(57)【要約】  本発明は、タンパク質コンジュゲートに関し、特に3つ以上のタンパク質又はポリペプチドのコンジュゲートに関する。本化合物は、所望の生成物を効率的に生産することができる三価リンカー部分を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造
【化１】
2018535195.tif 000110
[式中、
リンカーは化学的部分であり、
Sは硫黄原子であり、
タンパク質1は、リンカー及び硫黄原子を介してタンパク質2及びタンパク質3に共有結合的に連結されている]
のタンパク質コンジュゲート。
【請求項２】
コンジュゲートが以下の構造:
【化２】
2018535195.tif 000111
を有する、請求項1に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項３】
コンジュゲートが以下の構造
【化３】
2018535195.tif 000112
[式中、Uは中心の単位を表し、RRは反応性末端基を表し、S1、S2及びS3は個々のスペーサーを表す]
を有する、請求項1に記載のタンパク質コンジュゲート。
【請求項４】
硫黄原子(-S-)がチオエーテル(-CH2-S-CH2-)の一部である、請求項1から3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
Uが窒素原子を含むか又は窒素原子のみからなる、請求項3に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
タンパク質2及びタンパク質3がFcポリペプチドであり、コンジュゲートが以下の構造
【化４】
2018535195.tif 000113
から選択される構造を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
コンジュゲートが構造:
タンパク質1-RR-S1-U-[S2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc]2
[式中、
RRは反応性末端基であり、
Uは中心の単位を表し、
S1及びS2は個々のスペーサーを表し、
FcはFcポリペプチドである]
を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
タンパク質1が成長ホルモンである、請求項1から7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
コンジュゲートが構造:
GH-RR-S1-U-[S2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc]2
[式中、
GHは成長ホルモン分子を表し、
RR1は反応性末端基を表し、
Uは中心の単位を表し、
S1及びS2は個々のスペーサーを表し、
FcはFcポリペプチドである]
を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
各Fcポリペプチドのヒンジ領域がCys残基を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
硫黄原子(-S-)がタンパク質システイン、例えば野生型Cys残基又は変異体Cys残基に由来する、請求項1から10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
タンパク質1及びS1が-S-CH2-C(=O)-NH-を介して連結されている、請求項3から11のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
構造:
【化５】
2018535195.tif 000114
[式中、Uは中心の単位を表し、S1、S2及びS3は個々のスペーサーを表し、R1、R2及びR3は個々に反応性末端を表し、R1、R2及びR3は同一ではない]
の三価リンカー。
【請求項１４】
R2及びR3が-NH-C(=O)-CH2-LGを含み、構造:
【化６】
2018535195.tif 000115
[式中、LG2及びLG3はハロゲン脱離基である]
のリンカーを提供する、請求項13に記載のリンカー。
【請求項１５】
タンパク質1-SH、タンパク質2-SH及びチオール反応性リンカーを一緒にカップリングして、式II
タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2  (式II)
[式中、チオール反応性リンカーは構造:
LG1-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2
(式中、LG1はLG2より高い反応性を有する)
を有する]
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
b)  タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1と反応させる工程と、
c)  コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2を得る工程と、
d)  脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
e) d)のコンジュゲート中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
f)  タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、タンパク質コンジュゲート及びその調製方法である。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質コンジュゲートは多くの状況において有用であり、複雑性が増している生物学的治療用化合物の同定及び開発は、このような化合物を調製するための興味深い方法に着目してきた。2つ以上のタンパク質の連結では、タンパク質が従来の化学的成分と同程度には安定的ではなく、通常、タンパク質に損傷を与えることなく従来の反応化学を適用することは難しいため、困難を伴う。
【０００３】
特性改質剤(property modifying agent)を用いるタンパク質のコンジュゲーションは、様々なアミノ酸残基に、例えば、N末端残基、C末端残基、並びに、例えば特性改質剤の末端に配置されている様々な反応性基と反応し得るCys、Lys、Gln及びSer等の内部アミノ酸残基に連結する様々な方法によって得られている。
【０００４】
従来、タンパク質は、ペプチドリンカーによりできる限り連結された融合タンパク質の発現によって組換えにより連結されてきた。この戦略では、生産上の問題に直面し得る非常に大きなタンパク質分子が発現する可能性があり、効率的に生産することができる化合物の範囲が制限される。
【０００５】
融合タンパク質の代わりに、国際公開第2005001025号には、未変性ライゲーション、例えば、アミド結合形成をもたらすチオエステルのN末端システインへの連結も記載されている。このような連結もまた、タンパク質のN末端に制限される。
【０００６】
タンパク質の化学的連結は、ジ-ハロメチレン-ベンゼン、アジドとアセチレン単位の間の「クリック」ケミストリー、及び国際公開第201001196号に記載されているような末端にプロピオンアルデヒドを有するPEGリンカーを使用して探索されてきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2005001025号
【特許文献２】国際公開第201001196号
【特許文献３】国際公開第2011089250号
【特許文献４】国際公開第2011089255号
【特許文献５】国際公開第2012010516号
【特許文献６】国際公開第05001025号
【特許文献７】国際公開第2005070468号
【特許文献８】国際公開第2009027369号
【特許文献９】国際公開第05047334号
【特許文献１０】国際公開第05047335号
【特許文献１１】国際公開第05047336号
【特許文献１２】国際公開第05047337号
【特許文献１３】国際公開第2010052335号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995
【非特許文献２】Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Joseph Sambrook, E. F. Fritsch及びJ. Sambrook(著)
【非特許文献３】M. M. Kurfurst in Anal. Biochem. 200(2)、244-248、(1992)
【非特許文献４】Farge, F.ら、Journal of Chromatography (1976)、第123巻、247〜250ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
容易かつ効率的に生産することができる化合物形態(compound formats)の範囲を拡大するため、更なる連結技術の探索が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、タンパク質コンジュゲート及びそのようなコンジュゲートを調製する方法に関する。本方法は、2つ以上のタンパク質を規則的で位置選択的な方法で共有結合的に連結するのに有用であり得る。本タンパク質コンジュゲートは、1つ又は複数の治療用タンパク質、並びに1つ又は複数のエフェクタータンパク質を含み得る。本発明は、チオール反応性リンカーによるタンパク質-タンパク質コンジュゲーションに関する効果的なプロセスを提供する。例えば、異なる脱離基を有するハロ-アセトアミドを使用することにより反応物の連結を調節することができ、1つ又は複数のチオール-エーテルを介した連結が得られる。
【００１１】
このようなコンジュゲートの例は、次のとおりである:
【００１２】
【化１】
2018535195.tif 000002
【００１３】
本明細書で証明されているように、本方法は、Fc-コンジュゲートの形成に使用するのに成功した。Fcドメインは2つのFcポリペプチドを保持し、三価リンカーを使用することにより、Fcドメインは、2つのシステイン残基、例えば一般構造中の2つの個々のタンパク質を表す各Fcポリペプチド中のシステイン残基を介して目的のタンパク質に共有結合され得る。
【００１４】
本発明の一態様は、リンカーとそれぞれのFcドメインのポリペプチドの間の共有結合的連結を含むタンパク質-リンカー-Fcコンジュゲートに関する。
【００１５】
したがって、本発明は、構造
【００１６】
【化２】
2018535195.tif 000003
【００１７】
の化合物に関する。
【００１８】
Fcポリペプチドへの連結は、Fcポリペプチド中のシステイン残基由来の硫黄原子(-S-)を介している。
【００１９】
リンカーは化学的部分であり、したがって、タンパク質1は、リンカー及び硫黄原子を介してタンパク質2及びタンパク質3に共有結合的に連結している。
【００２０】
本発明の一態様は、様々なタンパク質コンジュゲートを調製するための本明細書で使用した三価リンカーに関する。一実施形態におけるリンカーは、少なくとも3つの結合機会を保持する-U=と呼ばれる中心の単位を包含する。リンカーの他の特徴は、中心の単位を反応性末端(R1〜R3)と連結するスペーサーエレメント1〜3(S1〜S3)であり、これらを使用してリンカーとタンパク質とをコンジュゲートすることができる。
【００２１】
一実施形態において、三価リンカーは、構造:
【００２２】
【化３】
2018535195.tif 000004
【００２３】
[式中、Uは、中心の単位を表し、
S1、S2及びS3は、個々のスペーサーを表し、
R1、R2及びR3は、個々に反応性末端を表す]
を有する。
【００２４】
本明細書で提供されている例は、窒素原子が適切な中心の単位であること、またチオール反応性末端が、コンジュゲートされる1つ又は複数のタンパク質中の遊離システインへの連結に適していることを証明している。
【００２５】
本発明の態様は、少なくとも2つのタンパク質がコンジュゲートされる、タンパク質コンジュゲートを調製する方法に関する。2つの異なる反応性末端を有するリンカーを使用することにより、順序ある反応プロセスが特異性、純度及び/又は収率を増加させることができる。一実施形態において、リンカーの反応性末端は、反応性が異なる反応性末端を提供する異なるハロゲンを有する2つのハロ-アセトアミドを保持する。第1のコンジュゲーション工程の後、コンジュゲート中間体は第2(又は第3)のタンパク質と反応させることができる。本方法の効力は、ハロ-アセトアミドのハロゲンの1つがClからIに交換された場合に増加する。本方法は、2つ以上のタンパク質のコンジュゲーションに使用可能であり、また2つのタンパク質が同一であって、同時にリンカーにコンジュゲートされる場合に使用され得る。
【００２６】
本発明の一実施形態は、タンパク質1-SH、タンパク質2-SH及びチオール反応性リンカーを一緒にカップリングして、式II
タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2  (式II)
[式中、チオール反応性リンカーは、構造:
LG1-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2
(式中、LG1は、LG2よりも高い反応性を有する)
を有する]
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
a)  タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1と反応させる工程と、
b)  コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C-(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e)  タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法に関する。
【００２７】
本明細書の開示から予測され得るように、開示されている方法、リンカー及び化合物は、例えば治療用製品の開発等において、複数の用途を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】タンパク質から本発明によるFcコンジュゲーションまでの概略図を示す。三価リンカーは、中心の単位(ここでは三角で示す)、独立したスペーサーエレメントS1、S2及びS3、並びに脱離基LG1、LG2及びLG3を含む。本方法を以下に説明する:1) コンジュゲートさせるタンパク質の混合ジスルフィド(I)を任意選択的に還元し、遊離Cys(-SH)(II)を有するタンパク質を得る2) 遊離Cys(-SH)(II)を三価リンカー(III)でアルキル化し、Cysコンジュゲートされたタンパク質リンカー中間体コンジュゲート(IV)を得る3) 水性フィンケルシュタインヨウ素交換反応(V)を介して、コンジュゲート中間体(IV)の脱離基LG2及びLG3を活性化し、ヨウ素活性化コンジュゲート中間体(VI)を得る4) Fcドメインジスルフィド架橋(VII)の選択的還元により、2つの還元型システイン(-SH)を有するFcドメイン(VIII)を得る5) 前記Fcドメイン(VIII)とヨウ素活性化コンジュゲート中間体(VI)とのカップリングにより、タンパク質-Fcコンジュゲート(IX)を得る。
【図２】本発明によるFcタンパク質コンジュゲーションの概略図を示す。三価リンカーは、中心の単位(ここでは三角で示す)、独立したスペーサーエレメントS1、S2及びS3、並びに脱離基LG1、LG2及びLG3を含む。本方法を以下に説明する:1) Fcドメインジスルフィド架橋(VII)の選択的還元により、2つの還元型システイン(-SH)を有するFcドメイン(VIII)を得る2) Fcドメイン(VIII)を三価リンカー(III)でアルキル化し、LG1-A-B-Fcコンジュゲート中間体(X)を得る3) コンジュゲートさせるタンパク質の混合ジスルフィド(I)を任意選択的に還元し、遊離Cys(-SH)(II)を有するタンパク質を得る4) 水性フィンケルシュタインヨウ素交換反応(V)を介して、コンジュゲート中間体(X)の脱離基LG1を活性化し、ヨウ素活性化コンジュゲート中間体(XI)を得る5) 前記の遊離Cys(-SH)(II)を有するタンパク質とヨウ素活性化コンジュゲート中間体(XI)とのカップリングにより、タンパク質-Fcコンジュゲート(IX)を得る。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
配列情報
IgG1及びIgG4の標準Fcポリペプチド配列は配列表で提供しているが、情報の参照を容易にするためにここに重複記載する。
【００３０】
配列番号:IgG1 C2〜C3
EU番号付与による全長重鎖のAA231〜447に対応する。
【００３１】
【化４】
2018535195.tif 000005
下線を付したアミノ酸残基は、L234、L235、G237及びA330及びP331に対応する。
【００３２】
配列番号2:IgG1  ヒンジ
EU番号付与による全長重鎖のAA217〜230に対応する。
PKSCDKTHTCPPCP
【００３３】
配列番号3:IgG4 C2〜C3
EU番号付与による全長重鎖のAA231〜447に対応する。
【化５】
2018535195.tif 000006
【００３４】
配列番号4:IgG4  ヒンジ
EU番号付与による全長重鎖のAA217〜230に対応する。
【化６】
2018535195.tif 000007
下線を付けた太字のSは、EU番号付与による全長IgG4重鎖のS228に対応する。
【００３５】
説明
本発明は、タンパク質コンジュゲート及びそのようなコンジュゲートを調製する方法に関する。本方法は、2つ以上のポリペプチドを共有結合的に連結するのに有用であり得る。
【００３６】
タンパク質コンジュゲート
本発明は、タンパク質コンジュゲート、例えば、翻訳後化学反応により共有結合的に連結されている2つ以上のタンパク質又はポリペプチドを含む化合物に関する。このような化合物及び分子は、複数の領域における、特に治療用化合物の開発に関連した使用を見出すことができる。
【００３７】
タンパク質/ポリペプチド
タンパク質又はポリペプチドは、当業者が一緒に共有結合的に連結させたいと考える任意のタンパク質又はポリペプチドであってよい。当業者は他のタンパク質及びポリペプチドに本方法を容易に適応させることができるので、したがって本発明は例示した化合物にとどまらない。以下において、治療用タンパク質及び治療用タンパク質の特性を改変することを目的としたエフェクタータンパク質を含むコンジュゲートについて重点を置く。また本発明の化合物の代替的使用も予見される。
【００３８】
本明細書において明らかであるように、開発された技術は、様々なサイズのタンパク質/ポリペプチドに機能的である。タンパク質/ポリペプチドの取り扱いは、概ね小分子として処理することができる小ペプチドの取り扱いよりも実質的にはより困難であることは周知である。一実施形態において、1つ又は複数のタンパク質又はポリペプチドは、少なくとも40アミノ酸長、例えば少なくとも60、80又は100アミノ酸長である。
【００３９】
一実施形態において、タンパク質/ポリペプチドは、すべて少なくとも40アミノ酸長、例えば少なくとも60、80又は100アミノ酸長である。
【００４０】
治療用タンパク質
治療用タンパク質は、疾患又は障害を処置する方法において有用なタンパク質又はポリペプチド、例えばアミノ酸配列である。
【００４１】
成長ホルモン
本明細書で使用される場合の用語「成長ホルモン化合物」とは、総称的に、配列番号5により同定される成熟ヒト成長ホルモンの機能的特徴を実質的に保持する成長ホルモン分子を意味する。したがって、本化合物は、成長ホルモン、成長ホルモン融合タンパク質、成長ホルモン変異体若しくは類似体、又は成長ホルモンコンジュゲート又は誘導体であり、アシル化又はアルキル化成長ホルモンを含むものであり得る。
【００４２】
成長ホルモン受容体(GHR)を介してシグナル伝達を刺激する成長ホルモン化合物の能力は、in vitro細胞ベースのアッセイ、例えばBAFアッセイ(本明細書のアッセイ2)で測定することができる。
【００４３】
GH変異体又は変異アミノ酸配列若しくは他の修飾を含むGH化合物は他の利点を有し得るので、BAFアッセイで測定されるGH活性がヒト成長ホルモン(hGH)のものよりも低い可能性はあるものの、その変異体又は化合物は、分子が受容体及び細胞の増殖を適度な程度まで刺激することができる限り依然として注目される分子である。
【００４４】
そのような一実施形態において、in vitro活性は、BAFアッセイにおいて測定される。一実施形態において、GH変異体は、配列番号5により同定されるhGHと比べた場合、BAFアッセイにおいて同等のin vitro活性を有する。アッセイ2に記載されているように、BAFアッセイの結果(BAF比)は、試験化合物(変異体/GH化合物)のEC50と基準(hGH/GH化合物  w.hGH配列)のEC50の間の比として表すことができる。一実施形態において、GH変異体又はGH化合物のin vitro活性は、hGH又はhGH配列を含む同等のGH化合物のin vitro活性に匹敵する。本明細書で匹敵するとは、BAF活性の比が1/100〜100/1の範囲内、例えば1/10〜10/1の範囲内であることを意味する。
【００４５】
多くの場合、ラットモデルを使用してGH変異体及び化合物の生物学的効果が試験される。試験は、正常ラット及び/又は下垂体摘出ラットで実施することができる。Sprague Dawleyラットが使用されることが多く、試験方法をアッセイ3及びアッセイ4に記載する。このような試験は、幾つかの薬物動態学的パラメーターに関する情報、例えば、AUC、T1/2(半減期)及びMRT(平均滞留時間)等を提供することができ、これらはレシピエントの血液中の所定の化合物の総曝露及び存在の持続時間を決定するのに適切である。更に、hGHの生物学的効果に関する更なる特徴の1つであるIGF-1応答の誘導を測定することができる(アッセイ5)。
【００４６】
代替又は補足として、アッセイ6に記載されているようにミニブタを使用することができる。
【００４７】
一実施形態において、GHコンジュゲートは、hGH(配列番号5)と比べて増加した半減期を有する。
【００４８】
一実施形態において、本発明によるGHコンジュゲートは、hGH(配列番号5)と比べて増加したin vivoでのT1/2を有する。
【００４９】
hGHは、本明細書で記載したアッセイ3において、約12〜14分のT1/2を有することに留意されたい。ヒトにおける半減期と同等ではないが、ラット又はミニブタにおけるin vivoでのT1/2の増加は、治療設定におけるin vivoでの存在の延長につながるとも思われる。
【００５０】
一実施形態において、GHコンジュゲートは、30分超、又は60分超、又は90分超又は120分超のT1/2を有する。更なる実施形態において、T1/2は60分又は1時間超、例えば2時間超、好ましくは4時間超である。一実施形態において、GHコンジュゲートは、2〜10時間、例えば4〜8時間のT1/2を有する。
【００５１】
一実施形態において、延長されたT1/2は、ラット又はミニブタに静脈内(iv.)投与又は皮下(sc.)投与した後の測定値である。GH変異体又はGH化合物の検出に利用することができるツールに応じて、このようなアッセイをどのように変更することができるかについては、当業者には公知である。
【００５２】
一実施形態において、GH化合物は、hGHと比べて増加した半減期を有する。一実施形態において、GH化合物は、8時間超、例えば12時間超、例えば24時間超のT1/2を有する。一実施形態において、GH化合物は、正常ラットに対して15nmolの単回i.v.投与をした後に測定した場合、8時間超、例えば12時間超、例えば24時間超のT1/2を有する。
【００５３】
一実施形態において、GH化合物は、下垂体摘出ラット(本明細書のアッセイ4を参照)に対して15nmolの単回i.v.投与をした後に測定した場合、8時間超、例えば12時間超、例えば24時間超のT1/2を有する。
【００５４】
一実施形態において、GH化合物は、下垂体摘出したラットに対して15nmolの単回i.v.投与をした後に測定した場合、48時間超、例えば60時間超、例えば72時間超のT1/2を有する。
【００５５】
IGF-1応答は、本明細書のアッセイ5に記載されているようにGH化合物の投与後に測定することができるが、当業者には代替方法を適用することもまた理解されよう。GHの単回投与後のラットにおけるIGF-1の血漿濃度は、好ましくは、GH化合物の血漿濃度の増加に対応する期間にわたって増加するはずである。
【００５６】
一実施形態において、本発明によるGH化合物は、IGF-1応答を誘導することができる。
【００５７】
したがって、IGF-1応答は、より高いIGF-1の血漿濃度に到達することにより、hGHに関して観察された応答よりも強力であり得る。血漿IGF-1の濃度は、72時間以内、例えば48時間以内、例えば36時間以内、例えば24時間以内に検出することができる。異なる化合物の効果を比較するために、値を異なる時点で測定し、それぞれの時点で、例えば、投与の6、12、24、36、48、72、96、144、192、240、288、336時間後のいずれかで比較することができる。
【００５８】
一実施形態において、GH化合物は、増加したIGF-1応答を誘導する。一実施形態において、GH化合物はIGF-1応答を誘導し、IGF-1応答は前記GH変異体又は化合物の単回投与後の96時間まで、又は例えば6、12、24、36、48、72時間後での増加した血漿IGF-1濃度として検出される。一実施形態において、GH化合物は、延長されたIGF-1応答を誘導する。IGF-1の血漿濃度がhGHに比べて延長された期間にわたって高く維持される場合、GH化合物は延長されたIGF-1応答を誘導する。一実施形態において、GH化合物は、wt型hGHによるIGF応答と比べて延長されたIGF-1応答を誘導する。一実施形態において、IGF-1応答は、24時間超、例えば48時間超を持続する。
【００５９】
成長ホルモンタンパク質の構造は、3つのループ(L1〜3)によって接続された4つのヘリックス(ヘリックス1〜4)及びC末端セグメントから構成されている。ヒト成長ホルモン(配列番号5)において、ヘリックス1はAA残基6〜35によって定義され、ヘリックス2はAA残基71〜98によって定義され、ヘリックス3はAA残基107〜127によって定義され、ヘリックス4はAA残基155〜184として定義される。
【００６０】
ヒト成長ホルモン変異体及びコンジュゲートを含む成長ホルモン分子は、国際公開第2011089250号、国際公開第2011089255号及び国際公開第2012010516号を含む複数の文書に記載されている。
【００６１】
一実施形態において、本発明による成長ホルモン化合物又はコンジュゲートは、hGHに対して8個未満の修飾(置換、欠失、付加)を有するGHタンパク質を含む。
【００６２】
一実施形態において、GHタンパク質は、hGHに対して7個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。一実施形態において、成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンに対して6個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。
【００６３】
一実施形態において、成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンに対して5個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。一実施形態において、成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンに対して4個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。一実施形態において、成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンに対して3個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。一実施形態において、成長ホルモンタンパク質は、ヒト成長ホルモンに対して2個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。
【００６４】
一連の実施形態において、成長ホルモンの成長ホルモンタンパク質は、配列番号5により同定されるヒト成長ホルモンと少なくとも95、96、97、98又は99%同一である。
【００６５】
一実施形態において、成長ホルモンタンパク質は、(コードDNA配列の変異により生成される特定のアミノ酸置換によって)タンパク質分解に対して安定化された変異体である。
【００６６】
タンパク質分解に対して安定化された成長ホルモンタンパク質の非限定的な例は、国際公開第2011089250号で確認することができる。
【００６７】
プロテアーゼ安定化成長ホルモンタンパク質変異体は、追加のジスルフィド架橋が導入された変異体を含む。更なるジスルフィド架橋は、好ましくは、L3をヘリックス2と接続する。これは、2つの余分なシステインアミノ酸残基を導入することによって得ることができ、好ましい実施形態においては、これらの残基は配列番号5のH2のAA84又はAA85及びL3のAA143又はAA144に対応する位置の野生型アミノ酸残基を置換する。したがって、本発明による成長ホルモン変異体は、好ましくは、配列番号5のL73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、又はF92C/T148Cに対応する一対のアミノ酸置換を含む。更なる実施形態において、成長ホルモン変異体は、配列番号5のL81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、又はF92C/T148Cに対応する一対のアミノ酸置換を含む。
【００６８】
一実施形態において、成長ホルモンタンパク質は、可能な限り上述のアミノ酸変化を安定化する任意のプロテアーゼに加えて、(DNA配列の変異による)アミノ酸置換によって導入された遊離システインに対する1つの化学的成分によるアルキル化等の一置換/部位特異的修飾に適した成長ホルモン変異体である。アルキル化に適した成長ホルモン変異体の非限定的なリストは、国際公開第2011089255号で確認することができる。
【００６９】
用語「遊離Cys」又は「遊離システイン」は、本明細書においては、還元型でコンジュゲーションに利用可能であり、したがって遊離チオール基(-SH)を有する、システインアミノ酸残基を示すために使用される。一般に、遊離Cysはジスルフィド結合に関与しない。通常、遊離Cysはタンパク質に導入される変異アミノ酸であるが、天然Cysは遊離Cysとして機能し得る。挿入又はアミノ酸置換により遊離Cysをタンパク質内に導入する能力によって、新規分子を作製するための選択肢が大幅に増強される。
【００７０】
更なる実施形態において、タンパク質は、遊離システインを含む成長ホルモン変異体である。更なる実施形態において、タンパク質は、配列番号5により同定されるヒト成長ホルモンに導入された遊離システインを含む成長ホルモン変異体である。更なる実施形態において、タンパク質は、T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62C、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C及びG190Cの群から選択されるアミノ酸置換によって導入される追加のシステインを含む成長ホルモン変異体である。このように導入されたCys残基は、遊離Cys置換と呼ばれる。更なる実施形態において、タンパク質は、T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C及びG126Cの群から選択される追加のシステインを含む成長ホルモン変異体である。
【００７１】
更なる実施形態において、遊離Cys置換は、hGHのAA93〜106内又はhGH変異体の対応する残基内に位置する。更なる特定の実施形態において、遊離Cys置換は、L2内に位置し、例えばAA99〜106又はAA99〜103又は対応する残基内に位置する。
【００７２】
更なる実施形態において、遊離Cys置換は、E30C、Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C、S95C、A98C、N99C、L101C、V102C及びS108Cの群から選択される。
【００７３】
一実施形態において、成長ホルモン変異体は、1つの遊離Cys置換を含む。
【００７４】
