(57)【要約】リンカーで連結された、２つの別個の機能性配列（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡとして通常知られる）を有する合成シングルガイドＲＮＡ類を提供する。これら合成シングルガイドＲＮＡ分子類は、真核細胞中のｃａｓ９などのＲＮＡ−ガイドエンドヌクレアーゼと用いる場合、遺伝子編集に有用である。合成シングルガイドＲＮＡ類を利用すると、ハイスループット方式で遺伝子編集用スクリーニングを簡単かつ便利に実施できる。【選択図】図１
2018515142.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）標的ＤＮＡの配列と相補的な配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）部位特異的修飾化ポリペプチドと相互作用する配列を有する第２のオリゴヌクレオチドと、を有する合成シングルガイドＲＮＡであって、
前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドは、非ホスホジエステル共有結合を介して結合していることを特徴とする、合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項２】
前記第１オリゴヌクレオチドは２５−６０ヌクレオチド長を有し、前記第２オリゴヌクレオチドは４０−１００ヌクレオチド長を有することを特徴とする、請求項１の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項３】
前記共有結合は、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、スルホン、スルホキシド、ウレア、チオウレア、ヒドラジド、オキシム、チアゾール、光感受性結合、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環状付加対または閉環メタセシス対、及びＭｉｃｈａｅｌ反応対のＣ−Ｃ結合生成基からなる群から選択される化学的部分を有することを特徴とする、請求項１−２の何れか１項の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項４】
前記部位特的修飾化ポリペプチドはＣａｓ９ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１−３の何れか１項の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項５】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドはストレプトコッカス・ピオゲネス由来であることを特徴とする、請求項１−４の何れか１項の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項６】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドはストレプトコッカス・サーモフィリス由来であることを特徴とする、請求項１−４の何れか１項の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項７】
前記した第１オリゴヌクレオチドまたは第２オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、化学的に修飾されていることを特徴とする、請求項１−６の何れか１項の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項８】
化学的に修飾された少なくとも１個のヌクレオチドは２’位修飾を有することを特徴とする、請求項７の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項９】
前記部位特異的修飾化ポリペプチドはキメラ型部位特異的修飾化ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１−８の何れか１項の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項１０】
前記標的ＤＮＡは哺乳類のＤＮＡであることを特徴とする、請求項１−９の何れか１項の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項１１】
前記哺乳類のＤＮＡはヒトのＤＮＡであることを特徴とする、請求項１０の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項１２】
酵素活性が低下または消失するように、前記Ｃａｓ９ポリペプチドは少なくとも１個の突然変異を有することを特徴とする、請求項１−１１の何れか１項の合成シングルガイドＲＮＡ。
【請求項１３】
（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）部位特異的修飾化ポリペプチドと相互作用する配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドと、非ホスホジエステル共有結合を介して結合している第２のオリゴヌクレオチドと、を有する            
（ｉ）合成シングルガイドＲＮＡと、
（ｉｉ）部位特異的修飾化ポリペプチドまたは前記部位特異的修飾化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
を有する組成物であって、
前記部位特異的修飾化ポリペプチドは、
（ア）前記合成シングルガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と、
（イ）部位特異的酵素活性を示す活性部分であって、前記合成シングルガイドＲＮＡの前記ヌクレオチド配列によって酵素活性部位が決定されることを特徴とする活性部分と、を有することを特徴とする組成物。
【請求項１４】
前記合成シングルガイドＲＮＡは６５−１６０ヌクレオチド長を有することを特徴とする、請求項１３の組成物。
【請求項１５】
前記共有結合は、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリアジン、ヒドラゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、スルホン、スルホキシド、ウレア、チオウレア、ヒドラジド、オキシム、チアゾール、光感受性結合、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環状付加対または閉環メタセシス対、及びＭｉｃａｈｅｌ反応対からなる群より選択される化学的部分を有することを特徴とする、請求項１３−１４の組成物。
【請求項１６】
前記部位特異的修飾化ポリペプチドはＣａｓ９ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１３−１５の組成物。
【請求項１７】
前記合成シングルガイドＲＮＡは少なくとも１個の化学的に修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１３−１６の組成物。
【請求項１８】
前記化学的に修飾されたヌクレオチドは、２’位修飾を有することを特徴とする、請求項１７の組成物。
【請求項１９】
標的ＤＮＡの部位特異的修飾化方法であって、前記方法は、
（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）部位特異的修飾化ポリペプチドと相互作用する配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドと、非ホスホジエステル共有結合を介して結合している第２のオリゴヌクレオチドと、を有する
（ｉ）合成シングルガイドＲＮＡと、      
（ｉｉ）部位特異的修飾化ポリペプチドまたは前記部位特異的修飾化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、に前記標的ＤＮＡを接触させる工程を有し、
前記部位特異的修飾化ポリペプチドは、
（ア）前記合成シングルガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と、
