(57)【要約】ＤＬＢＣＬの亜型の分類、ならびに分類の結果の、診断、予後判定、および療法選択のための使用に関する革新が本明細書に記載されている。このように、分類指標により、ＤＬＢＣＬの亜型を有効に分類し、医療上の実施およびＤＬＢＣＬ患者の利益のために意味のあるアウトプットをもたらすことができる。ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子の発現を測定するために使用することができるアレイおよびキットも記載されている。本発明の一局面では、ＤＬＢＣＬを、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）、または未分類に分類する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を分類する方法であって、
対象から得た試料中のＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの発現を測定し、それにより、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳについての発現値を得るステップと、
各発現値に重み付けし、それにより、重み付き発現値を生成するステップと、
前記重み付き発現値を合計し、それにより、合計重み付き発現値を生成するステップと、
前記合計重み付き発現値を使用して確率スコアを算出するステップと、
前記確率スコアを閾値と比較するステップと、
前記確率スコアがＡＢＣの範囲内の値であれば前記ＤＬＢＣＬを活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）に分類する、
前記確率スコアがＧＣＢの範囲内の値であれば前記ＤＬＢＣＬを胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）に分類する、または
前記確率スコアが未分類の範囲内の値であれば前記ＤＬＢＣＬを未分類に分類するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
核酸発現を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸が、ｍＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、固定された試料である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
発現を測定するステップが、ヌクレアーゼに基づくアッセイを使用して前記試料を分析することを含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
発現を測定するステップが、配列決定することを含み、前記発現値が、前記試料中に存在する分子の数を表す計数である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
発現を測定するステップが、発現を定量化することを含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
各発現値に重み付けするステップが、前記発現値に表５に示されている係数を掛けることを含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
確率スコアを算出するステップが、式：
【化７】
2018536387.tif 000020
を使用し、ここで式中、β０は定数であり、βは、分類指標となる遺伝子に対する重みのベクトルであり、ｘＴは、所与の試料についての前記分類指標となる遺伝子の測定値のベクトルである、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記閾値が、確率スコアｔカットオフである、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記確率スコアｔカットオフが、ＡＢＣについて＜０．４３、ＧＣＢについて＞０．５７、未分類について０．４３〜０．５７である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、ＤＬＢＣＬを有することが分かっているまたは有する疑いがある、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料の６％未満を未分類に分類する、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記発現値が、
前記試料を、隣接配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）と、各ＮＰＰＦがその標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下で接触させること、
前記試料を、前記隣接配列と相補的な配列（ＣＦＳ）を含む核酸分子と、前記隣接配列が前記ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下で接触させること、
前記試料を、一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、結合していない核酸分子を除去するために十分な条件下で接触させ、それにより、前記標的核酸分子および前記ＣＦＳ（複数可）とハイブリダイズしたＮＰＰＦを含む消化された試料を生成すること、
前記消化された試料中のＮＰＰＦを、増幅プライマーを用いて増幅し、それにより、ＮＰＰＦアンプリコンを生成すること、
前記ＮＰＰＦアンプリコンの少なくとも一部について配列決定すること、ならびに
ＮＰＰＦアンプリコンの数を計数し、それにより、前記試料中のＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳについての発現値を決定すること、
によって得られる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現値が、
前記試料を、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳ標的核酸分子に特異的なＮＰＰＦと接触させることであって、
各ＮＰＰＦが、
５’末端および３’末端、
前記ＮＰＰＦと前記標的核酸分子との特異的な結合を可能にする、前記ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳ標的核酸分子の領域と相補的な配列
を含み、
前記隣接配列が、前記標的核酸分子と相補的な配列に対して５’側、３’側、またはその両方に位置し、５’隣接配列は前記標的核酸分子と相補的な配列の５’側にあり、３’隣接配列は前記標的核酸分子と相補的な配列の３’側にあり、
前記隣接配列が、前記試料中に存在する核酸分子には見いだされない少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含み、
前記ＮＰＰＦが５’隣接配列を含む場合には、前記試料を、前記５’隣接配列と相補的な配列（５ＣＦＳ）、５’末端リン酸を含む核酸分子と、前記５’隣接配列が前記５ＣＦＳと特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、
前記ＮＰＰＦが３’隣接配列を含む場合には、前記試料を、前記３’隣接配列と相補的な配列（３ＣＦＳ）を含む核酸分子と、前記３’隣接配列が前記３ＣＦＳと特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、
前記３ＣＦＳおよび前記５ＣＦＳの少なくとも一方が、捕捉用部分を含む、接触させること、
前記標的核酸分子とハイブリダイズした、前記３ＣＦＳとハイブリダイズした、前記５ＣＦＳとハイブリダイズした、または前記３ＣＦＳおよび前記５ＣＦＳの両方とハイブリダイズしたＮＰＰＦを生成すること、
前記試料を、一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、結合していない核酸分子を除去するために十分な条件下で接触させ、それにより、前記標的核酸分子とハイブリダイズした、前記３ＣＦＳとハイブリダイズした、前記５ＣＦＳとハイブリダイズした、または前記３ＣＦＳおよび前記５ＣＦＳの両方とハイブリダイズしたＮＰＰＦを含む、消化された試料を生成すること、
前記標的核酸分子とハイブリダイズした、前記３ＣＦＳとハイブリダイズした、前記５ＣＦＳとハイブリダイズした、または前記３ＣＦＳおよび前記５ＣＦＳの両方とハイブリダイズした前記ＮＰＰＦを捕捉すること、
前記３ＣＦＳの５’リン酸と前記標的核酸分子の３’末端をライゲーションし、そして前記５ＣＦＳの３’末端と前記標的核酸分子の５’末端をライゲーションし、それにより、ライゲーションした標的核酸分子を生成すること、
前記ライゲーションした標的核酸分子から前記ＮＰＰＦを分離し、それにより、一本鎖のＮＰＰＦと一本鎖のライゲーションした標的核酸分子とを含む混合物を生成すること、ならびに
前記一本鎖のライゲーションした標的核酸分子の少なくとも一部分の配列決定をして、それにより、前記試料中の前記ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳ標的核酸分子の配列を決定すること
によって得られる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＮＰＰＦが少なくとも１つのｄＵＴＰを含み、前記方法が、変性後かつ配列決定前に、一本鎖のＮＰＰＦと一本鎖のライゲーションした標的核酸分子とを含む前記混合物を、ウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と、前記一本鎖のＮＰＰＦを分解するために十分な条件下で接触させるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＬＢＣＬがＧＣＢに分類される場合に、前記対象に、治療有効量の（１）シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンもしくはプレドニゾロン（ＣＨＯＰ）化学療法、（２）リツキシマブ＋ＣＨＯＰ（Ｒ−ＣＨＯＰ）化学療法、または（３）エトポシド＋Ｒ−ＣＨＯＰ（Ｒ−ＥＰＯＣＨ）化学療法を投与するステップをさらに含む、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＬＢＣＬがＡＢＣに分類される場合に、前記対象に、治療有効量の、ベンダムスチン、ピキサントロン、ゲムシタビン／オキサリプラチン、リポソームビンクリスチン、抗ＣＤ２０  ｍＡｂ、抗ＣＤ２２  ｍＡｂ、抗ＣＤ７４  ｍＡｂ、抗ＣＤ４０  ｍＡｂ、単鎖二重特異性抗ＣＤ１９およびＣＤ３  ｍＡｂ構築物、Ｉ−１３１トシツモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、９０Ｙ−エプラツズマブテトラキセタン、サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブ、ＮＰＩ−００５２、エベロリムス、テムシロリムス、ボリノスタット、オブリメルセンナトリウム、ＰＦ−３５１２６７６、１７−ＡＡＧ、ベバシズマブ、アフリベルセプト、ＣＡＬ−１０１、バルプロ酸、ジナシクリブ、ホスタマチニブ、ダサチニブ、エンザスタウリン、ＰＣＩ−３２７６５、ＳＢ１５１８、ならびにソラフェニブの１つまたは複数を投与するステップをさらに含む、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
プログラムされたときにそれにより計算処理システムに請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法を実施させるための、コンピューターで実行可能な指示が記憶された１つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体。
【請求項２０】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法の実施に適合させた計算処理システム。
【請求項２１】
以下：
少なくとも１６種の異なるＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳを含む容器であって、前記少なくとも１６種の異なるＮＰＰＦが、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳに特異的である、容器、ならびに、
前記少なくとも１６種の異なるＮＰＰＦのアンプリコンに特異的に結合することが可能なビーズを含む容器、
一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含む容器、
溶解緩衝液を含む容器、
洗浄緩衝液を含む容器、
ＰＣＲ用試薬を含む容器、
エタノールを含む容器、
リガーゼを含む容器、
ライゲーション緩衝液を含む容器、
変性用油を含む容器、および
プロテイナーゼＫを含む容器
の１つまたは複数
を含む、キット。
【請求項２２】
少なくとも１６種の異なるＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳを含む前記容器であって、前記少なくとも１６種の異なるＮＰＰＦが、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳに特異的である、容器、
一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含む容器、
溶解緩衝液を含む容器、ならびに
ヌクレアーゼ終結緩衝液を含む容器
を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
ＤＬＢＣＬの亜型に対する分類指標を実装する計算処理システムをさらに含む、請求項２１または２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記計算処理システムが、２種またはそれより多いＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子についての発現値を受信し、多数の値を各遺伝子についての対応する閾値に対してスコア化し、試料を前記試料のＤＬＢＣＬの亜型を示すフレームワーク内に分類するソフトウェアまたはコンピューター可読媒体を含む、請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年９月２９日に出願された米国仮出願第６２／２３４，４９１号（これは、参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の亜型を区別するための分類指標（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）、アレイおよびキット、ならびに分類の結果の、診断、予後判定（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）、および／または療法選択のための使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
リンパ腫は、最も一般的な血液がんである。リンパ腫の２つの主要な形態は、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫である。びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は非ホジキンリンパ腫の最も一般的な形態であり、新しく診断される症例の３０パーセントまでを占める。ＤＬＢＣＬは、遺伝子発現マーカーに基づいて、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）亜型としてまたは非ＧＣＢ様（活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）を含む）亜型としてさらに特徴付けることができる。ＧＣＢおよび非ＧＣＢ（ＡＢＣなど）亜型決定（ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ）は、（ｉ）非ＧＣＢ（またはＡＢＣ）亜型よりも予後が良好であるＧＣＢ様リンパ腫を有するリンパ腫患者の予後を予測する、および／あるいは（ｉｉ）例えば、ＧＢＣもしくはＡＢＣ標的化療法を用いた、または疾患の侵攻性に基づいた（一般にＡＢＣがＧＢＣ疾患よりも侵攻的である）、リンパ腫患者に対する処置を決定するために使用することができる。
【０００４】
ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬ亜型と非ＧＣＢ（例えば、ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ亜型を区別するため、および／またはＤＬＢＣＬ患者についての予後もしくは処置（複数可）を決定するための、受け入れられている診断検査は１つも存在しない。Ｃｏｌｏｍｏら（Ｂｌｏｏｄ、１０１巻（１号）：７８〜８４頁、２００３年）、Ｈａｎｓら（Ｂｌｏｏｄ、１０３巻：２７５〜２８２頁、２００４年）、Ｍｕｒｉｓら（Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．、２０８巻（５号）：７１４〜２３頁、２００６年）、Ｃｈｏｉら（Ｍｏｄ．  Ｐａｔｈｏｌ．、２１巻：２５０Ａ頁、２００８年）、およびＴａｌｌｙ（Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、２９巻（２号）：２００頁、２０１１年）の検査を含めた少数の免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づく検査が臨床上の実施において利用可能である。
【０００５】
ＤＬＢＣＬの臨床転帰は多種多様であるので、疾患の分子基盤も同等に複雑であると考えられており、臨床的に有用なバイオマーカーの発見が進められている。そのような研究の１つの目標は、「この臨床的に不均一な診断カテゴリーを、より均一な臨床的挙動を有する分子的に別個の疾患に細分すること」（Ａｌｉｚａｄｅｈら、Ｎａｔｕｒｅ、４０３巻：５０３頁、２０００年）である。その点で、ＩＨＣは、少なくとも、ほんの限られた数のタンパク質バイオマーカーしか同時検出することができないという理由により、本質的に限定された技術である。同様に、ゲノム（例えば、ＤＮＡ）分析は、少なくとも、ゲノム事象が、生物系に対する機能的影響を有するように発現されるかどうか不明であるという理由により、限定されている。
【０００６】
ｍＲＮＡ発現は、ゲノム活性のスナップショットをもたらし、同じ試料において多くのバイオマーカーを検出するための多重化に適するので、ｍＲＮＡトランスクリプトーム分析にはタンパク質分析およびＤＮＡ分析のどちらと比較しても利点がある。ＤＬＢＣＬ試料において示差的に発現するいくつかのｍＲＮＡが報告されている（例えば、Ａｌｉｚａｄｅｈら、Ｎａｔｕｒｅ、４０３巻：５０３頁、２０００年；Ｒｏｓｅｎｗａｌｄら、ＮＥＪＭ、３４６巻（２５号）：１９３７頁、２００２年；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、１００巻：９９９１頁、２００３年；およびＲｏｂｅｒｔｓら、Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、７８巻：９７９頁、２００７年）。しかし、この分野における有意かつ重要なギャップはまだ解決されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｌｉｚａｄｅｈら、Ｎａｔｕｒｅ（２０００年）４０３巻：５０３頁
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎｗａｌｄら、ＮＥＪＭ（２００２年）３４６巻（２５号）：１９３７頁
【非特許文献３】Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（２００３年）１００巻：９９９１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
種々の検出技術にわたって発現がＤＬＢＣＬに特有であるバイオマーカーの同定は、重要な最初のステップである（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、７８巻：９７９頁、２００７年）。しかし、実用的および臨床的展望から、残る重大な問題は、膨大な量の難解な発現データを合成して、医療上の実施およびＤＬＢＣＬ患者の利益のために意味のあるアウトプット（複数可）にすることである。
【０００９】
本開示は、ＤＬＢＣＬの亜型を分類すること、ならびに分類の結果を、診断、予後判定および療法選択のために使用することに関する革新を記載する。例えば、分類指標（コンピューターで実装することができるもの）により、ＤＬＢＣＬの亜型を、ＤＬＢＣＬを有する対象由来の試料中の２種またはそれよりも多いシグネチャー遺伝子の発現レベルなどの遺伝子発現に基づいて決定する。一部の例では、発現を、読み取りの総数（読み取りは、シークエンサーによって読み取ることができる特異的な配列（例えば、プローブに由来する）の相補的なコピーの数である）のうちの所与の遺伝子についての配列決定読み取りの比例的な数（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｎｕｍｂｅｒ）によって測定する。分類指標により、ＤＬＢＣＬの亜型を有効に分類し、医療上の実施およびＤＬＢＣＬ患者の利益のために意味のあるアウトプットをもたらすことができる。
【００１０】
革新の一態様によると、方法により、試料中の複数のＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子についての発現レベル（例えば、核酸またはタンパク質）を測定する。例えば、方法により、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのうちの少なくとも２種、またはＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのうちの少なくとも２種の発現を測定すること（これらの遺伝子１６種全ての発現を測定することなど）ができる。各遺伝子について結果として得られた発現値に重み付けし、重み付き発現値を合計することができる。合計重み付き発現値を使用して確率スコアを決定することができる。方法または分類指標により、確率スコアをＤＬＢＣＬ分類指標についての対応する閾値に対してスコア化または比較する。次いで、方法により、スコア化の結果に少なくとも一部基づいて、ＤＬＢＣＬ試料を活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）、または未分類に分類する。ＤＬＢＣＬの亜型の分類は、方法の一部として、方法の実施に適合させた計算処理システムの一部として、または、計算処理システムに方法を実施させるための、コンピューターで実行可能な指示が記憶された有形コンピューター可読媒体の一部として実装することができる。
【００１１】
本明細書に記載の革新は、分類の結果の、ＤＬＢＣＬを有する対象に対する診断、予後判定、および／または療法選択のための使用も含む。本明細書には、ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子の発現を決定するために使用することができるアレイおよびキットも記載されている。
【００１２】
本開示の前述および他の特色は、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な説明からより明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＤＬＢＣＬの亜型を分類するための一般化された技法を例示するフローチャートである。
【００１４】
【図２】図２は、ＤＬＢＣＬ分類指標モデルの訓練および検証のために使用された事例を示す流れ図である。
【００１５】
【図３】図３は、分類指標の実施形態を訓練および検証するために使用した、ＤＬＢＣＬアッセイに含まれる試料にわたる９６種の遺伝子の発現の分布を示すグラフである。
【００１６】
【図４】図４は、未分類の試料についての下限を決定するための手段を示すグラフである。
【００１７】
【図５】図５は、以前に、臨床的に受け入れられている方法によってＡＢＣ（黒色の点）またはＧＢＣ（赤色の点）として特徴付けられたＤＬＢＣＬ試料の検証セットの分類（すなわち、ＡＢＣ、ＧＢＣ、または未分類）を示すグラフである。試料はｘ軸に沿って識別される。ｙ軸は、各事例についての遺伝子発現プロファイリングに基づく予測確率を示す。この実施形態では、ＧＣＢ試料についての推定される確率のカットオフは０．５７であり（予測確率＞０．５７がＧＣＢ）、ＡＢＣ分類についてのカットオフは０．４３未満（予測確率＜０．４３）であり、未分類の試料は、ＡＢＣカットオフとＧＣＢカットオフを含め、その間のものとした（０．４３≦予測確率≧０．５７）。
【００１８】
【図６】図６は、ＧＣＢ  ＦＦＰＥ試料から調製した溶解物中のＣＤ２７４（ＰＤＬ−１）およびＰＤＣＤ１（ＰＤ１）についてのＬｏｇ２  ＣＰＭを示すグラフである。
【００１９】
【図７】図７は、ＡＢＣ  ＦＦＰＥ試料から調製した溶解物中のＣＤ２７４（ＰＤＬ−１）およびＰＤＣＤ１（ＰＤ１）についてのＬｏｇ２  ＣＰＭを示すグラフである。
【００２０】
【図８】図８は、各反復および条件についての分類プロットを示すグラフである。
【図９−１】図９Ａである。
【図９−２】図９Ｂ、図９Ｃおよび図９Ｄである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
配列表
本明細書において列挙されている核酸配列は、ヌクレオチド塩基については３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている標準の文字略語を使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのあらゆる言及によって相補鎖が含まれると理解される。本明細書と共に出願される配列表は参照により組み込まれる（２０１６年９月１日作成、３．６２ＫＢ）。提供されている配列中：
【００２２】
配列番号１〜１６は、例示的なプローブ核酸配列である。
【００２３】
詳細な説明
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用されている。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより出版、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．より出版、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．より出版、１９９５年（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）において見いだすことができる。
【００２４】
文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は複数の指示対象を含む。同様に、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、「または（ｏｒ）」という単語は「および（ａｎｄ）」を含むものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」は、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに関して示されている全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量の値は、概算値であり、説明のために提供されていることが理解されるべきである。本開示の実施またはテストには本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料が下に記載されている。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号（２０１５年９月２９日時点で存在する配列に関して）も同様である。矛盾する場合は、用語の説明を含めた本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。
【００２５】
特に断りがなければ、本開示の方法および技法は、一般に、当技術分野で周知であり、本明細書全体を通して引用され、考察されている種々の一般的なおよびより具体的な参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。例えば、そのそれぞれがそれら全体で参照により具体的に本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９９２年（および２０００年の補遺）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９９年；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年を参照されたい。
【００２６】
概要
ＤＬＢＣＬは、成人における非ホジキンリンパ腫の最も一般的な型である。ＤＬＢＣＬには２種の主要な亜型、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）および非ＧＣＢ（一般には、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ））が存在する。ＧＣＢには一般に好ましい予後が伴い、ＡＢＣまたは非ＧＢＣには一般に不良な予後が伴う（例えば、より侵攻的な疾患である）。原発性縦隔Ｂ細胞性リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）は一部の実務者からは別のＤＬＢＣＬの亜型であると考えられている（Ｌｏｓｓｏｓ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、２３巻：６３５１〜６３５７頁、２００５年）。ＰＭＢＣＬは胸腺において生じ、一般には縦隔内に塊として存在する。ＤＬＢＣＬの非ＧＣＢ亜型には、ＧＣＢ亜型以外の全てのＤＬＢＣＬ亜型が含まれる。同様に、ＤＬＢＣＬの非ＡＢＣ亜型にはＡＢＣ亜型以外の全てのＤＬＢＣＬ亜型が含まれる。
【００２７】
ＤＬＢＣＬの亜型を分類すること、ならびに分類の結果を診断、予後判定、および／または療法選択に使用することに関する革新が本明細書に記載されている。分類指標の例では、ＤＬＢＣＬの亜型が、ＤＬＢＣＬを有する対象由来の試料中の２種またはそれより多いシグネチャー遺伝子の遺伝子発現レベルに基づいて決定される。分類指標により、ＤＬＢＣＬの亜型を有効に決定することによって医療上の実施およびＤＬＢＣＬ患者の利益のために意味のあるアウトプットがもたらされる。
【００２８】
本明細書に記載の革新は、分類方法（完全にまたは部分的にコンピューターで実装することができる）、そのような方法を実施するための、コンピューターで実行可能な指示が記憶されたコンピューター可読媒体、およびそのような方法の実施に適合させた計算処理システムを含む。本明細書に記載の革新は、そのような分類の結果の、予後判定、療法選択および／または他の目的のための使用、ならびに分類のためのインプットとしてシグネチャー遺伝子の発現レベルを定量化する値をもたらすアレイおよびキットをさらに含む。
【００２９】
本明細書に記載の例に対する種々の代替物が可能である。例えば、本明細書に記載の方法はいずれも、記載されている方法行為の順序を変えることによって、ある特定の方法行為を分割すること、繰り返すこと、または省略することなどによって、変更することができる。開示されている技術の種々の態様は、組み合わせてまたは別々に使用することができる。種々の実施形態で記載の革新の１つまたは複数が使用される。本明細書に記載の革新の一部は、背景技術において示されている問題の１つまたは複数に対処する。一般には、所与の技法／ツールによりそのような問題の全ては解決されない。
【００３０】
ＤＬＢＣＬの亜型決定の方法
ＤＬＢＣＬの亜型（例えば、ＧＣＢまたは非ＧＣＢ（例えば、ＡＢＣ）亜型）を、ＤＬＢＣＬを有する対象由来の試料中の２種またはそれより多い遺伝子（２種またはそれより多いＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子など）の遺伝子発現に基づいて決定する方法が本明細書に開示されている。一般に、評価された各シグネチャー遺伝子の発現データに値を割り当てる（例えば、所与の試料についての総読み取りのうちの比例的な数量に基づいてまたは数量の割合として表す）。評価されたシグネチャー遺伝子に割り当てられた値に重み付けし、組み合わせてスコア（または確率スコア）をもたらす。次いで、スコアから、カットオフ、閾値、または他の判定基準に基づいてＤＬＢＣＬの亜型を決定する（例えば、ＧＣＢまたは非ＧＣＢのコール（ｃａｌｌ））。
【００３１】
一例では、本開示は、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を分類するための方法を提供する。そのような方法は、対象から得た試料（固定試料、例えば、ＦＦＰＥ試料など）中の複数のＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、もしくは全て、またはＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または全ての発現（核酸発現またはタンパク質発現など）を直接的または間接的に検出または測定することを含み得る。したがって、各ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子についての発現値（定量的であってよい）、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８のうちの少なくとも２種（または全て）について、またはＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのうちの少なくとも２種（または全て）についての発現値を得る。各ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子について結果として得られた発現値に重み付けし（例えば、表５に示されているものなどの係数値を掛けることによって）、それにより、少なくとも２つの重み付き発現値を生成することができる。結果として得られた重み付き発現値を合計または加算し、それにより、合計重み付き発現値を生成する。合計重み付き発現値を使用して（例えば、確率的モデルにおいて）、確率スコアを算出し、これを閾値またはカットオフ値と比較する。一例では、確率スコアの算出には、式
【化１】
2018536387.tif 000002
（式中、β０は、定数であり、βは、シグネチャー遺伝子（表１中のものなど）に対する重みであり、ｘＴは、そのようなシグネチャー遺伝子についての値である）を使用する。一例では、ＤＬＢＣＬ試料は、確率スコアがＡＢＣについての確立されたスコアを下回る場合には活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）に、確率スコアがＧＣＢについての確立されたカットオフを上回る場合には胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）に、または確率スコアが未分類に対するスコアの範囲内の値の場合には未分類に分類され、未分類に対するスコアは、一般には、ＡＢＣについてのカットオフスコアとＧＢＣについてのカットオフスコアを含め、その間に入る。
【００３２】
一部の例では、ｍＲＮＡなどの核酸分子の発現を測定する。一部の例では、タンパク質分子の発現を測定する。一部の例では、発現測定は、定量的または半定量的である。一部の例では、発現の測定には配列決定を利用し、各ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子についての発現値は、試料中に存在する標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）／タンパク質の数（相対的または絶対的）を表す計数である。
【００３３】
一部の例では、開示されている方法およびＤＬＢＣＬ分類指標は、試料の６％未満を未分類に、例えば、５％未満、または４〜６％を未分類に分類する。対照的に、他のＤＬＢＣＬ分類指標（これらの１２種の遺伝子：ＢＣＬ６、ＣＣＮＤ２、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＲＦ４、ＩＴＰＫＢ、ＬＭＯ２、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＭＹＢＬ１、およびＳＥＲＰＩＮＡ９の発現を測定するものなど）は未分類の試料のより高い率、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１１％、または少なくとも１２％、例えば、１０〜１２％を有する。したがって、開示されているＤＬＢＣＬ分類指標により、以前の方法によって分類不能であった試料の約４〜８％が今ではＡＢＣまたはＧＣＢに分類することが可能である。一部の例では、開示されている方法により、少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％の正確度でＤＬＢＣＬが亜型決定される（例えば、ＧＣＢまたはＡＢＣなどの非ＧＣＢとして）。
【００３４】
一部の例では、方法は、ヌクレアーゼに基づくアッセイを使用して発現を測定する。例えば、発現値は、試料を、（１）隣接配列を含む、少なくとも２つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）と、各ＮＰＰＦがその標的核酸分子（例えば、ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子）に特異的に結合するのに十分な条件下で、（２）隣接配列と相補的な配列（ＣＦＳ）を含む核酸分子と、隣接配列がＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下で、および（３）一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、結合していない核酸分子を除去するために十分な条件下で接触させる（例えば、直接物理的に会合させる）ことによって得ることができる。本明細書で使用される場合、十分な条件とは、所望の活性を可能にする、例えば、２つの核酸分子（例えば、プローブと標的核酸）の間の特異的な結合もしくはハイブリダイゼーションを可能にする、または結合していない核酸のヌクレアーゼによる除去（または消化）を可能にする任意の（例えば、Ｎａ＋、Ｃｌ−、Ｍｇ＋＋、Ｚｎ＋＋、もしくは他の特定のイオン（複数可）、カオトロピック剤（複数可）、もしくは界面活性物質（複数可）を含むもしくはそれが除かれた、または任意のそのようなイオン（複数可）、カオトロピック剤（複数可）もしくは界面活性物質（複数可）を特定の濃度で有する、または特定のイオン強度、ｐＨ、緩衝液の型もしくは濃度、もしくは温度を有する、水性）環境を指す。この結果、標的核酸分子およびＣＦＳ（複数可）とハイブリダイズしたＮＰＰＦを含む消化された試料がもたらされる。
【００３５】
任意選択で、結合していないまたは一本鎖である分子を試料から除去する。標的と、かつＣＦＳとハイブリダイズしたＮＰＰＦを、１つまたは複数の適切な増幅プライマーを用いて増幅し、それにより、ＮＰＰＦアンプリコンを生成する。ＮＰＰＦアンプリコンの少なくとも一部分について配列決定する（例えば、それがハイブリダイズした標的核酸分子（例えば、ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子）を決定するため）。ＮＰＰＦアンプリコンの数を計数するまたは値に割り当て、それにより、試料中のＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８のうちの少なくとも２種（または全て）、またはＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのうちの少なくとも２種（または全て）のそれぞれについての発現値を決定することができる。したがって、アッセイに使用したＮＰＰＦにより、ｍＲＮＡなどの標的核酸分子の検出、および一部の例では定量化が可能になる。
【００３６】
開示されている方法は、ＤＬＢＣＬ分類に応じて、治療有効量の適切な療法を投与するステップをさらに含んでよい。例えば、ＤＬＢＣＬがＧＣＢに分類される場合に、対象に、治療有効量の（１）シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンもしくはプレドニゾロン（ＣＨＯＰ）化学療法、（２）リツキシマブ＋ＣＨＯＰ（Ｒ−ＣＨＯＰ）化学療法、または（３）エトポシド＋Ｒ−ＣＨＯＰ（Ｒ−ＥＰＯＣＨ）化学療法を投与することができる。別の例では、ＤＬＢＣＬがＡＢＣまたは非ＧＣＢに分類される場合に、対象に、治療有効量の、ベンダムスチン、ピキサントロン、ゲムシタビン／オキサリプラチン、リポソームビンクリスチン、抗ＣＤ２０  ｍＡｂ、抗ＣＤ２２  ｍＡｂ、抗ＣＤ７４  ｍＡｂ、抗ＣＤ４０  ｍＡｂ、単鎖二重特異性抗ＣＤ１９およびＣＤ３  ｍＡｂ構築物、Ｉ−１３１トシツモマブ（抗ＣＤ２０放射免疫療法）、イノツズマブオゾガマイシン（ＣＭＣ−５４４）（ＣＤ２２標的化細胞傷害性免疫コンジュゲート）、９０Ｙ−エプラツズマブテトラキセタン（放射性標識されたヒト化抗ＣＤ２２  ｍＡｂ、ブレンツキシマブベドチン（ＳＧＮ−３５）（抗チューブリンモノメチルアウリスタチンＥ抗ＣＤ３０  ｍＡｂコンジュゲート）、サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブ（プロテアソーム阻害剤）、ＮＰＩ−００５２（プロテアソーム阻害剤）、エベロリムス（ｍＴＯＲ阻害剤）、テムシロリムス（ｍＴＯＲ阻害剤）、ボリノスタット（脱アセチル化酵素阻害剤）、オブリメルセンナトリウム（Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ＰＦ−３５１２６７６（ＴＬＲ９−アンタゴニスト）、１７−ＡＡＧ（ＨＳＰ９０阻害剤）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ）、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ融合タンパク質）、ＣＡＬ−１０１（ＰＩ３Ｋ阻害剤）、バルプロ酸（ＨＤＡＣＩ）、ジナシクリブ（ＣＤＫ１、２、５、９阻害剤）、ホスタマチニブ（Ｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂ）（Ｓｙｋ阻害剤）、ダサチニブ（ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＳＲＣ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦおよびエフリン受容体キナーゼのＲＴＫ阻害剤）、エンザスタウリン（プロテインキナーゼベータ阻害剤）、ＰＣＩ−３２７６５（ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤）、ＳＢ１５１８（ＪＡＫ２阻害剤）、ソラフェニブ（ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ｃ−ｋｉｔ／Ｆｌｔ３、種々のＶＥＧＦＲ、種々のＰＤＧＦＲ、ＲＥＴＲのＴＫＩ阻害剤）または当技術分野で公知の任意の他の療法（例えば、Ｆｏｏｎら、Ａｄｖ．  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、論文ＩＤ３０２５７０、２０１２年、ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／３０２５７０を参照されたい）を投与することができる。
【００３７】
プログラムされたときにそれにより計算処理システムに本明細書において提供されるＤＬＢＣＬ分類方法を実施させるための、コンピューターで実行可能な指示が記憶された１つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体も提供される。本明細書において提供されるＤＬＢＣＬ分類方法の実施に適合させた計算処理システムも提供される。
【００３８】
開示されているＤＬＢＣＬ分類方法と共に有用なキットが提供される。一部の例では、そのようなキットは、少なくとも２種の異なるＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳを含む容器を有し、少なくとも２種の異なるＮＰＰＦは、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、もしくはＴＮＦＲＳＦ８の２種もしくはそれより多く（例えば、全て）に特異的である、またはＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種もしくはそれより多く（例えば、全て）に特異的である。一部の例では、そのようなキットは、少なくとも２種の異なるＮＰＰを含む容器を有し、少なくとも２種の異なるＮＰＰは、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、もしくはＴＮＦＲＳＦ８の２種もしくはそれより多く（例えば、全て）に特異的である、またはＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種もしくはそれより多く（例えば、全て）に特異的である。キットは、少なくとも２種の異なるＮＰＰＦのアンプリコンに特異的に結合することが可能なビーズを含む容器、一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含む容器、溶解緩衝液を含む容器、ｐＨを６より高く上昇させることができる緩衝液などの、ヌクレアーゼを中和することが可能な緩衝液を含む容器、洗浄緩衝液を含む容器、ＰＣＲ用試薬を含む容器、エタノールを含む容器、変性用油を含む容器、ライゲーション緩衝液（例えば、リガーゼを含むもの）を含む容器、およびプロテイナーゼＫを含む容器の１つまたは複数をさらに含んでよい。一部の例では、キットは、ＮＰＰまたはＮＰＰＦまたはＣＳＦの３’末端または５’末端または両末端に実験タグ、および／または配列決定アダプターを付加することができるものなどの、ＮＰＰまたはＮＰＰＦの一部分に特異的なプライマーも含む。一部の例では、キットは、２種またはそれより多いＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子についての発現値を受信し、多数の値を各遺伝子についての対応する閾値に対してスコア化し、試料を、試料のＤＬＢＣＬの亜型を示すフレームワーク内に分類するソフトウェアまたはコンピューター可読媒体などの、ＤＬＢＣＬの亜型に対する分類指標を実装する計算処理システムも含む。
