(57)【要約】  本発明は、従属栄養培養及び／又は混合栄養培養により得られた黄緑色藻を原料としたω−７脂肪酸合成物、及び従属栄養培養及び／又は混合栄養培養方式で黄緑色藻を培養する方法を開示する。前記ω−７脂肪酸合成物において、ω−７脂肪酸の含有量は３０％−７０％である。前記培養方法は培地の栄養物組成、培養条件及び培養過程の操作ステップに関わる。本発明はさらに、前記方法の、黄緑色藻のバイオマス、ω−７脂肪酸を豊富に含む油脂、及び前記バイオマス及び／又は油脂を原料とした製品等の生産における応用を開示する。【選択図】図１
2018520636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄緑色藻に従属栄養培養及び／又は混合栄養培養を行うステップを含むことを特徴とする黄緑色藻の培養方法。
【請求項２】
回分発酵及び／又は連続発酵及び／又は流加発酵のモードで前記黄緑色藻の藻株の従属栄養培養及び／又は混合栄養培養を行うことを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記黄緑色藻は、トリボネマ・アケール（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ａｅｑｕａｌｅ）、トリボネマ・アファイン（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ａｆｆｉｎｅ）、トリボネマ・エレガンス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｇａｙａｎｕｍ、Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｉｎｔｅｒｍｉｘｔｕｍ、トリボネマ・マイナス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｍｉｎｕｓ）、トリボネマ・モノクロン（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｎ）、トリボネマ・アンガスティシマ（Ｔｒｉｃｏｎｅｍａ  ａｎｇｕｓｔｉｓｓｉｍｕｍ）、トリボネマ・ピレニゲルム（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｐｙｒｅｎｉｇｅｒｕｍ）、トリボネマ・レギュレア（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｒｅｇｕｌａｒｅ）、トリトリボネマ・シデロフィルム（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、トリボネマ・スピロタニア（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｓｐｉｒｏｔａｅｎｉａ）、トリボネマ・ウロトリコイデス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｕｌｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、トリボネマ・ウリクラツム（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｕｔｒｉｃｕｌｏｓｕｍ）、トリボネマ・ヴィリド（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリボネマ・ブルガレ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｖｕｌｇａｒｅ）、トリボネマ・ヤマダナム（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｙａｍａｄａｎｕｍ）、トリボネマ・ボンビキナム（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｂｏｍｂｙｃｉｎｕｍ）及びトリボネマ・ビルミクロリス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｖｅｒｍｉｃｈｌｏｒｉｓ）から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせであり、好ましくは、前記黄緑色藻は、トリボネマ・アケール（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ａｅｑｕａｌｅ）、トリボネマ・ブルガレ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｖｕｌｇａｒｅ）、トリボネマ・マイナス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｍｉｎｕｓ）、トリボネマ・ウロトリコイデス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｕｌｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）及びトリボネマ・ウリクラツムＴｒｉｂｏｎｅｍａ  ｕｔｒｉｃｕｌｏｓｕｍから選ばれる１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項４】
前記従属栄養培養及び／又は混合栄養培養のステップは、培養装置に培地を投入して、無菌黄緑色藻の藻株を接種して、培養温度２℃−４０℃、撹拌速度１ｒｐｍ−４００ｒｐｍ、通気速度０．０１ｖｖｍ−１ｖｖｍ、ｐＨ５−１０、光照射強度０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１−１０００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１、好ましくは、培養温度２５℃−３０℃、撹拌速度９０ｒｐｍ−２７０ｒｐｍ、通気速度０．１ｖｖｍ−０．２ｖｖｍ、ｐＨ７−９、光照射強度５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１−２００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２  ｓ−１で培養することを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項５】
前記培地は有機炭素源、窒素源、リン酸塩及びその他の栄養素からなり、
培地において、前記有機炭素源の濃度は０．１ｇ／Ｌ−２００ｇ／Ｌ、窒素源の濃度は０．１ｇ／Ｌ−２０ｇ／Ｌ、リン酸塩の濃度は０．０１ｇ／Ｌ−５ｇ／Ｌであり、好ましくは、培地において、前記有機炭素源の濃度は１０ｇ／Ｌ−６０ｇ／Ｌ、窒素源の濃度は１ｇ／Ｌ−４ｇ／Ｌ、リン酸塩の濃度は０．０５ｇ／Ｌ−１ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項４に記載の培養方法。
【請求項６】
前記有機炭素源はグルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、グリセロアルデヒド、グリセリン、酢酸塩、澱粉加水分解糖、セルロース加水分解糖のうちの１種及び／又は複数種を任意の比率で混合した混合物であり、
