(57)【要約】本発明は、1または複数のRORγ阻害剤を、単独で、または1または複数の抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬と組み合わせて含む、組成物、方法、およびキットを提供する。これらは、がん、たとえば、去勢抵抗性前立腺がん（CRPC）などの前立腺がん、ならびに肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、および神経膠腫などの多数の他のタイプのがんを治療するために有用である。2018513123.tif 000018
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてがんを治療するための方法であって、有効量のレチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ（RORγ）阻害剤を対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項２】
前記がんが、抗がん剤に抵抗性である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記抗がん剤が、抗アンドロゲン薬、化学療法剤、放射線治療剤、抗原特異的免疫治療剤、内分泌療法、チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記抗アンドロゲン薬が、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン（arbiraterone）、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記化学療法剤が、タモキシフェン、タキサン、またはこれらの組み合わせである、請求項3記載の方法。
【請求項６】
前記タキサンが、パクリタキセル、ドセタキセル、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記がんが、前立腺がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、および神経膠腫からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記前立腺がんが、去勢抵抗性前立腺がんである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記肺がんが、非小細胞肺がん（NSCLC）、K-Ras変異肺がん、BRAF変異肺がん、EGFR変異肺がん、チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性肺がん、または小細胞肺がん（SCLC）である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
前記乳がんが、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、タモキシフェン抵抗性乳がん、放射線抵抗性乳がん、HER2陽性乳がん、またはER陽性乳がんである、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
前記RORγ阻害剤が、低分子化合物である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記低分子化合物が、RORγに選択的に結合し、RORγ活性を阻害する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、がん治療を必要とするヒトである、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
対象においてがんを治療するための方法であって、有効量のレチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ（RORγ）阻害剤を、有効量の抗がん剤と組み合わせて、対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１５】
前記がんが、前記抗がん剤に抵抗性である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記RORγ阻害剤が、前記抗がん剤の治療効果を増強する、請求項14または15記載の方法。
【請求項１７】
前記RORγ阻害剤が、前記抗がん剤に対するがん細胞抵抗性を逆転するかもしくは減少させ、かつ／またはがん細胞を前記抗がん剤に対して感受性にする、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが、前立腺がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、および神経膠腫からなる群より選択される、請求項14〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記前立腺がんが、去勢抵抗性前立腺がんである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記肺がんが、非小細胞肺がん（NSCLC）、K-Ras変異肺がん、BRAF変異肺がん、EGFR変異肺がん、チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性肺がん、または小細胞肺がん（SCLC）である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
前記乳がんが、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、タモキシフェン抵抗性乳がん、放射線抵抗性乳がん、HER2陽性乳がん、またはER陽性乳がんである、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
前記RORγ阻害剤が、低分子化合物である、請求項14〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記低分子化合物が、RORγに選択的に結合し、RORγ活性を阻害する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記抗がん剤が、抗アンドロゲン薬、化学療法剤、放射線治療剤、抗原特異的免疫治療剤、内分泌療法、チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項14〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記抗アンドロゲン薬が、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記化学療法剤が、タモキシフェン、タキサン、またはこれらの組み合わせである、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
前記タキサンが、パクリタキセル、ドセタキセル、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が、がん治療を必要とするヒトである、請求項14〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ（RORγ）阻害剤と抗がん剤とを含む組成物。
【請求項３０】
前記RORγ阻害剤が、低分子化合物である、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
前記低分子化合物が、RORγに選択的に結合し、RORγ活性を阻害する、請求項30記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗がん剤が、抗アンドロゲン薬、化学療法剤、放射線治療剤、抗原特異的免疫治療剤、内分泌療法、チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項29〜31のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗アンドロゲン薬が、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項32記載の組成物。
【請求項３４】
前記化学療法剤が、タモキシフェン、タキサン、またはこれらの組み合わせである、請求項32記載の組成物。
【請求項３５】
前記タキサンが、パクリタキセル、ドセタキセル、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項34記載の組成物。
【請求項３６】
薬学的に許容可能な賦形剤または希釈剤をさらに含む、請求項29〜35のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３７】
レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ（RORγ）阻害剤と抗がん剤とを含むキット。
【請求項３８】
前記RORγ阻害剤が、低分子化合物である、請求項37記載のキット。
【請求項３９】
前記低分子化合物が、RORγに選択的に結合し、RORγ活性を阻害する、請求項38記載のキット。
【請求項４０】
前記抗がん剤が、抗アンドロゲン薬、化学療法剤、放射線治療剤、抗原特異的免疫治療剤、内分泌療法、チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項37〜39のいずれか一項記載のキット。
【請求項４１】
前記抗アンドロゲン薬が、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項40記載のキット。
【請求項４２】
前記化学療法剤が、タモキシフェン、タキサン、またはこれらの組み合わせである、請求項40記載のキット。
【請求項４３】
前記タキサンが、パクリタキセル、ドセタキセル、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項42記載のキット。
【請求項４４】
前記RORγ阻害剤および／または前記抗がん剤を対象に投与するための指示を有するラベルをさらに含む、請求項37〜43のいずれか一項記載のキット。
【請求項４５】
前記対象が、がん治療を必要とするヒトである、請求項37〜44のいずれか一項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2015年3月12日に出願された米国仮出願第62/132,465号、および2016年1月18日に出願された米国仮出願第62/280,081号の優先権を主張し、それらの開示は、すべての目的についてその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
合衆国政府の助成による研究または開発の下でなされた発明の権利に関する陳述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与された認可番号R01CA206222、およびアメリカ合衆国退役軍人省生物医学研究所研究開発サービス局により授与された認可番号I01BX002237の下において政府支援でなされたものである。政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がんは、アメリカ合衆国における死亡の主要な原因であり、化学療法、放射線療法、およびホルモン除去療法などの種々の異なる治療の開発にもかかわらず、これらの疾患に対して100%有効な治療法は存在しない。現在のがん治療法が、罹患した個体のがん性組織を根絶できない理由の1つは、がん性細胞が薬剤抵抗性を生じるためである。特定のがん薬剤に対して薬剤抵抗性を示す患者は、その薬剤にもはや反応せず、治療の継続にかかわらず成長し続け得る腫瘍を有するであろう。
【０００４】
薬剤抵抗性は、特定のがん治療を行う過程における一般的な結果であり得るので、新しい薬剤を開発し続けること、およびがんを治療するための新しい標的を同定することが重要である。たとえば、進行した前立腺がん（PCa）、たとえば、転移性去勢抵抗性前立腺がん（mCRPC）は致死的な疾患である。エンザルタミドやアビラテロンなどの最も有効な治療法は、PCa患者のサブグループにおいて、全体で数ヶ月の生存利益しかもたらさない。
【０００５】
したがって、現在、当該技術分野において、がん患者および薬剤抵抗性のがんを有する患者を治療するための新しい方法および組成物の必要性が存在する。本開示は、これらおよび他の必要性に取り組むものである。
【発明の概要】
【０００６】
第1の態様において、本発明は、対象においてがんを治療するための方法であって、有効量のレチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ（RORγ）阻害剤を対象に投与する段階を含む、方法を提供する。
【０００７】
特定の実施形態において、がんは、抗がん剤に対して抵抗性である。抗がん剤の非限定的な例は、抗アンドロゲン薬、化学療法剤、放射線治療剤、抗原特異的免疫治療剤、内分泌療法、チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせを含む。特定の例において、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。他の例において、化学療法剤は、タモキシフェン、タキサン（たとえば、パクリタキセル、および／またはドセタキセル）、またはこれらの組み合わせである。
【０００８】
特定の実施形態において、がんは、前立腺がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、および神経膠腫からなる群より選択される。
【０００９】
特定の実施形態において、前立腺がんは、去勢抵抗性前立腺がんである。特定の実施形態において、去勢抵抗性前立腺がんは、抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬および／またはタキサンに対して抵抗性である。特定の例において、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。他の例において、タキサンは、パクリタキセル、ドセタキセル、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１０】
特定の実施形態において、肺がんは、非小細胞肺がん（NSCLC）、K-Ras変異肺がん、BRAF変異肺がん、EGFR変異肺がん、チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性肺がん、または小細胞肺がん（SCLC）である。
【００１１】
特定の実施形態において、乳がんは、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、タモキシフェン抵抗性乳がん、放射線抵抗性乳がん、HER2陽性乳がん、またはER陽性乳がんである。
【００１２】
特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、低分子化合物である。低分子RORγ阻害剤の非限定的な例は、表1および式Iに示される。特定の実施形態において、低分子化合物は、RORγに選択的に結合し、RORγ活性を阻害する。他の実施形態において、対象は、がん治療を必要とする哺乳動物（たとえば、ヒト）である。
【００１３】
第2の態様において、本発明は、対象においてがんを治療するための方法であって、有効量のレチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ（RORγ）阻害剤を、有効量の抗がん剤と組み合わせて、対象に投与する段階を含む、方法を提供する。
【００１４】
特定の実施形態において、がんは、抗がん剤に対して抵抗性である。特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、抗がん剤の治療効果を増強する。たとえば、RORγ阻害剤は、抗がん剤に対するがん細胞抵抗性を逆転するかもしくは減少させ、かつ／またはがん細胞を抗がん剤に対して感受性にすることができる。
【００１５】
特定の実施形態において、がんは、前立腺がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、および神経膠腫からなる群より選択される。
【００１６】
特定の実施形態において、前立腺がんは、去勢抵抗性前立腺がんである。特定の実施形態において、去勢抵抗性前立腺がんは、抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬および／またはタキサンに対して抵抗性である。特定の例において、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。他の例において、タキサンは、パクリタキセル、ドセタキセル、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１７】
特定の実施形態において、肺がんは、非小細胞肺がん（NSCLC）、K-Ras変異肺がん、BRAF変異肺がん、EGFR変異肺がん、チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性肺がん、または小細胞肺がん（SCLC）である。
【００１８】
特定の実施形態において、乳がんは、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、タモキシフェン抵抗性乳がん、放射線抵抗性乳がん、HER2陽性乳がん、またはER陽性乳がんである。
【００１９】
特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、低分子化合物である。低分子RORγ阻害剤の非限定的な例は、表1および式Iに示される。特定の実施形態において、低分子化合物は、RORγに選択的に結合し、RORγ活性を阻害する。他の実施形態において、対象は、がん治療を必要とする哺乳動物（たとえば、ヒト）である。
【００２０】
特定の実施形態において、抗がん剤は、抗アンドロゲン薬、化学療法剤、放射線治療剤、抗原特異的免疫治療剤、内分泌療法、チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態において、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン（arbiraterone）、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。他の例において、化学療法剤は、タモキシフェン、タキサン（たとえば、パクリタキセル、および／またはドセタキセル）、またはこれらの組み合わせである。
【００２１】
非限定的な例として、エンザルタミドなどの抗アンドロゲン薬での治療に抵抗性である前立腺がんを有する患者に、抗アンドロゲン薬に対する前立腺がん細胞抵抗性を逆転するかもしくは減少させ、かつ／または前立腺がん細胞を抗アンドロゲン薬に対して感受性にするのに十分な量のRORγ阻害剤とともに、抗アンドロゲン薬を投与することができる。
【００２２】
別の非限定的な例として、ドセタキセルなどのタキサンでの治療に抵抗性である前立腺がんを有する患者に、タキサンに対する前立腺がん細胞抵抗性を逆転するかもしくは減少させ、かつ／または前立腺がん細胞をタキサンに対して感受性にするのに十分な量のRORγ阻害剤とともに、タキサンを投与することができる。
【００２３】
さらに別の非限定的な例として、タモキシフェンなどの化学療法剤での治療に抵抗性である乳がんを有する患者に、化学療法剤に対する乳がん細胞抵抗性を逆転するかもしくは減少させ、かつ／または乳がん細胞を化学療法剤に対して感受性にするのに十分な量のRORγ阻害剤とともに、化学療法剤を投与することができる。
【００２４】
さらなる非限定的な例として、放射線治療に抵抗性である乳がんを有する患者に、放射線治療に対する乳がん細胞抵抗性を逆転するかもしくは減少させ、かつ／または乳がん細胞を放射線治療に対して感受性にするのに十分な量のRORγ阻害剤とともに、放射線治療を行うことができる。
【００２５】
第3の態様において、本発明は、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ（RORγ）阻害剤と抗がん剤とを含む組成物を提供する。
【００２６】
特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、低分子化合物である。低分子RORγ阻害剤の非限定的な例は、表1および式Iに示される。特定の実施形態において、低分子化合物は、RORγに選択的に結合し、RORγ活性を阻害する。
【００２７】
特定の実施形態において、抗がん剤は、抗アンドロゲン薬、化学療法剤、放射線治療剤、抗原特異的免疫治療剤、内分泌療法、チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態において、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。他の例において、化学療法剤は、タモキシフェン、タキサン（たとえば、パクリタキセル、および／またはドセタキセル）、またはこれらの組み合わせである。
【００２８】
特定の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤または希釈剤をさらに含む。他の実施形態において、組成物は、経口、または非経口（たとえば静脈内）投与用に調製される。
【００２９】
第4の態様において、本発明は、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ（RORγ）阻害剤と抗がん剤とを含むキットを提供する。
【００３０】
特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、低分子化合物である。低分子RORγ阻害剤の非限定的な例は、表1および式Iに示される。特定の実施形態において、低分子化合物は、RORγに選択的に結合し、RORγ活性を阻害する。
【００３１】
特定の実施形態において、抗がん剤は、抗アンドロゲン薬、化学療法剤、放射線治療剤、抗原特異的免疫治療剤、内分泌療法、チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の例において、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。他の例において、化学療法剤は、タモキシフェン、タキサン（たとえば、パクリタキセル、および／またはドセタキセル）、またはこれらの組み合わせである。
【００３２】
特定の実施形態において、キットは、RORγ阻害剤および／または抗がん剤を対象に投与するための指示を有するラベルをさらに含む。特定の例において、対象は、がん治療を必要とする哺乳動物（たとえば、ヒト）である。
【００３３】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、下記の詳細な記述および図面から当業者に明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】オーファン核内受容体RORγは転移性前立腺がんにおいて過剰発現されていることを示す。図1A：Chandran UR, 2007およびGrasso CS, 2012の2つの遺伝子発現オムニバス（GEO）データセット由来のRORC転写レベルを疾患状態（良性、原発性、および転移性）との関連について調べた。図1B：核内受容体RORγの構造および機能を図示する。図1C：前立腺がんおよび非がん細胞株における、RORγタンパク質の免疫ブロット解析を示す。示したのは代表的なブロットである。図1D：正常な前立腺（n=8）またはPCa腫瘍標本コホート（n=70）のRORγ免疫組織化学からの代表的な画像を示す。
【図２Ａ】複数の異なるRORγアンタゴニストが強力な抗がん活性を呈することを示す。RORγアンタゴニストであるSR2211、8k、7k、および6f、ならびに抗アンドロゲン薬であるエンザルタミド（ENZ）の化学構造。
【図２Ｂ】複数の異なるRORγアンタゴニストが強力な抗がん活性を呈することを示す。表示した濃度のENZおよび8k（「Cmpd8k」）で異なる日数処理したC4-2B細胞の細胞増殖。注：8kはE11（図3A〜3D参照）およびXY011としても知られる。
【図２Ｃ】複数の異なるRORγアンタゴニストが強力な抗がん活性を呈することを示す。表示した濃度の6F、8C、および8kで異なる日数処理したC4-2B細胞の細胞増殖。
【図２Ｄ】複数の異なるRORγアンタゴニストが強力な抗がん活性を呈することを示す。表示した濃度のSR2211およびCmpd8kで異なる日数処理したCR-VCaP細胞の細胞増殖。CR-VCaPはマウスを去勢した後、該マウスにおいて再び増殖したVCaP異種移植腫瘍に由来する、VCaPの去勢抵抗性亜系である。VCaP細胞は初めはATCCから入手した。
【図２Ｅ】複数の異なるRORγアンタゴニストが強力な抗がん活性を呈することを示す。異なる細胞株における8kおよびビヒクルの相対細胞増殖。
【図２Ｆ】複数の異なるRORγアンタゴニストが強力な抗がん活性を呈することを示す。C4-2BおよびCR-VCaP細胞における、8kおよびビヒクルの相対細胞アポトーシス。
【図３】RORγアンタゴニストがエンザルタミド抵抗性腫瘍の成長を強力に阻害することを示す。MDV3100＝エンザルタミド。図3A：22Rv1異種移植片の成長に対する、表示した処置（SR2211、腹腔内に5 mg/kg；E11、腹腔内に10 mg/kgおよび20 mg/kg、それぞれ週に5回；またはビヒクル）の効果を示す（1群につきマウスn=6）。注：E11は8k（図2A〜2F参照）およびXY011としても知られる。図3B：ビヒクル、MDV3100、SR2211、およびE11でそれぞれ処理したマウス由来の異種移植腫瘍の画像を示す。図3C：ビヒクル、SR2211、またはE11で24日間処理したマウス由来の精巣の重量を示す。図3D：ビヒクルまたはSR2211で処理したマウス由来の精巣の代表的な画像を示す。
【図４】RORγアンタゴニストが、腫瘍の進行を推進する異常なアンドロゲン受容体（AR）の発現を強力に阻害することを示す。図4A：表示した濃度のSR2211およびビヒクルで72時間処理したC4-2Bにおける、AR（全長）およびAR-V7の免疫ブロットを示す。図4B：表示した濃度のSR2211およびビヒクルで72時間処理したVCaP細胞における、AR（全長）、AR-V7、およびGRの免疫ブロットを示す。
【図５】RORγアンタゴニストがゲノム全体でのARの結合を強力に阻害することを示す。AR標的遺伝子であるKLK2およびKLK3のエンハンサーおよび／またはプロモーター上のAR結合のゲノムブラウザ表示を示す。ChIP-seqはビヒクルまたはSR2211（5μM）で24時間処理したC4-2B細胞において行った。
【図６Ａ】RORγの過剰発現が転移性CRPCの進行に関連し、前立腺がん細胞の生存に必要であることを示す。Chandran UR, 2007およびGrasso CS, 2012の2つの遺伝子発現オムニバス（GEO）データセット由来のRORC転写レベルを疾患状態（良性、原発性、および転移性）との関連について調べた。P値は両側スチューデントのt検定を用いて計算した。ボックスプロットの線（上端から下端まで）：最大；Q3、第3の四分位数；中央値；Q1、第1の四分位数；および最小。
【図６Ｂ】RORγの過剰発現が転移性CRPCの進行に関連し、前立腺がん細胞の生存に必要であることを示す。正常な前立腺（n=8）またはPCa腫瘍標本のコホート（n=70）のRORγ免疫組織化学による代表的な画像。前立腺がん腫瘍標本のコホート（n=70）における、RORγタンパク質レベルと病理学的パラメータとの関連の免疫組織化学（IHC）解析。
【図６Ｃ】RORγの過剰発現が転移性CRPCの進行に関連し、前立腺がん細胞の生存に必要であることを示す。前立腺がんおよび非がん細胞株におけるRORγタンパク質の免疫ブロット解析。
【図６Ｄ】RORγの過剰発現が転移性CRPCの進行に関連し、前立腺がん細胞の生存に必要であることを示す。9％チャコール-デキストラン処理済（cds）ウシ胎児血清（FBS）を加えた1％FBS培地中のC4-2B細胞（左）および標準FBS培地中のVCaP細胞（右）に、RORCに対するsiRNA（siRORC-1およびsiRORC-2）または対照siRNA（siCont）を形質移入した。表示した時点で生存細胞を計数した。
【図６Ｅ】RORγの過剰発現が転移性CRPCの進行に関連し、前立腺がん細胞の生存に必要であることを示す。C4-2B細胞は図6Dのように処理し、カスパーゼ3/7活性を測定することによりアポトーシスを解析した。
【図６Ｆ】RORγの過剰発現が転移性CRPCの進行に関連し、前立腺がん細胞の生存に必要であることを示す。RORCまたは対照siRNAを形質移入して3日間培養したC4-2B細胞およびVCaP細胞における、表示したタンパク質の免疫ブロット解析。
【図７Ａ】RORγアンタゴニストがCRPC細胞の増殖を強力に阻害することを示す。RORγアンタゴニストであるSR2211およびXY011の化学構造。
【図７Ｂ】RORγアンタゴニストがCRPC細胞の増殖を強力に阻害することを示す。表示した濃度のENZ、RORαアゴニストであるSR3335、ならびにRORγアンタゴニストであるSR2211、XY011、およびSR1555で4日間処理したC4-2B細胞の、Cell-Titer GLO（Promega）で測定した細胞生存度。実験は3つの独立した実験を6連で行った。
【図７Ｃ】RORγアンタゴニストがCRPC細胞の増殖を強力に阻害することを示す。4日間処理した表示の細胞株における、SR2211およびENZの最大半量阻害濃度（IC50）を示す。
【図７Ｄ】RORγアンタゴニストがCRPC細胞の増殖を強力に阻害することを示す。C4-2B細胞および22Rv1細胞はビヒクル（DMSO）または表示した濃度のSR2211もしくはXY011で14日間処理し、その後コロニー形成を評価した。*P < 0.05、**P < 0.01；スチューデントのt検定、n=3。
【図７Ｅ】RORγアンタゴニストがCRPC細胞の増殖を強力に阻害することを示す。ビヒクルまたは表示したRORγアンタゴニストで3日間処理したC4-2B細胞および22Rv1細胞における、カスパーゼ3/7（Cas3/7）活性。**P < 0.01；スチューデントのt検定、n=3。
【図７Ｆ】RORγアンタゴニストがCRPC細胞の増殖を強力に阻害することを示す。ビヒクルまたはRORγアンタゴニスト（5μM）で処理したTUNEL陽性アポトーシス細胞を計数し、全細胞数に対するパーセンテージで表した。示したデータはアポトーシス細胞の平均パーセンテージ±s.d. である。*P < 0.05、**P < 0.01；スチューデントのt検定、n=3。
【図７Ｇ】RORγアンタゴニストがCRPC細胞の増殖を強力に阻害することを示す。ビヒクルまたは表示したRORγアンタゴニストで3日間処理したC4-2B細胞における、表示したタンパク質の免疫ブロット解析。代表的なブロット；n=3。
