(57)【要約】  本発明は、変異型Fc領域を含み、かつ親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を示すポリペプチドに関し、前記Fc領域が2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N、及び394Pから選択される1個の変異、並びに(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F 255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、379A、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、333G、339T、349S、325S、334N、334R、336T、340E、343S、345G、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nから選択される少なくとも1個の変異から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする。本発明はまた、そのようなポリペプチドの使用、それを含む組成物、及びそのようなポリペプチドを調製するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型Fc領域を含み、かつ親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を有するポリペプチドであって、前記Fc領域が、2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)307N、326E、326T、334N、334R、352L、378V、378T、394P、396L、397M、421Tの中から選択される1個の変異、並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
変異(i)が378V、396L、及び397Mの中から選択されることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
248E、326T、333G、及び423Yの中から選択される変異を更に含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Fc領域によって媒介される前記機能活性が、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、補体依存性細胞傷害性(CDC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、及びこれらの活性の少なくとも2つの組合せの中から選択されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
親ポリペプチドの機能活性と比較して増加している、Fc領域によって媒介される機能活性を有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
親ポリペプチドの機能活性と比較して、少なくとも2、好ましくは5より高く、好ましくは10より高く、好ましくは15より高く、好ましくは20より高く、好ましくは25より高く、好ましくは30より高い比率で増加している、Fc領域によって媒介される機能活性を有することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
親ポリペプチドの機能活性と比較して低下している、Fc領域によって媒介される機能活性を有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
親ポリペプチドの機能活性と比較して、少なくとも2、好ましくは5より高く、好ましくは10より高く、好ましくは15より高く、好ましくは20より高く、好ましくは25より高く、好ましくは30より高い比率で低下している、Fc領域によって媒介される機能活性を有することを特徴とする、請求項1〜4又は7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記変異型Fc領域が、C1q補体、並びにFcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)、及びFcgRIIb(CD32b)受容体の中から選択される、Fc領域の受容体(FcR)のうちの少なくとも1つに対する、改変された親和性を有することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記変異型Fc領域が、C1q補体、並びにFcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)、及びFcgRIIb(CD32b)受容体の中から選択される、Fc領域の受容体(FcR)のうちの少なくとも1つに対する、向上した親和性を有することを特徴とする、請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記変異型Fc領域が、C1q補体、並びにFcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)、及びFcgRIIb(CD32b)受容体の中から選択される、Fc領域の受容体(FcR)のうちの少なくとも1つに対する、低下した親和性を有することを特徴とする、請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記変異型Fc領域が、親ポリペプチドと比較して2〜20個の変異、好ましくは2〜10個の変異を含むことを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記変異型Fc領域が、C1q補体に対する向上した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが
i)378V、378T、396L、421T、334R、及び326Eの中から選択される1個の変異;並びに
ii)361H、290E、316D、248E、410R、421T、334R、394P、307P、447N、378V、284L、421T、396L、286I、315D、及び397Mの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜10又は12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記変異型Fc領域が、FcgRIIIa受容体(CD16a)に対する向上した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、326E、397M、334N、及び396Lの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、397M、334N、248E、231V、246R、336T、421T、361H、366A、439R、290E、394P、307P、378V、378T、286I、286Y、及び298Nの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜10又は12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記変異型Fc領域が、FcgRIIa受容体(CD32a)に対する増加した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、326E、397M、307N、394P、326T、396L、及び334Nの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、334R、334N、323I、231V、246R、336T、378T、286Y、286I、352S、383R、359A、421T、361H、315D、366A、290E、307P、及び439Rの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜10又は12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記変異型Fc領域が、FcgRIIb受容体(CD32b)に対する増加した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)326E、326T、378V、397M、352L、394P、396L、及び421Tの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、334R、248E、334N、418P、231V、320E、402D、359A、383R、421T、及び361Hの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜10又は12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記変異型Fc領域が、増加したCDC活性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、378T、396L、421T、334R、及び326Eの中から選択される1個の変異;並びに
ii)361H、290E、316D、248E、410R、421T、334R、394P、307P、447N、378V、284L、421T、396L、286I、315D、及び397Mの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜6又は12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記変異型Fc領域が、増加したADCC活性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、326E、397M、334N、及び396Lの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、397M、334N、248E、231V、246R、336T、421T、361H、366A、439R、290E、394P、307P、378V、378T、286I、286Y、及び298Nの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜6又は12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記変異型Fc領域が、3個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N、及び394Pの中から選択される1個の変異;並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも2個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とし、好ましくは、前記変異型Fc領域が、4個の変異の組合せを含み、前記組合せが、少なくとも1個の変異(i)及び少なくとも3個の変異(ii)を含み、好ましくは、前記変異型Fc領域が、5個の変異の組合せを含み、前記組合せが、少なくとも1個の変異(i)及び少なくとも4個の変異(ii)を含むことを特徴とする、請求項1〜18のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
親ポリペプチドが、ヒトFc領域、好ましくはヒトIgG1又はヒトIgG2のFc領域である親Fc領域を含むことを特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
単離されたFc領域、単離されたFc領域に由来した配列、抗体、及びFc領域を含む融合タンパク質の中から選択されることを特徴とする、請求項1〜20のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
Fc領域からなることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
抗体であることを特徴とする、請求項1〜22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
トランスジェニック動物の乳において産生されたポリペプチドであることを特徴とする、請求項1〜23のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
組成物の精製ポリペプチドが、それらのAsn297グリコシル化部位において、65%未満、好ましくは50%未満、より好ましくは40%未満のフコシル化率を有するN-グリカンを有することを特徴とする、請求項1〜24のいずれか一項に記載のポリペプチドの組成物。
【請求項２６】
