(57)【要約】  心臓構築物を作製する方法は、中間心臓構築物を形成させるために、生きた哺乳類の心臓細胞（例えば、個々の細胞、オルガノイドまたはスフェロイド）、フィブリノーゲン、ゼラチンおよび水を含む混合物を支持体上に堆積させるステップと、任意選択的に、前記中間構築物を支持するように、構造支持材（例えば、ポリカプロラクトン）を前記混合物とともに共堆積させるステップと、次いで、フィブリノーゲンを架橋し、フィブリンヒドロゲル中で共に自発拍動する生きた心臓細胞から構成される心臓構築物を（最初の心臓細胞の成熟状態によって、必要に応じて介在インキュベーションとともに）作製するのに有効な量のトロンビンを、前記構築物に接触させるステップとによって行われる。作製された構築物およびそれを使用する方法も述べる。
2018535659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓構築物を作製する方法であって、
中間心臓構築物を形成させるために、生きた哺乳類の心臓細胞（例えば、個々の細胞、オルガノイドまたはスフェロイド）、フィブリノーゲン、ゼラチンおよび水を含む混合物を支持体上に堆積させるステップと、
任意選択的に、前記中間構築物を支持するように、構造支持材（例えば、ポリカプロラクトン）を前記混合物とともに共堆積させるステップと、次いで、
フィブリノーゲンを架橋し、フィブリンヒドロゲル中で共に自発拍動する生きた心臓細胞から構成される心臓構築物を（最初の心臓細胞の成熟状態によって、必要に応じて介在インキュベーションとともに）作製するのに有効な量のトロンビンを、前記構築物に接触させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記心臓細胞が、心筋細胞の懸滴培養および／またはその３ｄバイオプリンティングにより生成されるオルガノイドの形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心臓構築物が、有効量のイソプロテレノールの投与によって頻度が増加し、有効量のキニジンの投与によって頻度が減少する自発拍動を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記心臓構築物の心臓細胞がＶＥＧＦ、アクチニンおよび／または心筋トロポニンＴを発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により作製される心臓構築物。
【請求項６】
（ａ）入口および出口を有する第１のチャンバー、ならびに
（ｂ）架橋フィブリンヒドロゲルおよび上記ヒドロゲル中で共に自発拍動する心臓細胞を含む、前記一次チャンバー内の心臓構築物
を含む装置。
【請求項７】
前記心臓構築物の心臓細胞がＶＥＧＦ、アクチニンおよび／または心筋トロポニンＴを発現する、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
（ｃ）（例えば、前記心臓構築物の拍動数をモニターするために）前記心臓構築物と作動可能に連結された心臓モニター（例えば、カメラ、電極または電極アレイ等）
をさらに含む、請求項６または７に記載の装置。
【請求項９】
（ｄ）前記一次チャンバーと流体連通した、少なくとも１つの二次チャンバー、および
（ｅ）前記二次チャンバー内の生きた哺乳類肝臓組織構築物
をさらに含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
（ｆ）前記一次および／または二次チャンバーと（例えば、それらの間の導管を介して）流体連通した少なくとも１つの追加の二次チャンバー、ならびに
（ｇ）前記追加の二次チャンバーのそれぞれの中に、少なくとも１つの追加の生きている組織構築物（例えば、肺、血管、腸、脳、結腸等）
をさらに含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
（ｈ）前記一次チャンバー内、前記二次チャンバーのそれぞれの中、およびそれらの間の前記導管内において、増殖培地
をさらに含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
前記一次および／または二次チャンバーにおいて、光学的に透明な窓をさらに含む、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記一次チャンバーに接続された流体入口、および前記二次チャンバーそれぞれに接続された流体出口をさらに含む、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
前記二次チャンバーが互いに直列、並列またはそれらの組合せにより接続されている、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記一次チャンバーから前記二次チャンバーに前記増殖培地を循環させるための、前記一次チャンバーと作動可能に連結されたポンプをさらに含む、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
前記一次チャンバーと作動可能に連結された増殖培地貯槽および／またはバブルトラップをさらに含む、請求項６〜１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記二次チャンバーを経て循環する増殖培地を前記一次チャンバーに戻すための、前記一次および二次チャンバー（ならびに前記ポンプ、ならびに貯槽および／または存在する場合にはバブルトラップ）と作動可能に連結された戻り導管をさらに含む、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記一次および二次チャンバー内のゲル状の一過性保護媒体とともに、任意選択的に前記容器内の冷却要素と一緒に、容器に包装された、請求項６〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
少なくとも１つの試験化合物を生理学的活性についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項６〜１７のいずれか１項に記載の装置を用意するステップと、
（ｂ）任意選択的に、前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーに増殖培地を循環させるステップと、
（ｃ）（例えば、試験化合物を増殖培地に加えることにより）少なくとも１つの試験化合物を構築物に投与するステップと、
（ｄ）前記試験化合物を投与しない場合に観測されるものと比較した場合の、前記心臓構築物の拍動頻度における変化を判定するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの試験化合物が、互いに同時に投与される少なくとも２つの異なる試験化合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記判定するステップが、互いに連続的に間隔をあけた複数の時点に（例えば、少なくとも１日の間隔をあけた少なくとも２つの機会に）行われる、請求項１９または２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、その開示がその全体として参照により本出願の一部をなすものである、２０１５年１０月２日に出願した米国仮特許出願第６２／２３６，３４８号の恩恵および優先権を主張するものである。
【０００２】
［政府支援］
本発明は、宇宙海戦システム太平洋センター（Ｓｐａｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｖａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｐａｃｉｆｉｃ）（ＳＳＣ  ＰＡＣＩＦＩＣ）の国防脅威削減局（Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｔｈｒｅａｔ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ）（ＤＴＲＡ）により授与された契約第Ｎ６６００１−１３−Ｃ−２０２７号および国立がん研究所により交付された助成金第ＮＣＩ  ＣＣＳＧ  Ｐ３０ＣＡ０１２１９７号のもとでの政府支援によってなされた。米国政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生理学および薬理学研究に有用なオルガノイドならびにそれを含む統合システムに関する。
【背景技術】
【０００４】
身体に対する薬剤ならびに化学剤および生物剤の効果を試験するための改善された生物学的モデルシステムが、決定的に必要とされている１，２。現在のところ、動物モデルは、試験のための究極の判断基準としての役割を果たしているが、動物における外部刺激に対する反応がヒトにおける反応を必ずしも予測するものでない３ため、そのようなモデルに関連する欠点としては、高い費用および結果の解釈の不確かさなどがある。種差および結果の変動のため、動物モデルは、ヒト有効性および毒性のしばしば不十分な予測材料であり、これが薬物脱落率に寄与する４。ヒト組織を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムは、この問題を回避する助けとなるものであるが、伝統的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２Ｄ培養は、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織の３Ｄ微小環境を再現することができない５，６。患者に拡大した場合、薬物の拡散速度論が劇的に変化し、２Ｄにおいて有効な薬物の用量が有効でなく、２Ｄにおける細胞−細胞間／細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）間の相互作用がしばしば不正確であり、これが細胞機能の喪失または変化に寄与する５，７，８。ｉｎ  ｖｉｖｏ組織の構造および細胞不均質性をより十分に模倣することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング応用にも適する、生物工学により作製された組織構築物プラットフォームが発展してきた。これらの技術は、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織の細胞−細胞間の、細胞−ＥＣＭ間の、および機械的な相互作用の動的役割を再現する可能性を有する。さらに、内皮細胞および線維芽細胞のような支持細胞ならびに物理的マトリックス成分の組込みは、天然組織微小環境をより完全に模倣することができる。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムがヒト生物学を反映することができるツールとしての役割を果たすためには、情報を提供し、信頼できる有効性、薬物動態および毒性試験を可能にするための重要な生理学的特徴および毒性学エンドポイントが、それらの設計に含められる必要がある。生理学的な流体流動条件下で多数の組織の相互作用を模擬し得る「ボディ・オン・チップ」デバイスは、これらの要件を満たす可能性を保持している。ヒトにおいて見出される反応を模倣するように設計されたマイクロ流体チップシステムは、薬剤、生物製剤および化学物質に対する身体の誘発反応の迅速で、信頼できる予測をもたらすことができるはずである。このシステムは、薬物開発情報ルートを効率化するための新たな技術の開発を前進させる可能性も有すると思われる。マイクロエンジニアリングおよびマイクロ流体工学技術の継続的な進歩は、３Ｄヒト組織チップモデルの発展およびそれらのより幅広い実装にさらに寄与した９。肝臓、脾臓、肺、骨髄、筋肉および心臓組織を含む、ヒト生体機能チップの様々な微小規模モデルならびに疾患モデルが現在存在する１０。
【０００６】
通常、創薬への応用のために、初代培養成人肝細胞１１および成人幹細胞または人工多能性幹細胞由来の心筋細胞１２，１３のような高機能の細胞の実装は、技術的に困難で費用がかかる工程であった。前述のように、伝統的な組織培養条件は、長期培養および生理学的機能の維持に、とりわけ初代肝細胞の培養には一般的に十分なものでない。組織培養皿は、細胞が単離された組織との、表面トポロジー、表面剛性、および最も重要なことには３Ｄ構造でなく２Ｄ構造、の３つの主要な相違点を有する。結果として、２Ｄ培養は、細胞に選択圧力をかけ、それらの最初の分子および表現型特性を実質的に変化させる。幸いなことに、生体材料１５およびバイオプリンティング１６−１８のような技術を利用する３Ｄバイオファブリケーションは、正確な構造、生理学および組織固有シグナルによる完全な組織構築物の創製を可能にし、それにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組織機能を効果的に向上させる生理的模倣環境を形成する。ｉｎ  ｖｉｖｏ組織機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣する能力は、実施される時間がかかり、費用がかかる動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験への依存を最小限とした、薬剤、薬剤候補および化学剤を迅速にスクリーニングするまたは試験するための、費用対効果が高い、高速大量処理プラットフォームの開発を可能にする。大量生産された場合、そのような生体機能チップシステムは、薬剤候補スクリーニングのために医薬産業にとって、および様々な疾患を研究している科学者にとって有用なものとなり得る１９。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、いずれかの、または大部分の組織型について用いることができるプラットフォームを得るために、Ａ．  Ｓｋａｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｂｉｏｉｎｋ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｎａｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ，  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  ２５：２４−３４  （Ｅｐｕｂ  ２２  Ｊｕｌｙ  ２０１５）に記載されている組織模倣バイオインクシステムを最初に開発した（米国仮特許出願第６２／０６８，２１８号；２０１４年１０月２４日出願も参照）。本発明者らは様々な組織および臓器の様々な細胞型でこのシステムの構成要素を使用した上でも依然として、大部分の組織型について用いることができるプラットフォームを得られたと考えている。
【０００８】
しかし、本発明者らが心臓オルガノイドに移行した際、本発明者らは、心臓に固有の細胞外マトリックス成分を含むまたは含まないヒドロゲルまたは上記の著作物に記載されている種類のヒドロゲルに、これらの心臓オルガノイドを組み込んだ場合、通常は自発拍動（または脈動）挙動を示したオルガノイドが、封入により拍動を停止し得ることを見いだした。本発明者らは、これがヒドロゲルバイオインク内の共有結合による架橋の剛性に起因し得るものであると推測した。明確化のために言うと、バイオインクゲルは、ヒトが触ると比較的に柔らかいが、本発明者らは、構築物における心臓細胞の観点からすると、周囲のヒアルロン酸、ゼラチンマトリックス、ポリエチレングリコールベースの架橋剤は、相互作用することが困難であった可能性があり、または容易には「たわま（ｇｉｖｅ）」なかったことで、心臓オルガノイドが拍動することを妨げると考えた。あるいは、シグナル伝達による拍動を妨げた、ある種の化学成分が存在した可能性がある。本明細書で述べるフィブリンベースのヒドロゲル材料は、この問題を克服することが見出された。
【０００９】
したがって、本発明の第１の態様は、心臓構築物を作製する方法であって、中間心臓構築物を形成させるために、生きた哺乳類の心臓細胞（例えば、個々の細胞、オルガノイドまたはスフェロイド）、フィブリノーゲン、ゼラチンおよび水を含む混合物を支持体上に堆積させるステップと；任意選択的に、前記中間構築物を支持するように、構造支持材（例えば、ポリカプロラクトン）を前記混合物とともに共堆積させるステップと；次いで、フィブリノーゲンを架橋し、フィブリンヒドロゲル中で共に自発拍動する生きた心臓細胞から構成される心臓構築物を（最初の心臓細胞の成熟状態によって、必要に応じて介在インキュベーションとともに）作製するのに有効な量のトロンビンを、前記構築物に接触させるステップとを含む方法である。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、
（ａ）入口および出口を有する一次チャンバー、ならびに
