(57)【要約】本発明は、免疫障害を同定し、評価し、防止し、処置するために、複数の可変ＩＬ−２用量を使用する方法の同定に部分的に基づく。一局面では、上記方法は、ａ）対象の血漿ＩＬ−２レベルを上昇させ、上記対象における、調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の、従来型Ｔリンパ球（Ｔｃｏｎ）に対する比（Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ）を増大させる用量で、上記対象に、インターロイキン２（ＩＬ−２）を持続的に投与することを含む誘導レジメンを、上記対象に施行するステップと；ｂ）その後、上記誘導レジメンの用量より高量であり、ｉ）上記対象の血漿ＩＬ−２レベルを、さらに上昇させ、ｉｉ）Ｔｒｅｇの、Ｔｃｏｎに対する上記比を、さらに増大させる、ＩＬ−２の維持用量を、上記対象に持続的に投与することを含む少なくとも１つの維持レジメンを、上記対象に施行し、これにより上記対象を処置するステップとを含む。
2018500276.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫障害に罹患した対象を処置する、複数の可変ＩＬ−２用量による方法であって、
ａ）前記対象の血漿ＩＬ−２レベルを上昇させ、前記対象における、調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の、従来型Ｔリンパ球（Ｔｃｏｎ）に対する比（Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ）を増大させる用量で、前記対象に、インターロイキン２（ＩＬ−２）を持続的に投与することを含む誘導レジメンを、前記対象に施行するステップと；
ｂ）その後、前記誘導レジメンの用量より高量であり、ｉ）前記対象の血漿ＩＬ−２レベルを、さらに上昇させ、ｉｉ）Ｔｒｅｇの、Ｔｃｏｎに対する前記比を、さらに増大させる、ＩＬ−２の維持用量を、前記対象に持続的に投与することを含む少なくとも１つの維持レジメンを、前記対象に施行し、これにより前記対象を処置するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＩＬ−２維持レジメンが、前記対象の血漿ＩＬ−２レベルを、前記誘導レジメンにより誘導されたピーク血漿ＩＬ−２レベルを超えて上昇させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血漿ＩＬ−２レベルを、ＩＬ−２の投与後１回または複数回、ＩＬ−２のタンパク質レベル、ＩＬ−２のタンパク質活性、ＩＬ−２の核酸レベル、Ｔｒｅｇの増殖、Ｔｒｅｇの活性、Ｔｒｅｇのリン酸化ＳＴＡＴ５レベル、ＴｒｅｇのＦＯＸＰ３レベル、およびＴｒｅｇのアポトーシスを解析することにより決定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記誘導レジメンの用量が、約０．３×１０６ＩＵ／ｍ２／日〜約３．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記誘導レジメンの用量が、約６．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日未満である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記誘導レジメンの前記持続的投与が、１日１回の投与を含み、患者が、臨床的利益を享受し続ける限りにおいて、無期限に持続される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導レジメンの前記持続的投与が、連続する少なくとも１〜１４日間中に、１日１回の投与を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記維持レジメンにおけるＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎを、前記誘導レジメン中の最大のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎから少なくとも２０％増大させる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記維持レジメンの用量が、前記誘導レジメンの用量より少なくとも約２０％高量である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記維持レジメンの用量が、約０．３×１０６ＩＵ／ｍ２／日〜約３．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記維持レジメンの用量が、約６．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日未満である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が、臨床的利益を享受し続ける限りにおいて、前記維持レジメンの前記持続的投与が、無期限の投与を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記維持レジメンの前記持続的投与が、連続する少なくとも１〜４２日間中に、１日１回の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＬ−２を、薬学的に許容される製剤により投与する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＩＬ−２を、皮下、静脈内、腹腔内、および筋内からなる群より選択される投与経路により投与する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＬ−２を、皮下投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫障害が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、固形臓器の移植拒絶、血管炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、およびアレルギー性喘息からなる群より選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫障害が、ｃＧＶＨＤである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象の、全身ステロイドに対する応答が、不十分であった、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、ステロイドを含む、少なくとも２回の以前の全身療法にも拘らず、遷延性または再発性の慢性ＧＶＨＤを有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、ＩＬ−２投与の前に、体外フォトフェレーシス（ＥＣＰ）を受けていた、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記誘導レジメンおよび／または前記維持レジメンが、前記免疫障害を処置する、１または複数のさらなる治療の施行をさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１または複数のさらなる治療が、ＥＣＰおよびＴｒｅｇからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔｒｅｇを、Ｔｒｅｇ以外のＴ細胞を含む組成物として投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、少なくとも１：２のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物を、Ｔ細胞を含む生体材料に対する、ＣＤ８＋およびＣＤ１９＋の共枯渇ならびにＣＤ２５＋の陽性選択から得る、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｔｒｅｇを、体重約１ｋｇ当たりの細胞０．１×１０６個〜体重１ｋｇ当たりの細胞１．０×１０６個の間で投与する、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象自身のＴｒｅｇを、前記対象に投与する、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
造血幹細胞移植片を得た、同じ造血幹細胞ドナーに由来するＴｒｅｇを使用する、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｔｒｅｇ組成物が、７０％超の総細胞生存率、陰性グラム染色、９０％以上のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋細胞、かつ／または５０％以上のＦｏｘＰ３＋細胞を有する、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔｒｅｇを、注入として投与する、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔｒｅｇを、ＩＬ−２の投与前に、ＩＬ−２の投与と共時的に、またはＩＬ−２の投与後に投与する、請求項２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｔｒｅｇを、ＩＬ−２の投与前に投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物が、免疫障害の動物モデルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法からの利益に従い、免疫障害に罹患した対象を層別化する方法であって、前記方法は、Ｔリンパ球を含む生体試料を、対象から得るステップと、前記対象試料中の、調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の、従来型Ｔリンパ球（Ｔｃｏｎ）に対する比（Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ）を決定するステップとを含み、ここで約０．０７を超えるかまたはそれと等しいＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、前記対象が、前記毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ることを示し、そして約０．０７未満のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、前記対象が、前記毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ないことを示す、方法。
【請求項３８】
毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法からの利益に従い、免疫障害に罹患した対象を層別化する方法であって、前記方法は、誘導レジメンの後で、Ｔリンパ球を含む生体試料を、対象から得るステップと、前記対象試料中の、調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の、従来型Ｔリンパ球（Ｔｃｏｎ）に対する比（Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ）を決定するステップとを含み、ここで約０．２０を超えるかまたはそれと等しいＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、前記対象が、前記毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ることを示し、そして約０．２０未満のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、前記対象が、前記毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ないことを示す、方法。
【請求項３９】
前記免疫障害が、前記毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ると決定される場合に、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法または請求項１から２３のいずれか一項に記載の処置法を、推奨するか、処方するか、または施行するステップをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記免疫障害が、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ないと決定される場合に、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法以外の抗免疫障害療法を、推奨するか、処方するか、または施行するステップをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年１０月９日に出願された米国仮出願第６２／０６１，９５２号の利益を主張する；上記出願の全体の内容は、この参照によってその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫寛容に必要であり、適応および先天免疫エフェクター細胞の主要な抑制因子として機能する。Ｔｒｅｇベースの治療薬は、固形臓器の移植拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの免疫障害において認められ、また、Ｔｒｅｇの機能不全に関連付けられることが多くなってきている、末梢における寛容が損なわれる他の障害（例えば、血管炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、およびアレルギー性喘息を含む全身性自己免疫疾患）（Ｓａａｄｏｕｎら（２０１１年）、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３６５巻：２０６７〜２０７７頁；Ｈａｒｔｅｍａｎｎら（２０１３年）、Ｌａｎｃｅｔ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１巻：２９５〜３０５頁；Ｈｕｍｒｉｃｈら（２０１４年）、Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．、７３巻：Ａ４６頁；Ｌａｍｂｒｅｃｈｔら（２０１３年）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４３巻：３１２５〜３１３７頁）においても認められる不適応性の免疫活性化を制御するホメオスタシス機構を提供する。しかし、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大されたＴｒｅｇの注入に基づく処置法は、実装が困難であり、長期にわたる炎症の制御のために、養子移入された細胞の機能を維持することの必要性に対処していない（Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎら（２０１１年）、Ｂｌｏｏｄ、１１７巻：１０６１〜１０７０頁）。さらに、低用量のＩＬ−２は、Ｔｒｅｇを増強しうるが、ｃＧＶＨＤ患者の半数は、臨床的利益を得ていない（Ｋｏｒｅｔｈら（２０１１年）、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３６５巻：２０５５〜２０６６頁）。したがって、当技術分野には、Ｔｒｅｇの能力を改良して、望ましくない免疫反応を改善するための組成物および方法に対する大きな必要性が存在する。特に、とりわけ、多年にわたり、硬化性皮膚、関節拘縮、または肺線維症など、ｃＧＶＨＤの消耗性の帰結を伴って生活する小児のために、ｃＧＶＨＤ治療の進展が、火急に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｂｌｏｏｄ（２０１１年）１１７巻：１０６１〜１０７０頁
【非特許文献２】Ｋｏｒｅｔｈら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２０１１年）３６５巻：２０５５〜２０６６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、少なくとも部分的に、ＧＶＨＤ（例えば、活動性の慢性ＧＶＨＤ）などの免疫障害を処置するために、複数の可変用量のＩＬ−２により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの数および活性を有意に増加させうるという発見に基づく。ＥＣＰおよび／またはＴｒｅｇの投与など、１または複数のさらなる抗免疫障害療法と組み合わせて、このような処置の効果をさらに増大させる。
【０００５】
一態様では、免疫障害に罹患した対象を処置する、複数の可変ＩＬ−２用量による方法であって、ａ）対象の血漿ＩＬ−２レベルを上昇させ、対象における、調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の、従来型Ｔリンパ球（Ｔｃｏｎ）に対する比（Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ）を増大させる用量で、インターロイキン２（ＩＬ−２）を、対象に持続的に投与することを含む誘導レジメンを、対象に施行するステップと；ｂ）その後、誘導レジメンの用量より高量であり、ｉ）対象の血漿ＩＬ−２レベルを、さらに上昇させ、ｉｉ）Ｔｒｅｇの、Ｔｃｏｎに対する比を、さらに増大させる、ＩＬ−２の維持用量を、対象に持続的に投与することを含む少なくとも１つの維持レジメンを、対象に施行し、これにより対象を処置するステップとを含む方法が提供される。
【０００６】
ある特定の実施形態は、本明細書で記載される任意の方法に適用可能である。例えば、一実施形態では、ＩＬ−２維持レジメンは、対象の血漿ＩＬ−２レベルを、誘導レジメンにより誘導されたピーク血漿ＩＬ−２レベルを超えて上昇させる。別の実施形態では、血漿ＩＬ−２レベルを、ＩＬ−２の投与後１回または複数回、ＩＬ−２のタンパク質レベル、ＩＬ−２のタンパク質活性、ＩＬ−２の核酸レベル、Ｔｒｅｇの増殖、Ｔｒｅｇの活性、Ｔｒｅｇのリン酸化ＳＴＡＴ５レベル、ＴｒｅｇのＦＯＸＰ３レベル、およびＴｒｅｇのアポトーシスを解析することにより決定する。さらに別の実施形態では、誘導レジメンの用量は、約０．３×１０６ＩＵ／ｍ２／日〜約３．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日である。さらに別の実施形態では、誘導レジメンの用量は、約６．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日未満である。別の実施形態では、誘導レジメンの持続的投与は、１日１回の投与を含み、患者が、臨床的利益を享受し続ける限りにおいて、無期限に持続される。さらに別の実施形態では、誘導レジメンの持続的投与は、連続する少なくとも１〜１４日間中に、１日１回の投与を含む。さらに別の実施形態では、維持レジメンにおけるＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を、誘導レジメン中の最大のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎから少なくとも２０％増大させる。別の実施形態では、維持レジメンの用量は、誘導レジメンの用量より少なくとも約２０％高量である。さらに別の実施形態では、維持レジメンの用量は、約０．３×１０６ＩＵ／ｍ２／日〜約３．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日である。さらに別の実施形態では、維持レジメンの用量は、約６．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日未満である。別の実施形態では、患者が、臨床的利益を享受し続ける限りにおいて、維持レジメンの持続的投与は、無期限の投与を含む。さらに別の実施形態では、維持レジメンの持続的投与は、連続する少なくとも１〜４２日間中に、１日１回の投与を含む。
【０００７】
さらに別の実施形態では、ＩＬ−２を、薬学的に許容される製剤により投与する。別の実施形態では、ＩＬ−２を、皮下、静脈内、腹腔内、および筋内からなる群より選択される投与経路により投与する。さらに別の実施形態では、ＩＬ−２を、皮下投与する。さらに別の実施形態では、免疫障害は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、固形臓器の移植拒絶、血管炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、およびアレルギー性喘息からなる群より選択される。別の実施形態では、免疫障害は、ｃＧＶＨＤである。さらに別の実施形態では、対象の、全身ステロイドに対する応答は、不十分である。さらに別の実施形態では、対象は、ステロイドを含む、少なくとも２回の以前の全身療法にも拘らず、遷延性または再発性の慢性ＧＶＨＤを有する。別の実施形態では、対象は、ＩＬ−２投与の前に、体外フォトフェレーシス（ＥＣＰ）を受けている。さらに別の実施形態では、誘導レジメンおよび／または維持レジメンは、免疫障害を処置する、１または複数のさらなる治療の施行をさらに含む。さらに別の実施形態では、１または複数のさらなる治療は、ＥＣＰおよびＴｒｅｇからなる群より選択される。別の実施形態では、Ｔｒｅｇを、Ｔｒｅｇ以外のＴ細胞を含む組成物として投与する。さらに別の実施形態では、組成物は、少なくとも１：２のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を有する。さらに別の実施形態では、組成物を、Ｔ細胞を含む生体材料に対する、ＣＤ８＋およびＣＤ１９＋の共枯渇ならびにＣＤ２５＋の陽性選択から得る。別の実施形態では、Ｔｒｅｇを、体重約１ｋｇ当たりの細胞約０．１×１０６個〜体重１ｋｇ当たりの細胞１．０×１０６個の間で投与する。さらに別の実施形態では、対象自身のＴｒｅｇを、対象に投与する。さらに別の実施形態では、造血幹細胞移植片を得た、同じ造血幹細胞ドナーに由来するＴｒｅｇを使用する。別の実施形態では、Ｔｒｅｇ組成物は、７０％超の総細胞生存率、陰性グラム染色、９０％以上のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋細胞かつ／または５０％以上のＦｏｘＰ３＋細胞を有する。さらに別の実施形態では、Ｔｒｅｇを、注入として投与する。さらに別の実施形態では、Ｔｒｅｇを、ＩＬ−２の投与前に、ＩＬ−２の投与と共時的に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）、またはＩＬ−２の投与後に投与する。別の実施形態では、Ｔｒｅｇを、ＩＬ−２の投与前に投与する。さらに別の実施形態では、対象は、ヒトまたは免疫障害の動物モデルなどの哺乳動物である。
【０００８】
別の態様では、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法からの利益に従い、免疫障害に罹患した対象を層別化する方法であって、Ｔリンパ球を含む生体試料を、対象から得るステップと、対象試料中の、調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の、従来型Ｔリンパ球（Ｔｃｏｎ）に対する比（Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ）を決定するステップとを含み、約０．０７を超えるかまたはそれと等しいＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、対象が、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ることを示し、約０．０７未満のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、対象が、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ないことを示す、方法が提供される。一実施形態では、方法は、免疫障害が、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ると決定される場合に、毎日の固定ＩＬ−２用量による方法または本明細書で記載される処置法を、推奨するか、処方するか、または施行するステップをさらに含む。別の実施形態では、方法は、免疫障害が、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ないと決定される場合に、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法以外の抗免疫障害療法を、推奨するか、処方するか、または施行するステップをさらに含む。
【０００９】
さらに別の態様では、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法からの利益に従い、免疫障害に罹患した対象を層別化する方法であって、誘導レジメンの後で、Ｔリンパ球を含む生体試料を、対象から得るステップと、対象試料中の、調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の、従来型Ｔリンパ球（Ｔｃｏｎ）に対する比（Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ）を決定するステップとを含み、約０．２０を超えるかまたはそれと等しいＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、対象が、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ることを示し、約０．２０未満のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、対象が、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ないことを示す、方法が提供される。一実施形態では、方法は、免疫障害が、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ると決定される場合に、毎日の固定ＩＬ−２用量による方法または本明細書で記載される処置法を、推奨するか、処方するか、または施行するステップをさらに含む。別の実施形態では、方法は、免疫障害が、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法から利益を得ないと決定される場合に、毎日の固定ＩＬ−２用量による処置法以外の抗免疫障害療法を、推奨するか、処方するか、または施行するステップをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１、毎日の低用量のＩＬ−２による処置の間の、ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇの、ｉｎ  ｖｉｖｏの拡大。ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  Ｔにゲートをかけた細胞選別解析の結果が示される。Ｔｒｅｇは、ＣＤ２５＋  ＣＤ１２７−として定義され、Ｔｃｏｎは、ＣＤ２５−  ＣＤ１２７＋である。ＣＤ４ゲート内のＴｒｅｇの％を、各プロット内に示す。図１は、用量レベルＢにおける代表的な患者を示す。
【００１１】
【図２】図２は、ＩＬ−２療法における、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比の中央値を示す。ＩＬ−２の開始から数週間以内に、急速な上昇およびプラトーの持続が見られ、８週でＩＬ−２を停止させた後で低下が見られた。中央値を四分位数間範囲と共に示す。
【００１２】
【図３】図３は、Ｔｒｅｇの絶対数が増大すると、ＩＬ−２レベルが下降することを示す。左パネルは、ＩＬ−２処置の間の、Ｔｒｅｇ細胞カウントおよびＩＬ−２レベルを示す。８週間のＩＬ−２処置レジメン中の、ｐｇ／μＬ単位の血漿ＩＬ−２レベル（三角）と対比した、１μＬ当たりのＴｒｅｇカウント（ボックス）を示す。右パネルは、ＩＬ−２受容体α（ＣＤ２５；ＩＬ−２Ｒ）の細胞表面発現を示す。低用量ＩＬ−２の間、Ｔｒｅｇ（上側の線）については、ＩＬ−２Ｒ発現の増大の持続が認められたが、Ｔｃｏｎ（下側の線）については認められなかった。
【００１３】
【図４】図４は、フェーズ１研究における、ＩＬ−２に媒介されるＴｒｅｇ効果を、フェーズ２研究と対比した結果を示す。左パネルは、フェーズ１試験における１μＬ当たりのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔｒｅｇカウント（丸）を、フェーズ２試験（ダイアモンド）と対比して示す。右パネルは、フェーズ１（丸）試験のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を、フェーズ２試験（ダイアモンド）と対比して示す。バーは、フェーズ１（８週間、下方バー）におけるＩＬ−２処置の持続期間を、フェーズ２（１２週間、上方バー）と対比して示す。
【００１４】
【図５】図５は、ＣｙＴＯＦを使用する、ＦｏｘＰ３発現についての、ＴｒｅｇサブセットのＳＰＡＤＥ解析の結果を示す。１２週間の低用量ＩＬ−２研究時の代表的な患者において、ＲＴＥ／ナイーブおよびメモリーＴｒｅｇ集団を、ＳＰＡＤＥ樹形図内で個別にクラスター化し、活性化Ｔｒｅｇ部分集団を、各群内でさらに描出する。バブルサイズは、細胞数を反映し、ＦｏｘＰ３発現レベル強度を示す。左上パネルでは、ＩＬ−２前のベースラインにおいて、メモリーＴｒｅｇ集団によるＦｏｘＰ３発現は大きかった。右上パネルでは、１週間で、ＩＬ−２は、全てのＴｒｅｇサブセット内で、ＦｏｘＰ３を誘導した。左下パネルでは、１２週間のＩＬ−２で、メモリーＴｒｅｇによるＦｏｘＰ３発現は大きかった。右下パネルでは、ＩＬ−２の中断後において、Ｔｒｅｇ集団は大幅に枯渇し、メモリーＴｒｅｇサブセット内で残存するＦｏｘＰ３発現は限定的であった。
【００１５】
【図６】図６は、低用量ＩＬ−２による、ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎのレパートリーの多様性についての、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列解析の結果を示す。Ｔｒｅｇエントロピー（Ｅ）は、８週間のＩＬ−２後の、ｃＧＶＨＤ患者において、Ｔｃｏｎエントロピーの変化を伴わずに増大した。Ｔｃｏｎを、上パネルに示し、Ｔｒｅｇを、下パネルに示す。エントロピー（Ｅ）を、各パネルについて示す。Ｙ軸スケールの増大（１Ｋ→５Ｋ）にも拘らず、右下パネルでは、左パネルと対比して、さらなる産生性のＴｒｅｇ  ＴＣＲ配列が明らかとなった。
【００１６】
【図７】図７は、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を使用する、ＩＬ−２療法に対する応答の予測因子を示す。ベースラインおよび１週目における、臨床レスポンダー（ＰＲ）についてのＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を、非レスポンダー（ＳＤ／ＭＲ／ＰＤ）と対比して示す。全てのデータは、固定用量によるＩＬ−２投与に由来する。
【００１７】
【図８】図８は、ＣＤ４＋  ＤＬＩ±ＩＬ−２後における、ＦＯＸＰ３発現の結果を示す。ＣＤ４＋  ＤＬＩ（下側の線）、低用量ＩＬ−２（中ほどの線）、またはＣＤ４＋  ＤＬＩ＋低用量ＩＬ−２（上側の線）を施された患者に由来するＰＢＭＣ中のリアルタイムＰＣＲにより評価されたＦＯＸＰ３発現（出典：Ｚｏｒｎら（２００９年）、Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１５巻：３８２〜３８８頁）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
血漿ＩＬ−２レベルは、固定用量によるＩＬ−２療法中に、急速に（例えば、１週目までに）上昇し、次いで、Ｔｒｅｇカウントが上昇する間、毎日のＩＬ−２投与にも拘らず低下する（Ｍａｔｓｕｏｋａら（２０１３年）、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、５巻：１７９ｒａ４３）ことが決定されており、この結果は、Ｔｒｅｇ上で構成的に発現する、高アフィニティーのＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）への結合を介するＩＬ−２隔離の増大に起因すると考えられる。その後、ＩＬ−２療法中において、Ｔｒｅｇの絶対数が増大するにつれ、Ｔｒｅｇ上のＣＤ２５発現のさらなる増大が見られる（Ｍａｔｓｕｏｋａら（２０１３年）、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、５巻：１７９ｒａ４３）。本明細書では、ピークＴｒｅｇ増殖は、ＩＬ−２誘導レジメン開始の１週間後までに、全てのＴｒｅｇサブセット内で、Ｔｒｅｇ集団サイズの増大と共に生じることが決定されている。しかし、ＩＬ−２処置の１２週目に、拡大されたＴｒｅｇ部分集団が保存される一方で、Ｔｒｅｇの増殖は、２週目の後で、Ｋｉ−６７発現（増殖）の降下と共に低下する。ｐＳＴＡＴ５およびＦｏｘＰ３マーカーを使用して、Ｔｒｅｇ活性化の同様の時間的パターンであって、初期においてまず、Ｔｒｅｇ部分集団にわたり、概して増強され、その後、ＩＬ−２処置の間に、増強されたＴｒｅｇ集団サイズの持続的な保存にも拘らず低下するパターンが観察される。次いで、ＩＬ−２の中断の４週間後までに、Ｔｒｅｇ活性化マーカー発現の降下およびＴｒｅｇ集団のかなりの枯渇が観察された。したがって、誘導レジメンによるピーク血漿ＩＬ−２レベルの後など、個々の患者におけるＩＬ−２用量の漸増を伴う維持レジメンは、血漿ＩＬ−２レベルを回復させ、Ｔｃｏｎの活性化も過剰な有害事象も誘導することなく、Ｔｒｅｇの増殖、活性化、および新生をさらに増進する。このようにして、ＩＬ−２により誘導されるＴｒｅｇの増強がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じ、数が増大した、ＣＤ２５発現が高い循環Ｔｒｅｇに結合後の血漿ＩＬ−２レベルの減退に起因するタキフィラキシーを回避する。したがって、本発明の方法は、ＩＬ−２を使用する、免疫障害の処置の予測外の増強を提供し、ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎを、このような免疫障害の処置におけるＩＬ−２の有効性についてのバイオマーカーとして、直接的にまたは間接的に使用することを可能とする。
【００１９】
Ｉ．定義
本明細書では、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」を使用して、冠詞の文法的目的語のうちの１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例を目的として述べると、「要素」とは、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００２０】
「変更された量」または「変更されたレベル」という用語は、バイオマーカー核酸の増大または減少されたコピー数（例えば、生殖細胞系列および／または体細胞の）、例えば、対照試料中のバイオマーカー核酸の発現レベルまたはコピー数と比較した生体試料中の増大または減少された発現レベルを指す。バイオマーカーの「変更された量」という用語はまた、正常な対照試料中の対応するタンパク質レベルと比較した、試料、例えば、免疫障害試料中の、バイオマーカータンパク質の増大または減少されたタンパク質レベルも含む。さらに、バイオマーカータンパク質の変更された量は、バイオマーカータンパク質の発現または活性に影響を及ぼしうる、マーカーのメチル化状態など、翻訳後修飾を検出することにより決定することができる。
【００２１】
バイオマーカーの量が、それぞれ、正常レベルより、量を評価するのに採用されるアッセイの標準誤差を超える量だけ大きいかまたは小さく、好ましくは正常量より、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％大きいかまたは小さい場合に、対象におけるバイオマーカーの量は、バイオマーカーの正常量より「有意に」高量または低量である。代替的に、対象におけるバイオマーカーの量は、量が、バイオマーカーの正常量の、少なくとも約２倍または２分の１であり、好ましくは、それぞれ、少なくとも約３、４、もしくは５倍、または最大で約３、４、もしくは５分の１である場合に、正常量より「有意に」高量または低量と考えることができる。
【００２２】
バイオマーカーの「発現の変更されたレベル」という用語は、被験試料、例えば、免疫障害を患う患者に由来する試料中のバイオマーカーの発現レベルまたはコピー数であって、発現またはコピー数を評価するのに採用されるアッセイの標準誤差より大きいかまたは小さく、対照試料（例えば、関連疾患を有さない健常対象に由来する試料）、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルまたはコピー数の、好ましくは少なくとも２倍または２分の１であり、より好ましくは３、４、５、もしくは１０倍、または最大で約３、４、５、もしくは１０分の１である、発現レベルまたはコピー数を指す。発現の変更されたレベルは、発現またはコピー数を評価するのに採用されるアッセイの標準誤差より大きいかまたは小さく、対照試料（例えば、関連疾患を有さない健常対象に由来する試料）、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルまたはコピー数の、好ましくは少なくとも２倍または２分の１であり、より好ましくは３、４、５、もしくは１０倍、または最大で約３、４、５、もしくは１０分の１である。
【００２３】
バイオマーカーの「変更された活性」という用語は、正常な対照試料中のバイオマーカーの活性と比較して、疾患状態、例えば、免疫障害試料中において増大または低下するバイオマーカーの活性を指す。バイオマーカーの変更された活性は、例えば、バイオマーカーの変更された発現、バイオマーカーの変更されたタンパク質レベル、バイオマーカーの変更された構造、あるいは、例えば、バイオマーカーと同じもしくは異なる経路に関与する他のタンパク質との変更された相互作用、または転写の活性化因子もしくは阻害剤との変更された相互作用の結果でありうる。
【００２４】
バイオマーカーの「変更された構造」という用語は、バイオマーカー核酸またはタンパク質内の変異または対立遺伝子改変体、例えば、バイオマーカー核酸またはタンパク質の発現または活性に、正常または野生型遺伝子またはタンパク質と比較して影響を及ぼす変異の存在を指す。例えば、変異は、置換、欠失、または付加変異を含むがこれらに限定されない。変異は、バイオマーカー核酸のコードまたは非コード領域内に存在しうる。
【００２５】
本明細書でそうでないことが明記されない限りにおいて、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）の天然に存在する形態、ならびに単鎖抗体、キメラ、およびヒト化抗体などの組換え抗体、ならびに多特異性抗体のほか、前出の全ての断片および誘導体であって、少なくとも抗原結合性部位を有する断片および誘導体を広く包含する。抗体の誘導体は、抗体とコンジュゲートさせたタンパク質または化学的部分を含みうる。
【００２６】
本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、抗体の「抗原結合性部分」（または単に、「抗体の部分」）も含む。本明細書で使用される「抗原結合性部分」という用語は、抗原（例えば、バイオマーカーポリペプチドまたはその断片）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合性部分」という用語の中に包含される結合性断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる、Ｆｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされているが、組換え法を使用して、それらが単一のタンパク質鎖となることを可能とする合成リンカーにより接合することができ、この場合、ＶＬ領域とＶＨ領域とは、対合して、一価ポリペプチドを形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５巻：５８７９〜５８８３頁；およびＯｓｂｏｕｒｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻：７７８頁を参照されたい）。抗体の「抗原結合性部分」という用語の中にはまた、このような単鎖抗体も包含することを意図する。完全なＩｇＧポリペプチドまたは他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特異的なｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域のｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結することができる。ＶＨおよびＶＬはまた、タンパク質化学反応または組換えＤＮＡ技術を使用する、免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖ、または他の断片の生成においても使用することができる。また、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）など、単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディとは、ＶＨおよびＶＬドメインを、単一のポリペプチド鎖上で、但し同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短過ぎるリンカーを使用して発現させ、これにより、ドメインに、別の鎖の相補的なドメインと対合させ、２つの抗原結合性部位を創出する、二価の二特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０巻：６４４４〜６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋら（１９９４年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻：１１２１〜１１２３頁を参照されたい）。
【００２７】
なおさらに、抗体またはその抗原結合性部分は、抗体または抗体の部分の、１または複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的または非共有結合的会合により形成される、より大型の免疫接着ポリペプチドの一部でありうる。このような免疫接着ポリペプチドの例は、四量体のｓｃＦｖポリペプチドを作る、ストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９５年）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６巻：９３〜１０１頁）、ならびに二価のビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを作る、システイン残基、バイオマーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９４年）、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻：１０４７〜１０５８頁）を含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片など、抗体の部分は、それぞれ、抗体全体のパパインまたはペプシン消化など、従来の技法を使用して、抗体全体から調製することができる。さらに、抗体、抗体の部分、および免疫接着ポリペプチドは、本明細書で記載される、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して得ることができる。
【００２８】
抗体は、ポリクローナルの場合もあり、モノクローナルの場合もあり、異種の場合もあり、同種の場合もあり、同系の場合もあり、これらの修飾形態（例えば、ヒト化、キメラなど）の場合もある。抗体はまた、完全にヒトのものである場合もある。好ましくは、本発明の抗体は、バイオマーカーポリペプチドまたはその断片に、特異的または実質的に特異的に結合する。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応することが可能な、抗原結合性部位の１つの分子種だけを含有する、抗体ポリペプチドの集団を指すのに対し、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することが可能な、抗原結合性部位の複数の分子種を含有する、抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する特定の抗原に対する、単一の結合アフィニティーを提示することが典型的である。
【００２９】
抗体はまた、「ヒト化」されてもよく、これはヒト細胞により作られる抗体により酷似するように変更された可変および定常領域を有する、非ヒト細胞により作られる抗体を含むように意図される。例えば、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列中に見出されるアミノ酸を組み込むように、非ヒト抗体アミノ酸配列を変更することを介する。本発明のヒト化抗体は、例えば、ＣＤＲ内に、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異により導入される変異）を含みうる。本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語はまた、マウスなど、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列を、ヒトフレームワーク配列へとグラフトした抗体も含む。
【００３０】
「割り当てられたスコア」という用語は、患者試料中で測定された後で、バイオマーカーの各々について指定される数値を指す。割り当てられたスコアは、試料中のバイオマーカーの非存在、存在、または推定量と相関する。割り当てられたスコアは、手作業で（例えば、目視により）、または画像の取得および解析のための装置の補助により生成することができる。ある特定の実施形態では、割り当てられたスコアを、定性的評価、例えば、グレード付けされたスケール上の蛍光リードアウトの検出、または定量的評価により決定する。一実施形態では、複数の測定されたバイオマーカーに由来する、割り当てられたスコアの組合せを指す、「集合スコア（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｓｃｏｒｅ）」を決定する。一実施形態では、集合スコアとは、割り当てられたスコアの合計である。別の実施形態では、割り当てられたスコアの組合せは、割り当てられたスコアに対する数学的演算を実行してから、それらを集合スコアへと組み合わせることを伴う。ある特定の実施形態では、本明細書ではまた、集合スコアを、予測スコアとも称する。
【００３１】
「バイオマーカー」という用語は、抗免疫障害療法および／または抗免疫障害の処置（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）の効果を予測することが決定されている、本発明の測定可能な実体を指す。バイオマーカーは、限定なしに述べると、細胞型（例えば、Ｔｒｅｇおよび／またはＴｃｏｎ）、細胞比（例えば、Ｔｒｅｇ対Ｔｃｏｎ比）、核酸（例えば、ゲノム核酸および／または転写された核酸）、およびタンパク質、特に、表１に示される、関与するものを含みうる。バイオマーカーはさらに、本明細書でさらに記載される、免疫学的標的、または目的の免疫障害を処置するために望ましくない免疫反応を下方調節する薬剤を含みうる。
【００３２】
「遮断」抗体または抗体「アンタゴニスト」とは、それが結合する抗原の少なくとも１つの生物学的活性を、阻害または低減する抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される遮断抗体もしくはアンタゴニスト抗体またはそれらの断片は、抗原の所与の生物学的活性を、実質的または完全に阻害する。
【００３３】
「体液」という用語は、体内から排出または分泌される流体のほか、通常体内から排出または分泌されない流体（例えば、羊水、房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎおよびｅａｒｗａｘ）、カウパー腺液または尿道球腺液（ｐｒｅ−ｅｊａｃｕｌａｔｏｒｙ  ｆｌｕｉｄ）、乳び、びじゅく、糞便、スキーン腺液（ｆｅｍａｌｅ  ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、間質液、細胞内液、リンパ、経血、母乳、粘液、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑膜液、涙、尿、膣液（ｖａｇｉｎａｌ  ｌｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ）、硝子体液、および吐瀉物）も指す。ある特定の実施形態では、Ｔリンパ球およびその部分集団など、リンパ球を含む体液を使用する。
【００３４】
「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域を指すのに対し、「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されない、ヌクレオチド配列の領域（例えば、５’および３’側非翻訳領域）を指す。
【００３５】
「相補的な」という用語は、２つの核酸鎖の領域の間または同じ核酸鎖の２つの領域の間の配列相補性についての広範な概念を指す。残基が、チミンまたはウラシルである場合、第１の核酸領域のアデニン残基は、第１の領域とアンチパラレルな、第２の核酸領域の残基と、特異的な水素結合（「塩基対合」）を形成することが可能であることが公知である。同様に、残基が、グアニンである場合、第１の核酸鎖のシトシン残基は、第１の鎖とアンチパラレルな、第２の核酸鎖の残基との塩基対合が可能であることが公知である。２つの領域が、アンチパラレルに配置される場合に、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が、第２の領域の残基との塩基対合が可能であれば、核酸の第１の領域は、同じまたは異なる核酸の第２の領域と相補的である。第１の領域は、第１の部分を含み、第２の領域は、第２の部分を含むことが好ましく、これにより、第１および第２の部分が、アンチパラレルに配置されている場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は、第２の部分内のヌクレオチド残基との塩基対合が可能である。より好ましくは、第１の部分の全てのヌクレオチド残基は、第２の部分内のヌクレオチド残基との塩基対合が可能である。
【００３６】
「対照」という用語は、被験試料中の発現産物との比較をもたらすのに適する、任意の基準物質を指す。一実施形態では、対照は、それに由来する発現産物のレベルを検出し、被験試料に由来する発現産物のレベルと比較する、「対照試料」を得ることを含む。このような対照試料は、アウトカムが既知である、対照免疫障害患者に由来する試料（保存された試料による測定値の場合もあり、かつての試料測定値の場合もある）；正常患者もしくは免疫障害患者などの対象から単離された正常組織もしくは細胞、正常対象もしくは免疫障害患者などの対象から単離された培養初代細胞／組織、免疫障害患者の同じ臓器もしくは身体の場所から得られた、隣接正常細胞／組織、正常対象から単離された組織もしくは細胞試料、または受託機関から得られた初代細胞／組織を含むがこれらに限定されない、任意の適切な試料を含みうる。別の好ましい実施形態では、対照は、ハウスキーピング遺伝子、正常組織（または他の既に解析された対照試料）からの発現産物レベルの範囲、ある特定のアウトカム（例えば、１、２、３、４年間にわたる生存など）を伴うか、またはある特定の処置（例えば、免疫障害療法の標準治療）を施される、患者群または患者のセットに由来する被験試料中の、既に決定された発現産物レベルの範囲を含むがこれらに限定されない、任意の適切な供給源に由来する、基準物質の発現産物レベルを含みうる。当業者は、このような対照試料および基準物質の発現産物レベルを、本発明の方法において、対照として組み合わせて使用しうることを理解するであろう。一実施形態では、対照は、正常または非免疫障害の細胞／組織試料を含みうる。別の好ましい実施形態では、対照は、免疫障害患者のセットなど、患者のセット、またはある特定の処置を施される免疫障害患者のセット、または別のアウトカムと対比した１つのアウトカムを伴う患者のセットについての発現レベルを含みうる。前者の場合、各患者の特異的な発現産物レベルを、百分位数による発現レベルへと割り当てることもでき、基準物質による発現レベルの平均値または平均より高いまたは低いレベルとして表すこともできる。別の好ましい実施形態では、対照は、正常細胞、組合せ化学療法により処置された患者に由来する細胞、および目的の処置に応答した免疫障害を有する患者に由来する細胞を含みうる。別の実施形態では、対照はまた、測定値、例えば、同じ集団内のハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較した、集団内の特定の遺伝子の平均発現レベルも含みうる。このような集団は、正常対象、いかなる処置も経ていない免疫障害患者（すなわち、処置ナイーブ）、標準治療ケアを受けている免疫障害患者、または目的の処置に応答した免疫障害を有する患者を含みうる。別の好ましい実施形態では、対照は、被験試料中の２つの細胞型および／または遺伝子の発現産物レベルの比を決定し、これを、基準物質中の、同じ２つの細胞型および／または遺伝子の任意の適切な比と比較すること；被験試料中の２つまたはそれ超の細胞型および／または遺伝子の発現産物レベルを決定し、任意の適切な対照中の発現産物レベルの差異を決定すること；ならびに被験試料中の２つまたはそれ超の細胞型および／または遺伝子の発現産物レベルを決定し、それらの発現を、被験試料中のハウスキーピング細胞型および／または遺伝子の発現に照らして正規化し、任意の適切な対照と比較することを含むがこれらに限定されない、発現産物レベルの比への変換を含む。特に好ましい実施形態では、対照は、被験試料と同じ系統および／または種類の対照試料を含む。別の実施形態では、対照は、免疫障害を伴う全ての患者など、患者試料のセット中の百分位数または患者試料のセットに基づく百分位数として群分けされた発現産物レベルを含みうる。一実施形態では、対照の発現産物レベルを確立し、この場合、例えば、特定の百分位数と比べて高いまたは低い発現産物レベルを、アウトカムを予測するためのベースとして使用する。別の好ましい実施形態では、既知のアウトカムを伴う免疫障害対照患者からの発現産物レベルを使用して、対照の発現産物レベルを確立し、被験試料に由来する発現産物のレベルを、アウトカムを予測するためのベースとして、対照の発現産物レベルと比較する。下記のデータにより裏付けられる通り、本発明の方法は、被験試料中の発現産物レベルを、対照と比較するときの特異的な切断点（ｃｕｔ−ｐｏｉｎｔ）の使用に限定されない。
