(57)【要約】  本発明は、フレキシブルセルバッグバイオリアクターなどのバイオリアクターにおける細胞培養に関する。より詳細には、本発明は、細胞療法における使用のための臨床的に適切な細胞製品の生成を単純化するための方法に関する。【選択図】図
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）細胞を非静的バイオリアクターに接種する工程；
（ｉｉ）前記非静的バイオリアクターに抗原刺激を加える工程；
（ｉｉｉ）少なくとも１種の細胞成長補助因子を前記非静的バイオリアクターに添加する工程；
（ｉｖ）前記細胞を増殖させて、臨床的に適切な細胞製品をもたらす工程；
を含み、
工程（ｉｉ）が、前記非静的バイオリアクターを第１の揺動速度で維持して実行され、
工程（ｉｖ）が、前記非静的バイオリアクターを前記第１の揺動速度よりも速い第２の揺動速度で維持して実行される方法。
【請求項２】
工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が工程（ｉｖ）の間に１または複数回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が白血球である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記白血球が、リンパ球、単球または単球に由来する細胞を含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記白血球が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉ）において、前記細胞が細胞懸濁液である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記非静的バイオリアクターがフレキシブルセルバッグを備える、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原刺激が抗原性ペプチドまたは腫瘍溶解物を含む、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞を増殖させる前記工程が、培養培地を一定の間隔で交換する工程を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞成長補助因子が、抗ＣＤ２８および／または抗ＣＤ３モノクローナル抗体を含む、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞成長補助因子が、本発明の方法において前記増殖工程（ｉｖ）の前に添加される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞成長補助因子が、サイトカインまたはサイトカインのカクテルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記サイトカインが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）およびインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞成長補助因子が、本発明の方法において前記増殖工程（ｉｖ）の前に添加される、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞成長補助因子が、前記増殖工程（ｉｖ）の間に一定の間隔で添加される、請求項１２乃至１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記臨床的に適切な細胞製品が、抗原特異的Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞または遺伝子改変ＰＢＭＣを含む、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記臨床的に適切な細胞製品が、抗原特異的Ｔ細胞、または遺伝子改変ＰＢＭＣを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原特異的Ｔ細胞が細胞傷害性ウイルス特異的Ｔ細胞または腫瘍特異的Ｔ細胞である、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子改変ＰＢＭＣが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞およびＴＣＲ改変Ｔ細胞である、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の揺動速度が４ｒｐｍ以下であり、角度が４度以下である、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の揺動速度が２〜４ｒｐｍであり、角度が２〜４度の間である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第２の揺動速度が４ｒｐｍを超え、角度が４度を超える、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の揺動速度が２５ｒｐｍまでであり、角度が１５度までである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の揺動速度が１５ｒｐｍまでである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
廃棄代謝産物の蒸発および／または凝縮および／または蓄積の制御手段をさらに含む、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フレキシブルセルバッグバイオリアクターなどのバイオリアクターにおける細胞培養に関する。より詳細には、本発明は、最初から最後まで単一の非静的細胞培養プラットフォームを使用する初期準静的培養を通して臨床スケールの細胞製品の生成を支援するプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
