(57)【要約】本発明は、高血圧の処置または予防において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高血圧の処置または予防において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物。
【請求項２】
少なくとも軽度高コレステロール血症を有する個体における高血圧の処置または予防において使用するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
高血圧の低減、予防および／または制御において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む食品材料組成物または栄養補助食品組成物。
【請求項４】
ラクトバチルス・プランタルムが１０５ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲内の用量で投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
１日１回または２回投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
食事後または食事中に投与または服用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
カプセル化されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ラクトバチルス・プランタルムが濃縮および／または凍結乾燥されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ビタミン、ミネラル、植物性化学物質、酸化防止剤およびそれらの組合せから選択される１つ以上の活性成分をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
１つ以上の追加高血圧低減剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
以下の物質、スタチン、ステロールおよび／またはスタノールのうちの１つ以上と組み合わせて投与または服用される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
４℃以下で保存される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ラクトバチルス・プランタルムの株の成長に特異的なプレバイオティック成長培地をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記プレバイオティック成長培地が、逆酵素反応により、前記ラクトバチルス・プランタルムの株によって生産されうる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記プレバイオティック成長培地がオリゴ糖を含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記オリゴ糖がガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
有効量のラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を有する組成物を投与することによって、高血圧を持つ個体または高血圧の危険がある個体を処置する方法。
【請求項１８】
ラクトバチルス・プランタルムが１０５ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲内の量で投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が１日２回投与される、請求項１７〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が食後に投与される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物がカプセル化されている、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ラクトバチルス・プランタルムが濃縮および／または凍結乾燥されている、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、ビタミン、ミネラル、植物性化学物質、酸化防止剤およびそれらの組合せから選択される１つ以上の活性成分をさらに含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が１つ以上のコレステロール低減剤をさらに含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が以下の物質、スタチン、ステロールおよび／またはスタノールのうちの１つ以上と組み合わせて投与される、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が４℃以下で保存される、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
１日１回または２回、１×１０５〜１０１２細胞の範囲内の量で投与される、高血圧を予防し、処置し、または調整する方法において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、またはその１つもしくは複数の変異株。
【請求項２８】
１×１０８〜１×１０１０細胞の範囲内の量で投与される、請求項２７に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項２９】
約１．８×１０９細胞の量で投与される、請求項２７または２８に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項３０】
活性株約１２０ｍｇの量で投与される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項３１】
朝食および夕食の直前、食中、または食後に投与される、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項３２】
朝食および夕食の直前に投与される、請求項３１に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項３３】
