(57)【要約】  本発明は、リポソームの製造方法であって、（１）被封入物質及びリン脂質を有機溶剤に溶解して有機相を得た後、前記有機相と水相とを混合してリポソーム供給液を得る工程と、（２）前記工程（１）で得られたリポソーム供給液をポリカーボネート膜により押し出す工程と、（３）凍結乾燥する工程とを含む、製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの製造方法であって、
（１）被封入物質及びリン脂質を有機溶剤に溶解して有機相を得た後、前記有機相と水相とを混合してリポソーム供給液を得る工程と、
（２）工程（１）で得られたリポソーム供給液をポリカーボネート膜により押し出す工程と、
（３）凍結乾燥する工程とを含む、製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法であって、
凍結乾燥保護剤を、前記工程（１）における前記水相に加え、又は前記工程（３）において凍結乾燥する前に加える、製造方法。
【請求項３】
リポソームの製造方法であって、
（１）被封入物質及びリン脂質を有機溶剤に溶解して有機相を得た後、前記有機相と水相とを混合してリポソーム供給液を得る工程と、
（２）工程（１）で得られたリポソーム供給液をポリカーボネート膜により押し出す工程と、
（３）注射用水を加え、ろ過滅菌し、分けて包装し、且つ凍結乾燥する工程とを含み、
その中で、凍結乾燥保護剤を、前記工程（１）における水相に加え、又は前記工程（３）においてろ過滅菌する前に加える、製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記被封入物質は、美西替康（Ｍｏｅｘｉｔｅｃａｎ：メシチカン）、ドセタキセル、パクリタキセル、アドリアマイシン、アンホテリシンＢ、タクロリムス、イリノテカン、アルプロスタジル、リスペリドン、シルデナフィル、リドカイン、フェンタニル、ブピバカイン、デキサメタゾン、トレプロスチニル、アフリバーセプト、フェブキソスタット、ナベルビン、セフピラミドナトリウム、イホスファミド、アムルビシン、フシダートナトリウム、セフメタゾールナトリウム、還元型グルタチオン、エダラボン、ガチフロキサシン、塩酸フルオキセチン、アルベンダゾール、ミトキサントロン、アルプラゾラム、バンコマイシン、セファクロル、セフィキシム、塩酸アンブロキソール、及びアトルバスタチンからなる群より選ばれる、製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記リン脂質は、卵黄ホスファチジルコリン、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、リン酸ジセチル、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジエルコイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジエルコイルホスファチジルエタノールアミン、及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミンからなる群より選ばれる１種以上であり、
好ましくは、前記リン脂質は、卵黄ホスファチジルコリン、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、及び水素添加大豆ホスファチジルコリンからなる群より選ばれる１種以上であり、
より好ましくは、前記リン脂質は、卵黄ホスファチジルコリンと水素添加大豆ホスファチジルコリンとの組み合わせであり、
さらに好ましくは、前記リン脂質は、卵黄ホスファチジルコリンと水素添加大豆ホスファチジルコリンとの組み合わせであり、その中で、卵黄ホスファチジルコリンと水素添加大豆ホスファチジルコリンとの重量比は３：１である、製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記工程（１）における前記有機溶剤は、無水エタノール、９５％のエタノール、メタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ブタノール、アセトン、メチルピロリドン、酢酸エチル、イソプロピルエーテル、及びエチルエーテルからなる群より選ばれる１種以上であり、
好ましくは、前記有機溶剤は、無水エタノール、９５％のエタノール、及びｔ−ブタノールからなる群より選ばれる、製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記工程（１）において前記被封入物質と前記リン脂質との重量比は、１：１〜５００であり、好ましくは１：１〜１００であり、より好ましくは１：１５〜５０であり、さらに好ましくは１：２０である、製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記工程（１）において前記被封入物質と前記有機溶剤との重量比は、１：１〜１００であり、好ましくは１：９〜５０であり、より好ましくは１：３０である、製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記水相は、水を主要成分として含んでおり、又は基本的に水から構成されており、例えば、脱イオン水、蒸留水、精製水、注射用水等であり、好ましくは、注射用水である、製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記水相は、金属イオンキレート剤をさらに含んでおり、前記金属イオンキレート剤は、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウムナトリウム、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン三酢酸三ナトリウム、及びＮ−ジ（２−ヒドロキシエチル）グリシンからなる群より選ばれる、製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記工程（１）において前記有機相と前記水相とを混合する際の温度は２５〜８０℃であり、好ましくは５５〜６５℃である、製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法であって、前記ポリカーボネート膜の孔径は０．１μｍ又は０．２μｍである、製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法であって、前記工程（２）において前記リポソーム供給液の温度は２５〜８０℃に制御し、好ましくは５５〜６５℃に制御する、製造方法。
【請求項１４】