（ｂ）架橋フィブリンヒドロゲルおよび上記ヒドロゲル中で共に自発拍動する心臓細胞を含む、前記一次チャンバー内の心臓構築物
を含む装置である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、前記装置は、
（ｄ）前記一次チャンバーと流体連通した、少なくとも１つの二次チャンバー、および
（ｅ）前記二次チャンバー内の生きた哺乳類肝臓組織構築物
をさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、前記装置は、
（ｆ）前記一次および／または前記二次チャンバーと（例えば、それらの間の導管を介して）流体連通した少なくとも１つの追加の二次チャンバー、ならびに
（ｇ）前記追加の二次チャンバー内にそれぞれ独立に選択される少なくとも１つの追加の生きている組織構築物（例えば、肺、血管、腸、脳、結腸等）
をさらに含む。
【００１３】
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下に示す明細書および図により詳細に説明されている。本明細書で引用したすべての米国特許参考文献の開示は、それらの全体として参照により本明細書の一部をなすものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】肝臓オルガノイドが、２Ｄ肝細胞培養と比較して劇的に増大したベースライン肝機能および代謝を保持し、毒素に反応することを示す図である。ａ）〜ｂ）ＥＬＩＳＡおよび比色アッセイにより分析した、培地中へのａ）アルブミンおよびｂ）尿素の標準化された分泌が、２Ｄ肝細胞サンドイッチ培養と比較して、３Ｄオルガノイドフォーマットにおいて劇的に増加した機能性分泌量を示す図である。主してＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ３Ａ４によるジアゼパム代謝物であるｃ）テマゼパム、ｄ）ノリダゼパムおよびｅ）オキサゼパムの定量を示す。ｆ）ＡＴＰの定量により評価した用量反応解析およびｇ）トログリタゾンの用量のサブセット（０μＭ、２５μＭ、５０μＭおよび１００μＭ）におけるリン脂質の蓄積により示した、トログリタゾン薬剤による肝臓オルガノイド処理の毒性影響を示す。統計的有意性：＊ｐ＜０．０５各時点における３Ｄおよび２Ｄ間比較。スケールバーは３００μｍである。
【図２】オルガノイド構築物バイオプリンティングおよびオンチップ統合を示す図である。ａ）〜ｃ）ヒドロゲルバイオインクを用いたオルガノイド構築物バイオプリンティングおよびスフェロイドオルガノイド構築ブロックが、流体システム内への統合のためのモジュラーチップ上のＰＣＬ支持構造内に印刷されることを示す。ａ）組織内部で開発した、バイオプリンティングに用いたバイオプリンターを示す図である。ｂ）オルガノイド固有のヒドロゲルバイオインクを用いてバイオプリントされた構築物の形状の描写である。バイオプリントされたｃ）肝臓およびｄ）心臓のオルガノイド構築物を示す。ｅ）マイクロ流体マイクロリアクター内へのオルガノイド構築物の統合の描写である。７ｍｍｘ７ｍｍのカバースリップ上のバイオプリント肝臓構築物を、ＰＤＭＳマイクロリアクターデバイスの中央チャンバー内に移す。デバイスを密封し、流体接続を完了し、インライン培地貯槽から培地を抜き出して、１０μＬ／分で流入を開始させる。
【図３】オンチップ肝臓オルガノイドの生存率、およびアセトアミノフェンに対する機能性反応、およびＮ−アセチル−Ｌ−システイン対抗手段を示す図である。ａ）〜ｃ）バイオプリントされた肝臓構築物の長期生存率を示す図である。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色画像は、４週間にわたり比較的一貫した細胞生存率を示している。緑−カルセインＡＭ染色された生存細胞；赤−エチジウムホモ二量体染色された死細胞。ｄ〜ｇ）肝臓オルガノイドがアセトアミノフェン毒性に反応し、ＮＡＣにより救出されることを示す。生存率は、１４日目にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により決定した。オルガノイドを、ｄ）０ｍＭのＡＰＡＰ（対照）、ｅ）１ｍＭのＡＰＡＰ、ｆ）１０ｍＭのＡＰＡＰ、またはｇ）１０ｍＭのＡＰＡＰ＋２０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システインに曝露した。スケールバーは１００μｍである。ｈ〜ｋ）培地の一部試料の分析により、ＡＰＡＰは、機能の喪失および細胞死を引き起こすが、ＮＡＣは、これらの負の影響を軽減する能力を有することが示唆される。ｈ）ヒトアルブミン、ｉ）尿素、ｊ）乳酸デヒドロゲナーゼおよびｋ）アルファ−ＧＳＴの定量を示す。アルブミンおよび尿素の分泌量は、ＡＰＡＰ処理による負の影響を受けるが、ＮＡＣは、この分泌の低下を低減させる。ＬＤＨおよびアルファ−ＧＳＴは、対照およびＡＰＡＰ＋ＮＡＣ群において低く、生存細胞を示唆するが、ＡＰＡＰは、レベルの上昇または急上昇を引き起こし、アポトーシスならびに培地中へのＬＤＨおよびアルファ−ＧＳＴの放出が示されている。統計的有意性：＊ｐ＜０．０５  対照およびＡＰＡＰ間；＃ｐ＜０．０５  ＡＰＡＰ＋ＮＡＣおよびＡＰＡＰ間
【図４】心臓オルガノイドの拍動のモニタリングおよび薬物処理の効果としての拍動数の変調を示す図である。ａ）ＥＣＨＯプラットフォーム内の培養中の拍動心臓オルガノイドの実時間ビデオを撮るために用いたオンチップカメラシステムの描写および画像である。ｂ）マイクロ流体システム内の拍動心臓オルガノイドのビデオからのキャプチャー画像、およびｃ）拍動数の定量化を可能にする、ＭａｔＬａｂカスタムコードにより生成された、拍動心臓オルガノイドの閾値以上の画素の動きを二値化したキャプチャー画像である。ｄ）拍動数が決定されるベースライン条件下の拍動出力プロットを示す図である。ｅ〜ｆ）ｅ）イソプロテレノールまたはｆ）キニジンを用いて、ベースラインから変化させた心臓オルガノイドの拍動ピークプロットを示す図である。ｇ〜ｈ）アドレナリンおよびプロプラノロールに対する心臓オルガノイドの反応を示すグラフである。ｇ）心臓オルガノイドは、５μＭアドレナリンおよびより高い濃度における拍動数のプラトーに達する前に、アドレナリン濃度の増加に伴う１からほぼ２倍までの範囲の拍動数の用量依存的な増加を経験する。ｈ）０〜２０μＭの範囲の濃度のプロプラノロールとの最初のインキュベーションにより、５μＭアドレナリンの投与後の拍動数の用量依存的な低下がもたらされる。
【図５】肝臓および心臓モジュールを組合せることにより、薬物に対して統合された反応性を有する生物学的システムがもたらされることを示す図である。ａ）環境操作に対する二連オルガノイド反応を試験するための、統合された肝臓および心臓システムを示す概略図である。ｂ）肝臓オルガノイドの組込みが、０．１μＭプロプラノロールおよび０．５μＭアドレナリンに対する心臓オルガノイドの反応の変化をもたらすことを示すグラフである。ｃ）下流の心臓拍動数に対する肝臓代謝活性の影響を示すグラフである。ＢＰＭ値は、０．５μＭアドレナリンによりベースラインから増加し、アドレナリンによる拍動数の増加は、０．１μＭプロプラノロールにより阻害される。肝臓オルガノイドが存在し、０．１μＭプロプラノロールを代謝することが可能とされる場合、０．１μＭアドレナリンは、ＢＰＭ値の増加を誘発することができる。統計的有意性：＊＜０．０５。ｄ〜ｇ）パネルｃ）に示した値に対応する心臓オルガノイドの拍動ピークプロットを示す図である。
【図６】マルチオルガノイドＥＣＨＯボディ・オン・チッププラットフォームにおけるセンサーの統合を示す図である。ａ）組立ＥＣＨＯシステムの構成要素を説明する全体写真である。ｂ）バブルトラップモジュールの組込みにより、乱れが減少して、終始一貫した、滑らかな流れが得られる。ｃ）温度プローブは、ＥＣＨＯ流体工学システムを流れる流体の環境温度をモニターし、インキュベーターを開けることによる温度の低下によって示される、環境変化に反応する。ｄ）ｉ）発光ダイオード、フィルターおよび培地の色を測定するためのフォトダイオードを用いて作動し、ｉｉ）出力感度がシステムにおける０．５ｐＨの減少および増加を用いて示される、光学ベースのｐＨセンサーを示す図である。ｅ）ＬＥＤおよびオンボードカメラおよびフォトダイオードシステムを用いてＯ２レベルを測定する酸素センサーを示す図である。ｆ）マイクロ流体多重アルブミン、α−ＧＳＴおよびＣＫ−ＭＢ電気化学検出モジュールを示す概略図である。ｇ）裸電極、自己組織化単分子膜、ＣＫアプタマー、培地、１ｎｇ／ｍＬのＣＫ、１０ｎｇ／ｍＬのＣＫ、および１００ｎｇ／ｍＬ条件下のアルブミン電気化学センサーのインピーダンス読取値を示す図である。ｈ）１２時間統合肝臓および心臓ＥＣＨＯシステム時間経過にわたるアルブミン、α−ＧＳＴおよびＣＫ−ＭＢの測定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態が示されている、添付図面を参照して、以下、本発明をより十分に説明する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化され得るものであり、本明細書に示す実施形態に限定されると解釈すべきではなく、むしろ本開示が詳細かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝達するようにこれらの実施形態が記載されている。
【００１６】
本明細書で用いる術語は、特定の実施形態のみを記述する目的のためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他の状態が明確に示されない限り、複数形も含むものとする。「含む」または「を含む」という用語は、本明細書で用いる場合、記載された特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分および／もしくは群またはそれらの組合せの存在を規定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分および／もしくは群またはそれらの組合せの存在または追加を排除しないことがさらに理解される。
【００１７】
別途定義しない限り、本明細書で用いるすべての用語（技術および科学用語を含む）は、本発明が属する分野における通常の技能を有する者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書において定義されているような用語は、本明細書および特許請求の範囲の文脈におけるそれらの意味と一致している意味を有すると解釈すべきであり、本明細書で明確にそのように定義されない限り、理想化されたまたは過度に格式ばった意味に解釈すべきではない。周知の機能または構造は、簡潔および／または明瞭を期すために詳細に記載することができない。
【００１８】
［Ａ．定義］
本発明で用いる「細胞」は、一般的に、動物細胞、とりわけ哺乳類および霊長類細胞であり、その例には、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヤギが含まれるが、これらに限定されない。細胞は、好ましくは少なくとも一部は、肝臓、腸、膵臓、リンパ節、平滑筋、骨格筋、中枢神経、末梢神経、皮膚、免疫系等のような、特定の細胞または組織型に分化している。一部の細胞は、下でさらに議論するように、がん細胞であり得、その場合、それらは、これも下でさらに検討するように、任意選択であるが、好ましくは検出可能な化合物を（天然で、または組換え技術により）発現する。
【００１９】
本明細書において、「３次元組織構築物」は、３次元または（単分子層と対立するものとしての）多層構造に配置された、典型的には担体媒体中の生きた細胞の組成物を意味する。適切な担体媒体は、下で述べるような架橋ヒドロゲルのような、ヒドロゲルを含む。そのような構築物は、モデル化されるまたは模倣される特定の組織または臓器によって、１つの分化細胞型または２つもしくはそれ以上の分化細胞型を含み得る。一部のオルガノイドは、下でさらに検討するように、がん細胞を含み得る。構築物ががん細胞を含む場合、それらは、組織細胞を含み得る、および／または、細胞外マトリックス（またはタンパク質もしくはそれに由来するポリマー）、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸塩等や、それらの組合せを含むような、細胞を含まない組織模倣物を含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、細胞を細胞外マトリックスまたは架橋マトリックスと一緒に混合して、構築物を形成し、一方、他の実施形態において、スフェロイドまたはオルガノイドのような細胞凝集体をあらかじめ形成し、次に細胞外マトリックスと混ぜ合わせることができる。
【００２０】
本明細書で用いられる「増殖培地」は、本発明を実施する際に用いられる細胞を維持する天然または人工のいかなる増殖培地（一般的に水性液体）であってよい。例として、必須培地もしくは最少必須培地（ＭＥＭ）、またはイーグルの最少必須培地（ＥＭＥＭ）やダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）のようなそれらの変形形態、ならびに血液、血清、血漿、リンパ液等およびそれらの合成模倣物を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、増殖培地は、ｐＨ呈色指示薬（例えば、フェノールレッド）を含む。
【００２１】
本明細書で用いられる「試験化合物」または「候補化合物」は、心臓組織および／もしくは他の組織に対する薬理学的もしくは生理学的活性、または、２つの試験化合物間の相互作用が決定されるべき化合物であり得る。例証的目的のために、イソプロテレノールおよびキニジンは、試験化合物として以下で別個に用いてそれらを独立して検討するが、プロプラノロールおよびアドレナリンは、試験化合物として同時にまたは互いに組み合わせて投与して、それらの間の相互作用を検討する。しかし、あらゆる化合物を用いることができ、一般的に、タンパク質、ペプチド、核酸および小有機化合物（脂肪族、芳香族および混合脂肪族／芳香族化合物）のような有機化合物を用いることができる。候補化合物は、コンビナトリアル技術によりランダムに生成させる、および／または、特定の標的に基づいて合理的に設計されることを含む、適切な技術により生成させることができる。薬物相互作用を試験すべきである場合、２つ（またはそれ以上）の試験化合物を同時に投与することができ、１つ（または両方）は、可能な併用効果が判断されるべき、公知の化合物であり得る。
【００２２】
［Ｂ．  一般的な組織構築物を製造するための組成物］
本発明の組成物は、「バイオインク」中の生細胞を含み得るものであり、「バイオインク」は、さらに、架橋性ポリマー、堆積後架橋基または剤、および、他の任意選択の構成要素（増殖因子、（例えば、架橋の）開始剤、（バランスのための）水等を含むが、これらに限定されない）から構成される。組成物は、好ましくはヒドロゲルの形態である。組成物の様々な構成要素および特性は、下でさらに検討する。
【００２３】
＜細胞＞
上で言及したように、本発明を実施するために用いられる細胞は、好ましくは動物細胞（例えば、鳥、爬虫類、両生類等）であり、いくつかの実施形態において、好ましくは哺乳類細胞（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サル、類人猿、ヒト）である。細胞は、分化または非分化細胞であり得るが、いくつかの実施形態において、組織細胞（例えば、肝細胞のような肝臓細胞、膵臓細胞、心筋細胞、骨格筋細胞等）である。
【００２４】
細胞の選択は、創製される特定のオルガノイドに依存する。例えば、肝臓オルガノイドについては、肝臓の肝細胞を用いることができる。末梢または中枢神経オルガノイドについては、末梢神経細胞、中枢神経細胞、グリア細胞またはそれらの組合せを用いることができる。骨オルガノイドについては、骨芽細胞、破骨細胞またはそれらの組合せを用いることができる。肺オルガノイドについては、肺気道上皮細胞を用いることができる。リンパ節オルガノイドについては、濾胞性樹状リンパ細胞、細網線維芽リンパ細胞、白血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはそれらの組合せを用いることができる。平滑筋または骨格筋オルガノイドについては、平滑筋細胞、骨格筋細胞またはそれらの組合せを用いることができる。皮膚オルガノイドについては、皮膚ケラチノサイト、皮膚メラニン細胞またはそれらの組合せを用いることができる。細胞は、組成物への組込み時に分化していてもよいし、または、その後分化させる非分化細胞を用いることができる。追加の細胞は、上述の組成物のいずれかに加えることができ、下で述べるがん細胞は、一次または「第１」のオルガノイドに加えることができる。
【００２５】
本発明に任意選択で用いられるがん細胞は、黒色腫、がん腫、肉腫、芽細胞腫、神経膠腫および星状細胞腫細胞等を含むが、これらに限定されない、あらゆる種類のがん細胞であり得る。