前記窒素源は酵母抽出物、ペプトン、アミノ酸、穀物スラリー、硝酸塩、尿素、アンモニウム塩のうちの１種及び／又は複数種を任意の比率で混合した混合物であり、
前記したその他の栄養素は、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸塩、ククエン酸鉄アンモニウム、炭酸塩、ＺｎＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＣｌ２、Ｎａ２ＭｏＯ４、Ｃｏ（ＮＯ３）４、Ｈ３ＢＯ３、ビオチン、ビタミンＢ１及びビタミンＢ１２であることを特徴とする請求項５に記載の培養方法。
【請求項７】
前記培養装置は、液体及び／又は固体基質を収納して黄緑色藻の無菌成長を維持できる密閉又は半密閉装置であり、好ましくは、前記培養装置は、通気型機械撹拌発酵槽、自吸式発酵槽、エアリフト型発酵槽、塔式発酵槽のうちの１種又は２種以上を併用した組合わせであることを特徴とする請求項４に記載の培養方法。
【請求項８】
請求項１に記載の黄緑色藻に従属栄養培養及び／又は混合栄養培養を行うステップと、黄緑色藻の培養液を収集して、黄緑色藻バイオマスを得るステップと、抽出及び／又は圧搾処理を行って、ω−７脂肪酸合成物を得るステップとを備え、
前記黄緑色藻バイオマスを得るステップでは、好ましくは、遠心及び／又は濾過及び／又は空気浮上方式により、黄緑色藻の培養液を収集して、黄緑色藻バイオマスを得ることを特徴とするω−７脂肪酸合成物の生産方法。
【請求項９】
請求項８に記載の生産方法で製造されたω−７脂肪酸合成物であって、ω−７脂肪酸の含有量は総脂肪酸の３０％以上、パルミトレイン酸の含有量は総脂肪酸の３０％以上であることを特徴とするω−７脂肪酸合成物。
【請求項１０】
請求項９に記載のω−７脂肪酸合成物の、食品、サプリメント、飲料、飼料、化学製品、燃料、化粧品、スキンケア用品、栄養補助食品、医薬品及び／又は食品添加剤の生産における応用。
【請求項１１】
請求項１に記載の黄緑色藻の培養方法で生産されるか、又は請求項１の培養方法で製造された黄緑色藻バイオマス及び／又は黄緑色藻油脂及び／又は請求項７の生産方法で製造されたω−７脂肪酸合成物に由来するものであり、
ω−７脂肪酸の含有量は０．１％−９９．９％、好ましくは３０％−７０％であることを特徴とする製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ω−７脂肪酸合成物、及び黄緑色藻を培養して該合成物を生産する方法と応用に関し、具体的には、従属栄養培養及び／又は混合栄養培養方式で黄緑色藻を培養する方法、該方法で培養された黄緑色藻を原料として生産するω−７脂肪酸合成物、及び上記ω−７脂肪酸合成物の、食品、サプリメント、飲料、飼料、化学製品、燃料、化粧品、スキンケア用品、栄養補助食品、医薬品、食品添加剤の製造における応用に関し、微細藻類の生物技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
ω−７脂肪酸は二重結合が七番目の炭素原子に位置する一価不飽和脂肪酸である。パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）は、英語名がｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄで、ω−７脂肪酸の1種であり、化学式がＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨである。パルミトレイン酸はパルミチン酸をｄｅｌｔａ−９デサチュラーゼで触媒して生合成するものである。
【０００３】
パルミトレイン酸は、医薬、サプリメント、工業等の分野において使用価値が高い。たとえば、パルミトレイン酸は、人体のインシュリンに対する感度を高めることができ、糖尿病、代謝症候群に効き、且つ顕著な副作用がないことが証明されている（Ｃａｏ  ＨＭ,ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｐｏｋｉｎｅ,ａ  ｌｉｐｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｏ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｃｅｌｌ,２００８,１３４,９３３−９４４．）。
【０００４】
それに加えて、パルミトレイン酸はＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルを低下させ、炎症を減少させることで心臓疾患、脳卒中のリスクを低減させる。パルミトレイン酸は、細胞膜の流動性を向上させて、血液中の低密度リポタンパク質ＬＤＬコレステロールの含有量を低下させ、血管中のアテローム硬化性プラークの形成に起因する血管の閉塞を減少させ、それにより不整脈を防止して高血圧等を減少させる（Ａｋａｚａｗａ  Ｙ,ｅｔ  ａｌ．Ｐａｌｍｉｔｏｌｅａｔｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｂｉｍ  ａｎｄ  ＰＵＭＡ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｌｉｐｏａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ,２０１０,５２,５８６−５９３．Ｍｉｓｒａ  Ａ,ｅｔ  ａｌ．Ｏｂｅｓｉｔｙ,ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ,ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｆａｔｓ  ａｎｄ  ｏｉｌｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｎｕｔｒ,２０１０,２９,Ｓ２８９−Ｓ３０１．）。
【０００５】
また、パルミトレイン酸は優れた皮膚透過性を有するため、皮膚老化、脂肪蓄積の防止、皮膚の弾力性回復について顕著な作用を有し、老化防止用化粧品の材料として好適である。
【０００６】
また、パルミトレイン酸は、工業での需要量が大きいオクテンの生産に直接利用できる（Ｒｙｂａｋ  Ａ,ｅｔ  ａｌ．Ａｃｙｃｌｉ  ｄｉｅｎｅ  ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｏｎｏｍｅｒ  ｆｒｏｍ  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｃｈｅｍ  Ｓｕｓ  Ｃｈｅｍ,２００８,１,５４２−５４７．）。同時に、パルミトレイン酸は一価不飽和脂肪酸であるため、優れた耐低温性と抗酸化性を有し、高品質バイオディーゼルの製造に適用できる（Ｃａｏ  ＹＪ,ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｍｏｎｏｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ,２０１４,７,５９．Ｋｎｏｔｈｅ  Ｇ,ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｉｌ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ,Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｎｕｔ  ｏｉｌ．Ｅｎｅｒｇｙ  Ｆｕｅｌ,２０１０,２４（３）,２０９８−２１０３．）。
