(57)【要約】  ヒトＣＤ４０に結合する、アゴニスト抗体またはその抗原結合部分が提供される。このような抗体は、所望によりＦｃγＲIIｂへの特異性が増強されたＦｃ領域を含む。本発明はまた処置を必要とする対象に本発明の抗体を投与することを含む、癌または慢性感染を処置する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ４０に特異的に結合するおよび１２Ｄ６(配列番号３および４)、５Ｆ１１(配列番号２３および２４)、８Ｅ８(配列番号４０および４１)、５Ｇ７(配列番号５２および５３)および１９Ｇ３(配列番号５８および５９)からなる群から選択される１以上の抗体との交差遮断アッセイにおいてヒトＣＤ４０と競合して結合する、単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
交差遮断アッセイにおける競合が、選択抗体と等モル濃度で使用したとき、競合ＥＬＩＳＡにおいて選択抗体のヒトＣＤ４０への結合を少なくとも２０％減少させる能力を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
ａ. 配列EPPTACREKQYLINS(配列番号１の残基２１〜３５)を含むまたはこれからなるエピトープ(抗体１２Ｄ６、５Ｇ７および１９Ｇ３)または
ｂ. 配列ECLPCGESE(配列番号１の残基５８〜６６)を含むまたはこれからなるエピトープ(抗体５Ｆ１１)
でヒトＣＤ４０に特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
ａ)少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−３９＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ４由来の重鎖ＣＤＲ配列および
少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ１由来の軽鎖ＣＤＲ配列(１２Ｄ６)、
ｂ)少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−４＿０２およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ３由来の重鎖ＣＤＲ配列および
少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＫ３−５＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ５由来の軽鎖ＣＤＲ配列(５Ｆ１１)、
ｃ)少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−８０＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ２由来の重鎖ＣＤＲ配列および
少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ２由来の軽鎖ＣＤＲ配列(８Ｅ８)、
ｄ)少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−１８＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ４由来の重鎖ＣＤＲ配列および
少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１０−９６＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ２由来の軽鎖ＣＤＲ配列(５Ｇ７)または
ｅ)少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＨ５−９−４＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ３由来の重鎖ＣＤＲ配列および
少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１−１１７＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ２由来の軽鎖ＣＤＲ配列(１９Ｇ３)
を含むヒトＣＤ４０に特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
重鎖が次のものからなる群から選択されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含み、軽鎖が次のものからなる群から選択されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合部分：
ａ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号５の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号６の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１２Ｄ６−０３のＣＤＲ、
ｂ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号７の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号９の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１２Ｄ６−２２のＣＤＲ、
ｃ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号１０の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号１１の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１２Ｄ６−２３のＣＤＲ、
ｄ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号１２の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号９の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１２Ｄ６−２４のＣＤＲ、
ｅ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号２５の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０６を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号２６の残基２４〜３８、５４〜６０および９３〜１０１を含む抗体５Ｆ１１−１７のＣＤＲ、
ｆ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号２７の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０６を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号２８の残基２４〜３８、５４〜６０および９３〜１０１を含む抗体５Ｆ１１−２３のＣＤＲ、
ｇ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号２９の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０６を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号３０の残基２４〜３８、５４〜６０および９３〜１０１を含む抗体５Ｆ１１−４５のＣＤＲ、
ｈ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号４２の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号４３の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体８Ｅ８−５６のＣＤＲ、
ｉ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号４４の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号４５の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体８Ｅ８−６２のＣＤＲ、
ｊ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号４６の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号４７の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体８Ｅ８−６７のＣＤＲ、
ｋ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号４８の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号４９の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体８Ｅ８−７０のＣＤＲ、
ｌ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号５０の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号５１の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体８Ｅ８−７１のＣＤＲ、
ｍ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号５４の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０２を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号５５の残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７を含む抗体５Ｇ７−２２のＣＤＲ、
ｎ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号５６の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０２を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号５７の残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７を含む抗体５Ｇ７−２５のＣＤＲ、
ｏ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号６０の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号６２の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１９Ｇ３−１１のＣＤＲおよび
ｐ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号６３の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号６４の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１９Ｇ３−２２のＣＤＲ。
【請求項６】
次のものからなる群から選択される重鎖および軽鎖可変ドメイン配列選択を含む、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合部分：
ａ)それぞれ配列番号５および配列番号６の残基１〜１１９および残基１〜１１２を含む抗体１２Ｄ６−０３の重鎖および軽鎖可変領域、
ｂ)それぞれ配列番号７および配列番号９の残基１〜１１９および残基１〜１１２を含む抗体１２Ｄ６−２２の重鎖および軽鎖可変領域、
ｃ)それぞれ配列番号１０および配列番号１１の残基１〜１１９および残基１〜１１２を含む抗体１２Ｄ６−２３の重鎖および軽鎖可変領域、
ｄ)それぞれ配列番号１２および配列番号９の残基１〜１１９および残基１〜１１２を含む抗体１２Ｄ６−２４の重鎖および軽鎖可変領域、
ｅ)それぞれ配列番号２５および配列番号２６の残基１〜１１７および残基１〜１１１を含む抗体５Ｆ１１−１７の重鎖および軽鎖可変領域、
ｆ)それぞれ配列番号２７および配列番号２８の残基１〜１１７および残基１〜１１１を含む抗体５Ｆ１１−２３の重鎖および軽鎖可変領域、
ｇ)それぞれ配列番号２９および配列番号３０の残基１〜１１７および残基１〜１１１を含む抗体５Ｆ１１−４５の重鎖および軽鎖可変領域、
ｈ)それぞれ配列番号４２および配列番号４３の残基１〜１２２および残基１〜１１２を含む抗体８Ｅ８−５６の重鎖および軽鎖可変領域、
ｉ)それぞれ配列番号４４および配列番号４５の残基１〜１２２および残基１〜１１２を含む抗体８Ｅ８−６２の重鎖および軽鎖可変領域、
ｊ)それぞれ配列番号４６および配列番号４７の残基１〜１２２および残基１〜１１２を含む抗体８Ｅ８−６７の重鎖および軽鎖可変領域、
ｋ)それぞれ配列番号４５および配列番号４９の残基１〜１２２および残基１〜１１２を含む抗体８Ｅ８−７０の重鎖および軽鎖可変領域、
ｌ)それぞれ配列番号５０および配列番号５１の残基１〜１２２および残基１〜１１２を含む抗体８Ｅ８−７１の重鎖および軽鎖可変領域、
ｍ)それぞれ配列番号５４および配列番号５５の残基１〜１１３および残基１〜１０７を含む抗体５Ｇ７−２２の重鎖および軽鎖可変領域、
ｎ)それぞれ配列番号５６および配列番号５７の残基１〜１１３および残基１〜１０７を含む抗体５Ｇ７−２５の重鎖および軽鎖可変領域、
ｏ)それぞれ配列番号６０および配列番号６２の残基１〜１１２および残基１〜１１２を含む抗体１９Ｇ３−１１の重鎖および軽鎖可変領域および
ｐ)それぞれ配列番号６３および配列番号６４の残基１〜１１２および残基１〜１１２を含む抗体１９Ｇ３−２２の重鎖および軽鎖可変領域。
【請求項７】
ＦｃγＲIIｂへの結合の特異性を増強するＦｃ領域修飾をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
５未満のＡ／Ｉ比を示す、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
１未満のＡ／Ｉ比を示す、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
修飾Ｆｃ領域がＳＥ(配列番号６６)、ＳＥＬＦ(配列番号６７)、Ｐ２３８Ｄ(配列番号６８)、Ｖ４(配列番号６９)、Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号７０)、Ｖ７(配列番号７１)、Ｖ８(配列番号７２)、Ｖ９(配列番号７３)、Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号７４)、Ｖ１１(配列番号７５)およびＶ１２(配列番号７６)からなる群から選択される重鎖定常領域内にある、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
次のものからなる群から選択される重鎖および軽鎖配列を含む、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合部分：
ａ)それぞれ配列番号１３および配列番号９の配列を含む抗体１２Ｄ６−２４−Ｐ２３８Ｄの重鎖および軽鎖、
ｂ)それぞれ配列番号１４および配列番号９の配列を含む抗体１２Ｄ６−２４−ＳＥの重鎖および軽鎖、
ｃ)それぞれ配列番号１５および配列番号９の配列を含む抗体１２Ｄ６−２４−ＳＥＬＦの重鎖および軽鎖、
ｄ)それぞれ配列番号１６および配列番号９の配列を含む抗体１２Ｄ６−２４−Ｖ４の重鎖および軽鎖、
ｅ)それぞれ配列番号１７および配列番号９の配列を含む抗体１２Ｄ６−２４−Ｖ４  Ｄ２７０Ｅの重鎖および軽鎖、
ｆ)それぞれ配列番号１８および配列番号９の配列を含む抗体１２Ｄ６−２４−Ｖ８の重鎖および軽鎖、
ｇ)それぞれ配列番号１９および配列番号９の配列を含む抗体１２Ｄ６−２４−Ｖ９の重鎖および軽鎖、
ｈ)それぞれ配列番号２０および配列番号９の配列を含む抗体１２Ｄ６−２４−Ｖ９  Ｄ２７０Ｅの重鎖および軽鎖、
ｉ)それぞれ配列番号２１および配列番号９の配列を含む抗体１２Ｄ６−２４−Ｖ１１の重鎖および軽鎖、
ｊ)それぞれ配列番号２２および配列番号９の配列を含む抗体１２Ｄ６−２４−Ｖ１２の重鎖および軽鎖、
ｋ)それぞれ配列番号３１および配列番号３０の配列を含む抗体５Ｆ１１−４５−ＳＥの重鎖および軽鎖、
ｌ)それぞれ配列番号３２および配列番号３０の配列を含む抗体５Ｆ１１−４５−ＳＥＬＦの重鎖および軽鎖、
ｍ)それぞれ配列番号３３および配列番号３０の配列を含む抗体５Ｆ１１−４５−Ｖ４の重鎖および軽鎖、
ｎ)それぞれ配列番号３４および配列番号３０の配列を含む抗体５Ｆ１１−４５−Ｖ４  Ｄ２７０Ｅの重鎖および軽鎖、
ｏ)それぞれ配列番号３５および配列番号３０の配列を含む抗体５Ｆ１１−４５  Ｖ８の重鎖および軽鎖、
ｐ)それぞれ配列番号３６および配列番号３０の配列を含む抗体５Ｆ１１−４５−Ｖ９の重鎖および軽鎖、
ｑ)それぞれ配列番号３７および配列番号３０の配列を含む抗体５Ｆ１１−４５−Ｖ９  Ｄ２７０Ｅの重鎖および軽鎖、
ｒ)それぞれ配列番号３８および配列番号３０の配列を含む抗体５Ｆ１１−４５−Ｖ１１の重鎖および軽鎖および
ｓ)それぞれ配列番号３９および配列番号３０の配列を含む抗体５Ｆ１１−４５−Ｖ１２の重鎖および軽鎖。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする、核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターで形質転換された、細胞。
【請求項１５】
ａ)請求項１４に記載の細胞において抗体またはその抗原結合部分を発現させ、そして
ｂ)細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離する
ことを含む、抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の製造方法。
【請求項１６】
ａ)請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分および
ｂ)担体
を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
対象に請求項１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法。
【請求項１８】
対象が腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象が慢性ウイルス感染を有し、ウイルスに対する免疫応答感染が刺激される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
処置を必要とする対象に治療有効量の請求項１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌を処置する方法。
【請求項２１】
癌が膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
処置を必要とする対象に治療有効量の請求項１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、慢性ウイルス感染を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１６年３月４日出願の米国仮出願６２／３０３,８３８、２０１５年１１月９日出願の６２／２５２,６１５号および２０１５年６月２９日出願の６２／１８６,０７６号に基づく優先権を主張し、これらの開示を全て引用により本明細書に包含させる。
【背景技術】
【０００２】
背景
最近の研究により、ヒト癌および慢性感染症は、悪性細胞または感染された細胞に対する患者の免疫応答を調節する薬剤により処置され得ることが確認されている。例えば、Reck & Paz-Ares (2015) Semin. Oncol. 42:402参照。ＣＰ−８７０８９３およびダセツズマブ(ＳＧＮ−４０)のようなアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、このような免疫応答を増強する可能性があるとの確信に基づき、癌処置のために試験されている。例えば、Kirkwood et al. (2012) CA Cancer J. Clin. 62:309; Vanderheide & Glennie (2013) Clin. Cancer Res. 19:1035参照。マウスにおける最近の実験は、阻害性Ｆｃ受容体ＦｃγＲIIｂへの特性が増強された抗ＣＤ４０抗体の抗腫瘍効力が増加していることが示されている。例えば、ＷＯ２０１２／０８７９２８号; Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 109:10966; Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754参照。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヒト対象における癌および慢性感染症の処置のための、改善されたアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体が必要とされている。このような抗体は、好ましくは活性性Ｆｃ受容体と比較して阻害性Ｆｃ受容体ＦｃγＲIIｂへの特異性が増強されており、増強された抗腫瘍および／または抗感染性活性を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要約
ヒトＣＤ４０(配列番号１の成熟配列)に特異的に結合する、所望によりＦｃγＲIIｂ受容体への結合特異性を増強する修飾Ｆｃ領域を有する、単離ヒト化マウスモノクローナル抗体がここに提供される。
【０００５】
ある実施態様において、本発明は、ヒトまたはヒト化抗体を含む、抗体１２Ｄ６(配列番号３および４)、５Ｆ１１(配列番号２３および２４)、８Ｅ８(配列番号４０および４１)、５Ｇ７(配列番号５２および５３)および１９Ｇ３(配列番号５８および５９)の１以上と結合について競合する、交差遮断するまたは同じエピトープに結合する抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０００６】
ある実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、WGCLLTAVHPEPPTACRE(配列番号１の残基１１〜２８)(抗体１２Ｄ６)、EPPTACREKQYLINS(配列番号１の残基２１〜３５)(抗体１２Ｄ６、５Ｇ７および１９Ｇ３)およびECLPCGESE(配列番号１の残基５８〜６６)(抗体５Ｆ１１)からなる群から選択される１以上の配列を含むまたはこれからなるエピトープに結合する。
【０００７】
ある実施態様において、本発明の抗体は、表３に開示する抗ｈｕＣＤ４０抗体１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７または１９Ｇ３と少なくとも一部同じマウス生殖系列Ｖ領域遺伝子セグメントおよびＪ領域遺伝子セグメントに由来する重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含み、軽鎖はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む。特に、抗体は、抗体１２Ｄ６(少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−３９＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ４由来の重鎖ＣＤＲ配列および少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ１由来の軽鎖ＣＤＲ配列)、抗体５Ｆ１１(少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−４＿０２およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ３由来の重鎖ＣＤＲ配列および少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＫ３−５＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ５由来の軽鎖ＣＤＲ配列)、抗体８Ｅ８(少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−８０＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ２由来の重鎖ＣＤＲ配列および少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ２由来の軽鎖ＣＤＲ配列)、抗体５Ｇ７(少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−１８＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ４由来の重鎖ＣＤＲ配列および少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１０−９６＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ２由来の軽鎖ＣＤＲ配列)または抗体１９Ｇ３(少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＨ５−９−４＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ３由来の重鎖ＣＤＲ配列および少なくとも一部マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１−１１７＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ２由来の軽鎖ＣＤＲ配列)と同じマウス生殖系列由来のＣＤＲ配列を含み得る。
【０００８】
種々の実施態様において、本発明の抗体は、重鎖がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３からなる群から選択される配列を含み、軽鎖がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３からなる群から選択される配列を含む、重鎖および軽鎖を含み、ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号５の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号６の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１２Ｄ６−０３のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号７の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号９の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１２Ｄ６−２２のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号１０の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号１１の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１２Ｄ６−２３のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号１２の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号９の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１２Ｄ６−２４のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号２５の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０６を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号２６の残基２４〜３８、５４〜６０および９３〜１０１を含む抗体５Ｆ１１−１７のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号２７の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０６を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号２８の残基２４〜３８、５４〜６０および９３〜１０１を含む抗体５Ｆ１１−２３のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号２９の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０６を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号３０の残基２４〜３８、５４〜６０および９３〜１０１を含む抗体５Ｆ１１−４５のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号４２の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号４３の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体８Ｅ８−５６のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号４４の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号４５の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体８Ｅ８−６２のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号４６の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号４７の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体８Ｅ８−６７のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号４８の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号４９の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体８Ｅ８−７０のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号５０の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号５１の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体８Ｅ８−７１のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号５４の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０２を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号５５の残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７を含む抗体５Ｇ７−２２のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号５６の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０２を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号５７の残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７を含む抗体５Ｇ７−２５のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号６０の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号６２の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１９Ｇ３−１１のＣＤＲならびにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号６３の残基３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０１を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号６４の残基２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２を含む抗体１９Ｇ３−２２のＣＤＲである。
【０００９】
種々の実施態様において、本発明の抗体は、１２Ｄ６(配列番号３の残基１〜１１９)、５Ｆ１１(配列番号２３の残基１〜１１７)、８Ｅ８(配列番号４０の残基１〜１２２)、５Ｇ７(配列番号５２の残基１〜１１３)および１９Ｇ３(配列番号５８の残基１〜１１２)からなる群から選択される可変ドメインと、ＩｇＧ１ｆ(配列番号６５)、ＳＥ(配列番号６６)、ＳＥＬＦ(配列番号６７)、Ｐ２３８Ｄ(配列番号６８)、Ｖ４(配列番号６９)、Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号７０)、Ｖ７(配列番号７１)、Ｖ８(配列番号７２)、Ｖ９(配列番号７３)、Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号７４)、Ｖ１１(配列番号７５)およびＶ１２(配列番号７６)からなる群から選択されるＦｃγＲIIｂ特異的Ｆｃ領域を含む定常領域を含む、重鎖を含む。
【００１０】
ある実施態様において、抗体は、１２Ｄ６−０３(それぞれ配列番号５および配列番号６の残基１〜１１９および残基１〜１１２)、１２Ｄ６−２２(それぞれ配列番号７および配列番号９の残基１〜１１９および残基１〜１１２)、１２Ｄ６−２３(それぞれ配列番号１０および配列番号１１の残基１〜１１９および残基１〜１１２)、１２Ｄ６−２４(それぞれ配列番号１２および配列番号９の残基１〜１１９および残基１〜１１２)、５Ｆ１１−１７(それぞれ配列番号２５および配列番号２６の残基１〜１１７および残基１〜１１１)、５Ｆ１１−２３(それぞれ配列番号２７および配列番号２８の残基１〜１１７および残基１〜１１１)、５Ｆ１１−４５(それぞれ配列番号２９および配列番号３０の残基１〜１１７および残基１〜１１１)、８Ｅ８−５６(それぞれ配列番号４２および配列番号４３の残基１〜１２２および残基１〜１１２)、８Ｅ８−６２(それぞれ配列番号４４および配列番号４５の残基１〜１２２および残基１〜１１２)、８Ｅ８−６７(それぞれ配列番号４６および配列番号４７の残基１〜１２２および残基１〜１１２)、８Ｅ８−７０(それぞれ配列番号４８および配列番号４９の残基１〜１２２および残基１〜１１２)、８Ｅ８−７１(それぞれ配列番号５０および配列番号５１の残基１〜１２２および残基１〜１１２、５Ｇ７−２２(それぞれ配列番号５４および配列番号５５の残基１〜１１３および残基１〜１０７)、５Ｇ７−２５(それぞれ配列番号５６および配列番号５７の残基１〜１１３および残基１〜１０７)、１９Ｇ３−１１(それぞれ配列番号６０および配列番号６２の残基１〜１１２および残基１〜１１２)および９Ｇ３−２２(それぞれ配列番号６３および配列番号６４の残基１〜１１２および残基１〜１１２)からなる群から選択される、特定の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。これらの抗体の何れもさらにＦｃγＲIIｂ特異的Ｆｃ領域を含む重鎖定常領域を含んでよく、該重鎖定常領域はＩｇＧ１ｆ(配列番号６５)、ＳＥ(配列番号６６)、ＳＥＬＦ(配列番号６７)、Ｐ２３８Ｄ(配列番号６８)、Ｖ４(配列番号６９)、Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号７０)、Ｖ７(配列番号７１)、Ｖ８(配列番号７２)、Ｖ９(配列番号７３)、Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号７４)、Ｖ１１(配列番号７５)およびＶ１２(配列番号７６)からなる群から選択される番号７６)。これらの抗体の何れもさらに配列番号７７の軽鎖カッパ定常領域を含んでよい。
【００１１】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号９の軽鎖および配列番号１３〜２２の何れかからなる群から選択される重鎖を含むヒト化１２Ｄ６−２４抗体または配列番号３０の軽鎖および配列番号３１〜３９の何れかからなる群から選択される重鎖を含むヒト化５Ｆ１１−４５抗体を含む。特定の抗体は、１２Ｄ６−２４  ＳＥ(配列番号９および１４)、１２Ｄ６−２４  ＳＥＬＦ(配列番号９および１５)、１２Ｄ６−２４  Ｐ２３８Ｄ(配列番号９および１３)、１２Ｄ６−２４  Ｖ４(配列番号９および１６)、１２Ｄ６−２４  Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号９および１７)、１２Ｄ６−２４  Ｖ８(配列番号９および１８)、１２Ｄ６−２４  Ｖ９(配列番号９および１９)、１２Ｄ６−２４  Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号９および２０)、１２Ｄ６−２４  Ｖ１１(配列番号９および２１)、１２Ｄ６−２４  Ｖ１２(配列番号９および２２)、５Ｆ１１−４５  ＳＥ(配列番号３０および３１)、５Ｆ１１−４５  ＳＥＬＦ(配列番号３０および３２)、５Ｆ１１−４５  Ｖ４(配列番号３０および３３)、５Ｆ１１−４５  Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号３０および３４)、５Ｆ１１−４５  Ｖ８(配列番号３０および３５)、５Ｆ１１−４５  Ｖ９(配列番号３０および３６)、５Ｆ１１−４５  Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号３０および３７)、５Ｆ１１−４５  Ｖ１１(配列番号３０および３８)および５Ｆ１１−４５  Ｖ１２(配列番号３０および３９)を含み、ここで、配列は軽鎖および重鎖についてそれぞれ提供されている。
【００１２】
さらなる実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、１２Ｄ６−２４  ＳＥ(配列番号９および１４)、１２Ｄ６−２４  ＳＥＬＦ(配列番号９および１５)、１２Ｄ６−２４  Ｐ２３８Ｄ(配列番号９および１３)、１２Ｄ６−２４  Ｖ４(配列番号９および１６)、１２Ｄ６−２４  Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号９および１７)、１２Ｄ６−２４  Ｖ８(配列番号９および１８)、１２Ｄ６−２４  Ｖ９(配列番号９および１９)、１２Ｄ６−２４  Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号９および２０)、１２Ｄ６−２４  Ｖ１１(配列番号９および２１)、１２Ｄ６−２４  Ｖ１２(配列番号９および２２)、５Ｆ１１−４５  ＳＥ(配列番号３０および３１)、５Ｆ１１−４５  ＳＥＬＦ(配列番号３０および３２)、５Ｆ１１−４５  Ｖ４(配列番号３０および３３)、５Ｆ１１−４５  Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号３０および３４)、５Ｆ１１−４５  Ｖ８(配列番号３０および３５)、５Ｆ１１−４５  Ｖ９(配列番号３０および３６)、５Ｆ１１−４５  Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号３０および３７)、５Ｆ１１−４５  Ｖ１１(配列番号３０および３８)または５Ｆ１１−４５  Ｖ１２(配列番号３０および３９)の重鎖および軽鎖の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％および９５％配列同一性を有する重鎖および軽鎖を含む。
【００１３】
なおさらなる実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、１２Ｄ６−２４  ＳＥ(配列番号９および１４)、１２Ｄ６−２４  ＳＥＬＦ(配列番号９および１５)、１２Ｄ６−２４  Ｐ２３８Ｄ(配列番号９および１３)、１２Ｄ６−２４  Ｖ４(配列番号９および１６)、１２Ｄ６−２４  Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号９および１７)、１２Ｄ６−２４  Ｖ８(配列番号９および１８)、１２Ｄ６−２４  Ｖ９(配列番号９および１９)、１２Ｄ６−２４  Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号９および２０)、１２Ｄ６−２４  Ｖ１１(配列番号９および２１)、１２Ｄ６−２４  Ｖ１２(配列番号９および２２)、５Ｆ１１−４５  ＳＥ(配列番号３０および３１)、５Ｆ１１−４５  ＳＥＬＦ(配列番号３０および３２)、５Ｆ１１−４５  Ｖ４(配列番号３０および３３)、５Ｆ１１−４５  Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号３０および３４)、５Ｆ１１−４５  Ｖ８(配列番号３０および３５)、５Ｆ１１−４５  Ｖ９(配列番号３０および３６)、５Ｆ１１−４５  Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号３０および３７)、５Ｆ１１−４５  Ｖ１１(配列番号３０および３８)または５Ｆ１１−４５  Ｖ１２(配列番号３０および３９)の重鎖および軽鎖の配列から本質的になる重鎖および軽鎖を含む。
【００１４】