健康補助食品として投与される、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項３４】
凍結乾燥された形態にある、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項３５】
１つ以上のプロバイオティクスおよび／またはプレバイオティクスと共に投与される、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項３６】
投与前は４℃以下で保存される、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項３７】
前記ラクトバチルス・プランタルムの株の成長に特異的なプレバイオティック成長培地と組み合わせて投与される、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項３８】
前記プレバイオティック成長培地が、逆酵素反応により、前記ラクトバチルス・プランタルムの株によって生産されうる、請求項３７に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項３９】
前記プレバイオティック成長培地がオリゴ糖を含む、請求項３８に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項４０】
前記オリゴ糖がガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）を含む、請求項３９に記載のラクトバチルス・プランタルム。
【請求項４１】
医薬品または栄養補助食品の調製において使用するためのラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を生産する方法であって、
ａ）培養ブロスを生産するのに十分な条件下でラクトバチルス・プランタルムを発酵させる工程、
ｂ）ラクトバチルス・プランタルム細胞の濃縮物が形成されるように前記培養ブロスから前記ラクトバチルス・プランタルムを濃縮する工程、
ｃ）混合物が形成されるように前記濃縮物を凍結保護物質にさらす工程、および
ｄ）前記混合物を凍結乾燥する工程
を含む方法。
【請求項４２】
前記ラクトバチルス・プランタルム細胞の凍結乾燥に関する生残率が７０％超である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ラクトバチルス・プランタルム細胞が最大８×１０１１ｃｆｕ／ｇの量で生産される、請求項４１または４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物のためのラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株、あるいは請求項２７〜４０のいずれか一項に記載のラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を生産するための、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）の処置、予防および／または管理に有用であることが示された、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧は、血圧上昇（ｈｉｇｈ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）とも別称され、重大な健康問題であり、心血管疾患（ＣＶＤ：ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）にとって危険因子である。世界保健機関（ＷＨＯ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ）は、２０２０年までに、すべてのヒトの死の最大４０％がＣＶＤに関係することになると予測している。高コレステロールは、血管におけるコレステロールプラークの蓄積により、高血圧と関連することが多い。
【０００３】
高血圧の処置には、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬およびベータ−遮断薬がある。しかし、これらの処置はいずれもそれぞれの副作用を伴わないわけではなく、それゆえに、代替的処置またはより自然な処置が好ましいであろう。
【０００４】
胆汁酸調節因子を調節することによるコレステロールレベルの低減、そしてそれゆえに可能性として高血圧の低減における、微生物株の使用は公知である。胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ：Ｂｉｌｅ  Ｓａｌｔ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）活性プロバイオティクスは管腔内胆汁酸脱抱合を増加させて、増加した循環脱抱合型胆汁酸塩レベルをもたらすことが、ヒトおよび動物研究において示されている。胆汁酸は腸内で脱抱合されるので、食事性および胆汁性コレステロールの吸収が低減し、胆汁の再循環が改変されて、血中の低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ：ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）レベルの、より良好な制御をもたらす。
【０００５】
血圧の低減におけるプロバイオティクスの役割は、研究によって示唆されている。９つの治験のメタ分析（非特許文献１）は、プロバイオティクス消費が、対照群と比較して、収縮期ＢＰを−３．５６ｍｍＨｇ（９５％信頼区間、−６．４６〜−０．６６）、拡張期ＢＰを−２．３８ｍｍＨｇ（９５％信頼区間、−２．３８〜−０．９３）変化させることを示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｈａｌｅｓｉ  ｅｔ．ａｌ．，（２０１４），Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，６４，（４），８９７−９０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それゆえに、高血圧のための改良された処置または代替的処置を提供することが、本発明の目的である。個体における、特に軽度高コレステロール血症を有する個体における、血圧を制御または低減する方法を提供することも、本発明の目的である。高血圧を低減するために使用することができるプロバイオティック組成物を提供することは、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様では、高血圧の処置、制御または予防において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物が提供される。
