(57)【要約】本発明の様々な態様及び実施形態は、ＩＶ型コラーゲンα５線維由来のペプチド医薬組成物、及び薬物治療におけるその使用法に関与する。ペプチドはα５β１及びαＶβ３インテグリンを標的とし、複数の受容体を通してシグナル伝達を阻害し、血管透過性、血管新生、リンパ管新の阻害を目的とする使用法を呈示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチド、またはその誘導体の効果的容量を、治療が必要な患者に投与することを含む、微小血管漏出を治療または予防する方法。
【請求項２】
前記誘導体が配列番号７〜３１のいずれか１つのペプチドである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記患者がインフルエンザに罹患しているか、または罹患しているリスクを有する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、インフルエンザの最初の症状から３日以内に最初に投与される、請求項３に記載の前記方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、インフルエンザの最初の症状の後に最初に投与される、請求項３に記載の前記方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、インフルエンザの最初の症状の前に最初に投与される、請求項３に記載の前記方法。
【請求項７】
前記ペプチドが肺の中の浮腫を低減する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項８】
前記ペプチドが１日に１〜５回投与される、請求項７に記載の前記方法。
【請求項９】
前記ペプチドが前記肺に局所的に投与される、請求項７に記載の前記方法。
【請求項１０】
前記患者が少なくとも１つの抗ウイルス剤及び／または抗炎症剤を使用した治療を受けている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１１】
血管新生または微小血管漏出の調節不全に関連し、選択的にＭＳまたはＰＤである神経病変を有する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項１２】
患者がアルツハイマー病に罹患しているか、またはアルツハイマー病に罹患しているリスクが確認され、前記ペプチドが血液脳関門の健全性を保持し、アルツハイマー病の発症または進行を遅らせるまたは予防する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項１３】
前記患者がアルツハイマー病の治療を目的とする少なくとも１つの追加の薬剤を用いた治療を受けている、請求項１２に記載の前記方法。
【請求項１４】
前記ペプチドが１日に１〜５回投与される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１５】
前記患者が出血熱に罹患しているか、または罹患しているリスクを有する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項１６】
前記患者がエボラウイルスを有する、請求項１５に記載の前記方法。
【請求項１７】
前記患者が少なくとも１つの出血熱の治療用の抗ウイルス剤を使用して治療を受けている、請求項１５に記載の前記方法。
【請求項１８】
前記ペプチドが１日に１〜５回投与される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１９】
前記患者が脳性マラリアに罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドが脳性マラリアに関連する脳浮腫及び／または虚血を低減する、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２１】
前記患者が抗マラリア薬治療を受けている、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２２】
前記ペプチドが脳性マラリア患者の血液脳関門及び血管の健全性を保持する、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２３】
前記ペプチドが１日に１〜５回投与される、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２４】
免疫チェックポイント阻害薬治療を受けている、または準備をしているがん患者に配列番号１〜６のいずれか１つの前記アミノ酸配列を有するペプチド、またはその誘導体の効果的容量を投与することを含む、がんを治療する方法。
【請求項２５】
前記誘導体が配列番号７〜３１のいずれか１つのペプチドである、請求項２４に記載の前記方法。
【請求項２６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項２４に記載の前記方法。
【請求項２７】
前記がんが非小細胞肺がん、メラノーマ、前立腺がん、転移性腎細胞がんから選択される、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２８】
前記がんがＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４に対して陽性である、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２９】
前記チェックポイント阻害薬治療は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４及びＢ７の間の相互関係を阻害する薬剤である、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３０】
インテグリンを標的とするＰＬＧＡ−ＰＥＧ共重合体及びコンジュゲートされたペプチドを含む、ナノ粒子。
【請求項３１】
前記ペプチドが配列番号１〜６のいずれか１つの前記アミノ酸配列、またはその誘導体を含む、請求項３０に記載の前記ナノ粒子。
【請求項３２】
前記誘導体が配列番号７〜３１のいずれか１つのペプチドである、請求項３１に記載の前記方法。
【請求項３３】
前記ナノ粒子がＰＬＧＡ−ＰＥＧペプチドコンジュゲートから形成される、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の前記ナノ粒子。
【請求項３４】
前記ナノ粒子が血管新生及び／またはリンパ管新生の阻害に対して効果的である、請求項３３に記載の前記ナノ粒子。
【請求項３５】
前記高分子の少なくとも５０％はコンジュゲートされたペプチドを有する、請求項３３に記載の前記ナノ粒子。
【請求項３６】
封入された活性剤をさらに含む、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の前記ナノ粒子。
【請求項３７】
前記ナノ粒子が前記活性剤の徐放を提供する、請求項３６に記載の前記ナノ粒子。
【請求項３８】
前記活性剤が化学療法剤である、請求項３６または３７に記載の前記ナノ粒子。
【請求項３９】
前記活性剤がペプチド薬剤、または標的抗がん薬治療である、請求項３６または３７に記載のナノ粒子。
【請求項４０】
約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲内の平均経を有する、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の前記ナノ粒子。
【請求項４１】
前記ナノ粒子がその表面にコンジュゲートされた追加の薬物または標的薬剤を含有する、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の前記ナノ粒子。
【請求項４２】
前記ナノ粒子が−１０〜−４０ｍＶの範囲内のゼータ電位を有する、請求項４０に記載の前記ナノ粒子。
【請求項４３】
前記ナノ粒子が球状である、請求項３０〜４２のいずれか１項に記載の前記ナノ粒子。
【請求項４４】
前記粒子が非球状である、請求項３０〜４２のいずれか１項に記載の前記ナノ粒子。
【請求項４５】
前記ナノ粒子または微粒子が長時間有効デポ剤を提供する、配列番号１〜６のいずれか１つのペプチドまたはその誘導体を封入する微粒子。
【請求項４６】
前記誘導体が配列番号７〜３１のいずれか１つのペプチドである、請求項４５に記載の前記微粒子。
【請求項４７】
前記粒子高分子がＰＬＧＡ−ＰＥＧ高分子のみから実質的になる、請求項４５または４６に記載の前記微粒子。
【請求項４８】
前記粒子が１週間に１回以下または１ヶ月に１回以下で投与される、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の前記微粒子。
【請求項４９】
前記微粒子が約１μｍ〜約１００μｍの範囲内の平均径を有する、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の前記微粒子。
【請求項５０】
前記粒子が球状である、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の前記微粒子。
【請求項５１】
前記粒子がだ円である、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の前記微粒子。
【請求項５２】
請求項３０〜５１のいずれか１項に記載のナノ粒子または微粒子の投与を含む、加齢性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞または糖尿病性網膜症を治療する方法。
【請求項５３】
前記ナノ粒子または微粒子を眼内注入によって投与する、請求項５２に記載の前記方法。
【請求項５４】
前記ナノ粒子または微粒子を、約１日に１回から約１ヶ月に１回から約６ヶ月ごとに１回注入する、請求項５２または５３に記載の前記方法。
【請求項５５】
請求項３０に記載の前記ナノ粒子が１つ以上の細胞に接触し、前記ナノ粒子と細胞の結合を可視化または検出することを含む、インテグリンを同定する方法。
【請求項５６】
前記細胞が溶液中または培養液中に存在する、請求項５５に記載の前記方法。
【請求項５７】
前記ナノ粒子を、インテグリンを過剰発現している血管がイメージ化された患者に投与する、請求項５５に記載の前記方法。
【請求項５８】
請求項３０〜４４のいずれか１項に記載の前記ナノ粒子の効果的容量を、治療が必要な患者に投与すること含む、固形腫瘍を治療する方法。
【請求項５９】
固形腫瘍がグリア芽腫または乳がんである、請求項５８に記載の前記方法。
【請求項６０】
前記乳がんがトリプルネガティブ乳がんである、請求項５９に記載の前記方法。
【請求項６１】
請求項３０〜４４のいずれか１項に記載の前記ナノ粒子の効果的容量を投与することを含む、血管新生または血管漏出を特徴とする疾病を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
優先権
本出願は２０１５年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／２５７，５６９号明細書の利益及び優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
これまでに、ＩＶ型コラーゲンに由来するペプチドの、血管新生及びリンパ管新生を阻害する潜在的可能性が言及されてきた。ＩＶ型コラーゲンα５線維の非コラーゲン領域に由来するペプチドモチーフは米国特許第９，０５６，９２３号明細書に記載され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、モチーフＮＩＮＮＶを含むペプチドは、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖、移動、及び細管形成を阻害することが記載されている。Ｒｏｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．８０（１）：２７−３７（２０１２）。
【０００３】
薬剤学的使用及び製品開発を支援及び／または誘導するために、これらのペプチドの生物学的標的、生物学的活性及び薬剤学的特性についてより詳細に理解する必要がある。
【０００４】
簡単な説明
本発明の様々な態様及び実施形態は、ＩＶ型コラーゲンα５線維由来のペプチド医薬組成物、及び薬物治療におけるその使用法に関与する。例示的なペプチドは、アミノ酸配列ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号２）、ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号３）、ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＷ（配列番号４）、ＦＴＮＩＮＮＶＴＮ（配列番号５）もしくはＦＴＤＩＮＤＶＴＮ（配列番号６）、または本明細書に記載の様々な誘導体を包含する、前述のいずれかの誘導体であるアミノ酸配列を含む。ペプチドはα５β１及びαＶβ３インテグリンを標的とし、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を包含する複数の受容体を通してシグナル伝達を阻害する。
【０００５】
