(57)【要約】  酸性化、凝固及びチーズのテクスチャーを制御するための凝固剤のブレンド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なるＣ／Ｐ比を有する２つ以上の凝固剤を含有する、凝乳のための組成物。
【請求項２】
異なる起源を有する２つ以上の凝固剤、例えばラクダキモシン及びウシキモシンを含有する、凝乳のための組成物。
【請求項３】
前記２つ以上の凝固剤が、異なる一般的なタンパク質分解活性、例えば少なくとも３倍の相違を有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
５ＩＭＣＵ／ｍＵ超のＣ／Ｐ比を有する少なくとも１つの凝固剤と、０．０５〜１．５ＩＭＣＵ／ｍＵのＣ／Ｐ比を有する少なくとも第２の凝固剤とを含有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
５ＩＭＣＵ／ｍＵ超のＣ／Ｐ比を有する少なくとも５０ｗ／ｗ％の１つの凝固剤と、０．０５〜１．５ＩＭＣＵ／ｍＵの範囲内のＣ／Ｐ比を有する少なくとも１５ｗ／ｗ％の第２の凝固剤とを含有し、ここで、ｗ／ｗ％は凝固剤の総量に対する１つの凝固剤の濃度を示す、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
２つ以上の異なる動物又は微生物種又は属に由来する２つ以上の凝固剤のブレンドを含有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
５ＩＭＣＵ／ｍＵ超のＣ／Ｐ比を有する少なくとも７０ｗ／ｗ％の１つの凝固剤と、０．０５〜１．５ＩＭＣＵ／ｍＵの範囲内のＣ／Ｐ比を有する１５〜３０ｗ／ｗ％の第２の凝固剤とを含有し、ここで、ｗ／ｗ％は凝固剤の総量に対する１つの凝固剤の濃度を示す、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
２つ以上の異なる凝固剤の少なくとも１つが、ウシ、バッファロー、ラクダ、ブタ、ラット、ヒツジ及び／又はケカビ（mucor）由来の凝固剤に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
乳、例えば豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、バッファロー乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳又は牛乳を含有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記乳が牛乳である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記乳が、約３％〜約５％のタンパク質、例えば３．５％〜４．５％のタンパク質、例えば３．８％のタンパク質を含む、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記乳が、約１．５％〜５％の脂肪、例えば２．５％〜４％の脂肪、例えば３．５％の脂肪を含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ウシ凝固剤と非ウシ凝固剤とのブレンドであるか、あるいは、ラクダ凝固剤と非ラクダ凝固剤とのブレンド、例えばラクダとウシキモシンとのブレンドである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の２つ以上の凝固剤のブレンドを含有する、食品又は飼料組成物。
【請求項１５】
ソフトチーズ、例えばブリ―又はカマンベールである、請求項１４に記載の食品又は飼料組成物。
【請求項１６】
前記ソフトチーズが表面熟成ソフトチーズである、請求項１５に記載の食品又は飼料組成物。
【請求項１７】
ソフトチーズの製造方法における、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物が、１つ又は複数のスターター培養物の添加後、２０分以内に、例えば１５分以内、例えば１０分以内、例えば５分以内に、乳に添加される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
乳ベースの製品の製造方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物の有効量を添加し、そしてさらなる製造工程を実施して乳ベースの製品を得ること、を含む、方法。
【請求項２０】
発酵乳製品の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）スターター培養物を乳に添加し、そして培養物を２８〜４２℃の温度で少なくとも５分間インキュベートし；
（ｂ）請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物を、２０００ＩＭＣＵ／１００ｌ〜３５００ＩＭＣＵ／１００ｌの総濃度で添加し；
（ｃ）培養物を２８〜４２℃の温度で少なくとも３時間さらにインキュベートし；
（ｄ）乳清を分離してチーズを得ること、
を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物が、１つ又は複数のスターター培養物の添加後、２０分以内に、例えば１５分以内、例えば１０分以内に、添加される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ソフトチーズ、例えばブリ―又はカマンベール、を製造するために使用される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、改善されたチーズ製造特性を有する凝固剤のブレンド及び／又はその混合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
凝乳酵素、例えばキモシン及びペプシンによる乳の酵素的凝固は、チーズの製造における最も重要な工程の１つである。酵素的な乳の凝固は次の２相工程である：タンパク質分解酵素であるキモシン又はペプシンが、κ−カゼインを攻撃し、カゼインミセル構造の準安定状態をもたらす第１相、及び、続いて乳が凝固し、凝固物を形成する第２相。
【０００３】
キモシン（ＥＣ３．４．２３．４）及びペプシン（ＥＣ３．４．２３．１）、すなわち哺乳類の胃の凝乳酵素は、広いクラスのペプチダーゼに属するアスパラギン酸プロテアーゼである。
【０００４】
胃粘膜細胞で産生される場合、キモシン及びペプシンはそれぞれ、酵素的に不活性なプレ−プロキモシン及びプレ−ペプシノーゲンとして生じる。キモシンが分泌されると、Ｎ末端ペプチドフラグメントである、プレ−フラグメント（シグナルペプチド）が切断され、プロ−フラグメントを含むプロキモシンが得られる。プロキモシンは酵素の実質的に不活性な形態であるが、プロ−フラグメントの自己触媒除去により活性キモシンへと酸性条件下で活性化される。この活性化は、適切なｐＨ条件下で胃管腔においてイン・ビボで、又は酸性条件下でイン・ビトロで起こる。
【０００５】