【図８Ａ】RORγがAR依存的な遺伝子プログラムを制御することを示す。SR2211（5μM）、XY011（5μM）、またはENZ（20μM）で48時間処理したC4-2B細胞においてRNA-seqによって検出された、ビヒクル（DMSO）と比較した遺伝子発現の倍率変化を表示するヒートマップ。左：表示した遺伝子は少なくとも1つの条件において、発現にlog2 > 0.5の変化があった。クラスター1、両方のアンタゴニストによって阻害された遺伝子；クラスター2、SR2211によって誘導されたがXY011によって阻害された遺伝子；クラスター3、両方のアンタゴニストによって誘導された遺伝子；クラスター4、SR2211によって阻害されたがXY011によって誘導された遺伝子。中間および右：AR ChIP-seqピークで定義した、発現に変化があったアンドロゲン応答性のAR活性シグネチャー遺伝子を表示する。AR標的遺伝子を明るい青色で示した。ENZによる影響も受けた遺伝子を比較のために表示する。
【図８Ｂ】RORγがAR依存的な遺伝子プログラムを制御することを示す。ビヒクルと比較した、5μMのSR2211（上）またはXY011（下）で処理したC4-2B細胞におけるAR活性シグネチャーのGSEA。シグネチャーは、PCa細胞におけるアンドロゲン刺激およびヒト腫瘍におけるアンドロゲン欠乏の結果、有意に発現が変化した遺伝子によって定義した。
【図８Ｃ】RORγがAR依存的な遺伝子プログラムを制御することを示す。ビヒクルまたはRORγアンタゴニスト（5μM）で48時間処理したC4-2B細胞における、表示した遺伝子のqRT-PCR解析。示したデータは平均±s.d.である。スチューデントのt検定、**P < 0.001； n=3。
【図９Ａ】RORγ阻害がARおよびその変異体の発現を強力に抑制し、ARのゲノム結合を排除することを示す。対照もしくはRORC siRNAまたは表示した濃度のRORγアンタゴニストで72時間処理したC4-2B細胞またはVCaP細胞における、AR（全長）およびAR変異体の免疫ブロット。代表的なブロット；n=4。
【図９Ｂ】RORγ阻害がARおよびその変異体の発現を強力に抑制し、ARのゲノム結合を排除することを示す。ビヒクル、5μMのSR2211で48時間処理したVCaP細胞における、全長AR発現およびAR-V7発現のqRT-PCR解析。**P < 0.01；スチューデントのt検定、n=3。
【図９Ｃ】RORγ阻害がARおよびその変異体の発現を強力に抑制し、ARのゲノム結合を排除することを示す。異なる処理における、AR結合部位（ARBS）全体でのAR濃縮（平均カバー度；左）および表示したゲノム距離全体でのH3K27ac濃縮（中間）のChIP-seq要約プロット。右：AR標的遺伝子KLK2、KLK3、およびCAMKK2のエンハンサーおよび／またはプロモーター上での、AR結合およびH3K27ac濃縮事象のゲノムブラウザ表示。ChIP-seqはビヒクルまたはSR2211（5μM）で24時間処理したC4-2B細胞において行った。
【図９Ｄ】RORγ阻害がARおよびその変異体の発現を強力に抑制し、ARのゲノム結合を排除することを示す。ビヒクルまたは5μM のSR2211で24時間処理したC4-2B細胞における、表示した遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサーにおける相対的なARのChIP-qPCR解析。*P < 0.05、**P < 0.01；スチューデントのt検定；n=3。上記データは平均±s.d.である。
【図９Ｅ】RORγ阻害がARおよびその変異体の発現を強力に抑制し、ARのゲノム結合を排除することを示す。ビヒクルまたは5μMのSR2211で24時間処理したC4-2B細胞における、表示した遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサーにおける、相対的なp300ヒストンアセチラーゼおよびPol II占有またはヒストン修飾のChIP-qPCR解析。*P < 0.05、**P < 0.01；スチューデントのt検定；n=3。上記データは平均±s.d.である。
【図１０Ａ】RORγはエキソンのROREおよびSRCを介してAR遺伝子発現を直接制御することを示す。上のパネルはAR遺伝子座の概略図であり、ChIPプライマー対の位置を水平な短い線で表示し、TSSに対するそれらの距離をkbで示した。RORE部位を増幅するプライマー対を強調表示した。下のパネルはビヒクルまたは5μMのSR2211で処理したC4-2B細胞における、該遺伝子座でのRORγ占有のChIP-qPCR解析を示す。n=3。示したデータは平均±s.d.である。
【図１０Ｂ】RORγはエキソンのROREおよびSRCを介してAR遺伝子発現を直接制御することを示す。AR-RORE領域を標的とするsgRNA、ゲノムDNA PCRまたはRT-PCRに使用したプライマー、および推定Cas9切断部位（矢じり）の位置を示す概略図。ここで、ROREまたはその近傍には付加的なプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列がないため、RORE配列に隣接する挿入欠失型変異を引き起こすように設計し得るのはsgRNA 2のみであることに注意されたい。
【図１０Ｃ】RORγはエキソンのROREおよびSRCを介してAR遺伝子発現を直接制御することを示す。表示したsgRNAおよびCas9で処理した編集異質（editing-heterogenous）C4-2B細胞に由来するゲノムDNAのPCRおよび配列決定解析。ゲノムDNAのPCRはP3およびP4プライマーを用いて行った。一番上のバンドは予測される全長PCRアンプリコンを示す。下の2つのバンドはsgRNA誘導編集によって生じた欠失を伴う、予測PCRアンプリコンを示す。欠失アンプリコンを含むPCR産物はクローニングし、配列決定した。予測される欠失接合部の代表的な配列決定クロマトグラム；n=25。矢じりは予測される欠失接合部を示す。
【図１０Ｄ】RORγはエキソンのROREおよびSRCを介してAR遺伝子発現を直接制御することを示す。表示したsgRNAで処理したC4-2B細胞における、P1およびP2プライマーを用いたAR mRNAのqRT-PCR解析。**P < 0.01；スチューデントのt検定；n=3。
【図１０Ｅ】RORγはエキソンのROREおよびSRCを介してAR遺伝子発現を直接制御することを示す。野生型または欠失対立遺伝子由来のAR mRNA発現に対するアンタゴニストの効果を判定するために、表示したsgRNAおよびRORγアンタゴニスト（5μM；48時間）で左で説明するように処理したC4-2B細胞において、P3およびP4プライマーを用いたAR mRNAの半定量的RT-PCR解析を行った。代表的なゲルの画像を示す；n=3。
【図１０Ｆ】RORγはエキソンのROREおよびSRCを介してAR遺伝子発現を直接制御することを示す。レポーターに結合したAR-ROREの野生型および変異型の配列（上）。RORE配列またはRORγを突然変異させる作用（左）またはRORγ活性化に対するアンタゴニストの効果（右）を示す、293T細胞を用いたAR-ROREレポーター遺伝子アッセイ。**P < 0.01；スチューデントのt検定；n=3。
【図１０Ｇ】RORγはエキソンのROREおよびSRCを介してAR遺伝子発現を直接制御することを示す。ビヒクルまたは5μMのSR2211で24時間処理したC4-2B細胞における、AR-RORE部位での表示したタンパク質による相対占有のChIP-qPCR解析。*P < 0.05、**P < 0.01；スチューデントのt検定；n=3。示したデータは平均±s.d.である。
【図１１Ａ】RORγアンタゴニストは腫瘍成長を強力に阻害することを示す。C4-2Bの増殖に対する、表示した処理（SR2211、腹腔内に5mg/kg、週に5回；またはビヒクル）の効果（1群につきマウスn=6）。処理はC4-2B腫瘍が約100mm3に達した時点で開始した。平均腫瘍体積±s.e.m.および代表的な腫瘍の画像を示す。スケールバー、1cm。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。*P = 0.000293、**P = 6.67 x 10-5、***P = 1.13 x 10-5。
【図１１Ｂ】RORγアンタゴニストは腫瘍成長を強力に阻害することを示す。22Rv1異種移植片の成長に対する、表示した処理（SR2211、腹腔内に5mg/kg、週に5回；ENZ、経口で10mg/kg、週に5回；またはビヒクル）の効果（1群につきマウスn=6）。処理は22Rv1腫瘍が約50mm3に達した時点で開始した。平均腫瘍体積±s.e.m.および代表的な腫瘍の画像を示す。スケールバー、1cm。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。*P = 3.03 x 10-8、**P = 1.77 x 10-9、***P = 1.14 x 10-8。
【図１１Ｃ】RORγアンタゴニストは腫瘍成長を強力に阻害することを示す。図11AのようなビヒクルまたはSR2211による処理から24日後の、C4-2B異種移植腫瘍の免疫ブロット（左）。各レーンの細胞溶解物はビヒクルまたはSR2211群のマウス3個体から無作為に組み合わせた、均質化した腫瘍組織に由来する。腫瘍切片の抗切断型カスパーゼ3免疫組織化学の画像を右に示す。スケールバー、50μm。
【図１１Ｄ】RORγアンタゴニストは腫瘍成長を強力に阻害することを示す。左：CRPC-VCaP異種移植腫瘍の確立および処理を説明する概略図。CRPC-VCaP異種移植片を有する去勢したマウス（1群につきマウスn=6）に、週に5回、示したようなビヒクル、SR2211（腹腔内、5mg/kg）、ENZ（経口、10mg/kg）、またはSR2211およびENZの組み合わせを投与した。平均腫瘍体積±s.e.m.を示す。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。*P = 1.98 x 10-10、**P = 1.46 x 10-10、***P = 7.21 x 10-13。
【図１２Ａ】RORαでもRORβでもなく、RORγの過剰発現が転移性CRPCの進行に関連することを示す。GEOデータベース由来の2つの前立腺がんのマイクロアレイ研究における、RORAおよびRORB転写物の発現。データセットは良性前立腺組織および原発性または転移性前立腺腫瘍組織における、それぞれRORαおよびRORβタンパク質をコードするRORAおよびRORB遺伝子の転写レベルについて解析した（上）。最近の研究45で報告された、150人の患者由来の転移性前立腺がん腫瘍における3つのROR遺伝子変化のcBioPortalによるOncoprint表示（下）。MYCおよびEZH2は、同じ研究におけるそれらの変化の頻度を個々の腫瘍と3つのROR遺伝子との関係と比較するために表示する。
【図１２Ｂ】RORαでもRORβでもなく、RORγの過剰発現が転移性CRPCの進行に関連することを示す。VCaP、22Rv1、LNCaP、およびPC-3細胞にRORCまたは対照siRNAを形質移入した。表示した期間後、生存細胞の計数により細胞増殖を判定するために細胞を回収した。n=3。
【図１２Ｃ】RORαでもRORβでもなく、RORγの過剰発現が転移性CRPCの進行に関連することを示す。C4-2BおよびVCaP細胞にRORCまたは対照siRNAを形質移入した。3日後、表示した抗体による免疫ブロットのために細胞を回収した。
【図１２Ｄ】RORαでもRORβでもなく、RORγの過剰発現が転移性CRPCの進行に関連することを示す。異所的にRORγを発現するLNCaP細胞および対照細胞をチャコール:デキストラン処理済（cds）血清添加培地において培養した。表示した期間後、生存細胞の計数により細胞増殖を判定するために細胞を回収した。n=3。3日後、RORγまたはGAPDH抗体による免疫ブロットのために細胞を回収した。
【図１３Ａ】RORγアンタゴニストはCRPC細胞の増殖および生存を強力に阻害することを示す。RORγアンタゴニストによる処理後のC4-2B細胞および22Rv1細胞の増殖。細胞は6ウェルプレートに播種し、表示した濃度のRORγアンタゴニストで0日間、2日間、4日間、および6日間処理した後、コールターカウンターで細胞を計数した。データは平均±s.d.で示す。n=3。
【図１３Ｂ】RORγアンタゴニストはCRPC細胞の増殖および生存を強力に阻害することを示す。ビヒクル、SR2211、またはXY011で14日間処理したC4-2B細胞および22Rv1細胞のコロニー形成の代表的な画像。
【図１３Ｃ】RORγアンタゴニストはCRPC細胞の増殖および生存を強力に阻害することを示す。22Rv1細胞中のビヒクルまたはアンタゴニスト（5μM）で処理したTUNEL陽性細胞の代表的な画像を示す。
【図１３Ｄ】RORγアンタゴニストはCRPC細胞の増殖および生存を強力に阻害することを示す。C4-2BをビヒクルまたはSR2211で処理した。3日後、表示した抗体による免疫ブロットのために細胞を回収した。
【図１３Ｅ】RORγアンタゴニストはCRPC細胞の増殖および生存を強力に阻害することを示す。22Rv1細胞をビヒクルまたはSR2211で処理した。3日後、表示した抗体による免疫ブロットのために細胞を回収した。
【図１４Ａ】RORγアンタゴニストはARシグナル伝達を強力に阻害することを示す。5μMのSR2211またはXY011で48時間処理したC4-2B細胞における、細胞の増殖および生存に関与する遺伝子の、阻害剤により変化した発現のヒートマップ表示。遺伝子発現プロファイリングはRNA配列決定と共に行った。
【図１４Ｂ】RORγアンタゴニストはARシグナル伝達を強力に阻害することを示す。ベン図はSR2211（5μM）、XY011（5μM）、およびENZ（20μM）処理の間で、C4-2B細胞において上方制御または下方制御された遺伝子（> 1.2倍）の重複数を示す。遺伝子発現プロファイリングはRNA配列決定の後に行った。
【図１４Ｃ】RORγアンタゴニストはARシグナル伝達を強力に阻害することを示す。上記のように処理したC4-2B細胞における、AR-V7により上方制御された遺伝子の変化した発現のヒートマップ表示。
【図１４Ｄ】RORγアンタゴニストはARシグナル伝達を強力に阻害することを示す。上記のように処理したC4-2B細胞における、16個のコアAR CRPC遺伝子セットの変化した発現のヒートマップ表示。
【図１４Ｅ】RORγアンタゴニストはARシグナル伝達を強力に阻害することを示す。表示したsiRNA（左）またはENZ（右）で48時間処理したC4-2B細胞における、表示した遺伝子のqRT-PCR解析。データは平均±s.d.で示す。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。**p < 0.001。
【図１５】RORγは前立腺がん細胞においてARおよびその変異体の発現を制御することを示す。図15A：表示したsiRNAで48時間処理したC4-2B細胞およびVCaP細胞における、AR全長および変異体AR-V7発現のqRT-PCR解析。データは平均±s.d.で示す。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。**p < 0.001。図15B：ビヒクルまたはXY011で72時間処理したC4-2B細胞およびVCaP細胞における、ARおよびその変異体またはAR-V7の免疫ブロット。図15C：ビヒクルまたはSR2211で72時間処理したPC346C細胞、22Rv1細胞、およびLAPC4細胞における、ARおよびその変異体AR-V7の免疫ブロット。図15D：チャコール:デキストラン処理済（cds）血清添加培地で培養した、RORγを異所的に発現するLNCaP細胞および対照細胞における、ARおよびRORγの免疫ブロット。
【図１６Ａ】臨床の腫瘍データセットにおける、RORγ発現とARの遺伝子発現およびCRPC ARシグネチャー活性との相関を示す。原発性腫瘍またはCRPC腫瘍における、RORγ遺伝子発現とAR遺伝子発現との相関を示す散布図。遺伝子発現プロファイルは異なる臨床データセット（GSE6811、GSE70768、およびGSE35988-GPL6480）に由来する。CRPC腫瘍におけるRORγ発現とAR発現との相関を示す散布図。
【図１６Ｂ】臨床の腫瘍データセットにおける、RORγ発現とARの遺伝子発現およびCRPC ARシグネチャー活性との相関を示す。原発性腫瘍またはCRPC腫瘍における、RORγ遺伝子発現とAR遺伝子発現との相関を示す散布図。遺伝子発現プロファイルは異なる臨床データセット（GSE6811、GSE70768、およびGSE35988-GPL6480）に由来する。CRPC腫瘍におけるRORγ発現とCPRC ARシグネチャー活性との相関を示す散布図。
【図１７Ａ】ARゲノム結合、ヒストン修飾、およびPol-II動員に対する、RORγ阻害の効果を示す。ビヒクルまたはSR2211（5μM）で24時間処理したC4-2B細胞における、ARおよびその変異体の免疫ブロット。
【図１７Ｂ】ARゲノム結合、ヒストン修飾、およびPol-II動員に対する、RORγ阻害の効果を示す。図17Aのように処理した細胞において、ビヒクルまたはSR2211（5μM）で24時間処理した細胞における、AR結合部位（ARBS）全体にわたるAR濃縮（平均カバー度）および濃縮領域全体にわたるH3K27ac濃縮のヒートマップ提示。
【図１７Ｃ】ARゲノム結合、ヒストン修飾、およびPol-II動員に対する、RORγ阻害の効果を示す。AR標的遺伝子NKX3.1、FKBP5、およびATAD2/ANCCAのエンハンサーおよび／またはプロモーターにおけるAR結合事象のゲノムブラウザ表示。AR ChIP-seqはビヒクルまたはSR2211（5μM）で24時間処理したC4-2B細胞において行った。
【図１７Ｄ】ARゲノム結合、ヒストン修飾、およびPol-II動員に対する、RORγ阻害の効果を示す。ビヒクルまたはSR2211（5μM）で24時間処理したC4-2B細胞における、AR標的遺伝子CAMKK2のプロモーターでのH3K4me2、H3K4me3、H3K27ac、RNAポリメラーゼII（pol II）、およびアセチラーゼp300の相対濃縮のChIP-qPCR解析。データは平均±s.d.で示す。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。**p < 0.001、n=3。
【図１７Ｅ】ARゲノム結合、ヒストン修飾、およびPol-II動員に対する、RORγ阻害の効果を示す。AR標的遺伝子KLK2、KLK3、およびCAMKK2のエンハンサーおよび／またはプロモーターにおける、AR、H3K4me2、H3K4me3、およびRNAポリメラーゼII（Pol II）結合事象のゲノムブラウザ表示。AR、H3K3K4me2/3、およびRNAポリメラーゼII（Pol II）のChIP-seqは、ビヒクルまたはSR2211（5μM）で24時間処理したC4-2B細胞において行った。注：ここに示したAR ChIP-seqデータは、図9A〜9Eに示したデータとは別の実験から得た。
【図１７Ｆ】ARゲノム結合、ヒストン修飾、およびPol-II動員に対する、RORγ阻害の効果を示す。対照siRNAまたはRORγ siRNAで72時間処理したC4-2B細胞におけるKLK3プロモーターでの、AR、H3K4me2、H3K4me3、H3K27ac、およびRNAポリメラーゼII（pol II）の相対濃縮のChIP-qPCR解析。データは平均±s.d.で示す。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。**p < 0.001、n=3。
【図１７Ｇ】ARゲノム結合、ヒストン修飾、およびPol-II動員に対する、RORγ阻害の効果を示す。異なる処理群における、対応する結合部位全体にわたるAR、H3K4me2、H3K4me3、およびpol IIの濃縮要約プロット。ChIP-seqは図17Eのように行った。
【図１８Ａ】RORγアンタゴニストはAR発現の抑制を介してAR機能を阻害することを示す。左：チャコール処理済培地中の22Rv1細胞に、表示したような5 x ARE-tk-lucおよびAR発現構築物を形質移入した。16時間後、ルシフェラーゼ活性を測定するために回収する前に、細胞を3nMのR1881で24時間処理した。右：22Rv1細胞に上記のように形質移入し、その後表示した濃度のR1881およびRORγアンタゴニストまたはARアンタゴニスト（エンザルタミド、ENZ）で処理した。*p < 0.05、**p < 0.01、n=3。
【図１８Ｂ】RORγアンタゴニストはAR発現の抑制を介してAR機能を阻害することを示す。チャコール処理済培地中の22Rv1細胞に、表示したような5.8kbのKLK3-lucおよびAR発現構築物を形質移入した。16時間後、ルシフェラーゼ活性の測定（左）または表示した抗体による免疫ブロット（右）のために回収する前に、細胞をR1881（3nM）およびRORγアンタゴニスト（5μM）またはARアンタゴニスト（ENZ、20μM）で処理した。**p < 0.01、n=3。
【図１９Ａ】AR遺伝子発現に対する、AR-RORE部位のCRISPR/Cas9編集の効果を示す。AR-RORE部位の欠失接合部の配列決定解析。sgRNA-2＋sgRNA-3欠失対立遺伝子由来のPCR産物（図10C）をクローニングし、19個の別々のクローンの配列を決定して、欠失接合部の配列と頻度を決定した。一番上の列は野生型配列を示し、矢印はCas9の予測切断部位を示す。
【図１９Ｂ】AR遺伝子発現に対する、AR-RORE部位のCRISPR/Cas9編集の効果を示す。ビヒクルまたはRORγアンタゴニストで処理した細胞における、AR野生型（WT）および表示したsgRNA欠失対立遺伝子由来の、RT-PCR産物の定量分析。C4-2B細胞はCas9および表示したsgRNAをコードするレンチウイルスに感染させた。2日後、半定量的RT-PCRのために回収する前に、細胞をさらに2日間ビヒクルまたはRORγアンタゴニスト（5μM）で処理した。PCR産物は図10Eに示したようにアガロースゲルにより分離した。実験は3回繰り返した。各実験のDNAバンドのピクセル濃度を定量化し、GAPDHに対して標準化した。
【図１９Ｃ】AR遺伝子発現に対する、AR-RORE部位のCRISPR/Cas9編集の効果を示す。AR発現に対する、個々のsgRNAが媒介するAR遺伝子座の変化の効果。左：表示したsgRNAを発現するレンチウイルスで処理したC4-2B細胞での、ARおよびGAPDHの免疫ブロット。右：上記のように処理したC4-2B細胞における、AR発現のリアルタイムqRT-PCR解析。**p < 0.01、n=3。
【図２０】異なる濃度のRORγアンタゴニストによる、ROR阻害、AR発現阻害、および抗増殖性の相関を示す。図20A：異なる濃度でのSR2211の表示した阻害活性のパーセンテージを示す散布図。結果はSR2211によるRORγ阻害、AR発現阻害、および抗増殖性が密接に相関することを示した。RORγ阻害は図10Fのようにレポーター遺伝子アッセイにより測定した。抗増殖性／細胞生存度は図7BのようにCell-Titer GLOにより測定した。AR発現阻害は、AR免疫ブロットの後に全長ARタンパク質バンドを定量化することにより解析した。図20B：異なる濃度でのSR2211のAR-RORE阻害、AR発現阻害、および抗増殖性の複合図。
【図２１】AR-RORE部位における、ヒストン修飾ならびにSRCおよびpol IIの占有に対する、RORγノックダウンの効果を示す。対照siRNAまたはRORγ siRNAで72時間処理したC4-2B細胞における、AR-ROREでのRORγ、H3K4me2、H3K4me3、H3K27ac、RNAポリメラーゼII（pol II）の相対濃縮のChIP-qPCR解析。**p < 0.01、n=3。
【図２２Ａ】AR発現に対する様々なSRC活性化補助因子阻害の効果、ならびにARプロモーターでのヒストン修飾およびPol II動員に対するSR2211の効果を示す。表示したsiRNA（左）またはブファリンでそれぞれ48時間または24時間処理したC4-2B細胞における、AR発現のqRT-PCR解析。*p < 0.05、**p < 0.01、n=3。
【図２２Ｂ】AR発現に対する様々なSRC活性化補助因子阻害の効果、ならびにARプロモーターでのヒストン修飾およびPol II動員に対するSR2211の効果を示す。左および中央：smart pool siRNA（左；O'Malleyら、Cancer Cell、28:240-252 (2015)参照）、または異なるSRCを標的とする個々のsiRNA（中央）もしくは対照siRNAを、個別にまたは異なる組み合わせで形質移入したC4-2B細胞における、表示したタンパク質の免疫ブロット解析。右：2日間ビヒクルまたは表示した濃度のブファリンで処理したC4-2B細胞の免疫ブロット解析。
【図２２Ｃ】AR発現に対する様々なSRC活性化補助因子阻害の効果、ならびにARプロモーターでのヒストン修飾およびPol II動員に対するSR2211の効果を示す。ビヒクルまたはSR2211（5μM）で24時間処理したC4-2B細胞における、AR遺伝子プロモーターでのH3K4me2、H3K4me3、H3K27ac、Pol II、およびH3による相対占有のChIP-PCR解析。**p < 0.01、n=3。データは平均±s.d.で示す。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。
【図２３】前立腺がん異種移植腫瘍の成長およびマウスの体重に対する、RORγアンタゴニストのインビボでの効果を示す。図23A：VCaP異種移植片の成長に対する、SR2211（5mg/kg、腹腔内、週に5回）またはビヒクル処理の効果（1群につきマウスn=8）。平均腫瘍体積±s.e.m.、平均体重±s.e.m.、および平均腫瘍重量±s.e.m.を示す。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。**p = 2.89E-09、***p = 3.44E-08。図23B：22Rv1異種移植片の成長に対する、XY011（20mg/kg、腹腔内、週に5回）またはビヒクル処理の効果（1群につきマウスn=6）。平均腫瘍体積±s.e.m.、平均体重±s.e.m.、および平均腫瘍重量±s.e.m.を示す。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。**p = 9.99E-08、***p = 4.71E-06。
【図２４】前立腺がんC4-2B異種移植腫瘍の成長およびマウスの体重に対する、RORγ shRNAのインビボでの効果を示す。C4-2B異種移植片の成長に対する、対照shRNAまたはRORγ shRNAの効果（1群につきマウスn=6）。平均腫瘍体積±s.e.m.および平均腫瘍重量±s.e.m.を示す。スチューデントのt検定、**p = 3.14E-08、***p = 3.52E-07。
【図２５】C4-2B前立腺がん同所腫瘍の成長、マウスの体重、および血清PSAレベルに対する、RORγアンタゴニストのインビボでの効果を示す。図25A：ビヒクルまたはSR2211（5mg/kg、腹腔内、週に5回）で処理したSCIDマウスにおいて成長した、同所移植したC4-2B腫瘍の写真。図25B：SR2211（5mg/kg、腹腔内、週に5回）またはビヒクルで処理したマウス由来のC4-2B同所腫瘍の重量（1群につきマウスn=6）。平均腫瘍重量±s.e.m.を示す。スチューデントのt検定、***p = 4.766E-05。図25C：表示した日数で血清PSAレベルを測定することにより、腫瘍成長をモニターした。平均PSAレベル±s.e.m.を示す。スチューデントのt検定、***p = 1.2683E-05。
【図２６】PC-3異種移植腫瘍の成長、マウスの体重、および腫瘍重量に対する、RORγアンタゴニストのインビボでの効果を示す。PC-3異種移植片の成長に対する、SR2211（5mg/kg、腹腔内、週に5回）またはビヒクル処理の効果（1群につきマウスn=6）。平均腫瘍体積±s.e.m.（図26A）、平均体重±s.e.m.（図26B）、および平均腫瘍重量±s.e.m.（図26C）を示す。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。#p = 0.06、##p = 0.07。
【図２７】RORγ阻害はARおよびその変異体の発現を強力に抑制し、インビボでのAR結合を排除することを示す。図27A：図11AのようにビヒクルまたはSR2211で処理した後の、C4-2B異種移植腫瘍におけるAR-RORE部位での相対RORγ占有のChIP解析。腫瘍は24日間処理した後に回収した。各処理において3つの異なる腫瘍をChIPアッセイに用いた。**p < 0.01、n=3。図27B：図27AのようにビヒクルまたはSR2211で処理した後の、C4-2B異種移植腫瘍におけるKLK3のプロモーターおよびエンハンサーARE部位での相対AR占有のChIP解析。*p < 0.05、**p < 0.01、n=3。図27C：図27AのようにビヒクルまたはSR2211で処理した後の、C4-2B異種移植腫瘍におけるARおよびAR標的遺伝子発現のqRT-PCR解析。**p < 0.01、n=3。
【図２８Ａ】異種移植モデルにおける腫瘍転移、マウスの体重、および臓器重量に対する、RORγ阻害のインビボでの効果を示す。ビヒクル、SR2211、ENZ、またはその組み合わせで23日間処理した、図11DのようなVCaP異種移植片を有するマウスを、大腿骨（骨髄）および肝臓への自然転移について評価した。ヒトAlu配列を（Alu-qPCRによって）測定することにより、これらの部位から単離したゲノムDNAを、転移した細胞に関して分析した。
【図２８Ｂ】異種移植モデルにおける腫瘍転移、マウスの体重、および臓器重量に対する、RORγ阻害のインビボでの効果を示す。異なる処理群のマウスの体重。
【図２８Ｃ】異種移植モデルにおける腫瘍転移、マウスの体重、および臓器重量に対する、RORγ阻害のインビボでの効果を示す。図11AのようにビヒクルまたはSR2211で24日間処理した、C4-2B異種移植モデルマウスの表示した組織の重量。有意性はスチューデントのt検定を用いて計算した。*p = 0.01、n=6。
【図２９】正常なマウスの前立腺および精巣に対する、RORγアンタゴニストのインビボでの効果を示す。図29A：ビヒクルまたはSR2211で24日間処理したマウス由来の、精嚢および前立腺ならびに精巣の代表的な画像を示す。図29B：ビヒクルまたはSR2211で処理したマウス由来の前立腺、精巣、および肝臓の代表的なH&E画像。図29C：ビヒクルまたはSR2211で処理したマウス由来の、前立腺および精巣切片の代表的な抗AR IHCの画像。
【図３０】非悪性のヒト前立腺上皮細胞において、RORγアンタゴニストによるAR発現への阻害効果がないことを示す。図30A：表示の処置を行った非悪性のヒト前立腺上皮RWPE1およびPZ-HPV7細胞における、RORγおよびAR発現の免疫ブロット解析。図30B：ROREモチーフに適合する配列および強調表示した逸脱を有する様々な種間での、ARエキソン1の3’末端領域におけるゲノムDNAの比較。注：対応するマウス配列（CTGGATCG）はコンセンサスROREモチーフから2つ逸脱があるため（下線部）、ROREのように機能的ではないと予測される。