一部の態様では、本発明は治療が必要な患者にペプチド薬剤の効果的用量を投与することを含む、微小血管漏出または透過性を治療または予防する方法を提供する。微小血管漏出が病状に関与し得るまたは病状を悪化させ得る疾患には、インフルエンザ（ｆｌｕ）、アルツハイマー病、神経病変（例えば、多発性硬化症）、出血熱、脳性マラリア、黄斑変性、黄斑浮腫（例えば、糖尿病性黄斑浮腫）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、糖尿病性網膜症、湿式ＡＭＤ、急性呼吸窮迫症候群、肺水腫、喘息、ＣＯＰＤ、呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ、肺炎、組織または臓器移植に関連する微小血管漏出及び血管透過性が包含される。
【０００６】
他の態様では、本発明はがんを治療する方法、特にチェックポイント阻害薬治療を改善する方法を提供する。具体的には、本方法はこれらの実施形態において、血管新生を阻害し、樹状細胞の成熟及びより強固なリンパ球の内皮輸送を可能にすることで、免疫チェックポイント阻害薬治療を改善する。本方法は、免疫チェックポイント阻害薬治療を受けているがん患者にペプチドの効果的容量を投与することを含む。ペプチドまたは医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害薬治療と一緒に（または治療期間中に）投与される場合がある。あるいは、患者にペプチドを用いて１〜４週間治療を行い、その後免疫チェックポイント阻害薬治療を行う場合がある。
【０００７】
ペプチドは全身送達または局所送達を目的として処方される場合があり、一部の実施形態では、ペプチドは高分子ナノ粒子または微粒子キャリアと共に処方される。一部の実施形態では、本発明は、例えば配列番号１〜６のいずれか１つのペプチド、またはその誘導体及び／またはその組合せなど、インテグリンを標的とするＰＬＧＡ−ＰＥＧ共重合体及びコンジュゲートされたペプチドを含むナノ粒子を提供する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ペプチドに共有結合したサイズ調節が可能な乳酸グリコール酸共重合体ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）ブロック共重合体、または上記の他の結合剤から合成される。様々な比率のコンジュゲート及び未コンジュゲート高分子の混合物は、表面に望ましい密度の標的薬剤を備えたナノ粒子を生成する可能性がある。粒子は循環血中の特性、体内分布及び分解速度を包含する、望ましい薬力学的有益性を提供するように設計される場合がある。このようなパラメータは、サイズ、形状、表面電荷、高分子の組成、リガンドコンジュゲーションの化学的性質、ペプチドコンジュゲーションの密度などを包含する。
【０００８】
一部の実施形態では、ナノ粒子はさらに封入された活性剤を含み、インフルエンザ、アルツハイマー病、出血熱、脳性マラリア、がん、黄斑変性または黄斑浮腫、臓器または組織移植、及び本明細書に記載のその他を包含する、微小血管漏出を特徴とする疾患の治療を目的として本明細書に開示された活性剤である場合がある。一部の実施形態では、封入された薬剤は本明細書に記載のペプチドである。ナノ粒子は一部の実施形態では実質的に球状であるが、ナノ粒子は細胞との相互作用、特にクリアランスを回避する免疫システムの細胞との相互作用に影響するよう選択的に非球状である場合がある。
【０００９】
一部の実施形態では、粒子は、送達薬物（例えば、本明細書に記載のペプチド、及び／または他の薬剤）を封入する微粒子である。粒子はその表面にコンジュゲートされたペプチドを含有するか、または含有しない場合がある。これらの実施形態では、粒子はペプチドの徐放を提供するために、長時間有効薬物デポ剤を提供する可能性がある。
【００１０】
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｐ０７が、微小血管内皮細胞内でＶＥＧＦ、ＨＧＦ及びＩＧＦのシグナル伝達を阻害することを示す図である。
【図２】Ｐ０７が、マウスモデルの過剰な血管漏出によって引き起こされる網膜剥離を阻害することを示す図である。
【図３】Ｐ０７が、ウサギの眼によるＶＥＧＦ誘発漏出モデルにおいて血管漏出を阻害することを示す図である。漏出は、無処置時を１．０に設定して比較する。
【図４】Ｐ０７が、用量依存的に同所性トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）異種移植片の増殖を阻害することを示す図である。
【図５】Ｐ０７が、同所性ＴＮＢＣ異種移植片の新血管形成を阻害することを示す図である。
【図６】Ｐ０８がＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳ共重合体に効率的にコンジュゲートされ、逆相ＨＰＬＣによって定量化されたことを実証する、Ｐ０８コンジュゲーションに対するＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図７】Ｐ０７のＺ平均粒子径が約７０〜８０ｎｍであることを示す図である。ナノ粒子にコンジュゲートされたＰ０７を用いたサンプルでは、サイズの増加がわずかに見られた。
【図８】Ｎ０７は、脱イオン水中でゼータ電位が陰性であり、ＰＥＧ上の種々の末端基を使用して−２５ｍＶ付近に調節することはほとんど不可能であることを示す図である。中性はメトキシ末端ＰＥＧである。陰性はカルボキシ末端ＰＥＧである。
【図９】インテグリンαｖβ３及びα５β１に対する粒子の結合を示す図である。
【図１０】様々なペプチドの競合によるインテグリンαｖβ３に対する粒子の結合を示す図である。
【図１１】Ｎ０７粒子のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＥＣ細胞に対する結合を示す図である。
【図１２】Ｎ０７で前処理したプレートに対して細胞の接着を測定する接着阻害アッセイの結果を示す図である。％はコンジュゲートされたＰ０７を有するＰＬＧＡ−ＰＥＧ分子の量を表す。「＋」または「−」は、封入されたＰ０７の有無を表す。
【図１３】ＭＥＣ細胞の増殖に対するＮ０７の抑制効果を示す図である。％はコンジュゲートされたＰ０７を有するＰＬＧＡ−ＰＥＧ分子の量を表す。「＋」または「−」は、封入されたＰ０７の有無を表す。
【図１４】Ｐ０７で前処理したプレートに対して細胞の接着を測定する接着アッセイの結果を示す図である。
【図１５】８５／１５ＰＬＧＡ及びＰ０７を用いてダブルエマルジョン技術により作製した、Ｍ０７とも呼ばれる微粒子（ＭＰ）を示す図である。凍結乾燥したサンプルをＳＥＭを用いてイメージ化した。（Ａ）充填０％、（Ｂ）最終ペプチド充填０．６重量％、（Ｃ）最終充填１％である。目盛りは１０μＭを示す。
【図１６】２．２５倍に延伸したＭ０７を示す図である。凍結乾燥したサンプルをＳＥＭを用いてイメージ化した。（Ａ）ブランクＭＰ、（Ｂ）Ｍ０７、（Ｃ）拡大したブランクＭＰ、（Ｄ）拡大したＭ０７である。
【図１７】ペプチドを充填したＭＰの未延伸（左）または２倍延伸（右）のＴＥＭイメージ図を示す図である。
【図１８】延伸したＭＰ中のＰ０７充填のゲル定量化を示す図である。銀染色及びペプチドスタンダードを使用して定量化した。最終のＰ０７ｗ／ｗ比は約１％であり、延伸前のＰ０７ｗ／ｗ比の約１％と同程度であった。
【図１９】Ｐ０７で充填した６５／３５  ＰＬＧＡ微粒子からのＰ０７の放出を示す図である。エラーバーは、標準偏差を表す。
【００１２】
詳細な説明
本発明の様々な態様及び実施形態は、ＩＶ型コラーゲンα５線維由来のペプチド医薬組成物、及び薬物治療におけるその使用法に関与する。例示的なペプチドは、アミノ酸配列ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号２）、ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号３）、ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＷ（配列番号４）、ＦＴＮＩＮＮＶＴＮ（配列番号５）もしくはＦＴＤＩＮＤＶＴＮ（配列番号６）または前述のいずれかの誘導体であるアミノ酸配列を含む。様々な誘導体が本明細書に開示される。ペプチドはα５β１及びαＶβ３インテグリンを標的とし、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を包含する複数の受容体を通してシグナル伝達を阻害する。
【００１３】
インテグリンを標的とするペプチドは米国特許第９，０５６，９２３号明細書に記載のペプチドを包含し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、以下の開示によるペプチドは、アミノ酸配列ＬＲＲＦＳＴＸＰＸＸＸＸＮＩＮＮＶＸＮＦ（配列番号１）を包み、ここで、Ｘは標準アミノ酸または遺伝的にコードされていないアミノ酸である。一部の実施形態では、７番目の部位ＸはＭ、ＡまたはＧであり、９番目の部位ＸはＦ、Ａ、ＹまたはＧであり、１０番目の部位ＸはＭ、Ａ、Ｇ、ｄＡまたはＮｌｅであり、１１番目の部位ＸはＦ、Ａ、Ｙ、Ｇまたは４−ＣｌＰｈｅであり、１２番目及び１８番目の部位ＸはＡｂｕ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｉ、ＬまたはＡｌｌｙｌ−Ｇｌｙから独立に選択される。様々な実施形態では、ペプチドは約３０個以下のアミノ酸、約２５個以下のアミノ酸、約２４個のアミノ酸、約２３個のアミノ酸、約２２個のアミノ酸、約２１個のアミノ酸または約２０個のアミノ酸を含有する。さらに他の実施形態では、例えば配列番号１の１、２または３個のアミノ酸など、１〜１０個のアミノ酸を欠失させる。例えば、一部の実施形態ではＮ末端からアミノ酸を欠失させる。
【００１４】
一部の実施形態では、ペプチドはアミノ酸配列ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号２）、ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号３）、ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＷ（配列番号４）、ＦＴＮＩＮＮＶＴＮ（配列番号５）、またはＦＴＤＩＮＤＶＴＮ（配列番号６）、または前述のいずれかの誘導体であるアミノ酸配列を含む。配列番号２のペプチドは、本明細書ではＰ０７とも呼ばれる。配列番号３のペプチドは、本明細書ではＰ０６とも呼ばれる。配列番号４のペプチドは、本明細書ではＰ０８とも呼ばれる。配列番号５のペプチドは、本明細書ではＰ０５とも呼ばれる。配列番号６のペプチドは、本明細書ではＰ０９とも呼ばれる。配列番号２のペプチドは（配列番号１と比較して）１３番目及び１６番目の部位にアスパラギン酸を有し、これにより生物学的活性に悪影響を与えることなくペプチドの物理的特性が改善される。配列番号２、３または４に関して、配列番号２〜４のペプチドの誘導体は、１〜５個のアミノ酸置換、挿入または欠失（例えば１、２、３、４または５個のアミノ酸の一括した置換、挿入または欠失）を有するペプチドを包含する。一部の実施形態では、配列番号２の１３番目及び１６番目の部位にあるＡｓｐは保持される。一部の実施形態では、配列ＤＩＮＤＶまたはＮＩＮＮＶは、誘導体の中で保持される。配列番号１に対応する部位でＸが占有する部位に、アミノ酸置換が選択的にある可能性がある。ペプチドは、通常少なくとも８個のアミノ酸を有する。配列番号５または６に関して、配列番号５または６のペプチドの誘導体は１、２または３個のアミノ酸置換を有する配列を含むペプチドを包含する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的または非保存的置換が独立的に選択される。これらのまたは他の実施形態では、ペプチドは１〜１０個のアミノ酸を末端の一方または両方に（一括して）加えたものを包含する。Ｎ及び／またはＣ末端は別の化学基（アミンまたはカルボキシ以外、例えばアミドまたはチオール）が選択的に占有する場合があり、これは、本明細書でさらに詳細に記載されるように、ＰＥＧまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧ共重合体を包含する他部のコンジュゲーションに有用である可能性がある。ペプチドは、特定の組織へ標的化したまたは持続した送達を行うために、一部の実施形態では製薬上許容される塩の形で提供されるか、または他の成分と複合化されるかもしくは粒子中に封入される場合がある。
【００１５】
保存的置換は、例えば、極性、荷電、サイズ、溶解性、疎水性、親水性および／または関与するアミノ酸残基の両親媒性の類似性に基づいて成される場合がある。遺伝的にコードされたアミノ酸２０個は、以下の６つの標準アミノ酸群
（１）疎水性：Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ；
（２）中性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族化合物：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅに分類することができる。
【００１６】