（イ）前記シングルガイドＲＮＡの前記ヌクレオチド配列によって酵素活性の部位が決定されることを特徴とする部位特異的酵素活性を示す活性部分と、を有することを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記合成シングルガイドＲＮＡは６５−１６０ヌクレオチド長を有することを特徴とする、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記共有結合は、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、スルホン、スルホキシド、ウレア、チオウレア、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光感受性結合、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環状付加対または閉環メタセシス対、及びＭｉｃｈａｅｌ反応対のＣ−Ｃ結合生成基からなる群から選定される化学的部分を有することを特徴とする、請求項１９−２０の方法。
【請求項２２】
前記部位特異的修飾化ポリペプチドはＣａｓ９ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１９−２１の方法。
【請求項２３】
前記合成シングルガイドＲＮＡは少なくとも１個の化学的に修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１９−２２の方法。
【請求項２４】
前記標的ＤＮＡはインビボ染色体の一部であることを特徴とする、請求項１９−２３の方法。
【請求項２５】
前記標的ＤＮＡはインビトロ染色体の一部であることを特徴とする、請求項１９−２３の方法。
【請求項２６】
請求項１の合成シングルガイドＲＮＡのライブラリであって、前記ライブラリは少なくとも１０個のＲＮＡ分子を有することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子編集分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
長年にわたり、細胞内の活性を制御するために、研究者はオリゴヌクレオチドの利用に関心を向けてきた。研究されてきた手順は、アンチセンス技術及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術に依拠したプロセスである。こうした各技術は、関連するヌクレオチド配列の相補性度合に基づき、あるオリゴヌクレオチドの活性を利用して１個以上の他の核酸類の領域又は複数領域を標的化している。
【０００３】
ＤＮＡ活性の制御について近年研究されてきた領域では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用している。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムによって、バクテリアの約４０％−６０％及び古細菌の約９０％で天然に存在するタンパク質を利用できる。天然起源のＣＲＩＳＰＲタンパク質類は、ある種の非翻訳型ＲＮＡとの組合せで、外来性ＤＮＡに対する耐性を、原核生物に付与することが示されてきた。原核生物中、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座位は、オペロンに配置されるｃａｓ遺伝子と、スペーサーと称されて同一反復配列が点在する特有のゲノム標的化配列類からなるＣＲＩＳＰＲ配列と、から構成される。
【０００４】
近年、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム由来のＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼである、Ｃａｓ９を用いた遺伝子発現の制御方法の開発が、研究者たちにより報告された。研究者たちは、一般的に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた共発現を行う場合、ストレプトコッカス・ピロゲネス由来のＣａｓ９タンパク質を用い、遺伝子編集に成功したと述べている。この文脈では、ｇＲＮＡは２個の別々のＲＮＡ分子からなるキメラ型分子、つまり、非標的化トランス活性配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と結合したＤＮＡ標的化配列（ｃｒＲＮＡ）である。一方、Ｃａｓ９発現細胞において２個の別個の合成ＲＮＡ、つまり、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを用いて、或いは、細胞内にＣａｓ９発現ベクター、Ｃａｓ９タンパク質、または、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを形質導入して、効率的に遺伝子編集を行うことも可能である。しかし、残念ながら、シングルガイドＲＮＡ分子の化学合成は、その大きさ（〜１１６ｎｔｓ）及び低収率のために、未だ実用化されてはいない。本発明はこの問題を解決する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＤＮＡを調節及び／または修飾するのに有用な、化学的に合成した様々なシングルガイドＲＮＡ分子類を目的とする。ここに開示した様々な技術を利用して、例えば、オリゴヌクレオチド類や、オリゴヌクレオチド−タンパク質複合体類を用いることで、生物の一細胞または複数の細胞で、ＤＮＡの活性を効率的かつ効果的に制御することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１実施形態中、本発明は、標的ＤＮＡの配列に相補的な配列を有する第１オリゴヌクレオチドと、部位特異的修飾化ポリペプチドと相互作用する配列を有する第２オリゴヌクレオチドとを有する、合成シングルガイドＲＮＡを提供する。第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドは、非ホスホジエステル共有結合によって結ばれている。また、第１オリゴヌクレオチドは、通常、約２５−６０ヌクレオチド長を有し、第２オリゴヌクレオチドは、通常、約４０−１００ヌクレオチド長を有する。ここに開示するヌクレオチド類の何れについても、化学的に修飾することが可能であり、例えば、２’位の修飾ができる。
【０００７】
共有結合の例として、以下に限定されるものではないが、カルバメート結合、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、イミン結合、アミジン結合、アミノトリアジン結合、ヒドラゾン結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオリン酸エステル結合、ジチオリン酸エステル結合、スルホン酸アミド結合、スルホン酸エステル結合、スルホン結合、スルホキシド結合、ウレア結合、チオウレア結合、ヒドラジド結合、オキシム結合、トリアゾール結合、光感受性結合、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環状付加対または閉環メタセシス対、及びＭｉｃｈａｅｌ反応対などのＣ−Ｃ結合生成基などが挙げられる。
【０００８】
部位特異的修飾化ポリペプチド類は、合成シングルガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と、二本鎖ＤＮＡの開裂など部位特異的酵素活性を示す活性部分とを有する、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ類である。部位特異的修飾化ポリペプチドの一例として、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来するＣａｓ９が挙げられる。このＣａｓ９ポリペプチドには、天然に存在する野生型タンパク質、突然変異型Ｃａｓ９（例えば、点変異、欠失変異、切断変異）、または、別の機能性タンパク質と結合したキメラ型ポリペプチドがある。標的ＤＮＡは任意のＤＮＡであってよいが、好適には真核生物のＤＮＡ、より好適には哺乳類のＤＮＡ，さらに好適にはヒトのＤＮＡである。標的配列は、ＤＮＡの鋳型鎖の翻訳領域、ＤＮＡの非鋳型鎖の翻訳領域、または、ＤＮＡの鋳型鎖のプロモータ領域などの非翻訳領域、ＤＮＡの非鋳型鎖のプロモータ領域、鋳型鎖または非鋳型鎖のエンハンサー領域、或いは、鋳型鎖または非鋳型鎖のインシュレータ領域などである。また、標的配列は、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）をコード化する非コード配列であってもよい。
【０００９】