【図３１Ａ】表示した濃度のSR2211で4日間処理した様々な乳がん細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３１Ｂ】表示した濃度のGSK805で4日間処理した様々な乳がん細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３１Ｃ】表示した濃度のGSK9Bで4日間処理した様々な乳がん細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３１Ｄ】SR2211およびGSK805はMCF-7 TamR細胞をタモキシフェン（TAM）誘導性細胞増殖阻害に対して感受性にした。
【図３１Ｅ】表示した濃度のSR2211、GSK805、およびGSK9bで4日間処理したMCF-7 C6放射線抵抗性細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３１Ｆ】4日間処理した表示の細胞株における、SR2211、GSK805、GSK9b、およびGNE3500の最大半量阻害濃度（IC50）。
【図３２Ａ】表示した濃度のSR2211で4日間処理した様々な肺がん細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３２Ｂ】表示した濃度のGSK805で4日間処理した様々な肺がん細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３２Ｃ】4日間処理した表示の肺がん細胞株における、SR2211およびGSK805の最大半量阻害濃度（IC50）。
【図３２Ｄ】肺がんA549異種移植片の成長に対する、表示した処置（SR2211、腹腔内に5mg/kg、週に5回；またはビヒクル）の効果（1群につきマウスn=6）。処置はA549腫瘍が約100mm3に達した時点で開始した。平均腫瘍体積±s.e.m.、平均腫瘍重量±s.e.m.、および代表的な腫瘍の画像を示す。P < 0.01。
【図３３Ａ】表示した濃度のSR2211、GSK9b、およびGSK805で4日間処理したOVCAR420卵巣がん細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３３Ｂ】表示した濃度のSR2211、GSK9b、およびGSK805で4日間処理したT24膀胱がん細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３３Ｃ】表示した濃度のSR2211、GSK9b、およびGSK805で4日間処理したECC1子宮内膜細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３３Ｄ】表示した濃度のSR2211、GSK9b、およびGSK805で4日間処理したHepG2およびHep3B肺がん細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３３Ｅ】表示した濃度のSR2211、GSK9b、およびGSK805で4日間処理したT98G神経膠芽腫細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３３Ｆ】表示した濃度のSR2211、GSK9b、およびGSK805で4日間処理したSUDHL4およびSUDHL6白血病細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３３Ｇ】表示した濃度のSR2211、GSK9b、およびGSK805で4日間処理したHCT116大腸がん細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３３Ｈ】SR2211およびGSK805で4日間処理した、C4-2Bドセタキセル抵抗性細胞の、Cell-Titer GLOで測定した細胞生存度。
【図３３Ｉ】4日間処理した表示の細胞株における、SR2211、GSK9b、およびGSK805の最大半量阻害濃度（IC50）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な記載
I. 導入
本開示は、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ（RORγまたはRORガンマ）として知られる核内受容体の阻害剤に関する。本発明の一態様において、驚くことに、RORγ阻害剤ががんの治療に役立つことが見出された。特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、異なるクラスの抗がん剤に対するがん細胞抵抗性を逆転するかもしくは減少させ、かつ／または薬剤抵抗性がん細胞をこのような抗がん剤に対して感受性にすることができることも見出された。抗がん剤の治療効果を増強するためにRORγ阻害剤と組み合わせて投与することができる抗がん剤の非限定的な例は、抗アンドロゲン薬（たとえば、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン等）、化学療法剤（たとえば、タモキシフェン、および／またはタキサン、たとえばドセタキセル）、およびこれらの組み合わせを含む。
【００３６】
RORγ阻害剤は、RORγ転写、翻訳、安定性、および／または活性を阻害する化合物を含む。RORγ活性の阻害は、アンドロゲン受容体（AR）ROR応答エレメント（RORE）へのSRC-1および／またはSRC-3などのコアクチベーターの動員の阻害を含み得る。特定の実施形態において、RORγ活性の阻害は、AR遺伝子および／またはその変異体、たとえば、AR-V7の転写の阻害を含み得る。
【００３７】
本明細書に記載されるように、本発明者らは、RORγの低分子阻害剤または遺伝子サイレンシングが、転移性去勢抵抗性前立腺がん（mCRPC）型前立腺がん（PCa）細胞および異種移植腫瘍の成長を強力に阻害し、顕著な細胞死を誘導することを見出した。ヒトPCa腫瘍の主要な割合がRORγタンパク質を過剰発現することも見出された。機構的に、RORγの1つの主要な標的がアンドロゲン受容体（AR）であることが見出され、ARの発現および機能は、RORγ特異的低分子およびsiRNAサイレンシングにより強力に阻害される。ARタンパク質は、mCRPCを含むPCaの腫瘍において異常に過剰発現され、中心的役割を果たす。本発明者らは、RORγの低分子阻害剤が、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、および多形性神経膠芽腫を含む、多数の他のがんタイプのがん細胞の増殖および生存を強力に阻害することも見出した。
【００３８】
特に、下記の例は、本発明の以下の典型的な新規の特徴および利点を示す。
1. 転写因子の核内受容体ファミリータイプのメンバーであるRORγタンパク質は、いずれのタイプのヒトがんにおいても直接的な機能を果たすことがこれまで全く暗示されていなかった。それゆえ、ヒトがんにおけるその機能および発現はほとんど完全に未知である。
2. RORγの阻害性低分子（RORαのそれではない）またはRORγ遺伝子サイレンシングsiRNAは、PCa細胞または腫瘍の阻害において作用機序（MOA）を有し、それは、病院で使用されたり（たとえば、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラトエロン）または開発されている（たとえば、ARN509、EPI-001、ASC-J9、ニクロサミド）現在のPCa治療とは極めて異なる。
3. 前臨床PCaモデルにおいて証明された潜在的な治療価値を有する低分子は、直接的な標的、すなわち、PCa腫瘍細胞において規定されるRORγタンパク質を有する。対照的に、PCaモデルの腫瘍阻害を示すASC-J9またはニクロサミドなどの他の低分子は、十分に規定されたタンパク質または他の細胞標的を有さない。
4. 1つのタンパク質標的、すなわち、RORγを標的にすることにより、2つの最も重要なPCa腫瘍駆動経路が強く阻害される。1つの経路は、AR遺伝子／タンパク質自体である。実施例に記載される発見は、RORγが、同じがん細胞においてAR遺伝子転写を直接的に活性化すること、および、RORγ阻害剤が、AR発現を強力に抑制することを示す。もう1つの経路は、腫瘍アンドロゲン生合成経路であり、多数の重要なアンドロゲン合成酵素遺伝子がRORγ阻害剤により阻害される。
5. 腫瘍細胞においてRORγを標的にすることは、進行PCaの問題、すなわち、PCa腫瘍細胞におけるAR（すなわち、全長ARおよびスプライシングしたAR変異体の両方）の異常な発現の、根底にある原因を実際に標的にする。多数の臨床および前臨床の研究は、異常なARが、PCaの進行および治療抵抗性の主要な推進力であることを示す。
6. RORγの様々な低分子阻害剤は、化学療法剤、放射線、およびタモキシフェンなどの標的療法を含む様々な治療に対して抵抗性である多数のがんタイプからのヒトがん細胞の増殖および生存を強力に阻害するのに有効である。RORγ阻害剤は、抵抗性のがん細胞を、タモキシフェンなどの治療剤に対して感受性にすることもできる。
7. RORγの低分子阻害剤は、異種移植肺がんモデルの腫瘍成長を強力に阻害する。
【００３９】
II. 定義
本願明細書および添付の特許請求の範囲に用いる場合、「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、他に文脈に明示しない限り、複数形の言及を含む。
【００４０】
用語「RORγ」は、RORC（RAR関連オーファン受容体C）遺伝子によりコードされる、いずれか一方または両方のアイソフォーム、すなわち、RORγ（RORγ1またはRORC1ともいう）およびRORγt（RORγ2またはRORC2としても知られる）をいう。
【００４１】
用語「対象」、「患者」、または「個体」は、本明細書において交換可能に用いられ、ヒトまたは動物を含む。たとえば、動物対象は、哺乳動物、霊長類（たとえば、サル）、家畜動物（たとえば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、またはヤギ）、コンパニオンアニマル（たとえば、イヌ、ネコ）、研究試験動物（たとえば、マウス、ラット、モルモット、トリ）、獣医学的に重要な動物、または経済的に重要な動物であり得る。
【００４２】
本明細書に用いる場合、「有効量」は、示される障害、状態、または精神的状態に関して所望の結果をもたらすのに十分な投与量を含む。所望の結果は、当該投与量のレシピエントにおける主観的または客観的な改善を含み得る。1つの非限定的な例において、有効量のRORγ阻害剤は、がん、たとえば、前立腺がん、たとえば、CRPCの、兆候、症状、または原因を緩和するのに十分な量を含む。これにより、有効量は、腫瘍成長を遅くし、もしくは逆転し、平均生存期間を増加させ、腫瘍進行もしくは転移を阻害し、または抵抗性になったかもしくは抵抗性である抗がん剤に対してがん細胞を感受性にする量であり得る。また、第2の非限定的な例において、有効量のRORγ阻害剤は、がんを有する対象に投与した場合に、対象において実質的な改善を引き起こすのに十分な量を含む。その量は、治療するがんのタイプ、がんの進行の段階、適用する組成物のタイプおよび濃度、ならびに対象に同じく投与される抗がん剤（たとえば、抗アンドロゲン薬）の量により変化するであろう。第3の非限定的な例において、有効量のRORγ阻害剤は、抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬（たとえば、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン等）、および／または化学療法剤（たとえば、タモキシフェンおよび／またはタキサン、たとえば、ドセタキセル）の治療活性を増強するのに有効である量を含む。
【００４３】
本明細書に用いる場合、用語「治療」は、これらに限定されないが、レシピエントの健康状態、たとえば、患者のがんの状態において有益な変化をもたらす方法および操作を含む。その変化は、主観的または客観的のいずれかであり得、治療するがんの症状または兆候などの特徴に関連し得る。たとえば、患者が痛みの減少に気づくなら、痛みの治療は成功している。たとえば、腫れの減少が起きたなら、炎症の治療は有益に行われている。同様に、医師が、客観的な変化、たとえば、がん細胞の数、がん細胞の増殖、がん腫瘍のサイズ、または別の抗がん剤に対するがん細胞の抵抗性の低減に気づくなら、がんの治療は有益である。レシピエントの状態の悪化を防ぐことも、この用語に含まれる。本明細書に用いる場合、治療は、RORγ阻害剤を単独で、または抗がん剤と組み合わせて、がんを有する対象に投与することも含む。特定の例において、がんは、前立腺がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、または多形性神経膠芽腫である。
【００４４】
本明細書に用いる場合、用語「投与」は、所定量の本明細書に記載の化合物、たとえば、1または複数のRORγ阻害剤を患者に提供することに関連する活動を含む。投与は、本明細書に記載の組成物の単位投与量を、それを必要とする患者に与えることを含む。投与は、有効量の化合物、たとえば、RORγ阻害剤を、特定の期間、たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、またはこれを超える日数の間、特定の順番で、たとえば、1または複数のRORγ阻害剤の投与の後に1または複数の抗がん剤の投与、またはその逆で、提供することを含む。
【００４５】
本明細書に用いる場合、用語「同時投与」は、2つ以上の構造的に異なる化合物を、逐次的または同時に投与することを含む。たとえば、2つ以上の構造的に異なる薬学的に活性な化合物は、2つ以上の構造的に異なる薬学的に活性な化合物を含む経口投与に適合した薬学的組成物を投与することにより、同時投与することができる。別の例として、2つ以上の構造的に異なる化合物は、1つの化合物を投与し、次に他の化合物を投与することにより、同時投与することができる。特定の例において、同時投与される化合物は、同じ経路により投与される。他の例において、同時投与される化合物は、異なる経路により投与される。たとえば、1つの化合物は、経口的に投与することができ、他の化合物は、たとえば、逐次的または同時に、静脈内または腹腔内注入により、投与することができる。
【００４６】
本明細書に用いる場合、用語「がん」は、固形がん、リンパ腫、および白血病を含む。様々なタイプのがんの例は、これらに限らないが、前立腺がん、肺がん（たとえば、非小細胞肺がんまたはNSCLC）、卵巣がん、結腸直腸がん、肝臓がん（すなわち、肝細胞がん）、腎臓がん（すなわち、腎細胞がん）、膀胱がん、乳がん、甲状腺がん、胸膜がん、膵臓がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、肛門がん、胆管がん、胃腸カルチノイド腫瘍、食道がん、胆嚢がん、虫垂がん、小腸がん、胃がん、中枢神経系のがん、皮膚がん、絨毛がん、頭頸部がん、血液がん、子宮内膜がん、骨原性肉腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、黒色腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、単球性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、および多発性骨髄腫を含む。特定の例において、がんは転移性であり得る、特定の例において、がんは、前立腺がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、または神経膠腫、たとえば、多形性神経膠芽腫である。他の例において、がんは、抗がん剤に対して抵抗性であり得、たとえば、抗アンドロゲン抵抗性がん、タキサン抵抗性がん（たとえば、ドセタキセル抵抗性がん）、タモキシフェン抵抗性がん、放射線抵抗性がん、またはチロシンキナーゼ阻害抵抗性がんであり得る。
【００４７】
本明細書に用いる場合、用語「前立腺がん」または「前立腺がん細胞」は、前立腺組織に存在するがん細胞をいう。前立腺がんは、良性、悪性、または転移性であり得る。前立腺がんは、アンドロゲン非感受性、ホルモン抵抗性、または去勢抵抗性であり得る。前立腺がんは、「進行期前立腺がん」または「進行前立腺がん」であり得る。進行期前立腺がんは、その疾患の早期段階を超えて進行している前立腺がんのクラスを含む。典型的には、進行段階前立腺がんは、不良な予後に関連する。進行期前立腺がんのタイプは、これらに限らないが、転移性前立腺がん、薬剤抵抗性前立腺がん、たとえば、抗アンドロゲン抵抗性前立腺がん（たとえば、エンザルタミド抵抗性前立腺がん、アビラテロン抵抗性前立腺がん、ビカルタミド抵抗性前立腺がん等）、タキサン抵抗性前立腺がん（たとえば、ドセタキセル抵抗性前立腺がん）等、ホルモン抵抗性前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん（CRPC）、転移性去勢抵抗性前立腺がん、AR-V7誘導性薬剤抵抗性前立腺がん、たとえば、AR-V7誘導性抗アンドロゲン抵抗性前立腺がん（たとえば、AR-V7誘導性エンザルタミド抵抗性前立腺がん）、AKR1C3誘導性薬剤抵抗性前立腺がん、たとえば、AKR1C3誘導性抗アンドロゲン抵抗性前立腺がん（たとえば、AKR1C3誘導性エンザルタミド抵抗性前立腺がん）、およびこれらの組み合わせを含む。特定の例において、進行期前立腺がんは、以下の慣用的な前立腺がん療法：エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびドセタキセル、のうちの1つまたは複数での治療に対して、全般的に応答しないか、または抵抗性である。本明細書に開示される進行期前立腺がんのタイプの1つまたは複数（たとえば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ超）を含む進行期前立腺がんなどの前立腺がんを治療するために、本発明の化合物、組成物、および方法が供される。
【００４８】
本明細書に用いる場合、「治療効果を増強する」との表現は、本明細書において議論されるような、有益な応答または治療される状態の改善を示す複数の主観的または客観的因子のうちのいずれかを含む。たとえば、抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬（たとえば、エンザルタミド、アビラテロン、またはビカルタミド）、または化学療法剤、たとえば、タモキシフェン、またはタキサン（たとえばドセタキセル）の治療効果を増強することは、がん細胞抵抗性を逆転するもしくは減少させること、かつ／または薬剤抵抗性がんを抗がん剤治療に対して感受性にすることを含む。また、たとえば、抗がん剤の治療効果を増強することは、薬剤抵抗性がん細胞を、抗がん剤に対して抵抗性でなくなるように変化させることを含む。また、たとえば、抗がん剤の治療効果を増強することは、付加的または相乗作用的に、抗がん剤の活性を改善または増加させることを含む。特定の実施形態において、増強は、がんを治療するのに用いる抗がん剤の治療活性における1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、または1000倍の増加を含む。
【００４９】
本明細書に用いる場合、「がん細胞抵抗性を逆転する」という表現は、抗がん剤治療に対して抵抗性であるがん細胞を、抗がん剤治療に対してもはや抵抗性でなくなるように変化させるかまたは改変することを含む。
【００５０】
本明細書に用いる場合、「がん細胞抵抗性を減少させる」という表現は、抗がん剤治療に対して抵抗性である、または以前にそうであったがん細胞に対する抗がん剤の治療活性を増加させることを含む。
【００５１】
本明細書に用いる場合、「がん細胞抵抗性を感受性にする」という表現は、抗がん剤治療に対して抵抗性であるがん細胞において、抗がん剤治療に対する感受性を誘導することを含む。本明細書に用いる「感受性にする」とは、がん細胞を抗がん剤で有効に治療できるように誘導することを含む。「感受性にする」は、抗がん剤により有益な効果を達成するために必要な投与量を減少させることも含む。
【００５２】
本明細書に用いる場合、「抗アンドロゲン薬」という表現は、アンドロゲン受容体をブロックし、細胞の表面上の結合部位について競合し、またはアンドロゲン生産に作用するかもしくはそれを仲介することにより、アンドロゲン経路を変化させる、抗アンドロゲン化合物を含む。抗アンドロゲン薬は、これに限らないが、前立腺がんを含む、いくつかの疾患を治療するために役立つ。抗アンドロゲン薬は、これらに限らないが、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせを含む。
【００５３】
本明細書に用いる場合、用語「アンドロゲン受容体」または「AR」は、細胞質内で雄性ホルモンテストステロンまたはジヒドロテストステロンに結合し、核に移動する核内受容体を含む。ARは、とりわけ、標的遺伝子のプロモーターにおいてアンドロゲン応答要素（ARE）に結合することにより、標的遺伝子の転写を調節する。
【００５４】
本明細書において、用語「AR変異体」は、全長ARのスプライスバリアントを含む。種々のARバリアントが既知である。Guo et al., Cancer Res., 69(6):2305-13 (2009)を参照。典型的なARバリアントは、これに限らないが、機能的なリガンド結合ドメイン（LBD）を欠如するバリアントを含む。LBDを欠如するARバリアントの例は、AR-V7である。「AR-V7」は、機能的なリガンド結合ドメイン（LBD）を欠如するARの構成的に活性なバリアントであるアンドロゲン受容体スプライスバリアント7を含む。たとえば、Hu et al., Cancer Research, 69(1):16-22 (2009)を参照。
【００５５】
「薬学的に許容可能」または「治療的に許容可能」は、活性成分の有効性または生物学的活性を妨害せず、かつ、用いる量においてホストに対して毒性でない物質を含む。ここで、ホストは、投与を受けるヒトまたは動物のいずれかであり得る。
【００５６】
「アルキル」は、示される数の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の飽和脂肪族基をいう。アルキルは、任意の数の炭素、たとえば、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6 および C5-6を含み得る。たとえば、C1-6アルキルは、これらに限らないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等を含む。アルキルは、20までの炭素原子を有するアルキル基、たとえば、これらに限らないが、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等も示し得る。アルキル基は、置換されても非置換でもよい。
【００５７】
「アルキレン」は、示される数の炭素原子を有し、かつ、少なくとも2つの他の基に結合する直鎖または分枝鎖の飽和脂肪族基、すなわち、二価炭化水素基をいう。アルキレンに結合する2つの成分は、そのアルキレン基の同じ原子または異なる原子に結合することができる。たとえば、直鎖アルキレンは、-(CH2)n-（式中、nは1、2、3、4、5、または6である）の二価基であり得る。代表的なアルキレンは、これらに限らないが、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、sec-ブチレン、ペンチレン、およびヘキシレンを含む。アルキレン基は、置換されても非置換でもよい。
【００５８】
「アルケニル」は、少なくとも2つの炭素原子および少なくとも1つの二重結合を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素をいう。アルケニルは、任意の数の炭素原子、たとえば、C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6、およびC6を含み得る。アルケニル基は、任意の適切な数、たとえばこれらに限らないが、1、2、3、4、5つ、またはそれ超の二重結合を有し得る。アルケニル基の例は、これらに限らないが、ビニル(エチル)、プロペニル、イソプロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、イソペンテニル、1,3-ペンタジエニル、1,4-ペンタジエニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、1,3-ヘキサジエニル、1,4-ヘキサジエニル、1,5-ヘキサジエニル、2,4-ヘキサジエニル、または 1,3,5-ヘキサトリエニルを含む。アルケニル基は、置換されても非置換でもよい。
【００５９】
「ヘテロアルキル」は、任意の適切な長さの、1〜3つのヘテロ原子、たとえば、N、O および Sを有するアルキル基をいう。付加的なヘテロ原子は、これらに限らないが、B、Al、Si および Pを含み、有用であり得る。ヘテロ原子は、酸化されてもよく、たとえば、これらに限らないが、-S(O)- および -S(O)2- でもあり得る。たとえば、ヘテロアルキルは、エーテル、チオエーテル、およびアルキル−アミンを含み得る。ヘテロアルキルのヘテロ原子部分は、アルキル基の水素原子を置き換えて、ヒドロキシ、チオ、またはアミノ基を形成し得る。あるいは、ヘテロ原子部分は、接続原子であっても、または、2つの炭素原子の間に挿入されてもよい。
【００６０】
「ハロアルキル」は、水素原子のいくつかまたはすべてがハロゲン原子で置換されているアルキル基をいう。アルキル基と同様に、ハロアルキル基は、任意の適切な数の炭素原子、たとえば、C1-6を有し得る。たとえば、ハロアルキルは、トリフルオロメチル、フルオロメチル等を含む。特定の例において、用語「ペルフルオロ」は、すべての水素がフッ素で置換されている化合物または基を規定するのに用いることができる。たとえば、ペルフルオロメチルは、1,1,1-トリフルオロメチルをいう。
【００６１】
「アルコキシ」は、連結点にアルキル基を接続する酸素原子を有するアルキル基をいう（アルキル-O-）。アルキル基と同様に、アルコキシ基は、任意の適切な数の炭素原子、たとえば、C1-6を有し得る。アルコキシ基は、たとえば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、iso-プロポキシ、ブトキシ、2-ブトキシ、iso-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ等を含む。アルコキシ基は、本明細書に記載される種々の置換基でさらに置換され得る。アルコキシ基は、置換されても非置換であってもよい。
【００６２】
「アリール」は、任意の適切な数の環原子および任意の適切な数の環を有する芳香族環系をいう。アリール基は、任意の適切な数の環原子、たとえば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 または 16個の環原子、および6〜10、6〜12、または6〜14個の環メンバーを含み得る。アリール基は、単環でも、融合して二環もしくは三環基でも、または結合により連結してビアリール基を形成してもよい。代表的なアリール基は、フェニル、ナフチル、およびビフェニルを含む。他のアリール基は、メチレン連結基を有するベンジルを含む。特定のアリール基は、6〜12個の環メンバーを有し、たとえば、フェニル、ナフチル、またはビフェニルである。他のアリール基は、6〜10個の環メンバーを有し、たとえば、フェニルまたはナフチルである。特定の他のアリール基は、6個の環メンバーを有し、たとえば、フェニルである。アリール基は、置換されても非置換であってもよい。
【００６３】
「ヘテロアリール」は、環原子の1〜5つがヘテロ原子、たとえば、N、O または Sである、5〜16個の環原子を含む、単環、または融合した二環もしくは三環の芳香族環アセンブリをいう。付加的なヘテロ原子は、これらに限らないが、B、Al、Si および Pを含み、有用であり得る。ヘテロ原子は、酸化されてもよく、たとえば、これらに限らないが、-S(O)- および -S(O)2-でもあり得る。ヘテロアリール基は、任意の数の環原子、たとえば、3〜6、4〜6、5〜6、3〜8、4〜8、5〜8、6〜8、3〜9、3〜10、3〜11、または3〜12個の環メンバーを含み得る。任意の適切な数のヘテロ原子を、ヘテロアリールに含めることができ、たとえば、1、2、3、4、もしくは 5個、または 1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、2〜3、2〜4、2〜5、3〜4、もしくは3〜5個である。ヘテロアリール基は、5〜8個の環メンバーおよび1〜4個のヘテロ原子、または5〜8個の環メンバーおよび1〜3個のヘテロ原子、または5〜6個の環メンバーおよび1〜4個のヘテロ原子、または5〜6個の環メンバーおよび1〜3個のヘテロ原子を有し得る。ヘテロアリール基は、ピロール、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾ−ル、テトラゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアジン (1,2,3-、1,2,4- および 1,3,5-異性体)、チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、およびイソキサゾールなどの基を含み得る。ヘテロアリール基は、芳香族環系、たとえばフェニル環と融合して、これらに限らないが、ベンゾピロール、たとえば、インドールおよびイソインドール、ベンゾピリジン、たとえば、キノリンおよびイソキノリン、ベンゾピラジン (キノキサリン)、ベンゾピリミジン (キナゾリン)、ベンゾピリダジン、たとえば、フタラジンおよびシンノリン、ベンゾチオフェン、およびベンゾフランを含むメンバーを形成することもできる。他のヘテロアリール基は、結合により連結したヘテロ環を含み、たとえば、ビピリジンである。ヘテロアリール基は、置換されても非置換であってもよい。
【００６４】
「シクロアルキル」は、3〜12個の環原子、または示される数の原子を含む、飽和した、または部分的に不飽和の、単環、融合した二環、または架橋された多環のアセンブリをいう。シクロアルキルは、任意の数の炭素、たとえば、C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11、および C3-12を含み得る。飽和単環式シクロアルキル環は、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチルを含む。飽和二環式および多環式シクロアルキルは、たとえば、ノルボルナン、[2.2.2] ビシクロオクタン、デカヒドロナフタレン、およびアダマンタンを含む。シクロアルキル基は、環内に1つまたは複数の二重または三重結合を有する、部分的に不飽和のものであってもよい。部分的に不飽和である代表的なシクロアルキル基は、これらに限らないが、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン、(1,3- および 1,4-異性体)、シクロヘプテン、シクロヘプジエン、シクロオクテン、シクロオクタジエン (1,3-、1,4- および 1,5-異性体)、ノルボルネン、およびノルボルナジエンを含む。シクロアルキルが飽和単環式C3-8シクロアルキルである場合、典型的な基は、これらに限らないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルを含む。 シクロアルキルが飽和単環式C3-6シクロアルキルである場合、典型的な基は、これらに限らないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルを含む。シクロアルキルは、置換されても非置換であってもよい。
