(57)【要約】  種を感染分離株に割り当てる計算時間を短縮するためのシステム、方法、及び装置が開示される。参照配列の系統樹に基づいて検索インデックスを１つ以上のサブインデックスに分割するための方法が開示される。種を感染分離株に割り当てるためにリードを試験セットに分割し、サブインデックスにアライメントするための方法が開示される。サブインデックスを使用して配列リードを参照配列のデータベースにアライメントするためのシステムが開示される。
2018505471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
データベースの高速検索を提供するための方法であって、前記方法は、
前記データベースに記憶された参照配列セットに対して、前記参照配列セット中の各配列を示す検索インデックスを生成することと、
前記参照配列セットに対する系統樹を生成することと、
前記系統樹のセクターに対して、それぞれが前記系統樹の対応するセクターに含まれる前記参照配列セット中の配列を示し、それぞれが前記検索インデックスよりも少ない配列を示す、前記検索インデックスのサブインデックスを生成することと、
前記サブインデックスをメモリに記憶することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記セクターは前記系統樹のクレードに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検索インデックスはハッシュ表を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検索インデックスは分類された辞書を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記系統樹は近隣結合法により生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記セクターは系統発生学的基準により制約される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記系統発生学的基準は進化距離である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
複数の配列リードに種を割り当てる計算時間を短縮する方法であって、前記方法は、
前記複数の配列リードを受信することと、
前記複数の配列リードから選択された配列リードを含む、前記複数の配列リードの試験セットを選択することと、
複数の種に対応する配列のセットの全ての配列を示すインデックスの、前記配列のセットから選択された配列を示し、それぞれが前記配列のセットの系統樹のセクターに対応する複数のサブインデックスを選択することと、
１つ以上の処理ユニットにより並列に行われる、前記試験セットの前記複数のサブインデックスへのアライメントを行うことと、
前記１つ以上の処理ユニットを用いて、前記試験セットの前記複数のサブインデックスへのアライメントに基づいて前記複数のサブインデックスの特定のサブインデックスを特定することと、
前記１つ以上の処理ユニットを用いて、前記複数の配列リードを前記特定のサブインデックスにアライメントすることと、
前記複数の配列リードを前記特定のサブインデックスにアライメントすることに基づいて前記種を前記複数の配列リードに割り当てることと、を含む、方法。
【請求項９】
前記複数の配列リードの試験セットを選択することは前記複数の配列リードからランダムな配列リードを選択することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のサブインデックスを選択することは前記インデックスの全てのサブインデックスを選択することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験セットは複数の試験セットを含み、前記複数の試験セットのそれぞれは前記複数のサブインデックスの異なるサブインデックスにアライメントされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の処理ユニットを用いて前記複数の配列リードを前記特定のサブインデックスにアライメントすることは、前記複数の配列リードを複数のサブセットにグループ化することを含み、各サブセットは前記特定のサブインデックスにアライメントされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記種を割り当てることは少なくとも部分的に確率論的方法に基づく、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
生命体の同定に関連する計算時間を短縮するための方法であって、前記方法は、
前記生命体に関連し、それぞれが前記生命体の遺伝子配列の一部と対応する複数の配列リードを受信することと、
既知の配列決定されたゲノムを含むデータベースであって、前記既知の配列決定されたゲノムに関連する少なくとも１つの系統樹、前記少なくとも１つの系統樹に関連する少なくとも１つのインデックス、及び前記少なくとも１つのインデックスのそれぞれに関連し、前記少なくとも１つのインデックスよりも小さい複数のサブインデックスを含むデータベースにアクセスすることと、
前記配列リードから選択された配列リードの、前記サブインデックスから選択されたサブインデックスへの並列な第１のアライメントを行うことと、
前記第１のアライメントの結果に基づいて前記サブインデックスから選択されたサブインデックスの最適なサブインデックスを選択することと、