【００３７】
バイオマーカー核酸の「コピー数」とは、特定の遺伝子産物をコードする、細胞（例えば、生殖細胞系列および／または体細胞）中のＤＮＡ配列の数を指す。一般に、所与の遺伝子について、哺乳動物は、各遺伝子の２つずつのコピーを有する。しかし、コピー数は、遺伝子増幅または重複により増大する場合もあり、欠失により低減される場合もある。例えば、生殖細胞系列のコピー数変化は、１または複数のゲノム遺伝子座における変化であって、前記１または複数のゲノム遺伝子座が、対照中の生殖細胞系列のコピーのうちの、正常相補体中のコピー数（例えば、特異的な生殖細胞系列のＤＮＡおよび対応するコピー数を決定した種と同じ種についての、生殖細胞系列のＤＮＡ内の正常コピー数）により説明されない変化を含む。体細胞のコピー数変化は、１または複数のゲノム遺伝子座における変化であって、前記１または複数のゲノム遺伝子座が、対照の生殖細胞系列のＤＮＡ中のコピー数（例えば、体細胞のＤＮＡおよび対応するコピー数を決定した対象と同じ対象についての、生殖細胞系列のＤＮＡ中のコピー数）により説明されない変化を含む。
【００３８】
バイオマーカー核酸の「正常」コピー数（例えば、生殖細胞系列および／または体細胞）またはバイオマーカー核酸もしくはタンパク質の「正常」発現レベルとは、生体試料、例えば、免疫障害に罹患していない対象、例えば、ヒト、または免疫障害を有する同じ対象における、対応する非免疫障害組織に由来する組織、全血、血清、血漿、口腔内切屑、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、および骨髄を含有する試料中の発現の活性／レベルまたはコピー数である。
【００３９】
「対象に適する処置レジメンを決定すること」という用語は、本発明に従う解析の結果に基づくか、または本質的に基づくか、または少なくとも部分的に基づき、開始、改変、および／または終了させる対象のための処置レジメン（すなわち、対象における免疫障害を防止および／または処置するために使用される、単一の療法または異なる療法の組合せ）の決定を意味するように理解する。１つの例は、免疫障害に対する標的化療法をもたらして、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）をもたらすかどうかを決定することである。決定は、本発明に従う解析の結果に加えて、処置される対象の個人的な特徴にも基づきうる。大半の場合、対象に適する処置レジメンの実際の決定は、主治医（ａｔｔｅｎｄｉｎｇ  ｐｈｙｓｉｃｉａｎまたはａｔｔｅｎｄｉｎｇ  ｄｏｃｔｏｒ）により実施する。
【００４０】
「発現シグネチャ」または「シグネチャ」という用語は、２つまたはそれ超の協同的に発現するバイオマーカーの群を指す。例えば、このシグネチャを構成する遺伝子、タンパク質などは、特異的な細胞系統、分化段階、または特定の生物学的応答中において発現されうる。バイオマーカーは、それらが発現する細胞型の生物学的側面を反映しうる。発現データおよび遺伝子の発現レベルは、コンピュータ可読媒体、例えば、マイクロアレイまたはチップ読取りデバイスと共に使用されるコンピュータ可読媒体上に保存することができる。このような発現データを操作して、発現シグネチャを生成することができる。
【００４１】
分子または細胞は、基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）から解離する分子または細胞の実質的な画分を伴わない流体（例えば、標準クエン酸食塩水（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）、ｐＨ７．４）で、基材をすすぎうるように、基材と共有結合的または非共有結合的に会合している場合、基材に「固定」されているか、または「付着」している。
【００４２】
「相同」という用語は、同じ核酸鎖の２つの領域の間または２つの異なる核酸鎖の領域の間のヌクレオチド配列の類似性を指す。両方の領域内のヌクレオチド残基の位置が、同じヌクレオチド残基で占有されている場合、領域は、その位置において相同である。各領域の、少なくとも１つのヌクレオチド残基の位置が、同じ残基で占有されている場合、第１の領域は、第２の領域と相同である。２つの領域の間の相同性は、同じヌクレオチド残基で占有された、２つの領域のヌクレオチド残基の位置の比率との関係で表される。例を目的として述べると、ヌクレオチド配列である５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域と、ヌクレオチド配列である５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域とは、５０％の相同性を共有する。第１の領域は、第１の部分を含み、第２の領域は、第２の部分を含むことが好ましく、これにより、部分の各々のヌクレオチド残基の位置の少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は、同じヌクレオチド残基で占有されている。より好ましくは、部分の各々の全てのヌクレオチド残基の位置は、同じヌクレオチド残基で占有されている。
【００４３】
「免疫障害」という用語は、所望の抗免疫障害応答が、免疫応答を抑制するような、望ましくない免疫応答を特徴とする状態を指す。免疫応答の下方調節が所望されるこのような状態は、当技術分野で周知であり、限定なしに述べると、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症、または本明細書でさらに記載される、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、アレルギー、過敏性応答、寄生生物およびウイルス感染、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の産生もしくは機能の増大を必要とする障害、ワクチン接種効率の改善を必要とする障害、ならびに調節性Ｔ細胞の産生もしくは機能の増大を必要とする障害などの自己免疫疾患における、組織、皮膚、および臓器移植の状況を含む。
【００４４】
「阻害する」という用語は、例えば、特定の作用、機能、または相互作用の低下、制限、または遮断を含む。一部の実施形態では、免疫障害の少なくとも１つの症状が、緩和されるか、終結するか、緩徐化するか、または防止される場合、免疫障害は、「阻害される」。本明細書で使用される通り、免疫障害の再発または拡大が、低減されるか、緩徐化するか、遅延するか、または防止される場合もまた、免疫障害は、「阻害される」。
【００４５】
２つの分子の間の相互作用に言及する場合の「相互作用」という用語は、分子の、互いとの物理的接触（例えば、結合）を指す。一般に、このような相互作用は、前記分子の一方または両方の活性（生物学的効果を生み出す）を結果としてもたらす。
【００４６】
「単離されたタンパク質」とは、細胞から単離されるかもしくは組換えＤＮＡ法により作製される場合の、他のタンパク質、細胞物質、分離媒体、および培養培地、または化学合成される場合の、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離された」または「精製された」タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、もしくは融合タンパク質が由来する細胞もしくは組織供給源に由来する、細胞物質もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成される場合の、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、バイオマーカーポリペプチドまたはその断片の調製物であって、タンパク質を、それが単離されるか、または組換えにより作製される細胞の細胞成分から分離した調製物を含む。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、バイオマーカータンパク質またはその断片の調製物であって、約３０％（乾燥重量で）未満の非バイオマーカータンパク質（本明細書ではまた、「夾雑タンパク質」とも称する）、より好ましくは約２０％未満の非バイオマーカータンパク質、さらにより好ましくは約１０％未満の非バイオマーカータンパク質、最も好ましくは約５％未満の非バイオマーカータンパク質を有する調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチド、もしくは融合タンパク質、またはそれらの断片、例えば、それらの生物学的に活性な断片を組換えにより作製する場合、それはまた、培養培地も実質的に含まないことが好ましい、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。
【００４７】
「キット」とは、本発明のマーカーの発現を特異的に検出し、かつ／またはこの発現に治療的に影響を及ぼすための、少なくとも１つの試薬、例えば、治療薬、プローブ、小分子などを含む、任意の製造物（例えば、パッケージまたは容器）である。キットは、本発明の方法を実行するためのユニットとして宣伝、流通、または販売することができる。キットは、本発明の方法において有用な組成物を発現するのに必要な、１または複数の試薬を含みうる。ある特定の実施形態では、キットは、基準物質、例えば、免疫学的応答、細胞の増殖、分裂、遊走、生存、またはアポトーシスを制御するシグナル伝達経路に影響を及ぼさず、これを調節しないタンパク質をコードする核酸をさらに含みうる。当業者は、一般的な分子タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質およびベータ−ガラクトシダーゼ）、遺伝子オントロジー基準により、細胞の増殖、分裂、遊走、生存、またはアポトーシスを包含する経路のうちのいずれにも分類されないタンパク質、または普遍的なハウスキーピングタンパク質を含むがこれらに限定されない、多くのこのような対照タンパク質を想定しうる。キット中の試薬は、個別の容器により供給することもでき、単一の容器内の、２つまたはそれ超の試薬の混合物として供給することもできる。加えて、キット内の組成物の使用について記載する指示材料も含まれ得る。
【００４８】
バイオマーカーの「正常」発現レベルは、免疫障害に罹患していない対象、例えば、ヒト患者の細胞内のバイオマーカーの発現レベルである。バイオマーカーの「過剰発現」または「有意に高い発現レベル」とは、発現を評価するのに採用されるアッセイの標準誤差よりも大きい、対照試料（例えば、バイオマーカー関連疾患を有さない健常対象に由来する試料）中のバイオマーカーの発現活性またはレベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルより少なくとも１０％高く、より好ましくは、この１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍またはそれ超である被験試料中の発現レベルを指す。バイオマーカーの「有意に低い発現レベル」とは、対照試料（例えば、バイオマーカー関連疾患を有さない健常対象に由来する試料）中のバイオマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルより少なくとも１０％低く、より好ましくは、この１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０分の１またはそれ未満の被験試料中の発現レベルを指す。このような「有意性」レベルはまた、発現、阻害、細胞傷害作用、細胞増殖などについて本明細書で記載される、他の任意の測定されるパラメータにも適用することができる。
【００４９】
「予測」という用語は、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法など、抗免疫障害療法に対する免疫障害の応答の可能性を決定するためのバイオマーカーの使用を含む。バイオマーカーの、このような予測的使用は、例えば、（１）コピー数の増大もしくは減少（例えば、ＦＩＳＨ、ＦＩＳＨおよびＳＫＹ、例えば、当技術分野では、少なくとも、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８６巻：２８９〜３０１頁において記載されている、単一分子シークエンシング、またはｑＰＣＲによる）、バイオマーカー核酸の過剰発現もしくは過少発現（例えば、ＩＳＨ、ノーザンブロット、またはｑＰＣＲによる）、バイオマーカー細胞または細胞の比の増大または減少（例えば、細胞選別および／または計数による）、タンパク質標的（例えば、ＩＨＣによる）および／もしくはバイオマーカー標的、または、例えば、アッセイされる免疫障害試料の約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％もしくはそれ超の、活性の増大もしくは減少；（２）生体試料、例えば、免疫障害に罹患した対象、例えば、ヒトに由来する、組織、全血、血清、血漿、口腔内切屑、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、または骨髄を含有する試料中の、その絶対的なまたは相対的にモジュレートされた存在または非存在；（３）免疫障害を伴う患者（例えば、特定の抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）に応答する患者、またはこれに対する抵抗性を発生させる患者）の臨床サブセット中の、その絶対的なまたは相対的にモジュレートされた存在または非存在により確認することができる。
【００５０】
「防止する」、「防止すること」、「防止」、「予防的処置」などの用語は、疾患、障害、または状態を有さないが、これらを発症する危険性があるか、またはこれらに感受性の対象における、疾患、障害、または状態を発症する確率を低減することを指す。
【００５１】
「プローブ」という用語は、具体的に意図される標的分子、例えば、バイオマーカー核酸によりコードされるかまたはこれに対応する、ヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合することが可能な任意の分子を指す。プローブは、当業者により合成される場合もあり、適切な生物学的調製物に由来する場合もある。標的分子の検出を目的として、プローブは、本明細書で記載される通りに標識されるように、特異的にデザインすることができる。プローブとして活用されうる分子の例は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子を含むがこれらに限定されない。
【００５２】
「予後診断」という用語は、免疫障害の可能性のある経過およびアウトカムまたは疾患からの回復の可能性についての予測を含む。一部の実施形態では、統計学的アルゴリズムの使用により、個体における免疫障害の予後診断をもたらす。例えば、予後診断は、手術、免疫障害の臨床亜型（例えば、慢性ＧＶＨＤなど、ＧＶＨＤの亜型）の発症、１もしくは複数の臨床因子の発症、または疾患からの回復でありうる。
【００５３】
「抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）に対する応答」という用語は、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）に対する免疫障害（例えば、ＧＶＨＤ）の任意の応答に関する。抗免疫障害応答は、実施例で記載される基準を含む、当技術分野で周知の方法に従い評価することができる。応答は、百分率の変化のように、定量的に記録することもでき、「病理学的完全応答」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定病態」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、または他の定性的基準のように、定性的に記録することもできる。応答の評価は、ネオアジュバントまたはアジュバント療法の開始後早期に、例えば、数時間後、数日間後、数週間後、または、好ましくは数カ月間後に行うことができる。一部の実施形態では、本明細書で記載される治療的処置の臨床有効性は、臨床的有用率（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｒａｔｅ）（ＣＢＲ）を測定することにより決定することができる。臨床的有用率は、治療の終了時から少なくとも６カ月後の時点において完全寛解（ＣＲ）している患者の百分率と、部分寛解（ＰＲ）している患者の数と、安定病態（ＳＤ）である患者の数との合計を決定することにより測定する。この式の略記は、６カ月間にわたるＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。一部の実施形態では、特定の抗免疫障害治療レジメンについてのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれ超である。抗免疫障害療法に対する応答を評価するためのさらなる基準は、以下：全生存としてもまた公知の死亡までの生存（ここで、前記死亡は、原因を問わない場合もあり、腫瘍に関連する場合もある）；「無再発生存」（ここで、再発という用語は、限局的および遠隔的再発の両方を含むものとする）；無病生存（ここで、疾患という用語は、免疫障害およびこれと関連する疾患を含むものとする）の全てを含む「生存」に関する。前記生存の長さは、規定された開始点（例えば、診断時または処置の開始）および終了点（例えば、死または再発）を参照することにより計算することができる。加えて、処置の有効性についての基準は、生存の確率、所与の期間内の再発の確率などを含むように拡張することができる。例えば、適切な閾値を決定するために、特定の治療レジメンを、対象の集団に施行することができ、アウトカムを、任意の治療を施行する前に決定されたバイオマーカー測定値と相関させることができる。アウトカム測定値は、ネオアジュバント状況において施される治療に対する病理学的応答でありうる。代替的に、全生存および無病生存などのアウトカム尺度を、バイオマーカー測定値が既知である治療後の対象について、ある期間にわたりモニタリングすることができる。対象をモニタリングする期間は、変動しうる。例えば、対象を、少なくとも０．２５、０．５、０．７��、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０カ月間にわたりモニタリングすることができる。抗免疫障害療法のアウトカムと相関する、バイオマーカーの測定閾値は、実施例節で記載される方法など、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。
【００５４】
用語はまた、例えば、最初の再発までの期間であり、再発のエビデンスを伴わない最初の事象もしくは死としての第２の独立の免疫障害については打ち切る、再発までの時間の延長、または処置から、任意の原因による死までの期間である、全生存の延長により反映される、予後診断の改善も指す場合がある。応答するまたは応答を有するとは、刺激に曝露された場合に達せられる有益なエンドポイントがあることを意味する。代替的に、刺激に曝露されると、負の（ｎｅｇａｔｉｖｅ）または有害な症状は、最小化されるか、軽減されるか、または緩和される。腫瘍または対象が、好適な応答を呈する可能性を評価することは、腫瘍または対象が、好適な応答を呈さない（すなわち、応答の欠如を呈するか、または非応答性である）可能性を評価することと同等であることが理解されるであろう。
【００５５】
本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉剤」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、標的バイオマーカー遺伝子の発現に干渉するか、またはこれを阻害する任意の薬剤として定義される。このようなＲＮＡ干渉剤は、本発明の標的バイオマーカー遺伝子またはその断片と相同なＲＮＡ分子を含む核酸分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、標的バイオマーカー核酸の発現に干渉するか、またはこれを阻害する小分子を含むがこれらに限定されない。
【００５６】
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」とは、進化において保存された過程であって、標的バイオマーカー核酸と同一であるか、または高度に類似する配列のＲＮＡを、発現させるか、または導入する結果として、その標的化遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の、配列特異的分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）をもたらし（Ｃｏｂｕｒｎ，  Ｇ．およびＣｕｌｌｅｎ，  Ｂ．（２００２年）、Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７６巻（１８号）：９２２５頁を参照されたい）、これにより、標的バイオマーカー核酸の発現を阻害する過程である。一実施形態では、ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。この過程は、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞において記載されている。天然では、ＲＮＡｉは、長鎖ｄｓＲＮＡの、ｓｉＲＮＡと称する二本鎖断片への加工的切断を促進する、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼであるＤｉｃｅｒにより誘発される。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識および切断するタンパク質複合体に組み込まれる。ＲＮＡｉはまた、核酸分子、例えば、合成ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または他のＲＮＡ干渉剤を導入して、標的バイオマーカー核酸の発現を阻害またはサイレンシングすることによっても誘発することができる。本明細書で使用される場合、「標的バイオマーカー核酸の発現の阻害」または「マーカー遺伝子の発現の阻害」は、標的バイオマーカー核酸または標的バイオマーカー核酸によりコードされるタンパク質の発現またはタンパク質活性またはレベルの任意の低下を含む。低下は、ＲＮＡ干渉剤により標的化されていない、標的バイオマーカー核酸の発現または標的バイオマーカー核酸によりコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％またはそれ超の低下でありうる。
【００５７】
少なくとも１つのバイオマーカーの存在またはレベルを検出または決定するために使用される「試料」という用語は、全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便（例えば、排泄物）、涙、および他の任意の体液（例えば、上記の「体液」の定義下で記載した）、または小腸、結腸試料、または手術による切除組織などの組織試料（例えば、生検材料）であることが典型的である。ある特定の場合には、本発明の方法は、試料中の少なくとも１つのマーカーの存在またはレベルを検出または決定する前に、試料を個体から得るステップをさらに含む。一部の実施形態では、Ｔリンパ球またはそのサブセットを含む任意の試料が、本発明に従い有用である。
【００５８】
「相乗効果」という用語は、２つまたはそれ超の抗免疫障害剤または療法の組合せ効果が、このような薬剤または治療単独の各々による個別の効果の合計より大きくなりうることを指す。
【００５９】
「対象」という用語は、任意の健常な動物、哺乳動物、もしくはヒト、または免疫障害に罹患した、任意の動物、哺乳動物、もしくはヒトを指す。「対象」という用語は、「患者」と互換的である。
【００６０】
「生存」という用語は、以下：全生存としてもまた公知の死亡までの生存（ここで、前記死亡は、原因を問わない場合もあり、腫瘍に関連する場合もある）；「無再発生存」（ここで、再発という用語は、限局的および遠隔的再発の両方を含むものとする）；無病生存（ここで、疾患という用語は、免疫障害およびこれと関連する疾患を含むものとする）の全てを含む。前記生存の長さは、規定された開始点（例えば、診断時または処置の開始）および終了点（例えば、死、再発または転移）を参照することにより計算することができる。加えて、処置の有効性についての基準は、治療への応答、生存の確率、所与の期間内の再発の確率などを含むように拡張することができる。
【００６１】
「治療効果」という用語は、薬理学的活性物質により引き起こされる、動物、特に哺乳動物、より特定すると、ヒトにおける局所または全身効果を指す。したがって、用語は、疾患の診断、治癒、軽減、処置、もしくは防止、または動物もしくはヒトにおける、所望の身体もしくは精神の発達および状態の増強における使用のために意図される任意の物質を意味する。「治療有効量」という語句は、何らかの所望の局所または全身効果を、任意の処置に適用可能な、妥当なベネフィット／リスク比で生み出す、このような治療または物質の量を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指数、溶解度などに依存するであろう。例えば、本発明の方法により発見されるある特定の化合物は、このような処置に適用可能な、妥当なベネフィット／リスク比をもたらすのに十分な量で投与することができる。
【００６２】
「転写されたポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド転写物」とは、バイオマーカー核酸の転写、ならびに、存在する場合、ＲＮＡ転写物の正常な転写後プロセシング（例えば、スプライシング）およびＲＮＡ転写物の逆転写により作られる成熟ｍＲＮＡの全部または一部に相補的であるか、またはそれと相同なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはこのようなＲＮＡもしくはｃＤＮＡのアナログ）である。
【００６３】
Ｉ．Ｔｒｅｇ、Ｔｃｏｎ、Ｔｒｅｇ／Ｔｃｏｎ比
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）とは、循環ＣＤ４＋  Ｔ細胞集団の約５〜１０％を構成し、自己反応性リンパ球を主に抑制し、先天および適応免疫応答を制御するように作用する、天然に存在するＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋  Ｔリンパ球である（ＰｉｃｃｉｒｉｌｌｏおよびＳｈｅｖａｃｈ（２００４年）、Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻：８１〜８８頁；ＦｅｈｅｒｖａｒｉおよびＳａｋａｇｕｃｈｉ（２００４年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻：２０３〜２０８頁；Ａｚｕｍａら（２００３年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６３巻：４５１６〜４５２０頁；Ｃｅｄｅｒｂｏｍら（２０００年）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０巻：１５３８〜１５４３頁；Ｍａｌｏｙら（２００３年）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９７巻：１１１〜１１９頁；Ｓｅｒｒａら（２００３年）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９巻：８７７〜８８９頁；ＴｈｏｒｎｔｏｎおよびＳｈｅｖａｃｈ（１９９８年）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１８８巻：２８７〜２９６頁；Ｊａｎｓｓｅｎｓら（２００３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１巻：４６０４〜４６１２頁；Ｇａｓｔｅｉｇｅｒら（２０１３年）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、２１０巻：１１６７〜１１７８頁；Ｓｉｔｒｉｎら（２０１３年）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、２１０巻：１１５３〜１１６５頁）。Ｔｒｅｇは、従来型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎ）の増殖、拡大、およびエフェクター活性を阻害することにより、この抑制を、少なくとも部分的に達成する。Ｔｒｅｇはまた、Ｔ細胞の補助（ｈｅｌｐ）および活性化を阻害することにより細胞間接触を介して、またはＩＬ−１０もしくはＴＧＦ−βなど、免疫抑制性サイトカインの放出を介して、エフェクターＴ細胞がそれらの（自己）標的を破壊することも抑制する。Ｔｒｅｇ細胞の枯渇は、ＩＬ−２誘導性抗腫瘍免疫を増強することが示された（Ｉｍａｉら（２００７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．、９８巻：４１６〜２３頁）。
【００６４】
Ｔｃｏｎとは、それらによる、１または複数のＴ細胞受容体の発現のために、免疫応答を増大させるエフェクター機能（例えば、サイトカインの分泌、細胞傷害活性など）を有する、Ｔｃｏｎｖとしてもまた公知の従来型Ｔ細胞である。Ｔｃｏｎは、Ｔｒｅｇではない任意のＴ細胞集団として定義され、例えば、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、休止Ｔｃｏｎ、または、例えば、Ｔｈ１もしくはＴｈ２系統へと分化したＴｃｏｎを含む。「ナイーブＴｃｏｎ」とは、骨髄内で分化し、胸腺における中枢性選択の正および負の過程を経ることには成功したが、いまだ抗原への曝露により活性化してはいないＣＤ４＋Ｔ細胞である。ナイーブＴｃｏｎは一般に、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現、ＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９など、活性化マーカーの非存在、およびＣＤ４５ＲＯなど、メモリーマーカーの非存在を特徴とする。したがって、ナイーブＴｃｏｎは、静止性でありかつ分裂しないものと考えられ、ホメオスタシス性生存のために、インターロイキン７（ＩＬ−７）およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を必要とする（少なくともＷＯ２０１０／１０１８７０を参照されたい）。このような細胞の存在および活性は、免疫応答の抑制の文脈では所望されない。Ｔｒｅｇと異なり、Ｔｃｏｎは、アネルギー性ではなく、抗原ベースのＴ細胞受容体の活性化に応答して増殖しうる（Ｌｅｃｈｌｅｒら（２００１年）、Ｐｈｉｌｏｓ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．、３５６巻：６２５〜６３７頁）。
【００６５】
したがって、Ｔｒｅｇの数を増大させ、Ｔｒｅｇの活性を増大させ、かつ／またはＴｒｅｇの細胞死（例えば、アポトーシス）を減少させることは、ある範囲の免疫障害（例えば、ｃＧＶＨＤ）と関連する望ましくない免疫反応を抑制するために有用である。例えば、マウスモデルにおいて、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇと、ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞との１：１のミックスを、ドナー骨髄幹細胞に添加したところ、移植後における悪性の再発の増大を伴わずに、同種免疫活性化およびＧＶＨＤが抑制された（Ｅｄｉｎｇｅｒら（２００３年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、９巻：１１４４〜１１５０頁）。ヒトでは、活動性のｃＧＶＨＤを伴う、ＨＳＣＴレシピエントにおけるＴｒｅｇ再構成の機能障害が生じる（Ｚｏｒｎら（２００５年）、Ｂｌｏｏｄ、１０６巻：２９０３〜２９１１頁）。活動性のｃＧＶＨＤを伴う患者では、Ｔｒｅｇ再構成の機能障害、低レベルのテロメラーゼ、およびテロメアの短縮が、Ｔｒｅｇの生存の短縮に寄与すると考えられている（Ｚｏｒｎら（２００５年）、Ｂｌｏｏｄ、１０６巻：２９０３〜２９１１頁；Ｍａｔｓｕｏｋａら（２０１０年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１２０巻：１４７９〜１４９３頁；Ｋａｗａｎｏら（２０１１年）、Ｂｌｏｏｄ、１１８巻：５０２１〜５０３０頁）。Ｔｒｅｇのホメオスタシスおよび機能におけるＩＬ−２の役割は、抗免疫障害療法としてのその限定された有効性の一因となると考えられ、ＩＬ−２に同系Ｔ細胞枯渇ドナー骨髄を加えたｉｎ  ｖｉｖｏ投与が、ＧＶＬ応答に影響を与えることなく、ＭＨＣミスマッチマウスａｌｌｏ−ＳＣＴ後におけるＧＶＨＤを防止するという知見（Ｓｙｋｅｓら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７巻：５６３３〜５６４７頁；Ｓｙｋｅｓら（１９９０年）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１７１巻：６４５〜６５８頁）を、部分的に説明する。マウスａｌｌｏ−ＨＳＣＴモデルでは、ｅｘ−ｖｉｖｏにおいて拡大されたＴｒｅｇの、ＩＬ−２との共注入もまた、免疫再構成を改善し、ＧＶＬ応答を保存しながら、ＧＶＨＤの抑制を結果としてもたらした（Ｔａｙｌｏｒら（２００２年）、Ｂｌｏｏｄ、９９巻：３４９３〜３４９９頁；Ｔｒｅｎａｄｏら（２００３年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１２巻：１６８８〜１６９６頁）。
【００６６】
Ｔｒｅｇはまた、炎症の抑制においても重要である。進行中の炎症の文脈では、処置が、ＧＶＨＤを悪化させうる、従来型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎ）または他のエフェクターの活性化を伴わずに、Ｔｒｅｇを優先的に増強することは極めて重要である。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの有効な増進はまた、末梢における寛容が損なわれた他の障害（例えば、ＳＬＥ、Ｔ１Ｄ、ＭＳ、乾癬、ＲＡ、ＩＢＤ、血管炎のような自己免疫疾患）であって、Ｔｒｅｇの機能不全がいっそう関与する障害にも、直接関連する（Ｇｒｉｎｂｅｒｇ−Ｂｌｅｙｅｒら（２０１０年）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、２０７巻：１８７１〜１８７８頁；Ｂｕｃｋｎｅｒ（２０１０年）、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻：８４９〜８５９頁；Ｈｕｍｒｉｃｈら（２０１０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０７巻：２０４〜２０９頁；Ｃａｒｂｏｎｅら（２０１４年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、２０巻：６９〜７４頁）。
【００６７】
ＩＩ．インターロイキン２（ＩＬ−２）
「インターロイキン２（ＩＬ−２）」または「Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）」という用語は、リンパ球の発生、生存、およびホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たす、１５．５ｋＤａの球状の糖タンパク質を指す。用語は、免疫阻害効果を所有する（例えば、Ｔｒｅｇの増大、Ｔｒｅｇの、Ｔｃｏｎに対する比の増大、Ｔｒｅｇの増殖の増大、Ｔｒｅｇの機能の増大などにより）、任意の精製または組換えＩＬ−２分子であって、修飾天然ＩＬ−２分子、切断型ＩＬ−２分子、改変体ＩＬ−２分子、および共有結合的に修飾されたＩＬ−２分子（例えば、グリコシル化または融合タンパク質形態）を含むがこれらに限定されないＩＬ−２分子を含む。
【００６８】
ＩＬ−２は、アンチパラレルで両親媒性の４つのαヘリックスであって、その機能に重要な四次構造を形成するαヘリックスからなる（Ｓｍｉｔｈ（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻：１１６９〜１１７６頁；Ｂａｚａｎ（１９９２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻：４１０〜４１３頁）。当技術分野では、ヒトＩＬ−２の核酸およびポリペプチド配列が周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより維持されているＧｅｎＢａｎｋデータベース上で入手可能な、ＮＭ＿０００５８６．３のｃＤＮＡ配列は、残基１〜２０が、シグナルペプチドを表し、残りの残基が、成熟サイトカインを表す、前駆体のＩＬ−２タンパク質（ＮＰ＿０００５７７．２）をコードする。一部の実施形態では、最初の２０、２１、２２、またはそれ超のアミノ酸を、成熟サイトカインをもたらすために、シグナルペプチドとして除去することができる。ヒト以外の種におけるＩＬ−２オーソログの核酸およびプロポリペプチド配列もまた、周知であり、例えば、チンパンジーＩＬ−２（ＸＭ＿５１７４２５．３およびＸＰ＿５１７４２５．１）、サルＩＬ−２（ＮＭ＿００１０４７１３０．１およびＮＰ＿００１０４０５９５．１）、イヌＩＬ−２（ＮＭ＿００１００３３０５．１およびＮＰ＿００１００３３０５．１）、マウスＩＬ−２（ＮＭ＿００８３６６．３およびＮＰ＿０３２３９２．１）、およびラットＩＬ−２（ＮＭ＿０５３８３６．１およびＮＰ＿４４６２８８．１）を含む。各プロポリペプチドの残基１〜２０は、シグナルペプチドを表し、残りの残基は、成熟サイトカインを表す。
【００６９】
ＩＬ−２オーソログの代表的な配列を、下記の表１に提示する。用語はさらに、ＩＬ−２分子に関して、本明細書で記載される特色の任意の組合せを指すために使用しうることに留意されたい。例えば、配列組成、同一性百分率、配列の長さ、ドメインの構造、機能的活性などの任意の組合せを使用して、本発明のＩＬ−２分子について記載することができる。
【００７０】
さらに他の実施形態では、「ＩＬ−２」という用語は、デス−アラニル−１、セリン−１２５ヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）；Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｃ．およびＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）および／または酵母内で産生される組換えヒトＩＬ−２（Ｒｏｎｃｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））を含む。アルデスロイキンは、２２ＭＩＵのアルデスロイキンを含有する単回使用用バイアル内の、滅菌、白色〜オフホワイトで、凍結乾燥させたケーキとして供給されている。２２００万国際単位（ＭＩＵ）のバイアルでは、１．２ｍＬの注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）で再構成した場合、各１ｍＬは、約１７０ｍｃｇの一塩基性リン酸ナトリウムおよび８９０ｍｃｇの二塩基性リン酸ナトリウムにより、７．５（範囲：７．２〜７．８）のｐＨへと緩衝化された１８ＭＩＵ（１．１ｍｇ）のＩＬ−２、５０ｍｇのマンニトール、および約１８０ｍｃｇのドデシル硫酸ナトリウムを含有する。天然ＩＬ−２とは対照的に、組換えＩＬ−２は、グリコシル化されておらず、２つのアミノ酸位置において異なる。ＩＬ−２の天然形態と組換え形態との間に、弁別可能な機能的差異は見られない。
【００７１】
例示的なＩＬ−２改変体、組換えＩＬ−２、ＩＬ−２を産生する方法、ＩＬ−２を精製する方法、製剤化の方法などは、当技術分野で周知であり、例えば、少なくとも、それらの各々が、参照により、それらの全体において、全ての目的で本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５３０，７８７号、同第４，５６９，７９０号、同第４，５７２，７９８号、同第４，６０４，３７７号、同第４，７４８，２３４号、同第４，８５３，３３２号、同第４，９５９，３１４号、同第５，４６４，９３９号、同第ＲＥ３３，６５３号、同第５，２２９，１０９号、同第７，５１４，０７３号、および同第７，５６９，２１５号において見出すことができる。
【００７２】
例えば、遺伝暗号の縮重に起因して、バイオマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列と異なり、したがって、同じタンパク質をコードする、バイオマーカー核酸分子が想定される。遺伝暗号（下記に示される）により規定される通り、特定のタンパク質のアミノ酸配列と、タンパク質をコードしうるヌクレオチド配列との間には、公知で明確な対応が見られる。同様に、遺伝暗号により規定される通り、特定の核酸のヌクレオチド配列とこの核酸によりコードされるアミノ酸配列との間に、公知で明確な対応が見られる。
遺伝暗号
アラニン（Ａｌａ、Ａ）  ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＴ
アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）  ＡＧＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ
アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）  ＡＡＣ、ＡＡＴ
アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）  ＧＡＣ、ＧＡＴ
システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）  ＴＧＣ、ＴＧＴ
グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）  ＧＡＡ、ＧＡＧ
グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）  ＣＡＡ、ＣＡＧ
グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）  ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＴ
ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）  ＣＡＣ、ＣＡＴ
イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）  ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＴ
ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）  ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ
リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）  ＡＡＡ、ＡＡＧ
メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）  ＡＴＧ
フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）  ＴＴＣ、ＴＴＴ
プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）  ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ
セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）  ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ
トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）  ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ
トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）  ＴＧＧ
チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）  ＴＡＣ、ＴＡＴ
バリン（Ｖａｌ、Ｖ）  ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＴ
終結シグナル（終了）  ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ
【００７３】
遺伝暗号の重要で周知の特色は、タンパク質を作るのに使用されるアミノ酸の大半について、１つを超えるコードヌクレオチドトリプレット（上記で例示された）を利用しうる、その冗長性である。したがって、いくつかの異なるヌクレオチド配列が、所与のアミノ酸配列をコードしうる。このようなヌクレオチド配列は、全ての生物において、同じアミノ酸配列の産生を結果としてもたらすので（ある特定の生物は、一部の配列を、他の配列より効率的に翻訳しうるが）、機能的に同等であると考えられる。さらに、時折、所与のヌクレオチド配列内では、プリンまたはピリミジンのメチル化改変体を見出すことができる。このようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと、対応するアミノ酸とのコード関係には影響を及ぼさない。
【００７４】
前出の点では、ＤＮＡまたはＲＮＡを、アミノ酸配列に翻訳する遺伝暗号を使用して、ポリペプチドのアミノ酸配列を導出するのに、バイオマーカータンパク質（またはその任意の部分）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列を使用することができる。同様に、ポリペプチドのアミノ酸配列については、ポリペプチドをコードしうる、対応するヌクレオチド配列を、遺伝暗号から推定することができる（その冗長性のために、任意の所与のアミノ酸配列について、複数の核酸配列をもたらすであろう）。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列についての、本明細書における記載および／または開示は、ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列についての記載および／または開示も含むと考えるものとする。同様に、本明細書における、ポリペプチドのアミノ酸配列についての記載および／または開示は、アミノ酸配列をコードしうる、全ての可能なヌクレオチド配列についての記載および／または開示も含むと考えるものとする。
【００７５】
加えて、当業者は、集団（例えば、ヒト集団）内には、アミノ酸配列の変化をもたらす、ＤＮＡ配列の多型が存在しうることを理解するであろう。このような遺伝子多型は、自然の対立遺伝子変異に起因して、集団内の個体間に存在しうる。対立遺伝子とは、所与の遺伝子座において代替的に生じる遺伝子群のうちの１つである。加えて、ＲＮＡの発現レベルに影響を及ぼすＤＮＡ多型はまた、その遺伝子の全発現レベルにも影響を及ぼしうる（例えば、調節または分解に影響を及ぼすことにより）ことが理解されるであろう。
【００７６】
本明細書では「対立遺伝子改変体」と互換的に使用される「対立遺伝子」という用語は、遺伝子またはその部分の代替的形態を指す。対立遺伝子は、相同な染色体上の、同じ遺伝子座または位置を占有する。対象が、遺伝子の２つの同一な対立遺伝子を有する場合、対象は、遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合性であるという。対象が、遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合、対象は、遺伝子または対立遺伝子についてヘテロ接合性であるという。例えば、バイオマーカーの対立遺伝子は、単一のヌクレオチドにおいて互いに異なる場合もあり、いくつかのヌクレオチドにおいて互いに異なる場合もあり、ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含みうる。遺伝子の対立遺伝子はまた、１または複数の変異を含有する遺伝子の形態でもありうる。
【００７７】
本明細書で互換的に使用される「遺伝子の多型領域の対立遺伝子改変体」または「対立遺伝子改変体」という用語は、集団内の遺伝子のこの領域内で見出される、いくつかの可能なヌクレオチド配列のうちの１つを有する、遺伝子の代替的形態を指す。本明細書で使用される場合、対立遺伝子改変体は、機能的な対立遺伝子改変体、非機能的な対立遺伝子改変体、ＳＮＰ、変異、および多型を包含することを意図する。
【００７８】
「一塩基多型」（ＳＮＰ）という用語は、対立遺伝子の配列間の変異部位である、単一のヌクレオチドにより占有された多型部位を指す。部位は通例、対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団のメンバー１００例中１例または１０００例中１例未満において変動する配列）を先行させ、これを後続させる。ＳＮＰは通例、多型部位における、１つのヌクレオチドによる、別のヌクレオチドの置換に起因して起こる。ＳＮＰはまた、基準対立遺伝子と比べた、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入からも起こりうる。多型部位は、基準塩基以外の塩基により占有されていることが典型的である。例えば、基準対立遺伝子が、多型部位において、塩基「Ｔ」（チミジン）を含有する場合、変更された対立遺伝子は、多型部位において、「Ｃ」（シチジン）、「Ｇ」（グアニン）、または「Ａ」（アデニン）を含有しうる。ＳＮＰは、タンパク質をコードする核酸配列内で生じる可能性があり、この場合、ＳＮＰは、欠損性の改変体タンパク質もしくは他の形の改変体タンパク質、または遺伝子疾患をもたらしうる。このようなＳＮＰは、遺伝子のコード配列を変更し、したがって、別のアミノ酸を指定する（「ミスセンス」ＳＮＰ）場合があり、またはＳＮＰは、終止コドンを導入する（「ナンセンス」ＳＮＰ）場合がある。ＳＮＰが、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない場合、ＳＮＰは、「サイレント」と呼ばれる。ＳＮＰはまた、ヌクレオチド配列の非コード領域内でも生じうる。これは、例えば、選択的スプライシングの結果としての欠損性のタンパク質発現を結果としてもたらす場合もあり、タンパク質の機能に対して影響を及ぼさない場合もある。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。このような自然の対立遺伝子変異は、所与の遺伝子のヌクレオチド配列内で、１〜５％の分散を結果としてもたらしうることが典型的である。代替的な対立遺伝子は、いくつかの異なる個体において、目的の遺伝子をシークエンシングすることにより同定することができる。これは、様々な個体における同じ遺伝子座を同定するハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、たやすく実行することができる。自然の対立遺伝子変異の結果であり、機能的活性を変更しない、あらゆるかつ全てのこのようなヌクレオチド変異および結果として生じるアミノ酸多型または変異は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００８０】
別の実施形態では、バイオマーカー核酸分子は、少なくとも７、１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、６５０、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３５００、４０００、４５００、またはそれ超のヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で、本発明のマーカーに対応する核酸分子または本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件であって、その下では、互いと少なくとも６０％（６５％、７０％、７５％、８０％、好ましくは８５％）同一なヌクレオチド配列が、互いとハイブリダイズしたままであることが典型的である条件について記載することを意図する。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ（１９８９年）の、６．３．１〜６．３．６節において見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の、好ましい、非限定的な例は、約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションとそれに続く、５０〜６５℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の、１回または複数回の洗浄である。
【００８１】
集団内に存在しうる、本発明の核酸分子の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列の変化を、変異により導入し、これにより、核酸分子によりコードされるタンパク質の生物学的活性を変更せずに、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらしうることをさらに理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基においてアミノ酸置換をもたらす、ヌクレオチド置換を施すことができる。「非必須」アミノ酸残基が、生物学的活性を変更せずに、野生型配列から変更されうる残基であるのに対し、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。例えば、多様な種のホモログの間で保存されないか、または半保存的であるに過ぎないアミノ酸残基は、活性に必須ではない可能性があるので、変更のための標的となる可能性が高いであろう。代替的に、多様な種（例えば、マウスおよびヒト）のホモログの間で保存されるアミノ酸残基は、活性に必須でありうるので、変更のための標的とならない可能性が高いであろう。
【００８２】
したがって、本発明の別の態様は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含有する、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。このようなポリペプチドは、アミノ酸配列が、本発明のマーカーに対応する、天然に存在するタンパク質とは異なるが、生物学的活性を保持する。一実施形態では、バイオマーカータンパク質は、本明細書で記載されるバイオマーカータンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも約４０％同一であり、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超同一なアミノ酸配列を有する。
【００８３】
