(57)【要約】上面を有する基板と、前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも１つのマイクロピットと、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも１つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも１つのマイクロトラップと、を備え、前記少なくとも１つのマイクロトラップは、前記少なくとも１つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも１つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している、垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。【選択図】図１７
2018515135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面を有する基板と、
前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも１つのマイクロピットと、
前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも１つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも１つのマイクロトラップと、を備え、
前記少なくとも１つのマイクロトラップは、前記少なくとも１つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも１つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している、
垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項２】
前記垂直なスロットの前記開口は、前記少なくとも１つのマイクロピットの一端部に実質的に整列している、請求項１に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項３】
カバー、及び一対の側壁を更に備え、前記カバーと前記一対の側壁とがそれらの間に流体通路を画定する、請求項１に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項４】
前記少なくとも１つのマイクロトラップは、前記基板に固定されている、請求項３に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項５】
前記少なくとも１つのマイクロトラップは、前記カバーに固定されている、請求項３に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項６】
前記垂直なスロットの前記開口は、前記少なくとも１つのマイクロピットの一部の上に重なっている、請求項１に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項７】
前記少なくとも１つのマイクロトラップの前記本体は、前記少なくとも１つのマイクロピット内に着座するように寸法決めされた舌部を備える、請求項６に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項８】
前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直なスロットが、前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記舌部内に延在する、請求項７に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項９】
カバー、及び一対の側壁を更に備え、前記基板と前記カバーと前記一対の側壁とがそれらの間に流体通路を画定する、請求項６に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのマイクロトラップが前記基板に固定されている、請求項９に記載の垂直セルペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのマイクロトラップが前記カバーに固定されている、請求項９に記載の垂直セルペアリング（VCP）システム。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのマイクロトラップの前記本体は、前記垂直なスロットの前記開口に隣接して配置された１対の表面を備え、前記１対の表面が、前記垂直なスロットの前記開口に対して後方に延びている、請求項６に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項１３】
前記１対の表面は、前記垂直なスロットの前記開口に対して約５度以上約３５度以下の角度で後方に延びている、請求項１２に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項１４】
前記１対の表面は、約１０度の角度で後方に延びている、請求項１３に記載の垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項１５】
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも１つのマイクロピットと、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも１つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも１つのマイクロトラップと、を備え、前記少なくとも１つのマイクロトラップは、前記少なくとも１つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも１つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している、垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムを用意するステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第1スラリーを流し、前記少なくとも１つのマイクロピット内に第1セルを着座させるステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第２スラリーを流し、第２細胞を前記少なくとも１つのマイクロトラップの前記垂直なスロットの前記開口に配置させるステップと、
を含む、細胞を垂直にペアリングする方法。
【請求項１６】
前記第１細胞が前記少なくとも１つのマイクロピットに整列または着座するように細胞の前記第１スラリーを流し、その後に、前記第１細胞が前記少なくとも１つのマイクロピットに着座することが確実になるように前記垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムを遠心分離することによって、前記少なくとも１つのマイクロピット内に前記第１細胞が着座する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２細胞が前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直なスロットの前記開口に配置された後に、前記第２細胞が前記第１細胞と細胞−細胞通信することが確実になるように前記垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムを遠心分離する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１細胞と前記第２細胞とが異なる細胞タイプである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記垂直なスロットの前記開口は、前記少なくとも１つのマイクロピットの一端部と実質的に整列している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムは、カバー、及び一対の側壁を更に備え、前記カバーと前記一対の側壁とがそれらの間に流体通路を画定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのマイクロトラップは、前記基板に固定されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのマイクロトラップは、前記カバーに固定されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記垂直なスロットの前記開口は、前記少なくとも１つのマイクロピットの一部の上に重なっている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのマイクロトラップの前記本体は、前記少なくとも１つのマイクロピット内に着座するように寸法決めされた舌部を備える、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直なスロットが、前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記舌部内に延在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
カバー、及び一対の側壁を更に備え、前記基板と前記カバーと前記一対の側壁とがそれらの間に流体通路を画定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのマイクロトラップが前記基板に固定されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのマイクロトラップが前記カバーに固定されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのマイクロトラップの前記本体は、前記垂直なスロットの前記開口に隣接して配置された１対の表面を備え、前記１対の表面が、前記垂直なスロットの前記開口に対して後方に延びている、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記１対の表面は、前記垂直なスロットの前記開口に対して約５度以上約３５度以下の角度で後方に延びている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１対の表面は、約１０度の角度で後方に延びている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直な溝と垂直なスロットとを有する本体を備え、前記垂直な溝は開口と出口とを有し、前記垂直な溝は、一対の細胞が垂直に整列しているときに前記一対の細胞が着座するように寸法決めされており、前記垂直なスロットは開口と出口とを有し、前記垂直なスロットは、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされており、前記垂直な溝の前記出口が前記垂直なスロットの前記開口と流体連通している、
垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム。
【請求項３３】
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直な溝と垂直なスロットとを有する本体を備え、前記垂直な溝は開口と出口とを有し、前記垂直な溝は、一対の細胞が垂直に整列しているときに前記一対の細胞が着座するように寸法決めされており、前記垂直なスロットは開口と出口とを有し、前記垂直なスロットは、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされており、前記垂直な溝の前記出口が前記垂直なスロットの前記開口と流体連通している、垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムを用意するステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第1スラリーを流し、前記少なくとも１つのマイクロトラップの前記垂直な溝内に第1セルを着座させるステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第２スラリーを流し、第２細胞を前記少なくとも１つのマイクロトラップの前記垂直な溝内に着座させるステップと、
を含む、細胞を垂直にペアリングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
係属中の先行特許出願
本願は、以下の継続中の特許出願における利益を出願するものである。
(i) 細胞−細胞通信の高解像度画像について、ザ・メソジスト・ホスピタル、及びチャン，ジュン・ヒー等によって２０１５年５月１日に提出された米国仮特許出願第６２／１５５，７６２号（代理人整理番号：METHODIST-21 PORV）
(ii) 細胞−細胞通信の高解像度画像について、ザ・メソジスト・ホスピタル、及びチン，リードン等によって２０１５年１０月１９日に提出された米国仮特許出願第６２／２４３，２５７号（代理人整理番号：METHODIST-21 R PORV）
上記に特定した２つの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して細胞画像化に関し、より詳細には、細胞−細胞通信の高解像度画像化に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞が相互に通信する能力は、真核生物における最も重要で基本的な活動の１つである。免疫システムの細胞は、様々な方策によって互いに通信する。これらの中で最も重要なものの１つは、免疫シナプス（ＩＳ）として知られる界面構造の形成である。原文から、免疫認識、癒着、活性、及び抑制のような重要な機能を成立させる細胞免疫応答において、ＩＳが重要な役割を果たすことを示す膨大な証拠が蓄積されている。
【０００４】
癌および感染に対する免疫応答におけるＩＳの重要な役割を考えると、実際の細胞−細胞接合においてＩＳの形成、信号、及び機能の基礎となる分子メカニズムを理解することが不可欠である。固定され且つ生細胞の従来の共焦点顕微鏡法は、ＩＳを研究するために利用可能な最も一般的な画像化技術である。伝統的に、免疫細胞は、標的細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）と混合される。固定後、細胞−細胞接合は共焦点顕微鏡で画像化される。しかしながら、シナプスを画像化する現在の方法はいくつかの限界に直面している。このうち最も明白なことの１つは、側方の細胞−細胞接合（すなわち、２つの細胞が横並びに配置されている）におけるＩＳ画像の低い解像度である。この状況では、細胞対は共焦点顕微鏡の焦点面に平行に伸び、シナプス界面はＺ軸（図１Ａ、左）に沿って焦点面に垂直に置かれる。その結果、シナプス界面全体をとらえるために、連続的なＺ方向にスタックした画像を撮影する必要がある。しかしながら、従来の共焦点顕微鏡は、典型的にＺ軸に沿った分解能が低いため、高分解能のシナプス画像（図１Ａ）を得ることは困難である。これは、幾何学においてシナプスにおける分解能が、入射レーザビームの細長い点拡がり関数（ＰＳＦ）（図１Ａ、右）によって大幅に減少するためである。画像の解像度は、単に細胞対を回転させ、ＩＳを水平の画像化平面上に配置することによって大幅に改善することができる（図１Ｂ）。最近では、ＩＳ画像化に理想的な焦点面を実現するために、研究者は光ピンセットを使用して手動で細胞を重ねて配置している。この技術は、シナプスを視覚化することができる解像度を効果的に高めることができた。しかしながら、光ピンセットで手動で細胞を別の細胞の上に置くことは、大きな労働力を要すると共に費用がかかってしまう。
【０００５】
さらに、光ピンセットの効果的な操作は、膨大な訓練を必要とする。加えて、光ピンセットを使用して細胞のスタックが成功した場合であっても、細胞画像化中に細胞（特に生細胞）の側方の運動が起こることがあり、シナプス界面の画像化を妨害する可能性がある。
【０００６】
近年、マイクロピットシステムが開発され、低コストでエフェクタ細胞と標的細胞との間の高分解能ＩＳ画像化が達成されている。しかし、マイクロピットシステム単独での細胞の充填効率は低く、約１０−１５％である。さらに、エフェクタ細胞と標的細胞との間の垂直方向のスタックの頻度も比較的低く、画像化の時間を消費してしまう。
【０００７】
したがって、細胞を垂直スタックするための新規なシステムの開発は、ＩＳ形成および細胞−細胞通信の研究を容易にする未だ十分に対処されていない要求を満たすであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、従来の共焦点顕微鏡法を用いた、高い処理能力、且つ、ＩＳの高解像度画像化を可能にする新しいシステムの提供および使用を含む。マイクロピットと単一細胞トラップを組み合わせたアレイにより、垂直方向に「スタックされた」細胞においてＩＳを視覚化できる新しいマイクロ流体プラットフォームが開発された。この垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムは、抑制性受容体、プログラムされた細胞死（ＰＤ−１）および単一細胞レベルでの細胞傷害性シナプスによって成立する抑制性シナプスの動態を調べるために使用されている。技術革新に加えて、ＩＳにおけるＦ−アクチンおよび細胞溶解性の顆粒の新規分布、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）ＩＳにおけるＰＤ−１マイクロクラスタ、及び細胞傷害性の動態を含む、ＶＣＰシステムを使用して新規な生物学的所見が実証された。高処理能力で、費用効果が高く、使い易いＶＣＰシステムは、従来の画像化技術と共に、さまざまな分野で多くの重要な生物学的問題に取り組むために使用され得る。
【０００９】
本発明の或る好ましい形態では、垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムが提供される。かかる垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムは、
上面を有する基板と、
前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも１つのマイクロピットと、
前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも１つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも１つのマイクロトラップと、を備え、
前記少なくとも１つのマイクロトラップは、前記少なくとも１つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも１つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している。
【００１０】
本発明の別の形態では、細胞を垂直にペアリングする方法が提案される。かかる方法は、
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも１つのマイクロピットと、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも１つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも１つのマイクロトラップと、を備え、前記少なくとも１つのマイクロトラップは、前記少なくとも１つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも１つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している、垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムを用意するステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第1スラリーを流し、前記少なくとも１つのマイクロピット内に第1セルを着座させるステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第２スラリーを流し、第２細胞を前記少なくとも１つのマイクロトラップの前記垂直なスロットの前記開口に配置させるステップと、を含む。
【００１１】
本発明の別の形態では、垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムが提供される。かかる垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムは、
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直な溝と垂直なスロットとを有する本体を備え、前記垂直な溝は開口と出口とを有し、前記垂直な溝は、一対の細胞が垂直に整列しているときに前記一対の細胞が着座するように寸法決めされており、前記垂直なスロットは開口と出口とを有し、前記垂直なスロットは、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされており、前記垂直な溝の前記出口が前記垂直なスロットの前記開口と流体連通している。