前記複数の配列リードの、前記サブインデックスから選択されたサブインデックスの最適なサブインデックスに関連するインデックスへの更なるアライメントを行うことと、
前記更なるアライメントに基づいて前記生命体を同定することと、を含む方法。
【請求項１５】
前記生命体は細菌、ウイルス、又は真菌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子配列はＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
感染分離株の種を決定するためのシステムであって、前記システムは、
処理ユニットと、
前記処理ユニットにアクセス可能なメモリと、
前記処理ユニットにアクセス可能なデータベースと、
前記処理ユニットに結合されたディスプレイと、を備え、
前記処理ユニットは、
前記メモリに記憶された前記感染分離株の複数の配列リードを、前記データベースに記憶された複数の種に対応する参照配列のセットの配列を示すインデックスの、前記配列のセットから選択された配列を示し、前記参照配列のセットの系統樹のセクターに対応する少なくとも１つのサブインデックスにアライメントして前記感染分離株の種を決定し、
前記感染分離株の種の決定を前記ディスプレイに提供する、システム。
【請求項１８】
前記複数の配列リードを前記メモリに提供する配列決定ユニットを更に含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記処理ユニットにアクセス可能なコンピュータシステムを更に含み、前記処理ユニットは前記感染分離株の種の決定を前記コンピュータシステムに提供する、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２０】
前記処理ユニットは複数の処理ユニットを含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２１】
前記データベースは複数のデータベースを含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２２】
前記処理ユニットは更に、前記感染分離株の種の決定が正しいとする確率を提供する、請求項１７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]  敗血症は血管の漏れ、血栓、臓器不全、及び死を引き起こす可能性のある過剰な免疫反応である。米国では１００万人を超える患者が敗血症になり、その死亡率は２８〜５０％と推定される（Hall MJ, Williams SN, DeFrances CJ, Golosinskiy A. Inpatient care for septicemia or sepsis: A challenge for patients and hospitals. NCHS data brief, no 62. Hyattsville, MD: National Center for Health Statistics. 2011 and Wood KA, Angus DC. Pharmacoeconomic implications of new therapies in sepsis. PharmacoEconomics. 2004; 22(14):895-906.を参照）。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は体内の感染症により引き起こされる。敗血症反応が感染症により引き起こされると、患者の容体は急速に悪化する可能性がある。感染源を迅速に取り除くことが重要である。第１の治療ステップは典型的には広域抗生命体質である。しかし、感染症は細菌だけではなく、真菌、ウイルス、又は病原体の組み合わせにより引き起こされる。更に、多くの感染症は広域抗生命体質に耐性のある細菌株により引き起こされる。病原体を特定することで臨床医は病原体に対して最も効果的な薬物を選択することができる。病原体の特定が早ければ早いほど、患者は最も効果的な治療を早く受けられる。これは敗血症を患う患者の転帰を改善する。
【０００３】
[002]  未知の遺伝子配列を既知の配列にアライメントすることが病原体を特定する正確な方法である。遺伝子配列決定技術がより広く使用されるようになるにつれて、患者からサンプルを採取して遺伝子情報の配列を決定することがより実現可能になっている。例えば次世代配列決定技術は生命体の配列決定を行うコストを指数関数的に減少させている。この遺伝子情報は感染症を引き起こす病原体、患者組織、又は他の情報源に由来する。サンプルの配列は病原体の特定を試みるために参照配列のデータベースと比較される。参照配列として使用するために何千もの微生命体の配列決定がこれまでに行われ、その数は数年以内に数十万に達することが予想される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
