(57)【要約】  本明細書には、腫瘍抗原を認識する刺激された樹状細胞により、疾患、特に癌を処置するための組成物及び方法が記載される。前記方法は、樹状細胞を保管し、配送し、及び／又は培養することを含み、ここで樹状細胞が硬表面上に保管される。細胞表面に埋め込まれた状態で維持される細胞表面分子を提供するために、溶解が細胞の完全な溶解を結果としてもたらさない、溶解プロトコルが記載される。非致死的なデングウイルス株も治療目的のために提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激された樹状細胞を産生する方法であって、該方法は、
ａ）硬表面上で樹状細胞を培養する工程；
ｂ）溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で少なくとも１つの細胞を溶解する工程；
ｃ）刺激された樹状細胞を産生するために樹状細胞を溶解物と接触させる工程；及び
ｄ）刺激された樹状細胞を成熟させる工程
を含み、
ここで、成熟させる工程は、刺激された樹状細胞をトール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストと接触させることを含む、方法。
【請求項２】
刺激された樹状細胞は少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
刺激された樹状細胞が少なくとも約６．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
刺激された樹状細胞が約１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
硬表面はプラスチック表面である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
硬表面はポリスチレンを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
硬表面には、刺激された樹状細胞により産生される１型反応を低減する構成要素が実質的にない、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
構成要素が、フッ素処理したポリエチレン、フッ素処理したポリプロピレン、及びフタル酸塩から選択される、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
溶解物は複数の無傷細胞を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
トール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストがイミダゾキノリン化合物である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
イミダゾキノリン化合物はＲ８４８である、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの細胞は腫瘍細胞である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
樹状細胞は被験体に対して自己由来又は同種異系である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
樹状細胞は、被験体に対して適合したＨＬＡである同種異系細胞である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
被験体から少なくとも１つの細胞を得る工程を含み、細胞は有害な病状に関連する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
有害な病状は増殖性障害又は自己免疫疾患である、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
成熟させる工程は更に、刺激された樹状細胞を、（ｉ）トール様受容体２アゴニスト、トール様受容体４アゴニスト、或いは（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニストはリポ多糖である、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
成熟させる工程は、刺激された樹状細胞を（ｉ）トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニスト、及び（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを更に含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
成熟させる工程は、刺激された樹状細胞をＲ８４８、リポ多糖、及びインターフェロンガンマと接触させることを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
刺激された樹状細胞を産生する方法であって、該方法は、
ａ）硬表面上で樹状細胞を培養する工程；
ｂ）被験体から少なくとも１つの癌細胞を得る工程；
ｃ）溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で少なくとも１つの癌細胞を溶解する工程；
ｄ）刺激された樹状細胞を産生するために樹状細胞を溶解物と接触させる工程；及び
ｅ）刺激された樹状細胞を成熟させる工程
を含み、
ここで、成熟させる工程は、刺激された樹状細胞をトール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストと接触させることを含む、方法。
【請求項２２】
刺激された樹状細胞は少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
刺激された樹状細胞が少なくとも約６．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
刺激された樹状細胞が約１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
硬表面はプラスチック表面である、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
硬表面はポリスチレンを含む、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
硬表面には、刺激された樹状細胞により産生される１型反応を低減する構成要素が実質的にない、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
構成要素が、フッ素処理したポリエチレン、フッ素処理したポリプロピレン、及びフタル酸塩から選択される、ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
溶解物は複数の無傷細胞を含む、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
複数の無傷細胞は、増殖により不活性化された癌細胞である、ことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
トール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストがイミダゾキノリン化合物である、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
イミダゾキノリン化合物はＲ８４８である、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
成熟させる工程は、刺激された樹状細胞を、（ｉ）トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニスト、或いは（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを含む、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニストはリポ多糖である、ことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
成熟させる工程は、刺激された樹状細胞を（ｉ）トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニスト、及び（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを更に含む、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
成熟させる工程は、刺激された樹状細胞をＲ８４８、リポ多糖、及びインターフェロンガンマと接触させることを含む、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニストはリポ多糖である、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
樹状細胞は被験体に対して自己由来又は同種異系である、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
樹状細胞は、被験体に対して適合したＨＬＡである同種異系細胞である、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
成熟させる工程は、刺激された樹状細胞を、トール様受容体２アゴニスト、トール様受容体４アゴニスト、インターフェロンガンマ、及びそれらの組み合わせから選択された少なくとも１つの成熟化剤と接触させることを含む、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
必要とする被験体の癌を処置又は低減する方法であって、該方法は、
ａ）硬表面上で樹状細胞を培養する工程；
ｂ）少なくとも１つの癌細胞を得る工程；
ｃ）溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で少なくとも１つの癌細胞を溶解する工程；
ｄ）樹状細胞を溶解物と接触させる工程であって、それにより刺激された樹状細胞を産生する、工程；及び
ｅ）必要とする被験体に刺激された樹状細胞を投与する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
刺激された樹状細胞は少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
刺激された樹状細胞が少なくとも約６．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
刺激された樹状細胞が約１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
樹状細胞は被験体に対して自己由来又は同種異系である、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１つの癌細胞は被験体由来である、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
刺激された樹状細胞を成熟させる工程を更に含み、ここで、成熟させる工程は成熟試薬を加えることを含み、成熟試薬はトール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストを含む、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
成熟させる工程は、刺激された樹状細胞を（ｉ）トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニスト、或いは（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを更に含む、ことを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニストはリポ多糖である、ことを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
成熟させる工程は、刺激された樹状細胞を（ｉ）トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニスト、及び（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを更に含む、ことを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
成熟させる工程は、刺激された樹状細胞をＲ８４８、リポ多糖、及びインターフェロンガンマと接触させることを含む、ことを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
必要とする被験体の癌を処置又は低減する方法であって、該方法は、
ａ）被験体から樹状細胞を得る工程；
ｂ）硬表面上で樹状細胞を培養する工程；
ｃ）被験体から癌細胞を得る工程；
ｄ）溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で癌細胞を溶解する工程；
ｅ）樹状細胞を溶解物と接触させる工程であって、それにより刺激された樹状細胞を産生する、工程；
ｆ）刺激されたＤＣを被験体に投与する工程；及び
ｇ）必要とする被験体にデングウイルスを投与する工程
を含む、方法。
【請求項５３】
デングウイルスはＤＥＮＶ−２株＃１７１０である、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
硬表面は硬プラスチック表面である、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
硬プラスチック表面はポリスチレン表面である、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
刺激された樹状細胞は少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
刺激された樹状細胞が約６．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
刺激された樹状細胞が約１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
被験体の癌細胞を取り除く方法であって、該方法は、
ａ）必要とする被験体にデング２型ウイルス血清型を投与する工程；
ｂ）樹状細胞を刺激する工程であって、刺激する工程は、刺激された樹状細胞を産生するために樹状細胞を溶解物に晒すことを含み、溶解物は複数の癌細胞を含み、各癌細胞は癌細胞の表面上に存在する抗原を含む、工程；及び
ｃ）被験体に刺激された樹状細胞を投与する工程
を含み、
ここで、投与は、被験体の癌細胞集団の３３％以上の除去をもたらす、方法。
【請求項６０】
投与が被験体の癌細胞集団の３３％の除去をもたらす、ことを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
デング２型ウイルス血清型を静脈内投与する工程、及び刺激された樹状細胞の集団を静脈内投与する工程を更に含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
複数の癌細胞は被験体由来である、ことを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
デング２型ウイルス血清型がＤＥＮＶ−２株＃１７１０である、ことを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
必要とする被験体の癌を処置又は低減する方法であって、被験体に請求項１乃至４０の方法の何れか１つにより産生される刺激された樹状細胞を投与する工程を含む、方法。
【請求項６５】
刺激された樹状細胞は静脈内投与される、ことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
被験体にデング２型ウイルスを投与する工程を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
デング２型ウイルスは株＃１７１０である、ことを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項１乃至４０の方法の何れか１つにより産生される、刺激された樹状細胞。
【請求項６９】
刺激された樹状細胞は癌の処置のために使用される、ことを特徴とする請求項６８に記載の刺激された樹状細胞。
【請求項７０】
癌を処置するための、請求項１乃至４０の方法の何れか１つにより調製される、刺激された樹状細胞の使用。
【請求項７１】
癌の処置に使用するための、請求項１乃至４０の方法の何れか１つにより調製される、刺激された樹状細胞の有効な量。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１５年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／２８４，４３４号の利益を主張し、該仮出願は、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を包含しており、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体を引用することで本明細書に組み込まれる。２０１６年９月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、４８２５３−７０３＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１，８３１バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫系の抗原提示細胞である。樹状細胞は、ウイルスに感染した細胞又は癌細胞を認識し且つ死滅させる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、及び抗体を作るＢリンパ球に、関連するタンパク質鎖標的（抗原ペプチド）を提示する前に、細菌、ウイルス、及び他の病原体の片（ｂｉｔｓ）を飲み込み且つ処理する。ＤＣはまた、損傷を受けた又は死滅した細胞を飲み込み、且つ、１型応答（活性化）、２型応答（耐性のある）、又は０型応答（中性）の何れかを誘発することを要求される。同じ２０のアミノ酸が本体部分（自己）に加え、病原体（非自己）を作るので、ＤＣは、抗原構造だけでなく、サイトカイン、及びその時に存在する他のシグナル伝達環境も評価しなければならない。この多層のシステムは、免疫系が自己を非自己と誤る場合には自己免疫を、同様に、中性の応答が平衡を維持するように要求される場合にはアレルギー応答も防ぐために適所にある。内部のチェックと平衡のこの複合システムは、「自己」細胞から発生する腫瘍細胞により開発される。腫瘍細胞は大抵、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）などの因子を分泌し、これは、ＴＨ２型の耐性応答への免疫細胞の応答に切り替わる。これにより、腫瘍細胞が確認されないまま成長し、且つ頻繁に免疫細胞により支援されることになる。ＤＣは、ＭＨＣ（自己タンパク質ＩＤ複合体）及び提示された関連するペプチドを認識するために、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＣＴＬをプログラムする能力を有している。しかし、その後ＣＴＬは、自己として細胞を無視するべきか、又は、例えばＦａｓ／ＦａｓＬ或いはＰｅｒｆｏｒｉｎ／ＧｒａｎｚｙｍｅのＢ細胞死系により溶解を開始すべきかを決定しなければならない。この決定は大抵、ＣＴＬの活性化状態、サイトカイン環境、及び、細胞傷害因子、例えば熱ショックタンパク質やトール様受容体活性化シグナルなどの存在又は不在に依存する。活発な病原体の感染中、このような系は、活性化され、１型攻撃モード（Ｔｙｐｅ  １  ａｔｔａｃｋ  ｍｏｄｅ）に対するＣＴＬ応答の操作を支援する。