養子Ｔ細胞療法は、患者に治療効果の徴候を示す最新の個別化された薬剤、主に腫瘍浸潤性Ｔ細胞および遺伝子改変Ｔ細胞である。Ｔ細胞療法は、Ｔ細胞製品の種類に依存して異なる独自の培養要件を有することが知られている。
【０００３】
臨床的に適切なＴ細胞の増殖のための公知のプロトコルは、Ｔ細胞刺激およびさらなる増殖を促進する、初期段階の細胞間接触を必要とする。細胞間接触のために必要とされる相互作用を促進するためには、細胞懸濁液の最小限の運動が必要であるとみなされ、インキュベーター内に置かれたフラスコまたは静的培養バッグを用いる静的培養が典型的にはこのプロセスのこの段階に使用される。これに関連して、ＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅおよびＤｕｄｌｅｙ（２０１２  ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；  １（８）：１４３５−１４３７）は、Ｘｕｒｉ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、以前はＷａｖｅ（商標）として知られていた）バイオリアクターなどの非静的バイオリアクターが、長期の物理的接触に留まることを細胞に要求するこの静的工程を含む、プロセス開発の課題を提示していることを記している。同様に、Ｒｏｏｎｅｙら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１０；  Ａｐｒｉｌ：３３（３）：３０５−３１５）は、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が細胞間接触に対して厳密な要件を有し、静的培養条件下の機能性細胞の生成が最良であるため、動的培養（ｍｏｖｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）への一貫した適応が困難であることが証明されたと記している。
【０００４】
Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、第２の共刺激シグナルに連動して抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の抗原−主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と結合すると、Ｔ細胞はインビボで活性化され、増殖するように誘導される。活性化に応答して、Ｔ細胞は、例えば細胞サイズの増大およびサイトカインの分泌を含む物理的、生物学的および表現型的な変化を起こす。この免疫応答は、ビーズまたは培養フラスコの底などの他の表面のいずれかに共固定された、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体および抗ＣＤ３モノクローナル抗体へのＴ細胞の結合によってエクスビボで模倣することもできる。増殖シグナルはまた、Ｔ細胞集団を、刺激因子を発現する操作された哺乳動物細胞系と接触させることによっても提供されている。細胞培養のためのＴ細胞の抗原刺激に利用可能なさまざまな方法のすべてに共通して、Ｔ細胞と、ＡＰＣまたは抗体のいずれかによって送達される共刺激シグナルとの間の近接性および１〜５日の長期の相互作用を可能にする条件が必要とされる。
【０００５】
培養フラスコおよび静的培養バッグの使用は、細胞療法分野でプロセス開発作業を行う際に広く普及しており、研究者によって利用されている。これらの単純な培養容器は、小数の細胞を処理することができ、標準的な実験装置を必要とする、比較的少ない範囲の作業量で要件を満たす。静的培養法は、Ｔ細胞刺激および活性化を促進することができる、長期の物理的細胞接触を支援する。細胞が増殖するにつれて、追加の培養容器が必要とされ、容器の数および細胞懸濁液の体積は時間とともに増加し、例えば、３０日以内に５０ｍｌから出発して２０Ｌ以上にすることが可能である。このようなワークフローでは、高度な有資格者と時間が必要であり、複数の容器を操作する必要があるため、煩雑である。培養容器の数が増えるにつれて、汚染および人的過誤のリスクも時間とともに増加する。
【０００６】
このプロトコルを、規制準拠の細胞免疫療法の生産のためのより自動化および自制されたプロセスに適応させようとする場合、この用途に利用可能なバイオリアクターシステムの数は限られている。さまざまなバイオリアクターシステム、例えば揺動プラットフォームは、いくつかの臨床研究グループによって評価されている。それらは、細胞療法の臨床生産プロセスの標準化とスケールアップを支援すると考えられており、これらのプロセスの第ＩＩＩ相臨床試験への実装を促進することができる。それにもかかわらず、これらのバイオリアクターの多くは、初期のＴ細胞刺激工程において必要とされる重要な細胞間相互作用を支援しない。
【０００７】
第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の準備をする際には、工業的にスケールアップして、すべての優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）要件の下で、治療用量、さらに１０〜２０人の患者の治療に達する十分な材料を生産できるようにしなければならない。さらに、十分な製品材料の規制準拠の生産を可能にし、第ＩＩＩ相試験の場合のようにはるかに大きなコホート（数百または数千人の患者）用にこの材料を供給するために、生産プロセスは多くの場合プロトコルの徹底的な操作を必要とする。
【０００８】