ウシ、すなわちボス・タウラス（Bos taurus）の、プレ−プロキモシン、プロキモシン及びキモシンの構造的及び機能的特性は広く研究されてきた。ウシプレ−プロキモシン分子のプレ−部分は１６個のａａ残基を含み、対応するプロキモシンのプロ−部分は４２個のａａ残基の長さを有する。３２３個のａａを含む活性ウシキモシンは、Ａ及びＢの２つの形態の混合物であり、それらのいずれも活性である。
【０００６】
キモシンは哺乳類種、例えばウシ、ラクダ、ヤギ（caprines）、バッファロー、ヒツジ、ブタ、ヒト、サル、ラットにおいて、天然に生成される。
【０００７】
ウシキモシンは長年にわたって酪農業界に市販されてきた。
国際公開第０２／３６７５２Ａ２号（Chr.Hansen）は、ラクダキモシンの組換え生成を記載している。
国際公開第２０１３／１７４８４０Ａ１号（Chr.Hansen）は、ウシ及びラクダキモシンの突然変異体／変異体を記載している。
国際公開第２０１３／１６４４７９Ａ２号（ＤＳＭ）は、ウシキモシンの突然変異体を記載している。
【０００８】
以下に列挙した参考文献は、本文脈において、キモシンの突然変異体を記載する参考文献として参照される：
- Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
- van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
- Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
- M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
- Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;
- Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;
- Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
【０００９】
上述の先行技術文献は、キモシンの分子構造、及びその特異性又は性能への影響に焦点を当てている。参考文献のいずれも、異なる特性及び異なる起源を有する異なるキモシンの複合効果を開示していない。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
本発明の発明者らは、特定の凝固剤及び／又はその混合物が、チーズ形成中の細菌の酸性化率及び酸性化エンドポイントの制御に適用できることを発見した。
【００１１】
さらに、本発明者らは、本発明が、特定のキモシンのブレンドを提供することによって、熟成及び貯蔵中のソフトチーズの構造発現の実現可能な制御を可能にすることを発見した。
【００１２】
本明細書の実施例で論じたように、本発明者らはまた、商業的に魅力的な特性、例えば期待される性能を超えた促進されたカード硬度発現を示す、多数の凝固剤ブレンドを同定した。
【００１３】
凝固剤ブレンドの比較分析に基づいて、本発明者らは、ブレンドを作製することにより改善された優れた凝固剤特性を得ることができるという意味で、本明細書において重要な多数のブレンドを同定した。
【００１４】
定義
本明細書において関連する用語の全ての定義は、本明細書で関連する技術的文脈に関して当業者により理解されることになるものに従う。
【００１５】
用語「凝固剤」とは、チーズ製造工程において凝乳に使用される酵素に関する。完全性のために、キモシンが凝固剤として考えられるべきである。
【００１６】
用語「高Ｃ／Ｐ凝固剤」又は「高Ｃ／Ｐ比凝固剤」とは、Ｃ／Ｐ＞４．５、例えばＣ／Ｐ＞５、例えばＣ／Ｐ＞６、例えばＣ／Ｐ＞７又は６〜１２のＣ／Ｐを有する、凝固剤、例えばキモシンに関する。市販されている高Ｃ／Ｐ凝固剤の例は、ChyMax M又はChyMax M1000（Chr.Hansen A/S）及びMaxirenXDS（DSM）を含む。
【００１７】
用語「低Ｃ／Ｐ凝固剤」又は「低Ｃ／Ｐ比凝固剤」とは、Ｃ／Ｐ＜４，５、例えばＣ／Ｐ＜４、例えばＣ／Ｐ＜３、例えばＣ／Ｐ＜２、例えばＣ／Ｐ＜１．５、例えばＣ／Ｐ＜１、例えばＣ／Ｐ＜０．５又はＣ／Ｐ＜０．１を有する、凝固剤、例えばキモシンに関する。市販されている低Ｃ／Ｐ凝固剤の例は、Hannilase L（登録商標）、Hannilase XP（登録商標）、Thermolase（登録商標）及びNaturen（登録商標）を含み、全てChr.Hansen A/Sから入手可能である。
【００１８】
用語「凝固剤ブレンド」とは、例えばチーズ製造工程において、凝乳に使用される酵素のブレンドに関する。
【００１９】
用語「キモシン」とは、ＥＣ３．４．２３．４クラスの酵素に関する。キモシンは高い特異性を有し、カゼインのカッパ−鎖における単一の１０５−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−｜−Ｍｅｔ−Ａｌａ−１０８結合の切断により、乳を凝固させる。当該技術分野において使用される別の名称はレンニンである。
【００２０】
用語「キモシン活性」とは、本文脈において当業者によって理解されるキモシン酵素のキモシン活性に関する。当業者は本明細書において関連するキモシン活性を決定する方法を知っている。
本明細書の実施例２において、特定のキモシン活性（他方では凝固活性又は凝乳活性とも呼ばれる）を決定するための標準的な方法の例が提供される。一例として凝固活性は、国際酪農連盟によって開発された標準的な方法（ＩＤＦ法）である、ＲＥＭＣＡＴ法を用いて決定することができる。
【００２１】
用語「単離された変異体」とは、人工的に変更された変異体を意味する。
【００２２】
用語「成熟ポリペプチド」とは、翻訳及び任意の翻訳後修飾、例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などの後の、最終形態のペプチドを意味する。本文脈において、本明細書で関連する成熟キモシンポリペプチドは、活性キモシンポリペプチド配列、すなわちプレ−部分及び／又はプロ−部分の配列を有さない配列として見られる。
【００２３】
用語「親」又は「キモシン活性を有する親ポリペプチド」とは、本発明の酵素変異体を生成するために改変が行われるポリペプチドを意味する。親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。
【００２４】
用語「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性に関し、当業者に利用可能な方法に従って計算することができる。
【００２５】
用語「変異体」とは、１つ又は複数の（いくつかの）位置に改変、すなわち、置換、挿入、及び／又は欠失を含む、キモシン活性を有するペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸での置き換えを意味し；欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；そして挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。
【００２６】
用語「野生型」キモシンペプチドとは、天然に存在する生物、例えば天然で見られる哺乳類（例えばラクダ又はウシ）によって発現される、キモシンを意味する。
【００２７】
