(57)【要約】本発明は、以下の式の化合物 2018505897.tif 000016またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。【選択図】なし
2018505897.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物
【化１】
2018505897.tif 000014
またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
前記化合物が、
【化２】
2018505897.tif 000015
である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
前記化合物が、（３Ｒ，４Ｓ）−１−［５−［［３−（４，４−ジフルオロシクロヘキセン−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ］ピリミジン−２−イル］−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ピロリジン−３−アミンである、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤のうちの少なくとも１つとを含む、医薬組成物。
【請求項５】
有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を、哺乳動物に投与することを含む、それを必要とする哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病を治療する方法。
【請求項６】
有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を、哺乳動物に投与することを含む、それを必要とする哺乳動物における肥満を治療する方法。
【請求項７】
医薬の製造における使用のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピラゾール化合物またはその薬学的に許容可能な塩に関する。本発明の化合物は、メチオニンアミノペプチダーゼ２（ＭｅｔＡＰ２）およびジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）の阻害剤である。
【背景技術】
【０００２】
ＭｅｔＡＰ２は、リボソームから出現する新生ペプチドから阻害剤メチオニンを切断するメタロプロテイナーゼである。特許文献１は、肥満治療のための小分子ＭｅｔＡＰ２阻害剤を報告している。
【０００３】
ＤＰＰ−４阻害剤は、２型糖尿病を有する患者において血糖管理を改善するための確立された薬物クラスである。ＭｅｔＡＰ２およびＤＰＰ−４の両方において二重阻害活性を有する化合物が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６５８７９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、二重ＭｅｔＡＰ２およびＤＰＰ−４阻害を有する新規化合物を提供する。これらの二重阻害化合物は、ＭｅｔＡＰ２およびＤＰＰ−４により媒介される状態の治療に有用であり得る。
【０００６】
本発明は、式Ｉの化合物
【化１】
2018505897.tif 000003
またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００７】
本発明の一実施形態において、化合物は、
【化２】
2018505897.tif 000004
またはその薬学的に許容可能な塩である。
【０００８】
本発明の一実施形態において、化合物は、（３Ｒ，４Ｓ）−１−［５−［［３−（４，４−ジフルオロシクロヘキセン−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ］ピリミジン−２−イル］−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ピロリジン−３−アミンである。
【０００９】
本発明は、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤および賦形剤からなる群から選択される少なくとも１つとを含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を哺乳動物に投与することを含む、それを必要とする哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病を治療する方法を提供する。本発明は、有効量の式Ｉの化合物を哺乳動物に投与することを含む、それを必要とする哺乳動物における肥満を治療する方法を提供する。別の実施形態において、療法に使用するための式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩である。さらに、医薬の製造に使用するための式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の化合物は薬学的に許容可能な塩として提供され得る。「薬学的に許容可能な塩」とは、臨床的および／または獣医学的使用に許容可能であるとみなされる本発明の化合物の塩を指す。薬学的に許容可能な塩およびそれらを調製するための一般的な方法は当該分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．６６、Ｎｏ．１、１９７７年１月を参照のこと。
【００１２】
さらに、以下の調製例に記載される特定の中間体は１つ以上の窒素保護基を含有してもよい。可変保護基は、実施される特定の反応条件および特定の変換に応じて各出現において同じであっても、または異なっていてもよい。保護および脱保護条件は当業者に周知であり、文献に記載されている（例えば、Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．ＷｕｔｓおよびＴｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅによる「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００７を参照のこと）。
【００１３】
