(57)【要約】本開示は、ブドウ球菌ロイコトキシン及びヘモリシンを結合する分子ならびに融合構築物に関する。本開示はさらに、本明細書に記載の結合分子及び融合構築物を用いて、対象のブドウ球菌感染症を治療、予防、及び診断する方法に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の修飾フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む結合分子であって、前記修飾ＦＮ３ドメインが、１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシン結合領域を含む１つ以上のループ領域を有する、前記結合分子。
【請求項２】
前記１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシン結合領域が、ロイコトキシンＥ（ＬｕｋＥ）結合領域を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
前記修飾ＦＮ３ドメインが、（ｉ）配列番号９９３のアミノ酸配列を含むＣ鎖及びＣＤループ領域と、（ｉｉ）配列番号９９４のアミノ酸配列を含むＦ鎖及びＦＧループ領域とを含む、請求項２に記載の結合分子。
【請求項４】
前記結合分子が配列番号９８９のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の結合分子。
【請求項５】
前記結合分子が配列番号２５及び７３９〜８１４のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の結合分子。
【請求項６】
前記修飾ＦＮ３ドメインが、（ｉ）配列番号９９５のアミノ酸配列を含むＣ鎖及びＣＤループ領域と、（ｉｉ）配列番号９９６のアミノ酸配列を含むＦ鎖及びＦＧループ領域とを含む、請求項２に記載の結合分子。
【請求項７】
前記結合分子が配列番号９９０のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の結合分子。
【請求項８】
前記結合分子が配列番号２６及び８１５〜８２７のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の結合分子。
【請求項９】
前記修飾ＦＮ３ドメインが、配列番号９９７のアミノ酸配列を含むＦＧループ領域を含む、請求項２に記載の結合分子。
【請求項１０】
前記結合分子が配列番号９９１のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１１】
前記結合分子が配列番号３７及び８２８〜８３９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１２】
前記１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシン結合領域が、ロイコトキシンＡＢ（ＬｕｋＡＢ）結合領域を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項１３】
前記修飾ＦＮ３ドメインが、（ｉ）配列番号９９８のアミノ酸配列を含むＣ鎖及びＣＤループ領域と、（ｉｉ）配列番号９９９のアミノ酸配列を含むＦ鎖及びＦＧループ領域とを含む、請求項１２に記載の結合分子。
【請求項１４】
前記結合分子が配列番号９９２のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の結合分子。
【請求項１５】
前記結合分子が配列番号１４及び６７３〜７３８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の結合分子。
【請求項１６】
前記結合分子が１つ以上のペプチドリンカーによって連結された２つ以上の修飾ＦＮ３ドメインを含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項１７】
前記結合分子が、ＬｕｋＥ結合領域を含む第１の修飾ＦＮ３ドメインと、１種以上の異なるブドウ球菌ロイコトキシン結合領域を含む第２の修飾ＦＮ３ドメインとを含む、請求項１４に記載の結合分子。
【請求項１８】
前記１種以上の異なるブドウ球菌ロイコトキシン結合領域がＬｕｋＡＢ結合領域を含む、請求項１７に記載の結合分子。
【請求項１９】
前記ＬｕｋＥ結合領域が、配列番号９８９、９９０、または９９１のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、前記ＬｕｋＡＢ結合領域が、配列番号９９２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の結合分子。
【請求項２０】
請求項１に記載の１つ以上の結合分子を含む第１の部分と、前記第１の部分に結合された第２の部分とを含み、前記第２の部分が第２の結合分子、薬学的に活性な部分、プロドラッグ、薬学的に許容される担体、診断部分、膜透過エンハンサー部分、及び／または半減期延長調節部分からなる群から選択される、融合構築物。
【請求項２１】
前記薬学的に活性な部分が、サイトカイン、毒素、ケモカイン、抗菌ペプチド、抗生物質、または酵素からなる群から選択される、請求項２０に記載の融合構築物。
【請求項２２】
前記第２の部分が、蛍光色素、放射性同位体、撮像に適した造影剤、または光増感剤からなる群から選択される診断部分を含む、請求項２０に記載の融合構築物。
【請求項２３】
前記第２の部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、アルブミン変種、または免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部分である半減期延長部分からなる群から選択される診断部分を含む、請求項２０に記載の融合構築物。
【請求項２４】
前記第２の部分が第２の結合分子を含む、請求項２０に記載の融合構築物。
【請求項２５】
前記第２の結合分子が、抗体またはその抗体結合ドメインである、請求項２４に記載の融合構築物。
【請求項２６】
前記抗体または抗体結合ドメインが、前記結合分子のアミノ末端と結合されたカルボキシ末端を有する、請求項２５に記載の融合構築物。
【請求項２７】
前記抗体またはその抗体結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体、またはそれらの抗体結合ドメインである、請求項２５に記載の融合構築物。
【請求項２８】
前記抗体またはその抗体結合ドメインが、単一特異性二価抗体、またはその抗体結合断片を含む、請求項２５に記載の融合構築物。
【請求項２９】
前記抗体またはその抗体結合ドメインが、二重特異性抗体、またはその抗体結合断片を含む、請求項２５に記載の融合構築物。
【請求項３０】
前記抗体または抗体結合ドメインが、免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項２５に記載の融合構築物。
【請求項３１】
前記抗体または抗体結合ドメインが、ブドウ球菌病原因子に結合する、請求項２５に記載の融合構築物。
【請求項３２】
ブドウ球菌病原因子が、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質を含む、請求項３１に記載の融合構築物。
【請求項３３】
前記抗体または抗体結合ドメインが、配列番号６０、６２、６４、または６６のいずれか１つのアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖を含む、請求項３２に記載の融合構築物。
【請求項３４】
前記抗体または抗体結合ドメインが、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質結合ドメインを含み、前記第１の部分がＬｕｋＥ結合領域を含む結合分子を含む、請求項２５に記載の融合構築物。
【請求項３５】
前記融合構築物が、配列番号８４８〜８５１、９００、９０３、または９８０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の融合構築物。
【請求項３６】
前記抗体または抗体結合ドメインが、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質結合ドメインを含み、前記第１の部分がＬｕｋＡＢ結合領域を含む結合分子を含む、請求項２５に記載の融合構築物。
【請求項３７】
前記融合構築物が、配列番号７０、７２、または９７９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の融合構築物。
【請求項３８】
前記抗体または抗体結合ドメインが、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質結合ドメインを含み、前記結合分子がＬｕｋＥ及びＬｕｋＡＢ結合領域を含む、請求項２５に記載の融合構築物。
【請求項３９】
前記融合構築物が、配列番号８５２〜８５９、８８７、８８８、８９３、８９４、９０６、９２０、９３１〜９５６、９６１、９７６、または９８４〜９８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の融合構築物。
【請求項４０】
前記抗体または抗体結合ドメインが、免疫グロブリン軽鎖可変領域をさらに含む、請求項３３に記載の融合構築物。
【請求項４１】
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号６１、６３、６５、または６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の融合構築物。
【請求項４２】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項２５〜４１のいずれか１項に記載の融合構築物をコードする核酸分子。
【請求項４３】
請求項４２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４４】
請求項４３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項２０〜４１のいずれか１項に記載の融合構築物、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４６】
ブドウ球菌感染症の治療または改善に使用される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項２０〜４１のいずれか１項に記載の融合構築物。
【請求項４７】
ブドウ球菌感染症の治療に有効な条件下で、請求項４６に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるブドウ球菌感染症の治療方法。
【請求項４８】
前記投与の前に、ブドウ球菌感染症を有する対象を選別することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ブドウ球菌感染症が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染症またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌感染症である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記投与を反復することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記医薬組成物の前記投与と併用して、抗感染症剤、抗生物質剤、及び抗微生物剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を投与することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
対象におけるブドウ球菌感染症の診断方法であって、
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項２０〜４１に記載の融合構築物を対象からのサンプルと接触させること；
前記接触に基づいて、前記サンプル中のブドウ球菌ロイコトキシンの有無を検出すること；及び
前記検出に基づいて、前記対象のブドウ球菌感染症を診断すること
を含む、前記診断方法。
【請求項５３】
対象におけるブドウ球菌感染症の予防方法であって、
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項２０〜４１に記載の融合構築物を対象からのサンプルと接触させること；
前記接触に基づいて、前記サンプル中のブドウ球菌ロイコトキシンを検出すること；及び
前記検出に基づいて、前記対象へのブドウ球菌感染症の予防に適した薬剤を投与すること
を含む、前記予防方法。
【請求項５４】
配列番号１０２６のアミノ酸残基１５２〜３０５と結合された配列番号１０２６のアミノ酸残基１〜１０９に対応するアミノ酸配列を含み、配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５１に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まない、ロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）ポリペプチド。
【請求項５５】
配列番号１０２６のアミノ酸残基１〜１０９に対応するアミノ酸残基が、セリン／グリシンリッチリンカーによって配列番号１０２６のアミノ酸残基１５２〜３０５に対応するアミノ酸残基に結合された、請求項５４に記載の組換えＬｕｋＢポリペプチド。
【請求項５６】
前記ＬｕｋＢポリペプチドが、配列番号１０２６のアミノ酸残基１２２〜１２６、配列番号１０２６のアミノ酸残基１３０〜１３４、または配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５１に対応するアミノ酸残基を含まない、請求項５４に記載の組換えＬｕｋＢポリペプチド。
【請求項５７】
前記ＬｕｋＢポリペプチドが、配列番号１０２９、配列番号１０３０、配列番号１０３１、配列番号１０３２、配列番号１１５０、または配列番号１１５１のアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の組換えＬｕｋＢポリペプチド。
【請求項５８】
配列番号１０１８のアミノ酸残基１７５〜３２４と結合された配列番号１０１８のアミノ酸残基１〜１３４に対応するアミノ酸配列を含み、配列番号１０１８のアミノ酸残基１３５〜１７４に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まない、組換えロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）ポリペプチド。
【請求項５９】
配列番号１０１８のアミノ酸残基１〜１３４に対応するアミノ酸残基が、セリン／グリシンリッチリンカーによって配列番号１０１８のアミノ酸残基１７５〜３２４に対応するアミノ酸残基に結合された、請求項５８に記載の組換えＬｕｋＡポリペプチド。
【請求項６０】
前記ＬｕｋＡポリペプチドが、配列番号１０１８のアミノ酸残基３２３に対応するアミノ酸残基にグルタミン酸からアラニンへの置換をさらに含む、請求項５８に記載の組換えＬｕｋＡポリペプチド。
【請求項６１】
前記ＬｕｋＡポリペプチドが、配列番号１０１８のアミノ酸残基１４４〜１４９、または配列番号１０１８のアミノ酸残基１３５〜１７４に対応するアミノ酸残基を含まない、請求項５８に記載の組換えＬｕｋＡポリペプチド。
【請求項６２】
前記ＬｕｋＡポリペプチドが、配列番号１０２２、配列番号１０２３、配列番号１０２４、配列番号１０２５、または配列番号１１４９のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の組換えＬｕｋＡポリペプチド。
【請求項６３】
配列番号１０２６のアミノ酸残基１５２〜３０５と結合された配列番号１０２６のアミノ酸残基１〜１０９に対応するアミノ酸配列を含む組換えロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）ポリペプチドであって、配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５１に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まない、前記ＬｕｋＢポリペプチドと、
配列番号１０１８のアミノ酸残基１７７〜３２４と結合された配列番号１０１８のアミノ酸残基１〜１３４に対応するアミノ酸配列を含む組換えロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）ポリペプチドであって、配列番号１０１８のアミノ酸残基１３５〜１７４に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まない、前記ＬｕｋＡポリペプチドと
を含む、ワクチン組成物。
【請求項６４】
前記組換えＬｕｋＢポリペプチドが、配列番号１０２６のアミノ酸残基１２２〜１２６、配列番号１０２６のアミノ酸残基１３０〜１３４、または配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５１に対応するアミノ酸残基を含まない、請求項６３に記載のワクチン組成物。
【請求項６５】
前記組換えＬｕｋＢポリペプチドが、配列番号１０２９、配列番号１０３０、配列番号１０３１、配列番号１０３２、配列番号１１５０、または配列番号１１５１のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載のワクチン組成物。
【請求項６６】
前記組換えＬｕｋＡポリペプチドが、配列番号１０１８のアミノ酸残基３２３に対応するアミノ酸残基にグルタミン酸からアラニンへの置換をさらに含む、請求項６３に記載のワクチン組成物。
【請求項６７】
前記組換えＬｕｋＡポリペプチドが、配列番号１０１８のアミノ酸残基１４４〜１４９、または配列番号１０１８のアミノ酸残基１３５〜１７４に対応するアミノ酸残基を含まない、請求項６３に記載のワクチン組成物。
【請求項６８】
前記ＬｕｋＡポリペプチドが、配列番号１０２２、配列番号１０２３、配列番号１０２４、配列番号１０２５、または配列番号１１４９のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載のワクチン組成物。
【請求項６９】
１つ以上の修飾フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む結合分子であって、前記修飾ＦＮ３ドメインが、１つ以上のブドウ球菌ヘモリシン結合領域を含む１つ以上のループ領域を有する、前記結合分子。
【請求項７０】
前記１つ以上のブドウ球菌ヘモリシン結合領域が、アルファヘモリシン結合領域を含む、請求項６９に記載の結合分子。
【請求項７１】
前記結合分子が配列番号１０９７、１０９９、１１１２、１１４２、及び１１００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載の結合分子。
【請求項７２】
請求項６９に記載の結合分子を含む第１の部分と、前記第１の部分に結合された第２の部分とを含み、前記第２の部分が第２の結合分子、薬学的に活性な部分、プロドラッグ、薬学的に許容される担体、診断部分、膜透過エンハンサー部分、及び／または半減期延長調節部分からなる群から選択される、融合構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年６月５日出願の米国仮特許出願第６２／１７１，７８８号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ブドウ球菌ロイコトキシン結合分子及び融合構築物に関する。本発明はさらに、本明細書に記載の結合分子及び融合構築物を用いて、対象のブドウ球菌感染を治療、予防、及び診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ブドウ球菌によって引き起こされる細菌感染症（すなわち、「ブドウ球菌感染症（ｓｔａｐｈ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」）は、一般集団に非常によく見られるものである。一般に個体の約２５％は、皮膚または鼻にブドウ球菌を保有している。ほとんどの場合、ブドウ球菌によって問題が生じることはなく、生じた場合でも比較的軽度の皮膚感染である。しかしながら、細菌が個体内の深部に侵入し、例えば血流、関節、骨、肺、または心臓に入り込んだ場合、ブドウ球菌感染症が致死性に転じる恐れがある。従来、致死的なブドウ球菌感染症は、入院患者や慢性疾病患者、免疫系が低下した人に起こり得るものであった。現在では、本来は健康である個人が生命にかかわるブドウ球菌感染症を発症することが次第に一般化しつつある。重要な点として、ブドウ球菌感染の多くは、真性の抗生物質耐性を示す株や既存の抗生物質に対する感受性が低下した株による感染により、抗生物質治療に対する不応性が生じている。このような抗生物質の有効性の低下は通常、合併症または同時投与される医薬品もしくは他の医療処置によって引き起こされる免疫老化または免疫機能低下により免疫系が低下した患者に顕著である。
【０００４】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、「黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈ）」、「黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）」、または「黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）」と称される場合も多い、主要なヒト病原体であり、表面損傷から毒素症、さらには心内膜炎、骨髄炎、肺炎、髄膜炎、及び敗血症などの生命にかかわる全身病態まで、数種類の感染を引き起こし得る多数の病原因子を産生する（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｏ，“Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５０５−５１８（２０１１）に概説）。ほとんどの個体は、出生直後に黄色ブドウ球菌と遭遇し（Ｈｏｌｔｆｒｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ−Ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３００：１７６−１９２（２０１０））、感染後、黄色ブドウ球菌に対する抗体と黄色ブドウ球菌抗体価を増加させる能力の両方を保有するが、こうした抗体は、再発性黄色ブドウ球菌感染を防御できない場合が多い（Ｆｏｓｔｅｒ  ＴＪ，“Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：９４８−９５８（２００５））。米国だけでも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）による年間死亡率は２万人を超え、インフルエンザ、ウイルス性肝炎、及びＨＩＶ／エイズに起因する死亡を上回っている（Ｆｏｓｔｅｒ，ＴＪ．，“Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：９４８−９５８（２００５）；Ｋｌｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ，Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，”Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４７：９２７−９３０（２００８））。
【０００５】
この病原体は、ヒト宿主内またはヒト宿主上での生存を容易にすると推定される様々な分子を産生する。二成分性の孔形成ロイコトキシンは、黄色ブドウ球菌によって産生される分泌性病原因子の１つである。この毒素は水溶性モノマーとして分泌され、オリゴマー化して、宿主細胞、とりわけ多形核白血球（ＰＭＮ）及び単核食細胞の形質膜に孔を挿入する（Ａｌｏｎｚｏ  Ｆ．ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ  Ｖ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７８（２）：１９９−２３０（２０１４））。この孔は細胞の浸透圧バランス及び膜電位を破壊し、標的細胞の死をもたらす。ロイコトキシンＥＤ（ＬｕｋＥＤ）の場合、宿主食細胞の標的化、結合、及び殺傷は、食細胞表面に位置する細胞標的ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、及びＣＸＣＲ２を介して起こる（Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ  ＥＤ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，”Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：４２３−４３５（２０１２）；Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．“ＣＣＲ５  ｉｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（７４３０）５１−５５（２０１２）；及びＲｅｙｅｓ−Ｒｏｂｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＸＣＲ１  ａｎｄ  ＣＸＣＲ２  ｔｏ  Ｋｉｌｌ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １４：４５３−４５９（２０１３））。実際に、ＬｕｋＥＤの細胞標的であるＣＣＲ５が宿主免疫細胞に存在しない場合、その宿主動物は、本来は致死性となる黄色ブドウ球菌感染に耐性である（Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．“ＣＣＲ５  ｉｓ  ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（７４３０）：５１−５５（２０１２））。最近の研究によれば、Ｄｕｆｆｙ抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）もＬｕｋＥＤの受容体として同定されており、ＬｕｋＥＤ媒介性の赤血球溶血に必要であるとされている（Ｓｐａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  Ｄｕｆｆｙ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  （ＤＡＲＣ）  ｔｏ  Ｌｙｓｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １８（３）：ｐ．３６３−３７０（２０１５））。
【０００６】
ロイコトキシンＡＢ（ＬｕｋＡＢ）はまた、宿主食細胞を死滅させることができ、細胞の外側及び内側の両方から、すなわち、微生物が宿主細胞に貪食された後にもその細胞溶解活性を作用させることができる（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＬｕｋＡＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  Ｋｉｌｌｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＤ１１ｂ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍａｃ−１，”ＰＮＡＳ  １１０（２６）：１０７９４−１０７９９  （２０１３））。これら両方のロイコトキシンは病原性への寄与を有することから、重大な黄色ブドウ球菌病原因子とみなされてきた（Ａｌｏｎｚｏ  ＩＩＩ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ａｍｉｄｓｔ  ａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｏｎｓｌａｕｇｈｔ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎｓ，”ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈ  ９（２）：ｅ１００３１４３（２０１３））。
【０００７】
黄色ブドウ球菌の発病を可能にするもう１つの重要な要素は、その表面タンパク質の特性に依存する（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｄｈｅｓｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，”Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５１：１８７−２２４  （２００６）；Ｐａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，“ＭＳＣＲＡＭＭ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｈｏｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：５８５−６１７（１９９４）；及びＰａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｎｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：７５２−７５８（１９９４））。黄色ブドウ球菌は接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ、ＭＳＣＲＡＭＭ）を用いて、宿主細胞のコラーゲン、ヘパリン関連多糖類、フィブリノーゲン、及び／またはフィブロネクチンを認識して宿主組織に接着しコロニーを形成する。黄色ブドウ球菌は、クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）、クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、及びＳｄｒＥを含む、セリン−アスパラギン酸ジペプチドリピート（ＳＤＲ）ドメインを含むＭＳＣＲＡＭＭのサブセットを発現する（Ｂｅｃｈｅｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．．“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣｎａＢＥ３  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ａｍｏｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｄｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（９）：ｅ７４７１８（２０１３））。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓもまた、このファミリーの３つのメンバー、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、及びＳｄｒＨを発現する（ＭｃＣｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｓｅｒｉｎｅ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｒｅｐｅａｔ（Ｓｄｒ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：１５３５−１５４６（２０００））。これらのタンパク質は、Ｎ末端リガンド結合Ａドメインと、それに続く２５〜２７５のセリン−アスパラギン酸ジペプチドリピートを含むＳＤＲドメインとを含む同様の構造を共有する。これらのタンパク質のＣ末端部分には、ソルターゼＡトランスペプチダーゼによる細胞壁への固定化を促進するＬＰＸＴＧモチーフが含まれている。これらのタンパク質中のセリン−アスパラギン酸ジペプチド領域は、２つのグリコシルトランスフェラーゼによるグリカンの連続的な付加によって修飾される。まず、ＳｄｇＢは、セリン−アスパラギン酸ジペプチド領域内のセリン残基にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を付加し、続いて糖タンパク質のＳｄｇＡ修飾を行い、二糖部分を形成する。このグリコシル化は、ＳＤＲを含むブドウ球菌タンパク質をカテプシンＧ媒介性の分解から保護する（Ｈａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ＳｄｇＡ  ａｎｄ  ＳｄｇＢ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９（１０）：ｅ１００３６５３（２０１３））。
【０００８】
黄色ブドウ球菌の表面に位置するプロテインＡもまた、宿主ＩｇＧのＦｃドメインならびにＩｇＧ及びＩｇＭのＶＨ３クラスのＦａｂドメインを捕捉することによって、防御性の宿主免疫反応からブドウ球菌を回避させるのに寄与する（Ｓｊｏｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｉｖｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｆｏｕｒ  Ｂｅｉｎｇ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｆｃ−Ｂｉｎｄｉｎｇ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：３４３−３５１（１９９７）；及びＣａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｌａｎ  Ｖ（Ｈ）ＩＩＩ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ７１８３，Ｊ６０６  ａｎｄ  Ｓ１０７  ａｎｄ  ＤＮＡ４  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  Ｃｏｍｍｏｎｌｙ  Ｅｎｃｏｄｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ  Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ，”Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：７６９−７７６（１９９９））。さらに、黄色ブドウ球菌は、免疫グロブリンに対する第２の結合タンパク質（Ｓｂｉ）と呼ばれる第２の免疫グロブリン結合タンパク質を発現する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｓｅｃｏｎｄ  ＩｇＧ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：９８５−９９１（１９９８）  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＳｐＡ  ａｎｄ  Ｓｂｉ：Ｈｏｓｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１６００−１６１１（２００８））。Ｓｂｉは、細胞エンベロープに分泌されるかまたはそれと会合し（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｓｂｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ”Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７９：３８０１−３８０９（２０１１）及びＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｂｉ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｏｃｃｕｒｓ  ｂｏｔｈ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ  ａｎｄ  Ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  Ａｃｉｄ”Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：７８９−８０４（２０１２））、ＩｇＧタンパク質のＦｃ領域への結合に関与するプロテインＡと保存的ヘリックス対を共有する（Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＳｐＡ  ａｎｄ  Ｓｂｉ：Ｈｏｓｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１６００−１６１１（２００８））。ＦｃのＣＨ３領域を介したこれらのタンパク質へのＩｇＧの結合は、黄色ブドウ球菌表面の���体を、好中球による細菌の効果的なＦｃ媒介性オプソニン作用を妨げる方向に隔離し、それによって重要な免疫回避因子としての役割を果たすと考えられている。
【０００９】
黄色ブドウ球菌はまた、免疫回避に関与する多数のプロテアーゼを分泌する。Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓらは、プラスミノーゲン活性化因子タンパク質であるスタフィロキナーゼの黄色ブドウ球菌分泌が、表面結合ＩｇＧ及び補体Ｃ３ｂの両方を切断するプラスミンの活性化をもたらし、最終的に免疫媒介性の黄色ブドウ球菌の破壊を減少させることを示している（Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉ−Ｏｐｓｏｎｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ，”Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ７：４７６−４８４（２００５））。黄色ブドウ球菌はまた、Ｅ２３３とＬ２３４（ＥＵ付番）との間の下部ヒンジ領域でヒトＩｇＧ１を直接切断することができるセリンプロテアーゼグルタミルエンドペプチダーゼＶ８（ＧｌｕＶ８）を分泌する（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｎｔｉｒｅ  ＧａｍｍａＧ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，”ＰＮＡＳ  ６３：７８−８５（１９６９），Ｂｒｅｚｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＩｇＧ１  Ｈｉｎｇｅ  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＩｇＧｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：３１８３−３１９２  （２００８））。また、黄色ブドウ球菌の表面に結合すると、ヒト抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧが直ちに切断されることも最近実証された（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｆａｌｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｄｅｃｒｅａｓｅ  ＩｇＧ  Ｓｈｅｄｄｉｎｇ  Ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１４１５−１４２２（２０１１））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
総合すると、これらの研究は、黄色ブドウ球菌が、その細胞表面にあるプロテインＡまたはＳｂｉの結合によりモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を直接切断し、ｍＡｂを隔離することによって、または治療有効性に必要とされるエフェクター細胞そのものを死滅させることによって、標準的なＩｇＧ１によるｍＡｂ治療に悪影響を及ぼし得る多数の機構を利用していることを示している。したがって、ヒトでの使用が最終承認された、黄色ブドウ球菌を標的とするｍＡｂによる療法が現在存在しないことは意外ではない。このように、（ｉ）プロテインＡ及びＳｂｉ結合を回避し、（ｉｉ）黄色ブドウ球菌誘発性のタンパク質分解を回避し、（ｉｉｉ）ロイコトキシンを中和でき、（ｉｖ）オプソニン化による黄色ブドウ球菌の食細胞への送達が可能である、ブドウ球菌感染を治療できる方法及び組成物が依然として必要とされている。本出願は、上記及びその他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
概要
本開示の第１の態様は、１つ以上の修飾フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む結合分子であって、それぞれの修飾ＦＮ３ドメインが、１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシン結合領域を含む１つ以上のループ領域を有する結合分子に関する。
【００１２】
本開示の別の態様は、１つ以上の修飾フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む結合分子であって、それぞれの修飾ＦＮ３ドメインが、１つ以上のブドウ球菌ヘモリシン結合領域を含む１つ以上のループ領域を有する結合分子に関する。
【００１３】
本開示の第２の態様は、融合構築物に関する。融合構築物は、本明細書に記載の１つ以上の結合分子を含む第１の部分と、前記第１の部分に結合された第２の部分とを含む。融合構築物の第２の部分は、第２の結合分子、薬学的に活性な部分、プロドラッグ、薬学的に許容される担体、診断部分、膜透過エンハンサー部分、及び／または半減期延長調節部分を含む。
【００１４】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の結合分子及び／または融合構築物を含む医薬組成物に関する。
【００１５】
本開示の他の態様は、本明細書に記載の結合分子、融合構築物、及び／または医薬組成物を使用して、対象のブドウ球菌感染症を治療、予防、及び診断する方法に関する。
【００１６】
本開示の別の態様は、配列番号１０２６のアミノ酸残基１５２〜３０５と結合された配列番号１０２６のアミノ酸残基１〜１０９に対応するアミノ酸配列を含む組換えロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）ポリペプチドであって、配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５１に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まないＬｕｋＢポリペプチドに関する。
【００１７】
本開示の別の態様は、配列番号１０１８のアミノ酸残基１７５〜３２４と結合された配列番号１０１８のアミノ酸残基１〜１３４に対応するアミノ酸配列を含む組換えロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）ポリペプチドであって、配列番号１０１８のアミノ酸残基１３５〜１７４に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まないＬｕｋＡポリペプチドに関する。
【００１８】
本開示の別の態様は、ワクチン組成物に関する。ワクチン組成物は、配列番号１０２６のアミノ酸残基１５２〜３０５と結合された配列番号１０２６のアミノ酸残基１〜１０９に対応するアミノ酸配列を含む組換えロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）ポリペプチドを含み、前記ＬｕｋＢポリペプチドは配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５１に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まない。さらにワクチン組成物は、配列番号１０１８のアミノ酸残基１７７〜３２４と結合された配列番号１０１８のアミノ酸残基１〜１３４に対応するアミノ酸配列を含む組換えロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）ポリペプチドを含み、前記ＬｕｋＡポリペプチドは配列番号１０１８のアミノ酸残基１３５〜１７４に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まない。
【００１９】
本明細書に記載のブドウ球菌ロイコトキシン結合分子は、システイン残基、ジスルフィド残基、またはグリコシル化残基を含んでいない、小型（約１０ｋＤａ）の単純な安定性の高い単一ドメインタンパク質である。この分子は、優れた生物物理学的特性を有し（例えば、１００ｍｇ／ｍＬ超の発現、１７０ｍｇ／ｍＬ超の溶解度、８２℃超の融解温度、低い推定免疫原性、及び血清中で１か月超安定）、また遺伝子操作により安定性を改善することができる。従来療法を上回る他の利点としては、局所投与、経口投与、または血液脳関門透過性の投与が可能であること、哺乳動物の細胞発現と比べ、起源として機能するタンパク質の発現を増加させる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現が可能であること、遺伝子操作により複数の標的または同一標的の複数のエピトープに結合する二重特異性分子の作製が可能であること、薬物、ポリマー、及びプローブとのコンジュゲートが可能であること、高濃度な製剤化が可能であること、ならびにそのような分子が疾患組織を効果的に透過できることが挙げられる。したがって、１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシン結合ドメインを含む本明細書に記載の結合分子は、ブドウ球菌感染に対抗する独自の治療的、予防的、及び診断的手法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｆは、ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質に対する最小エピトープ標的を定義している。図１Ａは、ＳｄｇＢグリコシル化形態のＳｄｒＣ４へのｍＡｂ  ５１３３の特異的結合を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｆは、ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質に対する最小エピトープ標的を定義している。図１Ｂは、ＳｄｇＢグリコシル化形態のＣｌｆＡへのｍＡｂ  ５１３３の特異的結合を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｆは、ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質に対する最小エピトープ標的を定義している。図１Ｃは、ＳｄｇＢグリコシル化形態のＣｌｆＢへのｍＡｂ  ５１３３の特異的結合を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｆは、ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質に対する最小エピトープ標的を定義している。図１Ｄは、グリコシル化ストレプトアビジン結合ＳＤペプチドとの濃度依存的なｍＡｂ５１３３の結合を示す。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｆは、ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質に対する最小エピトープ標的を定義している。図１Ｅのグラフは対照としての役割を果たし、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートにＳＤペプチドのグリコシル化形態と非グリコシル化形態とが等量で結合することを示す。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｆは、ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質に対する最小エピトープ標的を定義している。図１Ｆは、グリコシル化ＳＤペプチドへの、一連のｍＡｂ５１３３融合タンパク質の結合を示す。
【図２Ａ】標的への同時結合（図２Ａ）を含む、ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質による標的抗原への結合を示す。
【図２Ｂ】標的結合化学量論（図２Ｂ）を含む、ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質による標的抗原への結合を示す。
【図２Ｃ】結合親和性（図２Ｃ）を含む、ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質による標的抗原への結合を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質による標的結合が、融合タンパク質のｍＡｂ及びＦＮ３部分を連結するリンカーの長さによって変化し得ることを示す。図３Ａは、リンカー長の変更によるＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＥの結合親和性の変化を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質による標的結合が、融合タンパク質のｍＡｂ及びＦＮ３部分を連結するリンカーの長さによって変化し得ることを示す。図３Ｂは、黄色ブドウ球菌腎臓感染マウスモデルにおける融合構築物の有効性の変化に、リンカー長が与える影響を示すマトリックスである。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質による標的結合が、融合タンパク質のｍＡｂ及びＦＮ３部分を連結するリンカーの長さによって変化し得ることを示す。図３Ｃは、黄色ブドウ球菌腎臓感染モデルでのコロニー形成単位数によって測定される、ＬｕｋＥ（図３Ｃ）へのｉｎ  ｖｉｖｏ融合タンパク質の結合の変化にリンカー長が与える影響、およびＬｕｋＥ（図３Ｃ）に対する潜在的治療有効性の変化にリンカー長が与える影響を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質による標的結合が、融合タンパク質のｍＡｂ及びＦＮ３部分を連結するリンカーの長さによって変化し得ることを示す。図３Ｄは、黄色ブドウ球菌腎臓感染モデルでのコロニー形成単位数によって測定される、ＬｕｋＡＢ（図３Ｄ）へのｉｎ  ｖｉｖｏ融合タンパク質の結合の変化にリンカー長が与える影響、およびＬｕｋＡＢ（図３Ｄ）に対する潜在的治療有効性の変化にリンカー長が与える影響を示す。
【図４Ａ】ＬｕｋＥ結合領域、すなわちＬｕｋ２６（図４Ａ）を含む、３つのＦＮ３結合分子の代表的な一連の変種の毒素結合活性と中和活性の相関関係を示す。
【図４Ｂ】ＬｕｋＥ結合領域、すなわちＬｕｋ２７（図４Ｂ）を含む、３つのＦＮ３結合分子の代表的な一連の変種の毒素結合活性と中和活性の相関関係を示す。
【図４Ｃ】ＬｕｋＥ結合領域、すなわちＬｕｋ３８（図４Ｃ）を含む、３つのＦＮ３結合分子の代表的な一連の変種の毒素結合活性と中和活性の相関関係を示す。
【図５】ロイコトキシンＬｕｋＡＢを標的とする代表的な一連のＦＮ３変種の毒素結合活性と中和活性の相関関係を示す。
【図６】マウス腎臓感染モデルにおいて、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の潜在的治療有効性がｍＡｂ−５１３３よりも向上していることを示す。治療有効性は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を測定し、腎膿瘍病変の存在を評価することによって決定した。
【図７Ａ】ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、非ＳＤＲ接着因子タンパク質抗原を標的とするｍＡｂまたはｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質よりもマウス腎膿瘍感染モデルにおいて治療有効性を増強させることを示すグラフである。
【図７Ｂ】ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、非ＳＤＲ接着因子タンパク質抗原を標的とするｍＡｂまたはｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質よりもマウス腎膿瘍感染モデルにおいて治療有効性を増強させることを示すグラフである。
【図８】マウス腎臓感染モデルにおいて、ｍＡｂ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の有効性が、治療量以下濃度のバンコマイシンの存在下で増強されることを示すグラフである。
【図９】マウス菌血症モデルにおいて、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の有効性が、ｍＡｂ−５１３３単独と比較して向上したことを示すグラフである。図９の上部パネルは、黄色ブドウ球菌に感染させ、同定された抗体または抗体−ＦＮ３融合構築物を投与したマウスの血中に存在するコロニー形成単位の量を示す。図９の下部パネルは、黄色ブドウ球菌に感染させ、同定された抗体または抗体−ＦＮ３融合構築物を投与したマウスの脾臓に存在するコロニー形成単位の量を示す。
【図１０】マウス腎臓感染モデルにおいて、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の有効性がその複合体部分の合計よりも向上していることを示すグラフである。
【図１１Ａ】皮膚病変体積（図１１Ａ）によって評価されるマウス皮膚感染モデルにおいて、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の有効性がｍＡｂ−５１３３よりも向上していることを示すグラフである。
【図１１Ｂ】皮膚病変の細菌負荷（図１１Ｂ）によって評価されるマウス皮膚感染モデルにおいて、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の有効性がｍＡｂ−５１３３よりも向上していることを示すグラフである。
【図１２】ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、初代ヒト好中球の黄色ブドウ球菌媒介性細胞外細胞溶解からの保護をもたらすことを示すグラフである。
【図１３】ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、初代ヒト好中球の黄色ブドウ球菌媒介性細胞内細胞溶解からの保護をもたらすことを示すグラフである。
【図１４Ａ】ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、初代ヒト好中球において、ＵＳＡ３００  ＬＡＣ（図１４Ａ）を含む様々な黄色ブドウ球菌株のオプソニン貪食作用による死滅を増強することを示す。
【図１４Ｂ】ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、初代ヒト好中球において、ＵＳＡ３００  ＦＲＰ、１８８０７、１８８０８及び１８８０９（図１４Ｂ）を含む様々な黄色ブドウ球菌株のオプソニン貪食作用による死滅を増強することを示す。
【図１４Ｃ】ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、初代ヒト好中球において、ＢＫ４６４５ｂ（ＭＳＳＡ）（図１４Ｃ）を含む様々な黄色ブドウ球菌株のオプソニン貪食作用による死滅を増強することを示す。
【図１４Ｄ】ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、初代ヒト好中球において、ＵＳＡ５００  ＢＫ２３９５（図１４Ｄ）を含む様々な黄色ブドウ球菌株のオプソニン貪食作用による死滅を増強することを示す。
【図１５】Ｆｃ（結晶性断片）及び／またはＦａｂ（抗原結合断片）領域を介した結合を例示するため、黄色ブドウ球菌プロテインＡに対する一連のモノクローナル抗体の結合を示す。
【図１６】ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、ＬｕｋＡＢ依存細胞外殺傷からの初代ヒト好中球の保護を向上させることを示すグラフである。
【図１７Ａ】ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、非同族ロイコトキシン対、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ及びＬｕｋＥ／ＨｌｇＢによる細胞外殺傷からの初代ヒト好中球の保護を向上させることを示す。図１７Ａは、初代ヒト好中球に対する非同族ロイコトキシンＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ及びＬｕｋＥ／ＨｌｇＢの細胞溶解活性を示すグラフである。
【図１７Ｂ】ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、非同族ロイコトキシン対、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ及びＬｕｋＥ／ＨｌｇＢによる細胞外殺傷からの初代ヒト好中球の保護を向上させることを示す。図１７Ｂの上部及び下部のグラフは、細胞死亡率（上部グラフ）及びＬＤＨの放出（下部グラフ）によって測定された、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ媒介性の細胞溶解からの初代ヒト好中球の保護に、ＣＮＴＯ３９３０及び２つのｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が及ぼす相対的活性を示す。