【０００９】
本発明の別の一態様では、高血圧の処置、制御または予防において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物が提供される。
【００１０】
本発明のさらなる一態様では、高血圧の処置、制御または予防のための医薬品の製造において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物が提供される。
【００１１】
高血圧の処置または予防における本組成物の使用は、少なくとも軽度高コレステロール血症を有する個体における使用であることが好ましい。
【００１２】
本発明のさらにもう一つの態様では、高血圧の低減、予防および／または制御において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む食品材料組成物または栄養補助食品（ｆｏｏｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）組成物が提供される。
【００１３】
本発明のさらにもう一つの態様では、高血圧の処置、制御または予防のための栄養補助食品または食品材料の製造において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物が提供される。
【００１４】
すべての態様において、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株は、好ましくは、高血圧を低減、予防または制御するように有効量で、組成物中に存在するであろう。好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは１０５ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲内の量で個体に投与されるであろう。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは１０８ｃｆｕ／ｇ〜１０１０ｃｆｕ／ｇの範囲内の量で投与されるであろう。ラクトバチルス・プランタルムは１×１０５ｃｆｕ〜１×１０１２ｃｆｕの範囲内の量で個体に投与されうる。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは１×１０８ｃｆｕ〜１×１０１０ｃｆｕの範囲内の量で投与されるであろう。最も好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは、約１．８×１０９ｃｆｕを与える活性株約１２０ｍｇの量である。ただし、個体の状態および高血圧の程度ならびに他の医学的考慮事項に応じて、異なる投与量が投与されうることは理解されるであろう。
【００１５】
投与頻度も個体の状態に依存するであろうが、好ましくは、本組成物は１日２回投与されるであろう。
【００１６】
本組成物は１日のうちのいつ投与されてもよいが、好ましくは、本組成物は食後に投与される。食後の投与はＢＳＨ活性ラクトバチルス・プランタルムの脱抱合効果を有利に高めうる。ほとんどの胆汁酸分泌は食事の消費後に起こり、分泌される胆汁酸の量は消費された食品の量およびタイプと比例関係にある。
【００１７】
本組成物が、例えば粉末、錠剤、またはカプセル剤の形態など、容易に投与される任意の形態をとりうることは、当業者には理解されるであろう。あるいは、本組成物は食品材料または食品添加物の形態をとりうる。本組成物は、固形または液状の食品材料と混合することができる飲用可能な流動体、スプレッドおよび／または粉末の形態をとりうる。本組成物は、例えば食品／飲料に配合されるまたは食品／飲料と並行して消費される、健康補助食品（ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として使用することができるであろう。
【００１８】
本組成物は、腸環境での、成分のうちの１つ以上の放出プロファイルを修飾するための賦形剤または担体化合物を、さらに含みうる。放出は、コレステロール吸収を低減するのに最も適当な時間に起こり、よって高血圧を制御すべきである。典型的には、培養物は、それが小腸の腸細胞に到達するまでは、比較的完全な形で生き残らなければならない。
【００１９】
本組成物はカプセル化することができる。数多くのカプセル化技法が当業者には明らかであるだろう。そして使用されるカプセル化技法は、消化管通過時に要求されるラクトバチルス・プランタルムの安定性に適合しているであろう。カプセル化物は、ラクトバチルス・プランタルムに特異的に適合しているプレバイオティクスを含みうる。
【００２０】
ラクトバチルス・プランタルムは濃縮および／または凍結乾燥されうる。好都合なことに、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）は、パイロット規模の試験製造において優れた凍結乾燥生残性を示している。
【００２１】
本組成物は、ビタミン、ミネラル、植物性化学物質、酸化防止剤、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の活性成分を、さらに含みうる。
【００２２】
ビタミンは、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミンなどの脂溶性ビタミン、ならびにそれらの組合せを包含しうる。いくつかの実施形態において、ビタミンは、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＢ群（チアミン、すなわちＢ１、リボフラビン（ｒｉｂｏｆｌａｖｏｉｎ）、すなわちＢ２５、ナイアシン、すなわちＢ３、ピリドキシン、すなわちＢ６、葉酸、すなわちＢ９、シアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌｉｍｉｎ）、すなわちＢ１２、パントテン酸、ビオチン）などの水溶性ビタミン、ならびにそれらの組合せを包含しうる。
【００２３】
ミネラルは、ナトリウム、マグネシウム、クロム、ヨウ素、鉄、マンガン、カルシウム、銅、フッ化物、カリウム、リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組合せを包含しうるが、これらに限定されるわけではない。
