(57)【要約】いくつかの態様では、本発明は、プロテアーゼによって膜貫通ドメインから切断され得る細胞外ドメインを含む膜貫通タンパク質に関する。細胞外ドメインは、ＣＤ１ａなどの、抗原提示タンパク質の細胞外ドメインであり得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示タンパク質の細胞外ドメインを含む細胞外ドメインと、
膜貫通ドメインと、
前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するプロテアーゼ切断部位と、
を含むタンパク質であって、
前記プロテアーゼ切断部位が、前記膜貫通ドメインに近接して位置し、かつ
前記プロテアーゼ切断部位を認識するプロテアーゼが、少なくとも４残基のアミノ酸を含むアミノ酸配列を認識する、前記タンパク質。
【請求項２】
前記抗原提示タンパク質が、ＣＤ１タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記抗原提示タンパク質が、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、またはＣＤ１ｅである、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
細胞外ドメインと、
膜貫通ドメインと、
前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するプロテアーゼ切断部位と、
を含むタンパク質であって、
前記プロテアーゼ切断部位が、前記膜貫通ドメインに近接して位置し、かつ
前記プロテアーゼ切断部位を認識するプロテアーゼが、少なくとも４残基のアミノ酸を含むアミノ酸配列を認識する、前記タンパク質。
【請求項５】
前記膜貫通ドメインが、単一のアルファヘリックスからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記プロテアーゼ切断部位が、トロンビン、第Ｘａ因子、ＴＥＶプロテアーゼ、エンテロペプチダーゼ、またはライノウイルスの３Ｃプロテアーゼの認識配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記プロテアーゼ切断部位が、ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼの認識配列を含む、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記プロテアーゼ切断部位が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記プロテアーゼ切断部位が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項７または請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記タンパク質のＮ末端と前記プロテアーゼ切断部位との間に位置する第１のアフィニティータグをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記第１のアフィニティータグが、前記細胞外ドメインと前記プロテアーゼ切断部位との間に位置する、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記タンパク質のＣ末端と前記プロテアーゼ切断部位との間に位置する第２のアフィニティータグをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記第２のアフィニティータグが、前記膜貫通ドメインと前記プロテアーゼ切断部位との間に位置する、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記第１のアフィニティータグ及び前記第２のアフィニティータグの少なくとも１つが、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸、Ｅ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、ポリヒスチジン、Ｍｙｃ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、及びＳｐｙｔａｇから選択される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記第１のアフィニティータグ及び前記第２のアフィニティータグの少なくとも１つが、配列番号６〜２４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
膜を横切って前記細胞外ドメインを転位させるためのＮ末端リーダー配列をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質を細胞内で輸送するための細胞質ドメインをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記細胞質ドメインが、ＣＤ１ａの細胞質ドメインを含む、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子を含む、細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、原核細胞または真核細胞であり、
前記細胞が、プラスミドを含み、かつ
前記プラスミドが、前記遺伝子を含む、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、真核細胞であり、かつ
前記遺伝子が、前記細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、真核細胞であり、前記細胞が、前記タンパク質を発現する、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから選択される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記細胞が、前記プロテアーゼ切断部位において前記タンパク質を切断することができるプロテアーゼを発現しない生物に由来する、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、前記抗原提示タンパク質を発現する生物に由来する、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２６】
前記タンパク質が、前記細胞の膜を横切って前記細胞外ドメインを転位させるためのＮ末端リーダー配列を含み、かつ
前記細胞が、元々存在するタンパク質に前記Ｎ末端リーダー配列を発現する生物に由来する、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記タンパク質が、前記タンパク質を前記細胞内で輸送するための細胞質ドメインを含み、かつ
前記細胞が、前記細胞質ドメインを発現する生物に由来する、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２８】
前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２９】
