(57)【要約】  弾性波センサーを利用したアナライトの高感度アッセイ。標識本体が１５〜２５０ｎｍの距離だけ離間して弾性波センサーの表面にアンカーされるように、アナライトよりも大きい散逸容量を有する標識をアナライトを介して弾性波センサーの感知表面に接着する。標識が感知表面に結合したときの弾性波のエネルギー損失または周波数もしくは位相の変化を用いて標識の存在または量を測定する。標識の検出限界の実質的な向上が得られる。アナライトはたとえば核酸でありうるとともに、標識はたとえばリポソームを含みうる。
2018520681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感知表面を有する液体媒体弾性波センサーを用いてアナライトを測定する方法であって、前記感知表面にサンプル中のアナライトを接着しかつ前記アナライトおよび前記表面に標識を接着する工程であって、前記標識が標識本体を含み、それによりこの標識本体が５〜２５０ｎｍのアンカー長さで前記感知表面にアンカーされる、工程と、前記標識が前記表面に接着する前に前記液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の（ａ）エネルギー損失または（ｂ）周波数もしくは位相の一方または両方に関連するパラメーターの第１の測定を行う工程と、前記標識が前記表面に接着した後に前記パラメーターの第２の測定を行う工程と、前記第１および第２の測定間の前記パラメーターの変化から前記アナライトの存在および量の一方または両方を決定する工程と、を含み、前記標識が前記アナライトよりも少なくとも１０％大きい散逸容量を有する、方法。
【請求項２】
前記アナライトが、前記第１の測定を行った後ただし前記第２の測定を行う前に前記表面に接着し、かつ前記方法が、前記アナライトが前記表面に接着する前に予備測定を行う工程と、次いで、前記アナライトが前記表面に接着した後に前記第１の測定を行う工程と、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１および第２の測定が、それぞれ、前記液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失に関連するパラメーターの測定を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記パラメーターが弾性波のエネルギー損失に関連し、かつ前記第１および第２の測定が前記弾性波の振幅または散逸の測定を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記パラメーターが前記液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の周波数または位相に関連する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記液体媒体弾性波センサーがバルク弾性波型デバイスまたは表面弾性波デバイスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アナライトが前記第１の測定を行う前に前記感知表面に特異的に接着される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
次いで、前記標識が添加され、存在する場合は前記アナライトに結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標識が本体を含みかつ特異的認識エレメントが前記標識本体に結合され、前記特異的認識エレメントが前記アナライトに特異的に結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記特異的認識エレメントが標識結合スペーサー領域を介して前記標識本体に結合され、前記標識結合スペーサー領域が少なくとも５ｎｍの長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識が標識本体を含みかつ標識結合プローブが前記標識本体に結合され、前記標識結合プローブが核酸を含み、前記核酸が、前記特異的認識エレメントと、前記標識本体と前記特異的認識エレメントとの間のスペーサー領域と、を含み、前記スペーサー領域が少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識本体がそれに接着された核酸を有し、前記核酸が、前記アナライトと前記核酸プローブの特異的結合領域との間のハイブリダイゼーションにより前記アナライトと前記標識本体との接着を媒介する特異的結合領域と、前記特異的結合領域と前記標識本体との間のスペーサー領域と、を含み、前記核酸が１５〜７３５ヌクレオチドの長さを有し、かつ前記スペーサー領域が少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
特異的認識エレメントが前記感知表面に結合され、前記特異的認識エレメントが前記アナライトに特異的に結合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記特異的認識エレメントが表面結合スペーサー領域を介して前記感知表面に結合され、前記表面結合スペーサー領域が少なくとも５ｎｍの長さを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面プローブが前記感知表面に結合され、前記表面プローブが核酸を含み、前記核酸が、特異的認識エレメントと、前記特異的認識エレメントと前記表面との間のスペーサー領域と、を含み、前記スペーサー領域が少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標識が前記アナライトを介して前記感知表面に接着し、前記アナライトが、前記標識と前記感知表面との接着を媒介する５〜２５０ｎｍの長さを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記アナライトが二本鎖ＤＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面がそれに接着された核酸を有し、前記核酸が、前記アナライトと前記核酸の特異的結合領域との間のハイブリダイゼーションにより前記アナライトおよび標識と前記表面との接着を媒介する特異的結合領域と、前記特異的結合領域と前記感知表面との間のスペーサー領域と、を含み、前記核酸が１５〜７３５ヌクレオチドの長さを有し、かつ前記スペーサー領域が少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標識がリポソームを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記リポソームに１×１０−２Ｐａ・ｓ超の粘度の媒体が封入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識が、互いに連結された複数のリポソームのグループを含む、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アナライトを検出するための標識を液体媒体音響センサーにより選択する方法であって、前記アナライトが弾性波センサーの表面に結合したときの液相弾性波センサーにより発生された弾性波の（ａ）エネルギー損失の変化および（ｂ）周波数または位相の変化を測定することにより前記アナライトの散逸容量を決定する工程と、任意選択的に前記アナライトを介して前記標識が前記表面に結合したときの液相弾性波センサーにより発生された弾性波の（ａ）エネルギー損失の変化および（ｂ）周波数または位相の変化を測定することにより前記標識の散逸容量を計算する工程と、前記標識の計算された散逸容量が前記アナライトの計算された散逸容量よりも１０％超大きければ前記アナライトの検出に使用するための標識として前記標識を選択する工程と、を含む方法。
【請求項２３】
前記標識が標識本体を含み、かつそれにより前記標識本体が５〜２５０ｎｍのアンカー長さで前記感知表面にアンカーされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アナライトが、５〜２５０ｎｍの長さを有するスペーサー領域を介して前記感知表面に接着される、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標識が本体を含み、かつ前記標識本体が、５〜２５０ｎｍの長さを有するスペーサー領域を介して前記アナライトに接着される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標識が前記アナライトを介して前記表面に接着し、かつ前記アナライトが、前記標識と前記表面との接着を媒介する５〜２５０ｎｍの長さを有する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アナライトが二本鎖ＤＮＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記表面がそれに接着された核酸を有し、前記核酸が、前記アナライトと前記核酸プローブの特異的結合領域との間のハイブリダイゼーションにより前記アナライトおよび標識と前記表面との接着を媒介する特異的結合領域と、前記特異的結合領域と前記感知表面との間のスペーサー領域と、を含み、前記核酸が１５〜７３５ヌクレオチドの長さを有し、かつ前記スペーサー領域が少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有する、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
感知表面を有する液体媒体音響センサーを用いてアナライトを検出するためのキットであって、前記キットが、前記感知表面に接着可能なまたは感知表面に接着された表面プローブと、標識本体と、前記標識本体に接着されたまたは接着可能な標識プローブと、を含み、前記表面プローブおよび前記標識プローブが、それぞれ、前記アナライトのそれぞれの領域に特異的に結合するように構成された特異的認識エレメントを含み、前記表面プローブおよび／または前記標識プローブが、前記アナライトと前記表面プローブと前記標識プローブとを介して前記標識本体を前記表面に接着可能であることにより５〜２５０ｎｍのアンカー長さで前記標識本体を感知表面にアンカーするようにスペーサー領域を含み、前記標識が前記アナライトよりも少なくとも１０％大きい散逸容量を有する、キット。
【請求項３０】
前記標識プローブのスペーサー領域が少なくとも５ｎｍの長さを有し、かつ／または前記表面プローブのスペーサー領域が少なくとも５ｎｍの長さを有する、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記標識プローブおよび前記表面プローブが、それぞれ、１５〜７３５ヌクレオチドの長さを有するかつ少なくとも１０ヌクレオチドの長さのスペーサー領域を含む核酸である、請求項２９または請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弾性波センサーを用いてアナライトの存在および／または量を測定する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、核酸、タンパク質、ホルモンなどの少量のアナライトを感度良く、簡単に、かつ費用効果的に測定する問題に対処する。測定は、典型的には有無の結果を伴うバイナリー測定であるアナライトの存在（不在に対して）を検出することまたは存在するアナライトの量の定量測定を行うことを含む。
【０００３】
１９８０年代に開発されたＰＣＲによるＤＮＡの酵素的増幅は、分子診断における遺伝子マーカーの検出に大きな変化をもたらし、日々の臨床診療を変えるとともに疾患の分子基盤の観測および特異的バイオマーカーの同定を可能にした。現在でも依然としてＰＣＲは感度に関して究極を極めているが、複雑性、汚染感受性、コスト、および携帯性欠如をはじめとする重大な欠点を有する（Ｒｏｓｉ，Ｎ．Ｌ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．；Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０５：１５４７−１５６２（２００５））。
【０００４】
そのほかに、いくつかのＤＮＡ鋳型は同一の反応内で優先的に増幅される（ＰＣＲバイアスとして知られる現象）（Ｔａｎ  Ｄ．＆  Ｌｙｎｃｈ  Ｈ．Ｔ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０１３））。いくつかの状況では、ＰＣＲバイアスは増幅効率の１０〜３０倍の差を引き起こす可能性があるので、突然変異検出の過小評価または失敗をもたらすおそれがある。単一ヌクレオチド多型は有意なＰＣＲバイアスを引き起こす可能性があり、これはプルーフリーディングおよび非プルーフリーディングのポリメラーゼの両方で観測される。豊富な野生型配列中に稀な突然変異配列が存在する不均一なサンプルの場合、こうした稀な標的をＰＣＲで十分に増幅できないことがある。さらに、患者由来のサンプル中にヘパリンをはじめとする非特異的ＰＣＲ阻害剤や特徴付けられない成分が存在することがあるので、ミスプライミングや阻害などの望ましくない結果を招くおそれがある。
【０００５】
最近、ナノ材料分野の進歩によって新しい検出プラットフォームがもたらされ、きわめて有望な方法の１つであるバイオバーコード（ＢＢＣ）法は、ＤＮＡ検出でｚＭ濃度領域の超高感度を達成した（Ｎａｍ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ−Ｂａｒ−Ｃｏｄｅ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＰＣＲ−ｌｉｋｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ＪＡＣＳ，１２６：５９３２−５９３３（２００４））。しかしながら、この顕著な性能は、ＰＣＲで得られるものと同様に簡単には達成されず、外因性の表面改質成分や多工程の増幅・検出スキームの使用など、厄介で時間のかかる手順を必要とする。ＢＢＣを細菌ゲノムＤＮＡの検出に適用した場合、報告された検出限界はｆＭ領域であった（Ｎａｍ  Ｊ−Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  Ｂｉｏ−Ｂａｒ  Ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１：１８８４−１８８６（２００３））。
【０００６】
タンパク質アナライトの検出に関して、現在のゴールドスタンダードはｐＭ領域に検出限界を有する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。この場合も、ナノ材料の進歩およびＢＢＣ法によってタンパク質の検出がａＭ領域まで可能になった（Ｎａｍ  Ｊ−Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  Ｂｉｏ−Ｂａｒ  Ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１：１８８４−１８８６（２００３））。ＤＮＡ−ＢＢＣアッセイと同様に、この方法もいくつかの外因性の粒子および多工程の増幅工程を必要とする。
【０００７】
最近、生物物理学分析および臨床分析に非常に重要なプラットフォームとして音響センサーが出現した。興味深いことに、このために弾性波／ソフトマター相互作用の基礎をなす科学の理解を前進させるに及ばない。広く受け入れられている機構、すなわち、固／液界面を伝搬する弾性波が界面で起こる質量変化および溶液粘度変化に対して感受性があることは、５０年代後半および９０年代に行われた先駆的研究に遡る（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ  Ｇ．，Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｒ  Ｐｈｙｓｉｋ  １５５（２）：２０６−２２２（１９５９）、Ｒｉｃｃｏ  Ａ．Ｊ．＆  Ｍａｒｔｉｎ  Ｓ．Ｊ．，Ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｗａｖｅ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｓｅｎｓｏｒ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．５０，１４７４  （１９８７））。質量変化は音響速度、すなわち、波の周波数（Ｆ）または位相（Ｐｈ）の測定に反映され、現在では、ΔＦおよびΔＰｈがデバイス表面に堆積した弾性質量の量に類似していることが理論的にも実験的にも十分に実証されている（Ｍｉｔｓａｋａｋｉｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｍｗ  ｗｉｔｈ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ；ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖｓ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ，Ａｎａｌｙｓｔ，１３９：３９１８−３９２５（２０１４））。こうした理由から、弾性波センサーを活用する臨床用途は、ｎＭ濃度領域でタンパク質または抗体を定量するために、このパラメータ（すなわち速度など）の測定に基づく（Ｍｉｔｓａｋａｋｉｓ，Ｋ．；Ｇｉｚｅｌｉ，Ｅ．；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｉｓｋ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ．６９９：１（２０１１）、Ｌｅｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＳＡＷ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：８６２９（２０１１））。最近、Ａｕナノ粒子上への後続の触媒された金（Ａｕ）堆積により音響シグナルの増強をもたらすサンドイッチ免疫アッセイを用いてかなり改善された検出限界（ｐＭ）が報告された（Ｌｅｅ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｗａｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ，Ｓｅｎｓ．Ａｃｔ．Ｂ．，１７８：１９−２５（２０１３））。国際公開第２００８／１４５１３０号パンフレット（Ａｔｏｎｏｍｉｃｓ  Ａ／Ｓ）は、シグナル増強のために金堆積を用いることに関してＢＢＣ法に類似しており、音響検出に関して、追加質量の堆積はかなり高い位相応答をもたらす。
【０００８】
