(57)【要約】本明細書には、ＩＬ−３４の活性または発現の上昇に関連する、炎症性腸疾患などの炎症性疾患および／または線維症を処置するための、ＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列および方法が開示されている。炎症性疾患および／または線維症の処置に有用な、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物、ならびに、炎症性疾患および／または線維症の処置における使用のための、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬の製造も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜９：５’−ＧＣＴＧＧＧＴＧＡＣＧＣＴＴＴ−３’（配列番号１）、５’−ＴＧＧＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＡＧＧ−３’（配列番号２）、５’−ＣＣＡＡＧＡＴＡＧＣＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号３）、５’−ＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＡＴＣＴ−３’（配列番号４）、５’−ＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＡ−３’（配列番号５）、５’−ＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＡＡＧＣＡ−３’（配列番号６）、５’−ＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号７）、５’−ＴＣＧＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号８）、５’−ＧＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧＧＴＧＣ−３’（配列番号９）からなる群から選択される配列、その一部およびその相補物を含む、ＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記配列のヌクレオシド結合の少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、およびアミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合、またはボラノホスフェート結合からなる群から選択される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記配列のヌクレオシド間結合の少なくとも１つがホスホロチオエート結合である、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエート結合である、請求項１から３までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドまでの長さである、請求項１から４までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
１５ヌクレオチドから２２ヌクレオチドまでの長さである、請求項１から５までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
【請求項８】
炎症性疾患に罹患している患者の細胞における炎症性サイトカイン産生を阻害する方法であって、有効量の、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
【請求項９】
炎症性疾患に罹患している患者の細胞におけるＩＬ−３４媒介性炎症反応を低減させるまたは阻害する方法であって、有効量の、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
【請求項１０】
ＩＬ−３４発現の変更に関連する炎症性疾患を処置することを必要とする患者においてＩＬ−３４発現の変更に関連する炎症性疾患を処置する方法であって、有効量の、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、シェーグレン症候群（ＳＳ）、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、ＣＮＳ炎症性疾患、または自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項７から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症性腸疾患が、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン（肉芽腫性）大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを、局所投与、非経口投与、経口投与、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、または十二指腸内投与する、請求項７から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを、経口投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者がヒトである、請求項７から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドと医薬として許容されるキャリアとを含む、医薬として許容される組成物。
【請求項１９】
医薬組成物が、局所投与、非経口投与、経口投与、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、または十二指腸内投与に適したものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
炎症性疾患を処置するための医薬の製造における、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２１】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群（ＳＳ）、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、ＣＮＳ炎症性疾患、または自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記炎症性腸疾患が、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン（肉芽腫性）大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎からなる群から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
線維症を防止または処置するための方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
【請求項２５】
前記線維症が、腸線維症である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記線維症が、肺線維症である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記線維症が、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、および腎性全身性線維症からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
腸線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を医薬として有効な量で投与することを含む方法。
【請求項２９】
前記医薬調製物を経口投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者がヒトである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者が、クローン病、炎症性腸疾患、または潰瘍性大腸炎にも罹患している、請求項２８から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
肺線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を医薬として有効な量で投与することを含む方法。
【請求項３３】
前記医薬調製物を、経口投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者がヒトである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’−ＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＡ−３’（配列番号５）の配列を含む、請求項２８から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
医薬としての使用のための、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
炎症性疾患の処置における使用のための、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群（ＳＳ）、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、ＣＮＳ炎症性疾患、または自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項３７に記載の使用のためのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項３８に記載の使用のためのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
前記炎症性腸疾患が、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン（肉芽腫性）大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎からなる群から選択される、請求項３９に記載の使用のためのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
線維症の処置における使用のための、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記線維症が、腸線維症である、請求項４１に記載の使用のためのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記線維症が、肺線維症である、請求項４１に記載の使用のためのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記線維症が、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、および腎性全身性線維症からなる群から選択される、請求項４１に記載の使用のためのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月２５日に出願された米国仮出願第６２／２６０，０７６号に対する優先権を請求し、その全体の開示は、すべての目的について本明細書中に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−３４（ＩＬ−３４）は、関節リウマチなどの骨変性疾患における炎症および破骨細胞形成のメディエーターであるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ１およびＭＣＳＦ−１としても公知）と機能的に重複する、最近発見されたサイトカインである。炎症性疾患は、急性および慢性のどちらも、まだ完全には理解されていない重要な疾患カテゴリーである。
【０００３】
例えば、炎症性腸疾患は、胃腸管の慢性炎症性障害であり、米国ではおよそ１４０万名の患者が罹患している。炎症性腸疾患は、米国において最も蔓延している５つの胃腸疾患負荷のうちの１つであり、全体的な健康管理費用は１７億ドルを超える。米国では毎年、炎症性腸疾患は、７００，０００件を超える受診、１００，０００件の入院、および１１９，０００名の患者における能力障害の原因となっている。現在のところ医学的治癒法は存在せず、したがって、疾患管理には生涯にわたるケアが必要である。
【０００４】
クローン病および潰瘍性大腸炎は炎症性腸疾患の２つの最も一般的な形態である。クローン病は、胃腸管全体に影響を及ぼす可能性もあるが、主に回腸（小腸の遠位部または下部）および大腸に影響を及ぼす。潰瘍性大腸炎は、主に結腸および直腸に影響を及ぼす。炎症性腸疾患の病因は完全には理解されていないが、環境因子および遺伝因子の両方が当該疾患において役割を果たすと考えられている。環境構成成分は、摂取された食物および薬物への曝露の影響を受ける消化管の微生物叢の変更を含み得る。
【０００５】
炎症性腸疾患には、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、重度の痙攣、筋痙縮、体重減少、栄養不良、発熱、および貧血が伴う。炎症性腸疾患の患者は、皮膚病変、関節痛、眼炎、および肝障害にも罹患する可能性があり、また、潰瘍性大腸炎に罹患している小児では、成長不良を患う可能性がある。致死的であることは稀であるが、これらの症状は患者の生活の質を低下させるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、炎症性腸疾患などの炎症性障害を処置する、信頼できる方法を開発する差し迫った必要がある。広範囲の患者にわたって症状の有効かつ恒久的な軽減をもたらし、負の副作用または炎症および寛解のサイクルを伴わない処置方法を同定するさらなる必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書には、ＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１〜９のいずれかのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含むＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、本発明のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列５’−ｇｃｔｇｇｇｔｇａｃｇｃｔｔｔ−３’（配列番号１）、５’−ｔｇｇｔｃａｃｔｃａｇｔｃａｇｇ−３’（配列番号２）、５’−ｃｃａａｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｃ−３’（配列番号３）、５’−ｇｔｃａａｇｇｇｃｃａｃａｔｃｔ−３’（配列番号４）、５’−ａｇｃｔｇｃｔｃａｇｔｇｔｇａａ−３’（配列番号５）、５’−ａｃａｇａｇｇｃｃｔａａｇｃａ−３’（配列番号６）、５’−ｃｔｃａｔｔｃｔｇｃｇｔｃａａｇ−３’（配列番号７）、５’−ｔｃｇｇｇｇｃａｇｃａｇａｇ−３’（配列番号８）、または５’−ｇｇａｇｔｇａｇｃａｇｇｔｇｃ−３’（配列番号９）、その一部、またはその相補物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
【０００８】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合がホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、およびアミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合、またはボラノホスフェート結合であるアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の少なくとも１つがホスホロチオエート結合である。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエート結合である。
【０００９】
本明細書に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの数は変動し得る。例えば、一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドまでの長さである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドから２２ヌクレオチドまでの長さである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２２ヌクレオチドから４０ヌクレオチドまでの長さである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチドから２０ヌクレオチドまで、２０ヌクレオチドから３０ヌクレオチドまで、または３０ヌクレオチドから４０ヌクレオチドまでの長さである。
【００１０】
ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドがそれを必要とする患者に投与される処置方法も本明細書に記載する。例えば、炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、本明細書に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法を本明細書に記載する。炎症性疾患に罹患している患者の細胞における炎症性サイトカイン産生を阻害する方法であって、有効量の、本明細書に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も本明細書に記載する。
【００１１】
炎症性疾患に罹患している患者の細胞におけるＩＬ−３４媒介性炎症反応を低減させるまたは阻害する方法であって、有効量の、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も本明細書に記載する。ＩＬ−３４発現の変更に関連する炎症性疾患を処置することを必要とする患者においてＩＬ−３４発現の変更に関連する炎症性疾患を処置する方法であって、有効量の、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も本明細書に記載する。
【００１２】
本明細書に記載の方法は、これだけに限定されないが、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、シェーグレン症候群（ＳＳ）、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、ＣＮＳ炎症性疾患、または自己免疫疾患を含めた炎症性疾患を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、または特発性肺線維症（ＩＰＦ）を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン（肉芽腫性）大腸炎（Crohn’s  (granulomatous)  colitis）、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、または分類不能大腸炎である。特定の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病または潰瘍性大腸炎である。
【００１３】
一部の実施形態では、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを局所投与、非経口投与、経口投与、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、または十二指腸内投与する。特定の実施形態では、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを経口投与する。
【００１４】
一部の実施形態では、処置を必要とする患者は、ヒトである。
【００１５】
本明細書に記載のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドと医薬として許容されるキャリアとを含む、医薬として許容される組成物も本明細書に記載する。一部の実施形態では、医薬組成物は、局所投与、非経口投与、経口投与、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、または十二指腸内投与に適したものである。
【００１６】
医薬としての使用のためのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドも本明細書に記載する。
【００１７】