改変体タンパク質をコードする単離された核酸分子は、１または複数のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失を、コードされるタンパク質に導入するように、１または複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を、本発明の核酸のヌクレオチド配列に導入することにより創出することができる。変異は、部位指向変異誘発およびＰＣＲ媒介型変異誘発など、標準的な技法により導入することができる。保存的アミノ酸置換は、１または複数の、予測される非必須アミノ酸残基において施すことが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえた置換である。当技術分野では、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を伴うアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を伴うアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を伴うアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を伴うアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝型側鎖を伴うアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を伴うアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。代替的に、変異は、飽和変異誘発などにより、コード配列の全部または一部に沿って、ランダムに導入することができ、結果として得られる変異体を、生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発に続き、コードされるタンパク質を、組換えにより発現させ、タンパク質の活性を決定することができる。
【００８４】
本発明の別の態様は、バイオマーカータンパク質およびその生物学的に活性な部分の使用に関する。一実施形態では、マーカーに対応する天然ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製法を使用する、適切な精製スキームにより、細胞または組織供給源から単離することができる。別の実施形態では、本発明のマーカーに対応するポリペプチドを、組換えＤＮＡ法により作製する。組換え発現に対する代替法として、本発明のマーカーに対応するポリペプチドは、標準的なペプチド合成法を使用して、化学的に合成することができる。
【００８５】
バイオマーカーポリペプチドの生物学的に活性な部分は、本明細書で記載される、バイオマーカータンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるか、またはこれに由来するが、全長タンパク質よりも少ない数のアミノ酸を含み、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を呈するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を伴うドメインまたはモチーフを含むことが典型的である。本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、またはそれ超のアミノ酸の長さであるポリペプチドでありうる。さらに、タンパク質の他の領域を欠失させた、他の生物学的に活性な部分は、組換え法により調製し、本発明のポリペプチドの天然形態の機能的活性のうちの１または複数について評価することができる。
【００８６】
好ましいポリペプチドは、本明細書で記載される核酸分子によりコードされるバイオマーカータンパク質のアミノ酸配列を有する。他の有用なタンパク質は、これらの配列のうちの１つと実質的に同一（例えば、少なくとも約４０％、好ましくは、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）であり、対応する天然に存在するタンパク質のタンパク質の機能的活性を保持するが、自然の対立遺伝子変異または変異誘発に起因して、アミノ酸配列が異なる。
【００８７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するには、最適の比較を目的として、配列をアラインする（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適のアラインメントのために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列内に、ギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有される場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、配列により共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）×１００）。一実施形態では、２つの配列は、同じ長さである。
【００８８】
２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために活用される数学的アルゴリズムの、好ましい、非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８７巻：２２６４〜２２６８頁のアルゴリズムであって、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９０巻：５８７３〜５８７７頁における通りに改変されたアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴによるヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るように、スコア＝１００、ワード長＝１２とするＮＢＬＡＳＴプログラムにより実施することができる。ＢＬＡＳＴによるタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るように、スコア＝５０、ワード長＝３とするＸＢＬＡＳＴプログラムにより実施することができる。比較を目的として、ギャップを施されたアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁において記載されている通り、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを活用することができる。代替的に、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠隔的関係を検出する反復的検索を実施することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを活用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の、デフォルトのパラメータを使用することができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを参照されたい。配列の比較のために活用される数学的アルゴリズムの、別の好ましい、非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８年）、Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ、４巻：１１〜７頁のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するために、ＡＬＩＧＮプログラムを活用する場合、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用することができる。局所的配列類似性の領域およびアラインメントを同定するための、さらに別の有用なアルゴリズムは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５巻：２４４４〜２４４８頁において記載されている、ＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するために、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用する場合、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表は、例えば、ｋ−タプル値を２として使用することができる。
【００８９】
２つの配列の間の同一性パーセントは、ギャップの許容を伴うかまたは伴わずに、上記で記載した技法と同様の技法を使用して決定することができる。同一性パーセントの計算では、正確なマッチだけをカウントする。
【００９０】
本発明はまた、バイオマーカータンパク質に対応する、キメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書で使用される場合、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわち、マーカーに対応するポリペプチド以外のポリペプチド）に作動可能に連結した、本発明のマーカーに対応するポリペプチドの全部または一部（好ましくは、生物学的に活性な部分）を含む。融合タンパク質内で、「作動可能に連結された」という用語は、本発明のポリペプチドと、異種ポリペプチドとを、互いとインフレームで融合させていることを示すように意図する。異種ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端と融合させることができる。
【００９１】
１つの有用な融合タンパク質は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドを、ＧＳＴ配列のカルボキシル末端と融合させた、ＧＳＴ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、本発明の組換えポリペプチドの精製を容易としうる。
【００９２】
別の実施形態では、融合タンパク質は、異種シグナル配列、免疫グロブリン融合タンパク質、毒素、または他の有用なタンパク質配列を含有する。本発明のキメラおよび融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ法により作製することができる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成器を含む従来の技法により合成することができる。代替的に、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続的な遺伝子断片の間の相補的な突出をもたらすアンカープライマーを使用して実行することができ、その後、これを、アニールさせ、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照されたい）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をあらかじめコードする、多くの発現ベクターが、市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分を、本発明のポリペプチドに、インフレームで連結するように、このような発現ベクターへとクローニングすることができる。
【００９３】
シグナル配列を使用して、分泌されるタンパク質または目的の他のタンパク質の分泌および単離を容易とすることができる。シグナル配列は、１または複数の切断事象において、分泌中に成熟タンパク質から一般に切断される疎水性アミノ酸のコアを特徴とすることが典型的である。このようなシグナルペプチドは、それらが、分泌経路を通過するときに、シグナル配列の、成熟タンパク質からの切断を可能とするプロセシング部位を含有する。したがって、本発明は、シグナル配列を有する、記載されるポリペプチドのほか、シグナル配列が、タンパク質分解により切断されたポリペプチド（すなわち、切断産物）に関する。一実施形態では、シグナル配列をコードする核酸配列を、発現ベクター内で、通常分泌されないか、またはその他の点で、単離することが困難なタンパク質など、目的のタンパク質に作動可能に連結することができる。シグナル配列は、発現ベクターが形質転換される真核生物宿主などからのタンパク質の分泌を導き、シグナル配列は、その後、または共時的に、切断される。次いで、タンパク質は、細胞外培地から、当技術分野で認知された方法により、たやすく精製することができる。代替的に、ＧＳＴドメインを伴うなど、精製を容易とする配列を使用して、シグナル配列を、目的のタンパク質に連結することができる。
【００９４】
本発明はまた、本明細書で記載されるバイオマーカーポリペプチドの改変体にも関する。このような改変体は、アゴニスト（模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ））またはアンタゴニストとして機能しうる、変更されたアミノ酸配列を有する。改変体は、変異誘発、例えば、個別の点変異または切断により生成することができる。アゴニストは、タンパク質の天然に存在する形態と実質的に同じ生物学的活性、またはタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを保持しうる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的のタンパク質を含む、細胞内シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーに競合的に結合することにより、タンパク質の天然に存在する形態の活性のうちの１または複数を阻害しうる。したがって、限定された機能の改変体による処置により、特異的な生物学的効果を誘発することができる。タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体による対象の処置は、タンパク質の天然に存在する形態による処置と比べて、対象における少ない副作用を有しうる。
【００９５】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入した宿主細胞に関する。本明細書では、「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語を、互換的に使用する。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。続く世代には、変異または環境的影響に起因して、ある特定の修飾が生じうるため、このような子孫は、実のところ、親細胞と同一でない場合もあるが、本明細書で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。
【００９６】
宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物細胞）でありうる。
【００９７】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション法を介して、原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、外来核酸を、宿主細胞に導入するための、当技術分野で認知された様々な技法であって、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む技法を指すことを意図する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに適する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）、および他の実験室マニュアルにおいて見出すことができる。
【００９８】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション法に応じて、ほんのわずかな割合の細胞だけが、外来ＤＮＡを、それらのゲノムに組み込みうることが公知である。これらの組込み体を同定および選択するために、選択可能マーカー（例えば、抗生物質に対する抵抗性についての）をコードする遺伝子を、一般に、目的の遺伝子と共に、宿主細胞に導入する。好ましい選択可能マーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を付与する選択可能マーカーを含む。導入される核酸を、安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物による選択（例えば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は存続する一方、他の細胞は死滅する）により同定することができる。
【表１−１】
2018500276.tif 000003
【表１−２】
2018500276.tif 000004
【００９９】
＊表１には、ＲＮＡ核酸分子（例えば、チミンをウリジン（ｕｒｅｄｉｎｅ）で置きかえた）、コードされるタンパク質のオーソログをコードする核酸分子のほか、それらの全長にわたり、表１に列挙された任意の配列番号の核酸配列、またはその部分と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ超の同一性を有する核酸配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列が含まれる。本明細書でさらに記載される通り、このような核酸分子は、全長核酸の機能を有しうる。
【０１００】
＊表１には、タンパク質のオーソログのほか、それらの全長にわたり、表１に列挙された任意の配列番号のアミノ酸配列、またはその部分と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ超の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子が含まれる。本明細書でさらに記載される通り、このようなポリペプチドは、全長ポリペプチドの機能を有しうる。
【０１０１】
ＩＬ−２は、最大で３つの個別のサブユニットからなり、その異なる会合が、ＩＬ−２に対するそれらのアフィニティーが異なる受容体形態をもたらしうる、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）に結合することにより、その作用を媒介する。α（ＣＤ２５）サブユニットと、β（ＣＤ１２２）サブユニットと、γ（γｃ、ＣＤ１３２）サブユニットとの会合は、ＩＬ−２に対する、三量体の高アフィニティー受容体を結果としてもたらす。βサブユニットとγサブユニットとからなる、二量体のＩＬ−２受容体を、中アフィニティーＩＬ−２Ｒと称する。αサブユニットは、単量体の低アフィニティーＩＬ−２受容体を形成する。二量体の中アフィニティーＩＬ−２受容体は、ＩＬ−２に、三量体の高アフィニティー受容体の、約１００分の１のアフィニティーで結合するが、二量体および三量体のＩＬ−２受容体改変体は両方とも、ＩＬ−２への結合時に、シグナルを伝達することが可能である（Ｍｉｎａｍｉら（１９９３年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻：２４５〜２６８頁）。よって、αサブユニットであるＣＤ２５は、ＩＬ−２シグナル伝達に必須ではない。αサブユニットが、その受容体への高アフィニティーの結合を付与するのに対し、βサブユニットであるＣＤ１２２と、γサブユニットとは、シグナル伝達に枢要である（Ｋｒｉｅｇら（２０１０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０７巻：１１９０６〜１１９１１頁）。（休止）ＣＤ４＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）により、ＣＤ２５を含む三量体のＩＬ−２受容体が発現される。三量体のＩＬ−２受容体はまた、従来型の活性化Ｔ細胞上でも一過性に誘導されるが、休止状態では、これらの細胞は、二量体のＩＬ−２受容体だけを発現する。Ｔｒｅｇは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、一貫して、最高レベルのＣＤ２５を発現する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔら（２００５年）、Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：１１４２〜１１５１頁）。
【０１０２】
天然ＩＬ−２は、１９７６年に、Ｔリンパ球の増殖因子として、最初に同定された。天然ＩＬ−２は、ヒトクラスター分類（ｈｕｍａｎ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）（ＣＤ）４＋  Ｔ細胞およびいくつかのＣＤ８＋  Ｔ細胞により産生され、主に活性化Ｔ細胞、特にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により合成される。天然ＩＬ−２は、Ｔ細胞の増殖および分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生、ならびに末梢血リンパ球の、細胞傷害性細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞への分化を誘導し、Ｔ細胞による、サイトカインおよび細胞溶解性分子の発現を促進し、Ｂ細胞の増殖および分化、ならびにＢ細胞による免疫グロブリンの合成を容易とし、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の発生、増殖、および活性化を刺激する（例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎ（２００９年）、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：５９５〜６０１頁；ＯｌｅｊｎｉｃｚａｋおよびＫａｓｐｒｚａｋ（２００８年）、Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ｍｏｎｉｔ．、１４巻：ｒａ１７９〜１８９頁；Ｍａｌｅｋ（２００８年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６巻：４５３〜４７９頁を参照されたい）。
【０１０３】
ＩＬ−２は、免疫応答の発生において、中心的な役割を果たすことが公知である。がんの臨床試験では、高用量の組換えＩＬ−２（例えば、８時間ごと、最大で１４用量にわたる、６００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのＩＶボーラス用量）は、転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）および転移性黒色腫における抗腫瘍活性を裏付けた。したがって、このような高用量ＩＬ−２は、欧州では、１９８９年に、米国では、１９９２年に、転移性ＲＣＣの処置について承認された。１９９８年には、転移性黒色腫を伴う患者を処置するための承認が得られた。組換えヒトＩＬ−２（アルデスロイキン）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｃ．およびＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）は、現在のところ、米国食品医薬品局（ＵＳ  ＦＤＡ）により承認されている。
【０１０４】
しかし、ＩＬ−２は、エフェクター細胞の拡大および活性を媒介するだけでなく、また、末梢における免疫寛容の維持に枢要に関与するという点で、免疫応答において二重の機能を有する。末梢における自己寛容の根底をなす主要な機構は、Ｔ細胞内の、ＩＬ−２誘導性活性化誘導型細胞死（ＡＩＣＤ）である。ＡＩＣＤとは、完全な活性化Ｔ細胞が、ＣＤ９５（Ｆａｓとしてもまた公知）またはＴＮＦ受容体などの細胞表面発現型細胞死受容体の係合を介して、プログラム細胞死を経る過程である。高アフィニティーＩＬ−２受容体を発現する抗原活性化Ｔ細胞（ＩＬ−２へのあらかじめの曝露の後における）が、増殖中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を介して、抗原により再刺激されると、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の発現が誘導され、細胞は、Ｆａｓに媒介されるアポトーシスに対して感受性となる。この過程は、ＩＬ−２依存性であり（Ｌｅｎａｒｄｏ（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５３巻：８５８〜８６１頁）、ＳＴＡＴ５を介して媒介される。Ｔリンパ球内のＡＩＣＤ過程により、自己抗原に対してだけでなく、腫瘍抗原など、明らかに宿主による組成の一部ではない遷延性抗原に対しても、寛容が確立されうる。
【０１０５】
さらに、ＩＬ−２はまた、末梢Ｔｒｅｇの維持にも関与する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔら（２００５年）、Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：１１４２〜１１５１頁；Ｄ’ＣｒｕｚおよびＫｌｅｉｎ（２００５年）、Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：１１５２〜１１５９頁；ＭａｌｏｙおよびＰｏｗｒｉｅ（２００５年）、Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：１１７１〜１１７２頁）。ｉｎ  ｖｉｖｏの生理学的濃度において、ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇの発生、拡大、および生存に必要である（ＭａｌｅｋおよびＢａｙｅｒ（２００４年）、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻：６６５〜６７４頁；Ｎｅｌｓｏｎ（２００４年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７２巻：３９８３〜３９８８頁）。実のところ、免疫エフェクター細胞を刺激することを意図した、ＨＳＣＴ後早期の低用量ＩＬ−２投与は実際、低および中アフィニティー受容体を発現することが典型的なＴｃｏｎ上よりも、Ｔｒｅｇ上において、高アフィニティーＩＬ−２受容体α（ＣＤ２５）がより多く発現することに起因して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴｒｅｇを優先的に拡大した（Ｚｏｒｎら（２００６年）、Ｂｌｏｏｄ、１０８巻：１５７１〜１５７９頁）。ヒトでは、ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇ内のＦＯＸＰ３発現を調節し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの拡大を誘導する（Ｚｏｒｎら（２００６年）、Ｂｌｏｏｄ、１０８巻：１５７１〜１５７９頁）。ステロイド不応性ｃＧＶＨＤを有する患者は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、機能的なＴｒｅｇを優先的に増大させることにより、低用量ＩＬ−２に応答し（例えば、ＣＤ４＋  Ｔｃｏｎカウントに影響を与えずに、Ｔｒｅｇカウントは、＞７倍上昇し、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比の中央値は、ベースラインから＞５倍増大した（ｐ＜０．００１））、評価可能な患者の約５０％が、皮膚、関節／筋膜／筋肉、肝臓、および末梢神経を含む、ｃＧＶＨＤ病変（ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）の部位において、ＮＩＨ基準に従う、客観的部分応答（ＰＲ）を示した（Ｋｏｒｅｔｈら（２０１１年）、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３６５巻：２０５５〜２０６６頁；Ｐａｖｌｅｔｉｃら（２００６年）、Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１２巻：２５２〜２６６頁）。例えば、わずかな応答を有するＰＲまたは安定病態（ＳＤ）である患者１５例中１２例は、長期ＩＬ−２を持続し、長期ＩＬ−２における患者１２例中１０例は、中央値を１３カ月間とする追跡にわたり、平均値を６０％とするグルココルチコイド漸減（範囲、２５〜１００％）中に、臨床応答を持続した。ＴｒｅｇカウントおよびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、８週間の時点で上昇を維持し（両方について、ベースラインと対比したｐ＜０．００１）、次いで、ＩＬ−２の中止後に低下した。さらに、ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇによる高レベルのＦｏｘＰ３の発現を増強し、自家Ｔｃｏｎの阻害が機能的に可能であった。Ｔｒｅｇによる免疫応答は、長期ＩＬ−２療法中に持続した（Ｋｏｒｅｔｈら（２０１１年）、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３６５巻：２０５５〜２０６６頁）。
【０１０６】
血漿ＩＬ−２レベルは、１週目までに急速に上昇し、次いで、Ｔｒｅｇカウントが上昇する間、持続的な毎日のＩＬ−２投与にも拘らず低下した（Ｍａｔｓｕｏｋａら（２０１３年）、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、５巻：１７９ｒａ４３）。Ｔｒｅｇの絶対数が増大し、ＩＬ−２による治療期間中に、Ｔｒｅｇ上のＣＤ２５発現のさらなる増大が見られるにつれ、ＩＬ−２レベルは降下した。ＩＬ−２を開始して１週間以内に、Ｔｒｅｇのホメオスタシスは、大幅に増強され、Ｔｒｅｇの増殖が、急速に誘導され、胸腺のＴｒｅｇ新生の増大は、４〜６週目においてピークに達し、Ｔｒｅｇ内の細胞生存マーカーであるＢｃｌ−２は、４週目以降、上昇したが、これは、８週目にＩＬ−２を中断したところ、可逆性であった（Ｍａｔｓｕｏｋａら（２０１３年）、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、５巻：１７９ｒａ４３）。これと比較して、Ｔｃｏｎのホメオスタシスに対する影響は、限定的であった。免疫機能についての検討は、ＩＬ−２の相対的な機能的欠損およびＴｒｅｇによるｐＳＴＡＴ５の活性化を伴う、ＩＬ−７およびＩＬ−１５のレベルの上昇に起因して、ｃＧＶＨＤが、ＣＤ４  Ｔｃｏｎによる、Ｓｔａｔ５の構成的活性化を特徴とすることを明らかにした（Ｍａｔｓｕｏｋａら（２０１３年）、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、５巻：１７９ｒａ４３）。低用量ＩＬ−２療法は、ＩＬ−２を開始して１週間以内に、ｃＧＶＨＤ患者における、ＴｒｅｇによるＳｔａｔ５のリン酸化を、優先的に増強した。ＴｒｅｇによるｐＳＴＡＴ５活性化：ＴｃｏｎによるｐＳＴＡＴ５活性化比は、２週間後までに、正常範囲へと回復し、ＩＬ−２療法の持続期間にわたり維持された。また、自発性およびＦａｓ誘導アッセイにより評価されたアポトーシス抵抗性も、Ｔｒｅｇにおいて、Ｔｃｏｎと比較して優先的に誘導された。低用量ＩＬ−２は、ＴｃｏｎよりもＴｒｅｇのホメオスタシスの均衡を回復させる可能性があり、免疫寛容を促進しうる（Ｍａｔｓｕｏｋａら（２０１３年）、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、５巻：１７９ｒａ４３）。
【０１０７】
同様のＴｒｅｇの増強および臨床的利益はまた、ＨＣＶ誘導性血管炎においても記録された（Ｓａａｄｏｕｎら（２０１１年）、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３６５巻：２０６７〜２０７７頁）。低用量ＩＬ−２は、小児におけるＧＶＨＤの処置のためには使用されていないが、同種および自家ＨＳＣＴのいずれの後においても、小児における他の適応症のために、安全に使用されている。２つの研究が、ＳＣ  ＩＬ−２を、高リスク白血病および／または再発型転移性ユーイング肉腫を伴う移植後患者において、１〜２×１０６ＩＵ／ｍ２／日の範囲の用量で、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を誘導することにより再発を防止する戦略として使用した（Ｌｉｕら（２００８年）、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、４２巻：５３５〜５３９頁；Ｓｃｈｌｅｇｅｌら（２０１１年）、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、２４巻：４４３〜４５２頁）。１つの研究では、患者の年齢の中央値は、１１歳（範囲：４〜１６歳）であり、治療の持続期間は、１５〜２５０日間の範囲であった（Ｓｃｈｌｅｇｅｌら（２０１１年）、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、２４巻：４４３〜４５２頁）。同様に、神経芽細胞腫を伴う患者における用量漸増研究では、ＳＣ  ＩＬ−２を、２週間ごとに５日間ずつの６サイクルにおいて、３、６、および９×１０６ＩＵ／ｍ２／日の用量で施して、ＮＫ細胞数を増進した（Ｌａｄｅｎｓｔｅｉｎら（２０１１年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、２９巻：４４１〜４４８頁）。この研究における患者の年齢の中央値は、４．１歳（範囲：１．８〜７．４歳）であった。３つの研究全てにおいて、主要な有害作用は、発熱および注射部位における局所的炎症であった。
【０１０８】
「ＩＬ−２免疫療法」または「ＩＬ−２療法」という用語は、例えば、ある期間にわたる、ボーラスとして、または持続的注入による静脈内投与、筋内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、局所、吸入、および他の公知の経路など、任意の公知の経路を介する、それを必要とする対象へのＩＬ−２の投与を含む。一般に、ＩＬ−２の薬物動態は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、およびカニクイザルにわたり線形であるようである。皮下投与の後、ＩＬ−２の吸収は、比較的緩徐であり、平均滞留時間は、ＩＶ投与と比較して延長された。
【０１０９】
皮下（ＳＣ）経路によるＩＬ−２投与は、ラットにおけるいくつかの複数用量研究において、最大で１３週間にわたる毎日の投与について評価されている。これらの研究により、ラットにおけるＳＣ高用量毒性プロファイルが、ＩＶ投与後の高用量毒性プロファイルと同等であることが確認された。ＩＬ−２関連所見は、リンパ球増加症、好酸球増加症、微弱の貧血、髄外造血、リンパ過形成、肝腫大、および脾腫を含んだ。肝臓、肺、リンパ節、腎臓、脾臓、および骨髄を含む多くの臓器において、浸潤性および増殖性変化が見られた。７日間の投与後に、ウサギのＳＣ忍容性研究では、注射部位における局所的炎症性応答は、ＩＬ−２についての公知の効果、およびヒト試験において報告されている注射部位反応と符合した。
【０１１０】
したがって、動物におけるＩＬ−２の毒性は、用量および持続期間と関連し、全ての毒性作用は、ＩＬ−２の薬理学的活性と、直接的にまたは副次的に関連することが示された。全ての種において、処置に関連する効果は、２〜４週間にわたる無処置期間の後で、完全にまたは部分的に可逆性であった。所見は、ＩＬ−２のＩＶまたはＳＣ投与の反復の後で同等であった。標的臓器毒性の重症度は、これらの臓器への炎症性細胞浸潤の程度と相関した。動物における生物学的効果は一般に、臨床試験において報告される効果と同様であった。しかし、これらのＭＴＤ研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの増強のために提起される低用量ＩＬ−２ではなく、転移性ＲＣＣおよび黒色腫の処置のために使用される高用量ＩＬ−２に関する。
【０１１１】
ＩＬ−２の薬物動態は、がんを伴う患者およびＨＩＶを伴う患者において評価されている。短時間のＩＶ注入の後、ＩＬ−２の薬物動態プロファイルは、高血漿濃度、血管外スペースへの急速な分布、および半減期を１〜２時間とする、体内からの排除を特徴とした。ＳＣ投与の後、ＩＬ−２の吸収は、緩徐であり、平均滞留時間は、ＩＶ投与と比較して延長された。ＨＩＶ患者におけるＩＬ−２の最大血漿濃度は、ＳＣ投与後２〜５時間以内に達成され、終末期半減期は、５時間であると推定されたことから、吸収の延長が示唆される。
【０１１２】
ボーラス注入についてのクリアランス速度と、持続的ＩＶ注入についてのクリアランス速度とは、ほぼ等しい。その短い半減期から予測される通り、定常状態は、注入の約６時間後に達すると予測される。ＳＣ  ＩＬ−２投与についてのデータは、約３５％が、血流へと吸収されたことを示唆し、ＨＩＶに感染した参加者を伴う研究で、大きなバイオアベイラビリティー（＞６０％）が報告された。がんまたはＨＩＶ患者における、ＳＣまたは持続的ＩＶ投与による５日間の処置は、ＩＬ−２クリアランスの時間依存的増大を結果としてもたらした。これは、可溶性ＩＬ−２受容体の血清レベルの増大と関連した。投与サイクルの間の休薬日は、ＩＬ−２のクリアランスを、その初期の値へと回復させた。
【０１１３】
ＩＬ−２の全身除去には、少なくとも３つの機構：糸球体濾過、尿細管周囲における抽出、および誘導性受容体媒介型機構（ヒトにおける）が存在する。小型のペプチドおよびタンパク質の、糸球体後毛細血管から腎尿細管への、尿細管周囲における抽出と、その後の細胞内異化とは、糸球体濾過とは独立に生じる、腎による排除機構である。受容体媒介型クリアランスは主に、応答性細胞上の、その特異的な細胞性受容体に係合するＩＬ−２の機能である。Ｂ細胞など、他の細胞型は、機能的なＩＬ−２受容体を有するが、ＩＬ−２受容体の大部分は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上にある。
【０１１４】
高用量ボーラスＩＬ−２で処置された転移性黒色腫または腎細胞がんでは、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ細胞のほぼ６倍の増大が観察され、循環ＣＤ４＋  ＦＯＸＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞の頻度は４倍増大した（ＡｈｍａｄｚａｄｅｈおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（２００６年）、Ｂｌｏｏｄ、１０７巻：２４０９〜２４１４頁）。過去２０年間にわたり、転移性がんを伴う患者におけるＩＬ−２の効果について、かなりの臨床データが蓄積されている。大半のがん試験で使用される高用量のＩＬ−２では、かなりの毒性が記録されており、腫瘍の応答は時折であるに過ぎない。発熱、低血圧、黄疸、および高窒素血症が、頻繁な合併症であり、集中治療室への収容を余儀なくさせることが多い。造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者は、高用量ＩＬ−２を忍容する可能性が小さい。
【０１１５】
長期にわたる低用量ＳＣ  ＩＬ−２が、ＨＩＶ感染およびがんを伴う患者において評価されている。「超低用量」ＩＬ−２についての１つの研究では、最初の寛解にあるＨＩＶおよび非ホジキンリンパ腫を伴う７例の患者に、１×１０６ＩＵ／ｍ２／日のＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ）が施された（Ｓｈａｈら（２００６年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１２巻：３９９３〜３９９６頁）。約８週間の処置の後、単剤ＩＬ−２療法は、ＮＫ細胞（１．６倍）およびＴｒｅｇ（９倍）の統計学的に有意な、比例する増大をもたらした。他のリンパ球サブセットは、有意に変化しなかった。毒性は、軽度であり（疲労、局所的掻痒、筋痛、トランスアミナーゼの増大など）、グレード３の有害事象は見られなかった。
【０１１６】
低用量ＩＬ−２はまた、同種ＨＳＣＴの後でも使用されている。１つの研究では、免疫学的移植片対白血病（ＧＶＬ）効果を増強するために、ＩＬ−２（Ａｍｇｅｎ、Ｒｏｃｈｅ）が、持続的ＩＶ注入により、最大で３カ月間にわたり、ＣＤ６＋  Ｔ細胞枯渇（ＴＣＤ）移植後における、２９例の無症候性血液悪性疾患患者に、２〜６×１０５ＩＵ／ｍ２／日、（約０．６〜１．８×１０６Ｕ／ｍ２／日のＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ））の範囲の用量で投与された（Ｓｏｉｆｆｅｒら（１９９４年）、Ｂｌｏｏｄ、８４巻：９６４〜９７１頁）。低用量ＩＬ−２の忍容は良好であり、毒性に起因して早期に離脱した参加者は、４例だけであった。急性ＧＶＨＤは、参加者２９例中１例だけに発症した。予期されたＮＫ細胞の拡大に加えて、評価された８例中７例において、Ｔｒｅｇを表す可能性が高い、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔリンパ球の、中央値を４５％とする増大が生じた。さらに、実質的なＴｒｅｇの増強を示す、ＦＯＸＰ３発現の、約８．５倍増大の中央値も認められた（Ｚｏｒｎら（２００６年）、Ｂｌｏｏｄ、１０８巻：１５７１〜１５７９頁）。低用量ＩＬ−２の忍容は良好であるようであり、同種ＨＳＣＴの後における顕著なＴｒｅｇの拡大を伴った。
【０１１７】
ＩＬ−２免疫療法の非限定的な例は、当技術分野で周知であり、例えば、それらの各々が、参照により、それらの全体において、全ての目的で本明細書に組み込まれる、少なくとも、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９９３年）、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、８５巻：６２２〜６３２頁；Ｇｕｉｒｇｕｉｓら（２００２年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２５巻：８２〜８７頁；ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＭｅｌｌｏｎ（２００４年）、Ｐｏｓｔｇｒａｄ  Ｍｅｄ．  Ｊ．、８０巻：３２０〜３２７頁；Ｙａｎｇら（２００３年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、２１巻：３１２７〜２１３２頁；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔら（２００５年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、２３巻：１３３〜１４１頁；Ｎｅｇｒｉｅｒら（２００７年）、Ｃａｎｃｅｒ、１１０巻：２４６８〜２４７７頁；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ（２００９年）、Ｍｅｄ．  Ｏｎｃｏｌ．、２６巻：１３〜１７頁；米国特許第５，４１９，９００号、同第５，６９６，０７９号、同第６，０４５，７８８号、および同第６，５４８，０５５号において見出すことができる。
【０１１８】
ＩＩＩ．対象
一実施形態では、抗免疫障害処置が施行されるか、または抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量のＩＬ−２単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量のＩＬ−２）に対して効果的に応答することが予測される対象が、決定され、この対象は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長動物、非ヒト哺乳動物、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどの家畜動物）であり、好ましくはヒトである。成体対象のほか、小児対象も想定される。小児対象は、本明細書で記載される通りに処置しうるほか、最大で成体対象のために使用される用量の治療剤を使用して処置することもできる。
【０１１９】
本発明の方法の別の実施形態では、対象は、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量のＩＬ−２単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量のＩＬ−２）などの処置を経ていない。さらに別の実施形態では、対象は、ステロイドなどにより、このような処置を経ている。
【０１２０】
本発明の方法を使用して、免疫応答を抑制することまたはその他の方法で下方調節することが所望される多くの異なる免疫障害を処置し、かつ／またはこれらの抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量のＩＬ−２単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量のＩＬ−２）に対する応答性を決定することができる。活性化免疫細胞の機能は、免疫細胞応答を下方調節することにより阻害することができ、免疫細胞内の特異的なアネルギーを誘導することにより阻害することができ、またはこれらの両方により阻害することができる。
【０１２１】
例えば、本発明の方法を使用して、抗原を、このような方法による治療用組成物と共に共投与することにより、特異的な抗原に対する寛容を誘導することができる。特異的なタンパク質に対する寛容を誘導することができる。一実施形態では、それらに対する免疫応答が所望されない、アレルゲン（例えば、食物アレルゲン）または外来タンパク質に対する免疫応答を阻害することができる。例えば、第ＶＩＩＩ因子を施される患者は、この凝固因子に対する抗体を頻繁に発生させる。本発明の方法における組換え第ＶＩＩＩ因子の共投与（または第ＶＩＩＩ因子への物理的な連結、例えば、架橋により）は、免疫応答の下方モジュレーションを結果としてもたらしうる。同様にして、クローン除去の低減および／または消耗の増大（例えば、Ｔ細胞消耗）を誘導することができる。
【０１２２】
免疫応答の下方調節は、限定なしに述べると、造血幹細胞移植拒絶（例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ））、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、アレルギー、移植、過敏性応答などの自己免疫疾患、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の産生または機能の増大を必要とする障害、ワクチン接種効率の改善を必要とする障害、および調節性Ｔ細胞の産生または機能の増大を必要とする障害における、組織、皮膚、および他の固形臓器移植（例えば、腎臓、肝臓、心臓、および血管化複合同種移植である移植）の状況を含む、本発明に従ういくつかの「免疫障害」を処置するのに有用である。例えば、免疫細胞機能の遮断は、組織移植における組織破壊の低減を結果としてもたらす。組織移植では、移植物の拒絶は、免疫細胞による、外来物としてのその認識後、移植物を破壊する免疫反応を介して誘発されることが典型的である。移植の前または移植時における、本明細書で記載される薬剤の投与は、阻害性シグナルの発生を促進しうる。さらに、阻害はまた、免疫細胞をアネルギー化し、これにより、対象における寛容を誘導するのに十分でもありうる。長期にわたる寛容の誘導は、これらの遮断試薬の反復投与の必要性を回避する。
【０１２３】
免疫応答の下方モジュレーションはまた、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）および多発性硬化症などの自己免疫疾患を処置するのに有用でもある。多くの自己免疫性障害は、自己組織に対して反応性であり、疾患の病態に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する免疫細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化を防止することにより、疾患の症状を低減するか、または消失させることができる。本明細書で記載される薬剤の投与は、疾患過程に関与しうる自己抗体またはサイトカインの発生を防止するのに有用である。加えて、本発明の方法により、自己反応性免疫細胞の抗原特異的寛容であって、疾患を長期的に和らげうる寛容を誘導することができる。自己免疫性障害の防止または緩和における試薬の有効性は、ヒト自己免疫疾患についての、いくつかの十分に特徴付けられた動物モデルを使用して決定することができる。例は、マウス実験型自己免疫性脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、マウスの自己免疫性コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける真性糖尿病、ならびにマウス実験型重症筋無力症（例えば、Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３版、１９９３年、３０章を参照されたい）を含む。
【０１２４】
免疫細胞の活性化の阻害はまた、例えば、ＩｇＥの産生を阻害することによる、アレルギーおよびアレルギー反応の処置においても、治療的に有用である。アレルギー反応は、アレルゲンの侵入の経路およびマスト細胞または好塩基球上のＩｇＥの貯留のパターンに応じて、全身的性質の場合もあり、局所的性質の場合もある。したがって、免疫細胞に媒介されるアレルギー応答（例えば、食物に対する）は、本発明の方法に従い、局所的または全身的に阻害される。一実施形態では、アレルギーは、アレルギー性喘息である。
【０１２５】
免疫細胞の活性化の阻害はまた、免疫細胞の寄生生物およびウイルス感染においても、治療的に重要でありうる。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）では、免疫細胞の活性化により、ウイルスの複製が刺激される。これらの相互作用のモジュレーションは、ウイルス複製の阻害を結果としてもたらし、これにより、ＡＩＤＳの経過を改善することが可能である。これらの相互作用のモジュレーションはまた、妊娠の維持の促進においても有用でありうる。胚または胎児に対する免疫的拒絶のために、自然流産の危険性がある女性（例えば、既に自然流産をしたことがある女性または懐胎が困難であった女性）を、これらの相互作用をモジュレートする薬剤により処置することができる。
【０１２６】
本発明の方法に従う免疫応答の下方調節はまた、自家組織に対する自己免疫性の攻撃の処置においても有用でありうる。したがって、自己免疫性障害など、自己免疫性の攻撃により増悪する状態のほか、心疾患、心筋梗塞、およびアテローム性動脈硬化などの状態もモジュレートすることは、本発明の範囲内にある。
【０１２７】
好ましい実施形態では、免疫障害は、移植片対宿主病（例えば、慢性ＧＶＨＤ）である。血液悪性疾患を伴う多くの患者にとって、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、治癒の唯一の機会をもたらす。残念ながら、著明な障害が依然として存在し、疾患の再発およびＧＶＨＤは最も注目すべき障害である。ＨＳＣＴを経た患者の４０％超が、再発する一方、５０％超が、かなりの罹患率および死亡率と関連する多系統での免疫症状発現を伴う消耗性の状態である、ｃＧＶＨＤを発症する（Ｋａｈｌら（２００７年）、Ｂｌｏｏｄ、１１０巻：２７４４〜２７４８頁；Ｐｅｒｅｚ−Ｓｉｍｏｎら（２００８年）、Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１４巻：１１６３〜１１７１頁）。小児集団における発生率は低いが、ｃＧＶＨＤは、依然として、悪性疾患のための同種ＨＳＣＴ後における、再発以外による罹患率および死亡率の主要な原因であり、ＨＳＣＴ後１００日間を超えて生存する小児の２０〜５０％において生じる（Ｂａｉｒｄら（２０１０年）、Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．、５７巻：２９７〜３２２頁）。ドナー細胞に媒介される免疫応答は、ＧＶＬおよびＧＶＨＤ反応の一因をなす。新たに生着したドナー免疫系による、残存する腫瘍細胞の認識および破壊が不十分であると、患者の悪性疾患の再発が許容される一方、宿主抗原に対する制御不能の反応は、ＧＶＨＤをもたらす（Ａｎｔｉｎ（１９９３年）、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：２２７３〜２２７７頁；Ｆｅｒｒａｒａら（２００９年）、Ｌａｎｃｅｔ、３７３巻：１５５０〜１５６１頁）。慢性ＧＶＨＤの発症機序は、同種（ドナー／レシピエント多型）および自家（ドナー／レシピエント非多型）抗原に対する炎症性Ｔ細胞およびＢ細胞応答を伴い、依然として、同種ＨＳＣＴ後における、共通の問題であり、主要な治療的課題でもあり、長期生存者は、生活の質が損なわれることが多く、後年における死亡率が増大する（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら（２００７年）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２１巻：８５３〜８５９頁）。ＨＣＴのための幹細胞の供給源としての、骨髄ではなく、動員末梢血前駆細胞の使用を増大させることの結果として、ｃＧＶＨＤの発生率の明らかな増大がもたらされた（Ｃｕｔｌｅｒら（２００１年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、１９巻：３６８５〜３６９１頁；Ｌｅｅら（２００７年）、Ｂｌｏｏｄ、１１０巻：４５７６〜４５８３頁）。同種ＨＳＣＴが、鎌状赤血球貧血、免疫不全症、および先天性代謝性疾患など、非悪性適応症のためにますます実施されるようになるにつれ、小児患者におけるｃＧＶＨＤの発生率は、上昇することが予測される。成人および小児の両方において、ｃＧＶＨＤと関連する炎症性または線維症性変化は、皮膚、眼、口、肝臓、および気道に及ぶことが最も一般的である。
【０１２８】
全身ステロイドは、ｃＧＶＨＤを処置するのに日常的に使用されているが、限定された有効性およびかなりの毒性を有する。延長ステロイド療法の、成長および骨密度に対する影響は、小児において特に重大である（Ｃａｎａｌｉｓら（２００２年）、Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．、１５巻：１３４１〜１３４５頁）。小児では、大半のサルベージ剤（ｓａｌｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）の使用は、成人における経験から外挿されており、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、体外フォトフェレーシス（ＥＣＰ）、およびペントスタチンを含む、少数の治療だけが小児に対する試験で調べられている（Ｂｕｓｃａら（２０００年）、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２５巻：１０６７〜１０７１頁；Ｂｅｒｇｅｒら（２００７年）、Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．、２９巻：６７８〜６８７頁；Ｊａｃｏｂｓｏｈｎら（２００９年）、Ｂｌｏｏｄ、１１４巻：４３５４〜４３６０頁）。ｃＧＶＨＤのための確立された第二選択治療はない。ステロイド不応性ｃＧＶＨＤのために、それらの有効性は限定されているにも拘らず、さらなる免疫抑制剤が活用されることが多い。したがって、第二選択処置の選択肢は、限定されており、ステロイド不応性ｃＧＶＨＤは、主要な治療的課題を提起している。
【０１２９】
ＩＶ．抗免疫障害療法