【０００４】
免疫療法は、細胞傷害性薬物、放射線、及び手術とは異なり、腫瘍細胞を認識且つ死滅させるために免疫系を刺激するものである。腫瘍細胞を認識且つ破壊するために免疫系を刺激する際に、多数の試みが行われてきた。これらは、免疫療法、免疫活性化の欠如、有害事象、及び／又は腫瘍免疫回避機構の標的として選択されるペプチドの同一性が原因で、成功が制限されてきた。
【０００５】
進行した癌の患者における永続性の完全寛解を誘発する、現行の細胞療法、例えば樹状細胞治療の能力は、低い（最も免疫原性の癌型において５−１０％、他のものにおいてはより低い）。頻繁に、樹状細胞治療は、低い活性化（例えば、適当に癌細胞を全て死滅させるのに免疫細胞が十分ではない）、低い標的化（例えば、正常細胞は死滅され及び／又は腫瘍細胞は死滅されない）、又は免疫抑制された腫瘍内微小環境が原因で、所望の結果未満の結果をもたらし、薬効を制限してしまう。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書には、刺激された樹状細胞を産生する方法が提供され、該方法は、硬表面上で樹状細胞を培養する工程；溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で少なくとも１つの細胞を溶解する工程；刺激された樹状細胞を産生するために樹状細胞を溶解物と接触させる工程；及び刺激された樹状細胞を成熟させる工程を含み、ここで、成熟させる工程は、刺激された樹状細胞をトール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストと接触させることを含む。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が少なくとも約６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が少なくとも約６．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が約１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、硬表面がプラスチック表面である方法が提供される。本明細書には更に、硬表面がポリスチレンを含む方法が提供される。本明細書は更に、刺激された樹状細胞により産生される１型応答を低減する構成要素が硬表面には実質的にない方法が提供される。本明細書には更に、構成要素が、フッ素処理したポリエチレン、フッ素処理したポリプロピレン、及びフタル酸塩から選択される方法が、提供される。本明細書には更に、溶解物が複数の無傷細胞を含む方法が提供される。本明細書には更に、トール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストがイミダゾキノリン化合物である方法が提供される。本明細書には更に、イミダゾキノリン化合物がＲ８４８である方法が提供される。本明細書には更に、成熟させる工程が、刺激された樹状細胞を、（ｉ）トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニスト、或いは、（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを含む方法が提供される。本明細書には更に、トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニストがリポ多糖である方法が提供される。本明細書には更に、成熟させる工程が、刺激された樹状細胞を（ｉ）トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニスト、及び（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを含む方法が提供される。本明細書には更に、成熟させる工程が、刺激された樹状細胞をＲ８４８、リポ多糖、及びインターフェロンガンマと接触させることを含む方法が提供される。本明細書には更に、少なくとも１つの細胞が腫瘍細胞である方法が提供される。本明細書には更に、樹状細胞が被験体に対して自己由来又は同種異系である方法が提供される。本明細書には更に、樹状細胞が、被験体に対して適合したＨＬＡである同種異系細胞である方法が提供される。本明細書には更に、被験体から少なくとも１つの細胞を得る工程を含む方法が提供され、細胞は有害な病状に関連する。本明細書には更に、有害な病状が増殖性障害又は自己免疫疾患である方法が提供される。本明細書には更に、成熟させる工程が更に、刺激された樹状細胞を、（ｉ）トール様受容体２アゴニスト、トール様受容体４アゴニスト、或いは（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを含む方法が提供される。本明細書には更に、トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニストがリポ多糖である方法が提供される。本明細書には更に、成熟させる工程が、刺激された樹状細胞を（ｉ）トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニスト、及び（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを含む方法が提供される。本明細書には更に、成熟させる工程が、刺激された樹状細胞をＲ８４８、リポ多糖、及びインターフェロンガンマと接触させることを含む方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞の集団が凍結融解の後に７０％より大きい生存度を有している方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞の集団が凍結融解の後に約７１％〜約７９％の生存度を有している方法が提供される。
【０００７】
本明細書には、刺激された樹状細胞を産生する方法が提供され、該方法は、硬表面上で樹状細胞を培養する工程；被験体から少なくとも１つの癌細胞を得る工程；溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で少なくとも１つの癌細胞を溶解する工程；刺激された樹状細胞を産生するために樹状細胞を溶解物と接触させる工程；及び刺激された樹状細胞を成熟させる工程を含み、ここで、成熟させる工程は、刺激された樹状細胞をトール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストと接触させることを含む。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が少なくとも約６．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が約１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、硬表面がプラスチック表面である方法が提供される。本明細書には更に、硬表面がポリスチレンを含む方法が提供される。本明細書は更に、刺激された樹状細胞により産生される１型応答を低減する構成要素が硬表面には実質的にない方法が提供される。本明細書には更に、構成要素が、フッ素処理したポリエチレン、フッ素処理したポリプロピレン、及びフタル酸塩から選択される方法が、提供される。本明細書には更に、溶解物が複数の無傷細胞を含む方法が提供される。本明細書には更に、複数の無傷細胞が複数の増殖不活性化癌細胞である方法が提供される。本明細書には更に、トール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストがイミダゾキノリン化合物である方法が提供される。本明細書には更に、イミダゾキノリン化合物がＲ８４８である方法が提供される。本明細書には更に、トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニストがリポ多糖である方法が提供される。本明細書には更に、樹状細胞が被験体に対して自己由来又は同種異系である方法が提供される。本明細書には更に、樹状細胞が、被験体に対して適合したＨＬＡである同種異系細胞である。本明細書には更に、成熟させる工程が更に、刺激された樹状細胞を、トール様受容体２アゴニスト、トール様受容体４アゴニスト、インターフェロンガンマ、或いはそれらの組み合わせと接触させることを含む方法が提供される。
【０００８】
本明細書には、必要とする被験体の癌を処置又は低減する方法が提供され、該方法は、硬表面上で樹状細胞を培養する工程；少なくとも１つの癌細胞を得る工程；溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で少なくとも１つの癌細胞を溶解する工程；樹状細胞を溶解物と接触させる工程であって、それにより刺激された樹状細胞を産生する、工程；及び必要とする被験体に刺激された樹状細胞を投与する工程を含む。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が少なくとも約６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が少なくとも約６．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が約１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が約１５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０〜約２３ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が１５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０〜２３ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、樹状細胞が被験体に対して自己由来又は同種異系である方法が提供される。本明細書には更に、少なくとも１つの癌細胞が被験体由来である方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞を成熟させる工程を含む方法が提供され、ここで、成熟させる工程は成熟試薬を加えることを含み、成熟試薬はトール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストを含む。本明細書には更に、成熟させる工程が、刺激された樹状細胞を（ｉ）トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニスト、又は（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを含む方法が提供される。本明細書には更に、トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニストがリポ多糖である方法が提供される。本明細書には更に、成熟させる工程が、刺激された樹状細胞を（ｉ）トール様受容体２アゴニスト又はトール様受容体４アゴニスト、及び（ｉｉ）インターフェロンガンマと接触させることを含む方法が提供される。本明細書には更に、成熟させる工程が、刺激された樹状細胞をＲ８４８、リポ多糖、及びインターフェロンガンマと接触させることを含む方法が提供される。
【０００９】
本明細書には、必要とする被験体の癌を処置又は低減する方法が提供され、該方法は、被験体から樹状細胞を得る工程；硬表面上で樹状細胞を培養する工程；被験体から癌細胞を得る工程；溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で癌細胞を溶解する工程；樹状細胞を溶解物と接触させる工程であって、それにより刺激された樹状細胞を産生する、工程；刺激されたＤＣを被験体に投与する工程；及び必要とする被験体にデングウイルスを投与する工程を含む。本明細書には更に、デングウイルスがＤＥＮＶ−２株＃１７１０である方法が提供される。本明細書には更に、硬表面が硬プラスチック表面である方法が提供される。本明細書には更に、硬プラスチック表面がポリスチレン表面である方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が少なくとも約６．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が約１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を産生する方法が提供される。
【００１０】
本明細書には、被験体の癌細胞を取り除く方法が提供され、該方法は、必要とする被験体にデング２型ウイルス血清型を投与する工程；樹状細胞を刺激する工程であって、刺激する工程は、刺激された樹状細胞を産生するために樹状細胞を溶解物に晒すことを含み、溶解物は複数の癌細胞を含み、各癌細胞は癌細胞の表面上に存在する抗原を含む、工程；及び被験体に刺激された樹状細胞を投与する工程を含み、ここで、投与は、被験体の癌細胞集団の３３％以上の除去をもたらす。本明細書には更に、投与が被験体の癌細胞集団の３３％の除去をもたらす方法が提供される。本明細書には更に、デング２型ウイルス血清型を静脈内投与する工程、及び刺激された樹状細胞の集団を静脈内投与する工程を更に含む方法が提供される。本明細書には更に、複数の癌細胞が被験体由来である方法が提供される。本明細書には更に、デング２型ウイルス血清型がＤＥＮＶ−２株＃１７１０である方法が提供される。
【００１１】
本明細書には、必要とする被験体の癌を処置又は低減する方法が提供され、該方法は、刺激された樹状細胞を投与する工程を含み、刺激された樹状細胞は、以下の工程を含む方法により産生される：硬表面上で樹状細胞を培養する工程；溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で少なくとも１つの細胞を溶解する工程；刺激された樹状細胞を産生するために樹状細胞を溶解物と接触させる工程；及び刺激された樹状細胞を成熟させる工程を含み、ここで、成熟させる工程は、刺激された樹状細胞をトール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストと接触させることを含む。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が静脈内投与される方法が提供される。本明細書には更に、被験体にデング２型ウイルスを投与する工程を含む方法が提供される。本明細書には更に、デング２型ウイルスが株＃１７１０である方法が提供される。
【００１２】
本明細書には、刺激された樹状細胞が提供され、刺激された樹状細胞は、以下の工程を含む方法により産生される：硬表面上で樹状細胞を培養する工程；溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で少なくとも１つの細胞を溶解する工程；刺激された樹状細胞を産生するために樹状細胞を溶解物と接触させる工程；及び刺激された樹状細胞を成熟させる工程を含み、ここで、成熟させる工程は、刺激された樹状細胞をトール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストと接触させることを含む。本明細書には更に、刺激された樹状細胞が癌の処置のために使用される細胞が提供される。
【００１３】
本明細書には、刺激された樹状細胞の使用が提供され、刺激された樹状細胞は、以下の工程を含む方法により調製される：硬表面上で樹状細胞を培養する工程；溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で少なくとも１つの細胞を溶解する工程；刺激された樹状細胞を産生するために樹状細胞を溶解物と接触させる工程；及び刺激された樹状細胞を成熟させる工程を含み、ここで、成熟させる工程は、癌を処置するために、刺激された樹状細胞をトール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストと接触させることを含む。
【００１４】
本明細書には、有効な量の刺激された樹状細胞が提供され、刺激された樹状細胞は、以下の工程を含む方法により調製される：硬表面上で樹状細胞を培養する工程；溶解物を産生するために次亜塩素酸塩溶液で少なくとも１つの細胞を溶解する工程；刺激された樹状細胞を産生するために樹状細胞を溶解物と接触させる工程；及び刺激された樹状細胞を成熟させる工程を含み、ここで、成熟させる工程は、癌の処置に使用するために、刺激された樹状細胞をトール様受容体７アゴニスト又はトール様受容体８アゴニストと接触させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】デングウイルス及び刺激された樹状細胞による典型的な処置方法を表す。
【図２】デングウイルス及び刺激された樹状細胞での処置方法、並びに、デングウイルス及び刺激された樹状細胞での処置のスケジュールを例証する。
【図３】様々な処置条件下での、マウスの黒色腫細胞からの肺転移の数に対応するプロットを示す。模様付きの棒は、各条件に対する肺転移の平均数を表わす。
【図４】様々な処置条件下での、マウスの黒色腫細胞からの肺転移の数に対応するプロットを示す。模様付きの棒は、各条件に対する肺転移の平均数を表わす。
【図５】ＣＤ１４＋単球の単離を確認する、フローサイトメトリーデータのプロットを示す。