ある実施態様において、Ｖ４またはＶ９  Ｆｃ配列バリアントを含む本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、さらにＤ２７０Ｅ配列バリアントを含む。このような抗体はヒト化１２Ｄ６−２４  Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号９および１７)、１２Ｄ６−２４  Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号９および２０)、５Ｆ１１−４５  Ｖ４  Ｄ２７０Ｅ(配列番号３０および３４)および５Ｆ１１−４５  Ｖ９  Ｄ２７０Ｅ(配列番号３０および３７)を含み、ここで、配列は軽鎖および重鎖についてそれぞれ提供されている。別の実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ４０抗体は、これらの重鎖および軽鎖の配列から本質的になるまたはこれらの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％および９５％配列同一性を有する重鎖および軽鎖を含む鎖および軽鎖を含む抗体を含む。ある実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、天然に存在するＦｃ領域を有する抗体よりも、活性化受容体への結合とは対照的にＦｃγＲIIｂへの結合について大きな特異性を有する修飾Ｆｃ領域を含む。ある実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体についてのＡ／Ｉ比は５未満、好ましい実施態様において、１未満である。
【００１５】
ある実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、２重鎖および２軽鎖のような１以上の重鎖および１以上の軽鎖を含む。
【００１６】
本発明は、さらに、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸、該核酸分子を含む発現ベクター、該発現ベクターで形質転換した細胞ならびに抗体を発現ベクターで形質転換した細胞から発現させ、該抗体を回収することによる、抗体の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントおよび担体を含む医薬組成物も提供する。
【００１８】
本発明は、対象における免疫応答が増強されるように、対象に本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を投与することを含む、対象における免疫応答を増強する方法を提供する。ある実施態様において、対象は腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が増強される。他の実施態様において、対象はウイルス感染、例えば慢性ウイルス感染を有し、抗ウイルス免疫応答が増強される。
【００１９】
本発明はまた腫瘍の増殖が阻止されるように、対象に本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における腫瘍の増殖を阻止する方法を提供する。
【００２０】
本発明は、さらに、処置を必要とする対象に、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量を、例えば、医薬組成物として投与し、それにより癌を処置することを含む、例えば、免疫療法により、癌を処置する方法を提供する。ある実施態様において、癌は膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌である。ある実施態様において、癌は転移癌、難治性癌または再発性癌である。
【００２１】
ある実施態様において、ここに記載する免疫機能を調節する方法および処置する方法は、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体を、１以上の付加的治療剤、例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＴＬＲアゴニストまたはＩＤＯもしくはＴＧＦβの小分子アンタゴニストと組み合わせてまたは二特異性薬剤として投与することを含む。特定の実施態様において、抗ｈｕＣＤ４０治療を抗ＰＤ１および／または抗ＰＤ−Ｌ１治療、例えばヒトＰＤ１に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントでの処置と組み合わせる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ここに開示するＦｃ配列バリアントをより分かりやすくするために１１８〜４４６と再付番したヒトＩｇＧ１ｆ定常ドメインの配列(配列番号６５)を示す(表４)。変異に付した残基は太字であり、改変アミノ酸を残基の下に太字で示す。Ｄ２７０Ｅ置換は下線を付す。Ｃ末端リシン(Ｋ)残基は図１および配列番号６５ならびに配列表に開示する全ての他の重鎖および重鎖定常ドメイン配列から除いている。しかしながら、他の実施態様、特に本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体の重鎖および重鎖定常ドメインをコードする核酸構築物において、これらの配列は、タンパク質のＣ末端に付加的リシン残基または核酸の３’末端に付加的リシンをコードするヌクレオチドを含む。
【００２３】
【図２】図２は、本発明の抗体により結合されるヒトＣＤ４０のエピトープ群(“ビン”)ならびにＣＤ４０Ｌ結合の遮断を説明するベン図である。楕円または円が重複している抗体は、ヒトＣＤ４０への結合について競合し、長方形内に入る抗体はヒトＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌ結合を遮断する。
【００２４】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ＩＬ−６分泌により測定して、Ｆｃ配列の機能としてのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体による樹状細胞の活性化を示す。実施例７参照。ＩｇＧ１ｆ、ＳＥ、ＳＥＬＦ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２バリアントを含む、ｍＡｂ  １２Ｄ６−２４可変ドメインおよび種々のヒトＩｇＧ１ｆ定常領域を含む一連の抗体を構築した。図３Ａは、１ドナーからの細胞を使用して得たデータを示し、図３Ｂは異なるドナーからの細胞を使用して得たデータを示す。
【００２５】
【図４】図４は、細胞表面ＣＤ５４により測定して、可変ドメイン配列の機能としてのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体による細胞の活性化を示す。実施例７参照。ヒトＩｇＧ１ｆ−Ｖ１２定常領域および親(マウス)抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  １２Ｄ６、５Ｇ７、８Ｅ８、１９Ｇ３および５Ｆ１１からの可変ドメインを含む、一連の抗体を構築した。結果を抗体濃度の関数として中央蛍光強度(ＭＦＩ)としてプロットする。
【００２６】
【図５】図５は、Ｄ２７０置換を有する抗体を含む、本発明の種々の抗体によるパーセントＦｃγＲ結合を示す。実施例８参照。“−ｓｕｐ”を含む抗体の名前は、抗体生産細胞からの上清を表し、その他は精製抗体である。データは、ForteBio Octet systemにおいて測定した、抗体と受容体の各組み合わせの最大受容体結合価のパーセンテージとして示す。例えば、実施例３参照。３つの棒の各群は、左から右に、ｈＣＤ３２ａ／ＦｃγＲIIａ−Ｈ１３１(１０μM)(斜線付き棒)、ｈＣＤ３２ｂ／ＦｃγＲIIａ−Ｒ１３１(１０μM)(黒色棒)およびｈＣＤ３２ｂ／ＦｃγＲIIｂ(１μM)(白色棒)への結合を示す。
【００２７】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ヒトＣＤ４０およびヒトＦｃγ受容体を発現するトランスジェニックマウスにおける、それぞれＴ細胞活性化および血小板数変化に対する本発明の選択抗ＣＤ４０抗体の効果を示す。実施例９参照。図６Ａは、示すとおり、本発明の選択抗ＣＤ４０抗体で処置した動物におけるＴｅｔ−ＯＶＡ反応性ＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセントを示す。図６Ｂは、処置前血小板数のパーセンテージとしての、抗体注射２４時間後の血小板数を示す。図の比較は、活性化のレベルが血小板数減少と相関し、抗体１２Ｄ６−Ｖ１１が最高活性化だけでなく、最大血小板数減少を示す。実施例９参照。図６Ｃは、ＭＣ３８腫瘍細胞を接種され、抗ＣＤ４０  １２Ｄ６−２４および５Ｆ１１−４５クローンのＦｃバリアントで処置したヒト化ＣＤ４０／ＦｃγＲマウスの抗腫瘍応答を示す。結果は、平均±ＳＥＭとして示した。ｎ＝７(１２Ｄ６−２４)または６(５Ｆ１１−４５)。実施例９参照。図６Ｄは、Ｃに記載する実験における１２Ｄ６−２４群からの無腫瘍マウスにＭＣ３８細胞を皮下に再負荷し、腫瘍増殖を追跡した。対照群は未処置マウスからなる。結果は平均±ＳＥＭとして示した。ｎ＝４。実施例９参照。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な記載
本発明は、ヒトＣＤ４０(“ｈｕＣＤ４０”)に特異的に結合し、アゴニスト活性を有する単離抗体、特にモノクローナル抗体、例えば、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体を提供する。種々のヒト化マウス抗ｈｕＣＤ４０モノクローナル抗体について配列を提供する。ある実施態様において、ここに記載する抗体は特定のマウス重鎖および軽鎖生殖系列配列に由来するおよび／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域のような特定の構造特徴を含む。他の実施態様において抗体は、配列がここに提供される抗ＣＤ４０抗体と、ＣＤ４０結合について競合するまたは同じエピトープに結合する。ある実施態様において、重鎖Ｆｃ領域の配列は、ＦｃγＲIIｂへの結合が特異的に増強されるように修飾される。
【００２９】
このような抗体を製造する方法、このような抗体またはその抗原結合フラグメントを含む免疫複合体および二特異的分子ならびに抗体またはフラグメントを含むように製剤された医薬組成物もここに提供される。またここに提供されるのは、抗体を、単独でまたは他の免疫刺激剤(例えば、抗体)および／または癌治療または抗感染性治療と組み合わせて、免疫応答増強のために使用する方法である。従って、ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を、例えば、腫瘍増殖阻止および慢性ウイルス感染症処置を含む、広範な治療適用における処置に使用し得る。
【００３０】
定義
本明細書がより容易に理解され得るために、いくつかの用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な説明をとおして示される。
【００３１】
ＣＤ４０は、“ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５”(ＴＮＦＲＳＦ５)をいう。特に断らない限りまたは文脈から明らかではない限り、ここでのＣＤ４０の記載はヒトＣＤ４０(“ｈｕＣＤ４０”)を指し、抗ＣＤ４０抗体は抗ヒトＣＤ４０抗体を指す。ヒトＣＤ４０は、GENE ID NO: 958およびMIM (Mendelian Inheritance in Man): 109535にさらに記載される。２０アミノ酸シグナル配列を含むヒトＣＤ４０の配列(NP_001241.1)を配列番号１に提供する。
【００３２】
ＣＤ４０は、ＴＮＦＳＦ５、ｇｐ３９およびＣＤ１５４とも称されるＣＤ４０リガンド(ＣＤ４０Ｌ)と相互作用する。特に断らない限りまたは文脈から明らかではない限り、ここでのＣＤ４０Ｌの記載はヒトＣＤ４０Ｌ(“ｈｕＣＤ４０Ｌ”)を指す。ヒトＣＤ４０ＬはGENE ID NO: 959およびMIM: 300386にさらに記載される。ヒトＣＤ４０Ｌの配列(ＮＰ＿００００６５.１)を配列番号２に提供する。
【００３３】
特に断らない限りまたは文脈から明らかではない限り、ここで使用する用語“抗体”は、抗体全体およびそのあらゆる抗原結合フラグメント(すなわち、“抗原結合部分”)または一本鎖を含み得る。“抗体”は、ある実施態様において、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２重(Ｈ)鎖および２軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合フラグメントをいう。各重鎖は重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域からなる。ある天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体において、重鎖定常領域は３ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。ある天然に存在する抗体において。各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１ドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域(ＦＲ)と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは３ＣＤＲおよび４フレームワーク領域(ＦＲ)からなり、アミノ末端からカルボキシ末端で次のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃｌｑ)を含む宿主組織または因子への結合に介在し得る。
【００３４】
抗体は、一般にその同族抗原に、１０−７〜１０−１１Ｍまたはそれ未満の解離定数(ＫＤ)により反映される、高親和性で特異的に結合する。約１０−６Ｍより大きいあらゆるＫＤは、一般に非特異的結合を示すとみなされる。ここで使用する、抗原に“特異的に結合する”抗体は、その抗原および実質的に同一抗原に、１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、よりさらに好ましくは５×１０−９Ｍ以下、最も好ましくは１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍまたはそれ未満のＫＤを有することを意味する高親和性で結合するが、無関係の抗原に高親和性で結合しない抗体をいう。抗原は、ある抗原と高い程度の配列同一性を示すならば、例えば、その抗原の配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％またはよりさらに好ましくは少なくとも９９％配列同一性を示すならば、その抗原と“実質的に同一”である。例として、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する抗体は、ある非ヒト霊長類種(例えば、カニクイザル)からのＣＤ４０とも交差反応するであろうが、他の種からのＣＤ４０またはＣＤ４０以外の抗原と交差反応しない。
【００３５】
特に断らない限り、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない一般に知られるアイソタイプの何れか由来であり得る。ＩｇＧアイソタイプは、ある種でサブクラスに分割される。ヒトにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにマウスにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。免疫グロブリン、例えば、ヒトＩｇＧ１は、数アロタイプで存在し、これは最大数アミノ酸が互いに異なる。特に断らない限り、本発明の抗体は、ＩｇＧ１ｆ定常ドメイン(配列番号６５)を含む。特に断らない限り、“抗体”は、例として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ヒトおよび非ヒト抗体、完全合成抗体および一本鎖抗体を含み得る。
【００３６】
ここで使用する抗体の“抗原結合部分”または“抗原結合フラグメント”なる用語は、抗原(例えば、ヒトＣＤ４０)に特異的に結合する能力を維持した、抗体の１以上のフラグメントをいう。抗体の“抗原結合部分／フラグメント”なる用語に包含される結合フラグメントの例は、(ｉ)Ｆａｂフラグメント  −  ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、(ii)Ｆ(ａｂ’)２フラグメント  −  ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメント、(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメントおよび(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)を含む。単離相補性決定領域(ＣＤＲ)または合成リンカーにより結合された２以上の単離ＣＤＲの組み合わせは、抗原に結合できるならば、抗体の抗原結合ドメインを構成し得る。
【００３７】
一本鎖抗体構築物も本発明に包含される。Ｆｖフラグメントの２ドメイン、ＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子によりコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる一価分子を形成するように対合する単一タンパク質鎖として製造されることを可能にする、合成リンカーにより、組み換え方法を使用して結合できる(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:5879-5883参照)。このような一本鎖抗体も、抗体の“抗原結合部分／フラグメント”なる用語に包含されることを意図する。これらおよびその他の可能性のある構築物は、Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記載される。これらの抗体フラグメントは当業者に知られる慣用の技術を使用して得られ、該フラグメントを、インタクト抗体に準じて有用性についてスクリーニングする。抗原結合部分／フラグメントを組み換えＤＮＡ技術またはインタクト免疫グロブリンの酵素もしくは化学開裂により生産できる。
【００３８】
特に断らない限り、用語“フラグメント”は、特許請求の範囲におけるように、抗体と関連して使用するとき、“抗体またはフラグメント”が“抗体またはその抗原結合フラグメント”と同じ意味を有するように、抗体の抗原結合フラグメントをいう。
【００３９】
“二特異的”または“二機能性抗体”は、異なる抗原に対する特異性を有する２抗原結合部位を生ずる、２つの異なる重鎖／軽鎖対を有する人工ハイブリッド抗体である。二特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む、多様な方法により生産できる。例えば、Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553参照。
【００４０】
ここで使用する用語“モノクローナル抗体”は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す抗体または全抗体が特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す抗体の組成物をいう。一般に、このようなモノクローナル抗体は単一の抗体をコードする細胞または核酸に由来し、何ら配列改変を意図的に導入することなく増殖させる。従って、用語“ヒトモノクローナル抗体”は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および任意の定常領域を有するモノクローナル抗体をいう。ある実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックまたは染色体導入非ヒト動物(例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス)から得たＢ細胞の不死化細胞への融合により得た、ハイブリドーマにより生産される。
【００４１】
ここで使用する用語“組み換えヒト抗体”は、(ａ)ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたは染色体導入である動物(例えば、マウス)から単離した抗体またはそこから生産したハイブリドーマ、(ｂ)抗体を発現するようにトランスフォームした宿主細胞から単離された抗体、例えば、トランスフェクトーマ、(ｃ)組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および(ｄ)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により生産、発現、作製または単離した抗体のような、組み換え手段により生産、発現、作製または単離した全ヒト抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によりコードされる特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する可変および定常領域を含むが、例えば、抗体成熟中に生じる、その後の再配列および変異も含む。当分野で知られるとおり(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125参照)、可変領域は、外来抗原に特異的な抗体を形成するように再配置される種々の遺伝子によりコードされる、抗原結合ドメインを含む。再配列に加えて、可変領域は、さらに外来抗原に対する抗体の親和性を上げるために、複数一アミノ酸変化(体性変異または高頻度変異と称される)により修飾される。定常領域は、抗原へのさらなる応答で変化する(すなわち、アイソタイプスイッチ)。それ故に、抗原に応答して軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再配置され、体性変異された核酸配列は、元の生殖系列配列と同一ではないかもしれないが、その代わりに実質的に同一または類似(すなわち、少なくとも８０％同一性を有する)である。
【００４２】
“ヒト”抗体(ＨｕＭＡｂ)は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体をいう。さらに、抗体が定常領域を含むならば、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る(例えば、インビトロで無作為または部位特異的変異誘発によりまたはインビボで体性変異により導入した変異)。しかしながら、ここで使用する用語“ヒト抗体”は、マウスのような他の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことは意図しない。用語“ヒト”抗体および“完全ヒト”抗体は同義的に使用する。
【００４３】
“ヒト化”抗体は、非ヒト抗体、例えばマウス抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てが、ヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置き換えられた抗体をいう。抗体のヒト化形態のある実施態様において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全ては、ヒト免疫グロブリンからのアミノ酸で置き換えられており、一方１以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分または全ては変わらない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、抗体の特定の抗原に結合する能力を無くさない限り、許容される。“ヒト化”抗体は、元の抗体に類似する抗原特異性を保持する。
【００４４】
“キメラ抗体”は、可変領域がマウス抗体由来であり、定常領域がヒト抗体由来である抗体のような、可変領域がある種由来であり、定常領域が他の種由来である抗体をいう。“ハイブリッド”抗体は、マウス(親)重鎖およびヒト化軽鎖またはその逆のような異なるタイプの重鎖および軽鎖を有する抗体をいう。
【００４５】
ここで使用する“アイソタイプ”は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)をいう。
【００４６】
“アロタイプ”は、特定のアロタイプ群内の天然に存在するバリアントをいい、このバリアントは１または数アミノ酸が異なる。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照。
【００４７】
用語“抗原を認識する抗体”および“抗原に特異的な抗体”は、ここで、用語“抗原に特異的に結合する抗体”と相互交換可能に使用する。
【００４８】
ここで使用する“単離抗体”は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体をいう(例えば、ＣＤ４０に特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ４０以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。ＣＤ４０のエピトープに特異的に結合する単離抗体は、しかしながら、異なる種からの他のＣＤ４０タンパク質と交差反応性を有し得る。
【００４９】
抗体Ｆｃ領域とあるＦｃ受容体の相互作用に由来する“エフェクター機能”は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)のようなＦｃγＲ介在エフェクター機能ならびに細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)の下方制御を含むが、必ずしもこれらに限定されない。このようなエフェクター機能は、一般にＦｃ領域が抗原結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わされることを必要とする。
【００５０】
“Ｆｃ受容体”または“ＦｃＲ”は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、ＦｃγＲファミリーの対立遺伝子多型および選択的スプライシングされた形態を含む、ＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３活性化(マウスにおけるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲIV；ヒトにおけるＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および１阻害性(ＦｃγＲIIｂまたは等価にＦｃγＲIIＢ)受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の性質を表１に要約する。生得的エフェクター細胞型の大部分は１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲIIｂを共発現し、一方ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は、１活性性Ｆｃ受容体(マウスにおけるＦｃγＲIIIおよびヒトにおけるＦｃγＲIIIＡ)を選択的に発現するが、マウスおよびヒトにおいて阻害性ＦｃγＲIIｂを発現しない。ヒトＩｇＧ１は、大部分のヒトＦｃ受容体に結合し、結合する活性性Ｆｃ受容体のタイプについてマウスＩｇＧ２ａと等価であると考えられる。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
“Ｆｃ領域”(フラグメント結晶性領域)または“Ｆｃドメイン”または“Ｆｃ”は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)に位置するＦｃ受容体または古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)への結合を含む、宿主組織または因子への結合に介在する、抗体の重鎖のＣ末端領域をいう。それ故に、Ｆｃ領域は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、ＣＨ１またはＣＬ)を除く抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２重鎖の各々におけるＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含み、ＩｇＭおよびＩｇＥ  Ｆｃ領域は各ポリペプチド鎖の３重鎖定常ドメイン(ＣＨドメイン２〜４)を含む。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３およびＣγ１とＣγ２の間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変わるであろうが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常Ｃ２２６またはＰ２３０の位置(またはこれら２アミノ酸間のアミノ酸)から重鎖のカルボキシ末端のアミノ酸残基まで延びると定義され、ここで、ナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるＥＵ指数による。Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD；米国特許出願公開２００８／０２４８０２８号の図３ｃ〜３ｆも参照のこと。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインはアミノ酸約２３１〜アミノ酸約３４０まで伸び、一方ＣＨ３ドメインはＦｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、ＩｇＧのアミノ酸約３４１〜アミノ酸約４４７まで伸びる(Ｃ末端リシンを含む)。ここで使用する、Ｆｃ領域は、任意のアロタイプバリアントまたはバリアントＦｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)を含む、天然配列Ｆｃであり得る。Ｆｃはまた孤立してもしくは“Ｆｃ融合タンパク質”(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)とも称される“Ｆｃ領域を含む結合タンパク質”のようなＦｃ含有タンパク質ポリペプチドのような文脈においてこの領域も含意し得る。
【００５３】
“天然配列Ｆｃ領域”または“天然配列Ｆｃ”は、天然で見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ならびにその天然に存在するバリアントを含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの種々のアロタイプを含む。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照。
【００５４】
用語“エピトープ”または“抗原決定基”は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原(例えば、ｈｕＣＤ４０)の部位をいう。タンパク質抗原内のエピトープは、連続的アミノ酸(通常直線状エピトープ)またはタンパク質の三次折りたたみにより並置される非連続的アミノ酸(通常立体構造エピトープ)の両方から形成できる。連続的アミノ酸から形成されたエピトープは、一般に、しかし常にではなく、変性溶媒に曝された後保持され、一方三次折りたたみにより形成されたエピトープは、一般に変性溶媒での処理により喪失する。エピトープは、一般に、独特な空間的高次構造の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を含む。
【００５５】
用語“エピトープマッピング”は、抗体抗原認識に関与する抗原上の分子決定基を同定する過程をいう。どのエピトープがある抗体により結合されるかを決定する方法は、当分野で周知であり、例えば、抗原(例えば、ＣＤ４０)からの重複または連続的ペプチドをある抗体(例えば、抗ＣＤ４０抗体)との反応性について試験する、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイ、ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴、酵母ディスプレイ(実施例６参照)およびＨＤＸ−ＭＳ(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)(実施例５参照)を含む。
【００５６】
２以上の抗体に関する“同じエピトープに結合”なる用語は、抗体が、ある方法により決定して、アミノ酸残基の同じセグメントに結合することを意味する。抗体が、ここに記載する抗体と“ＣＤ４０上の同じエピトープ”に結合するか否かを決定する技術は、例えば、エピトープの原子分解能を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析および水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)のような、エピトープマッピング方法を含む。他の方法は、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失がしばしばエピトープ要素を示すと考えられる、抗体の抗原フラグメント(例えばタンパク分解性フラグメント)または抗原の変異変種への結合のモニター(Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081)または変異体標的配列バリアントの酵母ディスプレイ(実施例６参照)である。さらに、エピトープマッピングのコンピューター利用コンビナトリアル方法も使用できる。これらの方法は、目的の抗体がコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的短ペプチドを親和性単離する能力を利用する。同じまたは密接に関係するＶＨおよびＶＬまたは同じＣＤＲ配列を有する抗体は同じエピトープに結合すると予測される。
【００５７】
“標的への結合について他の抗体と競合する”抗体は、他の抗体の標的への結合を(部分的にまたは完全に)阻害する抗体をいう。２抗体が標的への結合について互いに競合するか、すなわち、ある抗体が他の抗体の標的への結合を阻害するか否かおよびどの程度阻害するかは、既知競合実験を使用して決定できる。ある実施態様において、抗体は、他の抗体の標的への結合と少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％競合し、阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が“遮断抗体”(すなわち、まず標的とインキュベートされる冷抗体)であるかにより異なる。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb. Protoc.; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277またはChapter 11 of “Using Antibodies” by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (USA) 1999に記載のとおり実施できる。競合抗体は、同じエピトープ、重複エピトープまたは隣接エピトープに結合する(例えば、立体障害により証明される)。
【００５８】
他の競合的結合アッセイは、固相直接的または間接的放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、固相直接的または間接的酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al. (1983) Methods in Enzymology 9:242参照)、固相直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al. (1986) J. Immunol. 137:3614参照)、固相直接的標識アッセイ、固相直接的標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press参照)、Ｉ−１２５標識を使用する固相直接的標識ＲＩＡ(Morel et al. (1988) Mol. Immunol. 25(1):7参照)、固相直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al. (1990) Virology 176:546)および直接的標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77)を含む。
【００５９】
ここで使用する用語“特異的結合”、“選択的結合”、“選択的に結合”および“特異的に結合”は、予め決定した抗原のエピトープに結合するが、他の抗原に結合しない抗体をいう。一般に、抗体は、(ｉ)例えば、予め決定した抗原、例えば、組み換えヒトＣＤ４０を検体として使用し、抗体をリガンドとして使用するBIACORE(登録商標)２０００表面プラズモン共鳴装置における表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)技術または抗体の抗原陽性細胞への結語のスキャッチャード分析により決定したとき、約１０−７Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれより低い平衡解離定数(ＫＤ)で結合するおよび(ii)予め決定した抗原に、予め決定した抗原または密接に関係する抗原以外の非特異的抗原(例えば、ＢＳＡ、カゼイン)への結合の親和性より少なくとも２倍高い親和性で結合する。従って、“ヒトＣＤ４０に特異的に結合する”抗体は、可溶性または細胞結合ヒトＣＤ４０に、１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれより低いＫＤで結合する抗体をいう。“カニクイザルＣＤ４０と交差反応する”抗体は、カニクイザルＣＤ４０に１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれより低いＫＤで結合する抗体をいう。
【００６０】
ここで使用する用語“ｋassoc”または“ＫＡ”は、特定の抗体抗原相互作用の会合速度定数をいい、一方ここで使用する用語“ｋdis”または“ＫＤ”は、特定の抗体抗原相互作用の解離速度定数をいう。ここで使用する用語“ＫＤ”は、平衡解離定数をいい、これは、ＫＤ対ＫＡ比(すなわち、ＫＤ／ＫＡ)から導き、モル濃度(Ｍ)として表す。抗体のＫＤ価は、当分野で十分に確立されている方法を使用して決定できる。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、好ましくはForteBio Octet REDデバイス(実施例３参照)を使用する、バイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)分析、好ましくはBIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴系(実施例４参照)のようなバイオセンサー系を使用する、表面プラズモン共鳴またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード分析である。
【００６１】
抗体またはその抗原結合フラグメントを使用するインビトロまたはインビボアッセイの文脈における用語“ＥＣ５０”は、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの半分の応答を誘発する抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度をいう。
【００６２】
用語“固定化ＣＤ４０に結合”は、例えば、細胞の表面に発現されたまたは固体支持体に結合したＣＤ４０に、ここに記載する抗体が結合する能力をいう。
【００６３】
ここで使用する用語“交差反応”は、ここに記載する抗体が異なる種からのＣＤ４０と結合する能力をいう。例えば、ここに記載するヒトＣＤ４０に結合する抗体は、他の種からのＣＤ４０(例えば、カニクイザルＣＤ４０)とも結合するかもしれない。ここで使用する交差反応性は、結合アッセイ(例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ)における精製抗原との特異的反応性またはＣＤ４０を生理学的に発現する細胞との結合または他の機能的相互作用の決定により測定できる。交差反応性を決定する方法は、例えば、BIACORE(登録商標)2000 SPR装置(BIACORE AB, Uppsala, Sweden)を使用するBIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析またはフローサイトメトリー技術による、ここに記載する標準的結合アッセイを含む。
【００６４】
物について適用されるここで使用する“天然に存在する”は、その物体が天然で見ることができることをいう。例えば、天然源から単離でき、研究室で人為的に修飾されていない生物(ウイルスを含む)に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００６５】
“ポリペプチド”は、少なくとも２個の連続的に連結されたアミノ酸残基を含む鎖をいい、鎖長の上限はない。タンパク質における１以上のアミノ酸残基は、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合を含むが、これらに限定されない修飾を含んでよい。“タンパク質”は１以上のポリペプチドを含み得る。
【００６６】
ここで使用する用語“核酸分子”は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡであり得る。
【００６７】
ここに提供する抗体配列への“保存的配列修飾”、すなわちヌクレオチド配列によりコードされるまたはアミノ酸配列を含む抗体の抗原への結合を無効にしないヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾も提供される。例えば、修飾を、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準的技術により導入できる。保存的配列修飾は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる保存的アミノ酸置換を含む。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それ故に、抗ＣＤ４０抗体における予測非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置き換えられる。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は当分野で周知である。例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94:412-417 (1997)参照。
