(57)【要約】  本発明は、第１のＴ細胞標的に特異的に結合することのできる第１の結合ドメインと、第２のＴ細胞標的に特異的に結合することのできる第２の結合ドメインと、を含み、第１及び第２のＴ細胞標的が、異なる標的である、二重特異性ポリペプチド、例えば二重特異性抗体などを提供する。本発明は、該二重特異性ポリペプチドの組成物、ならびにそれの方法及び使用をさらに提供する。第１及び／または第２のＴ細胞標的は、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、及びＣＤ２８から成る群から選択され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＴ細胞標的に特異的に結合することのできる、Ｂ１と呼称される第１の結合ドメインと、第２のＴ細胞標的に特異的に結合することのできる、Ｂ２と呼称される第２の結合ドメインと、を含み、前記第１及び第２のＴ細胞標的が、異なる標的である、二重特異性ポリペプチド。
【請求項２】
前記第１及び／または第２の結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片から成る群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記抗原結合断片が、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ断片またはジスルフィド結合Ｆｖ断片など）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ）２断片など）、及びドメイン抗体から成る群から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、二重特異性抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）Ｂ１が、ＩｇＧ１抗体を含むかもしくはそれから成り、Ｂ２が、非免疫グロブリンポリペプチドを含むかもしくはそれから成るか、またはその逆であるか、
（ｂ）Ｂ１が、ＩｇＧ１抗体を含むかもしくはそれから成り、Ｂ２が、ｓｃＦｖを含むかもしくはそれから成るか、またはその逆であるか、あるいは、
（ｃ）Ｂ１が、少なくとも１つのｓｃＦｖを含むかもしくはそれから成り、Ｂ２が、少なくとも１つのｓｃＦｖを含むかもしくはそれから成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ヒトＦｃ領域または前記領域の変異形を含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記第１のＴ細胞標的及び／または前記第２のＴ細胞標的が、Ｔ細胞の表面上で発現する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記第１のＴ細胞標的及び／または前記第２のＴ細胞標的が、チェックポイント分子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記第１のＴ細胞標的及び／または前記第２のＴ細胞標的が、刺激性チェックポイント分子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記第１のＴ細胞標的及び／または前記第２のＴ細胞標的が、阻害性チェックポイント分子である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記第１のＴ細胞標的及び／または前記第２のＴ細胞標的が、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記第１のＴ細胞標的及び／または第２のＴ細胞標的が、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、及びＣＤ２８から成る群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記第１のＴ細胞標的及び／または第２のＴ細胞標的が、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、及びＣＤ１３７から成る群から選択される、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及び／またはアポトーシスを誘導することができる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、腫瘍免疫を誘導することができる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
Ｂ１が、ＣＤ１３７に対して特異的であり、Ｂ２が、ＣＴＬＡ−４に対して特異的である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
Ｂ１が、ＣＤ１３７に対して特異的な抗体またはその抗原結合断片であり、Ｂ２が、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインであり、前記ポリペプチド結合ドメインが、
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、もしくは、
ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸が変更されているアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るが、ただし、前記結合ドメインが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件とする、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
Ｂ１が、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び／または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に結合している、請求項１６または１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
Ｂ１が、
少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記重鎖もしくは前記軽鎖のいずれかに結合しているか、
または、Ｂ１が、
２つの同一の重鎖（Ｈ）及び２つの同一の軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、両方の重鎖もしくは両方の軽鎖に結合している、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
Ｎ−Ｃの方向で書かれた次式：
（Ａ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（Ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ、
（Ｃ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、
（Ｄ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（式中、Ｘはリンカーであり、ｎは０または１である）のうちのいずれか１つに従って配置されたポリペプチド鎖を含むか、またはそれから成る、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
Ｘが、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、または（ＳＧ）ｍ（ここで、ｍは１〜７である）を含むペプチドである、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
１０×１０−９Ｍ、４×１０−９Ｍ、もしくは１．２×１０−９Ｍ未満のＫｄでヒトＣＤ１３７に結合し、かつ／または、６０×１０−９Ｍ、２５×１０−９Ｍ、もしくは１０×１０−９Ｍ未満であるＫｄ値でヒトＣＴＬＡ−４に結合する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
エフェクターＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、場合により、前記増加が、別々の分子として前記Ｔ細胞に投与された前記第１及び第２の結合ドメインの組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも、少なくとも１．５倍、４．５倍、または７倍高い、ポリペプチド。
【請求項２４】
Ｔ細胞活性の前記増加が、前記Ｔ細胞による増殖及び／またはＩＬ−２産生の増加である、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記Ｂ２のアミノ酸配列（ｉｉ）における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸が、配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに置換されており、場合により、配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに挿入または欠失が存在しない、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記第１の結合ドメインの前記アミノ酸配列における前記アミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、１２２位にあり、場合により、前記アミノ酸配列が、１０７位、１２１位、及び１２５位のうちの少なくとも１つにおいても置換されている、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記Ｂ２のアミノ酸配列が、配列番号８、６、７、及び９〜２４のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号１９８、２００、２０２、２０４、及び２０６から選択される軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号１９７、１９９、２０１、２０３、及び２０５から選択される軽鎖ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
１７９、１８１、１８５、１８９、及び１９３から成る群から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号１８０、１８２、１８６、１９０、及び１９４から成る群から選択される重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
ａ）配列番号１７９及び１９８、または、
ｂ）配列番号１８１及び２００、または、
ｃ）配列番号１８５及び２０２、または、
ｄ）配列番号１８９及び２０４、または、
ｅ）配列番号１９３及び２０６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
ＣＤ１３７結合ドメインが、ヒトＦｃ領域または前記領域の変異形を含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ＣＤ１３７結合ドメインが、ＣＴＬＡ−４結合ドメインから独立して存在するときに、次の機能的特徴：
Ｉ．２×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１．２×１０−９Ｍ未満であるＫＤ値で、ヒトＣＤ１３７に結合すること、及び、
ＩＩ．インビトロでＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の増加を引き起こす能力、のうちの少なくとも１つを示し、場合により、活性の前記増加が、前記Ｔ細胞による増殖、及び／またはＩＬ−２産生、及び／またはＩＦＮ−γ産生の増加である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
ＣＤ１３７結合ドメインが、配列番号１７７、１８３、１８７、１９１、及び１９５から成る群から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号１７９、１８１、１８５、１８９、及び１９３から成る群から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列とを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
ＣＤ１３７結合ドメインが、配列番号１７８、１８４、１８８、１９２、及び１９６から成る群から選択される軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、配列番号１８０、１８２、１８６、１９０、及び１９４から成る群から選択される重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
ＣＤ１３７結合ドメインが、表Ｉ（１）及びＩ（２）のものから選択されるＣＤＲ配列を含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
Ｂ１が、ＯＸ４０に対して特異的であり、Ｂ２が、ＣＴＬＡ−４に対して特異的である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
ＣＴＬＡ−４とＯＸ４０との両方に特異的に結合することのできる請求項３８に記載のポリペプチドであって、
Ｂ１が、ＯＸ４０に対して特異的な抗体またはその抗原結合断片であり、
Ｂ２が、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインであり、前記ポリペプチド結合ドメインが、
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、もしくは、
ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸が変更されているアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るが、ただし、前記結合ドメインが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件とする、ポリペプチド。
【請求項４０】
前記ポリペプチドによって特異的に結合されるＣＴＬＡ−４が、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのＣＴＬＡ−４であり、かつ／または、前記ポリペプチドによって特異的に結合されるＯＸ４０が、霊長類、好ましくはヒトのＯＸ４０である、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
Ｂ１が、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び／または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に結合している、請求項３９または４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
Ｂ１が、
少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記重鎖もしくは前記軽鎖のいずれかに結合しているか、
または、Ｂ１が、
２つの同一の重鎖（Ｈ）及び２つの同一の軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、両方の重鎖もしくは両方の軽鎖に結合している、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
Ｎ−Ｃの方向で書かれた次式：
（Ａ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（Ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ、
（Ｃ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、
（Ｄ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（式中、Ｘはリンカーであり、ｎは０または１である）のうちのいずれか１つに従って配置されたポリペプチド鎖を含むか、またはそれから成る、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
Ｘが、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４４）、または（ＳＧ）ｍ（ここで、ｍは１〜７である）を含むペプチドである、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
５０×１０−１０Ｍ、２５×１０−１０Ｍ、もしくは２０×１０−１０Ｍ未満のＫｄでヒトＯＸ４０に結合し、かつ／または、６０×１０−９Ｍ、２５×１０−９Ｍ、もしくは１０×１０−９Ｍ未満であるＫｄ値でヒトＣＴＬＡ−４に結合する、請求項３８〜４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
エフェクターＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導する、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、場合により、前記増加が、別々の分子として前記Ｔ細胞に投与されたＢ１及びＢ２の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも、少なくとも１．５倍、４．５倍、または７倍高い、ポリペプチド。
【請求項４７】
Ｔ細胞活性の前記増加が、前記Ｔ細胞による増殖及び／またはＩＬ−２産生の増加である、請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記Ｂ２のアミノ酸配列（ｉｉ）における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸が、配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに置換されており、場合により、配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに挿入または欠失が存在しない、請求項３８〜４７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記第１の結合ドメインの前記アミノ酸配列における前記アミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、１２２位にあり、場合により、前記アミノ酸配列が、１０７位、１２１位、及び１２５位のうちの少なくとも１つにおいても置換されている、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記Ｂ２のアミノ酸配列が、配列番号８、６、７、及び９〜２４のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る、請求項３８〜４９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
Ｂ１が、Ｂ２から独立して存在するときに、次の機能的特徴：
Ｉ．１０×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは５×１０−１０Ｍ未満であるＫＤ値で、ヒトＯＸ４０に結合すること、
ＩＩ．マウスＯＸ４０に結合しないこと、及び、
ＩＩＩ．他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７またはＣＤ４０に結合しないこと、のうちの少なくとも１つを示す、請求項３８〜５０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
Ｂ１が、以下：
（ａ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｆ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ／Ａ」を含む、重鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｉ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｔ」を含む、重鎖ＣＤＲ２配列、
（ｃ）９〜１７アミノ酸の長さであり、「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｆ／Ｖ／Ｄ、Ｇ／Ｙ／Ｐ／Ｆ、−／Ｈ／Ｓ、−／Ｎ／Ｄ／Ｈ、−／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ、−／Ｙ、−／Ｗ／Ａ／Ｖ、−／Ａ／Ｙ、−／Ｄ／Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｈ／Ｎ、Ｙ／Ｓ／Ｗ／Ａ／Ｔ、Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ、Ｄ、Ｙ」のコンセンサス配列を含む、重鎖ＣＤＲ３配列、
（ｄ）配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」から成る軽鎖ＣＤＲ１配列、
（ｅ）配列「Ａ、Ａ、Ｓ」から成る軽鎖ＣＤＲ２配列、
（ｆ）８〜１０アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｑ，Ｑ、Ｓ／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ／Ｈ／Ｇ、−／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｔ、Ｐ／Ｌ、Ｙ／Ｓ／Ｈ／Ｌ／Ｆ、Ｔ」を含む、軽鎖ＣＤＲ３配列、から独立して選択されるいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全ての特徴を含み、
（ｃ）の重鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１０アミノ酸の長さの配列か、またはコンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸の長さのＣＤＲ３配列であり、
（ｆ）の軽鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｙ、Ｔ」から成る、請求項３８〜５１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
Ｂ１が、表Ａ（１）に示されるＶＨ配列の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列、及び／もしくは表Ａ（２）に示されるＶＬ配列の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含むか、または、Ｂ１が、表Ｂに示される重鎖ＶＨ配列及び／もしくは軽鎖ＶＬ配列を含む、請求項３８〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
Ｂ１が、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸の長さの重鎖ＣＤＲ３配列と、配列番号９７の軽鎖ＶＬ配列（表Ｂに示される１１３５）と、を含み、場合により、配列番号９７の軽鎖ＶＬ配列が、より長い配列番号１２９の配列の一部（表Ｄに示される１１４１）として存在する、請求項３８〜５３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
Ｂ１が、ヒトＦｃ領域または前記領域の変異形を含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、請求項３８〜５４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
配列番号１２５〜１３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る、請求項３８〜５５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、場合により、前記ポリペプチドが、抗体の構成部分として提供される、ポリペプチド。
【請求項５７】
Ｂ１が、ＯＸ４０に対して特異的であり、Ｂ２が、ＣＤ１３７に対して特異的である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
前記ポリペプチドが、直接的または間接的に相互に結合した、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体（抗ＯＸ４０抗体）とＣＤ１３７に特異的に結合する抗体（抗ＣＤ１３７抗体）とを含む、二重特異性抗体である、請求項５７に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
特異的に結合されるＣＤ１３７が、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのＣＤ１３７であり、かつ／または、特異的に結合されるＯＸ４０が、霊長類、好ましくはヒトのＯＸ４０である、請求項５８に記載の二重特異性抗体。
【請求項６０】
５０×１０−１０Ｍ、２５×１０−１０Ｍ、もしくは２０×１０−１０Ｍ未満のＫｄでヒトＯＸ４０に結合し、かつ／または、１０×１０−９Ｍ、４×１０−９Ｍ、もしくは１．２×１０−９Ｍ未満であるＫｄ値でヒトＣＤ１３７に結合する、請求項５８または５９に記載の二重特異性抗体。
【請求項６１】
エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導する、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、場合により、前記増加が、別々の分子として前記Ｔ細胞に投与された対応する単一特異性抗体の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、または５倍高い、二重特異性抗体。
【請求項６２】
Ｔ細胞活性の前記増加が、前記Ｔ細胞による増殖、及び／またはＩＬ−２産生、及び／またはＩＦＮ−γ産生の増加であり、場合により、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項６１に記載の二重特異性抗体。
【請求項６３】
前記抗ＯＸ４０抗体及び前記抗ＣＤ１３７抗体が、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４４）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、または（ＳＧ）ｍ（ここで、ｍは１〜７である）のペプチドであるリンカーによって間接的に相互に結合している、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６４】
ｓｃＦｖ−ＩｇＧフォーマット二重特異性抗体である、請求項５８〜６３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６５】
前記抗ＯＸ４０抗体が、前記抗ＣＤ１３７抗体から独立して存在するときに、次の機能的特徴：
Ｉ．１０×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは５×１０−１０Ｍ未満であるＫＤ値で、ヒトＯＸ４０に結合すること、
ＩＩ．マウスＯＸ４０に結合しないこと、及び、
ＩＩＩ．他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７またはＣＤ４０に結合しないこと、のうちの少なくとも１つを示す、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６６】
前記抗ＯＸ４０抗体が、以下：
（ａ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｆ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ／Ａ」を含む、重鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｉ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｔ」を含む、重鎖ＣＤＲ２配列、
（ｃ）９〜１７アミノ酸の長さであり、「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｆ／Ｖ／Ｄ、Ｇ／Ｙ／Ｐ／Ｆ、−／Ｈ／Ｓ、−／Ｎ／Ｄ／Ｈ、−／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ、−／Ｙ、−／Ｗ／Ａ／Ｖ、−／Ａ／Ｙ、−／Ｄ／Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｈ／Ｎ、Ｙ／Ｓ／Ｗ／Ａ／Ｔ、Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ、Ｄ、Ｙ」のコンセンサス配列を含む、重鎖ＣＤＲ３配列、
（ｄ）配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」から成る軽鎖ＣＤＲ１配列、
（ｅ）配列「Ａ、Ａ、Ｓ」から成る軽鎖ＣＤＲ２配列、
（ｆ）８〜１０アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｑ，Ｑ、Ｓ／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ／Ｈ／Ｇ、−／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｔ、Ｐ／Ｌ、Ｙ／Ｓ／Ｈ／Ｌ／Ｆ、Ｔ」を含む、軽鎖ＣＤＲ３配列、から独立して選択されるいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全ての特徴を含み、
（ｃ）の重鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１０アミノ酸の長さの配列か、またはコンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸の長さのＣＤＲ３配列であり、
（ｆ）の軽鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｙ、Ｔ」から成る、請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６７】
前記抗ＯＸ４０抗体が、表Ａ（１）に示されるＶＨ配列の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列、及び／もしくは表Ａ（２）に示されるＶＬ配列の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含むか、または、前記抗ＯＸ４０抗体が、表Ｂに示される重鎖ＶＨ配列及び／もしくは軽鎖ＶＬ配列を含む、請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６８】
前記抗ＯＸ４０抗体が、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸の長さの重鎖ＣＤＲ３配列と、配列番号９７の軽鎖ＶＬ配列（表Ｂに示される１１３５）と、を含み、場合により、配列番号９７の軽鎖ＶＬ配列が、より長い配列番号１２９の配列の一部（表Ｄに示される１１４１）として存在する、請求項５８〜６７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６９】
前記抗ＯＸ４０抗体が、前記抗ＣＤ１３７抗体から独立して存在するときに、ＯＸ４０への結合について、請求項６５〜６８のいずれか１項に定義された抗ＯＸ４０抗体と競合する、請求項５８〜６８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７０】
前記抗ＣＤ１３７抗体が、前記抗ＯＸ４０抗体から独立して存在するときに、次の機能的特徴：
Ｉ．２×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１．２×１０−９Ｍ未満であるＫＤ値で、ヒトＣＤ１３７に結合すること、及び、
ＩＩ．インビトロでＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の増加を引き起こす能力、のうちの少なくとも１つを示し、場合により、活性の前記増加が、前記Ｔ細胞による増殖、及び／またはＩＬ−２産生、及び／またはＩＦＮ−γ産生の増加である、請求項５８〜６９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７１】
前記抗ＣＤ１３７抗体が、表Ｉ（１）に示されるＶＨ配列の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列、及び／もしくは表Ｉ（２）に示されるＶＬ配列の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含むか、または、前記抗ＣＤ１３７抗体が、表Ｈに示される重鎖ＶＨ配列及び／もしくは軽鎖ＶＬ配列を含む、請求項５８〜７０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７２】
前記抗ＣＤ１３７抗体が、表Ｉ（１）の第１の横列に示されるＶＨ配列の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列、及び／もしくは表Ｉ（２）の第１の横列に示されるＶＬ配列の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含むか、または、前記抗ＣＤ１３７抗体が、表Ｈの配列番号１７７〜１８０に示される重鎖ＶＨ配列及び／もしくは軽鎖ＶＬ配列を含む、請求項５８〜７１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７３】
前記抗ＣＤ１３７抗体が、前記抗ＯＸ４０抗体から独立して存在するときに、ＣＤ１３７への結合について、請求項６７に定義された抗ＣＤ１３７抗体と競合する、請求項５８〜７２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７４】
前記抗ＯＸ４０抗体及び／または前記抗ＣＤ１３７抗体が、ヒトＦｃ領域または前記領域の変異形を含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、請求項５８〜７３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７５】
配列番号１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、または１６３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５８〜７４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７６】
配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、または１７３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５８〜７５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７７】
−配列番号１６５、ならびに配列番号１４９、１５３、１５９、及び１６３のうちのいずれか１つ、または、
−配列番号１６７及び配列番号１５１、または、
−配列番号１６９及び配列番号１５５、または、
−配列番号１７１及び配列番号１５７、または、
−配列番号１７３及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む、請求項５８〜７６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７８】
個体の疾患もしくは病態を治療または防止するための方法で使用するための、請求項１〜７７のいずれか１項に記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項７９】
請求項１〜７８のいずれか１項に記載の二重特異性ポリペプチドを個体に投与することを含む、個体の疾患もしくは病態を治療または防止する方法。
【請求項８０】
前記疾患もしくは病態ががんであり、場合により、前記個体がヒトである、請求項７８に記載の二重特異性ポリペプチド、または請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記方法が、前記二重特異性抗体を全身投与すること、または腫瘍部位もしくは腫瘍排出リンパ節などに局所投与することを含む、請求項８０に記載の二重特異性ポリペプチドまたは方法。
【請求項８２】
前記がんが、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、黒色腫、膀胱がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、皮膚がん、リンパ腫、または神経膠芽腫である、請求項８０または８１に記載の二重特異性ポリペプチドまたは方法。
【請求項８３】
請求項１〜７８のいずれか１項に記載の二重特異性ポリペプチドの少なくとも１つのポリペプチド鎖をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項８４】
請求項１〜７８のいずれか１項に記載の二重特異性ポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容される希釈剤または担体と、を含む、組成物。
【請求項８５】
追加の治療部分と共役した、請求項１〜７８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
請求項７０〜７３のいずれか１項の定義の通りである、ＣＤ１３７に対して特異的な抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つの異なるＴ細胞標的に特異的に結合する二重特異性ポリペプチドに関する。例示的なＴ細胞標的としては、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、及びＣＤ１３７、特にヒトＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、及びＣＤ１３７が挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
がんは、先進国において早死の主な原因である。がんの免疫療法の目的は、腫瘍細胞に対して効果的な免疫応答を仕掛けることである。これは、例えば、腫瘍抗原に対する耐性を破壊すること、抗腫瘍免疫応答を増補すること、及び腫瘍部位における局所的なサイトカイン応答を刺激することによって達成され得る。長期にわたる抗腫瘍免疫応答の主要なエフェクター細胞は、活性化された腫瘍特異的エフェクターＴ細胞である。活性化されたエフェクターＴ細胞の強力な増大は、免疫応答を腫瘍に向け直し得る。この文脈において、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が、抗腫瘍免疫の阻害における役割を果たす。したがって、Ｔｒｅｇを枯渇させること、阻害すること、元に戻すこと、または不活性化させることは、抗腫瘍作用をもたらし、腫瘍微小環境における免疫抑制を元に戻し得る。さらに、例えば、樹状細胞によるエフェクターＴ細胞の活性化が不完全であると、非効率的な抗腫瘍応答をもたらすＴ細胞アネルギーが起こり得るが、樹状細胞による誘導が妥当であれば、活性化されたエフェクターＴ細胞の強力な増大が生じ、免疫応答が腫瘍に向き直り得る。加えて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現が下方制御されている腫瘍細胞を攻撃すること、そして抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を誘導することによって、腫瘍免疫学において重要な役割を果たす。したがって、ＮＫ細胞の刺激もまた、腫瘍成長を低減させ得る。
【０００３】
ＯＸ４０（別名ＣＤ１３４またはＴＮＦＲＳＦ４）は、主に活性化Ｔ細胞で（たいていはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞だが、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）でも）発現する、ＴＮＦＲファミリーのメンバーである。Ｔｒｅｇでのその発現は、マウスにおいては構成的であるが、ヒトにおいては構成的でない。ＯＸ４０の発現は、典型的に、活性化（Ｔ細胞受容体連結）の２４時間以内に起こり、４８〜７２時間後にピークに達する。ＯＸ４０の刺激は、活性化Ｔ細胞の生存及び増殖のために重要である。唯一知られているＯＸ４０のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、これは主に、樹状細胞及びＢ細胞などの抗原提示細胞で、典型的にはそれらの活性化後に発現する。ＯＸ４０媒介性Ｔ細胞活性化の正味の結果は、ＴＨ１エフェクターＴ細胞活性化プロファイルの誘導、ならびに、例えばＡＤＣＣもしくはＡＤＣＰによるＴｒｅｇ細胞の活性及び／または数の低減である。全体として、これらの作用は抗腫瘍免疫に寄与し得る。ＯＸ４０は、黒色腫、肺がん、及び腎がんなどの多くの固形腫瘍において、制御性Ｔ細胞で過剰発現する。
【０００４】
マウスにおける腫瘍モデルのＯＸ４０作動薬処置は、抗腫瘍作用、ならびに黒色腫、神経膠腫、肉腫、前立腺がん、結腸がん、及び腎がんを含むいくつかの異なるがん形態の治癒をもたらすことが示されている。このデータは、ＣＤ４０作動薬処置で見られる作用と類似して、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方が関与する腫瘍特異的Ｔ細胞応答と一致している。ＩＬ−１２及び他のサイトカインの添加、ならびに他の免疫調節薬及び化学療法／放射線療法との組み合わせは、ＯＸ４０作動薬処置の治療効果を向上させることが示されている。前臨床モデルのエビデンスは、抗ＯＸ４０抗体の作用がＦｃγＲの活性化に依存することを示唆する。あらゆる他の療法が奏効しなかった後期患者においてマウス抗ヒトＯＸ４０クローン９Ｂ１２を試験する第Ｉ相臨床試験が、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅにおいて行われた。この抗体は、良好な耐容性を示した。腫瘍の縮小ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の増加が観察された。低い毒性は、低い半減期及び抗薬物抗体（この抗体はマウス抗体であった）に起因する可能性もあるが、非活性化Ｔ細胞におけるＯＸ４０の比較的低い発現レベルに起因する可能性もある。この抗体での抗腫瘍作用は中程度であった。
【０００５】
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）もまた、ＴＮＦＲファミリーのメンバーである。ＣＤ１３７の活性化は、受容体オリゴマー化に依存する。ＣＤ１３７は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＤＣ、単球、マスト細胞、ならびに好酸球で発現する。ＣＤ１３７活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び生存において重要な役割を果たす。それは、エフェクター機能を開始するのではなく持続及び増補し、ＴＨ１サイトカイン産生を優先的に支持する。ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＣＤ１３７刺激は初めに活性化をもたらし、後に活性化誘導細胞死をもたらすが、このことは、ＣＤ１３７作動薬抗体が自己免疫だけでなく腫瘍免疫においても治療効果を示した理由を説明し得る。ＣＤ１３７はまた、Ｔｒｅｇ機能を抑制する。ＣＤ１３７は、サイトカインまたはＣＤ１６によって活性化されたＮＫ細胞で上方制御される。ＮＫ細胞でのＣＤ１３７の活性化は、マウス細胞とヒト細胞との両方においてＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を増加させることが示されている。さらに、ＣＤ１３７は樹状細胞及びマクロファージなどの抗原提示細胞で発現し、これらの細胞型におけるＣＤ１３７の刺激は、腫瘍指向性免疫をもたらし得る免疫活性化を誘導する場合がある。ＣＤ１３７作動薬抗体は、腫瘍環境内の内皮細胞を活性化させ、ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１の上方制御、ならびにＴ細胞動員の向上をもたらすことが示されている。いくつかの研究が、作動薬ＣＤ１３７抗体を用いた治療による腫瘍免疫の誘導を実証してきた。
【０００６】
２つのＣＤ１３７抗体が臨床開発中である。ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）（ＢＭＳ−６６５１３）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより開発された完全ヒトＩｇＧ４抗体である。様々な適応症におけるいくつかの第Ｉ相試験及び第ＩＩ相試験が現在進行中である。転移性黒色腫の二次治療としてウレルマブを用いた第ＩＩ相試験は、致死的な肝毒性のために２００９年に打ち切られた。臨床開発中のもう一方のＣＤ１３７  ｍＡｂは、Ｐｆｉｚｅｒにより開発された完全ヒトＩｇＧ２抗体であるＰＦ−０５０８２５６６である。これは現在、リンパ腫及び様々な固形がんにおいて第Ｉ相開発中であり、予備データは、これが良好な耐容性が示すが中程度の抗腫瘍作用しか有しないことを示唆する。
【０００７】
ＣＤ１３７またはＯＸ４０を標的とする既存の抗体は、概して、例えばＦｃガンマ受容体を介して他の細胞に架橋して、それぞれの受容体を発現する細胞への強力なシグナル伝達を誘導することに依存する。したがってそれらは、そのような架橋がもたらされない場合は効率的にシグナル伝達しない。加えて、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーによる長期かつ連続的な活性化は、免疫疲弊につながり得る。
【０００８】
Ｔ細胞受容体ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化の負の制御因子として機能し、最初の活性化の後にＴ細胞表面上で上方制御される。抗原提示細胞によって発現されるＣＴＬＡ−４受容体のリガンドは、Ｂ７タンパク質である。Ｔ細胞活性化の上方制御の原因となる、対応するリガンド受容体対は、ＣＤ２８−Ｂ７である。ＣＤ２８によるシグナル伝達は共刺激経路を構成し、Ｔ細胞が活性化したら、ＭＨＣ複合体により提示される抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を通る。Ｂ７−１リガンド及び、またはＢ７−２リガンドとのＣＴＬＡ−４相互作用を遮断することにより、免疫応答の正常なチェックポイントのうちの１つが除去され得る。正味の結果は、抗腫瘍免疫に寄与し得るエフェクターＴ細胞の活性の増強である。ＯＸ４０と同様に、これは、エフェクターＴ細胞の直接的な活性化に起因する可能性もあるが、例えばＡＤＣＣもしくはＡＤＣＰによるＴｒｅｇ細胞の活性及び／または数の低減に起因する可能性もある。臨床試験は、ＣＴＬＡ−４遮断が抗腫瘍作用をもたらすことを実証したが、抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与は、毒性の副作用と関連付けられている。ＣＴＬＡ−４は、黒色腫、肺がん、及び腎がんなどの多くの固形腫瘍において、制御性Ｔ細胞で過剰発現する。