個々の異性体、鏡像異性体、およびジアステレオマーは、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーなどの方法によって、本発明の化合物の合成における任意の好都合な点で当業者により分離または分割されてもよい（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓら、「Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９８１、ならびにＥ．Ｌ．ＥｌｉｅｌおよびＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ、「Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４を参照のこと）。
【００１４】
本発明の化合物またはその塩は当業者に公知の種々の手順によって調製されてもよく、それらのいくつかは以下の調製例および実施例に例示される。記載される経路の各々についての特定の合成工程は、本発明の化合物またはその塩を調製するために、異なる様式で組み合わされてもよいか、または異なるスキームからの工程と併せられてもよい。以下のスキームにおける各工程の生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、粉砕、および結晶化を含む、当業者に周知の従来の方法によって回収され得る。以下のスキームにおいて、他に示されない限り、全ての置換基は以前に定義される通りである。試薬および出発物質は当業者にとって容易に入手可能である。他のものは、公知の構造的に同様の化合物の合成と類似している有機化学および複素環化学の標準的な技術、ならびに任意の新規手順を含む以下の調製例および実施例に記載される手順によって作製され得る。
【００１５】
本明細書に使用される略語は、Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、Ｖｏｌ．１７、Ｎｏ．１、１９８４に従って定義される。他の略語は以下のように定義される：「ＡＭＣ」は７−アミド−４−メチルクマリン臭化水素酸塩を指し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し、「ＤＩＯ」は食餌性肥満を指し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し、「ＨＥＣ」はヒドロキシエチルセルロースを指し、「ＨＥＰＥＳ」は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を指し、「ＨＦＤ」は高脂肪食を指し、「ＨＯＡｃ」は酢酸を指し、「ＩＣ５０」は薬剤について可能な最大阻害反応の５０％を生じるその薬剤の濃度を指し、「ＭｅＯＨ」はメチルアルコールまたはメタノールを指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、「Ｔｒｉｓ」はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを指す。
【実施例】
【００１６】
調製例１
２−（２−クロロピリミジン−５−イル）オキシアセトニトリル
【化３】
2018505897.tif 000005
ＣＨ３ＣＮ（１００ｍＬ）中のブロモアセトニトリル（２．９４ｍＬ、４２．１８ｍｍｏｌ）、２−クロロピリミジン−５−オール（５ｇ、３８．３０ｍｍｏｌ）の混合物に、炭酸カリウム（７．９４ｇ、５７．４５ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を６０℃で２時間加熱する。室温で冷却した後、固体を濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣を、１００％のエタノールから１／１のエーテル／酢酸エチルの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、白色固体として標題化合物（６ｇ、３５．３８ｍｍｏｌ、９２．３７％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：１７０（Ｍ＋Ｈ）。
【００１７】
調製例２
２−（２−クロロピリミジン−５−イル）オキシ−３−オキソ−プロパンニトリル
【化４】
2018505897.tif 000006
１，２−ジメトキシエタン（２００ｍＬ、１９３０ｍｍｏｌ）中の２−（２−クロロピリミジン−５−イル）オキシアセトニトリル（６．００ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）およびギ酸エチル（２６．２ｇ、３５４ｍｍｏｌ）の溶液にカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５．９６ｇ、５３．１ｍｍｏｌ）を０℃にて少しずつ加える。混合物を８５℃にて一晩撹拌する。混合物を濃縮し、水（２００ｍＬ）中に溶解し、ＨＯＡｃでｐＨが約４になるようにｐＨを調整する。水相を酢酸エチル（５×２００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相を水（２×５００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、濃縮して標題化合物（６．１０ｇ、３０．９ｍｍｏｌ、８７．３％）を茶色の固体として得、それをさらに精製せずに使用する。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：１９６（Ｍ−Ｈ）。
【００１８】
調製例３
４−（２−クロロピリミジン−５−イル）オキシ−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン
【化５】
2018505897.tif 000007
酢酸（２０ｍＬ）およびエタノール（４０ｍＬ）中の２−（２−クロロピリミジン−５−イル）オキシ−３−オキソ−プロパンニトリル（６．００ｇ、３０．４ｍｍｏｌ）の溶液に水（５．００ｍＬ）中のヒドラジン（６４質量％）を加える。溶液を８５℃にて２時間撹拌し、濃縮し、７ＮのＮＨ３／ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）を加える。混合物を３０分間撹拌し、濃縮する。残渣を、１００％のＣＨ２Ｃｌ２から８０％のＣＨ２Ｃｌ２および２０％のＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物（３．１５ｇ、１４．９ｍｍｏｌ、４９％）を橙色の油として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：２１２（Ｍ＋Ｈ）。
