(57)【要約】  本発明は、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）等の低侵襲試料から単離された一連のバイオマーカーの発現又は濃度のレベルから逸脱する妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹るリスクがあるヒト被験体を同定する又はスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。さらに、本発明の方法は、妊娠の初期段階で高い感度及び特異度を提供し（以下に示される実施例及び図を参照されたい）、本発明の方法が、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症の該疾患の初期段階における検出に対して強力で費用対効果の大きい方法であることを意味し、したがって、母親及び赤ん坊の両者に対する非常に長期的で有害な作用を回避する有効な治療を獲得する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症からなる一覧から選択される妊娠関連疾患を発症するリスクがある被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）スクリーニングされる被験体、好ましくはヒト被験体から得られた歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）試料中の少なくとも胎盤性血管新生ペプチド（ＰｌＧＦ）、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）若しくは抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）の発現のパターン若しくはレベル、又はエクソソーム若しくは微小胞等の細胞外小胞（ＥＶ）の濃度レベルを測定することと、
（ｂ）スクリーニングされる前記ヒト被験体の少なくとも胎盤性血管新生ペプチド（ＰｌＧＦ）、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）若しくは抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）の前記発現のパターン若しくはレベル、又はエクソソーム若しくは微小胞等の細胞外小胞（ＥＶ）の濃度レベルを、既に確立された発現のパターン又はレベルと比較することと、
を含み、
ここで、少なくとも胎盤性血管新生ペプチド（ＰｌＧＦ）、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）若しくは抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）の差次的発現、又はエクソソーム若しくは微小胞等の細胞外小胞（ＥＶ）の濃度レベルが、妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症からなる一覧から選択される妊娠関連疾患の指標である、方法。
【請求項２】
前記妊娠関連疾患が妊娠糖尿病であり、前記方法が、
（ａ）スクリーニングされる被験体、好ましくはヒト被験体の歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）試料から得られた、少なくとも胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）の発現のパターン又はレベルを測定することと、
（ｂ）スクリーニングされる前記ヒト被験体の前記少なくともＰｌＧＦの発現のパターン又はレベルを、既に確立された発現のパターン又はレベルと比較することと、
を含み、
ここで、少なくともＰｌＧＦの過剰発現が妊娠糖尿病の指標である、
請求項１に記載の妊娠関連疾患を発症するリスクがある被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項３】
（ａ）少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の発現のパターン又はレベルを測定すること（ここで、ＰｌＧＦ、ＰＬＡＰ及びｓＦｌｔ−１は被験体から採取されたＧＣＦ試料から得られる）と、
（ｂ）スクリーニングされる被験体の少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰの、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の前記発現のパターン又はレベルを、既に確立された発現のパターン又はレベルと比較することと、
を含み、
ここで、少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰの、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の過剰発現が妊娠糖尿病の指標である、請求項２に記載の被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項４】
（ａ）スクリーニングされる被験体、好ましくはヒト被験体から得られた歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）試料中のエクソソーム又は微小胞等の細胞外小胞（ＥＶ）の濃度レベルを測定することと、
ｂ）前記濃度レベルを既に確立された濃度のパターン又はレベルと比較することと、
を更に含み、
ここで、既に確立された濃度のパターン又はレベルと比較した、スクリーニングされる被験体から得られた試料中の細胞外小胞（ＥＶ）の濃度レベルの濃度の増加が妊娠糖尿病の指標である、請求項２又は３に記載の被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項５】
請求項２又は３に記載の工程ａ）及び工程ｂ）と、任意に（ｃ）経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を用いて妊娠糖尿病の存在を確認する工程とを含む、妊娠糖尿病を有することが疑われる被験体を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項６】
請求項２又は３に記載の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、妊娠糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断に有用なデータを得る方法。
【請求項７】
請求項２又は３に記載の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、ヒト被験体を健康な被験体として又は妊娠糖尿病に罹っている被験体として分類するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項８】
請求項２又は３に記載の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、妊娠糖尿病を有する被験体において、治療法に対する反応をモニタリングする、又は妊娠糖尿病の進行をモニタリングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項９】
妊娠糖尿病に罹っているヒト被験体を治療する方法であって、
請求項２又は３に記載の工程ａ）及び工程ｂ）と、
（ｃ）妊娠糖尿病と診断された前記患者を治療する工程と、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記患者が適切な糖尿病食若しくは食事計画によって及び／又はメトフォルミン等の経口血糖降下薬の投与によって治療される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくともＰＩＧＦの差次的発現レベルを特定するバイオマーカー検出試薬を備えるキットの、妊娠糖尿病に対するリスクをｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断するための使用であって、
少なくともＰＩＧＦの過剰発現が妊娠糖尿病の指標である、使用。
【請求項１２】
少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の差次的発現レベルを特定する試薬を備え、
ここで、少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の過剰発現が妊娠糖尿病の指標である、請求項１１に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所与の疾患又は障害の同定に対して特異的なバイオマーカーを使用するオーダーメイド医療の分野に含まれ得る。具体的には、本発明では、母体の妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症を発症するリスクがあるヒト被験体の同定に対し、幾つかのバイオマーカーを使用する。
【背景技術】
【０００２】
母体の妊娠糖尿病（ＧＤＭ：gestational diabetes mellitus）は、妊娠のおよそ７％に生じ、他の危険因子の中でも感染症及び全身炎症と結びつけられている多因子疾患である（非特許文献１）。ＧＤＭは、妊娠中に発症又は最初に認識される耐糖能障害として定義され（非特許文献２）、妊娠中に出現し、通常は出産後に回復する糖尿病の形態である。治療しなければ、ＧＤＭは母親及び赤ん坊の両者に対して非常に長期的で有害な作用を引き起こす場合がある。周産期の罹病として、高インスリン血症、巨大児、低血糖症、高ビリルビン血症、及び呼吸窮迫症候群が挙げられ、これらは後に後遺症を生じる可能性がある。出生児に対する長期の罹病として、遺伝的要因と無関係の肥満及び糖尿病が挙げられる。さらに、母親のＧＤＭは、７０％のＩＩ型糖尿病を発症する生涯リスクと関連する。
【０００３】
本発明は、母親及び赤ん坊の両者に対する長期的で有害な作用を回避するために妊娠中、できるだけ早期に、妊婦被験体、特に妊娠糖尿病を発症するリスクがある女性を同定する新たな方法を提供する課題に立ち向かう。
【０００４】
さらに、妊娠高血圧腎症（ＰＥ：preeclampsia）は、世界中の妊婦のおよそ３％〜８％が罹患する多臓器疾患である。最近の証拠から、ＰＥを発症する中程度の又は高いリスクがある患者において妊娠前の数週間の低用量のアスピリンの投与が、ＰＥ、子宮内胎児発育遅延、早産及び周産期死亡のリスクの減少と関連することが示されている。病状が既に確立されている場合、ＰＥの診断に対する現在の「ゴールドスタンダード」は、妊娠の後半（妊娠２４週以降）に行われ、周産期の結果に対する潜在的な有害作用を覆す又は制限する可能性は限定されている。ＰＥは、妊娠中の母体及び乳児の死亡率の両方の主な原因である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】The association between Porphyromonas gingivalis-specific maternal serum IgG and low birth weight. Dasanayake AP, Boyd D, Madianos PN, Offenbacher S, Hills E. J Periodontol. 2001 Nov; 72(11): 1491-7.