更なる実施形態において、遊離Cys置換はE30Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はY42Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はS55Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はS57Cである。更なる実施形態において、Cys置換はS62Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はQ69Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はS95Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はA98Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はN99Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はS100Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はL101Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はV102Cである。更なる実施形態において、遊離Cys置換はS108Cである。
【００７５】
更なる実施形態において、タンパク質は、Y42C及びL101Cから選択されるシステイン置換を含む成長ホルモン変異体である。
【００７６】
エフェクタータンパク質
エフェクタータンパク質は、(治療用)タンパク質の特性を改変することができるポリペプチドである。エフェクタータンパク質の限定されない例は、PEG、アルブミン、XTEN、及びFcドメインであり、最後の記載は本出願の重要な例である。
【００７７】
Fcドメイン
抗体の結晶性断片領域(Fc領域又はFcドメイン)は、抗体の尾部である。IgG、IgA及びIgD抗体の場合、Fc領域は、2つの同一ポリペプチドを含有し、これらは両方とも重鎖の第2定常ドメイン及び第3定常ドメイン(CH2及びCH3)を含む。IgM及びIgE抗体のFc領域は、それぞれのポリペプチド鎖中に3つの重鎖定常ドメイン(CHドメイン2〜4)を含む。Fcドメインのタンパク質配列は、本明細書ではFcポリペプチドと呼ばれ、通常、少なくともCH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。2つのFcポリペプチドは非共有結合的に、またおそらくは共有結合的にも相互作用してヒンジシステインがジスルフィド結合を形成し得るので、Fcドメインは二量体とも呼ぶことができる。
【００７８】
Fcドメインは、Fc受容体と呼ばれる細胞表面受容体、並びに補体系の幾つかのタンパク質との相互作用を媒介する。Fc胎児性受容体(FcRn)との相互作用は特に注目される。
【００７９】
Fc領域は、抗体が免疫系と相互作用することを可能にする。抗体のFc領域は、抗体分子の長いin vivo半減期に少なくとも部分的に関与しており、IgGに関しては、それはヒトにおいて約720時間である。したがって、Fcドメインは、潜在的な治療用化合物のin vivo半減期を延長するための注目に値する遅延化物質(protractor)である。
【００８０】
本発明によれば、成長ホルモンの遅延化物質としてFcドメインを使用すると、注目に値する機能を有する成長ホルモンコンジュゲートが得られることがわかった。
【００８１】
一実施形態において、Fcドメインのアイソタイプは、IgGであり、例えばサブタイプIgG1であり、例えばIgG2であり、例えばIgG4である。
【００８２】
一実施形態において、Fcドメインは、配列番号1により定義されるヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、又は配列番号3により定義されるIgG4を含む。一実施形態において、成長ホルモンコンジュゲートは、それぞれ配列番号1又は配列番号3により定義される2つの同一のFcポリペプチドを含む。
【００８３】
ヒンジ領域は、抗体の定常領域のCH1とCH2の間にあるタンパク質セグメントである。一実施形態において、Fcポリペプチドは、1つ又は複数のシステインを含むヒンジ領域を含む。一実施形態において、Fcドメインのポリペプチドは、それぞれ、配列番号2又は配列番号4により定義される配列を含む。
【００８４】
一実施形態において、Fcポリペプチドは、ヒンジ並びにCH1ドメイン及びCH2ドメインを含む。
【００８５】
一実施形態において、ヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化するように、例えば増加又は減少するように修飾される。
【００８６】
一実施形態において、Fcポリペプチドのヒンジ領域は、1つのシステインのみを含む。一実施形態において、このシステインは、第2のFcポリペプチドの同一システインとジスルフィド結合を形成することが可能である。したがって、一実施形態において、Fcドメインの2つのポリペプチドは、ヒンジ領域内に2つのシステインを保持し、例えば、それぞれのポリペプチド内にシステインを保持する。タンパク質コンジュゲートの調製を記載しているセクションから明らかなように、そのようなジスルフィド結合は還元することが可能であり、チオールをリンカーへのカップリング及びそこを介した他のタンパク質へのカップリングに使用することができる。
【００８７】
Fcポリペプチドのシステインはジスルフィド結合を形成することができるが、還元された場合、遊離Cysとして作用し得る。一実施形態において、FcポリペプチドはCys残基を含む。特に、本明細書で示されているように、2つのFcポリペプチドを連結するヒンジ領域のジスルフィド結合を還元して、遊離システインのように作用し得る2つのシステインを生成することができる。一実施形態において、Fcポリペプチドは、ヒンジ配列中にCys残基を含む。
【００８８】
一実施形態において、Fcポリペプチドのヒンジ領域は、天然アミノ酸残基のみを含む。一実施形態において、ヒンジ領域は、ヒンジ領域にアミノ酸の挿入又は置換を含む。異種発現の場合、メチオニンは、発現ベクター中のDNAによりコードされていてもよいが、常にコンジュゲートのFcドメインに存在するとは限らない。一実施形態において、Fcポリペプチドは、N末端にメチオニンを含まない。
【００８９】
一実施形態において、ヒンジ配列は、本明細書で詳細に言及されているIgG1又はIgG4ヒンジ配列等のIgGヒンジ配列の切断型である。
【００９０】
一実施形態において、Fcヒンジのヒンジ配列は、IgG1ヒンジ配列PKSCDKTHTCPPCP(配列番号2)に由来する。
【００９１】
一実施形態において、ヒンジ配列は、
【化７】
2018535195.tif 000008
からなる群から選択される。
【００９２】
一実施形態において、Fcヒンジのヒンジ配列は、IgG4ヒンジ配列SKYGPPCPSCP(配列番号4)に由来する。一実施形態において、ヒンジ配列は、
【化８】
2018535195.tif 000009
からなる群から選択される。
【００９３】
一実施形態において、Fcポリペプチドは、ヒンジ配列中にCys残基を含む。一実施形態において、Fcポリペプチドは、ヒンジ中に1つのCys残基のみを含む。
【００９４】
一実施形態において、定常領域は分子を安定化させるために修飾されていてもよく、例えば、IgG4ヒンジ領域において、残基S228(上記で*表示した、EUインデックスにより番号付与した残基)はプロリンで置換され得る(S228P)。一実施形態において、Fcポリペプチドは、IgG4由来のヒンジ配列中の228位に、又は228位に対応する位置にプロリン残基を含む。
【００９５】
したがって、FcドメインのFcポリペプチドは、ジスルフィド架橋によって共有結合的に連結され得るか、或いは非共有結合的に結合され得る。
【００９６】
一実施形態において、Fc領域は、典型的には、とりわけ、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、タンパク質安定性及び/又は抗原依存性細胞傷害、或いはそれらの欠如等のその機能的特性の1つ又は複数を改変するように、Fc領域内に修飾を含むように操作することができる。
【００９７】
一実施形態において、FcドメインはFcRn結合部位を含み、したがって、wt型Fcポリペプチドに対するいかなるアミノ酸欠失、挿入又は置換も、国際公開第05001025号に記載されているのと同様のFc胎児性受容体と相互作用するFcドメインの能力を実質的に破壊又は低下させるものではない。そのような受容体の相互作用の結合アッセイは、当技術分野において周知である。
【００９８】
更に、本発明のFcドメインは、そのグリコシル化の程度を改変するように、更には抗体の1つ又は複数の機能的特性を改変するように、化学的に修飾することができる(例えば、Fc部分に1つ又は複数の化学的成分を結合させることができる)。
【００９９】
Fcドメインに対するそのような様々な変異はすでに記載されており、本発明によるFcドメインは、その機能性、例えばそれに連結されるタンパク質のin vivo半減期を増加させる能力が維持される限り、そのような変異を含むことができる。
【０１００】
IgG1 Fcドメインは、1つ又は複数の、おそらくは全ての以下のアミノ酸置換を含んでいてもよく、それにより、L234A、L235E、及びG237Aから選択される特定のFc受容体への親和性の低下、並びに/又はA330S及びP331Sから選択されるC1q媒介性補体結合の低下がそれぞれ生じる。
【０１０１】
FcRnに対する結合親和性を改善するために、Fc中の変異を含むことができ、IgG1アイソタイプのFcドメイン中のM428L及び/又はN434S等のアミノ酸置換を得ることができる。
【０１０２】
リンカー
リンカーは、タンパク質を共有結合的に連結するために使用される化学的成分である。リンカーは別個の成分であり、例えば、ジスルフィド結合のみによって連結されているタンパク質は、本発明によるリンカーを含むとは考えない。以下に示すように、リンカーは、アミノ酸、アミノ酸様エレメント及び非アミノ酸エレメントを含み得るが、リンカーはそれ自体、コンジュゲートの1つ又は複数のタンパク質の一部として異種発現により産生されない。
【０１０３】
リンカーがタンパク質と反応した場合、リンカー基が形成される。したがって、用語「-リンカー-」とは、タンパク質コンジュゲートの各タンパク質のアミノ酸残基に共有結合的に連結されているタンパク質-コンジュゲートの化学的単位（ユニット）を意味するものとする。
【０１０４】
結合点に応じて、リンカー末端の反応性は変化する。リンカーは、得ようとする所望の生成物に応じて、様々な形態をとることができる。一実施形態において、本明細書に記載されている概念は、異なるタンパク質がリンカーの各末端で結合されることを保証する規則的なコンジュゲーションに関する。
【０１０５】
反応性末端は、タンパク質のアミノ酸残基へのリンカーのコンジュゲーションに有用な化学的サブ構造である。反応性末端は、N末端、C末端又は内部アミノ酸残基への連結に適し得る。アミノ酸残基特異的である化学構造、並びにアミノ酸残基非特異的である化学構造を含む様々な形態が当技術分野で知られている。標的タンパク質に応じて、特定のアミノ酸残基を標的化し、所望する生成物の高収率を得ることが望ましい場合がある。
【０１０６】
反応性末端(又は基)は、標的とするアミノ酸残基に応じて異なる。
【０１０７】
実施例で証明されているように、チオールとのコンジュゲーションは、様々なシステイン又はチオール反応性末端を使用して得ることができるが、他の反応性基は、代替アミノ酸残基へのコンジュゲーションに適している。得られるコンジュゲートは、リンカーの一部として反応性末端の基を含む。得られた反応性末端の基は、結合のアミノ酸残基に共有結合する。この反応性末端の基は、-RR-と呼ぶことができる。したがって、コンジュゲートの-リンカー-部分は、反応性末端基(-リンカー-RR)を特定することによって更に説明することができる。
【０１０８】
N末端アミノ酸は、アルデヒド又はケトンにより標的化され得る。一実施形態において、N末端反応性末端は-CHOを含む。Lys残基は、すなわち、2,5-ジオキソピロリジン-1-イルにより標的化され得る。
【０１０９】
一実施形態において、反応性末端はLys反応性末端、例えばジオキシピロリジンを含む。Gln残基は、国際公開第2005070468号に記載されている二段階プロセスによって、トランスグルタミナーゼを使用して標的化され、アミン又はヒドロキシルアミンと反応するアルデヒドが生成され得る。一実施形態において、反応性末端はアルデヒド又はケトンを含む。Ser残基は、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)を使用してアルデヒド(グリオキシル)に酸化させることができ、これは還元的アミノ化条件下でアミンにより標的化され得る。同様に、Lys残基は、国際公開第2009027369号に記載されている逆トランスグルタミナーゼ反応に適し得る。
【０１１０】
リンカーを更に詳細に説明するために、R1、R2等を使用して個々の反応性末端を説明することができる。
【０１１１】
一実施形態において、個々の反応性末端は、C末端、N末端、Gln、Lys、Ser又はCys反応性末端から選択される。一実施形態において、R1、R2等は、N末端反応性末端である。一実施形態において、R1、R2等は、Gln反応性末端である。一実施形態において、R1、R2等は、Lys反応性末端である。一実施形態において、R1、R2等は、Ser反応性末端である。一実施形態において、R1、R2等は、Cys反応性末端である。
【０１１２】
位置選択性を得るために、1つのLys反応性末端と1つのCys反応性末端を有するリンカーを提供する等、反応性末端が異なることが好ましい場合がある。2つのCys反応性末端が使用される場合、反応性は、二価及び三価のリンカーについて下記に記載されているように調節することができる。
【０１１３】
本発明に記載のリンカーは、スペーサーにより分けられる1つ又は複数のチオール又はシステイン反応性末端を含み得る。リンカーの反応性末端は、一実施形態において、Cys又はチオール反応性末端と呼ぶことができる。反応性末端は、チオールの位置とは無関係にチオールと反応可能であることが好ましい。一実施形態において、チオール反応性末端は、N末端システインに連結することができる。一実施形態において、チオール反応性末端は、C末端システインに連結することができる。好ましい一実施形態において、チオール反応性末端は、内部アミノ酸残基、例えば本明細書に記載されている遊離システインと連結することができる。
【０１１４】
当業者には、システインにカップリングさせることができる幾つかの経路が周知である。2つの重要な反応性末端は、適切な脱離基(LG-アセトアミド)を有するα-置換アセトアミド(例えば、α-ハロゲンアセトアミド)及びα-β-不飽和カルボニル化合物(例えば、マレイミド等)である。したがって、反応性末端は、例えばマレイミド又はLG-アセトアミド等であってもよく、この場合、脱離基は、例えばスルホン酸エステル(例えばトシレート又はメシレート)又はハロゲン化物(α-ハロ-アセトアミドを形成する)である。ハロゲンは、Cl、Br又はIであり得る。代替の実施形態において、脱離(LG)基は、同じ機能性を提供する代替分子であってもよい。
【０１１５】
したがって、Cys反応性末端(又はチオール反応性末端)は、目的のタンパク質中のシステイン残基へのコンジュゲーションを可能にする化学物質である。Cys反応性末端基の例は、例えば、末端アルデヒド、ピロリジン-2,5-ジオン(2,5-ピロールジオン)(マレイミドとも呼ばれる)及び脱離基-アセトアミド(例えばハロ-アセトアミド)等である。
【０１１６】
一実施形態において、Cys反応性末端は、-ピロリジン-2,5-ジオンを含む。
【０１１７】
一実施形態において、Cys反応性末端は、-NHC(=O)-CH2-ピロリジン-2,5-ジオンを含む。
【０１１８】
一実施形態において、Cys反応性末端は、脱離基、例えば臭化物、塩化物又はヨウ化物によって例示されるハロゲン等を含む。一実施形態において、Cys反応性末端は、ハロ-アセトアミドを含む。ハロ-アセトアミドの場合、反応性末端-NH-C(=O)-CH2-Iは、-NH-C(=O)-CH2-Brよりも反応性が高く、これはまた-NH-C(=O)-CH2-Clよりも反応性が高い。
【０１１９】
ハロ-アセトアミドはCys残基に対して反応性であり、したがって、wt残基、より好ましくはコンジュゲーション目的で導入された変異アミノ酸残基の遊離Cysをそれぞれ含む2つのタンパク質のカップリングに使用することができる。
【０１２０】
以下の本明細書で更に説明されているように、リンカーの反応性末端は、異なる脱離基を含んでいてもよく、したがって、リンカーは、全体構造:LG1-リンカー-LG2を有していてもよい。脱離基は、一実施形態においてハロゲンであり、特に、異なる反応性を有するハロゲンである。脱離基がハロ-アセトアミドの一部として含まれる場合、反応性はI>Br>>Clである。
【０１２１】
一実施形態において、本発明は、構造:LG1-リンカー-LG2[式中、両末端はCys反応性であり、LG1及びLG2の反応性は異なる]のリンカーに関する。反応性末端間の部分は、ここではスペーサーと呼ばれる。スペーサーは、以下の本明細書で説明されているように、1つ又は複数のスペーサーエレメントで構成され得る。スペーサーエレメントは、ペプチド結合により連結されていてもよい。Cys反応性末端がハロ-アセトアミドの場合、ペプチド結合(-C(=O)-NH-/-NH-C(=O)-)は、反応性末端により含まれる。
【０１２２】
一実施形態において、リンカーは、構造:
ハロ1-CH2-C(=O)-NH-スペーサー-NH-C(=O)-CH2-ハロ2、
Cl-CH2-C(=O)-NH-スペーサー-NH-C(=O)-CH2-Br、又は
Br-CH2-C(=O)-NH-スペーサー-NH-C(=O)-CH2-Cl
を有する。
【０１２３】
三価リンカー
上述のように、本発明は、タンパク質とFcドメインとの連結を網羅する。とりわけ、Fcドメインは、ポリペプチド間のジスルフィド結合を含む、共有結合及び非共有結合により通常一緒になって保持される2つのポリペプチドからなる。従来の二価リンカーを使用する共有結合的連結の場合、連結はタンパク質からFcポリペプチドの一方のみになされる。本発明による三価リンカーを使用すると、2つのFcポリペプチド鎖の両方がタンパク質に連結されているタンパク質コンジュゲートを得ることができる。このような三価リンカーの使用がFcドメインのコンジュゲーションに限定されないのは明らかである。
【０１２４】
三価リンカーは、少なくともトリラジカルである、「U」と呼ばれる中心の単位を含む構造を有し得る。中心の単位は、この単位から延びる少なくとも3つの結合を可能にする任意の化学構造(-U=)であり得る。中心の単位は、一実施形態において、窒素原子(-N=)であってもよい。中心の単位は、一実施形態において、四価の炭素原子(=C=)であってもよく、この場合、第4の「アーム」は、-H、-CH3、又はリンカーの機能性に干渉しない他の任意の構造であり得る。中心の単位は、一実施形態において、ベンゼン環であってもよい。
【０１２５】
三価リンカー構造は、同一であっても異なっていてもよい3つのリンカーアームを含み得る。リンカーアームは、それぞれ、スペーサー部分(S)と反応性末端(R)を含む。全体の構造は:
【０１２６】
【化９】
2018535195.tif 000010
【０１２７】
[式中、Uは、トリラジカル(中心の単位)を表し、
S1、S2及びS3は、個々のスペーサーを表し、
R1、R2及びR3は、タンパク質分子にコンジュゲーションするための(好適な)個々の反応性末端を表す]
である。
【０１２８】
一実施形態において、R1、R2及びR3は同一ではない。一実施形態において、R2及びR3は同一である。一実施形態において、R2及びR3は同一であるが、R1は異なる。一実施形態において、1つ又は複数の反応性末端R1、R2及びR3は、チオール反応性末端である。一実施形態において、R2及びR3はチオール反応性末端である。一実施形態において、少なくともR2及びR3は、チオール反応性末端である。一実施形態において、R2及びR3はチオール反応性末端であるが、R1はチオール反応性末端ではない。一実施形態において、R1、R2及びR3はチオール反応性末端である。一実施形態において、R1、R2及びR3は、システインに対して異なる反応性を有する。
【０１２９】
一実施形態において、R2及びR3はチオール反応性末端であり、R1はチオール反応性末端ではない。そのような実施形態において、R1は、C末端、N末端、Gln、Lys及びSer反応性末端から選択される反応性末端であってよい。
【０１３０】
一実施形態において、チオール反応性末端はマレイミドを含む。一実施形態において、チオール反応性末端は脱離基(LG)を含み、そのような脱離基は、無機脱離基、例えば臭化物、塩化物、若しくはヨウ化物により例示されるハロゲン、又はメシレート若しくはトシレート等により例示される有機脱離基であり得る。
【０１３１】
一実施形態において、脱離基はハロゲン、例えば臭化物、塩化物又はヨウ化物である。一実施形態において、1つ又は複数の反応性末端はハロ-アセトアミドである。
【０１３２】
一実施形態において、R2及びR3は、チオール反応性末端、例えば-NH-C(=O)-CH2-CH2-LGであり、構造:
【０１３３】
【化１０】
2018535195.tif 000011
【０１３４】
[式中、LG2及びLG3は脱離基であり、R1は反応性末端であり、S1、S2及びS3は上記のような個々のスペーサーを表す]
を有するリンカーを提供する。
【０１３５】
一実施形態において、脱離基2(LG2)及び脱離基3(LG3)は同一であり、更なる実施形態において、脱離基2及び脱離基3は異なる。異なる脱離基は異なる反応性を有し、逐次コンジュゲーションを可能にし得る。
【０１３６】
一実施形態において、R1はチオール反応性末端を含む。一実施形態において、R1はチオール反応性末端である。一実施形態において、チオール反応性末端はハロアセトアミドである。
【０１３７】
一実施形態において、R1は脱離基(LG1)を含み、そのような脱離基は無機脱離基、例えば臭化物、塩化物若しくはヨウ化物により例示されるハロゲン、又はメシレート又はトシレート等の有機脱離基であり得る。
【０１３８】
一実施形態において、第1のリンカーアームは、構造:LG1-CH2-C(=O)-NH-S1を有する。一実施形態において、R1は、脱離基(LG)、例えば、臭化物、塩化物又はヨウ化物等のハロゲンを含む。
【０１３９】
一実施形態において、R1は、R2及びR3とは異なる。一実施形態において、R1は、R2及びR3とは異なる脱離基を含む。
【０１４０】
一実施形態において、LG1は、LG2及びLG3とは異なる。
【０１４１】
コンジュゲートするべき異なるタンパク質へのリンカーアームの逐次コンジュゲーションをもたらすために、異なる反応性末端を使用することができる。
【０１４２】
全てのアームがLGを含むチオール反応性末端を含む一実施形態において、LGは、タンパク質に対して異なる反応性を達成するために異なっていてもよい。一実施形態において、チオール反応性末端の反応性は異なる。
【０１４３】
一実施形態において、LG1の反応性は、LG2及びLG3の反応性よりも高い。一実施形態において、LG2及びLG3の反応性は、LG1の反応性よりも高い。
【０１４４】
ハロアセトアミドに対する反応性の順序は、I>Br>>Clである。したがって、-NH-C(=O)-CH2-Brの反応性末端は、-NH-C(=O)-CH2-Clよりも反応性が高く、-NH-C(=O)-CH2-Iは(還元型)システイン残基に対してより高い反応性を有する。
【０１４５】
したがって、本発明によるリンカーは、1つ若しくは複数のチオール、又はCys反応性基を含み得る。Cys反応基及び反応性末端基の重要な例は、次のとおりである:
【０１４６】
【表１】
2018535195.tif 000012
【０１４７】
ジグザグ形状の線及びN-*は残りのリンカーへの結合を示し、一方、左側への*-はCysアミノ酸残基の-S-への結合を示す。
【０１４８】
本発明のリンカーは、反応性末端を中心の単位に連結する個々のスペーサーセグメントを更に含み得る。スペーサーセグメントは、S1、S2及びS3で示される。上述のように、リンカーは、Fcドメインの対称性コンジュゲーションを可能にし、これは、例えばR2-S2及びR3-S3は同一であるが、第1のアームを介した目的のタンパク質への連結が異なっていてもよい場合に得られる。他の実施形態において、コンジュゲートは非対称であり、R1-S1、R2-S2及びR3-S3はすべて異なっていてもよい。
【０１４９】
スペーサーS1、S2及びS3は、異なるスペーサーエレメントを含んでいてもよい。タンパク質2及びタンパク質3が近接している状況において、ショートスペーサーをS2及びS3に使用することができる。ショートスペーサーは、最短距離で結合している原子の数を数えると、1〜10個の原子、例えば2〜5個の原子の長さであり得る。一実施形態において、ショートスペーサーは-(CH2)n-であり、式中、nは1〜5の範囲の整数である。一実施形態において、ショートスペーサーは-(CH2)n-であり、式中、nは1〜3の範囲の整数であり、例えばn=2、例えばn=3であり、したがってS2及びS3は-(CH2)2-又は-(CH2)3-である。
【０１５０】
一実施形態において、中心の単位からの距離は、1つ又は複数のスペーサーを延長することによって増大する。
【０１５１】
一実施形態において、リンカーは、少なくとも1つの延長スペーサーを含む。中心の単位までの距離をコンジュゲートのタンパク質の1つに対してのみ増大させる場合、スペーサーの1つだけを延長すべきである。一実施形態において、延長スペーサーはS1である。延長スペーサーは、S2及びS3に関して上記に例示したショートスペーサーよりも長い。延長スペーサーは、最短距離で結合している原子の数を数えると、10〜50個の原子、例えば20〜30個の原子の長さであり得る。
【０１５２】
中心の単位が窒素(N)を含む一実施形態において、リンカーの1つのアームは、アミド結合を介してNに連結され得る。更なる実施形態において、R1と中心の単位(ここではN)とを接続するS1は、窒素原子とアミド結合を形成し得るカルボニル(C=O)を末端に有する。
【０１５３】
更なる実施形態において、スペーサーは、1つ又は複数のアミノ酸様スペーサーエレメントを含み得る。スペーサーエレメントは、アミド結合によって連結され得る。したがって、そのようなスペーサーエレメントは、ポリペプチド中のアミノ酸と同様にN末端及びC末端を保持する。そのようなスペーサーエレメントは、アミノ酸残基又は修飾アミノ酸残基、又はアミド結合によって連結することが可能な代替化学物質であり得る。例としては、以下のa)〜d)に示すように、グリシン、アラニン、グルタミン酸、及びガンマ-Glu(γ-Glu)である。
【０１５４】
カルボニル末端は、リンカーアームの1つにおいて中心窒素とアミド結合を形成することができる。
【０１５５】
以下のe)及びf)によって例示したような(カルボニル基の代わりに)追加のアミノ基を含む代替アミノ酸様エレメントもまた、リンカーアームの1つにおいて中心窒素に隣接して使用することができる。ここにカップリングされる場合、尿素/カルバミド基はリンカー構造中に存在する。
【０１５６】
【化１１】
2018535195.tif 000013
【０１５７】
e) -NH-CH(-COOH)-(CH2-)4-NH-   f) -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-
グリシンスペーサーエレメントは、ポリエチレングリコール単位を含めることにより延長され得る。
【０１５８】
更なる実施形態において、スペーサーは、ポリエチレングリコール(PEG)部分を含む。PEG部分は、構造:
【０１５９】
【化１２】
2018535195.tif 000014
【０１６０】
[式中、n'は1より大きい整数である]
を含む二重ラジカルである。このような一実施形態において、n'は2〜20から選択される整数である。このような一実施形態において、n'は2〜10又は2〜5から選択される整数である。一実施形態において、n'は2である。
【０１６１】
一実施形態において、PEG部分は、構造:
【０１６２】
【化１３】
2018535195.tif 000015
【０１６３】
を有し得る。
【０１６４】
一実施形態において、PEG部分は、上述のようなアミノ酸又はアミノ酸様スペーサーエレメントに含まれる。
【０１６５】
一実施形態において、スペーサーエレメントは、式
【０１６６】
【化１４】
2018535195.tif 000016
【０１６７】
[式中、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数である]
を有する。特定の一実施形態において、k=1及びn=1の場合はスペーサーエレメント
【０１６８】
【化１５】
2018535195.tif 000017
【０１６９】
を提供する。
【０１７０】
一実施形態において、スペーサーエレメントg)は、k=1及びn=1によって定義され、OEG又は8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸のジラジカルとも呼ぶことができる、*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(=O)-*(e1)を提供する。
【０１７１】
上記の構造において、ジグザグ状の線は、スペーサー、中心の単位又は反応性末端への結合を示す。スペーサーが反応性末端に連結する場合、「-NH-」は反応性末端の一部と考えることができる。これは、反応性末端がハロ-アセトアミドを保持する上述の実施形態の場合であり得る。
【０１７２】
一実施形態において、R1-S1-は、アミド結合により連結されている3〜8個のスペーサーエレメントを含む。一実施形態において、R1-S1-は、アミド結合により連結されている4〜6個のスペーサーエレメントを含む。
【０１７３】
一実施形態において、三価リンカーの構造は、
【０１７４】
【化１６】
2018535195.tif 000018
【０１７５】
[式中、脱離基LG2及びLG3は同一である]
である。
【０１７６】
このような一実施形態において、R1はチオール反応性末端ではない。
【０１７７】
一実施形態において、三価ライナーの構造は、
【０１７８】
【化１７】
2018535195.tif 000019
【０１７９】
[式中、脱離基LG2及びLG3は同一であり、R1はSer、Lys、Gln、C末端又はN-末端反応性末端である]
である。
【０１８０】
代替の一実施形態において、全ての反応性末端はCys反応性である。一実施形態において、R2及びR3は同一であり、R1は異なるCys反応性末端である。そのような異なる反応性末端は、タンパク質の選択された連結を可能にする。一実施形態において、R2及びR3は、ハロ-アセトアミドを含む。
【０１８１】
一実施形態において、LG2及びLG3は、全体構造:
【０１８２】
【化１８】
2018535195.tif 000020
【０１８３】
を有するリンカーを伴うClである。
【０１８４】
一実施形態において、LG2及びLG3は、全体構造:
【０１８５】
【化１９】
2018535195.tif 000021
【０１８６】
を有するリンカーを伴うBrである。
【０１８７】
一実施形態において、全ての反応性末端はハロ-アセトアミドである。一実施形態において、R1は、LG1を含むハロ-アセトアミドを含む。
【０１８８】
一実施形態において、三価リンカーの構造は次のとおりである:
【０１８９】
【化２０】
2018535195.tif 000022
【０１９０】
一実施形態において、三価リンカーの構造は次のとおりである:
【０１９１】
【化２１】
2018535195.tif 000023
【０１９２】
一実施形態において、三価リンカーの構造は次のとおりである:
【０１９３】
【化２２】
2018535195.tif 000024
【０１９４】
一実施形態において、三価リンカーの構造は次のとおりである:
【０１９５】
【化２３】
2018535195.tif 000025
【０１９６】
一実施形態において、三価リンカーの構造は次のとおりである:
【０１９７】
【化２４】
2018535195.tif 000026
【０１９８】
一実施形態において、三価リンカーの構造は次のとおりである:
【０１９９】
【化２５】
2018535195.tif 000027
【０２００】
第2のアーム及び第3のアームが同一である実施形態において、リンカー部分は、一般構造A-B[式中、A-は第1のアームであり、-Bは中心の単位並びに第2のアーム及び第3のアームを含む]によって説明することができる。同様の構造が上述のように使用される場合、AはR1-S1-であり、Bは-N-(S2-R2)2である。
【０２０１】
したがって、リンカーの全体的なサイズは変わり得るが、本明細書の実施例で明らかなように、通常は比較的小さい。リンカーのサイズを測定する場合、コンジュゲート中に残っているリンカー部分のみが含まれ、脱離基が含まれないことを意味する。
【０２０２】
一実施形態において、リンカーのサイズは、10kDa未満、例えば5kDa未満、例えば2kDa未満、例えば1kDa未満、例えば500Da未満等である。一実施形態において、リンカーは250Da〜20kDa、例えば500Da〜10kDaである。