炎症性疾患を処置するための医薬の製造におけるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も本明細書に記載する。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群（ＳＳ）、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、ＣＮＳ炎症性疾患、または自己免疫疾患である。喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、または特発性肺線維症（ＩＰＦ）を処置するための医薬の製造におけるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も本明細書に記載する。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン（肉芽腫性）大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、または分類不能大腸炎である。
【００１８】
炎症性疾患の処置における使用のためのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドも本明細書に記載する。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群（ＳＳ）、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、ＣＮＳ炎症性疾患、または自己免疫疾患である。喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、または特発性肺線維症（ＩＰＦ）の処置における使用のためのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドも本明細書に記載する。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン（肉芽腫性）大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、または分類不能大腸炎である。
【００１９】
種々の実施形態では、本発明は、線維症、例えば腸線維症、肺線維症、もしくは肝臓線維症を処置もしくは防止するまたはコラーゲン沈着を防止する方法であって、線維症に罹患している患者においてＩＬ−３４を阻害することを含む方法である。本発明は、線維症を処置もしくは防止するまたはコラーゲン沈着を防止する方法であって、細胞、例えば腸細胞においてＩＬ−３４を阻害することを含む方法でもあり得る。一部の実施形態では、本発明は、患者において線維症を処置もしくは防止するまたはコラーゲン沈着を防止する方法であって、患者に、有効量のＩＬ−３４の特異的阻害剤、例えばＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法であり得る。
【００２０】
線維症を処置するための医薬の製造におけるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も本明細書に記載する。一部の実施形態では、線維症は、腸線維症である。一部の実施形態では、線維症は、肺線維症である。他の実施形態では、線維症は、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、または腎性全身性線維症である。
【００２１】
線維症の処置における使用のためのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドも本明細書に記載する。一部の実施形態では、線維症は、腸線維症である。一部の実施形態では、線維症は、肺線維症である。他の実施形態では、線維症は、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、または腎性全身性線維症である。
【００２２】
一部の実施形態では、線維症、例えば腸線維症に罹患している患者は、炎症性腸疾患に以前罹患していた、もしくは、炎症性腸疾患に罹患している、または、患者において腸線維症に先立って炎症性腸疾患が生じていた。一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病である。一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。
【００２３】
一部の実施形態では、腸線維症に罹患している患者は、大腸炎に以前罹患していた、もしくは、大腸炎に罹患している、または、患者において腸線維症に先立って大腸炎が生じていた。一部の実施形態では、大腸炎は、急性大腸炎である。一部の実施形態では、大腸炎は、慢性大腸炎である。
【００２４】
本発明の一部の実施形態では、患者は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。
【００２５】
本明細書に記載の本発明の方法において線維症を有する患者に投与されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、種々の投与経路によって投与することができることが理解されよう。種々の実施形態では、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、経口経路、局所経路、非経口経路、例えば、皮下注射によるもの、吸入噴霧によるもの、または直腸経路を含めた、１つまたはいくつかの経路によって投与することができる。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下注射、膵臓内投与、ならびに静脈内、筋肉内、腹腔内、および胸骨内注射または注入技法を含む。好ましい実施形態では、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを、線維症、例えば腸線維症または肺線維症を有する患者に経口投与することができる。
【００２６】
本発明は、ＩＬ−３４  ＲＮＡを分解の標的とすること、ＲＮＡスプライシングに干渉すること、またはＩＬ−３４遺伝子の発現もしくはタンパク質への翻訳を防止することが可能なＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を含む方法を提供することができる。本発明のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−３４  ｍＲＮＡの種々の領域を結合の標的とし得る。ヒトＩＬ−３４  ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１１７２７７１．１（配列番号１０）、ＮＭ＿００１１７２７７２．１（配列番号１１）、またはＮＭ＿１５２４５６．２（配列番号１２）の配列である。
【００２７】
ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、ＩＬ−３４  ＲＮＡを標的とすることが可能な複数の配列から選択することができる。本発明の一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエート、すなわち、ヌクレオチド間結合の少なくとも一部が患者の細胞への送達に適したホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチドである。さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、修飾された塩基、例えば５−メチル−２’−デオキシシチジンを含有するヌクレオチドを含み得る。
【００２８】
本発明の一部の実施形態では、患者において線維症、例えば腸線維症を処置する、腸線維症もしくは肺線維症を防止する、またはコラーゲン沈着を防止する方法は、医薬組成物、例えば、ＩＬ−３４の特異的阻害剤、例えばＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬として許容されるキャリアとを含む医薬組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、医薬組成物を非経口投与する。一部の実施形態では、医薬組成物を経口投与する。一部の実施形態では、医薬組成物は、腸溶コーティング、例えばアクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体を含む腸溶コーティングを含む。
【００２９】
本発明の複数の実施形態では、患者において線維症（例えば、腸線維症または肺線維症）を処置する、線維症（例えば、腸線維症または肺線維症）を防止する、またはコラーゲン沈着を防止する方法は、ＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を様々な量で投与することを含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１μｇ、少なくとも５μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも、２０μｇ、少なくとも、３０μｇ、少なくとも、４０μｇ、少なくとも、５０μｇ、少なくとも、６０μｇ、少なくとも、７０μｇ、少なくとも、８０μｇ、少なくとも、９０または少なくとも１００μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、３５ｍｇから５００ｍｇまで、１ｍｇから１０ｍｇまで、１０ｍｇから２０ｍｇまで、２０ｍｇから３０ｍｇまで、３０ｍｇから４０ｍｇまで、４０ｍｇから５０ｍｇまで、５０ｍｇから６０ｍｇまで、６０ｍｇから７０ｍｇまで、７０ｍｇから８０ｍｇまで、８０ｍｇから９０ｍｇまで、９０ｍｇから１００ｍｇまで、１００ｍｇから１５０ｍｇまで、１５０ｍｇから２００ｍｇまで、２００ｍｇから２５０ｍｇまで、２５０ｍｇから３００ｍｇまで、３００ｍｇから３５０ｍｇまで、３５０ｍｇから４００ｍｇまで、４００ｍｇから４５０ｍｇまで、４５０ｍｇから５００ｍｇまで、５００ｍｇから６００ｍｇまで、６００ｍｇから７００ｍｇまで、７００ｍｇから８００ｍｇまで、８００ｍｇから９００ｍｇまで、９００ｍｇから１ｇまで、１ｍｇから５０ｍｇまで、２０ｍｇから４０ｍｇまで、または１ｍｇから５００ｍｇまでのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【００３０】
肝線維症、肺線維症、または腸線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、ＩＬ−３４阻害剤、例えば、本明細書に開示されているＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を投与することを含む方法も本明細書において提供される。腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、特発性肺線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、および／または腎性全身性線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されているＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を投与することを含む方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１Ａは、刺激せずにおいたか（Ｕ）、リポフェクタミンに曝露させたか（Ｌ）、または０．５μｇ／ｍＬのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１の表１に示されている配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９）をトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ相対的発現を示す棒グラフである。
【００３２】
【図１Ｂ】図１Ｂは、刺激せずにおいたか（Ｕ）、リポフェクタミンに曝露させたか（Ｌ）、または１μｇ／ｍＬのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１の表１に示されている配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９）をトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ相対的発現を示す棒グラフである。
【図１Ｃ】図Ｃは、刺激せずにおいたか（Ｕ）、リポフェクタミンに曝露させたか（Ｌ）、または２μｇ／ｍＬのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１の表１に示されている配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９）をトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ相対的発現を示す棒グラフである。
【００３３】
【図２Ａ】図２Ａは、刺激せずにおいたか（Ｕ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したか（ポリ）、またはポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激し、かつ０．５μｇ／ｍＬのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１の表１に示されている配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９）をトランスフェクトした正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ相対的発現を示す棒グラフである。
【００３４】
【図２Ｂ】図２Ｂは、刺激せずにおいたか（ｕｎｓｔ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したか（ポリ）、またはポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激し、かつ１μｇ／ｍＬのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１の表１に示されている配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９）をトランスフェクトしたＰＢＭＣにおけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ相対的発現を示す棒グラフである。
【００３５】
【図２Ｃ】図２Ｃは、刺激せずにおいたか（ｕｎｓｔ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したか（ポリ）、またはポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激し、かつ２μｇ／ｍＬのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１の表１に示されている配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９）をトランスフェクトしたＰＢＭＣにおけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ相対的発現を示す棒グラフである。
【００３６】
【図３】図３は、散発性ＣＲＣ患者１２名からの対の非腫瘍（ＮＴ）組織試料および腫瘍（Ｔ）組織試料における正規化されたＩＬ−３４  ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【００３７】
【図４Ａ】図４Ａは、アイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ、上のパネル）またはＩＬ−３４抗体（下のパネル）のいずれかを用いてプローブした、散発性ＣＲＣ患者由来の非腫瘍（ＮＴ）結腸組織試料および腫瘍（Ｔ）結腸組織試料の一連の顕微鏡写真（４０倍；挿入図、２００倍）である。
【００３８】
【図４Ｂ】図４Ｂは、非腫瘍（ＮＴ）組織と比較した散発性ＣＲＣ患者の腫瘍（Ｔ）組織におけるＩＬ−３４陽性細胞の数の高倍率視野（ｈｐｆ）当たりの定量を示すグラフである（ｎ＝８名の患者；ＮＴ対Ｔ、ｐ＜０．０００１；バーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す）。
【００３９】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＩＬ−３４タンパク質レベルを測定するために散発性ＣＲＣの患者８名の非腫瘍（ＮＴ）領域および腫瘍（Ｔ）領域から取得した結腸外植片組織に対して実施したＥＬＩＳＡの結果を示す（ＮＴ対Ｔ、ｐ＝０．００２；バーはＳＥＭを表す）。
【００４０】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＩＬ−３４抗体およびβ−アクチン抗体を用いてプローブした、散発性ＣＲＣの患者５名の非腫瘍（ＮＴ）領域および腫瘍（Ｔ）領域に由来する組織抽出物のウエスタンブロットを示す（ブロットは２回の実験からの結果の代表である）。
【００４１】
【図５Ａ】図５Ａは、無刺激（Ｕｎｓｔ）または組換えヒトＩＬ−３４（２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌ）による刺激のＤＬＤ−１細胞増殖に対する効果を示すグラフである（ｎ＝４；５０ｎｇ／ｍｌ対Ｕｎｓｔ、ｐ＝０．００６；１００ｎｇ／ｍｌ対Ｕｎｓｔ、ｐ＝０．０２；バーはＳＥＭを表す）。
【００４２】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＥＲＫ１／２もしくはｐ３８の特異的阻害剤（それぞれＰＤ９８０５９またはＳＢ２０２１９０）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ビヒクルと一緒にプレインキュベートした後の、組換えヒトＩＬ−３４による刺激（５０ｎｇ／ｍＬ、４８時間）のＤＬＤ−１細胞増殖に対する効果を示すグラフである（ｎ＝４；ＩＬ−３４＋ＤＭＳＯ対ＤＭＳＯ、ｐ＝０．０１；ＤＭＳＯ対ＩＬ−３４＋ＳＢ２０２１９０、ｐ＝０．０１；ＤＭＳＯ＋ＩＬ−３４対ＰＤ９８０５９＋ＩＬ−３４、ｐ＝０．００６；バーはＳＥＭを表す）。
【００４３】
【図６Ａ】図６Ａは、無刺激（Ｕｎｓｔ）試料または組換えヒトＩＬ−３４（２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて４８時間にわたって処理した試料におけるＤＬＤ−１細胞死のパーセントを示すグラフである（ｎ＝４；バーは平均±ＳＥＭを表す；ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）；アネキシンＶ（ＡＶ））。
【００４４】
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＩおよび／またはＡＶ染色によって評定した、無刺激（Ｕｎｓｔ）試料または組換えヒトＩＬ−３４および／もしくはＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）を用いて処理した試料におけるＤＬＤ−１細胞死のパーセントを示すグラフである（ｎ＝４；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【００４５】
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＡＶ染色単独で評定した、無刺激（Ｕｎｓｔ）試料または組換えヒトＩＬ−３４および／もしくはＦａｓＬを用いて処理した試料におけるＤＬＤ−１細胞死のパーセントを示すグラフである（ｎ＝４；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【００４６】
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＰＩおよび／またはＡＶ染色によって評定した、無刺激（Ｕｎｓｔ）試料または組換えヒトＩＬ−３４および／もしくは腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を用いて処理した試料におけるＤＬＤ−１細胞死のパーセントを示すグラフである（ｎ＝４；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【００４７】
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＡＶ染色単独で評定した、無刺激（Ｕｎｓｔ）試料または組換えヒトＩＬ−３４および／もしくはＴＮＦ−αを用いて処理した試料におけるＤＬＤ−１細胞死のパーセントを示すグラフである（ｎ＝４；ＩＬ−３４対ＩＬ３４＋ＴＮＦα、ｐ＝０．０３；ＴＮＦα対ＩＬ３４＋ＴＮＦα、ｐ＝０．０５；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【００４８】