【００１９】
調製例４
５−［（３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）オキシ］−２−クロロ−ピリミジン
【化６】
2018505897.tif 000008
ＣＨ３ＣＮ（１００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルニトリル（２．１３ｍＬ、１７．９ｍｍｏｌ）の溶液に臭化銅（Ｉ）（２．５６ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）を加える。混合物をＮ２下で室温にて１時間撹拌し、続いてＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）中の４−（２−クロロピリミジン−５−イル）オキシ−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン（３．１５ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）を加える。混合物を３時間撹拌し、濃縮し、残渣を、１００％のＣＨ２Ｃｌ２から８０％のＣＨ２Ｃｌ２および２０％のＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物（１．３０ｇ、４．７２ｍｍｏｌ、３１．７％）を橙色の油として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：２７５（Ｍ＋Ｈ）。
【００２０】
調製例５
５−（３−ブロモ−１−テトラヒドロピラン−２−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−２−クロロ−ピリミジン
【化７】
2018505897.tif 000009
ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の５−［（３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）オキシ］−２−クロロ−ピリミジン（１．３０ｇ、１．３０ｇ、４．７２ｍｍｏｌ）の溶液に、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（ｐｒａｎ）（２．１５ｍＬ、２３．６ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（０．２４６ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を加える。混合物を６０℃にて３時間撹拌し、濃縮し、残渣を、１００％の石油エーテルから１：１の石油エーテル／酢酸エチルの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物（１．５ｇ、４．２ｍｍｏｌ、８８％）を白色固体として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：２５９（Ｍ＋Ｈ）。
【００２１】
調製例６
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（３Ｒ，４Ｓ）−１−［５−（３−ブロモ−１−テトラヒドロピラン−２−イル−ピラゾール−４−イル）オキシピリミジン−２−イル］−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］カルバメート
【化８】
2018505897.tif 000010
ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）中の５−（３−ブロモ−１−テトラヒドロピラン−２−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−２−クロロ−ピリミジン（１．５０ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（３Ｒ，４Ｓ）−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］カルバメート（１．４５ｇ、４．５９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１．７３ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃にて一晩撹拌する。混合物を室温に冷却し、水（１００ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出物を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、濃縮する。残渣を、１００％のＣＨ２Ｃｌ２から８０％のＣＨ２Ｃｌ２および２０％のＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物（２．３３ｇ、３．６４ｍｍｏｌ、８７．３％）を黄色の油として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：６３９（Ｍ＋Ｈ）。
【００２２】
調製例７
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（３Ｒ，４Ｓ）−１−［５−［３−（４，４−ジフルオロシクロヘキセン−１−イル）−１−テトラヒドロピラン−２−イル−ピラゾール−４−イル］オキシピリミジン−２−イル］−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］カルバメート
【化９】
2018505897.tif 000011