前記細胞が、マウス細胞またはヒト細胞である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記細胞が、７２１細胞、２９３Ｔ細胞、Ａ１７２細胞、Ａ２５３細胞、Ａ２７８０細胞、Ａ２７８０ＡＤＲ細胞、Ａ２７８０ｃｉｓ細胞、Ａ４３１細胞、Ａ−５４９細胞、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞、ＢＲ２９３細胞、ＢＴ−２０細胞、ＢｘＰＣ３細胞、Ｃａｌ−２７細胞、ＣＭＬ  Ｔ１細胞、ＣＯＲ−Ｌ２３細胞、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０細胞、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ細胞、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３細胞、ＣＯＶ−４３４細胞、ＤＵ１４５細胞、ＤｕＣａＰ細胞、ＥＭ２細胞、ＥＭ３細胞、ＦＭ３細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ６９細胞、ＨＣＡ２細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０細胞、ＨＭＥｐＣ細胞、ＨＴ−２９細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＢＭ−７細胞、ＫＣＬ２２細胞、ＫＧ１細胞、Ｋｕ８１２細胞、ＫＹＯ１細胞、ＬＮＣａｐ細胞、Ｍａ−Ｍｅｌ細胞、ＭＣＦ−１０Ａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、ＭＧ６３細胞、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６細胞、ＭＯＲ／０．２Ｒ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ細胞、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０細胞、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０細胞、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４細胞、Ｐｅｅｒ細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、ＳｉＨａ細胞、ＳＫＢＲ３細胞、ＳＫＯＶ−３細胞、Ｔ２細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞、Ｔ８４細胞、Ｕ３７３細胞、Ｕ８７細胞、Ｕ９３７細胞、ＶＣａＰ細胞、ＷＭ３９細胞、ＷＴ−４９細胞、及びＹＡＲ細胞から選択される、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
前記細胞が、３Ｔ３細胞、４Ｔ１細胞、Ａ２０細胞、ＡＬＣ細胞、Ｂ１６細胞、ｂＥｎｄ．３細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞、ＣＧＲ８細胞、ＣＴ２６細胞、Ｅ１４Ｔｇ２ａ細胞、ＥＬ４細胞、ＥＭＴ６／ＡＲ１細胞、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０細胞、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞、Ｊ５５８Ｌ細胞、ＭＣ−３８細胞、ＭＴＤ−１Ａ細胞、ＭｙＥｎｄ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＲｅｎＣａ細胞、ＲＩＮ−５Ｆ細胞、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ細胞、Ｘ６３細胞、及びＹＡＣ−１細胞から選択される、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３２】
前記細胞が、９Ｌ細胞、Ｂ３５細胞、ＢＨＫ−２１細胞、Ｃ６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＭＴ細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｄ１７細胞、ＤＨ８２細胞、ＭＤＣＫ  ＩＩ細胞、ＲＢＬ細胞、及びＶｅｒｏ細胞から選択される、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３３】
前記細胞が、不死化細胞株、末梢血単核球、または線維芽細胞の細胞である、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３４】
前記細胞が、ＣＤ１タンパク質を発現する、請求項１９〜３３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３５】
前記細胞が、ＣＤ１タンパク質を発現しない、請求項１９〜３３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３６】
前記抗原提示タンパク質の前記細胞外ドメインが、ＣＤ１ａに由来する、請求項１９〜３５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３７】
前記細胞が、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）を発現する、請求項１９〜３６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３８】
前記細胞が、抗原提示細胞である、請求項１９〜３４、請求項３６、及び請求項３７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３９】
前記細胞が、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）を発現しない、請求項１９〜３６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、抗原提示細胞ではない、請求項１９〜３３、請求項３５、請求項３６、及び請求項３９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４１】
抗原の単離方法であって、
請求項１９〜４０のいずれか１項に記載の細胞と前記抗原を含む混合物との接触と、
前記細胞と前記プロテアーゼ切断配列を認識するプロテアーゼとのインキュベートであって、それによって前記細胞から前記細胞外ドメインが切断される前記インキュベートと、
前記混合物からの前記細胞外ドメインの単離であって、それによって前記抗原が単離される前記単離と、
を含む、前記単離方法。
【請求項４２】
抗原の単離方法であって、
請求項１９〜４０のいずれか１項に記載の細胞と前記抗原を含む混合物との接触と、
前記混合物からの前記細胞の単離と、
前記細胞と前記プロテアーゼ切断配列を認識するプロテアーゼとのインキュベートであって、それによって前記細胞から前記細胞外ドメインが切断される前記インキュベートと、
前記細胞からの前記細胞外ドメインの単離であって、それによって前記抗原が単離される前記単離と、
を含む、前記単離方法。
【請求項４３】
前記タンパク質が、前記タンパク質の前記細胞外ドメインと前記プロテアーゼ切断部位との間に位置するアフィニティータグを含み、かつ
前記細胞外ドメインの単離が、前記アフィニティータグに特異的に結合する分子に対する前記細胞外ドメインの結合を含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｔ細胞の単離方法であって、
請求項１９〜４０のいずれか１項に記載の細胞と抗原との接触と、
前記細胞と複数のＴ細胞とのインキュベートと、
前記細胞に結合するＴ細胞の単離であって、それによって前記Ｔ細胞が単離される前記単離と、
前記細胞と前記プロテアーゼ切断配列を認識するプロテアーゼとのインキュベートであって、それによって前記細胞から前記Ｔ細胞が切断される前記インキュベートと、
を含む、前記単離方法。
【請求項４５】
前記細胞と前記抗原との接触が、
前記細胞を含む組成物に対する前記抗原の添加であって、それによって前記細胞及び前記抗原を含む組成物が得られる添加、または