【図７Ａ】図７Ａは、アイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ、上のパネル）またはマクロファージコロニー刺激因子−１受容体特異的抗体（Ｍ−ＣＳＦＲ−１；下のパネル）のいずれかを用いてプローブした、対照患者（ＣＴＲ）３名および散発性ＣＲＣ患者（ＣＲＣ）３名由来の結腸組織試料の一連の顕微鏡写真（２００倍；挿入図、４００倍）である。
【００４９】
【図７Ｂ】図７Ｂは、散発性ＣＲＣを有する個体６名由来の非腫瘍（ＮＴ）結腸組織および腫瘍（Ｔ）結腸組織における、正規化されたＭ−ＣＳＦＲ−１  ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。グラフ上の同じ患者からのＮＴデータ点とＴデータ点を線で結んでいる。水平のバーはＮＴ群およびＴ群のそれぞれにおけるＭ−ＣＳＦＲ−１  ｍＲＮＡ値の中央値を表す（ＮＴ対Ｔ、ｐ＝０．０１）。
【００５０】
【図７Ｃ】図７Ｃは、散発性ＣＲＣを有する個体６名由来の非腫瘍（ＮＴ）結腸組織および腫瘍（Ｔ）結腸組織における正規化された受容体型タンパク質−チロシンホスファターゼゼータ（ＰＴＰ−ζ）ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。グラフ上の同じ患者からのＮＴデータ点とＴデータ点を線で結んでいる。水平のバーはＮＴ群およびＴ群のそれぞれにおけるＰＴＰ−ζ  ｍＲＮＡ値の中央値を表す（ＮＴ対Ｔ、ｐ＝０．０３）。
【００５１】
【図８Ａ】図８Ａは、無刺激細胞（Ｕｎｓｔ）における、またはマクロファージコロニー刺激因子−１（ＭＣＳＦ−１）に２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、もしくは１００ｎｇ／ｍｌで曝露させた後の、ＤＬＤ−１細胞増殖を示すグラフである（ｎ＝１１；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【００５２】
【図８Ｂ】図８Ｂは、無刺激細胞（Ｕｎｓｔ）における、またはヒト組換えＩＬ−３４に２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、もしくは１００ｎｇ／ｍｌで曝露させた後の、ＤＬＤ−１細胞増殖を示すグラフである（ｎ＝７；Ｕｎｓｔ対２５ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００１；Ｕｎｓｔ対５０ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００１；Ｕｎｓｔ対１００ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００１；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【００５３】
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＡＶおよび／またはＰＩ染色によって測定した、無刺激細胞（Ｕｎｓｔ）における、またはＭＣＳＦ−１に２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、もしくは１００ｎｇ／ｍｌで曝露させた後の、ＤＬＤ−１細胞死を示すグラフである（ｎ＝６；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【００５４】
【図９】図９は、ＤＬＤ−１細胞、ＨＴ−２９細胞、ＨＣＴ−１１６細胞、およびＮＣＭ−４６０細胞における正規化されたＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【００５５】
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＩＬ−３４抗体またはβ−アクチン抗体を用いてプローブした、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＮＣ  ＡＳ）またはＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＬ−３４  ＡＳ）を２μｇ／ｍｌの濃度で４８時間にわたってトランスフェクトした細胞からのＤＬＤ−１細胞抽出物のウエスタンブロットの画像である（４回の実験のうちの１回からの代表的な画像）。
【００５６】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＡＶおよびＰＩについて染色した、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＮＣ  ＡＳ）またはＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＬ−３４  ＡＳ；配列番号５のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド）を２μｇ／ｍｌの濃度で７２時間にわたってトランスフェクトしたＤＬＤ−１細胞における細胞死のパーセントを示すグラフである（ｎ＝４；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。
【００５７】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＣＦＳＥを用いた染色後にフローサイトメトリーによって評価した、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＮＣ  ＡＳ）またはＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＬ−３４  ＡＳ；配列番号５のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド）を２μｇ／ｍｌの濃度で７２時間にわたってトランスフェクトしたＤＬＤ−１細胞における相対的な細胞増殖を示すグラフである（ｎ＝４；ＮＣ  ＡＳ対ＩＬ−３４  ＡＳ、ｐ＝０．０１；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。
【００５８】
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＩＬ−３４に対する抗体、総ＥＲＫ１／２に対する抗体（ＥＲＫ１／２）、リン酸化ＥＲＫ１／２に対する抗体（ｐＥＲＫ１／２）、またはβ−アクチンに対する抗体を用いてプローブした、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＮＣ  ＡＳ）またはＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＬ−３４  ＡＳ；配列番号５のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド）を２μｇ／ｍｌの濃度で７２時間にわたってトランスフェクトした細胞からのＤＬＤ−１細胞抽出物のウエスタンブロットの画像である（画像は、４回の実験の代表である）。
【００５９】
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｍ−ＣＳＦＲ−１抗体を用いて染色した大腸炎関連結腸がん患者由来の腫瘍（Ｔ）結腸組織および非腫瘍（ＮＴ）結腸組織を示す一連の顕微鏡写真を示す（画像は、患者３名からの結果の代表である；４０倍の倍率、挿入図、２００倍の倍率）。
【００６０】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、アゾキシメタン（ＡＯＭ）およびデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）への曝露の８４日後の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから採取した腫瘍（Ｔ）結腸組織および非腫瘍（ＮＴ）結腸組織における正規化されたＩＬ−３４  ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。同じ動物からのＮＴデータ点とＴデータ点を線で結んでいる。各欄の水平のバーは、ＮＴ群およびＴ群におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ値の中央値を表す（ＮＴ対Ｔ、ｐ＝０．０１）。
【００６１】
【図１２Ａ】図１２Ａは、対照患者（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ）、炎症性クローン病の患者（Ｉ  ＣＤ）、および線維狭窄性クローン病（fibro-stricturing  Crohn’s  disease）の患者（ＦＳ  ＣＤ）由来の回腸生検組織におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである（Ｉ  ＣＤ対Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ、ｐ＝０．００２；ＦＳ  ＣＤ対Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ、ｐ＝０．０３；ｎ＝５；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。
【００６２】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＩＬ−３４に対する抗体およびＥＲＫ１／２に対する抗体を用いてプローブした、対照患者（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ）２名、Ｉ  ＣＤ患者２名、およびＦＳ  ＣＤ患者２名からのタンパク質抽出物を含有するウエスタンブロットの画像を示す。
【００６３】
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＩＬ−３４検出用抗体を用いて染色した、正常対照（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ）１名およびＦＳ  ＣＤに罹患している患者１名由来の外科的腸試料のパラフィン包埋切片の一連の顕微鏡写真（１００倍）である（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ個体３名およびＦＳ  ＣＤ患者３名からの画像の代表）。
【００６４】
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、対照患者（ＣＴＲ）５名およびＦＳ  ＣＤ患者５名からの腸線維芽細胞における正規化されたＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである（ＣＴＲ対ＦＳ  ＣＤ、ｐ＝０．００３；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。
【００６５】
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、ＣＴＲ患者２名およびＦＳ  ＣＤ患者２名の腸線維芽細胞からのタンパク質抽出物を含有し、ＩＬ−３４に対する抗体およびβ−アクチンに対する抗体を用いてプローブしたウエスタンブロットの画像である。
【００６６】
【図１３Ａ】図１３Ａは、正常対照患者（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ）５名、Ｉ  ＣＤに罹患している患者５名、およびＦＳ  ＣＤの患者５名由来の回腸生検組織における正規化されたＭ−ＣＳＦＲ−１  ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ対Ｉ  ＣＤ、ｐ＝０．０３；Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ対ＦＳ  ＣＤ、ｐ＝０．００６；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。
【００６７】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、対照患者（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ）２名、Ｉ  ＣＤに罹患している患者２名、およびＦＳ  ＣＤの患者２名由来の回腸生検組織のタンパク質抽出物を含有し、Ｍ−ＣＳＦＲ−１に対する抗体およびＥＲＫ１／２に対する抗体を用いてプローブしたウエスタンブロットである。
【００６８】
【図１４Ａ】図１４Ａは、６時間にわたり、処理せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または組換えヒトＩＬ−３４タンパク質に５０ｎｇ／ｍｌの濃度で曝露させた（ＩＬ−３４）線維芽細胞における正規化された１型コラーゲンアルファ１鎖（Ｃｏｌ１Ａ１）レベルを示すグラフである（ｎ＝４；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。
【００６９】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、６時間にわたり、処理せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または組換えヒトＩＬ−３４タンパク質に５０ｎｇ／ｍｌの濃度で曝露させた（ＩＬ−３４）線維芽細胞における正規化されたＩＩＩ型コラーゲンアルファ１鎖（Ｃｏｌ３Ａ１）レベルを示すグラフである（Ｕｎｓｔ対ＩＬ−３４、ｐ＝０．０３；ｎ＝４；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。
【００７０】
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、４８時間にわたり、処理せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または組換えヒトＩＬ−３４タンパク質に５０ｎｇ／ｍｌの濃度で曝露させた（ＩＬ−３４）線維芽細胞におけるコラーゲンタンパク質レベルを示すグラフである（Ｕｎｓｔ対ＩＬ−３４、ｐ＝０．０１；ｎ＝４；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、標的タンパク質（例えば、ＩＬ−３４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と相補的な短い合成オリゴヌクレオチド配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡにハイブリダイズし、それにより、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を分解するＲＮａｓｅ  Ｈなどの遍在する触媒酵素の活性化をもたらし得る二本鎖ハイブリッドを生じさせ、したがって、タンパク質への翻訳を防止する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２’−Ｏ−アルキルを含む修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはモルホリノオリゴマー化学物質を含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドであっても二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよく、オリゴヌクレオチドの一方の鎖のみが標的配列と相補的である。
【００７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み入れられるヌクレオチド配列の標的化部分が、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ配列またはＩＬ−３４相互作用パートナーのｍＲＮＡ配列と完全にまたはほぼ完全に相補的になるように設計することができる。そのような相補的なまたはほぼ相補的なヌクレオチド配列を組み入れることにより、所与の標的に対する特異性の程度が高いアンチセンスオリゴヌクレオチドを工学的に作製することが可能になる。特異性は、解離定数などのパラメータの測定またはタンパク質もしくはＲＮＡの発現レベルの変化などの他の判定基準、あるいはＩＬ−３４の活性または発現を測定する他のアッセイによって評定され得る。
【００７３】
本明細書に開示されているようなＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５〜１００オリゴヌクレオチドの長さ、例えば、１０〜４０オリゴヌクレオチドの長さ、例えば、１４〜４０オリゴヌクレオチドの長さ、１０〜３０オリゴヌクレオチドの長さ、例えば、１４〜３０オリゴヌクレオチドの長さ、例えば、１４〜２５または１５〜２２オリゴヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド配列であり得る。ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ配列の一部と相補的なオリゴヌクレオチド配列であり得る。
【００７４】
本開示の一部の実施形態では、ＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９：５’−ＧＣＴＧＧＧＴＧＡＣＧＣＴＴＴ−３’（配列番号１）、５’−ＴＧＧＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＡＧＧ−３’（配列番号２）、５’−ＣＣＡＡＧＡＴＡＧＣＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号３）、５’−ＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＡＴＣＴ−３’（配列番号４）、５’−ＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＡ−３’（配列番号５）、５’−ＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＡＡＧＣＡ−３’（配列番号６）、５’−ＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号７）、５’−ＴＣＧＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号８）、５’−ＧＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧＧＴＧＣ−３’（配列番号９）のいずれか１つから選択される配列を含む。
【００７５】
ある実施形態では、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つまたは複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、およびアミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合、ならびに／またはボラノホスフェート結合などの、修飾された結合を有し得る。例えば、一部の実施形態では、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ、２つまたはそれより多く、例えば全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合であり得る。
【００７６】
特定の実施形態では、ＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５（５’−ＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＡ−３’）の配列を含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、ＩＬ−３４に対するホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＩＬ−３４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５（５’−ＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＡ−３’）の配列を含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合のうちの１つまたは複数がホスホロチオエート結合である、ＩＬ−３４に対するホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７７】
代替の実施形態では、開示される、ＩＬ−３４を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意選択で、配列内に、例えば、５’末端もしくは３’末端の一方のみまたは５’末端および３’末端の両方またはオリゴヌクレオチド配列に沿ってのいずれかに配置された少なくとも１つの修飾された核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン、および／または少なくとも１つのメチルホスホネートヌクレオチドを有し得ることが意図されている。