【００１２】
本発明の別の形態では、細胞を垂直にペアリングする方法が提案される。かかる方法は、
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直な溝と垂直なスロットとを有する本体を備え、前記垂直な溝は開口と出口とを有し、前記垂直な溝は、一対の細胞が垂直に整列しているときに前記一対の細胞が着座するように寸法決めされており、前記垂直なスロットは開口と出口とを有し、前記垂直なスロットは、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされており、前記垂直な溝の前記出口が前記垂直なスロットの前記開口と流体連通している、垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムを用意するステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第1スラリーを流し、前記少なくとも１つのマイクロトラップの前記垂直な溝内に第1セルを着座させるステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第２スラリーを流し、第２細胞を前記少なくとも１つのマイクロトラップの前記垂直な溝内に着座させるステップと、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１：光学的形状とＶＣＰシステム設計。（Ａ）従来の方法および対応するシミュレートされた励起ビームの点広がり関数（ＰＳＦ、右）によって、ＩＳを画像化する光学的形状（左）。（Ｂ）ＶＣＰシステムおよび対応するシミュレートされた励起ビームのＰＳＦ（右）によって、ＩＳを画像化するための光学的形状（左）。（Ｃ）細胞充填中のマイクロ流体プラットフォームおよび流路の全体設計。ＶＣＰ  ｖｅｒ．３（下記参照、図１８を含む）が示されている。（Ｄ）細胞充填後のマイクロ流体ＶＣＰシステムの明視野像と合わせた広視野蛍光顕微鏡画像。赤色チャネルおよび緑色チャネルは、それぞれＫ５６２及びＫＨＹＧ−１細胞に対応する。スケールバーは、それぞれ１００μｍ（左）と２０μｍ（右）を示している。（Ｅ）細胞充填操作中の各ステップにおけるトラップ捕捉細胞の割合。グラフは、ＶＣＰシステムの４つの異なる領域にわたる細胞捕捉効率の平均および標準偏差（ＳＤ）を示す。結果は、３つの独立した実験から得られている。
【図２】図２：上層のシミュレートされた流速分布。（Ａ）ＶＣＰ  ｖｅｒ．３における流速の概要。（Ｂ）細胞を含まない１つの微細構造周辺の流速分布。赤線は下層を示し、白いブロックは上部のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製の構造を示す。（Ｃ）流速分布は、捕捉された細胞を有する単一の微細構造の周りで変化する。流速は、低流速および高流速をそれぞれ示す冷色および暖色を有する擬似色である。
【図３】図３：共焦点蛍光顕微鏡で画像化した従来の（Ｃｏｎｖ．）およびＶＣＰシステムによるＩＳ構造の比較。ポリ−Ｌ−リジンで覆われたカバーガラス上のＫ５６２（標的）細胞（Ａ）と、接合されたＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１（ＮＫ）細胞およびＶＣＰ  ｖｅｒ．２によるＮＫ標的細胞対の垂直スタック（下記参照、図１６及び図１７を含む）（Ｂ）は、Ｆ−アクチン（赤色）、パーフォリン（緑色）、及び チューブリン（シアン）に対して固定され、透過処理され、染色される。スケールバーは５μｍを示す。ＩＳを中心とする３次元（３Ｄ）蛍光画像がＺ軸投影される。ポリ−Ｌリジン（Ｃ）で覆われたカバーガラスを用い、ＶＣＰ  ｖｅｒ．２システムを用いて得られた蛍光顕微鏡画像から拡大した領域（８×８μｍ、白いボックス）。（Ｄ）パーフォリン（緑色）およびＦ−アクチン（赤色）が可視化されている。スケールバーは２μｍを示す。（Ｅ）Ｆ−アクチンおよびパーフォリンの蛍光強度プロファイルが白線全体にわたって測定されている。パーフォリンおよびＦ−アクチンの蛍光強度は、それぞれ緑色および赤色の線で示される。Ｆ）垂直線（ＣおよびＤの青線）に沿った個々のパーフォリン顆粒の半値全幅（ＦＷＨＭ）および蛍光強度の標準誤差。（Ｇ）３Ｄ共局在分析からパーフォリンおよびＦ−アクチンについてピアソンの相関係数（ｒ）が計算されている。各ドットは各対を表す（従来のｎ＝４６、ＶＣＰ画像化のｎ＝４５）。（Ｈ）ピアソンの相関係数（ｒ）が、２Ｄ共局在分析から計算されている。 （Ｇ）と同じデータセットが使用されている。（Ｉ）２Ｄ共焦分析中に得られたＰ値（ピアソンの相関係数解析の信頼性を示す）。ＶＣＰ  ｖｅｒ．３が（Ｇ−Ｉ）に用いられている。
【図４】図４：ＶＣＰ  ｖｅｒ．３を用いた３Ｄ共焦点蛍光顕微鏡による「分散→集中→分散」（Ｄ→Ｃ→Ｄ）ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１クラスタの時間経過の画像。（Ａ）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１マイクロクラスタが合同してその後に分散したＮＫ標的細胞対（６８．２％、２２の観察のうち１５）の分集団の２つの例を示している。スケールバーは５μｍを示す。（Ｂ）Ｄ→Ｃ→Ｄ分集団のうちの細胞−細胞通信中のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１クラスタ運動の提案モデル。
【図５】図５：３Ｄ共焦点蛍光顕微鏡による「ステイ分散」（ｓＤ）ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１クラスタの時間経過撮影の画像。（Ａ）及び（Ｂ）は、ＶＣＰ  ｖｅｒ．３を用いて画像化された２つの細胞対上のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１クラスタ運動の分集団の２つの例を示す。画像化の間、この集団ではクラスタは合同しなかった（２２．７％、２２の観察のうち５）。スケールバーは５μｍを示す。
【図６】図６：３Ｄ共焦点蛍光顕微鏡による「分散→ステイ集中」（Ｄ→ｓＣ）ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１クラスタ（９．１％、２２回の観察のうち２）の時間経過撮影の画像。（Ａ）概略モデル（左）と時系列（右）。ＰＤ−Ｌ１−ｍＣｈｅｒｒｌｙ＋  Ｋ５６２（下部、赤色）とＰＤ−１−ＧＦＰ＋  ＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１（上部、緑色）細胞の間のＩＳ形成のためのＶＣＰ  ｖｅｒ．２システムを使用することによって画像化した生細胞から選択された時点の蛍光画像。ＰＤ−１−ＧＦＰ、ＰＤ−Ｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙ、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の明視野、融合、および共局在化が示される。スケールバーは１０μｍを示す。（Ｂ）共局在化蛍光画像におけるクラスタの追跡経路。黒い点線は中心クラスタ領域を示す。（Ｃ）負圧を遮断した後の明視野像と合わせた蛍光画像。
【図７】図７：広い領域の蛍光顕微鏡下で画像化されたＮＫ細胞によって媒介される細胞毒性の動態。（Ａ）Ｋ５６２（緑色）標的細胞に対するＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１（赤色）媒介細胞毒性の動力学を確立するために使用されたＶＣＰ  ｖｅｒ．３システムからの生細胞時間経過撮影画像。スケールバーは、それぞれ１００μｍ（左）及び１０μｍ（右）を示す。（Ｂ）６時間の取得中にＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１細胞（灰色）、Ｋ５６２細胞単独（緑色）、及びＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１細胞単独（赤色）と対になったＫ５６２細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。（Ｃ−Ｆ）Ｋ５６２標的細胞と対になったときのＮＫ細胞の死滅動態の分類。（Ｃ）６時間におけるＮＫ細胞と接合したＫ５６２細胞からの正規化ＭＦＩの「ゆっくりとした減衰」。（Ｄ）ＮＫ細胞と接合したＫ５６２細胞からの正規化ＭＦＩの「単純減少」（左）、及びＮＫ細胞との接合後のＫ５６２細胞における「単純減少」発生の定量化（右）。（Ｅ）６時間におけるＮＫ細胞と接合したＫ５６２細胞からの正規化されたＭＦＩの「急速な減衰」。（Ｆ）ＮＫ細胞と結合したＫ５６２細胞からの正規化ＭＦＩの「多段減少」（左）およびＮＫ細胞との接合後のＫ５６２細胞における「多段減少」発生の定量化（右）。黒い線は各母集団の平均を示す。
【図８】図８：開発された垂直な細胞ペアリングシステムの以前のバージョン及び現在のバージョン。垂直な細胞ペアリングシステムの異なるパラメータが並べて比較されている。
【図９】図９：段階的なＶＣＰシステム製造過程および細胞充填効率。（Ａ）垂直な細胞ペアリングシステムとフォトリソグラフィ工程の代表的な写真。（Ｂ）異なる細胞充填密度を有するＶＣＰ  ｖｅｒ．３システムに捕捉されたＫＨＹＧ−１（緑色）およびＫ５６２（赤色）細胞の選択された画像。（Ｃ）異なる細胞充填密度でのＶＣＰシステムの充填効率。プロットは、３つの独立した試験からのデータを示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１０】図１０：ＶＣＰ  ｖｅｒ．３の２つのＰＤＭＳ層の製作と寸法。（Ａ）下層の全体的なフォトマスク設計。（Ｂ）上層の全体的なフォトマスク設計。スケールバーは５ｍｍを示す。（Ｃ）マイクロピットアレイを含む下部ＰＤＭＳ層。（Ｄ）単一細胞トラップアレイを含む上部のＰＤＭＳ層。（Ｅ）配置されたマイクロ流体ＶＣＰシステムが明視野顕微鏡法を用いて画像化されている。
【図１１】図１１：共焦点蛍光顕微鏡で画像化した従来の（Ｃｏｎｖ．）及びＶＣＰシステムによるＩＳ構造の比較。ＶＣＰ  ｖｅｒ．３を用いたＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞−Ｋ５６２標的細胞対の垂直スタック（Ａ）とポリ−Ｌリジンで覆われたカバーガラス上のＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞−Ｋ５６２細胞対の垂直スタック（Ｂ）は、Ｆ−アクチン（赤色）、パーフォリン（緑色）、及び チューブリン（シアン）に対して固定され、透過処理され、染色される。スケールバーは縮小図では５μｍを示し、拡大図では２μｍを示す。
