(57)【要約】  本発明は、パウア材料の酵素加水分解によって生成される水溶性パウア抽出物に関する。抽出物は、高比率の低分子量ペプチドを含み、抗炎症特性を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性パウア抽出物。
【請求項２】
固体を基準として少なくとも約４５重量％のペプチドを含む、請求項１に記載の水溶性パウア抽出物。
【請求項３】
固体を基準として約４５重量％〜約６５重量％のペプチドを含む、請求項１に記載の水溶性パウア抽出物。
【請求項４】
ペプチドの９０重量％超が、５ｋＤａ未満である、請求項１から３のいずれか一項に記載の水溶性パウア抽出物。
【請求項５】
固体を基準として約５重量％以下の脂質を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の水溶性パウア抽出物。
【請求項６】
パウアが、ヘリトリアワビ（Haliotis iris）（ブラックフットパウア（Blackfoot paua））、サザナミトコブシ（Haliotis australis）（シルバーパウア（Silver paua）／イエローフットパウア（Yellow foot paua））およびキムスメアワビ（Haliotis virgenea）を含む群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の水溶性パウア抽出物。
【請求項７】
水溶性パウア抽出物を生成する方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質分解酵素を使用して、パウア材料の水性懸濁液を加水分解するステップと、
（ｂ）加水分解混合物中の該酵素を変性させるステップと、
（ｃ）不溶性材料を加水分解混合物から除去して、水溶性パウア抽出物をもたらすステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記タンパク質分解酵素が、わずかに酸性からほぼ中性のｐＨ最適値を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質分解酵素が、パパイン、Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｅｎｚｉｄａｓｅ  ＦＰおよびＥｎｚｉｄａｓｅ  Ｎｅｕｔｒａｌを含む群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記パウア材料が、新鮮な全身パウア、パウア粉末およびパウア超臨界残留物を含む群から選択される、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
パウアが、ヘリトリアワビ（Haliotis iris）（ブラックフットパウア）、サザナミトコブシ（Haliotis australis）（シルバーパウア／イエローフットパウア）およびキムスメアワビ（Haliotis virgenea）を含む群から選択される、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法によって生成される水溶性パウア抽出物。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれか一項に記載の水溶性パウア抽出物および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１から６のいずれか一項に記載の水溶性パウア抽出物および１つまたは複数の摂取可能な賦形剤を含む栄養補助食品組成物。
【請求項１５】
食品組成物、食品添加物組成物、健康補助食品または医療食品である、請求項１４に記載の栄養補助食品組成物。
【請求項１６】
必要とする対象において炎症を低減させる方法であって、該対象に、治療有効量の請求項１から６のいずれか一項に記載の水溶性パウア抽出物を投与することを含む方法。
【請求項１７】
必要とする対象において炎症と関連する状態を予防、治療または管理する方法であって、該対象に、治療有効量の請求項１から６のいずれか一項に記載の水溶性パウア抽出物を投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記炎症と関連する状態が、喘息、脳炎、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性疾患、線維症、若年性関節炎、乾癬性関節炎、関節リウマチおよび変形性関節症を含む関節炎、乾癬、多発性筋痛、腱炎、滑液包炎、喉頭炎、歯肉炎、胃炎、耳炎、セリアック病、憩室炎、アテローム性動脈硬化症、心臓病、肥満症、糖尿病、癌ならびにアルツハイマー病を含む群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年３月２４日に出願されたニュージーランド仮出願第７０６３０１号に基づく優先権を主張するものであり、当該仮出願は参照により本明細書に組み込まれる。
１．発明の分野
本発明は、水溶性パウア抽出物、それらを含む組成物ならびに栄養補助食品および医薬用途におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
貝は、健康を維持する化合物に富んでいることが知られている。貝抽出物は、世界市場において、確立された栄養補助食品のカテゴリーである。
【０００３】
貝の幾つかの抽出物は、抗炎症効果および他の薬物効果を有し、その効果は、多くの場合、脂質画分から生じると主張されている。炎症は、関節炎、アテローム性動脈硬化症および癌を含む多種多様な状態と関連付けられる。炎症の現行医療は、アスピリンなどの非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）に非常に大きく依存しており、その多くが、望ましくない副作用を有する。したがって、副作用がより少ない栄養補助食品の貝調製物が、非常に望ましい。
【０００４】
貝の多くの栄養補助食品調製物について説明されている。かかる調製物の実際の化学組成は、
（ａ）貝の種、その年齢、およびそれが成長した環境条件を含む原材料、ならびに
（ｂ）組成物を得るのに使用するプロセス、−例えば、ある特定の種類の化合物を選択的に除外または保持するステップ、および幾つかの種類の化合物を積極的に破壊または変化させるステップは、最終組成物の化学構成に影響を及ぼすであろう
を含む多くの要因に依存する。
【０００５】
これまで、貝の栄養補助食品調製物は、動物全身抽出物またはその材料の脂質画分に集中してきた。凍結乾燥させた材料の超臨界ＣＯ２抽出は、イガイ脂質抽出物、特にモエギイガイ（green-lipped mussel）脂質抽出物を生成するのに広く使用されている。こうして調製された栄養補助食品組成物は、商標名Ｌｙｐｒｉｎｏｌ（商標）で販売されている。
【０００６】
しかしながら、イガイ全身粉末は不溶性であり、一般的に、不快な「魚のような」風味を有することから、イガイ全身粉末は多くの食品中に含ませるのに適していない。イガイ脂質抽出物もまた不溶性であり、「魚のような」風味／匂いは、酸化によって悪化する可能性があり、それは、多くの標準的な食品加工工程中に起きる可能性が高い。それらは概して、不快な臭いおよび風味を隠すために脂質充填カプセルとして投与されなくてはならない。
【０００７】
したがって、相当するイガイ全身粉末および／または脂質抽出物または他の類似の貝生成物に付随する欠点を被らない、薬効を有する水溶性パウア抽出物を提供すれば、有利であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、かかる抽出物を提供すること、または公衆に有用な選択を少なくとも提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