請求項２〜１３のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記凍結乾燥保護剤は、マンニトール、グルコース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、及びトレハロースからなる群より選ばれる１種以上であり、
好ましくは、前記凍結乾燥保護剤は、スクロース、トレハロース、及びマンニトールからなる群より選ばれる１種以上であり、
より好ましくは、前記凍結乾燥保護剤は、スクロース、又はスクロースとマンニトールとの組み合わせから選ばれ、
さらに好ましくは、前記凍結乾燥保護剤は、スクロース、又はスクロースとマンニトールとの組み合わせから選ばれ、その中で、スクロースとマンニトールとの重量比は２：１である、製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記工程（１）において前記有機相は、抗酸化剤をさらに含んでおり、前記抗酸化剤は、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＣ、パルミチン酸アスコルビル、ｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール、ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン、酢酸トコフェロール、システイン、メチオニンからなる群より選ばれる１種以上である、製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記工程（３）において凍結乾燥する前にｐＨ調整剤を加えることができ、前記ｐＨ調整剤は、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、及びクエン酸ナトリウムからなる群より選ばれる、製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法で製造されたリポソームであって、
水又は水性溶剤を添加した後、前記リポソームを再構成し、再構成されたリポソームの粒径は５０〜４００ｎｍであり、好ましくは１００〜２５０ｎｍであることを特徴とする、リポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）  本願は２０１５年１２月８日に中華人民共和国国家知的財産局に出願された出願番号が２０１５１０８９７５５４．０である中国特許出願に基づく優先権及び利益を主張する。
【０００２】
本発明は、新規なリポソーム製造方法及び該方法により製造されたリポソームに関する。
【背景技術】
【０００３】
難水溶性又は水不溶性薬物の溶解度を向上させるために、このような薬物の製剤開発に、乳剤、ミセル及びリポソーム等の製剤技術は用いられる。しかしながら、乳剤及びミセル製剤には、いくつかの欠点を持っている。例えば、乳剤は熱力学的不安定性のシステムであり、貯蔵の期間おいて集積、融合、凝集、酸化、劣化分解（デグラデーション）、加水分解等の現象が起こしやすくなり、乳剤の質量及び薬物の効果を影響することになる。また、通常、ミセル製剤は、界面活性剤を用いてミセルを形成することにより薬物を可溶化させる。しかしながら、界面活性剤は、臨床に用いられる場合、有毒な副作用を生じ、過敏反応を引き起こして薬の安全性を影響しまう。リポソームは、薬物の生体内分布を変化させ、薬物の毒性を低減し、アレルギー反応や免疫反応を減軽し、薬物の放出を遅延させることができるが、従来の方法で得られたリポソーム製剤は、一般的に液体状態で熱力学不安定系に属し、安定性の低い問題が存在し、且つ封入率が低く、薬物が比較的に漏れしやすく、貯蔵の過程において細菌繁殖や沈降凝集が発生し、且つ粒径の制御が困難で粒径分布が広いである。凍結乾燥後、液体リポソームへ再構成させた場合でも、再構成されることは困難であり、再構成されたリポソームの粒径は非常に大きく、粒径分布は非常に広くなっている。
【０００４】
中国特許（専利）（特許番号：ＺＬ２０１１１０３５５７４７．５）には、下記式Ｉで表される化合物（美西替康（Ｍｏｅｘｉｔｅｃａｎ：メシチカン））ともいう）が開示された。
【化１】
2018536679.tif 000002
美西替康（Ｍｏｅｘｉｔｅｃａｎ：メシチカン）は、水及び水性媒体において不溶又は殆ど不溶であり、水難溶性薬物に属する。前記特許には、当該薬物を乳濁液、微細乳濁液やミセル製剤として調製すればよいことが記載された。しかしながら、発明人らは、当該薬物を乳濁液、微細乳濁液やミセル製剤として調製した後、安定性が非常に悪く、ミセル製剤の毒性がすごく大きくなることを見出した。したがって、水難溶性又は水不溶性薬物に適している新規な製剤及びその製造方法の開発は、差し迫った課題になっている。
【発明の概要】
【０００５】
一態様によれば、本発明は、ポソームの製造方法であって、
（１）被封入物質及びリン脂質を有機溶剤に溶解して有機相を得た後、前記有機相と水相とを混合してリポソーム供給液を得る工程と、
（２）工程（１）で得られたリポソーム供給液をポリカーボネート膜により押し出す工程と、
（３）凍結乾燥する工程とを含む、製造方法を提供する。
また、他の一態様によれば、本発明は、リポソームの他の製造方法であって、
（１）被封入物質及びリン脂質を有機溶剤に溶解して有機相を得た後、前記有機相と水相とを混合してリポソーム供給液を得る工程と、
（２）工程（１）で得られたリポソーム供給液をポリカーボネート膜により押し出す工程と、
（３）注射用水を加え、ろ過滅菌し、分けて包装し、且つ凍結乾燥する工程とを含み、
その中で、凍結乾燥保護剤を、工程（１）における水相に加え、又は工程（３）においてろ過滅菌する前に加える、製造方法をさらに提供する。
【０００６】
また、別の態様によれば、本発明は、上記製造方法で得られたリポソームであって、
水又は水性溶剤を添加した後、前記リポソームを再構成し、再構成されたリポソームの粒径は５０〜４００ｎｍであることを特徴とする、リポソームを提供する。
【０００７】
〔発明の詳細な説明〕
以下、それぞれ開示された実施形態を全体的に理解するために、具体的な詳細を含んで説明したが、当業者は、これらの詳細の一部又は複数の部分を用いずに他の方法、部品、材料などを用いても、これらの実施形態を実現することができると理解すべきである。
【０００８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全てにわたって、特に断らない限り、「含む／含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」のような用語、及びその英語の変形（例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」など）は、いずれも開放（オープンエンド）式の、包含式の意味、すなわち「…を含むがこれらに限定されない」として解釈されるべきである。