【００２４】
酸化防止剤は、アスコルビン酸、クエン酸、ローズマリー油、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リン酸ビタミンＥ、トコフェロール、リン酸ジ−アルファ−トコフェリル、トコトリエノール、アルファリポ酸、ジヒドロリポ酸、キサントフィル、ベータクリプトキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ベータ−カロテン、カロテン、混合カロテノイド、ポリフェノール、フラボノイド（ｆｉａｖｏｎｏｉｄ）、およびそれらの混合物を包含しうるが、これらに限定されるわけではない。
【００２５】
植物性化学物質は、カロテノイド（ｃａｒｔｏｔｅｎｏｉｄ）、クロロフィル、クロロフィリン、繊維、フラバノイド、アントシアニン（ａｎｔｈｏｃｙａｍｎ）、シアン化物（ｃｙａｎｉｄｉｎｇ）、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、フラバノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｉｌｏｃａｔｅｃｈｉｎｇａｌｌａｔｅ）、テアフラビン、テアルビジン、プロアントシアニン、フラボノール、ケルセチン、ケンペロール、ミリセチン、イソラムネチン、フラボノンヘスペレチン（ｆｌａｖｏｎｏｎｅｓｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ）、ナリンゲニン、エリオジクチオール、タンゲレチン、フラボン、アピゲニン、ルテオリン、リグナン、フィトエストロゲン、レスベラトロール、イソフラボン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、大豆イソフラボン、およびそれらの混合物を包含しうるが、これらに限定されるわけではない。
【００２６】
本組成物は１つ以上のコレステロール低減剤をさらに含みうる。例えば本組成物はベータグルカンを含みうる。
【００２７】
本組成物は、１つ以上のスタチン、ステロールおよび／またはスタノールと共に投与されうる。本組成物を、他の高血圧活性成分（ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｍｅｎｔ）と共投与するか、またはそのような活性成分との併用治療の一部として使用することで、投与される成分の量を低減し、それゆえに副作用を制限しうる。
【００２８】
好ましくは、本組成物は４℃以下で保存される。この温度範囲では細菌の成長が安定化するので、組成物の安定性が保証される。
【００２９】
本組成物は、ラクトバチルス・プランタルムの株の成長に特異的なプレバイオティック成長培地を、さらに含みうる。プレバイオティック成長培地は、好ましくは、逆酵素反応により、ラクトバチルス・プランタルムの株によって生産されうるであろう。この酵素は、糖分解酵素またはグリコシダーゼ酵素を含みうる。これらの糖分解酵素またはグリコシダーゼ酵素は細菌または真菌に由来しうる。
【００３０】
プレバイオティック成長培地は、ガラクト−オリゴ糖（ｇａｌａｃｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｈａｒｉｄｅ）（ＧＯＳ）、グルコ−オリゴ糖（ｇｌｕｃｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｈａｒｉｄｅ）、またはフルクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）などのオリゴ糖を、さまざまな濃度で含みうる。オリゴ糖の形態は、本株のβ−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、ならびにβ−キシロシダーゼの逆反応によって生産される形態と実質的に同じであることが好ましい。
【００３１】
プレバイオティック成長培地は、安全性、耐性、および貯蔵寿命に悪影響を及ぼすことなく腸内で本株の最適な成長および生残をもたらす量で存在しうる。
【００３２】
本発明のさらなる一態様によれば、有効量のラクトバチルス・プランタルムを有する組成物を投与することによって、上昇した高血圧を持つ個体または上昇した高血圧の危険がある個体を処置する方法が提供される。
【００３３】
本発明のさらなる一態様によれば、１日２回、１×１０５〜１０１２細胞の範囲内の量で投与される、高血圧を予防し、処置し、または調整する方法において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、またはその１つもしくは複数の変異株が提供される。
【００３４】
より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは、１×１０８〜１×１０１０細胞の範囲内の量で投与されうる。最も好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは約１．８×１０９細胞の量で投与される。ラクトバチルス・プランタルムが活性株約１２０ｍｇの量で投与されることも好ましい。
【００３５】
ラクトバチルス・プランタルムは、朝食および夕食の直前、食中、または食後に投与されうる。好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは、朝食および夕食の直前に投与される。
【００３６】
ラクトバチルス・プランタルムは、薬として、または健康補助食品として、投与されうる。
【００３７】
ラクトバチルス・プランタルムは凍結乾燥された形態をとりうる。
【００３８】
ラクトバチルス・プランタルムは１つ以上の追加高血圧活性成分要素と共に投与されうる。そのような要素は、アンジオテンシン−変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬またはベータ−遮断薬を含みうる。さらにまた、ラクトバチルス・プランタルムは、１つ以上のプロバイオティクスおよび／またはプレバイオティクスと共に投与されうる。ラクトバチルス・プランタルムは、ラクトバチルス・プランタルムの株の成長に特異的なプレバイオティック成長培地と組み合わせて投与されうる。プレバイオティック成長培地は、好ましくは、逆酵素反応により、ラクトバチルス・プランタルムの株によって生産されうるであろう。プレバイオティック成長培地はオリゴ糖を含むことができ、そのオリゴ糖は好ましくはガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）を含むであろう。