【００６５】
「ヘテロシクロアルキル」は、3〜13個の環メンバー、およびN、O および Sの1〜4個のヘテロ原子を有する、飽和した、または部分的に不飽和の環系をいう。ヘテロシクロアルキル基は、融合した二または三環系を含み得、1つまたは複数の不飽和点を含み得る。付加的なヘテロ原子は、これらに限らないが、B、Al、Si および Pを含み、有用であり得る。ヘテロ原子は酸化されてもよく、たとえば、これらに限らないが、 -S(O)- および -S(O)2-であり得る。ヘテロシクロアルキル基は、任意の数の環原子、たとえば、3〜6、4〜6、5〜6、3〜8、4〜8、5〜8、6〜8、3〜9、3〜10、3〜11、3〜12、または3〜13個の環メンバーを含み得る。任意の適切な数、たとえば、1、2、3、もしくは 4個、または 1〜2、1〜3、1〜4、2〜3、2〜4、もしくは3〜4個のヘテロ原子をヘテロシクロアルキル基に含めることができる。ヘテロシクロアルキル基は、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、アゾカン、キヌクリジン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、ピペラジン、 (1,2-、1,3- および 1,4-異性体)、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロフラン、オキサン (テトラヒドロピラン)、オキセパン、チイラン、チエタン、チオラン (テトラヒドロチオフェン)、チアン (テトラヒドロチオピラン)、オキサゾリジン、イソキサゾキジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ジオキソラン、ジチオラン、またはモルホリンなどの基を含み得る。ヘテロシクロアルキル基は、芳香族環または非芳香族環系に融合して、これに限らないが、インドリンを含むメンバーを形成することもできる。ヘテロシクロアルキル基は、不飽和であっても飽和であってもよい。たとえば、ヘテロシクロアルキル基は、とりわけ、C1-6アルキル、オキソ (=O)、またはアリールで置換することができる。
【００６６】
ヘテロシクロアルキル基は、環上の任意の位置で連結させることができる。たとえば、ピペリジンは、1-、2-、3- または 4-ピペリジンであり得、ピラゾリジンは、1-、2-、3- または 4-ピラゾリジンであり得、イミダゾリジンは、1-、2-、3- または 4-イミダゾリジンであり得、ピペラジンは、1-、2-、3- または 4-ピペラジンであり得、そしてモルホリンは、1-、2-、3- または 4-モルホリンであり得る。
【００６７】
III. 実施形態の説明
本発明は、1または複数のRORγ阻害剤を、単独で、または1または複数の抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬と組み合わせて含む、組成物、方法、およびキットを提供する。これらは、がん、たとえば、去勢抵抗性前立腺がん（CRPC）などの前立腺がん、ならびに、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、および神経膠腫などの多数の他のタイプのがんを治療するために有用である。
【００６８】
A. RORγ阻害剤
RORγ阻害剤（すなわち、RORγアンタゴニスト）は、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ（RORγ）の転写、翻訳、安定性、および／または活性を阻害する化合物を含む。特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、RORγに選択的に結合し、その受容体の活性を阻害する。他の実施形態において、RORγ阻害剤は、RORγに選択的に結合し、RORαおよび／またはRORβと比べてRORγ活性を阻害する。特定の実施形態において、RORγ活性の阻害は、アンドロゲン受容体（AR）ROR応答エレメント（RORE）へのSRC-1および／またはSRC-3などのコアクチベーターの動員の阻害を含み得る。他の例において、RORγ活性の阻害は、AR遺伝子および／またはその変異体、たとえば、AR-V7の転写の阻害を含み得る。
【００６９】
特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、RORγに結合し、その活性を、リガンド非存在下の構成的（固有のまたは基底の）活性より低いレベルまで減少させるインバースアゴニストを含む。特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、その薬学的に許容可能な塩、誘導体、アナログ、異性体、ラセミ体、プロドラッグ、共結晶性複合体、水和物、および溶媒和物を含む。
【００７０】
特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、低分子化合物である。特定の例において、RORγ阻害剤は、天然または合成のいずれかの小有機分子であり、それは、約50ダルトン超かつ約2500ダルトン未満、たとえば、約100〜約2000ダルトン、約100〜約1000ダルトン、約200〜約1000ダルトン、または約200〜約500ダルトンの分子量を有する。
【００７１】
特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、約100 nM〜約100 μM、たとえば、約100 nM〜約50 μM、約100 nM〜約25 μM、約100 nM〜約10 μM、約500 nM〜約100 μM、約500 nM〜約50 μM、約500 nM〜約25 μM、約500nM〜約10 μM、約1 μM〜約100 μM、約1 μM〜約50 μM、約1 μM〜約25 μM、約1 μM〜約10 μM、または約100 nM、200 nM、300 nM、400 nM、500 nM、600 nM、700 nM、800 nM、900 nM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、もしくは10 μMの最大半量阻害濃度(IC50)値を有する。特定の例において、特定のRORγ阻害剤についてのIC50値は、RORγ阻害剤とともにインキュベートされたがん細胞におけるインビトロアッセイを用いて測定される。IC50値は、がん細胞株または原発性腫瘍細胞からの細胞などのがん細胞の生存を阻害することにおけるRORγ阻害剤の効果に基づいて測定することができる。他の実施形態において、RORγ阻害剤は、IC50値と本質的に同じ数値であるかまたはIC50値の値の約半分である阻害定数(Ki)を有する。
【００７２】
RORγ阻害剤の非限定的な例は、これらに限らないが、表1に開示される低分子化合物を含む。
【００７３】
（表１）典型的なRORγ阻害剤
2018513123.tif 000003
2018513123.tif 000004
2018513123.tif 000005
【００７４】
RORγ阻害剤のさらなる例は、これらに限らないが、2-オキソ-1,2-ジヒドロベンゾ[cd]インドール-6-スルホンアミド誘導体、たとえば、その内容がすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるZhang et al., Eur. J. Med. Chem., 6;78:431-41 (2014)に記載されるこれら化合物などの誘導体を含む。
【００７５】
特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、式Iにより示される化合物を含む：
2018513123.tif 000006
式中、
R1は、H、C1-8アルキル、C2-8アルケニル、-C(O)Ra、-C(O)NHRa、C1-8ヘテロアルキル、C1-8アルキレンC(O)Ra、および C1-8アルキレンC(O)NHRaからなる群より選択され、
それぞれのRaは、H、C1-8アルキル、C2-5アルケニル、アルコキシ、-OH、および -SHからなる群より独立して選択され、
R2は、H、C1-8アルキル、-C(O)Rb、-C(O)NHRb、C1-8アルキレンC(O)Rb、および C1-8アルキレンC(O)NHRbからなる群より選択され、
Rbは、H、C1-5アルキル、アルコキシ、-OH、-SH、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択され、ここで、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基は、任意に、1〜3個の Rc 置換基で置換することができ、
それぞれのRcは、C1-8アルキル、C1-8ハロアルキル、C1-8ヘテロアルキル、-OH、-SH、-NHRa、-C(O)Ra、-C(O)NHRa、C1-8ヘテロアルキル、C1-8アルキレンC(O)Ra、および C1-8アルキレンC(O)NHRaからなる群より独立して選択され、
R3は、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、C1-8アルキレンシクロアルキル、C1-8アルキレンヘテロシクロアルキル、C1-8アルキレンアリール、C1-8アルキレンヘテロアリールからなる群より選択され、ここで、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール基は、任意に、1〜5個のRd置換基で置換することができ、
それぞれのRdは、ハロ、C1-8アルキル、アルコキシ、C1-8ハロアルキル、C1-8ヘテロアルキル、オキソ、チオキソ、アリール、ヘテロアリール、-ORe、-SRe、-NHRe、-C(O)Re、-C(O)NHRe、-NHC(O)Re、ジアゼニル-Re、C1-3アルキレンアリール、C1-3アルキレンヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
それぞれのReは、H、C1-8アルキル、C2-5アルケニル、アルコキシ、-OH、-SH、アリール、およびヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここで、アリール、およびヘテロアリールは、任意に、1〜3個のRa 置換基で置換することができる。
【００７６】
特定の実施形態において、R1は、HおよびC1-3 アルキルからなる群より選択される。
【００７７】
特定の実施形態において、R2は、HおよびC(O)Rbからなる群より選択され、ここで、Rbは、任意に置換されたヘテロアリールである。
【００７８】
特定の実施形態において、R3は、表2に示される置換基からなる群より選択される。
【００７９】
（表２）R3の典型的な置換基
2018513123.tif 000007
*波線は、分子の残りへの結合点を示す。
【００８０】
特定の実施形態において、変動可能な基R1、R2、および R3 は、その内容がすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公報第WO 2015/096771号において定義される通りである。
【００８１】
特定の実施形態において、式Iの化合物は、N-(3’,4’-ジメトキシフェニル)-1-エチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロベンゾ[cd]インドール-6-スルホンアミド (XY011、E11、および 8kとしても知られる)を含む。他の実施形態において、式Iの化合物は、(E)-1-エチル-2-オキソ-N-(4’-(フェニルジアゼニル)フェニル)-1,2-ジヒドロベンゾ[cd]インドール-6-スルホンアミド (7kとしても知られる)を含む。他の実施形態において、式Iの化合物は、1-エチル-N-(イソキノリン-7’-イル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロベンゾ[cd]インドール-6-スルホンアミド (6fとしても知られる)を含む。その内容がすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるZhang et al., Eur. J. Med. Chem., 6;78:431-41 (2014)を参照。
【００８２】
特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、その内容がすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公報第WO 2014/179564号に記載されるチアゾロピロリジン阻害剤 (たとえば、5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[3,4-d]チアゾール・コアを含む化合物)を含む。他の実施形態において、RORγ阻害剤は、その内容がすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公報第WO 2015/116904号に記載されるジヒドロピロロピリジン阻害剤 (たとえば、6,7-ジヒドロ-5H-ピロロ[3,4-b]ピリジン・コアを含む化合物)を含む。特定の実施形態において、ジヒドロピロロピリジン阻害剤はVTP-43742である。その内容がすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるGege, Expert Opinion on Therapeutic Patents, DOI: 10.1517/13543776.2016.1153066 (2016)を参照。
【００８３】
特定の実施形態において、RORγ阻害剤は、その内容がすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公報第WO 2015/008234号に記載される二環式ヘテロ環式阻害剤 (たとえば、チエノ[3,2-b]ピロールまたはチエノ[3,2-c]ピラゾール・コアを含む化合物)を含む。その内容がすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるGege, Expert Opinion on Therapeutic Patents, 25:10, 1215-1221, DOI: 10.1517/13543776.2015.1065816 (2015)を参照。
【００８４】
RORγ阻害剤のさらなる例は、これらに限らないが、国際特許公報WO 2013/171729に記載されるアリールおよびヘテロアリールアミド化合物、国際特許公報WO 2014/028589に記載される4-ヘテロアリール置換安息香酸化合物、国際特許公報WO 2014/028591に記載されるN-アルキル化インドールおよびインダゾール化合物、国際特許公報WO 2014/028597に記載される3-シクロヘキセニルおよびシクロヘキシル置換インドールおよびインダゾール化合物、国際特許公報WO 2014/028600に記載される3-アミノシクロアルキル化合物、国際特許公報WO 2015/036411に記載されるケト-イミダゾピリジン誘導体、国際特許公報WO 2015/083130に記載される融合ピリジンおよびピリミジン誘導体、国際特許公報WO 2015/101928に記載される融合チオフェンおよびチアゾール誘導体、国際特許公報WO 2012/100734、WO 2012/106995、WO 2013/160418、WO 2015/061515、WO 2015/082533、および WO 2013/019682に記載される化合物、Fauber et al., J. Med. Chem., 58(13):5308-22 (2015)に記載される δ-スルタム化合物、ならびにWang et al., ACS Med. Chem. Lett., 6:787-92 (2015)に記載されるビアリールアミドを含む。なお、これら文献の内容はすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
当業者は、がん細胞株または原発性がん（たとえば腫瘍）細胞の生存性、アポトーシス、増殖、および／またはコロニー形成を評価するインビトロアッセイを用いて、任意のタイプのがんに対する効果について、既知のおよび候補のRORγ阻害剤を試験することができることを理解するであろう。細胞生存性、アポトーシス、増殖、およびコロニー形成アッセイの例示的なプロトコルについては、実施例1を参照。当業者は、異種移植腫瘍モデルなどのインビボ動物モデルを用いて、任意のタイプのがんに対する効果について、既知のおよび候補のRORγ阻害剤を試験することができることを理解するであろう。異種移植腫瘍モデルおよびRORγ阻害剤での処置の例示的なプロトコルについては、下記の実施例1を参照。
【００８６】
B. 抗がん剤
特定の実施形態において、本発明のRORγ阻害剤は、抗がん剤と組み合わせて用いることができ、がん細胞を抗がん剤に対して感受性にすることにより、抗がん剤に対するがん細胞抵抗性を減少させるかまたは逆転する。
【００８７】
抗がん剤の非限定的な例は、抗アンドロゲン薬、化学療法剤、放射線治療剤、抗原特異的免疫治療剤、内分泌療法、チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせを含む。
【００８８】
1. 抗アンドロゲン薬
抗アンドロゲン薬は、アンドロゲン受容体（AR）またはその変異体（たとえばAR-V7）の転写、翻訳、安定性、および／または活性を阻害する化合物である。AR活性の阻害はアンドロゲン応答要素（ARE）へのARの動員の阻害を含み得る。特定の実施形態において、AR活性の阻害は、PSAプロモーターへのARの動員の阻害を含み得る。特定の実施形態において、AR活性の阻害は、PSAプロモーターのAR誘導活性の阻害を含み得る。特定の実施形態において、AR活性の阻害は、AR誘導PSA生産の阻害を含み得る。たとえば、ARの阻害は、DHTの欠如下でのPSAの生産の阻害を含み得る。
【００８９】
抗アンドロゲン薬は、これらに限らないが、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ニルタミド、フルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、およびこれらの組み合わせを含む。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数の抗アンドロゲン薬と組み合わせて含む組成物を提供する。特定の例において、組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤または希釈剤をさらに含む。他の例において、組成物は、経口または非経口投与用に調製される。
【００９１】
他の実施形態において、本発明は、対象においてがんを治療するための方法であって、有効量の1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数の抗アンドロゲン薬と組み合わせて、対象に投与する段階を含む、方法を提供する。特定の例において、1または複数のRORγ阻害剤の有効量は、抗アンドロゲン薬抵抗性がん、たとえば、抗アンドロゲン薬抵抗性前立腺がん（たとえば、去勢抵抗性前立腺がん）を、抗アンドロゲン薬治療に対して感受性にするのに十分な量である。RORγ阻害剤および抗アンドロゲン薬は、同じ投与経路（たとえば、経口または非経口）で、または異なる投与経路（たとえば、RORγ阻害剤は静脈内で抗アンドロゲン薬は経口的、またはその逆）で、対象に送達することができる。
【００９２】
2. 化学療法剤
化学療法剤は、当該技術分野において公知であり、これらに限らないが、アントラセンジオン（アントラキノン）、たとえば、アントラサイクリン（たとえば、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、およびバルルビシン）、ミトキサントロン、およびピクサントロン；白金ベースの剤（たとえば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、およびリポプラチン）；タモキシフェンおよびその代謝物、たとえば、4-ヒドロキシタモキシフェン（アフィモキシフェン）およびN-デスメチル-4-ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）；タキサン、たとえば、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル、カバジタキセル、ホングドウシャンA、ホングドウシャンB、ホングドウシャンC、バッカチンI、バッカチンII、および10-デアセチルバッカチン；アルキル化剤（たとえば、ナイトロジェンマスタード、たとえば、メクロロエタミン(HN2)、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン(L-サルコリシン)、およびクロランブシル）；エチレンイミンおよびメチルメラミン（たとえば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、アルキルスルホネート、たとえば、ブスルファン、ニトロソウレア、たとえば、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNLJ)、セムスチン(メチル-CCN-U)、およびストレプトゾエイン（ストレプトゾトシン）、およびトリアゼン、たとえば、デカルバジン（DTIC;ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキシアミド））；代謝拮抗剤（たとえば、葉酸アナログ、たとえば、メトトレキセート（アメトプテリン）、ピリミジンアナログ、たとえば、フルオロウラシル（5-フルオロウラシル; 5-FU）、フロキシウリジン（フルオロデオキシウリジン; FUdR）、およびシタラビン（シトシンアラビノシド）、およびプリンアナログおよびその関連する阻害剤、たとえば、メルカプトプリン（6-メルカプトプリン; 6-MP）、チオグアニン（6-チオグアニン; 6-TG）、およびペントスタチン（2'-デオキシコホニシン））；天然物（たとえば、ビンカアルカロイド、たとえば、ビンブラスチン(VLB)およびビンクリスチン、エピポドフィルロトキシン、たとえば、エトポシドおよびテニポシド、および抗生物質、たとえば、ダクチノマイシン（アクチノマイシン D）、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびミトマイシン（ミトマイシン Q）；酵素、たとえば、L-アスパラギナーゼ；生物学的応答変更因子、たとえば、インターフェロン・アルファ）；置換ウレア、たとえば、ヒドロキシウレア；メチルヒドラジン誘導体、たとえば、プロカルバジン（N-メチルヒドラジン; MIH)；副腎皮質抑制剤、たとえば、ミトタン(o,p'-DDD) およびアミノグルテチミド；それらのアナログ；それらの誘導体；ならびにそれらの組み合わせを含む。
【００９３】
特定の実施形態において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数の化学療法剤と組み合わせて含む組成物を提供する。特定の例において、組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤または希釈剤をさらに含む。他の例において、組成物は、経口または非経口投与用に調製される。
【００９４】
他の実施形態において、本発明は、対象においてがんを治療するための方法であって、有効量の1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数の化学療法剤と組み合わせて、対象に投与する段階を含む、方法を提供する。特定の例において、1または複数のRORγ阻害剤の有効量は、化学療法剤抵抗性がん、たとえば、タモキシフェン抵抗性がん（たとえば、タモキシフェン抵抗性乳がん）またはタキサン抵抗性がん（たとえば、ドセタキセル抵抗性前立腺がん）を、化学療法剤治療に対して感受性にするのに十分な量である。RORγ阻害剤および化学療法剤は、同じ投与経路（たとえば、経口または非経口）で、または異なる投与経路（たとえば、RORγ阻害剤は静脈内で化学療法剤は経口的、またはその逆）で、対象に送達することができる。
【００９５】
3. 放射線治療剤
放射線治療剤は当該技術分野において公知であり、外部ビーム照射療法および／または内部照射療法を含み得る。外部ビーム照射療法（外照射療法）は、高エネルギーX線および／またはガンマ線を患者の腫瘍に送達し、内部照射療法は、放射性原子を患者の腫瘍に送達する。外部ビーム照射療法および内部照射療法の両方とも、十分な量の放射能を標的部位に送達することにより、腫瘍成長を抑制するまたはがん細胞を殺すために用いられる。特定の実施形態において、放射線治療剤は、放射性原子を含み、標的部位への送達を増加させるために生物学的または合成の剤と複合化される。このような生物学的または合成の剤は当該技術分野において公知である。本発明のRORγ阻害剤とともに用いるための適切な放射性原子は、本明細書に記載される放射性核種のいずれか、または標的組織または細胞を破壊するのに十分なエネルギーを放射する任意の他のアイソトープを含む。特定の実施形態において、放射線治療剤は、がん性細胞への放射線治療剤の局在化を改善するために、標的指向成分、たとえば、抗体に結合させることができる。
【００９６】
用語「放射性核種」は、放射能を示すいずれの核種をも含むことを意図する。「核種」は、たとえば、炭素14 (14C)のように、その原子番号、原子質量、およびエネルギー状態により特定される原子のタイプをいう。「放射能」は、放射性物質から放射される、アルファ粒子、ベータ粒子、核子、電子、ポジトロン、ニュートリノ、およびガンマ線を含む、放射線をいう。本発明に用いるために適した放射性核種の例は、これらに限らないが、フッ素 18 (18F)、フッ素 19 (19F)、リン 32 (32P)、スカンジウム 47 (47Sc)、コバルト 55 (55Co)、銅 60 (60Cu)、銅 61 (61Cu)、銅 62 (62Cu)、銅 64 (64Cu)、ガリウム 66 (66Ga)、銅 67 (67Cu)、ガリウム 67 (67Ga)、ガリウム 68 (68Ga)、ルビジウム 82 (82Rb)、イットリウム 86 (86Y)、イットリウム 87 (87Y)、ストロンチウム 89 (89Sr)、イットリウム 90 (90Y)、ロジウム 105 (105Rh)、銀 111 (111Ag)、インジウム 111 (111In)、ヨウ素 124 (124I)、ヨウ素 125 (125I)、ヨウ素 131 (131I)、スズ 117m (117mSn)、テクネチウム 99m (99mTc)、プロメチウム 149 (149Pm)、サマリウム 153 (153Sm)、ホルミウム 166 (166Ho)、ルテチウム 177 (177Lu)、レニウム 186 (186Re)、レニウム 188 (188Re)、タリウム 201 (201Tl)、アスタチン 211 (211At)、およびビスマス 212 (212Bi)を含む。本明細書に用いる場合、117mSn および 99mTcにおける「m」は、メタ状態を表す。さらに、天然の放射能元素、たとえば、典型的に放射性同位体の混合物を表すウラン、ラジウム、トリウムは放射性核種の適切な例である。67Cu、131I、177Lu、および 186Re は、ベータおよびガンマ放出放射性核種である。212Bi は、アルファおよびベータ放出放射性核種である。211At は、アルファ放出放射性核種である。32P、47Sc、89Sr、90Y、105Rh、111Ag、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、および 188Re は、ベータ放出放射性核種の例である。67Ga、111In、99mTc、および 201Tl は、ガンマ放出放射性核種の例である。55Co、60Cu、61Cu、62Cu、66Ga、68Ga、82Rb、および 86Y は、ポジトロン放出放射性核種の例である。64Cu は、ベータおよびポジトロン放出放射性核種である。
【００９７】
特定の実施形態において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数の放射線治療剤と組み合わせて含む組成物を提供する。特定の例において、組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤または希釈剤をさらに含む。他の例において、組成物は、経口または非経口投与用に調製される。
【００９８】
他の実施形態において、本発明は、対象においてがんを治療するための方法であって、有効量の1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数の放射線治療剤と組み合わせて、対象に投与する段階を含む、方法を提供する。特定の例において、1または複数のRORγ阻害剤の有効量は、放射線抵抗性がん、たとえば、放射線抵抗性乳がんを、放射線治療に対して感受性にするのに十分な量である。RORγ阻害剤および放射線治療剤は、同じ投与経路（たとえば、経口または非経口）で、または異なる投与経路（たとえば、RORγ阻害剤は静脈内で放射線治療剤は経口的、またはその逆）で、対象に送達することができる。
【００９９】
4. 内分泌療法
内分泌療法は、標的ホルモンの生産もしくは活性を減少させるかまたは標的細胞の遺伝子発現パターンを変化させる特定のホルモンまたは薬剤の投与を介した、内分泌系の操作である。内分泌療法は、乳がんを含む特定のタイプのがんにおいて特に有用である。本発明において、任意の既知のホルモンアンタゴニストまたはモジュレーターを用いることができる。本発明に有用な内分泌療法は、これらに限らないが、アロマターゼ阻害剤（たとえば、レトロゾール）、酢酸メゲストロール、フルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、バゼドキシフェン、バゼドキシフェン／コンジュゲート・エストロゲン、およびこれらの組み合わせを含む。
【０１００】
特定の実施形態において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数の内分泌療法と組み合わせて含む組成物を提供する。特定の例において、組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤または希釈剤をさらに含む。他の例において、組成物は、経口または非経口投与用に調製される。
【０１０１】
他の実施形態において、本発明は、対象においてがんを治療するための方法であって、有効量の1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数の内分泌療法と組み合わせて、対象に投与する段階を含む、方法を提供する。特定の例において、1または複数のRORγ阻害剤の有効量は、内分泌療法抵抗性がん、たとえば、タモキシフェン抵抗性乳がんを、内分泌療法に対して感受性にするのに十分な量である。RORγ阻害剤および内分泌療法は、同じ投与経路（たとえば、経口または非経口）で、または異なる投与経路（たとえば、RORγ阻害剤は静脈内で内分泌療法は経口的、またはその逆）で、対象に送達することができる。