用語「異なる起源を有する凝固剤」とは、異なる生物由来、あるいは代わりに遺伝子改変による凝固剤に関する。したがって、ウシ野生型キモシン及び遺伝子改変ウシキモシンは、本発明の文脈において、異なる起源を有する凝固剤としてみなされることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本明細書において関連する異なるキモシン配列のアラインメント。示される「Bos_bovis_ chymosin_B」は、本明細書における配列番号１のウシキモシンであり、示される「Camelus_dromedarius」は本明細書における配列番号２のラクダキモシンである。本明細書に記載された参照配列としての配列番号１のウシキモシンを使用すると、例えば、ウシキモシンが位置１０で「Ｖ」を有し、そしてラクダキモシンが同じ位置１０で「Ａ」を有することがわかる。また、例えば、ウシ／ラット（Rat）は位置３５２で「Ｑ」を有し、及びラクダ／フタコブラクダ（C._bactrianus）は同じ位置３５２で「Ｅ」を有することもわかる。図１に示されたキモシン配列に関して、ヒツジ（Sheep）はウシ配列番号１と９４．５％の配列同一性を有し；フタコブラクダ（C._bactrianus）はウシ配列番号１と８３．２％の配列同一性を有し；ヒトコブラクダ（Camelus_dromedarius）（配列番号２のラクダキモシン）はウシ配列番号１と８４％の配列同一性を有し；ブタ（Pig）はウシ配列番号１と８０．３％の配列同一性を有し、そしてラットはウシ配列番号１と７１．９％の配列同一性を有する。本文脈において当業者により理解されるように、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン、すなわち配列番号１のアミノ酸位置５９〜３８１）との、例えばヒツジ、フタコブラクダ（C._bactrianus）、ラクダ、ブタ又はラットキモシンの成熟ポリペプチド配列の本明細書において関連する配列同一性パーセンテージは、上述の配列同一性パーセンテージに比較的類似している。
【図２】異なる凝固剤ブレンドで作られたブリ―タイプチーズの硬度。
【図３】異なる凝固剤ブレンドで作られたブリ―タイプチーズの粘着性。
【図４】異なる凝固剤ブレンドで作られたブリ―タイプチーズの脱型（demolding）工程時のｐＨ。
【図５】異なる凝固剤ブレンドで作られたブリ―タイプチーズの脱型工程時の乾物（ＤＭ）。
【図６】本発明において特に関心のある選択された凝固剤の相対的なタンパク質分解特異性。
【図７】３つの異なる凝固剤溶液の凝固速度及び硬度発現：赤の実線で印したラクダキモシン（Chymax（登録商標）M1000）、緑の破線で印したウシキモシン（Chymax（登録商標）＋）、及び青の点線で印したラクダ／ウシキモシン８０／２０比でのブレンド（Chymax（登録商標）soft）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本明細書で詳細に例示されるように、本発明は、２つ以上の異なる凝固剤を含有する組成物に関する。
【００３０】
関連する態様において、本発明は、異なる起源を有する２つ以上の凝固剤のブレンドを含有する、凝乳のための組成物に関する。
【００３１】
関連する態様において、本発明は、前記２つ以上の凝固剤が、異なるＣ／Ｐ比及び／又は凝固活性、例えば少なくとも３倍の相違を有する、本明細書に開示された組成物に関する。
【００３２】
関連する態様において、凝乳活性は、０．５ｇ／リットル（ｐＨ≒６．５）の塩化カルシウム溶液での、低温、低脂肪粉乳から調製された標準乳基質の目視可能な凝集に必要とされる時間から決定される。レンネット試料の凝固時間を、既知の凝乳活性を有し、かつＩＤＦ標準１１０Ｂによって当該試料と同一の酵素組成を有する、参照標準の凝固時間と比較する。試料及び参照標準を同一の化学的及び物理的条件下で測定する。変異体試料を、８４ｍＭの酢酸ｐＨ５．５緩衝液を用いて約３ＩＭＣＵ／ｍｌに調製する。以後、２００μｌの酵素を、一定の撹拌下で３２℃±１℃の一定温度を維持することができる水浴中に置いたガラス試験管中で１０ｍｌの予熱した乳（３２℃）に加える。
【００３３】
レンネットの総凝乳活性（強度）を、以下の式に従って、試料と同一の酵素組成を有する標準に対して国際凝乳単位（ＩＭＣＵ）／ｍｌで計算する：
【００３４】
【数１】
2018505672.tif 000002
Ｓ標準：      レンネットについての国際参照標準の凝乳活性
Ｔ標準：      標準希釈について得られた秒での凝固時間
Ｄ試料：      試料についての希釈係数
Ｄ標準：      標準についての希釈係数
Ｔ試料：      酵素の添加から凝集の時間までの希釈されたレンネット試料について得られた秒での凝固時間
【００３５】
総タンパク質含有量の決定
総タンパク質含有量を、Thermo ScientificからのPierce BCAタンパク質アッセイキットを使用し、提供者の指示に従って決定した。
【００３６】
特定の凝固活性の計算
凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｌ）を総タンパク質含有量（ｍｌ当たりのｍｇ総タンパク質）で割ることによって、特定の凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を決定した。
【００３７】
本明細書の実施例３では、タンパク質分解活性を決定するための標準的な方法の一例が提供される。
【００３８】
一例として、一般的なタンパク質分解活性は、基質として蛍光標識したBodipy-FLカゼイン（EnzChek; Molecular Bioprobes、E６６３８）を用いて測定することができる。ｐＨ−非感受性緑色蛍光Bodipy-FLで強く標識されたカゼイン誘導体は、コンジュゲートの蛍光のほぼ完全な消失をもたらす。プロテアーゼ触媒加水分解は蛍光Bodipy-FLを放出する。高Ｃ／Ｐ凝固剤はしばしば、低Ｃ／Ｐ凝固剤と比較して一般的な低いタンパク質分解活性を有するので、この方法は非常に高感度であり、それは本実験に必須である。
【００３９】
アッセイを、０．０４ｍｇ／ｍｌの最終基質濃度で所望のｐＨに調整した０．２Ｍリン酸緩衝液中で行った。１部の基質と１部の酵素とを混合する前に、両方をリン酸緩衝液中で調製し、全ての酵素変異体を５０ＩＭＣＵ／ｍｌに標準化した（実施例２に従う）。基質及び酵素を、９６ウェルのNunc Fluoroマイクロタイタープレート中で混合し、密閉して、３２℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、シーリングを除去し、蛍光を蛍光光度計で記録した。
【００４０】
当該技術分野で知られるように、本明細書において関連するいわゆるＣ／Ｐ比は、特定の凝固活性（Ｃ）（ＩＭＣＵ／ｍｌ）をタンパク質分解活性（Ｐ）（ｍＵ／ｍｌ）で割ることによって決定される。
【００４１】
当該技術分野で知られるように、より高いＣ／Ｐ比は、一般に、非特異的タンパク質分解による例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が低減されること、すなわちチーズの収率が向上されること、並びに、熟成中のチーズの苦味の発生を低減することを意味する。
【００４２】
本発明の別の態様は、２つ以上の異なるキモシンを含有する組成物であって、カード硬度及び凝固速度に有益な特性を伴う、組成物に関する。