Ｓａｄｅｇｈｉら（２０１１  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６４：９４−１００）は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の急速な増殖が、Ｔ−フラスコ中での予備活性化および増殖なしに、バイオリアクターシステムにおいて直接開始できることを報告した。ＴＩＬは組織生検から得られ、それ自体が、抗原が既に存在するように抗原として作用することができる。したがって、組織生検を用いて細胞培養を開始する場合、Ｔ細胞懸濁液と比較して最初の静的相の要件は異なる。しかしＳａｄｅｇｈｉらは、より大きな体積においてＴＩＬの急速な増殖の開始に成功するためには、フラスコまたはガス透過性バッグにおける活性化および予備増殖が必要であることも記した。
【０００９】
したがって、特に細胞培養プロセスを、別個の抗原刺激を必要とする細胞の懸濁液で開始する場合、臨床スケールの細胞製品生成のための改善された方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０８８１４７号パンフレット
【発明の概要】
【００１１】
一実施形態において、本発明は、
（ｉ）細胞を非静的バイオリアクターに接種する工程；
（ｉｉ）前記非静的バイオリアクターに抗原刺激を加える工程；
（ｉｉｉ）少なくとも１種の細胞成長補助因子を前記非静的バイオリアクターに添加する工程；
（ｉｖ）前記細胞を増殖させて、臨床的に適切な細胞製品をもたらす工程；
を含み、
工程（ｉｉ）が、前記非静的バイオリアクターを第１の揺動速度で維持して実行され、
工程（ｉｖ）が、前記非静的バイオリアクターを前記第１の揺動速度よりも速い第２の揺動速度で維持して実行される方法を提供する。
【００１２】
培養プロセスのすべての態様に対してバイオリアクターシステムを利用できることは、細胞が単一の容器に収容され、必要なオープン操作の数が低減し、したがって産物の汚染の可能性が低減するので、重要な利点である。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法における非静的バイオリアクターの使用に関する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法を実施するための指示書を含むキットを提供する。
【００１５】
本発明の方法について以下に定義される定義および特定の実施形態は、本発明の使用およびキットに等しく適用可能である。
【００１６】
本発明は、抗原刺激に曝露された細胞の懸濁液から増殖された細胞培養物を生成するための、最初から最後まで非静的バイオリアクターを使用する最適化された手順を表す。本発明の方法は、公知の方法で使用される複数の開放静的システムのための要件を排除する。本発明の利点は、自動化された閉鎖環境における細胞培養プロセスのスケールアップを可能にする、代替の準静的アプローチを提供することである。このアプローチはまた、培養期間中に長期の静的接触工程を必要とするさまざまな細胞培養手順に適合させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、Ｘｕｒｉ（商標）細胞増殖システムにおいて直接的に抗原特異的Ｔ細胞（ＡＳＴ）を生成するための一般的なワークフローを示す。
【図２】図２は、Ｘｕｒｉ（商標）バイオリアクターにおいて成長させた細胞の総細胞数（上）および生存率（下）を示す。ドナー１由来の細胞をＸｕｒｉ（商標）Ｗ２５システムで、ドナー２および３由来の細胞をＸｕｒｉ（商標）Ｗ５システムで培養した。
【図３】図３は、３人のドナーの各々について、Ｘｕｒｉ（商標）細胞増殖システムおよび組織培養フラスコにおける培養を通した細胞数の倍数増加を示す。
【図４】図４（上）は、代謝産物のグルコース（ｇ／Ｌ）、乳酸塩（ｍｍｏｌ／Ｌ）、およびアンモニウム（ｍｍｏｌ／Ｌ）のレベルを示し、図４（下）は、Ｘｕｒｉ（商標）システムにおける培養物についての総容積および灌流量を示す。Ｘｕｒｉ（商標）Ｗ２５システムにおけるドナー１由来の培養物についての代表的なデータを示す。
【図５】図５は、Ｘｕｒｉ（商標）システムにおける培養期間を通した末梢血リンパ球集団の頻度を示す。陽性細胞の数は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ）によって決定した。リンパ球は、その前方および側方散乱プロフィールに基づいてゲートをかけた。リンパ球ゲート内のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）およびＮＫＴ様細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）の％を示した。
【図６】図６は、ドナー１について、０日目および１８日目のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌についての代表的なフローサイトメトリープロットを示す。Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ（ＡＰＣ）単独（非特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞、陰性対照）またはＡＰＣ＋ＣＭＶ  Ｐｅｐｍｉｘｅｓ（特異性試験）のいずれかで刺激した。
【図７】図７は、Ｘｕｒｉ（商標）システムにおける培養を通したＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌を示す。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をグラフに示し、グラフの下のすべてのドナーについて特異性の倍数増加を示してある。Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ単独（非特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞）またはＰＢＭＣ＋ＣＭＶ  Ｐｅｐｍｉｘｅｓ（特異性試験）で刺激した。ＣＭＶ特異的Ｔ細胞＝（Ｔ細胞＋ＰＢＭＣ＋ＣＭＶペプチド）−（Ｔ細胞＋ＰＢＭＣ）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