組成物の精製ポリペプチドが、それらのAsn297グリコシル化部位において、非介在性末端マンノース及び/又は末端N-アセチルグルコサミンを有する、短い鎖、低いシアリル化を伴った二分岐型のグリカン構造を有することを特徴とする、請求項25に記載のポリペプチドの組成物。
【請求項２７】
組成物の精製ポリペプチドが、G0+G1+G0F+G1F型について60%より高い含有量を有し、G0F+G1F型についての含有量が50%未満であることを特徴とする、請求項26に記載のポリペプチドの組成物。
【請求項２８】
組成物の精製ポリペプチドが、G0+G1+G0F+G1F型について60%より高い含有量を有し、フコース含有量が65%未満であることを特徴とする、請求項26に記載のポリペプチドの組成物。
【請求項２９】
組成物の精製ポリペプチドが、G1F+G0F型について40%未満の含有量を有することを特徴とする、請求項26に記載のポリペプチドの組成物。
【請求項３０】
(i)請求項1〜24のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項25〜29のいずれか一項に記載の組成物、及び(ii)少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３１】
医薬品としての使用のための、請求項1〜24のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項25〜29のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、毒素、膜結合型又は循環型膜、膜受容体の中から選択される抗原に対する、請求項23に規定の抗体。
【請求項３３】
癌処置における使用のための、腫瘍抗原に対する、請求項32に記載の抗体。
【請求項３４】
ウイルス感染の処置における使用のための、ウイルス抗原に対する、請求項32に記載の抗体。
【請求項３５】
細菌感染の処置における使用のための、細菌毒素に対する、請求項32に記載の抗体。
【請求項３６】
炎症性疾患及び/又は自己免疫疾患の処置における使用のための、サイトカインに対する、請求項32に記載の抗体。
【請求項３７】
Fc領域を含み、かつ親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を有するポリペプチドを作製するための方法であって、前記方法が、2個の変異の少なくとも1つの組合せを導入する工程を含み、前記組合せが、
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N、及び394Pの中から選択される1個の変異;並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする、方法。
【請求項３８】
受容体C1q、FcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)、及びFcgRIIb(CD32b)の中から選択される、Fc領域の受容体(FcR)のうちの少なくとも1つとの、Fc領域を含むポリペプチドの結合を増加させるための方法であって、前記方法が、2個の変異の少なくとも1つの組合せを導入する工程を含み、前記組合せが、
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N、及び394Pの中から選択される1個の変異;並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型Fc領域を含み、かつ親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を有するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、重鎖と軽鎖の四量体で形成される。2つの軽鎖は同一であり、2つの重鎖は、同一で、かつジスルフィド架橋によって連結されている。重鎖の5つの型(α、γ、δ、ε、μ)があり、それらは、免疫グロブリンクラス(IgA、IgG、IgD、IgE、IgM)を決定する。軽鎖グループは、2つのサブタイプ:λ及びκを含む。
【０００３】
IgGは、血液及び他の体液に見出すことができる可溶性抗体である。IgGは、2つの重鎖及び2つの軽鎖で構成される、約150kDaの分子量をもつY形糖タンパク質である。各鎖は、定常領域及び可変領域によって特徴づけられる。重鎖の2つのカルボキシ末端ドメインはFc断片を形成し、一方、重鎖及び軽鎖のアミノ末端ドメインは、抗原を認識し、Fab断片として知られている。
【０００４】
Fc融合タンパク質は、抗体Fc断片と、所定の治療標的に対する特異性を提供するタンパク質ドメインとの組合せにより作製される。例は、Fc断片と、全ての型の治療用タンパク質又はその断片との組合せである。
【０００５】
治療抗体及びFc融合タンパク質は、現在、リウマチ性多発関節炎、乾癬、多発性硬化症、及び多数の型の癌等の様々な疾患を処置するために用いられている。治療抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、単一の抗原に対し同一の特異性を示す固有の抗体細胞産生系から得られる。治療用Fc融合タンパク質は、自己免疫疾患に対する医薬品として用いられ、又は開発されており、それらは、例えば、エタネルセプト(Amgen社製のEnbrel、Fc断片に連結したTNF受容体)又はアレファセプト(Biogen Idec社製のAmevive:ヒトIgG1のFc部分に連結したLFA-3)である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO02/038756
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Maryland、1991
【非特許文献２】Pierce Chemical Company社のカタログ、2005〜2006、technical section on cross-linking agents、321〜350頁
【非特許文献３】Poul MAら、Eur J. Immunol 25 (7): 2005〜2009頁、1995
【非特許文献４】Mondonら、J. Biotechnol 21: 76〜82頁(2007)
【非特許文献５】Emondら、Protein Eng Des Sel 21:267〜274頁、(2008)
【非特許文献６】Smith GP、Science 228: 1315頁(1985)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗体及びFc融合タンパク質がそれらの効果を発揮することができるように、Fc断片は、可能な限り最良の活性(例えば、抗体依存性細胞傷害性、補体依存性細胞傷害性、又は抗体依存性細胞貪食性)を有しなければならない。すなわち、それは最適化される。前記最適化により、向上した活性及び/若しくは効力、並びに/又は低下した副作用を有するタンパク質を得ることが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本出願人は、これ以降、向上した活性を有する特定のFc断片を開発した。これらの断片を、治療に用いて、それを含有する製造物に、向上した効力を与えることができる。
【００１０】
したがって、本発明は、Fc領域によって媒介される機能活性に関連した、最適化された性質を有する、親ポリペプチドのバリアントを提供する。本発明は、変異型Fc領域を含み、かつ親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を有するポリペプチドであって、前記Fc領域が、G316D、K326E、N315D、N361H、P396L、T350A、V284L、V323I、P352S、A378V、Y436H、V266M、N421T、G385R、K326T、H435R、K447N、N434K、K334N、V397M、E283G、A378T、F423L、A431V、F423S、N325S、P343S、K290E、S375R、F405V、K322E、K340E、N389S、F243I、T307P、N389T、S442F、K248E、Y349H、N286I、T359A、S383R、K334R、T394P、V259A、T393A、P352L、Q418P、V302A、L398P、F423P、S442P、V363I、S383N、S254F、K320E、G402D、I253F、V284A、A431T、N315H、Y319H、C226Y、F405L、T393I、N434S、R255W、A287T、N286Y、A231V、K274R、V308G、K414R、M428T、E345G、F243L、P247T、Q362R、S440N、Y278H、D312G、V262A、V305A、K246R、V308I、E380G、N276S、K439Q、S267G、F423Y、A231T、K320R、L410R、K320M、V412M、T307N、T366A、P230S、Y349S、A339T、K246E、K274E、A231P、I336T、S298N、L234P、S267N、V263A、E333G、V308A、K439R、K392R、S440G、V397I、I336V、Y373D、K288E、L309P、P227S、V379A、K288R、K320T、V282A、I377T、N421S及びC261Rの中から選択される少なくとも1個の変異を含み、ナンバリングはEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングである、ポリペプチドに関する。前記ポリペプチドは、本出願において「本発明のポリペプチド」と呼ばれる。
【００１１】
より具体的には、本発明は、変異型Fc領域を含み、かつ親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を有するポリペプチドであって、前記Fc領域が、2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)307N、326E、326T、334N、334R、352L、378V、378T、394P、396L、397M、及び421Tの中から選択される1個の変異、
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする、ポリペプチドに関する。好ましくは、変異(i)は、378V、396L、及び397Mの中から選択される。好ましくは、ポリペプチドはまた、248E、326T、333G、及び423Yの中から選択される変異を含む。
【００１２】
好ましくは、本発明の変異(ii)は、226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
この本出願を通して、Fc領域における残基のナンバリングは、EUインデックス又はKabatら(Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Maryland、1991)における相当物に従った、免疫グロブリン重鎖のナンバリングである。表現「EUインデックス又はKabat相当物」は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4抗体の残基のEUナンバリングを指す。これは、IMGTウェブサイト(http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html)上に見出すことができる。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」とは、少なくとも100個の共有結合したアミノ酸を含む配列を意味する。
「アミノ酸」とは、20個の天然アミノ酸又は非天然類似体のうちの1個を意味する。用語「位置」は、ポリペプチドの配列における位置を意味する。Fc領域について、位置は、EUインデックス又はKabat相当物に従ってナンバリングされる。
用語「抗体」は、それの一般的な意味で用いられる。それは、少なくとも1個のFc領域及び2個の可変領域を含む四量体に対応する。抗体は、特に、完全長免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全にヒトの抗体を含む。各重鎖のアミノ末端部分は、約100〜110個のアミノ酸で、抗原の認識を担う可変領域を含む。各可変領域において、3個のループが一緒になって、抗原への結合部位を形成する。ループのそれぞれは、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる。各重鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を定義する。
IgGは、いくつかのサブクラス、特に、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を有する。IgMサブクラスは、特に、IgM1及びIgM2である。したがって、「アイソタイプ」とは、それらの定常領域の化学的及び抗原的特性によって定義される免疫グロブリンサブクラスの1つを意味する。ヒト免疫グロブリンの既知のアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、lgA2、IgM1、lgM2、IgD、及びIgEである。