既知の配列の数が増えるにつれて、参照配列のデータベースを検索するために必要な時間及び計算能力が増加する。サンプルの配列を決定するコストは減少しているが、サンプル配列を参照配列にアライメントする計算コストが増大することによって、この病原体特定方法の実用性が低下する。また、例えば分子生命体学研究、食品安全、及び創薬等の他の用途への配列アライメントの可用性も低下する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[003]  データベースをより高速に検索するための例示的な方法は、データベースに記憶された参照配列セットに対して、参照配列セット中の各配列を示す検索インデックスを生成することと、参照配列セットに対する系統樹を生成することと、系統樹のセクターに対して、それぞれが系統樹の対応するセクターに含まれる参照配列セット中の配列を示し、それぞれが検索インデックスよりも少ない配列を示す、検索インデックスのサブインデックスを生成することと、サブインデックスをメモリに記憶することとを含む。
【０００６】
[004]  複数の配列リードに種を割り当てる計算時間を短縮するための例示的な方法は、複数の配列リードを受信することと、複数の配列リードから選択された配列リードを含む、複数の配列リードの試験セットを選択することと、複数の種に対応する配列のセットの全ての配列を示すインデックスの、配列のセットから選択された配列を示し、それぞれが配列のセットの系統樹のセクターに対応する複数のサブインデックスを選択することと、１つ以上の処理ユニットにより並列に行われる、試験セットの複数のサブインデックスに対するアライメントを行うことと、１つ以上の処理ユニットを用いて、アライメントに基づいて複数のサブインデックスの特定のサブインデックスを特定することと、１つ以上の処理ユニットを用いて、複数の配列リードを特定のサブインデックスにアライメントすることと、アライメントに基づいて種を複数の配列リードに割り当てることとを含む。
【０００７】
[005]  生命体の同定に関連する計算時間を短縮するための例示的な方法は、生命体に関連し、それぞれが生命体の遺伝子配列の一部と対応する複数の配列リードを受信することと、既知の配列決定されたゲノムを含むデータベースであって、既知の配列決定されたゲノムに関連する少なくとも１つの系統樹、少なくとも１つの系統樹に関連する少なくとも１つのインデックス、及び少なくとも１つのインデックスのそれぞれに関連し、少なくとも１つのインデックスよりも小さい複数のサブインデックスを含むデータベースにアクセスすることと、配列リードから選択された配列リードの、サブインデックスから選択されたサブインデックスに対する並列的な第１のアライメントを行うことと、第１のアライメントの結果に基づいてサブインデックスから選択されたサブインデックスの最適なサブインデックスを選択することと、複数の配列リードの、サブインデックスから選択されたサブインデックスの最適なサブインデックスに関連するインデックスに対する更なるアライメントを行うことと、更なるアライメントに基づいて生命体を同定することとを含む。
【０００８】
[006]  感染分離株の種を決定するための例示的なシステムは、処理ユニットと、処理ユニットにアクセス可能なメモリと、処理ユニットにアクセス可能なデータベースと、処理ユニットに結合されたディスプレイとを備える。処理ユニットは、メモリに記憶された感染分離株の複数の配列リードを、データベースに記憶された複数の種に対応する参照配列のセットの配列を示すインデックスの、配列のセットから選択された配列を示し、参照配列のセットの系統樹のセクターに対応する少なくとも１つのサブインデックスにアライメントして感染分離株の種を決定し、感染分離株の種の決定をディスプレイに提供するように構成される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】[007]  図１は、本開示の実施形態によるシステムの概略図である。
【図２】[008]  図２は、本開示の実施形態による方法のフローチャートである。
【図３Ａ】[009]  図３Ａは、本開示の実施形態による方法の概略図である。
【図３Ｂ】[010]  図３Ｂは、本開示の実施形態による方法の概略図である。
【図４】[011]  図４は、例示的な系統樹の図である。
【図５】[012]  図５は、本開示の実施形態による方法のフローチャートである。
【図６】[013]  図６は、本開示の実施形態による方法の概略図である。
【図７】[014]  図７は、本開示の実施形態による方法の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
[015]  以下の特定の例示的な実施形態の説明は事実上例示に過ぎず、本発明、その応用、又は使用を限定することを決して意図しない。本発明のシステム及び方法の実施形態の以下の詳細な説明において、その一部を成す添付の図面が参照され、図面には記載のシステム及び方法が実施される具体的実施形態が例として示される。これらの実施形態は当業者が現在開示されているシステム及び方法を実施することができるように十分詳細に記載され、他の実施形態が利用されること、及び本発明のシステムの精神及び範囲から逸脱することなく構造的及び論理的変更がなされることが理解されるべきである。
【００１１】
[016]  従って以下の詳細な説明は限定的な意味でとられるべきではなく、本発明のシステムの範囲は添付の請求項によってのみ規定される。本明細書の図中の参照数字の先頭数字は、複数の図にあらわれる同一部品が同じ参照数字で識別されることを除き、通常は図番号に対応する。更に、明瞭化を目的に、特定の特徴の詳細な説明は、それらが当業者に明らかであろうときには、本発明のシステムの説明を分かりにくくしないために論じられない。
【００１２】
[017]  病原体の同定が説明されているが、この用途はあくまでも例示的な目的で示されている。本明細書で説明される方法、システム、及び装置は幅広い用途に使用され、病原体同定に限定されない。他の用途はこれらに限定されないが系譜学、法医学、及び植物学を含む。