【０１０２】
5. チロシンキナーゼ阻害剤
チロシンキナーゼ阻害剤は、チロシンキナーゼタンパク質を阻害する低分子である。チロシンキナーゼは、リン酸基をタンパク質に付加することにより、細胞のシグナル伝達カスケードにおいて多くのタンパク質を活性化する酵素である。チロシンキナーゼタンパク質の高発現および異常な活性化は、がん性の細胞表現型に関連する制御不能な細胞増殖を引き起こし得る、細胞のシグナル伝達経路の不要な「スイッチ・オン」を引き起こし得る。十分に制御されていないチロシンキナーゼタンパク質の活性を、チロシンキナーゼ阻害剤で阻害し、または減少させることにより、様々な形態のがんが、現在、治療されている。チロシンキナーゼ阻害剤での治療計画は、がんの発生率を抑制し、減少させ、重症度を減少させ、または進行を阻害することができる。チロシンキナーゼ阻害剤の例は、これらに限らないが、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、ボルテゾミブ、サリノマイシン、およびこれらの組み合わせを含む。
【０１０３】
特定の実施形態において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて含む組成物を提供する。特定の例において、組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤または希釈剤をさらに含む。他の例において、組成物は、経口または非経口投与用に調製される。
【０１０４】
他の実施形態において、本発明は、対象においてがんを治療するための方法であって、有効量の1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて、対象に投与する段階を含む、方法を提供する。特定の例において、1または複数のRORγ阻害剤の有効量は、チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性がん、たとえば、チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性非小細胞がん（NSCLC）を、チロシンキナーゼ阻害剤治療に対して感受性にするのに十分な量である。RORγ阻害剤およびチロシンキナーゼ阻害剤は、同じ投与経路（たとえば、経口または非経口）で、または異なる投与経路（たとえば、RORγ阻害剤は静脈内でチロシンキナーゼ阻害剤は経口的、またはその逆）で、対象に送達することができる。
【０１０５】
6. 抗原特異的免疫治療剤
特定の実施形態において、抗原特異的免疫治療剤は、がん性細胞により発現または過剰発現された抗原を特異的に認識して免疫系を刺激するように設計された化合物および組成物を含む。他の実施形態において、抗原特異的免疫治療剤は、がん性細胞により発現または過剰発現された抗原を特異的に認識する化合物および組成物を含む。抗原特異的免疫治療剤の非限定的な例は、ワクチン（たとえば、ペプチドワクチン）、抗体、細胞障害性T細胞リンパ球(CTL)、キメラ抗原受容体T細胞(CAR-T 細胞)、免疫チェックポイント（たとえば、CTLA-4、PD-1、およびPD-L1）、免疫調節サイトカイン（たとえば、IL-6 および IL-17）、ならびにこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態において、がん性細胞により提示された抗原は、それぞれのがんのタイプに高度に特異的であり、用いるワクチン、抗体、CTL、および／またはCAR-T細胞は、治療すべきがんのタイプに依存する。
【０１０６】
ワクチンは、免疫系を刺激して、がん性細胞により提示された抗原を特異的に認識して攻撃することができる。ワクチンは、1または複数のペプチド、ペプチドフラグメント、融合ペプチド、DNA、RNA、他の生物学的もしくは非生物学的材料、またはこれらの組み合わせを含み得る。
【０１０７】
特定の実施形態において、1または複数のペプチド、ペプチドフラグメント、または融合ペプチドを、ペプチドワクチンのために用いることができる。ペプチドは、内因性ソースから収集するか、または化学的に合成することができる。選択されるペプチドは、治療すべきがんのタイプに特異的である。たとえば、がん細胞を標的にする場合、いくつかの一般に標的とされるタンパク質は、GM-CSF、IL-13Rα2、EphA2、およびSurvivinを含む。しかしながら、特定のタイプのがんは、罹患細胞を標的にするために用いられる特に好ましいペプチドを有するであろう。特定の実施形態において、ペプチドワクチンにおける1または複数のペプチドは、遊離した可溶性のペプチドである。他の実施形態において、ペプチドワクチンにおける1または複数のペプチドは、当該技術分野において任意の既知の手段を用いてつなぎ合わされる。
【０１０８】
特定の実施形態において、ワクチンは、がんワクチン、たとえば、テセモチド(L-BLP25)、オンコファージ、シプロイセル-T、およびこれらの組み合わせを含む。テセモチド(L-BLP25)は、MUC1の免疫原性タンデム反復領域からの25アミノ酸を含む、リポソームの抗原特異的がん免疫治療剤である（たとえば、Mehta NR et al., Clin. Cancer Res., 18:2861-2871 (2012)を参照）。
【０１０９】
抗体は、がん性細胞により発現または過剰発現された抗原を認識することができる。これらの抗体により認識される抗原は、細胞表面上で発現、活性化、もしくは過剰発現されたタンパク質、または細胞外液に分泌されたタンパク質であり得る。特定の実施形態において、抗体は、ヒトエフェクター細胞（たとえばマクロファージ）をがん性細胞に対して標的指向させるのに用いることができる。特定の実施形態において、抗体は、細胞表面受容体の正常な機能を阻害するのに用いることができる。特定の実施形態において、抗体は、細胞のシグナルカスケードをブロックするために細胞表面受容体のリガンドに結合する。抗原特異的免疫治療剤として用いる抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、ならびにキメラ、ヒト化、もしくはヒト抗体であり得、予め患者から単離するかまたは別の生物学的ソースから生産することができる。抗体を生産する方法は、当該技術分野において公知であり、任意の既知の手段で作り出すことができる。たとえば、本明細書に記載される抗体は、慣用的なモノクローナル抗体法、たとえば、その内容がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれるKohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術により生産することができる。特定の実施形態において、がんの治療に役立つ抗体は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。特定の実施形態において、がんの治療に役立つ抗体は、これらに限らないが、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、およびこれらの組み合わせを含む。
【０１１０】
抗原特異的免疫治療剤としてのCTLおよびCAR-T細胞の使用は、T細胞移入療法の形態である。養子T細胞移入療法は、疾患の細胞を有効に認識し、結合し、および殺すことができるT細胞を富化する、および／または設計することにより、がんと戦う天然の免疫系の能力をブーストすることができる技術である。CTLは、T細胞受容体（TCR）を用いてがん性細胞を認識し、結合することができる。TCRは、広範囲の抗原を認識することができる高度に可変性の結合領域を含む。TCRは、適切な抗原を提示するがん性細胞の主要組織適合性抗原複合体I（MHC I）に結合する。TCR結合は高度に特異的なので、ごく少数のCTLだけが、特定の抗原を認識することができるであろう。がん性細胞のMHC I複合体に結合するCTLにより抗原が認識されると、CTLは活性化して細胞死を誘導する。活性化されたCTLは、増殖して、検出されたがんと戦う。
【０１１１】
この療法において投与されるCTLは、対象から得ることができ、または他の生物学的ソースから得ることができる。特定の抗原に対するCTLを生産するための方法は、当該技術分野において公知であり、特定の抗原に対するCTLを有する個体から収集することができ、または体外（ex vivo）で生産することができる。たとえば、がんを治療する場合、対象の腫瘍から細胞障害性T細胞を単離し、最も大きな抗腫瘍活性を有する細胞障害性T細胞を同定し、その同定された細胞障害性T細胞を培養して大量の最も有効な細胞を生産し、そして、その培養された細胞障害性T細胞を対象に再導入して、がんを治療する。CTLは、その内容がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,962,318号および米国特許出願公報第2009/0324539号に記載される生体外技術を用いて健康な個体において生産することもできる。本明細書に記載される生体外法は、がんの発症前またはがんの発症後の両方の個体に対して有用であり得る。
【０１１２】
CAR-T細胞は、天然に生産されない細胞の特異性ドメインを有するように操作されている改変T細胞である。T細胞の天然の特異性ドメインは、MHCクラスI分子上に提示される特定の抗原を認識するT細胞受容体である。特定の実施形態において、CAR-T細胞は、対象の体において天然に生産されないT細胞受容体を有する。特定の実施形態において、細胞の特異性ドメインは、標的の細胞または組織に特異的であるモノクローナル抗体である。CAR-T細胞は、当該技術分野において既知の任意の手段を用いて生産することができる。特定の実施形態において、細胞障害性T細胞を対象の血液から収集し、その細胞障害性T細胞を、対象が罹患しているがんに特異的な抗原を認識する受容体をコードする遺伝子を挿入することにより遺伝的に改変し、CAR-T細胞を培養し、そして、後の使用のために保存するかまたは対象の体に再導入してがんを治療することができる。CAR-T細胞を生産する方法の詳細に関するさらなる情報については、たとえば、その内容がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第9,102,760号、米国特許第8,399,645号、米国特許第8,975,071号、および米国特許第8,916,381号を参照。
【０１１３】
特定の実施形態において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数の抗原特異的免疫治療剤と組み合わせて含む組成物を提供する。特定の例において、組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤または希釈剤をさらに含む。他の例において、組成物は、経口または非経口投与用に調製される。
【０１１４】
他の実施形態において、本発明は、対象においてがんを治療するための方法であって、有効量の1または複数のRORγ阻害剤を、1または複数の抗原特異的免疫治療剤と組み合わせて、対象に投与する段階を含む、方法を提供する。特定の例において、1または複数のRORγ阻害剤の有効量は、抗原特異的免疫治療剤での治療に耐性であるがんを、このような治療に対して感受性にするのに十分な量である。RORγ阻害剤および抗原特異的免疫治療剤は、同じ投与経路（たとえば、経口または非経口）で、または異なる投与経路（たとえば、RORγ阻害剤は静脈内で抗原特異的免疫治療剤は経口的、またはその逆）で、対象に送達することができる。
【０１１５】
C. 疾患および状態
特定の態様において、がんは、1または複数のRORγ阻害剤を投与することにより、治療し、または防止することができる。特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤は、抗がん剤と組み合わせて投与される。がんは概して、周囲の組織に浸潤して体の新しい部位に転移する傾向にある未分化の細胞の増殖を特徴とする種々の悪性新生物のいずれかを含む。本発明の組成物を用いる治療に適した様々なタイプのがんの非限定的な例は、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、甲状腺がん、肝臓がん、胸膜がん、膵臓がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、肛門がん、胆管がん、胃腸カルチノイド腫瘍、食道がん、胆嚢がん、直腸がん、虫垂がん、小腸がん、胃がん、腎臓がん（すなわち、腎細胞がん）、中枢神経系のがん、皮膚がん、絨毛がん、頭頸部がん、骨がん、骨原性肉腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、子宮内膜がん、黒色腫、白血病（たとえば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、またはヘアリーセル白血病）、リンパ腫（たとえば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、またはバーキットリンパ腫）、および多発性骨髄腫を含む。
【０１１６】
特定の実施形態において、がんは上皮がん（たとえば、前立腺がん、卵巣がん、乳がん等）、または血液がん（たとえば、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫）である。特定の実施形態において、がんは前立腺がんである。特定の実施形態において、前立腺がんは、転移性前立腺がん、薬剤抵抗性前立腺がん（たとえば、抗アンドロゲン抵抗性前立腺がん等、たとえば、エンザルタミド抵抗性前立腺がん、アビラテロン抵抗性前立腺がん、ビカルタミド抵抗性前立腺がん等；タキサン抵抗性前立腺がん；ドセタキセル抵抗性前立腺がん等）、ホルモン抵抗性前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん（CRPC）、転移性去勢抵抗性前立腺がん、AR-V7誘導性薬剤抵抗性前立腺がん、たとえば、AR-V7誘導性抗アンドロゲン抵抗性前立腺がん（たとえば、AR-V7誘導性エンザルタミド抵抗性前立腺がん）、AKR1C3誘導性薬剤抵抗性前立腺がん、たとえば、AKR1C3誘導性抗アンドロゲン抵抗性前立腺がん（たとえば、AKR1C3誘導性エンザルタミド抵抗性前立腺がん）、ならびにこれらの組み合わせのうちの1つまたは複数から選択される進行期の前立腺がんである。
【０１１７】
他の実施形態において、がんは、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、または神経膠腫である。特定の例において、肺がんは、非小細胞肺がん（NSCLC）、K-Ras変異肺がん、BRAF変異肺がん、チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性肺がん、小細胞肺がん（SCLC）、腺がん（たとえば、潜在腺がん）、扁平上皮がん、大細胞がん、気管支カルチノイド、またはこれらの組み合わせである。特定の例において、乳がんは、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）タモキシフェン抵抗性乳がん、放射線抵抗性乳がん、非浸潤性乳管がん、浸潤性乳管がん、HER2陽性乳がん、ER陽性乳がん、炎症性乳がん、転移性乳がん、髄様がん、管状腺がん、粘液性がん腫（コロイド）、またはこれらの組み合わせである。特定の例において、肝臓がんは、肝細胞がん（HCC）、胆管がん（胆管がん）、血管肉腫、肝芽腫、またはこれらの組み合わせである。特定の例において、神経膠腫は、上衣細胞腫、星状細胞腫（たとえば、多形性膠芽腫）、乏突起膠腫、脳幹膠腫、視神経膠腫、またはこれらの組み合わせ（たとえば、混合膠腫）である。
【０１１８】
D. 薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011と、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤もしくは希釈剤とを混合することにより作成された組成物を含む。このような組成物は、動物またはヒトにおける薬学的な使用に適している。
【０１１９】
本発明の薬学的組成物は、薬学の分野において公知である任意の方法により調製することができる。本発明に用いるのに適した薬学的に許容可能な担体は、標準的な薬学的な担体、緩衝剤、および賦形剤のいずれか、たとえば、リン酸緩衝塩類溶液、水、およびエマルション（たとえば、油／水または水／油エマルション）、ならびに任意のタイプの湿潤剤および／またはアジュバントを含む。適切な薬学的担体およびそれらの調製は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, 19th ed. 1995)に記載される。好ましい薬学的担体は、活性成分の意図される投与形態に依存する。
【０１２０】
本発明の薬学的組成物は、活性成分として、1または複数のRORγ阻害剤（たとえば、SR2211および／またはXY011）、1または複数の抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬（たとえば、エンザルタミド、アビラテロン、および／またはビカルタミド）および／または化学療法剤（たとえば、タモキシフェン、および／またはタキサン、たとえば、ドセタキセル）、または任意の薬学的に許容可能なそれらの塩、ならびに、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤もしくは希釈剤を含み得る。特定の例において、薬学的組成物は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011、ならびに、抗アンドロゲン薬、たとえば、エンザルタミドを含み得る。薬学的組成物は、任意に、他の治療成分を含み得る。
【０１２１】
本発明の化合物は、慣用的な薬学的配合技術に従って、適切な薬学的担体および／または賦形剤との密接な混合物中の活性成分として組み合わせることができる。投与のために所望される調製物の形態に適した任意の担体および／または賦形剤が、本明細書に開示される化合物との使用のために企図される。
【０１２２】
特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤を含む薬学的組成物、ならびに、1または複数の抗がん剤を含む薬学的組成物は、単一薬剤として調製される。他の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤を含む薬学的組成物、ならびに、1または複数の抗がん剤を含む薬学的組成物は、別個の薬剤として調製される。
【０１２３】
本発明の薬学的組成物は、局所、非経口、経肺、経鼻、直腸内、または経口の投与用に適した製剤を含む。任意の所定の場合の投与の最も適切な経路は、一部分において、がんの状態の性質および重症度、ならびに、任意に、がんの段階に依存するであろう。
【０１２４】
RORγ阻害剤が抗がん剤と組み合わせて投与される実施形態において、RORγ阻害剤および抗がん剤の投与は、同じまたは異なる投与ルートを用いて投与することができる。たとえば、特定の実施形態において、RORγ阻害剤および抗がん剤の両方を、経口的にまたは非経口的（たとえば、静脈内）に投与することができる。たとえば、他の実施形態において、RORγ阻害剤は経口的に投与して、抗がん剤は非経口的（たとえば、静脈内）に投与するか、またはその逆で投与することができる。
【０１２５】
他の好ましい組成物は、全身（腸内または非経口的）投与に適した組成物を含む。全身投与は、経口、直腸、舌下、または唇下投与を含む。特定の実施形態において、組成物は、シリンジで、または静脈内に投与することができる。
【０１２６】
肺投与用の組成物は、これらに限らないが、本明細書に記載される組成物またはその塩の粉末、ならびに、適切な担体および／または潤滑剤の粉末からなる、乾燥粉末組成物を含む。肺投与用の組成物は、当業者に既知の任意の適切な乾燥粉末吸入装置から吸入することができる。
【０１２７】
全身投与用の組成物は、これらに限らないが、本明細書に記載される組成物、ならびに、適切な担体および／または賦形剤の粉末からなる、乾燥粉末組成物を含む。全身投与用の組成物は、これらに限らないが、錠剤、カプセル、ピル、シロップ、溶液、および懸濁液に代表される。
【０１２８】
特定の実施形態において、本発明は、薬学的な界面活性剤をさらに含む組成物を提供する。他の例において、本発明は、凍結防止剤をさらに含む組成物を提供する。特定の実施形態において、凍結防止剤は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、グルタミン酸ナトリウム、PVP、HPβCD、CD、グリセロール、マルトース、マンニトール、およびサッカロースからなる群より選択される。
【０１２９】
特定の実施形態において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011、ならびに、1または複数の抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬（たとえば、エンザルタミド、アビラテロン、および／またはビカルタミド）および／または化学療法剤（たとえば、タモキシフェンおよび／またはタキサン、たとえば、ドセタキセル）を、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011、ならびに、抗アンドロゲン薬、たとえば、エンザルタミドを、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含む薬学的組成物を提供する。これらの実施形態のいくつかにおいて、薬学的に許容可能な賦形剤は、塩または希釈剤を含む。
【０１３０】
特定の実施形態において、本発明は、有効量の1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、経口投与または非経口（たとえば、静脈内）投与用に調製され、1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011、ならびに、水溶液および緩衝液からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーを含む。特定の実施形態において、組成物は、有効量の1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011、ならびに、1または複数の抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬（たとえば、エンザルタミド、アビラテロン、および／またはビカルタミド）および／または化学療法剤（たとえば、タモキシフェンおよび／またはタキサン、たとえば、ドセタキセル）を含み得る。
【０１３１】
本発明に用いるために薬学的組成物または薬剤は、1または複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を用いて、標準的な技術によって調製することができる。適切な薬学的担体は、本明細書、およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005)に記載される。
【０１３２】
経口投与のために、薬学的組成物または薬剤は、たとえば、薬学的に許容可能な賦形剤とともに慣用的な手段により調製される錠剤またはカプセルの形態をとり得る。活性成分とともに、（a）希釈剤または増量剤、たとえば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース（たとえば、エチルセルロース、微結晶性セルロース）、グリシン、ペクチン、ポリアクリレートおよび／またはリン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、（b）潤滑剤、たとえば、シリカ、無水コロイド状シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩（たとえば、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム）、ステアリン酸金属塩、コロイド状二酸化ケイ素、硬化植物油、コーンスターチ、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび／またはポリエチレングリコール；錠剤のために、（c）バインダー、たとえば、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、スターチペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはヒドロキシプロピルメチルセルロース；必要に応じて、（d）崩壊剤、たとえば、スターチ（たとえば、ポテトスターチ、またはナトリウムスターチ）、グリコレート、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩、または沸騰性混合物；（e）湿潤剤、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、および／または（f）吸収剤、着色剤、香味料、および甘味料を含む、錠剤およびゼラチンカプセルが好ましい。特定の実施形態において、錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール6000、および二酸化チタンの混合物を含む。錠剤は、当該技術分野において既知である方法に従って、フィルムコーティングまたは腸溶コーティングされ得る。
【０１３３】
経口投与用の液体調製物は、たとえば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態をとることができ、または、それらは、使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として提供することができる。このような液体調製物は、薬学的に許容可能な添加物、たとえば、懸濁剤、たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂、乳化剤、たとえば、レシチンまたはアカシア；非水性ビヒクル、たとえば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油；ならびに保存料、たとえば、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸とともに、慣用的な手段により調製することができる。調製物は、適切なら、緩衝塩類、香味料、着色料、および／または甘味料も含み得る。必要に応じて、経口投与用の調製物は、活性成分の制御放出を提供するように適切に調製することができる。
【０１３４】
本発明の組成物の制御放出非経口製剤は、インプラント、油性注射剤、または粒状システムとして作ることができる。送達システムの概要については、参照により本明細書に組み込まれるBanga, A.J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995)を参照。粒状システムは、マイクロスフィア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフィア、およびナノ粒子を含む。
【０１３５】
本発明の組成物のイオン制御放出のためにポリマーを用いることができる。制御された薬剤送達に用いるための種々の分解性および非分解性ポリマーマトリックスが当該技術分野において知られている(Langer R., Accounts Chem. Res., 26:537-542 (1993))。たとえば、ブロックコポリマー、ポラキサマー407は、低温で粘性だが流動性の液体として存在するが、体温で半固体ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン2およびウレアーゼの調製および持続性送達のための有効なビヒクルであることが示されている(Johnston et al., Pharm. Res., 9:425-434 (1992); and Pec et al., J. Parent. Sci. Tech., 44(2):58 65 (1990))。あるいは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとしてヒドロキシアパタイトが用いられている(Ijntema et al., Int. J. Pharm., 112:215-224 (1994))。さらに別の態様において、制御放出のため、および脂質カプセル化薬剤の薬剤標的指向のために、リポソームが用いられる(Betageri et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993))。治療タンパク質の制御送達のための多数のさらなるシステムが知られている。たとえば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,055,303、5,188,837、4,235,871、4,501,728、4,837,028 4,957,735 および 5,019,369、5,055,303; 5,514,670; 5,413,797; 5,268,164; 5,004,697; 4,902,505; 5,506,206、5,271,961; 5,254,342 および 5,534,496を参照。
【０１３６】
E. 投与方法
1または複数のRORγ阻害剤を含む薬学的組成物または薬剤は、本明細書に記載される通り、対象のがんを治療するために治療的に有効な投与量で対象に投与することができる。特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤を含む薬学的組成物または薬剤は、本明細書に記載されるように、対象のがんを治療するために治療的に有効な投与量で、有効量の抗がん剤と組み合わせて対象に同時投与することができる。特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤を含む薬学的組成物または薬剤は、対象において有効な治療応答を誘発するために十分な量で対象に投与される。特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤を含む薬学的組成物または薬剤は、対象において有効な治療応答を誘発するために、有効量の抗がん剤と組み合わせて、治療的に有効な投与量で対象に同時投与することができる。
【０１３７】