【００６８】
あるいは、他の実施態様において、例えば、飽和変異誘発により、抗ＣＤ４０抗体コード配列の全てまたは一部に沿って変異を無作為に作製し、得られた修飾抗ＣＤ４０抗体を結合活性改善についてスクリーニングし得る。
【００６９】
核酸について、用語“実質的相同性”は、２核酸またはその指定配列が、最適にアラインし、比較したとき、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴い、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常ヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。あるいは、実質的相同性は、セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下、鎖の相補体とハイブリダイズするとき、存在する。
【００７０】
ポリペプチド、用語“実質的相同性”は、２ポリペプチドまたはその指定配列が、最適にアラインし、比較したとき、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴い、アミノ酸の少なくとも約８０％、通常アミノ酸の少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。
【００７１】
２配列間のパーセント同一性は、配列を最適にアラインしたときのこれら配列により共有される同一位置の数の関数であり(すなわち、％相同性＝同一位置数／位置の総数×１００)、最適アラインメントは、２配列の最適アラインメントのために挿入する必要があるギャップ数および各ギャップ長を考慮に入れて決定する。配列の比較および２配列間のパーセント同一性の決定は、下記非限定的例のような数学的アルゴリズムを使用して達成できる。
【００７２】
２ヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用して、NWSgapdna.CMPマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または８０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定できる。２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれており、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する、E. Meyers and W. Miller(CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを使用しても決定できる。さらに、２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、Blossum 62マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用しても決定できる。
【００７３】
ここに記載する核酸およびタンパク質配列をさらに“クエリー配列”として使用して、公的データベースに対するサーチを実施して、例えば、関連配列を同定することが可能である。このようなサーチは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチをＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施して、ここに記載する核酸分子と相同であるヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチをＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して、ここに記載するタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でのギャップ付きアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおり利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータを使用できる。
【００７４】
核酸は細胞全体に、細胞ライセートにまたは部分的に精製したまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準的技術により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば、他の細胞核酸(例えば、染色体の他の部分)またはタンパク質から精製されるとき、“単離される”または“実質的に純粋とされる”。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
【００７５】
ここで使用する用語“ベクター”は、連結されている他の核酸の輸送が可能な核酸分子をいうことを意図する。ベクターの一つのタイプは“プラスミド”であり、これは、環状二本鎖ＤＮＡループであり、それに付加的ＤＮＡセグメントがライゲートされ得る。他のタイプのベクターは、付加的ＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。あるベクターは、導入された宿主細胞で自律複製可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合され、それにより宿主ゲノムと共に複製することができる。さらに、あるベクターは、操作可能に連結されている遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターはここでは“組み換え発現ベクター”(または単に“発現ベクター”)と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は、プラスミドが最も一般的に使用される形態のベクターである限り、相互交換可能に使用し得る。しかしながら、等価な機能を提供するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形態の発現ベクターも包含される。
【００７６】
ここで使用する用語“組み換え宿主細胞”(または単に“宿主細胞”)は、細胞に天然に存在しない核酸を含む細胞をいい、組み換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫もいうことを意図することは理解されるべきである。ある修飾が、変異または環境的影響により後代で生じる可能性があり、このような子孫は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、なお、ここで使用する用語“宿主細胞”の範囲内に包含される。
【００７７】
“免疫応答”は、外来因子に対する脊椎動物内の生物学的応答をいい、この応答は、生物をこれらの因子およびそれが原因の疾患から守る。免疫応答は、侵入病原体、病原体に感染された細胞もしくは組織、癌性もしくは他の異常細胞、または、自己免疫または病的炎症の場合、正常ヒト細胞もしくは組織の脊椎動物体内における選択的ターゲティング、結合、損傷、破壊および／または排除をもたらす、免疫系の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞の何れかまたは肝臓により生産される可溶性巨大分子(抗体、サイトカイン類および補体を含む)の作用が介在する。免疫反応は、例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞のようなＴ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞もしくはＴｈ細胞の活性化もしくは阻害またはＴreg細胞の阻害もしくは枯渇を含む。“Ｔエフェクター”(“Ｔeff”)細胞は、細胞溶解性活性を有するＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞)ならびにサイトカイン類を分泌し、他の免疫細胞を活性化および指揮するＴヘルパー(Ｔｈ)細胞をいうが、制御性Ｔ細胞(Ｔreg細胞)は含まない。
【００７８】
ここで使用する用語“Ｔ細胞介在応答”は、エフェクターＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋細胞)およびヘルパーＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋細胞)を含む、Ｔ細胞が介在する応答をいう。Ｔ細胞介在応答は、例えば、Ｔ細胞・細胞毒性および増殖を含む。
【００７９】
ここで使用する用語“細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答”は、細胞毒性Ｔ細胞により誘発される免疫応答をいう。ＣＴＬ応答は主にＣＤ８＋  Ｔ細胞により介在される。
【００８０】
“免疫調節因子”または“イムノレギュレーター”は、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る因子、例えば、シグナル伝達経路の成分をいう。免疫応答の“調節”、“制御”または“修飾”は、免疫系の細胞またはこのような細胞(例えば、エフェクターＴ細胞)の活性の何らかの改変をいう。このような調節は、種々の細胞型の数の増加または減少、これらの細胞の活性の増加または減少または免疫系内で生じ得る何らかの他の変化により顕在化され得る、免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性両方の免疫調節因子が同定されており、そのいくつかは腫瘍微小環境で増強された機能を有し得る。好ましい実施態様において、免疫調節因子は、Ｔ細胞の表面に位置する。“免疫調節性標的”または“免疫制御性標的”は、物質、薬剤、部分、化合物または分子の結合の標的であり、その活性がその結合により改変される免疫調節因子である。免疫調節性標的は、例えば、細胞表面受容体(“免疫調節性受容体”)および受容体リガンド(“免疫調節性リガンド”)を含む。
【００８１】
“免疫療法”は、疾患を有する、発症するもしくは再発するリスクのある対象の、免疫応答の誘発、増強、抑制または他の修飾を含む方法による処置をいう。
【００８２】
“免疫賦活性治療”または“免疫刺激性治療”は、例えば、癌処置のための、対象における免疫応答の増加(誘発または増強)をもたらす治療をいう。
【００８３】
“内因性免疫応答増強”は、対象に存在する免疫応答の有効性または効力の増加を意味する。有効性および効力のこの増加は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機構の克服または内因性宿主免疫応答を増強する機構の刺激により達成され得る。
【００８４】
ここで使用する、用語“連結”は、２以上の分子の結合をいう。結合は共有結合性でも非共有結合性でもよい。結合はまた遺伝子的(すなわち、組み換えによる融合)でもよい。このような結合は、化学的コンジュゲーションおよび組み換えタンパク質生産のような広範な当分野で認められている技術を使用して達成され得る。
【００８５】
ここで使用する、“投与”は、当業者に知られる種々の方法および送達系の何れかを使用する、治療剤を含む組成物の対象への物理的導入をいう。ここに記載する抗体のための好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語“非経腸投与”は、経腸および局所投与以外の、通常注射による投与方式を意味し、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射または点滴ならびにインビボエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的のような、非経腸ではない経路により投与できる。投与は、例えば、１回、複数回および／または１回以上の長期に実施し得る。
【００８６】
ここで使用する、用語“阻害”または“遮断”は相互交換可能に使用し、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％である部分的および完全な阻害／遮断を包含する。
【００８７】
ここで使用する、“癌”は、体内の異常細胞の未制御の増殖により特徴付けられる、広い疾患群をいう。未制御の細胞分裂は、隣接組織に浸潤し、リンパ系または血流を介して体の遠位部位に転移し得る悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。
【００８８】
ここで使用する用語“処置”および“処置する”は、症状、合併症、状態または疾患と関連する生化学的指標の進行、発症、重症度または再発の逆転、軽減、回復、阻止または減速もしくは防止の目的で、対象に実施するあらゆるタイプの介入もしくは過程または活性剤投与をいう。予防は、疾患を有していない対象への、疾患の発生を予防するまたは起こったとしてもその影響を最小限にするための、投与をいう。
【００８９】
用語“有効用量”または“有効投与量”は、所望の効果の達成または少なくとも部分的達成に十分な量として定義される。薬物または治療剤の“治療有効量”または“治療有効投与量”は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて使用したとき、疾患が原因の機能障害または身体障害の疾患症状の重症度の軽減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または予防により証明される、疾患退縮を促進する薬物のあらゆる量である。薬物の“予防有効量”または“予防有効投与量”は、疾患を発症するまたは疾患再発が起こるリスクのある対象に、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて使用したとき、疾患の発症または再発を阻止する薬物の量である。治療剤または予防剤が疾患退縮を促進するまたは疾患の発症または再発を阻止する能力は、臨床試験中ヒト対象において、ヒトにおける効力の予測である動物モデル系においてまたはインビトロアッセイにおける該薬剤の活性のアッセイによるような、当業者に知られる多様な方法を使用して評価できる。
【００９０】
例として、抗癌剤は、対象における癌進行を遅延させるまたは癌退縮を促進する薬物である。好ましい実施態様において、治療有効量の薬物は、癌を消失させる点までの癌退縮を促進する。“癌退縮促進”は、単独または抗新生物剤と組み合わせた有効量の薬物の投与が、腫瘍増殖またはサイズの低減、腫瘍の壊死、少なくとも一つの疾患症状の重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大、疾患が原因である機能障害もしくは身体障害の予防または患者における疾患症状の他の改善をもたらすことを意味する。薬理学的有効性は、薬物が患者における癌退縮を促進する能力をいう。生理学的安全性は、薬物投与に起因する細胞、臓器および／または生物レベルでの許容可能な低レベルの毒性または他の有害生理学的作用(有害作用)をいう。
【００９１】
腫瘍処置の例として、薬物の治療有効量または投与量は、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を、未処置対象と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、よりさらに好ましくは少なくとも約６０％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％阻害する。最も好ましい実施態様において、薬物の治療有効量または投与量は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する、すなわち、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻止する能力は、下記アッセイを使用して評価できる。腫瘍増殖の阻害は、処置の直後には生じないこともあり、一定時間後または反復投与後にのみ生じることもある。また、組成物のこの性質を、化合物が細胞増殖を阻止する能力を試験することにより評価でき、このような阻害は、インビトロで当業者に知られるアッセイを使用して測定できる。ここに記載する他の好ましい実施態様において、腫瘍退縮は、少なくとも約２０日、より好ましくは少なくとも約４０日またはよりさらに好ましくは少なくとも約６０日観察でき、その間処置を継続し得る。
【００９２】
ここで使用する“組み合わせ”治療は、文脈に明らかに反しない限り、協調的形式での２以上の治療剤の投与を包含することを意味し、同時投与を含むが、これに限定されない。特に、組み合わせ治療は、一方の治療剤の投与が、他の治療剤の投与と何らかの方法で協調している限り、共投与(例えば合剤の投与または別々の治療組成物の合併投与)および連続的または逐次的投与の両者を包含する。例えば、一方の治療剤を異なる治療剤の投与後にのみ投与し、処方期間作用をさせることができる。例えば、Kohrt et al. (2011) Blood 117:2423参照。
【００９３】
用語“患者”および“対象”は、予防または治療処置を受けるあらゆるヒトをいう。例えば、ここに記載する方法および組成物を、癌を有する対象の処置に使用できる。
【００９４】
ここに記載する種々の態様を、次のサブセクションでさらに詳細に記載する。
【００９５】
Ｉ. 抗ＣＤ４０抗体
本出願は、癌のような疾患の処置において治療剤として使用するための望ましい性質を有するアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を開示する。これらの性質は、ヒトＣＤ４０と高親和性で結合する能力、ヒト対象で許容可能な低免疫原性、ＦｃγＲIIｂに対する優先的結合能力および抗体の化学的安定性低減原因配列の不存在の１以上を含む。
【００９６】
配列によりここに開示する抗ＣＤ４０抗体は、実施例５および６に記載のとおり決定し得るように、ヒトＣＤ４０の特異的エピトープに結合する。同じまたは密接に関係するエピトープに結合する他の抗体は、これらの望ましい性質を共有する可能性があり、競合実験の実施により発見し得る。
【００９７】
ここに開示する抗ｈｕＣＤ４０抗体と競合する抗ｈｕＣＤ４０抗体
ｈｕＣＤ４０への結合について本発明の抗体と競合する抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ここに記載するものに類似する免疫化プロトコールを使用して生成させ得る(実施例１および２)。配列によりここに開示する抗ｈｕＣＤ４０抗体と結合について競合する抗体はまた、マウスまたは他の非ヒト動物をヒトＣＤ４０またはその細胞外ドメイン(配列番号１の残基２１〜１９３)を含む構築物で免疫化することによりまたはここに開示する抗ｈｕＣＤ４０抗体により結合されるエピトープを含むヒトＣＤ４０のフラグメントで免疫化することにより生産し得る。得られた抗体を、当分野で周知の方法により、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７および／または１９Ｇ３のヒトＣＤ４０への結合の遮断、例えばＥＬＩＳＡにおけるＣＤ４０の細胞外ドメインと免疫グロブリンＦｃドメインの融合タンパク質への結合の遮断または、例えばＦＡＣＳによる、表面にｈｕＣＤ４０を発現する細胞への結合能力の遮断能力によりスクリーニングできる。種々の実施態様において、試験抗体をＣＤ４０−Ｆｃ融合タンパク質(または表面にｈｕＣＤ４０を発現する細胞)に、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７または１９Ｇ３添加前、同時または後に接触させる。例えば、“ビニング”実験を実施し(実施例４)、配列によりここに開示する試験抗体が、 “参照”抗体としての配列によりここに開示する抗体および“試験”抗体として試験される抗体と同じ“ビン”に入るか否かを決定できる。配列によりここに開示する抗体のヒトＣＤ４０(Ｆｃ融合または細胞上の何れかとして)への結合を、特に大まかに化学量論濃度で、減少させる抗体は、同じ、重複または隣接エピトープと結合する可能性があり、それ故に１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７または１９Ｇ３の望ましい機能的性質を共有し得る。
【００９８】
従って、例えば、下の段落に記載するアッセイを使用するような、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳで測定して、ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体の細胞上のｈｕＣＤ４０への結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害するおよび／または細胞上のｈｕＣＤ４０への結合がここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体により少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害する抗ｈｕＣＤ４０抗体が提供される。
【００９９】
試験抗体が参照抗体の結合を遮断する(すなわち、“競合する”)か否かを決定する例示的競合実験を次のとおり実施できる。ＣＤ４０を発現する細胞を、９６ウェルプレートのサンプルウェルあたり１０５細胞で播種する。プレートを氷上に置き、続いて非コンジュゲート試験抗体を、０〜５０μg／mLの濃度範囲(５０μg／mLの最高濃度から開始する３倍タイトレーション)で添加する。無関係のＩｇＧを第一抗体のアイソタイプ対照として使用し、同じ濃度で添加してよい(５０μg／mLの最高濃度から開始する３倍タイトレーション)。５０μg／mL非標識参照抗体とプレインキュベートしたサンプルを、完全遮断(１００％阻害)の陽性対照として包含でき、一次インキュベーションにおいて抗体がないサンプルを陰性対照(競合なし；０％阻害)として使用し得る。３０分インキュベーション後、標識、例えば、ビオチニル化、参照抗体を、洗浄せずに２μg／mL／ウェルの濃度で添加する。サンプルを氷上でさらに３０分インキュベートする。未結合抗体を、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄することにより除去する。細胞結合標識参照抗体を標識を検出する試薬、例えば、ビオチン検出用ＰＥコンジュゲートストレプトアビジン(Invitrogen、catalog #S21388)で検出する。サンプルをFACS Calibur Flow Cytometer(BD、San Jose)に獲得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で分析する。結果を％阻害として表し得る。
【０１００】
一般に、同じ実験をその後逆向きで、すなわち、試験抗体を参照抗体とし、参照抗体を試験抗体として実施する。ある実施態様において、抗体は、他の抗体の標的、例えばヒトＣＤ４０またはそのフラグメントへの結合を少なくとも一部(例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％)または完全に(１００％)遮断し、阻害が一方または他方の抗体が参照抗体であるときに生じるか否かに無関係である。参照抗体および試験抗体は、抗体が互いに両方向で、すなわち、参照抗体をまず添加した競合実験および試験抗体をまず添加した競合実験で、競合するとき、標的への結合を“交差遮断”する。
【０１０１】
抗ｈｕＣＤ４０抗体は、例えば実施例４に記載するもののような競合実験において、おおよそ当濃度で存在するとき、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７および／または１９Ｇ３のヒトＣＤ４０への結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害するならば、ここに開示する抗ｈｕＣＤ４０抗体と競合すると考える。特に断らない限り、抗体は、先の２段落に概説した競合ＥＬＩＳＡ実験で測定して、本発明の抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択される抗体とおおよそ等モル濃度で使用したとき、選択抗体のヒトＣＤ４０(配列番号１)への結合を、少なくとも２０％減少させるならば、選択抗体と競合すると考えられる。
【０１０２】
同じエピトープに結合する抗ｈｕＣＤ４０抗体
ここに開示する抗体と同じまたは類似エピトープに結合する抗ｈｕＣＤ４０抗体を、ここに記載するものに類似する免疫化プロトコールを使用して生成させ得る(実施例１および２)。得られた抗体を、ヒトＣＤ４０に対する高親和性結合についてスクリーニングできる(実施例３)。継いで、選択抗体を、ｈｕＣＤ４０の配列バリアントが酵母細胞表面上に提示される酵母ディスプレイアッセイ(実施例６)または水素−重水素交換実験(実施例５)により試験して、抗体により結合される厳密なエピトープを決定できる。
【０１０３】
エピトープ決定は、当分野で知られる任意の方法によりなし得る。種々の実施態様において、抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ｈｕＣＤ４０の少なくとも１領域内の１以上の同じ残基と接触するならば、ｈｕＣＤ４０の少なくとも１領域内の残基の大部分と接触するならば、ｈｕＣＤ４０の各領域内の残基の大部分と接触するならば、ｈｕＣＤ４０の全長にわたり大部分の残基と接触するならば、ヒトＣＤ４０の同じ特徴的領域の全てと接触するならば、ヒトＣＤ４０の任意の一つの領域の全ての残基と接触するならばまたは同じ領域全ての同じ残基の全てと接触するならば、ここに開示する抗ｈｕＣＤ４０  ｍＡｂと同じエピトープに結合すると考えられる。エピトープ“領域”は、一次配列に沿った残基のクラスターである。
【０１０４】
ここに記載する抗体と“ｈｕＣＤ４０上の同じエピトープ”と結合する抗体を決定する技術は、エピトープの原子分解能を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析を含む。他の方法は、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失がしばしばエピトープ要素を示すと考えられる、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異変種への結合のモニターである。これらの方法は、目的の抗体が、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーまたは標的タンパク質のプロテアーゼ消化から特異的短ペプチド(天然三次元形態または変性形態)を親和性単離する能力も利用し得る。次いで、ペプチドを、ペプチドライブラリーのスクリーニングに使用する抗体に対応するエピトープの定義のためのリードと見なす。エピトープマッピングについて、立体配座的不連続エピトープをマッピングすることが示されている計算的アルゴリズムも開発されている。
【０１０５】
エピトープまたはエピトープを含む領域はまたＣＤ４０にまたがる一連の重複ペプチドへの結合のスクリーニングによっても同定できる。あるいは、Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899の方法を使用して、ここに記載する抗ＣＤ４０抗体と同じエピトープ、それ故に類似の性質を有する抗体の選択をガイドし得る。ファージディスプレイを使用して、まず抗ＣＤ４０抗体の重鎖を(好ましくはヒト)軽鎖のレパートリーと対合させて、ＣＤ４０結合抗体を選択し、次いで新規軽鎖を(好ましくはヒト)重鎖のレパートリーと対合させて、ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体と同じエピトープまたはエピトープ領域を有する(好ましくはヒト)ＣＤ４０結合抗体を選択する。あるいは、ここに記載する抗体のバリアントが、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異誘発により得ることができる。
【０１０６】
Cunningham & Wells (1989) Science 244: 1081に記載のアラニンスキャニング変異誘発またはＣＤ４０におけるアミノ酸残基のいくつかの他の形態の点変異誘発(例えば実施例６に提供する酵母ディスプレイ方法)も抗ＣＤ４０抗体の機能的エピトープ決定に使用し得る。
【０１０７】
特定の抗体により結合されるエピトープまたはエピトープ領域(“エピトープ領域”はエピトープを含むまたはエピトープと重複する領域である)はまたＣＤ４０のフラグメントを含むペプチドに対する抗体の結合の評価によっても決定され得る。ＣＤ４０(例えば、ヒトＣＤ４０)の配列を含む一連の重複ペプチドを、合成し、例えば直接的ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ(ペプチドを、マイクロタイタープレートのウェルに結合したＣＤ４０に対する抗体の結合を阻止する能力について評価する)またはチップで、結合についてスクリーニングできる。このようなペプチドスクリーニング方法は、ある非連続機能的エピトープ、すなわちＣＤ４０ポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続的ではないアミノ酸残基を含む機能的エピトープの検出ができない可能性がある。
【０１０８】
エピトープはまた水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)およびFast Photochemical Oxidation of Proteins(ＦＰＯＰ)のようなＭＳベースのタンパク質フットプリント法によっても同定され得る。ＨＤＸ−ＭＳは、例えば、Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95にさらに記載のように実施でき、その方法は引用により本明細書に明示的に包含させる。実施例５もまた参照のこと。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley & Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:205に記載のとおり実施でき、その方法は引用により本明細書に明示的に包含させる。
【０１０９】
抗ＣＤ４０抗体により結合されたエピトープはまた、Ｘ線結晶構造決定(例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３号)、分子モデリングおよび、遊離のときおよび目的の抗体との複合体において結合したときのＣＤ４０における不安定なアミド水素のＨ−Ｄ交換率のＮＭＲ決定を含む、核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピーのような構造的方法によっても決定できる(Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884)。
【０１１０】
Ｘ線結晶学に関して、結晶化は、マイクロバッチ(例えばChayen (1997) Structure 5:1269)、ハンギングドロップ蒸気拡散法(例えばMcPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300)、シーディングおよび透析を含む、当分野で知られる何れかの方法を使用して達成され得る(例えばGiege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1)。少なくとも約１mg／mL、好ましくは約１０mg／mL〜約２０mg／mLの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、約１０％〜約３０％(ｗ／ｖ)濃度範囲の、ポリエチレングリコール１０００〜２０,０００(ＰＥＧ；平均分子量約１０００〜約２０,０００Da)、好ましくは約５０００〜約７０００Da、より好ましくは約６０００Daを含む沈殿剤溶液中での達成が最良であり得る。タンパク質安定化剤、例えばグリセロールを約０.５％〜約２０％濃度範囲で包含させるのも望ましいことがある。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムのような適当な塩も、好ましくは濃度範囲約１mM〜約１０００mMで、沈殿剤溶液中にあるのが望ましいことがある。沈殿剤は、好ましくはｐＨ約３.０〜約５.０、好ましくは約４.０に緩衝化される。沈殿剤溶液において有用な具体的緩衝液は多様であり、当分野で周知である(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York)。有用な緩衝液の例は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸を含むが、これらに限定されない。結晶は、２℃、４℃、８℃および２６℃を含む広い範囲の温度で成長させ得る。
【０１１１】
抗体：抗原結晶を、周知のＸ線回折技術を使用して研究でき、Ｘ−ＰＬＯＲ(Molecular Simulations, Inc.により頒布のYale University, 1992；例えばBlundell & Johnson(1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press；米国特許公開２００４／００１４１９４号参照)およびＢＵＳＴＥＲ(Bricogne(1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne(1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323)のようなコンピューターソフトウェアを使用して精密化でき、これらの開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【０１１２】
特に断らない限り、そして特許請求の範囲に関して、抗体により結合されるエピトープは、実質的に実施例５に記載する、ＨＤＸ−ＭＳ方法により決定されたエピトープである。
【０１１３】
高親和性で結合する抗ＣＤ４０抗体
ある実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ここに開示する抗ｈｕＣＤ４０抗体と同様高親和性でｈｕＣＤ４０に結合し、効果的治療剤である可能性を高める。種々の実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ｈｕＣＤ４０に１０nM、５nM、２nM、１nM、３００pMまたは１００pM未満のＫＤで結合する。他の実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ｈｕＣＤ４０に、２nM〜１００pMのＫＤで結合する。抗体のｈｕＣＤ４０に対する結合能を評価する標準的アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット、バイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)(実施例３参照)およびBIACORE(登録商標)ＳＰＲ分析(実施例４参照)を含む。
【０１１４】
抗ＣＤ４０抗体配列バリアント
ここに開示する抗体配列におけるある程度の多様性は許容可能であり、抗体の望ましい性質をなお維持する。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ系を使用して線引きされる(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。従って、本発明は、さらに、ここに開示する抗体(すなわち１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７および１９Ｇ３およびそのヒト化誘導体)のＣＤＲ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣＤＲ配列を含む抗ｈｕＣＤ４０抗体を提供する。本発明はまた、ここに開示する抗体(すなわち１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７および１９Ｇ３およびそのヒト化誘導体)の重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列を含む抗ｈｕＣＤ４０抗体も提供する。
【０１１５】
ＣＤＲ配列を共有するまたは同じマウス生殖系列由来の抗ＣＤ４０抗体
抗原結合特異性が主にＣＤＲにより決定されることを考慮して、ここに開示する抗体(すなわち１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７および１９Ｇ３)とＣＤＲ配列を共有する抗体は、望ましい性質を共有する可能性がある。ある実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、抗体１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７または１９Ｇ３と同じマウスＶ領域およびＪ領域生殖系列配列由来の重鎖および軽鎖可変領域を含む。抗体１２Ｄ６は、マウス生殖系列ＶＨ１−３９＿０１およびＩＧＨＪ４由来の重鎖ならびに軽鎖生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＩＧＫＪ１を有する。抗体５Ｆ１１は、マウス生殖系列ＶＨ１−４＿０２およびＩＧＨＪ３由来の重鎖ならびに軽鎖生殖系列ＶＫ３−５＿０１およびＩＧＫＪ５を有する。抗体８Ｅ８は、マウス生殖系列ＶＨ１−８０＿０１およびＩＧＨＪ２由来の重鎖ならびに軽鎖生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＩＧＫＪ２を有する。抗体５Ｇ７は、マウス生殖系列ＶＨ１−１８＿０１およびＩＧＨＪ４由来の重鎖ならびに軽鎖生殖系列ＶＫ１０−９６＿０１およびＩＧＫＪ２を有する。抗体１９Ｇ３は、マウス生殖系列ＶＨ５−９−４＿０１およびＩＧＨＪ３由来の重鎖および軽鎖生殖系列ＶＫ１−１１７＿０１およびＩＧＫＪ２を有する。重鎖Ｄ領域生殖系列配列(ＣＤＲＨ３の一部を構成する)は、高可変性を鑑みて、しばしば帰属が困難であるため特定されず、故に、本発明の抗体は、列記したＶおよびＪ領域生殖系列およびあらゆるＤ領域生殖系列由来の重鎖を含み得る。ヒトＣＤ４０に結合し、これらの生殖系列配列の一部または全てに由来する他の抗体は、配列が、特に同じＶ領域遺伝子由来のものと密接に関係する可能性があり、それ故同じ望ましい性質を共有すると予測される。
【０１１６】
ここで使用する、マウス抗体は、抗体の可変領域がマウス生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られ、そして抗体配列が他のあらゆるものよりその生殖系列に由来する可能性が高い生殖系列と十分に関係するならば、特定の生殖系列配列に“由来する”重鎖または軽鎖可変領域である。このような系は、目的の抗原でのマウスの免疫化を含む。抗体の配列が“由来する”マウス生殖系列免疫グロブリン配列は、抗体のアミノ酸配列とマウス生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較し、抗体の配列と配列が最も近い生殖系列免疫グロブリン配列(すなわち、最高％同一性)を選択することにより同定できる。特定の生殖系列免疫グロブリン配列に“由来する”マウス抗体は、例えば、天然に存在する体性変異または部位特異的変異の意図的導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を有し得る。しかしながら、選択マウス抗体は、一般に生殖系列免疫グロブリン遺伝子(例えばＶ領域)によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列で少なくとも９０％同一である。ある場合、マウス抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子(例えばＶ領域)によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９５％または少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一である。一般に、特定のマウス生殖系列配列に由来する抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子(例えばＶ領域)によりコードされるアミノ酸配列と１０を超えないアミノ酸差異を示す。ある場合、マウス抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子(例えばＶ領域)によりコードされるアミノ酸配列と５を超えないまたは４、３、２もしくは１を超えないアミノ酸差異を示し得る。
【０１１７】
II. 改変および修飾抗体
ＶＨ領域およびＶＬ領域
修飾抗体に改変する出発物質としてここに開示するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上を有する抗体を使用して製造できる改変および修飾抗体も提供され、この修飾抗体は、出発抗体から改変された性質を有し得る。抗体は、可変領域の一方または両方(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)内、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上の残基の修飾により改変され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を変えるために、定常領域内の残基の修飾により改変され得る。
【０１１８】
実施可能な一つのタイプの可変領域改変は、ＣＤＲ移植である。このような移植は、ここに開示する抗ｈｕＣＤ４０抗体と結合について競合するおよび／またはここに開示する抗ｈｕＣＤ４０抗体と同じエピトープに結合する非ヒト抗ＣＤ４０抗体のヒト化に特に有用である。抗体は、主に６重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体抗原相互作用を担うため、異なる性質を有する異なる抗体からフレームワーク配列に移植された特定の参照抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の参照抗体の性質を模倣する組み換え抗体を発現することが可能である(例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. (USA) 86:10029-10033；Winterの米国特許５,２２５,５３９号およびQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１号、５,５８５,０８９号、５,６９３,７６２号および６,１８０,３７０号参照)。
【０１１９】