【００１３】
[018]  感染症は細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、又は他の生命体等の病原体により引き起こされる。一部の感染症は同時に存在する複数の種類の生命体により引き起こされる。
【００１４】
[019]  感染症が検出されると、医療スタッフにより患者からサンプルが採取される。サンプルには組織、血液、及び／又は体液が含まれる。次にサンプルは感染症を引き起こす病原体をサンプル内の他の物質から分離するために処理される。次に感染分離株は種々の方法により解析される。解析によって病原体の型、種、薬物耐性、及び／又は他の特性が決定される。
【００１５】
[020]  感染分離株の遺伝物質は配列決定される。配列決定方法の例には、単分子リアルタイム配列決定、ピロ配列決定、及びポロニー配列決定が含まれる。他の配列決定方法も使用される。ハイスループット配列決定（次世代配列決定としても知られている）を使用して、遺伝物質は並列に配列決定され、数千から数百万の配列断片が生成される。配列決定法により生成される配列断片は一般に「配列リード」、又は単に「リード」と呼ばれる。リードは数十から数万塩基対長の範囲である。一部の配列決定法では、リードは感染分離株配列の全長である。そして感染分離株のリードは参照配列とのマッチを発見するために解析される。１つ以上のリードを既知の配列にマッチさせるプロセスは一般にアライメントと呼ばれる。
【００１６】
[021]  配列及び／又はリードをアライメントする幾つかのアルゴリズムが開発されている。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム等の特定のアルゴリズムがリードと参照配列との間の最適アライメントを見つけるために使用される。最適アライメントであっても、リードと参照配列との間にミスマッチ及び／又は差異がある。差異は連続したミスマッチ塩基列及び／又は参照配列とリードの長さの差に起因する。最適アライメントにおいてリード及び参照配列をいかに上手くアライメントさせるかについてのスコア又は他の評価基準（例えばマッチした核酸の総数、最長差異の長さ等）が提供される。最適アライメントアルゴリズムは最も正確な結果を提供するが、これら多くのアルゴリズムの計算密度は、多くのリード及び／又は参照配列をアライメントしなければならない場合の実現を困難にする。
【００１７】
[022]  最適アライメントを保証しないことを代償にしてではあるが、配列アライメントの速度を高める確率的アルゴリズムが開発されている。これらのアルゴリズムは、最良のアライメントを発見した確率、及び／又は１つのリードとデータベース中の参照配列のセットの１つの参照配列との間の最も近いマッチを発見した確率の測度を提供する。
【００１８】
[023]  ある群の確率的アルゴリズムはリード及び配列をｋ−ｍｅｒｓ、即ち複数（ｋ）個の塩基対から構成される「ワード」に分解する。次にアルゴリズムはリードｋ−ｍｅｒｓ及び参照配列ｋ−ｍｅｒｓでマッチを検索する。斯かるアルゴリズムの一例は、ベーシックローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）である。別の群の確率的アルゴリズムは、Ｂｏｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換（ＢＷＴ）等の変換をリード及び配列に適用する。変換は配列の一部の同一コピーの数を減らし、アライメント時間を短縮する。このタイプのアライメントアルゴリズムの一例はＢｏｗｔｉｅアルゴリズムである。他の確率的アルゴリズムが使用されてもよい。（Li H, Homer N,「A survey of sequence alignment algorithms for next-generation sequencing」Briefings in Bioinformatics, 2(5), 473-483, 2010.）
【００１９】
[024]  多くの確率的アルゴリズムが一次データ構造の要素を示す検索インデックスと呼ばれる二次データ構造を生成する。例えば書籍では、検索インデックスは主要なトピックのリストを提供し、主要なトピックが議論されるページを示す。本出願では一次データ構造の要素は配列である。これらのインデックスは、参照配列及び／又はサンプルからの配列リードのために生成される。検索インデックスは、選択されたアルゴリズムにより検索を行い、マッチング配列及び／又は配列セグメントを見出すように最適化されたデータ構造を提供する。検索インデックスはアルゴリズムがリード及び配列をより高速及び／又は正確にアライメントすることを可能にする。この改善における性能トレードオフは追加のデータベースと検索インデックスを記憶するためのメモリの記憶空間である。検索インデックス構造の例は、これらに限定されないが、ハッシュ表、接尾辞／接頭辞木、ビニング、線形インデックスを含む。アライメントアルゴリズムは１つ以上の検索インデックスを使用する。
【００２０】