３．発明の概要
一態様では、本発明は、水溶性パウア抽出物を提供する。
一実施形態では、水溶性パウア抽出物は、固体を基準として少なくとも約４５重量％のペプチド、好ましくは低分子量ペプチドを含む。
【００１０】
一実施形態では、水溶性パウア抽出物は、固体を基準として約４５重量％〜約６５重量％のペプチド、好ましくは固体を基準として約５０重量％〜約６０重量％のペプチドを含む。
【００１１】
一実施形態では、ペプチドの９０重量％超、好ましくは９５重量％超が、５ｋＤａ未満である。
一実施形態では、ペプチドの７５重量％超、好ましくは８０重量％超が、２ｋＤａ未満である。
【００１２】
一実施形態では、ペプチドの３５重量％超、好ましくは４０重量％超が、１ｋＤａ未満である。
一実施形態では、水溶性パウア抽出物は、固体を基準として約５重量％以下の脂質を含む。
【００１３】
一実施形態では、水溶性パウア抽出物は、抗炎症活性を有する。
別の態様では、本発明は、水溶性パウア抽出物を生成する方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質分解酵素を使用して、パウア材料の水性懸濁液を加水分解するステップと、
（ｂ）加水分解混合物中の酵素を変性させるステップと、
（ｃ）不溶性材料を加水分解混合物から除去して、水溶性パウア抽出物をもたらすステップと
を含む方法を提供する。
【００１４】
一実施形態では、加水分解混合物は、酵素の変性後にｐＨ４に調節される。
一実施形態では、水溶性パウア抽出物は、精製および／または濃縮される。
一実施形態では、パウアは、ヘリトリアワビ（Haliotis iris）（ブラックフットパウア（Blackfoot paua））、サザナミトコブシ（Haliotis australis）（シルバーパウア（Silver paua）／イエローフットパウア（Yellow foot paua））およびキムスメアワビ（Haliotis virgenea）を含むが、これらに限定されない群から選択される。
【００１５】
一実施形態では、パウア材料は、食用筋肉組織の除去後に残される腸および／または生殖腺である。
別の態様では、本発明は、本発明の水溶性パウア抽出物および１つまたは複数の摂取可能な賦形剤を含む栄養補助食品組成物を提供する。
【００１６】
一実施形態では、栄養補助食品組成物は、マルトデキストリンおよび／または酸化防止剤を含む。
一実施形態では、栄養補助食品組成物は、食品組成物、食品添加物組成物、健康補助食品または医療食品を含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本発明の水溶性パウア抽出物および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
一実施形態では、医薬組成物は、経口投与剤形、好ましくは粉末を含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、必要とする対象において炎症を低減させる方法であって、対象に、治療有効量の本発明の水溶性パウア抽出物を投与することを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において炎症と関連する状態を予防、治療または管理する方法であって、対象に、治療有効量の本発明の水溶性パウア抽出物を投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
一実施形態では、炎症と関連する状態は、慢性状態である。
一実施形態では、炎症と関連する状態は、喘息、脳炎、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性疾患、線維症、若年性関節炎、乾癬性関節炎、関節リウマチおよび変形性関節症を含む関節炎、乾癬、多発性筋痛、腱炎、滑液包炎、喉頭炎、歯肉炎、胃炎、耳炎、セリアック病、憩室炎、アテローム性動脈硬化症、心臓病、肥満症、糖尿病、癌ならびにアルツハイマー病を含む。
【００２０】
一実施形態では、炎症と関連する状態は、炎症性ＴＮＦαおよび／またはＩＬ−１βのレベルを増加させる。
一実施形態では、本発明の水溶性パウア抽出物は、経口投与される。
【００２１】
これより、本発明の実施形態は、図面を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
４．図面の簡単な説明
【図１】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１βの阻害に関する陽性（デキサメタゾン）および陰性（ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）アッセイ対照を示すグラフである。
【図２】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１βの阻害に対するパウア残留物粉末由来の水溶性抽出物の効果を示すグラフである。
【図３】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１βの阻害に対するパウア全身粉末由来の水溶性抽出物の効果を示すグラフである。
【図４】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１βの阻害に対するパウア残留物粉末由来の水溶性抽出物（パイロット規模）の効果を示すグラフである。
【図５】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦαの阻害に関する陽性（デキサメタゾン）および陰性（ＤＭＳＯ）アッセイ対照を示すグラフである。
【図６】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦαの阻害に対するパウア残留物粉末由来の水溶性抽出物の効果を示すグラフである。
【図７】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦαの阻害に対するパウア全身粉末由来の水溶性抽出物の効果を示すグラフである。
【図８】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦαの阻害に対するパウア残留物粉末由来の水溶性抽出物（パイロット規模）の効果を示すグラフである。
【図９】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１βの阻害に対する加水分解されていないパウア残留物粉末の効果を示すグラフである。
【図１０】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１βの阻害に対する加水分解されていないパウア全粉末の効果を示すグラフである。
【図１１】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦαの阻害に対する加水分解されていないパウア残留物粉末の効果を示すグラフである。
【図１２】ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦαの阻害に対する加水分解されていないパウア全粉末の効果を示すグラフである。
【図１３】本発明の水溶性抽出物（ＰＡＲ４４）のＬＣ−ＭＳ分析によって生じる正のプロダクトイオンベースピーククロマトグラフである。
【図１４】本発明の水溶性抽出物（ＰＡＲ３６）のＬＣ−ＭＳ分析によって生じる正のプロダクトイオンベースピーククロマトグラフである。
【図１５】加水分解されていないパウア残留物粉末のＬＣ−ＭＳ分析によって生じる正のプロダクトイオンベースピーククロマトグラフである。
【図１６】加水分解されていないパウア全粉末のＬＣ−ＭＳ分析によって生じる正のプロダクトイオンベースピーククロマトグラフである。