【０２０３】
一実施形態において、リンカーは500〜2000Da、例えば600〜1500da、例えば700〜100daである。
【０２０４】
コンジュゲートの全リンカー長は、2つのタンパク質間の最短距離の原子の数を数えることによって推定することができる。2つのアームが同一である場合、その長さは、例えば、第2のアーム及び第3のアームが同一であり、第1のアームが最長である例においてタンパク質1からタンパク質2の最長距離である。中心原子がNである場合、これは1個の原子と数えるが、アームが対称的に配置されている場合、中心の単位としてのベンゼン環を3個の原子とカウントする。脱離基は最終コンジュゲートの一部ではないので、このように反応性末端基のみを数えることはない。
【０２０５】
一実施形態において、リンカーは、長さが5〜200原子、例えば8〜150原子、又は長さが10〜100原子である。更なる実施形態において、リンカーは長さが10〜80原子である。更なる実施形態において、リンカーは長さが10〜60原子である。更なる実施形態において、リンカーは、長さが10〜40原子であり、例えば15〜40原子、又は例えば20〜35原子である。
【０２０６】
本発明による三価リンカーの例をここで以下のtable 1(表2)に示す。
【０２０７】
【表２Ａ】
2018535195.tif 000028
【０２０８】
【表２Ｂ】
2018535195.tif 000029
【０２０９】
【表２Ｃ】
2018535195.tif 000030
【０２１０】
【表２Ｄ】
2018535195.tif 000031
【０２１１】
タンパク質コンジュゲート
したがって、本発明のタンパク質コンジュゲートは、リンカー部分を介して互いに共有結合されている2つ以上の個々のポリペプチド(タンパク質1、タンパク質2及び/又はタンパク質3)を含む。一実施形態において、タンパク質1、タンパク質2及びタンパク質3は、個々のポリペプチドである。一実施形態において、個々のポリペプチドは同一であってもよく、又はタンパク質1、タンパク質2及びタンパク質3の2つは同一であってもよい。したがって、個々のポリペプチドは、それぞれN末端及びC末端のアミノ酸残基を有する。その際に、個々のポリペプチドは、例えばジスルフィド結合を介して、互いに、又は更にポリペプチド/タンパク質に追加的に結合され得る。
【０２１２】
タンパク質がリンカーを介して互いに結合するので、リンカー部分は、本発明に網羅されている中間体も含めて、このような化合物の全ての一部である。
【０２１３】
一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、構造
【０２１４】
【化２６】
2018535195.tif 000032
【０２１５】
[式中、
リンカーは化学的部分であり、
Sは硫黄原子であり、
タンパク質1は、前記リンカー及び硫黄原子を介してタンパク質2及びタンパク質3に共有結合的に連結されている]
を有する。
【０２１６】
一実施形態において、硫黄原子はチオエーテルの一部であり、例えば、硫黄原子からの結合は、炭素原子が任意の有機構造の一部であってもよい、2つの個々の炭素原子C-S-Cになる。最も一般的なチオエーテルは-CH2-S-CH2-であり、この場合、1つのCH2基はリンカーに連結されているタンパク質に由来し、最も高頻度には、コンジュゲーションのための硫黄原子を提供するシステイン残基に由来する。
【０２１７】
一実施形態において、コンジュゲートの硫黄原子はジスルフィド結合の一部ではない。
【０２１８】
-S2-R2が-S3-R3と同一であり、タンパク質2の2つのコピーがタンパク質1とコンジュゲートされる一実施形態において、リンカーの構造は-A-B=によって説明することができ、得られるコンジュゲートは構造:タンパク質1-A-B-(タンパク質2)2である。Bがリンカーアームと考えられる場合、構造はタンパク質1-A-(B-タンパク質2)2であり得る。
【０２１９】
本発明の化合物の更なる例は、コンジュゲートを調製する方法に取り組む際に以下の本明細書中で説明する。
【０２２０】
Fcコンジュゲート
一実施形態において、タンパク質2及びタンパク質3は同じFcポリペプチドであり、一緒になってFcドメインを形成する。本明細書で説明しているように、Fcポリペプチドへの連結は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋を還元し、各々のシステインをリンカーに、例えばリンカーアーム2及び3を介して連結することによって得ることができる。第3のリンカーアーム(ここではリンカーアーム1)は、目的のタンパク質1に前又は後でコンジュゲートされる。タンパク質コンジュゲートの調製に関するセクションで説明されているように、コンジュゲートは、
【０２２１】
【化２７】
2018535195.tif 000033
【０２２２】
の形態を有し得る。
【０２２３】
反応性末端2及び3がハロアセトアミドである実施形態において、コンジュゲートは、
【０２２４】
【化２８】
2018535195.tif 000034
【０２２５】
の形態を有する。
【０２２６】
一実施形態において、コンジュゲートは、構造:
タンパク質1-RR1-S1-U-[S2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc]2
[式中、
RR1は反応性末端基を表し、
Uは中心の単位を表し、
S1及びS2は個々のスペーサーを表し、FcはFcポリペプチドである]
を有する。
【０２２７】
上記の代替の説明が使用される場合、Fcコンジュゲートは、
タンパク質1-A-(B-Fc)2
により説明することができることになる。
【０２２８】
Fcに連結するための硫黄原子が含まれる場合、構造は、
タンパク質1-A-(B-S-Fc)2
であり、チオエーテルを含む場合、構造は、Fcのシステインの-CH2-も示すならば、
タンパク質1-A-(B-CH2-S-Fc)2、又はタンパク質1-A-(B-CH2-S-CH2-Fc)2
である。連結がチオールとハロアセトアミドのカップリングにより得られる場合、その際、Bは、チオールとハロアセトアミドの反応から残っている少なくとも-NH-C(=O)-CH2-エレメントを含み、
タンパク質1-A-(B'-NH-C(=O)-CH2-S-Fc)2
を提供する。
【０２２９】
S2及びB'は、それらがリンカーアームの残りの部分を表すという意味で類似していると思われる。好ましい実施形態において、S2又はB'が-CH2-CH2-である場合、
タンパク質1-A-(CH2-CH2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc)2
のコンジュゲート構造を提供し、式中、Aはタンパク質1に接続しているリンカー単位であり、これは、本願の他の箇所で説明しているように、中心の単位(少なくとも3つの結合についての選択肢を有する)と、適切なスペーサーと、タンパク質1への連結を提供する反応性末端基とを含む。
【０２３０】
成長ホルモンFcコンジュゲート
一態様において、本発明は成長ホルモンFcコンジュゲートに関し、そのようなGHコンジュゲートは、好ましくは、野生型ヒト成長ホルモンに比べてin vivo半減期(T1/2)が増加している。更に、成長ホルモンFcコンジュゲートは、好ましくは、アッセイ1及びアッセイ2で説明されているように、BAFアッセイで受容体結合及び活性を試験することによってin vitroでアッセイすることができるヒト成長ホルモンの治療能力を維持する。動物モデルを使用して、成長ホルモンFcコンジュゲートの治療可能性を更に評価することができる(アッセイ3〜5)。
【０２３１】
本発明による成長ホルモンコンジュゲートの例は、以下の本明細書のtable 3(表3)に含まれている。
【０２３２】
【表３】
2018535195.tif 000035
【０２３３】
医薬組成物
本発明によるタンパク質コンジュゲートは、医薬組成物として製剤化することができる。
【０２３４】
製剤は更に、適切なバッファー、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定剤、及び/又は界面活性剤、並びに様々なこれらの組み合わせを含む。
【０２３５】
医薬組成物中の保存剤、等張剤、キレート剤、安定剤及び界面活性剤の使用は、当業者には周知である。製剤は、当分野で公知の標準的な手順を使用して調製することができる。Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照することができる。
【０２３６】
本発明の一実施形態において、医薬組成物は液体製剤である。本発明の一実施形態において、医薬組成物は水性組成物であり、すなわち、成分が水に溶解又は懸濁されている組成物である。そのような組成物は、典型的には、溶液又は懸濁液である。組成物が水に溶解させることができない成分を含む場合、組成物は2つの液体、多くの場合、水及び油又は脂肪酸系の液体のエマルジョンであってもよい。別の実施形態において、医薬組成物は凍結乾燥組成物であり、医師又は患者は使用前にそれに溶媒及び/又は希釈剤を添加する。
【０２３７】
一実施形態において、本発明の組成物は、5.0〜8.5のpH、例えば6.0〜8.5、例えば6.0〜8.2、例えば6.0〜8.0、例えば7.0〜8.5、例えば7.0〜8.0、例えば7.5〜8.0、例えば6.0〜7.5、例えば6.2〜7.5、例えば6.4〜7.2、例えば6.5〜7.0、例えば6.6〜7.0のpHを有する。pHは、6.6〜6.9又は6.7〜6.9であってもよい。更なる実施形態において、組成物のpHは、6.6、6.7、6.8、6.9又は7.0である。
【０２３８】
本発明の更なる実施形態において、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択される。
【０２３９】
一実施形態において、医薬組成物はグリシンを含まない。一実施形態において、組成物はバッファーとしてのヒスチジンを含む。
【０２４０】
一実施形態において、医薬組成物は、界面活性剤、例えばポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマーを含む。一実施形態において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例えば、Pluronic(登録商標)F68、ポロキサマー188及び407、並びにTriton X-100を含めたポロキサマーから選択される。一実施形態において、界面活性剤は、ポリオキシエチレン及びポリエチレン誘導体、例えば、アルキル化及びアルコキシル化誘導体(ツイーン、例えばTween-20、Tween-40、Tween-80及びBrij-35)から選択される。一実施形態において、界面活性剤はポリソルベート80である。
【０２４１】
更なる実施形態において、組成物は、薬学的に許容される保存剤を含む。本発明の更なる実施形態において、保存剤は、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、p-ヒドロキシ安息香酸ブチル、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール及びチメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロロフェネシン(3-(p-クロルフェノキシ)プロパン-1,2-ジオール)、又はそれらの混合物である。
【０２４２】
処置方法
本明細書で説明されているタンパク質コンジュゲートは、コンジュゲートのタンパク質の併用治療効果に応じて、様々な疾患及び障害の処置に有用であり得る。
【０２４３】
成長ホルモン化合物が成長ホルモン欠乏症の処置に適していることは知られている。基本的に、コンジュゲートされた成長ホルモンタンパク質を含む本発明による医薬組成物は、患者が循環成長ホルモン活性の増加から有益な結果がもたらされる任意の疾患又は障害の処置において使用することができる。現在の処置において、成長ホルモンタンパク質は投与されている。代替として成長ホルモン変異体又は化合物を投与して、成長ホルモン活性を提供することができる。本発明の一態様は、処置方法において使用するための成長ホルモンコンジュゲートである。
【０２４４】
本発明の一態様は、処置、特に小児及び/又は成人における成長ホルモン欠乏症、或いは患者が本明細書に説明されているような成長ホルモンのレベルの増加から有益な結果が得られる他の疾患又は状態の処置のための医薬の製造における成長ホルモンコンジュゲートの使用に関する。
【０２４５】
本発明は更に、成長ホルモンコンジュゲートを含めてタンパク質コンジュゲートを含む、処置方法で使用するための本発明による医薬組成物の調製の態様、並びに処置方法で使用するための医薬組成物の態様に関する。
【０２４６】
そのような実施形態において、本発明による医薬組成物は、小児及び/又は成人における成長ホルモン欠乏症の処置又は予防方法において使用するためのものである。循環成長ホルモンの濃度の増加が有用であり得る他の疾患又は障害もまた、本発明の医薬組成物を使用して処置又は予防することができる。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、循環成長ホルモンの量の増加による有益な結果が観察される疾患又は状態を処置する方法において使用するためのものである。このような疾患又は状態には、成長ホルモン欠乏症(GHD);ターナー症候群;プラダー-ウィリー症候群(PWS);ヌーナン症候群;ダウン症候群;慢性腎疾患、若年性関節リウマチ;嚢胞性線維症、HAART治療を受けている小児におけるHIV感染(HIV/HALS小児);在胎期間に比べて小さく誕生した低身長児(SGA);SGA以外の極低出生体重児における低身長(VLBW);骨格異形成;軟骨低形成症;軟骨無形成症;特発性低身長(ISS);成人におけるGHD;脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨、中足骨、及び指等、長骨における骨折若しくは長骨の骨折;頭蓋骨、手の指節骨底、及び足の趾節骨底等、海綿様骨における骨折若しくは海綿骨の骨折;例えば、手、膝、若しくは肩における腱若しくは靭帯の手術後における患者;仮骨延長法を施されているか若しくは経過しつつある患者;膝関節、股関節、肩関節、肘関節、手関節、若しくは顎関節等、股関節若しくは円板の置換術、半月板の修復術、脊椎の癒合術若しくは装具固定術後における患者;ネイル、スクリュー、及びプレート等の骨合成材料を体内に固定した患者;骨折による偽関節若しくは変形治癒を示す患者;例えば、脛骨又は第一趾からの骨切除術後の患者;移植片の体内移植後の患者;外傷若しくは関節炎により生じた膝における関節軟骨の変性;ターナー症候群を示す患者における骨粗鬆症;男性における骨粗鬆症;慢性透析の成人患者(APCD);栄養不良に伴うAPCDにおける心血管疾患;APCDにおける悪液質の逆転;APCDにおけるがん;APCDにおける慢性閉塞性肺疾患;APCDにおけるHIV;APCDの高齢者;APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群;クローン病;IBD、UC、肝機能不全;HIV感染を示す男性;短腸症候群;中心性肥満;HIVに伴う脂肪異栄養症候群(HALS);男性不妊症;大規模な待期的手術、アルコール/薬物解毒、若しくは神経外傷後における患者;老化;虚弱高齢者;骨関節症;外傷による軟骨損傷;勃起障害;線維筋痛;記憶障害;抑うつ症;外傷性脳傷害;クモ膜下出血;極低出生時体重;メタボリック症候群;グルココルチコイドミオパシー;又は小児におけるグルココルチコイド治療に起因する低身長が含まれる。成長ホルモンはまた、筋肉組織、神経組織、若しくは創傷の治癒の加速化;損傷組織への血流の加速化若しくは改善;又は損傷組織における感染率の低減にも使用されている。
【０２４７】
一実施形態において、成長ホルモンコンジュゲート及びその組成物は、小児のGHD、成人のGHD(AGHD)、ターナー症候群(TS)、ヌーナン症候群、特発性低身長(ISS)、短期在胎月齢での低身長(SGA)、プラダー-ウィリー症候群(PWS)、慢性腎不全(CRI)、骨格異形成、SHOX不全、AIDS消耗、HIVに伴う脂肪異栄養症(HARS)、ステロイド依存性疾患を任意選択的に含む短腸症候群、嚢胞性線維症、及び線維筋痛を処置するためのものである。
【０２４８】
一実施形態において、成長ホルモンコンジュゲート又は組成物は、本明細書で説明されている医薬組成物の製造において使用するためのものである。
【０２４９】
一実施形態において、本発明は、本発明による医薬組成物の活性が前記疾患又は状態の処置において有用である、上述の疾患又は状態を処置する方法に関する。医薬組成物、例えば、成長ホルモンコンジュゲートの投与によって、患者における循環成長ホルモン活性の量の増加に関連する治療上の有利な結果が得られる。一実施形態において、前記方法は、成長ホルモンコンジュゲートを含む医薬組成物の有効量を患者に投与し、それによって前記患者の症状を改善することを含む。
【０２５０】
一実施形態において、本発明は、本発明による医薬組成物の治療有効量の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。したがって、本発明は、これらの疾患又は状態を処置する方法であって、本発明による医薬組成物中の成長ホルモン変異体又は化合物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。
【０２５１】
本明細書で使用される場合の本発明の化合物の「治療有効量」とは、所定の疾患及びその合併症の臨床症状を治癒、軽減又は部分的に阻止するのに十分な量を意味する。これを達成するのに十分な量が「治療有効量」として定義される。
【０２５２】
各々の目的における有効量は、例えば、疾患又は傷害の重篤度、並びに対象の体重、性別、年齢及び全身状態に依存する。
【０２５３】
本明細書で説明されているように、成長ホルモン変異体又は医薬組成物の化合物は、各投与後に、患者における化合物への曝露を増加させることを目的とした長期半減期を有することができ、また医薬組成物の投与計画は効果的な曝露を達成するように調整されるべきである。
【０２５４】
タンパク質コンジュゲートを調製する方法
本発明の一態様は、本明細書に説明されているタンパク質コンジュゲートを調製する方法に関する。コンジュゲートしようとするタンパク質(タンパク質1、タンパク質2及び任意のタンパク質3)、並びにリンカーは、別々に生成され、適切な反応において一緒にカップリングされる。
【０２５５】
タンパク質の調製
目的のタンパク質に応じて、様々な供給源が当業者には利用可能である。タンパク質は、適切な宿主、例えば大腸菌、酵母又は哺乳動物細胞における異種発現によってのみ、組換えにより産生され得る(Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Joseph Sambrook, E. F. Fritsch及びJ. Sambrook(著))。
【０２５６】
GH調製の例は、本明細書の実施例セクションに提供されており、これらの変形物は当業者が所望するように実施することができる。
【０２５７】
本願は、Fcドメインを有する例を含む。Fcドメインは、ヒト及び他の動物から単離された全長抗体から得ることができるか、又は組換え産生され、形質転換された哺乳動物細胞若しくは微生物から得ることができる。Fcドメインを得るための多くの技術が当分野では公知である。
【０２５８】
Fcドメインは、全長抗体からタンパク質分解酵素、例えばパパイン又はペプシン等による消化によって産生することができる。プロテインAアフィニティークロマトグラフィー及びDEAE陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、得られたFab及びF(ab')2をFcドメインから分離することができる。SEC-HPLC分析に基づいて、Fcフラグメントの純度を決定することができる。
【０２５９】
組換え方法を使用する場合、所望のポリペプチドを発現させ、続いてFcドメインを精製することができる。一実施形態において、Fcドメインは、ヒト由来のFcドメイン、例えば、形質転換された微生物又は哺乳動物細胞から得られるヒトIgG Fcドメインである。
【０２６０】
更に、本発明のFcフラグメントは、天然糖鎖を有する形態、天然形態に比べて糖鎖が増加した形態、若しくは天然形態に比べて糖鎖が減少した形態であってもよく、或いは非グリコシル化形態であってもよい。Fcフラグメントの糖鎖の増加、減少又は除去は、当技術分野で一般的な方法、例えば、化学的方法、酵素的方法及び大腸菌等の微生物を使用する遺伝子工学的方法によって達成することができる。
【０２６１】
非グリコシル化される大腸菌由来のFcフラグメントは、Fcガンマ受容体I、IIa、IIb、IIIaに対してそれぞれ結合が低下し又は弱くなり、低ADCC及びCDCの利点を有する。好ましくは、Fcガンマ受容体IIIに対する結合を天然では有さない非グリコシル化hIgG4 Fcフラグメントである。
【０２６２】
硫黄原子及び遊離システイン
本明細書において上記で説明しているように、リンカーは、硫黄原子を介して1つ又は複数のタンパク質と共有結合している。硫黄原子は、一実施形態において、タンパク質チオール由来である。タンパク質チオールの最も一般的な供給源は、アミノ酸システインである。システインはジスルフィド結合に関与し得るが、チオールを供給するシステインは通常ジスルフィド結合に関与しないことが好ましい場合がある。或いは、ジスルフィド結合を還元して、コンジュゲーションに利用可能な2つの硫黄原子を提供することができる。
【０２６３】
一実施形態において、硫黄原子は、コンジュゲートのタンパク質中に存在するシステインアミノ酸のチオールに由来する。タンパク質コンジュゲートは1つ又は複数の硫黄原子を含み得るので、硫黄原子は1つ又は複数のタンパク質システインに由来し得る。したがって、タンパク質システインは、タンパク質のポリペプチドのシステイン残基である。
【０２６４】
一実施形態において、システインは野生型残基であってもよいが、他の実施形態においては、システインは変異体システイン、例えば野生型残基のアミノ酸置換であってもよい。複数のCysがコンジュゲートに関与し得る場合、幾つかの-S-はwt型Cys由来のものであり、他は変異体Cysであり得る。
【０２６５】
一実施形態において、本発明は、タンパク質システインの1つ又は複数が変異体アミノ酸残基である、先の実施形態のいずれかに記載のコンジュゲートに関する。
【０２６６】
本明細書で説明されている方法は、コンジュゲートしようとするタンパク質の少なくとも1つが遊離システインを含む、タンパク質コンジュゲートを調製するのに適している。遊離システイン(Cys)は、チオール反応性リンカーを介するコンジュゲーションに利用可能なシステイン残基である。遊離Cysは、通常、タンパク質内ジスルフィド結合に関与しないシステイン残基である。ヒト成長ホルモンについて本明細書の上記で説明しているように、遊離Cysは、目的のタンパク質の適切な場所にアミノ酸を導入する組換えによって生成され得る。通常、アミノ酸挿入は必須でないアミノ酸の置換であるが、Cysは追加のアミノ酸として導入することもできる。
【０２６７】
多くの場合、遊離Cysを有するタンパク質は他の硫黄分子、通常、タンパク質が産生及び精製されたときに細胞抽出物中に存在する有機小分子と混合ジスルフィドを形成し得るので、遊離システインはコンジュゲーション反応の前に遊離させる必要がある。
【０２６８】
遊離システインはまた、2つの遊離システインを利用可能にする、既存のジスルフィド結合を還元することによって生成され得る。一実施形態において、2つの等価システインは、Fcドメインの2つのポリペプチド間の少なくとも1つのジスルフィド結合を含むFcドメインを還元することによって生成され得る。一実施形態において、2つのFcポリペプチド間に単一ジスルフィド結合を有するFcドメインが調製される。一実施形態において、Fcドメインは、Fcドメインのヒンジ領域に単一ジスルフィド結合を含む。実施例2に示しているように、そのような分子は、本明細書で説明されている方法を使用して三価リンカーの2つのアームと連結され得る。得られたタンパク質コンジュゲーション(又はコンジュゲート中間体)は、Fcドメイン及び第2のタンパク質とのコンジュゲーションに利用可能な第3のアームと対称性連結を有する。下記に説明するように、コンジュゲーションの順序は変更することができる。
【０２６９】
リンカーの調製
本発明のリンカーは標準的な化学技術によって生成することができ、本明細書には多数の例が含まれている。
【０２７０】
タンパク質コンジュゲートに関する反応スキーム
コンジュゲーションで使用されるタンパク質及び使用される個々のリンカーに応じて、様々な方法を適用することができるが、当業者には、本発明の概念から逸脱することなく、任意の特定のニーズに対して本明細書に記載されている方法を調整することができることが予測されよう。
【０２７１】
コンジュゲートされるタンパク質及びリンカーは、別々に調製及び精製される。
【０２７２】
本発明の一態様は、少なくとも2つのタンパク質をカップリングするための方法に関する。2つのタンパク質との逐次反応は、異なる反応性末端を有するリンカーを使用することによって得られる。両方のタンパク質が遊離システインを含む実施形態において、このようなタンパク質は、2つのチオール反応性末端を有するリンカーを使用して一緒にカップリングされる。
【０２７３】
本方法は、リンカーに関して説明しているように、反応性末端としてハロ-アセトアミドを有するリンカーを使用して更に例示される。
【０２７４】
一実施形態における本発明は、チオール反応性リンカー:
LG1-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2、
[式中、LG1はLG2よりも高い反応性を有する]
を使用して、タンパク質1-SHとタンパク質2-SHを一緒にカップリングして式IIのタンパク質コンジュゲート
式II  タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2
を得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
a) タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1と反応させる工程と、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法に関する。
【０２７５】
1つのタンパク質2のみが遊離システインを含む場合、タンパク質1は、構造:
タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG
を有する中間体を提供する代替の経路によってカップリングされ得る。
【０２７６】
方法の工程c)、d)及びe)は、工程a)のコンジュゲーションが構造:
タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG
を有する中間体を使用して実施される、若干変更された方法で更に使用され得る。
【０２７７】
一実施形態において、本発明は、タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2とタンパク質2-SHを一緒にカップリングして、
式I:  タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法
[式中、LG2は低反応性の脱離基である]であって、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)によって得られる中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法に関する。
【０２７８】
水性フィンケルシュタインハロゲン交換反応等の脱離基交換反応を実施することにより、脱離基の反応性を増大させることができる。
【０２７９】
一実施形態において、LG2はClである。そのような実施形態において、-NH-C(=O)-CH2-Clは、工程c)において-NH-C(=O)-CH2-Iに変換され、その後、タンパク質2-SHと反応させてタンパク質コンジュゲートが得られる。このようにして、第1の中間体は、LG2を幾分不活性形態で調製することができる。
【０２８０】
一実施形態において、LG1はBrであり、LG2はClである。Br-アセトアミドはCl-アセトアミドよりも反応性が高いので、脱離基はコンジュゲーションの順序を決定し、LG2をClからIに変化させるその後の活性化により、第2中間体のリンカー末端が確実にタンパク質2と反応する。
【０２８１】
本発明はまた、3つ以上のタンパク質、例えば、本明細書で例示されている3つのタンパク質のGHによるカップリング及び実施例2のFcコンジュゲーションに関する。
【０２８２】
一実施形態において、本方法は、タンパク質1-SHとタンパク質2-SHの2つのコピーを一緒にカップリングして、式IVのタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートの調製についてである。
【０２８３】
一実施形態において、本発明は、チオール反応性リンカー:
【０２８４】
【化２９】
2018535195.tif 000036
【０２８５】
[式中、LG1はLG2よりも高い反応性を有する]
を使用して、タンパク質1-SHと2×(タンパク質2-SH)を一緒にカップリングして、
式IV
【０２８６】
【化３０】
2018535195.tif 000037
【０２８７】
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する
方法であって、
a) タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1 (R1)と反応させる工程と、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー[-NH-C(=O)-CH2-LG2]2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法に関する。
【０２８８】
上記のように、脱離基交換反応トランスフォーミングは、リンカーの第2及び第3の反応性末端を活性化させるように機能する。一実施形態において、LG2はClからIに変化し、反応性が増大する。一実施形態において、LG1はClからIに変化し、反応性が増大する。一実施形態において、最終中間体中のR2及びR3両方の反応性末端は、-NH-C(=O)-CH2-Iを含む。
【０２８９】
タンパク質リンカーコンジュゲートが第2の(及び/又は第3の)アーム中にチオール反応性末端のみを含む場合の代替手段によってb)の中間体が得られる場合、本方法は、工程2から開始して適用することができる。
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-リンカー[-NH-C(=O)-CH2-LG2]2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SH及びタンパク質3-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程。
【０２９０】
そのような一実施形態において、本方法は、タンパク質1-リンカーとタンパク質2-SHを一緒にカップリングして、タンパク質2の2つのコピーが硫黄原子を介して連結されている、式IIIのタンパク質コンジュゲート
式III
【０２９１】
【化３１】
2018535195.tif 000038
【０２９２】
を得る、タンパク質コンジュゲートを調製するためのものである。
【０２９３】
本方法は、
a) コンジュゲート中間体又は構造:
【０２９４】
【化３２】
2018535195.tif 000039
【０２９５】
[式中、LG2は低反応性の脱離基である]
を得る工程と、
b) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
c) b)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
d) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む。
【０２９６】
以下の構造:
【０２９７】
【化３３】
2018535195.tif 000040
【０２９８】
を有するタンパク質リンカー中間体を使用することができるが、上記で説明されているように、LGは、より高い反応性を有する代替ハロゲンと交換されるハロゲンであってもよく、また前述のように、Clは、Cys残基に対して高い反応性であるIと交換され得る。
【０２９９】
上記スキームに基づくと、反応性末端の反応性は重要であり、一実施形態において、LG1はLG2よりも高い反応性を有する。一実施形態において、LG1はBr又はIである。一実施形態において、LG2はClである。
【０３００】