純溶液たとえばグリセロールの充填時に起こる粘度変化は、エネルギー散逸測定で記述され、通常、散逸（Ｄ）または振幅（Ａ）で表される。しかしながら、バイオ分子がデバイス表面に装着されたときに音響エネルギーが散逸される機構は、依然として明らかになっておらず、臨床用途に活用されていない。我々は、エネルギー損失を流体力学的結合現象に帰属する理論をこれまでに開発してきた（欧州特許第２１７１０８３号明細書）。簡潔に述べると、周囲の液体中でバイオ分子（単一点を介する表面に装着される）を振動させることにより抗力が生成し、これによりエネルギーが消費される。関連する流体力学的パラメーターはΔＤ／ΔＦ比またはΔＡ／ΔＰｈ比に関連付け可能な結合分子／粒子の固有粘度［η］であることが、厳密な理論的取扱いにより示された（Ｔｓｏｒｔｏｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｈａｐｅ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｂｏｕｎｄ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｗａｖｅ  ｓｅｎｓｏｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９４：２７０６−２７１５（２００８）、Ｔｓｏｒｔｏｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｅａｒ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｗａｖｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ＱＣＭ−Ｄ，Ｂｉｏｓ．Ｂｉｏｅｌ．２４：８３６−８４１（２００８））。この機構は、装着エンティティーのサイズおよび形状に依存し、これについては各種コンフォメーションのＤＮＡおよび球状のタンパク質で実験的に証明されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、弾性波を用いて溶液中の非常に低濃度のアナライトを検出するための新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明はＱＣＭおよびラブ波デバイスを用いたアナライトの測定に関してさらに考察されるが、本発明は他のタイプの液体媒体弾性波センサーを用いて行いうる。液体媒体弾性波センサーとは、弾性波センサーの感知表面が使用時に液体に接触したときに伝搬可能な弾性波を支持する弾性波センサーを意味する。
【００１１】
本明細書内および添付の特許請求の範囲内では、アナライトまたは標識の散逸容量とは、デバイス表面へのアナライトまたは標識の結合に基づく、弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失の変化と、液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の周波数または位相の変化と、の比を意味する。
【００１２】
弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失は、弾性波の振幅または散逸を測定することにより測定しうるとともにデバイス／液体界面における粘弾性の変化を反映しうることが、当業者であれば分かるであろう。周波数および位相は、たとえば、弾性波センサーの感知表面上に堆積した質量の影響を受ける。したがって、アナライトまたは標識の散逸容量は、たとえば、弾性波センサーの感知表面へのアナライトまたは標識の結合から生じる弾性波の振幅（Ａ）または散逸（Ｄ）の変化と弾性波の周波数（Ｆ）または位相（Ｐｈ）の変化との比、たとえば、散逸の変化と周波数の変化との比ΔＤ／ΔＦでありうる。
【００１３】
この比ΔＤ／ΔＦまたはΔＤ／ΔＰｈは音響比として知られ、離散非相互作用バイオ分子またはエンティティーの結合の場合、感知表面に結合する質量に依存しない。比が表面被覆率に依存する場合、結合エンティティーの散逸容量は、横方向相互作用が存在しないと仮定しうる低表面被覆率（＜１０％）で得られる比として定義される。
【００１４】
本明細書内および添付の特許請求の範囲内では、タンパク質、核酸（たとえば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および他のヌクレオチドポリマー）、ホルモン、代謝物、または他の生体マクロ分子への参照は、天然マクロ分子と、非タンパク質構成残基を含むタンパク質、非天然塩基を含む核酸などの合成変異体と、の両方を含むことが意図される。「タンパク質」という用語は、なんら特定最小数のペプチド残基を示唆することを意図するものでない。「核酸」という用語は、なんら特定最小数のヌクレオチドを示唆することを意図するものでないが、本発明で利用される核酸は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチドを有する。
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、感知表面を有する液体媒体弾性波センサーを用いてアナライトを測定する方法であって、感知表面にサンプル中のアナライトを接着しかつアナライトおよび表面に標識を接着する工程と、標識が表面に接着する前に液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の（ａ）エネルギー損失または（ｂ）周波数もしくは位相の一方または両方に関連する（たとえば比例する）パラメーターの第１の測定を行う工程と、標識が表面に接着した後に前記パラメーターの第２の測定を行う工程と、前記第１および第２の測定間の前記パラメーターの変化からアナライトの存在および量の一方または両方を決定する工程と、を含む方法が提供される。
【００１６】
好ましくは、標識はアナライトよりも少なくとも１０％大きい散逸容量を有する。アナライトよりも少なくとも１０％大きい散逸容量を有する標識を用いると非標識アナライトの対応する量の測定と比較して測定の感度が劇的に向上することを我々は見いだした。標識を伴わないアナライトの結合に基づく、液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の（ａ）エネルギー損失または（ｂ）周波数もしくは位相の一方または両方に関連する前記パラメーターの測定値の変化は、液体媒体弾性波センサーの検出限界未満であるが、標識が結合すると前記パラメーターの測定値の変化は検出限界を超えることがある。
【００１７】
典型的には、標識は、アナライトよりも少なくとも２０％大きい、少なくとも２５％大きい、少なくとも５０％大きい、アナライトの少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも４倍の散逸容量を有する。
【００１８】
好ましくは、標識は、本体（たとえばリポソーム）を含み、感知表面への標識の接着により５〜２５０ｎｍのアンカー長さで標識本体を表面にアンカーする。アンカー長さとは、標識本体と表面との間の接続部により標識本体を表面から離間可能な最大距離を意味する。実際には、とくにアンカーが可撓性である場合、アンカーは必ずしも完全に伸長するとは限らないので、標識本体は表面にさらに近づくこともありうる。それにより標識本体と表面との間に形成されるアンカーは、典型的にはアナライトを含む。
【００１９】
典型的には、標識はアナライトに結合する。典型的には、標識はアナライトに特異的に結合する。典型的には、標識は、アナライトを介して感知表面に接着することによりアナライトおよび表面に接着する（アナライトが存在する場合）。
【００２０】
特異的認識エレメント（表面結合特異的認識エレメント）は感知表面に結合しうる。表面結合特異的認識エレメントは、使用時にアナライトに特異的に結合しうる（またはアナライトに特異的に結合するアナライト結合エレメントに結合するように構成しうる）。したがって、アナライト（および標識本体）は、表面に結合された特異的認識エレメントを介して感知表面に接着しうる。表面結合特異的認識エレメントは、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、抗体（たとえば、表面に結合されたスペーサー領域（たとえば長鎖）に装着されたもの）、高分子鎖（デキストラン、ＰＥＧなど）、またはペプチドでありうる。
【００２１】
表面結合特異的認識エレメントは、スペーサー領域を介して感知表面に結合しうる。
【００２２】
表面プローブは、感知表面に接着しうるとともに、特異的認識エレメントと、特異的認識エレメントと感知表面との間の前記スペーサー領域と、を含みうる。したがって、アナライト（および標識本体）は、表面プローブを介して表面に接着しうる。
【００２３】
スペーサー領域は、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。スペーサー領域は、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、または高分子鎖（デキストランやポリエチレングリコールなど）を含みうる。
【００２４】
アナライトは、アナライト（および標識）と表面との接着を媒介する少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さの表面プローブ（典型的には前記特異的認識エレメントとスペーサー領域とを含む）を介して表面に接着しうる。
【００２５】
表面結合特異的認識エレメントは、アナライトの領域に相補的な配列を有する核酸を含みうる（アナライトが核酸である場合）。表面プローブは核酸を含みうるとともに、核酸は表面結合特異的認識エレメント（アナライトの領域に相補的な配列である）と、表面結合特異的認識エレメントとセンサー表面と間のスペーサー領域と、を含みうる。
【００２６】
典型的には、前記核酸は、１５〜７３５ヌクレオチド、２９〜７３５ヌクレオチド、または５９〜７３５ヌクレオチドの長さを有する。核酸のスペーサー領域は、表面と特異的認識エレメントとの間に少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２９ヌクレオチドの長さを有しうる。標識本体と表面との間のアンカーの一部を形成するこのスペーサー領域は、全部または一部が一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００２７】
特異的認識エレメント（標識結合特異的認識エレメント）は標識本体に結合しうる。標識結合特異的認識エレメントは、使用時にアナライトに特異的に結合しうる（またはアナライトに特異的に結合するアナライト結合エレメントに結合するように構成しうる）。したがって、標識本体は、標識結合特異的認識エレメントを介してアナライト（および感知表面）に接着しうる。標識結合特異的認識エレメントは、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、抗体（たとえば、表面に結合されたスペーサー領域（たとえば長鎖）に装着されたもの）、高分子鎖（デキストラン、ＰＥＧなど）、またはペプチドでありうる。
【００２８】
標識結合特異的認識エレメントは、スペーサー領域を介して標識本体に結合しうる。
【００２９】
標識結合プローブは、標識本体に接着しうるとともに、標識結合特異的認識エレメントと、標識結合特異的認識エレメントと標識本体との間の前記スペーサー領域と、を含みうる。したがって、標識本体は、標識結合プローブを介してアナライト（および感知表面）に接着しうる。
【００３０】
標識結合スペーサー領域は、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。標識結合スペーサー領域は、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、または高分子鎖（デキストランやポリエチレングリコールなど）を含みうる。
【００３１】
アナライトは、アナライトと標識本体との接着を媒介する少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さの標識結合プローブ（典型的には前記標識結合特異的認識エレメントとスペーサー領域とを含む）を介して標識本体に接着しうる。
【００３２】
標識結合特異的認識エレメントは、アナライトの領域に相補的な配列を有する核酸を含みうる（アナライトが核酸である場合）。標識結合プローブは核酸を含みうるとともに、核酸は標識結合特異的認識エレメント（アナライトの領域に相補的な配列である）と、標識結合特異的認識エレメントと標識本体との間のスペーサー領域と、を含みうる。
【００３３】
典型的には、標識結合核酸は、１５〜７３５ヌクレオチド、２９〜７３５ヌクレオチド、または５９〜７３５ヌクレオチドの長さを有する。標識結合核酸のスペーサー領域は、標識本体と特異的認識エレメントとの間に少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２９ヌクレオチドの長さを有しうる。標識本体と表面との間のアンカーの一部を形成するこのスペーサー領域は、全部または一部が一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００３４】
いくつかの実施形態では、表面結合特異的認識エレメントは、アナライトの第１の領域に相補的な核酸配列を含み、標識結合特異的認識エレメントは、アナライトの第２の領域（典型的には、０〜５０ヌクレオチドの間隔を有してアナライトの第１の領域に近接する）に相補的な核酸配列を含む。
【００３５】
アナライトは、標識と表面との接着を媒介する５〜２５０ｎｍの長さ（任意選択的に少なくとも１０ｎｍまたは少なくとも２０ｎｍの長さ）を有し、前記標識本体はアナライトを介して感知表面に接着されることもありうる。この場合、アナライトは、５〜２５０ｎｍのアンカー長さで標識本体を感知表面にアンカーする。実際上、アナライトは、５〜２５０ｎｍの長さのスペーサーとして作用しうる。この場合、アナライトは二本鎖ＤＮＡでありうるとともに、本方法は、アナライトを得るために、たとえばポリメラーゼチェーンリダクション（ＰＲＣ）を用いて核酸増幅により標的核酸を増幅する初期工程を含みうる。これは、とりわけ少量の標的核酸を検出するために使用可能である。したがって、アナライトは、１５〜７３５塩基対、２９〜７３５塩基対、または５９〜７３５塩基対の長さの二本鎖ＤＮＡ分子でありうる。この場合、アナライトは、感知表面に直接接着しうる。感知表面は、アナライトに特異的に結合する特異的認識エレメントを含んでいなくてもよい。感知表面は、アナライトに特異的に結合するかつ核酸でない特異的認識エレメントを含んでいてもよい。感知表面は、共有結合によりアナライトに結合する特異的認識エレメントを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アナライトは、標識本体に直接接着しうる。その場合、標識本体は、アナライトに特異的に結合する特異的認識エレメントを含んでいなくてもよい。標識本体は、共有結合によりアナライトに結合する特異的認識エレメントを含んでいてもよい。本方法がアナライトを得るために標的核酸を増幅する工程を含む場合、標的核酸を増幅する工程は、感知表面または標識本体に結合するための結合部分、たとえば、ニュートラビジン、ビオチン、コレステロール、またはチオール基を含む１つ以上の核酸残基を導入する工程を含みうる。
【００３６】
アナライトは、第１の測定を行う前に表面に接着しうる。アナライトは、第１の測定を行った後ただし第２の測定を行う前に表面に接着しうる。本方法は、アナライトが表面に接着する前に予備測定を行う工程と、次いで、アナライトが表面に接着した後に第１の測定を行う工程と、を含みうる。これによりアナライトの接着に基づくパラメーターの変化の測定を行うことが可能になる。これは標識の接着に基づく第１および第２の測定間のパラメーターの変化と比較可能である。いくつかの状況では、アナライトの接着に基づく変化は検出不能であろうが、標識の接着に基づく変化は検出可能であろう。予備測定、第１の測定、および／または第２の測定は、連続測定の中から選択される測定でありうる。予備測定、第１の測定、および／または第２の測定は、それぞれ、複数回の測定の組合せ、たとえば、平均でありうる。
【００３７】
第１および第２の測定（および適用可能な場合は予備測定）は、それぞれ、液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失に関連する前記パラメーターの測定（第１のシグナル）を含みうる。この測定（第１のシグナル）は弾性波の振幅の測定でありうる。この測定（第１のシグナル）は弾性波の散逸の測定でありうる。この測定（第１のシグナル）は、音響センサーのインピーダンス、アドミタンス、抵抗、サセプタンス、コンダクタンス、またはバンド幅パラメーターなどの電気回路アナログパラメーターの測定でありうる。
【００３８】
第１および第２の測定（および適用可能な場合は予備測定）は、それぞれ、液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失に関連するパラメーターの測定（前記第１のシグナル）、さらには液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の周波数または位相に関連するパラメーターの測定（前記第２のシグナル）を含みうる。これらの各測定値の変化を考慮してアナライトの存在および量の一方または両方を決定しうる。
【００３９】
液体媒体弾性波センサーは、バルク弾性波型デバイス、たとえば、石英結晶マイクロバランス、厚み滑りモードレゾネーター、または厚み滑りバルク音響レゾネーター（たとえば、高基本周波数ＱＣＭ（ＨＦＦ−ＱＣＭ）および厚み滑りフイルムバルク音響レゾネーター（ＴＳ−ＦＢＡＲ））でありうる。この場合、第２のパラメーターは、典型的には、液体媒体弾性波センサーの振動周波数または共振周波数の測定であろう。また、弾性波のエネルギー損失に関連するパラメーター（第１のシグナル）は、典型的には、弾性波センサーにより発生された波のエネルギー散逸またはバンド幅に関連するであろう。
【００４０】
液体媒体弾性波センサーは、剪断波を発生する弾性波センサーでありうる。かかる表面弾性波型デバイスは、剪断波、たとえば、ラブ波、表面スキミングバルク波、音響プレートモード、ブルースタイン・グリヤエフ波、漏洩弾性波、または表面横波を発生するためにインターディジットトランスデューサーを利用可能である。この場合、弾性波のエネルギー損失に関連するパラメーター（第１のシグナル）は、典型的には、発生された表面弾性波の振幅の測定であろう。また、弾性波の速度に関連するパラメーター（第２のシグナル）は、典型的には、発生された表面弾性波の位相の測定であろう。
【００４１】
剪断弾性波センサーは、非接触非インターディジットトランスデューサーに基づくデバイス、たとえば、電磁励振剪断弾性波を利用するデバイスでありうる。液体媒体弾性波センサーは、撓みプレート波デバイスまたはラム波デバイスとして知られる構成で弾性波を励振する薄膜を用いた弾性波センサーでありうる。
【００４２】
アナライトは、第１の測定を行う前に感知表面に接着しうる。典型的には、次いで標識が添加され、存在する場合はアナライトに結合する。典型的には、標識は、アナライトに特異的に結合するか、またはアナライト結合エレメントに特異的に結合してからこれが典型的には特異的にアナライトに結合する。
【００４３】
アナライトは、任意のタイプの酵素的増幅（ＰＣＲもしくは等温）またはハイブリダイゼーションまたは任意の他の酵素反応により生成されたｄｓＤＮＡ断片でありうる。この場合、アナライトは、感知表面および／または標識本体との結合（典型的には共有結合）を形成するための１つ以上の結合部分を含みうる。たとえば、チオール修飾を介してｄｓアナライトをセンサー表面に直接結合することにより、特異的表面結合認識分子の必要性を排除しうる。アナライトが十分に長ければ、個別のスペーサー領域の補助を排除しうる。
【００４４】
典型的には、アナライトは、単一装着点を介して感知表面に離散的に結合する（たとえば、さらに互いに結合されない離散構造として、たとえば、アナライトが分子である場合は離散分子として）。標識は、各標識が単一のアナライトを介して感知表面に接着されるように感知表面に離散的に結合しうる。
【００４５】
それにもかかわらず、いくつかの実施形態では、標識はアナライトと一緒に感知表面に結合しうる。たとえば、存在する場合はアナライトに標識が結合するように標識およびアナライトを溶液に導入しうるとともに、次いで、結合された標識およびアナライトを感知表面に導入しうる。この場合、標識は、典型的には、アナライトに特異的に結合するための特異的認識エレメントを含むであろう。かつ／または、感知表面は、典型的には、アナライトに特異的に結合するための特異的認識エレメントを含むであろう。いくつかの場合には、あらかじめ形成された標識／アナライト複合体は、標識を介して表面結合特異的認識エレメントに結合しうる。この場合、標識は、２つの異なる特異的認識エレメント（一方はアナライトに結合するためのものおよび他方は表面結合特異的認識エレメントに結合するためのもの）を有しうる。