【００２６】
細胞は、非封入細胞、またはスフェロイドに事前に封入された細胞、またはあらかじめ形成したオルガノイド（上述のように）などの、いかなる適切な形態で組成物に組み込んでもよい。ポリマースフェロイドに封入されたまたは含まれた動物組織細胞は、公知の技術により製造することができる、または場合によっては市販されている（例えば、Ｉｎｓｐｈｅｒｏ  ＡＧ，  ３Ｄ  Ｈｅｐｇ２  Ｌｉｖｅｒ  Ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ  （２０１２）；  Ｉｎｓｐｈｅｒｉｏ  ＡＧ，  ３Ｄ  ＩｎＳｉｇｈｔＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅｓ（２０１２）参照）。
【００２７】
＜架橋性プレポリマー＞
本明細書で述べる方法に用いる場合、堆積後にその弾性係数を増加させるためにそれをさらに架橋させることができる限り、適切なプレポリマーを用いて、本発明を実施することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、プレポリマーは、（ｉ）オリゴ糖（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、それらの組合せおよびとりわけそのチオール置換誘導体）および（ｉｉ）第１の架橋剤（例えば、ポリアルキレングリコールジアクリレート、ポリアルキレングリコールメタクリレート等のようなチオール反応性架橋剤およびとりわけポリエチレングリコールジアクリレート等；チオール−チオールジスルフィド結合を形成するためのチオール化架橋剤；チオール−金結合を形成する金ナノ粒子金官能基化架橋剤；等、それらの組合せを含む）の少なくとも部分的架橋反応により形成される。
【００２９】
＜架橋基＞
いくつかの実施形態において、組成物は、堆積後架橋基（ｐｏｓｔ−ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を含む。ポリエチレングリコールジアルキン、他のアルキン官能基化基、アクリレートまたはメタクリレート基等のようなマルチアームチオール反応性（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍ  ｔｈｉｏｌ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）架橋剤を含むが、これらに限定されず、それらの組合せを含む、適切な架橋基を用いることができる。
【００３０】
＜開始剤＞
本発明の組成物は、任意選択的に、ただし、いくつかの実施形態においては好ましくは、開始剤（例えば、熱または光開始剤）を含み得る。上記プレポリマーと第２の（または堆積後）架橋基との間の反応を触媒するあらゆる適切な開始剤を（例えば、加熱時または光への曝露時に）用いることができる。
【００３１】
＜増殖因子＞
本発明の組成物は、任意選択的に、ただし、いくつかの実施形態においては好ましくは、（例えば、含められる特定の細胞および／または生成される個別の組織代替物に適切な）少なくとも１つの増殖因子を含み得る。いくつかの実施形態において、増殖因子および／または他の増殖促進タンパク質は、その組織細胞に対応する組織に由来する脱細胞化細胞外マトリックス組成物（「ＥＣＭ」）（例えば、生きている動物細胞が肝臓細胞である場合には、脱細胞化細胞外肝臓マトリックス；生きている動物細胞が心筋細胞である場合には、脱細胞化細胞外心筋マトリックス；生きている動物細胞が骨格筋である場合には、脱細胞化骨格筋マトリックス；等）に加えることができる。追加のコラーゲン、グリコサミノグリカン、および／またはエラスチン（例えば、細胞外マトリックス組成物を補うために加えることができる）等も含めることができる。
【００３２】
＜弾性係数＞
組成物は、好ましくは、どのような堆積方法が用いられるとしても（例えば、押出堆積）、操作して基材上に堆積させることができるような、室温かつ大気圧で十分に低い弾性係数を有する。さらに、任意選択的に、ただし、いくつかの実施形態においては好ましくは、それが、後に架橋するまで（架橋が自発的、熱または光開始等かを問わず）、堆積された形状または構造を実質的に保持するように再び室温かつ大気圧で十分に高い弾性係数を有する。いくつかの実施形態において、組成物は、堆積の前に、室温かつ大気圧で０．０５、０．１または０．５から１．５または１０キロパスカルまで、またはそれ以上の剛性を有する。
【００３３】
［Ｃ．  とりわけ心臓構築物を製造するための方法および組成物］
上述のように、本発明は、心臓構築物を製造する方法であって、中間心臓構築物を形成させるために、生きた哺乳類の心臓細胞（例えば、個々の細胞、オルガノイドまたはスフェロイド）、フィブリノーゲン、ゼラチンおよび水を含む混合物を支持体上に堆積させるステップと；任意選択的に、前記中間構築物を支持するように、構造支持材（例えば、ポリカプロラクトン）を前記混合物とともに共堆積させるステップと；次いで、フィブリノーゲンを架橋し、フィブリンヒドロゲル中で共に自発拍動する生きた心臓細胞から構成される心臓構築物を（最初の心臓細胞の成熟状態によって、必要に応じて介在インキュベーションとともに）作製するのに有効な量のトロンビンを、前記構築物に接触させるステップとを含む方法を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、心臓細胞は、心臓細胞の懸滴培養により生成されるオルガノイドの形態である。例えば、Ｓｔｏｐｐｉｎｉへの米国仮特許出願公開第２０１１／０２８７４７０号を参照されたい。
【００３５】
いくつかの実施形態において、心臓構築物（具体的には、その中の心臓細胞）は、有効量のイソプロテレノールの投与により頻度が増加し、有効量のキニジンの投与により頻度が減少する自発拍動を示す。
【００３６】
いくつかの実施形態において、心臓構築物（具体的には、その中の心臓細胞）は、ＶＥＧＦ、アクチニンおよび／または心筋トロポニンＴを発現する。
【００３７】
上の節で述べた一般的なバイオインクと同様に、その粘度を高めて、バイオプリンティング装置を用いてバイオプリントすることができる押出し可能な材料にするために、非修飾ゼラチンをフィブリノーゲンに加えることができる。このゼラチンは架橋されないので、心臓構築物をバイオプリントした後の生理的温度（３７℃）でのインキュベーションにより、ゼラチンが最終的に溶解して構築物から浸出し、架橋フィブリンおよび拍動性心臓構築物のみが残る。
【００３８】
［Ｄ．  デバイスを製造する方法］
非限定的であるが、好ましい１つの使用方法において、組成物は、本明細書で述べたデバイスにおける各個別の構築物を製造する方法に用いられる。そのような方法は、
（ａ）上述の押出し可能なヒドロゲル組成物を含む貯槽を用意するステップと、次いで
（ｂ）ヒドロゲル組成物を基材上に（例えば、注射器による押出しにより）堆積させるステップと、次いで
（ｃ）一般的な組成物およびそれらの組織構築物について、（適切な手段により二次構築物を製造することができるので）任意選択的に、上記ヒドロゲルの剛性を増加させ、上記３次元臓器構築物を形成するのに十分な量で第２の架橋基によりプレポリマーを架橋するステップ（例えば、ヒドロゲルを加熱する、ヒドロゲル組成物に光（例えば、環境光、ＵＶ光）を照射する、ヒドロゲルのｐＨを変化させる等）、ならびに
（ｄ）心臓構築物組成物について、上述のように、フィブリノーゲンを架橋し、フィブリンヒドロゲルを形成するために、ヒドロゲルをトロンビンと接触させるステップ
を含む。
【００３９】
堆積ステップは、Ｈ．−Ｗ．  Ｋａｎｇ、Ｓ．  Ｊ．  Ｌｅｅ、Ａ．  ＡｔａｌａおよびＪ．  Ｊ．  Ｙｏｏ、米国特許出願公開第２０１２／００８９２３８号（２０１２年４月１２日）に記載されているような３ｄバイオプリンティング技術（押出３ｄバイオプリンティングを含む）を含むが、これに限定されない、適切な装置を用いて行うことができる。いくつかの実施形態において、堆積ステップは、パターン化された堆積ステップである。すなわち、堆積される組成物が、規則または不規則格子、グリッド、らせん等のような、規則または不規則パターンの形態で堆積されるように堆積が行われる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、細胞を含むヒドロゲル組成物が、あらかじめ形成された細胞を含まない３Ｄオルガノイド基材の中央領域に加えられる結果として、外側のオルガノイドゾーンの内部に別個の細胞含有ゾーン（例えば、腫瘍細胞含有ゾーン）がもたらされる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、細胞を含まないゼラチンのみの流路をオルガノイド基材に形成させてよく、構築物中に拡散を促進し得る流路を形成することができる。
【００４２】
一般的な構築物のいくつかの実施形態において、架橋ステップは、上記ヒドロゲルの剛性を室温かつ大気圧で１または５から１０、２０または５０キロパスカルまで、またはそれ以上の剛性を増加させる。いくつかの実施形態において、上記架橋ステップ（ｃ）の後のヒドロゲルは、室温かつ大気圧で１または５から１０、２０または５０キロパスカルまでの剛性を有する。
【００４３】
いくつかの実施形態において、該方法は、上記ヒドロゲル組成物の位置に隣接する位置の上記基材上に支持ポリマー（例えば、ポリＬ−乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン；ポリスチレン；ポリエチレングリコール等、乳酸−グリコール酸コポリマーのようなそれらのコポリマーを含む）を堆積させるステップを（例えば、上記ヒドロゲルを堆積させるステップと同時か、その後か、またはそれと交互の反復で、および、いくつかの実施形態においては架橋ステップの前に）さらに含む。
【００４４】
有機および無機基材を含み、かつ、その上に形成されたウェル、チャンバーまたは流路のような特徴を有するまたは有さない基材を含む、適切な基材を堆積に用いることができる。本明細書で述べる個別の製品について、基材は、増殖培地が循環し得る一次流体導管により接続された少なくとも２つのチャンバー（チャンバーは、任意選択であるが、好ましくは入口流路および／または出口流路を伴う）を有し、堆積が各チャンバーにおいて独立に行われるマイクロ流体デバイスを含み得る。あるいは、基材は、第１および第２の平面部材（例えば、顕微鏡カバースリップ）を含み得、堆積ステップを当平面部材上で行うことができ、方法は、各平面部材をマイクロ流体デバイスの別個のチャンバーに挿入するステップをさらに含み得る。チャンバーの密封および細胞の生存能力の維持のような後処理ステップは、公知の技術により行うことができる。
【００４５】
本発明を主として単一の二次チャンバーに関して説明するが、所望により、同じまたは異なるオルガノイドを含む複数の二次チャンバーを基材上に含められることが理解されよう。したがって、二次チャンバーは、互いに、および一次チャンバーに対して、直列、並列またはそれらの組合せを含むいずれかの適切な配置で接続することができる。
【００４６】
一次および二次チャンバー、関連オルガノイド、入口、出口および導管を有する基材は、使用する追加の構成要素と組み合わせてより大きい装置内に取り付けることができる独立した「カートリッジ」または部分的組合せの形態で提供されてよい。したがって、いくつかのそのようなより大きい装置の実施形態において、装置は、一次チャンバーから二次チャンバーに増殖培地を循環させるための一次チャンバーと作動可能に連結されたポンプをさらに含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、装置は、（例えば、心臓構築物の拍動数または頻度をモニターするために）心臓構築物と作動可能に連結され、かつ、任意選択的に窓と作動可能に連結された、（ｃ）心臓モニターまたは拍動モニター（例えば、カメラ、電極または電極アレイ等）をさらに含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、装置は、一次チャンバーと作動可能に連結された増殖培地貯槽および／またはバブルトラップをさらに含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、装置は、二次チャンバーを経て循環する増殖培地を一次チャンバーに戻すための、一次および二次チャンバー（ならびにポンプ、ならびに貯槽および／または存在する場合にはバブルトラップ）と作動可能に連結された戻り導管をさらに含む。
【００５０】
［Ｄ．  包装、貯蔵および出荷］
上述の部分的組合せまたは「カートリッジ」は、製造された後、直ちに使用されてもよいし、または、貯蔵および／もしくは輸送のために準備されてもよい。
【００５１】
製品を貯蔵および輸送するために、水と混合されたゼラチンのような、室温（例えば、２５℃）で流動性液体であるが冷蔵温度（例えば、４℃）でゲルであるか固化する、一過性の保護支持媒体を、チャンバーに実質的または完全に満たすように、デバイス中に、および好ましくは連結された導管にも、加えることができる。入口および出口ポートは、適切なキャッピング要素（例えば、栓）またはキャッピング材（例えば、ワックス）により蓋をすることができる。次いで、デバイスを冷却要素（例えば、氷、ドライアイス、熱電冷却器等）と一緒に、すべてを（好ましくは断熱）包装中に入れて包装することができる。
【００５２】
あるいは、製品を貯蔵および輸送するために、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドおよびポリエチレングリコールのブロックコポリマーのような、冷却温度（例えば、４℃）で流動性液体であるが室温（例えば、２０℃）または体温（例えば、３７℃）のような加温温度ではゲルであるか固化する、一過性の保護支持媒体を用いることができる。
【００５３】
受取り時に、エンドユーザーは、付随した包装および冷却要素からデバイスを単に除去し、温度を上昇または低下させ（一過性の保護支持媒体の選択によって）、ポートの蓋を除去し、注射器で（例えば、増殖培地で洗い流すことにより）一過性の保護支持媒体を除去することができる。
【００５４】
［Ｅ．  使用方法］
上述の装置は、
（ａ）上述の装置を用意するステップと、
（ｂ）任意選択的に、第１のチャンバーから第２のチャンバーに増殖培地を循環させるステップと、
（ｃ）（例えば、試験化合物を増殖培地に加えることにより）少なくとも１つの試験化合物を構築物に投与するステップと、
（ｄ）典型的には、試験化合物を投与しない場合に観測されたものと比較し、（例えば、心臓モニターにより）心臓構築物の拍動頻度の変化を判定するステップと
により、少なくとも１つの試験化合物を、生理学的活性についてスクリーニングするために用いることができる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの試験化合物は、互いに同時に投与される少なくとも２つの異なる試験化合物を、例えば、それらの間の薬物相互作用を試験するために、含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、前記測定するステップは、互いに連続的に間隔をあけた複数の時点に（例えば、少なくとも１日の間隔をあけた少なくとも２つの機会に）行われる。
【００５７】
方法および装置は、とりわけ、特定の試験化合物の代謝を含む細胞代謝、または特定の試験化合物により誘発される細胞毒性、またはそれの相互作用の評価のために用いることができる。
【００５８】
本発明の態様は、以下の非限定的な実験例においてさらに説明する。
【００５９】
［実験］
この試験では、本発明者らは、薬物および毒性試験に対する生理学的反応を評価するための肝臓および心臓の二連オルガノイド・オン・チップシステムの開発および試験について述べる。これを遂行するために、本発明者らは、ヒドロゲル「バイオインク」および３Ｄバイオプリンティング技術により流体デバイスシステムに統合される、２種類の高機能性組織オルガノイドを開発した。このマルチオルガノイドボディ・オン・チップシステム上において、オルガノイドは、統合されたバイオセンサーシステムを環境および生物学的モニタリングに用いることができる、人体に見出される臓器動力学と同様に、様々な外部刺激に独立してまたは協調的に反応することができる２０。
【００６０】
［結果］
オルガノイドの形成および構造の特徴付け。懸滴培養法を用いて生成させた肝臓オルガノイドは、直径が約２５０μｍの球状凝集体を一貫して形成し、２８日間の培養期間を通して確実に＋／−１０μｍのままであった（データは示さず）。特定の細胞型の混合物を用いた、１５００細胞／オルガノイドの最初の播種は、所望の直径を確実に生じさせる。オルガノイドは、低酸素および壊死性コアの形成をもたらし得る溶質潅流制限２１と生物学的機能を均衡させるような、細胞数によって決定されるサイズを維持するように設計された。
【００６１】