【図１７】本発明の水溶性抽出物（ＰＡＲ４４）のＬＣ−ＭＳ分析によって生じる負のプロダクトイオンベースピーククロマトグラフである。
【図１８】本発明の水溶性抽出物（ＰＡＲ３６）のＬＣ−ＭＳ分析によって生じる負のプロダクトイオンベースピーククロマトグラフである。
【図１９】加水分解されていないパウア残留物粉末のＬＣ−ＭＳ分析によって生じる負のプロダクトイオンベースピーククロマトグラフである。
【図２０】加水分解されていないパウア全粉末のＬＣ−ＭＳ分析によって生じる負のプロダクトイオンベースピーククロマトグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
５．発明の詳細な説明
５．１定義
本明細書中で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、明らかに別記されない限り、少なくとも１つを意味する。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、その用語により修飾される値の上下１０％以内の値を指す。
「を含んでいる」という用語は、本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「で少なくとも部分的に構成される」ことを意味する。「を含んでいる」という用語を含む本明細書および特許請求の範囲における記述を解釈する場合、各記述におけるこの用語の後にくる特徴以外の他の特徴もまた存在することができる。「を含む」および「を含んだ」などの関連用語は、同様に解釈するべきである。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、「治療有効量」という用語は、対象に対する療法の投与の状況において、状態の重篤性、持続期間、または１つもしくは複数のその症状を低減または改善するのに、状態の進行を予防するのに、状態の退行を引き起こすのに、状態の再発、発達または発症を予防するのに、あるいは別の療法の予防的もしくは治療的効果を増強または改良するのに十分な量を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、「管理する」、「管理している」および「管理」という用語は、対象に対する療法の投与の状況において、状態の治癒をもたらさないが、対象が療法から得る有益な効果を指す。例えば、状態の管理は、状態の悪化を予防することを含む。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「予防する」、「予防している」および「予防」という用語は、対象に対する療法の投与の状況において、療法の投与に起因する状態の再発、発症もしくは発達の予防または阻害を指す。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、「治療する」、「治療」および「治療している」という用語は、対象に対する療法の投与の状況において、療法の投与に起因する、状態の進行、重篤性および／もしくは持続期間の低減もしくは改善、または１つもしくは複数のその症状の改善を指す。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、「水溶性」という用語は、材料に適用する場合、その材料が、少なくとも４５％（ｗ／ｖ）溶解度を有することを意味する。
本明細書において、特許明細書、他の外部文書または他の情報源について言及している場合、これは概して、本発明の特徴を考察するための状況を提供する目的のためである。具体的に別記されない限り、かかる外部文書に関する言及は、かかる文書またはかかる情報源が、いかなる権限においても、従来技術であるか、または当該技術分野における一般常識の一部を成すことを認めると解釈されるべきではない。
【００３０】
本明細書中の記載では、本出願の特許請求の範囲の範囲内ではない主題について言及されてもよい。その主題は、当業者によって容易に特定可能であるはずであり、本出願の特許請求の範囲で規定される本発明を実施するのを補助し得る。
５．２  本発明の水溶性パウア抽出物を生成する方法
本発明の水溶性パウア抽出物は、以下に記載するように、従来の加工処理技法を使用して容易に調製される。
【００３１】
本発明は、水溶性パウア抽出物を生成する方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質分解酵素を使用して、パウア材料の水性懸濁液を加水分解するステップと、
（ｂ）加水分解混合物中の酵素を変性させるステップと、
（ｃ）不溶性材料を加水分解混合物から除去して、水溶性パウア抽出物をもたらすステップと
を含む方法を提供する。
【００３２】
「パウア」という用語は、本明細書中で使用する場合、米国およびオーストラリアではアワビ（abalone）として、また英国ではアワビ貝（ormer shell）として知られているミミガイ科（family Haliotidae）（アワビ属（genus Haliotis）のみが存在する）の食用の海洋腹足類軟体動物を指す。
【００３３】
一実施形態では、パウア材料は、乾燥パウア粉末（全粉末）である。これは一般的に、新鮮パウアの腸および生殖腺を、通常凍結乾燥によって乾燥させることに、および粉末へと粉砕することによって得られるが、パウア肉を含むことができる。
【００３４】
別の実施形態では、パウア材料は、パウア超臨界残留物（supercritical marc）（残留物粉末）である。「残留物」という用語は一般的に、植物または動物材料などの生物学的材料の抽出後に残存する有機材料を指す。本明細書中で使用する場合、「超臨界残留物」という用語は、超臨界流体抽出後に残存する有機材料を意味する。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「パウア超臨界残留物」という用語は、パウア材料、好ましくは腸および生殖腺の超臨界流体抽出後に残存する有機材料を意味する。
一実施形態では、パウア材料は、パウア超臨界残留物、好ましくはヘリトリアワビ（Haliotis iris）である。
【００３６】
上記方法の第１のステップでは、パウア材料の水性懸濁液を、１つまたは複数のタンパク質分解酵素を用いて加水分解する。
加水分解は、使用する酵素または酵素系用に最適化した条件下で、パウア材料の水性懸濁液をタンパク質分解酵素（複数可）とともにインキュベートすることによって実行する。通常、ｐＨは、約５．５〜約８に調節すべきである。任意選択で、酸化防止剤、例えば、Ｏｘｙｌｅｓｓ  Ｕを水性懸濁液に添加することができる。
【００３７】
水性懸濁液は通常、使用する酵素系に応じて、約３０〜約６５℃へ、１〜２４時間加熱する。概して、パウア材料を、冷水中で懸濁して、混合物を所要温度へ加熱する。しかしながら、パウア材料は、代わりにすでに加熱された水中で懸濁することもできる。
【００３８】
加水分解中、パウア材料中に存在するタンパク質は、低分子量ペプチドへ加水分解される。加水分解は、適切な分子量範囲のペプチドを送達するために、酵素的に実施しなくてはならない。例えば酸による化学的な加水分解は、非選択的である。理論により拘束されないが、本発明の水溶性パウア抽出物の抗炎症特性は、存在する特定の低分子量ペプチド中に存在すると考えられる。これらのペプチドを破壊するか、またはそれらの形成を妨げる加工処理ステップは、抽出物の抗炎症活性を変更させる。
【００３９】
タンパク質分解酵素は、任意の種類、例えば、エンド、エキソプロテアーゼ／ペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ等であり得る。一実施形態では、タンパク質分解酵素はそれぞれ、わずかに酸性からほぼ中性のｐＨ最適値を有する。一実施形態では、タンパク質分解酵素は、非動物酵素である。
【００４０】