【非特許文献２】International Association of Diabetes in Pregnancy Study Group Working Group on Outcome D, Feig DS, Corcoy R, Jensen DM, Kautzky-Willer A, Nolan CJ, et al. Diabetes in pregnancy outcomes: A systematic review and proposed codification of definitions. Diabetes Metab Res Rev. 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、正確な同定及び高度な患者リスク階層化のため、並びに有効な治療的介入及びＰＥのモニタリングのため、ＰＥの正確な予測による、より早期の診断が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ：gingival crevicular fluid）等の低侵襲試料から単離した一連のバイオマーカーの発現又は濃度のレベルから逸脱する、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹るリスクがあるヒト被験体を同定する又はスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に焦点を当てることから、上に言及される課題に対する明確な解決策を提供する。さらに、本発明の方法は、妊娠の初期段階で高い感度及び特異度を提供し（以下に示される実施例及び図を参照されたい）、本発明の方法が、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症の該疾患の初期段階における検出に対して強力で費用対効果の大きい方法であることを意味し、したがって、母親及び赤ん坊の両者に対する非常に長期的な有害作用を回避する有効な治療を獲得する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】血糖対妊娠糖尿病の状態の受診者動作特性曲線の図である。
【図２】血糖及びＰｌＧＦ（歯肉溝滲出液）対妊娠糖尿病の状態の受診者動作特性曲線の図である。
【図３】血糖、ＰｌＧＦ（歯肉溝滲出液）及びＢＭＩ対妊娠糖尿病の状態の受診者動作特性曲線の図である。
【図４】非糖尿病患者対妊娠糖尿病患者における歯肉溝滲出液中のＰＩＧＦ（ｐｇ／ｍｌ）の図である。
【図５】Ａ．−妊娠糖尿病を発症する女性と比較した対照群の妊娠第一期肥満度指数（２７．５ｖ／ｓ３０．４  ｐ値＝０．００２２）の図である。Ｂ．−妊娠糖尿病を発症する女性と比較した対照群の妊娠第一期の血中の血糖レベル（ｐ値＝０．００１８）の図である。Ｃ．−妊娠糖尿病を発症する女性と比較した対照群の妊娠第一期の血圧拡張期レベル（ｐ値＝０．０１８）の図である。Ｄ．−健康な女性及び妊娠糖尿病を発症する女性における妊娠１１週〜１４週での臨床アタッチメントレベル（ｐ値＝０．９１８）の図である。Ｅ．−健康な女性及び妊娠糖尿病を発症する女性における妊娠１１週〜１４週での平均プロービングポケットデプスの測定（ｐ値＝０．５７０）の図である。Ｆ．−健康な女性及び妊娠糖尿病を発症する女性における妊娠１１週〜１４週でのプロービング時の出血の平均（％）（ｐ値＝０．１６０）の図である。Ｇ．−健康な女性及び妊娠糖尿病を発症する女性における妊娠１１週〜１４週での歯周表面炎症面積（ＰＩＳＡ）の平均（ｐ値＝０．２９４）の図である。
【図６】正常妊娠（対照群）と妊娠糖尿病（症例群）を有する患者との間の母体ＧＣＦ  ＰＬＡＰ濃度の比較の図である。ＧＣＦ−ＰＬＡＰ濃度は、健康な妊娠と比較して妊娠高血圧腎症を有する患者において有意に高かった。
【図７】妊娠１１週〜１４週の健常者及び妊娠糖尿病歯肉溝患者の歯肉溝滲出液試料中のエクソソームの特性評価の図である。Ａ）健常者のエクソソームＣＤ６３＋のウェスタンブロット。Ｂ）ＰＬＡＰ＋のウェスタンブロット。健常者（上）及び妊娠糖尿病患者（下）の電子顕微鏡検査。
【図８】Ａ）妊娠糖尿病又はＰＥを発症した妊娠第一期の患者対健康な妊娠（対照）に由来するＧＣＦ（歯肉溝滲出液）から単離した細胞外小胞（ＥＶ）の粒度分布の図である。Ｂ）ＧＤＭを発症した妊娠第一期の患者対対照に由来するＧＣＦ中のＥＶ濃度の定量の図である。ナノトラッキング粒子解析。得られたエクソソームの粒度分布を、製造業者の指示書に従ってＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００システム（NanoSight）を使用して分析する。ｈｇＭＳＣ、ＪＥＧ−３細胞及び胎盤の外植片から単離したエクソソーム試料を分析前にＰＢＳで希釈する。上記測定器は、ナノ粒子のブラウン運動の速度を測定し、粒度分布及び濃度を計算する。
【図９】ＧＤＭを発症した妊娠第一期の患者（ｎ＝１２）対対照（ｎ＝１７）に由来するＧＣＦ中のＥＶ濃度の定量の図である。Ｐ＝０．０００７。
【図１０】Ａ）健康な女性及び妊娠高血圧腎症を発症する女性における妊娠１１週〜１４週でのプロービングポケットデプスの測定の図である。Ｂ）健康な女性及び妊娠高血圧腎症を発症する女性における妊娠１１週〜１４週でのプロービング時の出血（％）の図である。Ｃ）健康な女性及び妊娠高血圧腎症を発症する女性における妊娠１１週〜１４週での臨床アタッチメントレベルの図である。
【図１１】Ａ）妊娠高血圧腎症と重度の歯周炎（Ｏ．Ｒ  ９．３６、ｐ値＝０．００９）との関連性に対する非補正オッズ比の図である。Ｂ）年齢、タバコ使用及び肥満度指数によって補正した、ＰＥと重症歯周炎との関連性に対する補正回帰モデルの図である。
【図１２】Ａ）正常妊娠（対照群）及び妊娠高血圧腎症（症例群）を有する女性間の歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）及び唾液のｓＦｌｔ−１濃度の比較の図である。メジアン母体ＧＣＦ及び唾液のｓＦｌｔ−１濃度は、正常妊娠（１１０．９（ｐ２５〜ｐ７５：１０６．４〜１１９．５）ｐｇ／ｍｌ及び１６０．５（ｐ２５〜ｐ７５：１３８．３〜１７３）ｐｇ／ｍｌ）の女性よりも、妊娠高血圧腎症を有する患者で有意に増加された（１４４．３（ｐ２５〜ｐ７５：１３１．９〜２０１．９）ｐｇ／ｍｌ及び１８０．５ｐｇ／ｍｌ（ｐ２５〜ｐ７５：１６０．５〜２７１．１）ｐｇ／ｍｌ）（それぞれ、ｐ＝０．０３３及びｐ＝０．０４５）。Ｂ）正常妊娠及び妊娠高血圧腎症を有する女性における母体ＧＣＦ及び唾液中のＰＬＡＰ／ＥＶ  ＣＤ６３＋比の図である。妊娠高血圧腎症を有する患者は、正常妊娠と比較して有意に高い母体ＧＣＦ  ＰＬＡＰ／ＣＤ６３＋比を有する（ｐ＝０．０００８）。これらの結果は、母体唾液では有意ではなかった。Ｃ）正常妊娠（対照群）と妊娠高血圧腎症（症例群）を有する女性間の歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）及び唾液のＰｌＧＦ濃度の比較の図である。ＰｌＧＦのメジアン母体ＧＣＦ及び唾液の濃度は、いずれの群間でも有意差はなかった。対照群は（ＧＣＦ中１７．９（ｐ２５〜ｐ７５：１１．３〜３９．４）ｐｇ／ｍｌ、及び唾液中１７．２（ｐ２５〜ｐ７５：１０．０〜２８．３）ｐｇ／ｍｌ）を提示し、妊娠高血圧腎症患者は（ＧＣＦ中１３．７（ｐ２５〜ｐ７５：７．５〜２７．０）ｐｇ／ｍｌ、及び唾液試料中１６．９（ｐ２５〜ｐ７５：４．８〜２９．６）ｐｇ／ｍｌ）を提示した。Ｄ）正常妊娠（対照群）と妊娠高血圧腎症の患者（症例群）との間の母体ＧＣＦ及び唾液のＰＬＡＰ濃度の比較の図である。ＧＣＦ−ＰＬＡＰ濃度は、健康な妊娠と比較して妊娠高血圧腎症を有する患者において有意に高かった。メジアン母体ＧＣＦ−ＰＬＡＰ濃度は、正常妊娠の女性（１８７５．９（ｐ２５〜ｐ７５：１８４４．０〜１９３８．４）ｐｇ／ｍｌ）と比較して、妊娠高血圧腎症を有する患者において１９２９．４（ｐ２５〜ｐ７５：１９１５．４〜２０８１．９）ｐｇ／ｍｌであった。唾液では、群間の有意差は観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
本発明について、下記定義が以下に含まれる：
【００１０】
「スクリーニング」の用語は、健康な個体と、診断が確定されていない妊娠糖尿病に罹っている、又は前記適応症に罹るリスクの高い人々とを識別する目的で妊娠糖尿病に罹るリスクがある、母集団に属する個体群の調査又は試験として理解される。
【００１１】
本明細書で使用される「妊娠糖尿病（ＧＤＭ）」は、妊娠中に発症する又は最初に認識される耐糖能障害として定義される。
【００１２】
「歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）」の表現は、歯肉縁又は歯肉溝内で収集することができる炎症性滲出液である。
【００１３】
本発明に記載されるバイオマーカーのいずれか又はそれらの組み合わせの「上方制御された」又は「過剰発現された」の用語は、所与の「閾値」又は「カットオフ値」に関して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％＞、少なくとも６５％＞、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％以上のそれらの発現レベルの増加を指す。
【００１４】
本発明に記載されるバイオマーカーの発現レベルを指す場合、「閾値」又は「カットオフ値」の用語は、患者の発現レベルが上記閾値又はカットオフ又は参照のレベルよりも上にある場合、被験体が所与の感度及び特異度で妊娠糖尿病に罹る可能性があることを示す参照発現レベルを指す。
【００１５】