第２実施形態中、本発明は、第１実施形態の合成シングルガイドＲＮＡと、部位特異的修飾化ポリペプチドまたはこのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドとを有する組成物を提供する。部位特異的修飾化ポリペプチドの一例として、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム由来のＣａｓ９が挙げられる。このＣａｓ９ポリペプチドには、天然に存在する野生型タンパク質、突然変異型Ｃａｓ９（例えば、点変異、欠失変異、切断変異）、または、別の機能性タンパク質と結合したキメラ型ポリペプチドがある。いくつかの実施形態中、修飾化ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、インビトロで転写されたＣａｓ９  ｍＲＮＡである。また、別の実施形態中、修飾化ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、修飾化タンパク質を発現するプラスミドＤＮＡ、または修飾化ポリペプチドを発現するウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）である。
【００１０】
また、第３実施形態中、本発明は、標的ＤＮＡを部位特異的に修飾する方法を提供する。この方法は、第１実施形態の合成シングルガイドＲＮＡと、部位特異的修飾化ポリペプチドまたはこのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドとを、細胞内に導入する。或いは、細胞と接触させる工程を有する。部位特異的修飾化ポリペプチドの一例として、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム由来のＣａｓ９が挙げられる。このＣａｓ９ポリペプチドには、天然に存在する野生型タンパク質、突然変異型Ｃａｓ９（例えば、点変異、欠失変異、切断変異）、または、別の機能性タンパク質と結合したキメラ型ポリペプチドがある。いくつかの実施形態中、修飾化ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、インビトロで転写されたＣａｓ９  ｍＲＮＡである。また、別の実施形態中、修飾化ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、修飾化タンパク質を発現するプラスミドＤＮＡ、または修飾化ポリペプチドを発現するウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）である。
【００１１】
さらに、本発明は、第１実施形態の合成シングルガイドＲＮＡのライブラリを提供する。このライブラリは、少なくとも１０、３０、５０、７５、または少なくとも１００個のＲＮＡ分子、少なくとも５００、或いは少なくとも１０００個のＲＮＡ分子からなるものであって、標的ＤＮＡの異なる配列を標的にする。この例において、標的ＤＮＡは、複数のｓｇＲＮＡで標的にされる同一遺伝子か、または異なる遺伝子を標的にする各ｓｇＲＮＡが標的にする複数の遺伝子であってよい。また、このライブラリは少なくとも２個の合成シングルガイドＲＮＡからなるプールの形態や、またはマルチウエル方式の各ウエルに入れた個々のＲＮＡであってもよい。
【００１２】
本発明の様々な実施形態は、遺伝子編集の高効率性、高特異性及び高利便性の一又は二つを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】３’−アジド−アデノシンポリスチレン担体の調製工程を示す。
【図２】５’−ヘキシンホスホロアミダイトの調製工程を示す。
【図３】本発明のシングルガイドＲＮＡの合成工程を例示する。
【図４】Ｔ７Ｅ１ミスマッチ検出アッセイの結果を示す。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ（レーンＣ）として複合体となった２個の別個の分子を用いてヒトＰＰＩＢ遺伝子を開裂する場合と同程度の開裂効率で、リンカー（レーンＤ及びＥ）で連結した９９個のヌクレオチドからなる合成シングルガイドＲＮＡが、同じ標的遺伝子（ヒトＰＰＩＢ遺伝子）を切断できることを示している。なお、レーンＡは非結合型合成９９ｍｅｒ、レーンＢは非結合型合成８１ｍｅｒを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、真核生物のＤＮＡ及び／またはクロマチン、及び／またはＤＮＡ及び／またはクロマチンに関連した他の部分からなる内在性領域を変更する、及び／または修飾するために、オリゴヌクレオチドの分子、複合体、システム及びその他組成物を提供する。さらに、これらオリゴヌクレオチドの分子、複合体、システム及びその他組成物を製造及び使用する方法を提供する。本発明の様々な実施形態によって、インビトロ及びインビボの活性を、所望の特異性度合で効果的且つ効率的に変更することが可能である。
【００１５】
（定義）
特に断らない限り、または文脈から暗に示されない限り、以下に述べる用語、成句、略語や頭字語は次に説明する意味を有する。
【００１６】
略語「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連部分、例えば、ＩＩ型のＣａｓ９やその誘導体を意味する。Ｃａｓ９タンパク質類は、酵素（つまり、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ類）ファミリーを構成し、天然に存在する場合、二本鎖ＤＮＡを開裂するために、活性化ｔｒａｃｒＲＮＡ及び標的化ｃｒＲＮＡ間に形成される塩基対構造に依拠する酵素類である。天然に存在するｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡの２次構造には、ｃｒＲＮＡの３’末端側２２個のヌクレオチドと、成熟ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端近傍セグメントとの間に塩基対が形成される。この塩基対の相互作用によって、例えば、ｃｒＲＮＡの５’末端側２０個のヌクレオチドは別のｃｒＲＮＡとは異なり、このｃｒＲＮＡがＣａｓタンパク質と連携するとき、標的ＤＮＡとの結合が可能となる。
【００１７】
また、略語「ＣＲＩＳＰＲ」は、クラスター化して規則的配列の短い回文型反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）を意味する。また、ＣＲＩＳＰＲは、ＳＰＩＤＲ（Ｓｐａｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｐｅｒｓｅｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｅａｔｓ）としても知られ、ＤＮＡ遺伝子座位のファミリーを構成する。こうした遺伝子座位は、通常、短く且つ保存性の高いＤＮＡ反復配列、例えば、１−４０回反復し、少なくとも部分的に回文配列した２４−５０塩基対から構成される。この反復配列は、通常、種特異的であり、一定の長さ、例えば、２０−５８塩基対からなる多様な配列で構成される。ＣＲＩＳＰＲ座位は、１以上のタンパク質と、タンパク質に翻訳されない１以上のＲＮＡとをコード化できる。よって、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ」システムは、バクテリアまたは古細菌と同一或いはそれらに由来するシステムであり、ＣＲＩＳＰＡＲ座位によってコード化される、または前記座位に由来する、Ｃａｓタンパク質を少なくとも１つ含むシステムである。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０のＩＩ型ＣＲＩＳＰＥＲ座位は、４個の遺伝子から構成され、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの遺伝子とともに、２個の非コードＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び、同一反復配列（ＤＲ）が配置されたヌクレアーゼガイド配列（スペーサ）を含む、プレｃｒＲＮＡ配列を有する。
【００１８】
また、略語「ｃｒＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡを意味する。ｃｒＲＮＡは、特定の位置で処理される一本の長いＲＮＡとして、構成的に転写されるＣＲＩＳＰＲ配列から得ることができる。また、ｃｒＲＮＡは、化学合成も可能である。ｃｒＲＮＡ分子は、ＤＮＡ標的化セグメントと、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク結合セグメントからなる不完全なｄｓＲＮＡ二本鎖の片方を構成するヌクレオチドのストレッチとを有する。
【００１９】