本明細書に記載されるがんを治療する特定の方法において、その方法は、最初に、1または複数のRORγ阻害剤、たとえばSR2211および／またはXY011を、がんを有する患者に投与し、次に、抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬および／または化学療法剤を、その患者に投与することを含む。本明細書に記載されるがんを治療する特定の方法において、その方法は、最初に、抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬および／または化学療法剤を、がんを有する患者に投与し、次に、1または複数のRORγ阻害剤、たとえばSR2211および／またはXY011を、その患者に投与することを含む。本明細書に記載されるがんを治療する特定の方法において、その方法は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえばSR2211および／またはXY011を、抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬および／または化学療法剤とともに、がんを有する患者に同時投与することを含む。
【０１３８】
特定の実施形態において、投与方法は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえばSR2211および／またはXY011を、単独で、または、エンザルタミドと組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む。他の実施形態において、投与方法は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえばSR2211および／またはXY011を、単独で、または、アビラテロンと組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む。さらに他の実施形態において、その方法は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえばSR2211および／またはXY011を、単独で、または、ビカルタミドと組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む。さらに他の実施形態において、その方法は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえばSR2211および／またはXY011を、単独で、または、タキサン、たとえばドセタキセルと組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む。さらなる実施形態において、その方法は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえばSR2211および／またはXY011を、単独で、または、タモキシフェンと組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む。
【０１３９】
特定の実施形態において、本発明は、有効量の1または複数のRORγ阻害剤、たとえばSR2211および／またはXY011を、がん、たとえば、前立腺がん（たとえば、CRPC）を有する患者に送達する方法を提供する。
【０１４０】
本明細書に記載されるRORγ阻害剤は、薬学的組成物または薬剤の製造に有用である。薬学的組成物または薬剤は、それを必要とする患者、たとえば、がん、たとえば、前立腺がん（たとえば、CRPC）、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、または神経膠腫を有する患者に投与することができる。
【０１４１】
本発明に用いるための薬学的組成物または薬剤は、1または複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を用いる標準的な技術により調製することができる。適切な薬学的担体は、本明細書、およびE.W. Martinの"Remington's Pharmaceutical Sciences" に記載される。本発明の化合物および剤、ならびにそれらの生理学的に許容可能な塩および溶媒和物は、吸入、局所、経鼻、経口、静脈内、非経口、または直腸内を含む、任意の適切な経路による投与用に調製することができる。
【０１４２】
1. 投与経路
局所投与用の典型的な製剤は、クリーム、軟膏、スプレー、ローション、およびパッチを含む。しかしながら、薬学的組成物は、任意のタイプの投与、たとえば、シリンジまたは他の装置による皮内、皮下、静脈内、筋内、鼻内、脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜内、冠動脈内、または腫瘍内注入用に調製することができる。吸入による投与（たとえば、エアロゾル）用、または経口もしくは直腸投与用の製剤も企図される。
【０１４３】
経皮的適用のための適切な製剤は、有効量の本明細書に記載の1または複数の化合物を、任意に担体とともに含む。好ましい担体は、ホストの皮膚を介する通過を補助するために、吸収性の薬理学的に許容可能な溶媒を含む。たとえば、経皮デバイスは、バッキング材、前記化合物を任意に担体と共に含むリザーバー、任意に、延長された期間にわたり制御された予め決められた速度でホストの皮膚に化合物を送達するための速度調節バリア、ならびに、デバイスを皮膚に固定するための手段を含む、包帯の形態である。マトリックス経皮製剤も用いることができる。
【０１４４】
経口投与のために、薬学的組成物または薬剤は、たとえば、薬学的に許容可能な賦形剤とともに慣用的な手段により調製された錠剤またはカプセルの形態をとり得る。本発明は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえばSR2211および／またはXY011を、単独で、または、他の化合物、たとえば、抗がん剤と組み合わせて含む、錠剤およびゼラチンカプセル、または、（a）希釈剤または増量剤、たとえば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース（たとえば、エチルセルロース、微結晶性セルロース）、グリシン、ペクチン、ポリアクリレートおよび／またはリン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、（b）潤滑剤、たとえば、シリカ、滑石、ステアリン酸、マグネシウムまたはカルシウム塩、ステアリン酸金属塩、コロイド状二酸化ケイ素、硬化植物油、コーンスターチ、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび／またはポリエチレングリコール；錠剤のために、（c）バインダー、たとえば、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、スターチペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはヒドロキシプロピルメチルセルロース；必要に応じて、（d）崩壊剤、たとえば、スターチ（たとえば、ポテトスターチ、またはナトリウムスターチ）、グリコレート、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩、または沸騰性混合物；（e）湿潤剤、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、および／または（f）吸収剤、着色剤、香味料、および甘味料と一緒の、これらの薬剤の乾燥固体粉末を提供する。
【０１４５】
錠剤は、当該技術分野において既知の方法に従って、フィルムコーティングまたは腸溶コーティングされ得る。経口投与用の液体調製物は、たとえば、溶液、シロップ、もしくは懸濁液の形態をとることができ、または、それらは、使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として提供され得る。このような液体調製物は、薬学的に許容可能な添加物、たとえば、懸濁剤、たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂、乳化剤、たとえば、レシチンまたはアカシア；非水性ビヒクル、たとえば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油；ならびに保存料、たとえば、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸とともに、慣用的な手段により調製することができる。調製物は、適切なら、緩衝塩類、香味料、着色料、および／または甘味料も含み得る。必要に応じて、経口投与用の調製物は、活性成分の制御放出を提供するように適切に調製することができる。
【０１４６】
本明細書に記載される組成物および製剤は、注入により、たとえば、ボーラス注入または連続的注入により、非経口投与用に調製することができる。注入のための製剤は、添加される保存料とともに、単位投与形態で、たとえば、アンプルまたは複数投与量容器において提供することができる。注入可能な組成物は、好ましくは、水性等張液または懸濁液であり、坐剤は、好ましくは、脂肪エマルションまたは懸濁液から調製される。組成物は、滅菌され、および／またはアジュバント、たとえば、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、たとえば、滅菌パイロジェンフリー水で構成するための粉末形態であり得る。さらに、それらは、他の治療的に価値のある物質も含み得る。組成物は、それぞれ慣用的な混合、顆粒化またはコーティング法に従って調製され、約0.1〜75%、好ましくは、約1〜50%の活性成分を含む。
【０１４７】
吸入による投与のために、本発明の組成物は、便利には、適切な噴霧剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスを用いて、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーを提供する形態で送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量した量を送達するためのバルブを提供することにより決定することができる。インへラーまたは吸入器に用いるための、たとえばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、化合物と適切な粉末ベース、たとえば、ラクトースまたはスターチとの粉末混合物を含めて調製することができる。
【０１４８】
本明細書に記載される組成物は、たとえば慣用的な坐剤ベース、たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドを含む、直腸用組成物、たとえば、坐剤または停留浣腸の形でも調製することができる。
【０１４９】
さらに、活性成分は、デポー製剤として調製することができる。このような長く作用する製剤は、移植（たとえば、皮下または筋内）により、または筋内注入により、投与することができる。これにより、本明細書に記載される1または複数の化合物は、適切なポリマーまたは疎水性材料（たとえば、許容可能な油中のエマルションとして）、もしくはイオン交換樹脂とともに、または難溶性の誘導体として、たとえば、難溶性の塩として、調製することができる。
【０１５０】
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物または薬剤は、（i）有効量の1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011、ならびに、（ii）任意に、抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬（たとえば、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド）、化学療法剤、たとえば、タキサン（たとえば、ドセタキセル）またはタモキシフェン、およびこれらの組み合わせを含み得る。治療剤は、1または複数の他のこのような治療剤と、個別に、連続的に、または組み合わせて、用いることができる（たとえば、第1の治療剤、第2の治療剤、本発明の化合物等）。投与は、同じもしくは異なる投与経路により、または、同じ薬学的製剤において一緒に行うことができる。
【０１５１】
2. 投与量
薬学的組成物または薬剤は、本明細書に記載されるように、がん、たとえば、前立腺がん（たとえば、CRPC）、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、または神経膠腫を予防し、治療し、感受性にし、または制御するために、治療的に有効な量で、対象に投与することができる。薬学的組成物または薬剤は、対象において有効な治療応答を誘発するのに十分な量で対象に投与される。有効な治療応答は、がんの症状または合併症を少なくとも部分的に抑止し、または遅くする応答を含む。これを達成するのに適した量は、「治療的に有効な量」として定義される。
【０１５２】
投与される活性成分の投与量は、対象の体重、年齢、個々の状態、治療すべき領域の表面領域または体積、ならびに投与の形態に依存する。投与のサイズは、特定の対象における特定の製剤の投与に伴う副作用の存在、性質、および程度によっても決定されよう。約50〜約70 kgの哺乳動物への経口投与のための単位投与量は、約5〜約500 mg、約25〜200 mg、約100〜約1000 mg、約200〜約2000 mg、約500〜約5000 mg、または約1000〜約2000 mgの活性成分を含み得る。約50〜約70 kgの哺乳動物への経口投与のための単位投与量は、約10 mg、20 mg、25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1,000 mg、1,250 mg、1,500 mg、2,000 mg、2,500 mg、3,000 mg、またはそれ超の活性成分を含み得る。典型的には、本発明の活性成分の投与量は、所望の効果を達成するのに十分である投与量である。最適な投与スケジュールは、対象の体における活性成分蓄積の測定結果から計算することができる。一般に、投与量は、毎日1回、週1回、月1回、またはそれ超で与えることができる。当業者は、最適な投与量、投与方法、および繰り返し率を容易に決定することができる。
【０１５３】
本発明の組成物の最適な投与量、毒性、および治療効能は、投与される組成物の相対的な有効性に依存して多様であり得、たとえば、LD50（集団の50%に対する致死量）およびED50（集団の50%において治療的に有効である投与量）を決定することにより、細胞培養物または実験動物において標準的な薬理学的手順により決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50の比率で表すことができる。大きな治療指数を示す剤が好ましい。毒性副作用を示す剤を用いることは可能であるが、正常細胞への潜在的な損傷を最小にすることにより副作用を減少させるため、このような剤を病気に冒された組織の部位に標的指向させる送達システムを設計することに注意を払うべきである。
【０１５４】
最適な投与スケジュールは、対象の体内の活性成分の蓄積の測定から計算することができる。一般に、投与量は、体重1kg当たり約1 ng〜約1,000 mgであり、毎日1回、週1回、月1回、年1回、またはそれ超で、提供することができる。当業者は、最適な投与量、投与方法、および繰り返し率を容易に決定することができる。当業者は、当該技術分野において既知である確立されたプロトコルおよび本明細書の開示内容に従って、1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011の、ヒトへの投与のための最適な投与量を決定することができよう。
【０１５５】
たとえば、動物研究（たとえば、げっ歯動物およびサル）から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量範囲を調製するのに用いることができる。本発明の化合物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を伴わないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いる投与形態および投与経路に依存してこの範囲内で変化させることができる。本発明の方法に用いるための任意の組成物について、治療的に有効な投与量は、最初に細胞培養アッセイから評価することができる。投与量は、細胞培養において決定されるIC50（症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて調製することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な投与量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中のレベルは、たとえば、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）により、測定することができる。一般に、キメラタンパク質、好ましくは組成物の同等の投与量は、典型的な対象について約1 ng/kg〜約100 mg/kgである。
【０１５６】
経口または静脈内投与用の本発明の典型的な組成物は、患者当たり1日約0.1〜約10 mgの活性成分；患者当たり1日約1〜約100 mgの活性成分；患者当たり1日約25〜約200 mgの活性成分；患者当たり1日約50〜約500 mgの活性成分；患者当たり1日約100〜1000 mgの活性成分；患者当たり1日約1000〜約2000 mgの活性成分であり得る。典型的な投与量は、これらに限らないが、患者当たり1日、約10 mg、20 mg、25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1,000 mg、1,250 mg、1,500 mg、2,000 mg、2,500 mg、3,000 mg、またはそれ超の活性成分を含む。投与可能な組成物を調製するための方法は、当業者に既知であるか、または明らかであり、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005)などの文献に、より詳細に記載されている。
【０１５７】
本明細書に記載される組成物の典型的な投与量は、対象またはサンプルの重量１キログラム当たりのミリグラムまたはマイクログラム量の組成物（たとえば、約1マイクログラム／キログラム〜約500ミリグラム／キログラム、約100マイクログラム／キログラム〜約5ミリグラム／キログラム、または約1マイクログラム／キログラム〜約50マイクログラム／キログラム）を含む。さらに、組成物の適切な投与量は、達成すべき所望の効果に関する組成物の有効性に依存することが理解される。1または複数のこれら化合物を哺乳動物に投与する場合、医師、獣医師、または研究者は、たとえば、最初は相対的に低い投与量を処方し、次に、適切な応答が得られるまで投与量を増加させることができる。加えて、任意の特定の哺乳動物対象のための特定の投与量レベルは、用いる特定の組成物の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、投与の時間、投与経路、排泄の速度、薬剤の組み合わせ、ならびに調節すべき発現または活性の程度を含む多様な因子に依存するであろうことが理解される。
【０１５８】
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物または薬剤は、たとえば、対象の体重1 kg当たり化合物約1 mg(1 mg/kg)から約1g/kgまでの範囲の1日投与量で、投与される。別の実施形態において、投与量は、約 5 mg/kg〜約 500 mg/kgの範囲の投与量である。さらに別の実施形態において、投与量は、約10 mg/kg〜約250 mg/kgである。別の実施形態において、投与量は、約25 mg/kg〜約150 mg/kgである。好ましい投与量は、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、40、または50 mg/kgである。1日投与量は、1日当たり1回投与するか、または、サブ投与量に分割することができ、複数の投与量で、たとえば、1日当たり2回、3回、または4回投与することができる。しかしながら、当業者に認められるであろうように、本明細書に記載される組成物は、異なる量および異なる回数で、投与することができる。当業者は、特定の因子、たとえば、これらに限らないが、疾患の重症度または悪性の状態、対象の以前の治療、全体的な健康、および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が、対象を有効に治療するのに必要な投与量およびタイミングに影響を与え得ることも認めるであろう。さらに、治療的に有効な量の組成物による対象の治療は、単一の治療を含むこともでき、または、好ましくは、一連の治療を含むこともできる。
【０１５９】
所望の治療効果を達成するために、本明細書に記載される化合物または剤は、治療的に有効な1日投与量で数日間、投与することができる。このように、対象において前立腺がんを治療するための化合物の治療的に有効な量は、3日間〜2週間またはそれより長い範囲の期間、継続する定期的な（たとえば、毎日の）投与を必要とし得る。本明細書に記載される組成物は、少なくとも3連続日、しばしば、少なくとも5連続日、よりしばしば、少なくとも10連続日、および時折、20、30、40、またはこれより長い連続日、投与することができる。連続的な毎日の投与は治療的に有効な投与量を達成するために好ましい方法であるが、その投与が対象において治療的に有効な剤の濃度を維持するのに十分に頻繁に繰り返される限り、その剤が毎日投与されなくても、治療に有益な効果を達成することができる。たとえば、1日おき、3日に1回、または、より高い投与量範囲を使用しそれが対象に許容されるなら、剤を1週間に1回投与することができる。
【０１６０】
特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤は、経口的に投与される。特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤（たとえば、SR2211および／またはXY011）は、1日当たり、おおよそ100; 200; 300; 400; 500; 600; 700; 800; 900; 1,000; 1,250; 1,500; 1,750; 2,000; 2,500; 3,000; 3,500; 4,000; 4,500; 5,000mg、またはそれ超の1日投与量で対象（たとえば、成人）に経口的に投与される。特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤（たとえば、SR2211および／またはXY011）は1日当たり1,000〜2,000 mgの1日投与量で対象（たとえば、成人）に経口的に投与される。特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤（たとえば、SR2211および／またはXY011）は1日当たり、おおよそ10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、500mg、またはそれ超の1日投与量で対象（たとえば、成人）に経口的に投与される。特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤（たとえば、SR2211および／またはXY011）は1日当たり25〜200 mgの1日投与量で対象（たとえば、成人）に経口的に投与される。特定の実施形態において、1または複数のRORγ阻害剤（たとえば、SR2211および／またはXY011）および抗がん剤は、経口的に同時投与される。たとえば、1または複数のRORγ阻害剤（たとえば、SR2211および／またはXY011）は、1日当たり25〜2000 mgの毎日の経口投与での抗がん剤とともに、1日当たり25〜1000 mgの毎日の経口投与で同時投与することができる。
【０１６１】
特定の実施形態において、方法は、1または複数のRORγ阻害剤、たとえば、SR2211および／またはXY011、次に、1または複数の抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬（たとえば、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド）、化学療法剤、たとえば、タキサン（たとえば、ドセタキセル）またはタモキシフェン、およびこれらの組み合わせを、連続的に投与する段階を含む。特定の実施形態において、方法は、1または複数の抗がん剤、次に、1または複数のRORγ阻害剤を連続的に投与する段階を含む。
【０１６２】
治療の成功の後は、がんの再発を防止するために対象に維持療法を行うことが望ましいことがある。
【０１６３】
有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内にある。一般的に、組成物の効果的または有効な量は、まず低投与量または少量の組成物を投与し、次に、治療される患者において最小の毒性副作用を伴ってまたは毒性副作用なしに所望の効果が観察されるまで、投与される量または投与量を次第に増加させ、必要に応じて第2または第3の薬物を加えることにより、決定される。
【０１６４】
患者が必要とするおよび患者により許容される投与量および頻度に応じて、組成物の単一または複数回の投与が行われる。いずれの場合でも、組成物は、患者を有効に治療するのに十分な量の本発明の組成物を提供するべきである。一般に、投与量は、許容できない毒性を患者に与えることなく症状または疾患の兆候を治療または緩和するのに十分な量である。
【０１６５】
F. キット、容器、装置、およびシステム
キットおよびシステムの意図されるユーザーに応じて、ならびに特定のユーザーのニーズに応じて、本発明に従い、広範囲の種々のキットおよびシステムを調製することができる。特定の実施形態において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤を含むキットを提供する。他の態様において、本発明は、1または複数のRORγ阻害剤と、1または複数の抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬（たとえば、エンザルタミド、アビラテロン、および／またはビカルタミド）および／または化学療法剤（たとえば、タモキシフェン、および／またはタキサン、たとえば、ドセタキセル）とを含むキットを提供する。
【０１６６】
本明細書に記載されるキットのいくつかは、1または複数のRORγ阻害剤、および／または1または複数の抗がん剤を投与する方法を記載したラベルを含み得る。本明細書に記載されるキットのいくつかは、がん、たとえば、前立腺がん（たとえば、CRPC）、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、または神経膠腫を有する対象においてがんを治療する方法を記載したラベルを含み得る。
【０１６７】
これらに限らないが、1または複数のRORγ阻害剤と、任意に、1または複数の抗がん剤とを含む組成物を含む本発明の組成物は、必要に応じて、化合物を含む1つまたは複数の投与量を提供し得る、アメリカ食品医薬品局 (FDA)または他の規制機関により認可されたボトル、ジャー、バイアル、アンプル、チューブ、または他の容器閉鎖システムにおいて提供することができる。パッケージまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形態の、機関による認可を示す、容器に付随した通知を伴い得る。特定の態様において、キットは、本明細書に記載される製剤または組成物、製剤を含む容器閉鎖システムまたは製剤を含む投与単位形態、ならびに、本明細書に記載される使用の方法を記載した通知または説明書を含み得る。
【０１６８】
特定の実施形態において、キットは、製剤または組成物の種々の要素（たとえば、乾燥成分および液体成分）を保持するためにコンパートメントに分かれた容器、製剤または組成物を作製するための説明書、ならびに、がんを有する患者において免疫応答を増強するための製剤または組成物を投与するための説明書を含む。
【０１６９】
特定の実施形態において、キットは、脱水または乾燥形態における薬学的調製物を、再水和（または再構成）および投与のための説明書とともに含み得る。
【０１７０】
たとえば、経口投与量、直腸内投与量、経皮投与量、または注入可能な投与量（たとえば、筋肉内、静脈内、または皮下注入）での本明細書に記載される化合物の単位投与量を有するキットが提供される。このようなキットにおいて、がん、たとえば、前立腺がん（たとえば、CRPC）、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、または神経膠腫を有する対象において免疫応答を増強するための組成物の使用および付随する利点を記載した情報のパッケージ挿入物を、単位投与量を含む容器に加えて、含めてもよい。
【０１７１】
本発明の特定の実施形態は、1または複数のRORγ阻害剤と、任意に、1または複数の抗がん剤、たとえば、抗アンドロゲン薬（たとえば、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド）および／または化学療法剤（たとえば、タモキシフェンおよび／またはタキサン、たとえば、ドセタキセル）とを含むパッケージを提供する。
【実施例】
【０１７２】
IV. 実施例
本発明を具体的な実施例によってより詳細に説明する。以下の実施例は、例示を目的として提供され、本発明を何らかの形で限定することを意図しない。当業者は、変更または改変しても本質的に同じ結果を得ることができる種々の重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【０１７３】
実施例1. がんの新規治療標的としての核内受容体RORγ
腫瘍は代謝の変化を有するという概念、および核内受容体ファミリータンパク質のメンバーは哺乳類の代謝の重要な制御因子であり、かつ非常に魅力的な治療標的であるという事実に基づき、発明者らは、PCa腫瘍における遺伝子発現のデータマイニングを行い、核内受容体RORγ遺伝子が、正常な前立腺または原発性PCa腫瘍と比較すると転移性PCa腫瘍で極めて過剰に発現していることを見出した。この知見は、RORγがPCa発生および進行において重要な役割を果たしている可能性があることを示す。したがって、発明者らは下記の実験を実施し、RORγが有効なPCa治療法の開発のための新規標的であるという発明者らの結論を強力に裏付ける以下の結果を得た。
(1) 定量的RT-PCR、ウエスタンブロット、および免疫組織化学(IHC)アッセイを発展させて使用し、RORγ mRNAおよびタンパク質を特異的に検出し、RORγがPCaがん細胞およびPCa腫瘍の亜群で過剰発現していることを実証した。図1A〜1Dを参照。
(2) RNA干渉媒介性のRORγ発現サイレンシング/抑制を、siRNAおよびレンチウイルスベクター-shRNAを用いて生じさせ、種々のPCa細胞におけるヒトRORγ遺伝子発現を特異的にブロックした。
(3)siRNAまたはレンチベクターshRNAによるRORγ発現および機能の抑制は、複数の細胞株におけるAR陽性PCa細胞の増殖および生存の強力な阻害をもたらしたが、AR陰性PCa細胞の阻害はもたらさなかった。抑制は、著しい細胞死/アポトーシスも誘導した。細胞増殖の強力な阻害は、転移性CRPCモデルならびにアンドロゲン依存性PCa細胞で観察された。