前記抗原を含む混合物に対する前記細胞の添加であって、それによって前記細胞及び前記抗原を含む組成物が得られる添加
のいずれかを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗原を含む前記混合物が、前記複数のＴ細胞を含むか、または前記細胞を含む前記組成物が、前記複数のＴ細胞を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が、前記細胞及び前記抗原を含む前記組成物に対する前記複数のＴ細胞の添加を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞からの前記Ｔ細胞の単離をさらに含む、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞に結合する前記Ｔ細胞の単離、及び／または前記細胞からの前記Ｔ細胞の単離が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁性活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含む、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の関与
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＡＲ４０３１２の下、政府の支援を得てなされた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本特許出願は、２０１５年５月２２日出願の米国仮特許出願第６２／１６５３４９号に対する優先権を主張し、当該文献は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＣＤ１タンパク質は、Ｔ細胞に対してリポ多糖／糖脂質抗原を提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）関連タンパク質である。ヒトＣＤ１ファミリーは、５つのアイソフォーム（ＣＤ１ａ−ｅ）からなり、こうしたアイソフォームは、特有の構造特性及び細胞内輸送特性を進化させてきており、この特性によって、こうしたアイソフォームがさまざまなエンドサイトーシスコンパートメント（例えば、エンドソーム、ファゴソーム、リソソーム）から収集された異なるクラスの疎水性抗原を提示することが可能となっている。現在までのところ、ＣＤ１／抗原相互作用に関する知見の大部分は、１）無細胞系における精製可溶性組換えタンパク質の人工的な負荷、２）これまでに同定された単一抗原または関連構造群を利用する細胞培養系、または３）上記のものの何らかの組み合わせに依存するものであった。こうした手法は、環境から個々の抗原を得て使用するなど、それ自体に作業者に基づく先入観が内在していることによってＣＤ１リガンドの同定を著しく制限するものであり、こうした環境は、多くの他の分子を含む可能性があるものである。
【発明の概要】
【０００４】
簡単な説明
いくつかの態様では、本発明は、プロテアーゼによって膜貫通ドメインから切断され得る細胞外ドメインを含む膜貫通タンパク質に関する。細胞外ドメインは、ＣＤ１ａなどの、抗原提示タンパク質の細胞外ドメインであり得る。本発明のいくつかの態様は、本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸、または当該核酸を含む細胞に関する。本発明の他の態様は、タンパク質及び／または抗原の精製方法及び／または単離方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】β−２ｍの細胞外ドメイン（β２Ｍ）、グリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、ＣＤ１ａの細胞外ドメイン（ＣＤ１ａ  ＥＣ）、ストレプトアビジンアフィニティータグ（Ｓｔｒｅｐ）、ヒスチジンアフィニティータグ（８Ｈｉｓ）、３Ｃプロテアーゼ切断部位（切断）、ＦＬＡＧアフィニティータグ（Ｆｌａｇ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞質ドメイン（ＣＴ）を含むタンパク質の設計及びアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。
【図２】マウスＢ１６細胞において発現させた、β−２ｍの細胞外ドメイン、ＣＤ１ａの細胞外ドメイン、及び３Ｃプロテアーゼ切断部位を含むタンパク質を、３Ｃプロテアーゼでの切断前及び切断後に、ＣＤ１ａ及びβ−２ｍの蛍光標識を使用してフローサイトメトリーで分析した結果を示す。「モック（Ｍｏｃｋ）」は、トランスフェクト未実施の対照細胞を示す。「ｃＣＤ１ａ１」及び「ｃＣＤ１ａ２」は、β−２ｍの細胞外ドメイン及びＣＤ１ａの細胞外ドメインを含む切断可能なタンパク質をトランスフェクトした細胞を示す。「ＷＴ  ＣＤ１ａ」は、野生型ヒトＣＤ１ａをトランスフェクトした細胞を示し、野生型ヒトＣＤ１ａは、β−２ｍの細胞外ドメイン及び３Ｃプロテアーゼ切断配列を含まないものである。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、パネル（Ａ）及びパネル（Ｂ）と表記した２つのパネルからなる。パネル（Ａ）は、真核細胞において発現させた、ＣＤ１ａの細胞外ドメイン及び３Ｃプロテアーゼ切断部位を含むタンパク質を、３Ｃプロテアーゼでの切断前及び切断後に（それぞれＣＤ１ａ及びＣＤ１ａ＋３Ｃ）、フローサイトメトリーで分析した結果を示す。パネル（Ｂ）は、３Ｃプロテアーゼを用いて細胞から切断し、Ｎｉ−ＮＴＡを使用して精製したタンパク質のポリアクリルアミドゲルを示す。Ｎｉ−ＮＴＡは、ヒスチジンタグと結合するものである。「溶出」レーンは、Ｎｉ−ＮＴＡを使用して精製したタンパク質に相当し、主要なバンドの分子量は、切断された細胞外ドメインの分子量に相当する。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃは、（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）と表記した３つのパネルからなる。ｃＣＤ１ａに結合した分子は、Ｎ−プロパノール（Ａ）、クロロホルム−メタノール−水（Ｂ；１０：１０：３）、及びクロロホルム−メタノール（Ｃ；２：１）を使用してＮｉ−ＮＴＡ樹脂から溶出し、その分子量を、質量分析を使用して測定した。白のひし形は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の可溶化液と共にｃＣＤ１ａ発現細胞をインキュベートした後、ｃＣＤ１ａから溶出した分子に相当する。黒のひし形は、対照に相当し、未処理のｃＣＤ１ａ発現細胞のものである。
【図５】リポタンパク質であるＬｐｐＸ（ＬｐｐＸ；ｘ軸）をさまざまな濃度で用いることによって誘導したインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）濃度（ｙ軸）を示すグラフである。野生型ＣＤ１ａ（ｗｔＣＤ１Ａ）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞、切断可能なＣＤ１ａ細胞外ドメイン（ｃＣＤＡ１）を含む操作タンパク質をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞、及びトランスフェクト未実施のＨｅＬａ細胞を、ＬｐｐＸ及びＬＣＤ４．Ｇ  Ｔ細胞と共にインキュベートした。ＬＣＤ４．Ｇ  Ｔ細胞は、ＬｐｐＸ抗原を認識するＣＤ１Ａ拘束性のＴ細胞クローンである。Ｔ細胞によるＩＮＦ−γ産生は、ＥＬＩＳＡによって測定した。ｃＣＤ１Ａをトランスフェクトした細胞がＩＮＦ−γ産生を誘導する能力は、ｗｔＣＤ１Ａをトランスフェクトした細胞のものと類似しており、このことは、ｃＣＤ１Ａ構築物が、Ｔ細胞に抗原を提示する能力を維持していたことを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