【００４６】
標識は、任意の分子、高分子構造、エンティティー、またはいくつかの分子、ポリマー、およびエンティティーの組合せの複合体であろう。いずれにせよ、標識は、アナライトよりも高い散逸容量により特徴付けられるべきである。エンティティーは、任意の種類の標識本体、たとえば、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、およびデンドリマー、またはより複雑な構造の以上の組合せを含みうる。ナノ粒子とは、１〜５００ｎｍの直径を有する任意の粒子を意味する。ナノ粒子は、任意の材料、たとえば、金属（たとえば金）、ポリマー、シリカなどで作製しうる。リポソームとは、ポリマー、ＤＮＡ、ペプチド、タンパク質などの追加の成分が表面に任意選択的に装着された脂質二重層（たとえばリン脂質二重層）により取り囲まれたコンパートメントを意味する。リポソームは、ユニラメラベシクルおよびマルチラメラベシクルの両方を含む。リポソームは、典型的には２０〜５００ｎｍの直径を有する。標識は、２５℃で１×１０−２Ｐａ・ｓ超または０．１Ｐａ・ｓ超の粘度を有する媒体たとえばグリセロールを封入したリポソームを含みうる。リポソームは、脂質二重層のいずれかの側さらには二重層内で脂質間に複数の架橋分子を含みうる。標識は、たとえばデンドリマーにより互いに連結された複数のリポソームのグループを含みうる。以上で考察したように、標識は、標識本体（たとえば、前記ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、デンドリマー）と、標識本体とアナライトとの接着を媒介する５〜２５０ｎｍの長さのスペーサー領域と、を含みうる。
【００４７】
第２の態様では、本発明は、液体媒体音響センサーによりアナライトを検出するための標識を選択する方法であって、アナライトが弾性波センサーの表面に結合したときの液相弾性波センサーにより発生された弾性波の（ａ）エネルギー損失の変化および（ｂ）周波数または位相の変化を測定することによりアナライトの散逸容量を決定する工程と、任意選択的にアナライトを介して標識が表面に結合したときの液相弾性波センサーにより発生された弾性波の（ａ）エネルギー損失の変化および（ｂ）周波数または位相の変化を測定することにより標識の散逸容量を計算する工程と、標識の計算された散逸容量がアナライトの計算された散逸容量よりも１０％超大きければアナライトの検出に使用するための標識として標識を選択する工程と、を含む方法に拡張される。次いで、標識は、本発明の第１の態様の方法でアナライトを検出するために使用しうる。さらなる選択肢は、本発明の第１の態様に関連して以上で考察したことに対応する。
【００４８】
第３の態様では、本発明は、感知表面を有する液体媒体音響センサーを用いてアナライトを検出するためのキットであって、キットが、感知表面に接着可能なまたは感知表面に接着された表面プローブと、標識本体と、標識本体に接着されたまたは接着可能な標識プローブと、を含み、表面プローブおよび標識プローブが、それぞれ、アナライトのそれぞれの領域に特異的に結合するように構成された特異的認識エレメントを含み、表面プローブおよび／または標識プローブが、アナライトと表面プローブと標識プローブとを介して標識本体を表面に接着することにより５〜２５０ｎｍのアンカー長さで標識本体を感知表面にアンカーできるようにスペーサー領域を含み、標識がアナライトよりも少なくとも１０％大きい散逸容量を有する、キットに拡張される。
【００４９】
標識プローブは、前記標識結合プローブでありうるか、または前記標識結合プローブを形成するように標識本体に接着可能でありうる。その場合、標識本体結合エレメント（たとえば、標識に結合するように構成された１つ以上の化学基）を含みうる。標識プローブは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。標識プローブのスペーサー領域は、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。標識プローブのスペーサー領域は、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、または高分子鎖（デキストランやポリエチレングリコールなど）を含みうる。標識プローブは、１５〜７３５ヌクレオチド、２９〜７３５ヌクレオチド、または５９〜７３５ヌクレオチドの長さの核酸を含みうる。核酸は、標識プローブの前記特異的認識エレメントであるかつアナライトの領域に相補的である領域と、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２９ヌクレオチドの長さを有するスペーサー領域（特異的認識エレメントと標識本体との接着を媒介する）と、を含みうる。
【００５０】
表面プローブは、表面結合プローブでありうるか、または表面結合プローブを形成するように感知表面に接着可能でありうる。その場合、感知表面に直接結合するようにまたは感知表面コーティングに結合するように構成された１つ以上の表面結合エレメントを含みうる。表面プローブは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。表面プローブのスペーサー領域は、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。表面プローブのスペーサー領域は、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、または高分子鎖（デキストランやポリエチレングリコールなど）を含みうる。表面プローブは、１５〜７３５ヌクレオチド、２９〜７３５ヌクレオチド、または５９〜７３５ヌクレオチドの長さの核酸を含みうる。核酸は、表面プローブの前記特異的認識エレメントであるかつアナライトの領域に相補的である領域と、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２９ヌクレオチドの長さを有するスペーサー領域（特異的認識エレメントと感知表面との接着を媒介する）と、を含みうる。
【００５１】
キットは、液体媒体音響センサーの感知表面をさらに含みうる。キットは、液体媒体音響センサーをさらに含みうる。表面プローブは、前記感知表面に接着しうる。
【００５２】
本発明の第２および第３の態様のさらなる任意選択的な特徴は、本発明の第１の態様に関連して以上で考察したことに対応する。
【００５３】
次に、以下の図を参照して本発明の実施形態を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１ａ】標識結合プローブとアナライトと表面プローブとを介して弾性波センサーの感知表面に接着した標識の模式図である。
【図１ｂ】二本鎖ＤＮＡアナライトを介して弾性波センサーの感知表面に接着した標識の模式図である。
【図２ａ】一本鎖核酸表面プローブの模式図である。
【図２ｂ】二本鎖スペーサー領域を有する核酸表面プローブの模式図である。
【図２ｃ】一本鎖核酸標識結合プローブを有する標識の模式図である。
【図２ｄ】二本鎖スペーサー領域を有する核酸標識結合プローブを有する標識の模式図である。
【図３ａ−ｂ】表面プローブが一本鎖（３（ａ））または二本鎖（３（ｂ））のスペーサー領域を有する条件で核酸アナライトを介して感知表面に接着した標識の模式図である。
【図４ａ−ｂ】標識結合プローブが一本鎖（４（ａ））または二本鎖（４（ｂ））のスペーサー領域を有する条件で核酸アナライトを介して感知表面に接着した標識の模式図である。
【図５】３つの異なる長さの二本鎖ＤＮＡ分子（アナライト）が感知表面に接着したとき（列（ｉｉｉ））および３つの異なる直径のリポソーム（標識）がＤＮＡに接着したとき（列（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ））の散逸容量（ΔＤ／ΔＦ）を示す結果の表である。
【図６】リポソーム標識のサンプルが６つの異なるＤＮＡ量に対して表面結合ＤＮＡに結合したときの散逸の変化（ΔＤ）のグラフであり、対応する量のＤＮＡが結合したときの周波数の変化を示す表と組み合わされる。
【図７】図６に示される対応する量のＤＮＡが標識を添加することなく感知表面に結合したときの周波数（ヘルツ単位）および散逸の変化を示す表である。
【図８】各種の可能な標識構造の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
図１（ａ）に関して、弾性波デバイス１は、液体媒体に接触する感知表面４を有する基材２を有する。表面プローブ６は、プローブの一方の末端８を介して感知表面に固定化される。プローブの他方の末端は、アナライト１２に特異的に結合するように選択された特異的認識エレメント１０を含む。初期にはアナライトは存在しない。
【００５６】
次いで、アナライトがアッセイされるサンプルを液体媒体に添加し（またはたとえばフロースルーの実施形態では液体媒体をサンプルで置き換え）、標識構築物を添加する。標識構築物１４、１６は、本体（１４）（たとえばリポソーム）と、同様にアナライトに選択的に結合する特異的認識エレメント１８を有する標識結合プローブ１６と、を有する。次いで、過剰の標識を濯いで除去する。
【００５７】
したがって、標識は、アナライトを介して感知表面に接着される。重要なこととして、標識結合プローブ、アナライト、および表面プローブは、組み合わされて、感知表面からの最大距離（２０と表示される）５〜２５０ｎｍで標識本体がアンカーされるように標識本体を感知表面に接着するアンカーとして機能する。実際には、アンカーは可撓性でありうるので、標識は表面にさらに近づくこともありうる。標識は、アナライトよりも少なくとも１０％大きい散逸容量を有するように選択される。
【００５８】
弾性波デバイスは、液体界面に弾性波を発生するように操作される制御ユニット２２を有し、測定は、（１）弾性波のエネルギー損失および／または（２）弾性波デバイスのタイプに依存して弾性波の周波数もしくは位相のいずれかについて行われる。たとえば、ＱＣＭデバイスの場合、波の散逸または周波数（またはその両方）が測定される。典型的には、エネルギー損失および／または周波数もしくは位相のいずれかの測定は、アナライトおよび続いて標識を添加しながら連続的に行われるが、これは本質的なことではない。一般的には、これらのパラメーターの第１の測定は、標識が表面に接着する前に行うべきであり、第２の測定は、標識が表面に接着した後に行うべきである。実際には、アナライトが存在する前、アナライトを添加した後ただし標識を添加する前に測定を行い、標識を存在させてから再び測定を行いうことが役に立つ。
【００５９】
標識の散逸容量をより大きくした結果としておよび標識本体と感知表面とを離間させた結果として、標識の結合により生じる測定パラメーターの変化がアナライトの結合により生じる変化よりもかなり大きくなるため、単にアナライトの結合により生じる測定パラメーターの変化から検出できるよりもかなり低い濃度のアナライトの検出が可能になることを、我々は見いだした。
【００６０】
アッセイは定性的でありうるか（アナライトが検出されるか否かを決定する）、または測定パラメーターの変化を検量線と比較することによりサンプル中のアナライト濃度の定量測定を行うことが可能である。
【００６１】
図１（ｂ）を参照して例示される代替的構成では、アナライト自体（１２）が、５〜２５０ｎｍの最大距離で標識本体を感知表面にアンカーするアンカーとして機能しうる。この構成は、たとえば、アナライトが１５〜８００塩基対の長さを有する二本鎖ＤＮＡである場合に好適である。この場合、アナライトは、溶液中で標識に接着してから標識されたアナライトが感知表面に接着するように感知表面に導入しうる。第１の測定は、標識およびアナライトが感知表面に接着一体化される前に行われ、第２の測定は、標識およびアナライトが接着した後に行われる。代替的に、図１（ａ）の例と同様に、最初にアナライトを感知表面に接着し、その後で標識を添加しうる。アナライトは、たとえば、標識に接着するように修飾しる（たとえば、コレステロール、ビオチン、またはチオール修飾で）。
【００６２】
図２（ａ）および図２（ｂ）は、アナライトが一本鎖核酸である場合の表面プローブの２つの可能な構成を例示する。図２（ａ）の例では、表面プローブ６は、アナライト核酸鎖の第１の末端に相補的な核酸配列の形態で一方の末端に特異的認識エレメント１０と、表面と相補的配列の開始部との間の表面プローブの一部であるスペーサー領域１１と、を有する一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む。図２（ｂ）では、表面プローブは二本鎖スペーサー領域１３を有し、一方の鎖はさらに伸長して特異的認識エレメント１０を形成する。
【００６３】
図２（ｃ）および図２（ｄ）は、標識結合プローブの２つの可能な構成を例示する。図２（ｃ）の例では、標識結合プローブ１６は、アナライトの一方の末端（表面プローブにより認識される部分の反対側の末端）に相補的な特異的認識エレメント１８として機能する配列を有する一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む。標識本体に接着される他方の末端は、スペーサー領域（１７）として機能する。図２（ｄ）では、標識結合プローブは二本鎖スペーサー領域１９を有し、一方の鎖は二本鎖部分を越えてさらに伸長して特異的認識エレメント１８を形成する。
【００６４】
図２（ａ）〜２（ｄ）の例では、標識本体と感知表面との間のアンカーの長さは、表面プローブのスペーサー領域（１１または１３）の長さ＋標識結合プローブのスペーサー領域（１７または１９）の長さ＋特異的認識エレメント（１０、１８）の間のアナライト核酸鎖１２の長さ＋表面プローブを表面に結合するおよび標識結合プローブを標識本体に結合する化学基に基づくいくらかの追加の長さである。このアンカーの長さは５〜２５０ｎｍである。典型的には、スペーサー領域（１１、１３、１７、１９）の長さは、５０〜２００ヌクレオチド／塩基対の範囲内である。アナライトは、特異的認識エレメントに結合する領域のいずれかの側に潜在的にさらに伸長可能であるが、いずれの追加の長さも、標識本体と表面との間のアンカーの全長に寄与しない。
【００６５】
図３（ａ）および図３（ｂ）は、一本鎖核酸アナライトまたはＤＮＡ（この場合、ＤＮＡの一方の鎖は、表面に接着されるアナライト１２として機能する）のいずれかを検出するための２つの可能な構成を例示する。図３（ａ）の実施形態では、表面プローブ６は、図２（ａ）のように、アナライトの表面プローブ結合領域２３に相補的であるかつ特異的結合エレメントとして機能する領域１０まで伸長するスペーサー領域１１を含む。標識結合プローブ１６、１８は、全部がアナライトのさらなる標識結合領域２１に相補的である。図３（ｂ）の実施形態では、表面プローブは、図２（ｂ）のように、特異的認識エレメント１０を形成するように一方の鎖がスペーサー領域を越えて伸長する二本鎖スペーサー領域１３を含み、標識結合プローブ１６、１８は、この場合も全部がアナライトのさらなる部分に相補的である。
【００６６】
図４（ａ）および図４（ｂ）は、一本鎖核酸アナライトまたはＤＮＡ（この場合、ＤＮＡの一方の鎖は、表面に接着されるアナライト１２として機能する）のいずれかを検出するための２つのさらなる可能な構成を例示する。これらの実施形態では、表面プローブ６、１０は、全体がアナライトの領域に相補的であり、標識結合プローブ１６は、アナライトのさらなる領域に相補的な特異的結合領域１８と、それぞれ一本鎖（図４（ａ））または二本鎖（図４（ｂ））のスペーサー領域１７または１９と、を有する。代替的構成では、表面プローブおよび標識結合プローブの両方のスペーサー領域は、少なくとも部分的に二本鎖でありうる。スペーサー領域が二本鎖領域を含む実施形態では、特異的結合領域を形成するように伸長する鎖はまた、二本鎖領域と特異的結合領域との間にスペーサー領域のさらなる部分を含みうる。
【００６７】
図３（ａ）、３（ｂ）、４（ａ）、および４（ｂ）の場合には、標識本体と表面との間のアンカーの長さは、標識結合プローブの長さ＋表面プローブの長さ＋アナライトにより橋渡しされる標識結合プローブと表面プローブとの間のギャップの長さ＋表面プローブを表面におよび標識結合プローブを標識本体に結合する化学基の長さにより決定される。この場合も、このアンカーの長さは５〜２５０ｎｍである。典型的には、スペーサー領域（１１、１３、１７、１９）の長さは、５０〜２００ヌクレオチド／塩基対の範囲内である。アナライトは、特異的認識エレメントに結合する領域のいずれかの側に潜在的にさらに伸長可能であるが、いずれの追加の長さも、標識本体と表面との間のアンカーの全長に寄与しない。
【００６８】
これらの例では、アナライトを含有するサンプルおよび標識は、個別の溶液として添加されたものであるが、多くの変形形態を利用可能であることは、当業者であれば分かるであろう。たとえば、アナライトおよび標識は、感知表面を通って流動しうる。標識はまた、アナライトが感知表面に結合する前にアナライトに結合しうる。これにより標識を感知表面に結合しうる。
【実施例】
【００６９】
一本鎖核酸アナライトを検出するための実施例では、弾性波センサーは、以下の材料および方法の節に記載されるように構築された石英結晶マイクロバランス（ＱＣＭ）である。センサーは、石英結晶基材２と、ニュートラアビジンが吸着される表面金層４により形成された感知表面と、を有する。表面プローブ６として５’ビオチン化一本鎖ＤＮＡ分子を使用する。このプローブは、好適なプライマーセットを用いてＰＣＲまたは等温増幅プロセスにより形成され、感知表面に接触する液体媒体に導入される。（短い５’ビオチン化一本鎖ＤＮＡ分子もまた市販されている）。表面プローブ一本鎖ＤＮＡは、ビオチン８と感知表面上のニュートラアビジンとの間の特異的相互作用により感知表面に接着する。各ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子の末端に装着されたビオチンを介して個別に装着される。いくつかの代替的化学のいずれかを用いて表面プローブを表面層上に固定化しうることは、当業者であれば分かるであろう。
【００７０】
表面へのアナライトの非特異的結合は、当業者の熟知する標準的プロトコルを用いて、たとえば、ブロック剤、生体適合性表面、ＰＥＧ修飾層などを用いて排除される。
【００７１】
表面プローブ６は、表面に近接する少なくとも１０ヌクレオチドの長さのスペーサー領域１１を有し、一本鎖ＤＮＡの他方の末端は、アナライト核酸１８の領域に相補的な機能するＤＮＡ配列として機能し、したがって、特異的認識エレメント１０として機能する。
【００７２】
使用時、アナライトを含有する（またはその存在がアッセイされる）液体サンプルは、ハイブリダイズ条件を確保した緩衝液中で感知表面に接触される。標的アナライト１２、この例では一本鎖循環腫瘍ＤＮＡ分子（ｃｔＤＮＡ）は、アナライト１２の表面プローブキャプチャー領域１９とＤＮＡ表面プローブ６の特異的認識エレメント１０との間の相互作用により表面プローブに特異的に結合する。液体サンプルを濯いで除去し、標識を添加する前に弾性波センサーを用いてＱＣＭの散逸および周波数の第１の測定を行う。
【００７３】
測定を達成するために、弾性波のエネルギー（第１のシグナルを構成する）および周波数（第２のシグナルを構成する）を連続的に測定する。デバイス表面に装着されたＤＮＡは、散逸変化として測定される弾性波のエネルギーの散逸をもたらす。サンプル中に存在するかつ特異的認識エレメントを介して表面に結合されるＤＮＡ分子の数が非常に少なければ、アナライトが結合しても測定可能なシグナルを生成しないであろう。この例では、ＤＮＡは非常に少ない量で存在し、それが直接結合しても測定可能な音響シグナルを生成しない。
【００７４】