【０００７】
現在、野生植物は市販されるパルミトレイン酸製品の主原料であり、シーバックソーン果実（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｒｈａｍｎｉｄｅｓ）からパルミトレイン酸を抽出して分離する会社は多い。シーバックソーンの果肉には２５％のパルミトレイン酸が蓄積されている（Ｙａｎｇ  Ｂ,ｅｔ  ａｌ．Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  ｓｅａ  ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ  Ｌ．）ｂｅｒｒｉｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｒｇｉｎｓ．Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ,２００１,４９,１９３９−１９４７．）。ヒキノカサ（Ｄｏｘａｎｔｈａ  ｕｎｇｕｉｓ−ｃａｔｉ）及びマカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）もパルミトレイン酸の重要な原料である。ヒキノカサの種子において、パルミトレイン酸の含有量は約６０％、マカダミアにおいて、パルミトレイン酸の含有量は約３０％である。また、ミンクオイルにも少量のパルミトレイン酸が含まれている。
【０００８】
しかしながら、上記したω−７脂肪酸を豊富に含む野生植物や動物は、資源に限りがあり、産量が低く、地理的分布が狭く又は個体群が少ない等の原因で、一般的な油料作物のように大規模な栽培や商業生産が実現されていない。現在、大規模に栽培するダイズ、トウモロコシ等の油料作物の種子は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）及びリノール酸（Ｃ１８：２）を主成分として含み、微量（＜２％）だけのパルミトレイン酸を含み（Ｃａｏ  ＹＪ,ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｍｏｎｏｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ,２０１４,７,５９．Ｉｍｋｅ  Ｌ,ｅｔ  ａｌ．Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ：ａ  ｃｏｍｐｒｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ２０００  ｓｔｒａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＳＡＧ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ,２０１１,１１,１２４．）、食用や工業用のニーズを満足できない（表１）。近年、一部の酵母（たとえば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の脂肪酸にパルミトレイン酸が高比率で含まれていることが見出された。しかしながら、これら酵母は総脂肪含有量が低いことにより、細胞乾燥重量に対するパルミトレイン酸含有量の比率が低い（Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓ  Ａ,ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,２０１１,９０,１１９３−１２０６．Ｌｉｕ  Ｙ,ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｕｄｅ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｔｏ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,２０１１,１０２,３９２７−３９３３．）。
【０００９】
【表１】
2018520636.tif 000003
【００１０】
パルミトレイン酸の有益な効果の発見や承認に伴い、その需要量も大幅に増加している。従って、パルミトレイン酸の含有量が高く、季節や地理的要因により制限されない新しい資源を探すことは原料不足の問題を解決するための最適な対策となる。
【００１１】
黄緑色藻は、緑藻植物門の黄緑藻綱のヘテロネマ目のトリボネマ科のトリボネマ属に属し、その植物体が分岐しない糸状体である。研究した結果、黄緑色藻は、成長速度が高く、油脂含有量が高いという特徴を有し、さらに、脂肪酸におけるパルミトレイン酸の含有量が５０％を超える（Ｗａｎｇ  Ｈ,ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ  Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｍｉｎｕｓ．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ,２０１３,１４２,３９−４４．Ｇｕｏ  Ｆ  Ｊ,ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｅｃｉａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ  Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｓｐ．．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４,１５８,１９−２４．）。従って、黄緑色藻は、従来の野生植物と動物の代わりとして、パルミトレイン酸を生産する新しい原料として使用できる。同時に、高密度且つ大規模に黄緑色藻を培養する方法の開発は求められる。
【００１２】
微細藻類の大規模培養は、主に、独立栄養培養と従属栄養培養の２種の方法がある。そのうち、独立栄養培養は温室効果ガスの二酸化炭素を固定するとともに酸素ガスを放出でき、環境に優しいが、微細藻類細胞間のシャドーイング効果により、光エネルギーの利用は大幅に制限される。細胞濃度が高いほど、このようなシャドーイング効果は明らかであり、細胞成長と油脂合成に大きな影響を及ぼす。従属栄養培養では、細胞成長は主に細胞の有機炭素源の吸収に依存し、光により制限されないため、有機炭素の添加によって細胞の培養密度を迅速に向上させるとともに油脂を効果的に合成し、ただし、光独立栄養培養に比べて、従属栄養培養した藻類は細胞タンパク質及び色素含有量が低い。従って、上記した２種の微細藻類の大規模培養方式はそれぞれ長所と短所を有し、実際に使用される時、必要に応じて選択する。