いくつかの態様では、本発明は、ＣＤ１糖タンパク質に由来する細胞外ドメインを含むタンパク質に関する。タンパク質は、ＣＤ１糖タンパク質に由来する細胞質ドメインを含み得る。遺伝子的に融合したタンパク質パートナーを異なる細胞内位置及び細胞外位置に異なって分布させる能力を有し、多くの場合、得られる機能に劇的な差異が伴うさまざまなタンパク質ドメインについて、これまでの研究で報告されてきた。より具体的には、遺伝子的に融合した異種性タンパク質を異なる細胞内位置に輸送するために、ヒトＣＤ１タンパク質から借用した配列を含む発現カセットが使用され得る（例えば、Ｎｉａｚｉ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２２（４）：５２２−３１（２００７）を参照のこと）。大部分の１型膜タンパク質のように、ＣＤ１遺伝子は、特有のサブドメインを有するポリペプチドをコードしており、それぞれが関連する機能を有している。ＣＤ１の場合、ドメインは４つ存在しており、このタンパク質のＮ末端（すなわち、「ドメイン１」）は、リーダーペプチドをコードしている。このリーダーペプチドは、残りのタンパク質を小胞体内腔へと転位させるために、ＣＤ１のメッセンジャーＲＮＡ及び関連リボソームを小胞体へと標的指向化する配列である。本質的には、リーダーペプチドの合成は、１型膜タンパク質を、細胞質ではなく分泌系及び細胞外空間へと標的指向化する第１段階である。リーダーペプチド配列に続く第２のＣＤ１サブドメイン（「ドメイン２」）は細胞外ドメインであり、このドメインは、ＭＨＣ  Ｉに対する配列相同性及び構造相同性を有しており、Ｔリンパ球への提示に向けてリポ多糖抗原に結合するものである。この細胞外ドメインを細胞膜に固定するための、野生型ＣＤ１配列における次のモジュール（「ドメイン３」）は、膜貫通ドメインである。このドメインは、細胞膜幅にまたがる１５以上の疎水性または無極性のアミノ酸残基の区間である。ＣＤ１の最終ドメイン（「ドメイン４」）は、ＣＤ１を、異なる細胞内エンドソーム小胞へと膜から輸送するための細胞内アダプタータンパク質によって捕獲される配列として働く細胞質側末端配列である。こうしたドメインを独立した機能単位としてそれぞれ使用し、ＣＤ１タンパク質の細胞外ドメインを、ＧＦＰ、マイコバクテリアのＧｒｏＥＳ、及び他のものなどの融合タンパク質と交換し得ることで、野生型ＣＤ１であれば輸送されることになるコンパートメントへとそうしたものが標的指向化され、それによって標的指向化カセットの一団が創出される（例えば、Ｎｉａｚｉ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２２（４）：５２２−３１（２００７）を参照のこと）。
【０００７】
本発明のいくつかの態様は、新規の特性を追加で含み、こうした追加特性は、例えば、ピコルナウイルスの３Ｃプロテアーゼの認識配列を含む、膜近位に存在するタンパク分解性の細胞外切断部位、及び例えば、６〜８残基のヒスチジン区間（８Ｈｉｓ）またはＳｔｒｅｐ−タグ配列などの、１つまたは複数の「アフィニティータグ」を含む精製ドメインなどである。３Ｃが認識する部位は、３Ｃプロテアーゼが生理学的なｐＨ及び塩濃度でその基質を切断する能力を有しており、それによって細胞溶解、及び細胞内タンパク質による標的タンパク質プールの続発汚染が阻止されるという理由に一部は基づいて選択され得るものである。アフィニティータグの位置は、タンパク質パートナーの機能的な許容度に応じて、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部の間で変わり得るものであり、切断配列は、理想的には、１型膜タンパク質の膜に近接化して位置する。こうしたモジュールは、２型の膜内在性タンパク質と組み合わせて使用してもよい。
【０００８】
Ｉ．組換えタンパク質
いくつかの態様では、本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するプロテアーゼ切断部位を含むタンパク質に関する。細胞外ドメインは、抗原提示タンパク質の細胞外ドメインを含み得る。プロテアーゼ切断部位は、膜貫通ドメインに近接して位置し得る。例えば、プロテアーゼ切断部位の位置は、膜貫通ドメインからのアミノ酸残基数として、５０以内、４０以内、３０以内、２９以内、２８以内、２７以内、２６以内、２５以内、２４以内、２３以内、２２以内、２１以内、２０以内、１９以内、１８以内、１７以内、１６以内、１５以内、１４以内、１３以内、１２以内、１１以内、１０以内、９以内、８以内、７以内、６以内、５以内、４以内、３以内、２以内、または１以内であり得る。
【０００９】
プロテアーゼ切断部位は、少なくとも４残基のアミノ酸を認識するプロテアーゼによって認識され得、少なくとも５残基、少なくとも６残基、少なくとも７残基、または少なくとも８残基のアミノ酸を認識するプロテアーゼなどによって認識され得る。プロテアーゼ切断部位は、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、または１０残基のアミノ酸であり得、すなわち、プロテアーゼ切断部位は、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、または１０残基のアミノ酸配列を認識するプロテアーゼによって認識され得る。プロテアーゼ切断部位は、例えば、トロンビン、第Ｘａ因子、ＴＥＶプロテアーゼ、エンテロペプチダーゼ、またはライノウイルスの３Ｃプロテアーゼによって認識され得、すなわち、プロテアーゼ切断部位は、トロンビン、第Ｘａ因子、ＴＥＶプロテアーゼ、エンテロペプチダーゼ、またはライノウイルスの３Ｃプロテアーゼによる切断部位であり得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、３Ｃプロテアーゼによって認識され、すなわち、プロテアーゼ切断部位は、３Ｃプロテアーゼ切断部位であり得る。プロテアーゼ切断部位の性質は、プロテアーゼが特異的である限り、特に限定されるものではない。プロテアーゼ切断部位は、例えば、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１；ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼよって切断される）；ＤＤＤＤＫ（配列番号２；エンテロペプチダーゼよって切断される）；ＩＥＧＲ（配列番号３；第Ｘａ因子よって切断される）；ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４；ＴＥＶプロテアーゼよって切断される）；またはＬＶＰＲＧＳ（配列番号５；トロンビンプロテアーゼよって切断される）であり得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、配列番号１を含む。
【００１０】
細胞外ドメインは、ＣＤ１タンパク質の細胞外ドメインを含み得、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、またはＣＤ１ｅの細胞外ドメインなどを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＤ１ａの細胞外ドメインを含み得る。ＣＤ１タンパク質は、ヒトＣＤ１であり得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、β−２ミクログロブリン（β−２Ｍ）に由来する細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩアルファ鎖に由来する細胞外ドメインを含む。
【００１１】