【０００９】
本明細書にわたって記載された「一実施形態」又は「実施形態」、或いは「別の実施形態では」又は「いくつかの実施形態では」とは、少なくとも１つの実施形態に、当該実施形態に記載の関連する具体的な参照要素、構造、又は特徴を含むことを意味する。したがって、明細書の全体にわたって異なる位置に記載の「一実施形態では」、「実施形態では」、「他の実施形態では」又は「いくつかの実施形態では」という語句は、必ずしも同じ実施形態を指すことではない。また、具体的な要素、構造又は特徴は、任意の適切な方式で１つ以上の実施形態の中に組み合せられる。
【００１０】
本発明の明細書及び添付の特許請求の範囲に用いられた単数形の冠詞「一」（「１つ（の）」、「１個（の）」）（英語の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などに相当する）は、特に断らない限り、複数の対象（オブジェクト）が含まれていると理解すべきである。したがって、例えば、前記「触媒」が含まれる反応には、１種の触媒、又は２種以上の触媒が含まれている。また、用語「又は（若しくは／或いは）」などは、特に断らない限り、通常「及び／又は」の意味を含んで用いられる。
【００１１】
一態様によれば、本発明は、リポソームの製造方法であって、
（１）被封入物質及びリン脂質を有機溶剤に溶解して有機相を得た後、前記有機相と水相とを混合してリポソーム供給液を得る工程と、
（２）工程（１）で得られたリポソーム供給液をポリカーボネート膜により押し出す工程と、
（３）凍結乾燥する工程とを含む、製造方法を提供する。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態では、凍結乾燥保護剤を、工程（１）における水相に加えてもよく、又は工程（３）における凍結乾燥する前に加えてもよい。
本発明のいくつかの実施形態では、工程（３）において凍結乾燥する前に、注射用水を加え、且つ分けて包装する。
本発明のいくつかの実施形態では、工程（３）において凍結乾燥する前に、注射用水を加え、ろ過滅菌し、その後分けて包装する。
【００１３】
また、他の一態様によれば、本発明は、リポソームの他の製造方法であって、
（１）被封入物質及びリン脂質を有機溶剤に溶解して有機相を得た後、前記有機相と水相とを混合してリポソーム供給液を得る工程と、
（２）工程（１）で得られたリポソーム供給液をポリカーボネート膜により押し出す工程と、
（３）注射用水を加え、ろ過滅菌し、分けて包装し、且つ凍結乾燥する工程とを含み、
その中で、凍結乾燥保護剤を、工程（１）における水相に加え、又は工程（３）においてろ過滅菌する前に加える、製造方法をさらに提供する。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態では、前記被封入物質は、薬物であってもよく、他の物質であってもよい。好ましくは、前記被封入物質は、薬物である。より好ましくは、前記被封入物質は、美西替康、ドセタキセル、パクリタキセル、アドリアマイシン、アンホテリシンＢ、タクロリムス、イリノテカン、アルプロスタジル、リスペリドン、シルデナフィル、リドカイン、フェンタニル、ブピバカイン、デキサメタゾン、トレプロスチニル、アフリバーセプト、フェブキソスタット、ナベルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、セフピラミドナトリウム、イホスファミド、アムルビシン、フシダートナトリウム、セフメタゾールナトリウム、還元型グルタチオン、エダラボン、ガチフロキサシン、塩酸フルオキセチン、アルベンダゾール、ミトキサントロン、アルプラゾラム、バンコマイシン、セファクロル、セフィキシム、塩酸アンブロキソール、及びアトルバスタチンからなる群より選ばれる。さらに好ましくは、前記被封入物質は、美西替康、ドセタキセル、パクリタキセル、タクロリムス、及びアルプラゾラムからなる群から選択される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態では、前記リン脂質は、卵黄ホスファチジルコリン、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｐｅｇｏｌ）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン（レシチン）、リン酸ジセチル、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジエルコイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジエルコイルホスファチジルエタノールアミン、及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミンからなる群より選ばれる１種以上である。好ましくは、前記リン脂質は、卵黄ホスファチジルコリン、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、及び水素添加大豆ホスファチジルコリンからなる群より選ばれる１種以上であり、より好ましくは、前記リン脂質は、卵黄ホスファチジルコリンと水素添加大豆ホスファチジルコリンとの組み合わせから選ばれ、さらに好ましくは、前記リン脂質は、卵黄ホスファチジルコリンと水素添加大豆ホスファチジルコリンとの組み合わせのうちの卵黄ホスファチジルコリンと水素添加大豆ホスファチジルコリンとの重量比が３：１である組み合わせから選ばれる。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態では、前記有機溶剤は、無水エタノール、９５％のエタノール、メタノール、プロパノール、トリクロロメタン、ジクロロメタン、ｔ−ブタノール、ｎ−ブタノール、アセトン、メチルピロリドン、酢酸エチル、イソプロピルエーテル、及びエチルエーテルからなる群より選ばれる１種以上である。好ましくは、前記有機溶剤は、無水エタノール、９５％のエタノール、及びｔ−ブタノールからなる群より選ばれる。より好ましくは、前記有機溶剤は無水エタノールである。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態では、被封入物質とリン脂質との重量比は１：１〜１：５００である。好ましくは、被封入物質とリン脂質との重量比は１：１〜１：１００である。より好ましくは、被封入物質とリン脂質との重量比は１：１５〜１：５０である。