また、「ガイドＲＮＡ」及び「シングルガイドＲＮＡ」の用語は、同じ意味で使用する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を化学的な意味で使用するとき、「合成シングルガイドＲＮＡ」または「合成ｓｇＲＮＡ」としての意味を有する。また、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡであって、修飾された或いは本来のサイズまたは形状の、２つの異なる機能性配列を有するポリヌクレオチド配列を意味する。また、ｇＲＮＡは、発現ベクターを用いて発現可能であるか、または化学的に合成できる。合成ｓｇＲＮＡは、リボヌクレオチドやその類似体、またはその修飾体、或いは、修飾体の類似体や非天然型ヌクレオシドを含むことができる。合成シングルガイドＲＮＡは、修飾された骨格や、非天然型のヌクレオシド間の連結部を含有してもよい。
【００２０】
また、本明細書で用いる「リンカー」の用語は、少なくとも２つの別個のオリゴヌクレオチド分子を連結する化学物質を意味する。幾つかの実施形態中、前記した第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとは、この第１オリゴヌクレオチドの３’末端と、第２オリゴヌクレオチドの５’末端とが共有結合で結ばれている。或いは、第１及び第２オリゴヌクレオチドは、この第１オリゴヌクレオチドの５’末端と、第２オリゴヌクレオチドの３’末端とが共有結合で結ばれていてもよい。
【００２１】
次に、「ヌクレオチド」の用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを意味する。幾つかの実施形態中、各ヌクレオチドは、リボヌクレオチドやその類似体や修飾体、または修飾体の類似物である。ヌクレオチドは、プリン型核酸塩基、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、及びこれらの誘導体及び類似体とともに、ピリミジン型核酸塩基、例えば、チトシン、ウラシル、チミン、及びこれらの誘導体や類似体を含む塩基種から構成される。
【００２２】
修飾された塩基の例として、以下のヌクレオチドが挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。例えば、アデニン、グアニン、チトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシン、及びクエオシンが挙げられる。なお、これら塩基は、１以上の原子や官能基で置換または付加反応して修飾される。この置換や付加反応によって、１以上の位置でヌクレオチドをアルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化、またはアセチル化することができる。
【００２３】
修飾された塩基のより具体的な例としては、以下に限定されるものではないが、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ-ジメチルアデニン，２−プロピルアデニン，２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３-メチルウリジン、５−メチルシチジン、５-メチルウリジン、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２-メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２-メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メトキシウリジン、デアザヌクレオチド類、例えば、７−デアザアデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチルー２−チオウリジン、及び２−チオウリジン、４−チオウリジン、２−チオウリジンなどのその他チオ塩基、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、クエウロシン、アルカエオシン、ナフチル及び置換ナフチル基、Ｎ６−メチルアデノシン、５-メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン  ５-オキシ酢酸、ピリジン４−オン、及びピリジン２−オンなどのＯ−及びＮ−アルキル化プリン及びピリミジン、アミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシ  ベンゼンなどのフェニル及び修飾フェニル基、Ｇ−クランプヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、８−置換アデニン及びグアニン、５−置換ウラシル及びチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、及びアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドなどが挙げられる。
【００２４】
修飾ヌクレオチドは、糖残基を修飾したヌクレオチドを含むと共に、リボシル基ではない糖またはその類似体を有するヌクレオチドも含む。例えば、糖残基は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、及びその他糖類、複素環、または炭素環式化合物や、それらの派生物である。糖残基の修飾例として、２’位の修飾が挙げられる。２’位リボースの修飾例としては、以下に限定されるものではないが、−ＯＨ基、−Ｈ（水素）、−Ｆ、−ＮＨ３、−ＯＣＨ３、及び他のＯ−アルキル残基（例えば、−ＯＣ２Ｈ５及び−ＯＣ３Ｈ７、アルケニル残基、アルキニル残基及びオルトエステル残基）などの残基による置換が挙げられる。
【００２５】
「相補的」の用語は、ポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成する能力を意味する。通常、塩基対は逆平行のポリヌクレオチド鎖または領域中のヌクレオチド単位間で水素結合して形成される。相補的なポリヌクレオチド二本鎖または領域は、ワトソンークリック型塩基対（例えば、Ａ対Ｔ，Ａ対Ｕ、Ｃ対Ｇ）、或いは、安定二本鎖を形成できる別の型での塩基対である。完全相補性または１００％相補性とは、１つのポリヌクレオチド鎖または領域の各ヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチド鎖または領域の各ヌクレオチド単位と水素結合を形成する状態をいう。また、不完全な相補性とは、２つの鎖または２個の領域のヌクレオチド単位の一部が、しかし全部ではないものが互いに水素結合を形成する状態をいう。本明細書に開示する合成シングルガイドＲＮＡは、例えば、１０−２０のヌクレオチド長を有するヌクレオチド配列であって、標的ＤＮＡの配列に相補的である。但し、この相補性は、合成シングルガイドＲＮＡが標的ＤＮＡの配列を、配列依存的に修飾できる限り、連続して相補的である必要はない。
【００２６】
「部位特異的修飾化ポリペプチド」の語句は、ＲＮＡに結合し、特定のＤＮＡ配列を標的にするポリペプチドまたはタンパク質を意味する。本発明中で用いる部位特異的修飾化ポリペプチドとは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼであって、合成シングルガイドＲＮＡ分子によって特定のＤＮＡ配列を標的にし、この合成シングルガイドＲＮＡと結合することで二本鎖標的ＤＮＡを開裂させる。本発明中好適なＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムまたはその誘導体由来のＣａｓ９タンパク質類である。これらは、天然に存在する野生型タンパク質、トランケートされたＣａｓ９タンパク質やキメラ型ｃａｓ９ポリペプチドを含む突然変異型Ｃａｓ９のいずれかである。このキメラ型ｃａｓ９ポリペプチドは、本来のＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質の断片と結合した別個の機能性ドメイン（例えば転写活性部）を有する。
【００２７】
「ＰＡＭ」の略語は、プロトスペーサ隣接部分を意味する。通常、ＰＡＭは３−５ヌクレオチド長で、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子配列の中で、非標的鎖の下流または３’位側のプロトスペーサに隣接して位置する。ＰＡＭ配列及びその位置は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのタイプに従って変化する。例えば、ストレプトコッカク・ピオゲネスＩＩ型システムにおいて、ＰＡＭはＮＧＧ共通配列を有し、この配列は２つのＧ：Ｃ塩基対を含み、標的ＤＮＡの中にプロトスペーサに由来する配列の下流に塩基対を１つ形成する。ＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡの非相補性鎖（プロトスペーサ）上に存在し、ＰＡＭの逆相補性部が標的ＤＮＡ配列の５’位に位置する。このＰＡＭ配列は、あるシステム、例えば、部位特異的修飾化タンパク質が由来するシステムに特異的である。