細胞外ドメインは、ＣＤ１タンパク質の細胞外ドメインの一部を含み得、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、またはＣＤ１ｅの細胞外ドメインの一部などを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＤ１ａの細胞外ドメインの一部を含む。ＣＤ１タンパク質は、ヒトＣＤ１であり得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、β−２Ｍに由来する細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩアルファ鎖に由来する細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、タンパク質の抗原提示ドメインを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、単一のアルファヘリックスである。タンパク質は、１型膜タンパクであり得、すなわち、タンパク質は、細胞外ドメインがタンパク質のＮ末端となり、細胞質ドメインがＣ末端となるように配向し得る。
【００１３】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質のＮ末端とプロテアーゼ切断部位との間に位置する第１のアフィニティータグをさらに含む。第１のアフィニティータグは、細胞外ドメインとプロテアーゼ切断部位との間に位置し得る。
【００１４】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質のＣ末端とプロテアーゼ切断部位との間に位置する第２のアフィニティータグをさらに含む。第２のアフィニティータグは、膜貫通ドメインとプロテアーゼ切断部位との間に位置し得る。
【００１５】
第１のアフィニティータグ及び第２のアフィニティータグの性質は、特に限定されるものではない。例えば、第１のアフィニティータグ及び第２のアフィニティータグの少なくとも１つは、ＡｖｉＴａｇ（配列番号６  ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、カルモジュリン−タグ（配列番号７  ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）、ポリグルタミン酸タグ（配列番号８  ＥＥＥＥＥＥ）、Ｅ−タグ（配列番号９  ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）、ＦＬＡＧ−タグ（配列番号１０  ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＨＡ−タグ（配列番号１１  ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、Ｈｉｓ−タグ（配列番号１２  ＨＨＨＨＨＨ）、Ｍｙｃ−タグ（配列番号１３  ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、Ｓ−タグ（配列番号１４  ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ＳＢＰ−タグ（配列番号１５  ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）、Ｓｏｆｔａｇ１（配列番号１６  ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）、Ｓｏｆｔａｇ３（配列番号１７  ＴＱＤＰＳＲＶＧ）、Ｓｔｒｅｐ−タグ（配列番号１８  ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ＴＣタグ（配列番号１９  ＣＣＰＧＣＣ）、Ｖ５タグ（配列番号２０  ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）、ＶＳＶ−タグ（配列番号２１  ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）、Ｘｐｒｅｓｓタグ（配列番号２２  ＤＬＹＤＤＤＤＫ）、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ（配列番号２３  ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ）、及びＳｐｙＴａｇ（配列番号２４  ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ）から選択され得る。いくつかの実施形態では、第１のアフィニティータグは、ｓｔｒｅｐ−タグ（配列番号１８）及び／またはｈｉｓ−タグ（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態では、第２のアフィニティータグは、ＦＬＡＧ−タグ（配列番号１０）を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、例えば、膜を横切って細胞外ドメインを転位させるためのＮ末端リーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、例えば、タンパク質を細胞内で輸送するための細胞質ドメインを含む。細胞質ドメインは、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、またはＣＤ１ｅなどのＣＤ１タンパク質の細胞質ドメインを含み得る。例えば、細胞質ドメインは、ヒトＣＤ１ａの細胞質ドメインの一部を含み得る。
【００１７】
タンパク質と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列との配列相同性は、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であり得る。タンパク質は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有し得る。
【００１８】
ＩＩ．組換え核酸
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載のタンパク質のいずれか１つをコードする核酸に関する。本明細書では、タンパク質をコードする核酸配列は、「遺伝子」と称される。核酸は、本明細書に記載のタンパク質のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結されたプロモーターをさらに含み得る。核酸は、抗生物質耐性遺伝子などの選択可能マーカーをさらに含み得る。核酸は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細胞における核酸のクローニングのための複製起点をさらに含み得る。
【００１９】
ＩＩＩ．細胞
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載のタンパク質のいずれか１つをコードする遺伝子（すなわち、組換え遺伝子）を含む細胞に関する。細胞は、例えば、遺伝子のクローニングのための原核細胞であり得る。細胞は、例えば、タンパク質を発現するための真核細胞であり得る。遺伝子は、プラスミドに存在し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば、発現細胞に安定的にトランスフェクトした後、プラスミドに存在しない。遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ得、すなわち、遺伝子をコードする核酸を用いて細胞を形質転換またはトランスフェクトした後に、細胞のゲノムに組み込まれ得る。細胞は、タンパク質及び選択可能マーカーをコードする遺伝子を含む核酸を含み得、こうした選択可能マーカーは、例えば、遺伝子を含む細胞を選択するための、遺伝子と結合した選択可能マーカーである。細胞は、真核細胞であり得、遺伝子は、細胞のゲノムへと組み込まれ得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、細胞は、クローニング細胞であり、例えば、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから選択され得る。