本明細書で述べる「保存的置換」とは、アミノ酸が上記の６つの標準アミノ酸群において同群内に列挙された別のアミノ酸と交換されることとして定義される。例えば、ＡｓｐをＧｌｕと交換することで、非常に改良されたポリペプチドにおいて１つの負電荷を保有する。加えて、グリシン及びプロリンは、αヘリックスを破壊する能力に基づいて互いに置換される場合がある。上記の６つの群内における一部の好ましい保存的置換は、以下の下位群（ｉ）Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ、（ｉｉ）Ｓｅｒ及びＴｈｒ、（ｉｉｉ）Ａｓｎ及びＧｌｎ、（ｉｖ）Ｌｙｓ及びＡｒｇならびに（ｖ）Ｔｙｒ及びＰｈｅの範囲内での交換である。
【００１７】
本明細書で述べる「非保存的置換」とは、アミノ酸が上記６つの標準アミノ酸群（１）〜（６）の異なる群中に列挙された別のアミノ酸によって交換されることとして定義される。
【００１８】
様々な実施形態では、ペプチド薬剤は約８〜約３０個のアミノ酸、または約１０個〜約２０個のアミノ酸のペプチドであり、配列番号２、３、４、５または６の少なくとも４個、少なくとも５個または少なくとも６個の連続したアミノ酸を有する。一部の実施形態では、ペプチドは少なくとも１個、少なくとも２個または少なくとも３個のＤ−アミノ酸を含有する。一部の実施形態では、ペプチドは１〜約５個（例えば、１、２または３個）の遺伝的にコードされていないアミノ酸を含有し、これらのアミノ酸は２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−クロロフェニルアラニン（４−ＣｌＰｈｅ）及びアリルグリシン（ＡｌｌｙｌＧｌｙ）から選択的に選ばれる。
【００１９】
例示的なペプチド薬剤は、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号７）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＡＭＦ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号８）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＡＦ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号９）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＡ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号１０）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦ（Ｎｌｅ）Ｆ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号１１）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭ（４−ＣｌＰｈｅ）（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号１２）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＳＮＩＮＮＶＳＮＦ（配列番号１３）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＡＮＩＮＮＶＡＮＦ（配列番号１４）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号１５）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＴＮＩＮＮＶＴＮＦ（配列番号１６）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＩＮＮＶ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＦ（配列番号１７）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＶＮＩＮＮＶＶＮＦ（配列番号１８）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦｄＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号１９）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号２０）、
ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号２１）、
ＬＲＲＦＳＴＡＰＦｄＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号２２）、
Ｆ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）Ｎ（配列番号２３）、
ＦＴＮＩＮＮＶＴＮ（配列番号２４）、
ＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号２５）、
ＦＳＮＩＮＮＶＳＮＦ（配列番号２６）、
ＦＡＮＩＮＮＶＡＮＦ（配列番号２７）、
Ｆ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＩＮＮＶ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＦ（配列番号２８）、
ＦＶＮＩＮＮＶＶＮＦ（配列番号２９）、
Ａ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号３０）または
（４−ＣｌＰｈｅ）（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号３１）を包含する、本開示による配列番号２〜６のペプチドの誘導体である場合がある。
【００２０】
本明細書に記載の様々な態様及び実施形態では、ペプチドはナノ粒子及び微粒子製剤の形態で、表面にコンジュゲートされるかまたは封入されるかのいずれかで送達される場合がある。ＰＬＧＡ−ＰＥＧ高分子をベースにした例示的な粒子製剤は、本明細書に詳細に記載される。
【００２１】
ペプチド製剤は、例えば固相合成など、既知の技術を用いて化学的に合成及び精製される可能性がある。米国特許第９，０５１，３４９号明細書を参照のこと。これによって、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
本明細書に記載のペプチドは、α５β１及びαＶβ３インテグリンを標的とし、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を包含する複数の受容体を通してシグナル伝達を阻害する。インテグリンは、細胞と細胞間、及び細胞と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）間の相互作用において架橋の役割を果たす膜貫通受容体である。インテグリンからのシグナル伝達は、例えば、細胞周期、細胞の形状、及び／または運動性の調節など、非常に多くの生物学的応答を制御するＥＣＭの化学的組成及び物理的状態、または細胞膜に追加されている新規の受容体に影響する。これにより、細胞表面のイベントに対して迅速で柔軟な応答が可能になる。インテグリンにはいくつかのタイプが存在し、細胞はその表面に関していくつかのタイプを有する場合がある。インテグリンは、例えば、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子、セレクチン及びシンデカンなど、他の受容体と共に作用し、細胞と細胞間、及び細胞とマトリックス間の相互作用を媒介する。インテグリンに対するリガンドは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びラミニンを包含する。
【００２３】
一部の態様では、本発明は上述のように配列番号１〜６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチド、またはその誘導体及び／またはその組合せの効果的用量を治療が必要な患者に投与することを含む、微小血管漏出または透過性を治療または予防する方法を提供する。血管透過性は、多くの場合が毛細血管透過性または微小血管透過性の形態をとるが、小分子（イオン、水、栄養素）または細胞そのものまでも血管内外へ流出入させる血管壁の能力を特徴とする。血管壁は、内皮細胞の単一層によって内側を覆われている。密着結合として知られている内皮細胞間のギャップは、組織のタイプ及び生理学的状態に応じて厳密に調節される。血管透過性の亢進は、体腔または身体組織に過剰の液体が集まることを特徴とした症状である浮腫を引き起こす可能性がある。
【００２４】
微小血管内皮は、炎症及び他の刺激に応答し、これにより多くの内科的疾患の病状に関して重要な役割を果たす可能性がある。可溶性因子及び細胞受容体を包含する血管透過性の潜在的仲介役、ならびにその潜在的役割及び相互作用は複雑であり、また組織及び特定の病状に依存し得る。例えば、微小血管の漏出は、インフルエンザ（ｆｌｕ）、アルツハイマー病、出血熱、脳性マラリア、黄斑変性、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞、糖尿病性網膜症、急性呼吸窮迫症候群、肺水腫、喘息、ＣＯＰＤ、呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ、肺炎、組織または臓器移植に関連する血管透過性などの病状に影響を与える場合がある。本明細書に記載のペプチドは、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を包含する、微小血管透過性に関与する複数の受容体を通してシグナル伝達を阻害することにより、これらの疾患の治療を支援する可能性がある。図１を参照のこと。
【００２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドまたは組成物は、微小血管漏出または透過性を防止または低減するため、肺、皮膚または眼に局所的に投与される。
【００２６】
一部の実施形態では、患者はインフルエンザに罹患しているか、または罹患しているリスクを有する。インフルエンザ（「ｆｌｕ」）は、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症である。症状は、高熱、鼻水、咽喉痛、筋肉痛、頭痛、咳及び疲労などがある。これらの症状は、一般的にウイルスに暴露した２日後に発症する。感染は、咽喉、喀痰、または鼻からウイルスの有無を検査することにより確認される場合がある。世界保健機関は、高リスクの対象者に年に１度のインフルエンザの予防接種を推奨しており、ワクチンは一般的に３または４タイプのインフルエンザに対して効果的である。抗ウイルス薬は、例えば、ノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、オセルタミビルなど）がインフルエンザの治療に使用され、適度な効用を示してきたが、効用を提供するためには感染初期（例えば、症状が現れたら速やかに）に使用しなければならない。インフルエンザに罹患した人の約３３％は、無症状である。インフルエンザの症状は、感染して約１〜２日後に急に発症する可能性がある。通常、最初の症状は悪寒または寒気であるが、感染初期は発熱も一般的である。抗ウイルス薬による治療は、適度な効用を提供する場合があるが、強力な世界的流行株で特に問題となるウイルス耐性のリスクを冒す。
【００２７】
ウイルス性疾患を治療する魅力的な代替法として、薬物耐性が生じる可能性を大幅に減らす宿主応答の治療があり、より進行した病期での治療を可能にするにあたって、その有効性を確かめるより大きな機会を提供し得る。宿主による主要な応答の１つは、呼吸不全に至る場合がある肺微小血管の漏出及び肺損傷によって引き起こされる炎症応答である。微小血管の漏出を阻害する抗浮腫剤は、インフルエンザの症状を改善する可能性がある。
【００２８】
一部の実施形態では、ペプチドまたは同ペプチドを含む医薬組成物は、インフルエンザの症状が現れる前に最初に投与される。例えば、患者のサンプルでウイルスの有無を検出する臨床検査を使用することにより、患者のインフルエンザが診断される場合があり、または患者がウイルスに暴露した後はインフルエンザに罹患しているリスクを有する。暴露の状況は、感染した及び／または症状のある個人との密接な接触によって決定する可能性がある。
【００２９】
別の実施形態では、ペプチドまたは医薬組成物は最初のインフルエンザの症状が現れた後に最初の投与を行う。一部の実施形態では、ペプチドまたは医薬組成物は最初のインフルエンザの症状が現れてから１〜４日以内（例えば、１または２日）に投与される。
【００３０】
本発明のこの態様により、ペプチドはインフルエンザウイルスに関連する肺の中の浮腫を低減し、これにより疾患の症状及び／または重症度を改善する。一部の実施形態では、罹患している全期間の長さは１日、２日、３日、４日またはそれ以上短縮する可能性があり、及び／または重症度及び不快感を実質的に低減する可能性がある。
【００３１】
インフルエンザに罹患しているか、またはそのリスクがある患者の治療に対して、本明細書に記載のペプチドまたは医薬組成物は、例えば１日に約１〜約３回など、１日に約１〜約５回投与される可能性がある。一部の実施形態では、ペプチドまたは医薬組成物は、例えば粉末または溶液エアロゾルによって肺へ局所的に投与されるか、または他の実施形態において全身的に投与される。
【００３２】