さらに好ましくは、被封入物質とリン脂質との重量比は１：２０である。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態では、被封入物質と有機溶剤との重量比は１：１〜１：１００である。好ましくは、被封入物質と有機溶剤との重量比は１：９〜１：５０である。より好ましくは、被封入物質と有機溶剤との重量比は１：３０である。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態では、前記水相は、水を主要成分として含んでおり、又は基本的に水から構成されており、例えば、脱イオン水、蒸留水、精製水、注射用水等であり、好ましくは、注射用水である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態では、前記有機相と水相とを混合する際の温度は２５〜８０℃である。好ましくは、有機相と水相とを混合する際の温度は、５５〜６５℃である。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態では、有機相と水相とは、窒素ガスの保護下で混合することができる。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態では、前記ポリカーボネート（Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）膜の孔径は、０．０１５、０．０３、０．０５、０．０８、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、２．０、３．０、５．０、８．０、１０．０、及び１２．０μｍからなる群より選ばれるものであり、好ましくは、０．１μｍ又は０．２μｍである。必要に応じて、ポリカーボネート膜の下に１層のポリエステル（Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ）膜をさらに加えてもよい。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態では、前記押し出すことは、大粒径のリポソームが前記膜を通過した後に小粒径のリポソームになることができる限り、任意の形態で押し出してもよく、当該工程では、供給液の温度を２５〜８０℃、好ましくは５５〜６５℃に制御する必要がある。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態では、前記凍結乾燥保護剤は、マンニトール、グルコース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、及びトレハロースからなる群より選ばれる１種以上である。好ましくは、前記凍結乾燥保護剤は、スクロース、トレハロース、及びマンニトールからなる群より選ばれる１種以上である。より好ましくは、前記凍結乾燥保護剤は、スクロース、及びスクロースとマンニトールとの組み合わせからなる群より選ばれる。さらに好ましくは、前記凍結乾燥保護剤は、スクロース、及びスクロースとマンニトールとの重量比が２：１である組み合わせからなる群より選ばれる。
【００２５】
必要に応じて、本発明のいくつかの実施形態では、工程（１）における前記有機相に抗酸化剤を加えてもよい。前記抗酸化剤は、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、パルミチン酸アスコルビル、ｔ−ブチルｐ−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、酢酸トコフェロール、システイン、及びメチオニンからなる群より選ばれる１種以上である。好ましくは、前記抗酸化剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム、ｔ−ブチルｐ−ヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、及び酢酸トコフェロールからなる群より選ばれる。より好ましくは、前記抗酸化剤は、ジブチルヒドロキシトルエン、及びピロ亜硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる。
【００２６】
必要に応じて、本発明のいくつかの実施形態では、工程（１）における前記水相に金属イオンキレート剤をさらに含んでもよい。前記金属イオンキレート剤は、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウムナトリウム、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン三酢酸三ナトリウム、及びＮ−ジ（２−ヒドロキシエチル）グリシンからなる群より選ばれる。好ましくは、前記金属イオンキレート剤は、エデト酸二ナトリウム、及びエデト酸カルシウムナトリウムからなる群より選ばれる。
【００２７】
必要に応じて、本発明のいくつかの実施形態では、工程（３）において凍結乾燥する前に、又は工程（３）において凍結乾燥保護剤を加えた後に、ｐＨ調整剤をさらに加えてもよい。前記ｐＨ調整剤は、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、及びクエン酸ナトリウムからなる群より選ばれる。好ましくは、前記ｐＨ調整剤は、塩酸及び水酸化ナトリウムからなる群より選ばれる。本発明のいくつかの実施形態では、ｐＨの調整範囲は２〜１０、好ましくは４〜７である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の製造方法で得られたリポソームは、それに水又は水性溶剤を加えた後に、迅速に再構成することができ、再構成されたリポソームの粒径は５０〜４００ｎｍ、好ましくは１００〜２５０ｎｍである。本発明のいくつかの実施形態では、粒径分散係数（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）は０．５以下、好ましくは０．２３以下である。
【００２９】
本発明の製造方法は、次のような利点、すなわち（１）製造プロセスが簡単であり、単に溶解、保温、混合、押出及び凍結乾燥等の工程のみを必要とし、工業的な大規模生産に特に適していることと、（２）凍結乾燥前のリポソーム供給液を０．２２μｍで過濾して除菌した後、無菌的に充填し、凍結乾燥し、工業的な生産に容易に実現でき、且つ製品が無菌であると確保されることと、（３）凍結乾燥されたリポソームが安定性にすぐれ、その粒径、含有量、関連物質、封入率等の重要な品質指標が０月目の場合に比べると、有意な変化がないことと、（４）凍結乾燥された製品に溶剤が殆ど残っていないこととのうちの１つ以上を持っている。
