(57)【要約】本発明は、免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｔｂ感染症の存在のｉｎ  ｖｉｖｏ判定および免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者である個人におけるＭｔｂ感染症の存在を安定的に評価するための皮膚検査の診断試薬（皮膚検査試薬）の調製へのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の使用を開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬がＥＳＡＴ６およびＣＦＰ−１０の２つの抗原のカクテルを含む免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）感染症の存在のｉｎ  ｖｉｖｏ診断のためのＭｔｂ抗原を含む組成物。
【請求項２】
例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来の適切な有機体中で前記２つの抗原をクローン化、産生および精製した請求項１に記載の免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症の存在のｉｎ  ｖｉｖｏ診断のためのＭｔｂ抗原を含む組成物。
【請求項３】
前記試薬が前記２つの抗原ｒｄＥＳＡＴ６およびｒＣＦＰ−１０のカクテルを含む請求項１〜２のいずれか一項に記載の免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症の存在のｉｎ  ｖｉｖｏ診断のためのＭｔｂ抗原を含む組成物。
【請求項４】
前記抗原が媒体中で混合される請求項３に記載の免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）感染症の存在のｉｎ  ｖｉｖｏ診断のためのＭｔｂ抗原を含む組成物。
【請求項５】
ｒｄＥＳＡＴ−６およびｒＣＦＰ１０を重量比１：１で混合する請求項４に記載の免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症の存在のｉｎ  ｖｉｖｏ診断のためのＭｔｂ抗原を含む組成物。
【請求項６】
前記抗原の量が各抗原について０．２５〜２．０μｇ／ｍＬである請求項５に記載の免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症の存在のｉｎ  ｖｉｖｏ診断のためのＭｔｂ抗原を含む組成物。
【請求項７】
前記媒体が０．０１％のポリソルベート２０および０．５％のフェノールを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む請求項４〜６のいずれか一項に記載の免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症の存在のｉｎ  ｖｉｖｏ診断のためのＭｔｂ抗原を含む組成物。
【請求項８】
前記２つの抗原ＥＳＡＴ６およびＣＦＰ−１０のカクテルを少量皮内注射することによる免疫細胞の刺激に対する反応で生じる皮膚の反応の大きさを測定することによって免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）感染症を診断する方法。
【請求項９】
前記カクテルがＣ−Ｔｂを含む請求項８に記載の免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｔｂ感染症を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＨＩＶの重感染者におけるＴＢ診断性能が改善された特定の皮膚検査組成物を調製するためのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の使用に関する。本発明は、免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）感染症のｉｎ  ｖｉｖｏ診断のためのＭｔｂ抗原を含む組成物を提供するものであり、ここでこの試薬はＥＳＡＴ６とＣＦＰ−１０の２つの抗原のカクテルを含む。
【背景技術】
【０００２】
ＴＢ／ＰＰＤの概説
１９０８年のロベルト・コッホによる発見以来、ツベルクリン精製タンパク質誘導物（ＰＰＤ）は、潜在性Ｍｔｂ感染症の診断検査として用いられてきた。
【０００３】
潜在性Ｍｔｂ感染症の診断検査を予防的治療の指針とすることは、後のＴＢ疾患の発生に劇的な効果を有する。Ｍｔｂ感染者は症状がなくより軽度の治療を必要とする一方で、活動性ＴＢ疾患を有する患者は疾患が重度で死亡率が高く、より長期かつ複雑な治療を必要とする。世界の人口の１／３がＭｔｂに感染しており、毎年８００万人が活動性ＴＢを発症し、そのうち１３０万人が死亡すると考えられる。