適切なタンパク質分解酵素として、パパイン、Ａｌｃａｌａｓｅ（サブチリシン）、Ｅｎｚｉｄａｓｅ  ＦＰ（コウジカビ変種（Aspergillus oryzae var.）の選択株に由来するエンド／エキソペプチダーゼ）およびＥｎｚｉｄａｓｅ  Ｎｅｕｔｒａｌ（バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の非遺伝子修飾株の制御発酵に由来するメタロ中性エンドペプチダーゼ）が挙げられる。
【００４１】
一実施形態では、タンパク質分解酵素は、パパイン、Ｅｎｚｉｄａｓｅ  ＦＰ、Ｅｎｚｉｄａｓｅ  Ｎｅｕｔｒａｌ、Ａｌｃａｌａｓｅ等を含む群から選択される。
別の実施形態では、タンパク質分解酵素は、Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｅｎｚｉｄａｓｅ  ＮｅｕｔｒａｌおよびＥｎｚｉｄａｓｅ  ＦＰを含む。
【００４２】
加水分解中のパウア材料の水性懸濁液の温度は、酵素を分解するか、またはその活性を阻害するほど熱くするべきではない。加水分解の持続期間は、使用する酵素（複数可）の活性およびパウア材料に依存する。
【００４３】
加水分解ステップは、酵素（複数可）とパウア材料との間の接触を最適化するために、攪拌しながら実施する。
加水分解が完了した後、酵素を変性させる。一実施形態では、加水分解混合物を、タンパク質分解酵素（複数可）を変性させるのに十分な条件下で加熱する。一実施形態では、加水分解混合物は、約８０℃〜約９５℃で、約２０〜約４０分間加熱する。
【００４４】
一実施形態では、加水分解されたパウア材料の水性懸濁液は、任意選択で、酵素を変性させる前に脂質を除去するように処理することができる。脂質除去は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えば遠心分離または化学的な抽出などの物理的な技法を使用して達成し得る。
【００４５】
化学的な抽出では、加水分解されたパウア材料の水性懸濁液から水を除去して、次にそれを、脂質画分が可溶性である溶媒と接触させる。続いて、脱脂生成物を水中に再懸濁して、加水分解酵素を変性させる。
【００４６】
別の実施形態では、加水分解されたパウア材料の水性懸濁液を凍結乾燥させて、粉末を形成し、それを有機溶媒ですすいで、脂質を除去する。使用することができる溶媒の例として、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサン、酢酸エチルおよびジメチルホルムアミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
別の実施形態では、加水分解されたパウア材料の水性懸濁液を乾燥させて、ＣＯ２またはＣＯ２／エタノールなどの超臨界溶媒で抽出して、脂質画分を除去する。続いて、脱脂生成物を水中に再懸濁して、加水分解酵素を変性させる。
【００４８】
パウア材料は、脂質をかなり多く含んでいる場合には、任意選択の脱脂ステップを使用してもよい。パウア材料が低脂質含有量を有する場合、脱脂ステップは省略することができる。
【００４９】
加水分解酵素の変性後に、微生物腐敗を防止するために、混合物のｐＨを約３．５〜約４．２、好ましくは約４に調節してもよい。リン酸（phosphorinic acid）、クエン酸または塩酸などの薬剤を使用して、ｐＨを調節することができる。
【００５０】
次に、加水分解混合物中に存在する不溶性材料を除去して、本発明の水溶性パウア抽出物をもたらす。
不溶性材料は、当該技術分野で公知の任意の方法によって除去することができる。一実施形態では、不溶性材料は、加水分解混合物を遠心分離すること、および上清を回収することによって除去する。
【００５１】
概して、ｐＨは、不溶性材料の除去前に調節するが、後者が殻の断片を含有する場合、この不溶性材料は、酸による殻の可溶化を防止するためにまず除去されるべきである。
本発明の水溶性パウア抽出物は、例えば、活性炭との接触により、望ましくない色彩および／または匂いに寄与する不純物を除去するように処理してもよい。炭は、容器中に含有されて、生成物をそれに通すことができる。あるいは、カーボン、残存する微粉および脂質残渣は、珪藻土でコーティングされたフィルタープレスまたは等価物を使用して除去することができる。
【００５２】
水溶性パウア抽出物はまた、存在する水の幾らかまたは全てを除去することによって濃縮してもよい。
一実施形態では、水溶性パウア抽出物を乾燥させて、粉末状抽出物をもたらす。乾燥は、凍結乾燥を含む当該技術分野で公知の任意の技法を使用して実施することができる。
【００５３】
マルトデキストリンおよび酸化防止剤などの作用物質を、本発明の水溶性パウア抽出物に添加してもよい。
実施例１〜実施例３は、本発明の水溶性パウア抽出物を生成する方法について記載する。
５．３  本発明の水溶性パウア抽出物
上述の本発明の方法は、ペプチド、特に低分子量ペプチドに富んでいる水溶性パウア抽出物を生成する。本明細書中で使用する場合、「低分子量ペプチド」という用語は、重量が５ｋＤａまたはそれ未満であるペプチドを意味する。
【００５４】
抽出物は、苦みを伴わない許容される風味を有する。抽出物は、寒冷沈降反応を伴わずに凍結させることができる。パウア抽出物の粉末溶解性の特徴は、乾燥保管時に変化しない。
【００５５】
本発明の水溶性パウア抽出物は主に、ペプチド、特に低分子量ペプチドを含む。実施例１〜実施例３で生成された抽出物の分子量プロファイルからわかるように、抽出物中に存在する９０％を上回るペプチドが、５ｋＤａよりも小さい。
【００５６】
本発明の水溶性パウア抽出物は、本発明の抽出物、ならびにパウア残留物およびパウア全粉末出発材料に関して実行したＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図１３〜図２０からわかるように、加水分解されていないパウア材料よりも多くの化合物を含む。
【００５７】
一実施形態では、水溶性パウア抽出物は、固体を基準として少なくとも約４５重量％のペプチド、好ましくは低分子量ペプチドを含む。
別の実施形態では、水溶性パウア抽出物は、固体を基準として少なくとも約４５重量％〜約６５重量％のペプチド、好ましくは約５０重量％〜約６０重量％のペプチドを含む。
【００５８】
一実施形態では、ペプチドの９０重量％超、好ましくは９５重量％超が、５ｋＤａ未満である。
一実施形態では、ペプチドの７５重量％超、好ましくは８０重量％超が、２ｋＤａ未満である。
【００５９】
一実施形態では、ペプチドの３５重量％超、好ましくは４０重量％超が、１ｋＤａ未満である。
幾つかの炭水化物材料、脂質ならびに他の材料および鉱物もまた、存在し得る。
【００６０】
抽出物のペプチド含有量は、その濃縮によって影響を受けないままであるように、存在する「固体」に基づいて算出される。抽出物中に存在する「固体」は、水を含む存在するあらゆる溶媒が除去される場合に残存する材料を構成する。存在する「固体」として、ペプチド、炭水化物および脂質ならびに任意の他の非溶媒材料が挙げられる。
【００６１】
本発明の抽出物の溶解度は、少なくとも４５％（ｗ／ｖ）である。溶解度は、水を抽出物で飽和させること（比１：１）、遠心分離すること、続いて得られた上清を乾燥させて、溶解した重量を確かめることによって決定することができる。
【００６２】
一実施形態では、本発明の水溶性パウア抽出物は、乾燥粉末である。
抽出物中に存在するペプチドの重量％は、マルトデキストリンおよび酸化防止剤などの抽出物に添加される固体賦形剤を排除して算出される。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、固体を基準として少なくとも約４５重量％のペプチドを含む水溶性パウア抽出物であって、ペプチドの９０重量％超が５ｋＤａ未満である、水溶性イガイ抽出物を提供する。
【００６４】