【図６】様々なコンパレータ方法により産生されたＤＣのものに対する、本明細書に開示された方法により産生されたＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０のタンパク質発現を表わすチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書には、刺激された樹状細胞（ＤＣ）を調製する方法が提供される。本明細書には更に、病状に関連した抗原、例えば腫瘍抗原に刺激された樹状細胞を晒し、その結果、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）から癌細胞の方への特異的且つ強固な応答を誘発することが可能な刺激された樹状細胞をもたらす方法が提供される。本明細書には更に、病状に関連した障害の処置のために被験体にそのようなＤＣを投与する方法が提供される。幾つかの例において、障害は癌である。幾つかの例において、障害は自己免疫疾患、例えば関節リウマチ及び多発性硬化症である。幾つかの例において、障害は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症又は後天性免疫不全症候群である。幾つかの例において、被験体は、刺激されたＤＣの投与の前に、デングウイルスを投与される。
【００１７】
樹状細胞を刺激することは通常、標的癌細胞上に存在する１つ以上の腫瘍抗原と樹状細胞を接触させることを含む。場合によっては、樹状細胞は、腫瘍抗原単独で刺激され、該腫瘍抗原は、合成、単離、又は精製されている。代替的に又は付加的に、樹状細胞は腫瘍細胞溶解物で刺激され、腫瘍細胞溶解物は腫瘍抗原を含む。場合によっては、樹状細胞は、腫瘍抗原を発現する癌細胞全体で刺激される。その後、樹状細胞は被験体に投与され、樹状細胞はＣＴＬに腫瘍抗原を提示し、従って、標的癌細胞の認識及び破壊のためにＣＴＬを調整する。
【００１８】
本明細書には、プラスチック容器材料に含まれるポリマーへの樹状細胞の曝露を制限する方法が提供される。例えば、軟質プラスチックバッグの場合、ポリマーは、媒体溶液（ｍｅｄｉａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）へと進出し、ＤＣの活性に影響を及ぼし得る。代わりに、樹状細胞は、ポリスチレン組織培養プレートなどの硬い容器の中、及びその上で培養され、貯蔵され、及び配送され得る。これにより、軟質プラスチックバッグに含まれるポリマーへの曝露により引き起こされ得る、樹状細胞の免疫賦活作用の減少が回避される。例えば、これらポリマーは、樹状細胞により産生されたＩＬ−１２の量を減らし、それにより、強固なＣＴＬ応答を誘発するそれらの能力を減らすことができる。本明細書に提供される例は、本明細書に開示された方法により生成される刺激された樹状細胞が、少なくとも１８ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を分泌することができ、一方で標準方法により産生された樹状細胞は典型的に、４−６ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０しか産生しないことを実証する。
【００１９】
場合によっては、腫瘍溶解物で樹状細胞を刺激することが望ましい、或いは都合がよい。特に、本明細書に開示される方法は、腫瘍抗原の保全性を維持する、緩やかな細胞溶解プロトコルを利用する。この緩やかな溶解は、多くとも約３０−６０分間、カルシウム又は次亜塩素酸ナトリウム溶液に腫瘍又は癌細胞を晒すことにより達成され得る。同様に、樹状細胞を刺激するために使用される任意の腫瘍細胞は、例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳのシステムなどにより、緩やかに切り離される。
【００２０】
本明細書に開示される方法により調製される、刺激された樹状細胞は、被験体の免疫系を高める薬剤と共に被験体に投与されてもよい。例えば、刺激された樹状細胞は、被験体をウイルスに感染させた後に被験体に投与されてもよい。一例として、本明細書に開示される方法及び例は、デングウイルス、特に、比較的安全である（例えば、致死性又は重篤有害事象の既知の発生がない）デング２型ウイルス血清型株＃１７１０を使用する。このウイルスは、（例えば、ＴＨ１の極性の推移の産生による）抑えられた免疫系の活性化を提供し、及び、標的化の特異性を改善し、それにより現行の細胞療法に比べてより高い効能及び安全性を提供する。刺激された樹状細胞とウイルス感染の組み合わせは、治療に対する被験体の密着性の負荷を回避する、恐らくわずか１回の最小の投与による有効な処置を提供する。刺激された樹状細胞は、被験体自身の細胞に由来することを意味する自己由来であり、或いは、同様の組織型を持つ別の被験体に由来する同種異系であり得る。
【００２１】
定義
本開示の全体にわたり、様々な実施形態は、範囲フォーマット（ｒａｎｇｅ  ｆｏｒｍａｔ）で提示される。範囲フォーマットでの記載は単に利便性と簡潔さのためのものであり、実施形態の範囲に対する確固たる制限として解釈されるべきでないことを、理解されたい。従って、範囲の記載は、全ての可能なサブ範囲、同様に、文脈が明確に指示していない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと考慮されねばならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６といった、具体的に開示されたサブ範囲、同様に、例えば１．１、２、２．３、５、及び５．９といった範囲内にある個々の値を有すると、考慮されねばならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。このような介在する範囲の上下限範囲は、より小さな範囲に独立して含まれ得、及び、明示された範囲における任意の明確に除外された制限に従い、本発明内にも包含される。述べられた範囲が制限の１つ又は両方を含む場合、そのような含まれている制限の何れか又は両方を除いた範囲も、文脈が明確に指示していない限り本発明に含まれる。
【００２２】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、何れの実施形態も制限するようには意図されていない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が他に明白に示していない限り、同様に複数形を含むように意図される。用語「含む」及び／又は「含むこと」は、本明細書での使用時に、明示された特徴、整数、工程、操作、要素、及び／又は構成要素の存在を特定するが、１以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、及び／又はそれらの群の存在又は追加を妨げないことが、更に理解される。本明細書で使用されるように、用語「及び／又は」は、関連する列挙された品目の１以上の、何れか及び全ての組み合わせを含む。
【００２３】
具体的に明示されていない、又は文脈から明白ではない限り、本明細書で使用されるように、数又はその範囲に関して用語「約」とは、数字又は数字の範囲に関して、明示された数及びその＋／−１０％の数を意味し、或いは、範囲について列挙された値に対する下限より１０％低い且つ上限より１０％高い数を意味する。
【００２４】
本明細書で使用されるような用語「被験体」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、ラット、マウス、非ヒト霊長類、及びヒトを含む霊長類を含む。
【００２５】
樹状細胞（ＤＣ）を単離及び刺激する方法
本明細書には、ＤＣを刺激し、必要とする被験体に刺激されたＤＣを投与する方法が提供され、ＤＣは、標的細胞の細胞傷害性をもたらす細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）からの応答を誘発する。ＤＣは、同種異系の樹状細胞又は自己由来の樹状細胞を含み得る。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、同種異系の刺激された樹状細胞を被験体に投与する工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、自己由来の刺激された樹状細胞を被験体に投与する工程を含む。被験体に刺激されたＤＣを投与する工程を含む、本明細書に開示される方法は、本明細書では「樹状細胞ワクチン投与」と呼ばれることもある。
【００２６】
幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、骨髄中のＣＤ３４＋前駆細胞から樹状細胞を得る工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、末梢血中のＣＤ１＋ＣＤ１４＋未成熟単球から樹状細胞を得る工程を含む。幾つかの例において、樹状細胞を得る工程は白血球除去を含む。白血球除去は、被験体又はドナーから１ユニットの血液（ａ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ）を引き抜くこと、一連の血液成分：赤血球、血小板、及び血漿因子の大部分を分離することを含み、一連の血液成分は、白血球が残った状態で被験体に戻される。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、無菌のために白血球を評価する工程、白血球を冷たい状態（４℃）で運ぶ又は保存する工程、又はアフェレーシス産物からＤＣを処理する工程を含む。
【００２７】
本明細書に開示されるＤＣの産生方法は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好酸球、及び好塩基球を含むがこれらに限定されない他の白血球から、１ユニットの血液中の単球を分離する工程を含み得る。これは、免疫磁気選別、又は付着特性により達成され得る。免疫磁気選別は、１ユニットの血液の白血球細胞を、限定されない例としてＣＤ表面タンパク質（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６など）などの免疫細胞のための抗体で覆われたプラスチックビーズを含む滅菌プラスチックカラムと接触させることを含む。望まれない（非単球）細胞はビーズに付着し、単球は通過して集められる。正の選別において、磁気ビーズは、単球を捕らえるためにＣＤ１及び／又はＣＤ１４のための抗体で覆われ、磁石はカラムに対して配され、望まれない細胞は緩衝生理食塩溶液又は細胞が生存可能な培地を含むカラムから流し出される。その後、単球はビーズから流し出され、次の工程で集められる。付着選別において、特定の表面に付く単球の特性を使用して、傾斜させたカラムの下にアフェレーシス産物を流すことによりそれらを分離する。
【００２８】
細胞収集のための方法が本明細書中に提供され、これは一ユニットの血液からわずか数千の単球のみ収集することを含んでもよい。有効な免疫療法には、一般的に５０００万の範囲内のＤＣの投与量を必要とする。したがって、本明細書に開示された方法は、単球ならびにその任意の前駆物質、およびそこから分化させられた任意の細胞（例えばＤＣ）を増大させる工程を含んでもよい。細胞を増大させる工程は、細胞を成長因子、コロニー刺激因子、サイトカイン、または、任意の他の増殖または成長誘導因子、およびその組み合わせと接触させる工程を含んでもよい。非制限的な例として、組み換え型のヒト成長因子ｒｈｕインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびｒｈｕ顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、ＤＣの数の増大を達成するために使用されてもよい。加えて、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦは、成熟したＤＣと比較して、貧弱な抗原取り込みおよびＣＴＬ刺激能力しかない単球から、成熟したＤＣを発達させるために必要とされてもよい。したがって、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦは成熟したＤＣマーカーの数および発達を増大させうる。ＤＣマーカーは、限定されないが、ＣＤ１１、ＣＤ８０およびＣＤ８３、ならびに、（ＣＤ８＋細胞に対するショートペプチドの提示のための）クラスＩおよび（ＣＤ４＋ヘルパー・インデューサーＴリンパ球に対するより長いペプチドの提示のための）クラスＩＩの両方のＭＨＣ複合体の発現増加、を含んでもよい。細胞を増大させることで、約２日以内に何千万の成熟したＤ  ＤＣ  Ｃを産生しうる。細胞を増大させることで、約３日以内に何千万の成熟したＤＣを産生しうる。細胞を増大させることで、約４日以内に何千万の成熟したＤＣを産生しうる。細胞を増大させることで、約５日以内に何千万の成熟したＤＣを産生しうる。細胞を増大させることで、約１週間以内に何千万の成熟したＤＣを産生しうる。
【００２９】
幾つかの例において、本明細書中に開示された方法は、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、及び／又は腫瘍支持細胞溶解物とＤＣを接触させること、またはパルスさせる工程を含む。用語「パルス」は、本明細書に使用されるように、通常、一般に、１つ以上の間隔で細胞を２回以上接触させることを指し、別段の指定がない限り、接触と交換可能に使用され得る。幾つかの例において、該方法は、ＭＨＣクラスＩ分子（「ＭＨＣクラスＩペプチド」）に結合するペプチドとＤＣを接触させまたはパルスさせる工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子（「ＭＨＣクラスＩＩペプチド」）に結合するペプチドとＤＣを接触させまたはパルスさせる工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、ＭＨＣクラスＩペプチドとＭＨＣクラスＩＩペプチドとＤＣを接触させまたはパルスさせる工程を含む。幾つかの例において、接触またはパルスさせる工程により、ＣＴＬを刺激しかつ腫瘍に対しＣＴＬを標的化する能力をＤＣに与える。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、製造された／合成のクラスＩ及び／又はクラスＩＩのペプチドとＤＣを接触させまたはパルスさせる工程を含む。幾つかの例において、クラスＩ及び／又はクラスＩＩのペプチドは、製造され、次いでＤＣ培地に添加され、随意にマイクログラム単位の量以下である。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、持続した免疫応答のためのクラスＩＩペプチドを含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、ペプチド（即ち腫瘍抗原）のＤＮＡ又はＲＮＡを配列決定する工程、及び／又は、抗原処理を引き起こすためにＤＮＡ又はＲＮＡをＤＣに挿入するためのエレクトロポレーションを使用する工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、ＤＣに適合するＨＬＡを必要としない。幾つかの例において、ペプチド又はその一部は、ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、（ＴＡＹＲＹＨＬＬ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、又はそれらの組み合わせから選択されたアミノ酸配列により表される。
【００３０】
クラスＩペプチドは製造されてもよく、次いで、マイクログラム単位の量でＤＣの培地に加えられてもよい。しかし、ペプチドが被験体のＨＬＡ型に適合しなければならないのでこの技術は高価であり、かつ、腫瘍細胞はその抗原を提示しない場合、検出と溶解を回避することができる。ＣＤ４＋ヘルプを活性化するためのクラスＩＩペプチドの欠如は、免疫応答力の急速な低下をもたらす。他の方法には、一般的な腫瘍抗原のＲＮＡ配列決定を含み、その後、抗原処理を引き起こすため、ＤＣにＲＮＡを挿入するようにエレクトロポレーションを使用してもよい。この方法はＨＬＡの適合を必要とせず、持続的な免疫応答のためのクラスＩＩペプチドを含んでいる。しかし、ＲＮＡ配列決定は技術的に複雑である場合があり、何千もの潜在的な遺伝子産物の限られた数の抗原しか提示しない場合がある。これらの理由から、自己の腫瘍細胞全体またはそれらの溶解物は、生検による低価格で容易な利用可能性（１−２ｇｍで十分）という利点を有し、広範囲かつ深い免疫応答のための潜在的な抗原の完全なアレイを含んでいる。
【００３１】
本明細書に記述された樹状細胞のプライミングのための方法は、全体の腫瘍細胞及び／又はその溶解物を得る工程を含んでもよい。腫瘍細胞は、放射線または他の方法により死滅させられてもよく、かつ、様々な方法により溶解物を調製する。幾つかの例において、腫瘍細胞を溶解する工程は、トリプシン酵素消化と凍結融解サイクルを含まず、これらは単純且つ迅速ではあるが、中にある繊細なペプチドを傷つけかねない。本明細書に開示された方法は、自動細胞処理装置（例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステム）を使用してもよく、これは、サンプルを手動で刻み、ＰＢＳ溶液中で懸濁させることが可能となり、次いで予め選択された組織特異的ソフトウェアにより制御されるローターシステムが腫瘍細胞を分離させる。単細胞懸濁液は膜溶解されてもよく、腫瘍ペプチドへの損傷は最小限である。
【００３２】
本明細書に記載される、樹状細胞のプライミングのための方法は、樹状細胞を自己由来腫瘍細胞又はその溶解物と接触させる工程を含んでもよい。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、広範囲且つ深い免疫応答のための潜在的な抗原の完全なアレイを含有する自己由来腫瘍細胞全体（例えば腫瘍細胞及び腫瘍支持細胞）又はその溶解物と、樹状細胞を接触させる工程を含む。本明細書に記載される樹状細胞のプライミングのための方法は、樹状細胞を、アポトーシス小体または壊死体を含む腫瘍細胞溶解物と接触させる工程を含んでもよい。更なる例において、腫瘍細胞溶解物は、細胞外マトリックスタンパク質などの、腫瘍細胞を取り囲む微小環境からの腫瘍抗原を含む。
【００３３】
本明細書に記述される、樹状細胞のプライミングのための方法は、ＤＣのプライミング、増殖または生存率を増強させる増強剤とＤＣを接触させる工程を含んでもよい。非制限的な実施例としては、増強剤は、リンホカイン、モノカイン、サイトカイン、成長因子、細胞、細胞片、（非タンパク質）小分子、抗体、抗体断片、核酸、およびその組み合わせから選択されてもよい。
【００３４】
ＤＣのプライミングのために細胞と抗原を調製する方法は標的細胞（例えば癌細胞）を細胞分裂ができなくする工程を含んでもよい。例えば、該方法は、細胞を細胞分裂ができなくするようにマイトマイシンＣまたは放射線で細胞を処置する工程を含んでもよい。これらは、ＤＣ（例えば腫瘍細胞）をパルスするために使用される増強剤または細胞として加えられる細胞を含んでもよい。
【００３５】
幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、約１時間から約２４時間ＤＣをパルスする工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、約１２時間から約４８時間ＤＣをパルスする工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、約８時間から約２４時間ＤＣをパルスする工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、約１８時間ＤＣをパルスする工程を含む。パルスする工程は、ＤＣを、少なくとも１回、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、及び／又は腫瘍支持細胞溶解物に接触させることを含んでもよい。パルスする工程は、ＤＣを、少なくとも２回、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、及び／又は腫瘍支持細胞溶解物に接触させることを含んでもよい。パルスする工程は、ＤＣを、少なくとも３回、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、及び／又は腫瘍支持細胞溶解物に接触させることを含んでもよい。パルスする工程は、ＤＣを、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物及び／又は腫瘍支持細胞溶解物に、２回未満、３回未満、４回未満、５回未満または１０回未満、接触させることを含んでもよい。パルスする工程は、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物及び／又は腫瘍支持細胞溶解物を、ＤＣに、２回以上加え、その結果、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物及び／又は腫瘍支持細胞溶解物がＤＣの培地に蓄積することを含んでもよい。パルスする工程は、１つ以上のパルスの間に、細胞の洗浄またはＤＣの培地の除去を含んでもよい。
【００３６】
本明細書に記載される方法は、ＤＣを成熟化剤と接触させて、ＤＣの成熟を増強、完了または最終化する工程を含んでもよい。幾つかの実施形態において、成熟化剤はまた「危険信号（ｄａｎｇｅｒ  ｓｉｇｎａｌ）」として作用する。この危険信号なしで、腫瘍抗原はＴｒｅｇ産生または活性を誘発する場合があり、これは最終的にＣＴＬ活性を低下させる。幾つかの実施形態において、成熟化剤／危険信号は炎症性シグナルである。炎症性シグナルは炎症性メディエーターと称される場合もある。炎症性メディエーターは、他の要因（例えばケモカイン、接着分子など）と同様にサイトカインを含んでもよく、これは当業者にはサイトカインとして分類されないかもしれないが、炎症に直接または間接的に影響する場合がある。いくつかの実施形態では、炎症性メディエーターは、ケモカイン、サイトカイン、病原体、非ペプチド小分子、化合物、抗体、ペプチド、その断片、その一部、およびその組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、炎症性シグナルは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、またはその経路のモジュレーターである。
【００３７】
いくつかの実施形態において、炎症性シグナルは、インターフェロン、トール様受容体シグナル伝達モジュレーター、およびその組み合わせから選択される。非制限的な例としては、インターフェロンはインターフェロンガンマでもよい。いくつかの実施形態において、炎症性シグナルはトール様受容体シグナル経路モジュレーターである。
【００３８】
いくつかの実施形態において、炎症性シグナルはトール様受容体（ＴＬＲ）シグナル経路レギュレーターである。非制限的な例としては、トール様受容体シグナル経路レギュレーターはリポ多糖（ＬＰＳ）、細菌細胞壁からの多糖類でもよい。
【００３９】
トール様受容体シグナル経路レギュレーターは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０を調節するトール様受容体シグナル経路レギュレーターから選択されてもよい。トール様受容体シグナル経路レギュレーターは、ＴＬＲに、リガンド、結合タンパク質、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。トール様受容体シグナル経路レギュレーターは、ペプチド、タンパク質、細胞片、細胞壁成分、リポ蛋白、ペプチドグリカン、多糖類、単糖類および小分子化合物から選択されてもよい。トール様受容体シグナル経路レギュレーターは、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、酵母菌、真菌細胞およびその組み合わせの一部であってもよい。トール様受容体シグナル経路レギュレーターはＴＬＲ２シグナル経路レギュレーターであってもよい。非制限的な例としては、ＴＬＲ２シグナル経路レギュレーターは、リポテイコ酸、ＭＡＬＰ−２、ＭＡＬＰ−４、ＯｓｐＡ、ポーリン、ＬｃｒＶ、リポマンナン、ＧＰＩアンカー、リゾホスファチジルセリン、リポホスホグリカン、グリコホスファチジルイノシトール（ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）、チモサン、ｈｓｐ６０、およびヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｌｕｔｉｎｉｎ）であってもよい。トール様受容体シグナル経路レギュレーターはＴＬＲ４シグナル経路レギュレーターであってもよい。非制限的な例としては、ＴＬＲ４シグナル経路レギュレーターは、ブプレノルフィン、カルバマゼピン、エタノール、フェンタニル、レボルファノール、ＬＰＳ、メタドン、モルヒネ、オクスカルバゼピン、オキシコドン、ペチジンおよびグルクロノキシロマンナンであってもよい。トール様受容体シグナル経路レギュレーターはＴＬＲ７シグナル経路レギュレーターであってもよい。非制限的な例としては、ＴＬＲ７シグナル経路レギュレーターは一本鎖ＲＮＡまたはイミダゾキノリン化合物であってもよい。トール様受容体シグナル経路レギュレーターはＴＬＲ８シグナル経路レギュレーターであってもよい。非制限的な例としては、ＴＬＲ８シグナル経路レギュレーターは、一本鎖ＲＮＡ、Ｇリッチオリゴヌクレオチドまたはイミダゾキノリン化合物であってもよい。イミダゾルキノリン化合物はＲ８４８であってもよい。
【００４０】
炎症性シグナルへの曝露後、ＤＣは、それらのＣＤ８０／ＣＤ８３＋活性化マーカーをアップレギュレートし、１型ＣＴＬ応答を誘発するためにＩＬ−１２ｐ７０の産生を増大させ、更なる抗原の取り込みと処理に耐性を持つようになる。
【００４１】
本明細書に記載されている刺激された樹状細胞を産生する方法は、刺激された樹状細胞をインターフェロンガンマと接触させる工程を含んでもよい。いくつかの実施形態において、該方法は、インターフェロンガンマの濃度が、約１００Ｕ／ｍＬから約１０，０００Ｕ／ｍＬと、約５００Ｕ／ｍＬから約５０００Ｕ／ｍＬと、約５００Ｕ／ｍＬから約２，０００Ｕ／ｍＬと、から選択される培地において、刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、該方法は、刺激された樹状細胞を、インターフェロンガンマの濃度が約５００Ｕ／ｍＬの培地において培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、該方法は、刺激された樹状細胞を、インターフェロンガンマの濃度が約１０００Ｕ／ｍＬの培地において培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、該方法は、刺激された樹状細胞を、インターフェロンガンマの濃度が約２０００Ｕ／ｍＬの培地において培養する工程を含む。
【００４２】
本明細書に記載されている、刺激された樹状細胞を産生する方法は、刺激された樹状細胞をＴＬＲ８アゴニストＲ８４８と接触させる工程を含んでもよい。いくつかの実施形態において、該方法は、Ｒ８４８の濃度が、約０．１μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬと、約１μｇ／ｍＬから約２０μｇ／ｍＬと、約１μｇ／ｍＬから約１０μｇ／ｍＬと、から選択される培地において、刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、該方法は、刺激された樹状細胞を、Ｒ８４８の濃度が約１μｇ／ｍＬの培地において培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、該方法は、刺激された樹状細胞を、Ｒ８４８の濃度が約５μｇ／ｍＬの培地において培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、該方法は、刺激された樹状細胞を、Ｒ８４８の濃度が約１０μｇ／ｍＬの培地において培養する工程を含む。
【００４３】
本明細書に記載されている、刺激された樹状細胞を産生する方法は、刺激された樹状細胞をリポ多糖と接触させる工程を含んでもよい。いくつかの実施形態において、該方法は、リポ多糖の濃度が、約１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬと、約１ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬと、約１ｎｇ／ｍＬから約２５ｎｇ／ｍＬと、から選択される培地において、刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、該方法は、刺激された樹状細胞を、リポ多糖の濃度が約５ｎｇ／ｍＬの培地において培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、該方法は、刺激された樹状細胞を、リポ多糖の濃度が約１０ｎｇ／ｍＬの培地において培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、該方法は、刺激された樹状細胞を、リポ多糖の濃度が約１５ｎｇ／ｍＬの培地において培養する工程を含む。
【００４４】
本明細書に記載されている方法は、ＤＣの無菌性、特異性および生存率の評価を含んでもよい。試験はＤＣの配送または保管の前に行われてもよい。試験はＤＣの配送または保管の後に行われてもよい。方法は、ＲＮＡまたはタンパク質レベルのいずれかにおいて、ＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルを測定する工程を含んでもよい。ＩＬ−１２ｐ７０は、直近２０年の間の多数の試験にわたり試験された、臨床的な応答の独立的な予測因子であり、いくつかは応答率が約４０％である。本明細書に開示された方法により産生された、刺激されたＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルは、従来の方法で産生され／保管され／配送される、刺激されたＤＣよりも少なくとも約２倍大きい場合がある。本明細書に開示された方法により産生された、刺激されたＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルは、従来の方法で産生され／保管され／配送される、刺激されたＤＣ（従来の刺激されたＤＣ）よりも少なくとも約２倍大きい場合がある。刺激されたＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約１００％、従来の刺激されたＤＣより大きい場合がある。刺激されたＤＣのＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルは、従来の刺激されたＤＣより少なくとも約３倍大きい場合がある。刺激されたＤＣのＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルは従来の刺激されたＤＣより少なくとも約４倍大きい場合がある。本明細書に開示された方法により産生された、刺激されたＤＣのＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルは、従来の刺激されたＤＣより約２倍から約２０倍大きい場合がある。
【００４５】
６ｎｇ／ｍＬを超えるＩＬ−１２ｐ７０を産生する樹状細胞が本明細書中で提供される。また、１０ｎｇ／ｍＬを超えるＩＬ−１２ｐ７０を生成する樹状細胞が本明細書中で提供される。幾つかの例においては、本明細書に記載される方法により産生されるＤＣは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２２ｎｇ／ｍＬ、または、少なくとも約２４ｎｇ／ｍＬ産生する。幾つかの例においては、本明細書に記述された方法により生成されたＤＣは、約１０ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬ産生する。幾つかの例においては、本明細書に記述された方法により生成されたＤＣは、約１０ｎｇ／ｍＬから約２５ｎｇ／ｍＬまで産生する。幾つかの例においては、本明細書に記述された方法により生成されたＤＣは、約１５ｎｇ／ｍＬから少なくとも約２３ｎｇ／ｍＬまで産生する。幾つかの例においては、本明細書に記述された方法により生成されたＤＣは、約６．５ｎｇ／ｍＬから少なくとも約２３ｎｇ／ｍＬまで産生する。
【００４６】
ＣＴＬ応答
本明細書に記載されているＤＣを産生する方法は、ＤＣのＣＴＬ応答を誘発する能力を試験する工程を含んでもよい。ＣＴＬ応答のレベルの測定は、被験体からの血液、血清または血漿中でサイトカインまたは炎症性メディエーターを測定する工程を含んでもよい。ＣＴＬ応答のレベルの測定は、被験体からの血液、血清または血漿中のサイトカインまたは炎症性メディエーターのレベルの変化を測定する工程を含んでもよい。ＣＴＬ応答のレベルの測定は、インビトロでのサイトカインまたは炎症性メディエーターの産生を測定する工程を含んでもよい。サイトカインと炎症性メディエーターは、インターロイキン、遊走阻害タンパク質（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、単球走化性タンパク質（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、単球遊走タンパク質（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質、モノカイン、ケモカイン、ケモカインリガンド（ＣＣＬ）およびＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン（ＣＸＣＬ）および、その受容体を含んでもよい。サイトカインと炎症性メディエーターは、限定されないが、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１ｂ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−５）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、ランテス、イオタキシン、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ−１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ−１ｂ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球遊走因子（ＭＣＰ−１）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮａ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）、インターフェロンガンマ誘発タンパク質（ＩＰ−１０）、およびガンマインターフェロン（ＭＩＧ）により誘発されたモノカイン、を含んでもよい。ＣＴＬ応答は、腫瘍応答遺伝子（ＭｘＡ等）の発現により測定されてもよく、高度に癌を死滅させる（「免疫原性の低い」腫瘍（ｃｏｌｄ  ｔｕｍｏｒ）を「高く」（ｈｏｔ）させる）ことが可能になり、かつ、不応答者または低応答者においてさらなる腫瘍の収縮を生成する。
【００４７】
硬表面
本明細書に記載されているＤＣの調製のための方法は、硬表面上でＤＣを培養する工程を含んでもよい。用語「硬表面」は、本明細書に使用されるように、通常、標準的なプラスチック組織培養プレートまたはフラスコ（例えばポリスチレンプレート）を指す。本明細書に開示された方法は、ＤＣが付着することができる硬表面上でＤＣを培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、硬表面は、タンパク質、ペプチド、細胞外基質分子、ポリマー、またはその組み合わせでコーティングされる。いくつかの実施形態において、硬表面はコーティングされない（例えば、ＤＣは、硬いプラスチック表面に直接付着する）。硬表面は、細胞分化バッグ（ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂａｇ）としても知られている軟組織培養バッグ（ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂａｇ）とは対照的である。軟組織培養バッグは、ＤＣの１型応答の機能を低下させるポリマーまたは化学物質（例えばフタル酸塩）を含むバッグであってもよい。軟組織培養バッグは、ＤＣから中性の０型応答を惹起するポリマーまたは化学物質を含むバッグであってもよく、ＤＣを機能的に不活性化させる。軟組織培養バッグは、ポリエチレン、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ヘキサフルオロプロピレン、テトラフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、および、そのコポリマーから選択されたポリマーを含むバッグおよびその組み合わせであってもよい。
【００４８】
本明細書に記載されているＤＣの調製のための方法は、保管ユニットにＤＣを移す工程を含んでもよい。保管ユニットは配送ユニットであってもよい。保管ユニットは、可撓または柔軟な容器または表面（例えばバッグ）、または硬質な容器または表面（例えばフラスコまたはプレート）から選択されてもよい。保管ユニットは、硬プラスチック表面を含んでもよい。保管ユニットは、実質的に硬プラスチック表面からなってもよい。保管ユニットは、硬プラスチック表面からなってもよい。保管ユニットは、非プラスチック表面（例えばガラス）を含んでもよい。保管ユニットは、実質的に非プラスチック表面からなってもよい。保管ユニットは、非プラスチック表面からなってもよい。保管ユニットは、保管ユニット内に保管された細胞に吸収され、および／または、応答を誘発するであろう任意のポリマーが無くてもよい。保管ユニットは、未成熟のＤＣにおいて中性または０型の応答を誘発するポリマーが無くてもよく、または実質的に無くてもよい。中性の応答は、ＩＬ−１２ｐ７０の低発現に特徴付けられうる。保管ユニットは、保管ユニット内に保管された細胞に吸収され、および／または、応答を誘発するであろう任意のポリマーが実質的に無くてもよい。「実質的に無い」とは、保管ユニット内に保管された細胞に吸収され、および／または、応答を誘発するであろう任意のポリマーが、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、保管ユニットに無いことを意味しうる。「実質的に無い」とは、保管ユニット内に保管された細胞に吸収され、および／または、応答を誘発するであろう任意のポリマーが、少なくとも９９．５％、９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％、保管ユニットに無いことを意味しうる。