【図１７Ｃ】ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、非同族ロイコトキシン対、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ及びＬｕｋＥ／ＨｌｇＢによる細胞外殺傷からの初代ヒト好中球の保護を向上させることを示す。図１７Ｃの上部及び下部のグラフは、細胞死亡率（上部グラフ）及びＬＤＨの放出（下部グラフ）によって測定された、ＬｕｋＥ／ＨｌｇＢ媒介性の細胞溶解からの初代ヒト好中球の保護に、ＣＮＴＯ３９３０及び２つのｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が及ぼす相対的活性を示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂは、ＬｕｋＥに結合して、ＬｕｋＥＤがｈＰＭＮに対して示す細胞溶解活性を中和するｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、ヒト赤血球に対するＬｕｋＥＤの溶血活性も中和することを示す。図１８Ａは、ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質処置によるＬｕｋＥＤ媒介性溶血の用量依存的減少を示す。このデータは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で観察される値を１００％として比較したときの、観察された溶血パーセントを示す。図１８Ｂは、ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質処置で観察されるＬｕｋＥＤ媒介性溶血の用量依存的減少を示す。このグラフでは、ＬｕｋＥＤ処置単独で観察される値を１００％として比較したときの、観察された溶血パーセントとしてデータを示す。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、液相水素／重水素交換（ＨＤＸ）質量分析法（ＭＳ）によって測定された、ＬｕｋＡＢ特異的ＦＮ３タンパク質（Ｌｕｋ１７  ＦＮ３）とＬｕｋＡＢとの相互作用を示す。図１９Ａは、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の存在下または不在下でのＨＤＸマッピングから得たＬｕｋＢ（配列番号１１）の差次的ヒートマップである。このマップで、保護ＬｕｋＢペプチド＃１及び保護ＬｕｋＢペプチド＃２としてそれぞれ特定されるＬｕｋＢペプチド領域、２６０ＩＤＷＮＲＨＧＦＷＧ２６９（配列番号１１のアミノ酸残基２６０〜２６９）及び２０１ＬＴＲＮＧＮＬＷＡＫＤＮＦＴＰＫＤＫＭＰＶＴＶＳ２２４（配列番号１１のアミノ酸残基２０１〜２２４）は、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３が結合するＬｕｋＡＢ中和エピトープの残基を含む。図１９Ｂは、Ｘ線結晶学によって決定した、ＬｕｋＡＢの公開された３次元構造（ＰＤＢエントリ４ｔｗ１）上でのこれらの線状配列の局在化を示す。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｂは、液相水素／重水素交換（ＨＤＸ）質量分析法（ＭＳ）によるロイコシジンＬｕｋＥ上の潜在的な中和エピトープの同定を示す。図２０Ａは、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３の存在下または不在下でのＨＤＸマッピングから得たＬｕｋＥ（配列番号１０５５）の差次的ヒートマップである。このマップで、重要な保護ＬｕｋＥペプチドとして同定されているＬｕｋＥペプチド領域、６９ＴＳＦＳＤＶＫＧＳＧＹＥＬＴ８２（配列番号１０５５のアミノ酸残基６９〜８２）及び２５５ＬＦＰＲＴＧＩＹＡＥＲＫＨＮＡＦＶＮＲＮＦ２７５（配列番号１０５５のアミノ酸残基２５５〜２７５）、ならびに重要でない保護ＬｕｋＥペプチドとして同定されている２４４ＹＧＲＮ２４７（配列番号１０５５のアミノ酸残基２４４〜２４７）は、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３が結合するＬｕｋＥ中和エピトープの残基を含む。図２０Ｂは、Ｘ線結晶学によって決定した、ＬｕｋＥの公開された３次元構造上でのこれらの線状配列の局在化を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａ〜２１Ｆは、Ｘ線結晶学によるＬｕｋＡＢ上のＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープの特性決定を示す。図２１Ａは、Ｘ線結晶学によって決定された、ＬｕｋＡＢ／Ｓ１７／２１４Ｆの三元複合体の全体的な構造を示す。この図では、ＬｕｋＡが暗灰色、ＬｕｋＢが白色、Ｆａｂ２１４が明灰色、Ｓ１７が黒色で示されている。
【図２１Ｂ】図２１Ａ〜２１Ｆは、Ｘ線結晶学によるＬｕｋＡＢ上のＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープの特性決定を示す。図２１Ｂは、ＬｕｋＡＢの八量体及びヘテロ二量体のＸ線構造から決定した、ＬｕｋＡとＬｕｋＢの膜孔形成セグメントの代替立体構造を示す。この図の左側部分は、ＬｕｋＢ（白色）の構造重ね合わせである。Ａ及びＢの２つのセグメントは、二量体及び八量体構造中で黒色及び暗灰色に着色されている。２種類の立体構造のスイッチ点は同一である。
【図２１Ｃ】図２１Ａ〜２１Ｆは、Ｘ線結晶学によるＬｕｋＡＢ上のＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープの特性決定を示す。図２１Ｃは、ＬｕｋＡＢ八量体形態の膜貫通セグメントに対する、ＬｕｋＡＢ上のＬｕｋ１７  ＦＮ３（Ｓ１７）タンパク質及びＦａｂ  ２１４Ｆ結合部位の相対位置を示す。ＬｕｋＡＢ／Ｓ１７／２１４Ｆ構造及びＬｕｋＡＢ八量体構造（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ｔｗ１）の複合体構造を示している。Ｓ１７及び２１４Ｆの結合は、二量体及び八量体いずれにも適合性がある。八量体のスイッチングセグメント（暗灰色）が内部孔を形成する一方、Ｓ１７及び２１４Ｆはいずれも八量体の外面に結合する。
【図２１Ｄ】図２１Ａ〜２１Ｆは、Ｘ線結晶学によるＬｕｋＡＢ上のＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープの特性決定を示す。図２１Ｄは、ＬｕｋＡＢ／Ｓ１７／２１４Ｆ三元複合体の構造から決定される、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質のＬｕｋＡＢ中和エピトープの最小構成要素を示す。
【図２１Ｅ】図２１Ａ〜２１Ｆは、Ｘ線結晶学によるＬｕｋＡＢ上のＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープの特性決定を示す。Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の対応するパラトープを図２１Ｅに示す。黒色で下線が引かれている標識は、結合の際に変異の影響が最も大きい残基を示し、他の黒色の標識は、中間の効果を有する残基を示す。いくつかのエピトープ残基は、変異されなかったか、または最小限の効果（灰色の標識）を有した。
【図２１Ｆ】図２１Ａ〜２１Ｆは、Ｘ線結晶学によるＬｕｋＡＢ上のＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープの特性決定を示す。図２１Ｆは、ＬｕｋＢエピトープ／Ｌｕｋ１７  ＦＮ３パラトープ界面における電子密度を表現したものである。この図では、白色の標識がＳ１７パラトープ残基を示し、黒色の標識がＬｕｋＢエピトープ残基を示す。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｂは、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープを確認するＬｕｋＢの変異マッピングを示す。図２２Ａは、一連のＬｕｋＢの部位特異的置換突然変異体に対するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって決定された、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の算出された親和性定数（ＫＤ）値を示す。アミノ酸番号はＰＤＢ  ＩＤ＃  ４ｔｗ１（配列番号１０２６）に従う。図２２Ｂは、一連の同様のＬｕｋＢ変種に対するＢＬＩによって決定された、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の算出された解離定数（Ｋｄｉｓ）値を示す。アミノ酸番号はＰＤＢエントリ４ｔｗ１（配列番号１０２６）に従う。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープを確認するＬｕｋＥの変異マッピングを示す。図２３Ａは、一連のＬｕｋＥの部位特異的置換突然変異体に対するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって決定された、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の算出された親和性定数（ＫＤ）値を示す。アミノ酸番号はＰＤＢ  ＩＤ＃  ３ＲＯＨ（配列番号１０５４）に従う。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープを確認するＬｕｋＥの変異マッピングを示す。図２３Ｂは、一連の同様のＬｕｋＥ変種に対するＢＬＩによって決定された、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の算出された解離定数（Ｋｄｉｓ）値を示す。アミノ酸番号はＰＤＢ  ＩＤ＃  ３ＲＯＨ（配列番号１０５４）に従う。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープを確認するＬｕｋＥの変異マッピングを示す。図２３Ｃは、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質のＬｕｋＥＤ中和エピトープに寄与する残基の局在を、ＬｕｋＥの公開された高分解能結晶構造の３次元表面にマッピングしたものを示す。アミノ酸番号はＰＤＢエントリ３ＲＯＨ（配列番号１０５４）に従う。明確化のため、ＨＤＸマッピングに使用した組換えＬｕｋＥ配列（実施例２０；配列番号１０５５）、変異分析に使用した組換えＬｕｋＥ配列（実施例２３；配列番号１０５６）、及び公開されたＬｕｋＥ構造の配列（ＰＤＢエントリ３ＲＯＨ；配列番号１０５４）内のＬｕｋＥＤ中和エピトープ領域のアラインメントを図２３Ｃに示す。注意点として、配列番号１０５４の付番は、公開されたＬｕｋＥ結晶構造において電子密度が明らかである、第１の残基として同定されているＴｈｒ３０に基づいている（Ｎｏｃａｄｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ”Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ７２：１１３−１２０（２０１６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる；ＰＤＢエントリ３ＲＯＨ）。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜２４Ｃは、ｍＡｂ  ５１３３のさらなる最小エピトープを定義し、Ｘ線結晶学により決定されるｍＡｂ  ５１３３とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの相互作用を特性決定している。図２４Ａは、ＥＬＩＳＡ形式アッセイで決定した、様々なグリコシル化特性を有する一連の合成セリン−アスパラギン酸（ＳＤ）リピートペプチドへのｍＡｂ  ５１３３の結合を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ａ〜２４Ｃは、ｍＡｂ  ５１３３のさらなる最小エピトープを定義し、Ｘ線結晶学により決定されるｍＡｂ  ５１３３とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの相互作用を特性決定している。図２４ＢはＳＭ１Ｂ２２９とＧｌｃＮＡｃとの複合体のリボン形式構造を示す。ＳＭ１Ｂ２２９の重鎖が灰色、軽鎖が白色、ＧｌｃＮＡｃが黒色で示されている。水素結合相互作用は点線で示されている。
【図２４Ｃ】図２４Ａ〜２４Ｃは、ｍＡｂ  ５１３３のさらなる最小エピトープを定義し、Ｘ線結晶学により決定されるｍＡｂ  ５１３３とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの相互作用を特性決定している。図２４Ｃは、ＳＭ１Ｂ２２９とＧｌｃＮＡｃとの複合体構造の静電表面電位を示す。正の静電表面電位は濃く塗りつぶされ、負の静電表面電位は薄く塗りつぶされている。ＧｌｃＮＡｃは白色で示されている。ＳＭ１Ｂ２２９の可変重鎖（ＶＨ）領域（配列番号１０８２のアミノ酸残基１〜１２０）及び可変軽鎖（ＶＬ）領域（配列番号１０８３のアミノ酸残基１〜１０７）を構造の下部に記載する。下線が引かれた領域は、各鎖のＣＤＲである。ＶＨ領域のＣＤＲ３（太字及び下線）は、ＧｌｃＮａｃ結合のための塩基性ポケットを形成する。
【図２５】ＥＬＩＳＡ形式アッセイで決定した、黄色ブドウ球菌のアルファヘモリシンとヒト血清アルブミンへのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインタンパク質及び対照の結合を示す。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｄは、ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ１７の中和エピトープを保持するＬｕｋＡＢのステムドメイン突然変異体の特性決定を示す。図２６Ａは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって決定した、Ｌｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡ（配列番号１１５３）及びＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡ（配列番号１１５２）ＦＮ３ドメイン結合タンパク質へのトキソイドＬｕｋＡＢの結合を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜２６Ｄは、ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ１７の中和エピトープを保持するＬｕｋＡＢのステムドメイン突然変異体の特性決定を示す。図２６Ｂは、ＢＬＩによって決定した、Ｌｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡ及びＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡ  ＦＮ３結合ドメインタンパク質へのＬｕｋＡＢｍｕｔ１ステムドメイン突然変異体の結合を示す。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜２６Ｄは、ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ１７の中和エピトープを保持するＬｕｋＡＢのステムドメイン突然変異体の特性決定を示す。図２６Ｃは、ＢＬＩによって決定した、Ｌｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡ及びＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡ  ＦＮ３結合ドメインタンパク質へのＬｕｋＡＢｍｕｔ２ステムドメイン突然変異体の結合を示す。
【図２６Ｄ】図２６Ａ〜２６Ｄは、ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ１７の中和エピトープを保持するＬｕｋＡＢのステムドメイン突然変異体の特性決定を示す。図２６Ｄは、ＢＬＩによって決定した、Ｌｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡ及びＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡ  ＦＮ３結合ドメインタンパク質へのＬｕｋＡＢｍｕｔ３ステムドメイン突然変異体の結合を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａ〜２７Ｉは、血清曝露が延長された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質が、致死量のロイコトキシンＬｕｋＥＤからマウスを保護することを示す。図２７Ａは、試験品投与から２時間後及び２４時間後のマウスからの血清中で検出されたＦＮ３ドメインタンパク質の相対レベルのウェスタンブロット分析を示す。親ＦＮ３ドメインタンパク質は、どちらの時点でも検出されていない。対照的に、長時間の血清滞留（及び血清中の曝露）を示すＦＮ３ドメイン融合タンパク質は、試験品投与後２時間及び２４時間の両方で、全長タンパク質として検出される。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜２７Ｉは、血清曝露が延長された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質が、致死量のロイコトキシンＬｕｋＥＤからマウスを保護することを示す。図２７Ｂは、致死用量のＬｕｋＥＤ毒素をマウスに投与した後に、一連のＦＮ３ドメインタンパク質に観察される相対的保護を示す。投与から４時間後、血清アルブミンと結合するアミノ末端ＦＮ３ドメインタンパク質と、ＬｕｋＥＤに結合し、その細胞溶解活性を中和するカルボキシル末端ＦＮ３ドメインタンパク質とを有するＳＡＦＮ３−ＬｕｋＥ２６融合タンパク質について１００％の保護が観察されている。
【図２７Ｃ】図２７Ａ〜２７Ｉは、血清曝露が延長された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質が、致死量のロイコトキシンＬｕｋＥＤからマウスを保護することを示す。図２７Ｃは、ＬｕｋＥＤによる初回致死毒素負荷から４．５時間後に、動物へのＳＡＦＮ３−ＬｕｋＥ２６の投与を再負荷すると、この１００％の保護が保持されることを示す。
【図２７Ｄ】図２７Ａ〜２７Ｉは、血清曝露が延長された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質が、致死量のロイコトキシンＬｕｋＥＤからマウスを保護することを示す。図２７Ｄは、致死用量のＬｕｋＥＤ毒素をマウスに投与した後に、一連のＦＮ３ドメインタンパク質に観察される相対的保護を示す。投与から４時間後、アミノ末端血清アルブミン結合ドメインと、ＬｕｋＥＤに結合し、その細胞溶解活性を中和するカルボキシル末端ＦＮ３ドメインタンパク質とを有するＳＡＢＤ−ＬｕｋＥ２６融合タンパク質について１００％の保護が観察されている。
【図２７Ｅ】図２７Ａ〜２７Ｉは、血清曝露が延長された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質が、致死量のロイコトキシンＬｕｋＥＤからマウスを保護することを示す。図２７Ｅは、ＬｕｋＥＤによる初回致死毒素負荷から４．５時間後に、動物へのＳＡＢＤ−ＬｕｋＥ２６の投与を再負荷すると、この１００％の保護が保持されることを示す。
【図２７Ｆ】図２７Ａ〜２７Ｉは、血清曝露が延長された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質が、致死量のロイコトキシンＬｕｋＥＤからマウスを保護することを示す。図２７Ｆは、致死用量のＬｕｋＥＤ毒素をマウスに投与した後に、一連のＦＮ３ドメインタンパク質に観察される相対的保護を示す。投与から４時間後、トランスフェリンと結合するアミノ末端ＦＮ３ドメインタンパク質と、ＬｕｋＥＤに結合し、その細胞溶解活性を中和するカルボキシル末端ＦＮ３ドメインタンパク質とを有するＴＦＦＮ３−ＬｕｋＥ２６融合タンパク質について１００％の保護が観察されている。
【図２７Ｇ】図２７Ａ〜２７Ｉは、血清曝露が延長された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質が、致死量のロイコトキシンＬｕｋＥＤからマウスを保護することを示す。図２７Ｇは、ＬＤＨの放出（図２７Ｇ）により測定された、新たに調製したヒトＰＭＮに対するＬｕｋＥＤのｅｘ  ｖｉｖｏ溶解活性の中和に一連のＦＮ３ドメインタンパク質が及ぼす相対的活性を示す。予測された通り、ＬｕｋＥＤの細胞溶解活性の中和はＬｕｋＥ２６要素を含むＦＮ３ドメインタンパク質すべてに観察されている。
【図２７Ｈ】図２７Ａ〜２７Ｉは、血清曝露が延長された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質が、致死量のロイコトキシンＬｕｋＥＤからマウスを保護することを示す。図２７Ｈは、細胞死（図２７Ｈ）により測定された、新たに調製したヒトＰＭＮに対するＬｕｋＥＤのｅｘ  ｖｉｖｏ溶解活性の中和に一連のＦＮ３ドメインタンパク質が及ぼす相対的活性を示す。予測された通り、ＬｕｋＥＤの細胞溶解活性の中和はＬｕｋＥ２６要素を含むＦＮ３ドメインタンパク質すべてに観察されている。
【図２７Ｉ】図２７Ａ〜２７Ｉは、血清曝露が延長された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質が、致死量のロイコトキシンＬｕｋＥＤからマウスを保護することを示す。最後に、図２７Ｉは、ＬｕｋＥＤよりもＳＡＢＤ−Ｌｕｋ２６の分子量が１倍、１０倍、１００倍でＳＡＢＤ−Ｌｕｋ２６を投与後、５、２４、及び４８時間後に致死用量のＬｕｋＥＤロイコシジンを逐次投与した後のマウスの保護の程度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
本開示の第１の態様は、１つ以上の修飾フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む結合分子であって、それぞれの修飾ＦＮ３ドメインが、１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシン結合領域を含む１つ以上のループ領域を有する結合分子に関する。
【００２２】
ＦＮ３ドメインは、長さが約１００アミノ酸であり、ベータサンドイッチ構造を有している進化的に保存されたタンパク質ドメインである。ヒトＦＮ３のベータサンドイッチ構造は、Ａ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖、Ｄ鎖、Ｅ鎖、Ｆ鎖、Ｇ鎖と呼ばれる７本のベータ鎖に加え、免疫グロブリンの結合ドメインと構造的相同性を示すＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ、及びＦＧループと呼ばれる６つの連結ループを含む。６つのループのうちの３つ、すなわちＤＥループ、ＢＣループ、及びＦＧループは、抗体の相補性決定領域、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と位相的に対応する。残りの３つのループは、抗体のＣＤＲ３と同様に表面に露出されている。本開示によれば、結合分子の各修飾ＦＮ３ドメインの１つ以上のループ領域は、１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシン結合領域を含むように修飾されている。
【００２３】
本発明の結合分子の修飾ＦＮ３ドメインは、これらのドメインを含む多様な動物、酵母、植物、及び細菌の細胞外タンパク質のいずれかに由来するＦＮ３ドメインであり得る。一実施形態では、ＦＮ３ドメインは、哺乳動物ＦＮ３ドメイン由来である。例示的ＦＮ３ドメインとしては、例えば、限定するものではないが、ヒトテネイシンＣ中に存在する１５種類のＦＮ３ドメイン、またはヒトフィブロネクチン（ＦＮ）中に存在する１５種類のＦＮ３ドメインのうちのいずれか１つ（例えば、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）が挙げられる。例示的ＦＮ３ドメインは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＪａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，に対する米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号に記載されているものなどの非天然の合成ＦＮ３ドメインも含む。個々のＦＮ３ドメインは、例えば、テネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、またはフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）のように、ドメイン番号及びタンパク質名で呼ぶ。
【００２４】
一実施形態では、結合分子のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１０１７）の天然に存在しないＦＮ３ドメイン由来である。Ｔｅｎｃｏｎは、ヒトテネイシンＣ由来の１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ＦＮ３  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ａ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ，  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２５：１０７−１１７（２０１２）、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、結合分子のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ−２５（配列番号１）の天然に存在しないＦＮ３ドメイン由来であり、これは、Ｄｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｅｎｔｙｒｉｎ  ＦＮ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  ａｔ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒａｎｄ  ａｎｄ  ｌｏｏｐ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １０：４１９−４２９（２０１４）に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
他のＦＮ３ドメイン同様、Ｔｅｎｃｏｎドメインは、６つのループ、すなわちＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ、及びＦＧループで連結された７本のベータ鎖、すなわちＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧをもつベータサンドイッチ構造を有する（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８９９０−８９９２（１９９２）及びＫｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，に対する米国特許第６，６７３，９０１号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらのループは、配列番号１のアミノ酸残基１３〜１６（ＡＢループ）、配列番号１のアミノ酸残基２２〜２８（ＢＣループ）、配列番号１のアミノ酸残基３８〜４３（ＣＤループ）、配列番号１のアミノ酸残基５１〜５４（ＤＥループ）、配列番号１のアミノ酸残基６０〜６４（ＥＦループ）、及び配列番号１のアミノ酸残基７５〜８１（ＦＧループ）に、またはその近傍に伸長する。本開示によれば、１つ以上のこれらのループ領域、または１つ以上のこれらのループ領域内の選択された残基が、ブドウ球菌ロイコトキシンとの結合特異性及び親和性を得るために修飾される。好適な修飾は、アミノ酸残基の置換、挿入、及び／または欠失を含む。一態様では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つすべてのループ領域のアミノ酸残基が、ブドウ球菌ロイコトキシンとの結合特異性及び親和性を得るために修飾される。一実施形態では、配列番号１の残基２２〜２８（ＢＣループ）、３８〜４３（ＣＤループ）、５１〜５４（ＤＥループ）、及び７５〜８１（ＦＧループ）と同一またはその近傍のループ領域内の１つ以上のアミノ酸修飾が、ブドウ球菌ロイコトキシンの結合領域を形成する。別の実施形態では、配列番号１の残基３８〜４３（ＣＤループ）及び７５〜８１（ＦＧループ）と同一またはその近傍のループ領域内の１つ以上のアミノ酸修飾が、ブドウ球菌ロイコトキシンの結合領域を形成する。修飾された１つ以上のループ領域は、好ましくは、抗体ＣＤＲのタンパク質との相互作用と同様に、その標的であるブドウ球菌ロイコトキシンタンパク質と相互作用する。
【００２６】
上述のように、ＦＮ３ドメインは、分子の対面に２組のＣＤＲ様ループを含んでいる。２組のループはＦＮ３構造の中心を形成するベータ鎖によって分離されている。ループ同様に、このベータ鎖を修飾して、標的分子の結合特異性及び親和性を強化することができる。ベータ鎖の表面に露出する残基の一部または全部を、ＦＮ３ドメイン固有の安定性に影響を与えることなく（または影響を最小限にして）ランダム化することが好ましい。ベータ鎖のうちの１つ以上が標的タンパク質と相互作用することができる。ＦＮ３結合分子のベータ鎖は、標的タンパク質、またはその標的タンパク質の特異的エピトープに影響を与える結合表面が、（隣接するループを含むタンパク質足場に見られる湾曲した結合表面と比較して）平坦であるため、ドメインが効果的に結合することができる。一態様では、ＦＮ３ドメインの１つ以上のベータ鎖の少なくとも一部が、ブドウ球菌ロイコトキシンタンパク質と相互作用するように修飾される。好適な修飾は、アミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失を含む。例えば、Ａベータ鎖（すなわち配列番号１の残基１〜１２に対応するアミノ酸残基）、Ｂベータ鎖（すなわち配列番号１の残基１７〜２１に対応するアミノ酸残基）、Ｃベータ鎖（すなわち配列番号１の残基２９〜３７に対応するアミノ酸残基）、Ｄベータ鎖（すなわち配列番号１の残基４４〜５０に対応するアミノ酸残基）、Ｅベータ鎖（すなわち配列番号１の残基５５〜５９に対応するアミノ酸残基）、Ｆベータ鎖（すなわち配列番号１の残基６５〜７４に対応するアミノ酸残基）、またはＧベータ鎖（すなわち配列番号１の残基８２〜８９に対応するアミノ酸残基）のうちの１つ以上のアミノ酸残基を修飾することで、ブドウ球菌ロイコトキシン結合ドメインを生成する、またはロイコトキシン結合の特異性もしくは親和性を増強することができる。一実施形態では、Ｃベータ鎖及び／またはＦベータ鎖の１つ以上のアミノ酸残基が、ブドウ球菌ロイコトキシンタンパク質に結合するように修飾される。
【００２７】
一実施形態では、本発明の結合分子は、本明細書でブドウ球菌ロイコシジンとも称する１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシンに特異的に結合する。ブドウ球菌ロイコトキシンは、黄色ブドウ球菌が放出する二成分毒素ファミリーであり、２つの関連性のないタンパク質またはサブユニット、すなわちＳサブユニット及びＦサブユニットの相乗作用により宿主防御細胞及び赤血球の膜を損傷させる（Ｍｅｎｅｓｔｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｄｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ−Ｂａｒｒｅｌ  Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ，”Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９（１１）：１６６１−１６７２（２００１）を参照）。本明細書に記載の結合分子は、ロイコトキシンＡ（ＬｕｋＡ）、ロイコトキシンＢ（ＬｕｋＢ）、ロイコトキシンＡＢ（ＬｕｋＡＢ）、ロイコトキシンＤ（ＬｕｋＤ）、ロイコトキシンＥ（ＬｕｋＥ）、ロイコトキシンＥＤ（ＬｕｋＥＤ）、パントンバレンタインロイコシジンＳ（ＬｕｋＳ−ＰＶ）、パントンバレンタインロイコシジンＦ（ＬｕｋＦ−ＰＶ）、パントンバレンタインロイコシジン（ＬｕｋＳＦ／ＰＶＬ）、ガンマ−ヘモリシンＡ（ＨｌｇＡ）、ガンマ−ヘモリシンＣ（ＨｌｇＣ）、ガンマ−ヘモリシンＢ（ＨｌｇＢ）、ガンマ−ヘモリシンＡＢ（ＨｌｇＡＢ）、及びガンマ−ヘモリシンＢＣ（ＨｌｇＢＣ）から選択される１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシンに結合する。一実施形態では、結合分子はＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥから選択される１つ以上のブドウ球菌ロイコトキシンに結合する。別の実施形態では、本明細書の結合分子は、上記タンパク質の断片に特異的に結合することができ、この断片は少なくともロイコトキシンタンパク質の中和エピトープを含む。ロイコトキシンタンパク質の中和エピトープへの本開示の結合分子の結合は、実質的にまたは完全にロイコトキシンの細胞溶解及び／または溶血活性を排除する。中和エピトープは一般に、宿主細胞膜または受容体への結合に関与するロイコトキシンタンパク質の領域、他のロイコトキシンタンパク質との相互作用とオリゴマー形成に関与するロイコトキシンタンパク質の領域、及び膜孔形成に関与するロイコトキシンタンパク質の領域を含む。本開示の結合分子は、結合分子の不在下でのロイコトキシン活性と比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または１００％までロイコトキシン活性を中和する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」または「特異的結合」とは、本開示の結合分子を含むＦＮ３が所定の抗原、すなわち、解離定数（ＫＤ）約１ｘ１０−６Ｍ以下、例えば約１ｘ１０−７Ｍ以下、約１ｘ１０−８Ｍ以下、約１ｘ１０−９Ｍ以下、約１ｘ１０−１０Ｍ以下、約１ｘ１０−１１Ｍ以下、約１ｘ１０−１２Ｍ以下、または約１ｘ１０−１３Ｍ以下のブドウ球菌ロイコトキシンに結合する能力を指す。通常、ロイコトキシン結合ＦＮ３ドメインは、表面プラズモン共鳴法により、例えばＰｒｏｔｅｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して測定したとき、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡまたはカゼイン）に対するＫＤの少なくとも１０分の１のＫＤをもつ標的ロイコトキシン（複数可）に結合する。したがって、本明細書に記載の分子を含む単一特異性、二重特異性、または多重特異性ロイコトキシンＦＮ３ドメインは、少なくとも１ｘ１０−６Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）をもつ各標的ロイコトキシンに特異的に結合する。ただし、ブドウ球菌ロイコトキシンに特異的に結合する、本開示の単離された修飾ＦＮ３ドメインは、他の関連する二成分毒素、例えば関連するＳサブユニットまたはＦサブユニットロイコトキシンとの交差反応性を有し得る。
【００２９】
一態様では、結合分子は、１つ以上のＬｕｋＥ結合領域を含む１つ以上のループ領域を有する修飾ＦＮ３ドメインを含む。この結合分子は、配列番号１０５５のアミノ酸配列またはその断片もしくはホモログを有するブドウ球菌ＬｕｋＥタンパク質に結合することができる。配列番号１０５５によって例示されるＬｕｋＥタンパク質は、Ｎ末端ヒスチジンタグを含むように修飾されたネイティブの成熟ＬｕｋＥタンパク質配列に相当する。したがって、配列番号１０５５の１２位のアミノ酸残基は、成熟ＬｕｋＥタンパク質の最初のアミノ酸残基に相当する。
【００３０】
一実施形態では、ＬｕｋＥへのＬｕｋＥ結合分子の結合は、例えば、ＬｕｋＥとＬｕｋＤの相互作用の阻害、ＬｕｋＥの白血球形質膜への結合の阻害、及び／またはＬｕｋＥＤの膜孔形成の阻害により、ＬｕｋＥ細胞溶解活性及び／または溶血活性を効果的に中和する。本実施形態によれば、ＬｕｋＥ結合分子は、配列番号１０５５の残基２２〜３３に対応するアミノ酸残基（ＬｕｋＥ−ＬｕｋＤのタンパク質相互作用に関与する残基）、配列番号１０５５の残基１２３〜１２８に対応するアミノ酸残基（ＬｕｋＥＤの膜透過に関与する残基）、または配列番号１０５５の残基１３７〜１４２に対応するアミノ酸残基（ＬｕｋＥＤの膜透過に関与する残基）を含むかまたはそれらからなるＬｕｋＥの領域内の１つ以上のＬｕｋＥのエピトープに結合する。別の実施形態では、ＬｕｋＥ結合分子は、ＬｕｋＥの細胞標的化に関与するＬｕｋＥの領域内の１つ以上のＬｕｋＥのエピトープに結合する。これらの領域は、配列番号１０５５の残基６８〜８６に対応するアミノ酸残基、配列番号１０５５の残基１５１〜１６１に対応するアミノ酸残基、配列番号１０５５の残基１７５〜１８９に対応するアミノ酸残基、配列番号１０５５の残基１９３〜２０７に対応するアミノ酸残基、及び配列番号１０５５の残基２４８〜２７８に対応するアミノ酸残基を含む。本明細書の実施例に示すように、配列番号１０５５のアミノ酸残基６９〜８４（配列番号１０５４のアミノ酸残基８６〜１０１に対応する）、及び配列番号１０５５のアミノ酸残基２５２〜２７５（配列番号１０５４のアミノ酸残基２６９〜２９２に対応する）は、ＬｕｋＥの中和エピトープを含む。
【００３１】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000003
を有するＣ鎖及びＣＤループ領域を含み、式中、
Ｘ３２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３４は、Ｅまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ３６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３９は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ４０は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４１は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ４２は、任意のアミノ酸残基であり；
ならびに本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000004
を有するＦ鎖及びＦＧループ領域を含み、式中、
Ｘ６６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ６８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７０は、Ｆまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７２は、Ｇまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７７は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７９は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８１は、任意のアミノ酸残基である。
【００３２】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、配列番号９９３のＣ鎖及びＣＤループ領域と、上記の配列番号９９４のＦ鎖及びＦＧループ領域とを含み、上記のＬｕｋＥの領域、すなわち配列番号１０５５のアミノ酸残基２２〜３３、１２３〜１２８、１３７〜１４２、６８〜８６、１５１〜１６１、１７５〜１８９、１９３〜２０７、及び２４８〜２７８のいずれかにあるＬｕｋＥの中和エピトープと結合する。
【００３３】
別の実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000005
を含み、式中、
Ｘ３２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３４は、Ｅまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ３６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３９は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ４０は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４１は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ４２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ６６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ６８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７０は、Ｆまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７２は、Ｇまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７７は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７９は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８１は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８４は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８６は、任意のアミノ酸残基である。
【００３４】
本態様によれば、例示的なＬｕｋＥ結合分子は、配列番号２５（Ｌｕｋ２６）及び７３９〜８１４のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、これらのＬｕｋＥ結合分子は、発現及び／または別の部分（例えば、別のロイコトキシン結合ＦＮ３ドメイン、半減期延長部分、または他の治療用部分）とのコンジュゲートを容易にするために、Ｎ末端に連結された開始メチオニン残基またはＣ末端に連結されたシステイン残基を含む。
【００３６】
別の実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、配列番号２５（Ｌｕｋ２６）の残基Ｅ３４、Ｗ３９、Ｗ４１、Ｆ７０、及びＧ７２に対応する１つ以上のアミノ酸残基をもつＬｕｋＥと結合する。したがって、ＬｕｋＥ結合領域を含むＦＮ３ドメイン結合分子は、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２５の残基Ｅ３４、Ｗ３９、Ｗ４１、Ｆ７０、及びＧ７２は固定されたままであるか、または機能的に等価なアミノ酸残基で置換される。
【００３７】
別の実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000006
を有するＣ鎖及びＣＤループ領域を含み、式中、
Ｘ３２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３４は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３８は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ３９は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４０は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４１は、任意のアミノ酸残基であり；
ならびに本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000007
を有するＦ鎖及びＦＧループ領域を含み、式中、
Ｘ６８は、Ｌまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７０は、Ｄまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７２は、Ｙまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７９は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８１は、Ｙまたは機能的に等価なアミノ酸残基である。
【００３８】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、配列番号９９５のＣ鎖及びＣＤループ領域と、上記の配列番号９９６のＦ鎖及びＦＧループ領域とを含み、上記のＬｕｋＥの領域、すなわち配列番号１０５５のアミノ酸残基２２〜３３、１２３〜１２８、１３７〜１４２、６８〜８６、１５１〜１６１、１７５〜１８９、１９３〜２０７、及び２４８〜２７８のいずれかにあるＬｕｋＥの中和エピトープと結合する。
【００３９】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000008
を含み、式中、
Ｘ３２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３４は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３８は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ３９は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４０は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４１は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ６８は、Ｌまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７０は、Ｄまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７２は、Ｙまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７９は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８１は、Ｙまたは機能的に等価なアミノ酸残基である。
【００４０】
本実施形態によれば、例示的なＬｕｋＥ結合分子は、配列番号２６（Ｌｕｋ２７）及び８１５〜８２７のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、これらのＬｕｋＥ結合分子は、発現及び／または別の部分（例えば、別のロイコトキシン結合ＦＮ３ドメイン、半減期延長部分、または他の治療用部分）とのコンジュゲートを容易にするために、Ｎ末端に連結された開始メチオニン残基またはＣ末端に連結されたシステイン残基を含む。
【００４１】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、配列番号２６（Ｌｕｋ２７）の残基Ｗ３８、Ｌ６８、Ｄ７０、Ｙ７２、Ｗ７９、及びＹ８１に対応する１つ以上のアミノ酸残基をもつＬｕｋＥと結合する。したがって、ＬｕｋＥ結合領域を含むＦＮ３ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２６の残基Ｗ３８、Ｌ６８、Ｄ７０、Ｙ７２、Ｗ７９、及びＹ８１は固定されたままであるか、または機能的に等価なアミノ酸残基で置換される。
【００４２】
別の実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000009
を有するＦＧループ領域を含み、式中、
Ｘ７５は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７７は、Ｉまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７９は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８０は、Ｇまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８１は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８２は、Ｌまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８３は、Ｄまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８４は、Ｆまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８５は、Ｖまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８６は、Ｆまたは機能的に等価なアミノ酸残基である。
【００４３】
一実施形態では、配列番号９９７のＦＧループ領域は１つ以上のアミノ酸挿入を含み得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸残基のアミノ酸挿入を、配列番号９９７または配列番号９９１の位置Ｘ７５及びＸ７６またはその近傍に行うことができる。同様に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸残基のアミノ酸挿入を、配列番号９９７または配列番号９９１の位置Ｘ７８及びＸ７９またはその近傍に行うことができる。
【００４４】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、上記の配列番号９９７のＦＧループ領域を含み、上記のＬｕｋＥの領域、すなわち配列番号１０５５のアミノ酸残基２２〜３３、１２３〜１２８、１３７〜１４２、６８〜８６、１５１〜１６１、１７５〜１８９、１９３〜２０７、及び２４８〜２７８のいずれかにあるＬｕｋＥの中和エピトープと結合する。
【００４５】
本実施形態によれば、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000010
を含み、式中、
Ｘ７５は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７７は、Ｉまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７９は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８０は、Ｇまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８１は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８２は、Ｌまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８３は、Ｄまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８４は、Ｆまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８５は、Ｖまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８６は、Ｆまたは機能的に等価なアミノ酸残基である。
【００４６】
本実施形態によれば、例示的なＬｕｋＥ結合分子は、配列番号３７（Ｌｕｋ３８）及び８２８〜８３９のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、これらのＬｕｋＥ結合分子は、発現及び／または別の部分（例えば、別のロイコトキシン結合ＦＮ３ドメイン、半減期延長部分、または他の治療用部分）とのコンジュゲートを容易にするために、Ｎ末端に連結された開始メチオニン残基またはＣ末端に連結されたシステイン残基を含む。
【００４７】
別の実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＥ結合分子は、配列番号３７（Ｌｕｋ３８）の残基Ｉ７７、Ｇ８０、Ｗ８１、Ｌ８２、Ｄ８３、Ｆ８４、Ｖ８５、及びＦ８６に対応する１つ以上のアミノ酸残基をもつＬｕｋＥと結合する。一実施形態では、ＬｕｋＥ結合領域を含むＦＮ３ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
さらなる例示的なＬｕｋＥ結合分子を本明細書で開示する。したがって、本開示の例示的なＬｕｋＥ結合分子は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、１１３、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１５５、３６３、３６４、３６６、３６７、３６８、３６９、３７５、３７６、３８８、及び５８６のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、１１３、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１５５、３６３、３６４、３６６、３６７、３６８、３６９、３７５、３７６、３８８、及び５８６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、これらのＬｕｋＥ結合分子は、発現及び／または別の部分（例えば、別のロイコトキシン結合ＦＮ３ドメイン、半減期延長部分、または他の治療用部分）とのコンジュゲートを容易にするために、Ｎ末端に連結された開始メチオニン残基またはＣ末端に連結されたシステイン残基を含む。
【００４９】
別の態様では、本明細書に記載の結合分子は、１つ以上のＬｕｋＡ及び／またはＬｕｋＢ結合領域を含む１つ以上の修飾ループ領域を有するＦＮ３ドメインを含む。この結合分子は、配列番号６７１のアミノ酸配列またはその断片もしくはホモログを有するＬｕｋＡタンパク質、及び／または配列番号１１のアミノ酸配列またはその断片もしくはホモログを有するＬｕｋＢタンパク質に結合することができる。一実施形態では、結合分子は、例えば、ＬｕｋＡとＬｕｋＢの相互作用を阻害することによって、または宿主免疫細胞へのＬｕｋＡＢの結合を阻害することによって、ＬｕｋＡＢ活性を中和する。本実施形態によれば、結合分子は、ＬｕｋＡの１つ以上の中和エピトープ及び／またはＬｕｋＢの１つ以上の中和エピトープに結合する。本明細書の実施例に詳細に記載するように、配列番号１１のアミノ酸残基２０１〜２２４及び２６０〜２６９は、中和エピトープを含むＬｕｋＢの領域を含む。
【００５０】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＡＢ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000011
を有するＣ鎖及びＣＤループ領域を含み、式中、
Ｘ３２は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ３４は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３６は、Ｅまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ３８は、Ｋまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ３９は、Ｆまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ４０は、Ｙまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ４１は、Ｒまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ４２は、任意のアミノ酸残基であり；
ならびに本明細書に記載のＬｕｋＡＢ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000012
を有するＦ鎖及びＦＧループ領域を含み、式中、
Ｘ６６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ６８は、Ｋまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７０は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７７は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７９は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８１は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基である。
【００５１】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＡＢ結合分子は、配列番号９９８のＣ鎖及びＣＤループ領域と、上記の配列番号９９９のＦ鎖及びＦＧループ領域とを含み、上記のＬｕｋＢの領域、すなわち配列番号１１のアミノ酸残基２０１〜２２４及び／または２６０〜２６９のいずれかにあるＬｕｋＢの中和エピトープと結合する。
【００５２】
本実施形態によれば、本明細書に記載の例示的なＬｕｋＡＢ結合分子は、アミノ酸配列
2018517708.tif 000013
を含み、式中、