【００１３】
米国特許ＵＳ２０１３／０１２９７７５Ａ１には、ω−７脂肪酸を豊富に含む合成物及びω−７脂肪酸を分離する方法が開示されている。該特許では、前記合成物は藻類バイオマスに由来するものであると記載されているが、藻の種類を明記せず、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）だけを実施例として簡単に説明した。
【００１４】
米国特許ＵＳ２０１４／０２７５５９６Ａ１には、藻類由来のω−７脂肪酸とω−３脂肪酸の混合合成物が開示されている。該特許の明細書では、複数種の藻類をω−７脂肪酸とω−３脂肪酸混合合成物を生産する由来として挙げるが、そのうち黄緑色藻がなかった。
【００１５】
文献「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｅｅｔ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｆｏｒ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏａｌｇａ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ」（Ｇａｏ  ＣＦ,ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｅｅｔ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｆｏｒ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏａｌｇａ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｅｒｇｙ,２０１０,８７,７５６−７６１．）和「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｂｙ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｓ  ｓｅｅｄ」（Ｈａｎ  ＦＦ,ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｂｙ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｓ  ｓｅｅｄ．  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ,２０１２,１１８,４３１−４３７．）」には、微細藻類の従属栄養培養方法が報道しており、ただし、従属栄養培養した微細藻類はすべて単細胞クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）である。同業者にとっては、クロレラの収集過程は大きな電気エネルギーを消費するか、又は所定量の凝集剤を添加する必要があることが自明である。黄緑色藻は、糸状体の形態のため、布篩で簡単に濾過し又は空気浮上をするだけで効率よく収集でき、収集コストを削減させるとともに、凝集剤を添加しなくてもよい。
【００１６】
黄緑色藻の大規模培養の場合は、先行研究はすべて光合成独立栄養培養に基づくものであり、その従属栄養培養又は混合栄養培養についての研究はまだなく、さらに、当業者は単細胞藻類の従属栄養培養に注目してきたが、多細胞糸状藻類の注目は少なく、従って、従来、黄緑色藻は一般的に独立栄養培養方式により培養と産業への応用を実施し、たとえば、中国特許ＣＮ１０３９６０１１７Ａには、黄緑色藻バイオオイルの製造方法及びそれで製造された黄緑色藻バイオオイルが開示されている。該特許で開示されている方法では、汎用微細藻類培地（すなわちＢＧ１１培地）を用いて、黄緑色藻を光照射培養して黄緑色藻バイオマスを取得し、黄緑色藻の成長方式は光合独立栄養成長であり、黄緑色藻バイオオイルは光合独立栄養成長による黄緑色藻バイオマスに由来する。しかし、環境、季節、生産能力等の要因による制限、及び細胞間のシャドーイング効果によって、黄緑色藻の成長速度、実現可能な細胞密度、及び黄緑色藻のバイオマス収率や油脂の収率に向上する余裕がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記従来技術に対して、本発明は、ω−７脂肪酸を豊富に含む黄緑色藻を従属栄養培養法及び／又は混合栄養培養法により大規模培養を行って、黄緑色藻細胞を得て原料としてω−７脂肪酸合成物を抽出する、有効な解決方法を提供する。細胞におけるω−７脂肪酸（主にパルミトレイン酸）の含有量は３０％−７０％である。本発明の方法は、黄緑色藻の大規模な培養時の環境、季節、生産能力等の要因による制限を解消して、黄緑色藻の繁殖速度、バイオマスの収率及び油脂収率を効果的に向上させ、黄緑色藻の大規模な光独立栄養培養過程に存在する問題を解決するために、ω−７脂肪酸のバイオマス資源の問題を解決し、重要な技術的手段を提供する。
【００１８】
用語説明
特記のない限り、本発明における「従属栄養培養」とは、光照射を提供せずに有機炭素源を提供する条件下で黄緑色藻を培養することを意味するため、「発酵」として理解でき、具体的には、黄緑色藻培養時に光照射を提供しないが、培地に適量の有機炭素源、窒素源、リン酸塩及びその他の栄養素を含むことを意味する。従属栄養培養条件において、黄緑色藻は有機炭素源をエネルギー源及びバイオマス合成用の炭素源とする。
前記「混合栄養培養」とは、光照射を提供すると同時に有機炭素源を提供する条件下で黄緑色藻を培養することを意味し、従って、「適切な光照射下での発酵」として理解でき、具体的には、黄緑色藻培養時、適量の光照射を提供すると同時に、培地に適量の有機炭素源、窒素源、リン酸塩及びその他の栄養素を含むことを意味する。混合栄養培養条件において、黄緑色藻は、光エネルギー及び／又は有機炭素源をエネルギー源として、有機炭素源及び／又は二酸化炭素をバイオマス合成用の炭素源とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の第一態様は、黄緑色藻に従属栄養培養及び／又は混合栄養培養を行うステップを含む黄緑色藻の培養方法を提供する。
【００２０】
上記培養方法では、前記従属栄養培養及び／又は混合栄養培養のステップは、培養装置に培地を投入して、無菌黄緑色藻の藻株を接種して、培養温度２℃−４０℃、撹拌速度１ｒｐｍ−４００ｒｐｍ、通気速度０．０１ｖｖｍ−１ｖｖｍ、ｐＨ５−１０、光照射強度０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２  ｓ−１−１０００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２  ｓ−１で培養することを含む。
【００２１】