【０００９】
ＯＸ４０またはＣＤ１３７またはＣＴＬＡ−４といった１つのＴ細胞標的のみを標的とする既存の単一特異性薬の代替物が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第１の態様は、第１のＴ細胞標的に特異的に結合することのできる、Ｂ１と呼称される第１の結合ドメインと、第２のＴ細胞標的に特異的に結合することのできる、Ｂ２と呼称される第２の結合ドメインと、を含む、二重特異性ポリペプチドを提供し、ここで、第１及び第２のＴ細胞標的は、異なる標的である。
【００１１】
ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、及びＯＸ４０などの２つの異なるＴ細胞標的を標的とする二重特異性抗体は、両方の標的が過剰発現する位置で免疫系を特異的に活性化させる潜在性を有する。例えば、ＣＴＬＡ−４及びＯＸ４０は、腫瘍微小環境内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で過剰発現するが、エフェクターＴ細胞でのそれらの発現はより低い。したがって、本発明の二重特異性抗体は、腫瘍微小環境内の制御性Ｔ細胞を選択的に標的とする潜在性を有する。
【００１２】
本発明の二重特異性抗体を用いて腫瘍微小環境内のＴｒｅｇ細胞を標的とすることは、Ｔｒｅｇの免疫抑制機能を枯渇または逆転させる潜在性も有する。この作用は、本発明の二重特異性抗体のＦｃ部分を介するＡＤＣＣもしくはＡＤＣＰの誘導によって（例えば、Ｆｕｒｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５（７）：２９０−８を参照されたい；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）、またはＯＸ４０及び／もしくはＣＴＬＡ−４を介して誘導されたシグナル伝達によって、かつ／あるいはＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路の遮断によって（例えば、Ｗａｌｋｅｒ，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１（１２）：８５２−６３を参照されたい；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）、媒介され得る。その一方で、エフェクターＴ細胞では、本発明の二重特異性抗体は、活性化と機能の増加との両方を、ＯＸ４０刺激を介し、かつＣＴＬＡ−４チェックポイント遮断を通じて誘導する潜在性を有する。
【００１３】
したがって、２つのＴ細胞受容体を標的とする二重特異性抗体の正味の効果は、次の通りである。
１．単一特異性抗体と比較して高い度合いの免疫活性化。免疫活性化は、単一特異性抗体の組み合わせよりも高い。
２．組み合わさった単一特異的バインダーと比較して高い度合いのＡＤＣＣの誘導。
３．より指向性／限局性の免疫活性化。免疫活性化は、高いＣＴＬＡ−４発現とＯＸ４０発現との両方を含む環境内でしか起こらない。腫瘍微小環境はそのような環境である。これは、作用を増加させ、また毒性の副作用を最小限に抑える潜在性を有する。したがって、治療濃度域が拡大する。
【００１４】
例示的な実施形態において、二重特異性ポリペプチドは、
（ａ）ＯＸ４０及びＣＴＬＡ−４、
（ｂ）ＯＸ４０及びＣＤ１３７、または、
（ｃ）ＣＤ１３７及びＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができる。
【００１５】
「ポリペプチド」は、本明細書では、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、または他のペプチド模倣薬の化合物を指すように、その最も広い意味で使用される。したがって、「ポリペプチド」という用語は、短いペプチド配列、ならびにより長いポリペプチド及びタンパク質も含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、ＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体及びペプチド模倣薬を含む、天然アミノ酸及び／または非天然もしくは合成のアミノ酸のいずれかを指す。
【００１６】
本明細書で使用される「二重特異性」という用語は、ポリペプチドが少なくとも２つの標的要素に特異的に結合することができることを意味する。
【００１７】
一実施形態において、第１及び／または第２の結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片から成る群から選択され得る。
【００１８】
例えば、本発明の二重特異性ポリペプチドは、
（ｉ）抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかまたはそれから成る第１の結合ドメイン、及び、抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかまたはそれから成る第２の結合ドメイン、あるいは、
（ｉｉ）抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかまたはそれから成る第１の結合ドメイン、及び、抗体可変ドメインもしくはその一部ではない第２の結合ドメインを含み得る。
【００１９】
したがって、一実施形態において、本ポリペプチドは二重特異性抗体である。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「抗体」（単数または複数）という用語は、抗原結合部位を含有する分子、例えば免疫グロブリン分子、及び抗原結合部位を含有する免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片を指す。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子とすることができる。抗体としては、合成抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、組換え産生抗体、多特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ（例えば、単一特異性及び二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記のうち任意のもののエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
「に対する（「ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ」または「ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ」）」抗体という用語は、本明細書では互換的に使用され、結合特異性（複数可）を特定の標的／マーカー／エピトープ／抗原に向けるように構築されている抗体、すなわち標的／マーカー／エピトープ／抗原に免疫特異的に結合する抗体を指す。また、「に対する」と同じ定義を有する、特定の標的／マーカー／エピトープ「に対して特異的な」抗体という表現が使用される場合がある。２つの異なる標的／マーカー／エピトープ／抗原に対する（それらに対して特異的な）二重特異性抗体は、両方の標的／マーカー／エピトープ／抗原に免疫特異的に結合する。したがって、ある抗体が、特定の標的抗原、例えばＣＤ１３７などに対するものである場合、該抗体は、該標的抗原構造上に存在する任意の好適なエピトープに対するものであり得ると想定される。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、Ｆ（ａｂ）．ｓｕｂ．２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部分である。構造を問わず、抗体断片は、インタクトな抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＯＸ４抗体断片は、ＯＸ４０に結合する。「抗体断片」という用語には、可変領域から成る単離された断片、例えば重鎖及び軽鎖の可変領域から成る「Ｆｖ」断片、ならびに軽鎖及び重鎖の可変領域がペプチドリンカーで接続されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）なども含まれる。本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、抗原結合活性を有しない抗体の部分、例えばＦｃ断片または単一のアミノ酸残基などを含まない。
【００２３】
ＳｃＦｖは、本明細書の二重特異性抗体への封入に特に好ましい。
【００２４】
したがって、本発明の二重特異性抗体の例示的な実施形態では、
（ａ）結合ドメインＢ１及び／または結合ドメインＢ２は、インタクトなＩｇＧ抗体であり（または、一緒にインタクトなＩｇＧ抗体を形成し）、
（ｂ）結合ドメインＢ１及び／または結合ドメインＢ２は、Ｆｖ断片（例えばｓｃＦｖ）であり、
（ｃ）結合ドメインＢ１及び／または結合ドメインＢ２は、Ｆａｂ断片であり、かつ／または、
（ｄ）結合ドメインＢ１及び／または結合ドメインＢ２は、単一ドメイン抗体（例えばドメイン抗体及びナノボディ）である。
【００２５】
本発明の二重特異性ポリペプチドがいくつかの異なる構造フォーマットのものであってもよいことは、当業者には理解されよう（例えば、開示内容が参照により本明細書に援用される、Ｃｈａｎ  ＆  Ｃａｒｔｅｒ，２０１６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０，３０１−３１６を参照されたい）。
【００２６】
例示的な実施形態において、二重特異性抗体は、
（ａ）二価の二重特異性抗体、例えばＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体など（例えば、Ｂ１が、インタクトなＩｇＧであり、Ｂ２が、ＩｇＧの軽鎖のＮ末端及び／もしくは軽鎖のＣ末端で、かつ／または重鎖のＮ末端及び／もしくは重鎖のＣ末端でＢ１に結合したｓｃＦｖであるか、あるいはその逆であるもの）、
（ｂ）一価の二重特異性抗体、例えばＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）（Ｇｅｎｍａｂ  ＡＳ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）または「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」二重特異性抗体（例えば、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、ｓｃＦｖ−ＫＩＨｒ、ＢｉＴＥ−ＫＩＨ、またはＢｉＴＥ−ＫＩＨｒなど（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，ｍＡｂｓ  ７（１）：２３１−２４２を参照されたい）、
（ｃ）ｓｃＦｖ２−Ｆｃ二重特異性抗体（例えば、Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＩｎｃによるＡＤＡＰＴＩＲ（商標）二重特異性抗体など）、
（ｄ）ＢｉＴＥ／ｓｃＦｖ２二重特異性抗体、
（ｅ）ＤＶＤ−Ｉｇ二重特異性抗体、
（ｆ）ＤＡＲＴ系二重特異性抗体（例えば、ＤＡＲＴ２−Ｆｃ、ＤＡＲＴ２−Ｆｃ、またはＤＡＲＴ）、
（ｇ）ＤＮＬ−Ｆａｂ３二重特異性抗体、ならびに、
（ｈ）ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体から成る群から選択される。
【００２７】
例えば、二重特異性抗体は、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗体であってもよい。ＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗体は、ＶＨ−ＶＬ配向またはＶＬ−ＶＨ配向のいずれであってもよい。一実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬとの間のＳ−Ｓ架橋によって安定化され得る。
【００２８】
一実施形態において、結合ドメインＢ１及び結合ドメインＢ２は、相互に直接融合している。
【００２９】
代替的な実施形態では、結合ドメインＢ１及び結合ドメインＢ２は、ポリペプチドリンカーを介して結合している。例えば、ポリペプチドリンカーは、約１０アミノ酸〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドであってもよい。このリンカーは通常、可撓性のためのグリシン、ならびに可溶性のためのセリンまたはスレオニンに富んでおり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続すること、またはその逆のいずれかを行うことができる。例示的なリンカーとしては、配列番号４７〜５０、または１４４のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のペプチドが挙げられる。配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４４）のペプチドが特に好ましい。同じリンカーを使用して、本発明の二重特異性抗体の抗ＯＸ４０部分を抗ＣＤ１３７部分に結合させてもよい。
【００３０】
本発明の二重特異性ポリペプチドは、当該技術分野で使用される任意の既知の好適な方法によって製造され得る。本発明の二重特異性抗体を調製する方法としては、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｆｃａｂ及びＭａｂ２（Ｆ−ｓｔａｒ）、Ｆｃ操作ＩｇＧｌ（Ｘｅｎｃｏｒ）、またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム交換に基づくもの、Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられる。二重特異性抗体の調製に有用な他のプラットフォームの例としては、ＷＯ  ２００８／１１９３５３（Ｇｅｎｍａｂ）、ＷＯ  ２０１１／１３１７４６（Ｇｅｎｍａｂ）に記載のもの、及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ−Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７（５８４４）：１５５４−７）により報告されるものが挙げられるが、これらに限定されない。ハイブリッドハイブリドーマ及び化学的共役法（Ｍａｒｖｉｎ  ａｎｄ  Ｚｈｕ（２００５）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ２６：６４９）などの従来法を使用することもできる。異なる重鎖及び軽鎖から成る２つの抗体を宿主細胞内で共発現させると、所望の二重特異性抗体に加えて、可能性のある抗体生成物の混合物がもたらされ、これは次に、例えば親和性クロマトグラフィまたは類似の方法によって単離され得る。
【００３１】
二重特異性抗体が、ヒトＦｃ領域または該領域の変異形を含み得、この領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域であることは、当業者には理解されよう。
【００３２】
抗体の定常（Ｆｃ）領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。Ｆｃ領域は、好ましくはヒトＦｃ領域または該領域の変異形である。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域であってもよい。Ｆｃ領域の変異形は、典型的に、ポリペプチドの機能及び／もしくは半減期の向上をもたらす変更された親和性で、ＦｃガンマＲ及び／または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのＦｃ受容体に結合する。生物学的機能及び／または半減期は、天然Ｆｃ領域を含むポリペプチドの半減期と比べて増加あるいは減少し得る。変異形Ｆｃ領域の存在によって調節され得るそのような生物学的機能の例としては、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及び／またはアポトーシスが挙げられる。
【００３３】
本明細書において開示される任意のＶＨ領域配列と（完全な重鎖を形成するように）組み合わされ得る例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列は、以下に再現されるＩｇＧ１重鎖定常領域配列である。
【化１】
2018520650.tif 000002
【００３４】
他の重鎖定常領域配列が当該技術分野で知られており、それらもまた、本明細書において開示される任意のＶＨ領域と組み合わせることができる。例えば、好ましい定常領域は、以下に再現されるものなどの改変されたＩｇＧ４定常領域である。
【化２】
2018520650.tif 000003
【００３５】
この改変されたＩｇＧ４配列は、野生型ＩｇＧ４と比べて低減したＦｃＲｎ結合を示し、よって低減した血清半減期をもたらす。加えて、これは、ＩｇＧ４をより安定にし、Ｆａｂアーム交換を防止する、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化を示す。
【００３６】
別の好ましい定常領域は、以下に再現されるものなどの改変されたＩｇＧ４定常領域である。
【化３】
2018520650.tif 000004
【００３７】
この改変されたＩｇＧ４配列は、ＩｇＧ４をより安定にし、Ｆａｂアーム交換を防止する、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化をもたらす。
【００３８】
以下に再現されるものなどの野生型ＩｇＧ４定常領域も好ましい。
【化４】
2018520650.tif 000005
【００３９】
本明細書において開示される任意のＶＬ領域配列と（完全な軽鎖を形成するように）組み合わされ得る例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列は、以下に再現されるカッパ鎖定常領域配列である。
【化５】
2018520650.tif 000006
【００４０】
他の軽鎖定常領域配列が当該技術分野で知られており、それらもまた、本明細書において開示される任意のＶＬ領域と組み合わせることができる。
【００４１】
本抗体またはその抗原結合断片は、以下により詳細に説明される特定の好ましい結合特徴及び機能的効果を有する。該抗体またはその抗原結合断片は、本発明の二重特異性ポリペプチドの一部として組み込まれたとき、これらの結合特徴及び機能的効果を保持することが好ましい。
【００４２】
一実施形態において、抗原結合断片は、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ断片またはジスルフィド結合Ｆｖ断片など）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ）２断片など）、及びドメイン抗体から成る群から選択され得る。
【００４３】
一実施形態において、二重特異性ポリペプチドは、非免疫グロブリンポリペプチド（例えばＣＴＬＡ−４結合ドメイン、例えばＣＤ８６またはその変異型、例えば配列番号１７など；以下参照）がカッパ鎖のＣ末端部に融合しているＩｇＧ１抗体であり得る。
【００４４】
一実施形態において、二重特異性ポリペプチドは、ｓｃＦｖ断片がガンマ１重鎖のＣ末端に融合しているＩｇＧ１抗体であってもよい。
【００４５】
一実施形態において、二重特異性ポリペプチドは、２つの異なる標的に結合する２〜４つのｓｃＦｖを含有してもよい。
【００４６】
ここで「Ｔ細胞標的」には、活性化状態または不活性状態でＣＤ３＋Ｔ細胞の細胞膜内に位置するポリペプチド受容体が含まれる。そのような膜結合受容体は、投与後に本発明の二重特異性ポリペプチドによってアクセスされるように、細胞外に露出していてもよい。
【００４７】
Ｔ細胞標的が細胞の表面上に局在してもよいことは、当業者には理解されよう。ここで「細胞の表面上に局在する」とは、Ｔ細胞標的の１つ以上の領域が細胞表面の外面上に存在するように、Ｔ細胞標的が細胞と会合していることを意味する。例えば、Ｔ細胞標的は、１つ以上の領域が細胞外表面上に提示されるように、細胞原形質膜に挿入されても（すなわち、膜貫通タンパク質として適応されても）よい。これは、細胞によるＴ細胞標的の発現の過程で起こり得る。したがって、一実施形態において、「細胞の表面上に局在する」とは、「細胞の表面上で発現する」を意味する場合がある。あるいは、Ｔ細胞標的は、細胞の外側にあって、共有結合性及び／またはイオン性の相互作用がそれを細胞表面の特定の領域（複数可）に局在させてもよい。
【００４８】
一実施形態において、第１及び／または第２のＴ細胞標的は、チェックポイント分子であってもよい。例えば、一実施形態において、第１及び／または第２のＴ細胞標的は、共刺激性または共阻害性の分子である。
【００４９】
ここで「共刺激性」には、Ｔ細胞活性化を促進することのできる共シグナル伝達性（ｃｏ−ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）分子が含まれる。ここで「共阻害性」には、Ｔ細胞活性化を抑制することのできる共シグナル伝達分子が含まれる。
【００５０】
したがって、一実施形態において、Ｔ細胞標的のうちの少なくとも１つは、刺激性チェックポイント分子（例えばＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、及びＯＸ４０など）であり得る。本発明の二重特異性ポリペプチドは、刺激性チェックポイント分子における作動薬であることが有利である。
【００５１】
あるいは、またはさらに、Ｔ細胞標的のうちの少なくとも１つは、阻害性チェックポイント分子（例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、Ｔｉｍ３、Ｌａｇ３、Ｔｉｇｉｔ、またはＶＩＳＴＡなど）であってもよい。本発明の二重特異性ポリペプチドは、阻害性チェックポイント分子における拮抗薬であることが有利である。
【００５２】
一実施形態において、Ｔ細胞標的のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）スーパーファミリーメンバーである。ここでＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーには、細胞外システインリッチドメインを介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力を特徴とするサイトカイン受容体が含まれる。ＴＮＦＲの例としては、ＯＸ４０及びＣＤ１３７が挙げられる。
【００５３】
一実施形態において、第１及び／または第２のＴ細胞標的は、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、及びＣＤ２８から成る群から選択され得る。例えば、第１及び／または第２のＴ細胞標的は、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、及びＣＤ１３７から成る群から選択されてもよい。
【００５４】
本発明の二重特異性抗体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及び／またはアポトーシスを誘導することができ得ることは、当業者には理解されよう。
【００５５】
さらなる実施形態において、本ポリペプチドは、腫瘍免疫を誘導することができる。これは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、例えば、ＩＬ−２及びＩＦＮγの産生を測定することによって、インビトロで試験することができる。エフェクターＴ細胞の活性化は、腫瘍特異的Ｔ細胞応答がインビボで達成され得ることを暗示する。さらに、マウスモデルなどのインビボモデルにおける抗腫瘍応答は、腫瘍に対する成功裏の免疫応答が達成されたことを暗示する。
【００５６】
本抗体は、Ｔ細胞標的を発現する細胞の活性を調節し得、該調節は、該細胞の活性の増加または減少である。この細胞は、典型的にはＴ細胞である。本抗体は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増加させる場合もあれば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させる場合もある。いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞、特にＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加である。エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は周知であり、それには、例えば、対照の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生及び／またはＴ細胞増殖のレベルと比べて、本抗体の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生のレベルの上昇またはＴ細胞増殖の増加を測定することが含まれる。細胞増殖及び／またはＩＬ−２産生に関するアッセイは周知であり、実施例に例示される。
【００５７】
例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、及びフローサイトメトリー分析を含む、標的に対するリガンドの結合能力を評価するための標準的アッセイが、当該技術分野において周知である。ポリペプチドの結合動態（例えば結合親和性）もまた、当該技術分野で知られる標準的アッセイによって、例えば表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）などによって評定することができる。
【００５８】
「結合活性」及び「結合親和性」という用語は、ポリペプチド分子が標的に結合するか結合しないかの傾向を指すよう意図される。結合親和性は、ポリペプチド及びその標的の解離定数（Ｋｄ）を決定することによって数量化され得る。より低いＫｄは、標的に対する親和性がより高いことを示す。同様に、ポリペプチドのその標的に対する結合の特異性は、ポリペプチドのその標的に対する比較解離定数（Ｋｄ）を、ポリペプチド及び別の非標的分子に関する解離定数と比較したものという観点で定義されてもよい。
【００５９】
この解離定数の値は、周知の方法によって直接決定することができ、複雑な混合物についてでさえ、例えば、Ｃａｃｅｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｙｔｅ  ９：３４０−３６２，１９８４；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）に記載されるものなどの方法によって算出することができる。例えば、Ｗｏｎｇ  ＆  Ｌｏｈｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，５４２８−５４３２，１９９３）に開示されるものなどの二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して、Ｋｄを確定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、及びフローサイトメトリー分析を含む、標的に対する抗体などのリガンドの結合能力を評価するための他の標準的アッセイが、当該技術分野において知られている。抗体の結合動態（例えば結合親和性）もまた、当該技術分野で知られる標準的アッセイによって、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム分析などによって評定することができる。
【００６０】
標的に対する抗体の結合が、その標的の別の既知のリガンド、例えば別の抗体などによる標的の結合と比較される、競合結合アッセイを実施してもよい。５０％の阻害が生じる濃度は、Ｋｉとして知られている。理想的な条件下では、ＫｉはＫｄと等価である。Ｋｉ値は、Ｋｄ未満になることは決してないため、好都合なことに、Ｋｉの測定値を代入してＫｄの上限を求めることができる。
【００６１】
結合親和性の代替的な尺度としては、ＥＣ５０またはＩＣ５０が挙げられる。この文脈において、ＥＣ５０は、ポリペプチドが、定量の標的に対するその最大結合の５０％を達成する濃度を示す。ＩＣ５０は、ポリペプチドが、定量の標的に対する定量の競合相手の最大結合の５０％を阻害する濃度を示す。両方の場合において、より低いレベルのＥＣ５０またはＩＣ５０は、標的に対する親和性がより高いことを示す。リガンドのその標的に対するＥＣ５０値及びＩＣ５０値は、両方とも、周知の方法、例えばＥＬＩＳＡによって決定することができる。ポリペプチドのＥＣ５０及びＩＣ５０を評定するための好適なアッセイは、実施例に記載される。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、その標的に対して、別の非標的分子に結合するその親和性よりも少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上である親和性で結合することができる。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、ポリペプチドの全てまたは一部が、該ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む細胞によって、融合タンパク質として発現されてもよい。
【００６４】
あるは、Ｂ１部分及びＢ２部分は、別々に産生され、その後１つに結合してもよい。結合は、任意の好適な手段、例えば上記に概説された化学的共役法及びリンカーによって達成され得る。Ｂ１部分及びＢ２部分の別々の産生は、任意の好適な手段によって達成され得る。例えば、以下により詳細に説明されるような、場合により別々の細胞内にある別々のヌクレオチドからの発現による。
【００６５】
変異形
本明細書に記載される二重特異性ポリペプチドまたはその構成要素である結合ドメイン（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、及びＣＴＬＡ−４結合ドメインなど）は、ポリペプチドまたは結合ドメインがその標的に対する結合性を保持する限り、本明細書に列挙される特定のアミノ酸配列のうちのいずれの変異形または断片を含んでもよい。一実施形態において、抗体の変異形または抗原結合断片は、本明細書に列挙される配列のＣＤＲ配列を保持してもよい。例えば、抗ＯＸ４０抗体または抗ＣＤ１３７抗体は、抗体がその標的に対する結合性を保持する限り、表Ｂ及びＨに列挙される特定のアミノ酸配列のうちのいずれの変異形または断片を含んでもよい。そのような変異形または断片は、典型的に、表ＢまたはＨの該配列のＣＤＲ配列を保持し得る。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、結合ドメインがその標的に対する結合性を保持する限り、表Ｃの配列のうちのいずれの変異形を含んでもよい。
【００６６】
本明細書に列挙される重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの断片は、該アミノ酸配列から少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、または少なくとも１００個連続したアミノ酸を含み得る。
【００６７】
本明細書に列挙される重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの変異形は、該配列の置換変異形、欠失変異形、または付加変異形であり得る。変異形は、該配列からの１個、２個、３個、４個、５個、最大１０個、最大２０個、最大３０個、もしくはそれ以上のアミノ酸置換及び／または欠失を含んでもよい。「欠失」変異形は、個々のアミノ酸の欠失、アミノ酸の小群、例えば２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸の欠失、またはより大きなアミノ酸領域の欠失、例えば特定のアミノ酸ドメインもしくは他の特徴の欠失などを含んでもよい。「置換」変異形は、好ましくは、１個以上のアミノ酸を同数のアミノ酸に置き換え、保存的なアミノ酸置換を行うことを伴う。例えば、アミノ酸は、類似の特性を有する代替的なアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、または別の脂肪族アミノ酸で置換されてもよい。好適な置換基を選択するために使用することのできる２０種の主なアミノ酸の特性の一部は、次の通りである。
【表１】
2018520650.tif 000007
【００６８】
本明細書におけるアミノ酸は、正式名、３文字表記、または１文字表記によって参照され得る。
【００６９】
好ましい「誘導体」または「変異形」としては、自然発生アミノ酸の代わりに、配列内に現れるアミノ酸がその構造類似体であるものが挙げられる。配列内で使用されるアミノ酸は、抗体の機能が著しく悪影響を受けない限り、誘導体化または修飾、例えば標識されてもよい。
【００７０】
上述の誘導体及び変異形は、抗体の合成中に、もしくは産生後の修飾によって調製されてもよく、または抗体が組換え型である場合は、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または核酸の酵素的切断及び／もしくは連結反応の既知の技術を使用して調製されてもよい。
【００７１】
好ましくは、変異形は、本明細書において開示される配列に示される配列に対して、６０％、または７０％超、例えば７５〜８０％、好ましくは８５％超、例えば９０または９５％超のアミノ酸同一性を有する、アミノ酸配列を有する。このレベルのアミノ酸同一性は、関連する配列番号の配列の全長にわたって見られてもよく、またはその配列の一部にわたって、例えば、全長ポリペプチドのサイズに応じて２０個、３０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、もしくはそれ以上のアミノ酸にわたって見られてもよい。
【００７２】
アミノ酸配列との関連で、「配列同一性」は、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２２）：４６７３−８０；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）を使用し、以下のパラメータを用いて評定された場合の規定値を有する配列を指す。
ペアワイズアラインメントパラメータ  −方法：正確、マトリックス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、ギャップ伸長ペナルティ：０．１０、
多重配列アラインメントパラメータ  −マトリックス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、遅延の同一性％（％  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｅｌａｙ）：３０、エンドギャップへのペナルティ（Ｐｅｎａｌｉｚｅ  ｅｎｄ  ｇａｐｓ）：オン、ギャップ分離距離：０、ネガティブマトリックス：なし、ギャップ伸長ペナルティ：０．２０、残基特異的（Ｒｅｓｉｄｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ギャップペナルティ：オン、親水性ギャップペナルティ：オン、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。特定の残基における配列同一性は、単に誘導体化されている同一の残基を含むよう意図される。
【００７３】
ポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞
本発明は、本発明のポリペプチドの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドにも関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される任意のポリペプチド、またはＢ１の全てもしくは一部、またはＢ２の全てもしくは一部をコードしてもよい。「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドかリボヌクレオチドかを問わず、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはその類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、何らかの周囲媒体からのポリペプチドの完全ではないが実質的な単離があり得ることを意味する。本ポリヌクレオチドは、それらの意図される用途を妨げない担体または希釈剤と混合されても、実質的に単離されていると見なされ得る。
【００７４】
選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な制御配列の制御下に置かれると、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンと、３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンとによって決定される。本明細書では、そのような核酸配列は、ウイルス、原核生物、もしくは真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、ウイルスもしくは原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡに由来するゲノム配列、そしてさらには合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置していてもよい。
【００７５】
抗体の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、本明細書において開示されるヌクレオチド配列、例えば、表ＢまたはＨに記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成ってもよい。表Ｄ、Ｇ、またはＨに示されるポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチドは、同様に表Ｄ、Ｇ、またはＨに示される対応するヌクレオチド配列（イントロン配列は小文字で示されている）を含むか、またはそれらから成ってもよい。ＣＴＬＡ−４結合ドメインの例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｅに示される配列番号２５〜４３のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成ってもよい。
【００７６】
あるいは、好適なポリヌクレオチド配列は、これらの特定のポリヌクレオチド配列のうちの１つの変異形であってもよい。例えば、変異形は、上記の核酸配列のいずれかの置換変異形、欠失変異形、または付加変異形であってもよい。変異形ポリヌクレオチドは、配列表に示される配列からの１個、２個、３個、４個、５個、最大１０個、最大２０個、最大３０個、最大４０個、最大５０個、最大７５個、もしくはそれ以上の核酸置換及び／または欠失を含んでもよい。
【００７７】
好適な変異形は、本明細書において開示される核酸配列のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドと少なくとも７０％相同、好ましくはそれと少なくとも８０または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％相同であり得る。好ましくは、これらのレベルにおける相同性及び同一性が、少なくともポリヌクレオチドのコード領域に関して存在する。相同性を測定する方法は当該技術分野で周知であり、この文脈において、相同性が核酸同一性に基づいて計算されることは、当業者には理解されよう。かかる相同性は、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも３０個、例えば少なくとも４０個、６０個、１００個、２００個、またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって存在し得る。かかる相同性は、未修飾のポリヌクレオチド配列の全長にわたって存在してもよい。
【００７８】
ポリヌクレオチドの相同性または同一性を測定する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用され得る（例えば、そのデフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７−３９５；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）。
【００７９】
例えば、開示内容が参照により本明細書に援用される、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載されるように、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性の計算または配列の整列を（典型的にはそれらのデフォルト設定で）行うこともできる。
【００８０】
ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に利用可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列内にある長さＷの短い単語で、データベース配列内にある同じ長さの単語と整列されたときに何らかの正値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たすものを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）をまず特定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積的アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。各方向におけるワードヒットの延長は、１つ以上の負スコアの残基アラインメントの累積に起因して、累積的アラインメントスコアがゼロ未満になるとき、または、いずれかの配列の終わりに達したときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスアラインメント（Ｂ）（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方のストランドの比較を使用する。
【００８１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、配列は、第１の配列を第２の配列と比較した最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、別の配列と類似していると見なされる。
【００８２】
相同体は、関連したポリヌクレオチド内の配列から、３個未満、５個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上の変異分異なり得る（変異のそれぞれは、置換、欠失、または挿入であり得る）。これらの変異は、相同体の、少なくとも３０個、例えば少なくとも４０個、６０個、もしくは１００個、またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって測定され得る。
【００８３】
一実施形態において、変異形配列は、配列表に提示された特定の配列から、遺伝コードの重複性によって異なってもよい。ＤＮＡコードは、４つの主な核酸残基（Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ）を有し、これらを使用して、生物の遺伝子内でタンパク質がコードしたアミノ酸を表す３文字のコドンを「綴る」。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直線状配列は、それらの遺伝子によってコードされるタンパク質（複数可）内のアミノ酸の直線状配列に翻訳される。コードは高度に縮重しており、６１個のコドンが２０種の天然アミノ酸をコードし、３個のコドンが「終止」シグナルを表す。したがって、ほとんどのアミノ酸は、２個以上のコドンによってコードされ、事実、いくつかは、５個以上の異なるコドンによってコードされる。したがって、本発明の変異形ポリヌクレオチドは、同じポリペプチド配列を本発明の別のポリヌクレオチドとしてコードする場合があるが、同じアミノ酸をコードするために異なるコドンを使用することから異なる核酸配列を有する場合がある。
【００８４】
したがって、本発明のポリペプチドは、それをコードし、かつそれを発現することのできるポリヌクレオチドの形態から産生されてもよいし、その形態で送達されてもよい。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドは、例としてＧｒｅｅｎ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）に記載されるような、当該技術分野で周知の方法によって合成することができる。
【００８６】
本発明の核酸分子は、挿入された配列に作動可能に連結された制御配列を含み、したがって本発明のポリペプチドのインビボでの発現を可能にする、発現カセットの形態で提供されてもよい。これらの発現カセットは、同様に、典型的には、ベクター（例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター）内で提供される。かかる発現カセットは、宿主対象に直接投与され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが宿主対象に投与されてもよい。ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを使用して調製及び／または投与されるのが好ましい。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を保有すること、及び本発明のポリペプチドの発現を可能にすることのできる、任意のベクターであり得る。
【００８７】
したがって、本発明は、かかるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。かかる発現ベクターは、分子生物学の技術分野で日常的に構築されており、例えば、プラスミドＤＮＡ及び適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、及び他のエレメント、例えば、本発明のペプチドの発現を可能にするために必要な場合があり、そのために正しい配向に位置付けられる、ポリアデニル化シグナルなどの使用を伴う場合がある。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう（Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記参照）。
【００８８】