【０００４】
診断検査として適用される場合、０．１ｍＬという少量のＰＰＤを皮膚の上層に注射して２〜３日後に、簡易の定規を用いて皮膚の硬結部を測定することによって陽性反応を判定することができる。ＰＰＤの皮膚反応の免疫学的背景は、ＩＶ型遅延型過敏反応、すなわち主としてＰＰＤ特異性のＴｈ１Ｔ細胞によってもたらされる反応である。
【０００５】
メンデルおよびマントゥーによって述べられている通りに適用される場合のＰＰＤは１９５５年以降世界保健機構によって承認されており、ＰＰＤベースのツベルクリン皮膚検査（ＴＳＴ）は依然として最も広く用いられている診断検査の一つであり毎年５０００万回を超える検査が実施されている。
【０００６】
ＰＰＤは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の複合培養物の濾液で、脂質および炭水化物に加え１０００を超えるタンパク質抗原を含む。このためＰＰＤはＭｔｂ感染者によって広く認識され、また極めて免疫原性的であり、皮膚における強いＴｈ１Ｔ細胞の反応を促進する。しかし、ＰＰＤの自然のままの複雑な組成はＰＰＤ  ＴＳＴに伴う問題の原因でもある。重要なことに、ＰＰＤ中の多数の抗原は、ＩＶ型反応の発生を選択的に阻害することができる制御性Ｔ細胞、ＣＤ１拘束性Ｔ細胞およびＴｈ２細胞によっても認識される。さらに、ＰＰＤ中の多数の抗原は、環境マイコバクテリアおよびＴＢに対する予防接種に用いられるカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）によっても発現するため、ＰＰＤ検査が不明確な状態になる。
【０００７】
ＨＩＶ及び免疫不全者
ＰＰＤ  ＴＳＴの使用に対する別の大きな課題は免疫不全者における信頼性の欠如である。特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染者において、ＰＰＤ  ＴＳＴは無反応および偽陰性となることが多いか、もしくはあまりに低いカットオフ値の適用が原因で偽陽性になる場合がある。
【０００８】
ＰＰＤのＩＶ型皮膚反応発生能力に対するＨＩＶの影響についての免疫学的背景は複雑であるが、ＨＩＶ感染によるＣＤ４Ｔ細胞の選択的消失が主原因であることが実証されている。したがって、ＣＤ４Ｔ細胞の消失に起因する免疫不全には、日和見感染ウイルスおよびバクテリアによる疾患をもたらす基礎的因子（ＨＩＶ／ＡＩＤＳの特質）とＰＰＤ  ＴＳＴへの反応不能の両方である。
【０００９】
このジレンマの結果は致命的になり得る。ＨＩＶ感染症（または他の免疫不全症）は、ＰＰＤ  ＴＳＴ検査時に診断されないことが多い。そのため、担当医師がＰＰＤ  ＴＳＴの結果を誤って信頼することがよくある。この誤った安心感から誤診が生じＭｔｂ感染症の適切な治療が施されないことが多く、後の活動性ＴＢ疾患の発症につながる。実際、Ｍｔｂ感染症のＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者には年間１０％のＴＢ発症リスクがあるが、ＴＢは最も多くのＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者を死に至らせる疾患である。
【００１０】
ＢＣＧに対する交差反応性に関する課題への取り組み
上述のようにＢＣＧと環境マイコバクテリアに対する交差反応性はＰＰＤ  ＴＳＴの大きな制約となる。交差反応性は特異性を損ない、偽陽性反応による過剰治療をもたらす可能性がある。この特異性の問題は、ＴＳＴのカットオフ値を５ｍｍから１０ｍｍもしくはさらに１５ｍｍの硬結に大きくすることによってある程度まで対処することができるが完全ではなく、カットオフ値を大きくすると検査の感度が損なわれる。
【００１１】
特に、ＴＢを発症するリスクが最も高いＨＩＶ感染症患者群および他の大きな患者群の場合、Ｍｔｂ感染症に対する治療が適切に提供されなければ、さらなる感度の消失は致命的になりうる。したがって、例えばＢＣＧ接種した場合のＰＰＤ  ＴＳＴ検査前のＨＩＶ検査には、ＰＰＤ  ＴＳＴの最適な実施が必要であると思われる。しかし、限られた資源および医療提供者と患者の双方のタブーが原因で、ＨＩＶ検査はＰＰＤ  ＴＳＴ検査を必要とする人に提供されないか、もしくは受け入れられないことが多い。
【００１２】
特異的検査の時代