本発明の方法（例えば、複数の可変用量のＩＬ−２単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量のＩＬ−２）は、所望の対象に投与することもでき、対象が、このような療法に対するレスポンダーの可能性が高いと示された場合に投与することもできる。別の実施形態では、本発明の治療法は、対象が、療法に対するレスポンダーである可能性が高くないと示される場合は回避することができ、標的化および／または非標的化抗免疫療法などの代替的処置レジメンを施行することができる。
【０１３０】
一実施形態では、免疫障害に罹患した対象を処置する、複数の可変ＩＬ−２用量による方法であって、ａ）対象の血漿ＩＬ−２レベルを上昇させ、対象における、調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の、従来型Ｔリンパ球（Ｔｃｏｎ）に対する比（Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ）を増大させる用量で、インターロイキン２（ＩＬ−２）を、対象に持続的に投与することを含む誘導レジメンを、対象に施行するステップと；ｂ）その後、誘導レジメンの用量より高量であり、ｉ）対象の血漿ＩＬ−２レベルを、さらに上昇させ、ｉｉ）Ｔｒｅｇの、Ｔｃｏｎに対する比を、さらに増大させる、ＩＬ−２の維持用量を、対象に持続的に投与することを含む少なくとも１つの維持レジメンを、対象に施行し、これにより対象を処置するステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、誘導レジメンから生じる血漿ＩＬ−２レベルを、誘導レジメン前の、以前のピーク血漿ＩＬ−２レベルを下回るように枯渇させる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２維持レジメンは、対象の血漿ＩＬ−２レベルを、誘導レジメンにより誘導されるピーク血漿ＩＬ−２レベルを超えて上昇させる。「複数の可変ＩＬ−２用量による方法」という用語は、１つを超えるＩＬ−２投与を含む治療的介入であって、１つを超えるＩＬ−２投与が、１つを超えるＩＬ−２用量を使用する治療的介入を指す。このような方法は、固定量のＩＬ−２を、毎日など、スケジュールされた形で投与する、「固定」投与方法と対比される。
【０１３１】
「誘導レジメン」という用語は、対象の血漿ＩＬ−２レベルを上昇させ、対象のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を増大させる用量における、ＩＬ−２の持続的投与を指す。一部の実施形態では、レジメンを、血漿ＩＬ−２のピークレベルが達成されるまで施す。対象の血漿ＩＬ−２レベルおよび／またはＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、治療開始前のベースライン比と比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％またはそれ超増大させることができる。
【０１３２】
ＦＤＡで承認された使用に従う、ある特定の用量および方法では、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比が実際に減少するように、Ｔｃｏｎを、Ｔｒｅｇと比べて優先的に活性化させる。対照的に、本発明の方法は、Ｔｃｏｎに対してＴｒｅｇを優先的に促進するように本明細書で決定され、免疫障害を有する対象において、安全かつ効果的である範囲の「低用量ＩＬ−２」を使用することにより、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を増大させる。「低用量ＩＬ−２」という用語は、Ｔｒｅｇが、Ｔｃｏｎと比べて優先的に増強される投与量の範囲を指す。一実施形態では、低用量ＩＬ−２は、抗がん免疫療法のために使用される、「高用量ＩＬ−２」による用量（例えば、１日当たり１ｍ２当たり１８００万ＩＵ〜１日当たり１ｍ２当たり２０００万ＩＵ、またはそれ超）の５０％未満であるか、またはそれと等しいＩＬ−２用量を指す。「低用量ＩＬ−２」の上限は、発熱、悪寒、無力症、および疲労など、処置の有害事象により、さらに限定されうる。ＩＬ−２は一般に、所与の時間単位当たり、体表面積（ＢＳＡ）と比較して投与される、国際単位（ＩＵ）で測定される量に従い投与される。ＢＳＡは、直接的な測定により計算することもでき、実施例で記載される方法など、いくつもの周知の方法（例えば、デュボアの式）により計算することもできる。一般に、ＩＬ−２は、１日当たりのＢＳＡ  １ｍ２当たりのＩＵを単位として投与する。本発明の方法に従う、例示的な低用量ＩＬ−２による用量は、１０６ＩＵ／ｍ２／日を単位として、間の任意の値および／または間の範囲を含む、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、および３．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日のうちのいずれか１つを含む。例えば、誘導レジメンの用量は、間の任意の値または範囲を伴う、０．３×１０６ＩＵ／ｍ２／日〜３．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日の間の範囲でありうる。
【０１３３】
「持続的投与」という用語は、間の間欠的中断を伴わない、規則的間隔における、ＩＬ−２の投与を指す。したがって、ＩＬ−２の途絶は生じない。例えば、誘導用量は、連続する少なくとも１〜１４日間または間の任意の範囲（例えば、連続する少なくとも４〜７日間）中に、毎日（例えば、１日１回または複数回）投与することができる。本明細書で記載される通り、長時間作用型ＩＬ−２薬剤および／または皮下投与以外の経路により投与されるＩＬ−２薬剤が想定される。当技術分野で記載される、ＩＬ−２の間欠的静脈内投与は、本発明に従う、血漿ＩＬ−２レベルの上昇およびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比の増大と適合しない、短いＩＬ−２半減期を結果としてもたらす。しかし、持続的な定常状態のＩＬ−２レベルを達成するために、毎日１回の皮下ＩＬ−２投与、持続的ＩＶ注入、長時間作用型皮下ＩＬ−２製剤などが想定される。
【０１３４】
血漿ＩＬ−２レベルおよびそのピーク値は、直接的または間接的に評価することができる。例えば、ＩＬ−２核酸およびタンパク質のレベルおよび／または活性は、核酸プローブ、ＥＬＩＳＡキット、ＩＬ−２受容体活性化アッセイなど（例えば、それらの各々が、参照により、それらの全体において、全ての目的で本明細書に組み込まれる、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  ＲＡＢ−０２８６；ならびに米国特許第４，５３０，７８７号、同第４，５６９，７９０号、同第４，５７２，７９８号、同第４，６０４，３７７号、同第４，７４８，２３４号、同第４，８５３，３３２号、同第４，９５９，３１４号、同第５，４６４，９３９号、同第ＲＥ３３，６５３号、同第５，２２９，１０９号、同第５，４１９，９００号、同第５，６９６，０７９号、同第６，０４５，７８８号、同第６，５４８，０５５号、同第７，５１４，０７３号、および同第７，５６９，２１５号を参照されたい）を使用することによるなど、当技術分野で周知の方法および試薬を使用して、直接的に解析することができる。
【０１３５】
別の実施形態では、血漿ＩＬ−２レベルおよび／または活性は、Ｔｒｅｇの増殖、Ｔｒｅｇの活性、Ｔｒｅｇのアポトーシスなどに対するＩＬ−２の効果を解析することにより、間接的に解析することができる。Ｔｒｅｇの増殖、Ｔｒｅｇの活性、および／またはＴｒｅｇのアポトーシスを決定するための方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載される実施例において例示される通りである。例えば、Ｔｒｅｇ細胞および／またはＴｃｏｎ細胞の分化および／または活性化についてのバイオマーカーは、ＣＤ２５、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）、ＦＯＸＰ３、ＫＩ６７、ＴＵＮＥＬなどの状態を解析することなどにより、解析することができる。さらに、リンパ球サブセットについての表現型解析、免疫応答、血漿サイトカインなどの低減をもたらす免疫モジュレーションについての機能アッセイは、本明細書でさらに記載される通りに解析することができる。
【０１３６】
さらに別の実施形態では、血漿ＩＬ−２レベルおよび／または活性は、誘導レジメン開始後の時間に従い間接的に決定することができる。例えば、本明細書では、ピーク血漿ＩＬ−２レベルには、誘導レジメンの開始後約７日間以内に達することが決定されている。本発明の一部の実施形態では、ピーク血漿ＩＬ−２レベルなどの血漿ＩＬ−２レベルを、誘導レジメンの開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ超の日数に従い決定する。
【０１３７】
ピーク血漿ＩＬ−２レベルおよび／または活性と、時間において可能な限り近接することが好ましいが、ピーク血漿ＩＬ−２レベルおよび／または活性の後など、誘導レジメンの後の任意の時点において、維持レジメンを開始することができる。「維持レジメン」という用語は、誘導レジメンの用量より高量であり、ｉ）対象の血漿ＩＬ−２レベルを、さらに上昇させ、ｉｉ）Ｔｒｅｇの、Ｔｃｏｎに対する比を、さらに増大させる用量における、対象への、ＩＬ−２の持続的投与を指す。一実施形態では、維持レジメンは、誘導レジメンから生じる血漿ＩＬ−２レベルを、誘導レジメン前の、以前のピーク血漿ＩＬ−２レベルを下回るように枯渇させた時点またはその後において始まる。上記で記載した通り、これは、誘導レジメンの開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ超の日数など、誘導レジメン開始後の日数を単位として測定することができる。
【０１３８】
血漿ＩＬ−２レベルを上昇させるために、ＩＬ−２を、対象に、誘導レジメンの用量より高量で投与する。一実施形態では、１０６ＩＵ／ｍ２／日を単位として、用量は、間の任意の値および／または間の範囲を含む、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、および３．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日のうちのいずれか１つである。例えば、誘導レジメンの用量は、間の任意の値または範囲を伴う、０．３×１０６ＩＵ／ｍ２／日〜３．０×１０６ＩＵ／ｍ２／日の間の範囲でありうる。維持レジメンの用量は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、もしくはそれ超、または間の任意の値および／もしくは間の範囲でありうる。血漿ＩＬ−２レベルの上昇はまた、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比も、比を、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、もしくはそれ超、または間の任意の値および／もしくは間の範囲だけ増大させることなどにより、誘導レジメンのＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎと比べて増大させる。
【０１３９】
誘導レジメンと符合して、「持続的投与」という用語は、間の間欠的中断を伴わない、規則的間隔における、ＩＬ−２の投与を指す。したがって、ＩＬ−２の途絶は生じない。これは、間欠的中断を伴わないＩＬ−２投与プロトコールを使用することにより達成しうるが、ＩＬ−２の持続的投与はまた、定常状態の血漿ＩＬ−２レベルをもたらすＩＬ−２薬剤を使用することにより達成することもできる。例えば、維持用量は、無期限など、長期治療ベースで、毎日（例えば、１日１回または複数回）投与することができ、一部の実施形態では、連続する少なくとも１〜４２日間または間の任意の範囲（例えば、連続する少なくとも１４〜４２日間）の間である。
【０１４０】
上記で記載した通り、ＩＬ−２は、薬学的に許容される製剤により、皮下、静脈内、腹腔内、経口、経鼻、経皮、または筋内投与などにより、任意の適する投与経路により投与することができる。一実施形態では、本発明は、１または複数の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と併せて製剤化された、治療有効量のＩＬ−２を含む、薬学的に許容される組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、以下：（１）経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の液剤または懸濁剤）、錠剤、ボーラス、散剤、顆粒剤、ペースト；（２）例えば、滅菌液剤もしくは懸濁剤としての、例えば、皮下、筋内、もしくは静脈内注射による、非経口投与；（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、もしくはスプレーとしての、局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリーム、もしくは泡沫として、膣内投与もしくは直腸内投与または（５）例えば、化合物を含有する、水性エアゾール、リポソーム調製物、もしくは固体粒子としてのエアゾールに適合させた固体または液体形態を含む、固体または液体形態における投与のために、特別に製剤化することができる。
【０１４１】
本明細書では、「薬学的に許容される」という語句は、健全な医療判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適し、妥当なベネフィット／リスク比に適う、薬剤、材料、組成物、および／または剤形を指すように用いられる。
【０１４２】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、対象の化学物質を、１つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分へと運ぶかまたは輸送することに関与する、液体または固体の、充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料など、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、対象に対して傷害性でないという意味で、「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として用いられうる材料の一部の例は、（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；（２）トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン；（３）セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど、その誘導体；（４）粉末トラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）滑石；（８）カカオ脂および坐剤用の蝋などの賦形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質非含有水；（１７）等張性食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝化溶液；ならびに（２１）医薬製剤中で利用される、他の非毒性の適合性物質を含む。
【０１４３】
本発明の方法において有用な製剤は、経口、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、膣、エアゾール、および／または非経口投与に適する製剤を含む。製剤は、単位剤形で好都合に提示することができ、製薬技術分野で周知の任意の方法により調製することができる。単一の剤形を作製するのに、担体材料と組み合わされうる有効成分の量は、処置される宿主、特定の投与方式に応じて変動するであろう。単一の剤形を作製するのに、担体材料と組み合わされうる有効成分の量は一般に、治療効果をもたらす化合物の量であろう。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約１パーセント〜約９９パーセントの有効成分の範囲であり、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲であろう。
【０１４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適するＩＬ−２製剤は、当技術分野で周知である（例えば、それらの各々が、参照により、それらの全体において、全ての目的で本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５３０，７８７号、同第４，５６９，７９０号、同第４，５７２，７９８号、同第４，６０４，３７７号、同第４，７４８，２３４号、同第４，８５３，３３２号、同第４，９５９，３１４号、同第５，４６４，９３９号、同第ＲＥ３３，６５３号、同第５，２２９，１０９号、同第５，４１９，９００号、同第５，６９６，０７９号、同第６，０４５，７８８号、同第６，５４８，０５５号、同第７，５１４，０７３号、および同第７，５６９，２１５号を参照されたい）。
【０１４５】
一部の実施形態では、ＩＬ−２または他の有用なバイオマーカー核酸分子は、有用であり、ベクターに挿入することができ、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。遺伝子治療用ベクターは、対象に、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９１巻：３０５４〜３０５７頁を参照されたい）により送達することができる。遺伝子治療用ベクターによる医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療用ベクターを含む場合もあり、遺伝子送達ビヒクルを包埋した緩徐放出マトリックスを含む場合もある。代替的に、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを、組換え細胞から、無傷で作製しうる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系をもたらす、１または複数の細胞を含みうる。
【０１４６】
哺乳動物、ヒトもしくは非ヒトまたはそれらの細胞へとポリヌクレオチドを導入するための任意の手段は、本発明の多様な構築物を、意図されるレシピエントに送達するための本発明の実施に適合させることができる。本発明の一実施形態では、ＤＮＡ構築物を、細胞に、トランスフェクションにより、すなわち、「ネイキッド」ＤＮＡの送達により、またはコロイド分散系との複合体により送達する。コロイド系は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系を含む。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合体化ＤＮＡまたはリポソーム−製剤化ＤＮＡである。前者の手法では、ＤＮＡを、例えば、脂質により製剤化する前に、まず、所望のＤＮＡ構築物を持つ導入遺伝子を含有するプラスミドを、発現について、実験的に最適化することができる（例えば、５’側非翻訳領域内のイントロンの含有および不要な配列の排除（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１２６〜１３９頁、１９９５年））。次いで、公知の方法および材料を使用して、例えば、種々の脂質またはリポソーム材料によるＤＮＡの製剤化を行い、レシピエントの哺乳動物に送達することができる。例えば、Ｃａｎｏｎｉｃｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１０巻：２４〜２９頁、１９９４年；Ｔｓａｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６８巻；Ａｌｔｏｎら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、５巻：１３５〜１４２頁、１９９３年；およびＣａｒｓｏｎらによる米国特許第５，６７９，６４７号を参照されたい。
【０１４７】
リポソームの標的化は、解剖学的および機構的因子に基づき、分類することができる。解剖学的分類は、選択性のレベル、例えば、臓器特異的、細胞特異的、および細胞小器官特異的選択性に基づく。機構的標的化は、それが、受動的であるか、能動的であるかに基づき、識別することができる。受動的標的化は、洞様毛細血管を含有する、臓器内の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞へと分布する、リポソームの自然の傾向を活用する。他方、能動的標的化は、リポソームを、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、もしくはタンパク質など、特異的なリガンドとカップリングさせることによる、または天然に存在する局在化部位以外の臓器および細胞型への標的化を達成するために、リポソームの組成またはサイズを変化させることによる、リポソームの変更を伴う。
【０１４８】
標的化される送達系の表面は、様々な方式で修飾することができる。リポソームによる標的化送達系の場合、標的化リガンドの、リポソーム二重層との安定的な会合を維持するために、脂質基を、リポソームの脂質二重層に組み込むことができる。脂質鎖を、標的化リガンドに接合するために、多様な連結基を使用することができる。ネイキッドＤＮＡまたは送達ビヒクル、例えば、リポソームと会合させたＤＮＡを、対象におけるいくつかの部位に投与することができる（下記を参照されたい）。
【０１４９】
核酸は、任意の所望のベクターにおいて送達することができる。これらは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびプラスミドベクターを含む、ウイルスまたは非ウイルスベクターを含む。例示的なウイルスの種類は、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、およびＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）を含む。核酸は、十分に効率的な送達レベルをもたらす、任意の所望のフォーマットであって、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、およびポリマーへの複合体化を含むフォーマットで投与することができる。
【０１５０】
目的のタンパク質をコードする核酸または目的の核酸は、プラスミドもしくはウイルスベクターまたは当技術分野で公知の他のベクターにありうる。このようなベクターは、周知であり、任意のベクターを、特定の適用のために選択することができる。本発明の一実施形態では、遺伝子送達ビヒクルは、プロモーターおよびデメチラーゼコード配列を含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーター、ならびにチミジンキナーゼおよびチミジル酸シンターゼプロモーターなど、細胞増殖により活性化するプロモーターである。他の好ましいプロモーターは、α−およびβ−インターフェロンプロモーターなど、ウイルスの感染により活性化可能なプロモーター、ならびにエストロゲンなどのホルモンにより活性化可能なプロモーターを含む。使用されうる他のプロモーターは、モロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターを含む。プロモーターは、構成的または誘導性でありうる。
【０１５１】
別の実施形態では、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号において記載されている通り、ネイキッドポリヌクレオチド分子を、遺伝子送達ビヒクルとして使用する。このような遺伝子送達ビヒクルは、増殖因子ＤＮＡまたはＲＮＡである場合があり、ある特定の実施形態では、死滅させたアデノウイルスに連結される（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ．  Ｔｈｅｒ．、３巻：１４７〜１５４頁、１９９２年）。任意選択で使用されうる他のビヒクルは、ＤＮＡ−リガンドの組合せ（Ｗｕら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６４巻：１６９８５〜１６９８７頁、１９８９年）、脂質−ＤＮＡの組合せ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８４巻：７４１３〜７４１７頁、１９８９年）、リポソーム（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８４巻：７８５１〜７８５５頁、１９８７年）、および微粒子銃（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８８巻：２７２６〜２７３０頁、１９９１年）を含む。
【０１５２】
遺伝子送達ビヒクルは、任意選択で、ウイルス複製起点またはパッケージングシグナルなどのウイルス配列を含みうる。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルスから選択することができる。好ましい実施形態では、増殖因子の遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびそれらの多様な使用については、例えば、Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、３３巻：１５３頁、１９８３年；ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：６３４９頁、１９８４年；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：５〜１４頁、１９９０年；米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、および同第４，９８０，２８９号；ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０２，４６８号、同第ＷＯ８９／０５，３４９号、および同第ＷＯ９０／０２，８０６号を含む、多数の参考文献において記載されている。本発明では、例えば、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻：３８６０〜３８６４頁、１９９３年；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻：９６２〜９６７頁、１９９３年；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻：８３〜８８頁、１９９３年；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．、３３巻：４９３〜５０３頁、１９９２年；Ｂａｂａら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、７９巻：７２９〜７３５頁、１９９３年（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５，２４２、およびＷＯ９１／０２８０５）において記載されているレトロウイルスによる遺伝子送達ビヒクルを含む、多数のレトロウイルスによる遺伝子送達ビヒクルを活用することができる。
【０１５３】
本発明のポリヌクレオチドを送達するのに使用しうる、他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（１９９７年５月２０日に交付された、Ｗｏｏらによる、米国特許第５，６３１，２３６号、およびＮｅｕｒｏｖｅｘによるＷＯ００／０８１９１）、ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ（１９８８年）、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ  Ｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ  Ｄ  Ｔ編、Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ（１９８６年）、「Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ」、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ編、Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｕｐａｒら（１９８８年）、Ｇｅｎｅ、６８巻：１〜１０頁）、およびいくつかのＲＮＡウイルスから導出されている。好ましいウイルスは、アルファウイルス、ポックスウイルス（ｐｏｘｉｖｉｒｕｓ）、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを含む。これらは、多様な哺乳動物細胞のために、いくつかの魅力的な特色を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１２７５〜１２８１頁；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年、前出；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年、前出；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８年；Ｈｏｒｗｉｃｈら（１９９０年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４巻：６４２〜６５０頁）。
【０１５４】
他の実施形態では、当技術分野で周知の方法を使用して、ゲノム内の標的ＤＮＡを操作することができる。これは、対象への注入の前に、対象のＴ細胞集団を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、組換えにより操作するのに有用でありうる。例えば、ゲノム内の標的ＤＮＡは、欠失、挿入、および／または変異、例えばレトロウイルスの挿入、人工染色体法、遺伝子挿入、組織特異的なプロモーターによるランダムな挿入、遺伝子標的化、転移因子、および／または外来ＤＮＡを導入するかもしくは修飾ＤＮＡ／修飾核ＤＮＡを作製するための他の任意の方法により操作することができる。他の修飾法は、ゲノムからＤＮＡ配列を欠失させるステップおよび／または核ＤＮＡ配列を変更するステップを含む。核ＤＮＡ配列は、例えば、部位指向変異誘発により変更することができる。
【０１５５】
他の実施形態では、組換えバイオマーカーポリペプチドおよびその断片を、対象に投与することができる。一部の実施形態では、生物学的特性を増強した融合タンパク質を構築し、投与することができる。加えて、バイオマーカーポリペプチドおよびその断片は、バイオアベイラビリティーの増大およびタンパク質分解の低下など、所望の生物学的活性をさらに増強するために、当技術分野で周知の薬理学的方法（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、オリゴマー化など）に従い、修飾することができる。
【０１５６】
一部の態様では、複数の可変用量によるＩＬ−２療法を、１または複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせることができる。
【０１５７】
一実施形態では、体外フォトフェレーシス（ＥＣＰ）が有用である。ＥＣＰとは、アフェレーシスにより回収された自家白血球のＵＶＡ照射からなるアフェレーシス手順であり、この自家白血球を、８−メトキシソラーレン（８−ＭＯＰ）で感作し、その後、再注入してＴｒｅｇを増大させ（Ｇａｔｚａら（２００８年）、Ｂｌｏｏｄ、１１２巻：１５１５〜１５２１頁；Ｃａｐｉｔｉｎｉら（２０１１年）、Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１７巻：７９０〜７９９頁；Ｍａｅｄａら（２００８年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８１巻：５９５６〜５９６２頁）、そしてアポトーシス性Ｔ細胞を介して、未成熟および形質細胞様ＤＣを誘導し、その後Ｔｒｅｇが増大する（Ｐｅｒｅｚら（１９９１年）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５１巻：１２８３〜１２８９頁；Ｓｔｅｎｇｅｒら（２０１２年）、Ｂｌｏｏｄ、１１９巻：５０８８〜５１０３頁；Ａｌｂｅｒｔら（１９９８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３９２巻：８６〜８９頁；Ｙｏｏら（１９９６年）、Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１０７巻：２３５〜２４２頁）。ＥＣＰ機構についてのヒトデータは、Ｔｒｅｇ表現型（Ｓｃｈｍｉｔｔら（２００９年）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８８巻：４１１〜４１６頁；Ｂｉａｇｉら（２００７年）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８４巻：３１〜３９頁）またはＤＣ表現型（Ｓｈｉｕｅら（２０１３年）、Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１３３巻：２０９８〜２１００頁）について選択的に報告しているが、不均質な集団内のデータにおいて、包含基準またはＥＣＰ前のベースラインデータを伴わないことが多い。ＥＣＰは、ｃＧＶＨＤのための、慣例的に推奨され、ＣＭＳにより承認されている、第二選択処置である（Ｄｉｇｎａｎら（２０１２年）、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１５８巻：６２〜７８頁）。実施は安全であるが、ＥＣＰ単独は限定された臨床的利益をもたらす。処置された患者のうちの約半数は、臨床応答を示していないが、部分応答が、レスポンダーの標準であり、拡大ＥＣＰ中における免疫抑制剤の漸減は、緩徐であり、不完全なことが多い。
【０１５８】
別の実施形態では、調節性Ｔ細胞の注入が有用である。Ｔｒｅｇの注入は、ＨＳＣＴ文脈におけて良好に忍容される。２３例の複数臍帯血（ＤＵＣＢ）によるＨＳＣＴレシピエントにおける試験では、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＩＬ−２により拡大されたＵＣＢ  Ｔｒｅｇを注入する安全性について評価された。ＩＬ−２は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは投与されなかった。患者には、移植の後で１ｋｇ当たりのＴｒｅｇ細胞０．１〜３０×１０５個の用量が施された。注入による毒性は、観察されなかった。ＵＣＢ  Ｔｒｅｇ注入を伴わずに、同一に処置された１０８例の歴史的対照と比較して、グレードＩＩ〜ＩＶの急性ＧＶＨＤの発生率が低く（６１％と対比した４３％、Ｐ＝０．０５）、感染、再発、または早期死亡への有害な影響は見られなかった（Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎら（２０１１年）、Ｂｌｏｏｄ、１１７巻：１０６１〜１０７０頁）。しかし、注入されたＵＣＢ  Ｔｒｅｇは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて１４日間しか検出することができなかった。高リスクのＨＬＡハプロタイプ一致（ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ）ＨＳＣＴを経た、２８例の血液悪性疾患患者についての別の試験では、その後にＴｃｏｎの注入を後続させる、ドナーＴｒｅｇ濃縮細胞の、移植前後における注入は、移植後における免疫抑制の非存在下であっても、ＧＶＨＤを防止し、リンパ球系の再構成を促進し、日和見病原体に対する免疫を改善したが、移植片対白血病効果は弱めなかった（Ｄｉ  Ｉａｎｎｉら（２０１１年）、Ｂｌｏｏｄ、１１７巻：３９２１〜３９２８頁）。研究では、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）免疫磁気ビーズによる分離を介する、２ステップのドナーＴｒｅｇ細胞濃縮：ａ）臨床グレードのＣＤ８＋／ＣＤ１９＋共枯渇（２．１枯渇プログラム、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ）、および、これに続く、ｂ）ＣＤ２５＋の陽性選択（３．１濃縮プログラム、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ）が活用された。Ｔｒｅｇ濃縮細胞生成物は、１：２のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抑制性であった。１ｋｇ当たり最大でＴｒｅｇ濃縮細胞４×１０６個の注入の後では、１ｋｇ当たり最大でＴｃｏｎ細胞２×１０６個（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳによる、ＣＤ１９＋枯渇させたドナーリンパ球）のその後の注入にも拘らず、毒性が報告されなかった。
【０１５９】
煩瑣で高価な、Ｔｒｅｇの拡大および精製手順を伴う調節性Ｔ細胞の公知の注入法とは異なり、本明細書では、実験室における細胞の拡大に対する必要を伴わない、ＨＳＣＴドナーまたは対象自身のＴｒｅｇの直接的な回収および注入は、免疫障害を処置するのに、簡素で、有効で、永続的な手段を提供することが決定されている。この効果が生じるのは、患者におけるＴｒｅｇを永続的に増強して、免疫障害を永続的に制御するために、低用量ＩＬ−２との組合せが、注入されたＴｒｅｇを、体内で直接的に拡大させる、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件を創出するからである。
【０１６０】
Ｔｒｅｇは、精製することもでき、濃縮することもできる。「濃縮Ｔｒｅｇ」とは、他のＴ細胞に加えて、組成物が、少なくとも１：２、１：１．９、１：１．８、１：１．７、１：１．６、１：１．５、１：１．４、１：１．３、１：１．２、１：１．１、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、１：０．１、もしくはそれ超、または間の任意の範囲および／もしくは間の任意の値であるＴｒｅｇのＴｃｏｎに対する比を有する比率でＴｒｅｇを含む組成物を指す。このような比は、Ｔ細胞を含む組成物を、ＣＤ２５＋細胞についての陽性選択と組み合わせた、ＣＤ８＋およびＣＤ１９＋の共枯渇により精製することにより達成することができる。濃縮されたＴｒｅｇを含む細胞集団は、対象の体重１キログラム当たりの細胞０．１×１０６、０．２×１０６、０．３×１０６、０．４×１０６、０．５×１０６、０．６×１０６、０．７×１０６、０．８×１０６、０．９×１０６、１．０×１０６個、もしくはそれ超、または間の任意の範囲もしくは間の任意の値で投与することができる。このような濃縮Ｔｒｅｇはさらに、細胞マーカーおよび／または生存率の関係でも規定することができる。例えば、濃縮Ｔｒｅｇ細胞組成物は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはそれ超、または間の任意の範囲もしくは間の任意の値の総細胞生存率を有しうる。濃縮Ｔｒｅｇ細胞組成物は、陰性グラム染色を有しうる。濃縮Ｔｒｅｇ細胞組成物は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはそれ超、または間の任意の範囲もしくは間の任意の値のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋細胞を含みうる。濃縮Ｔｒｅｇ細胞組成物は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはそれ超、または間の任意の範囲もしくは間の任意の値のＦｏｘＰ３＋細胞を含みうる。Ｔｒｅｇは、注入によるなど、本明細書で記載される任意の適する経路で投与することができる。Ｔｒｅｇはまた、ＩＬ−２の投与前、ＩＬ−２の投与と共時的に、またはＩＬ−２の投与後に投与することができる。
【０１６１】
さらに別の実施形態では、処置法はさらに、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＢ７−３など、他のＢリンパ球抗原の共刺激経路などの共刺激経路の活性を遮断して、免疫応答をさらに下方モジュレートする薬剤を使用しうる。対象において免疫細胞に媒介される免疫応答をより有効に下方調節するのに、免疫応答を下方モジュレートする２つの別個の薬剤を、単一の組成物として組み合わせることもでき、個別に（同時的または逐次的に）投与することもできる。さらに、免疫応答に影響を及ぼすのに、対象薬剤のうちの１または複数の治療的に活性な量を、他の下方モジュレート試薬と共に使用することができる。他の免疫モジュレート試薬の例は、限定なしに述べると、共刺激シグナルを遮断する抗体（例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳに対する）、ＣＴＬＡ４のアゴニストとして作用する抗体、および／または他の免疫細胞マーカーに対する抗体（例えば、ＣＤ４０に対する、ＣＤ４０リガンドに対する、またはサイトカインに対する）、融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ）、および免疫抑制性薬物（例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡ、またはＦＫ５０６）を含む。
【０１６２】
さらに、免疫チェックポイントタンパク質の活性を促進する薬剤が、有用である。「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞表面上の分子群であって、抗腫瘍免疫応答を下方モジュレートまたは阻害することにより、免疫応答を微調整する分子群を指す。免疫チェックポイントタンパク質は、当技術分野で周知であり、限定なしに述べると、上記で記載したＣＴＬＡ−４のほか、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリーの受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、およびＡ２ａＲ（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照されたい）を含む。当技術分野では、免疫チェックポイントタンパク質のレベルおよび活性を促進するのに有用な薬剤が周知である。
【０１６３】
さらに別の実施形態では、任意の第一または第二選択の免疫障害処置を、本発明の方法と組み合わせることができる。代表例は、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、およびペントスタチン（例えば、Ｂｕｓｃａら（２０００年）、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２５巻：１０６７〜１０７１頁；Ｂｅｒｇｅｒら（２００７年）、Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．、２９巻：６７８〜６８７頁；Ｊａｃｏｂｓｏｈｎら（２００９年）、Ｂｌｏｏｄ、１１４巻：４３５４〜４３６０頁を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【０１６４】
Ｖ．臨床有効性
臨床有効性は、当技術分野で公知の任意の方法により測定することができる。例えば、応答は、罹患面積の百分率の変化など、定量的に記録することもでき、半定量的方法を使用して、「病理学的完全応答」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定病態」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、または他の定性的基準など、定性的に記録することもできる。腫瘍応答の評価は、治療開始後の任意の時点、例えば、数時間後、数日間後、数週間後、または、好ましくは数カ月間後において実施することができる。
【０１６５】
一部の実施形態では、本明細書で記載される治療的処置の臨床有効性は、臨床的有用率（ＣＢＲ）を測定することにより決定することができる。臨床的有用率は、治療の終了時から少なくとも６カ月後の時点において、完全寛解（ＣＲ）している患者の百分率と、部分寛解（ＰＲ）している患者の数と、安定病態（ＳＤ）である患者の数との合計を決定することにより測定する。この式の略記は、６カ月間にわたるＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。一部の実施形態では、特定の治療レジメンのためのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれ超である。
【０１６６】
応答を評価するためのさらなる基準は、以下：全生存としてもまた公知の死亡までの生存（ここで、前記死亡は、原因を問わない場合もある）；「無再発生存」（ここで、再発という用語は、限局的および遠隔的再発の両方を含むものとする）；無病生存（ここで、疾患という用語は、免疫障害およびこれと関連する疾患を含むものとする）の全てを含む「生存」と関連する。前記生存の長さは、規定された開始点（例えば、診断時または処置の開始）および終了点（例えば、死または再発）を参照することにより計算することができる。
【０１６７】
例えば、適切な閾値を決定するために、特定の治療レジメンを、対象の集団に施行することができ、アウトカムを、任意の治療を施行する前に決定されたバイオマーカー測定値と相関させることができる。アウトカム測定値は、ネオアジュバント状況において施される治療に対する病理学的応答でありうる。代替的に、全生存および無病生存などのアウトカム尺度を、バイオマーカー測定値が既知である抗免疫障害療法後における対象について、ある期間にわたりモニタリングすることができる。ある特定の実施形態では、同じ用量の活性薬剤を、各対象に投与する。対象をモニタリングする期間は、変動しうる。例えば、対象を、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０カ月間にわたりモニタリングすることができる。抗免疫障害療法のアウトカムと相関する、バイオマーカーの測定閾値は、実施例節で記載される方法などの方法を使用して決定することができる。
【０１６８】
Ｖ．本発明のさらなる方法
バイオマーカー核酸および／またはバイオマーカーポリペプチドを、本明細書で記載されている方法および当業者に公知の技法に従い解析して、診断および予後診断の目的で有用な、このような遺伝子または発現の変更を同定することができる。例えば、Ｔｒｅｇおよび／またはＴｃｏｎを同定するバイオマーカーのほか、それらの活性についての細胞内のバイオマーカーも検出することができる。このような方法は、１）バイオマーカー転写物またはポリペプチドのレベルの変更、２）バイオマーカー遺伝子からの、１または複数のヌクレオチドの欠失または付加、４）バイオマーカー遺伝子の１または複数のヌクレオチドの置換、５）発現調節領域など、バイオマーカー遺伝子の異常な修飾などを含むがこれらに限定されない。
【０１６９】
ａ．試料の回収、調製、および分離
一部の実施形態では、対象に由来する試料中の、バイオマーカーの存在、非存在、量、および／または活性の測定値を、所定の対照（標準）試料と比較する。対象に由来する試料は、免疫障害細胞または組織などの罹患組織に由来することが典型的である。対照試料は、同じ対象に由来する場合もあり、異なる対象に由来する場合もある。対照試料は、正常な非罹患試料であることが典型的である。しかし、疾患の病期分類のため、または処置の有効性を評価するためなど、一部の実施形態では、対照試料は、罹患組織に由来する場合がある。対照試料は、何例かの異なる対象に由来する試料の組合せでありうる。一部の実施形態では、対象に由来するバイオマーカーの量および／または活性の測定値を、所定のレベルと比較する。この所定のレベルは、被験試料が得られた種と同じ種のメンバーの細胞もしくは組織型、または被験試料が得られた対象に由来する非罹患細胞もしくは組織における、バイオマーカーの正常なコピー数、量、または活性など、正常試料から得られることが典型的である。本明細書で記載される通り、「所定の」バイオマーカーの量および／または活性の測定値は、例だけを目的として述べると、処置のために選択されうる対象を評価し、抗免疫障害療法に対する応答（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）を評価するのに使用される、バイオマーカーの量および／または活性の測定値でありうる。所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、免疫障害を伴うかまたは伴わない患者の集団内で決定することができる。所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、あらゆる患者に同等に適用可能な、単一の数である場合があり、または所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、患者の特異的な部分集団に従い変動しうる。対象の年齢、体重、身長、および他の因子は、個体の所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値に影響を及ぼしうる。さらに、所定のバイオマーカーの量および／または活性は、各対象について個別に決定することができる。一実施形態では、本明細書で記載される方法により決定および／または比較される量は、絶対測定値に基づく。別の実施形態では、本明細書で記載される方法により決定および／または比較される量は、比（例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現、または多様な時点における遺伝子発現に照らして正規化されたバイオマーカーの発現）などの相対測定値に基づく。
【０１７０】
所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、任意の適切な標準物質でありうる。例えば、所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、患者の選択を評価するための、同じまたは異なるヒトから得ることができる。一実施形態では、所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、同じ患者についてのかつての評価から得ることができる。このようにして、患者の選択の進行を、ある時間にわたりモニタリングすることができる。加えて、対照は、別のヒトまたは複数のヒト、例えば、対象が、ヒトである場合に、選択されたヒトの群についての評価から得ることができる。このようにして、選択を評価するための、ヒトの選択の範囲を、適切な他のヒト、例えば、同様もしくは同じ状態を患うヒトおよび／または同じ民族（ｅｔｈｎｉｃ）群のヒトなど、目的のヒトと同様の状況にある他のヒトと比較することができる。
【０１７１】
本発明の一部の実施形態では、バイオマーカーの量および／または活性の測定値および／または比の、所定のレベルからの変化は、約０．５倍、約１．０倍、約１．５倍、約２．０倍、約２．５倍、約３．０倍、約３．５倍、約４．０倍、約４．５倍、または約５．０倍、またはそれ超である。一部の実施形態では、倍数変化は、約１倍未満、約５倍未満、約１０倍未満、約２０倍未満、約３０倍未満、約４０倍未満、または約５０倍未満である。他の実施形態では、バイオマーカーの量および／または活性の測定値の、所定のレベルと比較した倍数変化は、約１倍を超える、約５倍を超える、約１０倍を超える、約２０倍を超える、約３０倍を超える、約４０倍を超える、または約５０倍を超える。
【０１７２】
生体試料は、核酸および／またはタンパク質を含む、体液試料、細胞試料、または組織試料を含む、患者に由来する様々な供給源から回収することができる。「体液」とは、身体から排出または分泌される流体のほか、通常身体から排出または分泌されない流体（例えば、羊水、房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎおよびｅａｒｗａｘ）、カウパー腺液または尿道球腺液、乳び、びじゅく、糞便、スキーン腺液、間質液、細胞内液、リンパ、経血、母乳、粘液、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑膜液、涙、尿、膣液、硝子体液、吐瀉物）も指す。好ましい実施形態では、対象および／または対照試料は、細胞、細胞系、組織学スライド、パラフィン包埋組織、生検材料、全血、乳首吸引物、血清、血漿、口腔内切屑、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、および骨髄からなる群より選択される。一実施形態では、試料は、血清、血漿、または尿である。別の実施形態では、試料は、血清である。さらに他の実施形態では、Ｔリンパ球を含む生体試料であって、全血、精製血液、脾臓組織、リンパ液、リンパ節組織などを含むがこれらに限定されない生体試料は、有用である。
【０１７３】
試料は、個体から、長期にわたり繰り返し（例えば、日、週、月、毎年、隔年などのオーダーで１回または複数回）回収することができる。多数の試料を、個体から、ある期間にわたり得ることを使用して、早期の検出からの結果を検証し、かつ／または、例えば、疾患の進行、薬物処置などの結果としての、生物学的パターンの変更を同定することができる。例えば、対象試料を、本発明に従い、毎月、隔月、または１、２、もしくは３カ月間隔の組合せで採取およびモニタリングしうる。加えて、ある時間にわたり得られる、対象のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、モニタリング期間中に、互いと比較するほか、正常対照と比較し、これにより、長期モニタリングのための内部または個人対照としての対象自身の値をもたらしうると好都合である。
【０１７４】
試料の調製および分離は、回収される試料の種類および／またはバイオマーカー測定値の解析に応じる手順のうちのいずれかを伴いうる。このような手順は、例だけを目的として述べると、濃縮、希釈、ｐＨの調整、存在度の大きなポリペプチド（例えば、アルブミン、ガンマグロブリン、およびトランスフェリンなど）の除去、保存剤および較正物質の添加、プロテアーゼ阻害剤の添加、変性剤の添加、試料の脱塩、試料タンパク質の濃縮、脂質の抽出および精製を含む。
【０１７５】
また、試料の調製により、非共有結合的複合体中で、他のタンパク質（例えば、担体タンパク質）と結合した分子を単離することもできる。この工程により、特異的な担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合した分子を単離することもでき、例えば、酸を使用するタンパク質変性と、それに続く、担体タンパク質の除去を介する、全ての担体タンパク質からの、結合した分子の放出など、より一般的な工程を使用することもできる。
【０１７６】