別の実施形態では、本発明は、固体を基準として約５０重量％〜約６０重量％のペプチドを含む水溶性パウア抽出物であって、ペプチドの９５重量％超が５ｋＤａ未満である、水溶性イガイ抽出物を提供する。
５．４  本発明の水溶性ペプチド抽出物の使用
炎症は、生物体の生理学を変更させる分子および細胞シグナルの複雑な生物学的カスケードを含むプロセスである。急性炎症が、身体的傷害または感染後に身体を保護し癒す一方で、慢性炎症は、多くの変性疾患において重要な役割を果たす変化をもたらす。慢性炎症は主として、単球および長命のマクロファージによって媒介される。マクロファージは、ＩＬ−１、ＩＬ−６ファミリー、ＴＮＦαおよびプロスタグランジンを含む化学的媒介物質を放出する。これらの媒介物質は、他の炎症誘発性サイトカインのアップレギュレーションを誘発する。ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαは、静止細胞よりも炎症細胞において、より高レベルで見出される主要な炎症性バイオマーカーである。
【００６５】
細菌または外来粒子の貪食は、呼吸性バーストと呼ばれる好中球による酸素の取込みの増加と関連付けられる。この期間中、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシド陰イオン、一重項酸素および過酸化水素などの活性酸素種（ＲＯＳ）が生成される。これらの種は、侵入している微生物および寄生虫を死滅させる。
【００６６】
栄養補助食品は、ＩＬ−１およびＴＮＦαなどの炎症誘発性サイトカインの発現を阻止すること、ＲＯＳ生成酵素活性を阻害すること、またはＲＯＳ捕捉能を増加させることを含む幾つかのメカニズムを介して、炎症プロセスを阻害または低減することができる。
【００６７】
実施例４に提示するように、本発明の水溶性パウア抽出物は、炎症の公知のマーカーに対して活性であることが見出され、したがって、炎症を低減または予防すると考えられる。表５および表６に示すように、示した活性は、全粉末または残留物などの加水分解されていない出発パウア材料の抗炎症活性よりも数倍高い。
【００６８】
一態様では、本発明は、必要とする対象において炎症を低減させる方法であって、対象に、治療有効量の本発明の水溶性パウア抽出物を投与することを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において炎症と関連する状態を予防、治療または管理する方法であって、対象に、治療有効量の本発明の水溶性パウア抽出物を投与することを含む方法を提供する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、必要とする対象において炎症を低減させるための医薬の製造における本発明の水溶性パウア抽出物の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において炎症と関連する状態を予防、治療または管理するための医薬の製造における本発明の水溶性パウア抽出物の使用を提供する。
【００７０】
本発明はまた、必要とする患者において炎症を低減させることにおける使用のための本発明の水溶性パウア抽出物を提供する。
本発明はまた、必要とする患者において炎症と関連する状態を予防、治療または管理することにおける使用のための本発明の水溶性パウア抽出物を提供する。
【００７１】
一実施形態では、炎症と関連する状態は、慢性状態である。
別の実施形態では、炎症と関連する状態は、炎症性マーカーＴＮＦαおよび／またはＩＬ−１βのレベルを増加させる。
【００７２】
本発明により予防、治療または管理することができる、炎症と関連する状態の例として、喘息、脳炎、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性疾患、線維症、若年性関節炎、乾癬性関節炎、関節リウマチおよび変形性関節症を含む関節炎、乾癬、多発性筋痛、腱炎、滑液包炎、喉頭炎、歯肉炎、胃炎、耳炎、セリアック病、憩室炎、アテローム性動脈硬化症、心臓病、肥満症、糖尿病、癌ならびにアルツハイマー病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明はまた、必要とする対象において、炎症性マーカーＴＮＦαおよび／またはＩＬ−１βのレベルを減少させる方法であって、対象に、治療有効量の本発明の水溶性パウア抽出物を投与することを含む方法を提供する。
【００７４】
炎症と関連する状態の予防、治療または管理を必要とする対象は、かかる状態と診断されたか、かかる状態の危険性があるか、またはかかる状態から回復した対象である。対象は、遺伝的および／または環境的要因のため、状態にかかりやすい可能性があり、および／または状態の危険性があり得る。
【００７５】
一実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施形態では、対象は、ペットまたはウマである。
本発明の水溶性パウア抽出物の投与は、医薬組成物または栄養補助食品組成物を介し得る。
【００７６】
一態様では、本発明は、本発明の水溶性パウア抽出物および１つまたは複数の摂取可能な賦形剤を含む栄養補助食品組成物を提供する。
一実施形態では、本発明の栄養補助食品組成物は、食品組成物、食品添加物組成物、健康補助食品または医療食品組成物である。
【００７７】
「摂取可能な」という用語は、本明細書中で使用する場合、一般的に、動物およびヒトによる摂取に適切であるか、またはそれに関して政府の規制機関により認可されていることを意味する。
【００７８】
「食品」という用語は、本明細書中で使用する場合、加工処理されるか、半加工処理されるか、または未加工の任意の物質を意味し、それは、ヒトを含む動物による摂取を意図し、飲料およびチューインガムを含むが、これらに限定されない。本発明の食品組成物は、食品と組み合わせた本発明の水溶性パウア抽出物を含む。
【００７９】
「食品添加物」という用語は、本明細書中で使用する場合、通常はそれ自体で食品として摂取されず、技術的な目的で食品に添加される任意の物質を指す。例は、天然および人工甘味料、着色料、硬化およびピクリング剤、香味料、乳化剤、脂質代替物、安定剤、膨張剤、潤滑剤、保湿剤、防腐剤、安定化剤および増粘剤である。本発明の食品添加物組成物は、１つまたは複数の食品添加物と組み合わせた本発明の水溶性パウア抽出物を含む。
【００８０】
「健康補助食品」という用語は、本明細書中で使用する場合、下記成分：ビタミン、ミネラル、ハーブ、代謝産物、抽出物等のうちの１つまたは複数を含む、食事を補うことを意図する製品を指す。健康補助食品は通常、食事の単独の品目として使用されることを意図しておらず、任意の食品と無関係に摂取することができる。本発明の健康補助食品は、１つまたは複数の健康補助食品と組み合わせた本発明の水溶性パウア抽出物を含む。
【００８１】
「医療食品」という用語は、本明細書中で使用する場合、医師の監視下で摂取されるか、または経腸投与されるように配合される食品を指す。医療食品は、特徴的な栄養要件を有する状態の食事管理を意図している。医療食品の例として、単一指定栄養食品、経口補水液および代謝障害の食事管理における使用を意図する製品が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医療食品組成物は、医療食品と組み合わせた本発明の水溶性パウア抽出物を含む。
【００８２】
一実施形態では、本発明の栄養補助食品組成物は、食品組成物である。本発明の水溶性抽出物は、許容される匂いと風味がするので、食品用途での使用に適しており、したがって食品に直接添加することができる。他のパウア生成物とは異なり、それは、カプセル化する必要がない。
【００８３】
一実施形態では、食品組成物は、パン、ピザ生地、ケーキ、マフィン、ドーナッツ、ビスケット、トルティーヤ、ラップ、ナン、麺およびパスタを含むが、これらに限定されないベーカリー製品である。