Ｍｔｂ特異的免疫優性抗原の発見によってＭｔｂ感染症の診断のための重要な新規手段がもたらされた。初期の研究によって、ＰＰＤ  ＴＳＴをＭｔｂ抗原に対する反応におけるＴ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生を評価する検査で置き換える可能性が示された。同時期に、特異性を著しく改善した高い免疫原性を示す抗原、すなわち初期分泌抗原性標的−６（ＥＳＡＴ−６）および培養濾液タンパク質１０（ＣＦＰ−１０）が発見されたことが大きな進歩であった。これらの抗原は病原体の変異領域１（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  １）（ＲＤ１）内でコード化され、その結果全てのカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン系統およびほとんどの非結核性マイコバクテリア（例外としてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｚｕｌｇａｉなどがある）に存在しない。
【００１３】
ＲＤ１コード化抗原ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０のオーバーラッピングペプチドに対するＩＦＮ−γの反応は、２つの市販されているＩＦＮ−γ遊離試験（ＩＧＲＡ）検査、すなわちクォンティフェロンＴＢゴールド（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）とＴスポット．ＴＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ、オックスフォード、イギリス）におけるＭｔｂ感染症の検出の基礎を形成する。
【００１４】
クォンティフェロン−ＴＢゴールド（ＱＦＴ、ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）、すなわち全血酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、潜在性ＴＢ感染症および疾患の両方の検出について欧州ＣＥマーク承認とアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）承認を得ている。
【００１５】
Ｔスポット．ＴＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ、オックスフォード、イギリス）、すなわち末梢血単核細胞を用いる酵素結合免疫スポット検定法（ＥＬＩＳＰＯＴ）は、欧州ＣＥマーク承認とＦＤＡ承認を得ている。
【００１６】
ＩＧＲＡの限界
しかし、ＩＧＲＡは特異性がＴＳＴと比較して明らかに優れているにも関わらず、ＩＧＲＡにはいくつか限界がある。
【００１７】
血液試料に基づくＩＧＲＡ検査は採血、複雑な実験装置およびそれを操作する熟練したスタッフを必要とする。これらの制約のため、この検査はそのような検査の要望が最も高い資源の制約がある状況において実施することがほとんど不可能である。ＩＧＲＡ検査にはさらに、例えばインキュベーション段階の開始の遅延が原因の偽陰性反応など、事前分析段階の問題もある。
【００１８】
ＰＰＤ  ＴＳＴに関して、ＩＧＲＡ検査の診断を実行するには、被験者が信頼できる免疫反応を呈することができることが必要である。ＰＰＤ  ＴＳＴの場合と同様、ＩＧＲＡの感度は免疫抑制者では損なわれる場合がある。特に、ＨＩＶ感染症でＣＤ４Ｔ細胞数が低い患者もしくは免疫抑制薬物療法を受けている患者は、しばしば偽陰性もしくは不確定の反応を示す。
【００１９】
免疫抑制者においてＩＧＲＡ検査の性能が不良となる根本原因は恐らく、陽性と考えられる非常に弱いＩＦＮ−γの信号（２００，０００ＰＢＭＣ当たり１７．５ｐｇ／ｍＬまたは６個の反応性Ｔ細胞）の検出に依存していることである。そのような低い反応は臨床医学で用いられる最も高感度の検定法の検出レベルに近い。
【００２０】
したがって、体内で潜在的に利用されるあらゆる特異的Ｔ細胞によって免疫反応を促進することができる皮膚検査は本質的に、Ｔ細胞の利用可能な数が試料に含まれる少数の細胞に制限されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの診断検査と比較してはるかに安定であるように思われる。
【００２１】
Ｃａｔｔａｍａｎｃｈｉら（ＪＡＩＤＳ  ２０１１，  ５６（３）  ２３０−２３８）はメタ分析において、活動性ＴＢを有するＨＩＶ感染者（ＬＴＢＩについての代わりの参照標準）の場合、プールされた感度の推定値は不均一であったが、低所得から中所得の国においてはＱＦＴ検定法（６１％；９５％ＣＩ、４７〜７５％）よりＴスポット．ＴＢ検定法（７２％；９５％ＣＩ、６２〜８１％）の方が高かった。しかし、いずれのＩＧＲＡも直接比較した場合一貫してＰＰＤ  ＴＳＴより感度が低かった。著者らは、ＩＧＲＡへのＨＩＶ誘発性免疫抑制の程度による影響はＰＰＤ  ＴＳＴと比較して小さい場合があると結論したが、結果は地理的背景で異なった。
【００２２】