特許請求する本発明の主題をより明確かつ簡潔に記載し、指摘するために、本明細書および特許請求の範囲、ならびに本発明の例示的実施形態を通して使用される特定の用語には、以下の定義が与えられる。本明細書における特定の用語の例示は、非限定的な例としてみなされるべきである。
【００１９】
本明細書で使用される「接種する」という用語は、細胞培養を開始する目的で比較的少量の細胞を細胞培養容器に移すことを指す。一実施形態において、少量の細胞は細胞の懸濁液である。一実施形態において、少量の細胞は、組織生検などの組織片に由来しない。「細胞培養容器」という用語は、細胞培養フラスコ、バッグ、さまざまな種類のバイオリアクター、または当業者に周知の足場を含むことができる。一実施形態において、Ｔ細胞の培養物のために移される細胞の量は、約１×１０6〜２×１０6細胞／ｍＬである。一実施形態において、接種工程は、バイオリアクターのすべての揺動を開始する前に実施することができる。一実施形態において、接種工程は、本明細書で定義される第１の揺動速度で実施することができる。
【００２０】
本発明の文脈における「細胞」という用語は、細胞療法応用に使用することができる任意の細胞型を包含するものと理解することができる。このような細胞は、時として、先進治療医薬品（ＡＴＭＰ）と呼ばれる。「細胞療法応用」という用語は、自己または同種の細胞材料が、典型的には注射によって患者に投与される任意の療法を意味し、養子免疫療法または自己もしくは同種の移植などの手順を含む。本発明の文脈において、細胞材料は、投与前に細胞が所望の表現型を発現するように操作される。したがって、例えば、養子免疫療法（「養子細胞療法」とも呼ばれる）は、免疫系が癌および特定のウイルスによる感染症などの疾病と戦うのを助けるために用いられる治療である。ＮＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）による養子免疫療法の定義によれば、Ｔ細胞は患者から採取され、実験室でエクスビボで単離および増殖され、これにより癌細胞を殺す、もしくは感染症と戦うことができるＴ細胞の数を増加させる。これらのＴ細胞は、免疫系が疾患と戦うのを助けるために患者に戻される。
【００２１】
本発明の文脈における「非静的バイオリアクター」は、成長を容易にするために細胞培養物に運動を与える、細胞培養物を成長させるように構成された装置またはシステムである。適切には、運動の方法は細胞に損傷を与えない、例えば、細胞培養物にせん断力または粉砕力をほとんどまたは全く誘導しない。運動の非限定的な例としては、振盪、攪拌および揺動が挙げられる。本発明の一実施形態において、運動は揺動である。市販の非静的バイオリアクターの例としては、Ｘｕｒｉ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｂｉｏｓｔａｔ（商標）ＲＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）、およびＸＲＳ  ２０  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｐａｌｌ）が挙げられる。図１は、本発明の実施形態による、Ｘｕｒｉ（商標）細胞増殖システムにおいて直接的に抗原特異的Ｔ細胞（ＡＳＴ）を生成するための一般的なワークフローを示す。
【００２２】
「抗原刺激」は、白血球が物理的、生物学的および表現型的な変化を受けるように誘導する因子である。抗原刺激は、細胞集団のより支配的な部分になるように特定の表現型／特異性を有する細胞の特定の亜集団を誘導すると理解することができる。非限定的な例としては、人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって処理され、ＴＣＲ結合のためにＭＨＣ上に提示され得る抗原性ペプチドまたは腫瘍溶解物、またはＴＣＲのためにＭＨＣ複合体上にペプチドを提示するＡＰＣが挙げられる。後者の実施形態の公知の一例は、ＰＢＭＣと、ＥＢＶ特異的ＣＴＬを得るためにガンマ線照射された自己ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞株（ＥＢＶ−ＬＣＬ）とを共培養することである。
【００２３】
「細胞成長補助因子」という用語は、細胞の増殖を促進する因子を指す。これらは、溶液中に、またはビーズなどの固体表面に付着するかのいずれかで、非静的バイオリアクターに添加される。
【００２４】
一実施形態において、細胞成長補助因子の例としては、ビーズまたは培養フラスコの底などの他の表面上のいずれかに共固定化された、または溶液中に添加された抗ＣＤ２８および／または抗ＣＤ３モノクローナル抗体、または刺激因子を発現すように操作された哺乳動物細胞株、例えばＣＤ２８／ＣＤ３を発現するＫ５６２細胞株が挙げられる。ＥＰ１５９４９５８Ｂ１は、結合した抗ＣＤ３およびＣＤ２８を有するビーズでＴ細胞を刺激する公知の方法を記載している。一実施形態において、この実施形態の細胞成長補助因子は、本発明の方法において、第１の揺動速度で、増殖工程（ｉｖ）の前に添加される。
【００２５】
一実施形態において、細胞成長補助因子は、サイトカインまたはサイトカインのカクテルである。サイトカインの非限定的な例としては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）およびインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）ならびにそれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、サイトカインのカクテルは、ＩＬ−４とＩＬ−７との混合物、またはＩＬ−２とＩＬ−７と、および／またはＩＬ−１５とＩＬ−２１との混合物を含み得る。一実施形態において、この実施形態の細胞成長補助因子は、本発明の方法において、第１の揺動速度で増殖工程（ｉｖ）の前に添加され、および／またはこの実施形態の細胞増成長助因子は第２の揺動速度で本発明の方法の増殖工程（ｉｖ）の間に添加される。