Ｘ３２は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ３４は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３６は、Ｅまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ３８は、Ｋまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ３９は、Ｆまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ４０は、Ｙまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ４１は、Ｒまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ４２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ４６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ６６は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ６８は、Ｋまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７０は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ７２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７７は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７８は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ７９は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８１は、Ｗまたは機能的に等価なアミノ酸残基であり、
Ｘ８２は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８４は、任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ８６は、任意のアミノ酸残基である。
【００５３】
本実施形態によれば、例示的なＬｕｋＡＢ結合分子は、配列番号１４（Ｌｕｋ１７）及び６７２〜７３８のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、これらのＬｕｋＡＢ結合分子は、発現及び／または別の部分（例えば、別のロイコトキシン結合ＦＮ３ドメイン、半減期延長部分、または他の治療用部分）とのコンジュゲートを容易にするために、Ｎ末端に連結された開始メチオニン残基またはＣ末端に連結されたシステイン残基を含む。
【００５４】
別の実施形態では、本明細書に記載のＬｕｋＡＢ結合分子は、配列番号１４（Ｌｕｋ１７）の残基Ｗ３２、Ｔ３４、Ｅ３６、Ｋ３８、Ｆ３９、Ｙ４０、Ｒ４１、Ａ４４、Ｖ４６、Ｅ６６、Ｋ６８、Ｗ７０、Ｖ７２、Ｗ８１、及びＰ８２に対応する１つ以上のアミノ酸残基をもつＬｕｋＡＢと結合する。一実施形態では、ＬｕｋＡＢ結合領域を含むＦＮ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１４のアミノ酸残基Ｗ３２、Ｔ３４、Ｅ３６、Ｋ３８、Ｆ３９、Ｙ４０、Ｒ４１、Ａ４４、Ｖ４６、Ｅ６６、Ｋ６８、Ｗ７０、Ｖ７２、Ｗ８１、及びＰ８２は固定されたままであるか、または機能的に等価なアミノ酸残基で置換される。
【００５５】
さらなる例示的なＬｕｋＡＢ結合分子を本明細書で開示する。したがって、本開示の例示的なＬｕｋＡＢ結合分子は、配列番号１５、１６、１７、１４５、１５６、１５８、１６７、２１４、２２６、２４７、２８２、２８６、３１６、３７０、３８６、３８８、３９２、４４６、４５４、４６２、５３０、５４０、５６８、５７４、５８４、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６のいずれか１つのアミノ酸配列、ならびに、配列番号１５、１６、１７、１４５、１５６、１５８、１６７、２１４、２２６、２４７、２８２、２８６、３１６、３７０、３８６、３８８、３９２、４４６、４５４、４６２、５３０、５４０、５６８、５７４、５８４、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、これらのＬｕｋＡＢ結合分子は、発現及び／または別の部分（例えば、別のロイコトキシン結合ＦＮ３ドメイン、半減期延長部分、または他の治療用部分）とのコンジュゲートを容易にするために、Ｎ末端に連結された開始メチオニン残基またはＣ末端に連結されたシステイン残基を含む。
【００５６】
本開示の別の態様は、１つ以上の修飾フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む結合分子であって、修飾ＦＮ３ドメインが１つ以上のブドウ球菌ヘモリシン結合領域を含む１つ以上のループ領域を有する結合分子に関する。一実施形態では、本明細書に記載の結合分子は、１つ以上のブドウ球菌アルファ−ヘモリシン（Ｈｌａ）結合領域を含む１つ以上の修飾ループ領域を有するＦＮ３ドメインを含む。この結合分子は、配列番号１０８６のアミノ酸配列またはその断片もしくはホモログを有するＨｌａタンパク質に結合することができる。一実施形態では、結合分子は、Ｈｌａ活性、例えば、Ｈｌａ媒介性の膜孔形成及び細胞死を中和する。本実施形態によれば、結合分子は、Ｈｌａの１つ以上の中和エピトープに結合する。
【００５７】
本実施形態によれば、例示的なＨｌａ結合分子は、配列番号１０９７、１０９９、１１１２、１１４２、及び１１００のいずれか１つのアミノ酸配列、ならびに配列番号１０９７、１０９９、１１１２、１１４２、及び１１００のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、これらのＨｌａ結合分子は、発現及び／または別の部分（例えば、別のロイコトキシン結合ＦＮ３ドメイン、半減期延長部分、または他の治療用部分）とのコンジュゲートを容易にするために、Ｎ末端に連結された開始メチオニン残基またはＣ末端に連結されたシステイン残基を含む。
【００５８】
一実施形態では、本明細書に開示される結合分子は、単一特異性結合分子である。別の実施形態では、本明細書に開示される結合分子は、二重特異性結合分子である。本開示の二重特異性結合分子は、第１のブドウ球菌ロイコトキシン結合領域を有する第１のＦＮ３ドメインと、第１のブドウ球菌ロイコトキシン結合領域とは異なる第２のブドウ球菌ロイコトキシン結合領域を有する第２のＦＮ３ドメインとを含む分子である。別の実施形態では、本開示の結合分子は、多重特異性結合分子である。本明細書に記載の多重特異性結合分子は、各ＦＮ３ドメインが異なるブドウ球菌ロイコトキシン結合領域を有する、少なくとも第１、第２、及び第３のＦＮ３ドメインを有する分子である。すなわち、この結合分子は、それぞれが互いに異なる少なくとも第１、第２、及び第３ブドウ球菌ロイコトキシン結合領域を含む。本明細書に開示される二重特異性及び多重特異性結合分子は、任意の第１のブドウ球菌ロイコトキシン結合ＦＮ３ドメインと、任意の第２または第３またはそれ以上のブドウ球菌ロイコトキシン結合ＦＮ３ドメインとを直接的にまたはリンカーを介して共有結合することにより生成され得る。好適なリンカーには、グリシン及びセリンまたはアラニン及びプロリンなどの１つ以上のアミノ酸の反復モジュールで構成されるペプチドが含まれる。例示的なリンカーペプチドとしては、例えば（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ）ｎ、（Ａｌａ−Ｐｒｏ）ｎが挙げられ、ここでｎは１〜２５の整数である。リンカーの長さは、結合分子の機能に影響を及ぼさない限り、適宜調整することができる。標準的な１５アミノ酸（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカーペプチドは、（例えば、抗体一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ドメインの状況内で）十分に特性決定されており、非構造的で柔軟な立体構造を採ることが示されている。さらに、このリンカーペプチドは、それが結合するドメインの組み立て及び結合活性を妨害しない（Ｆｒｅｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”ＦＥＢＳ  ３２０：９７（１９９３）、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５９】
一実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、異なるロイコトキシン結合領域を有する第２のＦＮ３ドメインと結合された、ブドウ球菌ＬｕｋＥ結合領域、例えば上記のＦＮ３ドメインＬｕｋＥ結合領域のいずれかを有する第１のＦＮ３ドメインを含む。一実施形態では、第２のＦＮ３ドメインは、ＬｕｋＡＢ結合領域、例えば、上記のＦＮ３ドメインＬｕｋＡＢ結合領域のいずれかを含む。一実施形態では、二重特異性結合分子は、配列番号９８９、９９０、または９９１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬｕｋＥ結合ＦＮ３ドメインと、配列番号９９２のアミノ酸配列を含むＬｕｋＡＢ結合ＦＮ３ドメインとを有する。別の実施形態では、ＬｕｋＥ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号２５〜５９、１１３、１１６〜１３６、１５５、３６３、３６４、３６６〜３６９、３７５、３７６、３８８、５８６、及び７３９〜８３９から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＬｕｋＡＢ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１４、１５、１６、１７、１４５、１５６、１５８、１６７、２１４、２２６、２４７、２８２、２８６、３１６、３７０、３８６、３８８、３９２、４４６、４５４、４６２、５３０、５４０、５６８、５７４、５８４、５８７〜６６６、及び６７２〜７３８から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む。
【００６０】
本明細書に記載のブドウ球菌ロイコトキシンに特異的に結合するＦＮ３ドメインは修飾することで、熱安定性ならびに熱によるフォールディング及びアンフォールディングの可逆性などの特性を改善することができる。酷似した熱安定性配列との比較に基づく合理的な設計、ジスルフィド架橋を安定化する設計、アルファ−ヘリックス傾向性を増加させる変異、塩橋の遺伝子操作、タンパク質の表面電荷の改変、指向性進化、及びコンセンサス配列の構成を含む、複数の方法がタンパク質及び酵素の見かけの熱安定性の増加に適用されてきた（Ｌｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２：３７１−３７５（２００１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。熱安定性が高いと、発現タンパク質の収量を増加させ、溶解性または活性を改善し、免疫原性を低下させ、製造時の低温流通の必要性を最小限にすることができる。置換することで、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１０１７）またはＴｅｎｃｏｎ２５（配列番号１）の熱安定性を改善することができる残基としては、限定するものではないが、１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６位の残基が挙げられ、これらはＪａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの残基に対応する置換を、ＦＮ３ドメイン、すなわち単一特異性、二重特異性、または多重特異性ＦＮ３ドメインを含む本開示の結合分子に組み込むことができる。
【００６１】
本開示の結合分子は、好ましくは「単離された」結合分子である。本明細書に開示される結合分子の記載に使用される場合、「単離された」は、その産生環境の成分から同定、分離、及び／または回収された結合分子を意味する。好ましくは、単離された結合分子は、その産生環境由来の他の成分すべてを付随しない。組換えトランスフェクト細胞から生じる成分などの、その産生環境の混入成分は、通常はポリペプチドの診断または治療用途を妨げる物質であり、これは、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態では、結合分子は、（１）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いた非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一性が得られるまで精製される。ただし、通常、単離された結合分子は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００６２】
本明細書に記載の結合分子のアミノ酸配列修飾もまた企図される。例えば、結合分子の結合親和性及び／または他の生物学的特性の改善が望ましい場合がある。結合分子のアミノ酸配列変種は、結合分子の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。そのような修飾は、例えば、結合分子のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／または残基への挿入、及び／または残基の置換を含む。最終構築物がプロテインＡ結合及びＦｃγＲＩ結合の破壊、またはプロテアーゼ耐性などの望ましい特徴を保持する限り、最終構築物に到達するように欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが成される。
【００６３】
例示的な修飾は、例えば保存的置換または機能的に等価なアミノ酸残基置換であり、これは以下に記載される親結合分子及び融合構築物の特徴と類似する特徴を有する変種を生じるものを含む。保存的置換は、その側鎖に関連性があるアミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、次の４つのファミリーに区分することができる：（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；及び（４）無電荷極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、共に芳香族アミノ酸に分類されることがある。あるいは、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、セリン及びトレオニンは脂肪族ヒドロキシルとして別個に分類される場合もある；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）；ならびに（６）硫黄含有（システイン及びメチオニン）に分類することができる（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８１、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。クラスの異なるアミノ酸間でのアミノ酸残基の置換を伴う非保存的置換を結合分子に行い、結合分子及び融合構築物の特性を改善することができる。ポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列を変更したときに機能的ホモログになるかどうかは、本明細書に記載のアッセイを用いて、修飾済み結合分子が未修飾の結合分子と同様に応答可能であるかを評価することによって容易に決定することができる。
【００６４】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の１つ以上の結合分子を含む第１の部分と、前記第１の部分に結合された第２の部分とを含む融合構築物に関する。融合構築物の第２の部分は、第２の結合分子、薬学的に活性な部分、プロドラッグ、薬学的に許容される担体、診断部分、膜透過エンハンサー部分、半減期を延長する調節部分、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００６５】
本開示の本態様によれば、融合構築物の第１及び第２の部分は、上記のように直接またはリンカーを介して共有結合される。第１と第２の部分は、標準的なクローニング及び発現技術によって直接融合して生成することができる。あるいは、周知の化学的カップリング方法を使用して、直接またはペプチドもしくは他のリンカーを介して部分を結合し、本明細書に記載の融合構築物を組換え的に産生することができる。
【００６６】
一実施形態では、本開示の融合構築物の第２の部分は、半減期延長部分を含む。例示的な半減期延長部分としては、アルブミン、アルブミン変種（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，８２２，４１７号、Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，３１４，１５６号、及びＰｌｕｍｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，７４８，３８０号を参照）、アルブミン結合タンパク質及び／またはドメイン、トランスフェリンならびにその断片及び類似体（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｒｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第７，１７６，２７８号を参照）、Ｆｃ領域及び変種Ｆｃ領域（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，５４６，５４３号、Ｔｓｕｉに対する米国特許公開第２０１５０１２５４４４号、及びＳｅｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，７２２，６１５号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
融合構築物の第２の部分の半減期延長部分としては他に、所望する特性に応じて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばＰＥＧ５０００またはＰＥＧ２０，０００、様々な鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例えばラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、ステアリン酸塩、アラキジン酸塩、ベヘン酸塩、オレイン酸塩、アラキドン酸塩、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖または多糖）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、当技術分野で周知の方法を用いて分子のＣ末端にシステイン残基を付加し、そのシステインにＰＥＧ基を結合させることにより、本開示の二重特異性分子または単一特異性分子にＰＥＧ部分を付加することができる。
【００６８】
別の実施形態では、融合構築物の第２の部分は、薬学的に活性な部分、例えばサイトカイン、毒素、ケモカイン、抗菌ペプチド、抗生物質、酵素、特異的標的結合特性を有するペプチドもしくはタンパク質、蛍光色素、光増感剤、放射性核種、医療撮影用の造影剤、毒性化合物、凝固促進因子、プロドラッグ活性化のための酵素、アルブミン結合剤、アルブミン、ＩｇＧ結合剤、またはポリエチレングリコールなどを含む。
【００６９】
別の実施形態では、融合構築物の第２の部分は、膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。ＣＰＰは、見かけ上、エネルギーに依存しない経路によって真核細胞の形質膜を横断して移動するため、分子量が自身より数倍高い抗体、ペプチド、タンパク質、及び核酸を含む巨大分子の細胞内送達に利用され成功を収めている。ポリアルギニン、輸送体、プロタミン、マウロカルシン、及びＭ９１８を含む、複数のよく使用されるＣＰＰが当技術分野で知られている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍ  ６：２２４２−２２５５（２００８）を参照）。別の実施形態では、融合構築物の第２の部分は、膜透過性エンハンサー部分を含む。好適な膜透過エンハンサー部分としては、オリゴ−アルギニン誘導体（Ｂｅｒｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２３（７）：１４１５−２５（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、コロナ様（グアニジル）オリゴ糖誘導体（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｌｉｃｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．に対するＷＯ２０１２／０９７８７６を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
別の実施形態では、融合構築物の第２の部分は、診断部分を含む。好適な診断部分は、融合構築物の検出、定量、分離、及び／または精製を容易にする部分である。好適な診断部分としては、精製タグ（例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６−）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−））、蛍光タグ（例えば、キレート化合物（ユーロピウムキレート）、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、及びテキサスレッド）、酵素タグ、放射性同位元素もしくは放射性標識、撮影に適した造影剤、または光増感剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
別の実施形態では、融合構築物の第２の部分は、第２の結合分子を含む。一態様では、第２の結合分子は、抗体またはその抗体結合ドメインである。本明細書中で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部、例えば限定するものではないが、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、フレームワーク領域、またはそれらの任意の一部を含む、任意のタンパク質またはペプチドを含んでいる分子を含む。抗体は、全抗体、消化断片、それらの特定部分及び変種を包含し、これには、限定するものではないが、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（すなわち、他のＶ領域またはドメインの抗原またはエピトープに独立して特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ、またはＶＬであり得る可変ドメインを１つだけ含む抗体断片）を含む、抗体またはその特定の断片もしくは一部の構造及び／または機能を模倣する抗体部分が含まれるが、これには限定されない。機能的断片としては、特定の標的に結合する抗原結合断片が挙げられる。例えば、特定の標的またはその一部に結合できる抗体断片としては、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）、及びＦ（ａｂ’）２（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシンまたはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元及び再凝集による）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（例えば、分子生物学技術による）断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
そのような断片は、当技術分野で既知の、及び／または本明細書に記載の酵素的切断、合成、または組換え技術により作製することができる。抗体はまた、天然の終止部位の上流に１つ以上の終止コドンが導入された抗体遺伝子を用いて多様な短縮型形態で作製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子を、重鎖のＣＨ１ドメイン及び／またはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。抗体の様々な部分を、従来技術によって化学的に結合させることも、または遺伝子工学技術を用いて連続したタンパク質として調製することもできる。
【００７３】
さらに、用語「抗体」は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、ならびにヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、及び記載の抗体と同じ特異性を示す、本明細書に記載の抗体の誘導体または変種を包含する。「抗体変種」の例としては、ヒト以外の抗体のヒト化変種、「親和性成熟」抗体（例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ．  Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：８８９−８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７（１９９１）を参照）、エフェクター機能（複数可）が改変された抗体変種（例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，６４８，２６０号、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ  ｅｄ．２０１０、及びＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００９を参照）が挙げられる。
【００７４】
別の実施形態では、第２の結合分子は、抗原に特異的に結合するが、抗体とは構造的関連性がない抗体模倣体、すなわち、有機化合物、多くの場合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含む。例示的な抗体模倣体としては、アフィボディ（プロテインＡのＺドメインに基づく足場）、アフィリン（ガンマクリスタリンまたはユビキチンの構造に基づく足場）、アフィマー（シスタチンの構造に基づく足場）、アフィチン（ＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄに由来する足場）、アルファボディ（コイルドコイル構造に基づく足場）、アンチカリン（リポカリンに由来する足場）、アビマー（様々な膜受容体のＡドメインに由来する足場）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートモチーフに由来する足場）、フィノマー（ＦｙｎのＳＨ３ドメインに由来する足場）、及びＫｕｎｉｔｚドメイン（様々なプロテアーゼ阻害剤のＫｕｎｉｔｚドメインに由来する足場）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
第２の結合分子は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性結合分子であり得る。すなわち、第２の結合分子は、１つ以上の異なったタンパク質標的に結合する１つ、２つ、または多数の異なった結合部位を有する。第２の結合分子は、一価、二価、または多価であり得る。すなわち、第２の結合分子は、特定の標的分子に対する１つ、２つ、または多数の結合部位を有する。例えば、第２の結合分子は単一特異性、二重特異性、または三重特異性である抗体を含み得、かつ、この抗体は一価、二価、または多価であり得る。一実施形態では、抗体は単一特異性の二価抗体である。
【００７６】
一実施形態では、第２の結合分子のカルボキシ末端は、本開示の結合分子のアミノ末端に結合される。別の実施形態では、第２の結合分子のカルボキシ末端は、本開示の結合分子のカルボキシ末端に結合される。第２の結合分子が抗体を含む場合、１つ以上の同一または異なる結合分子が、抗体の軽鎖及び／もしくは重鎖、またはその結合断片と結合されている場合がある。一実施形態では、１つ以上の同一または異なる結合分子が、抗体の１つ以上の重鎖に結合される。別の実施形態では、１つ以上の同一または異なる結合分子が、抗体の１つ以上の軽鎖に結合される。別の実施形態では、１つ以上の異なる結合分子が、抗体の１つ以上の軽鎖及び重鎖に結合される。
【００７７】
一態様では、第２の結合分子は、野生型ＩｇＧ１を切断するブドウ球菌プロテアーゼ（配列番号６０中の２２２〜２３７（ＥＵ付番法）の残基間または残基位置で野生型ＩｇＧ１を切断するブドウ球菌プロテアーゼ、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼなど）によるタンパク質分解に対して耐性である（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，８７１，２０４号を参照）。
【００７８】
一態様では、第２の結合分子は、ヒトＦｃγＲＩに特異的に結合することができず、プロテインＡに特異的に結合することができず、Ｓｂｉに特異的に結合することができない。一態様では、第２の結合分子は、ＦｃＲｎに特異的に結合することができる。
【００７９】
一実施形態では、融合構築物の第２の結合分子は、ブドウ球菌タンパク質に対する結合特異性を有する。一実施形態では、第２の結合分子は、ブドウ球菌病原因子に対する結合特異性を有する。本明細書で使用される場合、「病原因子」とは、細菌による、宿主内のニッチにおけるコロニー形成（細胞への接着を含む）、免疫回避（すなわち、宿主の免疫応答の回避）、免疫抑制（すなわち、宿主の免疫応答の阻害）、細胞への侵入と細胞からの放出（病原体が細胞内のものである場合）、及び／または宿主からの栄養取得を可能にする、ブドウ球菌タンパク質によって発現される分子を指す。病原因子は、バクテリオファージなどの可動性遺伝因子にコードされている場合があり、水平遺伝子伝達を介して容易に拡散することができる。黄色ブドウ球菌病原因子の非限定的な例としては、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼ、コアグラーゼ、リパーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンテロトキシン、及びその他の毒素が挙げられる。本開示の目的では、ＳＤＲ含有タンパク質、例えばＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、及びＳｄｒＨなどのブドウ球菌表面タンパク質もまた病原因子と見なす。
【００８０】
一実施形態では、本開示の融合構築物の第２の結合分子は、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合することができる。グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合する例示的な第２の結合分子は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，４６０，６６６号及び同第８，２１１，４３１号に開示された抗体及び抗体結合ドメイン断片を含む。一実施形態では、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合する抗体または抗体結合ドメインは、配列番号６０、６２、６４、または６６から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を有する。別の実施形態では、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合する抗体または抗体結合ドメインは、配列番号６１、６３、６５、または６７から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を有する。あるいは、第２の結合分子は、（ａ）配列番号６０、６２、６４、または６６のアミノ酸配列を有する重鎖と、（ｂ）配列番号６１、６３、６５、または６７のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗体を含む。別の実施形態では、第２の結合分子は、（１）配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖；（２）配列番号６２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖；（３）配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖；（４）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖；（５）配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を有する軽鎖；（６）配列番号７０のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７１のアミノ酸配列を有する軽鎖；（７）配列番号７２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖；（８）配列番号７４のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７５のアミノ酸配列を有する軽鎖；（９）配列番号７６のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７７のアミノ酸配列を有する軽鎖；または（１０）配列番号７８のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７９のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗体を含む。
【００８１】
一実施形態では、本開示の融合構築物は、免疫グロブリン重鎖に結合されたＬｕｋＥ結合領域を有する結合分子を含み、ここで重鎖はグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合する可変領域を含む。本開示の本態様による例示的な融合構築物は、配列番号８４８〜８５１、９００、または９０３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、これらの例示的な融合構築物はさらに、免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。好適な軽鎖は、限定するものではないが、配列番号６１、６３、６５、または６７のいずれか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００８２】
別の実施形態では、本開示の融合構築物は、免疫グロブリン軽鎖に結合されたＬｕｋＥ結合領域を有する結合分子を含み、ここで軽鎖はグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合する可変領域を含む。本態様による例示的な融合構築物は、配列番号９８０のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、これらの例示的な融合構築物はさらに、免疫グロブリン重鎖可変領域または重鎖を含む。好適な重鎖は、限定するものではないが、配列番号６０、６２、６４、または６６のいずれか１つのアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【００８３】
一実施形態では、本開示の融合構築物は、免疫グロブリン重鎖に結合されたＬｕｋＡＢ結合領域を有する結合分子を含み、ここで重鎖はグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合する可変領域を含む。本開示の本態様による例示的な融合構築物は、配列番号７０及び７２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、これらの例示的な融合構築物はさらに、免疫グロブリン軽鎖を含む。好適な軽鎖は、限定するものではないが、配列番号６１、６３、６５、または６７のいずれか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００８４】
別の実施形態では、本開示の融合構築物は、免疫グロブリン軽鎖に結合されたＬｕｋＡＢ結合領域を有する結合分子を含み、ここで軽鎖はグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合する可変領域を含む。本開示の本態様による例示的な融合構築物は、配列番号９７９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、これらの例示的な融合構築物はさらに、免疫グロブリン重鎖可変領域または重鎖を含む。好適な重鎖は、限定するものではないが、配列番号６０、６２、６４、または６６のいずれか１つのアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【００８５】
別の実施形態では、本開示の融合構築物は、免疫グロブリン重鎖に結合されたＬｕｋＥ結合領域及びＬｕｋＡＢ結合領域を有する結合分子を含み、ここで重鎖はグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質に結合する可変領域を含む。本開示の本態様による例示的な融合構築物は、配列番号８５２〜８５９、８８７、８８８、８９３、８９４、９０６、９２０、９３１〜９５６、９６１、９７６、及び９８４〜９８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、これらの例示的な融合構築物はさらに、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質結合ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域または軽鎖を含む。好適な免疫グロブリン軽鎖は、限定するものではないが、配列番号６１、６３、６５、または６７のいずれか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００８６】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の結合分子及び融合構築物をコードする核酸分子に関する。本開示の核酸分子は、単離されたポリヌクレオチド、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳に使用される線状ＤＮＡ配列を含む、発現ベクターの一部または線状ＤＮＡ配列の一部、組成物もしくはその変異原の、原核生物、真核生物もしくは繊維状ファージによる発現、分泌及び／または提示に適合するベクターを含む。
【００８７】
一実施形態では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、上記に記載の結合分子をコードするものを含む。例示的な単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号２５〜５９、１１３、１１６〜１３６、１５５、３６３、３６４、３６６〜３６９、３７５、３７６、３８８、５８６、及び７３９〜８３９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＬｕｋＥ結合領域を含むＦＮ３ドメインをコードするものを含む。別の実施形態では、例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１４、１５、１６、１７、１４５、１５６、１５８、１６７、２１４、２２６、２４７、２８２、２８６、３１６、３７０、３８６、３８８、３９２、４４６、４５４、４６２、５３０、５４０、５６８、５７４、５８４、５８７〜６６６、及び６７２〜７３８のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＬｕｋＡＢ結合領域を含むＦＮ３ドメインをコードするものを含む。別の実施形態では、例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１０９７、１０９９、１１１２、１１４２、及び１１００のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＨｌａ結合領域を含むＦＮ３ドメインをコードするものを含む。
【００８８】
他の実施形態では、例示的なポリヌクレオチドは、本明細書に記載の抗体−結合分子の融合構築物をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。例えば、例示的な単離されたポリヌクレオチドは、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質結合ドメインを含む免疫グロブリン重鎖に結合されたＬｕｋＥ結合ドメイン（例えば、配列番号８４８〜８５１、９００または９０３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）、及びグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質結合ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖に結合されたＬｕｋＥ結合ドメイン（例えば、配列番号９８０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）を有する結合分子を含む融合構築物をコードするものを含む。例示的な単離されたポリヌクレオチドはまた、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質結合ドメインを含む免疫グロブリン重鎖に結合されたＬｕｋＡＢ結合ドメイン（例えば、配列番号７０及び７２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）、及びグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質結合ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖に結合されたＬｕｋＡＢ結合ドメイン（例えば、配列番号９７９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）を有する結合分子を含む融合構築物をコードするものを含む。例示的な単離されたポリヌクレオチドはまた、グリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質結合領域を含む免疫グロブリン重鎖に結合されたＬｕｋＥ及びＬｕｋＡＢ結合ドメインを有する結合分子を含む融合構築物をコードするもの（例えば、配列番号８５２〜８５９、８８７、８８８、８９３、８９４、９０６、９２０、９３１〜９５６、９６１、９７６、及び９８４〜９８８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）を含む。
【００８９】
本開示のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチドシンセサイザーで固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成によって作製し、完全な一本鎖または二本鎖分子に組み立ててもよい。あるいは、本開示のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続く通常のクローニングのような他の技術によって作製してもよい。所与の既知の配列のポリヌクレオチドを作製または取得するための技術は、当技術分野で周知である。
【００９０】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、プロモーターまたはエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するｃｉｓ配列などのような少なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列はまた、例えば、タンパク質の精製もしくは検出を容易にするためのヒスチジンタグもしくはＨＡタグなどのマーカーもしくはタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡ、Ｆｃなどの融合タンパク質パートナー、またはｐＩＸもしくはｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質をコードする追加アミノ酸をコードする追加配列を含んでもよい。
【００９１】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むベクターである。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づくベクター、または任意の手段によって所与の生物または遺伝的背景に本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであり得る。そのようなベクターは、そのようなベクターによってコードされるポリペプチドの発現を制御、調節、誘発、または許容することができる核酸配列エレメントを含む発現ベクターであってもよい。このようなエレメントは、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系においてコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含み得る。このような発現系は、当技術分野において既知の細胞を用いた系または無細胞系であり得る。
【００９２】
本発明の別の実施形態は、上記のベクターを含む宿主細胞である。本明細書に開示される結合分子及び／または融合構築物は、当技術分野で周知であるように、場合に応じて、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、または不死化細胞のクローン集団によって作製することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１）を参照）。
【００９３】
発現のために選択する宿主細胞は、哺乳動物起源であってもよく、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅ  Ｇ２、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫もしくは植物細胞、またはその任意の誘導体、不死化もしくは形質転換細胞から選択してもよい。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することができない種または生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及び天然または組換え型の大腸菌の種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の種、またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種のいずれかの株などの原核細胞または生物から選択することができる。
【００９４】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の結合分子及び融合構築物を作製及び単離する方法に関する。この方法は、結合分子または融合構築物が発現される条件下で、本開示の単離された宿主細胞を培養することと、宿主細胞培養物から発現された結合分子または融合構築物を精製することとを含む。
【００９５】
本明細書に記載の結合分子及び融合構築物は、周知の方法、例えばプロテインＡ精製、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、組換え細胞培養物から精製することができる。
【００９６】
本明細書に記載の精製または単離された結合分子及び融合構築物を、様々な非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーのうちのいずれかと結合してもよい。結合分子及び／または抗体構築物はまた、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに封入されていてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
治療用途の場合、薬学的に許容される担体中に有効量の結合分子を活性成分として含有する医薬組成物として、本明細書に記載の結合分子及び融合構築物を調製することができる。用語「担体」とは、活性化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、水及び油などの液体であってもよく、油は、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。溶液は、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために、必要に応じて、薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤及び着色剤などを含有することができる。本明細書に記載の結合分子または融合構築物の濃度は幅広く、すなわち約０．５重量％未満、通常は約１重量％または少なくとも約１重量％から最大で１５または２０重量％まで変更することができ、また選択される特定の投与様式に従って、主として必要用量、液体体積、粘度などに基づいて選択される。好適なビヒクル、及び他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む製剤は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ６９１−１０９２に記載されており、特にｐｐ．９５８−９８９を参照のこと。
【００９８】
本明細書に記載の結合分子及び融合構築物は、非単離形態でも単離形態でも使用することができる。さらに、本明細書の結合分子及び融合構築物は、単独で使用することも、あるいは少なくとも１つの本明細書の他の結合分子または融合構築物を含む混合物として使用することもできる。換言すれば、結合分子及び融合構築物は、例えば、本明細書の２つ以上の結合分子、２つ以上の融合構築物、１つの結合分子と融合構築物、ならびにそれらの変種または断片を含む医薬組成物として、組み合わせて使用することができる。例えば、異なるが相補的である活性を有する結合分子及び／または融合構築物を組み合わせて、単一療法で目的の治療効果を達成することができるが、一方で同一の活性を有する結合分子及び融合構築物を組み合わせて、単一療法で目的の予防、治療、または診断効果を達成することもできる。場合により、混合物はさらに、少なくとも１つの他の治療薬を含む。一態様では、他の治療薬は、ブドウ球菌感染症の予防及び／または治療に有用である抗感染剤、抗生物質薬、及び／または抗微生物剤であり得る。別の態様では、他の治療薬は、ブドウ球菌感染症に伴う病態の予防及び／または治療に有用であるいずれの薬剤でもあり得る。
【００９９】
結合分子、融合構築物、またはそれらを含む医薬組成物は、ブドウ球菌感染症の治療、予防、または改善に使用することができる。ブドウ球菌感染は、どのブドウ球菌種によっても生じ得る。一態様では、ブドウ球菌感染は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）を含む、黄色ブドウ球菌を原因とする。したがって、本開示は、本明細書に記載の結合分子、融合構築物、またはそれらを含有する組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ブドウ球菌感染症の治療、予防、または改善方法を提供する。
【０１００】
本態様によれば、標的「対象」は、あらゆる動物、例えばヒトなどの哺乳動物を包含する。対象におけるブドウ球菌感染症の防止を目的として本開示の組成物を投与するという文脈中で、標的対象は、ブドウ球菌に感染するまたはブドウ球菌感染症を発症するリスクのあるいずれの対象をも包含する。影響を受けやすい対象には幼児や青少年に加え、免疫不全の青少年、成人、及び高齢者が含まれる。ただし、ブドウ球菌感染症を発症するリスクのある、いかなる幼児、青少年、成人、もしくは高齢成人、または免疫不全の個人も本明細書に記載の方法に従って治療することができる。対象におけるブドウ球菌感染症の治療を目的として本開示の組成物を投与するという文脈中で、標的対象は、ブドウ球菌に感染したいずれの対象をも包含する。特に適した対象として、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）に感染するリスクのあるもの、感染しやすいもの、または感染したものが挙げられる。他の適した対象としては、ブドウ球菌感染症に起因する病態、すなわち、例えば、皮膚創傷及び皮膚感染症、組織膿瘍、毛嚢炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、関節膿症、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群などのブドウ球菌に関連する病態を発症し得る対象または発症するリスクがある対象が挙げられる。
【０１０１】
一実施形態では、結合分子、融合構築物、またはそれらを含有する医薬組成物を予防的に投与し、ブドウ球菌感染症または関連病態を発症するリスクのある対象におけるブドウ球菌感染の発生を予防、遅延、または阻害する。一態様では、本明細書に記載の１つ以上の結合分子の予防的投与は、個体での黄色ブドウ球菌感染の完全な予防に効果的である。他の実施形態では、予防的投与は、このような投与をしなければ発症していたはずの全面的な感染を防止する、すなわち、個体におけるブドウ球菌感染を実質的に予防、阻害、または最小限にするのに効果的である。
【０１０２】
別の実施形態では、本明細書に記載の結合分子、融合構築物、または医薬組成物を、ブドウ球菌感染症を有する個体に治療的に投与し、感染の進行及びさらなる発症を阻害する、すなわち個体内の他の細胞への感染の拡散を阻害及び／または予防する、感染を減少させる、ならびに感染症の１つ以上の症状を治療または緩和する。
【０１０３】
本明細書に記載の結合分子及び融合構築物の治療有効量は、例えば、医薬組成物中の結合分子または融合構築物の濃度、投与の様式及び頻度、治療する（または予防する）ブドウ球菌感染症の重度、ならびに年齢、体重、及び全身の健康及び免疫状態などの対象の詳細を含む多数の要因を考慮して、標準的手順に従って決定される。一般的な指針は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）の刊行物で参照することができる。臨床医は、本明細書に記載の結合分子または融合構築物を含む組成物を、目的のまたは必要な予防的または治療的効果を与える投与量に達するまで、単回投与で、または複数回投与プロトコールに従って投与することができる。この療法の進捗は、従来のアッセイによって容易にモニターすることができる。予防的用途の場合、比較的低投与量を長期間にわたって比較的低頻度で投与する。治療用途の場合、疾患の進行が抑制されるまたは停止するまで、好ましくは対象が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔（例えば、１５分、３０分、６０分、９０分、さらには２時間または３時間程度）で比較的高投与量が必要とされる場合がある。
【０１０４】
治療有効量、すなわち、ブドウ球菌感染症を有する対象にとって十分な投与量とは、ブドウ球菌感染の拡散または重症化の遅延または予防に十分である投与量、及び／またはブドウ球菌感染症に伴う病態の（部分的または完全な）予防、緩和に十分な投与量である。そのような治療有効量は、個体によって異なるが、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るが、それよりも高い、例えば、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｋｇでもあり得る。また固定単位用量、例えば５０、１００、２００、５００、または１０００ｍｇを投与してもよく、またはこの用量は、例えば４００、３００、２５０、２００、または１００ｍｇ／ｍ２など、患者の表面積に基づいたものでもよい。感染の治療には、通常１〜８（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）用量を投与することができるが、感染の重症度に応じて１０、１２、２０またはそれ以上の用量を投与してもよい。本開示の結合分子または融合構築物は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１か月、５週間、６週間、７週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月以上、またはそれ以上の後、反復投与してもよい。慢性投与と同様に、治療過程の反復も可能である。反復投与は、同一用量でも異なる用量でもよい。
【０１０５】
本開示の治療組成物は、治療しているブドウ球菌感染症の性質に応じて、単独で、または１つ以上の他の活性薬剤と組み合わせた併用療法の一部として投与することができる。このような追加の活性薬剤としては、当技術分野で十分に知られている抗感染剤、抗生物質薬、及び抗微生物剤が挙げられる。
【０１０６】
本明細書に記載の結合分子、融合構築物、及び医薬組成物の投与様式は、結合分子（複数可）または融合構築物（複数可）を宿主に送達するのに適した経路、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、もしくは皮下、肺などの非経口投与、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与、錠剤、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子中の製剤を使用した経路、及びシリンジ、注入装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに収容された製剤を使用した経路、または当技術分野で周知である当業者が理解している他の手段のいずれであってもよい。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ、ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心臓内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液内、胸腔内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、または経皮送達により達成することができる。