肝臓オルガノイドの組織学を用いて、一般的なオルガノイドの構造、異なる肝臓の細胞型の組織化、および機能特有の構造の形成を検討した。ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（データは示さず）により、スフェロイドの外側の内表面となる（ｌｉｎｉｎｇ）薄い、線維芽細胞様細胞を有する小型のオルガノイド構造が示されている。肝臓細胞は、天然の肝臓と同様に、密着結合を形成しているように見える。肝臓細胞の分化は、広範囲の局在を示す、アルブミンおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼについて染色することにより解析した。ヒト肝細胞の同定のための信頼できるマーカーであるサイトケラチン１８は、構造の外側に沿った一部の細胞を染色せず、線維芽細胞様細胞を再び強調した（データは示さず）。肝星細胞のマーカーであるＧＦＡＰは、少数の領域においてのみ見出され、これは、所望も割合と一致していた。コネキシン３２は、肝細胞により発現される主要なギャップ結合タンパク質であり、肝細胞が長期にわたる細胞分化に重要な構造を形成していることを示す。Ｅ−カドヘリン染色により、細胞間の細胞−細胞接着複合体の形成が明らかにされ、これは肝細胞の極性を示唆する（データは示さず）。
【００６２】
同様に、心臓オルガノイドを組織学的染色によりいくつかの構造および機能マーカーについて検討した。オルガノイドは、３Ｄ心筋培養において発現するが、２Ｄ培養では発現しないＶＥＧＦを発現したことから、血管新生２２、心臓筋原繊維のＺ線へのアクチンの付着に必要なミクロフィラメントタンパク質であるアクチニン、および、心臓の筋収縮に必須のタンパク質である心筋トロポニンＴを誘導する能力の改善（データは示さず）が示唆される。オルガノイドは、より高レベルで発現した場合には心筋細胞の未成熟状態への退行を示す、低レベルのミオシン調節軽鎖７を発現した（データは示さず）。興味深いことに、ＭＹＬ７の発現は、オルガノイドの外周上の結節様領域においてのみ認められた。Ｈ＆Ｅ染色により、オルガノイドの内部の全域の一貫性がある細胞の分布ならびに肝臓オルガノイドと比べて、より広がった凝集が示された（データは示さず）。培養における様々な時点にわたる生／死染色で、培養１日目、２８日目および３５日目に高レベルの生存率（＞９５％）が示されている（データは示さず）。
【００６３】
肝臓オルガノイド機能特性。各時点における発光ＡＴＰアッセイにより代謝を測定することによって肝臓オルガノイドの生存率をモニターし、オルガノイドが培養中で少なくとも２８日間にわたり生存能力を維持することが示されている（データは示さず）。共培養に含まれていた細胞が異なる代謝速度を有し、それらそれぞれの比が経時的に一貫性があることはあり得ないため、この方法を用いて培養中の生存細胞の正確な数を正確に測定することはできない。しかし、この方法は、時点間の全体としての培養生存率の推定を確実に可能にする。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色は、生存率の同様の証拠を提供した（データは示さず）。この３次元スフェロイド培養ヒト肝臓共培養における生存率の長期にわたる維持は、以前に報告されている２３。
【００６４】
肝臓オルガノイドの機能性は、最初に尿素およびアルブミンの産生を経時的に測定することによって評価した。これらの化合物の分泌は、培養中少なくとも２８日間維持され、長期にわたる肝細胞の生存能力および機能性が示唆される（図１ａ〜ｂ）。３次元肝臓オルガノイドは、培養当たりより少数の細胞（肝臓オルガノイド：約１，５００細胞／試料、単層培養：約１，４４０，０００細胞／試料）を含むにもかかわらず、伝統的な単層培養より有意に多くの尿素およびアルブミンを産生した。また、単層培養は、それぞれ２１および１４日間の培養後に、測定可能な尿素およびアルブミンの産生を維持することができなかった。スフェロイド形態のヒト肝細胞の生存能力および分化の長期にわたる維持は、他者により同様に報告されている２３−２５。
【００６５】
肝臓固有の薬物代謝および薬物毒性反応。薬物代謝能力を評価するために、一連の化合物（リファンピシン、３−メチルクロロアントラセンおよびフェノバルビタール）を用いてシトクロムＰ４５０酵素を誘導した。その後、細胞をジアゼパム（ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ１９により主として主要代謝物テマゼパムおよびノルジアゼパムに変換される）に曝露した（データは示さず）。副次的代謝物であるオキサゼパムが、上記の主要代謝物からさらに生成され得る。肝臓オルガノイドは、７日後にＣＹＰ４５０活性を失った標準単層サンドイッチ培養と比較して、培養中少なくとも２８日間にわたり測定可能なシトクロムＰ４５０薬物代謝活性を有することが見出された（図１ｃ〜ｅ）。スフェロイド培養における肝細胞と伝統的な単層における肝細胞との間のこの性能の差は、以前に報告されている２４，２６。３Ｄ培養モデル（約１，５００細胞／試料）と２Ｄ培養モデル（約１，４４０，０００細胞／試料）との間の総細胞数の差に再び注意することも重要である。
【００６６】
トログリタゾンは、十分に特徴付けられた肝毒性薬物であり、肝臓培養モデルにおける薬物毒性反応を測定するために用いられる。肝臓オルガノイドをトログリタゾンで４８時間処理した場合、用量反応曲線は、薬物の濃度が増加するにつれて生存率が低下することを示している（図１ｆ）。より低い濃度の薬物を用いた場合でさえ、かなりのリン脂質の蓄積がオルガノイドにおいて起こることが見出された（図１ｇ）。
【００６７】
肝臓および心臓オルガノイドのバイオプリンティング、ヒドロゲルバイオインク、オルガノイド構築物の設計ならびに流体システムへの統合。組織内部で開発された、Ｘ−Ｙ−Ｚ軸制御および多プリントヘッドを用いたバイオプリンティング技術２７を用いて（図２ａ）ボディ・オン・チップシステムにおけるより長期の培養上にオルガノイドを収容するための、３Ｄヒドロゲル微小環境から構成される構築物を創製した（図２ｂ〜ｄ）。これを達成するために、ｉ）押出しを促進し、ｉｉ）細胞の生存および機能を支持したヒドロゲルバイオインクを開発した。肝臓構築物については、バイオインクは、チオール化ヒアルロン酸（ＨＡ）、チオール化ゼラチン、肝臓細胞外マトリックス成分１５および２ステップ押出しバイオプリンティングプロトコールを促進するためのアクリレートまたはアルキン官能基を有する一組のポリエチレングリコール架橋剤２８から構成されていた。押出しステップを容易にするために、非修飾ＨＡおよびゼラチンをバイオインクに補足した。オルガノイドをバイオインク内に懸濁し、所望の構築物に印刷し、ＵＶ光を用いて、天然肝臓の弾性係数がほぼ得られるまで印刷済み材料をさらに架橋した。本出願および他の出願で用いたＵＶ光の強度は、非細胞毒性であることが以前に示されている２９，３０。安定化支持体としての役割を果たす、溶融硬化押出しポリカプロラクトンフィラメントをバイオインクに沿って印刷した。
【００６８】
心臓構築物については、バイオインクは、ｉ）フィブリノーゲンおよびゼラチン、ならびに、ｉｉ）トロンビンの２つの部分から構成されていた。フィブリノーゲン−ゼラチン混合物に懸濁したオルガノイドを、冷たいステージ（２０℃）上に印刷してゼラチンのゲル化状態を維持し、その後、トロンビンを上記構築物上に印刷してフィブリンの形成を誘導した。拡散を促進するために、細胞を含まないゼラチンのみの流路を心臓構築物の３Ｄ空間に組み込んだ。これらの構築物は、マイクロ流体デバイスへの統合のためにカバースリップ上にバイオプリントした。一般的に、バイオプリントされた肝臓構築物は、４５〜５０個の肝臓オルガノイドを含んでいたが、心臓構築物は、９〜１１個のオルガノイドを含み、比率は、ヒトにおける肝臓および心臓の質量を反映していた。
【００６９】
マイクロ流体デバイス（マイクロリアクターとも呼ばれる）は、並列回路に流通させるためのマイクロ蠕動ポンプに接続された個別にアドレス可能な入口および出口を有する流体流路を介してそれぞれアクセス可能な、オルガノイドのチャンバーを有する個々のユニットからなっていた（図２ｅ）。これらのデバイスは、通常のソフトリソグラフィーおよびレプリカモールディング３１を用いて作製される。オルガノイドとマイクロ流体の流動を支持するマイクロリアクターデバイスとの統合は、オルガノイドをマイクロリアクターオルガノイドチャンバーの内側に固定する能力に依存する。所定の位置に保持されていなかった場合、個々の球状オルガノイドは、循環に引き込まれ、マイクロ流体の流路および配管中の妨害物になり、それにより、培地が全システムに流れることを妨げることがあり得る。幸いにも、バイオプリンティングを促進し、オルガノイドの機能を支えることに加えて、ヒドロゲルバイオインクは、有効なオルガノイド固定化剤としての役割を果たした。７ｍｍ×５ｍｍのダイヤモンド形状のカバースリップ上のオルガノイド構築物をマイクロリアクターオルガノイドチャンバーに差し込んだ。密着により、構築物がチャンバーの底部に留まることが確保された。球状オルガノイドがヒドロゲル内に封入されたままであり、オルガノイドによる閉塞に起因する問題が回避された。図２ｅにバイオプリントされた肝臓オルガノイド構造とマイクロリアクターデバイスとの統合を示す。
【００７０】
肝臓構築物は、オンボードの流体システム培養において生存、表現型および機能を維持し、毒素に対して生理的に反応する。マイクロ流体システムにおけるヒドロゲル構築物中の肝臓オルガノイドを、初期のシステムの特徴付けのために心臓構築物と独立に評価した。８日間のバイオリアクター培養後に、オルガノイドを固定し、免疫蛍光を用いて染色し、構造および機能マーカーのパネルを評価した（データは示さず）。オルガノイドは、共に肝機能の維持を示す、薬物代謝に関与するシトクロムＰ４５０ファミリーにおける酵素であるＣＹＰ３Ａ７およびアルブミンについて、陽性に染色された（データは示さず）。さらに、いくつかの細胞は、基底外側輸送体であり、ＯＳＴ−αおよび頂端膜タンパク質であるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−４）を発現し、これは肝細胞内の極性を示唆するものであった（データは示さず）。さらに、肝臓細胞は、密着結合マーカーである、膜結合ＺＯ−１、ならびに適切な上皮様細胞間組織化（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を示す、Ｅ−カドヘリンおよびβ−カテニンを発現する（データは示さず）。総合すると、これらの画像は、肝臓オルガノイドが機能性肝臓組織に不可欠である多くの重要なタンパク質を発現することができ、重要なことには、これらのタンパク質が、オルガノイドが伝統的な培養の場から除去され、上述のマイクロ流体プラットフォームに統合された後も、発現し続けることを示している。
【００７１】
バイオプリントされた肝臓オルガノイドを、マイクロリアクター中で最長２８日間さらに培養し、その期間中、生存率の評価のために１日目、１４日目および２８日目に、培養から一式のオルガノイドを除去した。生存率は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色および全載顕微鏡法により定性的に評価した。図３ａ〜ｃに１日目、１４日目および２８日目にマイクロリアクター培養から除去された、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色された肝臓オルガノイドの代表的な画像を示す。画像は、カルセインＡＭにより緑色に染色された生存細胞の高い百分率を示している。各時点にエチジウムホモ二量体により赤色に染色された、死んでいると認められた細胞が存在していたが、一般的にこれらは、数がより少なかった。
【００７２】
臨床的関連性を示すために、毒性に対する肝臓構築物の反応をアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）の処理により、および臨床的に使用される薬物Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）により評価した。流体システム中の肝臓構築物は、薬物の投与を受けず、１ｍＭのＡＰＡＰ、１０ｍＭのＡＰＡＰ、または１０ｍＭのＡＰＡＰ＋２０ｍＭのＮＡＣの投与を受けた。生存率は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色および全載撮像により評価した。生きている（緑色）細胞と死んだ（赤色）細胞との比に基づいて、０ｍＭの対照群は、１４日間の実験を通して比較的に高いレベルの生存率（１４日目に７０〜９０％）を維持したことが明らかであった（図３ｄ）。これと比較して、１ｍＭのＡＰＡＰ群は、生存率の低下を有し（１４日目に３０〜５０％、図３ｅ）、一方、１０ｍＭのＡＰＡＰ群は、１４日目に生存細胞をほとんど有さないように思われた（図３ｆ）。ＮＡＣによる処理は、高濃度のＡＰＡＰに関連する病的状態のレベルを低下させ、代わりに、オルガノイドは、より低い１ｍＭの投与を受けたＡＰＡＰ処理オルガノイドにより類似していたように思われた（図３ｇ）。アルブミンの分析により、平均で１２０ｎｇ／ｍＬの近くに留まっていた、６日目までの肝臓オルガノイドによる一定のアルブミンの産生が明らかになった（図３ｈ）。最初の２つの時点におけるアルブミンレベルは、薬物をこの時点に投与しなかった場合に予測されたように、互いに比較して統計的に有意でなかった。６日目の後のＡＰＡＰの投与後に、アルブミンレベルは、０ｍＭ対照と比較して１ｍＭおよび１０ｍＭ群の両方において有意に低下した（ｐ＜０．０５）。さらに、１０ｍＭ群のアルブミンレベルは、１ｍＭと比較して有意に低下した（ｐ＜０．０５）。１４日目に１０ｍＭ群のアルブミンレベルは、ほぼ測定不可能であった。ＡＰＡＰ＋ＮＡＣオルガノイドにおけるアルブミンレベルは、１０ｍＭのＡＰＡＰ処理群のそれより有意に大きかった。データの一般的傾向は、適切であり、診療所における患者がそうであり得るように、肝臓オルガノイドがＡＰＡＰに正しく反応し、ＮＡＣにより救出され得ることが示唆される。尿素分析も類似の傾向を有する結果を示した（図３Ｉ）。尿素レベルは、ＡＰＡＰ投与前の時点において群間で有意に異なっていなかった。ＡＰＡＰ投与後には、測定尿素レベルは、ＡＰＡＰ濃度に関して用量依存的に低下するように思われた。１０日目の時点において、０ｍＭ対照群アルブミンレベルは、１ｍＭおよび１０ｍＭ群の両方より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。１４日目の時点において、これらの３群は、互いに有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＡＰＡＰ＋ＮＡＣオルガノイドの尿素レベルは、対照オルガノイドと有意に異なっていなかったが、１０ｍＭのＡＰＡＰの尿素レベルより有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。
【００７３】
次いで培地試料を、肝臓細胞から放出された場合には細胞死のインジケーターである、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびα−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（α−ＧＳＴ）について分析した（図３ｊ〜ｋ）。３日目にＬＤＨレベルの最初の変動が存在している。これは、バイオプリンティング中および培養のマイクロ流体開始段階で細胞に加えられたストレスに起因する可能性がある。６日目まで、すべての群が互いに区別できない。薬物投与後の最初の採取時点である１０日目に、１０ｍＭのＡＰＡＰ群は、培地中でＬＤＨ濃度の明らかな増加を示しているが、ＡＰＡＰ＋ＮＡＣ群は、対照群とほぼ同一である。ＡＰＡＰ群は、１０日目に他の群と有意に異なっていないが、傾向は明らかである。１４日目までに、ＬＤＨレベルがベースラインに低下し、ＬＤＨの大部分の放出が６日目と１０日目の間に起こり、ＡＰＡＰ群における１０日目での定量されたＬＤＨのスパイクが生じたことが示唆される。各群のオルガノイドは、３日目および６日目の時点に同様のレベルのα−ＧＳＴを分泌した。検出可能なレベルのα−ＧＳＴ（７〜１１ｎｇ／ｍＬ）が３日目にすべての群に存在し、次いで対照群において時間の経過とともに低下した。再び、これは、バイオプリンティング工程およびマイクロ流体培養の開始がオルガノイドにおける細胞にストレスを加え、マイクロリアクター培養の開始時にある程度の細胞死がもたらされた可能性があることを示唆するものである。１０ｍＭのＡＰＡＰの投与後に、α−ＧＳＴが１０日目までに１１ｎｇ／ｍＬ以上に増加し、培養の終了時までそのレベルの近くに留まっている。これと比較して、対照オルガノイド群においてα−ＧＳＴが４ｎｇ／ｍＬ未満に低下したことから、ＡＰＡＰが実際に細胞死を引き起こし、培地中へのα−ＧＳＴの放出がもたらされることがわかる。ＮＡＣとＡＰＡＰの投与は、ＡＰＡＰの作用を明確に減弱させた。１０日目および１４日目に、α−ＧＳＴは、ＡＰＡＰ＋ＮＡＣ培養においてそれぞれ約６および５ｎｇ／ｍＬで検出された。