【００７８】
意図されているＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意選択で、少なくとも１つの修飾された糖を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分は、２’−ＯＨ基がＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ（ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、Ｒ’はアルキレンである）からなる群から選択される任意の１つで置き換えられていてよいリボースである。
自己免疫疾患および炎症性疾患
【００７９】
本開示は、一部において、ＩＬ−３４活性に関連する炎症性障害を処置することを必要とする患者におけるＩＬ−３４活性に関連する炎症性障害の処置であって、開示されるアンチセンス化合物を投与することを含む処置を意図している。一部の実施形態では、炎症性疾患を処置することを必要とする患者において炎症性疾患を処置するための方法であって、開示されるアンチセンス化合物を投与することを含む方法が本明細書において提供される。本開示の一部の実施形態では、有効量の、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを、それを必要とする患者に投与して、炎症性疾患を処置する、例えば、炎症性疾患に罹患している患者の細胞における炎症性サイトカイン産生を阻害する、および／またはＩＬ−３４媒介性炎症反応を低減もしくは阻害することができる。
【００８０】
「炎症性疾患」は、本明細書で使用される場合、これだけに限定されないが、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症（例えば、歯周炎）、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群（ＳＳ）、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、ＣＮＳ炎症性疾患、または自己免疫疾患を含めた、いくつもの急性および慢性炎症性障害を指す。
【００８１】
一部の実施形態では、ループスに関連する皮膚病変を処置することを必要とする患者においてループスに関連する皮膚病変を処置する方法であって、開示される化合物を投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ループスに関連する皮膚病変の処置は、皮膚病変の数の減少、皮膚病変の形成の速度の低下、および皮膚病変の重症度の低減から選択される少なくとも１つの効果を含む。ループスおよび／またはループス腎炎に罹患している患者に対する、ループスおよび／またはループス腎炎の処置方法であって、開示されるアンチセンス化合物を投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ループスに関連する腎臓の状態の進行を遅くする方法が提供される。
【００８２】
ＣＮＳ炎症性疾患を処置する、それが発生するリスクを低下させる、またはその発症を遅らせることを必要とする被験体においてＣＮＳ炎症性疾患を処置する、それが発生するリスクを低下させる、またはその発症を遅らせる方法であって、開示される化合物を投与することを含む方法が本明細書において提供される。方法は、例えば、ＣＮＳ炎症性疾患が発生するリスクがある被験体を処置すること；例えば、被験体に、有効量の、開示されるＩＬ−３４アンチセンスを投与することを含む。このように処置することができるＣＮＳ炎症性疾患としては、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびパーキンソン病が挙げられる。
【００８３】
自己免疫疾患を処置する、それが発生するリスクを低下させる、またはその発症を遅らせることを必要とする被験体において自己免疫疾患を処置する、それが発生するリスクを低下させる、またはその発症を遅らせる方法であって、開示される化合物を投与することを含む方法も本明細書において提供される。方法は、自己免疫疾患を有するまたはそれが発生するリスクがある被験体を処置することを含む。このように処置することができる自己免疫疾患としては、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および特発性肺線維症が挙げられる。
炎症性腸疾患
【００８４】
本開示は、炎症性腸疾患を処置することを必要とする患者に対する、炎症性腸疾患を処置するための方法であって、開示される化合物を投与することを含む方法も提供する。「炎症性腸疾患」は、本明細書で使用される場合、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン（肉芽腫性）大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎を含めた、いくつもの慢性炎症性疾患を指す。クローン病および潰瘍性大腸炎が炎症性腸疾患の２つの最も一般的な形態である。炎症性腸疾患は、消化器系の自己免疫疾患である。クローン病は、回腸末端部を含めた胃腸管のあらゆる部分に局在し得、胃腸管の全ての細胞型に影響を及ぼし得る。潰瘍性大腸炎は、結腸および直腸に局在し、粘膜の細胞のみに影響を及ぼす。
【００８５】
環境因子および遺伝因子の両方が炎症性腸疾患において役割を果たすと考えられているが、そのような因子の実体は明確に定義されていない。環境構成成分は、摂取された食物および薬物への曝露の影響を受ける消化管の微生物叢の変更を含み得る。
【００８６】
炎症性腸疾患には、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、重度の痙攣、筋痙縮、体重減少、栄養不良、発熱、貧血、皮膚病変、関節痛、眼炎、肝障害、関節炎、壊疽性膿皮症、原発性硬化性胆管炎、および非甲状腺疾患症候群を含めた症状が伴い、開示されるアンチセンス化合物を使用してこれらの症状を処置することも、ある実施形態において、例えば、潰瘍性大腸炎に罹患しており、成長不良を患う可能性もある小児を処置することも意図されている。
腸線維症
【００８７】
腸線維症は、一般に、ＩＢＤによって引き起こされる慢性炎症などの炎症に対する腸組織の反応の結果生じる。ＩＢＤでは、ＳＭＡＤ７のレベルの上昇により、ＴＧＦ−β経路の活性化およびＳｍａｄ２／３リン酸化によって媒介される抗炎症性遺伝子の発現が遮断される。ＴＧＦ−βシグナル伝達の増加に曝露した筋線維芽細胞ではコラーゲンの産生量が増加する。クローン病に関しては、持続的な慢性炎症により線維化プロセスが促進され、その結果、小腸および結腸狭窄を含めた狭窄が形成される。
【００８８】
腸線維症は、造影超音波検査などの、いくつものイメージング技法のいずれかによって同定することができる。例えば、Quaiaら、The  value  of  small  bowel  wall  contrast  enhancement  after  sulfur  hexafluoride-filled  microbubble  injection  to  differentiate  inflammatory  from  fibrotic  strictures  in  patients  with  Crohn's  disease.  Ultrasound  Med.  Biol.、３８巻、１３２４〜１３３２頁（２０１２年）；Nylundら、Quantitative  contrast-enhanced  ultrasound  comparison  between  inflammatory  and  fibrotic  lesions  in  patients  with  Crohn's  disease.  Ultrasound  Med.  Biol.、３９巻、１１９７〜１２０６頁（２０１３年）；Stidhamら、Ultrasound  elasticity  imaging  for  detecting  intestinal  fibrosis  and  inflammation  in  rats  and  humans  with  Crohn's  disease.  Gastroenterology、１４１巻、８１９〜８２６頁（２０１１年）を参照されたい。磁化移動ＭＲＩなどのＭＲＩ技法も使用することができる。例えば、Maccioniら、Value  of  T2-weighted  magnetic  resonance  imaging  in  the  assessment  of  wall  inflammation  and  fibrosis  in  Crohn's  disease.  Abdom.  Imaging、３７巻、９４４〜９５７頁（２０１２年）；Adlerら、Magnetization  transfer  helps  detect  intestinal  fibrosis  in  an  animal  model  of  Crohn  disease.  Radiology、２５９巻、１２７〜１３５頁（２０１１年）；Pazahrら、Magnetization  transfer  for  the  assessment  of  bowel  fibrosis  in  patients  with  Crohn's  disease:  initial  experience.  Magn.  Reson.  Mat.  Phys.  Biol.  Med.、２６巻、２９１〜３０１頁（２０１３年）を参照されたい。
線維症
【００８９】
肝線維症、肺線維症、および／または腸線維症などの線維症を防止または処置する方法は本開示の一部を形成する。そのような方法は、それを必要とする患者またはリスクがある患者に、本明細書に開示されているＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を投与することを含み得る。例えば、肝線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されているＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法が提供される。あるいは、腸線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されているＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法が提供される。あるいは、肺線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されているＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法が提供される。
【００９０】
上記の方法を使用して処置される患者は、検出可能な線維症を有していても有していなくてもよい。一部の実施形態では、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後、例えば、１日後、２日後、１週間後、１カ月後または６カ月後もしくはそれよりも後に患者に存在する線維症の量が少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％またはさらには５０％もしくはそれより大きく減少する。そのようなＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、例えば、少なくとも毎日であり得る。化合物は、経口投与することができる。本明細書で開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与の結果としての患者における線維症の臨床症状の遅延は、本明細書に開示されているものなどのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を受けていない患者と比較して、少なくとも、例えば、６カ月、１年、１８カ月またはさらには２年もしくはそれよりも長い可能性がある。
【００９１】
必要とする患者は、硬変症に発展した肝線維症を有し得る。肝線維症のリスクがある患者としては、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の患者を挙げることができる。ＮＡＳＨは、脂肪症および硬変症を含めた非アルコール性脂肪肝疾患の範囲に含まれる。ＮＡＳＨは、肥満症、２型糖尿病、および脂質異常症によって特徴付けられるメタボリックシンドロームの構成要素であり、最終的に肝細胞癌に至る可能性がある。
【００９２】
肝線維症に関連する障害を処置する方法、例えば、以下：ある特定の蓄積症および先天性代謝異常、例えば、アルファ１−アンチトリプシン欠損症、銅蓄積症（例えば、ウイルソン病）、フルクトース血症、ガラクトース血症、糖原病（例えば、ＩＩＩ型、ＩＶ型、ＶＩ型、ＩＸ型およびＸ型）、鉄過剰症候群（例えば、ヘモクロマトーシス）、脂質異常（例えば、ゴーシェ病）、ペルオキシソーム障害（例えば、ツェルウェガー症候群）、およびチロシン血症；細菌感染症（例えば、ブルセラ症）；寄生虫感染症（例えば、エキノコックス症）；ＮＡＳＨ；ウイルス感染症（例えば、慢性Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎を含めたＢ型肝炎またはＣ型肝炎）；バッド・キアリ症候群；心不全；肝静脈閉塞症；ならびに門脈血栓症のうちの少なくとも１つの処置も提供される。先天性肝線維症を処置する方法も意図されている。組成物は、経口投与することができる。
【００９３】
薬物および／またはアルコールの乱用が肝線維症の症例に関係付けられている。薬物および／またはアルコールの乱用の履歴を有する患者において肝線維症を処置する方法が本明細書において意図されている。例えば、以下：アルコール、アミオダロン、クロルプロマジン、イソニアジド、メトトレキサート、メチルドパ、オキシフェニサチン、およびトルブタミドの少なくとも１つの乱用の履歴がある患者。
【００９４】
腸線維症のリスクがある患者としては、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、またはクローン病の患者を挙げることができる。リスクがある患者としては、クローン病もしくは大腸炎、広範囲かつ／もしくは重症の結腸疾患と診断されたときが低年齢である患者、原発性硬化性胆管炎が存在する患者、および／またはがんの家族歴を有する患者も挙げることができる。
【００９５】
腸線維症に関連する障害を処置する方法、例えば、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、またはクローン病のうちの少なくとも１つの処置も提供される。
【００９６】
腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、特発性肺線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、または腎性全身性線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されているＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を投与することを含む方法が本明細書において意図されている。
【００９７】
本発明のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独で、または本発明のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも２つを単一の組成物もしくは処置レジメンの一部として一緒に使用することによって互いと組み合わせて使用することができる。本発明のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬物および／もしくはアルコールの乱用、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、特発性肺線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、または腎性全身性線維症、薬物および／もしくはアルコールの乱用を処置するための他の薬物と組み合わせて使用することもできる。
処置および評価
【００９８】
「患者」とは、本明細書に記載される場合、これだけに限定されないが、哺乳動物、霊長類、およびヒトを含めた、炎症性疾患のリスクがある、それに罹患している、またはその診断を受けた任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、患者は、例えば、ネコ、イヌ、またはウマなどの非ヒト哺乳動物であり得る。患者は、炎症性疾患が発生するリスクが高いと診断された個体、炎症性疾患と診断された人、炎症性疾患に以前罹患していた人、または炎症性疾患の症状もしくは指標、例えばＩＬ−３４発現シグナルについて評価された個体であり得る。
【００９９】
「必要とする患者」とは、本明細書で使用される場合、炎症性疾患の症状もしくは徴候のいずれかが生じている患者、炎症性疾患の症状もしくは徴候のいずれかが生じる可能性がある患者、または炎症性疾患を処置するための本開示の方法が有益である可能性がある任意の患者を指す。必要とする患者とは、炎症性疾患が発生するリスクがあると診断されている患者、過去に炎症性疾患に罹患していた患者、または以前に炎症性疾患に対する処置を受けていた患者を含み得る。特に関連性があるのは、ＩＬ−３４発現または活性のレベルの増加に関連する炎症性疾患に罹患している個体である。
【０１００】
「処置する（treat）」、「処置（treatment）」、「処置すること（treating）」などの用語は、本明細書において、一般に、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味するように使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防止するという点で予防的なものであり得、かつ／または、疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用を部分的にもしくは完全に治癒するという点で治療的であり得る。「処置（treatment）」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患に対するあらゆる処置を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、今のところはまだそれを有すると診断されていない被験体において疾患が生じるのを防止すること；（ｂ）疾患を阻害する、すなわち、疾患の重症度もしくは範囲が増加するのを防止すること；（ｃ）疾患を軽減する、すなわち、疾患の部分的もしくは完全な好転を引き起こすこと；または（ｄ）疾患の再発を防止する、すなわち、以前の上首尾の疾患の症状の処置もしくは疾患の処置の後に疾患が活動的な状態に戻るのを防止することを含む。
【０１０１】
「有効量」は、本明細書で使用される場合、患者に投与したときに状態が少なくとも部分的に処置されるのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、状態の重症度、構成成分の投与経路、および処置される患者の年齢、体重などに応じて変動する。したがって、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量は、患者において炎症性疾患を処置する、したがって、薬剤の投与により、被験体において炎症性疾患が生じるのを防止する、炎症性疾患の進行を防止する（例えば、直腸出血、貧血、または胃腸炎などの炎症性腸疾患の症状の発症または重症度の増加を防止する）、または炎症性疾患の関連する症状の全てを軽減するもしくは完全に好転させる、すなわち、疾患の退縮を引き起こすために必要なＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの量である。
【０１０２】
処置の有効性は、炎症性疾患に関連する全般的な症状の評価、組織の組織学的分析、生化学的アッセイ、例えば磁気共鳴画像法などのイメージング方法、または他の公知の方法によって評価することができる。例えば、処置の有効性は、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを炎症性疾患に罹患している患者に投与した後の、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、痙攣、筋痙縮、体重減少、栄養不良、発熱、貧血または炎症性疾患に関連する全般的な病状の他の側面の変化などの全般的な疾患の症状を分析することによって評価することができる。
【０１０３】