「含む、含んでいる（comprising）」の用語は、限定されないが、「含む、含んでいる」の単語に続くもの全てを包含することを意味する。したがって、「含む、含んでいる」の用語の使用は、列挙される要素が必要又は必須であるが、他の要素が任意であり、存在してもよく又は存在しなくてもよいことを示す。
【００１６】
「のみからなる（consisting of）」によって、「のみからなる」の句に続くもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、「のみからなる」の句は、列挙される要素が必要又は必須であり、かつ他の要素が存在する可能性がないことを示す。
【００１７】
また、本明細書で使用される「キット」の用語は、いかなる具体的なデバイスにも限定されず、限定されないがマイクロアレイ、バイオアレイ、バイオチップ又はバイオチップアレイ等の本発明の実施に適した任意のデバイスを含むことに留意されたい。
【００１８】
本明細書で使用される「胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ：Placental Growth Factor）」は、血管新生の調節に関与する増殖因子の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーである。ＰｌＧＦは、ＶＥＧＦ−Ａと密接に関連し、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ−１、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１、ｓＦｌｔ−１としても知られる）に結合する。
【００１９】
本明細書で使用されるＧＤＭの診断は、妊娠２４週〜２８週に経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行うことにより確認される。
【００２０】
本明細書で使用される通り、４本以上の歯が４ｍｍ以上のプロービングポケットデプス（ＰＰＤ：probing pocket depth）を有する部位を１以上示した場合、また同様に、同じ部位で３ｍｍ以上の臨床アタッチメント喪失（ＣＡＬ：clinical attachment loss）、炎症、及びプロービング時の出血（ＢＯＰ：bleeding on probing）を有した場合に、その女性を歯周炎と診断した。２０％超の部位でのＢＯＰ及び歯肉の発赤を示したが、臨床アタッチメントの喪失を有しなかった女性を、歯肉炎を有すると診断した。
【００２１】
本明細書で使用される「血糖」は、その人の血液中又は血清中のグルコースの存在又はレベルを意味する。
【００２２】
本明細書で使用される「妊娠関連疾患（pregnant-related-diseases）」の用語は、早産、妊娠高血圧腎症、妊娠糖尿病等の妊娠に特有の疾患を意味する。
【００２３】
本明細書で使用される「エクソソーム」の用語は、ナノ小胞のサブタイプを意味し、後期エンドソームコンパートメントに由来する分泌された杯形膜小胞（３０ｎｍ〜１００ｎｍ）のサブタイプであり、ほぼ全ての細胞型及び腫瘍細胞から分泌される。
【００２４】
本明細書で使用される「微小胞」の用語は１００ｎｍより大きく２００ｎｍまでの膜小胞を意味する。
【００２５】
本明細書で使用される「ｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）」の用語は、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１と呼ばれるタンパク質、すなわち可溶性内皮受容体の一種を意味する。
【００２６】
本明細書で使用される「ＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）」の用語は、胎盤に特異的に由来するタンパク質を意味し、胎盤起源の微小胞及びエクソソームのマーキング（marked）に使用される。
【００２７】
説明
本発明は、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹る又はそれを有するリスクがある被験体を、この疾患に罹っている患者において上方制御又は過剰発現されるいくつかのバイオマーカーの発現のプロファイル又はレベルの測定に基づいてスクリーニングする又は同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。また、本発明は、被験体、好ましくはヒト被験体において、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症の診断に有用なデータを得る又はその診断をするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。また、治療方法も本発明に包含される。
【００２８】
特に、本発明は、妊娠関連疾患に罹っている又はそれを有している、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹っている又はそれらを有している患者の歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）試料中でエクソソーム及び微小胞が有意に上方制御されることが確認されるという発見に基づく。これは図８及び図９に明らかに図示され、これらの図における結果が、妊娠第三期の間に妊娠高血圧腎症又は妊娠糖尿病に罹らなかった又はそれらを有していなかった健康な妊婦個体から妊娠第一期の間に得られた対照ＧＣＦ試料と比較して、妊娠第三期の間に妊娠高血圧腎症又は妊娠糖尿病に罹った又はそれらを有した患者のＧＣＦ（ＧＣＦ試料が妊娠第一期の間に得られたことに留意されたい）中のエクソソーム及び微小胞のより高い濃度レベルを明らかに示す。さらに、結果は、妊娠の終わりに妊娠高血圧腎症又は妊娠糖尿病に罹った又はそれらを有した患者では、ＧＣＦ中の約１５０ｎｍ以下のエクソソーム又は微小胞の濃度が有意に増加されたのみならず、これらの個体はＧＣＦ中に有意に高い濃度の２００ｎｍを超える（好ましくは５００ｎｍ未満の）微小胞を提示したことを示す。
【００２９】
したがって、本発明の第１の実施形態は、（ａ）スクリーニングされる被験体、好ましくはヒト被験体の歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）試料から得られた少なくともエクソソーム及び微小胞の濃度レベルを測定することと、（ｂ）スクリーニングされる上記ヒト被験体の少なくともエクソソーム及び微小胞の上記濃度レベルを、妊娠関連疾患に罹っていない個体の既に確立された発現パターン又は濃度レベルと比較することとを含み、ここで、エクソソーム及び微小胞の濃度レベルの増加が、妊娠関連疾患を発症するリスク、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症を発症するリスクの指標である、妊娠関連疾患を発症するリスクがある、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症を発症するリスクがある被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。かかる特定は、１５０ｎｍ以下のエクソソーム又は微小胞、２００ｎｍ以下のエクソソーム又は微小胞、及び２００ｎｍ超、好ましくは５００ｎｍ未満の微小胞からなる一覧から選択される、ＧＣＦ試料中に存在するエクソソーム及び微小胞の総量の濃度レベルの測定、又はＧＣＦ試料中に存在するバイオマーカーの測定のいずれかによって行われ得ることが好ましい。
【００３０】
本発明の第２の実施形態は、少なくともＰｌＧＦの、又は少なくともＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の、又は少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰ及びｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の発現のパターン又はレベルを測定することを更に含み、ここで、ＧＣＦ試料に由来するＰｌＧＦ、ＰＬＡＰ及びｓＦｌｔ−１が被験体から採取される、本発明の第１の実施形態による被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００３１】
本発明の第３の実施形態は、本発明の第１又は第２の実施形態のいずれかの工程ａ）及び工程ｂ）と、任意に（ｃ）生物物理学的パラメーター及び臨床情報により、すなわち、妊娠糖尿病は経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を用いて、妊娠高血圧腎症はタンパク尿、尿酸、及び／又はトランスアミナーゼの定量を用いて、妊娠関連疾患の存在を確認する工程とを含む、妊娠関連疾患を有している又はそれに罹っていることが疑われる、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症を有している又はそれに罹っていることが疑われる被験体を診断、好ましくは早期診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００３２】
本発明の第４の実施形態は、本発明の第１又は第２の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、妊娠関連疾患を有している又はそれに罹っていることが疑われる、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症を有している又はそれに罹っていることが疑われる被験体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断に有用なデータを得る方法に関する。
【００３３】