【００３９】
図１は、ＤＬＢＣＬ試料を分類するための一般化された方法または技法（１００）を示す。方法（１００）の行為の少なくとも一部は、特殊用途診断ツール、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、タブレットもしくはスレートコンピューター、スマートフォン、または他のモバイル計算処理デバイスなどの計算処理システムによって実施することができる。そのような計算処理システムは、試料についてのＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子の遺伝子発現レベルを定量化する値を受信するリーダー（例えば、ネットワーク接続、ストレージデバイスへのインターフェース、ユーザーのインプットを直接受信するためのユーザーインターフェース、または遺伝子発現レベルを定量化する値を受信する他のインターフェース）、遺伝子発現値を分類のための閾値に対してスコア化し、スコア化の結果に少なくとも一部基づいて試料を分類する分類指標）、データ記憶装置（情報（例えば、測定されたＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子の遺伝子発現レベル、分類指標を動作させるためのソフトウェア、カットオフ値）を非一過性に記憶させるために使用することができ、計算処理システム内にアクセスすることができる、取り外し可能または取り外し不能であり、そして磁気ディスク、磁気テープもしくはカセット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、または任意の他の媒体を含む記憶装置など）、ならびにアウトプットモジュール（例えば、試験した試料がＡＢＣ、ＧＣＢ、または未分類であるかに関する決定などの、計算処理システムからのアウトプットを提供するオーディオアウトプットデバイス、ディスプレイ、タッチスクリーン、プリンター、ＣＤライター、または別のデバイス）を含んでよい。アーキテクチャは、データ記憶装置内に記憶された閾値またはカットオフをコンピューター処理する訓練モジュールも含んでよい。分類指標は、データプロセッサー（例えば、各遺伝子発現値に特定の重み値を掛け、重み付き値をスコア総計器（ｓｃｏｒｅ  ｔｏｔａｌｌｅｒ）に提供するためのもの）、スコア総計器（算出された重み付き値を合計し、それらを確率モジュールに提供するためのもの）、および確率モジュール（例えば、合計重み付き値を使用して特定の分類の確率を決定するため、および確率またはＤＬＢＣＬ亜型をアウトプットモジュールに提供するためのもの）を含んでよい。例えば、確率モジュールにより、算出された確率の値（複数可）をＡＢＣ、ＧＣＢ、および未分類についての対応する閾値と比較することができる。分類指標は、ＤＬＢＣＬ分類指標についての閾値が記憶されたデータ記憶装置から確率閾値／カットオフ値を得る。分類の結果として、分類指標により、非ＧＣＢ（例えば、ＡＢＣ）、ＧＣＢまたは未分類などの簡潔な分類をもたらすことができる。
【００４０】
図１に戻り、初めに、システムは、試料についての多数のＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子の遺伝子発現レベル（例えば、タンパク質および／またはｍＲＮＡ）をそれぞれ定量化する多数の値（例えば、検出された標的の相対発光量もしくは計数または相対的な読み取りもしくは比例的な読み取り）を受信する（１１０）（例えば、リーダーまたはシークエンサーから、したがって、記憶された状態から受信することができる）。一部の例では、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多く、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多くの遺伝子発現値を受信する。本明細書に記載されているまたは当業者に公知の手法のいずれかを使用して、試験試料についてＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子の遺伝子発現レベルの値を測定することができる。一部の例では、任意選択で、生のデータを、「調整する（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」ことができる、例えば、データからバックグラウンド値を差し引くことができ、かつ／またはデータを対数変換（例えば、ｌｏｇ２変換）することができる。システムは、任意選択で、分類が、訓練中に閾値を決定するために使用したものと同じ手法（または同様の手法）を正規化に使用する限り、スコア化の前に本明細書に記載されているいずれかの手法を使用して多数の値を正規化することができる。
【００４１】
各遺伝子について、その発現値に、例えば、試料のＡＢＣ、ＧＢＣまたは未分類への分類に対するその遺伝子の発現の寄与を反映する重み値を掛けることにより、重み付けする（１２０）。したがって、例えば、全ての分類指標遺伝子の重み付けがそれぞれ１．０である場合、そのような遺伝子は、分類指標アウトプットにおいて同等の重みを有することになる。例示的な重み値およびそれらの対応する遺伝子は表５に提供されている。システムは、重み付き遺伝子発現値を合計する（１３０）。すなわち、分析した各遺伝子についての重み付き値を合計し、その結果、重み付き合計がもたらされる。次いで、重み付き合計を使用し（例えば、統計学的モデルにおいて）、例えば、実施例１における方程式１を使用して確率スコアを得る（１４０）。分類指標を実装する計算処理システムを使用してこれらのタスクの１つまたは複数を実施することができる。
【００４２】
確率スコアを、試料がＡＢＣもしくはＧＢＣに分類されるまたはいずれにも分類されない（すなわち、未分類）予測確率（１５０）に関して、対応する閾値と比較する。スコア化のために使用する閾値および規則は実装に依存する。閾値の例は本明細書に記載されており、スコア化規則の例は下に記載されている。あるいは、システムは、他の閾値および／または他のスコア化規則を使用する。一例では、カットオフは、下の点が０．４３であり、上の点が０．５７である。
【００４３】
システムは、スコア化の結果に少なくとも一部基づいて試料を分類する（１６０）。分類のために使用する規則は実装に依存する。分類規則の例は下に記載されている。あるいは、システムは他の分類規則を使用する。一例では、予測確率が＜０．４３であればシステムは試料をＡＢＣに分類し、予測確率が＞０．５７であればシステムは試料をＧＣＢに分類し、予測確率が両端を含んで０．４３〜０．５７内であればシステムは試料を未分類に分類する。
【００４４】
Ｉ．遺伝子発現データを得るための調製
遺伝子発現は、ゲノム（遺伝子）内にコードされている情報が対応する遺伝子産物（例えば、ＲＮＡおよびタンパク質）（これらは、相互に関連して機能して、特徴のセット（別称、表現型）を生じさせる）に変換される（例えば、転写および翻訳プロセスによって）プロセスである。本開示の目的に関して、遺伝子発現は、現在公知のまたは今後公知になる任意の技法によって測定することができる。一般に、遺伝子発現は、目的の対象（ＤＬＢＣＬを有する対象など）から収集した試料中の発現された遺伝子の産物（例えば、ＲＮＡおよび／またはタンパク質）を検出することによって測定する。したがって、２種またはそれより多いＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子またはマーカーなどの２種またはそれより多い標的遺伝子の発現を測定することができる。一例では、遺伝子発現を、標的ｍＲＮＡに特異的に結合する１種または複数のプローブを検出し（例えば、配列決定によって）、ｍＲＮＡ標的に結合したプローブの数（相対的または絶対的）を決定することによって測定する。したがって、検出されるプローブの数が、遺伝子発現の尺度としての機能を果たす。ＤＬＢＣＬマーカー（複数可）の例としては、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多く、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種もまたはそれより多く（例えば、全て）が挙げられる。ＤＬＢＣＬマーカー（複数可）の他の具体的な例としては、ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種もしくはそれより多く（２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種など）（ＡＢＣ分類に関連付けられる）、またはＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ、およびＲＥＬの２種もしくはそれより多く（２種、３種、４種、５種、または６種など）（ＧＣＢ分類に関連付けられる）が挙げられる。開示されている方法を用いて分析することができる対象としては、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、およびマウスなどの獣医学の対象）が挙げられる。一例では、対象は、腫瘍、例えば、ＤＬＢＣＬなどのリンパ腫を有することが分かっているまたはその疑いがある。
【００４５】
Ａ．対象および試料
本明細書に開示されている方法における使用に適した試料としては、遺伝子またはタンパク質発現（表１のものなど）に関する情報が望まれる腫瘍（例えば、リンパ節、脾臓、肝臓、骨髄、脳および／または脊髄における腫瘍）に由来する細胞（例えば、Ｂ細胞）を含有する対象由来の任意の生体試料が挙げられる。試料として、対象から得た試料、例えば、対象（健康なもしくは見たところ健康なヒト対象、または、ＤＬＢＣＬ、より詳細にはＡＢＣもしくはＧＣＢなどの、診断もしくは調査すべき状態もしくは疾患に罹患したヒト患者に由来する試料を含む）から得た臨床試料などが挙げられる。一例では、対象はＤＬＢＣＬを有することが分かっているまたは有する疑いがある。例示的な試料は、正常細胞もしくは組織（例えば、対照試料として）から、および／または腫瘍細胞もしくは組織から得ることができる。特定の例では、生体試料として、リンパ腫の細胞を含有する試料などの腫瘍試料が挙げられる。一例では、試料として、ｍＲＮＡなどのＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態では、試料は、以前に、本明細書に記載されている以外の組織学または臨床的方法（例えば、ＩＨＣまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ））によってＤＬＢＣＬと診断された対象に由来する。
【００４６】
開示されているＤＬＢＣＬシグネチャーの２種またはそれより多い遺伝子の発現を決定するために使用される試料としては、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸断片、修飾された核酸、合成核酸など）またはタンパク質を含む任意の生物検体が挙げられる。一部の例では、非ホジキンリンパ腫（例えば、ＤＬＢＣＬ）などのリンパ腫を有する対象を、例えば、対象に対する診断もしくは予後を決定するためまたは１種もしくは複数の療法の選択のために選択する。
【００４７】
例示的な試料としては、限定することなく、細胞、細胞溶解物、血液塗抹標本、細胞遠心調製物、細胞診塗抹標本、体液（例えば、血液、血清、唾液、痰、尿など）、組織生検材料（例えば、腫瘍生検材料）、リンパ節組織もしくは生検材料、液体生検材料、細針吸引物、外科的検体、骨髄、羊水穿刺試料、剖検材料、および／または組織切片（例えば、クリオスタット組織切片および／またはパラフィン包埋組織切片）が挙げられる。対象から試料（組織など）を得る任意の方法を利用できること、および使用する方法の選択は、組織の型、対象の年齢、または実務者が利用可能な手順などの様々な因子に依存することを理解されたい。記載されている試料を取得するための標準の技法が利用可能である。例えば、ＴｕｂｂｓおよびＳｔｏｌｅｒ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（２００９年）を参照されたい。例えば、細胞性材料を含有する腫瘍由来の試料は、腫瘍の全部または一部の外科的切除によって、腫瘍から細針吸引物を収集することによって、ならびに当技術分野で公知の他の方法によって得ることができる。
【００４８】
開示されている方法は、感度が高くかつ特異的であり、ほんの限られた数の細胞を含有する試料中の標的核酸分子の検出を可能にする。少数の細胞、例えば、２５０，０００個未満の細胞（例えば、１００，０００個未満、５０，０００個未満、１０，０００個未満、１，０００個未満、５００個未満、２００個未満、１００未満の細胞、または１０個未満の細胞を含む試料としては、これだけに限定されないが、ＦＦＰＥ試料、細針吸引物（リンパ液または脾臓からのものなど）、パンチ生検材料、針生検材料、（例えば、ＦＡＣＳ）選別された細胞の小集団、少数のレーザーキャプチャーもしくはマクロダイセクションされた細胞、エキソソームおよび他の細胞内粒子、または体液（髄液など）が挙げられる。例えば、わずか１０００個の細胞（例えば、１０００個またはそれより多い細胞、例えば、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１０，０００個、１５，０００個、２０，０００個、５０，０００個、またはそれより多い細胞を含む試料）において標的ＲＮＡを検出することができる。一部の例では、約１０００〜１００，０００個の細胞、例えば、約１０００〜５０，０００個、１０００〜１５，０００個、１０００〜１０，０００個、１０００〜５０００個、３０００〜５０，０００個、６０００〜３０，０００個、または１０，０００〜５０，０００個の細胞において標的ＲＮＡの発現を検出することができる。一部の例では、約１００〜２５０，０００個の細胞、例えば、約１００〜１００，０００個、１００〜５０，０００個、１００〜１０，０００個、１００〜５０００個、１００〜５００個、１００〜２００個、または１００〜１５０個の細胞において標的ＲＮＡの発現を検出することができる。他の例では、約１〜１０００個の細胞（例えば、約１〜５００個の細胞、約１〜２５０個の細胞、約１〜１００個の細胞、約１〜５０個の細胞、約１〜２５個の細胞、または約１個の細胞）において標的ＲＮＡの発現を検出することができる。
【００４９】
特定の例では、試料を直接（例えば、新鮮または凍結させて）使用する、または使用前に、例えば固定（例えば、ホルマリン固定（中性緩衝ホルマリン、亜鉛ホルマリンおよび酸性ホルマリンなど）、エタノール固定）によって、および／もしくは固形媒体中に包埋することによって保存することができる。包埋用媒体は、一般には、不活性であり、水分をはじくことができ、また、組織を透過することができる（例えば、蝋、パラフィン、セロイジン、ＯＣＴ（商標）化合物、寒天、プラスチック、およびアクリル）。有用な試料のいくつかは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である。具体的な例では、分析する組織試料を、固定するか、より詳細には、固定し蝋（パラフィン）包埋する。脱パラフィンまたは脱蝋という用語は、あらゆる型の包埋用媒体の生体試料からの部分的なまたは完全な除去（例えば、開示されている方法を使用して分析する前）を指す。例えば、パラフィン包埋組織切片を、トルエン、キシレン、リモネン、または他の適切な溶媒などの有機溶媒に通すことによって脱蝋することができる。他の例では、パラフィン包埋組織切片を直接（例えば、脱蝋ステップを伴わずに）利用する。
【００５０】
組織は、灌流または固定液中への浸漬によるものを含めた任意の適切なプロセスによって固定することができる。固定液は、架橋結合剤（例えば、アルデヒド、例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒド、ならびに非アルデヒド架橋結合剤）、酸化剤（例えば、四酸化オスミウムおよびクロム酸などの金属イオンならびに錯体）、タンパク質変性剤（例えば、酢酸、メタノール、およびエタノール）、機構が分かっていない固定液（例えば、塩化第二水銀、アセトン、およびピクリン酸）、組み合わせ試薬（例えば、カルノア固定液、メタカン（ｍｅｔｈａｃａｒｎ）、ブアン液、Ｂ５固定液、ロスマン液、およびジャンドル液）、マイクロ波、および種々雑多な固定液（例えば、排除体積固定および蒸気固定）に分類することができる。緩衝液、界面活性剤、タンニン酸、フェノール、金属塩（塩化亜鉛、硫酸亜鉛、およびリチウム塩など）、ならびにランタンなどの添加剤も固定液中に含めることができる。
【００５１】
組織試料または細胞試料の調製において一般に使用される固定液は、ホルムアルデヒドであり、一般に、ホルマリン溶液（１０％緩衝ホルマリンと称される、緩衝溶液中４％ホルムアルデヒド）の形態である。一例では、固定液は、１０％中性緩衝ホルマリンである。
【００５２】
固定（例えば、ＦＦＰＥ）組織または細胞を含めたいくつかの試料は、試料を、そのような試料中に存在するｍＲＮＡのいかなる精製および／または逆転写も伴わずに、適切な溶液中に懸濁させることによって調製することができる（例えば、以下の実施例に記載されている通り）。固体表面（例えば、顕微鏡スライド）に付加した試料の全部または一部（例えば、予め測定された面積または体積）を直接適切な溶液中にこすり取り、穏やかに混合して（例えば、ピペッターを使用して）、試料の大きな片を分散させ、かつ／または破壊し、大部分が少なくとも懸濁物を適切な試薬と接触させている期間中は懸濁したままになる、細胞性材料を含む懸濁物を創出することができる。一部の実施形態では、試料のｍＲＮＡを部分的に分解することができる（しかし必要ではない）、または試料のｍＲＮＡの不完全な分解がいくらか生じていても問題はない。
【００５３】
一部の実施形態では、試料は、腫瘍または組織から得た細胞および／または組織の溶解物である。細胞溶解物は、細胞中に含有されるタンパク質および核酸の多くを含有し、それらとして、例えば、表１に示されているバイオマーカーが挙げられる。細胞溶解物を得るまたは調製するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８年）において見いだすことができる。一部の例では、試料中の細胞を水溶液中で溶解させるまたは透過処理する（例えば、溶解緩衝液を使用して）。水溶液または溶解緩衝液は、界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウムなど）および１つまたは複数のカオトロピック剤（ホルムアミド、グアニジニウムＨＣｌ、グアニジニウムイソチオシアネート、または尿素など）を含んでよい。溶液は、緩衝液（例えば、ＳＳＣ）も含有してよい。一部の例では、溶解緩衝液は、約８％〜６０％ホルムアミド（ｖ／ｖ）、約０．０１％〜０．５％ＳＤＳ、および約０．５〜６×ＳＳＣ（例えば、約３×ＳＳＣ）を含む。緩衝液は、任意選択で、約０．００１〜約２．０ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、またはリボヌクレアーゼ；ＤＮＡアーゼ；プロテイナーゼＫ；タンパク質、マトリックス、炭水化物、脂質、もしくは１つの種のオリゴヌクレオチドを分解する酵素（例えば、コラゲナーゼまたはリパーゼ）、またはこれらの組み合わせを含んでよい。溶解緩衝液は、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬も含んでよい。細胞を水溶液中で十分な期間（例えば、約１分〜約６０分、例えば、約５分〜約２０分、または約１０分）、十分な温度（例えば、約２２℃〜約１１５℃、例えば、約３７℃〜約１０５℃、または約５０℃〜約９５℃または約６５℃〜約１００℃）でインキュベートして、細胞を溶解させるまたは透過処理する。一部の例では、例えば、検出しようとする核酸がＲＮＡである場合には、溶解を約５０℃、６５℃、または９５℃で実施する。他の例では、例えば、検出しようとする核酸がＤＮＡである場合には、約１０５℃で溶解を実施する。一部の例では、溶解条件は、ゲノムＤＮＡはプローブに接近できないのに対してＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）はできるようなものであってよい。一部の例では、粗製細胞溶解物を、さらなる精製を行わずに直接使用する。
【００５４】
一部の例では、組織試料または細胞試料を基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に適用し、分析して、１種または複数の標的核酸の存在を決定する。開示されている方法において有用な固体支持体は、生体試料を担持するだけでよく、任意選択で、しかし有利には、試料中の成分（例えば、タンパク質および／または核酸配列）の都合のよい検出を可能にする。例示的な支持体としては、顕微鏡スライド（例えば、ガラス顕微鏡スライドまたはプラスチック顕微鏡スライド）、カバーガラス（例えば、ガラスカバーガラスまたはプラスチックカバーガラス）、組織培養ディッシュ、マルチウェルプレート、メンブレン（例えば、ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ））またはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップが挙げられる。
【００５５】
標的（ＲＮＡなど）を試料から単離または抽出し、それにより、試料中の他の非標的生物学的成分から離して精製することができる。しかし、ステップなどは任意選択である。精製とは、標的を、同じく試料中に見いだされる１つまたは複数の外来成分から分離することを指す。例えば、多くの場合、ｍＲＮＡの標的特異的プライマーの対を用いたＰＣＲに基づく検出の前に、総ｍＲＮＡまたは可溶性ｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡを含む）を試料中の細胞タンパク質および他の核酸から分離する。混合検体または試料から単離、抽出、または精製される成分は、一般には、精製されていないまたは抽出されていない試料と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９８％またはさらには少なくとも９９％富化されている。
【００５６】
一部の例では、試料中の核酸分子を、分析前に、例えばＰＣＲ（例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）を使用して増幅する。一例では、定量的ＰＣＲ法を使用する。
【００５７】
Ｂ．対照試料
対照試料を開示されている方法と並行して使用することができ、対照試料としては、表１に示されているバイオマーカーの発現と比較する任意の適切な対照試料を挙げることができる。一部の実施形態では、対照試料は、複数の非腫瘍組織試料などの非腫瘍組織である。一例では、非腫瘍組織は、組織学的に正常なリンパ組織などの、良性であることが分かっている組織である。一部の例では、非腫瘍組織は、正常だと思われるリンパ系または骨髄試料を含む、すなわち、細胞異形成または他の公知の疾患（例えば、ＤＬＢＣＬなどのリンパ腫）の指標が存在しない。一部の例では、非腫瘍組織は、リンパ系悪性疾患（ＤＬＢＣＬなど）に近接するまたはさらには遠位の非腫瘍組織などの、同じ対象から得られる。他の例では、非腫瘍組織は、健康な対照対象または数体の健康な対照対象から得られる。例えば、非腫瘍組織は、複数の健康な対照対象（例えば、リンパ腫がん（例えば、ＤＬＢＣＬ）を含めたいかなるがんも有さない対象から、例えば、複数のそのような対象由来の正常細胞または組織（例えば、リンパ節、脾臓、肝臓、骨髄、脳および／または脊髄に由来する）を含有する試料から得ることができる。一部の実施形態では、表１に示されているバイオマーカーの発現レベルについての参照（例えば、正常対照）値または値の範囲を得るために、１種または複数（例えば、複数の）対照試料を使用する。一部の実施形態では、対照試料から得る参照値は、母集団中心傾向（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｅｎｄｅｎｃｙ）（平均（ｍｅａｎ）、中央値または平均値（ａｖｅｒａｇｅ）など）、または母集団中心傾向の周囲±０．５、１．０、１．５もしくは２．０標準偏差（複数可）などの値の参照範囲であってよい。
【００５８】
Ｃ．試料分析の選択肢
一部の方法の実施形態では、固定された試料（例えば、ＦＦＰＥ組織試料）を使用する。固定技法は、場所ごと、国ごと、研究者ごとなどで変動し得（Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ、Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋ、ＧｉｌｌｅｓｐｉｅおよびＣｈｕａｑｕｉ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、２４４頁（２０１０年））、検出しようとする遺伝子産物（複数可）の完全性および／またはそれへの接近可能性に影響を及ぼす可能性がある。一部のそのような方法（例えば、ＰＣＲを伴う）では、ＲＮＡ回収（例えば、可逆的な架橋結合剤、エタノールに基づく固定液および／またはＲＮＡ抽出もしくは精製（全体的にまたは部分的に）を使用）が有利であり得、一方、他の代表的な方法（例えば、ｑＮＰＡまたはｑＮＰＳを伴う）では、ＲＮＡ回収は任意選択であるまたはＲＮＡ回収は特に必要ない。同様に、固定された組織からタンパク質遺伝子産物を回収し、それにより、そのようなタンパク質産物の検出を補助するために、組織前処理（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）を使用することができる。
【００５９】
生体試料中の腫瘍（例えば、ＤＬＢＣＬ）の百分率は変動し得、したがって、一部の開示されている実施形態では、試料面積（または試料体積）の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％または試料中の総細胞が腫瘍（例えば、ＤＬＢＣＬ）である。他の例では、試料を、例えば、主に腫瘍（例えば、ＤＬＢＣＬ）であるまたはそうであると思われる試料からエリアまたは細胞をマクロダイセクションすることによって、腫瘍細胞について富化することができる。任意選択で、病理学者または他の適切に訓練された専門家が試料（例えば、Ｈ＆Ｅ染色された組織切片）を精査して、テストするために十分な腫瘍が試料中に存在するかどうかを決定することおよび／またはマクロダイセクションすべきエリア（例えば、最も高密度の腫瘍エリア）にしるしを付けることができる。具体的な例では、腫瘍（例えば、ＤＬＢＣＬ）のマクロダイセクションにより壊死性および／または出血性エリアができる限り回避される。一部の開示されている方法において有用な試料は、試料体積もしくは面積または総細胞の２５％、１５％、１０％、５％、２％、または１％未満の壊死を有する。
【００６０】
試料負荷は、検出に利用可能な遺伝子産物（例えば、表１のバイオマーカー）の量および／または濃度に影響を及ぼす可能性がある。特定の実施形態では、少なくとも１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇの総ＲＮＡ、少なくとも１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇの総ＤＮＡ、または少なくとも０．０１ｎｇ、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、または１ｍｇの総タンパク質が試料（試料溶解物など）から単離される、かつ／またはその中に存在する。一部の実施形態では、厚さが少なくとも３、５、８、または１０μｍ（例えば、約３〜約１０μｍ）、および／または面積が少なくとも０．１５、０．２、０．５、１、１．５、２、５または１０ｃｍ２である組織試料（例えば、ＦＦＰＥリンパ節、脾臓、肝臓、骨髄、脳および／または脊髄組織）を使用する。一部の方法の実施形態において緩衝液中に懸濁させる試料の濃度は、少なくとも０．００６ｃｍ２／μｌ（例えば、緩衝液（例えば、溶解緩衝液）２５μＬ当たりＦＦＰＥ組織０．１５ｃｍ２）である。
【００６１】
ＩＩ．遺伝子および遺伝子セット
本明細書に開示されている革新の中には、ＤＬＢＣＬの亜型を区別するために有用な遺伝子（バイオマーカーとも称される）および遺伝子のセット（遺伝子シグネチャーとも称される）がある。特定の実施形態では、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬおよびＧＣＢ  ＤＬＢＣＬの亜型決定するための遺伝子および遺伝子セットが開示されている（表１参照）。そのような遺伝子および遺伝子のセットの発現は、ＤＬＢＣＬの分類指標およびアルゴリズムにおいて、ならびに／またはアレイもしくは他の開示されている組成物に対する、分析物に特異的な試薬（例えば、核酸プローブまたは抗体）を設計するために有用である。
【００６２】
一部の実施形態では、生体試料（腫瘍生検材料など）中の発現レベルを決定することは、表１に示されている２種またはそれより多い遺伝子産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）を、例えば、本明細書に記載の通り、試料中のそのような核酸（またはタンパク質）の相対的な量または実際の量を決定することによって検出することを含む。
Ａ．ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子
【００６３】
例示的なＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子としては、表１に示されているものが挙げられる。一部の実施形態では、ＤＬＢＣＬ遺伝子シグネチャーとして、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多く（例えば、これらのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または１０種全て）、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多く（例えば、これらのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、または１６種全て）が挙げられる。
【表１】
2018536387.tif 000003
【００６４】
インテグリン関連タンパク質としても公知の表面抗原分類４７（ＣＤ４７）（例えば、ＯＭＩＭ６０１０２８）は、膜インテグリンとパートナーになり、また、リガンドであるトロンボスポンジン−１およびシグナル調節タンパク質アルファにも結合する膜貫通タンパク質である。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＣＤ４７の核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１７７７．３、ＮＭ＿１９８７９３．２、およびＬＮ６８０４３７．１により、例示的なヒトＣＤ４７核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１７６８．１、ＮＰ＿９４２０８８．１、およびＣＥＪ９５６４０．１により、例示的なヒトＣＤ４７タンパク質配列が開示される。そのようなＣＤ４７配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＣＤ４７  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００６５】
Ｂ７−２としても公知の表面抗原分類８６（ＣＤ８６）（例えば、ＯＭＩＭ６０１０２０）は、抗原提示細胞上に発現し、Ｔ細胞の活性化および生存に関する共刺激シグナルをもたらす。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＣＤ８６の核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿１７５８６２．４、ＮＧ＿０２９９２８．１、ＮＭ＿１７６８９２．１、ＮＭ＿００１２０６９２４．１、およびＮＭ＿００１２０６９２５．１により、例示的なヒトＣＤ８６核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿７８７０５８．４、ＮＰ＿００８８２０．３、ＮＰ＿７９５７１１．１、ＮＰ＿００１１９３８５３．１、およびＮＰ＿００１１９３８５４．１により、例示的なヒトＣＤ８６タンパク質配列が開示される。そのようなＣＤ８６配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＣＤ８６  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００６６】
ＣＤ３９、ＡＴＰＤａｓｅ、およびＮＴＰＤａｓｅ−１としても公知のエクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１（ＥＮＴＰＤ１）（例えば、ＯＭＩＭ６０１７５２）は、ＡＴＰおよびＡＤＰをＡＭＰに加水分解し、アデノシンの生成を開始する酵素（ＥＣ  ３．６．１．５）である。ＥＮＴＰＤ１は、血管および免疫系の細胞を含め、広範に発現する。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＥＮＴＰＤ１の核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１７７６．５；ＮＭ＿００１０９８１７５．１；ＮＭ＿００１１６４１７８．１；ＮＭ＿００１１６４１７９．１；ＮＭ＿００１１６４１８１．１；およびＮＭ＿００１１６４１８２．１；ＮＭ＿００１１６４１８３．１により、例示的なヒトＥＮＴＰＤ１核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＨ４７６６４．１、ＮＰ＿００１０９１６４５．１、ＮＰ＿００１１５７６５０．１、ＮＰ＿００１１５７６５３．１、ＮＰ＿００１７６７．３、ＮＰ＿００１１５７６５１．１、ＮＰ＿００１１５７６５４．１、およびＮＰ＿００１１５７６５５．１により、例示的なヒトＥＮＴＰＤ１タンパク質配列が開示される。そのようなＥＮＴＰＤ１配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＥＮＴＰＤ１  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００６７】
フォークヘッドボックスタンパク質Ｐ１（ＦＯＸＰ１）（例えば、ＯＭＩＭ６０５５１５）は、ＤＮＡ結合性ドメインおよびタンパク質−タンパク質結合性ドメインを含有する転写因子であり、転写リプレッサーとして機能する。ＦＯＸＰ１は、肺、脳、胸腺および心臓の組織発生を含めた発生の種々の重要な面を調節する。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。Ｆｏｘｐ１の核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１０１２５０５．１；ＮＭ＿０３２６８２．５；ＮＭ＿００１２４４８０８．１；ＮＭ＿００１２４４８１２．１；ＮＭ＿００１２４４８１４．１；ＮＭ＿００１２４４８１５．１、ＮＭ＿００１２４４８１３．１；ＮＭ＿００１２４４８１０．１およびＮＭ＿００１２４４８１６．１により、例示的なヒトＦｏｘｐ１核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＧ４７６３２．１、ＮＰ＿００１２３１７４３．１；ＮＰ＿００１０１２５２３．１；ＮＰ＿００１２３１７３７．１、ＮＰ＿００１２３１７３９．１、ＮＰ＿００１２３１７４１．１、ＮＰ＿００１２３１７４２．１、およびＮＰ＿００１２３１７４４．１により、例示的なヒトＦｏｘｐ１タンパク質配列が開示される。そのようなＦｏｘｐ１配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＦｏｘｐ１  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００６８】
ＧＤＰ−Ｌ−Ｆｕｃ：Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニドアルファ１，６−フコシルトランスフェラーゼ；ＧＤＰ−フコース−糖タンパク質フコシルトランスフェラーゼ；およびアルファ−（１，６）−フコシルトランスフェラーゼとしても公知のフコシルトランスフェラーゼ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）（ＦＵＴ８）（例えば、ＯＭＩＭ６０２５８９）は、ＧＤＰ−フコースからＮ結合型複合グリコペプチドへのフコースの転移を触媒する酵素（ＥＣ  ２．４．１．６８）である。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）および非コードＲＮＡが同定されている。ＦＵＴ８の核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿１７８１５５．２、ＮＭ＿００４４８０．４、ＮＭ＿１７８１５６．２、ＮＲ＿０３８１６７．１、およびＮＲ＿０３８１７０．１により、例示的なヒトＦＵＴ８核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＩ４２９５９．１、ＮＰ＿８３５３６８．１、ＮＰ＿００４４７１．４、およびＮＰ＿８３５３６９，１により、例示的なヒトＦＵＴ８タンパク質配列が開示される。そのようなＦＵＴ８配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＦＵＴ８  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００６９】
インターロイキン１６（ＩＬ１６）（例えば、ＯＭＩＭ６０３０３５）は、ＣＤ４を発現するいくつかの免疫細胞に対する化学誘引物質として機能するサイトカインである。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＩＬ１６の核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００４５１３．５、ＮＭ＿１７２２１７．３、ＮＭ＿００１１７２１２８．１、ＸＭ＿０１１５２１５２０．１、およびＸＲ＿９３１８０５．１により、例示的なヒトＩＬ１６核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＩ３６６６１．１、ＡＡＤ１５９９０．１、ＮＰ＿００１１６５５９９．１、ＡＣＩ００２３６．１、およびＸＰ＿０１１５１９８２１．１により、例示的なヒトＩＬ１６タンパク質配列が開示される。そのようなＩＬ１６配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＩＬ１６  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００７０】
ＩＰ３  ３−キナーゼＢ、ＩＰ３Ｋ  Ｂ、および増殖誘導タンパク質３７としても公知のイノシトール１，４，５−三リン酸３−キナーゼＢ（ＩＴＰＫＢ）（例えば、ＯＭＩＭ１４７５２２）は、イノシトール１，４，５−三リン酸をＩｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４にリン酸化する。ＩＴＰＫＢの核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００２２２１．３およびＸＭ＿００５２７３１２０．１により、例示的なヒトＩＴＰＫＢ核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００２２１２．３およびＡＡＨ１５００９．１により、例示的なヒトＩＴＰＫＢタンパク質配列が開示される。そのようなＩＴＰＫＢ配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＩＴＰＫＢ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００７１】
ＪＡＷ１としても公知のリンパ系限局膜タンパク質（ＬＲＭＰ）（例えば、ＯＭＩＭ６０２００３）は、リンパ系細胞株および組織において発現する。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＬＲＭＰの核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００６１５２．３、ＮＭ＿００１２０４１２７．１、ＮＭ＿００１２０４１２６．１、ＸＭ＿００６７１９０７６．２、ＸＭ＿０１１５２０６６８．１、ＸＭ＿０１１５２０６６９．１、ＸＭ＿００５２５３３７４．２、およびＸＭ＿０１１５２０６７０．１により、例示的なヒトＬＲＭＰ核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００６１４３．２、ＮＰ＿００１１９１０５６．１、ＸＰ＿０１１５１８９７１．１、ＸＰ＿０１１５１８９７２．１、Ｑ１２９１２．３、およびＮＰ＿００１１９１０５５．１により、例示的なヒトＬＲＭＰタンパク質配列が開示される。そのようなＬＲＭＰ配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＬＲＭＰ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００７２】
ＣＤ１０、アトリオペプチダーゼ（ａｔｒｉｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、共通急性リンパ球性白血病抗原、エンケファリナーゼ、ネプリライシン、および中性エンドペプチダーゼとしても公知の膜メタロ−エンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）（例えば、ＯＭＩＭ１２０５２０）は、ペプチドを疎水性残基のアミノ側で切断し、グルカゴン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ニューロテンシン、オキシトシン、およびブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｎｉｎ）を含めたいくつかのペプチドホルモンを不活性化する中性エンドペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．１１）である。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＭＭＥの核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿０００９０２．３、ＮＭ＿００７２８７．２、ＮＭ＿００７２８８．２、ＢＣ１４３４６５．１、およびＮＭ＿００７２８９．２により、例示的なヒトＭＭＥ核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＩ４３４６６．１、ＡＡＩ０１６５９．１、ＮＰ＿０００８９３．２、ＮＰ＿００９２１８．２、ＮＰ＿００９２１９．２、およびＮＰ＿００９２２０．２により、例示的なヒトＭＭＥタンパク質配列が開示される。そのようなＭＭＥ配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＭＭＥ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００７３】
マーリンとしても公知のニューロフィブロミン２（ＮＦ２）（例えば、ＯＭＩＭ６０７３７９）は、腫瘍抑制因子の特性を有する細胞骨格タンパク質である。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＮＦ２の核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿０００２６８．３、ＮＭ＿０１６４１８．５、ＮＭ＿１８１８２８．２、およびＮＭ＿１８１８３１．２により、例示的なヒトＮＦ２核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿０００２５９．１、ＮＰ＿０５７５０２．２、ＮＰ＿８６１９６６．１、およびＮＰ＿８６１９６９．１により、例示的なヒトＮＦ２タンパク質配列が開示される。そのようなＮＦ２配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＮＦ２  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００７４】
癌原遺伝子セリン／トレオニン−プロテインキナーゼＰｉｍ−１（ＰＩＭ１）（例えば、ＯＭＩＭ１６４９６０）は、サイトカインシグナル伝達に関与する癌原遺伝子である。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＰＩＭ１の核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１２４３１８６．１、Ｍ２４７７９．１、およびＮＭ＿００２６４８．３により、例示的なヒトＰＩＭ１核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１２３０１１５．１、ＮＰ＿００２６３９．１、およびＡＡＨ２０２２４．１により、例示的なヒトＰＩＭ１タンパク質配列が開示される。そのようなＰＩＭ１配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＰＩＭ１  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００７５】