【００２８】
本明細書中、核酸やポリペプチドに使用する「キメラ型」の用語は、異なる起源に由来する構造で規定される２つの成分を示す。例えば、キメラ型ポリペプチドの文脈でキメラ型の用語を使用する場合、このキメラ型ポリペプチドは、２つの異なるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を有する。キメラ型ポリペプチドは、修飾型または天然存型のポリペプチド配列の何れか一方を含有する。本発明の合成シングルガイドＲＮＡとともに用いるキメラ型部位特異的修飾化ポリペプチドの例として、以下に限定されるものではないが、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を有するポリペプチドが挙げられる。例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ポリメラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ヘリカーゼ活性、インテグラーゼ活性などのものが挙げられる。
【００２９】
また、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」の用語は、本明細書中、相互に交換可能に使用され、任意の長さをもつアミノ酸ポリーマーを意味する。また、コードされたまたはコードされないアミノ酸や、化学的または生物学的に修飾或いは誘導したアミノ酸、及び修飾したペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれる。
【００３０】
本明細書の中で、ある範囲を述べるときは常に、例えば、温度範囲、時間範囲、パーセント配列相同性範囲、配列相補性範囲、長さの範囲、または、成分や濃度の範囲、全ての中間範囲や部分的範囲、並びに、これら範囲内に含まれる全ての個々の値は、本開示の中に含まれるものとする。
【００３１】
また、ここに使用する「有する」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の用語は、「含む」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、「含有する」（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）または「特徴をもつ」（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）と同意語であり、包括的または非限定的な意味をもち、追加や、ここに引用していない要素或いは方法の工程を除外するものではない。また、ここに使用する「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）の用語は、請求項の要素の中に明示されない要素、工程や成分を除外している。また、ここに使用する、「基本的に、からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）の用語は、請求項の基本的及び新規特徴に実質的に影響しない物質及び工程を除外するものではない。なお。個々の例において、「有する」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「基本的に、からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）及び「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）の用語は何れも、１個または他の２個の用語と交換することができる。また、ここに説明として述べる開示は、本明細書中に具体的に開示していない任意の要素や限定がなくとも実施することが可能である。
［合成シングルガイドＲＮＡ］
【００３２】
本発明は、Ｃａｓ９などの部位特異的修飾化ポリペプチドと共に使用する場合、標的ＤＮＡの特定の遺伝子座を修飾するのに有用な、合成シングルガイドＲＮＡ類を提供する。この合成シングルガイドＲＮＡ類は、共有結合した２個のオリゴヌクレオチドから構成される。第１のオリゴヌクレオチド（ｃｒＲＮＡとして知られる）は、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列に相補的な配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡと複合体をなす配列とを含有する。第２のオリゴヌクレオチド（ｔｒａｃｒＲＮＡとして知られる）は、部位特異的修飾化ポリペプチド（例えばＣａｓ９）と相互作用するヌクレオチド配列と、前記第１のオリゴヌクレオチドと複合体をなす配列とを有する。合成シングルガイドＲＮＡ及び部位特異的修飾化ポリペプチドは複合体を形成し、前記第１オリゴヌクレオチドの相補的配列によって決まる特定の配列で、この複合体は標的ＤＮＡを標的化して開裂する。
【００３３】
本発明のシングルガイドＲＮＡは、他の方法、例えば、ベクター発現法やインビトロ転写法で構築したガイドＲＮＡに比較していくつかの利点を有する。つまり、ｉ）その機能性を設計、付与及び試験することが簡単である。ｉｉ）所望に応じて、ヌクレオチドを化学的に修飾し、安定性及び特異性を増強することができる。ｉｉｉ）ハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニングの目的で、多数のシングルｇＲＮＡ類を構築可能である。さらに、結合化学を用いて２個の別々のオリゴヌクレオチドを結合することで、より長いＲＮＡ類を化学合成するときに生じる低収率問題を回避できる。
【００３４】
本発明の合成シングルガイドＲＮＡは、通常、約６５−１６０ヌクレオチド長、例えば、約６６−１２０ヌクレオチド長、約７０−１１０ヌクレオチド長、約８１−９９ヌクレオチド長を有する。ある実施形態中、第１オリゴヌクレオチドは、約２５−６０ヌクレオチド長を有し、第２オリゴヌクレオチドは、約４０−１００ヌクレオチド長を有する。また、幾つかの実施形態中、第１オリゴヌクレオチドは、約３０−５５ヌクレオチド長を有し、約３５−５０ヌクレオチド長、または、約４０−４５ヌクレオチド長を有する。第１ヌクレオチド内には、標的配列に相補的な領域または配列（つまり標的化配列）がある。また、幾つかの実施形態中、この標的化配列は、１８、１９または２０のヌクレオチド長を有する。標的化配列は、標的配列に対して１００％の相補性をもつ必要がないことは理解できよう。標的化配列は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の相補性を、標的配列に対して有してよい。幾つかの実施形態中、第２ヌクレオチドは、約５０−９０ヌクレオチド長を有し、約６０−８０ヌクレオチド長、または、約７０−７５ヌクレオチド長を有する。ある場合には、第１オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチド長の標的化配列を有し、少なくとも約７ヌクレオチド長の、少なくとも約１０ヌクレオチド長の、少なくとも約１５ヌクレオチド長の、少なくとも約２２ヌクレオチド長のｔｒａｃｒ結合配列を有する。また、ある事例では、第１ヌクレオチドは約４２ヌクレオチド長を有し、第２ヌクレオチドは約７４ヌクレオチド長を有する。さらにまた、幾つかの例では、第１ヌクレオチドは約３４ヌクレオチド長を有し、第２ヌクレオチドは約６５ヌクレオチド長を有する。また、別の例では、第１ヌクレオチドは３４ヌクレオチド長を有し、第２ヌクレオチドは４７ヌクレオチド長を有する。
【００３５】
また、幾つかの実施形態中、第１ヌクレオチド及び第２ヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、化学的に修飾されていてもよい。例えば、第１及び第２ヌクレオチドの任意のヌクレオチドは、２’−修飾を有していてもよい。また、別の実施形態では、第１ヌクレオチド、第２ヌクレオチド、及び合成ｓｇＲＮＡの最後のヌクレオチドは、単独でまたは組み合わせて化学的に修飾されていてもよい。幾つかの実施形態では、第１ヌクレオチド、第２ヌクレオチド及び前記した最後のヌクレオチド以外の各ヌクレオチドは、リボース糖上に２’−ＯＨ基を含有する。また幾つかの例では、第１ヌクレオチドまたは第２ヌクレオチドの一方が、或いは第１ヌクレオチドまたは第２ヌクレオチドの両方が、修飾されたオリゴヌクレオチドを含有してもよい。
【００３６】
本発明の合成ｓｇＲＮＡは、天然存在型のように、任意の対応するｃｒＲＮＡ対及びｔｒａｃｒＲＮＡ対を有することができる。なお、前記ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、幾つかのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに由来する先行技術で公知である（ＷＯ２０１３／１７６７７２）。