完全長IgGは、四量体であり、2個の免疫グロブリン鎖の2つの同一の対で構成され、各対が軽鎖及び重鎖を有し、各軽鎖がVL及びCLドメインを含み、各重鎖がドメインVH、Cγ1(CH1とも呼ばれる)、Cγ2(CH2とも呼ばれる)、及びCγ3(CH3とも呼ばれる)を含む。ヒトIgG1について、EUインデックス又はKabat相当物において、「CH1」は位置118〜215を指し、「CH2」は位置231〜340を指し、「CH3」は位置341〜447を指す。IgGの重鎖はまた、IgG1について位置216〜230を指すN末端可動性ヒンジ領域も含む。下部のヒンジ領域は、EUインデックス又はKabat相当物において、位置226〜230を指す。
「可変領域」とは、κ鎖、λ鎖、及び重鎖の免疫グロブリン鎖をそれぞれ構成する、遺伝子Vκ、Vλ、及び/又はVHのいずれかにより実質的にコードされる1つ又は複数のIgドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。可変領域は、相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を含む。用語「Fc」又は「Fc領域」は、第1の免疫グロブリン定常領域ドメイン(CH1)を除く、抗体の定常領域を表す。したがって、Fcは、IgG1定常領域の最後の2つのドメイン(CH2及びCH3)、及びこれらのドメインのN末端可動性ヒンジを指す。ヒトIgG1について、Fc領域は、EUインデックス又はKabat相当物においてのようにナンバリングされた、残基C226からそれのカルボキシ末端まで、すなわち、位置226〜447における残基に対応する。用いられるFc領域は、EUインデックス又はKabat相当物において、位置216〜226の間に位置する上部ヒンジ領域の部分を更に含み得る;この場合、用いられるFc領域は、EUインデックス又はKabat相当物においてのようにナンバリングされた、位置216〜447、217〜447、218〜447、219〜447、220〜447、221〜447、222〜447、223〜447、224〜447、又は225〜447における残基に対応する。好ましくは、この場合、用いられるFc領域は、EUインデックス又はKabat相当物においてナンバリングされた位置216〜447における残基に対応する。
好ましくは、用いられるFc領域は、配列番号1〜10の配列の中から選択される。
【００１４】
「親ポリペプチド」とは、参照ポリペプチドを意味する。前記親ポリペプチドは、天然又は合成起源であり得る。本発明の関連内において、親ポリペプチドは、「親Fc領域」と呼ばれるFc領域を含む。このFc領域は、野生型群Fc領域、それらの断片又は変異体の群の中から選択することができる。好ましくは、親ポリペプチドは、ヒトFc領域、好ましくは、ヒトIgG1のFc領域を含む。親ポリペプチドは、野生型Fc領域と比較して、Fc領域におけるアミノ酸の既存の改変を含み得る(例えば、Fc変異体)。有利には、親ポリペプチドは、単離されたFc領域(すなわち、Fc断片それ自体)、単離されたFc領域に由来する配列、抗体、Fc領域を含む融合タンパク質、又はFcコンジュゲートであり、このリストは非限定的である。「単離されたFc領域に由来する配列」とは、scFc(一本鎖Fc)又は多量体Fc等の、共に連結されている少なくとも2個の単離されたFc領域を含む配列を意味する。「Fc領域を含む融合タンパク質」とは、Fc領域に融合したポリペプチド配列を意味し、前記ポリペプチド配列は、好ましくは、任意の抗体の可変領域、受容体の、それのリガンドへの結合配列、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、及びケモカインの中から選択される。「Fcコンジュゲート」とは、Fc領域のコンジュゲーションパートナーとの化学的カップリングの結果である化合物を意味する。コンジュゲーションパートナーは、タンパク質様又は非タンパク質様であり得る。カップリング反応は、一般的に、Fc領域及びコンジュゲーションパートナー上の官能基を用いる。コンジュゲートの合成に適切であるような様々な結合基が、先行技術において知られている:例えば、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性結合基がよく知られている(Pierce Chemical Company社のカタログ、2005〜2006、technical section on cross-linking agents、321〜350頁参照)。適切なコンジュゲーションパートナーの中では、治療用タンパク質、標識、化学療法剤等の細胞傷害性物質、毒素、及びそれらの活性断片を挙げることができる。適切な毒素及びそれらの断片としては、とりわけ、ジフテリア毒素、エクソトキシンA、リシン、アブリン、サポリン、ゲロニン、カリケアマイシン、オーリスタチンE及びF、並びにメルタンシンが挙げられる。
有利には、親ポリペプチド(及び、それゆえに、本発明のポリペプチド)は、Fc領域からなる。
有利には、親ポリペプチド(及び、それゆえに、本発明のポリペプチド)は、抗体である。
最後に、好ましくは、親ポリペプチド(及び、それゆえに、本発明のポリペプチド)は、トランスジェニック動物の乳において産生されるポリペプチドである。
【００１５】
「変異」とは、ポリペプチドの配列における少なくとも1個のアミノ酸の変化、特に、親ポリペプチドのFc領域における少なくとも1個のアミノ酸の変化を意味する。得られた変異型ポリペプチドは、バリアントポリペプチドである;それは本発明のポリペプチドである。前記ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して変異型Fc領域を含む。好ましくは、変異は、少なくとも1個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失である。「置換」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置での1個のアミノ酸の別のアミノ酸による置き換えを意味する。例えば、置換N434Sは、位置434におけるアスパラギンがセリンに置き換えられているバリアントポリペプチドを指す。「アミノ酸の挿入」又は「挿入」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入G>235-236は、位置235と236の間でのグリシンの挿入を表す。「アミノ酸の欠失」又は「欠失」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置でのアミノ酸の欠失を意味する。例えば、E294delは、位置294でのグルタミン酸の欠失を表す。好ましくは、変異について以下の表示:「434S」又は「N434S」が用いられ、親ポリペプチドが、そのバリアントにおいてセリンに置き換えられる、位置434にアスパラギンを含むことを示す。置換の組合せがある場合には、好ましい型式は以下である:「259I/315D/434Y」又は「V259I/N315D/N434Y」。これは、バリアントにおいて、位置259、315、及び434での3つの置換があること、並びに親ポリペプチドの位置259でのアミノ酸、すなわち、バリンが、イソロイシンに置き換えられていること、親ポリペプチドの位置315でのアミノ酸、すなわち、アスパラギンが、アスパラギン酸に置き換えられていること、並びに親ポリペプチドの位置434でのアミノ酸、すなわち、アスパラギンが、チロシンに置き換えられていることを示す。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を有する。
「Fc領域によって媒介される機能活性」とは、特に、エフェクター機能を意味する。したがって、Fc領域によって媒介される機能活性は、特に、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、補体依存性細胞傷害性(CDC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、エンドサイトーシス活性、サイトカイン分泌、又はこれらの活性の少なくとも2つの組合せを含む。好ましくは、本発明において考慮中のFc領域によって媒介される機能活性は、ADCC、CDC、及びそれらの組合せの中から選択される。この機能活性は、実施例に記載されたもの(特に、実施例の4.4項及び4.5項を参照)等の先行技術においてよく知られた方法を用いて評価することができる。本発明のポリペプチドのFc領域によって媒介される機能活性は、親ポリペプチドの機能活性と比較して増加又は低下している。
【００１７】
第1のバリアントによれば、本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドの機能活性と比較して増加している、Fc領域によって媒介される機能活性を有する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、少なくとも2、好ましくは5より高く、好ましくは10より高く、好ましくは15より高く、好ましくは20より高く、好ましくは25より高く、好ましくは30より高い比率で、親ポリペプチドに対して増加している、Fc領域によって媒介される機能活性を有する。
【００１８】
第2のバリアントによれば、本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドの機能活性と比較して低下している、Fc領域によって媒介される機能活性を有する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、少なくとも2、好ましくは5より高く、好ましくは10より高く、好ましくは15より高く、好ましくは20より高く、好ましくは25より高く、好ましくは30より高い比率で、親ポリペプチドに対して低下している、Fc領域によって媒介される機能活性を有する。
【００１９】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、C1q補体、FcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)、及びFcgRIIb(CD32b)の中から選択される、Fc領域の受容体(FcR)のうちの少なくとも1つに対する、改変された親和性を有する。C1q補体は、CDC活性に関与する。FcgRIIIa受容体(CD16a)はADCCに関与する;それは、位置158においてV/F多型を示す。FcgRIIa受容体(CD32a)は血小板活性化及び貪食に関与する;それは、位置131においてH/R多型を示す。最後に、FcgRIIb受容体(CD32b)は、細胞活性の抑制に関与する。
【００２０】
好ましくは、前記変異型Fc領域は、FcRの少なくとも1つに対する、増加した親和性を有する。好ましくは、親和性は、親Fcの親和性と比較して、少なくとも2、好ましくは5より高く、好ましくは10より高く、好ましくは15より高く、好ましくは20より高く、好ましくは25より高く、好ましくは30より高い比率で増加している。言い換えれば、変異型Fc領域のFcRに対する親和性は、親ポリペプチドの親和性より高い。或いは、前記変異型Fc領域は、FcRの少なくとも1つに対する、低下した親和性を有する。好ましくは、親和性は、親Fcの親和性に対して、少なくとも2、好ましくは5より高く、好ましくは10より高く、好ましくは15より高く、好ましくは20より高く、好ましくは25より高く、好ましくは30より高い比率で低下している。言い換えれば、変異型Fc領域のFcRに対する親和性は、親ポリペプチドの親和性より低い。
Fc領域を含むポリペプチドのFcR親和性は、先行技術においてよく知られた方法で評価することができる。例えば、当業者は、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて親和性(Kd)を決定することができる。或いは、当業者は、適切なELISAアッセイを実施することができる。適切なELISAアッセイは、親Fcの結合力と変異型Fcの結合力の間での比較を可能にする。変異型Fcに特異的な検出シグナルと親Fcに特異的な検出シグナルが比較される。結合親和性は、ポリペプチド全体を評価しようとそれらの単離されたFc領域を評価しようと無関係に、決定することができる。
【００２１】
好ましくは、本発明の変異型Fc領域は、親ポリペプチドと比較して1〜20個の変異、好ましくは2〜20個の変異を含む。「アミノ酸の1〜20個の改変」により、これは、アミノ酸の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、及び20個の変異を包含する。好ましくは、それは、親ポリペプチドに対して、1〜15個の変異、好ましくは2〜15個の変異、好ましくは1〜10個の変異、好ましくは2〜10個の変異を含む。