【００４３】
これを測定する方法にはCHYMOgraph（登録商標）を用いる。CHYMOgraph（登録商標）は、チーズ製造における乳凝集時間並びにカード硬度展開の評価を可能にする。このソフトウェアはカード中のタンパク質ネットワークの構築速度を測定する。乳密度及びカード粘弾性の変化は、ユーザーフレンドリーなグラフデータに変換され、凝固剤の特性化のため、又は最適なカード切断時間を決定するために使用することができる。CHYMOgraph（登録商標）は、乳凝集時間、カード硬度及びその展開、並びにタンパク質ネットワークの構築速度を測定する。
【００４４】
乳の調製のために、乳組成物の目標に従った５００ｇの乳の容器を準備し、レンネットを添加する１時間前に、水浴中で３８℃のレンネッティング（renneting）温度に加熱した。乳の使用前に、ｐＨを調整し、記録した。好ましい乳組成物の例は以下のとおりである：
９０℃で３０秒間高熱処理した、３．８％のタンパク質を有する、強化乳
レンネッティング時のｐＨ：３８℃で６．１８及び（４℃）で６．２８。
レンネッティング温度：３８℃。この乳タイプは、ソフトチーズ乳タイプを製造する際に使用される乳組成物に対応する。
【００４５】
好ましい凝固剤を以下のとおり調製する：３つの凝固剤溶液を試験する：ラクダキモシン（ChyMax（登録商標）M１０００）、ウシキモシン（ChyMax（登録商標）+）及びChyMaxM soft（８０％ラクダキモシン（ChyMax（登録商標）M１０００）と２０％ウシキモシン（ChyMax（登録商標）+）とのブレンド）。各凝固剤溶液は、温水で２０ＩＭＣＵ／ｍＬ希釈の強度で調製され得る。この希釈は乳試料の十分な凝固をもたらすことを目的とし、その分散を促進する。
各凝固剤溶液を乳に添加し得る（５００ｇの乳に対して１ｍｌ、すなわち４０ＩＭＣＵ／１Ｌ）。凝固剤添加後、試料を回転することにより３０秒混合した。回転後、１０ｍｌの各凝固剤溶液をChymographに加えた。
【００４６】
当該技術分野で知られるように、異なる哺乳類種（例えば、ウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、又はラット）から得られた異なる天然野生型キモシンポリペプチド配列は、比較的高い配列類似性／同一性を有している。
【００４７】
本明細書の図１において、これは、本明細書において関連する異なるキモシン配列のアラインメントによって例示されている。
【００４８】
本文脈において、図１に示された、天然に得られる野生型キモシン（例えばウシキモシン又はラクダキモシン）は本明細書において、親ポリペプチド、すなわち本発明の変異体キモシンポリペプチドを産生するように改変が成された親ポリペプチドの例で有り得る。
【００４９】
さらに関連する態様では、本発明は、前記２つ以上の凝固剤が異なる比率でαＳ１及び／又はβ−カゼインを形成させる、本明細書に開示された組成物に関する。
【００５０】
さらなる関連態様では、本発明は、前記２つ以上の凝固剤が、異なる一般的なタンパク質分解活性、例えば少なくとも３倍の相違を有する、本明細書に開示された組成物に関する。
【００５１】
従って一態様では、本発明は、５ＩＭＣＵ／ｍＵ超のＣ／Ｐ比を有する少なくとも１つの凝固剤と、０．０５〜１．５ＩＭＣＵ／ｍＵの範囲内のＣ／Ｐ比を有する少なくとも第２の凝固剤とを含有する、上述された組成物を提供する。
【００５２】
例えば、前記組成物は、５ＩＭＣＵ／ｍＵ超のＣ／Ｐ比を有する少なくとも５０ｗ／ｗ％の１つの凝固剤と、０．０５〜１．５ＩＭＣＵ／ｍＵの範囲内のＣ／Ｐ比を有する少なくとも１５ｗ／ｗ％の第２の凝固剤とを含有してもよく、ここで、ｗ／ｗ％は凝固剤の総量に対する１つの凝固剤の濃度を示す。さらなる態様では、本発明は、５ＩＭＣＵ／ｍＵ超のＣ／Ｐ比を有する少なくとも７０ｗ／ｗ％の１つの凝固剤と、０．０５〜１．５ＩＭＣＵ／ｍＵの範囲内のＣ／Ｐ比を有する１５〜３０ｗ／ｗ％の第２の凝固剤とを含有する組成物を提供し、ここで、ｗ／ｗ％は凝固剤の総量に対する１つの凝固剤の濃度を示す。
【００５３】
さらなる関連態様では、本発明は、２つ以上の異なる動物又は微生物種又は属に由来する２つ以上の凝固剤のブレンドを含有する、本明細書に開示された組成物に関する。
【００５４】
さらなる関連態様では、本発明は、同じ親の凝固剤の変異体である、２つ以上の凝固剤のブレンドを含有する、本明細書に開示された組成物に関する。
【００５５】
さらなる関連態様では、本発明は、２つ以上の異なる属又は種が、以下：ウシ、バッファロー、ラクダ、ブタ、ラット、ヒツジ又はケカビ（mucor）、からなるリストから選択される、本明細書に開示された組成物に関する。
【００５６】
さらなる関連態様では、本発明は、２つ以上の異なる凝固剤の少なくとも１つが、ウシ、バッファロー、ラクダ、ブタ、ラット、ヒツジ及び／又はケカビ由来の凝固剤に由来する、本明細書に開示された組成物に関する。
【００５７】
さらなる関連態様では、本発明は、乳、例えば豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、バッファロー乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳又は牛乳を含有する、本明細書に開示された組成物に関する；そして
【００５８】
さらなる関連態様では、本発明は、ウシ凝固剤と非ウシ凝固剤とのブレンドであるか、あるいはラクダ凝固剤と非ラクダ凝固剤とのブレンドである、本明細書に開示された組成物に関する。
【００５９】
さらなる関連態様では、本発明は、凝固剤の総量に対して、１０〜５０％、例えば２０％の非ウシ又は非ラクダ凝固剤を含有する、本明細書に開示された組成物に関する。
【００６０】
さらなる関連態様では、本発明は、高Ｃ／Ｐ比凝固剤及び低Ｃ／Ｐ比凝固剤を含有する、本明細書に開示された組成物に関する。さらなる関連態様では、本発明は、凝固剤の総量に対して、１０〜５０％、例えば２０％の低Ｃ／Ｐ比凝固剤を含有する、本明細書に開示された組成物に関する。
【００６１】
さらなる実施形態では、本発明は、上述された２つ以上の凝固剤のブレンドを含有する、食品又は飼料組成物を提供する。前記食品又は飼料組成物は、ソフトチーズ、例えばブリ―又はカマンベールで有り得る。
【００６２】
さらなる関連態様では、本発明は、ソフトチーズ、例えばブリ―又はカマンベールの製造のための、本明細書に開示された組成物に関し、場合により、前記ソフトチーズは表面熟成ソフトチーズである。
【００６３】
さらに、本発明は、ソフトチーズの製造方法における、本明細書の態様のいずれか１つに記載の組成物の使用に関する。本明細書の態様に記載された組成物は、１つ又は複数のスターター培養物の添加後、２０分以内、例えば１５分以内、例えば１０分以内、例えば５分以内に、添加され得る。
【００６４】
適用可能であれば、乳ベースの製品を得るためのさらなる製造工程が追加される。
【００６５】
例えば、本発明は、発酵乳製品の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）スターター培養物を乳に添加し、そして培養物を２８〜４２℃の温度で少なくとも５分間インキュベートし；
（ｂ）２つ以上の異なる凝固剤を含有する組成物を、２０００ＩＭＣＵ／１００ｌ〜３５００ＩＭＣＵ／１００ｌの総濃度で添加し；