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子に対する生殖系列ＤＮＡ配列を、“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖系列配列データベースならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836に見ることができ、これら各々の内容を明示的に引用により本明細書に包含させる。
【０１２０】
ここに記載する抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、ここに記載する抗体により使用されるフレームワーク配列に構造的に類似するものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られるのと同一配列を有するフレームワーク領域に移植できまたはＣＤＲ配列を生殖系列配列と比較して２０までの、好ましくは保存的な、アミノ酸置換を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、ある場合に、抗体の抗原結合能を維持または増強するためのフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが判明している(例えば、Queen et al.の米国特許５,５３０,１０１号、５,５８５,０８９号、５,６９３,７６２号および６,１８０,３７０号)。
【０１２１】
ここに記載する改変抗体は、例えば、抗体の性質を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾がされているものを含む。しばしば、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低減させるために実施する。例えば、一つの試みは、１以上のフレームワーク残基の対応する生殖系列配列への“復帰変異”である。より具体的に、体性変異を受けている抗体は、該抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列と該抗体が由来する生殖系列配列を比較することにより同定できる。フレームワーク領域配列を生殖系列配置に戻すために、体性変異は、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発により、生殖系列配列に“復帰変異”され得る。このような“復帰変異”抗体も包含させることが意図される。
【０１２２】
他のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の可能性のある免疫原性を低減するために、フレームワーク領域内または１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基を変異させることを含む。この試みはまた“脱免疫化”とも称され、米国特許公開２００３０１５３０４３号にCarr et al.によりさらに詳述されている。
【０１２３】
他のタイプの可変領域修飾は、目的の抗体の１以上の結合性質(例えば、親和性)を改善するための、ＣＤＲ領域内のアミノ酸残基の変異である。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発を、抗体結合または目的の他の機能的性質に変異および効果を導入するために実施できる。好ましくは保存的修飾が導入される。変異は、アミノ酸付加、欠失または好ましくは置換であり得る。さらに、一般にＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５を超えない残基が改変される。
【０１２４】
抗体のＣＤＲにおけるメチオニン残基は、可能性のある化学的分解およびその後の抗体の効力の低減をもたらす、酸化され得る。従って、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲにおける１以上のメチオニン残基が酸化的分解を受けないアミノ酸残基に置き換えられた抗ＣＤ４０抗体も提供される。同様に、脱アミド化部位を、抗ＣＤ４０抗体、特にＣＤＲから除去し得る。抗原結合ドメイン内の可能性のあるグリコシル化部位は、抗原結合を妨害し得るグリコシル化を阻止するために、好ましくは除去される。例えば、米国特許５,７１４,３５０号参照。
【０１２５】
標的化抗原結合
種々の実施態様において、本発明の抗体は、抗原結合が有害であろう組織および環境における抗原結合を選択的に遮断するが、有益であろう抗原結合を可能にするために修飾される。ある実施態様において、抗体の抗原結合表面に特異的に結合し、抗原結合を妨害する遮断ペプチド“マスク”を生産し、このマスクは、ペプチダーゼ開裂可能リンカーによる抗体の結合アームの各々に連結される。例えば、CytomXの米国特許８,５１８,４０４号参照。このような構築物は、プロテアーゼレベルが非腫瘍組織と比較して腫瘍微小環境で極めて増加している癌の処置に有用である。腫瘍微小環境における開裂可能リンカーの選択的開裂は、ペプチドのマスキング／遮断の解離を可能とし、抗原結合が望まない副作用を引き起こす末梢組織ではなく、腫瘍において選択的な抗原結合を可能とする。
【０１２６】
あるいは、関連する実施態様において、(二価)抗体の両抗原結合表面に結合し、抗原結合を妨害する２抗原結合ドメインを含む二価結合化合物(“マスキングリガンド”)を開発し、ここで、２結合ドメインマスクは、例えばペプチダーゼにより開裂可能な、開裂可能リンカーにより、互いに(しかし抗体ではない)に連結されている。例えば、Tegopharm Corp.の国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０７７６４３号参照。マスキングリガンドは、抗体が結合することが意図される抗原を含むかまたはそれに由来し得るかまたは独立して生産され得る。このようなマスキングリガンドは、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが非腫瘍組織と比較して大きく上昇している癌の処置に有用である。腫瘍微小環境における開裂可能リンカーの選択的開裂は、２結合ドメインの互いの開裂を可能とし、抗体の抗原結合表面のアビディティーを低減する。マスキングリガンドの抗体からの得られた解離は、抗原結合が望まない副作用を引き起こす末梢組織ではなく、腫瘍において選択的な抗原結合を可能とする。
【０１２７】
Ｆｃおよび修飾Ｆｃ
本発明の抗体は、意図する使用のために抗体の生物学的活性(もしあれば)に基づき選択された種々のＦｃ領域を含む定常ドメインと組み合わせた本発明の可変ドメインを含み得る。Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369。ヒトＩｇＧは、例えば、４サブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類でき、これらの各々は、１以上のＦｃγ受容体(活性化受容体ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＣ(ＣＤ３２ａ,ｃ)、ＦｃγＲIIIＡおよびＦｃγＲIIIＢ(ＣＤ１６ａ,ｂ)および阻害性受容体ＦｃγＲIIＢ(ＣＤ３２ｂ)および補体の第一成分(Ｃ１ｑ)への結合について独特なプロファイルを有するＦｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は全Ｆｃγ受容体に結合し、ＩｇＧ２はＦｃγＲIIＡＨ１３１におよび低親和性でＦｃγＲIIＡＲ１３１  ＦｃγＲIIIＡＶ１５８に結合し、ＩｇＧ４はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢ、ＦｃγＲIIＣおよびＦｃγＲIIIＡＶ１５８に結合し、そして阻害性受容体ＦｃγＲIIＢは、全ての他のＦｃγ受容体よりもＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に低親和性を有する。Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716。ＦｃγＲＩはＩｇＧ２に結合せず、ＦｃγＲIIIＢはＩｇＧ２またはＩｇＧ４に結合しないことが試験により証明されている。同上。一般に、ＡＤＣＣ活性について、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２である。その結果、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインが、ＡＤＣＣが望まれるとき薬物における使用に選択され、ＦｃγＲIIIＡ発現ＮＫ細胞、単球またはマクロファージの活性化ならば、ＩｇＧ３が選択され、抗体がアレルギー患者に使用されるならば、ＩｇＧ４が選択される。抗体が全エフェクター機能を欠くことが望まれるならば、ＩｇＧ４がまた選択され得る。
【０１２８】
ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃに連結(例えば、共有結合性に連結または融合)されていてよく、これはあらゆるアロタイプまたはイソアロタイプであってよく、例えば、ＩｇＧ１についてＧ１ｍ、Ｇ１ｍ１(ａ)、Ｇ１ｍ２(ｘ)、Ｇ１ｍ３(ｆ)、Ｇ１ｍ１７(ｚ)、ＩｇＧ２についてＧ２ｍ、Ｇ２ｍ２３(ｎ)、ＩｇＧ３についてＧ３ｍ、Ｇ３ｍ２１(ｇ１)、Ｇ３ｍ２８(ｇ５)、Ｇ３ｍ１１(ｂ０)、Ｇ３ｍ５(ｂ１)、Ｇ３ｍ１３(ｂ３)、Ｇ３ｍ１４(ｂ４)、Ｇ３ｍ１０(ｂ５)、Ｇ３ｍ１５(ｓ)、Ｇ３ｍ１６(ｔ)、Ｇ３ｍ６(ｃ３)、Ｇ３ｍ２４(ｃ５)、Ｇ３ｍ２６(ｕ)、Ｇ３ｍ２７(ｖ)であってよい。(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。アロタイプの選択は、例えば抗薬物抗体の形成の最小化のための、免疫原性についての可能性のある懸念により影響され得る。
【０１２９】
好ましい実施態様において、本発明の抗ＣＤ４０抗体は、アゴニズム増強を提供できる、ＦｃγＲIIｂに結合するまたは結合が増強されているＦｃを有する。例えば、ＷＯ２０１２／０８７９２８号; Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754参照。ここに記載する可変領域は、例えばアポトーシス誘発またはアジュバント活性を増強するために、阻害性受容体ＦｃｙＲIIｂに対する親和性が増強されたＦｃバリアントに連結され得る。Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 109:10966; 米国特許公開２０１４／００１０８１２号参照。このようなバリアントは、例えばＢ細胞および単球を含む、ＦｃγＲIIｂ＋細胞と関係する免疫調節性活性を備えた抗体を提供する。ある実施態様において、Ｆｃバリアントは、１以上の活性化受容体に対してＦｃγＲIIｂへの親和性の選択的増強を提供する。このようなバリアントはまたＦｃＲ介在架橋の増強も示し得て、治療効力の増強をもたらす。ＦｃγＲIIｂへの結合を改変するための修飾は、ＥＵ指数による、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群から選択される位置での１以上の修飾を含む。ＦｃγＲIIｂ親和性を増強するための置換の例は、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅを含むが、これらに限定されない。置換の例は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙを含む。ＦｃγＲIIｂへの結合を増強するための他のＦｃバリアントは、２３５Ｙ−２６７Ｅ、２３６Ｄ−２６７Ｅ、２３９Ｄ−２６８Ｄ、２３９Ｄ−２６７Ｅ、２６７Ｅ−２６８Ｄ、２６７Ｅ−２６８Ｅおよび２６７Ｅ−３２８Ｆを含む。特に、ヒトＩｇＧ１のＳ２６７Ｅ−Ｌ３２８Ｆ二重バリアントを含むＳ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｌ３２８ＦおよびＩ３３２Ｅバリアントが、阻害性ＦｃγＲIIｂ受容体に対する親和性の特異的増強に特に価値がある。Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926; 米国特許公開２００６／０２４２９８；ＷＯ２０１２／０８７９２８号。ＦｃγＲIIｂについて増強された特異性(ＦｃγＲIIａＲ１３１と区別される)は、Ｐ２３８Ｄ置換および他の変異(Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589；ＷＯ２０１２／１１５２４１０号)ならびにＶ２６２ＥおよびＶ２６４Ｅ(Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723およびＷＯ２０１４／１８４５４５号)の付加により得られ得る。表４参照(上記)。
【０１３０】
半減期延長
ある実施態様において、抗体は、生物学的半減期延長のために修飾される。種々の試みが可能である。例えば、これは、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合親和性増加によりなし得る。ある実施態様において、抗体は、Presta et al.の米国特許５,８６９,０４６号および６,１２１,０２２号に記載のとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２ループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１またはＣＬ領域内を改変し得る。ＦｃＲｎの結合を増加するおよび／または薬物動態性質を改善する他の例示的Ｆｃバリアントは、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍを含む、２５９位、３０８位および４３４位の置換を含む。ＦｃＲｎへのＦｃ結合が増加した他のバリアントは、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ(Dall'Acqua et al., Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)を含む。米国特許８,３６７,８０５号参照。
【０１３１】
Ｎ４３４Ａバリアント(Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663)のような、ＩｇＧ  Ｆｃにおけるある保存的残基(Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｈ４３３、Ｎ４３４)の修飾が、ＦｃＲｎ親和性を増強させ、それ故に循環における抗体の半減期を延長する方法として提案されている。ＷＯ９８／０２３２８９号。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む組み合わせＦｃバリアントは、ＦｃＲｎ結合を増加させ、血清半減期を５倍まで延長することが示されている。Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ修飾を含む組み合わせＦｃバリアントも、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長させる。Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759。さらに、Ｍ２５２Ｙ−Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４ＭおよびＭ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｓバリアントを含む組み合わせＦｃバリアントも半減期延長を示している。ＷＯ２００９／０８６３２０号。
【０１３２】
さらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む組み合わせＦｃバリアントは、半減期を約４倍延長させる。Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514。ＦｃＲｎ親和性を増加させるが、ｐＨ依存を減少させる関連ＩｇＧ１修飾(Ｍ２５２Ｙ−Ｓ２５４Ｔ−Ｔ２５６Ｅ−Ｈ４３３Ｋ−Ｎ４３４Ｆ)が、他の抗体のＦｃＲｎへの結合を阻止する競合因子として使用するためのＩｇＧ１構築物(“ＭＳＴ−ＨＮ  Ａｂｄｅｇ”)の作製に使用されており、内因性ＩｇＧ(例えば自己免疫状況における)または他の外因性(治療)ｍＡｂの他の抗体のクリアランス増加をもたらす。Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283；ＷＯ２００６／１３０８３４号。
【０１３３】
ＦｃＲｎ結合を増加する他の修飾は、Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671；ＵＳ６,２７７,３７５号；ＵＳ６,８２１,５０５号；ＷＯ９７／３４６３１号；ＷＯ２００２／０６０９１９号に記載されている。
【０１３４】
ある実施態様において、ハイブリッドＩｇＧアイソタイプをＦｃＲｎ結合の増加および潜在的半減期延長のために使用し得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ１位置を、ＩｇＧ３からのこれら２アイソタイプが異なる位置のアミノ酸と置換することにより構築し得る。それ故に、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。ここに記載する他の実施態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域のＩｇＧ２位置を、ＩｇＧ１からのこれら２アイソタイプが異なる位置のアミノ酸と置き換えることにより構築し得る。それ故に、１以上の置換、例えば、１以上の次の、２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ(２３６位でのグリシン挿入をいう)および３２７Ａのアミノ酸置換を含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。米国特許８,６２９,１１３号参照。血清半減期が延長し、発現が改善されたと言われるＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４配列のハイブリッドが生産されている。米国特許７,８６７,４９１号(その中の配列番号１８)。
【０１３５】
本発明の抗体の血清半減期はペグ化によっても延長できる。抗体を、例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期延長のためにペグ化できる。抗体のペグ化のために、抗体またはそのフラグメントを、一般にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のようなＰＥＧ試薬と、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに結合するようになる条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子(または類似反応性水可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施する。ここで使用する用語“ポリエチレングリコール”は、モノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドのような他のタンパク質の誘導体化に使用されているあらゆる形態のＰＥＧを包含することを意図する。ある実施態様において、ペグ化する抗体は、脱グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野で知られ、ここに記載する抗体に適用できる。例えば、Nishimura et al.のＥＰ０１５４３１６号およびIshikawa et al.のＥＰ０４０１３８４号参照。
【０１３６】
あるいは、ある状況下で、本発明の抗体の半減期を、延長させるよりも、短縮させるのが望ましいことがあり得る。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＩ２５３Ａ(Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355)およびＨ４３５Ａ／Ｒ、Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ(Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819)のような修飾は、医学的造影のような迅速なクリアランスが好ましい状況において使用するために、ＦｃＲｎ結合を減少し、それ故に、半減期を短縮(クリアランス増加)できる。Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622も参照のこと。クリアランスを増強させるための他の手段は、ＦａｂフラグメントのようなＦｃＲｎに結合する能力を欠く抗体フラグメントとして本発明の抗原結合ドメインを整形(formatting)することを含む。このような修飾は、抗体の循環半減期を数週間から数時間に短縮できる。次いで、抗体フラグメントの選択的ペグ化を、必要であれば、抗体フラグメント半減期の微調整(延長)に使用できる。Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780。抗体フラグメントをまた半減期延長のために、例えば融合タンパク質構築物において、ヒト血清アルブミンと融合させてもよい。Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904。あるいは、二特異的抗体を、本発明の第一抗原結合ドメインと、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合する第二抗原結合ドメインで構築し得る。国際特許出願公開ＷＯ２００９／１２７６９１号およびその中に引用されている特許参照。あるいは、特定化ポリペプチド配列、例えば“ＸＴＥＮ”ポリペプチド配列を抗体フラグメントに付加して、半減期を延長できる。Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186；国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２号。
【０１３７】
付加的Ｆｃバリアント
ＩｇＧ４定常ドメインを使用するとき、通常、ＩｇＧ１におけるヒンジ配列を模倣する置換Ｓ２２８Ｐを包含させて、それによりＩｇＧ４分子を安定化する、例えば治療抗体と処置している患者の内因性ＩｇＧ４のＦａｂアーム交換を低減させるのが好ましい。Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925。
【０１３８】
ＩｇＧ１構築物のヒンジにおける潜在的プロテアーゼ開裂部位を、Ｄ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ修飾により除去し、抗体の安定性を増加できる。ＷＯ２０１４／０４３３４４号。
【０１３９】
Ｆｃバリアントのそのリガンド(Ｆｃ受容体)への親和性および結合性質は、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)または放射免疫アッセイ(ＲＩＡ))または動力学(例えば、BIACORE(登録商標)ＳＰＲ分析)ならびに間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)のような他の方法を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる、多様なインビトロアッセイ方法(生化学または免疫学ベースのアッセイ)により決定し得る。これらおよびその他の方法は、試験する１以上の成分の標識を利用する／または発色性、蛍光、発光または同位体標識を含むが、これらに限定されない多様な検出方法を用いることができる。結合親和性および動力学の詳細な記載は、抗体−免疫原相互作用に焦点を当てたPaul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見ることができる。
【０１４０】
さらに他の実施態様において、抗体のグリコシル化は、エフェクター機能を増加または減少させる修飾である。例えば、２９７位(例えばＮ２９７Ａ)における保存アスパラギン残基を変異させ、それ故に補体およびＦｃγＲＩ結合を消失させる、全エフェクター機能を欠く脱グリコシル化抗体を製造できる。Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403. See also Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595(２９７位のグリコシル化を排除するためのＩｇＧ１におけるＮ２９７Ｑを使用)。
【０１４１】
脱グリコシル化抗体は一般にエフェクター機能を欠くが、変異は該機能を回復させるために導入され得る。例えばＮ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／またはＨ変異由来またはタンパク質をグリコシル化しない系(例えば大腸菌)で生産された脱グリコシル化抗体を、さらに変異させてＦｃγＲ結合、例えばＳ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／またはＨ(ＷＯ２００９／０７９２４２号)またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ(Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 107:604)を生産し得る。
【０１４２】
糖鎖工学を使用して、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７に結合した炭水化物鎖のα２,６シアリル含量の変化により、ＩｇＧ構築物の抗炎症性性質も修飾でき、ここで、α２,６シアリル化形態の比率増加が、抗炎症性効果増強をもたらす。Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513参照。逆に、α２,６シアリル化炭水化物を有する抗体の比率の減少は、抗炎症性性質が望まれない場合、有用であり得る。例えばα２,６シアリル化形態の選択的精製または酵素修飾による抗体のα２,６シアリル化含量を修飾する方法は、米国特許出願公開２００８／０２０６２４６号に提供される。他の実施態様において、例えばＦ２４１Ａ修飾包含により、Ｆｃ領域のアミノ酸配列を修飾して、α２,６シアリル化の効果を模倣できる。ＷＯ２０１３／０９５９６６号。
【０１４３】
III. 抗体の物理的性質
ここに記載する抗体は、軽鎖または重鎖可変領域に１以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗原結合改変により、抗体の免疫原性増加または抗体のｐＫ改変をもたらし得る(Marshall et al. (1972) Ann. Rev. Biochem. 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172:5489-94; Wallick et al. (1988) J. Exp. Med. 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al. (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol. 37:697-706)。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで生じることが知られている。ある状況において、可変領域グリコシル化を含まない抗ｈｕＣＤ４０抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体の選択またはグリコシル化領域内の残基の変異により達成され得る。
【０１４４】
ある実施態様において、ここに記載する抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化はＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で生じ、イソアスパラギン酸残基の作製をもたらし、これはポリペプチド鎖にねじれを導入し、安定性を低減させる(イソアスパラギン酸効果)。
【０１４５】
各抗体は独特な等電点(ｐＩ)を有し、これは一般に６〜９.５のｐＨ範囲に入る。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、一般に７〜９.５のｐＨ範囲に入り、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、一般に６〜８のｐＨ範囲に入る。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、インビボ条件下、ある程度アンフォールディングおよび不安定性を有し得るとの推測がある。それ故に、正常範囲に入るｐＩ値を含む抗ＣＤ４０抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを有する抗体の選択または荷電表面残基の変異により達成できる。
【０１４６】
各抗体は、特徴的融解温度を有し、融解温度が高いほど、インビボでの全体的安定性が大きいことを示す(Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:361-71)。一般に、ＴＭ１(初期アンフォールディングの温度)が６０℃超、好ましくは６５℃超、よりさらに好ましくは７０℃超であるのが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定(Chen et al. (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999) Immunol. Lett. 68:47-52)または円二色性(Murray et al. (2002) J. Chromatogr. Sci. 40:343-9)を使用して測定できる。
【０１４７】
好ましい実施態様において、急速に分解しない抗体を選択する。抗体の分解をキャピラリー電気泳動(ＣＥ)およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定できる(Murray et al. (2002) J. Chromatogr. Sci. 40:343-9)。
【０１４８】
他の好ましい実施態様において、望まない免疫応答および／または改変されたもしくは好ましくない薬物動態性質の形成に至り得る、凝集効果が最小の抗体を選択する。一般に、２５％以下、好ましくは２０％以下、よりさらに好ましくは１５％以下、よりさらに好ましくは１０％以下、よりさらに好ましくは５％以下の凝集の抗体が許容される。凝集は、サイズ排除カラム(ＳＥＣ)、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)および光散乱を含む、幾つかの技術により測定できる。
【０１４９】
IV. 核酸分子
ここに記載する他の態様は、ここに記載する抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は細胞全体、細胞ライセートまたは一部精製もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準的技術により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば、他の細胞核酸(例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、本来単離ＤＮＡに連結している染色体ＤＮＡ)またはタンパク質から精製されるとき、“単離される”または“実質的に純粋とされる”。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。ここに記載するは、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、イントロン配列を含んでも、含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１５０】
ここに記載する核酸は、標準的分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、下にさらに記載するヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ)により発現される抗体について、ハイブリドーマにより製造される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー(例えば、ファージディスプレイ技術を使用)から得られる抗体について、抗体をコードする核酸をライブラリーから回収できる。
【０１５１】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントを、さらに、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的組み換えＤＮＡ技術により操作され得る。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨコード化ＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または可動性リンカーのような他のタンパク質をコードする他のＤＮＡフラグメントに操作可能に連結されり。この文脈で使用する用語“操作可能に連結”は、２ＤＮＡフラグメントが、２ＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、接続されることを意味する。
【０１５２】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨコード化ＤＮＡを、重鎖定常領域(ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３)をコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に結合させることにより、完全長重鎖遺伝子に変換できる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域に包含されるＤＮＡフラグメントを標準的ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子にいて、ＶＨコード化ＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に連結させ得る。
【０１５３】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを、ＶＬコード化ＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に連結することにより、完全長軽鎖遺伝子(ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子)に変換できる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域に包含されるＤＮＡフラグメントを標準的ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【０１５４】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬコード化ＤＮＡフラグメントを、ＶＨおよびＶＬ配列が連続的一本鎖タンパク質として発現され得るように可動性リンカー、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)３をコードする他のフラグメントと操作可能に連結し、ＶＬおよびＶＨ領域は可動性リンカーにより連結された(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554参照)。
【０１５５】
Ｖ. 抗体生産
本発明の種々の抗体、例えば抗ヒトＣＤ４０ここに開示する抗体と競合するまたは同じエピトープに結合するものを、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)に記載の標準的体性細胞ハイブリダイゼーション技術のような多様な既知技術を使用して生産できる。体性細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を生産する他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換、ファージヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するディスプレイ技術も使用できる。
【０１５６】
ハイブリドーマの生産に好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生産は、高度に確立された方法である。融合のための免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコールおよび技術は当分野で知られる。融合相手(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合手順も知られる。
【０１５７】
ここに記載するキメラまたはヒト化抗体は、上に記載のとおり製造したマウスモノクローナル抗体の配列に基づき生産できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、目的のマウスハイブリドーマから得て、標準的分子生物学技術を使用して非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むように改変できる。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域を、当分野で知られる方法を使用してヒト定常領域に連結できる(例えば、Cabilly et al.の米国特許４,８１６,５６７号参照)。ヒト化抗体を作製するために、マウスＣＤＲ領域を当分野で知られる方法を使用してヒトフレームワークに導入し得る(例えば、Winterの米国特許５,２２５,５３９号およびQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１号、５,５８５,０８９号、５,６９３,７６２号および６,１８０,３７０号参照)。
【０１５８】
ある実施態様において、ここに記載する抗体はヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトＣＤ４０に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソミックマウスを使用して生産できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスは、ここでそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称するマウスを含み、ここで、集合的に“ヒトＩｇマウス”と称する。
【０１５９】
ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化変異と共に、非再配列ヒト重(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子微小遺伝子座を含む(例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859参照)。従って、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入ヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子が、クラススイッチングおよび体性変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生産する(Lonberg, N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546)。ＨｕＭａｂマウスの作製および使用ならびにこのようなマウスにより担持されるゲノム修飾は、さらにTaylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; and Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851に記載され、これら全ての内容を、引用によりその全体を本明細書に明示的に包含させる。さらに、全てLonberg and Kayの米国特許５,５４５,８０６号、５,５６９,８２５号、５,６２５,１２６号、５,６３３,４２５号、５,７８９,６５０号、５,８７７,３９７号、５,６６１,０１６号、５,８１４,３１８号、５,８７４,２９９および５,７７０,４２９号、Surani et al.の米国特許５,５４５,８０７号、全てLonberg and KayのＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９７／１３８５２号、ＷＯ９８／２４８８４号およびＷＯ９９／４５９６２号ならびにKorman et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと。
【０１６０】
ある実施態様において、ここに記載する抗体を、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスのような導入遺伝子および導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを使用して生成させる。このようなマウスは、ここでは“ＫＭマウス”と称し、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８号に詳述される。
【０１６１】
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系が当分野で利用可能であり、ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体の生成に使用できる。例えば、Ｘｅｎｏマウス(Abgenix, Inc.)と称する別のトランスジェニック系を使用でき、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許５,９３９,５９８号、６,０７５,１８１号、６,１１４,５９８号、６,１５０,５８４号および６,１６２,９６３号に記載されている。