【００２６】
本発明の方法における「増殖させる」という用語は、細胞培養物中の細胞の数を増加させるプロセスを指す。増殖工程において、細胞が供給され、培養培地は一定の間隔で、一実施形態において供給レジメンに従って交換される。特定の供給レジメンにおいて添加される培地の特定のタイミングおよび量は、細胞数および培養物中の代謝産物のレベルに依存する。
【００２７】
「臨床的に適切な細胞製品」は、細胞療法応用に使用することができるものである。臨床的に適切な細胞製品は、臨床使用に適していなければならない。言い換えれば、それは、国際および／または国内の規制機関によって承認された医薬品の特定の要件を満たさなければならず、例えば、この製品は無菌で、エンドトキシンレベルが０．５  ＥＵ／ｋｇ未満でなければならない。「臨床使用」という用語は、個々の対象／患者による医薬製品の使用を指す。「医薬製品」という用語は、本発明の臨床的に適切な細胞製品を包含し、患者への投与を意図した薬学的に活性な物質の薬学的に許容された組成物を指すと理解することができる。臨床使用は、第Ｉ相、第ＩＩ相および第ＩＩＩ相臨床試験における医薬製品の使用、および臨床実務における患者による製品の使用を含むと理解することができる。一実施形態において、臨床的に適切な細胞製品は、臨床試験における使用に適している。治療用量に到達し、品質管理分析を実施するために十分な細胞を生成しなければならず、この生産プロセスは、一度に１人の患者に対して、複数の患者を並列に、または交互に行うことができる。１つのバッチの細胞製品中に１０7〜１０15細胞の範囲が適切であり得る。いずれの研究においても、適切な方法は、すべて優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）要件の下で、試験中の患者のそれぞれに対する治療用量に達する十分な材料の生産を可能にする。治療対象の数は研究の段階によって異なり、当業者には周知である。第ＩＩＩ相試験では、患者の数は数百または数千にまで達することがある。
【００２８】
本発明の方法は、一実施形態において、２つの操作モード、準静的培養、および迅速な増殖プロトコルに分けられることが理解される。「準静的培養」という用語は、前記第１の揺動速度で実施される本発明の方法の工程、すなわち、細胞相互作用を必要とする培養手順を実施し、前記細胞の生理学的変化が起こるのに必要な時間の間、非静的バイオリアクターにおいて前記細胞の活性化および成長を促進する工程を指すと理解される。「急速増殖プロトコル」は、前記第２の揺動速度で実施される工程、すなわち、細胞間相互作用があまり重要でない、準静的培養モードの操作の後の前記細胞の成長を最適化および刺激するための供給レジメンを含む。
【００２９】
「第１の揺動速度」は、静的状態が使用される公知の方法において工程に使用される準静的な運動速度である。一実施形態において、前記第１の揺動速度は、４ｒｐｍ以下の速度であり、角度は４度以下である。一実施形態において、第１の揺動速度は２〜４ｒｐｍの間であり、角度は２〜４度の間である。一実施形態において、第１の揺動速度は２ｒｐｍであり、角度は２度である。
【００３０】
前記細胞と成長刺激因子との間の近接が、活性化および増殖を誘導するために必要なので、開始細胞密度（細胞／ｍＬ）を一定レベルに保つことが推奨される。推奨される細胞密度の非限定的な例は、≧１０6生存細胞／ｍＬである。通常、ヒト細胞をエクスビボで増殖させる場合、開始集団は小さく、したがって推奨される細胞密度を可能にするために初期の低培養容積を必要とする。低開始容量の非限定的な例は、２ＬのＣｅｌｌｂａｇにおいて２５０ｍｌ以上である。
【００３１】
一実施形態において、本発明の方法は、特に、低培養量の段階で、廃物代謝産物の蒸発および／または凝縮および／または蓄積を制御する手段（以下、「制御手段」とも称される）をさらに含む。一実施形態において、前記制御手段は、上記の準静的培養モードの間に適用される。一実施形態において、前記制御手段は、本発明の方法の初期段階、例えば、工程（ｉ）〜（ｉｉ）または工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）に適用される。
【００３２】
一実施形態において、前記制御手段は断熱を含む。一実施形態において、断熱は、バイオリアクターの蓋を使用して達成される。別の実施形態において、前記断熱は、前記セルバッグを適切な絶縁材料で包むことによって達成される。一実施形態において、前記絶縁材料はアルミニウム箔である。Ｘｕｒｉ（商標）Ｗ５が使用される一実施形態において、正確な温度読み取りを可能にするために、プレートライザーをシステムのトレイに挿入することができる。
【００３３】
一実施形態において、前記制御手段は、ガス流量を制御することを含む。一実施形態において、前記ガス流量は０．０５〜０．１リットル／分（ＬＰＭ）に制御される。一実施形態において、前記ガス流量の制御は、最初の３〜４日間に適用される。
【００３４】
一実施形態において、前記制御手段は、毎日の培地添加を含む。一実施形態において、前記毎日の培地添加は最初の日に行われる。一実施形態において、前記培地添加は、細胞密度を必要な最小数／ｍｌ未満に希釈することなく、最大作業容積の＞４０％の総容量を５日目にもたらす。一実施形態において、前記毎日の培地添加は、温度を臨界レベル以上に保つために、例えば２〜３日目からゆっくりと行われ、一実施形態において、毎日の培地ショットは、開始容積が３００ｍｌである培養物において５０〜１００ｍｌ以下であってよい。一実施形態において、培地添加は、温度降下が設定値から≦１℃であるように行うことができる。
【００３５】