一実施形態において、LG2はClであり、Iに交換される。交換反応は水性ハロゲン交換、例えば水性フィンケルシュタイン反応として実施することができる。反応は、KI水溶液中で実施することができる。この溶液は、アスコルビン酸を更に含んでいてもよい。一実施形態において、反応は、0.1〜5MのKI及び10〜50mMのアスコルビン酸の存在下で実施される。
【０３０１】
コンジュゲーション方法の各種工程の持続時間は、コンジュゲートしようとする個々のタンパク質について調整することができる。
【０３０２】
タンパク質1との反応工程は、1〜24時間、例えば一晩実施することができる。
【０３０３】
タンパク質2との反応工程は、1〜24時間、例えば一晩実施することができる。
【０３０４】
上記の方法は、本明細書の上記で説明されているリンカー、例えば、必要に応じて2アーム型又は3アーム型リンカーを使用して実施することができる。
【０３０５】
本明細書で提供する全ての実施例において、ハロアセトアミドと還元型遊離システインの間の反応により、リンカー構造とポリペプチドとを接続する、チオエーテル(-CH2-S-CH2-)が形成される。チオエーテルの-CH2-基は、リンカー及び/又はタンパク質の一部と考えることができるが、連結の独自性を示すために構造に含めることができる。
【０３０６】
中間体
上記で説明した方法の全体的な設定に基づけば、説明されている一連の生成物及び中間体は本発明の一部である。
【０３０７】
タンパク質コンジュゲーションが多くの状況において逆の順序で実施され得ることは、上記から明らかである。本概要において、タンパク質1はコンジュゲートされる第1のタンパク質であると考えられる。コンジュゲーションの異なる2つの順序はまた、本願の実施例3に例示されている。
【０３０８】
【表４】
2018535195.tif 000041
【０３０９】
【表５】
2018535195.tif 000042
【０３１０】
【表６】
2018535195.tif 000043
【０３１１】
一実施形態において、中間体はリンカーの2つのアームに個別に連結されている2つのFcポリペプチドを有する構造であるが、第1のアームは異なるタンパク質/ペプチドとのコンジュゲーションに使用される。したがって、本発明による中間体は、Fcポリペプチドを含む三価リンカー構造によってアーム2及び3に連結され得るが、アーム1は依然遊離している。代わりに、中間体は三価リンカーのアーム1へのタンパク質コンジュゲートであり、したがってこれはアーム2及びアーム3を介するFcポリペプチドへのコンジュゲーションに適している。
【０３１２】
2つのFcポリペプチドを含むタンパク質コンジュゲートの全体的な構造は、リンカーの反応性末端とは無関係に、
【０３１３】
【化３４】
2018535195.tif 000044
【０３１４】
である。
【０３１５】
一実施形態において、コンジュゲートは、ハロ-アセトアミド脱離基によって媒介されるFcのチオール連結を含み、タンパク質コンジュゲート:
【０３１６】
【化３５】
2018535195.tif 000045
【０３１７】
中に挿入される構造-NH-C(=O)-CH2-を提供する。
【０３１８】
三価リンカーに関する詳細は、本願の他の箇所で提供されており、上記の構造に読み込むことができる。
【０３１９】
本発明の特定の特徴は本明細書に説明され、後続の実施例に示されているが、当業者には多くの改変、置き換え、変更、及び同等物が認識されるであろう。したがって、添付の実施形態及び特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨の範囲内に含まれる全てのそのような改変及び変更を網羅するものと理解されたい。
【０３２０】
実施形態
1.  以下の構造
【０３２１】
【化３６】
2018535195.tif 000046
【０３２２】
[式中、
リンカーは化学的部分であり、
Sは硫黄原子であり、
タンパク質1は、リンカー及び硫黄原子を介してタンパク質2及びタンパク質3に共有結合的に連結されている]
のタンパク質コンジュゲート。
【０３２３】
2.  コンジュゲートが以下の構造
【０３２４】
【化３７】
2018535195.tif 000047
【０３２５】
を有する、実施形態1のタンパク質コンジュゲート。
【０３２６】
3.  コンジュゲートが以下の構造
【０３２７】
【化３８】
2018535195.tif 000048
【０３２８】
[式中、Uは中心の単位を表し、RR1は反応性末端基を表し、S1、S2及びS3は個々のスペーサーを表す]
を有する、実施形態1のタンパク質コンジュゲート。
【０３２９】
4.  硫黄原子(-S-)がチオエーテル(-CH2-S-CH2-)の一部である、実施形態1〜3のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３３０】
5.  Uが窒素原子を含むか又は窒素原子のみからなる、実施形態1〜4のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３３１】
6.  Uがベンゼン環構造を含むか又はベンゼン環構造からなる、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３３２】
7.  タンパク質2及びタンパク質3がFcポリペプチドである、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３３３】
8.  コンジュゲートが構造:
【０３３４】
【化３９】
2018535195.tif 000049
【０３３５】
を有する、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３３６】
9.  コンジュゲートが構造:
タンパク質1-RR1-S1-U-[S2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc]2
[式中、
RR1は反応性末端基であり、
S1及びS2は個々のスペーサーを表し、
Uは中心の単位を表し、
FcはFcポリペプチドである]
を有する、実施形態1〜8のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３３７】
10.  タンパク質1が成長ホルモンである、実施形態1〜9のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３３８】
11.  コンジュゲートが構造:
【０３３９】
【化４０】
2018535195.tif 000050
【０３４０】
[式中、GHは成長ホルモン分子を表す]
を有する、実施形態1〜10のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３４１】
12.  コンジュゲートが構造:
GH-RR1-S1-U-[S2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc]2
[式中、
GHは成長ホルモン分子を表し、
RR1は反応性末端基を表し、
S1及びS2は個々のスペーサーを表し、
Uは中心の単位を表し、
FcはFcポリペプチドである]
を有する、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３４２】
13.  Fcポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4等のIgGに由来する、実施形態7〜12のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３４３】
14.  Fcポリペプチドがヒンジ領域を含む、実施形態7〜13のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３４４】
15.  各Fcポリペプチドのヒンジ領域がCys残基を含む、実施形態7〜14のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３４５】
16.   Fcポリペプチドのヒンジ領域が、IgG1由来ヒンジ配列及びIgG4由来配列からなる配列の群から選択される、実施形態7〜15のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３４６】
17.  IgG1由来ヒンジ配列がPKSCDKTHTCPPCP、PPCP、PCP及びCPから選択される、実施形態16に記載のコンジュゲート。
【０３４７】
18.  IgG4由来ヒンジ配列がSKYGPPCPSCP、PSCP、SCPL及びCPから選択される、実施形態16に記載のコンジュゲート。
【０３４８】
19.  以下の構造
【０３４９】
【化４１】
2018535195.tif 000051
【０３５０】
の実施形態1〜18のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３５１】
20.  コンジュゲートが構造:
【０３５２】
【化４２】
2018535195.tif 000052
【０３５３】
を有する、実施形態1〜19のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３５４】
21.  コンジュゲートが構造:
【０３５５】
【化４３】
2018535195.tif 000053
【０３５６】
を有する、実施形態1〜20のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３５７】
22.  硫黄原子(-S-)がタンパク質チオールに由来する、実施形態1〜21のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３５８】
23.  硫黄原子(-S-)がタンパク質システインに由来する、実施形態1〜22のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３５９】
24.  硫黄原子(-S-)が遊離Cysに由来する、実施形態1〜23のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３６０】
25.  1つ又は複数のタンパク質システインが野生型残基である、実施形態1〜24のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３６１】
26.  1つ又は複数のタンパク質システインが変異体アミノ酸残基である、実施形態1〜25のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３６２】
27.  タンパク質2及びタンパク質3とリンカーとを連結する-S-が野生型システインに由来する、実施形態1〜26のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３６３】
28.  タンパク質1とリンカーとを連結する-S-が変異体システインに由来する、実施形態19〜27のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３６４】
29.  タンパク質1を連結する-S-が遊離Cysに由来する、実施形態19〜28のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３６５】
30.  タンパク質1を連結する-S-が、T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62C、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C及びG190Cからなる群から選択される成長ホルモン変異体の遊離システインに由来する、実施形態19〜29のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３６６】
31.  タンパク質1を連結する-S-が、A98C、N99C、L101C、V102C及びS108Cからなる群から選択される成長ホルモン変異体の遊離システインに由来する、実施形態19〜30のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３６７】
32.  タンパク質1を連結する-S-が、成長ホルモン変異体中のAA93〜106内に位置するCys置換に由来する、実施形態19〜31のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
【０３６８】
33.  構造:
【０３６９】
【化４４】
2018535195.tif 000054
【０３７０】
[式中、Uは中心の単位を表し、
S1、S2及びS3は個々のスペーサーを表し、
R1、R2及びR3は個々に反応性末端を表す]
の三価リンカー。
【０３７１】
34.  R1、R2及びR3が同一ではない、実施形態33に記載のリンカー。
【０３７２】
35.  R2及びR3が同一である、実施形態33又は34に記載のリンカー。
【０３７３】
36.  R2及びR3が同一であるが、R1は異なる、実施形態33〜35のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３７４】
37.  R2及びR3がチオール反応性末端である、実施形態33〜36のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３７５】
38.  R2及びR3が、それぞれ、臭化物、塩化物又はヨウ化物等のハロゲン脱離基を含む、実施形態33〜37のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３７６】
39.  R2及びR3が-NH-C(=O)-CH2-LGを含み、構造:
【０３７７】
【化４５】
2018535195.tif 000055
【０３７８】
[式中、LG2及びLG3はハロゲン脱離基である]
のリンカーを提供する、実施形態33〜38のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３７９】
40.  反応性末端R2及びR3が同一のcys反応性末端である、実施形態33〜39のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３８０】
41.  R1がR2及びR3とは異なる、実施形態33〜40のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３８１】
42.  R1がR2及びR3と異なる反応性を有する、実施形態33〜41のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３８２】
43.  R1がチオール反応性末端である、実施形態33〜42のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３８３】
44.  R1が、臭化物、塩化物又はヨウ化物等の脱離基を含むチオール反応性末端である、実施形態33〜43のいずれか1つに記載のリンカー。
45.  第1のリンカーアームが、構造LG1-CH2-C(=O)-S1-を有する、実施形態33〜44のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３８４】
46.  R1がLG1としてのClを含み、R2及びR3がLG2としてのBrを含む、実施形態33〜45のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３８５】
47.  R1がLG1としてのBrを含み、R2及びR3がLG2としてのClを含む、実施形態33〜46のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３８６】
48.  S2及びS3が同一である、実施形態33〜47のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３８７】
49.  リンカーの長さが10〜60原子、例えば12〜45原子、又は15〜40原子である、実施形態33〜48のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３８８】
50.  S2及びS3がショートスペーサー、例えば-(CH2)2-である、実施形態33〜49のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３８９】
51.  S1がS2及びS3とは異なる、実施形態33〜50のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３９０】
52.  S1が10〜50原子の長さの延長スペーサーである、実施形態33〜51のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３９１】
53.  S1がペプチド結合によって連結されている1つ又は複数のスペーサーエレメントを含む、実施形態33〜52のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３９２】
54.  S1のスペーサーエレメントが
【０３９３】
【化４６】
2018535195.tif 000056
【０３９４】
e) -NH-CH(-COOH)-(CH2-)4-NH-、  f) -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-、及び
【０３９５】
【化４７】
2018535195.tif 000057
【０３９６】
[式中、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数である]
の群から選択される、実施形態33〜53のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３９７】
55.  スペーサーエレメントが*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-* (OEG又は8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸のジラジカル)である、実施形態33〜54のいずれか1つに記載のリンカー。
【０３９８】
56.  リンカーが
【０３９９】
【化４８】
2018535195.tif 000058
【０４００】
(S)-4-(2-{2-[((S)-1-{ビス-[2-(2-クロロ-アセチルアミノ)-エチル]-カルバモイル}-3-カルボキシ-プロピルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-2-(2-ブロモ-アセチルアミノ)-酪酸
【０４０１】
【化４９】
2018535195.tif 000059
【０４０２】
4S,18S)-4-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-ブロモアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸
【０４０３】
【化５０】
2018535195.tif 000060
【０４０４】
2-(2-ブロモアセトアミド)-N,N-ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)アセトアミド
【０４０５】
【化５１】
2018535195.tif 000061
【０４０６】
2-(2-(2-(2-(2-ブロモアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-N,N-ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)アセトアミド
【０４０７】
【化５２】
2018535195.tif 000062
【０４０８】
(13R,18S)-18-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)カルバモイル)-1-ブロモ-13-カルボキシ-2,11,16-トリオキソ-6,9-ジオキサ-3,12,17-トリアザヘンイコサン-21-オイック酸
【０４０９】
【化５３】
2018535195.tif 000063
【０４１０】
(18R,23S)-23-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)カルバモイル)-1-ブロモ-18-カルボキシ-2,7,16,21-テトラオキソ-11,14-ジオキサ-3,8,17,22-テトラアザヘキサコサン-26-オイック酸
【０４１１】
【化５４】
2018535195.tif 000064
【０４１２】
(R)-4-{2-[2-({ビス-[2-(2-クロロ-アセチルアミノ)-エチル]-カルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-チルカルバモイル}-2-[(S)-2-(2-{2-[2-(2-ブロモ-アセチルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-アセチルアミノ)-4-カルボキシ-ブチリルアミノ]-酪酸
【０４１３】
【化５５】
2018535195.tif 000065
【０４１４】
(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-ブロモアセトアミド)エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-クロロアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸
【０４１５】
【化５６】
2018535195.tif 000066
【０４１６】
(4S)-5-[ビス[3-[(2-クロロアセチル)アミノ]プロピル]アミノ]-4-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソ-ペンタン酸
【０４１７】
【化５７】
2018535195.tif 000067
【０４１８】
(2R)-6-[ビス[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチル]カルバモイルアミノ]-2-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサン酸
【０４１９】
【化５８】
2018535195.tif 000068
【０４２０】
N-[2-[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]エチルカルバモイル-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチル]アミノ]エチル]-2-クロロ-アセトアミド
及び
【０４２１】
【化５９】
2018535195.tif 000069
【０４２２】
(2R)-2-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-[2-[2-[2-[[(1S)-3-カルボキシ-1-[2-[(2-クロロアセチル)-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]-エチル]アミノ]エチルカルバモイル]プロピル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-5-オキソ-ペンタン酸
からなる群から選択される、実施形態33〜55のいずれか1つに記載のリンカー。
【０４２３】
57.  タンパク質1-SH、タンパク質2-SH及びチオール反応性リンカーを一緒にカップリングして、式II:
タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2 (式II)
[式中、チオール反応性リンカーは構造:
LG1-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2
(式中、LG1はLG2より高い反応性を有する)
を有する]
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
a) タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1と反応させる工程と、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法。
【０４２４】
58.  タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2とタンパク質2-SHを一緒にカップリングして、式I:
タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2 (式I)
[式中、LGは低反応性の脱離基である]
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LGを得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLGの反応性を増大させる工程と、
d) b)のコンジュゲート中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法。
【０４２５】
59.  タンパク質1-リンカーとタンパク質2-SHを一緒にカップリングして、式III:
【０４２６】
【化６０】
2018535195.tif 000070
【０４２７】
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
b) コンジュゲート中間体又は構造:
【０４２８】
【化６１】
2018535195.tif 000071
【０４２９】
[式中、LG2は低反応性の脱離基である]
を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) b)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法。
【０４３０】
60.  タンパク質1-SH、タンパク質2-SH及びチオール反応性リンカーを一緒にカップリングして、式IV
【０４３１】
【化６２】
2018535195.tif 000072
【０４３２】
[式中、チオール反応性リンカーは構造:
【０４３３】
【化６３】
2018535195.tif 000073
【０４３４】
(式中、LG1はLG2よりも高い反応性を有する)
を有する]
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
a) タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1と反応させる工程と、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー[-NH-C(=O)-CH2-LG2]2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法。
【０４３５】
61. LG1がBrである、実施形態57〜60のいずれか1つに記載の方法。
【０４３６】
62. LG2がClである、実施形態57〜61のいずれか1つに記載の方法。
【０４３７】
63. LG1がClである、実施形態57〜62のいずれか1つに記載の方法。
【０４３８】
64. LG2がBrである、実施形態57〜63のいずれか1つに記載の方法。
【０４３９】
65. 交換反応がClからIへの交換である、実施形態57〜64のいずれか1つに記載の方法。
【０４４０】
66. 交換反応が0.1〜5MのKI及び10〜50mMのアスコルビン酸の存在下で実施される、実施形態57〜65のいずれか1つに記載の方法。
【０４４１】
67. タンパク質-SHをチオール反応性リンカー又はコンジュゲート中間体と一晩反応させる、実施形態57〜66のいずれか1つに記載の方法。
【０４４２】
68. タンパク質1-リンカー-[NH-C(=O)-CH2-I]2をタンパク質2-SHと一晩反応させる、実施形態57〜67のいずれか1つに記載の方法。
【０４４３】
69. Fcドメインが両方のFcポリペプチド鎖の共有結合的連結を介してタンパク質1にコンジュゲートされる、実施形態57〜8のいずれか1つに記載の方法。
【０４４４】
70. 還元によってタンパク質-SHを得る工程が含まれる、実施形態57〜69のいずれか1つに記載の方法。
【実施例】
【０４４５】
略語:
amu=原子質量単位
Boc=tert-ブチルオキシカルボニル
O-t-Bu=tert-ブチルエステル
t-Bu=tert-ブチル
CDCl3=ジュウテリオクロロホルム
CD3OD=テトラジュウテリオメタノール
CV=カラム体積
DMSO-d6=ヘキサデューテリオジメチルスルホキシド
DCM=DCM、CH2Cl2、塩化メチレン
DIC=ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA=ジイソプロピルエチルアミン
DMF=N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルスルホキシド
DTT=ジチオスレイトール
EDAC=1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
Et2O=ジエチルエーテル
EtOAc=酢酸エチル
FA=ギ酸
Fmoc=9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Fmoc-Glu-O-t-Bu=N-Fmoc-グルタミン酸-1-t-ブチルエステル
Fmoc-Lys(Mtt)-OH=(S)-6-[(ジフェニル-p-トリル-メチル)-アミノ]-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸
Fmoc-OEG-OH=(2[2-(Fmoc-アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
Fmoc-Thx-OH=N-Fmoc-trans-4-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
H20=水
hr(s)=時間
Hz=ヘルツ
HOBt=1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC=高圧液体クロマトグラフィー
HPLC-MS=高圧液体クロマトグラフィー-質量分析
i.v.=静脈内
L=リットル
M=モル
mbar=ミリバール
mg=ミリグラム
min.=分
mL=ミリリットル
mM=ミリモル
mol=モル(s)
mmol=ミリモル
m/z=質量対電荷比
MS=質量分析
MeCN=アセトニトリル
MeOH=メタノール
μL=マイクロリットル
N=正常
nm=ナノメートル
nmol=ナノモル
NaCl=塩化ナトリウム
NaOH=水酸化ナトリウム
NMR=核磁気共鳴分光法
OEG=(2[2-(アミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル
ppm=百万分の一
PyBrOP=ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
p.o.=経口当たり
RP=逆相
rt又はRT=室温
tr又はRt=保持時間
sec=秒
s.c.=皮下
TCTU=O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル}-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
TEA=トリエチルアミン
TFA=トリフルオロ酢酸
THF=テトラヒドロフラン
TIS=トリイソプロピルシラン
TSTU=0-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウラニウムテトラフルオロボレート
HATU=1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート
TCEP=トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
TPPDS=ビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン
TPPTS=トリス((m-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン
【０４４６】
方法
方法1-成長ホルモンタンパク質を調製及び分析するための方法
成長ホルモン又は成長ホルモン変異体をコードする遺伝子をプラスミドベクターに組換え的に挿入した。続いて、適切な大腸菌株をプラスミドベクターの使用により形質転換した。hGH又はGH変異体は、N末端メチオニンにより発現させることができるか、又はMEAE融合体として発現させることができ、これからMEAE配列は続いて切断される。
【０４４７】
細胞ストックを25%グリセロールで調製し、-80℃で保存した。グリセロールストック株をLBプレートに接種し、続いて37℃で一晩インキュベートした。各プレートの内容物をLB培地で洗浄し、発現のために500mLのLB培地で希釈した。培養物を、OD600が0.6に達するまで、220rpmで振盪しながら37℃でインキュベートした。その後の誘導は、0.2mMのIPTGを使用し、25℃で16時間実施した。最後に細胞を遠心分離により回収した。