次に、ハイブリダイズ条件を確保した緩衝液中に標識を添加し、ハイブリダイズ条件を維持する。この場合、標識は、５’コレステロール修飾により結合されるかつ標識結合プローブ１６として機能する一本鎖ＤＮＡ分子を有するリポソーム１４を含む。表面に結合されていない標識結合プローブの末端には、標的アナライトの標識結合領域２１に相補的な配列１８が存在する。標識結合プローブに好適なＤＮＡ分子は、好適なプライマーを用いてＰＣＲまたは等温増幅法により生成可能である。アナライトの標識結合領域２１は、典型的には、表面プローブ結合領域２３に近接する。したがって、リポソーム１４は、アナライト１８（この場合はｃｔＤＮＡ）に特異的に接着することにより感知表面４に接着される。標識結合プローブおよび表面プローブは、それらの長さ＋アナライトの標識結合領域２１と表面プローブ結合領域２３との間のギャップの長さの合計が５〜２５０ｎｍの長さを有するように選択される）。
【００７５】
標識が添加されてアナライト（存在する場合）を介して表面に結合された後、弾性波の散逸および周波数の第２の測定を行う。第１および第２の測定間の弾性波の散逸の変化（ΔＤ）および周波数の変化（ΔＦ）を計算する。散逸または周波数のいずれかの変化が統計的に有意であれば、アナライトが存在することならびに散逸および／または周波数の変化量を検量線と比較してアナライトの量の定量測定を行えることが示唆される。リポソームは一本鎖ＤＮＡよりもかなり大きい散逸容量を有するので、表面に接着されたリポソームの結合による散逸および周波数の変化は、アナライト一本鎖ＤＮＡの結合による変化よりもかなり大きく、いくつかの場合には、以上で説明したように、標識が結合する前にアナライトが単独で結合しても、周波数または散逸の変化はゼロになりうる。したがって、アナライトの検出限界は、アナライトが単独で感知表面に結合したときの散逸または周波数の変化の測定で可能な検出限界と比較して大幅に向上する。
【００７６】
実験結果
アナライトの音響シグナルおよび検出レベルを向上させる高散逸性標識の能力を実証するために、ＤＮＡおよびリポソームの結合が散逸および周波数に及ぼす影響を比較した。二本鎖ＤＮＡは、リポソームが相補的ＤＮＡ配列の結合を介してアナライトＤＮＡに接着されてからアナライトが相補的ＤＮＡ配列の結合を介して表面プローブひいてはセンサー表面に接着される以上の第１の例のアッセイ方法を用いて形成されるＤＮＡ構造を厳密にモデル化する。二本鎖ＤＮＡはまた、第２の例の方法によっても測定可能である。二本鎖ＤＮＡはまた、ＤＮＡ増幅反応（たとえばＰＣＲまたは任意の等温増幅法）内の特異的標的核酸の存在に定性的および定量的に関連付け可能である。これにより標的核酸を感度良く検出できるようになる。
【００７７】
標的核酸自体は、さらなるアナライトのアッセイの標識でありうる。たとえば、標的核酸は、さらなるアナライトに特異的に結合する抗体または他の特異的認識エレメントの標識でありうるので、標的核酸の検出は、さらなるアナライトの高感度検出を可能にしうる。
【００７８】
ＤＮＡサンプルの調製
特異的プライマーセット（ＨＲ１Ｆ−ＨＲ１Ｒ，Ｖｏｒｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ２０  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＲＣＡ１  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３（２０１０）１７８−１８５）を用いてヒトゲノムＤＮＡから１５７ｂｐのＤＮＡ断片を生成した。２５ｍｌの最終体積でＰＣＲキット製造業者のプロトコル（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）に従ってＰＣＲ反応を構成した。２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＵＳＡ）をテンプレートとして使用した。増幅プロトコルを次のように構成した。すなわち、９５℃で１分の初期変性、９５℃で１０秒の変性と６０℃で１０秒のアニーリングと７２℃で１０秒の伸長とからなるサイクルを３５回、および７２℃で１分の最終伸長であった。１反応当たりそれぞれ５ｐｍｏｌの２つのプライマーを添加した。ＨＲ１Ｆプライマーの５’末端をビオチン化した。ＨＲ１Ｒの５’末端をコレステロールで修飾した。後ＰＣＲ精製を行うことなくまたは製造業者の説明書に従ってＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した後、ＰＣＲ産物に使用した。
【００７９】
標識の調製
直径Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３がそれぞれ５０、１００、および２００ｎｍであるリポソームを調製した。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）を含む２ｍｇの脂質の混合物をクロロホルムで希釈して−２０℃に維持した。クロロホルムを窒素と共に蒸発させ、脂質を窒素フロー下で１時間放置した。７．５のｐＨで１０ｍＭトリス、２００ｍＭ  ＮａＣｌの１ｍｌの緩衝液中に脂質を再懸濁させて１時間撹拌した。次いで、所望の直径に基づいて選択された膜に通して少なくとも２１回押し出した。次いで、得られたリポソームを必要になるまで冷蔵した後、実験に使用する際に泳動緩衝液で少なくとも１０倍希釈した。
【００８０】
ＰＯＰＣ以外に、多くの他の市販の脂質、たとえば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）など（たとえばＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＵＳＡ）から入手可能である）、または他の合成脂質、たとえば、ＮＴＡ脂質、ＰＥＧ含有脂質なども使用可能であることは当業者であれば分かるであろうことに留意されたい。また、コレステロール、ステロールなどの他の分子、さらには一方の末端に長いテールを有するように修飾された脂質も、リポソーム構造に組み込みうる。
【００８１】
弾性波デバイスの作製
ＱＣＭ−Ｄ構成
Ｑ−Ｓｅｎｓｅ  Ｅ４装置（ＱＳｅｎｓｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて音響実験を行った。この装置は、並列配置で使用可能な４つのセンサーを含む。いずれの実験測定の前でも、空気を用いてハイパワーでＨａｒｒｉｃｋ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｌｅａｎｅｒにより１つ以上の金結晶を２．３０分間エッチングした。ただちに金センサーをそれらのチャンバーに移して蠕動ポンプを用いてＰＢＳ緩衝液を充填した。約７５ｍｌ／分の一定フロー下で２００ｍｌのニュートラアビジン（２００ｍｇ／ｍｌ）をセンサーに充填し、続いてＰＢＳで濯いだ。３５ＭＨｚで動作するＱＣＭデバイスを用いて表面結合イベント時の波の散逸（Ｄ）および周波数（Ｆ）を記録した。
【００８２】
測定および結果
図５の表は、調製した３つの長さのｄｓＤＮＡの塩基対の長さを列（ｉ）に、ｎｍ単位の長さを列（ｉｉ）に示す。列（ｉｉｉ）は、センサー表面上のストレプトアビジンに結合するように第１の末端がビオチンで修飾され、かつリポソームに結合するように他方の末端がコレステロールで修飾されてセンサー表面に結合する二本鎖ＤＮＡ分子の散逸容量（ΔＤ／ΔＦとして表される）を示す。列（ｉｖ）、（ｖ）、および（ｖｉ）は、テザー連結ＤＮＡ分子に特異的に結合する（ｉｖ）５０ｎｍ（Ｄ１）、（ｖ）１００ｎｍ（Ｄ２）、および（ｖｉ）２００ｎｍ（Ｄ３）の３つの直径のリポソームの測定された散逸容量を示す。エネルギー散逸／単位質量（すなわちΔＤ／ΔＦ）は１０−６Ｈｚ−１単位で表されており、３５ＭＨｚでＱＣＭデバイスを用いて得られたものである。いずれの場合も、ＤＮＡ／リポソームの表面被覆率は低かった。各結果は、１０〜１５％の変動で少なくとも１０回の実験から導出した。
【００８３】
比ΔＤ／ΔＦ（散逸容量）はリポソームがＤＮＡに結合した場合にＤＮＡ分子が表面に結合した場合の数倍であることが、図５の表から明確に示される。散逸容量（ΔＤ／ΔＦ）はＤＮＡ鎖が長くなるほどおよびリポソームの直径が大きくなるほど大きいことが、結果から示される。したがって、装着されるエンティティーのジオメトリー（ＤＮＡの長さおよびリポソームの直径）は、アッセイを最適化するために所望によりより大きいまたはより小さい散逸を与えるように調整可能である。
【００８４】
図６は、ＤＮＡ分子の検出限界を向上させるために標識としてリポソームを使用する効果を実証する。対応する機器およびプロトコルを用いて、ビオチンおよびコレステロールで修飾された１５７ｂｐのｄｓＤＮＡを一連の量（２００マイクロリットルの緩衝液中０．００１、０．０１、０．１、１、１０、および１００ｎｇ）でセンサー表面に添加し、次いで、直径２００ｎｍのリポソームサンプルを加えた。リポソームの結合の前後で散逸の変化（ΔＤ）を測定した。各データ点は２または３回の実験の平均である。
【００８５】
図６のグラフは、これにより１ｐｇのｄｓＤＮＡ（１０アトモルまたは６００万分子）または等価量の２００μｌの５０フェムトモルＤＮＡ程度の少量で検出されたことを実証する。これとは対照的に、図６の表を参照すると、ｄｓＤＮＡサンプルを加えたときの散逸の変化（ΔＤ）を測定することにより最小１０ｎｇのｄｓＤＮＡを検出可能であるにすぎなかった。
【００８６】
この新しい方法は、核酸の結合時に直接検出するよりも３〜４桁少ないＤＮＡを音響的に検出可能であることを示した。ＤＮＡのわずか４倍の散逸容量を有するリポソームを単に添加することによりこれが達成されたことは興味深い（図５の上端行で、最大サイズのリポソームを添加した場合、ΔＤ／ΔＦは０．１４３であったのに対して、１５７ｂｐのＤＮＡを添加した場合、０．０３１７であった。２つの比は０．１４３／．０３１７＝４．５であるが、検出限界は３〜４桁向上した）。
【００８７】
ＤＮＡ検出の顕著な向上は、本発明が２つの分子の流体力学的性質の差を活用するという事実に依拠する。すなわち、大きいかつ柔らかい球体であるリポソームは、より硬いＤＮＡ分子により散逸されるエネルギーと比較して振動時に有意に多くのエネルギーを散逸する。
【００８８】
エネルギー損失に関連するパラメーター（たとえば、散逸の変化ΔＤ）または周波数に関連するパラメーター（たとえば、ΔＦ）または位相に関連するパラメーターと検量線とを比較することにより、アナライトの量の定量的尺度を決定することが可能である。
【００８９】
アンカーの使用
我々はまた、標識本体がセンサー表面から５〜２５０ｎｍの位置にアンカーされるようにセンサー表面と標識のバルクを構成する本体との間に５〜２５０ｎｍのスペーサーが存在する場合にアッセイ感度が向上することを見いだした。したがって、アナライトが一本鎖または二本鎖の核酸でありかつＤＮＡ表面プローブが少なくとも１５塩基対の長さを有する場合、感度が向上する。少なくとも２９塩基対（１０ｎｍ）または少なくとも８４４塩基対（１５ｎｍ）または少なくとも５９塩基対（２０ｎｍ）では、またさらなる向上が見いだされる。これらの実験で表面結合二本鎖ＤＮＡを２１塩基対（７ｎｍ）から１５７ｂｐ（５３ｎｍ）に増加させたところ、２００ｎｍのリポソーム（本体として機能する）の散逸容量が１．３倍に増加したことは、注目に値する。
【００９０】
したがって、第１の例に係るいくつかの実施形態では、表面とアナライトキャプチャー領域との間の領域４（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃに示される）は、典型的には１０ヌクレオチド以上の長さのアンカーとして機能しうる（ただし、好適な間隔を提供するために、表面プローブおよびアナライトの長さは全体で少なくとも１５ヌクレオチドである）。
【００９１】
センサー表面とアナライトとの間と同様に、アンカーは、本体（リポソームなど）をアナライトに接続する標識の一部でありうる。この場合も、アンカーは、典型的には５〜２５０ｎｍの長さを有するであろう。したがって、リポソーム２４は本体とみなしうるとともに、一本鎖分子２６はアンカーと見なしうる。
【００９２】
またさらに、アナライト（たとえば、二本鎖ＤＮＡ）自体は、５〜２５０ｎｍの長さを有するアンカーとして機能しうる（図４）。
【００９３】
変形形態
本発明は、広範にわたるアナライトさらには一本鎖または二本鎖の核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）に適用可能である。たとえば、タンパク質、糖タンパク質、ペプチドなどのタンパク質バイオマーカー、およびホルモン、グルコース、コレステロールなどの低分子量アナライト、および他の代謝物。表面へのアナライトの特異的結合およびアナライトへの標識の特異的結合は、任意の適切な特異的認識エレメントを用いて、たとえば、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、化学結合剤、たとえば、当業者に公知のクリックケミストリータイプまたは他のタイプの特異的認識エレメントを用いて、達成可能である。
【００９４】
当業者であれば、特異的認識エレメントをセンサー表面に結合するために使用可能な各種化学に気付くであろう。たとえば、ＤＮＡ表面プローブは、代替的に、金または他の好適なセンサー表面に接着するように修飾された５’−チオールでありうる。
【００９５】
測定を特異的なものとするために、アナライトは典型的には感知表面に特異的に結合し、標識はアナライトに特異的に結合する。しかしながら、両方のステージが特異的であることは不可欠ではなく、たとえば、標的核酸を表面に特異的に結合すれば、次いで、非特異的核酸結合部分で修飾された標識を使用しても十分でありうる。
【００９６】
さらに、追加の特異的認識エレメント、たとえば、抗体または他の特異的結合分子、たとえば、アプタマーおよびアフィマーにより、標識をアナライトに接着しうるか、または標識を感知表面に接着しうる（サンドイッチアッセイ方式）。他の実施形態では、最初に標識がアナライトに結合し、その後でアナライトが感知表面に結合される。
【００９７】
例として、代替実施形態では、アナライトが表面プローブＤＮＡに結合されたら、アナライトの第２の領域（標識キャプチャー領域）に相補的な配列を有する５’−コレステロール修飾一本鎖オリゴ核酸は、ハイブリダイズ条件でセンサー表面に導入され、存在する場合はアナライトに結合する。次いで、リポソームが導入されうるとともに、５’−コレステロール修飾一本鎖オリゴ核酸のコレステロール部分に接着し、それにより、リポソーム標識は、結合されたアナライトの量に対応する量で感知表面に接着する。
【００９８】
本明細書に与えられた例では、リポソームを高散逸性標識として使用した。しかしながら、標的アナライトよりも有意に大きい音響散逸容量を有するのであれば、他の構造を標識として利用してもよい。標識として使用可能な他の高散逸性構造の例としては、種々のサイズおよび組成のリポソーム、ビーズまたはコロイド粒子（十分に散逸性の材料からなる）、ポリマー、デンドリマー、両親媒性ナノ粒子などの非脂質骨格からなるベシクル、架橋されたリポソームまたはベシクル、膜の外側で可撓性高分子構造を利用したリポソーム／ベシクル、緩衝液の代わりに高粘性媒体を封入したベシクル／リポソーム、２つまたは３つのリポソームを結合するために中心担体（デンドリマー）を使用した合成複合体、脂質とポリジアセチレン（ＰＤＡ）とを含む重合脂質／ポリジアセチレンベシクル、ならびに双頭型両親媒性ベシクルが挙げられる。
【００９９】
たとえば、図８は、本体３０と特異的認識エレメントまで伸長するスペーサー領域１７とを有する標識のいくつかの可能な構造を例示する。８（ａ）では、本体は、本発明の実施例で使用されるように、標的核酸配列に相補的なＤＮＡプローブを有するリポソームである。８（ｂ）では、本体は、周囲の液体よりも粘性の溶液を封入した対応するリポソームである。８（ｃ）では、本体は、脂質の一部が架橋されている以外は図８（ａ）の例に対応するリポソームである。８（ｄ）では、溶液中に伸長するより少量の親水性ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール鎖）を有するリポソームを例示する。８（ｅ）では、本体としての複数のリポソームと複合体化されたデンドリマーがスペーサー領域である例である。スペーサー１７は、核酸配列、ポリエチレングリコールなどなどのポリマーでありうる。
【０１００】
本発明は、かなりの利点を有する。それは、限定されるものではないがＤＮＡをはじめとするきわめて少量のアナライトのきわめて特異的な検出を可能にする。したがって、それは、ＤＮＡを検出するためのＰＣＲの代替手段として有用であり、ＤＮＡ抽出の必要性の除去または低減、時間およびコストの削減、ＰＣＲバイアスリスクの回避、より少ない加熱エレメントおよびより少ないパワー消費を有する比較的単純な関連機器の必要性をはじめとする各種の利点を有する。音響システムは、適宜、Ｍｉｔｓａｋａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｋ．Ｍｉｔｓａｋａｋｉｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２００８，１７，１０１０−１０１９に記載のマイクロフルイディクスと組合せ可能である。最後に、提案されたアッセイの固有の単純性および完全に定量的な特性は、高い感度および音響デバイスと他のモジュールとの統合能と相まって、オンサイト分析および低コスト操作（両方とも発展途上国の個別化医療や診断プラットフォームなどの用途にきわめて重要である）に真に有用なものとなりうる。
【０１０１】
本発明はまた、限られたラウンド数またはより速いプロトコルで標的アナライト増幅（たとえば、ＰＣＲまたは等温増幅）を行った後でアナライトを検出するためにも利用しうる。これにより検出限界を向上させうるが、多く（典型的には３０〜５０）のラウンド数で増幅を行う必要のあるＰＣＲまたは等温増幅のみの使用と比較して、全検出プロセスを迅速化でき、ＰＣＲバイアスが最小限に抑えられる。
【０１０２】
したがって、本アッセイは、非常に低濃度で見いだされるアナライトの検出に、たとえば、血液中の腫瘍循環ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の検出にとりわけ役に立つ。
【０１０３】
本明細書に開示される発明の範囲内で、さらなる変更形態および変形形態を行うる。
【図１（ａ）】
2018520681.tif 000003
【図１（ｂ）】
2018520681.tif 000004
【図２（ａ）】
2018520681.tif 000005
【図２（ｂ）】
2018520681.tif 000006
【図２（ｃ）】
2018520681.tif 000007
【図２（ｄ）】
2018520681.tif 000008
【図３（ａ）】
2018520681.tif 000009
【図３（ｂ）】
2018520681.tif 000010
【図４（ａ）】
2018520681.tif 000011
【図４（ｂ）】
2018520681.tif 000012
【図５】
2018520681.tif 000013
【図６】
2018520681.tif 000014
【図７】
2018520681.tif 000015
【図８】