所望されないタンパク質（例えば、存在度が大きいか、情報を与えないか、または検出不能なタンパク質）の、試料からの除去は、高アフィニティー試薬、高分子量フィルター、超遠心分離、および／または電気透析を使用して達成することができる。高アフィニティー試薬は、存在度の大きなタンパク質に選択的に結合する、抗体または他の試薬（例えば、アプタマー）を含む。試料の調製はまた、イオン交換クロマトグラフィー、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、等電点電気泳動（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）、吸着クロマトグラフィー、等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）、および類縁の技法も含みうる。分子量フィルターは、サイズおよび分子量に基づき、分子を分離する膜を含む。このようなフィルターは、逆浸透、ナノ濾過、限外濾過、および微細濾過をさらに利用しうる。
【０１７７】
超遠心分離とは、所望されないポリペプチドを、試料から除去するための方法である。超遠心分離とは、光学システムで、粒子の沈降（またはその欠如）をモニタリングしながらの、約１５，０００〜６０，０００ｒｐｍにおける、試料の遠心分離である。電気透析とは、電位勾配の影響下で、半透膜を介して、イオンを、１つの溶液から別の溶液へと輸送する工程において、電気膜（ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｍｂｒａｎｅ）または半透膜を使用する手順である。電気透析において使用される膜は、正もしくは負の電荷を有するイオンを選択的に輸送し、反対の電荷を有するイオンを棄却する能力、または分子種が、サイズおよび電荷に基づき、半透膜を介して移動することを可能とする能力を有しうるので、電気透析を、電解質の濃縮、除去、または分離に有用とする。
【０１７８】
本発明における分離および精製は、当技術分野で公知の任意の手順、例えば、キャピラリー電気泳動（例えば、キャピラリー内またはチップ上）またはクロマトグラフィー（例えば、キャピラリー内、カラム内、またはチップ上）などを含みうる。電気泳動とは、電界の影響下で、イオン性分子を分離するのに使用しうる方法である。電気泳動は、ゲル内、キャピラリー内、またはチップ上のマイクロチャネル内で行うことができる。電気泳動のために使用されるゲルの例は、デンプン、アクリルアミド、ポリエチレンオキシド、アガロース、またはこれらの組合せを含む。ゲルは、その架橋、洗浄剤または変性剤の添加、酵素または抗体（アフィニティー電気泳動）または基質（ザイモグラフィー）の固定化、およびｐＨ勾配の組込みにより修飾することができる。電気泳動のために使用されるキャピラリーの例は、エレクトロスプレーと接続するキャピラリーを含む。
【０１７９】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、複合体である親水性分子と、高度に荷電した溶質とを分離するのに好ましい。ＣＥ技術はまた、マイクロ流体チップ上でも実装することができる。使用されるキャピラリーおよび緩衝液の種類に応じて、ＣＥは、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速回転電気泳動（ｃＩＴＰ）、およびキャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）などの分離法へと、さらに分けることができる。ＣＥ法を、エレクトロスプレーによるイオン化とカップリングさせる実施形態は、揮発性溶液、例えば、揮発性の酸および／または塩基と、アルコールまたはアセトニトリルなどの有機物とを含有する水性混合物の使用を伴う。
【０１８０】
キャピラリー等速回転電気泳動（ｃＩＴＰ）は、解析物が、キャピラリーを介して、一定の速度で移動するが、それらのそれぞれの移動度により分離される技法である。自由溶液ＣＥ（ＦＳＣＥ）としてもまた公知のキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、分子上の電荷と、移動中に分子にかかる摩擦抵抗であって、分子のサイズに正比例することが多い摩擦抵抗とにより決定される、分子種の電気泳動移動度の差異に基づく。キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）は、弱くイオン化可能な両親媒性分子を、ｐＨ勾配下の電気泳動により分離することを可能とする。ＣＥＣとは、従来の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とＣＥとのハイブリッド法である。
【０１８１】
本発明で使用される分離法および精製法は、当技術分野で公知の、任意のクロマトグラフィー手順を含む。クロマトグラフィーは、ある特定の解析物の差次的な吸着および溶出または移動相と固定相との間における、解析物の分配に基づきうる。クロマトグラフィーの異なる例は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを含むがこれらに限定されない。
【０１８２】
ｂ．コピー数および／またはゲノム核酸の変異を検出するための方法
当業者には、バイオマーカー核酸のコピー数および／またはゲノム核酸の状態（例えば、変異）を評価する方法が周知である。染色体の増加または減少の存在または非存在は、本明細書で同定される領域またはマーカーのコピー数の決定により、簡単に評価することができる。
【０１８３】
一実施形態では、生体試料を、ゲノムマーカーを含有するゲノム遺伝子座のコピー数の変化の存在について調べる。
【０１８４】
バイオマーカー遺伝子座のコピー数を評価する方法は、ハイブリダイゼーションベースのアッセイを含むがこれに限定されない。ハイブリダイゼーションベースのアッセイは、サザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨおよびＳＫＹを加えたＦＩＳＨ）法など、従来の「直接プローブ」法、および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、例えば、ｃＤＮＡベースまたはオリゴヌクレオチドベースのＣＧＨなど、「比較プローブ」法を含むがこれらに限定されない。方法は、基材（例えば、膜またはガラス）結合法またはアレイベースの手法を含むがこれらに限定されない、多種多様なフォーマットで使用することができる。
【０１８５】
一実施形態では、試料中のバイオマーカー遺伝子のコピー数の評価は、サザンブロットを伴う。サザンブロットでは、ゲノムＤＮＡ（断片化され、電気泳動ゲル上で分離されることが典型的である）を、標的領域に特異的なプローブとハイブリダイズさせる。標的領域についてのプローブに由来するハイブリダイゼーションシグナルの強度の、正常ゲノムＤＮＡ（例えば、同じまたは類縁の細胞、組織、臓器などのうちの、増幅されない部分）の解析に由来する対照プローブシグナルとの比較は、標的核酸の相対的なコピー数についての推定値をもたらす。代替的に、ノーザンブロットを、試料中のコード核酸のコピー数を評価するために活用することができる。ノーザンブロットでは、ｍＲＮＡを、標的領域に特異的なプローブとハイブリダイズさせる。標的領域についてのプローブに由来するハイブリダイゼーションシグナルの強度の、正常ＲＮＡ（例えば、同じまたは類縁の細胞、組織、臓器などのうちの、増幅されない部分）の解析に由来する対照プローブシグナルとの比較は、標的核酸の相対的なコピー数についての推定値をもたらす。代替的に、適切な対照と比べて高いまたは低い発現（例えば、同じまたは類縁の細胞、組織、臓器などのうちの、増幅されない部分）により、標的核酸の相対的なコピー数についての推定値がもたらされるように、当技術分野で周知の、ＲＮＡを検出する他の方法を使用することができる。
【０１８６】
ゲノムコピー数を決定するための代替的手段は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７年）、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５２巻：６４９頁）である。一般に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、以下のステップ：（１）解析される組織または生物学的構造の固定；（２）標的ＤＮＡのアクセス可能性を増大させ、非特異的結合を低減する、生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理；（３）核酸混合物の、生物学的構造または組織内の核酸とのハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかった核酸断片を除去するハイブリダイゼーション後の洗浄；および（５）ハイブリダイズさせた核酸断片の検出を含む。これらのステップの各々において使用される試薬と、使用のための条件は、特定の適用に応じて変動する。典型的なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞を、固体支持体、典型的には、スライドガラスに固定する。核酸をプロービングする場合、細胞は、熱またはアルカリにより変性させることが典型的である。次いで、細胞を、ハイブリダイゼーション溶液と、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのアニーリングを許容する、中程度の温度で接触させる。次いで、適切なシグナル対ノイズ比が得られるまで、標的（例えば、細胞）を、所定のストリンジェンシーで、またはストリンジェンシーを増大させて洗浄することが典型的である。プローブは、例えば、放射性同位元素または蛍光レポーターで標識することが典型的である。一実施形態では、プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイズするように、十分に長い。プローブは一般に、約２００塩基〜約１０００塩基の長さの範囲である。一部の適用では、反復配列のハイブリダイゼーション能を遮断することが必要である。したがって、一部の実施形態では、ｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、またはＣｏｔ−Ｉ  ＤＮＡを使用して、非特異的なハイブリダイゼーションを遮断する。
【０１８７】
ゲノムコピー数を決定するための代替的手段は、比較ゲノムハイブリダイゼーションである。一般に、ゲノムＤＮＡを、正常基準細胞のほか、被験細胞（例えば、腫瘍細胞）からも単離し、必要な場合は、増幅する。２つの核酸を、差次的に標識し、次いで、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて、基準細胞の中期染色体とハイブリダイズさせる。基準ＤＮＡおよび被験ＤＮＡの両方における反復配列を除去するか、またはそれらのハイブリダイゼーション能を、いくつかの手段により、例えば、適切な遮断核酸によるプレハイブリダイゼーションおよび／または前記ハイブリダイゼーション中における前記反復配列に対するこのような遮断核酸配列を含むことにより低減する。次いで、必要な場合、結合させ、標識されたＤＮＡ配列を、視覚化可能な形態とする。コピー数が増大または減少している、被験細胞内の染色体領域は、２つのＤＮＡに由来するシグナルの比が変更された領域を検出することにより同定することができる。例えば、被験細胞内のコピー数を減少させた領域は、ゲノムの他の領域と比較して、基準より比較的低い、被験ＤＮＡに由来するシグナルを示すであろう。被験細胞内のコピー数を増大させた領域は、被験ＤＮＡに由来する、比較的高いシグナルを示すであろう。染色体の欠失または増倍が存在する場合は、２つの標識に由来するシグナルの比の差異が検出され、比は、コピー数の尺度をもたらすであろう。ＣＧＨの別の実施形態である、アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）では、固定化された染色体エレメントを、アレイ上の固体支持体に結合させた標的核酸のコレクションで置きかえ、ゲノムの大部分または全体を、固体支持体に結合させた標的のコレクションにより表すことを可能とする。標的核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド（例えば、一塩基多型を検出する）などを含みうる。アレイベースのＣＧＨはまた、単色の標識化（対照試料と、可能な腫瘍試料とを、２つの異なる色素で標識化し、それらをハイブリダイゼーションの前に混合し、ハイブリダイゼーションにより、アレイ上のプローブの競合的ハイブリダイゼーションに起因する比をもたらすことと対照的に）により実施することもできる。単色ＣＧＨでは、対照を、標識し、１つのアレイとハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み取り、可能な腫瘍試料を、標識し、第２のアレイ（同一な内容物を伴う）とハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み取る。コピー数の差異は、２つのアレイに由来する絶対シグナルに基づき計算する。当技術分野では、固定化された染色体またはアレイを調製し、比較ゲノムハイブリダイゼーションを実行する方法が周知である（例えば、米国特許第６，３３５，１６７号；同第６，１９７，５０１号；同第５，８３０，６４５号；および同第５，６６５，５４９号；ならびにＡｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４年）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３巻：１２２７〜１２３４頁；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５巻：９１３８〜９１４２頁；欧州特許公開第４３０，４０２号；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３３巻、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｃｈｏｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（１９９４年）などを参照されたい）。別の実施形態では、Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０巻：２０７〜２１１頁、またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９巻：５３２１〜５３２５頁（１９９２年）のハイブリダイゼーションプロトコールを使用する。
【０１８８】
さらに別の実施形態では、増幅ベースのアッセイを使用して、コピー数を測定することができる。このような増幅ベースのアッセイでは、核酸配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））内の鋳型として作用する。定量的増幅では、増幅産物の量は、元の試料中の鋳型の量と比例するであろう。適切な対照、例えば、健常な組織との比較は、コピー数の尺度をもたらす。
【０１８９】
当業者には、「定量的」増幅法が周知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同じプライマーを使用して、既知の量の対照配列を、同時に共増幅することを伴う。これは、ＰＣＲ反応を較正するのに使用しうる、内部標準をもたらす。定量的ＰＣＲのための詳細なプロトコールは、Ｉｎｎｉｓら（１９９０年）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）において提示されている。定量的ＰＣＲ解析を使用する、マイクロサテライト遺伝子座におけるＤＮＡコピー数の測定は、Ｇｉｎｚｏｎｇｅｒら（２０００年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６０巻：５４０５〜５４０９頁において記載されている。遺伝子についての既知の核酸配列は、当業者が、遺伝子の任意の部分を増幅するプライマーを日常的に選択することを可能とするのに十分である。本発明の方法ではまた、蛍光発生定量的ＰＣＲも使用することができる。蛍光発生定量的ＰＣＲでは、定量化は、蛍光シグナル、例えば、ＴａｑＭａｎおよびＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎの量に基づく。
【０１９０】
他の適切な増幅法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９年）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４巻：５６０頁、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：１０７７頁；ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０年）、Ｇｅｎｅ、８９巻：１１７頁を参照されたい）、転写増幅（Ｋｗｏｈら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８６巻：１１７３頁）、自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８７巻：１８７４頁）、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲなどを含むがこれらに限定されない。
【０１９１】
ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）およびＭＣＰ（ｍａｊｏｒ  ｃｏｐｙ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）によるマッピング（Ｗａｎｇ，  Ｚ．Ｃ．ら（２００４年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４巻（１号）：６４〜７１頁；Ｓｅｙｍｏｕｒ，  Ａ．  Ｂ．ら（１９９４年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５４巻、２７６１〜４頁；Ｈａｈｎ，  Ｓ．  Ａ．ら（１９９５年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５５巻、４６７０〜５頁；Ｋｉｍｕｒａ，  Ｍ．ら（１９９６年）、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ、１７巻、８８〜９３頁；Ｌｉら、（２００８年）、ＭＢＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．、９巻、２０４〜２１９頁）もまた、増幅または欠失の領域を同定するのに使用することができる。
【０１９２】
ｃ．バイオマーカー核酸の発現を検出するための方法
バイオマーカーの発現は、転写された分子またはタンパク質の発現を検出するための、多種多様な周知の方法のうちのいずれかにより評価することができる。このような方法の非限定的な例は、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、または核タンパク質を検出するための免疫学的方法、タンパク質の精製法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、および核酸増幅法を含む。
【０１９３】
好ましい実施形態では、特定の遺伝子の活性は、遺伝子転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の尺度、翻訳されるタンパク質の量の尺度、または遺伝子産物の活性の尺度により特徴付けられる。バイオマーカーの発現は、それらのいずれもが標準的な技法を使用して測定されうる、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはタンパク質活性を検出することを含む、様々な方式でモニタリングすることができる。検出は、遺伝子発現（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、または酵素活性）のレベルの定量化を伴う場合もあり、代替的に、特に対照レベルと比較した遺伝子発現のレベルについての定性的評価である場合もある。検出されるレベルの種類は、文脈から明らかであろう。
【０１９４】
別の実施形態では、バイオマーカーおよび機能的に類似するそのホモログであって、その断片または遺伝子の変更（例えば、その調節性またはプロモーター領域内の）を含むホモログの発現レベルの検出または決定は、目的のマーカーについてのＲＮＡレベルの検出または決定を含む。一実施形態では、被験対象に由来する１または複数の細胞を得、ＲＮＡを、細胞から単離する。好ましい実施形態では、乳腺組織（ｂｒｅａｓｔ  ｔｉｓｓｕｅ）細胞の試料を、対象から得る。
【０１９５】
一実施形態では、ＲＮＡを、単一の細胞から得る。例えば、細胞は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）により、組織試料から単離することができる。この技法を使用して、細胞を、染色された組織切片を含む組織切片から単離し、これにより、所望の細胞が単離されたことを確認することができる（例えば、Ｂｏｎｎｅｒら（１９９７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：１４８１頁；Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら（１９９６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻：９９８頁；Ｆｅｎｄら（１９９９年）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．、１５４巻：６１頁；およびＭｕｒａｋａｍｉら（２０００年）、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５８巻：１３４６頁を参照されたい）。例えば、Ｍｕｒａｋａｍｉら、前出は、細胞の、以前に免疫染色された組織切片からの単離について記載している。
【０１９６】
また、ＲＮＡを抽出しうるより大きな細胞集団を得るように、細胞を対象から得、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養することも可能である。当技術分野では、非形質転換細胞の培養物、すなわち、初代細胞培養物を確立するための方法が公知である。
【０１９７】
ＲＮＡを、個体に由来する組織試料または細胞から単離する場合、組織または細胞を、対象から取り出した後における、遺伝子発現の、任意のさらなる変化を防止することが重要でありうる。発現レベルの変化は、摂動後、例えば、熱ショック後、またはリポ多糖（ＬＰＳ）もしくは他の試薬による活性化後において、急速に変化することが公知である。加えて、組織および細胞内のＲＮＡは、迅速に分解されうる。したがって、好ましい実施形態では、対象から得られる組織または細胞を、可能な限り速やかに、瞬時凍結させる。
【０１９８】
ＲＮＡは、様々な方法、例えば、チオシアン酸グアニジウム溶解と、それに続く、ＣｓＣｌ遠心分離により、組織試料から抽出することができる（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８巻：５２９４〜５２９９頁）。単一細胞に由来するＲＮＡは、Ｄｕｌａｃ，  Ｃ．  （１９９８年）、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、３６巻、２４５頁；およびＪｅｎａら（１９９６年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９０巻：１９９頁において記載されている方法など、単一の細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法において記載されている通りに得ることができる。例えば、ＲＮＡｓｉｎの包含により、ＲＮＡの分解を回避するように、注意を払わなければならない。
【０１９９】
次いで、ＲＮＡ試料を、特定の分子種において濃縮することができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡを、ＲＮＡ試料から単離する。一般に、このような精製は、ｍＲＮＡ上のポリＡテールを利用する。特に、かつ、上記で言及した通り、ポリＴオリゴヌクレオチドを、固体支持体上に固定化して、ｍＲＮＡに対するアフィニティーリガンドとして用いることができる。これを目的とするキット、例えば、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が市販されている。
【０２００】
好ましい実施形態では、マーカー配列内のＲＮＡ集団を、濃縮する。濃縮は、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成、またはｃＤＮＡ合成に基づく、複数ラウンドの線形増幅、および鋳型指向的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（例えば、Ｗａｎｇら（１９８９年）、ＰＮＡＳ、８６巻、９７１７頁；Ｄｕｌａｃら、前出；およびＪｅｎａら、前出を参照されたい）により着手することができる。
【０２０１】
ＲＮＡの集団は、特定の分子種または配列が濃縮されている場合であれ、そうでない場合であれ、さらに増幅することができる。本明細書で規定される場合、「増幅工程」は、ＲＮＡ中の分子を強化するか、増大させるか、または増進するようにデザインされる。例えば、ＲＮＡが、ｍＲＮＡである場合、シグナルが検出可能であるか、または検出が増強されるように、ＲＴ−ＰＣＲなどの増幅工程を活用して、ｍＲＮＡを増幅することができる。このような増幅工程は、特に、生体、組織、または腫瘍試料のサイズまたは体積が小さい場合に有益である。
【０２０２】
多様な増幅法および検出法を使用することができる。例えば、ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡへと逆転写するのに続いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を施すこと；または、米国特許第５，３２２，７７０号において記載されている通り、両方のステップのために単一の酵素を使用すること；または、Ｒ．  Ｌ．  Ｍａｒｓｈａｌｌら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４巻：８０〜８４頁（１９９４年）により記載されている通り、ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡへと逆転写するのに続いて、シンメトリックギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を施すことは、本発明の範囲内にある。また、リアルタイムＰＣＲも、使用することができる。
【０２０３】
本明細書で活用されうる、他の公知の増幅法は、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７巻：１８７４〜１８７８頁（１９９０年）において記載されており、また、Ｎａｔｕｒｅ、３５０巻（６３１３号）：９１〜９２頁（１９９１年）においても記載されている、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」法；欧州特許出願（ＥＰＡ）公開第４５４４６１０号において記載されているＱベータ増幅；鎖置換増幅（Ｇ．  Ｔ．  Ｗａｌｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．、４２巻：９〜１３頁（１９９６年）；および欧州特許出願第６８４３１５号において記載されている）；ＰＣＴ公開ＷＯ９３２２４６１号により記載されている標的媒介型増幅；ＰＣＲ；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４巻、５６０頁（１９８９年）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻、１０７７頁（１９８８年）を参照されたい）；自己持続配列複製（ＳＳＲ）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８７巻、１８７４頁（１９９０年）を参照されたい）；および転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８６巻、１１７３頁（１９８９年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【０２０４】
現況技術では、遺伝子発現の絶対および相対レベルを決定するための多くの技法が公知であり、本発明における使用に適する一般に使用される技法は、ノーザン解析、ＲＮアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ、ならびに定量的ＰＣＲおよびディファレンシャルディスプレイＰＣＲなど、ＰＣＲベースの技法を含む。例えば、ノーザンブロット法は、ＲＮＡの調製物を、変性アガロースゲル上で泳動させ、これを、活性化セルロース、ニトロセルロース、またはガラス、またはナイロン膜など、適切な支持体に転写するステップを伴う。次いで、放射性標識されたｃＤＮＡまたはＲＮＡを、調製物とハイブリダイズさせ、洗浄し、オートラジオグラフィーにより解析する。
【０２０５】
放射性標識されたアンチセンスＲＮＡプローブを、生検試料の薄い切片とハイブリダイズさせ、洗浄し、ＲＮアーゼにより切断し、オートラジオグラフィーのために、感光性エマルジョンに曝露する、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる可視化もまた利用することができる。試料を、ヘマトキシリンで染色して、試料の組織学的組成を裏付けることができ、適切な光フィルターによる暗視野イメージングは、現像されたエマルジョンを示す。ジゴキシゲニンなどの非放射性標識もまた、使用することができる。
【０２０６】
代替的に、ｍＲＮＡの発現は、ＤＮＡアレイ、チップ、またはマイクロアレイ上で検出することができる。対象から得られた被験試料の、標識された核酸を、バイオマーカーＤＮＡを含む固体表面とハイブリダイズさせることができる。バイオマーカー転写物を含有する試料については、陽性ハイブリダイゼーションシグナルが得られる。当技術分野では、ＤＮＡアレイを調製する方法およびそれらの使用が周知である（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６１８，６７９６号；同第６，３７９，８９７号；同第６，６６４，３７７号；同第６，４５１，５３６号；同第５４８，２５７号；Ｕ．Ｓ．２００３０１５７４８５；ならびにＳｃｈｅｎａら（１９９５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０巻、４６７〜４７０頁；Ｇｅｒｈｏｌｄら（１９９９年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、２４巻、１６８〜１７３頁；およびＬｅｎｎｏｎら（２０００年）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、５巻、５９〜６５頁を参照されたい）。ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）もまた、実施することができる（例えば、米国特許出願第２００３０２１５８５８号を参照されたい）。
【０２０７】
ｍＲＮＡレベルをモニタリングするために、例えば、ｍＲＮＡを、被験生体試料から抽出し、逆転写させ、蛍光標識されたｃＤＮＡプローブを生成する。次いで、マーカーｃＤＮＡとハイブリダイズすることが可能なマイクロアレイを、標識されたｃＤＮＡプローブでプロービングし、スライドを走査し、蛍光強度を測定する。この強度は、ハイブリダイゼーション強度および発現レベルと相関する。
【０２０８】
本明細書で記載される方法において使用されうるプローブの種類は、ｃＤＮＡ、リボプローブ、合成オリゴヌクレオチド、およびゲノムプローブを含む。使用されるプローブの種類は一般に、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのリボプローブ、およびノーザンブロット法のためのｃＤＮＡなど、特定の状況により指示されるであろう。一実施形態では、プローブを、ＲＮＡに固有なヌクレオチド領域へと方向付ける。プローブは、マーカーｍＲＮＡ転写物を差次的に認識するのに必要となる程度に短くすることが可能であり、例えば、１５塩基程度に短くすることも可能であるが、少なくとも１７、１８、１９または２０またはそれ超の塩基のプローブを使用することができる。一実施形態では、プライマーおよびプローブは、ストリンジェントな条件下で、マーカーに対応するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片と特異的にハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、ヌクレオチド配列内に少なくとも９５％の同一性が見られる場合に限り、ハイブリダイゼーションが生じることを意味する。別の実施形態では、「ストリンジェントな条件」下におけるハイブリダイゼーションは、配列間で、少なくとも９７％の同一性が見られる場合に生じる。
【０２０９】
プローブを標識化する形態は、放射性同位元素、例えば、３２Ｐおよび３５Ｓの使用など、適切な任意の形態でありうる。放射性同位元素による標識化は、プローブが化学合成されるのであれ、生体により合成されるのであれ、適切に標識された塩基の使用により達成することができる。
【０２１０】
一実施形態では、生体試料は、被験対象に由来するポリペプチド分子を含有する。代替的に、生体試料は、被験対象に由来するｍＲＮＡ分子または被験対象に由来するゲノムＤＮＡ分子を含有しうる。
【０２１１】
別の実施形態では、方法は、対照生体試料を、対照対象から得るステップと、マーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片の存在が、生体試料中に検出されるように、対照試料を、マーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片を検出することが可能な化合物または薬剤と接触させるステップと、対照試料中の、マーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片の存在を、被験試料中の、マーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片の存在と比較するステップとをさらに伴う。
【０２１２】
ｄ．バイオマーカータンパク質の発現を検出するための方法
バイオマーカータンパク質の活性またはレベルは、発現したポリペプチドを検出または定量化することにより、検出および／または定量化することができる。ポリペプチドは、当業者に周知の多数の手段のうちのいずれかにより、検出および定量化することができる。バイオマーカー核酸および機能的に類似するそのホモログであって、その断片または遺伝子の変更（例えば、その調節性またはプロモーター領域内の）を含むホモログによりコードされるポリペプチドのポリペプチド発現の異常なレベルは、免疫障害の、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）に対する応答の可能性と関連する。ポリペプチドを検出するための、当技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。このような方法は、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロット法、結合剤−リガンドアッセイ、免疫組織化学法、凝集反応、補体アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ハイパーディフュージョンクロマトグラフィー（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）など（例えば、参照により組み込まれる、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＳｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．、２１７〜２６２頁、１９９１年）を含むがこれらに限定されない。抗体を、１または複数のエピトープと反応させるステップと、標識されたポリペプチドまたはその誘導体を、競合的に置換するステップとを含む、結合剤−リガンド免疫アッセイ法が好ましい。
【０２１３】
例えば、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ手順は、所望のバイオマーカータンパク質の標準物質を標識し（１２５Ｉもしくは３５Ｓなどの放射性同位元素、または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどのアッセイ可能な酵素により）、非標識の試料と併せて、対応する抗体と接触させ、このとき、第１の抗体に結合するように、第２の抗体を使用し、放射能または固定化された酵素をアッセイするように行う（競合アッセイ）。代替的に、試料中のバイオマーカータンパク質を、対応する固定化された抗体と反応させ、放射性同位元素または酵素で標識された、抗バイオマーカータンパク質抗体を、系と反応させ、放射能または酵素をアッセイする（ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイ）。適切な場合、他の従来の方法もまた、利用することができる。
【０２１４】
上記の技法は本質的に、「１ステップ」または「２ステップ」アッセイとして行うことができる。「１ステップ」アッセイは、抗原を、固定化された抗体と接触させ、洗浄を伴わずに、混合物を、標識された抗体と接触させるステップを伴う。「２ステップ」アッセイは、混合物を、標識された抗体と接触させる前に、洗浄を伴う。適切な場合、他の従来の方法もまた、利用することができる。
【０２１５】
一実施形態では、バイオマーカーのタンパク質レベルを測定するための方法は、生物学的検体を、バイオマーカータンパク質に選択的に結合する、抗体またはその改変体（例えば、断片）と接触させるステップと、前記抗体またはその改変体が、前記試料に結合するかどうかを検出するステップと、これにより、バイオマーカータンパク質のレベルを測定するステップとを含む。
【０２１６】
バイオマーカータンパク質および／または抗体の酵素標識および放射性標識は、従来の手段により行うことができる。このような手段は一般に、とりわけ、酵素の活性に有害な影響を及ぼさないように、酵素の、問題の抗原または抗体への、グルタルアルデヒドなどによる共有結合的連結を含むであろうが、これは、全ての酵素が活性であることは必要でないが、アッセイを行うことを可能とするのに十分な活性が残存するという条件で、酵素が、なおも、その基質と相互作用することが可能であることを意図する。実際、酵素を結合させるための一部の技法は、非特異的（ホルムアルデヒドを使用するなど）であり、ある比率の活性酵素をもたらすに過ぎない。
【０２１７】
通例、アッセイ系の１つの構成要素を、支持体上に固定化し、これにより、系の他の構成要素を、この構成要素と接触させ、煩瑣で時間のかかる作業を伴わずに、たやすく除去することを可能とすることが所望される。第１の相と離れて、第２の相を固定化することも可能であるが、通例は、１つの相で十分である。
【０２１８】
酵素自体を支持体上に固定化することが可能であるが、固相の酵素が必要である場合、これは一般に、抗体に結合させ、抗体を支持体に取り付けることにより、最も良く達成され、そのモデルおよび系は、当技術分野で周知である。単純なポリエチレンは、適切な支持体を提供することができる。
【０２１９】
標識化のために利用可能な酵素は、特に限定されないが、例えば、オキシダーゼ群のメンバーから選択することができる。これらは、それらの基質との反応により、過酸化水素の生成を触媒するが、その良好な安定性、入手の容易さ、および安価であることのほか、その基質（グルコース）の入手のたやすさのためにも、グルコースオキシダーゼを使用することが多い。オキシダーゼの活性は、当技術分野で周知の制御条件下における、酵素標識された抗体の、基質との反応の後において形成される、過酸化水素の濃度を測定することによりアッセイすることができる。
【０２２０】
本開示に基づき、バイオマーカータンパク質を検出するのに、実施者の好みに従い、他の技法を使用することができる。１つのこのような技法は、適切に処置された試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させてから、ニトロセルロースフィルターなどの固体支持体に転写する、ウェスタンブロット法（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、７６巻：４３５０頁（１９７９年））である。次いで、抗バイオマーカータンパク質抗体（非標識）を、支持体と接触させ、標識されたプロテインＡまたは抗免疫グロブリン（１２５Ｉ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含む、適切な標識）などの二次的免疫試薬によりアッセイする。クロマトグラフィーによる検出もまた使用することができる。
【０２２１】
免疫組織化学を使用して、例えば、生検試料中のバイオマーカータンパク質の発現を検出することができる。適切な抗体を、例えば、細胞の薄層と接触させ、洗浄し、次いで、第２の標識された抗体と接触させる。標識化は、蛍光のマーカー、ペルオキシダーゼなどの酵素、アビジン、または放射性標識による標識化でありうる。アッセイは、顕微鏡を使用して、目視によりスコア付ける。
【０２２２】
イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）などの抗バイオマーカータンパク質抗体もまた、例えば、対象の細胞および組織内のバイオマーカータンパク質の存在を検出する、イメージング目的で使用することができる。適切な標識は、放射性同位元素である、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネシウム（９９ｍＴｃ）、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンを含む。
【０２２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングの目的のために、抗体は、それ自体として、体外から検出可能ではないので、検出を可能とするように、標識するか、または他の方式で修飾しなければならない。この目的のマーカーは、抗体の結合に実質的に干渉しないが、外部からの検出を可能とする、任意のマーカーでありうる。適切なマーカーは、Ｘ線撮影、ＮＭＲ、またはＭＲＩにより検出されうるマーカーを含みうる。Ｘ線撮影法では、適切なマーカーは、例えば、バリウムまたはセシウムなど、検出可能な放射線を放射するが、対象に明らかに有害ではない、任意の放射性同位元素を含む。ＮＭＲおよびＭＲＩに適切なマーカーは一般に、例えば、関与するハイブリドーマのための栄養素の適切な標識化により、抗体に組み込みうる重水素など、検出可能な特徴的スピンを伴うマーカーを含む。
【０２２４】
対象のサイズおよび使用されるイメージングシステムが、診断画像をもたらすのに必要とされるイメージング部分の量を決定するであろう。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象については、注射される放射能の量は通常、約５〜２０ミリキュリーのテクネチウム９９の範囲であろう。次いで、標識された抗体または抗体断片は、バイオマーカータンパク質を含有する細胞の場所に優先的に蓄積されるであろう。次いで、公知の技法を使用して、標識された抗体または抗体断片を検出することができる。
【０２２５】
バイオマーカータンパク質を検出するのに使用しうる抗体は、自然であれ、合成であれ、全長であれ、その断片であれ、モノクローナルであれ、ポリクローナルであれ、検出されるバイオマーカータンパク質に、十分に強力かつ特異的に結合する、任意の抗体を含む。抗体は、最大で、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２ＭのＫｄを有しうる。「特異的に結合する」という語句は、例えば、抗体の、エピトープまたは抗原または抗原性決定基への結合であって、同一または同様のエピトープ、抗原、または抗原決定基の第２の調製物により置換される場合もあり、これと競合する場合もある結合を指す。抗体は、類縁のタンパク質など、他のタンパク質と比べて、バイオマーカータンパク質に優先的に結合しうる。
【０２２６】
抗体は、市販されているか、または当技術分野で公知の方法に従い調製することができる。
【０２２７】
使用されうる抗体およびその誘導体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ、ヒト、ヒト化、霊長動物化（ＣＤＲグラフト抗体）、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）、または単鎖抗体のほか、抗体の機能的な断片、すなわち、バイオマーカータンパク質結合性断片を包含する。例えば、バイオマーカータンパク質またはその部分に結合することが可能な抗体断片であって、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を含むがこれらに限定されない抗体断片を使用することができる。このような断片は、酵素的切断または組換え法により作製することができる。例えば、パパインまたはペプシン切断により、それぞれ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を生成することができる。また、必須の基質特異性を伴う他のプロテアーゼも、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を生成するのに使用することができる。抗体はまた、１または複数の終止コドンを、自然の終結部位の上流に導入した、抗体遺伝子を使用して、様々な切断形態でも作製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２の重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むようにデザインすることができる。
【０２２８】
合成および操作抗体については、例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号；Ｑｕｅｅｎら、欧州特許第０４５１２１６Ｂ１号；およびＰａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら、ＥＰ０５１９５９６Ａ１において記載されている。霊長動物化抗体に関しては、Ｎｅｗｍａｎ，  Ｒ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１４５５〜１４６０頁（１９９２年）、単鎖抗体に関しては、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号およびＢｉｒｄ，  Ｒ．  Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁（１９８８年）もまた参照されたい。ライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーから作製される抗体もまた使用することができる。
【０２２９】
一部の実施形態では、バイオマーカータンパク質に特異的に結合する薬剤であって、ペプチドなど、抗体以外の薬剤を使用する。バイオマーカータンパク質に特異的に結合するペプチドは、当技術分野で公知の任意の手段により同定することができる。例えば、ペプチドのファージディスプレイライブラリーを使用して、バイオマーカータンパク質の特異的なペプチド結合剤についてスクリーニングすることができる。
【０２３０】
ｅ．バイオマーカーの構造的変更を検出するための方法
以下の例示的な方法を使用して、例えば、Ｔｒｅｇ、Ｔｃｏｎ、および／またはＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比に影響を及ぼす配列または薬剤を同定するために、バイオマーカー核酸分子および／またはバイオマーカーポリペプチド分子内の構造的変更の存在を同定することができる。
【０２３１】
ある特定の実施形態では、変更の検出は、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ  ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照されたい）、または、代替的に、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：１０７７〜１０８０頁；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９１巻：３６０〜３６４頁を参照されたい）におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、これらのうちの後者は、バイオマーカー遺伝子など、バイオマーカー核酸内の点変異を検出するのに、特に有用でありうる（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３巻：６７５〜６８２頁を参照されたい）。この方法は、細胞の試料を対象から回収するステップと、核酸（例えば、ゲノム核酸、ｍＲＮＡ、またはこれらの両方）を、試料の細胞から単離するステップと、核酸試料を、バイオマーカー遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、バイオマーカー遺伝子と特異的にハイブリダイズする、１または複数のプライマーと接触させるステップと、増幅産物の存在もしくは非存在を検出するか、または増幅産物のサイズを検出するステップと、長さを対照試料と比較するステップとを含みうる。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書で記載される、変異を検出するために使用される技法のうちのいずれかと共に、予備的な増幅ステップとして使用するのに所望されうることが予期される。
【０２３２】
代替的な増幅法は、自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，  Ｊ．  Ｃ．ら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８７巻：１８７４〜１８７８頁）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，  Ｄ．  Ｙ．ら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８６巻：１１７３〜１１７７頁）、Ｑベータ複製（Ｌｉｚａｒｄｉ，  Ｐ．  Ｍ．ら（１９８８年）、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：１１９７頁）、または他の任意の核酸増幅法に続き、当業者に周知の技法を使用する、増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、とりわけ、このような分子が、非常に少数で存在する場合、核酸分子の検出に有用である。
【０２３３】
代替的な実施形態では、試料細胞に由来するバイオマーカー核酸内の変異は、制限酵素の切断パターンの変更により同定することができる。例えば、試料および対照ＤＮＡを、単離し、増幅し（任意選択で）、１または複数の制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル電気泳動により断片長サイズを決定し、比較する。試料ＤＮＡと対照ＤＮＡとの間の断片長サイズの差異は、試料ＤＮＡ内の変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号を参照されたい）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失により、特異的な変異の存在についてスコア付けすることができる。
【０２３４】
他の実施形態では、バイオマーカー核酸内の遺伝子変異は、試料核酸および対照核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイとハイブリダイズさせること（Ｃｒｏｎｉｎ，  Ｍ．  Ｔ．ら（１９９６年）、Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．、７巻：２４４〜２５５頁；Ｋｏｚａｌ，  Ｍ．  Ｊ．ら（１９９６年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、２巻：７５３〜７５９頁）により同定することができる。例えば、バイオマーカー遺伝子の変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６年）、前出において記載されている通り、発光型ＤＮＡプローブを含有する二次元アレイにより同定することができる。略述すると、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを、一連の重複するプローブの直線状のアレイを作ることにより、試料および対照内のＤＮＡの長い連なりを通して走査して、配列間の塩基変化を同定するのに使用することができる。このステップは、点変異の同定を可能とする。このステップに続いて、検出される全ての改変体または変異に相補的な、小型で特化したプローブアレイを使用することにより、特異的な変異の特徴付けを可能とする、第２のハイブリダイゼーションアレイを施す。各変異アレイは、一方は、野生型遺伝子に相補的であり、他方は、変異体遺伝子に相補的である、パラレルなプローブセットから構成される。このようなバイオマーカー遺伝子の変異は、例えば、生殖細胞系列および体細胞変異を含む、様々な文脈で同定することができる。
【０２３５】
さらに別の実施形態では、当技術分野で公知の様々なシークエンシング反応のうちのいずれかを使用して、バイオマーカー遺伝子を直接シークエンシングし、試料バイオマーカーの配列を、対応する野生型（対照）配列と比較することにより、変異を検出することができる。シークエンシング反応の例は、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７４巻：５６０頁またはＳａｎｇｅｒ（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７４巻：５４６３頁により開発された技法に基づく反応を含む。また、診断アッセイを実行する場合に、質量分析によるシークエンシング（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号；Ｃｏｈｅｎら（１９９６年）、Ａｄｖ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、３６巻：１２７〜１６２頁；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３年）、Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３８巻：１４７〜１５９頁を参照されたい）を含む、様々な自動化シークエンシング手順（Ｎａｅｖｅ（１９９５年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９巻：４４８〜５３頁）のうちのいずれかを活用しうることも想定される。
【０２３６】