【００３０】
当該技術分野における従来の方法により製造されたリポソームに比べて、本発明の製造方法で得られたリポソームは、次のような利点、すなわち（１）封入率が高く（＞９９％）、貯蔵の過程において薬物が漏れなく、且つ封入率が低下しないことと、（２）本発明に係るリポソームは、ポリカーボネート膜により複数回押し出した後、粒径分布が狭くなり、分散係数が０．１８以下であり、リポソームの粒径や粒径分布を良好に制御することと、（３）一般的な製剤（例えば、ミセル製剤や乳剤等）に比べて、本発明に係るリポソームは、薬物製剤の毒性が低下し、生体内の特定の器官及び組織に集中して分布しており、標的性があり、薬物製剤の薬効が向上することが動物実験で裏付けられることと、（４）本発明に係るリポソームは固体であり、液体形態のリポソームに比べて安定性が有意に増加し、よりよい再現性があり、容易に再構成され、さらに容易に貯蔵及び運搬することとのうちの１つ以上を持っている。
【００３１】
本発明に係るリポソームは、通常のリポソーム、長期滞留型リポソーム（ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、感熱性リポソーム、免疫リポソーム、又は特殊効果を有する他のリポソームであってもよい。
【００３２】
本発明に係るリポソームは、任意の適当な経路により患者や被験者に投与することができ、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、関節内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、鼻スプレー、肺吸入、経口投与、及び当業者に公知の他の適切な投与経路が挙げられる。本発明に係るリポソームを利用して治療可能な組織病変は、膀胱、肝臓、肺、腎臓、骨格、軟組織、筋肉、乳房等の組織の病変が挙げられるが、これらに限らない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】美西替康リポソーム３０ｍｇ／ｋｇをラットに静脈内投与した後、生体内における美西替康の組織分布図である。
【図２】美西替康リポソーム３０ｍｇ／ｋｇをラットに静脈内投与した後、生体内における活性代謝物ＳＮ３８の組織分布図である。
【図３】蛍光マーカーＩＲ６２３、及びＩＲ６２３で標識された美西替康リポソームの、マウス体内における分布図である。
【図４】蛍光マーカーＩＲ６２３、及びＩＲ６２３で標識された美西替康リポソームの、マウス腫瘍部位及び各臓器における分布図である。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例により、本発明の具体的な製造方法を例示的に説明したが、本発明の保護範囲は、これに限定されるものではなく、当業者は、本発明に開示された技術範囲内に本発明の技術案及びその発明思想を基づく同等の置換又は変更は、本発明の保護範囲内に入るべきである。
【００３５】
実施例１
【表１】
2018536679.tif 000003
製造プロセス：処方量の美西替康、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、水相を剪断しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．１μｍのポリカーボネート膜により３回押し出し、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００３６】
実施例２
【表２】
2018536679.tif 000004
製造プロセス：処方量の美西替康、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、水相を剪断しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．２μｍのポリカーボネート膜により３回押し出し、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１５ｋｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００３７】
実施例３
【表３】
2018536679.tif 000005
製造プロセス：処方量の美西替康、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、処方量のスクロース及び調製量の７０％の注射用水を取って６０℃で加熱溶解させて水相とし、水相を剪断又は撹拌しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．４μｍのポリカーボネート膜により３回押し出し、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００３８】
実施例４
【表４】
2018536679.tif 000006
製造プロセス：処方量の美西替康、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、水相を剪断又は撹拌しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．２μｍのポリカーボネート膜により３回押し出し、処方量のスクロース及びマンニトールを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００３９】
実施例５
【表５】
2018536679.tif 000007
製造プロセス：処方量のＢＨＴ及び美西替康を処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解して清澄化させた後、処方量の卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを加え、６０℃で加熱溶解させて清澄化させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、水相を剪断又は撹拌しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．２μｍのポリカーボネート膜により押し出し、一定粒径サイズ及び一定粒径分布を有するリポソーム供給液を得ることができ、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００４０】
実施例６
【表６】
2018536679.tif 000008