【００２２】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)378V、396L、及び397Mの中から選択される1個の変異;
(ii)231V、248E、286I、286Y、290E、298N、308A、315D、316D、326E、333G、334N、334R、336T、352S、361H、366A、378T、396L、397M、412M、421T、423Y、及び447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００２３】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)378V、396L、及び397Mの中から選択される1個の変異;
(ii)248E、316D、326E、333G、378T、396L、及び421Tの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００２４】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドのADCC及びCDC機能活性と比較して増加したADCC及びCDC機能活性を有する変異型Fc領域を含み、前記Fc領域が2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)378V、396L、及び397Mの中から選択される1個の変異;
(ii)248E、316D、326E、333G、378T、396L、及び421Tの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする。好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)変異378V;
(ii)298N及び336Tの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００２５】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)378V、396L、及び397Mの中から選択される1個の変異;
(ii)231V、286I、286Y、290E、315D、334N、352S、361H、366A、378T、397M、412M、421T、及び423Yの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００２６】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドのADCC機能活性と比較して増加したADCC機能活性を有する変異型Fc領域を含み、前記Fc領域が2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)378V、396L、及び397Mの中から選択される1個の変異;
(ii)231V、286I、286Y、298N、290E、315D、334N、336T、352S、361H、366A、378T、397M、412M、421T、及び423Yの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする。
【００２７】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)変異378V;
(ii)248E、308A、334R、447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００２８】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドのCDC機能活性と比較して増加したCDC機能活性を有する変異型Fc領域を含み、前記Fc領域が2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)変異378V;
(ii)248E、308A、334R、447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする。
【００２９】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、以下の組合せの中から選択される変異の組合せを含む:
K320E/T394P/G402D
K290E/K320E/T350A/P396L
T359A/S383R/V397M
【００３０】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、C1q補体に対する向上した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、378T、396L、421T、334R、及び326Eの中から選択される1個の変異;並びに
ii)361H、290E、316D、248E、410R、421T、334R、394P、307P、447N、378V、284L、421T、396L、286I、315D、及び397Mの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００３１】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、FcgRIIIa受容体(CD16a)に対する向上した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、326E、397M、334N、及び396Lの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、397M、334N、248E、231V、246R、336T、421T、361H、366A、439R、290E、394P、307P、378V、378T、286I、286Y、及び298Nの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００３２】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、FcgRIIa受容体(CD32a)に対する増加した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、326E、397M、307N、394P、326T、396L、及び334Nの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、334R、334N、323I、231V、246R、336T、378T、286Y、286I、352S、383R、359A、421T、361H、315D、366A、290E、307P、及び439Rの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。好ましくは、変異(ii)は、316D、334R、334N、323I、231V、246R、336T、378T、286Y、286I、352S、383R、359A、421T、361H、366A、290E、307P、及び439Rの中から選択される。
【００３３】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、FcgRIIb受容体(CD32b)に対する増加した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)326E、326T、378V、397M、352L、394P、396L、及び421Tの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、334R、248E、334N、418P、231V、320E、402D、359A、383R、421T、及び361Hの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００３４】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、増加したCDC活性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、378T、396L、421T、334R、及び326Eの中から選択される1個の変異;並びに
ii)361H、290E、316D、248E、410R、421T、334R、394P、307P、447N、378V、284L、421T、396L、286I、315D、及び397Mの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００３５】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、増加したADCC活性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、326E、397M、334N、及び396Lの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、397M、334N、248E、231V、246R、336T、421T、361H、366A、439R、290E、394P、307P、378V、378T、286I、286Y、及び298Nの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００３６】
好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、3個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N、及び394Pの中から選択される1個の変異;並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも2個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
好ましくは、少なくとも2個の変異(ii)は、226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P、及び447Nの中から選択される。
【００３７】
より好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、4個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、上記のような少なくとも1個の変異(i)、及び上記のような少なくとも3個の変異(ii)を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００３８】
より好ましくは、本発明のポリペプチドの変異型Fc領域は、5個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、上記のような少なくとも1個の変異(i)、及び上記のような少なくとも4個の変異(ii)を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
【００３９】
本発明の更なる対象は、本発明のポリペプチドの組成物であり、前記精製ポリペプチドが、それらのAsn297のグリコシル化部位において、65%未満、好ましくは50%未満、より好ましくは40%未満のフコシル化率を有するN-グリカンを有する。好ましくは、前記精製ポリペプチドが、それらのAsn297のグリコシル化部位において、非介在性末端マンノース及び/又は非介在性末端N-アセチルグルコサミンを有する、短い鎖、低いシアリル化を伴った二分岐型のグリカン構造を有する。より好ましくは、前記精製ポリペプチドは、G0+G1+G0F+G1F型について60%より高い含有量を有し、G0F+G1F型についての含有量が50%未満である。より好ましくは、前記精製ポリペプチドは、G0+G1+G0F+G1F型について60%より高い含有量を有し、フコース含有量が65%未満である。
より好ましくは、前記精製ポリペプチドは、G1F+G0F型について40%未満の含有量を有する。
【００４０】
本発明の更なる対象は、(i)本発明のポリペプチド又は前段落に記載されているような組成物、及び(ii)少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００４１】
本発明の更なる対象は、医薬品としての使用のための、本発明のポリペプチド、又は前に記載されているような組成物である。
【００４２】
前に指摘したように、有利には、親ポリペプチドは抗体であり、したがって本発明のポリペプチドも抗体である。この場合、抗体は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、毒素、膜結合型又は循環型サイトカイン、及び膜受容体に対するものであり得る。
抗体が腫瘍抗原に対するものである場合、それは、癌の処置における使用に特に適している。「癌」とは、異常な細胞増殖によって特徴づけられる任意の生理学的状態を意味する。癌の例としては、とりわけ、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫(脂肪肉腫を含む)、神経内分泌腫瘍、中皮腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、及び悪性リンパ性病態が挙げられ、このリストは完全に網羅されているわけではない。
