(57)【要約】  少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロック及び少なくとも１つのポリブタジエンブロックを含むブロックコポリマーから形成されたベシクル；及びそのようなベシクルを含む膜。少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロック及び少なくとも１つのポリブタジエンブロックを含むブロックコポリマー（但し、該コポリマーは、４０個のブタジエン単位及び１９０個の２−メチル−２−オキサゾリン単位からなり、末端が水酸基であるダイブロックコポリマーではない）は新規であり、本発明の一部を形成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロック及び少なくとも１つのポリブタジエンブロックを含むブロックコポリマー、但し、該コポリマーは、４０個のブタジエン単位及び１９０個の２−メチル−２−オキサゾリン単位からなり、末端が水酸基であるダイブロックコポリマーではない。
【請求項２】
ブタジエン単位の数が、２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリン単位の数の少なくとも半分である請求項１に記載のブロックコポリマー。
【請求項３】
ブタジエン単位の数が、２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリン単位の数の少なくとも２倍である請求項２に記載のブロックコポリマー。
【請求項４】
５〜２００個のブタジエン単位及び５〜１８０個の２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリン単位を含む請求項１〜３のいずれかの請求項に記載のブロックコポリマー。
【請求項５】
（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロックの末端に、−ＯＨ以外の末端基を少なくとも１個有する請求項１〜４のいずれかの請求項に記載のブロックコポリマー。
【請求項６】
該末端基が、カルボキシ、活性化カルボキシ、アミン、メタクリレート、チオール、アジド、及びアルキンから選ばれる、請求項５に記載のブロックコポリマー。
【請求項７】
該末端基が、カルボキシ、活性化カルボキシ、又は式−ＮＨＲを有するアミン末端基から選ばれる請求項６に記載のブロックコポリマー、ここで、Ｒは、少なくとも１個の−ＮＨ２基で置換された炭素数１〜６個のアルキル基を表す。
【請求項８】
ブロックコポリマーが、ダイブロックコポリマー又はトリブロックコポリマーＡＢＡである請求項１〜７のいずれかの請求項に記載のブロックコポリマー、ここで、（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンがＡブロックを形成し、ポリブタジエンがＢブロックを形成している。
【請求項９】
(ポリ)２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンが、(ポリ)２−メチル−２−オキサゾリンである請求項１〜８のいずれかの請求項に記載のブロックコポリマー。
【請求項１０】
少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロック及び少なくとも１つのポリブタジエンブロックを含むブロックコポリマーから形成されたベシクル。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかの請求項に記載のブロックコポリマーを含む請求項１０に記載のベシクル。
【請求項１２】
異なるブロックコポリマー鎖のポリブタジエンブロック中に存在するＣ＝Ｃ二重結合が互いに架橋している請求項１０又は請求項１１のいずれかに記載のベシクル。
【請求項１３】
その中に膜貫通タンパク質を組み込んで有する請求項１０〜１２のいずれかに記載のベシクル。
【請求項１４】
膜貫通タンパク質が、アクアポリンである請求項１３に記載のベシクル。
【請求項１５】
薬物又は美容剤を含んでいる請求項１０〜１２のいずれかに記載のベシクル。
【請求項１６】
請求項１３又は請求項１４のいずれかに記載されたベシクルを含有する濾過膜。
【請求項１７】
多孔質担体及び、その担体表面に共有結合され、請求項１３又は請求項１４のいずれかに記載された、多数のベシクルを含む層を、含有し；該層内で、ベシクルが互いに共有結合して凝集した集団を形成している、請求項１６に記載の濾過膜。
【請求項１８】
請求項１３又は請求項１４のいずれかに記載されたベシクルの水性懸濁液を供給し；該ベシクル懸濁液を、多孔質担体の表面上にデポジットし；そして異なるベシクル間及びベシクルと該表面の間に、共有結合が形成されるような反応条件を供給することを含む、請求項１７に記載の濾過膜の製造方法。
【請求項１９】
下記のいずれかを含む、請求項１８に記載の方法：
(a)請求項１３又は請求項１４のいずれかに記載されたベシクルの水性懸濁液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有するブロックコポリマーから形成されている；
(b)ポリマーの末端基Ｘと反応する、少なくとも２個の反応性基Ｙを有する多官能性結合剤を供給する；
(c)ポリマーの末端基Ｘか又は反応性基Ｙと反応する表面を有する担体の上に、該ベシクル懸濁液及び該多官能性結合剤をデポジットする；及び
(d)末端基Ｘと基Ｙとの反応、及び末端基Ｘか又は基Ｙと該担体表面との反応を引き起こす；或いは
(aa)請求項１３又は請求項１４のいずれかに記載されたベシクルの第一の水性懸濁液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有するブロックコポリマーから形成されている；
(bb)請求項１３又は請求項１４のいずれかに記載されたベシクルの第二の水性懸濁液を供給する、該ベシクルはポリマーの末端基Ｘと反応する反応性末端基Ｙを有するブロックコポリマーから形成されている；
(cc)ポリマーの末端基Ｘか又はＹと反応する表面を有する担体の上に、該両ベシクル懸濁液をデポジットする；及び
(dd)末端基Ｘと末端基Ｙとの反応、及び末端基Ｘか又は末端基Ｙと該担体表面との反応を引き起こす。
【請求項２０】
工程(b)の多官能性結合剤が、Ｎ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートである請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブロックコポリマーから、特にブタジエン及び２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンのブロックコポリマーから、形成されたベシクル（vesicles）に関する。また、本発明は、そのようなベシクルから形成された膜(membranes)に関する。殆どのポリブタジエン／（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロックコポリマーは新規であり、そしてこれらの新規なブロックコポリマーも、本発明の一部を構成する。
【背景技術】
【０００２】
本来、ベシクル及び細胞は、両親媒性の脂質から構築されコレステロールによって支持されたナノ−コンテナー（nano-containers）である。両親媒性ブロックコポリマーは、人工ベシクルの製造において使用するための合成用代替物として、研究されてきたが、研究されたブロックコポリマーの多くは非常に小さく、（ポリ）２−メチル−２−オキサゾリン（ＰＭＯＸＡ）／ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）／ＰＭＯＸＡ；及びＰＥＧ／ポリブタジエン（ＰＢ）の各コポリマーに、主に、絞られてきた。ＷＯ００／３７５４１は、親水性セグメント及び疎水性セグメントを含む新規な両親媒性ブロックコポリマーに関しており、一方、ＵＳ６，９１６，４８８は、両親媒性コポリマーから製造されたベシクルを開示している。ＵＳ６，９１６，４８８のベシクルは、薬物送達（drug delivery）又はナノリアクター(nanoreactors)として、使用されることができ、又その壁中に膜タンパク質を組み込ませることができる；そのコポリマーは、ＡＢ又はＡＢＡブロックコポリマーであることができ、ここで、Ａ及びＢの一方が親水性で他方が疎水性である。ＵＳ６，９１６，４８８の著者は、Ａ及びＢの広い範囲の可能な候補を挙げているが、例示した唯一のポリマーは、ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ポリ（ジメチルシロキサン）−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）である。ＵＳ６，７２３，８１４は、両親媒性コポリマーから形成された平面膜に関している。ＵＳ２００８／０３０５１４９は、薬物の粘膜送達のために、粘膜付着性基を有するブロックコポリマーベシクルの使用を開示している。
【０００３】
ＷＯ２００４／０１１６００は、アクアポリンを、トリブロックコポリマー中に組み込んで、全ての混在物を除いて水だけを通す膜を形成できることを、開示している。この開示以来、膜貫通タンパク質を組み込んだ膜を開発すべく、多くの研究がなされてきており、これらのいくつかは、ブロックコポリマーベシクルを用いて試みられた。例えば、ＷＯ２０１３／０４３１１８は、アクアポリンを含んでいるか又は含んでおらず、支持膜上のポリアミド層中に埋め込まれているベシクルの使用を開示している。そのコポリマーは、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ又は多くの他のコポリマー、即ちＥＯ−ＰＯ、ＥＯ−Ｂｄ、ＥＯ−ＰＤＭＳ及びＥＯ−ＢＯであってよい。ここで、ＥＯはエチレンオキシドであり、ＰＯはプロピレンオキシドであり、Ｂｄはブタジエンであり、そしてＢＯはブチレンオキシドである。
【０００４】
ポリエチレングリコール及びブタジエンの両親媒性コポリマーはよく知られている。例えば、M.A.ヒルマイアー（Hillmyer）及びF.S.ベイテス（Bates）、「ポリアルカン−ポリ（エチレンオキシド）ブロックコポリマーのモデルの合成及び特性評価」、Macromolecules, 29, 6994 (1996)を参照のこと。しかしながら、それらは、多くの不利益を有している。例えば、エチレンオキシドは、ガス状であるので、特に大量の場合、取扱いが困難である。なぜなら、それは、可燃性で、毒性が高く、高度に規制されている化合物であるからである。更に、エチレンオキシドの官能基化又は架橋は、容易ではない。
【０００５】
マックス・プランク／コロイド・界面科学研究所及びhttp://www.mpikg.mpg.de/48071/HORDYJEWICZ-BARAN_Dissertation.pdfから入手できる、ポツダム大学のゾフィア・ホーディジュビック−バラン（Zofia Hordyjewicz-Baran）による「親水的修飾したポリブタジエンの合成及び凝集挙動の研究」という表題の学位論文（dissertation）は、親水的に修飾したブタジエンのホモポリマー及びブロックコポリマーについて、記載している。コポリマーの中でも、水酸基末端ＰＢ４０−ｂ−ＰＭＯＸＡ１９０コポリマーが作成され、そしてこのコポリマーは２−メルカプトエチルアミン塩酸塩と反応せしめられ、それはポリブタジエンブロック中に存在する二重結合と反応する。ベシクルがこのコポリマーから製造し得るのか又は製造すべきなのかについての示唆は無く、このコポリマーの末端基をどんな方法で修飾すべきであるかについてのどのような示唆も無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ００／３７５４１
【特許文献２】ＵＳ６，９１６，４８８
【特許文献３】ＵＳ６，７２３，８１４
【特許文献４】ＵＳ２００８／０３０５１４９
【特許文献５】ＷＯ２００４／０１１６００
【特許文献６】ＷＯ２０１３／０４３１１８
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】M.A.ヒルマイアー及びF.S.ベイテス、「ポリアルキレン−ポリ（エチレンオキシド）ブロックコポリマーのモデルの合成及び特性評価」、Macromolecules, 29, 6994 (1996)
【非特許文献２】マックス・プランク／コロイド・界面科学研究所及びhttp://www.mpikg.mpg.de/48071/HORDYJEWICZ-BARAN_Dissertation.pdfから入手できる、ポツダム大学のゾフィア・ホーディジュビック−バランによる「親水的修飾したポリブタジエンの合成及び凝集挙動の研究」という表題の学位論文
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
我々は、ここに、少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロック及び少なくとも１つのポリブタジエンブロックを含むブロックコポリマー、特に特定の末端基を有するそのようなコポリマーが、ベシクル形成のために、又膜中で、用いられたときに、大きな利点を有していることを、見出した。特に、そのブロックコポリマーは非常に容易にベシクルを形成し；そのベシクルの大きさを調整することが容易であり；そのベシクルを安定化させることが容易であり；そして広範な反応を実施するように、容易に官能基化させることができる。更に、そのブロックコポリマーの透過性は、本来的に低く、又非常に低く調節することができ、そのことが、そのポリマーを、例えば薬物及び化粧品を含む物質の送達用のベシクルにおける使用を含む多くの応用のために、及び膜内における使用のために、価値あるものとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロック及び少なくとも１つのポリブタジエンブロックを含むブロックコポリマーから形成されたベシクルを、提供する。また、その中に組み込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクル、及びそのようなタンパク質含有ベシクルを含む濾過膜をも提供する。少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロック及び少なくとも１つのポリブタジエンブロックを含む、殆どのブロックコポリマーは、新規であり、本発明は、更に、新規なこれらのポリマーそれ自体を提供する。特に、本発明は、少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロック及び少なくとも１つのポリブタジエンブロックを含むブロックコポリマーを提供する。但し、当該コポリマーは、４０個のブタジエン単位及び１９０個の２−メチル−２−オキサゾリン単位からなり、末端が水酸基であるダイブロックコポリマーではない、即ち、ダイブロック水酸基末端ＰＢ４０−ｂ−ＰＭＯＸＡ１９０ではない。
【００１０】
ブロックコポリマー（Block copolymers）
本発明で用いられるブロックコポリマーは、少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリン（ＰＡＯＸＡ）ブロック及び少なくとも１つのポリブタジエン（ＰＢ）ブロックを含む。そのポリマーは、適切には、ダイブロックコポリマーＡＢ又は特にＢＡであり、又はトリブロックコポリマーＡＢＡである。ここで、ＰＡＯＸＡはＡブロックを形成し、ＰＢはＢブロックを形成する。
【００１１】
少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリン（ＰＡＯＸＡ）ブロック及び少なくとも１つのポリブタジエン（ＰＢ）ブロックを含むブロックコポリマーは、それらを、ベシクルの形成において用いるために特に適切にする、多くの特性を有している。
【００１２】
水酸基末端ＰＢ４０−ｂ−ＰＭＯＸＡ１９０を除けば、そのような全てのコポリマーは、新規であり、本発明の一部を構成する。本発明による適切なコポリマーは、ＰＡＯＸＡブロック中に、１９０より少ない２−アルキル−２−オキサゾリン単位を含んでいる。上記のホーディジュビック−バラン（Hordyjewicz-Baran）の学位論文において開示された特定の水酸基末端ＰＢ４０−ｂ−ＰＭＯＸＡ１９０ポリマーは、疎水性のブタジエン単位に比して、大きく優位な親水性のＭＯＸＡ単位を含んでおり、高度に親水性である。疎水性のブタジエン単位をより大きい割合で含むコポリマー、例えば、ＰＢブロック中のブタジエン単位の数が、ＰＡＯＸＡブロック中の２−アルキル−２−オキサゾリン単位の数の少なくとも半分であるコポリマー、例えばＰＢブロック中のブタジエン単位の数が、ＰＡＯＸＡブロック中の２−アルキル−２−オキサゾリン単位の数と少なくとも同じであるコポリマー、特にＰＢブロック中のブタジエン単位の数が、ＰＡＯＸＡブロック中の２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリン単位の数の２倍よりも多いコポリマー、は本発明の用途のために、特に価値がある。例えば、ＰＢブロック中のブタジエン単位の数対ＰＡＯＸＡブロック中の２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリン単位の数の割合が、１：１．７５よりも大きいのがよい。この割合は、親水性対親油性の割合１７．６４と同等である。