[025]  本開示の実施形態による、リードを１つ以上の参照配列にアライメントするために使用されるシステム１００の一例が図１のブロック図として示される。感染分離株サンプルからのデジタル形式の配列リードがメモリ１０５に含められる。メモリ１０５は処理ユニット１１５にアクセス可能である。処理ユニット１１５は１つ以上の処理ユニットを含む。処理ユニット１１５は１つ以上のアライメントアルゴリズムを実行するように構成される。処理ユニット１１５は１つ以上の参照配列及び／又はインデックスを含むデータベース１１０にアクセスすることができる。データベース１１０は１つ以上のデータベースを含む。処理ユニット１１５はそのアライメントの結果をディスプレイ１２０及び／又はデータベース１１０に提供する。ディスプレイ１２０はユーザから見える電子ディスプレイである。任意選択的に、処理ユニット１１５は更にコンピュータシステム１２５にアクセスする。コンピュータシステム１２５は追加のデータベース、メモリ及び／又は処理ユニットを含む。コンピュータシステム１２５はシステム１００の一部である、又はシステム１００により遠隔アクセスされる。一部の実施形態ではシステム１００はまた、配列決定ユニット１３０を含む。配列決定ユニット１３０は感染分離株を処理して配列リードを生成し、デジタル形式のリードを生成する。
【００２１】
[026]  図２は、図１に示されたシステム１００等のシステムにより実行される、リードを１つ以上の参照配列にアライメントするための例示的な方法２００のフローチャートである。まずステップ２０５において配列リードが受信される。配列リードはメモリ１０５等のメモリにロードされる。次にリードはステップ２０５において検索インデックスに対してアライメントされる。検索インデックスはデータベース１１０等のデータベースに記憶された１つ以上の参照配列を示す。検索インデックスもデータベースに記憶される。処理ユニット１１５等の処理ユニットはアライメントアルゴリズムを用いてリードを検索インデックスにアライメントする。アライメントアルゴリズムは前述のアライメントアルゴリズムのうちの１つである。アライメント後、システムはステップ２１５においてリードと最適に一致する参照配列を提供する。システムはこれらの結果をディスプレイ１２０等のディスプレイ、及び／又はコンピュータシステム１２５等の別のコンピュータシステムを介してユーザに提供する。コンピュータシステムは、結果が例えば病院規模の感染追跡システム又は疾病管理センター（ＣＤＣ）報告システム等の他のシステムにアクセスできるようになることを可能にする。リードと最適に一致する参照配列を提供する他の方法も使用される。他の結果もシステムにより提供される。他の結果は、これらに限定されないが、配列間のマッチの割合、最適な一致を見出したパーセント確率、及び誤差を含む。
【００２２】
[027]  参照配列、リード、及び／又はインデックスは異なるデータベースに記憶される。データベースは１つ以上の処理ユニットによりアクセス可能な異なるメモリに記憶される。一部のケースでは１つ以上のデータベースが複数のメモリ間に分割される。例えば参照配列のデータベースの一部はあるメモリに記憶される一方、参照配列のデータベースの第２の部分は別のメモリに記憶される。各メモリはデータベースのユニークな部分を含む、又は各メモリは別のメモリにも記憶されたデータベースの一部を含む。これはハードウェアが故障した場合のバックアップ保護、及び／又はよく使われるデータへのより高速なアクセスをもたらす。
【００２３】
[028]  データを複数のデータベース及び／又は複数のメモリに分けることによって、１つ以上の処理ユニットがリードのアライメントを並列に実行することができる。これによって計算時間が短縮される。例えば１０００個の参照配列を示す検索インデックスはそれぞれが１００個の参照配列を示す１０個のサブインデックスに分割される。１つの処理ユニット又は複数の処理ユニットはメモリ内の５０００個のリードにアクセスし、リードを各サブインデックスに並列にアライメントする。この結果、５０００個のリードを全検索インデックスにアライメントする場合よりも短時間のアライメントがもたらされる。
【００２４】
[029]  図３Ａ〜図３Ｂは上記２つの方法３００Ａ〜３００Ｂの概略図である。図３Ａは、リードのセット３０５が全検索インデックス３１０にアライメントされて結果３１５をもたらすことを示す。図３Ｂは、リードのセット３０５がサブインデックス３１０ａ〜ｆのセットにアライメントされて結果３１５をもたらすことを示す。サブインデックス３１０ａ〜ｆは単一のデータベース又は複数のデータベースに記憶される。データベースは１つ以上の処理ユニットがアクセス可能な１つ以上のメモリに記憶される。リードのセット３０５は同じメモリ又はサブインデックス３１０ａ〜ｆと異なるメモリに記憶される。サブインデックスは検索インデックス３１０をセグメントにランダムに分割することにより生成される。サブインデックス３１０ａ〜ｆはまた、サブインデックスにより示される参照配列間の共通性に従って生成される。例えば第１のサブインデックスはＡＧＣで始まる全ての検索インデックスの参照配列を示し、第２のサブインデックスはＣＧＣで始まる全ての参照配列を示す等。サブインデックスは系統発生学的基準に従って生成される。
【００２５】
[030]  系統学は生命体間の進化的関係の研究である。斯かる関係は樹等の重み付きグラフとして表されることが多い。系統樹４００の一例が図４に示される。データ粒度の異なるレベルが系統樹に示される。例えば亜種を表す枝が単一の種に結合される。別の例では、樹の各枝は単一の種を表す。枝間のリンクは幾つかの種を属等のより大きなカテゴリーにグループ化する。２つ以上の属が１つの科に結合される等。突然変異率、生命体間の進化距離等の追加情報も系統樹に盛り込まれる。例えば枝の長さは２つの生命体間の進化距離に相当する。系統学的方法は生命体の遺伝子配列の全て又は一部を解析する。参照配列のセットの進化史を特定することにより、参照配列のセット、検索インデックス、及び／又はサブインデックスを体系化して感染分離株からのリードを参照配列にアライメントするのに要する時間を短縮することが可能になる。進化史によるデータの体系化はまた、サンプルからの感染分離株の病原体が他の病原体とどんな関係があるかについての理解を与える。