【００３９】
好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは、投与前は４℃以下で保存される。
【００４０】
本発明のさらなる一態様によれば、医薬品または栄養補助食品の調製において使用するためのラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を生産する方法であって、
ａ）培養ブロスを生産するのに十分な条件下でラクトバチルス・プランタルムを発酵させる工程、
ｂ）ラクトバチルス・プランタルム細胞の濃縮物が形成されるように培養ブロスからラクトバチルス・プランタルムを濃縮する工程、
ｃ）混合物が形成されるように濃縮物を凍結保護物質にさらす工程、および
ｄ）混合物を凍結乾燥する工程
を含む方法が提供される。
【００４１】
上述の方法によるラクトバチルス・プランタルム細胞の凍結乾燥に関する生残率は７０％超である。さらにまた、好都合なことに、本方法はラクトバチルス・プランタルム細胞を最大８×１０１１ｃｆｕ／ｇの量で生産することが見いだされている。
【００４２】
本方法は、当然、上述の組成物のためのラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を、さらに言えば上述のラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）を、生産するのに適しているであろう。
【００４３】
本発明の第１態様に関して列挙した本組成物の特徴のうちのいくつかが、本方法において投与される組成物と交換可能であるだろうことは、当業者には明らかであるだろう。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明の実施形態を、単なる例として、以下に説明する。
【００４５】
ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２を含む組成物を４９人の軽度高コレステロール血症成人に投与することにより、安全性、コンプライアンスおよび高血圧制御の程度を確立するために、ヒトボランティア試験を行った。この試験は、英国レディング大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｅａｄｉｎｇ）の食品栄養科学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、独立して実行された。この試験はヘルシンキ宣言に従って実行され、すべてのボランティアから文書によるインフォームドコンセントを得た。試験プロトコールはレディング大学の研究倫理委員会によって承認された。
【００４６】
被験者は３０〜６５歳の男女であった。被験者が直近６ヶ月以内の心血管イベントの既往を有している場合、甲状腺機能障害に関係する続発性異常脂質血症が存在する場合、被験者が過去３ヶ月間に脂質代謝に影響を及ぼす何らかの薬物を使用していた場合、被験者にアルコール乱用の経歴がある場合、被験者が過去６ヶ月間に抗生物質の投薬を受けていた場合、または被験者が直近の１ヶ月間にプレバイオティクス／プロバイオティック調製物を摂取していた場合、その被験者は除外した。
【００４７】
本試験の開始に先だって、組み入れ基準を満たす被験者をスクリーニングした。ベースライン血液サンプルを採取し、被験者のＢＭＩおよび血圧を測定した。
【００４８】
この試験は単一施設前向き無作為化二重盲プラセボ対照並行群間治験であった。被験者を、プラセボまたはラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２による処置の２群に、ランダムに分配した。プラセボ群および処置群に、ブリスター包装されたＤＲ１カプセル剤を与えた。処置群には、１カプセルあたり１．８×１０９細胞の用量をもたらす１２０ｍｇの活性ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２を与え、これを、１日２回、朝食時に１回および夜に１回、投与した。参加者には、治験期間を通して日常の食事または身体活動を変えないように勧告した。習慣的食事を事前検証済みの５日間食事日記（週末２日および平日３日）によって評価した。
【００４９】
活性製剤およびプラセボ製剤に関する製剤の詳細をそれぞれ下記表１および表２に示す。
【００５０】
【表１】
2018535940.tif 000002
【００５１】
【表２】
2018535940.tif 000003
【００５２】
ボランティアを試験開始の２週間前に事前スクリーニングし、あらゆるプレ／プロバイオティクス摂取を差し控えるように勧告した。試験は処置期間（１２週）およびウォッシュアウト期間（４週）の二相からなった。この試験は、選抜時のベースライン来院、中間時点での来院、および処置期間の終了時点での来院（それぞれ０週目、６週目および１２週目）、ならびにウォッシュアウト期間後の４回目の来院（１６週目）を含んだ。
【００５３】
初期分析セットでは、２つの群が十分に対応していることを保証するために、ベースラインでの人口統計的変数およびアウトカム変数を調べた。連続変数は対応のないｔ検定を使って分析し、一方、カテゴリー変数にはカイ二乗検定を使用した。
【００５４】
２つの試験群間の試験アウトカムを、時点間の変化に関して分析した。ベースライン〜中間点（０〜６週）、中間点〜終了点（６〜１２週）、ベースライン〜終了点（０〜１２週）、および終了点〜ウォッシュアウト（１２〜１６週）の４つの試験期間を、アウトカムの変化について調べた。各分析のためのデータはその分析における２つの特定時点に限定した。分析は共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を使って行った。後者の時点をアウトカム変数として使用し、先の時点を共変量とみなした。このアプローチは、テスト群および対照群の可変的出発値を考慮するので、群間で経時的変化を単純に比較するより、数学的に好ましい。
【００５５】
この試験を通してボランティアによって報告された安全性、コンプライアンス、または耐性の問題はなかった。３人のボランティアは、無関係な病気のために抗生物質処置を受け、そのため以後の試験への参加から除外されることになったため、試験から離脱した。
【００５６】
ベースライン特徴（身体測定値、収縮期圧および拡張期圧）をプラセボ群（ｎ＝２３）と活性剤群（ｎ＝２３）との間で比較した。それらを下記表３に示す。これらの結果は、それらの人口統計（年齢、性別）に関して、またはベースラインでの身体測定値のいずれについても、２つの試験群間に有意差がないことを示唆した。