処置の有効性は、組織レベルまたは細胞レベルで、例えば、組織生検材料（例えば、胃腸組織生検材料）を得、全般的な組織または細胞の形態または染色性を評価することによって評価することもできる。タンパク質またはＲＮＡの発現を検査する生化学的アッセイを使用して処置の有効性を評価することもできる。例えば、解離細胞または非解離組織における炎症性疾患、炎症性サイトカイン産生、またはＩＬ−３４媒介性炎症反応を示す、ＩＬ−３４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−アルファ、または別のタンパク質もしくは遺伝子産物のレベルを、免疫細胞化学的方法、免疫組織化学的方法、ウエスタンブロット方法、もしくはノーザンブロット方法、または、定量的もしくは半定量的ポリメラーゼ連鎖反応などの、ＲＮＡレベルを評価するのに有用な方法によって評価することができる。糞便、血漿、または血清において見いだされる有用なバイオマーカーの存在または発現レベルを評価して、病態および処置の有効性を評価することもできる。
【０１０４】
処置の有効性の評価では、有効な評定を確実にするために、適切な対照を選択することができる。例えば、炎症性疾患の患者において開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後に評価された症状と、同じ患者における処置前もしくは処置の過程中の早期の時点の症状または炎症性疾患と診断されていない別の患者における症状を比較することができる。あるいは、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の胃腸組織の生化学的分析または組織学的分析の結果と、同じ患者由来または炎症性疾患と診断されていない個体由来またはＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する前の同じ患者由来の胃腸組織の生化学的分析または組織学的分析の結果を比較することができる。さらに、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の血液、血清、細胞、または糞便試料と、炎症性疾患と診断されていない個体由来またはＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する前の同じ患者由来の同等の試料を比較することができる。
【０１０５】
ＩＬ−３４阻害の検証は、ＩＬ−３４の発現レベルまたは活性の直接または間接的な評定によって決定することができる。例えば、ＩＬ−３４タンパク質またはＲＮＡの発現を測定する生化学的アッセイを使用して、全体的なＩＬ−３４阻害を評価することができる。例えば、胃腸組織におけるＩＬ−３４タンパク質レベルをウエスタンブロットによって測定して、全体的なＩＬ−３４レベルを評価することができる。ＩＬ−３４  ｍＲＮＡレベルをノーザンブロットまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定して、全体的なＩＬ−３４阻害を決定することもできる。解離細胞、非解離組織、血液、血清、または糞便におけるＩＬ−３４タンパク質レベルまたはＩＬ−３４シグナル伝達活性を示す別のタンパク質のレベルを免疫細胞化学的方法または免疫組織化学的方法によって評価することもできる。
【０１０６】
ＩＬ−３４阻害は、マクロファージもしくは単球の生成もしくは増殖などのパラメータを測定すること、または、ＭＡＰキナーゼリン酸化およびＩＬ−３４受容体−マクロファージコロニー刺激因子受容体（Ｍ−ＣＳＦＲ−１、ＭＣＳＦＲ−１、Ｍ−ＣＳＦＲ１、およびＣＳＦ１Ｒとしても公知）のシグナル伝達活性化の他の指標を含めた、ＩＬ−３４活性の変化と相関する他のパラメータの変更を測定することによって間接的に評価することもできる。例えば、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処置された患者の細胞における活性なＭＡＰＫ１またはＭＡＰＫ３リン酸化のレベルを前記細胞におけるＩＬ−３４活性の指標として測定することができる。血漿、血液、糞便または組織において見いだされる有用なバイオマーカーの存在または発現レベルを評価してＩＬ−３４阻害の有効性を評価することもできる。
【０１０７】
本明細書に開示されている処置方法は、炎症性サイトカイン産生を阻害する方法を含む。「炎症性サイトカイン産生」は、炎症性サイトカイン応答を開始させるおよび／または促進するサイトカインの発現を指す。「炎症性サイトカイン応答」は、顆粒球動員、リンパ球動員、全身性炎症（特に胃腸管またはその一部分（複数可）の炎症）、発熱、組織破壊、ショック、および／または死亡によって特徴付けられ得る免疫応答を指す。炎症性サイトカイン応答は、個々のサイトカインとそれらの同種の細胞表面受容体との結合（例えば、ＩＬ−３４のＣＳＦ１Ｒへの結合）ならびにその後の細胞機能および遺伝子発現を変更させる細胞内シグナル伝達のカスケードによって特徴付けられ得る。炎症性サイトカインとしては、これだけに限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−３４、およびＴＮＦ−アルファが挙げられる。炎症性サイトカインの発現は、例えば、マクロファージ、単球、粘膜固有層（propia  lamina）単核細胞、または胃腸管の他の細胞もしくは免疫系の細胞において起こり得る。炎症性サイトカイン産生を阻害する方法は、炎症性疾患に罹患している患者において炎症性サイトカインの一部または全部の発現レベルを低下させる方法を含む。炎症性サイトカイン産生を阻害する方法は、炎症性疾患に罹患している患者の細胞における炎症性サイトカインの一部または全部の発現レベルを低下させる方法も含む。
【０１０８】
炎症性サイトカイン産生を阻害するための本開示の方法は、ＩＬ−３４媒介性炎症反応を低減させるまたは阻害する方法を含む。「ＩＬ−３４媒介性炎症反応」は、本明細書で使用される場合、ＩＬ−３４発現またはＩＬ−３４シグナル伝達活性によって開始される、容易になる、または促進される炎症反応を指す。ＩＬ−３４媒介性炎症反応により、これだけに限定されないが、ＩＬ−３４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＴＮＦ−アルファを含めた炎症性サイトカインの発現、および炎症性サイトカインシグナル伝達の活性化がもたらされ得る。さらに、ＩＬ−３４媒介性炎症反応は、顆粒球動員、リンパ球動員、全身性炎症（特に胃腸管またはその一部分（複数可）の炎症）、発熱、組織破壊、ショック、および／または死亡によって特徴付けられ得る。ＩＬ−３４媒介性炎症反応は、ＩＬ−３４シグナル伝達の活性化、例えば、ＩＬ−３４のＣＳＦ１Ｒへの結合および下流のＭＡＰキナーゼのリン酸化によっても特徴付けられ得る。ＩＬ−３４媒介性炎症反応の低減または阻害は、ＩＬ−３４媒介性炎症反応に関連する細胞変化および全身変化のいずれかまたは全ての緩和を指す。例えば、炎症性サイトカイン産生、免疫細胞動員、または組織炎症の低減により、ＩＬ−３４媒介性炎症反応の低減または阻害が示される。
【０１０９】
本開示は、炎症性疾患に罹患している患者の細胞においてＩＬ−３４を阻害する方法も提供する。ＩＬ−３４は、胃腸管、免疫系、および血液の細胞を含めた、ＩＬ−３４発現または活性が生じる任意の細胞において阻害することができる。胃腸管の細胞（胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸および肛門管の細胞を含む）としては、円柱上皮細胞、粘膜上皮細胞、酵素原細胞、頸部粘液細胞、壁細胞、ガストリン細胞、杯細胞、パネート細胞、オリゴ粘液細胞（oligomucus  cell）、および絨毛吸収細胞（villus  absorptive  cell）が挙げられる。免疫系の細胞としては、白血球（leukocyte）、食細胞（例えば、マクロファージ、好中球、および樹状細胞）、単球、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、固有細胞（innate  cell）、リンパ球、Ｂ細胞、およびＴ細胞が挙げられる。血液細胞としては、赤血球（red  blood  cell）（赤血球（erythrocyte））および白血球（white  blood  cell）（白血球（leukocyte）、単球、および血小板）が挙げられる。
医薬組成物および投与経路
【０１１０】
本開示は、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の投与によって炎症性疾患を処置するための方法も提供する。別の態様では、本開示は、炎症性疾患の処置において使用するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ＩＬ−３４を標的とする開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと医薬として許容されるキャリアとで構成されるものであってよい。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、例えば、炎症性疾患を処置するために、哺乳動物、例えばヒトに投与される、医薬として許容されるキャリア中に指定量の治療用化合物、例えば、治療有効量の治療用化合物を含有する混合物を意味する。一部の実施形態では、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドと医薬として許容されるキャリアとを含む医薬組成物が本明細書において意図されている。別の態様では、本開示は、炎症性疾患を処置するための医薬の製造における、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。「医薬」は、本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語と基本的に同じ意味を有する。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「医薬として許容されるキャリア」とは、妥当なベネフィット／リスク比に見合う、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適したバッファ、キャリア、および賦形剤を意味する。キャリア（複数可）は、製剤の他の成分と適合し、レシピエントにとって有害ではないという意味で、「許容される」ものであるべきである。医薬として許容されるキャリアとしては、医薬投与に適合するバッファ、溶媒、分散媒、コーティング、等張化剤（isotonic  agent）および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および剤の使用は当技術分野で公知である。一実施形態では、医薬組成物は、経口投与され、封入されている物質の消化器系または消化管内での吸収部位を調節するのに適した腸溶コーティングを含む。例えば、腸溶コーティングとしては、アクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体が挙げられる。
【０１１２】
一実施形態では、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび任意のその医薬組成物は、局所経路、非経口経路、経口経路、肺経路、気管内経路、鼻腔内経路、経皮経路、または十二指腸内経路を含めた１つまたはいくつかの経路によって投与することができる。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下注射、膵臓内投与、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内注射または注入技法を含む。例えば、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを被験体に皮下投与することができる。別の例では、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを被験体に経口投与することができる。別の例では、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを胃腸系、または胃腸系の特定の領域（例えば、回腸、結腸、または直腸）に非経口投与によって直接投与することができる。
【０１１３】
本明細書に開示されているものなどの開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、単位剤形で提示されてよく、また、任意の適切な方法によって調製することができる。医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化されるべきである。有用な製剤は、製薬技術分野において周知の方法によって調製することができる。例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１８版（Mack  Publishing  Company、１９９０年）を参照されたい。
【０１１４】
医薬製剤は、例えば、滅菌されたものである。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって実現することができる。組成物が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥および再構成の前またはその後にフィルター滅菌を行うことができる。
非経口投与
【０１１５】
本開示の医薬組成物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、病巣内経路、または腹腔内経路による注射用に製剤化することができる。開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する水性医薬組成物などの水性組成物の調製は、本開示を考慮すれば当業者であればわかっている。一般には、そのような組成物は、液剤または懸濁剤としてのいずれかの注射剤として調製することができ、注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固体形態も調製することができ、また、調製物を乳化させることもできる。
【０１１６】
注射による使用に適した医薬形態としては、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌注射液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、当該形態は滅菌されなければならず、また、容易な注射可能性（syringability）が存在する程度に流体でなければならない。当該形態は、製造および保管の条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。
【０１１７】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の液剤をヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物で、ならびに油で分散液剤を調製することもできる。さらに、滅菌された不揮発性油を溶媒または懸濁媒として使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激性の不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製において使用することができる。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射液剤、懸濁剤、またはエマルション、例えば、１，３−ブタンジオール中の液剤としてであってもよい。使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液である。一実施形態では、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（商標）８０を含むキャリア流体中に懸濁させることができる。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために防腐剤を含有する。
【０１１８】
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用し、公知の技術に従って製剤化することができる。一般に、分散液剤は、種々の滅菌した活性成分を、基礎分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。本開示の滅菌注射液剤は、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを、必要量の適切な溶媒中に、必要に応じて上に列挙されている種々の他の成分と共に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。滅菌注射液剤を調製するための滅菌粉剤の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ技法であり、それにより、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過したその溶液から得る。注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することによって滅菌することができる。
【０１１９】
筋肉内注射用のより多くまたは高度に濃縮された液剤の調製も意図されている。この点について、溶媒としてＤＭＳＯを使用することが好ましく、これは、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの非常に迅速な透過がもたらされ、高濃度で狭い面積に送達されるからである。
【０１２０】
そのような液剤に使用するための適切な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなどが挙げられる。適切な緩衝液としては、ｐＨを約ｐＨ６からｐＨ８の間、および例えば、約ｐＨ７からｐＨ７．５の間に維持するために十分な量の、ホウ酸、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム（potassium  10  carbonate）、酢酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどが挙げられる。適切な張度調整剤（tonicity  agent）は、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなどであり、溶液の塩化ナトリウム当量が０．９プラスマイナス０．２％の範囲内になるようにする。適切な抗酸化剤および安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム（sodium  thiosulfite）、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿潤剤および清澄剤としては、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールが挙げられる。適切な増粘剤としては、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
経口投与
【０１２１】
一部の実施形態では、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの経口送達に適した組成物、例えば、組成物がＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを例えば患者の胃腸管に送達することができるように、腸溶コーティング、例えば胃耐性（gastro-resistant）コーティングを含む錠剤が本明細書において意図されている。例えば、そのような投与により、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを患者の胃腸管の影響を受けている部分に直接、実質的に局所的に適用して、局所的な効果をもたらすことができる。そのような投与により、一部の実施形態では、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの望ましくない全身的吸収を実質的に回避することができる。
【０１２２】
例えば、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば配列番号１で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬として許容される賦形剤とを含む顆粒を含む（例えば、少なくとも部分的に顆粒から形成される）経口投与用の錠剤が提供される。そのような錠剤は、腸溶コーティングでコーティングされていてよい。意図されている錠剤は、充填剤、結合剤、崩壊剤、および／または滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、ウインターグリーン、オレンジ、キシリトール、ソルビトール、フルクトース、およびマルトデキストリンなどの香味剤、ならびに香料、防腐剤ならびに／または抗酸化剤などの医薬として許容される賦形剤を含み得る。
【０１２３】