一実施形態において、前記制御手段は、総容積１Ｌ未満において高浸透圧を回避するために、初期段階の間に加えられた灌流（２００ｍｌ／日）を含む。２Ｌの培養容器中の適切な容積の例は４００〜５００ｍｌであり、推奨最小細胞密度は≧０．８ｘ１０6細胞／ｍｌである。培養液中に高浸透圧および廃棄代謝産物が蓄積されている場合、培地添加のほかに、早期段階でも灌流を考慮することができる。主に、廃棄代謝産物の蓄積が培養物に有害であり、最終的に後期段階でその増殖速度に影響を及ぼすことがあるためである。灌流量を２００ｍｌ／日以下（Ｘｕｒｉ（商標）Ｗ５システムではショットベースの灌流で２５ｍｌ以下のショット）にして、温度を一定に保ち、温度制御を容易にすることができる。細胞間相互作用があまり重要でなく、前記細胞が準静的培養中に活性化されるか、または物理的変化を受けると、「迅速増殖プロトコル」（ＲＥＰ）が適用される。第２の揺動速度が適用され、ガス流量が増加すると、灌流レジメンは温度によってではなく、細胞濃度および培養体積によって制限される。バイオリアクターへのガス流量の増加の非限定的な例は、≧０．１〜０．６ＬＰＭである。
【００３６】
「第２の揺動速度」は、細胞が増殖している、本発明の方法の工程（ｉｖ）の間に使用される。第２の揺動速度は、細胞培養物中の細胞量の関数として、増殖工程（ｉｖ）を通して変化させることができる、すなわち、存在する細胞が多いほど、場合に、第２の揺動速度は速くてよい。一実施形態において、第２の揺動速度は、４ｒｐｍを超える速度であり、角度は４度を超える。一実施形態において、前記第２の揺動速度は２５ｒｐｍまでであり、角度は１５度までである。一実施形態において、前記第２の揺動速度は１５ｒｐｍまでであり、角度は１５度までである。一実施形態において、前記第２の揺動速度は１０ｒｐｍまでであり、角度は１０度までである。一実施形態において、２6細胞／ｍｌ未満の細胞密度および１Ｌ未満の容積に対して、第２の揺動速度は４〜８ｒｐｍであり、角度は４〜６度である。一実施形態において、第２の揺動速度は、２6細胞／ｍｌ超および容積１Ｌ超に対して８〜１０ｒｐｍの間および６度の角度である。＞１５6の細胞密度の一実施形態において、第２の揺動速度は１０〜１５ｒｐｍであり、角度は６度である。
【００３７】
本発明の方法は、オープン操作を制限し、汚染のリスクを低減し、より効率的なワークフローを促進するので、公知のプロセスと比較して有用な開発を提供する。
【００３８】
一実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞の生成のために、最初から最後までＸｕｒｉ（商標）細胞増殖プラットフォームを使用する手順が開発されており、実施例１に記載されている。従来のプロトコルからいくつかの重要な工程をＸｕｒｉ（商標）細胞増殖システムに適応させることにより、このプロセスでは従来の方法で必要とされる、複数のオープンな静的システムを使用する要件が排除されている。したがって、ＡＳＴを生成するためのＸｕｒｉ（商標）細胞増殖システムの適用は、自動化された閉鎖環境におけるＡＳＴ培養プロセスのスケールアップを可能にする、代替の準静的アプローチを提供する。準静的アプローチを用いて、このプラットフォームは、培養期間中に長期間の静的接触工程を必要とする任意の他の細胞培養手順にも適合させることができる。実施例１は、非静的バイオリアクターが、従来の組織培養フラスコと比較して細胞数の倍数増加がより高いＴ細胞成長を支援することを実証している（図２、３および５）。ＣＭＶに対する高い抗原特異性を含むＴ細胞培養物の増殖は、Ｘｕｒｉ（商標）細胞増殖システムを用いてすべてのドナーに関して達成した（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋細胞についてそれぞれ３５．７〜４６２．４および１３４．６〜１８３．９の倍数増加に及び、３５倍を超えて特異性が増加した；図７および８を参照されたい）。
【００３９】
実施例の簡単な説明
実施例１は、Ｘｕｒｉ（商標）プラットフォームを用いた臨床的に適切な抗原特異的Ｔ細胞の増殖を記載する。３人の健康なドナー由来の新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に、ＨＣＭＶＡ  Ｐｅｐｍｉｘｅｓ（ＰＭ−ＩＥ１およびＰＭ−ｐｐ６５）をパルスし、Ｘｕｒｉ（商標）細胞増殖システムＷ５またはＷ２５において、非常に穏やかな揺動／角度で直接Ｃｅｌｌｂａｇに接種した。７日後、照射した、Ｐｅｐｍｉｘをパルスした自己ＰＢＭＣで細胞培養物を再刺激した。１０／１１日目に、増殖段階を促進するために揺動を増加した。両方のドナーの細胞培養を、準静的培養物との比較として、組織培養フラスコにおいて同時に設定した。
【００４０】
実施例において使用する略語リスト
ＣＭＶ  サイトメガロウイルス
ＤＭＳＯ：  ジメチルスルホキシド
ｈｒ  時間
ＰＢＭＣ  末梢血単核細胞
ｒｐｍ  回転数／分
【実施例１】
【００４１】
Ｘｕｒｉ（商標）プラットフォームを用いた臨床的に適切な抗原特異的Ｔ細胞の増殖。
【００４２】
材料と方法
３人のＣＭＶ血清陽性の健康なドナー由来の新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ培地（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて単離した。ＰＢＭＣの一部を培養開始のために保存し、残りの細胞を９０％熱不活性化ヒト血清（ＴＣＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で凍結保存し、後に自己フィーダーとして使用した。
【００４３】
１０ｍｌの完全培地：５％の熱不活性化ヒト血清、２ｍＭ  のＧｌｕｔａＭＡＸ  ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および３００単位／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加したＸ−ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）に、開始細胞数３５０Ｅ６の細胞を再懸濁した。細胞に、ＨＣＭＶＡ  Ｐｅｐｍｉｘ  ＰＭ−ＩＥ１（ＪＰＴ）およびＨＣＭＶＡ  Ｐｅｐｍｉｘ  ＰＭ−ｐｐ６５（ＪＰＴ）を１０ｎｇ／１５Ｅ６細胞で、３７℃において２時間パルスした。