製造プロセス：処方量の美西替康を処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解して清澄化させた後、処方量の卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを加え、６０℃で加熱溶解させて清澄化させて有機相とし、処方量のエデト酸二ナトリウム及び調製量の７０％の注射用水を取って６０℃で加熱溶解させて水相とし、水相を剪断又は撹拌しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．１μｍのポリカーボネート膜により押し出し、一定粒径サイズ及び一定粒径分布を有するリポソーム供給液を得ることができ、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００４１】
実施例７
【表７】
2018536679.tif 000009
製造プロセス：処方量の美西替康を処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解して清澄化させた後、処方量の卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを加え、６０℃で加熱溶解させて清澄化させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃で保温した後水相とし、水相を剪断又は撹拌しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．２μｍのポリカーボネート膜により押し出し、一定粒径サイズ及び一定粒径分布を有するリポソーム供給液を得ることができ、処方量のスクロースを加え、且つ塩酸又は水酸化ナトリウムを加えてｐＨ５に調整し、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００４２】
実施例８
【表８】
2018536679.tif 000010
製造プロセス：処方量の美西替康を処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解して清澄化させた後、処方量の卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを加え、６０℃で加熱溶解させて清澄化させて有機相とし、処方量のスクロース及び調製量の７０％の注射用水を取り、６０℃で加熱溶解して水相とし、水相を剪断又は撹拌しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．１μｍのポリカーボネート膜により押し出し、一定粒径サイズ及び一定粒径分布を有するリポソーム供給液を得ることができ、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００４３】
実施例９
【表９】
2018536679.tif 000011
製造プロセス：処方量の美西替康を処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解して清澄化させた後、処方量の卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加卵黄ホスファチジルコリンを加え、６０℃で加熱溶解させて清澄化させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃で保温した後水相とし、水相を剪断又は撹拌しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．１μｍのポリカーボネート膜により押し出し、一定粒径サイズ及び一定粒径分布を有するリポソーム供給液を得ることができ、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００４４】
実施例１０
【表１０】
2018536679.tif 000012
製造プロセス：具体的実施工程は、実施例２と同じである。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００４５】
実施例１１
【表１１】
2018536679.tif 000013
製造プロセス：具体的実施工程は、実施例２と同じである。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００４６】
実施例１２
【表１２】
2018536679.tif 000014
製造プロセス：具体的実施工程は、実施例２と同じである。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００４７】
実施例１３
【表１３】
2018536679.tif 000015
製造プロセス：具体的実施工程は、実施例２と同じである。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００４８】
実施例１４
【表１４】
2018536679.tif 000016
注：処方における美西替康の代わりにパクリタキセルを用いる以外、実施例２〜１３における各処方及びプロセスでも該実施例に適用されている。
【００４９】
製造プロセス：処方量のパクリタキセル、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、水相を剪断しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．１μｍのポリカーボネート膜により３回押し出し、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００５０】
実施例１５
【表１５】
2018536679.tif 000017
注：処方における美西替康の代わりにドセタキセルを用いる以外、実施例２〜１３における各処方及びプロセスでも該実施例に適用されている。
【００５１】
製造プロセス：処方量のドセタキセル、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、水相を剪断しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．１μｍのポリカーボネート膜により３回押し出し、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００５２】
実施例１６
【表１６】
2018536679.tif 000018
注：処方における美西替康の代わりにタクロリムスを用いる以外、実施例２〜１３における各処方及びプロセスでも該実施例に適用されている。
【００５３】