本発明は、本発明のポリペプチドを発現するように改変されている細胞も含む。かかる細胞は、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞などの、一過性もしくは好ましくは安定な高等真核細胞株、酵母などの下等真核細胞、または細菌細胞などの原核細胞を含む。本発明のポリペプチドをコードするベクターまたは発現カセットの挿入によって改変され得る細胞の特定例としては、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＳ０細胞、及びＣＯＳ細胞が挙げられる。選択される細胞株は、安定であるだけでなく、ポリペプチドの成熟グリコシル化及び細胞表面発現を可能にもするものであるのが好ましい。
【００８９】
そのような本発明の細胞株は、本発明のポリペプチドを産生するための日常的な方法を使用して培養されてもよく、本発明の抗体を対象に送達するように治療的または予防的に使用されてもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、またはベクターは、対象の細胞にエクスビボで投与され、次に対象の身体に戻されてもよい。
【００９０】
薬学的製剤、治療上の使用、及び患者群
別の態様において、本発明は、本発明の分子、例えば本明細書に記載の抗体、二重特異性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞などを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、１つ以上の本発明の分子、例えば１つ以上の本発明の抗体及び／または二重特異性ポリペプチドなどと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。担体は、非経口投与、例えば静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与（例えば、注射または輸注による投与）に好適であることが好ましい。投与経路に応じて、ポリペプチドは、酸の作用及びポリペプチドを不活性化または変性させ得る他の自然条件からポリペプチドを保護する材料でコーティングされてもよい。
【００９２】
好ましい薬学的に許容される担体は、水性担体または希釈剤を含む。本発明の組成物に用いられ得る好適な水性担体の例としては、水、緩衝水、及び食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることが好ましい。
【００９３】
本発明の組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでもよい。これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの補助剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順（上記）と、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの封入との両方によって、確実にすることができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることも望ましい場合がある。加えて、注射可能な薬学的形態の持続的吸収が、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンといった吸収を遅延させる薬剤の封入によってもたらされてもよい。
【００９４】
治療用組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。
【００９５】
滅菌注射溶液は、活性剤（例えばポリペプチド）を、必要に応じて上記に列挙された成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要な量で組み込み、続いて滅菌精密濾過を行うことによって調製することができる。概して、分散液は、基本的な分散媒と上記に列挙されたものから必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに、活性剤を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、事前に滅菌濾過されたその溶液から、活性剤に加えて所望される任意の追加の成分の粉末をもたらす、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【００９６】
特に好ましい組成物は、全身投与用または局所投与用に製剤化される。局所投与は、腫瘍部位で行われても、腫瘍排出リンパ節内に行われてもよい。本組成物は、好ましくは、ある期間にわたる持続放出のために製剤化され得る。したがって、本組成物は、持続放出を促進するマトリックスの一部として提供されてもよい。好ましい持続放出マトリックスは、モンタニドまたはγ−ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）のナノ粒子を含み得る。場合により持続的な期間にわたる、本発明のポリペプチドの局所放出は、ＣＴＬＡ−４拮抗薬の投与に関連する自己免疫副作用の可能性を低減させ得る。
【００９７】
本発明の組成物は、本発明のポリペプチドだけでなく追加の活性成分を含んでもよい。上記で言及したように、本発明の組成物は、１つ以上の本発明のポリペプチドを含んでもよい。それらはまた、追加の治療剤または予防剤を含んでもよい。
【００９８】
本発明のポリペプチドまたは他の組成物及び使用説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。本キットは、上述の追加の治療剤または予防剤といった１つ以上の追加の試薬をさらに含んでもよい。
【００９９】
本発明によるポリペプチドは、治療法または予防法において使用されてもよい。治療用途において、ポリペプチドまたは組成物は、障害もしくは病態を既に患っている対象に、病態もしくはその症状のうちの１つ以上を治癒するか、軽減するか、または部分的に抑止するのに十分な量で投与される。かかる治療処置は、疾患症状の重症度の減少、または無症状期間の頻度もしくは持続期間の増加をもたらし得る。これを達成するのに妥当な量は、「治療有効量」と定義される。予防用途では、ポリペプチドまたは組成物は、障害もしくは病態の症状を未だ示していない対象に、症状の発症を防止するか、または遅延させるのに十分な量で投与される。そのような量は、「予防有効量」と定義される。対象は、任意の好適な手段によって、疾患または病態を発症するリスクがあるものと特定されてよい。
【０１００】
特に、本発明の抗体及び二重特異性ポリペプチドは、がんの治療または防止に有用であり得る。したがって、本発明は、がんの治療または防止に使用するための、本発明の抗体または二重特異性ポリペプチドを提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドを個体に投与することを含む、がんを治療または防止する方法を提供する。本発明はまた、がんの治療または防止用の薬物の製造に使用するための、本発明の抗体または二重特異性ポリペプチドを提供する。
【０１０１】
がんは、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、黒色腫、膀胱がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、皮膚がん、リンパ腫、または神経膠芽腫であり得る。
【０１０２】
本発明の抗体もしくは二重特異性ポリペプチド、または該抗体もしくは該ポリペプチドを含む組成物は、当該技術分野で知られる多様な方法のうちの１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路を介して投与され得る。当業者には理解されるように、投与の経路及び／または形態は、所望の結果に応じて異なる。全身投与または局所投与が好ましい。局所投与は、腫瘍部位で行われても、腫瘍排出リンパ節内に行われてもよい。本発明のポリペプチドまたは組成物の好ましい投与形態としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口の投与形態、例えば注射または輸注によるものが挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」という表現は、通常は注射による、腸内投与及び局所投与以外の投与形態を意味する。あるいは、本発明のポリペプチドまたは組成物は、非経口でない形態、例えば局所、上皮性、または粘膜の投与形態などによって投与されてもよい。
【０１０３】
本発明の抗体またはポリペプチドの好適な薬用量は、熟練した医師によって決定され得る。本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の薬用量レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物、及び投与形態に対して所望の治療応答を達成するために効果的である活性成分の量が得られるように、変化させることができる。選択される薬用量レベルは、用いられる特定のポリペプチドの活性、投与経路、投与時間、ポリペプチドの排泄速度、治療の持続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全体的な健康、及び以前の病歴、ならびに医学の技術分野で周知の同様の要素を含む、多様な薬物動態学的な要素に依存する。
【０１０４】
本発明の抗体またはポリペプチドの好適な用量は、例えば、治療される患者の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１００ｍｇの範囲であり得る。例えば、好適な薬用量は、体重１ｋｇ当たり１日に約１μｇ〜約１０ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり１日に約１０ｇ〜約５ｍｇであり得る。
【０１０５】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば治療応答）をもたらすように調整され得る。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、いくつかに分割された用量が時間をかけて投与されてもよく、治療状況の緊急事態によって指示されるように用量が比例的に低減または増加されてもよい。投与しやすさ及び投与の均一性のために、単位剤形における非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、治療される対象のための単一の薬用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要とされる薬学的担体に関連する所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性化合物を含有する。
【０１０６】
抗体またはポリペプチドは、単一用量で投与されても、複数用量で投与されてもよい。複数用量は、同じかまたは異なる経路で、同じかまたは異なる位置に投与され得る。あるいは、抗体またはポリペプチドは、上述の持続放出製剤として投与されてもよく、その場合、頻度の低い投与が必要とされる。薬用量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期、及び所望される治療の持続期間に応じて異なり得る。薬用量及び投与の頻度はまた、治療が予防的であるか治療的であるかに応じて異なってもよい。予防用途では、比較的低い薬用量が、長期にわたって比較的頻度の低い間隔で投与されてもよい。治療用途では、例えば、疾患の症状の部分的または完全な寛解を患者が示すまで、比較的高い薬用量が投与されてもよい。
【０１０７】
２つ以上の薬剤の併用投与は、いくつかの異なる方法で達成され得る。一実施形態において、本抗体またはポリペプチド及び他の薬剤が、単一の組成物中で一緒に投与されてもよい。別の実施形態では、本抗体またはポリペプチド及び他の薬剤は、併用療法の一部として別々の組成物中で投与されてもよい。例えば、調節薬は、他の薬剤の前に、その後に、またはそれと同時に投与されてもよい。
【０１０８】
本発明の抗体、ポリペプチド、または組成物は、第１及び第２のＴ細胞標的を発現する細胞集団の活性化を増加させる方法において使用されてもよく、本方法は、該細胞と本発明のポリペプチドとの間の相互作用を許容するのに好適な条件下で、該細胞集団に、本発明のポリペプチドまたは組成物を投与することを含む。細胞集団は、典型的には、第１のＴ細胞標的を発現する少なくともいくつかの細胞、典型的にはＴ細胞と、第２のＴ細胞標的を発現する少なくともいくつかの細胞とを含む。本方法は、典型的にはエクスビボで行われる。
【０１０９】
例えば、本発明の抗体、ポリペプチド、または組成物は、ヒトＯＸ４０及びヒトＣＴＬＡ−４を発現する細胞集団の活性化を増加させる方法において使用されてもよく、本方法は上述の通りである。
【０１１０】
あるいは、本発明の抗体、ポリペプチド、または組成物は、ヒトＯＸ４０及びヒトＣＤ１３７を発現する細胞集団の活性化を増加させる方法において使用されてもよく、本方法は上述の通りである。
【０１１１】
あるいは、本発明の抗体、ポリペプチド、または組成物は、ヒトＣＴＬＡ−４及びヒトＣＤ１３７を発現する細胞集団の活性化を増加させる方法において使用されてもよく、本方法は上述の通りである。
【０１１２】
ＣＤ１３７に対する結合ドメイン
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＣＤ１３７に対して特異的な結合ドメインを含んでもよい。
【０１１３】
ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、特定の好ましい結合特徴及び機能的効果を有し、それらは以下により詳細に説明される。該抗体またはその抗原結合断片は、本発明の二重特異性抗体の一部として組み込まれたとき、これらの結合特徴及び機能的効果を保持することが好ましい。本発明はまた、単離形態における、すなわち本発明の二重特異性抗体から独立した抗体またはその抗原結合断片として、該抗体を提供する。
【０１１４】
抗ＣＤ１３７抗体は、ＣＤ１３７に特異的に結合する、すなわち、ＣＤ１３７には結合するが、他の分子には結合しないか、またはより低い親和性で結合することが好ましい。本明細書で使用されるＣＤ１３７という用語は、典型的にはヒトＣＤ１３７を指す。ヒトＣＤ１３７の配列は、配列番号１４８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ０６１９６．１に対応する）に記載されている。本抗体は、非ヒト霊長類、例えばＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）由来のＣＤ１３７といった他の哺乳動物由来のＣＤ１３７に対して、いくらかの結合親和性を有し得る。本抗体は、マウスＣＤ１３７に結合せず、かつ／または他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＯＸ４０もしくはＣＤ４０に結合しないことが好ましい。
【０１１５】
本抗体は、天然状態のＣＤ１３７に、特に細胞の表面上に局在するＣＤ１３７に結合する能力を有する。好ましくは、本抗体は、ＣＤ１３７に特異的に結合する。すなわち、本発明の抗体は、それが別の分子に結合する結合親和性よりも高い結合親和性でＣＤ１３７に結合することが好ましい。
【０１１６】
「細胞の表面上に局在する」とは、これまでに定義した通りである。
【０１１７】
本抗体は、ＣＤ１３７を発現する細胞の活性を調節し得、該調節は、該細胞の活性の増加または減少である。この細胞は、典型的にはＴ細胞である。本抗体は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増加させる場合もあれば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させるか、またはそれを枯渇させる場合もある。いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞、特にＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＮＫエフェクターＴ細胞の活性の増加である。エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は周知であり、先に記載した通りである。
【０１１８】
本抗体は、好ましくは、インビトロでＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の増加を引き起こし、場合により、活性の該増加は、Ｔ細胞による増殖、ＩＦＮ−γ産生、及び／またはＩＬ−２産生の増加である。この増加は、好ましくは、同じアッセイで測定されるアイソタイプ対照抗体によって引き起こされる活性の変化よりも、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらにより好ましくは少なくとも２５倍高い。
【０１１９】
本抗体は、好ましくは、１０×１０−９Ｍ未満または７×１０−９Ｍ未満、より好ましくは４もしくは２×１０−９Ｍ未満、最も好ましくは１．２×１０−９Ｍ未満であるＫｄ値で、ヒトＣＤ１３７に結合する。
【０１２０】
例えば、本抗体は、マウスＣＤ１３７または何らかの他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばＯＸ４０もしくはＣＤ４０などに結合しないことが好ましい。したがって、典型的には、ヒトＣＤ１３７に対する本抗体のＫｄは、例えばマウスＣＤ１３７、他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、または環境内の何らかの他の無関係の物質もしくは付随する物質といった他の非標的分子に対するＫｄよりも、２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍低い。より好ましくは、Ｋｄは５０倍低く、より好ましくは１００倍低く、さらにより好ましくは２００倍低い。
【０１２１】
この解離定数の値は、前述のように、周知の方法によって直接決定することができる。前述のように、競合結合アッセイを行うこともできる。
【０１２２】
本発明の抗体は、好ましくは、その標的に対して、別の非標的分子に結合するその親和性よりも少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上である親和性で結合することができる。
【０１２３】
したがって、要約すると、抗ＣＤ１３７抗体は、次の機能的特徴：
Ｉ．１０×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１．２×１０−９Ｍ未満であるＫＤ値で、ヒトＣＤ１３７に結合すること、及び、
ＩＩ．インビトロでＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の増加を引き起こすことができること、のうちの少なくとも１つを示すことが好ましく、場合により、活性の該増加は、Ｔ細胞による増殖、ＩＦＮ−γ産生、及び／またはＩＬ−２産生の増加である。この増加は、好ましくは、同じアッセイで測定されるアイソタイプ対照抗体によって引き起こされる活性の変化よりも、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらにより好ましくは少なくとも２５倍高い。
【０１２４】
本抗体は、ＣＤ１３７、典型的にはヒトＣＤ１３７に対して特異的であり、表Ｉ（１）及びＩ（２）における横列の任意の対応する対の例示的なＣＤＲ配列のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含み得る。
【０１２５】
例えば、本抗体は、表Ｉ（１）及び表Ｉ（２）の第１の横列の例示的なＣＤＲ配列（配列番号２０７、２１２、２１７、８０、８１、２２２）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含んでもよい。
【０１２６】
あるいは、本抗体は、表Ｉ（１）及びＩ（２）の第２、第３、第４、または第５の横列の例示的なＣＤＲ配列のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含んでもよい。
【０１２７】
好ましい抗ＣＤ１３７抗体は、表Ｉ（１）の任意の個々の横列に定義される重鎖ＣＤＲ３、及び／または表Ｉ（２）の任意の個々の横列に定義される軽鎖ＣＤＲ３を少なくとも含み得る。本抗体は、表Ｉ（１）の個々の横列に示される３つの重鎖ＣＤＲ配列全て（すなわち、所与の「ＶＨ番号」の３つの重鎖ＣＤＲ全て）、及び／または、表Ｉ（２）の個々の横列に示される３つの軽鎖ＣＤＲ配列全て（すなわち、所与の「ＶＬ番号」の３つの軽鎖ＣＤＲ全て）を含んでもよい。
【０１２８】
抗ＣＤ１３７抗体の完全な重鎖及び軽鎖の可変領域アミノ酸配列の例は、表Ｈに示される。各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列も示される。配列番号１７７〜１９６は、抗ＣＤ１３７抗体に関連するアミノ酸及びヌクレオチド配列を指す。表Ｈ中の該ＶＨ領域及びＶＬ領域の付番は、表Ｉ（１）及び（２）にあるように使用される付番方式に対応する。したがって、例えば、「１２０５、軽鎖ＶＬ」のアミノ酸配列は、表Ｉ（２）に示されるＶＬ番号１２０５の３つのＣＤＲ全てを含む完全なＶＬ領域配列の例であり、「１２０４、重鎖ＶＨ」のアミノ酸配列は、表Ｉ（１）に示されるＶＨ番号１２０４の３つのＣＤＲ全てを含む完全なＶＨ領域配列の例である。
【０１２９】
好ましい本発明の抗ＣＤ１３７抗体は、特定のＶＨ番号の３つのＣＤＲ全てを含むＶＨ領域と、特定のＶＬ番号の３つのＣＤＲ全てを含むＶＬ領域とを含む。例えば、抗体は、ＶＨ番号１２０４の３つのＣＤＲ全て、及びＶＬ番号１２０５の３つのＣＤＲ全てを含み得る。そのような抗体は、１２０４／１２０５と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｈに示される１２０４及び１２０５に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１７９及び１７７）を含み得る。
【０１３０】
あるいは、抗体は、ＶＨ番号１２１４の３つのＣＤＲ全て、及びＶＬ番号１２１５の３つのＣＤＲ全てを含んでもよい。そのような抗体は、１２１４／１２１５と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｈに示される１２１４及び１２１５に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１８１及び１８３）を含み得る。
【０１３１】
あるいは、抗体は、ＶＨ番号１６１８の３つのＣＤＲ全て、及びＶＬ番号１６１９の３つのＣＤＲ全てを含んでもよい。そのような抗体は、１６１８／１６１９と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｈに示される１６１８及び１６１９に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１８５及び１８７）を含み得る。
【０１３２】
あるいは、抗体は、ＶＨ番号１６２０の３つのＣＤＲ全て、及びＶＬ番号１６２１の３つのＣＤＲ全てを含んでもよい。そのような抗体は、１６２０／１６２１と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｈに示される１６２０及び１６２１に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１８９及び１９１）を含み得る。
【０１３３】
あるいは、抗体は、ＶＨ番号１６２６の３つのＣＤＲ全て、及びＶＬ番号１６２７の３つのＣＤＲ全てを含んでもよい。そのような抗体は、１６２６／１６２７と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｈに示される１６２６及び１６２７に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１９３及び１９５）を含み得る。
【０１３４】
抗ＣＤ１３７抗体は、本明細書に記載される特定の抗ＣＤ１３７抗体のうちのいずれかと同じエピトープに結合し得る。１２０４／１２０５、１２１４／１２１５、１６１８／１６１９、１６２０／１６２１、及び１６２６／１６２７と呼称される抗体のうちのいずれか１つと同じエピトープに結合するのが好ましい。
【０１３５】
ＣＴＬＡ−４に対する結合ドメイン
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４に対して特異的な結合ドメインを含んでもよい。
【０１３６】
ＣＤ８６及びＣＤ８０は、本明細書において、Ｂ７タンパク質（それぞれ、Ｂ７−２及びＢ７−１）と称される場合がある。これらのタンパク質は、抗原提示細胞の表面上で発現し、Ｔ細胞受容体ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４と相互作用する。ＣＤ２８に対するＢ７分子の結合は、Ｔ細胞活性化を促進し、一方で、ＣＴＬＡ−４に対するＢ７分子の結合は、Ｔ細胞の活性化を停止させる。Ｂ７タンパク質とＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ−４との相互作用は、免疫活性化及び制御において重要な役割を果たす共刺激性シグナル伝達経路を構成する。したがって、Ｂ７分子は、免疫抑制を解くことにより患者の免疫を増強させるための操作を行いやすい経路の一部である。
【０１３７】
ＣＤ８６タンパク質はモノマーであり、２つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインから成る。ＣＤ８６の受容体結合ドメインは、典型的なＩｇＶセット構造を有するが、膜近位ドメインは、Ｃ１セット様構造を有する。ＣＤ８０及びＣＤ８６の構造は、それら単独で、またはＣＴＬＡ−４と複合して決定されている。ＣＤ８０分子及びＣＤ８６分子上の接触残基は、可溶性細胞外ドメインにあり、ほとんどが（ＣＤＲ様）ループ内ではなくベータシート内に位置する。
【０１３８】
配列番号３は、ヒト野生型ＣＤ８６のモノマー可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列である。この野生型配列は、場合により、Ｎ末端のアラニン及びプロリン、すなわち２４位及び２５位を欠いていてもよい。これらのアミノ酸は、本明細書において、それぞれＡ２４及びＰ２５と称される場合がある。
【０１３９】
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ポリペプチド結合ドメインとして、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なドメイン、すなわち「ＣＴＬＡ−４結合ドメイン」を組み込んでもよい。そのような結合ドメインの好適な例は、ＷＯ  ２０１４／２０７０６３に開示されており、その内容は、参照により援用される。ＣＴＬＡ−４に対して特異的な結合ドメインは、ＣＤ２８にも結合し得る。本明細書で使用されるＣＴＬＡ−４という用語は、典型的にはヒトＣＴＬＡ−４を指し、本明細書で使用されるＣＤ２８という用語は、典型的にはヒトＣＤ２８を指す。ヒトＣＴＬＡ−４及びヒトＣＤ２８の配列は、それぞれ、配列番号１及び２に記載されている。本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、他の哺乳動物由来のＣＴＬＡ−４もしくはＣＤ２８、例えば霊長類またはマウスのＣＴＬＡ−４もしくはＣＤ２８に対して、いくらかの結合親和性を有し得る。
【０１４０】
ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、天然状態のＣＴＬＡ−４に、特に細胞の表面上に局在するＣＴＬＡ−４に結合する能力を有する。
【０１４１】
「細胞の表面上に局在する」とは、上記の定義の通りである。
【０１４２】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメイン部分は、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、または、
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸が変更されているアミノ酸配列を含むか、またはそれから成り得るが、ただし、該結合ドメインが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件とする。
【０１４３】
言い換えると、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、（ｉ）ヒト野生型ＣＤ８６のモノマー可溶性細胞外ドメイン、または（ｉｉ）該可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異形（ただし、該ポリペプチド変異形が、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件とする）を含むか、もしくはそれから成る、ヒトＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインである。
【０１４４】
したがって、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ヒト野生型ＣＤ８６と同じ標的結合特性を有してもよく、ヒト野生型ＣＤ８６の標的結合特性と比較して異なる標的結合特性を有してもよい。かかる特性を比較する目的において、「ヒト野生型ＣＤ８６」とは、典型的には、前節に記載のヒト野生型ＣＤ８６のモノマー可溶性細胞外ドメインを指す。
【０１４５】
ヒト野生型ＣＤ８６は、２つの標的、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８に特異的に結合する。したがって、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合特性は、ポリペプチドがこれらの標的のそれぞれに結合する能力の個々の指標として表される場合がある。例えば、ヒト野生型ＣＤ８６のモノマー細胞外ドメインのポリペプチド変異形は、ＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６の結合親和性よりも高い結合親和性でＣＴＬＡ−４に結合することが好ましい。そのようなポリペプチドは、場合により、ＣＤ２８に対する野生型ヒトＣＤ８６の結合親和性よりも低い結合親和性でＣＤ２８に結合してもよい。
【０１４６】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインである。これが意味するのは、好ましくはそれが別の分子に結合する結合親和性よりも高い結合親和性で、それがＣＴＬＡ−４に結合するということである。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６の親和性と同じ親和性か、またはそれよりも高い親和性で、ＣＴＬＡ−４に結合することが好ましい。
【０１４７】
好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＫｄは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＫｄよりも、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも８倍、または少なくとも１０倍低い。最も好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対するＣＴＬＡ−４結合ドメインのＫｄは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＫｄよりも、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍低い。ＣＴＬＡ−４に対するポリペプチドのＫｄを決定するための好ましい方法は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたＳＰＲ分析である。ポリペプチドのＳＰＲ分析のための好適なプロトコルは、実施例に記載される。
【０１４８】
好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＥＣ５０は、同じ条件下のヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＥＣ５０よりも、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１７倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または少なくとも５０倍低い。最も好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対するＣＴＬＡ−４結合ドメインのＥＣ５０は、同じ条件下のヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＥＣ５０よりも、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍低い。ＣＴＬＡ−４に対するポリペプチドのＥＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡによるものである。ポリペプチドのＥＣ５０の評定に使用するための好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載される。
【０１４９】
好ましくは、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＩＣ５０は、ヒトＣＴＬＡ−４との結合について野生型ヒトＣＤ８６と競合するとき、同じ条件下の野生型ヒトＣＤ８６のＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１３倍、少なくとも１５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍低い。最も好ましくは、ＣＴＬＡ−４結合ドメインのＩＣ５０は、同じ条件下の野生型ヒトＣＤ８６のＩＣ５０よりも、少なくとも１０倍、または少なくとも３００倍低い。本発明のポリペプチドのＩＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡによるものである。本発明のポリペプチドのＩＣ５０の評定に使用するための好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載される。
【０１５０】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＤ２８にも特異的に結合し得る。すなわち、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４を例外として、それが別の分子に結合する結合親和性よりも高い結合親和性でＣＤ２８に結合し得る。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ヒトＣＤ２８に対する野生型ヒトＣＤ８６の親和性よりも低い親和性でヒトＣＤ２８に結合してもよい。好ましくは、ヒトＣＤ２８に対するＣＴＬＡ−４結合ドメインのＫｄは、ヒトＣＤ２８に対する野生型ヒトＣＤ８６のＫｄよりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍高い。
【０１５１】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合特性は、ポリペプチドが２つの標的すなわちＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８に結合する能力の相対的尺度として表される場合もある。すなわち、ＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合特性は、ＣＴＬＡ−４に結合するポリペプチドの能力の、ＣＤ２８に結合するその能力に対する相対的尺度として表されてもよい。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＤ２８と比べてＣＴＬＡ−４と結合する相対的な能力が、それに対応する、ＣＤ２８と比べてＣＴＬＡ−４に結合するヒト野生型ＣＤ８６の相対的な能力と比較した場合に、増加していることが好ましい。
【０１５２】
ＣＴＬＡ−４とＣＤ２８との両方に対するポリペプチドの結合親和性が、同じパラメータ（例えば、Ｋｄ、ＥＣ５０）を使用して評定される場合、各標的に対するポリペプチドの相対的結合能力は、各標的に対するパラメータの値の単比として表され得る。この比は、ポリペプチドの結合比または結合強度比と称される場合がある。結合親和性を評定するために使用される多くのパラメータ（例えば、Ｋｄ、ＥＣ５０）に関して、より低い値は、より高い親和性を示す。これが該当する場合、ＣＴＬＡ−４対ＣＤ２８の結合親和性の比は、次式に従って計算される単一の数値として表されることが好ましい。
結合比＝［ＣＤ２８に対する結合親和性］÷［ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性］
あるいは、より高い値がより高い親和性を示すパラメータを使用して結合親和性が評定される場合は、上記の式の逆が好ましい。いずれの文脈においても、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ヒト野生型ＣＤ８６よりも高い結合比を有することが好ましい。所与のポリペプチドに関する結合比の、別のポリペプチドに関する結合比との直接比較では、結合親和性を評定し、両方のポリペプチドに関する結合比を計算するために、同じパラメータが使用されることが典型的に必要であることは理解されよう。
【０１５３】
好ましくは、ポリペプチドの結合比は、各標的に対するポリペプチドのＫｄを決定し、次に［ＣＤ２８に対するＫｄ］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＫｄ］の式に従って比を計算することによって計算される。この比は、ポリペプチドのＫｄ結合比と称される場合がある。標的に対するポリペプチドのＫｄを決定するための好ましい方法は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたＳＰＲ分析である。本発明のポリペプチドのＳＰＲ分析のための好適なプロトコルは、実施例に記載される。この方法に従って計算された本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合比は、好ましくは、同じ方法に従って計算された野生型ヒトＣＤ８６の結合比よりも、少なくとも２倍、または少なくとも４倍高い。
【０１５４】
あるいは、ポリペプチドの結合比は、各標的に対するポリペプチドのＥＣ５０を決定し、次に［ＣＤ２８に対するＥＣ５０］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０］の式に従って比を計算することによって計算されてもよい。この比は、ポリペプチドのＥＣ５０結合比と称される場合がある。標的に対するポリペプチドのＥＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡによるものである。本発明のポリペプチドのＥＣ５０の評定に使用するための好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載される。この方法に従って計算された本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合比は、同じ方法に従って計算された野生型ヒトＣＤ８６の結合比よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い。
【０１５５】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４への結合について別のポリペプチドと交差競合する（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）能力を有し得る。例えば、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４との結合について、配列番号６〜２４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと交差競合し得る。かかる交差競合ポリペプチドは、標準的な結合アッセイにおいて特定され得る。例えば、ＳＰＲ分析（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いるもの）、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用して、交差競合を実証することができる。
【０１５６】
上記の機能的特徴に加えて、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、特定の好ましい構造的特徴を有する。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、（ｉ）ヒト野生型ＣＤ８６のモノマー可溶性細胞外ドメイン、または（ｉｉ）該可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異形（ただし、該ポリペプチド変異形が、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件とする）を含むか、もしくはそれから成るかのいずれかである。
【０１５７】
ヒト野生型ＣＤ８６のモノマー可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異形は、場合によりＡ２４及びＰ２５を欠いている、ヒト野生型ＣＤ８６のそれに由来するアミノ酸配列、特にヒト野生型ＣＤ８６の可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）を含むか、またはそれから成る。特に、変異形は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸が変更されているアミノ酸配列を含む。「変更されている」とは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較して、少なくとも１個のアミノ酸が欠失しているか、挿入されているか、または置換されていることを意味する。「欠失している」とは、アミノ酸配列が１個のアミノ酸分短縮されるように、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）内に存在する少なくとも１個のアミノ酸が除去されていることを意味する。「挿入される」とは、アミノ酸配列が１個のアミノ酸分延長されるように、少なくとも１個の追加のアミノ酸が配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）内に導入されることを意味する。「置換される」とは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）内の少なくとも１個のアミノ酸が、代替のアミノ酸に置き換えられることを意味する。
【０１５８】
典型的には、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較したときに、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個のアミノ酸が変更されている。典型的には、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較したときに、１０個以下、９個、８個、７個、６個、５個、４個、２個、または１個のアミノ酸が変更されている。これらの下限のうちのいずれかを、これらの上限のうちのいずれかと組み合わせて、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較した変化の許容される数の範囲を定義することができることは理解されよう。したがって、例えば、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較したアミノ酸変化の許容される数が、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６などの範囲内である、アミノ酸配列を含み得る。
【０１５９】
配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較したときに、少なくとも２個のアミノ酸が変更されていることが特に好ましい。好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較したアミノ酸変化の許容される数は、２〜９、２〜８、または２〜７の範囲内である。
【０１６０】
上に記載した数及び範囲は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較した欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを用いて達成され得る。例えば、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較して、欠失のみ、挿入のみ、もしくは置換のみ、または欠失、挿入、もしくは置換の任意の混合が存在してもよい。好ましくは、変異形は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較した変化の全てが置換であるアミノ酸配列を含む。すなわち、配列番号３の配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較して、アミノ酸の欠失または挿入がない配列。好ましい変異形のアミノ酸配列では、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較したときに、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個のアミノ酸が置換されており、配列番号３の配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較して、アミノ酸の欠失または挿入がない。
【０１６１】
好ましくは、配列番号３の配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較した変化は、配列番号３のＦＧループ領域（１１４位〜１２１位）及び／またはベータシート領域内に存在する。ベータシート領域のストランドは、配列番号３における次の位置を有する：Ａ：２７−３１、Ｂ：３６−３７、Ｃ：５４−５８、Ｃ´：６４−６９、Ｃ´´：７２−７４、Ｄ：８６−８８、Ｅ：９５−９７、Ｆ：１０７−１１３、Ｇ：１２２−１３３。
【０１６２】
最も好ましくは、配列番号３の配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較した変化は、３２、４８、４９、５４、７４、７７、７９、１０３、１０７、１１１、１１８、１２０、１２１、１２２、１２５、１２７、または１３４から選択される位置のうちの１つ以上に存在する。本明細書におけるアミノ酸位置の付番は全て、Ｎ末端から始まる配列番号４のアミノ酸の計数に基づく。したがって、配列番号３のＮ末端における第１の位置は、２４と付番される（図４の概略図を参照されたい）。
【０１６３】