【００１３】
絶対値において、本発明のコポリマーは、少なくとも５、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のブタジエン単位、例えば２００まで、特に１６０まで、及び最も特に１２０までのブタジエン単位；及び少なくとも５、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリン単位、例えば１８９まで、特に１８０まで、例えば１６０まで、及び最も特に１２０までの２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリン単位を、含んでいるのが好ましい。
【００１４】
上記特徴のいずれか１つ又はそれ以上とは別に又は上記特徴のいずれか１つ又はそれ以上に加えて、特定の態様において、本発明は、少なくとも１つのＰＡＯＸＡブロック及び少なくとも１つのＰＢブロックを含むコポリマーを提供する、但し、そのポリマーは−ＯＨ以外の末端基を有する、特にそのポリマーは（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロックの末端に−ＯＨ以外の少なくとも１つの末端基を有する；及び／又はそのコポリマーはトリブロックコポリマーである；及び／又はそのＰＡＯＸＡブロックは１９０より少ない；及び／又はそのブタジエン単位の数対２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリン単位の数の割合は４：１９よりも大きい；及び／又はそのＰＡＯＸＡブロック中のＣ１−３アルキル基はＣ2−３アルキルである。
【００１５】
（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロックにおけるＣ１−３アルキル基は、メチル、エチル又はプロピル又はそれらの混合物であってよい。好ましくは、その又は各（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロックは、（ポリ）２−メチル−２−オキサゾリンブロックである。本明細書を通じて、別段の解釈を要しない限り、Ｃ１−３アルキルのいずれの言及も、メチルの特定の言及を含むと解釈されるべきである。
【００１６】
前述のホーディジュビック−バランの学位論文は、ブロックコポリマーの一つの特定の製造方法を開示している。重合によるブロックコポリマーの合成は、良く知られており、そして出発セグメント上で共重合される１以上のセグメントの長さは、共重合のために加えられるモノマーの量を調節することによって、及び／又は適当な連鎖停止キャッピング剤を添加することによって、容易に調節することができる。
【００１７】
各ブロックの絶対的及び相対的長さは、ベシクル形成用のコポリマーの適合性の決定において重要であることが、当分野で知られている（いわゆるポリマー疎水性割合）。更に、本発明ベシクルの所期の用途の一つが、以下に述べる様に、膜貫通タンパク質を、その中に組み込んで有するベシクルから膜を形成することにあるので、本願で意図するポリマー中の各ブロックの長さは、好ましくは、ベシクル壁の厚さが、膜貫通タンパク質がベシクル壁中に、チャネルが封鎖されることなく、容易に組み込まれ得るように、膜貫通タンパク質の長さと広範に相当するようであるべきである。例えば、ベシクル壁の厚さは、１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内であることができる。疎水性のポリブタジエンブロックの長さは特に重要であり、そしてこれは、好ましくは、２００反復単位よりも大きくあるべきではない。
【００１８】
ポリマー鎖上の両末端基は、互に同じであってもよく、又は異なっていてもよい。もしも、ＢＡダイブロックコポリマーのＢブロックがポリブタジエンである場合、そのブロックの末端基は、一般に、合成に従って、ＰＢ重合のために用いた開始剤に依存する基を含むであろう。例えば、もしもアルキルリチウム開始剤のＲ−Ｌｉを用いた場合、それは、アルキル基Ｒを含むだろう。開始剤は、例えばsec−ブチルリチウムであってもよく、その場合、末端基は、sec−ブチル基であろう。ＰＢブロックの各繰り返し単位は、勿論Ｃ＝Ｃ二重結合を含むであろう。Ａ（ＰＡＯＸＡ）基の末端基は、成長するポリマー鎖を停止するために用いる手段に依存するであろう。ＡＢＡトリブロックコポリマーにおいて、両末端基はＰＡＯＸＡ基にあるであろうし、一方中間のＢブロックは、架橋が無い場合には、Ｃ＝Ｃ二重結合を含むであろう。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、ブロックコポリマーのＰＡＯＸＡブロックは、−ＯＨ基以外である末端基を含む。適切な末端基の選択により、ベシクル形成を促進でき、又はポリマーの以降の反応のために官能性を提供できる。特に、好ましい末端基としては、カルボキシル基及び活性化カルボキシル基；アミン基；メタクリレート基；チオール基；アジド基；及びアルキン基が含まれる。一つの好ましい態様において、そのブロックコポリマーは、そのＰＡＯＸＡブロックの末端に少なくとも１つのカルボキシル末端基を含んでいる。他の好ましい態様において、そのブロックコポリマーは、−ＮＨ２基を含むＰＡＯＸＡ基の末端に末端基を含んでいる。特に好ましくは、−ＮＨ２及び−ＮＨ−基の両者を含む末端基、即ち一級及び二級アミン基の両者を含む末端基である。
【００２０】
必要な末端基は、コポリマーの初期合成に続いて存在していてもよいし、コポリマー合成に続いて導入されてもよい。もしも、初期合成に続いて存在していない場合は、適切なブロックの末端で、適当な反応によって適切な末端基を導入することが可能である。この目的のために、成長するセグメントの重合を、適当な鎖長に達してその鎖端にキャップされた開始基が存在した後に、止めることができる。例えば、水を用いたキャッピングは−ＯＨ末端基の結果となるであろうし、一方適切なアミンでのキャッピングはアミン末端基へと導くであろう。代替的に、キャッピングは、他のどんな望ましい停止剤を用いても行うことができ、必要な末端基は、公知の化学を用いて、導入することができる。例えば、停止は、ＫＯＨ／ＭｅＯＨ又はセグメントの成長末端の不飽和基を用いて、行うことができる。その末端基は、次いで、従来の化学を用いて、必要な基を導入するために、反応させることができる。
【００２１】
本発明の特に好ましい態様では、ブロックコポリマーは、式−ＮＨＲを有する少なくとも１つの末端基Ｘで終結する。ここで、Ｒは、少なくとも１個、例えば１、２又は３個の−ＮＨ２基で置換された炭素数１〜６個の直鎖状又は分枝状であってよいアルキル基を表す。好ましくは、そのような末端基Ｘは、式−ＮＨ−ＣＨ−(ＮＨ２)２又は、好ましくは、−ＮＨ−(ＣＨ２)ｎ−ＮＨ２を有しており、ここで、ｎは２〜６、好ましくは２〜４の整数、特に２である。そのような末端基は、−ＯＨ末端基を有するポリマーを、適当な反応性アミンＮＨ２Ｒと反応させることによって、導入することができる。この反応性アミンとしては、例えばジアミン、例えばＨ２Ｎ−(ＣＨ２)ｎ−ＮＨ２、特にＨ２Ｎ−(ＣＨ２)２−ＮＨ２、又はトリアミン、例えばＮ([ＣＨ２]ｎＮＨ２)３又はＣＨ([ＣＨ２]ｎＮＨ２)３、例えばＣＨ(ＮＨ２)３又はトリス(３−アミノプロピル)アミンである。分枝状のオリゴマーイミン類も又使用できる。代替的に、上述したように、成長するポリマー鎖は、適当なアミンを用いて、キャップされることができる。
【００２２】
末端基についての更なる情報は、後記の「膜」の項で、提供される。
【００２３】
ベシクル（Vesicles）
少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロック及び少なくとも１つのポリブタジエンブロックを含むブロックコポリマーは、ベシクル形成用として特に適切であることが見出された。そして、本発明は、そのようなコポリマーから形成されたベシクルを提供する。
【００２４】
本発明のベシクルは、当分野で良く知られている方法で、ブロックコポリマーから調製することができる。一般的には、これらの方法は、溶剤置換か又は溶剤を用いない再水和を含む。溶剤置換法においては、ブロックコポリマーは、水と混合する前に、有機溶剤に溶解される。混合後、及び任意に有機溶剤除去後、自発的に自己集合して、結果としてベシクルを生成する。溶剤を用いない再水和においては、乾燥したブロックコポリマーは、水性媒体と接触せしめられ、そこで、水和が起こり、自発的に自己集合したベシクルを結果的に生成する。溶剤を用いない再水和の特別な場合の薄膜（thin-film）再水和方法では、ブロックコポリマーは、有機溶剤に溶解され、次いで薄いフィルムが形成されるような条件下で有機溶剤が除去される。このフィルムは、次いで、水と接触させられて、水和され、そしてベシクルが、自己集合によって、形成される。代替的な公知のベシクル製造方法は、超音波処理の使用を包含する。超音波処理の程度が、形成されるベシクルの初期サイズを決定する。
【００２５】
本発明のブロックコポリマーは、当初は、しばしば、比較的大きなベシクル（「巨大単層ベシクル(Giant Unilamellar Vesicles)」，ＧＵＶｓと記載することがある）を形成する傾向がある。ＧＵＶｓは、一般に、１〜２０μｍ(microns)の直径を有している。望ましいサイズを有し、低い多分散性のベシクルは、当初に形成されたベシクルの集団から、公知の方法、例えば、ポアサイズが既知である一以上の膜(membranes)を通した、大きい単層及び多層の薄層状多分散ベシクル(uni- and multi-lamellar polydisperse vesicles)の押出によって、得ることができる。トラックエッチドポリカーボネートメンブレン、例えばミリポア社から市販のアイソポア（Isopore、商標）メンブレンは、この目的のために好適である。本発明のコポリマーから作成されるベシクルのサイズを調整するのは、公知のコポリマーからベシクルを作成する場合よりも、より容易であることが、見出された。特に、本発明のコポリマーを用いてＧＵＶｓを作成するのは、公知のコポリマーを用いる場合よりも、より容易である。本発明において、製造され又使用されるベシクルの最適なサイズは、それらの意図する用途に依存するだろう。例えば、ベシクルは、３０〜１０，０００ｎｍ、好ましくは５０〜１０００ｎｍ、より好ましくは１００〜４００ｎｍ、特に１５０〜２５０ｎｍの範囲の平均直径を有することができる。
【００２６】
ミセルの様な他の自己集合構造よりもむしろベシクルを形成するブロックコポリマーの性質は、各ブロックの絶対的及び相対的なサイズに依存する；このことは当分野で知られている。それはまた、ポリマー末端基の性質にも依存するが、このことは当分野で知られていない。例えば、ポリマーが−ＯＨ基末端であるとき、及び各ブロックが比較的高い分子量であるとき、ミセルが形成される傾向にあり、これは、もしもベシクルが必要であるならば、より低分子量のポリマーが好ましいことを意味している。驚くべきことに、カルボキシル基又はアミン基、特に−ＮＨ２及び−ＮＨ−基の両者を含むアミン基である、末端基の存在が、ベシクルの形成を促進する。
【００２７】
必要であれば、本発明のベシクルは、ＰＢブロック中の二重結合によって、内部架橋することができる。内部架橋は、公知の方法に類似した方法を用いて、例えば、開始剤を用いて、又はＵＶ光を用いて、行うことができる。内部架橋は、ベシクルの安定性を増加させ、多くの異なった適用例えば物質の送達において、それらを特に有用にする。代替的に、ベシクルの安定性は、適切な官能性末端基を用いて、ポリマー鎖を架橋することによっても、増加させることができる。ＰＢブロック中の二重結合によって、架橋することは、そのコポリマーから形成されるベシクルの透過性を低下させること、従って架橋がベシクルの透過性を制御して適合させる容易な方法を提供することも、見出された。
【００２８】
本発明の１つの好ましい態様は、少なくとも１つの（ポリ）２−Ｃ１−３アルキル−２−オキサゾリンブロック及び少なくとも１つのポリブタジエンブロックを含むブロックコポリマーから形成されたベシクルであって、それらの壁中に組み込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルを提供する。そのようなベシクルは、膜貫通タンパク質特にアクアポリンの存在下で、ベシクル形成工程を行うことによって、形成することができ、それによって、その膜貫通タンパク質は、ベシクルの壁中に組み込まれる様になる。一般的に、そのようなベシクルの形成工程は、そのタンパク質の完全性及び生物的機能を維持することを助長する界面活性剤（detergent）の存在下で、行われる。従って、上記再水和工程は、好ましくは界面活性剤も含む膜貫通タンパク質の水溶液を用いて、行うことができる。アクアポリンの使用が好ましく、そしてアクアポリンは、広範な製造条件下に、強健（robust）である。膜貫通タンパク質の更なる詳細は、後記の「膜貫通タンパク質」の項で、提示される。
【００２９】
その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルは、膜の形成における有用性を有する。これは、後記の「膜」の項で、論じられる。
【００３０】
膜の形成における有用性を有することは勿論のこと、ベシクルは、他の適用においても用いることができる。本発明のベシクルの更なる用途は、物質例えば薬物又は化粧品の送達（delivery）にあり、そして本発明のブロックコポリマーはこの用途に特に適切であり、何故ならば、それらは高い封入効率のベシクルに導かれるからである。加えて、本発明のコポリマーから形成されたベシクルは、公知のコポリマーから形成されたベシクル（界面活性剤に接触してその構造を失う傾向にある）よりも、界面活性剤に抵抗性であり、このことが、界面活性剤様分子を含む美容剤（cosmetic agents）の送達用に、本発明を特に適切にする。広範な様々な物質を、ベシクルの壁によって境界が定められた（defined）ベシクルの空洞（cavity）中に、多くの異なるルートによって、例えば、その物質を、ブロックコポリマーの製造中に、ブロックコポリマーに加えることによって、その物質を、ベシクル形成中に、ブロックコポリマーに導入することによって、又はベシクルを、その物質の溶液で、物質がベシクル中に吸収されるまで、処理することによって、含ませることができる。中でも考えられる物質は、薬物、美容剤、芳香剤（fragrances）、染料（dyes）、顔料（pigments）、光活性化合物（photoactive compounds）、金属粒子、ナノ粒子（nanoparticles）、生物ポリマー（biological polymers）、生物オルガネラ、細胞オルガネラ、及び化学試薬である。特に好ましいベシクルの用途は、薬物又は化粧品の送達の分野であり、本発明は、更に、薬物又は美容剤を含む、特にベシクルの壁によって境界が定められた空洞（cavity）中に薬物又は美容剤を含む、本発明のベシクルを提供する。広範な様々な薬物又は美容剤、例えば、小分子薬物（small molecule drugs）、毒素（toxins）、細胞毒薬物（cytoxic drugs）、遺伝子又はＲＮＡ、及びタンパク質例えば治療用タンパク質又は酵素を含む適切な薬物を、使用することができる。
【００３１】
本発明のベシクルは、末端官能基を有するコポリマーから製造できるので、標的分子と、例えば、標的例えば抗体又は抗体フラグメント上の結合相手と結合することができる結合タンパク質と、これらの末端基を介して、共有結合されることができる。従って、本発明は、ミサイル療法（targeted drug delivery）の分野において、有用性を有する。
【００３２】
膜（Membranes）