【０４４８】
続いて、細胞を0.05%のTween20、2.5mMのEDTA、10mMのシステアミン及び4Mの尿素を含有する10mMのトリス-HCl、pH9.0に懸濁し、細胞破砕機を使用し30kPSIで破砕した。上清を遠心分離により回収し、続いてクロマトグラフィー精製に供した。
【０４４９】
精製はイオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用を使用し、その後、CHO細胞から発現されたヒトジペプチジルペプチダーゼI(hDPPI)を使用してペプチドタグを除去して実施した。最終精製は、同種沈降(isoprecipitation)及びイオン交換クロマトグラフィーにより行った。また精製は、限定するものではないが、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び当業者に公知の膜に基づいた分離技術を使用することによっても達成することができる。
【０４５０】
成長ホルモン製剤の特性
完全精製タンパク質は、MALDI-MSを使用して分析した。観察された質量は、アミノ酸配列から推定される理論的質量に合致した。
【０４５１】
予測される連結ジスルフィド結合は、トリプシン及びAspN消化の後、DTTによるジスルフィド結合の還元前後のこの消化物のMALDI-MS分析を使用するペプチドマッピングによって実証することができる。
【０４５２】
タンパク質分解による消化:
重炭酸アンモニウムバッファー中1mg/mLの試験化合物溶液100μLを、37℃で24時間まで酵素によって分解する。部分試料を様々な時点で採取し、1%TFAへの10倍希釈により試料を酸性化させることによってタンパク質分解反応を停止させる。これらの希釈試料を逆相HPLCにより分析し、タンパク質分解による消化の程度を評価する。
【０４５３】
HPLC法:
水中0.1%TFA〜0.1%TFA含有100%MeCNの直線勾配で溶出させる逆相Vydac C4 2×150mmカラムに、30分間にわたり流速0.2mL/分で10μlの上記溶液を注入する。ピークの検出は、214nmにおけるUV吸収で実施する。時点t=Tにおける完全化合物のパーセンテージ(%)は、時点t=T(AT)におけるピーク面積とt=0(A0)におけるピーク面積から(AT/A0)×100%として計算する。GraphPad Prismソフトウェアver 5.01を使用して、完全化合物のパーセンテージ(%)を時間に対してプロットする。また半減期(T1/2)は、GraphPad Prismソフトウェアによって、1相減衰として計算する。使用することができる酵素の例は、エラスターゼ(Sigma社製、ブタ膵臓由来)及びキモトリプシン(Roche社製、配列決定グレード)である。バッファーの例は、50mMの重炭酸アンモニウム、pH=8.5である。
【０４５４】
キャピラリー電気泳動:
キャピラリー電気泳動は、Agilent Technologies 3DCEシステム(Agilent Technologies社製)を使用して実施した。データ取得及びシグナル処理は、Agilent Technologies 3DCE ChemStationを使用して実施した。キャピラリーは、64.5cm(有効な長さ56.0cm)で、50μm内径のAgilent社製の「Extended Light Path Capillary」であった。UV検出は、200nmで実施した(16nm Bw、基準380nm及び50nm Bw)。電気泳動電解質は、50mMのpH7  リン酸緩衝液であった(方法A)。キャピラリーは、0.1MのNaOHで3分間、次いで、Milli-Q水で2分間、電解質で3分間、調整した。各泳動後、キャピラリーをmilli-Q水で2分間、リン酸で2分間、milli-Q水で2分間洗い流した。流体力学的注入は、50mbarで4.0秒間行った。電圧は+25kVであった。キャピラリー温度は30℃であり、電気泳動時間は10.5分であった。
【０４５５】
Maldi-Tof質量分析法:
分子量は、Autoflex Maldi-Tof装置(Bruker社製)を使用して決定した。試料は、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸を使用して調製した。
【０４５６】
RP-HPLC:
RP-HPLC分析は、Vydac 218TP54 4.6mm×250mm 5μm C-18シリカカラム(The Separations Group社製、Hesperia)を使用してAgilent 1100システムで実施した。検出は、214nm、254nm、280nm及び301nmでのUVによるものであった。カラムは0.1%TFA/H2Oで平衡化し、試料は0.1%TFA/H2Oに対して0〜90%MeCNの適切な勾配により溶出した。
【０４５７】
LC-MS:
LC-MS分析は、2台のPerkin Elmer Series 200マイクロポンプ、Perkin Elmer Series 200オートサンプラー、Applied Biosystems 785A UV検出器、及びSedex 75蒸発光散乱検出器を備えたPE-Sciex API 100又は150質量分析計で実施した。Waters Xterra 3.0mm×50mm 5μC-18シリカカラムを室温にて1.5mL/分で溶出した。これを5%MeCN/0.1%TFA/H2Oで平衡化し、5%MeCN/0.1%TFA/H2Oで1.0分間溶出し、次いで7分間かけて90%MeCN/0.1%TFA/H2Oまでの直線勾配で溶出した。検出は、214nmでのUV検出及び蒸発光散乱により行った。カラム溶出液のフラクションをPE-Sciex API 100質量分析計のイオンスプレー界面に導入した。質量範囲300〜2000amuを、実行中2秒ごとに走査した。
【０４５８】
タンパク質の定量:
タンパク質濃度は、NanoDrop ND-1000 UV-分光光度計を使用し、280nmでの吸光度を測定することにより判定した。
【０４５９】
誘導体化部位を決定するための酵素的ペプチドマッピング:
ペプチドマッピングは、還元及びアルキル化タンパク質のAsp-N消化を使用して実施した。最初に、標準的な手順に従い、タンパク質をDTT及びヨードアセトアミドで処理した。アルキル化生成物は、HPLCを使用して精製した。続いて、アルキル化した精製生成物をエンドプロテアーゼAsp-N(Boehringer社製)により1:100の酵素:基質比で一晩消化した。消化物を、C-18カラム及び標準的なTFA/MeCNバッファー系を使用してHPLC分離した。得られたペプチドマップを、非誘導体化hGHのペプチドマップと比較し、保持時間の異なるフラクションを収集し、更にMaldi-tof質量分析法を使用して分析した。
【０４６０】
SDS page:
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動は、NuPAGE4%〜12%Bis-トリスゲル(Invitrogen社製  NP0321BOX)を使用して実施した。ゲルを銀染色(Invitrogen社製  LC6100)又はクマシー染色(Invitrogen社製  LC6065)し、適切な場合にはM. M. Kurfurst in Anal. Biochem. 200(2)、244-248、(1992)に記載されているようにヨウ化バリウムでPEGに対して染色した。
【０４６１】
タンパク質クロマトグラフィー:
タンパク質クロマトグラフィーは、Akta Explorerクロマトグラフィーシステム及びGE Health Care社製のカラムで実施した。アニオン交換は、Q-Sepharose HP 26/10カラムを使用して行った。開始バッファーは20mMトリエタノールアミン緩衝液pH8.5であり、溶出緩衝液は開始バッファー+0.2M NaClであった。化合物は、典型的には、15カラム量にわたって0〜75%溶出緩衝液の勾配で溶出した。脱塩及びバッファー交換は、HiPrep 26/10カラムを使用して実施した。
【０４６２】
方法2 - Fcドメインを調製する方法
Fcドメインは、当分野で公知の技術により、例えば、大腸菌(国際公開第05047334号、国際公開第05047335号、国際公開第05047336号、国際公開第05047337号及び国際公開第05001025号)又はHEC等の哺乳動物細胞(Farge, F.ら、Journal of Chromatography (1976)、第123巻、247〜250ページ)における発現により発現され得る。以下の全方法が本出願に適用されている。
【０４６３】
Fcドメインは、ヒトIgG4のフラグメントを使用して取得し、これはヒンジ領域のN末端で切断された。Met開始コドンを含むコード領域をpET11d由来ベクターに挿入して、MPSCPAPEFLGGPSVF...N末端を含むFcポリペプチドの発現を誘導した。Fcポリペプチドは、大腸菌において発現させた。使用した菌株は、ybhEノックインを更に含む、国際公開第2010052335号に記載されている(BL21(DE3)_TKO::ybhEであった。その後、Fcドメインを精製した。イニシエーターATG(Met-コドン)を、切断されたヒンジと一緒にインフレームに含めて大腸菌で発現できるようにした。宿主酵素によって、このメチオニンは除去され、精製されたFc中には存在せず、したがってN末端にプロリンを有する。規定の培地を使用して、大腸菌の細胞質から発現レベルが5g/Lを超える可溶性Fcフラグメントを得た。精製後、1.4g/Lの収量が得られた。in vitroでのジスルフィド架橋形成工程が、Fcドメインの正確なフォールディングを確実にするために含まれた。
【０４６４】
大腸菌細胞を規定の培地中37℃で、20L発酵槽中で約80の光学密度(OD600)まで培養した。次いで、培養物を0.2mMのIPTGで誘導し、25℃で一晩培養を継続した。最後に、細胞を遠心分離によって回収した。
【０４６５】
トリス-HCl 50mM、NaCl 300mM、EDTA 5mM及びDTT 1mMを含有するバッファー、pH7.4中で細胞ペレットをホモジナイズした後、標的タンパク質を0.2%PEI(ポリエチレンイミン)で30分間処理し、続いて6,000×gで遠心分離することにより回収した。Fcは、MabSelect SuR(GE Healthcare Life Sciences社製)を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞溶解液上清から精製し、次いで、尿素3.5M、シスタミン0.01mM、pH 8.5を室温で一晩添加することにより酸化した。最後に、形成されたFc二量体を、pH8.5のQ Sepharose HP(GE Healthcare Life Sciences社製)を使用するイオン交換クロマトグラフィーにより更に精製した。最終タンパク質は、TEA(トリス-アセテート-EDTA)20mM、NaCl 500mM、pH8.0中に存在する。
【０４６６】
方法4-タンパク質コンジュゲートを調製する方法-最初にGH
化学
コンジュゲーション方法は、適切な結合点を含む種々の適切なタンパク質を用いて実施することができるが、ここでは、GH変異体、及びリンカーに対するコネクターとして機能する1つ又は複数の硫黄原子を含む全てのFcドメインを使用して例示する。
【０４６７】
コンジュゲート、GH-A-B-タンパク質(IX)は、以下に示すように調製される:
【０４６８】
【化６４】
2018535195.tif 000074
【０４６９】
リンカーが最初にhGHに結合し、続いてFcに結合する反応。
【０４７０】
(I)のシステイン残基は、混合ジスルフィド(GH-S-S-R)として任意選択的に保護され、式中、Rは小さな有機部分である。混合ジスルフィドの非限定的な例には、システアミン(R=-CH2CH2NH2);システイン(R=-CH2CH(C(=O)OH)NH2);ホモシステイン(R=-CH2CH2CH(C(=O)OH)NH2);とグルタチオン(R=-CH2CH(C(=O)NH-CH2C(=O)OH)NH-C(=O)CH2CH2CH(C(=O)OH)NH2)の間のジスルフィドが含まれ得る。
【０４７１】
コンジュゲーションプロセスは、三価リンカーのLG1-A-B-(LG2)2(III)[式中、LG1及びLG2は、独立して、-Cl、-Br、-I等の無機脱離基及び/又はメシレート又はトシレート等の有機脱離基を表す]を利用する。還元型GH(II)とリンカーLG1-A-B-(LG2)n(III)とのコンジュゲーションは、求核置換(II+III→IV)を介して生じる。LG1対LG2の選択性は、LG1とLG2の間の脱離基能力の差を利用することにより得られる。LG2が次の工程において適切な脱離基として作用するためには、ヨウ化カリウムを用いた水性フィンケルシュタイン反応を介してヨード(VI)に変化させる。次に、このコンジュゲート中間体(VI)は、目的のタンパク質(VIII)と、ここでは、適切な還元剤として例えばジチオスレイトール(DTT)、TCEP、TPPTS、TPPDS等の使用によりジスルフィド結合が選択的に還元された(VII→VIII)Fcドメインと処理され、GH-A-B-タンパク質コンジュゲート(IX)が得られる。
【０４７２】
反応の工程は、以下のように、内部遊離Cysを有するGH化合物(I)、三価リンカー(III)及び還元可能なジスルフィド結合を含むFcドメインから出発して説明することができる。
【０４７３】
1)  混合ジスルフィド(I)を適切な選択的還元剤で還元することにより、遊離Cys GH(II)を任意選択的に遊離させる
2)  遊離Cys GH(II)を三価リンカー(III)でアルキル化し、Cysコンジュゲート型GHタンパク質リンカー中間体(IV)を得る
3)  水性フィンケルシュタインヨウ素交換反応(V)を介して、中間体(IV)中の脱離基LG2を活性化し、活性化Cys GHコンジュゲート中間体(VI)を得る
4)  適切な選択的還元剤でジスルフィド架橋を選択的に還元することにより、Fcドメイン(VII)の遊離システインを遊離させ、(VIII)を得る
5) Fcドメイン(VIII)と活性化Cys GHコンジュゲート中間体(VI)とのカップリングにより、Cysコンジュゲート型GH-Fcコンジュゲート(IX)を得る
【０４７４】
方法5-タンパク質コンジュゲートを調製するための方法-最初にFc
代替法において、コンジュゲートGH-A-B-タンパク質(IX)は、下記に示したように調製される:
【０４７５】
【化６５】
2018535195.tif 000075
【０４７６】
リンカーが最初にFcに結合し、続いてGHに結合する反応。
【０４７７】
式中、(I)のシステイン残基は、混合ジスルフィド(GH-S-S-R)として任意選択的に保護されていてもよく、ここで、Rは小さな有機部分である。混合ジスルフィドの非限定的な例には、システアミン(R=-CH2CH2NH2);システイン(R=-CH2CH(C(=O)OH)NH2);ホモシステイン(R=-CH2CH2CH(C(=O)OH)NH2);とグルタチオン(R=-CH2CH(C(=O)NH-CH2C(=O)OH)NH-C(=O)CH2CH2CH(C(=O)OH)NH2)の間のジスルフィドが含まれ得る。
【０４７８】
コンジュゲーションプロセスは、三価リンカーのLG1-A-B-(LG2)2(III)[式中、LG1及びLG2は、独立して、-Cl、-Br、-I等の無機脱離基及び/又はメシレート又はトシレート等の有機脱離基を表す]を利用する。リンカー(III)は求核置換を介して還元型タンパク質(VIII)に、例えば、(DTT、TCEP、TPPTS、及びTPPDS、又は他の還元剤)を使用するジスルフィド結合の選択的還元(VII→VIII)を介して(VII)から得られたFcドメインにコンジュゲートされ、LG1-A-B-タンパク質コンジュゲート(X)が得られる。LG1対LG2の選択性は、LG1とLG2の間の脱離基能力の差を利用することにより得られる。化合物(X)中のLG1が次のカップリング工程の適切な脱離基として作用するためには、ヨウ化カリウムを用いた水性フィンケルシュタイン反応を介してヨード(XI)に変化させる。次いで、化合物(XI)を還元型GH(II)とカップリングして、GH-A-B-タンパク質コンジュゲート(IX)を得る。
【０４７９】
反応の工程は、以下のように、内部遊離Cysを有するGH化合物(I)、三価リンカー(III)及び還元可能なジスルフィド結合を含むFcドメインから出発して説明することができる。
【０４８０】
1)  適切な選択的還元剤でジスルフィド架橋を選択的に還元することにより、Fcドメイン(VII)の遊離システインを遊離させ、(VIII)を得る
2)  Fcドメイン(VIII)を三価リンカー(III)でアルキル化し、LG1-A-B-Fcコンジュゲート中間体(X)を得る
3)  混合ジスルフィド(I)を適切な選択還元剤で還元することにより、遊離Cys GH(II)を任意選択的に遊離させる
4)  水性フィンケルシュタインヨウ素交換反応(V)を介して、中間体(X)の脱離基LG1を活性化し、活性化コンジュゲート中間体(XI)を得る
5)  遊離Cys GH(II)と活性化コンジュゲート中間体(XI)とのカップリングにより、Cysコンジュゲート型GH-Fc-化合物(IX)を得る
【０４８１】
アッセイ
アッセイ1 - GH受容体結合アッセイ
GH化合物の受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴(SPR)分析を使用して分析される。この方法は、GH化合物にとって一般的である。
【０４８２】
部位1を介したhGH及びGH化合物とhGH受容体との相互作用は、Biacore T100装置(GE Healtcare社製、Sweden)を使用し、表面プラズモン共鳴により検討した。抗hGH mAb(Fitzgerald Industries International社製、USA、#10G05B)は、製造業者の指示に従って、典型的には5000RUのレベルでCM-5チップ上に固定化した。hGH又はGH化合物をランニングバッファー(10mM HEPES、0.15M NaCl、30mM EDTA、0.05%界面活性剤P20、pH7.4)により10〜25μg/mLで捕捉し、250〜400RUの捕捉リガンドが得られた。続いて、0〜800nmol濃度のhGHRを30mL/分でその表面上に注入した。固定された抗hGH mAbを有するが捕捉されたhGHを有さない表面を基準として使用した。
【０４８３】
キネティックデータは、1:1のLangmuir結合モデルを用いるBiacore(商標)Evaluationソフトウェア2.0により分析する。
【０４８４】
アッセイ2-成長ホルモン活性を決定するためのBAF-3GHRアッセイ
hGH化合物の生物活性は、細胞に基づいた受容体効力増殖アッセイ、すなわちBAFアッセイで測定する。BAF-3細胞(骨髄に由来するマウスプロBリンパ球細胞株)は、増殖及び生存について本来IL-3依存性である。IL-3は、刺激の際にGHが活性化される同じ媒介物質であるJAK-2及びSTATを活性化する。ヒト成長ホルモン受容体のトランスフェクション後、細胞株を成長ホルモン依存性細胞株に転換した。このクローンを使用して、BAF-3GHRの生存に対する様々な成長ホルモン試料の効果を評価することができる。
【０４８５】
BAF-3GHR細胞は、飢餓培地(成長ホルモンを含まない培養培地)中、37℃、5%CO2で24時間増殖させる。
【０４８６】
細胞を洗浄し、飢餓培地に再懸濁し、プレートに播種する。10μLのヒト成長ホルモン及び試験する成長ホルモン化合物を異なる濃度で使用し、プレートを37℃、5%CO2で68時間インキュベートする。
【０４８７】
AlamarBlue(登録商標)を各ウェルに添加し、次いで細胞を更に4時間インキュベートする。AlamarBlue(登録商標)は酸化還元指示薬であり、細胞代謝に固有の反応によって還元されるため、生存細胞数の間接的測定値を提供する。
【０４８８】
最後に、細胞の代謝活性を蛍光プレートリーダーで測定する。試料の吸光度は、成長ホルモン化合物又は対照で刺激されていない細胞の%で表され、濃度-反応曲線から、活性(細胞を50%刺激する化合物の量)を計算することができる。
【０４８９】
アッセイ3:正常ラットにおける成長ホルモン化合物の薬物動態パラメーターを評価するためのアッセイ
実施例の化合物の薬物動態は、静脈内(iv.)単回用量投与後に、オスSprague Dawleyラットにおいて調査する。
【０４９０】
試験化合物を、グリシン20mg/mL、マンニトール2mg/mL、NaHCO3 2.5mg/mL、pHを8.2に調整した希釈バッファー中で、150nmol/mLの最終濃度に希釈する。
【０４９１】
試験化合物を、体重約250gのオスSprague Dawleyラットにおいて試験する。試験化合物を、27Gの針を用いて、所定の用量、例えば、0.1mLの容量中15nmol/ラット(濃度150nmol/mL)又は約60nmol/kg体重等で尾静脈にiv.により単回注射として投与する。
【０４９２】
各試験化合物について、血液サンプリングを以下のスケジュールに従って行う:
【０４９３】
【表７】
2018535195.tif 000076
【０４９４】
各サンプリング時間に、200μlの血液を、25Gの針を使用して尾静脈又は舌下叢から採取する。血液をEDTAコーティングした試験管にサンプリングし、4℃、1200×Gで10分間の遠心分離を行うまで氷上で保存する。2回、50μlの血漿を2つの別個のMicronicチューブに移し、分析まで-20℃で保存する。
【０４９５】
試験物質の濃度は、均質ビーズに基づくアッセイであるLuminescence Oxygen Channeling Immunoassay(LOCI)によって決定される。LOCI試薬は、2つのラテックスビーズ試薬、及びサンドイッチの一部であるビオチン化GH結合タンパク質を含む。ビーズ試薬の1つは、一般的な試薬(ドナービーズ)であり、ストレプトアビジンでコーティングされており、感光性色素を含む。第2のビーズ試薬(アクセプタービーズ)は、サンドイッチを作製する抗体でコーティングされている。アッセイ中、3つの反応物は分析物と結合して、ビーズ-凝集体-免疫複合体を形成する。複合体の照射は、ドナービーズから一重項酸素を放出させ、それがアクセプタービーズに流入し、化学発光を誘発し、それをEnVisionプレートリーダーで測定する。生成される光の量は、hGH誘導体の濃度に比例する。LOCIバッファーで40倍に希釈した試料/キャリブレータ/対照の2μLを384ウェルLOCIプレートに適用する。ビオチン化GH結合タンパク質とmAb M94169抗(hGH)コンジュゲートアクセプタービーズの混合物15μLを各ウェルに添加する(21〜22℃)。プレートを21〜22℃で1時間インキュベートする。30μLのストレプトアビジンコーティングドナービーズ(67μg/mL)を各ウェルに添加し、全てを21〜22℃で30分間インキュベートする。プレートは、680nmolレーザーによる励起後に、520〜645nmolのバンド幅を有するフィルターを用いて、21〜22℃でEnvisionプレートリーダーにおいて読み取る。1ウェル当たりの総測定時間は、70msの励起時間を含む210msである。成長ホルモン化合物の検出限界は、50pMである。ノンコンパートメント薬物動態分析は、WinNonlin Professional(Pharsight Inc.社製、Mountain View、CA、USA)を使用し、各試験化合物の平均濃度-時間プロファイルに対して実施する。終末半減期(T1/2)及び平均滞留時間(MRT)の薬物動態パラメーター推定値を計算する。IGF-1血漿濃度-時間プロファイルを各化合物について作成する。
【０４９６】
アッセイ4:下垂体摘出Sprague Dawleyラットにおける成長ホルモン化合物のin vivo応答を評価するアッセイ。
in vivo応答は、下垂体摘出オスSprague Dawleyラットにおいて試験する。下垂体摘出ラットは、下垂体を外科的に切除した後に成長ホルモンの産生が起こらない、周知で認識されている成長ホルモン欠乏症の動物モデルである。またこれにより、ヒトにおける成長ホルモン欠乏症の別の重要な臨床的特徴である、インスリン様成長因子-1(IGF-1)の低循環レベルをもたらす。
【０４９７】
下垂体摘出術は、通常、体重90〜100gの4週齢オスラットに対して実施される。手術後3〜4週間で体重100〜110gの動物に試験を開始する。手術後3〜4週間の体重増加が10%を超える動物については、試験を開始することができない。
【０４９８】
下垂体摘出手順
麻酔及び術前鎮痛
ラットに、フェンタニル-フルアニゾン(Hypnorm 1ml当たり0.315mgのフェンタニル及び10mgのフルアニゾン)、並びにミダゾラム(Midazolam Accord 1ml当たり5mgのミダゾラム)で麻酔する。ラットに、滅菌水で希釈したフェンタニル-フルアニゾンとミダゾラムの混合物を2mL/kgで腹腔内投与する。得られた混合物は、0.079mgのフェンタニル、2.5mgのフルアニゾン及び1.25mgのミダゾラムを1mL当たり含有する。
【０４９９】
外科手順
ラットを無菌手術のために準備する。ラットを、下垂体摘出手順のために設計したHoffman-Reiter定位固定装置に載せる。
【０５００】
ガラスシリンジに付けた18G針をラットの右耳に導入する。回転運動させる間に、針は、鼓膜、中耳及び側頭骨を通る。この位置から、下垂体を吸引する。
【０５０１】
ラットを定位固定装置から外し、回復のためにサーモプレートに移す。ラットが回復したら、ケージに移す。
【０５０２】
術後鎮痛及びケア
回復前に、ラットを、滅菌水で希釈したカルプロフェン5mg/mLを含有する溶液を用いて、1mL/kgのカルプロフェン(Rimadyl 50mg/mLのカルプロフェン)により皮下処置する。術後鎮痛は、飲料水の代わりにラットに提供される5%デキストロース溶液に1ml当たり0.05mgのカルプロフェンを添加することにより、手術後2日間にわたり維持する。術後の最初の2日間の後、飲料水として5%デキストロース溶液を術後10〜14日までラットに与える。
【０５０３】
下垂体摘出したSprague Dawleyラットを、各群10匹の動物の異なる投与群に無作為に割り当てた。1つの群はビヒクルのみが与えられ、対照群として機能した。全ての試験群において、各動物は、それぞれ、1、5、15、50及び150nmolの試験化合物の単回sc用量を受けた。試験中、体重を毎日午前8〜10時に測定した。曝露測定及びIGF-1測定のための血液サンプリングは、0、1、3、5、7、10及び14日目に午前8〜10時に行った。
【０５０４】
各サンプリング時間に、200μlの血液を、25Gの針を使用して尾静脈又は舌下叢から採取する。血液をEDTAコーティングした試験管にサンプリングし、4℃、1200×Gで10分間の遠心分離を行うまで氷上で保存する。50μlの血漿をMicronicチューブに移し、分析まで-20℃で保存する。IGF-1濃度-時間プロファイルを各化合物について作成する。
【０５０５】
アッセイ5:ラットにおけるIGF応答を検出するアッセイ。
血漿IGF-1濃度は、市販のELISAアッセイ(Immunodiagnostic Systems Ltd.社製による市販アッセイ、Octeia Rat/Mouse IGF-1、カタログ番号AC-18F1 IDS Ltd., England)により決定する。アッセイは、捕獲剤として高IGF-1特異的ポリクローナル抗体を使用し、検出剤として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識高親和性モノクローナル抗体を使用するサンドイッチELISAである。アッセイの検出の下限は63ng/mLである。IGF-1血漿濃度-時間プロファイルは、ベースライン補正したIGF-1血漿濃度-時間プロファイルと一緒に、各化合物について作成する。ベースライン補正したプロファイルがゼロを超える時間及び程度を化合物効力の尺度として使用する。
【０５０６】
アッセイ6:ミニブタにおける成長ホルモン化合物の薬物動態パラメーターを評価するためのアッセイ。
実施例の化合物の薬物動態は、皮下(sc.)単回用量投与後に、メスGottingenミニブタにおいて調査する。試験化合物を、グリシン20mg/mL、マンニトール2mg/mL、NaHCO3 2.5mg/mL、pHを8.2に調整した希釈バッファー中で15mg/mLの最終濃度に希釈する。試験化合物を体重約10〜12kgのメスGottingenミニブタにおいて試験する。
【０５０７】
試験化合物は、首の右側、耳から約5〜7cm及び首の中央から7〜9cmに、単回皮下注射として投与した。注射は、21Gの針にストッパーを付けて行い、針の0.5cmが導入されるようにした。各動物は、0.1mL/kgの投与量で20nmol/kgの用量が投与された。
【０５０８】
各試験化合物について、各動物からの血液サンプリングは以下のスケジュールに従って行った:投与前、投与の1、4、12、24、36、48、72、96、168、240、336、504、672、840及び1008時間後。2mLの血液試料を、頸動脈管(V.Jugularis)に挿入されたバキュテナーを使用することにより、未麻酔ミニブタからEDTAチューブに採取した。採血の直後、チューブを静かに反転させて十分に混合させた。血液は、氷上に最大10分間保持した後、4℃で10分間、1500gで遠心分離を行った。200μlの血漿を化合物濃度決定のためにMicronicチューブにピペットで移し、200μlの血漿をIGF-1決定のためにMicronicチューブにピペットで移した。血漿試料を分析まで-20℃で保存した。
【０５０９】
試験物質の濃度は、均質ビーズに基づくアッセイであるLuminescence Oxygen Channeling Immunoassay(LOCI)によって決定した。LOCI試薬は、2つのラテックスビーズ試薬、及びサンドイッチの一部であるビオチン化GH結合タンパク質を含む。ビーズ試薬の1つは、一般的な試薬(ドナービーズ)であり、ストレプトアビジンでコーティングされており、感光性色素を含む。第2のビーズ試薬(アクセプタービーズ)は、サンドイッチを作製する抗体でコーティングされている。アッセイ中、3つの反応物は分析物と結合してビーズ-凝集体-免疫複合体を形成する。複合体の照射は、ドナービーズから一重項酸素を放出させ、それがアクセプタービーズに流入し、化学発光を誘発し、それをEnVisionプレートリーダーで測定する。生成される光の量は、GH誘導体の濃度に比例する。LOCIバッファーで40倍に希釈した試料/キャリブレータ/対照の2μLを384ウェルLOCIプレートに適用する。ビオチン化GH結合タンパク質とmAb M94169抗(hGH)コンジュゲートアクセプタービーズの混合物15μLを各ウェルに添加する(21〜22℃)。プレートを21〜22℃で1時間インキュベートする。30μLのストレプトアビジンコーティングドナービーズ(67μg/mL)を各ウェルに添加し、全てを21〜22℃で30分間インキュベートする。プレートは、680nmolレーザーによる励起後に、520〜645nmolのバンド幅を有するフィルターを用いて、21〜22℃でEnvisionプレートリーダーにより読み取る。1ウェル当たりの総測定時間は、70msの励起時間を含む210msである。成長ホルモン化合物の検出限界は50pMである。
【０５１０】
ノンコンパートメント薬物動態分析は、WinNonlin Professional(Pharsight Inc.社製、Mountain View、CA、USA)を使用し、各試験化合物の平均濃度-時間プロファイルに対して実施した。終末半減期(T1/2)及び平均滞留時間(MRT)の薬物動態パラメーター推定値を計算した。
【０５１１】
(実施例1)
三価リンカー1
【０５１２】
【化６６】
2018535195.tif 000077
【０５１３】
(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-ブロモアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸
反応スキーム:
【０５１４】
【化６７】
2018535195.tif 000078
【０５１５】
合成プロトコル
2-(1-ヒドロキシ-3-メチルブチリデン)-5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン(2)(37.7g、168mmol)のDCM(200mL)中の溶液を、ジエチレントリアミン(1)(8.64mL、80.0mmol)のDCM(130mL)中の溶液に滴下して加えた。反応混合物を一晩撹拌し、次いで、溶媒を蒸発させて、2,2'-(((アザンジイルビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)(3)を淡黄色油状物として得た。
【０５１６】
収率: 41.2 g (100%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 3.57 (q, 4 H); 3.06-2.89 (m, 8 H); 2.36 (bs, 8 H); 2.05-1.89 (m, 2 H); 1.09-0.94 (m, 26 H).