【図１２】図１２：流動細胞分析による細胞株の確認。（Ａ）ＰＤ−１−ＧＦＰ＋  ＣＤ１６−ＫＨＧＹ−１細胞（左）およびＰＤ−１−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗体（右）で染色した細胞のヒストグラム。未染色のＣＤ１６−ＫＨＧＹ−１細胞は陰性対照（灰色）として機能した。（Ｂ）ＰＤ−Ｌ−ｍＣｈｅｅｒｙ＋  Ｋ５６２細胞（左）およびＰＤ−Ｌ１−ＦＩＴＣ抗体で染色した細胞（右）のヒストグラム。未染色のＫ５６２細胞は陰性対照（灰色）として機能した。
【図１３】図１３は、垂直に対をなす細胞のための従来技術のマイクロピットシステムの概略図である。
【図１４】図１４は、垂直に対をなす細胞のためのマイクロトラップの概略図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、図１４に示すマイクロトラップの概略正面図である。
【図１５】図１５は、細胞を垂直にペアリングするための新規な垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム（ＶＣＰ  ｖｅｒ．１下記参照、図１５を含む）の概略図である。
【図１５Ａ】図１５に示す垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム（ＶＣＰ  ｖｅｒ．１）の概略正面図である。
【図１６】図１６：垂直方向に対をなす細胞のための新規な垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム（ＶＣＰ  ｖｅｒ．２）の概略図。
【図１６Ａ】図１６Ａ：図１６に示す垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム（ＶＣＰ  ｖｅｒ．２）の概略正面図である。
【図１７】図１７：ＶＣＰシステムに第１の細胞タイプおよび第２の細胞タイプ配置された図１６に示す垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム（ＶＣＰ  ｖｅｒ．２）の概略図である。
【図１８】図１８は、垂直方向に対をなす細胞のための新規な垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム（ＶＣＰ  ｖｅｒ．３）の概略図である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、図１８に示す垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム（ＶＣＰ  ｖｅｒ．３）の概略正面図である
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、添付の図面とともに考察される本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明によって、十分に開示され、または明白になるであろう。
【００１５】
本発明は、ＩＳを水平方向に高分解能かつ高処理速度で研究するための新規なシステムの提供および使用を含む。
【００１６】
マイクロピットと単一細胞トラップを組み合わせたアレイである、新たな開発のマイクロ流体プラットフォームが、ＩＳ画像化における前述した困難性に応じた様々な技術的新規性を提供する。対になった細胞の垂直細胞配向は、ＩＳを水平面内で画像化することを可能にし、固定細胞、及び生細胞画像化の両方について解像度を高める。この垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システムは、焦点面での横方向の細胞の漂流を最小限に抑えることができ、接合した細胞を垂直な位置にさせることができる。このシステムはまた、高充填効率で一度に３０００以上の接合を捕捉することができる。このＶＣＰシステムを用いて、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ＩＳの構造で「対面式」な型が示される。
【００１７】
従来の細胞−細胞接合と比較して、ＩＳにおけるＦ−アクチンの構成は、従来の共焦点顕微鏡法を用いた高解像度のＶＣＰシステムではっきりと観察することができる。本発明のＶＣＰシステムは、ＩＳでの低Ｆ−アクチン密度の領域にわたってパーフォリン陽性溶解性の顆粒の位置を検出することができ、その詳細は超解像顕微鏡法で以前に報告されているが、従来の手法を用いて画像化することは困難であることが判明している。加えて、細胞溶解性の顆粒から分離された明るいＦ−アクチンの点紋が、ＮＫシナプスの中心で観察された。これは通常、従来の共焦点顕微鏡法では見分けがつかない。さらに、ＮＫシナプスにおけるＰＤ−１マイクロクラスタの新規な動態、及び実際の細胞−細胞界面でＮＫ細胞によって媒介される標的細胞溶解もＶＣＰシステムで観察された。このように、ＶＣＰシステムは、従来の技術の多くの問題に好適に対処できるだけでなく、様々な他の生物学分野において幅広く取り扱うことができる、ＩＳ画像化に対する高処理能力、高効率、およびユーザフレンドリなアプローチを提供する。
【００１８】
新規な垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム
まず、図１３を参照すると、Ｂｉｇｇｓらによって開発されたマイクロピットシステムのような従来技術のマイクロピットシステム５が示されている。マイクロピットシステム５は、上部平坦面１５を有する基板１０と、その内部に形成されたマイクロピット２０とによって特徴付けられる。マイクロピット２０は、第１細胞タイプの細胞の第１スラリーが上部平坦面１５上に流されたときに、その第１細胞タイプの細胞がマイクロピット２０内に入ることができるように寸法決めされている。マイクロピット２０は、その後に第２細胞タイプの細胞の第２スラリーが上部平坦面１５の上に流されたときに、その第２細胞タイプの細胞もマイクロピット２０内に入り、第２細胞タイプの細胞が第１細胞タイプの細胞の上に着座することができるように寸法決めされている。図１３に示す従来技術のマイクロピットシステム５では、第１及び第２細胞スラリーが連続して通過することができるチャネルを形成するように、基板１０の上に離間してカバー（図示せず）が配置されることが理解されよう。
【００１９】
先行技術のマイクロピットシステム５は、（ｉ）（細胞がマイクロピット２０に入るのを誘導することが困難であることによる）低い収率、および（ｉｉ）低い細胞収容性（両方の細胞がマイクロピット２０に収容されても第２細胞タイプの細胞が第１細胞タイプの細胞と垂直配向から外れ得る）を含む多くの欠点に悩まされている。
【００２０】
図１４及び図１４Ａは、本発明に沿って形成されたマイクロトラップシステム２５を示す。マイクロトラップシステム２５は、上部平坦面３５を有する基板３０と、上部平坦面３５上に配置されたマイクロトラップ４０とによって特徴付けられる。マイクロトラップ４０は、垂直な溝５０、及び垂直なスロット５５によって特徴付けられる本体４５を備える。垂直な溝５０は、第１細胞タイプの細胞の第１スラリーが上部平坦面３５の上に流されたときに、第１細胞タイプの細胞が垂直な溝５０内に入ることができるように寸法決めされている。垂直な溝５０は、その後に第２細胞タイプの細胞の第２スラリーが上部平坦面３５の上に流されたときに、第２細胞タイプの細胞も垂直な溝５０の中に入り、第２細胞タイプの細胞が第１細胞タイプの細胞の上に着座することができるように寸法決めされている。好ましい構造においては、第１及び第２細胞スラリーが連続して通過することができるチャネルを形成するように、基板３０の上に離間してカバー（図示せず）が配置されることが理解されよう。
【００２１】
マイクロピットシステム２５は、（ｉ）（細胞が垂直な溝５０に入るのを誘導することが困難であることによる）低い収率、および（ｉｉ）２つの異なるタイプの細胞の低いペアリング効率（つまり、大部分のマイクロトラップにおいて同じタイプの細胞が対となる）を含む多くの欠点に悩まされている。
【００２２】
本発明によれば、図１５及び図１５Ａを参照して、垂直細胞ペアリング（ＶＣＰ）システム１００（ＶＣＰ  ｖｅｒ．１）が提供される。垂直細胞ペアリングシステム１００は、上部平坦面１１０を有する基板１０５と、その内部に形成されたマイクロピット１１５とによって特徴付けられる。マイクロピット１１５は、後述するように、第１細胞タイプの細胞を受けることができるように寸法決めされている。垂直細胞ペアリングシステム１００はさらに、上部平坦面１１０上に配置されたマイクロトラップ１２０（以下、「マイクロピラー」ともいう）を備える。マイクロトラップ１２０は、垂直なスロット１３０によって特徴付けられる本体１２５を備える。垂直スロット１３０は、細胞スラリーが上部平坦面１１０の上に流されたときに、細胞が垂直なスロット１３０の口に到達できるように寸法決めされている。マイクロトラップ１２０は、垂直スロット１３０がマイクロピット１１５と長手方向に整列するように、上部平坦面１１０上に配置される。
【００２３】
上記の理由から、第１細胞タイプの細胞の第１スラリーが上部平坦面１１０の上に流されたとき、第１細胞タイプの細胞はマイクロトラップ１２０の垂直なスロット１３０によってマイクロピット１１５の真上に捕捉される。その後、細胞ペアリングシステム１００が（例えば、遠心分離機を用いて）遠心力を受けると、マイクロトラップ１２０によって捕獲された第１細胞タイプの細胞が、マイクロピット１５に入り、マイクロピット１１５内に着座する。次いで、洗浄工程が実施され（例えば、上部平坦面１１０上にバッファー溶液を流し）、マイクロピット１１５に入っていない細胞を洗い流してもよい。次に、第２細胞タイプの細胞の第２スラリーが上部平坦面１１０の上に流され、第２細胞タイプの細胞がマイクロトラップ１２０によって捕捉される。つまり、第２細胞タイプの細胞が、マイクロピット１１５によって捕捉された第１細胞タイプの細胞の上に通じて配置される。必要に応じて、細胞ペアリングシステム１００は、（マイクロトラップ１２０によって捕捉された）第２細胞タイプの細胞が、（マイクロピット１１５によって捕捉された）第１細胞タイプの細胞と安定して接触することが確実となるように、（例えば、遠心分離機を用いて）更に遠心力が加えられてもよい。本発明の好ましい形態では、第１および第２細胞スラリーを連続して通過することができるチャネルを形成するように、基板１０５の上に離間してカバー（図１５では図示せず）が配置される。
【００２４】