【０１０７】
本明細書で提供される結合分子及び融合構築物はまた、対象におけるブドウ球菌感染症の診断方法にも使用することができる。一態様では、ブドウ球菌感染症の診断方法は、診断しようとする対象からのサンプルに本明細書に記載の結合分子または融合構築物を接触させることと、少なくともサンプル中の１種以上のブドウ球菌ロイコトキシンの有無を検出することとを含む。別の態様では、ブドウ球菌感染症の診断方法は、診断しようとする対象からのサンプルに本明細書に記載の結合分子または融合構築物を接触させることと、サンプル中の１種以上のブドウ球菌ロイコトキシンの有無、及び例えばグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質などの１つ以上の他のブドウ球菌タンパク質の有無を検出することとを含む。この検出に基づいて、その対象のブドウ球菌感染を診断する。換言すれば、１種以上のブドウ球菌ロイコトキシン単独、または別のブドウ球菌タンパク質との組み合わせが検出された場合、ブドウ球菌感染の陽性診断を示す。
【０１０８】
本態様によれば、対象からのサンプルは、血液、組織、細胞、血清、または任意の他の生物学的サンプルを含み得る。
【０１０９】
別の態様は、サンプルにおけるブドウ球菌感染症の検出方法に関する。本方法は、本明細書に記載の結合分子または融合構築物をサンプルと接触させることと、少なくとも１種以上のブドウ球菌ロイコトキシンの有無を検出することとを含む。場合により、本明細書に記載の１つ以上の融合構築物を使用して、１種以上のブドウ球菌ロイコトキシン、及び１種以上の追加のブドウ球菌タンパク質、例えばグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質の有無を検出することができる。１種以上のブドウ球菌ロイコトキシン単独、または別のブドウ球菌タンパク質との組み合わせが検出された場合、サンプル中のブドウ球菌の存在を示す。本態様によれば、サンプルは、環境、動物、またはヒトから得た任意の生物学的サンプルであり得る。
【０１１０】
対象または他の箇所から得たサンプルでのブドウ球菌ロイコトキシン単独、または別のブドウ球菌タンパク質との組み合わせの検出を伴う本明細書に記載の方法は、検出可能に標識された結合分子または融合構築物の使用を含む。したがって、一態様では、本明細書に記載の結合分子または融合構築物を、検出可能な標識に結合させることができる。好適な検出可能な標識は、当技術分野で周知であり、これには、検出可能なタグ（例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６−）タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−）タグ、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−）タグ）；放射性標識（例えば、炭素（１４Ｃ）またはリン（３２Ｐ））；蛍光標識（例えば、フルオレセイン及びその誘導体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン及びその誘導体、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリン）；発光標識（例えば、ルミノール）；生物発光標識（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン）；または酵素標識（例えば、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ）が挙げられる。あるいは、結合分子に検出可能な標識を結合することができ、例えば、検出可能な標識を含む二次抗体を結合することができる。
【０１１１】
サンプル中のブドウ球菌ロイコトキシン及び／または別のブドウ球菌タンパク質に結合した標識結合分子または融合構築物を検出するための検出アッセイは、当技術分野で周知であり、それには例えば、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０１１２】
さらに、本開示の結合分子及び融合構築物は、ブドウ球菌感染の予防に使用することができる。本方法は、本明細書に記載の結合分子または融合構築物を対象からのサンプルと接触させることと、その接触の結果としてブドウ球菌ロイコトキシン及び／または別のブドウ球菌タンパク質、例えばグリコシル化ブドウ球菌表面タンパク質を検出することとを含む。ブドウ球菌ロイコトキシン及び／または別のブドウ球菌タンパク質が対象サンプル中に検出された場合、ブドウ球菌感染の予防に適した薬剤が対象に投与される。例示的な予防薬としては、本明細書に記載の結合分子、１種以上の抗生物質（例えば、ムピロシン、ナフシリン、セファゾリン、ジクロキサシリン、クリンダマイシン、バンコマイシン、リネゾリド、リファンピン、スルファメトキサゾール−トリメトプリム）、及び／またはブドウ球菌感染に対して有効な他の抗感染薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
本開示の別の態様は、ステムドメイン変異及び／または欠失を含むロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）及びロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）ポリペプチドに関する。二成分ロイコシジンのステムドメインは、宿主細胞膜を貫通し、浸透圧溶解による細胞死を引き起こす、毒素の活性オリゴマー性膜孔形態の形成に関与する構造ドメインである。本明細書の実施例に示すように、ＬｕｋＡ及びＬｕｋＢのステムドメイン変種は、本明細書に記載のＬｕｋＡＢ結合分子（Ｌｕｋ１７）によって認識される中和エピトープを保持する。したがって、ステムドメイン変種は細胞溶解活性を示さずに中和エピトープを提示するため、黄色ブドウ球菌ワクチン組成物の成分として理想的である。
【０１１４】
一実施形態では、組換えＬｕｋＢポリペプチドステムドメイン変種は、配列番号１０２６のアミノ酸残基１５２〜３０５と結合された配列番号１０２６のアミノ酸残基１〜１０９に対応するアミノ酸配列を含む。ＬｕｋＢポリペプチドは、配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５１に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まない。換言すれば、配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５１に対応する１つ以上のアミノ酸残基が欠失または変異しており、それによってＬｕｋＢポリペプチドのステムドメインが不活性であるか、または非機能的となる。２つ以上のアミノ酸残基が欠失または変異している場合、その２つ以上のアミノ酸残基は隣接していても不連続であってもよい。例えば、本明細書に記載のＬｕｋＢポリペプチドにおいて、配列番号１０２６の１１０〜１５１に対応するアミノ酸残基の伸長内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、または４２の隣接したまたは不連続であるアミノ酸残基が欠失または変異している。一実施形態では、ＬｕｋＢポリペプチドは、配列番号１０２６のアミノ酸残基１２２〜１２６に対応するアミノ酸残基の欠失を含む。別の実施形態では、ＬｕｋＢポリペプチドは、配列番号１０２６のアミノ酸残基１３０〜１３４に対応するアミノ酸残基の欠失を含む。別の実施形態では、ＬｕｋＢポリペプチドは、配列番号１０２６のアミノ酸残基１０８〜１５０に対応するアミノ酸残基の欠失を含む。別の実施形態では、ＬｕｋＢポリペプチドは、配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５０に対応するアミノ酸残基の欠失を含む。別の実施形態では、ＬｕｋＢポリペプチドは、配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５１に対応するアミノ酸残基の欠失を含む。ＬｕｋＢポリペプチドの残りの部分、例えば、配列番号１０２６の残基１〜１０９に対応する、及びそれを含むアミノ酸残基と、配列番号１０２６の残基１５２〜３０５に対応する、及びそれを含むアミノ酸残基とを、直にまたは短いリンカーを介して結合することができる。好適なリンカーとしては、グリシンリッチ（例えば、Ｇ３−５）またはグリシン／セリンリッチ（例えば、ＧＳＧ、ＧＳＧＳ、（ＳＧＧ）２、ＧＳＮＧ）リンカー配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本開示の本態様による例示的なＬｕｋＢポリペプチドとしては、配列番号１０２９、配列番号１０３０、配列番号１０３１、配列番号１０３２、配列番号１１５０、または配列番号１１５１のアミノ酸配列を含むＬｕｋＢポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
組換えロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）ポリペプチドステムドメイン変種は、配列番号１０１８のアミノ酸残基１７５〜３２４と結合された配列番号１０１８のアミノ酸残基１〜１３４に対応するアミノ酸配列を含む。ＬｕｋＡポリペプチドは、配列番号１０１８のアミノ酸残基１３５〜１７４に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まない。換言すれば、配列番号１０１８のアミノ酸残基１３５〜１７４に対応する１つ以上のアミノ酸残基が欠失または変異しており、それによってＬｕｋＡポリペプチドのステムドメインが不活性であるか、または非機能的となる。２つ以上のアミノ酸残基が変異または欠失している場合、その２つ以上のアミノ酸残基は隣接していても不連続であってもよい。例えば、本明細書に記載のＬｕｋＡポリペプチドにおいて、配列番号１０１８の１３５〜１７４に対応するアミノ酸残基の伸長内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０の隣接したまたは不連続であるアミノ酸残基が欠失または変異している。一実施形態では、ＬｕｋＡポリペプチドは、配列番号１０１８のアミノ酸残基１４４〜１４９に対応するアミノ酸残基の欠失を含む。別の実施形態では、ＬｕｋＡポリペプチドは、配列番号１０１８のアミノ酸残基１３５〜１７４に対応するアミノ酸残基の欠失を含む。ＬｕｋＡポリペプチドの残りの部分、すなわち、配列番号１０１８の残基１〜１３４に対応するアミノ酸残基と、配列番号１０１８の残基１７５〜３２４に対応するアミノ酸残基とを、直にまたは好適なリンカーを介して結合することができる。好適なリンカーとしては、グリシンリッチ（例えば、Ｇ３−５）またはグリシン／セリンリッチ（例えば、ＧＳＧ、ＧＳＧＳ、（ＳＧＧ）２、ＧＳＮＧ）リンカー配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
本明細書に記載の組換えＬｕｋＡポリペプチドはさらに、配列番号１０１８のアミノ酸残基３２３に対応するアミノ酸残基にグルタミン酸からアラニンへの置換を含んでもよい（ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｒｕｃｉａｌ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＬｕｋＡＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，”Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．８２（３）：１２６８−７６（２０１４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１８】
本開示の本態様による例示的なＬｕｋＡポリペプチドとしては、配列番号１０２２、配列番号１０２３、配列番号１０２４、配列番号１０２５、または配列番号１１４９を含むＬｕｋＡポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本開示の別の態様は、上記のようなＬｕｋＢ及びＬｕｋＡステムドメイン変種を含むワクチン組成物に関する。換言すれば、ワクチン組成物は、配列番号１０２６のアミノ酸残基１５２〜３０５と結合された配列番号１０２６のアミノ酸残基１〜１０９に対応するアミノ酸配列を含む組換えロイコシジンＢ（ＬｕｋＢ）ポリペプチドを含み、前記ＬｕｋＢポリペプチドは配列番号１０２６のアミノ酸残基１１０〜１５１に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まない。さらにワクチン組成物は、配列番号１０１８のアミノ酸残基１７７〜３２４と結合された配列番号１０１８のアミノ酸残基１〜１３４に対応するアミノ酸配列を含む組換えロイコシジンＡ（ＬｕｋＡ）ポリペプチドを含み、前記ＬｕｋＡポリペプチドは配列番号１０１８のアミノ酸残基１３５〜１７４に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含まない。例示的なＬｕｋＢ及びＬｕｋＡのステムドメイン変種は、上記に記載されている。
【０１２０】
ワクチン組成物はさらに、１種以上のアジュバントを含んでもよい。好適なアジュバントは当技術分野で既知であり、フラジェリン、Ｆｒｅｕｎｄの完全または不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ、及びリポソームポリカチオンＤＮＡ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本明細書に記載のワクチン組成物は、組換え作製されたＬｕｋＡ及びＬｕｋＢステムドメイン変種を、薬学的に許容される担体及び場合により薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化することによって調製することができる。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」及び「薬学的に許容される賦形剤」（例えば、希釈剤、免疫刺激剤、アジュバント、抗酸化剤、防腐剤、及び可溶化剤などの添加剤）は、使用投与量及び使用濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である。薬学的に許容される担体の例として水があり、例えばリン酸、クエン酸、及び別の有機酸を含む緩衝液が挙げられる。有用であり得る薬学的に許容される賦形剤の代表例としては、アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；アジュバント；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；塩を形成する対イオン、例えばナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）が挙げられる。
【０１２２】
本開示の別の態様は、黄色ブドウ球菌感染に対する免疫を対象に付与する方法に関する。本方法は、ＬｕｋＡ及びＬｕｋＢステムドメイン変種を含むワクチン組成物を、黄色ブドウ球菌感染に対する免疫を対象に付与するのに有効な量で投与することを含む。本発明の本態様による治療に適した対象は、黄色ブドウ球菌感染症を発症するリスクのある対象である。
【０１２３】
本態様によれば、黄色ブドウ球菌感染に対する免疫を付与するために対象に投与されるワクチン組成物の治療有効量は、体液性（すなわち、抗体媒介性）免疫応答を生じさせるのに必要な量である。生じた体液性応答は、そのような応答がない場合に発症するであろう黄色ブドウ球菌感染を予防するか、または少なくともその程度を低減するのに十分である。好ましくは、本明細書に記載の治療有効量のワクチン組成物の投与は、対象において黄色ブドウ球菌に対する免疫応答の中和を誘導する。対象において有効な免疫応答をもたらすために、組成物が、１つ以上の追加の黄色ブドウ球菌抗原または上記のアジュバントをさらに含有してもよい。代替的実施形態では、アジュバントは、本発明の組成物の投与前、投与後、または投与と同時に、組成物とは別に対象に投与される。
【０１２４】
本開示の本態様の目的で、標的「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを包含する。対象における黄色ブドウ球菌感染症の防止を目的としてワクチン組成物を投与するという文脈中で、標的対象は、黄色ブドウ球菌に感染するリスクのあるいずれの対象をも包含する。特に影響を受けやすい対象には幼児や青少年に加え、免疫不全の青少年、成人、及び高齢者が含まれる。ただし、黄色ブドウ球菌感染症を発症するリスクのある、いかなる幼児、青少年、成人、もしくは高齢成人、または免疫不全の個人も本明細書に記載の方法及びワクチン組成物によって治療することができる。特に適した対象として、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）に感染するリスクのあるものが挙げられる。
【０１２５】
免疫付与のためのＬｕｋＡ及びＬｕｋＢを含むワクチン組成物の治療有効量は、アジュバントが同時投与されるかどうかによって異なり、アジュバントを投与しない場合には高投与量が必要となる。ＬｕｋＡＢの投与量は、ヒト投与の場合、患者１人あたり１μｇ〜５００μｇ、より一般的には注射１回につき５〜５００μｇの間で変更される場合がある。場合によっては、注射１回につき１〜２ｍｇの高用量が使用される。通常はヒトへの注射ごとに約１０、２０、５０、または１００μｇが使用される。注射のタイミングは、１日１回から、１年に１回、１０年に１回まで、大幅に変化し得る。一般に、有効投与量は、対象からの体液サンプル、一般には血清サンプルを採取し、ＬｕｋＡＢに対して発現する抗体価を、当技術分野で周知され、測定する特定の抗原に容易に適合できる方法を用いて測定することによりモニターすることができる。理想的には、初回投与前にサンプルを採取し、それ以降は各免疫付与後にサンプルを採取して抗体価を測定する。一般に、血清希釈１：１００で、対照または「バックグラウンド」レベルよりも少なくとも４倍大きい検出可能な抗体価をもたらす用量または投与計画が望ましいが、ここで、バックグラウンドとは、対照血清に対するもの、またはＥＬＩＳＡアッセイにおけるプレートのバックグラウンドに対するものと定義される。
【実施例】
【０１２６】
本開示を説明するために実施例を以下に記載する。各実施例は、本開示を任意の特定の用途または動作原理に限定することを意味しない。
【０１２７】
実施例１：ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３を用いた融合タンパク質に対する最小エピトープ標的の定義
セリン−アスパラギン酸リピート（ＳＤＲ）ファミリーのメンバーである黄色ブドウ球菌ＳｄｒＣタンパク質のグリコシル化形態の組換え変種に対するｍＡｂ  ５１３３の特異性を一連のウェスタンブロット分析で予め実証した（Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．に対するＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１５０８９０７３、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。具体的には、精製された組換えＳｄｒＣタンパク質は、黄色ブドウ球菌株ＪＥ２から調製された全細胞溶解物（Ｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，”ｍＢｉｏ  ４（１）：ｅ００５３７−１２（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）とインキュベートした後、ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼが発現しない点を除いてＪＥ２の同族誘導体である黄色ブドウ球菌ＮＥ１０５から調製された溶解物とのインキュベート後に検出されたものとは対照的に、ウェスタンブロットにより特異的タンパク質バンドが検出された（Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．に対するＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１５０８９０７３、参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、精製された組換えＳｄｒＣタンパク質と組換え形態のＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼとのインキュベーションは同様に、ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）の存在に依存してｍＡｂ  ５１３３特異的エピトープを産生した（Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．に対するＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１５０８９０７３、参照により本明細書に組み込まれる）。ｍＡｂ  ５１３３に対する最小エピトープをさらに限定するために、１０コピーのセリン−アスパラギン酸ジペプチド配列を含むが、黄色ブドウ球菌のＳＤＲファミリーのタンパク質のうち任意の５つのメンバーに由来する任意の追加のタンパク質配列を欠失する合成ペプチドをＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ基質として使用した（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｎｅ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐｏｓｓｉｂｌｙ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（４）：ｅ３４７５６（２０１２）；Ｂｅｃｈｅｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣｎａＢＥ３  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ａｍｏｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｄｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（９）：ｅ７４７１８（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２８】
手順。それぞれ配列番号６６８及び６６９に対応する、黄色ブドウ球菌ＳＤＲファミリーメンバークランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）及びクランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）の組換え変種を、各々がアミノ末端Ｓ−タグ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ；  Ｒａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｓ−Ｔａｇ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：３６２−３６７（２０００）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、トロンビン切断部位、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性タグを有するようにベクターｐＥＴ２９ａ（＋）に組み込んだ。これらの組換えタンパク質を見かけ上、均一に精製し、続いて大腸菌における誘導可能な過剰発現、さらにＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ  １０１８２４４）及びＳ−Ｔａｇ（商標）トロンビン精製キット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ６９２３２）による精製を行った。Ｃ末端ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）６親和性タグ（配列番号９９）を有する黄色ブドウ球菌ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼの組換え形態も同様に大腸菌で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグリコシル化反応のために、１００μｇの組換えＳＤＲタンパク質［ＳｄｒＣ４／配列番号１００、ＣｌｆＡ／配列番号６６８、及びＣｌｆＢ／配列番号６６９］を、１０％グリセロールを加えた最終体積１００μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）または１００μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中で、＋／−３０μｇのウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）、＋／−４μｇの組換えＳｄｇＢ／配列番号９９と３７℃で１時間インキュベートした。高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの組換えタンパク質ＳＤＲタンパク質（ＳｄｇＢ媒介性グリコシル化あり／なし）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｔｈｅｒｍｏ  ３７５１５）で周囲温度にて１時間ブロックした。別々の希釈プレートにて、開始濃度１μＭまたは１０μＭで、試験品をブロッキング緩衝液で３倍に系列希釈した。ＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、抗体希釈液を希釈プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し、周囲温度にて１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、二次ヤギ抗ヒトＦｃガンマ特異的ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  １０９−０３５−０９８）をブロッキング緩衝液で１：１０，０００に希釈し、プレートに添加した。プレートを二次抗体と周囲温度で１時間インキュベートし、次いでＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で４回洗浄した。次いで、ＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１５８２９５０００１）をプレートに添加し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒで４０５ｎｍの吸光度を直ちに読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してデータを解析した。値��対数スケールに変換し、非線形回帰シグモイド用量反応式を用いてフィッティングし、各抗原に対する各抗体について１１点の結合曲線を得た。
【０１２９】
ペプチド試験のために、アミノ酸配列：
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の２８残基ペプチドを合成した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｉｎｃ．、Ｇａｒｄｎｅｒ，ＭＡ）。このペプチドは、１０コピーのＳＤジペプチドリピートエレメントと、それに続く８残基のポリヒスチジン配列を含み、さらにアミノ末端ビオチン部分を有するように修飾した。このペプチドは本明細書で「ＳＤペプチド」と称し、３４７５ダルトンの測定分子量を有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグリコシル化反応のために、１００μｇのＳＤペプチドを、１０％グリセロール及び３０μｇのウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１００μｌ中の組換えＳｄｇＢタンパク質４μｇと３７℃で１時間インキュベートした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグリコシル化度の分析は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析により測定した。ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３を用いた融合タンパク質のＳＤペプチド（＋／−グリコシル化）への結合を、プレートによるＥＬＩＳＡ形式を用いて測定した。ここで、ＳＤペプチド（＋／−グリコシル化）は、ＰＢＳ中のストレプトアビジン５μｇ／ｍＬでコーティングして、４℃で一晩インキュベートした高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に捕捉した。ＨＲＰをコンジュゲートしたＦ（ａｂ’）２断片ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０９−００６−１４９、ロット１１２９３２）を用いて、結合した試験品の検出を行い、ＨＲＰをコンジュゲートした抗ポリヒスチジン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ０５０ＨポリヒスチジンＨＲＰ  ＭＡｂクローンＡＤ１．１．１０）の使用によりストレプトアビジンプレートに結合したＳＤペプチド（＋／−グリコシル化）を検出した。次いで、ＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１５８２９５０００１）をプレートに添加し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒで４０５ｎｍの吸光度を直ちに読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してデータを解析した。値を対数スケールに変換し、非線形回帰シグモイド用量反応式を用いてフィッティングし、ＳＤペプチド（＋／−グリコシル化）抗原に対する各抗体について１１点の結合曲線を得た。
【０１３０】
結果。図１は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した、ｍＡｂ  ５１３３（表１：構築物１）の組換え黄色ブドウ球菌ＳＤＲタンパク質（＋／−ＳｄｇＢ媒介性グリコシル化）への結合を示す。図１Ａは、以前に報告したウェスタンブロット分析に基づく、ＳｄｇＢグリコシル化形態のＳｄｒＣ４（配列番号１００）へのｍＡｂ  ５１３３の特異的結合を示す（Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．に対するＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１５０８９０７３、参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、図１Ｂ及び１Ｃは、ＳｄｇＢグリコシル化形態の２つの追加黄色ブドウ球菌ＳＤＲタンパク質、ＣｌｆＡ（配列番号６６８）（図１Ｂ）及びＣｌｆＢ（配列番号６６９）（図１Ｃ）に対するｍＡｂ  ５１３３の特異的結合を示す。大腸菌から調製した精製された組換えタンパク質には明らかな結合が見られなかった。これらのデータはさらに、ｍＡｂ  ５１３３によって認識される抗原エピトープが、ＳｄｇＢ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃの存在下でのタンパク質のインキュベーションによって産生されるＳＤＲタンパク質の特異的なグリコシル化形態であることを実証している。
【０１３１】
ＳＤペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳｄｇＢ媒介性グリコシル化のＭＡＬＤＩ分析により、約２０３ダルトンの差がある一連の異なった種が見られ、これはモノマーペプチドあたり最大１０個の明らかなグリコシル化部位を有するセリン残基への個々のＧｌｃＮａｃ単位の付加を示す。図１Ｄに示すように、ｍＡｂ  ５１３３は、ＳｄｇＢ酵素による事前のグリコシル化に完全に依存して、濃度依存的にストレプトアビジン結合ＳＤペプチドを認識する。図１Ｅは対照としての役割を果たし、ＨＲＰをコンジュゲートした抗ポリヒスチジン抗体を用いて検出したとき、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートにＳＤペプチドのグリコシル化形態と非グリコシル化形態とが等量で結合することを示す。図１Ｆは、ストレプトアビジンによる捕捉によってプレートに固定化されたＳｄｇＢグリコシル化ＳＤペプチドへの、一連のｍＡｂ  ５１３３を用いた融合タンパク質の結合を示す。重要なことに、これらのデータは、親ｍＡｂ配列の重鎖部分のカルボキシル末端への二重タンデムＦＮ３ドメイン（表１：構築物１１、１２、１３、及び１４）の融合は、ｍＡｂ  ５１３３由来のＶ領域によって媒介されるグリコシル化ＳＤペプチド抗原に対する試験品の親和性に検出可能な影響をまったく及ぼさないことを示している。さらに、（ＣＨ３変異Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆの導入によって与えられる）ｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質のプロテインＡ結合の排除は、グリコシル化ＳＤペプチド抗原（表１：構築物１１及び１２）に対する試験品の親和性に検出可能な影響を及ぼさない。
【０１３２】
まとめ。これらのデータは、（ｉ）ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質のエピトープ標的を、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの存在下で黄色ブドウ球菌ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼによって修飾されたＳＤ反復配列をわずか１０コピーしか含まないペプチド配列で最小限定義することができ、（ｉｉ）ＳｄｒＣタンパク質の他の配列、すなわち他の黄色ブドウ球菌ＳＤＲファミリーメンバー［クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）、クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、ＳｄｒＤ、またはＳｄｒＥ］は、ｍＡｂ  ５１３３によって認識される最小抗原エピトープの必須成分ではないことを示している。
【０１３３】
（表１）抗体及び抗体−ＦＮ３融合構築物の特徴
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略語：ＰＲＡＳＡ−ヒンジ領域内のＧｌｕＶ８媒介性プロテアーゼ切断を排除する重鎖変異；Ａ６−プロテインＡ結合を排除するＦｃ領域の変異；ＨＣ−重鎖；ＬＣ−軽鎖。
【０１３４】
実施例２：ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質による標的抗原への結合；標的への同時結合、標的結合化学量論、及び結合親和性
異なる組織部位において、黄色ブドウ球菌感染の確立及び／または維持に、個々のＳＤＲタンパク質及びロイコトキシンＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＥＤが果たす役割は多様であると予測される。いくつかの状況では、グリコシル化形態のＳＤＲタンパク質は、宿主組織への接着因子として、または全身血液循環中、もしくは宿主の細胞外環境もしくは宿主の細胞内環境の細胞内小器官いずれかにある他の体液中の可溶性因子として、特定の宿主表面受容体を介して機能する際に重要な場合がある（Ｈａｚｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ＳｄｇＡ  ａｎｄ  ＳｄｇＢ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．９（１０）：ｅ１００３６５３  （２０１３）；Ｔｈｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｎｅ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（６）：３４７８−８６（２０１４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。対照的に、ロイコトキシンＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＥＤは、免疫細胞の特異的クラスに対する標的化された細胞溶解活性により侵襲性疾患を媒介する際に独特の役割を果たす可能性が高い（Ｙｏｏｎｇ  ＆  Ｔｏｒｒｅｓ，“Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ：  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｅｙｏｎｄ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（１）：６３−９（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、ＬｕｋＡＢがヒト多形核白血球（ＰＭＮ）内に取り込まれた細菌の逃避を促進することは確認されているが、宿主細胞（例えば、ファゴリソソーム）の細胞内環境での黄色ブドウ球菌の生存、または環境からの逃避を促進する上で、これらの異なる病原因子が果たす役割は完全には特定されていない（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｅｌａｂｏｒａｔｅｓ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ  ＡＢ  ｔｏ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｅｓｃａｐｅ  Ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．８１（５）：１８３０−４１（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＳＤＲファミリータンパク質と、ロイコトキシンＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＥＤのいずれもが、いくつかの感染状況において重要な共通の病原因子である可能性を考慮すると、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が複数のタンパク質標的に同時に結合し得ることを実証することが重要であった。本明細書では、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を使用して測定された、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質と精製された標的抗原タンパク質との相互作用について記載する。
【０１３５】
手順。本明細書に記載の本実施例及び他の実施例で使用されるｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質のロイコトキシン結合ＦＮ３ドメインは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．に対するＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１５０８９０７３に記載されているように開発した。本実施例で利用するｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の特徴を表１に示す。各試験では、ｍＡｂ  ５１３３を用いたｍＡｂ及びｍＡｂ−５１３３−ＦＮ３融合タンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を使用して、ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、製品番号１０９−００５−０９８）で修飾されたＣＭ４センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製品ＢＲ−１００５−３４）にリガンドとして捕捉した。結合試験では、標的アナライトとして、（ｉ）本明細書でＳｄｒＣ４ＧｌｃＮａｃと称するＶ領域標的抗原である、ＳｄｒＣ４タンパク質（配列番号１００）の単一のＳｄｇＢグリコシル化調製物、（ｉｉ）黄色ブドウ球菌から調製されたＬｕｋＥ（配列番号１３）の組換えポリヒスチジン標識変種、及び（ｉｉｉ）Ｅ３２３Ａ変異を有する、黄色ブドウ球菌から調製されたＬｕｋＡＢ（配列番号１０のＬｕｋＡ変種及び配列番号１１のＬｕｋＢ）の組換えポリヒスチジン標識トキソイド変種を使用した（ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｒｕｃｉａｌ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＬｕｋＡＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，”Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．８２（３）：１２６８−７６（２０１４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。結合試験では、０．２μＭの濾過済み脱気ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製品ＢＲ１０００５４）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）を、リガンド固定化ランニング緩衝液（ＩＲＢ）及びＢｉａｃｏｒｅランニング緩衝液（ＢＲＢ）の両方に使用した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器の「シングルサイクルカイネティクス」モードを用いてアナライトの流速６０μＬ／分で速度論的結合データを取得し、解離を９００秒間モニターした。要約すると、（ｉ）緩衝液注入によって生成された曲線（平均）をアナライト注入時のリファレンス減算曲線（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ｃｕｒｖｅ）から差し引いて、緩衝液を原因とするシグナルノイズ及び機器ノイズを補正し（Ｍｙｓｚｋａ，“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．１２：２７９−２８４（１９９９）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、（ｉｉ）速度論及び親和性測定値を得るため、Ｔ２００  ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、ＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＥの単純な１：１結合モデル、ならびにＳｄｒＣ４ＧｌｃＮａｃの２状態モデルを用いて解析された速度論データで解析して得られた処理データにより、データ解析を実施した（Ｊｏｎｓｓ��ｎ  ＆  Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ，“Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｔｏ  Ｏｎｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，２：２９１−３３６（１９９２）；Ｍｏｒｔｏｎ  ＆  Ｍｙｓｚｋａ，“Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９５：２６８−２９４（１９９８）；Ｓｖｉｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｂｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｔｒａｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，９２：１７４２−１７５８（２００７）；Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｔｉｇｅｎ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｂｙ  Ｋｉｎｅｔｉｃ−  ａｎｄ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２８（１）：３５−４３（２００４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３６】
結果。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体によってＣＭ４センサーチップに捕捉された試験品リガンドは、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１：構築物４／配列番号６６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＡＢ（表１：構築物６／配列番号７０  ＨＣと配列番号７１  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ（表１：構築物１５／配列番号８４８  ＨＣと配列番号７１  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１：構築物１１／配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。標的結合の初期段階（段階Ａ）では、ＳｄｒＣ４ＧｌｃＮａｃ（４５０ｎｍのグリコシル化ＳｄｒＣ４タンパク質）は明らかに飽和するまで固定化リガンドに結合した。図２Ａの段階Ａの結合に示すように、ＣＭ４センサーに結合した全リガンドが、グリコシル化ＳｄｒＣ４タンパク質と結合し、これはベースラインからの応答単位（ＲＵ）の増加に表われている。図２Ａの段階Ｂに示すように、フロー溶液に（１μＭで）ＬｕｋＥを添加すると、ＬｕｋＥ標的化ＦＮ３ドメインを有する試験品リガンド構築物１５及び１１のＲＵはさらなる増加を示した。最後に、図２Ａの段階Ｃに示すように、フロー溶液に（１００ｎＭで）ＬｕｋＡＢを添加すると、試験品の構築物６（ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＡＢ）及び構築物１１（ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ）の実測ＲＵはさらなる増加を示した。構築物がそれぞれＬｕｋＡＢ標的化ＦＮ３ドメインを有することから、これも予測されたことであった。対照的に、構築物４（ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６）または構築物１５（ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ）によるＬｕｋＡＢの明らかな結合は検出されなかった。このことは、これらのタンパク質にＬｕｋＡＢ標的化ＦＮ３ドメインがないことと整合する。
【０１３７】
これらの結合データの分析から、それぞれの標的抗原の結合化学量論の定量的評価が可能であり、そのデータを図２Ｂに示す。ＬｕｋＥに特異的なＦＮ３ドメインを含む試験品の場合はすべて、＞１（１．２〜１．５の範囲）の化学量論的結合が観察され、これは全固定化リガンドの一部がＬｕｋＥ抗原の２つのコピーに同時に関与したことを示す。同様に、ＬｕｋＡＢに特異的なＦＮ３ドメインを含む試験品の場合はすべて、＞１（１．４〜１．８の範囲）の化学量論的結合が観察され、これは全固定化リガンドの一部がＬｕｋＡＢ抗原の２つのコピーに同時に関与したことを示す。
【０１３８】
最後に、これらの結合データの分析から、それぞれの標的抗原の結合親和性の決定も可能であり、そのデータを図２Ｃに示す。ｍＡｂ５１３３由来のＶ領域を有する試験品の場合、グリコシル化ＳｄｒＣ４タンパク質への結合親和性は、０．６３〜０．９９ｎＭの範囲であり、ＫＤ値にかなりの一致が観察された。同様に、ＬｕｋＥに特異的なＦＮ３ドメインを含む試験品の場合、ＬｕｋＥへの結合親和性は、０．８８〜１．０１ｎＭの範囲であり、ＫＤ値にかなりの一致が観察された。対照的に、ＬｕｋＡＢに特異的なＦＮ３ドメインを含む試験品の場合、構築物１１の結合親和性（１２ｐＭ）は、構築物６で観察された結合親和性（７０ｐＭ）の約６倍であることが判明した。これらのデータは、局所配列状況が標的抗原に対するＦＮ３ドメインの親和性に影響を与え得ることを示している。具体的には、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３ドメインの親和性は、構築物１１（ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ）のＬｕｋ２６下流に付加された場合、構築物６（ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＡＢ）のｍＡｂ  ５１３３のカルボキシル末端への付加と比較して増強されることが明らかである。ｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質での局所的配列状況に基づいた、ＦＮ３結合ドメインのそれぞれの標的抗原に対する親和性の変化は非自明であり、先験的に予測することはできない。
【０１３９】
まとめ。これらのデータは、ＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＥを標的とするｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、両方の毒素標的と関与すると同時に、抗体部分のＶ領域を介してＳＤ−ＧｌｃＮａｃ抗原とも同時に関与する証拠を示している。ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質のこの機能は、グリコシル化形態のＳＤＲファミリー接着因子タンパク質に加え、ロイコトキシンＡＢ及び／またはＥＤの役割が感染の確立及び／または維持に重要である、黄色ブドウ球菌が媒介する一部の疾患状態の宿主組織及び／または細胞小器官に重要であり得る。同様に、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質がＬｕｋＡＢとＬｕｋＥの両方に同時に結合する明らかな能力はまた、両方のロイコトキシンを発現する黄色ブドウ球菌疾患状態において重要であり得る。各毒素標的抗原に対する見かけの化学量論的結合が＞１であることは、単一のＬｕｋＡＢ分子の結合が第２のＬｕｋＡＢ分子の結合を妨げる、または単一のＬｕｋＥ分子の結合が第２のＬｕｋＥ分子の結合を妨げる場合にもたらされるよりも高い中和を可能にすると推定される。最後に、ｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質におけるＦＮ３ドメインの状況が、標的親和性に有意な影響を与え得るという観察は、ｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質の標的結合を、ｍＡｂの軽鎖及び／または重鎖に対する異なる位置の付加を探索すること、ならびにタンデムＦＮ３ドメインを有するｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質のＦＮ３ドメイン順序を探索することにより、配列状況を調節して最適化できることを示唆している。この知見はそれぞれ予想外であり、先験的に予測することはできなかった。
【０１４０】
実施例３：ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質による標的結合：ロイコトキシン標的に対するＦＮ３成分の親和性、及びリンカー長の改変によるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の調節
多重特異性融合タンパク質に使用されるリンカー配列の長さ及び性質は、おそらく標的（抗原）相互作用及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学−薬力学（ＰＫ−ＰＤ）に影響を及ぼす要素を変更することで、個々の成分の活性及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に影響を与える可能性がある。本実施例では、単一のｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）の一連の２４の誘導体の合成及び特性決定について記載する。ここで、ｍＡｂ重鎖のカルボキシル末端と第１のＦＮ３ドメイン（ＬｕｋＥを標的とする）との間のリンカー長は、Ｇ４Ｓリンカーの０〜４コピーの間で変化し（以下「リンカー１」と称する）、同様に、第１のＦＮ３ドメイン（ＬｕｋＥを標的とする）のカルボキシル末端と第２のＦＮ３ドメイン（ＬｕｋＡＢを標的とする）のアミノ末端との間のリンカー長は、Ｇ４Ｓリンカーの０〜４コピーの間で変化する（以下「リンカー２」と称する）。
【０１４１】
手順。可変リンカー長を有する、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質構築物１１（ＣＲ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）の誘導体を標準的な分子法で合成し、一過性トランスフェクトしたヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞から調製したタンパク質を精製した。各ロイコトキシン標的、すなわちＬｕｋＥ（配列番号１３）、及び野生型毒素のＥ３２３Ａに対応する変異を有する（ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｒｕｃｉａｌ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＬｕｋＡＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，”Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．８２（３）：１２６８−７６（２０１４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＬｕｋＡＢトキソイド変種（配列番号１０及び１１）の結合親和性をＥＬＩＳＡにより検出した。簡潔には、５μｇ／ｍＬストレプトアビジンの１００μｌ溶液（ＰＢＳ中）を９６ウェル白色Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４３６１１０）の各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、３００μＬ／ウェルのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３７５４３）でブロックし、室温（ＲＴ）で４５〜６０分間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、０．２μｇのビオチン化型ロイコトキシン標的抗原（１００μＬ）を各試験ウェルに添加し、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。別々の希釈プレートにて、開始濃度１０μＭで、試験品をブロッキング緩衝液で３倍に系列希釈した。ＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、抗体希釈液を希釈プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し、穏やかに振盪しながら周囲温度にて１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、二次ヤギ抗ヒトＦｃガンマ特異的ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  １０９−０３５−０９８）をブロッキング緩衝液で１：１０，０００に希釈し、プレートに添加した。プレートを二次抗体と周囲温度で１時間インキュベートし、次いでＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で４回洗浄した。次に、ＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１５８２９５０００１）をプレートに添加し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒで４０５ｎｍの吸光度を直ちに読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してデータを解析した。値を対数スケールに変換し、非線形回帰シグモイド用量反応式を用いてフィッティングし、各抗原に対する各抗体について１１点の結合曲線を得た。
【０１４２】
黄色ブドウ球菌の腎臓感染症のマウスモデルを使用して、ｍＡｂ−ＦＮ３融合リンカー変種の相対的なｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を評価した。簡潔には、感染の２４時間前に、５〜６週齢の雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＮＤ４マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）に試験品（群あたり８）を腹腔内経由で投与（ＩＰ注射）した。その後、所定の一定濃度（マウスあたり約１０＾６Ｌｏｇ１０ＣＦＵ）の黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ、体積１００μＬを２８Ｇ、１／２インチ針を使用して眼窩後に（イソフルラン麻酔下で）注射してマウスを感染させた。この濃度は、取り出した腎臓のホモジネートから測定したコロニー形成単位（ＣＦＵ）、及び腎臓表面膿瘍病変の目視観察と計数の測定に基づいて得られる細菌負荷によって定義される、頑強な腎臓感染を一般に生じる最低の細菌接種量に相当した。試験品はどの場合でも感染の２４時間前に投与した。感染の９６時間後にマウスを安楽死させ、腎臓を採取した。腎臓は可視病変数により感染の重症度を採点した。腎臓を取り出し、計量し、均質化し、得られたホモジネートを系列希釈して、細菌増殖培地（トリプシン大豆寒天（ＴＳＡ））上にプレーティングし、ＣＦＵエンドポイントにより個々の腎臓あたりの最終生存細菌負荷を決定した。健康状態を観察するためマウスを毎日モニターした。腎臓膿瘍の重症度スコアを、１〜２の可視病変＝重症度スコア１、３〜９の可視病変＝重症度スコア２、及び１０以上の可視病変＝重症度スコア３として記録した。