（ｃ）培養物を２８〜４２℃の温度で少なくとも３時間さらにインキュベートし；
（ｄ）乳清を分離してチーズを得ること、
を含む、方法を提供する。
【００６６】
当該方法は、有利には、ソフトチーズ、例えばブリ―又はカマンベールを製造するために使用することができる。
【００６７】
また、本明細書の態様のいずれか１つに記載された組成物は、関連する実施形態として、１つ又は複数のスターター培養物の添加後、２０分以内、例えば１５分以内、例えば１０分以内、例えば５分以内に、添加され得る。
【００６８】
目的のキモシンのアミノ酸位置の決定
上記で論じたように、本明細書において関連する目的のキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシ等）のアミノ酸位置の決定のための参照配列として、本明細書で使用されるのは、本明細書において配列番号１として開示される公知のウシキモシン配列である。
【００６９】
上述のよく知られたコンピュータープログラムを使用することによって、対応するキモシンにおいて本明細書において関連する目的のキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシ等）のアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常的な作業である。
【００７０】
単離されたキモシンポリペプチド変異体の作製方法
上記で論じられ、当該技術分野において知られているように、当業者は、彼らの共通する一般的知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体を日常的に産生及び精製し得る。言い換えれば、当業者が本明細書において関連する目的のキモシン活性を有する親ポリペプチド（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、又はラット由来）を有していれば、そのような目的の親キモシンの変異体を作製することは当業者にとって日常的な作業である。
【００７１】
キモシン（変異体又は親）を産生及び単離するのに適した方法の一例は、よく知られた、例えば、国際公開第０２／３６７５２Ａ２号（Chr. Hansen）に記載されたような、真菌組換え発現／産生に基づく技術によるもので有り得る。
【００７２】
当該技術分野で知られるように、キモシン活性は、特定の凝固活性（Ｃ）をタンパク質分解活性（Ｐ）で割ることによって決定される、いわゆるＣ／Ｐ比によって決定され得る。
【００７３】
本明細書の実施例２において、特定の凝固活性（Ｃ）を決定するための適切な方法を記載し、本明細書の実施例３において、タンパク質分解活性（Ｐ）を決定するために適切な方法を記載している。
【００７４】
上記で論じたように、本明細書において関連する目的のキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシ等）のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書で使用されるのは、本明細書において配列番号１として開示される、公知のウシキモシン配列である。
【００７５】
上記で論じたように、例えば本明細書で論じられたコンピューター配列アラインメントプログラムに基づいて、本明細書において関連する目的のキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシ等）の本明細書において関連するアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常的な作業である。
【００７６】
本文脈において当業者により理解されるように、本明細書において関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドは、既に、例えば対応する野生型キモシンなどの、変異体であり得る。例えば、配列番号２の野生型ラクダキモシンポリペプチドと比較して例えば５〜１０の改変（例えば置換）を有する、ラクダキモシン変異体は、依然として、例えば本明細書の第１の態様で要求された、配列番号１（ウシ）の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。
言い換えれば、本明細書において関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、例えば本明細書の第１の態様の位置以外の位置における、改変（例えば置換）を含んでもよい。
【００７７】
一実施形態は、当該改変が、例えば本明細書の第１の態様の位置のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における、置換、欠失又は挿入を含む、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。
【００７８】
ペプチドの少なくとも１つの改変に存在するキモシンにおける相違が置換であることが好ましい場合がある、すなわち、本明細書において関連する凝固剤は、単離されたウシキモシンポリペプチド変異体、例えば、改変が、成熟ウシキモシン親配列における位置５１及び／又は２２１、好ましくはＡ５１Ｖ及びＫ２２１Ｍのいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換を含んでいる、変異体に関する。
【００７９】
好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有する。
【００８０】
一例として、本明細書において好適な関連する親ポリペプチドは、例えばウシキモシンＡで有り得る。当該技術分野で知られるように、ウシキモシンＡは本明細書の配列番号１のウシキモシンＢと比較して１つのアミノ酸の差異のみを有し得る。
【００８１】
上記で論じたように、本明細書の実施例では、親ポリペプチドとして配列番号１（ウシ）のポリペプチドを用いて変異体が作製された。そのような変異体は、本明細書においてウシキモシン変異体と呼ばれ得る。
【００８２】
従って、好ましい実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、そしてさらにより好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性を有する。親ポリペプチドは配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドであることが好ましい場合がある。
【００８３】
本文脈において当業者によって理解されるように、本明細書において関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドは、既に、例えば対応する野生型キモシンの、例えば変異体で有り得る。
【００８４】
乳ベースの製品の製造方法
上記で論じたように、本明細書に記載された２つ以上の異なる凝固剤を含有する組成物は、例えば目的の乳ベースの製品（例えばチーズ製品）を製造するために、当該技術に従って使用され得る。
【００８５】