ＣＤ４５とも称されるタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｃ（ＰＴＰＲＣ）（例えば、ＯＭＩＭ１５１４６０）は、Ｔ細胞およびＢ細胞抗原受容体シグナル伝達を調節する、造血細胞において発現する酵素（ＥＣ  ３．１．３．４８）である。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。この遺伝子は、３４エクソンを含有し、一次転写産物の３エクソンが代替的にスプライシングされて最大８種の異なる成熟ｍＲＮＡが生成され、そして翻訳後に８種の異なるタンパク質産物が生成される。これらの３エクソンは、ＲＡアイソフォーム、ＲＢアイソフォームおよびＲＣアイソフォームを生じる。ＰＴＰＲＣの核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００２８３８．４、ＮＭ＿０８０９２１．３、ＮＲ＿０５２０２１．１およびＮＭ＿００１２６７７９８．１により、例示的なヒトＰＴＰＲＣ核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００２８２９．３、ＮＰ＿５６３５７８．２、Ｐ０８５７５．２およびＮＰ＿００１２５４７２７．１により、例示的なヒトＰＴＰＲＣタンパク質配列が開示される。そのようなＰＴＰＲＣ配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＰＴＰＲＣ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００７６】
ｖ−ｒｅｌトリ細網内皮症ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＲＥＬ）（例えば、ＯＭＩＭ１６４９１０）は、Ｒｅｌ相同性ドメインを含有し、Ｂ細胞の生存および増殖において役割を果たす転写因子である。ＲＥＬ遺伝子はＤＬＢＣＬにおいて増幅または変異している。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＲＥＬの核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００２９０８．３、ＮＭ＿００１２９１７４６．１、およびＤＱ３１４８８８．１により、例示的なヒトＲＥＬ核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００２８９９．１、ＮＰ＿００１２７８６７５．１、およびＡＡＩ４３８８６．１により、例示的なヒトＲＥＬタンパク質配列が開示される。そのようなＲＥＬ配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＲＥＬ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００７７】
シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ３）（例えば、ＯＭＩＭ１０２５８２）は、腫瘍の遺伝的背景に応じて腫瘍形成性または腫瘍抑制因子の役割を有し得る転写活性化因子である。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＳＴＡＴ３の核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿１３９２７６．２、ＮＭ＿００３１５０．３、ＮＭ＿２１３６６２．１、およびＮＧ＿００７３７０．１により、例示的なヒトＳＴＡＴ３核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿６４４８０５．１、ＮＰ＿００３１４１．２、およびＮＰ＿９９８８２７．１により、例示的なヒトＳＴＡＴ３タンパク質配列が開示される。そのようなＳＴＡＴ３配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＳＴＡＴ３  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００７８】
ＣＤ３０としても公知の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー８（ＴＮＦＲＳＦ８）（例えば、ＯＭＩＭ１５３２４３）は、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞によって発現される。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＴＮＦＲＳＦ８の核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１２４３．４、ＸＭ＿０１１５４２４４２．１、ＸＭ＿０１１５４２４４４．１、ＸＭ＿０１１５４２４４３．１、およびＡＹ４９８８６０．１により、例示的なヒトＴＮＦＲＳＦ８核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１２３４．３、ＸＰ＿０１１５４０７４６．１、およびＮＰ＿００１２６８３５９．２により、例示的なヒトＴＮＦＲＳＦ８タンパク質配列が開示される。そのようなＴＮＦＲＳＦ８配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＴＮＦＲＳＦ８  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００７９】
チミジル酸シンテターゼ（ＴＹＭＳ）（例えば、ＯＭＩＭ１８８３５０）は、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）のデオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）への変換を触媒する酵素（ＥＣ  ２．１．１．４５）である。この遺伝子について、転写物バリアント（例えば、代替的にスプライシングされた転写物）が同定されている。ＴＹＭＳの核酸配列およびタンパク質配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１０７１．２およびＮＧ＿０２８２５５．１により、例示的なヒトＴＹＭＳ核酸配列が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１０６２．１、ＥＡＸ０１７１６．１、およびＥＡＸ０１７１７．１により、例示的なヒトＴＹＭＳタンパク質配列が開示される。そのようなＴＹＭＳ配列のバリアント、例えば、ＤＬＢＣＬにおいて（例えば、ＡＢＣおよび／またはＧＣＢにおいて）発現が変化するもの、例えば、本明細書において提供される任意のＴＹＭＳ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を、ＤＬＢＣＬを分類するために使用することができることが当業者には理解されよう。
【００８０】
ＤＬＢＣＬを亜型決定するために有用な具体的な実施形態は、限定することなく、以下：
ａ．ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの１種または複数（例えば、少なくともまたはそれに固定して、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種）；
ｂ．ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの全て；
ｃ．ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの１種または複数（例えば、少なくともまたはそれに固定して、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、または１６種）；
ｄ．ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの１種または複数（例えば、少なくともまたはそれに固定して、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種）；
ｅ．ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ、およびＲＥＬの１種または複数（例えば、少なくともまたはそれに固定して、２種、３種、４種、５種、または６種）；
ｆ．以下の２種の遺伝子の組み合わせの任意の１つまたは任意の２つ（重複しない範囲で）を含む、またはそれからなる任意の遺伝子セット：｛ＣＤ４７、ＣＤ８６｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝；
ｇ．以下の３種の遺伝子の組み合わせの任意の１つまたは任意の２つ（重複しない範囲で）を含む、またはそれからなる任意の遺伝子セット：｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ；
ｈ．以下の４種の遺伝子の組み合わせの任意の１つまたは任意の２つ（重複しない範囲で）を含む、またはそれからなる任意の遺伝子セット：｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝；
ｉ．以下の２種の遺伝子の組み合わせの任意の１つまたは任意の２つ（重複しない範囲で）を含む、またはそれからなる任意の遺伝子セット：｛ＣＤ４７、ＣＤ８６｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６｝｛ＣＤ４７、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ４７、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ４７、ＭＭＥ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６｝｛ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ８６、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ８６、ＭＭＥ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＭＭＥ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＮＦ２｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＩＭ１｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＲＥＬ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ｝｛ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ｝｛ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ｝｛ＦＯＸＰ１、ＮＦ２｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＩＭ１｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＯＸＰ１、ＲＥＬ｝｛ＦＯＸＰ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＯＸＰ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６｝｛ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ｝｛ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ｝｛ＦＵＴ８、ＭＭＥ｝｛ＦＵＴ８、ＮＦ２｝｛ＦＵＴ８、ＰＩＭ１｝｛ＦＵＴ８、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＵＴ８、ＲＥＬ｝｛ＦＵＴ８、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＵＴ８、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＵＴ８、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ｝｛ＩＬ１６、ＬＲＭＰ｝｛ＩＬ１６、ＭＭＥ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＴＹＭＳ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＲＥＬ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＴＰＫＢ、ＴＹＭＳ｝｛ＬＲＭＰ、ＭＭＥ｝｛ＬＲＭＰ、ＮＦ２｝｛ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１｝｛ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＬＲＭＰ、ＲＥＬ｝｛ＬＲＭＰ、ＳＴＡＴ３｝｛ＬＲＭＰ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＬＲＭＰ、ＴＹＭＳ｝｛ＭＭＥ、ＮＦ２｝｛ＭＭＥ、ＰＩＭ１｝｛ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＭＭＥ、ＲＥＬ｝｛ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３｝｛ＭＭＥ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＭＭＥ、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝；ならびに
ｊ．以下の３種の遺伝子の組み合わせの任意の１つまたは任意の２つ（重複しない範囲で）を含む、またはそれからなる任意の遺伝子セット：｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＦＵＴ８｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＭＭＥ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＭＭＥ｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＦＯＸＰ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＩＬ１６｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＭＭＥ｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＦＵＴ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＭＭＥ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＩＬ１６、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ４７、ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ｝｛ＣＤ４７、ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＩＴＰＫＢ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＩＴＰＫＢ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＩＴＰＫＢ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ｝｛ＣＤ４７、ＬＲＭＰ、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＬＲＭＰ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＬＲＭＰ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＬＲＭＰ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＬＲＭＰ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＭＭＥ、ＮＦ２｝｛ＣＤ４７、ＭＭＥ、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＭＭＥ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＭＭＥ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＭＭＥ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ４７、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ４７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＭＭＥ｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＮＦ２｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＮＦ２｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＦＯＸＰ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＩＬ１６｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＭＭＥ｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＮＦ２｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＦＵＴ８、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＭＭＥ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ｝｛ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ｝｛ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２｝｛ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ｝｛ＣＤ８６、ＬＲＭＰ、ＮＦ２｝｛ＣＤ８６、ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＬＲＭＰ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＬＲＭＰ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＬＲＭＰ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＬＲＭＰ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＭＭＥ、ＮＦ２｝｛ＣＤ８６、ＭＭＥ、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＭＭＥ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＭＭＥ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＭＭＥ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＣＤ８６、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＣＤ８６、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＮＦ２｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＰＩＭ１｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＲＥＬ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＭＭＥ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＮＦ２｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＰＩＭ１｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＰＴＰＲＣ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＲＥＬ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＦＵＴ８、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６、ＬＲＭＰ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６、ＭＭＥ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６、ＮＦ２｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６、ＰＩＭ１｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６、ＲＥＬ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＬ１６、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ、ＲＥＬ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＩＴＰＫＢ、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ、ＮＦ２｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ、ＲＥＬ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＬＲＭＰ、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＭＭＥ、ＮＦ２｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＭＭＥ、ＰＩＭ１｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＭＭＥ、ＲＥＬ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＭＭＥ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＭＭＥ、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＥＮＴＰＤ１、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＭＭＥ｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＮＦ２｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＰＩＭ１｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＲＥＬ｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６、ＬＲＭＰ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６、ＭＭＥ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６、ＮＦ２｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６、ＰＩＭ１｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６、ＲＥ
Ｌ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＬ１６、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ、ＲＥＬ｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＩＴＰＫＢ、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ｝｛ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ、ＮＦ２｝｛ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１｝｛ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ、ＲＥＬ｝｛ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＬＲＭＰ、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ、ＮＦ２｝｛ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ、ＰＩＭ１｝｛ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ、ＲＥＬ｝｛ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＭＭＥ、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＦＯＸＰ１、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＯＸＰ１、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＦＯＸＰ１、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＯＸＰ１、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＯＸＰ１、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＯＸＰ１、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＦＯＸＰ１、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＬＲＭＰ｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＭＭＥ｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＮＦ２｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＰＩＭ１｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＲＥＬ｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ｝｛ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ｝｛ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２｝｛ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１｝｛ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ、ＲＥＬ｝｛ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＵＴ８、ＩＴＰＫＢ、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ｝｛ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ、ＮＦ２｝｛ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１｝｛ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ、ＲＥＬ｝｛ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＵＴ８、ＬＲＭＰ、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＭＭＥ、ＮＦ２｝｛ＦＵＴ８、ＭＭＥ、ＰＩＭ１｝｛ＦＵＴ８、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＵＴ８、ＭＭＥ、ＲＥＬ｝｛ＦＵＴ８、ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＵＴ８、ＭＭＥ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＵＴ８、ＭＭＥ、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＦＵＴ８、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＵＴ８、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＦＵＴ８、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＵＴ８、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＵＴ８、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＦＵＴ８、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＦＵＴ８、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＵＴ８、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＵＴ８、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＦＵＴ８、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＵＴ８、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＵＴ８、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＦＵＴ８、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＵＴ８、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＦＵＴ８、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＦＵＴ８、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ｝｛ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ｝｛ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２｝｛ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１｝｛ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ｝｛ＩＬ１６、ＬＲＭＰ、ＮＦ２｝｛ＩＬ１６、ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１｝｛ＩＬ１６、ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＬ１６、ＬＲＭＰ、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＬＲＭＰ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＬＲＭＰ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＬＲＭＰ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＭＭＥ、ＮＦ２｝｛ＩＬ１６、ＭＭＥ、ＰＩＭ１｝｛ＩＬ１６、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＬ１６、ＭＭＥ、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＭＭＥ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＭＭＥ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＬ１６、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＩＬ１６、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＮＦ２｝｛ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１｝｛ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＲＥＬ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ、ＮＦ２｝｛ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ、ＰＩＭ１｝｛ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ、ＲＥＬ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＴＰＫＢ、ＭＭＥ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＴＰＫＢ、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＴＰＫＢ、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＩＴＰＫＢ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＴＰＫＢ、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＩＴＰＫＢ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２｝｛ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＰＩＭ１｝｛ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ｝｛ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＲＥＬ｝｛ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３｝｛ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＴＹＭＳ｝｛ＬＲＭＰ、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＬＲＭＰ、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＬＲＭＰ、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＬＲＭＰ、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＬＲＭＰ、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＬＲＭＰ、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＬＲＭＰ、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＬＲＭＰ、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＬＲＭＰ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＬＲＭＰ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＬＲＭＰ、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＬＲＭＰ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＬＲＭＰ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＬＲＭＰ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１｝｛ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ｝｛ＭＭＥ、ＮＦ２、ＲＥＬ｝｛ＭＭＥ、ＮＦ２、ＳＴＡＴ３｝｛ＭＭＥ、ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＭＭＥ、ＮＦ２、ＴＹＭＳ｝｛ＭＭＥ、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＭＭＥ、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＭＭＥ、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＭＭＥ、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＭＭＥ、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＭＭＥ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＭＭＥ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＭＭＥ、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＭＭＥ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＭＭＥ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＲＥＬ｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＮＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＮＦ２、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＰＩＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＰＴＰＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＰＴＰＲＣ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８｝｛ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＹＭＳ｝｛ＲＥＬ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝｛ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＹＭＳ｝
の発現を決定または測定することを含む。
【００８１】
ＩＩＩ．遺伝子発現情報の入手
遺伝子発現は、生物体のゲノム内の遺伝した情報（例えば、遺伝子；ＤＮＡ領域）が具体的な機能的産物（時には遺伝子産物と呼ばれる）に変換されるプロセスである。遺伝子産物としては、ＲＮＡ（リボ核酸）およびタンパク質が挙げられる。特定の生体試料中の遺伝子発現は、そのような試料中のＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡなど）またはタンパク質を含めた遺伝子産物の発現を検出することによって測定することができる。一部の例では、遺伝子発現を、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に結合する１種または複数のプローブについて配列決定することによって測定する。
【００８２】
目的の試料中の遺伝子発現を測定するための様々な技法が利用可能である（または利用可能になり得る）。しかし、本開示は、遺伝子発現を得る、測定する、または検出する、特定の方法に限定されない。そのような技法の多くは、そのような試料中で発現する遺伝子の産物（例えば、核酸（ＲＮＡなど）および／またはタンパク質）を検出することを伴う。遺伝子の活性または染色体ＤＮＡの活性（例えば、転写速度）を、それによりもたらされる遺伝子産物の測定とは独立して直接検出することも可能であり得（または可能になり得）、そのような技法も、本明細書に開示されている方法において有用である。
【００８３】
ＤＬＢＣＬ亜型の決定に遺伝子発現を利用することができる。例えば、２種またはそれより多い遺伝子（２種またはそれより多いＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子など）の遺伝子発現を、ＤＬＢＣＬ腫瘍がＧＣＢ亜型のものであるか非ＧＣＢ（例えば、ＡＢＣ）亜型のものであるか、または未分類であるかを決定することに利用する。一部の実施形態では、ＤＬＢＣＬシグネチャーは、（１）ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種もしくはそれより多く、または（２）ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種もしくはそれより多く（例えば、全て）を含む。ＤＬＢＣＬマーカー（複数可）の他の具体的な例としては、ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種もしくはそれより多く（２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種など）（ＡＢＣ分類に関連付けられる）、またはＣＤ８６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣ、およびＲＥＬの２種もしくはそれより多く（２種、３種、４種、５種、または６種など）（ＧＣＢ分類に関連付けられる）が挙げられる。
【００８４】
Ａ．核酸遺伝子産物の検出
核酸遺伝子産物は、名称が示す通り、核酸である遺伝子発現の産物である。例示的な核酸としては、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｃＤＮＡ、タンパク質コードＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）または非コードＲＮＡ（例えば、長い、非コード（ｌｎｃ）ＲＮＡ）が挙げられる。ＲＮＡまたはＤＮＡの相補鎖間の塩基対合（すなわち、核酸ハイブリダイゼーション）により、核酸遺伝子産物を検出するための技法の大きな代表的なクラスについて基礎の全部または一部が形成される。他の代表的な検出技法は、核酸配列決定を伴い、これは、ハイブリダイゼーションステップおよび／またはバイオインフォマティクスステップ（例えば、核酸配列情報をその対応する遺伝子に関連付けるため）を伴っても伴わなくてもよい。これらおよび他の核酸を検出する方法は、当技術分野で公知であり、代表的な技法が本明細書に記載されているが、本開示は特定の核酸検出方法に限定されない。
【００８５】
１．任意選択の核酸単離
一部の例では、核酸を、試料中のそのような核酸を相補的な核酸プローブもしくはプライマーと接触させ、かつ／または他の様式で試料中のそのような核酸を検出する前に、試験試料から単離または抽出する。核酸（ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ）またはＤＮＡなど）は、いくつかの方法のいずれかに従って試料から単離することができる。核酸を単離および精製する代表的な方法は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｐａｒｔ  Ｉ．  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３年）の第３章およびＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐａｒｔ  Ｉ．  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３年）の第３章に詳しく記載されている。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ）抽出の代表的な方法も同様に当技術分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７年）を含めた分子生物学の標準的な教本に開示されている。
【００８６】
核酸（例えば、ＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡなど）またはＤＮＡ）を試料から単離または抽出した後、単離された核酸の濃度の測定、分解されたもしくは損傷を受けたＲＮＡの修復（または回復）、ＲＮＡ逆転写、および／またはＲＮＡもしくはＤＮＡの増幅を含めた、いくつかの任意選択の他のステップのいずれかを実施して、そのような核酸を検出のために調製することができる。
【００８７】