バイオマーカー遺伝子内の変異を検出するための他の方法は、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖内のミスマッチ塩基を検出する方法（Ｍｙｅｒｓら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：１２４２頁）を含む。一般に、当技術分野における「ミスマッチ切断」法は、野生型バイオマーカー配列を含有する（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料から得られる、潜在的に変異体である、ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることにより形成されるヘテロ二重鎖を提供することによって開始される。二本鎖状の二重鎖を、対照鎖と試料鎖との間の塩基対のミスマッチに起因して存在するものなど、二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮアーゼで処理することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、ＳＩヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ領域を酵素的に消化する。他の実施形態では、ミスマッチした領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化の後、次いで、結果として得られる材料を、変性ポリアクリルアミドゲル上で、サイズにより分離して、変異部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５巻：４３９７頁およびＳａｌｅｅｂａら（１９９２年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７巻：２８６〜２９５頁を参照されたい。好ましい実施形態では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡを、検出のために標識することができる。
【０２３７】
さらに別の実施形態では、ミスマッチ切断反応では、細胞の試料から得られたバイオマーカーｃＤＮＡ内の点変異を検出およびマッピングするための、規定された系において、二本鎖ＤＮＡ内のミスマッチ塩基対を認識する、１または複数のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を利用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチにおけるＡを切断し、ＨｅＬａ細胞に由来するチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチにおけるＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４年）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１５巻：１６５７〜１６６２頁）。例示的な実施形態に従い、バイオマーカー配列、例えば、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理された野生型バイオマーカーと、存在する場合、切断産物とに基づくプローブを、電気泳動プロトコールなど（例えば、米国特許第５，４５９，０３９号）により検出することができる。
【０２３８】
他の実施形態では、電気泳動移動度の変更を使用して、バイオマーカー遺伝子内の変異を同定することができる。例えば、一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体核酸と、野生型核酸との間の電気泳動移動度の差異を検出することができる（Ｏｒｉｔａら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６巻：２７６６頁；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３年）、Ｍｕｔａｔ．  Ｒｅｓ．、２８５巻：１２５〜１４４頁およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２年）、Ｇｅｎｅｔ．  Ａｎａｌ．  Ｔｅｃｈ．  Ａｐｐｌ．、９巻：７３〜７９頁もまた参照されたい）。試料および対照バイオマーカー核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を、変性させ、復元する。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従い変動し、結果として得られる電気泳動移動度の変更は、単一の塩基変化さえも検出可能とする。ＤＮＡ断片は、標識されたプローブにより標識または検出することができる。アッセイの感度は、二次構造が配列の変化に対してより感受性であるＲＮＡ（ＤＮＡではなく）を使用することにより増強することができる。好ましい実施形態では、対象の方法により、ヘテロ二重鎖解析を活用して、電気泳動移動度の変化に基づいて、二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離する（Ｋｅｅｎら（１９９１年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、７巻：５頁）。
【０２３９】
さらに別の実施形態では、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用して、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中の変異体または野生型断片の移動についてアッセイする（Ｍｙｅｒｓら（１９８５年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１３巻：４９５頁）。ＤＧＧＥを、解析法として使用する場合、例えば、ＰＣＲにより、約４０ｂｐの高融点のＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを添加することにより、ＤＮＡを修飾して、それが完全に変性しないことを確認する。さらなる実施形態では、温度勾配を、変性勾配の代わりに使用して、対照ＤＮＡと、試料ＤＮＡとの、移動度の差異を同定する（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７年）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１２７５３頁）。
【０２４０】
点変異を検出するための他の技法の例は、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を含むがこれらに限定されない。例えば、既知の変異を中央部に配したオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで、完全なマッチが見出される場合に限り、ハイブリダイゼーションを許容する条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズさせることができる（Ｓａｉｋｉら（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻：１６３頁；Ｓａｉｋｉら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８６巻：６２３０頁）。オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイズする膜に接合させ、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズさせる場合は、このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたはいくつかの異なる変異とハイブリダイズさせる。
【０２４１】
代替的に、選択的ＰＣＲ増幅に依存する、対立遺伝子特異的増幅技術を、本発明と共に使用することができる。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中央部（増幅が、差次的ハイブリダイゼーションに依存するように）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７巻：２４３７〜２４４８頁）または、適切な条件下で、ミスマッチが、ポリメラーゼによる伸長を防止または低減しうる、一方のプライマーの３’端の最末端（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３年）、Ｔｉｂｔｅｃｈ、１１巻：２３８頁）において、目的の変異を保有しうる。加えて、新規の制限部位を、変異領域内に導入して、切断ベースの検出を創出することは、所望でありうる（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２年）、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅ、６巻：１頁）。ある特定の実施形態では、増幅はまた、増幅のために、Ｔａｑリガーゼを使用して実施することもできることが予期される（Ｂａｒａｎｙ（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８巻：１８９頁）。このような場合、ライゲーションは、５’側配列の３’末端において完全なマッチがなされる場合に限り生じることから、増幅の存在または非存在を探索することにより、特異的な部位における、既知の変異の存在を検出することが可能となる。
【０２４２】
本明細書で記載される組成物は、本明細書で記載されるバイオマーカーに関する、様々な診断、予後診断、および治療適用において使用することができる。
【０２４３】
ｆ．予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後診断アッセイ、および臨床試験のモニタリングを、予後診断（予測）の目的で使用して、これにより、個体を予防的に処置し、かつ／または有効性の可能性を決定する予測医学の分野にも関する。したがって、本発明の一態様は、表１で列挙されるバイオマーカーなど、本明細書で記載されるバイオマーカーの存在、非存在、量、および／または活性レベルを、生体試料（例えば、血液、血清、細胞、または組織）の文脈で決定して、これにより、元の免疫障害においてであれ、再発性免疫障害においてであれ、免疫障害に罹患した個体が、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）に応答する可能性が高いかどうかを決定するための診断アッセイに関する。このようなアッセイを、予後診断または予測の目的で使用して、これにより、バイオマーカーポリペプチド、核酸の発現または活性を特徴とするか、またはこれらと関連する障害の発症の前、または再発の後で、個体を予防的に処置することができる。当業者は、任意の方法により、表１で列挙されるバイオマーカーなど、本明細書で記載されるバイオマーカーのうちの１または複数（例えば、組合せ）を使用しうることを理解するであろう。
【０２４４】
本発明の別の態様は、薬剤（例えば、薬物、化合物、および核酸ベースの小分子）の、Ｔｒｅｇの増殖、Ｔｒｅｇ数、Ｔｒｅｇの活性、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比などのバイオマーカーの発現または活性に対する影響のモニタリングに関する。
【０２４５】
当業者はまた、ある特定の実施形態では、本発明の方法は、コンピュータプログラムおよびコンピュータシステムを実装することも理解するであろう。例えば、コンピュータプログラムを使用して、本明細書で記載されるアルゴリズムを実施することができる。コンピュータシステムはまた、本発明の方法により生成されるデータであって、本発明の方法の実装において、コンピュータシステムが使用しうる、複数のバイオマーカーシグナルの変化／プロファイルを含むデータを保存し、操作することも可能である。ある特定の実施形態では、コンピュータシステムは、バイオマーカーの発現データを受容し；（ｉｉ）データを保存し；（ｉｉｉ）本明細書で記載されるいくつかの方式（例えば、適切な対照と比べた解析）で、データを比較して、免疫障害の影響を受ける組織に由来する、情報を与えるバイオマーカーの状態を決定する。他の実施形態では、コンピュータシステムは、（ｉ）決定されたバイオマーカーの発現レベルを、閾値と比較し；（ｉｉ）前記バイオマーカーレベルが、閾値に対して（例えば、閾値を上回るかまたは下回るように）有意にモジュレートされているかどうかについての表示、または前記表示に基づく表現型を出力する。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、このようなコンピュータシステムはまた、本発明の一部と考えることもできる。多数の種類のコンピュータシステムを使用して、バイオインフォマティクスおよび／またはコンピュータの技術分野における当業者が所有する知識に従い、本発明の解析法を実装することができる。このようなコンピュータシステムの作動中に、いくつかのソフトウェアコンポーネントを、メモリにロードすることができる。ソフトウェアコンポーネントは、当技術分野で標準的なソフトウェアコンポーネント、および本発明に特有のコンポーネント（例えば、Ｌｉｎら（２００４年）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０巻、１２３３〜１２４０頁において記載されている、ｄＣＨＩＰソフトウェア；当技術分野で公知の、放射基底型機械学習アルゴリズム（ｒａｄｉａｌ  ｂａｓｉｓ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（ＲＢＭ））の両方を含みうる。
【０２４７】
本発明の方法はまた、式の記号入力と、使用される特殊なアルゴリズムを含む、高レベルの処理仕様とを可能とする、数学ソフトウェアパッケージへとプログラム化またはモデル化し、これにより、使用者を、個々の式およびアルゴリズムを手順通りにプログラミングする必要から解放することもできる。このようなパッケージは、例えば、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ（Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓ．）製のＭａｔｌａｂ、Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、Ｉｌｌ．）製のＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ、またはＭａｔｈＳｏｆｔ（Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）製のＳ−Ｐｌｕｓを含む。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、コンピュータは、バイオマーカーデータを保存するためのデータベースを含む。このような保存されたプロファイルは、後の時点において、目的の比較を実施するのに、アクセスおよび使用することができる。例えば、免疫障害の影響を受けていない対象の組織に由来する試料についての、バイオマーカー発現プロファイルおよび／または同じ種の関与する集団内の、情報を与える、目的の遺伝子座の、集団ベースの分布から生成されるプロファイルを保存し、後に、免疫障害の影響を受けた対象の組織に由来する試料または免疫障害の影響を受けていることが疑われる対象の組織のプロファイルと比較することができる。
【０２４９】
本明細書で記載される例示的なプログラム構造およびコンピュータシステムに加えて、当業者には、他の代替的なプログラム構造およびコンピュータシステムが、たやすく明らかであろう。したがって、上記で記載されたコンピュータシステムおよびプログラム構造から、精神または範囲において逸脱しない、このような代替的システムは、付属の特許請求の範囲内に包含されることを意図する。
【０２５０】
ｃ．診断アッセイ
本発明は、部分的に、生体試料が、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）に応答する可能性が高い免疫障害と関連するかどうかを正確に分類するための方法、系、およびコードを提供する。一部の実施形態では、本発明は、統計学的アルゴリズムおよび／または経験的データ（例えば、本明細書で記載されるバイオマーカーの量または活性）を使用して、試料（例えば、対象に由来する）を、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）に応答するかまたは応答しない免疫障害と関連するかまたはこの危険性があるものとして分類するのに有用である。
【０２５１】
バイオマーカーの量または活性を検出するための例示的な方法であり、したがって、試料が、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）に応答する可能性が高いか、その可能性が低いかを分類するのに有用な方法は、被験対象から生体試料を得るステップと、生体試料を、生体試料中のバイオマーカーの量または活性を検出することが可能な薬剤であって、抗体もしくはその抗原結合性断片のようなタンパク質結合性薬剤、またはオリゴヌクレオチドのような核酸結合性薬剤などの薬剤と接触させるステップとを伴う。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性断片を使用し、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超のこのような抗体または抗体断片を、組み合わせて（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて）または逐次的に使用することができる。ある特定の場合には、統計学的アルゴリズムは、単一の学習統計分類子システム（ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）である。例えば、単一の学習統計分類子システムを使用して、バイオマーカーの予測または確率値および存在またはレベルに基づき、試料を分類することができる。単一の学習統計分類子システムの使用は、試料を、例えば、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）の、レスポンダーまたはプログレッサー試料である可能性が高いと、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の感度、特異度、陽性予測値、陰性予測値、および／または全体精度で分類することが典型的である。
【０２５２】
当業者には、他の適切な統計学的アルゴリズムが周知である。例えば、学習統計分類子システムは、複雑なデータセット（例えば、目的のマーカーのパネル）に適応し、このようなデータセットに基づき、決定を下すことが可能な、機械学習アルゴリズム技術を含む。一部の実施形態では、分類木（例えば、ランダムフォレスト）など、単一の学習統計分類子システムを使用する。他の実施形態では、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ超の学習統計分類子システムの組合せを、好ましくはタンデムで使用する。学習統計分類子システムの例は、帰納学習（例えば、ランダムフォレスト、分類および回帰木（Ｃ＆ＲＴ）、ブースティングツリー（ｂｏｏｓｔｅｄ  ｔｒｅｅ）などの決定／分類木）、ＰＡＣ（Ｐｒｏｂａｂｌｙ  Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ  Ｃｏｒｒｅｃｔ）学習、コネクショニスト学習（例えば、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジーネットワーク（ＮＦＮ）、ネットワーク構造、パーセプトロン、例えば、多層パーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークの応用、信念ネットワークにおけるベイジアン学習など）、強化学習（例えば、ナイーブ学習、適応動的学習、および時間差学習など、既知の環境における受動学習、未知の環境における受動学習、未知の環境における能動学習、学習行動値関数、強化学習の応用など）、ならびに遺伝的アルゴリズムおよび進化的プログラミングを使用する、学習統計分類子システムを含むがこれらに限定されない。他の学習統計分類子システムは、サポートベクターマシン（例えば、カーネル法）、ＭＡＲＳ（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｐｌｉｎｅｓ）、レーベンバーグ−マーカートアルゴリズム、ガウス−ニュートンアルゴリズム、ガウス混合、勾配降下アルゴリズム、および学習ベクトル量子化法（ＬＶＱ）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、試料の分類結果を、臨床医、例えば、腫瘍学者に送るステップをさらに含む。
【０２５３】
別の実施形態では、対象の診断に続いて、診断に基づき、個体に、治療有効量の、規定された処置を施行する。
【０２５４】
一実施形態では、方法は、対照生体試料（例えば、免疫障害を有さないか、またはその免疫障害が、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）に対して感受性である対象に由来する生体試料）、寛解中の対象に由来する生体試料、または抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）にも拘らず、進行性免疫障害を発症することに対する処置期間中の対象に由来する生体試料を得るステップをさらに伴う。
【０２５５】
ｄ．予後診断アッセイ
本明細書で記載される診断法はさらに、抗免疫障害療法（例えば、複数の可変用量によるＩＬ−２療法単独、または１もしくは複数の他の抗免疫障害療法と組み合わせた、複数の可変用量によるＩＬ−２療法）に応答性である可能性が高いか、またはその可能性が低い免疫障害を有するか、またはこれを発症する危険性がある対象を同定するのに活用することができる。前出の診断アッセイまたは以下のアッセイなど、本明細書で記載されるアッセイを活用して、免疫障害などにおける、本発明の少なくとも１つのバイオマーカーの量もしくは活性の誤調節と関連する障害を有するか、またはこれを発症する危険性がある対象を同定することができる。代替的に、予後診断アッセイを活用して、免疫障害などにおける、本発明の少なくとも１つのバイオマーカーの誤調節と関連する障害を有するか、またはこれを発症する危険性がある対象を同定することができる。さらに、本明細書で記載される予後診断アッセイを使用して、対象に、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬物候補）を投与して、異常なバイオマーカーの発現または活性と関連する疾患または障害を処置しうるかどうかを決定することができる。
【０２５６】
ｅ．処置法
本発明の別の態様は、本明細書で記載される１または複数のバイオマーカー（例えば、Ｔｒｅｇの増殖、Ｔｒｅｇ数、Ｔｒｅｇの活性、Ｔｒｅｇのアポトーシス、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比、表１および実施例で列挙されるバイオマーカーまたはそれらの断片など）の発現または活性を、治療目的でモジュレートする方法に関する。本発明のバイオマーカーは、免疫障害の処置と相関することが裏付けられている。したがって、バイオマーカーの活性および／または発現のほか、１または複数のバイオマーカーまたはそれらの断片と、その自然の結合パートナーまたはそれらの断片との間の相互作用も、免疫障害を処置するためにモジュレートすることができる。
【０２５７】
本発明のモジュレート法は、上記で記載した通り、細胞を、表１および実施例で列挙される１もしくは複数のバイオマーカーまたはそれらの断片を含む、本発明の１または複数のバイオマーカー、あるいは細胞と関連するバイオマーカー活性のうちの１または複数をモジュレートする薬剤と接触させるステップを伴う。バイオマーカー活性をモジュレートする薬剤は、核酸もしくはポリペプチド、バイオマーカーの天然に存在する結合パートナー、バイオマーカーに対する抗体、バイオマーカーに対する抗体と他の免疫関連標的に対する抗体との組合せ、１もしくは複数のバイオマーカーアゴニストもしくはアンタゴニスト、１もしくは複数のバイオマーカーアゴニストもしくはアンタゴニストのペプチド模倣剤、１もしくは複数のバイオマーカーのペプチド模倣剤、他の小分子、または１もしくは複数のバイオマーカー核酸の遺伝子発現産物を指向する低分子ＲＮＡもしくはこれらの模倣剤など、本明細書で記載される薬剤でありうる。
【０２５８】
表１および実施例で列挙される１もしくは複数のバイオマーカーまたはそれらの断片を含む、本発明の１または複数のバイオマーカーの発現をモジュレートする薬剤は、例えば、アンチセンス核酸分子、ＲＮＡｉ分子、ｓｈＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ結合性部位、もしくはそれらの改変体、または他の低分子ＲＮＡ分子、三重鎖オリゴヌクレオチド、リボザイム、あるいは１または複数のバイオマーカーポリペプチドを発現させるための組換えベクターである。例えば、１または複数のバイオマーカーポリペプチドの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的なオリゴヌクレオチドを合成することができる。１または複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞培地に、典型的には、２００μｇ／ｍｌで添加することもでき、１または複数のバイオマーカーポリペプチドの合成を防止するように、患者に投与することもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞により取り込まれ、１または複数のバイオマーカーｍＲＮＡとハイブリダイズして、翻訳を防止する。代替的に、三重鎖構築物を形成して、ＤＮＡの巻き戻しおよび転写を防止するように、二本鎖ＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチドを使用することができる。いずれの結果としても、バイオマーカーポリペプチドの合成が遮断される。バイオマーカーの発現をモジュレートする場合、このようなモジュレーションは、バイオマーカー遺伝子をノックアウトすることによる以外の手段により生じることが好ましい。
【０２５９】
発現をモジュレートする薬剤は、それらが、細胞内のバイオマーカーの量を制御するという事実のために、また、細胞内のバイオマーカー活性の総量もモジュレートする。
【０２６０】
一実施形態では、薬剤は、表１および実施例で列挙される１もしくは複数のバイオマーカーまたはそれらの断片を含む本発明の１または複数のバイオマーカーの１または複数の活性を刺激する。このような刺激性薬剤の例は、活性なバイオマーカーポリペプチドまたはその断片、および細胞に導入された、バイオマーカーまたはその断片をコードする核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ結合性部位、もしくはそれらの改変体、または当業者に公知の、他の機能的に同等の分子）を含む。別の実施形態では、薬剤は、１または複数のバイオマーカー活性を阻害する。一実施形態では、薬剤は、バイオマーカーの、その自然の結合パートナーとの相互作用を阻害または増強する。このような阻害性薬剤の例は、アンチセンス核酸分子、抗バイオマーカー抗体、バイオマーカー阻害剤、および本明細書で記載されるスクリーニングアッセイで同定される化合物を含む。
【０２６１】
これらのモジュレート法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて（例えば、細胞を薬剤と接触させることにより）実施することもでき、代替的に、薬剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞と接触させることにより（例えば、薬剤を対象に投与することにより）実施することもできる。一実施形態では、方法は、薬剤（例えば、本明細書で記載されるスクリーニングアッセイにより同定される薬剤）、またはバイオマーカーの発現もしくは活性をモジュレートする（例えば、上方調節または下方調節する）薬剤の組合せを投与するステップを伴う。別の実施形態では、方法は、低減した、異常な、または望ましくないバイオマーカーの発現または活性を補完する治療としての、１または複数のバイオマーカーポリペプチドまたは核酸分子を投与するステップを伴う。
【０２６２】
バイオマーカーが異常に下方調節されている状況、および／またはバイオマーカー活性の増大が、有益な効果を及ぼす可能性が高い状況では、バイオマーカー活性の刺激が所望される。同様に、バイオマーカーが異常に上方調節されている状況、および／またはバイオマーカー活性の低下が、有益な効果を及ぼす可能性が高い状況では、バイオマーカー活性の阻害が所望される。
【０２６３】
加えて、これらのモジュレート剤はまた、例えば、化学療法剤、ホルモン、抗血管新生剤（ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎ）、放射性標識化合物との組合せ治療において投与することもでき、手術、寒冷療法、および／または放射線治療との組合せ治療において投与することもできる。前出の処置法は、従来の治療の他の形態（例えば、当業者に周知の免疫障害のための標準治療処置）と共に施行することができ、従来の治療と連続的に、その前に、またはその後に施行することができる。例えば、これらのモジュレート剤は、治療有効用量の免疫抑制剤または治療と共に施行することができる。
【０２６４】
本発明はまた、本明細書で記載されるバイオマーカーを検出および／またはモジュレートするためのキットも包含する。本発明のキットはまた、本明細書で提示される、開示される発明の方法における、開示される発明のキットまたは抗体の使用を開示または記載する指示材料も含みうる。キットはまた、キットがデザインされる特定の適用を容易とする、さらなる構成要素も含みうる。例えば、キットは加えて、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光の標識、ヒツジ抗マウス−ＨＲＰなどの適切な二次標識を検出するフィルターセットなど）、および対照（例えば、対照生体試料または標準物質）のために必要な試薬を含有しうる。キットは加えて、開示される発明の方法における使用のための、認知された緩衝液および他の試薬を含みうる。非限定的な例は、担体タンパク質または洗浄剤など、非特異的結合を低減する薬剤を含む。
【０２６５】
以下の実施例では、本発明の他の実施形態について記載する。本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、これらは、さらに限定的を加えるものとみなされるべきでない。
【実施例】
【０２６６】
（実施例１：低用量ＩＬ−２は、ＴｒｅｇおよびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を増強する）
臨床において、低用量ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇを増強しうる。ステロイド不応性ｃＧＶＨＤについてのフェーズ１研究では、８週間毎日の皮下ＩＬ−２（１×１０６ＩＵ／ｍ２）療法は、安全かつ忍容可能であった（最大で３×１０ＩＵ／ｍ２の用量）（Ｋｏｒｅｔｈら（２０１１年）、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３６５巻：２０５５〜２０６６頁）。適格性は、４週間にわたる、少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇのプレドニゾンに応答しなかったｃＧＶＨＤ、感染の非存在、および事前の、４週間にわたる免疫抑制の安定的な用量を含んだ。研究は、３つの用量レベル（８週間にわたり０．３、１、および３×１０６ＩＵ／ｍ２／日）を伴う、フェーズ１の用量漸増デザインを有した。
【０２６７】
登録された（ａｃｃｒｕｅｄ）２９例の参加者：２８例は、毒性について評価可能であり、２３例は、応答について評価可能である。１×１０６ＩＵ／ｍ２／日のＩＬ−２を、ＭＴＤであると決定した。２例の参加者が、用量制限毒性（血栓性微小血管症）を発症した。ＧＶＨＤ発赤を経験した参加者は存在しなかった。悪性疾患の再発は、見られなかった。２３例の参加者中１２例は、客観的臨床応答を示した。低用量ＩＬ−２は、従来型ＣＤ４＋  Ｔ（Ｔｃｏｎ）カウントに影響を与えずに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇカウントを、選択的に増大させた（図１）。Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比もまた、上昇した（図２）。ＮＫ細胞カウントは、より低い程度まで上昇した。低用量ＩＬ−２は、ＣＤ８＋  Ｔ、ＣＤ８＋  Ｂ、またはＣＤ８＋  ＮＫＴカウントに影響を及ぼさなかった。ＴｒｅｇカウントおよびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、８週間のＩＬ−２において上昇を維持し、次いで、ＩＬ−２を中止したら、低下した。ＩＬ−２誘導性Ｔｒｅｇは、ＦＯＸＰ３＋を発現し、Ｔｃｏｎ抑制アッセイにおいて機能的であった。臨床および免疫応答が、１２週間を超える長期ＩＬ−２療法に対するレスポンダーにおいて持続し、併用免疫抑制の漸減を可能としたことは重要であった。
【０２６８】
しかし、全例におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの優先的増強にも拘らず、評価可能な参加者の半数しか臨床応答（部分応答、ＰＲ）を示さなかった（Ｋｏｒｅｔｈら（２０１１年）、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３６５巻：２０５５〜２０６６頁）。毎日の皮下（ＳＣ）低用量ＩＬ−２療法でさえも、参加者の半数は、臨床的利益を得ない（Ｋｏｒｅｔｈら（２０１１年）、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３６５巻：２０５５〜２０６６頁）。これらのデータは、低用量ＩＬ−２が、ｃＧＶＨＤにおいて安全であり、Ｔｒｅｇを優先的に増進することを示す。
【０２６９】
血漿ＩＬ−２レベルは、固定用量によるＩＬ−２療法中に、急速に（例えば、１週目までに）上昇し、次いで、Ｔｒｅｇカウントが上昇する間、毎日のＩＬ−２投与にも拘らず低下した（Ｍａｔｓｕｏｋａら（２０１３年）、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、５巻：１７９ｒａ４３）が、結果は、Ｔｒｅｇ上で構成的に発現する、高アフィニティーのＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）への結合を介するＩＬ−２隔離の増大に起因すると考えられる。その後、ＩＬ−２療法中に、Ｔｒｅｇの絶対数が増大するにつれ、Ｔｒｅｇ上のＣＤ２５発現のさらなる増大が見られる（Ｍａｔｓｕｏｋａら（２０１３年）、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、５巻：１７９ｒａ４３）（図３）。
【０２７０】
かつて、同様の解析を実施して、不可逆性の実質、皮膚、および筋骨格変化が開始する前に、ｃＧＶＨＤ経過の早期に誘発される低用量ＩＬ−２の効果を解析した。このフェーズ２研究では、２系統（ｌｉｎｅ）以下のｃＧＶＨＤ治療を既に施された患者を、１×１０６ＩＵ／ｍ２／日（すなわち、上記で記載したＭＴＤ）で毎日ＳＣ  ＩＬ−２の１２週間のクールにより処置した。４週間の中断の後で、臨床的利益を享受する患者には、長期ＩＬ−２療法を施すことができ、この間に、併用免疫抑制の漸減が可能となった。主要目的は、ｃＧＶＨＤの臨床応答率を決定することであった。患者は、ＮＩＨ基準（Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃｈら（２００５年）、Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１１巻：９４５〜９５６頁）に従い、研究時のベースライン、６、１２、および１６週間、および１年において、ｃＧＶＨＤ評価を受けた。副次的目的は、毒性の評価；免疫学的影響；免疫効果の、臨床応答との相関；および１年におけるコルチコステロイドの使用を含んだ。ｃＧＶＨＤ病変部位の中央値が４であり、以前のｃＧＶＨＤ治療数の中央値が１である３５例の患者を登録した。上記で記載した通り、低用量ＩＬ−２処置は一般に、良好に忍容され、患者の悪性疾患は再発しなかった。１２週目に、評価可能な患者３３例中２０例では、ｃＧＶＨＤ客観的応答（ＰＲ）が記録され、２例の患者では、ｃＧＶＨＤが進行した。ｃＧＶＨＤ応答の部位は、皮膚（ｎ＝９）；関節／筋膜／筋肉（ｎ＝３）；肝臓（ｎ＝７）；消化管（ｎ＝３）；ＧＵ路（ｎ＝１）；および肺（ｎ＝５）を含んだ。臨床的利益（ＰＲまたはわずかな応答を伴うＳＤ）を伴う２３例の患者は、１６週目の後で長期ＩＬ−２療法を開始し、２０１３年１２月３１日現在において、中央値が５．８カ月間（範囲：０．４〜２６．１）の長期ＩＬ−２療法中において、平均５０％のステロイド用量の漸減（範囲：０〜１００）を示している。１４例は、長期ＩＬ−２療法を続ける。
【０２７１】
上記で記載した結果と同様に、免疫学的には、低用量ＩＬ−２は、Ｔｃｏｎに影響を及ぼすことなく、Ｔｒｅｇカウントの同様の上昇を誘導し、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比の中央値は上昇した（図４）。ＴｒｅｇカウントおよびＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比は、１２週目にも上昇を維持し、ＩＬ−２の中止後に低下した。このフェーズ２試験は、ｃＧＶＨＤにおける低用量ＩＬ−２の臨床的影響と、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎのホメオスタシスに対するその機能的な効果とを確認する。進行中の検査室研究により、免疫学的効果が、臨床応答と相関しうるかどうかと、それらが低用量ＩＬ−２療法の後で持続する程度とが決定されるであろう。
【０２７２】
本明細書では、ピークＴｒｅｇ増殖が、ＩＬ−２誘導レジメン開始の１週間後までに、全てのＴｒｅｇサブセット内で、Ｔｒｅｇ集団サイズの増大と共に生じたことがさらに決定されている。ＳＰＡＤＥ（ｓｐａｎｎｉｎｇ−ｔｒｅｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｎｓｉｔｙ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｅｖｅｎｔｓ）を使用する飛行時間型マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）解析を選んだ。なぜなら、ＣｙＴＯＦが、スペクトルの重複および自己蛍光に起因する、蛍光サイトメトリーに固有のバックグラウンドノイズを回避し、抗原に結合した抗体または他のプローブを、高感度で測定するために、最大で３７のランタニドアイソトープを同時に提供するからである。Ｔｒｅｇの増殖に関しては、ベースラインにおいて、活性化したメモリーＴｒｅｇおよびナイーブＴｒｅｇの小サブセットに制限された、限定されたＫｉ−６７の増殖が観察された。ピークＴｒｅｇ増殖は、ＩＬ−２の開始の１週間後までに、全てのＴｒｅｇサブセット内で、Ｔｒｅｇ集団サイズの増大と共に生じた（図５）。しかし、ＩＬ−２処置の１２週目に、拡大されたＴｒｅｇ部分集団が保存される一方で、Ｔｒｅｇの増殖は、２週目の後で、Ｋｉ−６７発現（増殖）の降下と共に低下した。しかし、ＩＬ−２の中断の４週間後までに、Ｋｉ−６７  Ｔｒｅｇの増殖レベルおよびＴｒｅｇ集団は枯渇した。ｐＳＴＡＴ５およびＦｏｘＰ３マーカーを使用して、Ｔｒｅｇ活性化の同様の時間的パターンであって、初期においてまず、Ｔｒｅｇ部分集団にわたり、全身で増強され、その後、ＩＬ−２処置期間中に、増強されたＴｒｅｇ集団サイズの持続的な保存にも拘らず低下するパターンが観察された（図５）。次いで、ＩＬ−２の中断の４週間後までに、Ｔｒｅｇ活性化マーカー発現の降下およびＴｒｅｇ集団のかなりの枯渇が観察された。
【０２７３】
全ての患者が応答したわけではなく、レスポンダーにおける利益は、部分的であることが多かった。フェーズ１データでは、ｃＧＶＨＤの臨床応答は、研究参入時における、高いＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比と連関し、循環ＴｒｅｇカウントまたはＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比の上昇とは連関しないようであった。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの増強にも拘らず、一部の患者において、臨床応答が欠如したことはまた、進行性ｃＧＶＨＤにおける、Ｔｒｅｇ細胞の内在性欠陥（例えば、短縮したテロメア）を記録する本発明者らのデータとも符合する（Ｋａｗａｎｏら（２０１１年）、Ｂｌｏｏｄ、１１８巻：５０２１〜５０３０頁）。さらに、ＩＬ−２を停止させると、Ｔｒｅｇの増強が急速に減衰したことから、重大なＴｒｅｇ欠損を伴う進行性ｃＧＶＨＤ患者が、Ｔｒｅｇの数および機能をさらに増大させ、それらの低下を遅延させるか、または防止するには、さらなる介入が必要であることが示される。
【０２７４】
本明細書では、このようなさらなる介入は、Ｔｃｏｎの活性化も過剰な有害事象も誘導することなく、血漿ＩＬ−２レベルをより完全に回復させ、Ｔｒｅｇの増殖、活性化、および新生をさらに増進するために、血漿ＩＬ−２レベルを誘導した後で、個々の患者におけるＩＬ−２用量の漸増を伴う維持レジメンを含むことが決定された。Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ２５を構成的に発現し、これは高アフィニティーＩＬ−２受容体の形成に寄与するので、ＩＬ−２の隔離が増大し、持続的な毎日のＩＬ−２投与にも拘らず、血漿ＩＬ−２レベルが降下すると考えられる。加えて、ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇ上のＣＤ２５発現の増大を誘導し、ＩＬ−２の取込みをさらに増大させる。ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇの増殖、ｐＳＴＡＴ５およびＦｏｘＰ３  Ｔｒｅｇ活性化を誘導した。実際、ＲＴＥ  Ｔｒｅｇの発生は、その後、ＩＬ−２療法の経過中に、血漿ＩＬ−２レベルの降下と共に低下した。このようにして、ＩＬ−２により誘導されるＴｒｅｇの増強がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じ、数が増大した、ＣＤ２５発現が高い循環Ｔｒｅｇに結合後の血漿ＩＬ−２レベルの減退に起因するタキフィラキシーを回避する。これらの方法は、低用量ＩＬ−２によるｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの増進にも拘らず認められる部分的な臨床ｃＧＶＨＤ応答を克服する。血漿ＩＬ−２レベルの予期される降下時における、個々の患者のＩＬ−２用量の漸増は、ＩＬ−２レベルを回復させ、Ｔｃｏｎの活性化または全身性ＡＥを誘導することなく、Ｔｒｅｇの増殖および活性化をさらに増進する機構をもたらす。
【０２７５】
さらに、本明細書では、Ｔｒｅｇレパートリーの劇的な増強が、低用量ＩＬ−２が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｔ細胞の寛容および免疫に媒介される炎症の抑制を増強する機構のうちの１つであり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、低用量ＩＬ−２の、Ｔｒｅｇに対する選択的効果をさらに裏付けることが決定されている。特に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シークエンシング（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；ワールドワイドウェブ上のｉｍｍｕｎｏｓｅｑ．ｃｏｍにおいて入手可能）を使用して、レパートリーの多様性を精査した（Ｒｏｂｉｎｓら（２０１２年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３７５巻：１４〜１９頁；Ｒｏｂｉｎｓら（２００９年）、Ｂｌｏｏｄ、１１４巻：４０９９〜４１０７頁；Ｒｏｂｉｎｓら（２０１０年）、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、２巻：４７ｒａ６４）。アッセイでは、マルチプレックスＰＣＲにより、４５のＶβおよび１３全てのＪβセグメントに対するプライマーを活用して、Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントと、それらの関連する非鋳型化挿入部分との接合により形成される可変領域にわたり、ＴＣＲの再配列ＣＤＲ３領域を増幅する。ＴＣＲ配列の数および頻度を使用して、エントロピーにより測定されるＴ細胞レパートリーの多様性を特徴付けたが、この場合、より高いエントロピースコアは、各試料について、ＴＣＲ頻度内で、より大きな、ｌｏｇによる多様性を反映した。ＴＣＲ配列解析はまた、ある時間にわたる一連の患者試料中の、個々のＴ細胞クローンの追跡も可能とした。低用量ＩＬ−２療法の後における、ｃＧＶＨＤ患者における結果は、Ｔｒｅｇ  ＴＣＲの多様性の、２〜３ｌｏｇの増大を示したが、Ｔｃｏｎ多様性の変化は示さなかった（図６）。データを組み合わせると、図７は、予測値応答を、ベースラインまたは１週目におけるＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比に従い層別化する、応答予測因子を示す。
【０２７６】
本明細書ではまた、ＢＨ−３プロファイリング解析により、ＩＬ−２処置は、Ｔｒｅｇの、外因性および内因性経路によるアポトーシス感受性を、より生理学的レベルへと回復させることも決定されている。
【０２７７】
（実施例２：代表的な、複数の可変用量によるＩＬ−２治療レジメン）
以下では、本発明の、複数の可変用量によるＩＬ−２治療法についての、代表的な非限定的実施形態を提示する。
【０２７８】
以下の患者集団基準を使用する：１）慢性ＧＶＨＤを伴い、全身ステロイドに対する応答が不十分な、成人および小児の参加者；２）少なくとも２回にわたる以前の全身療法（ステロイドを含む）にも拘らず、遷延性または再発性の慢性ＧＶＨＤ；３）制御不良の活動性感染症を伴わないこと；４）悪性疾患の再発を伴わないこと；および５）カルノフスキーＰＳ≧６０。
【０２７９】
具体的な包含および除外基準については、下記で詳述する。
１）参加者数：２０例（成人１０例；小児１０例）；
２）研究デザインおよび方法：不応性ｃＧＶＨＤを伴う、成人（ｎ＝１０）および小児（ｎ＝１０）患者に、３つの用量レベルにわたり、２週間ごとに、各患者において用量漸増される、毎日のＳＣ  ＩＬ−２（ＤＬＴまたは重度のＤＬＴ以外のＡＥの非存在下で）を施し、それらの個々のＭＴＤで、６週間にわたり維持した。
３）フェーズＩ
【化１】
2018500276.tif 000005
【０２８０】
安全性および有効性解析は、以下の通りである。主要評価項目は、個々の患者において用量漸増されるＩＬ−２の安全性、毒性、およびＭＴＤである。副次的評価項目は、個々の患者において用量漸増されるＩＬ−２の臨床的および免疫学的影響であって、１）不応性ｃＧＶＨＤにおける免疫学的影響についての評価；２）臨床的ｃＧＶＨＤ応答についての評価；ならびに３）免疫学的効果の、臨床応答との相関、および固定用量ＩＬ−２で処置された患者の免疫学的および臨床応答との比較を含む臨床的および免疫学的影響である。
【０２８１】
評価（８週間にわたる）は、以下の通りである：１）重度の血液毒性についての評価；２）グレード３またはそれ超の非血液毒性についての評価；３）重篤な感染症についての評価；４）免疫学的影響についての評価；および５）ＧＶＨＤの応答または進行についての評価。
【０２８２】
参加者は、以前に開始されたｃＧＶＨＤ治療を、８週間の研究中に持続することができる。これらの薬剤の具体的な用量およびスケジュールは、研究の目的にとって重要ではなく、施設の基準に従う用量の調整（例えば、薬物レベルに基づく調整）を許容する。８週間の研究中における併用ｃＧＶＨＤ治療の漸減は、一般に意図されないが、このような改変は、主治医に従い臨床的に必要な場合は許容される。ステロイドの用量は、研究参入時および８週目において記録する。
【０２８３】
治療前、治療中、および治療後に得られる末梢血試料を活用して、処置の免疫学的効果を評価する。このような研究は、以下を含む。
１）リンパ球サブセットについての表現型解析：末梢血の、リンパ球マーカーに特異的なモノクローナル抗体とのインキュベーションを使用して、機能的に異なるリンパ球サブセットを同定する。末梢血細胞の、蛍光色素とコンジュゲートさせたモノクローナル抗体との直接的なインキュベーションの後、個々のサブセットを、フローサイトメトリーにより数え上げる。ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇのほか、他のＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のサブセット、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞についての抗体パネルを開発した。この表現型解析は、胸腺新生のほか、表現型的に十分に規定されたＴ細胞サブセットの増殖およびアポトーシス感受性を評価する定量的方法を提示する。これらは、用量漸増ＩＬ−２療法に応答する、各Ｔ細胞集団のホメオスタシス均衡の測定を可能とする。ＥＣＰを組み合わせる研究では、これらの変化を、ＥＣＰで処置された細胞の用量であって、各ＥＣＰ手順により再注入されるバフィーコートの、フローサイトメトリーの細胞カウントにより決定される用量と相関させる。
【０２８４】
２）血漿サイトカイン：ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、血漿試料中のＩＬ−２のレベルを測定する。必要な場合、Ｔ細胞のホメオスタシスにおいて役割を果たす、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１５など、他のサイトカインもまた、これらの試料中で測定することができる。
【０２８５】
３）機能アッセイ：処置に応答して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて拡大するＴｒｅｇ細胞の機能的能力を評価するために、選択された試料を使用して、それらの免疫抑制性能力を評価する。これらの実験では、Ｔｒｅｇを、高速細胞選別により精製し、その後、自家Ｔ細胞の増殖を抑制するそれらの能力について調べる。
【０２８６】
４）ＤＮＡ解析：免疫細胞の再構成について評価するさらなる遺伝子解析（例えば、ＴＣＲシークエンシング）を考慮することができ、このような解析のために、委託されたＤＮＡおよび細胞試料にアクセスすることができる。
【０２８７】
まとめると、これらのアッセイは、個々の患者のＩＬ−２用量漸増の、参加者の免疫細胞に対する効果を定量化する。
【０２８８】
参加者は、以下の適格性基準に従い選択する。１）ＨＬＡ  ８抗原（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１）中７〜８抗原をマッチさせた同種造血幹細胞移植のレシピエント；および２）参加者は、２つまたはそれ超の治療の使用にも拘らず、ステロイド不応性ｃＧＶＨＤを有さなければならない。ステロイド不応性ｃＧＶＨＤとは、≧０．２５ｍｇ／ｋｇ／日（または０．５ｍｇ／ｋｇずつ隔日）で、少なくとも４週間にわたるプレドニゾンの使用（または代替的なグルココルチコイドの同等の投与）にも拘らず、ｃＧＶＨＤの遷延性の徴候および症状（表２および３）を有し、徴候および症状の完全な消失を伴わないことと規定される。全身療法を必要とする、広範性または限局性の慢性ＧＶＨＤを伴う参加者は、適格である。
【表２】
2018500276.tif 000006
【表３−１】
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【表３−２】
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【０２８９】
登録前の４週間にわたる、安定用量のグルココルチコイド。
登録前の４週間にわたり、他の免疫抑制医薬（例えば、カルシニューリン阻害剤、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル）の追加または削減を伴わない。免疫抑制薬の用量は、その薬物の治療範囲に基づき調整することができる。
【０２９０】
参加者は、下記で規定される通りの十分な臓器機能を有さなければならない：
１）肝臓：肝機能不全が、推定されるｃＧＶＨＤの症状発現でない限りにおいて、肝機能が十分である（総ビリルビン≦２．０ｍｇ／ｄｌ−ギルバート症候群を伴う参加者において許容される例外；ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）／ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）≦２×施設のＵＬＮ）こと。ＬＦＴの異常を、ｃＧＶＨＤの唯一の症状発現として伴う参加者には、登録の前に、肝臓生検についてのＧＶＨＤの記録が必要である。主治医が、ＬＦＴの異常を、肝臓ｃＧＶＨＤと符合すると記録する場合は、他の臓器系に及ぶ活動性のｃＧＶＨＤの文脈におけるＬＦＴの異常もまた、許容することができ、この状況では、肝臓生検は、必須でなくなる；
２）肺：肺機能不全が、慢性ＧＶＨＤに起因するとみなされない限りにおいて、ＦＥＶ１≧予測値の５０％またはＤＬＣＯ（Ｈｂ）≧予測値の４０％であること；
３）腎臓：血清クレアチニン≦施設のＵＬＮまたはクレアチニンレベルが施設の正常値を上回る参加者については、クレアチニンクリアランス＞６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２であること；
４）小児患者は、血清クレアチニンレベルに関わらず、クレアチニンクリアランス≧６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有さなければならない；
５）増殖因子または輸血を伴わずに、絶対好中球カウント（ＡＮＣ）≧１０００／ｍｃＬおよび血小板≧５０，０００／ｍｃＬにより示される十分な骨髄機能；
６）心臓：登録前６カ月以内の心筋梗塞またはＮＹＨＡクラスＩＩＩもしくはＩＶの心不全、制御不良の狭心症、重度の制御不良の心室性不整脈、あるいは急性虚血症または活動性伝導系の異常（ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ）についての心電図によるエビデンスがないこと。研究への登録の前に、スクリーニング時における、任意のＥＣＧ異常は、研究者が、医療上関与性ではないものとして記録しなければならないこと；
７）カルノフスキー／ランスキーパフォーマンスステータス≧６０％であること（表４）；
【表４】
2018500276.tif 000009