一部の実施形態では、ペプチドは、個別の薬物製剤または合剤製品のいずれかとして、インフルエンザに有効な１つ以上の抗ウイルス剤と併せて投与されるか、または代替的に１つ以上の抗炎症剤と併せて投与される。例示的な抗ウイルス剤は、タミフル（リン酸オセルタミビル）、リレンザ（ザナミビル）、ラピバブ（ペラミビル）、アマンタジン及びリマンタジンを包含する。抗炎症剤は、ＮＳＡＩＤ（例えばアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン及びナプロキセン）を包含する。
【００３３】
他の実施形態では、ペプチドまたは医薬組成物は、アルツハイマー病の治療またはその進行を遅らせるために投与される。血液脳関門（ＢＢＢ）は、血液由来産物、病原体及び細胞の脳内への侵入を制限し、これは正常な神経機能及び情報処理に不可欠である。剖検による組織解析から、アルツハイマー病においてＢＢＢの損傷が示唆されている。ＢＢＢが破綻するタイミングは、まだ解明されていない。高時空間分解能を有した先進的なダイナミック造影ＭＲＩにより、ヒト生体脳のＢＢＢの透過性を定量化することで、アルツハイマー病（ＡＤ）初期に影響を受ける学習及び記憶に関して重要な海馬領域で、年齢に依存したＢＢＢの破綻が示された。これらのデータは、ＢＢＢの破綻が高齢のヒト脳の海馬で始まる初期イベントであり、認知障害に寄与し得ることを示唆している。したがって、血液脳関門の損傷を阻害し、その結果透過性を亢進させる薬剤はアルツハイマー病の進行を遅らせる可能性を有する。一部の実施形態において本明細書に記載のペプチドまたは組成物の投与は、血液脳関門の健全性を保持し、したがってアルツハイマー病の発症または進行を遅らせるか、または予防する。
【００３４】
一部の実施形態では、患者はアルツハイマー病の治療を目的とする少なくとも１つの追加の薬剤を用いた治療を受けており、その薬剤はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤（タクリン、リバスチグミン、ガランタミン及びドネペジル）またはメマンチンから選択される場合がある。
【００３５】
アルツハイマー病の潜在的な症状を示す患者、特に疾病初期の患者の治療に対し、本明細書に記載のペプチドまたは医薬組成物は、疾病の発症または進行を遅らせるため、例えば１日に約１〜約３回など、１日に約１〜約５回投与される可能性がある。疾病初期は多くの場合、学習及び記憶における障害の悪化が観察され、最終的に決定的診断に至る。一部では、言語、実行機能、認知（失認）または運動の実行（失行）に伴う困難は記憶に関する問題より顕著である。言語の問題は、全般的な話し言葉及び書き言葉による言語の貧困につながる、語彙の縮小及び発言の流暢さの欠如を特徴とする。
【００３６】
一部の実施形態では、初期アルツハイマー病患者またはアルツハイマー病を発症するリスクを有する患者（遺伝的な素因があるか、またはＡＤに関連する１つ以上のバイオマーカーが陽性であるかのいずれか）に、ペプチドまたは医薬組成物が投与され、ここでペプチド薬治療は脳循環を正常化し、疾病の進行を遅らせるかまたは予防する。
【００３７】
一部の実施形態では、患者は、例えば多発性硬化症（ＭＳ）またはパーキンソン病（ＰＤ）などの、血管新生または血管漏出の調節不全に関連する神経病変を有する。一部の実施形態では、ペプチドまたは医薬組成物は、疾病の進行を予防するかもしくは遅らせる、または疾病の症状を改善するために１日に１〜３回投与される。
【００３８】
他の実施形態では、患者は出血性ウイルスによって引き起こされる出血熱もしくは出血症候群に罹患しているか、または罹患しているリスクを有する。これらのうち最も有名なものは、エボラウイルス及びマールブルグウイルスである。デング熱またはラッサ熱罹患者も同様に出血が起こる。エボラでは、この出血症候群はしばらく遅れて症状が起こり、一般的に死亡の２４〜４８日前に発症する。出血を伴う場合は症状が劇的である可能性があり、鼻、口、および身体の他の開口部より起こる場合がある。出血に至る機序は大筋として次のように知られている。ウイルスは、肝臓によって産生される凝固因子のアップレギュレーションを引き起こし、凝固因子の増加により小血管で血栓が形成され、肝臓によって産生される凝固因子の供給は、肝臓がウイルスの攻撃下にあるために枯渇し、過剰に活性化した免疫系が血管の出血を起こす炎症性タンパク質の産生量を増加させ、凝固因子の欠乏は出血の抑止が不可能であることを意味する。出血がない場合であっても多くの患者が死亡するが、出血した患者の死亡率は非常に高い。症状が最初に現れた後に投与された薬剤は、未投与の場合に出血症候群の進行が見られる患者の微小血管からの出血を止める可能性がある。
【００３９】
一部の実施形態では、患者はエボラウイルスまたはマールブルグウイルスを有する。例えば、患者は、例えば、発熱及び出血に対する感受性の増加、ならびに／または顔面及び胸部の紅潮、小さな赤色もしくは紫色の斑点（点状出血）など、出血熱の初期徴候を有する場合がある。出血熱の他の兆候及び症状には、倦怠感、筋肉痛、頭痛、嘔吐及び下痢が包含される。一部の実施形態では、エボラウイルスまたは他の出血熱ウイルスの存在が患者のサンプルで確認される。一部の実施形態では、患者は、例えばリバビリンの静脈内投与など、少なくとも１つの抗ウイルス剤もしくは抗炎症剤、または出血熱の治療薬を使用した治療を受けている。出血熱に罹患しているか、またはそのリスクを有する患者の治療に対して、本明細書に記載のペプチドまたは医薬組成物は、疾病の進行を遅らせるため、例えば１日に約１〜約３回など、１日に約１〜約５回投与される可能性がある。
【００４０】
さらに他の実施形態では、患者は脳性マラリア（ＣＭ）に罹患しているか、または罹患しているリスクを有する。ＣＭは熱帯熱マラリア原虫によるマラリアの最も致命的な合併症の１つであり、マラリアに関連する死亡者数の大部分を占めている。世界保健機関（ＷＨＯ）はＣＭを、無性熱帯熱マラリア原虫による寄生虫血症の発症、かつ他の脳症の原因がない状態で、発作終了後または低血糖の回復後に、少なくとも１時間持続する昏睡（痛みを伴う刺激の認識不能、またはＢｌａｎｔｙｒｅ昏睡スコア≦２）と定義している。ＣＭに関連する死亡率は７５％にのぼり、入院から２４時間以内に起こる。イメージ化、拡散、灌流、血管造影、分光法などのマルチモーダル磁気共鳴技術により、ＣＭ罹患時に起こる血液脳関門の破綻及び出血を包含した血管損傷が示されてきた。これらの影響は、炎症過程に起因すると考えられている。Ｐｅｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００５  Ａｕｇ  １０；２５（３２）：７３５２−８）では、ＣＭのマウスモデルを用いることで、ＣＭ罹患時に脳灌流が低減すると共に多数の浮腫が形成され、高エネルギーリン酸塩が減少し、脳内の乳酸濃度が上昇した虚血性の代謝プロファイルを伴うことを示している。著者グループはまた、主要な血行動態の機能不全に対して有力な証拠を提供する血管造影法を使用した。重要な事として、最終的には死因となる血流虚脱に至る大脳動脈の圧迫によって、浮腫がさらに虚血を悪化させることが呈示された。これらの所見は炎症性病変及び虚血性病変の共存を実証し、実験に基づいた脳性マラリアの致死的転帰において浮腫の主要な役割を証明するものである。脳内の浮腫及び／または虚血を阻害する薬剤は、これらの患者の治療を改善するために寄生虫を直接標的とする抗マラリア剤と組み合わせて使用される可能性がある。一部の実施形態では、患者はクロロキン、メフロキン、ドキシサイクリンまたはアトバクオン及び塩酸プログアニル（マラロン）の組合せから選択された抗マラリア薬治療を受ける。
【００４１】
これらの実施形態では、ペプチドは、脳性マラリア患者の血液脳関門及び血管の健全性を保持する。脳性マラリアに罹患しているか、またはそのリスクを有する患者の治療に対して、本明細書に記載のペプチドまたは医薬組成物は、疾病の進行を遅らせる及び／または死亡を予防するため、例えば１日に約１〜約３回など、１日に約１〜約５回投与される可能性がある。
【００４２】
他の態様では、本発明はがんを治療するか、または腫瘍の微小環境を正常化する方法、特にチェックポイント阻害薬治療を改善する方法を提供する。
【００４３】
本方法は、免疫チェックポイント阻害薬治療を受けている（または治療の準備をしている）がん患者に配列番号１〜６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチド、その誘導体またはその組合せの効果的容量を投与することを含む。血管新生は、がんを治療するための薬物標的である。ＶＥＧＦ及びその受容体ＶＥＧＦＲ２は、血管新生の重要な仲介役である。様々なタイプのがんに対して、ヒトＶＥＧＦを抑制する抗体ベバシズマブ、及びＶＥＧＦＲ２を阻害する他のチロシンキナーゼ阻害剤の小分子が開発されてきた。その血管新生促進活性が広く知られていることに加え、ＶＥＧＦは樹状細胞の成熟を阻害することにより免疫抑制因子としても機能する。腫瘍は新生血管系を誘引するため、また成熟免疫細胞の数を減少させ、リンパ球内皮輸送を変調させることで免疫系を抑制するためにＶＥＧＦを産生すると考えられている。
【００４４】
腫瘍は、自身の増殖を促進するために免疫系を制御する。ここ２〜３年にわたって、腫瘍が免疫系を抑制し続けることによる多くの機序が解明された。腫瘍細胞の多くのタイプが、腫瘍を侵攻して休止させるＴ細胞上の受容体と相互作用する、ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４などの表面分子を発現する。これらの発見は、例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ及びペンブロリズマブなどの制がん剤として、いわゆる「チェックポイント阻害剤」の開発を可能にした。これらの薬物は、腫瘍細胞の細胞障害性Ｔ細胞に対する結合を遮断して抑制状態から解放し、腫瘍細胞を死滅させることを可能にする。
【００４５】
進行メラノーマ患者に対し、ＣＴＬＡ−４を遮断する抗体ベバシズマブ及びイピリムマブを組み合わせた少なくとも１つの試験を実施した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１４Ｊｕｌ；２（７）：６３２−４２）。炎症に関してＶＥＧＦの遮断の効果に加えて、リンパ球輸送及び免疫制御についても明らかとなった。これらの試験をベースに、ベバシズマブ及び他の抗血管新生剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤の小分子）をチェックポイント阻害剤と組み合わせた、さらなる臨床試験が開始された。
【００４６】
本発明のペプチド及び組成物が相乗的に作用し得る、チェックポイント阻害剤の他の標的は、ＬＡＧ−３、ＫＩＲ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１及びＴＩＭ−３を包含する。
【００４７】
さらに、本明細書に開示のように、α５β１及びαＶβ３インテグリンに対するペプチド（例えば、配列番号１〜６、及び誘導体）の特異性は、がん薬治療においてペプチドが医学的に重要な別の役割を果たすことを示唆している。受容体はα５β１及びαＶβ３インテグリンと同定された。インテグリンは補助受容体として多くの種々の増殖因子受容体に対して機能する。本明細書に記載のペプチド及びその誘導体は、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ２）、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−ｍｅｔ）及びインスリン様増殖因子受容体などからのシグナル伝達を阻害する。Ｐ０７は、例えば、網膜及び脈絡膜の新血管形成ならびに血管漏出のマウスモデルにおいて、ＶＥＧＦ誘発による新血管形成及び漏出を強力に阻害する。血管新生を促進することに加え、ＶＥＧＦは免疫抑制も引き起こし、これは腫瘍によって利用され、腫瘍に対する免疫応答を弱める。Ｐ０７はＶＥＧＦによるシグナル伝達を遮断するため、免疫系の増強剤として効果的に働き、これにより免疫系による腫瘍への攻撃を促進する可能性がある。これらのデータは、Ｐ０７（本明細書に開示された他のペプチド及び誘導体と同様に）がチェックポイント阻害剤との組み合わせにより良好に作用する可能性があることを示唆する。これは同時に血管新生の阻害、ならびに樹状細胞の成熟及びより強固なリンパ球内皮輸送を可能にすることで腫瘍への免疫応答の強化を支援し、これによってチェックポイント阻害剤が、腫瘍細胞を死滅させる細胞傷害性T細胞の浸潤を可能にし得る。
【００４８】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体である。本方法は、免疫チェックポイント薬治療が有用であるいずれかのがんに対して効果的であり得るが、一部の実施形態では、がんは、肉腫、がん腫または生殖細胞系腫瘍から選択された固形腫瘍がん、中枢神経系の腫瘍、乳がん、前立腺がん、子宮頸がん、子宮がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、甲状腺がん、星細胞腫、グリオーマ、膵がん、胃がん、肝がん、大腸がん、メラノーマ（進行メラノーマを包含する）、腎臓がん、膀胱がん、食道がん、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん、直腸がん、子宮内膜がん、扁平上皮がん、腺がん、小細胞がん、神経芽細胞腫、中皮腫、副腎皮質がん、上皮がん、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、Ｅｗｉｎｇ肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞がん、リンパ腫、メラノーマ、非横紋筋肉腫性軟部肉腫、骨肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫及び腎芽腫である。一部の実施形態では、がんは非小細胞肺がん、メラノーマ、前立腺がん、転移性腎細胞がんである。通常、がんはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４に対して陽性であり、チェックポイント阻害薬治療はＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１間、またはＣＴＬＡ−４及びＢ７間の相互作用を阻害する薬剤である。