好ましくは、前記培養温度は２５℃−３０℃、撹拌速度は９０ｒｐｍ−２７０ｒｐｍ、通気速度は０．１ｖｖｍ−０．２ｖｖｍ、ｐＨは７−９、光照射強度は５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２  ｓ−１−２００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２  ｓ−１である。好ましい培養条件では、黄緑色藻は、同じ培養時間内でより高いバイオマス量と油脂含有量を実現できる。
【００２２】
上記培養方法では、前記培地は、有機炭素源、窒素源、リン酸塩及びその他の栄養素からなり、培地において、前記有機炭素源の濃度は０．１ｇ／Ｌ−２００ｇ／Ｌ、窒素源の濃度は０．１ｇ／Ｌ−２０ｇ／Ｌ、リン酸塩の濃度は０．０１ｇ／Ｌ−５ｇ／Ｌである。
【００２３】
好ましくは、培地において、前記有機炭素源の濃度は１０ｇ／Ｌ−６０ｇ／Ｌ、窒素源の濃度は１ｇ／Ｌ−４ｇ／Ｌ、リン酸塩の濃度は０．０５ｇ／Ｌ−１ｇ／Ｌである。
【００２４】
前記有機炭素源は、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、グリセロアルデヒド、グリセリン、酢酸塩、澱粉加水分解糖、セルロース加水分解糖のうちの１種及び／又は複数種を任意の比率で混合した混合物であってもよい。
【００２５】
好ましくは、前記有機炭素源はグルコースである。
【００２６】
前記窒素源は、酵母抽出物、ペプトン、アミノ酸、穀物スラリー、硝酸塩、尿素、アンモニウム塩のうちの１種及び／又は複数種を任意の比率で混合した混合物であってもよい。
【００２７】
好ましくは、前記窒素源はペプトンである。
【００２８】
前記その他の栄養素は、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸塩、ククエン酸鉄アンモニウム、炭酸塩、ＺｎＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＣｌ２、Ｎａ２ＭｏＯ４、Ｃｏ（ＮＯ３）４、Ｈ３ＢＯ３、ビオチン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２である。
【００２９】
上記方法では、前記培養装置は、液体及び／又は固体基質を収納するとともに黄緑色藻の無菌成長を維持できる密閉又は半密閉装置である。前記培養装置は、通気型機械撹拌発酵槽、自吸式発酵槽、エアリフト型発酵槽、塔式発酵槽を含むが、それらに制限されない。
【００３０】
上記培養方法では、前記無菌黄緑色藻の藻株の製造手段としては、適量の抗生物質を黄緑色藻の藻液に添加し、２日間培養後、黄緑色藻の藻体を無菌水に移し替えて再懸濁させる。バイオ技術分野の公知の検査手段により、再懸濁液が無菌であるか否かをテストする。本ステップを、無菌の黄緑色藻の藻株が得られるまで繰り返す。
【００３１】
前記適量の抗生物質とは、ワーキング溶液の濃度が２０ｍｇ／Ｌ−２００ｍｇ／Ｌであるクロロマイセチン、カナマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン又はその他の抗生物質である。
【００３２】
上記培養方法では、黄緑色藻の従属栄養培養及び／又は混合栄養培養方法は、一般的に黄緑色藻の発酵培養と呼ばれる。黄緑色藻の発酵培養方式は回分発酵及び／又は連続（流加）発酵及び／又は流加発酵である。
【００３３】
本発明の一実施例では、回分発酵と流加発酵の方式によれば、黄緑色藻を６日間培養すると、バイオマスはそれぞれ２８ｇ／Ｌと３０ｇ／Ｌに達する。
【００３４】
本発明に係る黄緑色藻は、トリボネマ属の２０種類余りの藻株であり、トリボネマ・アケール（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ａｅｑｕａｌｅ）、トリボネマ・アファイン（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ａｆｆｉｎｅ）、トリボネマ・エレガンス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｇａｙａｎｕｍ、Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｉｎｔｅｒｍｉｘｔｕｍ、トリボネマ・マイナス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｍｉｎｕｓ）、トリボネマ・モノクロン（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｎ）、トリボネマ・アンガスティシマ（Ｔｒｉｃｏｎｅｍａ  ａｎｇｕｓｔｉｓｓｉｍｕｍ）、トリボネマ・ピレニゲルム（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｐｙｒｅｎｉｇｅｒｕｍ）、トリボネマ・レギュレア（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｒｅｇｕｌａｒｅ）、トリトリボネマ・シデロフィルム（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、トリボネマ・スピロタニア（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｓｐｉｒｏｔａｅｎｉａ）、トリボネマ・ウロトリコイデス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｕｌｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、トリボネマ・ウリクラツム（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｕｔｒｉｃｕｌｏｓｕｍ）、トリボネマ・ヴィリド（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリボネマ・ブルガレ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｖｕｌｇａｒｅ）、トリボネマ・ヤマダナム（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｙａｍａｄａｎｕｍ）、トリボネマ・ボンビキナム（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｂｏｍｂｙｃｉｎｕｍ）及びトリボネマ・ビルミクロリス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｖｅｒｍｉｃｈｌｏｒｉｓ）を含むが、それらに制限されない。
好ましくは、本発明の前記黄緑色藻はトリボネマ・アケール（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ａｅｑｕａｌｅ）、トリボネマ・ブルガレ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｖｕｌｇａｒｅ）、トリボネマ・マイナス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｍｉｎｕｓ）、トリボネマ・ウロトリコイデス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ｕｌｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）及びトリボネマ・ウリクラツムＴｒｉｂｏｎｅｍａ  ｕｔｒｉｃｕｌｏｓｕｍを含むが、それらに制限されない。