【００７４】
心臓構築物はベースライン機能を支持し、拍動数を変化させる薬物に反応する。心臓構築物の主要な出力計測の１つが拍動の定量化であるので、心臓構築物マイクロリアクターハウジングと統合するように特注生産されたオンボードＬＥＤおよびカメラシステムを用いて、心臓オルガノイドの実時間視覚モニタリングを実現した（図４ａ）。このシステムは、随意のビデオキャプチャー機能を有し、実時間で拍動する心臓オルガノイドのビデオファイルを備えていた（図４ｂ）。一連のＭａｔＬａｂ関数を有するＭａｔＬａｂカスタムコードを用いて、各フレームにおける移動ピクセルを経時的に決定し、拍動伝播の二値化表示（図４ｃ）および拍動数を視覚化するプロットを得た。ベースライン条件下の拍動プロットの例を図４ｄに示す。
【００７５】
人工心臓構築物に必要な機能は、薬物および他の外部刺激に対して生理学的に正確に応答する能力である。様々な心臓拍動調節薬を心臓構築物に投与し、その間に、上記のような拍動挙動の変化が得られた。徐脈患者を治療するためにしばしば用いられるベータアドレナリン作動薬である、イソプロテレノール（０．１ｍＭ）は、オルガノイドの拍動数を増加させた（図４ｅ）。逆に、脱分極および再分極を遅くし、抗不整脈薬として用いられるイオンチャンネル遮断薬であるキニジン（１μＭ）は、予想通りオルガノイドの拍動を遅くした（図４ｆ）。
【００７６】
さらに、生理学的に関連性がある濃度のアドレナリンおよびプロプラノロールを、心臓オルガノイドの拍動数の増加を誘導し、かつ、妨げるそれらの有効性について評価した。最初に、明確に識別できるより速い拍動を開始させる最低濃度を決定するために、５つのアドレナリン濃度（０、０．１、０．５、５および５０μＭ）を心臓オルガノイドにおいて試験した。オルガノイドの拍動数は、アドレナリンの投与の前後に測定した。オルガノイドの拍動は、ベータアドレナリン受容体の飽和に起因する可能性がある、５μＭの後のプラトーに達するまで、用量依存的に増加した（図４ｇ）。次に、４つのプロプラノロール濃度（０、０．５、５および２０μＭ）を心臓オルガノイドに投与した。オルガノイドをこれらの条件下で２０分間インキュベートし、その後、アドレナリンを５μＭで加えた。一般的に、プロプラノロールインキュベーションの濃度を増加させることにより、拍動数のアドレナリン誘発性の増加がより効果的に妨げられ（図４ｈ）、アドレナリンの存在下における適切なベータ遮断反応が示された。
【００７７】
二連オルガノイド肝臓および心臓プラットフォームにおける肝代謝が薬物に対するシステムの反応に影響を及ぼす。ヒト体内において、臓器は、互いに複雑に相互作用する。オルガノイドプラットフォームがマルチオルガノイド相互作用も維持し得ること実証するために、下流の心臓構築物の機能が上流の肝臓構築物代謝に依存していた実験を実施した。流体システムのモジュール性を用いて、そのようなプラットフォームを実現した。ＰＤＭＳから構成される中央流体経路制御ブレッドボードを用いて、μ−蠕動ポンプおよび培地貯槽からバブルトラップ、肝臓構築物を含むマイクロリアクター、統合オンボードカメラシステム付きの心臓構築物を含むマイクロリアクターを経て、ポンプに戻る共通培地の直接の流れを導いた（図５ａ）。これらの実験に用いなかったが、システムのさらなる特注生産を考慮した追加の任意選択ポートを図５ａに示す。
【００７８】
１つのシステムにおいて２種類の組織構築物を組み合わせることによる影響を評価するために、両システムおいて一緒に試験する前に、心臓のみのシステムまたはタンデムシステムを用いて、アドレナリンおよびプロプラノロールの作用を最初に独立して試験した。プロプラノロールのみ（０．１μＭ）による処理は、心臓のみのシステムにおける拍動数に、小さい（約１０％）が有意な（ｐ＜０．０５）倍率の減少をもたらした。しかし、肝臓構築物の存在下では、拍動数の減少は存在せず、薬物の多少の代謝が起こったことが示唆された（図５ｂ）。同様に、アドレナリンのみ（０．５μＭ）による処理は、心臓のみのシステムにおける拍動数の有意な（約４０％）倍率の増加をもたらした。肝臓成分の追加は、アドレナリンにより誘発された拍動数の増加を打ち消さなかったが、その増加を約４０％〜３０％低下させ（ｐ＜０．０５、図５ｂ）、統合オルガノイドシステム反応をさらに示した。
【００７９】
次に、心臓のみのシステムおよびタンデムシステムにおいて、両薬物間の相互作用を評価した。上述の結果（図４ｇ〜ｈ）に基づいて０．１μＭプロプラノロールおよび０．５μＭアドレナリンの薬物濃度を選択した。プロプラノロールを最初に投与し、その後、アドレナリンを続けて追加した。オルガノイドが存在し、機能していたことによって、アドレナリンの効果が異なった（図５ｃ）。各条件における拍動プロットを図５ｄ〜ｇに示す。肝臓オルガノイドを有していなかった群１において、０．１μＭプロプラノロールは活性のままであり、０．５μＭアドレナリンの効果であるベータアドナリン作動性効果の遮断に成功した。遮断薬を代謝する肝臓成分が存在しなかったので、これは、予想されたことであった。肝臓成分が加えられた群２において、アドレナリンが投与された後に、ＢＰＭの１．２５倍の増加が認められた。これは、アドレナリン投与前にプロプラノロールが投与されなかった実験対照における心臓ＢＰＭの１．５倍の増加と同程度であった。これは、３Ｄ肝臓オルガノイドが、アドレナリンが心臓オルガノイドの有意な割合のベータアドレナリン受容体を活性化し得るように十分なプロプラノロールを代謝し、対照アドレナリンのみの反応の約５０％に相当する反応を誘導したことを示唆しており、単一オルガノイドシステムと比較して複数のオルガノイドシステムが有する効果を強調する。興味深いことに、マイクロリアクター内の３Ｄオルガノイドを構成する５０，０００個の細胞に対して、組織培養プラスチック上１〜２百万個の細胞から構成される２Ｄ肝細胞培養を用いて群２における条件を反復した。２Ｄ培養は、アドレナリン誘発性の拍動数の増加の回復を達成することができず、３Ｄシステムと比較して２Ｄ培養における十分な代謝活性の欠如がさらに示唆された。
【００８０】
統合バイオセンシングシステム。先行するデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏオルガノイドプラットフォームに対するシステム生物学アプローチが有し得る可能性を示すものである。しかし、解析の観点からは、心臓拍動活性モニタリングを除いて、データ出力は、依然としてＥＬＩＳＡｓおよび免疫染色のような、確立されてはいるが、しばしば飽きられた、伝統的な技術によって達成される、比較的少数の時点のスナップショットの形態である。これらの標準的な測定技術を改善するために、センサーをマイクロ流体構成要素と組み合わせて、外部の構成要素への流体の流れの経路制御のための中央ブレッドボード、培地貯槽、バブルトラップ、複数のオルガノイドマイクロリアクター、物理的センサーチップおよび電気化学センサーチップから構成されるシステムを創製した（図６ａ）。統合されたバブルトラップは、通過する培地流がポストのグリッドに遭遇するモジュールから構成されており、ポストは気泡を捕捉し結合させる役割を果たし、ここで所望により気泡をシステムから除去することができる３２。インラインＭｉｔｏｓフローセンサーを用いた試験により、バブルトラップを用いた場合のより均一で、一貫性がある流れと比較してバブルトラップを用いない場合に流速が変動することが示されている（図６ｂ）。物理的センサーモジュールは、温度プローブ、ｐＨセンサーおよび酸素センサーの３つのセンサーを収容する。熱電対温度プローブは、通過する培地流の温度を記録し、インキュベーターの扉を開け、周囲の室温の空気を流入させることによって示される（図６ｃ）ように、環境温度の擾乱に応答する。培地のｐＨおよび酸素センサーは、インラインＬＥＤおよびフォトダイオードシステムに基づいており、ｐＨ６．０〜８．５（図６ｄ）および０％〜２１％Ｏ２（図６ｅ）のような、生理学的値の範囲に対してとりわけ感度が高い３３。最後に、抗体またはアプタマー結合および電極インピーダンスの変化に基づく電気化学的センサーは、システム操作の過程にわたり一度に３種までの可溶性バイオマーカーの間欠的な測定を可能にする（図６ｆ〜ｇ）。１２時間サイクルの過程で組織構築物分泌アルブミン、α−ＧＳＴおよびクレアチンキナーゼに関する電気化学的バイオマーカーデータを記録した操作統合システムを構築した。アルブミンレベルは、測定可能で、一貫性があったが、α−ＧＳＴおよびクレアチンキナーゼは、これらのベースライン条件下では毒性は予期されなかった通り、低いままである（図６ｈ）。
【００８１】
［考察］
有効な新薬候補の開発は、ヒトベースの組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで正確に具現化することができないため、限定的であり、信じられないほど費用がかかるものとなっていた。動物モデルは、限定的な操作とこれらの機序の試験を可能にするにすぎず、ヒトにおける結果を必ずしも予測するものではない。伝統的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの薬物および毒性試験は、２Ｄ培養における細胞株を用いて実施されてきた。薬剤における多くの発見が得られたにもかかわらず、２Ｄ培養は、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織の３Ｄ微小環境を正確に再現することができない５，７，８。３Ｄ組織オルガノイドに移行することによって、これらの欠点の多くを克服し得る。３Ｄオルガノイドは、サイズが小さいが、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織とより類似した拡散特性を有し、さらに天然に存在する細胞間および細胞−マトリックス相互作用の多くが生じることも可能にする。本発明者らが、本発明者らのオルガノイド特徴付けデータにおいて示したように、そのようなオルガノイドは、それらの２Ｄ対応物と比較して劇的に改善された組織固有の機能性を有する。より重要なことに、これらのオルガノイドは、実際のヒト臓器と同様に薬物および毒素に反応する能力を有し、したがって、それらは、薬物スクリーニング応用のための改善されたプラットフォームとなる。
【００８２】
本発明者らは、一連の薬物に反応するマルチオルガノイドを最終的にもたらす、バイオプリンティングおよびマイクロ流体技術によるこれらの肝臓オルガノイドおよび心臓オルガノイドの統合をさらに述べる。最初に、本発明者らは、肝臓および心臓オルガノイドを別個に評価した。大用量で服用した場合の一般的な肝臓毒素であるアセトアミノフェンは、肝臓オルガノイド分泌アルブミンおよび尿素の両方を用量依存的に減少させることが示された。さらに、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率評価により、漸増ＡＰＡＰ用量が細胞死の明らかな増加をもたらしたことが示された。これらの反応は、予想されたものであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバイオプリントされたこれらのオルガノイドがあるべき形でＡＰＡＰに反応することを示唆するものであった。次の実験は、ＡＰＡＰの毒性作用を軽減するための中和剤としてＮ−アセチル−Ｌ−システインを用いることに焦点を合わせた。ＡＰＡＰの投与と同時のＮＡＣの投与により、毒性作用が低下し、無薬物対照群により高度に類似した機能的アウトプットがもたらされた。ＮＡＣは、ＡＰＡＰにより誘発されるアルブミンおよび尿素の分泌量の減少を軽減し、アポトーシス細胞死によるＬＤＨおよびα−ＧＳＴの放出の発生率も低下させ、ひいては中毒性薬物用量に対するだけでなく、救出薬に対する肝臓オルガノイドの反応性を示す。心臓オルガノイドの反応性は、アドレナリン、ベータアドレナリン作動薬およびベータ遮断薬であるプロプラノロールを用いて試験した。アドレナリンによるベータアドレナリン受容体の活性化は、通常拍動数の増加をもたらすが、プロプラノロールは、この作用を阻害する。一連のアドレナリン濃度を試験したところ、オルガノイドの拍動は、ベータアドレナリン受容体の飽和に起因すると思われるプラトー状態に最終的に達するまで、用量依存的に増加した。高濃度のアドレナリンの投与の前にプロプラノロールを投与した場合、心臓拍動数の増加を用量依存的に低下または阻害することができた。重要なことに、システムにおける流体の流量が低いにもかかわらず、アドレナリンに対する反応が速やかであり、様々な薬物に対するほぼ生理学的反応速度を達成することが可能であり得ることが示唆された。
【００８３】
薬物に対する個々のオルガノイドの反応よりも重要なことは、１つのオルガノイドの反応が他のオルガノイドの反応と密接な関係を有する、マルチオルガノイドシステムの反応である。この概念を探究するために、肝臓および心臓オルガノイドを単一循環流体システム内で組み合わせた。天然の健常肝臓は、プロプラノロールを効率的に代謝でき、それによりベータ受容体のブロッキングが無効化されるので、プロプラノロールのブロッキングおよびアドレナリンに基づくベータ受容体の活性化の効果を、肝臓オルガノイドの存在下および非存在下で評価した。肝臓オルガノイドを含まないシステムでは、プロプラノロールはシステム内でその活性型のままであり、アドレナリンが拍動数の増加を誘発することを阻害することに成功した。しかし、３Ｄ肝臓オルガノイドを導入した場合、それらは、プロプラノロールの一部を代謝し、アドレナリンの投与により、拍動数が増加し、有意な肝臓代謝が示された。とりわけ、２Ｄにおける肝細胞培養を３Ｄ肝臓オルガノイドの代わりに用いた場合、プロプラノロールは、肝臓細胞が全く存在しなかったかのようにアドレナリンの作用を阻害した。これは、肝臓オルガノイドプラットフォームが有効であることをさらに確認し、３Ｄ組織の組織化の重要性を実証するものであった。
【００８４】
３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングプラットフォームにおける高レベルの細胞生存能力および機能を維持する必要性があることに加えて、改善されたデータ取得システムの必要性もある。取得およびモニタリング技術が操作することが簡単または包括的でないならば、最も進歩した生物学的プラットフォームでさえも広範に使用されることはない。これらの要件を満たすために、本発明者らのチームは、プラグアンドプレイ方式で迅速な遂行を可能にする、プラットフォームの他の構成要素と同様にモジュール型であるセンシングシステムのポートフォリオを開発した。温度、流量、酸素およびｐＨを含む、一式の物理的環境センサー、ならびに心臓オルガノイドの拍動を捕捉するためのオンボードカメラおよび可溶性バイオマーカー濃度をモニターするための高度な抗体またはアプタマーベースの電気化学的センサーを含む、細胞ベースのセンサーを示す。これらのセンサーと組織構築物単位および流体構成要素とのさらなる統合および効率化は、本発明者らのプラットフォームの有用性を高め、低い試薬および試料の消費、短いアッセイ時間ならびに低い運転費用を支え続けるであろう３４。
【００８５】
［方法］
オルガノイドの製造および維持。オルガノイドは、ＧｒａｖｉｔｙＰｌｕｓ懸滴培養プレート（ｉｎＳｐｈｅｒｏ  ＡＧ）を用いて凝集させた。細胞を、９０％ＨＣＭ培地（Ｌｏｎｚａ）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）およびラット尾コラーゲンＩ（１０ｎｇ／μｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）から構成される細胞播種混合物中に混ぜ合わせた。肝臓オルガノイドは、８０％肝細胞（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）、１０％肝星細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）および１０％クッパー細胞（Ｇｉｂｃｏ）の混合物を用いて製造した。４０μＬの培地当たり約１５００個の細胞を用いて、懸滴培養で凝集体を形成した。心臓オルガノイドは、培養の純度および分化を維持するために１００％心筋細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて心筋細胞維持培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）中で同様に製造した。３７℃で５％ＣＯ２を用いた４日間の培養の後、オルガノイドを下流応用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）のために移し、それらの各培地中で８０μｌ／ウェルで培養した。
【００８６】