本発明は、更に、その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有する多数の本発明のベシクルを含有する濾過膜(filtration membrane)を提供する。そのような膜の好ましい構造は、２０１４年３月２６日の英国出願１４０５３９０からの優先権を主張する、我々の同じくペンディング中のレファレンスＮｏ．Ｐ０２１８８９ＷＯの出願中に記載されており、それは、多孔質担体及び、その担体表面に共有結合され、その中に組み込まれた膜貫通タンパク質を有する多数のベシクルを含む層を、含有し、該ベシクルは両親媒性のブロックコポリマーから形成されている、濾過膜であって；該層内で、ベシクルが互いに共有結合して凝集した集団（coherent mass）を形成していることを特徴とする濾過膜に関する。本発明のベシクルは、そのような膜において特に有用性を有する。そのような膜において、担体は、多数のベシクルが互いに密に充填したベシクル層を有している（carries）。層中の充填は、例えば、六方密充填（hexagonal close packing）であってよい。担体表面に存在するベシクル層は、ベシクルの平均直径よりも厚く、即ち、それはベシクルの単層により供されるだろう厚さよりも大きな厚さである。その層は、ベシクルの平均直径の少なくとも２倍、例えば少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１５０倍、及び最も好ましくは少なくとも２００倍に等しい厚さを有するべきことが好ましい。好ましくは、その層は、ベシクルの平均直径の５００倍を超えず、例えば３００倍を超えない。従って、例えば、その層は、ベシクルの平均直径の２〜５００倍、例えば５０〜３００倍、特に２００〜３００倍の厚さを有していてよい。絶対値において、ベシクル層の厚さは、好ましくは少なくとも０．０４μｍ、例えば少なくとも０.１μｍ、例えば少なくとも０．２μｍ、例えば少なくとも２μｍ、好ましくは少なくとも１０μｍ、より好ましくは少なくとも３０μｍ、及び最も好ましくは少なくとも４０μｍである。その層については、特に好ましい最大の厚さは無い。その層は、例えば１００μｍまでの厚さ、例えば６０μｍまでの厚さを有していてよい。よって、例えば、その層は、０．０４〜１００μｍ、例えば０．２〜１００μｍ、好ましくは１０〜６０μｍ、特に４０〜６０μｍの厚さを有していてよい。
【００３３】
強健性（robustness）の増加のため、完成した膜内のベシクル層は、好ましくは保護トップコーティング層又は担体層の反対側上に第二の担体層が、供されている。このトップコーティングは、例えば、ローリング工程の間の機械的損傷からの追加的保護を提供する。それは、例えば、親水性ポリマー、例えばポリビニルアルコールを含むことができる。
【００３４】
我々の同じくペンディング中の出願中に記載された構造の濾過膜は、その中に組み込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの水性懸濁液を供給し、該ベシクルは本発明のブロックコポリマーから形成されている；該ベシクル懸濁液を、多孔質担体の表面上にデポジットし（depositing）；そして異なるベシクル間及びベシクルと該表面の間に、共有結合が形成されるような反応条件を供給することを含む方法により、製造される。
【００３５】
好ましくは、その濾過膜は水濾過膜であり、そして好ましくはその膜貫通タンパク質はアクアポリンである。本明細書及び特許請求の範囲を通じて、別段の解釈を要しない限り、濾過膜への言及は、水濾過膜への特定的な言及を含むように解釈すべきであり、膜貫通タンパク質への言及は、アクアポリンへの特定的な言及を含むように解釈すべきである。
【００３６】
膜の製造方法は、いくつかの異なった方法で行うことができる。第一の好ましい態様においては、その方法は下記を含む：
(a)その中に組み込まれた膜貫通タンパク質を有する本発明のベシクルの水性懸濁液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有するブロックコポリマーから形成されている；
(b)ポリマーの末端基Ｘと反応する、少なくとも２個の反応性基Ｙを有する多官能性結合剤を供給する；
(c)ポリマーの末端基Ｘか又は反応性基Ｙと反応する表面を有する担体の上に、該ベシクル懸濁液及び該多官能性結合剤をデポジットする（depositing）；及び
(d)末端基Ｘと基Ｙとの反応、及び末端基Ｘか又は基Ｙと該担体表面との反応を引き起こす。
【００３７】
第二の好ましい態様では、その方法は下記を含む：
(a)その中に組み込まれた膜貫通タンパク質を有する本発明のベシクルの第一の水性懸濁液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有するブロックコポリマーから形成されている；
(b)その中に組み込まれた膜貫通タンパク質を有する本発明のベシクルの第二の水性懸濁液を供給する、該ベシクルはポリマーの末端基Ｘと反応する反応性末端基Ｙを有するブロックコポリマーから形成されている；
(c)ポリマーの末端基Ｘか又はＹと反応する表面を有する担体の上に、該両ベシクル懸濁液をデポジットする；及び
(d)末端基Ｘと末端基Ｙとの反応、及び末端基Ｘか又は末端基Ｙと該担体表面との反応を引き起こす。
【００３８】
上記各方法は、任意に結合剤（linker）を介して互いに結合しており、又担体表面とも結合した、物理的に強健な本発明のポリマーベシクル層に、帰着する。
【００３９】
ブロックコポリマーの末端基の一方又は両者は、前述した末端基の一つであることができる。好ましくは、末端基の一方又は両者は、−ＮＨ２及び−ＮＨ−基の両者を含む基Ｘである。膜の製造方法で用いる全てのブロックコポリマー分子が反応性末端基を有すべきことは、必要ではない。反応性末端基を有するブロックコポリマーの割合は重要ではない。但し、ベシクルの二次的集団内か又は多官能性結合剤内の反応性基と反応して、凝集した集団を形成するのに十分な基があることを条件とする。一般的には、ベシクルを形成するために用いられるブロックコポリマー分子の少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％、又は１００％までが、官能性末端基Ｘ又はＹを有しているだろう。類似して、ただ一種類の末端基Ｘ又はＹが存在していることは、必要ではない。例えば、複数のブロックコポリマーのブレンドを用いることが望ましく、そのコポリマーの一つは一つの反応性末端基Ｘ(1)例えば−ＮＨ２基を含む末端基を含み、第二のコポリマーは異なる反応性末端基Ｘ(2)を含んでいる。
【００４０】
ある特定のブロックコポリマー分子上の末端基は互いに同じであってもよく、それらは異なっていてもよい。例えば、一つの末端基が反応性末端基Ｘであってよく、一方他の末端基が非反応性基であってよい。各基の正確な性質は、勿論、膜の製造方法の性質に依存するし、担体の表面の性質にも依存する。
【００４１】
好適な反応性基としては、アミン基（例えば、カルボン酸基、活性化カルボン酸基及び／又はアジド基と反応性）、カルボン酸基、活性化カルボン酸基及び／又はアジド基（例えば、アミン基Ｙと反応性）、及び「クリックケミストリー」基（例えば、アジド基又はアルキン基、これらはそれぞれアルキン基又はアジド基Ｙと反応性である）を；同様にＰＢブロック中に存在するＣ＝Ｃ二重結合をも、包含する。アミン基の使用が、特に好ましい。
【００４２】
広範な種類のアミン系末端基を利用でき、そしてこれらは−ＮＨ２基及び／又は−ＮＨ−基を含むことができる。そのような末端基を有する、少なくとも１つのＰＡＯＸＡブロック及び少なくとも１つのＰＢブロックを含むブロックコポリマーが供給されるとき、そのブロックコポリマーが自己集合してベシクルとなる能力が高められることが見出された：これは驚きであり、一般的に、ベシクル形成に最も影響を与える両親媒性ブロックコポリマーの特性は、(i)その各ブロックのサイズと性質；及び(ii)そのポリマーの多分散性であることが予期される。
【００４３】
多官能性結合剤を用いるとき、その剤中に存在する反応性基は、互いに同じであっても、又はそれらが異なっていてもよい。それらは、ベシクル中に存在する相補的反応性基と及び／又は担体表面と反応するようであるのに違いない。望ましい基は、上述の通りである。多官能性試薬を用いるとき、その試薬は、例えば３又は４個の反応性基を含み得るが、好ましくはそれは２個の反応性基を含み、そしてここでの多官能性試薬へのあらゆる言及は、特に二官能性試薬への言及を含むと解釈されるべきである。
【００４４】
本発明の好ましい態様において、ベシクルはアミン基を包含する反応性基を含む；そして、活性化カルボン酸基又はアジド基例えばフェニルアジド基である相補的反応性基が供される。
【００４５】
上述の膜を製造するとき、担体表面は、１以上の工程において、相補的反応性基Ｘ（即ち、−ＮＨ２及び−ＮＨ−の両者を含む基）及び／又はＹと反応できる特定の反応性基Ｚを導入するために、官能基化されることができる。好適な基としては、アミン基（例えば、カルボン酸基又は活性化カルボン酸基Ｘ及び／又はＹと反応性）；カルボン酸基又は活性化カルボン酸基（例えば、アミン基Ｘ及び／又はＹと反応性）；及び「クリックケミストリー」基（例えば、アルキン基又はアジド基Ｘ及び／又はＹと反応性のアジド基又はアルキン基）を、包含する。表面の多段階官能基化の一つの例は、酸例えば塩酸を用いて、ポリアクリロニトリル表面を加水分解して、表面にカルボン酸基を導入することであり、それは、続いて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、活性化され、次いで、例えばプロパルギルアミンを用いてアルキン基に、又は例えばアミノ−トリエチレングリコール−アジドを用いてアジド基に、変換されることができる。しかし、本発明の他の態様では、担体表面の官能基化をする必要がないであろう。何故ならばＸ及び／又はＹが担体を形成している物質中に既に存在する基と反応できるからである。例えば、Ｙがアジド基であってよく：そのような基は、一度ＵＶ光で活性化されると反応性が高められて、担体物質中に存在する多くのポリマー中に存在するＣ−Ｈ結合と反応できるようになる。特に、アジド基殊にフェニルアジド基は、ポリスルホンと共有結合できる。ポリスルホンは、後述するように、本発明で用いる好ましい担体物質である。
【００４６】
活性化カルボン酸基に言及した場合、これは、あらゆる従来の活性化カルボン酸基を包含するものと解釈されるべきであり、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような活性化エステル、又は酸ハライドが包含される。そのような活性化技術は、当分野で良く知られている。好ましい態様において、活性化カルボン酸末端基は、カルボン酸基をＥＤＣ及びＮＨＳと反応させることによって調製される。これは、タンパク質のコンジュゲーション及び固定化の分野においてたびたび用いられる良く知られた技術である。カルボキシル基とＥＤＣ及びＮＨＳとの反応によって、アミン反応性のＮＨＳエステルの形成がされる結果となる。
【００４７】
多官能性結合剤を用いる場合、それが、Ｘ基及びＹ基と反応して、ベシクルと一緒に、結合が起きるように、十分に反応できる限りにおいて、その正確な性質は、決定的なことではない。
【００４８】
好適な多官能性結合剤としては、ホモ二官能性クロスリンカー(crosslinkers)、即ち両末端に同じ官能性を有するクロスリンカーを包含する。アミン基と結合できる例としては以下のものを包含する：
【００４９】
(i)ＮＨＳエステル類。代表的エステルは以下のものを含む：
【００５０】
ジスクシンイミジルグルタレート：
【化１】
2018515636.tif 000002
【００５１】
ビス（スクシンイミジル）ポリエチレングリコール：
【化２】
2018515636.tif 000003
例えば、ビス（スクシンイミジルペンタ（エチレングリコール））；
【００５２】
エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）：
【化３】
2018515636.tif 000004
【００５３】
３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）：
【化４】
2018515636.tif 000005
【００５４】
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）：
【化５】
2018515636.tif 000006
【００５５】
ジスクシンイミジルタルトレート：
【化６】
2018515636.tif 000007
【００５６】
このタイプの試薬は、弱アルカリ性条件下、例えばｐＨ７．２〜８．５、例えばｐＨ７．２〜８．０で、一級アミンと反応して、安定なアミド結合を生じる。反応温度は、典型的には、０〜３０℃の範囲、例えば４〜２５℃である。その反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを生成するが、これは透析又は脱塩によって除去できる。その反応は、例えば、ｐＨ７．２〜８．０のＰＢＳ緩衝液中、室温又は４℃で０．５〜４時間で、行うことができる。
【００５７】
スルホＮＨＳエステルは、ＮＨＳ環上に、−ＳＯ３基を含んでいる。これは、反応の化学には影響しないが、そのような試薬は水溶性を上昇させる傾向がある。
【００５８】
(ii)イミドエステル類。代表的イミドエステルは以下のもの（しばしば二塩酸塩として得られる）を含む：
【００５９】
ジメチルアジピミデート：
【化７】
2018515636.tif 000008
【００６０】
ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート：
【化８】
2018515636.tif 000009
【００６１】
ジメチルスベリミデート：
【化９】
2018515636.tif 000010
【００６２】
ジメチルピメリミデート：
【化１０】
2018515636.tif 000011
【００６３】
ジメチルアジピミデート：
【化１１】
2018515636.tif 000012
【００６４】
イミドエステルは、一級アミンと反応して、アミジン結合を生じる。一級アミンに対する特異性を確実にするために、反応は、典型的には、ホウ酸緩衝液中で、アミンを含まないアルカリ条件下（ｐＨ９〜１１、例えばｐＨ１０）で、行われる。
【００６５】
(iii)ゲニピン（genipin）、下記式を有する：
【化１２】
2018515636.tif 000013
【００６６】
(iv)エポキシド類、例えば下記トリグリシジルアミン：
【化１３】
2018515636.tif 000014
【００６７】
(v)ジアルデヒド化合物類、例えば、ＨＯＣ-(ＣＨ２)ｘ-ＣＨＯ、ここで、ｘは１〜６である。代表的なジアルデヒドとしては、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、及びフタルアルデヒドを包含する。
【００６８】
(vi)ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ。この試薬は水溶性であり、そしてもし望むならばＥＤＣ／ＮＨＳで活性化して、アミンとの反応性を供することができる。
【００６９】
好適な多官能性結合剤としては、ヘテロ二官能性クロスリンカー、即ち両末端に異なる官能性を有するクロスリンカーをも包含する。例としては以下のものを包含する：
【００７０】
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（通常、塩酸塩の形態で得られる）：
【化１４】
2018515636.tif 000015
【００７１】
カルビトール：
【化１５】
2018515636.tif 000016
【００７２】
エポキシド類、例えば、トリグリシドアラミン（triglycidalamine）;
ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２；
スルホスクシンイミジル  ６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート；
ポリ（２−ヒドロキシエチル−ｃｏ−２−メタクリロキシエチルアスパルタミド）；
【００７３】
Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート：
【化１６】
2018515636.tif 000017
【００７４】
ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド：
【化１７】
2018515636.tif 000018
【００７５】
膜の製造法は、「クリックケミストリー」を利用でき、それは、例えば、アジドとアルキンの反応を利用できる。例えば、一級アミンとＮＨＳエステルとの反応によって、アルキン基を、基Ｙとして、導入できる。多くのアジド−ＰＥＧ−アジドリンカーは、商業的に入手できる。
【００７６】
好ましくは、多官能性結合剤は、(ＣＨ２)ｍ鎖を含む、ここでｍは２〜２０、好ましくは３〜１０、特に３〜９である。特に好ましい二官能性結合剤は、市販品のＮ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートである。このものは、下記式を有する：
【化１８】
2018515636.tif 000019
【００７７】