【００３５】
上記培養方法では、培養する黄緑色藻は、上記トリボネマ属から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせである。
【００３６】
本発明の第二態様は、黄緑色藻に従属栄養培養及び／又は混合栄養培養を行うステップと、黄緑色藻の培養液を収集して、黄緑色藻バイオマスを得るステップと、抽出及び／又は圧搾処理して、ω−７脂肪酸合成物を得るステップとを含むω−７脂肪酸合成物の生産方法を提供する。
【００３７】
上記生産方法では、バイオ技術分野の公知の技術的手段、例えば遠心、濾過、空気浮上等を用いて、黄緑色藻の培養液を収集して、黄緑色藻バイオマスを得る。
【００３８】
上記生産方法では、黄緑色藻バイオマスが得られた後、本分野の公知の抽出方法、例えばクロロホルム−メタノール抽出、ノルマルヘキサン抽出、超臨界二酸化炭素抽出等、又は圧搾方法、例えば間間圧搾、冷間圧搾等を用いて処理して、黄緑色藻油脂及びω−７脂肪酸合成物を得る。
【００３９】
本発明の第三態様は、ω−７脂肪酸の含有量が３０％−７０％、パルミトレイン酸の含有量が３０％−７０％であるω−７脂肪酸合成物を提供する。
【００４０】
上記開示されているω−７脂肪酸合成物は、食品、サプリメント、飲料、飼料、化学製品、燃料、化粧品、スキンケア用品、栄養補助食品、医薬品や食品添加剤の生産に用いられ得るが、それらに制限されない。
【００４１】
本発明の前記培養方法で得られた黄緑色藻バイオマスは、抽出又は圧搾処理を行わずに、食品、サプリメント、飲料、飼料、化学製品、燃料、化粧品、スキンケア用品、栄養補助食品、医薬品、食品添加剤の生産に用いられ得るが、それらに制限されない。
【００４２】
本発明で生産されたω−７脂肪酸合成物及び／又は黄緑色藻バイオマスは、食品や薬品の分野において周知するものであり、ω−７脂肪酸は、人体のインシュリンに対する感度を高めることができ、糖尿病、代謝症候群に効き、且つ顕著な副作用を有することが証明される。従って、本発明で開示されているω−７脂肪酸合成物、黄緑色藻の培養方法、パルミトレイン酸を豊富に含む製品は医薬品分野に適用できる。
【００４３】
当業者が分かるように、ω−７脂肪酸は、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルを低下させ、炎症を減少させることで心臓疾患、脳卒中のリスクを低下させ、ω−７脂肪酸は、細胞膜の流動性を向上させて、血液中の低密度リポタンパク質ＬＤＬコレステロールの含有量を低下させ、血管中のアテローム硬化性プラーク形成に起因する血管の閉塞を減少させ、それにより不整脈を防止して高血圧等を減少させる。従って、本発明で開示されているω−７脂肪酸合成物、黄緑色藻の培養方法、パルミトレイン酸を豊富に含む製品は、サプリメント、栄養補助食品分野に適用できる。
【００４４】
当業者が分かるように、ω−７脂肪酸は、優れた皮膚透過性を有し、皮膚老化防止、脂肪蓄積、皮膚の弾力性回復に対して顕著な作用を果たし、老化防止用化粧品の原料として好適である。従って、本発明で開示されているω−７脂肪酸合成物、黄緑色藻の培養方法、パルミトレイン酸を豊富に含む製品は、化粧品、スキンケア用品の分野に適用できる。
【００４５】
また、微細藻類は、食品、飲料、飼料、食品添加剤の分野に幅広く使用されている。黄緑色藻は、微細藻類の一種として、同様に前記関連分野に適用できる。
【００４６】
本発明の別の用途では、パルミトレイン酸は、工業での需要量が大きいオクテンの生産に直接利用できる。同時に、パルミトレイン酸は一価不飽和脂肪酸であるため、優れた耐低温性と抗酸化性を有し、高品質バイオディーゼルの製造に適用できる。従って、本発明で開示されているω−７脂肪酸合成物（主成分はパルミトレイン酸である）、黄緑色藻の培養方法、パルミトレイン酸を豊富に含む製品は、化学製品、燃料の分野に適用できる。
【００４７】
本発明の第四態様は、本発明で開示されている黄緑色藻の培養方法により生産されるか、又は本発明で開示されている培養方法で得られた黄緑色藻バイオマス及び／又は黄緑色藻油脂及び／又はω−７脂肪酸合成物に由来する製品を提供する。
【００４８】
前記製品は、食品、サプリメント、飲料、飼料、化学製品、燃料、化粧品、スキンケア用品、栄養補助食品、医薬品、食品添加剤であるが、それらに制限されない。
【発明の効果】
【００４９】
本発明の有益な効果は以下のとおりである。
【００５０】
従来、ω−７脂肪酸の原料は主に野生植物と動物であり、種子が小さくて、産量が低いため、地理的分布が狭く又は個体群が少ない等の原因で、ω−７脂肪酸の原料不足を引き起こす。本発明では、ω−７脂肪酸を豊富に含む黄緑色藻をω−７脂肪酸を生産するための新しい原料とし、さらに黄緑色藻の繁殖速度、バイオマス収率及び油脂収率を効果的に向上できる培養方法を提供し、微細藻類の大規模な培養時に環境、季節、生産能力等の要因による制限を解消し、ω−７脂肪酸の原料不足の現状を効果的に解決する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】黄緑色藻の従属栄養培養、混合栄養培養及び光合独立栄養培養条件での成長比較である。
【図２】黄緑色藻の従属栄養培養、混合栄養培養及び光合独立栄養培養条件での油脂含有量比較である。
【図３】黄緑色藻の従属栄養培養、混合栄養培養及び光合独立栄養培養条件での脂肪酸組成の比較である。
【図４】黄緑色藻の各種の有機炭素源条件での成長状況である。
【図５】黄緑色藻の各種のグルコース初期濃度条件での成長状況である。
【図６】黄緑色藻の各種の撹拌速度条件での成長状況である。
【図７】黄緑色藻の各種の初期接種量条件での成長状況である。
【図８】回分発酵方式での黄緑色藻の成長曲線とグルコース濃度変化曲線である。
【図９】流加発酵方式での黄緑色藻の成長曲線とグルコース濃度変化曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
実施例をもって本発明をより説明するが、下記説明は本発明を解釈するために過ぎず、その内容を限定するものではない。
【００５３】
本発明に使用される黄緑色藻はいずれも寄託された野生種であり、当業者であれば、市販品として入手し、又は天然水域から分離して精製することができ、特許手続による生物材料の保藏を必要としない。
【００５４】
実施例１
黄緑色藻の従属栄養及び／又は混合栄養培養方法は、具体的には、
（１）バイオ技術分野の公知の技術的手段により、適量の抗生物質を黄緑色藻の藻液に添加して、２日間培養後、黄緑色藻の藻体を無菌水に移し替えて再懸濁させた。バイオ技術分野の公知の検査手段により再懸濁液が無菌であるか否かをテストした。本ステップを、無菌の黄緑色藻の藻株が得られるまで繰り返した。前記適量の抗生物質とは、ワーキング溶液の濃度が２０ｍｇ／Ｌ−２００ｍｇ／Ｌのクロロマイセチン又はカナマイシン又はストレプトマイシン又はアンピシリン又はその他抗生物質である。