重要なことに、マイクロトラップ１２０をマイクロピット１１５と対にすることによって、垂直細胞ペアリングシステム１００は、（ｉ）（第１細胞タイプの細胞をマイクロトラップ１２０によって捕捉し、マイクロピット１１５に充填することが容易であることと、第２細胞タイプの細胞が第１細胞タイプの細胞に隣接するマイクロトラップ１２０によって捕捉され易いこととによる）高い収率、および（ｉｉ）（マイクロトラップ１２０の垂直なスロット１３０がマイクロピット１１５と整列していることによる）第２細胞タイプの細胞の第１細胞タイプの細胞との確実な位置合わせと、を提供する。
【００２５】
図１６、図１６Ａ、及び図１７は、本発明に沿って形成された別の垂直細胞ペアリングシステム２００（ＶＣＰ  ｖｅｒ．２）を示している。垂直細胞ペアリングシステム２００は、（ｉ）垂直細胞ペアリングシステム２００のマイクロピット２１５が流れの方向に伸びており、（ｉｉ）マイクロトラップ２２０の本体２２５がマイクロピット２１５の一部に着座するように寸法決めされている舌部２３５を含むことを除いて、上述した垂直細胞ペアリングシステム１００と実質的に同一である。これにより、マイクロトラップ２２０の垂直なスロット２３０が常にマイクロピット２１５の長手方向の中心線と整列することが保証される。マイクロトラップ２２０の本体２２５上に舌部２３５を形成することによって、完全な組立体を形成するために互いに「スナップ」する２つのスライド上に垂直細胞ペアリングシステム２００を提供することが可能であることを理解されたい。つまり、スライドから離れて延びる舌部２３５（または複数の舌部２３５）を有する第１のスライドが、マイクロトラップ２２０の本体２２５（または複数のマイクロトラップ２２０の複数の本体２２５）を含み、第２のスライドが本体２２５の舌部２３５を収容するように配置された基板２０５及びマイクロピット２１５（または複数のマイクロピット２１５）を含む。このように、マイクロトラップ２２０の舌部２３５のマイクロピット２１５との整列は、垂直細胞ペアリングシステム２００の組み立てを助けることができる。
【００２６】
図１８及び図１８Ａは、本発明に沿って形成された別の垂直細胞ペアリングシステム３００（ＶＣＰ  ｖｅｒ．３）を示す。垂直細胞ペアリングシステム３００は、垂直なスロット３３０の口を画定するマイクロトラップ３２０の「上流」の表面３４０が、図１６及び図１７に示される形状からわずかに「後退」していることを除いて、上述の垂直細胞ペアリングシステム２００と実質的に同一である。「後退」は、好ましくは約５度から約３５度までの角度で、例えば図１０に示す１０度の角度である。この「後退」した構成は、マイクロトラップ３２０の垂直なスロット１３０と直接に整列した細胞のみがマイクロトラップ３２０の上流の表面に保持されることを保証にするので、非常に優れている。より詳細には、この「後退」された構成は、垂直なスロット３３０の口に1つのセルしか捕捉されず、捕捉されたセルがマイクロピット３１５と直接垂直に整列することを保証する。これにより、マイクロトラップ３２０の表面３４０の「後退」された構成は、垂直細胞ペアリングシステム３００の充填効率を高めることができる。
【００２７】
材料および方法
１．マイクロ流体ＶＣＰシステムの製造
製造手順の概略フローを図９に要約する。酸素プラズマクリーニングされたシリコン（１００）ウェハ（厚さ５００μｍ、Silicon Quest International、米国）上にネガティブフォトレジスト（SU-83025、MicroChem、Newton、MA）をコーティングした。フォトレジストを２９００ｒｐｍで３０秒間回転させ、上型用に３０μｍの厚さをもたらし、４０００ｒｐｍで６０秒間回転させ、下型用に１５μｍの厚さをもたらした。フォトレジストを９５℃で３分間ソフトベークし、フォトマスクを介してＵＶ光に露光させた。フォトレジストを６５℃で１分間、９５℃で４分間ベークして現像した後、マイクロピットおよびトラップのアレイの型が得られた。型は、大気圧で３０分間トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）によって被覆された。
【００２８】
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Sylgard 184、Dow Corning Corp.）を硬化剤と１０：１の比率で混合した。マイクロピットアレイ型（下型）をＰＤＭＳに浸漬し、加熱機械的プレス（CH4386、Carver press）によって４０ニュートンでナンバー１．５のカバーガラス（厚さ１７０μｍ）にプレスした。ＰＤＭＳを８０℃で２時間硬化させ、型を取り除いて下層が得られた。ＰＤＭＳをトラップアレイ型（上型）に注ぎ、７７℃で１時間硬化させた。ＰＤＭＳを型から持ち上げて上層が得られた。流入孔（直径４ｍｍ）及び負圧ポート（直径０．５ｍｍ）を上部ＰＤＭＳ層に打ち抜いた（Accu-Punch、Syneo）。少量のメタノールを潤滑に適用し、上層を下層にスナップして２層を組み立てた。
【００２９】
２．細胞培養
Ｋ５６２骨髄性白血病細胞株（American Type Culture Collection、ATCC）をＲＰＭＩ培地（Gibco、米国）で培養した。ＫＨＹＧ−１ヒトＮＫ細胞株（Dr. David T. Evans、Harvard Medical School提供）を、１０％ウシ胎仔血清（FBS、Gibco、米国）、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Gibco、USA）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Gibco、米国）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Cellgro、米国）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco、米国）、及び１％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Gibco、米国）が加えられたＲＰＭＩ培地からなるＲＩＯ培地中で維持した。さらに、各移行のために、１ｐｇ／ｍｌのシクロスポリンＡ（ＣｓＡ、Sigma-Aldrich、米国）、５０ｐｇ／ｍｌのＰｒｉｍｏｃｉｎ、及び１０Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２）をＲ１０培地に新たに加えた。使用の１日前に、ＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１細胞の培地をＣｓＡを含まない培地と交換した。ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を、１０％のＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ（Gibco、米国）で培養した。
【００３０】
３．ＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１、及びＫ５６２細胞株のプラスミドおよび導入
ＰＤ−１−ＧＦＰ構成物を生成するために、プライマ5'-AATCCGGAATTCGCCGCCGCGATCGCCATGC-3 '（フォワード）及び5'-AATCGCGGATCCTTAAACTCTTTCTTCACC-3'（リバース）によってＰＤ−１−ＧＦＰ融合タンパク質配列（OriGene、MD）の全長を増幅した。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（Thermo Scientific）で消化されたＰＣＲ成果物を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化されたレンチベクターｐＣＤＨ（２３）と結合した。同様に、Ｃ末端ｍＣｈｅｒｒｙ標的化ＰＤ−Ｌ１構成物を生成するために、プライマ5'-AATCCGGAATTCATGAGGATATTTGCTGTCT-3 '（フォワード）及び5'-AATCGCGGATCCCGTCTCCTCCAAATGTGTA-3'（リバース）によって、ＰＤ−Ｌ１  ｃＤＮＡ（OriGene、MD）の全長を増幅した。ＰＣＲ成果物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１ベクター（Clontech）と結合し、Ｃ末端ｍＣｈｅｒｒｙ標的化ＰＤ−Ｌ１を生成した。次に、ＰＤ−Ｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙ配列をプライマ5'-TAGAGCTAGCGAATTATGAGGATATTTGCTGTCTTTA-3 '（フォワード）および5'-ATTTAAATTCGAATTTCACGCCTTGTACAGCTCGTCC-3'（リバース）によって増幅した。このＰＣＲ生成物を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Clontech）によって、ＥｃｏＲＩ消化したpCDHレンチベクターに挿入した。すべてのプラスミドをシークエンス処理によって確認した。
【００３１】
ＰＤ−１−ＧＦＰ＋  ＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１、及びＰＤ−Ｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙ＋  Ｋ６５２細胞配列を生成するために、ＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１及びＫ５６２細胞配列の両方に、ｐＣＤＨ  ｃＤＮＡクローニング及び発現レンチウイルスシステムを導入した（SBI、System Biosciences）。レンチウイルスは、リポフェクタミン試薬（Invitrogen）によって、ＰＤ−１−ＧＦＰ又はＰＤ−Ｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙを含むレンチウイルスベクターおよび３つのパッケージングプラスミド（pMLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.g）をヒト胚性腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞と共同移入することによって生成された。簡潔には、すべてで０．８ｐｇのＤＮＡ（０．１２８ｐｇのｐＣＤＨ、０．３２ｐｇのｐＭＬｇ・ｐＲＲＥ、０．１６ｐｇのｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、０．１９２ｐｇのｐＭＤ２．ｇ）が４μｌのリポフェクタミンと混合され、６ウェルプレートで約９０％の集密で培養した２９３Ｔ細胞の１つのウェルへ加えられた。４８時間の移入後、ウイルス粒子を採取し、０．４５μｍフィルタ（GE）でろ過した。次に、４μｌのＲ１０培地に加えられた２×１０５個のＣＤ−ＫＨＹＧ−１又はＫ５６２細胞を４μｌのウイルス上清に感染させた。移入した細胞を８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で２４時間培養し、続いてＡｒｉａ  ＩＩ細胞選別機（ＢＤ）で選別した。ＰＤ−１−ＧＦＰ及びＰＤ−Ｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙの発現を流動細胞分析（ＢＤ LSR Fortessa）によって確認した。