他の例では、試料（例えば、ＦＦＰＥ組織試料）を緩衝液（例えば、溶解緩衝液）に懸濁させ、懸濁試料中に存在する核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）をそのような懸濁試料から単離または抽出（例えば、全体的にまたは部分的に精製）せずにそのような懸濁物中で１種または複数の相補的な核酸プローブ（例えば、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ）と接触させ、それにより、試料から核酸（例えば、ＲＮＡ）を単離または抽出する必要性を排除する。この実施形態は、懸濁試料中に存在する核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）が細胞構造に架橋結合するかまたは固定されており、容易に単離可能または抽出可能ではない場合に特に有利である。一部の非抽出方法の実施形態では、比較的短い（例えば、１００塩基対未満、例えば、７５〜２５塩基対または５０〜２５塩基対）検出用プローブが有用である。試料中の核酸（例えば、ＲＮＡ）を、そのような核酸を事前に抽出せずに検出するための具体的な方法（例えば、ｑＮＰＡおよびｑＮＰＳ）が本明細書に記載されている。
【００８８】
２．核酸ハイブリダイゼーション
一部の例では、本明細書において提供される方法において、２種またはそれより多い開示されているＤＬＢＣＬバイオマーカー（表１のＤＬＢＣＬバイオマーカーの２種またはそれより多くなど）の発現レベルを決定することは、試料を、それぞれが表１のバイオマーカーに特異的でありそれと相補的である複数の核酸プローブ（ＮＰＰまたはＮＰＰＦ＋ＣＦＳなど）または増幅プライマーの対と、複数の核酸プローブまたはプライマーの対が、表１の、それ／それらの相補的なバイオマーカーとハイブリダイズすることが可能になる条件下で接触させることを含んでよい。一例では、方法は、試料を複数の核酸プローブ（ＮＰＰまたはＮＰＰＦ＋ＣＦＳなど）と接触させた後、試料を、一本鎖核酸分子を消化するヌクレアーゼと接触させることも含んでよい。他の例では、表２の少なくとも２種のバイオマーカーのそれぞれを、そのようなバイオマーカーのそれぞれに特異的な多数の（例えば、少なくとも２種、少なくとも５種、または少なくとも１０種のプローブ、例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種の）プローブ（例えば、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ）からなる「タイル状プローブ」と接触させ、この設計は、例えば、そのような遺伝子産物から得られるシグナルを増大させるため、または同じ遺伝子産物の多数のバリアントを検出するために有用であり得る。例えば、タイル状プローブセット内の各プローブは、標的核酸分子の異なる領域に結合し得る（またはわずかに重複する）。
【００８９】
一部の例では、核酸を、核酸ハイブリダイゼーションによって検出する。核酸ハイブリダイゼーションは、プローブおよび標的核酸（例えば、表１の標的核酸のうちの少なくとも２種）を、プローブと、その相補的な標的が、相補的な塩基対合によって安定なハイブリッド２重鎖を形成することが可能な条件下で提供することを伴う。一部の例では、次いで、ハイブリッド２重鎖を形成していない核酸を除去し（例えば、洗い流すか、ヌクレアーゼによって消化するかまたは物理的に除去し）、ハイブリダイズした核酸は、例えば、（直接的または間接的に）付着させた検出可能な標識の検出によって検出されるように残す。具体的な例では、ハイブリッド２重鎖を形成していない核酸、例えば、そのそれぞれの標的とハイブリダイズしない任意の過剰なプローブ、および標的配列のプローブと相補的ではない領域を、ヌクレアーゼを添加することによって消化し、相補的なプローブの標的配列のハイブリッド２重鎖だけを残すことができる。
【００９０】
核酸を含有する緩衝液の温度を上昇させることおよび／または塩濃度を低下させることにより核酸が変性することが一般に認識されている。低ストリンジェンシー条件下（例えば、低温および／または高塩濃度）では、アニーリングされる配列が完全に相補的でない場合であってもハイブリッド２重鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ）が形成される。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低いストリンジェンシーでは低下する。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高い温度またはより低い塩濃度）では、上首尾のハイブリダイゼーションにはミスマッチがより少ないことが必要になる。種々の程度のストリンジェンシーがもたらされるようにハイブリダイゼーション条件を設計できることが当業者には理解されよう。プローブ内に非天然塩基を含めることによって、例えば、ロックド核酸またはペプチド核酸を含めることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを低下させることなくハイブリダイゼーションの強度を増加させることができ、したがって、高ストリンジェンシー緩衝液におけるハイブリダイゼーションの特異性を維持することができる。
【００９１】
これらの方法によって検出される核酸の発現および／または核酸の存在の変化としては、例えば、そのような核酸のレベル（量）もしくは機能活性の、それらの発現もしくはタンパク質への翻訳の、またはそれらの局在化もしくは安定性の増大もしくは低減を挙げることができる。例えば、正規化バイオマーカーと比較した増大または低減は、例えば、少なくとも１倍、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、例えば、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍の、表１に示されているバイオマーカーに対応する核酸などの特定の核酸の発現および／または存在の変化（増大または低減）であり得る。
【００９２】
一例では、多重化された方法体系を使用して遺伝子発現を測定する。そのような方法では、単一の試料において複数の測定（例えば、遺伝子発現測定）を行うことができる。単一の試料における多数の遺伝子のモニタリングを可能にする種々の技術が発展してきた（例えば、従来のマイクロアレイ、多重化ＰＣＲ、遺伝子発現連鎖分析（ＳＡＧＥ；例えば、米国特許第５，８６６，３３０号）、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、ハイスループットな配列決定、標識されたビーズに基づく技術（例えば、米国特許第５，７３６，３３０号および同第６，４４９，５６２号）、デジタル分子バーコード化技術（例えば、米国特許第７，４７３，７６７号）。
【００９３】
アレイは、遺伝子発現の多重検出のためのツールのセットの１つである。アレイは、値（例えば、遺伝子発現値）のセットを同定の鍵と関連付けることができる、エレメント（例えば、分析物捕捉試薬（標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ、アプタマー、または抗体など））の系統的な配置である。整列されたエレメントは、別々に同定可能な表面（例えば、フローチャネルまたはビーズ）を使用して、またはその組み合わせによって、単一の表面上で系統的に同定することができる（例えば、空間的マッピングによってまたは示差的なタグ付けによって）。
【００９４】
他の有用な実施形態は、多数の試料を一度に照会することができる、ハイスループットな方法体系を伴う。ハイスループットな多重化実施形態（複数の試料中の複数の遺伝子の発現を同時に測定すること）も意図されている。開示されているバイオマーカーを検出するために使用することができる方法およびアッセイ系の例は、ハイスループットなアッセイ技法が記載されている限りは参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２００３／００２７５０号および同第ＷＯ２００８／１２１９２７号、同第ＷＯ１９９９／０３２６６３号、同第ＷＯ２０００／０７９００８号、同第ＷＯ／２０００／０３７６８４号、および同第ＷＯ２０００／０３７６８３号ならびに米国特許第６，２３２，０６６号、同第６，４５８，５３３号、同第６，２３８，８６９号、および同第７，６５９，０６３号に開示されているハイスループットなアッセイ技法である。
【００９５】
一部のアレイの実施形態では、２種またはそれより多い、表１に示されている遺伝子の産物を捕捉（直接的または間接的に）するために設計された目的の核酸配列（オリゴヌクレオチドなど）をマイクロチップ基材上にプレーティングするかまたは整列させる。例えば、アレイは、表２に示されている遺伝子のうちの少なくとも２種（表１に示されている遺伝子のうちの少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１６種全てなど）に対して十分な相補性を有するオリゴヌクレオチドを含んでよい。他の例では、アレイは、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのうちの少なくとも２種、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８の２種またはそれより多く、例えば、表１に示されている遺伝子のうちの少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、または１６種全ての産物と相補的な部分を有するヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の一部分と相補的なオリゴヌクレオチドを含んでよい。
【００９６】
次いで、整列させた配列を、試験試料（例えば、ＡＢＣまたはＧＣＢとしての特徴付けが望まれる対象から得たＤＬＢＣＬ試料）に由来するｃＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）などの核酸とハイブリダイズさせる。一例では、試験試料由来の核酸（単離することができる）を標識し、その結果、それらと、アレイ上の特異的な相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを決定することができる。あるいは、試験試料核酸を標識せず、例えば、標識された、標的と相補的な追加的なオリゴヌクレオチドを使用したサンドイッチアッセイを使用してアレイ上のオリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する。
【００９７】
一実施形態では、試料核酸に付着させたまたは標的核酸と直接的もしくは間接的にハイブリダイズする核酸プローブに付着させた１種または複数の標識を検出することによって、ハイブリダイズした核酸を検出する。標識は、いくつかの方法のいずれかによって組み入れることができる。一例では、試料核酸の調製における増幅ステップの間に標識を同時に組み入れる。したがって、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、標識された増幅産物がもたらされる。一実施形態では、標識されたヌクレオチド（フルオレセインで標識されたＵＴＰおよび／またはＣＴＰなど）を使用した転写増幅により、転写される核酸に標識が組み入れられる。
【００９８】
開示されている方法（例えば、核酸またはタンパク質の検出または配列決定のための）のいずれかにおける使用に適した検出可能な標識としては、別の分子（核酸分子またはヌクレオチドなど）と、その分子の検出を容易にするために直接的または間接的にコンジュゲートした、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の化合物または組成物が挙げられる。標識の非限定的な例としては、蛍光および蛍光発生部分、色素形成部分、ハプテン、アフィニティータグ、酵素、ならびに放射性同位元素が挙げられる。有用な標識としては、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートを用いた染色用のビオチン、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡに一般に使用される他のもの）、およびコロイド金または色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色標識が挙げられる。そのような標識の使用が教示されている特許として、米国特許第３，８１７，８３７号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，９３９，３５０号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，２７７，４３７号；米国特許第４，２７５，１４９号；および米国特許第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【００９９】
そのような標識を検出する手段も周知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、放出された光を検出する光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、一般には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって生成される反応産物を検出することによって検出され、比色標識は、単に呈色した標識を可視化することによって検出される。
【０１００】
標識は、ハイブリダイゼーションの前に、またはその後に標的（試料）核酸（複数可）に付加することができる。いわゆる「直接標識」は、ハイブリダイゼーション前に標的（試料）核酸に直接付着させるまたは組み入れる、検出可能な標識である。対照的に、いわゆる「間接標識」は、ハイブリダイゼーション後にハイブリッド２重鎖に接合させる。多くの場合、間接標識は、ハイブリダイゼーション前に標的核酸に付着させた結合性部分に付着させる。したがって、例えば、標的核酸を、ハイブリダイゼーション前にビオチン化することができる。ハイブリダイゼーション後、アビジンとコンジュゲートしたフルオロフォアは、ビオチンを有するハイブリッド２重鎖に結合し、これは、容易に検出される標識を提供する（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４巻：  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９３年を参照されたい）。
【０１０１】
色素形成ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）および銀ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）などのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、目的の遺伝子（表１の遺伝子のうちの少なくとも２種など）の発現を検出し、比較するための例示的な方法である。ＩＳＨは、相補的な核酸を使用して１種または複数の特異的な核酸配列を組織（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の一部分もしくは切片に、または、組織が十分に小さな場合には組織全体（ホールマウントＩＳＨ）に局在化させる、ハイブリダイゼーションの一種である。ＲＮＡ  ＩＳＨを使用して、表１のバイオマーカーの発現など、組織における発現パターンをアッセイすることができる。ＤＮＡ  ＩＳＨ（ＣＩＳＨおよびＳＩＳＨなど）を使用して、核酸をゲノムレベルで検出することができる。
【０１０２】
試料細胞または組織を、表１のバイオマーカーに特異的なプローブなどのプローブの細胞への侵入を可能にするそれらの透過性が増大するように処理する。処理した細胞にプローブを添加し、適切な温度でハイブリダイズさせ、過剰なプローブを洗い流す。相補的なプローブは、放射性タグ、蛍光タグまたは抗原性タグなどの検出可能な標識で標識することができ、したがって、例えば、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡またはイムノアッセイを使用して組織内のプローブの位置および数量を決定することができる。
【０１０３】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲは、ＩＳＨ前の、標的核酸配列のＰＣＲに基づく増幅である。ＲＮＡの検出に関しては、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの前に細胞内逆転写ステップを導入してＲＮＡ鋳型から相補ＤＮＡを生成する。これにより、低コピーＲＮＡ配列の検出が可能になる。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの前に、細胞または組織試料を固定し、透過処理して形態を保存し、増幅する細胞内配列へのＰＣＲ試薬の接近を可能にする。次に、標的配列のＰＣＲ増幅を、懸濁物中に保持されたインタクトな細胞において、または直接ガラススライド上の細胞遠心調製物もしくは組織切片において実施する。前者の手法では、ＰＣＲ反応混合物に懸濁させた固定細胞を、従来のサーマルサイクラーを使用して熱サイクルにかける。ＰＣＲの後、細胞をガラススライド上で細胞遠心し、それと共に、細胞内ＰＣＲ産物をＩＳＨまたは免疫組織化学によって可視化する。カバーガラスの下、ＰＣＲ混合物で試料の表面を覆い、次いでそれを密閉して反応混合物の蒸発を防止することにより、ガラススライド上でのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲを実施する。熱サイクルは、ガラススライドを従来のもしくは特別に設計されたサーマルサイクラーの加熱ブロックの上部に直接置くことによって、または熱サイクルオーブンを使用することによって達成される。
【０１０４】
細胞内ＰＣＲ産物の検出は、一般に、２種の異なる技法、ＰＣＲ産物特異的プローブを用いたＩＳＨによる間接ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、または、熱サイクルの間にＰＣＲ産物中に組み入れられた標識されたヌクレオチド（ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、３Ｈ−ＣＴＰまたはビオチン−１６−ｄＵＴＰなど）を直接検出することによる、ＩＳＨを伴わない直接ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、の一方により達成される。
【０１０５】
３．核酸の増幅
一部の例では、標的核酸分子（核酸遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ）など）を、それらを検出するための手段として（またはそれらの検出におけるステップとして）増幅する。一部の例では、増幅の間に、例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用することによって核酸発現レベルを決定する。したがって、増幅方法および適切なプライマーを使用して試料中の表１のＤＬＢＣＬバイオマーカーの１種または複数を検出することができる（例えば、定量的に）。
【０１０６】
使用することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法の例としては、これだけに限定されないが、定量的リアルタイムＰＣＲ、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ、鎖置換増幅；無転写等温増幅；修復鎖反応増幅；リガーゼ連鎖反応増幅；ギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅；カップリングしたリガーゼ検出およびＰＣＲおよびＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ無転写増幅が挙げられる。一例では、ライゲーションに基づく増幅方法を使用する。
【０１０７】
４．ＲＮＡ配列決定
ＲＮＡ配列決定を使用して、多重化され、かつ一部の実施形態ではハイスループットな、遺伝子発現情報、例えば、表１のマーカーの発現に関する情報を得ることができる。ＲＮＡ配列決定の方法は公知である（例えば、ＣｈｕおよびＣｏｒｅｙ、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２２巻：２７１頁（２０１２年）を参照されたい）。全トランスクリプトーム配列決定および標的化ＲＮＡ配列決定技法のそれぞれが、開示されている方法において利用可能であり、有用である。配列決定に基づく遺伝子発現分析のための代表的な方法としては、遺伝子発現連鎖分析（ＳＡＧＥ）、大規模並列処理シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定（別称、ＷＴＳＳまたはＲＮＡ−Ｓｅｑ）、またはヌクレアーゼ保護配列決定（別称、ｑＮＰＳまたはＮＰＳｅｑ；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／１５１１１１号参照；以下でより詳細に考察されている）が挙げられる。
【０１０８】
５．定量的ヌクレアーゼ保護アッセイ（ｑＮＰＡ）
一部の例では、試料中の、発現を測定しようとする核酸分子を、例えば、全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ９９／０３２６６３号；同第ＷＯ００／０３７６８３号；同第ＷＯ００／０３７６８４号；同第ＷＯ００／０７９００８号；同第ＷＯ０３／００２７５０号；同第ＷＯ０８／１２１９２７号；および同第ＷＯ２０１２／１５１１１１号ならびに米国特許第６，２３８，８６９号；同第６，４５８，５３３号；同第７，６５９，０６３号、および同第８，７４１，５６４号に記載されている通り、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイを利用して試料中で検出する。Ｍａｒｔｅｌら、Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．、２００２年、１巻（１−１号）：６１〜７１頁；Ｍａｒｔｅｌら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ、２００２年、３巻：３５〜４３頁；Ｍａｒｔｅｌら、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｑ．  ＬｕおよびＭ．  Ｗｅｉｎｅｒ編、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｃｋ（２００２年）；Ｓｅｌｉｇｍａｎｎ  ＰｈａｒｍａｃｏＧｅｎｏｍｉｃｓ、２００３年、３巻：３６〜４３頁；Ｍａｒｔｅｌら、「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」中の「Ａｒｒａｙ  Ｆｏｒｍａｔｓ」、Ｕ．Ｒ．  ＭｕｌｌｅｒおよびＤ．  Ｎｉｃｏｌａｕ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２００５年）；Ｓａｗａｄａら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、２０巻：１５０６〜１５１３頁、２００６年；Ｂａｋｉｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．  ＆  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ、１７巻：３４７３〜３４７９頁、２００７年；Ｋｒｉｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１４４巻：１２５６〜１２６６頁、２００７年；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、８７巻：９７９〜９９７頁、２００７年；Ｒｉｍｓｚａら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年１０月１５日、１１２巻（８号）：３４２５〜３４３３頁；Ｐｅｃｈｈｏｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻：１０３８〜１０４２頁、２００９年も参照されたい。これらの全てが参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０１０９】
ｑＮＰＡ法を使用して、ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）を標的配列（表１の配列など）にハイブリダイズさせ、その後、試料を、一本鎖核酸分子を消化するヌクレアーゼと一緒にインキュベートする。したがって、ＮＰＰが検出された場合には（例えば、ヌクレアーゼによって消化されない）、プローブの標的、例えば、表１に示されている標的核酸が試料中に存在し、この存在を定量化することができる。ＮＰＰを個々の標的に対して設計し、同定（例えば、アレイ上での（ｑＮＰＡと称される）または配列決定による（ｑＮＰＳと称される））のためのカクテルとしてアッセイに添加することができる。したがって、多数の遺伝子標的を同じアッセイおよび／またはアレイ内で測定することができる（例えば、多数のＮＰＰを使用することによって）。
【０１１０】
ＮＰＰは、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に対して、標的核酸と特異的にハイブリダイズすることを可能にする十分な相補性を有する核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）である。ＮＰＰにより、相補的な標的核酸分子が一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼなどのヌクレアーゼによる切断から保護される。一部の例では、ＮＰＰは、少なくとも３５ヌクレオチド（４０〜８０または５０〜１５０ヌクレオチドなど）であり、標的核酸分子と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の相補性を共有する。ＮＰＰは、非天然塩基を含み得る。一部の例では、開示されている方法を使用して、試料中のいくつかの異なる標的核酸分子（表１に列挙されているものなど）を複数のＮＰＰ（ＮＰＰＦなど、以下を参照されたい）を使用して検出（または配列決定）し、ここで、各ＮＰＰ（またはＮＰＰＦ）は特定の標的核酸分子に特異的に結合する。
【０１１１】
具体的な例では、ＮＰＰは、５’末端および／または３’末端に１つまたは複数の隣接配列をさらに含み、ＮＰＰＦと称される（Ｕ．Ｓ．８，７４１，５６４参照）。ＮＰＰＦは、標的核酸分子の全部または一部分と相補的な配列を含み、したがって、標的核酸分子とＮＰＰＦの間の特異的な結合またはハイブリダイゼーションが可能になる。例えば、標的核酸分子の領域と相補的なＮＰＰＦの領域は、高い特異性を有する標的核酸分子の領域と結合するまたはハイブリダイズする（また、一部の例では、二機能性リンカーの領域にも結合し得る）。標的核酸分子の領域と相補的なＮＰＰＦの部分は、少なくとも６ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも１０、少なくとも２５、または少なくとも６０、例えば、６〜６０ヌクレオチドの長さであり得る。ＮＰＰＦは、ＮＰＰＦの５’末端および／または３’末端に１つまたは複数の隣接配列をさらに含む。したがって、１つまたは複数の隣接配列は、標的核酸分子と相補的な配列に対して５’側、３’側、またはその両方に位置する。一部の例では、ＮＰＰＦが５’末端と３’末端の両方に隣接配列を含む場合、各ＮＰＰＦの配列は異なり、相補的ではない。隣接配列（複数可）は、試料中に存在する核酸分子には見いだされない配列（例えば、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、例えば、１２〜５０ヌクレオチドの配列）を有するいくつかの連続したヌクレオチドを含み、ユニバーサルハイブリダイゼーションおよび／または増幅配列をもたらす。このユニバーサルハイブリダイゼーションおよび／または増幅配列が増幅プライマーの少なくとも一部分と相補的な配列を有する場合、同じ増幅プライマーを使用して異なる標的核酸分子に特異的なＮＰＰＦを増幅することができるので、多重化が可能になる。それにより、検出可能な標識をＮＰＰＦに付加するため、またはＮＰＰＦを捕捉し濃縮するために使用することができる全てのＮＰＰＦに対するユニバーサルハイブリダイゼーション配列ももたらされる。例えば、異なる標的核酸分子に特異的なＮＰＰＦ上に同じ隣接配列が存在する場合、ＮＰＰＦが異なる核酸分子を標的とするものであっても、同じ隣接配列を有する任意のＮＰＰＦを増幅するために同じプライマーを使用することができる。例えば、隣接配列を使用して、ＮＰＰＦを、例えば表面上に捕捉することができる。隣接配列は、特異的なＮＰＰＦそれぞれに対して特異的な配列などの可変配列を含有していてもよく、表面上のそのＮＰＰＦを捕捉するため、または他の目的、例えば、ＮＰＰＦを同定するために使用することができる。一部の例では、ＮＰＰＦは、少なくとも３５ヌクレオチド、例えば、４０〜８０または５０〜１５０ヌクレオチドである。一部の例では、ＮＰＰＦは、２つの隣接配列を含み、一方は５’末端にあり、他方は３’末端にある。一部の例では、５’末端にある隣接配列は、３’末端にある隣接配列とは異なる。さらに、ＮＰＰＦが２つの隣接配列を含む場合、２つの隣接配列は同様の融解温度（Ｔｍ）、例えば、＋／−５℃のＴｍを有することが理想的である。
【０１１２】
一部の実施形態では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦは、標的配列の全部または一部と特異的にハイブリダイズする、および／またはそれと相補的である。したがって、ＮＰＰおよびＮＰＰＦは、標的核酸分子と相補的な少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、またはそれより多い連続的ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、ＮＰＰおよびＮＰＰＦは、標的核酸分子と相補的な５００ヌクレオチド以下、例えば、４００個以下、３００個以下、２５０個以下、２００個以下、１００個以下、５０個以下、もしくはさらには２５個以下の連続的ヌクレオチド（例えば、標的核酸分子と相補的な１０〜５００ヌクレオチド、１０〜４００ヌクレオチド、１０〜２５０ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、２５〜７５ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、４０〜８０ヌクレオチド、１００〜２００ヌクレオチドなど）、または１０〜５０個の連続的ヌクレオチドである。特定の例では、ＮＰＰおよびＮＰＰＦは、本明細書に開示されている標的配列（例えば、表１のもの）などの標的核酸配列またはその一部分と相補的な、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも１０個の連続したヌクレオチドである。本開示の方法を実施するために使用することができる特定の長さのＮＰＰおよびＮＰＰＦは、標的核酸分子またはその一部分と相補的な少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、またはそれより多い連続したヌクレオチドを有するプローブを含む。一部の例では、ＮＰＰおよびＮＰＰＦは、標的配列の逆相補物に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％の配列同一性）を有する核酸配列を含む（またはＮＰＰはそれからなる）。一部の例では、ＮＰＰおよびＮＰＰＦは、標的核酸分子の逆相補物と比較して１カ所、２カ所、３カ所、またはそれより多いミスマッチを含み得る。
【０１１３】
一部の例では、ＮＰＰおよびＮＰＰＦは、１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれより多く）の合成塩基または代替塩基（イノシンなど）を含み得る。他の例では、ＮＰＰは、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドまたは核酸類似体、例えば、１つもしくは複数のロックド核酸（例えば、米国特許第６，７９４，４９９号を参照されたい）または１つもしくは複数のペプチド核酸を含み得る。修飾されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、合成または代替ヌクレオチドは、ＮＰＰまたはＮＰＰＦの１つまたは複数の位置（例えば、１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、またはそれより多い位置）に使用することができる。ＮＰＰおよびＮＰＰＦ、例えば、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ内の指定の位置にヌクレオチドの混合物（例えば、２、３、または４ヌクレオチド）を含むＮＰＰまたはＮＰＰＦはまた、１つまたは複数の位置（例えば、１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、またはそれより多い位置）において縮重していてもよい。
【０１１４】
一部の実施形態では、対象由来の試料（例えば、ＲＮＡなどの核酸を含む試料）を複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦと接触させることができ、ここで、ＮＰＰおよびＮＰＰＦの少なくとも一部は、少なくとも２種の異なる標的核酸分子（例えば、表１に示されているもの）に特異的に結合する。一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦは、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのうちの少なくとも２種（例えば、これらの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種全て）、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多く（例えば、これらの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、または１６種全て）に特異的に結合する。一部の実施形態では、対象由来の試料（例えば、ＲＮＡなどの核酸を含む試料）を、１種または複数のハウスキーパー／正規化遺伝子に特異的な１種または複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（例えば、ＡＮＴに特異的な１種または複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ）とも接触させる。
【０１１５】
一部の例では、複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦは、それぞれが単一の標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡの独特の領域に特異的な１種より多く（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、または１６種またはそれより多く）の異なるＮＰＰまたはＮＰＰＦを含む（例えば、表２のＮＰＰＦ配列の標的特異的部分を参照されたい）。複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦを試料と一緒に、ＮＰＰまたはＮＰＰＦがそれらのそれぞれの標的ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下でインキュベートする。ＮＰＰＦを使用する場合、方法は、試料を、隣接配列と相補的な配列（ＣＦＳ）を含む核酸分子（複数可）と、ＮＰＰＦの隣接配列（複数可）がＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下で接触させることを含む。試料を一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と接触させ、各ＮＰＰまたはＮＰＰＦの存在を検出（または配列決定）する。一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦを検出（または配列決定）の前に増幅する。ｍＲＮＡ（複数可）を、それらのそれぞれのＮＰＰ（複数可）またはＮＰＰＦ（複数可）が検出されたら、試料中に存在するものと同定し、かつ／または定量化する。
【０１１６】
ａ．試料の処理
一部の例では、対象に由来する試料（例えば、細胞または組織）をまず水溶液中で溶解させるまたは透過処理する（例えば、溶解緩衝液を使用して）。細胞を水溶液中で十分な期間（例えば、約１分〜約６０分、例えば、約５分〜約２０分、または約１０分）、十分な温度（例えば、約２２℃〜約１１５℃、例えば、約３７℃〜約１０５℃、または約９０℃〜約１１０℃）でインキュベートして、細胞を溶解させるまたは透過処理する。一部の例では、溶解を約９５℃で実施する。一部の例では、溶解ステップは、試料を約９５℃で約５〜１５分間インキュベートして、試料中のＲＮＡを変性させ、しかしゲノムＤＮＡは変性させないことを含む。他の例では、溶解ステップは、試料を約１０５℃で約５〜１５分間インキュベートして試料中の核酸を変性させることを含む。一例では、溶解緩衝液中にプロテイナーゼＫを含める。
【０１１７】
一部の例では、１種または複数の標的と相補的な１種または複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（配列番号１〜１６に示されている配列を含むまたは有するものなど）を、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｈ２ＰＯ４、ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくはこれらの組み合わせ（例えば、６×ＳＳＰＥ−Ｔ：０．９ＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含有するものなどの緩衝液または溶解緩衝液中約１０ｐＭ〜約１０ｎＭ（約３０ｐＭ〜５ｎＭ、約１００ｐＭ〜約１ｎＭなど）の範囲の濃度で試料に添加することができる。一例では、各ＮＰＰまたはＮＰＰＦを少なくとも１０ｐＭ、例えば、少なくとも２０ｐＭ、少なくとも３０ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも１５０ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも１ｎＭ、または少なくとも１０ｎＭの最終濃度で試料に添加する。一例では、各ＮＰＰまたはＮＰＰＦを約３０ｐＭの最終濃度で試料に添加する。別の例では、各ＮＰＰまたはＮＰＰＦを約１６７ｐＭの最終濃度で試料に添加する。さらなる例では、各ＮＰＰまたはＮＰＰＦを約１ｎＭの最終濃度で試料に添加する。一例では、ＮＰＰＦを使用する場合、各ＣＦＳをプローブの量のおよそ少なくとも６倍、例えば、プローブの量の少なくとも１０倍または少なくとも２０倍（例えば、プローブの量の６〜２０倍）の最終濃度で試料に添加する。一例では、各ＣＦＳを少なくとも１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、または少なくとも２００ｎｍ、例えば、１〜１００、５〜１００または５〜５０ｎＭで添加する。例えば、６種のプローブがそれぞれ１６６ｐＭで存在する場合、各ＣＦＳを５〜５０ｎＭで添加することができる。そのような例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦが標的配列などの相補配列とハイブリダイズ（２重鎖を形成）していれば、ＮＰＰまたはＮＰＰＦは、Ｓ１などのヌクレアーゼによって消化されない。
【０１１８】
ｂ．例示的なハイブリダイゼーション条件
当業者は、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）が試験試料中に存在するその標的と特異的にハイブリダイズするのに十分な条件を同定することができる。例えば、当業者は、選択されたストリンジェンシーの条件下で核酸（例えば、融合プローブ）が別の核酸（例えば、表２〜８のいずれかの標的核酸）とハイブリダイズすることを可能にする一方で、他の物質または分子との非特異的なハイブリダイゼーションを最小化する特色（長さ、塩基組成、および相補性の程度など）を実験的に決定することができる。一般には、ＮＰＰの核酸配列は、対応する標的配列に対して、選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすること、例えば、約３７℃またはそれより高く（例えば、約３７℃、４２℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、またはそれより高く）でハイブリダイズすることを可能にするために十分な相補性を有する。変動し得るハイブリダイゼーション反応パラメーターの中では、塩濃度、緩衝液、ｐＨ、温度、インキュベーションの時間、ホルムアミドなどの変性剤の量および型がある。
【０１１９】
試料中の核酸分子を変性させ（例えば、約９５℃〜約１０５℃で約５〜１５分間）、複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）と、約１０分〜約７２時間の間（例えば、約１０分〜約２４時間の間、例えば、少なくとも約１時間〜２０時間、または約６時間〜１６時間）、約４℃〜約７０℃（例えば、約３７℃〜約６５℃、約４２℃〜約６０℃、または約５０℃〜約６０℃）の範囲の温度でハイブリダイズさせる。一部の例では、複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）を、試料と一緒に、少なくとも約３７℃、少なくとも約４０℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、または少なくとも約７０℃の温度でインキュベートする。一例では、複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）を試料と一緒に約３７℃でインキュベートする。別の例では、複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）を試料と一緒に約４２℃でインキュベートする。さらなる例では、複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）を試料と一緒に約５０℃でインキュベートする。これらのハイブリダイゼーション温度は例示的なものであり、当業者は、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）の長さおよびヌクレオチド組成などの因子に応じて、適切なハイブリダイゼーション温度を選択することができる。
【０１２０】
一部の実施形態では、方法は、核酸精製を含まない（例えば、試料をＮＰＰもしくはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）と接触させる前に核酸精製を実施せず、かつ／または試料をＮＰＰもしくはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）と接触させた後に核酸精製を実施しない）。一部の例では、方法は、核酸の増幅を含まない（例えば、試料をＮＰＰもしくはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）と接触させる前に核酸の増幅を実施せず、かつ／または試料をＮＰＰもしくはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）と接触させた後に核酸の増幅を実施しない）。一部の例では、細胞溶解以外に試料の前処理は必要ない。一部の例では、細胞溶解と、試料を複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）に接触させることは逐次的に行われる。他の例では、細胞溶解と、試料を複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）と接触させることは同時に行われ、一部の非限定的な例では、間にいかなるステップも介在しない。
【０１２１】
ｃ．ヌクレアーゼを用いた処理
試料中で１種または複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（＋ＣＦＳ）と核酸をハイブリダイズさせた後、試料をヌクレアーゼ保護手順に供する。標的核酸とハイブリダイズしたＮＰＰまたはＮＰＰＦはヌクレアーゼによって加水分解されず、後で検出することができる。
【０１２２】
１つまたは複数のヌクレアーゼを用いた処理により、全てのｓｓ核酸分子（ＮＰＰまたはＮＰＰＦとハイブリダイズしていない（したがって、それによって保護されていない）試料中のＲＮＡおよびＤＮＡ、標的核酸とハイブリダイズしていないＮＰＰまたはＮＰＰＦ、ならびに、ＮＰＰＦとハイブリダイズしていないＣＦＳ（使用した場合）を含む）は破壊されるが、ＣＦＳおよび試料中に存在する標的核酸分子とハイブリダイズしたＮＰＰＦならびに試料中に存在する標的核酸分子とハイブリダイズしたＮＰＰなどのｄｓ核酸分子は破壊されない。例えば、試料が細胞抽出物または溶解物を含む場合、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ核酸標的が大多数の核酸標的配列を構成する場合では、非標的ゲノムＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および相補的なＮＰＰまたはＮＰＰＦ配列とハイブリダイズしていない標的核酸分子（複数可）の一部分（突出部など）などの不要な核酸をこのステップにおいて実質的に破壊することができる。これにより、化学量論量の標的核酸／ＮＰＰ２重鎖または標的核酸／ＣＦＳ／ＮＰＰＦ２重鎖が残る。標的分子が固定により生じた組織と架橋結合している場合、ＮＰＰまたはＮＰＰＦは、架橋結合した標的分子と、架橋結合を逆転させる、または他の様式で標的核酸をそれが架橋結合している組織から放出させることを必要とせずに、ハイブリダイズする。
【０１２３】