【０１４３】
結果。ロイコトキシン結合親和性に可変リンカー長が与える影響を先験的に予測することはできなかったが、図３Ａのデータは、リンカー１及びリンカー２のそのような変化が、両方の毒素抗原に対する結合親和性に与える非自明性の影響を例示している。例えば、リンカー位置１に関して、ｍＡｂ重鎖のカルボキシル末端と第１のＦＮ３ドメイン（ＬｕｋＥを標的とする）との間のＧ４Ｓリンカーのコピーを含まない変種（０ｘ０、０ｘ１、０ｘ２、０ｘ３、及び０ｘ４）は、０ｘ０変種がＬｕｋＡＢに対して幾分弱い結合を示す以外は、ＬｕｋＥ及びＬｕｋＡＢに対して、４ｘ４変種とほぼ等価の結合親和性を示している。対象的に、リンカー位置２に関して、第１のＦＮ３ドメイン（ＬｕｋＥを標的とする）のカルボキシル末端と第２のＦＮ３ドメイン（ＬｕｋＡＢを標的とする）のアミノ末端との間のＧ４Ｓリンカーのコピーを含まない変種（０ｘ０、１ｘ０、２ｘ０、３ｘ０、及び４ｘ０）はすべて、４ｘ４変種と比較してＬｕｋＡＢに対する結合の有意な減少を示し、また０ｘ０変種を除いて、４ｘ４変種と比較してＬｕｋＥに対する結合親和性の可変的な減少を示している。全体として、毒素結合親和性と、リンカー１及びリンカー２の長さとの間に認識可能な傾向がないことは、各リンカーが毒素標的それぞれへの結合に与え得る影響を強調するものであり、したがって毒素標的に対する結合親和性に関して、これらのｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質を最適化する上で、リンカー変種の広範なパネルを中立的に評価することが必要である。
【０１４４】
同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に可変リンカー長が与える影響を先験的に予測することはできなかったが、図３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄのデータは、リンカー１及び／またはリンカー２のそのような変化が、黄色ブドウ球菌腎臓感染マウスモデルでの有効性に与える非自明性の影響を例示している。例えば、１ｘ４及び４ｘ４変種は、同等の（高い）有効性を示し、ＬｕｋＥとＬｕｋＡＢのいずれに対しても強力な結合を保持している（それぞれ図３Ｃ及び３Ｄ）。対照的に、３ｘ２、３ｘ３、及び３ｘ４変種は、ＬｕｋＥとＬｕｋＡＢのいずれに対しても強力な結合を示しているが、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は弱いか、またはまったく示していない（それぞれ図３Ｃ及び３Ｄ）。このように、リンカーの組成の差が、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学−薬力学（ＰＫ−ＰＤ）を左右する要素に影響を与える可能性が高いことから、リンカーの長さと有効性との関係を単純に毒素結合親和性の変化で説明することはできない。このデータもまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に関して、これらのｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質を最適化する上で、リンカー変種の広範なパネルを中立的に評価する必要性を顕著に示している。
【０１４５】
まとめ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ活性にｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の可変リンカー長が与える影響を、先験的に予測することはできなかった。本明細書で例示するように、単一のｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質のリンカー変種の広範なパネルのロイコトキシン標的結合、毒素中和、及びｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の試験を通じて、リンカー１及び／またはリンカー２のそのような変化がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、及びｉｎ  ｖｉｖｏ活性に与える非自明性の影響を実証した。この試験は、ｍＡｂ重鎖のカルボキシル末端と第１のＦＮ３ドメインとの間に用いられるＧ４Ｓリンカー長、及びそれに関連して、第１のＦＮ３ドメインのカルボキシル末端と第２のＦＮ３ドメインのアミノ末端との間のリンカー長の変化によって、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の活性を最適化できる可能性を顕著に示している。
【０１４６】
実施例４：ロイコトキシンＬｕｋＥＤのＬｕｋＥ成分を標的とするＦＮ３変種の毒素結合と中和活性の相関関係
いくつかのＦＮ３変種に観察されたロイコトキシン結合及び中和の特異性は、それらが高度に特異的な方法で相互作用することを意味している。ＦＮ３タンパク質とＬｕｋＥサブユニットとの間の重要な分子間相互作用を特定する取り組みの一貫として、一連の３つのＬｕｋＥ特異的ＦＮ３変種、具体的にはＬｕｋ２６（配列番号２５）、Ｌｕｋ２７（配列番号２６）、及びＬｕｋ３８（配列番号３７）の変異誘導体を作製し、誘導体中の、親の野生型ＴＥＮＣＯＮのＦＮ３タンパク（配列番号１）とは異なる残基をそれぞれ独立してアラニンに変更し、推定のＬｕｋＥ結合表面にわたるいわゆる「アラニンスキャン」セットの変種を生成する。次いで各変種を、（ｉ）ＥＬＩＳＡ形式アッセイで測定される、精製した組換えＬｕｋＥタンパク質への結合の保持、及び（ｉｉ）単離された初代ヒト好中球を用いたアッセイにおけるＬｕｋＥＤ毒素中和活性について評価した。
【０１４７】
手順。精製した組換えＬｕｋＥタンパク質（配列番号１３）に対するＦＮ３変種の結合をＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔には、５μｇ／ｍＬストレプトアビジンの１００μｌ溶液（ＰＢＳ中）を９６ウェル白色Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４３６１１０）の各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ウェルをＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、３００μＬ／ウェルのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３７５４３）でブロックし、室温（ＲＴ）で４５〜６０分間インキュベートした。次いで、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、０．２μｇのＬｕｋＥタンパク質のビオチン化調製物（１００μＬ）を各試験ウェルに添加し、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。別々の希釈プレートにて、開始濃度１μＭで、試験品をブロッキング緩衝液で３倍に系列希釈した。１００μＬの漸減濃度の試験品を試験ウェルに添加し、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。結合した試験品を検出するため、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０で１：５０００に希釈したポリクローナル抗ＦＮ３−ＨＲＰ抗体を１００μＬ／ウェル添加し、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。結合した抗ＦＮ３−ＨＲＰ抗体を検出するために、ＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１５８２９５０００１）１００μＬ／ウェルをプレート測定の直前に添加し、基質添加から１５分以内にＰａｒａｄｉｇｍまたはＥｎｖｉｓｉｏｎリーダーを使用してプレートを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してデータを解析した。値を対数スケールに変換し、非線形回帰シグモイド用量反応式を用いてフィッティングし、各抗原に対する各抗体について１１点の結合曲線を得た。
【０１４８】
ＬｕｋＥＤ中和試験のため、ＦＮ３ドメイン試験品（１００μＬ反応物中１０μｇ／ｍＬ）を、精製した組換えＬｕｋＥＤ（配列番号１２及び１３）と４℃で３０分間インキュベートした。新たに単離したヒト初代多形核白血球（ｈＰＭＮ、ＲＰＭＩ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．１％  ＨＳＡ中２００，０００細胞）を、毒素及びＦＮ３ドメインタンパク質の混合物に添加し、最終体積を１００μｌにした。次いで、臭化エチジウムを、最終希釈１：２０００で細胞に添加し、毒素の添加から３０分後及び６０分後にプレートを読み取った。ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１時間、毒素負荷した後、プレートを１５００ＲＰＭで１０分間遠心沈殿させた後に、上清２５μｌを慎重に新しいプレートに移した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を残存細胞に添加し、１．５時間インキュベートした。損傷膜を有する細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を迅速に測定するため、上清２５μｌを同量のＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。培養培地へのＬＤＨの放出を、レサズリンが変化して蛍光レゾルフィン生成物となる１０分間の結合酵素アッセイを用いて測定した。中和実験では、ＬｕｋＥＤを濃度７２．５ｎＭ（サブユニットあたり２．５μｇ／ｍＬ）で使用した。
【０１４９】
結果。図４Ａに示すように、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質誘導体の「アラニンスキャン」セットでは、ＬｕｋＥ結合親和性と、ＬｕｋＥＤ毒素中和活性（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒのエンドポイントにより表される）との間に合理的な相関関係があることがわかる。ＬｕｋＥ結合が保持され、中和が喪失する事例は見られなかった。対照的に、２つの変種（Ｗ３９Ａ及びＷ４１Ａ）が、ＬｕｋＥ結合親和性とＬｕｋＥＤ中和活性のほぼ全体的な喪失を示すと同時に、他の変種（例えば、Ｅ３４Ａ、Ｆ７０Ａ、及びＧ７２Ａ）が、結合親和性の低下と、ＬｕｋＥＤ中和活性の部分的喪失を示した。これらのデータは、Ｌｕｋ２６による高度に特異的なＬｕｋＥ結合を媒介し、ＦＮ３パラトープの成分を定義すると思われる重要な残基を同定している。
【０１５０】
同様に、図４Ｂに示すように、Ｌｕｋ２７  ＦＮ３タンパク質誘導体の「アラニンスキャン」セットでは、ＬｕｋＥ結合親和性と、ＬｕｋＥＤ毒素中和活性（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒのエンドポイントにより表される）との間に合理的な相関関係があることがわかる。ここでも、ＬｕｋＥ結合が保持され、中和が喪失する事例は見られなかった。対照的に、１つの変種（Ｄ７０Ａ）が、ＬｕｋＥ結合親和性とＬｕｋＥＤ中和活性のほぼ全体的な喪失を示すと同時に、他の変種（例えば、Ｗ３８Ａ、Ｌ６８Ａ、Ｙ７２Ａ、Ｗ７９Ａ、及びＹ８１Ａ）が、結合親和性の低下と、ＬｕｋＥＤ中和活性の部分的喪失を示した。これらのデータは、Ｌｕｋ２７による高度に特異的なＬｕｋＥ結合を媒介し、ＦＮ３パラトープの成分を定義すると思われる重要な残基を同定している。
【０１５１】
最後に、図４Ｃに示すように、Ｌｕｋ３８  ＦＮ３タンパク質誘導体の「アラニンスキャン」セットでは、ＬｕｋＥ結合親和性と、ＬｕｋＥＤ毒素中和活性（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒのエンドポイントにより表される）との間に合理的な相関関係があることがわかる。２つの変種（Ｗ８１Ａ及びＤ８３Ａ）が、ＬｕｋＥ結合親和性とＬｕｋＥＤ中和活性のほぼ全体的な喪失を示すと同時に、別の変種（Ｆ８６Ａ）が、結合親和性の低下と、ＬｕｋＥＤ中和活性の部分的喪失を示した。他の変種（例えば、Ｉ７７Ａ、Ｇ８０Ａ、Ｆ８４Ａ、Ｖ８５Ａ、及びＦ８６Ａ）では、ＬｕｋＥ結合が有意に保持されることが明らかである一方、ＬｕｋＥＤ中和活性が有意に減少した。これらのデータは、Ｌｕｋ３８による高度に特異的なＬｕｋＥ結合を媒介し、ＦＮ３パラトープの成分を定義すると思われる重要な残基を同定している。
【０１５２】
まとめ。これらのデータは、Ｌｕｋ２６、Ｌｕｋ２７、及びＬｕｋ３８  ＦＮ３ドメインタンパク質が、それぞれのパラトープ−エピトープ表面で一連の特異的分子間相互作用によって結合し、ＬｕｋＥＤを中和することを示している。さらに、これらのＬｕｋＥ特異的ＦＮ３タンパク質において、アラニンに変異させたとき、ＬｕｋＥ結合にもＬｕｋＥＤ中和にも明らかな影響を与えない残基を同定することで、この残基を代わりのアミノ酸に変更することにより、ＬｕｋＥの結合及びＬｕｋＥＤの中和に関する効力をさらに増強する可能性が得られる。
【０１５３】
実施例５：ロイコトキシンＬｕｋＡＢを標的とするＦＮ３変種の毒素結合と中和活性の相関関係
いくつかのＦＮ３変種に観察されたロイコトキシン結合及び中和の特異性は、それらが高度に特異的な方法で相互作用することを意味している。ＦＮ３タンパク質とＬｕｋＡＢ毒素との間の重要な分子間相互作用を特定する取り組みの一貫として、Ｌｕｋ１７（配列番号１４）の変異誘導体を作製し、誘導体中の、親の野生型ＴＥＮＣＯＮのＦＮ３タンパク（配列番号１）とは異なる残基をそれぞれ独立してアラニンに変更し、推定のＬｕｋＡＢ結合表面にわたるいわゆる「アラニンスキャン」セットの変種を生成する。次いで各変種を、（ｉ）ＥＬＩＳＡ形式アッセイで測定される、精製した組換えＬｕｋＡＢタンパク質への結合の保持、及び（ｉｉ）単離された初代ヒト好中球を用いたアッセイにおけるＬｕｋＡＢ毒素中和活性について評価した。
【０１５４】
手順。ＦＮ３変種の、野生型毒素配列のＥ３２３Ａに対応する変異を有する（ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｒｕｃｉａｌ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＬｕｋＡＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．８２（３）：１２６８−７６（２０１４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、黄色ブドウ球菌から調製したＬｕｋＡＢ（配列番号１０及び１１）の精製された組換えポリヒスチジン標識トキソイド変種への結合性をＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔には、５μｇ／ｍＬストレプトアビジンの１００μｌ溶液（ＰＢＳ中）を９６ウェル白色Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４３６１１０）の各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ウェルをＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、３００μＬ／ウェルのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３７５４３）でブロックし、室温（ＲＴ）で４５〜６０分間インキュベートした。次いで、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、０．２μｇのＬｕｋＡＢ（Ｅ３２３Ａ）タンパク質のビオチン化調製物（１００μＬ）を各試験ウェルに添加し、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。別々の希釈プレートにて、開始濃度１０μＭで、試験品をブロッキング緩衝液で３倍に系列希釈した。１００μＬの漸減濃度の試験品を試験ウェルに添加し、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。結合した試験品を検出するため、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０で１：５０００に希釈したポリクローナル抗ＦＮ３−ＨＲＰ抗体を１００μＬ／ウェル添加し、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。結合した抗ＦＮ３−ＨＲＰ抗体を検出するために、ＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１５８２９５０００１）１００μＬ／ウェルをプレート測定の直前に添加し、基質添加から１５分以内にＰａｒａｄｉｇｍまたはＥｎｖｉｓｉｏｎリーダーを使用してプレートを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してデータを解析した。値を対数スケールに変換し、非線形回帰シグモイド用量反応式を用いてフィッティングし、各抗原に対する各抗体について１１点の結合曲線を得た。
【０１５５】
ＬｕｋＡＢ中和試験のため、ＦＮ３ドメイン試験品（反応物体積１００μＬ中４０μｇ／ｍＬ）を、精製した組換えＬｕｋＡＢ（配列番号６７１及び１１）と４℃で３０分間インキュベートした。新たに単離したヒト多形核好中球（ｈＰＭＮ、ＲＰＭＩ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．１％  ＨＳＡ中２００，０００細胞）を、毒素及びＦＮ３ドメインタンパク質の混合物に添加し、最終体積を１００μｌにした。次いで、臭化エチジウムを、最終希釈１：２０００で細胞に添加し、毒素の添加から３０分後及び６０分後にプレートを読み取った。ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１時間、毒素負荷した後、プレートを１５００ＲＰＭで１０分間遠心沈殿させた後に、上清２５μｌを慎重に新しいプレートに移した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を残存細胞に添加し、１．５時間インキュベートした。損傷膜を有する細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を迅速に測定するため、上清２５μｌを同量のＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。培養培地へのＬＤＨの放出を、レサズリンが変化して蛍光レゾルフィン生成物となる１０分間の結合酵素アッセイを用いて測定した。中和実験では、ＬｕｋＡＢを濃度３３．７５ｎＭ（サブユニットごとに１．２５μｇ／ｍＬ）で使用した。
【０１５６】
結果。図５に示すように、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質誘導体の「アラニンスキャン」セットでは、ＬｕｋＡＢ結合親和性と、ＬｕｋＡＢ毒素中和活性（臭化エチジウム取り込みエンドポイントにより表される）との間に良好な相関関係があることがわかる。ＬｕｋＡＢ結合が有意に保持され、中和が喪失する事例は見られなかった。対照的に、一連の変種（Ｅ３６Ａ、Ｋ３８Ａ、Ｆ３９Ａ、Ｒ４１Ａ、及びＷ７０Ａ）が、ＬｕｋＡＢ結合とＬｕｋＡＢ中和活性のほぼ全体的な喪失を示すと同時に、他の変種（Ｗ３２Ａ、Ｙ４０Ａ、Ｋ６８Ａ、及びＷ８１Ａ）が、結合親和性の低下と、ＬｕｋＥＤ中和活性の部分的喪失を示した。これらのデータは、Ｌｕｋ１７による高度に特異的なＬｕｋＡＢ結合を媒介し、ＦＮ３パラトープの成分を定義すると思われる重要な残基を同定している。
【０１５７】
まとめ。これらのデータはＬｕｋ１７  ＦＮ３ドメインタンパク質が、パラトープ−エピトープ表面で一連の特異的分子間相互作用によって結合し、ＬｕｋＡＢを中和することを示している。さらに、Ｌｕｋ１７において、アラニンに変異させたとき、ＬｕｋＡＢ結合にも中和にも明らかな影響を与えない残基を同定することで、この残基を代わりのアミノ酸に変更することにより、ＬｕｋＡＢの結合及び中和に関する効力をさらに増強する可能性が得られる。
【０１５８】
実施例６：マウス腎臓感染モデルにおいて、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質はｍＡｂ−５１３３に比べて有効性が向上している
ヒト黄色ブドウ球菌感染症の動物モデルにおける有効性に関して、ｍＡｂ  ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質の可変（Ｖ）領域及び／または抗毒素ＦＮ３成分の相対的な寄与を理解する上で、マウス腎臓（ｒｅｎａｌ／ｋｉｄｎｅｙ）感染疾患モデルにおける相対的有効性に関して一連の試験品を比較した。具体的には、（グリコシル化形態のＳＤＲファミリー接着因子を標的とする）ｍＡｂ  ５１３３由来の同じＶ領域を有するが、ＬｕｋＥ単独またはＬｕｋＥとＬｕｋＡＢとの組み合わせの標的化に関してはＦＮ３ドメイン組成が異なる一連の試験品を「直接比較で」評価した。アイソタイプのＩｇＧ１対照として、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質を標的とする非抗ブドウ球菌性抗体ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）を使用した。
【０１５９】
手順。感染の２４時間前に、５〜６週齢の雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＮＤ４マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）に試験品（群あたり８）を２００μＬ／マウスの固定用量体積で腹腔内（ＩＰ）経由にて投与した。その後、所定の一定濃度（マウスあたり約６．７ｘ１０＾６Ｌｏｇ１０ＣＦＵ）の黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ：Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｍａｊｏｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｓｌａｎｄｓ，”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０（１）：３００−３１０（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、体積１００μＬを２８Ｇ、１／２インチ針を使用して眼窩後に（イソフルラン麻酔下で）注射してマウスを感染させた。この感染用量は、結果生じる細菌負荷によって定義される、頑強な腎臓感染を一般に生じる最低の細菌接種量に相当する。細菌負荷は、取り出した腎臓のホモジネートから測定したコロニー形成単位（ＣＦＵ）、及び腎臓表面病変の目視観察と計数によって決定される。いずれの場合も、試験品は感染の２４時間前に投与し、感染から９６時間後にマウスを安楽死させ、腎臓を採取した。健康状態を観察するためマウスを毎日モニターした。解剖顕微鏡を用いた可視病変（膿瘍）数により腎臓の感染重症度を採点した後、取り出し、計量し、均質化し、得られたホモジネートを系列希釈して、細菌増殖培地（トリプシン大豆寒天（ＴＳＡ））上にプレーティングし、ＣＦＵエンドポイントにより個々の腎臓あたりの最終生存細菌負荷を決定した。健康状態を観察するためマウスを毎日モニターした。病変データ及び細菌負荷（ＣＦＵ）データ両方の統計分析を、Ｄｕｎｎの方法を用いてｐ値を計算することによって実施した。評価した試験品は、ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物４；配列番号６６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ（表１の構築物１５；配列番号８４８  ＨＣと配列番号７１  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。試験品はすべて、感染の２４時間前に５００μｇ／動物の用量でＩＰ投与した。
【０１６０】
結果。図６は、腎臓の重症度スコア、群あたりの総腎臓表面病変、及び各投与動物から回収された個々の腎臓あたりの生存細菌負荷の減少を示す。予測された通り、アイソタイプ対照、抗ＲＳＶ抗体（ＣＮＴＯ３９３０、レーン１）による処置は、腎臓での平均細菌負荷が腎臓あたり平均７．０ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇと最も高く、動物８匹の群から採取した各腎臓で可視的な証拠となる病変が最も多かった（１６／１６）。ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（レーン２）による処置は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０よりも０．８ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、腎臓病変の発生率を５０％（８／１６）まで低下させた。さらにｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ（レーン３）による処置は、腎臓での細菌負荷を、具体的にＣＮＴＯ３９３０よりも１．８ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、腎臓病変の発生率をさらに２５％（４／１６）まで低下させた。しかしながら、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（レーン４）による処置が、腎臓での細菌負荷または病変の発生率いずれによる測定でも全体で最も高い有効性を示した。具体的には、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢによる処置は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０と比較して２．６ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へとさらに減少させ、検出限界を超える腎臓病変の発生率を低下させた（０／１６）。
【０１６１】
まとめ。これらのデータは、ｍＡｂ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質のＶ領域と抗毒素ＦＮ３成分の両方が、この腎臓感染マウスモデルにおいて観察された全体的な有効性に顕著に寄与することを示している。ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６による処置は、腎臓病変の発生率を５０％に減少させ、腎臓での細菌負荷を組織あたり０．８ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減に減少させ、非抗ブドウ球菌性ｍＡｂ（ＣＮＴＯ３９３０）よりも有効性を改善した。しかしながら、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅに例示される、ＬｕｋＥを標的とする単一のＦＮ３融合タンパク質の付加は、腎臓病変の発生率をさらに（２５％）減少させ、腎臓での細菌負荷を組織あたり１．８ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へとさらに減少させた。しかしながら、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢに例示される、ＬｕｋＥ及びＬｕｋＡＢを標的とする二重タンデムＦＮ３融合タンパク質の付加は、腎臓での細菌負荷を全体で最も低下させ（ＣＮＴＯ３９３０と比較して、組織あたり２．６ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減）、検出限界を超える腎臓病変の発生率を低下させた（０／１６）。全体として、これらのデータは、ｍＡｂ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質のＶ領域と抗毒素ＦＮ３成分の両方が、この腎臓感染マウスモデルにおける有効性に寄与すること、さらにＬｕｋＥとＬｕｋＡＢの両方を標的とするｍＡｂ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質が全体的に最も優れた有効性を示すことを示唆している。最後に、これらのデータは、ｍＡｂ  ５１３３（グリコシル化形態のＳＤＲファミリー接着因子）の抗原標的、ならびにロイコトキシンＥＤ及びＡＢはすべて、この腎臓感染マウスモデルに寄与する病原因子であることを示唆している。
【０１６２】
実施例７：ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質は、非ＳＤＲの黄色ブドウ球菌タンパク質抗原を標的とするｍＡｂまたはｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質と比較して、マウス腎膿瘍感染モデルにおいて有効性の向上を示す
ヒト黄色ブドウ球菌感染症の動物モデルにおける有効性に関して、ｍＡｂ  ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質のＶ領域及び／または抗ロイコトキシンＦＮ３成分の相対的な寄与を理解する上で、マウス腎臓（ｒｅｎａｌ／ｋｉｄｎｅｙ）感染疾患モデルにおける相対的有効性について、一連の試験品を比較した。具体的には、ｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質のｍＡｂ要素の重鎖に融合された抗毒素ＦＮ３成分において、Ｖ領域成分のみが異なるがそれ以外は同一である一連の試験品を「直接比較で」評価した。試験品には、鉄調節型表面決定因子Ｂ（ｉｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  Ｂ、ＩｓｄＢ）タンパク質（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｆｕｌｌｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｉｒｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  Ｂ（ＩｓｄＢ）Ｗｉｔｈ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，”Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １９（４）：１１３−２８（２０１０）；Ｐａｎｃａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＳ−Ｄ７，ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｉｒｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  Ｂ  （ＩｓｄＢ），”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２（３６）：１−１３（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を標的とする非ブドウ球菌抗体、免疫グロブリンＧ結合タンパク質プロテインＡ、リポタイコ酸（Ｗｅｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｓｅ  １／２  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｂｌｉｎｄ，Ｐｌａｃｅｂｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，Ｄｏｓｅ  Ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，Ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ  （ＢＳＹＸ−Ａ１１０），ａｎ  Ａｎｔｉｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｉｎ  Ｖｅｒｙ−Ｌｏｗ−Ｂｉｒｔｈ−Ｗｅｉｇｈｔ  Ｎｅｏｎａｔｅｓ，”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  ＆  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５３（７）：２８７９−８６（２００９）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、または特性不明の黄色ブドウ球菌細胞表面抗原（ｍＡｂ  ＣＲ６５２６を用いたＦＮ３融合タンパク質）を含めた。ｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質の状況下、かつアイソタイプのＩｇＧ１対照抗体ＣＮＴＯ３９３０として、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質を標的とするＣＮＴＯ３９３０に由来する抗ＲＳＶのＶ領域を対照として含めた。
【０１６３】
手順。感染の２４時間前に、５〜６週齢の雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＮＤ４マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）に試験品（群あたり８）を腹腔内経由で投与（ＩＰ注射）した。その後、所定の一定濃度（マウスあたり約１０＾６Ｌｏｇ１０ＣＦＵ）の黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ：Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｍａｊｏｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｓｌａｎｄｓ，”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０（１）：３００−３１０（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、体積１００μＬを２８Ｇ、１／２インチ針を使用して眼窩後に（イソフルラン麻酔下で）注射してマウスを感染させた。この投与濃度は、結果生じる細菌負荷によって定義される、頑強な腎臓感染を一般に生じる最低の細菌接種量に相当する。細菌負荷は、取り出した腎臓のホモジネートから測定したコロニー形成単位（ＣＦＵ）、及び腎臓表面病変の目視観察と計数によって決定される。いずれの場合も、試験品は感染の２４時間前に投与し、感染から９６時間後にマウスを安楽死させ、腎臓を採取した。腎臓は可視病変数により感染の重症度を採点した。次いで、腎臓を取り出し、計量し、均質化し、得られたホモジネートを系列希釈して、細菌増殖培地（トリプシン大豆寒天（ＴＳＡ））上にプレーティングし、ＣＦＵエンドポイントにより個々の腎臓あたりの最終生存細菌負荷を決定した。健康状態を観察するためマウスを毎日モニターした。腎臓膿瘍の重症度スコアを、１〜２の可視病変＝重症度スコア１、３〜９の可視病変＝重症度スコア２、及び１０以上の可視病変＝重症度スコア３として記録した。病変データ及び細菌負荷（ＣＦＵ）データ両方の統計分析を、Ｄｕｎｎの方法を用いてｐ値を計算することによって実施した。評価した試験品は、ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物４；配列番号６６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ＰｒｏＡ３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１６；配列番号ＨＣ  ８６８と配列番号８４１  ＬＣ）、ＰｒｏＡ９  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１７；配列番号ＨＣ  ８８０と配列番号８４２  ＬＣ）、ＩｓｄＢ  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１８；配列番号ＨＣ  ９２１と配列番号８４４  ＬＣ）、ｍＡｂ  ６５２６  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物２３；配列番号ＨＣ  ９２３と配列番号８４５  ＬＣ）、ＲＳＶ  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ（表１の構築物２０；配列番号９２７  ＨＣと配列番号８４３  ＬＣ）、ＬＴＡ  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１９；配列番号ＨＣ  ９２５と配列番号８４６  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ���−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。試験品はすべて、感染の２４時間前に５００μｇ／動物の用量でＩＰ投与した。
【０１６４】
結果。図７は、腎臓の重症度スコア、群あたりの総腎臓表面病変、及び各投与動物から回収された個々の腎臓あたりの生存細菌負荷の減少を示す。予測された通り、アイソタイプ対照、抗ＲＳＶ抗体（ＣＮＴＯ３９３０、図７Ａ及び７Ｂのレーン１）による処置は、腎臓での平均細菌負荷が腎臓あたり平均８．２（図７Ａ）または７．０（図７Ｂ）ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇと最も高く、動物８匹の群から採取した各腎臓で可視的な証拠となる病変が最も多かった（１６／１６）。ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（図７Ａ及び７Ｂのレーン２）による処置は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０よりも０．５〜０．７ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、腎膿瘍病変の発生率を８７．５％（１４／１６）まで低下させた。ｍＡｂ要素の重鎖に融合された抗毒素ＦＮ３成分において、Ｖ領域成分のみが異なるがそれ以外は同一であるｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質による処置は、一部の特定の事例でのみｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６よりも有効性の増強をもたらした。具体的には、ブドウ球菌抗原プロテインＡ（図７Ａのレーン３及び４）またはＬＴＡ（図７Ｂのレーン３）を標的とするｍＡｂ−ＦＮ３融合体による処置は、群あたりの腎臓表面病変、及び各投与動物から回収された個々の腎臓あたりの生存細菌負荷により実証される有効性の増強をごくわずかしか示さなかった。対照的に、ＩｓｄＢ（図７Ａのレーン５）、ｍＡｂ  ６５２６の未知の表面抗原（図７Ａのレーン６）、またはグリコシル化形態のＳＤＲファミリー接着因子タンパク質（図７Ａのレーン８、及び図７Ｂのレーン４）のいずれかを標的とするｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質は、他のｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６よりも有意に改善された有効性を示した。なかでも、ＳＤＲファミリーの接着因子タンパク質を標的とする、ｍＡｂ  ５１３３を用いたｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質（ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ；表１の構築物１１）は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０と比較して１．９〜２．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減に減少させ、腎臓病変の発生率を５０％（８／１６）〜６２．５％（６／１６）に低下させ、全体で最も有効であった。
【０１６５】
まとめ。このデータ的裏付けは、ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質のＶ領域標的が、プロテインＡ、リポタイコ酸、鉄硫黄決定因子Ｂ（Ｉｒｏｎ  Ｓｕｌｆｕｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  Ｂ、ＩｓｄＢ）を含む、ｍＡｂ  ＣＲ−６５２６が標的とする、異なる黄色ブドウ球菌表面発現抗原を標的とする他の抗ブドウ球菌ｍＡｂ及びｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質よりも改善された有効性をもたらすことを示している。
【０１６６】
実施例８：マウス腎臓感染モデルにおいて、ｍＡｂ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の有効性は、治療量以下濃度のバンコマイシンの存在下で増強される
抗ブドウ球菌生物学的薬剤の投与から臨床的利益を得ることができる、重篤と診断された黄色ブドウ球菌感染症患者は、抗生物質療法を受ける可能性が高い。したがって、抗ブドウ球菌生物学的薬剤の同時投与が、抗生物質活性を妨害するか、抗生物質の効果に影響を与えないか、または場合によっては増強させるどうかを理解することは注目に値する。これに取り組むにあたり、一般に使用される第一選択薬である抗ＭＲＳＡ抗生物質バンコマイシンを治療用量以下で与えているマウスに一連の生物学的試験品を投与し、マウス腎臓（ｒｅｎａｌ／ｋｉｄｎｅｙ）感染疾患モデルにおける効力を評価した。アイソタイプのＩｇＧ１対照として、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質を標的とする非抗ブドウ球菌性抗体ＣＮＴＯ３９３０（配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）を使用した。
【０１６７】
手順。感染の２４時間前に、５〜６週齢の雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＮＤ４マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）に試験品（群あたり８）を腹腔内経由で投与（ＩＰ注射）した。その後、所定の一定濃度（マウスあたり約１０＾６Ｌｏｇ１０ＣＦＵ）の黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ：Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｍａｊｏｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｓｌａｎｄｓ，”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０（１）：３００−３１０（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、体積１００μＬを２８Ｇ、１／２インチ針を使用して眼窩後に（イソフルラン麻酔下で）注射してマウスを感染させた。この投与濃度は、結果生じる細菌負荷によって定義される、頑強な腎臓感染を一般に生じる最低の細菌接種量に相当する。細菌負荷は、取り出した腎臓のホモジネートから測定したコロニー形成単位（ＣＦＵ）、及び腎臓表面（膿瘍）病変の目視観察と計数の測定によって表す。いずれの場合も、試験品は感染の２４時間前に投与し、感染から９６時間後にマウスを安楽死させ、腎臓を採取した。腎臓は可視病変数により感染の重症度を採点した。次いで、腎臓を取り出し、計量し、均質化し、得られたホモジネートを系列希釈して、細菌増殖培地（トリプシン大豆寒天（ＴＳＡ））上にプレーティングし、ＣＦＵエンドポイントにより個々の腎臓あたりの最終生存細菌負荷を決定した。健康状態を観察するためマウスを毎日モニターした。病変データ及び細菌負荷（ＣＦＵ）データ両方の統計分析を、Ｄｕｎｎの方法を用いてｐ値を計算することによって実施した。評価した試験品は、ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ（表１の構築物２；配列番号６２  ＨＣと配列番号６３  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ（表１の構築物１５；配列番号８４８  ＨＣと配列番号７１  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。試験品はすべて、感染の２４時間前に５００μｇ／動物の用量でＩＰ投与した。投与する際、バンコマイシンは感染から１時間後と３時間後に３．１２５ｍｇｓ／ｋｇをＩＰ投与した。
【０１６８】
結果。図８は、群あたりの総腎臓表面病変、及び各投与動物から回収された個々の腎臓あたりの生存細菌負荷の減少を示す。予測された通り、アイソタイプ対照、抗ＲＳＶ抗体（ＣＮＴＯ３９３０、図８、レーン１）による処置は、腎臓での平均細菌負荷が腎臓あたり平均７．０ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇと最も高く、動物８匹の群から採取した各腎臓で可視的な証拠となる病変が最も多かった（１６／１６）。治療用量以下のバンコマイシン（３．１２５ｍｇｓ／ｋｇ、感染後１時間及び３時間）とＣＮＴＯ３９３０との併用は、病変スコアを７５％（１２／１６）に低下させ、平均細菌負荷を腎臓あたり０．９ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減（図８、レーン２）へと減少させ、有効性の増強をもたらした。ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ（図８、レーン３）による処置は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０と比較して腎臓あたり平均１．３ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、ＣＮＴＯ３９３０と比較して腎臓病変を３７．５％（６／１６）に減少させた。治療用量以下のバンコマイシン（３．１２５ｍｇｓ／ｋｇ、感染後１時間及び３時間）とｍＡｂ５１３  ＰＲＡＳＡとの併用は、病変スコアを１８．７５％（３／１６）に低下させ、平均細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０及びＣＮＴＯ３９３０とバンコマイシンの併用と比較して、腎臓あたりそれぞれ１．８または２．７ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減（図８、レーン４）へと減少させ、有効性の増強をもたらした。ｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＬｕｋＥタンパク質（図８、レーン５）による処置は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０と比較して腎臓あたり平均１．２ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、ＣＮＴＯ３９３０と比較して腎臓病変を５０％（８／１６）に減少させた。治療用量以下のバンコマイシン（３．１２５ｍｇｓ／ｋｇ、感染後１時間及び３時間）とｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＬｕｋＥとの併用は、明らかな腎臓病変がなく（０／１６）、平均細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０及びＣＮＴＯ３９３０とバンコマイシンの併用と比較して、腎臓あたりそれぞれ１．７または２．６ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減（図８、レーン６）へと減少させ、有効性のさらなる増強をもたらした。ｍＡｂ−ＦＮ３融合タンパク質、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＬｕｋＥ−Ｌ４−ＬｕｋＡＢタンパク質（図８、レーン７）による処置は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０と比較して腎臓あたり平均１．６ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、ＣＮＴＯ３９３０と比較して腎臓病変を１２．５％（２／１６）に減少させた。最後に、治療用量以下のバンコマイシン（３．１２５ｍｇｓ／ｋｇ、感染後１時間及び３時間）とｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＬｕｋＥ−Ｌ４−ＬｕｋＡＢとの併用は、明らかな腎臓病変がなく（０／１６）、平均細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０及びＣＮＴＯ３９３０とバンコマイシンの併用と比較して、腎臓あたりそれぞれ１．８または２．７ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減（図８、レーン８）へと減少させ、有効性のさらなる増強をもたらした。
【０１６９】
まとめ。これらのデータは、グリコシル化形態のＳＤＲファミリー接着因子タンパク質を標的とし、ロイコトキシンＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＥＤを中和する生物学的薬剤を、バンコマイシンのような標準治療の抗生物質薬と併用することで、重篤な黄色ブドウ球菌感染症と診断された患者にとって治療的利点の向上をもたらし得ることを示している。
【０１７０】
実施例９：マウス菌血症モデルにおいて、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質はｍＡｂ−５１３３と比較して有効性が向上した
ヒト黄色ブドウ球菌感染症の動物モデルにおける有効性に関して、ｍＡｂ  ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質のＶ領域及び／または抗ロイコトキシンＦＮ３成分の相対的な寄与を理解する上で、菌血症疾患マウスモデルにおける相対的有効性について、一連の試験品を比較した。具体的には、（グリコシル化形態のＳＤＲファミリー接着因子を標的とする）ｍＡｂ  ５１３３由来の同じＶ領域を有するが、それらのＦＮ３ドメイン組成が異なる一連の試験品を「直接比較で」評価した。アイソタイプのＩｇＧ１対照として、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質を標的とする非抗ブドウ球菌性抗体ＣＮＴＯ３９３０（配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）を使用した。
【０１７１】
手順。感染の４時間前に、５〜６週齢の雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＮＤ４マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）に試験品（群あたり４〜８）を１００μＬ／マウスの固定用量体積で眼窩後（ＲＯ）経由にて投与した。その後、一定濃度（マウスあたり１ｘ１０５．４Ｌｏｇ１０ＣＦＵ）の黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ、体積２００μＬを２７Ｇ、１／２インチ針を使用して腹腔内（ＩＰ）経由で注射してマウスを感染させた。２時間後、マウスをＣＯ２窒息により安楽死させ、即座に心臓穿刺によりリチウムヘパリン管へ採血し、未希釈血液とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の系列希釈液を即座にトリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）プレート上にプレーティングした。次いで２〜５ｍＬの滅菌生理食塩水を腹腔内（ＩＰ）経路で注入し、マウスを数回反転させて静かに混合し、腹膜を開き、１ｃｃシリンジを用いて体液を吸引することにより腹膜液を採取した。腹膜液を採取した後、脾臓を回収し、秤量してホモジナイズした。脾臓ホモジネート及び腹膜液を滅菌生理食塩水で系列希釈し、細菌増殖培地（ＴＳＡ）上にプレーティングし、腹膜液と脾臓両方の最終生存細菌負荷を決定した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０を使用して、対応のないｔ検定により実施した。評価した試験品は、ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物４；配列番号６６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢ（表１の構築物１２；配列番号  ９５２  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢ−ＦＬＡＧ（表１の構築物１３；配列番号９６５  ＨＣと配列番号６３  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ−ＦＬＡＧ（表１の構築物１４；配列番号９７０  ＨＣと配列番号６３  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。試験品はすべて、５００μｇ／動物の用量でＲＯ投与した。
【０１７２】
結果。図９は、個々の動物あたりの血液及び脾臓における生存細菌負荷の減少を示す。予測された通り、アイソタイプ対照、抗ＲＳＶ抗体（ＣＮＴＯ３９３０、図９、レーン１）による処置は、血液（図９、上部パネル）と脾臓（図９、下部パネル）の両方で平均細菌負荷が最も高かった。ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（図９、レーン２）による処置は、血液と脾臓の両方で細菌負荷を減少させたが、血液及び脾臓それぞれの算出ｐ値は０．２３及び０．０８であり、その減少はＣＮＴＯ３９３０による処置に対して有意ではなかった。対照的に、ＬｕｋＥ及びＬｕｋＡＢを標的とするｍＡｂ  ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質すべて（図９、レーン３、４、５、及び６）による処置は、ＣＮＴＯ３９３０と比較して血液（上部パネル）と脾臓（下部パネル）の両方で細菌負荷を減少させ、算出ｐ値は０．００６〜０．０００１の範囲であった。
【０１７３】
まとめ。これらのデータは、グリコシル化形態のＳＤＲファミリー接着因子タンパク質を標的とし、ロイコトキシンＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＥＤを中和するｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、黄色ブドウ球菌媒介性菌血症の治療において治療的有用性を有し得ることを示している。
【０１７４】
実施例１０：ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質は複合部分の合計と比較して有効性が向上した
ヒト黄色ブドウ球菌感染症の動物モデルにおける有効性に関して、ｍＡｂ  ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質のＶ領域及び／または抗毒素ＦＮ３成分の相対的な寄与を理解する上で、マウス腎臓（ｒｅｎａｌ／ｋｉｄｎｅｙ）感染疾患モデルにおける相対的有効性について、一連の試験品を比較した。具体的には、（グリコシル化形態のＳＤＲファミリー接着因子を標的とする）ｍＡｂ  ５１３３由来の同じＶ領域を有するが、それらのＦＮ３ドメイン組成が異なる一連の試験品を「直接比較で」評価した。アイソタイプのＩｇＧ１対照として、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質を標的とする非抗ブドウ球菌性抗体ＣＮＴＯ３９３０（配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）を使用した。
【０１７５】