【００３２】
４．細胞充填
作製したＶＣＰマイクロ流体システムを真空乾燥機に１５分間置いた。チューブを介してポートに１ｍｌシリンジを接続して負圧を生じさせ、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）における２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を注入口に導入した。ＶＣＰシステムを３７℃で３０分間培養した。次いで、Ｒ１０培地を使用してＶＣＰシステムのＢＳＡ溶液を置換した。１０６−１０７細胞／ｍｌの濃度範囲を有する１０μｌの第１細胞懸濁液を注入口に加えた。１５μｌ／分の流速を使用して、シリンジポンプを用いた細胞を播種した。３０秒の播種後、残りの細胞懸濁液をＰＢＳで３回洗浄した。マイクロ流体ＶＣＰシステムをシリンジから切り離し、２０００ｒｐｍ（７００×ｇ）で１０分間遠心分離し（Sorvall Legend X1R、Thermo scientific）、マイクロピットアレイに細胞を遠心沈殿させた。遠心分離後、シリンジを再接続し、第２の細胞懸濁液を注入口に加えた。第２細胞懸濁液を播種するためのパラメータは、第１細胞懸濁液のためのパラメータと同一である。
【００３３】
生細胞画像化のために、ＰＤ−Ｌ１ｍＣｈｅｒｒｙを安定に発現するＫ５６２細胞を、まずＶＣＰシステムに注入した。ＶＣＰシステムを倒立蛍光顕微鏡台に設置した。単一のセルに、６３倍の油浸対物レンズで焦点を当てた。次いで、ＰＤ−１−ＧＦＰを発現するＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１細胞を注入した。エフェクタ細胞を標的細胞の上に固定した後、入口の細胞懸濁液を２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含む新しい細胞培地と交換した。３０秒ごとに１０分間シナプス面で生細胞の画像化を行った。生細胞の画像化中、流速を０．５μｌ／分に維持した。固定細胞の画像化のために、ＣＤ１６ＫＨＹＧ−１細胞を最初に注入した。ＶＣＰシステムを３７度で１時間培養した。細胞−細胞接合体をＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド溶液で１５分間固定し、次いでＰＢＳで５分間洗浄した。ＰＢＳ中に５％の正常ロバ血清（ＮＳＤＳ）及び０．５％のトリトンＸ−１００を含む透過処理緩衝液をＶＣＰシステムに添加した。ＶＣＰシステムを４℃で一晩培養した。透過処理緩衝液をＰＢＳで５分間洗浄した。次に、ＰＢＳ中の３％のＮＤＳ及び０．５％のトリトンＸ−１００を含有する抗体緩衝液中のα−チューブリン（Abeam）に対する一次抗体をＶＣＰシステム内に圧送した。ＶＣＰシステムを４℃で一晩培養した。抗体緩衝液をＰＢＳで５分間洗浄した。細胞を蛍光標識した二次抗体（Life Technologies）で染色した。抗体緩衝液をＰＢＳで５分間洗浄し、最後に、少量のＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（登録商標）退色防止試薬封入剤培地（Life Technologies）をＶＣＰシステムに加えた。
【００３４】
５．共焦点顕微鏡
高解像度画像は、６３倍油浸対物レンズ（NA 1.47、Leica Microsystem）を備えた共焦点蛍光顕微鏡（Leica TCS SP8、Leica Microsystem）で捕捉された。固定細胞画像では、チューブリン、パーフォリン、及びアクチンのＺ方向スタックが連続して捕捉された。高解像度の生細胞画像は３７℃で実施された。生細胞内での動きを説明するために、ＩＳを中心とした４．５μｍのＺ方向スタックを取得した。ＰＤ−１−ＧＦＰ、ＰＤ−Ｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙ、及び明視野像からの蛍光が同時に検出された。画像は、ＬＡＳ  ＡＦソフトウェア（Leica）によって取得され、ＩｍａｇｅＪ及びＩｍａｒｉｓ（Bitplane）ソフトウェアで分析された。
【００３５】
結果
１．垂直細胞ペアリングマイクロ流体システムの設計最適化
ＶＣＰシステム設計の開発および最適化プロセスを図８に要約する。単一層のマイクロピットとマイクロトラップの設計が以前にテストされており、最適な充填条件で異種細胞対の３０％までが達成できた（図８）。マイクロピラー（マイクロトラップ）とマイクロピットを組み合わせることで、ペアリング効率は５５％まで（ＶＣＰ  ｖｅｒ．１）に増加した。しかしながら、マイクロスケールで２つの層を整列させることは、時間がかかり、大きな労働力を要する。さらに、硬化プロセス中のＰＤＭＳ収縮によって、全領域にわたって完全な整列を行うことはほとんど不可能である。したがって、ＶＣＰシステムはスナップイン構造（ＶＣＰ  ｖｅｒ．２）で設計された。上層のトラップ構造をワンクリック整列で下層の貫通孔とスナップすることにより２つの層を整列させ、下層のマイクロピットが上層のマイクロトラップと整列する（図９）。この方法は、特別な道具を必要とせずにすべての微細構造を正確に整列させることができる。また、この方法は、上記２つの層の設計において生じる、整列ずれの問題、及びＰＤＭＳ収縮率の不一致を防止する。マイクロピットアレイの１５μｍの高さは、マイクロトラップアレイの３０μｍの高さによって覆われ、２つのＰＤＭＳ層間に１５μｍの高い流路が形成される。マイクロピラー（マイクロトラップ）（ＶＣＰ  ｖｅｒ．３）にスイープ角を加えることによって、設計の更なる最適化が行われた。スイープ角は約５から約３５度が好ましい。本発明の１つの好ましい形態では、スイープ角は約１０度である。マイクロピラー（マイクロトラップ）の１０度のスイープ角は、７０％を超えた改善された充填効率を有する、より良い１対１の細胞対を提供する。ＶＣＰ  ｖｅｒ．３システムの詳細な寸法は図１０に示される。
【００３６】
製造方法は、上記した材料および方法のセクションでより詳細に記載されている。簡潔には、４０００個の個々のマイクロピットを含むポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）プレポリマー被覆型の下層のモールドを、Ｎｏ．  １．５、厚さ１７０μｍののカバーガラス上に直接打ち抜いた。マイクロトラップアレイを含む上層は、標準的なフォトリソグラフィ手順によって用意した。
【００３７】
マイクロ流体ＶＣＰシステムは、流速および方向を制御するために、流入量、負圧ポート、区域１、及び区域２を含む４つの領域を備える（図１Ｃ）。培地および細胞懸濁液が注入口から注入される。負圧ポートに接続された１ｍｌシリンジによって流圧が生成される。区域１は、細胞クラスタを分解し、培地および懸濁された細胞の流れを区域２に均等に分配するためのマイクロチャンネルからなる。ゾーン２は、細胞を捕捉するマイクロトラップアレイを含んでいる。細胞充填機構を管理するための２つの経路が存在している（図１Ｃ）。水平経路（それぞれ経路１及び経路２と表示される）は、マイクロトラップ構造の周りを流れ、トラップ間の３μｍの隙間を通過する。細胞懸濁液が入口を介して注入されると、細胞は、高い流速のために優先的に経路１をとる。複数の細胞が同じ経路をとっているときには流れが妨げられ、経路２をとることによって単一の細胞をトラップの間に固定することができる。トラップ間の３μｍの隙間に細胞が割り込むと、トラップされた細胞による閉塞のため、トラップの周囲の流れ分布が変化する。したがって、後続の細胞は経路１をとり、微細構造に捕捉された単一細胞を残し、側方の細胞の動きを抑制する。詳細な流速分布を図２に示す。図２Ｂの低流速領域は、細胞をマイクロピラー（マイクロトラップ）の間にトラップした後に大きくなり、このことは、流れ抵抗を減少させるのに寄与する（図２Ｃ）。このため、後続の細胞は、優先的にマイクロピラー（マイクロトラップ）を迂回する。注目すべきは、以前の研究は、層流下の空洞が全体的な流れ特性に影響を与えない一方で、層流が空洞内に渦を導くことを示している。したがって、マイクロトラップ構造は流れ分布を示すために省略される。このシステムでは、細胞をマイクロピットに引き下げる重力（図１Ｃの赤い矢印）は無視できる程度である。マイクロピットは、初めに細胞懸濁培地で満たされる。培地のおよその密度は、製造業者によれば１．０ｇ／ｍｌであり、血球の密度は１．１ｇ／ｍｌである。このため、細胞をマイクロトラップに固定する水平流れは、細胞に作用する重力を容易に圧倒する。しかし、遠心分離によって人工的に重力を増加させることにより、細胞がマイクロピットに容易に降下させられる。この後、第２の細胞懸濁液を同じ機構によって第１の細胞の上に注入して固定した（図１Ｃ及びＤ）。
【００３８】
ＶＣＰシステムの充填効率を試験するために、図１に示すように、各ステップにおける捕捉細胞の割合を測定した。まず、ＣＤ１６（ＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１；図１Ｄの緑色）を発現するＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１を、９２．８±１．１％の捕捉効率でVCPシステムに注入した。捕捉された細胞の割合は、遠心分離後に９２．２±５．９％に維持された。標的Ｋ５６２（ヒトの不死化骨髄性白血病細胞）細胞（図１Ｄの赤色）の連続した注入は、８１．３±２．７％の捕捉効率を達成した。最後に、ＫＨＹＧ−１及びＫ５６２細胞の両方を捕捉する微細構造の割合は、７３．７±４．４％であった（図１Ｅ）。充填効率（流速および細胞充填密度など）に影響を及ぼす要因を独立して評価した。流速については、細胞へのせん断応力を最小にするために、細胞充填については１５μｌ／分、生細胞画像化については0０．５μｌ／分を使用した。充填効率は、細胞充填密度の関数として増加した（図９Ｂ及び９Ｃ）。実験を通して、５０μｌの培地に懸濁された約１０６個の細胞を使用し、６０〜７０％の効率で細胞対を画像化することができた。これらの結果は、垂直に「スタックした」標的細胞およびエフェクタ細胞を高処理能力、高効率の方法で同時捕捉することができるＶＣＰシステムを好適に製造できることを実証する。
【００３９】
２．ＶＣＰシステムによる固定細胞上のＩＳの高分解能画像化細胞内構造