肝臓および心臓固有のヒドロゲルバイオインクの調製。肝臓に固有のヒドロゲルバイオインクは、以前に記載された１５ように、脱細胞化ブタ肝臓から調製した、増殖培地、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびエラスチンを含む、肝臓ＥＣＭ溶液を注入したヒアルロン酸およびゼラチンヒドロゲルシステムを用いて調合した。バイオインクの調製のために、ＨｙＳｔｅｍ−ＨＰヒドロゲルキットからのチオール化ヒアルロン酸およびゼラチンベースの材料成分（それぞれＨｅｐｒａｓｉｌおよびＧｅｌｉｎ−Ｓ、ＥＳＩ−ＢＩＯ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を光開始剤（４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−プロピル）ケトン、Ｓｉｇｍａ）の０．１重量／容積％溶液に溶解して、２重量／容積％溶液を調製した。ＰＥＧＤＡ架橋剤（ＭＷ  ３．４ｋＤａ、ＥＳＩ−ＢＩＯ）を光開始剤溶液に溶解して、４重量／容積％溶液を調製した。さらに、８アームＰＥＧアルキン架橋剤を溶解して、８重量／容積％溶液を調製した。ヒドロゲルバイオインク溶液を調製するために、４部の２％Ｈｅｐｒａｓｉｌ、４部の２％Ｇｅｌｉｎ−Ｓ、１部の架橋剤１、１部の架橋剤２を８部の肝臓ＥＣＭ溶液および２部のＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＨＣＭ、Ｌｏｎｚａ）と混ぜ合わせた。次いで非修飾ＨＡおよびゼラチンをバイオインクに添加した（それぞれ１．５ｍｇ／ｍＬおよび３０ｍｇ／ｍＬ）。得られた混合物をボルテックスして混合し、注射器またはプリンターカートリッジに移し、自発的に３０分間架橋させた（ステージ１架橋）。二次架橋（ステージ２）が望ましい場合、例えば、バイオプリンティングの後、押出されたステージ１架橋ゲルに紫外線（３６５ｎｍ、１８ｗ／ｃｍ２）を照射して、チオール−アルキン重合反応を開始させた。
【００８７】
心臓ヒドロゲルバイオインクは、単純なフィブリン−ゼラチン２部システムを用いて調合した。第１の部分は、３０ｍｇ／ｍＬフィブリノーゲンおよび３５ｍｇ／ｍＬゼラチンをＰＢＳに溶解することによって調製し、一方、第２の部分は、２０Ｕ／ｍＬトロンビンをＰＢＳに溶解することによって調製した。バイオインク成分のヒドロゲル内への架橋は、所望の容積のフィブリノーゲン−ゼラチン溶液をトロンビン溶液で覆い、それにより、酵素的フィブリノーゲン切断およびその後の架橋を開始させることによって達成された。
【００８８】
肝臓構築物および心臓構築物のバイオプリンティング。肝臓構築物を作製するために、初代肝臓スフェロイドをヒドロゲルバイオインク溶液中に懸濁し、バイオプリンターカートリッジに移し、その後、溶液に第１の架橋ステージ（チオール−アクリレート反応）を３０分間受けさせた。最初の架橋の後に、組織内部で開発された３Ｄバイオプリンター２７を用いて、ヒドロゲルバイオインクをポリカプロラクトンと同時に押し出して、７ｍｍ×５ｍｍのダイヤモンド形のプラスチックカバースリップ上で、支持ＰＣＬ構造間に一組のヒドロゲル「流路」を形成した。この構造を図２ｂ〜ｃに示す。印刷は、プリントヘッドを約３００ｍｍ／分の速度で、Ｘ−Ｙ面内を移動させながらバイオプリンターにより加えられた２０ｋＰａの圧力下で行われた。堆積後、１〜２秒間のＵＶ光の照射を用いて、二次架橋メカニズムを開始させ、構築物を安定化し、材料の剛性を増大させた。構築物を１２ウェルプレートの底部に入れ、２ｍＬのＨＣＭで覆い、プレートをさらなる使用時まで３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中に入れた。
【００８９】
心臓構築物を作製するために、心臓オルガノイドをフィブリノーゲン−ゼラチン溶液中に懸濁し、バイオプリンターカートリッジに移した。ゼラチン成分を十分な粘度となるまでバイオインクに加えて、オルガノイドを懸濁液中に保持し、滑らかな堆積を促進した。３Ｄバイオプリンターは、上述の同じ７ｍｍ×５ｍｍプラスチックカバースリップの外辺部に沿って位置する支持ＰＣＬフレーム内に、オルガノイド添加バイオインクを堆積した。印刷を上述のように実施し、その後、トロンビンの二次溶液を用いて、バイオプリントされた構築物を覆い、フィブリノーゲン成分の架橋を開始させた。構築物を１２ウェルプレートの底部に入れ、２０μｇ／ｍＬアプロチニンを含む２ｍＬ  ＣＭＭ（Ｓｉｇｍａ）で覆って、フィブリンゲルの酵素分解を防止し、ウェルプレートをさらなる使用時まで３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中に入れた。
【００９０】
バイオプリンティングの後の細胞生存率の確認のために、バイオプリントされた構築物をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて染色した。手短に述べると、構築物をＰＢＳおよびＨＣＭの１：１混合物中２μＭカルセイン−ＡＭおよび４μＭエチジウムホモ二量体−１の濃度とともに１時間インキュベートした。染色後、構築物を４％パラホルムアルデヒドで６０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＬＳＩマクロ共焦点顕微鏡を用いて構築物を撮像した。各構築物の１５０μｍのＺスタックを取得し、それから最大画像を得た。後の実験に使用するために、９０％以上の生存率（示さず）を有するバッチのオルガノイドのみを用いた。
【００９１】
マイクロ流体マイクロリアクターデバイスとの統合。マイクロ流体デバイスは、通常のソフトリソグラフィーおよびレプリカモールディングにより形成されたＰＤＭＳ構成要素の組立てにより作製した３１。マイクロバイオリアクターは、ＰＭＭＡクランプにより上部および底部から強固に保持された、流体の流れを導くためのＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）ブロックからなっている。作製プロセスは、バイオリアクターの内側のＰＤＭＳ構造を固定し、他の構造の追加を容易にする２つのＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）クランプを機械加工することから開始した。ＰＭＭＡ層は、レーザー切断（３ｍｍ）ＰＭＭＡ（８５６０Ｋ２３９、ＭｃＭａｓｔｅｒ）を用いて機械加工した。底部ＰＭＭＡクランプは、１５×１０ｍｍの長方形の端に８個の２ｍｍ穴を有していた。上部は、同じ位置合わせされた８個の穴（ネジ固定用）および中心がマイクロバイオリアクターの入口／出口ポストに位置合わせされた、２つの３．５ｍｍの穴からなっていた。
【００９２】
リアクターのマイクロ流体構成要素は、ＰＤＭＳのソフトリソグラフィーを用いて作製した。ＰＤＭＳマイクロ流体構成要素の型を作製するために、レーザーカッターを用いて機械加工またはＳＵ−８フォトレジストを用いて、ＰＭＭＡシートを形成した。ＰＤＭＳプレポリマーは、シリコーンベースおよび硬化剤（１０：１容積比）を５分間十分に混合した後、真空チャンバー中でＰＤＭＳ混合物を３０分間脱気することによって調製した。次いで、プレポリマーをそれぞれの押込み型上に注いだ。薄い下層（入口要素）用には１０ｃｍペトリ皿当たり２．０ｇを用い、一方、厚い上層（出口要素）用には６．０ｇを加えた。第２の脱気処置を行って、存在するすべての気泡を除去した後、８０℃で少なくとも９０分間ＰＤＭＳを硬化させた。硬化した後、２つのＰＤＭＳ層を型と対照して切断した。細胞チャンバー部分を下層から切り離したが、後のプラズマボンディングステップのために残しておいた。入口／出口接続用の穴は、上層対して１ｍｍパンチを用いて切り取った。
【００９３】
システムの組立ては、チャンバー面がガラススライドに対向するように、ＴＭＳＰＭＡ処理ガラススライドへのＰＤＭＳ底層の標準的な不可逆空気プラズマボンディング（Ｐｌａｓｍａ  Ｃｌｅａｎｅｒ  ＰＤＣ−３２Ｇ、Ｈａｒｒｉｃｋ  Ｐｌａｓｍａ）を用いて実施した、底層の調製から開始した。ボンディングの前に、ガラススライドおよびＰＤＭＳ層をスコッチテープと対照して十分に浄化した。結合された構築物を８０℃オーブン中に終夜保持した。
【００９４】
バイオリアクターの製作プロセスにおける次のステップは、上層の２つのパンチ穴への１ｍｍコネクターの挿入であった。対応する穴を有するＰＭＭＡ構造を、接続の近くの所定の位置にＰＤＭＳを含む保護層として用いた。穴を完全に埋めるようにＰＤＭＳプレポリマーを加えた後、８０℃オーブン中で６０分間硬化させた。硬化後、コネクターを注意深く除去し、ＰＴＦＥチューブを穴に挿入し、エポキシ接着剤により固定した。クッション層を構成する、ＰＤＭＳパッドは、７．５ｇの脱気ＰＤＭＳを１０ｃｍの皿に注加した後、硬化させて、１ｍｍの厚さのＰＤＭＳパッドを得ることにより作製した。このクッション層は、ガラススライドと底部ＰＭＭＡカバーとの間に用いた。使用するためにマイクロリアクターの層を固定し、ネジで留めてそれらを一緒に保持した。
【００９５】
バイオプリントされたオルガノイド構築物を収容するために、滅菌済み鉗子を用いて、カバースリップ上の構築物を７ｍｍ×５ｍｍオルガノイドチャンバーマイクロバイオリアクターデバイス中に移した。次いで、使用直前にマイクロリアクターデバイスを密封し、固定した。各デバイスをチューブによりマイクロ流体ポンプ、バブルトラップおよびその後の実験条件による適切な種類の培地（ＨＣＭ、ＣＭＭまたは５０：５０共通培地）を含む培地貯槽に接続した。流入を１０μＬ／分で開始し、維持して、システムを満たした。
【００９６】
肝臓構築物合成機能、アセトアミノフェン傷害に対する反応およびＮ−アセチル−Ｌ−システインによる介入。有毒薬物傷害に対する肝臓オルガノイドシステムの反応を評価するために、アセトアミノフェンを用いた。肝臓オルガノイドを前述のようにマイクロリアクター中で１４日間培養した。３、６、１０および１４日目に培地試料を採取した。６日目の培地の採取後に、１組のオルガノイドを通常の培地で継続し、１組のオルガノイドを１ｍＭのＡＰＡＰで処理し、１組のオルガノイドを１０ｍＭのＡＰＡＰで処理した。肝臓オルガノイドシステムに用いるべき対抗処置の有効性を評価するために、ＡＰＡＰ誘発性毒性に対する臨床的に適切な処置として、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを検討した。この最後の組のオルガノイドを１０ｍＭｎおＡＰＡＰおよび２０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システインで処理した。培地の交換中、薬物処理を受けている群は、適切な薬物濃度も含む新たなＨＣＭを受けた。
【００９７】
ベースライン条件下ならびにＡＰＡＰへの曝露中の肝臓オルガノイドのアルブミンおよび尿素の分泌の評価のために、採取した培地の一部試料をＨｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて分析し、採取した培地中の分泌尿素の量を、Ｕｒｅａ比色アッセイ（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。生存率の評価のために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による染色のために、最終培地採取時点（１４日目）の直後にオルガノイドを除去した。染色は、２μＭカルセインＡＭ／ＰＢＳ：ＨＣＭ（１：）溶液（生細胞を緑色に染色する）および４μＭのＥｔｈＤ−１（死細胞を赤色に染色する）中のインキュベーションからなっていた。染色後、オルガノイドをＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳに移してマクロ共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＬＳＩ）を用いて撮像した。さらに、培地試料をＬａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を用いて、毒性により細胞膜破裂が引き起こされた後に細胞から放出される酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の存在について、および、α−ＧＳＴ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、毒性への曝露後にこれも細胞から放出される肝細胞特異酵素であるα−ＧＳＴについて、分析した。
【００９８】
心臓構築物のベースライン機能のモニタリングおよび薬物に対する拍動数反応。オンボードカメラは、市販の費用対効果が高いｗｅｂｃａｍ（Ｌｏｇｉｔｅｃｈ  Ｃ１６０）に基づいて設計され、製造され、レンズレス型からかなり改良された３５，３６。図４ａにおける略図に、ｗｅｂｃａｍからコンパイルされた部品を有する顕微鏡の製造法を示す。最初にＣＭＯＳセンサーを復活するためにｗｅｂｃａｍのカバーを外す。次いでｗｅｂｃａｍのレンズをその最初の位置から取り外し、反転させ、後退させてホルダーに組み込んで、それを拡大レンズに転換する。次いでバイオリアクターの底部に合うように小顕微鏡用の基部を設ける。基部は、レーザーカッター（ＶＬＳ  ２．３０  Ｄｅｓｋｔｏｐ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてバイオリアクターの寸法に切断されたＰＭＭＡシート（厚さ１／８”、１２”ｘ１２”、ＭｃＭａｓｔｅｒ  ８５０５Ｋ１１）の二層構造からなっていた。４組のネジ／ボルトを用いて、ＣＭＯＳモジュールをＰＭＭＡ構造の対の間に強固に固定した。さらなる４組のネジ／ボルトを構造の隅にさらに取り付けて、焦点ノブとしての役割を果たさせた。バイオリアクター自体の非常にわずかな変更が必要であり、すなわち、底部で撮像装置に合うように４つの別の穴を下側のＰＭＭＡボードにドリルで開けた。
【００９９】
心臓構築物の培養中に、ビデオを撮り、心臓オルガノイドの拍動数を解析した。ビデオファイルは、一連のＭａｔＬａｂ関数を有するＭａｔＬａｂカスタムコードを用いて解析した。ソフトウエアは、ビデオの最初のフレームに基づいて参照フレームを作り、それぞれの後のフレームにおける画素を比較し、どの画素が経時的な運動を表していたかを決定した。次いで各フレームにおける運動画素を用いて、拍動挙動の白黒画素化表示を発生させて、拍動伝播の視覚化を可能にし、運動画素の数対時間を示すプロットを発生させ、拍動数の決定を可能にした。
【０１００】
薬物に対する心臓オルガノイドの拍動数反応を評価するために、ベースライン条件下で、または０．１ｍＭイソプロテレノール、１μＭキニジンもしくはアドレナリンとプロプラノロールとの併用により処理した状態で、心臓オルガノイドのビデオを撮影した。最初に後者の２つの薬物について、アドレナリンを０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭの濃度で投与し、オルガノイドの拍動数を決定した。次に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの心拍数の増加を妨げるベータ遮断薬であるプロプラノロールの影響下でのアドレナリンの反応は、最初に１５分間にわたり０μＭ、０．５μＭ、５μＭおよび２０μＭを用いて心臓オルガノイドをインキュベートし、その後、アドレナリンを５μＭの濃度で投与し、拍動数を顕微鏡下で視覚的に決定することによって評価した。
【０１０１】
統合オルガノイドシステムおよび薬物に対する統合反応。両方の種類のオルガノイドの組合せが薬物反応にどのように影響するのかを評価するために、アドレナリンおよびプロプラノロールを独立に、および一緒に試験した。独立シナリオでは、オルガノイドプラットフォームを以下の２つの群で用意した。群１は、心臓のみからなる一組のオルガノイドと「ブランク」肝臓モジュールからなっていた。群２は、心臓および肝臓の両方からなっていた。しかし、心臓および肝臓構築物がインキュベーション期間中別個に維持されていた一方で、薬物が肝臓構築物または「ブランク」肝臓モジュールに投与され、その後、心臓拍動数を評価する前にモジュールを３０分間一緒にしたことに注意すべきである。ベースラインの心臓オルガノイド拍動数を薬物の投与前に各群において決定した。次いで、薬物、つまり０．１μＭプロプラノロールまたは０．５μＭアドレナリンのいずれかを投与し、１時間インキュベートし、その後モジュールを接続し、データを収集した。
【０１０２】
アドレナリンおよびプロプラノロールの組合せに対する肝臓および心臓システムの統合された反応を試験するために、上述の実験群を用意し、同じプロトコール（モジュールの接続の前の個々のユニットのインキュベーション）に従った。しかし、インキュベーション期間を終夜（１８時間）に延ばした。群１と群２の両方に０．１μＭプロプラノロールを投与した。インキュベーション期間の後、モジュールを接続し、０．５μＭアドレナリンを両群に投与した。さらに、並行して、群２と同様であるが、２Ｄ比較として肝臓構築物の代わりに２Ｄ肝細胞培養（１００〜２００万個細胞／ウェル）を用いた群３条件を用いた。