特に好ましい挿入としては、１１６位と１１７位との間に挿入された単一の追加のアミノ酸、及び／または、１１８位と１１９位との間に挿入された単一の追加のアミノ酸が挙げられる。挿入されたアミノ酸は、好ましくは、チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）である。
【０１６４】
特に好ましい置換は、アルギニン（Ｒ）である１２２位におけるものである。本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較して少なくとも１２２位が置換されているアミノ酸配列を含む。１２２位における最も好ましい置換は、アルギニン（Ｒ）をリジン（Ｋ）またはアスパラギン（Ｎ）（優先度順に順位化されている）に置き換えるものである。この置換は、Ｒ１２２Ｋ／Ｎと称される場合がある。
【０１６５】
他の好ましい置換は、１０７位、１２１位、及び１２５位におけるものであり、これらはそれぞれ、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、及びグルタミン酸（Ｑ）である。１２２位における置換に加えて、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４及びＰ２５を欠いている該配列）と比較して、１０７位、１２１位、及び１２５位におけるアミノ酸のうちの少なくとも１つがまた置換されているアミノ酸配列を含むことが好ましい。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、３２位、４８位、４９位、５４位、６４位、７４位、７７位、７９位、１０３位、１１１位、１１８位、１２０位、１２７位、及び１３４位のうちの１つ以上において置換されていてもよい。
【０１６６】
１０７位における最も好ましい置換は、ロイシン（Ｌ）を、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはアルギニン（Ｒ）（優先度順に順位化されている）に置き換えるものである。この置換は、Ｌ１０７Ｉ／Ｆ／Ｒと称される場合がある。本明細書に記載される他の置換にも同様の表記法が使用される。１２１位における最も好ましい置換は、イソロイシン（Ｉ）をバリン（Ｖ）に置き換えるものである。この置換は、Ｉ１２１Ｖと称される場合がある。
【０１６７】
１２５位における最も好ましい置換は、グルタミン（Ｑ）をグルタミン酸（Ｅ）に置き換えるものである。この置換は、Ｑ１２５Ｅと称される場合がある。
【０１６８】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において好ましい場合がある他の置換としては、Ｆ３２Ｉ、Ｑ４８Ｌ、Ｓ４９Ｔ、Ｖ５４Ｉ、Ｖ６４Ｉ、Ｋ７４Ｉ／Ｒ、Ｓ７７Ａ、Ｈ７９Ｄ／Ｓ／Ａ、Ｋ１０３Ｅ、Ｉ１１１Ｖ、Ｔ１１８Ｓ、Ｍ１２０Ｌ、Ｎ１２７Ｓ／Ｄ、及びＡ１３４Ｔが挙げられる。
【０１６９】
ヒト野生型ＣＤ８６の該可溶性細胞外ドメインの特に好ましい変異形は、表Ｃに示される配列番号６〜２４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成る。
【０１７０】
配列番号６〜１４に示されるアミノ酸配列は、場合により、Ｎ末端に追加の残基ＡＰを含んでもよい。配列番号１５〜２４に示されるアミノ酸配列は、場合により、Ｎ末端における残基ＡＰを欠いていてもよい。いずれの場合においても、これらの残基は、配列番号３のＡ２４及びＰ２５に対応する。
【０１７１】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ヒト野生型ＣＤ８６の該可溶性細胞外ドメインの上述の変異形のうちのいずれかを含むか、またはそれから成ってもよい。すなわち、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、表Ｃに示される配列番号６〜２４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれから成ってもよい。
【０１７２】
結合ドメインは、例えば、Ｔ細胞などのＣＴＬＡ−４を発現する細胞に投与されたとき、ＣＴＬＡ−４からのシグナル伝達を調節し得る。好ましくは、結合ドメインは、該シグナル伝達を低減させ、すなわち阻害または遮断し、それにより、該細胞の活性化を増加させる。試験薬剤（例えば結合ドメインなど）の投与の結果としてのＣＴＬＡ−４シグナル伝達の変化及び細胞活性化は、任意の好適な方法によって決定され得る。好適な方法には、試験薬剤の存在下または好適な対照の存在下で、膜結合ＣＤ８６（例えばＲａｊｉ細胞上のもの）が、Ｔ細胞の表面上で発現したＣＴＬＡ−４に結合し、それを通じてシグナル伝達する能力についてアッセイすることが含まれる。対照の存在下におけるＴ細胞ＩＬ−２産生レベル及び／またはＴ細胞増殖と比べた、試験薬剤の存在下におけるＴ細胞ＩＬ−２産生レベルの上昇またはＴ細胞増殖の増加は、ＣＴＬＡ−４を通じたシグナル伝達の低減及び細胞活性化の増加を示す。この種類の典型的なアッセイは、ＵＳ２００８／０２３３１２２の実施例９に開示されている。
【０１７３】
ＯＸ４０に対する結合ドメイン
本発明の二重特異性結合分子は、結合ドメインとして（例えば、Ｂ１として）、任意のＯＸ４０結合ドメイン、例えば抗ＯＸ４０抗体を組み込むことができる。
【０１７４】
ＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、特定の好ましい結合特徴及び機能的効果を有し、それらは以下により詳細に説明される。該抗体またはその抗原結合断片は、本発明の二重特異性抗体の一部として組み込まれたとき、これらの結合特徴及び機能的効果を保持することが好ましい。この結合ドメインは、本発明の二重特異性分子から独立して提供されてもよい。
【０１７５】
本抗体は、ＯＸ４０に特異的に結合する、すなわち、ＯＸ４０に結合するが、他の分子には結合しないか、またはより低い親和性で結合することが好ましい。本明細書で使用されるＯＸ４０という用語は、典型的にはヒトＯＸ４０を指す。ヒトＯＸ４０の配列は、配列番号５１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００３３１８．１に対応する）に記載されている。本抗体は、非ヒト霊長類（例えばＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）由来のＯＸ４０といった他の哺乳動物由来のＯＸ４０に対して、いくらかの結合親和性を有し得る。本抗体は、マウスＯＸ４０に結合せず、かつ／または他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７もしくはＣＤ４０に結合しないことが好ましい。
【０１７６】
本抗体は、天然状態のＯＸ４０に、特に細胞の表面上に局在するＯＸ４０に結合する能力を有する。好ましくは、本抗体は、ＯＸ４０に特異的に結合する。すなわち、本発明の抗体は、それが別の分子に結合する結合親和性よりも高い結合親和性でＯＸ４０に結合することが好ましい。
【０１７７】
「細胞の表面上に局在する」とは、上記の定義の通りである。
【０１７８】
本抗体は、ＯＸ４０を発現する細胞の活性を調節し得、該調節は、上記の定義の通り、該細胞の活性の増加または減少である。この細胞は、典型的にはＴ細胞である。本抗体は、上述のように、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増加させる場合もあれば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させる場合もある。
【０１７９】
いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞、特にＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加である。エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は周知であり、上述の通りである。
【０１８０】
本抗体は、好ましくは、５０×１０−１０Ｍ未満または２５×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは１０、９、８、７、もしくは６×１０−１０Ｍ未満、最も好ましくは５×１０−１０Ｍ未満であるＫｄ値で、ヒトＯＸ４０に結合する。
【０１８１】
例えば、本抗体は、マウスＯＸ４０または何らかの他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばＣＤ１３７もしくはＣＤ４０などに結合しないことが好ましい。したがって、典型的には、ヒトＯＸ４０に対する本抗体のＫｄは、例えばマウスＯＸ４０、他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、または環境内の何らかの他の無関係の物質もしくは付随する物質といった他の非標的分子に対するＫｄよりも、２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍低い。より好ましくは、Ｋｄは５０倍低く、より好ましくは１００倍低く、さらにより好ましくは２００倍低い。
【０１８２】
この解離定数の値は、上述のように、周知の方法によって直接決定することができる。
【０１８３】
本発明の抗体は、好ましくは、その標的に対して、別の非標的分子に結合するその親和性よりも少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上である親和性で結合することができる。
【０１８４】
したがって、要約すると、本抗体は、次の機能的特徴：
Ｉ．１０×１０−１０Ｍ未満であるＫＤ値で、ヒトＯＸ４０に結合すること、
ＩＩ．マウスＯＸ４０に結合しないこと、
ＩＩＩ．他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７またはＣＤ４０に結合しないこと、のうちの少なくとも１つを示すことが好ましい。
【０１８５】
本抗体は、ＯＸ４０、典型的にはヒトＯＸ４０に対して特異的であり、次のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含み得る：
（ａ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｆ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ／Ａ」を含む、重鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｉ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｔ」を含む、重鎖ＣＤＲ２配列、
（ｃ）９〜１７アミノ酸の長さであり、「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｆ／Ｖ／Ｄ、Ｇ／Ｙ／Ｐ／Ｆ、−／Ｈ／Ｓ、−／Ｎ／Ｄ／Ｈ、−／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ、−／Ｙ、−／Ｗ／Ａ／Ｖ、−／Ａ／Ｙ、−／Ｄ／Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｈ／Ｎ、Ｙ／Ｓ／Ｗ／Ａ／Ｔ、Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ、Ｄ、Ｙ」のコンセンサス配列を含む、重鎖ＣＤＲ３配列（この定義内の好ましい重鎖ＣＤＲ３配列には、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１０アミノ酸の長さのＣＤＲ３配列か、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸の長さのＣＤＲ３配列が含まれる）、
（ｄ）配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」から成る軽鎖ＣＤＲ１配列、
（ｅ）配列「Ａ、Ａ、Ｓ」から成る軽鎖ＣＤＲ２配列、
（ｆ）８〜１０アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｑ，Ｑ、Ｓ／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ／Ｈ／Ｇ、−／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｔ、Ｐ／Ｌ、Ｙ／Ｓ／Ｈ／Ｌ／Ｆ、Ｔ」を含む、軽鎖ＣＤＲ３配列（この定義内の好ましい例である軽鎖ＣＤＲ３配列は、配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｙ、Ｔ」から成る）。
本抗体は、（ｃ）に定義された重鎖ＣＤＲ３、及び／または（ｆ）に定義された軽鎖ＣＤＲ３を少なくとも含み得る。本抗体は、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の３つの重鎖ＣＤＲ配列全て、ならびに／または（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）の３つの軽鎖ＣＤＲ配列全てを含んでもよい。
【０１８６】
例示的なＣＤＲ配列が、表Ａ（１）及びＡ（２）、配列番号５２〜８８に列挙されている。
【０１８７】
好ましい抗ＯＸ４０抗体は、表Ａ（１）の任意の個々の横列に定義される重鎖ＣＤＲ３、及び／または表Ａ（２）の任意の個々の横列に定義される軽鎖ＣＤＲ３を少なくとも含み得る。本抗体は、表Ａ（１）の個々の横列に示される３つの重鎖ＣＤＲ配列全て（すなわち、所与の「ＶＨ番号」の３つの重鎖ＣＤＲ全て）、及び／または、表Ａ（２）の個々の横列に示される３つの軽鎖ＣＤＲ配列全て（すなわち、所与の「ＶＬ番号」の３つの軽鎖ＣＤＲ全て）を含んでもよい。
【０１８８】
完全な重鎖及び軽鎖の可変領域アミノ酸配列の例は、表Ｂに示される。各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列も示される。表Ｂ中の該ＶＨ領域及びＶＬ領域の付番は、表Ａ（１）及び（２）にあるように使用される付番方式に対応する。したがって、例えば、「１１６７、軽鎖ＶＬ」のアミノ酸配列は、表Ａ（２）に示されるＶＬ番号１１６７の３つのＣＤＲ全てを含む完全なＶＬ領域配列の例であり、「１１６６、重鎖ＶＨ」のアミノ酸配列は、表Ａ（１）に示されるＶＨ番号１１６６の３つのＣＤＲ全てを含む完全なＶＨ領域配列の例である。
【０１８９】
好ましい本発明の抗ＯＸ４０抗体は、特定のＶＨ番号の３つのＣＤＲ全てを含むＶＨ領域と、特定のＶＬ番号の３つのＣＤＲ全てを含むＶＬ領域とを含む。例えば、
−抗体は、ＶＨ番号１１６６の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１１６７の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１１６６／１１６７と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１１６６及び１１６７に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号９１及び８９）を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１１７０の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１１７１の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１１７０／１１７１と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１１７０及び１１７１に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号９５及び９３）を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１１６４の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１１３５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１１６４／１１３５と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１１６４及び１１３５に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号９９及び９７）を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１１６８の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１１３５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１１６８／１１３５と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１１６８及び１１３５に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１０１及び９７）を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１４８２の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１４８３の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１４８２／１４８３と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１４８２及び１４８３に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１０５及び１０３）を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１４９０の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１１３５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１４９０／１１３５と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１４９０及び１１３５に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１０７及び９７）を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１５１４の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１５１５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１５１４／１５１５と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１５１４及び１５１５に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１１１及び１０９）を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１５２０の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１１３５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１５２０／１１３５と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１５２０及び１１３５に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１１３及び９７）を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１５２４の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１５２５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１５２４／１５２５と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１５２４及び１５２５に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１１７及び１１５）を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１５２６の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１５２７の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１５２６／１５２７と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１５２６及び１５２７に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１２１及び１１９）を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１５４２の３つ全てのＣＤＲ、及びＶＬ番号１１３５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１５４２／１１３５と称される場合がある。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂに示される１５４２及び１１３５に対応する完全なＶＨ配列及びＶＬ配列（配列番号１２３及び９７）を含み得る。
【０１９０】
本抗体は、本抗体がヒトＯＸ４０に結合し、機能的特徴Ｉ〜ＩＩＩのうちの少なくとも１つを示す限り、表Ｂに列挙される特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異形または断片を含んでもよい。そのような変異形または断片は、典型的に、表Ｂの該配列のＣＤＲ配列を保持し得る。
【０１９１】
表Ｂに示される重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの断片は、該アミノ酸配列から少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、または少なくとも１００個連続したアミノ酸を含み得る。
【０１９２】
表Ｂに示される重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの変異形は、上記の定義の通り、該配列の置換変異形、欠失変異形、または付加変異形であり得る。
【０１９３】
本抗体は、本明細書に記載される特定の抗体のうちのいずれかと同じエピトープに結合し得る。１１６６／１１６７、１１７０／１１７１、１１６４／１１３５、１１６８／１１３５、１４８２／１４８３、１４９０／１１３５、１５１４／１５１５、１５２０／１１３５、１５２４／１５２５、１５２６／１５２７、及び１５４２／１１３５と呼称される抗体のうちのいずれか１つと同じエピトープに結合するのが好ましい。
【０１９４】
本明細書において開示される任意のＶＨ領域配列と（完全な重鎖を形成するように）組み合わされ得る例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列、例えばＩｇＧ１重鎖定常領域配列などは、上述の通りである。
【０１９５】
本明細書において開示される任意のＶＬ領域配列と（完全な軽鎖を形成するように）組み合わされ得る例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列、例えばカッパ鎖定常領域配列などは、上述の通りである。
【０１９６】
本発明の実施形態：ＣＴＬＡ−４及びＣＤ１３７に対して特異的な二重特異性ポリペプチド
本発明の第１の態様のある実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、ＣＤ１３７及びＣＴＬＡ−４に対して特異的な結合ドメインを有し、例えば、Ｂ１は、ＣＤ１３７に対して特異的であり、Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に対して特異的である。
【０１９７】
これらの結合ドメインは、上記の定義の通りである。
【０１９８】
本実施形態の二重特異性ポリペプチドのＢ１部分−ＣＤ１３７に対して特異的な結合ドメイン
ＣＤ１３７に対して特異的な結合ドメインは、上記の定義の通りである。
【０１９９】
本実施形態の二重特異性ポリペプチドのＢ２部分−ＣＴＬＡ−４に対して特異的な結合ドメイン
ＣＴＬＡ−４に対して特異的な結合ドメインは、上記の定義の通りである。
【０２００】
本実施形態の二重特異性ポリペプチド
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ヒトＣＤ１３７とヒトＣＴＬＡ−４との両方に特異的に結合することができる。「ＣＤ１３７とＣＴＬＡ−４との両方に特異的に結合することができる」とは、各部分について上記に提供された定義に従って、抗ＣＴＬＡ−４部分がＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、抗ＣＤ１３７部分がＣＤ１３７に特異的に結合することを意味する。二重特異性ポリペプチドは、本明細書に記載される任意のＣＴＬＡ−４結合ドメインに連結した、本明細書に記載される任意のＣＤ１３７結合ドメインを含み得る。好ましくは、異なる部分のそれらそれぞれの標的に対する結合特徴は、それらが本発明の二重特異性抗体の一部として存在する場合に、別々の要素として存在する場合の個々の部分に関する該特徴と比較したときに不変であるか、または実質的に不変である。
【０２０１】
これが典型的に意味するのは、二重特異性分子が、単独で存在するときのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＣＴＬＡ−４に対するＫｄ値と好ましくは実質的に同じであるＣＴＬＡ−４に対するＫｄを有するということである。あるいは、二重特異性分子が、単独で存在するときのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＣＴＬＡ−４に対するＫｄと比べて増加したＣＴＬＡ−４に対するＫｄを有する場合は、その増加は、１０倍以下、好ましくは９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、または２倍以下である。加えて、二重特異性分子は、独立して、単独で存在するときのＣＤ１３７結合ドメインのＣ１３７に対するＫｄ値と好ましくは実質的に同じであるＣＤ１３７に対するＫｄを有する。あるいは、二重特異性分子が、単独で存在するときの抗ＣＤ１３７抗体のＣＤ１３７に対するＫｄと比べて増加したＣＤ１３７に対するＫｄを有する場合は、その増加は、１０倍以下、好ましくは９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、または２倍以下である。個々の結合ドメインに対する好ましいＫｄ値は、上記の定義の通りである。
【０２０２】
所与の二重特異性分子の結合特徴を説明するために、ＣＴＬＡ−４結合の倍変化のうちのいずれかが、独立して、列挙されたＣＤ１３７結合の倍変化のうちのいずれかと組み合わされてもよいことは理解されよう。
【０２０３】
本発明の任意の二重特異性ポリペプチドのＣＤ１３７またはＣＴＬＡ−４に対する結合特徴は、任意の好適なアッセイによって評定され得る。特に、別々の各部分について上に記載されたアッセイを二重特異性抗体に適用してもよいし、両方の標的に対する同時結合を評定するための組み合わされたアッセイを使用してもよい。本発明の二重特異性ポリペプチドの結合特徴を評定するための好適なアッセイもまた、実施例に記載される。
【０２０４】
本実施形態の二重特異性ポリペプチドは、ＣＤ１３７もしくはＣＴＬＡ−４の個々の作動薬単独よりも、またはそのような個々の作動薬の組み合わせよりも高い程度まで、免疫系の細胞の活性を調節することができる。特に、二重特異性ポリペプチドの投与は、より高いレベルのＴ細胞活性、特にエフェクターＴ細胞活性、例えばＣＤ４＋エフェクターＴ細胞活性をもたらす。また、エフェクターＴ細胞活性の増加は、個々のＣＤ１３７またはＣＴＬＡ−４作動薬単独（またはそれらの組み合わせ）の投与から生じるものよりも局在化するが、これは、二重特異性ポリペプチドが、ＣＴＬＡ−４とＣＤ１３７との両方が高度に発現する微小環境でのみ最も高い効果を発揮するためである。腫瘍は、そのような微小環境である。ＣＤ１３７は、ＣＤ８Ｔ細胞において高レベルで発現し、したがって特にそれらを活性化させ得る。ＣＤ８Ｔ細胞は、効果的な腫瘍応答の主なエフェクター成分の１つである。
【０２０５】
エフェクターＴ細胞活性の増加は、ＣＤ１３７経路の活性化またはＣＴＬＡ−４阻害経路の遮断によるエフェクターＴ細胞の刺激から直接的に生じる場合もあれば、Ｔｒｅｇの枯渇または下方制御から間接的に生じる場合もあり、それにより、それらの免疫抑制作用が低減する。Ｔｒｅｇの枯渇／下方制御は、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機序により媒介され得る。全体として、その結果は、殺腫瘍活性を即時発生させる非常に強力な限局性の免疫活性化となる。
【０２０６】
ＣＴＬＡ−４及びＣＤ１３７の細胞表面発現パターンは部分的に重複しており、そのため、本発明の二重特異性抗体は、シスとトランスとの両方における両方の標的に結合し得る。これは、同じ細胞上でシスの受容体クラスター形成のレベルを上昇させること、あるいはトランスで２つの細胞間に人工の免疫学的シナプスを作り出すこと（これは次に、受容体クラスター形成の増強及び両方の細胞におけるシグナル伝達の増加につながり得る）のいずれかによって、ＦｃγＲ架橋非依存的様式（ＦｃγＲ−ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ）でＣＤ１３７及びＣＴＬＡ−４を通じた刺激をもたらし得る。全体として、その結果は、殺腫瘍活性を発生させる非常に強力な腫瘍指向性の免疫活性化となる。
【０２０７】
本発明の二重特異性ポリペプチドが免疫系の細胞に及ぼす作用の測定は、任意の好適なアッセイで達成され得る。例えば、エフェクターＴ細胞の活性の増加は、二重特異性ポリペプチドの個々の構成要素であるＢ１及びＢ２に関して上述されたアッセイによって測定され得、対照と比べて二重特異性ポリペプチドの存在下でＣＤ４＋及び／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖またはそれらによるＩＬ−２産生を測定することを含み得る。対照と比べた増殖またはＩＬ−２産生の増加は、細胞活性化の増加を示す。この種類の典型的なアッセイは、ＵＳ２００８／０２３３１２２の実施例９に開示されている。細胞増殖及び／またはＩＬ−２産生に関するアッセイは周知であり、実施例にも記載される。同じアッセイで評定したとき、二重特異性分子は、典型的には、同じ標的に結合する単一特異性薬剤の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも少なくとも１．５倍高いか、または少なくとも２倍高い、より好ましくは３倍高い、最も好ましくは５倍高い、エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導する。
【０２０８】
二重特異性分子は、ＣＤ１３７とＣＴＬＡ−４との両方が高度に発現する微小環境に置かれると、免疫系を強力に活性化させる。典型的には、二重特異性分子は、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増加させるか、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させ得る。いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞、特にＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加である。同じアッセイで評定したとき、二重特異性分子は、典型的には、同じ標的に結合する単一特異性薬剤の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも少なくとも１．５倍高いか、または少なくとも１．７倍高い、より好ましくは４．５倍高い、最も好ましくは７倍高い、エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導する。
【０２０９】
エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は周知であり、先に記載した通りである。細胞増殖及び／またはＩＬ−２産生に関するアッセイは周知であり、実施例に例示される。
【０２１０】
例えば、本ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４とＣＤ１３７との両方に特異的に結合することができる場合があり、Ｂ１は、ＣＤ１３７に対して特異的な抗体またはその抗原結合断片であり得、Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインであり得、このポリペプチド結合ドメインは、
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、もしくは、
ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸が変更されているアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るが、ただし、該結合ドメインが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件とする。
【０２１１】
本ポリペプチドによって特異的に結合されるＣＴＬＡ−４は、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのＣＴＬＡ−４であり得、かつ／または、本ポリペプチドによって特異的に結合されるＣＤ１３７は、霊長類、好ましくはヒトのＣＤ１３７であり得る。
【０２１２】
本発明のポリペプチドのＢ１部分は、典型的には少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び／もしくは少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含む、抗体またはその抗原結合断片である。本発明のポリペプチドのＢ２部分は、Ｂ１のいずれの部分に結合していてもよいが、典型的には、該少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に、好ましくはＮ末端またはＣ末端のいずれかで結合し得る。本発明のポリペプチドのＢ２部分は、直接的にそのように結合していてもよいし、任意の好適な連結分子（リンカー）を介して間接的に結合していてもよい。
【０２１３】
Ｂ１部分は、好ましくは、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２部分は、好ましくは、該重鎖（Ｈ）または該軽鎖（Ｌ）のいずれかのＮ末端もしくはＣ末端に結合している。Ｂ１の例示的な抗体は、２つの同一の重鎖（Ｈ）及び２つの同一の軽鎖（Ｌ）から成る。そのような抗体は、典型的には２つのアームとして配置され、アームのそれぞれは、ヘテロ二量体として結合した１つのＨ及び１つのＬを有し、２つのアームは、Ｈ鎖間のジスルフィド結合によって結合される。したがって、本抗体は事実上２つのＨ−Ｌヘテロ二量体から形成されたホモ二量体である。本発明のポリペプチドのＢ２部分は、そのような抗体の両方のＨ鎖または両方のＬ鎖に結合していてもよいし、１つのＨ鎖だけ、または１つのＬ鎖だけに結合していてもよい。
【０２１４】
したがって、本発明のポリペプチドは、ヒト野生型ＣＤ８６もしくはその変異形のモノマー可溶性細胞外ドメインを含むかまたはそれから成る、ＣＴＬＡ−４に対して特異的な少なくとも１つのポリペプチド結合ドメインが結合している、抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片として、代替的に説明することができる。Ｂ１及びＢ２の結合ドメインは、本発明のポリペプチド中の唯一の結合ドメインであってもよい。
【０２１５】
本発明のポリペプチドは、Ｎ−Ｃの方向で書かれた次式：
（Ａ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（Ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ、
（Ｃ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、
（Ｄ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（式中、Ｈは抗体の（すなわちＢ１の）重鎖であり、Ｌは抗体の（すなわちＢ１の）軽鎖であり、Ｘはリンカーであり、ｎは０または１である）のうちのいずれか１つに従って配置されたポリペプチドを含み得る。リンカー（Ｘ）がペプチドである場合、これは、典型的にはアミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、または（ＳＧ）ｍ（ここで、ｍは１〜７である）を有する。式（Ａ）〜（Ｄ）の概略的表現が図１に示されている。
【０２１６】
本発明は、式（Ａ）〜（Ｄ）のうちのいずれかに従って配置されたポリペプチドから成るポリペプチドも提供する。該ポリペプチドは、モノマーとして提供されてもよいし、抗体などの多量体タンパク質の構成要素として存在してもよい。該ポリペプチドは単離されてもよい。かかるポリペプチドのアミノ酸配列の例は、表Ｈに示される。各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列も示される。例示的なアミノ酸及びヌクレオチド配列が、配列番号１９７〜２０６に列挙されている。
【０２１７】
Ｂ２部分は、本発明のポリペプチドの任意の部分に、またはリンカーに、任意の好適な手段によって結合させることができる。例えば、ポリペプチドの様々な部分を、例えばペプチド結合などでの化学的共役によって結合させてもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、場合によりペプチドリンカーによって結合されているＢ１（またはその構成部分）とＢ２とを含む、融合タンパク質を含むか、またはそれから成ってもよい。そのような融合タンパク質では、Ｂ１のＣＤ１３７結合ドメイン（複数可）及びＢ２のＣＴＬＡ−４結合ドメイン（複数可）が、唯一の結合ドメインであり得る。
【０２１８】
分子をポリペプチドと共役させるための他の方法が、当該技術分野において知られている。例えば、カルボジイミド共役（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ  ＆  Ｗｉｌｃｈｅｋ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１５１−１５９を参照されたい；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）を使用して、ドキソルビシンを含む多様な薬剤を抗体またはペプチドと共役させることができる。水溶性のカルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、官能性部分を結合性部分と共役させるために特に有用である。さらなる例として、適切な反応物質の過ヨウ素酸ナトリウム酸化、続いて還元的アルキル化によって、またはグルタルアルデヒド架橋によって、共役を達成してもよい。しかしながら、どの方法が選択されるかに関わらず、Ｂ１部分及びＢ２部分が本発明のポリペプチドの一部として存在するときにそれらの標的結合特性を保持するかまたは実質的に保持するという判定が、好ましくは行われるべきであるとされる。
【０２１９】
同じ技術を使用して、本発明のポリペプチドを（直接的または間接的に）別の分子に連結させてもよい。他方の分子は、治療剤または検出可能な標識であり得る。好適な治療剤には、細胞傷害性の部分または薬物が含まれる。
【０２２０】
本発明のポリペプチドは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、何らかの周囲媒体からのポリペプチドの完全ではないが実質的な単離があり得ることを意味する。本ポリペプチドは、それらの意図される用途を妨げない担体または希釈剤と混合されても、実質的に単離されていると見なされ得る。
【０２２１】
本発明の例示的なポリペプチドは、表Ｈに示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成ってもよい。
【０２２２】
抗体の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、配列番号１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、または１９６として表Ｈに記載されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成ってもよい。表Ｈに示されるポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチドは、同様に表Ｈに示される対応するヌクレオチド配列（イントロン配列は小文字で示されている）（例えば、配列番号１９７、１９９、２０１、２０３、及び２０５）を含むか、またはそれらから成ってもよい。Ｂ２部分の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｅに示される配列番号２５〜４３のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成ってもよい。
【０２２３】
本発明の実施形態：ＯＸ４０及びＣＴＬＡ−４に対して特異的な二重特異性ポリペプチド
本発明の第１の態様の代替的な実施形態では、本ポリペプチドは、ＯＸ４０及びＣＴＬＡ−４に対して特異的な結合ドメインを有し、例えば、Ｂ１は、ＯＸ４０に対して特異的であり、Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に対して特異的である。
【０２２４】
これらの結合ドメインは、上記の定義の通りである。
【０２２５】
本実施形態の二重特異性ポリペプチドのＢ１部分−ＯＸ４０に対して特異的な抗体
ＯＸ４０に対して特異的な結合ドメインは、上記の定義の通りである。
【０２２６】
本実施形態の二重特異性ポリペプチドのＢ２部分−ＣＴＬＡ−４に対して特異的な結合ドメイン
本発明のポリペプチドのＢ２部分は、上述のように、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインである。
【０２２７】
本実施形態の二重特異性ポリペプチド
本実施形態の二重特異性ポリペプチドは、ＯＸ４０もしくはＣＴＬＡ−４の個々の作動薬単独よりも、またはそのような個々の作動薬の組み合わせよりも高い程度まで、免疫系の細胞の活性を調節することができる。特に、二重特異性ポリペプチドの投与は、より高いレベルのエフェクターＴ細胞活性、特定のＣＤ４＋エフェクターＴ細胞活性をもたらす。また、エフェクターＴ細胞活性の増加は、個々のＯＸ４０またはＣＴＬＡ−４作動薬単独（またはそれらの組み合わせ）の投与から生じるものよりも局在化するが、これは、二重特異性ポリペプチドが、ＣＴＬＡ−４とＯＸ４０との両方が高度に発現する微小環境でのみ最も高い効果を発揮するためである。腫瘍は、そのような微小環境である。腫瘍浸潤性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、高レベルの、かつエフェクターＴ細胞（ＣＤ４とＣＤ８との両方）よりも高い、ＣＴＬＡ−４及びＯＸ４０を発現する。
【０２２８】
エフェクターＴ細胞活性の増加は、ＯＸ４０経路の活性化またはＣＴＬＡ−４阻害経路の遮断によるエフェクターＴ細胞の刺激から直接的に生じる場合もあれば、Ｔｒｅｇの枯渇または下方制御から間接的に生じる場合もあり、それにより、それらの免疫抑制作用が低減する。Ｔｒｅｇの枯渇／下方制御は、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機序により媒介され得る。エフェクターＴ細胞と比較してＴｒｅｇ上で高いＣＴＬＡ−４とＯＸ４０との両方の発現は、単一特異性抗体と比較して著しく高いＴｒｅｇの殺滅を誘導し得る。ＣＴＬＡ−４及びＯＸ４０の発現がより低いエフェクターＴ細胞は、この機序によって枯渇しない。全体として、その結果は、殺腫瘍活性を即時発生させる非常に強力な限局性の免疫活性化となる。
【０２２９】
本発明の二重特異性ポリペプチドが免疫系の細胞に及ぼす作用の測定は、任意の好適なアッセイで達成され得る。例えば、エフェクターＴ細胞の活性の増加は、二重特異性ポリペプチドの個々の構成要素であるＢ１及びＢ２に関して上述されたアッセイによって測定され得、対照と比べて二重特異性ポリペプチドの存在下でＣＤ４＋及び／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖またはそれらによるＩＬ−２産生を測定することを含み得る。
【０２３０】
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ヒトＣＴＬＡ−４とヒトＯＸ４０との両方に特異的に結合することができ、上記の定義の通りＢ１及びＢ２を含む。
【０２３１】
「ＣＴＬＡ−４とＯＸ４０との両方に特異的に結合することができる」とは、各部分について上記に提供された定義に従って、Ｂ１部分がＯＸ４０に特異的に結合し、Ｂ２部分がＣＴＬＡ−４に特異的に結合することを意味する。好ましくは、Ｂ１部分及びＢ２部分のそれらそれぞれの標的に対する結合特徴は、それらが本発明のポリペプチドの一部として存在する場合に、別々の要素として存在する場合のＢ１部分及びＢ２部分に関する該特徴と比較したときに不変であるか、または実質的に不変である。
【０２３２】
これが典型的に意味するのは、二重特異性分子が、単独で存在するときのＢ１のＯＸ４０に対するＫｄ値と好ましくは実質的に同じであるＯＸ４０に対するＫｄを有するということである。あるいは、二重特異性分子が、単独で存在するときのＢ１のＯＸ４０に対するＫｄと比べて増加したＯＸ４０に対するＫｄを有する場合は、その増加は、１０倍以下、好ましくは９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、または２倍以下である。二重特異性分子は、好ましくは、５０×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは２５×１０−１０Ｍ未満、最も好ましくは２０×１０−１０Ｍ未満であるＫｄ値で、ヒトＯＸ４０に結合する。加えて、二重特異性分子は、独立して、単独で存在するときのＢ２のＣＴＬＡ４に対するＫｄ値と好ましくは実質的に同じであるＣＴＬＡ−４に対するＫｄを有する。あるいは、二重特異性分子が、単独で存在するときのＢ２のＣＴＬＡ−４に対するＫｄと比べて増加したＣＴＬＡ−４に対するＫｄを有する場合は、その増加は、３倍以下、好ましくは２倍以下である。二重特異性分子は、好ましくは、６０×１０−９Ｍ未満、より好ましくは２５×１０−９Ｍ未満、最も好ましくは１０×１０−９Ｍ未満であるＫｄ値で、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する。
【０２３３】