【００２１】
細胞は、Ｃ６／３６細胞、Ｓ２細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｓｆ９細胞、及びＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞から選択され得る。
【００２２】
いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞であり、細胞は、タンパク質を発現する。細胞は、マウス細胞またはヒト細胞などの哺乳類細胞であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、７２１細胞、２９３Ｔ細胞、Ａ１７２細胞、Ａ２５３細胞、Ａ２７８０細胞、Ａ２７８０ＡＤＲ細胞、Ａ２７８０ｃｉｓ細胞、Ａ４３１細胞、Ａ−５４９細胞、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞、ＢＲ２９３細胞、ＢＴ−２０細胞、ＢｘＰＣ３細胞、Ｃａｌ−２７細胞、ＣＭＬ  Ｔ１細胞、ＣＯＲ−Ｌ２３細胞、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０細胞、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ細胞、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３細胞、ＣＯＶ−４３４細胞、ＤＵ１４５細胞、ＤｕＣａＰ細胞、ＥＭ２細胞、ＥＭ３細胞、ＦＭ３細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ６９細胞、ＨＣＡ２細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０細胞、ＨＭＥｐＣ細胞、ＨＴ−２９細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＢＭ−７細胞、ＫＣＬ２２細胞、ＫＧ１細胞、Ｋｕ８１２細胞、ＫＹＯ１細胞、ＬＮＣａｐ細胞、Ｍａ−Ｍｅｌ細胞、ＭＣＦ−１０Ａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、ＭＧ６３細胞、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６細胞、ＭＯＲ／０．２Ｒ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ細胞、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０細胞、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０細胞、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４細胞、Ｐｅｅｒ細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、ＳｉＨａ細胞、ＳＫＢＲ３細胞、ＳＫＯＶ−３細胞、Ｔ２細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞、Ｔ８４細胞、Ｕ３７３細胞、Ｕ８７細胞、Ｕ９３７細胞、ＶＣａＰ細胞、ＷＭ３９細胞、ＷＴ−４９細胞、及びＹＡＲ細胞から選択され得る。細胞は、３Ｔ３細胞、４Ｔ１細胞、Ａ２０細胞、ＡＬＣ細胞、Ｂ１６細胞、ｂＥｎｄ．３細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞、ＣＧＲ８細胞、ＣＴ２６細胞、Ｅ１４Ｔｇ２ａ細胞、ＥＬ４細胞、ＥＭＴ６／ＡＲ１細胞、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０細胞、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞、Ｊ５５８Ｌ細胞、ＭＣ−３８細胞、ＭＴＤ−１Ａ細胞、ＭｙＥｎｄ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＲｅｎＣａ細胞、ＲＩＮ−５Ｆ細胞、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ細胞、Ｘ６３細胞、及びＹＡＣ−１細胞から選択され得る。細胞は、９Ｌ細胞、Ｂ３５細胞、ＢＨＫ−２１細胞、Ｃ６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＭＴ細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｄ１７細胞、ＤＨ８２細胞、ＭＤＣＫ  ＩＩ細胞、ＲＢＬ細胞、及びＶｅｒｏ細胞から選択され得る。細胞は、不死化細胞株、末梢血単核球、または線維芽細胞の細胞であり得る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、細胞は、プロテアーゼ切断部位においてタンパク質を切断することができるプロテアーゼを発現しない生物に由来する。好ましい実施形態では、細胞は、抗原提示タンパク質を発現する生物に由来する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞の膜を横切って細胞外ドメインを転位させるためのＮ末端リーダー配列を含み、細胞は、元々存在するタンパク質にＮ末端リーダー配列を発現する生物に由来する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質を細胞内で輸送するための細胞質ドメインを含み、細胞は、細胞質ドメインを発現する生物に由来する。
【００２４】
細胞は、ＣＤ１タンパク質を内因性に発現し得るか、または内因性に発現し得ない。本明細書では、「内因性発現」は、本明細書に記載の遺伝子のトランスフェクトとは無関係なタンパク質発現、すなわち、トランスフェクトによって導入される遺伝子ではなく、細胞に元々存在する遺伝子から転写されるｍＲＮＡからタンパク質が発現するタンパク質発現を指す。細胞は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、及び／またはＣＤ１ｅを内因性に発現し得るか、または内因性に発現し得ない。ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ１（例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、及び／またはＣＤ１ｅ）を内因性に発現せず、細胞は、本明細書に記載の抗原提示タンパク質であるＣＤ１ａの細胞外ドメインを含むタンパク質を発現する。
【００２５】
細胞は、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣクラスＩ）を内因性に発現し得るか、または内因性に発現し得ない。細胞は、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）を内因性に発現し得るか、または内因性に発現し得ない。細胞は、抗原提示細胞であり得るか、またはあり得ない。
【００２６】
ＩＶ．抗原の単離方法