【００８４】
別の実施形態では、食品組成物は、牛乳、フルーツジュース、スムージー、ヨーグルト、スープおよびソフトドリンクを含む液体食品である。本発明の水溶性パウア抽出物はまた、インスタントスープ、飲料、プディングおよびケーキミックスなどの乾燥ミックスに添加することができる。
【００８５】
一態様では、本発明は、本発明の水溶性パウア抽出物および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書中で使用する場合、動物、特にヒトにおける使用に関して政府の規制機関により認可されていることを意味する。
【００８６】
「賦形剤」という用語は、本明細書中で使用する場合、本発明の水溶性パウア抽出物が、ともに保管、輸送または投与されるビヒクル、担体、希釈剤、補助剤、安定化剤または充填剤を含む。適切な賦形剤は、薬学の当業者に周知であり、デンプン（およびマルトデキストリンなどのその誘導体）、グルコース、ショ糖、小麦粉、シリカゲル、グリセロール、塩化ナトリウム、水、アスコルビン酸およびエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。特定の賦形剤が、本発明の医薬組成物への組込みに適しているかどうかは、剤形を投与する方式に依存するであろう。
【００８７】
本発明の医薬組成物は、非経口、経口、鼻腔内、局所、経皮、経粘膜および直腸を含むが、これらに限定されない任意の適切な経路によって投与することができる。
剤形の組成および形状は通常、用法に応じて様々である。剤形の例として、錠剤、カプセル剤、丸剤、ペレット剤、液体を含有するカプセル剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、分散剤、坐剤、点鼻薬（ｎａｓａｌ  ｓｐｒａｙｓ）または吸入剤、ゲル剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤およびエリキシル剤が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８８】
一実施形態では、本発明は、経口投与剤形の本発明の水溶性パウア抽出物を提供する。それらの投与の容易さのため、栄養補助食品組成物としても、医薬組成物としても、経口投与剤形が好ましい。典型的な経口投与剤形は、本発明の乾燥水溶性パウア抽出物を、固体経口投与剤形における使用に適した少なくとも１つの賦形剤と組み合わせることによって調製される。続いて、生成物は、望ましい剤形に成形される。
【００８９】
かかる賦形剤として、希釈剤、造粒剤、湿潤剤、懸濁化剤、充填剤、潤滑剤、結合剤および崩壊剤が挙げられるが、これらに限定されない。結合剤の例として、コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたは他のデンプン、ゼラチン、アラビアおよびグァーなどのゴム、アルギン酸ナトリウム、粉末状トラガカント、セルロースならびにカルボキシメチルセルロース、予めゼラチン化させたセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよび微結晶性セルロースを含むその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。充填剤の例として、タルク、炭酸カルシウム顆粒または粉末、微結晶性セルロース、粉末状セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ソルビトールおよびデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。崩壊剤は、水性環境に曝露されると、確実に錠剤を崩壊させる。例として、寒天、炭酸カルシウム、アルギン酸、クロスカルメロースナトリウム、微結晶性セルロース、予めゼラチン化させたデンプン、クレイおよびゴムが挙げられるが、これらに限定されない。潤滑剤として、ステアリン酸カルシウム、軽油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、硬化植物油および寒天が挙げられるが、これらに限定されない。湿潤剤として、レシチンおよびステアリン酸ポリオキシエチレンが挙げられるが、これらに限定されない。懸濁化剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロースおよびアルギン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
錠剤は、圧縮または成形によって調製することができる。本発明の経口用の剤形はまた、チューイング錠剤、硬質ゼラチンカプセル剤または軟質ゼラチンカプセル剤を含む。経口投与用の液体調製物は、液剤、シロップ剤または懸濁液を含むが、これらに限定されず、使用前の水または別の適切なビヒクルによる再構成用の乾燥製品として提供されてもよい。
【００９１】
炎症と関連する状態の予防、治療または管理において有効である本発明の水溶性パウア抽出物の量は、疾患または状態の性質および重篤性、および抽出物が投与されるべき経路、ならびに対象の年齢、体重、性別および既往歴などの対象に特異的な要因により様々である。
【００９２】
概して、炎症と関連する状態の急性治療で使用される剤形は、慢性状態の治療で使用されるよりも大量の水溶性パウア抽出物を含む。同様に、非経口投与剤形は、経口投与剤形よりも少ない水溶性パウア抽出物を含有し得る。特定の剤形の配合は、薬学の当業者によって容易に理解される。本発明者らは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌｌｅｎ等、第２２版．ＩＳＢＮ  ９７８−０−８５７１１−０６２−６を参照している。
【００９３】
当業者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験から得られる用量応答曲線から有効量を予測することができる。概して、本発明の水溶性パウア抽出物の有効量は、１日を通して、１日１回用量としてまたは分割用量として、１日当たり約１００ｍｇ〜約３０００ｍｇである。
【００９４】
これより、本発明の様々な態様を、下記の実施例を参照して非限定的に説明する。
【実施例】
【００９５】
６．実施例
６．１  材料および方法
Ｏｘｙｌｅｓｓ  Ｕは、Ｎａｔｕｒｅｘ（アヴィニョン、フランス）から調達した。マルトデキストリン（Ｍａｌｔｒｉｎ  １００または１５０）は、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔａｒｃｈ（オークランド、ＮＺ）製であった。Ｃｅｌｉｔｅ  ＨｙＦｌｏおよびＣｅｌｉｔｅ  ５４５は、Ｉｍｅｒｙｓ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ  Ｉｎｃ．（サンノゼ、カリフォルニア、米国）製であった。Ｅｎｚｉｄａｓｅパパイン６０００Ｌ、Ｅｎｚｉｄａｓｅ  ＦＰおよびＥｎｚｉｄａｓｅ  Ｎｅｕｔｒａｌは、Ｚｙｍｕｓ（オークランド、ＮＺ）製であった。Ａｌｃａｌａｓｅは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（バウスベア、デンマーク）製であった。
【００９６】
他の化学物質および試薬は全て、標準的な研究室供給品であった。
サイズ排除ＨＰＬＣ設定
カラム：Ｙａｒｒａ（商標）３μｍ  ＳＥＣ−２０００（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。
試料調製：
１．リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８  １００ｍＬ中に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で凍結乾燥させた抽出物試料を溶解させる。