言い換えると、二重特異性分子は、５０×１０−１０Ｍ、２５×１０−１０Ｍ、または２０×１０−１０Ｍ未満であるＯＸ４０に対するＫｄを有し、独立して、６０×１０−９Ｍ、２５×１０−９Ｍ、または１０×１０−９Ｍ未満であるＣＴＬＡ−４に対するＫｄを有し得る。所与の二重特異性分子の結合特徴を説明するために、ＯＸ４０に関して列挙されたＫｄ値のうちのいずれかが、独立して、ＣＴＬＡ−４に関して列挙されたＫｄ値のうちのいずれかと組み合わされてもよいことは理解されよう。同様に、所与の二重特異性分子の結合特徴を説明するために、列挙されたＯＸ４０結合の倍変化のうちのいずれかが、独立して、列挙されたＣＴＬＡ−４結合の倍変化のうちのいずれかと組み合わされてもよい。
【０２３４】
本発明のポリペプチドの一部として存在するときのＢ１部分及びＢ２部分の結合特徴は、任意の好適なアッセイによって評定され得る。特に、Ｂ１及びＢ２が本発明のポリペプチドの一部として存在する場合、別々の各部分について上に記載されたアッセイをそれらに適用してもよい。本発明の二重特異性ポリペプチドの結合特徴を評定するための好適なアッセイもまた、実施例に記載される。
【０２３５】
二重特異性分子は、ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４との両方が高度に発現する微小環境に置かれると、免疫系を強力に活性化させる。典型的には、二重特異性分子は、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増加させるか、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させ得る。いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞、特にＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加である。同じアッセイで評定したとき、二重特異性分子は、典型的には、同じ標的に結合する単一特異性薬剤の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも少なくとも１．５倍高いか、または少なくとも１．７倍高い、より好ましくは４．５倍高い、最も好ましくは７倍高い、エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導する。
【０２３６】
エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は周知であり、先に記載した通りである。細胞増殖及び／またはＩＬ−２産生に関するアッセイは周知であり、実施例に例示される。
【０２３７】
例えば、本ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４とＯＸ４０との両方に特異的に結合することができる場合があり、Ｂ１は、ＯＸ４０に対して特異的な抗体またはその抗原結合断片であり得、Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインであり得、このポリペプチド結合ドメインは、
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、もしくは、
ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸が変更されているアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るが、ただし、該結合ドメインが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件とする。
【０２３８】
本ポリペプチドによって特異的に結合されるＣＴＬＡ−４は、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのＣＴＬＡ−４であり得、かつ／または、本ポリペプチドによって特異的に結合されるＯＸ４０は、霊長類、好ましくはヒトのＯＸ４０であり得る。
【０２３９】
本発明のポリペプチドのＢ１部分は、典型的には少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び／もしくは少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含む、抗体またはその抗原結合断片である。本発明のポリペプチドのＢ２部分は、Ｂ１のいずれの部分に結合していてもよいが、典型的には、該少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に、好ましくはＮ末端またはＣ末端のいずれかで結合し得る。本発明のポリペプチドのＢ２部分は、直接的にそのように結合していてもよいし、任意の好適な連結分子（リンカー）を介して間接的に結合していてもよい。
【０２４０】
Ｂ１部分は、好ましくは、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２部分は、好ましくは、該重鎖（Ｈ）または該軽鎖（Ｌ）のいずれかのＮ末端もしくはＣ末端に結合している。Ｂ１の例示的な抗体は、２つの同一の重鎖（Ｈ）及び２つの同一の軽鎖（Ｌ）から成る。そのような抗体は、典型的には２つのアームとして配置され、アームのそれぞれは、ヘテロ二量体として結合した１つのＨ及び１つのＬを有し、２つのアームは、Ｈ鎖間のジスルフィド結合によって結合される。したがって、本抗体は事実上２つのＨ−Ｌヘテロ二量体から形成されたホモ二量体である。本発明のポリペプチドのＢ２部分は、そのような抗体の両方のＨ鎖または両方のＬ鎖に結合していてもよいし、１つのＨ鎖だけ、または１つのＬ鎖だけに結合していてもよい。
【０２４１】
したがって、本発明のポリペプチドは、ヒト野生型ＣＤ８６もしくはその変異形のモノマー可溶性細胞外ドメインを含むかまたはそれから成る、ＣＴＬＡ−４に対して特異的な少なくとも１つのポリペプチド結合ドメインが結合している、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片として、代替的に説明することができる。Ｂ１及びＢ２の結合ドメインは、本発明のポリペプチド中の唯一の結合ドメインであってもよい。
【０２４２】
本発明のポリペプチドは、Ｎ−Ｃの方向で書かれた次式：
（Ａ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（Ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ、
（Ｃ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、及び、
（Ｄ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（式中、Ｈは抗体の（すなわちＢ１の）重鎖であり、Ｌは抗体の（すなわちＢ１の）軽鎖であり、Ｘはリンカーであり、ｎは０または１である）のうちのいずれか１つに従って配置されたポリペプチドを含み得る。リンカー（Ｘ）がペプチドである場合、これは、典型的にはアミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、または（ＳＧ）ｍ（ここで、ｍは１〜７である）を有する。式（Ａ）〜（Ｄ）の概略的表現が図１に示されている。
【０２４３】
本発明は、式（Ａ）〜（Ｄ）のうちのいずれかに従って配置されたポリペプチドから成るポリペプチドも提供する。該ポリペプチドは、モノマーとして提供されてもよいし、抗体などの多量体タンパク質の構成要素として存在してもよい。該ポリペプチドは単離されてもよい。かかるポリペプチドのアミノ酸配列の例は、表Ｄに示される。各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列も示される。
【０２４４】
Ｂ２部分は、本発明のポリペプチドの任意の部分に、またはリンカーに、任意の好適な手段によって結合させることができる。例えば、ポリペプチドの様々な部分を、例えばペプチド結合などでの化学的共役によって結合させてもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、場合によりペプチドリンカーによって結合されているＢ１（またはその構成部分）とＢ２とを含む、融合タンパク質を含むか、またはそれから成ってもよい。そのような融合タンパク質では、Ｂ１のＯＸ４０結合ドメイン（複数可）及びＢ２のＣＴＬＡ−４結合ドメイン（複数可）が、唯一の結合ドメインであり得る。
【０２４５】
分子をポリペプチドと共役させるための他の方法が、当該技術分野において知られている。例えば、カルボジイミド共役（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ  ＆  Ｗｉｌｃｈｅｋ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１５１−１５９を参照されたい；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）を使用して、ドキソルビシンを含む多様な薬剤を抗体またはペプチドと共役させることができる。水溶性のカルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、官能性部分を結合性部分と共役させるために特に有用である。さらなる例として、適切な反応物質の過ヨウ素酸ナトリウム酸化、続いて還元的アルキル化によって、またはグルタルアルデヒド架橋によって、共役を達成してもよい。しかしながら、どの方法が選択されるかに関わらず、Ｂ１部分及びＢ２部分が本発明のポリペプチドの一部として存在するときにそれらの標的結合特性を保持するかまたは実質的に保持するという判定が、好ましくは行われるべきであるとされる。
【０２４６】
同じ技術を使用して、本発明のポリペプチドを（直接的または間接的に）別の分子に連結させてもよい。他方の分子は、治療剤または検出可能な標識であり得る。好適な治療剤には、細胞傷害性の部分または薬物が含まれる。
【０２４７】
本発明のポリペプチドは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、何らかの周囲媒体からのポリペプチドの完全ではないが実質的な単離があり得ることを意味する。本ポリペプチドは、それらの意図される用途を妨げない担体または希釈剤と混合されても、実質的に単離されていると見なされ得る。
【０２４８】
本発明の例示的なポリペプチドは、表Ｄに示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成ってもよい。一実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号１２５〜１３４の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれから成り、場合により、該ポリペプチドは、抗体の構成部分として提供される。
【０２４９】
抗体の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｂに記載されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成ってもよい。表Ｄに示されるポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチドは、同様に表Ｄに示される対応するヌクレオチド配列（イントロン配列は小文字で示されている）を含むか、またはそれらから成ってもよい。Ｂ２部分の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｅに示される配列番号２５〜４３のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成ってもよい。
【０２５０】
本発明の実施形態：ＯＸ４０及びＣＤ１３７に対する二重特異性ポリペプチド
本発明の第１の態様の代替的な実施形態では、本ポリペプチドは、ＯＸ４０及びＣＤ１３７に対して特異的な結合ドメインを有する。
【０２５１】
これらの結合ドメインは、上述の通りである。
【０２５２】
本実施形態の二重特異性ポリペプチド−ＯＸ４０に対して特異的な結合ドメイン
ＯＸ４０に対して特異的な結合ドメインは、上記の定義の通りである。
【０２５３】
本実施形態の二重特異性ポリペプチド−ＣＤ１３７に対して特異的な結合ドメイン
ＣＤ１３７に対して特異的な結合ドメインは、上記の定義の通りであり、これまでに記載された機能的特徴及び構造的特徴を有する。
【０２５４】
好ましくは、本抗体は、表Ｈ及びＩの配列を参照してこれまでに定義した１２０４／１２０５である。抗ＣＤ１３７抗体は、本明細書に記載される特定の抗ＣＤ１３７抗体のうちのいずれかと同じエピトープに結合し得る。１２０４／１２０５と呼称される抗体と同じエピトープに結合するのが好ましい。
【０２５５】
本実施形態の二重特異性ポリペプチド
本発明の二重特異性抗体は、ヒトＣＤ１３７とヒトＯＸ４０との両方に特異的に結合することができる。「ＣＤ１３７とＯＸ４０との両方に特異的に結合することができる」とは、各部分について上記に提供された定義に従って、抗ＯＸ４０部分がＯＸ４０に特異的に結合し、抗ＣＤ１３７部分がＣＤ１３７に特異的に結合することを意味する。二重特異性抗体は、本明細書に記載される任意の抗ＯＸ４０抗体に連結した、本明細書に記載される任意の抗ＣＤ１３７抗体を含み得る。好ましくは、異なる部分のそれらそれぞれの標的に対する結合特徴は、それらが本発明の二重特異性抗体の一部として存在する場合に、別々の要素として存在する場合の個々の部分に関する該特徴と比較したときに不変であるか、または実質的に不変である。
【０２５６】
これが典型的に意味するのは、二重特異性分子が、単独で存在するときの抗ＯＸ４０抗体のＯＸ４０に対するＫｄ値と好ましくは実質的に同じであるＯＸ４０に対するＫｄを有するということである。あるいは、二重特異性分子が、単独で存在するときの抗ＯＸ４０抗体のＯＸ４０に対するＫｄと比べて増加したＯＸ４０に対するＫｄを有する場合は、その増加は、１０倍以下、好ましくは９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、または２倍以下である。加えて、二重特異性分子は、独立して、単独で存在するときの抗ＣＤ１３７抗体のＣ１３７に対するＫｄ値と好ましくは実質的に同じであるＣＤ１３７に対するＫｄを有する。あるいは、二重特異性分子が、単独で存在するときの抗ＣＤ１３７抗体のＣＤ１３７に対するＫｄと比べて増加したＣＤ１３７に対するＫｄを有する場合は、その増加は、１０倍以下、好ましくは９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、または２倍以下である。
【０２５７】
所与の二重特異性分子の結合特徴を説明するために、ＯＸ４０結合の倍変化のうちのいずれかが、独立して、列挙されたＣＤ１３７結合の倍変化のうちのいずれかと組み合わされてもよいことは理解されよう。
【０２５８】
本発明の任意の二重特異性抗体のＣＤ１３７またはＯＸ４０に対する結合特徴は、任意の好適なアッセイによって評定され得る。特に、別々の各部分について上に記載されたアッセイを二重特異性抗体に適用してもよいし、両方の標的に対する同時結合を評定するための組み合わされたアッセイを使用してもよい。本発明の二重特異性ポリペプチドの結合特徴を評定するための好適なアッセイもまた、実施例に記載される。
【０２５９】
本発明の二重特異性抗体は、ＯＸ４０もしくはＣＤ１３７の個々の作動薬単独よりも、またはそのような個々の作動薬の組み合わせよりも高い程度まで、免疫系の細胞の活性を調節することができる。特に、二重特異性抗体の投与は、高いレベルのＴ細胞活性をもたらす。また、エフェクターＴ細胞活性の増加は、個々のＯＸ４０またはＣＤ１３７作動薬単独（またはそれらの組み合わせ）の投与から生じるものよりも局在化するが、これは、二重特異性ポリペプチドが、ＣＤ１３７とＯＸ４０との両方が高度に発現する微小環境でのみ最も高い効果を発揮するためである。腫瘍は、そのような微小環境である。
【０２６０】
ＯＸ４０及びＣＤ１３７の細胞表面発現パターンは部分的に重複しており、そのため、本発明の二重特異性抗体は、シスとトランスとの両方における両方の標的に結合し得る。これは、同じ細胞上でシスの受容体クラスター形成のレベルを上昇させること、あるいはトランスで２つの細胞間に人工の免疫学的シナプスを作り出すこと（これは次に、受容体クラスター形成の増強及び両方の細胞におけるシグナル伝達の増加につながり得る）のいずれかによって、ＦｃγＲ架橋非依存的様式でＣＤ１３７及びＯＸ４０を通じた刺激をもたらし得る。全体として、その結果は、殺腫瘍活性を発生させる非常に強力な腫瘍指向性の免疫活性化となる。
【０２６１】
本発明の二重特異性抗体が免疫系の細胞に及ぼす作用の測定は、任意の好適なアッセイで達成され得る。例えば、エフェクターＴ細胞の活性の増加は、二重特異性抗体の単一特異的成分に関して上述されたアッセイによって測定され得、対照と比べて二重特異性抗体の存在下でＣＤ４＋及び／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖またはそれらによるＩＬ−２産生を測定することを含み得る。対照と比べた増殖またはＩＬ−２産生の増加は、細胞活性化の増加を示す。この種類の典型的なアッセイは、ＵＳ２００８／０２３３１２２の実施例９に開示されている。細胞増殖及び／またはＩＬ−２産生に関するアッセイは周知であり、実施例にも記載される。同じアッセイで評定したとき、二重特異性分子は、典型的には、同じ標的に結合する単一特異性薬剤の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも少なくとも１．５倍高いか、または少なくとも２倍高い、より好ましくは３倍高い、最も好ましくは５倍高い、エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導する。
【０２６２】
本発明は、直接的または間接的に相互に結合した、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体（抗ＯＸ４０抗体）とＣＤ１３７に特異的に結合する抗体（抗ＣＤ１３７抗体）とを含む、二重特異性抗体を提供する。「間接的に結合した」とは、別の部分（リンカー）が抗ＯＸ４０抗体を抗ＣＤ１３７抗体に連結させることを意味する。例示的なリンカーとしては、配列番号４７〜５０、または１４４のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のペプチドが挙げられる。配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４４）のペプチドが特に好ましい。
【０２６３】
抗ＯＸ４０抗体は、抗ＣＤ１３７抗体の任意の部分に、またはリンカーに、任意の好適な手段によって結合させることができる。例えば、ポリペプチドの様々な部分を、例えばペプチド結合などでの化学的共役によって結合させてもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、場合によりペプチドリンカーによって結合されている抗ＯＸ４０抗体（またはその抗原結合断片）と抗ＣＤ１３７抗体（またはその抗原結合断片）とを含む、融合タンパク質を含むか、またはそれから成ってもよい。そのような融合タンパク質では、ＣＤ１３７結合ドメイン（複数可）及びＯＸ４０結合ドメイン（複数可）が、存在する唯一の結合ドメインであり得る。
【０２６４】
分子をポリペプチドと共役させるための他の方法が、当該技術分野において知られている。例えば、カルボジイミド共役（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ  ＆  Ｗｉｌｃｈｅｋ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１５１−１５９を参照されたい；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）を使用して、ドキソルビシンを含む多様な薬剤を抗体またはペプチドと共役させることができる。水溶性のカルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、官能性部分を結合性部分と共役させるために特に有用である。さらなる例として、適切な反応物質の過ヨウ素酸ナトリウム酸化、続いて還元的アルキル化によって、またはグルタルアルデヒド架橋によって、共役を達成してもよい。しかしながら、どの方法が選択されるかに関わらず、二重特異性抗体の抗ＯＸ４０部分及び抗ＣＤ１３７部分が本発明の二重特異性抗体の一部として存在するときにそれらの標的結合特性を保持するかまたは実質的に保持するという判定が、好ましくは行われるべきであるとされる。
【０２６５】
同じ技術を使用して、本発明の任意の抗体を（直接的または間接的に）別の分子に連結させてもよい。他方の分子は、治療剤または検出可能な標識であり得る。好適な治療剤には、細胞傷害性の部分または薬物が含まれる。
【０２６６】
本発明の二重特異性抗体は、任意の好適なフォーマットで一緒に配置された抗ＯＸ４０抗体（またはその抗原結合断片）と抗ＣＤ１３７抗体（またはその抗原結合断片）とを含み得る。いかなる所与の二重特異性フォーマットにおいても、抗ＯＸ４０抗体及び抗ＣＤ１３７抗体がそれぞれ独立して全抗体またはその抗原結合部分であり得ることは理解されよう。使用される特定の二重特異性フォーマットに関係なく、本明細書に記載される二重特異性抗体は、典型的には、ＯＸ４０結合ドメイン（これは、結合ドメイン１と称される場合がある）の組成、及びＣＤ１３７結合ドメイン（これは、結合ドメイン２と称される場合がある）の組成に基づいた付番方式によって参照され得る。したがって、この付番方式は、典型的には、ＯＸ４０結合ドメイン（結合ドメイン１）に関するＶＨ１／ＶＬ１と、ＣＤ１３７結合ドメイン（結合ドメイン２）に関するＶＨ２／ＶＬ２とが、一緒にＶＨ１／ＶＬ１−ＶＨ２／ＶＬ２と書かれた形態である。したがって、例えば、１１６４／１１３５−１２０４／１２０５と称される二重特異性抗体は、ＶＨ配列１１６４及びＶＬ配列１１３５から成る少なくとも１つのＯＸ４０結合ドメイン（すなわち１１６４／１１３５＝ＶＨ１／ＶＬ１）と、ＶＨ配列１２０４及びＶＬ配列１２０５から成る少なくとも１つのＣＤ１３７結合ドメイン（すなわち１２０４／１２０５＝ＶＨ２／ＶＬ２）とを含む。この付番方式は、二重特異性抗体中に存在する結合ドメインの総数も、二重特異性抗体中のいかなる定常領域の存在または非存在も反映せず、これらの両方が、使用される二重特異性抗体の特定のフォーマットによって決定されることは理解されよう。結合ドメインの総数及び定常領域の存在または非存在は、当該技術分野において知られる任意の好適な二重特異性抗体フォーマットに従い得る。
【０２６７】
二重特異性抗体の好適なフォーマットは当該技術分野において多く知られており、本発明の二重特異性抗体は、これらのフォーマットのうちの任意のものであり得る。好適なフォーマットとしては、図１及び１９に記載のものが挙げられる（また、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，２０１５，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．８３８−８４７を参照されたい；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）。
【０２６８】
図１９中、定常領域は、薄灰色で塗りつぶされて示されており、可変重鎖領域ＶＨ１は、白黒の格子柄として示されており、可変軽鎖領域ＶＬ１は、白色で塗りつぶされて示されており、可変重鎖領域ＶＨ２は、黒色で塗りつぶされて示されており、可変軽鎖領域ＶＬ２は、白地に斜線で示されている。したがって、ＯＸ４０結合ドメイン（結合ドメイン１と称される）は、典型的には、白黒の格子柄のドメインと白色で塗りつぶされたドメインとの対として表され、ＣＤ１３７結合ドメイン（結合ドメイン２と称される）は、典型的には、黒色で塗りつぶされたドメインと白地に斜線のドメインとの対として表される。しかしながら、示されているフォーマットの全てにおいて結合ドメイン１及び２が交換され得ることは理解されよう。すなわち、ＯＸ４０結合ドメインは、図１９に示されるＣＤ１３７ドメインのいずれの位置に存在してもよく、その逆も同様である。
【０２６９】
二重特異性抗体の好ましいフォーマットは、図１９の第２の横列の最初に示されている、ｋｉｈすなわち「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」配置である。この配置では、各抗体の重鎖のＣＨ３ドメインが、抗ＯＸ４０抗体の重鎖と抗ＣＤ１３７抗体の重鎖との間のヘテロ二量体化を可能にするように変異している。各重鎖は、その対応する軽鎖と会合して、１つの完全なＯＸ４０結合ドメイン及び１つの完全なＣＤ１３７結合ドメインを形成する。正しい軽鎖との会合を促進するために、重鎖ＣＨ１領域に修飾が行われてもよい。Ｋｉｈフォーマットの二重特異性抗体は、当該技術分野において周知である。例えば、開示内容が参照により本明細書に援用される、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ  １９９６；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９：６１７−６２１を参照されたい。
【０２７０】
本発明の二重特異性抗体の別の好ましいフォーマットは、図１９の第２の横列の２番目に示されているｓｃＦｖ２−Ｆｃフォーマットである。この配置では、各標的に対して特異的な１つのｓｃＦｖが、免疫グロブリンの定常ドメインに融合している。これらの一本鎖は、一方の特異性がＦｃ領域のＮ末端に融合し、他方の特異性がＣ末端に融合した状態で、重鎖のＦｃ領域に融合してもよい（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７（１８）：１１２３−３０；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）。
【０２７１】
本発明の二重特異性抗体の別の好ましいフォーマットは、ＢＩＴＥ／ｓｃＦｖ２フォーマットであり、これは、図１９の第２の横列に示されている３番目のフォーマットである。この配置では、一方がＯＸ４０に対して特異的であり他方がＣＤ１３７に対して特異的である２つのｓｃＦｖが、リンカーで一緒に融合している（Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３０（８）：７９８−８０７；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）。リンカーは、場合により、可溶性及び血清半減期を増加させるタンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、図１９の第４の横列に示されるｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体をもたらし得る。
【０２７２】
本発明の二重特異性抗体の別の好ましいフォーマットは、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）免疫グロブリンであり、これは、図１９の第２の横列に示されている４番目のフォーマットである。この配置では、第２の可変ドメイン（ＶＬ２）が、ＩｇＧ分子の第１の可変軽鎖（ＶＬ１）に融合しており、第２の可変重鎖（ＶＨ２）が、第１の可変重鎖（ＶＨ１）に融合している。ＶＨ１とＶＬ１とが結合部位１を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが結合部位２を形成し、したがって二重特異性抗体が作り出される（Ｗｕ，２００７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５（１１）：１２９０−７；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）。
【０２７３】
本発明の二重特異性抗体の別の好ましいフォーマットは、ＶＨ１がＶＬ２に融合し、ＶＨ２がＶＬ１に融合し、短いペプチドリンカーがそれらに強制的にＶＨ１／ＶＬ１結合部位及びＶＨ２／ＶＬ２結合部位を形成させる、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）フォーマットである。この構築物は、結合部位間のジスルフィド架橋の形成によって安定化し得る。ＤＡＲＴフォーマットは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインに融合し、一価の二重特異性抗体（ＤＡＲＴ−Ｆｃ）または二価の二重特異性抗体（ＤＡＲＴ２−Ｆｃ）が作り出され得る（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ  １１７（１７）：４５４２−５１）。ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ−Ｆｃ、及びＤＡＲＴ２−Ｆｃフォーマットは、図１９の第３の横列に示されている。
【０２７４】
本発明の二重特異性抗体の別の好ましいフォーマットは、ドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ  ａｎｄ  ｌｏｃｋ）技術（ＤＮＬ）によって生成された二重特異性抗体である。ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡ及びＡキナーゼアンカータンパク質を、各標的に対する抗体、Ｆａｂ断片、またはｓｃＦｖと融合させ、それによって、多価の二重特異性抗体、例えばＤＮＬ−Ｆａｂ３を生成することができる（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３（１８  Ｐｔ  ２）：５５８６ｓ−５５９１ｓ、図１９の第４の横列に示される通り；その開示内容は、参照により本明細書に援用される）。
【０２７５】
本発明の二重特異性抗体の特に好ましいフォーマットは、ｓｃＦｖ−ＩｇＧフォーマットである。このフォーマットの可能性のある４つの異なる配置が、図１９の最上列に示されている。図１９に示されるように、ｓｃＦｖ−ＩｇＧフォーマットにおいて、抗ＯＸ４０抗体はＩｇＧ分子全体であり、抗ＣＤ１３７抗体は、４つの概略位置（重鎖定常領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域）のうちのいずれか１つで抗ＯＸ４０抗体に接続されたｓｃＦｖ抗体である。それぞれの場合で、逆の配置も想定される。すなわち、抗ＣＤ１３７抗体をＩｇＧ全体とし、抗ＯＸ４０抗体を、４つの概略位置のうちのいずれか１つで抗ＣＤ１３７抗体に接続されたｓｃＦｖとするものである。このｓｃＦｖ−ＩｇＧフォーマットでは、ＩｇＧ分子全体は、ｓｃＦｖに直接的に結合していてもよいし、リンカーを介して間接的に結合していてもよい。例示的なリンカーとしては、配列番号４７〜５０、または１４４のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のペプチドが挙げられ、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４４）のペプチドが特に好ましい。
【０２７６】
図１９に示される第１のｓｃＦｖ−ＩｇＧ配置（図の最上部左方）において、二重特異性抗体は、重鎖可変配列ＶＨ２（黒色の塗りつぶし）及び軽鎖可変配列ＶＬ２（白地に斜線）から成るｓｃＦｖ配列に（場合によりリンカーを介して）連結された、重鎖定常配列（Ｈｃ；灰色の塗りつぶし）に連結された、重鎖可変配列ＶＨ１（白黒の格子柄）を含む、ポリペプチド鎖の２つのコピーを含む。この鎖は、ＶＨ１−Ｈｃ−ＶＨ２／ＶＬ２（Ｎ末端−Ｃ末端の順）と称される場合がある。この二重特異性抗体はまた、ＶＬ１−Ｌｃ（Ｎ末端−Ｃ末端の順）と称され得る、軽鎖定常配列（Ｌｃ；灰色の塗りつぶし）に連結された軽鎖可変配列ＶＬ１（白色の塗りつぶし）を含む、より小さな鎖の２つのコピーを含む。図１９に示される代替的なｓｃＦｖ−ＩｇＧ配置もまた、同様の様式で説明され得る２つの異なる鎖のそれぞれの２つのコピーを含む。したがって、図２２の最上列を左から右に読むと、第２の配置は、２つのＶＨ１−Ｈｃ鎖と、２つのＶＬ１−Ｌｃ−ＶＨ２／ＶＬ２鎖とを含む。第３の配置は、２つのＶＨ１／ＶＨ２−ＶＨ１−Ｈｃ鎖と、２つのＶＬ１−Ｌｃ鎖とを含む。第４の配置は、２つのＶＨ１−Ｈｃ鎖と、２つのＶＨ１／ＶＨ２−ＶＬ１−Ｌｃ鎖とを含む。
【０２７７】
本発明の二重特異性抗体の最も好ましいｓｃＦｖ−ＩｇＧフォーマットは、図１９に示される最初のｓｃＦｖ−ＩｇＧ配置（図の最上部左方）である。このｓｃＦｖ−ＩｇＧ配置におけるＶＨ１−Ｈｃ−ＶＨ２／ＶＬ２タイプのポリペプチド鎖の例示的なアミノ酸配列は、表Ｆに示されており、実施例の二重特異性分子に使用される。それぞれの場合で、アミノ酸配列に関し、下線／太字の配列はＶＨ１であり、イタリック体の配列は重鎖定常配列Ｈｃであり（典型的には、示された配列内のＩｇＧ１定常ドメインであるが、これは、本明細書において開示されるものなどの任意の好適なＩｇＧ定常ドメインに置き換えられてもよい）、下線が引かれた配列は、任意選択のリンカーであり、太字の配列はＶＨ２であり、太字でイタリック体の配列はＶＬ２である。これらのポリペプチド鎖をコードする対応する例示的なヌクレオチド配列も、表Ｆに示される。ヌクレオチド配列はイントロンを含む。このｓｃＦｖ−ＩｇＧ配置におけるＶＬ１−Ｌｃタイプのポリペプチド鎖の例示的なアミノ酸配列も、表Ｇに示されており、実施例の二重特異性分子に使用される。それぞれの場合で、アミノ酸配列に関し、下線／太字の配列はＶＬ１であり、イタリック体の配列は軽鎖定常配列Ｌｃである（典型的にはカッパであるが、任意の好適な軽鎖定常領域に置き換えられてもよい）。これらのポリペプチド鎖をコードする対応する例示的なヌクレオチド配列も、表Ｇに示される。
【０２７８】
本発明は、表Ｆ及びＧに記載のアミノ酸配列のうちのいずれかを、単独で、あるいは、好ましくは単一特異性もしくは二重特異性抗体の一部として含むか、またはそれから成るポリペプチドを提供する。表Ｆ及びＧに示される配列の全てにおいて、重鎖または軽鎖の定常領域に対応する配列は例示的なものであり、任意の他の好適な重鎖または軽鎖の定常領域の配列に置き換えられてもよい。好ましい重鎖及び軽鎖の定常領域配列は、配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、及び１３９のものである。
【０２７９】
本発明の二重特異性または単一特異性抗体は、単離された形態または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、何らかの周囲媒体からのポリペプチドの完全ではないが実質的な単離があり得ることを意味する。本ポリペプチドは、それらの意図される用途を妨げない担体または希釈剤と混合されても、実質的に単離されていると見なされ得る。
【０２８０】
本発明の抗体は、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、抗体の全てまたは一部が、該ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む細胞によって、融合タンパク質として発現されてもよい。
【０２８１】
あるいは、個々の部分は、別々に産生され、その後１つに結合してもよい。結合は、任意の好適な手段、例えば上記に概説された化学的共役法及びリンカーによって達成され得る。個々の部分の別々の産生は、任意の好適な手段によって達成され得る。例えば、以下により詳細に説明されるような、場合により別々の細胞内にある別々のヌクレオチドからの発現による。
【０２８２】
本発明の抗体の全てまたは一部をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｂ、Ｆ、Ｇ、及びＨに記載されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成ってもよい。好適なポリヌクレオチドは、代替的には、上記の定義の通り、これらの配列のうちのいずれかの変異形であってもよい。
【０２８３】
本発明のさらなる態様
本発明の第２の態様は、上述のように、個体の疾患もしくは病態を治療または防止するための方法で使用するための、本発明の第１の態様による二重特異性ポリペプチドを含む。
【０２８４】
本発明の第３の態様は、上述のように、本発明の第１または第２の態様による二重特異性ポリペプチドを個体に投与することを含む、個体の疾患もしくは病態を治療または防止する方法である。
【０２８５】
本発明の一実施形態は、疾患もしくは病態ががんであり、場合により、個体がヒトである、本発明の第２の態様による二重特異性ポリペプチド、または本発明の第３の態様による方法である。
【０２８６】
さらなる実施形態において、本方法は、上述のように、二重特異性抗体を全身投与すること、または腫瘍部位もしくは腫瘍排出リンパ節などに局所投与することを含む。
【０２８７】
がんは、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、黒色腫、膀胱がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、皮膚がん、リンパ腫、または神経膠芽腫であり得る。
【０２８８】
本発明の第４の態様は、上述のように、本発明の第１または第２の態様による二重特異性ポリペプチドの少なくとも１つのポリペプチド鎖をコードする、ポリヌクレオチドである。
【０２８９】
本発明の第５の態様は、本発明の第１または第２の態様による二重特異性ポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容される希釈剤または担体と、を含む、組成物である。
【０２９０】
本発明の一実施形態において、実施形態の第１または第２いずれかの態様によるポリペプチドは、追加の治療部分と共役している。
【０２９１】
本発明の第６の態様は、先に定義した通りである、ＣＤ１３７に対して特異的な抗体である。
【０２９２】
本発明の実施形態
本発明の実施形態を以下の項目に記載する。
【０２９３】
１．ＣＴＬＡ−４とＯＸ４０との両方に特異的に結合することのできるポリペプチドであって、該ポリペプチドが、Ｂ１及びＢ２を含み、
Ｂ１が、ＯＸ４０に対して特異的な抗体またはその抗原結合断片であり、
Ｂ２が、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインであり、前記ポリペプチド結合ドメインが、
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、もしくは、
ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸が変更されているアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るが、ただし、前記結合ドメインが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件とする、ポリペプチド。
【０２９４】
２．該ポリペプチドによって特異的に結合されるＣＴＬＡ−４が、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのＣＴＬＡ−４であり、かつ／または、該ポリペプチドによって特異的に結合されるＯＸ４０が、霊長類、好ましくはヒトのＯＸ４０である、項目１に記載のポリペプチド。
【０２９５】
３．Ｂ１が、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び／または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、該少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に結合している、項目１または２に記載のポリペプチド。
【０２９６】
４．Ｂ１が、
−少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、該重鎖もしくは該軽鎖のいずれかに結合しているか、
または、Ｂ１が、
−２つの同一の重鎖（Ｈ）及び２つの同一の軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、両方の重鎖もしくは両方の軽鎖に結合している、項目３に記載のポリペプチド。
【０２９７】
５．Ｎ−Ｃの方向で書かれた次式：
（Ａ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（Ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ、
（Ｃ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、
（Ｄ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（式中、Ｘはリンカーであり、ｎは０または１である）のうちのいずれか１つに従って配置されたポリペプチド鎖を含むか、またはそれから成る、項目１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０２９８】
６．Ｘが、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、または（ＳＧ）ｍ（ここで、ｍは１〜７である）を含むペプチドである、項目５に記載のポリペプチド。
【０２９９】
７．５０×１０−１０Ｍ、２５×１０−１０Ｍ、もしくは２０×１０−１０Ｍ未満のＫｄでヒトＯＸ４０に結合し、かつ／または、６０×１０−９Ｍ、２５×１０−９Ｍ、もしくは１０×１０−９Ｍ未満であるＫｄ値でヒトＣＴＬＡ−４に結合する、項目１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３００】
８．エフェクターＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導する、項目１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、場合により、該増加が、別々の分子としてＴ細胞に投与されたＢ１及びＢ２の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも、少なくとも１．５倍、４．５倍、または７倍高い、ポリペプチド。
【０３０１】
９．Ｔ細胞活性の該増加が、Ｔ細胞による増殖及び／またはＩＬ−２産生の増加である、項目８に記載のポリペプチド。
【０３０２】
１０．該Ｂ２のアミノ酸配列（ｉｉ）における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸が、配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに置換されており、場合により、配列番号３のアミノ酸配列と比較したときに挿入または欠失が存在しない、項目１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３０３】
１１．該第１の結合ドメインの該アミノ酸配列における該アミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、１２２位にあり、場合により、該アミノ酸配列が、１０７位、１２１位、及び１２５位のうちの少なくとも１つにおいても置換されている、項目１０に記載のポリペプチド。
【０３０４】
１２．該Ｂ２のアミノ酸配列が、配列番号８、６、７、及び９〜２４のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る、項目１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３０５】
１３．Ｂ１が、Ｂ２から独立して存在するときに、次の機能的特徴：
Ｉ．１０×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは５×１０−１０Ｍ未満であるＫＤ値で、ヒトＯＸ４０に結合すること、
ＩＩ．マウスＯＸ４０に結合しないこと、及び、
ＩＩＩ．他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７またはＣＤ４０に結合しないこと、のうちの少なくとも１つを示す、項目１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
１４．Ｂ１が、以下：
（ａ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｆ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ／Ａ」を含む、重鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｉ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｔ」を含む、重鎖ＣＤＲ２配列、
（ｃ）９〜１７アミノ酸の長さであり、「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｆ／Ｖ／Ｄ、Ｇ／Ｙ／Ｐ／Ｆ、−／Ｈ／Ｓ、−／Ｎ／Ｄ／Ｈ、−／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ、−／Ｙ、−／Ｗ／Ａ／Ｖ、−／Ａ／Ｙ、−／Ｄ／Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｈ／Ｎ、Ｙ／Ｓ／Ｗ／Ａ／Ｔ、Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ、Ｄ、Ｙ」のコンセンサス配列を含む、重鎖ＣＤＲ３配列、
（ｄ）配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」から成る軽鎖ＣＤＲ１配列、
（ｅ）配列「Ａ、Ａ、Ｓ」から成る軽鎖ＣＤＲ２配列、
（ｆ）８〜１０アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｑ，Ｑ、Ｓ／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ／Ｈ／Ｇ、−／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｔ、Ｐ／Ｌ、Ｙ／Ｓ／Ｈ／Ｌ／Ｆ、Ｔ」を含む、軽鎖ＣＤＲ３配列、から独立して選択されるいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全ての特徴を含み、
（ｃ）の重鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１０アミノ酸の長さの配列か、またはコンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸の長さのＣＤＲ３配列であり、
（ｆ）の軽鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｙ、Ｔ」から成る、項目１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３０６】
１５．Ｂ１が、表Ａ（１）に示されるＶＨ配列の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列、及び／もしくは表Ａ（２）に示されるＶＬ配列の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含むか、または、Ｂ１が、表Ｂに示される重鎖ＶＨ配列及び／もしくは軽鎖ＶＬ配列を含む、項目１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３０７】