本発明の第５の実施形態は、本発明の第１又は第２の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、ヒト被験体を健康な被験体として、又は妊娠関連疾患に罹っている、特に妊娠糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症を有している若しくはそれに罹っていることが疑われる被験体として分類するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００３４】
本発明の第６の実施形態は、本発明の第１又は第２の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、妊娠糖尿病を有する被験体において、治療法に対する反応をモニタリングする、又は妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症の進行をモニタリングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００３５】
本発明の第７の実施形態は、本発明の第１又は第２の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）と、（ｃ）妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症と診断された患者を治療する工程とを含む、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症と診断されたヒト被験体を治療する方法に関する。
【００３６】
本発明の第８の実施形態は、上記患者が糖尿病と診断され、適切な糖尿病食若しくは食事計画によって、及び／又はメトフォルミン等の経口血糖降下薬の投与によって治療される、本発明の第７の実施形態による方法に関する。
【００３７】
本発明の第９の実施形態は、上記患者が妊娠高血圧腎症と診断され、胎児の肺を促進するステロイド、アセチルサリチル酸（アスピリン）等の抗血液凝固剤及び／又はメトフォルミン等の低酸素誘導因子１αの阻害剤によって治療される、本発明の第７の実施形態による方法に関する。
【００３８】
本発明の第１０の実施形態は、妊娠関連疾患を発症するリスクがある、特に妊娠糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症を発症するリスクがある被験体のスクリーニングのための、又は妊娠関連疾患、特に糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症を有する被験体の診断、特に早期診断のための、被験体、好ましくはヒト被験体から得られた歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）試料中の少なくともエクソソーム及び微小胞の濃度レベルを特定可能なバイオマーカー検出試薬を備えるキット又はデバイスのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用に関する。
【００３９】
また、本発明は、妊娠糖尿病に罹っている患者において上方制御又は過剰発現され、妊娠高血圧腎症に罹っている患者で下方制御される血管新生ペプチド（ＰｌＧＦ）の発現のプロファイル又はレベルの測定に基づいて、妊娠関連疾患に罹る又はそれを発症するリスクがある、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹る又はそれらを発症するリスクがある被験体をスクリーニングする又は同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。この意味において、図１、図２、図３及び図４並びに表３、表５及び表６に目立って示されるように、ＧＣＦ中の高レベルのＰＩＧＦ自体が、又は血清血糖と組み合わせて、妊娠糖尿病の存在と有意に関連し、ここで、ＰＩＧＦは、ＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）又はｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）等の本明細書で試験した他のバイオマーカーと比較して最も良好な結果を提供する。妊娠高血圧腎症について同じことが言え、図１３に示されるように、ＧＣＦ中のより低い又は下方制御されたレベルのＰＩＧＦ自体が妊娠高血圧腎症の存在と有意に関連する。
【００４０】
したがって、本発明の第１１の実施形態は、（ａ）スクリーニングされる被験体、好ましくはヒト被験体の歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）試料から得られた少なくとも胎盤性血管新生ペプチド（ＰｌＧＦ）の発現のパターン又はレベルを測定することと、（ｂ）上記スクリーニングされるヒト被験体の少なくともＰｌＧＦの発現のパターン又はレベルを、既に確立された発現のパターン又はレベルと比較することとを含み、ここで、少なくともＰｌＧＦの差次的発現が妊娠関連疾患、特に過剰発現の場合には糖尿病、又は下方制御の場合には妊娠高血圧腎症の指標である、妊娠関連疾患に罹る又はそれを発症するリスクがある、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹る又はそれらを発症するリスクがある被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００４１】
本発明の第１２の実施形態は、（ａ）少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の発現のパターン又はレベルを測定すること（ここで、ＰｌＧＦ、ＰＬＡＰ及びｓＦｌｔ−１は被験体から採取されたＧＣＦ試料から得られる）と、（ｂ）スクリーニングされる被験体の少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰの、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の上記発現のパターン又はレベルを、既に確立された発現のパターン又はレベルと比較することとを含み、ここで、少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰの、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の差次的発現レベルが妊娠関連疾患、特に上述のバイオマーカーのいずれか若しくはそれらの組み合わせの過剰発現の場合には妊娠糖尿病、又はＰＩＧＦの下方制御及び上に言及される残りのバイオマーカーの上方制御若しくは過剰発現の場合には妊娠高血圧腎症の指標である、本発明の第１１の実施形態による被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００４２】
本発明の第１３の実施形態は、本発明の第１１又は第１２の実施形態のいずれかの工程ａ）及び工程ｂ）と、任意に（ｃ）生物物理学的パラメーター及び臨床情報により、すなわち、妊娠糖尿病は経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を用いて、妊娠高血圧腎症はタンパク尿、尿酸又はトランスアミナーゼの定量を用いて、妊娠関連疾患の存在を確認する工程とを含む、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症を有している又はそれらに罹っていることが疑われる被験体を診断、特に早期診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００４３】
本発明の第１４の実施形態は、本発明の第１１又は第１２の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症を有している又はそれらに罹っていることが疑われる被験体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断に有用なデータを得る方法に関する。
【００４４】
本発明の第１５の実施形態は、本発明の第１１又は第１２の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、ヒト被験体を、健康な被験体として、又は妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症を有している若しくはそれらに罹っていることが疑われる被験体として分類するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００４５】
本発明の第１６の実施形態は、本発明の第１１又は第１２の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、被験体において、治療法に対する反応をモニタリングする、又は妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症の進行をモニタリングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００４６】
本発明の第１７の実施形態は、本発明の第１１又は第１２の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）と、（ｃ）上記妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症と診断された患者を治療する工程とを含む、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹っているヒト被験体を治療する方法に関する。