手順。感染の２４時間前に、５〜６週齢の雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＮＤ４マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）に試験品（群あたり８）を２００μＬ／マウスの固定用量体積で腹腔内（ＩＰ）注射により投与した。その後、所定の一定濃度（マウスあたり約６．８ｘ１０＾６Ｌｏｇ１０ＣＦＵ）の黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ：Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｍａｊｏｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｓｌａｎｄｓ，”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０（１）：３００−３１０（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、体積１００μＬを２８Ｇ、１／２インチ針を使用して眼窩後に（イソフルラン麻酔下で）注射してマウスを感染させた。この感染用量は、結果生じる細菌負荷によって定義される、頑強な腎臓感染を一般に生じる最低の細菌接種量に相当する。いずれの場合も、試験品は感染の２４時間前に投与し、感染から９６時間後にマウスを安楽死させ、腎臓を採取した。健康状態を観察するためマウスを毎日モニターした。解剖顕微鏡を用いた可視病変（膿瘍）数により腎臓の感染重症度を採点した後、取り出し、計量し、均質化し、得られたホモジネートを系列希釈して、細菌増殖培地（トリプシン大豆寒天（ＴＳＡ））上にプレーティングし、ＣＦＵエンドポイントにより個々の腎臓あたりの最終生存細菌負荷を決定した。腎臓膿瘍の重症度スコアを、１〜２の可視病変＝重症度スコア１、３〜９の可視病変＝重症度スコア２、及び１０以上の可視病変＝重症度スコア３として記録した。健康状態を観察するためマウスを毎日モニターした。病変データ及び細菌負荷（ＣＦＵ）データ両方の統計分析を、Ｄｕｎｎの方法を用いてｐ値を計算することによって実施した。評価した試験品は、ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物４；配列番号６６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物６；配列番号７０  ＨＣと配列番号７１  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ（表１の構築物１５；配列番号８４８  ＨＣと配列番号７１  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。試験品はすべて、単独でまたは組み合わせて、感染の２４時間前に２５０μｇ／動物の用量でＩＰ投与した。
【０１７６】
結果。図１０は、腎臓の重症度スコア、群あたりの総可視腎臓表面病変、及び各投与動物から回収された個々の腎臓あたりの生存細菌負荷の減少を示す。予測された通り、アイソタイプ対照、抗ＲＳＶ抗体（ＣＮＴＯ３９３０、図１０、レーン１）による処置は、腎臓での平均細菌負荷が腎臓あたり平均６．９ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇと最も高く、動物８匹の群から採取した各腎臓で可視的な証拠となる病変が最も多かった（１６／１６）。ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（図１０、レーン２）による処置は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０と比較して０．２ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、腎臓病変の発生率を８７．５％（１４／１６）まで低下させた。ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＡＢ（図１０、レーン３）による処置は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０と比較して０．２ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、腎臓病変の発生率を６２．５％（１０／１６）までさらに低下させた。ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ（図１０、レーン４）による処置は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０と比較して１．３ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、腎臓病変の発生率を５６．２５％（９／１６）までさらに低下させた。各２５０μｇ／動物（動物あたり合計５００μｇ）用量でのｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＡＢとｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅの併用（図１０、レーン５）は、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０と比較して１．７ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、腎臓病変の発生率を５０％（８／１６）までさらに低下させた。しかしながら、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（レーン６）による処置は、用量２５０μｇ／動物で、腎臓での細菌負荷をＣＮＴＯ３９３０と比較して２．６ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少させ、腎臓病変の発生率を３７．５％（６／１６）まで低下させ、最大の有効性をもたらした。
【０１７７】
まとめ。これらのデータは、この腎臓感染マウスモデルにおいて、ロイコトキシンＥＤとＡＢの両方を標的とするＦＮ３ドメインのタンデム付加物を有するｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、ロイコトキシンＥＤ及びＡＢを個々に標的とするｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質よりも増強された有効性を与えることを示している。さらに、２５０μｇ／動物で投与されたｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢの有効性は、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅと組み合わせて投与されたｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＡＢ（それぞれ２５０μｇ／動物で投与）の有効性よりも増強されており、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢの有効性が複合体部分（ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ＡＢ及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ）の合計よりも向上するという見解を裏付けている。
【０１７８】
実施例１１：マウス皮膚感染モデルにおいて、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質はｍＡｂ５１３３と比較して有効性が向上した
ヒト黄色ブドウ球菌感染症の動物モデルにおける有効性に関して、ｍＡｂ  ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質のＶ領域及び／または抗毒素ＦＮ３成分の相対的な寄与を理解する上で、皮膚感染マウスモデルにおける相対的有効性について、一連の試験品を比較した。具体的には、（グリコシル化形態のＳＤＲファミリー接着因子を標的とする）ｍＡｂ  ５１３３由来の同じＶ領域を有するが、それらのＦＮ３ドメイン組成が異なる一連の試験品を「直接比較で」評価した。アイソタイプのＩｇＧ１対照として、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質を標的とする非抗ブドウ球菌性抗体ＣＮＴＯ３９３０（配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）を使用した。
【０１７９】
手順。この試験では、非近交系の無毛免疫適格系統であるＳＫＨ−１  Ｅｌｉｔｅマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用した。感染の４時間前または４時間後に、８〜１０週齢の雌マウスに試験品（群あたり８）を２００μＬ／マウスの固定用量体積で腹腔内（ＩＰ）注射により投与した。その後、イソフルラン麻酔下で、所定の一定濃度（マウスあたり約６．６ｘ１０６Ｌｏｇ１０ＣＦＵ）の黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ株ＪＥ２（Ｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，”ｍＢｉｏ  ４（１）：ｅ００５３７−１２（２０１３）、その全体が参照により本明細書で組み込まれる）を体積２００μＬの０．１％デキストリンマイクロキャリアビーズ（Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（登録商標）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）懸濁液として２７Ｇ、１／２インチ針を使用して皮下（ＳＣ）注射してマウスを感染させた。感染３日後に、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。皮膚病変を電子デジタルノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｒｏｒａ，ＩＬ）により（長さ及び幅を）測定し、付随する皮膚を無菌的に回収して、滅菌生理食塩水で系列希釈し、ＴＳＡプレート上にプレーティングして細菌負荷を測定した。病変体積スコアを次の式から導出した：ＬＶ＝（π／６）（ＬｘＷ２）。ここで、ＬＶ＝病変体積、Ｌ＝病変のｍｍ長さ、及びＷ＝病変のｍｍ幅である（Ｂｕｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６０：２６３６−２６４０（１９９２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０を使用して、対応のないｔ検定により実施した。評価した試験品は、ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物４；配列番号６６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢ（表１の構築物１２；配列番号９５２  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。試験品はすべて、５００μｇ／動物の用量でＩＰ投与した。
【０１８０】
結果。図１１は、感染の４時間前または４時間後に投与したときの皮膚病変の体積（図１１Ａ）または皮膚病変の細菌負荷（図１１Ｂ）によって評価された、このヒト黄色ブドウ球菌皮膚感染マウスモデルにおける評価試験品の有効性を示す。予測された通り、アイソタイプ対照、抗ＲＳＶ抗体（ＣＮＴＯ３９３０、レーン１）による処置は、平均皮膚病変体積（図１１Ａ）が最も高く、皮膚病変の細菌負荷（図１１Ｂ）は皮膚あたり６．０〜６．２ｘｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇに相当し、最も高かった。ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（レーン２）による処置は、ＣＮＴＯ３９３０と比較した平均皮膚病変体積が算出ｐ値０．００４〜０．００５（図１１Ａ、レーン３及び４）と有意に減少したが、皮膚病変の細菌負荷（図１１Ｂ、レーン３及び４）は、感染前及び感染後に投与した場合それぞれ０．８及び０．１ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ減へと減少したものの、その観察された有効性は、ＣＮＴＯ３９３０で観察された有効性と比較して統計的有意性は見られなかった（ｐ値０．２６及び０．９６）。対照的に、ｍＡｂ５１３３を用いたＦＮ３融合タンパク質両方による処置は、感染４時間前または４時間後いずれの投与の場合にも、皮膚病変体積（図１１Ａ）と皮膚病変の細菌負荷（図１１Ｂ）の両方をＣＮＴＯ３９３０と比較して統計的有意に減少させ、算出ｐ値は０．００３〜０．０００１の範囲であった。
【０１８１】
まとめ。これらのデータは、グリコシル化形態のＳＤＲファミリー接着因子タンパク質を標的とし、曝露を受けた皮膚組織においてロイコトキシンＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＥＤを中和するｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、黄色ブドウ球菌媒介性皮膚感染症の治療において治療的有用性を示すことを表している。
【０１８２】
実施例１２：ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質は、初代ヒト好中球のブドウ球菌媒介性細胞外殺傷からの保護を向上させる
ロイコトキシンは、好中球を含む主要なクラスのヒト免疫細胞を、免疫細胞表面の特異的受容体との結合により誘導される過程を経て細胞外部から殺傷することも、ファゴリソソームからのロイコトキシン媒介性回避により細胞内部から殺傷することもできる（Ａｌｏｎｚｏ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，“Ｔｈｅ  Ｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．７８（２）：１９９−２３０（２０１４），その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の試験では、ロイコトキシンＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＡＢに結合してそれを中和するｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、黄色ブドウ球菌ＵＳＡ  ３００  ＣＡ−ＭＲＳＡ株ＢＫ１８８０７によって媒介される細胞外殺傷から初代ヒト好中球を保護する能力を例示する（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｃｌｏｎａｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１３２７−１３３２（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。アイソタイプのＩｇＧ１対照として、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質を標的とする非抗ブドウ球菌性抗体ＣＮＴＯ３９３０（配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）を使用した。
【０１８３】
手順。黄色ブドウ球菌ＢＫ１８８０７をＲＰＭＩ＋ＣＡＳ培地で一晩増殖させ、次いでＲＰＭＩ＋ＣＡＳ中、１：１００で継代培養し、さらに５時間増殖させた。その後、培養物をＲＰＭＩ＋ＣＡＳで１ｘ１０９ＣＦＵ／ｍＬに標準化した。次いで細菌懸濁液（８５μＬ）（約８．５ｘ１０７ＣＦＵ）を原液濃度２．５ｍｇ／ｍＬの各試験品（それぞれ４５０μｇ）１８０μＬと混合し、４５５μＬのＲＰＭＩ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加して、最終体積７２０μＬを得た。９６ウェルプレートを２０％ヒト血清で３７℃、５％ＣＯ２で２０分間コーティングし、次いで１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ＨＳＡを加えたＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ−ＨＨ）で２回洗浄した。次いで、新たに精製したヒト初代多形核白血球（ＰＭＮ）８０μｌを、ウェルあたり約２５０，０００細胞になるように各試験ウェルに添加し、プレートを室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。次いで、細菌のオプソニン化懸濁液２０μｌを、各ＰＭＮを含有するウェルに添加して、感染多重度（ＭＯＩ）を約１０にし、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で１２０分間インキュベートした。次いで、プレートを１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出による細胞溶解を評価するために、各試験ウェルから上清２５μＬを新しい黒色透明底９６ウェルプレートに移した。ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）２５μＬを添加し、プレートを暗所で１５分間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬により、レサズリンが変化して蛍光レゾルフィン生成物となる結合酵素アッセイによって、細胞膜破壊による細胞からのＬＤＨの放出を分光計でのプレート読み取りによって検出して測定する。これらの実験は、６人の独立したドナーからの精製されたヒト初代多形核白血球（ＰＭＮ）を用いて実施した。評価した試験品は、ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物４；配列番号６６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ−ＦＬＡＧ（表１の構築物２４；配列番号９１８  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｃ−Ｍｙｃ−ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物２５；配列番号９１９  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、及びｃ−Ｍｙｃ−ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ−ＦＬＡＧ（表１の構築物２６；配列番号９２０  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。
【０１８４】
結果。図１２は、黄色ブドウ球菌ＢＫ１８８０７との試験品のプレインキュベーションが、ＬＤＨの放出によって測定される細胞溶解からの初代ヒト好中球の保護に及ぼす相対的な影響を示す。予測された通り、ＣＮＴＯ３９３０（レーン１）は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質に特異的なＶ領域を有するが、細胞溶解性ロイコトキシンに結合して中和することができる付加ＦＮ３ドメインを持たないため保護効果が最も低かった。同様に、ｍＡｂ  ５１３３（レーン２）は最小限のＰＭＮ保護をもたらしたが、これは、このアッセイにおいてグリコシル化形態のＳＤＲタンパク質のＶ領域表面結合に有意な保護効果がないことを示す。対照的に、ＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＡＢに結合して中和するＦＮ３ドメインを有するｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質は、試験した４つすべてが最大のＰＭＮ保護（レーン３〜６）を示している。
【０１８５】
まとめ。これらのデータは、ロイコトキシンＬｕｋＡＢとＬｕｋＥＤに結合して、その細胞溶解活性を中和するｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、ロイコトキシン媒介性の殺傷からヒト初代好中球を保護することができることを示している。ＬｕｋＥＤ及び／またはＬｕｋＡＢを標的とするｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質のこの活性は、黄色ブドウ球菌媒介性ヒト感染症に関して治療的に有用であり得る。
【０１８６】
実施例１３：ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質は、初代ヒト好中球のブドウ球菌媒介性細胞内殺傷からの保護を向上させる
ロイコトキシンは、好中球を含む主要なクラスのヒト免疫細胞を、免疫細胞表面の特異的受容体との結合により誘導される過程を経て細胞外部から殺傷することも、ファゴリソソームからのロイコトキシン媒介性回避により細胞内部から殺傷することもできる（Ａｌｏｎｚｏ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，“Ｔｈｅ  Ｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．７８（２）：１９９−２３０（２０１４），その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の試験では、ロイコトキシンＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＡＢに結合してそれを中和するｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、黄色ブドウ球菌ＵＳＡ  ３００  ＭＲＳＡ株ＬＡＣによって媒介される細胞内殺傷から初代ヒト好中球を保護する能力を例示する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．，“Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＭＲＳＡ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｃｏｎｖｅｒｇｅ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．  Ｊ．Ｍｅｄ．３５２：１４８５−１４８７（２００５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。アイソタイプのＩｇＧ１対照として、呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質を標的とする非抗ブドウ球菌性抗体ＣＮＴＯ３９３０（配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）を使用した。
【０１８７】
手順。黄色ブドウ球菌ＬＡＣ及びｌｕｋＡＢ遺伝子を欠失した変種（ＬＡＣΔＬｕｋＡＢ）をＲＰＭＩ＋ＣＡＳ培地で一晩増殖させ、次いでＲＰＭＩ＋ＣＡＳ中、１：１００で継代培養し、さらに５時間増殖させた。その後、培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１ｘ１０９ＣＦＵ／ｍＬに標準化し、さらに目標感染多重度（ＭＯＩ）に合わせてＰＢＳで希釈した。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２中、２０％ヒト血清でコーティングし、次いでＲＰＭＩ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳで２回洗浄した。新たに精製したヒト初代多形核白血球（ＰＭＮ）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ＨＳＡを加えたＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ−ＨＨ）で再懸濁し、ウェルあたり約２５０，０００になるように各試験ウェルに添加した。プレートを室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。ロイコトキシンを含有する上清を、一晩培養物の１：１００希釈後、ＲＰＭＩ＋ＣＡＳ中、３７℃で５時間増殖させた黄色ブドウ球菌ＬＡＣ  ＷＴ及びΔｌｕｋＡＢの培養物からの培養上清の濾液として調製した。目標ＭＯＩ＝１．０（２３．６μＬ中、５ｘ１０６ＣＦＵ／ｍＬ）の細菌、４７．２５μＬの濾過済み黄色ブドウ球菌ＬＡＣ培養上清（ロイコトキシンの外来性起源として）、試験品の２．５ｍｇ／ｍＬ原液９４５μＬ＋３７０９．１５ｍＬのＲＰＭＩ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを混合し、最終体積４７２５μＬを得て、黄色ブドウ球菌ＬＡＣのオプソニン化を開始した。ウェルごとに、５０μＬのオプソニン化した細菌混合物を５０μＬの新鮮なＰＭＮ懸濁液と混合し、１，５００ｒｐｍで７分間プレートを遠心分離することにより同調させた。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを１，４００ｒｐｍで７分間遠心した。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出による細胞溶解を評価するために、各試験ウェルから上清２５μＬを新しい黒色透明底９６ウェルプレートに移した。ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）２５μＬを添加し、プレートを暗所で１５分間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬により、レサズリンが変化して蛍光レゾルフィン生成物となる結合酵素アッセイによって、細胞膜破壊によるＬＤＨの放出を分光計でのプレート読み取りによって検出して測定する。これらの実験は、６人の独立したドナーからの精製されたヒト初代多形核白血球（ＰＭＮ）を用いて実施した。評価した試験品は、ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物４；配列番号６６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。
【０１８８】
結果。図１３は、ＬＤＨの放出によって測定された、黄色ブドウ球菌ＬＡＣ及びＬＡＣΔＬｕｋＡＢ株によって媒介される細胞溶解からの初代ヒト好中球の保護に試験品が及ぼす相対的活性を示す。予測された通り、ＣＮＴＯ３９３０（レーン２）は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質に特異的なＶ領域を有するが、細胞溶解性ロイコトキシンに結合して中和することができる付加ＦＮ３ドメインを持たないため、緩衝液のみの対照（レーン１）と比較した黄色ブドウ球菌ＬＡＣ媒介性の殺傷からの保護効果が最も低かった。しかしながら、本アッセイで、ＬｕｋＡＢロイコトキシンの遺伝的不活性化によりＰＭＮの殺傷が排除されたことは注目に値する（レーン１〜４）。同様に、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（レーン３）は多少保護したが、これは、この細胞内殺傷アッセイにおいてグリコシル化形態のＳＤＲタンパク質のＶ領域表面結合が保護機構ではないことを示す。対照的に、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（レーン４）は、黄色ブドウ球菌ＬＡＣΔＬｕｋＡＢ株で見られたものと同等の全体的な減少を示し、黄色ブドウ球菌ＬＡＣ媒介性殺傷からの完全な保護をもたらした。
【０１８９】
まとめ。これらのデータは、ロイコトキシンＬｕｋＡＢに結合して、その細胞溶解活性を中和するｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、細胞内環境への取り込み後のロイコトキシン媒介性殺傷からヒト初代好中球を保護することができることを示している。ＬｕｋＡＢを標的とするｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質のこの活性は、黄色ブドウ球菌媒介性のヒト感染症に関して治療的に有用であり得る。
【０１９０】
実施例１４：ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質は、初代ヒト好中球による黄色ブドウ球菌のオプソニン化貪食作用殺傷を向上させる
好中球を含む主要なクラスのヒト免疫細胞は、オプソニン化貪食作用を介して黄色ブドウ球菌を殺傷するが、この過程で、細菌はファゴリソソーム体に取り込まれ、溶解酵素及び消化酵素の作用を介して殺傷される。この作用を妨害するために、黄色ブドウ球菌は、酸性ｐＨ及びファゴリソソーム環境の内容を感知し、ロイコトキシンＡＢを含む主要な病原性決定因子の発現を上方調節して、ＬｕｋＡＢを媒介してファゴリソソームから回避した後、内部から食細胞を殺傷する（Ａｌｏｎｚｏ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，“Ｔｈｅ  Ｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．７８（２）：１９９−２３０（２０１４），その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の試験では、ロイコトキシンＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＡＢに結合してそれを中和するｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、初代ヒト好中球によるオプソニン化貪食作用殺傷を増強する能力を例示する。陰性対照として、ＲＳＶ  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ｗｔＴＥＮＣＯＮ融合タンパク質（表１の構築物２７；配列番号９７７  ＨＣと配列番号８４３  ＬＣ）を使用した。この構築物は、そのＶ領域を介して呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質を標的とし、ロイコトキシンの結合活性または中和活性を示さない親（野生型コンセンサス）ＦＮ３ドメインを有する。
【０１９１】
手順。この試験では、ＵＳＡ３００系統の種々のＭＲＳＡ（ＬＡＣ、ＦＰＲ、１８８０７、１８８０８、及び１８８０９）、ＵＳＡ５００系統株（ＢＫ２３９５）、及びＭＳＳＡ株（ＢＫ４６４５ｂ）を使用した。黄色ブドウ球菌株をＲＰＭＩ＋ＣＡＳ培地で一晩増殖させ、次いでＲＰＭＩ＋ＣＡＳ中、１：１００で継代培養し、さらに５時間増殖させた。その後、培養物をＲＰＭＩ＋ＣＡＳで１ｘ１０９ＣＦＵ／ｍＬに標準化した。ロイコトキシンを含有する上清を、一晩培養物の１：１００希釈後、ＲＰＭＩ＋ＣＡＳ中、３７℃で５時間増殖させた黄色ブドウ球菌の培養物からの培養上清の濾液として調製した。オプソニン化を生じさせるために、目的のＭＯＩの達成に必要な所定のアリコートの細菌を、培養上清（１１μＬ）の添加あり、またはなしで試験品と混合し、ＲＰＭＩ−ＨＥＰＥＳを添加して、体積を４４０μＬにした（各試験品の最終濃度１．２５ｍｇ／ｍＬ）。９６ウェルプレートを２０％ヒト血清で５％ＣＯ２中、３７℃でコーティングし、次いで１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ＨＳＡを加えたＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ−ＨＨ）で２回洗浄した。精製したヒト初代多形核白血球（ＰＭＮ）を新たに調製し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ＨＳＡを加えたＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ−ＨＨ）で再懸濁し、ウェルあたり約２５０，０００になるように各試験ウェルに添加した。プレートを室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。２０μＬのオプソニン化した黄色ブドウ球菌混合物をウェルごとに添加し、１５００ｒｐｍで７分間プレートを遠心分離することにより同調させた。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、１１μＬの１％サポニンを各ウェルに添加し、プレートを氷上で２０分間インキュベートした。その後、各ウェルからのアリコートをリン酸緩衝生理食塩水で系列希釈し、アリコートをＴＳＡプレート上にプレーティングし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の測定により残存する生存黄色ブドウ球菌細胞を決定した。これらの実験は、６人の独立したドナーからの精製されたヒト初代多形核白血球（ＰＭＮ）を用いて実施した。評価した試験品は、ＲＳＶ  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ｗｔＴＥＮＣＯＮ（表１の構築物２７；配列番号９７７  ＨＣと配列番号８４３  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物４；配列番号６６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ（表１の構築物１５；配列番号８４８  ＨＣと配列番号７１  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物２８；配列番号８５８  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。
【０１９２】
結果。図１４Ａ〜１４Ｄは、さまざまな試験品が、初代ヒト好中球による多数の異なる黄色ブドウ球菌株のオプソニン化貪食作用殺傷の増強に及ぼす相対的活性を示す。図１４Ａに、ＭＯＩが１、＋／−０．５％ＬＡＣ培養上清（外来性起源の分泌ロイコトキシンとして）のＭＲＳＡ  ＬＡＣ株を用いて実施したオプソニン化貪食作用殺傷（ＯＰＫ）アッセイでのデータを示す。予測された通り、ＲＳＶ  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−ｗｔＴＥＮＣＯＮ（図１４Ａのレーン１及び６）は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質に特異的なＶ領域を有するが、細胞溶解性ロイコトキシンに結合して中和することができる付加ＦＮ３ドメインを持たないため、ＣＡ−ＭＲＳＡ  ＬＡＣ株のオプソニン化貪食作用殺傷からの保護効果が最も低かった。対照的に、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（図１４Ａのレーン２）は培養上清を添加しない場合、顕著にＯＰＫが増強したが、これは、グリコシル化形態のＳＤＲタンパク質のＶ領域表面結合に保護効果があることを示す。しかしながら、培養上清の存在下でアッセイを実施した場合、この保護効果は喪失する（図１４Ａのレーン７）。対照的に、ＬｕｋＡＢ及び／またはＬｕｋＥＤに結合して、その細胞溶解活性を中和する一連のｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質は、培養上清の存在下または不在下でオプソニン化貪食作用殺傷の増強を示し（図１４Ａのレーン３〜５及び８〜１０）、このうちＬｕｋＡＢとＬｕｋＥＤの両方に結合して、その細胞溶解活性を中和するｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質で観察された保護効果が全体で最も高かった。追加のＵＳＡ３００系統ＭＲＳＡ株ＦＰＲ、１８８０７、１８８０８、及び１８８０９（図１４Ｂ）、ＭＳＳＡ株ＢＫ４６４５ｂ（図１４Ｃ）、ならびにＵＳＡ５００系統ＭＲＳＡ株ＢＫ２３９５（図１４Ｄ）を含む、様々な黄色ブドウ球菌株を用いたＯＰＫアッセイでも、同様の観察が認められる。
【０１９３】
まとめ。これらのデータは、ロイコトキシンＬｕｋＥＤとＬｕｋＡＢの両方に結合して、その細胞溶解活性を中和するｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、ヒト好中球が媒介するオプソニン化貪食作用殺傷を最も増強させることを示している。ロイコトキシンＬｕｋＥＤとＬｕｋＡＢの両方を標的とするｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質のこの活性は、黄色ブドウ球菌媒介性のヒト感染症に関して治療的に有用であり得る。
【０１９４】
実施例１５：黄色ブドウ球菌プロテインＡを標的とするモノクローナル抗体の同定及び特性決定
黄色ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）は、細胞表面で発現して組み立てられるか、または細菌によって分泌される重要な免疫回避因子である。プロテインＡは、免疫グロブリンのＦｃ（結晶性断片）ドメイン、ならびにＶＨ３クラスＩｇＧ及びＩｇＭの断片抗原結合（Ｆａｂ）ドメインと結合する（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ  Ａ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＶＩ．Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇ  γ１−ａｎｄ  γ２−ｇｌｏｂｕｌｉｎ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００：９２７−３０（１９６８）；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  Ｇ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｏｏｄｙｅａｒ，Ｃ．  Ｓ．，“Ｃｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ  Ｂ−ｃｅｌｌ  Ｄｅｆｅｎｃｅｓ：Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ”，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４６５−７５（２００６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。このプロテインＡのＦｃ結合活性によって、黄色ブドウ球菌はオプソニン化貪食作用殺傷を回避できるが、ＶＨ３型のＩｇＭ  Ｂ細胞受容体の架橋は適応免疫応答の発生を妨害する（Ｆａｌｕｇｉ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｏｓｔ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ”，ｍＢｉｏ  ４：ｅ００５７５−６１３（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。他の細胞表面局在化黄色ブドウ球菌抗原を標的とする抗体によって媒介されるオプソニン化貪食作用殺傷の制限に、プロテインＡによるＦｃ媒介性結合が及ぼす相対的な寄与（複数可）を考察するにあたり、Ｆａｂドメインを介してプロテインＡと特異的に結合する一連のモノクローナル抗体を同定し、その後、Ｆｃ相互作用が媒介するプロテインＡ結合を除去するように遺伝子操作した。
【０１９５】
手順。組換えプロテインＡ（ＰｒｏＳｐｅｃ−ＴａｎｙＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ  Ｌｔｄ．）に対して高い親和性を有するＦａｂドメインをファージディスプレイによって同定し、ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂに変換した。スクリーニングプロセスでＶＨ３クラスＦａｂを選択的な制限消化により除外した。さらなる特性決定のために３つのプロテインＡ特異的ｍＡｂ、ＰｒｏＡ３（配列番号１００１  ＨＣと配列番号８４１  ＬＣ）、ＳＭ１Ｆ５（配列番号１００７  ＨＣと配列番号１０１６  ＬＣ）、及びＳＭ１Ｆ９（配列番号１０１２  ＨＣと配列番号８４２  ＬＣ）を選択し、続いて、ＰＲＡＳＡヒンジ領域変異（表１を参照）の導入によりＧｌｕＶ８プロテアーゼ耐性を示すように、及び／またはＡ６変異（表１を参照）の導入によりＦｃ領域を介してプロテインＡと結合するように遺伝子操作した。プロテインＡ結合の特性をＥＬＩＳＡにより決定した。簡潔には、プレートをストレプトアビジン（ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬ、ウェルあたり５０μＬ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した後、ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬ（ウェルあたり５０μＬ）のビオチン化プロテインＡで室温にて１時間コーティングした。さらにプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、３％ＢＳＡ、ウェルあたり２００μＬ）でブロックした。次いで、開始濃度１０μｇ／ｍＬの試験品を３倍希釈系列で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いでプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、ウェルあたり５０ｍＬのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトカッパ軽鎖（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＰ５０２Ｐ）をＰＢＳ中の３％ＢＳＡに１：１５，０００希釈で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いでプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で５回洗浄し、発色基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を使用して、結合したＨＲＰを検出した。評価した試験品は、ＰｒｏＡ３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物２９）、ＰｒｏＡ３  ＩｇＧ１（表１の構築物３０）、ＰｒｏＡ３  ＰＲＡＳＡ（表１の構築物３１）、抗ＬＴＡ（パギバキシマブ）ＩｇＧ１（表１の構築物３２）、及び抗ＬＴＡ（パギバキシマブ）ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物３３）であった。
【０１９６】
結果。いずれもＦａｂドメインを介してリポタイコ酸を標的とする、ＩｇＧ１野生型パギバキシマブ及び組換え型ＰＲＡＳＡ  Ａ６変種のＥＬＩＳＡ結合曲線を比較することにより、モノクローナル抗体がＦｃ相互作用を介してのみプロテインＡに結合することを図１５に例示する。予測された通り、ＰＲＡＳＡ  Ａ６変種の場合、プロテインＡへの検出可能な結合は観察されていない。例として、ＰｒｏＡ３関連の一連の試験品の試験では、Ｆａｂドメインを介したプロテインＡを標的とするモノクローナル抗体の結合が増強されることを図１５に例示している。これらの分子では、ＩｇＧ１及びＰＲＡＳＡ変種で同等の結合が観察されているが、ＰＲＡＳＡ  Ａ６変種で観察されたプレート固定化プロテインＡへの結合の方が明らかに強固である。
【０１９７】
まとめ。抗プロテインＡ抗体ＰｒｏＡ３のＰＲＡＳＡ  Ａ６変種が、プレート固定化プロテインＡに対して明らかに高い結合親和性を示す根拠となる理由は不明であるが、これらのデータは、通常のＦｃ媒介性相互作用とは異なり、Ｆａｂ領域を介して黄色ブドウ球菌プロテインＡに結合可能なＩｇＧ抗体の同定を例示するものである。
【０１９８】
実施例１６：ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質は、初代ヒト好中球のＬｕｋＡＢ依存細胞外殺傷からの保護を向上させる
ロイコトキシンは、好中球を含む主要なクラスのヒト免疫細胞を、免疫細胞表面の特異的受容体との結合により誘導される過程を経て細胞外部から殺傷することも、ファゴリソソームからのロイコトキシン媒介性回避により細胞内部から殺傷することもできる（Ａｌｏｎｚｏ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，“Ｔｈｅ  ｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７８（２）：１９９−２３０（２０１４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の試験では、ロイコトキシンＬｕｋＥＤ及びＬｕｋＡＢに結合してそれを中和するｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、多数の黄色ブドウ球菌株によって媒介される細胞外殺傷から初代ヒト好中球を保護する能力、及びこの現象がＬｕｋＡＢの発現に依存することを例示する。この試験では、ＬｕｋＡＢを産生するか、またはＬｕｋＡＢオペロンを遺伝子操作により欠失しているためＬｕｋＡＢを産生できない、本来は同種同系である株の対を使用した。具体的には、（ｉ）黄色ブドウ球菌株Ｎｅｗｍａｎ（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ：  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｍａｊｏｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｓｌａｎｄｓ，”Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０（１）：３００−３１０（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）（「Ｎｅｗｍａｎ−ＷＴ」と表記）、及びそのｌｕｋＡＢ欠失誘導体（「Ｎｅｗｍａｎ−ΔＡＢ」）、  （ｉｉ）黄色ブドウ球菌ＵＳＡ  ３００  ＭＲＳＡ株ＬＡＣ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．，“Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＭＲＳＡ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｃｏｎｖｅｒｇｅ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２：１４８５−１４８７（２００５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）（「ＬＡＣ−ＷＴ」と表記）、及びそのｌｕｋＡＢ欠失誘導体（「ＬＡＣ−ΔＡＢ」）、（ｉｉｉ）菌血症患者から２００５年に単離された、黄色ブドウ球菌ＵＳＡ  ３００  ＭＲＳＡ株ＢＫ１８８０７（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｃｌｏｎａｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１３２７−１３３２（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）（「１８８０７−ＷＴ」と表記）、及びそのｌｕｋＡＢ欠失誘導体（「１８８０７−ΔＡＢ」）、（ｉｖ）心内膜炎患者から２００５年に単離された、黄色ブドウ球菌ＵＳＡ  ３００  ＭＲＳＡ株ＢＫ１８８０８（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉ��ｔｅｄ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｃｌｏｎａｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１３２７−１３３２（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）（「１８８０８−ＷＴ」と表記）、及びそのｌｕｋＡＢ欠失誘導体（「１８８０８−ΔＡＢ」）、ならびに（ｖ）菌血症患者から２００５年に単離された、黄色ブドウ球菌ＵＳＡ  ３００  ＭＲＳＡ株ＢＫ１８８０９（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｃｌｏｎａｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１３２７−１３３２（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）（「１８８０９−ＷＴ」と表記）、及びそのｌｕｋＡＢ欠失誘導体（「１８８０９−ΔＡＢ」）であった。
【０１９９】
手順。黄色ブドウ球菌株をＲＰＭＩ＋ＣＡＳ培地で一晩増殖させ、次いでＲＰＭＩ＋ＣＡＳ中、１：１００で継代培養し、さらに５時間増殖させた。その後、培養物をＰＢＳで１ｘ１０９ＣＦＵ／ｍＬに標準化した。９６ウェルプレートを２０％ヒト血清で５％ＣＯ２中、３７℃で２０分間コーティングし、次いで１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを加えたＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ−Ｈ）で２回洗浄した。次いで、精製したヒト初代多形核白血球（ＰＭＮ）７５μＬを新たに調製し、ウェルあたり約２００，０００細胞になるように各試験ウェルに添加し、プレートを室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。１０μＬの試験品（１．２５ｍｇ／ｍＬ）を該当するウェルに添加し、最終濃度を１２５μｇ／ｍＬにした。次いで、事前に希釈した細菌をウェルあたり２０μＬ添加し、約２５の感染多重度（ＭＯＩ）を得た。５％ＣＯ２中、３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを４℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出により細胞溶解の評価を決定したそのために、各試験ウェルから上清２５μＬを新しい黒色透明底９６ウェルプレートに移し、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）２５μＬを添加し、プレートを暗所で１５分間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬により、レサズリンが変化して蛍光レゾルフィン生成物となる結合酵素アッセイによって、細胞膜破壊による細胞からのＬＤＨの放出を分光計でのプレート読み取りによって検出して測定する。評価した試験品は、ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物４；配列番号６６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢ（表１の構築物１２；配列番号９５２  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。
【０２００】
結果。図１６は、ＬＤＨの放出によって測定された、ＬｕｋＡＢロイコトキシンの発現のみが異なる、本来は同種同系である株の一連の対とのインキュベーション後に、試験品が初代ヒト好中球の細胞溶解からの保護に及ぼす相対的活性を示す。
【０２０１】
この試験では、最大のＬＤＨ放出の観察が示すように、ＣＮＴＯ３９３０及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６が、すべてのＬｕｋＡＢ産生株によって媒介される殺傷から初代ヒト好中球を保護する効果が最小であった。ＬｕｋＡＢ発現を欠失した株が使用されている場合、ＣＮＴＯ３９３０またはｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６いずれの存在下でも、ＬＤＨの放出がまったく観察されないという結果は、この殺傷がＬｕｋＡＢ産生に依存することを裏付けている。対照的に、ＬｕｋＡＢに結合して中和するｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質、すなわちｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢの試験ではいずれもが、ＬＤＨ放出の減少が示すように、すべてのＬｕｋＡＢ産生株によって媒介される殺傷から初代ヒト好中球を保護し、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢは一般に、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢよりも多少保護の増強をもたらした。予測された通り、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢの存在下での殺傷は、ＬｕｋＡＢの産生に依存することが観察された。
【０２０２】
まとめ。これらのデータは、ロイコトキシンＬｕｋＡＢに結合して、その細胞溶解活性を中和するｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、ロイコトキシン媒介性の殺傷からヒト初代好中球を保護することができることを示している。ＬｕｋＡＢを標的とするｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質のこの活性は、黄色ブドウ球菌媒介性のヒト感染症に関して治療的に有用であり得る。
【０２０３】
実施例１７：ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質は、非同族のロイコトキシン対、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ及びＬｕｋＥ／ＨｌｇＢによる細胞外殺傷から初代ヒト好中球を保護する
ロイコシジンをコードする遺伝子の遺伝子配列、Ｓ及びＦサブユニットをコードする遺伝子座の共調節、ならびに天然タンパク質の精製及び特性決定に基づいて、黄色ブドウ球菌の５つの同族ロイコシジン、ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＳ−ＰＶ／ＬｕｋＦ−ＰＶ、ＬｕｋＥＤ、ＨｌｇＡＢ、及びＨｌｇＣＢが同定されている（Ａｌｏｎｚｏ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，“Ｔｈｅ  ｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７８（２）：１９９−２３０（２０１４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、多くの研究で、天然ヘテロ二量体として産生されるＬｕｋＡＢを除いて、非同族対の組換え型Ｓ及びＦサブユニットの組み合わせによって活性ロイコシジンを調製でき（Ｇｒａｖｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｅｍｂｅｒ，ＬｕｋＥ−ＬｕｋＤ，  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎｓ  ｆａｍｉｌｙ，”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３６：２０２−２０８（１９９８）；Ｍｏｒｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｔ  ＬｕｋＥ−ＬｕｋＤ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｌｅｕｋｏｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｂｉ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７（１）：８１−９０（２００３）；Ｒｏｕｈａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｉｖｅ  ｂｉｒｄｓ，  ｏｎｅ  ｓｔｏｎｅ：Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ａｎｄ  ｆｏｕｒ  ｂｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，”ＭＡｂｓ．７（１）：２４３−５４（２０１５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、これには、非同族対のＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ及びＬｕｋＥ／ＨｌｇＢを含むことが報告されている。本明細書に記載の試験では、ロイコトキシンＬｕｋＥＤ（及びＬｕｋＡＢ）に結合してそれを中和するｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ及びＬｕｋＥ／ＨｌｇＢによって媒介される細胞外殺傷から初代ヒト好中球を保護する能力を例示する。
【０２０４】
手順。ＬｕｋＥ、ＬｕｋＦ−ＰＶ、及びＨｌｇＢサブユニットの組換え変種を、個々に黄色ブドウ球菌から調製した。非同族ロイコシジンのＬｕｋＥ  ／ＬｕｋＦ−ＰＶとＬｕｋＥ／ＨｌｇＢのロイコシジン活性を実証するために、個々のサブユニットを等重量単位で、ＲＰＭＩ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中で新たに精製したヒト初代多形核白血球（ＰＭＮ）２００，０００個と混合して総体積を１００μＬにし、ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを１５００ＲＰＭで１０分間遠心沈殿させた後、上清２５μｌを慎重に新しいプレートに移し、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、代謝活性細胞の指標であるＡＴＰの存在の定量に基づいて細胞溶解を決定した。ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ及びＬｕｋＥ／ＨｌｇＢロイコトキシンのヒトＰＢＭＣに対する細胞溶解活性を中和するｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質の相対的活性を測定するため、２．５μｇのＬｕｋＥ及び２．５μｇのＨｌｇＢ、または５μｇのＬｕｋＥ＋５μｇのＨｌｇＬｕｋＦ−ＰＶを、漸増濃度の各試験品と混合し、氷上で２０分間インキュベートした。次いで、新たに単離した初代ヒト好中球（ｈＰＭＮ、７０μＬのＲＰＭＩ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＨＳＡ中、２００，０００細胞）を添加し、混合物を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、反応プレートを４℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出により細胞溶解の評価を決定した。そのために、各試験ウェルから上清２５μＬを新しい黒色透明底９６ウェルプレートに移し、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）２５μＬを添加し、プレートを暗所で１５分間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬により、レサズリンが変化して蛍光レゾルフィン生成物となる結合酵素アッセイによって、細胞膜破壊による細胞からのＬＤＨの放出を分光計でのプレート読み取りによって検出して測定する。評価した試験品は、ＣＮＴＯ３９３０（表１の構築物２１；配列番号１０４  ＨＣと配列番号１０５  ＬＣ）、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）、及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢ（表１の構築物１２；配列番号９５２  ＨＣと配列番号６７  ＬＣ）であった。追加対照として、精製したＬｕｋＥＤ毒素（最終濃度２．５μｇ／ｍＬ）をＣＮＴＯ３９３０またはｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢを含有する反応物に添加した。