このＶＣＰシステムを好適に開発した後、ほとんどの研究機関で一般的な機器である従来の共焦点顕微鏡にて高解像度画像化が可能になるかどうかを決定するために、さらなるテストが行われた。ＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１細胞をエフェクタ細胞として使用し、Ｋ５６２細胞株を感受性標的細胞として使用した。ＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１エフェクタ細胞をＶＣＰシステムに充填し、続いて標的細胞を充填した。固定後、細胞−細胞接合をＦ−アクチン、パーフォリン、およびチューブリンについて染色した。対照として、従来の顕微鏡スライドガラスを前述のように同時に調製した。各蛍光チャネルで３次元（３Ｄ）画像を取得した。３Ｄスタックの再構成後、２つのセル間の界面のＺ方向投影が示された（図３）。
【００４０】
ＶＣＰシステムによって得られた代表的な画像は、従来の方法によって得られた画像のものよりも、２つの点で著しい改善を示している。第１に、本システムは、ＩＳの変形を防止する。従来の方法では、細胞は、原形質膜とポリリジン被膜されたカバースリップとの間の相互作用のために広がっている（図３Ａ）。対照的に、ＶＣＰシステムは歪みのない自然な形でＩＳを維持した（図３Ｂ）。第２に、ＶＣＰシステムは、従来の方法に比べて優れた空間分解能を提供する。従来のカバーガラス（図３Ｃ）およびＶＣＰシステム（図３Ｄ）の両方によって取得された３Ｄ共焦点画像から得られた拡大領域を比較した。パーフォリン陽性細胞溶解顆粒の丸い形状は、ＶＣＰシステムによって測定された画像において容易に識別されたが、細胞溶解性顆粒は、従来の方法によって取得された画像において伸長しているように見えた。さらに、ＶＣＰシステム（図３Ｄ）によって得られた画像における細かいＦ−アクチンの網目状構造の詳細は、従来の手法によって取得された画像のものよりも優れていた。パーフォリン陽性細胞溶解性顆粒は、Ｆ−アクチンの低密度領域上に位置して観察され（図３Ｅ）、以前の観察と一致した。分解能の向上を定量化するために、細胞溶解性顆粒の蛍光線強度プロファイルの半値全幅（ＦＷＨＭ、顆粒サイズの指標）を測定した。ＶＣＰシステムで測定された細胞溶解性顆粒のＦＷＨＭは、従来のアプローチを用いて測定されたものよりも明らかに小さかった（図３Ｅ）。
【００４１】
ＩＳ中のパーフォリン陽性細胞溶解性顆粒からよく分離されていると思われるＦ−アクチンの点紋の独特の特徴をさらに定量化するために、共局在分析を行い、ＶＣＰシステムおよびＶＣＰシステムを用いて得られた画像についてピアソンの相関係数（Pearson's r）を算出した（図３及び図１１）。Ｆ−アクチンはＩＳの中心に多数の天紋を形成し、パーフォリン陽性細胞溶解性顆粒はこれらのＦ−アクチンの天紋によってよく分離され（従来の方法を用いた側面視では認められなかった現象である）、これはＦ−アクチンがシナプスの中心で取り除かれているという以前の観察とは異なる。これらの観察をさらに定量化するために、３Ｄおよび２Ｄ共局在分析からのピアソンのｒを、それぞれＩｍａｒｉｓ（Bitplane）およびＩｍａｇｅＪソフトウェアによって計算した（図３Ｇ及びＨ）。ＮＫ細胞シナプスにおけるパーフォリンとＦ−アクチンとの間の顕著な負の相関関係が、従来型および現在のＶＣＰ画像法の両方を使用することによって観察されている。どちらの方法がより信頼性の高い分析法を提供するのかを定量的に決定するために、２Ｄ共局在分析からｐ値を抽出した（図３１）。従来の方法は平均５０％の信頼水準を示しているが、ＶＣＰシステムによって得られたｐ値の大部分は１００％に近い信頼水準を示している。
【００４２】
３.ＶＣＰシステムによる生細胞上のＰＤ−１マイクロクラスタの動態の高分解能画像化
ライブ画像化は、固定細胞の画像からは得られない抑制性ＩＳの動態に関する前例のない情報を提供する。ＶＣＰシステムによって可能にされたＩＳの高分解能画像化を好適に実証した後、ＶＣＰシステムをさらに試験して、ＶＣＰシステムがＩＳの生細胞画像化を可能にするか否かを判断した。ここでは、抑制性シナプスの動態を研究するためのモードとして、リンパ球に発現する重要な抑制性受容体である、蛍光標識されたプログラム細胞死―１（ＰＤ−１）を使用した。ＶＣＰシステムがＰＤ−１の動態をＩＳで視覚化することができるかどうかを試験するために、ＰＤ−１配位子（ＰＤ−Ｌ１）−ｍＣｈｅｒｒｙ（図１２）を発現する感受性Ｋ５６２標的細胞とともに、ＰＤ−１−ＧＦＰを発現するＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１細胞を使用した。生細胞画像化は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１マイクロクラスタがＮＫ  ＩＳにおいて３つの異なるパターンを形成することを明らかにした。３つの異なるパターンをさらに定量化するために、２２個の生細胞対をそれぞれに画像化した（図４−６）。ＩＳ形成の初期段階を捕捉するために、まずＰＤ−１−ＧＦＰ＋  ＣＤ−１６ＫＨＹＧ−１細胞をＶＣＰシステムに充填した。ＶＣＰシステムを顕微鏡に搭載した後、ＰＤ−Ｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙ＋  Ｋ５６２標的細胞をＶＣＰシステムに加えた。２２個の細胞対は、ＮＫ  ＩＳにおけるＰＤ−１マイクロクラスタの動きに基づいて、３つの異なるパターンに分類された。接合の大部分（６８．２％、２２のうち１５）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１クラスタが、早期段階（相互作用後５分未満）でＩＳの中心で合体し、その後、後期段階でＩＳの周りに分散することを示した（図４）。シナプスにおけるこの動的ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１運動は、図４に示すように、「分散→集中→分散」（「Ｄ→Ｃ→Ｄ」と略記する）と呼ぶこともできる。すべての接合の大部分（６８．２％）で観察されるパターンである、ＩＳ形成の初期段階（１−２分以内）にＩＳの中心に移動するという、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１マイクロクラスタが合体したＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１クラスタの動的移動のモデルが提案される（図４Ｂ）。その後、これら一時的に集中したクラスタは互いに解離し、シナプス全体にランダムな動きで分散する。
【００４３】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１が１０分間の時間経過の画像収集中に集中クラスタを形成しない、シナプス内のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１マイクロクラスタ運動の第２パターンも観察された（図５）。これらのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１マイクロクラスタ（２２．７％、２２の接合のうち５）は、取得中に分散したままである（図５）。このパターンは、図５に示すように、「分散したまま」（「ｓＤ」と略記する）と呼ぶことができる。
【００４４】
「Ｄ→Ｃ→Ｄ」および「ｓＤ」パターンに加えて、少数のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１マイクロクラスタ（９．１％、２２の接合のうち２）が、ＩＳの周囲に形成されてシナプスの中心に合流し、そこで群れたままとなることも観察された（図６Ａ）。このシナプスにおけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の動態の運動は、「分散→中央集中」（「D→ C」と略記する）と呼ぶことができる。以前の観察と一致して、ＰＤ−１マイクロクラスタは、ＳＬＢとヒト初代ＮＫ細胞との間に形成されるＨＬＡ−Ｅクラスタと類似していた。ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１マイクロクラスタの時間に対する運動を定量化するために、個々のマイクロクラスタの軌跡を経時的に追跡した。図６Ｂに示すように、９つのマイクロクラスタがシナプスの中心に急速に蓄積した。各軌道の平均速度を計算した（１９±５ｎｍ／ｓ、ｎ=９）。ＶＣＰシステムで垂直に配向したＮＫ及びＫ５６２細胞上の安定した抑制性シナプス形成を確認するために、０．５μｌ／分の一定な流速で画像化中に培地を連続的に流した。流れが除去されたら、画像化されているＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１細胞（緑色、上部）を単一細胞トラップの上層から放出させたが、Ｋ５６２細胞の上部に残ったままであった（赤色、下部、図６Ｃ）。
【００４５】
これらの観察から、生細胞における抑制性シナプスマイクロクラスタの動態は、ＶＣＰシステムにおいて容易に観察され得ると結論付けられた。これは、高分解能を有する実際の細胞−細胞接合体におけるＩＳでの単一のマイクロクラスタ動態の最初の観察であると考えられる。一方、ＩＳ中のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１マイクロクラスタの明確なパターンは、ＰＤ−１陽性ＮＫ細胞とＰＤ−Ｌ１陽性標的細胞との間に形成される抑制性シナプスの顕著な特徴である。
【００４６】
４.ＶＣＰシステムによって検出された生ＮＫ細胞傷害活性の動態
次に、ＶＣＰシステムを試験して、細胞溶解殺傷が生細胞のＶＣＰシステムによって観測できるかどうかを調べた。これを試験するために、Ｋ５６２細胞にカルセインＡＭ緑色生存性色素を充填した。硬化細胞を標的細胞から区別するために、ＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄで標識した。細胞−細胞接合体を、広視野蛍光顕微鏡検査によって画像化した（図７）。カルセインＡＭ緑色蛍光信号の消失を、標的細胞の事実上の死滅のための読み出しとして使用した。ＣＤ１６−ＫＨＹＧ−１エフェクタ細胞と共培養したＫ５６２細胞では、緑色蛍光信号の明らかな減少が観察された（図７Ａ）。細胞−細胞複合体において、赤色信号の比較的な安定、及び緑色信号の突然の減少が観察された。ＶＣＰシステムにおける細胞傷害性の動態を定量化するために、２０４個のエフェクタ細胞−標的細胞対を分析した。カルセインＡＭ緑色で標識したＫ５６２細胞からの蛍光強度を１０分ごとに測定した（図７Ｂ）。ＮＫ細胞によって誘発された細胞毒性の動態は、Ｋ５６２細胞の蛍光強度プロファイルによって分類された。ここで、カルセインＡＭの完全な消失を、細胞死のための読み取り値として使用した。ＮＫ細胞との６時間の接合後、約４５．６％のＫ５６２細胞（２０４の接合体のうち９３）が蛍光を発したままであり、これらのＫ５６２細胞が生きたままであることが示唆された（図７Ｃ）。この蛍光プロファイルは、「低速減衰」と呼ぶことができる。Ｋ５６２細胞の平均蛍光減衰プロファイルは、非接合化Ｋ５６２細胞のものと同様であった（図７Ｂの緑色の線）。