１６．Ｂ１が、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸の長さの重鎖ＣＤＲ３配列と、配列番号９７の軽鎖ＶＬ配列（表Ｂに示される１１３５）と、を含み、場合により、配列番号９７の軽鎖ＶＬ配列が、より長い配列番号１２９の配列の一部（表Ｄに示される１１４１）として存在する、項目１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３０８】
１７．Ｂ１が、ヒトＦｃ領域または該領域の変異形を含み、該領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、項目１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３０９】
１８．配列番号１２５〜１３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る、項目１〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、場合により、該ポリペプチドが、抗体の構成部分として提供される、ポリペプチド。
【０３１０】
１９．個体の疾患もしくは病態を治療または防止するための方法で使用するための、項目１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３１１】
２０．項目１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを個体に投与することを含む、個体の疾患もしくは病態を治療または防止する方法。
【０３１２】
２１．疾患もしくは病態ががんであり、場合により、個体がヒトである、項目１９に記載のポリペプチド、または項目２０に記載の方法。
【０３１３】
２２．該方法が、ポリペプチドを全身投与すること、または腫瘍部位もしくは腫瘍排出リンパ節などに局所投与することを含む、項目２１に記載のポリペプチドまたは方法。
【０３１４】
２３．がんが、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、黒色腫、膀胱がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、皮膚がん、リンパ腫、または神経膠芽腫である、項目２１または２２に記載のポリペプチドまたは方法。
【０３１５】
２４．項目１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【０３１６】
２５．追加の治療部分と共役した、項目１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０３１７】
２６．項目１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容される希釈剤または担体と、を含む、組成物。
【０３１８】
さらなる特徴的な実施形態を以下の項目に記載する。
【０３１９】
１．直接的または間接的に相互に結合した、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体（抗ＯＸ４０抗体）とＣＤ１３７に特異的に結合する抗体（抗ＣＤ１３７抗体）とを含む、二重特異性抗体。
【０３２０】
２．特異的に結合されるＣＤ１３７が、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのＣＤ１３７であり、かつ／または、特異的に結合されるＯＸ４０が、霊長類、好ましくはヒトのＯＸ４０である、項目１に記載の二重特異性抗体。
【０３２１】
３．５０×１０−１０Ｍ、２５×１０−１０Ｍ、もしくは２０×１０−１０Ｍ未満のＫｄでヒトＯＸ４０に結合し、かつ／または、１０×１０−９Ｍ、４×１０−９Ｍ、もしくは１．２×１０−９Ｍ未満であるＫｄ値でヒトＣＤ１３７に結合する、項目１または２に記載の二重特異性抗体。
【０３２２】
４．エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導する、項目１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、場合により、該増加が、別々の分子としてＴ細胞に投与された対応する単一特異性抗体の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、または５倍高い、二重特異性抗体。
【０３２３】
５．Ｔ細胞活性の該増加が、Ｔ細胞による増殖、及び／またはＩＬ−２産生、及び／またはＩＦＮ−γ産生の増加であり、場合により、Ｔ細胞が、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、項目４に記載の二重特異性抗体。
【０３２４】
６．抗ＯＸ４０抗体及び抗ＣＤ１３７抗体が、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４４）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、または（ＳＧ）ｍ（ここで、ｍは１〜７である）のペプチドであるリンカーによって間接的に相互に結合している、項目１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３２５】
７．ｓｃＦｖ−ＩｇＧフォーマット二重特異性抗体である、項目１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３２６】
８．抗ＯＸ４０抗体が、抗ＣＤ１３７抗体から独立して存在するときに、次の機能的特徴：
Ｉ．１０×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは５×１０−１０Ｍ未満であるＫＤ値で、ヒトＯＸ４０に結合すること、
ＩＩ．マウスＯＸ４０に結合しないこと、及び、
ＩＩＩ．他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７またはＣＤ４０に結合しないこと、のうちの少なくとも１つを示す、項目１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３２７】
９．抗ＯＸ４０抗体が、以下：
（ａ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｆ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ／Ａ」を含む、重鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｉ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｔ」を含む、重鎖ＣＤＲ２配列、
（ｃ）９〜１７アミノ酸の長さであり、「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｆ／Ｖ／Ｄ、Ｇ／Ｙ／Ｐ／Ｆ、−／Ｈ／Ｓ、−／Ｎ／Ｄ／Ｈ、−／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ、−／Ｙ、−／Ｗ／Ａ／Ｖ、−／Ａ／Ｙ、−／Ｄ／Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｈ／Ｎ、Ｙ／Ｓ／Ｗ／Ａ／Ｔ、Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ、Ｄ、Ｙ」のコンセンサス配列を含む、重鎖ＣＤＲ３配列、
（ｄ）配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」から成る軽鎖ＣＤＲ１配列、
（ｅ）配列「Ａ、Ａ、Ｓ」から成る軽鎖ＣＤＲ２配列、
（ｆ）８〜１０アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｑ，Ｑ、Ｓ／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ／Ｈ／Ｇ、−／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｔ、Ｐ／Ｌ、Ｙ／Ｓ／Ｈ／Ｌ／Ｆ、Ｔ」を含む、軽鎖ＣＤＲ３配列、から独立して選択されるいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全ての特徴を含み、
（ｃ）の重鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１０アミノ酸の長さの配列か、またはコンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸の長さのＣＤＲ３配列であり、
（ｆ）の軽鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｙ、Ｔ」から成る、項目１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３２８】
１０．抗ＯＸ４０抗体が、表Ａ（１）に示されるＶＨ配列の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列、及び／もしくは表Ａ（２）に示されるＶＬ配列の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含むか、または、抗ＯＸ４０抗体が、表Ｂに示される重鎖ＶＨ配列及び／もしくは軽鎖ＶＬ配列を含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３２９】
１１．抗ＯＸ４０抗体が、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸の長さの重鎖ＣＤＲ３配列と、配列番号９７の軽鎖ＶＬ配列（表Ｂに示される１１３５）と、を含み、場合により、配列番号９７の軽鎖ＶＬ配列が、より長い配列番号１２９の配列の一部（表Ｄに示される１１４１）として存在する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３３０】
１２．抗ＯＸ４０抗体が、抗ＣＤ１３７抗体から独立して存在するときに、ＯＸ４０への結合について、項目８〜１１のいずれか１項に定義された抗ＯＸ４０抗体と競合する、項目１〜１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３３１】
１３．抗ＣＤ１３７抗体が、抗ＯＸ４０抗体から独立して存在するときに、次の機能的特徴：
Ｉ．２×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１．２×１０−９Ｍ未満であるＫＤ値で、ヒトＣＤ１３７に結合すること、及び、
ＩＩ．インビトロでＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の増加を引き起こす能力、のうちの少なくとも１つを示し、場合により、活性の該増加が、Ｔ細胞による増殖、及び／またはＩＬ−２産生、及び／またはＩＦＮ−γ産生の増加である、項目１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３３２】
１４．抗ＣＤ１３７抗体が、表Ｉ（１）の第１の横列に示されるＶＨ配列の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列、及び／もしくは表Ｉ（２）の第１の横列に示されるＶＬ配列の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含むか、または、抗ＣＤ１３７抗体が、表Ｈ、配列番号１７７〜１８０に示される重鎖ＶＨ配列及び／もしくは軽鎖ＶＬ配列を含む、項目１〜１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３３３】
１５．抗ＣＤ１３７抗体が、抗ＯＸ４０抗体から独立して存在するときに、ＣＤ１３７への結合について、項目１４に定義された抗ＣＤ１３７抗体と競合する、項目１〜１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３３４】
１６．抗ＯＸ４０抗体及び／または抗ＣＤ１３７抗体が、ヒトＦｃ領域または該領域の変異形を含み、該領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、項目１〜１５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３３５】
１７．配列番号１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、または１６３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、項目１〜１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３３６】
１８．配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、または１７３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、項目１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３３７】
１９．
−配列番号１６５、ならびに配列番号１４９、１５３、１５９、及び１６３のうちのいずれか１つ、または、
−配列番号１６７及び配列番号１５１、または、
−配列番号１６９及び配列番号１５５、または、
−配列番号１７１及び配列番号１５７、または、
−配列番号１７３及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む、項目１〜１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３３８】
２０．個体の疾患もしくは病態を治療または防止するための方法で使用するための、項目１〜１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【０３３９】
２１．項目１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を個体に投与することを含む、個体の疾患もしくは病態を治療または防止する方法。
【０３４０】
２２．疾患もしくは病態ががんであり、場合により、個体がヒトである、項目２０に記載の二重特異性抗体、または項目２１に記載の方法。
【０３４１】
２３．該方法が、二重特異性抗体を全身投与すること、または腫瘍部位もしくは腫瘍排出リンパ節などに局所投与することを含む、項目２２に記載の二重特異性抗体または方法。
【０３４２】
２４．がんが、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、黒色腫、膀胱がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、皮膚がん、リンパ腫、または神経膠芽腫である、項目２２または２３に記載の二重特異性抗体または方法。
【０３４３】
２５．項目１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の少なくとも１つのポリペプチド鎖をコードする、ポリヌクレオチド。
【０３４４】
２６．項目１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される希釈剤または担体と、を含む、組成物。
【０３４５】
２７．項目１３〜１５のいずれか１項の定義の通りである、ＣＤ１３７に対して特異的な抗体。
【０３４６】
ここで、以下の図を参照して、本発明の特定の態様を具現する好ましい非限定的な例を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０３４７】
【図１】本発明の二重特異性ポリペプチドの例示的な配置の構造の概略図を示す。抗ＯＸ４０抗体可変ドメインは黒色で塗りつぶされており、定常ドメインは白色である。ＣＴＬＡ−Ａ結合ドメインは、斜線で網掛けされている。
【図２】ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定された、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＣＴＬＡ−４結合特性を示す。
【図３】ＥＬＩＳＡ阻害アッセイによって決定された、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＣＴＬＡ−４結合特性を示す。
【図４】本明細書において開示されるヒト野生型ＣＤ８６アミノ酸配列の概略図を提供する。（Ａ）は、Ｎ末端シグナル配列を含まないヒトＣＤ８６のモノマー可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）であり、（Ｂ）は、Ｎ末端シグナル配列を含むヒト野生型ＣＤ８６のモノマー細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）であり、（Ｃ）は、ヒトＣＤ８６の全長アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢＫ４１９３１．１、配列番号４４）である。Ａの配列は、場合により、太字で示されるＮ末端のアラニン及びプロリン、すなわち２４位及び２５位を欠いていてもよい。Ｂ及びＣにおけるシグナル配列には下線が引かれている。アミノ酸位置の付番は、Ｎ末端から始まる配列番号４及び４４に基づく。
【図５】本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインがヒトとマウスとの両方のＣＴＬＡ−４に対して同様の規模の結合親和性を有することを実証する、阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図６】表面プラズモン共鳴によって決定された、例示的な抗ＯＸ４０抗体に関する解離速度定数の会合速度定数に対するプロットである。
【図７−１】フローサイトメトリーによって測定された、ＣＨＯ細胞で過剰発現したヒトＯＸ４０に対する例示的な抗ＯＸ４０抗体の結合を示す。
【図７−２】同上。
【図８】様々な例示的な抗ＯＸ４０抗体と共にインビトロでインキュベートしたときの、Ｔ細胞によるＩＬ−２産生のレベルを示す。ｙ軸は、試験した抗体によるＩＬ−２産生のトップ値／参照抗体のトップ値の比である。少なくとも４つのドナーからの平均及びＳＥＭ値が示されている。
【図９】個々の標的ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４に対する例示的な二重特異性分子の結合に関するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１０】ＯＸ４０とＣＴＬＡ４との両方に対する例示的な二重特異性分子の結合の表面プラズモン共鳴分析の結果を示す。異なる二重特異性抗体にセンサ上を通過させた（始点がＩによって示される））。表面の飽和近くで緩衝液を適用し（ＩＩ）、その後、ＣＴＬＡ−４（ＩＩＩ）にセンサ表面上を通過させ、実線で表される第２の会合相を生成した。３分後、緩衝液（ＩＶ）を適用し、続く解離相は、ＣＴＬＡ−４とＯＸ４０  Ａｂとの両方の解離を反映する。対照として、点線で表されるＣＴＬＡ−４を含まない緩衝液のみを添加した。
【図１１】ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４との両方に対する例示的な二重特異性分子の同時結合を示す、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１２Ａ】滴定シリーズ（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｅｓ）における様々な例示的な二重特異性分子：Ａ）１１６４／１１４１及び１１６６／１１４１、Ｂ）１１６８／１１４１及び１１７０／１２６３、Ｃ）１５１４／１５８１及び１５２０／１１４１、Ｄ）１５２６／１５８５及び１５４２／１１４１、または各標的に対する２つの対応する単一特異性抗体の組み合わせ（アイソタイプＩｇＧ抗体に連結したモノクローナルＯＸ４０抗体またはＣＴＬＡ−４結合ドメイン：１７５６／１７５７）と共にインビトロでインキュベートしたときの、Ｔ細胞によるＩＬ−２産生のレベルを示す。アッセイは、ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）及びＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ）でコーティングされたＵ字型の組織培養処理されていない９６ウェルプレートで行った。４つのドナーの平均が提示されている。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１２Ｄ】同上。
【図１３】１．４９ｎＭにおける様々な例示的な二重特異性分子、または各標的に対する対応する単一特異性抗体の組み合わせ（アイソタイプ抗体に連結したａ−ＯＸ４０  ｍＡｂまたはＣＴＬＡ−４−ドメイン：１７５６／１７５７）と共にインビトロでインキュベートしたときの、Ｔ細胞によるＩＬ−２産生のレベルを示す。アッセイは、ＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ）ありまたはなし（「＋」または「−」で示される）で、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）でコーティングされたＵ字型の組織培養処理されていない９６ウェルプレートで行った。４つのドナーの平均及びＳＤが提示されている。
【図１４】フローサイトメトリーによって測定された、ＣＨＯ細胞で過剰発現したヒト及びカニクイザルのＣＤ１３７に対する例示的な抗ＣＤ１３７抗体１２０４／１２０５の結合を示す。
【図１５】ＣＤ８Ｔ細胞作動薬アッセイにおける、参照抗体１１１／１１２と比較した、例示的な抗ＣＤ１３７抗体１２０４／１２０５のＩＦＮγ産生の正規化された刺激指数を示す。
【図１６−１】滴定シリーズにおける様々な例示的な二重特異性分子：Ａ）１１６４／１１３５−１２０４／１２０５、Ｂ）１１６６／１１６７−１２０４／１２０５、Ｃ）１１６８／１１３５−１２０４／１２０５、Ｄ）１１７０／１１７１−１２０４／１２０５、Ｅ）１４８２／１４８３−１２０４／１２０５、Ｆ）１５２０／１１３５−１２０４／１２０５、Ｇ）１５２６／１５２７−１２０４／１２０５、Ｈ）１５４２／１１３５−１２０４／１２０５、または各標的に対する２つの対応する単一特異性抗体の組み合わせと共にインビトロでインキュベートしたときの、Ｔ細胞によるＩＬ−２産生のレベルを示す。アイソタイプ対照１１８８／１１８７（ＩｇＧ１）は、全ての実験で陰性対照として使用した。これらの細胞は、抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）でコーティングされたＵ字型の組織培養処理されていない９６ウェルプレートで、７２時間にわたって培養した。２つのドナーの平均ＩＬ−２レベルが提示されている。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１６−４】同上。
【図１７】１ｎＭにおける例示的な二重特異性分子１１６４／１１３５−１２０４／１２０５と共にインビトロでインキュベートしたときの末梢血単核細胞によるＩＬ−２産生のレベルを、各標的に対する対応する単一特異性抗体：抗ＯＸ４０  ｍＡｂである１１６４／１１３５、もしくは抗ＣＤ１３７  ｍＡｂである１２０４／１２０５、またはアイソタイプ対照１１８８／１１８７（ＩｇＧ１）と比較して示す。これらの細胞は、抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）でコーティングされたＵ字型の組織培養処理されていない９６ウェルプレートで、４８時間にわたって培養した。２つのドナーの平均ＩＬ−２レベルが提示されている。
【図１８】ＯＸ４０とＣＤ１３７との両方に対する例示的な二重特異性分子の同時結合を示す、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１９】本発明の二重特異性抗体の例示的なフォーマットの構造の概略図を示す。各フォーマットにおいて、定常領域は、薄灰色で塗りつぶされて示されており、可変重鎖領域ＶＨ１は、白黒の格子柄として示されており、可変軽鎖領域ＶＬ１は、白色で塗りつぶされて示されており、可変重鎖領域ＶＨ２は、黒色で塗りつぶされて示されており、可変軽鎖領域ＶＬ２は、白地に斜線で示されている。ＯＸ４０結合ドメイン（結合ドメイン１）は、典型的には、白黒の格子柄のドメインと白色で塗りつぶされたドメインとの対（ＶＨ１／ＶＬ１）として表され、ＣＤ１３７結合ドメイン（結合ドメイン２）は、典型的には、黒色で塗りつぶされたドメインと白地に斜線のドメインとの対（ＶＨ２／ＶＬ２）として表される。しかしながら、示されているフォーマットの全てにおいて結合ドメイン１及び２が交換され得ることは理解されよう。すなわち、ＯＸ４０結合ドメインは、この図に示されるＣＤ１３７ドメインの位置に存在してもよく、その逆も同様である。さらに、結合ドメイン２は、異なる可変重鎖及び軽鎖の順、すなわちＶＨ２／ＶＬ２またはＶＬ２／ＶＨ２のいずれかの順で存在してもよい。
【図２０】細胞で発現したヒトＣＤ１３７及びカニクイザルＣＤ１３７に対する、フローサイトメトリーによって測定された、様々なＣＤ１３７抗体の結合を示す。
【図２１】ヒト／マウスＣＤ１３７キメラの概観（マウス配列＝黒色の列、ヒト配列＝白色の列）を示す。
【図２２】ＣＤ１３７Ｌ結合を遮断する能力を評価した実施例の結果を示す。１００％の結合は、遮断の不在を反映する。１００％未満のシグナルは、結合の遮断を反映する（抗体濃度は左から右に０．２５、２．５、及び２５μｇ／ｍｌ）。
【図２３】ＩＦＮγの放出によって測定された、単一特異性ＣＤ１３７抗体がＣＤ８Ｔ細胞を刺激する能力を示す。
【図２４】二重ＥＬＩＳＡの結果を示す。ＣＤ１３７をＥＬＩＳＡウェルにコーティングし、二重特異性抗体を様々な濃度で加えた。ビオチン化ＣＴＬＡ−４を使用して、結合を検出した。
【図２５】１．５ｎＭのＣＤ１３７−ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはＣＴＬＡ−４結合性のみを有するアイソタイプ対照で刺激したヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞から測定された上清中のＩＦＮγレベルを示す。アッセイは、ＣＴＬＡ−４ありまたはなしで、ＣＤ３でコーティングされたプレート上で行った。
【図２６】ＣＤ１３７−ＣＴＬＡ４二重特異性抗体（様々な濃度のもの）またはＣＴＬＡ−４結合性のみを有するアイソタイプ対照で刺激したヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞から測定された上清中のＩＦＮγレベルの全希釈曲線を示す。アッセイは、ＣＴＬＡ−４ありのＣＤ３でコーティングされたプレート上で行った。
【図２７】様々な濃度における、単独及び組み合わせでの単一特異性ＣＴＬＡ−４（ＣＴＬＡ−４結合部分すなわちドメインを有する対照ＩｇＧ）及びＯＸ４０（１１６６／１１６７）結合分子によるＡＤＣＣの誘導を、ＣＴＬＡ−４及びＯＸ４０を標的とする例示的な二重特異性抗体によって誘導されたＡＤＣＣと比較して示す。
【図２８】ＣＴＬＡ−４とＯＸ４０との両方を発現するＣＨＯ細胞を、漸減濃度の１１６６／１２６１か、または２つの単一特異性バインダー１１６６／１１６７（ＯＸ４０特異性モノクローナル抗体）及びＣＴＬＡ−４結合部分を有する対照ＩｇＧ（単一特異性ＣＴＬＡ４結合ＩｇＧ融合タンパク質）（２００ｎＭ〜０，００３４ｎＭ）、続いてＰＥ共役抗ヒトＩｇＧで染色した。フローサイトメトリーを使用して、蛍光を検出した。「対照ＩｇＧ」は、陰性アイソタイプ対照である。
【図２９】ＨＥＫ−ＣＴＬＡ４及びＣＨＯ−ＯＸ４０を、それぞれＰＫＨ２６及びＰＫＨ６７で染色し、１１６６／１２６１、または２つの単一特異性ＯＸ４０結合分子とＣＴＬＡ−４結合分子との組み合わせ（１１６６／１１６７及びＣＴＬＡ−４結合部分を有する対照ＩｇＧ）と共にインキュベートした。フローサイトメトリー（代表的な実験）を使用して、二重陽性／凝集細胞の割合を数量化した。
【図３０】投与後の様々な時点で測定した、二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体１１６６／１２６１、及び単一特異性ＯＸ４０抗体１１６６／１１６７の血漿レベル。２つの異なるＥＬＩＳＡ方法、すなわち、ＯＸ４０をウェルにコーティングし、結合を検出するために抗Ｆｃを使用したＥＬＩＳＡ−１と、ＯＸ４０をウェルにコーティングし、検出のためにビオチン化ＣＴＬＡ−４を使用したＥＬＩＳＡ−２とを使用した。
【図３１】０日目に、ＨＴ−２９結腸癌細胞（４×１０６）を右下側腹部／背に皮下接種した。ヒトＰＢＭＣ細胞（７×１０６）を同日に腹腔内投与した。６日目、１３日目、及び２０日目に、腹腔内注射（６６７ｎｍｏｌ／用量）によって処置を行った。Ｎ（マウス）＝５／ドナー、ｎ（ドナー＝４）、ＨＴ２９レスポンダーからのプールデータ。
【０３４８】
配列の説明
配列番号１は、ヒトＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ００６９８．１に対応する）。
配列番号２は、ヒトＣＤ２８のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５１９４４．１に対応する）。
配列番号３は、Ｎ末端から２３アミノ酸のシグナル配列を除外した、ヒト野生型ＣＤ８６のモノマー細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４は、Ｎ末端のシグナル配列を含む、ヒト野生型ＣＤ８６のモノマー細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列である（図４参照）。本明細書におけるアミノ酸位置の付番は全て、Ｎ末端から始まる配列番号４における位置に基づく。したがって、配列番号３のＮ末端におけるアラニンは、２４番である。
配列番号５は、Ｐｅａｃｈら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，ｖｏｌ  ２７０（３６），２１１８１−２１１８７）に開示されるヒトＣＤ８６の細胞外ドメインの変異型のアミノ酸配列である。野生型配列の７９位におけるＨは、配列番号５の配列で対応する位置においてＡで置換されている。この変化は、本明細書ではＨ７９Ａと称される。本明細書において言及される他のアミノ酸置換についても、同等の命名法が一貫して使用される。位置の付番は、上記に概説された配列番号４に基づく。
配列番号６〜２４は、本発明の特定のタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２５〜４３は、それぞれ、配列番号６〜２４のそれぞれのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４４は、ヒトＣＤ８６の全長アミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＫ４１９３１．１に対応する）。
配列番号４５は、マウスＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列である（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９７９３．１に対応する）。
配列番号４６は、マウスＣＤ２８のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３７３９５．１に対応する）。
配列番号４７〜５０は、本発明の二重特異性ポリペプチドにおいて使用され得る様々なリンカーである。
配列番号５１は、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００３３１８．１に対応する）。
配列番号５２〜８８は、本明細書において開示される抗ＯＸ４０抗体の例示的なＣＤＲ配列である。
配列番号８９〜１２４は、本明細書において開示される抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の例示的なアミノ酸配列ならびにヌクレオチド配列である。
配列番号１２５〜１３４は、本明細書において開示される二重特異性ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列及びヌクレオチド配列である。
配列番号１３５は、例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号１３６は、例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号１３７は、ヒンジ領域（１０８位）にＳｅｒからＰｒｏへの、そしてＣＨ３領域（３１５位）にＨｉｓからＡｒｇへの変異を有する、修飾された例示的なヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域配列である。変異は、血清半減期の低減、及び、ＩｇＧ４をより安定にし、Ｆａｂアーム交換を防止する、ＩｇＧ４のコアヒンジを安定化をもたらす。
配列番号１３８は、例示的な野生型ヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域配列である。これは、配列番号１３７の変異を欠いている配列である。
配列番号１３９は、ヒンジ領域（１０８位）にＳｅｒからＰｒｏへの単一の変異を有する、修飾された例示的なヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域配列である。変異は、ＩｇＧ４をより安定にし、Ｆａｂアーム交換を防止する、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化をもたらす。
配列番号１４０は、配列番号１３７のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なｃＤＮＡ配列（すなわちイントロンを欠いているもの）である。
配列番号１４１は、配列番号１３７のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列（すなわちイントロンを含むもの）である。
配列番号１４２は、配列番号１３８のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なｃＤＮＡ配列（すなわちイントロンを欠いているもの）である。
配列番号１４３は、配列番号１３８のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列（すなわちイントロンを含むもの）である。
配列番号１４４は、本発明の二重特異性ポリペプチドにおいて使用され得るリンカーである。
配列番号１４５及び１４６は、それぞれ、配列番号１３５のＩｇＧ１定常領域をコードする例示的なｃＤＮＡ配列及びゲノムＤＮＡ配列である。
配列番号１４７は、配列番号１３６の軽鎖カッパ領域をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
配列番号１４８は、ヒトＣＤ１３７のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ０６１９６．１に対応する）。
配列番号１４９〜１７４は、本明細書において開示される例示的な二重特異性抗体のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列である。
配列番号１７５は、配列番号１３９のＩｇＧ４領域をコードする例示的なｃＤＮＡ配列（すなわちイントロンを欠いているもの）である。
配列番号１７６は、配列番号１３９のＩｇＧ４領域をコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列（すなわちイントロンを含むもの）である。
配列番号１７７〜１９６は、本明細書において開示される抗ＣＤ１３７抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の例示的なアミノ酸配列ならびにヌクレオチド配列である。
配列番号１９７〜２０６は、本発明の例示的な二重特異性ポリペプチドである。
配列番号２０７〜２２６は、ＣＤ１３７結合ドメインの例示的なＣＤＲ配列に対応する（配列番号８０及び８１も同様である）。
【０３４９】
表（配列）
表Ａ（１）−例示的な重鎖ＣＤＲ配列（ＯＸ４０抗体）
【表２】
2018520650.tif 000008
表Ａ（２）−例示的な軽鎖ＣＤＲ配列（ＯＸ４０抗体）
【表３】
2018520650.tif 000009
表Ｂ−例示的な配列（ＯＸ４０抗体）
【表４−１】
2018520650.tif 000010
【表４−２】
2018520650.tif 000011
【表４−３】
2018520650.tif 000012
【表４−４】
2018520650.tif 000013
【表４−５】
2018520650.tif 000014
【表４−６】
2018520650.tif 000015
【表４−７】
2018520650.tif 000016
【表４−８】
2018520650.tif 000017
【表４−９】
2018520650.tif 000018
【表４−１０】
2018520650.tif 000019
表Ｃ−ヒトＣＤ８６のドメインの例示的な変異形
【表５−１】
2018520650.tif 000020
【表５−２】
2018520650.tif 000021
表Ｄ−ＯＸ４０及びＣＴＬＡ−４に対する例示的なポリペプチド
【表６−１】
2018520650.tif 000022
【表６−２】
2018520650.tif 000023
【表６−３】
2018520650.tif 000024
【表６−４】
2018520650.tif 000025
【表６−５】
2018520650.tif 000026
【表６−６】
2018520650.tif 000027
【表６−７】
2018520650.tif 000028
【表６−８】
2018520650.tif 000029
【表６−９】
2018520650.tif 000030
【表６−１０】
2018520650.tif 000031
表Ｅ−Ｂ２−ＣＴＬＡ−４をコードする例示的なポリヌクレオチド
【表７−１】
2018520650.tif 000032
【表７−２】
2018520650.tif 000033
【表７−３】
2018520650.tif 000034
【表７−４】
2018520650.tif 000035
【表７−５】
2018520650.tif 000036
【表７−６】
2018520650.tif 000037
表Ｆ−例示的な配列
【表８−１】
2018520650.tif 000038
【表８−２】
2018520650.tif 000039
【表８−３】
2018520650.tif 000040
【表８−４】
2018520650.tif 000041
【表８−５】
2018520650.tif 000042
【表８−６】
2018520650.tif 000043
【表８−７】
2018520650.tif 000044
【表８−８】
2018520650.tif 000045
【表８−９】
2018520650.tif 000046
【表８−１０】
2018520650.tif 000047
【表８−１１】
2018520650.tif 000048
【表８−１２】
2018520650.tif 000049
【表８−１３】
2018520650.tif 000050
【表８−１４】
2018520650.tif 000051
【表８−１５】
2018520650.tif 000052
【表８−１６】
2018520650.tif 000053
【表８−１７】
2018520650.tif 000054
【表８−１８】
2018520650.tif 000055
【表８−１９】
2018520650.tif 000056
【表８−２０】
2018520650.tif 000057
【表８−２１】
2018520650.tif 000058
【表８−２２】
2018520650.tif 000059
【表８−２３】
2018520650.tif 000060
【表８−２４】
2018520650.tif 000061
【表８−２５】
2018520650.tif 000062
表Ｇ−例示的な配列
【表９−１】
2018520650.tif 000063
【表９−２】
2018520650.tif 000064
【表９−３】
2018520650.tif 000065
【表９−４】
2018520650.tif 000066
【表９−５】
2018520650.tif 000067
【表９−６】
2018520650.tif 000068
表Ｈ−例示的なＣＤ１３７結合ドメインならびにＣＤ１３７及びＣＴＬＡ−４に対する二重特異性ポリペプチド
【表１０−１】
2018520650.tif 000069
【表１０−２】
2018520650.tif 000070
【表１０−３】
2018520650.tif 000071
【表１０−４】
2018520650.tif 000072
【表１０−５】
2018520650.tif 000073
【表１０−６】
2018520650.tif 000074
【表１０−７】
2018520650.tif 000075
【表１０−８】
2018520650.tif 000076
【表１０−９】
2018520650.tif 000077
【表１０−１０】
2018520650.tif 000078
【表１０−１１】
2018520650.tif 000079
【表１０−１２】
2018520650.tif 000080
表Ｉ（１）−例示的なＣＤ１３７のＣＤＲ配列
【表１１】
2018520650.tif 000081
表Ｉ（２）−例示的なＣＤ１３７のＣＤＲ配列
【表１２】
2018520650.tif 000082
他の配列
配列番号１（ヒトＣＴＬＡ−４）
【化６】
2018520650.tif 000083
配列番号２（ヒトＣＤ２８）
【化７】
2018520650.tif 000084
配列番号３
【化８】
2018520650.tif 000085
配列番号４
【化９】
2018520650.tif 000086
配列番号５
【化１０】
2018520650.tif 000087
配列番号４４（ヒトＣＤ８６）
【化１１】
2018520650.tif 000088
配列番号４５（マウスＣＴＬＡ−４）
【化１２】
2018520650.tif 000089
配列番号４６（マウスＣＤ２８）
【化１３】
2018520650.tif 000090
配列番号５１（ヒトＯＸ４０）
【化１４】
2018520650.tif 000091
配列番号１４０
【化１５】
2018520650.tif 000092
配列番号１４１
【化１６】
2018520650.tif 000093
配列番号１４２
【化１７】
2018520650.tif 000094
配列番号１４３
【化１８】
2018520650.tif 000095
【化１９】
2018520650.tif 000096
配列番号１４５
【化２０】
2018520650.tif 000097
配列番号１４６
【化２１】
2018520650.tif 000098
配列番号１４７
【化２２】
2018520650.tif 000099
配列番号１４８（ヒトＣＤ１３７、アミノ酸配列：＞ｇｉ｜５７１３２１｜ｇｂ｜ＡＡＡ５３１３３．１｜４−１ＢＢ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］）
【化２３】
2018520650.tif 000100
配列番号１７５
【化２４】
2018520650.tif 000101
配列番号１７６
【化２５】
2018520650.tif 000102
【化２６】
2018520650.tif 000103
【実施例】
【０３５０】
本発明は以下の実施例によってさらに例証されるが、実施例は、さらなる限定と解釈されるべきではない。本明細書全体に引用される全ての図ならびに全ての参考文献、特許、及び公開特許出願の内容は、参照によって本明細書に明示的に援用される。
【０３５１】
実施例１−ＣＴＬＡ−４結合ドメイン
ＣＴＬＡ−４結合ドメインポリペプチドを選択し、ＷＯ  ２０１４／２０７０６３（実施例参照）に記載のように発現させ、後述のＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴のうちの少なくとも１つによって、ＣＴＬＡ−４に対する結合をアッセイした。
【０３５２】
結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェルの平底高結合性プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５０７４番）を、４℃で一晩インキュベートすることによって、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、３０Ｒ−ＣＤ１５２番）またはＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、３４２−ＣＤ）のいずれかでコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ、０９−９４１０−１００番）、次にＰＢＳＴ＋３％のＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、１．１２０１８．０１００番）中でブロッキングした。プレートを再度洗浄し、試料または対照（２００から０，００１μｇ／ｍｌに１／５段階希釈したもの）をウェルに加えた。試料を室温で１時間インキュベートし、次に洗浄した。検出抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３５−０９８番）を添加し、その後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３７０６９番）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出した。ＣＴＬＡ４とＣＤ２８との両方について、ＥＣ５０値を計算した。結合比（ＥＣ５０結合比＝［ＣＤ２８に対するＥＣ５０］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０］）を各ポリペプチドについて計算したものを、表１．１に示す。
【０３５３】
表面プラズモン共鳴
従来のアミンカップリングを使用して、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、３０Ｒ−ＣＤ１５２番）またはＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、３４２−ＣＤ）のいずれかを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサチップ、ＣＭ５に固定化した。ＣＤ８６変異体分子及び対照（１００から１．５ｎＭに１／２段階希釈したもの）を、３０μｌ／ｍｌの流量でＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ、ＢＲ−１００３−６８）中での結合について分析した。会合を３分間、そして解離を１０分間追跡した。再生は、５ｍＭのＮａＯＨを３０秒間使用して２回行った。動態パラメータ及び親和定数は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェアを使用して計算した（表１．３）。
【０３５４】
阻害ＥＬＩＳＡ