【００２６】
[031]  進化距離、節約、及び最大尤度に基づく方法を含む複数の系統学的方法が存在する。距離に基づく方法では各生命体間の進化距離が計算される。進化距離は生命体の遺伝子配列間の類似度に基づいて計算される。進化距離を決定するための斯かる方法の１つはＪｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒ（Evolution of protein molecules In Mammalian protein metabolism, Vol. III (1969), pp. 21-132 by T. H. Jukes, C. R. Cantor edited by M. N. Munro）法と呼ばれ、ゲノムの任意の特定のヌクレオチドから別のものへの転移、即ちトランジション又はトランスバージョンが同じ確率で起こり得る。
[032]
【数１】
2018505471.tif 000003
【００２７】
[033]  上記式１では瞬間速度行列Ｑは、瞬間あたりのヌクレオチド対間の変化速度を表す。確率転移行列Ｐは以下のように与えられる。
[034]
【数２】
2018505471.tif 000004
【００２８】
[035]  結果として、このモデルにおける任意の２つの生命体間の進化距離は単純に以下のようになる：
[036]
【数３】
2018505471.tif 000005
[037]  ここでｐは、配列間で異なる単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）／ＤＮＡに沿う部位の数である。距離はｐが平衡値に近づく（部位の７５％が異なる）につれて無限大に近づく。しかしこの単純なモデルは、トランジション（プリンからプリン（ａ−ｇ）又はピリミジンからピリミジン（ｔ−ｃ））及びトランスバージョン（プリンからピリミジン又はその逆）が異なる速度で生じるという生命体学的考慮が考慮されていない。別の距離モデルである木村２パラメータモデル（Kimura, Motoo.「A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences」Journal of molecular evolution 16.2 (1980): 111-120）はこれを修正しようとする。このケースでは、以下のようになる：
[038]
【数４】
2018505471.tif 000006
[039]  ｐ（トランジションの比率）であり、ｑ（トランスバージョンの比率）である。
【００２９】
[040]  参照配列がその進化距離を決定するために比較されると、進化の速度が決定される。次に、参照配列間の進化距離及び関係は樹プロットのようにグラフ形状でプロットされる。近隣結合法（Saitou N, Nei M.「The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees.」Molecular Biology and Evolution, volume 4, issue 4, pp. 406-425, July 1987）は無根系統樹を構築する１つの方法である。この方法は、まず同じ親節点ｋを有する一対の隣接する葉ｉ及びｊを見つけることにより配列間の等しくない進化速度を修正する。つまり、葉ｉ及びｊは一般的な病原体ｋから進化した病原体である。次に葉ｉ及びｊは葉節点リストから除外され、ｋは現在の節点リストに追加され、節点距離が再計算される。このアルゴリズムは貪欲な「最小進化」アルゴリズムの一例である。
【００３０】
[041]  系統樹を構築する別の方法は、算術平均を用いる非加重ペアグループ法（ＵＰＧＭＡ）（Sokal R., Michener C.「A statistical method for evaluating systematic relationships」University of Kansas Science Bulletin 38: 1409-1438, 1958）である。ＵＰＧＭＡアルゴリズムは凝縮型であり、有根系統樹を生成する。最初に各配列は単一のクラスターを規定する。繰り返すたびにクラスターが結合され、より大きなクラスターが形成される。これは全ての配列が単一のクラスターに含められるまで続く。繰り返すたびに最も短い進化距離を有することが分かった配列の２つのクラスターが結合されて上位クラスターになる。クラスター間の進化距離は、各クラスターにおける対応する配列対間の全ての進化距離の平均である。アルゴリズムは全ての参照配列が樹に配置されるまで繰り返す。
【００３１】
[042]  単連結クラスタリングは有根系統樹を構築するＵＰＧＭＡに類似の方法である。しかし、クラスター間の全ての対応する配列対間の平均進化距離を用いるのではなく、クラスター間の進化距離は第１のクラスターの配列及び第２のクラスターの配列間の最小距離により規定される。つまり、１対の配列の距離はクラスター間の距離を規定する。
【００３２】
[043]  完全連結クラスタリングもまた有根系統樹を構築するＵＰＧＭＡ及び単結合クラスタリングに類似の方法である。単連結クラスタリングと同様に、それぞれ異なるクラスターに含まれる１対の配列間の進化距離は２つのクラスター間の進化距離を規定する。しかし、完全連結クラスタリングでは最大進化距離を有する配列対は２つのクラスター間の進化距離を規定する。