【００４７】
本発明の第１８の実施形態は、上記患者が妊娠糖尿病と診断され、適切な糖尿病食若しくは食事計画、及び／又はメトフォルミン等の経口血糖降下薬の投与によって治療される、本発明の第１７の実施形態による方法に関する。
【００４８】
本発明の第１９の実施形態は、上記患者が妊娠高血圧腎症と診断され、胎児の肺を促進するステロイド、アセチルサリチル酸（アスピリン）等の抗血液凝固剤及び／又はメトフォルミン等の低酸素誘導因子１αの阻害剤によって治療される、本発明の第１７の実施形態による方法に関する。
【００４９】
本発明の第２０の実施形態は、妊娠関連疾患を発症するリスクがある、特に妊娠糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症を発症するリスクがある被験体のスクリーニングのための、又は妊娠関連疾患、特に糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症に罹っている被験体の診断のための、ＧＣＦ試料中の少なくともＰＩＧＦの差次的発現レベルを特定可能なバイオマーカー検出試薬を備えるキットの使用に関する。
【００５０】
本発明の第２１の実施形態は、少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の差次的発現レベルを特定する試薬を備え、ここで、少なくともＰｌＧＦと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の差次的発現が妊娠関連疾患、特に糖尿病又は妊娠高血圧腎症の指標である、本発明の第２０の実施形態によるキットの使用に関する。
【００５１】
また、さらに本発明は、妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹っている患者のＧＣＦ中で上方制御又は過剰発現されるＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の発現のプロファイル又はレベルの測定に基づいて、妊娠関連疾患に罹る又はそれを発症するリスクがある、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹る又はそれらを発症するリスクがある被験体をスクリーニングする又は同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。この意味で、図６に目立って示されるように、ＧＣＦ中の高レベルのＰＬＡＰ自体が、又は他のバイオマーカーと組み合わせて、妊娠糖尿病の存在と有意に関連する。妊娠高血圧腎症について同じことが言え、図１３に示されるように、ＧＣＦ中の高レベルのＰＬＡＰ自体が妊娠高血圧腎症の存在と有意に関連する。
【００５２】
したがって、本発明の第２２の実施形態は、（ａ）スクリーニングされる被験体、好ましくはヒト被験体の歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）試料から得られた少なくともＰＬＡＰの発現のパターン又はレベルを測定することと、（ｂ）スクリーニングされるヒト被験体の少なくともＰＬＡＰの上記発現のパターン又はレベルを、既に確立された発現のパターン又はレベルと比較することとを含み、ここで、少なくともＰＬＡＰの過剰発現が、妊娠関連疾患、特に糖尿病又は妊娠高血圧腎症の指標である、妊娠関連疾患に罹る又はそれを発症するリスクがある、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹る又はそれらを発症するリスクがある被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００５３】
本発明の第２３の実施形態は、（ａ）少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の、又は少なくともＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の発現のパターン又はレベルを測定すること（ここで、ＰｌＧＦ、ＰＬＡＰ及びｓＦｌｔ−１が被験体から採取されたＧＣＦ試料から得られる）と、（ｂ）スクリーニングされる被験体の上記発現のパターン又はレベルを、既に確立された発現のパターン又はレベルと比較することとを含み、ここで、上に言及されるいずれかの組み合わせの差次的発現が妊娠関連疾患、特に糖尿病又は妊娠高血圧腎症の指標である、本発明の第１１の実施形態による被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００５４】
本発明の第２４の実施形態は、本発明の第２２又は第２３の実施形態のいずれかの工程ａ）及び工程ｂ）と、任意に（ｃ）生物物理学的パラメーター及び臨床情報により、すなわち、妊娠糖尿病は経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を用いて、妊娠高血圧腎症はタンパク尿、尿酸又はトランスアミナーゼの定量を用いて、妊娠関連疾患の存在を確認する工程とを含む、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症を有している又はそれらに罹っていることが疑われる被験体を診断、特に早期診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００５５】
本発明の第２５の実施形態は、本発明の第２２又は第２３の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症を有している又はそれらに罹っていることが疑われる被験体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断に有用なデータを得る方法に関する。
【００５６】
本発明の第２６の実施形態は、本発明の第２２又は第２３の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、ヒト被験体を、健康な被験体として、又は妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症を有している若しくはそれらに罹っていることが疑われる被験体として分類するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００５７】
本発明の第２７の実施形態は、本発明の第２２又は第２３の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、被験体において、治療に対する反応をモニタリングする、又は妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症の進行をモニタリングする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００５８】
本発明の第２８の実施形態は、本発明の第２２又は第２３の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）と、（ｃ）上記妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症と診断された患者を治療する工程とを含む、妊娠関連疾患、特に妊娠糖尿病又は妊娠高血圧腎症に罹っているヒト被験体を治療する方法に関する。
【００５９】
本発明の第２９の実施形態は、上記患者が妊娠糖尿病と診断され、適切な糖尿病食若しくは食事計画によって、及び／又はメトフォルミン等の経口血糖降下薬の投与によって治療される、本発明の第２８の実施形態による方法に関する。
【００６０】
本発明の第３０の実施形態は、上記患者が妊娠高血圧腎症と診断され、胎児の肺を促進するステロイド、アセチルサリチル酸（アスピリン）等の抗血液凝固剤、及び／又はメトフォルミン等の低酸素誘導因子１αの阻害剤によって治療される、本発明の第２８の実施形態による方法に関する。
【００６１】
本発明の第３１の実施形態は、妊娠関連疾患を発症するリスクがある、特に妊娠糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症を発症するリスクがある被験体のスクリーニングのための、又は妊娠関連疾患、特に糖尿病若しくは妊娠高血圧腎症に罹っている被験体の診断のための、ＧＣＦ試料中の少なくともＰＬＡＰの差次的発現レベルを特定可能なバイオマーカー検出試薬を備えるキットの使用に関する。
【００６２】
本発明の第３２の実施形態は、少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）の、又は少なくともＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の差次的発現レベルを特定する試薬を備え、ここで、少なくともＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰと血糖の、又は少なくともＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の過剰発現が妊娠関連疾患、特に糖尿病又は妊娠高血圧腎症の指標である、本発明の第２０の実施形態によるキットの使用に関する。
【００６３】