８）年齢≧２歳であること。施設の経験により、かつ、公表された報告に従い、２歳未満の小児におけるｃＧＶＨＤの発生率は希少である（Ｚｅｃｃａら（２００２年）、Ｂｌｏｏｄ、１００巻：１１９２〜１２００頁）。２歳という若齢の、ＨＳＣＴ後の小児患者において、低用量ＩＬ−２の、毎日のＳＣ注射が使用されている（Ｌａｄｅｎｓｔｅｉｎら（２０１１年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、２９巻：４４１〜４４８頁）。Ｉｎｓｕｆｌｏｎ（登録商標）留置ＳＣカテーテルを使用することにより、低分子量のヘパリンおよびインスリンなど、他の薬物の、長期にわたる毎日のＳＣ注射が、若齢の小児集団において一般に投与され、良好に忍容されている；
９）ＩＬ−２の、発生しつつあるヒト胎児に対する効果は未知である。この理由で、かつ、化学療法剤は、催奇形性であることが公知であるため、出産の潜在的可能性のある参加者および父親となる潜在的可能性のある参加者は、研究登録の前に、研究参加期間にわたり、十分な避妊（産児制限のホルモンまたはバリア法；禁欲）を使用することに同意しなければならない。女性またはその配偶者が本研究に参加している間に、その女性が妊娠するかまたは妊娠していることが疑われる場合、その女性は、自らの主治医に速やかに通知するものとする。本プロトコールで処置または登録される男性もまた、研究の前、研究参加期間、およびＩＬ−２投与の完了後４カ月間にわたり、十分な避妊を使用することに同意しなければならないこと；ならびに
１０）参加者またはそれらの親／法的に認証された代表者の、書面でのインフォームドコンセント文書を理解する能力および／またはこれに署名する意向。
【０２９１】
参加者は、以下の除外基準に従い除外される：１）進行中のプレドニゾン（同等物）用量要件を、＞１ｍｇ／ｋｇ／日（または同等量）とする参加者；２）カルシニューリン阻害剤にシロリムスを加えた併用（どちらかの薬剤単独は許容可能である）がなされている参加者；３）過去４週間以内に、新規の免疫抑制医薬、体外フォトフェレーシス、またはリツキシマブ療法を開始した参加者；４）過去１００日以内に、ドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）、またはＴ細胞もしくはＩＬ−２標的化医薬（例えば、ＡＴＧ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、デニロイキンディフチトクス）への移植後曝露がなされた参加者；５）主要研究者により承認されない場合の、登録前４週間以内における他の被験薬。４週間前に中断された、以前の固定用量ＩＬ−２療法は、許容される；６）以前の血液障害の、活動性で悪性の再発または再燃を伴う参加者；７）ＩＬ−２処置レジメンに適合することが不可能な参加者；８）臓器移植（同種移植片）のレシピエント；９）組合せ抗レトロウイルス療法中のＨＩＶ陽性個体は、同種ＨＳＣＴの後で使用される薬剤との薬物動態相互作用の潜在的可能性のために、不適格であること。加えて、これらの個体は、致死性の感染症の危険性が増大している。適応の場合に組合せ抗レトロウイルス療法を施されている参加者においては、適切な研究が企図されている；１０）ＩＬ−２と化学的または生物学的組成が類似する化合物に帰せられる、重度のアレルギー反応の既往歴；１１）進行中または活動性の感染症、症候性のうっ血性心不全、不安定狭心症、心不整脈を含むがこれらに限定されない、制御不良の併発性疾病、または研究要件に対する遵守を制限する精神疾病／社会的状況；１２）活動性で制御不良のＢ型肝炎またはＣ型肝炎を伴う個体は、ＨＳＣＴ後における、致死性の処置関連肝毒性の危険性が高いので、不適格であること；および１３）妊婦は、催奇形または堕胎作用の潜在的可能性のために、本研究から除外されること。母体の処置に続発して、乳児における有害事象の、未知であるが潜在的な危険性があるため、授乳は中断するべきである。
【０２９２】
対象は、以下の処置レジメンに従い処置する。
各参加者には、８週間にわたる自己投与として、毎日の皮下ＩＬ−２を施す。各参加者の初期登録は、適切な場合、成人または小児への投与のための、ＩＬ−２の用量レベルＡでなされる。下記のシェーマ（表５）に従い、成人および小児の各参加者（ｎ＝１０ずつ）には、ＤＬＴまたは重度のＤＬＴ以外のＡＥの非存在下で、２週目（用量レベルＢへと）および４週目において（用量レベルＣへと）用量漸増される、毎日のＳＣ  ＩＬ−２を施し、のべ４週間にわたり、ＭＴＤ  ＩＬ−２を持続する。小児は、ＩＬ−２に誘導される胸腺Ｔｒｅｇの発生が、成人と比較して大きいと予測され、結果として、より少ないＩＬ−２を必要とする場合がある。一連の患者ＰＢＭＣ試料は、処置の効果をモニタリングするために、ベースラインおよびＩＬ−２療法中において得る。略述すると、それらは、Ｔｒｅｇ、Ｔｃｏｎ、ＣＤ８、Ｂ、ＮＫ、およびＤＣの測定値のほか、血漿サイトカインレベル（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５）を含む。ＩＬ−２の免疫学的影響についての詳細な評価は、ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎのホメオスタシスに焦点を絞る。Ｔｒｅｇ濃縮生成物および患者ＰＢＭＣのアリコートは、ＴＣＲシークエンシングを経る。
【表５】
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【０２９３】
プレドニゾン（または同等のステロイド）および他のｃＧＶＨＤ用薬剤は、ＩＬ−２との併用で持続し、典型的には、用量漸減を伴わない。しかし、参加者の利益になるとみなされる（例えば、ステロイド毒性）場合は、主治医の裁量で、プレドニゾンの漸減を許容する。プレドニゾンを、８週目以前に漸減しなければならない場合、「８週目と同等の」ｃＧＶＨＤ評価を漸減時に行って、応答を記録する。他の免疫抑制治療の漸減中である場合、８週目以前のｃＧＶＨＤの進行が、毒性または有効性の欠如のエビデンスと考えられないことに留意されたい。
【０２９４】
長期治療：研究期間（８週間のＩＬ−２研究処置）を完了した後で、許容可能な毒性プロファイルで、臨床的利益（完全または部分応答のほか、部分応答についてのＮＩＨ基準を満たさないわずかな応答）を享受する参加者には、主治医の裁量で、長期ＩＬ−２処置を持続することを許容する。参加者を、長期ＩＬ−２療法の６カ月後ごとに再評価して、ＩＬ−２療法の持続の根拠を記録する主治医の裁量で、ＩＬ−２療法を持続すべきかどうかを決定する。
【０２９５】
長期ＩＬ−２療法中の参加者は、フェーズＩの毒性評価項目について評価可能である。長期ＩＬ−２中における、他の免疫抑制医薬の漸減は、主治医の裁量下にある。長期治療を持続する参加者のために、応答を増強する他のｃＧＶＨＤ治療の追加を、主治医の裁量で許容する。ＩＬ−２に帰せられる毒性が生じた場合は、主治医の裁量で、用量の改変を許容する。長期ＩＬ−２療法中、参加者を、以下のスケジュールで評価する：
【０２９６】
１）４週間（±２週間）ごとの、ＩＬ−２の毒性および臨床的利益を評価するための、診療所来院および検査室検査（ｌａｂ）（ＣＢＣ、クレアチニン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン）；
【０２９７】
２）定量的血清免疫グロブリン；血漿バンキング；およびさらなる単核細胞の保存を含む８週間（±２週間）ごとの免疫アッセイ；
【０２９８】
３）ＩＬ−２処置の開始から１年となるか、または参加者が、ＩＬ−２療法を停止する場合のいずれかが先に生じるまで、１６週間（±４週間）ごとのｃＧＶＨＤ評価（１１．１節）およびｃＧＶＨＤの症状スコアシート。
【０２９９】
小児患者における調査研究を目的とする血液の回収：小児患者における免疫学的研究のために、各採血時に回収される血液の体積は、３０ｍｌまたは３ｍｌ／ｋｇのうちのいずれか少ない方を超えない。この体積は、調査研究目的で許容可能な、最大総採血体積以内である。施設のガイドラインに従い、調査研究目的の採血は、１週間に２回より頻繁には行わない。加えて、２８日間に、患者の体重に基づき、調査研究目的で採取されうる血液の体積に対する限界についても、施設のガイドラインに従う。
【０３００】
以下の評価を、全ての参加者について、処置の前２週間以内に実施する：１）病歴および患者の疾患の処置についての根拠（ステロイド用量を含む）についての記録；２）バイタルサイン、体重、パフォーマンスステータスを含む身体検査；３）ｃＧＶＨＤ評価；４）出産の潜在的可能性がある女性についての妊娠検査；５）感染性疾患マーカーについての検査；６）血液学：鑑別を伴う全血球計算（ＣＢＣ）；７）血清化学：グルコース、ＢＵＮ、クレアチニン、総ビリルビン、尿酸、アルカリホスファターゼ、ＬＤＨ、総タンパク質、アルブミン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびカルシウム；８）小児患者については、２４時間にわたる尿収集または核医学的糸球体濾過量（ＧＦＲ）研究により、ベースラインクレアチニンクリアランスを測定しなければならない；９）甲状腺機能検査（ＴＳＨ、Ｔ４、遊離Ｔ４）；１０）ＣＭＶウイルス負荷；および１１）免疫学：定量的血清免疫グロブリン；血漿バンキング；およびさらなる単核細胞の保存。
【０３０１】
以下の評価が、そうでないことが示されない限り、ｃＧＶＨＤが特異的な臓器系に及ぶ参加者について処置の前２週間以内に必要である：１）眼のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための（任意選択の）、シルマー試験を伴う眼検査；２）皮膚のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための皮膚評価（成人には、±生検）；３）口腔のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための（任意選択の）口腔検査（成人には、±生検）；４）ｃＧＶＨＤの肺症状発現を伴う参加者のための肺機能検査；５）ｃＧＶＨＤと関連する拘縮または筋骨格病変を伴う個体のための、罹患関節についての屈曲評価；６）処置期間中（１、２、３、４、５、６、８週目の終了時）の評価；７）病歴および臨床検査；８）既往歴および臨床検査と同じ日に行われる毒性評価；９）血液学：鑑別を伴うＣＢＣ；１０）血清化学：グルコース、ＢＵＮ、クレアチニン、尿酸、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＬＤＨ、総タンパク質、アルブミン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびカルシウム；１１）ＣＭＶウイルス負荷；１２）免疫学：定量的免疫グロブリン；血漿バンキング；およびさらなる単核細胞の保存；ならびに１３）甲状腺機能検査（ＴＳＨ、Ｔ４、遊離Ｔ４）（８週目）。
【０３０２】
ｃＧＶＨＤが特異的な臓器系に及ぶ参加者については、以下の評価（ｃＧＶＨＤの症状スコアに加えた）が、そうでないことが示されない限り、８週間の研究処置の終了時およびステロイド漸減時に必要である（早期の場合）：１）ステロイド用量；２）眼のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための（任意選択の）、シルマー試験を伴う眼検査；３）皮膚のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための皮膚評価（成人には、±生検）；４）口腔のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための（任意選択の）口腔検査（成人には、±生検）；５）ｃＧＶＨＤの肺症状発現を伴う参加者のための肺機能検査；および６）ｃＧＶＨＤと関連する拘縮または筋骨格病変を伴う個体のための、罹患関節についての屈曲評価。
【０３０３】
以下は、ＩＬ−２投与の詳細である。
組換えヒトＩＬ−２（アルデスロイキン）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｃ．およびＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．））は、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．により供給されている。組換えヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））は、静脈内（ＩＶ）投与を意図される、２２ＭＩＵのアルデスロイキンを含有する単回使用用バイアル内の、滅菌、白色〜オフホワイトで、凍結乾燥させたケーキとして供給されている。２２００万国際単位（ＭＩＵ）のバイアルでは、１．２ｍＬの注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）で再構成した場合、各ｍＬは、約１７０ｍｃｇの一塩基性リン酸ナトリウムおよび８９０ｍｃｇの二塩基性リン酸ナトリウムにより、７．５（範囲：７．２〜７．８）のｐＨへと緩衝化された１８ＭＩＵ（１．１ｍｇ）のＩＬ−２、５０ｍｇのマンニトール、および約１８０ｍｃｇのドデシル硫酸ナトリウムを含有する。再構成の後、結果として得られる溶液は、無色透明〜黄色がかった液体となるはずである。記載されている手順以外の再構成および希釈手順は、ＩＬ−２の送達および／または薬理学を変更する可能性があり、推奨されない。
【０３０４】
Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎは、保存されていない（ｕｎｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）滅菌生成物である。凍結乾燥させたＩＬ−２のバイアルは、冷蔵庫内、２〜８℃（３６〜４６°Ｆ）で保存する。ラベルに印刷された有効期限を超えては使用しない。バイアルは、夾雑の可能性を最小化するように、再構成のための投入を１回限りとすべきである。速やかに使用しない場合、再構成が、層流気流フード内の、制御および確認された無菌条件下で実施されたのでない限りにおいて、使用中の保存時間は通常、２〜８℃で、２４時間より長くすべきでない。指示に従い再構成および希釈した場合、ＩＬ−２は、冷蔵温度および室温［２〜２５℃（３６〜７７°Ｆ）］で保存すると、プラスチック製のバッグ（例えば、ＰＶＣバッグ）内、最大で４８時間にわたり安定である。再構成および希釈された溶液は、冷蔵庫内、２〜８℃で保存するものとする。凍結させない。生成物は、粒子状物質または変色について目視により精査し、投与の前に室温とする。データは、再構成され希釈されたＩＬ−２調製物（ＳＷＦＩで再構成され、Ｄ５Ｗでさらに希釈された）の安定性および滅菌性；ならびにＳＷＦＩで再構成されているがさらに希釈されてはいない生成物の安定性および滅菌性を、毎日の使用のための単回使用用シリンジを、有資格の医療ケア従事者が、無菌状態下で調製する（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）の研究者向け冊子（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２００３年９月１０日、１１３頁）に従い）場合に、２〜８℃（３６〜４６°Ｆ）で、最大で１４日間にわたり裏付ける。したがって、再構成および希釈を、層流フードを使用して、制御および確認された条件下で実施する場合、このようにして調製され、２〜８℃（３６〜４６°Ｆ）で保存された、１または複数の用量は、１４日以内に使用する必要がある。
【０３０５】
ＩＬ−２は、Ｄ５Ｗを加えた注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）で再構成するものとする。注射用静菌水または０．９％の注射用塩化ナトリウムによる再構成または希釈は、凝集物の増大のために回避すべきである。再構成および希釈された溶液を含有する、毎日の単回使用用シリンジは、冷蔵庫内、２〜８℃で保存するものとする。凍結させない。生成物は、粒子状物質または変色について目視により精査し、投与の前に室温とする。
【０３０６】
毎日の外来ＳＣ使用のための、全てのＩＬ−２シリンジは、２２ＭＩＵのＩＬ−２バイアルを、１．２ｍｌのＳＷＦＩおよび４．８ｍｌのＤ５Ｗ（最終ＩＬ−２濃度＝３．６ＭＩＵ／ｍＬ）で希釈した後、調剤室内で同時に調製するものとし、任意の残りの生成物は、速やかに廃棄するものとする。再構成時に、ＳＷＦＩを、バイアルの側面に方向付けて、発泡を回避し、バイアルの内容物を、静かに旋回させるものとする。バイアルは、振とうしないものとする。再構成の後、家庭用冷蔵庫内の、２〜８℃における保存のために、単回使用用シリンジ（必要な場合冷却パック内の）に、最大で２週間分のＩＬ−２供給がなされる。単回使用用シリンジ１本ずつを、毎日、自宅でのＳＣ自己投与時に使用し、用意されるシャープスコンテナ内に廃棄することになる。
【０３０７】
ＩＬ−２は、毎日の皮下注射により、自宅、外来、または入院状況下で自己投与することができる。参加者は、注射部位を巡回させることが推奨されるであろう。調剤師（または調剤師の監督下にある指定担当者）は、無菌条件下で、薬物を調製する。投与される薬物量（ＩＵ単位の）は、体表面積（ＢＳＡ）に基づき決定する。ＢＳＡは、デュボアの式（表３）または同等の小児用代替式を使用して、体重に基づき計算する。用量は、研究登録時における体重に基づき計算するものとする。その後の用量の改変を行う場合は、本明細書で記載されている。静注（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｐｕｓｈ）または静脈内ボーラスは行わない。初回のＩＬ−２用量またはその後の用量の前における前投薬は、必要でない。
表６：体表面積（ＢＳＡ）およびクレアチニンクリアランス
体表面積（ＢＳＡ）は、デュボアの式を使用して計算するものとし、これにより、平方メートル（ｍ２）単位の以下の結果：
ＢＳＡ＝（Ｗ０．４２５×Ｈ０．７２５）×０．００７１８４
［式中、体重は、キログラム単位であり、身長は、センチメートル単位である］がもたらされる。
【０３０８】
クレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）は、コックロフト−ゴールトの式を使用して、以下の通りに計算することができる。
【化２】
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【０３０９】
女性には、計算されたＣｒＣｌ値の８５％を使用する。
【０３１０】
注：顕著に肥満した参加者では、コックロフト−ゴールトの式は、クレアチニンクリアランスを過大評価する傾向がある（脂肪組織は、腎クリアランスを必要とするクレアチニンに、ほとんど寄与しない傾向がある）。
【０３１１】
小児用の使用には、ＢＳＡ（モステラー）およびＣｒＣｌ（シュワルツ）のための代替式が許容される。
【０３１２】
抗ウイルス、抗真菌、および抗細菌の予防およびモニタリングは、ＨＳＣＴの標準操作プロトコール（ＳＯＰ）に準拠して、ｃＧＶＨＤ管理のための施設の実施に従うものとする。これらは、ＨＳＶ予防のための毎日のアシクロビル（または同等物）、ＰＣＰ予防のためのバクトリム（または同等物）、低ガンマグロブリン血症のためのＩＶガンマグロブリン、危険性の大きな参加者における真菌予防のためのアゾールの使用のほか、危険性の大きな参加者における、ベータ−グルカンおよびガラクトマンナンレベルのモニタリングを含むことが典型的である。
【０３１３】
治療の持続期間は、上記で記載したシェーマに従う。有害事象に起因する処置の遅延の非存在下では、以下の基準のうちの１つが、該当するまで、処置を持続することができる：１）対象が同意を撤回すること；２）服薬遵守の不履行；３）運営上の理由；４）許容不可能な有害事象；５）重篤なアナフィラキシー反応；６）他のグレード４の毒性事象；７）再発性または非消失性のグレード３の毒性事象；８）持続または再帰する、重度の血液毒性（６．２節）；９）主治医の裁量下における、ＩＬ−２時の重篤な感染症；１０）血液悪性疾患の再発；１１）主治医の判断に従い、８週目の前に新規の免疫抑制医薬の追加を必要とする、ＧＶＨＤの臨床的増悪。コルチコステロイド用量の増大は、ＧＶＨＤの増悪のエビデンスと考えられるであろう。治療レベルのみを維持する、他の免疫抑制医薬の用量の変化では、除外の基準とならないこと；または１２）参加者の状態の一般的または特異的な変化は、処置している研究者の見解により、参加者を、さらなる処置に許容不可能とすること。
【０３１４】
参加者は、治療の開始からの１年間、または死亡するまでの間のいずれかが先に生じるまで追跡される。許容不可能な有害事象のために除外された参加者は、有害事象が消失または安定化するまで追跡される。参加者はまた、それらが生じた場合に、その後の毒性もまた同定しうるように、長期追跡を可能とすることを求められる。長期治療で利益を得る参加者のためのフォローアップ（有害事象を含む）は、１年間を超えて持続することができる。フォローアップは、参加者が、地元で生活する場合に、ＤＦＣＩで行うか、または、遠隔で生活する場合に、地元のがん治療提供者と共に行う。参加者が遠隔で生活する場合、地元のがん治療提供者への電話連絡は、６カ月ごとのベースで行うことができる。
【０３１５】
参加者は、列挙された基準のうちのいずれかが該当する場合、除外される。研究からの除外の理由および参加者を除外する日付は、研究個別の症例報告書（ＣＲＦ）に記録する。代替的なケア選択肢については、参加者と共に議論する。参加者を研究から除外する理由および参加者を除外する日付は、症例報告書（ＣＲＦ）に記録する。参加者を除外する場合は、ＱＡＣＴＴｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｅｎｄｅｄ／Ｏｆｆ  Ｓｔｕｄｙ  Ｆｏｒｍに記入する。
【０３１６】
８週間のＩＬ−２研究治療中の用量の遅延および用量の改変は、以下の推奨を使用して行う。毒性評価は、ワールドワイドウェブ上のｃｔｅｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｏｃｏｌＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ＿ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｃｔｃ．ｈｔｍのＣＴＥＰウェブサイトにおいて同定および場所が特定される、ＣＴＥＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＣＩ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）を使用して行う。可能な場合、症状は、症状として管理する。毒性の場合、適切な医療処置を使用する（制吐剤、止瀉剤などを含む）。参加者が受けた、全てのＣＴＣＡＥグレード３およびこれを超える有害事象は、研究処置の初回用量時から、研究を通して、最終回の研究来院まで収集する。研究以外の来院時に毒性を被り続けている参加者には、毒性が消失するか、または不可逆的であるとみなされるまで、さらなる評価のために連絡を取る。長期ＩＬ−２の参加者には、用量の改変が推奨されるが、必須ではない。
【０３１７】
投与される薬剤と関連する有害事象および潜在的危険性のリストを、下記に掲げるが、これにより、用量の遅延および用量の改変を行うかどうか、または事象が、慣用的な報告に加えて、緊急の報告を必要とするかどうかを決定する。
【０３１８】
ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）は、市販の薬剤である。ＨＳＣＴ参加者における、低用量ＩＬ−２の、関与する副作用を、下記に記載する。高用量ＩＬ−２と主に関連する、さらに詳細な毒性情報は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎの添付文書中に見出すことができる。
【０３１９】
局所反応：低用量ＳＣ  ＩＬ−２を施される、大半のＨＳＣＴ参加者は、注射部位反応、典型的には、数日間で消失し、硬結が２〜３週間後に消失する限局性紅斑について報告した。より顕著な硬結（ＣＴＣグレード３）を伴う参加者においては時折、用量の途絶が要請された。長期にわたる用量の途絶は、応答について評価不可能な参加者を結果としてもたらす場合がある。
【０３２０】
全身症状：低用量ＩＬ−２にある一部のＨＳＣＴ参加者は、ＩＬ−２を開始して７２時間以内に、発熱、悪心、疲労、および関節痛を発症した。治療を途絶させる結果として、３日間で症状の消失がもたらされた。参加者は、低用量におけるＩＬ−２の再導入を忍容した。長期にわたる用量の途絶は、応答について評価不可能な参加者を結果としてもたらす場合がある。
【０３２１】
甲状腺機能不全：低用量ＩＬ−２にある一部のＨＳＣＴ参加者では、甲状腺機能検査異常が認められた。２例の参加者が、ＩＬ−２の一方で、治療を余儀なくさせる、臨床的な甲状腺機能低下症を発症した。ＩＬ−２の中止後、甲状腺機能は、正常に戻った。よって、研究登録時および研究の８週目に、甲状腺パネル（ＴＳＨ、Ｔ４、遊離Ｔ４）レベルを点検する。甲状腺機能低下症のエビデンスを伴う参加者は、精密検査し（抗ミクロソーム、抗サイログロブリン抗体）、臨床的に適応の場合は、チロキシン置換を施す。
【０３２２】
造血：ＨＳＣＴ後早期に、低用量ＩＬ−２は、１週間の治療後、大半の参加者において、絶対リンパ球カウントの初期の減少を引き起こした。その後、注入の持続により、全ての参加者において、リンパ球カウントの定常的な増大が生じた。低用量ＩＬ−２はまた、好酸球カウントの初期の増大（３週間でピーク）に続いて、段階的な低下も引き起こした。単球または好中球カウントの変化は、観察されなかった。血小板カウントは、低用量ＩＬ−２にある一部のＨＳＣＴ参加者において、２０％超低下した。この減少は、ＩＬ−２時の最初の２週間以内に認められたが、処置の持続は、血小板カウントのさらなる低下と関連しなかった。血小板輸血を必要とするか、または出血事象を示す参加者は、見られなかった。低用量ＩＬ−２の、ヘモグロビンレベルまたは網状赤血球カウントに対する著明な影響は、認められなかった。
【０３２３】
血栓性微小血管症（ＴＭＡ）：毎日の低用量ＳＣ  ＩＬ−２にある２例の参加者は、おそらくＩＬ−２と関連すると考えられる、血栓性微小血管症（血小板減少症、分裂赤血球増加症を伴う微小血管症性溶血性貧血、腎機能不全）のＳＡＥを発症した。ＴＭＡはまた、カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）およびシロリムス（両方の参加者は、これらの両方を施されている）の公知の合併症でもあるが、ＩＬ−２がこれに寄与した可能性がある。１例の患者が、長期にわたる血液透析を必要とした。その後、ＣＮＩにシロリムスの使用を加えた組合せを却下した後で、ＴＭＡを発症する患者は、見られなかった。
【０３２４】
ｃＧＶＨＤに関連する毒性と、その処置で使用される免疫抑制医薬に関連する毒性とが存在する。これらの毒性は、研究者により日常的に管理される。有害作用の包括的なリストについては、個々の免疫抑制剤の添付文書を参照されたい。
【０３２５】
毒性は、ＮＣＩ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０に従い評価するものとする。
【０３２６】
以下の状況のうちのいずれかが見られれば、参加者を除外し、ＩＬ−２療法を中止するものとする。
アナフィラキシー：ＩＬ−２と関連する重篤なアナフィラキシーは、ＩＬ−２の中断を必要とし、ＤＬＴと考えられる；
血栓性微小血管症（ＴＭＡ）：ＣＮＳ機能不全、血液透析／ＣＶＶＨを必要とする腎機能不全、または入院の必要を伴うＴＭＡは、ＩＬ−２の中断を必要とし、ＤＬＴと考えられる；
ＣＴＣグレード４の毒性：ＩＬ−２と関連する、グレード４の非血液毒性は、無症候性の、是正可能な検査室値（例えば、尿酸）だけを表すのでない限りにおいて、ＩＬ−２の中断を必要とし、ＤＬＴと考えられる；
ＣＴＣグレード３の毒性：無症候性の、是正可能な検査室値（例えば、尿酸）だけを表すのでない限りにおいて、グレード３の、予測外の非血液毒性が見られれば、ＩＬ−２を差し控える。毒性が、２週間以内に、グレード１またはそれを下回るように消失する場合、ＩＬ−２を、再漸増しない、５０％の用量（用量レベルＡにおける毒性である場合）または以前の低用量レベル（用量レベルＢまたはＣにおける毒性である場合）で再開することができる。毒性が、２週間以内に、グレード１もしくはそれを下回るように消失しないか、または、低用量のＩＬ−２を再開した後で、グレード３もしくはそれを上回るように再帰する場合、ＩＬ−２を中断し、ＤＬＴと考える；
重度の血液毒性：悪性疾患の再発、感染症、または他の病因と関連しない、末梢カウントの重度の低下（ＡＮＣ＜５００、血小板＜１０，０００）が見られれば、ＩＬ−２を差し控える。カウントが、２週間以内に改善すれば（ＡＮＣ＞１０００、血小板＞２０，０００）、ＩＬ−２を、再漸増しない、５０％の用量（用量レベルＡにおける毒性である場合）または以前の低用量レベル（用量レベルＢまたはＣにおける毒性である場合）で再開する。末梢カウントが、２週間以内に改善しないか、またはＩＬ−２を再開した後で、再度降下する（ＡＮＣ＜５００、血小板＜１０，０００）場合、ＩＬ−２を中断し、ＤＬＴと考える；
死：処置に関する死は、ＤＬＴと考えられる。
【０３２７】
以下は、さらなる検討事項である。
感染症：ｃＧＶＨＤおよび併用の免疫抑制医薬のいずれも、感染症の公知の危険性因子であるので、感染症は、処置関連であると考えられないことに留意されたい。感染症は、ｃＧＶＨＤの予測される合併症であると考えられる。しかし、ＩＬ−２療法の８週目を完了する前に、ＣＴＣグレード３またはそれ超の感染症を発症する参加者には、ＩＬ−２を差し控える場合がある。ＩＬ−２を差し控える場合、感染症の制御後に、主治医の裁量で、ＩＬ−２の再開について検討することができる。ＩＬ−２用量は、以下の通りである。処置の途絶≦１週間または用量レベルＡの場合、同じ用量で再開し；処置の途絶＞１週間であり、用量レベルがＢまたはＣの場合、これを下回る１つの用量レベルで再開し、シェーマに従い、２週間ごとに漸増する；
再発：同様に、ｃＧＶＨＤ患者は、公知の再発率を有するので、血液悪性疾患の再発もまた、処置関連であると考えられない。しかし、全ての再発症例は記録し、ＩＬ−２は差し控える；
処置の途絶：より短いＩＬ−２療法のクールによるｃＧＶＨＤの客観的改善が記録されていない限りにおいて、ＩＬ−２療法の＞４週間の途絶の結果、参加者は、応答について評価不可能と考えられる；
予測される非血液毒性：ＣＴＣＡＥグレード３未満の毒性（例えば、遷延性の全身性症状）が見られれば、患者の忍容性の利益で、かつ、主治医の裁量により、ＩＬ−２を差し控えることもでき、かつ／または、用量漸増しない、５０％の用量（用量レベルＡにおける毒性である場合）または以前の用量レベル（用量レベルＢまたはＣにおける毒性である場合）で再開することもできる；
ｃＧＶＨＤの増悪：新規の免疫抑制医薬の追加（主治医の裁量で）を必要とする、８週間のＩＬ−２療法中のＧＶＨＤの増悪は、ＩＬ−２中断の基準である。８週目の前における、ベースラインを上回るコルチコステロイド用量の増大は、ｃＧＶＨＤの増悪のエビデンスであると考えられる。治療レベルのみを維持する、他の免疫抑制医薬の用量の変化では、ＩＬ−２中断の基準となったり、ｃＧＨＶＤ増悪のエビデンスと考えられたりすることはない。
【０３２８】
以下の表は、記録のためのデータの要約である。
【表７−１】
2018500276.tif 000012
【表７−２】
2018500276.tif 000013
【０３２９】
毒性および応答の両方について評価する。ＩＬ−２を施される参加者は、毒性について評価可能である。少なくとも４週間のＩＬ−２を施された参加者は、応答の欠如について評価可能であると考えられる。参加者は、ＮＩＨガイドライン（ワールドワイドウェブ上のａｓｂｍｔ．ａｆｆｉｎｉｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ／１１７４１／ｆｉｌｅｓ／ＲｅｓｐｏｎｓｅＣｒｉｔｅｒｉａＡＰＰＥＮＤＩＸＡＦｏｒｍＡ．ｐｄｆで入手可能である）に従う、標準化されたｃＧＶＨＤ評価を、ベースラインおよび研究の８週目（および、必要な場合、８週目の前の、早期ステロイド漸減時）に受ける（Ｆｌｉｐｏｖｉｃｈら（２００５年）、Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１１巻：９４５〜９５６頁）。ｃＧＶＨＤ応答は、ＮＩＨコンセンサス基準（Ｐａｖｌｅｔｉｃら（２００６年）、Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１２巻：２５２〜２６６頁）に従い評価する。口腔および眼部位は、これらの部位には、さらなる局所治療が許容されるので、応答の決定に含まれない。参加者は、以下の定義に従い分類される応答を示す。
【０３３０】
完全応答：臓器応答：特異的な臓器内の、ｃＧＶＨＤと関連する、全ての可逆性の症状発現の消失；全体応答：ｃＧＶＨＤ病変の各臓器または部位内の、全ての可逆性の症状発現の消失。関与する臓器系病変に応じて、参加者は眼、口腔、皮膚、筋骨格、および肺系についての、詳細な評価を繰り返し受ける；
部分応答：臓器応答：ｃＧＶＨＤと関連する疾患症状発現を測定するのに使用されるスケールにおける、少なくとも５０％の改善（例えば、皮膚発疹の５０％の減少であって、ＢＳＡのうちの８０％からＢＳＡのうちの４０％への減少）であって、開始値の百分率だけと対比した、フルスケールにおける、最低２５％の改善（表８）；全体応答：他の任意の臓器または部位における尺度の進行を伴わない、少なくとも１つの臓器または部位における尺度の改善。包括的評定および類別スケールでは、３または７ポイントのスケールにおける１ポイントの変化、または０〜１０ポイントのスケール上の２〜３ポイントの変化（０．５  ＳＤの変化）を、臨床的に有意義であると考えられることに留意されたい。加えて、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）に対する治療への応答についての特徴は、３カ月間中のＦＥＶ１のさらなる減少を伴わない、肺機能の安定化である。非レスポンダー（例えば、わずかな応答、安定病態）は、部分応答または疾患進行についてのＮＩＨ基準を満たす、ｃＧＶＨＤの変化を示さない。
【表８】
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【０３３１】
進行性疾患：臓器進行：ｃＧＶＨＤと関連する疾患症状発現を測定するのに使用されるスケールにおける、少なくとも２５％の絶対的増大（表９）。包括的評定および類別スケールでは、３または７ポイントのスケールにおける１ポイントの変化、または０〜１０ポイントのスケール上の２〜３ポイントの変化（０．５  ＳＤの変化）を、臨床的に有意義であると考えられることに留意されたい。加えて、参加者は、進行についての客観的なＮＩＨ基準を満たさない症状の増悪を受ける場合があるので、「ｃＧＶＨＤの臨床的増悪」は、ＮＩＨ基準に従う、ｃＧＶＨＤの進行と同義ではない。ｃＧＶＨＤの進行と同義である場合、ＩＬ−２の有効性の欠如に対して、参加者はさらに、主治医の判断で、ＩＬ−２を中断し、さらなる免疫抑制を開始する選択肢を有する。
【表９】
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【０３３２】
参加者は、確認された慢性ＧＶＨＤ症状スケール（表１０）を使用して、ｃＧＶＨＤの症状および徴候について自己報告する。自己報告される症状スケールは、ベースラインおよび８週目の終了時（および、必要な場合、８週目の前の、早期ステロイド漸減時）において得られる。
【表１０】
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【０３３３】
参加者のコルチコステロイドの総１日用量は、ベースラインおよび８週間のＩＬ−２の終了時において記録される。コルチコステロイドの毎日の代替的投与の場合、研究目的で、平均１日用量を記録する。参加者はまた、ＩＬ−２を開始する前、ならびに１、２、３、４、６、および８週目の終了時に実施される、免疫機能についての検査も受ける。検査は、定量的免疫グロブリン、血漿バンキング、およびさらなる単核細胞の保存を含む。
【０３３４】
低用量ＩＬ２についてのかつての研究では、固定用量を患者コホートに施したところ、血漿ＩＬ−２レベルは、治療の１週目にピークに達した後で、Ｔｒｅｇカウントが上昇する間、毎日のＩＬ−２投与にも拘らず低下することが観察された。さらなる探索は、Ｔｒｅｇの増殖および活性化レベルもまた、２週目の後に低下することを明らかにした。本明細書では、ＩＬ−２により拡大されたＴｒｅｇ上で発現する高アフィニティーのＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の増大によるその取込みおよび隔離に起因すると考えられる、血漿ＩＬ−２レベルの低減は、その後における、ＩＬ−２の、拡大されたＴｒｅｇプールへのアベイラビリティーを低減しうる。患者内の用量漸増は、ＩＬ−２により誘導される、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの増強を最大化し、数が増大した、ＣＤ２５発現が高い循環Ｔｒｅｇに結合後の血漿ＩＬ−２レベルの減退に起因するタキフィラキシーを回避すると考えられる。さらに、用量漸増時に、大きなＴｒｅｇプールが、ＩＬ−２の取込みおよび隔離に利用可能であるので、毒性／ＤＬＴ率は、各患者内の逐次的な用量増大と共に低下すると考えられる。
【０３３５】
上記で記載した通り、ＩＬ−２の３つの漸増用量が、各患者におけるＭＴＤ：成人患者についての、０．６７×１０６（用量レベルＡ）、１．３５×１０６（用量レベルＢ）、および２×１０６ＩＵ／ｍ２／日（用量レベルＣ）、ならびに小児患者についての、０．３３×１０６（用量レベルＡ）、０．６７×１０６（用量レベルＢ）、および１×１０６ＩＵ／ｍ２／日（用量レベルＣ）を決定すると考えられる。各参加者の初期登録は、用量レベルＡでなされる。成人および小児の各参加者には、ＤＬＴまたは重度のＤＬＴ以外のＡＥの非存在下で、２週目において（用量レベルＢへと）および４週目において（用量レベルＣへと）用量漸増し、のべ４週間にわたり、ＭＴＤ  ＩＬ−２を持続する。患者が、任意の用量レベルにおいて、ＤＬＴを被る場合は、患者を研究から除外する。患者が、用量漸増時に、許容不可能な、ＩＬ−２関連のＡＥ（ＤＬＴ以外の）を被る場合は、患者を、既に忍容された用量へと、漸減することができる。ＭＴＤは、各患者における、ＤＬＴの非存在下の最大用量レベルとして定義される。下記の表１１は、多様なＤＬＴ率下における、個別の用量漸増の確率を示す。例えば、個体についての、真であるが未知のＤＬＴ率が、１０％である場合、用量漸増の確率は、９０％であり、これは、ＤＬＴ率に対する補完的確率である。
【表１１】
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【０３３６】
合計２０例の患者（成人患者１０例および小児患者１０例）を登録し、研究デザインの実行可能性について評価する。成人患者におけるＩＬ−２についてのかつての研究では、１×１０６ＩＵ／ｍ２／日のＩＬ−２を、ＭＴＤであると決定した。しかし、患者内用量漸増の本デザインでは、患者が被る毒性は小さく、したがって、ＭＴＤ用量レベルは、より高いと考えられる。２０例の患者中１５例またはそれ超の患者が、用量レベルＢまたはＣを、彼らのＭＴＤとして明示する場合、本研究デザインは、実行可能であると考えられる。この決定規則によれば、真であるが未知の実行可能性率が８５％である場合に、研究デザインを実行可能であると結論付ける確率は、０．９３であり、実行可能性率が８０％である場合、０．８であり、実行可能性率が５５％である場合、０．０６である。
【０３３７】
以前の研究に基づくと、各コホート内の少なくとも７例の患者は、ＤＬＴを被らずにそれらのＭＴＤを達成すると考えられ、真であるが未知のＤＬＴ率が０．２である場合に、ＤＬＴを伴わずにそれらのＭＴＤを完遂する、少なくとも７例の患者を観察する確率は、０．８８となり、ＤＬＴ率が０．３である場合、０．６５となる。相関研究では、組合せならびに個別による、成人および小児患者についての、ＩＬ−２用量、血漿ＩＬ−２レベル、およびＴｒｅｇと臨床応答との関係を解析する。
【０３３８】
対象の性別は、包含または除外基準として使用しないものとし、マイノリティーの登録者数（ａｃｃｒｕａｌ）に制限を設けない。２０１３年において、移植を受けた全ての患者の４１％は女性であり、患者の約１０％はマイノリティーであった。２０１３年の本発明者らによる移植プログラムにおいて自己報告された、この民族および性別に基づき、性別および人種（ｒａｃｅ）により規定される亜群内で予期される登録者数を、下記の表１２にまとめる。
【表１２】
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【０３３９】
副次的評価項目は、８週目までの慢性ＧＶＨＤの応答率、研究登録の１年後までの全生存および再発、ならびに８週間の処置期間中の免疫学的評価を含む。副次的評価項目は、記載およびグラフにより解析する。相関研究では、組合せならびに個別による、成人および小児患者についての、ＩＬ−２用量、血漿ＩＬ−２レベル、ならびにＴｒｅｇの増殖および活性化と臨床応答との関係を探索する。
【０３４０】
（実施例３：調節性Ｔ細胞の投与と組み合わせた、代表的な低用量ＩＬ−２治療レジメン）
以下では、調節性Ｔ細胞の投与と組み合わせた低用量ＩＬ−２治療レジメンについての、代表的な非限定的実施形態を提示する。他の実施形態では、低用量ＩＬ−２治療レジメンを、実施例１および／または本明細書で記載されている方法であって、任意の実施例からの任意の組合せを含む方法による複数の可変用量によるＩＬ−２治療レジメンで置きかえることができる。例えば、かつ、そうでないことが言明されない限りにおいて、実施例２による基準を、完全にまたは部分的に、下記の実施例３で記載される基準と共に使用することができる。
【０３４１】
低用量ＩＬ−２は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｔｒｅｇを、優先的に増進しうるが、永続的臨床応答は、ｃＧＶＨＤ患者のほんの５０％である。さらに、ＨＳＣＴ後における悪性の再発を伴う患者における移植片対白血病（ＧＶＬ）応答の増強を求める試験では、ＣＤ４＋濃縮ドナーリンパ球注入（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳによるＣＤ８＋枯渇；用量：１ｋｇ当たりのＣＤ４＋細胞３〜１０×１０７個）に加えた、１２週間の低用量ＩＬ−２（０．６×１０６ＩＵ／ｍ２／日）は、ＧＶＨＤを誘導することなく、低用量ＩＬ−２単独またはＣＤ４＋濃縮細胞注入単独と比較して大きな、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ＦＯＸＰ３＋  Ｔｒｅｇの拡大を誘導した（Ｚｏｒｎら（２００９年）、Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１５巻：３８２〜３８８頁）（図８）。低用量ＩＬ−２と併用して、ＣＤ４について濃縮されたＤＬＩを施された患者は、低用量ＩＬ−２単独を施された患者（ｐ＝０．０３）、またはＣＤ４について濃縮されたＤＬＩ単独を施された患者（ｐ＝０．００１）と比較して大きな、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの拡大を示した（図８）。これらのＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔ細胞は、正常な抑制性機能を提示し、ＣＤ４について濃縮されたＤＬＩおよびＩＬ−２による処置は、ＧＶＨＤと関連しなかった。イタリアで、ＣＤ３４で選択されたハプロタイプ一致ＨＳＣＴを受けた２８例の患者についての試験では、移植前後における、ドナーＴｒｅｇ濃縮細胞の注入に続く、ドナーＴｃｏｎの注入は、移植後における免疫抑制の非存在下であっても、ＧＶＨＤを防止した（Ｄｉ  Ｉａｎｎｉら（２０１１年）、Ｂｌｏｏｄ、１１７巻：３９２１〜３９２８頁）。
【０３４２】
本明細書で記載される結果に基づき、低用量ＩＬ−２と、養子Ｔｒｅｇ濃縮細胞療法とを組み合わせることにより、さらなる臨床的利益がもたらされると考えられる。最初の参加者には、ドナーＴｒｅｇ濃縮細胞の注入に加えて、低用量ＩＬ−２を施したが、いかなる病的作用も生じなかった。さらに、５つの独立の白血球アフェレーシスに由来するデータは、２ステップの、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳによるＣＤ８／ＣＤ１９共枯渇に続く、ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ濃縮の実行可能性を確認する（表１３）。６．５〜９．７％のＣＤ２０＋  Ｂ細胞、１１．４〜２８．３％のＣＤ８＋  Ｔ細胞、および５．９〜１６．７％のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  ＣＤ１２７−  Ｔｒｅｇ細胞を含む、生存総有核細胞（ＴＮＣ）１．６〜４．０７×１０１０個による白血球アフェレーシス生成物から出発して、０〜０．４％のＣＤ２０＋  Ｂ細胞、０．０１〜１．２％のＣＤ８＋  Ｔ細胞、８３．１〜９２％のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ濃縮細胞、および７２．８〜９３．９％のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  ＣＤ１２７−  Ｔｒｅｇ細胞を含む、生存ＴＮＣ０．５８〜１．７６×１０８個によるＴｒｅｇ濃縮生成物を達成した。カノニカルのＦＯＸＰ３＋  Ｔｒｅｇは、生成物の４１．３〜６９．６％を構成し、抑制についてのＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比もまた、１：２を上回った。
【表１３】
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【０３４３】
以下の患者集団基準を使用する：１）全身療法を必要とする慢性ＧＶＨＤ（全身療法を必要とする、広範性または限局性の慢性ＧＶＨＤ）を伴う参加者；２）用量を≧０．２５ｍｇ／ｋｇ／日（または同等量）とする、少なくとも４週間のプレドニゾンを含む、２つまたはそれ超の治療にも拘らず、活動性のｃＧＶＨＤ；３）制御不良の活動性感染症を伴わないこと；および４）悪性疾患の再発を伴わないこと。
【０３４４】
具体的な包含および除外基準については、下記で詳述する。
１）参加者数：２〜２５；
２）研究デザインおよび方法：ステロイド不応性慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）における、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）について濃縮された細胞に加えた８週間の毎日の低用量インターロイキン２（ＩＬ−２）の、安全性および最大耐量レベル（ＭＴＤ）を評価する。
３）フェーズＩ
【化３】
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Ｔｒｅｇ濃縮細胞の標的用量：
用量レベルＡ：１ｋｇ当たりの細胞０．１×１０６個（開始用量レベル）
用量レベルＢ：１ｋｇ当たりの細胞０．３×１０６個
用量レベルＣ：１ｋｇ当たりの細胞１×１０６個
【０３４５】
安全性および有効性解析は、以下の通りである。主要評価項目は、Ｔｒｅｇ濃縮ドナー細胞の注入に、毎日の低用量ＳＣ  ＩＬ−２（１×１０６Ｕ／ｍ２／日）を加えた場合の毒性およびＭＴＤである。副次的評価項目は、１）Ｔｒｅｇ濃縮注入に、８週間の低用量ＩＬ−２を加えた場合の実行可能性；２）Ｔｒｅｇ濃縮注入に、８週間の低用量ＩＬ−２を加えた場合の臨床応答；３）Ｔｒｅｇ濃縮注入に、８週間の低用量ＩＬ−２を加えた場合の免疫学的効果；および４）臨床応答についての予測因子である。
【０３４６】
評価（８週間まで）は、以下の通りである：１）Ｔｒｅｇ濃縮細胞の注入の実行可能性についての評価；２）Ｔｒｅｇ濃縮細胞の注入による注入毒性についての評価；３）悪性疾患と関連しないグレード３またはそれ超の血液毒性についての評価；４）ＧＶＨＤと関連しないグレード３またはそれ超の非血液毒性についての評価；５）重篤な感染症についての評価；６）慢性ＧＶＨＤの応答または進行についての評価；および７）免疫学的影響についての評価。
【０３４７】
加えて、ベースラインおよび８週間のＩＬ−２処置後の、ドナー由来のＴｒｅｇ濃縮細胞生成物中および研究患者における、ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎ集団についての、包括的なＴ細胞レパートリーの多様性を評価する。結果として得られる配列データを使用して、一連の患者試料にわたり、個々のＴ細胞クローンを追跡することができ、低用量ＩＬ−２療法中における、養子Ｔｒｅｇ細胞生成物に固有なＴ細胞クローンの、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける拡大および生存の追跡が可能となる。ＴＣＲレパートリーが、ＴｒｅｇとＴｃｏｎとの間で共有される程度、および、それが、Ｔｒｅｇのホメオスタシスを再確立するためのパラメータとして、組合せ養子Ｔｒｅｇ細胞の注入に加えた低用量ＩＬ−２処置の後で、どのように変化するかもまた、決定する。
【０３４８】
試料構成要素の単離および低温保存：単核細胞を単離するために、抗凝固処理された試料を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ上で層状化し、次いで、１７℃、１，０００×ｇで２０分間にわたり遠心分離した。遠心分離の後、ｆｉｃｏｌｌと培地との界面にある細胞を採取し、ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、カウントする。クライオバイアルに、コード化されたＣＭ番号でバーコード標識し、蒸気相の液体窒素中で保存し、場所情報を、Ｆｒｅｅｚｅｒｗｏｒｋｓにより記録する。血漿を保存するためには、抗凝固処理された一次試料を、穏やかにスピンさせ、血漿を除去してから、上記で記載した通り、細胞ペレットを、培地で希釈する。低温保存されない試料（例えば、フローサイトメトリーのための全血）が必要である場合、試料を、さらなる加工を伴わずに分配する。試料の出納は、検査室ＳＯＰに従って行う。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を、製造元の推奨プロトコールを使用する、Ｑｉａｇｅｎ  Ｂｌｏｏｄ  ＭｉｎｉおよびＭｉｃｒｏカラム（細胞量に応じて）を使用して、２．５×１０４〜１０×１０６個の間の細胞から、ＴＣＲシークエンシングのために単離する。試料を、１００μＬの溶出緩衝液へと溶出させる。溶出させたｄｓＤＮＡは、製造元の指示に従う、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加、ＤＮＡ検量線の作成、および蛍光マイクロプレートリーダー上の測定の後で定量化する。
【０３４９】
免疫学的方法：表現型解析：免疫再構成は、末梢血中の、規定されたリンパ球サブセットの数え上げにより評価する。１５％のＥＤＴＡと共に回収された全血を解析する。蛍光色素コンジュゲート抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ）を、各反応チューブに添加するのに続き、１００μＬの全血を添加する。１０分間のインキュベーションの後、１ｍＬのＢＤ  ＦＡＣＳＬｙｓｅを添加し、試料を、ボルテックスし、１５分間にわたりインキュベートする。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ＩＩフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを使用して、抗体で標識された細胞を解析する。これらのアッセイは、回収から２４時間以内の、新鮮な全血に対して日常的に行うが、また、低温保存されたＰＢＭＣにも使用することができる。直接的にコンジュゲートさせた試薬および蛍光色素のパネルを、下記の表１４に示す。各チューブ内の７〜８色についての同時的な解析は、３チューブパネルによる、Ｔ、Ｂ、およびＮＬ細胞中の異なるサブセットについての包括的な調査をもたらす。
【表１４】
2018500276.tif 000021
【０３５０】
４００μＬの全血だけを使用し、各チューブ内の細胞２００，０００個について解析する。さらなるチューブを、この標準的なパネルに追加して、特異的なサブセットについてのより詳細な解析をもたらすこともでき、新規のサブセットのためのマーカーを追加することもできる。Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅの密度沈降による低温保存および融解と関連する変動性が消失するので、全血の使用は、各試料中の特異的な細胞の絶対数の正確な数え上げを容易とする。
【０３５１】
ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎのホメオスタシス：ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎサブセットについての解析では、既に開発された表現型および機能アッセイ（Ｍａｔｓｕｏｋａら（２０１０年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１２０巻：１４７９〜１４９３頁）を活用する。マーカーについての表現型パネルを、下記の表１５にまとめる。
【表１５】
2018500276.tif 000022
【０３５２】
これらのアッセイは、表現型的に十分に規定されたＴ細胞サブセットの、胸腺における発生、増殖、およびアポトーシス感受性を評価する定量的方法をもたらす。Ｔ細胞の新生（例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ３１＋）、増殖（例えば、Ｋｉ−６７）、活性化（例えば、ｐＳＴＡＴ５）、および生存（例えば、Ｂｃｌ−２）についての顕著に異なる尺度に焦点を当てることで、これらのアッセイは、各Ｔ細胞集団のホメオスタシス均衡についての詳細な評価をもたらす。フローサイトメトリーにより選別された細胞集団はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける機能アッセイ（例えば、Ｆａｓ誘導アッセイを介するアポトーシス抵抗性；ＣＦＳＥ希釈、チミジン組込み、またはＩＦＮ−γアッセイを介するＴｃｏｎの阻害）にも利用可能である。同じ試料中のＴｒｅｇサブセットとＴｃｏｎサブセットとの内部交差比較は、一般的なｉｎ  ｖｉｖｏ環境に対する差次的な効果および応答を評価する、固有の方法をもたらす。規定された間隔を置いた結果の比較により、ある時間にわたる、ホメオスタシス均衡の変化が同定される。
【０３５３】
血漿サイトカインの測定：血漿は、１０００×ｇで１５分間にわたる全血遠心分離により単離し、リポジトリーアリコートを、−７０℃で保存する。ＥＬＩＳＡを使用して、多様な時点におけるホメオスタシスサイトカインレベルを測定する。結果は、フローサイトメトリー、機能アッセイ、および臨床アウトカムと相関させる。現在、市販の高感度で再現性の高いキット：Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ：型番８４７７２）；Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−７ＨＳ（Ｒ＆Ｄ：型番ＨＳ７５０）；およびＱｕａｎｔｉＧｌｏ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ：型番Ｑ１５００Ｂ）が使用されている。推奨される手順は、試料を、適切な標準希釈液および対照とともに二連で使用することを含む、以下の手順である。濃度が既知の３つの試料を、各９６ウェル試験プレートに組み入れて、アッセイ間精度を評価する。Ｓｐｅｃｔｒａ  １８０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、アッセイ結果を測定する。
【０３５４】