スルホスクシンイミド基は、活性化されたカルボン酸エステルである反応性基Ｙであり、アミノ基と自発的に反応できる。フェニルアジド基は、光の無い条件下で不活性な基Ｙであるが、ＵＶ光を用いて活性化されたときは、反応性が高くなって、アミン基と容易に反応する。アミン基が無い場合には、活性化された基は、より低い反応性の基とも反応でき、ある環境下においてはＣ−Ｈ結合とさえ反応する；特に、それは、ポリスルホン中の芳香族性Ｃ−Ｈ基と反応することができる。
【００７８】
前記膜製造方法の工程(d)、即ち相補的反応基ＸとＹとの反応、及びＸか又はＹと担体表面との反応を起こすことを成し遂げる条件は、勿論、様々な反応性基の性質に依存するだろう。いくつかの態様では、反応性基は、好適な条件下に、一度一緒に接触すれば、互いに自発的に反応するだろう。他の態様では、光活性化基が存在しており、そこで反応物が互いに接触され、引き続いて光照射されて反応が起きる。好ましい態様では、末端基Ｘと接触して反応する第一の基Ｙ、及び末端基Ｘ及びＵＶ光で照射される担体表面と反応する第二の基Ｙを有する多官能性試薬を用いて、両機構が結合される。
【００７９】
従って、該方法の一つの態様の各工程は、以下の様に行うことができる：
(a)その中に組み込まれた膜貫通タンパク質を有する本発明ベシクルの水溶液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有するブロックコポリマーから形成されている；
(b)ポリマーの末端基Ｘと反応する、少なくとも２個の反応性基Ｙを有する多官能性結合剤好ましくは二官能性結合剤を供給する、基Ｙはポリマーの末端基Ｘと第一の反応条件設定下で反応する第一の反応性基Ｙ(1)、及びポリマーの末端基Ｘと、第一の反応条件設定下では反応しないが、第二の反応条件設定下では反応する第二の反応性基Ｙ(2)を含んでいる；
(b’)第一の反応条件設定下に、該ベシクルの水溶液を該多官能性結合剤と混合して、反応性基Ｙ(1)が、ポリマーの末端基Ｘと反応するようにする；
(c)得られた溶液を、望ましいベシクル層を生成するのに十分な量で、第二の反応性基Ｙ(2)と反応する担体上にデポジットする；及び
(d)第二の反応条件設定を適用することによって、末端基Ｘと第二の反応性基Ｙ(2)との反応、及び第二の反応性末端基Ｙ(2)と該担体表面との反応を起こさせる。
【００８０】
二つの反応工程を異ならせる、どのような好適な反応条件も使用され得る。例えば、第一の反応条件設定は、第一の温度で基Ｘ及びＹ(1)が反応することを含むことができ、一方第二の反応条件設定が、第二のより高い温度で基Ｘ及びＹ(2)が反応することを含むことができる。しかしながら、好ましい態様においては、Ｘ及びＹ(1)が接触して自発的に、又は必要なら加熱によって、反応し、一方、Ｘ及びＹ(2)が、光照射により活性化したときにのみ反応する。従って、特に好ましい方法は、以下を含む：
(a)その中に組み込まれた膜貫通タンパク質を有する本発明ベシクルの水溶液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有するブロックコポリマーから形成されている；
(b)ポリマーの末端基Ｘと反応する、少なくとも２個の反応性基Ｙを有する多官能性結合剤好ましくは二官能性結合剤を供給する、基Ｙはポリマーの末端基Ｘと接触すると反応する第一の反応性基Ｙ(1)、及びポリマーの末端基Ｘと光照射すると反応する第二の反応性基Ｙ(2)を含んでいる；
(b’)第一の反応性基Ｙ(2)がポリマーの末端基Ｘと反応するような条件下に、該ベシクルの水溶液を該多官能性結合剤と混合する；
(c)得られた溶液を、望ましいベシクル層を生成するのに十分な量で、第二の反応性基Ｙ(2)と反応する担体上にデポジットする；及び
(d)末端基Ｘと第二の反応性基Ｙ(2)との反応、及び第二の反応性末端基Ｙ(2)と該担体表面との反応を起こすように、光照射を適用する。
【００８１】
上記の全ての態様において、工程(c)においてデポジットされる懸濁液の量は、担体表面に連続したベシクル層を供するのに十分な量である。一般的には、工程(d)が行われた後に、この層が、ベシクルの平均直径よりも大きい厚さを有する凝集した集団を形成しているか；又は絶対値において少なくとも０．０１μｍ特に０．０４μｍの厚さを有するようにする。
【００８２】
上記各工程を成し遂げるために、非常に広範囲の反応条件を使用できる。一つの態様において、多官能性結合剤を用いるとき、用いる多官能性結合剤の量は、適度な架橋を確実にするために、存在する反応性基Ｙの全量が、存在するポリマー末端基Ｘの全量の過剰量にあるようにするだろう。ｐＨ、温度及びその他の反応条件の調節は、常法通りであり、当業者が通常実施する範囲内である。
【００８３】
全体として、本発明のベシクルを相補的多官能性結合剤と共に使用することは、実用的濾過膜の公知の製造法に比して、大きな利点を与える。
【００８４】
担体は、任意の好適な多孔質物質から、調製することができる。例えば、逆浸透膜又は限外濾過膜において用いられるような、従来の膜担体に基づくことができる。かかる担体は、例えば、ポリオレフィン、セルロース、再生セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリエーテルスルホン、又はポリスルホンから、調製することができる。本発明の好ましい態様では、該担体は、ポリスルホンから調製される。
【００８５】
担体膜の化学的官能性は、低分子量であっても高分子であってもよい添加物の形態で、注型ドープ（casting dope）に届けることができ、或いは担体表面の官能基化、例えば化学的処理、グラフト重合又はプラズマ重合によって、もたらし得る。これらの手段によって、例えば以下の担体の化学的変換を果たすことができる：アミン基のカルボン酸基への変換、又はその逆；アルデヒドのアミンへの変換；及び水酸基のカルボン酸基への変換。全てのこの様な反応は、当分野で良く知られている。
【００８６】
多孔質限外濾過膜は、例えば、ポリマーを溶解した溶液を、非常に遅い様式で溶剤の蒸発を制御する一連の空気流ダクトの下を、通過させるエアーキャスティング（air casting）；溶解したポリマーを、移動ベルト上に広げて、液体バス中を貫流させて、バス中の液体をラッカー中の溶剤と交換させ、そして細孔（pores）の形成を起こさせる溶剤又はエマーションキャスティング（solvent or emersion casting）；与えられた溶剤系におけるポリマーの溶解性を駆り立てる（drive）ために、熱を用いるサーマルキャスティング（thermal casting）;によって調製することができる。ラッカーは、次いで、冷却されている移動ベルト上に、キャストされる。ラッカー中の熱を冷して、沈殿を起こさせ始め、そして細孔（pores）を形成させる。その方法に典型的に使用される物質としては、限定されるものではないが、再生セルロース、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ポリアミド、ポリスルホン、ポリ（エーテルスルホン）、ポリカーボネート、ポリ（エーテルイミド）、ポリ（２，６−ジメチル−１，４−フェニレンオキシド）、ポリイミド、ポリ（フッ化ビニリデン）、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、及びポリジメチルシロキサンを包含する。キャストの形態（morphology）は、最終モジュールの形状（configuration）によって、調節される。それは、例えば、らせん状に巻きとったエレメント用の平面シート；中空繊維エレメント用の中空繊維；又は管状であってよい。
【００８７】
ベシクルの凝集した集団を含む層を有する膜であって、該層が規定の厚さを有するものの製造は、担体に適用されるベシクル溶液中に存在するベシクルの濃度を調節することによって、及び／又は担体上にデポジットする溶液の量によって、達成することができる。
【００８８】
本発明の膜の有利な点は、ポリマーベシクルの壁中に埋め込まれた膜貫通タンパク質を通じる以外には、膜を通じる如何なる可能な経路も最小化されており、その一方、担体膜の単位表面積当りの多数の可能な膜貫通タンパク質が供されているので、膜を通じた流量（flux）が最大化されていることにある。その膜の製造方法は、技術的に簡便であり、そして得られた膜は物理的に強健である。
【００８９】
膜貫通タンパク質（Transmembrane proteins）
本発明のベシクル及び膜は、膜貫通タンパク質を含むことができる。アクアポリンは、生物細胞の膜貫通タンパク質であり、その機能は水を選択的に輸送し他の如何なる分子も通さないことである；そのタンパク質の輸送チャネルは、それを通して、水がどちらの方向にも流れ得る二方向チャネルである。それらは、多くのヒト細胞タイプによって、又細菌及び植物細胞によって、発現されている。アクアポリンタンパク質ファミリーの如何なる異なるメンバーも、本発明に使用することができる。好適なアクアポリンとしては、Aqp4、Aqp1及び、特にAqpZが包含される。アクアポリンは、単量体、二量体、四量体及びさらに高いオリゴマーの形態でも、一次配列の変異、コンジュゲート及び切形(truncated)の変種でも、存在することができる。アクアポリンの生物的機能、即ち選択的水輸送が維持される限り、これらのいずれも、本発明のブロックコポリマーから形成された膜中に使用することができる。
【００９０】
望ましい輸送特性を有する他の如何なる膜貫通タンパク質も、本発明に使用することができる。自然に又は非自然に生じる変異体及びそのようなタンパク質のオーソログ（orthologs）又はパラログ（paralogs）を含む、そのような膜貫通タンパク質の変異体を使用することができる。そのようなタンパク質は、例えば、以下のものである：
【００９１】
●  モノトピック膜タンパク質（Monotopic Membrane Proteins）
○  シクロオキシゲナーゼ(Cyclooxygenases)
・雄羊プロスタグランジンH2シンターゼ-1 (シクロオキシゲナーゼ-1又はCOX-1): Ovis aries
・雄羊プロスタグランジンH2シンターゼ-1 (COX-1) R120Q/ネイティブヘテロダイマー(Native Heterodimer): Ovis aries
・アスピリンアセチル化(Aspirin Acetylated) COX-1
・シクロオキシゲナーゼ-2: Mus Musculus
○  スクアレン−ホーペンサイクラーゼ(Squalene-Hopene Cyclases)
・スクアレン−ホーペンサイクラーゼ: Alicyclobacillus acidocaldarius
○  モノアミンオキシダーゼ(Monoamine Oxidases)
・モノアミンオキシダーゼ B: ヒトミトコンドリア外膜
・モノアミンオキシダーゼ A: ラットミトコンドリア外膜
・モノアミンオキシダーゼ A: ヒトミトコンドリア外膜
・G110A ミュータント
○  ヒドロラーゼ(Hydrolases)
・脂肪酸アミドヒドロラーゼ: Rattus norvegicus
○  オキシドレダクターゼ(モノトピック)[Oxidoreductases (Monotopic)]
・スルフィド:デシルユビキノンとの複合体におけるキノンオキシドレダクターゼ: Aquifex aeolicus
・電子伝達フラボプロテイン-ユビキノンオキシドレダクターゼ(ETF-QO): Sus scrofa
○  ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ(Peptidoglycan Glycosyltransferases)
・ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ: Staphylococccus aureus
・ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ  ペニシリン−結合タンパク質 1a (PBP1a): Aquifex aeolicus
・ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ  ペニシリン−結合タンパク質1b (PBP1b): Escherichia coli  
○  ペプチダーゼ(Peptidases)
・シグナルペプチダーゼ (SPase): Escherichia coli
・シグナルペプチドペプチダーゼ (SppA), ネイティブタンパク質(native protein):  Eschericia coli  
○  デヒドロゲナーゼ(Dehydrogenases)
・グリセロール-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ (GlpD, ネイティブ): Escherichia coli
○  ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ(Dihydroorotate Dehydrogenases) (DHODH, class 2)
・ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ: Escherichia coli
・ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ: Rattus rattus  
・ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ, アポフォーム(apo form): Homo sapiens
・ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ: Plasmodium falciparum 3d7
○  ポリメラーゼ(Polymerases)
・TagF テイコ酸ポリメラーゼ: Staphylococcus epidermidis 
○  ADP-リボース化ファクター(ADP-Ribosylation Factors)
・ADP-リボース化ファクター (ARF1), ミリストイル化(myristoylated): Saccharomyces cerevisiae 
・ADP-リボース化ファクター (ARF1*GTP), ミリストイル化: Saccharomyces cerevisiae 
○  イソメラーゼ(Isomerases)
・RPE65 視覚サイクルレチノイドイソメラーゼ: Bos Taurus
【００９２】
●  膜貫通タンパク質：β-バレル(Transmembrane Proteins: Beta-Barrel)
○  β-バレル膜タンパク質：多量体(Beta-Barrel Membrane Proteins: Multimeric)
・ポーリン(Porin): Rhodobacter capsulatus
・ポーリン: Rhodopeudomonas blastica
・OmpK36 オスモポーリン(osmoporin): Klebsiella pneumonia
・Omp32 アニオン選択ポーリン(anion-selective porin): Comamonas acidovorans
・Omp32 アニオン選択ポーリン: Delftia acidovorans
・OmpF マトリックスポーリン(Matrix Porin): Escherichia coli
・OmpC オスモポーリン: Escherichia coli
・OmpG モノメリックポーリン(*monomeric* porin): Escherichia coli
・PhoE: Escherihia coli
・LamB マルトポーリン(Maltoporin): Salmonella typhimurium
・LamB マルトポーリン: Escherichia coli
・LamB マルトポーリン: Escherichia coli
・ScrY スクロース特異的ポーリン(sucrose-specific porin): Salmonella typhimurium
・MspA マイコバクテリアポーリン(mycobacterial porin): Mycobacterium smegmatis
・OprP ホスフェート特異的トランスポーター(phosphate-specific transporter): Pseudomonas aeruginosa
・OprD 塩基性アミノ酸取込みチャネル: Pseudomonas aeruginosa
・OpdK 炭化水素トランスポーター: Pseudomonas aeruginosa
・PorB 外膜タンパク質, 天然構造(native structure): Neisseria meningitides
○  β-バレル膜タンパク質：単量体/二量体(Beta-Barrel Membrane Proteins: Monomeric/Dimeric)
・TolC 外膜タンパク質: Escherichia coli
・TolC 外膜タンパク質, リガンドブロック(ligand blocked): Escherichia coli