RORγに対する研究は従来、概日リズム、代謝およびTh17細胞の分化の制御におけるその生物学的機能に向けられる。RORγtと呼ばれるRORγのT細胞特異的アイソフォームは、自己免疫疾患の処置のための治療標的として研究されている。これまで、がん細胞におけるRORγ(またはRORγt)の役割に対するいかなる報告も存在していない。したがって、(1)から(3)における上述の知見は、核内受容体RORγが、以前には述べられていない機能をがんにおいて担い、がんの新規治療標的であるという初めての証拠となる。
(4)8k(N-(3',4'-ジメトキシフェニル)-1-エチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロベンゾ[cd]インドール-6-スルホンアミド；XY011およびE11としても公知である)、7k((E)-1-エチル-2-オキソ-N-(4'-(フェニルジアゼニル)フェニル)-1,2-ジヒドロベンゾ[cd]インドール-6-スルホンアミド)、6f(1-エチル-N-(イソキノリン-7'-イル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロベンゾ[cd]インドール-6-スルホンアミド)、SR2211およびSR1555を含むRORγの低分子阻害剤(インバースアゴニストとしても公知)でPCa細胞を処理することによるRORγ機能の阻害はまた、様々な細胞株モデルにおいてAR陽性PCa細胞の増殖および生存の強力な阻害ももたらしたが、AR陰性細胞ではそうではなかった。図2A〜2Fを参照。siRNAと同様に、当該低分子阻害剤処理は顕著な細胞死を誘発し、強力な阻害活性が複数のmCRPC細胞モデルおよびエンザルタミド耐性PCa細胞モデルにおいて観察された。これに対して、RORα特異的な低分子阻害剤SR3335による同じPCa細胞の処理は、いかなる有意な増殖阻害も示さなかった。RORαはRORサブファミリーの関連メンバーである。
(5)低分子阻害剤SR2211および8k(XY011およびE11としても公知)による免疫無防備状態のヌードマウスの処置は、AR陽性PCa細胞株の1つに由来する異種移植腫瘍の成長を強力に阻害した。図3A〜3Dを参照。これに対して、同じ実験において、エンザルタミド(MDV3100)による処置は、同じタイプの異種移植腫瘍に対していかなる有意な阻害作用も示さなかった。したがって、結果は、RORγがエンザルタミド耐性前立腺がんを治療するのに有効である可能性を有することを示す。TMP778およびGSK805などの多くの他のRORγ阻害剤の中で、発明者らの試験で用いられた低分子阻害剤SR2211および8k(XY011およびE11としても公知)は、関節リウマチ(RA)、炎症性腸疾患(IBD)、および多発性硬化症(MS)などの免疫細胞媒介性自己免疫疾患を処置するための治療としての使用可能性のために、免疫細胞におけるRORγt機能を阻害するそれらの活性に基づき特定された。がん細胞増殖および/または生存におけるそれらの活性は、いずれのタイプのがんでも報告されていない。したがって、(4)から(5)における上述の知見は、RORγを標的とする低分子阻害剤ががんの新規治療剤になる可能性があるという初めての証拠となる。
(6) qRT-PCRおよびウエスタンブロット分析は、SR2211などの低分子阻害剤およびRORγを標的とするsiRNAがAR(たとえば、全長およびARV7などの選択的スプライスバリアントの両方) mRNAの発現およびタンパク質発現を強力に阻害したことを明らかにした。図4A〜4Bを参照。
(7)上記分析はまた、RORγ阻害剤がPCa細胞においてエンザルタミドによる全長ARおよびARバリアントの発現の誘導を効果的に打ち消すことができることも明らかにした。
(8)遺伝子発現プロファイル分析は、RORγの低分子阻害剤が、明確に定義されたAR標的遺伝子の大部分の発現を阻害したことも明らかにした。図5を参照。
(9)遺伝子発現プロファイル分析はまた、RORγ阻害剤が、重要な細胞増殖および生存遺伝子、ならびにアンドロゲン合成の重要な酵素をコードする遺伝子の発現も強力に抑制したことも明らかにした。
(10)特異的ChIPアッセイは、生きているがん細胞における特定のゲノムDNA配列へのRORγ結合を検出するために開発され、ヒトAR遺伝子座における特異的結合部位を検出した。したがって、(6)、(7)、および(8)の知見とともに、この結果は、RORγ阻害剤による1つの主な作用機序（MOA）は、PCa細胞および腫瘍において、AR遺伝子発現の活性化におけるRORγ機能を直接的に阻害することであるという結論を強力に裏付ける。
【０１７４】
現在、PCaの低分子治療剤は、ARを標的とする（エンザルタミドなどのいわゆる抗アンドロゲン物質）か、またはアンドロゲン生合成酵素を標的とする（アビラテロンなど）。
【０１７５】
利点1：1つのタンパク質標的、すなわちRORγを標的とすることによって、2つの最も重要なPCa腫瘍推進経路を強力に阻害する。1つの経路はAR遺伝子/タンパク質自体である。発明者らの知見は、RORγが同じがん細胞におけるAR遺伝子転写を直接的に活性化すること、およびRORγ阻害剤がAR発現を強力に抑制することを示す。もう一方は、腫瘍アンドロゲン生合成経路であり、複数の重要なアンドロゲン合成酵素遺伝子がRORγ阻害剤によって阻害される。
【０１７６】
利点2：腫瘍細胞においてRORγを標的とすることは、エンザルタミドおよびアビラテロンなどの現在の先進的な治療剤に対する耐性の発生を妨げる。いずれの治療剤も、全長ARタンパク質よりさらに強い影響を及ぼすARの選択的スプライスバリアント形態の腫瘍による産生を誘導し、PCa進行をより致死的な形へと推進することが示されている。ARバリアント誘導は、エンザルタミドおよびアビラテロンに対する耐性の主要な機序であると考えられている。発明者らは、RORγ阻害が腫瘍細胞におけるエンザルタミドによるARバリアントタンパク質の誘導を効果的に打ち消すことができることを見出した。
【０１７７】
利点3：腫瘍細胞においてRORγを標的とすることは、他の治療剤に対して耐性を生じているがん(たとえば、エンザルタミド耐性前立腺がん)を処置するのに有効である可能性を有する。
【０１７８】
実施例2．がんの処置のための核内受容体RORγ-AR軸の治療標的化
以下の実施例は、RORγ阻害剤をがんの処置においてどのように用いることができるかを例示する。本実施例は、モデルシステムとして去勢抵抗性前立腺がん(CRPC)を用いる。
【０１７９】
概要
アンドロゲン受容体(AR)は、去勢抵抗性前立腺がん(CRPC)で過剰発現し、活性化過剰となる。しかしながら、AR過剰発現の決定因子は明らかにされていない。本明細書において、発明者らは、Th17細胞の主要制御因子および自己免疫疾患の治療標的であるRORγを、AR異常発現の重要な推進力として特定する。RORγは転移性腫瘍において過剰発現および増幅される。その過剰発現はCRPC細胞増殖をもたらす。RORγは、AR-ROREに活性化補助因子 SRC-1およびSRC-3を動員し、AR遺伝子転写を刺激する。その特異的アンタゴニストは、ARおよびそのバリアントAR-V7の発現を強力に抑制する。RORγアンタゴニストはまた、ゲノム全体でのAR結合、H3K27acマークおよびAR遺伝子ネットワークの発現を著しく減少させる。インビボでは、アンタゴニストは、明らかな毒性なしに、複数のモデルにおいて腫瘍成長を強力にブロックし、CRPC腫瘍をエンザルタミドに対し効果的に感受性にする。まとめると、この結果は、ARの上流で作用することにより、CRPCにおけるこれまで知られていないキープレーヤーとして、および進行性前立腺がんの可能性のある治療標的として、RORγを確立する。
【０１８０】
序論
核内受容体(NR)スーパーファミリーのメンバーであるアンドロゲン受容体(AR)による持続性のまたは再活性化したシグナル伝達は、前立腺がんを、その致死的な形、すなわち、転移性去勢抵抗性前立腺がんすなわちmCRPCへと進行させる。大部分のmCRPCにおける腫瘍は、その遺伝子増幅または変異の有る無しにかかわらず、ARを高度に過剰発現する1。しかしながら、AR遺伝子発現を上方制御する重要な因子についてはほとんど知られていない。アンドロゲンシグナル伝達阻害剤エンザルタミド(ENZ)およびアンドロゲン合成阻害剤アビラテロン(ABI)など最近承認された治療剤は一部の患者に有益である。しかしながら、デノボの獲得耐性は不可避のようである。異常なレベルの全長ARおよび腫瘍内アンドロゲン合成に加えて、機能的リガンド結合ドメイン(LBD)を欠くAR-V7などARの選択的スプライスバリアントの腫瘍細胞による産生は、別の主要な耐性機構を構成する2, 3。現在の治療剤開発は、効力を増大させた抗アンドロゲン物質に大きく焦点を合わせているが、機能的に異常なARのN末端ドメインを破壊するまたはARタンパク質分解を促進することができる作用物質も求められている4〜10。
【０１８１】
RAR関連オーファン受容体(ROR)は、広く認められる組織内因性リガンドに対するNRである。3種類のROR、すなわちRORα、RORβおよびRORγ（それぞれ遺伝子名RORA、RORBおよびRORCである）は異なる組織発現パターンを有し、代謝恒常性および概日リズムを含む異なる生理的機能を果たすようである11, 12。興味深いことに、T細胞は、T細胞特異的なプロモーター使用のためにN末端で異なるアイソフォームであるRORγt(またはヒトではRORc2)を発現する。RORγtは、Th17細胞の発生および自己免疫疾患において重大な役割を果たす。自己免疫疾患および代謝性疾患に対して強力な治療可能性を持つRORγアンタゴニスト/インバースアゴニストがますます開発されている11, 13。他のRORと同様に、RORγは、そのゲノム標的でROREへの単量体結合を通じて構成的トランス活性化機能を示す14, 15。マウスでは、RORγは胸腺、筋肉、および精巣で発現する。前立腺および肝臓でも低いmRNAレベルで検出される。RORγグローバルノックアウトマウスは比較的健常で繁殖可能である16。しかしながら、ヒト腫瘍細胞におけるRORγの発現および機能はほとんど調査されていない。
【０１８２】
この試験において、発明者らは、RORγが前立腺がんの転移性腫瘍において高度に過剰発現しており、CRPC細胞および腫瘍におけるAR過剰発現および異常なシグナル伝達の重要な決定因子として機能することを見出した。RORγ選択的アンタゴニストは、AR遺伝子発現、そのゲノムワイドな結合および異種移植腫瘍の成長を強力に阻害する。よって、発明者らの知見は、CRPCのこれまで知られていないキープレーヤーおよび新規治療標的としてRORγを確立する。
【０１８３】
結果
RORγ/RORCは転移性CRPCにおいて過剰発現および増幅され、CRPC細胞の生存および増殖のために必要とされる
核内受容体(NR)は魅力的な治療標的である17, 18。がん進行におけるNSの潜在的役割を評価するために、発明者らは、発現が変化するNRについて腫瘍遺伝子発現プロファイルの複数のデータセットを検索し、RORサブファミリーのメンバーが異なる発現パターンを示したことを見出した。2種類の異なるデータセットにおいて、RORαおよびRORβの発現は、良性の前立腺組織または限局性腫瘍と比較すると、転移性腫瘍において有意に低下した。これに対して、RORγの発現は転移性腫瘍において著しい増加を示した。重要なことに、RORγ遺伝子RORCは、最近の試験において転移性CRPC腫瘍の6％で増幅が見られる(図6A；図12A)。前立腺検体の抗RORγIHC分析は、核RORγが腫瘍の50％超で過剰発現し、高レベルのRORγタンパク質が腫瘍転移に有意に関連することを明らかにした(図6B)。RORγタンパク質は、CRPC腫瘍に大部分が由来するAR陽性がん細胞株(たとえば、LNCaP、C4-2B、22Rv1、VCaP、PC346CおよびLAPC4)で容易に見られたが、非悪性のヒト前立腺上皮細胞(RWPE1およびPNT-2)では見られなかった(図6C)。
【０１８４】
次に、発明者らは、がん細胞におけるRORγの機能を調べた。様々なRORC siRNAによるRORγのノックダウンは、LNCaPおよびそのCRPC派生C4-2B細胞の増殖を著しく阻害した。強力な増殖阻害はまた、VCaPおよび22Rv1など他のアンドロゲン感受性およびCRPCモデルでも観察されたが、AR陰性PC-3細胞では観察されなかった(図6Dおよび図12B)。この増殖阻害に合致して、RORγノックダウンは著しいアポトーシスももたらし、これは、カスパーゼ活性およびPARP1切断、および重要な増殖および生存タンパク質発現(たとえば、サイクリン-A、-E、-D3、-Cdc2、-Cdc6、およびBcl-xL)ならびにMycおよびERGなど前立腺がんの他の主要な推進力の発現の強力な阻害によって実証された(図6E、6F；図12C)。増殖および生存におけるその決定的な役割と一致して、アンドロゲン感受性LNCaP細胞におけるRORγの異所性発現は、アンドロゲン欠乏条件においてそれらの増殖を強力に促進した(図12D)。
【０１８５】
RORγ選択的アンタゴニストはCRPC細胞の増殖および生存を強く阻害する
最近の研究によって、複数のRORγ特異的アンタゴニストリガンド(たとえば、SR2211およびGSK805、図7A)が特定された19〜23。それらは、Th17細胞媒介性自己免疫疾患モデルの抑制におけるそれらの治療の可能性について評価されている22，24。前立腺がん細胞におけるRORγの決定的な機能を踏まえて、発明者らは、そのアンタゴニストが何らかの増殖阻害作用を有するかどうかを調べた。際立ったことに、試験したRORγアンタゴニストのすべてが、ENZのものよりもはるかに高い効力を有する強力な増殖阻害を示した。たとえば、SR2211はLNCaP細胞において低μMでの阻害効力を示し(1.5 μMのIC50)、その前駆体SR1555はわずかに低い効力を有する有意な阻害作用を示した(図7B、7C；図13A、13B)。RORα/RORAは前立腺がんにおいて別の役割を果たす可能性があるということを含意する図12Aにおける発明者らのデータと一致して、RORα選択的アンタゴニストSR333525はいなかる有意な作用も示さなかった。さらに、SR2211による強力な増殖阻害は、22Rv1、VCaP、LNCaP、LAPC4およびPC346Cを含む他のAR陽性PCa細胞モデルで観察された(図7Cおよび図13A、13B)。RORγアンタゴニストによる有意な増殖阻害は、試験した濃度では非悪性ヒト前立腺細胞RWPE1、正常ヒト線維芽細胞IMR90、またはAR陰性PCa細胞では見られなかった(図7C；図13B)。RORγ遺伝子ノックダウンによる細胞死作用と一致して、アンタゴニストSR2211によるC4-2Bおよび22Rv1細胞の処置は、コロニー形成不良および著しいアポトーシスによって示されるような、細胞生存の顕著な阻害を誘発した(図7D〜7F；図13C、13D)。細胞作用に合致して、アンタゴニストは、Mycを含む重要な増殖および生存タンパク質の発現を強力に阻害した(図7G；図13E)。
【０１８６】
RORγアンタゴニストはARシグナル伝達を強く阻害する
発明者らは次に、2種類の構造的に異なるアンタゴニスト、SR2211およびXY011(以前に化合物8k21として報告された)で処置した細胞のRNA-seqトランスクリプトームを分析し、RORγ阻害により影響を受ける遺伝子プログラムを特定した。いずれかのアンタゴニストによって発現が(ビヒクルと比較して)有意に変化した遺伝子のクラスター形成は、2種類のRORγ阻害剤間の発現変化と高度な一致を示し、両方のアンタゴニストによって75％を上回る遺伝子が減少(クラスター1)または増加(クラスター3)した(図8A)。特に、アンドロゲン除去療法に対する臨床腫瘍反応の予測において有用である26、AR活性シグネチャーの遺伝子は、2つの主要なクラスター(クラスター1および3)の一部を構成する。AR標的として特徴付けられる遺伝子またはアンドロゲン誘導遺伝子は、両方のアンタゴニストによって有意に阻害された。反対に、アンドロゲンで抑制された遺伝子はアンタゴニストによって強力に誘導された(図8A)。重要なことには、アンドロゲン誘導がん細胞の増殖および生存に関連づけられる遺伝子もクラスター1および3に含まれた(図14A)。さらに、アンタゴニストのプロファイルは、抗アンドロゲン物質ENZのものと有意に重複した(下方制御された遺伝子に関してSR2211で41％、XY011で38％) (図8A；図14B)。AR活性シグネチャー26を用いる遺伝子セット濃縮分析(GSEA)によるさらなる試験は、RORγ阻害によってAR遺伝子プログラムが極めて強固に妨害されることを明らかにした(図8B)。重大なことには、アンタゴニストはまた、AR-V727によって優先的に上方制御される遺伝子、および最近ヒトCRPC腫瘍において特定された16-AR標的遺伝子セット28の大部分の発現も強力に阻害した(図14C、14D)。qRT-PCRによって、アンタゴニストおよびRORγノックダウンがKLK3、KLK2、Nkx3.1、およびFKBP5などの古典的なAR標的の一部、およびCAMKK229およびANCCA/ATAD230などCRPCに関連づけられる標的を強力に阻害したことが立証された(図8C；図14E)。
【０１８７】
RORγの阻害はARおよびそのバリアントの発現を強力に抑制し、ARゲノム結合を排除する
ARで制御された遺伝子プログラムに対するRORγ阻害による顕著な影響は、RORγがARの発現および/または機能を制御しているかどうか発明者らが調査するように促した。実際、RORγノックダウンは、C4-2BおよびVCaP細胞における全長ARおよびAR-Vs/7のmRNAおよびタンパク質発現を強力に抑制した。驚くべきことには、RORγアンタゴニスト(SR2211およびXY011)は、ARおよびAR-V7の発現も用量依存的に強く阻害した(図9A、9B；図15A、15B)。類似の用量依存的な阻害は、22Rv1、LAPC4およびPC346Cを含む他のAR陽性がん細胞でも観察された(図15C)。反対に、RORγ過剰発現は、LNCaP細胞におけるAR発現を有意に増大した(図15D)。細胞モデルからの結果に一致して、臨床CRPC腫瘍からの複数のデータセットにおいて、RORγの発現は、AR発現と強力に相関したのみならず、CRPC ARシグネチャー28とも相関した(図16A、16B)。
【０１８８】
AR機能に対するアンタゴニスト作用を評価するために、発明者らは、5μM SR2211で24時間処置してAR発現の有意だが不完全な抑制を引き起こしたC4-2B細胞を用いて、抗AR ChIP-seqを実施した(図17A)。際立ったことに、この処置は、その標的遺伝子座へのゲノムワイドなAR結合の劇的な阻害、ならびに遺伝子活性化関連ヒストンマークH3K27acの有意な減少をもたらした(図9C、9D；図17B)。KLK2、KLK3、CAMKK2、NKX3.1、FKBP5、およびANCCA/ATAD2などその標的のエンハンサーおよび/またはプロモーターでのAR結合は、アンタゴニストによってほぼ完全に排除された(図9C、右パネル；図17C)。AR占有の喪失と一致して、H3K27acおよびH3K4me2/3を含む転写活性化に関連づけられるヒストンマークは、KLK3プロモーターまたはエンハンサーにおいて有意に低減した。予想通り、標的プロモーターでのRNAポリメラーゼII(Pol-II)動員は強く影響された(図9E；図17D、17E)。アンタゴニスト作用と一致して、RORγのノックダウンはAR結合および関連するヒストンマークに対して類似の阻害作用を示した(図17F)。興味深いことに、H3K4me2およびH3K4me3マークならびにPol-IIピークのゲノムワイドな全体的分布は、アンタゴニストに著しく影響されることはなく(図17G)、H4K3me2/3およびPol-IIに対するRORγ阻害が標的遺伝子座特異的であることを示す。
【０１８９】
RORγ選択的アンタゴニスト(SR2211およびXY011)を、RORγ LBDの特有のポケット構造に基づき特定した。しかしながら、アンタゴニストがARを通じて直接的に作用する可能性を除外するために、発明者らはレポーター遺伝子アッセイを実施した。合成アンドロゲンR1881によって活性化され、かつ抗アンドロゲン物質ENZによって抑制することができる多量体化したARE推進レポーターにおいて、RORγアンタゴニストは最大で10 μMで、アンドロゲンAR活性に対していかなる作用も示さなかった(図18A)。さらなる証拠を提供するために、発明者らは、AR増大およびアンドロゲン刺激の両方に感受性を有する5.8 kb KLK3制御配列に関連づけられたレポーターを用いてARレスキュー実験を行った。図18Bの結果は、内因性ARのアンドロゲン非依存性活性およびアンドロゲン刺激性活性の両方が、おそらくAR発現の抑制のゆえに、RORγアンタゴニストによって強力に抑制されたことを示す。際立ったことに、CMVプロモーターによって推進されるAR異所性発現は、アンタゴニストによる阻害を効果的にブロックした。これに対して、異なる機構を介して作用すると、抗アンドロゲン物質ENZは依然として異所性AR活性のブロックに有効であった。まとめると、発明者らの結果は、RORγアンタゴニストは、RORγを通じて作用し、異常なAR発現およびそのゲノム機能を効果的に抑制することを強力に示す。
【０１９０】
RORγは、エクソンROREならびに活性化補助因子SRC-1 およびSRC-3/ACTRを通じてAR遺伝子発現を直接的に制御する
RORγノックダウンまたはアンタゴニストによるAR発現の強力な阻害は、RORγがAR遺伝子転写を直接制御するかどうかの試験に発明者らを導いた。RORγは、特異的配列モチーフAA/TNTAGGTCA(古典的ROREモチーフ)またはCT/AG/AGGNCA(バリアントROREモチーフ)によりDNAに結合する14, 31。250 kb AR遺伝子座にわたって20超の推定ROREを含有する領域のChIP-qPCRは、第1のエクソン(AR TSSの2.3 kb下流)中の部位が強力なRORγ結合を示したことを実証した(図10A)。この部位はバリアントROREモチーフと適合する配列を含有する。重要なことには、細胞をRORγアンタゴニストで処置したとき、おそらくRORγ発現に対する阻害作用のゆえに、RORγ結合は強力に低減した(図7G；図10A)。
【０１９１】
AR遺伝子のRORγ調節を媒介する際の推定ROPE含有部位の機能を調べるために、発明者らはレンチウイルスCRISPR-Cas9編集システムを用いて、まずC4-2B細胞において2セットのsgRNAにより該部位を除去した(図10B、10C；図19A)。細胞増殖および生存が高く上昇したARに依存していることは、編集低減ARを有する細胞クローンを拡大するのを妨げることから、発明者らは、編集において異質な細胞集団を分析した。発明者らは、細胞集団の約半分における除去ですら、上流プライマーP1およびP2によって検出される総AR転写物の強力な低減をもたらしたことを見出した(図10D)。次に、発明者らは、レンチウイルスに感染した細胞をRORγアンタゴニストで処置し、プライマーP3およびP4を用いて欠失させたまたは野生型の対立遺伝子からのAR転写物を分析した。予想通り、WT対立遺伝子からの転写物はアンタゴニストによって強力に阻害された。反対に、同じサンプルにおいて、欠失させた対立遺伝子からの転写物レベルは、いずれのアンタゴニストによっても変化せず(図10E；図19B)、この部位がAR転写のRORγアンタゴニスト阻害に必要とされることを示した。その上、予想通りに、3種類のsgRNAは、単独で使用すると、ARタンパク質発現に対して「ノックアウト」作用を引き起こした。重要なことには、RORE配列に隣接するインデル型の変化を引き起こすように設計された唯一のsgRNAであるsgRNA#2、は、AR mRNA発現の有意な阻害を示したが、他の2つは作用を示さなかった(図19C)。最後に、発明者らは、ROREについてレポーター遺伝子アッセイを実施し、それがRORγ媒介性トランス活性化に高い反応性を有することを見出した。コアRORE配列における変異またはRORγのC末端のAF2トランス活性化ドメインの欠失は、AR-RORE依存性活性化を完全に抑止した。RORγアンタゴニストは用量依存的に活性化を抑制した(図10F)。その上、RORγ阻害、AR発現阻害および抗増殖の間に厳密な相関性が観察され(図20A〜20B)、RORγアンタゴニストによるAR発現の抑制はがん細胞におけるそれらの作用の主要な機構を構成することを示した。
【０１９２】
RORγは、p160/SRC/NCoAファミリーメンバーなどの補因子との会合を通じて遺伝子転写を活性化する32。実際、SRC-1およびSRC-3/ACTRはAR-RORE部位を占めることが見出されたが、SRC-2はそうでなかった。さらに、それらの結合は、RORγアンタゴニストまたはノックダウンによって強力に低減し(図10G；図21)、SRCがRORγを介して該部位に動員されたことを示した。SRC-1およびACTRのノックダウンは個別でもまたは組み合わせでもAR mRNAおよびタンパク質発現を強力に減少させたが、SRC-2はそうではなかった。がん細胞においてSRC-1およびACTRを選択的に分解することが最近示された強心配糖体阻害剤であるブファリンによる細胞の処置33もまた、AR発現の用量依存的な阻害をもたらした(図21；図22A、22B)。次に、発明者らは、局所クロマチンに対するRORγ阻害の影響を評価した。SR2211による処置は、RORE部位およびARプロモーターにおいて遺伝子活性化マークH3K4me3およびH3K27acを強力に低下させた(図10G；図22C)。AR転写物の強力な低下と一致して、ARプロモーターおよびRORE部位でのPol-II占有は、RORγ阻害剤によって有意に阻害された。
【０１９３】
RORγのアンタゴニストは腫瘍成長を強く阻害し、CRPC腫瘍をENZに対して感受性にする
発明者らは次に、前立腺がん腫瘍成長に対するアンタゴニスト作用を評価した。疾患不均一性を考慮し、異なる特性を有する異種移植腫瘍(たとえば、変異AR LBDを有するC4-2B、増幅AR遺伝子およびAR-V7を有するVCaP、高レベルの複数のARバリアントを有する22Rv1、およびAR陰性PC3)を用いた。ENZ耐性22Rv1を含む3種類のAR陽性腫瘍モデルにおいて、発明者らは、5 mg/kgのSR2211の腹腔内投与によるマウスの処置が腫瘍成長を効果的に停止させたことを見出した(図11A、11B；図23A)。強力な腫瘍成長阻害はまた、試験したモデルにおいて他のアンタゴニストXY011ならびにRORγのshRNAノックダウンでも観察された(図23B；図24)。さらに、同所性モデルにおいて、アンタゴニストはまた、腫瘍成長のブロックに非常に効果的であった(図25A〜25C)。図7CのようにインビトロでPC3細胞の増殖に対して強力な作用がないことと一致して、PC3由来異種移植腫瘍ではアンタゴニストによる有意な阻害作用は観察されなかった(図26A〜26C)。
【０１９４】
とりわけ、腫瘍ARおよびAR-V7発現ならびにAR標的は著しく阻害された一方で、切断されたカスパーゼ-3/7によって測定される腫瘍細胞アポトーシスは強く誘導された(図11C)。腫瘍のChIP分析は、アンタゴニスト処置がAR-ROREへのRORγ結合およびKLK3へのAR結合ならびにH3K27ac濃縮を強力にブロックしたことを示した(図27A〜27C)。その上、VCaP由来の去勢抵抗性モデルでは、5 mg/kgのアンタゴニストSR2211単独がCRPC腫瘍成長の阻害において非常に強力であった一方で、10 mg/kgのENZ単独はわずかに効果を有するだけであった。この2つの同時投与は腫瘍サイズの持続的な低減をもたらし、RORアンタゴニストがCRPC腫瘍をENZに対して感受性にすることができることを示した(図11D)。以前に報告されたように34, 35、VCaP異種移植腫瘍は微小転移を示す。SR2211処置は、大腿骨および肝臓への転移を強力に阻害した(図28A)。ENZと同様に、RORγアンタゴニストは、動物の全体重および重要臓器の重量、ならびにそれらの一般的挙動に基づき、良好な耐容性を示した(図28B、28C)。RORγが脂肪生成因子である36ことと一致して、アンタゴニストは白色脂肪組織の量を低下させた。このように、アンタゴニストは、明らかな毒性なしに、CRPC腫瘍成長をブロックし、腫瘍をENZに対して効果的に感受性にすることができる。
【０１９５】
興味深いことに、ENZとは異なり、アンタゴニストは、マウス前立腺および精巣などのアンドロゲン反応性組織の成長または該組織におけるAR発現に対していかなる認識可能な作用も示さなかった(図29A〜29C)。2種類の非悪性ヒト前立腺上皮細胞の分析は、アンタゴニストが内因性AR発現に対していかなる有意な作用も有さなかったことを示した(図30A)。基礎にある機序を調べるために、発明者らはChIPを実施し、マウス前立腺組織および2種類のヒト細胞株ではRORE対応部位への検出可能なRORγ結合は見出せなかった(データは示さず)。免疫ブロットは、ヒト細胞における非常に低レベルのRORγ発現を明らかにした(図30A)。配列比較は、マウスAR遺伝子の対応部位が機能的ROREを欠くことを示した14, 15(図30B)。まとめると、発明者らの結果は、RORγアンタゴニストは腫瘍細胞特異的にAR発現を阻害できることを示す。
【０１９６】
考察
CRPC発生の最も一般的な機序は、腫瘍における高レベルのARおよびそのバリアントによって媒介されるARシグナル伝達の再活性化であるように思われる。その極めて重要な役割にもかかわらず、AR発現を効果的に抑制する治療的に実施可能な手段は未だ欠いている。本明細書における発明者らの研究は、RORγがAR遺伝子発現の重要な決定因子として作用することを実証するのみならず、CRPCの有効な治療的介入のためのまたとない機会も提供する。発明者らは、RORγがエクソンROREに結合することによっておよび部分的にNR活性化補助因子SRC-1およびSRC-3を通じて、AR遺伝子転写を直接的に刺激することを見出した。SRCおよび他のAR活性化補助因子は前立腺がんで重要な役割を果たすものと考えられる37〜41が、それらはAR遺伝子過剰発現に直接的に関与することは示されていない。本明細書において発明者らは、RORγの低分子アンタゴニストがRORγおよびAR遺伝子座へのSRC結合を強く妨害し、局所活性化ヒストンマークを低減させかつインビトロおよびインビボでのAR発現を効果的に抑制することを実証する。E2F1、LEF1およびNF-κBなど少数の転写因子はAR発現を活性化することが示されている42〜45。RORγは、SRCおよび他の活性化補助因子との同時相互作用を通じて、前記転写因子または他の因子と協力して作用する可能性がある46。
【０１９７】
抗アンドロゲン物質およびCYP17阻害剤(たとえば、ENZおよびABI)によって処置された腫瘍におけるARの選択的スプライスバリアントは治療耐性および転移に関連がある47。最近、AR NTD、すなわち内因性の構造化されていない/無秩序なドメインを標的とするか、または全長ARタンパク質の分解を促進する作用物質が探索されている5〜9。本明細書における発明者らの研究は、異なる合理的なアプローチを提案する。発明者らは、その選択的アンタゴニストによりRORγを標的とすることによって、AR-V7などのARバリアントならびに全長ARの発現が遺伝子転写レベルで効果的に阻害され、そのために問題の根本的原因、すなわち、高く上昇したAR遺伝子転写物およびタンパク質が軽減されるか、またはさらには取り除かれることを見出した。アンタゴニストの顕著な分子作用は、腫瘍成長の強力な阻害において現れ、これは、AR遺伝子増幅および/または高レベルのARバリアントを有するモデルを含む様々なAR陽性モデルにおいて一貫して観察されるが、AR陰性モデルでは観察されない。重要なことには、ENZに耐性を有する腫瘍はアンタゴニスト(単独でまたはENZとの組み合わせでのいずれか)に対して非常に感受性が高く、RORγを標的とすることは幅広い臨床的有用性を有し得ることを示す。AR発現に対するRORγアンタゴニストの作用は、AR LBD機能の代わりに、抗アンドロゲン物質とは異なる治療上の利点を提案する可能性もある。実際、精巣および前立腺などの正常なアンドロゲン反応性組織の成長および機能の明白な抑制を示す抗アンドロゲン物質とは異なり、RORγアンタゴニストは、マウス組織のサイズまたは該組織およびヒト非悪性前立腺細胞におけるAR発現に対していかなる有意な影響も示さない。このアンタゴニストの腫瘍特異的作用はおそらく、腫瘍細胞が高く上昇したレベルのARに依存していること、およびRORγによるARの腫瘍細胞特異的制御に起因し得る。