ハイブリダイズした複合体の性質および試料中に存在する望ましくない核酸の性質に応じて、膵臓ＲＮＡｓｅ、リョクトウヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ  Ａ、リボヌクレアーゼＴ１、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＲＮＡｓｅ  ＣＬＢ、ＲＮＡｓｅ  ＰｈｙＭ、ＲＮＡｓｅ  Ｕ２などを含めた種々のヌクレアーゼのいずれかを使用することができる。特定の例では、ヌクレアーゼは、一本鎖核酸に対して特異的な、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼである。本明細書に開示されている一部の方法の実施形態において一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを使用することの有利な点は、そのような一本鎖（「粘着性」）分子が、望ましくないバックグラウンドまたは交差反応性を導く可能性のあるその後の反応ステップから除去されることである。Ｓ１ヌクレアーゼは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ（カタログ番号Ｍ５７６１）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ（カタログ番号１８００１−０１６）；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ（カタログ番号ＥＮ０３２１）、および他から市販されている。これらの酵素の反応条件は、当技術分野で周知であり、経験的に最適化することができる。
【０１２４】
一部の例では、緩衝液（酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＺｎＳＯ４、ＫＡＴＨＯＮ、またはこれらの組み合わせを含有するものなど）中に希釈したＳ１ヌクレアーゼをハイブリダイズしたプローブ／試料混合物に添加し、約３７℃〜約６０℃（約５０℃など）で１０〜１２０分間（例えば、１０〜３０分、３０〜６０分、６０〜９０分、または１２０分）インキュベートして、試料に由来するハイブリダイズしていない核酸およびハイブリダイズしていないＮＰＰまたはＮＰＰＦを消化する。
【０１２５】
任意選択で、試料を、ハイブリダイズしていない材料を他の様式で除去するため、および／または残留する酵素を不活性化もしくは除去するために処理することができる（例えば、加熱、フェノール抽出、沈殿、カラム濾過、プロテイナーゼＫの添加、ヌクレアーゼ阻害剤の添加、ヌクレアーゼの活性に必要な二価カチオンのキレート化、またはこれらの組み合わせによって）。一部の例では、任意選択で、試料を、標的核酸およびＣＦＳ（複数可）が相補的なＮＰＰＦから、または標的核酸が相補的なＮＰＰから解離するように処理する（例えば、塩基加水分解および熱を使用して）。一部の例では、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理後、ＮＰＰまたはＮＰＰＦとハイブリダイズした標的核酸分子を、例えば、塩基中でＮＰＰまたはＮＰＰＦとの２重鎖を解離させ、次いで、核酸をヌクレアーゼによってまたは高温での塩基加水分解などの化学的／物理的処理によって破壊することにより分解し、ＮＰＰまたはＮＰＰＦが、標的核酸とどれだけハイブリダイズしたかに正比例させることができる。あるいは、試料を、標的核酸の（一本鎖）ハイブリダイズした部分、またはハイブリダイズした標的核酸およびプローブによって形成された２重鎖を、さらに分析するために残すように処理することができる。
【０１２６】
一部の例では、ヌクレアーゼと一緒にインキュベートした後、塩基（ＮａＯＨまたはＫＯＨなど）を添加してｐＨを約９〜１２に上昇させ、試料を加熱する（例えば、９５℃まで、１０分間）。これにより、二量体が解離し、一本鎖状態のＮＰＰまたはＮＰＰＦを残し、ＲＮＡの場合ではＲＮＡ標的分子が加水分解される。このステップでは、例えばｐＨを約６を超えて上昇させることによって、ヌクレアーゼを中和または非活性化することもできる。
【０１２７】
一部の例では、試料を、例えば、酸（ＨＣｌなど）を添加することによって処理してｐＨを約７〜約８に調整する。一部の例では、ｐＨをＴｒｉｓ緩衝液で約７〜約８まで上昇させる。ｐＨの上昇により、ＤＮＡの脱プリンを防止することができ、また、多くのｓｓ特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１）が完全に機能することも防止される。
【０１２８】
一部の例では、試料を、例えばゲル精製または他の分離方法によって精製または分離して、望まれない核酸または他の分子を除去する。
【０１２９】
ｄ．任意選択の増幅
一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦの検出の前にそれらを増幅する。例えば、結果として得られたＮＰＰ、ＮＰＰＦ、またはＮＰＰもしくはＮＰＰＦから分離された結果として得られた標的核酸分子を、例えば、ＰＣＲもしくは他の形態の酵素的増幅またはライゲーションに基づく増幅方法などの常套的な方法を使用して増幅することができる。
【０１３０】
使用することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法の例としては、これだけに限定されないが、定量的リアルタイムＰＣＲ、鎖置換増幅；無転写等温増幅；修復鎖反応増幅；リガーゼ連鎖反応増幅；ギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅；カップリングしたリガーゼ検出およびＰＣＲ；ならびにＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ無転写増幅が挙げられる。一例では、ライゲーションに基づく増幅方法を使用し、ここで、プライマーはＮＰＰＦ特異的であり、突き合わさる（ｂｕｔｔ  ｕｐ）ものであり、したがって、一連のサイクルにわたり一緒にライゲーションし、融解させ、次いで、新たなプライマーを一緒にライゲーションすることができる。ライゲーションは、酵素的なものであっても非酵素的なものであってもよい。ＮＰＰＦ隣接配列をプライマーのハイブリダイゼーションに使用する場合、増幅はユニバーサルなものであってよい。
【０１３１】
増幅中に、実験タグ、および／または配列決定アダプターを、例えばプライマーおよび伸長構築物の一部として、例えば、ＮＰＰまたはＮＰＰＦの３’末端または５’末端または両末端に組み入れることができる。一部の例では、そのようなタグまたはアダプターを増幅前に付加する。生成されたＮＰＰもしくはＮＰＰＦアンプリコン（例えば、ＮＰＰもしくはＮＰＰＦが最初に標識されていない場合または追加的な標識付けが望まれる場合）、または検出もしくはクエンチを可能にする他の分子に検出可能な標識を導入するために増幅を使用することもできる。例えば、増幅プライマーは、増幅中にＮＰＰまたはＮＰＰＦに組み入れられる検出可能な標識、ハプテン（ｈａｐｔａｎ）、またはクエンチャーを含んでよい。そのような標識、ハプテン、またはクエンチャーは、ＮＰＰもしくはＮＰＰＦアンプリコンの末端のいずれか（または両末端）、または間のどこにでも導入することができる。
【０１３２】
一部の例では、結果として得られたＮＰＰまたはＮＰＰＦアンプリコンを検出または配列決定の前に浄化する。例えば、増幅反応混合物を、当技術分野で周知の方法（例えば、ゲル精製、ビオチン／アビジン捕捉および放出、キャピラリー電気泳動）を使用して浄化することができる。一例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦアンプリコンをビオチン化し（または別のハプテンを含めて）、アビジンまたは抗ハプテンコーティングしたビーズまたは表面上に捕捉し、洗浄し、次いで、検出または配列決定のために放出させる。増幅された産物を増幅の最後のステップの後、なお二本鎖である間に、一本鎖オリゴヌクレオチドを加水分解するヌクレアーゼ（エキソヌクレアーゼＩなど）を使用する方法によって浄化することもでき、このヌクレアーゼを今度は表面へのハイブリダイゼーションなどの次のステップを続ける前に不活性化することができる。
【０１３３】
ｅ．標識を使用したＮＰＰまたはＮＰＰＦの検出
ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（または残存する標的、標的：ＮＰＰ複合体、または標的：ＮＰＰＦ：ＣＦＳ複合体）、ＮＰＰアンプリコン、またはＮＰＰＦアンプリコンの存在を検出することができる。ＮＰＰもしくはＮＰＰＦプローブまたはアンプリコン（または残存する標的  標的：ＮＰＰ複合体、または標的：ＮＰＰＦ：ＣＦＳ複合体）の検出のために、任意の適切な方法を使用することができる。一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）は検出可能な標識を含み、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）の存在の検出は、検出可能な標識を検出することを含む。一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を同じ検出可能な標識で標識する。他の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を異なる検出可能な標識（各標識に対して異なる標識など）で標識する。他の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を間接的に、例えば、標識された核酸を用いたハイブリダイゼーションによって検出する。
【０１３４】
具体的な非限定的な例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）は、ビオチン標識を含む。この例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）は、それらをアビジン−ＨＲＰまたはストレプトアビジン−ＨＲＰ、またはアルカリホスファターゼなどの別の適切な酵素とのコンジュゲートと一緒にインキュベートし（例えば、支持体、例えば、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を含有するアレイまたはビーズ上で）、次いで、支持体を色素形成基質、化学発光基質、または蛍光発生基質に接触させることによって検出することができる。１つの非限定的な例では、基質は、ＴＭＡ−３（Ｌｕｍｉｇｅｎ、Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、ＭＩ）である。追加的な化学発光基質は、ＬｕｍｉＧｌｏ（登録商標）（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、およびＥＣＬ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）など、市販されている。基質から生じるシグナルを、例えば、マイクロアレイイメージャー（ＯＭＩＸ、ＯＭＩＸ  ＨＤ、ＣＡＰＥＬＬＡ、またはＳＵＰＥＲＣＡＰＥＬＬＡイメージャー、ＨＴＧ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚｏｎａなど）スキャナーを利用して、または、側方流動デバイスにおいてなど視覚的に、検出する。ユウロピウムに基づく発光、ならびにエレクトロルミネセンスまたは光散乱、または電気的性質（例えば、導電率（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）または抵抗）を使用することができる。
【０１３５】
別の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）は、Ｃｙ−３またはＣｙ−５などの蛍光標識を含む。標準のマイクロアレイイメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標）イメージャー（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）マイクロアレイスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）スキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、フローサイトメトリー法、または蛍光顕微鏡法などを利用してＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を検出することができる。当業者は、これらまたは他の検出可能な標識に対する適切な検出方法および試薬を選択することができる。
【０１３６】
ｆ．捕捉用分子を使用したＮＰＰまたはＮＰＰＦの検出
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理（および任意選択の増幅）の後、試料を、それぞれが捕捉用分子を含む多数の空間的に別個の領域を含む表面と接触させる、または、それぞれが捕捉用分子を含む複数の表面と接触させる。例えば、表面は、ビーズの集団であり、ここで、ビーズの亜集団がそれぞれ少なくとも１種の捕捉用分子を含む。例えば、第１の亜集団は少なくとも１種の捕捉用分子を含んでよく、一方、第２の亜集団は第１のものとは異なる配列を有する少なくとも１種の捕捉用分子を含んでよく、他も同様である。一部の例では、捕捉用分子は、二機能性リンカー（「プログラミングリンカー」とも称される）と結びついた少なくとも１種のアンカーを含む。あるいは、捕捉用分子は、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）の少なくとも一部分と相補的な配列、例えば、ＮＰＰＦまたはそのアンプリコンの隣接領域の全部または一部分と相補的な配列を有する核酸捕捉用プローブを含む。
【０１３７】
捕捉用分子が二機能性リンカーと結びついた少なくとも１種のアンカーを含む例では、アンカーと二機能性リンカーは、ハイブリダイゼーション、アニーリング、共有結合による連結、または他の結合によって結びついている。二機能性リンカーは、アンカーに特異的に結合する（例えば、それと相補的である）第１の部分と、複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）の１つに特異的に結合する（例えば、それと相補的である）第２の部分とを含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、開示されている方法は、表面上（例えば、アレイ上）のアンカーを含み、これは、ヌクレアーゼまたは増幅ステップ後にＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を捕捉するために利用される二機能性リンカーと結びついている。一部の例では、アンカーは、約８〜１５０ヌクレオチドの長さ（例えば、約８〜１００、１５〜１００、２０〜８０、２５〜７５、または２５〜５０、例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドである。１つの非限定的な例では、アンカーは、約２５ヌクレオチドの長さである。一部の例では、アンカーは、二機能性リンカーの第１の部分に特異的に結合する第１の部分と、表面とアンカーの第１の部分の間のスペーサーとして作用する第２の部分とを含む。一部の例では、アンカーの第２の部分は、約６〜６０炭素原子またはヌクレオチドの長さ（例えば、約６、１２、２４、３０、３６、４２、４８、５４、または６０炭素原子またはヌクレオチド）である。他の例では、アンカーの第２の部分は、約５〜１００炭素原子またはヌクレオチドの長さ（例えば、約１０〜５０、１５〜４０、２０〜３０、または約２５炭素原子またはヌクレオチド）である。
【０１３９】
開示されている方法のアンカーの塩基組成は、アンカーと二機能性リンカーの対形成の熱力学的安定性が高くなるようなものである。一部の例では、アンカーの塩基組成の百分率は、Ｇが約３０〜４０％、Ｃが３０〜４０％、Ａが１０〜２０％、およびＴが１０〜２０％である。一部の例では、アンカーにおける最近接頻度により、Ｇ−ＧまたはＣ−Ｃ最近接を最小にして、Ｇ四重鎖（Ｇ  ｑｕａｒｔｅｔ）形成により媒介される副反応を低減する。他の例では、非天然塩基、またはペプチド核酸をアンカーまたは二機能性リンカーに組み入れて、その特性を改変することができる。
【０１４０】
開示されている方法において使用するアンカーを設計および合成する方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２４０９８号に記載されている。一部の例では、他のものと実質的に相違があるアンカーのセットが望ましい。相違があるアンカーのセットを得るための例示的なアルゴリズムは以下の通りである：
【０１４１】
１）セットのサイズを定義する。一部の実施形態では、１６、２４、３６、４８、４９、６４、８１、９６、および１００により有用なサイズが構成される。
【０１４２】
２）アンカーセットの全体的な配列構造を定義する。上記の長さおよび塩基組成を使用してそのようなパラメーターを定義する。一般に、Ｇ塩基とＣ塩基の数は同等に保持され、Ａ塩基とＴ塩基の数も同様である。この同等性により、最終的なセットの立体配置的な多様性が最適化される。したがって、そのようなセットは、方程式ＧｎＣｎＡｍＴｍにより記載される。
【０１４３】
３）ｍおよびｎによって定義されるセットの構造について、乱数発生器を用いてランダムな配列異性体のセットを生成する。
【０１４４】
４）ランダムな配列のセットの１メンバーを選択してセットのエレメント＃１として使用する。
【０１４５】
５）セットのメンバーの間で許容される最大類似性を定義する。局所ペアワイズ塩基比較の観点から類似性を定義する。例えば、同一長さｎである２つのオリゴマー鎖を５’末端および３’末端が合うようにアラインメントした場合、ミスマッチの欠如は、全ての位置１−ｎにおいて２つの鎖の塩基が同一であるという状況を指す。完全なミスマッチは、全ての位置１−ｎにおいて２つの鎖の塩基が異なるという状況を指す。例えば、有用な最大類似性は、１６のセット、１６ｍｅｒの捕捉用プローブ内のミスマッチが１０またはそれより多い場合がある。
【０１４６】
６）ランダムな配列のセットの第２のメンバーを選択し、エレメント＃１に対するその類似性を決定する。エレメント＃２がエレメント＃１に対して最大許容類似性に満たない類似性を有する場合、セット内に保持する。エレメント＃２が最大許容類似性を超える類似性を有する場合、廃棄し、新しい配列を比較のために選択する。このプロセスを、第２のエレメントが決定されるまで繰り返す。
【０１４７】
７）以前に選択されたエレメント全てに関して、逐次的に、相違制約を満たすランダムな配列のセットの追加的なメンバーを選択する。
【０１４８】
他の例では、捕捉用分子は、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）の少なくとも一部分と相補的な、例えば、ＮＰＰＦアンプリコンの隣接領域の全部または一部分と相補的な配列を有する少なくとも１種の核酸捕捉用プローブを含む。例えば、核酸捕捉用プローブは、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）と相補的な領域を含んでよく、かつ、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）と相補的でない領域（表面へのプローブの付着を可能にする領域など）を含んでよい。核酸捕捉用プローブは、表面に直接付着させることができる。例えば、核酸捕捉用プローブは、表面への共有結合による付着のためのアミンを含んでよい。一部の例では、核酸捕捉用プローブは、少なくとも８ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００ヌクレオチドの長さ（例えば、約８〜１００、１５〜１００、２０〜８０、２５〜７５、または２５〜５０、例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドである。ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）の領域と相補的な核酸捕捉用プローブの領域は、核酸捕捉用プローブと適切なＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）の間でハイブリダイゼーションが起こり得る限りは、１００％相補的である必要はないことが当業者には理解されよう。一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）の領域と相補的な核酸捕捉用プローブの領域は、少なくとも８ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００ヌクレオチドの長さ（例えば、約８〜１００、１５〜１００、２０〜８０、２５〜７５、または２５〜５０、例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ヌクレオチドの長さ）である。
【０１４９】
一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰ（またはそのアンプリコン）を含有する試料を、アレイの表面に接触させる前に変性させる（例えば、９５℃まで、５分間加熱し、試料を氷上で急速に冷却することによって）。一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を含有する試料を、表面と接触させる前に調整する（例えば、塩またはホルムアミドの濃度を調整するため）。ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を含有する試料を、表面（例えば、アレイまたはビーズ）と一緒に、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）が捕捉用分子に特異的に結合する（例えば、ハイブリダイズする）のに十分な期間インキュベートする。一部の例では、試料を表面と一緒に約３７℃〜約６５℃（例えば、約４５℃〜約６０℃、または約５０℃〜約６０℃、例えば５０℃）で少なくとも１時間（例えば、１〜８時間、１〜３６時間、１２〜２４時間、または１６〜２４時間、または終夜）インキュベートしてＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を捕捉用分子にハイブリダイズさせる。捕捉時間は、例えば、マイクロ流体デバイスもしくはマクロ流体デバイス、側方流動デバイスを使用する場合、または拡散を低減し、能動的な流動もしくは混合を使用することによって、短縮することができる。
【０１５０】
開示されている方法において使用することができる表面（または基材）のいくつかは、商業的な供給者から容易に入手可能である。一部の実施形態では、表面は、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルマイクロタイタープレート、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒにより販売されている改変プレートである。他の実施形態では、基材として、１種または複数のビーズ（例えばフローサイトメトリーにより、サイズまたは色によって弁別することができるビーズの集団など）が挙げられる。あるいは、アルミニウムまたはスチールなどの物質を微細加工して鋳型を調製し、次いで、プラスチックまたは同様の材料を鋳型に微量注入して構造を形成することにより、くぼみまたは「小さなくぼみ」を含むウェルを含む表面を形成することができる。あるいは、ガラス、プラスチック、セラミックなどで構成される構造を組み立てることができる。セパレーターは、例えば、全体を通して一定の間隔で置かれた穴を有する材料、例えば、シリコーンの一片であってよく、したがって、３つの片が接合すると各穴が試験ウェルの壁を形成する。サブディバイダーは、例えば、スクリーンまたは細かい網目構造の形態に形づくられた材料、例えば、シリコーンの薄片であってよい。異なる反応物を分離する表面上のディバイダーは、溶液が接着しないコーティングされた表面、またはナノ構造、または単に個別の液滴、またはキャピラリーまたはマイクロ流体チャネルもしくは位置であってよい。一部の例では、基部は、例えば、生化学的アッセイに使用される典型的なマイクロプレートの下部の形状の材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）の平らな片である。基部の上面は、平らであってもよく、またはサブディバイダーの形状と整列させて、各試料ウェル内において完全な細区分もしくはウェルをもたらすくぼみを有するように形成することもできる。３つの片を標準の手順、例えば、シリコンウェーハの組立てに使用される手順によって接合することができる。
【０１５１】
アンカーを配置するための多種多様なアレイ形式を本開示に従って用いることができる。１つの適切な形式は、別個の細胞の２次元パターン（６４×６４アレイにおける４０９６個の四角など）を含む。当業者には理解される通り、これだけに限定されないが、スロット（長方形）および環状アレイを含めた他のアレイ形式も使用に同等に適する（米国特許第５，９８１，１８５号を参照されたい）。一部の例では、アレイはマルチウェルプレートである。
【０１５２】
一実施形態では、予め形成した核酸アンカー（例えば、オリゴヌクレオチドアンカー）またはＮＰＰもしくはＮＰＰＦ（もしくはそのアンプリコン）の少なくとも一部分と相補的な配列を有する核酸捕捉用プローブを、フォトリソグラフィもしくはシルクスクリーンによる化学的付着、インクジェット技術、キャピラリー、スクリーンもしくは流体チャネルチップによる配置、電極アレイを使用した電気化学的パターン化、ピンもしくはクイルに接触させること、または、変性させ、その後、ベーキングもしくはフィルターへのＵＶ照射を含めた、種々の従来の技法のいずれかによって試験領域の表面上または内部に位置させることができる（例えば、Ｒａｖａら（１９９６年）、米国特許第５，５４５，５３１号；Ｆｏｄｏｒら（１９９６年）、米国特許第５，５１０，２７０号；Ｚａｎｚｕｃｃｈｉら（１９９７年）、米国特許第５，６４３，７３８号；Ｂｒｅｎｎａｎ（１９９５年）、米国特許第５，４７４，７９６号；ＰＣＴ  ＷＯ９２／１００９２；ＰＣＴ  ＷＯ９０／１５０７０を参照されたい）。オリゴヌクレオチドアンカーまたはプローブを試験領域の上面に置くこともでき、例えばポリアクリルアミドゲルパッドの場合では、表面に、アンカーまたはプローブの一部がゲル構造からゲル内およびゲル表面の水性部分に突出し、リンカー、ＮＰＰ、ＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）との相互作用に利用可能になるように包埋することもできる。これは、二機能性リンカー、ＮＰＰ、またはＮＰＰＦを含有する溶液と接触している表面のエリアなどの第１の部分は浸透性であるが、例えば表面までにいくらかの距離がある第２の部分は浸透性ではない表面などの、浸透性の表面および部分的に浸透性の表面に当てはまる。一実施形態では、予め形成したオリゴヌクレオチドアンカーまたはプローブを５’末端において遊離のアミノ基で誘導体化し、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．５および１ｍＭのＥＤＴＡなどの緩衝液中、常套的に経験的に決定された濃度（例えば、約１μＭ）で溶解させ、Ｐｉｘｕｓナノジェットディスペンサー（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて約１０．４ナノリットルの小滴として、上部表面が新たな乾燥したＤＮＡ  Ｂｉｎｄ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）のものである試験ウェル内の特定の場所に分配する。オリゴヌクレオチドの付着および蒸発の相対的な速度に応じて、調製中ウェル内の湿度を制御することが必要になり得る。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドアンカーまたはプローブを、例えば、成長しているオリゴヌクレオチド鎖の光により活性化される脱保護などの従来の方法を使用して（例えば、部位特異的「マスク」の使用と併せて）、またはナノジェットディスペンサーを使用して非活性化化合物のナノリットル小滴をパターン化分散させることによって、試験領域の表面上で直接合成することができる。例えば、単一ヌクレオチドを受け取るはずの全ての成長しているオリゴヌクレオチドの脱保護を行うことができ、次いで、ヌクレオチドを表面全体にわたって添加することができる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドアンカーまたはプローブを、従来の方法体系を使用してオリゴヌクレオチドの３’末端を介���て表面に付着させる。
【０１５３】
ｇ．代替方法を利用したＮＰＰまたはＮＰＰＦの検出
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ処理、および任意選択の増幅の後、ハイスループットなプラットフォームなどの代替方法を利用してＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を検出する。一部の例では、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、配列決定、従来のマイクロアレイ分析、増幅中の検出、またはハイブリッド捕捉を利用してＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を検出する。一部の実施形態では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）は検出可能な標識を含まず、間接的な検出方法を利用する。そのような方法は、当業者には公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、本明細書に記載の方法が挙げられる。
【０１５４】
一例では、ビーズアレイなどの、ビーズに基づくアッセイを利用してＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を検出する。ビーズに基づくアッセイの１つの例では、Ｘ−ＭＡＰ（登録商標）ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、例えば、ＱＢＥＡＤアッセイを利用する。一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）をＸ−ＭＡＰ（登録商標）ビーズまたは他のビーズ上でビーズと結びついたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって捕捉する（例えば、約５０℃で約１時間）。ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）に含まれる検出可能な標識を、例えば、フローサイトメトリーによって検出することができる（Ｌｕｍｉｎｅｘ  ２００、Ｆｌｅｘｍａｐ  ３Ｄ、または他の適切な計器を利用するなど）。
【０１５５】
別の例では、標準のマイクロアレイを利用してＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を検出する。そのようなアレイの１つの例は、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎマイクロアレイ（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）である。一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含むアレイとハイブリダイズさせる。ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）に含まれる検出可能な標識を検出することができる。
【０１５６】
一部の例では、「バーコード」アッセイを用いてＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を検出する。そのようなアッセイの１つの例はｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）である。一部の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）を１つまたは複数の色分けされたタグ（「バーコード」）を含むプローブとハイブリダイズさせる。色分けされたタグの検出により、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）の同定がもたらされる。例えば、ＷＯ０７／０７６１２８２；ＷＯ０７／０７６１２９；ＷＯ０７／１３９を参照されたい。
【０１５７】
ｈ．アンプリコン（ｑＮＰＳ）の配列決定
一部の例では、結果として得られたＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）について、例えば、ＮＰＰもしくはＮＰＰＦ（もしくはそのアンプリコン）全体、またはその一部分（標的核酸分子の同定を可能にするために十分な量など）について配列決定することによって配列決定する。本開示は特定の配列決定方法に限定されない。一部の例では、多数の異なるＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）について単一反応において配列決定する。一例では、特定の標的配列に対応するように設計することができるＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）の実験タグについて配列決定することができる。したがって、ＮＰＰＦアンプリコンの３’末端が末端の２〜２５ヌクレオチド（例えば、末端の２〜５または２〜７、例えば、末端の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド）に、測定される各標識に独特の配列を表す配列を有する場合には、これは、配列決定して標的を同定する必要があるＮＰＰＦアンプリコンの全てであり、配列決定されたそのような実験タグの数を計数することにより、試料中の各標的の量を決定することができる。
【０１５８】
一例では、ＤＮＡで構成されるものなどの、結果として得られたＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）について、連鎖停止方法を使用して配列決定する。結果として得られた断片を、例えば、スラブポリアクリルアミドゲル、または粘性ポリマーを満たした細いガラスチューブ（キャピラリー）における電気泳動によってサイズ分離する。代替方法は、ダイターミネーター配列決定である。別の例では、Ｂｉｏｔａｇｅ（ロースループットな配列決定用）および４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ハイスループットな配列決定用）によって商業化されている方法などのパイロシークエンシングを使用する。別の例では、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）について、ブリッジＰＣＲ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））（例えば、ＨｉＳｅｑ）またはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）、４５４（登録商標）、Ｈｅｌｉｃｏｓ（登録商標）、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）、Ｓｏｌｉｄ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｏａｓｙｓｔｅｍｓ）または任意の数の他の商業的な配列決定システムを使用して配列決定する。配列決定アダプター（例えばＰＣＲを使用して導入された、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ（またはそのアンプリコン）上に存在するポリＡまたはポリＴ尾部など）を捕捉のために使用する。
【０１５９】
６．直接定量的ヌクレアーゼ保護配列決定（ｑＮＰＳ）
一部の例では、発現を測定しようとする試料中の核酸分子を、試料において、例えば、米国仮出願第６２／２９４，１４３号、２０１６年２月１１日出願（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている通り、上記の定量的ヌクレアーゼ保護アッセイの代替法を利用して検出する（図９Ａ）。この方法でもＮＰＰＦおよびＣＦＳを使用するが、ＮＰＰＦ代理物を検出または配列決定する代わりに、この方法では、標的核酸分子の直接配列決定が可能になる。
【０１６０】
方法は、試料を、少なくとも１種のＮＰＰＦに、ＮＰＰＦが標的核酸分子と特異的に結合するまたはハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させることを含む。ＮＰＰＦが５’末端および３’末端の両方に隣接配列を含む場合、一部の例では、各ＮＰＰＦの配列は、異なり、互いと相補的ではない。一例では、（例えば、隣接配列の一方もしくは両方および／または標的核酸分子の全部または一部分と相補的な領域の配列における）ＮＰＰＦは、少なくとも１つのｄＵＴＰ、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのｄＵＴＰを含む。一例では、ＮＰＰＦの「Ｔ」の全てを「Ｕ」に置き換える。そのような塩基が存在することにより、後のステップにおいて（例えば、ライゲーションした標的由来のＮＰＰＦを変性させた後であるが配列決定の前、例えば、ライゲーションした標的の増幅前または増幅中に）ウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を用いて一本鎖のＮＰＰＦを分解または破壊することが可能になる。
【０１６１】
隣接配列（複数可）はＣＦＳと相補的である。一部の例では、少なくとも１つの隣接配列は、少なくとも１つのｄＵＴＰを含む。一部の例では、ＮＰＰＦは、２つの隣接配列を含み、それぞれが少なくとも１つのｄＵＴＰを有する。一部の例では、ＮＰＰＦは、２つの隣接配列を含むが、一方のみが少なくとも１つのｄＵＴＰを有する。一部の例では、ＮＰＰＦは、少なくとも１つのｄＵＴＰを有する単一の隣接配列を含む。一部の例では、ｄＵＴＰの位置は、標的核酸分子の領域と相補的な配列の近く、例えば、標的核酸分子の領域と相補的な配列から１、２、３、４、５塩基離れたところ（例えば、１、２、３、４、５塩基以内）である。一部の例では、ｄＵＴＰの位置は、標的核酸分子の領域と相補的な配列から少なくとも２塩基（少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５塩基など）離れたところである。
【０１６２】
方法は、試料を、隣接配列に対して相補性を有する少なくとも１つの核酸分子（ＣＦＳ）と、ＣＦＳがＮＰＰＦの隣接配列と特異的に結合するまたはハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させることをさらに含む。例えば、ＮＰＰＦが５’隣接配列を有する場合、試料を、５’隣接配列に相補的な配列（５ＣＦＳ）および５’末端リン酸を有する核酸分子と、５’隣接配列が５ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下で接触させる。同様に、ＮＰＰＦが３’隣接配列を有する場合、試料を、３’隣接配列に相補的な配列（３ＣＦＳ）を有する核酸分子と、３’隣接配列が３ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下で接触させる。一例では、３ＣＦＳおよび５ＣＦＳの少なくとも一方が、標的配列の捕捉、分離、回収、または単離を可能にする捕捉用部分を含む。単一のＣＦＳを使用して隣接配列を保護する代わりに、多数のＣＦＳを使用して隣接配列を保護することができる（例えば、多数の５ＣＦＳを使用して５’隣接配列を保護することができる）ことが当業者には理解されよう。一部の例では、標的核酸分子はＤＮＡであり、５ＣＦＳおよび３ＣＦＳはＤＮＡであるか、または５ＣＦＳはＤＮＡであり３ＣＦＳはＲＮＡである。一部の例では、標的核酸分子はＲＮＡであり、５ＣＦＳはＤＮＡであり３ＣＦＳはＲＮＡであるか、または５ＣＦＳはＲＮＡであり３ＣＦＳはＲＮＡである。一部の例では、標的核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡであり、５ＣＦＳおよび／または３ＣＦＳはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴである、例えば、５ＣＦＳの５’塩基（単数または複数）および／または３ＣＦＳの３’塩基（単数または複数）はＲＮＡであり、５ＣＦＳおよび３ＣＦＳの残りはＤＮＡである。
【０１６３】
これにより、標的核酸分子（またはその一部分）、ならびにＣＦＳ（複数可）が結合したＮＰＰＦ分子の生成がもたらされ、それにより、標的およびＣＦＳ上の相補的な塩基とのハイブリダイゼーションに関与するＮＰＰＦの塩基を含む二本鎖分子が生成する。ＣＦＳ（複数可）をその対応する隣接配列とハイブリダイズさせ、したがって、隣接配列をその後のステップにおけるヌクレアーゼを用いた消化から保護する。一部の例では、各ＣＦＳはちょうどその対応する隣接配列の長さである。一部の例では、ＣＦＳは、その対応する隣接配列と完全に相補的である。しかし、５’末端隣接配列を保護する５ＣＦＳの３’末端または３’末端隣接配列を保護する３ＣＦＳの５’末端には、これらの位置のそれぞれにおける１ヌクレオチドなどの差異があってよいことが当業者には理解されよう。
【０１６４】
標的核酸分子およびＣＦＳ（複数可）をＮＰＰＦと結合させた後、方法は、試料を、一本鎖（ｓｓ）核酸分子または核酸分子のｓｓ領域に特異的なヌクレアーゼ、例えばＳ１ヌクレアーゼと、相補的な塩基とハイブリダイズしていない核酸塩基を除去するために十分な条件下で接触させることをさらに含む。したがって、例えば、標的核酸分子またはＣＦＳと結合していないＮＰＰＦ、ならびに結合していない標的核酸分子、試料中の他のｓｓ核酸分子、および結合していないＣＦＳが分解される。これにより、５ＣＦＳ、３ＣＦＳ、またはその両方、および標的核酸の一部分とハイブリダイズした二本鎖付加生成物として存在するインタクトなＮＰＰＦを含む消化された試料が生成する。一部の例では、例えば、ＮＰＰＦがＤＮＡで構成される場合、ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはこれらの組み合わせを含んでよい。
【０１６５】
その後、ＣＦＳ（複数可）を標的核酸とライゲーションすることができ、例えば、５ＣＦＳの５’リン酸を標的核酸分子の３’末端とライゲーションし、３ＣＦＳの３’末端を標的核酸分子の５’末端とライゲーションし、それにより、ライゲーションした標的核酸分子（本明細書では、ライゲーションした標的と称される）が生成する。
【０１６６】
二本鎖ＮＰＰＦ：ライゲーションした標的核酸分子をｓｓ核酸分子に分離して（例えば、試料を加熱することまたは試料のｐＨを上昇させることによって）、それにより、ｓｓのＮＰＰＦとｓｓのライゲーションした標的核酸分子の混合物が生成する。ｓｓのライゲーションした標的核酸分子を、任意選択で、例えばハイブリダイゼーションまたは捕捉用部分（例えば、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳ上）の使用によって、例えば捕捉することにより、回収する。一部の例では、ｓｓのＮＰＰＦとｓｓのライゲーションした標的核酸分子の混合物をウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と一緒に、少なくとも１つのｄＵＴＰを有するｓｓのＮＰＰＦを分解または破壊するために十分な条件下でインキュベートする。
【０１６７】
方法は、配列決定しようとする標的を、例えば、ＮＰＰＦ、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳを使用することによって捕捉または回収することを可能にする１つまたは複数のステップを含んでよい。例えば、図９Ｂ〜９Ｄに示されている通り、そのような捕捉は、ハイブリダイゼーション中、ヌクレアーゼ消化後、またはハイブリダイゼーション後であるがライゲーション前に行うことができる。図９Ａおよび９Ｃは、ヌクレアーゼ消化後に捕捉を行う例を示す。さらに、追加的な捕捉ステップを、例えばライゲーション後に含めることができる。一例では、ＮＰＰＦ、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳを固体基材（マルチウェルプレートなど）に付着させることにより、分子が、係留されたＮＰＰＦ、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳとハイブリダイズしたときにそれらを捕捉することが可能になる。別の例では、捕捉用部分（標的、ＮＰＰＦ、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳに付着させた粒子または標識など）を使用して、捕捉用部分を含有する分子に付着またはハイブリダイズした分子を試料の他の成分と物理的に分離することを可能にし得る。捕捉方法に応じて、そのような方法は、固体捕捉用部分を収集するための遠心分離、磁気ビーズ捕捉、固体支持体への結合またはハイブリダイゼーション、濾過などを含んでよい。さらに、そのような捕捉ステップは、捕捉された核酸分子を洗浄することを含んでよい（それにより、ハイブリダイズしていないＮＰＰＦおよびハイブリダイズしていないＣＦＳなどの捕捉されない分子を分離または除去することを可能にする）。そのような方法は、捕捉された核酸分子を、マルチウェルプレートのウェルまたは単一の反応チューブもしくは器（ｖｅｓｓｅｌ）などの固体支持体から放出させることを含んでもよく、捕捉された核酸分子を固体支持体に付加したままもしくはその内部にあるままにしてもよい。一部の例では、このステップは、例えば標的核酸分子を器またはチューブの底部に捕捉するための遠心分離、および望まれないまたは不必要な薬剤の除去を可能にするための洗浄を含む。一部の例では、このステップは、標的核酸分子の磁気ビーズ捕捉、および望まれないまたは不必要な薬剤の除去を可能にするための洗浄を含む。一部の例では、このステップは、標的核酸分子を捕捉するための濾過、および望まれないまたは不必要な薬剤の除去を可能にするための洗浄を含む。このステップは、標的核酸分子の洗浄を含んでよく、これは、一部の例では、もはや必要ない薬剤（例えば、ヌクレアーゼ）を除去し、かつ／または標的核酸分子を別の溶液に懸濁させることを可能にし、これにより、特定の方法の実施形態では１つまたは複数の次のステップを容易にすることができる。