偽陰性のＰＰＤ  ＴＳＴとＩＧＲＡの結果の生死に関わる可能性がある結果は、Ｓｅｓｔｅｒら（Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２０１４  Ｎｏｖ  １５；１９０（１０）：１１６８−７６．  ｄｏｉ：  １０．１１６４／ｒｃｃｍ．２０１４０５−０９６７ＯＣ．）によって述べられている。この７６８人のＨＩＶ感染症患者から成る大規模前向き研究において、８人のＨＩＶ感染症患者が経過観察中に活動性ＴＢ疾患を発症した。明確なＩＧＲＡ検査の結果が得られた８人の患者のうち５人はスクリーニング時に偽陰性のＩＧＲＡ検査結果を示し、予防的治療は提供されなかった。さらに３人のＨＩＶ感染症患者がＴＢを発症したが、ＩＧＲＡ検査の結果は不確定であった。ＴＢを発症した１１人全員についてＰＰＤ  ＴＳＴを行った。ＨＩＶ最適化カットオフ値５ｍｍを用いた場合、このグループにおいて検査した１１人中４人のみが陽性であった。
【００２３】
ディアスキンテストは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＣＦ−ＥＳＡＴで産生されるＣＦＰ１０−ＥＳＡＴ６の組み換え型融合タンパク質である。このタンパク質は６×ヒスチジン標識化タンパク質として発現し、ロシア連邦のＧｅｎｅｒｉｕｍによって製造されている。用量は０．２μｇ／０．１ｍＬである。あらゆる大きさの硬結がＭｔｂ感染を示すと考えられる。ヒスチジン標識はネオエピトープのリスクを引き起こす。ディアスキンテストは、許容範囲の選択性で作用するが、高い比率（４１４％）で胞状壊死性変化、リンパ管炎、およびリンパ節炎を伴う（Ｋｉｓｅｌｅｖ，ＶＩ；  Ｐｒｏｂｌ．  Ｔｕｂｅｒｋ．  Ｂｏｌｅｚｎ．  Ｌｅｇｋ．  ２００９；  ２：１１−６）。高用量の抗原の反復注射は、さらに有害反応のリスクを促進する偽陽性反応につながり得る感作のリスクを引き起こす場合がある。ディアスキンテストは臨床に用いられる唯一の製品である。いくつかの研究においてＨＩＶ感染者におけるディアスキンテストの性能が調べられており、ディアスキンテストの性能に対するＨＩＶ感染の非常に強い悪影響が見出されている。ＰａｎｋｒａｔｏｖａはＨＩＶ陽性の対象において感度が４２．９％であるのに対してＨＩＶ感染症がない対象では７９．７％であることを見出したが（Ｐａｎｋｒａｔｏｖａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１２，  ｖｏｌ  ４０，  Ｓｕｐｐｌ  ５６／Ｐ４３１）、同様の顕著な結果がＬｉｔｖｉｎｏｖによって報告されており、ＨＩＶ感染者において４３．５％であるのに対しＨＩＶ陰性の場合は８９．７％であった（Ｌｉｔｖｉｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １８５；２０１２：Ａ４７０３）。
【００２４】
要約すると、ＰＰＤ  ＴＳＴは潜在性Ｍｔｂ感染症の魅力的で簡単な検査であるが、ＰＰＤ抗原成分は非特異的でありＨＩＶ感染者におけるＰＰＤ  ＴＳＴ検査の結果は偽陰性であることが多い。ＩＧＲＡ検査は特異的Ｍｔｂ抗原ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０に基づくものであり、ＰＰＤ  ＴＳＴ検査の特異性の問題に対処してきたが、これらの検査は実施および実行が複雑であり、さらにＨＩＶ感染者において偽陰性を呈することが多い。ディアスキンテストは皮膚検査にＩＧＲＡのような特異性を与えるが、ＨＩＶ感染者におけるディアスキンテストの性能は著しく影響を受け、感度はＨＩＶ非感染者と比較してＨＩＶ感染者においては半分まで低下する。したがって、ＰＰＤ  ＴＳＴに対し優れた特異性を有しＨＩＶ感染者における感度が改善されたＭｔｂ感染症の新規な診断皮膚検査が必要とされている。
【発明の概要】
【００２５】
本発明は、免疫不全者もしくはＨＩＶと重感染している個人、その他既存の検査の感度不足によりＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染していると認識されない個人においてＭｔｂを診断するためのｉｎ  ｖｉｖｏ診断法（皮膚検査）および診断薬を開示する。
【００２６】
その効果は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原であるＥＳＡＴ６とＣＦＰ１０のカクテルをこれらの抗原を含むカクテルから構成される皮膚検査薬の調製に用いることで得られる。好適な実施形態において抗原ｒｄＥＳＡＴ−６およびｒＣＦＰ−１０のカクテルが用いられる。Ｃ−Ｔｂ抗原カクテルはＨＩＶ感染者において極めて安定的に作用し、感度はクォンティフェロンの場合４５％低下するのに対して全体としてわずか３３％低下するだけである。他の検査の様式と異なり、Ｃ−ＴｂはＣＤ４＋Ｔ細胞数が１００ＣＤ４＋Ｔ細胞／μｌ未満である最も重症の場合にのみＨＩＶ感染症に影響されるように思われる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症の存在のｉｎ  ｖｉｖｏでの判定に用いるＭｔｂ抗原を含む組成物を開示するものであり、ここでこの薬剤はＥＳＡＴ６とＣＦＰ−１０の２つの抗原のカクテルを含む。