上記で論じたように、本発明の一態様は、食品又は飼料製品の製造方法であって、本明細書に記載された凝固剤ブレンドの有効量を食品又は飼料成分（複数）に添加し、そしてさらなる製造工程を実施して食品又は飼料製品を得ること、を含む、方法に関する。
【００８６】
好ましくは、前記食品又は飼料製品は乳ベースの製品であり、ここで、前記方法は、本明細書に記載された凝固剤ブレンドの有効量を乳に添加し、そしてさらなる製造工程を実施して乳ベースの製品を得ることを含む。
【００８７】
前記乳は、例えば豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、バッファロー乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳又は牛乳であってもよい。
【００８８】
前記乳ベースの製品は、例えば発酵乳製品、クワルク（quark）又はチーズで有り得る。
【００８９】
本発明はさらに、以下の関連する要約態様に関する：
態様１．異なるＣ／Ｐ比を有する２つ以上の凝固剤のブレンドを含有する、凝乳のための組成物。
【００９０】
態様２．異なる起源を有する２つ以上の凝固剤のブレンド、例えばラクダキモシン及びウシキモシンを含有する、凝乳のための組成物。
【００９１】
態様３．前記２つ以上の凝固剤が、異なる一般的なタンパク質分解活性、例えば少なくとも３倍の相違を有する、態様１又は２に記載の組成物。
【００９２】
態様４．５ＩＭＣＵ／ｍＵ超のＣ／Ｐ比を有する少なくとも１つの凝固剤と、０．０５〜１．５ＩＭＣＵ／ｍＵのＣ／Ｐ比を有する少なくとも第２の凝固剤とを含有する、態様１から３のいずれか１つに記載の組成物。
【００９３】
態様５．５ＩＭＣＵ／ｍＵ超のＣ／Ｐ比を有する少なくとも５０ｗ／ｗ％の１つの凝固剤と、０．０５〜１．５ＩＭＣＵ／ｍＵの範囲内のＣ／Ｐ比を有する少なくとも１５ｗ／ｗ％の第２の凝固剤とを含有し、ここで、ｗ／ｗ％は凝固剤の総量に対する１つの凝固剤の濃度を示す、態様１から４のいずれか１つに記載の組成物。
【００９４】
態様６．２つ以上の異なる動物又は微生物種又は属に由来する２つ以上の凝固剤のブレンドを含有する、態様１から５のいずれか１つに記載の組成物。
【００９５】
態様７．５ＩＭＣＵ／ｍＵ超のＣ／Ｐ比を有する少なくとも７０ｗ／ｗ％の１つの凝固剤と、０．０５〜１．５ＩＭＣＵ／ｍＵの範囲内のＣ／Ｐ比を有する１５〜３０ｗ／ｗ％の第２の凝固剤とを含有し、ここで、ｗ／ｗ％は凝固剤の総量に対する１つの凝固剤の濃度を示す、態様１から６のいずれか１つに記載の組成物。
【００９６】
態様８．２つ以上の異なる凝固剤の少なくとも１つが、ウシ、バッファロー、ラクダ、ブタ、ラット、ヒツジ及び／又はケカビ由来の凝固剤に由来する、態様１から７のいずれか１つに記載の組成物。
【００９７】
態様９．乳、例えば豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、バッファロー乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳又は牛乳を含有する、態様１から８のいずれか１つに記載の組成物。
【００９８】
態様１０．前記乳が牛乳である、態様９に記載の組成物。
【００９９】
態様１１．前記乳が、約３％〜約５％のタンパク質、例えば３．５％〜４．５％のタンパク質、例えば３．８％のタンパク質を含む、態様９又は１０に記載の組成物。
【０１００】
態様１２．前記乳が、約１．５％〜５％の脂肪、例えば２．５％〜４％の脂肪、例えば３．５％の脂肪を含む、９から１１のいずれか１つに記載の組成物。
【０１０１】
態様１３．ウシ凝固剤と非ウシ凝固剤とのブレンドであるか、あるいは、ラクダ凝固剤と非ラクダ凝固剤とのブレンド、例えばラクダとウシキモシンとのブレンドである、態様１から１２のいずれか１つに記載の組成物。
【０１０２】
態様１４．態様１から１３のいずれか１つに記載の２つ以上の凝固剤のブレンドを含有する、食品又は飼料組成物。
【０１０３】
態様１５．ソフトチーズ、例えばブリ―又はカマンベールである、態様１４に記載の食品又は飼料組成物。
【０１０４】
態様１６．前記ソフトチーズが表面熟成ソフトチーズである、態様１５に記載の食品又は飼料組成物。
【０１０５】
態様１７．ソフトチーズの製造方法における、態様１から１３のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【０１０６】
態様１８．態様１から１３のいずれか１つに記載の組成物が、１つ又は複数のスターター培養物の添加後、２０分以内、例えば１５分以内、例えば１０分以内、例えば５分以内に、乳に添加される、態様１７に記載の使用。
【０１０７】
態様１９．乳ベースの製品の製造方法であって、態様１から１３のいずれか１つに記載の組成物の有効量を添加し、そしてさらなる製造工程を実施して乳ベースの製品を得ること、を含む、方法。
【０１０８】
態様２０．発酵乳製品の製造方法であって以下のステップ：
（ａ）スターター培養物を乳に添加し、そして培養物を２８〜４２℃の温度で少なくとも５分間インキュベートし；
（ｂ）態様１から１３のいずれか１つに記載の組成物を、２０００ＩＭＣＵ／１００ｌ〜３５００ＩＭＣＵ／１００ｌの総濃度で添加し；
（ｃ）培養物を２８〜４２℃の温度で少なくとも３時間さらにインキュベートし；
（ｄ）乳清を分離してチーズを得ること、
を含む、方法。
【０１０９】
態様２１．態様１から１３のいずれか１つに記載の組成物が、１つ又は複数のスターター培養物の添加後、２０分以内に、例えば１５分以内、例えば１０分以内に、添加される、態様２０に記載の方法。
【０１１０】
態様２２．ソフトチーズ、例えばブリ―又はカマンベールを製造するために使用される、態様２０又は２１に記載の方法。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：キモシンタンパク質配列及び変異体配列のアラインメント及び番号付け
キモシンタンパク質配列を、ＥＢＩにより提供され（ＥＢＩ、ツール、多重配列アラインメント、CLUSTALW”、http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw２/）、そして、Larkin MA、Blackshields G、Brown NP、Chenna R、McGettigan PA、McWilliam H、Valentin F、Wallace IM、Wilm A、Lopez R、Thompson JD、Gibson TJ、Higgins DG（２００７）.Bioinformatics ２３（２１）、２９４７-２９４８に記載された、ClustalWアルゴリズムを用いて整列した。
【０１１２】
多重配列アラインメントのためのClustalW２設定は、タンパク質重量マトリックス=BLOSUM、ギャップオープン=１０、ギャップ伸長=０.０５、ギャップ距離=８、末端ギャップなし、ITERATION=なし、NUMITER=１、CLUSTERING=NJであった。
【０１１３】
参照配列として、ウシキモシンBプレプロキモシンを使用し（Genbank受託番号P００７９４、配列番号１として本明細書に開示される）、ここで、Ｎ末端メチオニンが番号１を有し（ＭＲＣＬ……）、そしてＣ末端イソロイシン（タンパク質配列において…ＬＡＫＡＩ）が番号３８１を有する。変異体をウシＢプレ−プロ−キモシンに対して整列し、残基を対応するウシキモシン残基に従って番号付けした。