［第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドどの結合］
【００３７】
本発明の合成シングルガイドＲＮＡは、通常、約６５から１６０ヌクレオチド長を有し、以下の式で表される。
Ａ−Ｌ−Ｂ
【００３８】
ここに、Ａは約２５−６０ヌクレオチド長の第１オリゴヌクレオチドを表し、Ｌは柔軟性をもつリンカーを表し、Ｂは約４０−１００ヌクレオチド長の第２オリゴヌクレオチドを表す。
【００３９】
本発明のシングルガイドＲＮＡを合成するために、標準的ホスホロアミド合成プロトコール（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，編集、分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、Ｃｏｌ.２８８，オリゴヌクレオチド合成：方法と応用（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（２０１２））を用い、先ず、２個の別々のオリゴヌクレオチド（第１及び第２オリゴヌクレオチド）を合成する。ある例では、第１オリゴヌクレオチドまたは第２オリゴヌクレオチドは、合成完結時に、第２または第１オリゴヌクレオチドと結合できる適当な官能基を有する。しかし、第１または第２オリゴヌクレオチドが結合用に好適な官能基を含有しない場合、従来技術で公知の標準的プロトコール（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，バイオコンジュゲート技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０１３））を用いて官能基化することができる。
【００４０】
官能基の例としては、以下に限定されるものではないが、水酸基、アミノ基、カルボン酸基、カルボン酸ハライド基、カルボン酸活性エステル基、アルデヒド基、カルボニル基、クロロカルボニル基、イミダゾリルカルボニル基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、チオール基、マレイミド基、ハロアルキル基、スルホニル基、アリル基、プロパギル基、ジエン基、アルキン基及びアジド基などが挙げられる。一旦、第１オリゴヌクレオチド及び第２ヌクレオチドが官能基化されれば、この２個のオリゴヌクレオチド間に共有化学結合または連結が形成される。化学結合の例としては、以下に限定されるものではないが、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドラゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、スルホン、スルホキシド、ウレア、チオウレア、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光感受性結合、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環状付加対または閉環メタセシス対、及びＭｉｃｈａｅｌ反応対などのＣ−Ｃ結合形成基などが挙げられる。
【００４１】
本発明は、ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いて例示される。このシステムにおいて、ｃｒＲＮＡは天然存在型の４２ヌクレオチド長を有し、ｔｒａｃｒＲＮＡは天然存在型の７４ヌクレオチド長を有する。先に説明したように、ｃｒＲＮＡの３’末端側２２個のヌクレオチドと、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端近傍セグメントとの間に塩基対が形成され、この塩基対形成によってＣａｓ９との複合体形成が可能になるため、配列特異的に二本鎖ＤＮＡを開裂できる。
【００４２】
ここに開示する合成シングルガイドＲＮＡの一例として、９９ヌクレオチド長であって、６５ｍｅｒの第２オリゴヌクレオチドと結合する３４ｍｅｒの第１オリゴヌクレオチドが挙げられる（表１のＯＤＮ−６参照）。
【００４３】
第１オリゴヌクレオチド（３４ｍｅｒ）の塩基対領域のヌクレオチド配列を以下に示す（ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０由来）。
５’−Ｎ２０−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。なお、Ｎ２０は標的配列に相補的な配列を示す。
【００４４】
次に、第２オリゴヌクレオチド（６５ｍｅｒ）の塩基対領域のヌクレオチド配列を以下に示す（ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０由来）。
５’−ＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
【００４５】
なお、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓ９ポリペプチドに基づいて例示したが、如何なるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム類に由来するｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃａｓ９ポリペプチドの配列を用いても、本発明を実施することができる。公知のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、以下に限定されるものではないが、ストレプトコッカス・サーモフィリス、ストレプトコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ミュータンツ、リステリア・イノクア、ナイセリア・メニンギチデス、パスチューレラ・ムルトシダ、エム・モバイルなどが挙げられる。従って、これらシステム由来のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を利用可能であり、本明細書で記載したｓｇＲＮＡ類を設計及び合成して、対応するＣａｓ９ポリペプチド、機能的相同体またはキメラ型Ｃａｓ−９と共に使用し、標的ＤＮＡを修飾可能である。ｃｒＲＮＡや対応するｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＣａｓ−９タンパク質のヌクレオチド配列を含む詳細については、ＷＯ２０１３／１７６７７２を参照。
［合成シングルガイドＲＮＡとタンパク質複合体］
【００４６】
合成シングルガイドＲＮＡの第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが好適な二次構造を形成するとき、修飾の形態に拘わらず、この合成ｓｇＲＮＡは、部位特異的修飾化ポリペプチドと結合することができる。この部位特異的修飾化ポリペプチドは、ＲＮＡ結合領域と活性領域とを有する。ＲＮＡ結合領域は二本鎖領域またはその近傍でｓｇＲＮＡと結合できる。また、活性領域は、標的または標的と結合した分子や部分に作用することができる。
【００４７】
幾つかの実施形態中、修飾化タンパク質はエンドヌクレアーゼ活性をもつ天然存在型のＣａｓ９である。また、別の実施形態では、修飾化タンパク質はエンドヌクレアーゼ活性をもたない非天然型Ｃａｓ９である。例えば、ＲｕｖＣｌの非活性型変異体と、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン（例えばＤ１０Ａ及びＨ８４１Ａ；ＷＯ２０１３／１４１６８０）とを含有するか、或いは、これらドメインを欠失するが、異なる活性ドメインや非活性ドメインを随意もたせたストレプトコッカス・ピオゲネス由来のＣａｓ９タンパク質であってよい。
【００４８】
また、幾つかの実施形態中、修飾化タンパク質は標的ＤＮＡのプロトスペーサ隣接部分（ＰＡＭ）を認識できる、及び／または、ＤＮＡ成分に直接結合できる。ＤＮＡ成分とは、ＤＮＡヌクレオチドの一本鎖または二本鎖ストレッチ、クロマチン、或いはクロマチン内部のタンパク質（例えばヒストン）である。幾つかの実施形態中、部位特異的活性、例えば、標的の開裂は以下の２条件で決まる位置で発生する。つまり、（ｉ）第１オリゴヌクレオチドの標的化領域と、標的との間で生じる塩基対の相補性、及びｉｉ）標的内におけるＰＡＭ配列。
【００４９】
これとは別に、または追加すると、前記修飾化タンパク質はヘリカーゼ活性を有する。ヘリカーゼ活性によって、第１オリゴヌクレオチドの標的化配列で特定されるＤＮＡ標的配列を、前記修飾化タンパク質は解きほぐすことができる。ＤＮＡが解きほぐされると、前記標的化配列は、ＤＮＡ標的と塩基対を形成できる。