【０１６８】
一部の例では、方法の多数のステップ（図９Ａに示されているステップの２つ、３つ、または４つなど）を同じ器または容器中で実施する。例えば、開示されている方法では、所望の成分（複数可）を多数のステップの間、同じ器中に残すと同時に、望まれないまたは不必要な成分を除去すること（例えば、捕捉および洗浄ステップの反復を使用して）が可能になる。例えば、分析しようとする試料を器中で溶解させることができる。適切なＮＰＰＦおよびＣＦＳをその器に添加し、ヌクレアーゼをその器に添加し、器中でｄｓ核酸分子を捕捉する（例えば、器の底部に引き付けられる磁気ビーズを用いて）。捕捉されたｄｓ核酸分子を洗浄して望まれない薬剤を除去し、所望の緩衝液または試薬を器に添加する（例えば、リガーゼ緩衝液）。次いで、ｓｓのライゲーションした標的核酸分子を器中で捕捉し、洗浄することができる。
【０１６９】
任意選択で、ライゲーションした標的核酸分子を、例えばＰＣＲ増幅を使用して増幅する。そのような方法を使用して、実験タグおよび／もしくは配列アダプターをライゲーションした標的に付加すること、ならびに／またはライゲーションした標的のコピーの数を増大させることができる。ｓｓのライゲーションした標的核酸分子（またはそのアンプリコン）の少なくとも一部分について配列決定し、それにより、試料中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列を決定する。一部の例では、標的核酸分子はＲＮＡであり、方法は、配列決定前にそれらをＤＮＡに逆転写することを含む。
【０１７０】
ライゲーションした標的を、１つまたは複数の増幅プライマーを使用して増幅し、それにより、ライゲーションした標的アンプリコンを生成することができる。少なくとも１つの増幅プライマーは、標的とライゲーションしたＣＦＳと相補的な領域を含む。一部の例では、標的を５ＣＦＳとその５’末端において、３ＣＦＳとその３’末端においてライゲーションし、２つの増幅プライマーを使用し、ここで、一方の増幅プライマーは５ＣＦＳの領域と相補的な領域を有し、他方の増幅プライマーは３ＣＦＳの領域と相補的な領域を有する。一部の例では、標的を５ＣＦＳまたは３ＣＦＳのいずれかと、それぞれその５’末端および３’末端においてライゲーションし、１つの増幅プライマーを使用し（例えば、急速増幅またはｃＤＮＡ末端を使用する）、ここで、増幅プライマーは５ＣＦＳまたは３ＣＦＳの領域と相補的な領域を有する。増幅プライマーの一方または両方が、増幅中にライゲーションした標的アンプリコンに実験タグおよび／または配列決定アダプターを付着させることを可能にする配列を含んでよく、ＮＰＰＦアンプリコンの標識付けを可能にするために、プライマーの一方または両方を標識することができる。一部の例では、実験タグおよび配列決定アダプターの両方を、例えば、ライゲーションした標的アンプリコンの反対側の末端に付加する。例えば、そのようなプライマーを使用することにより、ライゲーションした標的アンプリコンの５’末端もしくは３’末端から、または３’末端および５’末端の両方から伸長した実験タグおよび／または配列アダプターを生成して、可能性のある多重化の程度を増大させることができる。実験タグは、試料、対象、または標的核酸配列の同定を可能にする独特の核酸配列を含んでよい。配列決定アダプターは、結果として得られた、ライゲーションした標的アンプリコンを配列決定プラットフォームに捕捉することを可能にする核酸配列を含んでよい。一部の例では、プライマーを配列決定前に混合物から除去する。
【０１７１】
ライゲーションした標的またはライゲーションした標的アンプリコン（またはその一部分）について、例えば、上記の方法を使用して配列決定する。ライゲーションした標的またはライゲーションした標的アンプリコンの配列決定のために任意の方法を使用することができ、本開示は特定の配列決定方法に限定されない。一部の例では、使用される配列決定方法は、連鎖停止配列決定、ダイターミネーション配列決定、パイロシークエンシング、ナノポア配列決定、または大規模並列処理配列決定（次世代配列決定（またはＮＧＳ）とも呼ばれる）であり、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ（商標））、ＩｌｌｕｍｉｎａブランドのＮＧＳシークエンサー（例えば、ＭｉＳｅｑ（商標）、ＨｉＳｅｑ（商標））（または他のＳｏｌｅｘａ（商標）配列決定に由来するもの）、およびＲｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な４５４配列決定によって例示される。一部の例では、単一分子配列決定を使用する。一部の例では、方法は、例えば、標的変異が存在するか否かを決定するために、得られた標的配列を配列データベースと比較することも含む。一部の例では、方法は、得られた各標識配列の数を決定する（例えば、計数する）ことを含む。
【０１７２】
図９Ａは、開示されている方法に関してＮＰＰＦ  ２０２を核酸分子の配列決定に使用することに関するある実施形態の概要を示す概略図である。ステップ１に示されている通り、試料破壊または溶解緩衝液を用いて処理した（例えば、溶解させた、または他の様式で核酸に接近可能になるように処理した）試料（標的核酸、２００を含有することが分かっているまたは含有する疑いがある試料など）を、第１の標的核酸２００（標的ＤＮＡまたはＲＮＡなど）に特異的に結合する少なくとも１種のＮＰＰＦを含む１つまたは複数の隣接配列（ここでは５’隣接配列および３’隣接配列の両方、それぞれ２０４および２０６と共に示されている）を有する複数のヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）２０２に接触させるまたはそれと一緒にインキュベートする。反応物は、第２の標的核酸などに特異的に結合する他のＮＰＰＦも含んでよい。例えば、方法では、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのそれぞれに特異的なＮＰＰＦなどの、独特の各標的核酸分子に特異的であるように設計された１つまたは複数の異なるＮＰＰＦを使用することができる。一部の例では、複数のＮＰＰＦは、単一の標的核酸分子に特異的な１種より多い（例えば、２種、３種、４種、５種、１０種、２０種、５０種またはそれよりも多い）ＮＰＰＦ（ＮＰＰＦのタイル状セットと称される）を含んでよい。反応物は、隣接配列と相補的な核酸分子（ＣＦＳ）２０８、２１０も含む。したがって、ＮＰＰＦが５’隣接配列２０４を有する場合、反応物は、５’隣接配列と相補的な配列（５ＣＦＳ）２０８を含み、ＮＰＰＦが３’隣接配列、２０６を有する場合、反応物は、３’隣接配列と相補的な配列（３ＣＦＳ）２１０を含む。一部の例では、５ＣＦＳ  ２０８は、後のステップにおいて標的２００とのライゲーションを可能にする５’末端リン酸を有する。一部の例では、ＣＦＳの少なくとも１つは、所望の時点での標的の回収を可能にする捕捉用部分２１２を含む。捕捉用部分２１２は５ＣＦＳ  ２０８内に示されているが、それが存在する実施形態では、３ＣＦＳ  ２１０、ＮＰＰＦ  ２０２または標的２００上に代替的にあってよいことが理解されよう。ＣＦＳの配列は存在する隣接配列に応じて変動することが当業者には理解されよう。さらに、隣接領域が保護されることを確実にするために、１種より多いＣＦＳを使用することができる（例えば、単一の隣接配列の異なる領域に結合する少なくとも２種のＣＦＳを使用することができる）。ＣＦＳは、天然または非天然塩基を含んでもよい。
【０１７３】
図２Ａの捕捉用部分、２１２は、任意選択であるか、または３ＣＦＳ  ２１０もしくは標的２００上にあってもよい。試料、ＮＰＰＦおよびＣＦＳを、ＮＰＰＦがそれらのそれぞれの標的核酸分子に特異的に結合し（例えば、ハイブリダイズし）、かつＣＦＳがＮＰＰＦ隣接配列上のそれらの相補配列と結合する（例えば、ハイブリダイズする）のに十分な条件下でインキュベートする。一部の例では、ＮＰＰＦ  ２０２よりも過剰のＣＦＳ  ２０８、２１０、例えば、ＮＰＰＦの少なくとも５倍のＣＦＳ（モル過剰）、例えば、ＮＰＰＦの少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍のＣＦＳを添加する。一部の例では、試料中の全核酸分子よりも過剰のＮＰＰＦ  ２０２、例えば、試料中の全核酸分子の少なくとも５０倍のＮＰＰＦ（モル過剰）、例えば、試料中の全核酸分子の少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍のＮＰＰＦを添加する。実験の利便性のために、測定される最も豊富な核酸標的に対して、その核酸標的の少なくとも５０倍、例えば、少なくとも１００倍過剰のＮＰＰＦが存在するように、同様の濃度の各ＮＰＰＦを含めてカクテルを作製することができる。使用される全てのＮＰＰＦの実際の過剰量および総量は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）の、標的核酸標的とハイブリダイズしていない全てのＮＰＰＦを破壊する能力によってのみ限定される。一部の例では、反応物を加熱する、例えば、５０℃で終夜（１６時間など）インキュベートする。
【０１７４】
図９Ａのステップ２に示されている通り、結合／ハイブリダイゼーション反応物を生じさせた後、試料を、一本鎖（ｓｓ）核酸分子に特異的な試薬（ヌクレアーゼなど）と、結合していない核酸分子（例えば、結合していないＮＰＰＦ、結合していないＣＦＳ、および結合していない標的核酸分子、または一本鎖のままであるそのような分子の一部分、例えばＮＰＰＦに結合していない標的核酸分子の一部分）などのｓｓ核酸分子を除去する（または消化する）ために十分な条件下で接触させる。これにより、ｄｓ  ＮＰＰＦ／標的のハイブリダイズした複合体（または２重鎖）２１４が生成する。図９Ａに示されている通り、試料をｓｓ核酸分子に特異的なヌクレアーゼと一緒にインキュベートすることにより、存在するあらゆるｓｓ核酸分子の分解がもたらされ、それに結合したＮＰＰＦおよびＣＦＳおよび標的核酸分子を含めたインタクトな二本鎖核酸分子が残る。例えば、反応物をＳ１ヌクレアーゼと一緒に５０℃で１．５時間インキュベートすることができる（しかし、加水分解は他の温度でも起こり、他の期間にわたり行うことができ、また、一部において、必要な時間および温度は、ヌクレアーゼの量、および加水分解される必要がある核酸の量、ならびに保護されている二本鎖領域のＴｍの関数である）。
【０１７５】
図９Ａのステップ３に示されている通り、ＮＰＰＦ／標的複合体２１４（ライゲーション前のある時点で捕捉または回収され（図９Ｂ〜９Ｄ参照）、かつ、ハイブリダイズしていない材料は除去される）を、標的配列２００（ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい）がＣＦＳ（例えば、５ＣＦＳ  ２０８、３ＣＦＳ  ２１０、またはその両方）とライゲーションするのを可能にし、それにより、ライゲーションした標的２１６が生成するライゲーション条件に曝露する。ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、またはＴａｑリガーゼなどの、標的配列とＣＦＳ（複数可）を共有結合により接合することが可能な任意のリガーゼを使用することができる（したがって、そのようなリガーゼは、本明細書において提供されるキット中に、例えば単独でまたはライゲーション緩衝液中で存在してよい）。使用されるリガーゼは、標的配列に最も近いＣＦＳ上に存在するヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）に左右され得る。一部の例では、リガーゼを緩衝液（例えば、ＮＡＤ＋またはＡＴＰなどの必須な補因子、緩衝剤を含有するもの）中に希釈し、陽イオンを、ＮＰＰＦ／標的２重鎖を含有する混合物に添加し、約４℃〜６０℃（リガーゼに応じて）（例えば、少なくとも４℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３７℃、少なくとも５０℃、または少なくとも６０℃、例えば、４〜３７℃、４〜２５℃、または２０〜２５℃）で、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または少なくとも１６時間インキュベートして、ＣＦＳと標的核酸分子をライゲーションさせる（ＣＦＳおよび標的はすでにＮＰＰＦとハイブリダイズしている）。一例では、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＡＴＰを含む。５ＣＦＳ  ２０８は、標的２００の３’末端とライゲーションすることができる５’末端リン酸を含んでよい。３ＣＦＳ  ２１０は、標的の５’末端リン酸とライゲーションすることができる３’末端（３’末端ヌクレオチドなど）を含んでよい。ＮＰＰＦ上に隣接配列が１つのみ存在する場合、１つのＣＦＳのみがＮＰＰＦ／標的複合体に結合しており、標的は、１つのＣＦＳのみとライゲーションする。ＣＦＳはＤＮＡまたはＲＮＡ（または両方のヌクレオチド型の混合物）であってよい。ＣＦＳまたは標的がＤＮＡである場合、ＤＮＡとのライゲーションのための５’末端リン酸ドナーはリボヌクレオチドであることはできない。一例では、標的がＲＮＡである場合、５ＣＦＳ  ２０８はＤＮＡまたはＲＮＡであり、３ＣＦＳ  ２１０はＲＮＡである。一例では、標的がＤＮＡである場合、５ＣＦＳ  ２０８はＤＮＡ（または少なくとも５ＣＦＳ  ２０８の５’末端ヌクレオチドが標的の３’末端とライゲーションするｄＮＴＰである）またはＲＮＡであり、３ＣＦＳ  ２１０はＲＮＡである。
【０１７６】
図９Ａのステップ４に示されている通り、ＣＦＳ（複数可）を標的とライゲーションした後、ＮＰＰＦ  ２０２を、ライゲーションした標的２１６から分離する。すなわち、ＮＰＰＦ／標的複合体２１４（例えば、二本鎖核酸分子）を２つの一本鎖核酸分子、ＮＰＰＦ  ２０２とライゲーションした標的２１６とに分離する。このステップにより、ライゲーションしていない核酸分子（例えば、ライゲーションしていないＣＦＳ）を除去することもできる。例えば、反応物を、ＮＰＰＦ  ２０２がライゲーションした標的２１６から解離し、その結果、一本鎖のＮＰＰＦ  ２０２と、一本鎖のライゲーションした標的２１６の混合集団が生じることが可能になる条件下で加熱することまたはｐＨを変更すること（例えば、塩基性のｐＨを有する反応物がもたらされる）ができる。一部の例では、ライゲーションした標的２１６を、ＣＦＳ上の捕捉用部分２１２を使用することによってこの混合物から分離する。本明細書に記載の捕捉方法を使用して、ライゲーションした標的２１６を捕捉することができる。例えば、捕捉用部分２１２がビーズである場合、ライゲーションした標的２１６を、遠心分離を使用して回収することができる。捕捉用部分２１２が金属ビーズである場合、ライゲーションした標的２１６を、磁石を使用して回収することができる。捕捉用部分２１２がカルボキシル基を含む場合、ライゲーションした標的２１６を、適切にアミンで標識された固体基材を使用して捕捉することができる。ライゲーションした標的２１６の捕捉後、反応物の残り（例えば、ＮＰＰＦ  ２０２）を除去することができる（例えば、洗浄することによって）。一部の例では、ライゲーションした標的２１６を、濾過を使用して捕捉する。
【０１７７】
図９Ａのステップ５に示されている通り、次いで、単離されたライゲーションした標的２１６（またはそのアンプリコン）について配列決定する。一部の例では、複数のライゲーションした標的について並行して、例えば、同時にまたは同時期に配列決定する。したがって、この方法を使用して、複数のライゲーションした標的配列について配列決定することができる。
【０１７８】
任意選択で、ライゲーションした標的２１６を、配列決定前に増幅する（例えば、ＰＣＲを使用して）、洗浄する、またはその両方を行う。一部の例では、例えば、少なくとも１つの隣接配列または捕捉用配列がｄＵＴＰを含む場合、ＮＰＰＦ  ２０２を、ウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を用いて分解する。そのような分解は、増幅前または増幅中に生じさせることができる。標的がＲＮＡである場合などの一部の例では、逆転写ステップを増幅の一部として含めることができる。したがって、次いで、結果として得られた、ライゲーションした標的アンプリコン２２６について配列決定することができる。ＰＣＲプライマーまたはプローブは、１つまたは複数の実験タグ２２２、２２４および／または配列決定アダプター２１８、２２０（例えば、ライゲーションした標的について特定の配列決定プラットフォームによって配列決定することを可能にするものであり、したがって、そのようなアダプターは、配列決定チップ上の捕捉用配列と相補的である）を含んでよい。ＰＣＲプライマー／プローブの少なくとも一部分は、５ＣＦＳ  ２０８および／または３ＣＦＳ  ２１０に特異的である。一部の例では、プライマーの濃度は、ライゲーションした標的２１６よりも過剰であり、例えば、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも１５０，０００倍、少なくとも２００，０００倍、少なくとも４００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、少なくとも６００，０００倍、少なくとも８００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍過剰である。一部の例では、反応物中のプライマー２０８の濃度は、少なくとも２００ｎＭ（少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも６００ｎＭ、少なくとも７５０ｎＭ、または少なくとも１０００ｎＭなど）である。
【０１７９】
図９Ｂ〜９Ｄに示されている通り、ライゲーション（例えば、図９Ａのステップ３）前の時点（複数可）で、標的（図９Ａの２００）および標的に付着／ハイブリダイズした他の分子を回収または捕捉し（ステップ３２０）、したがって、試料中の残りの薬剤（例えば、ハイブリダイズしていない材料）を除去し、新しい試薬を添加することが可能になる。さらに、標的を捕捉することにより、その後、標的にハイブリダイズしたまたは他の様式で付着した核酸分子を洗浄すること（例えば、残留する酵素を不活性化または除去するため）が可能になる。
【０１８０】
一例では、標的を、ハイブリダイゼーション時に回収または捕捉する（図９Ｂ）。図９Ｂに示されている通り、任意選択の変性３００の後、標的を含有する試料を、ＮＰＰＦおよびＣＦＳ（複数可）と一緒に、ハイブリダイゼーション３１０が可能になり、それにより、ハイブリダイズした複合体が生じる条件下でインキュベートする。そのような例では、標的を、それがハイブリダイズするＮＰＰＦ、およびＮＰＰＦとハイブリダイズすることができるＣＦＳ（複数可）と一緒に、結果として得られたハイブリダイズした複合体３２０の捕捉を可能にする材料を含有する固体支持体の存在下でインキュベートする。例えば、３ＣＳＦ、５ＣＳＦ、および／またはＮＰＰＦ上に存在する捕捉用部分（例えば、図９Ａの２１２）を固体支持体として利用することができる。例えば、捕捉用部分がビーズまたはプレート（例えば、ＣＦＳ上のアミノ基とビーズ上のカルボキシなどのカルボキシ−アミン連結を使用してＣＦＳに付着させる）である場合、固体支持体は、ビーズまたはプレートである。この場合、捕捉用部分／固体支持体により、ハイブリダイズした複合体が固体支持体と結合することが可能になる（例えば、ＮＰＰＦが固体支持体に付着したＣＦＳとハイブリダイズし、標的および他のＣＦＳがＮＰＰＦにハイブリダイズするので）。方法は、ハイブリダイゼーションの後に洗浄ステップを含んでよい。ヌクレアーゼ消化３３０、洗浄３４０、ライゲーション３５０、ＵＤＧ消化３７０（任意選択、ＮＰＰＦがｄＵＴＰを含む場合のみ）、および／またはＰＣＲ増幅３８０などのその後のステップの１つまたは複数を、試薬を除去し、そして試薬を捕捉された標的に添加することを可能にする固体支持体の存在下で行うことができる。
【０１８１】
一例では、標的を、ヌクレアーゼ処理の後（例えば、図９Ａのステップ２の後）であるが、ライゲーションの前（例えば、図９Ａのステップ３の前）に回収または捕捉する（図９Ｃ）。図９Ｃに示されている通り、任意選択の変性４００、ハイブリダイゼーション４１０、およびヌクレアーゼ消化４３０（ＮＰＰＦ／標的複合体（図９Ａの２１４）が生じる）の後、ＮＰＰＦ／標的複合体をステップ４２０において試料混合物から回収する。一部の例では、ＮＰＰＦ／標的複合体を、ＣＦＳ上の捕捉用部分を使用することにより、ＮＰＰＦ／標的２重鎖のｓｓ核酸分子への分離を伴わずに回収する。例えば、３ＣＳＦ、５ＣＳＦ、および／またはＮＰＰＦ上に存在する捕捉用部分（例えば、図９Ａの２１２）を固体支持体として利用することができる。例えば、捕捉用部分がビーズまたはプレート（例えば、ＣＦＳ上のアミノ基とビーズ上のカルボキシなどのカルボキシ−アミン連結を使用してＣＦＳに付着させる）である場合、固体支持体は、ビーズまたはプレートである。この場合、捕捉用部分／固体支持体は、ＮＰＰＦ／標的複合体の一部であり、これにより、その捕捉または回収が可能になる。方法は、回収の後に洗浄ステップ４４０を含んでよい。ライゲーション４５０、洗浄４６０、ＵＤＧ消化４７０（任意選択、ＮＰＰＦがｄＵＴＰを含む場合のみ）、および／またはＰＣＲ増幅４８０などのその後のステップの１つまたは複数を、試薬を除去し、そして試薬を捕捉された標的に添加することを可能にする固体支持体の存在下で行うことができる。
【０１８２】
一例では、標的を、ハイブリダイゼーションの後（例えば、図９Ａのステップ１の後）であるがヌクレアーゼ消化の前（例えば、図９Ａのステップ２の前）に回収または捕捉する（図９Ｄ）。図９Ｄに示されている通り、ハイブリダイズした複合体を生じる、任意選択の変性５００およびハイブリダイゼーション５１０の後、結果として得られたハイブリダイズした複合体をステップ５２０において試料混合物から回収する。一部の例では、ハイブリダイズした複合体を、ＣＦＳ上の捕捉用部分を使用することによって回収する。例えば、３ＣＳＦ、５ＣＳＦ、および／またはＮＰＰＦ上に存在する捕捉用部分（例えば、図９Ａの２１２）を固体支持体として利用することができる。例えば、捕捉用部分がビーズまたはプレート（例えば、ＣＦＳ上のアミノ基とビーズ上のカルボキシなどのカルボキシ−アミン連結を使用してＣＦＳに付着させる）である場合、固体支持体は、ビーズまたはプレートである。この場合、捕捉用部分／固体支持体は、ハイブリダイズした複合体の一部であり、これにより、その捕捉または回収が可能になる。方法は、回収後に洗浄ステップを含んでよい。ヌクレアーゼ消化５３０、ライゲーション５５０、洗浄５４０、５６０、ＵＤＧ消化５７０（任意選択、ＮＰＰＦがｄＵＴＰを含む場合のみ）、および／またはＰＣＲ増幅５８０などのその後のステップの１つまたは複数を、試薬を除去し、そして試薬を捕捉された標的に添加することを可能にする固体支持体の存在下で行うことができる。
【０１８３】
Ｂ．遺伝子発現を検出するためのタンパク質
開示されている方法の一部の実施形態では、試料中の遺伝子発現レベルを決定するステップは、試料中の１つまたは複数のタンパク質を検出すること（例えば、そのようなタンパク質の相対的なまたは実際の量を決定することによって）を含む。常套的なタンパク質の検出方法は、当技術分野で公知であり、本開示は特定のタンパク質検出方法に限定されない。
【０１８４】
ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫ブロットアッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、化学発光アッセイおよび他のペプチド検出戦略などのイムノアッセイにおいて使用される標的タンパク質（表１のものなど）に特異的なタンパク質特異的結合剤（抗体またはアプタマーなど）によって認識される新規のエピトープにより、試料中のタンパク質遺伝子産物（例えば、表１のもの）を検出することができ、タンパク質発現のレベルを決定することができる。一般に、これらの方法では、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が利用される。
【０１８５】
したがって、一部の実施形態では、生体試料中に存在する標的タンパク質発現のレベル（表１のものなど）、したがって、発現したタンパク質の量を、検出可能に標識することが可能な抗体またはその断片などの標的タンパク質特異的結合剤を使用して検出する。一部の実施形態では、特異的な結合剤は、標的タンパク質（表１のものなど）に特異的に結合する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などの抗体である。したがって、ある特定の実施形態では、生体試料中のタンパク質のレベルまたは量を決定するステップは、対象由来の試料をタンパク質特異的結合剤（表１に示されているタンパク質に特異的に結合する抗体など）と接触させること、結合剤と試料が結合したかどうかを検出し、それにより、試料中に存在するタンパク質の量を測定することを含む。一実施形態では、特異的な結合剤は、標的タンパク質（表１のものなど）に特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。表１のものなどの標的タンパク質に対する抗体に関しては商業的供給源が存在することが当業者には理解されよう。
【０１８６】
標的タンパク質（表１のものなど）の存在は、１種、２種、３種、またはそれより多い特異的な結合剤などの多数の特異的な結合剤を用いて検出することができる。したがって、方法では、１種より多い抗体を利用することができる。一部の実施形態では、抗体の１つをマルチウェルプレート（マイクロタイタープレートなど）、ビーズ、メンブレンなどの固体支持体に付着させる。実際には、マイクロタイタープレートを固相として都合よく利用することができる。しかし、抗体反応を液相で行うこともできる。
【０１８７】
一部の例では、方法は、試料を、標的タンパク質（表１のものなど）に特異的に結合する第１の抗体に特異的に結合する第２の抗体に接触させることを含んでよい。一部の例では、第２の抗体を、例えば、フルオロフォア（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、蛍光タンパク質など）、酵素（ＨＲＰなど）、放射性標識、またはナノ粒子（例えば、金粒子または半導体ナノ結晶、例えば、量子ドット（ＱＤＯＴ（登録商標）））を用いて検出可能に標識する。この方法では、抗体に結合している酵素を、色素形成基質などの適切な基質と、例えば、分光光度測定によって、蛍光定量的に、または視覚的手段によって検出することができる化学的部分が生じるように反応させる。抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素としては、これだけに限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。検出は、酵素に対する色素形成基質を用いる比色法によって達成することができる。
【０１８８】
検出は、基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準物質と比較する視覚的な比較によって達成することもできる。蛍光化合物を用いて抗体を標識することも可能である。例示的な蛍光標識用化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、テキサスレッドおよびフルオレスカミンが挙げられる。抗体はまた、１５２Ｅｕ、またはランタニド系列の他のものなどの蛍光放出性金属を使用して検出可能に標識することもできる。抗体とコンジュゲートすることができる他の金属化合物としては、これだけに限定されないが、フェリチン、コロイド金、例えばコロイド超常磁性ビーズが挙げられる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのような金属キレート化基を使用して抗体に付着させることができる。抗体はまた、化学発光化合物とカップリングすることによって検出可能に標識することもできる。化学発光標識用化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。同様に、生物発光化合物を使用して抗体を標識することができる。一例では、抗体を、ルシフェリン、ルシフェラーゼまたはエクオリンなどの生物発光化合物を用いて標識する。抗体とコンジュゲートすることができるハプテンとして、これだけに限定されないが、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサゾロン（ｏｘａｚａｌｏｎｅ）、およびニトロフェノールが挙げられる。抗体とコンジュゲートするまたはそれに組み入れられることができる放射性化合物としては、これだけに限定されないが、テクネチウム９９ｍ（９９Ｔｃ）、１２５Ｉ、ならびに、これだけに限定されないが、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓを含めた任意の放射性ヌクレオチドを含むアミノ酸が挙げられる。
【０１８９】
一般に、タンパク質（表１のものなど）についてのイムノアッセイは、一般には、生体試料を抗体の存在下でインキュベートし、結合した抗体を当技術分野で周知のいくつかの技法のいずれかによって検出することを含む。一例では、生体試料（メラニン細胞を含有するものなど）を、ニトロセルロースもしくはマルチウェルプレートなどの固相支持体もしくは担体、または細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することが可能な他の固体支持体と接触させ、その上に固定化することができる。次いで、支持体を適切な緩衝液で洗浄し、その後、標的タンパク質（表１のものなど）に特異的に結合する抗体を用いて処理することができる。次いで、固相支持体を緩衝液で二度目に洗浄して、結合していない抗体を除去することができる。抗体が直接標識されている場合、次いで、固体支持体に結合した標識の量を従来の手段によって検出することができる。抗体が標識されていない場合、標的タンパク質（表１のものなど）に特異的に結合する抗体を検出する、標識された第２の抗体を使用することができる。
【０１９０】
あるいは、抗体を固体支持体に固定化し、次いで、組織生検材料などの生体試料から単離されたタンパク質と、抗体とタンパク質が互いと特異的に結合することが可能になる条件下で接触させる。次いで、結果として得られた抗体：タンパク質複合体を、例えば、タンパク質に特異的な別の抗体を添加すること（したがって、抗体：タンパク質：抗体サンドイッチを形成させること）によって検出することができる。添加された第２の抗体が標識されている場合、複合体を検出することができ、あるいは、添加された第２の抗体に対して特異的である、標識された二次抗体を使用することができる。
【０１９１】
固相支持体または担体としては、試料、抗原または抗体を結合させることが可能な材料が挙げられる。例示的な支持体として、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩ならびに磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、ある程度まで可溶性であるか不溶性であるかのいずれであってもよい。支持材料は、カップリングした分子がその標的（抗体またはタンパク質など）と結合することが可能である限りは、事実上あらゆる可能性のある構造的構成を有してよい。したがって、支持体の構成は、ビーズのように球状であっても、試験管の内面または棒の外面のように円柱状であってもよい。あるいは、表面は、シートまたは試験ストリップなど、平らであってもよい。
【０１９２】
一実施形態では、標的タンパク質（複数可）を検出するために酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を利用する。ＥＬＩＳＡは、試料中のタンパク質の存在を、例えば標的タンパク質（表１のものなど）に特異的に結合する抗体を使用することによって検出するために使用することができる。一部の例では、抗体を酵素と、例えば、直接コンジュゲートするかまたは二次抗体を通じて連結し、酵素により検出可能なシグナルに変換することが可能な物質を添加する。したがって、蛍光ＥＬＩＳＡの場合では、試料に適切な波長の光を放つと、あらゆる抗原：抗体複合体が蛍光を発し、したがって、蛍光の大きさによって試料中の抗原の量を推定することができる。タンパク質（メラニン細胞を含有する試料から抽出または単離されたタンパク質など）を、通常、非特異的に（例えば、表面への吸着によって）または特異的に（例えば、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおいて同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉によって）、固体支持体（例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレート）上に固定化する。一般には、各ステップの間に、プレートを、ＮＰ４０またはＴＷＥＥＮを伴うまたは伴わないリン酸緩衝食塩水などの弱い界面活性剤溶液を用いて洗浄して、特異的に結合していないあらゆるタンパク質または抗体を除去する。最終的な洗浄ステップの後、プレートを、酵素の基質を添加することによって展開して、試料中のタンパク質の数量を示す可視シグナルを生じさせる。
【０１９３】
検出は、種々の他のイムノアッセイのいずれかを使用して達成することもできる。例えば、抗体または抗体断片を放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用することによってフィンガープリント遺伝子野生型または変異体ペプチドを検出することが可能になる。別の例では、感度が高く特異的なタンデムイムノラジオメトリックアッセイを使用することができる（ＳｈｅｎおよびＴａｉ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６１巻：２５号、１１５８５〜１１５９１頁、１９８６年を参照されたい）。放射性同位元素は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０１９４】
一例では、分光測定法を利用して標的タンパク質（表１のものなど）の発現レベルを検出または定量化する。例示的な分光測定法としては、質量分析、核磁気共鳴分光測定、およびこれらの組み合わせが挙げられる。一例では、質量分析を使用して生体試料中の標的タンパク質（表１のものなど）の存在を検出する。
【０１９５】
標的タンパク質（表１のものなど）は、免疫親和性アッセイとカップリングさせた質量分析アッセイ、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）によって分離されたタンパク質のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量マッピングおよび液体クロマトグラフィー／四重極飛行時間型エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＬＣ／Ｑ−ＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）配列タグの使用によって検出することもできる。
【０１９６】
ＳＥＬＤＩなどの定量的質量分光法を使用して、試料中のタンパク質発現を分析することができる。一例では、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用することにより、表面増強レーザー脱離−イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を使用して、タンパク質発現を検出する。そのような方法は当技術分野で周知である。ＳＥＬＤＩは、分析物が、分析物の捕捉または脱離を増強する表面上のエネルギーの流れに提示される、脱離の固相方法である。
【０１９７】
簡単に述べると、ＳＥＬＤＩの１つのバージョンでは、表２〜８のいずれかのものなどの目的の分析物を選択的に捕捉する化学的性質を有するクロマトグラフィー表面を使用する。クロマトグラフィー表面は、疎水性、親水性、イオン交換、固定化された金属、または他の化学物質で構成されていてもよい。例えば、表面の化学的性質としては、分析物の共有結合または非共有結合による固定化の酸素依存性、炭素依存性、硫黄依存性、および／または窒素依存性手段に基づく結合機能性が挙げることができる。タンパク質−タンパク質相互作用およびタンパク質−ＤＮＡ相互作用などの生体分子相互作用研究に使用されることも多い抗体、受容体、またはオリゴヌクレオチドなどの特定の「ベイト」分子を共有結合により固定するために活性化された表面を使用する。
【０１９８】
表面の化学的性質により、結合した分析物を保持し、結合していない材料を洗い流すことが可能になる。その後、表面に結合した分析物（表１のものなど）を脱離させ、いくつかの手段のいずれかによって、例えば、質量分析を使用して分析することができる。レーザー脱離／イオン化質量分析においてなど、脱離のプロセスにおいて分析物をイオン化する場合、検出器はイオン検出器であってよい。質量分析計は、一般に、脱離したイオンの飛行時間を決定するための手段を含む。この情報を質量に変換する。しかし、脱離したイオンを分解し検出するためにその質量を決定する必要はない。イオン化された分析物が違う時間に検出器に衝突するという事実から、それらの検出および分解がもたらされる。あるいは、分析物を検出可能に標識することができる（例えば、フルオロフォアまたは放射性同位元素を用いて）。これらの場合、検出器は、蛍光検出器であっても放射能検出器であってもよい。アレイ内の各位置に保持される分子と会合する分析物の成分および機能を十分に調べるために、複数の検出手段を順次実装することができる。
【０１９９】
したがって、特定の例では、クロマトグラフィー表面は、標的タンパク質（表１のものなど）に特異的に結合する抗体を含む。他の例では、クロマトグラフィー表面は、標的タンパク質（表１のものなど）に特異的に結合する抗体から本質的になる、またはそれからなる。一部の例では、クロマトグラフィー表面は、正規化タンパク質（例えば、表１のもの）などの他の分子に結合する抗体を含む。
【０２００】
別の例では、細菌Ｆｃ結合性支持体を使用して抗体を表面上に固定化する。クロマトグラフィー表面を母斑の試料などの試料と一緒にインキュベートする。試料中に存在する抗原は、クロマトグラフィー表面上の抗体を認識することができる。結合していないタンパク質および質量分析に干渉する化合物を洗い流し、クロマトグラフィー表面上に保持されているタンパク質をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって分析し、検出する。次いで、試料からのＭＳプロファイルを、示差的なタンパク質発現マッピングを使用して比較し、それによって、特定の分子量のタンパク質の相対的な発現レベルを種々の統計学的技法およびはバイオインフォマティクスソフトウェアシステムによって比較することができる。
【０２０１】
あるいは、標的タンパク質の量は、蛍光法を使用して決定することができる。例えば、量子ドット（例えば、Ｑｄｏｔｓ（登録商標）標識）は、増大している免疫組織化学、フローサイトメトリー、およびプレートに基づくアッセイを含めた適用の一覧において有用であり、したがって、本開示と併せて使用することができる。量子ドットナノ結晶は、感度および定量化に関しては非常に明るいシグナル；ならびにイメージングおよび分析に関しては高い光安定性を含めた独特の光学的特性を有する。単一の励起源が必要であり、増大している様々なコンジュゲート（例えば、抗体コンジュゲート）により、それらが広範囲の適用において有用になっている。量子ドットからの放出は狭く対称的であり、これは、はるかに多くの色を同時に使用することができるという事実にもかかわらず、他の色との重複が最小化され、その結果、近接する検出チャネルへの流出が最小になり、クロストークが減弱することを意味する。例えば、ＩＨＣは、量子ドットとコンジュゲートした二次抗体またはストレプトアビジンとコンジュゲートした量子ドットをビオチン標識された一次抗体または二次抗体と組み合わせて用いて実施することができる。
【０２０２】
Ｃ．任意選択のアッセイ制御措置
任意選択で、遺伝子発現産物（例えば、核酸（ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡなど）またはタンパク質）を検出するために使用するアッセイは、アッセイの性能を評価するために使用される陽性および陰性プロセス対照エレメントを含む。
【０２０３】
陽性対照は、アッセイ（または試料）に含まれ、標的（複数可）と並行して検出することができ、そのような標的（複数可）の検出に干渉（例えば、交差反応）しない、好ましくは標的と同様の性質の任意の公知のエレメントであってよい（例えば、ＲＮＡ標的であれば、ＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）陽性対照）。一例では、陽性対照は、別の試料として並行して実行される、または各試料中に既知量で「スパイク」されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物（ＩＶＴ）である。そのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物についての陽性結果を確実にするために、ＩＶＴに特異的な結合剤（例えば、ＮＰＰまたはＮＰＰＦなどのオリゴヌクレオチドプローブ）、該当する場合にはＩＶＴに特異的な検出剤も各アッセイに含める。
【０２０４】
一部の状況では、例えば、正規化群を分析することにより、そうでなければ制御されない予想外のプロセスに関連する問題から異常なシグナルがもたらされる可能性があり、したがって、一部の実施形態では、任意の検体に対するアッセイの成功または失敗を、検体の安定性、完全性、またはインプットレベルに関係なく示すために、試料に依存しないプロセス対照エレメント（複数可）を含めることが有用である。核酸遺伝子発現産物を検出する方法の実施形態は、アッセイごとに既知濃度のＲＮＡ試料（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物ＲＮＡまたはＩＶＴ）を含んでよい。そのような対照エレメント（例えば、ＩＶＴ）は、各アッセイにおいて測定することができ、アッセイプロセス品質管理として機能する。
【０２０５】
ＲＮＡ遺伝子発現産物を伴う一部の開示されている方法の実施形態は、ユニバーサルヒト参照ＲＮＡを含有する並行処理された試料を含む必要はないが、含んでもよい。そのようなユニバーサルＲＮＡ試料が、適用可能なアッセイによる検出のために標的化されるＲＮＡの全部または一部を含む場合、そのような含められたＲＮＡについての陽性シグナルを予想することができ、これは、ある１つの（または別の）アッセイプロセス品質管理としての機能を果たし得る。
【０２０６】
陰性プロセス対照エレメントとしては、試験試料中で発現することが予想されない遺伝子産物を検出するために設計または選択された分析物に特異的な結合剤（例えば、オリゴヌクレオチドまたは抗体）を挙げることができる。例えば、ヒトトランスクリプトームまたはプロテオームにおける任意の遺伝子発現産物を認識する分析物に特異的な結合剤を多重化アッセイに含めることができる（それぞれヒト遺伝子発現産物が所望の標的である植物または昆虫または線形動物のＲＮＡまたはタンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたは抗体など）。この陰性対照エレメントは、適用可能なアッセイにおいてシグナルを生じさせないはずである。そのような陰性プロセス対照エレメントについてのバックグラウンドを超えるシグナルはいずれもアッセイ失敗の指標である。一例では、陰性対照はＡＮＴである。
【０２０７】
ＩＶ．遺伝子発現データ
遺伝子発現データは、「疾患の予防および治癒、生物学的進化機構ならびに薬物の発見に関する基本的な問題に取り組むための鍵を含有する」（ＬｕおよびＨａｎ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２８巻：２４３〜２６８頁（２００３年））。一部の例では、そのようなデータから情報を引き出すことは、検出された１種または複数の遺伝子産物の有無または定性的な量（例えば、高い、中程度である、低い）から定性的決定を行うほど単純である。他の例では、未加工の遺伝子発現データを前処理すること（例えば、バックグラウンドを差し引くこと、対数変換すること、および／または補正すること）、正規化すること、および／または分類アルゴリズムに適用することができる。しかし、そのようなデータの前処理は任意選択である。
【０２０８】
多くの生物学的変数（例えば、遺伝子発現データ）は、パラメトリックな統計的検定の仮定に合わず、例えば、そのような変数は、正規分布しないか、分散が均一でないか、またはその両方である（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１８巻：Ｓ１０５頁（２００２年）。一部の場合では、データを変換することにより、統計学的仮定により良好にフィットするようになる。一部の方法の実施形態では、有用なデータ変換は、（ｉ）各観察の対数、例えば、１０を底とする対数、２を底とする対数、ｅを底とする対数（自然対数としても公知）をとること；そのような対数は定数因子により異なるので対数選択による差異はない；または、例えばＤｕｒｂｉｎ（上記）により記載されている分散安定化変換（ｖａｒｉａｎｃｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）からなる対数変換を含んでよい。具体的な例では、そのような方法において検出された各バイオマーカー（例えば、表１の少なくとも２つのバイオマーカー）についての未加工の発現値を対数（例えば、ｌｏｇ２またはｌｏｇ１０）変換する。発現の計数／読み取りを算出する場合、変換は、各試料についての総読み取りを含んでよく、この値を百万の読み取り当たりにスケール調整する：遺伝子レベルの読み取りを試料についての総読み取りと比較して比例的に評価し、ｌｏｇ２変換し、百万当たりの計数（ＣＰＭ）の２が底の対数、
【化２】
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（式中、ｒｇｉは、各試料についてマッピングされた読み取りの数（ライブラリー計数）（Ｒｉ、比例的な読み取り  対  ライブラリーサイズの比がゼロよりも大きくなることを確実にするために定数１でスケール調整したもの）について調整した、各プローブ（ｇ）および試料（ｉ）についての配列読み取りの数（ゼロ計数を回避するためにスケール調整したもの）である）を得る。