【０１１４】
実施例２：特定のキモシン活性の決定
２．１凝固活性の決定
凝乳活性を、国際酪農連盟によって開発された標準的な方法（ＩＤＦ法）である、ＲＥＭＣＡＴ法を用いて決定した。凝乳活性は、０．５ｇ／リットル（ｐＨ≒６．５）の塩化カルシウム溶液での、低温、低脂肪粉乳から調製された標準乳基質の目視可能な凝集に必要とされる時間から決定される。レンネット試料の凝固時間を、既知の凝乳活性を有し、かつＩＤＦ標準１１０Ｂによって当該試料と同一の酵素組成を有する、参照標準の凝固時間と比較する。試料及び参照標準を同一の化学的及び物理的条件下で測定した。変異体試料を、８４ｍＭの酢酸ｐＨ５．５緩衝液を用いて約３ＩＭＣＵ／ｍｌに調製した。以後、２００μｌの酵素を、一定の撹拌下で３２℃±１℃の一定温度を維持することができる水浴中に置いたガラス試験管中で１０ｍｌの予熱した乳（３２℃）に加えた。
【０１１５】
レンネットの総凝乳活性（強度）を、以下の式に従って、試料と同じ酵素組成を有する標準に対して国際凝乳単位（ＩＭＣＵ）／ｍｌで計算した：
【０１１６】
【数２】
2018505672.tif 000003
Ｓ標準：      レンネットについての国際参照標準の凝乳活性
Ｔ標準：      標準希釈について得られた秒での凝固時間
Ｄ試料：      試料についての希釈係数
Ｄ標準：      標準についての希釈係数
Ｔ試料：      酵素の添加から凝集の時間までの希釈されたレンネット試料について得られた秒での凝固時間
【０１１７】
２．２総タンパク質含有量の決定
総タンパク質含有量を、Thermo ScientificからのPierce BCAタンパク質アッセイキットを使用し、提供者の指示に従って決定した。
【０１１８】
２．３特定の凝固活性の計算
凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｌ）を総タンパク質含有量（ｍｌ当たりのｍｇ総タンパク質）で割ることによって、特定の凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を決定した。
【０１１９】
実施例３：タンパク質分解活性の決定
一般的なタンパク質分解活性を、基質として蛍光（fluoresecently）標識したBodipy-FLカゼイン（EnzChek; Molecular Bioprobes、E６６３８）を用いて測定した。ｐＨ−非感受性緑色蛍光Bodipy-FLで強く標識されたカゼイン誘導体は、コンジュゲートの蛍光のほぼ完全な消失をもたらす。プロテアーゼ触媒加水分解は蛍光Bodipy-FLを放出する。CHYMAX Mは今日までに知られている全ての凝固剤のなかで最も低い一般的なタンパク質分解活性を有するので、この方法は非常に高感度であり、それは本実験に必須であった。
【０１２０】
アッセイを、０．０４ｍｇ／ｍｌの最終基質濃度で所望のｐＨに調整した０．２Ｍリン酸緩衝液中で行った。１部の基質と１部の酵素とを混合する前に、両方をリン酸緩衝液中で調製し、全ての酵素変異体を５０ＩＭＣＵ／ｍｌに標準化した（実施例２に従う）。基質及び酵素を、９６ウェルのNunc Fluoroマイクロタイタープレート中で混合し、密閉して、３２℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、シーリングを除去し、蛍光を蛍光光度計で記録した。
【０１２１】
実施例４：２種類の凝固剤ブレンドの評価：ラクダ−ウシキモシンブレンド及びラクダ−ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）凝固剤
ソフトチーズ技術において、高Ｃ／Ｐ比凝固剤、例えばChyMax（登録商標）Mを使用することはいくつかの利益を有する。より重要な一部は:増加した貯蔵寿命、減少した苦味、カッティング時により高い硬度による増加した脂肪回復（fat recovery）、特にファストストレイン（fast strains）を使用する場合における減少した後酸性化（post-acidification）、である。
しかしながら、ある場合にはデフォルトとみなされる一般的な変更は、より高いチーズ硬度である。
高Ｃ／Ｐ比、例えばChyMax（登録商標）Mの利益を維持し、チーズの硬度を低減するために、ChyMax（登録商標）Mとより低いＣ／Ｐ比を有する他の凝固剤とのブレンドが定義されている。
【０１２２】
ブリ―タイプ安定化ソフトチーズは異なる凝固剤比で製造されている。チーズは脱型（demolding）時及び貯蔵寿命中に分析された。
【０１２３】
乳：（全ての試験について同じ）
−  タンパク質：３６．２ｇ／Ｌ（添加された乳清タンパク質なし）
−  脂肪：６１．７ｇ／Ｌ
−  脂肪／タンパク質比：１．７
−  低温殺菌：７２℃／２０秒
−  総体積／試験：５００Ｌ（１００Ｌの５つのバット）
−  添加されたＣａＣｌ２：１５ｇ／１００Ｌ
−  凝固剤添加時の温度：４０℃
−  凝固剤添加時のｐＨ：６．３
−  凝固剤用量：３０００ＩＭＣＵ／１００Ｌの乳（８２８７ＩＭＣＵ／ｇのタンパク質に対応する）。
【０１２４】
凝固剤ブレンド：
−  ブレンドの第１のタイプを試験した：ChyMax（登録商標）Mと、２０％、３０％又は５０％のChyMax（登録商標）（低Ｃ／Ｐを有するウシ凝固剤）、図２〜５に正方形のマーカーと赤線で示した。
−  ブレンドの第２のタイプを試験した：ChyMax（登録商標）Mと、２０％又は３０％のHannilase（登録商標）（低Ｃ／Ｐ比を有するムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）凝固剤）、図２〜５にひし形マーカーと青色の線で示した。
−  同じ用量及びパラメーターでの純粋ChyMax（登録商標）M試験を参照として行った。この参照は、０％の非ChyMax（登録商標）M成分を有するブレンドである、両方のタイプのブレンドに使用され、図２〜５に含まれる表の最初の列に示される。
【０１２５】
結果：
（値は５つのバットの平均である）
−  脱型時のｐＨ（図４）：低Ｃ／Ｐ比成分が増加すると脱型時のｐＨが低くなるわずかな傾向が、使用された両方のタイプの低Ｃ／Ｐ比凝固剤について観察された：純粋ChyMax（登録商標）M試験についてのｐＨ５.０６から、ｐＨは、２０％のHannilase（登録商標）を有するブレンドについて５.０３であり、２０％のChyMax（登録商標）では依然として５.０６であった。ｐＨメーターの精度を考えても、５つのバットの平均としてこの変動は依然として顕著である。次に３０％では、ｐＨは、Hannilase（登録商標）とのブレンドについて５.０３、すなわち２０％のブレンドと同様であり、そしてChyMax（登録商標）とのブレンドについて５.０２、すなわちHannilase（登録商標）２０％及び３０％ブレンドによる結果と同様である。次に、５０％のChyMax（登録商標）ブレンドでは、ｐＨは３０％のブレンドと同様である。このことは、高Ｃ／Ｐ比凝固剤、例えばChyMax（登録商標）Mと、低Ｃ／Ｐ比、例えばChyMax（登録商標）又はHannilase（登録商標）とのブレンドを使用することは、ブリ―タイプソフトチーズにおける脱型時のｐＨ値を減少させる傾向があることを示している。この傾向は２０％のHannilaseで既に有効であり、ChyMax（登録商標）については、この傾向は３０％超でのみ見られる。