【００３３】
[044]  近隣結合法と異なり、ＵＰＧＭＡアルゴリズム及び関連するクラスタリングアルゴリズムは一定の進化速度を前提とする。系統樹を生成する上記の方法はあくまで例示目的で提供される。系統樹を生成する他の方法は本開示の範囲から逸脱することなく用いられる。
【００３４】
[045]  図５は、本開示の実施形態による検索インデックス及びサブインデックスを生成するための方法５００のフローチャートである。まずステップ５０５において、１つの検索インデックスが参照配列のセットに対して生成される。例えばハッシュ表インデックス。次にステップ５１０において、参照配列のセットの系統樹が生成される。系統樹は前述の方法の１つ以上及び／又は別の方法により生成される。一部の実施形態ではステップ５１０はステップ５０５に先行する。系統樹が生成された後に、検索インデックスはステップ５１５においてサブインデックスに分割される。検索インデックスは系統樹のセクターによりサブインデックスに分割される。セクターの例はこれらに限定されないが、属、クレード、枝、及び門を含む。セクターを制約するために他の系統発生学的基準も使用される。例えば互いに設定された進化距離にある種及び／又は同じ突然変異率を有する種。次にサブインデックスは１つ以上のデータベース及び／又はメモリに記憶される。サブインデックスは、生成されるとリードのアライメントのために繰り返し使用される。しかし方法５００は、参照配列のセットが変更される場合は繰り返される。例えば新しい参照配列の追加又は削除がセットに対して行われる。
【００３５】
[046]  前述のように次世代配列決定方法は、１つの感染分離株に対して数千から数百万のリードを生成する。インデックスがサブインデックスに分割されたとしても、全てのリードを各サブインデックスに並列にアライメントするには長い時間がかかる。図６は、本開示の実施形態によるアライメントのためにリードをサブセットに分割する例示的な方法６００の概略図である。試験セット６０６を生成するためにリードのセット６０５が使用される。試験セット６０６はリードのセット６０５からランダムに選択されたリードを含む。次に試験セット６０６はサブインデックス６１０ａ〜ｆの全てに並列にアライメントされる。これはアライメントの結果６１５を生成するために使用される。結果６１５は試験セット６０６と最適に一致する可能性が最も高い参照配列である。結果６１５は、全てのリード６０５を使用する結果３１５等の結果よりも精度が低い。代替的には結果６１５は、最適に一致する参照配列を示したサブインデックス６１０ａ〜ｆ、例えばサブインデックス６１０ｂを示す。図６に示されるように、次に全てのリード６０５はサブインデックス６１０ｂにアライメントされ、そしてこのアライメントの最終結果６１７はリードと最適に一致する可能性が最も高い参照配列である。これによってリードのセット６０５全体がアライメントされる参照配列の数が減り、結果的に計算時間が短縮される。
【００３６】
[047]  リードのセットを細分する他の置換が考えられる。例えばリードのセットは任意の数の試験セットに分割され、各試験セットは１つ以上のサブインデックスにアライメントされる。試験セットは１つ以上の処理ユニットがアクセス可能な１つ以上のメモリに記憶される。試験セットは同じメモリ又はリードのセットと異なるメモリに記憶される。試験セットは同じメモリ又は検索インデックス及び／又はサブインデックスと異なるメモリに記憶される。試験セットは、結合された場合にリードのセット全体を含む。しかし試験セットは、結合された場合にリードのセット全体の一部のみを含むこともある。これによって、試験セットをアライメントするのに要する計算時間が短縮される。次に１つ以上の試験セットと最適に一致することが分かったサブインデックスはリードの完全セットにアライメントされる。このステップは精度の低い結果で十分な場合は省略される。
【００３７】
[048]  サブインデックスがインデックスにより示される参照配列から生成される系統樹のセクターである場合は、アライメントは少なくとも結果の一部として系統情報を返す。例えば感染分離株サンプルの配列決定から生成されたリードのセットが１つ以上のサブインデックスにアライメントされた後、結果は感染分離株の最も可能性の高い種を含む。他の系統情報も提供される。
【００３８】
[049]  図７は、本開示の実施形態による種を複数の配列リード７００に割り当てることを示す概略図である。この方法は図１に示されたシステム１００等のシステムにより実行される。感染分離株がサンプルから得られる。次に感染分離株は複数のリードを生成した配列決定手法により配列決定される。次に複数のリードは電子的方式でメモリに提供される。そしてメモリはリードのセット７０５を含む。次にリードのセットは１つ以上の試験セット７０６ａ〜７０６ｅに分割される。６つの試験セットが示されているが、任意の数の試験セットがリードのセット７０５から生成される。
【００３９】
[050]  参照配列のデータベース７１０もメモリ又は独立のメモリに記憶される。参照配列は、全ての生命体の既知の参照配列のセット全体であるか、又は既知の参照配列のセット全体の一部、例えば細菌の参照配列のみである。検索インデックスがデータベース７１０の参照配列に対して生成される。検索インデックスもデータベース７１０に記憶される。一部の実施形態では、データベース７１０は複数のデータベースを含む。系統樹が参照配列に対して生成される。系統樹に基づいて、１つ以上のサブインデックス７１０ａ〜ｅが生成される。各サブインデックス７１０ａ〜ｅは系統樹の対応するセクターにおける参照配列を示す。例えば各サブインデックス７１０ａ〜ｅは参照配列の系統樹のクレードを表す。５つのサブインデックスが示されているが、任意の数のサブインデックスが検索インデックスから生成される。検索インデックス及びサブインデックスの生成はリードのセットを受信する前に行われる。検索インデックス及びサブインデックスの生成は一回行われれば十分であり、結果として得られる検索インデックス及びサブインデックスは任意の数のリードのセットに対して複数回使用される。