抗体がウイルス抗原に対するものである場合、それは、ウイルス感染の処置における使用に特に適している。ウイルス感染は、特に、HIV、レトロウイルス、コクサッキーウイルス、天然痘ウイルス、インフルエンザウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、又はB型若しくはC型肝炎ウイルスによる感染であり、このリストは完全に網羅されているわけではない。
抗体が毒素に対するものである場合、それは、細菌感染、例えば、破傷風毒素、ジフテリア毒素、炭疽菌(Bacillus anthracis)毒素の感染の処置、又はボツリヌス毒素、リシン毒素、志賀毒素の感染の処置における使用に特に適しており、このリストは完全に網羅されているわけではない。
抗体がサイトカインに対するものである場合、それは、炎症性疾患及び/又は自己免疫疾患の処置における使用に特に適している。炎症性疾患及び/又は自己免疫疾患には、とりわけ、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、移植片又は移植拒絶、移植片対宿主病、リウマチ性多発関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、様々な型の硬化症、原発性シェーグレン症候群(又はグージュロー・シェーグレン症候群(Gougerot-Sjogren syndrome)、多発性硬化症等の自己免疫性多発ニューロパチー、I型糖尿病、自己免疫性肝炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、痛風関節炎、セリアック病、クローン病、慢性橋本甲状腺炎(甲状腺機能低下症)、アジソン病、自己免疫性肝炎、バセドー氏病(甲状腺機能亢進症)、潰瘍性大腸炎、ANCA関連全身性血管炎等の血管炎(抗好中球細胞質自己抗体)、自己免疫性急性又は慢性血小板減少症等の成人及び子どもにおける自己免疫性血球減少症及び他の血液系の合併症、自己免疫性溶血性貧血、新生児溶血性疾患(HDN)、寒冷凝集素症、自己免疫性後天性血友病;グッドパスチャー症候群、膜性腎症、自己免疫性皮膚水疱性障害、治療抵抗性筋無力症、混合性クリオグロブリン血症、乾癬、若年性関節リウマチ、炎症性筋炎、皮膚筋炎、並びに小児性抗リン脂質症候群を含む子どもにおける全身性自己免疫性障害、結合組織疾患、自己免疫性肺炎症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、自己免疫性甲状腺炎、真性糖尿病(mellitis)、重症筋無力症、自己免疫性の眼の炎症性疾患、視神経脊髄炎(デビック病)、強皮症、天疱瘡、インスリン抵抗性による糖尿病、多発性筋炎、ビールメル(Biermer)貧血、糸球体腎炎、ウェゲナー病、ホートン病、結節性多発性動脈炎(PAN)及びチャーグ・ストラウス症候群、スチル病、萎縮性多発性軟骨炎、ベーチェット病、単クローン性免疫グロブリン血症、ウェゲナー肉芽腫症、ループス、出血性結腸大腸炎、乾癬性関節炎、サルコイドーシス、コラーゲン形成大腸炎、疱疹状皮膚炎、家族性地中海熱、IgA沈着を伴う糸球体腎炎、ランバート・イートン筋無力症症候群、交感性眼炎、Fiessinger-Leroy-Reiter症候群、並びにぶどう膜髄膜脳炎症候群が挙げられる。他の炎症性疾患もまた含まれ、例えば、
急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性敗血症性関節炎、アジュバント関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性血管炎、アレルギー、喘息、アテローム性動脈硬化症、慢性細菌又はウイルス感染による慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、冠疾患、脳炎、小腸炎症性疾患、炎症性骨溶解症、急性及び遅延性過敏症反応に関連した炎症、腫瘍に関連した炎症、末梢神経損傷又は脱髄性疾患、火傷及び虚血等の組織外傷に関連した炎症、髄膜炎による炎症、多臓器不全症候群(MODS)、肺線維症、敗血症及び敗血症性ショック、スティーブンス・ジョンソン症候群、未分化型関節炎、並びに未分化型脊椎関節症である。
【００４３】
本発明の特定の一実施形態において、自己免疫疾患は、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)である。
【００４４】
本発明の更なる対象は、Fc領域を含み、かつ親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を有するポリペプチドを作製するための方法であり、前記方法が、G316D、K326E、N315D、N361H、P396L、T350A、V284L、V323I、P352S、A378V、Y436H、V266M、N421T、G385R、K326T、H435R、K447N、N434K、K334N、V397M、E283G、A378T、F423L、A431V、F423S、N325S、P343S、K290E、S375R、F405V、K322E、K340E、N389S、F243I、T307P、N389T、S442F、K248E、Y349H、N286I、T359A、S383R、K334R、T394P、V259A、T393A、P352L、Q418P、V302A、L398P、F423P、S442P、V363I、S383N、S254F、K320E、G402D、I253F、V284A、A431T、N315H、Y319H、C226Y、F405L、T393I、N434S、R255W、A287T、N286Y、A231V、K274R、V308G、K414R、M428T、E345G、F243L、P247T、Q362R、S440N、Y278H、D312G、V262A、V305A、K246R、V308I、E380G、N276S、K439Q、S267G、F423Y、A231T、K320R、L410R、K320M、V412M、T307N、T366A、P230S、Y349S、A339T、K246E、K274E、A231P、I336T、S298N、L234P、S267N、V263A、E333G、V308A、K439R、K392R、S440G、V397I、I336V、Y373D、K288E、L309P、P227S、V379A、K288R、K320T、V282A、I377T、N421S及びC261Rの中から選択される少なくとも1個の変異を前記Fc領域において導入する工程を含み、ナンバリングはEUインデックス又はKabat相当物である。
【００４５】
好ましくは、本発明の対象は、Fc領域を含み、かつ親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を有するポリペプチドを作製するための方法であり、前記方法が、2個の変異の少なくとも1つの組合せを導入する工程を含み、前記組合せが、
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N、及び394Pの中から選択される1個の変異;並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P、及び447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
好ましくは、変異(ii)は、226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P、及び447Nの中から選択される。
【００４６】
本発明の更なる対象は、受容体C1q、FcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)、及びFcgRIIb(CD32b)の中から選択される、Fc領域の受容体(FcR)のうちの少なくとも1つとの、Fc領域を含むポリペプチドの結合を増加させるための方法であり、前記方法が、G316D、K326E、N315D、N361H、P396L、T350A、V284L、V323I、P352S、A378V、Y436H、V266M、N421T、G385R、K326T、H435R、K447N、N434K、K334N、V397M、E283G、A378T、F423L、A431V、F423S、N325S、P343S、K290E、S375R、F405V、K322E、K340E、N389S、F243I、T307P、N389T、S442F、K248E、Y349H、N286I、T359A、S383R、K334R、T394P、V259A、T393A、P352L、Q418P、V302A、L398P、F423P、S442P、V363I、S383N、S254F、K320E、G402D、I253F、V284A、A431T、N315H、Y319H、C226Y、F405L、T393I、N434S、R255W、A287T、N286Y、A231V、K274R、V308G、K414R、M428T、E345G、F243L、P247T、Q362R、S440N、Y278H、D312G、V262A、V305A、K246R、V308I、E380G、N276S、K439Q、S267G、F423Y、A231T、K320R、L410R、K320M、V412M、T307N、T366A、P230S、Y349S、A339T、K246E、K274E、A231P、I336T、S298N、L234P、S267N、V263A、E333G、V308A、K439R、K392R、S440G、V397I、I336V、Y373D、K288E、L309P、P227S、V379A、K288R、K320T、V282A、I377T、N421S及びC261Rの中から選択される少なくとも1個の変異を前記Fc領域において導入する工程を含み、ナンバリングはEUインデックス又はKabat相当物である。
【００４７】
好ましくは、本発明の対象は、受容体C1q、FcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)、及びFcgRIIb(CD32b)の中から選択される、Fc領域の受容体(FcR)のうちの少なくとも1つとの、Fc領域を含むポリペプチドの結合を増加させるための方法であり、前記方法が、2個の変異の少なくとも1つの組合せを導入する工程を含み、前記組合せが
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N、及び394Pの中から選択される1個の変異;並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする。
好ましくは、変異(ii)は、226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される。
【００４８】
本出願において記載された配列は、以下の通り、要約することができる:
【００４９】
【表１】
2018515446.tif 000002
【００５０】
本発明は、以下の実施例を読むことにより、より良く理解されるだろう。
【実施例】
【００５１】
(実施例1)
本発明の変異型Fc領域を有するポリペプチドの同定及び前記ポリペプチドの特徴づけ
1.  材料及び方法
1.  ヒトFc領域のバンクの構築
アミノ酸226〜447(EUインデックス又はKabat相当物)、すなわち、ヒトIgG1の重鎖に由来し、かつアロタイプG1m1,17を有するFc領域を含むポリペプチド(配列番号1)をコードするヒトFc遺伝子(Poul MAら、Eur J. Immunol 25 (7): 2005〜2009頁、1995)を、標準PCRプロトコールに従って、BamHI/EcoRI断片としてファージミドベクターpMG58(pMG58_Fc226)においてクローニングした。いくつかの完全にランダム化されたバンクを、MUTAGEN(商標)方法(WO02/038756)(低忠実度ヒトDNAポリメラーゼ(ムターゼ)を用いて、標的配列全体において均一にランダム変異を導入する)を適用して作製した。3つの異なるムターゼ(pol β、pol η、及びpol ι)を異なる条件下で用いることにより、相補的な変異プロファイルが生じた。これらのヒトポリメラーゼを、前に記載されているように(Mondonら、J. Biotechnol 21: 76〜82頁(2007)、Emondら、Protein Eng Des Sel 21:267〜274頁、(2008))、産生し、精製した。
【００５２】
1.1  MUTAGEN(商標)方法での変異誘発
MUTAGEN(商標)方法は、出願WO02/038756に記載された。