【０５１７】
上記アミン(3)(33.4g、64.8mmol)のDMF(320mL)中の溶液を、2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸5-tert-ブチルエステル(Fmoc-Glu(OtBu)-OH、63.4g、149mmol)、HATU(56.6g、149mmol)、DIPEA(40.0mL、227mmol)のDMF(530mL)中溶液に加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、EtOAc(1.6L)及び水(1.6L)を添加した。分離させた有機層を10% K2CO3の水溶液(2×1.6L)で洗浄し、無水Na2SO4上で脱水し、濾過し、真空で蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.063〜0.040mm;溶離液:DCM/MeOH 50:1〜40:1)で精製し、tert-ブチル4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス-2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタノエート(4)を黄色粘性油状物として得た。
【０５１８】
収率: 59.2 g (99%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.59 (m, 2 H); 7.40 (t, J=7.5 Hz, 2 Hz); 7.36-7.26 (m, 2 H); 5.65 (d, J=9.2 Hz, 1 H); 4.72-4.59 (m, 1 H); 4.46-4.27 (m, 2 H); 4.24-4.16 (m, 1 H); 4.12-3.99 (m, 1 H); 3.94-3.53 (m, 6 H); 3.48-3.33 (m, 1 H); 2.97 (bs, 4 H); 2.46-2.26 (m, 10 H); 2.08-1.83 (m, 4 H); 1.79-1.64 (m, 1 H); 1.43 (s, 9 H); 1.07-0.90 (m, 24 H).
【０５１９】
DCM(50mL)に溶解したtert-ブチル4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス-(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタノエート(4)(59.2g、64.8 mmol)を、TFA/水混合物(95:5、400mL)に加え、2時間撹拌した。次いで、溶媒を蒸発させ、残渣を3回トルエンで同時蒸発させた。残渣をDCM(800mL)に溶解し、水(3×800mL)で洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.063〜0.040mm;溶離液:DCM/MeOH 60:1〜10:1)により精製し、4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)-アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタン酸(5)を白色粉末として得た。
【０５２０】
収率: 42.1 g (76%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 7.79 (d, J=7.3 Hz, 2 H); 7.64 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.39 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 7.36-7.26 (m, 2 H); 4.83 (bs, 1 H); 4.48-4.30 (m, 2 H); 4.27-4.19 (m, 1 H); 4.19-3.62 (m, 7 H); 3.61-3.46 (m, 1 H); 3.28-2.90 (m, 4 H); 2.55 (t, J=6.7 Hz, 2 H); 2.43 (s, 8 H); 2.01-1.81 (m, 4 H); 1.07-0.88 (m, 24 H)
【０５２１】
Wang樹脂0.63mmol/g(25.7g、16.2mmol)をTHF(250mL)中で20分間膨潤させた。4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタン酸(5)(42.0g、48.5mmol)のTHF(250mL)中溶液を樹脂に加え、次いで、DIC(7.60mL、48.5mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、200mg、1.62mmol)を加えた。混合物を18時間振盪した。樹脂を濾過し、DCM(6×250mL)で洗浄した。樹脂を無水酢酸(40mL)、ピリジン(40mL)のDMF(360mL)中溶液で15分間処理し、DCM(6×250mL)で洗浄し、化合物(6)を黄色固体として得た。
収量:36.0g。
ローディング:51%(0.321mmol/g)。
【０５２２】
上記化合物(6)(6.27g、2.01mmol)をDCM(50mL)中で20分間膨潤させた。Fmoc基は、DMF中の20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×30mL)。樹脂をDMF(3×30mL)、2-プロパノール(3×30mL)及びDCM(3×30mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、1.25g、3.24mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、1.15g、3.24mmol)及びDIPEA(1.13mL、6.48mmol)のDMF(35mL)中の溶液を樹脂に添加し、混合物を3時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×30mL)、DCM(3×30mL)及びDMF(3×30mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中の20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×30mL)。樹脂をDMF(3×30mL)、2-プロパノール(3×30mL)及びDCM(3×30mL)で洗浄した。(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、1.38g、3.24mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、1.15g、3.24mmol)及びDIPEA(1.13mL、6.48mmol)のDMF(35mL)中の溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。Fmoc基は、DMF中の20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×30mL)。樹脂をDMF(3×30mL)、2-プロパノール(3×30mL)及びDCM(3×30mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、1.25g、3.24mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、1.15g、3.24mmol)及びDIPEA(1.13mL、6.48mmol)のDMF(35mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を3.5時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×30mL)、DCM(3×30mL)及びDMF(3×30mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中の20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×30mL)。樹脂をDMF(3×30mL)、2-プロパノール(3×30mL)及びDCM(3×30mL)で洗浄した。
【０５２３】
1-(クロロ-ジフェニル-メチル)-4-メチル-ベンゼン(MttCl、2.02g、6.90mmol)及びDIPEA(2.55mL、14.6mmol)の無水DCM(50mL)中の溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DCM(4×30mL)及びDMF(4×30mL)で洗浄した。IvDde基は、DMF中の2%ヒドラジン一水和物で処理することにより(3×30mL、3×3分)除去した。樹脂をDMF(8×30mL)で洗浄した。クロロ酢酸(0.92g、9.74mmol)、ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBrOP、4.54g、9.74mmol)及びDIPEA(3.39mL、19.5mmol)のDMF(60mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を3時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×30mL)、DCM(4×30mL)、DMF(4×30mL)、DCM(10×30mL)で洗浄した。Mtt基は、DCM中の80% 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理することにより(4×30mL、2×10分、2×30分)除去した。樹脂をDCM(5×30mL)及びDMF(4×30mL)で洗浄した。ブロモ酢酸(4.50g、32.4mmol)及びDIC(4.27mL、27.6mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を25分間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×30mL)、MeCN(2×30mL)及びDCM(10×30mL)で洗浄した。生成物をTFA/TIS/H2O(95:2.5:2.5、50mL)の切断カクテルで2時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾過し、TFA/DCM混合物(1:1、50mL)及びDCM(10×50mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発乾固させた。溶媒を3回トルエンで同時蒸発させた。残渣をColumn X-Bridge3 C18、OBD、5μm、50×250mm(移動相:A=0.05%TFA/H2O、B=0.05%TFA/MeCN、勾配:5%〜35%)で精製し、(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-ブロモアセトアミド)エトキシ)-エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸(7)を白色固体として得た。
【０５２４】
収率: 694 mg (37%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 5.13 (dd, J=9.3 Hz, J=4.2 Hz, 1 H); 4.68 (dd, J=8.3 Hz, J=5.3 Hz, 1 H); 4.20-4.06 (m, 8 H); 3.95 (s, 2 H); 3.91-3.41 (m, 24 H); 2.61-2.08 (m, 7 H); 2.08-1.88 (m, 1 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 5:95〜100:0 + 0.1% FA): Rt = 4.74分.
LC-MS m/z: 926.6 (M+H)+.
UPLC純度: 97.5% (214 nm).
UPLC Rt (Acquity UPLC BEHC 18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm; MeCN/水 5:95〜95:5 + 0.05% TFA): Rt = 1.64分.
【０５２５】
三価リンカー2
【０５２６】
【化６８】
2018535195.tif 000079
【０５２７】
2-(2-ブロモアセトアミド)-N,N-ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)アセトアミド
反応スキーム:
【０５２８】
【化６９】
2018535195.tif 000080
【０５２９】
合成プロトコル:
2-(1-ヒドロキシ-3-メチルブチリデン)-5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン(44.9g、200mmol)のMeOH(400mL)中溶液を、ジエチレントリアミン(1)(DETA、10.3g、100mmol)のDCM(1.50L)中溶液に40分以内に加えた。反応混合物を一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.040〜0.063mm;溶離液:DCM/MeOH 25/1)で精製し、純化合物(2)を黄色ががった蝋状固体として得た。
【０５３０】
収率: 41.0 g (80%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 13.83 (bs, 2 H); 3.57 (q, J=5.7 Hz, 4 H); 3.10-2.91 (m, 8 H); 2.36 (bs, 8 H); 1.97 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.05-0.96 (m, 24 H).  
【０５３１】
上記化合物(2)(3.09g、6.00mmol)の溶液に、DCM(200mL)及びDMF(40mL)の混合物中の(tert-ブトキシカルボニル)グリシン(BocGlyOH、2.10g、12.0mmol)、HATU(4.56g、12.0mmol)、及びDIPEA(4.19mL、3.10g、24.0mmol)の混合物を加えた。反応混合物を2時間撹拌させた。次いで、炭酸カリウムの1M水溶液(200mL)を加えた。有機相を分離し、塩酸の1M溶液(200mL)で洗浄し、無水Na2SO4で脱水した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.040〜0.063mm;溶離液:EtOAc)により精製し、純化合物(3)を茶色がかった粘性油状物として得た。
【０５３２】
収率: 3.98 g (99%).
RF (SiO2, EtOAc): 0.50.
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 14.03 (bs, 1 H); 13.87 (bs, 1 H); 5.43 (bs, 1 H); 4.01 (d, J=4.7 Hz, 2 H); 3.79-3.56 (m, 8 H); 3.06-2.89 (m, 4 H); 2.48-2.27 (m, 8 H); 1.95 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.45 (s, 9 H); 1.05-0.95 (m, 24 H).
【０５３３】
上記化合物(3)(3.98g、5.91mmol)をDCM(5mL)中に溶解し、TFA(30mL)を加えた。2時間後、揮発性物質を減圧下で除去し、炭酸カリウムの飽和水溶液を加えた(60mL)。生成物をEtOAc(3×40mL)で抽出した。有機相を無水Na2SO4で脱水し、溶媒を減圧下で除去し、純化合物(4)をオフホワイト色固体泡状物として得た。
【０５３４】
収率: 3.38 g (100%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 14.01 (s, 1 H); 13.88 (s, 1 H); 3.80-3.70 (m, 2 H); 3.68-3.58 (m, 6 H); 3.52 (s, 2 H); 3.06-2.93 (m, 4 H); 2.45-2.29 (m, 8 H), 1.95 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.06-0.95 (m, 24 H). 
【０５３５】
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ1.8mmol/g(4)(2g、7.43mmol)を無水DCM(100mL)中で20分間膨潤させた。上記化合物(4)(2.83g、4.95mmol)及びDIPEA(3.28mL、18.8mmol)の無水DCM(60mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、MeOH/DCM混合物(4:1、100mL、2×5分)中のDIPEA(1.73mL、9.90mmol)の溶液で処理した。次いで、樹脂をDMF(3×90mL)、2-プロパノール(2×90mL)及びDCM(3×90mL)で洗浄した。保護基は、ヒドラジン一水和物(DMF中2%溶液、3×90mL、3×5分)で処理することにより除去した。次いで、樹脂をDMF(3×90mL)、2-プロパノール(2×90mL)及びDCM(3×90mL)で洗浄した。クロロ酢酸(3.74g、39.6mmol)、2,4,6-コリジン(2,4,6-collidine, 7.83mL、59.4mmol)及びDIC(6.13mL、39.6mmol)のDMF(70mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を45分間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×90mL)、2-プロパノール(2×90mL)及びDCM(8×90mL)で洗浄した。生成物は、切断カクテル(DCM中50%TFA、80mL)で1時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾別し、DCM(3×40mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発乾固させ、所望の化合物(5)を濃茶色油状物として得た。
【０５３６】
収率: 2.01 g (95%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.23 (s, 2 H); 4.19 (s, 2 H); 4.16 (s, 2 H); 3.71-3.51 (m, 8 H). 
【０５３７】
重炭酸ナトリウム(1.58g、18.8mmol)及び無水ブロモ酢酸(1.71g、6.59mmol)のMeCN(20mL)中の混合物を、上記化合物(5)(2.01g、4.71mmol)のMeCN(20mL)中溶液に加えた。90分後、反応混合物を、焼結ガラスを通して濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をHPLC(Colimn X-Bridge4 C18、OBD、5μm、50×250mm、MeCN/H2O 5:95〜45:55+0.05%TFA)によって精製した。得られた溶液を凍結乾燥し、表題化合物を無色粘性油状物として得た。MeCN(8mL)の添加により無色結晶が形成され、溶媒を減圧下で除去し、2-(2-ブロモアセトアミド)-N,N-ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)アセトアミド(6)を無色固体として得た。
【０５３８】
収率: 900 mg (44%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.27 (s, 2 H); 4.19 (s, 2 H); 4.13 (s, 2 H); 4.02 (s, 2 H); 3.70-3.50 (m, 8 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 2.90分.
LC-MS m/z: 433.0 (M+H)+.
【０５３９】
三価リンカー3
【０５４０】
【化７０】
2018535195.tif 000081
【０５４１】
2-(2-(2-(2-(2-ブロモアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-N,N-ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)アセトアミド
反応スキーム:
【０５４２】
【化７１】
2018535195.tif 000082
【０５４３】
合成プロトコル:
TFA(30mL)を、tert-ブチル(2-(ビス-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-2-オキソエチル)カルバメート(1)(3.98g、5.91mmol、実施例2、化合物(3)に記載されたようにして調製したもの)のDCM(5mL)中溶液に加えた。2時間後、揮発性物質を減圧下で除去し、炭酸カリウムの飽和水溶液を加えた(60mL)。生成物をEtOAc(3×40mL)で抽出した。有機相を無水Na2SO4で脱水し、溶媒を減圧下で除去し、純化合物(2)をオフホワイト色固体泡状物として得た。
【０５４４】
収率: 3.38 g (100%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 14.01 (s, 1 H); 13.88 (s, 1 H); 3.80-3.70 (m, 2 H); 3.68-3.58 (m, 6 H); 3.52 (s, 2 H); 3.06-2.93 (m, 4 H); 2.45-2.29 (m, 8 H); 1.95 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.06-0.95 (m, 24 H).
【０５４５】
上記化合物(2)(2.84g、4.97mmol)の溶液に、2,2-ジメチル-4-オキソ-3,8,11-トリオキサ-5-アザトリデカン-13-オイック酸(Boc-OEG-OH、1.31g、4.97mmol)、HATU(1.89g、4.97mmol)及びDIPEA(1.74mL、9.94mmol)のDCM(200mL)及びDMF(30mL)中の混合物を加えた。反応混合物を一晩撹拌した。次いで、炭酸カリウムの1M水溶液(200mL)を添加した。有機相を分離させ、塩酸の1M溶液(200mL)で洗浄し、無水Na2SO4で脱水した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.040〜0.063mm;溶離液:DCM/MeOH 20:1)により精製し、純化合物(3)を茶色がかった粘性油状物として得た。
【０５４６】
収率: 3.19 g (78%).
RF (SiO2 DCM/MeOH 20:1): 0.15.
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 14.06 (bs, 1 H); 13.91 (bs, 1 H); 7.66 (bs, 1 H); 5.45 (bs, 1 H); 4.19 (d, J=4.7 Hz, 2 H); 4.05 (s, 2 H); 3.79-3.62 (m, 12 H); 3.57 (t, J=5.1 Hz, 2 H); 3.38-3.29 (m, 2 H); 3.04-2.92 (m, 4 H); 2.45-2.27 (m, 8 H); 1.93 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.43 (s, 9 H); 1.05-0.94 (m, 24 H).
【０５４７】
TFA(30mL)を、上記化合物(3)(3.19g、3.89mmol)のDCM(5mL)中溶液に加えた。2時間後、揮発性物質を減圧下で除去し、水酸化ナトリウムの1M水溶液を添加した(60mL)。生成物を酢酸エチル(7×30mL)で抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧下で除去し、純化合物(4)をオフホワイト色固体泡状物として得た。
【０５４８】
収率: 2.97 g (83%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 13.95 (bs, 1 H); 13.79 (bs, 1 H); 7.69 (bs, 1 H); 4.17-4.10 (m, 2 H); 4.03 (s, 2 H); 3.74-3.56 (m, 12 H); 3.52 (t, J=5.1 Hz, 2 H); 3.03-2.83 (m, 6 H); 2.32 (s, 8 H); 2.13 (bs, 2 H); 1.93 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.43 (s, 9 H); 1.03-0.90 (m, 24 H).
【０５４９】
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ1.8mmol/g(2.97g、5.35mmol)を無水DCM(100mL)中で20分間膨潤させた。上記化合物(4)(2.92g、3.57mmol)及びDIPEA(2.36mL、13.6mmol)の無水DCM(40mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、MeOH/DCM混合物(4:1、2×5分、70mL)中のDIPEA(1.38mL、10.7mmol)の溶液で処理した。次いで、樹脂をDMF(3×70mL)、2-プロパノール(2×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。保護基は、ヒドラジン一水和物(DMF中2%溶液、3×6分、3×70mL)で処理することにより除去した。次いで、樹脂をDMF(3×70mL)、2-プロパノール(2×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。クロロ酢酸(2.70g、28.6mmol)、2,4,6-コリジン(5.63mL、42.8mmol)及びDIC(4.42mL、28.6mmol)のDMF(70mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を45分間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×70mL)、2-プロパノール(2×70mL)及びDCM(8×70mL)で洗浄した。生成物を、切断カクテル(DCM中50%TFA、80mL)で1時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾別し、DCM(3×40mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発乾固させ、所望の化合物(5)を濃茶色油状物として得た。
【０５５０】
収率: 1.84 g (90 %).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.32 (s, 2 H); 4.20 (s, 2 H); 4.18 (s, 2 H); 4.16 (s, 2 H); 3.84 (t, J=4.8 Hz, 2 H); 3.81-3.72 (m, 4 H); 3.68-3.51 (m, 8 H); 3.38 (t, J=4.8 Hz, 2 H). 
【０５５１】
重炭酸ナトリウム(0.81g、9.63mmol)及び無水ブロモ酢酸(1.67g、6.42mmol)のMeCN(20mL)中の混合物を、上記化合物(5)(1.84g、3.21mmol)のMeCN(20mL)中溶液に加えた。90分後、反応混合物を、焼結ガラスを通して濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をHPLC(Column labio DeltaPak C18、15μm、50×500mm、MeCN/水5:95〜45:55+0.05%TFA)により精製した。得られた溶液を凍結乾燥し、2-(2-(2-(2-(2-ブロモアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-N,N-ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)アセトアミド(6)を無色粘性油状物として得た。
【０５５２】
収率: 516 mg (33%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.29 (s, 2 H); 4.19 (s, 2 H); 4.16 (s, 2 H); 4.14 (s, 2 H); 3.98 (s, 2 H); 3.75-3.49 (m, 16 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 3.02分.
LC-MS m/z: 480.2 (M+H)+.
【０５５３】
三価リンカー4
【０５５４】
【化７２】
2018535195.tif 000083
【０５５５】
(R)-4-{2-[2-({ビス-[2-(2-クロロ-アセチルアミノ)-エチル]-カルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-チルカルバモイル}-2-[(S)-2-(2-{2-[2-(2-ブロモ-アセチルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-アセチルアミノ)-4-カルボキシ-ブチリルアミノ]-酪酸
反応スキーム:
【０５５６】
【化７３】
2018535195.tif 000084
【０５５７】
合成プロトコル:
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ1.8mmol/g(1、41.7g、75.1mmol)を無水DCM(350mL)中で20分間膨潤させた。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、19.3g、50.1mmol)及びDIPEA(33.1mL、190mmol)の無水DCM(250mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、DIPEA(17.4mL、100mmol)のMeOH/DCM混合物(4:1、5分、200mL)中の溶液で処理した。次いで、樹脂をDCM(2×250mL)及びDMF(2×250mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中の20%ピペリジン(1×5分、1×15分、2×250mL)で処理することにより除去した。樹脂をDMF(2×250mL)、2-プロパノール(2×250mL)、DCM(2×250mL)及びDMF(2×250mL)で洗浄した。2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-Glu-OtBu、42.6g、100mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、35.6g、100mmol)及びDIPEA(31.4mL、180mmol)のDMF(200mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を4時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×250mL)及びDCM(10×250mL)で洗浄した。生成物を2,2,2-トリフルオロエタノール(350mL)で一晩処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾別し、DCM(2×200mL)で洗浄し、溶媒を蒸発させ、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.040〜063mm;溶離液:DCM/MeOH 95:5〜85:15)により精製し、(R)-4-[2-(2-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチルカルバモイル]-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-酪酸tert-ブチルエステル(2)を黄褐色蝋状固体として得た。
【０５５８】
収率: 18.6 g (65%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.65-7.50 (m, 2 H); 7.47-7.37 (m, 2 H); 7.37-6.72 (m, 2 H); 6.84-6.72 (m, 1 H); 5.92-5.81 (m, 1 H); 4.58-4.30 (m, 2 H); 4.30-3.95 (m, 4 H); 3.79-3.51 (m, 6 H); 3.43 (q, J=4.6 Hz, 2 H); 2.39-1.90 (m, 4 H); 1.54-1.39 (m, 9 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 20:80〜100:0 + 0.1% FA): 3.65分.
LC-MS m/z: 570.6 (M+H)+.
【０５５９】
ジエチレントリアミン(3)(1.62mL、15.0mmol)を、2-(1-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリデン)-5,5-ジメチル-シクロヘキサン-1,3-ジオン(4)(6.73g、30.0mmol)のDCM(125mL)中溶液に加えた。得られた溶液を一晩撹拌し、次いで溶媒を蒸発させ、残渣を真空中で乾燥し、2,2'-(((アザンジイルビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)(5)を黄色油状物として得た。
【０５６０】
収率: 7.74 g (100%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 13.81 (bs, 2 H); 3.64-3.44 (m, 4 H); 3.12-2.83 (m, 8 H); 2.34 (s, 8 H); 2.06-1.86 (m, 2 H); 1.05-0.87 (m, 24 H).
【０５６１】
化合物(2)(18.5g、32.5mmol)をDCM(220mL)に溶解し、続いてHATU(12.4g、32.5mmol)、DIPEA(8.30mL、47.6mmol)及びアミン(5)(7.04g、13.6mmol)のDCM(150mL)中溶液を加えた。得られた溶液を一晩撹拌し、次いで溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸エチル(250mL)に溶解し、水(4×250mL)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60,0.040〜063mm;溶離液:DCM/MeOH 97:3〜96:4)により精製し、(R)-4-(2-{2-[(ビス-{2-[1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン)-3-メチル-ブチルアミノ]-エチル}-カルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-酪酸tert-ブチルエステル(6)を白色固体として得た。
【０５６２】
収率: 11.6 g (80%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 14.02-13.78 (m, 2 H); 7.77 (d, J=7.2 Hz, 2 H); 7.60 (d, J=6.8 Hz, 2 H); 7.40 (t, J=7.1 Hz, 2 H); 7.35-7.24 (m, 2 H); 6.76 (bs, 1 H); 5.85 (d, J=8.5 Hz, 1 H); 4.50-4.13 (m, 6 H); 3.79-3.35 (m, 16 H); 3.06-2.85 (m, 4 H); 2.45-2.12 (m, 11 H); 2.09-1.82 (m, 3 H); 1.47 (s, 9 H); 1.07-0.85 (m, 24 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 70:30〜100:0 + 0.1% FA): 2.12分.
LC-MS m/z: 1068.3 (M+H)+.
【０５６３】
上記で調製した化合物(6)(11.6g、10.9mmol)をTFA/H2O(95:5、150mL)の混合物に溶解し、2.5時間静置した。次いで、溶媒を蒸発させた。残渣をDCM(30mL)に溶解し、ジエチルエーテル(200mL)を加えた。混合物を一晩撹拌した。次いでジエチルエーテルをデカントした。残渣をジエチルエーテル(200mL)で処理し、次いで再度デカントした。この手順をもう一回繰り返した。残渣を真空中で乾燥し、(R)-4-(2-{2-[(ビス-{2-[1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン)-3-メチル-ブチルアミノ]-エチル}-カルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-酪酸(7)を淡黄色固体として得た。
【０５６４】
収率: 10.7 g (96%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 13.90-13.65 (m, 2 H); 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.67-7.53 (m, 2 H); 7.40 (t, J=7.2 Hz, 2 H); 7.35-7.23 (m, 3 H); 6.01 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 4.49-4.34 (m, 3 H); 4.31-4.15 (m, 3 H); 3.86-3.30 (m, 16 H); 3.14-2.84 (m, 4 H); 2.55-2.31 (m, 10 H); 2.30-2.05 (m, 2 H); 2.03-1.78 (m, 2 H); 1.11-0.88 (m, 24 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 35:65〜100:0 + 0.1% FA): 3.68分.