・TolC 外膜タンパク質(Y362F, R367E): Escherichia coli
・C2フォーム(Form)
・P2:2:2フォーム
・VceC 外膜タンパク質: Vibrio cholera
・OprM 薬物排出外膜タンパク質: Pseudomonas aeruginosa
・CusC 重金属排出外膜タンパク質: Escherichia coli
・CusBA 重金属流出複合外膜タンパク質: Escherichia coli
・BenF-ライクポーリン(推定): Pseudomonas fluorescens
・OprM 薬物排出外膜タンパク質: Pseudomonas aeruginosa
・apo BtuB コバラミントランスポーター: Escherichia coli
・BtuB: Escherichia coli
・apo BtuB メソ結晶化による(by in meso crystallization): Escherichia coli
・コリシン(Colicin) I 受容体: Escherichia coli
・OmpA: Escherichia coli, 2.5オングストローム
・OmpA ４個の短縮ループと共に(with four shortened loops): Escherichia coli
・β-バレルプラットフォーム(β-barrel platform)(BBP)と呼ばれる
・OmpT 外膜プロテアーゼ: Escherichia coli
・Pla プラスミノーゲン活性化因子(ネイティブ 1): Yersinia pestis
・OmpW 外膜タンパク質: Escherichia coli
・斜方晶形(Orthorhomibic Form)
・三方晶形(Trigonal Form)
・OprG 外膜タンパク質: Pseudomonas aeruginosa
・OmpX: Escherichia coli
・TtoA 外膜タンパク質(OMP): Thermus thermophilus HB27
・OmpLA (PldA) 外膜ホスホリパーゼ A モノマー: Escherichia coli
・OmpLA (PldA) 活性部位変異体(active-site mutant)(N156A): Escherichia coli
・OpcA 接着タンパク質(adhesin protein): Neisseria meningitidis
・NspA 表面タンパク質: Neisseria meningitides
・NalP 自動トランスポーター輸送体ドメイン(autotransporter translocator domain): Neisseria meningitides
・NanC ポーリン(Porin), KdgMポーリンファミリー用モデル(model for KdgM porin family): Escherichia coli
・Hia1022-1098 トリメリック自動トランスポーター(trimeric autotransporter): Haemophilus influenza
・Hia992-1098
・EspP 自動トランスポーター, 開裂後状態(postcleavage state): Escherichia coli
・EstA 自動トランスポーター, フルレングス(full length): Pseudomonas aeruginosa
・PagP 外膜パルミトイルトランスフェラーゼ(palimitoyl transferease): Escherichia coli
・FadL 長鎖脂肪酸トランスポーター: Escherichia coli
・FadL 長鎖脂肪酸トランスポーターA77E/S100R ミュータント: Escherichia coli
・ΔS3 キンク(kink)
・P34A ミュータント
・N33A ミュータント
・ΔNPA ミュータント
・G212E ミュータント
・FadL 長鎖脂肪酸トランスポーター同族体: Pseudomonas aeruginosa
・FauA アルカリギン(alcaligin)外膜トランスポーター: Bordetella pertusssis
・TodX 炭化水素トランスポーター: Pseudomonas putida
・TbuX 炭化水素トランスポーター: Ralstonia pickettii
・Tsx ヌクレオシドトランスポーター(アポタンパク質): Eschericia coli
・FhuA, フェリクロム-鉄受容体: Escherichia coli
・FepA, フェリックエンテロバクチン(Ferric enterobactin) 受容体: Escherichia coli
・FecA, シデロフォア(siderophore)トランスポーター: Escherichia coli
・HasR ヘム取込み受容体: Serratia marcescens
・Ile671Gly ミュータント
・FptA, ピオチェリン(pyochelin)外膜受容体: Pseudomonas aeruginosa
・FpvA, ピオベルジン(Pyoverdine)受容体: Pseudomonas aeruginosa
・FpvA, ピオベルジン受容体アポフォーム(apo form): Pseudomonas aeruginosa
・Pピルスアッシャー(pilus usher)トランスロケーションドメイン(translocation domain), PapC130-640: Escherichia coli
○  β-バレル膜タンパク質：ミトコンドリア外膜(Beta-Barrel Membrane Proteins: Mitochondrial Outer Membrane)
・VDAC-1 電位依存アニオンチャネル(voltage dependent anion channel): Human
・VDAC-1 電位依存アニオンチャネル: Murine  
○  Omp85-TpsB外膜トランスポータースーパーファミリー(Omp85-TpsB Outer Membrane Transporter Superfamily)
・FhaC 糸状ヘマグルチニントランスポーター(Filamentous Hemagglutinin Transporter): Bordetella pertussis
・TeOmp85-N POTRA ドメイン: Thermosynechococcus anaOmp85-N Anabaena sp. PCC7120
・BamA: Escherichia coli
・BamE: Escherichia coli
○  ノンコンスティテューティブ。β-シートポアフォーミングトキシン(Non-constitutive. Beta-sheet Pore-forming Toxins)
・α−ヘモリシン(Alpha-hemolysin): Staphylococcus aureus
・LukF: Staphylococcus aureus
・パーフリンゴリシン(Perfringolysin) O (PFO) プロトマー(protomer): Clostridium perfringens
・炭疽病防御抗原(Anthrax Protective Antigen) (PA)及び致死因子(Lethal Factor) (LF) プレチャネル複合体(Prechannel Complex): Bacillus anthraciss
・リンパ球プレフォリンモノマー(Lymphocyte preforin monomer): Mus musculus
【００９３】
●  膜貫通タンパク質：α-ヘリカル(Transmembrane Proteins:Alpha-Helical)
○  ノンコンスティテューティブα-ヘリカルポアフォーミングトキシン(Non-constitutive. Alpha-helical Pore-forming Toxins.)
・細胞溶解素(Cytolysin) A (ClyA, aka HlyE): Escherichia coli
・FraC イソギンチャクからの真核性ポア形成トキシン(eukaryotic pore-forming toxin from sea anemone): Actinia fragacea
○  外膜タンパク質(Outer Membrane Proteins)
・Wza 莢膜多糖のトランスロコン(translocon for capsular polysaccharides): Escherichia coli
・ポーリンBモノマー: Corynebacterium glutamicum
・Type IV 外膜分泌複合体(secretion complex): Escherichia coli
・バクテリオロドプシン(Bacteriorhodopsin) (BR): Halobacterium salinarium
・ハロロドプシン(Halorhodopsin) (HR): Halobacterium salinarium
・ハロロドプシン(HR): Natronomonas pharaonis
・感覚(Sensory)ロドプシン(Rhodopsin)I(SRI): Anabaena (Nostoc) sp. PCC7120
・感覚ロドプシン II (SRII): Natronomonas pharaonis
・アーカエロドプシン(Archaerhodopsin)-1 (aR-1): Halorubrum sp. aus-1
・アーカエロドプシン-2 (aR-2): Haloroubrum sp. aus-2
・キサントロドプシン(Xanthorhodopsin): Salinibacter ruber  
○  Gタンパク質共役受容体(G Protein-Coupled Receptors) (GPCRs)
・ロドプシン: ウシロッドアウターセグメント(Bovine Rod Outer Segment) (Bos Taurus)
・ロドプシン: イカ(Squid) (Todarodes pacificus)
・β1アドレナリン受容体(adrenergic receptor) (engineered): Meleagris gallopavo (七面鳥)
・β2アドレナリン受容体: Homo sapiens
・メチル化β2アドレナリン受容体: Homo sapiens
・A2A アデノシン(adenosine)受容体: Homo sapiens
・CXCR4 ケモカイン(Chemokine)受容体: Homo sapiens
・ドーパミン(Dopamine) D3受容体: Homo sapiens
○  自律的フォールディング「膜タンパク質」(Autonomously Folding "Membrane Proteins") (Sec-independent)
・ミスティック膜統合タンパク質(Mistic membrane-integrating protein): Bacillus subtilis
○  グリコプロテイン(Glycoproteins)
・グリコホリン(Glycophorin) A膜貫通ドメインダイマー(transmembrane-domain dimer): Homo sapiens
○  スネアプロテインファミリー(SNARE Protein Family)
・シンタキシン(Syntaxin) 1A/SNAP-25/シナプトブレビン（Synaptobrevin）-2 複合体: ratus ratus  
○  インテグリン接着受容体(Integrin Adhesion Receptors)
・ヒトインテグリン αIIbβ3 膜貫通細胞質ヘテロダイマー(transmembrane-cytoplasmic heterodimer): Homo sapiens
【００９４】
○  ヒスチジンキナーゼ受容体(Histidine Kinase Receptors)
・ArcB (1-115) 好気性呼吸コントロールセンサー膜ドメイン(Aerobic Respiration Control sensor membrane domain): Escherichia coli
・QseC (1-185) センサータンパク質膜ドメイン(Sensor protein membrane domain): Escherichia coli
・KdpD (397-502) センサータンパク質膜ドメイン: Escherichia coli
○  免疫受容体(Immune Receptors)
・TCR-CD3複合体の膜貫通ζ-ζダイマー: Homo sapiens
・DAP12 ダイメリック(dimeric): Homo sapiens
○  チャネル：カリウム及びナトリウムイオン選択性(Channels: Potassium and Sodium Ion-Selective)
・KcsA カリウムチャネル, H+ゲート(gated): Streptomyces lividans
・KcsA カリウムチャネル E71H-F103A 不活性化状態ミュータント(inactivated-state mutant) 閉鎖状態(closed state): Streptomyces lividans
・KcsA カリウムチャネル E71I モデルゲーティング(modal-gating)ミュータント: Streptomyces lividans
・KvAP 電位依存性カリウムチャネル(Voltage-gated potassium Channel): Aeropyrum pernix
・Kv1.2 電位依存性カリウムチャネル: Rattus norvegicus
・Kv1.2/Kv2.1電位依存性カリウムチャネル キメラ(chimera): Rattus norvegicus
・F233W ミュータント
・MthK カリウムチャネル, Ca++ゲート(gated): Methanothermobacter thermautotrophicus
・ヒト BKチャネル Ca2+-活性化アパラタス(activation apparatus):Homo sapiens
・Kir3.1-原核(Prokaryotic)Kirキメラ:Mus musculus & Burkholderia xenovornas
・Kir2.2 内向き整流カリウムチャネル(Inward-Rectifier Potassium Channel): Gallus gallus
・KirBac1.1 内向き整流カリウムチャネル: Burkholderia pseudomallei
・MlotiK1 環状ヌクレオチド調節(cyclic nucleotide-regulated) K+-チャネル: Mesorhizobium loti
・mGIRK1 G-タンパク質ゲート(Gated)内向き整流カリウムチャネル: Mus musculus
・NaK チャネル (Na+複合体):  Bacillus cereus  
・D66/S70E ミュータント
・D66N ミュータント
・D66E ミュータント
・CNG-mimicking NaKチャネルミュータント: Bacillus cereus
・NaK チャネル; K+選択ミュータント: Bacillus cereus
○  チャネル：他のイオンチャネル(Channels: Other Ion Channels)
・GluA2 グルタメート受容体 (AMPA-サブタイプ): Rattus norvegicus
・M2 プロトンチャネル: Influenza A
・M2 プロトンチャネル: Influenza B
・ASIC1 酸センシング(Acid-Sensing)イオンチャネル: Gallus gallus
・ATP-ゲート(gated) P2X4 イオンチャネル (アポタンパク質): Danio rerio (zebra fish)
・ニコチン性アセチルコリン受容体ポア(Pore): Torpedo marmorata
・原核(Prokaryotic)ペンタメリック リガンドゲート(ligand-gated)イオンチャネル (pLGIC): Erwinia chrysanthemi
・原核ペンタメリック リガンドゲートイオンチャネル (GLIC): Gloebacter violaceus  
・E221A ミュータント
・原核ペンタメリック リガンドゲートイオンチャネル (GLIC), 野性型(wildtype)-TBSb 複合体: Gloebacter violaceus  
・野性型-TEAs複合体
・E221D-TEAs複合体
・野性型-TMAs複合体
・野性型-ブロモリドカイン(bromo-lidocaine)複合体
・野性型-Cd2+複合体
・野性型-Zn2+複合体
・野性型-Cs+複合体
・MscL機械感受性チャネル(Mechanosensitive channel): Mycobacterium tuberculosis
・MscS 電位調節(voltage-modulated)機械感受性チャネル: Escherichia coli
・CorA Mg2+トランスポーター: Thermotoga maritime
・MgtE Mg2+トランスポーター: Thermus thermophiles
・SLAC1 アニオンチャネル, TehA ホモログ(homolog) (野性型): Haemophilus influenza