いくつかの態様では、本発明は、抗原の単離方法に関する。方法は、本明細書の上記細胞と抗原を含む混合物との接触と、細胞と細胞が発現する（本明細書に記載の）タンパク質のプロテアーゼ切断配列を認識するプロテアーゼとのインキュベートであって、それによって細胞からタンパク質の細胞外ドメインが切断されるインキュベートと、混合物からの、タンパク質の細胞外ドメインの単離であって、それによって細胞外ドメインに結合した抗原が単離される単離と、を含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書の上記細胞と抗原を含む混合物との接触と、混合物からの細胞の単離と、細胞と細胞が発現する（本明細書に記載の）タンパク質のプロテアーゼ切断配列を認識するプロテアーゼとのインキュベートであって、それによって細胞からタンパク質の細胞外ドメインが切断されるインキュベートと、細胞からの細胞外ドメインの単離であって、それによって抗原が単離される単離と、を含む。前述の方法では、細胞は、好ましくは、真核細胞であり、より好ましくは、マウス細胞またはヒト細胞などの哺乳類細胞である。タンパク質は、アフィニティータグを含み得る。混合物からの細胞の単離は、混合物と、アフィニティータグに特異的に結合する分子とのインキュベートを含み得るか、または含み得ない。細胞の単離は、細胞のペレット化及び上清の除去、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または磁性活性化細胞選別（ｍａｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＭＡＣＳ）を含み得る。タンパク質は、細胞外ドメインとプロテアーゼ切断部位との間にアフィニティータグを含み得る。したがって、細胞外ドメインの単離は、細胞外ドメインを含む組成物（例えば、混合物）と、アフィニティータグに特異的に結合する分子とのインキュベートを含み得る。細胞外ドメインの単離は、例えば、アフィニティータグに特異的に結合する固定相を用いたアフィニティークロマトグラフィーを含み得る。方法は、細胞外ドメインからの抗原の単離をさらに含み得る。例えば、方法は、抗原、細胞外ドメイン、及びアフィニティータグに特異的に結合する分子を含む複合体と、尿素またはグアニジンなどの化学的な変性剤との接触であって、接触の間、細胞外ドメインは、アフィニティータグに特異的に結合する分子に結合している接触と、複合体からの抗原の分離（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離、濾過、または磁性分離によるもの）と、を含み得る。あるいは、細胞外ドメインからの抗原の単離は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィーを含み得る。方法は、抗原の同定をさらに含み得る。例えば、方法は、質量分析（例えば、ＨＰＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、シングル四重極型、トリプル四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、四重極−飛行時間型、及び／またはタンデム型のＭＳ）を含み得る。
【００２７】
アフィニティータグに特異的に結合する分子は、粒子、ビーズ、樹脂、または他の固体支持構造に結合（例えば、共有結合で結合）され得る。粒子、ビーズ、樹脂、または他の固体支持構造によって、遠心分離、濾過、アフィニティークロマトグラフィー、または磁性分離による精製が可能となり得る。分子は、フルオロフォアに結合（例えば、共有結合で結合）され得る。
【００２８】
Ｖ．Ｔ細胞の単離方法
いくつかの態様では、本発明は、Ｔ細胞の単離方法に関し、当該方法は、（例えば、本明細書に記載のタンパク質を発現する）細胞と抗原との接触と、細胞と複数のＴ細胞とのインキュベートと、細胞に結合するＴ細胞の単離であって、それによってＴ細胞が単離される単離と、細胞とタンパク質のプロテアーゼ切断部位を認識するプロテアーゼとのインキュベートであって、それによって細胞からＴ細胞が切断されるインキュベートと、を含む。複数のＴ細胞の少なくともいくつかは、好ましくは、抗原／抗原提示タンパク質複合体に特異的に結合する能力を有しており、その結果、細胞外ドメインが提示する抗原をＴ細胞が認識するのであれば、複数のＴ細胞のいくつかは、細胞に発現したタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合する可能性がある。したがって、細胞に発現したタンパク質の細胞外ドメインは、好ましくは、複数のＴ細胞と同一の種のものである。細胞は、好ましくは、複数のＴ細胞と同一の種のものである。
【００２９】
細胞と抗原との接触は、細胞を含む組成物に対する抗原の添加であって、それによって細胞及び抗原を含む組成物が得られる添加、または抗原を含む混合物に対する細胞の添加であって、それによって細胞及び抗原を含む組成物が得られる添加のいずれかを含み得る。抗原を含む混合物は、複数のＴ細胞を含み得る。あるいは、細胞を含む組成物は、複数のＴ細胞を含み得る。あるいは、方法は、細胞及び抗原を含む組成物に対する複数のＴ細胞の添加を含み得る。
【００３０】
例えば、タンパク質が、ＣＤ１ａなどの、ＣＤ１ファミリーのメンバーの細胞外ドメインを含むとき、複数のＴ細胞は、ＣＤ１拘束性Ｔ細胞を含み得る（またはＣＤ１拘束性Ｔ細胞から本質的になり得る）。例えば、タンパク質が、ＣＤ１ファミリーの対応メンバーの細胞外ドメインを含むとき、複数のＴ細胞は、ＣＤ１ａ拘束性Ｔ細胞、ＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞、ＣＤ１ｃ拘束性Ｔ細胞、及び／またはＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞を含み得る（またはＣＤ１ａ拘束性Ｔ細胞、ＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞、ＣＤ１ｃ拘束性Ｔ細胞、及び／またはＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞から本質的になり得る）。
【００３１】
方法は、細胞からのＴ細胞の単離をさらに含み得る。
【００３２】
細胞に結合するＴ細胞の単離、及び／または細胞からのＴ細胞の単離は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または磁性活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含み得る。例えば、方法は、細胞と細胞が発現したタンパク質のアフィニティータグに特異的に結合する分子との接触であって、例えば、分子が、フルオロフォア、または磁性粒子、常磁性粒子、もしくは超常磁性粒子に結合され、それによって、細胞に結合したＴ細胞の単離（すなわち、プロテアーゼとのインキュベート前）、または細胞からのＴ細胞の単離（すなわち、プロテアーゼとのインキュベート後）のいずれかが可能となる接触を含み得る。
【００３３】
複数の他のＴ細胞及び細胞からＴ細胞を単離した後、続けてＴ細胞の増殖、及び／または特徴付けを実施してよい。例えば、方法は、例えば、抗原に特異的に結合するアミノ酸配列を同定するために、Ｔ細胞のＴ細胞受容体の相補性決定領域の配列決定を含み得る。方法は、αβＴ細胞受容体（αβＴＣＲ）及び／またはγδＴ細胞受容体（γδＴＣＲ）の相補性決定領域の配列決定であって、例えば、タンパク質が、ＣＤ１ファミリーのメンバーの細胞外ドメインを含む配列決定を含み得る。
【００３４】
下記の実験詳細から、本開示に対する理解が深まるであろう。しかしながら、議論される特定の方法及び結果は、後述の実施形態においてより完全に説明される本開示の例示にすぎないことを当業者であれば容易に理解するであろう。
【実施例】
【００３５】
実施例１：切断可能な細胞外ドメインの設計