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（３Ｒ，４Ｓ）−１−［５−（３−ブロモ−１−テトラヒドロピラン−２−イル−ピラゾール−４−イル）オキシピリミジン−２−イル］−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］カルバメート（２．３３ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）、２−（４，４−ジフルオロシクロヘキセン−１−イル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（１．０７ｇ、４．３７ｍｍｏｌ）、クロロ（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル）［２−（２−アミノエチル）フェニル］パラジウム（ＩＩ）（０．１３６ｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）、２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル（０．１７７ｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）およびリン酸三カリウム（１．５９ｇ、７．２９ｍｍｏｌ）の混合物に、水（８ｍＬ）および１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）を加える。混合物をＮ２下で１１０℃にて一晩撹拌する。混合物を濃縮し、残渣を、１００％のＣＨ２Ｃｌ２から８０％のＣＨ２Ｃｌ２および２０％のＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物（１．６１ｇ、２．３８ｍｍｏｌ、６５．３％）を淡黄色の泡状物として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：６７７（Ｍ＋Ｈ）。
【００２３】
実施例１
（３Ｒ，４Ｓ）−１−［５−［［３−（４，４−ジフルオロシクロヘキセン−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ］ピリミジン−２−イル］−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ピロリジン−３−アミン
【化１０】
2018505897.tif 000012
ジクロロメタン（１０ｍＬ、１５６．０ｍｍｏｌ）中のｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（３Ｒ，４Ｓ）−１−［５−［３−（４，４−ジフルオロシクロヘキセン−１−イル）−１−テトラヒドロピラン−２−イル−ピラゾール−４−イル］オキシピリミジン−２−イル］−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］カルバメート（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）の溶液に室温にてトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を加える。混合物を室温にて１６時間撹拌し、減圧下で濃縮する。残渣を、１００％のＣＨ２Ｃｌ２（０．５％のＮＨ４ＯＨ）から９０％のＣＨ２Ｃｌ２（０．５％のＮＨ４ＯＨ）、１０％のＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物（１．０２ｇ、２．０７ｍｍｏｌ、９３％）を白色の泡状物として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４９３（Ｍ＋Ｈ），１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ２．０９−２．２０（ｍ，２Ｈ），２．６４−２．７５（ｍ，４Ｈ），３．３３−３．３６（ｍ，１Ｈ），３．４８−３．６０（ｍ，２Ｈ），３．６９−３．７５（ｍ，１Ｈ），４．０３−４．１３（ｍ，２Ｈ），６．２７（ｓ，１Ｈ），７．１７−７．４１（ｍ，３Ｈ），８．１９（ｓ，２Ｈ）。
【００２４】
アッセイ
ＭｅｔＡＰ２およびＭｅｔＡＰ１の酵素活性アッセイ
本明細書に例示した化合物は本質的に以下に記載されるように試験し、ヒトおよびマウスＭｅｔＡＰ２アッセイについて１０００ｎＭ以下のＩＣ５０を示し、ＭｅｔＡＰ１の値は３０μＭより大きく、ＭｅｔＡＰ２に対して選択的であるとみなされる。
【００２５】
完全長ＭｅｔＡＰ２（ヒトおよびマウス）およびＭｅｔＡＰ１（ヒト）タンパク質を、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３、４２、５０３５−５０４２に記載されているものと同様の手順を使用してＳｆ９細胞から生成する。ＭｅｔＡＰ２およびＭｅｔＡＰ１をそれぞれ、５ｍＭのＭｎＣｌ２および２ｍＭのＣｏＣｌ２の存在下で精製し、使用前に−７８℃で保存する。
【００２６】
本発明における化合物によるヒトおよびマウスＭｅｔＡＰ２の触媒活性の阻害を、ＬＣ／ＭＳにより基質ペプチド（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ）からの生成物ペプチド（Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ）の形成をモニタリングすることによって測定する。反応は、典型的に、１００μｌのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．５にて５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１７ｍＭのＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００）中で４０分間、酵素、試験化合物および基質（１５０μＭ）をインキュベートすることによって行う。反応を２００μｌのＣＨ３ＣＮの添加により停止させた後、生成物および残存基質のレベルを質量分析計により定量する。ヒトＭｅｔＡＰ１の活性を、４６０ｎｍの励起光および５３５ｎｍの発光で分光光度計において、基質であるメチオニン−ローダミン−メチオニンからの蛍光生成物であるローダミン−メチオニンの形成によってモニタリングする。反応は、典型的に、１００μｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０、５０μＭのＣｏＣｌ２）中で６０分間、酵素、試験化合物および基質（５０μＭ）をインキュベートすることによって行う。ＩＣ５０値（ＭｅｔＡＰ２活性の５０％阻害を与える試験化合物の濃度）は、典型的に、４パラメーター方程式を使用して１０点用量滴定曲線から算出する。