また最後に、本発明が、妊娠高血圧腎症に罹っている患者のＧＣＦにおいて上方制御される又は過剰発現される少なくともｓＦｌｔ−１（抗血管新生因子ｓＦｌｔ−１）の発現のプロファイル又はレベルの測定に基づいて、妊娠高血圧腎症に罹る又はそれを発症するリスクがある被験体をスクリーニングする又は同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関することに留意することが重要である。この意味で、実施例２に目立って示されるように、ＧＣＦ中の高レベルのｓＦｌｔ−１自体が、又は他のバイオマーカーと組み合わせて妊娠高血圧腎症の存在と有意に関連する。この意味で、本発明の第３３の実施形態は、（ａ）スクリーニングされる被験体、好ましくはヒト被験体の歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）試料から得られた少なくともｓＦｌｔ−１の発現のパターン又はレベルを測定することと、（ｂ）スクリーニングされる上記ヒト被験体の少なくともｓＦｌｔ−１の上記発現のパターン又はレベルを、既に確立された発現のパターン又はレベルと比較することとを含み、ここで、少なくともｓＦｌｔ−１の過剰発現が、妊娠関連疾患、特に糖尿病又は妊娠高血圧腎症の指標である、妊娠高血圧腎症に罹る又はそれを発症するリスクがある被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００６４】
本発明の第３４の実施形態は、少なくともＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰＩＧＦとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１の、又は少なくともＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１と血糖の、又は少なくともＰｌＧＦとＰＬＡＰとｓＦｌｔ−１と血糖の発現のパターン又はレベルを測定することを更に含み、ここで、ＧＣＦ試料に由来するＰｌＧＦ、ＰＬＡＰ及びｓＦｌｔ−１が上記被験体から採取される、本発明の第３３の実施形態による被験体をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００６５】
本発明の第３５の実施形態は、本発明の第３３又は第３４の実施形態のいずれかの工程ａ）及び工程ｂ）と、任意に（ｃ）生物物理学的パラメーター及び臨床情報により、すなわち、タンパク尿、尿酸又はトランスアミナーゼの定量を用いて妊娠高血圧腎症の存在を確認する工程とを含む、妊娠高血圧腎症を有している又はそれに罹っていることが疑われる被験体を診断、特に早期診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００６６】
本発明の第３６の実施形態は、本発明の第３３又は第３４の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、妊娠高血圧腎症を有している又はそれに罹っていることが疑われる被験体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断に有用なデータを得る方法に関する。
【００６７】
本発明の第３７の実施形態は、本発明の第３３又は第３４の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、ヒト被験体を、健康な被験体として、又は妊娠高血圧腎症を有している若しくはそれに罹っていることが疑われる被験体として分類するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００６８】
本発明の第３８の実施形態は、本発明の第３３又は第３４の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）を含む、被験体において、治療法に対する反応をモニタリングする、又は妊娠高血圧腎症の進行をモニタリングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００６９】
本発明の第３９の実施形態は、本発明の第３３又は第３４の実施形態の工程ａ）及び工程ｂ）と、（ｃ）上記妊娠高血圧腎症と診断された患者を、好ましくは胎児の肺を促進するステロイド、アセチルサリチル酸（アスピリン）等の抗血液凝固剤及び／又はメトフォルミン等の低酸素誘導因子１αの阻害剤によって治療する工程とを含む、妊娠高血圧腎症に罹っているヒト被験体を治療する方法に関する。
【００７０】
本発明の第４０の実施形態は、妊娠高血圧腎症を発症するリスクがある被験体のスクリーニングのための、又は妊娠高血圧腎症に罹っている被験体の診断のための、ＧＣＦ試料中の少なくともｓＦｌｔ−１の差次的発現レベルを特定可能なバイオマーカー検出試薬を備えるキットの使用に関する。
【００７１】
発現の閾値又はカットオフレベルを確立する様々な統計学的及び数学的方法が従来技術において知られている。特定のバイオマーカーに対する閾値又はカットオフ発現レベルは、例えば、本発明の実施例及び図面に記載される受診者動作特性（ＲＯＣ）プロットによるデータに基づいて選択されてもよい。当業者は、感度又は特異度に関して種々の値を得るため、例えば、特定のバイオマーカー又はそれらの組み合わせに対するＲＯＣプロットに沿って移動することによって、これらの閾値又はカットオフ発現レベルを変化させることができ、それによって全体的なアッセイ性能に影響を及ぼすことを十分に理解する。例えば、目的が臨床の観点からロバストな診断方法を有することである場合、高い感度を有しようとすべきである。しかしながら、目標が費用対効果の大きい方法を有することである場合、高い特異度を得ようとすべきである。最も良好なカットオフは、最も良好な感度及び特異度をもたらす、特定のバイオマーカーに対するＲＯＣプロットから得た値を指す。感度及び特異度の値を閾値（カットオフ）の範囲に亘って計算する。したがって、閾値又はカットオフ値を感度及び／又は特異度が少なくとも約７０％であるように選択することができ、例えば、アッセイされる患者集団の少なくとも６０％において、又はアッセイされる患者集団の少なくとも６５％、７０％、７５％若しくは８０％において、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％であってもよい。
【００７２】
したがって、本発明の上記の引用される実施形態は、各々、好ましくは、診断又はスクリーニングされる被験体から単離されたＧＣＦ試料及び任意には血清試料（血糖の特定に対して）中の先に引用されたバイオマーカーのうちの少なくともいずれかの発現又は濃度のレベルを特定すること、並びに上記バイオマーカーの発現又は濃度のレベルを、所定の閾値若しくはカットオフ値と、又は確立された発現若しくは濃度のパターン若しくはレベルと比較することによって実行され、ここで、上記所定の閾値又はカットオフ値が、妊娠関連疾患に罹るリスクがある患者集団において特定されたバイオマーカーの発現又は濃度のレベルに基づいて計算されたＲＯＣ曲線において所望の感度で最も高い特異度と相関する上記バイオマーカーの濃度又は発現のレベルに対応し、上記バイオマーカーの少なくとも１つの差次的発現（バイオマーカーに応じた過剰発現又は発現の減少）が、上記所定のカットオフ値に関して、上記望ましい感度で、その被験体が妊娠関連疾患に罹っている又はそれを有するという指標である。またさらに、本発明の上記の引用される実施形態は、各々、好ましくは、診断又はスクリーニングされる被験体から単離された上記バイオマーカーの発現又は濃度のレベルを、健康な集団から得られた上記バイオマーカーの確立された発現又は濃度のパターン若しくはレベルと比較することによって実行することができ、ここで、上記バイオマーカーの少なくとも１つの差次的発現（バイオマーカーに応じた過剰発現又は発現の減少）が、上記確立された発現又は濃度のパターン若しくはレベルに関して、その被験体が妊娠関連疾患に罹っている又はそれを有するという指標である。
【００７３】
本明細書に実例として記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素（単数又は複数）、限定（単数又は複数）のない状態で好適に実施されてもよい。したがって、例えば、「含む、含んでいる（comprising）」、「含む、含んでいる、挙げられる（including）」、「含有する、含有している（containing）」等の用語は、拡大的に、限定なく読まれるものとする。さらに、本明細書で採用される用語及び表現は、限定ではなく説明する用語として使用されており、かかる用語及び表現の使用において、示され記載される特徴又はそれらの一部の任意の等価物を除外する意図はなく、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲において様々な修飾が可能であることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される好ましい実施形態に具体化される本発明の任意の特徴、変更形態及び変形形態が当業者によって用いられてもよく、かかる変更形態及び変形形態は、本発明の範囲に含まれるものとすることが理解されるべきである。
【００７４】
本発明は、本明細書において広く包括的に記載される。また、包括的な開示に含まれるより狭い下位概念（species）及び下位（sub-generic）分類の各々が本発明の一部をなす。これは、削除されるものが具体的に本明細書に列挙されるかどうかにかかわらず、但し書き又は否定的な限定を伴って、上位概念（genus）から任意の主題を除く本発明の包括的な記載を含む。
【００７５】
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲及び非限定的な実施例に含まれる。さらに、本発明の特徴又は態様が群によって記載される場合、当業者は、任意の個々のメンバー又はその群のメンバーのサブグループによっても本発明が説明されることを認識する。
【実施例】
【００７６】
実施例１．妊娠糖尿病
材料及び方法