【０２０９】
Ｖ．方法の実装
本明細書に記載の分類指標を伴うものなどの方法は、多数の様式で実装することができる。いくつかの代表的な非限定的な実施形態が下に記載されている。一部の方法の実施形態では、遺伝子発現データを、多数の遺伝子発現データ点を収集し、処理する場合に特に有利である、本明細書に記載の種々のアルゴリズムを適用するためのコンピューターまたは他のデバイス、マシンもしくは器具にインプットする（例えば、手動でまたは自動的に）。したがって、一部の例では、開示されている方法を使用して得られる遺伝子発現データまたは確率の値をコンピューターメモリに記憶させる。他の実施形態は、通信基盤、例えば、インターネットの使用を伴う。特定の分類指標および方法の実施形態を実装するために様々な形態のハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、プロセッサー、またはこれらの組み合わせが有用である。ソフトウェアは、プログラムストレージデバイス、または、ユーザーの計算処理環境（例えば、アプレットとして）および関連するリモートサイト（例えば、サービス提供者の施設）に位置していてよいレビュアーの計算処理環境で実装されるソフトウェアの異なる部分に明確に具体化されたアプリケーションプログラムとして実装することができる。
【０２１０】
例えば、ユーザーによるデータインプット中またはその後に、ユーザー側の計算処理環境においてデータ処理の一部分を実施することができる。例えば、ユーザー側の計算処理環境を、可能性「スコア」を示す定義された試験コードがもたらされるようにプログラムすることができ、スコアは、レビュアーの計算処理環境に、処理されたまたは部分的に処理された応答として、レビュアーの計算処理環境において結果を提供し、かつ／またはレポートを作成するためのその後の１つまたは複数のアルゴリズムの実行のための試験コードの形態で伝達される。スコアは、数値スコア（数値を表す）であっても数値または数値の範囲を表す非数値スコア（例えば、ある転帰の可能性が９０〜９５％であることを表す「Ａ」）であってもよい。
【０２１１】
本明細書に記載のアルゴリズムを実行するためのアプリケーションプログラムを任意の適切なアーキテクチャを含むマシンにアップロードし、それにより実行させることができる。一般に、マシンは、１つまたは複数の中央処理装置（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、およびインプット／アウトプット（Ｉ／Ｏ）インターフェース（複数可）などのハードウェアを有するコンピュータープラットフォームを伴う。コンピュータープラットフォームは、オペレーティングシステムおよびマイクロ命令コードも含む。本明細書に記載の種々のプロセスおよび機能は、オペレーティングシステムを介して実行されるマイクロ命令コードの一部またはアプリケーションプログラムの一部のいずれか（またはこれらの組み合わせ）であってよい。さらに、追加的なデータストレージデバイスおよび印刷デバイスなどの種々の他の周辺機器をコンピュータープラットフォームに接続することができる。
【０２１２】
コンピューターシステムとして、システムは、一般に、プロセッサーユニットを含む。プロセッサーユニットは、情報を受信するように作動し、情報は、試験データ（例えば、応答遺伝子のレベル、参照遺伝子産物（複数可）のレベル；応答遺伝子の正規化されたレベルを含んでよく、また、患者データなどの他のデータも含んでよい。この受信された情報をデータベース内に少なくとも一時的に記憶させ、上記の通りデータを分析してレポートを作成することができる。
【０２１３】
インプットデータおよびアウトプットデータの一部または全部を電子的に送信することもでき、ある特定のアウトプットデータ（例えば、レポート）を電子的にまたは電話によって（例えば、ファックスバックなどのデバイスを使用してファクシミリによって）送信することができる。例示的なアウトプット受信デバイスとしては、ディスプレイエレメント、プリンター、ファクシミリデバイスなどを挙げることができる。伝達および／またはディスプレイの電子形式としては、電子メール、インタラクティブテレビなどを挙げることができる。一実施形態では、インプットデータの全部もしくは一部分および／または、アウトプットデータ（例えば、通常は少なくとも最終的なレポート）の全部もしくは一部分を、典型的なブラウザーを用いたアクセス、好ましくは機密アクセス用のウェブサーバー上で維持する。所望の通り、医療従事者がデータにアクセスするまたは医療従事者にデータを送信することができる。最終的なレポートの全部または一部分を含むインプットデータおよびアウトプットデータを使用して患者の医療記録を格納する（ｐｏｐｕｌａｔｅ）ことができ、これは、健康管理施設における機密のデータベース内に存在してよい。一部の例では、方法は、レポートを作成することを含む。一部の例では、レポートは、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬに対して「ＡＢＣ」またはＧＣＢ  ＤＬＢＣＬに対して「ＧＣＢ」などの、試料の分類を示すアイコンを含む。
【０２１４】
本明細書に記載の方法において使用するためのシステムは、一般に、少なくとも１つのコンピュータープロセッサー（例えば、方法の全体が単一の場所において行われる場合）または少なくとも２つのネットワーク化されたコンピュータープロセッサー（例えば、ユーザー（本明細書では「クライアント」とも称される）によりデータがインプットされ、分析用の第２のコンピュータープロセッサーのためにリモートサイトに伝達される場合、第１のコンピュータープロセッサーと第２のコンピュータープロセッサーがネットワークによって、例えば、イントラネットまたはインターネットを介して接続される場合）を含む。システムは、インプットのためのユーザーコンポーネント（複数可）；ならびにデータ、作成されたレポートの精査および手動介入のためのレビュアーコンポーネント（複数可）も含んでよい。システムの追加的なコンポーネントとして、サーバーコンポーネント（複数可）；およびデータを記憶するためのデータベース（複数可）（例えば、レポートエレメント、例えば、解釈のレポートエレメントのデータベース、またはユーザーによるデータインプットおよびデータアウトプットを含んでよいリレーショナルデータベース（ＲＤＢ）におけるような）を挙げることができる。コンピュータープロセッサーは、一般には、パーソナルデスクトップコンピューター（例えば、ＩＢＭ、Ｄｅｌｌ、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）、携帯型コンピューター、メインフレーム、ミニコンピューター、タブレット、または他の計算処理デバイスに見られるプロセッサーであってよい。
【０２１５】
ネットワーク化されたクライアント／サーバーアーキテクチャを所望の通り選択することができ、これは、例えば、古典的な２段または３段クライアントサーバーモデルであってよい。アプリケーションサーバーコンポーネントの一部としてまたは別のコンポーネント（ＲＤＢマシン）としてのリレーショナルデータベース管理システム（ＲＤＭＳ）により、データベースにインターフェースがもたらされる。
【０２１６】
一例では、アーキテクチャは、クライアントアプリケーションが、一般に、データベース（またはデータベースサーバー）に必要に応じて種々のレポートエレメント、特に解釈のレポートエレメント、とりわけ解釈テキストおよびアラートを有するレポートを格納するように要求するアプリケーションサーバーからのサービスを要求する、データベースセントリッククライアント／サーバーアーキテクチャとして提供される。サーバー（複数可）（例えば、アプリケーションサーバーマシンの一部または別のＲＤＢ／リレーショナルデータベースマシンとして）がクライアントの要求に応答する。
【０２１７】
インプットクライアントコンポーネントは、アプリケーションを実行するための最大限の電源および特徴を提供する完全な独立型のパーソナルコンピューターであってよい。クライアントコンポーネントは、通常、任意の所望のオペレーティングシステムの下で作動し、通信エレメント（例えば、ネットワークに接続するためのモデムまたは他のハードウェア）、１つまたは複数のインプットデバイス（例えば、キーボード、マウス、キーパッド、または情報もしくはコマンドを転送するために使用する他のデバイス）、ストレージエレメント（例えば、ハードドライブまたは他のコンピューター可読のコンピューターに書き込み可能な記憶媒体）、およびディスプレイエレメント（例えば、モニター、テレビ、ＬＣＤ、ＬＥＤ、または情報をユーザーに伝える他のディスプレイデバイス）を含む。ユーザーは、コンピュータープロセッサーにインプットデバイスを通じてインプットコマンドを入力する。一般に、ユーザーインターフェースは、ウェブブラウザーアプリケーションのために書かれたグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）である。
【０２１８】
サーバーコンポーネント（複数可）は、パーソナルコンピューター、ミニコンピューター、またはメインフレームであってよく、データ管理、クライアント間での情報共有、ネットワーク管理およびセキュリティを提供する。使用するアプリケーションおよび任意のデータベースは、同じまたは異なるサーバー上にあってもよい。
【０２１９】
メインフレームなどの単一のマシン上での処理、マシンの集合、または他の適切な構成を含めた、クライアントおよびサーバー（複数可）に対する他の計算処理アレンジメントが意図されている。一般に、クライアントおよびサーバーマシンは共に働いて本開示の処理を達成する。
【０２２０】
使用される場合、データベース（複数可）は、通常、データベースサーバーコンポーネントに接続され、データを保持する任意のデバイスであってよい。例えば、データベースは、コンピューター用の任意の磁気または光学記憶デバイス（例えば、ＣＤＲＯＭ、内部ハードドライブ、テープドライブ）であってよい。データベースは、サーバーコンポーネントに対してリモートに（ネットワーク、モデムなどを介してアクセスする）、またはサーバーコンポーネントに対してローカルに設置することができる。
【０２２１】
システムおよび方法に使用される場合、データベースは、データ項目間の関係に応じて組織化され、アクセスされるリレーショナルデータベースであってよい。リレーショナルデータベースは、一般に、複数の表（実体）で構成される。表の行は、記録（別々の項目に関する情報の集合）を表し、列はフィールド（記録の特定の属性）を表す。その最も単純な概念では、リレーショナルデータベースは、少なくとも１つの共通するフィールドを通じて互いと「関連する」データエントリーの集合である。
【０２２２】
データを入力するサービスの時点で、および、一部の実施形態では、所望であれば適切なレポートを作成する時点で、コンピューターおよびプリンターを備えた追加的なワークステーションを使用することができる。コンピューター（複数可）は、アプリケーションを起動して、所望の通り、データエントリー、伝達、分析、レポート受信などの開始を容易にするためのショートカット（例えば、デスクトップ上に）を有してよい。
【０２２３】
１．コンピューター可読記憶媒体
本開示は、計算処理環境において実行されると本明細書に記載の応答可能性評価の結果の全部または一部分を行うためのアルゴリズムの実装をもたらすプログラムが記憶されたコンピューター可読記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、メモリキー、フラッシュメモリカード、ディスケットなど）も意図している。コンピューター可読媒体が本明細書に記載の方法を行うための完全なプログラムを含有する場合、プログラムは、アウトプットを収集、分析、および生成するためのプログラム指示を含み、一般に、本明細書に記載の通りユーザーと対話し、そのデータを分析情報と併せて処理し、そのユーザーに対する独特の印刷されたまたは電子媒体を生成するためのコンピューター可読コードデバイスを含む。
【０２２４】
記憶媒体が、本明細書に記載の方法の一部分（例えば、方法のユーザー側面（例えば、データインプット、レポート受信能など）の実装をもたらすプログラムを提供する場合、プログラムにより、ユーザーによるデータインプットの伝達（例えば、インターネットを介して、イントラネットを介してなど）がリモートサイトにおける計算処理環境にもたらされる。データの処理または処理の完了をリモートサイトで行ってレポートを作成することができる。完全なレポートをもたらすためのレポートの精査および任意の必要な手動介入の完了後、次いで、完全なレポートをユーザーに電子文書または印刷された文書（例えば、ファックスまたは郵送される紙レポート）として伝達し戻すことができる。本明細書に記載のプログラムを含有する記憶媒体は、適切な基材に記録された指示（例えば、プログラムのインストール、使用などに関するもの）またはそのような指示を得ることができるウェブアドレスと共にパッケージ化することができる。コンピューター可読記憶媒体はまた、応答可能性評価を行うための１種または複数の試薬（例えば、プライマー、プローブ、アレイ、または他のそのようなキット成分）と組み合わせて提供することもできる。
【０２２５】
２．アウトプット
一部の実施形態では、特定の試料（患者）についてのスコアが決定されたら、そのスコアの表示を臨床医または他の介護者に提示および／または伝えることができる。例えば、試験の結果を、ユーザー（臨床医または他の医療関係者、検査室職員、または患者など）に、試験の結果に関する情報をもたらす知覚可能なアウトプットで提供する。一部の例では、アウトプットは、紙アウトプット（例えば、書面によるまたは印刷されたアウトプット）、スクリーン上での提示、図式的なアウトプット（例えば、グラフ、チャート、または他の図表）、または可聴アウトプットである。したがって、アウトプットは、作成されたレポートを含んでよい。
【０２２６】
例えば、アウトプットは、テキスト（任意選択で、対応する）スコアであってよい。例えば、テキストアウトプットは、「ＡＢＣ」など、または「ＧＣＢ」など、または「不確定」などであってよい。そのようなテキストアウトプットは、例えば、ＤＬＢＣＬ亜型ＧＣＢであるかＤＬＢＣＬ亜型ＡＢＣであるかの診断をもたらすために使用することもでき、単に臨床医が亜型ＡＢＣとＧＣＢを区別するのを補助するために使用することもできる。
【０２２７】
他の例では、アウトプットは、予測確率の値などの数値（例えば、定量的アウトプット）である。追加的な例では、アウトプットは、グラフ表示、例えば、予測確率を示すグラフである。特定の例では、アウトプット（図式的なアウトプットなど）は、試験した試料をＡＢＣまたはＧＣＢとして特徴付けるカットオフ値またはレベルを示すまたは提供する。他の例では、アウトプットは、アイコン、例えば、試料がＡＢＣに分類される場合には「ＡＢＣ」、試料がＧＣＢに分類される場合には「ＧＣＢ」、または、試料が未分類に分類される（例えば、ＡＢＣまたはＧＣＢのいずれとも一致しない）場合には「Ｕ」もしくは「？」である。一部の例では、アウトプットをユーザーに、例えば、アウトプットを物理的、可聴、または電子的手段を介して提供することによって（例えば、郵便物、電話、ファクシミリ伝達、電子メール、または電子医療記録への通信によって）通信する。
【０２２８】
一部の例では、アウトプットには、データを解釈するためのガイドライン、例えば、ＤＬＢＣＬがＡＢＣまたはＧＣＢであることを示す数値または他の限界値が伴う。ガイドラインは、ＤＬＢＣＬがＡＢＣであるかＧＣＢであるかを特定する必要はないが、そのような診断を含んでよい。アウトプットにおける指標は、例えば、正常なもしくは異常な範囲またはカットオフを含んでよく、次いで、アウトプットの受信者が、例えば、診断または処置計画に達するために、それを使用して結果を解釈する。他の例では、アウトプットは、推奨される治療レジメンを提供してもよい。一部の例では、試験は、他の臨床的情報の決定（試料中の１種または複数の追加的なＤＬＢＣＬバイオマーカーの量の決定など）を含み得る。
【０２２９】
ＶＩ．遺伝子セットおよび分類指標アウトプットの臨床使用
開示されている遺伝子セットまたは分類指標により、ＤＬＢＣＬ試料をＧＣＢ亜型または非ＧＣＢ亜型（ＡＢＣなど）、または不確定として特徴付ける（例えば、診断する）ことができる。これら（および他の可能性のある）結果のそれぞれは、訓練された臨床専門家にとって有用である。一部の代表的な臨床使用を以下により詳細に記載する。これだけに限定されないが、物理的、可聴、または電子的手段（例えば、郵便物、電話、ファクシミリ伝達、電子メール、または電子医療記録への通信による）を含めた任意の適切な手段によって診断または予後判定を対象（例えば、患者または医師）に提供することができる。
【０２３０】
Ａ．診断指標
診断により、対象（例えば、患者）に、どんな疾患または状態を有しているまたは有している可能性があるかが通知される。本開示全体にわたってより詳細に記載されている通り、ＤＬＢＣＬ亜型を分類する任意の開示されている方法の任意の結果を、例えば対象または医療従事者に、診断として提供することができる。したがって、診断は、ＤＬＢＣＬがＧＣＢ亜型であるか非ＧＣＢ亜型（ＡＢＣなど）であるか、または不確定であるかを決定することを含む。
【０２３１】
Ｂ．予後判定指標
予後判定は、その試料について特定の試験結果（例えば、ＤＬＢＣＬのＧＣＢ亜型または非ＧＣＢ亜型（ＡＢＣなど））を受け取った対象についての可能性のある健康転帰である。予後不良とは、対象についての長期間の見通しが良好でないこと、例えば、１年、２年、３年または５年生存率が５０％またはそれ未満（例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％または１％またはそれ未満）であることを意味する。他方では、予後良好とは、対象についての長期間の見通しがまあまあ〜良好である、例えば、１年、２年、３年または５年生存率が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％または９０％より高いことを意味する。
【０２３２】
ＡＢＣ亜型のＤＬＢＣＬなどの非ＧＣＢ亜型のＤＬＢＣＬは、ＧＣＢ亜型のＤＬＢＣＬよりも予後が不良であることが示されている。したがって、開示されている方法のいずれかによるＡＢＣ亜型のＤＬＢＣＬなどの非ＧＣＢ亜型のＤＬＢＣＬの所見を使用して、試験試料を採取した対象について比較的に予後不良であると予測することができる。逆に、開示されている方法のいずれかによるＧＣＢ亜型のＤＬＢＣＬの所見を使用して、対応する対象について比較的に予後良好であると予測することができる。
【０２３３】
Ｃ．治療的（予測的）指標
開示されている方法は、対象を、それらの対応する試料がＧＣＢ亜型のＤＬＢＣＬまたはＡＢＣ亜型のＤＬＢＣＬなどの非ＧＣＢ亜型のＤＬＢＣＬとして亜型決定された場合、ＧＣＢ亜型のＤＬＢＣＬまたはＡＢＣ亜型のＤＬＢＣＬなどの非ＧＣＢ亜型のＤＬＢＣＬに対する処置のために選択すること（または選択しないこと）をさらに含んでよい。例示的な処置方法を以下のセクションに提供する。したがって、一例では、試料がＧＣＢ亜型のＤＬＢＣＬであると決定される場合、試料を得た対象を、（１）シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンもしくはプレドニゾロン（ＣＨＯＰ）化学療法、（２）リツキシマブ＋ＣＨＯＰ（Ｒ−ＣＨＯＰ）化学療法、または（３）エトポシド＋Ｒ−ＣＨＯＰ（Ｒ−ＥＰＯＣＨ）を用いて処置する。別の例では、試料がＡＢＣ亜型のＤＬＢＣＬであることが決定される場合、試料を得た対象は、ＣＨＯＰまたはＲ−ＣＨＯＰ療法に応答する可能性が低く、そのような対象を、１種または複数の代替療法（本明細書に開示されているものなど）を用いた処置のために選択することができる。
【０２３４】
一部の実施形態では、開示されている方法は、患者の診断に応じて、以下の１つまたは複数も含んでよい：ａ）対象の決定された診断がＧＣＢ亜型のＤＬＢＣＬである場合、対象に対して処置レジメン（例えば、１種または複数の化学療法剤または全身性療法；例えば、ＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＨＯＰ、またはＲ−ＥＰＯＣＨを用いた処置）を処方すること；ｂ）対象の決定された診断がＡＢＣ亜型のＤＬＢＣＬである場合、対象に対して処置レジメンを処方すること；またはｃ）対象の決定された診断がＡＢＣ亜型のＤＬＢＣＬである場合、対象に対して処置レジメンを処方しないこと（ＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＨＯＰ、またはＲ−ＥＰＯＣＨを処方しないことなど）。
【０２３５】
ＶＩＩ．ＤＬＢＣＬを有する対象を処置する方法
一部の実施形態では、ＤＬＢＣＬ亜型の分類後、例えば、対象由来の試料がＧＣＢ  ＤＬＢＣＬまたは非ＧＣＢ（例えば、ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬとしてスコア化された場合、対象を、１種または複数の療法を用いた処置のために選択することができる。さらに、その後、選択された対象に１種または複数の療法を投与することができる。
【０２３６】
一部の例では、対象に、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンもしくはプレドニゾロン（ＣＨＯＰ）化学療法またはリツキシマブ＋ＣＨＯＰ（Ｒ−ＣＨＯＰ）化学療法を投与する。一例では、対象に、Ｒ−ＣＨＯＰに対するエトポシドも投与し、その結果、Ｒ−ＥＰＯＣＨと呼ばれる薬物の組み合わせをもたらす。
【０２３７】
他の例では、対象に、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ＧＡ１０１、トシツモマブ、またはイブリツモマブチウキセタン）、抗ＣＤ２２（例えば、エプラツズマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、ＳＡＲ３４１９またはブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｕｍａｂ））、抗ＣＤ３０（例えば、ブレンツキシマブベドチン）、抗ＣＤ４０（例えば、ダセツズマブまたはルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ））、または抗ＣＤ７０（例えば、ＳＧＮ−７５）などの１種または複数のモノクローナル抗体を投与する。一部の例では、モノクローナル抗体を毒素、放射性標識、または薬物とコンジュゲートする。追加的な例では、対象に、１種または複数のＢｃｌ−２阻害剤（例えば、ＡＢＴ−７３７、オバトクラックス、またはオブリメルセンナトリウム）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、またはデフォロリムス（リダフォロリムス））、Ｓｙｋ阻害剤（例えば、ホスタマチニブ（タマチニブ））、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、プロテインキナーゼＣ阻害剤（例えば、エンザスタウリンまたはソトラスタウリン）、免疫調節剤（例えば、レナリドマイドおよびポマリドマイド）、オーロラＡキナーゼ阻害剤（例えば、アリセルチブ）、またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（例えば、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット、アベキシノスタット、またはエンチノスタット）を投与する。
【０２３８】
一部の例では、対象に、ＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＨＯＰ、またはＲ−ＥＰＯＣＨを第一選択の療法として投与し、再発またはＤＬＢＣＬがＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＨＯＰ、もしくはＲ−ＥＰＯＣＨによる処置に対して不応性の際、上記のものなどの追加的な療法（および一部の例では、幹細胞移植）を投与する。他の例では、Ｒ−ＣＨＯＰまたはＲ−ＥＰＯＣＨおよび上に列挙されている追加的な療法の１つまたは複数をＤＬＢＣＬを有する対象に投与することができる。リツキシマブおよび上に列挙されている追加的な療法の１つまたは複数を対象に投与することもできる。
【０２３９】
ＧＣＢまたは非ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬを有する対象を処置するために使用することができる追加的な療法としては、放射線療法および／または１種もしくは複数の化学療法薬が挙げられる。一部の例では、化学療法剤としては、これだけに限定されないが、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、およびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、およびウラムスチン；代謝拮抗物質、例えば、葉酸（例えば、メトトレキセート、ペメトレキセド、およびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、およびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、およびゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシド、およびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）；細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン）、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、およびマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、およびトラスツズマブ；光増感剤、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、およびベルテポルフィン；ならびに、他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、およびトレチノインが挙げられる。
【０２４０】
対象を、上記の療法の１つまたは複数を含めた療法の組み合わせを用いて処置することができる。具体的な例では、対象に、プロテインキナーゼＣ阻害剤を、リツキシマブ、ゲムシタビン、およびオキサリプラチン（Ｒ−ＧＥＭＯＸ）と組み合わせて投与することができる。別の具体的な例では、対象に、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブなど）を、Ｒ−ＣＨＯＰと組み合わせてまたはエトポシド、ビンクリスチン、およびドキソルビシン＋シクロホスファミドおよびプレドニゾン（ＥＰＯＣＨ）と組み合わせて投与することができる。具体的な例では、対象に、Ｒ−ＡＣＶＢＰ（リツキシマブ＋ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンデシン、ブレオマイシン、およびプレドニゾン）を投与する。
【０２４１】
当業者は、対象に対して適切な療法、投与量、および投薬スケジュールを選択することができる。必要な用量は、対象の種、年齢、体重および全身状態、使用される特定の治療剤（複数可）、ならびに投与の形式（複数可）に応じて対象間で変動する。
【０２４２】
発現を検出するためのアレイ
例えば、ＤＬＢＣＬを有する対象におけるＤＬＢＣＬ亜型の決定における使用のための、遺伝子発現（表１のバイオマーカーの２種またはそれより多い発現など）を検出または測定するために使用することができるアレイが本明細書に開示されている。一部の実施形態では、１種または複数の対照遺伝子（例えば、正規化バイオマーカー）の発現を検出するためにも開示されているアッセイを使用することができる。特定の例では、アレイ表面は、プレート、ビーズ、またはフローセルを含む。
【０２４３】
一部の実施形態では、アレイは、特異的に別個になった領域またはアドレス可能な位置を含む固体表面を含んでよく、各領域は、表１のバイオマーカーと直接的または間接的にハイブリダイズすることが可能な少なくとも１つの固定化されたオリゴヌクレオチドを有する（したがって、アレイは、それぞれが例えば表１のバイオマーカーに特異的な複数の領域を有してよい）。例えば、アレイは、特異的に別個になった領域を含んでよく、各領域は、表１のバイオマーカーの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも５種、少なくとも１０種、または１６種全てと直接的または間接的に特異的にハイブリダイズすることが可能な少なくとも１つまたは少なくとも２つの固定化された捕捉用プローブ（ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのそれぞれと直接的または間接的に特異的にハイブリダイズすることが可能な捕捉用プローブなど）を有する。一部の例では、オリゴヌクレオチドは、アレイ上のそれらの位置によって同定可能である。他の例では、オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識（オリゴヌクレオチドと直接的または間接的に結びついたもの）によって同定可能である。別の例では、アレイは、特異的に別個になった領域を含んでよく、各領域は、少なくとも１つまたは少なくとも２つの固定化されたオリゴヌクレオチドを有する。
【０２４４】
一部の例では、アレイは、ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子または対照遺伝子のＮＰＰと直接的または間接的に特異的にハイブリダイズすることが可能な２種またはそれより多い捕捉用プローブを含む。例えば、アレイは、表１のＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子のうちの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、または１６種全てと相補的なオリゴヌクレオチドを含むまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド（例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのそれぞれと相補的なオリゴヌクレオチドを含むまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１〜１６に示されているもの）を含んでよい。一部の例では、アレイ（ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのそれぞれと直接的または間接的に特異的にハイブリダイズすることが可能な捕捉用プローブを含むものなど）は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、または少なくとも９種の対照遺伝子と相補的なオリゴヌクレオチドを含むまたはそれらからなるオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【０２４５】
特定の例では、アレイは、表１に開示されている標的核酸の領域の全部または一部分を含む核酸などの標的核酸配列（またはそのような配列と相補的なオリゴヌクレオチド）を含むオリゴヌクレオチド（例えば、プログラミングリンカー）を含む。一部の例では、プログラミングリンカーは、基材に結びついたオリゴヌクレオチド（アンカーなど）と相補的な部分およびＮＰＰの少なくとも一部分と相補的な部分を含む二機能性オリゴヌクレオチドである。
【０２４６】
一部の実施形態では、アレイは、空間的に別個の領域（マルチウェル表面上のウェル、ビーズ、またはフローセル中のチャネルなど）を有する表面を含んでよく、各領域は表面およびオリゴヌクレオチド（例えば、プログラミングリンカー）に安定に（例えば、共有結合により）付着したアンカーを含み、プログラミングリンカーは、アンカーと相補的な第１の部分およびＮＰＰと相補的な第２の部分を有するヘテロ二機能性リンカーであり、ＮＰＰは、標的核酸（例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多く、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多く、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの全て）と相補的である。一部の実施形態では、アレイは、第１の部分がアンカーと相補的であり、第２の部分がＮＰＰと相補的である二機能性リンカーを含むまたはそれから本質的になる。一部の例では、アレイは、第１の部分がアンカーと相補的であり、第２の部分が対照マーカーと相補的なＮＰＰと相補的である二機能性リンカーをさらに含む。追加的な例では、アレイは、第１の部分がアンカーと相補的であり、第２の部分が陰性対照（ＡＮＴなど）と相補的なＮＰＰと相補的である二機能性リンカーもさらに含む。そのようなアレイには、少なくともＮＰＰと相補的でない二機能性リンカーのセグメントとハイブリダイズしたアンカーが付着している。そのようなアレイは、（１）プログラミングリンカーの第１の部分とハイブリダイズしたアンカープローブ、（２）プログラミングリンカーの第２の部分とハイブリダイズしたＮＰＰ、（３）ＮＰＰとハイブリダイズした第１の部分および検出用プローブとハイブリダイズした第２の部分を有する二機能性検出用リンカー、（４）検出用プローブ；（５）標識（アビジンＨＲＰなど）、またはこれらの組み合わせをさらに含んでよい。
【０２４７】
キット
例えば、試料を本明細書で考察されている通りＡＢＣ、ＧＣＢ、または未分類のＤＬＢＣＬとして特徴付けることにおいて使用するために、ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子のレベル（例えば、表１のバイオマーカーの２種またはそれより多い発現など）を検出または測定するために使用することができるキットも本明細書に開示されている。一部の実施形態では、開示されているキットを、１種または複数の対照マーカー（例えば、ＡＮＴ）の発現を検出するために使用することもできる。特定の例では、キットは、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのそれぞれと直接的または間接的に特異的にハイブリダイズすることが可能な捕捉用プローブを含むアレイなどの、本明細書において提供されるアレイの１つまたは複数を含む。
【０２４８】
一部の例では、キットは、核酸発現を検出するため、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種もしくはそれより多く、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種もしくはそれより多く、または例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの全てを検出するための、プローブ（例えば、ＮＰＰまたはＮＰＰＦ）および／またはプライマーを含む。例えば、キットは、少なくとも２種の異なるＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳを含んでよく、少なくとも２種の異なるＮＰＰＦは、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、もしくはＴＮＦＲＳＦ８の２種もしくはそれより多く（少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、または１０種全てなど）に特異的であるか、または、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種もしくはそれより多く（少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種または１６種全てなど）に特異的である。例えば、キットは、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳのそれぞれに特異的なＮＰＰ（またはＮＰＰＦ）、例えば、配列番号１〜１６に示されている配列を含む、またはそれらからなるＮＰＰを含んでよい。
【０２４９】
一部の例では、キットは、１種または複数の対照バイオマーカーをさらに含む。一部の例では、キットは、１種または複数の対照バイオマーカー（例えば、ＡＮＴ）を検出するためのプローブおよび／またはプライマーをさらに含む。
【０２５０】
キット内に含まれるプローブは、配列番号１〜１６に示されている配列を含むプローブなどの、本明細書に開示されている標的配列と相補的であるまたはそれと特異的にハイブリダイズする１種または複数のＮＰＰまたはＮＰＰＦを含んでよい。一部の例では、キットは、本明細書に開示されているバイオマーカーを検出するためのアレイを構築するために必要とされた１種または複数の核酸プローブを含んでよい。
【０２５１】
一部の例では、キットは、表１に列挙されている１種または複数のバイオマーカーに特異的に結合する抗体、および任意選択で、１種または複数の対照バイオマーカーに特異的に結合する抗体を含む。例えば、キットは、タンパク質発現を検出するため、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多く、例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多く（ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの全てなど）、ならびに一部の例では１種または複数の対照バイオマーカーを検出するための抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および／または抗体断片）を含んでよい。
【０２５２】
一部の例では、キットは、緩衝液（溶解緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄緩衝液、および／または配列決定緩衝液など）を含有する容器；一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼ（Ｓ１ヌクレアーゼなど）を含有する容器；核酸プログラミングリンカーを含有する容器；エタノールを含有する容器；変性用油を含有する容器；プロテイナーゼＫを含有する容器；少なくとも２種の異なるＮＰＰＦのアンプリコンに特異的に結合することが可能なビーズを含有する容器；およびＰＣＲ用の試薬（ＰＣＲ緩衝液、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰなど）を含有する容器（複数可）の１つまたは複数を追加的に含む。一部の例では、キットは、特定の分量のＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳ核酸またはタンパク質などの対照試料をさらに含む。
【０２５３】
一例では、キットは、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳと相補的であるまたはそれと特異的にハイブリダイズするＮＰＰまたはＮＰＰＦ、例えば、配列番号１〜１６に示されている配列を含む、またはそれらからなるＮＰＰを含む。キットがＮＰＰＦを含む場合、キットは、対応するＣＦＳをさらに含んでよい。一部の例では、そのようなキットは、溶解緩衝液、ヌクレアーゼ溶液（Ｓ１を含むものなど）、終結緩衝液（例えば、ヌクレアーゼを中和または非活性化できるもの、例えば、ｐＨを６より高く、例えば約９〜１２に上昇させることができるもの）をさらに含む。一部の例では、そのようなキットは、プロテイナーゼＫ；変性用油；ならびに任意選択で、マイクロアレイプレートおよびピペットチップをさらに含む。一部の例では、そのようなキットは、ライゲーション緩衝液（例えば、リガーゼを含むもの）をさらに含む。一部の例では、キットは、ＮＰＰまたはＮＰＰＦまたはＣＦＳの一部分に特異的なプライマー、例えば、ＮＰＰまたはＮＰＰＦの３’末端または５’末端または両末端に実験タグ、および／または配列決定アダプターを付加することが可能なプライマーも含む。
【０２５４】
一例では、キットは、ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子（例えば、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＩＴＰＫＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＥＬ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８、およびＴＹＭＳの２種またはそれより多く）のｍＲＮＡ発現を測定または検出する多数の値を受信し、方程式１を使用して多数の値を処理し、予測確率を計算し、試料を、試料のＤＬＢＣＬの亜型を示すフレームワーク内に分類する（例えば、ＡＢＣ、ＧＣＢ、または未分類）、本明細書に記載のソフトウェアまたはコンピューター可読媒体などの、ＤＬＢＣＬの亜型に対する分類指標を実装する計算処理システムを含む。
【０２５５】
一例では、キットは、ＤＬＢＣＬ  ＡＢＣおよび／またはＧＣＢ亜型、ならびに任意選択で未分類の試料において予想される予想値または値の範囲（予測確率値など）を示すグラフまたは表を含む。
【０２５６】
キットは、説明用材料および追加的な試薬、例えば、酵素に基づく検出系（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼおよび適切な基質を含む検出用試薬）などの検出用試薬などの追加的な成分をさらに含んでよい。キットは、キットが設計される特定の適用を容易にするための追加的な成分（例えば、マイクロタイタープレート、ピペットチップなど）も含んでよい。キットは、二次抗体（例えば、表１のタンパク質に特異的に結合する一次抗体に特異的に結合する抗体、または対照タンパク質に特異的に結合する一次抗体に特異的に結合する抗体）、または抗体を標識するための手段も含んでよい。一例では、キットは、対照核酸および／または対照タンパク質をさらに含む。そのようなキットおよび適切な含有量は、当業者に周知である。説明用材料は、書面、電子形式（コンピューターディスケットまたはコンパクトディスクなど）であってもよく、視覚的（ビデオファイルなど）であってもよい。
【０２５７】
本開示を以下の非限定的な実施例によってさらに例示する。
【実施例】
【０２５８】
（実施例１）
ＤＬＢＣＬシグネチャー遺伝子一覧の同定
本実施例では、ＤＬＢＣＬを２つのクラス、ＡＢＣおよびＧＣＢに亜型決定するための分類指標を構築するために使用した統計学的方法を記載する。さらに、未分類と表示される、不確実な領域を含む第３の亜型を分類に追加した。データ分析は全てＲプログラミング言語バージョン３．２．２およびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージバージョン３．１（６４ビットバージョン）を使用して実施した。
【０２５９】
推定性能の開発およびテストの両方に単一のデータのセットを使用する場合、Ｈａｓｔｉｅ、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、およびＦｒｅｉｄｍａｎ（Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ：  Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ，  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，  Ｉｎｃ．、２００９年）において概説されているものと同様の戦略を使用して一般的な統計学的設計手順を展開した。亜型分類指標の開発に２つの一般的なステップ、モデル開発およびモデル評価を使用した。モデル開発は、モデル／変数の選択、パラメーター調整、および亜型を定義する最終的なモデルのテストの内部評価を含む。評価は、予測誤差の推定を含む。これらのステップはどちらも、専門臨床医によって評価された関連するＤＬＢＣＬステータスを有するＤＬＢＣＬ  ＦＦＰＥカール（ｃｕｒｌ）の前向きに得た単一施設簡便試料を利用して実施した。
【０２６０】
品質管理
配列決定の完了後、３つの品質管理（ＱＣ）測定基準（ｍｅｔｒｉｃｓ）を各試料に適用した。順番に評価した相互排他的ＱＣ測定基準のそれぞれについて故障モード（ｆａｉｌｕｒｅ  ｍｏｄｅ）を同定した。第１のＱＣ測定基準は、プローブ配列に対してマッピングされた読み取りのアラインメント率（Ｂｏｗｔｉｅに基づく）である。期待値は、全アラインメントが≧８５％であることであり、これが満たされない場合、試料はＱＣ１の故障モードを有する。ＱＣ１品質測定基準を満たす全事例に適用される第２のＱＣ測定基準は、試料が示差的な発現を有することである。発現は、発現の第１の四分位数（Ｑ１）におけるプローブと発現の第３の四分位数（Ｑ３）におけるプローブの間の発現差異を評価することによって確立され、発現の平均値間の比が２．０未満（Ｑ１／Ｑ３＜２．０）であれば、試料は第２のＱＣ測定基準（ＱＣ２）に不合格となる（Ｓ１不良または数の壁と称される）。ＱＣ１およびＱＣ２に合格した試料／事例に適用される第３のＱＣ測定基準（ＱＣ３）には、陰性対照：ＡＮＴプローブ（ＡＮＴ１、ＡＮＴ２、ＡＮＴ３）が関与した。陰性対照に対する統計的プロセス制御（ＳＰＣ）測定基準は、ＳＵＤＨＬ６細胞株溶解物からの９０ウェルの単一の技術的反復について配列決定したベースライン研究において確立した。ＳＰＣ特徴付け研究により、陰性対照についての許容値の上限が確立され、次いで、この許容値を新しい試料全てに適用して、期待性能の範囲内に入る性能を実証した。期待性能を、ＡＮＴシグナル変動性の平均値を評価することによって確立した。期待値は、平均レベルと比較したＡＮＴの平均値が所定のカットオフを超えて変動しないというものである。カットオフは、ｌｏｇ２（ＣＰＭ）で７．７５であった。試料のＡＮＴの平均値がこの値を超える試料はいずれも第３のＱＣ測定基準（ＱＣ３）に不合格になる。これらの故障モードのいずれかを有する試料は全て、分類指標コールを損なう可能性がある。
【０２６１】
試料
全部で２５７の事例が、配列決定のために十分な代表的な組織を有し、上記の配列決定の品質管理手順に合格し、遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）によって確認されたＤＬＢＣＬステータスを有した。分析に使用した試料は、ＡＮＴ値（陰性対照）の平均値についての品質管理測定基準に合格し、配列アラインメントが≧８５％のプローブを有した。ＲＮＡｓｅｑは、特定の配列にマッピングされる読み取りの数を計数する方法体系である。アラインメント率は、ＰＣＲにより生成されたＲＮＡコピーに正確にマッピングされている塩基対の数を定量化するための方法であり、試料中で入手可能な読み取りの少なくとも８５％がマッピングされることが予想される。この量を下回ることは、マッピングされていない産物が試料中に存在することを暗示する。図２は、入手可能な全事例からの事例選択についてのデータフロー図を示す。