［方法］
【００５０】
本発明のオリゴヌクレオチド及び複合体を、インビトロ及びインビボで用いると、細胞または生物に変化を起こす。例えば、本発明によって、一本鎖オリゴヌクレオチド、つまり、合成シングルガイドＲＮＡを細胞内に導入できる。合成シングルガイドＲＮＡは、上記したように結合した第１オリゴヌクレオチドと、第２オリゴヌクレオチドとを有する。
【００５１】
また、部位特異的修飾化タンパク質を導入することもできる。第２オリゴヌクレオチドセグメントにリンカーで結合した第１オリゴヌクレオチドを含む一本鎖合成ｓｇＲＮＡを導入前、導入後、または導入時に、細胞外部から修飾化タンパク質が導入される。その成分は複合体として導入してもよいが、または、その成分が細胞内で複合体を形成してもよい。
【００５２】
この導入操作は、受動的またはビークルを介して実施可能であり、修飾化タンパク質は導入時にバッファー中に混入しておいてもよい。よって、幾つかの実施形態中、修飾化タンパク質、合成ｓｇＲＮＡ、または前記修飾化タンパク質をコードするベクターをキットの一部とすることができる。或いは、修飾化タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを、遺伝子編集用に合成ｇＲＮＡと共に使用することができる。
【００５３】
また、一方で、修飾化タンパク質を細胞内にあらかじめ存在させておくか、または、ベクターによって細胞内で発生させておくこともできる。このベクターは、例えば、修飾化タンパク質の遺伝子コードをもつＤＮＡポリヌクレオチドを含む組換発現ベクターであってよい。幾つかの実施形態で、ベクターを使用する場合、このベクターは誘導性プロモータを含有する。
【００５４】
また、別の実施形態では、上記したように化学修飾したオリゴヌクレオチドを有する合成ｓｇＲＮＡを、細胞内に導入できる。その他の方法としては、修飾化タンパク質を導入してもよい。この修飾化タンパク質は、ガイドＲＮＡの導入以前、導入後、または導入時に、外部から導入可能である。或いは、修飾化タンパク質を細胞内にあらかじめ存在させておくか、または、ベクターによって細胞内に発生させてもよい。幾つかの実施形態では、ベクターを用いる場合、このベクターは誘導性プロモータを含有する。
【００５５】
こうして、細胞内または核内に全ての成分が揃い、複合体が生成すると、第１オリゴヌクレオチドの標的化領域、または、第１オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍に位置する標的化配列は、標的に対する標的化領域の相補性によって、複合体を標的に向かわせる。続いて、この複合体の活性領域は、標的配列、標的配列の発現、または標的配列に近接した部分に作用する。
【００５６】
もし、誘導性プロモータによって１以上の成分が発生する場合、この方法を開始する以前、または実行する間、前記プロモータを誘導する分子は導入されていなければならない。
【００５７】
この方法によって、タンパク質の発現や発現速度を増加または減少させることができ、或いは、転写速度を増加または減少できる。限定されない例としては、この方法によって、標的ＤＮＡの部位特異的修飾を行うことができる。さらに、幾つかの例では、この方法によって、修飾化タンパク質の以下に記した１以上の活性領域により、ＤＮＡまたは付随したタンパク質を変化させることができる。つまり、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、デアミネーション活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体生成活性、インテグラーゼ活性、トランスポラーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、グリコラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、デユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または、脱ミリストイル化活性などが挙げられる。
例えば、活性部位がヌクレアーゼの場合に前記方法を行うとき、修飾化タンパク質は、標的ＤＮＡ中に二本鎖切断を誘導する。活性領域は、天然存在型の修飾化タンパク質の一部またはそれ由来するものである。或いは、活性領域は天然存在タンパク質と結合しているか、または、天然に存在しないキメラ型タンパク質の一部と結合している。
【００５８】
幾つかの実施形態中、非相同的末端結合または相同的特異的修復を可能にする条件下で、前記方法は実施される。さらに、ある実施形態では、前記方法はドナーポリペプチドに標的ＤＮＡを接触させる工程を有する。詳細に関しては、Ｍａｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１５、Ｍａｙ３３（５）２８０−２９４及びＣｈｅn  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１  Ｓｅｐｔ：８（９）７５３−７５７参照。
［合成］
【００５９】
本発明はシステム類も提供する。これらシステム類は、複合体の成分を有するか、または、複合体の任意の１以上の成分を生成できるベクターと、１以上のオリゴヌクレオチド、例えば、単一のＲＮＡ分子としてｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含有するオリゴヌクレオチドと、の組合せを有する。
【００６０】
１実施形態中、本発明は細胞中の一部分を、または細胞中の一部分の発現を変化させるシステムを提供する。このシステムは、部位特異的修飾化タンパク質を発現するベクター及び合成シングルガイドＲＮＡを有する。使用する細胞は遺伝修飾された細胞であるか、またはこの細胞になるものである。ある例では、この細胞は、古細菌細胞、バクテリア細胞、真核細胞、真核単細胞生物、身体細胞、細菌細胞、幹細胞、植物細胞、藻類細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト細胞、及びヒト細胞からなる群から選ばれる細胞、または、これら細胞に由来する細胞である。
【００６１】
ベクターが存在する場合、このベクターは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列への転写を通して、修飾化タンパク質を発現することができる。上記したように、この修飾化タンパク質は、オリゴヌクレオチド結合領域と、活性領域とを有する。また、随意、ベクターは誘導性プロモータを含有することができる。ベクターを用いる場合、このベクターは、例えば、プラスミドＤＮＡまたはウイルス粒子である。第１実施形態中、Ｃａｓ９タンパク質は、ＣｏｌＥｌ複製起点を含むプラスミド上のアンヒドロテトラサイクリン（ａＴＣ）−誘導性プロモータから発現させる。また、別の実施形態では、ドキシサイクリン誘導性発現システムを使用する。
【００６２】
前記修飾化タンパク質の遺伝子コードのベクター内には、蛍光タンパク質、及び／または、ピューロマイシンまたはブラスチサイジンなどの選択マーカータンパク質の遺伝子コードの配列が存在する。蛍光タンパク質またはマーカータンパク質の遺伝子コードの配列は、修飾化タンパク質の遺伝子コードである同じプロモータの制御を受けるか、或いは、前記配列は同じベクター上にありながら異なるプロモータの制御を受ける。一方、前記配列は、別個のプロモータの制御を受ける異なるベクター上に存在することも可能である。蛍光タンパク質または選択マーカータンパク質を制御する別個のプロモータが存在する場合、このプロモータは、同じまたは異なる分子によって誘導されるか、または、修飾化タンパク質の遺伝子コードの配列の転写を誘導できる刺激によって誘導される。
【実施例】
【００６３】
ここに記載する実施例は、説明を目的としたものである。特に言及しない限り、または、文脈から明確である限り、ある実施例に関して言及した如何なる特徴も、他の任意の実施例と関連させて使用することができる。
【実施例１】
【００６４】
３’−アジドアデノシンポリスチレン担体の合成（図１）
Ｎ６−イソブチリル−２’−Ｏ−［２−（２−ヒドロキシエチル）メチルカルバメート］−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン（２）：
【００６５】