（２）有機炭素源、窒素源、リン酸塩及びその他の栄養素を含有する培地を培養装置に投入して、１１５℃で２０分間滅菌した。
（３）ステップ（２）における培地の温度が室温に下げられた後、ステップ（１）で得られた無菌黄緑色藻の藻株を培養装置に接種し、従属栄養培養及び／又は混合栄養培養を行った。従属栄養培養の条件としては、培地においてグルコース濃度が１０ｇ／Ｌで且つ光照射を提供せず、混合栄養培養の条件としては、培地においてグルコース濃度が１０ｇ／Ｌで且つ５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２  ｓ−１の光照射を提供し、培養温度は２５℃、シェーカーの回転数は１８０ｒｐｍである。
（４）培養終了後、バイオ技術分野の公知の技術的手段、例えば濾過、空気浮上等を用いて、黄緑色藻の培養液を収集して、黄緑色藻バイオマスを得た。
【００５５】
黄緑色藻バイオマスが得られた後、本分野の公知の抽出方法、例えば、クロロホルム−メタノール抽出、ノルマルヘキサン抽出等、又は圧搾方法、例えば熱間圧搾、冷間圧搾等により処理して、黄緑色藻油脂及びω−７脂肪酸合成物を得た。
【００５６】
従属栄養培養と混合栄養培養条件において、黄緑色藻の脂肪酸組成は表２に示される。従属栄養培養条件において、黄緑色藻の総脂肪含有量は乾燥バイオマスの４０．３％、ω−７脂肪酸の含有量は総脂肪酸の５８．４％、パルミトレイン酸の含有量は総脂肪酸の５８．４％であった。混合栄養培養条件において、黄緑色藻の総脂肪含有量は乾燥バイオマスの４３．５％、ω−７脂肪酸の含有量は総脂肪酸の５０．１％、パルミトレイン酸の含有量は総脂肪酸の５０．１％であった。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
実施例２
黄緑色藻の、従属栄養培養、混合栄養培養及び光合独立栄養培養条件での成長、油脂含有量及び脂肪酸組成
【００５９】
従属栄養培養、混合栄養培養及び光合独立栄養培養条件下で、それぞれ黄緑色藻を培養した。従属栄養培養条件としては、グルコース濃度は１０ｇ／Ｌ、ペプトン濃度は２ｇ／Ｌ、その他の栄養塩の濃度はＢＧ１１培地と同様であり、光照射強度は０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１、初期バイオマスは０．３ｇ／Ｌであった。混合栄養培養条件としては、グルコース濃度は１０ｇ／Ｌ、ペプトン濃度は２ｇ／Ｌ、その他栄養塩の濃度はＢＧ１１培地と同様であり、光照射強度は５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１、初期バイオマスは０．３ｇ／Ｌであった。光合独立栄養培養条件としては、グルコース濃度は０ｇ／Ｌ、ペプトン濃度は０ｇ／Ｌ、その他の栄養塩の濃度はＢＧ１１培地と同様であり、光照射強度は５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１、初期バイオマスは０．３ｇ／Ｌであった。前記ＢＧ１１培地の各栄養成分は表３に示される。２５０ｍＬ三角フラスコを培養容器として、単一の培養体積は１００ｍＬであった。前記三角フラスコをシェーカーに入れて、温度とシェーカーの回転数をそれぞれ２５℃と１８０ｒｐｍに設定して、振とう培養を行った。培養過程において、毎日、所定時刻にサンプリングしてバイオマス（乾燥重量）を測定した。培養終了後、黄緑色藻バイオマスを収集して、凍結乾燥させて、クロロホルム−メタノール溶液で黄緑色藻油脂を抽出し、ガスクロマトグラフィーによりその脂肪酸組成を分析した。
【００６０】
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【００６１】
図１に示されるように、三種類の異なる培養方式では、黄緑色藻の混合栄養培養時の成長速度は最高で、実現可能な最大バイオマスも最高で、２日間培養後、バイオマスは５．５ｇ／Ｌに達する。従属栄養培養条件において、黄緑色藻の成長速度はわずかに低下し、実現可能な最大バイオマスも低下し、３日間培養後、バイオマスは２．７ｇ／Ｌ程度になる。光合独立栄養培養条件において、黄緑色藻の成長速度は大幅に低下し、培養終了時に実現可能なバイオマスは０．８ｇ／Ｌしかなく、別の２種の培養方式よりもはるかに大きい。以上から明らかなように、本発明で提供する黄緑色藻の従属栄養培養と混合栄養培養方法は、黄緑色藻を用いてより短時間内でより大きなバイオマスを製造できる。
【００６２】
図２に示されるように、三種類の異なる培養方式では、混合栄養培養では、黄緑色藻の油脂含有量は最高であり、従属栄養培養はそれに次ぎ、光合独立栄養培養は最低である。三種類の差別は小さく、且つ油脂含有量はいずれも４０％程度に維持される。以上から明らかなように、本発明で提供した黄緑色藻の従属栄養培養と混合栄養培養方法は、黄緑色藻の成長速度とバイオマスを向上させると同時に、その高油脂含有量の特性を保持する。
【００６３】
図３は、三種類の異なる培養方式での黄緑色藻の脂肪酸組成を示す。三種類の培養方式では、黄緑色藻の脂肪酸組成はいずれもＣ１６：０とＣ１６：１（すなわちパルミトレイン酸）を主成分とし、この２種の脂肪酸の含有量は約総脂肪酸の８０％程度であり、Ｃ１６：１の含有量は最高で、約総脂肪酸の５０％−６０％である。なお、混合栄養培養と光合独立栄養培養の２種の条件では、黄緑色藻の脂肪酸組成はほぼ同じであり、従属栄養培養条件では、黄緑色藻の脂肪酸組成は前記両者と一定の差異があり、具体的には、Ｃ１６：０の含有量は２８％から１９％に低下し、さらに、Ｃ１６：１の含有量は５０％から５８％に向上する。
【００６４】
実施例３
各種の有機炭素源による黄緑色藻成長への影響
混合栄養培養条件において、グルコース、グリセリン及び酢酸ナトリウムをそれぞれ有機炭素源として黄緑色藻を培養した。前記混合栄養培養条件としては、有機炭素源の濃度は１０ｇ／Ｌ、ペプトン濃度は２ｇ／Ｌ、その他の栄養塩の濃度はＢＧ１１培地と同様であり、光照射強度は５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１、初期バイオマスは０．３ｇ／Ｌであった。２５０ｍＬ三角フラスコを培養容器として、単一の培養体積を１００ｍＬとした。前記三角フラスコをシェーカーに入れて、温度とシェーカー回転数をそれぞれ２５℃と１８０ｒｐｍに設定して、振とう培養を行った。培養過程において、毎日、所定時刻にサンプリングしてそのバイオマス（乾燥重量）を測定した。
【００６５】
図４に示されるように、本実施例で使用された三種類の有機炭素源のうち、グルコースの効果は最適である。黄緑色藻はグルコースを用いて迅速に成長でき、２日間培養後、バイオマスは５．５ｇ／Ｌに達する。グリセリンと酢酸ナトリウムを黄緑色藻成長用の有機炭素源として使用してもよいが、成長速度は低い。
【００６６】
実施例４
グルコース初期濃度による黄緑色藻成長への影響