【００４７】
カルセインＡＭ緑からの「低速減衰」蛍光プロファイルに加えて、Ｋ５６２細胞におけるカルセインＡＭ緑の消失の３つの異なる動態も観察された。カルセインＡＭの第２パターン（３３．８％、２０４の接合のうち６９）は、ＮＫ細胞によるＫ５６２細胞の溶解を示す「単純減少」プロファイルを示した（図７Ｄ）。以前の観察と一致して、ＮＫ媒介細胞毒性の平均時間は、注射後約２２２．２分（SD＝８４．３分）であった（図７Ｄ）。
【００４８】
カルセインＡＭの第３の蛍光プロファイル（１１．３％、２０４の接合体のうち２３）を「急速減衰」と呼ぶ（図７Ｅ）。「急速減衰」動態では、カルセインＡＭ緑のレベルは最終的に接合後６時間以内に検出されなくなり、ＮＫ細胞によって誘発される異なる細胞毒性機構を示唆している。
【００４９】
特に、カルセインＡＭ蛍光（９．３％、２０４の接合体のうち１９）における経時的な複数の段階的減少（「多段減少」プロフィール）も観察され、これは、ＮＫ細胞からの複数の細胞溶解性ヒットを有するモデル機構が示唆される。この分集団における平均細胞死亡時間は、２９３．２分（ＳＤ＝４９．１分）であると判定された。
総じて、これらのデータは、経時的な細胞傷害性の動態が、高処理能力、及び単一細胞レベルの精製において、ＶＣＰシステムによって容易に検出できる。これは、特定の期間後の培養物全体にわたる殺傷活性のブランケット測定値を提供するだけであり、個々の細胞溶解性および非細胞溶解性の細胞対形成を区別することができない従来の４時間５１Ｃｒ放出アッセイによっては不可能であった。
【００５０】
討論
免疫学的シナプスは、適応免疫システムおよび自然免疫システムの両方において有効な免疫応答を媒介するための重要なプラットフォームである。シナプス幾何学に関する現在の研究は、抗体被覆されたカバーガラス、又はガラス支持された平面脂質二重層システムのような人工システムに限定されている。本発明は、実際の細胞−細胞通信設定においてＩＳを研究するための新規な高処理能力のＶＣＰマイクロ流体システムを提供する。このシステムを製造するための詳細な実施要綱は、本明細書で示されています。このシステムを使用して、エフェクタ細胞と標的細胞との間に形成されるＩＳの高解像度画像が従来の共焦点顕微鏡法で達成された。また、このシステムの潜在的な適用は、ＩＳにおけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１マイクロクラスタ形成の動態を調べることによって実証されており、垂直方向の実際の細胞−細胞接合体におけるＩＳでのマイクロクラスタの初めての観察を、単一細胞レベルでの死滅動態と共に提供した。本発明は、ユーザフレンドリなＶＣＰシステムを提供し、様々な分野における細胞−細胞通信を研究するための新規技術の実現可能性および適用を実証する。さらに、このＶＣＰシステムを使用することにより、いくつかの重大な生物学的問題についての洞察を提供することができる。
【００５１】
Ｂｉｇｇｓらによって開発されたマイクロピットシステムと比較して、ＶＣＰシステムは２つの顕著な利点を有する。好適な垂直接合体の割合は、マイクロピットシステムと、細胞をピットに効率的に導く単一細胞トラップアレイとの新規な組み合わせにより、ＶＣＰシステムで著しく高かった。第２に、ＶＣＰシステムは、充填効率（すなわち、単一のピットに入る２つの細胞対の成功率）と垂直配向との間に避けがたいトレードオフがあった従来のマイクロピットシステムの大きな困難の1つに対処する。マイクロピットシステムでは、ピットの直径が大きくなるほど充填効率が向上するが、マイクロピットにおける細胞の周囲面積が大きいため、しばしば上方の細胞が下方の細胞の上部に完全に位置合わせされない。逆に、狭いピット直径は充填効率を著しく低下させる。単一細胞トラップアレイによって細胞を狭いマイクロピットに誘導することにより、ＶＣＰシステムは充填効率を損なうことなく垂直配向を維持することができる。
【００５２】
革新的な設計の結果として、ＶＣＰシステムは多くの重大な問題に取り組んだ。細胞傷害性免疫学的シナプスにおけるＦ−アクチンの構成は、依然として非常に議論の余地がある。Ｔ細胞ＩＳにおいて、F−アクチンはシナプスの中心から完全に除去され、ＩＳの中心で脱顆粒事象を引き起こすことが示されている。しかし、この現象はＮＫ細胞シナプスでは異なる。 高解像の誘導放出制御（ＳＴＥＤ）と構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）を用いて、２つの独立した研究グループが、Ｆ−アクチンがＩＳの中心で完全に除去されていないことを示した。代わりに、中断された低密度のＦ−アクチン網目構造がＮＫ細胞シナプスの中心に観察されており、パーフォリン陽性細胞溶解性顆粒がＦ−アクチンの天紋によってよく分離されている。これらの観察結果と一致して、パーフォリン陽性細胞溶解性顆粒は、従来の共焦点顕微鏡法では通常見分けられない極めて細部であるＶＣＰシステムの低密度Ｆ−アクチン領域に位置していることが見られる。ＶＣＰシステムを使用して、初めて、超解像度画像化技術を必要とせずに、ＮＫ細胞と標的細胞との間に形成されるＩＳの中心の低密度Ｆ−アクチン領域の間にパーフォリン陽性細胞溶解性顆粒が位置することがきれいに観察された。したがって、ＶＣＰシステムで得られた結果は、ヒトＮＫ細胞においてＦ−アクチン「低密度」がＩＳの中心に存在し、細胞溶解性顆粒がそこで収束するという現象を証拠立てる。
【００５３】
固定された細胞の画像化から得られた情報に加えて、ＶＣＰシステムによるライブ画像化は、固定されたＮＫ細胞の以前の研究から得られない抑制性免疫学的シナプスの動態に関する更なる重要な情報を提供する。プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）は、慢性ウイルス感染および腫瘍形成時にＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞において明らかに増加して出現する免疫チェックポイントタンパク質である。ＫＩＲおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａなどの他の抑制性受容体と同様に、ＰＤ−１の細胞内ドメインは、ＮＫ細胞抑制に重要な役割を果たす免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合は、ＣＤ１６−ＫＨＹＧＩ細胞によるＫ５６２標的細胞の細胞傷害性殺傷を抑制し、抑制性シナプスの発生を示す。しかし、NK細胞が安定な抑制性シナプスを形成できるか否かはまだ議論の余地がある。以前の研究は、NK細胞が抑制性受容体の存在下で安定したシナプスを形成しないことを示した。ＶＣＰプラットフォームを用いて、ＩＳにおけるＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１のマイクロクラスタが、シナプスにおいて中心クラスタに接合することが観察された。このパターンは、ヒト初代ＮＫ細胞が、抑制性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの配位子であるＨＬＡ−Ｅを保有する脂質二重層上で安定な抑制性シナプスを形成することを示す以前の研究を連想させる。さらに、この新規なＶＣＰシステムによって得られた結果は、ＮＫ  ＩＳにおける３つの異なるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１マイクロクラスタパターンを示し、高価な超解像画像化システムを必要とすることなく、高分解能で実際の細胞−細胞複合体におけるＰＤ−１マイクロクラスタの動態を初めて説明した。
【００５４】
ＩＳの安定性を支配する力の理解は、その機能を特定するために不可欠である。ＩＳの最も重要な機能の1つは、標的細胞に対して依存性細胞傷害をもたらすことである。明らかな放射線安全合意を伴うＣｒ放出アッセイのようなＮＫ細胞の細胞傷害を観察する典型的な方法は、高価であると共に時間がかかる。本明細書で説明したＶＣＰプラットフォームは、ＮＫ細胞の細胞傷害をリアルタイムで観察するための、迅速で定量的で高処理能力で機能的な測定を可能にする。単一のピット内の標的細胞における色素の消失は、単一細胞レベルでの細胞死についての明確な読み取りを提供し、他のエフェクタ細胞−標的細胞対の存在によって遮られず、オープンウェル型システムにおいて大きな成果となり得る。したがって、ＩＳの研究の強化のためのプラットフォームを提供することに加えて、ＶＣＰシステムは、ＩＳ媒介性細胞傷害を研究するための代替方法を提供する。
【００５５】
このように、固定され且つ生細胞の画像化のための細胞−細胞通信を研究するための新規で高処理能力のＶＣＰシステムが開発されていることが分かる。このＶＣＰシステムの実現可能性と潜在的な適用が首尾よく実証された。この高処理能力でユーザフレンドリなＶＣＰシステムは、単一細胞分析、細胞融合、細胞−細胞通信、及び細胞表面配位子可動性などの免疫学および細胞生物学において多くの重大な問題に取り組むために使用できる強力な新しい画像化プラットフォームを提供する。
【００５６】
好ましい実施形態の変形
本発明の性質を説明するために本明細書に記載され説明された細部、材料、ステップ、及び部品の配置の多くの追加的な変更が当業者にとってなされ得るが、それらは本発明の原理および範囲に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１４Ａ】
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【図１５】
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【図１５Ａ】
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【図１６】
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【図１６Ａ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１８Ａ】
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【国際調査報告】
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