簡潔に述べれば、ヒトFc遺伝子(Fc遺伝子)を、5'プライマーMG_619: 5'-AGTACTGACTCTACCTAGGATCCTGCCCACCGTGC-3'(配列番号11)及び3'プライマーMG_621: 5'-ACTGCTCGATGTCCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-3'(配列番12)を用いて、ムターゼで複製した。モデルとしてのpMG58_Fc226プラスミド(野生型Fc領域又は選択されたバリアント)の0.6μg、プライマーMG_619及びMG_621(各250nM)、並びに適切な複製バッファー(下記の詳細を参照)を含有する混合物を、95℃で5分間、処理し、すぐに、4℃へ冷却して、DNA鎖を変性した。pol βについて、複製バッファーは、50mM Tris HCl pH8.8、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM DTT、及び1%(v/v)グリセロールであった。pol η(又はpol η及びpol ι)についての複製バッファーは、25mM Tris HCl pH7.2、5mM MgCl2、10mM KCl、1mM DTT、及び2.5%(v/v)グリセロールであった。変性工程後、50μM ATP/dCTP、100μM dTTP/dGTP、並びに1μgのpol β又は100μMのdNTP及び1μgのpol η(又はpol η及びpol ι、1μgの各ムターゼ)を加えることにより変異原性複製が得られた。複製反応を、37℃で2時間、行った。続いて、複製産物をMicroconカラム(Millipore社)において濃縮及び脱塩した。
【００５３】
1.2.  変異型断片の選択的増幅及びクローニング
前に得られた複製産物を、テールプライマーでの選択的PCRによって増幅した。プライマー(MG_619 MG_621)を、モデルに非相補的であるテールを有するように設計し、ムターゼにより合成されたDNA断片の特異的増幅を可能にした。複製産物の1つの画分を、PCRバッファー(20mM Tris HCl pH8.4、50mM KCl)、1.5mM MgCl2、10pmolの5'及び3'プライマー、200pMのdNTP、並びに1.25UのPlatinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を含有する混合物に加えた。PCRサイクルは以下であった:94℃で2分間、64℃で10秒間、75℃で30秒間、94℃で1分間の最初のサイクル、続いて94℃で20秒間及び75℃で30秒間の30回の選択的サイクル。
【００５４】
増幅された複製産物を、1%(w/v)のアガロースゲル上で精製し、BamHI及びEcoRIで消化し、pMG58ベクターにおいてクローニングした。ライゲーション混合物を、大腸菌(E. Coli)XL1-Blueエレクトロコンピテントセルにおいて形質転換し、100μg/mlのアンピシリン及び1%(w/v)グルコースを加えた固形2YT培地(16g/lペプトン、10g/l酵母抽出物、5g/l NaCl、15g/l寒天)の上に広げた。増殖後、コロニーの数を決定して、バンクのサイズを推定し、バンクあたり少なくとも48個のクローンを、PCR及び高速DNAシーケンシング(fast DNA sequencing)に供した。細胞を、15%グリセロールを含む2YT培地中に再懸濁し、凍結し、-80℃で保存した。
【００５５】
1.3.  Mut3バンクの構築
野生型Fc遺伝子においてpol βを用いて、第1のバンクが得られ、3.2×106個のクローン(Mut1.1と呼ぶ)を含有していた。この第1のバンクのDNAを用いて、第2及び第3のバンクを、それぞれ、pol β(3.8×106個のクローン、Mut1.2)、並びにpol η及びι(3.0×106個のクローン、Mut1.3)を使用して、作製した。2つの蓄積された複製工程を有するこのストラテジーは、変異率の増加を可能にした。野生型Fc遺伝子へpol ηのみを用いて、第4のバンク(1.0×106個のクローン、Mut1.4)が得られた。最後に、これらの4つのバンクを、比例的に混合し、1.1×107個の異なるクローンを表す、Mut1と呼ばれる最終バンクが得られた。
【００５６】
その後、FcRn受容体において単離された単一変異体及び二重変異体のDNAプールを用いて、2つの異なるバンクを構築した。pol βを用いて第1のバンク(1.9×107個のクローン、Mut2.1)、及びpol ηを用いて第2のバンク(1×106個のクローン、Mut2.2)が得られた。最後に、これらの2つのバンクを比例的に混合して、Mut2と呼ばれる最終バンク、すなわち、2×107個の異なるクローンが得られた。
【００５７】
野生型Fc遺伝子においてpol βを用いて、4.7×107個のクローンの多様性を有する新しいバンクが得られた。
【００５８】
最後に、バンクMut1、Mut2、及び新しいバンクを比例的に混合して、Mut3と呼ばれる最終バンク、すなわち、7.8×107個の異なるクローンが得られた。
Mut3バンクは、最終的に、Fcあたり平均2.2個の変異型アミノ酸を有する、フェーズが揃った3×107個の変異型クローンを含有していた。
【００５９】
1.4.  Mut4selバンクの構築
Mut3バンクから選択された、C1q及び/又はCD16aVとの結合が向上した36個のクローンからFcバリアントのバンクを構築した(平均して、Fcあたり1.6個の変異型アミノ酸)。(pol βの複製バッファー中)pol β及びpol ηポリメラーゼの等モル混合物を用いてMut4バンクが得られた。Mut4バンクは、1.3×107個のクローンの多様性を有し、77%のクローンでフェーズが揃っており、Fcあたり平均2.6個の変異型アミノ酸を有する。このバンクをpMG93ベクター(β-ラクタマーゼの遺伝子との融合を通してアンピシリン培地上でコード配列(ORF)の選択を可能にする、Fc用に開発された選択ベクター)においてクローニングした。この構築物を、非抑制性細菌HB2151(この菌株において停止コドンであることが知られているTAGコドンの除去を可能にした)において形質転換した。このバンクのクローンを、少量のアンピシリンを含有する寒天培地のディッシュに低密度で表面塗抹し、ORFの選択を行い、その後、生存クローンを回収し、凍結した。500個のペトリディッシュ(120×120)に表面塗抹することにより、Mut4バンク全体の網羅が可能になった。このように選択されたバンクは、Mut4selと称され、フェーズが揃った92%のクローン、すなわち、フェーズが揃った1×107個のクローンを含有し、Fcあたり平均2.5個の変異型アミノ酸を有していた。その後、Mut4selバンクを、標的上の「ファージディスプレイ」による選択を可能にするために、XL1-Blue細菌におけるファージミドpMG58にサブクローニングした。
【００６０】
1.5.  Mut5バンクの構築
Mut4selバンクから選択された、C1q及び/又はFcgR受容体の1つとの結合が向上した42個のクローンからFcバリアントのバンクを構築した(平均してFcあたり2.4個の変異型アミノ酸)。低変異率を得るために、ポリメラーゼpol βのみを用いてMut5バンクが得られた。最終的に、得られたMut5バンクは、95%のクローンでフェーズが揃っており、Fcあたり平均3.1個の変異型アミノ酸を有する、1.2×107個のクローンを含有していた。このバンクは、その良い質により、Mut4バンクについて必要とされたようなORFの選択を必要としなかった。
【００６１】
2.  Fcバンクのファージディスプレイ発現及び向上したバリアントの選択
選択工程において、バンクMut3、Mut4sel、及びMut5を、標準手順(Smith GP、Science 228: 1315頁(1985))に従って、M13バクテリオファージの表面上に発現させた。pMG58ベクターにおいてクローニングされた発現されるべきバンクを含有する、大腸菌XL1-Blue細菌を、100μg/mlアンピシリン、15μg/mlテトラサイクリン、及び1%(w/v)グルコースを加えた60mlの2YT培地中、30℃で培養した。その後、細胞に、補助ファージM13(M13K07、Biolabs社、細菌/ファージ比=1:3)を37℃で20分間、感染させ、Fcファージの産生を、0.5mM IPTG及び50μgカナマイシン/mlを含む2YT/アンピシリン/グルコース、230rpm、26℃で一晩、継続した。次の日、ファージを、標準手順に従って、PEG6000で沈殿させ、1mlのPBSバッファー、pH7.4中に再懸濁し、XL1-Blue細胞を感染させることにより滴定した。
【００６２】
2.1  用いられる組換えタンパク質:
C1q補体は市販されている(Calbiochem社)。
【００６３】
CD16aはFcとの結合部位における位置158にV/F多型を有するアクチベーター受容体である。親和性はCD16aVで向上している。
CD16aVは市販されている(R&D system社)。
CD16aFは、PX'Therapeutics社により製造された。
【００６４】
CD32aはFcとの結合部位における位置131にH/R多型を有するアクチベーター受容体である。親和性はCD32aHで向上している。
CD32aRは市販されている(R&D system社)。
CD32aHはPX'Therapeutics社により製造された。CD32bは、CD32aRより低い、IgG1に対する親和性を有するインヒビター受容体である。それは市販されている(R&D system社)。
【００６５】
2.2.  固相選択:
固相選択について、PBS/5%スキムミルク/0.1% Tween 20中に希釈されたFc-ファージを、あらかじめ、500ng/ウェルのCD16aV、ビオチン化CD16aV、ビオチン化CD16aF、ビオチン化C1q、ビオチン化CD32aR、又はビオチン化CD32bでコーティングされ、かつPBS中5%スキムミルクでブロッキングされたMaxisorpプレート(最終100μl中、1〜4×1011個のファージ/ウェル)の8ウェルにおいてインキュベートした。37℃で2時間のインキュベーション後、ウェルを、PBS/0.1% Tween 20で8回、及びPBSで2回、洗浄した。CD32aR及びCD32bに関する選択について、対抗選択ラウンドも行った:Maxisorpプレート上に固定化された標的への結合工程の前に、Fc-ファージを、競合受容体と、8ウェルにおいて類似した様式でプレインキュベートした。その後、第1の標的上の結合していないFc-ファージのみを、前に記載されているように、第2の標的を含有するウェルへ移した。選択されたファージを、指数増殖期中のXL1-Blue細菌への感染(2×150μl/ウェル、37℃で20分間、振盪なし)により溶出した。感染した細菌を、固形2YT/アンピシリン/グルコース培地上に表面塗抹した。次の日、その細胞を、15%グリセロールを含む2YT培地中に再懸濁し、凍結させ、次の選択ラウンドまで-80℃で保存した。
【００６６】
2.3.  液相選択:
液相選択について、4×1011個のファージを、まず、ビオチン化CD16aV(250nM)、ビオチン化CD16aF(1000nM)、又はビオチン化C1q(250nM)と、室温で軽く振盪させながら1時間、インキュベートした。その後、あらかじめPBS中5%スキムミルクでブロッキングされた、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ(Dynal社)を、ファージに、室温で30分間、加えた。ファージ-ビーズ複合体を、磁石を用いて、PBS/0.1% Tween 20で10回、洗浄した。ファージ-ビーズ複合体を用いて、指数増殖中の5mlのXL1-Blue細菌に感染させ、それらを、固形2YT/アンピシリン/グルコース培地上に表面塗抹した。次の日、その細胞を、15%グリセロールを含む2YT培地中に再懸濁し、凍結させ、次の選択ラウンドまで-80℃で保存した。
【００６７】
2.4.  バンクからの選択:
Mut3バンク:
液相選択について、3つのビオチン化標的: CD16aV、CD16aF、及びC1qに関して6ラウンド実施した(クローンはDL6A、DL6B、及びQL6Aと称される)。固相選択ラウンドについて、3つの標的: CD16aV、ビオチン化CD16aV、及びビオチン化C1qに関して6ラウンド実施した(クローンはDS6A、DS6B、及びQS6Aと称される)。
【００６８】
Mut4selバンク:
選択ラウンドをもっぱら固相においてだけ行った:ビオチン化CD16aVに関して3選択ラウンド、ビオチン化C1qに関して3ラウンド、ビオチン化CD32aRに関して3ラウンド(3回目のラウンドについてCD32bに関して+/-除去)、及びビオチン化CD32bに関して3ラウンド(3回目のラウンドについて、CD32aRに関して+/-除去)(クローンはA3A、G3A、J3A/B、及びK3A/Bと称される)。
【００６９】
Mut5バンク:
選択ラウンドを前のように行った:ビオチン化CD16aFに関して3選択ラウンド、ビオチン化C1qに関して3ラウンド、ビオチン化CD32aRに関して3ラウンド、ビオチン化CD32bに関して3ラウンド、ビオチン化CD32aRに関して2ラウンド及びビオチン化CD32bに関する除去を含む2ラウンド、並びにビオチン化CD32bに関して2ラウンド及びビオチン化CD32aRに関する2除去ラウンド(クローンはN3A、O3A、P3A、Q3A、P4B、及びQ4Bと称される)。その後、選択を前に記載されているように実施した。