【００９７】
２．リン酸緩衝液中の試料４部および１０％ＳＤＳ１部の比で、溶液を希釈して、最終濃度２％ＳＤＳを得る。
３．５０℃で５分間加熱する。
【００９８】
４．１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
５．バイアルへ上清を充填して、ＨＰＬＣを行う。
ペプチドのＳＥ−ＨＰＬＣに対する操作条件：
【００９９】
【表１】
2018513211.tif 000002
【０１００】
６．２  本発明の水溶性抽出物を生成するためのパウアの抽出
様々なパウア（Ｈ．ｉｒｉｓ）供給源を、以下に提供する実施例に従って加工処理した。プロセスおよび試料コードを以下の表１に概要する。
【０１０１】
【表２】
2018513211.tif 000003
【０１０２】
実施例１：パウア超臨界残留物の抽出（ＰＡＲ３９）
凍結乾燥させたパウアの超臨界ＣＯ２抽出から生じる残留物（１６０ｇ）を、水６００ｍｌ中に懸濁した。Ｏｘｙｌｅｓｓ  Ｕ酸化防止剤（０．２５ｇ）を添加した。Ａｌｃａｌａｓｅ（２．５ｍｌ）およびＥｎｚｉｄａｓｅ  Ｎｅｕｔｒａｌ（２．５ｍｌ）を添加して、混合物を振とう水浴中で３時間、６０℃に加熱した。次に、Ｅｎｚｉｄａｓｅ  ＦＰ（０．１２５ｇ）を添加して、振とう水浴中で６０℃にて、さらに１時間、加水分解を続けた。
【０１０３】
加水分解混合物を、９５℃でさらに３０分間加熱して、続いて１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清（５００ｍｌ）を回収した。リン酸を用いて、上清のｐＨをｐＨ４に調節した。活性炭を添加した（２ｇ）。上清を、珪藻土を使用したＳｅｉｔｚ  ９００フィルターボード（プレコート２０ｇ＋ボディーフィード２０ｇ）に通して濾過した。濾液を回収して（４５０ｍｌ）、マルトデキストリンおよびＯｘｙｌｅｓｓ  Ｕ酸化防止剤と混合した。得られた溶液を凍結乾燥させて、固体生成物（パウア残留物抽出物）を得た。
【０１０４】
パウア残留物抽出物は、完全に水溶性であった。パウア残留物中に存在する固体の４２％を回収した。生成物の分子量プロファイルを以下の表２に示す。
【０１０５】
【表３】
2018513211.tif 000004
【０１０６】
実施例２：パウア全粉末の抽出（ＰＡＲ３６）
凍結乾燥させた粉末状パウア腸材料（１６０ｇ）を、水６００ｍｌ中に懸濁した。Ｏｘｙｌｅｓｓ  Ｕ酸化防止剤（０．２５ｇ）を添加して、ｐＨを５．５〜８．０に調節した。Ａｌｃａｌａｓｅ（２．５ｍｌ）およびＥｎｚｉｄａｓｅ  Ｎｅｕｔｒａｌ（２．５ｍｌ）を添加して、混合物を振とう水浴中で３時間、６０℃に加熱した。次に、Ｅｎｚｉｄａｓｅ  ＦＰ（０．１２５ｇ）を添加して、振とう水浴中で６０℃にて、さらに１時間、加水分解を続けた。
【０１０７】
加水分解混合物を、９５℃でさらに４０分間加熱して、続いて１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清（５０５ｍｌ）を回収した。リン酸を用いて、上清のｐＨをｐＨ４に調節した。活性炭を添加した（２ｇ）。上清を、珪藻土を使用したＳｅｉｔｚ  ９００フィルターボード（プレコート２０ｇ＋ボディーフィード２０ｇ）に通して濾過した。濾液を回収して（４３５ｍｌ）、マルトデキストリンおよびＯｘｙｌｅｓｓ  Ｕ酸化防止剤と混合した。得られた溶液を凍結乾燥させて、固体生成物（パウア全粉末の抽出物）を得た。
【０１０８】
ＧＳＭ全粉末の抽出物は、完全に水溶性であった。パウア原料中に存在する固体の４１％を回収した。生成物の分子量プロファイルを以下の表３に示す。
【０１０９】
【表４】
2018513211.tif 000005
【０１１０】
実施例３：パウア超臨界残留物の抽出（パイロット規模）ＰＡＲ４４
パウアの超臨界ＣＯ２抽出から生じる残留物（１０．０ｋｇ）を、水１５０Ｌ中に懸濁した。Ｏｘｙｌｅｓｓ  Ｕ酸化防止剤（１６ｇ）を添加して、ｐＨを５．６〜８．０に調節した。Ａｌｃａｌａｓｅ（１４８ｍｌ）およびＥｎｚｉｄａｓｅ  Ｎｅｕｔｒａｌ（１６０ｍｌ）を添加して、混合物を振とう水浴中で３時間、５９℃に加熱した。次に、Ｅｎｚｉｄａｓｅ  ＦＰ（３２ｇ）を添加して、振とう水浴中で６０℃にて、さらに１時間、加水分解を続けた。
【０１１１】
加水分解混合物を、８０℃でさらに２０分間加熱して、続いて液体−スラッジ分離器に通して遠心分離した（２回）後、上清（１３５Ｌ）を回収した。リン酸を用いて、上清のｐＨをｐＨ４に調節した。活性炭を添加した（６０ｇ）。上清を、珪藻土を使用したＳｅｉｔｚ  ９００フィルターボード（プレコート９４０ｇ＋ボディーフィード１０７０ｇ）に通して濾過した。濾液を回収して（１４４Ｌ）、溶解するまでマルトデキストリン（１．６ｋｇ）およびＯｘｙｌｅｓｓ  Ｕ酸化防止剤（１６ｇ）と混合した。得られた溶液を凍結乾燥させて、固体生成物（パウア残留物抽出物）６．３ｋｇを得た。
【０１１２】
パウア残留物抽出物は、完全に水溶性であった。パウア材料中に存在する固体の６６％を回収した。生成物の分子量プロファイルを以下の表４に示す。
【０１１３】
【表５】
2018513211.tif 000006
【０１１４】
ＰＡＲ４４の近似組成が得られた。試料を、１０３℃で１６時間乾燥させた（重量測定）。ＡＯＡＣ  ９４５．１５、第１９版。灰分は、マッフル炉６００℃、６時間における着火によって決定した（重量測定）。ＡＯＡＣ  ９４２．０５、第１９版。総窒素は、デュマ燃焼を使用して決定した。ＡＯＡＣ  ９９２．１５、第１９版。総タンパク質は、総窒素×６．２５に基づいて算出した。ＡＯＡＣ  ９９２．１５、第１９版。総タンパク質の値はまた、６．７５のファクターに基づいても与えられる（これは、かなりの水が、ペプチド結合に付加されている高度に加水分解されたタンパク質により適している）。脂質は、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．、＆Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（１９５９年）、「Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３７巻（８）、９１１〜９１７頁の方法を使用して決定した。
【０１１５】
結果を以下の表５に示す。
【０１１６】
【表６】
2018513211.tif 000007
【０１１７】
値は、いかなる添加物も含まない凍結乾燥させた材料のｇ／１００ｇである。
６．３  本発明の水溶性パウア抽出物の抗炎症活性
実施例４：単球ＴＨＰ−１細胞におけるＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激ＩＬ−１βおよびＴＮＦα分泌の阻害
ＩＬ−１βおよびＴＮＦαは、炎症性応答の重要な媒介物質である。それらは、侵入している微生物および外傷に対する身体の自然防御を調節する事象のカスケードを開始させる。正常な条件下では、これらの炎症誘発性サイトカインは、局在性であり、短命である。しかしながら、慢性炎症性条件下では、それらの発現は延長され、ある特定の状況では、身体全体にわたって広がる。これが、炎症誘発性応答を永続させて、免疫細胞の異常な漸増および活性化の基礎となる。
【０１１８】
したがって、慢性炎症性状態においてＩＬ−１βおよびＴＮＦα発現および生物学的活性を制限することにより、慢性炎症が抑制される。さらに、様々な免疫細胞が、慢性炎症中にＩＬ−１βおよびＴＮＦαを発現することが知られている。しかしながら、それらの発現に関する誘因は、非常に多様であり、それらは、侵入している微生物に対する異常な免疫細胞シグナル伝達の結果である。
【０１１９】