【００２７】
ヒトおよびマウスＭｅｔＡＰ２アッセイの実施例１についてのＩＣ５０は１０００ｎＭより低く、ｈＭｅｔＡＰ１についてのＩＣ５０は＞３０μＭであり、ＭｅｔＡＰ１と比較して選択的ＭｅｔＡＰ２阻害を実証している。
【００２８】
ＤＰＰ−４の酵素活性アッセイ
ヒトＤＰＰ−４（（３９−７６６）−Ｈｉｓ）およびマウスＤＰＰ−４（（２９−７６０）−Ｈｉｓ）をこのアッセイにおける使用のために精製する。このアッセイにおけるｈＤＰＰ−４およびｍＤＰＰ−４の最終濃度はそれぞれ０．０４ｎＭおよび０．２２ｎＭである。
【００２９】
本発明における化合物によるヒトおよびマウスＤＰＰ−４の触媒活性の阻害を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて、基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｇ２７６１）からの生成物である蛍光ＡＭＣ（７−アミド−４−メチルクマリン臭化水素酸塩）の形成によってモニタリングする。反応は、典型的に、７５μｌのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．５にて０．０１％のＢＳＡ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５０μＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ（商標）−Ｘ１００、０．１ＭのＮａＣｌ）中で３０分間、酵素、試験化合物、および基質（１０μＭ）をインキュベートすることによって行う。反応を２５μｌのＺｎＳＯ４（１０ｍＭ）の添加により停止させた後、蛍光生成物ＡＭＣの形成を、３５５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長でＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて測定する。ＩＣ５０値は、典型的に、４パラメーターロジスティック方程式を使用して１０点用量滴定曲線から算出する。
【００３０】
実施例１についてのＩＣ５０は、ヒトおよびマウスＤＰＰ−４アッセイにおいて１０００ｎＭ未満であり、結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2018505897.tif 000013
【００３２】
化合物の治療的体重減少効果の測定
治療的体重減少効果および代謝パラメーターの改善を決定するために、本発明からの化合物を、高脂肪食（ＨＦＤ）を供給することにより誘導した肥満マウスモデル（ＤＩＯマウス）において試験する。このモデルにおいて、Ｃ５７／Ｂｌ６Ｊオスマウスに６０％のＨＦＤ（Ｄ１２４９２ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）を１６〜２８週間与えて、約５０ｇに到達する体重を有する肥満を確立する。マウスの体重を約５０ｇに徐々に増加させ、その体重をこの肥満状態に維持する。試験化合物（５ｍＬ／ｋｇで０．５％のＨＥＣと０．２５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０のビヒクルによる）を、研究期間全体を通して１日に１回または２回、肥満のＤＩＯマウスに経口投与する。１日に１回、２０ｍｇ／ｋｇおよび６０ｍｇ／ｋｇでの実施例１の経口処置についての肥満ＤＩＯマウスの用量依存的な体重減少は、１４日においてビヒクル群と比較してそれぞれ約４％および１７％の体重減少である。このデータは、実施例１の化合物が所望の体重減少と関連し、治療的体重減少効果を与えることができることを支持している。
【００３３】
マウスにおけるＤＰＰ−４薬力学的アッセイ
ＭｅｔＡＰ２とＤＰＰ−４二重阻害化合物によるインビボでのＤＰＰ−４阻害を決定するために、Ｃ５７Ｂ／Ｌ６除脂肪マウスに給餌状態で化合物を投与し、次いで血漿中のＤＰＰ−４標的会合を測定する。
【００３４】
動物を秤量し、体重によって無作為化する。経口強制投与により各マウスに、ビヒクルまたは最大で３倍までビヒクルで製剤化した試験化合物を投与する。第１回目の用量は１日目の９〜１０ａｍに投与する。第２回目の用量は１日目の１６：３０〜１７：３０に投与する。第３回目の用量は２日目の９〜１０ａｍに投与する。２日目の約３ｐｍの終了前の最後の用量の後、マウスを６時間絶食させる。血液試料を第１回目の投与から１時間後、および終了時に採取する。５ｍＭの最終濃度でＥＤＴＡ−Ｋ２を、抗凝固剤として使用する。血液試料から単離した血漿を使用して、血漿ＤＰＰ−４酵素活性を決定する。
【００３５】
本発明における血漿ＤＰＰ−４酵素活性を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーによって基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｇ２７６１）からの蛍光ＡＭＣの形成率によってモニタリングする。反応は、典型的に、４０μＬのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．５にて０．０１％のＢＳＡ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５０μＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ（商標）−Ｘ１００、０．１ＭのＮａＣｌ）中で、血漿（２０μｍ）および基質（１０μＭ）をインキュベートすることによって行う。蛍光シグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて動力学的モデルで反応の開始直後に読み取る。励起波長は３５５ｎｍに設定し、発光波長は４６０ｎｍに設定する。血漿ＤＰＰ−４活性は反応速度から算出する。血漿ＤＰＰ−４阻害パーセントはビヒクル群において血漿ＤＰＰ−４活性に対して正規化し、それを０％阻害と設定する。
【００３６】
アッセイ条件下で実施例１についての血漿ＤＰＰ−４阻害は、第１回目の投与から１時間後、および終了時のそれぞれについて８６％および８３％である。データは、実施例１の化合物が、治療的血糖管理を生じることができる所望のＤＰＰ−４阻害に関連することを支持している。
【国際調査報告】
2018505897.tif 000017
2018505897.tif 000018