【００４４】
Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）バイオリアクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、５％ＣＯ2を充填したＸｕｒｉ（商標）細胞増殖システムＷ５またはＷ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかに置き、完全培地を含むリザーバーと廃棄バッグとを接続した。初期容積２００〜２５０ｍｌの完全培地をＣｅｌｌｂａｇ（商標）に加え、３７℃において２時間平衡化させた。
【００４５】
２時間後、ペプチドをパルスした３００Ｅ６の細胞をＣｅｌｌｂａｇ（商標）に接種し、追加の培地を加えて、Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）あたり１Ｅ６細胞／ｍｌで総量３００ｍｌにした。細胞を、角度２°およびガス流量０．０５ＬＰＭにおいて、毎分２回の揺動の準静的条件で培養した。培養の準静的段階の間の培養培地の蒸発を最小限に抑えるために、Ｃｅｌｌｂａｇｓ（商標）をアルミニウム箔で覆うか（Ｘｕｒｉ（商標）細胞増殖システムＷ５の場合）、または機器の蓋を使用するか（Ｘｕｒｉ（商標）細胞増殖システムＷ２５の場合）のいずれかを行った。いったん開始したら、Ｃｅｌｌｂａｇｓ（商標）中の培養物を、細胞間の相互作用が起こるように、３日間乱すことなく放置した。
【００４６】
準静的培養との比較として、従来の静的培養を並行して設定した。５０Ｅ６の細胞を５０ｍｌに再懸濁し（１Ｅ６／ｍｌ）、フラスコ内で３７℃のインキュベーターにおいて培養した。３日目から新鮮な培地をＣｅｌｌｂａｇｓ（商標）に加え、７日目までに４００ｍｌ〜５００ｍｌに達した。細胞の計数および生化学分析（乳酸塩、アンモニウム、グルコース、ｐＨ）のために毎日のサンプリングを行った。フラスコには同様の比例容積で流加培養した。５〜６日目から７日まで、揺動／角度を、揺動を４回／分、角度を４度に増加させた。再刺激のためにフィーダーを添加する２４時間前に、２００ｍｌの培地を灌流させて、乳酸塩、アンモニウムおよびグルコースレベルを制御した。同一の灌流量を、遠心分離によってフラスコに対して手動で行った。
【００４７】
７日目に、培養物を、自己ペプチドをパルスしたフィーダーで再刺激した。凍結保存した自己ＰＢＭＣを完全培地中で解凍し、３０Ｇｙで照射し、Ｐｅｐｍｉｘｅｓを２時間パルスした（１０ｎｇ／１５Ｅ６細胞）。細胞を、１：１のフィーダー対Ｔ細胞の比でＣｅｌｌｂａｇ（商標）およびフラスコ培養物に添加した。培養物を、２°の角度で２ｒｐｍにおいて干渉することなく３日間インキュベートした。１０日目から、１Ｌの最大容積が得られるまで、少なくとも１Ｅ６／ｍｌを維持するように流加培養した。その後、代謝産物の測定値に応じて灌流量を２４時間あたり２００−７００ｍｌに調整し、グルコースおよび廃棄代謝産物である乳酸塩およびアンモニウムを制御した（図４参照）。容積が１００ｍｌに達するまで同じ比例培地添加をフラスコ内で行い、１０日目から２日毎に手動灌流を行った。毎日のモニタリング、細胞計数および生化学分析を実施した。１１日目から、揺動／角度を、４ｒｐｍ／４°、８ｒｐｍ／６°、１０ｒｐｍ／６°（２〜２０Ｅ６細胞／ｍｌ）に毎日徐々に増加させ、細胞が＞２０Ｅ６／ｍｌになったら１２ｒｐｍ／６°に増加させた。
【００４８】
表現型解析
フローサイトメトリー分析用の試料を、０日目、７日目、１５日目および１８日目に採取し、凍結保存した。細胞を解凍し、リンパ球集団に対する免疫表現型マーカーを検出する抗体パネルで染色した。１×１０6細胞を、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ（商標）Ｃｙ（商標）５．５（ＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４−Ｖ５００（ＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または−ＰＥ（ＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８（ＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＣＤ５６−ＰＥ（ＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とを併せて、およびＣＤ１９−ＡＰＣ（ＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。
【００４９】
サイトカイン発現の分析のために、細胞を陰性対照（細胞＋ＰＢＭＣ）と特異性試験用（細胞＋ＰＢＭＣ＋Ｐｅｐｍｉｘｅｓ）に分割した。これらを３７℃において一晩インキュベートした。サイトカイン分泌アッセイを行い、抗原特異性について、ＭＡＣｓ  ＩＦＮ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎアッセイ検出キットを使用して製造指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従って試験した。
【００５０】
染色された細胞を、ＦＡＣＳＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターにおいてＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアを使用して製造業者の指示書（ＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って分析した。
［実施態様１］
（ｉ）細胞を非静的バイオリアクターに接種する工程；
（ｉｉ）前記非静的バイオリアクターに抗原刺激を加える工程；
（ｉｉｉ）少なくとも１種の細胞成長補助因子を前記非静的バイオリアクターに添加する工程；