2018520681.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成29年5月3日(2017.5.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感知表面（４）を有する液体媒体弾性波センサー（１）を用いてアナライト（１２）を測定する方法であって、標識が前記感知表面に離散的に結合して、結果的に、各標識が単一のアナライトを介して前記感知表面に接着されるように、単一装着点を介してサンプル中のアナライトを前記感知表面に接着しかつ標識（１４、１６、１８、３０）を前記アナライトおよび前記表面に接着する工程であって、前記標識が標識本体を含み、それによりこの標識本体が５〜２５０ｎｍのアンカー長さで前記感知表面にアンカーされる、工程と、前記標識が前記表面に接着する前に前記液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失に関連するパラメーターの第１の測定を行う工程と、前記標識が前記表面に接着した後に前記パラメーターの第２の測定を行う工程と、前記第１および第２の測定間の前記パラメーターの変化から前記アナライトの存在および量の一方または両方を決定する工程であって、前記標識が、前記感知表面への前記アナライトまたは標識の結合に基づく散逸容量、すなわち、前記弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失の変化と、前記液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の周波数または位相の変化と、の比を有し、この散逸容量がアナライトのものよりも少なくとも１０％大きい、工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記アナライト（１２）が、前記第１の測定を行った後ただし前記第２の測定を行う前に前記表面（４）に接着し、かつ前記方法が、前記アナライトが前記表面に接着する前に予備測定を行う工程と、次いで、前記アナライトが前記表面に接着した後に前記第１の測定を行う工程と、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１および第２の測定が前記弾性波の振幅または散逸の測定を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記液体媒体弾性波センサー（１）がバルク弾性波型デバイスまたは表面弾性波デバイスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アナライト（１２）が前記第１の測定を行う前に前記感知表面に特異的に接着される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
次いで、前記標識（１４、１６、１８、３０）が添加され、存在する場合は前記アナライト（１２）に結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標識（１４、１６、１８、３０）が本体（１４）を含みかつ特異的認識エレメント（１８）が前記標識本体に結合され、前記特異的認識エレメントが前記アナライト（１２）に特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記特異的認識エレメント（１８）が標識結合スペーサー領域（１７、１９）を介して前記標識本体（１４）に結合され、前記標識結合スペーサー領域が少なくとも５ｎｍの長さを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標識（１４）が標識本体（１４）を含みかつ標識結合プローブ（１６）が前記標識本体に結合され、前記標識結合プローブが核酸を含み、前記核酸が、前記特異的認識エレメント（１８）と、前記標識本体と前記特異的認識エレメントとの間のスペーサー領域（１７、１９）と、を含み、前記スペーサー領域が少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識本体（１４）がそれに接着された核酸を有し、前記核酸が、前記アナライト（１２）と前記核酸プローブの特異的結合領域との間のハイブリダイゼーションにより前記アナライトと前記標識本体との接着を媒介する特異的結合領域（１８）と、前記特異的結合領域と前記標識本体との間のスペーサー領域（１７、１９）と、を含み、前記核酸が１５〜７３５ヌクレオチドの長さを有し、かつ前記スペーサー領域が少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
特異的認識エレメント（６）が前記感知表面（４）に結合され、前記特異的認識エレメントが前記アナライト（１２）に特異的に結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記特異的認識エレメント（６）が表面結合スペーサー領域（１１、１３）を介して前記感知表面（４）に結合され、前記表面結合スペーサー領域が少なくとも５ｎｍの長さを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記表面プローブ（６）が前記感知表面（４）に結合され、前記表面プローブが核酸を含み、前記核酸が、特異的認識（１０）エレメントと、前記特異的認識エレメントと前記表面との間のスペーサー領域（１１、１３）と、を含み、前記スペーサー領域が少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識（１４、１６、１８、３０）が前記アナライト（１２）を介して前記感知表面（４）に接着し、前記アナライトが、前記標識（１４、１６、１８、３０）と前記感知表面との接着を媒介する５〜２５０ｎｍの長さを有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アナライト（１２）が二本鎖ＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記表面（４）がそれに接着された核酸（１６）を有し、前記核酸が、前記アナライトと前記核酸の特異的結合領域との間のハイブリダイゼーションにより前記アナライト（１２）および標識（１４、１６、１８、３０）と前記表面との接着を媒介する特異的結合領域（１０）と、前記特異的結合領域と前記感知表面との間のスペーサー領域（１１、１３）と、を含み、前記核酸が１５〜７３５ヌクレオチドの長さを有し、かつ前記スペーサー領域が少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識（１４、１６、１８、３０）がリポソーム（１４、３０）を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記リポソーム（１４、３０）に１×１０−２Ｐａ・ｓ超の粘度の媒体が封入される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標識（１４、１６、１８、３０）が、互いに連結された複数のリポソーム（３０）のグループを含む、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
液体媒体音響センサー（１）によりアナライト（１２）を検出するための標識を選択する方法であって、前記アナライトが単一装着点を介して前記感知表面に離散的に結合するように前記アナライトが前記弾性波センサーの感知表面（４）に結合したとき、前記液相弾性波センサー（１）により発生された弾性波のエネルギー損失の変化を測定することにより、前記アナライトの散逸容量を決定する工程と、前記標識が前記感知表面に離散的に結合して、結果的に、各標識が単一のアナライトを介して前記感知表面に接着されるように前記標識（１４、１６、１８、３０）が前記表面に結合したとき、前記液相弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失の変化を測定することにより、前記標識の散逸容量を計算する工程と、前記標識の計算された散逸容量が前記アナライトの計算された散逸容量よりも１０％超大きければ前記アナライトの検出に使用するための標識として前記標識を選択する工程であって、前記散逸容量が、前記感知表面への前記アナライトまたは標識の結合に基づく、前記弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失の変化と、前記液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の周波数または位相の変化と、の比である、工程と、を含む方法。
【請求項２１】
前記標識が標識本体（１４）を含み、かつそれにより前記標識本体が５〜２５０ｎｍのアンカー長さで前記感知表面（４）にアンカーされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アナライト（１２）が、５〜２５０ｎｍの長さを有するスペーサー領域を介して前記感知表面（４）に接着される、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標識（１４、１６、１８、３０）が本体（１４、３０）を含み、かつ前記標識本体が、５〜２５０ｎｍの長さを有するスペーサー領域を介して前記アナライト（１２）に接着される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標識（１４、１６、１８、３０）が前記アナライト（１２）を介して前記表面（４）に接着し、かつ前記アナライトが、前記標識と前記表面との接着を媒介する５〜２５０ｎｍの長さを有する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記アナライト（１２）が二本鎖ＤＮＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記表面がそれに接着された核酸を有し、前記核酸が、前記アナライトと前記核酸プローブの特異的結合領域との間のハイブリダイゼーションにより前記アナライト（１２）および標識（１４、１６、１８、３０）と前記表面（４）との接着を媒介する特異的結合領域と、前記特異的結合領域と前記感知表面との間のスペーサー領域と、を含み、前記核酸が１５〜７３５ヌクレオチドの長さを有し、かつ前記スペーサー領域が少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有する、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
感知表面を有する液体媒体音響センサー（１）を用いてアナライトを検出するためのキットであって、前記キットが、前記感知表面（４）に接着可能なまたは感知表面に接着された表面プローブと、標識本体と、前記標識本体（１４、３０）に接着されたまたは接着可能な標識プローブと、を含み、前記表面プローブおよび前記標識プローブが、それぞれ、アナライト（１２）のそれぞれの領域に特異的に結合するように構成された特異的認識エレメントを含み、前記表面プローブおよび／または前記標識プローブが、前記アナライトと前記表面プローブと前記標識プローブとを介して前記標識本体を前記表面に離散的に接着可能で結果的に各標識を単一のアナライトを介して前記感知表面に接着することにより５〜２５０ｎｍのアンカー長さで前記標識本体を感知表面にアンカーするようにスペーサー領域を含み、前記標識が、前記感知表面への前記アナライトまたは標識の結合に基づく散逸容量、すなわち、前記弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失の変化と、前記液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の周波数または位相の変化と、の比を有し、この散逸容量がアナライトのものよりも少なくとも１０％大きい、キット。
【請求項２８】
前記標識プローブ（６）のスペーサー領域（１７、１９）が少なくとも５ｎｍの長さを有し、かつ／または前記表面プローブ（１６）のスペーサー領域（１１、１３）が少なくとも５ｎｍの長さを有する、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記標識プローブ（６）および前記表面プローブ（１６）が、それぞれ、１５〜７３５ヌクレオチドの長さを有するかつ少なくとも１０ヌクレオチドの長さのスペーサー領域（１１、１３、１７、１９）を含む核酸である、請求項２７または請求項２８に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弾性波センサーを用いてアナライトの存在および／または量を測定する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、核酸、タンパク質、ホルモンなどの少量のアナライトを感度良く、簡単に、かつ費用効果的に測定する問題に対処する。測定は、典型的には有無の結果を伴うバイナリー測定であるアナライトの存在（不在に対して）を検出することまたは存在するアナライトの量の定量測定を行うことを含む。
【０００３】
１９８０年代に開発されたＰＣＲによるＤＮＡの酵素的増幅は、分子診断における遺伝子マーカーの検出に大きな変化をもたらし、日々の臨床診療を変えるとともに疾患の分子基盤の観測および特異的バイオマーカーの同定を可能にした。現在でも依然としてＰＣＲは感度に関して究極を極めているが、複雑性、汚染感受性、コスト、および携帯性欠如をはじめとする重大な欠点を有する（Ｒｏｓｉ，Ｎ．Ｌ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．；Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０５：１５４７−１５６２（２００５））。
【０００４】
そのほかに、いくつかのＤＮＡ鋳型は同一の反応内で優先的に増幅される（ＰＣＲバイアスとして知られる現象）（Ｔａｎ  Ｄ．＆  Ｌｙｎｃｈ  Ｈ．Ｔ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０１３））。いくつかの状況では、ＰＣＲバイアスは増幅効率の１０〜３０倍の差を引き起こす可能性があるので、突然変異検出の過小評価または失敗をもたらすおそれがある。単一ヌクレオチド多型は有意なＰＣＲバイアスを引き起こす可能性があり、これはプルーフリーディングおよび非プルーフリーディングのポリメラーゼの両方で観測される。豊富な野生型配列中に稀な突然変異配列が存在する不均一なサンプルの場合、こうした稀な標的をＰＣＲで十分に増幅できないことがある。さらに、患者由来のサンプル中にヘパリンをはじめとする非特異的ＰＣＲ阻害剤や特徴付けられない成分が存在することがあるので、ミスプライミングや阻害などの望ましくない結果を招くおそれがある。
【０００５】
最近、ナノ材料分野の進歩によって新しい検出プラットフォームがもたらされ、きわめて有望な方法の１つであるバイオバーコード（ＢＢＣ）法は、ＤＮＡ検出でｚＭ濃度領域の超高感度を達成した（Ｎａｍ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ−Ｂａｒ−Ｃｏｄｅ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＰＣＲ−ｌｉｋｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ＪＡＣＳ，１２６：５９３２−５９３３（２００４））。しかしながら、この顕著な性能は、ＰＣＲで得られるものと同様に簡単には達成されず、外因性の表面改質成分や多工程の増幅・検出スキームの使用など、厄介で時間のかかる手順を必要とする。ＢＢＣを細菌ゲノムＤＮＡの検出に適用した場合、報告された検出限界はｆＭ領域であった（Ｎａｍ  Ｊ−Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  Ｂｉｏ−Ｂａｒ  Ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１：１８８４−１８８６（２００３））。
【０００６】
タンパク質アナライトの検出に関して、現在のゴールドスタンダードはｐＭ領域に検出限界を有する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。この場合も、ナノ材料の進歩およびＢＢＣ法によってタンパク質の検出がａＭ領域まで可能になった（Ｎａｍ  Ｊ−Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  Ｂｉｏ−Ｂａｒ  Ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１：１８８４−１８８６（２００３））。ＤＮＡ−ＢＢＣアッセイと同様に、この方法もいくつかの外因性の粒子および多工程の増幅工程を必要とする。
【０００７】
最近、生物物理学分析および臨床分析に非常に重要なプラットフォームとして音響センサーが出現した。興味深いことに、このために弾性波／ソフトマター相互作用の基礎をなす科学の理解を前進させるに及ばない。広く受け入れられている機構、すなわち、固／液界面を伝搬する弾性波が界面で起こる質量変化および溶液粘度変化に対して感受性があることは、５０年代後半および９０年代に行われた先駆的研究に遡る（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ  Ｇ．，Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｒ  Ｐｈｙｓｉｋ  １５５（２）：２０６−２２２（１９５９）、Ｒｉｃｃｏ  Ａ．Ｊ．＆  Ｍａｒｔｉｎ  Ｓ．Ｊ．，Ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｗａｖｅ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｓｅｎｓｏｒ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．５０，１４７４  （１９８７））。質量変化は音響速度、すなわち、波の周波数（Ｆ）または位相（Ｐｈ）の測定に反映され、現在では、ΔＦおよびΔＰｈがデバイス表面に堆積した弾性質量の量に類似していることが理論的にも実験的にも十分に実証されている（Ｍｉｔｓａｋａｋｉｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｍｗ  ｗｉｔｈ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ；ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖｓ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ，Ａｎａｌｙｓｔ，１３９：３９１８−３９２５（２０１４））。こうした理由から、弾性波センサーを活用する臨床用途は、ｎＭ濃度領域でタンパク質または抗体を定量するために、このパラメータ（すなわち速度など）の測定に基づく（Ｍｉｔｓａｋａｋｉｓ，Ｋ．；Ｇｉｚｅｌｉ，Ｅ．；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｉｓｋ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ．６９９：１（２０１１）、Ｌｅｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＳＡＷ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：８６２９（２０１１））。最近、Ａｕナノ粒子上への後続の触媒された金（Ａｕ）堆積により音響シグナルの増強をもたらすサンドイッチ免疫アッセイを用いてかなり改善された検出限界（ｐＭ）が報告された（Ｌｅｅ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｗａｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ，Ｓｅｎｓ．Ａｃｔ．Ｂ．，１７８：１９−２５（２０１３））。国際公開第２００８／１４５１３０号パンフレット（Ａｔｏｎｏｍｉｃｓ  Ａ／Ｓ）は、シグナル増強のために金堆積を用いることに関してＢＢＣ法に類似しており、音響検出に関して、追加質量の堆積はかなり高い位相応答をもたらす。音響速度、すなわち、周波数（Ｆ）または位相（Ｐｈ）の変化の測定から標識アナライトを検出することは、たとえば、米国特許出願公開第２００２／０２３４９３号明細書（Ｍｉｙａｋｅ  Ｊ���ｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許出願公開第２００９／１７０１１９号明細書（Ｌｅｅ  Ｈｕｎ  Ｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許出願公開第２０１０／１０５０７９号明細書（Ｗａｒｔｈｏｅ  Ｐｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第４，２３６，８９３号明細書（Ｒｉｃｅ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｋ）、米国特許出願公開第２００５／１４８０６５号明細書（Ｚｈａｎｇ  Ｙｕｅｇａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、およびＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ＢＶ，ＮＬ．，ｖｏｌ．２６，ｎｏ．１２，２３  Ｍａｙ  ２０１１（Ｈｉｒｏｔｓｕｇｕ  Ｏｇｉ  ｅｔ  ａｌ．）からも知られている。