・F262A ミュータント
・F262L ミュータント
・F262V ミュータント
・G15D ミュータント
○  チャネル：プロテインコンダクティング(Channels: Protein-Conducting)
・SecYEβプロテインコンダクティングチャネル: Methanococcus jannaschii  
○  チャネル：アクアポリン及びグリセロポリン(Channels: Aquaporins and Glyceroporins)
・AQP0 アクアポリン水チャネル: ウシ水晶体
・AQP1 アクアポリン水チャネル: ヒト赤血球
・AQP1 アクアポリン水チャネル: ウシ赤血球
・AQP4 アクアポリン水チャネル: ラットグリア細胞(glial cells)
・S180D ミュータント
・AQP4 アクアポリン水チャネル: Human
・AQP5 アクアポリン水チャネル (HsAQP5): Human
・AqpM アクアポリン水チャネル: Methanothermobacter marburgensis
・AqpZ アクアポリン水チャネル: Escherichia coli
・AqpZ アクアポリン (C9S/C20S), T183C ミュータント: Escherichia coli
・L170C ミュータント
・AqpZ アクアポリン ミュータント F43W : Escherichia coli
・H17G/T183F ミュータント
・F43WH174G/T183F ミュータント
・SoPIP2;1 植物アクアポリン: Spinacia oleracea
・GlpF グリセリンファシリテーターチャネル(glycerol facilitator channel): Escherichia coli
・GlpF グリセリンファシリテーターチャネル, W84F/F200T-ミュータント: Escherichia coli
・PfAQP アクアグリセロポリン(aquaglyceroporin): Plasmodium falciparum
・Aqy1 イーストアクアポリン (pH 3.5): Pischia pastoris
○  チャネル：ホルマートニトレートトランスポーターファミリー(Channels : Formate Nitrate Transporter (FNT) Family)
・FocA, ペンタメリックアクアポリン様ホルマートトランスポーター(formate transporter): Escherichia coli
・FocA ホルマート無しのホルマートトランスポータ(formate transporter without formate): Vibrio cholera
・FocA ホルマートトランスポータ: Salmonela typhimurium
○  チャネル：尿素トランスポーター(Channels: Urea Transporters)
・尿素トランスポーター: Desulfovibrio vulgaris
・コネキシン(Connexin) 26 (Cx26; GJB2) ギャップ結合(gap junction): Human
○  チャネル：Amt/Rhタンパク質(Channels: Amt/Rh proteins)
・AmtB アンモニアチャネル(ミュータント): Escherichia coli
・AmtB アンモニアチャネル(野性型): Escherichia coli
・H168E ミュータント
・H168A ミュータント
・H168F ミュータント
・H318A ミュータント
・H318 ミュータント
・H318F ミュータント
・H168A/H318A ミュータント
・Amt-1 アンモニアチャネル: Archaeoglobus fulgidus
・Rh タンパク質, アンモニア又はCO2チャネルの可能性: Nitrosomonas europaea
・ヒトRh C グリコプロテインアンモニアトランスポーター: Homo sapiens
○  膜内プロテアーゼ(Intramembrane Proteases)
・GlpG ロンボイドファミリー(rhomboid-family)膜内プロテアーゼ: Eschericia coli
・W136A ミュータント
・S201T 活性部位(Active-Site) ミュータント
・GlpG ロンボイドファミリー膜内ペプチダーゼ:  Haemophilus influenzae
・Site-2 プロテアーゼ (S2P). 膜内メタロプロテアーゼ:  Methanocaldococcus jannaschii
・シグナルペプチドペプチダーゼ (SppA), ネイティブタンパク質(native protein):  Escherichia coli
○  膜結合メタロプロテアーゼ(Membrane-Bound Metalloproteases)
・apo-FtsH ATP-依存メタロプロテアーゼ:  Thermotoga maritima 
【００９５】
○  H+/Cl-交換トランスポーター(H+/Cl- Exchange Transporters)
・H+/Cl-交換トランスポーター: Salmonella typhimurium 
・H+/Cl-交換トランスポーター: Escherichia coli
・E148A ミュータント
・E148Q ミュータント
・S107A/E148Q/445A ミュータント
・モノメリック H+/Cl-交換トランスポーター: Escherichia coli
・+/Cl-真核(Eukaryotic)交換トランスポーター: Cyanidioschyzon merolae
・H+/Cl-真核交換トランスポーター: Synechocystis sp. pcc 6803
○  細菌の水銀無毒化タンパク質(Bacterial Mercury Detoxification Proteins)
・MerF Hg(II)トランスポーター: Morganella morganii
○  マルチドラッグ流出トランスポーター(Multi-Drug Efflux Transporters)
・AcrB 細菌のマルチドラッグ流出トランスポーター: Escherichia coli
・AcrB 細菌のマルチドラッグ流出トランスポーター, アポタンパク質, N109A ミュータント: Escherichia coli
・AcrB 細菌のマルチドラッグ流出トランスポーター, D407A ミュータント: Escherichia coli
・MexB 細菌のマルチドラッグ流出トランスポーター: Pseudomonas aeruginosa
・CusA メタルイオン流出ポンプ: Escherichia coli
・EmrE 細菌のマルチドラッグ流出トランスポーター: Escherichia coli
・NorM マルチドラッグ及びトキシン化合物排出 (MATE) トランスポーター(アポフォーム): Vibrio cholera
○  エイコサノイド及びグルタチオン代謝における膜結合タンパク質(Membrane-Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione Metabolism) (MAPEG)
・ミクロソームプロスタグランジン(Microsomal Prostaglandin) E シンターゼ 1: Human
・５−リポキシゲナーゼ−活性化タンパク質 (FLAP)とBound MK-591インヒビター: Human
・ロイコトリエン(Leukotriene) LTC4シンターゼ: Human
○  メジャーファシリテータースーパーファミリートランスポーター(Major Facilitator Superfamily (MFS) Transporters)
・LacY ラクトースパーミアーゼ(Lactose Permease)トランスポーター (C154G ミュータント): Escherichia coli
・LacY ラクトースパーミアーゼ(野生型)とTDG: Escherichia coli
・FucP 外向きコンホメーション(outward-facing conformation)のフコーストランスポーター: Escherichia coli
・N162A ミュータント
・GlpT グリセロール-3-ホスフェートトランスポーター: Escherichia coli
・EmrD 多剤(Multidrug)トランスポーター: Escherichia coli
・PepTSo オリゴペプチド-プロトン同伴輸送(symporter): Shewanella oneidensis
○  溶質ナトリウム同伴輸送ファミリー(Solute Sodium Symporter (SSS) Family)
・vSGLT ナトリウムガラクトース(Sodium Galactose)トランスポーター: Vibrio parahaemolyticus
・K294A ミュータント
○  核酸塩基カチオン共輸送-1ファミリー(Nucleobase-Cation-Symport-1 (NCS1) Family)
・Mhp1 ベンジル-ヒダントイントランスポーター: Microbacterium liquefaciens
○  ベタイン/コリン/カルニチントランスポーターファミリー(Betaine/Choline/Carnitine Transporter (BCCT) Family)
・BetP グリシンベタイントランスポーター: Corynebacterium glutamicum
・CaiT カルニチントランスポーター: Escherichia coli
・CaiT カルニチントランスポーター: Proteus mirabilis
○  アミノ酸/ポリアミン/オルガノカチオンスーパーファミリー(Amino Acid/Polyamine/Organocation (APC) Superfamily)
・AdiC アルギニン:アグマチンアンチポーター: Escherichia coli
・N22A, L123W ミュータント
・N101A ミュータント
・apo ApcT Na+-インディペンデント(independent)アミノ酸トランスポーター: Methanocaldococcus jannaschii
○  アミノ酸二次トランスポーター(Amino Acid Secondary Transporters)
・LeuTAa ロイシントランスポーター: Aquifex aeolicus
・野性型 LeuT トランスポーター: Aquifex aeolicus
・E290S ミュータント
・ミュータント LeuT トランスポーターと窒素酸化物スピンラベル(Spin Label) (F177R1): Aquifex aeolicus
・I204R1 ミュータント
・グルタメートトランスポーターホモログ(Glutamate Transporter Homologue) (GltPh): Pyrococcus horikoshii 
・アスパルテート(Aspartate)トランスポーター Li+-結合状態(GltPh): Pyrococcus horikoshii 
○  カチオン拡散ファシリテーターファミリー(Cation Diffusion Facilitator (CDF) Family)
・YiiP 亜鉛トランスポーター: Escherichia coli
○  アンチポーター(Antiporters)
・NhaA Na+/H+アンチポーター: Escherichia coli
・ミトコンドリアADP/ATPキャリア: ウシ心臓ミトコンドリア
○  エネルギー-カップリングファクタートランスポーター(Energy-Coupling Factor (ECF) Transporters)
・RibU, リボフラビントランスポーターのS成分: Staphylococcus aureus 
【００９６】
○  ATP結合カセットトランスポーター(ATP Binding Cassette (ABC) Transporters)
・BtuCD ビタミンB12トランスポーター: Escherichia coli
・Sav1866 多剤トランスポーター: Staphylococcus aureus
・モリブデン酸塩トランスポーター ModB2C2: Archaeoglobus fulgidus
・ModBC モリブデン酸塩ABCトランスポーター: Methanosarcina acetivorans
・HI1470/1 推定(Putative) メタルキレートタイプABCトランスポーター: Haemophilus influenza
・MsbA リピド(Lipid) "フリッパーゼ(flippase)"とbound AMPPNP: Salmonella typhimurium 
・P-グリコプロテイン(Glycoprotein): Mus musculus (マウス)
・MalFGK2-MBP マルトース取込みトランスポーター複合体: Escherichia coli
・MetNI メチオニン取込みトランスポーター複合体: Escherichia coli
・FbpC 鉄イオン(ferric iron)取込みトランスポーター ヌクレオシド結合ドメイン: Neisseria gonorrhoeae
○  K+トランスポーターのスーパーファミリー(Superfamily of K+ Transporters) (SKT proteins)
・TrkH カリウムイオントランスポーター: Vibrio parahaemolyticus 
・カルシウムATPアーゼ: ウサギ筋小胞体(sarcoplasmic reticulum)
・Na,K-ATPアーゼ: ブタ腎臓
・Na,K-ATPアーゼ: サメ
・Na,K-ATPアーゼ制御タンパク質 FXYD1: Human 
・ホスホランバン(Phospholamban)ホモペンタマー: ヒト筋小胞体
・形質膜(Plasma Membrane) H+-ATPアーゼ: Arabidopsis thaliana
○  V−タイプATPアーゼ(V-type ATPase)
・VタイプNa+-ATPアーゼのロータ(Rotor): Enterococcus hirae
・V1−ATPアーゼ複合体: Thermus thermophiles
・A3B3 V1−ATPアーゼの複合体: Thermus thermophilus 
○  F−タイプATPアーゼ(F-type ATPase)
・ウシ心臓ミトコンドリアからのF1−ATPアーゼ: Bos Taurus
・ATP シンターゼ(F1c10): S. cerevisiae
・F1 ATPアーゼ: S. cerevisiae
・Na+-依存性F-ATPシンターゼのロータ(Rotor) (c11): Ilyobacter tartaricus
・ホウレンソウ葉緑体のH+-依存性F-ATPシンターゼのロータ(Rotor) (c14): Spinacia oleracea
・好アルカリ性シアノバクテリアのH+-依存性F-ATPシンターゼのロータ(Rotor) (c15): Spirulina platensis
・H+-依存性F-ATPシンターゼのロータ(Rotor) (c13): Bacillus pseudofirmus
・H+-依存性F-ATPシンターゼのペリフェラルストーク(Peripheral stalk): Thermus thermophilus 
○  ホスホトランスフェラーゼ(Phosphotransferases)
・ジアシルグリセロールキナーゼ(DAGK): Escherichia coli
○  ヒドロラーゼ(Hydrolases)
・エストロンスルファターゼ(Estrone Sulfatase): ヒト胎盤
【００９７】
○  オキシゲナーゼ(Oxygenases)
・粒状メタンモノオキシゲナーゼ(pMMO): Methylococcus capsulatus
・粒状メタンモノオキシゲナーゼ(pMMO): Methylosinus trichosporium OB3b
○  オキシドレダクターゼ(Oxidoreductases)
・スルフィド(Sulfide):キノンオキシドレダクターゼ: Aquifex aeolicus
・電子伝達フラボプロテイン-ユビキノンオキシドレダクターゼ (ETF-QO): Sus scrofa
・グリセロール-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ (GlpD, ネイティブ): Escherichia coli
・NarGHI 硝酸レダクターゼA: Escherichia coli
・K86A ミュータント
・H66Y ミュータント
・NrfH シトクロムCキノール(Quinol)デヒドロゲナーゼ: Desulfovibrio vulgaris
・DsbB-DsbA ペリプラズムオキシダーゼ複合体: E. coli
・DsbB-Fab 複合体: Eschericia coli
・wtDsbB-DsbA(Cys133A)-Q8 複合体: E. coli
・ビタミンK エポキシドレダクターゼ: Synechococcus sp. 