（ｉｖ）前記細胞を増殖させて、臨床的に適切な細胞製品をもたらす工程；
を含み、
工程（ｉｉ）が、前記非静的バイオリアクターを第１の揺動速度で維持して実行され、
工程（ｉｖ）が、前記非静的バイオリアクターを前記第１の揺動速度よりも速い第２の揺動速度で維持して実行される方法。
［実施態様２］
工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が工程（ｉｖ）の間に１または複数回繰り返される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
前記細胞が白血球である、実施態様１または２に記載の方法。
［実施態様４］
前記白血球が、リンパ球、単球または単球に由来する細胞を含む群から選択される、実施態様３に記載の方法。
［実施態様５］
前記白血球が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施態様３に記載の方法。
［実施態様６］
工程（ｉ）において、前記細胞が細胞懸濁液である、実施態様１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様７］
前記非静的バイオリアクターがフレキシブルセルバッグを備える、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様８］
前記抗原刺激が抗原性ペプチドまたは腫瘍溶解物を含む、実施態様１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様９］
前記細胞を増殖させる前記工程が、培養培地を一定の間隔で交換する工程を含む、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１０］
前記細胞成長補助因子が、抗ＣＤ２８および／または抗ＣＤ３モノクローナル抗体を含む、実施態様１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１１］
前記細胞成長補助因子が、本発明の方法において前記増殖工程（ｉｖ）の前に添加される、実施態様１０に記載の方法。
［実施態様１２］
前記細胞成長補助因子が、サイトカインまたはサイトカインのカクテルである、実施態様１０に記載の方法。
［実施態様１３］
前記サイトカインが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）およびインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）から選択される、実施態様１２に記載の方法。
［実施態様１４］
前記細胞成長補助因子が、本発明の方法において前記増殖工程（ｉｖ）の前に添加される、実施態様１２または実施態様１３に記載の方法。
［実施態様１５］
前記細胞成長補助因子が、前記増殖工程（ｉｖ）の間に一定の間隔で添加される、実施態様１２乃至１４に記載の方法。
［実施態様１６］
前記臨床的に適切な細胞製品が、抗原特異的Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞または遺伝子改変ＰＢＭＣを含む、実施態様１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１７］
前記臨床的に適切な細胞製品が、抗原特異的Ｔ細胞、または遺伝子改変ＰＢＭＣを含む、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］
前記抗原特異的Ｔ細胞が細胞傷害性ウイルス特異的Ｔ細胞または腫瘍特異的Ｔ細胞である、実施態様１６または実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］
前記遺伝子改変ＰＢＭＣが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞およびＴＣＲ改変Ｔ細胞である、実施態様１６または実施態様１７に記載の方法。
［実施態様２０］
前記第１の揺動速度が４ｒｐｍ以下であり、角度が４度以下である、実施態様１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２１］
前記第１の揺動速度が２〜４ｒｐｍであり、角度が２〜４度の間である、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２２］
第２の揺動速度が４ｒｐｍを超え、角度が４度を超える、実施態様１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２３］
前記第２の揺動速度が２５ｒｐｍまでであり、角度が１５度までである、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２４］
前記第２の揺動速度が１５ｒｐｍまでである、実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２５］
廃棄代謝産物の蒸発および／または凝縮および／または蓄積の制御手段をさらに含む、実施態様１乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２６］
前記制御手段が断熱を含む、実施態様２５に記載の方法。
［実施態様２７］
前記制御手段がガス流量の制御を含む、実施態様２５に記載の方法。
［実施態様２８］
前記制御手段が毎日の媒体添加を含む、実施態様２５に記載の方法。
［実施態様２９］
実施態様１乃至２８のいずれか１項に記載の方法における非静的バイオリアクターの使用。
［実施態様３０］
実施態様１乃至２８のいずれか１項に記載の方法を実施するための指示書を含むキット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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