【０００８】
純溶液たとえばグリセロールの充填時に起こる粘度変化は、エネルギー散逸測定で記述され、通常、散逸（Ｄ）または振幅（Ａ）で表される。しかしながら、バイオ分子がデバイス表面に装着されたときに音響エネルギーが散逸される機構は、依然として明らかになっておらず、臨床用途に活用されていない。我々は、エネルギー損失を流体力学的結合現象に帰属する理論をこれまでに開発してきた（欧州特許第２１７１０８３号明細書）。簡潔に述べると、周囲の液体中でバイオ分子（単一点を介する表面に装着される）を振動させることにより抗力が生成し、これによりエネルギーが消費される。関連する流体力学的パラメーターはΔＤ／ΔＦ比またはΔＡ／ΔＰｈ比に関連付け可能な結合分子／粒子の固有粘度［η］であることが、厳密な理論的取扱いにより示された（Ｔｓｏｒｔｏｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｈａｐｅ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｂｏｕｎｄ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｗａｖｅ  ｓｅｎｓｏｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９４：２７０６−２７１５（２００８）、Ｔｓｏｒｔｏｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｅａｒ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｗａｖｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ＱＣＭ−Ｄ，Ｂｉｏｓ．Ｂｉｏｅｌ．２４：８３６−８４１（２００８））。この機構は、装着エンティティーのサイズおよび形状に依存し、これについては各種コンフォメーションのＤＮＡおよび球状のタンパク質で実験的に証明されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、弾性波を用いて溶液中の非常に低濃度のアナライトを検出するための新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明はＱＣＭおよびラブ波デバイスを用いたアナライトの測定に関してさらに考察されるが、本発明は他のタイプの液体媒体弾性波センサーを用いて行いうる。液体媒体弾性波センサーとは、弾性波センサーの感知表面が使用時に液体に接触したときに伝搬可能な弾性波を支持する弾性波センサーを意味する。
【００１１】
本明細書内および添付の特許請求の範囲内では、アナライトまたは標識の散逸容量とは、デバイス表面へのアナライトまたは標識の結合に基づく、弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失の変化と、液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の周波数または位相の変化と、の比を意味する。
【００１２】
弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失は、弾性波の振幅または散逸を測定することにより測定しうるとともにデバイス／液体界面における粘弾性の変化を反映しうることが、当業者であれば分かるであろう。周波数および位相は、たとえば、弾性波センサーの感知表面上に堆積した質量の影響を受ける。したがって、アナライトまたは標識の散逸容量は、たとえば、弾性波センサーの感知表面へのアナライトまたは標識の結合から生じる弾性波の振幅（Ａ）または散逸（Ｄ）の変化と弾性波の周波数（Ｆ）または位相（Ｐｈ）の変化との比、たとえば、散逸の変化と周波数の変化との比ΔＤ／ΔＦでありうる。
【００１３】
この比ΔＤ／ΔＦまたはΔＤ／ΔＰｈは音響比として知られ、離散非相互作用バイオ分子またはエンティティーの結合の場合、感知表面に結合する質量に依存しない。比が表面被覆率に依存する場合、結合エンティティーの散逸容量は、横方向相互作用が存在しないと仮定しうる低表面被覆率（＜１０％）で得られる比として定義される。
【００１４】
本明細書内および添付の特許請求の範囲内では、タンパク質、核酸（たとえば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および他のヌクレオチドポリマー）、ホルモン、代謝物、または他の生体マクロ分子への参照は、天然マクロ分子と、非タンパク質構成残基を含むタンパク質、非天然塩基を含む核酸などの合成変異体と、の両方を含むことが意図される。「タンパク質」という用語は、なんら特定最小数のペプチド残基を示唆することを意図するものでない。「核酸」という用語は、なんら特定最小数のヌクレオチドを示唆することを意図するものでないが、本発明で利用される核酸は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチドを有する。
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、感知表面を有する液体媒体弾性波センサーを用いてアナライトを測定する方法であって、標識が感知表面に離散的に結合して、結果的に、各標識が単一のアナライトを介して感知表面に接着されるように、単一装着点を介してサンプル中のアナライトを感知表面に接着しかつ標識をアナライトおよび表面に接着する工程と、標識が表面に接着する前に液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失に関連する（たとえば比例する）パラメーターの第１の測定を行う工程と、標識が表面に接着した後に前記パラメーターの第２の測定を行う工程と、前記第１および第２の測定間の前記パラメーターの変化からアナライトの存在および量の一方または両方を決定する工程と、を含む方法が提供される。
【００１６】
標識はアナライトよりも少なくとも１０％大きい散逸容量を有する。アナライトよりも少なくとも１０％大きい散逸容量を有する標識を用いると非標識アナライトの対応する量の測定と比較して測定の感度が劇的に向上することを我々は見いだした。標識を伴わないアナライトの結合に基づく、液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失に関連する前記パラメーターの測定値の変化は、液体媒体弾性波センサーの検出限界未満であるが、標識が結合すると前記パラメーターの測定値の変化は検出限界を超えることがある。
【００１７】
典型的には、標識は、アナライトよりも少なくとも２０％大きい、少なくとも２５％大きい、少なくとも５０％大きい、アナライトの少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも４倍の散逸容量を有する。
【００１８】
標識は、本体（たとえばリポソーム）を含み、感知表面への標識の接着により５〜２５０ｎｍのアンカー長さで標識本体を表面にアンカーする。アンカー長さとは、標識本体と表面との間の接続部により標識本体を表面から離間可能な最大距離を意味する。実際には、とくにアンカーが可撓性である場合、アンカーは必ずしも完全に伸長するとは限らないので、標識本体は表面にさらに近づくこともありうる。それにより標識本体と表面との間に形成されるアンカーは、典型的にはアナライトを含む。
【００１９】
典型的には、標識はアナライトに結合する。典型的には、標識はアナライトに特異的に結合する。標識は、アナライトを介して感知表面に接着することによりアナライトおよび表面に接着する（アナライトが存在する場合）。
【００２０】
特異的認識エレメント（表面結合特異的認識エレメント）は感知表面に結合しうる。表面結合特異的認識エレメントは、使用時にアナライトに特異的に結合しうる（またはアナライトに特異的に結合するアナライト結合エレメントに結合するように構成しうる）。したがって、アナライト（および標識本体）は、表面に結合された特異的認識エレメントを介して感知表面に接着しうる。表面結合特異的認識エレメントは、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、抗体（たとえば、表面に結合されたスペーサー領域（たとえば長鎖）に装着されたもの）、高分子鎖（デキストラン、ＰＥＧなど）、またはペプチドでありうる。
【００２１】
表面結合特異的認識エレメントは、スペーサー領域を介して感知表面に結合しうる。
【００２２】
表面プローブは、感知表面に接着しうるとともに、特異的認識エレメントと、特異的認識エレメントと感知表面との間の前記スペーサー領域と、を含みうる。したがって、アナライト（および標識本体）は、表面プローブを介して表面に接着しうる。
【００２３】
スペーサー領域は、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。スペーサー領域は、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、または高分子鎖（デキストランやポリエチレングリコールなど）を含みうる。
【００２４】
アナライトは、アナライト（および標識）と表面との接着を媒介する少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さの表面プローブ（典型的には前記特異的認識エレメントとスペーサー領域とを含む）を介して表面に接着しうる。
【００２５】
表面結合特異的認識エレメントは、アナライトの領域に相補的な配列を有する核酸を含みうる（アナライトが核酸である場合）。表面プローブは核酸を含みうるとともに、核酸は表面結合特異的認識エレメント（アナライトの領域に相補的な配列である）と、表面結合特異的認識エレメントとセンサー表面と間のスペーサー領域と、を含みうる。
【００２６】
典型的には、前記核酸は、１５〜７３５ヌクレオチド、２９〜７３５ヌクレオチド、または５９〜７３５ヌクレオチドの長さを有する。核酸のスペーサー領域は、表面と特異的認識エレメントとの間に少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２９ヌクレオチドの長さを有しうる。標識本体と表面との間のアンカーの一部を形成するこのスペーサー領域は、全部または一部が一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００２７】
特異的認識エレメント（標識結合特異的認識エレメント）は標識本体に結合しうる。標識結合特異的認識エレメントは、使用時にアナライトに特異的に結合しうる（またはアナライトに特異的に結合するアナライト結合エレメントに結合するように構成しうる）。したがって、標識本体は、標識結合特異的認識エレメントを介してアナライト（および感知表面）に接着しうる。標識結合特異的認識エレメントは、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、抗体（たとえば、表面に結合されたスペーサー領域（たとえば長鎖）に装着されたもの）、高分子鎖（デキストラン、ＰＥＧなど）、またはペプチドでありうる。
【００２８】
標識結合特異的認識エレメントは、スペーサー領域を介して標識本体に結合しうる。
【００２９】
標識結合プローブは、標識本体に接着しうるとともに、標識結合特異的認識エレメントと、標識結合特異的認識エレメントと標識本体との間の前記スペーサー領域と、を含みうる。したがって、標識本体は、標識結合プローブを介してアナライト（および感知表面）に接着しうる。
【００３０】
標識結合スペーサー領域は、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。標識結合スペーサー領域は、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、または高分子鎖（デキストランやポリエチレングリコールなど）を含みうる。
【００３１】
アナライトは、アナライトと標識本体との接着を媒介する少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さの標識結合プローブ（典型的には前記標識結合特異的認識エレメントとスペーサー領域とを含む）を介して標識本体に接着しうる。
【００３２】
標識結合特異的認識エレメントは、アナライトの領域に相補的な配列を有する核酸を含みうる（アナライトが核酸である場合）。標識結合プローブは核酸を含みうるとともに、核酸は標識結合特異的認識エレメント（アナライトの領域に相補的な配列である）と、標識結合特異的認識エレメントと標識本体との間のスペーサー領域と、を含みうる。
【００３３】
典型的には、標識結合核酸は、１５〜７３５ヌクレオチド、２９〜７３５ヌクレオチド、または５９〜７３５ヌクレオチドの長さを有する。標識結合核酸のスペーサー領域は、標識本体と特異的認識エレメントとの間に少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２９ヌクレオチドの長さを有しうる。標識本体と表面との間のアンカーの一部を形成するこのスペーサー領域は、全部または一部が一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００３４】
いくつかの実施形態では、表面結合特異的認識エレメントは、アナライトの第１の領域に相補的な核酸配列を含み、標識結合特異的認識エレメントは、アナライトの第２の領域（典型的には、０〜５０ヌクレオチドの間隔を有してアナライトの第１の領域に近接する）に相補的な核酸配列を含む。
【００３５】
アナライトは、標識と表面との接着を媒介する５〜２５０ｎｍの長さ（任意選択的に少なくとも１０ｎｍまたは少なくとも２０ｎｍの長さ）を有し、前記標識本体はアナライトを介して感知表面に接着されることもありうる。この場合、アナライトは、５〜２５０ｎｍのアンカー長さで標識本体を感知表面にアンカーする。実際上、アナライトは、５〜２５０ｎｍの長さのスペーサーとして作用しうる。この場合、アナライトは二本鎖ＤＮＡでありうるとともに、本方法は、アナライトを得るために、たとえばポリメラーゼチェーンリダクション（ＰＲＣ）を用いて核酸増幅により標的核酸を増幅する初期工程を含みうる。これは、とりわけ少量の標的核酸を検出するために使用可能である。したがって、アナライトは、１５〜７３５塩基対、２９〜７３５塩基対、または５９〜７３５塩基対の長さの二本鎖ＤＮＡ分子でありうる。この場合、アナライトは、感知表面に直接接着しうる。感知表面は、アナライトに特異的に結合する特異的認識エレメントを含んでいなくてもよい。感知表面は、アナライトに特異的に結合するかつ核酸でない特異的認識エレメントを含んでいてもよい。感知表面は、共有結合によりアナライトに結合する特異的認識エレメントを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アナライトは、標識本体に直接接着しうる。その場合、標識本体は、アナライトに特異的に結合する特異的認識エレメントを含んでいなくてもよい。標識本体は、共有結合によりアナライトに結合する特異的認識エレメントを含んでいてもよい。本方法がアナライトを得るために標的核酸を増幅する工程を含む場合、標的核酸を増幅する工程は、感知表面または標識本体に結合するための結合部分、たとえば、ニュートラビジン、ビオチン、コレステロール、またはチオール基を含む１つ以上の核酸残基を導入する工程を含みうる。
【００３６】
アナライトは、第１の測定を行う前に表面に接着しうる。アナライトは、第１の測定を行った後ただし第２の測定を行う前に表面に接着しうる。本方法は、アナライトが表面に接着する前に予備測定を行う工程と、次いで、アナライトが表面に接着した後に第１の測定を行う工程と、を含みうる。これによりアナライトの接着に基づくパラメーターの変化の測定を行うことが可能になる。これは標識の接着に基づく第１および第２の測定間のパラメーターの変化と比較可能である。いくつかの状況では、アナライトの接着に基づく変化は検出不能であろうが、標識の接着に基づく変化は検出可能であろう。予備測定、第１の測定、および／または第２の測定は、連続測定の中から選択される測定でありうる。予備測定、第１の測定、および／または第２の測定は、それぞれ、複数回の測定の組合せ、たとえば、平均でありうる。
【００３７】
第１および第２の測定（および適用可能な場合は予備測定）は、それぞれ、液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失に関連する前記パラメーターの測定（第１のシグナル）を含みうる。この測定（第１のシグナル）は弾性波の振幅の測定でありうる。この測定（第１のシグナル）は弾性波の散逸の測定でありうる。この測定（第１のシグナル）は、音響センサーのインピーダンス、アドミタンス、抵抗、サセプタンス、コンダクタンス、またはバンド幅パラメーターなどの電気回路アナログパラメーターの測定でありうる。
【００３８】
第１および第２の測定（および適用可能な場合は予備測定）は、それぞれ、液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失に関連するパラメーターの測定（前記第１のシグナル）、さらには液体媒体弾性波センサーにより発生された弾性波の周波数または位相に関連するパラメーターの測定（前記第２のシグナル）を含みうる。これらの各測定値の変化を考慮してアナライトの存在および量の一方または両方を決定しうる。
【００３９】
液体媒体弾性波センサーは、バルク弾性波型デバイス、たとえば、石英結晶マイクロバランス、厚み滑りモードレゾネーター、または厚み滑りバルク音響レゾネーター（たとえば、高基本周波数ＱＣＭ（ＨＦＦ−ＱＣＭ）および厚み滑りフイルムバルク音響レゾネーター（ＴＳ−ＦＢＡＲ））でありうる。この場合、第２のパラメーターは、典型的には、液体媒体弾性波センサーの振動周波数または共振周波数の測定であろう。また、弾性波のエネルギー損失に関連するパラメーター（第１のシグナル）は、典型的には、弾性波センサーにより発生された波のエネルギー散逸またはバンド幅に関連するであろう。
【００４０】
液体媒体弾性波センサーは、剪断波を発生する弾性波センサーでありうる。かかる表面弾性波型デバイスは、剪断波、たとえば、ラブ波、表面スキミングバルク波、音響プレートモード、ブルースタイン・グリヤエフ波、漏洩弾性波、または表面横波を発生するためにインターディジットトランスデューサーを利用可能である。この場合、弾性波のエネルギー損失に関連するパラメーター（第１のシグナル）は、典型的には、発生された表面弾性波の振幅の測定であろう。また、弾性波の速度に関連するパラメーター（第２のシグナル）は、典型的には、発生された表面弾性波の位相の測定であろう。
【００４１】
剪断弾性波センサーは、非接触非インターディジットトランスデューサーに基づくデバイス、たとえば、電磁励振剪断弾性波を利用するデバイスでありうる。液体媒体弾性波センサーは、撓みプレート波デバイスまたはラム波デバイスとして知られる構成で弾性波を励振する薄膜を用いた弾性波センサーでありうる。
【００４２】
アナライトは、第１の測定を行う前に感知表面に接着しうる。典型的には、次いで標識が添加され、存在する場合はアナライトに結合する。典型的には、標識は、アナライトに特異的に結合するか、またはアナライト結合エレメントに特異的に結合してからこれが典型的には特異的にアナライトに結合する。