【０２０５】
結果。図１７Ａは、同族ＬｕｋＥＤ、ならびに非同族のＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ及びＬｕｋＥ／ＨｌｇＢロイコトキシンの初代ヒト好中球に対する相対的な細胞溶解活性を示し、すべての試験品で濃度依存的な溶解が観察され、この条件下でＬｕｋＥ／ＨｌｇＢ＞ＬｕｋＥＤ＞ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶの順に明らかな効力を有した。図１７Ｂは、ＬＤＨの放出によって測定された、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ媒介性の細胞溶解からの初代ヒト好中球の保護に、ＣＮＴＯ３９３０及び２つのｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が及ぼす相対的活性を示す。予測された通り、抗ＲＳＶ  ＣＮＴＯ３９３０抗体に、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ細胞溶解からの明らかな保護効果は認められず、全体的な細胞殺傷はＬｕｋＥＤの添加による影響を受けなかった。対照的に、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢはいずれも、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ媒介性の細胞溶解からの濃度依存的な保護をもたらし、ＬｕｋＥＤの添加により、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢは全体的な中和活性が多少の低下を示した。同様に、図１７Ｃ（上部及び下部パネル）に示すように、抗ＲＳＶ  ＣＮＴＯ３９３０抗体には、ＬｕｋＥ／ＨｌｇＢ媒介性の細胞溶解からの明らかな保護効果は認められず、全体的な細胞殺傷はＬｕｋＥＤの添加による影響を受けなかった。対照的に、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ及びｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢはいずれも、ＬｕｋＥ／ＨｌｇＢ媒介性の細胞溶解からの濃度依存的な保護をもたらし、ＬｕｋＥＤの添加により、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ１−ＡＢは全体的な中和活性が多少の低下を示した。
【０２０６】
まとめ。これらのデータは、ＬｕｋＥに結合して、ＬｕｋＥＤロイコシジンの細胞溶解活性を中和するｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質もまた、ＬｕｋＥサブユニットを有する２つの非同族ロイコトキシン、すなわちＬｕｋＥ／ＬｕｋＦ−ＰＶ及びＬｕｋＥ／ＨｌｇＢによって媒介される細胞溶解性の殺傷からヒト初代好中球を保護することができることを示している。ＬｕｋＥを標的とするｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質のこの広範なロイコシジン中和活性は、黄色ブドウ球菌媒介性のヒト感染症に関して治療的に有用であり得る。
【０２０７】
実施例１８：ｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質によるヒト赤血球のＬｕｋＥＤ媒介性溶血の中和
血流中の黄色ブドウ球菌病原体の主な特徴は、哺乳動物の最も豊富な鉄源であるヘモグロビンを放出する赤血球を溶解する毒素の産生によって鉄を捕捉することである。最近の研究で、Ｄｕｆｆｙ抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）が黄色ブドウ球菌の溶血性ロイコシジンＬｕｋＥＤ及びＨｌｇＡＢの受容体として同定された（Ｓｐａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  Ｄｕｆｆｙ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  （ＤＡＲＣ）  ｔｏ  Ｌｙｓｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １８（３）：ｐ．３６３−３７０（２０１５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本実施例では、新たに単離したｈＰＭＮを使用したアッセイ（実施例４を参照）において決定されるＬｕｋＥＤ毒素中和活性を示すｍＡｂ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質はまた、ＬｕｋＥＤ媒介性の溶血からヒト赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ／ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）を保護することを実証する。
【０２０８】
手順。サブユニットあたり４．８μｇ／ｍＬの一定濃度の組換えＬｕｋＥＤ（マウスＬＤ９０濃度に相当）、体積４０μＬを、総体積８０μＬの漸増濃度のｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６（表１の構築物４；配列番号６６  ＨＣと６７  ＬＣ）またはｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ（表１の構築物１１；配列番号８５６  ＨＣと６７  ＬＣ）と氷上で３０分間インキュベートした。新鮮なヒトｌｅｕｋｏｐａｋからの血液を０．９％生理食塩水で３回洗浄し、０．９％生理食塩水中、８ｘ１０７細胞の赤血球（ＲＢＣ）、体積８０μＬを９６ウェルプレート中の毒素と試験品の混合物に添加した。（ｉ）試験品を含まないＬｕｋＥＤ及びＲＢＣ単独、及び（ｉｉ）試験品またはＬｕｋＥＤを含まない、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えたＲＢＣ単独という２種類の対照反応を並行して実施した。５％ＣＯ２の存在下で、３７℃で３０分間、毒素刺激／インキュベートした後、プレートを４℃、１７８０ｇで１０分間遠心沈殿させた。次いで１００μＬの無細胞溶解物を新しい９６ウェルプレートに移し、溶血の測定値としてＯＤ４０５ｎｍを測定した。図１８Ａ及び１８Ｂに示すデータは、３個体の血液ドナーを用いた試験結果をまとめたものである。溶血の程度（％で表す）は以下の式を用いて導出した。
2018517708.tif 000022
【０２０９】
結果。図１８Ｂは、ＬｕｋＥＤ単独の場合に観察される値を１００％として比較したとき、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６またはｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢの存在下でＬｕｋＥＤに観察された溶血(％)を示す。予測された通り、ＬｕｋＥＤを中和するＦＮ３ドメインを有するｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ試験品のみ、ＬｕｋＥＤ媒介性の溶血から赤血球を保護することが観察されている。図１８Ａは、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００単独の場合に観察される値を１００％として比較したとき、ｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６またはｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢの存在下でＬｕｋＥＤに観察された溶血(％)を示す。同様に、ＬｕｋＥＤを中和するＦＮ３ドメインを有するｍＡｂ  ５１３３  ＰＲＡＳＡ  Ａ６  ＨＣ−Ｌ４−Ｅ−Ｌ４−ＡＢ試験品のみ、ＬｕｋＥＤ媒介性の溶血から赤血球を保護することが観察されている。
【０２１０】
まとめ。これらのデータは、ＬｕｋＥに結合して、ＬｕｋＥＤロイコシジンのｈＰＭＮに対する細胞溶解活性を中和するｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が、ヒト赤血球に対するＬｕｋＥＤロイコシジンの溶血活性も中和することを示している。ｈＰＭＮのＬｕｋＥＤ細胞溶解は、ＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２受容体を介した標的細胞への結合後に媒介されると考えられるが、赤血球の溶血はＤＡＲＣ受容体を介した標的細胞への結合後に媒介されると考えられる。したがって、これらのデータは、ｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質が媒介するＬｕｋＥＤの細胞溶解活性の中和が、特異的な標的細胞受容体によって付与される標的細胞への結合性とは無関係であり得るという考察を裏付けている。
【０２１１】
実施例１９：液相水素／重水素交換（ＨＤＸ）質量分析法（ＭＳ）によるロイコシジンＬｕｋＡＢ上の潜在的な中和エピトープの同定
高次構造研究にとって、本明細書でＨＤＸ−ＭＳと称する水素−重水素交換と質量分析法を組み合わせた解析は、相互作用するタンパク質間の結合表面の同定に有効な方法であることが証明されている（Ｈａｍｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｂｙ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，”Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：  １７１−１８２（２００３）  ａｎｄ  Ｈｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｈ／Ｄ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：８４８８−８４９８（２００６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本実施例では、黄色ブドウ球菌から産生されたＬｕｋＡＢタンパク質（配列番号１０及び１１）の組換えトキソイド変種（ＬｕｋＡ  Ｅ３２３Ａ）を使用した、液相ＨＤＸ−ＭＳ法によって、ＬｕｋＡＢヘテロ二量体上の、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質（配列番号１４）に対する潜在的な結合エピトープ（複数可）を同定する試験について記載する。Ｌｕｋ１７  ＦＮ３の不在下または存在下で、組換えＬｕｋＡＢヘテロ二量体を重水素化水溶液中で所定の時間インキュベートすると、交換可能な水素原子に重水素が組み込まれる。９９％超のＬｕｋＡＢタンパク質が特異的ペプチドにマッピングされた試験において、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質に結合した領域は、水素−重水素交換から比較的保護された部位であると推測され、したがって標準のＬｕｋＡＢタンパク質よりも少ない重水素分画を含む。
【０２１２】
手順。ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ型消化及びＬＣ−ＭＳ：ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ型消化のため、５Ｍグアニジン塩酸塩６３μＬ（最終ｐＨ２．５）を添加して、混合物を３分間インキュベートすることにより、１２５μＬの対照緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４の１００ｍＭ塩化ナトリウム）中で５μｇのＬｕｋＡＢを変性させた。次いで、混合物にオンカラムによるペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ型消化を施し、得られたペプチドを、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ハイブリッド四重極−オービトラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）に連結したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣからなる超高速液体クロマトグラフ質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ）システムを使用して分析した。グラジエント時間１６．５分で、２〜３２％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．１％ギ酸）から５０ｍｍｘ１ｍｍのＣ８カラムでペプチドを分離した。溶媒Ａは、０．０２％トリフルオロ酢酸及び０．０８％ギ酸の水溶液であった。注入バルブ及びペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ型カラム、ならびにそれらに関連する連結チューブを１１℃に維持された冷却ボックス内に収容した。さらに、第２の切換バルブ、Ｃ８カラム、及びそれらに関連する連結ステンレス鋼チューブを０℃に維持された冷却循環ボックス内に収容した。ペプチド同定は、Ｍａｓｃｏｔソフトウェアパッケージを使用して、ＭＳ／ＭＳデータからＬｕｋＡＢ配列を検索することによって行った（Ｋｏｅｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｏｂｕｓｔ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＡＳＣＯＴ  ｓｃｏｒｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，”Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．７（９）：３７０８−１７（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。プレカーサーイオン及びプロダクトイオンの質量許容値は、それぞれ２０ｐｐｍ及び０．０５Ｄａであった。
【０２１３】
Ｈ／Ｄ交換：５μＬのＬｕｋＡＢ（１０μｇ）、またはＬｕｋＡＢとＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の複合体（それぞれ１０μｇ及び７．３５μｇ）５μＬを、重水の標識緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４の１００ｍＭ塩化ナトリウム）１２０μＬと０秒間、６０秒間、３００秒間、１８００秒間、７２００秒間、及び１４４００秒間インキュベートした。６３μＬの５Ｍグアニジン塩酸塩（最終ｐＨ２．５）を添加することにより、重水素交換をクエンチし、次いでクエンチしたサンプルに、上述のオンカラムによるペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ型消化及びＬＣ−ＭＳ分析を施した。マススペクトルはＭＳのみのモードで記録した。Ｈ／Ｄ交換ＭＳデータ分析用のＨＤＸ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈソフトウェアを使用して、未加工のＭＳデータを処理した（Ｐａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈ／Ｄ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ＭＳ  Ｄａｔａ，”Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２３（９），１５１２−１５２１（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。重水素レベルを、重水素化ペプチドとその天然形態（ｔ０）との間の平均質量差を用いて算出した。
【０２１４】
結果。Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質が標的とするＬｕｋＡＢ上のペプチドレベルの相互作用部位（複数可）を確定するために、ＬｕｋＡＢを重水中にて、単独でまたはＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質との複合体のいずれかでインキュベートした。重水素交換は室温で０秒、６０秒、３００秒、１８００秒、７２００秒、及び１４４００秒間、実施した。同定されたペプチドの重水素レベルをＬＣ／ＭＳの質量シフトからモニターした。ＬｕｋＡは、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質への結合時に重水素取り込みの有意な減少を示さなかった。対照的に、ＬｕｋＢペプチドの大部分は、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質分子の有無にかかわらず、同一または類似の重水素レベルを示したが、ＬｕｋＢのうち２つの異なるペプチドは、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質結合時に重水素取り込みを有意に減少させた。具体的には、ＬｕｋＢペプチド領域
2018517708.tif 000023
（配列番号１１のアミノ酸残基２６０〜２６９）は強い重水素保護を受けた。したがって、この強力に保護された領域が、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質に対する潜在的エピトープ成分に対応する。さらに、ＨＤＸ−ＭＳ分析では、１つのセグメント
2018517708.tif 000024
（配列番号１１のアミノ酸残基２０１〜２２４）にもわずかな保護が見られた。Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質とＬｕｋＢ（配列番号１１）との液相相互作用によって保護されるこれら２つの領域を、図１９Ａに示す差次的ＬｕｋＢのヒートマップ模式図に黒色
2018517708.tif 000025
及び暗灰色
2018517708.tif 000026
で強調表示する。
【０２１５】
これらの２つの推定ＬｕｋＡＢ／Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質相互作用部位を、二成分毒素ＬｕｋＡＢ（別名ＬｕｋＧＨ）の公開された八量体結晶構造にマッピングした（Ｂａｄａｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  ＬｕｋＧＨ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０，１４２−１５６（２０１５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これを図１９Ｂに示す。興味深いことに、ＬｕｋＢの同定された２つの線状ペプチドは、３次元結晶構造において互いに近接して位置する。この結論はさらに、本明細書に記載のヘテロ二量体ＬｕｋＡＢ構造上の同じペプチドのマッピングによって実証されている（実施例２１を参照）。これらのデータは、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質のＬｕｋＡＢ中和エピトープが、ＬｕｋＢペプチド配列、（配列番号１１の）
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内に包含される残基によって定義されることを示唆している。
【０２１６】
まとめ。これらのデータは、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質がＬｕｋＢサブユニットとの特異的相互作用（複数可）を介してＬｕｋＡＢに結合することを示している。ＬｕｋＡＢと標的細胞受容体ＣＤ１１ｂとの会合（Ｂａｄａｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  ＬｕｋＧＨ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０，１４２−１５６（２０１５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）（実施例２１を参照）、及びその後の八量体孔を形成する際の標的細胞膜での会合に関するモデルに基づくと、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質が媒介するＬｕｋＡＢの細胞溶解活性の中和は、標的細胞へのＬｕｋＡＢ結合の変動及び／または標的細胞膜における八量体孔の形成に伴うＬｕｋＡＢの立体構造変化によって生じると推定される。
【０２１７】
実施例２０：液相水素／重水素交換（ＨＤＸ）質量分析法（ＭＳ）によるロイコシジンＬｕｋＥサブユニット上の潜在的なＬｕｋＥＤ中和エピトープの同定
本実施例では、黄色ブドウ球菌から産生された組換えＬｕｋＥタンパク質（配列番号１０５５）を使用した、液相ＨＤＸ−ＭＳ法によって、ＬｕｋＥサブユニット構造上のＬｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質（配列番号２５）に対する潜在的な結合エピトープ（複数可）を同定する試験について記載する。本試験では、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の不在下または存在下で組換えＬｕｋＥタンパク質を重水素化水溶液中で所定の時間インキュベートすると、交換可能な水素原子に重水素が組み込まれる。９９％超のＬｕｋＥタンパク質が特異的ペプチドにマッピングされた試験において、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質に結合した領域は、交換から比較的保護された部位であると推測され、したがって標準のＬｕｋＥタンパク質よりも少ない重水素分画を含む。
【０２１８】
手順。ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ型消化及びＬＣ−ＭＳ：ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ型消化のため、５Ｍグアニジン塩酸塩６３μＬ（最終ｐＨ２．５）を添加して、混合物を３分間インキュベートすることにより、１２５μｌの対照緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中のＬｕｋＥタンパク質５μｇを変性させた。次いで、混合物にオンカラムによるペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ型消化を施し、得られたペプチドを、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ハイブリッド四重極−オービトラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）に連結したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣからなる超高速液体クロマトグラフ質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ）システムを使用して分析した。グラジエント時間１６．５分で、２〜３２％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．１％ギ酸）から５０ｍｍｘ１ｍｍのＣ８カラムでペプチドを分離した。溶媒Ａは、０．０２％トリフルオロ酢酸及び０．０８％ギ酸の水溶液であった。注入バルブ及びペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ型カラム、ならびにそれらに関連する連結チューブを１１℃に維持された冷却ボックス内に収容した。さらに、第２の切換バルブ、Ｃ８カラム、及びそれらに関連する連結ステンレス鋼チューブを０℃に維持された冷却循環ボックス内に収容した。ペプチド同定は、Ｍａｓｃｏｔソフトウェアパッケージを使用して、ＭＳ／ＭＳデータからＬｕｋＡＢ配列を検索することによって行った（Ｋｏｅｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｏｂｕｓｔ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＡＳＣＯＴ  ｓｃｏｒｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，”，Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．７（９）：３７０８−１７（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。プレカーサーイオン及びプロダクトイオンの質量許容値は、それぞれ２０ｐｐｍ及び０．０５Ｄａであった。
【０２１９】
Ｈ／Ｄ交換：５μＬのＬｕｋＥ（５μｇ）タンパク質単独、またはＬｕｋＥとＬｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質（それぞれ５μｇ及び３．９３μｇ）５μＬを、重水の標識緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．４）１２０μＬと０秒間、６０秒間、３００秒間、１８００秒間、７２００秒間、及び１４４００秒間インキュベートした。６３μＬの５Ｍグアニジン塩酸塩（最終ｐＨ２．５）を添加することにより、重水素交換をクエンチし、次いでクエンチしたサンプルに、上述のオンカラムによるペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ型消化及びＬＣ−ＭＳ分析を施した。マススペクトルはＭＳのみのモードで記録した。Ｈ／Ｄ交換ＭＳデータ分析用のＨＤＸ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈソフトウェアを使用して、未加工のＭＳデータを処理した（Ｐａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈ／Ｄ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ＭＳ  Ｄａｔａ，”Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２３（９），１５１２−１５２１（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。重水素レベルを、重水素化ペプチドとその天然形態（ｔ０）との間の平均質量差を用いて算出した。
【０２２０】
結果。Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質が標的とするＬｕｋＥ上のペプチドレベルの相互作用部位（複数可）を確定するために、ＬｕｋＥを重水中にて、単独でまたはＬｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質との複合体のいずれかでインキュベートした。重水素交換は室温で０秒、６０秒、３００秒、１８００秒、７２００秒、及び１４４００秒間、実施した。同定されたペプチドの重水素レベルをＬＣ／ＭＳの質量シフトからモニターした。ＬｕｋＥペプチドの大部分は、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の有無にかかわらず、同一または類似の重水素レベルを示したが、２つのペプチドセグメントは、結合時に重水素取り込みを有意に減少させた。具体的には、ＬｕｋＥは、配列番号１０５５に使用したアミノ酸の付番によれば、ペプチド領域
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（各領域は、配列番号１０５４のアミノ酸残基８６〜９９及び配列番号１０５４のアミノ酸残基２７２〜２９２に対応する）でＬｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質に結合すると重水素取り込みの有意な減少を示す。Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質によって保護されるこれら２つの領域を、図２０Ａに示す差次的ヒートマップ模式図に黒色で強調表示する。したがって、これらの領域が、ＬｕｋＥのＬｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質に対する主要な相互作用部位に相当する。加えて、ＨＤＸ−ＭＳ分析では、１つのセグメント、（配列番号１０５５の）２４４ＹＧＲＮ２４７にもわずかな保護が見られた。これを図２０Ａに示す差次的ヒートマップ模式図に暗灰色で強調表示する。この領域は、配列番号１０５４のアミノ酸残基２６１〜２６４に対応する。
【０２２１】
これらの推定ＬｕｋＥ／Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質相互作用部位を、ＬｕｋＥの公開された高分解能結晶構造にマッピングした（Ｎｏｃａｄｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ”Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ７２：１１３−１２０（２０１６）ＰＤＢエントリ３ｒｏｈ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの相互作用部位は、３次元構造において互いに近接して位置し（図２０Ｂの強調された領域を参照）、ＬｕｋＥのいわゆる「リム」ドメインの要素を含むことが見出された。その後のＬｕｋＥの変異マッピングは、推定ＬｕｋＥ／Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質相互作用部位のそれぞれの残基がＬｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質への結合に影響を与えたことを示した（下記実施例２３を参照）。
【０２２２】
まとめ。これらのデータは、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質がリムドメイン領域における特異的相互作用（複数可）によってＬｕｋＥに結合し、この結合がＬｕｋＥＤの細胞溶解性（実施例４）及び溶血活性（実施例１９）を中和するのに十分であることを示している。ロイコトキシンのリムドメインは、標的細胞膜の脂質二重層との相互作用、及び特異的標的細胞膜結合受容体との相互作用にとって重要であると考えられるため、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質のＬｕｋＥへの結合は、膜表面でのＬｕｋＥＤヘテロ二量体及び／もしくは高次オリゴマーの受容体結合、膜結合ならびに／または形成のいずれをも妨害することが可能である。ＬｕｋＥＤの場合、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質が媒介する受容体結合の妨害は、赤血球及び内皮細胞上のＤｕｆｆｙ抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の乱れによって（Ｓｐａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  Ｄｕｆｆｙ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  （ＤＡＲＣ）  ｔｏ  Ｌｙｓｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １８（３）：３６３−７０（２０１５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、または好中球上のケモカイン受容体ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２との相互作用の乱れによって（Ｓｐａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＸＣＲ１  ａｎｄ  ＣＸＣＲ２  ｔｏ  Ｋｉｌｌ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １４（４）：４５３−４５９（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）起こり得る。
【０２２３】
実施例２１：Ｘ線結晶学によるＬｕｋＡＢ上のＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の中和エピトープの特性決定
本実施例では、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質、ＬｕｋＡＢ、及びＬｕｋＡＢ特異的Ｆａｂ（抗原結合断片）で構成される三元複合体（１：１：１）の高分解能Ｘ線結晶構造の決定により、ロイコトキシンＬｕｋＡＢ上のＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質に対する結合エピトープを同定する試験について記載する。
【０２２４】
手順。タンパク質。本明細書に記載の構造試験に使用するタンパク質は、（ｉ）本明細書でＬｕｋＡＢと称する黄色ブドウ球菌から産生されたＬｕｋＡＢタンパク質（配列番号１０及び１１）の組換えトキソイド変種（ＬｕｋＡ  Ｅ３２３Ａ）、（ｉｉ）本明細書で「Ｓ１７」と称するＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質（配列番号１０５３）のポリヒスチジン標識変種、及び（ｉｉｉ）ＬｕｋＡＢ特異的ｍＡｂ（配列番号１０８０  ＨＣと１０８１  ＬＣ；表１の構築物３５）に由来し、本明細書で「２１４Ｆ」と称する組換えＦａｂ（配列番号１０７８  ＨＣと１０７９  ＬＣ；表１の構築物３４）である。ＬｕｋＡＢを１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で精製し、５ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌで精製し、８．４ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。２１４Ｆを２０ｍＭ  ＭＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）で精製し、１．９１ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
【０２２５】
複合体形成、結晶化、及びＸ線データの収集。ＬｕｋＡＢ、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質、及び２１４Ｆで構成される三元複合体を、ＬｕｋＡＢと過剰のＬｕｋ１７  ＦＮ３及び２１４Ｆとのインキュベーションにより調製した。複合体を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロールで予め平衡化したＭｏｎｏ  Ｓ  ５／５０  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。サンプルをカラムに充填した後、三元複合体を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、１Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、三元複合体の存在を確認した。精製したＬｕｋＡＢ／Ｌｕｋ１７  ＦＮ３／２１４Ｆ複合体を含む画分をプールし、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール中で１３．４２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。結晶化スクリーニング及び最適化は、Ｍｏｓｑｕｉｔｏ結晶化ロボット（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、三元複合体のシードを用いたシーディングにより実施した。０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、２６％ＰＥＧ３３５０、０．２Ｍ酒石酸ジアンモニウムから結晶を回収し、０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、２５％ＰＥＧ３３５０、０．２Ｍ酒石酸二アンモニウム、２０％グリセロールからなる凍結保護溶液と混合した。この結晶を液体窒素中でフラッシュ冷却した。回折データは、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏ  Ｓｏｕｒｃｅ（ビームライン１７−ＩＤ）で収集した。Ｘ線データを「ＸＤＳ」（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．，Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６（２）：１２５−１３２（２０１０）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により分解能３オングストロームまで処理した。Ｘ線データの詳細を以下の表２にまとめる。
【０２２６】
構造決定。三元複合体の構造は、Ｐｈａｓｅｒ（Ｒｅａｄ，”Ｐｕｓｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，”Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５７（１０）：１３７３−１３８２（２００１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）による分子置換によっていくつかの段階を経て分析した。ｐｄｂ  ＩＤ  ４ｔｗ１からのＬｕｋＡＢ二量体（Ｂａｄａｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  ＬｕｋＧＨ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０，１４２−１５６（２０１５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を、膜孔形成セグメントを手動で除去した後にテンプレートとして使用した。２１４Ｆ  Ｆａｂを、ＭＯＥ（ＣＣＧ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）で生成されたＦｖ及び３ｎａ９由来の２つの定常ドメインの相同性モデルを使用して配置した（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｖｋａｐｐａ  ＣＤＲ−Ｌ３  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０２（４）：７０８−７１９（２０１０）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。最後に、Ｓ１７を、ｐｄｂ  ｉｄ  ３ｔｅｓ由来の単量体に基づく相同性モデルを使用して配置した（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ＦＮ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２５（３）：１０７−１１７（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。精密化はＰｈｅｎｉｘ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＨＥＮＩＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔ．１１（１）：５３−５５（２００４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて実施し、モデルフィッティングはＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｏｔ：ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ，”Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０（１２  Ｐｔ  １）：２１２６−２１３２（２００４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて実施した。精密化統計値を表２にまとめる。グラフィックはすべてＰｙｍｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  ＬＬＣ、ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて生成し、他のすべての計算はＣＣＰ４（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  １９９４）を用���て実施した。
【０２２７】
（表２）Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質、ＬｕｋＡＢ、及び「２１４Ｆ」と命名されたＬｕｋＡＢ特異的Ｆａｂ（抗原結合断片）で構成される三元複合体（１：１：１）の高分解能Ｘ線結晶構造のＸ線データ統計値及び精密化統計値
2018517708.tif 000029
*括弧内の値は最外殻分解能である
【０２２８】
結果。ＬｕｋＡＢ／Ｓ１７／２１４Ｆ三元複合体の全体的な構造を図２１Ａに示す。構造モデルには、１つのＬｕｋＡＢヘテロ二量体（ＬｕｋＡの残基１６〜３０５、ＬｕｋＢの残基４１〜３２３、ＰＤＢ  ＩＤ  ４ｔｗ１による付番号付け）、１つの２１４Ｆ分子（軽鎖の残基１〜２１３、重鎖の残基１〜２２４）、及び１つのＳ１７分子（開始メチオニン（Ｍ１）及びＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグの２つのＨｉｓ残基を含むｃｅｎｔｙｒｉｎ  Ｓ１７の残基１〜９４）を含む。
【０２２９】
三元複合体中のＬｕｋＡＢは、以前に決定したＬｕｋＡＢ構造の界面２に対応するＬｕｋＡ／ＬｕｋＢ界面をもつヘテロ二量体であり、サブユニット界面の公開された変異解析と一致する（Ｂａｄａｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  ＬｕｋＧＨ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０，１４２−１５６（２０１５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＬｕｋＡ及びＬｕｋＢ単量体構造は、八量体形成に関与するループセグメントを除いて、八量体構造のものと非常に類似している（それぞれ、２２３  ＬｕｋＡ  Ｃα原子に対するＲＭＤＳが０．３６オングストローム、２２４  ＬｕｋＢ  Ｃα原子に対するＲＭＤＳが０．３４オングストローム）。図２１Ｂに示すように、各膜孔形成セグメント（それぞれＬｕｋＡの残基１３２〜１７５及びＬｕｋＢの残基１０６〜１５３）は、単離された二量体において非常に異なる立体構造を採っている。興味深いことに、ＬｕｋＡとＬｕｋＢの２つの立体構造のスイッチ点は、構造と同様に配列が同一である。
【０２３０】
ＬｕｋＡＢ上のＳ１７及びＦａｂ  ２１４Ｆに対する結合部位は、スイッチングセグメントから離れている（図２１Ｃ）。したがって、両方の分子は、ＬｕｋＡＢヘテロ二量体に加え、ＬｕｋＡＢ八量体にも結合できるはずである。Ｆａｂ  ２１４Ｆの親ｍＡｂは、ＬｕｋＡＢに対する中和活性を示さないことが知られている。対照的に、Ｓ１７はＬｕｋＡＢ中和活性を示す（実施例５）。八量体構造上のＳ１７エピトープの局在（図２１Ｃ）に基づくと、Ｓ１７は宿主細胞受容体との相互作用をブロックするか、または八量体孔の膜への挿入を立体的に妨げることによって宿主細胞との相互作用を乱すと思われる。
【０２３１】
Ｓ１７は、ＬｕｋＢサブユニット（図２１Ａ〜２１Ｂ）のいわゆるリムドメインに結合し、ＬｕｋＡサブユニットとは何ら明らかな接触をしない。Ｓ１７／ＬｕｋＢ結晶接触に基づくと、ＬｕｋＡＢ上のＳ１７結合エピトープは、ＬｕｋＢ残基：配列番号１１のＹ７３、Ｗ７４、Ｎ１９１、Ｎ１９２、Ｒ１９３、Ｋ１９５、Ｎ２０６、Ｌ２０７、Ｗ２０８、Ｗ２６２、Ｎ２６３、Ｒ２６４、Ｈ２６５、Ｇ２６６、Ｆ２６７、Ｙ２７０で最小限構成される（図２１Ｄ）。これらのエピトープ残基は、ＨＤＸマッピング（実施例１９）によって同定されたエピトープセグメントと大部分は一致し、変異分析結果（実施例２２）とも一致する。図２１Ｆは、ＬｕｋＢエピトープ／Ｌｕｋ１７  ＦＮ３パラトープ界面における代表的な電子密度を示したものである。
【０２３２】
Ｓ１７は、親ＦＮ３結合タンパク質（配列番号１）に対する変種である残基に対応する、その凹面上に露出したアミノ酸残基を介してＬｕｋＢに結合する。Ｓ１７／ＬｕｋＢ結晶接触に基づくと、ＬｕｋＢに結合するＳ１７パラトープを定義する残基は、Ｍ１、Ｗ３３、Ｔ３５、Ｅ３７、Ｋ３９、Ｆ４０、Ｙ４１、Ｒ４２、Ａ４５、Ｖ４７、Ｅ６７、Ｋ６９、Ｗ７１、Ｖ７３、Ｗ８２、及びＰ８３であり、図２１Ｅで強調表示されている。これらの構造的パラトープ残基はまた、変異試験と一致する（実施例５及び図５；ここでは、アミノ末端メチオニンが含まれるため、Ｓ１７の付番が実施例５から１残基だけシフトされていることに留意）。注目すべき点として、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の部位特異的変種のＬｕｋＡＢ結合及び中和に関する分析によって同定された主要なＬｕｋ１７  ＦＮ３パラトープ残基（実施例５及び図５を参照）が、結晶構造中の同定されたＬｕｋ１７  ＦＮ３パラトープ残基と合致している。例えば、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３のＡｒｇ４２、Ｇｌｕ３７、及びＬｙｓ３９（配列番号１０５３；配列番号１４及び実施例５のＡｒｇ４１、Ｇｌｕ３６、及びＬｙｓ３８に対応する）が、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３の同定されたＬｕｋＡＢ中和エピトープの残基と特異的な結晶接触を行う。
【０２３３】
まとめ。ＬｕｋＡＢ／Ｓ１７／２１４Ｆ三元複合体の構造は、以前に公開された八量体ＬｕｋＡＢ構造に観察されたものと立体構造が非常に異なる八量体形成セグメントを有する完全なＬｕｋＡＢヘテロ二量体を示す（Ｂａｄａｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  ＬｕｋＧＨ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０：１４２−１５６（２０１５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＬｕｋＢ上のＳ１７（Ｌｕｋ１７  ＦＮ３）タンパク質の構造的に定義されたエピトープは、ＬｕｋＡＢの液相ＨＤＸマッピング試験（実施例１９）及びＬｕｋＢの部位特異的変種の特性決定（実施例２２）からのデータと一致する。最後に、この構造はまた、ＬｕｋＡＢと、標的細胞受容体（ＣＤ１１ｂ）及び／または細胞膜との相互作用を立体的に遮断するＳ１７の興味深い中和機構を示し得る。加えて、Ｓ１７結合は、ヘテロ二量体から八量体の膜埋め込み孔への移行の際にＬｕｋＡＢが受ける通常の立体構造変化を妨げることが可能である。
【０２３４】
実施例２２：Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質のＬｕｋＡＢ中和エピトープを確認するＬｕｋＢの変異マッピング
Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の部位特異的変異体の、ＬｕｋＡＢ結合及び中和特性に関する特性決定（実施例５）に加えて、本実施例では、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質、ＬｕｋＡＢ、及び「２１４Ｆ」ＬｕｋＡＢ特異的Ｆａｂで構成される三元複合体（１：１：１）の高分解能Ｘ線結晶構造の決定（実施例２１を参照）による同定と同様に、パラトープ／エピトープ界面での特異的Ｌｕｋ１７  ＦＮ３／ＬｕｋＢ相互作用を確認する同等の試験について記載する。
【０２３５】
手順。本明細書に記載の試験に使用するタンパク質は、（ｉ）ＬｕｋＡ配列のアミノ末端にポリヒスチジン及びストレプトアビジン結合配列を有し、配列番号１０２１（ＬｕｋＡ）と組み合わせた配列番号１０３３〜１０５２（ＬｕｋＢ変種）に対応する、ＬｕｋＡＢタンパク質の組換えトキソイド変種（ＬｕｋＡ  Ｅ３２３Ａ）の部位特異的ＬｕｋＢ突然変異体、及び（ｉｉ）カルボキシル末端ポリヒスチジン配列を有するＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の変種（配列番号１０５３）である。組換えＬｕｋＡＢ変種をニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって、ビオチンリガーゼを発現する大腸菌株から、可溶性ヘテロ二量体として精製した。Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって大腸菌から精製した。
【０２３６】
親和性（ＫＤ）及び解離（Ｋｄｉｓ）定数の決定。ＬｕｋＢに部位特異的変異を有するＬｕｋＡＢ変種に対するＫＤ値及びＫｄｉｓ値を、基本的な速度論的プロトコールを実行するＯｃｔｅｔＲＥＤ  ３８４機器（ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｉｎｃ．）を使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により決定した（“Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｏｃｔｅｔ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ”、ＦｏｒｔｅＢＩＯのウェブサイトからアクセスできるＰａｌｌ  ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｃｏｒｐ．のアプリケーションノート１４に概説、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡潔には、ビオチン化ＬｕｋＡＢ変異体タンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、濃度１０μｇ／ｍＬでＤｉｐ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ（商標）ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーピン上に１０分間ロードした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で１分間洗浄することによりベースラインを設定した。次いで、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の会合速度を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、濃度１０ｕｇ／ｍＬで１０分間かけて添加することにより測定した。次いで、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質の解離速度を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で５分間洗浄した後に測定した。ＫＤ値を決定するためのカーブフィッティングでは、最初の６０秒を会合及び解離段階に使用し、オンレート及びオフレートを分析した。
【０２３７】
結果。Ｌｕｋ１７  ＦＮ３／ＬｕｋＢ結晶接触に基づくと、ＬｕｋＡＢ上のＬｕｋ１７  ＦＮ３結合エピトープは、ＬｕｋＢ残基：配列番号１１のＹ７３、Ｗ７４、Ｎ１９１、Ｎ１９２、Ｒ１９３、Ｋ１９５、Ｎ２０６、Ｌ２０７、Ｗ２０８、Ｗ２６２、Ｎ２６３、Ｒ２６４、Ｈ２６５、Ｇ２６６、Ｆ２６７、Ｙ２７０で最小限構成される（図２１Ｄ）。図２２Ａ及び２２Ｂはそれぞれ、ＬｕｋＢエピトープ残基がｐｄｂ  ＩＤ  ４ｔｗ１からのＬｕｋＡＢ構造と一致する付番の残基をもつＸまたはＹのいずれかに変異された一連のＬｕｋＡＢ変種について算出した親和性（ＫＤ）定数及び解離（Ｋｄｉｓ）定数を示す（Ｂａｄａｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  ＬｕｋＧＨ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０，１４２−１５６（２０１５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２３８】
ＬｕｋＡＢ／Ｌｕｋ１７  ＦＮ３（Ｓ１７）／２１４Ｆ結晶構造（実施例２１）で同定されたＬｕｋ１７  ＦＮ３／ＬｕｋＢ相互作用表面の程度を考慮すると、ＬｕｋＢエピトープまたはＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質パラトープのいずれかの個々の部位特異的（置換）変異体が全体の結合を無効にすることは予想していなかった。しかし、重要なパラトープ−エピトープ相互作用を妨害する変異が、ＬｕｋＡＢとＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質との間の相互作用の親和性に有意な影響を有することは予想された。評価したＬｕｋＢ部位特異的変異体のうち、Ｔｙｒ７３Ａｌａ、Ｔｒｐ７４Ａｌａ、Ａｒｇ２６４Ｇｌｕ、及びＴｒｐ２６８Ａｌａは、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３親和性（ＫＤ値に反映；図２２Ａ）に最も有意な影響を及ぼし、Ｔｙｒ７３Ａｌａ及びＡｒｇ２６４Ｇｌｕは解離特性（Ｋｄｉｓ値に反映；図２２Ｂ）に最も有意な影響を示すことが観察された。
【０２３９】
まとめ。本明細書に記載のＬｕｋＡＢ変種のＬｕｋ１７  ＦＮ３（Ｓ１７）タンパク質結合特性の変異分析は、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３（Ｓ１７）タンパク質のＬｕｋＡＢ中和エピトープの主要な構成要素であるＬｕｋＡＢ／Ｓ１７／２１４Ｆ三元複合体のＸ線結晶試験（実施例２１）により同定されたＬｕｋＢ残基の重要性を実証している。評価したＬｕｋＢ部位特異的変異体のうち、Ｔｙｒ７３Ａｌａ、Ｔｒｐ７４Ａｌａ、Ａｒｇ２６４Ｇｌｕ、及びＴｒｐ２６８Ａｌａは、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３親和性（ＫＤ値に反映）に最も有意な影響を及ぼし、Ｔｙｒ７３Ａｌａ及びＡｒｇ２６４Ｇｌｕは解離特性（Ｋｄｉｓ値に反映）に最も有意な影響を示すことが観察された。
【０２４０】
実施例２３：Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質のＬｕｋＥＤ中和エピトープを確認するＬｕｋＥの変異マッピング
Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の部位特異的変異体の、ＬｕｋＥ結合及びＬｕｋＥＤ中和特性に関する特性決定（実施例４、図４Ａ）に加えて、本実施例では、液相水素／重水素交換（ＨＤＸ）質量分析法（ＭＳ）マッピング（実施例２０）による同定と同様に、明らかなパラトープ／エピトープ界面での特異的Ｌｕｋ２６  ＦＮ３／ＬｕｋＥ相互作用を確認する同等の試験について記載する。
【０２４１】
手順。本明細書に記載の試験に使用するタンパク質は、（ｉ）ＬｕｋＥ配列（配列番号１０５６）のアミノ末端にポリヒスチジン及びストレプトアビジン結合配列を有し、配列番号１０５７〜１０７６に対応する組換え形態のＬｕｋＥの部位特異的突然変異体、及び（ｉｉ）カルボキシル末端ポリヒスチジン配列を有するＬｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の変種（配列番号１０７７）である。組換えＬｕｋＥ変種をニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって、ビオチンリガーゼを発現する大腸菌株から、可溶性タンパク質として精製した。Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって大腸菌から精製した。
【０２４２】