LC-MS m/z: 1012.2 (M+H)+.
【０５６５】
Wang樹脂0.68mmol/g(1)(4.97g、3.38mmol)をTHF(110mL)中で60分間膨潤させた。化合物(7)(10.3g、10.1mmol)、DIC(1.57mL、10.1mmol)及び4-ジメチルアミノ-ピリジン(0.04g、0.34mmol)のTHF(80mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、DCM(2×100mL)で洗浄し、無水酢酸(5.00mL、50.1mmol)及びピリジン(5.00mL、61.6mmol)のDCM(70mL)中溶液で10分間処理した。樹脂をDCM(6×100mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジン(1×5分、1×15分、2×80mL)で処理することにより除去した。樹脂をDMF(2×100mL)、2-プロパノール(2×100mL)、DCM(2×100mL)及びDMF(2×100mL)で洗浄した。(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(tert-ブトキシ)-5-オキソペンタン酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH、4.31g、10.1mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、3.60g、10.1mmol)及びDIPEA(3.18mL、18.2mmol)のDMF(70mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を3時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×100mL)、DCM(2×100mL)及びDMF(2×100mL)で洗浄した。DMF中20%ピペリジン(1×5分、1×15分、2×80mL)で処理することによりFmoc基を除去した。樹脂をDMF(2×100mL)、2-プロパノール(2×100mL)、DCM(2×100mL)及びDMF(2×100mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、3.90g、10.1mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、3.60g、10.1mmol)及びDIPEA(3.18mL、18.2mmol)のDMF(70mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×100mL)、DCM(2×100mL)及びDMF(2×100mL)で洗浄した。DMF中20%ピペリジン(1×5分、1×15分、2×80mL)で処理することによりFmoc基を除去した。樹脂をDMF(2×100mL)、2-プロパノール(2×100mL)、DCM(2×100mL)及びDMF(2×100mL)で洗浄した。1-(クロロ-ジフェニル-メチル)-4-メチル-ベンゼン(MttCl、2.97g、10.1mmol)及びDIPEA(3.53mL、20.3mmol)の無水DCM(70mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を4.5時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×100mL)、DCM(3×100mL)及びDMF(3×100mL)で洗浄した。IvDde基は、DMF中2%ヒドラジン一水和物(3×3分、3×80mL)で処理することにより除去した。樹脂をDMF(6×100mL)で洗浄した。クロロ酢酸(1.91g、20.3mmol)、DIC(3.14mL、20.3mmol)及び2,4,6-トリメチルピリジン(5.35mL、40.5mmol)のDMF(80mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2.5時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×100mL)及びDCM(3×100mL)で洗浄した。Mtt基は、DCM中80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理することにより除去した(2×10分、3×30分、5×75mL)。樹脂をDCM(3×100mL)及びDMF(3×100mL)で洗浄した。ブロモ酢酸(9.39g、67.6mmol)及びDIC(8.90mL、57.5mmol)のDMF(80mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を20分間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×100mL)及びDCM(10×100mL)で洗浄した。TFAと水の混合物(98:2、100mL)で1時間処理することにより生成物を樹脂から切断した。樹脂を濾過し、DCM(2×80mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発乾固させた。残渣をHPLC(Column DeltaPak C18、15μm;50×500mm;MeCN/水  5:95〜60:40+0.05%TFA)により精製し、凍結乾燥し、表題化合物(9)を白色固体として得た。
【０５６６】
収率: 425 mg (14%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.76 (dd, J=7.8及び5.9 Hz, 1 H); 4.57 (dd, J=8.9及び4.9 Hz, 1 H); 4.36 (s, 2 H); 4.20 (s, 2 H); 4.14 (s, 4 H); 3.98 (s, 2 H); 3.81-3.41 (m, 24 H); 2.56 (t, J=8.0 Hz, 2 H); 2.47 (t, J=7.2 Hz, 2 H); 2.37-2.20 (m, 2 H); 2.20-2.05 (m, 2 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 3.58分.
LC-MS m/z: 925.6 (M+H)+.
【０５６７】
三価リンカー5
【０５６８】
【化７４】
2018535195.tif 000085
【０５６９】
(13R,18S)-18-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)カルバモイル)-1-ブロモ-13-カルボキシ-2,11,16-トリオキソ-6,9-ジオキサ-3,12,17-トリアザヘンイコサン-21-オイック酸
反応スキーム:
【０５７０】
【化７５】
2018535195.tif 000086
【０５７１】
合成プロトコル:
Wang樹脂-結合物1の調製は、プロトコルREaD-24247(バッチNo.218-004-1)に記載した。
【０５７２】
Wang樹脂-結合物(1、2.85g、0.92mmol)をDCM(20mL)中で20分間膨潤させた。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×20mL)。樹脂をDMF(3×20mL)、2-プロパノール(3×20mL)及びDCM(3×20mL)で洗浄した。(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、1.17g、2.75mmol)、TCTU(0.98g、2.75mmol)及びDIPEA(0.96mL、5.49mmol)のDMF(20mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×20mL)。樹脂をDMF(3×20mL)、2-プロパノール(3×20mL)及びDCM(3×20mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、1.06g、2.75mmol)、TCTU(0.98g、2.75mmol)及びDIPEA(0.96mL、5.49mmol)のDMF(20mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を3.5時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×20mL)、DCM(3×20mL)及びDMF(3×20mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×20mL)。樹脂をDMF(3×20mL)、2-プロパノール(3×20mL)及びDCM(3×20mL)で洗浄した。
【０５７３】
1-(クロロ-ジフェニル-メチル)-4-メチル-ベンゼン(MttCl、1.20g、4.10mmol)及びDIPEA(1.44mL、8.27mmol)の無水DCM(40mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、DCM(4×20mL)及びDMF(4×20mL)で洗浄した。IvDde基は、DMF中2%ヒドラジン一水和物で処理することにより除去した(3×3分、3×20mL)。樹脂をDMF(8×20mL)で洗浄した。クロロ酢酸(0.52g、5.49mmol)、PyBroP(2.56g、5.49mmol)及びDIPEA(1.91mL、11.0mmol)のDMF(25mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を3時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×20mL)、DCM(4×20mL)、DMF(4×20mL)、DCM(10×20mL)で洗浄した。Mtt基は、DCM中の80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールでの処理によって除去した(2×10分、2×30分、4×25mL)。樹脂をDCM(5×20mL)及びDMF(4×20mL)で洗浄した。ブロモ酢酸(2.54g、18.3mmol)及びDIC(2.41mL、15.6mmol)のDMF(30mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を25分間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×20mL)、MeCN(2×20mL)及びDCM(10×20mL)で洗浄した。生成物をTFA/TIS/H2O(95:2.5:2.5、30mL)の切断カクテルで1時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾過し、DCM(10×30mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発乾固させた。溶媒を3回トルエンと同時蒸発させた。残渣をHPLC(Column X-Bridge3 C18、OBD、5μm、50×250mm、MeCN/水5%〜35%+0.05%TFA)により精製し、(13R,18S)-18-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)カルバモイル)-1-ブロモ-13-カルボキシ-2,11,16-トリオキソ-6,9-ジオキサ-3,12,17-トリアザヘンイコサン-21-オイック酸(2)を白色固体として得た。
【０５７４】
収率: 333 mg (47%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 5.08 (dd, J=9.5 Hz, J=4.2 Hz, 1 H); 4.71 (dd, J=8.1 Hz, J=5.1 Hz, 1 H); 4.19-4.09 (m, 6 H); 3.96 (s, 2 H); 3.90-3.44 (m, 16 H); 2.59-2.07 (m, 7 H); 2.01-1.86 (m, 1 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 4.56分.
LC-MS m/z: 781.5 (M+H)+.
UPLC純度: 99% (220 nm).
UPLC Rt (Acquity UPLC BEHC 18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm; MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% TFA): 1.57分.
【０５７５】
三価リンカー6
【０５７６】
【化７６】
2018535195.tif 000087
【０５７７】
(18R,23S)-23-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)カルバモイル)-1-ブロモ-18-カルボキシ-2,7,16,21-テトラオキソ-11,14-ジオキサ-3,8,17,22-テトラアザヘキサコサン-26-オイック酸
反応スキーム:
反応スキーム:
【０５７８】
【化７７】
2018535195.tif 000088
【０５７９】
合成プロトコル:
化合物(1)の調製。
2-(1-ヒドロキシ-3-メチルブチリデン)-5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン(37.7g、168mmol)のDCM(200mL)中溶液を、ジエチレントリアミン(8.64mL、80.0mmol)のDCM(130mL)中溶液に滴下して加えた。反応混合物を一晩撹拌し、次いで溶媒を蒸発させ、2,2'-(((アザンジイルビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)を淡黄色油状物として得た。
【０５８０】
収率: 41.2 g (100%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 3.57 (q, 4 H); 3.06-2.89 (m, 8 H); 2.36 (bs, 8 H); 2.05-1.89 (m, 2 H); 1.09-0.94 (m, 26 H).
【０５８１】
上記アミン(33.4g、64.8mmol)のDMF(320mL)中溶液を、2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸5-tert-ブチルエステル(Fmoc-Glu(OtBu)-OH、63.4g、149mmol)、HATU(56.6g、149mmol)、DIPEA(40.0mL、227mmol)のDMF(530mL)溶液に加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、酢酸エチル(1.6L)及び水(1.6L)を添加した。分離させた有機層を10%のK2CO3水溶液(2×1.6L)で洗浄し、無水Na2SO4で脱水し、濾過し、真空で蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.063〜0.040mm;溶離液:DCM/MeOH 50:1〜40:1)で精製し、tert-ブチル4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタノエートを淡黄色粘性油状物として得た。
【０５８２】
収率: 59.2 g (99%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.59 (m, 2 H); 7.40 (t, J=7.5 Hz, 2 Hz); 7.36-7.26 (m, 2 H); 5.65 (d, J=9.2 Hz, 1 H); 4.72-4.59 (m, 1 H); 4.46-4.27 (m, 2 H); 4.24-4.16 (m, 1 H); 4.12-3.99 (m, 1 H); 3.94-3.53 (m, 6 H); 3.48-3.33 (m, 1 H); 2.97 (bs, 4 H); 2.46-2.26 (m, 10 H); 2.08-1.83 (m, 4 H); 1.79-1.64 (m, 1 H); 1.43 (s, 9 H); 1.07-0.90 (m, 24 H).
【０５８３】
DCM(50mL)に溶解させたtert-ブチル4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタノエート(59.2g、64.8mmol)をTFA/H2O混合物(95:5、400mL)に添加し、2時間撹拌した。次いで、溶媒を蒸発させ、残渣を3回トルエンと同時蒸発させた。残渣をDCM(800mL)に溶解し、水(3×800mL)で洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.063〜0.040mm;溶離液:DCM/メタノール60:1〜10:1)により精製し、4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)-カルボニル)アミノ)-5-(ビス(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)-アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタン酸を白色粉末として得た。
【０５８４】
収率: 42.1 g (76%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 7.79 (d, J=7.3 Hz, 2 H); 7.64 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.39 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 7.36-7.26 (m, 2 H); 4.83 (bs, 1 H); 4.48-4.30 (m, 2 H); 4.27-4.19 (m, 1 H); 4.19-3.62 (m, 7 H); 3.61-3.46 (m, 1 H); 3.28-2.90 (m, 4 H); 2.55 (t, J=6.7 Hz, 2 H); 2.43 (s, 8 H); 2.01-1.81 (m, 4 H); 1.07-0.88 (m, 24 H).
【０５８５】
Wang樹脂0.63mmol/g(25.7g、16.2mmol)をテトラヒドロフラン(250mL)中で20分間膨潤させた。4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタン酸(42.0g、48.5mmol)のTHF(250mL)中溶液を樹脂に加え、次いで、DIC(7.60mL、48.5mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、200mg、1.62mmol)に加えた。混合物を18時間振盪した。樹脂を濾別し、DCM(6×250mL)で洗浄した。樹脂を無水酢酸(40mL)、ピリジン(40mL)のDMF(360mL)中溶液で15分間処理し、DCM(6×250mL)で洗浄し、化合物(1)を黄色固体として得た。
収量:36.0g。
ローディング:51%(0.321mmol/g)。
【０５８６】
Wang樹脂-結合化合物(1)(2.85g、0.92mmol)をDCM(20mL)中で20分間膨潤させた。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×40mL)。樹脂をDMF(3×70mL)、2-プロパノール(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、1.17g、2.75mmol)、TCTU(0.98g、2.75mmol)及びDIPEA(0.96mL、5.49mmol)のDMF(60mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を3時間振盪した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×40mL)。樹脂をDMF(3×70mL)、2-プロパノール(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、1.06g、2.75mmol)、TCTU(0.98g、2.75mmol)及びDIPEA(0.96mL、5.49mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×70mL)、DCM(3×70mL)及びDMF(3×70mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×40mL)。樹脂をDMF(3×70mL)、2-プロパノール(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。
【０５８７】
4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)ブタン酸(Fmoc-GABA、0.88g、2.70mmol)、TCTU(0.96g、2.70mmol)及びDIPEA(0.94mL、5.40mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×70mL)、DCM(3×70mL)及びDMF(3×70mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×40mL)。樹脂をDMF(3×70mL)、2-プロパノール(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。1-(クロロ-ジフェニル-メチル)-4-メチル-ベンゼン(MttCl、0.79g、2.70mmol)及びDIPEA(0.94mL、5.4mmol)の無水DCM(60mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を3時間振盪した。樹脂を濾別し、DCM(3×70mL)及びDMF(3×70mL)で洗浄した。IvDde基は、DMF中2%ヒドラジン一水和物で処理することにより除去した(3×3分、3×30mL)。樹脂をDMF(5×40mL)で洗浄した。クロロ酢酸(0.51g、5.40mmol)、DIC(0.85mL、5.40mmol)及び2,4,6-トリメチルピリジン(1.43mL、10.8mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2.5時間振盪した。樹脂を濾別し、DMF(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。Mtt基は、DCM中の80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理することにより除去した(2×10分、2×30分、4×50mL)。樹脂をDCM(5×50mL)及びDMF(4×50mL)で洗浄した。ブロモ酢酸(0.38g、2.70mmol)及びDIC(0.42mL、2.70mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2.5時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。生成物を、TFA/TIS/H2O(95:2.5:2.5、26mL)の切断カクテルで1時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾別し、DCM(6×40mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発乾固させた。残渣をHPLC(Column Gemini C18、5μm;50×250mm;MeCN/H2O 5:95〜40:60で180分間、及び5:95〜35:65で60分間+0.05%TFA)により精製し、凍結乾燥し、表題化合物(2)を白色固体として得た。
【０５８８】
収率: 336 mg (43%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 5.07 (dd, J=9.9及び2.9 Hz, 1 H); 4.72 (dd, J=8.7及び4.7 Hz, 1 H); 4.22-4.12 (m, 6 H); 3.96 (s, 2 H); 3.93-3.37 (m, 16 H); 3.33 (t, J=6.8 Hz, 3 H); 2.59-2.29 (m, 7 H); 2.10 (d, J=4.9 Hz, 2 H); 1.97-1.80 (m, 3 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 2.86分.
LC-MS m/z: 866.5 (M+H)+.
UPLC純度: 98.7% (214 nm).
UPLC Rt (Acquity UPLC BEHC 18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm; MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.05% TFA): 2.74分.
【０５８９】
三価リンカー6
【０５９０】
【化７８】
2018535195.tif 000089
【０５９１】
(18R,23S)-23-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)カルバモイル)-1-ブロモ-18-カルボキシ-2,7,16,21-テトラオキソ-11,14-ジオキサ-3,8,17,22-テトラアザヘキサコサン-26-オイック酸
反応スキーム:
【０５９２】
【化７９】
2018535195.tif 000090
【０５９３】
合成プロトコル:
化合物(1)の調製。
2-(1-ヒドロキシ-3-メチルブチリデン)-5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン(37.7g、168mmol)のDCM(200mL)中溶液を、ジエチレントリアミン(8.64mL、80.0mmol)のDCM(130mL)中溶液に滴下して加えた。反応混合物を一晩撹拌し、次いで溶媒を蒸発させ、2,2'-(((アザンジイルビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)を淡黄色油状物として得た。
【０５９４】
収率: 41.2 g (100%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 3.57 (q, 4 H); 3.06-2.89 (m, 8 H); 2.36 (bs, 8 H); 2.05-1.89 (m, 2 H); 1.09-0.94 (m, 26 H).
【０５９５】
上記アミン(33.4g、64.8mmol)のDMF(320mL)中の溶液を、2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸5-tert-ブチルエステル(Fmoc-Glu(OtBu)-OH、63.4g、149mmol)、HATU(56.6g、149mmol)、DIPEA(40.0mL、227mmol)のDMF(530mL)中溶液に加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、酢酸エチル(1.6L)及び水(1.6L)を添加した。分離させた有機層を10%のK2CO3水溶液(2×1.6L)で洗浄し、無水Na2SO4で脱水し、濾過し、真空で蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.063〜0.040mm;溶離液:DCM/MeOH 50:1〜40:1)により精製し、tert-ブチル4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタノエートを淡黄色粘性油状物として得た。
【０５９６】
収率: 59.2 g (99%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.59 (m, 2 H); 7.40 (t, J=7.5 Hz, 2 Hz); 7.36-7.26 (m, 2 H); 5.65 (d, J=9.2 Hz, 1 H); 4.72-4.59 (m, 1 H); 4.46-4.27 (m, 2 H); 4.24-4.16 (m, 1 H); 4.12-3.99 (m, 1 H); 3.94-3.53 (m, 6 H); 3.48-3.33 (m, 1 H); 2.97 (bs, 4 H); 2.46-2.26 (m, 10 H); 2.08-1.83 (m, 4 H); 1.79-1.64 (m, 1 H); 1.43 (s, 9 H); 1.07-0.90 (m, 24 H).
【０５９７】
DCM(50mL)に溶解したtert-ブチル4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス-(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタノエート(59.2g、64.8mmol)をTFA/H2O混合物(95:5、400mL)に加え、2時間撹拌した。次いで溶媒を蒸発させ、残渣を3回トルエンと同時蒸発させた。残渣をDCM(800mL)に溶解し、水(3×800mL)で洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.063〜0.040mm;溶離液:DCM/メタノール60:1〜10:1)により精製し、4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタン酸を白色粉末として得た。
【０５９８】
収率: 42.1 g (76%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 7.79 (d, J=7.3 Hz, 2 H); 7.64 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.39 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 7.36-7.26 (m, 2 H); 4.83 (bs, 1 H); 4.48-4.30 (m, 2 H); 4.27-4.19 (m, 1 H); 4.19-3.62 (m, 7 H); 3.61-3.46 (m, 1 H); 3.28-2.90 (m, 4 H); 2.55 (t, J=6.7 Hz, 2 H); 2.43 (s, 8 H); 2.01-1.81 (m, 4 H); 1.07-0.88 (m, 24 H).
【０５９９】
Wang樹脂0.63mmol/g(25.7g、16.2mmol)をテトラヒドロフラン(250mL)中で20分間膨潤させた。4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-5-(ビス(2-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-5-オキソペンタン酸(42.0g、48.5mmol)のTHF(250mL)中溶液を樹脂に加え、次いでDIC(7.60mL、48.5mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、200mL、1.62mmol)に加えた。混合物を18時間振盪した。樹脂を濾別し、DCM(6×250mL)で洗浄した。樹脂を無水酢酸(40mL)、ピリジン(40mL)のDMF(360mL)中溶液で15分間処理し、DCM(6×250mL)で洗浄し、化合物(1)を黄色固体として得た。
収量:36.0g。
ローディング:51%(0.321mmol/g)。
【０６００】
Wang樹脂結合化合物(1)(2.85g、0.92mmol)をDCM(20mL)中で20分間膨潤させた。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×40mL)。樹脂をDMF(3×70mL)、2-プロパノール(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、1.17g、2.75mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、0.98g、2.75mmol)及びDIPEA(0.96mL、5.49mmol)のDMF(60mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を3時間振盪した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×40mL)。樹脂をDMF(3×70mL)、2-プロパノール(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、1.06g、2.75mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、0.98g、2.75mmol)及びDIPEA(0.96mL、5.49mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×70mL)、DCM(3×70mL)及びDMF(3×70mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×40mL)。樹脂をDMF(3×70mL)、2-プロパノール(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。
【０６０１】
4-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)ブタン酸(Fmoc-GABA、0.88g、2.70mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、0.96g、2.70mmol)及びDIPEA(0.94mL、5.40mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×70mL)、DCM(3×70mL)及びDMF(3×70mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(1×5分、1×30分、2×40mL)。樹脂をDMF(3×70mL)、2-プロパノール(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。1-(クロロ-ジフェニル-メチル)-4-メチル-ベンゼン(MttCl、0.79g、2.70mmol)及びDIPEA(0.94mL、5.4mmol)の無水DCM(60mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を3時間振盪した。樹脂を濾別し、DCM(3×70mL)及びDMF(3×70mL)で洗浄した。IvDde基は、DMF中2%ヒドラジン一水和物で処理することにより除去した(3×3分、3×30mL)。樹脂をDMF(5×40mL)で洗浄した。クロロ酢酸(0.51g、5.40mmol)、DIC(0.85mL、5.40mmol)及び2,4,6-トリメチルピリジン(1.43mL、10.8mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2.5時間振盪した。樹脂を濾別し、DMF(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。Mtt基は、DCM中80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理することにより除去した(2×10分、2×30分、4×50mL)。樹脂をDCM(5×50mL)及びDMF(4×50mL)で洗浄した。ブロモ酢酸(0.38g、2.70mmol)及びDIC(0.42mL、2.70mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2.5時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×70mL)及びDCM(3×70mL)で洗浄した。生成物をTFA/TIS/H2O(95:2.5:2.5、26mL)の切断カクテルで1時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾別し、DCM(6×40mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発乾固させた。残渣をHPLC(Column Gemini C18、5um;50×250mm;MeCN/H2O 5:95〜40:60を180分間及び5:95〜35:65を60分間+0.05%TFA)で精製し、凍結乾燥し、表題化合物(2)を白色固体として得た。
【０６０２】
収率: 336 mg (43%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 5.07 (dd, J=9.9及び2.9 Hz, 1 H); 4.72 (dd, J=8.7及び4.7 Hz, 1 H); 4.22-4.12 (m, 6 H); 3.96 (s, 2 H); 3.93-3.37 (m, 16 H); 3.33 (t, J=6.8 Hz, 3 H); 2.59-2.29 (m, 7 H); 2.10 (d, J=4.9 Hz, 2 H); 1.97-1.80 (m, 3 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 2.86分.
LC-MS m/z: 866.5 (M+H)+.
UPLC純度: 98.7% (214 nm).
UPLC Rt (Acquity UPLC BEHC 18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm; MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.05% TFA): 2.74分.
【０６０３】
三価リンカー7
【０６０４】
【化８０】
2018535195.tif 000091
【０６０５】
(S)-4-(2-{2-[((S)-1-{ビス-[2-(2-クロロ-アセチルアミノ)-エチル]-カルバモイル}-3-カルボキシ-プロピルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-2-(2-ブロモ-アセチルアミノ)-酪酸
反応スキーム:
【０６０６】
【化８１】
2018535195.tif 000092
【０６０７】
合成プロトコル:
Wang樹脂0.63mmol/g(1、5.08g、3.20mmol)をTHF(60mL)中で45分間膨潤させた。(S)-4-(ビス-{2-[1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン)-エチルアミノ]-エチル}-カルバモイル)-4-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-酪酸(7.52g、9.61mmol)、DIC(1.49mL、9.61mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.04g、0.32mmol)のTHF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×50mL、1×5分、1×20分)。樹脂をDMF(2×50mL)、2-プロパノール(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、2.47g、6.41mmol)、TCTU(2.28,6.41mmol)及びDIPEA(2.01mL、11.5mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×50mL、1×5分、1×20分)。樹脂をDMF(2×50mL)、2-プロパノール(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-Glu-OtBu、2.04g、4.80mmol)、TCTU(1.71、4.80mmol)及びDIPEA(1.67mL、9.61mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を1.5時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×50mL、1×5分、1×20分)。樹脂をDMF(2×50mL)、2-プロパノール(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。1-(クロロ-ジフェニル-メチル)-4-メチル-ベンゼン(MttCl、1.13g、3.84mmol)及びDIPEA(1.67mL、9.61mmol)の無水DCM(50mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DCM(4×50mL)及びDMF(4×50mL)で洗浄した。Dde基は、DMF中2%ヒドラジンで処理することにより除去した(3×50mL、3×3分)。樹脂をDMF(8×50mL)で洗浄した。クロロ酢酸(0.91g、9.61mmol)、PyBrOP(4.48g、9.61mmol)及びDMF(3.35mL、19.2mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を一晩振盪した。ニンヒドリン試験は依然として陽性であったため、再カップリングを行った。クロロ酢酸(0.91g、9.61mmol)、PyBrOP(4.48g、9.61mmol)及びDIPEA(3.35mL、19.2mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を3時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×50mL)及びDCM(4×50mL)で洗浄した。Mtt基は、DCM中80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理することにより除去した(7×50mL、2×10分、5×30分)。樹脂をDCM(5×50mL)及びDMF(4×50mL)で洗浄した。ブロモ酢酸(8.90g、64.1mmol)及びDIC(8.43mL、54.5mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を20分間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×30mL)及びDCM(10×30mL)で洗浄した。生成物をTFA(50mL)で1.5時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾別し、TFA(1×50mL)及びDCM(2×50mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発させた。残渣をトルエンで2回同時蒸発させ、調製用LC/MS(SunFire Prep C18 OBD 5m、19×100mm、勾配0.1%FA中5〜100%MeCN/H2O)により精製した。純生成物を含有するフラクションを合わせ、凍結乾燥し、表題化合物をベージュ色固体として得た。
【０６０８】
収率: 150 mg (30%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 5.19-5.05 (m, 1 H); 4.72-4.56 (m, 1 H); 4.27-4.07 (m, 6 H); 4.06-3.37 (m, 18 H); 2.60-2.37 (m, 4 H); 2.36-2.22 (m, 1 H); 2.21-1.87 (m, 3 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 05:95〜100:0 + 0.1% FA): 2.94分.
LC-MS m/z: 780.4 (M+H)+.