○  Mo/W ビス-MGDオキシドレダクターゼ (Mo/W bis-MGD Oxidoreductases)
・ポリスルフィドレダクターゼ PsrABC (ネイティブ): Thermus thermophiles
○  電子伝達系複合体：複合体I(Electron Transport Chain Complexes: Complex I)
・複合体 Iメンブレンドメイン: Escherichia coli
・複合体 I コンプリート(complete): Thermus thermophiles
○  電子伝達系複合体:複合体II(Electron Transport Chain Complexes:Complex II)
・ネイティブ フマル酸塩(Fumarate)レダクターゼ複合体: Escherichia coli
・フマル酸塩レダクターゼ複合体: Wolinella succinogenes
・ギ酸塩(Formate)デヒドロゲナーゼ-N: Escherichia coli
・コハク酸塩(Succinate)デヒドロゲナーゼ (複合体 II): Escherichia coli
・コハク酸塩: ユビキノンオキシドレダクターゼ (SQR, 複合体 II): ブタ心臓ミトコンドリア
・コハク酸塩: ユビキノンオキシドレダクターゼ (SQR, 複合体 II): ニワトリ心臓ミトコンドリア
○  電子伝達系複合体：複合体III(Electron Transport Chain Complexes: Complex III) [シトクロムbc 1(Cytochrome bc1)]
・シトクロム bc1: Bos Taurus
・シトクロム bc1: Gallus gallus
・シトクロム bc1: Sarcomyces cerevisiae
・シトクロム bc1: Rhodobacter Sphaeroides
○  電子伝達系複合体：酸素光合成のシトクロムb6f(Electron Transport Chain Complexes: Cytochrome b6f of Oxygenic Photosynthesis)
・シトクロム b6f複合体: Mastigocladus laminosus
・シトクロム b6f複合体: Chlamydomonas reinhardtii
・シトクロム b6f複合体: Nostoc sp. PCC 7120
○  電子伝達系複合体：複合体IV(Electron Transport Chain Complexes: Complex IV) [シトクロムCオキシダーゼ (Cytochrome C Oxidase)]
・シトクロムCオキシダーゼ, aa3: Bos taurus (ウシ) 心臓ミトコンドリア
・シトクロムCオキシダーゼ, aa3: Paracoccus denitrificans
・N131D ヴァリアント(Variant)
・シトクロムオキシダーゼ, cbb3: Pseudomonas stutzeri
・シトクロム ba3: Thermus thermophiles
・シトクロムCオキシダーゼ 野性型: Rhodobacter sphaeroides
・ユビキノンオキシダーゼ, シトクロム bo3: E. coli
○  酸化窒素レダクターゼ(Nitric Oxide Reductases)
・酸化窒素レダクターゼ: Pseudomonas aeruginosa
○  光化学系(Photosystems)
・光化学系 I: Thermosynechococcus elongates
・光化学系 I (植物):  Psium sativum
・光化学系 II: Thermosynechococcus elongates
・光化学系 II: Thermocynechococcus vulcanus
○  集光性複合体(Light-Harvesting Complexes)
・集光性複合体: Rhodopseudomonas acidophila
・集光性複合体: Rhodospirillum molischianum
・集光性複合体 LHC-II, ホウレンソウ光化学系 II: Spinacia oleracia
・集光性複合体 CP29, ホウレンソウ光化学系 II: Spinacia oleracia
・集光性複合体 LHC-II, エンドウ光化学系 II: Pisum sativum
○  光合成反応中心(Photosynthetic Reaction Centers)
・光合成反応中心: Blastochloris viridis
・光合成反応中心: Rhodobacter sphaeroides 
・光合成反応中心: Thermochromatium tepidum
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】１Ａ及び１Ｂは、本発明のベシクルのＬＳＭ画像の顕微鏡写真を示した図である。
【図２】実施例２のストップトフロー法の実験結果を示した図である。
【図３】実施例２のストップトフロー法の実験結果を示した図である。
【図４】実施例２のＤＬＳの実験結果を示した図である。
【図５】実施例３で記載した様に、本発明のベシクルにアクアポリンＺタンパク質を組み込んだ影響を示したグラフの図である。
【図６】実施例５の膜の顕微鏡写真を示した図である。
【図７】実施例５の膜におけるポリブタジエンの内部架橋の影響を示した図である。
【図８】実施例６で記載した封入効率の実験結果を示した図である。
【実施例】
【００９９】
以下の実施例は、本発明を説明するものである。
【０１００】
実施例１：ポリマーの調製
ステップ（ａ）：ＰＢ合成
Hillmyer, M. A.; Bates, F.S. 1996,9297,6994-7002のプロトコールに従い、いくらかの修正をして、ポリブタジエンを合成した。ブタジエンのアニオン重合を、開始剤としてsec−ブチル−ブチルリチウムを用いて、−６０〜−５０℃で、ＴＨＦ中で行った。乾いた二口フラスコをオーブン中で一夜乾燥し、一方のポートと他方とに、隔膜（septum）と共に、ラインを取り付けた。そのフラスコを炎で乾燥し、撹拌棒を加えた。３０ｍｌの乾燥溶媒（Dry Solv）ＴＨＦを、カニューレを用いて、その二口フラスコに加えた。１１ｍｌのブタジエン（０．１３モル）を、縮合フラスコ中で、縮合させた。ポリブタジエンを縮合するために、最初に液体窒素を用い、それから、乾燥氷冷アセトン浴を用いて、融解した。これを、その二口フラスコに、カニューレを用いて、移した。７ｍｌ（０．００９８モル）の１．４Ｍ sec−ブチルリチウム開始剤を、すばやく加えた。重合を、３時間進行させた。末端保護（End capping）は、ブタジエンの変換完了後、−６０℃で、２ｍｌ（０．０５１モル）のエチレンオキシドを加えることによって、果たした。次いで、酸性メタノール（５ｍｌ ＨＣｌ：５０ｍｌメタノール）を、溶媒の蒸発によって分離されるポリブタジエンアルコールを遊離させるために、用いた。ポリマーのシクロヘキサン溶液の蒸留水での抽出によって、無機塩を除去した。ポリマーを、水を除くために、高真空下に放置した。ソックスレー抽出器中の分子篩を用いて、乾燥ヘキサン中で、ポリマーを環流することによって、更なる乾燥を成し遂げた。
【０１０１】
ステップ（ｂ）：ＰＢ−ＰＭＯＸＡの合成
２０ｇ（０．０２６０モル）のポリブタジエン（Ｍｎ７６９ｇ／ｍｏｌ）を、２．６３ｇ（０．０２６０モル）のトリエチルアミン（シグマアルドリッチ社Ｔ０８８６）の存在下に、アルゴン下−１０℃で、７．３３ｇ（０．０２６０モル）のトリフルオロメタンスルホン酸無水物（シグマアルドリッチ社１７６１７６−５Ｇ）で官能基化させた。有機塩を、更に濾去した。トリフラート官能基化されたＰＢは、２−メチル−２−オキサゾリン（シグマアルドリッチ社１３７４４８）のカチオン開環重合のマクロ開始剤として、用いられた。重合は、無水酢酸エチル（シグマアルドリッチ社２７０９８９）中で、４０℃で１２時間、進行させた。反応は、０．４ｇのエチレンジアミン（シグマアルドリッチ社０３５５０）で停止させた。これにより、一級−及び二級−アミン末端ＰＢ−ＰＭＯＸＡポリマーが得られた。
【０１０２】
ポリマーの特性：
ＰＢ１２−ＯＨ
ＮＭＲ
５．４５ｐｐｍ −ＣＨ＝ＣＨ２（繰り返し単位）、４．９４ｐｐｍ −ＣＨ＝ＣＨ２（繰り返し単位）、２．１２ｐｐｍ ＣＨ（繰り返し単位−主鎖(backbone)）、1.２７ｐｐｍ ＣＨ２（繰り返し単位−主鎖）、ＣＨ２及びＣＨ３ ３．６５ｐｐｍ  ０．８２ｐｐｍ−末端基。
【表１】
2018515636.tif 000020
【０１０３】
ＰＢ１２−ＰＭＯＸＡ５−ＮＨ−(ＣＨ２)−ＮＨ２
ＮＭＲ
ＰＢ：５．４５ｐｐｍ −ＣＨ＝ＣＨ２（繰り返し単位）、４．９４ｐｐｍ −ＣＨ＝ＣＨ２（繰り返し単位）、２．１２ｐｐｍ ＣＨ（繰り返し単位−主鎖）、1.２７ｐｐｍ ＣＨ２（繰り返し単位−主鎖）、ＣＨ２及びＣＨ３ ３．６５ｐｐｍ ０．８２ｐｐｍ−末端基。ＰＭＯＸＡ：３．４５ｐｐｍ（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−）、２．１１ｐｐｍ（−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ３）。
【０１０４】
実施例２：ベシクルの調製
ＰＢ１２−ＰＭＯＸＡ５−ＮＨ−(ＣＨ２)２−ＮＨ２ポリマー（５０ｍｇ）を、丸底フラスコ（パイレックス２００ｍｌ）中の１ｍｌクロロホルム中に溶解した。溶剤を、減圧下に、ロータリーエバポレーター上で留去して、薄いポリマーフィルムを生成した。続く３時間の高真空処理によって、痕跡量のクロロホルムを除去した。更に５ｍｌの水を加え、６００ｒｐｍで撹拌した。こうして、１０ｍｇ／ｍｌのベシクル懸濁液を調製した。特性評価（ＬＳＭ、ストップトフロー法、ＤＬＳ）のためのサンプリングにおいて、その懸濁液を、１μｍ、８００ｎｍ、４００ｎｍ、２００ｎｍのポリカーボネートトラックエッチドフィルター（ミリポア社製）を通して、連続的に押し出した。各押出において、特性評価のために懸濁液をサンプリングした。
【０１０５】
ベシクルは、以下の様にして、特性評価された。低温透過型電子顕微鏡（クライオ−ＴＥＭ）を粒子の画像化のために使用し、表面官能基化はＬＳＭ（レーザー走査型顕微鏡）の画像化を用いて調べた。
【０１０６】
クライオ−ＴＥＭのため、顕微鏡は、ＦＥＩ社のTecnaiG2,TF20であった。サンプルは、ガラス化ロボット（vitrification robot）のVitrobotＴＭFEIを用いて、ガラス化（vitrified）した。用いた倍率は、２５０００×（較正倍率３１６２５×）＝スケールバー２００μｍであった。
【０１０７】
ＬＳＭ画像化のため、上述のように調製したベシクルの表面に存在するアミン末端基を、イソチオシアン酸テトラメチルローダミン蛍光染料と反応させ（１：１０００モル比）、脱イオン水に対して透析した。透析は、透析液が蛍光サインを示さなくなるまで行い、非特異的結合を除去するため脱イオン水の付加的交換を続けた。ベシクルは、Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27である対物レンズ及び５６１ｎｍのレーザー発振線を備えた、ツァイス社のＬＳＭ７１０倒立共焦点顕微鏡を用いて、可視化した。ピンホールは、５０μｍから７０μｍまで変化させた。これにより、共焦点平面をして、ベシクルを「透視」できるので、ベシクルが焦点の内外を動的に浮遊している懸濁液において、光の縁（rims）（共焦点ポイントのセンターにおけるベシクルのセンター）又は光の円盤（discs）（共焦点ポイントにおけるベシクルのトップ）として、ベシクルが現れる。図１Ａ及び１Ｂは、ベシクルを明瞭に示す２枚の顕微鏡写真サンプルを示す。
【０１０８】
ベシクルの構造を調べる第二のアプローチは、透過性を測定するためのストップトフロー実験の使用である。ストップトフロー分光計は、ベシクル懸濁液を、高張性溶液又は低張性溶液のいずれかと混合するために利用され、そして光散乱シグナルが、ストップシリンジの展開によって、収集された。このことが、ポリマー二重層を横切る濃度グラジエントに導き、グラジエントの方向への水透過性の結果となった。高張性溶液の場合にはポリマーベシクルの収縮が、低張性溶液の場合にはポリマーベシクルの膨潤が、観察された。サイズの変化は、光散乱の方法でモニターすることができ、変化が起こる速度は、ベシクルの所定のサイズでの水の透過性に帰することができる。これは、また、凝集物の形態を検証するために、示された（アクアポリンに基づく生体模倣膜の有望性の正確な評価のための枠組み、M. Grzelakowski, M. F. Cherenet, Y. Shen, M. Kumar、Journal of Membrane Science doi:10.1016/j.memsci.2015.01.023.）。
【０１０９】
ベシクル懸濁液を、１６℃で、浸透圧溶液と、１：１の割合で素早く混合し、光散乱シグナルを、３６５ｎｍで、８ｍＬ／ｓの流速で、集めた。浸透的水透過係数（Ｐｆ）を、下記数式から算出した：
【０１１０】
【数１】
2018515636.tif 000021
ここで、ｋは時間の経過によるベシクルの直径の変化に対応する光散乱曲線の当初の傾きであり、Ｓはベシクルの当初の表面積であり、Ｖ0はベシクルの当初の容量であり、ＶWは水のモル体積であり、及びΔOSMはベシクルの収縮を進める浸透圧モル濃度差である。
【０１１１】
定められた量のＮａＣｌを水和バッファー（０．１Ｍ  ＮａＭＯＰＳ）に加えることによって、様々な各高張性溶液を調製して、結果的に、６００ｍＭ、３００ｍＭ、１５０ｍＭ、７５ｍＭ、０ｍＭ（水和バッファー）及び−１００ｍＭ（純脱イオン水）のグラジエントを得た。予期され、図２に示されるように、高張性による収縮は、低張性溶液で膨潤へと反転させられ、従ってベシクルの形態が確認された。
【０１１２】
加えて、ストップトフロー法を用いて、押出工程の全てのステップでのベシクルの形態を確認した。水透過時間は、高張条件に曝されたベシクルのサイズに正比例していた。二分子膜の透過性は一定のままであり、従って、より大きな面積の膜を通って透過するより多くの量の水によって、より長い時間枠がもたらされる。図３は、ポアサイズが減少していくフィルターを通して押出されたベシクルのストップトフローの各グラフを示す。
【０１１３】
マルバーン社のゼータサイザーＴＭナノ−Ｓである動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置を用いて、粒子直径及びサイズ多分散指数を測定した。ＤＬＳ測定前に、平衡化のために、ベシクル懸濁液を、一夜放置した。その後、ポアサイズが８００、４００、２００及び１００ｎｍの各膜を通して、試料が押出された。ＤＬＳ測定は、押出後６時間で、行われた。比較物質としてポリスチレンラテックス（ＲＩ：１．５９０；吸収：６３３ｎｍで０．０１０）が、そして分散媒として水（粘度：０．９７８１ｃＰ；ＲＩ：１．３３０）が、用いられた。測定は、サイエンスブランドの使い捨てミクロキュベット中で、試料体積１００μＬで、２１℃で、行われた。各試料は５回測定し、各測定値は１１ラン（runs）の平均であった。結果を、下記表中及び図４に示す。
【０１１４】
【表２】
2018515636.tif 000022
【０１１５】
実施例３：ベシクルへのタンパク質の挿入
ポリマーベシクルの透水性は、水チャネル膜タンパク質−アクアポリンＺの再構成によって、高められる。フィルム水和工程は、ＰｏＰｒ４００でのタンパク質の付加に適合するために、修正させた。簡単には:水和したベシクルに、タンパク質溶液が、ＰｏＰｒ４００で加えられた。次の各ステップは、標準のベシクル形成プロトコールに従った。