【００４９】
様々な実施形態では、患者は初期ステージがん（例えば、ステージＩもしくはＩＩ）、または後期ステージがん（ステージＩＩＩもしくはステージＩＶ）である可能性がある。ステージＩのがんは身体の１部に限局している。ステージＩＩのがんは局所的に進行し、ステージＩＩＩのがんも同様である。がんがステージＩＩまたはステージＩＩＩのどちらに認定されるかは、がんの特定のタイプに依存する可能性がある。例えば、ステージＩＩは隔膜の片側のみに影響を受けたリンパ節を示唆する可能性があり、一方、ステージＩＩＩは隔膜の両側が影響を受けたリンパ節を示唆する。したがって、ステージＩＩ及びＩＩＩの特定基準は診断によって異なる。ステージＩＶのがんは多くの場合が、他の臓器または身体全体に転移または拡散している。
【００５０】
一部の実施形態では、がんは切除不可能である。切除不可能ながんは、転移病巣の数または外科手術において危険な部位にあることのいずれかに起因して、外科的に除去することができない悪性腫瘍である。
【００５１】
一部の実施形態では、患者は免疫チェックポイント阻害剤単独の使用に対して応答しないか、または部分的にしか応答しない。一方、ペプチドまたは医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害薬治療と共に（または治療期間中に）投与される場合があり、一部の実施形態では、患者にペプチドを用いて１〜４週間治療を行い、その後免疫チェックポイント阻害薬治療を行う。
【００５２】
一部の実施形態では、ペプチドまたは医薬組成物は、臓器または組織移植に関連する微小血管漏出もしくは血管透過性またはリンパ管新生を低減し、これにより急性または超急性拒絶反応の発生を低減するために投与される。例えば、ペプチドは皮膚移植、角膜同種移植、腎臓、肺、もしくは心臓移植、または他の臓器もしくは組織移植のレシピエントに投与される可能性がある一方で、急性または超急性拒絶反応のリスクを有する。例えば、ペプチドは少なくとも１日に１回を、１〜８週間または１〜４週間にわたり投与する場合がある。
【００５３】
上記の様々な実施形態では、ペプチドは望ましい経路及び／または用量によって様々な形態で投与される可能性がある。
【００５４】
ペプチドは製薬上許容される塩として送達される可能性があり、当技術分野で既知の任意数のキャリアを包含する場合がある。「製薬上許容される塩」には、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製された塩を包含する。本明細書で述べる「製薬上許容されるキャリア」とは、水、生理食塩水、ブドウ糖溶液、ヒト血清アルブミン、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子及びナノ粒子を包含することを意図するが、これに限定されない。
【００５５】
治療される特異的疾患によって、ペプチド薬剤は液体または固体剤形として処方され、全身的または局所的に投与される場合がある。薬剤は、例えば、当業者に既知の持続性放出または徐放の形態で送達される場合がある。製剤及び投薬の技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２０ｔｈ  ｅｄ．）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  （２０００）に呈示されている場合がある。好適な経路は、経口、口腔内、吸入スプレー、舌下、直腸、経皮、膣、経粘膜、経鼻または腸内投与を包含し、非経口的送達では、筋肉内、皮下、髄腔内及び髄内注入、脳室内直接投与、静脈内、関節内、胸骨内、滑膜内、肝臓内、病巣内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、もしくは眼内注入またはその他の送達方法を包含する場合がある。
【００５６】
投与の形態及び／または経路は変更する可能性があり、一部の実施形態では、ペプチドまたは医薬組成物は非経口的に投与される（例えば、皮下、静脈内または筋肉内への投与）か、または一部の実施形態では肺に直接投与される。肺への局所的投与は、医薬エアロゾルを包含する様々な製剤計画によって達成される可能性があり、医薬エアロゾルは、溶液エアロゾルまたは粉末エアロゾルであってもよい。粉末製剤は一般的に小粒子を含む。好適な粒子は、当技術分野で既知の任意の手段を用いて、例えばエアージェットミル、ボールミルもしくは振動ミルによる粉砕、ふるい分け、微量沈降、噴霧乾燥、凍結乾燥または制御結晶化により調製される可能性がある。一般的に、粒子は直径約１０ミクロン以下である。粉末製剤は、当業者に既知の少なくとも１つの製薬上許容される微粒子キャリアを選択的に含有する場合がある。好適な医薬キャリアの実施例は、例えばアラビノース、ブドウ糖、フルクトース、リボース、マンノース、ショ糖、トレハロース、ラクトース、マルトース、でんぷん、デキストラン、マンニトールまたはソルビトールなど、単糖類、二糖類、多糖類及び糖アルコールを包含する糖類を包含するが、これに限定されない。あるいは、溶液エアロゾルは当業者に既知の任意の手段、例えば計量した用量の組成物を送達するように適合させたバルブを備えるエアロゾルを用いて調製される場合がある。活性成分の吸入可能な形態が噴霧可能な水性、有機または水性／有機分散系である場合、吸入装置は、例えば、分散液１〜５０ｍｌ、一般には１〜１０ｍｌを含有する場合があるネブライザーで、例えばエアージェットネブライザのような、従来の空気噴霧式ネブライザーもしくは超音波式ネブライザー、または、より少ない噴霧量、例えば１０〜１００μｌを可能にする携帯ネブライザーである場合がある。
【００５７】
注入を目的として、本開示の薬剤は、例えばハンクス液、リンゲル液または生理的食塩水緩衝液など、生理学的に適合する緩衝液などの水性溶液中で処方及び希釈される場合がある。
【００５８】
本開示の実践のために本明細書に開示の化合物を全身投与に好適な投薬量で処方するための、製薬上許容される不活性キャリアの使用法については、本開示の範囲内である。キャリアの適切な選択及び好適な製造方法を用いて、本開示の組成物、特に溶液として製剤化された組成物は、例えば、静脈内注入などによって非経口的に投与される場合がある。化合物は、当技術分野で周知の製薬上許容されるキャリアを使用し、経口投与に好適な投薬量に容易に処方される可能性がある。このようなキャリアは本開示の化合物を、治療対象（例えば、患者）の経口摂取を目的としてタブレット、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。
【００５９】
経鼻または吸入による送達を目的として、本開示の薬剤は当業者に既知の方法によって処方される場合があり、例えば、生理食塩水、ベンジルアルコールなどの防腐剤、吸収促進剤、及びフッ化炭素など、実施例の可溶化、希釈または分散物質を包含し得るが、これに限定されない。
【００６０】
一部の実施形態では、ペプチドは高分子ナノ粒子または微粒子キャリアを用いて処方される。例えば、一部の実施形態では、微粒子またはナノ粒子は、例えば、エステル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、無水物結合及び酵素分解の影響を受けやすい結合など、１つ以上の分解可能な結合を有する物質を含む。特定の実施形態では、微粒子またはナノ粒子は、生分解性高分子または、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸（Ｐ３ＨＢ）及びヒドロキシ酪酸ヒドロキシ吉草酸共重合体のみからなる群から選択された高分子の混合物を含む。他の実施形態では、例えば、ポリスチレンなど当技術分野で使用される非分解性の高分子は、分解性高分子または上記の高分子と混合され、共重合体系を生成する。したがって、一部の実施形態では、非分解性高分子は生分解性高分子と混合される。
【００６１】
一部の実施形態では、本発明はインテグリンを標的とするＰＬＧＡ−ＰＥＧ共重合体及びコンジュゲートされたペプチドを含むナノ粒子を提供する。コンジュゲートされたペプチドは、配列番号１〜３１のいずれか１つ以上のペプチド、またはその誘導体である可能性がある。例えば、Ｎ０７は抗血管新生及び抗腫瘍形成の特性を有するＰ０７をベースとしてペプチドがコンジュゲートされたナノ粒子に対し、本明細書で使用される呼称である。Ｎ０７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗血管新生及び抗腫瘍形成活性、インテグリンαＶβ３複合体に対する特異的結合性、ならびに封入された送達薬物を運搬する能力を有する。
【００６２】
一部の実施形態では、ナノ粒子はその表面にコンジュゲートされた追加の薬物または標的薬剤を含有する。例えば、ナノ粒子はＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｘ及びＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｙ高分子から作製される場合があり、ここでＸは前記ペプチドであり、Ｙは別の薬物または標的薬剤である。標的薬剤は組織選択的な標的薬剤である場合があるか、またはがん細胞に対して選択的である場合がある。これらの実施形態でのナノ粒子（コンジュゲートされたペプチド、及び選択的に追加の標的薬剤を有する）は、上記の固形腫瘍を包含するがん、及びグリア芽腫または乳がん（トリプルネガティブ乳がんを包含する）を包含するがんの治療に使用される場合がある。
【００６３】
他の標的結合剤は、追加的または代替的（代替のインテグリン結合部を包含する）に使用される場合があり、この標的結合剤は抗体及びその抗体結合部分を包含する。さまざまな標的結合のフォーマットには、単一ドメイン抗体、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖のみ抗体（ＶＮＡＲ）、微小タンパク質（システインノットタンパク質、ｋｎｏｔｔｉｎ）、設計アンキリンリピートタンパク質、テトラネクチン、アフィボディ；トランスボディ、アンチカリン、アドネクチン、アフィリン、マイクロボディ、ペプチドアプタマー、フィロマー、ストラドボディ、マキシボディ、エビボディ、フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオマブ、トロイボディ、プロボディ、ワクシボディ、ユニボディ、デュオボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ペプチド模倣分子、もしくは合成分子、または米国特許もしくは米国特許出願公開第７，４１７，１３０号、第２００４／１３２０９４号、第５，８３１，０１２号、第２００４／０２３３３４号、第７，２５０，２９７号、第６，８１８，４１８号、第２００４／２０９２４３号、第７，８３８，６２９号、第７，１８６，５２４号、第６，００４，７４６号、第５，４７５，０９６号、第２００４／１４６９３８号、第２００４／１５７２０９号、第６，９９４，９８２号、第６，７９４，１４４号、第２０１０／２３９６３３号、第７，８０３，９０７号、第２０１０／１１９４４６号及び／または第７，１６６，６９７号明細書に記載のフォーマットを包含し、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｔｏｒｚ  ＭＡｂｓ．  ２０１１  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；  ３（３）：  ３１０―３１７を参照のこと。
【００６４】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、ペプチド（例えば配列番号１〜６のいずれか１つの配列、またはその誘導体を含む）に共有結合したサイズ調節が可能な乳酸グリコール酸共重合体ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）ブロック共重合体、または上記の他の結合剤から合成される。任意の比率のコンジュゲート及び未コンジュゲート高分子の混合物は、表面に望ましい密度の標的薬剤を備えたナノ粒子を生成するために使用される可能性がある。粒子の調節可能な特徴の説明は、表１で呈示される可能性がある。
【００６５】
一部の実施形態では、粒子にコンジュゲートされるペプチドは、上述の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはその誘導体（例えば、配列番号７〜３１のペプチドを包含する）を有する。一部の実施形態におけるナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧペプチドコンジュゲートから形成される、または他の実施形態では、ペプチドはあらかじめ形成された粒子にコンジュゲートされる。