【００４９】
本明細書中に記載された方法によって産生されたＤＣを保管するための保管ユニットが本明細書中に提供され、該保管ユニットは内側表面を含み、該内側表面は、保管ユニットの中に保管される細胞と接触する、保管ユニットの表面である。内側表面は硬プラスチック表面からなってもよい。内側表面はガラスであってもよい。内側表面は、保管ユニット内に保管された細胞に吸収され、および／または応答を誘発するであろう任意のポリマーが存在しなくてもよい。内側表面は、保管ユニット内に保管された未成熟のＤＣまたは任意の細胞によって吸収されないポリマーから構成されてもよい。内側表面は、保管ユニット内に保管された細胞に吸収され、および／または応答を誘発するであろう任意のポリマーが無くてもよい。内側表面は、保管ユニット内に保管された細胞に吸収され、および／または応答を誘発するであろう任意のポリマーが実質的に無くてもよい。内側表面は、細胞および保管培地の添加後に保管ユニット内に保管された細胞に吸収され、および／または、応答を誘発するであろう任意のポリマーが、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、無くてもよい。内側表面は、細胞および保管培地の添加後に保管ユニット内に保管された細胞に吸収され、および／または、応答を誘発するであろう任意のポリマーが、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％、無くてもよい。内側表面は、未成熟のＤＣにおいて中性の応答または０型応答を誘発するポリマーが無くてもよく、または実質的に無くてもよい。中性の応答は、ＩＬ−１２ｐ７０の低発現に特徴付けられうる。
【００５０】
本明細書中に記載された方法によって産生されるＤＣを保管するための保管ユニットが本明細書中に提供され、該保管ユニットは、液体窒素中で−７０度で冷凍し、最大１年保管し、使用のためにクリニックに配送するのに適している。該方法は、保管ユニット中の成熟したＤＣ、未成熟のＤＣ、単球または血液を配送する工程及び／又は保管する工程を含んでもよい。該方法は、一晩中冷却して細胞を配送する工程を含んでもよい。該方法は、３７度（例えば暖水槽内）まで細胞を融解し、または加温する工程を含んでもよい。
【００５１】
腫瘍細胞を分離及び溶解する方法
被験体を処置する方法であって、腫瘍細胞を標的化するために本明細書中に開示されたＤＣを投与する工程を含む方法が本明細書中に提供される。幾つかの例において、ＤＣは、被験体由来の腫瘍細胞で刺激される。幾つかの例において、腫瘍細胞は、本明細書において腫瘍支持細胞と称される、被験体の腫瘍微小環境から分離された細胞である。幾つかの例において、樹状細胞は、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、及び／又はそれらのペプチドに晒され／腫瘍細胞、腫瘍支持細胞及び／又はそのペプチドでパルスされ、それにより樹状細胞は、腫瘍細胞、及び／又は、腫瘍の増殖と転移を支持する腫瘍支持細胞（例えば内皮細胞、血管細胞、免疫細胞など）を標的とする。幾つかの例において、腫瘍細胞及び腫瘍支持細胞由来のペプチド／抗原は、腫瘍細胞と腫瘍支持細胞両方の上でペプチド／抗原に対する受容体を持つ樹状細胞又は細胞障害性リンパ球を誘発し、その結果、腫瘍細胞のみではなく腫瘍微小環境への樹状細胞又は細胞障害性リンパ球の標的化がもたらされる。幾つかの例において、腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞は腫瘍組織の生検から得られる。幾つかの例において、生検は、腫瘍細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、浸潤性免疫細胞、及びそれらの組み合わせから選択された細胞を含む。いくつかの実施形態において、該方法は、効果的にかつ最適にＤＣを刺激／パルスするために、腫瘍細胞、腫瘍細胞溶解物、または腫瘍細胞抗原の数を十分にするように腫瘍細胞を拡大する工程を含む。拡大する工程は、腫瘍細胞をインビトロで増殖させる工程を含んでもよい。
【００５２】
腫瘍細胞を標的化するために、本明細書に開示されたＤＣを活性化するための方法が本明細書中に提供され、ＤＣは、溶解した腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞及び周囲の細胞外マトリックスで活性化される。幾つかの例において、溶解は、赤血球を除去するために腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞をＮＨ４Ｃｌ酵素溶液と接触させることを含む。幾つかの例において、溶解は、免疫原性細胞死を誘発するために腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞を次亜塩素酸溶液と接触させることを含む。幾つかの例において、細胞は、ペプチドを破壊しないよう十分に優しく溶解される。幾つかの例において、細胞は、アポトーシス小体または壊死体を生成するために溶解される。幾つかの例において、前記方法は、酵素溶液により腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞を溶解する工程を含む。幾つかの例において、前記方法は、過酸化物を含まない溶液又は低過酸化物含有溶液により腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞を溶解する工程を含む。
【００５３】
本明細書に開示されたＤＣを活性化するための方法であって、次亜塩素酸塩溶液（ＨＯＣＬ）で腫瘍細胞を溶解する工程を含む方法が本明細書中に提供される。幾つかの例において、次亜塩素酸塩溶液は亜塩素酸ナトリウムを含む。幾つかの例において、次亜塩素酸塩溶液は塩化カルシウムを含む。幾つかの例において、腫瘍細胞が懸濁される培地における次亜塩素酸塩の濃度は、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、または、約１００μＭである。
【００５４】
ＤＣを活性化するための方法であって、ＤＣとの接触に先だって、腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞を洗浄剤で溶解する工程を含む方法が本明細書中で提供される。幾つかの例において、洗浄剤は、限定されないが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ  ２０、及びＣＨＡＰＳＯから選択される。幾つかの例において、洗浄剤溶液から、過酸化物及び他の不純物が精製される。幾つかの例において、洗浄剤は、洗浄剤溶液の約０．１％〜約１０％  ｖ／ｖである。幾つかの例において、洗浄剤は、洗浄剤溶液の約０．１％〜約５％ｖ／ｖである。幾つかの例において、洗浄剤は、洗浄剤溶液の約０．５％〜約５％ｖ／ｖである。幾つかの例において、洗浄剤は、洗浄剤溶液の約１％〜約１０％ｖ／ｖである。幾つかの例において、洗浄剤は、洗浄剤溶液の約１％〜約５％ｖ／ｖである。幾つかの例において、前記方法は、細胞の振盪、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）、冷凍、融解、剪断圧力、超音波処理、及び／又は加熱を行うことなく、細胞を溶解する工程を含む。
【００５５】
幾つかの例においては、本明細書に記載されている細胞溶解のための方法は、さらに、溶解を停止する工程または中和する工程を含む。例えば、細胞は、溶解を中和するために緩衝生理食塩溶液（リン酸緩衝生理食塩溶液またはハンクス液）で洗浄されてもよい。
【００５６】
併用療法
併用療法であって、最適な結果を達成するために他の型の治療で本明細書に開示された治療剤を含む併用療法が、本明細書で提供される。例えば、幾つかの例において、癌免疫療法に対する併用手法は、腫瘍が突然変異して回避することができる単一軸の攻撃（ｓｉｎｇｌｅ−ａｘｉｓ  ａｔｔａｃｋｓ）よりも成功する場合がある。いくつかの実施形態において、療法は癌療法である。癌療法は、限定されないが、化学療法、放射線、小分子阻害剤およびモノクローナル抗体を含む。
【００５７】
組成物と方法本明細書に記載され、樹状細胞ワクチン投与が、腫瘍免疫回避機構を克服し且つ腫瘍細胞を枯渇させるために、ウイルスのアジュバント効果と組み合わされる。本明細書に開示された併用療法の概略図が図１に表される。本明細書に記載される方法は、被験体から樹状細胞（１０２）と腫瘍細胞（１０４）を得ること（１０１）、樹状細胞を刺激（または「活性化」）するために樹状細胞を「パルスする」とも称される、腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物（１０５）に樹状細胞を晒すこと、被験体の免疫系がウイルス（１０８）で刺激された後に、結果として生じる刺激されかつ腫瘍を標的とする樹状細胞を被験体に送達すること（１０７）により、癌を患う被験体（１０１）を処置するために使用されてもよい（例えば、図１を参照）。随意に、被験体由来ではない腫瘍抗原が、樹状細胞をパルスするために使用され得る。
【００５８】
腫瘍免疫回避機構は、大半の免疫療法プラットフォームに見られる効果の欠如の原因である。本明細書に記載される組成物と方法は、腫瘍細胞を破壊するために、生理学的（腫瘍灌流の温熱減少（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ））経路、免疫学的（適応性且つ先天性の免疫系のエフェクター細胞の活性化）経路、及びアポトーシス誘発経路（ｓＴＲＡＩＬ）を組み合わせる、多角的な手法を提供する。アジュバントとしてデングウイルス（ＤＶ）のようなウイルスを使用し、相乗効果において作用する多くの経路を活性化することで、突然変異した腫瘍細胞の撲滅が支援され、癌免疫療法の臨床効果が改善されることがある。本明細書に記載される方法は、同時に作用の複数の機構に基づいた癌免疫療法を提供し、結果として、１つの方法のみの送達と比べて、腫瘍細胞が抵抗法を利用する能力の低下をもたらす。
【００５９】
疾患または疾病を有する被験体を処置する方法が本明細書に提供され、該方法は：樹状細胞（ＤＣ）を得る工程；少なくとも１つの腫瘍細胞抗原でＤＣをインキュベートする工程；ウイルスを被験体に投与する工程；及びＤＣを被験体に投与する工程、を含む。幾つかの例において、樹状細胞は自己由来樹状細胞である。幾つかの例において、樹状細胞は同種異系樹状細胞である。幾つかの例において、少なくとも１つの腫瘍抗原でＤＣをインキュベートする工程は、腫瘍細胞でＤＣをインキュベートすることを含む。幾つかの例において、少なくとも１つの腫瘍抗原でＤＣをインキュベートする工程は、腫瘍細胞溶解物でＤＣをインキュベートすることを含む。幾つかの例において、少なくとも１つの腫瘍抗原でＤＣをインキュベートする工程は、腫瘍細胞により発現されたペプチドでＤＣをインキュベートすることを含む。幾つかの実施形態において、疾患または疾病は癌である。幾つかの実施形態において、ウイルスはアルボウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスはデングウイルスである。
【００６０】
被験体の癌を処置する方法が本明細書中に開示され、該方法は：樹状細胞（ＤＣ）を得る工程；少なくとも１つの腫瘍細胞抗原でＤＣをインキュベートする工程；デング２型ウイルスの血清型株を被験体に投与する工程；および、ＤＣを被験体に投与する工程、を含む。幾つかの例において、デング２型ウイルスの血清型株はＤＥＮＶ−２＃１７１０である。幾つかの例において、樹状細胞は自己由来樹状細胞である。幾つかの例において、樹状細胞は同種異系樹状細胞である。幾つかの例において、少なくとも１つの腫瘍抗原でＤＣをインキュベートする工程は、腫瘍細胞でＤＣをインキュベートすることを含む。幾つかの例において、少なくとも１つの腫瘍抗原でＤＣをインキュベートする工程は、腫瘍細胞溶解物でＤＣをインキュベートすることを含む。
【００６１】
ウイルスを投与する工程は、癌細胞死亡または癌細胞溶解を、ＤＣのみにより誘発された癌細胞死亡または癌細胞溶解以上に、増大させることがある。癌細胞死亡は、少なくとも約１０％から約２５％、少なくとも約１０％から約５０％、少なくとも約２０％から約１００％、少なくとも約２０％から約２００％、増大されることがある。ウイルスを投与する工程は、ＤＣのみにより縮小された腫瘍病変以上に、腫瘍病変のサイズを縮小させることがある。腫瘍病変のサイズは、少なくとも約１０％から約５０％、少なくとも約１０％から約３０％、少なくとも約１５％から約８０％、縮小することがある。ウイルスを投与する工程は、腫瘍内微小環境における骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数を、ＤＣのみにより減少した数以上に減少させることがある。ウイルスを投与する工程は、腫瘍内微小環境における骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数を、少なくとも約１０％から約６５％、少なくとも約１０％から約８５％、少なくとも約１０％から約１００％、または少なくとも約１０％から約２００％、減少させることがある。
【００６２】
デングウイルス
併用療法のための方法が本明細書に提供され、該方法は腫瘍細胞を標的化するために、本明細書に記載されるデングウイルス（ＤＶ）及び活性化されたＤＣを投与する工程を含み、ＤＶは被験体に投与される。本明細書で使用されるように、用語「デングウイルス」は、デングウイルスの血清型１型、２型、３型、４型、又は５型のいずれかの血清型を含む。デングウイルスという用語はまた、遺伝子的に改変されたＤＶ、インビトロで突然変異したＤＶ、および、ＤＶまたはそのタンパク質／ペプチドの組み合わせ、を包含してもよい。ＤＶは、生きていても、死んでいても、組み換え型でも、またはそのタンパク質／ペプチドであってもよい。
【００６３】
初期感染において、ＤＶ由来の死亡率は非常に低い（マンソン熱帯病（Ｍａｎｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ）当たり６１，０００分の１）。ウイルスは、単球マクロファージと樹状細胞系列のＡＰＣを感染させるが、死滅させない。その後、このような感染したＡＰＣは、炎症性促進性（ＴＮＦ−アルファとＩＬ−１ベータ）、及びＴＨ１（ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ１５、及びＩＬ−２１）タイプのサイトカインカスケードを発生させる（ｂｅｇｉｎ）。このようなサイトカインは、適応性（ＣＴＬ）及び先天性（ＮＫ）両方の免疫系の強力な活性化がもたらされうる。３−５日の潜伏期の後、発熱が３９．５−４０．５℃で生じ、４−５日間にわたり上昇し続ける。被験体は、激しい頭痛、関節痛、倦怠感、及び光に対する過敏性を経験する。胸部と背部、時には脚と腕を覆う発疹が、発熱の３日目までに発達しうる。臨床的に、デング感染の結果として血小板数の低下がもたらされ、それにより出血が引き起こされ、これはショック症候群の場合に軽微なものから生命の危険があるものにまで及ぶ。賢明な流体管理に基づく適切な支援的ケアにより、回復は症例の９９％において達成される。
【００６４】
デングウイルスはアルボウイルスであり、ネッタイシマカ腫及びヒトスジシマカ種の蚊により排他的に伝搬される。ウイルスは、未確認の森林に生息する哺乳動物リザーバー（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）（恐らく霊長類）及びヒト宿主に関する、複雑な生活環を持つ。メスの蚊は感染した人から血粉を得て、ウイルスは腸管の上皮細胞において高感染力価（１０＾５／ｍｌ）にまで複製し、その後、蚊が別の血粉の後に逆圧を使用して自身の口針を引っ込める時に、他者に伝染される。デング伝染病は毎年５０００万人に感染し、数千人の死者は、大抵、二次感染に関連するショックの処置が不適切な子供である。
【００６５】
デングウイルスゲノムは、構造タンパク質、カプシドタンパク質Ｃ、膜タンパク質Ｍ、エンベロープタンパク質Ｅ、及び非構造タンパク質、ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、及びＮＳ５をコード化する。幾つかの例において、デングウイルスは、デングウイルスの生きた株である。幾つかの例において、デングウイルスは、デングウイルスの弱毒化株である。幾つかの例において、デングウイルスは、デングウイルスの弱められた株である。幾つかの例において、デングウイルスは、デングウイルスの以下の血清型から選択される：ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、及びＤＥＮＶ−５、並びにそれらの組み合わせ。
【００６６】
デングウイルスは、トガウイルス・ファミリー（フラビウイルス科のサブファミリー）（群Ｂ）のプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルスは、正２０面体（ｉｃｏａｓｈｅｄｅｒａｌ）の幾何学的構造を有しており、直径およそ４０−４５ナノメートルである。１１，０００の塩基ゲノムは、ヌクレオカプシド（ＮＣ）、タンパク質、ｐｒＭ膜融合タンパク質、エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、及び５つの非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ５をコードする。ＮＣタンパク質は、ｐｒＭ複合体を介して取り付けられたエンベロープスパイクを持つ、ウイルスコアを形成する。Ｅ糖タンパク質は中和抗体の主要標的であり、ＮＳ−３とＮＳ−４のタンパク質は、ＣＤ４＋とＣＤ８＋ＣＴＬのために主要標的を構築する。
【００６７】
デングウイルスは、５つの別個の血清型である、ＤＥＮＶ−１〜ＤＥＮＶ−５を構築する。血清型２型と４型は、ＩｇＧに対して交差中和性（ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）であり、１型と３型も交差中和性である。免疫性は完全ではないが、デングは、非交差中和性の血清型による後の感染が、免疫の過剰活性化からのショック症候群に起因した死亡率の危険性の増大をもたらすという点で、ウイルス感染の中でも独特なものである。
【００６８】