９６ウェルの平底プレート高結合性プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５０７４番）を、４℃で一晩インキュベートすることによって、野生型ＣＤ８６−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、７６２５−Ｂ２番）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ、０９−９４１０−１００番）、次にＰＢＳＴ＋３％のＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、１．１２０１８．０１００番）中でブロッキングした。この試料（ＣＤ８６変異体または野生型タンパク質；３００００から０．３ｎｇ／ｍｌに１／４段階希釈したもの）を、ビオチン化ＣＴＬＡ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、３０Ｒ−ＣＤ１５２番）と共に室温で１時間インキュベートし、次にこの混合物を、ＥＬＩＳＡプレートのブロッキングしたウェルに加えた。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、２１１２６番）を用いて検出を行い、その後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３７０６９番）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出した。その結果を図２に示す。ＩＣ５０値を計算したものを、以下の表に示す。試験した全ての分子が、野生型とＨ７９Ａとの両方よりも良好なＩＣ５０値を示し、最良の変異体ＣＤ８６分子のＩＣは、野生型を比較して１００倍超向上した。例示的な分子９００、９０１、９０４、９０６、９０７、９０８、９１０、９１５、及び９３８の結果を表１．１に示す。Ｋｄ結合比＝［ＣＤ２８に対するＫｄ］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＫｄ］である。例示的な分子９００、９０１、９０４、９０６、９０７、９０８、９１０、９１５、及び９３８の完全なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号６〜１４として提供される。
表１．１
【表１３】
2018520650.tif 000104
【０３５５】
例示的な分子１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、及び１０４７の結果を、表１．２及び１．３、ならびに図２及び３に示す。例示的な分子１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、及び１０４７の完全なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１５〜２４として提供される。
表１．２
【表１４】
2018520650.tif 000105
表１．３
【表１５】
2018520650.tif 000106
【０３５６】
実施例２−クローン１０４０からの例示的なポリペプチドのマウスＣＴＬＡ−４に対する交差反応性
阻害ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用して、例示的な変異体ＣＤ８６分子１０４０のマウス及びヒトのＣＴＬＡ−４に対する相対親和性を調査した。これらの実験で使用した１０４０分子は、二重特異性分子の一部として抗ＣＤ４０抗体と共役させた。ＣＤ８６分子のＣＴＬＡ−４結合特性は、この共役による影響を受けていない（データ図示せず）。
【０３５７】
簡潔に述べると、９６ウェルの平底プレート高結合性プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５５０７４番）を、４℃で一晩インキュベートして、ヒトＣＴＬＡ−４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０，０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ０９−９４１０−１００番）、次にＰＢＳＴ＋３％のＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、１．１２０１８．０１００番）中でブロッキングした。
【０３５８】
この試料（例示的なＣＤ８６変異体）を、異なる濃度（３００００から０．３ｎｇ／ｍｌへの１／４段階希釈）で、可溶性ビオチン化ヒトＣＴＬＡ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ３０Ｒ−ＣＤ１５２番）または可溶性マウスＣＴＬＡ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、室温で１時間プレインキュベートした。
【０３５９】
次にこの混合物を、ＥＬＩＳＡプレートのブロッキングしたウェルに加えた。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、２１１２６番）を用いて検出を行い、その後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３７０６９番）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出した。その結果を図５に示す。マウス及びヒトのＣＴＬＡ−４で観察された阻害曲線は、ＣＴＬＡ−４の２つの形態に対する例示的なＣＤ８６変異体（１０４０）の結合親和性が、同様の規模であることを実証する。実施例１で試験した他のクローンもまた、マウスＣＴＬＡ−４に結合することが見出された（データ図示せず）。
【０３６０】
実施例３−ＯＸ４０抗体の特性評価
例示的なＯＸ４０抗体の特徴を、以下の表３．１に要約する。
表３．１
【表１６】
2018520650.tif 000107
【０３６１】
２つの抗ＯＸ４０抗体を、これらの実験における比較を目的とする参照抗体として使用するためだけに合成した。本明細書において、それらはそれぞれ、「７２」または「７２／７６」、及び「７４」または「７４／７８」と呼称される。
【０３６２】
表面プラズモン共鳴による動力学定数の測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、３３５８＿ＯＸ番）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサチップ、ＣＭ５に固定化した。試験した抗体及び対照（１００から２ｎＭに１／３または１／２段階希釈したもの）を、３０μｌ／ｍｌの流量でＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ、ＢＲ−１００３−６８番）中での結合について分析した。会合を３分間、そして解離を２０分間追跡した。再生は、５０ｍＭのＮａＯＨを６０秒間使用して２回行った。動態パラメータ及び親和定数は、ベースラインがドリフトしている状態での１：１のＬａｎｇｍｕｉｒモデルを使用して計算した。試験した抗体は、全体として、様々なオン速度及びオフ速度でサブナノモル〜ナノモルの範囲内にあった（図６及び表３．１）。抗体のほとんどは、５ｎＭ未満の親和性を有した。動態パラメータ及び親和定数は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェアを使用して計算した。
【０３６３】
ＥＬＩＳＡによるヒト及びマウスのＯＸ４０に対する結合、ならびにＣＤ１３７及びＣＤ４０に対する結合のＥＬＩＳＡによる測定
ＥＬＩＳＡプレートを、０．１もしくは０．５μｇ／ｍｌのヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、３３８８−ＯＸ）、ＣＤ４０（Ａｎｃｅｌｌ）、またはＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで洗浄し、次に室温で１時間にわたりＰＢＳＴ＋２％  ＢＳＡでブロッキングし、次にＰＢＳＴで再度洗浄した。これらの抗体を段階希釈して、室温で１時間にわたりＥＬＩＳＡプレートに加え、次にＰＢＳＴで洗浄した。室温で１時間インキュベートしたヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ＨＲＰを使用して、結合を検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔを基質として使用し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【０３６４】
試験した全てのＯＸ４０抗体がヒトＯＸ４０に結合し、１ｎＭ未満のＥＣ５０値を示した。これらの抗体は、マウスＯＸ４０または試験した他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーには結合しなかった（データ図示せず）。
【０３６５】
ＣＨＯ細胞で過剰発現したヒトＯＸ４０に対する結合の測定
ヒトＯＸ４０の細胞外部分を、ｈＣＤ４０の膜貫通及び細胞内部分に融合させ、ｐｃＤＮＡ３．０にクローニングした。その後、ベクターを、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。ＯＸ４０の発現を、市販のＯＸ４０抗体（ｈｕＯＸ４０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に４℃で３０分間インキュベートすることによって確認し、次に、４℃で３０分間、ａ−ｈｕＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。アッセイのために、トランスフェクト細胞を試験抗体及び対照と共に４℃で３０分間インキュベートし、次に、４℃で３０分間、ａ−ｈｕＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーによって細胞を分析した。
【０３６６】
全てのクローンが、ＣＨＯ細胞で過剰発現したｈＯＸ４０に、用量依存性様式で結合した（図７）。
【０３６７】
実施例４−ＯＸ４０抗体の配列分析
各抗体について、重鎖と軽鎖との両方の可変領域のＣＤＲ配列を分析した。表４．１は、ＶＨ  ＣＤＲ３配列について行った分析を例証する。表４．１中の位置は、ＩＭＧＴ付番方式に従って定義される。以下のパターンが特定された。
【０３６８】
ＶＨ領域は全て、以下を含む：
（ａ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｆ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ／Ａ」を含む、重鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）８アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｉ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｔ」を含む、重鎖ＣＤＲ２配列、及び、
（ｃ）９〜１７アミノ酸の長さであり、「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｆ／Ｖ／Ｄ、Ｇ／Ｙ／Ｐ／Ｆ、−／Ｈ／Ｓ、−／Ｎ／Ｄ／Ｈ、−／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ、−／Ｙ、−／Ｗ／Ａ／Ｖ、−／Ａ／Ｙ、−／Ｄ／Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｈ／Ｎ、Ｙ／Ｓ／Ｗ／Ａ／Ｔ、Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ、Ｄ、Ｙ」のコンセンサス配列を含む、重鎖ＣＤＲ３配列。
【０３６９】
ＶＬ領域は全て、以下を含む：
（ａ）配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」から成る軽鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）配列「Ａ、Ａ、Ｓ」から成る軽鎖ＣＤＲ２配列、
（ｃ）８〜１０アミノ酸の長さであり、コンセンサス配列「Ｑ，Ｑ、Ｓ／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ／Ｈ／Ｇ、−／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｔ、Ｐ／Ｌ、Ｙ／Ｓ／Ｈ／Ｌ／Ｆ、Ｔ」を含む、軽鎖ＣＤＲ３配列。
【０３７０】
重鎖ＣＤＲ３のコンセンサス配列内で、２つのサブファミリーが特定された。第１のサブファミリーにおける各抗体は、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１０アミノ酸の長さのＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む。このファミリーの抗体は、ファミリーＺと称され、表４．１にあるように特定される。第２のサブファミリーにおける各抗体は、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸の長さのＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む。このファミリーの抗体は、ファミリーＰと称され、表４．１にあるように特定される。ファミリーＺまたはＰの抗体が好ましい。ファミリーＰのＶＨ配列を有する抗体は、典型的には、「Ｑ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｙ、Ｔ」のＣＤＲ３配列、ＣＤＲ１配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」、及び「Ａ、Ａ、Ｓ」のＣＤＲ２配列を有するＶＬ配列も含む。したがって、これら３つのＣＤＲ配列を含むＶＬ領域を有する抗体が好ましい。
表４．１
【表１７】
2018520650.tif 000108
【０３７１】
実施例５−ＯＸ４０抗体のドメインマッピング
ＯＸ４０の細胞外部分は４つのドメインから成り、これらのドメインのそれぞれは、２つのモジュールに細分することができる。標準的な試験室技術を使用して、ＯＸ４０ヒト／マウスキメラの遺伝子を合成した。ヒトＯＸ４０のドメインまたはモジュールを対応するマウスＯＸ４０と交換することによって、様々なキメラを設計した。これらのキメラは、ヒト配列及びマウス配列の評価ならびにヒトＯＸ４０の３Ｄ調査に基づいて設計した。合成した遺伝子に、プロジェクト固有のＩＤ番号を割り当てた（表５．１参照）。これらの構築物をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【０３７２】
これらのマウス／ヒトキメラを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３７Ｃ、８％  ＣＯ２、１３５ｒｐｍで４８時間インキュベートしたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、ヒトＯＸ４０抗体、ヒトＯＸ４０Ｌ（ｈＯＸ４０Ｌ、ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスＯＸ４０Ｌ（ｍＯＸ４０Ｌ、ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び対照と共に、４℃で３０分間インキュベートし、次に、４℃で３０分間、ａ−ｈｕＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を分析した。異なるキメラ構築物に対する結合を、アイソタイプ対照の結合と比較した相対（平均蛍光強度）ＭＦＩとして計算した。結果を表５．２に示す。
【０３７３】
試験したヒトＯＸ４０抗体のいずれも、マウスＯＸ４０に結合しない。したがって、所与の抗体が特定のキメラに結合しなければ、これにより示されるのは、その抗体が、そのキメラにおいてマウスドメインに置き換えられているドメインのうちの１つに対して特異的であるということである。
表５．１
キメラ構築物の同一性
【表１８】
2018520650.tif 000109
少なくとも４つの別々の結合パターンが特定された。
【０３７４】
パターンＡ：
抗体１１７０／１１７１、１５２４／１５２５、及び１５２６／１５２７は、同様の結合パターンを示し、結合のために同じドメイン内の残基に依存する。結合のために非常に重要なアミノ酸残基は、ドメイン２内のモジュールＢ、及びドメイン２のモジュールＡ内に位置する可能性が高い。ＣＤＲＨ３ファミリー「Ｚ」の抗体の過半数は、パターンＡに従って結合し（１１６６／１１６７は例外である）、この種類のＣＤＲＨ３を有する抗体がこのエピトープに結合しやすいことを示している。
【０３７５】
パターンＢ：
抗体１１６８／１１３５、１５４２／１１３５、１５２０／１１３５、１４９０／１１３５、１４８２／１４８３、及び１１６４／１１３５は、同様の結合パターンを示し、結合のためにドメイン３内に位置する残基に主に依存する。ＣＤＲＨ３ファミリー「Ｐ」の全ての抗体がこのパターンで結合し、ＣＤＲＨ３配列における類似性が共通の結合エピトープを明らかにすることを実証している。
【０３７６】
パターンＣ：
抗体１１６６／１１６７は独特の結合パターンを有し、結合のためにドメイン２内のモジュールＡ及びモジュールＢ内に位置する残基に依存する可能性が高い。しかしながら、結合を破壊するためには両方のモジュールが同時に交換されなければならず、構造的に複雑なエピトープが示唆される。
【０３７７】
パターンＤ：
抗体１５１４／１５１５は独特の結合プロファイルを示し、結合のためにドメイン２内のモジュールＢ内に位置するアミノ酸に大部分は依存する可能性が高い。
【０３７８】
参照抗体７２はパターンＢに従って結合する。ヒトＯＸ４０リガンドの結合パターンは、パターンＣと同様である。
表５．２
ドメインマッピング実験の結果
【表１９】
2018520650.tif 000110
【０３７９】
実施例６−Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａとの交差反応性
Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来のＯＸ４０の細胞外部分を、ｈＣＤ４０の膜貫通及び細胞内部分に融合させ、ｐｃＤＮＡ３．０にクローニングした。その後、ベクターを、ＨＥＫ細胞に安定にトランスフェクトした（ｍａｃＯＸ４０−ＨＥＫ）。
【０３８０】
ＯＸ４０の発現を、市販のＯＸ４０抗体（ｈｕＯＸ４０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に４℃で３０分間インキュベートすることによって確認し、次に、４℃で３０分間、ａ−ｈｕＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。アッセイのために、トランスフェクト細胞を試験抗体及び対照と共に４℃で３０分間インキュベートし、次に、４℃で３０分間、ａ−ｈｕＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーによって細胞を分析した。
【０３８１】
以下の表６．１に示すように、試験した抗体は、ヒトＯＸ４０に対して達成されたものに匹敵するＥＣ５０値でＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ  ＯＸ４０に結合し、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａが毒性研究で使用するのに好適であることが示唆される。
【０３８２】
Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａはＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）と遺伝的に酷似しているため、カニクイザルも毒性研究に好適な種である可能性が非常に高い。
表６．１
ヒト及びサルＯＸ４０に対する結合（９５％の信頼区間）
【表２０】
2018520650.tif 000111
【０３８３】
実施例７−ヒトＴ細胞アッセイにおける作動薬活性
ＭｉｌｔｅｎｙｉのＴ細胞ネガティブセレクションキットにより、血液バンク（Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から得た白血球フィルタからのＰＢＭＣから、ヒトＴ細胞を得た。ＯＸ４０抗体を、９６ウェルの培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｕ字型プレート（３７９９番）の表面にコーティングし、３μｇ／ｍｌの固定化された抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）と、５μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）との組み合わせと共に培養した。抗ＣＤ３は、４℃で一晩事前にコーティングした。翌日、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＯＸ４０抗体を３７℃で１〜２時間コーティングした。３７℃、５％  ＣＯ２の加湿チャンバにおける７２時間のインキュベーション後、上清中のＩＬ−２レベルを測定した。
【０３８４】
ヒトＴ細胞を刺激してＩＬ−２を産生させる抗体の能力を参照抗体７４と比較し、相対的な活性を図８に示す。抗体の過半数が、参照抗体と匹敵するＴ細胞活性化レベルをもたらした。いくつかの抗体は、より高いレベルのＴ細胞活性化をもたらした。
【０３８５】
二重特異性分子
続く実施例では、試験した二重特異性分子は、番号、例えば１１６４／１１４１によって参照される。これが意味するのは、その分子が、表Ｂ及びＤに示されるそれぞれのＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列を含むということである。例えば、１１６４／１１４１は、表Ｂに示される重鎖ＶＨ領域配列１１６４（配列番号９９）と、表Ｄに示される二重特異性鎖１１４１番（配列番号１２９）とを含む。所与の分子の規定のＶＨ領域配列は、典型的には、配列番号１３５のＩｇＧ１重鎖定常領域配列に（単一の連続したポリペプチド鎖の一部として）連結された状態で提供される。この配列は、典型的には、表Ｂの規定のＶＨ領域配列のＣ末端に存在する。
【０３８６】
実施例８−単一の標的への結合に対する例示的な二重特異性分子の親和性
表面プラズモン共鳴による動力学定数の測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、３３５８＿ＯＸ番）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサチップ、ＣＭ５に固定化した。試験した抗体及び対照（１００から２ｎＭに１／３または１／２段階希釈したもの）を、３０μｌ／ｍｌの流量でＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ、ＢＲ−１００３−６８番）中での結合について分析した。会合を３分間、そして解離を２０分間追跡した。再生は、５０ｍＭのＮａＯＨを３０秒間使用して２回行った。動態パラメータ及び親和定数は、ベースラインがドリフトしている状態での１：１のＬａｎｇｍｕｉｒモデルを使用して計算した。試験した分子は、対応するモノマー抗体よりも概して低いＯＸ４０に対する親和性と共に、様々なオン速度及びオフ速度を有したが、依然としてナノモル範囲内であった（表８．１）。
表８．１
【表２１】
2018520650.tif 000112
【０３８７】
ＥＬＩＳＡによる測定
ＥＬＩＳＡプレートを、それぞれ０．４または０．５μｇ／ｍｌの、ＣＴＬＡ−４を有するヒト（ＢＭＳ、Ｏｒｅｎｃｉａ）またはヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、３３８８−ＯＸ）でコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで洗浄し、次に室温で１時間にわたりＰＢＳＴ＋２％  ＢＳＡでブロッキングし、次にＰＢＳＴで再度洗浄した。二重特異性分子を段階希釈してプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、室温で１時間にわたりヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ＨＲＰを使用して、結合を検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔを基質として使用し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【０３８８】
試験した全ての二重特異性分子が両方の標的に結合し、ＥＣ５０値は、単一特異性抗体としてのそれらの親和性に基づいて期待される範囲内である（図９）。
【０３８９】
実施例９−例示的な二重特異性分子の両方の標的に対する二重結合
表面プラズモン共鳴による測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、３３５８＿ＯＸ番）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサチップ、ＣＭ５に固定化した。試験した二重特異性分子（０．５μＭまたは０．２５μＭ）及び対照を、３０μｌ／ｍｌの流量でチップ上に流した。会合を３分間、そして解離を３分間追跡した。次にＣＴＬＡ４−Ｆｃ（ＢＭＳ、Ｏｒｅｎｃｉａ）を注入し、会合を３分間、そして解離を３分間追跡した。対照として、ＣＴＬＡ４の代わりにブランクＰＢＳを注入した。
【０３９０】
図１０）に示されるように、試験した全ての二重特異性分子が、両方の標的に同時に結合した。
【０３９１】
ＥＬＩＳＡによる測定
ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩、ＯＸ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、３３５８＿ＯＸ番）（０．４μｇ／ｍｌ）でコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで洗浄し、次に室温で１時間にわたりＰＢＳＴ＋２％  ＢＳＡでブロッキングし、次にＰＢＳＴで再度洗浄した。二重特異性分子を希釈してプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ビオチン化ＣＴＬＡ−４（１μｇ／ｍｌ）を加え、プレート上で室温においてインキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを結合の検出のために使用した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔを基質として使用し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【０３９２】
試験した全ての二重特異性分子について、両方の標的に対する結合が確認された。図１１に示されるように、試験した二重特異性分子は、０．０１５μｇ／ｍｌに対応する０．１ｎＭの濃度で検出されることができた。アッセイにおける相対値は、表面プラズモン共鳴により測定された親和性とよく対応する。
【０３９３】
実施例１０−ヒトＣＤ４Ｔ細胞アッセイにおける例示的な二重特異性分子の作動薬活性
血液バンク（Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から得た白血球フィルタからのＰＢＭＣのＣＤ４Ｔ細胞ネガティブセレクション（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット１３０−０９６−５３３）によって、ヒトＣＤ４Ｔ細胞を単離した。ＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ、２．５μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ−１、１ｕｇ／ｍｌ）を、４℃で一晩、９６ウェルの培養プレート（組織培養処理されていないＵ字型９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＶＷＲ  ７３８−０１４７番）の表面にコーティングした。ＣＴＬＡ−４とＣＤ３との両方でコーティングすることにより、このアッセイは、ＣＴＬＡ−４が過剰発現した腫瘍微小環境の実験モデルを提供する。ＣＴＬＡ−４は、対照としていくつかのウェルから省略した。
【０３９４】
試験対象の二重特異性分子を、段階希釈で溶解させてウェルに加え、同じモル濃度で対照と比較した。試験した各二重特異性分子について、２つの異なる対照を使用した。第１の対照は、１７５６／１７５７と呼称される二重特異性分子である（１０４０  ＣＴＬＡ４結合領域に融合したアイソタイプ対照抗体、つまりＣＴＬＡ４には結合するがＯＸ４０には結合しない）。第２の対照は、試験した二重特異性分子に対応する、二重特異性１７５６／１７５７対照と単一特異性ＯＸ４０抗体との混合物である。３７℃、５％  ＣＯ２の加湿チャンバにおける７２時間のインキュベーション後、上清中のＩＬ−２レベルを測定した。
【０３９５】
図１２に示されるように、ＣＴＬＡ−４でコーティングされたプレートで培養するとヒトＴ細胞活性化の増加（ＩＬ−２産生の増加によって測定される）を誘導する、二重特異性分子の用量依存性作用が存在する。対照はこれに当てはまらない。図１３は、ＣＴＬＡ−４の存在下または非存在下において、二重特異性抗体及び対照について固定濃度（１．５ｎＭ）で行った場合の、同じアッセイの結果を示す。Ｔ細胞活性化の増加は、ＣＴＬＡ−４の非存在下では見られない。対応する単一特異性分子の組み合わせと比較した、各二重特異性分子によって誘導されたＩＬ−２レベルの倍変化を、表１０．１に示す。各二重特異性分子または対照について産生されたＩＬ−２の平均値（ｐｇ／ｍｌ）を、表１０．２に示す。
【０３９６】
このアッセイは、ＣＴＬＡ−４が過剰発現した腫瘍微小環境の実験モデルとなるため、その結果は、試験した二重特異性分子が、かかる微小環境内で単一特異性抗体よりも高い作用を有すると期待され得ることを示唆する。
表１０．１
対応物と比較した、二重特異性分子によって誘導されたＩＬ−２レベルの倍変化
【表２２】
2018520650.tif 000113
１．５ｎＭにおける単一特異性分子の組み合わせ
表１０．２．
１．５ｎＭの二重特異性抗体または対照で誘導された平均ＩＬ−２レベル（ｐｇ／ｍｌ）
【表２３】
2018520650.tif 000114
【０３９７】
実施例１１−例示的な二重特異性分子の安定性
抗体の融点を、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）によって分析した。ＰＢＳ中の抗体試料を、１０００倍に希釈したＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅと混合した。２５〜９５℃の熱走査を実時間ＰＣＲ機で行い、１度毎に測定を行った。参照抗体２５０／２５１を比較のために使用し、参照と比べた溶融温度Ｔｍの差（ΔＴｍ）を決定した。参照と比較して１．１℃超のＴｍの差は、統計的に有意と見なされる。表１１．１に示されるように、試験した全ての二重特異性分子が、６５℃以上の値で良好な熱安定性を示した。
表１１．１
【表２４】
2018520650.tif 000115
【０３９８】
実施例１２−ＣＤ１３７抗体の特性評価
例示的なＣＤ１３７抗体（１２０４／１２０５と称される）の全体的な化学特性を日常的な分析で決定したものを、表１２．１に示す。
表１２．１
【表２５】
2018520650.tif 000116
【０３９９】
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサチップ、ＣＭ５に固定化した。試験した抗体及び対照（１０から０．６３ｎＭに１／２段階希釈したもの）を、３０μｌ／ｍｌの流量でＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ、ＢＲ−１００３−６８番）中での結合について分析した。会合を５分間、そして解離を１５分間追跡した。再生は、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７を３０秒間使用して２回行った。動態パラメータ及び親和定数は、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒモデルを使用して計算した。代表的例として、１２０４／１２０５抗ＣＤ１３７抗体は、低いナノモル範囲の親和性を有する。表１２．２を参照されたい。
表１２．２
【表２６】
2018520650.tif 000117
【０４００】
組換えヒトＣＤ１３７に対するＣＤ１３７  ｍＡｂの結合をサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５５０７４番）を、４℃で一晩または３７℃で１時間、０．５μｇ／ｍｌ、あるいは０．０５μｇ／ｍｌの組換えヒトＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ８３８−４Ｂ番）でコーティングした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、ＰＢＳＴ＋１％のＢＳＡでブロッキングした。試験対象のＣＤ１３７抗体を段階希釈系列で加え、次に、ＰＢＳＴで洗浄する前に室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＳＴＡＲ１２７Ｐ番）を使用して結合を検出し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａを使用して測定したＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ  ３７０６９番）を用いて展開した。２〜６つの別々の実験において様々なｍＡｂのＥＣ５０値を決定した。
【０４０１】
代表的例として、１２０４／１２０５抗ＣＤ１３７抗体は、この方法によって評定したときにおよそ０．３ｎＭのＥＣ５０値を有する。表１２．３を参照されたい。
表１２．３．
【表２７】
2018520650.tif 000118
【０４０２】
ＣＨＯ細胞で過剰発現したヒトまたはカニクイザルのＣＤ１３７に対する結合の測定
ヒトまたはカニクイザルのＣＤ１３７の細胞外部分を、ｈＣＤ４０の膜貫通及び細胞内部分に融合させ、ｐｃＤＮＡ３．０にクローニングした。その後、ベクターを、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。ＣＤ１３７の発現を、市販のＣＤ１３７抗体（ｈｕＣＤ１３７−ＰＥ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５５９５６番）と共に４℃で３０分間インキュベートすることによって確認した。
【０４０３】
アッセイのために、トランスフェクト細胞を試験抗体及び対照と共に４℃で少なくとも１時間インキュベートして、結合を飽和させた。抗体内部移行を最低限に抑えるため、０．０５％のアジ化ナトリウムをインキュベーション緩衝液中に使用し、全ての作業を氷上で行った。４℃で３０分間インキュベートした抗ｈＩｇＧ−ＰＥ抗体（１０９−１１５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、検出を達成した。染色直後に、パラホルムアルデヒド溶液（１０倍濃縮ＢＤ  ＣｅｌｌＦＩＸ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３４０１８１番）で細胞を固定した。ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリーによって細胞を分析した。各試料の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を決定し、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して用量応答データを分析した。ＭＦＩデータをＧｒａｐｈ  Ｐａｄに当てはめるために、ＭＦＩデータを各抗体に対して正規化し、ここで、各抗体の用量滴定において０％が最低値と定義され、１００％が最高値であった。
【０４０４】
ヒト及びカニクイザルのＣＤ１３７に対する結合を、例示的な抗体１２０４／１２０５に関する２つの別々の実験で確認した。結合親和性は、カニクイザル及びヒトのＣＤ１３７間で酷似していた（図１４、表１２．４）。
表１２．４
正規化されたデータの２つの実験からの平均として決定されたＥＣ５０に対する９５％の信頼区間。
【表２８】
2018520650.tif 000119
【０４０５】
ヒトＴ細胞アッセイにおけるＣＤ１３７抗体の作動薬活性
初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に基づくＴ細胞アッセイにおいて、ＣＤ１３７  ｍＡｂの作動薬活性を評価した。簡潔に述べると、製造元のプロトコルに従ったＭＡＣＳ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  １３０−０９６−４９５番）によって、ＣＤ８＋Ｔ細胞をヒト末梢血単核細胞から分離させた。抗ＣＤ３  ｍＡｂ（クローンＯＫＴ３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６−００３７番）で事前にコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮｕｎｃＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２６８２００番）において細胞をインキュベートし、試験対象のＣＤ１３７  ｍＡｂの濃度を滴定した。７２時間または９６時間のインキュベーションの後、培養培地を採取し、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ  ５５５１４２番）によってＩＦＮ−γレベルを決定した。各クローンを複数のドナーで分析し、参照ＣＤ１３７  ｍＡｂである１１１／１１２及びアイソタイプ対照（６２／６３）と比較した。
【０４０６】
ドナー内変動が大きかったため、刺激指数（ＳＩ、アイソタイプ対照と比較したｍＡｂによる倍誘導（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ））を各試料につき決定し、参照抗体１１１／１１２の刺激指数に正規化した。
【０４０７】
例示的な１２０４／１２０５抗体は、参照抗体１１１／１１２に匹敵するか、またはそれと比較してより良好であった、Ｔ細胞の活性化を誘導した。８つのドナーの正規化された平均ＳＩ±ＳＤが、図１５に表されている。表１２．５は、ＣＤ１３７刺激により誘導された絶対ＩＦＮ−γレベルを示す。
表１２．５
様々なｍＡｂによって誘導されたＩＦＮ−γ産生レベル
【表２９】
2018520650.tif 000120
配列情報
ＶＨ  ＣＤＲ１＝ＧＦＴＦＳＳＹＹ（配列番号２０７）
ＶＨ  ＣＤＲ２＝ＩＧＳＹＹＧＹＴ（配列番号２１２）
ＶＨ  ＣＤＲ３＝ＡＲＡＹＹＤＹＮＹＹＹＡＹＦＤＹ（配列番号２１７）
ＶＬ  ＣＤＲ１＝ＱＳＩＳＳＹ（配列番号８０）
ＶＬ  ＣＤＲ２＝ＡＡＳ（配列番号８１）
ＶＬ  ＣＤＲ３＝ＱＱＳＶＰＨＹＰＦＴ（配列番号２２２）
表１２．６
【表３０】
2018520650.tif 000121
【０４０８】
実施例１３−ＣＤ１３７抗体のドメインマッピング
ＣＤ１３７の細胞外部分は４つのドメインから成り、これらのドメインは、２つのモジュールにさらに細分することができる。標準的な試験室技術を使用して、ＣＤ１３７ヒト／マウスキメラの遺伝子を合成した。ヒトＣＤ１３７のドメインまたはモジュールを対応するマウスＣＤ１３７と交換することによって、様々なキメラを設計した。これらのキメラは、ヒト配列及びマウス配列の評価ならびにヒトＣＤ１３７の３Ｄ調査に基づいて設計した。合成した遺伝子に、プロジェクト固有のＩＤ番号を割り当てた（表１３．１参照）。これらの構築物をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をＣＤ１３７抗体及び対照抗体と共にインキュベートし、続いて検出のために抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートし、ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。異なるキメラ構築物に対する結合を、アイソタイプ対照の結合と比較した相対ＭＦＩとして計算し、続いて、個々の抗体間の親和性の差の影響を最低限に抑えるために、全長ヒトＣＤ１３７構築物に正規化した。
【０４０９】
異なる構築物に対する例示的な抗体１２０４／１２０５の結合の結果を、表１３．２に示す。これらの結果によって示されるように、抗体１２０４／１２０５は、主にドメイン２に依存する。加えて、結合のいくらかの損失も構築物１５５５に見られ、ドメイン１の影響もまた示される。
表１３．１．
ドメインマッピングに使用されたＣＤ１３７構築物
【表３１】
2018520650.tif 000122
表１３．２
フローサイトメトリーによって測定された、異なるＣＤ１３７構築物に対する抗体１２０４／１２０５の結合。全長ヒトＣＤ１３７に正規化された、ｍＡｂ試料／アイソタイプ対照の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）。
【表３２】
2018520650.tif 000123
【０４１０】
二重特異性抗体
実施例１４−インビトロの例示的な二重特異性分子の作動薬活性
ネガティブセレクション（Ｐａｎ  Ｔ細胞単離キット、ヒト、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０−０９６−５３５）を使用して、フィコール分離したＰＢＭＣ（Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの血液バンクの白血球フィルタから得たもの）から、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を精製した。ＰＢＳで希釈した５０μｌの抗ＣＤ３（クローン：ＵＣＨＴ−１、ＢＤ、濃度：１μｇ／ｍｌ）を、４℃で一晩、組織培養処理されていないＵ字型９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＶＷＲ  ７３８−０１４７番）の表面にコーティングした。二重特異性抗ＯＸ４０／抗ＣＤ１３７ポリペプチドを、段階希釈してウェルに加え、対照と同じモル濃度で比較した。試験した各二重特異性分子について、２つの異なる対照を使用した。第１の対照は、ＧＦＰに対して特異的なアイソタイプ対照抗体である（１１８８−１１８７と呼称される）。第２の対照は、試験した二重特異性に対応する、単一特異性ＯＸ４０とＣＤ１３７抗体との混合物である。３７℃、５％  ＣＯ２の加湿チャンバにおける７２時間のインキュベーション後、上清中のＩＬ−２レベルを測定した。
【０４１１】
図１６Ａ〜Ｈに示されるように、抗ＣＤ３でコーティングされたプレートで培養するとヒトＴ細胞活性化の増加（ＩＬ−２産生の増加によって測定される）を誘導する、二重特異性分子の用量依存性作用が存在する。対照はこれに当てはまらない。図１７は、例示的な二重特異性抗体１１６４／１１３５−１２０４／１２０５及び対照について固定濃度（１ｎＭ）で行った場合の、同様のアッセイの結果を示す。このアッセイでは、フィコール密度分離を使用して、Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の血液バンクの白血球濃縮物から、ヒトＰＢＭＣを得た。ＰＢＳで希釈した５０μｌの抗ＣＤ３（クローン：ＵＣＨＴ−１、ＢＤ、濃度：１μｇ／ｍｌ）を、４℃で一晩、組織培養処理されていないＵ字型９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＶＷＲ  ７３８−０１４７番）の表面にコーティングした。二重特異性抗ＯＸ４０／抗ＣＤ１３７抗体１１６４／１１３５−１２０４／１２０５を溶解させてＰＢＭＣと一緒にウェルに加え、アイソタイプ対照１１８８−１１８７またはその対応する単一特異性ＯＸ４０及びＣＤ１３７抗体と同じモル濃度（１ｎＭ）で比較した。３７℃、５％  ＣＯ２の加湿チャンバにおける４８時間のインキュベーション後、上清中のＩＬ−２レベルを測定した。二重特異性抗体は、異なる細胞（ＰＢＭＣ）が混合した集団内であっても、対照よりも著しく高いＴ細胞活性化を誘導する。
【０４１２】
このアッセイは、ＯＸ４０とＣＤ１３７との両方が比較的過剰発現している腫瘍微小環境の実験モデルとなるため、その結果は、試験した二重特異性分子が、かかる微小環境内で単一特異性抗体よりも高い作用を有すると期待され得ることを示唆する。
【０４１３】
実施例１５−例示的な二重特異性分子の両方の標的に対する二重結合
ＥＬＩＳＡによる測定
ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩、ＯＸ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、３３８８＿ＯＸ番）（０．４μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）でコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで洗浄し、次に室温で１時間にわたりＰＢＳＴ＋２％のＢＳＡでブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、二重特異性抗体及び対照を５０ｎＭ〜６．４×１０−４ｎＭの様々な濃度で添加し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ビオチン化ＣＤ１３７−Ｆｃを（１μｇ／ｍｌで）添加し、プレート上で室温において１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを結合の検出（室温で１時間のインキュベーション）のために使用した。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、次にＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔを基質として使用し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａを製造元のプロトコルに従って使用して、発光を測定した。
【０４１４】
図１８に示されるように、試験した全ての二重特異性分子について、両方の標的に対する結合が確認された。二重特異性抗体のそれぞれは、８×１０−２ｎＭで検出可能であった。これらの二重特異性抗体はまた、アッセイを逆転させても（ＣＤ１３７をコーティングし、可溶性ビオチン化ＯＸ４０を検出に使用しても）両方の標的に結合する（データ図示せず）。
【０４１５】
実施例１６−Ａｌｌｉｇａｔｏｒ  ＧＯＬＤ（商標）ライブラリからのＣＤ１３７抗体の選択、及び試験したクローンの概説
ヒト抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリであるＡｌｌｉｇａｔｏｒ  ＧＯＬＤを使用して、ファージ提示選択を行った。ビーズもしくは管の表面上にコーティングされた、またはＣＤ１３７トランスフェクト細胞の表面上で発現した、可溶型の組換えＣＤ１３７に対する選択を行った。ＣＴＬＡ４−Ｆｃ及び無関係のＨｉｓタグ付きタンパク質を、選択において過度に含まれた非標的として使用した。各選択ラウンドの前に、ファージストックを、ビオチン化ベリグロビン、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、ビーズ、またはＣＤ１３７陰性細胞に対して事前選択して、非特異的バインダーを除去した。
【０４１６】