【００６６】
本明細書で述べる「ナノ粒子」とは、１ｎｍ〜１０００ｎｍの間の任意の整数値を包含し（約１、２、５、１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００及び１０００ｎｍ、ならびにその間の全ての整数及び小数を包含する）、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲内の少なくとも１つの寸法を有するペプチドを表す。一部の実施形態では、ナノ粒子は約５０〜約１００ｎｍの少なくとも１つの寸法、例えば直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は約７０〜約１００ｎｍの直径を有する。
【００６７】
一部の実施形態では、粒子は微粒子である。「微粒子」には、少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）の範囲内で少なくとも１つの寸法を有する粒子を包含する。本明細書で述べる「粒子」とは、ナノ粒子及び微粒子を包含することを意味する。
【００６８】
粒子は循環血中の特性、体内分布及び分解速度を包含する、望ましい薬力学的有益性を提供するように設計される場合がある。このようなパラメータは、サイズ、形状、表面電荷、高分子の組成、リガンドコンジュゲーションの化学的性質、ペプチドコンジュゲーションの密度などを包含する。例えば、一部の実施形態では、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ高分子の一部がペプチドの末端結合を有し、粒子はＰＬＧＡ高分子コア、及びＰＬＧＡ−ＰＥＧ共重合体のＰＥＧ部分によって形成された親水性シェルを有する。親水性シェルは、例えば、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＭｅＯＨ高分子などの官能基に関して不活性な、エステルでエンドキャップされたＰＬＧＡ−ＰＥＧ高分子をさらに含む場合がある。一部の実施形態では、未コンジュゲート高分子の一部または全てが他の末端基（例えば、カルボキシ）を有し、表面特性の微調節を提供する。
【００６９】
本明細書に記載のペプチドは、任意の利用可能な工程を使用し、粒子に対して化学的にコンジュゲートされ得る。ペプチドコンジュゲーションに使用される官能基は、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＰＥＧ−ＮＨ２、ＰＥＧ−ＳＨを包含する。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  ＢｌＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９６を参照のこと。活性官能基は、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシル、アミン、スルフヒドリル、アルデヒド、不飽和結合、ヒドラジド、イソシアネート、イソチオシアネート、ケトン、及び化学結合で活性化することが知られている他の官能基を包含する。あるいは、ペプチドは小分子カップリング試薬を用いることによりコンジュゲートされる可能性がある。カップリング試薬の非限定的な実施例は、カルボジイミド、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビスクロロエチルアミン、例えばグルタルアルデヒド、無水物などの二官能性アルデヒドを包含する。
【００７０】
例示的な一実施形態では、ナノ粒子は、（ＰＬＧＡ高分子の乳酸（ＬＡ）：グリコール酸（ＧＡ）の比率及び／または分子量を調整することによって）ｉｎ  ｖｉｖｏで特異的生分解速度が調節される可能性があるコア（ＰＬＧＡ）を有する。一部の実施形態では、ＰＬＧＡは、乳酸／グリコール酸（Ｌ／Ｇ）組成が５／９５、１０／９０、１５／８５、２０／８０、２５／７５、３０／７０、３５／６５、４０／６０、４５／５５、５０／５０、５５／４５、６０／４０、６５／３５、７０／３０、７５／２５、８０／２０、８５／１５、９０／１０、または９５／５であることを包含し、ＬＡ：ＧＡの比率が２０：１〜１：２０であることをベースにする。ＰＬＧＡは、そのエステル結合の加水分解によって分解する。ＰＬＧＡの分解に必要な時間はモノマーの比率に関連し、グリコリド単位の含有量が多いほど、主にラクチド単位と比較して分解に必要な時間は短くなる。加えて、エステルでエンドキャップされた高分子は（遊離カルボン酸に対して）、より長い分解半減期を有する。
【００７１】
一部の実施形態では、ナノ粒子を製造するために用いるＰＬＧＡ高分子は、調節が可能な粒径を提供するため、例えば約２０Ｋ、約２５Ｋ、約３０Ｋ、約４０Ｋ、約５０Ｋ、約６０Ｋまたは約７０Ｋなど、約１０Ｋ〜約７０Ｋの範囲内の分子量を有する。一部の実施形態では、微粒子を製造するために使用されるＰＬＧＡ高分子は、例えば約１００〜約２００Ｋなど、約２０Ｋ〜約２００Ｋの範囲内の分子量を有する。高分子のＰＥＧ部分は、通常２Ｋ〜５Ｋの範囲内である。様々な実施形態では、ＰＬＧＡ−ＰＥＧペプチドと未コンジュゲートＰＬＧＡ−ＰＥＧの比率は、例えば約１：１５〜約１５：１、約１：１０〜約１０：１、約１：５〜５：１、または約１：２〜約２：１など、約１：２０〜約２０：１の範囲に及ぶ。一部の実施形態では、ＰＬＧＡ−ＰＥＧペプチド及び未コンジュゲート共重合体の比率は約１：１である。一部の実施形態では、高分子の少なくとも５０％はコンジュゲートされたペプチドを有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は約５０〜約２００ｎｍ、または約５０〜約１００ｎｍの範囲内のサイズ（平均径）を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は脱イオン水中で約−５ｍＶ〜約−４０ｍＶの範囲内、また、一部の実施形態では、約−１０ｍＶ〜約−３０ｍＶの範囲内（例えば、約−２０ｍＶ、約−２５ｍＶまたは約−３０ｍＶ）のゼータ電位を有する。
【００７２】
一部の実施形態では、ナノ粒子はさらに封入された活性剤を含み、その活性剤はインフルエンザ、アルツハイマー病、出血熱、脳性マラリア、がん、急性拒絶反応の予防及び本明細書に記載のその他を包含する、微小血管漏出を特徴とする疾患の治療を目的として本明細書に開示された活性剤である場合がある。これらの実施形態では、ナノ粒子は活性剤の徐放を提供する。例えば、一部の実施形態では、活性剤は、例えばアミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトセシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロン酸、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンエストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロン酸、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タクロリムス、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンのうち１つ以上の化学療法剤である。
【００７３】
一部の実施形態ではナノ粒子が実質的に球状であるが、ナノ粒子は選択的に非球状である場合がある。
【００７４】
物質が生体系と相互作用する経緯に影響を及ぼし得る、様々な物理的及び化学的特性が存在する。微粒子及びナノ粒子ベースの物質の場合、物質の選択、粒径分布及び粒子の形状分布は、全て粒子の活性に影響する重要なパラメータである。粒子のサイズ及び形状は、身体の様々な細胞との相互作用に影響し得ることが示されてきた。例えば、粒子の形状は様々な細胞タイプがどのように粒子を取り込み得るかに影響する可能性があり、通常だ円粒子は、細胞による取込みが球状粒子よりも困難である。粒子の形状を延伸することにより、例えば免疫系細胞などによる不要な粒子の取込みが低減する可能性があり、したがって身体内での粒子の半減期が延長される。粒子のサイズは、細胞の取込及び粒子との相互作用の能力にも影響する。したがって、粒子ベース系の活性の最適化は、粒子の粒径分布及び形状分布を調節することによって達成され得る。
【００７５】
一部の実施形態では、国際公開第２０１３／０８６５００号パンフレットに開示のナノ粒子の寸法及び／または粒子を延伸する工程は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
特定の実施形態では、三次元の微粒子またはナノ粒子は、長だ円体がａ＞ｂ＝ｃの式で記載できるように、ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）よりも大きく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）がｚ軸に沿った寸法（ｃ）と実質的に等しい長だ円体を含む。他の実施形態では、三次元の微粒子またはナノ粒子は、三軸だ円体がａ＞ｂ＞ｃの式で記載できるように、ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）よりも大きく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）がｚ軸に沿った寸法（ｃ）よりも大きい三軸だ円体である。さらに他の実施形態では、だ円体は、扁平だ円体がａ＝ｂ＞ｃの式で記載できるように、ｘ軸に沿った寸法（ａ）がｙ軸に沿った寸法（ｂ）と等しく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）がｚ軸に沿った寸法（ｃ）よりも大きい扁平だ円体である。ただし、本明細書に開示の非対称粒子は、ａ＝ｂ＝ｃである実施形態を包含しない。
【００７７】
さらに他の実施形態では、微粒子またはナノ粒子は、約１．１〜約５の範囲のアスペクト比を有する。他の実施形態では、アスペクト比は約５〜約１０の範囲を有する。一部の実施形態では、アスペクト比は約１．５〜約３．５の範囲を有する。
【００７８】
一部の実施形態では、粒子は、送達薬物（例えば、本明細書に記載のペプチド、及び／または他の薬剤）を封入する微粒子である。これらの実施形態では、粒子はその表面にコンジュゲートされたペプチドを含有するか、または含有しない場合がある。これらの実施形態では、粒子はペプチドの徐放を提供するために、長時間有効薬物デポ剤を提供する可能性がある。例示的な粒子のフォーマットは、国際公開第２０１４／１９７８９２号パンフレットに記載のものを包含し、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、粒子がポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）を取り込まず、高分子は実質的にＰＬＧＡ−ＰＥＧブロック共重合体のみからなる。これらの粒子が、例えば、黄斑変性（例えば、滲出性または萎縮性加齢性黄斑変性）または糖尿病性黄斑浮腫の治療として、眼内注入に使用される可能性がある。一部の実施形態では、送達物には望ましい場所に送達される活性剤を組み合わせることができる。一部の実施形態では、ナノ粒子はがんの治療を目的として投与される。これらのまたは他の実施形態では、粒子は、例えば約１〜約２５０μｍの範囲内など、１〜５００μｍの範囲内のサイズ（平均径）を有する。粒子は、ペプチドまたは薬物の徐放期間に応じて、約１日１回〜６ヶ月に１回、または約１週間もしくは約１ヶ月に１回注入する可能性がある。
【００７９】
他の態様では、本発明は１つ以上の細胞上でインテグリンの発現を同定する方法を提供する。例えば一部の実施形態では、本方法は、記載された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６のペプチド（または配列番号７〜３１のペプチドを包含する、上述の配列番号１〜６のいずれか１つの誘導体）を有した、（上記のように）その表面に１つ以上の細胞とコンジュゲートしたナノ粒子または微粒子に接触すること、及びナノ粒子の細胞への結合を可視化または検出することを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、例えば蛍光性、発光性、酵素性、または放射性標識などの検出可能な標識をさらに含み、その標識はＰＬＧＡ−ＰＥＧ高分子の一部にコンジュゲートされるか、ナノ粒子内に封入されるか、または他部を介して間接的に結合する可能性がある。一部の実施形態では、細胞は溶液中または培養液中に存在する場合がある。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの用途では、結合は、結合粒子の直接可視化、フローサイトメトリー、または溶液中の細胞からのプルダウンによって判定することができる。一部の実施形態では、磁性粒子は、高分子粒子とは対照的に、標的のインテグリンを発現している細胞を分離する利便性の高い方法を実現するために用いられる。
【００８０】
さらに他の実施形態では、ナノ粒子は患者に投与され、インテグリンを過剰発現している血管は、例えば腫瘍の近くでイメージ化される。
【実施例】
【００８１】
実施例１
ＶＥＧＦ、ＨＧＦ及びＩＧＦのシグナル伝達を阻害するＰ０７