【００２８】
本発明は、免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者である個人におけるＭｔｂ感染症の存在を安定的に評価する皮膚検査用診断薬（皮膚検査薬）の調製へのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの使用を開示する。
【００２９】
本発明はさらに免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者におけるＭｔｂ感染症を診断する方法も開示する。この診断方法は、Ｍｔｂ特異的抗原による特異的免疫細胞の刺激に対する反応で生じる皮膚の反応の大きさを測定することに基づいている。
【００３０】
２つの抗原は、好ましくは適切な有機体、例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、ｒＥＳＡＴ６およびｒＣＦＰ１０、ならびに最も好ましくはダブル−ＥＳＡＴ−６（ｒｄＥＳＡＴ−６；２つのＥＳＡＴ−６分子の融合物）由来の有機体中でクローン化、発酵および精製される。ｒＥＳＡＴ−６およびｒＣＦＰ１０は好ましくは重量比１：１で混合される。組成物は媒体中で混合された２つの抗原を含むが、ここで最も好ましい媒体は０．０１％のポリソルベート２０と０．５％のフェノールを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【００３１】
定義
用語「結核」は、種々の系統のマイコバクテリア、通常Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる臨床状態の結核疾患のことをいう。
【００３２】
用語「潜在性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症」は無症状もしくは潜在性のＭ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症のことをいい、活動性疾患の兆候もしくは症状がないＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫反応の存在によって定義される。
【００３３】
本発明の用語「ＥＳＡＴ−６」はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって産生される６ｋＤａの初期分泌抗原性標的（ｅｓｘＡ）のことをいい、分泌タンパク質であり強力なＴ細胞抗原であるローカスタグＲｖ３８７５である。
【００３４】
本発明の用語「ＣＦＰ１０」は、ＥＳＡＴ−６様タンパク質ｅｓｘＢもしくは分泌抗原性タンパク質ＭＴＳＡ−１０としても知られているＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の１０ｋＤａの分泌抗原もしくは１０ｋＤａの培養物濾液抗原であるＲｖ３８７４のことをいう。
【００３５】
本発明の用語「カクテル」および「抗原カクテル」は、共に媒体または溶液中にある少なくとも２つのタンパク質のことをいう。
【００３６】
用語「免疫欠損」または「免疫抑制」あるいは「免疫不全」は、免疫系の感染症疾患と戦う能力もしくは免疫反応を呈する能力が損なわれているか、もしくは完全に存在しない状態のことをいう。
【００３７】
用語「Ｃ−Ｔｂ」はｒｄＥＳＡＴ−６とｒＣＦＰ−１０の組成物の製剤のことをいう。
【００３８】
用語「ＨＩＶ」はレンチウイルス属のヒト免疫不全ウイルスのことをいい、ＨＩＶ感染症を引き起こし時がたつにつれて後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）につながることがあり得る。
【００３９】
用語「融合タンパク質」は、任意の長さおよび配列のアミノ酸リンカー／スペーサー（複数可）の存在下もしくは非存在下で融合したＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓもしくはその類似物由来のランダムに並んだ２つ以上の免疫原性ポリペプチドと理解される。下流生成におけるタンパク質の凝集を避けるために、融合タンパク質中の全てのシステインをあらゆるアミノ酸によって置き換えることができるが、システインと構造的に高い類似性を有することからセリンが好適な置換基である。
【００４０】