組成物およびそのような組成物を用いる方法が本明細書において提供され、その組成物は、デングウイルス血清型１、２、３、４、または５型を含む。いくつかの例において、ＤＶは血清型２型である。いくつかの例において、ＤＶ血清型２型はＤＥＮＶ−２株＃１７１０である。ＤＥＮＶ−２株＃１７１０は、被験体を感染させる際はより軽度なので、他のＤＶ株よりも効果的である可能性があり、したがってより安全である。他のより激毒性の株はより強い抗腫瘍効果を有することもあり、それらは安全性への懸念から適切ではない可能性がある。より激毒性の株は、非限定的な例としてＤＥＮＶ−２株＃１５８４である。ＤＥＮＶ−２株＃１７１０は、１９８５年にプエルトリコで採取されたサンプル由来であり、エンベロープ遺伝子領域に特異的な４つのプライマー（表１を参照）を用いる制限部位特異的ＲＴ‐ＰＣＲ解析によってＡ型として特徴づけられる。Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５３，８６−９５（１９９９）を参照されたい。これらのプライマーを備えた制限部位特異的ＲＴ−ＰＣＲは、５８２塩基対、７５４塩基対、およびことによると６７６塩基対の増幅産物を生成する。ＤＥＮＶ−２株＃１７１０は、エントリーＮｏ．５５５としてＣＤＣデータベース内に記録されている。Ｈａｒｒｉｓ（１９９９）を参照されたい。ＤＥＮＶ−２株＃１７１０は、プエルトリコで流行した際に単離された。この発生において、ＤＶが疑われたが、そのウイルスによる死亡は確認されなかった事例が９，５４０件あり、このことによってＤＥＮ−２株＃１７１０の毒性は非常に小さく、それゆえ本明細書において開示される方法に適していることが示される。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
ＤＶとＤＶ感染症の特定の特徴は、本明細書において開示される方法のために特に有用である、このウイルスを作ってもよい。例えば、ＤＶの独自の特徴は、主要な感染症が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のヘルパー・インデューサー、ならびに細胞傷害性エフェクターのＣＴＬのＴＨ１型の応答の活性化を結果として引き起こすことである。抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞）を感染させるが、死滅させないことによって、ＤＶは、ＡＰＣにおけるＣＤ８０とＣＤ８３発現をアップレギュレートし、炎症促進性のＴＨ１サイトカインプロファイルを結果としてもたらす。主要なＤＶ感染症は、リンホカイン活性化キラー細胞と同様に活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞とともにＴＨ１型の応答を誘発する。これは、本明細書において開示される刺激された樹状細胞を活用する処置法などの、癌免疫療法に対する完全寛解の尤度を増加させることもある。
【００７１】
場合によっては、デングウイルスは、腫瘍の免疫回避メカニズムへの対抗手段をもたらす可能性がある。腫瘍の免疫回避メカニズムは、非限定的な例として、ＣＴＬの認識を妨げる腫瘍細胞上の低レベルのＭＨＣであることもあり、その対抗手段は、ＭＨＣ遺伝子発現をアップレギュレートすることによりＭＨＣレベルを上げる、高いインターフェロン−γであってもよい。腫瘍の免疫回避メカニズムはまた、非限定的な例として、ＴＣＲの結合を妨げるために腫瘍ペプチドにおける１つ以上の点変異であってもよく、その対抗手段は、異常なペプチドまたはＭＨＣを発現させる「逃れた」腫瘍細胞を標的とするために、リンホカイン活性化キラー細胞、またはサイトカインに誘発されたキラー細胞を刺激していることもある。いくつかの実施形態では、腫瘍の免疫回避メカニズムは、腫瘍血管がＣＴＬ付着、および輸送のための因子を欠くことであり、その対抗手段は、高いＴＮＦ−αが、ＰＥＣＡＭ−１を変質させることにより間隙を修復し、ＩＣＡＭ−１／ＶＣＡＭ−１の発現ならびにＰおよびＥ−セレクチンを修復することである。いくつかの実施形態では、腫瘍の免疫回避メカニズムは、ＦａｓＬがアポトーシスを引き起こすことによりＦａｓ＋ＣＴＬを死滅させることであり、その対抗手段は、高いＩＬ−６および／またはＩＬ１５が、ＦＬＩＰリガンドをアップレギュレートすることによってＦａｓ＋ＣＴＬを保護することである。いくつかの実施形態では、腫瘍の免疫回避メカニズムは、ＨＬＡ‐ＧがＮＫ細胞から保護することであり、その対抗手段は、高いＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、および／またはＩＬ１５がＮＫの活性化を高めることであってもよい。腫瘍の免疫回避メカニズムは、間質性のバリアがＣＴＬを阻害することであってもよく、その対抗手段は、高いＩＦＮ−γがマクロファージをＭ１へと活性化することであってもよい。腫瘍の免疫回避メカニズムは、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）であってもよく、その対抗手段は、ｉＮＫＴ細胞がＭＤＳＣを減少させることであってもよい。腫瘍の免疫回避メカニズムは、ＣＴＬがＴＧＦ―βによって不活性化されることであってもよく、その対抗手段は、ＴＨ１サイトカインが耐性のあるＣＴＬを再活性化することであってもよい。腫瘍の免疫回避メカニズムは、腫瘍ＰＩ−９がＣＴＬの死滅を遮ることであってもよく、その対抗手段は、高いＣＤ８＆ＩＣＡＭ−１の発現が、ＴＣＲとＭＨＣ＋自己ペプチド（ＭＨＣ＋ｓｅｌｆ−ｐｅｐｔｉｄｅ）との間の弱い相互作用を安定させることによって、低い結合活性のＣＴＬの認識および溶解を修復することであってもよい。腫瘍の免疫回避メカニズムは、制御性Ｔ細胞がＣＴＬを遮ることであってもよく、その対抗手段は、高いＣＤ４Ｈｅｌｐｅｒ細胞がＣＤ４Ｒｅｇ細胞を克服することであってもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、方法は、被験体へデングウイルスを投与することにより、被験体の免疫応答を活性化する工程、または増強する工程を含む。活発化する工程、または増強する工程は、サイトカインおよび炎症性メディエーターの発現を誘発すること、または増加させることを含んでもよい。ＤＶ感染症によって増加することもある、被験体の細胞における遺伝子の発現は、限定されないが、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ１５、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ  ＣＤ８抗原、ＩＣＯＳＬＧ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＴＲＡＩＬ、ＩＰ１０、ＧＮＬＹ、ＧＺＭＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＰアルファ１、ＨＬＡ−ＤＰベータ１、およびＺＡＰ７０を含む。
【００７３】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体へＤＶを投与する工程を含み、ここでその投与する工程は、免疫系によるＴＮＦ−αの放出を結果としてもたらす。ＴＮＦαは、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦアポトーシス誘発リガンド）を介する腫瘍細胞の直接的な死滅を含む多面的効果を有する炎症性サイトカインである。これらの遺伝子に対応するタンパク質の増大したレベルは、組織内で観察されることもあれば、同様に被験体の体液で循環していることもある。レベルは少なくとも２倍に増大することもある。レベルは２倍から１０００倍まで増大することもある。レベルは２倍から１００倍まで増大することもある。レベルは２倍から１０倍まで増大することもある。
【００７４】
いくつかの例において、ＤＶを投与することで、γδＣＴＬ、活性化されたＭ１マクロファージ、および形質細胞様のＤＣ（ｐＤＣ）を含む様々な細胞から高レベルの可溶なＴＲＡＩＬ（ｓＴＲＡＩＬ）が誘発される。いくつかの例において、ＤＶはＩＦＮβ、すなわちＩＦＮαと同じ受容体のための１０倍のより高い親和性を備えた多機能なサイトカインを活性化させる。ＩＦＮβは、ウイルスＲＮＡの転写を抑える工程において類似の抗ウイルス剤特性を有するが、腫瘍細胞内のアポトーシスの誘発におけるＩＦＮαよりもはるかに効き目がある。一酸化窒素およびＩＦＮβは、デング熱感染時に相乗的な様式で作用しうる。これらの分子は、Ｍ１マクロファージ、ｐＤＣ、およびδγＣＴＬによって誘発された高レベルのｓＴＲＡＩＬが媒介するアポトーシスに対する耐性を克服するために、ともに作用することもある。
【００７５】
被験体の免疫系を活性化する工程、または増強する工程は、被験体内に存在する細胞型を誘発するまたは増加させることを含んでもよい。これらの細胞型は、限定されないが、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋６２Ｌ−細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌｌｏ細胞、ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ８＋細胞、Ｔｉａ−１  ＣＤ８＋細胞、ＶＬＡ−４  ＣＤ８＋細胞、ＩＣＡＭ−１  ＣＤ８＋細胞およびＬＦＡ−１  ＣＤ８＋細胞を含む。
【００７６】
＜癌＞
本明細書に開示される処置薬の投与を含む癌処置のための方法が、本明細書において提供される。本明細書において記載された方法は、癌細胞を除去する工程も提供する。いくつかの例において、被験体へＤＶを投与する工程は、免疫応答を誘発する。いくつかの例において、その免疫応答は、風邪ウイルスなどの一般的なウイルスと比較して効き目がある。いくつかの例において、免疫応答は腫瘍縮小を結果としてもたらす。本明細書に開示される方法は、被験体の身体内の全ての腫瘍細胞を除去を結果としてもたらす免疫応答を誘発することができるＤＣを発現させる工程を含んでもよい。
【００７７】
ＤＮＡマイクロアレイ分析によって、遺伝学的に別個な数百の腫瘍のクローンが、進行した腫瘍を有する単一の被験体内に存在する可能性が明らかとなった。Ｏ２供給量および遺伝子突然変異率との間に負の相関のパターンが存在する。細胞障害性薬物、抗体および小分子などの大部分の薬剤は、ほぼ常に血液由来であり、ダーウィン説の選択圧（Ｄａｒｗｉｎｉａｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を処置のメカニズムを逃れる腫瘍のクローンに及ぼす。最も低い灌流量のクローンは、低い薬物曝露と、免疫系による検出を逃れる高い能力との両方を有し、これによって、クローンは既存の療法に対して耐性を付ける。癌細胞を標的とするための方法が本明細書において提供され、その方法は、癌の被験体へＤＶを投与することにより高熱を誘発する工程と、変異表現型の低流量の耐性クローンを飢えさせる工程と、より遺伝学的に安定したクローンを、活性化されたリンパ球と、免疫系の他の群とによって除去するために残す工程と、を含む。いくつかの例において、その方法は、パルスされたＤＣを投与することより、熱をＣＴＬおよびリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）の活性化と組み合わせる工程を含み、それによって、従来の癌処置（例えば抗体薬物複合体、キナーゼ阻害剤、小分子等）またはＣＴＬ単独よりも奏効率が高いという結果をもたらす。進行癌の被験体内で見られる免疫抑制は、複合かつ動的プロセスである。その免疫抑制は、腫瘍抗原自体に対する耐性を伴い、ＣＴＬによる「自己（ｓｅｌｆ）」として通常認められる。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、この耐性を弱める工程と、ＤＶ感染症が誘発する高レベルのＴＨ１サイトカインを達成する工程と、を含む。
【００７８】
本明細書において標的とされる癌は、再発性の癌、および／または難治性の癌であってもよい。いくつかの実施形態では、癌は急性の癌または慢性の癌である。いくつかの例において、癌は進行性の難治性の癌である。いくつかの例において、癌は寛解である。いくつかの例において、癌は、第１期、第２期、第３期または第４期の癌である。いくつかの実施形態では、癌は若年性の癌または成人の癌である。癌の例は、限定されないが、肉腫、細胞腫、リンパ腫、または白血病を含む。いくつかの例において、癌は固形腫瘍または脂肪肉腫である。
【００７９】
いくつかの例において、癌は肉腫である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織もしくは支持組織の癌であってもよい。いくつかの例において、肉腫は、限定されないが、骨癌、線維肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、両側性前庭神経鞘腫、骨肉腫、軟部肉腫（例えば、胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、葉状肉腫、皮膚線維肉腫、類腱腫、類上皮肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管周皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫）を含む。肉腫はユーイング肉腫を含んでもよい。
【００８０】
いくつかの例において、癌は細胞腫である。細胞腫は上皮細胞内に発生する癌であり、身体の表面を覆い、ホルモンを生成し、腺を生じさせる細胞である。非限定的な例として、細胞腫は乳癌、膵癌、肺癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、ファロピウス管の癌、頭頚部癌、胃腸の間質性の癌、腺癌、皮膚黒色腫もしくは眼球内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、頚部の癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、主要なＣＮＳのリンパ腫、脳幹神経膠腫、および脊椎軸の腫瘍を含む。いくつかの例において、癌は、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、非黒色腫、または光線（太陽）性の角化症などの皮膚癌である。いくつかの例において、癌は膀胱癌である。
【００８１】
いくつかの例において、癌は神経内分泌癌である。いくつかの例において、癌は膵癌である。いくつかの実施形態では、癌は甲状腺癌である。いくつかの例において、癌は、上皮癌、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、間質性の卵巣癌、または子宮頚癌である。いくつかの実施形態では、癌は前立腺癌である。いくつかの例において、癌は皮膚癌である。いくつかの例において、癌は新血管形成の皮膚癌（ｎｅｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｓｋｉｎ  ｃａｎｃｅｒ）である。いくつかの例において、癌は黒色腫である。いくつかの例において、癌は腎癌、または肺癌である。典型的な肺癌は、制限されることなく、小細胞肺癌または非小細胞肺癌を含む。いくつかの例において、癌は大腸癌、例えば胃癌、結腸癌である。いくつかの例において、癌は脳癌である。いくつかの例において、癌は脳腫瘍である。いくつかの例において、癌は膠芽腫または星細胞腫である。
【００８２】
いくつかの例において、癌は乳癌である。いくつかの実施形態では、乳癌は、三種陰性乳癌（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびＨｅｒ２に対して陰性）である。いくつかの実施形態では、乳癌はエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）である。
【００８３】
いくつかの例において、癌は肺癌である。いくつかの例において、肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、または中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍｉａ）である。ＮＳＣＬＣの例は、有棘細胞癌、腺癌、および大細胞癌を含む。いくつかの例において、中皮腫は、肺胞および胸腔（胸膜）の内膜、または腹部（腹膜）の内膜の癌性の腫瘍である。いくつかの例において、中皮腫はアスベスト曝露による。
【００８４】
いくつかの例において、癌は中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍である。いくつかの例において、ＣＮＳ腫瘍は、神経膠腫または非神経膠腫として分類される。いくつかの例において、神経膠腫は悪性神経膠腫、高悪性度の神経膠腫（ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ  ｇｌｉｏｍａ）、小児脳幹部グリオーマ（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐｏｎｔｉｎｅ  ｇｌｉｏｍａ）である。神経膠腫の例は、星細胞腫、乏突起膠腫（もしくは乏突起膠腫および星細胞腫（ａｓｔｏｃｙｔｏｍａ）の要素の組み合わせ）、ならびに上衣腫を含む。星細胞腫は、限定されないが、低悪性度星細胞腫、未分化星細胞腫、多形神経膠芽腫、毛様細胞性星細胞腫、多形黄色星細胞腫、および上衣下巨細胞星細胞腫を含む。乏突起膠腫は、低悪性度の乏突起膠腫（もしくは乏突起星細胞腫）、および退形成乏突起神経膠腫（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｏｇｌｉｏｍａ）を含む。非神経膠腫は、髄膜腫、下垂体腺腫、主要なＣＮＳリンパ腫、および髄芽腫を含む。いくつかの例において、癌は髄膜腫である。
【００８５】
いくつかの例において、癌は血液癌である。いくつかの例において、癌は白血病である。いくつかの例において、癌は骨髄性白血病である。いくつかの例において、癌はリンパ腫である。いくつかの例において、癌は非ホジキンリンパ腫である。いくつかの例において、癌は、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、好中球性白血病、骨髄異形成症候群、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、大細胞型リンパ腫、混合細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、再発性の小リンパ球性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、多発性骨髄腫、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、巨核芽球性白血病、単芽球性白血病、単球性白血病、赤白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ）、赤白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、および肝細胞癌から選択される。いくつかの例において、癌は血液学的悪性腫瘍である。いくつかの例において、血液学的悪性腫瘍はＢ細胞悪性腫瘍である。いくつかの例において、癌は慢性リンパ球性白血病である。いくつかの例において、癌は急性リンパ性白血病である。いくつかの例において、癌はＣＤ１９陽性のバーキットリンパ腫である。いくつかの例において、白血病は、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病または慢性骨髄性白血病である。さらなる型の白血病は、限定されないが、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄単球性白血病、および若年性の骨髄単球性白血病を含む。
【００８６】