自然防御系の一部として、ヒトは、異物を認識して、適切な細胞防御プロセスを誘発するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）として公知の群を含む複雑な細胞表面マーカーを発達させてきた。
【０１２０】
単球免疫細胞においてＴＬＲ４を活性化する細菌リガンドを、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαの発現をアップレギュレートするのに利用して、慢性炎症性状態においてこれらの炎症誘発性サイトカインの発現を抑制する際のパウア抽出物の効率を探究した。
方法：１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含有するＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所）培地中で増殖させた単球細胞株ＴＨＰ−１（２×１０６個の細胞／ｍＬ）を、哺乳動物細胞培養条件下で、ＴＬＲ４−リポ多糖［ＬＰＳ］（０．５〜５０ｎｇ／ｍＬ）ともに６時間インキュベートした。上清を収集して、市販のＥＬＩＳＡを使用して、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα生成に関して測定した。最適用量のＴＬＲ４（最大生理活性のおよそ７０％）を使用して、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα分泌に対するパウア抽出物の効果を調べた。公知の免疫抑制剤であるデキサメタゾン（０．００１〜１０μＭまたは０〜３．９２５μｇ／ｍＬ）を使用して、このバイオアッセイを確証した。
【０１２１】
慢性炎症性シナリオにおいてＩＬ−１βおよびＴＮＦαの発現を減弱させる際のパウア抽出物の有効性を評価した。ＴＨＰ−１細胞を最初に、最適用量のＴＬＲ４で３０分間刺激して、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα発現のアップレギュレーションを誘起した。次に、パウア抽出物（通常、１〜１００μｇ／ｍＬ）を添加して、細胞とともにさらに６時間インキュベートした。続いて、培養培地を収集して（細胞を遠沈させることによって）、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１βおよびＴＮＦα分泌に関して測定した。データは、サイトカインｐｇ／ｍＬとして算出し、ＴＬＲ４刺激ＩＬ−１βまたはＴＮＦα分泌の阻害パーセントとして提示した。
【０１２２】
結果を図１〜図８に示す。試験した水溶性パウア抽出物は全て、抗炎症活性を示した。
図９〜図１２は、上述のアッセイにおける加水分解されていないパウア材料の効果を示す。
【０１２３】
以下の表５は、アッセイにおいて１００μｇ／ｍＬで適用した場合の、ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞中におけるＩＬ−１βの阻害に対する様々なパウア生成物の効果を示す。凍結乾燥させた生成物は、アッセイへの添加に先立って、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれか中に再懸濁した。
【０１２４】
各列では、値１を割り当てた可溶性抽出物の効果（最も高い阻害）と比較して、結果を表している。
【０１２５】
【表７】
2018513211.tif 000008
【０１２６】
以下の表６は、アッセイにおいて１００μｇ／ｍＬで適用した場合の、ＴＬＲ４（ＬＰＳ）刺激単球ＴＨＰ−１細胞中におけるＴＮＦαの阻害に対する様々なパウア生成物の効果を示す。凍結乾燥させた生成物は、アッセイへの添加に先立って、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれか中に再懸濁した。
【０１２７】
各列では、値１を割り当てた可溶性抽出物の効果（最も高い阻害）と比較して、結果を表している。
【０１２８】
【表８】
2018513211.tif 000009
【０１２９】
実施例５：パウア残留物、全粉末および本発明の水溶性抽出物のＬＣ−ＭＳ分析
方法
各試料を割り当て、ボルテックスを用いて０．５％ギ酸水溶液中で混合して、極性構成成分を溶解させたが、以下の表７に示すように、幾つかの試料は、幾らか溶解されていない固体を維持した。
【０１３０】
【表９】
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【０１３１】
ＬＣ−ＭＳシステムは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（サンノゼ、ＣＡ、米国）のＦｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＭＳポンプ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ａｃｃｅｌａ  Ｏｐｅｎオートサンプラー（ＤＬＷを伴うＰＡＬ  ＨＴＣ−ｘｔ）、検出器を加えたＦｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＰＤＡ、およびＴｈｅｒｍａＳｐｈｅｒｅ  ＴＳ−１３０カラムヒーター（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トーランス、ＣＡ、米国）で構成されていた。
【０１３２】
各調製抽出物の２μＬ分取量を、流速２００μｌ／分で３０℃にて維持した水性順相クロマトグラフィー（Ｃｏｇｅｎｔ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ−Ｈｙｄｒｉｄｅ（商標）、４μｍ、１００Å、１５０×２．１ｍｍ、ＭｉｃｒｏＳｏｌｖ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）によって、水中の０．１％ギ酸（Ａ）およびアセトニトリル中の０．１％ギ酸（Ｂ）で構成される移動相を用いて分離させた。勾配を適用した：０〜２分、５％Ａ；３０〜３９．５分、９０％Ａ；４０〜４５分、５％Ａ。
【０１３３】
データは、前駆物質質量に対し負および正のモードでのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用い、ＭＳに対するプロダクトイオンの範囲ｍ／ｚ１００〜２０００ａｍｕで、ＡＰＩ−ＭＳ（ＬＴＱ、２Ｄ線形イオントラップ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ、サンノゼ、ＣＡ、米国）によって獲得した。
【０１３４】
結果を図１３〜図２０に示す。本発明の水溶性抽出物のＬＳ−ＭＳクロマトグラム（図１３、図１４、図１７および図１８）は、出発パウア材料のＬＣ−ＭＳクロマトグラム（図１５、図１６、図１９および図２０）で見られるよりも多くのピークを伴うより複雑な組成を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
７．産業上の利用可能性
本発明の水溶性パウア抽出物およびそれらを含む組成物は、健康効果を高めるために食品または健康補助食品に添加することができる。それらの水溶性および許容される風味により、それらを広範囲にわたる摂取可能な製品に直接取り込ませることが可能となる。製品は、錠剤、カプセル剤、飲料健康「ショット」、プレミックススープトニックの形態で、および機能性食品、例えばおいしい健康食品バーの構成成分として存在する可能性が高い。
【０１３６】
それらはまた、炎症と関連する状態を予防、治療または管理するのを助けるための医薬品としても使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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