【００５７】
【表３】
2018535940.tif 000004
【００５８】
ベースラインから１２週後の処置終了時までの身体測定値の変化を、プラセボ処置群および活性剤処置群の全被験者（ｎ＝４６）について、以下の表４に示す。表４には、ベースラインおよび１２週後に測定された各アウトカムについて、平均値および標準偏差が示されている。ＡＮＣＯＶＡ分析による群差も平均差および対応する信頼区間で示す。これらは、ベースライン値について調整して、活性剤群のアウトカムからプラセボ群のアウトカムを差し引いた値として報告されている。結果の有意性を示すＰ値を報告する。体重はｋｇ、ＢＭＩはｋｇ／ｍ２、胴囲はｃｍ、収縮期／拡張期圧はｍｍＨｇの単位で表されている。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
ベースラインと１２週における処置終了時点との間で、体重、ＢＭＩおよび胴囲に関連する身体測定パラメータに、有意な変化は認められなかった。
【００６１】
ベースラインと１２週との間での収縮期血圧および拡張期血圧の相違の群証拠（ｇｒｏｕｐ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ）があった。収縮期血圧の相違は統計的にも臨床的にも有意であった。全被験者活性剤処置群では、収縮期血圧が３．６ｍｍＨｇ低く（−３％）、一方、拡張期圧は１．６ｍｍＨｇ（２．２％）低減した。収縮期血圧の低減の大半は６〜１２週期間に起こった。これは、プラセボ群と比較した場合に、活性剤群における、６ｍｍＨｇ（５．１％）の収縮期血圧の統計的に有意な低減（Ｐ＝０．００３）を示した（表４ではデータ省略）。これは、ＡＣＥ阻害剤、ＡＲＢおよびレニン阻害剤によって達成される平均３ｍｍＨｇの脈圧低減ならびに非選択的ベータ遮断薬による２ｍｍＨｇの脈圧低減より高い。またこの低減は、プロバイオティクスによる血圧低減を分析する試験（Ｋｈａｌｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１４）において示された対照群との比較で−３．５６ｍｍＨｇ（９５％信頼区間、−６．４６〜−０．６６）の収縮期ＢＰ低減よりも、大きい。
【００６２】
これらの結果は、ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２が少なくとも軽度高コレステロール血症被験者における収縮期血圧を低下させる可能性を有することを示している。
【００６３】
活性ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２カプセル剤およびプラセボカプセル剤は、試験の継続期間を通して、４℃で保存した。試験のベースライン時、６週時および１２週時（処置の終了時）に製品安定性をチェックしたが、細菌数に有意な変化は観察されなかった。プラセボカプセル剤において細菌成長は検出されなかった。
【００６４】
安全性パラメータの分析は、ラクトバチルス・プランタルム（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）消費の有害な作用を示さなかった。ラクトバチルス・プランタルムは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ：Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によってＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ：一般に安全と認められる）とみなされている広く使用されるプロバイオティクスであり、欧州食品基準庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ａｇｅｎｃｙ）による特定微生物の安全性推定（ＱＰＳ：Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｆｅｔｙ）指定を有する。これは、ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２が高血圧を処置するための安全で有効な処置である可能性を有することを示唆するものであるだろう。
【００６５】
ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２に関して工業的スケールアップ実験も行った。以下の作業を行った：ａ）さまざまな低アレルギー性培地に関するフラスコのテスト、ｂ）試験を行うための、１〜５Ｌの発酵、少量の濃縮および凍結乾燥、ｃ）さまざまな凍結保護物質のテスト、ｄ）さまざまな凍結乾燥曲線のテスト、ｅ）８０Ｌでの発酵、濃縮および凍結乾燥。最終工程は８０Ｌ発酵槽での生産であり、これは、（ｉ）細胞数＞８×１０１１ｃｆｕ／ｇ、（ｉｉ）Ａｗ：０．１１、（ｉｉｉ）いかなる賦形剤でも希釈／規格化されていない、凍結乾燥された、濃縮バイオマス量７００ｇをもたらした。それゆえにこの特定株は、製造上の観点から、極めて有望であると思われる。細胞の生残率は７０％超であることが見いだされ、収率は極めて高い１．２５％であった。
【００６６】
上記の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護の範囲を限定しようとするものではなく、むしろ本発明をどのように実施しうるかの例を記載するためのものである。
【００６７】
生物の寄託
本願は、寄託された生物学的材料の以下の表示に関係する。
名称：欧州細胞カルチャーコレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）
所在地：英国ＳＰ４  ０ＪＧソールズベリー、ポートンダウン、イングランド公衆衛生局ポートンダウン（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ）、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ＰＨＥカルチャー・コレクションズ（ＰＨＥ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）、微生物部門（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）
日付：２０１３年１１月４日
受託番号：１３１１０４０２
【国際調査報告】
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