−  テクスチャー：テクスチャー測定を、ギロチンツールを有するTAXT２針入度計（penetrometer）を用いて貯蔵寿命の２５日後のチーズに実施した。
−  硬度（図２）：硬度は、ブレンド中の低Ｃ／Ｐ凝固剤のパーセンテージが上昇するにつれて明らかに減少し、その後、より高いパーセンテージでは安定した。ChyMax（登録商標）ブレンドについては、硬度は、純粋ChyMax（登録商標）M試験についての１３２５ｇから、２０％のブレンドについての１１８０ｇに、次に３０％のブレンドについての１０２２ｇへと減少した。Hannilase（登録商標）ブレンドについては、硬度は、２０％で既に１０５０に減少し、次に３０％のブレンドでほぼ同じ値である１０５３ｇを維持している。
−  粘着性（図３）：粘着性は、ChyMax（登録商標）Mと低Ｃ／Ｐ比凝固剤とをブレンドした場合に明らかに増加している。２０％の両方のタイプの低Ｃ／Ｐ比凝固剤について、粘着性をわずかに増加している：純粋ChyMax（登録商標）Mについての５０ｇ／秒の値から、２０％のChyMax（登録商標）での試験は７２ｇ／秒に達し、２０％のHannilase（登録商標）ブレンドでの試験は５９ｇ／秒に達した。これらの値は、まだ許容されるチーズの粘着性に相当する。次に、３０％で両方のタイプのブレンドは、９５に近い値に達している（ChyMax（登録商標）について９６及びHannilase（登録商標）について９２）。これらの値は明らかに、粘着性に関して許容されないチーズに結びついている。
−  テクスチャーの最適条件：本実験の目的は硬度を低減することであった;しかしながら、粘着性は所望の特性ではない。それゆえ、テクスチャー改善のための最適なブレンドは、両方のタイプの低Ｃ／Ｐ比凝固剤について２０％であった。
−  脱型時の乾物（DM）（図５）：乾物は、純粋ChyMax（登録商標）M試験と比較してブレンドで増加している。両方のタイプのブレンドについて、脱型時の乾物は２０％及び３０％で増加しており、純粋ChyMax（登録商標）M試験の４８.２％から、２０％のブレンドでの乾物は、ChyMax（登録商標）ブレンドについて４９％、Hannilase（登録商標）ブレンドについて５０.５％であり、そして３０％の試験については、乾物は、ChyMax（登録商標）ブレンドについて５２％、Hannilase（登録商標）ブレンドについて５２.５％であった。
−  乾物対硬度：これらの乾物の結果とテクスチャー測定を比較すると、チーズが、純粋ChyMax（登録商標）M試験と比較して、ブレンドでは脱型時により乾燥していても、テクスチャーはさらにやわらかいことがわかる。このことは、ChyMax（登録商標）Mと低Ｃ／Ｐ凝固剤とをブレンドすることが、乾物を増加させながらも、硬度を低減するのに強く有効であるということを示している。
−  最適な結果：これらの異なる結果を用いると、ChyMax（登録商標）MとChyMax（登録商標）とのブレンドについて、並びに、ChyMax（登録商標）MとHannilase（登録商標）とのブレンドについて、最適な比率は、高Ｃ／Ｐ比凝固剤の利点を維持し、かつ硬度が望まれない場合に硬度を低減するために、２０％に近いことがわかる。
【０１２６】
実施例５：ウシ、ラクダ及びブレンドされたキモシンの凝固挙動の決定
凝固挙動を追うために、本発明者らはCHYMOgraph（登録商標）（特許取得済みChr. Hansen tool）を使用した。CHYMOgraph（登録商標）は、チーズ製造における乳凝集時間並びにカード硬度展開の評価を可能にする。このソフトウェアはカード中のタンパク質ネットワークの構築速度を測定する。乳密度及びカード粘弾性の変化は、ユーザーフレンドリーなグラフデータに変換され、凝固剤の特性化のため、又は最適なカード切断時間を決定するために使用することができる。CHYMOgraph（登録商標）は、乳凝集時間、カード硬度及びその展開、並びにタンパク質ネットワークの構築速度を測定する。
【０１２７】
乳調製
乳組成物の目標に従った５００ｇの乳の容器を準備し、レンネットを添加する１時間前に、水浴中で３８℃のレンネッティング温度に加熱した。乳の使用前に、ｐＨを調整し、記録した。
【０１２８】
乳組成物
３．８％のタンパク質を有する強化乳、高熱処理：９０℃３０秒間
レンネッティング時のｐＨ：３８℃で６．１８及び（４℃）で６．２８。
レンネッティング温度：３８℃。この乳タイプは、ソフトチーズ乳タイプを製造する際に使用される乳組成物に対応する。
【０１２９】
凝固剤調製
３つの凝固剤溶液を試験した：ラクダキモシン（ChyMax（登録商標）M１０００）、ウシキモシン（ChyMax（登録商標）+）及びChyMaxM soft（８０％ラクダキモシン（ChyMax（登録商標）M１０００）と２０％ウシキモシン（ChyMax（登録商標）+）とのブレンド）。各凝固剤溶液を、温水で２０ＩＭＣＵ／ｍＬ希釈の強度で調製した。この希釈は乳試料の十分な凝固をもたらすことを目的とし、その分散を促進する。
各凝固剤溶液を乳に添加した（５００ｇの乳に対して１ｍｌ、すなわち４０ＩＭＣＵ／１Ｌ）。凝固剤添加後、試料を回転することにより３０秒混合した。回転後、１０ｍｌの各凝固剤溶液をChymographに加えた。
【０１３０】
結果
図７に示されるように、ウシとラクダキモシンとのブレンド（ChyMax soft）を使用した場合の凝固の速度は、ラクダキモシン（ChyMax（登録商標）M１０００）又はウシキモシン（ChyMax+）を単独で使用した場合の凝固の速度を上回る。熟練した科学者はブレンド中に含まれる２つの成分の加重平均に相当するブレンドの性能を期待することになるので、このことは非常に驚くべきことである。
【０１３１】
参考文献：
１：国際公開第02/36752A2号（Chr. Hansen）
２：Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71
３：Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569
４：van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310.
５：Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83
６：M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997
７：Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871
８：Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139
９：Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
１０：国際公開第2013/174840A1号（Chr. Hansen）
１１：国際公開第2013/164479A2号（DSM）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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