【０１１６】
ＰＢ１２−ＰＭＯＸＡ５−ＮＨ−(ＣＨ２)２−ＮＨ２ポリマー（５０ｍｇ）を、丸底フラスコ（パイレックス２００ｍｌ）中の１ｍｌクロロホルム中に溶解した。溶剤を、減圧下に、ロータリーエバポレーター上で留去して、薄いポリマーフィルムを生成した。続く３時間の高真空処理によって、痕跡量のクロロホルムを除去した。更に、０．１２４５ｍｇのアクアポリンＺ（アプライド・バイオミメティック社製）を含む１００ｍＭ Ｎａ-ＭＯＰＳ緩衝液５ｍｌ及び０．５％オクチルグルコシド（製品番号Ｏ３１１、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、商品名Anagrade、Anatrace社製）を加え、６００ｒｐｍで撹拌した。１０ｍｇ／ｍｌのプロテオ−ベシクル懸濁液を、２００ｎｍのポリカーボネートトラックエッチドフィルター（ミリポア社製）を通して、押し出した。ストップトフロー分光計を用いて、透過性測定を行った。
【０１１７】
ストップトフロー分光法は、タンパク質の挿入を評価するために用いた。これは、アクアポリン水チャネルで再構成されたベシクルの透水性の増加として、測定される。加えられたタンパク質の量がＰｏＰＲ（タンパク質に対するポリマーの割合）が４００と少ない場合で、コントロールベシクルに対する透水性の増加は、４６倍と測定された。結果を、図５に示した。
【０１１８】
実施例４：フリーラジカルを用いた、ＰＢ−ＰＭＯＸＡベシクルのコアの架橋
実施例２と同様に調製したＰＢ−ＰＭＯＸＡベシクルを、ＰＢコアを架橋して、より低い透過性で／より強固な構造とするために、等張条件下に、定められた量のフリーラジカル生成溶液に供した。
【０１１９】
ＰＢ−ＰＭＯＸＡを、実施例１と同様にして調製し、１００ｍＭ  ＮａＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）中での薄膜（thin-film）の再水和を用いて、ベシクルを作成した。次いで、ベシクルは、ポアサイズ０．２μｍのミリポア社のアイソポアＴＭメンブレンを通して、押出され、KintekＴＭのＳＦＬＳ及びゼータサイザーナノＴＭＤＬＳ（マルバーン社）で試験した。全ての化学薬品及び緩衝液は、シグマアルドリッチ社から購入した。
【０１２０】
調製したＰＢ−ＰＭＯＸＡベシクルを、４個の透明な４ｍＬガラスバイアルに分取し（２５０μＬ）、平衡化させるために、室温で静置した。３つの溶液が、架橋工程のために、ナノプル（NanoPur）水中で調製された。１００ｍＭ過硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）は１００ｍｇを３．６９９ｍＬナノプル（NanoPur）水中に溶解して、１００ｍＭメタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）は１００ｍｇを５．２６ｍＬナノプル水中に溶解して、及び１００ｍＭ硫酸鉄(II)７水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）は１００ｍｇを３．５９７ｍＬナノプル水中に溶解して、調製した。各２バイアルのベシクルが、５０μＬの１００ｍＭ過硫酸カリウム、２５μＬの１００ｍＭメタ重亜硫酸ナトリウム、及び１μＬの１００ｍＭ硫酸鉄(II)７水和物で、又その他の各２バイアルが１００μＬ、５０μＬ、及び２μＬで、それぞれ得られた。次いで、これらのペアは分けられ；一方は室温で反応させられ、他方は７０℃で反応させられた。各試料は、１時間反応させられ、次いで室温で平衡化後、ＤＬＳ及びＳＦＬＳでサイズ及び透過性が調べられた。
【０１２１】
疎水性コアの架橋の効果は、架橋されたポリマーのベシクルの有機溶剤中での溶解性の変化によって、明らかにされた。架橋前に、そのポリマーは、エタノール及びクロロホルムの両者に可溶性であった。架橋後、そのベシクルは、両者中での溶解性が減少した。加えられたラジカル開始剤溶液の量は、クロロホルム中での架橋物の溶解性の減少に、直接的に比例した。
【０１２２】
実施例５：膜の調製
この実施例では、デポジットされたベシクルの濃度を一定に保って、動的光散乱法(マルバーン社、ゼータサイザーナノ)において、カウントレート（250kcps）を、静的アテニュエーター（static attenuator）と調和させることによって、モニターした。
【０１２３】
Sulfo-SANPAH(SS)溶液（１００ｍＭ ＮａＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）中１０ｍＭ）を、前記で調製したＰＢ−ＰＭＯＸＡ−ＮＨ−(ＣＨ２)２−ＮＨ２ベシクルと、光の無い状態で、反応させた（２５０μＬのベシクル溶液を５０μＬのＳＳと、１５分間結合させた）。一連の４７ｍｍポリスルホン膜（手動でキャストした）を、打ち抜きプレスでカットし、テフロン（登録商標）製の膜ホルダー内に置き、脱イオン水ですすいだ。過剰な水を圧縮空気で除去し、そして各３００μＬのＳＳ−活性化ベシクル懸濁液を、ポリスルホン担体膜上に置いた。その膜ホルダーを、次いで、光源から約５ｃｍのＵＶ光下に置き、そして防護のために３０分間ホイルでカバーした。次に、１ｍｌのピペットを用いて、膜表面に触れることなく、過剰な反応物を膜表面から除いた。上記各ステップを３回繰り返し、膜をホルダーから取り出し、２５ｍｍ直径の膜サンプルを、打ち抜きプレスを用いて、被覆された部分から、カットした。次いで、振動テーブル上で、これらを、過剰な１００ｍＭ  ＮａＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）中で、試験前に、少なくとも１時間すすいだ。
【０１２４】
図６は、得られた膜の顕微鏡写真であり、担体膜の表面上の架橋された多数のベシクルを含む凝集した集団を示している。
【０１２５】
上記工程で調製された膜は、１０μＬか又は１５０μＬのフリーラジカル開始溶液での処理に供した。該溶液の構成：
２５ｍＭ硫酸鉄(II)７水和物、
２５ｍＭメタ重亜硫酸ナトリウム、
２５ｍＭ過硫酸カリウム
該処理は、ＰＢ疎水性コアの架橋をもたらした。
【０１２６】
得られた各膜サンプルについて、標準分画分子量分析技術を用いて、細孔径分布を調べた。前記工程で調製した２５ｍｍの各サンプルについて、それらの分画分子量、即ち与えられた分子量の少なくとも９０％の分子がその膜によって保持されるポイントを測定することによって、高分子物質を保持する能力を試験した。リン酸緩衝液（０．０３Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４＋０．０３Ｍ ＫＨ２ＰＯ４）を、０．２μｍの膜で予め濾過し、溶液の調製に使用する前に、ｐＨを７．２に合わせた。標準デキストラン（ＤＸＴ）を、リン酸緩衝液に溶解した（ＤＸＴ１６５ｋＤａ，３２５ｋＤａ，５４８ｋＤａ，１３００ｋＤａ，及び５０００ｋＤａ，ＤＸＴ０．５０５ｋＤａ，４ｋＤａ，６ｋＤａ，１１ｋＤａ，２０ｋＤａ，及び２８ｋＤａ）。全てのデキストラン溶液を、リン酸緩衝液で、０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、使用前に、０．２μｍのポリエチレンスルホン膜を用いて、予め濾過した。全ての濾過実験は、１０ｍｌのアミコン(Amicon)撹拌式限外濾過セル(Model 8010, ミリポア社製)中で、行った。全てのサンプルは、下記プロトコールに従って、評価された：
□ １０ｍｌ容量の脱イオン水を、２０psiで濾過して、細孔構造及びシステム全体を濡らす。
□ フィード(feed)ラインを、デキストラン溶液フィードと共に、デジタルペリスタポンプ(サーモフィッシャーサイエンス社製)に接続し、セルを２０psiに再加圧し、濾液流量を５μｍ／sにセットする。
□ 平衡化のため２，０００μＬの水を濾過し、膜の下流のデッドボリュームを洗い出した後、濾液溶液のサンプル８００μＬを採取する。
□ １ｍｌの浸透サンプルを、濾過後のセルから、直接採取する。
□ 脱イオン水でシステム全体を、洗浄し、そしてすすぐ。
□ 撹拌速度は６００ｒｐｍに保ち、全ての実験は室温（２２±３℃）で行った。
【０１２７】
浸透は、高圧液体クロマトグラフィーを用いて、更に評価した（ＨＰＬＣカラム；ＰＬ１１４９−６８４０，分子量１０，０００〜２００，０００、ＰＬ１１２０−６８３０，分子量１００〜３０，０００、ＰＬ１１４９−６８６０，分子量２００，０００〜＞１０，０００，０００）。浸透クロマトグラムへのフィードの比較が、保持係数及び膜の分画分子量の計算を可能にした。結果を図７に示す。図７は、コントロール膜の分画分子量は、ベシクルで被覆されたときに、半減したことを示している。ベシクルで被覆した膜の分画分子量は、開始剤を用いてポリブタジエンのコア(core)を架橋すると、４０００Ｋａまで減少した。分画分子量の減少は、用いたクロスリンカーの量に依存することが、示されている。
【０１２８】
実施例６：ベシクルの封入効率
フルオレセイン（シグマ−アルドリッチ社Ｆ６３７７）の１ｍＭ溶液を、ナトリウム−ＭＯＰＳ（ＧＦＳ５４４０）１００ｍＭ中で、調製した。水和媒体としてフルオレセインのＮａ−ＭＯＰＳ溶液を用いて、実施例２に従って、ポリマーベシクルを調製した。更に、ポリマーベシクルを、２００ｎｍで、ポリカーボネート製のトラックエッチドフィルター（ミリポア社)を通して、押出した。封入されなかった染料は、１００ｍＭナトリウム−ＭＯＰＳ（１：１０００の体積比、交換３回）に対する透析（サーモフィッシャーサイエンティフィック  ６６３８３  １０ｋＤａ）によって、取り除かれた。
【０１２９】
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いて、１ベシクル当りの封入された染料分子の数を、定量した。実験は、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）モジュール（ベッカー−ヒックル社製、ドイツ国ベルリン）で、行った。詳細な機器設定については、ガラパリ(Gullapalli)等、“Integrated multimodal microscopy, time-resolved fluorescence, and optical-trap rheometry: toward single molecule mechanobiology”, J. Biomedical Optics, 2007 Jan-Feb;12(1):014012、パブメド PMID: 17343487、パブメドセントラル PMCID: PMC3251961[イーパブ(Epub) 2007/03/09の検索エンジン]中に、記載されている。用いた光源は、発光最大が５３２ｎｍであるＮｄ：ＹＡＧパルスレーザーであった。１．２の開口数（numerical aperture）を有する６０倍水浸対物レンズを使用して、レーザビームを試料内のカバーガラス上４０μｍの回折限界（diffraction-limited）焦点に集束させた。レーザー出力は、対物レンズの開口部の背部で光強度を測定することによって、３０μＷ／ｍ２に設定した。
【０１３０】
ＦＣＳ実験において、微小観察（共焦点）体積（〜１フェムトリットル）内の蛍光強度の経時変化がモニターされ、その揺らぎが下記自己相関関数（式１）にあてはめられる。
【０１３１】
【数２】
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ここで、Ｇ(τ)は規格化（normalized）自己相関関数であり；σＦ(ｔ)は時間ｔの蛍光強度の揺らぎであり；σＦ(ｔ＋τ)はタイムラグτ後の蛍光強度の揺らぎであり、そしてＦ(ｔ)は時間ｔの平均蛍光強度である。τ＝０のとき、式１の右側の項は蛍光強度の揺らぎの分散に等しく、それはＧ(０)＝１／Ｎとなる。Ｎは、共焦点体積中の蛍光体の平均数を表す。これらの原則は、ＦＣＳ実験から観測された自己相関曲線を、下記式２及び上記ガラパリ(Gullapalli)等において示された３Ｄ分散モデルにあてはめて、水溶液及びポリマーベシクル中のフルオレセイン濃度を得るために用いられた。
【０１３２】
【数３】
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ここで、ｒ及びｚは共焦点体積の半径及び半分の高さであり、それは、しばしば、３Ｄのガウス照度プロフィル（Gaussian illumination profile）を有すると想定される（メイチ（Maiti）等、Proc. Nat. Acad. Sci., 1997;94(22):11753-7を参照）。τDiは、共焦点体積を横切る蛍光種ｉの２Ｄ横への拡散時間である。ｆｉは、蛍光種ｉの画分(fraction)である。我々は、フルオレセイン染料無し及び封入された染料を有するポリマーベシクルの双方に適する単一の種を用いた。
【０１３３】
分子輝度（Molecular brightness）は、ＦＣＳに基づく方法を用いて測定され、リグラー（Rigler）等、Correlation Spectroscopy, 2006 (9):367-73に記載されているように、ベシクル１個当りのフルオレセイン分子の数（Ｎencap-fluor）を計算した。この方法において、０.１Ｍ  ＮａＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．５）中の遊離フルオレセイン分子を、標準として用いた。フルオレセインの分子輝度（標準励起速度で１分子当りに放出される光子）（εfluorescein）は、時間シフトされた自己相関曲線を３Ｄ拡散モデル（式２）に適合させることによって得られるように、実験を通して収集された光子の総数を測定の継続時間（duration）で除し、その数を共焦点体積中のフルオレセイン分子の数（Ｎfree-fluor）で割ることによって測定した。フルオレセイン封入ポリマーベシクルの分子輝度（εpolymersome）も同様に測定した。ポリマーベシクルの分子輝度対遊離フルオレセインの分子輝度の割合（εpolymersome／εfluorescein）は、ポリマーソーム（polymersome）当たりのフルオレセイン分子数（Ｎencap-fluor．μ）の推定値をもたらした。
【０１３４】
得られた結果を、図８に示す。フルオレセインの分子輝度（εfluorescein）は、２９photons/molecule/secondであった。０．２μｍのポリマーソームの分子輝度（εpolymersome）は、１１２４４photons/molecule/secondであった。従って、ポリマーソーム当りの封入されたフルオレセイン分子の数（Ｎfluorescein＝εpolymersome／εfluorescein）は、３８７分子であった。２００ｎｍベシクルの半径を、壁厚（クライオＴＥＭ、Ｒ effective＝９．０９×Ｅ−０８ｍ）について補正して、ベシクルの封入容量を計算したところ、３．１４×Ｅ−１８ｄｍ３であった。１ｍＭ溶液をポリマーベシクルの水和に使用し、ベシクル内で測定したフルオレセインの濃度は、０．２０４１９６９９２ｍＭであった。従って、これらの結果は、２５％の封入効率を示し、これは高い数値である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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