【０２６２】
ＤＬＢＣＬ組織溶解物をＦＦＰＥ組織切片から調製した。組織切片を測定し、次いで、かみそりの刃を使用し、スライド上のあらゆる過剰なパラフィンを回避しながらこすり取り、標識されたエッペンドルフチューブ中に入れた。試料の面積を使用して、添加する溶解緩衝液の量を計算した：総面積（ｃｍ２）×／２８μｌ／０．２５ｃｍ２組織または総面積（ｃｍ２）×／２５μｌ／０．２５ｃｍ２組織。試料を溶解緩衝液（予熱した（５０℃）、ホルムアミドおよびＳＤＳを含むＳＳＣ緩衝液）に懸濁させた。次いで、界面活性物質（例えば、Ｂｒｉｊ−９７）（「非水層」）を含有する鉱油５００μｌを組織懸濁物にオーバーレイし、この溶解反応物を９５℃で１０〜２０分間インキュベートした。反応混合物を軽く冷却した後、プロテイナーゼＫを溶解緩衝液の体積の２０分の１の比になるように添加し、インキュベーションを５０℃で６０〜１２０分間継続した。溶解反応物は、すぐに使用することも、−７０℃〜−８０℃で凍結させ、保管することもできる。凍結させた溶解反応物は、その後に使用する前に５０℃で１０〜１５分間解凍する。試料インプットは公知の試料インプットを有する試料について０．０２ｃｍ２／２８μｌであった。
【０２６３】
ｑＮＰＳアッセイ
各溶解した反応混合物２８μｌを９６ウェルプレートのウェルに入れ、非水層７０μｌをオーバーレイした。各ウェルに、５’および３’隣接配列ならびに各隣接配列に対する適切な相補的な隣接配列（ＣＦＳ）を有するヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）を含有する混合物５μｌを添加した。ＮＰＰＦの配列は、標的、ならびに３’および５’隣接配列に特異的に結合する捕捉用配列を含んだ。表２は、ＤＬＢＣＬ分類指標の１６種の遺伝子に対するＮＰＰＦの捕捉用配列部分を示す。したがって、標的配列は、示されている配列の相補物である。ミックス中には、検出しようとする複数のｍＲＮＡ標的のそれぞれと相補的なＮＰＰＦを１ｎＭ（過剰量）で存在させた。各９６ウェルプレートに３０例（それぞれ３連）の異なるＤＬＢＣＬ溶解物および６例の対照試料（２例の非試料対照および４例の細胞株溶解物）を含めた。ＤＬＢＣＬ試料をプレート上に盲検式でランダム化した（すなわち、盲検試料アノテーション）。
【表２】
2018536387.tif 000005
【０２６４】
９６ウェル試験プレートを８５℃で１０分間加熱して核酸を変性させ、次いで、５２℃で１６時間インキュベートしてＮＰＰＦをそれらのそれぞれのｍＲＮＡ標的とハイブリダイズさせ、かつ、ＣＦＳをそれらのそれぞれの隣接配列標的とハイブリダイズさせた。
【０２６５】
ハイブリダイゼーションステップ後、酢酸ナトリウム緩衝液中の過剰なＳ１ヌクレアーゼ（２．５Ｕ／μｌ）２０μｌを各ウェルの水相に添加した。Ｓ１反応を５２℃で９０分間進行させて、結合していないｍＲＮＡおよび結合していないＮＰＰＦおよび結合していないＣＦＳを消化した。
【０２６６】
Ｓ１消化ステップの間に、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ９．０）を含有する溶液５μｌを９６ウェル試験プレート中の反応物に対応する各ウェルに添加することによって９６ウェル「停止」プレートを調製した。９６ウェル試験プレート中の各反応物４０μｌを第２の９６ウェル停止プレートの対応するウェルに移し、非水層７０μｌをオーバーレイした。停止プレートを１００℃で２０分間インキュベートし、次いで、室温で３０分間冷却した。
【０２６７】
捕捉反応の完了後、プレートを−２０℃で保管することも、ＰＣＲタグ付けに直接使用することもできる。プレートを凍結保管した場合、ＰＣＲに使用する前に室温で３０〜４０分間穏やかに振とうしながら解凍することができる。
【０２６８】
以下の通り、ライブラリー調製物の配列決定のためにＰＣＲタグ付けを実施した。水６μｌ、ＮＥＢ  ＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｘ２  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＧＣ緩衝液１５μｌ、フォワードプライマー３μｌ、リバースプライマー３μｌ、および試料３μｌを含むＰＣＲ試薬をきれいなチューブに添加した。陰性対照として、一部の試料には単に水を与えた。ＰＣＲを２０サイクル実施した。
【０２６９】
ＰＣＲ後に過剰なプライマーを除去するために、各ＰＣＲ試料（ＰＣＲ陰性対照を除く）１５μｌを微量遠心チューブ中にプールした。プールしたＰＣＲ反応物３５０μｌを５ＭのＮａＣｌ、１３５μｌ、４０％ＰＥＧ溶液１３７μｌ、およびＡＭＰｕｒｅビーズ３５μｌと混合した。チューブをボルテックスし、室温で５分インキュベートした。チューブを磁石スタンドに５分間置いてビーズを収集した。上清を廃棄した。ビーズに、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３０μＬおよびＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ、７５μＬを添加した。チューブをボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。チューブを磁石スタンドに５分間置いてビーズを収集した。上清を廃棄した。ビーズを８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを３７℃で５分間乾燥させた。ビーズを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０に懸濁させた。上清３０μｌを新しいチューブに添加し、これは浄化したものを含有した。ライブラリー１０μＬを２％アガロースゲル上に流すことによってプライマーの除去を確認した。
【０２７０】
きれいにしたアンプリコンを、ＫａｐａＱｕａｎｔキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０１７６１００）を使用し、製造業者の指導に従って１：１０，０００に希釈した。
【０２７１】
きれいにしたアンプリコンについて、ＭｉＳｅｑシークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定した。ライブラリーの変性およびシークエンサーのセットアップおよびローディングに関する製造業者の指示に従ってライブラリー３０ｐＭをＭｉＳｅｑ  １５０ｂｐ  Ｖ３キットにロードした。
【０２７２】
モデル開発
分類指標アルゴリズムの構築における第１のステップとして、遺伝子発現（ＧＥＰ）コールが入手可能であった２５７例の品質管理されたＤＬＢＣＬ試料を、分類指標の開発のための１７２例のランダムな試料を含む２つの重複しないデータセットにランダムにサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）し、残りの８６例を検証セットとして使用した。ランダムな選択によって偏りが導入されていないことを確実にするために、これらの２例のランダムな試料の類似性を評価した。表３に、ＧＥＰコールによるこれらの２つのサブセットの分布を記載する。
【０２７３】
最初に、ｑＮＰＳを使用してＤＬＢＣＬ試料の全てにおける９６種の遺伝子の発現を決定した。図３は、２つのセットにわたる陰性、陽性、およびハウスキーピング遺伝子を除去した後の、可能性のある分類指標となる遺伝子のランダムな性質を示す；図３の通り偏りは重複ではなくｌｏｇ２（ＣＰＭ）計数の差異に現れる。ハウスキーピングおよび対照プローブ（表４）は統計分析を実施する前に除去した。これらのプローブを除去した結果、８３種の遺伝子が分類指標とみなされた。
【表３】
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【表４】
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【０２７４】
ロジスティック回帰としても公知のロジットリンク関数を用いた一般化線形モデルを使用して分類指標の開発を実施した。ロジスティック回帰は、応答（転帰）データが、二成分とも呼ばれる２つのカテゴリーを有する場合に使用されるモデルであり、この場合、２つのカテゴリーは、ＡＢＣ分類／亜型およびＧＣＢ分類／亜型である。所与の分類の確率を推定するために使用される統計学的モデルは、以下の通り記載される：
【化３】
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式中、β０は、切片を示し、βは、プローブのベクトル、ｘＴに関連するパラメーター推定値である。開発試料を使用して（１）に記載されているロジスティックモデルにフィットさせて、「重み」と呼ばれるパラメーター推定値
【化４】
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を得た。任意の新しい（開発データセットとは独立した）データのセットにおいて、これらの重みを各遺伝子についての発現レベル計数の値と併せて使用してＡＢＣまたはＧＣＢに分類される予測確率Ｐｒ（Ｙ＝ｙ｜ｘ）を決定する。最終的なモデルは、確率を計算するために使用したプローブと同数の
【化５】
2018536387.tif 000010
値を有し得る。推定確率は０と１との間に制限され、確率についての最適なカットオフを使用して今後の患者を分類する。
【０２７５】
モデルの開発部分は２つのステップ、訓練およびテストを含んだ。テスト相は、最適なプローブ／標的を同定し、標的／プローブの選択および係数の縮小／スケール調整の後にパラメーター（重み）を得るために使用した内部測定基準を指す。これは、３つのランダムなデータのセット：訓練、テスト、検証を使用すべきであると示唆している一部の統計学の文献（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、Ｊ．  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ）５８巻：２６７〜２８８頁、２００６年）とはわずかに異なる。本分類指標の目的に関して、訓練およびテストを同じ開発セットにおいて実施した。ＡＢＣ、ＧＣＢおよび未分類の患者分類についての確率の最適なカットオフの決定をテスト相において実施した。これらのステップの全てを、事例の開発セットを使用して実施した。
【０２７６】
重みの最適化と共に確率的計算に使用する８３種の標的の選択を、「ｌａｓｓｏ」と呼ばれるアルゴリズムを使用して実施した。統計学的に、これらの方法は、最適化の一部として適用される「ペナルティ」の型によって群分けされ、このペナルティは、サンプルサイズが小さいことに基づく潜在的な偏りを調整するために重みを縮小する。この手法を記載する方法は公開されている（例えば、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、Ｊ．  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ）５８巻：２６７〜２８８頁、２００６年を参照されたい）。本分類指標の開発のために用いられるｌａｓｓｏアルゴリズムは、Ｒの「ｇｌｍｎｅｔ」パッケージにおいて実装され、Ｆｒｉｅｄｍａｎら（Ｊ．  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、３３巻（１号）：１〜２２頁、２０１０年）に記載されている。再サンプリングとして１０倍交差検証を使用して最適な変数を決定した。これは、最初の開発データセットを、サイズ１０の同等のサイズにしたサブサンプルに分ける方法であり、そのようなサブサンプルを１００個創出した。これらのサブサンプルを、２つの亜型（すなわち、ＡＢＣ、ＧＣＢ）への分類が最も良好なモデル（例えば、フィットさせた回帰パラメーター）を見いだすため、ならびに、重み（例えば、生じ得る任意のスケール調整および縮小後の係数）として使用する値を決定するために使用した。
【０２７７】
この方法を使用して、８３種の標的のフィールドを表５の１６種の標的まで狭めた。表５には、最適な係数のセットに対する「重み」（
【化６】
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）（すなわち、各標的について）も列挙されている。１未満（すなわち、負）の重みを有する標的はＡＢＣ分類に関連付けられ、１より大きい重みを有する標的はＧＣＢ分類に関連付けられる。
【表５】
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【０２７８】
予測確率カットオフ
最適な標的および重みが得られたら、予測確率のためのカットオフを得た。ちょうど２つの分類が存在する場合、クラスを定義する確率は、予測確率の範囲全体にわたって感度（試料がＡＢＣと正確に特定される確率）および特異性（試料がＧＣＢと正確に特定される確率）を最大にすることによって得られる。ＤＬＢＣＬ分類指標は、「未分類」の試料のサブセットも含んだ。これらの試料は、おそらくＡＢＣでもＧＣＢでもなく、それにより、別の亜型（例えば、ＡＢＣまたはＧＣＢコールを行うことができない）に潜在的に入る試料のセットとして同定される。感度＋特異性（これらの組み合わせは正確度と呼ばれる）が、誤分類率（ｍｉｓｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）が上昇するのと同じ点である、最大点から低下し始める点を決定した。これを下限と呼んだ。上限は、この値に関連して対称となる最高点（ｈｉｇｈ  ｐｏｉｎｔ）である。図４は、この決定点（ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）を図表で示す。数値的には、カットオフは下の点が０．４３であり、上の点が０．５７である。結果として得られたＡＢＣ／ＧＣＢコールは、推定確率＜０．４３である事例がＡＢＣであり、推定確率＞０．５７である事例がＧＣＢであり、両端を含んで０．４３〜０．５７の間に入る全てが未分類である。
【０２７９】
（実施例２）
独立した試料へのＤＬＢＣＬ分類指標の適用
本実施例は、実施例１において開発されたＤＬＢＣＬ分類指標により、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料においてＤＬＢＣＬのＧＣＢ亜型およびＡＢＣ亜型を同定することが可能になることを実証する。
【０２８０】
分類指標の最終的なテストから、「過剰フィット（ｏｖｅｒ−ｆｉｔｔｉｎｇ）」（例えば、過大評価（ｏｖｅｒ−ｏｐｔｉｍｉｓｍ））の傾向が低いことが示され、結果として得られた重みを検証セットに適用して性能を実証した。したがって、このデータのセットに対する分類指標の開発が完了した。
【０２８１】
分類指標の開発に使用しなかった残りの８６例のＤＬＢＣＬ試料を検証セットとして使用した。表５の１６種の遺伝子のｑＮＰＳ分析を上記の通り実施した。結果として得られたデータを分類指標に供した（例えば、ｑＮＰＳを使用して得られた各遺伝子についての値を、方程式１を用いて分析し、予測確率を決定した）。本明細書の他の箇所に記載の通り、ＣＤ８６、ＩＴＰＫＡＢ、ＬＲＭＰ、ＭＭＥ、ＰＴＰＲＣおよびＲＥＬは、ＤＬＢＣＬのＧＣＢ亜型に関連する傾向がある遺伝子であり、ＣＤ４７、ＥＮＴＰＤ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＴ８、ＩＬ１６、ＮＦ２、ＰＩＭ１、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ８およびＴＹＭＳは、ＤＬＢＣＬのＡＢＣ亜型に関連する傾向がある遺伝子である。ｑＮＰＳから得られた１６種の遺伝子のそれぞれについてのアウトプット値に、表５に示されている重み値を掛け、これらの１６種の遺伝子の総和を決定し、予測確率を決定し、ここで、結果として得られた予測確率の値により、試料がＡＢＣ、ＧＣＢ、または未分類であるかが決定される。
【０２８２】
分類指標の性能についての測定基準は、分類指標によりＧＥＰコールと同じＡＢＣ／ＧＣＢコールを得ることができた事例の割合として定義される誤分類率を含む。追加的な測定基準には、陽性的中率（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）および陰性的中率（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）（それぞれＰＰＶおよびＮＰＶ；すなわち、ＡＢＣまたはＧＣＢのいずれかに正確に分類される事例）が含まれた。未分類の試料はこれらの測定基準の評価には含めないことに留意されたい。表６は、検証セットに適用した分類指標の検証の要約を示し、図５は、各試料についての分類を示す。
【表６】
2018536387.tif 000013
【０２８３】
（実施例３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＤＬＢＣＬ診断アッセイ
本実施例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ次世代シークエンサーで実施する検出を伴うＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑシステムを使用してＦＦＰＥ組織からびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）腫瘍の起源細胞（ＣＯＯ）亜型を決定するために使用することができる方法を記載する。プロファイルされたデータを、分類アルゴリズムによって評価し、腫瘍が、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）、胚Ｂ細胞様（ＧＣＢ）、または未分類の亜型のものであるかを決定する。
【０２８４】
ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑシステムは、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイ（ｑＮＰＡ）化学と次世代配列決定（ＮＧＳ）プラットフォームを組み合わせて、９６種の標的化遺伝子を単一のアッセイで半定量的に分析することを可能にする（図１）。ｑＮＰＡ化学では、大多数の試料からの核酸抽出が必要なく、それにより、試料インプットの必要量が有意に低減する。ｑＮＰＡ化学ではまた、核酸抽出、サイズ選択、ｃＤＮＡの合成、およびアダプターライゲーションに関連する偏りも排除される。自動化された手順により、操作誤差が低減し、それにより、ＦＦＰＥ組織のような貴重な試料から調製された配列決定ライブラリーを確実に再現性よく生成できることが補助される。ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑシステムの使用により、実験者が生の試料から配列決定の準備が整ったライブラリーまで、３時間未満の実施時間でおよそ３６時間以内にたどり着くことが可能になる。
【０２８５】
ｑＮＰＡ技術（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７４１，５６４号を参照されたい）により、抽出を伴わない、非ＲＮＡ増幅形式でのｍＲＮＡの定量化が可能になる。ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ化学プロセスの２つの主要エレメントは、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリダイゼーションおよびＳ１ヌクレアーゼ消化である。ユニバーサルウイング配列が隣接する機能的ＤＮＡヌクレアーゼ保護プローブを標的ＲＮＡとハイブリダイズさせ、これらはどちらも可溶性であり、生物学的マトリックス内で架橋結合することが可能である。ユニバーサルＤＮＡウイングメンプローブをウイングとハイブリダイズさせてＳ１ヌクレアーゼ消化を防止する。Ｓ１ヌクレアーゼを添加して過剰なハイブリダイズしていないＤＮＡプローブおよびハイブリダイズしていないＲＮＡを消化し、唯一残っている完全にインタクトな機能的ＤＮＡ保護プローブは、標的ＲＮＡとハイブリダイズしたプローブである。これにより、本質的に１：１の比であるＤＮＡの検出用プローブと試料中の最初に標的化されたＲＮＡが生じる。熱変性により保護プローブをＤＮＡ：ＲＮＡ２重鎖から放出させる。放出されたＤＮＡ保護プローブは数え上げる準備が整っている。
【０２８６】
ＤＮＡ保護プローブを、サーモサイクラーにおいて配列決定アダプターおよびタグで標識する。標識されたＤＮＡ保護プローブを濃縮し、プールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームにおける標準のＮＧＳプロトコールを使用した配列決定の準備を整える。ＮＧＳ計器からの遺伝子発現データを、例えば、ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑホストシステムソフトウェアによって処理し、レポートする。
【０２８７】
標的ｍＲＮＡ内の相補配列とハイブリダイズする特別に設計されたオリゴヌクレオチド（プローブ）を、ｍＲＮＡのレベルを測定するための手段として使用する。これらのオリゴヌクレオチドは、潜在的な二次構造が確実に存在しないことが確認された配列に対して設計し、他のレポートされたヒト配列に対してＢＬＡＳＴ検索に供して、アッセイ内の他の遺伝子との有意な相同性または相補性がないことを確実する。各オリゴヌクレオチドは、１００ｍｅｒであり、５’末端における２５ｍｅｒの「ウイング」、３’末端における２５ｍｅｒの「ウイング」、および、それらの間の、標的ｍＲＮＡと相補的な５０ｍｅｒ配列で構成される。
【０２８８】
ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＤＬＢＣＬ  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ａｓｓａｙは、４つの主要なステップを含む。（１）試料の調製（手作業によるステップ）：ＨＴＧ溶解緩衝液を添加してＦＦＰＥ組織試料を溶解および／または透過処理することにより、ＲＮＡをその後の対応する標的特異的ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）への結合に利用可能にする。溶解させた試料を、試料プレートと称される標準の９６ウェルマイクロタイタープレートに移す。（２）ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ化学による標的捕捉（自動化されたステップ）：標的捕捉をＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ化学によって行う。簡単に述べると、ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）を試料プレート中の溶解させた試料に過剰量で添加し、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズさせる。次いで、Ｓ１ヌクレアーゼを添加してハイブリダイズしていないｍＲＮＡおよび過剰なＮＰＰを消化し、したがって、化学量論量の標的−ｍＲＮＡ／ＮＰＰ２重鎖を生じさせる。Ｓ１消化が完了した後、処理された試料を停止プレートと称されるＶ底を有する新しい９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、終結溶液を添加し、その後、Ｓ１酵素を熱変性させることによってＳ１消化を終結させる。（３）アダプターおよびバーコードの付加のためのＰＣＲ増幅（手作業によるステップ）：停止プレートからの処理された試料のそれぞれを、タグと称される特別に設計されたプライマーを用いたＰＣＲ反応をセットアップするための鋳型として使用する。これらのタグは、プローブの５’末端および３’末端「ウイング」配列と相補的な共通の配列ならびにＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ配列決定プラットフォームにおけるクラスター生成のために必要な共通のアダプターを共有する。さらに、各タグは、試料の同定および多重化のために使用される独特のバーコードを含有する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームにおいて１２種のフォワードプライマータグおよび８種のリバースプライマータグを使用することができ、したがって、最大９６例の試料を同時に分析することができる。８例、２４例、または９６例の試料をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ計器で同時に分析するように、ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＤＬＢＣＬ  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ａｓｓａｙを構成する。ＰＣＲ増幅の完了後、清浄化手順を実施して、組み入れられなかったタグをＰＣＲ産物（ライブラリーと称される）から除去する。次いで、個々のＰＣＲ反応物を用いてＰＣＲ清浄化を実施する。（４）ライブラリーの定量化および配列決定（半自動化されたステップ）：Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームにおいてＭｉＳｅｑ  ｖ３キットを使用して配列決定を実施する。適切なクラスター生成が確実になるように試料ライブラリーの濃度を平衡化し、調整する。標的遺伝子のｍＲＮＡ発現に関する配列決定データをＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑパーサーソフトウェアにインポートし、そこで、ＤＬＢＣＬ  ＣＯＯ亜型を実験者に表の形式でレポートすることができる。
【０２８９】
試料の処理：ＦＦＰＥ試料に関しては、試験する切片は、厚さ４〜６ミクロンであるべきであり、ガラス顕微鏡スライド上に載せる。試験する切片のエリア（複数可）はＤＬＢＣＬであることが決定されているべきである。各試料について、目的のエリアに明白に印が付けられたＨ＆Ｅ染色したスライドまたはスキャン画像１枚がスライドからの目的のエリアのマクロダイセクションをガイドするよう強く示唆されている。一般には、染色していない切片が１つ必要である。切片中に含有される腫瘍部分が非常に小さい場合、多数の切片をこすり取り、テストのために合わせて単一のチューブに入れることができる。
【０２９０】
腫瘍のサイズを測定する際、あらゆる正常な他の非腫瘍または壊死性組織を組織切片から排除する。排除が実用的でない状況では、非腫瘍組織をサイズ計算に含めない。組織切片により最大推奨試料インプットよりも大きな表面積がもたらされる場合、関連する腫瘍部分全体をこすり取り、溶解緩衝液を使用して適切な作用濃度に希釈する。非常に小さな組織をテストする場合、多数の切片を合わせて単一のチューブに入れて所望の組織インプット量を達成し、単一の試料として処理することができる。変性用油は、室温で保管した場合、白色沈殿物を形成し得る。変性用油を５０℃で１０分間温め、ビンを軽く混合して沈殿物を溶解させる。すぐに使用しない溶解させた試料は、最大１週間、微量遠心チューブ中−８０℃で凍結させておくことができる。試料は、９６ウェル試料プレート中で凍結させるべきではない。
【０２９１】
ＦＦＰＥ組織の処理を以下の通り実施することができる。試験する適切なエリア（複数可）を、Ｈ＆Ｅ染色、ＩＨＣ、または他の適切な手段で同定し、このエリアに、スライドの裏側から消えないマーカーを使用して印をつける。印をつけたエリアに包含される総表面積（ｍｍ２単位）を測定し、計算する。低細胞充実性、非標的組織、壊死性である、または他の点で試験結果を損なう可能性がある組織エリアを排除する。ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＤＬＢＣＬ  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ａｓｓａｙについて許容されるインプット量は、試験当たり１．５６〜１２．５ｍｍ２の組織である。非常に小さな試料（例えば、針コア生検材料）の場合では、多数の組織切片を合わせて同じチューブに入れて必要な試料量を達成することができる。溶解緩衝液および変性用油を５０℃で３０分間解凍する。プロテイナーゼＫは、使用する準備が整うまで−２０℃で維持すべきである。染色していない切片から開始して、印をつけたスライドをガイドとして使用し、染色していないスライドの適切な組織のエリアをかみそりの刃でこすり取る。組織を適切に標識したＲＮＡｓｅフリー微量遠心チューブに入れる（かみそりの刃から取り、微量遠心チューブ中に入れるのを補助するためにピペットを使用することができる）。軽く遠心分離して（約２０秒間）ＦＦＰＥ組織をチューブの底部に引き寄せる。組織の標的化エリア当たり３５μＬのＨＴＧ溶解緩衝液をチューブに添加する。例えば：
【表７】
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【０２９２】
非常に大きな切片は、上に列挙されている溶解緩衝液体積の倍数を使用して処理することができる。各チューブに変性用油５００μＬを添加し、チューブに蓋をする。ボルテックスはしない。試料を９５℃まで、１５分間加熱し、試料を室温で１０分間冷却する。プロテイナーゼＫを各チューブの下層（赤色）に溶解緩衝液の体積の１／２０の比で添加する。例えば：
【表８】
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【０２９３】
溶液を６回ピペットで吸引排出することによってプロテイナーゼＫを混合する。溶解させた試料を５０℃で３時間、オービタルシェーカー上でまたは３０分ごとにピペットで混合しながらインキュベートする。試料を処理することも、−７０〜−８０℃で凍結させて最大４週間保管することもできる。
【０２９４】
ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑプロセッサーでの実行の開始：ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋをパッケージから取り出し、室温で８０分間解凍する。
【０２９５】
試薬トレーを振とうしたり逆さにしたりせず、使用前に試薬を計器上で混合する。１０％ブリーチ、その後、７０％イソプロピルアルコールを使用してＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋをきれいにする。溶解させた試料が凍結している場合、５０℃で４５分間解凍し、使用前に各試料の水相をピペットで混合する。試料を軽く遠心分離して全ての液体をチューブの底部に戻す。各試料３５μＬを試料プレートの適切なウェル中にピペットで入れる。ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑシステムバーコードスキャナーを使用して、ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  Ｐｌａｔｅ  Ｐａｃｋからの試料プレートをスキャンする。次いで、ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑプロセッサーを始動させ、およそ２０時間実行させる。処理後、停止プレートを取り出し、分析する。
【０２９６】
ライブラリー処理：ＰＣＲマスターミックスを、例えば、ＮＥＢ  ＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＧＣ緩衝液、分子グレードの水、および配列決定タグを使用して調製することができる。この混合物をリバースプライマーと一緒に停止プレート中の適切な試料の一部分に添加し、ＰＣＲを以下の通り実施する：９５℃で４分間、次いで、９５℃で１５秒間、５６℃で４５秒間、および６８℃で４５秒間を２０サイクル、次いで、６８℃で１０分間、そして、４℃で保持する。結果として得られた反応物は、すぐに処理することも、−２０℃で保管することもできる。ライブラリーを以下の通りプールし、浄化することができる。各ＰＣＲ産物１５μＬを新しい予め標識された９６ウェルＰＣＲプレートに移す。ウェル当たり３７．５μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを添加する（室温に予め温めておき、１分間ボルテックスすることによって十分に混合する）。ウェルを混合し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートする。試料を磁石スタンドに置き、３分間ビーズを収集する。目に見えるビーズのペレットが形成されるはずである。上清を取り出し、ビーズペレットは乱さない。ビーズペレットが緩い場合には、ビーズによるコンタミネーションを防ぐために、残留液体５〜１０μＬを残すことができる。新たに調製した８０％エタノール２００μＬを添加し、３０秒〜１分間放置する。各ウェルからエタノールを除去する。エタノール洗浄を繰り返し、合計で２回の洗浄を行う。プレートを磁石スタンドから取り、室温で５分間乾燥させる。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＬを各ウェルに添加し、ピペットで混合してビーズを再懸濁させる。室温で５分間放置する。プレートを磁石スタンドに２分間置き、ビーズを収集する。各ライブラリー上清３０μＬを新たなウェルに移す。
【０２９７】
配列決定前に、例えばＫＡＰＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎシステムを使用して、以下の通り、創出された個々の試料ライブラリーを定量化し、個々のライブラリー濃度を平衡化させることができる。１：１００段階希釈を実施する（例えば、３連で）。１０ｍＭのＴｒｉｓ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、２９７μＬを１：１００希釈物の各ウェルに添加する。浄化したライブラリー３μＬをディープウェルプレートの対応するウェルに添加する。試料を混合する。第２の１：１００希釈を実施して、最終的な希釈因子１：１０，０００を達成する。１０ｍＭのＴｒｉｓ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、２９７μＬを１：１０，０００希釈物の各ウェルに添加する。「１：１００希釈」プレートからの試料３μＬを「１：１０，０００希釈」プレートの対応するウェルに添加する。十分に混合する。１：１００，０００希釈物が必要な場合、追加的な１：１０希釈を実施する。ＫＡＰＡライブラリー定量化キットを室温で３０分間解凍する。初回使用では、１０×Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐｒｅｍｉｘ、１ｍＬを２×ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（５ｍｌ）のビンに添加し、混合する。ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ試料および標準物質に対する２×Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、５０×ＲＯＸ  Ｈｉｇｈ  Ｄｙｅ（必要な場合）、および分子生物学グレードのＨ２Ｏの体積を製造業者の指示に従って計算する。利用するｑＰＣＲシステムに適した命令入力およびプロトコールを創出する。製造業者の指示に従ってｑＰＣＲ計器をロードし、試料をサイクルさせる。サイクルが完了した後、結果をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ファイルとしてエクスポートする。検量線についてのＱＣ測定基準が製造業者の仕様書に適合することを確実にする。
【０２９８】
例えば、ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＩＶＤ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを使用して、プールしたライブラリーを創出することができる。
【０２９９】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍにおける配列決定：プールしたライブラリーの配列決定を以下の通り、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ計器を製造業者の指示に従って使用して実施することができる。各Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ計器に対する最適な最終的なプールされたライブラリー濃度は変動し得る。結果として得られた配列決定データを分析することができる。
【０３００】
ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＤＬＢＣＬ  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ａｓｓａｙ分類システムでは、試料分類を作成する前にデータ品質評価を実施する。これらの要件に合格しない試料は、番号を付して「ＱＣ不合格」としてレポートされる。分類するためには不十分な配列決定読み取りが得られた場合には、ライブラリーのプールおよび定量化の段階で試料が適正に定量化され、十分なライブラリーが添加されたことを確実にし、残りのあらゆる試料溶解物からの試料について再度実行し、ＦＦＰＥ組織の新たな切片からの試料を再度溶解させる。組織を再度評価して利用されたエリアが腫瘍であることを確実にする、またはこれらの組み合わせを行う。データのプロファイルがＤＬＢＣＬから得られる発現の典型的なパターンを反映しない場合、これは、潜在的な試料の調製またはプロセッサーの問題を示す。この状況では、残りのあらゆる試料溶解物からの試料について再度実行し、かつ／またはＦＦＰＥ組織の新たな切片からの試料を再度溶解させ、組織を再度評価して利用されたエリアが腫瘍であることを確実にする。
【０３０１】
ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＤＬＢＣＬ  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ａｓｓａｙの実施：ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＤＬＢＣＬ  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ａｓｓａｙと共に提供される凍結成分を、試薬を混合も撹拌もせずに、室温で８０分間解凍する。あらゆる凍結試料溶解物を５０℃で３０分間加熱することによって解凍した後、試料を試料プレートにピペットで入れる。ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑプロセッサー内への消耗品の配置は、処理される試料の数に伴って変動し得る。
【０３０２】
アッセイ結果：アッセイレポートにより、ＤＬＢＣＬ事例と一致する３つの潜在的な結果（１）「ＡＢＣ」もしくは活性化Ｂ細胞亜型、（２）「ＧＣＢ」もしくは胚Ｂ細胞亜型、（３）遺伝子発現のパターンがＡＢＣもＧＣＢも示さない場合の「未分類」、または（４）試料から、分類前に試料−レベル品質管理測定基準に合格する結果がもたらされず、試料に対して再度実行すべきであることを示す「ＱＣ不合格」がもたらされる。
【０３０３】
ＡＢＣ亜型を示す腫瘍は、一般に、予後および標準治療のＤＬＢＣＬ療法への応答がＧＣＢ亜型のものよりも不良である。ＤＬＢＣＬ腫瘍の亜型決定により、臨床医を、再発した患者における代替的な療法の形態に導くことができる（Ｖｏｓｅ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０１１年、２９巻：４０６５〜４０６６頁；Ｔｈｉｅｂｌｅｍｏｎｔら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０１１年、２９巻：４０７９〜８７頁）。最近、これらの差異を認識するため、およびＡＢＣ亜型に対するより有効な処置に関する調査を容易にするために、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ＤＬＢＣＬ分類に関して変更がなされた（Ｓｗｅｒｄｌｏｗら、Ｂｌｏｏｄ、２０１６年；１２７巻：２３７５〜９０頁）。これらの選択肢には多数の新しい治療薬に関する治験が含まれる。
【０３０４】
性能特徴
試料インプット：ＦＦＰＥ試料からの反復試料溶解物（１つのＡＢＣおよび１つのＧＣＢ）をウェル当たり１２．５〜０．３９ｍｍ２の間の２倍希釈物にわたって試験した。分類は、６つの試験した希釈点の１００％で、推奨される１．５６ｍｍ２を下回る組織であっても一貫したままであった。この一貫性を２種の低発現プローブ、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤＣＤ１（ＰＤ−１）でも評価した。図６および７は、試料発現を、ＡＢＣ試料およびＧＣＢ試料のどちらにおいても低試料インプット量から高試料インプット量まで示す。
【０３０５】
アッセイ再現性：日ごとの再現性を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）によって以前に特徴付けられた８０例の試料（４０例のＡＢＣ、４０例のＧＣＢ）を使用して評価した。以前に「未分類」として特徴付けられた試料は意図的に排除した。およそ５ｍｍ２の等価のＦＦＰＥ組織が各試料ウェルに存在し、３つの別々の日に単一のＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑプロセッサーおよびＭｉＳｅｑシークエンサーで配列決定した。生じた２４０例の総データセットのうち、２３６例（９８．３３％）が予備分類ＱＣに合格した。１例のＡＢＣおよび１例のＧＣＢ試料が１日目に、２例のＡＢＣ試料が２日目にＱＣ不合格になり、３日目にＱＣ不合格になった試料はなかった。表９に、ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＤＬＢＣＬ  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ａｓｓａｙによる試料亜型決定の最終的な結果をＧＥＰと比較して記載し、全体的な一致率は全日にわたって１００％であった。
【表９】
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【０３０６】
ＩＨＣに対するアッセイの一致：ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＤＬＢＣＬ  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  ＡｓｓａｙのＩＨＣ方法体系と比較した一致を、２つの独立したコホートを使用した遡及的研究によって実施した。第１のコホートは、Ｖｉｓｃｏ−Ｙｏｕｎｇ法（Ｌｅｎｚら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００８年；３５９巻（２２号）：２３１３〜２３頁）によって以前にＡＢＣまたはＧＣＢとして特徴付けられた１３２例の試料からなった。第２のコホートの２４例の試料は、Ｃｈｏｉ法（Ｒｏｓｅｎｗａｌｄら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００２年；３４６巻（２５号）：１９３７〜４７頁）を使用して特徴付けられた。各コホートについて未分類の試料を除いた一致率を計算した。ＧＥＰに対して最適化されたＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＤＬＢＣＬ  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ａｓｓａｙは、Ｃｈｏｉ  ＩＨＣアルゴリズムにより一貫して実施され、全体的な一致は９１％であった（表１０）。ＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑ  ＤＬＢＣＬ  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  ＡｓｓａｙとＶｉｓｃｏ−Ｙｏｕｎｇ  ＩＨＣの間の全体的な一致は８３％であった（表１１）。ＩＨＣアルゴリズムには未分類の亜型分類カテゴリーが含まれないので、いずれの全体的な一致率にも未分類の試料は含めなかった。
【表１０】
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【表１１】
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【０３０７】
診断再現性：１４例の以前に特徴付けられた臨床試料を２つの試料インプット量で溶解させた。全ての試料について３回の反復を３つのＨＴＧ  ＥｄｇｅＳｅｑプロセッサーにわたって行い、単一の日に配列決定した。全ての条件にわたってプールして合計で２５２のＧＣＢ／ＡＢＣ分類コールが生成した。
【０３０８】
合計で試料の９７％（２４４／２５２）がその後の分類のためのＱＣ測定基準に合格した。未分類の試料を排除した場合、９９パーセント（９９％）の一致が得られた（総誤分類が１例）；未分類の結果を含めた場合には９７％の一致が得られた。未分類の結果は合計で８例であり、これらのうちの６例は単一の試料から得られた。これらの一致率を表１２に要約する。各反復についての分類のグラフ表示が図８に示されている。
【表１２】
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【０３０９】
本開示の原理を適用することができる多くの可能性のある実施形態を考慮して、例示されている実施形態は単に例であり、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではないことが認識されるべきである。そうではなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、これらの特許請求の範囲の範囲および主旨に入る全てが本発明者らの発明であることを主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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