Ｐ０７の標的は、α５β１及びαＶβ３インテグリンと同定された。インテグリンは、例えば血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲまたはｃ−ｍｅｔ）、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）などの多くの増殖因子受容体に対する補助受容体として機能する。この機序と一致して、Ｐ０７はこれらの受容体からのシグナル伝達を阻害することを呈示した（図１）。
【００８２】
これらの受容体及びその他は、血管新生及び微小血管透過性に関与する。この多因子阻害は、複数の機序が関与する疾病が、Ｐ０７及びその誘導体を用いて効果的に治療される可能性を高める。
【００８３】
実施例２
複数の眼モデルで新血管形成を阻害するＰ０７
Ｐ０７は、ヒト血管内皮の増殖因子（ＶＥＧＦ）を網膜で過剰発現させたトランスジェニックマウスにおいて、血管漏出を阻害することを呈示した。モデルの血液漏出は、網膜下に溜まった血液が網膜剥離を引き起こすほど重度である。本モデルにおいて、Ｐ０７はほぼ完全に網膜剥離を抑止した（図２）。
【００８４】
Ｐ０７は、ウサギ眼の浮腫モデルにおいても同様に試験を行った。本モデルでは、局所血管が漏出しやすくなっている眼に、ヒトＶＥＧＦを直接注入した。ＶＥＧＦを注入した３日後にフルオレセインナトリウムを静脈内投与し、その結果生じた漏出から眼中の蛍光の量を測定して漏出の程度を評価した。ＶＥＧＦの注入前に、眼中に約５０μｇのＰ０７が存在した場合、血管漏出は劇的に阻害された（図３）。これらの結果は、Ｐ０７がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて強力な抗浮腫剤であることを示唆する。
【００８５】
実施例３
がん組織の増殖を阻害するＰ０７
Ｐ０７は、同所性トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）異種移植片（図４）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）及びグリア芽腫異種移植片（図なし）の増殖を阻害する。Ｐ０７に応答する腫瘍は、劇的に血管を減退させる（図５）。
【００８６】
これらの結果は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた場合に、Ｐ０７が相乗効果を有し得ることを示唆する。Ｐ０７及び免疫チェックポイント阻害剤は、同時に血管新生の阻害、ならびに樹状細胞の成熟及びより強固なリンパ球内皮輸送を可能にすることで腫瘍への免疫応答を強化し、チェックポイント阻害剤が、腫瘍細胞を死滅させる細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤を可能にし得る。
【００８７】
実施例４
Ｐ０７とコンジュゲートしたナノ粒子（Ｎ０７）の特性
Ｎ０７は、抗血管新生及び抗腫瘍形成の特性を有する、ペプチドとコンジュゲートしたナノ粒子である。Ｎ０７はインテグリンαＶβ３複合体と特異的に結合し、封入された送達薬物を運搬する能力を有する。
【００８８】
Ｎ０７は、共有結合によってＮ０７とコンジュゲートする、サイズ調節が可能な乳酸グリコール酸共重合体ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）ブロック共重合体から合成される。任意の比率のコンジュゲート及び未コンジュゲート高分子の混合物は、表面に望ましい密度のＰ０７を備えたナノ粒子を生成するために使用される可能性がある。粒子の調節可能な特徴についての説明は、表１に示される可能性がある。
【００８９】
【表１】
2018535224.tif 000003
【００９０】
Ｎ０７は、Ｐ０７ペプチド及びＰＬＧＡ−ＰＥＧブロック共重合体から合成された。Ｐ０７は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅにて固相合成により産生され、ＨＰＬＣ／ＭＳにより純度を評価した。ペプチドはＮ末端にアミン、かつＣ末端にアミドを有する。ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロック共重合体はＰｏｌｙＳｃｉＴｅｃｈ（登録商標）から購入し、純度及び分子量はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及びフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）により評価した。
【００９１】
コンジュゲーションを行うため、Ｐ０７をＤＭＳＯ中に溶解して１００ｍｇ／ｍｌとし、１７０ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ官能基化ＰＬＧＡ−ＰＥＧ（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）のＤＭＦ溶液に加えた。混合物に４０倍モル過剰量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加え、一晩室温で撹拌した。その後、混合物をエーテル及びメタノールの冷混合物に滴下して加え、遠心機により２２，０００ｘｇで沈降させた。その後、ペレットをメタノールで繰り返し洗浄し、未反応のペプチドを除去するために遠心機で沈降させた。上澄みを廃棄し、ペレットは真空下に放置して数時間乾燥し、固形のＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＳＰ２０４３を産生した。例えば、薬物及び色素など、他の送達物も同様に類似の工程を経てＰＬＧＡ−ＰＥＧにコンジュゲートされる可能性がある。
【００９２】
ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｐ０７及びＰＬＧＡ−ＰＥＧの混合物をＤＭＦ中に溶解して１０ｍｇ／ｍｌとし、磁気撹拌下で脱イオン水中に滴下して、ナノ沈降と呼ばれる工程によりナノ粒子を形成した。ナノ沈降を行う前に、望ましい送達物をＤＭＦ混合物に加え、疎水性ＰＬＧＡコア内に充填した送達物を備えたナノ粒子を得た。数時間攪拌した後、粒子はＵｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ８１００９６）を用いてろ過及び濃縮した。
【００９３】
ＨＰＬＣを使用して、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳのＰ０７に対するコンジュゲーションの効率を評価した。場合によっては、ｃ末端のＦはＷに交換され、Ｗ残基の吸光度及び蛍光の計測を可能にした。エーテル及びメタノール中で沈降させる前の反応混合物からＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｐ０７をＤＭＳＯで希釈し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００カラムを通じて水−アセトニトリル移動相内で流した。ペプチドは、吸光度が２２０ｎｍ（ペプチド骨格）及び２８０ｎｍ、ならびに蛍光が２９５／３４８ｎｍの励起／発光（トリプトファン、Ｗ）を介して検出された。未反応のＰ０７の量は、遊離したＰ０７のピークを積分することにより判定した。ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｐ０７反応混合物を、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨまたはＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ及びＰ０７の対照反応混合物と比較したが、いずれもＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｐ０７を形成する反応を起こさないと考えられる。反応したＰ０７は、遊離したＰ０７のピークに寄与しないと考えられたため、対照反応と比較した時のＰ０７のピークの減少は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳ共重合体へのコンジュゲーションを示唆する。全ての積分値がペプチド濃度の直線範囲内に収まるように、結果を遊離ペプチドの標準曲線と比較した。結果を表２及び図６に示す。
【００９４】
【表２】
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【００９５】
ＬａｖａＰｅｐ（商標）による評価：Ｎ０７の表面上のペプチドを直接検出するため、ＬａｖａＰｅｐ（商標）ペプチド定量化キット（Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＬＰ０２２０１０）を使用した。粒子を超純水中に３〜５ｍｇ／ｍｌになるよう懸濁させ、暗所でＬａｖａＰｅｐ希釈標準溶液と共に９６ウェルプレート中で１時間インキュベートした。ＬａｖａＰｅｐ希釈標準溶液中のエピココノン色素は、ペプチド上のＡｒｇ残基と相互作用して高蛍光性分子になる。蛍光は、Ｂｉｏｔｅｋ  ＨＴ  Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーにより５３０／５９０ｎｍで計測した。ナノ粒子から得たシグナルを、既知量の遊離ペプチドの標準希釈曲線と比較した。定量化の結果は表３に示され、ＳＰ２０４３が効率的にＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳ共重合体にコンジュゲートされ、ナノ粒子に取り込まれたことを実証している。
【００９６】
【表３】
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【００９７】
サイズ評価：Ｎ０７を水に懸濁させて１ｍｇ／ｍｌとし、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０を使用して分析した。Ｚ平均粒子径及び強度ベースの粒径分布を測定して記録した。結果は表４及び図７に示され、Ｐ０７のＺ平均粒子径が約７０〜８０ｎｍであり、ナノ粒子にコンジュゲートされたＰ０７を用いたサンプルでは、サイズの増加がわずかに見られたことを実証している。
【００９８】
【表４】
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【００９９】
ゼータ電位：Ｎ０７を水に懸濁させて１ｍｇ／ｍｌとし、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０を使用して分析した。表面のゼータ電位を測定して記録した。結果は図８に示され、Ｎ０７は、脱イオン水中においてゼータ電位が陰性であり、ＰＥＧ上の種々の末端基を用いて２５ｍＶ付近に調節することはほとんど不可能であることを実証している。図８では、中性はメトキシ末端ＰＥＧであり、陰性はカルボキシ末端ＰＥＧである。
【０１００】
実施例５
インテグリンαｖβ３及びインテグリンα５β１標的に対するＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｐ０７の結合
粒子は上記のように調製され、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｐ０７またはＰＬＧＡ−ｍＰＥＧのいずれかになるよう完全に作製される。インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１及びヒト血清アルブミンは、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８  ＴＦＰ−ｅｓｔｅｒによって標識された。粒子はインテグリンのＰＢＳ溶液と共に、並行して粒子を含まないインテグリンまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＰＢＳ溶液を対照サンプルと共に室温で一晩インキュベートした。その後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  ＨＲメディアを使用し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）遠心分離スピンカラムを介して遊離したインテグリンまたはＨＳＡタンパク質から粒子を分離した。分離後、蛍光シグナルをＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダーで計測し、ＳＥＣメディアに通した粒子からのインテグリンの量を評価した。結果を図９に示す。
【０１０１】
インテグリンαｖβ３に対する結合について、競合サンプルを添加して上記プロトコールを繰り返し行った。簡潔に述べれば、様々なペプチド（Ｐ０７及び不活性であることが示されているＰ０７の部分的スクランブル配列）を、標的粒子及び１００倍過剰のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８で標識した遊離インテグリン溶液に加えて室温で一晩インキュベートした。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  ＨＲメディアを使用し、ＳＥＣ遠心分離スピンカラムを介して溶液を分離した。前述のように、蛍光を使用して、ＳＥＣメディアに通した粒子から得たインテグリンの量を評価した。結果を図１０に示す。
【０１０２】