【００７０】
2.5.  pMGM05ベクターにおけるプールクローニング:
選択ラウンド後に選択されたクローンを、混合物(条件あたり約104個のクローン)として、真核生物ベクターpMGM05-CD20(pCEP4 InvitroGen社)(Fc断片のためのpMG58ファージミドと同じクローニング部位(BamHI及びNotI)及び抗CD20抗体のVH可変鎖を含有する)へ直接、移入した。この構築物は、Fcにおける2個のアミノ酸の変異(アミノ酸224及び225、HTがGSへ変化)、及びFcのC末端におけるEFAAA配列の付加をもたらしたが、非常に多数のクローンの迅速な試験を可能にする。これらの変異がIgG-WTの異なる受容体への結合を改変しないことは、最初に検証された。その後、陽性対照を、その検証のためにこの系においてクローニングした:
-  Xencor社による抗CD19 XmAb5574抗体に由来したIgG1-S239D、I332E (C1): CD16aに対する陽性対照;
-  Xencor社製に由来したIgG1-G236A (C4): CD32aH/Rに対する陽性対照;
-  Abgenix/Genentech社製に由来したIgG1-K326W、E333S (C3): C1qに対する陽性対照;及び
-  Xencor社による抗CD19 XmAb5574抗体に由来したIgG1-S267E、L328F (C5): CD32bに対する陽性対照。
選択ラウンドにより単離された約100個のクローンのDNAを、コロニーPCRによりシーケンシングした。生物情報学的分析後、新しい変異を含むクローンを、XL1-Blue細菌において-80℃で凍結し、その配列を本発明者らのデータベースに含めた。結果として、Mut3バンクから158個のクローン、Mut4selバンクから371個のクローン、及びMut5バンクから171個のクローンが単離された。
【００７１】
2.6.  HEK293細胞におけるバリアントの産生
抗CD20の軽鎖を、pMGM01-CDC20(pCEP4 InvitroGen社)と称する、重鎖のために用いられたベクターと同一のpCEP4ベクターに挿入した。24ウェルプレートで培養されたHEK293-F Freestyle(商標)細胞(Invitrogen社)に、等モル量(250ng/ml)でのベクターpMGM01-CD20及びpMGM05-CD20(Fc-WT及びバリアント)をFreestyle(商標) MAX試薬(1μl/ml)と共に、標準手順(Invitrogen社)に従ってコトランスフェクトした。その細胞を、トランスフェクション後7日間、無血清培地中、懸濁培養し、100gで10分間の細胞の遠心分離後、IgGを含有する上清(1ml)を収集した。上清中の分泌されたIgGを、標準として用いられる293-F細胞において産生された精製抗CD20抗体と共に、組換えプロテインL(Pierce社)に関するELISAアッセイを用いて定量化した。上清、及びPBS/0.05% Tween-20中に段階希釈された標準抗体を、あらかじめ0.25μgプロテインL/ウェルでコーティングされ、かつPBS中5%スキムミルクでブロッキングされたMaxisorpイムノプレート(Nunc社)においてアッセイした。37℃で1時間のインキュベーション後、ウェルをPBS/0.05% Tween-20で3回、洗浄した。IgGバリアントの結合を、ヤギ抗ヒトIgG HRPのF(ab')2断片(γ鎖に特異的)(Sigma社)で検出した。産生されたIgGバリアントを、標準曲線を用いて定量化した(1〜4μg/ml)。
【００７２】
2.7.  293-F細胞の上清における産生されたIgGバリアントに関するELISAアッセイ
IgGバリアントを、ヒトC1q補体及びいくつかのヒトFcRとのそれらの結合についてELISAによりアッセイした。Maxisorpイムノプレートを、PBS中の、0.5μg C1q補体/ウェル、0.05μg CD32aH/ウェル、0.2μg CD16aF/ウェル、又は0.1μg CD16aV/ウェルでコーティングした。固定化ニッケルキレート化プレート(Nunc社)を、0.01M KCl中の、0.1μg CD32aR/ウェル又は0.4μg CD32b/ウェルでコーティングした。4℃で一晩のコーティング後、プレートを、PBS/0.05% Tween-20で2回、洗浄し、37℃で2時間、PBS/4% BSAで飽和させた。並行して、上清をPBS中に0.5μg IgG/mlの最終濃度に希釈し、室温で2時間、同じ濃度のヤギ抗ヒトIgG HRPのF(ab')2断片と混合した。その後、F(ab')2と会合したIgGを、C1q、CD16aF、CD32aR、及びCD32bについては希釈なし(すなわち、0.5μg/mlのIgG)で、CD16aV及びCD32aHについては0.25μg/mlとしてPBS中に希釈して、飽和ELISAプレート上で、30℃で1時間、穏やかに撹拌しながら、インキュベートした。その後、プレートを、TMB(Pierce社)で検出し、吸光度を450nmで読み取った。
【００７３】
Mut3バンクにおける選択:
このELISAアッセイを用いて、ファージディスプレイによって選択されたバリアントを、C1q補体及び異なる受容体とのそれらの結合についてアッセイした。それらを、野生型Fc(Fc-WT)及び陽性対照との比較によりアッセイした。それに従って、CD16aV及び/又はC1qに関して36個の陽性クローンが、Mut3バンクにおいて選択され、Mut4バンクを構築するために用いられた。
【００７４】
Mut4selバンクにおける選択:
371個の単離されたクローンにおいて実施されたELISAアッセイにより、少なくとも1つのFcγRに対し2より高い比率を有する116個のクローン、及びC1qのみに対し3より高い比率を有する17個のクローンが同定され、したがって、これらは、目的の133個のクローンに相当する(Table 1(表2))。
【００７５】
【表２Ａ】
2018515446.tif 000003
【００７６】
【表２Ｂ】
2018515446.tif 000004
【００７７】
【表２Ｃ】
2018515446.tif 000005
【００７８】
【表２Ｄ】
2018515446.tif 000006
【００７９】
これらのクローンの中で、47個の向上したクローンを、Mut5バンクを構築するために用いた。
これらの結果から、目的の変異を蓄積するための定方向変異誘発により18個の新しいバリアントが構築された(Table 2(表3))。
【００８０】
【表３】
2018515446.tif 000007
【００８１】
最後に、これらの151個のアッセイされたバリアントから、よりラージスケールでの製造及びより特異的な研究のために、目的の26個のバリアントを選択した(Table 3(表4))。
【００８２】
【表４】
2018515446.tif 000008
【００８３】
Mut5バンクにおける選択:
171個の単離されたクローンにおいて実施されたELISAアッセイにより、アッセイされたFcγR又はC1q補体のうちの少なくとも1つに対し2より高い比率を有する87個のクローンが同定された(Table 4(表5))。
【００８４】
【表５Ａ】
2018515446.tif 000009
【００８５】
【表５Ｂ】
2018515446.tif 000010
【００８６】
【表５Ｃ】
2018515446.tif 000011
【００８７】
【表５Ｄ】
2018515446.tif 000012
【００８８】
これらのバリアントの中から、目的の10個のバリアントを選択した(Table 5(表6))。
【００８９】
【表６】
2018515446.tif 000013
【００９０】
3.  目的のバリアントの産生及び精製
pCEP4-WT-H-CD20における定方向変異誘発によりIgGバリアントが得られた。G1m3アロタイプ(G1m1,17と比較して3個の変異を含む: (K214R/)D356E/L358M)に関して、IgG対照、すなわち、C1、C3、C4、C5、及び野生型(WT)を産生させた。
G1m1,17アロタイプに関して、Mut4selバンクに由来した26個のIgGバリアント及び野生型を産生させた。それらは、F17培地での293-E細胞(Freestyle Invitrogen社)のバッチ(250〜300ml)における6〜7日間のインキュベーションにより産生した。
その後、遠心分離及び濾過を行った。
Protein A Hi-Trapにおいて精製を実施し、25mMクエン酸バッファー、pH=3.0での溶出、中和、及び滅菌前のTBS又はPBS中での透析を実施した。
【００９１】
10mgの各IgG対照、すなわち、C1、C3、C4、C5、及び野生型(WTG1m3及びWTG1m1,17)、並びに2〜3mgの26個のIgGバリアントが得られた。
それらの特徴づけにより、分子量が維持されていること、及びグリコシル化プロファイルが全バリアントについて類似していることが示されている。
【００９２】
4.  目的のバリアントのアッセイ
4.1.  FcRnにおける結合アッセイ
Jurkat-FcRn細胞を、異なる濃度(0〜1000μg/ml)でのIgGバリアント、及びリツキシマブ-アレクサと、pH=6.0においてインキュベートした。
結合したリツキシマブ-アレクサにおいてフローサイトメトリを行った。
結果により、全てのIgGバリアントについてFcRnとの結合のいかなる損失も示されていない。
【００９３】
4.2.  抗原との結合アッセイ
Raji細胞を、1μg/mlでのIgGバリアントと、4℃で15分間、インキュベートした。
結合したIgGを、PE抗ヒトIgG二次抗体での結合(4℃で15分間)により検出した。
【００９４】
結果により、抗原の認識が、Fcにおける異なる変異によって低下しないことを示している。
IgGバリアントの全てが、IgG-WT対照と同じように、細胞上のCD20と結合した。
【００９５】
4.3.  CD16aV/FとのELISA結合アッセイ
精製抗体を、2.6項の下で記載されているのと同じプロトコールに従って、抗体を異なる濃度に希釈して、CD16F及びCD16aVとの結合について、ELISAでアッセイした。
【００９６】
4.4.  ADCC活性アッセイ
異なる濃度(0.005〜5000ng/ml)のIgGバリアントの存在下で、NK細胞を、CD20を発現する標的Raji細胞とインキュベートした。
溶解した標的細胞により放出された細胞内LDHのレベルを測定した。
ヒトNK細胞を、Miltenyi社により開発されたネガティブデプリーション法を用いて健康なボランティアドナーの末梢血から精製した。ADCCアッセイは、異なる濃度の抗CD20抗体の存在下でのNK細胞の、CD20抗原を発現する標的Raji細胞とのインキュベーションを含んだ。16時間のインキュベーション時間後、抗CD20抗体により誘導された細胞傷害性を、細胞上清において細胞内乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)を定量化することにより測定した。特異的溶解の結果は、抗体濃度の関数として溶解パーセンテージとして表現されている。EC50値(IgG-WTにより誘導される最大溶解の50%を誘導する抗体濃度)及びEmax値(パーセンテージ最大溶解)を、ソフトウェアGraphPad PRISMを用いて計算した。
結果は、Table 6(表7)及びTable 7(表8、表9、表10)に示されている。
【００９７】
【表７】
2018515446.tif 000014
【００９８】
【表８】
2018515446.tif 000015
【００９９】
【表９】
2018515446.tif 000016
【０１００】
【表１０】
2018515446.tif 000017
【０１０１】
4.5.  CDC活性アッセイ
補体供給源としてウサギ血清(Cedarlane社、1/10希釈)の存在下で、CD20抗原を発現する標的Raji細胞を、異なる濃度(0〜5000ng/ml)の抗CD20抗体とインキュベートした。37℃での1時間のインキュベーション時間後、溶解した標的細胞により上清へ放出されたLDHのレベルを、色素生産量として測定し(Roche Applied Sciences社による細胞傷害性検出キット)、それを用いて、抗体媒介性補体依存性細胞傷害性を定量化した。結果は、パーセント溶解として表現されている。EC50(50%最大溶解を誘導する抗体の数)及びEmax(パーセント最大溶解)を、ソフトウェアGraphPad PRISMを用いて計算した。
【０１０２】
結果はTable 8(表11)及びTable 9(表12、表13)に示されている。
【０１０３】
【表１１】
2018515446.tif 000018
【０１０４】
【表１２】
2018515446.tif 000019
【０１０５】
【表１３】
2018515446.tif 000020
【０１０６】
下記のTable 10(表14)は、サブグループへ分類されるいくつかのバリアントで得られた結果を示す。
【０１０７】
【表１４Ａ】
2018515446.tif 000021
【０１０８】
【表１４Ｂ】
2018515446.tif 000022