【０１６２】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモソミック動物系が当分野で利用可能であり、ここに記載する抗ＣＤ４０抗体の生成に使用できる。例えば、“ＴＣマウス”と称するヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を担持するマウスを使用でき、このようなマウスはTomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 97:722-727に記載される。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが文献に記載されており(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体の生成に使用できる。
【０１６３】
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ｈｕＣＤ４０抗体の生成のために文献に記載されている付加的マウス系は、(ｉ)キメラ抗体(ヒトＶ／マウスＣ)がマウスで生成されるように、内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えにより、内因性マウス定常領域に操作可能に連結した、ヒト重鎖および軽鎖可変領域に置き換えられ、続いて、標準的組み換えＤＮＡ技術を使用して完全ヒト抗体に変換される、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)および(ii)マウスは単一再配列ヒト共通軽鎖可変領域以外非再配列ヒト重鎖可変領域を含む、MeMo(登録商標)マウス(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)を含む。このようなマウスおよび抗体生成のためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７号、ＵＳ２０１０／００６９６１４号、ＷＯ２０１１／０７２２０４号、ＷＯ２０１１／０９７６０３号、ＷＯ２０１１／１６３３１１号、ＷＯ２０１１／１６３３１４号、ＷＯ２０１２／１４８８７３号、ＵＳ２０１２／００７０８６１号およびＵＳ２０１２／００７３００４号に記載されている。
【０１６４】
ここに記載するヒトモノクローナル抗体はまたヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリースクリーニングのためのファージディスプレイ方法を使用しても製造できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ方法は当分野で確立されている。例えば、Ladner et al.の米国特許５,２２３,４０９号、５,４０３,４８４号および５,５７１,６９８号、Dower et al.の米国特許５,４２７,９０８号および５,５８０,７１７号、McCafferty et al.の米国特許５,９６９,１０８号および６,１７２,１９７号ならびにGriffiths et al.の米国特許５,８８５,７９３号、６,５２１,４０４号、６,５４４,７３１号、６,５５５,３１３号、６,５８２,９１５号および６,５９３,０８１号参照。
【０１６５】
ここに記載するヒトモノクローナル抗体はまたヒト抗体応答が免疫化により生産されるようにヒト免疫細胞が再構成されている、ＳＣＩＤマウスを使用しても生産できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許５,４７６,９９６号および５,６９８,７６７号に記載されている。
【０１６６】
免疫化
ヒトＣＤ４０に対する完全ヒト抗体を生産するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子(例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス)を含むマウスまたはトランスジェニックもしくは導入染色体マウスを、他の抗原について、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４号により記載のとおり、ＣＤ４０抗原および／またはＣＤ４０を発現する細胞の精製または富化調製物で免疫化することができる。あるいは、マウスを、ヒトＣＤ４０をコードするＤＮＡで免疫化できる。好ましくは、マウスは、最初の点滴時６〜１６週齢である。例えば、組み換えヒトＣＤ４０抗原の精製または富化調製物(５〜５０μg)を使用して、マウスを腹腔内免疫し得る。ＣＤ４０抗原の精製または富化調製物を使用した免疫化が抗体を生成しない場合、マウスをまた免疫応答促進のために、ＣＤ４０を発現する細胞、例えば、細胞株で免疫化してよい。
【０１６７】
種々の抗原での経験の蓄積は、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスが、Ｒｉｂｉアジュバント内の抗原でまず腹腔内(ＩＰ)または皮下(ＳＣ)免疫化し、続いて隔週でＲｉｂｉアジュバント内の抗原でＩＰ／ＳＣ免疫化(計１０回まで)することにより最良に応答することを示している。免疫応答を、血漿サンプルを後眼窩採血により得て、免疫化プロトコールにわたりモニターできる。血漿をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ(下記)でスクリーニングし、十分な力価の抗ＣＤ４０ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に使用できる。マウスを静脈内的に抗原により３日ブーストし、その後殺し、脾臓およびリンパ節を摘出し得る。各免疫化について２〜３融合を実施する必要があることは予測される。６〜２４匹のマウスを、一般に各抗原について免疫化する。通常、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２両方の導入遺伝子を、２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する単一マウスに合わせて育種できる(ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２)。
【０１６８】
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの生産
ここに記載するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを生産するために、免疫化マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を、単離し、マウス骨髄腫細胞株のような適切な不死化細胞株に融合させ得る。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の生産についてスクリーニングし得る。例えば、免疫化マウスからの臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧを用いてＳｐ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞(ATCC, CRL 1581)に融合できる。細胞を、平底マイクロタイタープレートに約２×１０５で播種し、続いて、１０％Fetal Clone血清、１８％“６５３”条件培地、５％オリジン(ＩＧＥＮ)、４mM  Ｌ−グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、５mM  ＨＥＰＥＳ、０.０５５mM  ２−メルカプトエタノール、５０単位／mlペニシリン、５０mg／mlストレプトマイシン、５０mg／mlゲンタマイシンおよび１Ｘ  ＨＡＴ(Sigma)を含む選択培地で２週間インキュベーションする。約２週間後、細胞を、ＨＡＴがＨＴに置き換えられた培地で培養し得る。次いで、個々のウェルをＥＬＩＳＡでヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてスクリーニングし得る。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、培地は通常１０〜１４日後に観察できる。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングでき、なおヒトＩｇＧについて陽性であるならば、モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローン化できる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴付けのために組織培養培地中で少量の抗体を生産できる。
【０１６９】
モノクローナル抗体を精製するために、選択ハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の２リットルスピナーフラスコで増殖させ得る。上清を濾過および濃縮し、その後プロテインＡ−セファロースを用いる親和性クロマトグラフィー(Pharmacia, Piscataway, N.J.)し得る。溶出ＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで点検し、純度を確認し得る。緩衝液をＰＢＳ中に交換し、濃度を、１.４３透過係数を使用するＯＤ２８０により決定できる。モノクローナル抗体を等分し、−８０℃で保存できる。
【０１７０】
VI. 抗体製造
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を生産するトランスフェクトーマの生産
配列が提供されている特定の抗体およびその他関連抗ＣＤ４０抗体の両方を含む本発明の抗体を、当分野で周知のとおり、例えば、組み換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション方法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで生産し得る(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
【０１７１】
例えば、抗体または抗体そのフラグメントを発現するために、部分的または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを標準的分子生物学技術(例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング)により得て、ＤＮＡを、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に連結されるように発現ベクターに導入できる。この文脈において、用語“操作可能に連結”は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳の制御の意図される機能に役立つように、ベクターにライゲートされることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合性であるように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別個のベクターに挿入しても、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入してもよい。抗体遺伝子を、標準的方法により発現ベクターに挿入する(例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しないならば平滑末端ライゲーション)。ここに記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用して、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに操作可能に連結し、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに操作可能に連結するように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製できる。これに加えてまたはこれとは別に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローン化できる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドでも異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)でもよい。
【０１７２】
抗体鎖遺伝子に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御性配列を担持し得る。用語“制御性配列”は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を包含することを意図する。このような制御性配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology.  Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載されている。制御性配列の選択を含む発現ベクターの設計は、トランスフォームする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子により得ることは当業者には認識される。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御性配列は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ))およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーのような、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントである。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターのような非ウイルス制御性配列を使用し得る。なおさらに、制御性エレメントは、ＳＶ４０早期プロモーターからの配列を含むＳＲαプロモーター系およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列のような異なる供給源からの配列を含む(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
【０１７３】
抗体鎖遺伝子および制御性配列に加えて、組み換え発現ベクターは宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列(例えば、複製起点)および選択可能マーカー遺伝子のような付加的配列を担持し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する(例えば、全てAxel et al.の米国特許４,３９９,２１６号、４,６３４,６６５号および５,１７９,０１７号)。例えば、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能マーカー遺伝子はジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(メトトレキサート選択／増幅でのｄｈｆｒ−宿主細胞に使用するため)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択のためめ)を含む。
【０１７４】
軽鎖および重鎖発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的技術により宿主細胞にトランスフェクトする。種々の形態の用語“トランスフェクション”は、外因性ＤＮＡの原核または真核生物宿主細胞への導入に一般に使用される広範な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。ここに記載する抗体を原核または真核生物宿主細胞で発現させることは理論的に可能であるが、真核生物細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での抗体の発現が、このような真核生物細胞および特に哺乳動物細胞が原核細胞よりも適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を凝集し、分泌する可能性が高いため、最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性抗体の高収率生産には無効であることが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。本発明の抗体はまた酵母ピキア・パストリスの糖鎖工学株でも生産できる。Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210。
【０１７５】
ここに記載する組み換え抗体の発現のための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ細胞)(Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216-4220に記載され、例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載のとおり、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用するｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞を含む)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用するために、他の好ましい発現系はＷＯ８７／０４４６２号、ＷＯ８９／０１０３６号およびＥＰ３３８,８４１号に開示のＧＳ遺伝子発現系である。組み換え発現ベクターコード化抗体遺伝子が哺乳動物宿主細胞に導入されたら、抗体を、宿主細胞における抗体の発現、または、より好ましくは、宿主細胞が増殖している培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間宿主細を培養することにより生産される。抗体を標準的タンパク質精製方法を使用して培養培地から回収できる。
【０１７６】
本発明の抗体ポリペプチド鎖のＮおよびＣ末端は、一般に見られる翻訳後修飾により予測配列と異なるかもしれない。例えば、Ｃ末端リシン残基はしばしば抗体重鎖から欠損している。Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132。Ｎ末端グルタミン残基および程度は少ないがグルタミン酸残基は、しばしば治療抗体の軽鎖および重鎖両方でピログルタミン酸残基に変換される。Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211。
【０１７７】
種々の本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体についてのアミノ酸配列は配列表に提供され、表８に要約される。上記理由から、Ｃ末端リシンは、重鎖または重鎖定常ドメインについて配列表におけるあらゆる配列に含まれない。しかしながら、別の実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体の各重鎖および／またはこのような抗体をコードする遺伝子的構築物またはその重鎖もしくは軽鎖は、重鎖のＣ末端にこの付加的リシン残基を含む。
【０１７８】
VII. アッセイ
ここに記載する抗体は、例えば、標準的ＥＬＩＳＡにより、ＣＤ４０への結合について試験し得る。簡潔にいうと、マイクロタイタープレートを精製ＣＤ４０で、１〜２μg／mlのＰＢＳ溶液で被覆し、５％ウシ血清アルブミンのＰＢＳで遮断する。抗体の希釈(例えば、ＣＤ４０免疫化マウスからの血漿の希釈)を、各ウェルに添加し、１〜２時間、３７℃でインキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)にコンジュゲートした二次試薬(例えば、ヒト抗体または他のヒト重鎖定常領域を有する抗体について、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬)と、１時間、３７℃でインキュベートする。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質(Moss Inc, product: ABTS-1000)で発色させ、分光光度計でＯＤ４１５〜４９５で分析する。次いで、免疫化マウスからの血清を、さらにヒトＣＤ４０を発現する細胞株に結合し、ＣＤ４０を発現しない対照細胞株に結合しないことをフローサイトメトリーでスクリーニングする。簡潔にいうと、抗ＣＤ４０抗体の結合を、ＣＤ４０発現ＣＨＯ細胞と、抗ＣＤ４０抗体を１：２０希釈でインキュベートすることにより評価する。細胞を洗浄し、結合をＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ  Ａｂで検出する。フローサイトメトリー分析を、FACScanフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して実施する。好ましくは、最高力価を生じるマウスを融合に使用する。類似実験を、マウス抗ｈｕＣＤ４０抗体を検出するならば、抗マウス検出抗体を使用して実施できる。
【０１７９】
上記ＥＬＩＳＡを使用して、ＣＤ４０免疫原と正の反応性を示す抗体、それ故に、抗体を生産するハイブリドーマをスクリーニングできる。ＣＤ４０と、好ましくは高親和性で、結合する抗体を生産するハイブリドーマを次いでサブクローン化し、さらに特徴付けできる。親細胞の反応性を保持する(ＥＬＩＳＡによる)各ハイブリドーマからの１クローンを、次いで細胞銀行作製および抗体精製のために選択し得る。
【０１８０】
抗ＣＤ４０抗体精製のために、選択ハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用２リットルスピナーフラスコで増殖できる。上清を濾過および濃縮し、プロテインＡ−セファロースを用いる親和性クロマトグラフィー(Pharmacia, Piscataway, NJ)に付す。溶出ＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで点検し、純度を確認し得る。緩衝液をＰＢＳに交換し、濃度を、１.４３透過係数を使用するＯＤ２８０により決定できる。モノクローナル抗体を等分し、−８０℃で保存できる。
【０１８１】
選択抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が独特なエピトープに結合するかを決定するために、各抗体を市販試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用してビオチニル化する。ビオチニル化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジン標識プローブで検出できる。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合試験を、上記ＣＤ４０被覆ＥＬＩＳＡプレートを使用して実施できる。
【０１８２】
精製抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用して実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを１μg／mlの抗ヒト免疫グロブリンで、一夜、４℃で被覆し得る。１％ＢＳＡで遮断後、プレートを１μg／ml以下の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、環境温度で１〜２時間反応させる。次いでウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼコンジュゲートプローブと反応させ得る。プレートを上記のとおり展開および分析する。
【０１８３】
モノクローナル抗体のＣＤ４０を発現する生存細胞への結合を試験するために、フローサイトメトリーを使用できる。簡潔にいうと、膜結合ＣＤ４０を発現する細胞株(標準的増殖条件下で増殖)を、種々の濃度のモノクローナル抗体と、０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中、４℃で１時間混合する。洗浄後、細胞をフィコエリトリン(ＰＥ)標識抗ＩｇＧ抗体と、一次抗体染色と同じ条件下で反応させる。サンプルを光および側方散乱性質を使用してFACScan装置により分析し、単一細胞についてゲーティングし、標識抗体の結合を決定することができる。蛍光顕微鏡を使用する別のアッセイを、フローサイトメトリーアッセイ(に加えてまたはその代わりに)使用し得る。細胞を直ぐ上に記載したとおり染色し、蛍光顕微鏡で試験できる。この方法は個々の細胞の可視化を可能とするが、抗原の密度により感度が低減することがあり得る。
【０１８４】
抗ｈｕＣＤ４０抗体を、さらにウェスタンブロッティングによりＣＤ４０抗原との反応性について試験できる。簡潔にいうと、ＣＤ４０を発現する細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付す。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清で遮断し、試験するモノクローナル抗体でプローブする。ＩｇＧ結合を抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)で展開できる。
【０１８５】
種々の抗ＣＤ４０抗体の結合親和性、交差反応性および結合動力学を分析する方法は、当分野で知られる標準的アッセイ、例えば、バイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)分析およびBIACORE(登録商標)2000 SPR装置(BIACORE AB, Uppsala, Sweden)を使用するBIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析を含む。
【０１８６】
ある実施態様において、抗体は、ヒトＣＤ４０の細胞外領域に特異的に結合する。抗体は、ＣＤ４０の細胞外ドメイン内の特定のドメイン(例えば、機能的ドメイン)に特異的に結合し得る。ある実施態様において、抗体は、ヒトＣＤ４０の細胞外領域およびカニクイザルＣＤ４０の細胞外領域に特異的に結合する。好ましくは、抗体はヒトＣＤ４０に高親和性で結合する。
【０１８７】
VIII. 二特異的分子
ここに記載する抗体を、二特異的分子形成のために使用し得る。抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド)に誘導体化または連結して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二特異的分子を生産できる。ここに記載する抗体は、実際、１を超える他の機能的分子に誘導体化または連結して、２を超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異的分子を生産でき、このような多特異的分子はまたここで使用する用語“二特異的分子”に包含されることを意図する。ここに記載する二特異的分子を作製するために、ここに記載する抗体を、二特異的分子が生じるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣体のような１以上の他の結合分子と機能的に連結(例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的結合またはその他)できる。
【０１８８】
従って、ＣＤ４０に対する少なくとも一つの第一結合特異性および第二標的エピトープに対する第二結合特異性を含む二特異的分子が提供される。二特異的分子が多特異的であるここに記載する実施態様において、分子はさらに第三結合特異性を含み得る。
【０１８９】
ある実施態様において、ここに記載する二特異的分子は、結合特異性として、少なくとも一抗体または、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖを含む、その抗体フラグメントを含む。抗体はまたLadner et al. の米国特許４,９４６,７７８(その内容を引用により明示的に本明細書に包含させる)に記載のような、軽鎖もしくは重鎖二量体またはＦｖもしくは一本鎖構築物のようなそのあらゆる最小フラグメントであり得る。
【０１９０】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、ここに記載する二特異的分子において用いることができる他の抗体はマウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０１９１】
ここに記載する二特異的分子を、当分野で知られる方法を使用して、成分結合特異性をコンジュゲートすることにより製造できる。例えば、二特異的分子の各結合特異性を別々に生産し、次いで互いにコンジュゲートし得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるならば、多様なカップリングまたは架橋剤を共有結合性コンジュゲーションのために使用できる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)を含む(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:8648参照)。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載のものを含む。好ましい接合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両方Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。
【０１９２】
結合特異性が抗体であるとき、それらは、２重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートできる。特に好ましい実施態様において、ヒンジ領域を、コンジュゲーション前に奇数の、好ましくは１個の、スルフヒドリル残基を含むように修飾する。
【０１９３】
あるいは、両結合特異性を同じベクターでコード化し、同じ宿主細胞で発現および集合させ得る。この方法は、二特異的分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき、特に有用である。ここに記載する二特異的分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子でも、２つの結合決定基を含む一本鎖二特異的分子でもよい。二特異的分子は少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二特異的分子を製造する方法は、例えば米国特許５,２６０,２０３号、米国特許５,４５５,０３０号、米国特許４,８８１,１７５号、米国特許５,１３２,４０５号、米国特許５,０９１,５１３号、米国特許５,４７６,７８６号、米国特許５,０１３,６５３号、米国特許５,２５８,４９８号および米国特許５,４８２,８５８号に記載されている。
【０１９４】
二特異的分子のその特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)またはウェスタンブロットアッセイのような当分野で認められている方法を使用して確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に特に興味深いタンパク質抗体複合体の存在を、該興味深いの複合体に特異的な標識試薬(例えば、抗体)を用いて検出する。
【０１９５】
IX. 組成物
さらに提供されるのは、薬学的に許容される担体と製剤された、ここに記載する１以上の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物、例えば、医薬組成物である。このような組成物は、ここに記載する１個または組み合わせでの(例えば、２以上の異なる)抗体または免疫複合体もしくは二特異的分子を含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原の異なるエピトープに結合するまたは相補的活性を有する抗体の組み合わせ(または免疫複合体または二特異的分子)を含み得る。
【０１９６】
ある実施態様において、組成物は、抗ＣＤ４０抗体を少なくとも１mg／ml、５mg／ml、１０mg／ml、５０mg／ml、１００mg／ml、１５０mg／ml、２００mg／mlまたは１〜３００mg／mlまたは１００〜３００mg／mlの濃度で含む。
【０１９７】
ここに記載する医薬組成物はまた組み合わせ治療で、すなわち、他の薬剤と組み合わせても投与できる。例えば、組み合わせ治療は、ここに記載する抗ＣＤ４０抗体と少なくとも一つの他の抗癌および／またはＴ細胞刺激(例えば、活性化)剤の組み合わせを含む。組み合わせ治療において使用できる治療剤の例は、ここに記載する抗体の使用についての下のセクションに詳述される。
【０１９８】
ある実施態様において、ここに開示する治療組成物は、癌の処置に使用する他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤は、例えば、化学療法薬物、小分子薬物またはある癌に対する免疫応答を刺激する抗体を含み得る。ある状況において、治療組成物は、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０(ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる)抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、ＴＬＲアゴニストまたはＩＤＯもしくはＴＧＦβの小分子アンタゴニストの１以上を含み得る。
【０１９９】
ここで使用する、“薬学的に許容される担体”は、生理学的に適合性である任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与(例えば、注射たは点滴)に適する。投与経路によって、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二特異的分子を、化合物を酸および化合物を不活性化し得る他の天然条件から保護する物質でコートし得る。
【０２００】
ここに記載する医薬化合物は１以上の薬学的に許容される塩を含み得る。“薬学的に許容される塩”は、親化合物の所望の生物学的活性を維持し、望まない毒性効果を全く与えない塩である(例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照)。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などのような非毒性無機酸ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカノン酸、ヒドロキシアルカノン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような非毒性有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属ならびにＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような非毒性有機アミン由来のものを含む。
【０２０１】
ここに記載する医薬組成物はまた薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、(１)アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水可溶性抗酸化剤、(２)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどのような油可溶性抗酸化剤および(３)クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート剤を含む。
【０２０２】
ここに記載する医薬組成物で用いることが可能な適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適当な混合物、オリーブ油のような植物油およびオレイン酸エチルのような注射可能有機エステルを含む。適当な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持できる。
【０２０３】
これらの組成物はまた防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含み得る。微生物の存在の防止を、上記滅菌手順および種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含により確実にし得る。組成物に糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を包含させることも望ましいことがある。さらに、注射可能医薬形態の長期吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤の包含により達成し得る。
【０２０４】
薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散体および無菌注射可能溶液または分散体の即時の調製用の無菌粉末を含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で知られる。何らかの慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性でない限り、ここに記載する医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的活性化合物も組成物に包含させ得る。
【０２０５】
治療組成物は、一般に無菌であり、製造および保存条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適する他の規則的構造として製剤され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適当な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持できる。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能医薬形態の長期吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤の包含により達成し得る。
【０２０６】
無菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒に、必要に応じて上記の１成分または成分の組み合わせと共に取り込み、続いて滅菌微量濾過することにより製造できる。一般に、分散体を、活性化合物を塩基性分散媒体および必要な上記からの他の成分を含む無菌媒体に取り込むことにより製造する。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、予め無菌濾過した溶液からの活性成分と任意の付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。
【０２０７】
単一投与量形態を生産するための担体材料と組み合わせ得る活性成分の量は、処置する対象および投与の具体的方式により代わる。単一投与量形態を生産するための担体材料と組み合わせ得る活性成分の量は、一般に治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００％中、この量は薬学的に許容される担体と組み合わせた、活性成分が約０.０１〜約９９パーセント、好ましくは活性成分が約０.１〜約７０パーセント、最も好ましくは約１〜約３０％の範囲である。
【０２０８】
投与レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するために調節される。例えば、単一ボーラスを投与でき、数分割用量を時間をかけて投与できまたは治療状況の要求により示されるとおり用量を比例的に減少させても増加させてもよい。投与の容易さおよび投与量均一性のため、投与量単位形態の非経腸組成物に製剤するのが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、処置対象の単位の投与量として適する物理的に分離された単位であり、各単位は、必要な医薬担体と共に、所望の治療効果を生じるよう計算した予め決定した量の活性化合物を含む。ここに記載する投与量単位形態の明細は(ａ)活性化合物の独特な特徴および達成すべき特定の治療効果および(ｂ)個体における感受性の処置のためのこのような活性化合物の配合の当分野固有の限界により指示され、これらに直接依存する。
【０２０９】
抗体の投与について、投与量は約０.０００１〜１００mg／kg、より一般には０.０１〜５mg／kg宿主体重の範囲である。例えば投与量は、０.３mg／kg体重、１mg／kg体重、３mg／kg体重、５mg／kg体重または１０mg／kg体重または１〜１０mg／kgの範囲内であり得る。例示的処置レジメは、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月に１回、３ヶ月に１回または６ヶ月に１回の投与を伴う。
【０２１０】
ある方法において、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、各抗体の投与する投与量は、記載した範囲内に入る。治療抗体は、通常複数回投与する。一投与量の間の間隔は、例えば、週、月、３ヶ月毎または年であり得る。間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血中濃度の測定により示されるとおり、不規則であり得る。ある方法において、投与量を、約１〜１０００μg／ml、ある方法において約２５〜３００μg／mlの血漿抗体濃度を達成するよう調節する。
【０２１１】
抗体を遅延放出製剤として投与でき、この場合必要な投与の頻度が少ない。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期により変わる。一般に、ヒト抗体は最長半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、処置が予防的かまたは治療的かによってかわり得る。予防適用において、比較的低投与量が、比較的低頻度で、長期間にわたり投与される。ある患者は処置を一生投与され続ける。治療適用において、比較的短い間隔での比較的高投与量が、疾患進行が低減するかまたは停止するまで、好ましくは患者が疾患症状の部分的なまたは完全な改善を示すまで、必要な場合がある。その後、患者は、所望により予防レジメを投与され得るが、多くの免疫腫瘍学適応症において、継続処置は必要ではない。
【０２１２】