症例対照研究を行った。被験体に対する選択基準は、ＧＤＭと診断された妊婦であるということであった。２０１５年１月〜１０月の間、チリ国サンチアゴのソテロ・デル・リオ病院の母子ユニットに入院した８０名の女性の出産前コホートから合計で１４症例を集めた。対照は、６６名の対照妊娠女性の試料を生成する同じコホートとした。いずれの群も同等の社会経済的レベルの単生児妊娠の被験体で構成された。臨床登録及び身体計測データを妊娠１１週〜１４週で収集した後、１人の歯周病専門歯科医によって歯科評価及び全顎歯周検査を行った。上記研究に関する全ての臨床関連データをコンピューターデータベースに保存した。歯が１８本未満の、先の３ヶ月間に全身又は局所の抗微生物／抗炎症療法を使用したことがある女性を除外した。研究に参加することに合意した女性から、アンデス大学倫理委員会によって承認された書面のインフォームド・コンセントを得た。
【００７７】
調べた変数は、ＧＤＭ、年齢、肥満度指数（ＢＭＩ）、歯数、ＧＣＦ−ＰＬＡＰ、ＰｌＧＦ、ｓＦｌｔ−１、並びに歯周の臨床測定及び診断であった。
【００７８】
試料収集及び評価
両群の同じ妊娠期間に歯周検査及び口腔液試料の収集を行った。歯を巻綿で隔離した後、歯肉縁上のプラークをキュレット（米国イリノイ州グレイシーのHu Friedy）で歯肉縁に触れずに除去した。その後、歯肉溝をエアシリンジで穏やかに乾燥した。ＧＣＦを紙片（米国ニューヨーク州アミティビルのPro-Flow）により収集した。紙片を軽く抵抗を感じるまで溝／ポケットに入れ、３０秒間そのまま置いた。唾液又は血液によって汚染された紙片を研究から除外した。ＧＣＦ収集の後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む（ＰＢＳ−Ｔ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌの入ったエッペンドルフバイアルに紙片を入れた。５分間、１００００ｇの遠心分離（Hermle Labortech Nik.  Ｚ−２３３  ＭＫ−２）によってＧＣＦを抽出した。溶離手順を２回繰り返し、最も冒されている歯周部位で４つの歯周ポケット（１×四分円）からＧＣＦ試料を得た。さらに、４ｍｌ〜６ｍｌの唾液を１０ｍｌのファルコン（商標）チューブに収集した。いずれの試料も収集後に液体窒素に入れ、更なる解析まで保存した。
【００７９】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＧＣＦ及び唾液の試料中のＰＬＡＰ、ＰｌＧＦ及びｓＦｌｔ−１の濃度を製造業者の指示書に従い商業的に入手可能なＥＬＩＳＡを使用して定量した（ＰＬＡＰ、ヒトＰＬＡＰ  Ｅｌｉｓａキット、MyBioSource（商標）、カタログ番号ＭＢＳ７０１９９５８４、２０００ｐｇ／ｍｌ検出範囲；ヒトＰｌＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｅｌｉｓａキット、R & D Systems、カタログ番号ＤＰＧ００、１５．６ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｐｇ／ｍｌ範囲検出；及びＶＥＦＲ／Ｆｌｔ−１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｅｌｉｓａキット、R & D Systems、カタログ番号ＤＶＲ１００Ｂ、３１．２ｐｇ／ｍｌ〜２０００ｐｇ／ｍｌ範囲検出）。４５０ｎｍの波長にて、自動ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＥｌｉｓａプレートを読んだ（マイクロプレートリーダー、ＥＬｘ８０８、米国バーモント州ウィヌースキーのBiotek Instruments）。母体の口腔液試料中のｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ及びＰＬＡＰの濃度を標準曲線からの内挿によって決定した。アッセイを行う研究所職員は、臨床情報を知らされていなかった。
【００８０】
統計学的分析
データの正規性をシャピロ−ウィルコックス検定を使用して検定した。ＰｌＧＦ、ｓＦＬＴ−１及びＰＬＡＰの母体のＧＣＦ及び唾液の濃度が正規分布に従わなかったことから、分析にノンパラメトリック検定を使用した。カイ２乗又はフィッシャー直接検定によって比率間の比較を行い、連続変数の比較に対してマン−ホイットニーＵ検定を使用した。ＢＭＩ、歯周の診断及びタバコ使用によって補正した多重ロジスティック回帰モデルを使用して関連強さ（association strength）を判断した。非補正及び補正のオッズ比（ＯＲ）を特定し、ＳＴＡＴＡソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  １１；米国テキサス州レイクウェイドライブ、カレッジステーションのStataCorp）を使用して統計学的分析を行った。
【００８１】
結果
症例群及び対照群の人口統計的特性及び臨床的特性を表１に提示する。全ての試料は、同じ歯科医によって妊娠１１週〜１４週に採取された。存在する歯のメジアン数は両群において同じであった（２７）。両方の群において、全ての歯周の臨床測定を表２に示す。
【００８２】
ＧＤＭを発症した女性に対するＧＣＦ中のＰＬＡＰレベルの観察された平均値は、健康な妊娠における４．７ｐｇ／ｍｌと比較して１２．２ｐｇ／ｍＬであった。ＰｌＧＦレベルは、健常者で１ｐｇ／ｍｌ及び症例群で５．３ｐｇ／ｍｌであった。
【００８３】
興味深いことに、表４に反映されるように、歯肉溝滲出液（ｐｇ／ｍｌ）から得られたＰｌＧＦ値は統計学的に有意であり、血糖について同じことが言える。さらに、図２に示されるように、血糖に対するＲＯＣ曲線の（de）面積は０．８２１４であり、この面積は、血糖をＧＣＦ液から得られたＰｌＧＦ値と合わせた場合に有意に増加された。
【００８４】
実施例２．妊娠高血圧腎症
材料及び方法
研究計画
チリ国サンチアゴのソテロ・デル・リオ病院の母子ユニットに入院したＰＥを有する患者（ｎ＝１０）を含めて症例対照研究を行った。正常妊娠を伴う女性を無作為に選択して対照群（ｎ＝２０）を作り、年齢及び社会経済的状態について関連付けた。いずれかの関連する医学的障害（既存の高血圧症、腎疾患、貧血又は糖尿病等）を有する女性を除外した。また、歯が１８本未満の、先の３ヶ月間に全身又は局所の抗微生物／抗炎症療法を使用したことのある、又は以前に歯周治療の既往のある女性を除外した。１人の歯周病専門歯科医によって歯科評価及び全顎歯周検査を行った。臨床及び研究目的の唾液及びＧＣＦの研究及び収集は、アンデス大学及びソテロ・デル・リオ病院の両方の倫理委員会によって承認された。試料の収集に先立って、登録時、全ての患者から書面のインフォームド・コンセントを得た。
【００８５】
定義
妊娠高血圧腎症は、以前に正常血圧の女性において妊娠２０週の後に発症する、４時間の間隔で少なくとも２回、収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ超及び／又は拡張期血圧９０ｍｍ超の存在で診断され、またタンパク尿がなくてはならない（２４時間で３００ｍｇ超、又は２４時間の収集が不可能である場合、中間尿（midstream）又はカテーテルの尿検体の尿試験紙分析で２＋超の２回の読み取り）。タンパク尿がない場合、以下の全身所見、すなわち（ａ）血小板減少症（血小板数１０００００μＬ未満）、（ｂ）腎不全（クレアチニン１．１ｍｇ／ｄＬ超、又は腎疾患の基礎疾患がない状態でクレアチニンの２倍の増加）、（ｃ）異常肝機能（すなわち、肝臓トランスアミナーゼレベルが正常値の２倍）、及び（ｄ）肺水腫又は大脳若しくは視覚的な症状のいずれかの新たな発症を含む。米国産科婦人科学会（ＡＣＯＧガイドライン。妊娠高血圧腎症及び子癇の診断及び管理）３０、及び米国高血圧教育計画（妊娠中の高血圧に関する米国高血圧教育計画ワーキンググループの報告書）３１に従って、対照群を慢性の病状又は分娩時合併症のない単生児妊娠の正常血圧の女性として定義した。
【００８６】
４本以上の歯が４ｍｍ以上のプロービングポケットデプスを有する部位を１以上示した場合、また同様に、同じ部位で３ｍｍ以上の臨床アタッチメントの喪失、炎症、及びプロービング時の出血（ＢＯＰ）を有した場合、その女性を歯周炎と診断した。２０％超の部位でのＢＯＰ及び歯肉の発赤を示したが、臨床アタッチメントの喪失を有しなかった女性を、歯肉炎を有すると診断した。
【００８７】
試料収集及び評価
両群の同じ妊娠期間に歯周検査及び口腔液試料の収集を行った。歯を巻綿で隔離した後、歯肉縁上のプラークをキュレット（米国イリノイ州グレイシーのHu Friedy）で歯肉縁に触れずに除去した。その後、歯肉溝をエアシリンジで穏やかに乾燥した。ＧＣＦを紙片（米国ニューヨーク州アミティビルのPro-Flow）により収集した。紙片を軽く抵抗を感じるまで溝／ポケットに入れ、３０秒間そのまま置いた。唾液又は血液によって汚染された紙片を研究から除外した。ＧＣＦ収集の後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む（ＰＢＳ−Ｔ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μＬの入ったエッペンドルフバイアルに紙片を入れた。５分間、１００００ｇの遠心分離（Hermle Labortech Nik.  Ｚ−２３３  ＭＫ−２）によってＧＣＦを抽出した。溶離手順を２回繰り返し、最も冒されている歯周部位で４つの歯周ポケット（１×四分円）からＧＣＦ試料を得た。さらに、４ｍＬ〜６ｍＬの唾液を１０ｍＬのファルコン（商標）チューブに収集した。いずれの試料も収集後に液体窒素に入れ、更なる解析まで保存した。
【００８８】
唾液及びＧＣＦの超遠心分離