ＨＩＶ感染者における診断感度の驚くべき改善は機序を集約することによって達成されるであろう。例えばリンカーで結合された２つのタンパク質を含むハイブリッド構築物であるディアスキンテストに対して、Ｃ−Ｔｂ皮膚検査試薬は抗原のカクテルから構成される。Ｃ−Ｔｂのカクテル設計から、リンカータンパク質からの干渉が無い良好なエピトープ暴露を含むいくつかの潜在的な利益が得られる。さらに、この皮膚検査の形式からはＩＧＲＡの形式を超える利益が得られる。インキュベーション時間を延長することにより、ＩＧＲＡにおいて監視された場合と同一のエフェクターＴ細胞の集団の動員が可能となるが、さらにより低分化の細胞の集団の動員も可能となる。より広いＴ細胞動員を皮膚検査カクテルの形式と組み合わせると優れた感度が可能となるなり得る。
【００４１】
皮膚検査の診断薬は２つの抗原ＥＳＡＴ−６とＣＦＰ１０を含む。好ましい実施形態において、皮膚検査試薬は２つの抗原の組み換え型から構成される。最も好ましい実施形態において、２つの抗原はダブル−ＥＳＡＴ−６（ｒｄＥＳＡＴ−６；２つのＥＳＡＴ−６分子の融合物）およびｒＣＦＰ−１０である。２つの抗原はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓまたはＥ．ｃｏｌｉ由来の適切な有機体中でクローン化、発酵および精製される。抗原は媒体もしくは薬学的に許容されるキャリア中で混合される。最も好ましい実施形態において、ｒｄＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０は、０．０１％のポリソルベート２０（登録商標）（および０．５％のフェノール）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の媒体中、重量比１：１で混合される。抗原の用量は各抗原について０．２５〜２．０μｇ／ｍＬである。好ましい量は０．１μｇ／０．１ｍＬで、総濃度１μｇ抗原／ｍＬに相当し、各抗原０．５μｇ／ｍＬに相当する。このｒｄＥＳＡＴ−６とｒＣＦＰ−１０の特異的製剤をＣ−Ｔｂと呼ぶ。この試薬はこれらの抗原のみに制約されず、さらにＲｖ３６１５のような他の抗原を含んでもよい。
【００４２】
皮膚検査の実施
皮膚検査は少量のＣ−Ｔｂを皮内注射、例えば前腕の内表面に０．１ｍｌ注射することにより行われる。
【００４３】
注射はニードルベベルが上を向いたツベルクリン用シリンジを用いて行わなければならない。しかし他の皮内注射の手段も使用することができる。正しい位置に注射した場合、Ｃ−Ｔｂ注射によって皮膚に直径６〜１０ｍｍの青白い隆起（膨疹）が生じるはずである。
【００４４】
その皮膚検査の反応は投与後４８〜７２時間に読み取らなければならない。７２時間以内に戻らない患者はもう一度皮膚検査を行うためスケジュールを再調整する必要がある。
【００４５】
皮膚反応の大きさは硬結部をミリメーターで測定することによって検知し得る（触知可能で、隆起し、硬化した領域もしくは腫脹の直径）。硬化した領域の直径は前腕を横切る形で（前腕の長軸に対して垂直に）測定しなければならない。
【００４６】
１０、４、３、２、１ｍｍを含む他のカットオフ値、もしくは０ｍｍより大きいあらゆる反応を用いることも有り得るという事実にもかかわらず、実施例の物質で用いられたような５ｍｍ以上の硬結が好適のカットオフ値である。
【００４７】
Ｃ−Ｔｂの概念は、ポイントオブケア医療もしくは看護スタッフによって引き渡され説明されるＭｔｂ感染者を特定するため、ＩＧＲＡ由来の特異的抗原を用いるよく知られたマントー法を、２〜３日後のＢＣＧ接種およびＨＩＶの状態の読み取り値に関わらず５ｍｍの硬結という単一の普遍的なカットオフ値を用いる特異的皮膚検査に組み合わせることである。
【００４８】
診断
特異的試薬を用いる皮膚検査は免疫抑制者に使用する場合特に有益である。ＨＩＶは、Ｍｔｂ感染症が急速に活動性疾患に進行する可能性がある極めて重要なリスクの状態にある集団を構成する。ＨＩＶ感染者はＣＤ４Ｔ細胞機能不全であり、そのため試薬を用いる皮膚検査は特異的にＴｈ１Ｔ細胞を標的とするが、Ｔｈ２または調節Ｔ細胞も優れていることではない。
【００４９】
Ｃ−Ｔｂの標的集団は、Ｍｔｂに暴露された個人もしくはＴＢの兆候または症候を示し、一旦感染するとＴＢを発症するリスクが高いグループに対する特別な注意を受けている個人を含む。これらのグループは、接触追跡調査中に特定された新規に感染した症例、５歳未満の小児およびＨＩＶ感染者を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明は、ＨＩＶ重感染者におけるＭｔｂ感染症の存在を安定的に評価する皮膚検査試薬を提供する。提示する実施例で明示するように、特異的皮膚検査（Ｃ−Ｔｂ）の実施例はＰＰＤ  ＴＳＴおよびＩＧＲＡのいずれに対しても優れた性能を有する。
【００５１】
ｒｄＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０は媒体中においてある重量比で混合される。好ましい実施形態においてはその比は１：１であるが、１：５、１：４、１：３、１：２、２：１、３：１、４：１、５：１などの他の重量比および１：２０〜２０：１の他の比が有用であると予想されるであろう。
【００５２】
抗原の用量は各抗原について０．２５〜２．０μｇ／ｍＬである。好ましい量は０．１μｇ／０．１ｍＬで、総濃度１μｇ抗原／ｍＬに相当し、各抗原０．５μｇ／ｍＬに相当する。抗原量が増加すると皮膚の硬化反応をより強く促進するが有害もしくは不必要に強い反応のリスクが増加する。臨床状況、遺伝的あるいは民族的体質、免疫抑制の程度または被験集団の他の特性に依存して、抗原の用量はそれぞれの抗原について０．２５〜２０．０μｇ／ｍｌの範囲内で選択することができる。
【００５３】
本発明ではｒｄＥＳＡＴ−６およびｒＣＦＰ−１０の特異的製剤について説明するが、この薬剤はこれらの抗原に限定されるものではなく、さらにｅｓｐＣ（Ｒｖ３６１５）のような他の抗原やＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって発現される他の特異的抗原を含んでもよい。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ群の感染性有機体によって特異的に発現されることが知られているいくつかの抗原がＣ−ＴｂのＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０に適切に追加もしくは置換されることもあり得る。これらの抗原には、ＲＤ１拘束性抗原、ＲＤ１関連抗原および当業者に既知のＲｖ２５６４、Ｒｖ３８６５、Ｒｖ３８７７、Ｒｖ２３４８、Ｒｖ３６１４、Ｒｖ３６１６などのような免疫診断の可能性を有する抗原が含まれる。
【００５４】
Ｃ−Ｔｂ検査の好ましい実施形態では皮内注射が教示される。シリンジと針を用いる注射はいくつかある投与方法の一つに過ぎないということを理解されたい。代わりの方法には、ヒーフガン（ステーニードル）および噴射式注射、粉末および金粒子を用いるプロジェクタイルデリバリー（すなわち、遺伝子銃）、ソリッドマイクロニードルパッチ（金属もしくは溶解性マイクロニードル）、マイクロニードル前処理後のＣ−Ｔｂの局所追加、タトゥーガン、または例えば皮膚剥削術、超音波、エレクトロポレーション、レーザーポレーション、化学的促進剤、及び熱剥離など、送達パッチと組み合わせて皮膚透過性を増加させることを意図する技術などがあるがこれらに限定されない様々な他の方法が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＴＢが疑われるＨＩＶ陰性者５３４人およびＨＩＶ陽性者２７７人についてのＣ−Ｔｂ（黒；カットオフ値５ｍｍ）およびＱＦＴ（白；カットオフ値０．３５ＩＵ／ｍＬ）の陽性率。エラーバーは９５％ＣＩを示す。
【図２】ＣＤ４数によって階層化したＴＢが疑われる２９２人についてのＣ−Ｔｂ（黒）およびＱＦＴ（白）の陽性率。エラーバーは９５％ＣＩを示す。
【実施例】
【００５６】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来の２つの抗原ｒｄＥＳＡＴ−６およびｒＣＦＰ−１０の組み換え型をクローン化、発酵および精製することによって診断薬Ｃ−Ｔｂを調製した。０．０１％のポリソルベート２０（登録商標）（および０．５％のフェノール）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の媒体中、ｒｄＥＳＡＴ−６とｒＣＦＰ−１０の重量比１：１に相当する当モル量のＥＳＡＴ−６とＣＦＰ−１０で抗原を混合した。
【００５７】
Ｃ−Ｔｂ、ＰＰＤおよびクォンティフェロン（登録商標）−ＴＢゴールドインチューブ（ＱＦＴ）という名前のＩＧＲＡの診断能を、Ｍｔｂ感染症が疑われる５歳未満の幼児および小児、ならびにＴＢ疾患が疑われるより年長の小児および成人による第ＩＩＩ相試験で比較した。この被験者１１９０人の試験では２９９人がＨＩＶ陽性、７３０人がＨＩＶ陰性であった。ＱＦＴ検査用の血液は皮膚検査前に採取した。Ｃ−ＴｂおよびＰＰＤは、ランダム化、スプリットボディーデザインで個別の腕に二重盲検で注射した。対を成す結果が利用できるボランティアの結果を含めた。
【００５８】
図１から明らかなように、Ｃ−ＴｂとＱＦＴはＨＩＶ陰性者においてほぼ同一の陽性率を示し、Ｃ−Ｔｂでは５３４人中２９２人（５４．７％）が陽性、ＱＦＴでは５３４人中２８５人（５３．４％）が陽性であった。総数２７７人のＨＩＶ感染者の検査を両方の検査法を用いて行った。驚くことに、Ｃ−Ｔｂの方がＱＦＴ検査より有意にＭｔｂ感染者が多いことが明らかで、Ｃ−Ｔｂでは２７７人中１０２人（３６．８％）が陽性であるのに対しＱＦＴでは２７７人中わずか８０人（２８．９％）であった（表１、マクネマー検定；Ｐ＝０．００９）。