ここに記載する医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特定の患者、組成物および投与方式について所望の治療応答を達成するのに効果的な活性成分の量を得るために変わり得る。選択投与量レベルは、用いるここに記載する特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミド、投与経路の活性、投与の時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および先の病歴および医学分野で周知の類似因子を含む、多様な薬物動態因子による。
【０２１３】
ここに記載する抗ＣＤ４０抗体の“治療有効投与量”は、好ましくは疾患症状の重症度の軽減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または疾患が原因の機能障害または身体障害の予防をもたらす。癌の場合、治療有効用量は、好ましくは癌と関係する身体症状のさらなる悪化を阻止する。癌の症状は当分野で周知であり、例えば、異常な黒子特性、非相称、境界、色および／または直径を含む黒子の見かけの変化、新たに着色された皮膚領域、異常黒子、爪の下の黒ずんだ領域、乳房腫瘤、乳頭変化、乳房嚢胞、乳房痛、死亡、体重減少、脱力、過度の疲労、食事困難、食欲不振、慢性咳、息切れ悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満感、腹部膨満、腹水、膣出血、便秘、鼓腸、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、多量の発汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋肉攣縮、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などを含む。治療効力は、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０  ｍＡｂの最初の投与直後に観察されるかもしれず、一定時間および／または一連の後にしか観察されないかもしれない。このような効力遅延は、６ヶ月、９ヶ月または１２ヶ月までの数ヶ月の処置後にのみ観察され得る。ある免疫腫瘍学剤で示される効力遅延に鑑み、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０  ｍＡｂが治療的効力を欠くと早まって決定しないことが重要である。
【０２１４】
治療有効用量は、癌の発症を、該疾患の早期または予備的徴候が存在するときに望まれ得るように、予防または遅延し得る。癌の診断に利用する臨床検査は、化学(可溶性ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌレベル測定を含む)(Hock et al. (2006) Cancer 106:2148; Chung & Lim (2014) J. Trans. Med. 12:102)、血液学、血清学および放射線学を含む。従って、前記の何れかをモニターするあらゆる臨床的または生化学的アッセイを使用して、特定の処置が、癌処置の治療有効用量であるか否かを決定できる。当業者は、対象の体格、対象の症状の重症度および特定の組成物または投与経路選択のような因子に基づき、このような量を決定できる。
【０２１５】
ここに記載する組成物を、当分野で知られる１以上の多様な方法を使用して、１以上の投与経路により投与できる。当業者には認識されるとおり、投与経路および／または方式は所望の結果により変わる。ここに記載する抗体の好ましい投与経路は、例えば、注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語“非経腸投与”は、経腸および局所投与以外の、通常注射による投与方式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含むが、これらに限定されない。
【０２１６】
あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所のような、非経腸ではない経路により投与できる。
【０２１７】
活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤のような、急速な放出に対して化合物を保護する担体と製剤できる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤の製造のための多くの方法が特許されているかまたは一般に当業者に知られる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
【０２１８】
治療組成物を、当分野で知られるメディカルデバイスを用いて投与できる。例えば、好ましい実施態様において、ここに記載する治療組成物を、米国特許５,３９９,１６３号、５,３８３,８５１号、５,３１２,３３５号、５,０６４,４１３号、４,９４１,８８０号、４,７９０,８２４号または４,５９６,５５６号に開示のデバイスのような無針皮下注射器により投与できる。ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体と使用するための周知のインプラントおよびモジュールは、米国特許４,４８７,６０３号(これは、制御された速度で薬を分配する埋め込み可能マイクロインフュージョンポンプを開示する)、米国特許４,４８６,１９４号(これは、皮膚を介する医薬の投与用治療デバイスを開示する)、米国特許４,４４７,２３３号(これは、厳密な点滴速度での薬物の送達のための薬物インフュージョンポンプを開示する)、米国特許４,４４７,２２４号(これは、連続的薬物送達用の可変流速埋め込み可能点滴装置を開示する)、米国特許４,４３９,１９６号(これは、多チャンバーコンパートメントを有する浸透圧性薬物送達系を開示する)および米国特許４,４７５,１９６号(これは浸透圧性薬物送達系を開示する)を含む。これらの特許は、引用により本明細書に包含させる。多くの他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールは当業者に知られる。
【０２１９】
ある実施態様において、ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を、インビボでの適当な分布を確実にするために製剤できる。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。ここに記載する治療化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために(望むならば)、例えば、リポソームに製剤できる。リポソームの製造法について、例えば、米国特許４,５２２,８１１号、５,３７４,５４８号および５,３９９,３３１号参照のこと。リポソームは、特異的細胞または臓器に選択的に輸送され、それ故に標的化薬物送達を増強する、１以上の部分を含み得る(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。ターゲティング部分の例は、葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許５,４１６,０１６号参照)、マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)、抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)、界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)、ｐ１２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)を含み、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273もまた参照のこと。
【０２２０】
Ｘ. 使用および方法
ここに記載する抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＣＤ４０シグナル伝達の刺激による免疫応答の増強に関する、多数のインビトロおよびインビボ有用性を有する。好ましい実施態様において、ここに記載する抗体はヒトまたはヒト化抗体である。例えば、ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を培養中の細胞に、インビトロまたはエクスビボでまたはヒト対象に、例えば、インビボで投与して、多様な疾患における免疫を増強し得る。従って、対象における免疫応答が増強、刺激または上方制御されるように、対象にここに記載する抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における免疫応答を修飾する方法がここに提供される。
【０２２１】
好ましい対象は、免疫応答の増強が望まれるヒト患者である。方法は、免疫応答(例えば、Ｔ細胞介在免疫応答)増強により処置し得る障害を有するヒト患者の処置に特に適する。特定の実施態様において、方法は、インビボでの癌の処置に特に適する。免疫の抗原特異的増強を達成するために、ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を、目的の抗原と共に投与できまたは該抗原は処置する対象に既に存在しているかもしれない(例えば、腫瘍担持またはウイルス担持対象)。ＣＤ４０に対する抗体が他の薬剤と共に投与されるとき、これら２剤は別々に投与しても一緒に投与してもよい。
【０２２２】
サンプルおよび対照サンプルと、ヒトＣＤ４０に特異的に結合するａヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、抗体またはそのフラグメントとヒトＣＤ４０の複合体の形成を可能にする条件下、接触させることを含む、サンプルにおけるヒトＣＤ４０抗原の存在を検出するまたはヒトＣＤ４０抗原の量を測定する方法も包含される。次いで、複合体の形成を検出し、ここで、対照サンプルと比較したサンプルの複合体形成差異がサンプルにおけるヒトＣＤ４０抗原の存在の指標である。さらに、ここに記載する抗ＣＤ４０抗体を使用して、免疫親和性精製によりヒトＣＤ４０を精製できる。
【０２２３】
ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体がＴ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答の共刺激を増強する能力を応慮して、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激、増強または上方制御するためにここに記載する抗体を使用するインビトロおよびインビボ方法がここに提供される。
【０２２４】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は抗ＣＤ４０抗体を使用して増強され得る。Ｔ細胞はＴeff細胞、例えば、ＣＤ４＋  Ｔeff細胞、ＣＤ８＋  Ｔeff細胞、Ｔヘルパー(Ｔｈ)細胞およびＴ細胞毒性(Ｔｃ)細胞であり得る。
【０２２５】
さらに夫雄癌されるのは、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)が増強されるように対象にここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)を増強する方法である。好ましい実施態様において、対象は腫瘍担持対象であり、腫瘍に対する免疫応答が増強される。腫瘍は固形腫瘍または液性腫瘍、例えば、造血器腫瘍であり得る。ある実施態様において、腫瘍は免疫原性腫瘍である。ある実施態様において、腫瘍は非免疫原性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ−Ｌ１陽性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ−Ｌ１陰性である。対象はウイルス担持対象であり、ウイルスに対する免疫応答が増強される可能性もある。
【０２２６】
さらに、対象において腫瘍の増殖が阻止されるように、対象にここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻止する方法が提供される。また提供されるのは、対象において慢性ウイルス感染が処置されるように、対象にここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象における慢性ウイルス感染を処置する方法である。
【０２２７】
ある実施態様において、抗ｈｕＣＤ４０抗体を、対象に補助治療として投与する。抗ｈｕＣＤ４０抗体での癌を有する対象の処置は、現在の標準治療に比して長期持続性応答、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれ以上の長期生存、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年または１０年またはそれ以上の無再発生存を導き得る。ある実施態様において、抗ｈｕＣＤ４０抗体での癌を有する対象の処置は、癌の再発を予防するかまたは癌の再発を、例えば、１年、２年、３年、４年、５年または１０年またはそれ以上遅延させる。抗ＣＤ４０処置を、第一または第二選択処置として使用できる。
【０２２８】
ここに記載するこれらおよびその他の方法を、下にさらに詳述する。
【０２２９】
癌
対象が処置されるように、例えば、癌性腫瘍の増殖が阻止または低減されるおよび／または腫瘍が退行するように、対象にここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法が提供される。抗ｈｕＣＤ４０抗体を癌性腫瘍の増殖阻止にも使用できる。あるいは、抗ｈｕＣＤ４０抗体を他の薬剤、例えば、下記のとおり、他の免疫原製剤、標準的癌処置または他の抗体と組み合わせて使用できる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体のようなＰＤ−１の阻害剤との組み合わせも提供される。例えば、Ellmark et al. (2015) OncoImmunology 4:7 e1011484参照。
【０２３０】
従って、ここに提供されるのは、対象に治療有効量のここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体、例えば、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７または１９Ｇ３のヒト化形態またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における、例えば、腫瘍細胞の増殖の阻止により、癌を処置する方法である。抗体は、ここに具体的に記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体の少なくとも一つと競合して結合するまたは同じエピトープに結合するヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体(例えばここに記載するヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体の何れか)、ヒトキメラ抗ｈｕＣＤ４０抗体またはヒト化非ヒト抗ｈｕＣＤ４０抗体、例えば、ヒト、キメラまたはヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体であり得る。
【０２３１】
本発明の抗体を使用して増殖が阻止され得る癌は、一般に免疫療法に応答性の癌を含む。処置のための癌の非限定的例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、扁平上皮非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、消化器癌、腎臓癌(例えば明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎臓細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、神経膠芽腫(多形神経膠芽腫)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌および頭頸部癌(または癌腫)、胃癌、生殖細胞腫瘍、小児科肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、皮膚または眼内悪性黒色腫のような転移悪性黒色腫)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門部癌、精巣癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系新生物(ＣＮＳ)、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌、ウイルス関連癌(例えば、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)関連腫瘍)および二大血球系統、すなわち、骨髄細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞生産)またはリンパ系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞生産)、何れか由来の血液系腫瘍、例えば全タイプの白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病、例えば急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ(Ｍ０)、骨髄芽球性白血病(Ｍ１)、骨髄芽球性白血病(Ｍ２、細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３バリアント[Ｍ３Ｖ])、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４バリアント[Ｍ４Ｅ])、単球性白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球性白血病(Ｍ７)、孤立性顆粒球性肉腫および緑色腫、リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ  １＋)大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性、およびリンパ腫／白血病(Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性浸出リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ系造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性組織球性リンパ腫(ＤＨＬ)、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも称される)およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)、骨髄腫、��えばＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(低悪性度骨髄腫とも称される)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞リンパ腫、骨髄系造血性腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍、精上皮腫、奇形癌腫、星状細胞腫、シュワン腫を含む中枢および末梢神経の腫瘍、線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍および黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫、リンパ系造血性腫瘍、例えばＴ細胞障害、例えば小細胞および大脳様細胞型を含むＴ前リンパ球性白血病(Ｔ−ＰＬＬ)を含むが、これに限定されないＴ細胞およびＢ細胞腫瘍を含む他の腫瘍、大顆粒状リンパ球白血病(ＬＧＬ)、好ましくはＴ細胞型のもの、ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫、末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽球性サブタイプ)、血管中心性(経鼻)Ｔ細胞リンパ腫、頭頸部癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、急性骨髄リンパ腫ならびに該癌のあらゆる組み合わせを含む。ここに記載する方法を、転移癌、難治性癌(例えば、先の、例えば、遮断ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１抗体での免疫療法に難治性の癌)および再発性癌の処置に使用し得る。
【０２３２】
上記にもかかわらず、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０アゴニストでの処置により増悪の恐れがある、ＣＤ４０発現を伴う血液癌の処置に利用されない。ある癌は、ＣＤ４０を発現することが知られており、このような増悪の対象となる可能性があるためカテゴリーとして除外される。他の実施態様において、特定の腫瘍サンプルをＣＤ４０発現について試験し、試験結果に基づき、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体での治療から除外する。
【０２３３】
抗ｈｕＣＤ４０抗体を単剤療法としてもしくは唯一の免疫賦活性治療として投与しても、癌ワクチン戦略において、癌性細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫賦活性サイトカイン類をコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞のような、免疫原性製剤と組み合わせてもよい(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００のペプチドのような黒色腫抗原のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞を含む。腫瘍に対するワクチン接種の多くの実験的戦略が考案されている(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; see also Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition参照)。これらの戦略の一つにおいて、ワクチンを自己または同種腫瘍細胞を使用して製造する。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されているとき、最も効果的であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種による抗原提示の強力なアクティベーターであることが示されている。Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 3539-43。
【０２３４】
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義を導いている。Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および該腫瘍が生じた細胞において発現する分化抗原、例えばメラニン形成細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示され得る。ＣＤ４０アゴニストを、腫瘍で発現される組み換えタンパク質および／またはペプチドのコレクションと組み合わせて、これらのタンパク質に対する免疫応答を生じるために使用できる。これらのタンパク質は通常免疫系で自己抗原として見られ、それ故にそれらに対して寛容である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成を必要とし、８５％を超えるヒト癌で発現され、限られた数の体性組織でしか発現されない、タンパク質テロメラーゼを含み得る(Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013)。腫瘍抗原はまたタンパク質配列を改変するか２つの無関係な配列間の融合タンパク質(すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ)を作製する体性変異のため、癌細胞で発現される“ネオ抗原”またはＢ細胞からの腫瘍イディオタイプでもあり得る。
【０２３５】
他の腫瘍ワクチンは、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)のようなヒト癌に関与するウイルスからのタンパク質を含む。ＣＤ４０阻害と組み合わせて使用できる他の形態の腫瘍特異的抗原は、腫瘍組織自体から単離した精製ヒートショックタンパク質(ＨＳＰ)である。これらのヒートショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質のフラグメントを含み、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫誘発のために抗原提示細胞への送達が高度に効率的である(Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120)。
【０２３６】
樹状細胞(ＤＣ)は、抗原特異的応答の生成に使用できる、強力な抗原提示細胞である。樹状細胞はエクスビボで生産し、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物に負荷できる(Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332)。樹状細胞はまたこれらの腫瘍抗原を同様に発現させるために遺伝子的手段で形質導入もされ得る。樹状細胞はまた免疫化目的で腫瘍細胞に直接融合されている(Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン接種の方法として、樹状細胞免疫化は、より強力な抗腫瘍応答を活性化(放出)するために、ＣＤ４０アゴニズムと効果的に組み合わされ得る。
【０２３７】
ＣＤ４０のアゴニズムをまた標準的癌処置(例えば、手術、放射線および化学療法)とも組み合わせ得る。ＣＤ４０のアゴニズムは、化学療法レジメと効果的に組み合わせ得る。これらの例において、投与する化学療法剤の用量を低減することが可能であり得る(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組み合わせの例は、黒色腫処置のための、ダカルバジンと組み合わせた抗ｈｕＣＤ４０抗体である。このような組み合わせの他の例は、黒色腫処置のための、インターロイキン−２(ＩＬ−２)と組み合わせた抗ｈｕＣＤ４０抗体である。ＣＤ４０アゴニストと化学療法の組み合わせ使用の科学的根拠は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルを増加させることである。細胞死によりＣＤ４０アゴニズムと相乗作用をもたらし得る他の組み合わせ治療は、放射線、手術およびホルモン除去である。これらのプロトコールの各々は、宿主における腫瘍抗原の源を作る。血管形成阻害剤もまたＣＤ４０アゴニストと組み合わせ得る。血管形成の阻害は、宿主抗原提示経路に腫瘍抗原を供給し得る腫瘍細胞死をもたらす。
【０２３８】
ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を、ＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に向かわせる二特異的抗体と組み合わせでも使用できる(例えば、米国特許５,９２２,８４５号および５,８３７,２４３号)。二特異的抗体は、２つの個別の抗原を標的とするのに使用できる。例えば抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ)二特異的抗体は、マクロファージを腫瘍部位に標的化するために使用されてきた。この標的化は、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームはＣＤ４０のアゴニズムにより増強される。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二特異的抗体の使用により樹状細胞に直接送達させ得る。
【０２３９】
腫瘍は、宿主免疫監視を多種多様な機構により回避する。これらの機構の多くは、腫瘍による免疫抑制性タンパク質発現の不活性化により克服され得る。これらは、数ある中で、ＴＧＦ−β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらのものの各々への抗体を、抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせで使用して、免疫抑制性因子の効果を相殺し、宿主による腫瘍免疫応答を支持することができる。
【０２４０】
抗ＣＤ４０抗体は、効果的にＴ細胞ヘルパー活性の代替となり得る。Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478。ＣＴＬＡ−４(例えば、米国特許５,８１１,０９７号)、ＯＸ−４０(Weinberg et al. (2000) Immunol. 164: 2160-2169)、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ(Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997))およびＩＣＯＳ(Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)のようなＴ細胞共刺激性分子に対する活性化抗体もＴ細胞活性化のレベルを増加させるために使用し得る。ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤も抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせて使用し得る。
【０２４１】
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するための、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化および拡張ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を含む、いくつかの実験的処置プロトコールもある(Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51)。これらの方法も、ＣＭＶのような感染因子に対するＴ細胞応答の活性化に使用できる。抗ＣＤ４０抗体存在下のエクスビボ活性化は、養子移入されるＴ細胞の頻度および活性を高め得る。
【０２４２】
慢性ウイルス感染症
他の態様において、ここに記載する本発明は、対象が感染性疾患に関して処置されるように、対象に抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における感染性疾患を処置する方法を提供する。
【０２４３】
上に記載した腫瘍への適用に準じて、抗体介在ＣＤ４０アゴニズムを、単独でまたはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を増強し得る。この治療法が特に有用であり得る病原体の例は、現在効果的なワクチンがない病原体または現在のワクチンの効果が完全とはいえない病原体を含む。これらは、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢおよびＣ)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を含むが、これらに限定されない。ＣＤ４０アゴニズムは、感染の間に改変された抗原を提示するＨＩＶのような因子による確立された感染症に対して特に有用である。これら新規エピトープは、抗ヒトＣＤ４０抗体投与時に外来として認識され、それ故に強いＴ細胞応答を引き起こす。
【０２４４】
ここに記載する方法により処置可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例は、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−IIおよびＣＭＶ、エプスタイン・バールウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、乳頭腫ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス性脳炎ウイルスを含む。
【０２４５】
ここに記載する方法により処置可能な感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの例は、クラミジア、リケッチア性細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、テタヌス、ボツリヌス症、炭疽、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌を含む。
【０２４６】
ここに記載する方法により処置可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例は、カンジダ(アルビカンス、クルセイ、グラブラータ、トロピカリスなど)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス(フミガーツス、ニガーなど)、ケカビ目(ケカビ属、ユミケカビ属、クモノスカビ)、スポロスリックス・シェンキー、ブラストマイセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラスマ・カプスラーツムを含む。
【０２４７】
ここに記載する方法により処置可能な感染症を引き起こす病原性寄生虫のいくつかの例は、エントアメーバ・ヒストリティカ、バランチジウム・コリ、ネグレリア・フォーレリ、アカントアメーバ種、ジアルジア・ランビア、クリプトスポリジウム種、ニューモシスティス・カリニ、プラスモジウム・ ビバックス、バベシア・ミクロチ、トリパノソーマ・ブルーセイ、トリパノソーマ・クルージ、リーシュマニア・ドノバニ、トキソプラズマ・ゴンディ、ニッポストロンジラス・ブラジリエンシスを含む。
【０２４８】
上記方法の全てにおいて、ＣＤ４０アゴニズムを、腫瘍抗原の提示の増強を提供する、サイトカイン処置(例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２)または二特異的抗体治療のような他の形態の免疫療法と組み合わせ得る。Ｓｅｅ、例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123参照。
【０２４９】
ワクチンアジュバント
ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を使用して、抗ｈｕＣＤ４０抗体と目的の抗原、例えば、ワクチンの共投与により、抗原特異的免疫応答を増強できる。従って、対象に(ｉ)抗原および(ii)抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、対象における該抗原に対する免疫応答が増強されるように投与することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法がここに提供される。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体からの抗原であり得る。このような抗原の非限定的例は、上記の腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記のウイルス、細菌または他の病原体からの抗原のような上記のものを含む。
【０２５０】
インビボおよびインビトロでのここに記載する抗体組成物(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多特異的および二特異的分子および免疫複合体)の適当な投与経路は当分野で周知であり、当業者により選択され得る。例えば、抗体組成物を注射(例えば、静脈内または皮下)により投与できる。使用する分子の適当な投与量は、対象の年齢および体重および濃度および／または抗体組成物の製剤による。
【０２５１】
先に記載のとおり、ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を、１以上の他の治療剤、例えば、細胞毒性剤、放射性毒性薬剤または免疫抑制性剤と共投与できる。抗体を該薬剤と連結しても(免疫複合体として)、該薬剤と別個に投与してもよい。後者(別個の投与)の場合、抗体を該薬剤の前、後または同時に投与できまたは他の既知治療、例えば、抗癌治療、例えば、放射線と共投与できる。このような治療剤は、数あるなかで、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素のような抗新生物を含み、これは、それ自体、患者に毒性または準毒性であるレベルでしか効果的ではない。シスプラチンは、１００mg／ml用量を４週に１回静脈内投与され、アドリアマイシンは６０〜７５mg／ml用量を２１日毎に１回静脈内投与される。ここに記載する抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと化学療法剤の共投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果を生じる、異なる機構で作用する２抗癌剤を提供する。このような共投与は、細胞の抗体への未反応性を付与する薬物に対する耐性の獲得または腫瘍細胞の抗原性変化による問題を解決し得る。
【０２５２】
またここに記載する範囲内にあるのは、ここに記載する抗体組成物(例えば、ヒト抗体、二特異的または多特異的分子または免疫複合体)および使用指示を含む、キットである。キットは、さらに少なくとも一つの付加的試薬または１以上のここに記載する付加的ヒト抗体(例えば、ＣＤ４０抗原における第一ヒト抗体と異なるエピトープと結合する相補的活性を有するヒト抗体)を含み得る。キットは、一般にキット内容物の意図する使用を指示するラベルを含む。用語ラベルは、キット上にまたはキットと共にもしくは他の方法でキットに付随して供給される、何らかの書面または記録媒体を含む。
【０２５３】
組み合わせ治療
上に提供する組み合わせ治療に加えて、ここに記載する抗ＣＤ４０抗体をまた下記のとおり、例えば、癌の処置のために組み合わせ治療で使用できる。
【０２５４】
本発明は、抗ｈｕＣＤ４０抗体を、免疫応答増強に効果的である１以上の付加的薬剤、例えば、抗体と共投与し、それによりさらに対象における免疫応答を増強、刺激または上方制御する、組み合わせ治療の方法を提供する。
【０２５５】
一般に、ここに記載する抗ｈｕＣＤ４０抗体を、(ｉ)他の共刺激性受容体のアゴニストおよび／または(ii)Ｔ細胞上の阻害性シグナルのアンタゴニストと組み合わせることができ、この何れも抗原特異的Ｔ細胞応答増強をもたらす(免疫チェックポイントレギュレーター)。共刺激性および共阻害性分子の大部分は、免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーであり、ここに記載する抗ＣＤ４０抗体を、免疫応答増加のためにＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とする薬剤と投与し得る。共刺激性または共阻害性受容体に結合する膜結合リガンドの一つの重要なファミリーはＢ７ファミリーであり、これはＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１(ＰＤ−Ｌ１)、Ｂ７−ＤＣ(ＰＤ−Ｌ２)、Ｂ７−Ｈ２(ＩＣＯＳ−Ｌ)、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７−Ｈ６を含む。共刺激性または共阻害性受容体に結合する膜結合リガンドの他のファミリーは、同族ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに結合する分子のＴＮＦファミリーであり、これは、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα  １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲを含む(例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1参照)。
【０２５６】
他の態様において、抗ｈｕＣＤ４０抗体を、例えば、癌のような増殖性疾患の処置のために、免疫応答を刺激するために、Ｔ細胞活性化(例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ)を阻害するサイトカイン類または他の“免疫抑制性サイトカイン類”のアンタゴニストまたはＴ細胞活性化を刺激するサイトカイン類と組み合わせて使用できる。
【０２５７】
ある態様において、Ｔ細胞応答を、本発明の抗ｈｕＣＤ４０  ｍＡｂおよび１以上の(ｉ)ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４のようなＴ細胞活性化を阻害するタンパク質(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)のアンタゴニストおよび(ii)Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８ＨのようなＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニストの組み合わせにより刺激できる。
【０２５８】
上記タンパク質の一つを調節し、癌の処置のために、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体、例えば、上記のものと組み合わせ得る薬剤の例は、ヤーボイ(登録商標)／イピリムマブまたはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ−９３６５５８(ＰＤ−１に対する)、ピディリズマブ／ＣＴ−０１１(ＰＤ−１に対する)、キイトルーダ(登録商標に対する)／ペムブロリズマブ／ＭＫ−３４７５(ＰＤ−１に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７−ＤＣ／ＰＤ−Ｌ２に対する)、ＢＭＳ−９３６５５９(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ−５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する  −  ＷＯ１１／１０９４００号)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ−３に対する)、ウレルマブ／ＢＭＳ−６６３５１３およびＰＦ−０５０８２５６６(ＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する)、バルリルマブ／ＣＤＸ−１１２７(ＣＤ２７に対する)、ＭＥＤＩ−６３８３およびＭＥＤＩ−６４６９(ＯＸ４０に対する)、ＲＧ−７８８８(ＯＸ４０Ｌに対する  −  ＷＯ０６／０２９８７９号)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ムロモナブ−ＣＤ３(ＣＤ３に対する)、イピルムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)を含む。