ファージ選択から特異的バインダーを特定するために、組換え標的（ＣＤ１３７−Ｆｃ）または非標的（ＣＴＬＡ４−Ｆｃ）タンパク質のいずれかでコーティングされたＥＬＩＳＡを使用して、およそ４５００個の個々のクローンをファージフォーマットでスクリーニングし、続いて、いくつかのクローンを可溶性ｓｃＦｖとして確認した。ＣＤ１３７に対して特異的な結合を示すクローンを配列決定し、さらなる特性評価のためのＩｇＧとして独特のクローンを産生させた。
【０４１７】
作動薬特性を有する５つのヒトＣＤ１３７抗体を特性評価したものを、本明細書に記載する（表１６．１に要約する）。試験した抗体は、機能的Ｔ細胞アッセイにおいて、臨床的に活性の参照抗体に匹敵する。エピトープドメインマッピング研究に基づいて、４つの異なる種類の抗体を特定した。ＣＤ１３７遮断抗体と非遮断抗体との両方を得た。
表１６．１
ＣＤ１３７抗体の概要
【表３３】
2018520650.tif 000124
【０４１８】
実施例１７−ＣＤ１３７抗体の特徴−ＥＬＩＳＡによって測定されたヒトＣＤ１３７に対する結合
組換えヒトＣＤ１３７に対するＣＤ１３７抗体の結合をサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔に述べると、組換えヒトＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ８３８−４Ｂ番）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５５０７４番）を、調査対象の様々なＣＤ１３７抗体の段階希釈物と共にインキュベートした。ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＳＴＡＲ１２７Ｐ番）を使用してＣＤ１３７抗体を検出し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ  ３７０６９番）を用いて展開した。複数の別々の実験において様々な抗体のＥＣ５０値を決定した。
【０４１９】
１８１１／１８１２及び１８１３／１８１４と呼称される２つの異なる参照抗体を、この研究に使用した。
【０４２０】
参照抗体１８１１／１８１２は、ＣＤ１３７のドメイン１に結合し、リガンドを遮断しないＣＤ１３７作動薬である。これは、その標的に高い親和性及び特異性で結合する。この配列を有する抗体は、臨床治験において評価されている。
【０４２１】
参照抗体１８１３／１８１４は、ＣＤ１３７上のドメイン３〜４に結合する抗体である。これは、その標的に高い親和性及び特異性で結合する。この配列を有する抗体は、臨床治験において評価されている。
【０４２２】
これらの抗体の過半数は、参照抗体の範囲と同様の範囲、すなわちｎＭ以下または低いｎＭのＥＣ５０値を示す。データを表１７．１に要約する。
表１７．１
ヒトＣＤ１３７に対してＥＬＩＳＡによって決定されたＡｌｌｉｇａｔｏｒ−ＧＯＬＤ由来ＣＤ１３７抗体のＥＣ５０値（ｎＭ）。
【表３４】
2018520650.tif 000125
【０４２３】
実施例１８−ＣＤ１３７抗体の特徴−フローサイトメトリーによって測定されたヒト及びカニクイザルのＣＤ１３７に対する結合
ヒト及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＣＤ１３７に対するＥＣ５０及び結合を、ヒトＣＤ１３７、カニクイザルＣＤ１３７、または空のベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のフローサイトメトリーを使用して決定した。ヒトまたはカニクイザルのＣＤ１３７の細胞外部分を、ヒトＣＤ４０の膜貫通及び細胞内部分に融合させ、ｐｃＤＮＡ３．０にクローニングした。その後、ベクターを、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。ＣＤ１３７の発現を、ＣＤ１３７抗体（ヒトＣＤ１３７−ＰＥ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５５９５６番）を４℃で３０分間使用したフローサイトメトリーによって確認した。ＣＤ１３７トランスフェクト細胞及び空ベクタートランスフェクト細胞を、ＣＤ１３７抗体と共に４℃で少なくとも１時間インキュベートして、結合を飽和させた。抗体内部移行を最低限に抑えるため、０．０５％のアジ化ナトリウムをインキュベーション緩衝液中に使用し、全ての作業を氷上で行った。４℃で３０分間インキュベートしたＰＥ共役抗ｈＩｇＧ抗体（１０９−１１５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ＣＤ１３７抗体を検出した。染色直後に、パラホルムアルデヒド溶液（１０倍濃縮ＢＤ  ＣｅｌｌＦＩＸ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３４０１８１番）で細胞を固定した。ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリーによって細胞を分析した。各試料の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を決定し、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して用量応答データを分析した。
【０４２４】
ＭＦＩデータを各抗体に対して正規化し、ここで、各抗体の用量滴定において０％が最低値と定義され、１００％が最高値である。２つの実験からのデータ（非線形回帰（曲線当てはめ）、０及び１００に設定された制約）に基づき、Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、ＥＣ５０及び９５％の信頼区間を計算した。
【０４２５】
ＣＨＯ−ｈｕＣＤ１３７、ＣＨＯ−ｃｙＣＤ１３７、及びＣＨＯ−ｐｃＤＮＡに対する結合を、２つの別々の実験で確認した（図２０）。全てのＣＤ１３７抗体が、２つの参照抗体１１８１／１８１２及び１８１３／１８１４に匹敵するＥＣ５０で、ヒトＣＤ１３７に比較的良好に結合する。全く結合しない参照抗体１８１１／１８１２と、結合が弱く完全飽和に達しないクローン１６２０／１６２１とを例外として、試験した全てのＣＤ１３７抗体が、カニクイザルＣＤ１３７に良好に結合する。結合パターンもまた、刺激された初代カニクイザルＰＢＬで確認した。
【０４２６】
ＥＣ５０の定量は、アッセイ間及びアッセイ内の変動を含めるために、試験した各ＣＤ１３７抗体に関する９５％の信頼区間として提示されている（表１８．１）。
表１８．１
正規化されたデータの２つの実験からの平均として決定された各ＣＤ１３７抗体のＥＣ５０に対する９５％の信頼区間。
【表３５】
2018520650.tif 000126
【０４２７】
実施例１９−ＣＤ１３７抗体の特徴−Ｂｉａｃｏｒｅによって測定された親和性
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサチップ、ＣＭ５に固定化した。試験した抗体及び対照（１０から０．６３ｎＭに１／２段階希釈したもの）を、３０μｌ／ｍｌの流量でＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ、ＢＲ−１００３−６８番）中での結合について分析した。会合を５分間、そして解離を１５分間追跡した。再生は、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７を３０秒間使用して２回行った。動態パラメータ及び親和定数は、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒモデルを使用して計算した。
【０４２８】
結果及び結論
抗体の親和性は、チップ表面にコーティングされたＣＤ１３７上に流した二価抗体を使用して測定して、ナノモルからサブナノモルの範囲内であった（表１９．１）。
表１９．１
表面プラズモン共鳴によって測定された動態パラメータ
【表３６】
2018520650.tif 000127
【０４２９】
実施例２０−ＣＤ１３７抗体の特徴−ＣＤ１３７抗体の標的特異性
他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー（ＣＤ４０及びＯＸ４０）に対するＣＤ１３７抗体の非特異性結合の定量を評価して、非標的タンパク質と交差反応する潜在的傾向を検出した。
【０４３０】
ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５５０７４番）を、３７℃で１時間、または４℃で一晩、ＰＢＳ中で０．５μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した、５０μｌ／ウェルの組換えヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  １４９３−ＣＤ番）、ＣＤ４０−Ｆｃ（Ａｎｃｅｌｌ  ５０４−８２０番）、またはＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ  ８３８−４Ｂ番）でコーティングした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴＷＥＥＮ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、続いてＰＢＳＴ＋１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。抗体試料を、ＰＢＳＴ＋１％のＢＳＡ中で１０から０．０１μｇ／ｍｌの１／１０段階希釈物として調製し、室温で１時間インキュベートし、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗ヒトカッパ軽鎖抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＳＴＡＲ１２７Ｐ番）を使用した検出を行い、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ  ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３７０６９番）を使用して展開した。
【０４３１】
結果及び結論
表２０．１
ＯＸ４０及びＣＤ４０に対するＣＤ１３７抗体の非特異性結合の概要
【表３７】
2018520650.tif 000128
【０４３２】
ＯＸ４０またはＣＤ４０に対するＣＤ１３７抗体の結合は検出されなかった。分析した抗体の概説及び２つの実験の結果を、表２０．１に示す。
【０４３３】
さらに、複数の血液ドナーからの初代ＰＢＬに対する結合を試験した。ＰＢＬに対する結合は、参照抗体と同様であった。関連性のある非標的タンパク質に対する非特異性結合は検出されなかった。
【０４３４】
実施例２１−ＣＤ１３７抗体の特徴−ＣＤ１３７に結合する抗体のドメインマッピング
トランスフェクト細胞の表面上で発現したヒト／マウスＣＤ１３７キメラのパネルに結合する各抗体の能力を、フローサイトメトリーによって分析した。
【０４３５】
ヒトＣＤ１３７のドメインまたはモジュールを対応するマウスドメインと交換することによって、キメラを設計した（図２１）。ＣＤ１３７ヒト／マウスキメラの遺伝子を合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、構築物をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をＣＤ１３７抗体及び対照抗体と共にインキュベートし、続いて検出のために抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートし、ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。異なるキメラ構築物に対する結合を、アイソタイプ対照の結合と比較した相対ＭＦＩとして計算し、続いて、個々の抗体間の親和性の差の影響を最低限に抑えるために、全長ヒトＣＤ１３７構築物に正規化した。
【０４３６】
結果及び結論
後述のように、６つの結合パターンを観察することができる。データを表２１．１に要約する。
【０４３７】
パターンＡ
抗体１６１８／１６１９は、ドメイン１に依存する。
【０４３８】
パターンＢ
抗体１２０４／１２０５は、主にドメイン２に依存する。加えて、結合のいくらかの損失も構築物１５５５に見られ、ドメイン１の影響もまた示される。
【０４３９】
パターンＣ
抗体１６２０／１６２１は、主にドメイン３Ｂ〜４Ａに依存するようである。しかしながら、全ての構築物で結合の損失が見られ、このパターンはパターンＤとかなり似たものとなっている。
【０４４０】
パターンＤ
抗体１２１４／１２１５及び１６２６／１６２７については、特定のＣＤ１３７ドメインへの明確な依存は実証され得なかった。むしろ、これらの抗体は、全てのキメラに対する結合の大規模な損失を示した。
表２１．１
ＣＤ１３７抗体のドメインマッピング。この表は、ヒトＣＤ１３７配列の一部がマウスＣＤ１３７配列と交換されている様々なＣＤ１３７構築物に対する相対的結合を示す。全長ヒトＣＤ１３７に正規化された、抗体試料／アイソタイプ対照の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）。
【表３８】
2018520650.tif 000129
【０４４１】
実施例２２−ＣＤ１３７抗体の特徴−ＣＤ１３７リガンド遮断
目的は、ＣＤ１３７抗体がＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）結合を遮断するかどうかを判定することであった。
【０４４２】
これまでのドメインマッピング実験では、ＣＤ１３７抗体は、ＣＤ１３７抗原の同様のサブドメインに対するそれらの結合に基づいて、異なる群に分割された。ＣＤ１３７抗体が、リガンド結合領域に近いエピトープに結合する場合、抗原への結合は、リガンド結合の部分的または完全な遮断につながり得る。ＣＤ１３７リガンド結合エピトープの近くへの結合は、ＣＤ１３７リガンド結合エピトープの立体障害または立体構造の変化に起因して、リガンド結合に影響を及ぼす場合もある。全てのＣＤ１３７抗体を、リガンド遮断特性の評価のために固定濃度のＣＤ１３７Ｌに対して滴定した。
【０４４３】
ヒトＣＤ１３７をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、リガンド競合のために使用した。ヒトＣＤ１３７の細胞外部分を、ｈＣＤ４０の膜貫通及び細胞内部分に融合させ、ｐｃＤＮＡ３．０にクローニングした。その後、ベクターを、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。ＣＤ１３７の発現を、ＣＤ１３７を標的とする市販の抗体を用いた染色によって確認した。
【０４４４】
＋４Ｃで１時間にわたり、既定の飽和濃度から用量を漸減（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ  ｄｏｗｎ）させながら（２５、２．５、及び０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣＨＯ−ｈｕＣＤ１３７をＣＤ１３７モノクローナル抗体と共にプレインキュベートし、その後、ＣＤ１３７リガンドをＥＣ５０の濃度で添加した。＋４Ｃでさらに３０分間にわたる共インキュベーションの後、細胞を洗浄し、結合したＣＤ１３７リガンドを抗ＦＬＡＧ−ＡＰＣ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出した。分析前に、パラホルムアルデヒド（１０倍濃縮ＢＤ  ＣｅｌｌＦＩＸ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を固定した。ＦＡＣＳｖｅｒｓｅを用いて分析を行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＭＦＩ（蛍光強度中央値）を計算した。
【０４４５】
結果及び結論
ＣＤ１３７Ｌ遮断実験は２回行った。試験した全てのＣＤ１３７  ｍＡｂがＣＤ１３７リガンド結合を遮断していたわけではないと結論することができる（表２２．１、図２２）。ドメイン２Ｂ〜４Ａに結合する、Ｂ群及びＣ群に属するＣＤ１３７  ｍＡｂ（１２０４及び１６２０）は、ＣＤ１３７Ｌを遮断していた。抗体１８１４はＣＤ１３７Ｌを遮断すると報告されているが、このことは、我々のＣＤ１３７Ｌ遮断アッセイでは立証できなかった。ドメイン１に結合したＡ群に属する１８１２及び１６１８は、ＣＤ１３７リガンドを遮断せず、むしろＣＤ１３７Ｌ結合を相乗的に増加させた。抗体１６２６及び１２１４は、行われた２つの実験においてＣＤ１３７Ｌを遮断しなかった。
表２２．１
ＣＤ１３７抗体の最大のＣＤ１３７リガンド競合、２つの実験の平均
【表３９】
2018520650.tif 000130
【０４４６】
実施例２３−ＣＤ１３７抗体の特徴−競合ＥＬＩＳＡ
各ＣＤ１３７抗体を互いに競合させることにより、同様のエピトープに対する抗体の結合を、それらの遮断パターンに基づいて決定することが可能である。競合ＥＬＩＳＡは、コーティングされたＣＤ１３７−Ｆｃに結合するときに非ビオチン化ＣＤ１３７抗体とビオチン化ＣＤ１３７抗体を共インキュベートすることによって行われる。競合とは、ビオチン化ＣＤ１３７抗体からのシグナルの損失と定義される。低い競合値は、抗体間の競合の不在または抗体の結合動態のいずれかに起因し得る。１つの抗体の結合は、他のＣＤ１３７抗体の結合に影響する抗原に結合するときの立体障害または立体構造の変化につながる場合もある。
【０４４７】
ＣＤ１３７抗体をビオチン化し（ＥＺ−ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ１３７−Ｆｃに対するインタクトな結合特性を、ビオチン化された抗ＣＤ１３７  ｍＡｂとビオチン化されていないものとの間でＥＣ５０を比較することによるＥＬＩＳＡを用いて検証した。非ビオチン化抗ＣＤ１３７（抗ＣＤ１３７）を、０．５時間にわたり、決定されたＥＣ５０よりも３０倍高い濃度で、ＣＤ１３７−Ｆｃに対してプレインキュベートした。洗浄せずに抗ＣＤ１３７−ビオを添加し、さらに１時間にわたり共インキュベートした。抗ＣＤ１３７−ビオの結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出した。競合は、その最大の競合（それ自体との競合）と比べて測定された他の抗体への結合を除すことによる相対数として計算した。得られた相対値を、最大遮断能力に対して正規化した（表２３．１）。
表２３．１
２つの実験からのＣＤ１３７抗体競合ＥＬＩＳＡの概要
値は、ＣＤ１３７−ビオとの競合％として表されている
【表４０】
2018520650.tif 000131
【０４４８】
結果及び結論
競合ＥＬＩＳＡは２回行った。両方の実験において、ＣＤ１３７  ｍＡｂのうちのいくつかは、それ自体と十分に競合しなかった。各抗体の相対競合値を正規化すると、競合パターンが現れた（表２３．１）。ドメインマッピングＡ群に属する抗体１８１２及び１６１８は、競合ＥＬＩＳＡにおいて独特のパターンを示した（Ｘ群）。分析した他のＣＤ１３７抗体は、同様の遮断パターンを有した（Ｙ群）。Ｙ群内の小さな変動がエピトープ結合の実際の差を反映するということは排除され得ないが、結合動態の差は、Ｙ群の抗体間の結合パターンのわずかな変動の一部を説明し得る。
【０４４９】
実施例２４−ＣＤ１３７抗体の特徴−ＣＤ１３７抗体のインビトロ効力
目的は、作動薬活性を有するＣＤ１３７抗体を特定することであった。
初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に基づくＴ細胞アッセイにおいて、ＣＤ１３７抗体の作動薬活性を評価した。簡潔に述べると、製造元のプロトコルに従ったＭＡＣＳ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  １３０−０９６−４９５番）によって、ＣＤ８＋Ｔ細胞をヒト末梢血単核細胞から分離させた。抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６−００３７番）で事前にコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮｕｎｃＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２６８２００番）において細胞をインキュベートし、試験対象のＣＤ１３７抗体の濃度を滴定した。７２時間または９６時間のインキュベーションの後、培養培地を採取し、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ  ５５５１４２番）によってＩＦＮ−γレベルを決定した。
【０４５０】
各クローンを少なくとも６つのドナーで分析し、参照ＣＤ１３７抗体である１８１１／１８１２及び陰性対照抗体と比較した。
【０４５１】
ドナー内変動が大きかったため、刺激指数（ＳＩ、陰性対照と比較した抗体による倍誘導）を各試料につき決定し、参照抗体１８１１／１８１２の刺激指数に正規化した。
【０４５２】
結果及び結論
参照１８１１／１８１２に匹敵する効力を有するいくつかのクローンが特定された（図２３参照）。
【０４５３】
表２４．１は、ＣＤ１３７刺激により誘導された絶対ＩＦＮ−γレベルを示す。しかしながら、全ての抗体を全てのドナーで付き合わせて分析したわけではなく、正規化されたＳＩは、効力の比較に対してより関連性がある。抗体はＩｇＧ１フォーマットで評価し、効力は、ウェルの表面にコーティングされた抗体を使用して測定したが、このことは、効力に影響を及ぼし得る。
表２４．１
様々な抗体によって誘導されたＩＦＮ−γ産生レベル。
【表４１】
2018520650.tif 000132
【０４５４】
二重特異性抗体
実施例２５−ＣＤ１３７及びＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−二重ＥＬＩＳＡにおける両方の標的に対する結合
目的：ＥＬＩＳＡを使用して、二重特異性抗体が両方の標的に結合する能力を評価し確認すること。
【０４５５】
材料及び方法
ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩、ｒｈＣＤ１３７−Ｆｃ（ｒｈ４−１ＢＢ、０．５μｇ／ｍｌ）でコーティングした。二重特異性抗体を希釈して添加し、ビオチン化ＣＴＬＡ−４（１μｇ／ｍｌ）、続いてＨＲＰ標識ストレプトアビジン（０．１６７μｇ／ｍｌ）の添加によって検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔを基質として使用し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【０４５６】
結果
このアッセイでは、二重特異性抗体は、およそ０．１ｎＭで検出され得、およそ０．５〜１ｎＭのＥＣ５０値を示した（図２４参照）。この結果は、二重特異性ＣＤ１３７−ＣＴＬＡ−４抗体が両方の標的に同時に結合し得ることを示す。
【０４５７】
実施例２６−ＣＤ１３７及びＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−ＣＴＬＡ−４を発現する細胞との関連における活性化能力
目的
ＣＴＬＡ−４を発現する細胞との関連において免疫細胞を活性化させる能力を判定すること。目的は、ＣＴＬＡ−４が存在するときにより高い活性化（効力及び力価）を達成することである。
【０４５８】
材料及び方法
血液バンク（Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から得た白血球フィルタからのＰＢＭＣのネガティブセレクション（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット、１３０−０９６−４９５）を使用して、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞を得た。ＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ、２．５μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３、３ｕｇ／ｍｌ）を、４℃で一晩、９６ウェルのＵ字型培養プレート（Ｎｕｎｃ、ＶＷＲ、７３８−０１４７番、組織培養処理なし）の表面にコーティングした。二重特異性抗体及び対照をウェルに加えた。３７℃、５％  ＣＯ２の加湿チャンバにおける９６時間のインキュベーション後、上清中のＩＦＮγレベルを測定した。
【０４５９】
結果
その結果（図２５、図２６）は、二重特異性抗体が、ＣＴＬＡ−４でコーティングされたプレートで培養したときにのみＴ細胞を活性化させることを示す。このインビトロアッセイは、ＣＴＬＡ−４が比較的過剰発現している腫瘍微小環境の状況の実験モデルとなる。したがって、その結果は、二重特異性抗体が、高レベルのＣＴＬＡ−４を有する環境、例えば腫瘍において、増加した作用を有することを暗示する。
【０４６０】
実施例２７−ＣＴＬＡ４及びＯＸ４０を標的とする例示的な二重特異性抗体によるＡＤＣＣの誘導における（単独または組み合わせの単一特異性抗体の作用と比較した）相乗作用
材料及び方法
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の評定
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体及びホタルルシフェラーゼの発現を推進するＮＦＡＴ応答エレメントを安定に発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｖ１５８変異形）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、ＡＤＣＣの評定におけるエフェクター細胞として使用した。９６ウェルの不透明な発光プレートの複製ウェルにおいて抗体を滴定し、エフェクター細胞と、ＯＸ４０とＣＴＬＡ４との両方を発現する標的細胞とを、５：１の比で添加した。３７℃、９５％  Ｏ２の加湿したインキュベータにおける６時間のインキュベーション後、培地対照ウェル（ブランクサブトラクション（ｂｌａｎｋ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）用）を含む全てのウェルにルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加え、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ）で発光を検出した。倍誘導された（Ｆｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ＡＤＣＣは、（標的溶解−ブランク）／（自発的溶解−ブランク）として計算した。トップ値は、Ｐｒｉｓｍ  ６．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したログ（作動薬）対応答（３つのパラメータ）曲線当てはめに基づいて計算した。
【０４６１】
抗体
●「１１６６／１１６７」＝単一特異性ＯＸ４０抗体
●「ＣＴＬＡ−４結合部分を有する対照ＩｇＧ」＝ＩｇＧタンパク質に融合した単一特異性ＣＴＬＡ４結合ドメイン
●「１１６６／１２６１」＝ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体（上述の単一特異性バインダーとして同一のＯＸ４０及びＣＴＬＡ−４結合部分を含有する）。
●「対照ＩｇＧ」＝陰性アイソタイプ対照
【０４６２】
結果
例示的な二重特異性抗体である１１６６／１２６１は、ＡＤＣＣの優れた誘導を示す
図２７に示されるように、検出可能なレベルのＡＤＣＣが、試験した全ての成分によって誘導された。陰性アイソタイプ対照は、ＡＤＣＣを全く誘導しなかった（データ図示せず）。最も注目すべきことに、二重特異性１１６６／１２６１抗体は、対照と比較して約１２３倍のＡＤＣＣを誘導した。単一特異性ＯＸ４０抗体（１１６６／１１６７）は、約２９倍のＡＤＣＣを誘導し、単一特異性ＣＴＬＡ−４結合ドメイン（６２／３７６）は、約１０倍のＡＤＣＣを誘導したが、２つの単一特異性成分の混合物（１１６６／１１６７＋６２／３７６）は、約３１倍のＡＤＣＣを誘導した。
【０４６３】
このように、ＯＸ４０及びＣＴＬＡ−４に結合する二重特異性分子によって、予想外かつ顕著な相乗作用が得られた。
【０４６４】
実施例２８−ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−ＯＸ４０とＣＴＬＡ４との両方を発現する細胞に対する特異的結合
背景
この研究の目的は、ＯＸ４０とＣＴＬＡ４との両方を発現する細胞に対する、１１６６／１２６１ならびに対応する単一特異性結合要素の結合効力及びＥＣ５０を、フローサイトメトリーを使用して判定することであった。二重特異性抗体は、ＯＸ４０とＣＴＬＡ４との両方に同時に結合するように設計される。この目的のために、対象の標的を安定に発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞を使用した。ＣＨＯ  Ｐ４細胞は、ＯＸ４０とＣＴＬＡ４との両方の高い発現レベルを有する。
【０４６５】
方法及び結果
最初に、ＯＸ４０とＣＴＬＡ４との両方を発現する二重トランスフェクトＣＨＯ細胞を、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって、両方の標的を高レベルで発現する細胞プールに分別した（ＣＨＯ  Ｐ４と示す）。ジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ）及びゼオシン（ｚｅｏｃｉｎｅ）の淘汰圧下で細胞を培養することにより、標的発現を安定に保った。トランスフェクトしていないＣＨＯ野生型細胞を対照として使用した。
【０４６６】
漸減濃度の１１６６／１２６１（ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体）か、または２つの単一特異性バインダー１１６６／１１６７（ＯＸ４０特異性モノクローナル抗体）及びＣＴＬＡ−４結合部分を有する対照ＩｇＧ（単一特異性ＣＴＬＡ４結合ＩｇＧ融合タンパク質）（２００ｎＭ〜０，００３４ｎＭ）、続いてＰＥ共役抗ヒトＩｇＧで、細胞を染色した。ＦＡＣＳｖｅｒｓｅ計器を使用して蛍光を検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して取得値を分析した。各染色につき、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を決定した。
【０４６７】
ＣＨＯ  Ｐ４の結合効力曲線を図２８（３つの実験のうちの代表的な１つ）に提示する。１１６６／１２６１は、ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４の発現が高い細胞に、１１６６／１１６７またはＣＴＬＡ−４結合要素を有する対照ＩｇＧよりも良好に結合する。これはおそらく、１１６６／１２６１が２つの標的に同時に結合可能であることの相加効果である。
【０４６８】
実施例２９−ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−フローサイトメトリーによって測定されたＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を発現する細胞の二重結合
目的
フローサイトメトリーを使用して凝集した細胞の数を測定することによって、細胞で過剰発現したＯＸ４０とＣＴＬＡ４との両方に対する１１６６／１２６１による同時結合を測定すること。
【０４６９】
材料及び方法
ＣＨＯ−ＯＸ４０細胞及びＨＥＫ−ＣＴＬＡ４細胞を、それぞれ蛍光染料ＰＫＨ−６７（緑色蛍光染料）、ＰＫＨ−２６（赤色蛍光染料）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で細胞内染色した。細胞集団が均質に染色されたことを確かめた後、細胞を混合し、１１６６／１２６１（ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体）、または２つのモノクローナル抗体１１６６／１１６７（単一特異性抗ＯＸ４０抗体）と、ＣＴＬＡ４結合ドメインを含む対照ＩｇＧとの組み合わせのいずれかと共にインキュベートした。染色後、細胞を直ちに固定し、ＦＡＣＳ−ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、凝集した二重陽性細胞の数を数量化した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６を使用して、データ分析及び非線形回帰を行った。
【０４７０】
結果及び結論
例示的な二重特異性抗体である１１６６／１２６１は、濃度の増加と共に、凝集した細胞の数を増加させる（図２９）（２つの実験のうちの代表的な１つ）。
【０４７１】
実施例３０−ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−マウスにおける薬物動態
材料及び方法
抗体
●１１６６／１２６１（ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体）
●１１６６／１１６７（ＯＸ４０を標的とする単一特異性対照抗体）
インビボ研究
Ｔａｃｏｎｉｃ’ｓ  Ｄｅｎｍａｒｋによる雌のＣ５７ＢＬ／６（７〜８週齢）マウスを実験に使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０４７２】
マウスに１００μｇの各抗体を腹腔内注射し、０時間後、１時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、７２時間後、及び１週間後に、伏在静脈を介してか、または殺処分（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）時に大静脈を介してかのいずれかで、血液をヘパリン処置管に引き入れた。各時点につき３匹のマウスを使用した。血液を２５００ｒｐｍで３０分間回転させ、血漿をさらなる分析のために−８０℃に凍結させた。
【０４７３】
１１６６／１２６１及び１１６６／１１６７の血漿中レベルの決定のためのアッセイ
２つの異なるアッセイを使用した。単一標的ＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ１）及び二重ＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ２）である。簡潔に述べると、これらのアッセイは、次のステップから成った。白色で高結合性の平底ＬＩＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ａｕｓｔｒｉａ）を、０．８μｇ／ｍＬのヒトＯＸ４０−Ｆｃ（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ，ＵＳＡ）で一晩コーティングした。洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）（Ｍｅｄｉｃａｇｏ，Ｓｗｅｄｅｎ）を追加したホスファターゼ緩衝食塩水）で洗浄した後、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、周囲室温（ＡＲＴ）で１時間にわたって振盪しながらウェルをブロッキングし、再度洗浄し、その後、アッセイ緩衝液（ＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡ）中で１：２００及び１：５０００に希釈した血漿試料を、検量線試料（１１６６／１２６１、濃度６〜０．００１２μｇ／ｍＬ）と一緒に添加した。振盪しながらＡＲＴで１時間インキュベートし、その後洗浄した後、二次試薬を１μｇ／ｍＬで添加し、この二次試薬は、単一標的ＥＬＩＳＡではヒト抗カッパ抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ共役体（ＨＲＰ）（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＵＫ）、またはビオチン化ヒトＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｏｒｅｎｃｉａ）のいずれかから成り、二重ＥＬＩＳＡでは、続いて、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＮ，ＵＳＡ）を製造元の指示に従って添加した。ＨＲＰ基質であるＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してシグナルを得た。振盪しながら暗所で１０分間インキュベーションした後に、Ｆｌｕｒｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ（ＭＢＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して発光測定値を収集した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを使用して、このデータを分析した。
【０４７４】
結果
１１６６／１２６１及び１１６６／１１６７の注射後の様々な時点で収集した試料を、それぞれ１１６６／１２６１及び１１６６／１１６７の血漿レベルの決定のために、単一標的ＥＬＩＳＡのみ、または単一標的ＥＬＩＳＡ及び二重ＥＬＩＳＡで分析した。その結果は、１１６６／１２６１及び１１６６／１１６７の血漿中のレベルが、腹膜注射後の最初の４時間あたりで上昇し、その後低下したことを示す（図３０の上パネル）。１１６６／１２６１と１１６６／１１６７との両方が検出可能なレベルで１週間後の血漿中に存在する（図３０の中央及び下のパネル）。
【０４７５】
１１６６／１２６１の血漿中のレベルは、モノクローナル抗体１１６６／１１６７について得られたレベルと同様であり、１１６６／１２６１が、同等の単一特異性抗ＯＸ４０抗体の半減期に匹敵する良好な半減期をインビボで示すことが示される。
【０４７６】
参考文献
Ｈｅｍｅｒｌｅ  Ｔ．，Ｗｕｌｈｆａｒｄ  Ｓ．，Ｎｅｒｉ  Ｄ．，（２０１２）Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｄａｔａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ，２５，ｐｐ  ８５１−８５４。
【０４７７】
実施例３１−ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−ＨＴ−２９結腸がんモデルにおけるインビボ抗腫瘍作用
概要
ｈＰＢＭＣヒト化免疫不全マウス及びＨＴ−２９結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、１１６６／１２６１（ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体）の抗腫瘍作用を調査した。
【０４７８】
１１６６−１２６１は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を示した。
【０４７９】
材料及び方法
Ｔａｃｏｎｉｃ’ｓ  Ｄｅｎｍａｒｋによる雌のＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウス（６〜９週齢）を実験に使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０４８０】
ＨＴ−２９結腸がんは、ＡＴＣＣから取得し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。対数増殖中のＨＴ−２９細胞株を皮下注射した（０日目（Ｄ０）において４×１０６細胞／１００〜２００μＬ）。白血球濃縮物から単離したヒトＰＢＭＣ（７×１０６／２００μＬ）を同日に腹腔内注射した。６日目、１３日目、及び２０日目に腹腔内処置（６６７ｐｍｏｌ）を行った。
【０４８１】
白血球濃縮物は、Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから取得した。
【０４８２】
測径器を用いて腫瘍の幅、長さ、及び高さを測定し、それらから腫瘍体積を計算した（幅／２×長さ／２×高さ／２×パイ×（４／３））。腫瘍体積が２ｃｍ３に達する前、創傷時、またはマウスの健康に影響が及んだ場合、動物を殺処分した。
【０４８３】
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを使用したＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって分析した。参照抗体１８７４に応答したドナーを、レスポンダードナーと見なした。指数関数的な腫瘍成長期間中における最低で１０％の平均腫瘍抑制を、応答と見なした。
【０４８４】
結果
レスポンダードナー（２つの別々の実験からの４つのドナー）を移植したマウスから得たプールデータは、１２〜１６日目において、ビヒクル群（ＺＺ）と比較して１１６６／１２６１抗体で処置されたときの腫瘍成長の抑制という形態における統計的に有意な抗腫瘍効力を示した（ｐ＝０．０４６９対ｐ＝０．００７４、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック両側検定）。腫瘍体積の抑制率は、１１６６／１２６１では１０日目から２１日目の間で２２〜３６％の範囲であった（図３１及び表３１．１参照）。
【０４８５】
結論すると、ｈＰＢＭＣヒト化免疫不全マウス及びＨＴ−２９結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、１１６６／１２６１の抗腫瘍作用を調査した。１１６６／１２６１は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を示した。
表３１．１
統計分析及び腫瘍抑制率
【表４２】
2018520650.tif 000133
【０４８６】
実施例３２−ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−Ｒａｊｉリンパ腫モデルにおけるインビボ抗腫瘍作用
概要
ｈＰＢＭＣヒト化免疫不全マウス及びＲａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫の皮下腫瘍モデルを使用して、１１６６／１２６１（ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体）の抗腫瘍作用を調査した。
【０４８７】
１１６６／１２６１は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を示した。
【０４８８】
材料及び方法
Ｔａｃｏｎｉｃ’ｓ  Ｄｅｎｍａｒｋによる雌のＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウス（６〜９週齢）を実験に使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０４８９】
Ｒａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫は、ＡＴＣＣから取得し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。対数増殖中のＲａｊｉ細胞株を、バフィーコートから単離したヒトＰＢＭＣ（１０×１０６／２００μＬ）と一緒に皮下注射した（１０×１０６細胞）。０日目、７日目、及び１４日目に腹腔内処置（６６７ｐｍｏｌ）を行った。
【０４９０】
バフィーコートは、Ｋａｌｍａｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから取得した。
【０４９１】
測径器を用いて腫瘍の幅、長さ、及び高さのサイズを測定し、それらから腫瘍体積を計算した（幅／２×長さ／２×高さ／２×パイ×（４／３））。腫瘍体積が２ｃｍ３に達する前、創傷時、またはマウスの健康に影響が及んだ場合、動物を殺処分した。
【０４９２】
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを使用したＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって分析した。参照抗体１８７４に応答したドナーを、レスポンダードナーと見なした。指数関数的な腫瘍成長期間中における最低で１０％の平均腫瘍抑制を、応答と見なした。
【０４９３】
結果及び結論
応答したドナー、二重特異性１１６６／１２６１抗体を含む実験群から得たプールデータは、１４日目及び２１日目において、ビヒクルと比較して統計的に有意な抗腫瘍効力を示した（ｐ＝０．００６８及びｐ＝０，０２８８、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定）（表３２．１）。
表３２．１
統計分析及び腫瘍抑制率
【表４３】
2018520650.tif 000134
【図１】
2018520650.tif 000135
【図２】
2018520650.tif 000136
【図３】
2018520650.tif 000137
【図４】
2018520650.tif 000138
【図５】
2018520650.tif 000139
【図６】
2018520650.tif 000140
【図７−１】
2018520650.tif 000141
【図７−２】
2018520650.tif 000142
【図８】
2018520650.tif 000143
【図９】
2018520650.tif 000144
【図１０】
2018520650.tif 000145
【図１１】
2018520650.tif 000146
【図１２Ａ】
2018520650.tif 000147
【図１２Ｂ】
2018520650.tif 000148
【図１２Ｃ】
2018520650.tif 000149
【図１２Ｄ】
2018520650.tif 000150
【図１３】
2018520650.tif 000151
【図１４】
2018520650.tif 000152
【図１５】
2018520650.tif 000153
【図１６−１】
2018520650.tif 000154
【図１６−２】
2018520650.tif 000155
【図１６−３】
2018520650.tif 000156
【図１６−４】
2018520650.tif 000157
【図１７】
2018520650.tif 000158
【図１８】
2018520650.tif 000159
【図１９】
2018520650.tif 000160
【図２０】
2018520650.tif 000161
【図２１】
2018520650.tif 000162
【図２２】
2018520650.tif 000163
【図２３】
2018520650.tif 000164
【図２４】
2018520650.tif 000165
【図２５】
2018520650.tif 000166
【図２６】
2018520650.tif 000167
【図２７】
2018520650.tif 000168
【図２８】
2018520650.tif 000169
【図２９】
2018520650.tif 000170
【図３０】
2018520650.tif 000171
【図３１】
2018520650.tif 000172
【配列表】
2018520650000001.app
【国際調査報告】
2018520650.tif 000173
2018520650.tif 000174
2018520650.tif 000175
2018520650.tif 000176
2018520650.tif 000177
2018520650.tif 000178
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