【表１】
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【００５９】
ＣＤ４Ｔ細胞数による残りの結果を階層化すると（図２）、Ｃ−Ｔｂによる高い感度は低いＣＤ４Ｔ細胞の層だけでなくＣＤ４Ｔ細胞数の全スペクトルにわたる安定性の著しい増加によることが明らかになっている。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月18日(2018.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者における潜在性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）感染症の診断のための組成物であって、
ＥＳＡＴ６およびＣＦＰ−１０の２つのＭｔｂ抗原のカクテルを含む、組成物。
【請求項２】
前記２つの抗原が、適切な有機体中でクローン化、産生および精製されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記適切な有機体が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓに由来する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
リコンビナントダブルＥＳＡＴ６およびリコンビナントＣＦＰ−１０の２つの抗原のカクテルを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原が媒体中で混合されたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
リコンビナントダブルＥＳＡＴ−６およびリコンビナントＣＦＰ１０が重量比１：１で混合される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
リコンビナントダブルＥＳＡＴ−６およびリコンビナントＣＦＰ１０が重量比１：２０〜２０：１で混合される、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原の量が各抗原について０．２５〜２．０μｇ／ｍＬである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記媒体が０．０１％のポリソルベート２０および０．５％のフェノールを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記診断が、前記組成物を皮内注射することによる免疫細胞の刺激に対する反応で生じる皮膚の反応の大きさを測定することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物の投与後４８〜７２時間に反応の大きさが測定される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
１または複数のさらなるＭｔｂ抗原を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記１または複数のさらなるＭｔｂ抗原が、ＲＤ１拘束性抗原、ＲＤ１関連抗原、Ｒｖ２５６４、Ｒｖ３８６５、Ｒｖ３８７７、Ｒｖ２３４８、Ｒｖ３６１４およびＲｖ３６１６からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者が小児である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者が成人である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者が、Ｍｔｂ感染症が疑われる者である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者が、ＴＢ疾患を有すると疑われる者である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者が、活動性ＴＢ疾患の兆候および／または症状のない者である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
投与後の硬結が予め定められたカットオフ値よりも大きい場合に、前記免疫不全者もしくはＨＩＶとの重感染者が、潜在性Ｍｔｂ感染を有すると診断される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
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