ＣＤ１ａ／β−２ミクログロブリン（β−２ｍ）融合タンパク質をモデルタンパク質として使用した。β−２ｍは、それ自体にリーダーペプチドを有しているため、このドメインと、ＣＤ１ａ由来の機能的に同等な配列との交換は実施しなかったが、発現細胞の膜へのタンパク質の標的指向化が生じる限り、任意のリーダーペプチドまたはシグナル配列を使用してよい。開発下にある表面発現、切断、及び精製の系が有用性を有しているという機能的な証拠を得るために、構築物では、ＣＤ１ａがリポ多糖に結合するという能力を利用している。結果として、ＣＤ１ａ系は、抗原の取り込み、プロセシング、及び生細胞による提示に続いて確証的に負荷されたＣＤ１ａ結合型抗原のプールを直接的にサンプリングする手段を提供するものであり、それによって作業者の先入観が取り除かれている。細胞内輸送、細胞表面からのオンデマンドの切断、及び精製容易性の実現が可能な組換えＣＤ１ａタンパク質を創出するために、下記の構築物を設計した。
【００３６】
オーバーラップオリゴヌクレオチドに基づくポリメラーゼ連鎖反応を利用する、カセットに基づくクローニングスキームを使用し、ヒトβ−２ミクログロブリン（β２Ｍ）、グリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、成熟ＣＤ１ａ細胞外ドメイン（ＣＤ１ａ  ＥＣ）、Ｓｔｒｅｐ−タグ配列（Ｓｔｒｅｐ）、ポリ−ヒスチジンアフィニティータグ（８Ｈｉｓ）、ヒトライノウイルスの３Ｃプロテアーゼモチーフ（切断）、グリシン−セリンリンカー及びＦＬＡＧエピトープ（ＦＬＡＧ）、ならびに野生型ＣＤ１ａの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン（それぞれＴＭ及びＣＴ）をコードするキメラ遺伝子をクローニングした（図１を参照のこと）。得られた発現タンパク質は、分泌されないものであるが、輸送様式は野生型ＣＤ１ａと類似しており、細胞による抗原のプロセシング及び負荷の後に、切断及び精製することが可能である。
【００３７】
β−２ｍリーダーペプチドをコードする配列は、ドメイン１として働き、残りのβ−２ｍ、グリシン−セリンリンカー、及びＣＤ１ａの細胞外ドメインは、ドメイン２に相当し、精製及び切断のモジュールは、ドメイン２とドメイン３との間に挿入されており、ＦＬＡＧタグを有するＣＤ１ａ膜貫通ドメインは、ドメイン３として働き、ＣＤ１ａの細胞質ドメインは、ドメイン４に相当する。ＣＤ１ａの細胞質側末端は、特有の能力を有しているわけではないが、理想的な標的指向化配列である。この理由は、ＣＤ１ａの細胞質側末端が、融合したタンパク質パートナーを細胞表面または再循環性エンドソームへと優位に輸送することができるためである。
【００３８】
実施例２：融合タンパク質の発現及び切断
新たに操作した切断可能なＣＤ１ａ（ｃＣＤ１ａ）遺伝子が、細胞表面に発現し得るかを検証するために、ｃＣＤ１ａ構築物の２つの異なる調製物、または野生型ＣＤ１ａを用いてマウスＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（ヒトＣＤ１ａ及びβ−２ｍの両方を欠いている）を一過性にトランスフェクトし、３Ｃプロテアーゼによる処理有りまたは処理無しで、ＣＤ１ａに特異的な抗体及びヒトβ−２ｍに特異的な抗体を用いて表面を染色した（図２）。細胞表面におけるＣＤ１ａ及びヒトβ−２ミクログロブリンの発現減少は、ｃＣＤ１ａを発現する細胞のみで観測され、ｗｔＣＤ１ａでは観測されておらず、このことは、細胞表面からのプロテアーゼに基づく切断がｃＣＤ１ａに特異的な性質であり、ｗｔＣＤ１ａではそうではないということを示唆している。下流の生化学的な分取精製に向けて十分なｃＣＤ１ａ発現が得られる系を創出するために、ｃＣＤ１ａ導入遺伝子をプラスミドへとサブクローニングして哺乳類での薬物選択を可能にすることで、ヒトＨｅＬａ細胞株の基礎環境において安定的にｃＣＤ１ａを産生する２つのクローンの産生させることが可能であった。導入遺伝子の産物は、３Ｃプロテアーゼによる切断に対して感受性であることが再び示された（図３Ａ）。ｃＣＤ１ａタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価では、予想サイズと一致するバンドが、出発材料及び最終溶出物の両方で示されている（図３Ｂ）。
【００３９】
実施例３：抗原の単離
ｃＣＤ１ａタンパク質の抗原結合能力を評価するために、高発現安定クローン５に由来する細胞を、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの可溶化液と共にインキュベートし、ｃＣＤ１ａ  タンパク質を切断して精製した。未処理細胞から収集したｃＣＤ１ａを負の対照とした。この実験ではｃＣＤ１ａタンパク質をＮｉ−ＮＴＡに結合させ、非極性／疎水性溶媒を増加させて使用することでそこから回収した画分を質量分析で評価したところ、マイコバクテリアの脂質抗原のスペクトルが存在し、このスペクトルは抗原処理した群に特有であり、対照試料では観測されないことが明らかとなった（図４）。こうした知見は、現存する方針と比較して、より広範な抗原環境を探索する手段としてのｃＣＤ１ａ系の能力を確認する「概念証明」データを提供しており、３Ｃプロテアーゼ系が、哺乳類細胞表面にディスプレイされたタンパク質の調製手段としての柔軟性を有していることを強調するものである。
【００４０】
実施例４：ｃＣＤ１ａ機能は保存される
野生型ＣＤ１ａ（ｗｔＣＤ１Ａ）、またはＣＤ１ａの細胞外ドメイン及び細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に操作したプロテアーゼ切断部位を含む構築物（ｃＣＤ１Ａ）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ｗｔＣＤ１Ａをトランスフェクトした細胞及びｃＣＤ１Ａ細胞のそれぞれについて、トランスフェクトした２０，０００個のＨｅＬａ細胞を、１０，０００個のＬＣＤ４．Ｇ  Ｔ細胞及び０．００１〜１０μｇ／ｍＬのＬｐｐＸと共に、９６ウェルプレートにおいてインキュベートした。ＬＣＤ４．Ｇは、リポタンパク質であるＬｐｐＸ抗原を認識する能力を有するＣＤ１ａ拘束性のＴ細胞クローンである。１０％のヒト血清を含むＲＰＭＩ培地において細胞をインキュベートした。ＬＣＤ４．Ｇ細胞及びＬｐｐＸと共にインキュベートしたトランスフェクト未実施のＨｅＬａ細胞を負の対照として使用した。インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）の産生は、ＥＬＩＳＡによって監視した。ｃＣＤ１ＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞は、ｗｔＣＤ１ａをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞と同程度のＩＮＦ−γ産生誘導能力を有しており、リポタンパク質であるＬｐｐＸの濃度上昇に伴ってＩＮＦ−γの濃度上昇を誘導した（図５）。負の対照は、認識可能量のＩＮＦ−γを全く誘導しなかった。こうした結果は、ｃＣＤ１ＡがＴ細胞に対する抗原提示能力を有していることを示唆している。
【００４１】
参照による援用
本明細書に引用される米国特許、米国公開特許出願、外国特許、外国特許出願、及び他の刊行物はすべて、参照によって本明細書に援用される。
【００４２】
同等形態
当業者であれば、単に日常の実験方法を使用するだけで、本明細書に記載の発明の特定の実施形態に対する多くの同等形態を認識または思いつくことが可能であろう。そのような同等形態は、下記の特性を有し得るものである。
【図１】
2018515126.tif 000003
【図２】
2018515126.tif 000004
【図３】
2018515126.tif 000005
【図４】
2018515126.tif 000006
【図５】
2018515126.tif 000007
【配列表】
2018515126000001.app
【国際調査報告】
2018515126.tif 000008
2018515126.tif 000009