【０６０９】
三価リンカー8
【０６１０】
【化８２】
2018535195.tif 000093
【０６１１】
(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-ブロモアセトアミド)エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-クロロアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸
反応スキーム:
【０６１２】
【化８３】
2018535195.tif 000094
【０６１３】
合成プロトコル:
樹脂(1)(8.25g、2.71mmol、実施例5に記載の調製物)の一部からのIvDde基は、DMF中2%ヒドラジン一水和物で処理することにより除去した(3×3分、3×50mL)。樹脂をDMF(6×50mL)で洗浄した。ブロモ酢酸(2.26g、16.3mmol)、DIC(2.52mL、16.3mmol)及び2,4,6-コリジン(4.30mL、32.5mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2.5時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×50mL)、DCM(3×50mL)、DMF(3×50mL)及びDCM(4×50mL)で洗浄した。Mtt基は、DCM中の80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理することにより除去した(2×10分、2×30分、4×50mL)。樹脂をDCM(5×50mL)及びDMF(4×50mL)で洗浄した。クロロ酢酸(5.12g、54.2mmol)及びDIC(7.13mL、46.1mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を30分間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×50mL)及びDCM(10×50mL)で洗浄した。生成物をTFA/TIS/H2O(95:2.5:2.5、50mL)の切断カクテルで2時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾過し、TFA/DCM混合物(1:1、50mL)及びDCM(10×30mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発乾固させた。残渣をHPLC(column X-Bridge3 C18、OBD、5μm、50×250mm MeCN/H2O 3:35〜35:40+0.05%TFA)により精製し、(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-ブロモアセトアミド)エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-クロロアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸(2)を白色固体として得た。
【０６１４】
収率: 213 mg (8%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 5.12 (dd, J=9.5及び3.9 Hz, 1 H); 4.69 (dd, J=8.0及び5.4 Hz, 1 H); 4.19-4.10 (m, 6 H); 3.94 (s, 2 H); 3.90-3.43 (m, 24 H); 2.55 (t, J=7.0 Hz, 2 H); 2.48 (m, 2 H); 2.41-1.99 (m, 4 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 3.06分.
LC-MS m/z: 970.5 (M+H)+.
UPLC純度: 98.3% (214 nm).
UPLC Rt (Acquity UPLC BEHC 18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm; MeCN/H2O 5:95〜95:5 + 0.05% TFA): 1.66分.
【０６１５】
三価リンカー9
【０６１６】
【化８４】
2018535195.tif 000095
【０６１７】
(4S)-5-[ビス[3-[(2-クロロアセチル)アミノ]プロピル]アミノ]-4-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソ-ペンタン酸
三価リンカー9は、三価リンカー1について実施例1で説明した方法と同様の方法で、2,2'-(((アザンジイルビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)を2,2'-(((アザンジイルビス(プロパン-3,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)と置き換えて調製した。粗(4S)-5-[ビス[3-[(2-クロロアセチル)アミノ]プロピル]アミノ]-4-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソ-ペンタン酸を分取LC-MS(Column Labio C18、50×500mm、MeCN/水+0.05%TFA、勾配10:40で120分間)により精製し、純(4S)-5-[ビス[3-[(2-クロロアセチル)アミノ]プロピル]アミノ]-4-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソ-ペンタン酸を無色油状物として得た。
【０６１８】
収率: 0.25 g (56%).
LC-MS純度: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 3.01分.
LC-MS m/z: 680.2 (M+H)+.
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.71-7.60 (m, 2 H); 7.49-7.41 (m, 1 H); 7.35-7.29 (m, 1 H); 5.17-5.07 (m, 1 H); 4.43 (bs, 1 H); 4.12-3.98 (m, 6 H); 3.90 (s, 2 H); 3.76-3.57 (m, 8 H); 3.50-3.14 (m, 8 H); 2.50-2.42 (m, 2 H); 2.10-1.70 (m, 6 H).
【０６１９】
三価リンカー10
【０６２０】
【化８５】
2018535195.tif 000096
【０６２１】
N-[2-[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]エチルカルバモイル-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチル]アミノ]エチル]-2-クロロ-アセトアミド
反応スキーム:
【０６２２】
【化８６】
2018535195.tif 000097
【０６２３】
合成プロトコル:
Wang-OH樹脂0.53mmol/g(1、3.85g、2.04mmol)を無水DCM(40mL)中で30分間膨潤させた。4-ニトロフェニルカルボノクロリデート(2、0.27g、1.36mmol)及びピリジン(0.12mL、1.50mmol)の無水DCM(40mL)中溶液を樹脂(1)に加え、混合物を一晩振盪した。樹脂(3)を氷水(1×30mL)、氷水/1,4-ジオキサン混合物(1:1、1×30mL)、DMF(3×30mL)及びDCM(3×30mL)で洗浄した。
【０６２４】
2,2'-(エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-1-アミン)(4)(0.59mL、4.08mmol)のDMF(30mL)中溶液を樹脂(3)に加え、混合物を一晩振盪した。樹脂(5)をDMF(4×30mL)、DCM(3×30mL)、DMF(2×30mL)及びDCM(2×30mL)で洗浄した。
【０６２５】
4-ニトロフェニルカルボノクロリデート(2)(1.10g、5.44mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.88mL、6.80mmol)のDMF/テトラヒドロフラン混合物(1:1、30mL)中溶液を樹脂(5)に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂(6)をDMF(4×30mL)、DCM(4×30mL)及びDMF(4×30mL)で洗浄した。
【０６２６】
2,2'-(((アザンジイルビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(アザンジイル)ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)(7)(1.40g、2.72mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.47mL、2.72mmol)のDMF(30mL)中溶液を樹脂(6)に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂(8)をDMF(4×30mL)、DCM(4×30mL)及びDMF(4×30mL)で洗浄した。
【０６２７】
ivDde保護基は、DMF中のヒドラジン一水和物の2%溶液で処理することにより除去した(3×5分、3×30mL)。樹脂をDMF(3×30mL)、DCM(3×30mL)及びDMF(3×30mL)で洗浄した。無水クロロ酢酸(0.93g、5.44mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.90mL、10.9mmol)のDMF(30mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×30mL)、DCM(3×30mL)、DMF(3×30mL)及びDCM(10×30mL)で洗浄した。生成物(9)を水中95%トリフルオロ酢酸(30mL)で3時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾別し、DCM(3×10mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発乾固させた。残渣をMeCN(50mL)の60%水溶液に溶解し、凍結乾燥し、所望の化合物(9)を濃い黄色油状物として得た。
収量:240mg(42%)。
LC-MS純度:93%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、MeCN/H2O 5:95〜100:0+0.1%FA):2.42分。
LC-MS m/z:430.29(M+H)+。
【０６２８】
上記化合物(9)(0.24g、0.56mmol)のMeCN(20mL)中の撹拌溶液を0℃で冷却し、無水ブロモ酢酸(0.22g、0.84mmol)及び炭酸水素ナトリウム(0.18g、2.09mmol)を加えた。反応混合物を0℃で1時間撹拌した。反応混合物を凍結乾燥し、表題粗化合物(10)を無色油状物として得た。この粗化合物(10)を分取LC/MS(SunFire Prep C18 OBD、5μL、19×100mm、MeCN/H2O 5:95〜100:0+0.1%FA)で2回精製し、表題化合物のN-[2-[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]エチルカルバモイル-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチル]アミノ]エチル]-2-クロロ-アセトアミドを無色油状物として得た。
【０６２９】
収率: 35.0 mg (12%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.45 (bs, 2 H); 7.27 (bs, 1 H); 6.06-5.93 (m, 1 H); 4.06 (s, 4 H); 3.90 (s, 2 H); 3.64 (s, 4 H); 3.62-3.55 (m, 4 H); 3.53-3.38 (m, 12 H).
LC-MS純度: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 2.91分.
LC-MS m/z: 552.3 (M+H)+.
【０６３０】
三価リンカー11
【０６３１】
【化８７】
2018535195.tif 000098
【０６３２】
(2R)-6-[ビス[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチル]カルバモイルアミノ]-2-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサン酸
【０６３３】
三価リンカー11は、三価リンカー10について説明したのと同様の方法で調製した。
【０６３４】
三価リンカー12
【０６３５】
【化８８】
2018535195.tif 000099
【０６３６】
(2R)-2-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-[2-[2-[2-[[(1S)-3-カルボキシ-1-[2-[(2-クロロアセチル)-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチル]アミノ]エチルカルバモイル]プロピル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-5-オキソ-ペンタン酸
反応スキーム:
【０６３７】
【化８９】
2018535195.tif 000100
【０６３８】
合成プロトコル:
Wang樹脂結合化合物(1)(1.42g、0.70mmol)をDCM(20mL)中で20分間膨潤させた。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×5分、1×20分、3×10mL)。樹脂をDMF(3×15mL)、2-プロパノール(3×15mL)及びDCM(3×15mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、0.77g、2.00mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、0.71g、2.00mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.63mL、3.60mmol)のDMF(10mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×15mL)、DCM(3×15mL)及びDMF(3×15mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×5分、1×20分、3×10mL)。樹脂をDMF(3×15mL)、2-プロパノール(3×15mL)及びDCM(3×15mL)で洗浄した。(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-L-Glu-OtBu、0.85g、2.00mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、0.71g、2.00mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.63mL、3.60mmol)のDMF(10mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×15mL)、DCM(3×15mL)及びDMF(3×15mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×5分、1×20分、3×10mL)。樹脂をDMF(3×15mL)、2-プロパノール(3×15mL)及びDCM(3×15mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、0.77g、2.00mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、0.71g、2.00mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.63mL、3.60mmol)のDMF(10mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×15mL)、DCM(3×15mL)及びDMF(3×15mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×5分、1×20分、3×10mL)。樹脂をDMF(3×15mL)、2-プロパノール(3×15mL)及びDCM(3×15mL)で洗浄した。
【０６３９】
DCM(10mL)に溶解したジ-tert-ブチルジカーボネート(0.44g、2.00mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.35mL、2.00mmol)の溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂をDMF(3×15mL)、DCM(3×15mL)及びDMF(3×15mL)で洗浄した。樹脂をDMF中のヒドラジン一水和物溶液(2%v/v溶液、3×10分、3×15mL)で処理した。樹脂(2)をDMF(3×15mL)、DCM(3×15mL)及びDMF(3×15mL)で洗浄した。樹脂(2)を、酢酸(0.12mL、2.00mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.34mL、2.00mmol)のDMF(10mL)中溶液で16時間処理した。樹脂をDMF(3×15mL)、DMF(10mL)中のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.34mL、2.00mmol)、DCM(2×15mL)及びDMF(3×15mL)で洗浄した。クロロ酢酸(0.53g、5.60mmol)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(0.86mL、5.60mmol)及び2,4,6-コリジン(0.74mL、5.60mmol)を加え、混合物を2時間振盪した。樹脂をDMF(3×15mL)、DCM(6×15mL)で洗浄した。生成物をトリフルオロ酢酸/水混合物(98:2、20mL)で2時間処理することにより樹脂から切断した。溶液を真空中で濃縮し、トリフルオロ酢酸の残渣をトルエンとの同時蒸発により除去した。ブロモ酢酸(276mg、2.00mmol)及びN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、0.21mL、1.00mmol)の溶液をMeCN(5mL)に溶解し、15分間撹拌し、濾過した。この溶液を、樹脂から切断した粗生成物に加え、0℃に冷却し、炭酸水素ナトリウム(0.24mmol、2.80mmol)を加えた。混合物を撹拌し、3時間25℃に加温した。混合物を濾過し、蒸発させ、粗生成物を分取HPLC(Gemini NXC18、5μm、50×250mm、MeCN/H2O 5:95〜45:55を180分間及び45:55〜50:50を10分間+0.05% TFA)により精製し、(2R)-2-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-[2-[2-[2-[[(1S)-3-カルボキシ-1-[2-[(2-クロロアセチル)-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチル]アミノ]エチルカルバモイル]プロピル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-5-オキソ-ペンタン酸を得た。
【０６４０】
収率: 33 mg (5%).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.74-4.55 (m, 2 H); 4.33 (s, 1 H); 4.31 (s, 1 H); 4.23-4.10 (m, 6 H); 3.98 (s, 2 H); 3.83-3.42 (m, 24 H); 2.59-2.41 (m, 4 H); 2.38-2.08 (m, 4 H). 
LC-MS純度: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 5:95〜100:0 + 0.1% TFA): 3.04分.
LC-MS m/z: 927.0 (M+H)+.
【０６４１】
(実施例2)
GH-Fcコンジュゲート1
GH-三価リンカー1中間体
[(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチルアミン)))-Glu-OEG-γGlu-OEG]-カルボニルメチレン-S101-hGH[L101C]
工程1
【０６４２】
【化９０】
2018535195.tif 000101
【０６４３】
hGH[L101C]の調製:
上記で得られたhGH[L101C]は、グルタチオン及びシスタミンでブロックされているその遊離システインの部分を有していた。脱ブロックは、GSH及びGSSGを含有する平衡バッファー中でグルタレドキシンII(Grx2)を使用して酵素的に実施した。脱ブロックされたhGH[L101C]は、Sephadex G25カラムでのバッファー交換により低分子量GSH/GSSGから分離された。
【０６４４】
使用したhGH[L101C]:100mg(20.2mL)、Mw=22190.93
使用したFc:200mg(50mM重炭酸アンモニウム  pH7.8中100mL)。
濃度2.03mg/mL
【０６４５】
手順(工程1):hGH[L101C](50mg、4.95mg/mL、225μM、20mMトリエチルアミン中、100mM NaCl、pH8)を含むバイアルに、3当量のビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物二カリウム(TPPDS、3.6mg)を室温で添加した。1時間インキュベーションした後、3当量の(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-ブロモアセトアミド)-エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸(実施例1から、6.3mg)をNaCl(177mg 0.3MのNaCl最終濃度が得られる)と一緒に加え、得られた反応混合物を室温で18時間インキュベートし、その後、20mM HEPES、10mM EDTA、pH7.5にバッファー交換し、限外濾過により22mg/mLに高濃縮した(2.2mL)。
【０６４６】
収量=50mg(99%)。
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=22959,43;計算値m/z=22959,48
HPLCでの純度:214nmで93%。
システム:Agilent 1200シリーズHPLC
カラム:Zorbax 300SB-C3、4.6×50mm、3.5μ
検出器:Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)
検出器設定:DAD:280nm、(G1315A)
走査範囲:m/z分  100、m/z max 3000
リニアリフレクタモード
ポジティブモード
条件:工程勾配:5%〜90%B
実行時間:12分:0〜1分  5%B、1〜8分  5〜90%B、8〜9分  90%B、9〜9.1分  90〜5%B 9.1〜12分  5%B
流速:1.00mL/分固定
カラム温度:40℃
溶離液:溶媒A:99.9% H2O、0.1%  ギ酸
溶媒B:99.9% MeCN、0.1%  ギ酸
【０６４７】
3つの別個の工程を含む工程2の反応の概要を以下に説明する。
【０６４８】
【化９１】
2018535195.tif 000102
【０６４９】
[(ビス(2-(2-Fc-S3-アセトアミド)エチルアミン)))-Glu-OEG-γGlu-OEG]-カルボニルメチレン-S101-hGH[L101C]
工程2の手順:
1.  クロロからヨードへの交換(フィンケルシュタイン反応):工程1から得た上記化合物[(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチルアミン)))-Glu-OEG-γGlu-OEG]-カルボニルメチレン-S101-hGH[L101C](2.2mL、22mg/mL、956μM)を、2.2mLの5M KI水溶液、50mMアスコルビン酸溶液で希釈し、室温で18時間、暗所でインキュベートした。最後に、反応混合物を20mM HEPES、10mM EDTA、pH7.5バッファー(2.3mL、21.7mg/mL、945μM)中でバッファー交換し、以下の工程3で直接使用した。
2. Fc-フラグメントジスルフィド架橋の還元:上記のようにして得られたFcフラグメント(50mL、2.03mg/mL、50mM重炭酸アンモニウム中41μM、pH7.8)に、5当量のジチオスレイトール(DTT、20mM HEPES、10mM EDTA中の195mM溶液52μL、pH7.5)を加え、室温で2時間インキュベートした。その後、反応混合物をバッファー交換し、限外濾過により4.3mL(23.6mg/mL、二量体として475μM)まで高濃縮し、以下の工程3で直接使用した。
3. hGH[L101C]-Fcコンジュゲートの形成:工程1から得たhGH[L101C]化合物(50mg、21.7mg/mL、945μM)を、工程2から得た還元Fcフラグメント(100mg、23.6mg/mL、475μM)と混合し、hGH[L101C]とFcとのモル比を1.1対1とした。反応混合物(6.6mL)を暗所で18時間インキュベートし、その後、HICモードで操作するCapto Adhere 16/10カラム(CV=20mL;A:20mM TEA、pH7.5; B:40mM MES、40mMギ酸、pH3.5;  適用バッファー:20mM TEA、200mM NaCl、pH7.5;  セグメント勾配:セグメント1:0〜30% B、1CV;セグメント2:30〜70% B、15CV;セグメントC:70〜100% B、1CV;流速3mL/分)で反応混合物から所望のコンジュゲートを精製した。生成物を含有するフラクションをPBSでバッファー交換し、50mgの所望のコンジュゲートを得た(25mL、2.0mg/mL、27.5μM)。
収量=50mg(34%)。
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=72682.09;計算値m/z=72682.13
HPLCによる純度:214nmで96%。
【０６５０】
GH-Fcコンジュゲート2
[(ビス(2-(2-Fc-S3-アセトアミド)エチルアミン)))-Gly]-カルボニルメチレン-S101-hGH[L101C]
【０６５１】
【化９２】
2018535195.tif 000103
【０６５２】
化合物は、リンカー(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)-エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-ブロモアセトアミド)-エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸(実施例1、リンカー1)をHEPES/EDTA中の2-(2-ブロモアセトアミド)-N,N-ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)アセトアミド(実施例1、リンカー2)100mgと置き換える以外、実施例2のコンジュゲート1で説明されている方法を使用して調製した。
【０６５３】
精製:
上記反応混合物をローディングバッファー(トリス+塩)にバッファー交換し、G25カラムにローディングした:
カラム:50/30 Sephadex G25 fine
バッファーA:10mM  重炭酸アンモニウム
流量:10mL/分
温度:室温
フラクション:フラクションあたり40mL
【０６５４】
フラクションA4+A5をプールし、Capto Adhereカラムにアプライした:
カラム:Capto Adhere 16 /10
バッファーA:20mM TEA pH7.5
バッファーA2:40mM TEA+0.2M NaCl pH7.5
バッファーB:40mM MES+40mMギ酸  pH3.5
勾配1:1CVに0〜30%  バッファーB
勾配2:15CVに30〜70%  バッファーB
勾配3:1CVに70〜100%  バッファーB
流量:3mL/分
温度:室温
フラクション:ピーク分画においてフラクション当たり1mL
【０６５５】
フラクションA6〜A10をプールし、UF(Amicon ultra 15K)によりPBSバッファーにバッファー交換した。
【０６５６】
濃度=>7.22mg/mL=>トータルで101mg
収量:101mg(31%)
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=72193.48;計算値m/z=72190.6444
HPLCでの純度:214nmで約100%。
【０６５７】
GH-FCコンジュゲート3
[(ビス(2-(2-Fc-S3-アセトアミド)エチルアミン)))-Gly-OEG]-カルボニルメチレン-S101-hGH[L101C]
【０６５８】
【化９３】
2018535195.tif 000104
【０６５９】
化合物は、リンカー(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)-エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-ブロモアセトアミド)-エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸(実施例1)をHEPES/EDTA中の2-(2-(2-(2-(2-ブロモアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-N,N-ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチル)アセトアミド(実施例1、リンカー3)100mgと置き換える以外、実施例2のコンジュゲート1で説明されている方法を使用して調製した。
【０６６０】
使用したhGH[L101C]:上記の100mg(20.2mL)。Mw=22190.93
使用したFc:200mg(50mM重炭酸アンモニウム中100mL pH7.8)。
濃度2.03mg/mL
【０６６１】
精製:
上記反応混合物をローディングバッファー(トリス+塩)にバッファー交換し、G25カラムにローディングした:
【０６６２】
カラム:50/30 Sephadex G25 fine
バッファーA:10mM  重炭酸アンモニウム
流量:10mL/分
温度:室温
フラクション:フラクション当たり40mL
フラクションA4+A5をプールし、Capto Adhereカラムにアプライした:
【０６６３】
カラム:Capto Adhere 16 /10
バッファーA:20mM TEA pH7.5
バッファーA2:40mM TEA+0.2M NaCl pH7.5
バッファーB:40mM MES+40mM  ギ酸  pH3.5
勾配1:1CVに0〜30%のバッファーB
勾配2:15CVに30〜65%のバッファーB
勾配3:1CVに65〜100%のバッファーB
流量:3mL/分
温度:室温
フラクション:ピークフラクションにおいてフラクション当たり3mL
【０６６４】
フラクションA4〜A9をプールし、UF(Amicon ultra 15K)によりPBSバッファーにバッファー交換し、所望のhGH-リンカー-Fcコンジュゲート[(ビス(2-(2-Fc-S3-アセトアミド)エチルアミン)))-Gly-OEG]-カルボニルメチレン-S101-hGH[L101C]を得た。
収量:91mg(28%)
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=72338.69;計算値m/z=72335.8008
HPLCでの純度:214nmで81%。
【０６６５】
GH-FCコンジュゲート4
【０６６６】
【化９４】
2018535195.tif 000105
【０６６７】
コンジュゲート1〜3について上記で説明したのと同様の方法で、コンジュゲート4を、実施例1の三価リンカー4を使用して調製した。
【０６６８】
GH-FCコンジュゲート5
【０６６９】
【化９５】
2018535195.tif 000106
【０６７０】
コンジュゲート1〜3について上記で説明したのと同様の方法で、コンジュゲートを、実施例1の三価リンカー6を使用して調製した。
【０６７１】
代替方法によるGH-Fcコンジュゲート1
Fc-リンカー中間体
工程1
【０６７２】
【化９６】
2018535195.tif 000107
【０６７３】
手順工程1:
上記で説明したようにして得られたFcフラグメント(12mL、2.03mg/mL、50mLの重炭酸アンモニウム中41μM、pH7.8)をvivaspin UF装置(CU 30kDa、PES膜)により1.9mLまで高濃縮した(22mg、11.6mg/mL、232μM)したものに、10mM TCEPのPBS(4.3当量)中溶液の220μLを加え、室温で1時間インキュベートした。反応混合物を50mMリン酸緩衝液、400mM NaCl、10mM EDTAにバッファー交換し、19.25mgの還元Fc(7.7mg/mL、二量体として154μM)を得た。これに、(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-ブロモアセトアミド)エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-クロロアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸の同一バッファー中の新たに調製した5mM溶液の375μLを添加し(2.5当量)、室温で18時間、暗所でインキュベートし、その後、反応混合物をゲル濾過によりPBSにバッファー交換し、標的Fc-リンカーコンジュゲートを定量的に得た。
収量=50mg(95%)。
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=50605.58;計算値m/z=50605.68
HPLCでの純度:214nmで92%。
システム:Agilent 1200シリーズHPLC
カラム:Zorbax 300SB-C3、4.6×50mm、3.5μ
検出器:Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)
検出器設定:DAD:280nm、(G1315A)
走査範囲:m/z分  100、m/z max. 3000
リニアリフレクタモード
ポジティブモード
条件:工程勾配:5%〜90%B
実行時間:12分:0〜1分  5%B、1〜8分  5〜90%B、8〜9分  90%B、9〜9.1分  90-5%B 9.1〜12分  5%B  
流速:1.00mL/分固定
カラム温度:40℃
溶離液:溶媒A:99.9% H2O、0.1%  ギ酸
溶媒B:99.9% MeCN、0.1%  ギ酸
【０６７４】
以下に説明している3つの別個の工程を含む工程2の反応の概要。
【０６７５】
【化９７】
2018535195.tif 000108
【０６７６】
手順(工程2):
1.  クロロからヨードへの交換(フィンケルシュタイン反応):工程1から得た上記化合物Fc-リンカーコンジュゲート(2.5mL、7.7mg/mL、152μM)を、Zebaスピンカラム(10mLサイズ、Pierce)でのゲル濾過により50mMリン酸緩衝液、5M KI、50mMアスコルビン酸、100mM NaCl、pH6にバッファー交換し、室温で暗所にて18時間インキュベートした。最後に、反応混合物をvivaspin UF装置(CU 30kDa、PES膜)で1.3mLまで高濃縮し、Zeba spinカラム(10mLサイズ、Pierce)でのゲル濾過により50mM PB、1M NaCl、10mM EDTA、pH7.6にバッファー交換し、工程3で直ちに使用した。
【０６７７】
2.  システインのhGH[L101C]キャップ除去:hGH[L101C](24.75mg、4.95mg/mL、225μM、20mMトリエチルアミン中、100mM NaCl、pH8)を入れたバイアルに3当量のビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物二カリウム(TPPDS、3.6mg)を添加し、室温で18時間インキュベートした。その後、反応混合物を50mM PB、1M NaCl、10mM EDTA、pH7.6にバッファー交換し、限外濾過により17mg/mLまで高濃縮し(1.45mL)、工程3で直ちに使用した。
【０６７８】
3.hGH[L101C]-Fcコンジュゲートの形成:工程1から得たFc-活性化リンカーコンジュゲート(1.3mL、14.8mg/mL、300μM)及び工程2から得た遊離Cys hGH[L101C]化合物(0.61mL、17mg/mL、770μM)を一緒に混合し、FcとhGH[101]とのモル比を1対1.2とした。反応混合物(1.91mL)を暗所で18時間インキュベートし、その後、所望のコンジュゲートをHICモードで操作するCapto Adhere 16/10カラムで反応混合物から精製した(CV=20mL; A:20mM TEA、pH7.5; B:40mM MES、40mMギ酸、pH3.5;  適用バッファー:20mM TEA、200mM NaCl、pH7.5;セグメント勾配:セグメント1:0〜30% B、1CV;セグメント2:30〜70%B、15CV;セグメントC:70〜100%B、1CV;流速3mL/分)。生成物を含有するフラクションをPBSでバッファー交換し、8.6mgの所望のコンジュゲートを得た(4.3mL、2.0mg/mL、27.5μM)。
収量=8.6mg(30%)。
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=72682.09;計算値m/z=72682.13
HPLCによる純度:214nmで94%。
【０６７９】
(実施例3)
GH化合物の評価
上記実施例2に従って生成したGH化合物を、アッセイ2、3及び5に説明したように評価した。全ての化合物を静脈内投与し、平均滞留時間(MRT)を算出した。IGF-1血漿濃度-時間のプロファイルを各化合物について作成した。
【０６８０】
【表８】
2018535195.tif 000109
【図１】
2018535195.tif 000116
【図２】
2018535195.tif 000117
【配列表】
2018535195000001.app
【国際調査報告】
2018535195.tif 000118
2018535195.tif 000119
2018535195.tif 000120