【００４０】
[051]  １つ以上の処理ユニットが試験セット７０６ａ〜ｅにアクセスし、各試験セット７０６ａ〜ｅを対応するサブインデックス７１０ａ〜ｅにアライメントする。各試験セットの各サブインデックスへのアライメントは並列に行われる。一部の実施形態では、試験セット７０６ａ〜ｅはサブインデックス７１０ａ〜ｅの特定のサブインデックスのみにアライメントされる。例えば一部のサブインデックスは病原性種を含まないことが知られている系統樹のセクターに対応する。この場合これらのサブインデックスは感染分離株種を探す際のアライメントから除外される。処理ユニットはアライメントの結果７１５を分析し、最適アライメントの又は最適アライメントを含む確率が最も高いサブインデックスを特定する。図７に示される例では、サブインデックス７１０ｃが最適サブインデックスである。
【００４１】
[052]  次にリードのセット７０５は、１つ以上のサブセット７０７ａ〜ｅに分割される。５つのサブセットが示されているが、任意の数のサブセットがリードのセット７０５から生成される。サブセット７０７ａ〜ｅは、結合された場合にリードのセット７０５全体を含む。サブセット７０７ａ〜ｅは試験セット７０６ａ〜ｅと同じか又は異なる。例えば結合された試験セット７０６ａ〜ｅがリードのセット７０５のリードの一部のみを含む場合は、サブセット７０７ａ〜ｅは異なる。別の例では、試験セットよりも多いか又は少ないサブセットが生成される。
【００４２】
[053]  １つ以上の処理ユニットがサブセット７０７ａ〜ｅにアクセスし、各サブセット７０７ａ〜ｅを最適インデックス７１０ｃに並列にアライメントする。一部の実施形態では、アライメントの並列処理を促進するために最適インデックス７１０ｃの複数のコピーが生成される。並列処理を促進する他の方法も用いられる。処理ユニットは、サブセット７０７ａ〜ｅの最適サブインデックス７１０ｃへのアライメントの結果を分析する。次に処理ユニットは感染分離株の最も可能性の高い種の結果７１７を返す。前述の確率論的方法が最も可能性の高い種の割り当てに用いられる。他の情報も結果７１７と共に提供される。例えば、正しい種が同定された確率、最も可能性の高い種の参照配列及び感染分離株の配列リード間の類似度、及び／又は他の可能性がある種が含まれる。結果７１７は、電子ディスプレイでユーザに提供される、外部のコンピュータシステムに送信される、及び／又はメモリに記憶される。
【００４３】
[054]  上記のシステム、方法、及び装置は、感染分離株からの配列リードに種を割り当てる計算時間を短縮することにより患者の転帰を改善する。患者が感染していると判断された場合は、患者からサンプルが採取される。サンプルは感染分離株を採取するために処理される。次に感染分離株は複数の配列リードを生成する配列決定デバイスにより配列決定が行われる。配列リードは電子的形式に変換され、本開示の実施形態によるシステムに提供されて感染分離株の種を決定するために配列リードと参照配列とが比較される。システムは上記のリード及び／又は検索インデックスを細分する１つ以上の方法を用い、これによって種を感染分離株に割り当てるのに要する計算時間が短縮される。感染分離株の種割り当てによって、臨床医は患者を感染させる特定の病原体に対する最も効果的な治療を行うことが可能になる。これによって感染から最も効果的な治療の開始までの時間が短縮される。また、望ましくない副作用がある非効果的又は効果の弱い治療法で患者を治療することも少なくなる。例えば感染が広域抗生命体質に耐性がある細菌により生じていると判断される場合は、広域抗生命体質による治療が回避される。
【００４４】
[055]  上記のシステム、方法及び装置は、より安価なメモリ、データベース、及び／又は処理ユニットが実施のために使用されることを可能にする。これは配列決定機能及びアライメント機能へのアクセスを拡大する。
【００４５】
[056]  上記の実施形態又はプロセスのいずれか１つは、１つ以上の他の実施形態及び／又はプロセスと組み合わされるか、或いは本発明のシステム、デバイス及び方法にかかる個別のデバイス又はデバイス部の間で分離されるか、及び／又は実行されることが理解されるべきである。
【００４６】
[057]  最後に、上記考察は本発明のシステムの例示に過ぎないことを意図し、添付の請求項をいかなる特定の実施形態又は実施形態のグループにも限定するものと解釈されてはならない。従って、本発明のシステムは例示的な実施形態を参照して特に詳細に記載されているが、多数の変更及び代替的実施形態が、以下の請求項に記載の本発明のシステムの上位の及び意図された精神と範囲から逸脱することなく、当業者によって考案されることも理解されるべきである。従って、明細書と図面は例示と見なされるものであり、添付の請求項の範囲を限定することを意図しない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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