【０１９８】
CRPC細胞におけるARプログラムに対するRORγアンタゴニストの影響は広範囲にわたるように見え、CRPC腫瘍において上方制御される、下方制御される、または持続的に発現されるAR標的を含む28。しかしながら、CRPC腫瘍に対する全体的な影響はARおよびそのプログラムに限定されるとは考えにくい。たとえば、Mycの強力な抑制は、AR阻害の下流作用であるとは考えにくい。その上、炎症性腫瘍微少環境は、IL-17を含むサイトカインの産生を通じてCRPCおよび腫瘍転移を促進すると考えられ48、ここで、腫瘍細胞中のRORγまたは白血球中のRORγt は重要な役割を果たす可能性がある。これらのことから、RORγを標的とすることは、おそらく異常なARシグナル伝達を含む複数の経路をブロックすることを通じて、腫瘍成長および転移を止めることができる。より強力かつ経口で生体利用可能なRORγアンタゴニストが開発されており、ヒト自己免疫疾患について臨床試験に入っていることから、本明細書における発明者らの知見はおそらく、新世代の前立腺がん治療の開発において直接的な意味合いを持つであろう。
【０１９９】
材料および方法
細胞培養
LNCaP、C4-2B、22Rv1、PC-3、およびPC346Cの前立腺がん細胞をRPMI1640中で培養し、VCaP、HEK293Tおよびヒト線維芽細胞 IMR90細胞をDMEM中で培養し、LAPC-4をIscove's MEM(すべてCorningより)中で培養し、RWPE-1およびPZ-HPV-7を添加剤を加えたKeratinocyte Serum Free Medium (K-SFM) (Invitrogen)中で培養した。RWPE-1およびPZ-HPV-7を除くすべての培養培地に、他に指示された場合を除き、10％FBS(Hyclone)を追加した。実験のために、C4-2B細胞を、他に指示のない限り、(CRPC状態を模倣するために)1％標準FBSを加えた9％cds-FBSを追加したRPMI中で培養し、22Rv1細胞を10％cds-FBSを追加したRPMI中で培養した。細胞を5％C02インキュベーター中で37℃にて増殖させた。LNCaP、VCaP、22Rv1、PC-3、293T、IMR90、PZ-HPV-7およびRWPE-1はATCCに由来する。C4-2BはUroCor Inc.(Oklahoma City, OK)に由来する。LAPC4およびPC346Cはそれぞれ、Dr. Charles Sawyers (MSKCC, New York)またはDr. Adrie van Bokhoven (University of Colorado)によって提供された。前立腺がん細胞株は、STRプロファイリングを用いてATCCによって最近確認された。細胞株はマイコプラズマに対して陰性であることを定期的に試験した。
【０２００】
化学物質
化学物質の供給元は以下の通りである；SR2211、CalbiochemおよびTOCRIS；SR1555およびSR3335、Cayman。化合物8kとして以前に報告されたXY011に対する情報は以前に記載された21。他の化学物質は、他に指示のない限り、Sigma由来である。
【０２０１】
qRT-PCRおよび免疫ブロット分析
全RNAを6ウェルもしくは10cmプレートの細胞からまたは異種移植腫瘍から単離し、cDNAを、以前のように49調製し、SYBRの存在下で増幅および測定した。簡単に説明すると、蛍光値を収集し、融解曲線分析を実施した。倍数差を以前に記載されたように計算した49。実験を少なくとも3回実施し、データを平均値±s.d.として表した。細胞溶解物を、RORγ、AR、AR-V7および表示したタンパク質を特異的に認識する抗体による免疫ブロットによって分析した。この試験で用いられるPCRプライマーおよびすべての抗体を表3および4で説明する。
【０２０２】
臨床腫瘍におけるROR mRNA発現、遺伝子変異、およびCRPC ARシグネチャーとの関連の分析
以前の研究50〜53からの公的に入手可能な前立腺がん発現データセットGSE6919、GSE35988、GSE6811およびGSE70768をGEOからhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/にてダウンロードした。データセットは、良性、原発性、転移性および/またはCRPC腫瘍サンプルの遺伝子発現プロファイルを含有する。RORについて正規化したプローブセット発現を、有意性について両側ｔ検定によって様々な組織/腫瘍群間で比較した。計算をR統計パッケージで実行した(http://www.r-project.org/)。ROR遺伝子の遺伝子変異について、Cancer GenomicsのcBioPortal(http://www.cbioportal.org)にある最近のゲノム研究54からのデータを調べ、遺伝子変異のOncoPrint表示を提示した。腫瘍におけるRORγとARとの間の発現相関性をピアソンの相関係数(r)および有意性について両側t検定を計算することによって評価した。RORγとARシグネチャー活性との間の相関性について、150個のCRPC ARシグネチャー遺伝子28の発現を以前に報告された55ように1つの発現プロファイルとして要約し、その後、ピアソンの相関統計の計算に適用した。
【０２０３】
免疫組織化学的検査(IHC)および統計解析
IHCを、以下の改変を加えて以前に記載された49, 56ように実施した。組織マイクロアレイ(Biomax.USからのTMA PR803b)の切片の抗原回復を圧力釜で実施した。次いで、スライドを1：50希釈での抗RORγモノクローナル抗体(AFKJS-9, eBioscience)と一緒に4℃にて一晩インキュベートし、続いて、Vectastain Eliteキット中のビオチン化二次抗体およびABC試薬と一緒にインキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色した。TMAは70症例の前立腺がん由来の検体を含有した。陽性核染色のパーセンテージは以下のようにスコア化された：0％〜＜5％、スコア0；5％〜＜10％、スコア1；10％〜50％、スコア2；＞50％、スコア3。グループ間の免疫ブロットにおける差および相関性はχ2検定により分析した。
【０２０４】
細胞の生存度、アポトーシスおよび増殖アッセイ、ならびにコロニー形成
細胞生存度について、細胞を合計100 μlの培地中で1ウェル当たり1500〜2500細胞(増殖に最適な密度)で96ウェルプレートに播種した。12時間後に、100 μlの培地中に段階的に希釈した化合物を、細胞に添加した。インキュベーションの4日後に、Cell-Titer GLO試薬(Promega)を添加し、GLOMAXマイクロプレートルミノメーター(Promega)で製造者の説明書に従って発光を測定した。すべての実験ポイントを6連の生物学的反復で設定し、実験全体を3回繰り返した。データを、ビヒクルで処置した細胞を100として設定した生細胞のパーセンテージとして表示する。推定インビトロIC50値をGraphPad Prism 6ソフトウエアを用いて計算した。
【０２０５】
アポトーシスに関して、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介性dUTPニックエンドラベリング(TUNEL)を、以前に記載された56ように、インサイチュー細胞死検出キット(Roche)を用いて実施した。結果を、アポトーシス細胞数/総細胞数のパーセンテージとして表す。カスパーゼ-3/7活性を、製造者の説明書に従って発光カスパーゼ-Glo 3/7アッセイキット(Promega Corporation, Madison, USA)を用いて測定した。細胞増殖について、細胞をウェル当たり2×105で6ウェルプレートに播種し、表示したように処理した。総生細胞数をコールター細胞カウンターを用いて計数した。コロニー形成について、800細胞を6ウェルプレートのウェルに播種し、培地を3日毎に交換し14日間培養した。細胞クローンが目に見えるレベルで増殖したときに、培地を除去し、細胞を10％ホルマリンで10分間固定した。次いで、プレートをPBSで2回洗浄し、細胞コロニーを0.2％クリスタルバイオレット(10％ホルマリン中)で15分間染色した。PBSで5回洗浄した後に細胞コロニーの数を計数した。上記アッセイを3連で行い、全体の実験を3回繰り返した。
【０２０６】
shRNAおよび過剰発現レンチウイルス産生ならびにsiRNAトランスフェクション
RORγ/RORCを標的とするshRNAをコードするレンチウイルスプラスミド(TRCN0000033655およびTRCN0000033658)をSigmaから購入した。非標的指向対照shRNAを記載のように49用いた。RORγ過剰発現について、pLX304(DNASU)中のヒトRORγ cDNAを増幅し、レセプターN末端にV5タグを有する改変pLX304ベクター内にクローン化した。記載49のように、10 cmディッシュ中での上記shRNAレンチウイルスベクター、psPAX2およびpMD2.Gのコトランスフェクション後に、レンチウイルス粒子を293T細胞内に産生させた。遺伝子ノックダウンのためのsiRNAをDharmaconから購入した。RORγおよび様々なSRC向けのsiRNA標的配列を表5に列記する。トランスフェクションを、製造者の説明書に従ってOptiMEM (Invitrogen)およびDharmafectin#l (Dharmacon)により実施した。
【０２０７】
レポーター構築物およびレポーター遺伝子アッセイ
一過性トランスフェクションおよびレポーター遺伝子アッセイを、以下の改変を加えて以前に記載された49ように実施した。22Rv1細胞に5×ARE-tk-luc、pcDNA3.1-hAR、および正規化のためのpCMV-β-galをトランスフェクトすることによってAREレポーター遺伝子アッセイを実施した。用いた全DNAと同じ量を保証するよう、特定の遺伝子発現を除いた構築物によるトランスフェクションのために、対応する空のベクターを用いた。簡単に説明すると、10％cds-FBS (Hyclone)を追加したホルモン欠乏培地で96ウェルプレートに播種した22Rv1細胞に、リポフェクタミン2000 (Life technology, Carlsbad, CA, USA)および表示したプラスミドDNAをトランスフェクトした。次いで、トランスフェクションの12時間後に細胞を3 nm R1881、表示した濃度のRORγアンタゴニスト、またはENZでさらに24時間処理し、その後、β-galおよびルシフェラーゼアッセイのために回収した。ROREレポーター遺伝子アッセイについて、4コピーの新たに特定したAR-RORE TTCTGGGTCAをtk-ルシフェラーゼレポーターベクター内に挿入することによって、4×AR-RORE-tk-lucを構築した。AR-RORE変異体型(AR- RORE mut)は、TTCTGGGTCAからTTCTGAACGAへと変異した配列を含有する。リポフェクタミン2000(Life technology, Carlsbad, CA, USA)を用いて、示したようにCMX-RORγまたはCMX-RORγΔH12発現ベクターおよびRORE-tk-lucレポータープラスミドを細胞(HEK293T)にコトランスフェクトした。12時間のインキュベーション後、細胞を、示したようにビヒクルまたはRORγアンタゴニストでさらに24時間処理した。Gal4駆動レポーターアッセイについて、293T細胞にGal4-RORγLBDおよびpGL5-lucレポーターをトランスフェクトした。次いで、ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼをLuciferase Assay Substrate (Promega)および発光β-ガラクトシダーゼ Detection Kit II (Clontech)で分析した。すべてのトランスフェクションを3連で実施し、各実験を少なくとも3回繰り返した。
【０２０８】
ゲノム欠失を検出するための、CRISPR/Cas9 sgRNA設計、レンチウイルス産生およびPCRに基づくアッセイ
sgRNAを、MIT CRISPR設計ソフトウエア(http://crispr.mit.edu)を用いて設計した。sgRNAに対応するオリゴを合成し、lentiCRISPRv2およびlentiGuideオリゴクローニングプロトコル(Addgene, plasmid#52961)に従って、lentiCRISPR v2内にクローン化した。sgRNA配列は以下の通りである：
2018513123.tif 000008
レンチウイルス粒子を上述のように293T細胞中で産生させた。
【０２０９】
C4-2B細胞を6ウェルプレートに1ウェル当たり2×105細胞でプレーティングした。16時間後、1 mlのウイルス含有上清を10 ng ポリブレンと一緒に細胞に添加した。4から6時間後、培地を標準培地に変更し、さらに72時間培養した。ゲノムDNAを、Pure link Genomic DNAキット(Life technology)を用いて細胞から単離した。sgRNA標的部位に隣接する表示したプライマーを用いてPCRを実施した。欠失させた対立遺伝子からのPCR産物を、アガロースゲルを泳動させることによって精製し、pGEM-T Easy Vector System (Promega)を用いてプラスミド内にライゲーションした。プラスミドDNAをミニプレップキット(Qiagen)によって単一細菌コロニーから精製し、Sanger配列決定法を用いてGENEWIZ (Davis, California)によって配列決定した。
【０２１０】
CRISPR/Cas9-sgRNAレンチウイルスで処理した細胞におけるAR mRNA発現の分析
細胞を上記のようにCRISPR/Cas9 sgRNAレンチウイルスに感染させ、2日間培養した。次いで、RORγアンタゴニストまたはビヒクルを加え、細胞をさらに2日間培養した。全RNAをTRIzolにより抽出し、逆転写した。生じた鋳型cDNAおよび表示したプライマーを用いて、半定量的RT-PCRを実施した。PCR産物をアガロースゲル上で分離させた。バンドの定量化を以前に報告された57ように実施した。バンド強度を相対的吸光度単位として表し、GAPDHに対して正規化した。
【０２１１】
RNA-seqデータ分析
RNA抽出前に、C4-2B細胞をビヒクルまたはアンタゴニストXY011 (5 μM)およびSR2211(5 μM)またはENZ (20 μM)で48時間処理した。1 μg全RNA由来のRNA-seqライブラリーを、製造者の説明書に従って、Illumina Tru-Seq RNA Sampleを用いて調製した。ライブラリーをAgilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)で検証した。配列決定をBGI Tech (Hong Kong)にてIllumina HiSeq 2000シークエンサーで実施した。FASTQフォーマット済の配列データを、標準的なBWA-Bowtie-Cufflinksワークフロー58〜60を用いて分析した。簡単にいえば、BWAおよびBowtieソフトウエアを用いて配列リードを参照ヒトゲノムアセンブリ(Feb. 2009, GRCh37/hg19)にマッピングした。続いて、Cufflinksパッケージ61をRPKM(リード/キロベース/100万個のマッピングされたリード)またはFPKM(断片/エクソンモデルのキロベース/100万個のマッピングされたリード)で転写物アセンブリ、正規化された遺伝子およびアイソフォーム発現の定量化に適用し、差次的発現(Cuffdiff)について試験した。低発現値を原因とする誤った倍数レベルを避けるために、(両方である必要はないが)ビヒクル/対照細胞、またはアンタゴニストで処理した細胞のいずれかに対して、発現RPKM値またはFPKM値＞1を有する遺伝子のみを含める。少なくとも1.5倍上下した発現変化をClusterソフトウエア62においてK-平均法クラスター化アルゴリズムでクラスター化した。クラスターはツリー表示で示された。RNA-seqデータはアクセッションコードGSE72483でNCBI-GEOに寄託されている。
【０２１２】
GSEA分析
以前に記載された63ようにJavaデスクトップソフトウエア(http://www.broadinstitute.org/gsea)を用いて、GSEAを実施した。縮重limma log2倍数変化に従って遺伝子をランク付けし、GSEAツールをすべてのデフォルトパラメータによる「プレランク付け」モードで用いた。以前に報告されたAR活性シグネチャー遺伝子26をGSEA分析で用いた。
【０２１３】
ChIP-qPCR分析
ChIP-qPCR分析を以前に記載されたように49実施した。ChIPアッセイに用いた抗体は、AR (Santa Cruz；sc-815)；RNA Pol-II (Santa cruz；sc-899)；H3K4me2 (Abcam ab32356)；H3K4me3 (Abcam；ab8580)；H3K27ac (Abcam；ab4729)；H3 (Active Motif；#39163)；p300 (Santa Cruz；sc-585)；SRC-1(Santa Cruz；sc-8995)；SRC-3/ACTR64、およびIgG (Santa Cruz；sc-2027)である。ChIPアッセイで用いたPCRプライマーは補足表2に列記した。ChIPを各実験ポイントで3連で実施し、各実験は3回繰り返した。
【０２１４】
ChIP-seqおよびデータ分析
C4-2B細胞をビヒクルまたはSR2211 (5 μM)で24時間処置し、その後ChIP-seqのために回収した。ChIP-seq実験を記載された65ように実施した。抗AR ChIP-seqを2つの独立した実験で繰り返した。AR (Santa Cruz；sc-815)；RNA Pol II (Santa cruz；sc-899)；H3K4me2 (Abcam ab32356)；H3K4me3 (Abcam；ab8580)；H3(acetyl K27) (Abcam；ab4729)に対する抗体を用いた。ライブラリーをBioanalyzer 2100 (Agilent)で定量化し、Illumina HiSeq 2000 Sequencer (BGI, Hong Kong)で配列決定した。Bowtie 266を用いて、配列決定タグをホモ・サピエンス(Homo Sapiens)(ヒト)参照ゲノム(hg19)に対してマッピングした。独自にマッピングしたタグをMACS(2.1.0) 67によるピーク呼び出しに用いて、バックグラウンドと比較してChIP-Seq濃縮の領域を特定した。5×10-2の濃縮のq値閾値をすべてのデータセットに用いた。生のリードアライメントファイルから正規化したゲノムワイドなシグナル被覆度トラックを、 UCSCツール MACS2 (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/bedGraphToBigWig/bedClip)およびbedTools (http://code.google.com/p/bedtools/)により構築した。濃縮されたゲノム領域でのChIP-seqシグナルの視覚化(avgprofおよびheatmap)を、ngs.plot (https://github.com/shenlab-sinai/ngsplot)を用いることによって達成した。ChIP-seqデータはアクセッションコードGSE72714でNCBI-GEOに寄託されている。
【０２１５】
異種移植腫瘍モデルおよび化学物質処置
4週齢のオスSCID C.B17マウス(C4-2BおよびVCaP用)またはBALB/c nu/nu胸腺欠損マウス(22Rv1およびPC-3用)をHarlan Inc.から購入した。腫瘍を確立するために、2×106細胞を合計で100 μLのPBS/マトリゲル(1：1)に懸濁し、マウスの両側の側面に位置する背部に皮下移植した。検出力計算(http://www.biomath.info/power/)および同じ異種移植モデルに関連する以前の研究34, 68に基づくと、6匹以上の動物群サイズが高い統計的検出力を有すると推定された。腫瘍体積がおよそ80 mm3であったときに、マウスをランダム化し、次いで、100 μlのビヒクルまたはRORγアンタゴニストSR2211、XY011/8k(15％ Cremophor EL、Calbiochem、82.5％PBS、および2.5％DMSOの製剤で)のいずれかで週に5回腹腔内(i.p.)処置した。腫瘍成長をノギスによってモニターし、式：(π/6(長さ×幅2))を用いて体積を計算した。試験過程時の体重もモニターした。試験の最後にマウスを屠殺し、腫瘍を解剖し、重さを量った。加えて、前立腺、精嚢、精巣、腎臓、心臓、肺、肝臓、精巣上体脂肪体および脾臓も回収し、重さを量った。去勢抵抗性VCaP異種移植片(CRPC-VCaP)の成長に対するRORγアンタゴニストおよびENZの組み合わせの作用を評価するために、最初に、上記のようにSCID C.B17マウスにVCaP細胞を注入し、腫瘍を確立した。次いで、およそ180 mm3の腫瘍を有するマウスを外科的に去勢した。次いで、それらを腫瘍縮小について観察した。腫瘍が去勢前のサイズに戻ったら、マウスをランダム化し、ビヒクル、5 mg kg-1 SR2211、10 mg kg-1 ENZまたは5 mg kg-1 SR2211と10 mg kg-1 ENZとの組み合わせで処置した。ENZは以前に記載された68ように経口胃管栄養によって与えられ、SR2211は上記のようにi.p.投与された。ランダム化の時点で、腫瘍を有さないか平均より2倍大きいまたは小さい腫瘍を有する場合、マウスを試験から除外した。
【０２１６】
同所性前立腺腫瘍の成長に対するRORγアンタゴニストの作用を評価するために、上記のようにマトリゲルに懸濁させたC4-2細胞をSCID C.B17マウスに同所的に注入した。腫瘍成長をモニターするために、マウスから採血し、PSA(ヒト)ELISAキット(Abnova)を用いて血清PSAレベルを測定した。血清PSAが検出可能であったとき、マウスを処置についての種々の群にランダム化した。腫瘍成長に対するRORγノックダウンの作用を評価するために、対照shRNAまたはRORγを標的とするshRNAをコードするレンチウイルスに感染させたC4-2B細胞を、マウスの背部側面の両側に皮下注入した。腫瘍成長をノギスにより毎週モニターした。腫瘍体積を(処置群に対して)盲検で測定した。この手法はInstitutional Animal Care and Use Committee of University of California Davisによって承認された。
【０２１７】
統計解析
示したように、細胞培養に基づく実験を3回以上実施し、アッセイポイントは3連または6連で行った。データは3回の独立した実験からの平均値±s.d.として表す。統計解析は両側Student t検定を用いて実施し、平均値と比較した。p＜0.05は有意とみなした。
【０２１８】
（表３）免疫ブロット用の抗体
2018513123.tif 000009
【０２１９】
（表４）qPCRおよびChIPアッセイ用のプライマー
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【０２２０】
（表５）siRNA配列
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【０２２１】
実施例3. 様々なヒトがんの腫瘍細胞における受容体特異的な低分子阻害剤による核内受容体RORγの標的化
以下の実施例は、多種多様な異なるRORγ阻害剤が、前立腺がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、リンパ腫、および神経膠腫を含む多数の異なるタイプのがんの処置においてどのように用いることができるかを例示する。
【０２２２】
CellTiter-GLOアッセイを用いて、異なるタイプのがんの細胞の生存度を、異なる濃度のRORγ低分子阻害剤による4日間の処置後に測定した。図31A〜31Cは、RORγ阻害剤SR2211、GSK805、およびGSK9bが、主要な分子的特徴が異なる乳がん細胞の増殖および生存を強力に阻害し、トリプルネガティブ乳がん(TNBC)細胞はER陽性乳がん細胞より感受性が高いことを示す。具体的には、RORγ阻害剤GSK805およびSR2211は、MDA-MB468、MDA-MB231、BT20、SUM149、およびHCC1937を含むTNBC細胞においておよそ1 μMから10 μM未満の範囲のIC50値を示した(図31F)。GSK805およびSR2211はまた、SKBR3およびHCC1954などのHER2陽性細胞の比較的強力な阻害も示した(図31F)。加えて、GSK805およびSR2211は、10 μMを上回るIC50値で、MCF-7およびT47DなどのER陽性細胞の有意な阻害を示した(図31F)。GSK9bは、よりわずかに低い効果であったが、GSK805のものと同様の阻害パターンを示した。RORγ阻害剤GNE3500もまた、HER2陽性HCC 1954細胞株、TNBC MDA-MB468およびMDA-MB231細胞株、ならびに放射線耐性MCF-7-C6細胞株など様々な乳がん細胞の増殖および生存の有意な阻害を示した(図31F)。
【０２２３】
図31Eおよび31Fは、様々なRORγ低分子阻害剤が、放射線(MCF-7-C6)およびタモキシフェン(MCF-7-TamR)などの標的療法を含む様々な療法に耐性を有するヒト乳がん細胞の増殖および生存を強力に阻害するのに有効であったことを示す。図31Dは、SR2211およびGSK805などのRORγ阻害剤はタモキシフェン耐性乳がん細胞をタモキシフェンに対して感受性にすることができたことを示す。タモキシフェン耐性MCF-7-TamR細胞株の場合、タモキシフェン(1 μMの4(OH)-タモキシフェン)単独ではいかなる阻害作用も示さず、実際には、わずかな刺激を示した。しかしながら、タモキシフェンは、SR2211およびGSK805などのRORγ阻害剤と組み合わせて用いると、タモキシフェン耐性乳がん細胞に対する相乗的な増殖阻害作用を示した。
【０２２４】
図32A〜32Cは、RORγ阻害剤SR2211およびGSK805が、発がん性変異KRAS遺伝子(たとえば、A427、Calu1、A549、H23、およびH358)を有する細胞、発がん性BRAF変異遺伝子(たとえば、H1666)を有する細胞、EGFR変異遺伝子(たとえば、HCC827およびPC-9)を有する細胞、およびEGFRチロシンキナーゼ阻害剤エルロチニブに感受性を有する(たとえば、HCC827およびPC-9)または耐性を有する(たとえば、A427およびH1975)細胞を含む、異なる分子的および組織学的特徴を有する肺がん細胞の増殖および生存を強力に阻害したことを示す。これらの細胞はすべて、非小細胞肺がん(NSCLC)のヒト腫瘍に由来する。RORγ阻害剤はまた、H69およびH209などの小細胞肺がん(SCLC)のヒト腫瘍に由来する細胞の阻害においても有効であった。
【０２２５】
図32Dは、SR2211などのRORγ阻害剤が異種移植肺腫瘍モデルの腫瘍成長を強力に阻害したことを示す。RORγ特異的阻害剤が腫瘍成長の阻害に有効である可能性があることを実証するために、A549ヒト肺がん細胞の異種移植腫瘍を有するマウスをビヒクルまたは5 mg/kg/日のSR2211のいずれかで処置した(i.p.)。処置の6週後に、RORγ阻害剤による担腫瘍マウスの処置は腫瘍成長を有意に阻害した。
【０２２６】
図33A〜33Iは、RORγ阻害剤SR2211、GSK805、およびGSK9bが、卵巣がん細胞(たとえば、OVCAR420)、膀胱がん細胞(たとえば、T24)、子宮内膜がん細胞(たとえば、ECC1)、肝臓がん細胞(たとえば、HepG2およびHep3B)、神経膠芽腫細胞(たとえば、T98G)、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)(たとえば、SUDHL4およびSUDHL6)、結腸がん細胞(たとえば、HCT116)、およびドセタキセル耐性細胞(たとえば、C4-2B)の増殖および生存の有意な阻害を示したことを示す。
【０２２７】
V. 参考文献
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【０２２８】
前述の発明は、例示ならびに明瞭性および理解のための例として一部詳細に説明されているが、本発明の教示を踏まえ、特定の変形、変更、改変および置換が本発明の精神および範囲から必ずしも逸脱することなく行われ得ることが当業者には容易に明らかであろう。結果として、本明細書に記載された態様は、様々な改変および変更などに供され、本発明の範囲は、本明細書に添付の特許請求の範囲への参照によってのみ決定される。当業者は、本質的に類似の結果を得るために変更、変化、または改変することができる様々な重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書で用いられる用語は特定の態様を説明することのみを目的としており、限定を意図しないことも理解されるべきである。加えて、本明細書で提供される各参考文献は、各参考文献が参照によって個別に組み入れられた場合と同じ程度に、その全体が参照によって組み入れられる。本出願と本明細書で提供される参考文献との間にコンフリクトが存在する場合、本出願が優先される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
2018513123.tif 000064
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
2018513123.tif 000100
【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
2018513123.tif 000114
【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３３Ｇ】
2018513123.tif 000121
【図３３Ｈ】
2018513123.tif 000122
【図３３Ｉ】
2018513123.tif 000123
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月14日(2017.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018513123000001.app
【国際調査報告】
2018513123.tif 000124
2018513123.tif 000125