一部の実施形態では、意図されている医薬製剤は、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば配列番号１で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬として許容される塩とを含む、例えば、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば配列番号１で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬として許容される充填剤とを含む粒内相を含む。例えば、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび充填剤を、任意選択で、他の賦形剤と一緒に混和し、顆粒に形成することができる。一部の実施形態では、粒内相は、湿式造粒を使用して形成することができ、例えば、混和させたＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物および充填剤に液体（例えば、水）を添加し、次いで、配合物（combination）を乾燥させ、破砕し、かつ／またはふるいにかけて顆粒を作製する。粒内相を実現するために他のプロセスを使用することができることが当業者には理解されよう。
【０１２４】
一部の実施形態では、意図されている製剤は、粒外相を含み、粒外相は、１つまたは複数の医薬として許容される賦形剤を含んでよく、粒内相と混和して、開示される製剤を形成することができる。
【０１２５】
開示される製剤は、充填剤を含む粒内相を含んでよい。例示的な充填剤としては、これだけに限定されないが、セルロース、ゼラチン、リン酸カルシウム、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、微結晶セルロース、ペクチン、ポリアクリレート、デキストロース、酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、部分アルファ化デンプン、炭酸カルシウム、およびこれらの組合せを含めたものなどが挙げられる。
【０１２６】
一部の実施形態では、開示される製剤は、一般に医薬製剤の成分が一緒に保持されるように機能し得る結合剤を含む粒内相および／または粒外相を含んでよい。本開示の例示的な結合剤としては、これだけに限定されないが、以下：例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ラクトース、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、糖アルコールおよびこれらの組合せを含めたものなどのデンプン、糖、セルロースまたは変性セルロースを挙げることができる。
【０１２７】
意図されている製剤、例えば、粒内相および／または粒外相を含む製剤は、これだけに限定されないが、例えば、デンプン、セルロース、架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギネート、トウモロコシデンプン、クロスメロースナトリウム（crosmellose  sodium）、架橋結カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム、およびこれらの組合せを含めたものなどの崩壊剤を含んでよい。例えば、粒内相および／または粒外相が崩壊剤を含んでよい。
【０１２８】
一部の実施形態では、意図されている製剤は、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドと、マンニトール、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびデンプングリコール酸ナトリウムまたはこれらの組合せから選択される賦形剤とを含む粒内相、ならびに、微結晶セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、およびステアリン酸マグネシウムまたはそれらの混合物のうちの１つまたは複数を含む粒外相を含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、意図されている製剤は、滑沢剤を含んでよく、例えば、粒外相が滑沢剤を含有してよい。滑沢剤としては、これだけに限定されないが、タルク、シリカ、脂肪、ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、二酸化ケイ素（silicone  dioxide）、ケイ酸カルシウム、リン酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸金属塩、硬化植物油、トウモロコシデンプン、安息香酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、酢酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、タルク、およびステアリン酸が挙げられる。
【０１３０】
一部の実施形態では、医薬製剤は、腸溶コーティングを含む。一般に、腸溶コーティングにより、経口薬に対して、消化路に沿って薬物が吸収される場所を制御するバリアが生じる。腸溶コーティングは、ｐＨに応じて異なる速度で崩壊するポリマーを含んでよい。腸溶コーティングは、例えば、酢酸フタル酸セルロース、アクリル酸メチル−メタクリル酸共重合体、酢酸コハク酸セルロース、フタル酸ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（hydroxylpropylmethyl  cellulose  phthalate）、メタクリル酸メチル−メタクリル酸共重合体、アクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体、メタクリル酸共重合体Ｃ型、ポリビニルアセテートフタレート、および酢酸フタル酸セルロースを含んでよい。
【０１３１】
例示的な腸溶コーティングとしては、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）ＡＭＢ、Ａｃｒｙｌ−ＥＺＥ（登録商標）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）グレードが挙げられる。一部の実施形態では、腸溶コーティングは、重量で、意図されている錠剤の約５％〜約１０％、約５％〜約２０％、８〜約１５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約２０％、もしくは約１２〜約２０％、または約１８％を構成し得る。例えば、腸溶コーティングは、アクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体を含んでよい。
【０１３２】
例えば、意図されている実施形態では、重量で約０．５％〜約７０％、例えば、約０．５％〜約１０％、または約１％〜約２０％の開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬として許容されるその塩を含むまたはそれから本質的になる錠剤が提供される。そのような錠剤は、例えば、重量で約０．５％〜約６０％のマンニトール、例えば、重量で約３０％〜約５０％のマンニトール、例えば、重量で約４０％のマンニトール；および／または重量で約２０％〜約４０％の微結晶セルロース、もしくは重量で約１０％〜約３０％の微結晶セルロースを含んでよい。例えば、開示される錠剤は、約３０％〜約６０％、例えば重量で約４５％〜約６５％、またはあるいは、重量で約５〜約１０％の開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド、約３０％〜約５０％、またはあるいは重量で約５％〜約１５％のマンニトール、約５％〜約１５％の微結晶セルロース、約０％〜約４％、または約１％〜約７％のヒドロキシプロピルメチルセルロース、および約０％〜約４％、例えば重量で約２％〜約４％のデンプングリコール酸ナトリウムを含む粒内相を含んでよい。
【０１３３】
別の意図されている実施形態では、開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを経口投与するための医薬錠剤製剤は、開示されるＩＬ−３４アンチセンスまたは医薬として許容されるその塩（例えば、ナトリウム塩）と、医薬として許容される充填剤とを含む粒内相を含み、また、崩壊剤などの医薬として許容される賦形剤を含み得る粒外相も含んでよい。粒外相は、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、およびそれらの混合物から選択される構成成分を含んでよい。医薬組成物は、重量で錠剤の約１２％〜２０％である腸溶コーティングも含んでよい。例えば、経口使用のための、医薬として許容される錠剤は、重量で約．５％〜１０％の開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬として許容されるその塩、重量で約３０％〜５０％のマンニトール、重量で約１０％〜３０％の微結晶セルロース、およびアクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体を含む腸溶コーティングを含んでよい。
【０１３４】
別の例では、経口使用のための、医薬として許容される錠剤は、重量で約５〜約１０％の開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬として許容されるその塩、重量で約４０％のマンニトール、重量で約８％の微結晶セルロース、重量で約５％のヒドロキシプロピルメチルセルロース、および重量で約２％のデンプングリコール酸ナトリウムを含む粒内相；重量で約１７％の微結晶セルロース、重量で約２％のデンプングリコール酸ナトリウム、重量で約０．４％のステアリン酸マグネシウムを含む粒外相；ならびに錠剤を覆う、アクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体を含む腸溶コーティングを含んでよい。
【０１３５】
一部の実施形態では、医薬組成物は、重量で約１３％または約１５％、１６％、１７％もしくは１８％の、例えばＡｃｙｒｌＥＺＥ（登録商標）（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０５４８２６号を参照されたい）を含む腸溶コーティングを含有してよい。
【０１３６】
コーティングが溶解し、活性成分が放出される点での率がそれの溶解率である。ある実施形態では、意図されている錠剤は、例えば、ＵＳＰ／ＥＰ  ２型器具（パドル）において１００ｒｐｍおよび３７℃、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液中で試験した場合に、約１２０分〜約２４０分後、例えば１８０分後にＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの約５０％〜約１００％が放出されるという溶解プロファイルを有し得る。別の実施形態では、意図されている錠剤は、例えば、ＵＳＰ／ＥＰ  ２型器具（パドル）において１００ｒｐｍおよび３７℃、ｐＨ１．０の希釈したＨＣｌ中で試験した場合に、１２０分後に放出されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドが実質的に存在しないという溶解プロファイルを有し得る。別の実施形態では、意図されている錠剤は、例えば、ＵＳＰ／ＥＰ  ２型器具（パドル）において１００ｒｐｍおよび３７℃、ｐＨ６．６のリン酸緩衝液中で試験した場合に、３０分後に、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの約１０％〜約３０％、または約５０％以下が放出されるという溶解プロファイルを有し得る。
【０１３７】
一部の実施形態では、意図されている製剤、例えば錠剤は、患者に経口投与した場合に、患者において、最小のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの血漿中濃度をもたらし得る。別の実施形態では、開示される製剤は、患者に経口投与した場合、患者の結腸または直腸、例えば、患者の影響を受けているまたは疾患にかかっている部位に局所的に送達される。
【０１３８】
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、本明細書に開示されている疾患および障害の処置を対象とする少なくとも１つの他の薬剤を投与することをさらに含んでよい。一実施形態では、意図されている他の薬剤を共投与すること（例えば、逐次的にまたは同時に）ができる。
【０１３９】
意図されている薬剤としては、グルココルチコイド、細胞増殖抑制薬、抗体、イムノフィリンに作用する薬剤、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合性タンパク質、ミコフェノレート、および低分子生物学的製剤を含めた免疫抑制剤が挙げられる。例えば、意図されている免疫抑制剤としては、これだけに限定されないが、タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、シロリムス、エベロリムス、ミコフェノール酸、フィンゴリモド、デキサメタゾン、フルダラビン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド、テリフルノミド、アナキンラ、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、ムロモナブ−ＣＤ３、アフツズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、エファリズマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、ナタリズマブ、およびエタネルセプトが挙げられる。他の意図されている薬剤としては、抗生物質、止瀉薬、緩下剤、鎮痛剤、鉄補給剤、およびカルシウムまたはビタミンＤもしくはＢ−１２補給剤が挙げられる。
投与量および投与の頻度
【０１４０】
例示的な製剤は、約３５ｍｇ〜約５００ｍｇの開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むまたはそれから本質的になる剤形を含む。例えば、約３５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、または２５０ｍｇの開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤が本明細書において意図されている。一実施形態では、製剤は、約４０ｍｇ、８０ｍｇ、または１６０ｍｇの開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、製剤は、少なくとも１００μｇの開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、製剤は、約０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの開示されるＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。投与される量は、処置される疾患または適応症の型および程度、患者の全体的な健康状態およびサイズ、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける効力、医薬製剤、ならびに投与経路などの変数に左右される。所望の血中レベルまたは組織中レベルを迅速に実現するために、最初の投与量を、上位レベルを超えて増加させることができる。あるいは、最初の投与量を最適よりも少なくし、処置の過程中に投与量を次第に増加させることができる。ヒトへの投与量は、例えば、４０ｍｇから１６０ｍｇまでにわたって実施するようデザインされた従来の第Ｉ相用量漸増試験において最適化することができる。投薬頻度は、投与経路、投薬量および処置される疾患などの因子に応じて変動し得る。例示的な投薬頻度は、１日１回、１週間に１回および２週間毎に１回である。一部の実施形態では、投薬は、１日１回、７日間である。
診断方法
【０１４１】
本開示は、患者の１つまたは複数の生体試料中のＩＬ−３４発現シグナルのレベルを検出することに依拠する、炎症性疾患を有すると患者を診断する方法も提供する。本明細書で使用される場合、「ＩＬ−３４発現シグナル」という用語は、ＩＬ−３４遺伝子発現、または遺伝子もしくは遺伝子産物の活性の任意の指標を指し得る。ＩＬ−３４遺伝子産物は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ペプチド、およびタンパク質を含む。評定することができるＩＬ−３４遺伝子発現を指し示すものとしては、これだけに限定されないが、ＩＬ−３４遺伝子もしくはクロマチンの状態、ＩＬ−３４遺伝子と遺伝子発現を調節する細胞構成成分との相互作用、ＩＬ−３４遺伝子産物の発現レベル（例えば、ＩＬ−３４  ＲＮＡ発現レベル、ＩＬ−３４タンパク質発現レベル）、またはＩＬ−３４  ＲＮＡもしくはタンパク質と転写機構、翻訳機構もしくは翻訳後プロセシング機構との相互作用が挙げられる。ＩＬ−３４遺伝子産物の活性を指し示すものとしては、これだけに限定されないが、ＩＬ−３４シグナル伝達活性の評定（例えば、ＣＳＦ１Ｒ活性化またはＭＡＰＫ１／ＭＡＰＫ３リン酸化の評定）およびＩＬ−３４受容体結合（例えば、ＣＳＦ１Ｒ結合）の評定が挙げられる。
【０１４２】
ＩＬ−３４発現シグナルの検出は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏにおける方法によって実現することができる。好ましい実施形態では、本開示の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。検出方法は、患者の血液、血清、糞便、組織、または細胞における検出を伴い得る。検出は、全組織、組織外植片、細胞培養物、解離細胞、細胞抽出物、または血液もしくは血清を含めた体液におけるＩＬ−３４発現シグナルを測定することによって実現することができる。意図されている検出方法としては、ＩＬ−３４遺伝子産物発現レベルを測定するアッセイ、例えば、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、他の定量的結合アッセイ、細胞もしくは組織成長アッセイ、ノーザンブロット、定量的もしくは半定量的ポリメラーゼ連鎖反応、医用画像方法（例えば、ＭＲＩ）、または免疫染色方法（例えば、免疫組織化学的検査または免疫細胞化学的検査）が挙げられる。
【実施例】
【０１４３】
本開示を以下の実施例によってさらに例示する。実施例は、例示する目的でのみ提供され、本開示の範囲または内容をいかなる形でも限定するものとは解釈されない。
（実施例１）
ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドによりＨＴ−２９細胞およびポリ（Ｉ：Ｃ）により刺激したＰＢＭＣにおけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現が低減する
【０１４４】
ＨＴ−２９細胞におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現に対するＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調査した。リポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（表１）をＨＴ−２９細胞にトランスフェクトした。ＨＴ−２９細胞を、それぞれ１０％ＦＢＳを補充したマッコイ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、漸増濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド（０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、または２μｇ／ｍＬ）を２４時間にわたってトランスフェクトした。ＩＬ−３４発現を、β−アクチンを参照として使用し、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって評価した。
【表１】
2018535681.tif 000002
【０１４５】