【００４３】
アナライトは、任意のタイプの酵素的増幅（ＰＣＲもしくは等温）またはハイブリダイゼーションまたは任意の他の酵素反応により生成されたｄｓＤＮＡ断片でありうる。この場合、アナライトは、感知表面および／または標識本体との結合（典型的には共有結合）を形成するための１つ以上の結合部分を含みうる。たとえば、チオール修飾を介してｄｓアナライトをセンサー表面に直接結合することにより、特異的表面結合認識分子の必要性を排除しうる。アナライトが十分に長ければ、個別のスペーサー領域の補助を排除しうる。
【００４４】
アナライトは、単一装着点を介して感知表面に離散的に結合する（たとえば、さらに互いに結合されない離散構造として、たとえば、アナライトが分子である場合は離散分子として）。標識は、各標識が単一のアナライトを介して感知表面に接着されるように感知表面に離散的に結合する。
【００４５】
それにもかかわらず、いくつかの実施形態では、標識はアナライトと一緒に感知表面に結合しうる。たとえば、存在する場合はアナライトに標識が結合するように標識およびアナライトを溶液に導入しうるとともに、次いで、結合された標識およびアナライトを感知表面に導入しうる。この場合、標識は、典型的には、アナライトに特異的に結合するための特異的認識エレメントを含むであろう。かつ／または、感知表面は、典型的には、アナライトに特異的に結合するための特異的認識エレメントを含むであろう。いくつかの場合には、あらかじめ形成された標識／アナライト複合体は、標識を介して表面結合特異的認識エレメントに結合しうる。この場合、標識は、２つの異なる特異的認識エレメント（一方はアナライトに結合するためのものおよび他方は表面結合特異的認識エレメントに結合するためのもの）を有しうる。
【００４６】
標識は、任意の分子、高分子構造、エンティティー、またはいくつかの分子、ポリマー、およびエンティティーの組合せの複合体であろう。いずれにせよ、標識は、アナライトよりも高い散逸容量により特徴付けられるべきである。エンティティーは、任意の種類の標識本体、たとえば、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、およびデンドリマー、またはより複雑な構造の以上の組合せを含みうる。ナノ粒子とは、１〜５００ｎｍの直径を有する任意の粒子を意味する。ナノ粒子は、任意の材料、たとえば、金属（たとえば金）、ポリマー、シリカなどで作製しうる。リポソームとは、ポリマー、ＤＮＡ、ペプチド、タンパク質などの追加の成分が表面に任意選択的に装着された脂質二重層（たとえばリン脂質二重層）により取り囲まれたコンパートメントを意味する。リポソームは、ユニラメラベシクルおよびマルチラメラベシクルの両方を含む。リポソームは、典型的には２０〜５００ｎｍの直径を有する。標識は、２５℃で１×１０−２Ｐａ・ｓ超または０．１Ｐａ・ｓ超の粘度を有する媒体たとえばグリセロールを封入したリポソームを含みうる。リポソームは、脂質二重層のいずれかの側さらには二重層内で脂質間に複数の架橋分子を含みうる。標識は、たとえばデンドリマーにより互いに連結された複数のリポソームのグループを含みうる。以上で考察したように、標識は、標識本体（たとえば、前記ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、デンドリマー）と、標識本体とアナライトとの接着を媒介する５〜２５０ｎｍの長さのスペーサー領域と、を含みうる。
【００４７】
第２の態様では、本発明は、液体媒体音響センサーによりアナライトを検出するための標識を選択する方法であって、アナライトが単一装着点を介して感知表面に離散的に結合するようにアナライトが弾性波センサーの表面に結合したとき、液相弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失の変化を測定することにより、アナライトの散逸容量を決定する工程と、標識が感知表面に離散的に結合して、結果的に、各標識が単一のアナライトを介して感知表面に接着されるように標識が表面に結合したとき、液相弾性波センサーにより発生された弾性波のエネルギー損失の変化を測定することにより、標識の散逸容量を計算する工程と、標識の計算された散逸容量がアナライトの計算された散逸容量よりも１０％超大きければアナライトの検出に使用するための標識として標識を選択する工程と、を含む方法に拡張される。次いで、標識は、本発明の第１の態様の方法でアナライトを検出するために使用しうる。さらなる選択肢は、本発明の第１の態様に関連して以上で考察したことに対応する。
【００４８】
第３の態様では、本発明は、感知表面を有する液体媒体音響センサーを用いてアナライトを検出するためのキットであって、キットが、感知表面に接着可能なまたは感知表面に接着された表面プローブと、標識本体と、標識本体に接着されたまたは接着可能な標識プローブと、を含み、表面プローブおよび標識プローブが、それぞれ、アナライトのそれぞれの領域に特異的に結合するように構成された特異的認識エレメントを含み、表面プローブおよび／または標識プローブが、アナライトと表面プローブと標識プローブとを介して標識本体を表面に離散的に接着して結果的に各標識を単一のアナライトを介して感知表面に接着することにより５〜２５０ｎｍのアンカー長さで標識本体を感知表面にアンカーできるようにスペーサー領域を含み、標識がアナライトよりも少なくとも１０％大きい散逸容量を有する、キットに拡張される。
【００４９】
標識プローブは、前記標識結合プローブでありうるか、または前記標識結合プローブを形成するように標識本体に接着可能でありうる。その場合、標識本体結合エレメント（たとえば、標識に結合するように構成された１つ以上の化学基）を含みうる。標識プローブは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。標識プローブのスペーサー領域は、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。標識プローブのスペーサー領域は、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、または高分子鎖（デキストランやポリエチレングリコールなど）を含みうる。標識プローブは、１５〜７３５ヌクレオチド、２９〜７３５ヌクレオチド、または５９〜７３５ヌクレオチドの長さの核酸を含みうる。核酸は、標識プローブの前記特異的認識エレメントであるかつアナライトの領域に相補的である領域と、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２９ヌクレオチドの長さを有するスペーサー領域（特異的認識エレメントと標識本体との接着を媒介する）と、を含みうる。
【００５０】
表面プローブは、表面結合プローブでありうるか、または表面結合プローブを形成するように感知表面に接着可能でありうる。その場合、感知表面に直接結合するようにまたは感知表面コーティングに結合するように構成された１つ以上の表面結合エレメントを含みうる。表面プローブは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。表面プローブのスペーサー領域は、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍの長さを有しうる。表面プローブのスペーサー領域は、たとえば、一本鎖もしくは二本鎖の核酸、アプタマー、または高分子鎖（デキストランやポリエチレングリコールなど）を含みうる。表面プローブは、１５〜７３５ヌクレオチド、２９〜７３５ヌクレオチド、または５９〜７３５ヌクレオチドの長さの核酸を含みうる。核酸は、表面プローブの前記特異的認識エレメントであるかつアナライトの領域に相補的である領域と、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２９ヌクレオチドの長さを有するスペーサー領域（特異的認識エレメントと感知表面との接着を媒介する）と、を含みうる。
【００５１】
キットは、液体媒体音響センサーの感知表面をさらに含みうる。キットは、液体媒体音響センサーをさらに含みうる。表面プローブは、前記感知表面に接着しうる。
【００５２】
本発明の第２および第３の態様のさらなる任意選択的な特徴は、本発明の第１の態様に関連して以上で考察したことに対応する。
【００５３】
次に、以下の図を参照して本発明の実施形態を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１ａ】標識結合プローブとアナライトと表面プローブとを介して弾性波センサーの感知表面に接着した標識の模式図である。
【図１ｂ】二本鎖ＤＮＡアナライトを介して弾性波センサーの感知表面に接着した標識の模式図である。
【図２ａ】一本鎖核酸表面プローブの模式図である。
【図２ｂ】二本鎖スペーサー領域を有する核酸表面プローブの模式図である。
【図２ｃ】一本鎖核酸標識結合プローブを有する標識の模式図である。
【図２ｄ】二本鎖スペーサー領域を有する核酸標識結合プローブを有する標識の模式図である。
【図３ａ−ｂ】表面プローブが一本鎖（３（ａ））または二本鎖（３（ｂ））のスペーサー領域を有する条件で核酸アナライトを介して感知表面に接着した標識の模式図である。
【図４ａ−ｂ】標識結合プローブが一本鎖（４（ａ））または二本鎖（４（ｂ））のスペーサー領域を有する条件で核酸アナライトを介して感知表面に接着した標識の模式図である。
【図５】３つの異なる長さの二本鎖ＤＮＡ分子（アナライト）が感知表面に接着したとき（列（ｉｉｉ））および３つの異なる直径のリポソーム（標識）がＤＮＡに接着したとき（列（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ））の散逸容量（ΔＤ／ΔＦ）を示す結果の表である。
【図６】リポソーム標識のサンプルが６つの異なるＤＮＡ量に対して表面結合ＤＮＡに結合したときの散逸の変化（ΔＤ）のグラフであり、対応する量のＤＮＡが結合したときの周波数の変化を示す表と組み合わされる。
【図７】図６に示される対応する量のＤＮＡが標識を添加することなく感知表面に結合したときの周波数（ヘルツ単位）および散逸の変化を示す表である。
【図８】各種の可能な標識構造の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
図１（ａ）に関して、弾性波デバイス１は、液体媒体に接触する感知表面４を有する基材２を有する。表面プローブ６は、プローブの一方の末端８を介して感知表面に固定化される。プローブの他方の末端は、アナライト１２に特異的に結合するように選択された特異的認識エレメント１０を含む。初期にはアナライトは存在しない。
【００５６】
次いで、アナライトがアッセイされるサンプルを液体媒体に添加し（またはたとえばフロースルーの実施形態では液体媒体をサンプルで置き換え）、標識構築物を添加する。標識構築物１４、１６は、本体（１４）（たとえばリポソーム）と、同様にアナライトに選択的に結合する特異的認識エレメント１８を有する標識結合プローブ１６と、を有する。次いで、過剰の標識を濯いで除去する。
【００５７】
したがって、標識は、アナライトを介して感知表面に接着される。重要なこととして、標識結合プローブ、アナライト、および表面プローブは、組み合わされて、感知表面からの最大距離（２０と表示される）５〜２５０ｎｍで標識本体がアンカーされるように標識本体を感知表面に接着するアンカーとして機能する。実際には、アンカーは可撓性でありうるので、標識は表面にさらに近づくこともありうる。標識は、アナライトよりも少なくとも１０％大きい散逸容量を有するように選択される。
【００５８】
弾性波デバイスは、液体界面に弾性波を発生するように操作される制御ユニット２２を有し、測定は、（１）弾性波のエネルギー損失および／または（２）弾性波デバイスのタイプに依存して弾性波の周波数もしくは位相のいずれかについて行われる。たとえば、ＱＣＭデバイスの場合、波の散逸または周波数（またはその両方）が測定される。典型的には、エネルギー損失および／または周波数もしくは位相のいずれかの測定は、アナライトおよび続いて標識を添加しながら連続的に行われるが、これは本質的なことではない。一般的には、これらのパラメーターの第１の測定は、標識が表面に接着する前に行うべきであり、第２の測定は、標識が表面に接着した後に行うべきである。実際には、アナライトが存在する前、アナライトを添加した後ただし標識を添加する前に測定を行い、標識を存在させてから再び測定を行いうことが役に立つ。
【００５９】
標識の散逸容量をより大きくした結果としておよび標識本体と感知表面とを離間させた結果として、標識の結合により生じる測定パラメーターの変化がアナライトの結合により生じる変化よりもかなり大きくなるため、単にアナライトの結合により生じる測定パラメーターの変化から検出できるよりもかなり低い濃度のアナライトの検出が可能になることを、我々は見いだした。
【００６０】
アッセイは定性的でありうるか（アナライトが検出されるか否かを決定する）、または測定パラメーターの変化を検量線と比較することによりサンプル中のアナライト濃度の定量測定を行うことが可能である。
【００６１】
図１（ｂ）を参照して例示される代替的構成では、アナライト自体（１２）が、５〜２５０ｎｍの最大距離で標識本体を感知表面にアンカーするアンカーとして機能しうる。この構成は、たとえば、アナライトが１５〜８００塩基対の長さを有する二本鎖ＤＮＡである場合に好適である。この場合、アナライトは、溶液中で標識に接着してから標識されたアナライトが感知表面に接着するように感知表面に導入しうる。第１の測定は、標識およびアナライトが感知表面に接着一体化される前に行われ、第２の測定は、標識およびアナライトが接着した後に行われる。代替的に、図１（ａ）の例と同様に、最初にアナライトを感知表面に接着し、その後で標識を添加しうる。アナライトは、たとえば、標識に接着するように修飾しる（たとえば、コレステロール、ビオチン、またはチオール修飾で）。
【００６２】
図２（ａ）および図２（ｂ）は、アナライトが一本鎖核酸である場合の表面プローブの２つの可能な構成を例示する。図２（ａ）の例では、表面プローブ６は、アナライト核酸鎖の第１の末端に相補的な核酸配列の形態で一方の末端に特異的認識エレメント１０と、表面と相補的配列の開始部との間の表面プローブの一部であるスペーサー領域１１と、を有する一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む。図２（ｂ）では、表面プローブは二本鎖スペーサー領域１３を有し、一方の鎖はさらに伸長して特異的認識エレメント１０を形成する。
【００６３】
図２（ｃ）および図２（ｄ）は、標識結合プローブの２つの可能な構成を例示する。図２（ｃ）の例では、標識結合プローブ１６は、アナライトの一方の末端（表面プローブにより認識される部分の反対側の末端）に相補的な特異的認識エレメント１８として機能する配列を有する一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む。標識本体に接着される他方の末端は、スペーサー領域（１７）として機能する。図２（ｄ）では、標識結合プローブは二本鎖スペーサー領域１９を有し、一方の鎖は二本鎖部分を越えてさらに伸長して特異的認識エレメント１８を形成する。
【００６４】
図２（ａ）〜２（ｄ）の例では、標識本体と感知表面との間のアンカーの長さは、表面プローブのスペーサー領域（１１または１３）の長さ＋標識結合プローブのスペーサー領域（１７または１９）の長さ＋特異的認識エレメント（１０、１８）の間のアナライト核酸鎖１２の長さ＋表面プローブを表面に結合するおよび標識結合プローブを標識本体に結合する化学基に基づくいくらかの追加の長さである。このアンカーの長さは５〜２５０ｎｍである。典型的には、スペーサー領域（１１、１３、１７、１９）の長さは、５０〜２００ヌクレオチド／塩基対の範囲内である。アナライトは、特異的認識エレメントに結合する領域のいずれかの側に潜在的にさらに伸長可能であるが、いずれの追加の長さも、標識本体と表面との間のアンカーの全長に寄与しない。
【００６５】
図３（ａ）および図３（ｂ）は、一本鎖核酸アナライトまたはＤＮＡ（この場合、ＤＮＡの一方の鎖は、表面に接着されるアナライト１２として機能する）のいずれかを検出するための２つの可能な構成を例示する。図３（ａ）の実施形態では、表面プローブ６は、図２（ａ）のように、アナライトの表面プローブ結合領域２３に相補的であるかつ特異的結合エレメントとして機能する領域１０まで伸長するスペーサー領域１１を含む。標識結合プローブ１６、１８は、全部がアナライトのさらなる標識結合領域２１に相補的である。図３（ｂ）の実施形態では、表面プローブは、図２（ｂ）のように、特異的認識エレメント１０を形成するように一方の鎖がスペーサー領域を越えて伸長する二本鎖スペーサー領域１３を含み、標識結合プローブ１６、１８は、この場合も全部がアナライトのさらなる部分に相補的である。
【００６６】
図４（ａ）および図４（ｂ）は、一本鎖核酸アナライトまたはＤＮＡ（この場合、ＤＮＡの一方の鎖は、表面に接着されるアナライト１２として機能する）のいずれかを検出するための２つのさらなる可能な構成を例示する。これらの実施形態では、表面プローブ６、１０は、全体がアナライトの領域に相補的であり、標識結合プローブ１６は、アナライトのさらなる領域に相補的な特異的結合領域１８と、それぞれ一本鎖（図４（ａ））または二本鎖（図４（ｂ））のスペーサー領域１７または１９と、を有する。代替的構成では、表面プローブおよび標識結合プローブの両方のスペーサー領域は、少なくとも部分的に二本鎖でありうる。スペーサー領域が二本鎖領域を含む実施形態では、特異的結合領域を形成するように伸長する鎖はまた、二本鎖領域と特異的結合領域との間にスペーサー領域のさらなる部分を含みうる。
【００６７】
図３（ａ）、３（ｂ）、４（ａ）、および４（ｂ）の場合には、標識本体と表面との間のアンカーの長さは、標識結合プローブの長さ＋表面プローブの長さ＋アナライトにより橋渡しされる標識結合プローブと表面プローブとの間のギャップの長さ＋表面プローブを表面におよび標識結合プローブを標識本体に結合する化学基の長さにより決定される。この場合も、このアンカーの長さは５〜２５０ｎｍである。典型的には、スペーサー領域（１１、１３、１７、１９）の長さは、５０〜２００ヌクレオチド／塩基対の範囲内である。アナライトは、特異的認識エレメントに結合する領域のいずれかの側に潜在的にさらに伸長可能であるが、いずれの追加の長さも、標識本体と表面との間のアンカーの全長に寄与しない。
【００６８】
これらの例では、アナライトを含有するサンプルおよび標識は、個別の溶液として添加されたものであるが、多くの変形形態を利用可能であることは、当業者であれば分かるであろう。たとえば、アナライトおよび標識は、感知表面を通って流動しうる。標識はまた、アナライトが感知表面に結合する前にアナライトに結合しうる。これにより標識を感知表面に結合しうる。
【実施例】
【００６９】
一本鎖核酸アナライトを検出するための実施例では、弾性波センサーは、以下の材料および方法の節に記載されるように構築された石英結晶マイクロバランス（ＱＣＭ）である。センサーは、石英結晶基材２と、ニュートラアビジンが吸着される表面金層４により形成された感知表面と、を有する。表面プローブ６として５’ビオチン化一本鎖ＤＮＡ分子を使用する。このプローブは、好適なプライマーセットを用いてＰＣＲまたは等温増幅プロセスにより形成され、感知表面に接触する液体媒体に導入される。（短い５’ビオチン化一本鎖ＤＮＡ分子もまた市販されている）。表面プローブ一本鎖ＤＮＡは、ビオチン８と感知表面上のニュートラアビジンとの間の特異的相互作用により感知表面に接着する。各ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子の末端に装着されたビオチンを介して個別に装着される。いくつかの代替的化学のいずれかを用いて表面プローブを表面層上に固定化しうることは、当業者であれば分かるであろう。
【００７０】
表面へのアナライトの非特異的結合は、当業者の熟知する標準的プロトコルを用いて、たとえば、ブロック剤、生体適合性表面、ＰＥＧ修飾層などを用いて排除される。