混合栄養培養条件において、グルコースを有機炭素源として黄緑色藻を培養した。前記混合栄養培養条件としては、グルコース濃度は５ｇ／Ｌ〜６０ｇ／Ｌ、ペプトン濃度は２ｇ／Ｌ、その他の栄養塩の濃度はＢＧ１１培地と同様であり、光照射強度は５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１、初期バイオマスは０．３ｇ／Ｌであった。２５０ｍＬ三角フラスコを培養容器として、単一の培養体積を１００ｍＬとした。前記三角フラスコをシェーカーに入れて、温度とシェーカーの回転数をそれぞれ２５℃と１８０ｒｐｍとして設定して、振とう培養を行った。培養過程において、毎日、所定時刻にサンプリングしてそのバイオマス（乾燥重量）を測定した。
【００６７】
図５に示されるように、グルコース初期濃度の増加に伴い、黄緑色藻が実現可能な最高バイオマスも徐々に向上し、グルコース初期濃度が５ｇ／Ｌである場合、実現可能な最大バイオマスは３ｇ／Ｌ程度であり、グルコース初期濃度が６０ｇ／Ｌに増加すると、実現可能な最大バイオマスは２８ｇ／Ｌ程度であった。グルコース初期濃度の増加に伴い、最大バイオマスに達するのに必要な培養時間も徐々に増加した。なお、グルコース初期濃度が高い時、培養してから１−２日間内、黄緑色藻の成長は抑制されるが、この期間において、成長速度は低く、培養時間の延長に連れて、このような抑制作用は低下し、黄緑色藻のバイオマスは迅速に増加する。
【００６８】
実施例５
撹拌速度による黄緑色藻成長への影響
混合栄養培養条件において、グルコースを有機炭素源として黄緑色藻を培養した。前記混合栄養培養条件としては、グルコース濃度は１０ｇ／Ｌ、ペプトン濃度は２ｇ／Ｌ、その他の栄養塩の濃度はＢＧ１１培地として同様であり、光照射強度は５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１、初期バイオマスは０．３ｇ／Ｌであった。２５０ｍＬ三角フラスコを培養容器として、単一の培養体積を１００ｍＬとした。前記三角フラスコをシェーカーに入れて、温度設定を２５℃、撹拌速度を９０〜２７０ｒｐｍに設定して、振とう培養を行った。培養過程において、毎日、所定時刻にサンプリングしてそのバイオマス（乾燥重量）を測定した。
【００６９】
図６に示されるように、撹拌速度が９０ｒｐｍと１８０ｒｐｍである時、黄緑色藻の成長速度は低く、２日間培養後、安定期に達し、且つ両方は実現可能な最大バイオマスの差異が小さい。撹拌速度が２７０ｒｐｍである時、黄緑色藻の成長は大幅に低下し、バイオマスは培養過程にわたり増加して、５ｇ／Ｌ程度に達する。この結果から明らかなように、温和な撹拌環境よりも、黄緑色藻の成長に役立つ。
【００７０】
実施例６
初期接種量による黄緑色藻成長への影響
混合栄養培養条件において、グルコースを有機炭素源として黄緑色藻を培養した。前記混合栄養培養条件としては、グルコース濃度は１０ｇ／Ｌ、ペプトン濃度は２ｇ／Ｌ、その他の栄養塩の濃度はＢＧ１１培地と同様であり、光照射強度は５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１、培養温度は２５℃、初期接種量は０．１〜３ｇ／Ｌであった。１５００ｍＬ円柱状エアリフト型式反応器を培養装置として、単一の培養体積を１０００ｍＬとした。濾過後の空気を、通気速度０．１ｖｖｍで前記円柱状エアリフト型式反応器に導入した。培養過程において、毎日、所定時刻にサンプリングしてそのバイオマス（乾燥重量）を測定した。
【００７１】
結果は図７に示されるとおりであり、初期接種量の増加に伴い、黄緑色藻が実現可能な最大バイオマスは大幅に向上し、且つ最大バイオマスに達するのに必要な培養時間も大幅に短縮される。
【００７２】
実施例７
黄緑色藻の回分発酵培養
混合栄養培養条件において、グルコースを有機炭素源として黄緑色藻に回分発酵培養を行った。前記混合栄養培養条件としては、グルコース濃度は６０ｇ／Ｌ、ペプトン濃度は１２ｇ／Ｌ、リン酸塩は０．４ｇ／Ｌ、その他の栄養塩の濃度はＢＧ１１培地と同様であり、初期接種量は０．３ｇ／Ｌであった。１０Ｌ透光型発酵槽を培養装置として、培養体積を８Ｌとした。外付けＬＥＤランプを光源として、光照射強度を５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１とした。濾過後の空気を、通気速度０．１ｖｖｍで前記発酵槽に導入した。培養温度と撹拌速度はそれぞれ２５℃と１８０ｒｐｍに設定される。培養過程において、毎日、所定時刻にサンプリングしてそのバイオマス（乾燥重量）と培地中のグルコース残留量を測定した。前記グルコース残留量の測定は生物センサにより行われる。
【００７３】
図８は回分発酵方式での黄緑色藻の成長曲線と培地中のグルコース濃度の変化曲線を示す。図から明らかなように、培養してから１日目に、黄緑色藻の成長は抑制され、次に、黄緑色藻は迅速に成長し始め、それに対応して、培養液中のグルコース含有量も迅速に低下する。培養してから６日間目に、培地中のグルコース含有量は０に低下し、その際、黄緑色藻のバイオマスは２８ｇ／Ｌに達する。
【００７４】
実施例８
黄緑色藻の流加発酵培養
混合栄養培養条件において、グルコースを有機炭素源として黄緑色藻に流加発酵培養を行った。前記混合栄養培養条件としては、グルコース濃度は１０ｇ／Ｌ、ペプトン濃度は２ｇ／Ｌ、リン酸塩は０．４ｇ／Ｌ、その他の栄養塩の濃度はＢＧ１１培地と同様であり、初期接種量は０．３ｇ／Ｌであった。毎日、培地にグルコース１０ｇ／Ｌ及びペプトン２ｇ／Ｌを添加した。１０Ｌ透光型発酵槽を培養装置、培養体積を８Ｌとした。外付けＬＥＤランプを光源、光照射強度を５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１とした。濾過後の空気を、通気速度０．１ｖｖｍで前記発酵槽に導入した。培養温度と撹拌速度はそれぞれ２５℃と１８０ｒｐｍに設定される。培養過程において、毎日、所定時刻にサンプリングしてそのバイオマス（乾燥重量）と培地中のグルコース残留量を測定した。前記グルコース残留量の測定は生物センサにより行われる。なお、毎日、サンプリング過程はグルコースとペプトンを添加する前に行われる。
【００７５】
図９は流加発酵方式での黄緑色藻の成長曲線と培地中のグルコース濃度変化曲線を示す。図から明らかなように、培養開始後、黄緑色藻は培養終了まで高速成長した。それに対応して、毎日添加したグルコースは翌日グルコースを添加する前に完全に黄緑色藻により吸収されて利用されてもよい。黄緑色藻は、６日間流加発酵培養後、バイオマスが３０ｇ／Ｌ、バイオマス収率が５ｇ／Ｌ／ｄになる。培養終了後、黄緑色藻バイオマスを収集して、凍結乾燥させた後、クロロホルム−メタノール溶液で黄緑色藻油脂を抽出し、測定した結果、黄緑色藻油脂の含有量はバイオマス乾燥重量の４５％に達し、油脂の収率は２．２５ｇ／Ｌ／ｄである。ガスクロマトグラフィーによりその脂肪酸組成を分析した結果、ω−７脂肪酸の含有量は総脂肪酸の５０％、ω−７脂肪酸の収率は１．１２５ｇ／Ｌ／ｄに達する。黄緑色藻において、前記ω−７脂肪酸はパルミトレイン酸であり、つまり、パルミトレイン酸の含有量は総脂肪酸の５０％、パルミトレイン酸の収率は１．１２５ｇ／Ｌ／ｄである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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