製造プロセス：処方量のタクロリムス、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、水相を剪断しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．１μｍのポリカーボネート膜により３回押し出し、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００５４】
実施例１７
【表１７】
2018536679.tif 000019
注：処方における美西替康の代わりにアルプラゾラムを用いる以外、実施例２〜１３における各処方及びプロセスでも該実施例に適用されている。
【００５５】
処方量のアルプラゾラム、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、水相を剪断しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．１μｍのポリカーボネート膜により３回押し出し、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。限外ろ過法により測定された封入率＞９９％。
【００５６】
比較例１：薄膜分散法
【表１８】
2018536679.tif 000020
製造プロセス：処方量の美西替康、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、有機相を取って梨型フラスコ内に入れてロータリーエバポレーターに置き、６０℃で減圧回転蒸発によりエタノールを除去し、有機相を１層の薄膜に形成させ、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、回転蒸発で形成された薄膜を有するフラスコ内に水相を加え、水化させた後、リポソーム供給液を形成し、得られたリポソーム供給液を０．２μｍのポリカーボネート膜により押し出し、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。
【００５７】
結果：水化をスムーズに行うことができず、均一なリポソーム供給液を形成するのが困難であり、且つ得られたリポソーム供給液をポリカーボネート膜により押し出すことができず、且つ、静置後、沈降して層化するため、薄膜分散法は美西替康のリポソームの製造に適用されていない。
【００５８】
比較例２：マイクロ流動化法
【表１９】
2018536679.tif 000021
製造プロセス：処方量の美西替康、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、水相を剪断しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液をマイクロ流動化処理し、その後処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れた後、凍結乾燥させて仕上げる。
【００５９】
結果：得られたリポソームサンプルの再構成が困難であり、再構成された粒径が非常に大きく、粒径分布が非常に広い。
【００６０】
比較例３：ミセル製剤１
【表２０】
2018536679.tif 000022
製造プロセス：処方量の美西替康、ポリオキシエチレンヒマシ油、グリセロール及び無水エタノールを取り、４５℃で水浴において加熱溶解して清澄化させた後、ろ過滅菌し、分けて包装して仕上げる。
【００６１】
比較例４：乳剤
【表２１】
2018536679.tif 000023
製造プロセス：（i）処方量の美西替康、ビタミンＥ及び無水エタノールを取って加熱溶解して清澄化させ、（ii）処方量のＦ６８及び処方量の水を取って溶解して清澄化させ、（iii）前記（ii）で得られた溶液の半分を取って剪断しながら、それに前記（i）で得られた溶液を加え、十分に剪断した後、それに前記（ii）で得られた溶液の他の半分を加え、剪断して均一に混合させ、（iv）前期（iii）で得られた溶液を１０回高圧均質化処理し、分けて包装して仕上げる。
【００６２】
比較例５：ミセル製剤２
【表２２】
2018536679.tif 000024
製造プロセス：処方量の美西替康及びｔ−ブタノールを取り、加熱溶解して清澄化させた後、ろ過滅菌し、分けて包装して凍結乾燥した後、美西替康粉末が得られる。
【表２３】
2018536679.tif 000025
製造プロセス：処方量のＥＬＰ、グリセロール及び無水エタノールを取り、均一に混合した後、ろ過滅菌し、分けて包装して専用溶媒を得る。
【００６３】
使用法：１００倍量の専用溶媒を用いて美西替康粉末を溶解させた後注射液を得、そして希釈して投与することができる。
【００６４】
比較例６：高圧均質化法
【表２４】
2018536679.tif 000026
【００６５】
比較例７：
【表２５】
2018536679.tif 000027
製造プロセス：処方量の美西替康、卵黄ホスファチジルコリン及び水素添加大豆ホスファチジルコリンを処方量の無水エタノールに溶解させ、６０℃で加熱溶解させて有機相とし、調製量の７０％の注射用水を取って６０℃まで加熱して水相をとし、水相を剪断しながら、有機相を水相に加えてリポソーム供給液を得、得られたリポソーム供給液を０．１μｍのポリカーボネート膜により３回押し出し、処方量のスクロースを加え、さらに注射用水を加えて得られた混合物が１０００ｇになるまで希釈し、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤瓶（ペニシリンボトル）に分けて入れて仕上げる。結果：得られたサンプルは、４０℃で１５日間放置された後、性状が著しく変化し、すなわち白色乳濁液から黄色乳濁液に変更した。
【００６６】
実施例１８：安定性試験
実施例１〜７、比較例３、４、５及び７における処方と製造プロセスに従って、美西替康含有医薬組成物１０バッチを製造した。各バッチのサンプルは、４０℃で１５日間保存され、各サンプルにおける性状及び関連物質を検出して０日目で検出された結果に比べたところ、次の通りである。
【表２６】
2018536679.tif 000028
【００６７】
実施例１９：長期安定性試験
実施例１〜７の処方及び製造プロセスにしたがって美西替康含有医薬組成物７バッチを製造し、各バッチの医薬組成物を、それぞれ６℃及び２５℃に置かれる条件下で保存した。サンプルは、６℃で保存された場合、それぞれ、３ヶ月目、６ヶ月目、９ヶ月目、１２ヶ月目にサンプリングして関連物質を検出し、２５℃で保存された場合、それぞれ１ヶ月目、２ヶ月目、３ヶ月目、６ヶ月目にサンプリングして関連物質を検出し、且つ０日目での検出結果に比べたところ、次の通りである。
【表２７】
2018536679.tif 000029
【表２８】
2018536679.tif 000030
【００６８】
実施例２０：粒径検出