【００７１】
表面プローブ６は、表面に近接する少なくとも１０ヌクレオチドの長さのスペーサー領域１１を有し、一本鎖ＤＮＡの他方の末端は、アナライト核酸１８の領域に相補的な機能するＤＮＡ配列として機能し、したがって、特異的認識エレメント１０として機能する。
【００７２】
使用時、アナライトを含有する（またはその存在がアッセイされる）液体サンプルは、ハイブリダイズ条件を確保した緩衝液中で感知表面に接触される。標的アナライト１２、この例では一本鎖循環腫瘍ＤＮＡ分子（ｃｔＤＮＡ）は、アナライト１２の表面プローブキャプチャー領域１９とＤＮＡ表面プローブ６の特異的認識エレメント１０との間の相互作用により表面プローブに特異的に結合する。液体サンプルを濯いで除去し、標識を添加する前に弾性波センサーを用いてＱＣＭの散逸および周波数の第１の測定を行う。
【００７３】
測定を達成するために、弾性波のエネルギー（第１のシグナルを構成する）および周波数（第２のシグナルを構成する）を連続的に測定する。デバイス表面に装着されたＤＮＡは、散逸変化として測定される弾性波のエネルギーの散逸をもたらす。サンプル中に存在するかつ特異的認識エレメントを介して表面に結合されるＤＮＡ分子の数が非常に少なければ、アナライトが結合しても測定可能なシグナルを生成しないであろう。この例では、ＤＮＡは非常に少ない量で存在し、それが直接結合しても測定可能な音響シグナルを生成しない。
【００７４】
次に、ハイブリダイズ条件を確保した緩衝液中に標識を添加し、ハイブリダイズ条件を維持する。この場合、標識は、５’コレステロール修飾により結合されるかつ標識結合プローブ１６として機能する一本鎖ＤＮＡ分子を有するリポソーム１４を含む。表面に結合されていない標識結合プローブの末端には、標的アナライトの標識結合領域２１に相補的な配列１８が存在する。標識結合プローブに好適なＤＮＡ分子は、好適なプライマーを用いてＰＣＲまたは等温増幅法により生成可能である。アナライトの標識結合領域２１は、典型的には、表面プローブ結合領域２３に近接する。したがって、リポソーム１４は、アナライト１８（この場合はｃｔＤＮＡ）に特異的に接着することにより感知表面４に接着される。標識結合プローブおよび表面プローブは、それらの長さ＋アナライトの標識結合領域２１と表面プローブ結合領域２３との間のギャップの長さの合計が５〜２５０ｎｍの長さを有するように選択される）。
【００７５】
標識が添加されてアナライト（存在する場合）を介して表面に結合された後、弾性波の散逸および周波数の第２の測定を行う。第１および第２の測定間の弾性波の散逸の変化（ΔＤ）および周波数の変化（ΔＦ）を計算する。散逸または周波数のいずれかの変化が統計的に有意であれば、アナライトが存在することならびに散逸および／または周波数の変化量を検量線と比較してアナライトの量の定量測定を行えることが示唆される。リポソームは一本鎖ＤＮＡよりもかなり大きい散逸容量を有するので、表面に接着されたリポソームの結合による散逸および周波数の変化は、アナライト一本鎖ＤＮＡの結合による変化よりもかなり大きく、いくつかの場合には、以上で説明したように、標識が結合する前にアナライトが単独で結合しても、周波数または散逸の変化はゼロになりうる。したがって、アナライトの検出限界は、アナライトが単独で感知表面に結合したときの散逸または周波数の変化の測定で可能な検出限界と比較して大幅に向上する。
【００７６】
実験結果
アナライトの音響シグナルおよび検出レベルを向上させる高散逸性標識の能力を実証するために、ＤＮＡおよびリポソームの結合が散逸および周波数に及ぼす影響を比較した。二本鎖ＤＮＡは、リポソームが相補的ＤＮＡ配列の結合を介してアナライトＤＮＡに接着されてからアナライトが相補的ＤＮＡ配列の結合を介して表面プローブひいてはセンサー表面に接着される以上の第１の例のアッセイ方法を用いて形成されるＤＮＡ構造を厳密にモデル化する。二本鎖ＤＮＡはまた、第２の例の方法によっても測定可能である。二本鎖ＤＮＡはまた、ＤＮＡ増幅反応（たとえばＰＣＲまたは任意の等温増幅法）内の特異的標的核酸の存在に定性的および定量的に関連付け可能である。これにより標的核酸を感度良く検出できるようになる。
【００７７】
標的核酸自体は、さらなるアナライトのアッセイの標識でありうる。たとえば、標的核酸は、さらなるアナライトに特異的に結合する抗体または他の特異的認識エレメントの標識でありうるので、標的核酸の検出は、さらなるアナライトの高感度検出を可能にしうる。
【００７８】
ＤＮＡサンプルの調製
特異的プライマーセット（ＨＲ１Ｆ−ＨＲ１Ｒ，Ｖｏｒｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ２０  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＲＣＡ１  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３（２０１０）１７８−１８５）を用いてヒトゲノムＤＮＡから１５７ｂｐのＤＮＡ断片を生成した。２５ｍｌの最終体積でＰＣＲキット製造業者のプロトコル（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）に従ってＰＣＲ反応を構成した。２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＵＳＡ）をテンプレートとして使用した。増幅プロトコルを次のように構成した。すなわち、９５℃で１分の初期変性、９５℃で１０秒の変性と６０℃で１０秒のアニーリングと７２℃で１０秒の伸長とからなるサイクルを３５回、および７２℃で１分の最終伸長であった。１反応当たりそれぞれ５ｐｍｏｌの２つのプライマーを添加した。ＨＲ１Ｆプライマーの５’末端をビオチン化した。ＨＲ１Ｒの５’末端をコレステロールで修飾した。後ＰＣＲ精製を行うことなくまたは製造業者の説明書に従ってＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した後、ＰＣＲ産物に使用した。
【００７９】
標識の調製
直径Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３がそれぞれ５０、１００、および２００ｎｍであるリポソームを調製した。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）を含む２ｍｇの脂質の混合物をクロロホルムで希釈して−２０℃に維持した。クロロホルムを窒素と共に蒸発させ、脂質を窒素フロー下で１時間放置した。７．５のｐＨで１０ｍＭトリス、２００ｍＭ  ＮａＣｌの１ｍｌの緩衝液中に脂質を再懸濁させて１時間撹拌した。次いで、所望の直径に基づいて選択された膜に通して少なくとも２１回押し出した。次いで、得られたリポソームを必要になるまで冷蔵した後、実験に使用する際に泳動緩衝液で少なくとも１０倍希釈した。
【００８０】
ＰＯＰＣ以外に、多くの他の市販の脂質、たとえば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）など（たとえばＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＵＳＡ）から入手可能である）、または他の合成脂質、たとえば、ＮＴＡ脂質、ＰＥＧ含有脂質なども使用可能であることは当業者であれば分かるであろうことに留意されたい。また、コレステロール、ステロールなどの他の分子、さらには一方の末端に長いテールを有するように修飾された脂質も、リポソーム構造に組み込みうる。
【００８１】
弾性波デバイスの作製
ＱＣＭ−Ｄ構成
Ｑ−Ｓｅｎｓｅ  Ｅ４装置（ＱＳｅｎｓｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて音響実験を行った。この装置は、並列配置で使用可能な４つのセンサーを含む。いずれの実験測定の前でも、空気を用いてハイパワーでＨａｒｒｉｃｋ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｌｅａｎｅｒにより１つ以上の金結晶を２．３０分間エッチングした。ただちに金センサーをそれらのチャンバーに移して蠕動ポンプを用いてＰＢＳ緩衝液を充填した。約７５ｍｌ／分の一定フロー下で２００ｍｌのニュートラアビジン（２００ｍｇ／ｍｌ）をセンサーに充填し、続いてＰＢＳで濯いだ。３５ＭＨｚで動作するＱＣＭデバイスを用いて表面結合イベント時の波の散逸（Ｄ）および周波数（Ｆ）を記録した。
【００８２】
測定および結果
図５の表は、調製した３つの長さのｄｓＤＮＡの塩基対の長さを列（ｉ）に、ｎｍ単位の長さを列（ｉｉ）に示す。列（ｉｉｉ）は、センサー表面上のストレプトアビジンに結合するように第１の末端がビオチンで修飾され、かつリポソームに結合するように他方の末端がコレステロールで修飾されてセンサー表面に結合する二本鎖ＤＮＡ分子の散逸容量（ΔＤ／ΔＦとして表される）を示す。列（ｉｖ）、（ｖ）、および（ｖｉ）は、テザー連結ＤＮＡ分子に特異的に結合する（ｉｖ）５０ｎｍ（Ｄ１）、（ｖ）１００ｎｍ（Ｄ２）、および（ｖｉ）２００ｎｍ（Ｄ３）の３つの直径のリポソームの測定された散逸容量を示す。エネルギー散逸／単位質量（すなわちΔＤ／ΔＦ）は１０−６Ｈｚ−１単位で表されており、３５ＭＨｚでＱＣＭデバイスを用いて得られたものである。いずれの場合も、ＤＮＡ／リポソームの表面被覆率は低かった。各結果は、１０〜１５％の変動で少なくとも１０回の実験から導出した。
【００８３】
比ΔＤ／ΔＦ（散逸容量）はリポソームがＤＮＡに結合した場合にＤＮＡ分子が表面に結合した場合の数倍であることが、図５の表から明確に示される。散逸容量（ΔＤ／ΔＦ）はＤＮＡ鎖が長くなるほどおよびリポソームの直径が大きくなるほど大きいことが、結果から示される。したがって、装着されるエンティティーのジオメトリー（ＤＮＡの長さおよびリポソームの直径）は、アッセイを最適化するために所望によりより大きいまたはより小さい散逸を与えるように調整可能である。
【００８４】
図６は、ＤＮＡ分子の検出限界を向上させるために標識としてリポソームを使用する効果を実証する。対応する機器およびプロトコルを用いて、ビオチンおよびコレステロールで修飾された１５７ｂｐのｄｓＤＮＡを一連の量（２００マイクロリットルの緩衝液中０．００１、０．０１、０．１、１、１０、および１００ｎｇ）でセンサー表面に添加し、次いで、直径２００ｎｍのリポソームサンプルを加えた。リポソームの結合の前後で散逸の変化（ΔＤ）を測定した。各データ点は２または３回の実験の平均である。
【００８５】
図６のグラフは、これにより１ｐｇのｄｓＤＮＡ（１０アトモルまたは６００万分子）または等価量の２００μｌの５０フェムトモルＤＮＡ程度の少量で検出されたことを実証する。これとは対照的に、図６の表を参照すると、ｄｓＤＮＡサンプルを加えたときの散逸の変化（ΔＤ）を測定することにより最小１０ｎｇのｄｓＤＮＡを検出可能であるにすぎなかった。
【００８６】
この新しい方法は、核酸の結合時に直接検出するよりも３〜４桁少ないＤＮＡを音響的に検出可能であることを示した。ＤＮＡのわずか４倍の散逸容量を有するリポソームを単に添加することによりこれが達成されたことは興味深い（図５の上端行で、最大サイズのリポソームを添加した場合、ΔＤ／ΔＦは０．１４３であったのに対して、１５７ｂｐのＤＮＡを添加した場合、０．０３１７であった。２つの比は０．１４３／．０３１７＝４．５であるが、検出限界は３〜４桁向上した）。
【００８７】
ＤＮＡ検出の顕著な向上は、本発明が２つの分子の流体力学的性質の差を活用するという事実に依拠する。すなわち、大きいかつ柔らかい球体であるリポソームは、より硬いＤＮＡ分子により散逸されるエネルギーと比較して振動時に有意に多くのエネルギーを散逸する。
【００８８】
エネルギー損失に関連するパラメーター（たとえば、散逸の変化ΔＤ）または周波数に関連するパラメーター（たとえば、ΔＦ）または位相に関連するパラメーターと検量線とを比較することにより、アナライトの量の定量的尺度を決定することが可能である。
【００８９】
アンカーの使用
我々はまた、標識本体がセンサー表面から５〜２５０ｎｍの位置にアンカーされるようにセンサー表面と標識のバルクを構成する本体との間に５〜２５０ｎｍのスペーサーが存在する場合にアッセイ感度が向上することを見いだした。したがって、アナライトが一本鎖または二本鎖の核酸でありかつＤＮＡ表面プローブが少なくとも１５塩基対の長さを有する場合、感度が向上する。少なくとも２９塩基対（１０ｎｍ）または少なくとも８４４塩基対（１５ｎｍ）または少なくとも５９塩基対（２０ｎｍ）では、またさらなる向上が見いだされる。これらの実験で表面結合二本鎖ＤＮＡを２１塩基対（７ｎｍ）から１５７ｂｐ（５３ｎｍ）に増加させたところ、２００ｎｍのリポソーム（本体として機能する）の散逸容量が１．３倍に増加したことは、注目に値する。
【００９０】
したがって、第１の例に係るいくつかの実施形態では、表面とアナライトキャプチャー領域との間の領域４（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃに示される）は、典型的には１０ヌクレオチド以上の長さのアンカーとして機能しうる（ただし、好適な間隔を提供するために、表面プローブおよびアナライトの長さは全体で少なくとも１５ヌクレオチドである）。
【００９１】
センサー表面とアナライトとの間と同様に、アンカーは、本体（リポソームなど）をアナライトに接続する標識の一部でありうる。この場合も、アンカーは、典型的には５〜２５０ｎｍの長さを有するであろう。したがって、リポソーム２４は本体とみなしうるとともに、一本鎖分子２６はアンカーと見なしうる。
【００９２】
またさらに、アナライト（たとえば、二本鎖ＤＮＡ）自体は、５〜２５０ｎｍの長さを有するアンカーとして機能しうる（図４）。
【００９３】
変形形態
本発明は、広範にわたるアナライトさらには一本鎖または二本鎖の核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）に適用可能である。たとえば、タンパク質、糖タンパク質、ペプチドなどのタンパク質バイオマーカー、およびホルモン、グルコース、コレステロールなどの低分子量アナライト、および他の代謝物。表面へのアナライトの特異的結合およびアナライトへの標識の特異的結合は、任意の適切な特異的認識エレメントを用いて、たとえば、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、化学結合剤、たとえば、当業者に公知のクリックケミストリータイプまたは他のタイプの特異的認識エレメントを用いて、達成可能である。
【００９４】
当業者であれば、特異的認識エレメントをセンサー表面に結合するために使用可能な各種化学に気付くであろう。たとえば、ＤＮＡ表面プローブは、代替的に、金または他の好適なセンサー表面に接着するように修飾された５’−チオールでありうる。
【００９５】
測定を特異的なものとするために、アナライトは典型的には感知表面に特異的に結合し、標識はアナライトに特異的に結合する。しかしながら、両方のステージが特異的であることは不可欠ではなく、たとえば、標的核酸を表面に特異的に結合すれば、次いで、非特異的核酸結合部分で修飾された標識を使用しても十分でありうる。
【００９６】
さらに、追加の特異的認識エレメント、たとえば、抗体または他の特異的結合分子、たとえば、アプタマーおよびアフィマーにより、標識をアナライトに接着しうるか、または標識を感知表面に接着しうる（サンドイッチアッセイ方式）。他の実施形態では、最初に標識がアナライトに結合し、その後でアナライトが感知表面に結合される。
【００９７】
例として、代替実施形態では、アナライトが表面プローブＤＮＡに結合されたら、アナライトの第２の領域（標識キャプチャー領域）に相補的な配列を有する５’−コレステロール修飾一本鎖オリゴ核酸は、ハイブリダイズ条件でセンサー表面に導入され、存在する場合はアナライトに結合する。次いで、リポソームが導入されうるとともに、５’−コレステロール修飾一本鎖オリゴ核酸のコレステロール部分に接着し、それにより、リポソーム標識は、結合されたアナライトの量に対応する量で感知表面に接着する。
【００９８】
本明細書に与えられた例では、リポソームを高散逸性標識として使用した。しかしながら、標的アナライトよりも有意に大きい音響散逸容量を有するのであれば、他の構造を標識として利用してもよい。標識として使用可能な他の高散逸性構造の例としては、種々のサイズおよび組成のリポソーム、ビーズまたはコロイド粒子（十分に散逸性の材料からなる）、ポリマー、デンドリマー、両親媒性ナノ粒子などの非脂質骨格からなるベシクル、架橋されたリポソームまたはベシクル、膜の外側で可撓性高分子構造を利用したリポソーム／ベシクル、緩衝液の代わりに高粘性媒体を封入したベシクル／リポソーム、２つまたは３つのリポソームを結合するために中心担体（デンドリマー）を使用した合成複合体、脂質とポリジアセチレン（ＰＤＡ）とを含む重合脂質／ポリジアセチレンベシクル、ならびに双頭型両親媒性ベシクルが挙げられる。
【００９９】
たとえば、図８は、本体３０と特異的認識エレメントまで伸長するスペーサー領域１７とを有する標識のいくつかの可能な構造を例示する。８（ａ）では、本体は、本発明の実施例で使用されるように、標的核酸配列に相補的なＤＮＡプローブを有するリポソームである。８（ｂ）では、本体は、周囲の液体よりも粘性の溶液を封入した対応するリポソームである。８（ｃ）では、本体は、脂質の一部が架橋されている以外は図８（ａ）の例に対応するリポソームである。８（ｄ）では、溶液中に伸長するより少量の親水性ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール鎖）を有するリポソームを例示する。８（ｅ）では、本体としての複数のリポソームと複合体化されたデンドリマーがスペーサー領域である例である。スペーサー１７は、核酸配列、ポリエチレングリコールなどなどのポリマーでありうる。
【０１００】
本発明は、かなりの利点を有する。それは、限定されるものではないがＤＮＡをはじめとするきわめて少量のアナライトのきわめて特異的な検出を可能にする。したがって、それは、ＤＮＡを検出するためのＰＣＲの代替手段として有用であり、ＤＮＡ抽出の必要性の除去または低減、時間およびコストの削減、ＰＣＲバイアスリスクの回避、より少ない加熱エレメントおよびより少ないパワー消費を有する比較的単純な関連機器の必要性をはじめとする各種の利点を有する。音響システムは、適宜、Ｍｉｔｓａｋａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｋ．Ｍｉｔｓａｋａｋｉｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２００８，１７，１０１０−１０１９に記載のマイクロフルイディクスと組合せ可能である。最後に、提案されたアッセイの固有の単純性および完全に定量的な特性は、高い感度および音響デバイスと他のモジュールとの統合能と相まって、オンサイト分析および低コスト操作（両方とも発展途上国の個別化医療や診断プラットフォームなどの用途にきわめて重要である）に真に有用なものとなりうる。
【０１０１】
本発明はまた、限られたラウンド数またはより速いプロトコルで標的アナライト増幅（たとえば、ＰＣＲまたは等温増幅）を行った後でアナライトを検出するためにも利用しうる。これにより検出限界を向上させうるが、多く（典型的には３０〜５０）のラウンド数で増幅を行う必要のあるＰＣＲまたは等温増幅のみの使用と比較して、全検出プロセスを迅速化でき、ＰＣＲバイアスが最小限に抑えられる。
【０１０２】
したがって、本アッセイは、非常に低濃度で見いだされるアナライトの検出に、たとえば、血液中の腫瘍循環ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の検出にとりわけ役に立つ。
【０１０３】
本明細書に開示される発明の範囲内で、さらなる変更形態および変形形態を行うる。
【国際調査報告】
2018520681.tif 000017
2018520681.tif 000018
2018520681.tif 000019