いくつかの例において、リンパ腫はＢリンパ球またはＴリンパ球から発現する。２つの主要な型のリンパ腫は、従来よりホジキン病として公知のホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫である。いくつかの例において、非ホジキンリンパ腫は無痛性である。いくつかの例において、非ホジキンリンパ腫は高悪性である。非ホジキンリンパ腫は、限定されないが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、およびリンパ腫様肉芽腫症を含む。
【００８７】
＜投与の方法＞
本明細書に開示される細胞を投与する工程を含む、被験体の疾患を処置するための方法が本明細書において提供される。その方法はＤＣを投与する工程を含んでもよい。その方法は、ＤＣを蓄積すること、または送ることなく、ＤＣをパルスした後にＤＣを投与することを含んでもよい。その方法は、ＤＣを蓄積した後、または送った後にＤＣを投与する工程を含んでもよい。その方法は、ＤＣをパルスした後の約１時間から約２４時間後の間から選択された時点で、ＤＣを投与する工程を含んでもよい。その方法は、ＤＣをパルスした後の約１日から約３０日後の間から選択された時点で、そのＤＣを投与する工程を含んでもよい。その方法は、ＤＣをパルスした後の約１週間から約１２週間後の間から選択された時点で、そのＤＣを投与する工程を含んでもよい。
【００８８】
ＤＣが必要な被験体へＤＣを投与する工程を含む、被験体の疾患を処置するための方法が本明細書において提供される。いくつかの例において、ＤＣは溶液中に提供される。いくつかの例において、ＤＣは、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、経皮投与、静脈内（「ｉ．ｖ．」）投与、鼻腔内投与、リンパ内注射、および経口投与から選択された経路によって投与される。いくつかの実施形態では、他の形態の投与（例えば皮下注射）よりも望ましい応答を引き出す、静脈内投与が望ましい。いくつかの例では、リンパ管内へのマイクロカテーテル（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｃａｔｈｅｔｅｒ）によってＤＣが被験体に注入される。
【００８９】
本明細書に記載された方法は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与のための溶液（例えば０．９％ＮａＣＬ溶液）中で細胞を懸濁する工程、または混合する工程を含んでも良い。ｉ．ｖ．ＤＣは肺に出入りし、そのいくつかが捕らえられることもあれば、その大部分が、肝臓および脾臓の白脾髄（ｓｐｌｅｅｎ  ｗｈｉｔｅ  ｐｕｌｐｓ）のＴ細胞領域などの第２のリンパ器官まで通過し、ＣＴＬを刺激することもある。
【００９０】
いくつかの例において、デングウイルスは、樹状細胞を投与する前の少なくとも２４時間に最初に投与される。いくつかの例において、デングウイルスは、樹状細胞を投与する前の約１２時間から９６時間の間に最初に投与される。いくつかの例において、デングウイルスは、刺激された樹状細胞を投与する前の約２４時間から７２時間の間に最初に投与される。いくつかの例において、デングウイルスは、刺激された樹状細胞を投与する前の１日から４日の間に最初に投与される。いくつかの例において、デングウイルスは、一度だけ投与される。いくつかの例において、デングウイルスは二度以上投与される。いくつかの例において、デングウイルスは樹状細胞を受ける前にのみ投与される。いくつかの例において、デングウイルスは刺激された樹状細胞を受け入れた後に投与される。いくつかの例において、デングウイルスは刺激された樹状細胞を受け入れる前後に投与される。
【００９１】
図２に見られるように、その方法は、全処置が１週間以内に実施されるように、０日目に刺激されたＤＣを投与し、その後ウイルスを２回注射する工程を含んでもよい。いくつかの例において、被験体は全処置を一度だけしか受けない。いくつかの実施形態では、全処置は一回を超えて繰り返されることはない。いくつかの実施形態では、全処置は二回を超えて繰り返されることはない。いくつかの実施形態では、全処置は三回を超えて繰り返されることはない。いくつかの実施形態では、全処置は十回を超えて繰り返されることはない。
【００９２】
いくつかの例において、その方法は、１０６ｐｆｕ／ｍｌの約０．５ｍｌの投与量でデングウイルスを投与する工程を含む。いくつかの例において、その投与量は約１０３ｐｆｕ／ｍｌから約１０８ｐｆｕ／ｍｌの間である。いくつかの例において、その投与量は約１０３ｐｆｕ／ｍｌから約１０６ｐｆｕ／ｍｌの間である。
【００９３】
いくつかの例において、デングウイルスでの被験体の感染または接種の成功は、高熱または熱が進行することによって確認される。いくつかの例において、デングウイルスを有する被験体の成功した感染または接種は、被験体の血液／血漿内の循環しているサイトカインの存在または増加によって確認される。サイトカインは、限定されないが、インターロイキン２およびインターフェロンガンマを含んでもよい。
【００９４】
いくつかの例において、本明細書に記載された方法は刺激された樹状細胞が必要な被験体へ、刺激された樹状細胞を一度だけ投与する工程を含む。いくつかの例において、刺激された樹状細胞は二度以上投与される。いくつかの例において、刺激された樹状細胞は第１の時間および第２の時間に投与され、ここで第１の時間と第２の時間の間は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約８日、約１０日、約１２日、または約１８日空けられる。いくつかの例において、第１の時間と第２の時間の間は、約１週、約２週、約３週、または約１か月空けられる。いくつかの例において、第１の時間と第２の時間の間は、１か月以上空けられる。いくつかの例において、第１の時間と第２の時間の間は、１２か月未満空けられる。いくつかの例において、第１の時間と第２の時間の間は、１２か月を超えて空けられる。
【００９５】
いくつかの例において、本明細書に記載された方法は、被験体が高熱であるときに、被験体へ刺激された樹状細胞を投与する工程を提供する。いくつかの例において、刺激された樹状細胞は、被験体の熱が急上昇した後に投与される。いくつかの例において、被験体の体温が約３７．５℃から約４２℃の間の体温まで上昇した後、刺激された樹状細胞は投与される。いくつかの例において、被験体の体温が約３８℃から約４２℃の間の体温まで上昇した後、刺激された樹状細胞は投与される。いくつかの例において、被験体の体温が少なくとも約３８．５℃まで上昇した後、刺激された樹状細胞は投与される。いくつかの例において、被験体の体温が約３８．５℃まで上昇した後、刺激された樹状細胞は投与される。いくつかの例において、被験体の体温が摂氏３８度以上を到達した後、刺激された樹状細胞は被験体に投与される。いくつかの例において、被験体の体温は、鼓膜による方法または口による方法によって測定される。
【００９６】
本明細書に記載された刺激されたＤＣを生成するための方法は、インビトロでＴ細胞を活性化する工程を含んでもよく、そのＤＣは、本明細書に開示されるその方法によって生成される。いくつかの例において、被験体は効果的な免疫応答を増加させることができない。例えば、被験体は免疫無防備状態であることもある。被験体は、免疫無防備状態になる処置法を受けてきた可能性がある。被験体は、免疫無防備状態になる疾患を有することもある。この場合、その方法は、ＨＬＡ適合の被験体からのＴ細胞を、ＤＣと接触させる工程を含んでもよい。Ｔ細胞をＤＣとインビトロで接触させる工程は、ＣＴＬ応答を誘発することもある。Ｔ細胞をＤＣとインビトロで接触させる工程は、Ｔ細胞の増殖も誘発することもある。
【実施例】
【００９７】
実施例１．マウス樹状細胞（ＤＣ）の生成およびパルス
Ｌｕｔｚ  Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２３：７７−９２，１９９９）によって記載されたような方法を、マウス骨髄から成熟したＤＣを生成するために利用した。骨髄の懸濁液は、１０日間にわたって、組換えマウスＧＭ−ＣＳＦで補われた培地内で、ペトリ皿においてインキュベートした。非付着性細胞を採取し、遠心分離機にかけ、ＧＭ−ＣＳＦおよびリポ多糖を含んでいる培地内で再懸濁した。２日後にＤＣを採取し、それらの増殖力をトリパンブルー色素排除によって測定した。ＤＣの純度をフローサイトメトリー分析によって測定した。ＤＣを、１８時間にわたって１０μｇ／ｍｌの合成ペプチドとともにパルスした。１８時間のインキュベーション後、ＤＣを採取し、ＨＢＳＳ内で２回洗浄し、そして付加的な研究のためのＨＥＳＳにおいて再懸濁した（実施例２および３を参照）。
【００９８】
実施例２．第１のマウスモデルにおける黒色腫を処置するためのデングウイルスおよび樹状細胞
マウスモデルアッセイを実施し、デングウイルス（ＤＶ）株、および腫瘍抗原の刺激された樹状細胞（ＤＣ）を使用して、癌細胞の併用標的化に起因する結果を観察した。ＤＶ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、尾の付け根への注射によって、１×１０６または１×１０７ｐｆｕ／ｍｌで、０．０５ｍｌのデングウイルス（ＤＥＮ−２株＃１７１０）を接種させた。組換えマウスＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）およびＩＦＮ−ガンマ（Ｓｉｇｍａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、デングウイルス（Ｄｒ．Ｄｕａｎｅ  Ｇｕｂｌｅｒによって提供されたＤＥＮ−２株＃１７１０、ＣＤＣデータベースエントリー番号５５５）の投与後の５、１０、１５、および２０日目に、２，０００（ｒＩＬ−２）および５００  １Ｕ（ｒＩＦＮ−ガンマ）で、静脈注入によって投与した。デングウイルスを投与した７日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２つのペプチドとともに別々にインキュベートしたマウスＤＣで免疫を与え、それを静脈内に注射した。ペプチドを合成した。オボアルブミン（ＯＶＡ−８）、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）からのＨ−２ｂ−拘束性ペプチドを対照として使用した。マウスＤＣをパルスするために、抗原ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７（ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））、およびＴＲＰ−１／７５（ＴＡＹＲＹＨＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２））に由来するＢ１６黒色腫関連Ｈ−２ｂ−拘束性ペプチドを使用した（詳細に関しては実施例１を参照）。ＤＣを用いる２回のさらなる免疫化を、１４日の間隔で実施した。最後のＤＣ注入の３日後、マウスを側方の尾静脈に５×１０４の生存可能なＢ１６黒色腫細胞で負荷を与え、その後生存を観察し、腫瘍注射の後に、経時的に（数日）生存した動物のパーセンテージとして記録した。データを５以上のマウス／群から記録した（表２および図３を参照）。
【００９９】
【表２】
2018535191.tif 000004
【０１００】
群２（デングウイルス血清型２株＃１７１０および腫瘍ペプチドの刺激されたＤＣ）の投与されたマウスにおいて観察された肺転移の数は、デングウイルスなしの腫瘍ペプチドの刺激されたＤＣが投与された群１における対照のマウスよりも７．５％低かった。
【０１０１】
実施例３．第２のマウスモデルにおける黒色腫を処置するためのデングウイルスおよび樹状細胞
マウスモデルアッセイを実施し、デングウイルス（ＤＶ）株、および腫瘍抗原の刺激された樹状細胞（ＤＣ）を使用する、癌細胞の組み合わせ標的化に起因する結果を観察した。ヒトにおいて観察されたＤＶに対する応答に応じてサイトカインを、マウスに投与した。
【０１０２】
Ｈ−２ｂ−拘束性Ｂ１６マウス黒色腫細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−６３２２）を使用して、腫瘍をマウス内で株化した。樹状細胞をパルスするために使用されるペプチド（抗原ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７およびＴＲＰ−１／ｇｐ７５に由来したＢ１６黒色腫関連Ｈ−２ｂ−拘束性ペプチド）を合成した。樹状細胞は、Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２３：７７−９２，１９９９）に記載されるような方法にかかるマウス骨髄から生成された。
【０１０３】
０日目には、転移性肺腫瘍を株化するために、マウスは、側方の尾静脈中に、５×１０４の生存可能なＢ１６黒色腫細胞を受けた。７日目には、尾の付け根へ注射することによって、１×１０６あるいは１×１０７ｐｆｕ／ｍｌで、０．０５ｍｌのデングウイルス（ＤＥＮ−２株＃１７１０、ＣＤＣデータベースエントリーＮｏ．５５５）を、マウスに接種させた。デングウイルス（ＤＥＮ−２株＃１７１０）の投与後に、組換えマウスＩＬ−２（ジェンザイム）およびＩＦＮ−ガンマ（シグマ・ファーマシューティカルズ）を、５日間の間隔で、２，０００  １Ｕ（ｒＩＬ−２）および５００  １Ｕ（ｒＩＦＮ−ガンマ）で、静脈注射によって投与した。２１、３５および４９日目には、マウスＤＣを２つのペプチドを用いて別々にインキュベートし、そして同じ日に２連続投与で静脈内に注射し、被験体における投与の手段およびスケジュールを一致させた（付加的な詳細に関しては実施例２を参照）。マウスの対照群には、デングウイルスまたはオボアルブミン（ＯＶＡ−８）、ＳＩＩＮＦＫＥＬからのＨ−２ｂ−拘束性ペプチドを用いてパルスされた樹状細胞を受けさせなかった。処置と対照群を表３に示す。
【０１０４】
【表３】
2018535191.tif 000005
【０１０５】
９０日目には動物を屠殺し、肺腫瘍のコロニーを数えた。Ｆｅｋｅｔｔｅ溶液（Ｆｅｋｅｔｔｅ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を肺に注入し固定した後に、転移性肺腫瘍を盲検コード式で数え上げた。データを、転移の平均数として報告した；４マウス／群（表４および図４を参照）。以下の主な臓器系の病理組織診断を実行した：脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓および生殖腺（データは示されていない）。
【０１０６】
【表４】
2018535191.tif 000006
【０１０７】
群Ｃ（ウイルス無しで、腫瘍抗原で刺激されたＤＣが投与された）のマウスにおいて観察された肺転移の数は、対照群Ｄ（ＤＥＮＶ−２＃１７１０、および対照ペプチドに露出されたＤＣが投与された）よりも４７％少なかった。群Ａ（ＤＥＮＶ−２＃１７１０、および腫瘍抗原で刺激されたＤＣが投与された）のマウスにおいて観察された肺転移の数は、対照群Ｄ（ＤＥＮＶ−２＃１７１０、および対照ペプチドに露出されたＤＣが投与された）よりも５４％少なかった。群Ｂ（ＤＥＮＶ−２＃１７１０、および腫瘍抗原で刺激されたＤＣが投与された）のマウスにおいて観察された肺転移の数は、対照群Ｄ（ＤＥＮＶ−２＃１７１０、および対照ペプチドに露出されたＤＣが投与された）よりも５１％少なかった。群Ｄと比較された群Ａおよび群Ｂの平均減少は、５２．８％であった。
【０１０８】
実施例４．それほど病原性でないデングウイルスの製造およびスクリーニング
Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓細胞）由来の検証且つ認証された細胞株を持つＭａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋを設け、汚染物質と外来性の生体の不在について試験した。Ｖｅｒｏ株は、様々なウイルス性ワクチンを産生するために世界保健機関により使用されている。ＦＤＡ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（ＣＢＥＲ）により確立されたガイドラインに従い、デングウイルスを、Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ由来の検証されたＶｅｒｏ株において継代させ、ワーキングセルバンク（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）として確立させた。最初の原種からの２つのデング２型ウイルス株（ＤＮＶ−２ ＃１５８４およびＤＥＮＶ−２ ＃１７１０）を、１０−５のＭＯＩでＷＣＢのＶｅｒｏ細胞に加えた。
【０１０９】
１リットル当たり、栄養培地（０．１６５％のラクトアルブミン加水分解物［Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， Ｍｉｃｈ．］）中の１％のＳｅａＫｅｍ ＬＥアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， Ｍａｉｎｅ）、０．０３３％の酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］、アール平衡塩類溶液、２５ｍｇの硫酸ゲンタマイシン［ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．］および１．０ｍｇのアムホテリシンＢ［Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ；Ｅ． Ｒ． Ｓｑｕｉｂｂ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， Ｎ．Ｊ．］および２％のＦＢＳを含有している、第１の４ｍｌの重層培地を、３７℃で１．５時間、２００ｍｌのウイルス接種材料の吸着後に加えた。７日間３７℃でのインキュベーション後、１ｍｌ当たり追加の８０ｍｇのニュートラルレッド生体染色（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄ．）を含有している第２の２ｍｌの重層培地を加えた。プラークを感染の８〜１１日後に数えた。
【０１１０】
最終的なウイルス培養物に関するプラークアッセイを行った。プラークアッセイから推定されるように、ＤＮＶ−２ ＃１５８４の力価は、約５Ｅ＋０６ ＰＦＵ／ｍｌであり、ＤＥＮＶ−２ ＃１７１０の力価は、３．５Ｅ＋０６ ｐｆｕ／ｍＬであった。ＡＴＣＣからのデング２型ウイルス（ＤＮＶ−２；＃１５８４）は、感染の５日後にＶｅｒｏ細胞において明らかな細胞変性効果を示したが、Ｖｅｒｏ細胞は、盲継代＃２（＃１７１０ウイルス）の感染の１１日後に形態変化を有するように見える（データは示されず）。アッセイは、ＤＥＮＶ−２ ＃１７１０ウイルスが、ＤＮＶ−２ ＃１５８４株よりはるかに細胞変性が少ないことを示している。
【０１１１】
実施例５．ＤＶを用いる及び用いないパルスＤＣとの癌細胞死滅アッセイ