実施例１〜９及び比較例２の処方と製造プロセスにしたがって美西替康含有医薬組成物１０バッチを製造し、各バッチの医薬組成物をそれぞれ１本（瓶）を取って水を加えて再構成させた後サンプリングし、且つナノ粒子径測定装置により粒径を検出し、結果は次の通りである。
【表２９】
2018536679.tif 000031
【００６９】
実施例２１：毒性試験
実施例２の処方と製造プロセスにしたがって美西替康含有医薬組成物１バッチを製造し、比較例５の処方と製造プロセスにしたがって美西替康含有ミセル製剤１バッチを製造した。得られた２バッチの薬物製剤を用い、それぞれ同じ用量でマウス及びラットの体に対して、マウスへの急性毒性試験、ラットへの急性毒性試験、及びラットへの４週間投与後の毒性試験を行った。２種の薬物製剤の毒性試験結果を比較した結果は、次の通りである。
【表３０】
2018536679.tif 000032
【００７０】
実施例２２：薬効試験
実施例２の処方と製造プロセスにしたがって美西替康含有医薬組成物１バッチを製造し、比較例５の処方と製造プロセスにしたがって美西替康含有ミセル製剤１バッチを製造した。得られた２バッチの薬物を、ＮＣＩ−Ｈ２９２肺癌ヌードマウスの体に対して薬効試験、すなわち異種移植腫瘍増殖に対する阻害効果の試験を行った。２種の薬物製剤の薬効試験結果は、次の通りである。
【表３１】
2018536679.tif 000033
【００７１】
実施例２３：長期毒性試験
実施例２の処方と製造プロセスにしたがって美西替康含有医薬組成物１バッチを製造し、比較例５の処方と製造プロセスにしたがって美西替康含有ミセル製剤１バッチを製造した。得られた２バッチの薬物を用い、ラットの体に対して長期毒性試験を行った。ラットの投与量は、それぞれ６０、３０及び１０ｍｇ／ｋｇである。２種の薬物製剤の試験結果を比較した結果は、次の通りである。
【表３２】
2018536679.tif 000034
【００７２】
実施例２４：組織分布
実施例２の処方と製造プロセスにしたがって美西替康含有医薬組成物１バッチを製造した。ＳＤラット１８匹を取って、３群に分け、各群は６匹で雌３匹、雄３匹である。各群のラットには、尾静脈注射により３０ｍｇ／ｋｇの美西替康の医薬組成物を投与した後、それぞれ、投与後１５分間、２時間及び６時間の時間点に麻酔して血液サンプル及び組織を収集し、血液サンプル及び組織をそれぞれ処理して血漿及び組織ホモジェネートのサンプルを得、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を構築して血漿及び組織ホモジェネートにおける美西替康及びその活性代謝物ＳＮ−３８（化学名：２０（ｓ）−７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）を測定し、結果を図１及び図２に示した。図１では、美西替康が主に直腸、肝臓、肺、血漿、結腸、腎臓、卵巣及び心臓等の器官に分布されていることを示し、図２では、ＳＮ−３８が主に結腸、直腸、肝臓、肺、血漿、卵巣、空腸、回腸、十二指腸及び腎臓等の器官に分布されていることを示した。直腸における美西替康及びＳＮ−３８の濃度はいずれも非常に高く、且つ、結腸における美西替康の濃度は、血漿における濃度よりも低かったが、美西替康の活性代謝物ＳＮ−３８の濃度は最も高かったであり、このように、本発明にかかる医薬組成物が特定の器官や組織に集中して分布していることが明らかにされる。美西替康及びＳＮ−３８は、いずれも脳及び睾丸における濃度が最も低かった。
【００７３】
実施例２５：生体内標的指向性の検討
実施例１の処方（約０．８％（ｗ／ｗ、処方におけるリン脂質の合計量を１００％として計算）の、蛍光プローブＩＲ６２３と結合されたＤＳＰＥ（それを有機相に加えて溶解させ）をさらに加える必要となり）、及び製造プロセスにより、蛍光プローブ（ＩＲ６２３）含有美西替康の医薬組成物（粒径：約１００ｎｍ）１バッチを製造した。実施例３の処方（約０．８％（ｗ／ｗ、処方におけるリン脂質の合計量を１００％として計算）の、蛍光プローブＩＲ６２３と結合されたＤＳＰＥ（それを有機相に加えて溶解させ）をさらに加える必要となり）、及び製造プロセスにより、蛍光プローブ（ＩＲ６２３）含有美西替康の医薬組成物（粒径：約４００ｎｍ）１バッチを製造した。２バッチの医薬組成物を用い、それぞれＨＴ２９腸癌の担癌ヌードマウスの体において近赤外生体イメージング技術により生体内標的指向性を検討し、そして蛍光プローブＩＲ６２３の生体内標的指向性と比較した結果を、図３及び図４に示した。
【００７４】
結果によれば、遊離の蛍光プローブを尾静脈注射により生体内に投与した後、０．５時間のときに腹部に顕著な蛍光信号が認められた。時間の経過に伴って、蛍光信号が次第に低減しており、生体外へ代謝されている（結果を図３に示した）。粒径１００ｎｍの蛍光プローブを有する美西替康リポソームを注射したマウスは、０．５時間のときに蛍光信号が体の全体にわたって分布しており、蛍光信号が４時間から腫瘍部位へ集中し始め、８時間のときに腫瘍部位の蛍光信号の強度が最も強く、８時間後に腫瘍部位の蛍光信号が低減し始め、４８時間のときに腫瘍部位にも蛍光信号がまだ残っている（結果を図３に示した）。粒径４００ｎｍの蛍光プローブを有する美西替康リポソームを注射したマウスは、０．５時間のときに腹部に顕著な蛍光信号を有し、４時間のときに腹部の蛍光信号が強くなり、その後、蛍光信号がずっと腹部に集中している（結果を図３に示す）。
【００７５】
薬物を注射してから４８時間後、担癌マウスを解剖し、その生体内における各臓器（腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓及び腸）を取って生体イメージング装置に入れて各臓器の蛍光分布状況を観察した。図４に示すように、遊離の蛍光プローブを注射したマウスの器官における蛍光が非常に弱くて殆ど完全に代謝されたことは認められた。粒径１００ｎｍの蛍光プローブ含有美西替康リポソームを注射したマウスの器官において、他の器官に比べて、腫瘍に比較的強い蛍光を有する。粒径４００ｎｍの蛍光プローブ含有美西替康リポソームを注射したマウスの器官において、肝臓における蛍光は最も強かった。
【００７６】
これにより、粒径１００ｎｍの蛍光プローブ含有美西替康リポソームは、受動的な腫瘍標的指向性を持っているが、粒径４００ｎｍの蛍光プローブ含有美西替康リポソームは、主に肝臓に蓄積されていることを推断することができる。蛍光プローブは、主に腸管や腎臓により代謝されて生体外へ排出される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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