【０１０３】
［補足的な材料および方法］
肝臓細胞の供給源および培養。用いたすべての細胞は、商業的に調達されたヒト初代細胞であった。オルガノイドの形成に用いるための肝星細胞（ＨＳＣｓ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）は、冷凍保存の前に２継代にわたって増殖培養した。増殖中、ＨＳＣｓは、３７℃、５％ＣＯ２条件下、ラット尾コラーゲンＩコーティング（１０ｎｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で、９０％高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏ．）中にて培養した。初代ヒト肝細胞（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）は、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）を用いて製造業者の取扱説明書に従って解凍した。クッパー細胞も製造業者の取扱説明書（Ｇｉｂｃｏ）に従って解凍した。２次元肝細胞サンドイッチ培養は、肝臓オルガノイドとの比較として用いた。初代ヒト肝細胞（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）は、上述のように解凍し、次いで、約１５０，０００細胞ｃｍ２／の密度でＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｐｌａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）を用いて、コラーゲン被覆（１０ｎｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）６ウェル培養プレート上で平板培養した。細胞は、マトリゲルを重層（ＢＤ）として加える前に３７℃で５％ＣＯ２を用いて４時間インキュベートした。さらに２４時間インキュベートした後、新たなＨＣＭ培地（Ｌｏｎｚａ）を加えた。
【０１０４】
心臓細胞の供給源および培養。人工多能性幹細胞由来の心筋細胞をＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓから商業的に調達し、オルガノイドを心筋維持培地（ＣＭＭ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）中で培養した。
【０１０５】
オルガノイド生存率アッセイ。以下のホワイトペーパー１に詳述されているように、オルガノイドの生存率を、代謝活性の尺度としてのＡＴＰの産生により評価した。１つのオルガノイド／ウェルを黒色不透明９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移すことにより、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＡＴＰを測定した。８０μｌ／ウェルのＨＣＭ培地（Ｌｏｎｚａ）を用いたブランクを含めた。１ウェル当たり８０μｌの調製済みＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ緩衝液を加え、振盪機上に５分間のせて、細胞を溶解し、次いで遮光してさらに１５分間インキュベートした。プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて０．５秒／ウェルの積分時間でプレートを読み取った。サンプルタイムポイント（ｓａｍｐｌｅ  ｔｉｍｅ  ｐｏｉｎｔｓ）を２標本不等分散ｔ検定により比較した。生／死染色も用いて生存率を評価した。オルガノイドをＰＢＳで洗浄し、次いで生／死、生存率／細胞毒性キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２μＬ／ｍＬエチジウムホモ二量体−１およびカルセインＡＭ（ＰＢＳで希釈）で遮光して室温で４５分間染色した。オルガノイドを凹型ガラススライド（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、次いで５ｘマクロ対物レンズ付きＴＣＳ  ＬＳＩマクロ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて撮像した。
【０１０６】
オルガノイド機能アッセイ。培地交換の２４時間後に個々のウェルから上清を採取することにより、尿素およびアルブミンの産生を測定した。尿素の産生は、比色アッセイＱｕａｎｔｉｃｈｒｏｍ  Ｕｒｅａ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造業者の取扱説明書に従って測定した。試料は、４３０ｎｍに設定されたプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、９６ウェル透明アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて測定した。データは、２標本不等分散ｔ検定を用いて解析した。アルブミンの産生は、Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って測定した。試料は、４５０ｎｍに設定されたプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、データは、２標本不等分散ｔ検定を用いて解析した。
【０１０７】
個々のオルガノイドの免疫組織化学。組織化学用のオルガノイドの用意。オルガノイドを採取し、４％パラホルムアルデヒドで室温で１時間固定した。オルガノイドは、Ｈｉｓｔｏｇｅｌ（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に包埋し、次いで、パラフィン包埋物を４μｍ切片にする前に、一連の段階的エタノール洗浄により脱水した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、ＤＭ４０００Ｂ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて光学顕微鏡法により撮像した。
【０１０８】
免疫組織化学。別途述べない限り、すべての洗浄をＴＢＳで、インキュベーションステップを室温で実施した。切片を脱パラフィンし、水和し、次いで熱誘導エピトープ回復ステップを０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で実施した。内因性酵素活性をＤｕｅｌ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｌｏｃｋ  （Ｄａｋｏ）を用いてブロックし、１０分間インキュベートした。スライドは、Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｄａｋｏ）で１５分間ブロックした。一次抗体をＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ）で希釈し、４℃で終夜インキュベートした。用いた抗体は、マウス抗ヒト血清アルブミン（Ａｂｃａｍ、ａｂ１０２４１）、ウサギ抗シトケラチン１８（Ａｂｃａｍ、ａｂ５２９４８）、ウサギ抗シトクロムＰ４５０レダクターゼ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３５１３）、ウサギ抗ＧＦＡＰ  （Ａｂｃａｍ、ａｂ７２６０）、ウサギ抗コネキシン３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、７１−０７００）およびウサギ抗Ｅカドヘリン（Ａｂｃａｍ、ａｂ４０７７２）、マウス抗トロポニンＴ−Ｃ（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、ｓｃ７３２３４）を含む。二次抗体をＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ）で希釈し、１時間インキュベートした。用いた二次抗体は、ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、７１１−０３５−１５２）、ビオチン抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＢＡ−２０００）およびビオチン抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＢＡ−１０００）を含む。ＨＲＰコンジュゲート抗体については、ＮｏｖａＲｅｄ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて試料を得た。アビジン−ビオチニル化コンジュゲート抗体については、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ）およびＶｅｃｔｏｒＲｅｄ  ＡＰ基質（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いてスライドを得た。スライドをヘマトキシリンで染色し、次いでＭｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ  ２４（Ｌｅｉｃａ）を用いて永久的にカバースリップを載せた。スライドを、ＤＭ４０００Ｂ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて光学顕微鏡法により撮像した。
【０１０９】
オルガノイドのホールマウント免疫蛍光染色。心臓オルガノイドをホールマウント免疫蛍光染色法により解析した。別途述べない限り、すべての洗浄をＰＢＳで、ステップを室温で実施した。オルガノイドを採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、振盪機上で１時間インキュベートした。オルガノイドを０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いて透過処理し、振盪機上で１時間インキュベートした。試料をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｄａｋｏ）で１時間処理した。一次抗体をＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ）で希釈し、４℃で終夜インキュベートした。用いた一次抗体は、ウサギ抗ＶＥＧＦ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−１５２）、マウス抗アクチニン（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、ｓｃ−１７８２９）およびマウス抗ＭＹＬ７（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、ｓｃ−３６５２５５）を含む。二次抗体をＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ）で希釈し、４℃で終夜インキュベートした。用いた二次抗体は、ヤギ抗ウサギＡＦ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびヤギ抗マウスＡＦ５９４であった。試料を振盪機上でＤＡＰＩを用いて２０分間染色した。５ｘマクロ対物レンズ付きＴＣＳ  ＬＳＩマクロ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて撮像するために試料を凹型ガラススライド（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。
【０１１０】
薬物代謝に関する質量分析。この実験に用いたすべての薬剤化合物は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から調達した。オルガノイドおよび単層培養における薬物毒性は、ＨＣＭ培地（Ｌｏｎｚａ）中、リファンピシン（２５ｍＭ）、３−メチルクロルアントラセン（３．７８μｇ／ｍＬ）およびフェノバルビタール（５８．０μｇ／ｍＬ）の混合物を用いて、細胞を２４時間誘導し、シトクロムＰ４５０活性を誘導することによって評価した。次いでジアゼパム（２．５μｇ／ｍＬ）をＨＣＭ培地に２４時間加えた。ジアゼパム代謝物であるテマゼパム、ノルジアゼパムおよびオキサゼパムを細胞上清中で測定した。試料容積を測定し、４−ＯＨクマリンを内部標準として５００ｐｇ／μｌの最終濃度で加え、２５μｌを５０℃に維持されたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ３μｍ  Ｃ１８−ＢＤ  １５０ｍｍ長Ｘ２ｍｍＩ．Ｄ．カラム（Ｐ／Ｎ  ００Ｆ−４０１８−Ｂ０）に注入し、０．２ｍｌ／分の流量で溶出した。ＬＣ勾配は、０分に９５％Ａ、０〜６分に３０％Ａまで、６〜２０分に３０％Ａに保持、２０〜２２分に９５％Ａまで、２２〜３０分に９５％Ａに保持であり、溶媒Ａは、９５：５（容積／容積）Ｈ２Ｏ：メタノール＋０．１５％ギ酸であり、溶媒Ｂは、メタノール＋０．１５％ギ酸であった。用いたシステムは、Ｓｐａｒｋ  Ｈｏｌｌａｎｄ  ＬＣならびにＲｅｌｉａｎｃｅオートサンプラーおよび４℃に維持された調整スタッカーにより自動化された、ポジティブイオンおよび多重反応モニタリングモードで操作されるＴｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｍａｘ３連四重極質量分析計であった。スプレー電圧は、３５００Ｖであり、キャピラリー温度は、２５０℃であり、スキャン時間は、０．１秒であり、Ｑ１およびＱ３ピーク幅は、両方が０．７０であり、Ｑ２衝突ガス圧力は、０．８ｍトルであった。
【０１１１】
トログリタゾン毒性。トログリタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）保存溶液をＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に懸濁し、次いでＨＣＭ培地により、０μＭ、１μＭ、１．６７μＭ、２μＭ、２．３３μＭ、２．６７μＭおよび３μＭの濃度に希釈した。ＤＭＳＯ毒性対照は、ＨＣＭ培地中１％ＤＭＳＯを用いて調製し、すべての処理保存溶液（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｏｃｋｓ）は、＜１％のＤＭＳＯを含んでいた。オルガノイドは、試料の採取前にトログリタゾンで４８時間処理した。オルガノイドの生存率は、前述のように記録されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。オルガノイド内のリン脂質の蓄積は、ＨＣＳ  ＬｉｐｉｄＴｏｘ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて撮像した。ＬｉｐｉｄＴｏｘ試薬をトログリタゾンと同時に１：５００の比で培地に加えた。４８時間の薬物処理の後、オルガノイドを４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、次いで５ｘマクロ対物レンズ付きＴＣＳ  ＬＳＩマクロ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて撮像するために凹型ガラススライド（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。
【０１１２】
マイクロリアクター培養肝臓構築物の表現型および長期生存率の特徴付け。免疫染色による表現型の特徴付けのために、オルガノイドを培養中で最長２８日間維持し、その間、様々な時点にいくつかの解析を実施した。３日目、６、１０、１４、１７、２１、２４および２８日目に、消費された培地を新たなＨＣＭと交換した。８日後に、オルガノイド構築物を４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳですすぎ、その後、組織学的解析（下記）のために処理するまで構築物をＰＢＳで４℃に維持した。アルブミンおよび尿素の分泌の解析のために、オルガノイドを培養中で１４日間維持し、その間、３、７、１０および１４日目に培地を採取し、新たなＨＣＭと交換した。生存率の評価のために、オルガノイドを培養中で２８日間維持した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による染色のために１日目、１４日目および２８日目にオルガノイドのサブセットをマイクロリアクター培養から除去し、その後、それらを４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳに移し、マクロ共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＬＳＩ）を用いて撮像した。