対照群において、正常なヒト腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、ヒト黒色腫ＦＥＭＸ細胞に直接適用した。Ｔ細胞受容体を、ＨＬＡ Ａ２．１＋を介してＦＥＭＸ黒色腫細胞株に一致させた。処置群において、ヒトＴＩＬを、インターフェロン担体およびインターロイキンを含有しているＤＶの上清に暴露した。暴露したＴＩＬ＋ＤＶの上清を、ＦＥＭＸ腫瘍細胞を用いて培養液に入れた。両方の群を、５対１のＴ細胞対腫瘍細胞（１００，０００対２０，０００の細胞）の比率で４時間癌細胞を死滅させたままにした。その後、残存した腫瘍細胞を、フローサイトメトリーによって開始細胞の％として数えた。表５に示される結果は、ＤＶがパルスＤＣ抗癌応答を超えて３５％の追加の癌細胞死滅を誘発することを実証している。
【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
実施例６．黒色腫溶解物抗原を用いるヒト樹状細胞の単離およびパルス
以下の例は、純粋な、単離されたＣＤ１４＋単球からの高レベルのヒトＩＬ−１２ｐ７０を発現する高純度のＣＤ１１ａ＋成熟ＤＣ集団の生成に加えて、黒色腫細胞溶解物でのＤＣのプライミングも実証しており、その全プロセスは１週間未満で完了する。細胞を、硬質プラスチックプレート上で培養し、軟質プラスチックバッグには暴露しなかった。
【０１１４】
ＣＤ１４＋単球を、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ４５および７ＡＡＤの発現のために単離して分析した。プロディジー（ｐｒｏｄｉｇｙ）にかけた後、入力細胞の９０．２５％はＣＤ１４＋であった（図５を参照）。ＣＤ１４＋細胞を、プレーティングの２４時間後にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で処理して、未熟な樹状細胞を生成した。
【０１１５】
ＡＴＣＣからのＲＰＭＩ−７９５１黒色腫細胞は、プロディジーにかけた日に到着し、それらを、再懸濁し、数え、蒔いた。黒色腫細胞を、その後、次亜塩素酸カルシウム溶液で処理した。代替的に、細胞を亜塩素酸ナトリウム溶液で処理した。黒色腫細胞溶解物を未熟なＤＣに加え、成熟化剤ＩＦＮガンマ（１０００Ｕ／ｍＬ）、Ｒ８４８（５μｇ／ｍＬ）およびＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）を加えた。
【０１１６】
成熟ＤＣからの上清を、黒色腫細胞溶解物でのパルスの２２時間後に及び成熟化剤の追加の１８時間後にマイコプラズマおよびエンドトキシンのために収集して検査した。病原菌は観察されなかった。ＤＣ培地からの上清を使用して、ＩＬ−１２ｐ７０レベルを測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実行した。ＩＬ−１２ｐ７０の濃度は、４−６ｎｇ／ｍＬの業界基準とは対照的に、細胞の第１のバッチにおいて１９＋／−４ｎｇ／ｍＬであった。同じプロトコルによって産生された細胞の様々なバッチは、１５−２３ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０の濃度を示した。生存率アッセイを実行し、（７０％を示したコンパレータと比較して）細胞が凍結され、融解され、および培養された後に平均生存度が７９．２％で記録された。図６は、幾つかのコンパレータの産生に対するＤＣ ＩＬ−１２ｐ７０産生を示す（図６のサンプル１を参照）。これらのコンパレータ方法は、細胞を軟質プラスチックバッグに暴露する工程、亜塩素酸塩溶液以外の溶液で細胞を溶解する工程を含み、成熟細胞に対してＬＰＳ、ＩＦＮガンマおよびＲ８４８の組み合わせを使用しない。
【０１１７】
細胞は、さらに凍結し、その後、４℃で融解して、凍結および融解後の細胞数および生存度を試験した。これらを、融解開始後およそ１６時間  １８時間  ２０時間および２２時間で測定した。結果は表６を参照されたい。非パルスＤＣの追加の産物を、凍結保存研究において試験し、７０％を超える生存度を示した。凍結保存前の生存度は８５−８９％で変動した。
【０１１８】
【表６】
2018535191.tif 000008
【０１１９】
これらの遅い融解（表６に示される１６時間〜２２時間）から急速な融解（約３０秒から約５分の間の３７℃の水浴）への切り換えは、７１−７９％の生存度を結果としてもたらした。パルスされていない細胞を、凍結保存研究に使用した。生存度は７１．４％から７９．２％までで変動した。
【０１２０】
実施例７：デングウイルスを用いるヒト白血球におけるサイトカインの誘発
単球、樹状細胞およびＴリンパ球を含む、ヒト白血球（ＷＢＣ）を、時間＝０での３つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）、０．１のＭＯＩ、０．５のＭＯＩおよび２のＭＯＩで、偽ウイルスまたはデングウイルスのいずれかに感染させた。様々なサイトカインのレベル（ｐｇ／ｍＬ）を、感染の４８時間、７２時間および９６時間後に測定した。処理を３回繰り返した。結果は、表７−９に各時点に対して示される（Ｍ＝偽。０．１、０．５および２はＭＯＩである）。評価されたＭＯＩでの偽ウイルスとデング熱ウイルスとの間の変化の３回の平均を計算し、表１０においてパーセンテージとして示す。
【０１２１】
【表７−１】
2018535191.tif 000009
【０１２２】
【表７−２】
2018535191.tif 000010
【０１２３】
【表８−１】
2018535191.tif 000011
【０１２４】
【表８−２】
2018535191.tif 000012
【０１２５】
【表９−１】
2018535191.tif 000013
【０１２６】
【表９−２】
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【０１２７】
【表１０−１】
2018535191.tif 000015
【０１２８】
【表１０−２】
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【０１２９】
実施例８：
追加のウイルス製造プロトコル
実施例４の方法に加えて、ＶｅｒｏおよびＦＲｈＬの細胞の両方を、それぞれ、盲継代 ＃２、ＤＥＮＶ−２ ＃１７１０およびＤＮＶ−２ ＃１５８４からの上清の希釈液を使用して感染させる。検出感度を増大させるために、蛍光免疫染色を、盲継代＃２からの上清で感染させられた細胞においてウイルスを検出するように開発する。
【０１３０】
必要な場合に、超遠心分離を使用して、ウイルスを濃縮する。ウイルス力価の確認後、最終生成物を、濾過して細胞残屑を取り除き、外来性の生体の不在について評価し、最終ロット（ｌｏｔ）が放出されると、５ｍｌのボトルに詰め、配送および投与の準備ができるまで４℃で保管する。
【０１３１】
実施例９：ドナーからのＰＢＭＣの収集
ドナー（自己由来またはＨＬＡ適合の同種異系のいずれか）は、訓練された人員および適切な設備を備えた施設で実行される白血球除去の処置を受ける。白血球除去が完了した後、赤血球、血小板、および血漿タンパク質をドナーに戻す。アフェレーシス産物を、細菌汚染の有無を確認するために現場で評価する（グラム染色試験およびＬｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂａ Ｌｙｓｉｓ［ＬＡＬ］）。継代後、（小さな試験サンプル容器が付けられた）回収容器に、ドナー特異的な情報とともにバーコードを付け、それを、非感染性の生体物質の保管および配送のためのＦＤＡおよびＤＯＴ両方の規制に準拠する承認された配送用容器に入れる。配送用容器を、冷却要素（例えば、固体のＣＯ２、液体のＮ２）とともにパッケージ化し、温度をモニタリングする。配送用容器は硬質プラスチックフラスコである。配達人が、２４時間以内に容器をＧＭＰ製造設備へと運ぶ。
【０１３２】
実施例１０：腫瘍抗原でパルスされた樹状細胞の製造および使用
単球を、他の収集した白血球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好酸球および好塩基球）から分離する。これは、免疫磁気選別、または代替的に付着特性によって達成される。免疫磁気選別は、免疫細胞のＣＤ表面タンパク質：（ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ５６など）に対する抗体でコーティングされたプラスチックビーズを有する滅菌プラスチックカラムに白血球を注ぐことを含む。
【０１３３】
免疫磁気選別の一例は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂ．Ｃ， Ｃａｎａｄａ， ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ）から入手可能なＥａｓｙＳｅｐ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキットである。ＥａｓｙＳｅｐキットを使用するために、アフェレーシス産物を、滅菌したＰＢＳ中に懸濁し、ヒトＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１２３、およびグリコホリンＡに対するマウス抗体との四量体抗体の複合体を含んでいるＥａｓｙＳｅｐプラスチックカラムに注ぐ。１０分間のインキュベーション後、ＥａｓｙＳｅｐ磁性粒子を加える。ビーズに付着する細胞を電磁石選別から除外した。磁石を反転させ、望ましい細胞画分（単球）を、追加の処理のために滅菌したポリスチレンフラスコに注ぐ。代替的に、陽性の付着選別アッセイにおいて、ＣＤ１＋／ＣＤ１４＋抗体でコーティングされた磁気ビーズを単球と混合し、磁石をカラムに置き、非結合細胞をＰＢＳ溶液でカラムから流し出す。単球を、その後、ビーズから洗い流す。陽性の付着選別において、特定の表面に付く単球の特性を使用して、傾斜させたカラムの下にアフェレーシス産物を流すことによって単球を分離する。
【０１３４】
代替的に、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対するモノクローナル抗体での蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、リンパ球およびＭＨＣクラス陽性細胞のために骨髄細胞を枯渇させる。残りの細胞を、ヒトＡＢ血清を補足した基底細胞培地において５％のＣＯ２雰囲気下での３７℃で一晩培養する。ヒトＡＢ血清が、他の血清型より速い速度で細胞を成長させることが要因で選択され、無血清培地が、はるかにより低いＴ細胞刺激能を有するＤＣを産生する。２４時間後、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および９００Ｕ／ｍｌでの組換え型ＩＬ−４の存在下で、細胞を再播種して培養する。３〜４日後、培地を新鮮なサイトカイン培地と交換される。
【０１３５】
代替的に、真皮樹状細胞（ＤＤＣ）を、以下の方法を使用して調製する：健康なヒトボランティアからの角膜片（Ｋｅｒａｔｏｍｅｓ）を、３７℃で１時間の間、ＲＰＭＩ１６４０において１．２Ｕ／ｍｌの終末濃度で細菌プロテアーゼであるディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ）２型の溶液中でインキュベートする。インキュベーション期間後、上皮と真皮は簡単に分離する。上皮と真皮のシートを、その後、ＰＢＳで数回洗浄した後に小片（１−１０ｍｍ）に切り、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したＲＰＭＩ１６４０に入れ、１０ｃｍの組織培養プレートに置く。２−３日後、組織片を取り除き、培地を収集する。組織切片から培地へと遊走する細胞を、遠心沈殿させ、１−２ｍｌの新鮮な培地中で再懸濁し、トリパンブルーで染色する。さらなる富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を、メトリザミド勾配上での分離によって達成する。細胞を、高張の１４．５％のメトリザミドの３ｍｌのカラム上へと層状にし、室温で１０分間６５０ｇで沈降させる。低密度の間期細胞を収集し、それほど高張でない洗浄剤（１０％のＦＢＳと４０ｍＭのＮａＣｌを有するＲＰＭＩ１６４０）中で２回連続して洗浄し、細胞を等張性に戻す。
【０１３６】
単球は、収集されたときに、数が数千にしかならない場合もある。ＤＣの数を５０００万の範囲まで拡大させるために、組換え型ヒト成長因子ｒｈｕインターロイキン−４（ＩＬ−４）、およびｒｈｕ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を、複数工程のプロトコルにおいて使用する。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの追加後、細胞を、成熟ＤＣマーカー：（ＣＤ１１＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８３＋）の数の拡大および発達の他に、（ＣＤ８＋に対するショートペプチドの提示のための）クラスＩ、および（ＣＤ４＋ヘルパー・インデューサーＴリンパ球に対するより長いペプチドの提示のための）クラスＩＩのＭＨＣ複合体両方の発現の増加に関しても評価する。およそ３−４日後、成熟ＤＣの数を測定する。例えば、単球に富んだ画分を、ＮｕｃｌｏｎでコーティングしたＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れ、ＧＭＰ−２％のヒトＡＢ血清、５００ＩＵ／ｍｌ（約５０ｎｇ／ｍｌ）のｒｈｕＩＬ−４（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、５００ＩＵ／ｍｌ（約５０ｎｇ／ｍｌ）のｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を補足した、無血清ＤＣの培地（ＣｅｌｌＧｒｏ，Ｉｎｃ．）を、最初の２４時間後に加える。最終生産物は総培地量のおよそ約１Ｌである。約７２時間の培養後に、未熟ＤＣの集団を、以下のマーカー：ＣＤ１＋ＣＤ１１＋ＣＤ１４＋に関して評価する。
【０１３７】
実施例１１：樹状細胞のパルス
様々な腫瘍抗原源を以下の高品質のＤＣに使用する：ペプチド、自己腫瘍からの溶解物、腫瘍細胞全体、および特定の腫瘍抗原をコードするＲＮＡ。白血病細胞またはリンパ腫細胞を含有している切除生検または血液サンプルを、手術または採血によって得て、その後、磁気選別により白血病細胞／リンパ腫細胞を得る。腫瘍細胞は、一旦得られると、バーコードを付けられ、前にアフェレーシスに関して記載された容器に類似した承認された容器でＧＭＰ設備に配送される。サンプルは、細菌汚染試験に通った後に−７０℃で凍結されてもよい。
【０１３８】
自己腫瘍細胞溶解物全体を、幾つかの方法によって調製する。溶解物を調製するために、腫瘍サンプルは、水浴または他の手順を使用して、およそ３５℃に再び温められてもよい。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステムのような自動細胞処理装置の開発によって、サンプルを手動で刻み、ＰＢＳ溶液中で懸濁させることが可能となり、次いで予め選択された組織特異的なソフトウェアにより制御されるローターシステムが腫瘍細胞を分離する。細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離装置（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ）に移す前に酵素混合物に加える。単個細胞浮遊液は、次亜塩素酸塩溶液を使用して、腫瘍ペプチドに対する最小の損傷で膜溶解され得、これによって、あらゆる残存する腫瘍細胞を死滅させ、ｄＴＨ２サイトカインを中和し、優れたＣＴＬ親和性、結合活性および活性化のために免疫原性を増大させる。次亜塩素酸塩を加えた後に、培養プレートを、１時間、摂氏３７度、５％のＣＯ２でインキュベートし、３０分で軽く手で撹拌して、次亜塩素酸塩を分散させる。細胞を、２回洗浄して、（例えばＨＢＳＳで）溶解反応物を中和する。次亜塩素酸塩で処理した細胞は、続く凍結融解サイクルにさらされてもよい。代替的に、サンプルは腫瘍細胞を分離しない。代わりに、サンプルは、腫瘍細胞および支持細胞（例えば、腫瘍微小環境からの細胞）を含んだままにされる。ＣＴＬ誘発に必要とされるペプチドを破壊することなく、細胞を次亜塩素酸カルシウムで溶解して、赤血球を除去し、アポトーシス小体および壊死体を産生する。
【０１３９】
ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳからの溶解物を、未熟ＤＣの産生の３日目に加える。未熟ＤＣを、約１６時間腫瘍溶解物とともに共培養する。最終の工程は、炎症シグナルによる成熟である。臨床グレードＬＰＳ（６０ＥＵ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、およびインターフェロンガンマ（２０００ＩＵ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、フラスコに加え、約１２時間インキュベートして、パルスＤＣを成熟させる。ＬＰＳへの暴露後、ＤＣをＣＤ８０／ＣＤ８３＋活性化マーカーのアップレギュレーション、およびＩＬ−１２ｐ７０の産生の増加に関して評価する。プロセスにおいて、この段階での試験には、無菌性（前に記載された通り）、生存度（トリパンブルー色素排除による％生細胞）、および特異性（ＣＤ１１ｃフローサイトメトリーにより測定された％ＤＣ）が含まれる。
【０１４０】
最終的な無菌性、特異性、および生存度の評価後、ＤＣを、液体Ｎ２中の−７０℃での凍結、最大１年の保管、および使用のための診療所への配送に適した、硬質プラスチック容器に移す。容器を、冷たい状態で一晩配送し、その後、温水槽中で３７℃に再び温め、３０分にわたって同時に０．９％のＮａＣＬ溶液での静脈内投与を行う。ＤＣを静脈内に投与する。
【０１４１】
実施例１２：癌の処置のための併用送達
デングウイルスの投与は、他のウイルス性ワクチン注射の投与に類似している。被験体の肩（三角筋）領域における皮膚の領域を、アルコールで清潔にし、その後、０．５ｍｌのウイルスを皮膚下に注入して、蚊咬傷を模倣する。ＤＶ注入の２−３日後に、被験体は、熱が３８．５℃に達すると、リンパ内マイクロカテーテルによってパルス（刺激された）樹状細胞を注入される。被験体が疾患に対して陰性になるまで、注入を繰り返す。ＤＣ融合には、実施例６で製造された細胞を使用する。
【０１４２】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、記載されているが、このような実施形態がほんの一例として提供されることは、当業者に明白となる。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者によって想到される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲内の方法および構造並びにそれらの同等物が、それによって包含されることが意図されている。
【図１】
2018535191.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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