【０２５９】
癌の処置のためにアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせ得る他の分子は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストを含む。例えば、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体をＫＩＲのアンタゴニスト(例えば、リリルマブ)と組み合わせ得る。
【０２６０】
組み合わせ治療のためのさらに他の薬剤は、ＲＧ７１５５(ＷＯ１１／７００２４号、ＷＯ１１／１０７５５３号、ＷＯ１１／１３１４０７号、ＷＯ１３／８７６９９号、ＷＯ１３／１１９７１６号、ＷＯ１３／１３２０４４号)またはＦＰＡ−００８(ＷＯ１１／１４０２４９号、ＷＯ１３／１６９２６４号、ＷＯ１４／０３６３５７号)のようなＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体を含むＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストを含むが、これに限定されない、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇させる薬剤である。
【０２６１】
一般に、ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、陽性共刺激性受容体をライゲートするアゴニスト剤、阻害性受容体を経るシグナル伝達を減弱させる遮断剤および抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に増加させる１以上の薬剤、腫瘍微小環境内の異なる免疫抑制経路を克服する薬剤(例えば、阻害性受容体結合遮断(例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用)、Ｔreg枯渇または阻害(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体(例えば、ダクリズマブ)使用またはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇による)、ＩＤＯのような代謝酵素阻害またはＴ細胞アネルギーまたは消耗回復／予防)および腫瘍部位で自然免疫活性化および／または炎症を誘発する薬剤の１以上と共に使用できる。
【０２６２】
対象において、例えば腫瘍増殖を阻害するまたは抗ウイルス応答を刺激するために、免疫応答が刺激されるようにＣＤ４０アゴニスト、例えば、抗体およびＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体および／またはＬＡＧ３アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体のような１以上の付加的免疫刺激性抗体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法がここに提供される。ある実施態様において、対象に、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体を投与する。ある実施態様において、対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する。ある実施態様において、対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与する。ある実施態様において、少なくとも一つの付加的免疫刺激性抗体(例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ−１、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４および／またはアンタゴニスト抗ＬＡＧ３抗体)はヒト抗体である。あるいは、少なくとも一つの付加的免疫刺激性抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体(例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＬＡＧ３抗体から調製)である。
【０２６３】
ここに提供されるのは、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニストＰＤ−１抗体を対象に投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を治療量以下の用量で投与する、抗ＰＤ−１抗体を治療量以下の用量で投与するまたは両方を治療量以下の用量で投与する。
対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−１抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置と関係する有害事象を改変する方法もここに提供される。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ここに開示する抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体のようなヒト化モノクローナル抗体である。
【０２６４】
ここに記載する方法における使用に適する適当なＰＤ−１アンタゴニストは、リガンド、抗体(例えば、モノクローナル抗体および二特異的抗体)および多価剤を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ−２４４のようなＦｃ融合タンパク質である。ある実施態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０２６５】
抗ＰＤ−１抗体の例は、オプジーボ(登録商標)／ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８)またはＷＯ２００６／１２１１６８号に記載の抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１の一つのＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ＭＫ−３４７５(ＷＯ２０１２／１４５４９３号に記載のキイトルーダ(登録商標)／ペムブロリズマブ／以前はランブロリズマブ)、ＷＯ２０１２／１４５４９３号に記載のＡＭＰ−５１４／ＭＥＤＩ−０６８０、およびＣＴ−０１１(ピディリズマブ、以前はＣＴ−ＡｃＴｉｂｏｄｙまたはＢＡＴ、例えば、Rosenblatt et al. (2011) J. Immunotherapy 34:409を参照)である。さらに知られるＰＤ−１抗体および他のＰＤ−１阻害剤は、ＷＯ２００９／０１４７０８号、ＷＯ０３／０９９１９６号、ＷＯ２００９／１１４３３５号、ＷＯ２０１１／０６６３８９号、ＷＯ２０１１／１６１６９９号、ＷＯ２０１２／１４５４９３号、米国特許７,６３５,７５７号および８,２１７,１４９号および米国特許公開２００９／０３１７３６８号に記載のものを含む。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示の抗ＰＤ−１抗体の何れかも使用できる。これらの抗体の一つと競合して結合するおよび／またはＰＤ−１上の同じエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体も組み合わせ処置に使用し得る。
【０２６６】
ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＰＤ−１に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＰＤ−１に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合しまたはヒトＰＤ−１に１×１０-８Ｍ〜１×１０-１０Ｍまたはそれ未満のＫＤで結合する。
【０２６７】
対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニストＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法がここに提供される。ある実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を治療量以下の用量で投与する、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を治療量以下の用量で投与するまたは両方を治療量以下の用量で投与する。対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置と関係する有害事象を改変する方法がここに提供される。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ここに開示する抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体のようなヒト化モノクローナル抗体である。
【０２６８】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９(ＷＯ２００７／００５８７４号および米国特許７,９４３,７４３号で１２Ａ４と称される)、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ(ＷＯ２０１３／７９１７４号)またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４号および米国特許７,９４３,７４３号に記載の３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はMEDI4736(抗Ｂ７−Ｈ１としても知られる)またはＭＰＤＬ３２８０Ａ(ＲＧ７４４６としても知られる)である。ＷＯ２０１３／１７３２２３号、ＷＯ２０１１／０６６３８９号、ＷＯ２０１２／１４５４９３号、米国特許７,６３５,７５７号および８,２１７,１４９号および米国公開２００９／１４５４９３号に開示の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の何れもまた使用できる。これらの抗体の何れかと競合して結合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体も組み合わせ処置に使用し得る。
【０２６９】
なおさらなる実施態様において、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体をＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−Ｌ１アンタゴニストのようなＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達のアンタゴニストと組み合わせ、さらに第三の免疫治療剤との組み合わせる。ある実施態様において、第三の免疫治療剤は、ここに開示する抗ＧＩＴＲまたは抗ＯＸ４０抗体のようなＧＩＴＲアンタゴニストまたはＯＸ−４０アンタゴニストである。
【０２７０】
他の態様において、免疫腫瘍剤(immuno-oncology agent)は、アゴニストＧＩＴＲ抗体のようなＧＩＴＲアゴニストである。適当なＧＩＴＲ抗体は、例えば、ＢＭＳ−９８６１５３、ＢＭＳ−９８６１５６、ＴＲＸ−５１８(ＷＯ０６／１０５０２１号、ＷＯ０９／００９１１６号)およびＭＫ−４１６６(ＷＯ１１／０２８６８３号)を含む。
【０２７１】
他の態様において、免疫腫瘍剤はＩＤＯアンタゴニストである。適当なＩＤＯアンタゴニストは、例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０(ＷＯ２００６／１２２１５０号、ＷＯ０７／７５５９８号、ＷＯ０８／３６６５３号、ＷＯ０８／３６６４２号)、インドキシモドまたはＮＬＧ−９１９(ＷＯ０９／７３６２０号、ＷＯ０９／１１５６６５２号、ＷＯ１１／５６６５２号、ＷＯ１２／１４２２３７号)を含む。
【０２７２】
ここに提供されるのは、対象にここに記載するアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を治療量以下の用量で投与する、抗ＣＴＬＡ−４抗体を治療量以下の用量で投与するまたは両方を治療量以下の用量で投与する。対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置と関係する有害事象を改変する方法がここに提供される。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヤーボイ(登録商標)(イピリムマブまたは抗体１０Ｄ１、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４号に記載)、トレメリムマブ(以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６)および次の刊行物ＷＯ９８／４２７５２号；ＷＯ００／３７５０４号；米国特許６,２０７,１５６号; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206); and Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される抗体である。ＷＯ２０１３／１７３２２３号に開示の抗ＣＴＬＡ−４抗体の何れも使用できる。
【０２７３】
アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および抗ＬＡＧ−３抗体を対象に投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法がここに提供される。さらなる実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を治療量以下の用量で投与する、抗ＬＡＧ−３抗体を治療量以下の用量で投与するまたは両方を治療量以下の用量で投与する。ここに提供されるのは、対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＬＡＧ−３抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置と関係する有害事象を改変する方法である。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ここに開示する抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体のようなヒト化モノクローナル抗体である。抗ＬＡＧ３抗体の例は、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体であり、これは、米国特許公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２号およびＷＯ２０１４／００８２１８号に記載される。ある実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体はＢＭＳ−９８６０１６である。使用できる他の当分野で認められている抗ＬＡＧ−３抗体は、ＵＳ２０１１／００７０２３号に記載のＩＭＰ７３１を含む。ＩＭＰ−３２１も使用できる。これらの抗体の何れかと競合して結合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＬＡＧ−３抗体も組み合わせ処置に使用し得る。
【０２７４】
ある実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒトＬＡＧ−３に５×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＬＡＧ−３に１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＬＡＧ−３に５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するまたはヒトＬＡＧ−３に１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍまたはそれ未満のＫＤで結合する。
【０２７５】
ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と、ＬＡＧ−３および／またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１のような１以上の第二標的抗原へのアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体の投与は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強できる。本開示の複数抗体を使用して増殖が阻止され得る癌は、一般に免疫療法に応答性の癌を含む。本開示の組み合わせ治療の処置のための癌の代表例は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体での単剤療法の記載において上に具体的に挙げた癌を含む。
【０２７６】
ある実施態様において、ここに記載の複数治療抗体の組み合わせを、薬学的に許容される担体中の単一組成物として同時にまたは各抗体が薬学的に許容される担体にある別個の組成物として同時に投与できる。他の実施態様において、複数治療抗体の組み合わせは逐次的に投与され得る。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体を最初に、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を次に投与するまたはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に、抗ＣＴＬＡ−４抗体を次に投与するように、抗ＣＴＬＡ−４抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は逐次的に投与され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ−１抗体を最初に、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を次に投与するまたはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に、抗ＰＤ−１抗体を次に投与するように、抗ＰＤ−１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は逐次的に投与され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を最初に、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を次に投与するまたはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を次に投与するように、抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は逐次的に投与され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＬＡＧ−３抗体を最初に、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を次に投与するまたはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に、抗ＬＡＧ−３抗体を次に投与するように、抗ＬＡＧ−３抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は逐次的に投与され得る。
【０２７７】
さらに、組み合わせ治療が１回を超えて逐次的に投与されるならば、逐次投与の順番は各投与時に逆の順番になっても同じ順番を維持してもよく、逐次投与を同時投与もしくはこれらの任意の組み合わせと組み合わせてもよい。例えば、組み合わせ抗ＣＴＬＡ−４抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与はまず抗ＣＴＬＡ−４抗体、続いてアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の順で逐次であってよく、三回目の投与はまずアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体、続いて抗ＣＴＬＡ−４抗体の順で逐次などでよい。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＰＤ−１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与はまず抗ＰＤ−１抗体、続いてアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の順で逐次であってよく、三回目の投与はまずアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体、続いて抗ＰＤ−１抗体の順で逐次などでよい。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与はまず抗ＰＤ−Ｌ１抗体、続いてアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の順で逐次であってよく、三回目の投与はまずアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体、続いて抗ＰＤ−Ｌ１抗体の順で逐次などでよい。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＬＡＧ−３抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与はまず抗ＬＡＧ−３抗体、続いてアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の順で逐次であってよく、三回目の投与はまずアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体、続いて抗ＬＡＧ−３抗体の順で逐次などでよい。他の代表的投与スキームは、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０、続いて抗ＣＴＬＡ−４抗体(および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体)の順である最初の投与を含み、二回目およびその後の投与は同時であり得る。
【０２７８】
所望により、唯一の免疫治療剤としてのアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と１以上の付加的免疫治療抗体(例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３遮断)の組み合わせを、さらに癌性細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫賦活性サイトカイン類をコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)のような免疫原製剤と組み合わせ得る。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００のペプチドのような黒色腫抗原のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞(下にさらに記載)を含む。ＣＤ４０アゴニストおよび１以上の付加的抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)をさらに標準的癌処置とも組み合わせ得る。例えば、ＣＤ４０アゴニストおよび１以上の付加的抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)を、化学療法レジメと効果的に組み合わせ得る。これらの例において、本開示の組み合わせと共に投与する他の化学療法剤の用量を減少させることが可能である(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組み合わせの例は、黒色腫処置のための、さらにダカルバジンとの組み合わせを併用するかまたは併用しないＣＤ４０アゴニスト抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体)のような付加的抗体の組み合わせである。他の例は、黒色腫処置のための、さらにインターロイキン−２(ＩＬ−２)との組み合わせを併用するかまたは併用しないアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３抗体の組み合わせである。ＣＤ４０アゴニズムおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と化学療法のの組み合わせ使用の裏にある科学的根拠は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルを増加させることである。細胞死によりＣＤ４０アゴニズムとＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を伴うまたは伴わない組み合わせと相乗作用をもたらし得る他の組み合わせ治療は、放射線、手術またはホルモン除去を含む。これらのプロトコールの各々は、宿主における腫瘍抗原の源を作る。血管形成阻害剤も組み合わせたＣＤ４０アゴニズムおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と組み合わせ得る。血管形成の阻害は、宿主抗原提示経路に腫瘍抗原を供給し得る腫瘍細胞死をもたらす。
【０２７９】
唯一の免疫治療剤またはＣＤ４０アゴニストおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断抗体との組み合わせでのアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、ＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に向かわせる二特異的抗体とも組み合わせても使用し得る。例えば、米国特許５,９２２,８４５号および５,８３７,２４３号参照。二特異的抗体は、２つの個別の抗原を標的とするのに使用できる。これらの応答のＴ細胞アームは組み合わせたＣＤ４０アゴニズムおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の使用により増強される。
【０２８０】
他の例において、唯一の免疫治療剤または抗ＣＤ４０抗体および付加的免疫賦活剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３剤、例えば、抗体との組み合わせでのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ(登録商標)(エプラツズマブ)、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびタルセバ(登録商標)(エルロチニブ)などのような抗新生物抗体と組み合わせて使用できる。例としておよび理論に縛られることを望まないが、トキシンにコンジュゲートした抗癌抗体または抗癌抗体は、免疫賦活剤、例えば、ＣＤ４０、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３剤、例えば、抗体が介在する免疫応答を増強する、癌細胞死(例えば、腫瘍細胞)をもたらし得る。例示的実施態様において、過増殖性疾患(例えば、癌腫瘍)の処置は、抗宿主による腫瘍免疫応答を増強し得る、抗癌剤、例えば、抗体と、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体、および所望により付加的免疫賦活剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体の、同時のまたは逐次的なまたはその任意の組み合わせでの組み合わせを含むことができる。
【０２８１】
対象に治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体を併用してまたは併用せずに、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患(例えば、癌)の処置に関連する有害事象を改変する方法がここに提供される。例えば、ここに記載する方法は、患者への非吸収性ステロイドの投与による免疫刺激性治療抗体誘発大腸炎または下痢の発生率を低減する方法を提供する。ここで使用する、“非吸収性ステロイド”は、肝臓での代謝後、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるように、広範な初回通過代謝を示す、グルココルチコイである。ここに記載するある実施態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後、主に肝臓により広範に代謝される、局所作用性グルココルチコステロイドである。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)(Astra-Zeneca)は、回腸へのおよび結腸を通る薬物送達の最適化のために開発された、ブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)は、米国において、回腸および／または上行結腸が関与する軽度から中度クローン病の処置に承認されている。クローン病処置のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)の通常の経口投与量は６〜９mg／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)は、腸で遊離され、その後腸粘膜に吸収され、維持される。腸粘膜標的組織を通ったら、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)は肝臓のシトクロムＰ４５０系により広範に代謝され、極わずかなグルココルチコイド活性を有する代謝物となる。それ故に、バイオアベイラビリティは低い(約１０％)。ブデソニドの低バイオアベイラビリティは、それほど広範ではない初回通過代謝を受ける他のグルココルチコイドと比較して、治療比改善をもたらす。ブデソニドは、全身作用性コルチコステロイドより低い視床下部−下垂体抑制を含む、少ない有害作用をもたらす。しかしながら、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)の慢性投与は、副腎皮質機能亢進および副腎抑制のような全身性グルココルチコイド効果を生じ得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610参照。
【０２８２】
なおさらなる実施態様において、非吸収性ステロイドと組み合わせた、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を伴うまたは伴わないＣＤ４０アゴニスト(すなわち、ＣＤ４０に対する免疫刺激性治療抗体および所望により抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体)を、さらにサリチレートと組み合わせ得る。サリチレートは、例えばスルファサラジン(アザルフィジン(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)、オルサラジン(ＤＩＰＥＮＴＵＭ(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)、バルサラジド(ＣＯＬＡＺＡＬ(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.)、およびメサラミン(ＡＳＡＣＯＬ(登録商標)、Procter & Gamble Pharmaceuticals、ペンタサ(登録商標)、Shire US、ＣＡＮＡＳＡ(登録商標)、Axcan Scandipharm, Inc.、ＲＯＷＡＳＡ(登録商標)、Solvay)のような５−ＡＳＡ剤を含む。
【０２８３】
ここに記載する方法によって、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３抗体および非吸収性ステロイドを伴いまたは伴わずにアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせて投与されるサリチレートは、免疫刺激性抗体により誘発される大腸炎の発生率を低減する目的で、サリチレートおよび非吸収性ステロイドのあらゆる重複したまたは逐次の投与を含む。それ故に、例えば、ここに記載する免疫刺激性抗体により誘発される大腸炎の発生率を低減する方法は、サリチレートおよび非吸収性の同時のまたは逐次的な(例えば、サリチレートを非吸収性ステロイドの６時間後投与)またはその任意の組み合わせを包含する。さらに、サリチレートおよび非吸収性ステロイドを同じ経路で(例えば、両方とも経口投与)または異なる経路で(例えば、サリチレートを経口投与および非吸収性ステロイドを直腸投与)投与してよく、これは、抗ｈｕＣＤ４０および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体の投与に使用する経路と異なってよい。
【０２８４】
ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および組み合わせ抗体治療を、処置される適応症(例えば、癌)に対して特定の有用性について選択される他の周知治療と組み合わせて使用してもよい。ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の組み合わせを既知の薬学的に許容される薬剤と逐次的に使用し得る。
【０２８５】
例えば、ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および組み合わせ抗体治療を、照射、化学療法(例えば、カンプトテシン(ＣＰＴ−１１)、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５−ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(６×コンボ)を使用)、１以上のプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)、１以上のＢｃｌ−２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ−２’(ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤)、インドールアミンｄｉオキシゲナーゼ−１(ＩＤＯ１)阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０)、ＡＴ−１０１(Ｒ−(−)−ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ−２６３(小分子)、ＧＸ−１５−０７０(オバトクラックス)またはＭＣＬ−１(骨髄白血病細胞分化タンパク質−１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(阻害剤ｏｆアポトーシスタンパク質)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃ模倣体、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15参照)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ−３５１５６(ＧＥＭ−６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管形成阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲをターゲティングする抗血管形成剤(例えば、アバスチン(登録商標))、合成トリテルペノイド(Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808参照)、ｃ−ＦＬＩＰ(細胞性ＦＬＩＣＥ−阻害性タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲγ(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ)の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスのようなｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドミド、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物のような付加的処置と組み合わせて(例えば、同時または別々)使用してよい。
【０２８６】
ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および組み合わせ抗体治療を、さらに１以上の抗増殖性細胞毒性剤と組み合わせて使用できる。抗増殖性細胞毒性剤として使用され得る化合物群は、次のものを含むが、これらに限定されない。
アルキル化剤(窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼンを含むが、これらに限定されない)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(シトキサンＴＭ)、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホロアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない)：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
【０２８７】
アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせるのに適当な抗増殖剤は、タキサン類、パクリタキセル(パクリタキセルはタキソールＴＭとして市販)、ドセタキセル、ディスコデルモライド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、Ｐｅｌｏｒｕｓｉｄｅ  Ａ、エポチロン類、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、[１７]−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、[１８]デヒドロデスオキシエポチロン類Ｂ、Ｃ１２,１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、ｔｒａｎｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、ｃｉｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモライド、パツピロン(ＥＰＯ−９０６)、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモライド)、ＴＺＴ−１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ−６５１(タシドチン塩酸塩)、ハリコンドリンＢ、メシル酸エリブリン(Ｅ−７３８９)、ヘミアスタリン(ＨＴＩ−２８６)、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、メイタンシノイド免疫複合体(ＤＭ−１)、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２(イスピネシブ)、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７ベータ−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１,３,５(１０)−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４,１６−ジデメチル−(＋)−ディスコデルモライドおよびクリプトチロン１と、それに加えて当分野で知られる他の微小管安定化剤であるが、これらに限定されない。
【０２８８】
ここに記載するアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体での処置と共にまたはその前に異常に増殖している細胞を静止状態にさせるのが望ましいとき、ホルモンおよびステロイド(合成アナログを含む)、例えば１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックスＴＭも患者に投与できる。ここに記載する方法または組成物を用いるとき、制吐剤のような臨床状況で腫瘍増殖または転移の調節において使用される他の薬剤も、所望により投与してよい。
【０２８９】
化学療法剤の安全かつ効果的投与方法は当業者に知られる。さらに、その投与は標準的参考書に記載されている。例えば、多くの化学療法剤の投与はPhysicians' Desk Reference (PDR)の例えば、1996版(Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, (USA)に記載されており、その開示を、引用により本明細書に包含させる。
【０２９０】
化学療法剤および／または放射線治療を、当分野で周知の治療プロトコールにより適用できる。化学療法剤および／または放射線治療の適用は、処置する疾患ならびにその疾患に対する化学療法剤および／または放射線治療の既知効果により変わり得ることは、当業者には認識される。また、熟練した医師の知識により、治療プロトコール(例えば、投与量および投与回数)を、患者における投与した治療剤の観察される効果および投与した治療剤に対する疾患の観察される応答を見て変えることができる。
【０２９１】