図１Ａは、０．５μｇ／ｍＬのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、および９）をトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞では無刺激対照（Ｕ）と比較してＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現が低減したことを示す。図１Ｂは、１μｇ／ｍＬの、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞ではＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現が低減したことを示す。１μｇ／ｍＬの配列番号９のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞ではＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現の低減は観察されなかった。図１Ｃは、２μｇ／ｍＬのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、および９）をトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞ではＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現が低減したことを示す。これらの結果を表２に要約し、そこでは、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたＨＴ−２９細胞における無刺激対照（Ｕ）と比較したＩＬ−３４  ｍＲＮＡの低減の百分率を示している。結果から、試験したＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれのトランスフェクションにより、ＨＴ−２９細胞におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現を低減させることができることが実証される（１μｇ／ｍＬの濃度の配列番号９のアンチセンスオリゴヌクレオチドでのトランスフェクションを例外として）。
【表２】
2018535681.tif 000003
【０１４６】
ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激した正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現に対するＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調査した。リポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（表１）をＰＢＭＣにトランスフェクトした。ＰＢＭＣを、それぞれ１０％ＦＢＳを補充したマッコイ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、漸増濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド（０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、または２μｇ／ｍＬ）を２４時間にわたってトランスフェクトした。ＩＬ−３４発現を、β−アクチンを参照として使用し、ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＰＢＭＣにおけるＩＬ−３４発現を誘導するために、細胞を、トランスフェクション後に８ｍｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）を用いて６時間にわたって処理した。
図２Ａは、０．５μｇ／ｍＬの、配列番号１、２、３、４、５、６、７、または８のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＰＢＭＣにおいて、トランスフェクトしていない、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＰＢＭＣ（ポリ）と比較してＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現が低減したことを示す。０．５μｇ／ｍＬの配列番号９のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＰＢＭＣではＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルの低減は観察されなかった。図２Ｂは、１μｇ／ｍＬのＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、および９）をトランスフェクトした、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＰＢＭＣではＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現が低減したことを示す。図２Ｃは、２μｇ／ｍＬの配列番号１、３、４、５、６、７、および８のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＰＢＭＣではＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現が低減したことを示す。２μｇ／ｍＬの配列番号２または９のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＰＢＭＣではＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルの低減は観察されなかった。ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＰＢＭＣにＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドを０．５μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの濃度でトランスフェクトした結果を表３に要約し、そこでは、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＰＢＭＣにおける、対照（ポリ）と比較したＩＬ−３４  ｍＲＮＡの低減の百分率を示している。結果から、試験したＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれのトランスフェクションにより、試験したトランスフェクション濃度のほぼ全てで、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＰＢＭＣにおけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現を低減させることができることが実証される。
【表３】
2018535681.tif 000004
（実施例２）
結腸直腸がん（ＣＲＣ）腫瘍組織ではＩＬ−３４発現が増加する
【０１４７】
ＩＬ−３４発現の増加が結腸直腸腫瘍組織に関連するかどうかを決定するために、散発性ＣＲＣの患者１２名の非腫瘍（ＮＴ）領域および腫瘍（Ｔ）領域から対の結腸外植片を採取した。ＲＴ−ＰＣＲを実施して、外植片におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルを分析した。β−アクチンｍＲＮＡレベルを参照として使用してＩＬ−３４  ｍＲＮＡレベルを正規化した。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果が図３に示されている。図３のグラフ上の各点は単一の患者におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルを表し、同じ患者に由来する腫瘍組織および非腫瘍組織から収集したデータ点を線で結んでいる。ＮＴ欄およびＴ欄の水平のバーは、各群におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現値の中央値を示す。結果から、ＩＬ−３４発現が、個々の腫瘍組織試料の全てにおいて、同じ患者に由来する非腫瘍組織試料と比較して増加したことが実証される。結果から、腫瘍組織では、ＣＲＣ患者に由来する非腫瘍組織と比較して、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡの中央レベル（medial  level）が全体として有意に増加したことも実証される（図３；ＮＴ対Ｔ、ｐ＝０．０１）。
（実施例３）
散発性ＣＲＣ腫瘍組織ではＩＬ−３４発現が増加する
【０１４８】
散発性ＣＲＣ腫瘍組織においてＩＬ−３４タンパク質発現が増加するかどうかを決定するために、散発性ＣＲＣ患者の結腸組織試料を結腸組織の非腫瘍（ＮＴ）領域および腫瘍（Ｔ）領域から採取し、免疫組織化学的検査によって分析した。凍結組織試料をアイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ）（図４Ａ、上のパネル）またはＩＬ−３４抗体（図４Ａ、下のパネル）のいずれかに曝露させた。アイソタイプ対照に曝露させた組織およびＩＬ−３４検出用抗体に曝露させた非腫瘍組織では、可視のＩＬ−３４抗体シグナルはわずかに示されたか全く示されなかった。ＩＬ−３４検出用抗体に曝露させた腫瘍組織では、非腫瘍組織およびアイソタイプ対照試料と比較してＩＬ−３４抗体シグナルの明らかな増加が示された（図４Ａ）。代表的な顕微鏡写真は、２００倍の画像が挿入された４０倍の倍率のＩＬ−３４検出用抗体およびアイソタイプ対照の染色を示している（図４Ａ）。非腫瘍（ＮＴ）組織と比較した、腫瘍（Ｔ）組織におけるＩＬ−３４陽性細胞の数の定量により、高倍率視野（ｈｐｆ；すなわち、２００×）当たりのＩＬ−３４陽性細胞の数の有意な増加が実証された（図４Ｂ；ｎ＝８名の患者；ＮＴ対Ｔ、ｐ＜０．０００１；バーはＳＥＭを表す）。
【０１４９】
散発性ＣＲＣの患者８名の非腫瘍（ＮＴ）領域および腫瘍（Ｔ）領域から取得した結腸外植片組織についてＥＬＩＳＡも実施してＩＬ−３４タンパク質レベルを測定した（図４Ｃ）。腫瘍（Ｔ）組織におけるＩＬ−３４タンパク質濃度の非腫瘍（ＮＴ）組織と比較した定量により、腫瘍組織におけるＩＬ−３４タンパク質濃度の有意な増加が実証された（図４Ｃ；ｎ＝８名の患者；ＮＴ対Ｔ、ｐ＝０．００２；バーはＳＥＭを表す）。
【０１５０】
散発性ＣＲＣ患者の腫瘍結腸組織においてＩＬ−３４タンパク質レベルが増加するかどうかを決定するために、ウエスタンブロッティングも実施した。散発性ＣＲＣの患者５名の非腫瘍（ＮＴ）領域および腫瘍（Ｔ）領域に由来する組織抽出物を含有するウエスタンブロットをプローブするためにＩＬ−３４検出用抗体を使用した。ブロットをβ−アクチン抗体でプローブして対照を提供した。図４Ｄは、ＩＬ−３４抗体およびβ−アクチン対照抗体でプローブした、散発性ＣＲＣ患者２名からの腫瘍結腸組織抽出物および非腫瘍結腸組織抽出物の代表的なウエスタンブロットを示す。ＩＬ−３４抗体でプローブしたウエスタンブロットの分析では、散発性ＣＲＣ患者からの腫瘍結腸組織において、非腫瘍結腸組織と比較してＩＬ−３４抗体シグナルのレベルの明らかな増加が示された。
【０１５１】
これらの結果から、散発性ＣＲＣの患者の腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較してＩＬ−３４タンパク質レベルが有意に増加したことが実証される。
（実施例４）
ＩＬ−３４により、ＥＲＫ１／２依存性経路を通じた細胞増殖が誘導される
【０１５２】
ＩＬ−３４により細胞増殖が刺激されるかどうかを決定するために、血清を欠乏させたＤＬＤ−１がん細胞を、４８時間ににわたり、刺激せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または漸増用量の組換えヒトＩＬ−３４タンパク質（２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。ＤＬＤ−１細胞増殖を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色を用いてフローサイトメトリーによって評価した。５０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌでのＤＬＤ−１細胞の刺激では、どちらも、無刺激対照試料と比較して細胞増殖の有意な増加がもたらされた（図５Ａ；ｎ＝４；５０ｎｇ／ｍｌ対Ｕｎｓｔ、ｐ＝０．００６；１００ｎｇ／ｍｌ対Ｕｎｓｔ、ｐ＝０．０２；バーはＳＥＭを表す）。これらの結果から、ＩＬ−３４により、血清を欠乏させたＤＬＤ−１細胞の細胞増殖の有意な増加が刺激されたことが実証される。
【０１５３】
ＩＬ−３４により、ＥＲＫ１／２またはｐ３８依存性経路を介して細胞増殖が刺激されるかどうかを決定するために、血清を欠乏させたＤＬＤ−１細胞を、ＥＲＫ１／２もしくはｐ３８のいずれかの特異的阻害剤（それぞれＰＤ９８０５９もしくはＳＢ２０２１９０）またはビヒクルＤＭＳＯと一緒に１時間プレインキュベートし、次いで、組換えヒトＩＬ−３４タンパク質を５０ｎｇ／ｍＬの濃度で用いて４８時間にわたって刺激した。ＤＬＤ−１細胞増殖を、ＣＦＳＥ染色を用いてフローサイトメトリーによって評価した。ＩＬ−３４タンパク質による、血清を欠乏させたＤＬＤ−１細胞の刺激により、ビヒクル単独に曝露させた細胞の増殖と比較して、細胞増殖の有意な増加がもたらされた（図５Ｂ；ｎ＝４；ＩＬ−３４＋ＤＭＳＯ対ＤＭＳＯ、ｐ＝０．０１；バーはＳＥＭを表す）。ｐ３８遮断薬であるＳＢ２０２１９０と一緒にプレインキュベートした細胞のＩＬ−３４による刺激により、ビヒクルと一緒にプレインキュベートした無刺激対照と比較して細胞増殖の有意な増加がもたらされたが（ＩＬ−３４単独に曝露させた細胞の細胞増殖の増加と同等）、ビヒクルと一緒にプレインキュベートし、ＩＬ−３４単独を用いて刺激した細胞との比較では有意な増加はなかった（図５Ｂ、ＤＭＳＯ対ＩＬ−３４＋ＳＢ２０２１９０、ｐ＝０．０１；バーはＳＥＭを表す）。しかし、ＩＬ−３４を用いて刺激し、ビヒクルと一緒にプレインキュベートしたＤＬＤ−１細胞の増殖は、ＥＲＫ１／２遮断薬であるＰＤ９８０５９と一緒にプレインキュベートし、その後、ＩＬ−３４タンパク質を用いて刺激したＤＬＤ−１細胞の増殖よりも有意に大きかった（図５Ｂ；ＤＭＳＯ＋ＩＬ−３４対ＰＤ９８０５９＋ＩＬ−３４、ｐ＝０．００６；バーはＳＥＭを表す）。これらの結果から、ＩＬ−３４タンパク質により、細胞の増殖を、ＥＲＫ１／２依存性経路を通じて刺激できたことが実証される。
（実施例５）
ＩＬ−３４により、ＣＲＣ細胞株におけるＴＮＦ−αにより誘導されるアポトーシスが増加する
【０１５４】
ＩＬ−３４によりＣＲＣ細胞のアポトーシスが刺激されるかどうかを決定するために、血清を欠乏させたＤＬＤ−１細胞を、４８時間にわたり、刺激せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または漸増用量の組換えヒトＩＬ−３４（２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。細胞を、ＰＩおよびＡＶについてフローサイトメトリーによって分析して、各試料における細胞死のパーセントを決定した。ＩＬ−３４で刺激した試料において、無刺激対照と比較して細胞死の有意な増加は観察されなかった（図６Ａ；ｎ＝４；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【０１５５】
ＩＬ−３４によりＦａｓリガンド媒介性細胞死が増強されるかどうかを決定するために、血清を欠乏させたＤＬＤ−１細胞を、４８時間にわたり、刺激せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または組換えヒトＩＬ−３４を５０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて、および／もしくはＦａｓリガンド（Ｆａｓ  Ｌ）を２００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて刺激した。細胞を、ＰＩシグナルおよび／またはＡＶシグナルについてフローサイトメトリーによって分析して各試料における細胞死のパーセントを決定した。図６Ｂは、ＡＶ＋ＰＩ＋染色、ＡＶ＋ＰＩ−染色、およびＡＶ−ＰＩ＋染色によって評定した細胞死のパーセントを示す。図６Ｃは、ＡＶ＋ＰＩ−染色単独で評定した細胞死のパーセントを示す。ＩＬ−３４およびＦａｓＬでのＤＬＤ−１細胞の刺激により、ＦａｓＬ刺激単独と比較して、細胞死の有意な増加はもたらされなかった（図６Ｂおよび６Ｃ；ｎ＝４；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【０１５６】
ＩＬ−３４によりＴＮＦα媒介性細胞死が増強されるかどうかを決定するために、血清を欠乏させたＤＬＤ−１細胞を、４８時間にわたり、刺激せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または組換えヒトＩＬ−３４を５０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて、および／もしくはＴＮＦαを１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて刺激した。細胞を、ＰＩシグナルおよび／またはＡＶシグナルについてフローサイトメトリーによって分析して各試料における細胞死のパーセントを決定した。図６Ｄは、ＡＶ＋ＰＩ＋染色、ＡＶ＋ＰＩ−染色、およびＡＶ−ＰＩ＋染色によって評定した細胞死のパーセントを示す。図６Ｅは、ＡＶ＋ＰＩ−染色単独で評定した細胞死のパーセントを示す。ＩＬ−３４およびＴＮＦαでのＤＬＤ−１細胞の刺激により、ＩＬ−３４またはＴＮＦαによる刺激単独のいずれかと比較して細胞死の有意な増加がもたらされた（図６Ｄおよび６Ｅ；ｎ＝４；ＩＬ−３４対ＩＬ３４＋ＴＮＦα、ｐ＝０．０３；ＴＮＦα対ＩＬ３４＋ＴＮＦα、ｐ＝０．０５；バーは平均±ＳＥＭを表す）。これらの結果から、ＩＬ−３４により、ＴＮＦα単独での刺激によって引き起こされるＣＲＣ細胞の細胞死の量を増強することができたことが実証される。
（実施例６）
ヒト散発性ＣＲＣではＩＬ−３４受容体が増加している
【０１５７】
ヒト散発性ＣＲＣにおいてＩＬ−３４受容体タンパク質の発現が増加するかどうかを決定するために、対照患者（ＣＴＲ）３名および散発性ＣＲＣの患者３名から結腸組織試料を採取し、切片作製し、ＩＬ−３４受容体であるマクロファージコロニー刺激因子−１受容体（Ｍ−ＣＳＦＲ−１）に特異的な抗体またはアイソタイプ対照ＩｇＧを用いて染色した。対照アイソタイプＩｇＧで染色した組織切片の顕微鏡写真からは有意なシグナルは示されなかった（図７Ａ、上部のパネル）。Ｍ−ＣＳＦＲ−１で染色した、対照患者のパラフィン包埋組織切片（図７Ａ、左下のパネル）では、散発性ＣＲＣ患者由来の組織切片と比較してより少ない量のＭ−ＣＳＦＲ−１シグナルが示された（図７Ａ、右下のパネル；顕微鏡写真は、全ての試料の代表である；元の倍率、２００倍；挿入図、４００倍）。
【０１５８】
ヒト散発性ＣＲＣにおいてＩＬ−３４受容体ｍＲＮＡの発現が増加するかどうかを決定するために、散発性ＣＲＣの患者６名由来の非腫瘍（ＮＴ）結腸組織および腫瘍（Ｔ）結腸組織から採取した結腸外植片を、Ｍ−ＣＳＦＲ−１  ｍＲＮＡ発現についてＲＴ−ＰＣＲによって分析した。結腸組織を、代替ＩＬ−３４受容体ＰＴＰ−ζをコードするｍＲＮＡの発現についても分析した。結果を、β−アクチンｍＲＮＡレベルを参照として使用して正規化した。図７Ｂは、散発性ＣＲＣを有する個体６名由来のＮＴ結腸組織およびＴ結腸組織における正規化されたＭ−ＣＳＦＲ−１  ｍＲＮＡレベルを示す。図７Ｃは、散発性ＣＲＣを有する個体６名由来のＮＴ結腸組織およびＴ結腸組織における正規化されたＰＴＰ−ζ  ｍＲＮＡレベルを示す。各グラフ上の同じ患者からのＮＴデータ点とＴデータ点を線で結んでいる。図７Ｂおよび７Ｃの各欄の水平のバーは、それぞれ、ＮＴ群およびＴ群のそれぞれにおけるＭ−ＣＳＦＲ−１  ｍＲＮＡ値の中央値またはＰＴＰ−ζ  ｍＲＮＡ値の中央値を表す。図７Ｂは、各個体において、Ｍ−ＣＳＦＲ−１  ｍＲＮＡのレベルが腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して高かったこと、およびＭ−ＣＳＦＲ−１の中央値レベルが腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して有意に高かったことを示す（図７Ｂ、ｐ＝０．０１）。図７Ｃは、各個体において、ＰＴＰ−ζ  ｍＲＮＡのレベルが腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して高かったこと、およびＰＴＰ−ζの中央値レベルが腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して有意に高かったことを示す（図７Ｃ、ｐ＝０．０３）。
【０１５９】
これらの結果から、散発性ＣＲＣ患者の腫瘍組織ではＩＬ−３４受容体のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルがどちらも増加していることが実証される。
（実施例７）
マクロファージコロニー刺激因子−１はＣＲＣ細胞の細胞成長または細胞死に影響を及ぼさない
【０１６０】
Ｍ−ＣＳＦＲ−１リガンドであるマクロファージコロニー刺激因子−１（ＭＣＳＦ−１）がＣＲＣ細胞成長に影響を及ぼすかどうかを決定するために、血清を欠乏させたＤＬＤ−１細胞を、刺激せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または漸増用量の組換えヒトＭＣＳＦ−１（２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。ＤＬＤ−１細胞の細胞増殖を、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）陽性細胞を計数することによって分析した。ＭＣＳＦ−１を用いた刺激後に細胞増殖の有意な増加は検出されなかった（図８Ａ、ｎ＝１１；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【０１６１】