ＴＣＲ配列の解析：ベースラインおよび低用量ＩＬ−２後における、養子Ｔｒｅｇ濃縮細胞生成物および患者の一連のＰＢＭＣ試料に由来する、ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  ＣＤ２５ｍｅｄ−ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＴｒｅｇおよびＣＤ３＋  ＣＤ４＋  ＣＤ２５ｎｅｇ−ｌｏｗＣＤ１２７ｍｅｄ−ｈｉｇｈＴｃｏｎについて解析する。ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎ（各々＞２５，０００個の細胞）を、上記の免疫表現型プロファイルに基づく細胞選別により精製し、各試料について、４００〜１２００ｎｇの抽出ｄｓＤＮＡをプレートに入れ（ｐｌａｔｅ）、ＩｍｍｕｎｏＳｅｑ解析のために発送する。
【０３５５】
相関解析：探索的統計解析では、臨床変数（例えば、ｃＧＶＨＤ特徴および／または併用薬剤）またはある時間にわたり測定された免疫学的変数（例えば、ＩＬ−２の前および後における、Ｔｒｅｇカウント、Ｔｒｅｇ／Ｔｃｏｎ比、Ｔｒｅｇの拡大）と、処置応答との関連を決定する。
【０３５６】
参加者は、以下の適格性基準に従い選択する。
１）ＨＬＡ  ８抗原（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１）中７〜８抗原をマッチさせた同種造血幹細胞移植のレシピエント；
２）参加者は、２つまたはそれ超の治療の使用にも拘らず、ステロイド不応性ｃＧＶＨＤを有さなければならない。ステロイド不応性ｃＧＶＨＤとは、≧０．２５ｍｇ／ｋｇ／日（または０．５ｍｇ／ｋｇずつ隔日）で、少なくとも４週間にわたるプレドニゾンの使用（または代替的なグルココルチコイドの同等の投与）にも拘らず、ｃＧＶＨＤの遷延性の徴候および症状（表２および３）を有し、徴候および症状の完全な消失を伴わないことと規定される。全身療法を必要とする、広範性の慢性ＧＶＨＤまたは限局性の慢性ＧＶＨＤを伴う参加者は、適格である；
３）登録前の４週間にわたる、安定用量のグルココルチコイド；
４）登録前の４週間にわたり、他の免疫抑制医薬（例えば、カルシニューリン阻害剤、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル）の追加または削減を伴わない。免疫抑制薬の用量は、その薬物の治療範囲に基づき調整することができる；
５）患者年齢≧１８歳とする。＜１８歳の参加者におけるＩＬ−２の使用についての投与または有害事象データは、現在入手可能ではないため、小児は、この研究から除外する；
６）ＥＣＯＧパフォーマンスステータスを０〜２とする（表４）；
７）参加者は、規定される通りの十分な臓器機能を有さなければならない。ａ）肝臓：肝機能不全が、推定されるｃＧＶＨＤの症状発現でない限りにおいて、肝機能が十分である（総ビリルビン＜２．０ｍｇ／ｄｌ−ギルバート症候群を伴う参加者において許容される例外；ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）／ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）≦２×ＵＬＮ）こと。ＬＦＴの異常を、ｃＧＶＨＤの唯一の症状発現として伴う参加者には、登録の前に、肝臓生検についてのＧＶＨＤの記録が必要である。主治医が、ＬＦＴの異常を、肝臓ｃＧＶＨＤと符合すると記録する場合は、他の臓器系に及ぶ活動性のｃＧＶＨＤの文脈におけるＬＦＴの異常もまた、許容することができ、この状況では、肝臓生検は、必須でなくなる；ｂ）肺：肺機能不全が、慢性ＧＶＨＤに起因するとみなされない限りにおいて、ＦＥＶ１≧予測値の５０％またはＤＬＣＯ（Ｈｂ）≧予測値の４０％であること；ｃ）腎：血清クレアチニンが、施設の正常限界の上限未満であるか、またはクレアチニンレベルが施設の正常値を上回る参加者については、クレアチニンクリアランス≧６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２であること；ｄ）増殖因子または輸血を伴わずに、ＡＮＣ＞１０００／ｍｍ３および血小板＞５０，０００／ｍｍ３により示される十分な骨髄機能；およびｅ）心臓：登録前６カ月以内の心筋梗塞またはＮＹＨＡクラスＩＩＩもしくはＩＶの心不全、制御不良の狭心症、重度の制御不良の心室性不整脈、あるいは急性虚血症または活動性伝導系の異常についての心電図によるエビデンスがないこと。研究への登録の前に、スクリーニング時における、任意のＥＣＧ異常は、研究者が、医療上関与性ではないものとして記録しなければならないこと；
８）ＩＬ−２の、発生しつつあるヒト胎児に対する効果は未知である。この理由で、かつ、化学療法剤は、催奇形性であることが公知であるため、出産の潜在的可能性のある女性および男性は、研究登録の前に、研究参加期間にわたり、十分な避妊（産児制限のホルモンまたはバリア法；禁欲）を使用することに同意しなければならない。女性が、本研究に参加している間に、妊娠するかまたは妊娠していることが疑われる場合、その女性は、自らの主治医に速やかに通知するものとすること；ならびに
９）書面でのインフォームドコンセント文書を理解する能力およびこれに署名する意向。
【０３５７】
参加者は、以下の除外基準に従い除外される：１）進行中のプレドニゾン要件＞１ｍｇ／ｋｇ／日（または同等量）；２）カルシニューリン阻害剤にシロリムスを加えた併用（どちらかの薬剤単独は許容可能である）；３）血栓性微小血管症、溶血性尿毒症症候群、または血栓性血小板減少性紫斑病の既往歴；４）過去４週間における、新規の慢性ＧＶＨＤ治療（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ、体外フォトフェレーシス、リツキシマブ、免疫抑制医薬）；５）過去４週間における、低用量ＩＬ−２療法；６）過去１００日以内における、Ｔ細胞標的化医薬または代替的なＩＬ−２標的化医薬（例えば、ＡＴＧ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、デニロイキンディフチトクス）への移植後曝露；７）過去１００日以内における、ドナーリンパ球注入；８）活動性で悪性の再発；９）活動性で制御不良の感染症；１０）ＩＬ−２処置レジメンに適合することが不可能；１１）臓器移植（同種移植片）のレシピエント；１２）組合せ抗レトロウイルス治療中のＨＩＶ陽性個体は、同種ＨＳＣＴの後で使用される薬剤との薬物動態相互作用の潜在的可能性のために、不適格であること。加えて、これらの個体は、致死性の感染症の危険性が増大している。適応の場合に組合せ抗レトロウイルス療法を施されている参加者においては、適切な研究が企図されている；１３）活動性で制御不良のＢ型肝炎またはＣ型肝炎を伴う個体は、ＨＳＣＴ後における、致死性の処置関連肝毒性の危険性が高いので、不適格であること；１４）主要研究者により承認されない場合の、登録前４週間以内における他の被験薬；および１５）妊婦は、催奇形または堕胎作用の潜在的可能性のために、本研究から除外されること。母体の処置に続発して、乳児における有害事象の、未知であるが潜在的な危険性があるため、授乳は中断するべきである。
【０３５８】
対象は、以下の処置レジメンに従い処置する。
ドナー白血球アフェレーシス：本研究のためのアフェレーシスは、通例の非改変型白血球アフェレーシスと比較して、ドナーに対する危険性の付加を伴わない。同じ元の造血幹細胞ドナーにアフェレーシスを施して、ドナーリンパ球を得る。可能な場合、これは、末梢静脈内アクセスを介して実施する。ドナーの評価およびアフェレーシスは、他の施設（国外の試験施設を含む）で実施しうるが、各ドナーの施設の標準操作手順に従う、適切な同意および医学的評価の完遂を必要とする。全てのドナーは、２１  ＣＦＲ  １２７１のＰａｒｔ  Ｃに従い評価し、移植レシピエントおよびそれらのそれぞれのドナーについての法規に準拠して応対する。ドナーリンパ球は、単回のアフェレーシスで回収することが好ましい。アフェレーシスの後、生成物のアリコートに、ベースラインの細胞カウント、生存率を決定するように解析を施し、微生物学的／滅菌性検査を施す。生成物は、ＣＭＣＦに従い、十分であれば、下記で詳述する通りに加工し、加工が完了して３６時間以内に注入する。
【０３５９】
研究治療：Ｔｒｅｇ濃縮細胞生成物：ドナー白血球アフェレーシス生成物を受領したら、製造元の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従い、臨床グレードのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ試薬系を使用して、逐次的な２ステップのＴｒｅｇ細胞濃縮：ｉ）ＣＤ８＋／ＣＤ１９＋共枯渇（２．１枯渇プログラム、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ）に続く、ｉｉ）ＣＤ２５＋の陽性選択（３．１濃縮プログラム、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ）を施す。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ試薬系の調製および使用のための詳細なプロトコールは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌに従う（表１６）。例えば、対象のための、以前の幹細胞ドナーに、アフェレーシスを施して、対象のためのドナーリンパ球を得ることができる。生成物は、十分（１ｋｇ当たりのＣＤ３＋細胞の最小用量≧３×１０７個）であれば、下記で記載する通りに加工し、明示された生成物の有効期限以内に注入する。ドナー白血球アフェレーシス生成物を受領したら、製造元の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従い、臨床グレードのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ試薬系を使用して、ＣＤ８＋／ＣＤ１９＋共枯渇に続く、ＣＤ２５＋の陽性選択を伴う、逐次的な２ステップによるＴｒｅｇ細胞濃縮を施す。加工の前およびＴｒｅｇ濃縮が完了した後に取り出された試料を使用して、細胞生存率を決定し、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７＋、およびＦｏｘＰ３＋細胞を数え上げる。生成物を、「Ｔｒｅｇ濃縮細胞」と称する。リリース基準は、細胞生存率＞７０％であり、グラム染色が陰性であること；生成物中のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋細胞≧９０％であること；およびＦｏｘＰ３＋細胞≧５０％であることを含む。
【表１６】
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【０３６０】
細胞生成物の評価：試料は、加工の前およびＴｒｅｇ濃縮が完了した後に取り出す。加工の前および／または後に、これらを使用して、細胞生存率を決定し、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７＋、およびＦｏｘＰ３＋細胞（必要に応じて、組み合わせて、例えば、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞）を数え上げる。また、グラム染色、内毒素、および滅菌性検査も、実施する。生成物を、「Ｔｒｅｇ濃縮細胞」と称する。リリース基準は、トリパンブルーによる細胞生存率≧７０％であり、グラム染色／内毒素が陰性であり、生成物中のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋細胞≧７０％であり、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  ＣＤ１２７−細胞≧５０％であること（表１７）を含む。
【表１７−１】
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【０３６１】
１ｋｇ当たりの標的Ｔｒｅｇ濃縮細胞用量が、リリース基準ではないことに留意されたい。生成物は、１ｋｇ当たりの細胞用量が、必須のＱＣ試料が得られた後で利用可能な細胞の最大数において、標的を下回る場合であっても、注入される。
【０３６２】
Ｔｒｅｇ濃縮細胞の用量：ドナーＴｒｅｇ濃縮総有核細胞の規定された用量を、参加者の標的とする。初期登録は、標的用量レベルＡである。後続のコホートは、下記のシェーマに従い用量漸増する。
【表１７−２】
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【０３６３】
これは、フェーズＩの用量設定デザインである：５例の参加者が、所与の用量レベルで登録される（初期の４例の参加者が登録された後、２８日間の中断を必須とする）。２８日目までにＤＬＴを示す参加者が、５例中≦１例である場合は、用量漸増を行う。これが用量レベルＣである場合は、この用量をＭＴＤとする。コホート内の≧２例の参加者が、ＤＬＴを被る場合は、ＭＴＤを超えたと考える。これが用量レベルＡである場合は、登録を停止する。これが用量レベルＢである場合は、用量レベルＡをＭＴＤとする。これが用量レベルＣである場合は、用量レベルＢをＭＴＤとする。次いで、毒性および有効性をさらに評価するために、仮のＭＴＤで、さらに１０例の参加者が登録される。
【０３６４】
Ｔｒｅｇ濃縮細胞の注入：ＣｌｉｎｉＭＡＣＳによる細胞生成物は、リリース基準に合格するまで投与しない（表１７）。リリース基準が満たされない場合は、生成物を注入せず、患者は、ＤＬＴ評価について評価不可能ではないが、生成物は、実行可能性については評価可能である。適切なＴｒｅｇ濃縮生成物の生成についての実行可能性は、本明細書で記載される通りに決定する。
【０３６５】
リリース基準が満たされたら、生成物を、中心または末梢静脈カテーテルを介して、レシピエントに注入する。細胞は、静脈内カテーテルを介して、約５〜１０分間にわたり注入する。Ｔｙｌｅｎｏｌ  ６５０ｍｇ  ＰＯおよびＢｅｎａｄｒｙｌ  ２５ｍｇ  ＩＶの前投薬が、注入前に通例である（しかし必要ではない）。注入終了後の約１時間にわたり、参加者を、注入反応の発生についてモニタリングする。注入される用量を超過する、Ｔｒｅｇ濃縮細胞のアリコートを、表現型、機能、ならびに／またはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質研究のために活用する。任意の残りのＴｒｅｇ濃縮細胞は、将来の品質管理における使用および相関解析のために、標準操作手順に従い低温保存する。
【０３６６】
インターロイキン２：Ｔｒｅｇ濃縮細胞の注入日から始めて、各参加者には、８週間にわたる自己投与として、毎日の皮下ＩＬ−２を施すのに続いて、４週間の中断を行う（本発明の方法に従う、複数の可変用量によるＩＬ−２レジメンを適用する場合を除いて）。ＩＬ−２は、外来ベースで投与する。予測される毒性および潜在的危険性のほか、用量の改変については、実施例２に記載されている。
【０３６７】
プレドニゾン（または同等のステロイド）および他の薬剤は、用量の改変を伴わずに、ＩＬ−２との併用で持続する。プレドニゾンの漸減は、研究の初期の６週間中は許容されないが、その後、レスポンダーにおいては、主治医の裁量（例えば、ステロイド毒性）で、低減することができる（ＮＩＨのｃＧＶＨＤ基準に従う応答の記録後において）。他の免疫抑制医薬の漸減中の、臨床的に安定なｃＧＶＨＤは、有効性のエビデンスと考えられ、他の免疫抑制治療の漸減中の、ｃＧＶＨＤの進行は、毒性または有効性の欠如のエビデンスと考えられないことに留意されたい。
【０３６８】
長期治療：研究期間（８週間のＩＬ−２研究処置および４週間のＩＬ−２の中止）を完了した後で、許容可能な毒性プロファイルで、臨床的利益（完全または部分応答のほか、部分応答についてのＮＩＨ基準を満たさないわずかな応答）を享受する参加者には、主治医の裁量で、長期ＩＬ−２処置を持続することを許容する。参加者を、長期ＩＬ−２療法の６カ月後ごとに再評価して、ＩＬ−２療法の持続の根拠を記録する主治医の裁量で、ＩＬ−２療法を持続すべきかどうかを決定する。
【０３６９】
長期ＩＬ−２療法中の参加者は、フェーズＩの毒性評価項目について（例えば、細胞用量漸増／漸減の目的で）評価不可能である。長期ＩＬ−２中における、他の免疫抑制医薬の漸減は、主治医の裁量下にある。長期治療を持続する参加者のために、応答を増強する他のｃＧＶＨＤ治療の追加を、主治医の裁量で許容する。ＩＬ−２に帰せられる毒性が生じた場合は、ガイドラインに従い、主治医の裁量で、用量の改変を許容する。長期ＩＬ−２療法中、参加者を、以下に提案されるスケジュール：１）４週間（±２週間）ごとの、ＩＬ−２の毒性および臨床的利益を評価するための、診療所来院および検査室検査（ＣＢＣ、クレアチニン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン）；２）定量的血清免疫グロブリン；血漿バンキング；およびさらなる単核細胞の保存を含む８週間（±２週間）ごとの免疫アッセイ；ならびに３）ＩＬ−２処置の開始から１年となるか、または参加者が、ＩＬ−２療法を停止する場合のいずれかが先に生じるまで、１６週間（±４週間）ごとのｃＧＶＨＤ評価およびｃＧＶＨＤの症状スコアシートで評価する。
【０３７０】
以下の評価は、全ての参加者について、処置の前２週間以内に実施する：１）病歴および患者の疾患の処置についての根拠（ステロイド用量を含む）についての記録；２）バイタルサイン、体重、パフォーマンスステータスを含む身体検査；３）ｃＧＶＨＤ評価；４）出産の潜在的可能性がある女性についての妊娠検査；５）感染性疾患マーカーについての検査；６）肺機能検査（４週間前以内）；７）血液学：鑑別を伴う全血球計算（ＣＢＣ）；８）血清化学：グルコース、ＢＵＮ、クレアチニン、尿酸、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＬＤＨ、総タンパク質、アルブミン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびカルシウム；９）甲状腺機能検査（ＴＳＨ、Ｔ４、遊離Ｔ４）；１０）ＣＭＶウイルス負荷；ならびに１１）免疫学：定量的血清免疫グロブリン；血漿バンキング；およびさらなる単核細胞の保存。
【０３７１】
以下の評価が、ｃＧＶＨＤが特異的な臓器系に及ぶ参加者について、そうでないことが示されない限りにおいて、処置の前２週間以内に必要である：１）眼のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための（任意選択の）、シルマー試験を伴う眼検査；２）皮膚のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための皮膚評価；３）口腔のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための（任意選択の）口腔検査（±生検）；および４）ｃＧＶＨＤと関連する拘縮または筋骨格病変を伴う個体のための、罹患関節についての屈曲評価。
【０３７２】
処置期間中（１、２、３、４、６、８週目の終了時）、ＩＬ−２の中止期間中（１０、１２週目の終了時）、および長期観察期間中（１６、２０、２４週目の終了時）の評価は、１）病歴および臨床検査；２）既往歴および臨床検査と同じ日に行われる毒性評価；３）血液学：鑑別を伴うＣＢＣ；４）血清化学：グルコース、ＢＵＮ、クレアチニン、尿酸、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＬＤＨ、総タンパク質、アルブミン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびカルシウム；５）ＣＭＶウイルス負荷；６）免疫学：定量的免疫グロブリン；血漿バンキング；およびさらなる単核細胞の保存；ならびに７）甲状腺機能検査（ＴＳＨ、Ｔ４、遊離Ｔ４）（８、１６、２４週目）を含む。
【０３７３】
ｃＧＶＨＤが特異的な臓器に及ぶ参加者については、以下の評価（ｃＧＶＨＤの症状スコアに加えた）が、そうでないことが示されない限りにおいて、８週間の研究処置の終了時およびステロイド漸減時に必要である（早期の場合）：１）ステロイド用量；２）眼のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための（任意選択の）、シルマー試験を伴う眼検査；３）皮膚のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための皮膚評価；４）口腔のｃＧＶＨＤを伴う参加者のための（任意選択の）口腔検査（±生検）；５）ｃＧＶＨＤの肺症状発現を伴う参加者のための肺機能検査；および６）ｃＧＶＨＤと関連する拘縮または筋骨格病変を伴う個体のための、罹患関節についての屈曲評価。
【０３７４】
Ｔｒｅｇ濃縮細胞の注入についての有害事象のリスト：悪性疾患の再発を処置するための、非選択ドナーリンパ球注入は、Ｔｃｏｎに媒介されるＧＶＨＤ発赤と関連し、主に、骨髄に及ぶ著明な白血病／リンパ種の症例では、骨髄抑制と関連している。しかし、Ｔｒｅｇは、Ｔｃｏｎの主要な抑制因子であり、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳによるＴｒｅｇ濃縮生成物は、１：２のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比であっても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抑制性であり、活動性のＧＶＨＤも悪性疾患の再発も伴わないＨＳＣＴレシピエントにおいて、１ｋｇ当たり最大で細胞４×１０６個の注入の後で毒性は報告されていない（Ｄｉ  Ｉａｎｎｉら（２０１１年）、Ｂｌｏｏｄ、１１７巻：３９２１〜３９２８頁）。したがって、開始用量レベルを、１ｋｇ当たりの細胞０．５×１０６個とし、５０％以上のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  ＣＤ１２７−  Ｔｒｅｇ（抑制効果のある、１：２のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比を上回る）を含有する、Ｔｒｅｇ濃縮生成物の注入は、安全であると考えられる。ＧＶＨＤの進行および骨髄抑制をモニタリングして、活動性のｃＧＶＨＤにおける、Ｔｒｅｇ濃縮細胞の注入の安全性を確認する。
【０３７５】
以下の表は、記録のためのデータの要約である。
【表１８】
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【０３７６】
毒性および応答の両方について評価する。Ｔｒｅｇ濃縮細胞の注入を施される参加者は、毒性について評価可能である。Ｔｒｅｇ濃縮細胞の注入に加えて、少なくとも６週間のＩＬ−２を施された参加者は、応答の欠如について評価可能であると考えられる。これらの参加者は、本明細書で言明される定義に従い分類される応答を示す。例えば、かつ、実施例２における定義に加えて、慢性ＧＶＨＤ症状スコアとは、確認された慢性ＧＶＨＤ症状スケールを使用した、参加者の自己報告によるｃＧＶＨＤの症状および徴候を指す。自己報告される症状スケールは、ベースラインおよび８、１０、１２週目の終了時（および、必要な場合、８週目の前の、早期ステロイド漸減時）において得られる。慢性ＧＶＨＤのためのステロイド使用とは、参加者のコルチコステロイドの総１日用量が、ベースラインおよび８週間のＩＬ−２の終了時において記録されていることを指す。コルチコステロイドの毎日の代替的投与の場合、研究目的で、平均１日用量を記録する。免疫評価とは、参加者が、ＩＬ−２を開始する前、ならびに１、２、３、４、６、８、１０、１２、１６、および２４週目の終了時に実施される、免疫機能についての検査を受けることを指す。検査は、定量的免疫グロブリン、血漿バンキング、およびさらなる単核細胞の保存を含む。
【０３７７】
このフェーズＩ研究の主要評価項目は、１×１０６ＩＵ／ｍ２／日の皮下ＩＬ−２と共に、全身療法を必要とするステロイド不応性慢性ＧＶＨＤを有する参加者に施される、Ｔｒｅｇ濃縮細胞のＭＴＤを決定することである。ＭＴＤは、８週間のＩＬ２処置後に、ＤＬＴにより評価する。Ｔｒｅｇ濃縮細胞の３つの漸増用量が、ＭＴＤ：１ｋｇ当たりの細胞０．１×１０６個（用量レベルＡ）；１ｋｇ当たりの細胞０．３×１０６個（用量レベルＢ）；１ｋｇ当たりの細胞１×１０６個（用量レベルＣ）を決定すると考えられる。文献では、１ｋｇ当たり最大でＴｒｅｇ濃縮細胞４×１０６個の用量は、良好に忍容されたが、本研究では、１ｋｇ当たりのＴｒｅｇ濃縮細胞０．１×１０６個を、初期の用量レベルとして、解析の緩衝域を設ける。リリース基準を満たす生成物を施される、評価可能な参加者５例のコホートが、各標的用量レベルに参入する（初期の参加者４例が登録された後に、２８日間の中断を伴う）。ＤＬＴを発症せずに、研究からの早期除外を必要とする場合、参加者は、ＭＴＤの決定について評価不可能であると考えられる。追加の参加者を、特異的な用量コホートに登録して、研究から除外された、コホート内の任意の参加者の代役とする。参加者５例のコホート内で≦１ＤＬＴが観察される場合は、用量漸増を行う。これが用量レベルＣである場合は、この用量をＭＴＤとする。コホート内で≧２ＤＬＴが観察される場合は、ＭＴＤを超えたと考える。これが用量レベルＡである場合は、登録を停止する。これが用量レベルＢである場合は、用量レベルＡをＭＴＤとする。これが用量レベルＣである場合は、用量レベルＢをＭＴＤとする。
【０３７８】
このデザインでは、真であるが未知のＤＬＴ率が、１０％である場合、用量漸増の確率は、０．９２であり；ＤＬＴ率が２０％である場合、０．７４であり、ＤＬＴ率が４０％である場合、０．３４である。下記の表１９は、用量漸増の動作特性を示す。
【表１９】
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【０３７９】
ＭＴＤを確立したら、さらなる１０例の評価可能な参加者を、ＭＴＤで処置する。１０例の評価可能な参加者では、毒性についての９０％の信頼区間の最大幅は、±２８％以内である。試料サイズは、被験用量レベルの数に応じて、評価可能な参加者約２〜２５例の範囲となろう。
【０３８０】
副次的評価項目もまた、解析する。例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ評価を実施する。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳデバイスを使用して、成功裏のＴｒｅｇ濃縮注入生成物を達成する実行可能性を評価する。白血球アフェレーシス生成物は、それが、細胞生存率≧７０％であり、微生物について陰性であることを含有する場合、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳによる選択の実行可能性の決定のために適格であると考えられる。注入されるＣｌｉｎｉＭＡＣＳ生成物は、加工の後で、細胞生存率≧７０％であり、グラム染色／内毒素が陰性であり、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋細胞≧７０％であり、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  ＣＤ１２７−Ｔｒｅｇ≧５０％であることを含有し、ＭＴＤ評価に適格である。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ系は、ＭＴＤの決定に適格な生成物率（実行可能率）が、８０％またはそれ超である場合は、実行可能であると考えられ、５０％またはそれ未満である場合は、実行不可能であると考えられる。最初の１０例の生成物中、６またはそれ未満の生成物がこれらの基準を満たす場合、系は、実行不可能であると考えられる。逆に、最初の１０例の生成物中≧７例が基準を満たす場合は、研究を進める。この決定規則によれば、真であるが未知の実行可能性率が、５０％である場合に、早期に停止させる確率は、０．８３であり、実行可能性率が８０％である場合、０．１２である。標的とされる細胞用量レベルを満たすＴｒｅｇ濃縮生成物を製造する実行可能性もまた評価する。実際に達成される細胞用量が、標的とされる用量レベル未満である場合、投与される実際の細胞用量は、１０例の患者による拡大コホートのために選び出される、仮のＭＴＤに情報をもたらす。
【０３８１】
副次的評価項目はまた、完全応答および部分応答、安定病態および進行性疾患のほか、８週間の低用量ＩＬ−２を加えた、Ｔｒｅｇ濃縮注入の免疫学的効果を描出する、簡素で記載的な概要的統計によりまとめられる臨床応答も含む。副次的評価項目は主に、記載およびグラフにより解析する。特に、８週間の低用量ＩＬ−２を加えた、Ｔｒｅｇ濃縮注入の、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞に対する免疫学的効果を、処置前と処置後との間の、細胞数およびサイトカイン産生の変化の両方との関係で特徴付ける。加えて、試料サイズが許容する場合、応答についての臨床予測因子（患者および移植関連の）および生物学的予測因子（例えば、Ｔｒｅｇの数、Ｔｃｏｎの数、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比およびＴｒｅｇ機能）を探索する。
【０３８２】
また、応答をモニタリングする。少なくとも６週間のＩＬ−２を施される参加者は、プロトコールによる処置からの大きな逸脱があるとしても、または不適格であるとしても、応答の欠如について評価可能である。各参加者には、以下の類別：１）ＮＩＨ基準に従う完全ｃＧＶＨＤ応答、２）ＮＩＨ基準に従う部分的ｃＧＶＨＤ応答、３）ＮＩＨ基準に従う応答なし（安定病態を含む）、４）ＮＩＨ基準に従う進行性ｃＧＶＨＤ、５）悪性疾患の再発、６）毒性による早期の死、７）他の原因のための早期の死、または９）未知（評価不可能、不十分なデータ）のうちの１つを割り当てる。任意の慣例により、類別９は通例、臨床データベース中の任意の種類のデータについての「未知」の状態を指定する。
【０３８３】
毒性もまた、モニタリングする。Ｔｒｅｇ濃縮細胞生成物を施される全ての参加者は、毒性について評価可能である。ｃＧＶＨＤの進行（ＮＩＨ基準に従う）は、ＤＬＴであると考えられる。かつての研究では、８週間のＩＬ−２中に、主治医の判断に従い、さらなる治療またはステロイドの増大を必要とするような、ｃＧＶＨＤの進行を被る患者は見られなかった。参加者はまた、悪性疾患の再発および感染症についても評価する。
【０３８４】
（実施例４：体外フォトフェレーシス（ＥＣＰ）と組み合わせた、代表的な低用量ＩＬ−２治療レジメン）
以下では、ＥＣＰと組み合わせた低用量ＩＬ−２治療レジメンについての、代表的な非限定的実施形態を提示する。他の実施形態では、低用量ＩＬ−２治療レジメンを、実施例１および／または本明細書で記載されている方法であって、任意の実施例からの任意の組合せを含む方法による複数の可変用量によるＩＬ−２治療レジメンで置きかえることができる。例えば、かつ、そうでないことが言明されない限りにおいて、実施例２による基準を、完全にまたは部分的に、下記の実施例４で記載される基準と共に使用することができる。
【０３８５】
ＥＣＰの最も一般的な適応は、同種ＨＳＣＴの後における、グルココルチコイド不応性ｃＧＶＨＤである。急性ＧＶＨＤについてのマウスモデルにおける初期研究は、ＥＣＰの治療機構が、従来型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎ）により媒介される自己免疫応答および同種免疫応答を制御するように作用する、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に依存することを示す。しかし、ＥＣＰ  Ｔｒｅｇ仮説を裏付けるヒトデータは、ほとんど存在しない。これと並行して、グルココルチコイド不応性ｃＧＶＨＤのための、低用量インターロイキン２（ＩＬ−２）についてのヒト試験は、Ｔｒｅｇ数および機能の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増大と同時に、臨床応答を示す。しかし、処置された患者の半数は、臨床応答を示さず、長期ＥＣＰ期間中の免疫抑制剤の漸減は、緩徐であり、不完全なことが多い（Ｄｉｇｎａｎら（２０１２年）、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、５８巻：６２〜７８頁；Ｆｌｏｗｅｒｓら（２００８年）、Ｂｌｏｏｄ、１１２巻：２６６７〜２６７４頁）。１）定量的ＴｒｅｇおよびＤＣサブセットデータについて報告する、２）関与するサイトカイン変化について報告する、または３）これらの変化のうちのいずれかを、ＥＣＰ用量またはリンパ球アポトーシスの程度と相関させる、ＥＣＰ患者における研究は存在しない。ＥＣＰおよび低用量ＩＬ−２は両方とも、ｃＧＶＨＤにおける、測定可能な臨床有効性を示す。
【０３８６】
本明細書で記載される結果に基づき、組合せ介入の戦略は、ｃＧＶＨＤのほか、免疫応答の抑制が所望される他の状態も良好に抑制するために、Ｔｒｅｇの拡大を有意にモジュレートすると考えられる。ＩＬ−２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、Ｔｒｅｇに増殖および生存シグナルを送達する。
【０３８７】
実際、４例の対象は、不応性の皮膚のｃＧＶＨＤのために、本明細書で記載されるＩＬ−２およびＥＣＰを、既に施されていたが、副作用を示さなかった。４例全てが、３カ月で、皮膚の柔軟性の増大を伴う、客観的ｃＧＶＨＤ応答を示し、４例全てが、ＩＬ−２およびＥＣＰを持続することを選んだ。被験対象２例中２例が、単剤療法と比較して、ＩＬ−２およびＥＣＰによるｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの上昇を示したことは重要であった。ＩＬ−２に対してＰＲを示した患者１例が、長期ＩＬ−２療法期間中にＥＣＰを開始したところ、ＩＬ−２単独と比較して、ｃＧＶＨＤ臨床応答が増強され、Ｔｒｅｇは１．７倍に上昇した。ＥＣＰに対する応答が不十分な別の患者では、低用量ＩＬ−２の追加により、ＥＣＰ単独と比較した、Ｔｒｅｇの３３倍の上昇と共に、ｃＧＶＨＤの応答が誘導された。
【０３８８】
研究を、１〜１６週目における毎週２回のＥＣＰによる１６週間の試験へと拡張し、８〜１６週目中において、１×１０６ＩＵ／ｍ２／日で投与される毎日の低用量ＩＬ−２を逐次的に追加し、ＥＣＰ処置を、ｃＧＶＨＤに最適化することを目標とする。一部の実施形態では、研究は、１〜１２週目には、ステロイド不応性ｃＧＶＨＤを伴う患者に、ＥＣＰを施し、６〜１２週目には、低用量ＩＬ−２を逐次的に追加する１２週間の研究である。
【０３８９】
以下の患者集団基準を使用する：１）全身療法を必要とするｃＧＶＨＤを伴う患者。全身療法を必要とする、広範性ｃＧＶＨＤまたは限局性ｃＧＶＨＤを伴う患者は、適格である；および２）≧０．２５ｍｇ／ｋｇ／日（または同等量）の用量で、少なくとも４週間にわたるプレドニゾンに対する応答が不十分である。
【０３９０】
具体的な包含および除外基準については、下記で詳述する。
１）参加者数：２５〜３４例；
２）研究デザインおよび方法：
【化４】
2018500276.tif 000028
【０３９１】
安全性および有効性解析は、以下の通りである。主要評価項目は、ステロイド不応性ｃＧＶＨＤにおける、毎日の低用量ＳＣ  ＩＬ−２を加えたＥＣＰの全臨床応答率を決定することである。例えば、１６週目における全ｃＧＶＨＤ応答率、ＥＣＰに追加された、８週間毎日のＩＬ−２の毒性、低用量ＩＬ−２を加えたＥＣＰの免疫学的効果、低用量ＩＬ−２を加えたＥＣＰ中のプレドニゾンの使用、ならびに全生存および無進行生存、再発を伴わない死亡、ならびに研究登録の１年後における再発を評価することができる。副次的評価項目は、１）低用量ＳＣ  ＩＬ−２療法を加えたＥＣＰの毒性を決定すること；２）毎日の低用量ＳＣ  ＩＬ−２を加えたＥＣＰの免疫学的効果を評価すること；３）低用量ＩＬ−２療法を加えたＥＣＰを伴う、進行中のプレドニゾン使用を決定すること；ならびに４）全生存、無進行生存、再発を伴わない死亡、および低用量ＩＬ−２を加えたＥＣＰを開始した１年後における再発を評価することである。
【０３９２】
参加者は、以下の適格性基準に従い選択する。
１）骨髄破壊的または非骨髄破壊的前処置レジメンによるＨＬＡ  ８抗原中７〜８抗原をマッチさせた、成人ドナーの同種幹細胞移植のレシピエント；
２）参加者は、ステロイド不応性ｃＧＶＨＤを有さなければならない。ステロイド不応性ｃＧＶＨＤとは、≧０．２５ｍｇ／ｋｇ／日（または０．５ｍｇ／ｋｇずつ隔日）で、少なくとも４週間にわたるプレドニゾンの使用（または代替的なコルチコステロイドの同等の投与）にも拘らず、ｃＧＶＨＤの遷延性の徴候および症状（表２および３）を有し、徴候および症状の完全な消失を伴わないことと規定される。全身療法を必要とする、広範性の慢性ＧＶＨＤまたは限局性の慢性ＧＶＨＤを伴う患者は、適格である；
３）登録前の４週間にわたる、安定用量のコルチコステロイド；
４）登録前の４週間にわたり、他の免疫抑制医薬（例えば、カルシニューリン阻害剤、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル）の追加または削減を伴わない。免疫抑制薬の用量は、その薬物の治療範囲に基づき調整することができる；
５）患者年齢≧１８歳とする。＜１８歳の参加者におけるＩＬ−２の使用についての投与または有害事象データは、現在入手可能ではないため、小児は、この研究から除外する；
６）推定平均余命が３カ月より長いこと；
７）ＥＣＯＧパフォーマンスステータスを０〜２とする（表４）；
８）参加者は、規定される通りの十分な臓器機能を有さなければならない。ａ）肝臓：肝機能不全が、推定されるｃＧＶＨＤの症状発現でない限りにおいて、肝機能が十分である（総ビリルビン＜２．０ｍｇ／ｄｌ−ギルバート症候群を伴う患者において許容される例外；ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）／ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）≦２×ＵＬＮ）こと。ＬＦＴの異常を、ｃＧＶＨＤの唯一の症状発現として伴う患者には、登録の前に、肝臓生検についてのＧＶＨＤの記録が必要である。主治医が、ＬＦＴの異常を、肝臓ｃＧＶＨＤと符合すると記録する場合は、他の臓器系に及ぶ活動性のｃＧＶＨＤの文脈におけるＬＦＴの異常もまた、許容することができ、この状況では、肝臓生検は、必須でなくなる；ｂ）腎：血清クレアチニンが、施設の正常限界以内であるか、またはクレアチニンレベルが施設の正常値を上回る参加者については、クレアチニンクリアランス≧６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２であること；ｃ）増殖因子または輸血を伴わずに、ＡＮＣ＞１０００／ｍｍ３および血小板＞５０，０００／ｍｍ３により示される十分な骨髄機能；およびｄ）心臓：登録前６カ月以内の心筋梗塞またはＮＹＨＡクラスＩＩＩもしくはＩＶの心不全、制御不良の狭心症、重度の制御不良の心室性不整脈、あるいは急性虚血症または活動性伝導系の異常についての心電図によるエビデンスがないこと。研究への登録の前に、スクリーニング時における、任意のＥＣＧ異常は、研究者が、医療上関与性ではないものとして記録しなければならないこと；
９）ＩＬ−２の、発生しつつあるヒト胎児に対する効果は未知である。この理由で、かつ、化学療法剤は、催奇形性であることが公知であるため、出産の潜在的可能性のある女性および男性は、研究登録の前に、および研究参加期間にわたり、十分な避妊（産児制限のホルモンまたはバリア法；禁欲）を使用することに同意しなければならない。女性が、本研究に参加している間に、妊娠するかまたは妊娠していることが疑われる場合、その女性は、自らの主治医に速やかに通知するものとすること；ならびに
１０）書面でのインフォームドコンセント文書を理解する能力およびこれに署名する意向。
【０３９３】
参加者は、以下の除外基準に従い除外される：１）進行中のプレドニゾン要件＞１ｍｇ／ｋｇ／日（または同等量）；２）カルシニューリン阻害剤にシロリムスを加えた併用。どちらかの薬剤単独は許容可能である；３）血栓性微小血管症、溶血性尿毒症症候群、または血栓性血小板減少性紫斑病の既往歴；４）登録前４週間における、任意の新規の免疫抑制医薬への曝露；５）登録前４週間以内における、体外フォトフェレーシス（ＥＣＰ）またはリツキシマブ療法；６）ＥＣＰに対する任意の禁忌、すなわち、ヘパリンまたは８−ＭＯＰに対する禁忌；７）登録前１００日以内における、任意の新規の免疫抑制医薬（例えば、アレムツズマブ）に対する移植後曝露；８）登録前１００日以内におけるドナーリンパ球注入；９）活動性で悪性の再発；１０）活動性で制御不良の感染症；１１）ＩＬ−２処置レジメンに適合することが不可能；１２）制御不良の狭心症または症候性のうっ血性心不全（ＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶ；表９）；１３）臓器移植（同種移植片）のレシピエント；１４）組合せ抗レトロウイルス療法中のＨＩＶ陽性個体は、同種ＨＳＣＴの後で使用される薬剤との薬物動態相互作用の潜在的可能性のために、不適格であること。加えて、これらの個体は、致死性の感染症の危険性が増大している。適応の場合に組合せ抗レトロウイルス療法を施されている参加者においては、適切な研究が企図されている；１５）活動性のＢ型肝炎またはＣ型肝炎を伴う個体は、ＨＳＣＴ後における、致死性の処置関連肝毒性の危険性が高いので、不適格であること；１６）主要研究者により承認されない場合の、登録前４週間以内における他の被験薬；および１７）妊婦は、催奇形または堕胎作用の潜在的可能性のために、除外されること。母体の処置に続発して、乳児における有害事象の、未知であるが潜在的な危険性があるため、授乳は中断するべきである。
【０３９４】
対象は、以下の処置レジメンに従い処置する。
各研究参加者には、輸血薬についてのＳＯＰに従い、標準治療である、毎週２回のＥＣＰを、１６週間にわたり施す。略述すると、ＥＣＰは、Ｔｈｅｒａｋｏｓ  ＵＶＡＲ  ＸＴＳシステムにより実施する。加工される血液体積および８−ＭＯＰの投与は、製造元のガイドラインに従い、対象のヘマトクリットおよび血液体積により決定する。ＥＣＰ再循環バッグからの５００μＬのバフィーコートアリコートもまた、光活性化の前に回収し、ＷＢＣサブセットの絶対数について特徴付けることができる。ＥＣＰおよびＩＬ−２を加えたＥＣＰの免疫学的影響についての詳細な評価は、末梢血中のＴｒｅｇ、Ｔｃｏｎ、ＣＤ８、Ｂ、ＮＫ、およびＤＣ細胞のサブセットであって、アポトーシス集団を含むサブセットに対して実施することができる。サイトカインは、各ＥＣＰサイクルの後で測定する。ある時間にわたる、応答の、プレドニゾンの使用、全生存、無進行生存、再発を伴わない死亡、および再発についての解析を含む、免疫学的変数との関連もまた、決定する。アフェレーシス担当医は、出血、血球減少症、および手順に対する非忍容性（すなわち、全身症状または心血管の不安定性）を含むＥＣＰに関する毒性について評価することができる。任意のＥＣＰまたはＩＬ−２を加えたＥＣＰを施される参加者における処置毒性も、モニタリングする。以前のｃＧＶＨＤ治療の数の影響を含む、単変量解析などを使用して、応答についての予測因子もまた、決定する。
【０３９５】
臨床レスポンダーは、長期ＩＬ−２療法を伴うかまたは伴わずに、１６週目の後も、ＥＣＰを、標準治療として持続する。ＥＣＰの参加者が、８週目の前にさらなる治療を必要とするｃＧＶＨＤの増悪を被る場合、研究ＰＩとの相談の上で、早期に、低用量ＩＬ−２を開始することができる。８週目の後、参加者は、毎日の低用量ＳＣ  ＩＬ−２（１×１０６ＩＵ／ｍ２／日）を、残りの８週間のＥＣＰにわたり、すなわち、８週目の終了時〜１６週目までの自己投与として開始する。ＩＬ−２は、外来ベースで投与することが典型的である。予測される毒性および潜在的危険性のほか、用量の改変については、実施例２に記載されている。プレドニゾン（または同等のステロイド）は、ＩＬ−２との併用で持続し、用量の改変を伴わない。参加者の利益になるとみなされる（例えば、ステロイド毒性）場合は、主治医の裁量で、プレドニゾンの漸減を許容する。他の免疫抑制医薬の漸減中の臨床的に安定なｃＧＶＨＤは、ＩＬ−２の有効性のエビデンスと考えられ、他の免疫抑制治療の漸減中のｃＧＶＨＤの進行は、ＩＬ−２の毒性または有効性の欠如のエビデンスと考えられないことに留意されたい。
【０３９６】
他の実施形態では、毎週２回ずつ１２週間にわたるＥＣＰと、１×１０６ＩＵ／ｍ２／日で、６〜１２週目中の６週間のＩＬ−２とによる、１段階の単一アーム試験を、０．２５／ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、少なくとも４週間のプレドニゾンまたはその同等物に対する応答が不十分であり；総白血球カウント≧１０００／ｍｍ３、血小板≧２５，０００／ｍｍ３であり；以前にＥＣＰまたはＩＬ−２療法を受けていないｃＧＶＨＤ対象などの、ｃＧＶＨＤ対象に投与する。
【０３９７】
長期治療：１６週間の研究を完了した後で、許容可能な毒性プロファイルで、臨床的利益（完全または部分応答のほか、部分応答についてのＮＩＨ基準を満たさないわずかな応答）を享受する患者には、主治医の裁量で、長期ＩＬ−２処置を無期限に持続することを許容する。長期処置の再開は、正当な臨床上または運営上の理由のために、最大で２週間に限り遅延させることができる。処置の再開における、より長期の遅延は、主要研究者により承認されなければならない。長期ＩＬ−２中は、患者を、４週間ごとに再評価して、ＩＬ−２療法の持続の根拠を記録する主治医の裁量で、ＩＬ−２療法を持続すべきかどうかを決定する。
【０３９８】
長期ＩＬ−２についての毒性データは、進行中ベースで収集し、全ての処置に関するＳＡＥは、主要研究者およびＩＲＢに報告する。長期ＩＬ−２中における、他の免疫抑制医薬の漸減は、主治医の裁量下にある。ＩＬ−２に帰せられる毒性が生じた場合は、主治医の裁量で、本明細書で記載される用量の改変を許容する。
【０３９９】
長期ＩＬ−２療法中の患者について必要な評価は、以下を含む。１）４週間（±２週間）ごとの、ＩＬ−２の毒性および臨床的利益を評価するための、地元の診療所または研究センターへの来院。必要な検査室検査は、鑑別を伴うＣＢＣおよび血清化学（グルコース、ＢＵＮ、クレアチニン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、カルシウム）である。２）８週間（±４週間）ごとの研究センターにおける診療所への来院。必要な検査室検査（上記に加えた）は、定量的血清免疫グロブリン；血漿バンキング；およびさらなる単核細胞の保存を含む免疫アッセイである。
【０４００】
以下の評価を、全ての参加者について、ＥＣＰの前２週間以内に実施する：１）病歴および患者の疾患の処置についての根拠（ステロイド用量を含む）についての記録；２）バイタルサイン、体重、パフォーマンスステータスを含む身体検査；３）ｃＧＶＨＤ評価；４）出産の潜在的可能性がある女性についての妊娠検査；５）血液学：鑑別を伴う全血球計算（ＣＢＣ）；６）血清化学：グルコース、ＢＵＮ、クレアチニン、尿酸、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＬＤＨ、総タンパク質、アルブミン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびカルシウム；７）甲状腺機能検査（ＴＳＨ、Ｔ４、遊離Ｔ４）；８）ＣＭＶウイルス負荷；９）定量的血清免疫グロブリン；ならびに１０）免疫学：血漿バンキングおよびさらなる単核細胞の保存。
【０４０１】
以下の評価が、ｃＧＶＨＤが特異的な臓器系に及ぶ患者について（指示がある場合を除き）ＥＣＰの前２週間以内に必要である：１）眼のｃＧＶＨＤを伴う患者のための（任意選択の）、シルマー試験を伴う眼検査；２）皮膚のｃＧＶＨＤを伴う患者のための皮膚評価（±生検）；３）口腔のｃＧＶＨＤを伴う患者のための（任意選択の）口腔検査（±生検）；４）ｃＧＶＨＤの肺症状発現を伴う患者のための肺機能検査（処置前の４週間以内〜処置の１週間後）；および５）ｃＧＶＨＤと関連する拘縮または筋骨格病変を伴う個体のための、罹患関節についての屈曲評価。
【０４０２】
以下は、ＥＣＰおよびＩＬ−２による処置期間中（１、２、４、６、８、９、１０、１２、１４週目の終了時）、ならびに中止期間中（１６週目の終了時）の評価である：１）病歴および臨床検査（８および１６週目におけるステロイド用量を含む）；２）研究チームのメンバーによる投薬日誌の検討（ＩＬ−２処置と共に開始する）；３）毒性評価は、既往歴および臨床検査と同じ日に行う；４）血液学：鑑別を伴うＣＢＣ；５）血清化学：グルコース、ＢＵＮ、クレアチニン、尿酸、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＬＤＨ、総タンパク質、アルブミン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびカルシウム；６）ＣＭＶウイルス負荷（または施設の慣行に従う）；７）定量的血清免疫グロブリン（４、８、１２、１６週目）；８）免疫学：血漿バンキングおよびさらなる単核細胞の保存（１、２、４、６、８、９、１０、１２、１４、１６週目）；ならびに９）甲状腺機能検査（ＴＳＨ、Ｔ４、遊離Ｔ４）（１６週目）。
【０４０３】
以下は、ｃＧＶＨＤが特異的な臓器に及ぶ患者について（指示がある場合を除き）研究の８および１６週目の終了時に（ｃＧＶＨＤの症状スコアに加えて）必要な評価である。１）ｃＧＶＨＤ評価；２）眼のｃＧＶＨＤを伴う患者のための（任意選択の）、シルマー試験を伴う眼検査；３）皮膚のｃＧＶＨＤを伴う患者のための皮膚評価（±生検）；４）口腔のｃＧＶＨＤを伴う患者のための（任意選択の）口腔検査（±生検）；５）ｃＧＶＨＤの肺症状発現を伴う患者のための肺機能検査；および６）ｃＧＶＨＤと関連する拘縮または筋骨格病変を伴う個体のための、罹患関節についての屈曲評価。
【０４０４】
以下の表は、記録のためのデータの要約である。
【表２０】
2018500276.tif 000029
【０４０５】
毒性および応答の両方について評価する。少なくとも１つの用量のＩＬ−２を施される参加者は、ＩＬ−２処置の毒性について評価可能である。少なくとも４週間のＩＬ−２を施され、それらの疾患について再評価された参加者は、ＩＬ−２にＥＣＰ応答を加えた組合せについて評価可能であると考えられる。これらの参加者は、本明細書で提示され、下記で言明される定義に従い分類される応答を示す。例えば、かつ、実施例２における定義に加えて、慢性ＧＶＨＤ症状スコアとは、参加者が、確認された慢性ＧＶＨＤ症状スケールを使用して、ｃＧＶＨＤの症状および徴候について自己報告することを指す。自己報告される症状スケールは、ベースラインならびに８および１６週目において得られる。慢性ＧＶＨＤのためのステロイド使用とは、参加者のコルチコステロイドの総１日用量が、ベースラインならびに８および１６週において記録されていることを指す。コルチコステロイドの毎日の代替的投与の場合、研究目的で、平均１日用量を記録する。免疫評価とは、参加者が、ベースラインならびに１、２、４、６、８、９、１０、１２、１４、および１６週目に実施される、免疫機能についての検査を受けることを指す。検査は、血漿バンキングおよびさらなる単核細胞の保存を含む。定量的免疫グロブリンは、ベースラインならびに４、８、１２、および１６週目において調べる。
【０４０６】
ステロイド不応性慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）を伴う患者において、６〜１２週目にわたる、毎日の低用量皮下（ＳＣ）インターロイキン２（ＩＬ−２）を追加した、１２週間の体外フォトフェレーシス（ＥＣＰ）の有効性を評価する、１段階のフェーズＩＩ試験では、主要評価項目は、１２週の処置で評価される全応答である。プラセボと対比したＥＣＰについての無作為化フェーズ２試験（皮膚のｃＧＶＨＤによる応答率は４０％であり、皮膚以外のｃＧＶＨＤによる応答率は３３％である）（Ｆｌｏｗｅｒｓら（２００８年）、Ｂｌｏｏｄ、１１２巻：２６６７〜２６７４頁）に基づくと、ＥＣＰを加えたＩＬ−２は、全応答率が≧６０％である場合は効果的であるが、４０％以下の場合は無効である。このデザインによれば、真であるが未知の応答率が６０％である場合に、処置を効果的であると結論付ける確率は、０．８４であり、真の応答率が４０％である場合、０．０９である。同じ患者集団内の、かつてのフェーズ１  ＩＬ−２研究では、ベースラインＴｒｅｇカウントの中央値は、１μＬ当たりの細胞１６．８個であった。３４例の患者において、同様のベースラインＴｒｅｇカウントを仮定すると、有効サイズ（すなわち、その標準偏差で除した平均差）が１である場合、ＥＣＰの６週目における、Ｔｒｅｇカウントの、１μＬ当たりの細胞３３．６個への増大を検出する検出力は、＞９９％となり、有効サイズを０．６である場合、検出力は、９０％となる。ＩＬ−２を加えたＥＣＰによる、Ｔｒｅｇカウントに対する相乗効果もまた、考える。３４例の患者のうち、３０例が、１２週目の処置を完了し、Ｔｒｅｇが、６週目における３３．６から、１２週目における２００へと上昇する場合、有効サイズを１とすると、この差異を検出する検出力は、＞９９％となり、有効サイズを０．６とすると、検出力は、８７％となる。縦断的なデータ解析により、ある時間にわたるＴｒｅｇの増大を評価し、これが、ＥＣＰ単独またはＩＬ−２を加えたＥＣＰと関連するかどうかを決定する。免疫学的応答と臨床応答との関連付けも行う。
【０４０７】
本研究では、対象の性別を、包含または除外基準として使用せず、マイノリティーの登録者数に制限を設けない。２０１３年において、移植を受けた全ての患者の４１％は女性であり、患者の約１０％はマイノリティーであった。２０１３年の本発明者らによる移植プログラムにおいて自己報告された、この民族および性別に基づき、性別および人種により規定される亜群内で予期される登録者数を、下記の表２１にまとめる。
【表２１】
2018500276.tif 000030
【０４０８】
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが、具体的かつ個別に示された場合と同様に、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。利益相反の場合は、本明細書における任意の定義を含む本出願により処理する。
【０４０９】
また、ワールドワイドウェブ上のＴｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）および／またはワールドワイドウェブ上のｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により維持されているデータベースなど、公表されているデータベースへの登録と対応する受託番号を参照する、任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列も、参照によりそれらの全体において組み込まれる。
【０４１０】
同等物
当業者は、慣用的な実験だけを使用して、本明細書で記載される、本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識するか、またはこれらを確認することが可能であろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【図１】
2018500276.tif 000031
【図２】
2018500276.tif 000032
【図３】
2018500276.tif 000033
【図４】
2018500276.tif 000034
【図５】
2018500276.tif 000035
【図６】
2018500276.tif 000036
【図７】
2018500276.tif 000037
【図８】
2018500276.tif 000038
【配列表】
2018500276000001.app
【国際調査報告】
2018500276.tif 000039
2018500276.tif 000040
2018500276.tif 000041