【０１１３】
固定された肝臓構築物をプラスチックカバースリップから注意深く除去し、パラフィン処理し（段階的エタノール洗浄、キシレンおよびパラフィン）、組織切片作製の用意をした。ガラス顕微鏡スライド上組織切片（５μｍ）をミクロトームを用いて作製した。ＩＨＣのために、別途述べない限り、すべてのインキュベーションを室温で行った。スライドを６０℃で１時間加温して、スライドへの結合を増大させた。抗原賦活化は、すべてのスライドについて実施し、プロテイナーゼＫ（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）中の５分間のインキュベーションにより達成された。０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中、５分間のインキュベーションにより、切片を透過処理した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （Ａｂｃａｍ）中の１５分間のインキュベーションにより、非特異的抗体結合をブロックした。切片は、加湿チャンバー内で、以下、すべてが抗体希釈剤（Ａｂｃａｍ）により１：２００希釈された、一次アルブミン（マウスにおいて産生、カタログ＃Ａ６６８４、Ｓｉｇｍａ）、ＣＹＰ３Ａ４（ウサギにおいて産生、カタログ＃ＮＢＰ１−９５９６９、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）、Ｏｓｔ−Ａｌｐｈａ（ウサギにおいて産生、カタログ＃ｓｃ−１０００７８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ウサギにおいて産生、カタログ＃ａｂ２８３４０）、Ｅ−カドヘリン（マウスにおいて産生、カタログ＃６１０１８１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ＺＯ−１（ウサギにおいて産生、カタログ＃６１−７３００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはβ−カテニン（ウサギにおいて産生、カタログ＃７１−２７００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、６０分間インキュベートした。
【０１１４】
一次インキュベーションの後、スライドをＰＢＳで５分間にわたり３回洗浄した。次いで試料を適宜、抗体希釈剤（１：２００希釈）中で抗ウサギもしくは抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または抗マウスＤｙｌｉｇｈｔ  ５９４二次抗体とともに１時間インキュベートした。細胞をＤＡＰＩで５分間対比染色し、蛍光撮像の前に１×ＰＢＳで３回洗浄した。陰性対照は、一次抗体インキュベーションと並行して実施し、一次抗体の代わりにブロッキング溶液とのインキュベーションを含めた。陰性対照切片において免疫反応性は認められなかった。試料は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ４０００Ｂ正立顕微鏡で４８８ｎｍ、５９４ｎｍおよび３８０ｎｍの蛍光を用いて撮像した。
【０１１５】
オンボードセンサーの実装。物理的センサー。酸素センサーの操作は、酸素の存在下における外因性光輝性色素のクエンチングに基づくものであり（Ｐａｐｋｏｖｓｋｙ，  Ｄ．  Ｂ．  ＆  Ｄｍｉｔｒｉｅｖ，  Ｒ．  Ｉ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｅｎｓｉｎｇ．  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ  ４２，  ８７００−８７３２，  ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ３ｃｓ６０１３１ｅ（２０１３））、Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．（Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｉ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｆｗｉｔｈ  ａｄｊｕｓｔａｂｌｅ  ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １５：  ３６６１−９  （２０１５））により詳細に記載されている。センサーは、ＵＶ光源、励起フィルター（４６０ｎｍ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）および発光フィルター（６３０ｎｍ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）ならびにガラススライド上に沈着した酸素感受性色素からなっていた。ガラススライドを、９０秒間にわたるエタノールおよびプラズマ処理により十分に浄化した。次いで、スコッチテープ片をスライド上にのせ、レーザーカッターを用いてテープにおける正方形の開口部を切り出した。エタノール中トリス（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ジクロリド（ＡｌｆａＡｅｓａｒ）を、ガラススライド上に分注し、暗所で蒸発して、色素の層を残した。テープを除去し、色素の乾燥した層を残した。流体の流れによって洗い流されることから色素を保護するために、５００ｒｐｍで１０秒間、その後、６０００ｒｐｍで６０秒間のスピンコーティングによって、スライド上の色素上にＰＤＭＳの薄層を被覆した。次いで、スライドを８０℃で３０分間硬化させた。次いで、ガラススライドを、プラズマ処理を用いて、ｐＨ、酸素および温度センサーを収容するための空間を有するＰＤＭＳ流路に結合させた。流路は、主流体回路にセンシングモジュールを接続する１つの入口および１つの出口を有していた。要求される容積を最小限にするために、３つのセンサーは、単一流路を共有している。
【０１１６】
ｐＨセンサーの操作は、上記のＺｈａｎｇに記載されているように、センサー流路を流れる異なるｐＨレベルのフェノールレッド含有培地におけるＵＶ光の吸収に基づくものであった。具体的には、センシングは、６〜８の間のｐＨ値であるフェノールレッド含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の吸収スペクトルに焦点を合わせている。約４２０ｎｍおよび５６０ｎｍの２つの主要な吸収ピークが存在する。異なるｐＨ値におけるピーク間の差異は、５６０ｎｍにおいて４２０ｎｍと比較してより顕著であった。ＤＭＥＭを含有するフェノールレッドの、各ｐＨ値における異なる吸収レベルを活用して、光学センサーが開発された。センサーは、組み立てられ、ＰＤＭＳ流体流路に接続された光源としての白色光ＬＥＤ（Ｒａｄｉｏｓｈａｃｋ）、フォトダイオード（ＦＤＳ１００、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）およびロングパスフィルター（４９５ｎｍ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）からなっていた。ロングパスフィルターを利用して、異なるｐＨ値における電圧の読み（ｍＶ）に基づく線形校正曲線を得た。４９５ｎｍのカットオフ波長を有するハイパスフィルターをフォトダイオードの前に取り付けて、４９５ｎｍ未満の波長を有するシグナルを除去した。ブロードバンドＬＥＤにより照射された場合、バイオリアクターの底部のフォトダイオードが、培養培地に加えたフェノールレッド内の光の吸収を検出し、これが培地中のｐＨ値と直線的に相関していた。
【０１１７】
温度センサーは、柔軟な熱電対マイクロプローブ（ＩＴ−１８、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）および熱電対測定インターフェース装置（ＮＩ  ＵＳＢ−ＴＣ０１、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製）から構成されていた。殺菌済み熱電対マイクロプローブを培養培地と直接接触させて温度を測定した。温度センサーの分解能は、０．１℃であった。温度センサーを流路に組み込むために、それをガラススライドに結合させる前に直径１ｍｍの穴をＰＤＭＳ流路に開けた。同じ直径の２つの穴を入口および出口ポートとして開けた。チューブを用いてセンシングモジュールをブレッドボードに接続し、迅速乾燥エポキシを用いて温度マイクロプローブを所定の位置に固定した。
【０１１８】
センサーからのデータの取得は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  （ＮＩ）製のデータ取得カードおよび特注コード化ＬａｂＶＩＥＷプログラムにより行われ、制御された。さらに、プログラムは、白色ＬＥＤおよびＵＶ−ＬＥＤの照明持続時間を電気リレーにより制御した。ｐＨおよび酸素センサーのフォトダイオードからの出力は、データ取得カードを用いて収集された。温度センサーは、組織内開発ＬａｂＶＩＥＷプログラムとのその統合を可能にするデータ取得用の内蔵プログラムを有していた。
【０１１９】
電気化学的センサー。メディエーターのような固有の電気化学反応を伴わないバイオマーカーを検出するために、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）を測定技術として用いた。ＥＩＳは、電極表面の電気化学的特性、ならびに電解質および電極表面との間の分子の結合速度論の研究を可能にする電気化学技術である。バイオマーカーを捕捉するために、種々の抗原に対するそれらの選択性および感受性のため、抗体またはアプタマーを、バイオマーカーを捕捉するためのバイオレセプターの親和性要素として用いる。補助（対）電極および参照電極ならびに作用電極と、電流が加えられるまたは測定される回路を備えた３電極セルを用いて電気分析化学を行う。フェリシアン化カリウム（Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］）電解質を試験溶液に加えて、十分な伝導性を確保する。電解質および特定の作用電極材料（Ａｕ）との組合せにより、印加電位の範囲が決定される。簡単に言うと、電極表面への抗体の付着は、システムに電荷移動抵抗を導入する。
【０１２０】
サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）および矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）ＥＩＳによる電気化学的解析は、ＣＨＩ  ６６０Ｅ電気化学ワークステーション（ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施した。ＥＩＳ技術については、初期電位を０．０５Ｖに設定し、周波数の範囲を０．１Ｈｚから１０ｋＨｚまでスキャンした。ＳＷＶにおいて、電位は、２５ｍＶの振幅のステップと４ｍＶの２つの連続するステップの間の増分で−０．５Ｖから０．５Ｖまで増加させた。周波数は、３０．１Ｈｚに設定し、感度スケールは、０．０００１Ａ／Ｖであった。ＣＶの場合、電位範囲を０．０５Ｖ／秒のスキャン速度で０．５Ｖから０．５Ｖまでスキャンした。全検出には６セグメント（３サイクル）を必要とし、感度は０．００００１  Ａ／Ｖに設定した。すべての測定は、５ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］レドックスプローブシステムで行った。電気化学的検出は、市販のスクリーンプリント金電極（Ｄｒｏｐｓｅｎｓ）を用いて行った。Ｄｒｏｐｓｅｎｓ電極は、補助および作用電極としてのＡｕならびに参照電極としての銀電極からなっていた。セラミック基材のサイズは、３３ｍｍÅ〜１０ｍｍÅ〜０．５ｍｍ（長さÅ〜幅Å〜高さ）である。作用電極の面積は、４πｍｍ２である。
【０１２１】
電極の表面は、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−［３−ジメチルアミノプロピル］−Ｎ’−エチルカルボジイミド  ヒドロクロリド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）による自己組織化単層（ＳＡＭ）（カルボン酸基）とＳＰＶ（アミン基）との間の共有結合により作用電極上にストレプトアビジン（ＳＰＶ）を固定化することによって官能基化した。ＳＡＭ溶液は、エタノール中メルカプトウンデカン酸（１０ｍＭ）を用いて調製した。Ａｕ電極は、ＳＡＭ溶液中に室温で１時間インキュベートし、次いで電極をエタノールで洗浄した。ＳＡＭ層上に共有結合性リンカーを形成するために、５０ｍＭのＥＤＣ／ＮＨＳ混合物／クエン酸（ｐＨ４．５）を、ＳＡＭ官能基化電極上に１５分間加えた。この時点では洗浄ステップは必要でなく、過剰のＥＤＣ／ＮＨＳを除去するために表面を単に乾燥した。次いで電極をＳＰＶ（１０μｇ／ｍｌ）中で１時間インキュベートした。洗浄した後、１時間のインキュベーション中にビオチン官能基化抗体（１０μｇ／ｍｌ）をＳＰＶ官能基化電極上に固定化した。アプタマーの場合、ＳＰＶを用いずに、ＥＤＣ／ＮＨＳステップの後にそれらを電極上に固定化した。バイオレセプター官能基化電極を、ブロッキング溶液として用いた１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを含むＤＭＥＭベースの細胞培養培地中でインキュベートした。
【０１２２】
統計解析。すべての定量的結果を平均値±標準偏差（ＳＤ）として表示した。実験は、３重またはそれ以上で実施した。値は、２標本不等分散としたＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（両側）を用いて比較し、ｐ＜０．０５またはそれ未満は、統計的に有意とみなした。
【０１２３】
［実施例２］
＜ラット心臓組織の３Ｄバイオプリンティング＞
本試験では、機能性かつ収縮性の心臓組織構築物を作製するために、３Ｄバイオプリンティングを適用した。ラット新生児の心臓組織を得て、心筋細胞を単離し、細胞をフィブリンベースのヒドロゲルバイオインクに懸濁した。細胞を添加したヒドロゲルを、空気圧により３００μｍノズルを介して印刷した。バイオプリントされた心臓組織構築物は、印刷後の３日後に自発収縮を示し、培養１４日後に同期収縮を示し、心臓組織の発達および成熟が示された。心臓組織の形成は、α−アクチニンおよびコネキシン４３に特異的な抗体による免疫染色により確認され、これにより、整列した高密度の成熟心筋細胞が示された。バイオプリントされた心臓組織構築物は、公知の心臓薬（アドレナリンおよびカルバコール）に対する生理学的反応（拍動頻度および収縮力）も示した。さらに、印刷心臓組織の組織発達は、ノッチシグナル遮断により加速され得る。これらの結果は、モデル薬理学的応用に用いることができる機能性心臓組織の印刷の実現可能性を示すものであった。
【０１２４】
参考文献
【表１Ａ】
2018535659.tif 000003
【表１Ｂ】
2018535659.tif 000004
【表１Ｃ】
2018535659.tif 000005
【表１Ｄ】
2018535659.tif 000006
【０１２５】
上記は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。本発明は、以下のクレームにより規定され、クレームの同等物は、それに含まれるものとする。
【図１Ａ】
2018535659.tif 000007
【図１Ｂ】
2018535659.tif 000008
【図１Ｃ】
2018535659.tif 000009
【図１Ｄ】
2018535659.tif 000010
【図１Ｅ】
2018535659.tif 000011
【図１Ｆ】
2018535659.tif 000012
【図１Ｇ】
2018535659.tif 000013
【図２Ａ−２Ｄ】
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【図２Ｅ】
2018535659.tif 000015
【図３Ａ−３Ｇ】
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【図３Ｈ−３Ｋ】
2018535659.tif 000017
【図４Ａ−４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ−４Ｈ】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ−６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【国際調査報告】
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