血清を欠乏させたＤＬＤ−１細胞をまた、刺激せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または漸増用量の組換えヒトＩＬ−３４（２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。ＤＬＤ−１細胞の細胞増殖を、ＢｒｄＵ陽性細胞を計数することによって分析した。全ての濃度で、ＩＬ−３４による刺激により、無刺激対照と比較して細胞増殖の有意な増加がもたらされた（図８Ｂ、ｎ＝７；Ｕｎｓｔ対２５ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００１；Ｕｎｓｔ対５０ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００１；Ｕｎｓｔ対１００ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００１；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【０１６２】
Ｍ−ＣＳＦＲ−１リガンドであるマクロファージコロニー刺激因子−１（ＭＣＳＦ−１）がＣＲＣ細胞死に影響を及ぼすかどうかを決定するために、血清を欠乏させたＤＬＤ−１細胞を、刺激せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または漸増用量の組換えヒトＭＣＳＦ−１（２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。細胞を、ＰＩシグナルおよび／またはＡＶシグナルについてフローサイトメトリーによって分析して各試料における細胞死のパーセントを決定した。ＭＣＳＦ−１を用いた刺激後に細胞死の有意な増加は検出されなかった（図８Ｃ、ｎ＝６；バーは平均±ＳＥＭを表す）。
【０１６３】
これらの結果から、ＩＬ−３４とは異なり、Ｍ−ＣＳＦＲ−１リガンドであるＭＣＳＦ−１はＣＲＣ細胞の細胞増殖または成長に対して認められるほどの効果を有さないことが実証される。
（実施例８）
ＨＴ−２９  ＣＲＣ細胞株はＩＬ−３４を高レベルで発現する
【０１６４】
ヒトＣＲＣ細胞株におけるＩＬ−３４発現を評価するために、ＤＬＤ−１、ＨＴ−２９、およびＨＣＴ−１１６ヒトＣＲＣ細胞株における、およびＮＣＭ−４６０正常腸上皮細胞株におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルを、β−アクチンｍＲＮＡレベルを参照として使用して正規化した。図９に示されている通り、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現はＨＴ−２９細胞において豊富であった。
（実施例９）
ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、ＩＬ−３４のレベルがノックダウンされ、ＥＲＫ１／２依存性機構を通じてＣＲＣ細胞増殖が阻害される
【０１６５】
ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドによりＤＬＤ−１  ＣＲＣ細胞株におけるＩＬ−３４タンパク質発現を下方制御することができるかどうかを決定するために、ＤＬＤ−１細胞に、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＮＣ  ＡＳ）またはＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＬ−３４  ＡＳ；配列番号５のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド）を２μｇ／ｍｌの濃度で４８時間にわたってトランスフェクトした。タンパク質をＤＬＤ−１細胞から抽出し、ウエスタンブロットを、ＩＬ−３４抗体を用いてまたは対照をもたらすためにβ−アクチン抗体を用いてプローブした。ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクションにより、ＩＬ−３４抗体シグナルの認められるほどの減少がもたらされた（図１０Ａ；４回の実験のうちの１回からの代表的な画像が示されている）。この結果から、ＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドによりＣＲＣ細胞株におけるＩＬ−３４レベルを認められるほどにノックダウンすることができたことが実証される。
【０１６６】
ＤＬＤ−１細胞におけるＩＬ−３４レベルの低下により細胞死の増加がもたらされるかどうかを決定するために、ＤＬＤ−１細胞に、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＮＣ  ＡＳ）またはＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＬ−３４  ＡＳ；配列番号５のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド）を２μｇ／ｍｌの濃度で７２時間にわたってトランスフェクトした。細胞死の百分率をフローサイトメトリー分析によってＡＶ陽性細胞および／またはＰＩ陽性細胞のパーセントとして評定した。ＩＬ−３４  ＡＳ試料においてＮＣ  ＡＳ試料と比較してＤＬＤ−１細胞死の有意な増加は観察されなかった（図１０Ｂ；ｎ＝４；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。これらの結果から、ＩＬ−３４ノックダウンはＤＬＤ−１細胞株における細胞死に対して有意な効果を有さなかったことが実証される。
【０１６７】
ＤＬＤ−１細胞におけるＩＬ−３４レベルの低下により細胞増殖の増加がもたらされるかどうかを決定するために、ＤＬＤ−１細胞に、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＮＣ  ＡＳ）またはＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＬ−３４  ＡＳ；配列番号５のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド）を２μｇ／ｍｌの濃度で７２時間にわたってトランスフェクトした。細胞増殖を、ＣＦＳＥを用いて染色した後にフローサイトメトリーによって評価した。ＩＬ−３４  ＡＳを用いたトランスフェクションにより、ＮＣ  ＡＳでのトランスフェクションと比較してＤＬＤ−１細胞増殖の有意な低減がもたらされた（図１０Ｃ；ｎ＝４；ＮＣ  ＡＳ対ＩＬ−３４  ＡＳ、ｐ＝０．０１；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。この結果から、ＩＬ−３４ノックダウンにより、ＤＬＤ−１細胞増殖が有意に低減したことが実証される。
【０１６８】
ＩＬ−３４ノックダウンがＥＲＫ１／２タンパク質の発現に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＤＬＤ−１細胞に、ＮＣ  ＡＳまたはＩＬ−３４  ＡＳ（配列番号５のＩＬ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチド）のいずれかを２μｇ／ｍｌの濃度で７２時間にわたってトランスフェクトした。タンパク質をＤＬＤ−１細胞から抽出し、ウエスタンブロットを、ＩＬ−３４、総ＥＲＫ１／２（ＥＲＫ１／２）、リン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ１／２）、またはβ−アクチンについてプローブした。ＩＬ−３４  ＡＳを用いたトランスフェクションにより、ＩＬ−３４ならびにｐＥＲＫ１／２のレベルの認められるほどのノックダウンがもたらされたが、総ＥＲＫ１／２ではそうではなかった（図１０Ｄ；画像は、４回の実験の代表である）。これらの結果から、ＩＬ−３４ノックダウンにより、ＤＬＤ−１細胞におけるｐＥＲＫ１／２のレベルの低下も引き起こされたことが実証される。これらの結果から、高レベルのｐＥＲＫ１／２を維持するためにＩＬ−３４発現が必要であること、およびＣＲＣ細胞増殖に対するＩＬ−３４の効果はＥＲＫ１／２依存性経路を通じて起こり得ることも示唆される。
（実施例１０）
大腸炎関連結腸がん腫瘍ではＩＬ−３４およびその受容体が発現する
【０１６９】
大腸炎関連結腸がん（ＣＡＣ）腫瘍組織においてＭ−ＣＳＦＲ−１が発現しているかどうかを決定するために、ＣＡＣ患者３名から採取した腫瘍結腸組織および非腫瘍結腸組織を切片作製し、パラフィンに包埋し、Ｍ−ＣＳＦＲ−１抗体を用いて染色した。Ｍ−ＣＳＦＲ−１シグナルは、結腸の腫瘍組織において結腸非腫瘍組織と比較してより豊富であるようであった（図１１Ａ；４０倍の倍率で取得した代表的な顕微鏡写真；挿入図、２００倍の倍率）。
【０１７０】
ＣＡＣ腫瘍組織においてＩＬ−３４が発現しているかどうかを決定するために、ＡＯＭおよびＤＳＳに曝露させることによってＣＡＣを誘導した野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから腫瘍結腸組織および非腫瘍結腸組織を採取した。ＡＯＭ＋ＤＳＳ処置後８４日目に屠殺したマウス７匹由来の結腸組織の非腫瘍領域および腫瘍領域から対の外植片を採取し、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現についてＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＩＬ−３４  ｍＲＮＡレベルをβ−アクチンｍＲＮＡレベルに対して正規化した。図１１Ｂは、マウス７匹由来の非腫瘍（ＮＴ）結腸組織および腫瘍（Ｔ）結腸組織における正規化されたＩＬ−３４  ｍＲＮＡレベルを示す。同じ動物からのＮＴデータ点とＴデータ点を線で結んでいる。各欄の水平のバーは、ＮＴ群およびＴ群におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ値の中央値を表す。ＩＬ−３４の中央値レベルは、ＣＡＣマウス由来の腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して有意に高かった（図１１Ｂ、ｐ＝０．０１）。
【０１７１】
これらの結果から、ＩＬ−３４およびその受容体であるＭ−ＣＳＦＲ−１のレベルがどちらもＣＡＣ腫瘍組織において上昇していることが実証される。
（実施例１１）
線維狭窄性クローン病ではＩＬ−３４発現が上昇している
【０１７２】
線維狭窄性クローン病（ＦＳ  ＣＤ）に罹患している個体の腸組織においてＩＬ−３４  ＲＮＡ発現が上昇しているかどうかを評価するために、炎症性クローン病（Ｉ  ＣＤ）またはＦＳ  ＣＤに罹患していない対照患者（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ）５名、Ｉ  ＣＤの患者５名、およびＦＳ  ＣＤの患者５名から回腸生検材料を採取した。各生検材料におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−ＰＣＲによって評価した。β−アクチンｍＲＮＡ発現シグナルを使用してＩＬ−３４  ｍＲＮＡレベルを正規化した。ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルはＩ  ＣＤ試料およびＦＳ  ＣＤ試料において対照試料と比較して有意に高かった（図１２Ａ；Ｉ  ＣＤ対Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ、ｐ＝０．００２；ＦＳ  ＣＤ対Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ、ｐ＝０．０３；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。
【０１７３】
ＦＳ  ＣＤに罹患している個体の腸組織においてＩＬ−３４タンパク質レベルが防火している上昇しているかどうかを評価するために、Ｉ  ＣＤまたはＦＳ  ＣＤに罹患していない対照患者（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ）、Ｉ  ＣＤの患者、およびＦＳ  ＣＤの患者から回腸生検材料を採取した。生検組織のタンパク質抽出物を、ＩＬ−３４に対する抗体およびローディング対照としてＥＲＫ１／２に対する抗体を使用してウエスタンブロット分析によって分析した。ＩＬ−３４タンパク質シグナルは、Ｉ  ＣＤ試料およびＦＳ  ＣＤ試料において対照試料と比較して高いようであった（図１２Ｂ；Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ患者２名、Ｉ  ＣＤ患者２名、およびＦＳ  ＣＤ患者２名からの抽出物のプローブの結果を示す代表的なブロット）。
【０１７４】
ＦＳ  ＣＤにおいてＩＬ−３４タンパク質レベルが上昇しているかどうかをさらに分析するために、正常対照（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ）１名およびＦＳ  ＣＤに罹患している患者１名から採取した外科的腸試料のパラフィン包埋切片を、ＩＬ−３４検出用抗体を使用して染色した。染色された切片の分析により、ＦＳ  ＣＤ患者の腸の固有層および間質区画の両方にＩＬ−３４陽性細胞が存在することが明らかになった。ＩＬ−３４陽性細胞の数は、ＦＳ  ＣＤ患者由来の組織切片において対照個体由来の同等の切片よりも多いようであった（図１２Ｃ；１００倍の倍率の顕微鏡写真は、Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ個体３名およびＦＳ  ＣＤ患者３名からの画像の代表である）。
【０１７５】
ＦＳ  ＣＤの患者の腸線維芽細胞においてＩＬ−３４  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現が上昇しているかどうかを決定するために、対照患者（ＣＴＲ）５名およびＦＳ  ＣＤ患者５名から腸線維芽細胞を収集した。線維芽細胞におけるＩＬ−３４  ＲＮＡ  ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルを、β−アクチンｍＲＮＡ発現シグナルを使用して正規化した。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現レベルがＦＳ  ＣＤ患者の腸線維芽細胞においてＣＴＲ患者と比較して有意に上昇していることが実証された（図１２Ｄ；ＣＴＲ対ＦＳ  ＣＤ、ｐ＝０．００３；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。ＣＴＲ患者およびＦＳ  ＣＤ患者の腸線維芽細胞からの総タンパク質抽出物をウエスタンブロットによって分析した。線維芽細胞抽出物のブロットを、ＩＬ−３４に対する抗体およびβ−アクチン（ローディング対照）に対する抗体を用いてプローブした。ＩＬ−３４検出シグナルはＦＳ  ＣＤ患者の腸線維芽細胞抽出物において対照患者由来の試料と比較して上昇しているようであった（図１２Ｅ；ＣＴＲ患者２名およびＦＳ  ＣＤ患者２名からのプローブした抽出物を示す代表的な画像）。
【０１７６】
これらの結果から、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルが、ＦＳ  ＣＤに罹患している患者の回腸組織および個々の腸線維芽細胞の細胞において、健康な患者におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルと比較して上昇していたことが実証される。これらの結果から、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルがＩ  ＣＤに罹患している患者の回腸組織において、健康な患者におけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルと比較して上昇していたことも実証される。
（実施例１２）
炎症性クローン病および線維狭窄性クローン病ではＩＬ−３４受容体であるＭ−ＣＳＦＲ−１の発現が上昇している
【０１７７】
ＦＳ  ＣＤではＩＬ−３４受容体であるＭ−ＣＳＦＲ−１の発現が上昇しているかどうかを評価するために、正常対照患者（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ）５名、Ｉ  ＣＤに罹患している患者５名、およびＦＳ  ＣＤの患者５名から回腸生検材料を採取した。各試料中のＭ−ＣＳＦＲ−１  ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲを使用して評価した。Ｍ−ＣＳＦＲ−１  ｍＲＮＡレベルを、β−アクチンｍＲＮＡ発現シグナルを使用して正規化した。Ｍ−ＣＳＦＲ−１  ｍＲＮＡ発現レベルは、Ｉ  ＣＤ試料およびＦＳ  ＣＤ試料において対照試料と比較して有意に上昇していた（図１３Ａ；Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ対Ｉ  ＣＤ、ｐ＝０．０３；Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ対ＦＳ  ＣＤ、ｐ＝０．００６；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。対照患者（Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ）、Ｉ  ＣＤに罹患している患者、およびＦＳ  ＣＤの患者由来の回腸生検組織のタンパク質抽出物をウエスタンブロットによって分析して、ＦＳ  ＣＤにおけるＭ−ＣＳＦＲ−１タンパク質発現のレベルを評価した。回腸生検組織抽出物のブロットを、Ｍ−ＣＳＦＲ−１に対する抗体およびＥＲＫ１／２（ローディング対照）に対する抗体を用いてプローブした。Ｍ−ＣＳＦＲ−１検出シグナルはＩ  ＣＤ患者の抽出物およびＦＳ  ＣＤ患者の抽出物において対照患者由来の試料と比較して上昇していると思われた（図１３Ｂ；Ｉｌｅａｌ  ＣＴＲ患者２名、Ｉ  ＣＤ患者２名、およびＦＳ  ＣＤ患者２名からのプローブした抽出物を示す代表的な画像）。
【０１７８】
これらの結果から、Ｉ  ＣＤ患者およびＦＳ  ＣＤ患者の腸組織においてＩＬ−３４受容体であるＭ−ＣＳＦＲ−１のタンパク質発現レベルおよびｍＲＮＡ発現レベルが上昇していることが実証される。
（実施例１３）
ＩＬ−３４により正常線維芽細胞におけるコラーゲン産生が刺激される
【０１７９】
ＩＬ−３４への曝露がコラーゲン産生に影響を及ぼすかどうかを評価するために、対照患者から正常線維芽細胞を単離し、６〜４８時間にわたり、処理せずにおいたか（Ｕｎｓｔ）または組換えヒトＩＬ−３４タンパク質に５０ｎｇ／ｍｌの濃度で曝露させた。６時間後に、１型コラーゲンアルファ１鎖（Ｃｏｌ１Ａ１；図１４Ａ）およびＩＩＩ型コラーゲンアルファ１鎖（Ｃｏｌ３Ａ１；図１４Ｂ）ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲによって評価した。Ｃｏｌ１Ａ１  ｍＲＮＡレベルおよびＣｏｌ３Ａ１  ｍＲＮＡレベルをβ−アクチンｍＲＮＡ発現シグナルに対して正規化した。Ｃｏｌ１Ａ１  ｍＲＮＡ発現レベルはＩＬ−３４で処理した試料において無処理の試料と比較して上昇していた（図１４Ａ；ｎ＝４；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。Ｃｏｌ３Ａ１  ｍＲＮＡ発現レベルは、ＩＬ−３４で処理した試料において無処理の試料と比較して有意に上昇していた（図１４Ｂ；Ｕｎｓｔ対ＩＬ−３４、ｐ＝０．０３；ｎ＝４；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。４８時間後に、細胞の上清中のコラーゲン分泌をＳｉｒｃｏｌアッセイによって評価した。４８時間の時点で、コラーゲンレベルはＩＬ−３４で処理した試料において無処理の試料と比較して有意に上昇していた（図１４Ｃ；Ｕｎｓｔ対ＩＬ−３４、ｐ＝０．０１；ｎ＝４；データは平均±ＳＥＭとして表されている）。これらの結果から、ＩＬ−３４により線維芽細胞におけるコラーゲン発現が刺激されたことが実証される。
参照による組み込み
【０１８０】
本明細書において引用されている特許文書および科学論文のそれぞれの開示全体は、全ての目的に関して参照により組み込まれる。
等価物
【０１８１】
本開示は、その本質的な特性から離れて他の特定の形態で具体化することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載されている開示に対する限定ではなく、例示的なものとみなされるべきである。本開示の範囲は、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と同等の意味および範囲の中に入る変化は全て特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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