ナノ粒子のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び微小血管内皮細胞（ＭＥＣ細胞）に対する結合試験を行った。粒子は、上記のように１重量％のＴＡＭＲＡ色素を添加して調製した。ナノ沈降を行った後、粒子はＡｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒｓ（ＭＷＣＯ  １００，０００）を用いて濃縮し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  ＨＲメディアを使用し、ＳＥＣ遠心分離スピンカラムを介してろ過することによって、遊離したＴＡＭＲＡ色素または遊離した高分子もしくはペプチド物質を除去した。その後、細胞をナノ粒子と共に１００，０００細胞／ｍｌ及び粒子１ｍｇ／ｍｌの条件でインキュベートした。ナノ粒子は、標的ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｐ０７高分子または非標的ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ高分子のいずれかから作製される。３７℃で１時間インキュベーションを行った後、細胞を遠心機により沈降させ、上澄みを除去した。細胞をＰＢＳに再懸濁させ、その結果生じたシグナルをＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダーで読み取り、細胞からの蛍光粒子の量を評価した。結果を図１１に示す。
【０１０３】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び微小血管内皮細胞（ＭＥＣ）の接着を阻害する能力について、粒子の試験を行った。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行う前に、粒子は超遠心分離カラムを使用して超純水から適切なメディアに移し、メディア中で１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、９６ウェルプレートに加えた。メディア単体及び１００μＭ及び２５μＭのＡＸＴ２０１（既知の接着阻害剤）を有するメディアを、陽性対照及び陰性対照としてプレートに加えた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＥＣ細胞を、２０，０００細胞／ウェルの条件で粒子、ペプチド及びメディアに加えた。９６ウェルプレートを、３７℃及び５％ＣＯ２下で約２時間インキュベートした。その後、ウェルをＣａ２＋及びＭｇ２＋含有ＤＰＢＳで洗浄し、４μｇ／ｍｌのカルセインＡＭ色素を含有したメディアを注いだ。その後、プレートを３０分間インキュベートし、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋含有ＤＰＢＳで再洗浄した。その後、蛍光をＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダーにより４８５／５２８ｎｍで計測し、ウェルの表面に接着した細胞数を定量した。結果は図１２に示され、Ｎ０７がＭＤＡ−ＭＤ−２３１腫瘍細胞及びＭＥＣ細胞に対して抗接着活性を有することを実証している。図１２では、％はＰ０７とコンジュゲートしたＰＬＧＡ−ＰＥＧ分子の量を表す。「＋」または「−」は、封入されたＰ０７の有無を表す。
【０１０４】
ＭＥＣ増殖の阻害について粒子の試験を行った。ＭＥＣ細胞に対して、ＭＴＴ  Ｖｙｂｒａｎｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用した比色ベースの増殖アッセイを実行した。２０００細胞／ウェルになるようフェノールレッド不含ＥＣＭ−２ＭＶメディアを使用して９６ウェルプレートに播種し、１８〜２０時間かけて接着させた。粒子を含まない元のメディアは、５ｍｇ／ｍｌになるようメディアに懸濁させたＮ０７粒子、もしくはＡＸＴ２０１ペプチド含有メディア、またはメディア単体と交換した。メーカーの推奨に従って、４日後にメディアを１００μｌのＭＴＴ試薬と交換した。４時間後、１００μｌのＳＤＳ溶液を各ウェルに加え、３７℃でさらに４時間インキュベートした。吸光度は、Ｂｉｏｔｅｋ  ＨＴ  Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーにより５７０ｎｍで計測し、生細胞中のミトコンドリア還元酵素によるＭＴＴからホルマザンへの変化をとらえた。結果は図１３に示され、Ｎ０７がＭＥＣ細胞に対して抗増殖活性を有することを実証している。図１３では、％はＰ０７とコンジュゲートしたＰＬＧＡ−ＰＥＧ分子の量を表す。「＋」または「−」は、封入されたＰ０７の有無を表す。
【０１０５】
ＰＥＧ−Ｐ０７コンジュゲートが接着を阻害する能力について試験を行った。ＮＨＳで官能基化したＰＥＧ８及びＰＥＧ２４を、ＤＭＦに約１５０ｍｇ／ｍｌになるよう溶解した。ペプチドを１：１モル比でＤＭＳＯに加えて１００ｍｇ／ｍｌとし、同時に４０倍モル過剰量のＤＩＰＥＡを加えた。混合物を冷エーテル及びメタノール中で沈降させて数回洗浄し、ＤＩＰＥＡ、溶媒及び遊離ＰＥＧを除去した。その結果生じた混合物を、上記のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた接着アッセイにおいて、陽性及び陰性対照と共に使用した。結果は図１４に示され、ＰＥＧ−Ｐ０７の接着活性を実証している。
【０１０６】
実施例６
ペプチドとコンジュゲートした粒子の延伸
粒子のサイズ及び形状は、粒子の活性を最適化するために精巧に処理された。粒子は効率よく作製及び延伸された。延伸プロトコールの前後でペプチドの充填量は同じままであり、ペプチドは工程を通して安定し続けている。
【０１０７】
微粒子形成：最初に乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）に２０ｍｇ／ｍＬになるよう試験管内で溶解し、ボルテックスで十分に溶解した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のＰ０７ペプチドストック（２０ｍｇ／ｍL）を、ＰＬＧＡ／ＤＣＭ溶液にマイクロピペットで移した。初期のペプチドのＰＬＧＡに対する質量比は、例えばペプチド：ＰＬＧＡが１：５０及び１：２０など、変更する可能性がある。ブランクの微粒子用に、ＤＭＳＯのみ同じ容量をピペットで量り取った。混合物の超音波処理を、試験管を用いて氷上で行った。超音波処理を約５〜１０Ｗに等しい振幅設定である「３０」で２０秒間行った。この一次エマルジョンを、速やかに５０ｍＬの１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液に注ぎ、３．６〜３．８ｋｒｐｍで１分間ホモジナイズした。全容量を１００ｍＬの０．５％ＰＶＡ溶液に移し、ドラフトの中で約３．５時間攪拌した。その後、洗浄過程を３回行った。洗浄過程ごとに、微粒子溶液を４℃、４ｋｒｐｍで５分間遠心機にかけ、その後上澄みを除去した。続いて、４０ｍＬの冷却Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて微粒子のペレットを再懸濁させ、洗浄過程を繰り返し行った。最後の遠心分離を行った後、５ｍＬの水を加えてサンプルを再懸濁させた。サンプルは液体窒素中で簡易凍結させ、凍結乾燥機内に置いた。凍結乾燥後、全ての微粒子を−２０℃で保存した。
【０１０８】
ナノ粒子形成：最初にＰＬＧＡをＤＣＭに望ましい濃度（通常２０ｍｇ／ｍＬまたは４０ｍｇ／ｍＬ）になるよう試験管内で溶解し、ボルテックスで十分に溶解した。ＤＭＳＯ中の、例えばＰ０７などのペプチドストック（２０ｍｇ／ｍL）を、ＰＬＧＡ／ＤＣＭ溶液にマイクロピペットで移した。ペプチドのＰＬＧＡに対する質量比は変更する可能性がある。例示的な製剤は、ペプチド：ＰＬＧＡが１：５０である。ブランクのナノ粒子用に、ＤＭＳＯのみ同じ容量をピペットで量り取った。混合物の超音波処理を、試験管を用いて氷上で行った。超音波処理（Ｍｉｓｏｎｉｘ）を約５〜１０Ｗに等しい振幅設定である「３０」で２０秒間行った。この一次エマルジョンを、速やかに５０ｍＬの１％ＰＶＡ溶液に注ぎ、「３０」〜「１００」のうち任意の振幅設定で、氷上において２分間超音波処理を行った。全容量を１００ｍＬの０．５％ＰＶＡ溶液に移し、ドラフトの中で約３．５時間攪拌した。その後、洗浄過程を３回行った。洗浄過程ごとに、ナノ粒子溶液を４℃、１７ｋｒｐｍで１０分間遠心機にかけ、その後上澄みを除去した。続いて、３０ｍＬの冷却Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を加えてナノ粒子のペレットを再懸濁させ、洗浄過程を繰り返し行った。最後の遠心分離を行った後、５ｍＬの水を加えてサンプルを再懸濁させた。サンプルは液体窒素中で簡易凍結させ、凍結乾燥機内に置いた。凍結乾燥後、全てのナノ粒子を−２０℃で保存した。
【０１０９】
微粒子の延伸：凍結乾燥したＰＬＧＡ粒子は、１０％ＰＶＡ／２％グリセロール溶液中で２．５ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解し、この溶液の１０ｍｌを長方形のペトリ皿に入れて一晩乾燥した。その結果生じたフィルムを一定のサイズに切断し、２つのアルミニウム台の間に充填して９０℃になるまで加熱した。フィルムの長さを測定し、カスタマイズした延伸装置を使用してフィルムを徐々に延伸し、望ましい倍数の延伸フィルム（例えば、２倍延伸しただ円粒子）を産生した。その後、フィルムを室温まで冷却し、アルミニウムブロックから除去した。ＰＶＡフィルムは水に溶解して、その結果生じた粒子懸濁液を３回洗浄した。粒子は使用する前に凍結乾燥させた。
【０１１０】
ＳＥＭ及びＴＥＭによる評価：走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で使用するため、凍結乾燥させた粒子をカーボンテープ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｈａｔｆｉｅｌｄ，  ＰＡ）の上に置き、アルミニウム台の上に置いた。サンプルは金パラジウムを用いてスパッタされ、ＪＨＵ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＭｉｃＦａｃのＬＥＯ／Ｚｅｉｓｓ  ＦＥＳＥＭを用いてＳＥＭイメージングを行った。ＳＥＭイメージのＩｍａｇｅＪ解析を用いて、微粒子サンプルのサイジングを行った。結果を図１５に示す。延伸した粒子を図１６に示す。
【０１１１】
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で使用するため、最初にナノ粒子を水に１ｍｇ／ｍＬになるように再懸濁させた。１０μＬのサンプルをカーボンコーティングした銅グリッドの上に滴下し、ドラフトの中で２時間乾燥させた。その後、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１２０システムを使用して、ＴＥＭによる無染色イメージングを行った。結果は図１７に示され、ペプチドを充填したＮＰの未延伸（左）または２倍延伸（右）の状態を示す。
【０１１２】
微粒子の充填及び放出の定量化：充填量を測定するため、既知の質量の微粒子をＤＭＳＯに溶解した。ペプチド充填微粒子及び対応するブランク微粒子に対し、ゲル電気泳動（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮシステム）及び銀染色解析による定量化を行った。１２ウェルの１０％〜２０％Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮトリス−トリシンゲルを使用し、同時に１０倍トリス／トリシン／ＳＤＳ泳動用緩衝液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１倍に希釈した。各ゲルは、既知量のペプチドのスタンダードシリーズを含有した。ペプチドのスタンダードシリーズは各ウェルにつき０、６２．５、１２５、２５０及び５００ｎｇのペプチドを包含した。残りのウェルはタンパク質スタンダード、ならびにペプチド充填及び対照用ブランクの、２つの微粒子サンプルを包含した。ＤＭＳＯサンプルを１：１の容量でサンプル緩衝液と混合した。サンプル緩衝液を２４％グリセロール１倍ＰＢＳ溶液で作製した。ゲル電気泳動では、２．５ｋＤａのタンパク質スタンダードのバンドが、ゲル下流側へ約３分の２進むまで泳動を行った。ゲル染色の後に銀染色プロトコールを行った。展開を行う過程で、最小のペプチドスタンダード（この場合は６２．５ｎｇ）が現れ始めたら直ちに反応停止液を加えた。ゲルイメージをデジタルカメラでキャプチャし、ＩｍａｇｅＪのゲルバンド強度定量化機能を用いて解析した。結果を図１８に示す。
【０１１３】
放出量を測定するため、既知の質量の微粒子を１ｘＰＢＳに懸濁させて、３７℃のオーブン内にあるシェーカーの上に置いた。様々な時点で、サンプルを約２．５ｋｒｃｆで５分間遠心機にかけた。上澄みを採取して−８０℃で保存し、新鮮なＰＢＳをサンプルに加えた。上澄みに放出されたペプチドの定量化を、ゲル電気泳動、銀染色、及びゲルバンド解析により行った。結果を図１９に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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