親和性（ＫＤ）及び解離（Ｋｄｉｓ）定数の決定。ＬｕｋＥに部位特異的変異を有するＬｕｋＥＤ変種に対するＫＤ値及びＫｄｉｓ値を、基本的な速度論的プロトコールを実行するＯｃｔｅｔＲＥＤ  ３８４機器（ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｉｎｃ．）を使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により決定した（“Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｏｃｔｅｔ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ”、ＦｏｒｔｅＢＩＯのウェブサイトからアクセスできるＰａｌｌ  ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｃｏｒｐ．のアプリケーションノート１４に概説、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡潔には、ビオチン化ＬｕｋＥ変異体タンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、濃度１０μｇ／ｍＬでＤｉｐ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ（商標）ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーピン上に１０分間ロードした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で１分間洗浄することによりベースラインを設定した。次いで、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の会合速度を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、濃度１０ｕｇ／ｍＬで１０分間かけて添加することにより測定した。次いで、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の解離速度を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で５分間洗浄した後に測定した。ＫＤ値を決定するためのカーブフィッティングでは、最初の６０秒を会合及び解離段階に使用し、オンレート及びオフレートを分析した。
【０２４３】
結果。ＨＤＸマッピング（図２０Ａ）及びＬｕｋＥの公開された結晶構造上の推定ＬｕｋＥＤ中和エピトープのマッピング（図２０Ｂ）によって、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３結合エピトープの潜在的な成分として同定されたＬｕｋＥ残基に基づいて、ＬｕｋＥの一連の部位特異的（置換）変異体を調製し、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質への結合に関して特性決定した。具体的には、ＬｕｋＥペプチド領域
2018517708.tif 000030
（ＰＤＢエントリ３ＲＯＨ；配列番号１０５４に使用されるアミノ酸付番に従う）のＬｕｋＥ変種を作製した。Ｌｕｋ２６  ＦＮ３／ＬｕｋＥ相互作用表面の程度を考慮すると、ＬｕｋＥエピトープまたはＬｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質パラトープのいずれかの個々の部位特異的（置換）変異体が全体の結合を無効にすることは予想していなかった。しかし、重要なパラトープ−エピトープ相互作用を妨害する変異が、ＬｕｋＥとＬｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質との間の相互作用の親和性に有意な影響を有することは予想された。評価したＬｕｋＥ部位特異的変異体のうち、ペプチド領域
2018517708.tif 000031
（配列番号１０５４に従う）に対応する残基の変異は、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３結合親和性（ＫＤ値の低下（図２３Ａ）、及びＫｄｉｓ値の上昇（図２３Ｂ）に反映）に対して、すべてが野生型（親）ＬｕｋＥタンパク質と比較して弱い結合を示す（図２３Ａ〜２３Ｂ）Ｓｅｒ８９Ａｌａ、Ｖａｌ９１Ａｌａ、Ｌｙｓ９２Ａｌａ、Ｇｌｙ９３Ａｒｇ、Ｔｙｒ９６Ａｌａ、Ｌｅｕ９８Ａｌａ、及びＴｈｒ９９Ａｌａ突然変異体（配列番号１０５４による付番）と最も一致する影響を与えた。加えて、ＬｕｋＥのＡｒｇ１０１Ａｌａ変種はまた、有意に弱いＬｕｋ２６  ＦＮ３結合及び解離特性の増強を示すことが見出されたことから、この明らかなエピトープ成分は、ＨＤＸマッピングにより同定された線状ＬｕｋＥ領域を超えて伸長し得る。対照的に、
2018517708.tif 000032
ペプチド領域中の残基の変異は一般に、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３結合にあまり有意な影響を与えなかった（図２３Ａ〜２３Ｂ）。しかしながら、ＬｕｋＥのＴｙｒ２６９Ａｌａ、Ｐｈｅ２８７Ａｌａ、及びＡｒｇ２９０Ａｌａ変種に観察された低い結合親和性と速い解離速度によって、この線状ＬｕｋＥ配列からの残基がＬｕｋ２６  ＦＮ３エピトープに寄与することは明らかである。
【０２４４】
Ｌｕｋ２６  ＦＮ３に対するＬｕｋＥ結合及びＬｕｋＥＤ中和エピトープ成分を表すこのデータから推定される特異的残基の局在をＬｕｋＥの公開された結晶構造（Ｎｏｃａｄｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ，”Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ７２：１１３−１２０（２０１６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる；ＰＤＢエントリ３ＲＯＨ）にマッピングした。これを図２３Ｃで模式的に強調表示している。注目すべきは、同定されたエピトープ残基が、ＬｕｋＥのいわゆるリムドメインの構造要素に局在していることである。明確化のため、組換えＬｕｋＥ配列、配列番号１０５５及び１０５６と、公開されたＬｕｋＥ構造（ＰＤＢエントリ３ＲＯＨ；配列番号１０５４）のＬｕｋＥタンパク質配列とのアラインメントを図２３Ｃに付記している。
【０２４５】
まとめ。本明細書に記載するＬｕｋＥ変種のＬｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質への結合特性の分析は、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質に対するＬｕｋＥ結合及びＬｕｋＥＤ中和エピトープの形成に、ＬｕｋＥのリムドメインにある主要残基が重要であることを実証している。具体的には、配列番号１０５４の残基Ｓｅｒ８９、Ｖａｌ９１、Ｌｙｓ９２、Ｇｌｙ９３Ａｒｇ、Ｔｙｒ９６、Ｌｅｕ９８及びＴｈｒ９９、Ｔｙｒ２６９、Ｐｈｅ２８７及びＡｒｇ２９０が、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質の最小エピトープを定義している。ロイコトキシンのリムドメインは、標的細胞膜の脂質二重層との相互作用、及び特異的標的細胞膜結合受容体との相互作用にとって重要であると考えられるため、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質のＬｕｋＥへの結合は、膜表面でのＬｕｋＥＤヘテロ二量体及び／もしくは高次オリゴマーの受容体結合、膜結合ならびに／または形成のいずれをも妨害することが可能である。ＬｕｋＥＤの場合、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３タンパク質が媒介する受容体結合の妨害は、赤血球及び内皮細胞上のＤｕｆｆｙ抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の乱れによって（Ｓｐａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  Ｄｕｆｆｙ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  （ＤＡＲＣ）  ｔｏ  Ｌｙｓｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １８（３）：３６３−７０（２０１５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、または好中球上のケモカイン受容体ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２との相互作用の乱れによって（Ｓｐａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ  ＥＤ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＸＣＲ１  ａｎｄ  ＣＸＣＲ２  ｔｏ  Ｋｉｌｌ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １４（４）：４５３−４５９（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）起こり得る。
【０２４６】
実施例２４：ｍＡｂ  ５１３３のさらなる最小エピトープの定義、及びＸ線結晶学により決定されるｍＡｂ  ５１３３とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの相互作用の特性決定
セリン−アスパラギン酸リピート（ＳＤＲ）ファミリーのメンバーである黄色ブドウ球菌  ＳｄｒＣタンパク質のグリコシル化形態の組換え変種に対するｍＡｂ  ５１３３の特異性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．に対するＷＯ２０１５０８９０７３で実証された。具体的には、精製された組換えＳｄｒＣタンパク質は、黄色ブドウ球菌株ＪＥ２から調製された全細胞溶解物（Ｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｇｅｎｅｓ”，ｍＢｉｏ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４  Ｉｓｓｕｅ  １  ｅ００５３７−１２（２０１３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）とのインキュベート後、ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼが発現しない点を除いてＪＥ２の同族誘導体である黄色ブドウ球菌ＮＥ１０５から調製された溶解物とのインキュベート後に検出されたものとは対照的に、ウェスタンブロットにより特異的タンパク質バンドが検出された（実施例１４のＷＯ２０１５０８９０７３を参照。これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、精製された組換えＳｄｒＣタンパク質のＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼの組換え形態とのインキュベーションは同様に、ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）の存在に依存してｍＡｂ  ５１３３特異的エピトープを産生した（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９３４７；実施例１５）。
【０２４７】
本明細書の実施例１では、ｍＡｂ  ５１３３に対する最小エピトープをさらに限定するために、組換え黄色ブドウ球菌ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏグリコシル化の存在下または不在下で合成ペプチドへのｍＡｂ  ５１３３の結合を試験し、（ｉ）ｍＡｂ  ５１３３及びｍＡｂ  ５１３３−ＦＮ３融合タンパク質のエピトープ標的を、ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃの存在下で黄色ブドウ球菌ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼによって修飾されたＳＤ反復配列をわずか１０コピーしか含まないペプチド配列で最小限定義することができ、（ｉｉ）ＳｄｒＣタンパク質の他の配列、すなわち他の黄色ブドウ球菌ＳＤＲファミリーメンバー［クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）、クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、ＳｄｒＤ、またはＳｄｒＥ］は、ｍＡｂ  ５１３３によって認識される最小抗原エピトープの必須成分ではないことが示された。
【０２４８】
本明細書で実証するように、ｍＡｂ  ５１３３の最小エピトープは、ペプチドが１０個のＳＤ反復単位からなる場合に、単一のＧｌｃＮａｃ修飾セリン残基にさらに限定することができる。さらに、ｍＡｂ  ５１３３とＧｌｃＮａｃ部分との相互作用の特異性は、ＧｌｃＮａｃの存在下で測定したｍＡｂ  ５１３３の可変領域の高分解能構造から明らかである。
【０２４９】
手順。ペプチド、タンパク質、及び試薬。ペプチド試験のために、以下の配列を有する一連の２８残基ペプチドを合成して精製した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｉｎｃ．、Ｇａｒｄｎｅｒ，ＭＡ）：
（ｉ）
2018517708.tif 000033
（本明細書で「ＳＤペプチド」と称する）（配列番号６７０）；
（ｉｉ）
2018517708.tif 000034
（本明細書で「ＴＤペプチド」と称する）（配列番号１０８４）；
（ｉｉｉ）
2018517708.tif 000035
（本明細書で「ＳＤ−ＧｌｃＮａｃペプチド」と称する）（配列番号１０８５）。
【０２５０】
各ペプチドは８残基のポリヒスチジン配列を有し、さらに長鎖（ＬＣ）リンカーを介して連結されるアミノ末端ビオチン部分で修飾されている。「ＳＤ−ＧｌｃＮａｃペプチド」は、カルボキシル末端セリン残基に導入された単一のＧｌｃＮａｃを用いて合成した。
【０２５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグリコシル化反応のために、１００μｇのいずれかのペプチドを、１０％グリセロール及び３０μｇのウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１００μＬ中の組換えＳｄｇＢタンパク質４μｇと３７℃で１時間インキュベートした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグリコシル化度の分析は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析により測定した。ＳＤ、ＴＤ、及びＳＤ−ＧｌｃＮＡｃペプチド（＋／−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳｄｇＢ媒介性グリコシル化）へのｍＡｂ  ５１３３の結合を、プレートによるＥＬＩＳＡ形式を用いて測定した。この形式では、ＰＢＳ中のストレプトアビジン５μｇ／ｍＬでコーティングして、４℃で一晩インキュベートした高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）にビオチン化ペプチドを捕捉した。ＨＲＰをコンジュゲートしたＦ（ａｂ’）２断片ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０９−００６−１４９、ロット１１２９３２）を用いて、結合した試験品の検出を行い、ＨＲＰをコンジュゲートした抗ポリヒスチジン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ０５０ＨポリヒスチジンＨＲＰ  ＭＡｂクローンＡＤ１．１．１０）の使用によりストレプトアビジンプレートに結合したＳＤペプチド（＋／−グリコシル化）を検出した。次いで、ＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１５８２９５０００１）をプレートに添加し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒで４０５ｎｍの吸光度を直ちに読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してデータを解析した。値を対数スケールに変換し、非線形回帰シグモイド用量反応式を用いてフィッティングし、ＳＤペプチド（＋／−グリコシル化）抗原に対する各抗体について１１点の結合曲線を得た。
【０２５２】
ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼの組換え形態（配列番号９９）を実施例１に記載されるように精製した。ｍＡｂ  ５１３３のＦａｂ変種、ＳＭ１Ｂ２２９（配列番号１０８２  ＨＣ及び１０８３  ＬＣ；表１の構築物３６）を、ＨＥＫ  ２９３細胞での一過性発現によって産生し、Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィー、ＳＥＣ、及び２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌの最終緩衝液でイオン交換によって精製した。Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃを）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号Ａ８６２５）から購入した。共結晶化のため、ＳＭ１Ｂ２２９  Ｆａｂを最終濃度１００ｍＭに濃縮したＧｌｃＮＡｃと混合した。最終サンプルは、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ中、ＳＭ１Ｂ２２９  Ｆａｂ１６ｍｇ／ｍＬであった。
【０２５３】
結晶化。結晶化スクリーニングは、２０％ＰＥＧ  ３３５０、０．１Ｍ硝酸アンモニウム、０．１Ｍギ酸カリウム中で、ＳＭ１Ｂ２２９  Ｆａｂの結晶種を使用してシーディングすることにより実施した。
【０２５４】
データ収集及び処理。２０．２％ＰＥＧ３３５０、０．２Ｍフッ化ナトリウムから結晶を採取し、２１．６％ＰＥＧ３３５０、０．２Ｍフッ化ナトリウム、２０％グリセロールからなる凍結保護溶液と混合した。この結晶を液体窒素中でフラッシュ冷却した。ＳＭ１Ｂ２２９＋ＧｌｃＮＡｃのＸ線回折データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ビームラインＩＭＣＡ−ＣＡＴ）で収集し、Ｐｉｌａｔｕｓ  ６Ｍ検出器を用いて検出した。回折強度はＸ−ｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＸＤＳ）ソフトウェアパッケージで処理した。
【０２５５】
構造決定及び分析。分子置換は、Ｐｈａｓｅｒ（Ｒｅａｄ，”Ｐｕｓｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，”Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５７（１０）：１３７３−１３８２（２００１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、遊離ＳＭ１Ｂ２２９  Ｆａｂ構造からなる検索モデルで実施した。精密化はＰｈｅｎｉｘ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＨＥＮＩＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ”，Ｊ．Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔ．１１（１）：５３−５５（２００４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて実施し、モデルフィッティングはＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｏｔ：ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ，”Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０（１２  Ｐｔ  １）：２１２６−２１３２（２００４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて実施した。精密化統計値を表３にまとめる。グラフィックはすべてＰｙｍｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  ＬＬＣ、ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて生成し、他のすべての計算はＣＣＰ４（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  １９９４）を用いて実施した。ＳＭ１Ｂ２２９  Ｆａｂ／ＧｌｃＮａｃ共結晶構造は分解能２．５０オングストロームまで分析した。
【０２５６】
（表３）ＧｌｃＮａｃの存在下でＳＭ１Ｂ２２９（ｍＡｂ  ５１３３のＦａｂ変種）について決定された構造のＸ線データ統計値及び精密化統計値を示す
2018517708.tif 000036
【０２５７】
結果。ｍＡｂ  ５１３３に対する最小エピトープをさらに限定するために、ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏグリコシル化をした、またはしていない一連の合成ペプチドを用いた。図２４Ａに示されるように、どのｍＡｂ  ５１３３もグリコシル化されていないＳＤペプチドと結合しないことは明らかである。対照的に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃの存在下でのＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾後には、強力な結合性が観察される。予測された通り、ＳｄｇＢによる事前処理の有無を問わずＴＤペプチドとｍＡｂ  ５１３３が結合しないことが明らかであり、またＭＡＬＤＩ分析によりＴＤペプチドがグリコシル化されないことが明らかであった。これらのデータは、ＳＤ反復ペプチドまたはタンパク質のセリン残基に特異的なＧｌｃＮａｃの付加における、ＳｄｇＢグリコシルトランスフェラーゼの特異性を実証している。最後に、「ＳＤ−ＧｌｃＮａｃ」ペプチドのカルボキシル末端セリン残基への単一のＧｌｃＮａｃ残基の化学的導入により、ＳｄｇＢ修飾されたＳＤペプチドで観察された結合親和性の約４００分の１と明らかに結合親和性が弱い、ｍＡｂ  ５１３３に対する結合エピトープが形成されることが観察された。
【０２５８】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）との複合体のＳＭ１Ｂ２２９（ｍＡｂ  ５１３３のＦａｂ変種）のＸ線結晶構造は分解能２．５０オングストロームで決定した。表３は、ＧｌｃＮａｃの存在下でＳＭ１Ｂ２２９（ｍＡｂ  ５１３３のＦａｂ変種）について決定された構造のＸ線データ統計値及び精密化統計値を示す。非対称単位あたり４つの分子（重鎖のＩＤ：Ｈ、Ａ、Ｃ、Ｅ；軽鎖のＩＤ：Ｌ、Ｂ、Ｄ、Ｆ）が存在する。ＧｌｃＮＡｃは、ＨＬ及びＡＢの２つのコピーにのみ見出され、ＧｌｃＮＡｃ分子は鎖Ｈ及び鎖Ａに結合する。ＨＬ及びＡＢの可変領域は、ｒｍｓｄ＝０．２７で重なり、ＧｌｃＮＡｃは両方のコピーと同じ方向である。構造解析は、コピーＡＢを用いて実施した。図２４Ｂに示されるように、ＧｌｃＮＡｃはＨ３−ＣＤＲ（Ｆ）の残基Ｒ９８−Ｈ１０９によって形成される結合ポケット内に位置している。ＧｌｃＮＡｃへの結合は、Ｔ１０３及びＹ１０６の側鎖ヒドロキシル基の水素結合相互作用と、Ｇ１００、Ｙ１０５、及びＹ１０６の主鎖水素結合によって媒介される。Ｙ１０６とＧｌｃＮＡｃのグルコピラノシル環とのスタッキング相互作用も存在する（図２４Ｂ〜２４Ｃ）。軽鎖はこの相互作用に関与しない。
【０２５９】
セリン残基のＧｌｃＮＡｃ修飾は、高極性で酸性と予測される抗原を形成する。ＳＭ１Ｂ２２９の静電表面電位は、図２４Ｃに示す可変重鎖領域配列に示されるアミノ酸で構成される、ＣＤＲ−Ｈ３によって形成される塩基性ポケットを表す（太字及び下線の配列を参照）。Ｔｙｒ３２（ＶＨ）とＴｙｒ９１（ＶＬ）が一列になり、ポケットを完成する。同定されたＧｌｃＮＡｃの結合部位に加えて、ポケットに沿って並んだ周囲の塩基性ＣＤＲ−Ｈ３（Ａｒｇ及び／またはＨｉｓ）残基は、ＳＤＲタンパク質の酸性アスパラギン酸残基（複数可）と相互作用する可能性が高い。
【０２６０】
まとめ。本明細書に記載の試験ではさらに、ｍＡｂ  ５１３３の最小結合エピトープが、ＳＤ反復配列の場合に、単一のＧｌｃＮａｃ修飾セリン残基に限定されている。ＧｌｃＮＡｃと複合体化されるＳＭ１Ｂ２２９（ｍＡｂ  ５１３３のＦａｂ変種）の構造は、ＧｌｃＮＡｃ部分の形状と固有に相互作用することが明らかである。最後に、抗原結合ポケットの観察により、抗原の酸性アスパラギン酸残基と結合することが予測される残基を明らかにし、複数のＳｅｒＧｌｃＮａｃＡｓｐ単位が収容され得ることを示している。
【０２６１】
実施例２５：黄色ブドウ球菌のアルファヘモリシン（Ｈｌａ）に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの特性決定
本実施例では、黄色ブドウ球菌のアルファヘモリシン（Ｈｌａ）タンパク質に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン変種の特性決定について記載する。
【０２６２】
手順。タンパク質試薬。本試験に加えた試験品には、Ｈｌａ結合物質として選択された組換え型、精製済みポリヒスチジン標識型のＬｕｋ９６７（配列番号１０９７）、Ｌｕｋ９６９（配列番号１０９９）、Ｌｕｋ９８２（配列番号１１１２）、Ｌｕｋ１０１２（配列番号１１４２）、Ｌｕｋ９７０（配列番号１１００）、及び親対照ＦＮ３結合ドメインタンパク質ＴＥＮＣＯＮ親（配列番号１２４１）を含めた。すべてをニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって標準方法を使用して大腸菌から精製した。Ｈｌａのトキソイド（Ｈ３５Ｌ）形態のポリヒスチジン標識変種（Ｍｅｎｚｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｏｘｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ，”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：１８４３−４７（１９９４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）をニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって大腸菌から精製した。これは配列番号１０８６に対応する。ＥＬＩＳＡアッセイのために、ＳｕｒｅＬＩＮＫ（商標）Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＨｌａＨ３５Ｌをｉｎ  ｖｉｔｒｏでビオチン化した。ビオチンとコンジュゲートされたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（アルブミン１モルあたりビオチン１０〜２０モル）を、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．から購入した（製品番号００９−０６３３）。アルファヘモリシンに特異的なマウスモノクローナル［８Ｂ７］はＩＢＴ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓから購入した（製品番号０２１０−００１）。最後に、ポリヒスチジン配列の検出に特化したＨＲＰコンジュゲートモノクローナル抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（製品番号ＭＡＢ０５０Ｈ）。
【０２６３】
ＥＬＩＳＡアッセイ。精製した組換えＨｌａＨ３５Ｌタンパク質及びＨＳＡに対するＦＮ３ドメインタンパク質及び対照試験品の相対的結合をＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔には、５μｇ／ｍＬストレプトアビジンの１００μｌ溶液（ＰＢＳ中）を９６ウェル白色Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４３６１１０）の各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ウェルをＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、３００μＬ／ウェルのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３７５４３）でブロックし、室温（ＲＴ）で４５〜６０分間インキュベートした。次いで、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、０．２μｇのビオチン化型標的抗原（１００μＬ中のＨＳＡまたはＨｌａＨ３５Ｌ）を各試験ウェルに添加し、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。試験品をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０で１μＭに希釈し、１００μＬを試験ウェルに添加して、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。ＦＮ３ドメイン結合した試験品を検出するため、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０で１：５０００に希釈したポリクローナル抗ＦＮ３−ＨＲＰ抗体を１００μＬ／ウェル添加し、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。結合した試験品を検出するため、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０で１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ、ＦＣ−γ断片特異的抗体のペルオキシダーゼコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製品１１５−０３６−０７１）１００μＬ／ウェルを添加し、プレートを穏やかに振盪しながら室温で４５〜６０分間インキュベートした。次いでプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。結合したヤギ抗マウス抗体のＦ（ａｂ’）２断片を検出するために、ＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１５８２９５０００１）１００μＬ／ウェルをプレート測定の直前に添加し、基質添加から１５分以内にＥｎｖｉｓｉｏｎリーダーを使用してプレートを読み取った。
【０２６４】
結果。図２５Ａは、ＨＳＡ及びＨｌＡＨ３５Ｌタンパク質の両方に関して、それぞれの試験品に検出された相対的なＥＬＩＳＡシグナルを示す。予測された通り、ＦＮ３ドメインタンパク質は、ＨｌａＨ３５Ｌタンパク質の結合には明らかな範囲の効果を示しているが、ＨＳＡとの検出可能な結合はごくわずかしか示していない。試験した条件下で一部のＦＮ３ドメインタンパク質よりもシグナルが弱いものの、ＨｌＡＨ３５Ｌタンパク質に対する「８Ｂ７」マウスモノクローナル抗体の特異的結合もまた明らかである。最後に、対照として、抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いた検出によって、プレートに結合したＨｌＡＨ３５Ｌタンパク質の検出が示されている。
【０２６５】
まとめ。これらのデータは、ＦＮ３ドメイン変種が、黄色ブドウ球菌  Ｈｌａ（アルファヘモリシン）タンパク質への特異的な結合を示すと同定できることを示している。黄色ブドウ球菌の他の毒素タンパク質と選択的に結合する関連ＦＮ３ドメイン変種の過去の特性決定に基づいて（Ｔｏｒｒｅｓに対するＷＯ２０１５０８９０７３を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、本明細書に記載のＦＮ３ドメイン変種のサブセットがＨｌａの細胞溶解活性を中和することが予想される。
【０２６６】
実施例２６：ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ１７の中和エピトープを保持するＬｕｋＡＢのステムドメイン突然変異体の特性決定
黄色ブドウ球菌の二成分ロイコシジンのいわゆるステムドメインは、宿主細胞膜を貫通し、浸透圧溶解による細胞死を引き起こす、毒素の活性オリゴマー性膜孔形態の形成に必要とされる重要な構造要素である。黄色ブドウ球菌のＬｕｋＥ及びＬｕｋＤ配列のアミノ酸配列の考察により、各ロイコシジンの単量体サブユニットのステムドメインに局在するグリシンリッチモチーフが以前に明らかにされており、配列中にインフレーム欠失を有するロイコシジン変種及び関連するロイコシジンの変種はいずれも毒素として不活性であり、ドミナントネガティブ表現型を示すことが見出された（Ｒｅｙｅｓ−Ｒｏｂｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｔｏｘｉｎｓ  ｔｏ  ｃｏｍｂａｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，”ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １７（３）：４２８−４０（２０１６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。膜孔中間体の立体構造におけるＬｕｋＡＢのヘテロ二量体構造の決定（実施例２１を参照）によって、より広範なステムループ欠失変種を設計するに至った。その特性を本明細書に記載する。そのような変異体はＬｕｋ１７  ＦＮ３ドメインタンパク質によって認識されるＬｕｋＡＢ中和エピトープを保持しており（実施例２１及び２２を参照）、その点でこれがワクチン組成物のタンパク質抗原として潜在的有用性を有することを本明細書で批判的に実証する。
【０２６７】
手順。タンパク質及び試薬。ステムドメインにインフレーム欠失＋／−挿入を有するＬｕｋＡ及びＬｕｋＢ変種を設計し、これを表４に記載する。各事例で、これらのステム変異体をＬｕｋＡＢタンパク質のトキソイド変種（ＬｕｋＡ  Ｅ３２３Ａ）に関連して作製し（ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｒｕｃｉａｌ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＬｕｋＡＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，”Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．８２（３）：１２６８−７６（２０１４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、さらにＬｕｋＡサブユニットのアミノ末端にポリヒスチジン配列を有するように遺伝子操作した。組換えＬｕｋＡＢステム変異体タンパク質を、各サブユニットを共発現する大腸菌細胞から精製し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって大腸菌から可溶性ヘテロ二量体として精製した。この試験のため、抗ＬｕｋＡＢ  Ｌｕｋ１７  ＦＮ３ドメインタンパク質の変種、及び親ＴＥＮＣＯＮ対照ＦＮ３ドメインタンパク質を、ポリヒスチジンとストレプトアビジン両方の結合配列を含むカルボキシル末端伸長を有するように遺伝子操作した。これらは、それぞれ配列番号１１５３と１１５２に対応し、本明細書でＬｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡ及びＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡと称する。両方のタンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって、ビオチンリガーゼを発現する大腸菌株から精製した。
【０２６８】
（表４）ＬｕｋＡ及びＬｕｋＢステムドメイン変異体
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*PDBファイル4TW1に従うアミノ酸付番
【０２６９】
Ｌｕｋ１７  ＦＮ３ドメイン結合試験。ＬｕｋＡＢ及びＬｕｋＡＢステム突然変異体への、ビオチン化変種のＬｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡ及びＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡ  ＦＮ３ドメインタンパク質の結合を、ＯｃｔｅｔＲＥＤ  ３８４機器（ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｉｎｃ．）を使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により決定した。簡潔には、Ｌｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡ及びＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡタンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、濃度１０μｇ／ｍＬでＤｉｐ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ（商標）ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーピン上に５分間ロードした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で１分間洗浄することによりベースラインを設定した。その後、ＬｕｋＡＢまたはステムドメインＬｕｋＡＢ変種を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、濃度１０ｕｇ／ｍＬでロードし、５分間にわたり会合を測定した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で１分間洗浄することによりベースラインをリセットした。
【０２７０】
結果。図２６Ａは、ＬｕｋＡＢトキソイドタンパク質（ＬｕｋＡ  Ｅ３２３Ａ）に対するＬｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡとＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡタンパク質の会合を示している。予測された通り、Ｌｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡと対照的に、親対照ＦＮ３ドメインタンパク質ＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡでは結合が検出されない。図２６Ｂ〜２６Ｃは、ＬｕｋＡとＬｕｋＢ両方のステムドメインに短いグリシンリッチ配列の標的化インフレーム欠失を有する、ＬｕｋＡＢｍｕｔ１及びＬｕｋＡＢｍｕｔ２ステムドメイン変種（表４）に対するＬｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡとＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡタンパク質の会合（ＤｕＭｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．８２（３）：１２６８−７６（２０１４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を示す。各場合において、Ｌｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡタンパク質の結合は観察されたが、ＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡタンパク質の明らかな結合は観察されていない。これはＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質のＬｕｋＡＢ中和エピトープが、ＬｕｋＡＢｍｕｔ１及びＬｕｋＡＢｍｕｔ２ステムドメイン変種で保持されていることを示している。
【０２７１】
同様に、図２６Ｄは、ＬｕｋＡ及びＬｕｋＢのステムドメイン全体が短い柔軟なペプチド挿入配列、すなわち（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ）２で置換されているＬｕｋＡＢｍｕｔ３変種に対するＬｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡとＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡタンパク質の会合を示している。膜孔中間体の立体構造におけるＬｕｋＡＢのヘテロ二量体構造の分析（実施例２１を参照）によって、このステム突然変異体及び関連変種（配列番号１０２３、１０２４、１０２５、１０３０、１０３１、及び１０３２）を設計した。この場合も、Ｌｕｋ１７−Ｈｉｓ−ＳＡタンパク質の結合は観察されたが、ＴＥＮＣＯＮ−Ｈｉｓ−ＳＡタンパク質の明らかな結合は観察されていない。これはＬｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質のＬｕｋＡＢ中和エピトープが、ＬｕｋＡＢｍｕｔ３ステムドメイン変種で保持されていることを示している。
【０２７２】
まとめ。本明細書に記載の試験では、ＬｕｋＡＢロイコトキシンの構造に基づく設計変種の、ワクチン抗原としての可能性を確定している。具体的には、宿主細胞膜内または宿主細胞膜での局在化に必要とされる活性オリゴマー性膜孔形態の形成に重要なループ配列内のインフレーム欠失を有するＬｕｋＡＢ変種は、Ｌｕｋ１７  ＦＮ３タンパク質に対するＬｕｋＡＢ中和エピトープを保持している。その点で、そのようなＬｕｋＡＢ変種をワクチン組成物のタンパク質抗原として使用すると、同様にＬｕｋＡＢに結合してその細胞溶解活性を中和する生成抗体を誘発することが期待される。
【０２７３】
実施例２７：血清曝露が延長された抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質は、致死量のロイコトキシンＬｕｋＥＤからマウスを保護する
ＦＮ３ドメインタンパク質は、１０〜１１ｋＤａの範囲の分子量を有し、約７０ｋＤａの糸球体濾過分子量カットオフ値を大幅に下回っているため、腎クリアランスによって血流から迅速に除去される。したがって、血清中のＦＮ３ドメインタンパク質の測定半減期は短い（１時間未満）。本実施例では、親ＦＮ３ドメインタンパク質が、融合タンパク質の血清曝露を延長する特性を付与するパートナータンパク質ドメインと遺伝的に融合されるように設計された融合タンパク質の特性決定について記載する。第１の例では、抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ２６は、血清アルブミンに結合するＦＮ３ドメインタンパク質と融合される。第２の例では、抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ２６は、トランスフェリンに結合するＦＮ３ドメインタンパク質と融合される。第３の例では、抗ＬｕｋＥ  ＦＮ３ドメインタンパク質Ｌｕｋ２６は、血清アルブミン結合ドメインタンパク質と融合される。各例では、親ＦＮ３ドメインタンパク質、ＴＥＮＣＯＮと同等の融合タンパク質もまた作製した。いずれの場合も、Ｇ４Ｓリンカーの４つのコピーを融合接合部に使用し、精製を容易にするためポリヒスチジン配列をカルボキシル末端に付加した。血清アルブミン及びトランスフェリンは、血中で最も高濃度なタンパク質のうちの２つであり、これらの血清タンパク質それぞれの高親和性結合ドメインとＦＮ３ドメインタンパク質との融合は、親ＦＮ３ドメインタンパク質と比較したとき、融合タンパク質の血清中での滞留時間（及び血清中での曝露）の延長をもたらすと想定した。
【０２７４】
手順。試験品。表５は、本明細書に記載の試験で用いた試験品の詳細を示す。いずれの場合も、タンパク質は、標準方法を使用してニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより大腸菌から精製し、エンドトキシン混入物質は市販のキット（Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ装着Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）Ｕｎｉｔ、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．）を用いて除去した。
【０２７５】
（表５）利用した試験品
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【０２７６】
血清中の試験品の検出。試験品をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で調製し、それぞれ５００μｇ（体積１００μＬ）を５〜６週齢の雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＮＤ４マウスに、試験品あたり１群３匹の動物を用いて眼窩後（ＲＯ）経由で投与した。投与後２時間で５０μＬの血液を尾部経由で各動物から採取し、さらに２４時間後、血液サンプルを末端心臓穿刺によって得た。各時点で、血液を血清分離チューブに回収し、少なくとも３０分間静置した後、４５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで血清サンプルを回収し、以降の分析に備え−８０℃で凍結した。ウェスタンブロットによる分析のため、各血清サンプルのアリコートを氷上で解凍し、１群３匹の動物それぞれからの血清を混合することにより、２時間後及び２４時間後のサンプル用に血清を試験品ごとにプールした。各サンプルをＰＢＳで１：１０に希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにレーンあたり２μＬをロードした。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＴＥＮＣＯＮ  ＦＮ３結合ドメインタンパク質のフレームワークに特異的であり、Ｌｕｋ２６  ＦＮ３ドメインタンパク質と交差反応性であるウサギモノクローナル抗体の蛍光コンジュゲート（ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＬＴ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｄｙｅ（ＬＩＣＯＲ））調製物を用いて試験品を検出した。
【０２７７】
ＬｕｋＥＤ中和試験。ＦＮ３ドメイン試験品を、開始濃度７．２μＭの漸減濃度で、新たに単離したヒトＰＭＮ上の一定用量（ＬＤ９０）の精製済みＬｕｋＥＤに対して加えた。健常ドナーから新たに単離したヒトＰＭＮ（ｈＰＭＮ、２００，０００）をＲＰＭＩ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．１％ヒト血清アルブミン中で最終体積１００μｌにし、１時間、毒素負荷した。ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１時間、毒素負荷した後、プレートを１５００ＲＰＭで１０分間遠心沈殿させた後に、上清２５μｌを慎重に新しいプレートに移した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を残存細胞に添加し、１．５時間インキュベートした。損傷膜を有する細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出量を迅速に測定するため、上清２５μｌを同量のＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。培養培地へのＬＤＨの放出を、レサズリンが変化して蛍光レゾルフィン生成物となる１０分間の結合酵素アッセイを用いて測定した。ｅｘ  ｖｉｖｏ中和実験では、精製したＬｕｋＥＤを最終濃度７２．５ｎＭ（サブユニットあたり２．５μｇ／ｍＬ）で使用した。
【０２７８】
ＬｕｋＥＤ毒性試験。５週齢のＮＤ４マウスを各試験品の１３８．７μＭ標準化ストック１３０μｌで、各群３匹のマウスへの静脈内（ＩＶ）眼窩後投与により処置した。１時間後、サブユニットあたり６μｇのＬｕｋＥＤ（致死量）ＩＶで精製毒素によりマウスに毒素負荷した後、呼吸困難、毛の逆立ち、及び麻痺／運動の欠如といった切迫した死の徴候をモニターした。次いで、最初の毒素負荷で生存したマウスに第２の致死用量のＬｕｋＥＤを第１の致死用量のＬｕｋＥＤの投与から約４．５時間後にＩＶ投与した（５時間の合計２４μｇ）。既述と同様にマウスの切迫した死の徴候をモニターした。さらなる試験では、投与したＬｕｋＥＤ毒素に対して１倍、１０倍、及び１００倍のモル比に相当する用量のＳＡＢＤ−ＬｕｋＥ２６によりマウスを処置した後、投与後５、２４、及び４８時間に負荷した。
【０２７９】
結果。図２７Ａは、試験品それぞれを投与したマウスからの血清サンプルの分析を示す。予測された通り、ＴＥＮＣＯＮ（レーン１）タンパク質もＬｕｋＥ２６  ＦＮ３結合ドメイン（レーン２）タンパク質も、投与から２時間後または２４時間後いずれにも検出されなかった。対照的に、ＦＮ３ドメイン融合タンパク質はそれぞれ投与後２時間及び２４時間の両方で検出され、ＬｕｋＥ２６融合タンパク質は投与後２４時間で全体的に多少低いレベルを示した。これらのデータは、ＴＥＮＣＯＮまたはＬｕｋＥ２６  ＦＮ３結合ドメインタンパク質のいずれもが、３つのタンパク質融合パートナーいずれかとの融合により、血中での期待される滞留時間（及び血中での曝露）の増加をもたらすことを示している。
【０２８０】
図２７Ｂは、ＳＡＦＮ３−ＴＥＮＣＯＮ、ＳＡＦＮ３−ＬｕｋＥ２６、及び親ＦＮ３ドメインタンパク質の投与から１時間後の致死用量のＬｕｋＥＤロイコシジンの投与後のマウスの相対的保護を示す。試験品組成及び血清曝露から予測される通り、ＳＡＦＮ３−ＬｕｋＥ２６タンパク質でのみ保護が観察された。次いで、ＳＡＦＮ３−ＬｕｋＥ２６タンパク質の投与により保護されたマウスに、最初のＬｕｋＥＤの負荷から約４．５時間後に再負荷（５時間の合計２４μｇ）した。観察されたマウスの相対的保護を図２７Ｃに示す。この場合も、ＳＡＦＮ３−ＬｕｋＥ２６群に１００％の保護が観察された。
【０２８１】
図２７Ｄは、ＳＡＢＤ−ＴＥＮＣＯＮ、ＳＡＢＤ−ＬｕｋＥ２６、及び親ＦＮ３ドメインタンパク質の投与から１時間後の致死用量のＬｕｋＥＤロイコシジンの投与後のマウスの相対的保護を示す。試験品組成及び血清曝露から予測される通り、ＳＡＢＤ−ＬｕｋＥ２６タンパク質でのみ保護が観察された。次いで、ＳＡＢＤ−ＬｕｋＥ２６タンパク質の投与により保護されたマウスに、最初のＬｕｋＥＤの負荷から約４．５時間後に再負荷（５時間の合計２４μｇ）した。観察されたマウスの相対的保護を図２７Ｅに示す。この場合も、ＳＡＢＤ−ＬｕｋＥ２６群に１００％の保護が観察された。
【０２８２】
図２７Ｆは、ＴＦＦＮ３−ＬｕｋＥ２６、ＴＦＦＮ３−ＴＥＮＣＯＮ、及び親ＦＮ３ドメインタンパク質の投与から１時間後の致死用量のＬｕｋＥＤロイコシジンの投与後のマウスの相対的保護を示す。試験品組成及び血清曝露から予測される通り、ＴＦＦＮ３−ＬｕｋＥ２６タンパク質でのみ保護が観察された。
【０２８３】
図２７Ｇ〜２７Ｈは、ＬＤＨの放出（図２７Ｇ）及び生存細胞の測定値としてのＡＴＰの定量（図２７Ｈ）によって決定される、試験品の存在下で観察されたＬｕｋＥＤ媒介性のｈＰＭＮ細胞溶解の保護の程度を示す。予測された通り、ＬｕｋＥＤ媒介性のｈＰＭＮ細胞溶解からの保護は、ＬｕｋＥ２６を有する４つの試験品でのみ観察された。
【０２８４】
最後に、図２７Ｉは、ＬｕｋＥＤよりもＳＡＢＤ−Ｌｕｋ２６の分子量が１倍、１０倍、１００倍でＳＡＢＤ−Ｌｕｋ２６を投与後、５、２４、及び４８時間後に致死用量のＬｕｋＥＤロイコシジンを逐次投与した後のマウスの保護の程度を示す。本試験では、モル比１：１のＳＡＢＤ−Ｌｕｋ２６及びＬｕｋＥＤの投与から５時間後にＬｕｋＥＤを負荷したとき、保護は観察されなかった。対照的に、ＳＡＢＤ−Ｌｕｋ２６：ＬｕｋＥＤのモル比１０：１及び１００：１での投与後、５時間及び２４時間では、いずれも１００％の保護が観察されており、１００：１の用量の場合、４８時間を超えても１００％の保護が観察されている。
【０２８５】
まとめ。本明細書に記載の試験は、ＬｕｋＥに結合してＬｕｋＥＤのｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞溶解活性を中和するＦＮ３ドメインタンパク質が、血清の滞留時間、及び血清中での曝露を延長するように、血清タンパク質と結合するタンパク質ドメインに融合されている場合、ＬｕｋＥＤ毒素によって媒介される致死中毒からマウスを保護できることを立証している。細菌毒素の細胞溶解活性を中和するタンパク質生物製剤の設計と開発に関連して、本出願の別の箇所で例示した軽鎖及び／または重鎖配列を介した免疫グロブリンへの付加物を含め、血清滞留時間と露出を延長するはずである毒素標的ＦＮ３ドメインタンパク質に対する多数の融合パートナーを想定することができる。
【０２８６】
（表６）本開示の核酸及びアミノ酸配列
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【０２８７】
本明細書で好ましい実施形態を示し、詳細に説明してきたが、本開示の趣旨から逸脱することなく、種々の変更、追加、置換などがなされ得るため、これらも以下の特許請求の範囲に定義されるような本開示の範囲内にあると見なされることは当業者に明らかであろう。
【図１Ａ】
2018517708.tif 000234
【図１Ｂ】
2018517708.tif 000235
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
2018517708.tif 000239
【図２Ａ】
2018517708.tif 000240
【図２Ｂ】
2018517708.tif 000241
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2018517708.tif 000243
【図３Ｂ】
2018517708.tif 000244
【図３Ｃ】
2018517708.tif 000245
【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2018517708.tif 000248
【図４Ｃ】
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【図５】
2018517708.tif 000250
【図６】
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【図７Ａ】
2018517708.tif 000252
【図７Ｂ】
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【図８】
2018517708.tif 000254
【図９】
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【図１０】
2018517708.tif 000256
【図１１Ａ】
2018517708.tif 000257
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
2018517708.tif 000260
【図１４Ａ】
2018517708.tif 000261
【図１４Ｂ】
2018517708.tif 000262
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
2018517708.tif 000266
【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
2018517708.tif 000268
【図１７Ｃ】
2018517708.tif 000269
【図１８】
2018517708.tif 000270
【図１９】
2018517708.tif 000271
【図２０】
2018517708.tif 000272
【図２１Ａ】
2018517708.tif 000273
【図２１Ｂ】
2018517708.tif 000274
【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
2018517708.tif 000277
【図２１Ｆ】
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【図２２】
2018517708.tif 000279
【図２３Ａ】
2018517708.tif 000280
【図２３Ｂ】
2018517708.tif 000281
【図２３Ｃ】
2018517708.tif 000282
【図２４Ａ】
2018517708.tif 000283
【図２４Ｂ】
2018517708.tif 000284
【図２４Ｃ】
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【図２５】
2018517708.tif 000286
【図２６Ａ】
2018517708.tif 000287
【図２６Ｂ】
2018517708.tif 000288
【図２６Ｃ】
2018517708.tif 000289
【図２６Ｄ】
2018517708.tif 000290
【図２７Ａ】
2018517708.tif 000291
【図２７Ｂ】
2018517708.tif 000292
【図２７Ｃ】
2018517708.tif 000293
【図２７Ｄ】
2018517708.tif 000294
【図２７Ｅ】
2018517708.tif 000295
【図２７Ｆ】
2018517708.tif 000296
【図２７Ｇ】
2018517708.tif 000297
【図２７Ｈ】
2018517708.tif 000298
【図２７Ｉ】
2018517708.tif 000299
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月6日(2018.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018517708000001.app
【国際調査報告】
2018517708.tif 000300
2018517708.tif 000301
2018517708.tif 000302