【０１０９】
以下のTable 11(表15)は、本発明のいくつかの可能なバリアントを示す:
【０１１０】
【表１５】
2018515446.tif 000023
【配列表】
2018515446000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月8日(2017.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型Fc領域を含み、かつ親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を有するポリペプチドであって、前記Fc領域が、2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)307N、326E、326T、334N、334R、352L、378V、378T、394P、396L、397M、421Tの中から選択される1個の変異、並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
変異(i)が378V、396L、及び397Mの中から選択されることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
248E、326T、333G、及び423Yの中から選択される変異を更に含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Fc領域によって媒介される前記機能活性が、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、補体依存性細胞傷害性(CDC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、及びこれらの活性の少なくとも2つの組合せの中から選択されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
好ましくは少なくとも2、好ましくは5より高く、好ましくは10より高く、好ましくは15より高く、好ましくは20より高く、好ましくは25より高く、好ましくは30より高い比率で、親ポリペプチドの機能活性と比較して増加している、Fc領域によって媒介される機能活性を有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
好ましくは少なくとも2、好ましくは5より高く、好ましくは10より高く、好ましくは15より高く、好ましくは20より高く、好ましくは25より高く、好ましくは30より高い比率で、親ポリペプチドの機能活性と比較して低下している、Fc領域によって媒介される機能活性を有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記変異型Fc領域が、C1q補体、並びにFcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)、及びFcgRIIb(CD32b)受容体の中から選択される、Fc領域の受容体(FcR)のうちの少なくとも1つに対する、改変された親和性を有することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記変異型Fc領域が、親ポリペプチドと比較して2〜20個の変異、好ましくは2〜10個の変異を含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記変異型Fc領域が、C1q補体に対する向上した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが
i)378V、378T、396L、421T、334R、及び326Eの中から選択される1個の変異;並びに
ii)361H、290E、316D、248E、410R、421T、334R、394P、307P、447N、378V、284L、421T、396L、286I、315D、及び397Mの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記変異型Fc領域が、FcgRIIIa受容体(CD16a)に対する向上した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、326E、397M、334N、及び396Lの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、397M、334N、248E、231V、246R、336T、421T、361H、366A、439R、290E、394P、307P、378V、378T、286I、286Y、及び298Nの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記変異型Fc領域が、FcgRIIa受容体(CD32a)に対する増加した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、326E、397M、307N、394P、326T、396L、及び334Nの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、334R、334N、323I、231V、246R、336T、378T、286Y、286I、352S、383R、359A、421T、361H、315D、366A、290E、307P、及び439Rの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記変異型Fc領域が、FcgRIIb受容体(CD32b)に対する増加した親和性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)326E、326T、378V、397M、352L、394P、396L、及び421Tの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、334R、248E、334N、418P、231V、320E、402D、359A、383R、421T、及び361Hの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記変異型Fc領域が、増加したCDC活性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、378T、396L、421T、334R、及び326Eの中から選択される1個の変異;並びに
ii)361H、290E、316D、248E、410R、421T、334R、394P、307P、447N、378V、284L、421T、396L、286I、315D、及び397Mの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜5又は8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記変異型Fc領域が、増加したADCC活性を有し、かつ2個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
i)378V、326E、397M、334N、及び396Lの中から選択される1個の変異;並びに
ii)316D、397M、334N、248E、231V、246R、336T、421T、361H、366A、439R、290E、394P、307P、378V、378T、286I、286Y、及び298Nの中から選択される少なくとも1個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とすることを特徴とする、請求項1〜5又は8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記変異型Fc領域が、3個の変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せが、
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N、及び394Pの中から選択される1個の変異;並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも2個の変異
を含み、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とし、好ましくは、前記変異型Fc領域が、4個の変異の組合せを含み、前記組合せが、少なくとも1個の変異(i)及び少なくとも3個の変異(ii)を含み、好ましくは、前記変異型Fc領域が、5個の変異の組合せを含み、前記組合せが、少なくとも1個の変異(i)及び少なくとも4個の変異(ii)を含むことを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
親ポリペプチドが、ヒトFc領域、好ましくはヒトIgG1又はヒトIgG2のFc領域である親Fc領域を含むことを特徴とする、請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
単離されたFc領域、単離されたFc領域に由来した配列、抗体、及びFc領域を含む融合タンパク質の中から選択されることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
トランスジェニック動物の乳において産生されたポリペプチドであることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
組成物の精製ポリペプチドが、それらのAsn297グリコシル化部位において、65%未満、好ましくは50%未満、より好ましくは40%未満のフコシル化率を有するN-グリカンを有することを特徴とする、請求項1〜18のいずれか一項に記載のポリペプチドの組成物。
【請求項２０】
組成物の精製ポリペプチドが、それらのAsn297グリコシル化部位において、非介在性末端マンノース及び/又は末端N-アセチルグルコサミンを有する、短い鎖、低いシアリル化を伴った二分岐型のグリカン構造を有することを特徴とする、請求項19に記載のポリペプチドの組成物。
【請求項２１】
組成物の精製ポリペプチドが、G0+G1+G0F+G1F型について60%より高い含有量を有し、G0F+G1F型についての含有量が50%未満、好ましくは40%未満であることを特徴とする、請求項20に記載のポリペプチドの組成物。
【請求項２２】
組成物の精製ポリペプチドが、G0+G1+G0F+G1F型について60%より高い含有量を有し、フコース含有量が65%未満であることを特徴とする、請求項20に記載のポリペプチドの組成物。
【請求項２３】
(i)請求項1〜18のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項19〜22のいずれか一項に記載の組成物、及び(ii)少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２４】
医薬品としての使用のための、請求項1〜18のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項19〜22のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、毒素、膜結合型又は循環型膜、膜受容体の中から選択される抗原に対する、請求項17に規定の抗体。
【請求項２６】
Fc領域を含み、かつ親ポリペプチドの機能活性と比較して改変されている、Fc領域によって媒介される機能活性を有するポリペプチドを作製するための方法であって、前記方法が、2個の変異の少なくとも1つの組合せを導入する工程を含み、前記組合せが、
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N、及び394Pの中から選択される1個の変異;並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする、方法。
【請求項２７】
受容体C1q、FcgRIIIa(CD16a)、FcgRIIa(CD32a)、及びFcgRIIb(CD32b)の中から選択される、Fc領域の受容体(FcR)のうちの少なくとも1つとの、Fc領域を含むポリペプチドの結合を増加させるための方法であって、前記方法が、2個の変異の少なくとも1つの組合せを導入する工程を含み、前記組合せが、
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N、及び394Pの中から選択される1個の変異;並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nの中から選択される少なくとも1個の変異
の中から選択され、ナンバリングがEUインデックス又はKabat相当物のナンバリングであり、かつ変異(i)が、変異(ii)と同じアミノ酸で起こらないことを条件とする、方法。
【国際調査報告】
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