XI. 本発明の特定のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の特徴付け
本発明のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を実施例１に記載のとおりに得た。例示的本発明の抗体の可変ドメインおよびＣＤＲ配列領域を配列表に提供し、表２に要約する。可変ドメインおよびＣＤＲ領域ナンバリングは、同じ元のクローンに由来する全抗体について同じであり、すなわちここに提供するヒト化バリアントは挿入または欠失を何ら含まない。
【０２９２】
【表２】
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【０２９３】
本発明はまた、同じマウス生殖系列配列、特にＶおよびＪ領域遺伝子セグメント由来であることにより、配列がここに開示されるものと関連する抗ｈｕＣＤ４０抗体も提供する。ここに開示する抗体の各々のマウス生殖系列配列を表３に提供する。
【０２９４】
【表３】
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【０２９５】
本発明は、さらに、そうしなければヒト化中に喪失するであろう抗原(ヒトＣＤ４０)親和性を回復するためまたは配列傾向を除去するためにさらなる変異(“復帰変異”)を併用してまたは併用しないで、マウスフレームワーク配列をヒトフレームワーク配列で置き換えてここに開示するマウス親抗体に由来するヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体を提供する。実施例３参照。
【０２９６】
本発明はまた、ここに開示する新規可変ドメイン配列および、他のＦｃ受容体、すなわち活性化受容体に対する親和性と比較して、ＦｃγＲIIｂに対する親和性が増強された修飾Ｆｃ領域を有する定常ドメインを含む、抗体構築物も提供する。ＦｃγＲIIｂ特異性が増強されたこのようなアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、癌および慢性感染の処置において優れた効力を発揮することが予測される。Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754。理論に限定されることを意図しないが、このようなＦｃγＲIIｂ特異的アゴニスト抗ＣＤ４０  ｍＡｂは、抗腫瘍応答増強に至る、細胞毒性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の拡張および活性化を促進する、樹状細胞の成熟の増加により、増強されたアジュバント効果を示し得る。同上。理論に限定されることを意図しないが、本発明の受容体クラスタリングまたは“架橋”増加によるアゴニストＣＤ４０抗体のＦｃＲ介在シグナル増強は、治療効力への主要寄与因子である。ＣＤ４０アゴニスト抗体の、抗体のＦｃ部分によるＦｃＲ結合による架橋はシグナル強度を高め、それにより細胞の活性化を増強し得る。
【０２９７】
活性化(Ａ)対阻害性(Ｉ)Ｆｃ受容体に対する抗体の相対的結合親和性は、“Ａ／Ｉ”比として表すことができ、一般にＩｇＧ抗体のＦｃ領域の関するである。ＷＯ２０１２／０８７９２８号参照。阻害性受容体ＦｃγＲIIｂへの結合について特異性が増強された抗体は低いＡ／Ｉ比を有する。本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体としての好ましい抗体は、例えば、５、４、３、２、１、０.５、０.３、０.１、０.０５、０.０３または０.０１未満のＡ／Ｉ比を有する。
【０２９８】
ＦｃγＲIIｂ特異性を増強するための変異を含むヒトＩｇＧ１定常ドメインも配列表に提供し、表４に要約し、図１に図説する。配列バリアントを、配列番号６５に提供するヒトＩｇＧ１ｆ定常ドメイン配列を参照して定義する。Ｆｃ領域における変異の位置に関する命名法(ナンバリング)は、Kabat et al. (1981) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)のＥＵ指数に従い、これは、種々の可変ドメイン長の抗体における相当位置でのＦｃ配列の比較を容易にする。Edelman et al. (1969) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 63:78；ＷＯ２０１２／１３０８３１号(同じナンバリングシステムを使用)も参照のこと。これは配列表における配列ナンバリングと適合しない。図１は、表４のＦｃ配列バリアントの図形的表示を提供し、これから、当業者はここに開示する抗体配列における対応する位置を用意に認識する。ＳＥおよびＳＥＬＦバリアントはChu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926に記載されている。Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９、Ｖ１１およびＶ１２バリアントは、Mimoto et al. (2013) Protein Engineering Design & Selection 26:589に記載されている(例えばその中の表１)。
【０２９９】
【表４】
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【０３００】
ＦｃγＲIIｂに対する親和性が増強されたさらなるＦｃ配列バリアントはYu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723(およびＷＯ２０１４／１８４５４５号)に開示され、例えばＳ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆと組み合わせて使用する、Ｖ２６２ＥおよびＶ２６４Ｅを含む。
【０３０１】
Ｄ２７０Ｅ変異を有するさらなるバリアントを生産し、Ｖ４およびＶ９  Ｆｃ配列バリアントにおいて生じるＤ２７０異性化を減少させており、これらは、そうしなければ、加速分解試験で、４℃のＰＢＳ中で、２年後、他のバリアントの約５〜７％と比較して、約１２〜１６％異性化を示唆する、増強された異性化率を示した。表５参照(一実験からのデータを示すが、反復実験も同等な価を示した)。２７０位のアスパラギン酸のグルタミン酸での置換は、このようなＤＧ異性化の可能性を排除し、化学的により安定である抗体およびより均一な抗体調製物をもたらした。Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０ＳおよびＤ２７０ＴのようなＶ９の他のＤ２７０置換は、ＦｃγＲIIａおよびＦｃγＲIIｂ受容体への結合を効果的に排除した(ＫＤは５μMを超えた)。Ｄ２７０Ｅ変異は、ＦｃγＲIIｂ受容体への結合を一桁減少させたが、Ｖ９−Ｄ２７０Ｅバリアントは、ＦｃγＲIIａと比較して  ＦｃγＲIIｂ受容体への親和性について好ましいバイアスおよびＦｃγＲIIｂに対する許容される絶対親和性を維持した。実施例８参照。
【０３０２】
【表５】
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【０３０３】
種々の本発明の抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性を測定した。実施例７および図３Ａ、３Ｂおよび４参照。アゴニスト活性は、抗原(ヒトＣＤ４０)結合を決定する可変ドメイン配列(ｍＡｂクローン番号)およびＦｃ受容体(ＦｃγＲIIｂ)結合を決定するＦｃ領域の配列の両方に依存することが判明した。
【０３０４】
次の実施例により本発明をさらに説明し、これはさらに限定するものと解釈してはならない。本明細書をとおして引用されている全ての図および全ての引用文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願は、引用により明示的に本明細書に包含させる。
【実施例】
【０３０５】
実施例１
ヒトＣＤ４０に対するマウスモノクローナル抗体の生産
マウス抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体を、マウス抗体遺伝子を発現する野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス(Charles Rivers Labs)を使用して、次のとおり生産した。
【０３０６】
抗原
ｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ可溶性組み換えタンパク質を、免疫化用抗原として使用した。可溶性融合タンパク質は、９１.６ＫＤのＭＷを有し、ｈｕＣＤ４０の細胞外部分と、そのＣ末端で連結したマウスＩｇＧ２ｂ  Ｆｃからなる。この融合タンパク質を、ここでは“ｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ融合タンパク質”と称する。融合タンパク質を、標準的組み換えＤＮＡ方法により酸性し、該可溶性融合タンパク質を培養上清に分泌するトランスフェクトＣＨＯ細胞で発現させた。トランスフェクションに使用したＣＨＯ宿主細胞はInvitrogen(Cat #11619-012)から得た。分泌可溶性融合タンパク質を、免疫原として使用するために精製した。
【０３０７】
マウスの免疫化
ヒトＣＤ４０に対するマウスモノクローナル抗体を生産するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを精製ｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ融合タンパク質で免疫化した。マウスは、抗原の最初の注入時点で約２〜４ヶ月齢であった。精製組み換えｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ抗原調製物(融合タンパク質を発現するトランスフェクト哺乳動物細胞から１０μgを精製)を使用して、２つの免疫化プロトコール(ＡおよびＢ)を使用してマウスを免疫化した。プロトコールＡは、４回毎週足蹠(ＦＰ)免疫化からなり、プロトコールＢは、７回毎週皮下(ＳＣ)／腹腔内(ＩＰ)／膝免疫化からなった。両方の場合、免疫原をＲＩＢＩアジュバント(Sigma Cat#M6536)と１：１混合した。
全マウスを、４回目の免疫化の１週間後採血し、抗原特異的力価を評価した。また屠殺時に、各マウスから最終採血も得た。免疫応答を後眼窩採血によりモニターした。血漿を、免疫化に使用した組み換えタンパク質を使用して、ＥＬＩＳＡ分析によりスクリーニングした。プロトコールＡからのマウスは、融合前−２日および−３日に可溶性抗原で、２回の最終ブーストを静脈内(IV)および足蹠(ＦＰ)に受けた。プロトコールＢからのマウスは、融合前−２日および−３日に可溶性抗原で、２回の最終ブーストを静脈内ならびにＩＰおよび膝に受けた。
プロトコールＡからの全４匹のマウス(ＩＤ  ２９１７６３、２９１７６４、２９１７６５、２９１７６６)を屠殺した。リンパ節および脾臓細胞を摘出し、融合のために混合した(融合３５８２および３５８３)。プロトコールＢからのマウス２匹のみ(ＩＤ２９４２８６および２９４２８８)を屠殺した。各マウスからの脾臓およびリンパ節を混合し、融合した(融合３７１６および３７１７)。
【０３０８】
ヒトＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの生産
高力価Ｂａｌｂ／ｃマウスから単離したマウス脾細胞およびリンパ節を、電場ベースの電気細胞融合Ｈｙｂｒｉｍｕｎｅ装置および大０.９ml融合チャンバー(BTX Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA)を使用して、マウス骨髄腫融合パートナーと融合させた。免疫化マウスからのリンパ球の単一細胞懸濁液を、同数のＰ３Ｘ６３  Ａｇ８.６.５３(ATCC CRL 1580)非分泌型マウス骨髄腫細胞と融合させた。得られた細胞を、ハイブリドーマを選択するためのアミノプテリン天下選択的ClonaCell-HY Medium E(catalog # 03805; STEMCELL Technologies Inc., Vancouver BC, Canada)中、２.０×１０４細胞／ウェルで、平底マイクロタイタープレートに播種した。約７日後、培養培地をMedium E(アミノプテリン無添加)に置き換えた。
１０〜１２日後、個々のウェルを、均一ＨＴＲＦアッセイを使用してマウスＩｇＧ／マウスカッパ軽鎖抗体の存在についてスクリーニングした。このアッセイにおいて、９６ウェル融合プレートからの上清を慣用標識テルビウム−クリプテートヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｆｃγ特異的)(Cisbio US Inc. Bedford, MA)およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７(Jackson ImmunoResearch; Catalog # 109-605-098)標識ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ’２と混合した。１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＲｕｂｙｓｔａｒリーダーで読んだ。次いで、マウスＩｇＧ／マウスカッパ軽鎖抗体について陽性のウェル由来のハイブリドーマ細胞を、ヒトＣＤ４０でトラスフェクトしたＣＨＯ細胞および対照としてのＣＨＯ非トランスフェクト細胞(融合３５８２／３５８３)を使用するＦＡＣＳまたは組み換えタンパク質を使用するＥＬＩＳＡと、続く陰性対照としてのＤａｕｄｉ  Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞(融合３７１６／３７１７)でのＦＡＣＳによりスクリーニングした。ＦＡＣＳ陽性親系統を２４ウェルプレートに移した。数日後、個々のウェルからの細胞上清をＦＡＣＳで再スクリーニングして、ヒトＣＤ４０に対するＩｇＧ特異性を確認した。
一団の抗原特異的ハイブリドーマを、連続希釈によりクローン化し、ＣＨＯトランスフェクタントまたはＤａｕｄｉ細胞を使用してＦＡＣＳにより再スクリーニングした。融合３５８２／３５８３からの１９抗体および融合３７１６／３７１７からの２０抗体を精製し、機能的活性について試験した。この一団の抗体から、５個の強力なアゴニストが二回目のサブクローニングに選択された。これら５抗体、すなわち１８０２.３５８２.１９Ｇ３.Ｆ１０.Ｅ１、１８０２.３５８３.５Ｇ７.Ｆ１２.Ｇ３、１８０２.３５８３.８Ｅ８.Ｃ１０.Ｇ２、１８０２.３７１６.１２Ｄ６.Ｂ１.Ｅ３および１８０２.３７１７.５Ｆ１１.Ａ１１.Ｅ７をその後配列決定に付し、さらに分析した。
【０３０９】
実施例２
完全ヒト抗ｈｕＣＤ４０抗体の生産
ここに開示するヒト化抗ＣＤ４０抗体と同じエピトープに結合するおよび／または結合を交差遮断する完全ヒト抗ｈｕＣＤ４０モノクローナル抗体は、本発明の方法において用途が発見され得る。このような抗体を、次のとおり、ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを使用して生産し得る。
【０３１０】
抗原
ｈｕＣＤ４０可溶性組み換えタンパク質を、免疫化用抗原として使用する。可溶性融合タンパク質は、ｈｕＣＤ４０の細胞外部分とそのＣ末端に連結したマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃからなる。この融合タンパク質を、ここでは“ｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ融合タンパク質”と称する。融合タンパク質を標準的組み換えＤＮＡ方法により生産し、可溶性融合タンパク質を培養上清に分泌するトランスフェクトＣＨＯ細胞で発現させる。トランスフェクションに使用するＣＨＯ宿主細胞は、Invitrogen(Cat #11619-012)から得る。分泌可溶性融合タンパク質を免疫原として使用するために精製する。シグナル配列を含む完全長ヒトＣＤ４０の配列を配列番号１に提供する。
【０３１１】
トランスジェニックマウス
完全ヒトＣＤ４０に対するヒトモノクローナル抗体を、CMD++;JKD++;KCo5(9272)+^;SC20+遺伝子型からのマウス(以後ＫＭ(登録商標)マウスと称する)を使用して調製する。個々の導入遺伝子命名がカッコ内にあり、無作為に統合された導入遺伝子数の系統番号が続く。記号＋＋および＋はホモ接合性またはヘミ接合性を示し、しかしながら、マウスが無作為に統合されたヒトＩｇ導入遺伝子のヘテロ接合性およびホモ接合性の区別を可能としないＰＣＲベースのアッセイを使用して一般にスクリーニングさえるため、＋命名は、実際これらの要素についてホモ接合であるマウスになされ得る。この系統において、内因性マウスカッパ軽鎖遺伝子はChen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820に記載ようにホモ接合性に破壊されており、内因性マウス重鎖遺伝子は、ＷＯ２００１／０９１８７号の実施例１に記載のようにホモ接合性に破壊されている。さらに、このマウス系統は、ＷＯ２０００／０２６３７３号に記載のようにヒトカッパ軽鎖座位の大部分を担持する酵母人工染色体(ＹＡＣ)を担持する、Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に記載のようにヒトカッパ軽鎖導入遺伝子であるＫＣｏ５を担持する。
【０３１２】
マウスの免疫化
完全ヒトＣＤ４０に対するヒトモノクローナル抗体を生産するために、ＫＭマウスを精製ｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ融合タンパク質で免疫化する。一般的免疫化スキームは、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４号に記載されている。マウスは、抗原の最初の融合時約４ヶ月齢である。精製組み換えｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ抗原調製物(融合タンパク質を発現するトランスフェクト哺乳動物細胞から精製した１０μg)またはヒトＣＤ４０をトランスフェクトした３００−１９細胞を使用して、マウスを腹腔内的および皮下的に免疫化する。免疫原を、ＲＩＢＩアジュバント(Sigma Cat#M6536)と１：１に混合する。
マウスを５〜７日間隔で５回免疫化する。最初のおよび二回目の免疫化を組み換えタンパク質で実施する。三回目の免疫化は細胞を用い、四回目の免疫化はタンパク質を用い、五回目の免疫化は細胞を用いる。マウスを、最後の免疫化１週間後に採血し、抗原特異的力価を評価する。免疫応答を後眼窩採血によりモニターする。血漿をトランスフェクト３００−１９細胞を使用するＦＡＣＳ分析でスクリーニングし、抗ヒトＣＤ４０ヒトＩｇＧについて最高力価のマウスをｒ融合に使用する。マウスは可溶性抗原の２日の静脈内(IV)および腹腔内(ＩＰ)注射および３日のトランスフェクト細胞による最終ブーストを受けた後、屠殺し、脾臓を摘出する。
【０３１３】
ヒトＣＤ４０に対するヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの生産
高力価ＫＭマウスから単離したマウス脾細胞およびマウス骨髄腫融合パートナーを、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ大チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)を使用する電場ベースの電気細胞融合で融合させる。免疫化マウスからの臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、同数のＰ３Ｘ６３  Ａｇ８.６.５３(ATCC CRL 1580)非分泌型マウス骨髄腫細胞と融合させる(融合番号：２５４１)。得られた細胞を、高グルコース(Cellgro #10-013-CM)および１０％ウシ胎児血清(Hyclone #SH30071.03)を含む選択的ＤＭＥＭ培地中、２.０×１０４細胞／ウェルで平底マイクロタイタープレートに播種し、ベータ−メルカプトエタノール(１０００Ｘ、Gibco #21985-023)、７mM  ＨＥＰＥＳ(Cellgro 25-060-Cl)、付加的２mM  Ｌ−グルタミン(Cellgro 25-005-Cl)、ＨＡＴ(５０Ｘ、Sigma #H-0262)、５％ハイブリドーマクローニング因子(BioVeris #210001)、１０％Ｐ３８８ＤＩ(ATCC #CRL TIB-63)順化培地およびペニシリン−ストレプトマイシン(１００ｘ、Cellgro #30-002-CI)を添加する。約７日後、ＨＡＴを含む培地のいくつかをＨＴ(Cellgro #25-047-CI)を含む培地に置き換える。
１０〜１２日後、個々のウェルを、均一ＨＴＲＦアッセイを使用してヒトＩｇＧ／ヒトカッパ軽鎖抗体の存在についてスクリーニングする。このアッセイにおいて、９６ウェル融合プレートからの上清をユーロピウム−クリプテート標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Ｆｃフラグメント特異的)、ビオチニル化ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖(Bethyl #A80-115B)、ストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔと混合し、１時間インキュベートする。次いでプレートをＲＵＢＹｓｔａｒリーダーで読む。
ヒトＩｇＧ／ヒトカッパ軽鎖またはヒトＩｇＧ／ヒトラムダ軽鎖抗体について陽性のウェルからのハイブリドーマ細胞を、次いで、ヒトＣＤ４０をトランスフェクトした３００−１９細胞および対照として３００−１９非トランスフェクト細胞を使用するＦＡＣＳでスクリーニングする。ＦＡＣＳ陽性親系統を２４ウェルプレートに移す。数日後、個々のウェルからの細胞上清をＦＡＣＳで再スクリーニングして、ヒトＣＤ４０に対するＩｇＧ特異性を確認する。
ハイブリドーマを連続希釈によりクローン化し、ＦＡＣＳで再スクリーニングする。
【０３１４】
実施例３
抗ｈｕＣＤ４０抗体のヒト化
親(マウス)本発明の抗体を、ヒト治療剤として使用される可能性のためにヒト化した。最も近いマッチングヒト生殖系列領域配列を各マウス可変ドメインについて選択し、これらのヒトフレームワーク領域を使用して、抗体の“ＣＤＲ移植”バージョンにおけるマウスフレームワークを置換した。次いで、フレームワーク復帰変異のような付加的アミノ酸置換をヒト化抗体の結合親和性の回復の必要に応じてなした。さらにアミノ酸置換を配列傾向除去のために行った。種々の形態の本発明の抗体間の配列関係を表６に提供する。種々のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の可溶性ヒトＣＤ４０への結合を、ForteBio Octet RED(Rapid system - Extended Detection)無標識相互作用分析装置を使用してバイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)分析により決定した。全試験を１０mM  ＮａｘＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、０.０５％界面活性剤Ｐ２０(ｐＨ７.１)中、２５℃で実施した。簡潔にいうと、抗ｈｕＣＤ４０抗体上清(１０μg／mlに希釈または上清濃度が１０μg／ml未満であるならば未希釈で捕捉)を、プロテインＡ被覆バイオセンサー(Pall Fortebio #18-5010)に、負荷時間９０秒および振盪速度１０００rpmに捕捉した。上清を、まず、結合サイクル間、１０mM  グリシン、ｐＨ１.５を使用する２回の１５秒順化段階を伴い、１０００rpmで、１８０秒会合時間および解離時間を使用して１μM  組み換えヒトＣＤ４０モノマー(ｈｕＣＤ４０モノマー)への結合についてスクリーニングした。１μM  ｈｕＣＤ４０モノマー実験中で結合シグナルを示した全上清を、次いで、３倍希釈シリーズの異なる７濃度のｈｕＣＤ４０モノマーへの結合について試験し、そこで、最高濃度は、１μMスクリーニング実験における結合シグナル強度に依存して、１０μM  ｈｕＣＤ４０モノマーまたは１μM  ｈｕＣＤ４０モノマーであった。選択抗体およびその配列バリアントの結果を表６に示す。
【０３１５】
【表６】
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【０３１６】
ヒト化抗体について、ＶＨおよびＶＬカラムは、フレームワーク領域が基づくヒト可変ドメイン生殖系列を提供する。“ＣＤＲ移植”は、列挙したヒトフレームワーク配列に直接移植された非修飾親(マウス)ＣＤＲを含む可変ドメインをいう。表６における全配列バリアントの残基ナンバリングはＫａｂａｔに従い、それ故に表６における配列変化位置は、配列表における抗体配列の残基ナンバリングと適合しない。下線を使用して、潜在的配列傾向を補正することを意図する配列修飾、すなわち産物不均一性を生じる、化学修飾および潜在的分解に付される残基を示す。他の配列修飾は親和性回復、一般にフレームワーク復帰変異(ヒト生殖系列フレームワーク配列から元のマウスフレームワーク残基に復帰)を意図する。抗体５Ｇ７の重鎖におけるＭ６９Ｌ修飾は、フレームワーク復帰変異および傾向補正の両方である。
【０３１７】
実施例４
抗ＣＤ４０抗体エピトープビニング実験
エピトープビニング実験を、どの抗ヒトＣＤ４０抗体がｈｕＣＤ４０と結合について他のものと競合し、それ故に類似エピトープに結合するかを決定するために実施し得る。複数抗ｕＣＤ４０抗体間のペアワイズ競合を次のとおり実施し、そこでは、参照抗体がセンサーチップ表面に結合し、試験抗体が混合物中ｈｕＣＤ４０ポリペプチド構築物とプレインキュベートされ、プレインキュベート混合物を、センサーチップ上を流して、試験抗体がチップ表面上の参照抗体へのｈｕＣＤ４０ポリペプチド構築物の結合を妨害する程度を決定する。このような競合実験をBIACORE(登録商標)ＳＰＲ装置を使用して実施し得る。簡潔にいうと、参照抗ｈｕＣＤ４０抗体をセンサーチップＣＭ５チップ(Series S, GE Healthcare CAT# BR-1005-30)表面、フローセル２、フローセル３およびフローセル４(５０００ＲＵ)に固定化し、フローセル１を陰性対照として使用する。試験抗体を、出発濃度で１２０μg／mL(２Ｘ)に希釈する。試験抗体の一連の希釈を、１：３濃度の抗体を緩衝液で異なる７濃度および滴定曲線を得るための対照サンプル(０μg／ml)について希釈することにより製造する。各抗体濃度シリーズを、二分した。濃度シリーズの最初の半分に、４０nM(２Ｘ)ヒトＣＤ４０抗原(例えばｈｕＣＤ４０／Ｆｃ)を添加して、各ウェルにおいて最終濃度シリーズ(６０μg／ml〜０.０μg／ml)および２０nMの最終抗原濃度とする。濃度シリーズの第二の半分に、抗原の代わりに、緩衝液を添加して、抗体を同じ濃度に希釈させ、この半分をブランクとして処理する。試験抗ＣＤ４０抗体とｈｕＣＤ４０／Ｆｃの複合体を２時間インキュベートする。４０μL複合体を参照抗体被覆表面に、３０μL／分で注入する。BIACORE(登録商標)Ｔ２００表面プラズモン共鳴装置を使用し、ランニング緩衝液は、濾過、脱気したＨＢＥ−ＥＰ、GE Healthcare CAT# BR-1001-88、０.０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、０.１５  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.００５％界面活性剤Ｐ２０である。表面を２５mM  ＮａＯＨ(注文コード：BR-1003-58, GE Healthcare)で、１００μL／分で５秒再生させる。Microsoft Excelを使用してデータを分析し、そこでは、試験抗体の濃度を対応する応答単位に対してプロットして、滴定曲線を得る。
本発明の抗ＣＤ４０抗体についてのこのようなエピトープビニング実験の結果を図２に提供する。抗体５Ｆ１１および８Ｅ８は、リガンド(ＣＤ４０Ｌ)結合を遮断する。５個の本発明の抗ＣＤ４０抗体は、３エピトープ群内に入る  −  １２Ｄ６／５Ｇ７／１９Ｇ３、５Ｆ１１／５Ｇ７／１９Ｇ３および８Ｅ８。
【０３１８】
実施例５
ＨＤＸによるエピトープマッピング
本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体１２Ｄ６、５Ｇ７、１９Ｇ３および５Ｆ１１のエピトープを、水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)により決定した。ＨＤＸ−ＭＳは、主鎖アミド水素原子の重水素交換の速度および程度のモニタリングにより、溶液中のタンパク質配座および配座動力学をプローブする。Huang & Chen (2014) Anal. Bioanalytical Chem. 406:6541; Wei et al. (2014) Drug Disc. Today 19:95。ＨＤＸのレベルは、主鎖アミド水素原子およびタンパク質水素結合の溶媒到達性による。ＨＤＸによるタンパク質の質量増加は、ＭＳにより厳密に測定できる。この技術を酵素消化と組み合わせたとき、ペプチドレベルでの構造特性を解析でき、表面に露出されているペプチドと、内側のものまたはタンパク質−タンパク質複合体の界面で隔離されているものとの区別を可能にする。一般に、重水素標識およびその後の消光実験、続く酵素消化、ペプチド分離およびＭＳ分析を実施する。
エピトープマッピング実験前に、非重水素化実験を実施し、組み換えヒトＣＤ４０モノマー(１０μM)およびＣＤ４０とｍＡｂ  １２Ｄ６、５Ｇ７、１９Ｇ３および５Ｆ１１のタンパク質複合体(１：１モル比)について、共通ペプチドの一覧を作成する。ＨＤＸ−ＭＳ実験において、５μLの各サンプル(ＣＤ４０またはそれぞれＣＤ４０とｍＡｂ  １２Ｄ６、５Ｇ７、１９Ｇ３および５Ｆ１１)を、５５μLのＤ２Ｏ緩衝液(１０mM  リン酸緩衝液、Ｄ２Ｏ、ｐＨ７.０)に希釈して、標識反応を開始させた。反応を２０秒、１分、１０分および２４０分の異なる時間実施した。各標識反応時間の最後に、反応を消光緩衝液(１００mM  リン酸緩衝液と４Ｍ  ＧｄｎＣｌおよび０.４Ｍ  ＴＣＥＰ、ｐＨ２.５、１：１、ｖ／ｖ)の添加により消光さえ、５０μLの消光サンプルを分析のためにWaters HDX-MS系に注入した。共通消化性ペプチドの重水素取り込みレベルを、ＣＤ４０  ｍＡｂ存在下／非存在下でモニターした。得られた配列包括度は８２％であった。
抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  １２Ｄ６、５Ｇ７、１９Ｇ３および５Ｆ１１についてのＨＤＸエピトープを表７に提供する。抗体１２Ｄ６は２つのペプチドを保護し、その一方(残基１１〜２８)はシグナル配列の一部を含み、それ故にそれ自体生理学的に関連する可能性はないが、１２Ｄ６が、ｍＡｂ  ５Ｇ７および１９Ｇ３により為されない、領域２１〜２８において接触することを示す。
【０３１９】
【表７】
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【０３２０】
実施例６
酵母ディスプレイによるエピトープマッピング
本発明の選択キメラまたはヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体のエピトープを、無作為に変異させたｈｕＣＤ４０細胞外領域バリアントを酵母に提示させ、これらの酵母を特定の抗体への結合の失敗に基づき、選別することにより決定する。結合に失敗した選択酵母細胞を増殖し、特定のキメラまたはヒト化形態の本発明の抗体への結合ができないことに基づき、付加的ラウンドの選択に付す。例えば、Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342:539参照。ｈｕＣＤ４０バリアントの配列を得られた酵母について決定し、抗体結合についての各残基の効果を分析する。本発明の抗体への結合エピトープは、一アミノ酸変異が本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体への結合を妨害する、ｈｕＣＤ４０配列内の遺伝子座として決定される。
簡潔にいうと、エラープローンＰＣＲを使用して、ヒトＣＤ４０コード化ＤＮＡを構築物にクローン化し、さらにｃ−ｍｙｃ標識配列および酵母細胞壁プロテインＡｇａ１ｐを含む融合タンパク質のアミノ末端部分としてｈｕＣＤ４０バリアントの発現を可能とする。このような構築物は、酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)で発現されたとき、酵母細胞の表面上に、Ａｇａ１ｐポリペプチドにより細胞表面に係留された、バリアントｈｕＣＤ４０ポリペプチドを提示する。ｃ−ｍｙｃ標識を、所望により、ある酵母細胞上のｈｕＣＤ４０融合タンパク質の提示についての陽性対照として使用してよい。酵母細胞をＦＡＣＳで選別し、および適切に折りたたまれたｈｕＣＤ４０−融合タンパク質(二次アロフィコシアニン(ＡＰＣ)標識ヤギ抗マウスＩｇＧにより検出された対照マウス抗ｈｕＣＤ４０抗体の結合により決定)として発現されるが本発明の抗体に結合しない(二次としてフィコエリトリン(ＰＥ)標識ヤギ抗ヒトＩｇＧでの検出により決定)ものをプールし、増幅させ、選択のその後のラウンドに使用する。ｈｕＣＤ４０配列を、数ラウンドの選択後残っている酵母からの構築物について決定する。抗ｈｕＣＤ４０抗体選択がない対照実験を実施し、ｈｕＣＤ４０配列に沿った各位置での良好な変異体包括度を確認し、選択ライブラリーにより得た結果の標準化のためのベースラインを提供する。
【０３２１】
実施例７
抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性
本発明の選択抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性に対するＦｃ配列変異の効果を、未成熟樹状細胞(ＤＣ)の活性化の測定により評価した。ヒトＩｇＧ１ｆ(対照)、ＳＥ、ＳＥＬＦ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４、Ｖ８およびＶ１２  Ｆｃ配列を有する抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  １２Ｄ６−２４構築物で実験を行った。ヒト単球(ＣＤ１４＋)を、プラスチック接着またはヒトＣＤ１４マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を使用して健常正常ドナーから単離した。単球を１００ng／mL  ＧＭ−ＣＳＦ(Miltenyi Biotec)および１００ng／mL  ＩＬ−４(Miltenyi Biotec)で培養した。２日目および５日目に培地の半分を除き、補充した。未成熟樹状細胞を６〜７日目に回収した。２ドナーからの樹状細胞を記載する濃度の抗体と一夜、３７℃でインキュベートした。細胞培養上清を回収し、ヒト−ＩＬ−６生産(Cisbio)についてアッセイした。図３Ａおよび３Ｂ参照。
対照ヒトＩｇＧ１ｆ抗体は、１００nMまで使用したときＩＬ−６分泌を誘発せず、Ｐ２３８Ｄバリアントは弱くしか誘発しなかった。対照的に、ＳＥ、ＳＥＬＦ、Ｖ９およびＶ１２バリアントは、全て劇的にＩＬ−６分泌を増強し、Ｖ８およびＶ４は中程度の効果を示した。これらの結果を大まかにＦｃγＲIIｂに対する結合親和性と相関させ、適当なＦｃ配列バリアントがアゴニスト活性が増強された抗ＣＤ４０抗体をもたらすこｔができることを確認する。
さらに、８Ｅ８、５Ｇ７、１２Ｄ６、１９Ｇ３および５Ｆ１１可変領域を有する抗体間のアゴニスト活性における差異を、共通ヒトＩｇＧ１ｆ  Ｖ１２定常ドメインを有するキメラ抗ＣＤ４０  ｍＡｂ構築物を使用する実験で評価した。細胞を９６ウェルプレートに播種し、記載する抗体を添加し、一夜、３７℃でインキュベートすることにより、活性化をインビトロで未成熟樹状細胞で測定した(前段落に記載のとおり単離)。次いで細胞を回収し、蛍光抗ＣＤ５４抗体で染色し、これを蛍光活性化セルソーティング(ＦＡＣＳ)により検出した。図４参照。
対照ヒトＩｇＧ１ｆ抗体は有意なＣＤ５４上方制御を引き起こさず、一方１２Ｄ６は劇的なＣＤ５４上方制御を引き起こした。抗体１９Ｇ３および８Ｇ８は、１２Ｄ６よりいくぶん効果が低く、抗体５Ｇ７および５Ｆ１１は類似し、比較的低い刺激を示した。活性化結果は、抗体５Ｆ１１がほぼ最高結合親和性を有するがまだ弱いアゴニストであるのに対し、抗体１９Ｇ３が逆であるため、ＣＤ４０との結合親和性について必ずしも相関しない。差異の理由と無関係に、これらの結果は、適切な抗原結合ドメイン配列の使用が、アゴニスト活性が増強された抗ＣＤ４０抗体を得るのに重要であることを確認する。
【０３２２】
実施例８
ＤＧ異性化の修正
Ｖ４およびＶ９  Ｆｃバリアント配列を有する本発明の抗体は、Ｄ２７０位で許容されないレベルのＤＧ異性化を示す。このような異性化は、産物不均一性および効力減少の可能性をもたらすため、望ましくない。このような異性化を低減するため、Ｖ４  Ｆｃの２７０位のアスパラギン酸残基はグルタミン酸に変えられ(Ｄ２７０Ｅ)、Ｖ９  Ｆｃの２７０位はアラニン、グルタミン酸、グルタミン、セリンおよびスレオニンに変えられた(Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｓ、Ｄ２７０Ｔ)。これらの抗体を発現する細胞から上清を得て、ｈＣＤ３２／ＦｃγＲIIへの結合についてアッセイした。２７０位を変異させていない選択精製抗体を対照として使用した。これらの実験を、ｍＡｂ  １２Ｄ６−２４および５Ｆ１１−４５からの可変ドメインを有する抗体で実施した。結果を図５に提供する。
Ｖ４およびＶ９  Ｆｃバリアントの両方について、Ｄ２７０Ｅ置換は受容体結合の中程度の減少に至った。試験した他のＶ９  Ｆｃバリアント(Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｓ、Ｄ２７０Ｔ)は受容体結合の大きな減少に至った。結果は抗体が１２Ｄ６であるか、５Ｆ１１であるかに無関係であった。全例で、３試験受容体(ＦｃγＲIIａ−Ｈ１３１、ＦｃγＲIIａ−Ｒ１３１およびＦｃγＲIIｂ)に対する相対的(順番)結合は類似のままであり、ＦｃγＲIIａ−Ｒ１３１およびＦｃγＲIIｂへの結合はほぼ同等であり、ＦｃγＲIIａ−Ｈ１３１への結合は有意に弱かった。
Ｖ４およびＶ９バリアントの両方について、Ｄ２７０Ｅ置換は許容可能に高いＦｃγＲ親和性を維持し、本発明の抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性増強に望ましいＦｃγＲIIｂへの特異性を維持した。
【０３２３】
実施例９
ヒトＣＤ４０／ヒトＦｃγＲトランスジェニックマウスにおける抗ＣＤ４０活性
本発明の選択アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を、ヒトＣＤ４０およびヒトＦｃγ受容体[ＣＤ４０−／−ｈＣＤ４０＋  Ｆｃｇｒａ−／−Ｆｃｇｒ１−／−  ｈＦＣＧＲＩ＋ｈＦＣＧＲIIＡ＋ｈＦＣＧＲIIＢ＋ｈＦＣＧＲIIIＡ＋ｈＦＣＧＲIIIＢ＋]についてトランスジェニックなマウスに投与した。ヒトＦｃγ受容体についてトランスジェニックなマウスはSmith et al. (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 109(16):6181-6に記載されている。このようなトランスジェニックヒトＣＤ４０／ＦｃγＲマウスは、ヒトＣＤ４０およびヒトＦｃγＲへの結合が必然的である、ヒト治療抗ＣＤ４０抗体の可能性の研究によく適する。アゴニスト活性を、Li & Ravetch (2011) Science 333:1030に記載の“ＤＥＣ−ＯＶＡ”モデルで測定し、血小板レベルも測定した。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。１２Ｄ６−Ｖ１１およびそれには及ばないものの１２Ｄ６−Ｖ４のような最大級の試験アゴニスト活性を示す抗体はまた２４時間で血小板数の最大減少をもたらした。血小板数減少は一時的な現象であり、注射後７日までに正常レベルに回復した(データは示していない)。
５Ｆ１１抗体は、ＣＤ４０Ｌ結合エピトープと重複するエピトープを認識し、ＣＰ−８７０,８９３に類似して、ＣＤ４０Ｌ結合エピトープと異なるｈＣＤ４０と結合する１２Ｄ６抗体と異なる。１２Ｄ６抗体はＣＰ−８７０,８９３結合を遮断するが、５Ｆ１１抗体はしない(データは示していない)。インビトロ樹状細胞活性化アッセイは、１２Ｄ６のＳＥ−ＦｃおよびＶ１１−Ｆｃバリアントについて顕著な活性を示しており、一方１２Ｄ６  Ｆｃバリアントは５Ｆ１１バリアントと比較して増強された活性を示す。１２Ｄ６−Ｆｃバリアントのインビトロ活性は野生型ＩｇＧ１より大きいが、インビトロ試験は種々のＦｃバリアントの活性を区別しなかった。我々は、それ故にヒト化ＣＤ４０／ヒトＦｃγＲマウスにおけるこれらの抗体およびこれらのＦｃバリアントの活性を評価した。クローンＣＰ−８７０,８９３で観察されたように、これらのｍＡｂの選択的ＦｃγＲIIＢ増強Ｖ１１  ＦｃバリアントはそのＦｃγＲIIＡ／IIＢ増強ＳＥバリアントおよび野生型ＩｇＧ１サブクラスと比較してインビボで優れた活性を示した。さらに、新たに開発した１２Ｄ６−Ｖ１１のインビボ活性強度は、ＣＰ−８７０,８９３(ＩｇＧ２)の活性より約２０倍高い。
【０３２４】
ＣＤ４０アゴニストＡｂｓ、１２Ｄ６−２４および５Ｆ１１−４５の抗腫瘍活性を評価した。各クローンの野生型ＩｇＧ１、ＳＥおよびＶ１１変異体をＭＣ３８腫瘍モデルにおけるそれらの活性について試験した。これらの抗体のＦｃγＲIIＢ選択的増強Ｖ１１バリアントは、ＣＰ−８７０,８９３誘導体で観察されたインビボＴ細胞刺激活性および抗腫瘍活性階層に一致して、試験した他のＦｃバリアントと比較して、優れた抗腫瘍活性を有する。結果を図６Ｃに示す。１２Ｄ６−２４処置群からの無腫瘍マウスに、ＣＤ４０  Ａｂ処置３０日後、ＭＣ３８腫瘍細胞を再負荷した。結果を図６Ｄに示す。この群の全マウスは、再負荷２週間以内に腫瘍を拒絶し、１２Ｄ６−２４単回注射で長期保護が介在されることを示す。
これらのデータは、アゴニストヒトＣＤ４０  Ａｂの抗腫瘍活性が、ＦｃγＲIIＢ結合の選択的増強を提供するＦｃ改変により増強でき、Ｖ１１  Ｆｃバリアントが、アゴニズム増強に特に効果的であることを示す。
【０３２５】
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【０３２６】
配列表は、成熟重鎖および軽鎖の配列を提供する(すなわち、配列はシグナルペプチドを含まない)。例えばヒト細胞における本発明の抗体の生産用のシグナル配列は配列番号７８に提供される。
【０３２７】
均等物：
当業者は、ここに開示する具体的実施態様の多くの均等物を認識し、または、常套的なレベルを超えない実験を使用して、確認できる。このような均等物は添付する特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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