唾液及びＧＣＦの試料を４℃、１５００ｇで１０分間遠心分離した。その後、上清を除去して別のチューブに入れ、４℃、１７０００ｇで１５分間遠心分離した。最初の遠心分離工程の後、上清を無菌チューブに移し、４℃、１６００００ｇで１時間、超遠心分離を行った。超遠心分離の後、水層を除去し、ＥＶを含有するペレットをＰＢＳで洗浄し、４℃、１６００００ｇで１時間、再び超遠心分離した。上清を除去し、ＣＤ６３＋のＥＬＩＳＡアッセイ用にペレットを準備した。
【００８９】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＧＣＦ及び唾液の試料中のＣＤ６３＋  ＥＶ量、並びにＰＬＡＰ、ＰｌＧＦ及びｓＦｌｔ−１の濃度を製造業者の指示に従い商業的に入手可能なＥＬＩＳＡを使用して定量した（ＣＤ６３  ｅｘｏＥｌｉｓａ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）カタログ番号ＥＸＯＥＬ−ＣＤ６３Ａ−１、ＰＬＡＰ、ヒトＰＬＡＰ  Ｅｌｉｓａキット、MyBioSource（商標）、カタログ番号ＭＢＳ７０１９９５８４、２０００ｐｇ／ｍＬ検出範囲；ヒトＰｌＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｅｌｉｓａキット、R & D Systems、カタログ番号ＤＰＧ００、１５．６ｐｇ／ｍＬ〜１０００ｐｇ／ｍＬ範囲検出；及びＶＥＦＲ／Ｆｌｔ−１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｅｌｉｓａキット、R & D Systems、カタログ番号ＤＶＲ１００Ｂ、３１．２ｐｇ／ｍＬ〜２０００ｐｇ／ｍＬ範囲検出）。ＣＤ６３＋  ＥｘｏＥｌｉｓａ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）を使用してＥＶを定量し、結果をＥＶの数で提示した。４５０ｎｍの波長にて自動ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＥＬＩＳＡプレートを読んだ（マイクロプレートリーダー、ＥＬｘ８０８、米国バーモント州ウィヌースキーのBiotek Instruments）。母体の口腔液試料中のｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、ＰＬＡＰ及びＣＤ６３＋  ＥＶの濃度を標準曲線からの内挿によって特定した。アッセイを行う研究所職員は、臨床情報を知らされていなかった。
【００９０】
リアルタイムＰＣＲ
製造業者（米国カリフォルニア州バレンシアのQiagen）からの指示書に従い、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキットを使用してＧＣＦからトータルＲＮＡを単離した。その後、トータルＲＮＡを分光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００、米国デラウェア州ウィルミントンのThermo Scientific）によって定量し、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで吸光度の比を使用してその質を判断した。８０ナノグラムのトータルＲＮＡをＤＮａｓｅＩで処理し、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ逆転写システム（米国マディソンのPromega）を使用することによって逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲアッセイをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３０００Ｐシステム（米国サンタクララのAgilent Technologies）で行った。ｈＰＬに対して以下の遺伝子特異的プライマーを使用した：フォワード５’ＧＣＧＡＴＧＡＣＴＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＡＡＡＧ３’及びリバース５’ＣＡＴＧＧＴＴＧＴＧＣＧＡＧＴＴＴＧＴＧ３’。遺伝子３６Ｂ４（酸性リボソームリンタンパク質）をハウスキーピング遺伝子として使用した。ＰＣＲ産物をそれぞれの陰性対照と共に２％アガロースゲルにおいて可視化した。
【００９１】
統計学的分析
データの正規性をシャピロ−ウィルコックス検定を使用して検定した。ＣＤ６３＋  ＥＶ量と同様に、ＰｌＧＦ、ｓＦＬＴ−１及びＰＬＡＰの母体のＧＣＦ及び唾液の濃度が正規分布に従わなかったことから、分析にノンパラメトリック検定を使用した。カイ２乗又はフィッシャー直接検定によって比率間の比較を行い、連続変数の比較に対してマン−ホイットニーＵ検定を使用した。肥満度指数（ＢＭＩ）、歯周の診断及びタバコ使用によって補正した多重ロジスティック回帰モデルを使用して関連強さを判断した。非補正及び補正のオッズ比を特定し、ＳＴＡＴＡソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  １１；米国テキサス州レイクウェイドライブ、カレッジステーションのStataCorp）を使用して統計学的分析を行った。
【００９２】
結果
症例群及び対照群の人口統計的特性及び臨床的特性を表７に提示する。群間で母体のメジアン年齢及びＢＭＩの有意差は識別されなかった。一旦ＰＥと診断されたら２４時間を超えない時間範囲（妊娠３３±１週のメジアン）で全ての試料を採取した。また、対照群はサンプル手順（samples procedure）に対する妊娠時期について同等とした（妊娠３１±３週間のメジアン）。存在する歯のメジアン数はＰＥ群で２６本、対照で２７．５本であった。平均プロービングデプスは、両群で類似した。観察されたＢＯＰを示す部位のパーセンテージは、ＰＥにおいて５５．１％及び対照群において３７．３％であったが、この差は統計学的には有意ではなかった。プラークが付着した部位のレベルもまた、群間で類似した（データを示していない）。さらに、ＰＥを有する患者の５０％（５／１０）で慢性歯周炎が見られ、残りの患者は歯肉炎と診断された。対照群では、患者の４０％は慢性歯周炎と診断され、６０％は歯肉炎と診断された。
【００９３】
母体の以前の喫煙歴は、ＰＥ群の３０％及び対照群の３５％で有り（positive）であった。ＰＥと、ＰＬＡＰのＧＣＦレベル（ｐ値＝０．０４９９）及びｓＦｌｔ−１（ｐ値＝０．０３３）との関連が観察されたが、以前のタバコ使用、ＢＭＩ及び歯周の診断によって補正されたＰｌＧＦ及びＣｄ６３＋  ＥＶ（それぞれ、ｐ値＝０．３５８、ｐ値＝０．５９５）では観察されなかった。唾液試料では、ｓＦｌｔ−１レベルとＰＥ診断との間の関連が観察された（ｐ値＝０．０４５）。
【００９４】
多重ロジスティック回帰分析は、ＧＣＦ中のＰＬＡＰ及びｓＦｌｔ−１のレベルの増加（それぞれＯ．Ｒ＝１．０１；及びＯ．Ｒ＝１．１０）がタバコ使用、ＢＭＩ及び歯周の診断によって補正された妊娠患者においてＰＥと関連することを示唆する（表８）。唾液とＧＣＦの両方のｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、ＣＤ６３＋  ＥＶ及びＰＬＡＰの濃度を図１５以降にそれぞれ示す。さらに、ＰＥを有する女性患者のＧＣＦ中のＰＬＡＰ／ＣＤ６３＋  ＥＶ比は、正常妊娠を有する女性のものよりも有意に高かった（ｐ値＝０．０００８）（図５）。ＧＣＦ中の特定の胎盤起源の成分の存在を証明するために、ｈＰＬのｍＲＮＡを測定した。ｈＰＬの転写をＧＣＦにおいて検出した。興味深いことに、ｈＰＬのｍＲＮＡは、ＰＥを有する患者（ｎ＝５）に由来するＧＣＦではなく、対照群（ｎ＝４）に由来するＧＣＦにおいて検出された。
【００９５】
結論として、これは、妊娠中の母体の口腔液（ＧＣＦ及び唾液）中のＰＬＡＰ、ＰＩＧＦ及びｓＦｌｔ−１の濃度の同定及び変化を報告し、また正常妊娠と比較して、これらの分子がＰＥで有意に上昇される又は減少されることを示す最初の研究である。
【００９６】
【表１】
2018536170.tif 000002
【００９７】
【表２】
2018536170.tif 000003
【００９８】
【表３】
2018536170.tif 000004
【００９９】
【表４】
2018536170.tif 000005
【０１００】
【表５】
2018536170.tif 000006
【０１０１】
【表６】
2018536170.tif 000007
【０１０２】
【表７】
2018536170.tif 000008
【０１０３】
【表８】
2018536170.tif 000009
【図１】
2018536170.tif 000010
【図２】
2018536170.tif 000011
【図３】
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【図４】
2018536170.tif 000013
【図５Ａ−５Ｂ】
2018536170.tif 000014
【図５Ｃ−５Ｄ】
2018536170.tif 000015
【図５Ｅ−５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2018536170.tif 000020
【図９】
2018536170.tif 000021
【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
2018536170.tif 000023
【図１１】
2018536170.tif 000024
【図１２Ａ−１２Ｂ】
2018536170.tif 000025
【図１２Ｃ−１２Ｄ】
2018536170.tif 000026
【国際調査報告】
2018536170.tif 000027
2018536170.tif 000028
2018536170.tif 000029
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