化合物１（１０．０ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）１７０ｍＬ溶液に、ＣＤＩ（１，１’−カルボニルジイミダゾール）（２．９ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）を加えた。１８時間撹拌後、２−（メチルアミノ）エタノール（５．２ｇ、６８．８ｍｍｏｌ）を加えた。１．５時間後に反応を終了し、溶媒を蒸発乾固させた。粗生成物を１００ｇ  Ｕｌｔｒａ  ｃａｒｔｒｉｇｅと、酢酸エチル：ＭｅＯＨグラジエント系（０→１０％）を用いたＢｉｏｔａｇｅ  ＩｓｏｌｅｒａＴＭで精製し、化合物２を白色泡状物として得た（１０．８ｇ，９３％）。化合物２はＲＰ−ＨＰＬＣで分析した：10.54min, 99.4%。 1NMR (CDCI3, 300 mHz)δ8.65 (s, 1 Η), 8.63 (s, 1 Η), 8.10 (s, 1 Η),6.04 (d, J= 8.8 Hz, 1 Η), 5.64 (d, J= 5.3 Hz, 1 Η), 5.15 (m, 1 Η), 4.16-3.98 (m, 4 Η),  3.76 (m, 2 Η), 3.56-3.15 (m, 3 Η), 3.05 及び2.96 (各々 s, 3 Η), 2.86 (s, 1 Η), 2.59 (m, 1Η), 1.27 (d, J= 6.8 Hz, 6 Η), 1.08-1.01 (m, 28 Η)。
Ｎ６−イソブチリル−２’−Ｏ−［２−（２−アジドエチル）メチルカルバメート］アデノシン（３）：
【００６６】
化合物２（６．０ｇ，８．８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ４４ｍＬ溶液に、トリエチルアミン（２．７ｇ，２６．４ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴でこの溶液を冷却し、次に、メタンスルホニルクロリド（１．２ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）を、５分間かけてゆっくりと加えた。３０分撹拌後、ＤＣＭ１００ｍＬでこの溶液を希釈し、分液ロートに移した。有機相を、１０％クエン酸（２×５０ｍＬ）、水（１×５０ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（１×５０ｍＬ）で続けて洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４パッドに通し、濃縮してＮ６−イソブチリル−２’’−Ｏ−［２−（２−メタンスルホネート−オキシエチル）メチルカルバメート］−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルージシロキサン−１，３−ジイル）アデノシンを白色泡状物として得た。これをＲＰ−ＨＰＬＣで分析した：10.97 min,  96.7%。 1HNMR (CDCI3, 300 mHz) δ8.62 (s, 1 Η), 8.58 (s, 1 Η), 8.11 (s, 1 Η), 6.06 (s, 1 Η), 5.64,(d, J= 4.7 Hz, 1 Η), 5.15 (m, 1 Η), 4.39-4.26 (m, 2 Η), 4.15-3.99 (m, 3 Η), 3.85-3.68(m, 1 Η), 3.60-3.41 (m, 1 Η), 3.23- 3.17 (m, 1 Η), 3.07 及び 3.02 (各々s, 3 Η), 1.27 (d, J= 6.8 Hz, 6 Η), 1.08-1.00 (m, 28 Η)。
【００６７】
得られた化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２０ｍＬに、直接溶解した。この溶液に、アジ化ナトリウム（１．９ｇ，２９．２ｍｍｏｌ）を加えた。続いて得られた懸濁液を６０℃で１０時間加熱し、次に水１００ｍＬで希釈した。反応混合物をＥｔ２Ｏで抽出した（３×１００ｍＬ）。エーテル抽出層を合わせ、水（１×５０ｍＬ）で、続いて飽和ＮａＣｌ（１×５０ｍＬ）で洗浄した。この溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、Ｎ６−イソブチリル−２’−Ｏ−［２−（２−アジドエチル）メチルカルバメート］−３’，５’−Ｏ−テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３’−ジイル）アデノシンを、白色泡状物として得た（５．５ｇ，８９％）。これをＲＰ−ＨＰＬＣで分析した：11.88 min, 94.1%。 1H NMR
(CDCI3, 300 mHz) δ8.64 (s, 1 Η), 8.61 (s, 1 Η), 6.04 (d, J= 3.1 Hz, 1 Η), 5.65 (d, J= 5.3Hz, 1 Η), 5.15 (m, 1 Η), 4.16-3.99 (m, 3 Η), 3.54-3.37 (m, 3 Η), 3.27-3.18 (m, 1 Η), 3.05及び 2.97 (各々s, 3 Η), 1.27 (d, J= 6.8 Hz, 6 Η), 1.08-1.00 (m, 28 Η)。
【００６８】
得られた化合物を、追加精製することなく脱シリル化工程を行った。ＴＥＭＥＤ（４．５０ｇ，３９．０ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ３１ｍＬ溶液に、０℃にて、約４８％ＨＦ（１．０ｍＬ，２７．３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。この溶液を１０分間撹拌し、別のフラスコ中のＮ６−イソブチリル−２’−Ｏ−［２−（２−アジドエチル）メチルカルバメート］−３’，５’−Ｏ−テトライソプロピル−ジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン（５．５ｇ，７．８ｍｍｏｌ）に加えた。反応混合物を２時間撹拌し、濃縮乾固した。この粗生成物を、５０ｇＵｌｔｒａ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅを用い、８５：１５の酢酸エチル：ヘキサン溶液（０．１％ＴＥＭＥＤ）から酢酸エチル（０．１％ＴＥＭＥＤ）の６％ＭｅＯＨ溶液へとグラジエント系で行うＢｉｏｔａｇｅ  ＩｓｏｌｅｒａＴＭで精製し、化合物３を白色泡状物として得た（３．３ｇ，化合物２から８１％）。このものをＲＰ−ＨＰＬＣで分析した：4.78 min，96.1%。 1NMR (CDCI3, 300 mHz) δ9.08 (bs, 1 Η), 8.63 (s, 1 Η), 8.21 (d, J= 3.6 Hz, 1Η), 6.18 (d, J= 6.1 Hz, 1 Η), 5.66 and 5.59 (each as m, 1 Η), 4.76 (m, 1 Η), 4.27 (m, 1Η), 3.00-2.94 (m, 1 Η), 3.81-7.77 (m, 1 Η), 3.57-3.38 (m, 1 Η), 3.31-3.20 (m, 4 Η), 2.94及び2.84 (各々 s, 3 Η), 1.24 (d, J= 6.8 Hz, 6 Η)。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−イソブチリル−２’−Ｏ−［２−（２−アジドエチル）メチルカルバメート］−アデノシン（４）
【００６９】
化合物３（３．３ｇ，７．１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ７０ｍＬ溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（２．３ｇ，２１．３ｍｍｏｌ）を加えた。ＤＭＴ−クロリド（２．６３ｇ，７．８ｍｍｏｌ）を滴定するようにして、０．２当量分過剰量の反応混合物に対して、添加毎に赤色が消えるように添加した。１．１当量のＤＭＴ−クロリドの添加を２０分かけて行い、反応を完結させた。この反応混合物を、ＤＣＭ５０ｍＬで希釈し、飽和ＮａＣl（１×５０ｍＬ）で洗浄した。この溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。得られた粗生成物を、５０ｇ  Ｕｌｔｒａ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅを用い、ＤＣＭ−アセトン溶液でグラジエント系（０→３０％）で行う、Ｂｉｏｔａｇｅ  ＩｓｏｌｅｒａＴＭで精製し、化合物４を白色泡状物として得た（４．７ｇ，８６％）。このものをＲＰ＾ＨＰＬＣで分析した：8.64 min, 98.9%。 1NMR (CDCI3, 300 mHz) δ8.63 (s, 1Η), 8.57 (s, 1 Η), 8.5 (s, 1 Η), 7.40-7.16 (m, 9 Η), 6.76 (d, J= 8.6 Hz, 4 Η), 6.32-6.28 (m,1 Η), 5.75及び5.67 (各々 m, 1 Η), 4.81-4.75 (m, 1 Η), 4.25 (m, 1 Η), 3.75 (s, 6 Η),  3.69-3.59 (m, 5 Η), 3.51-3.35 (3 Η), 2.98及び2.71 (各々  s, 3 Η), 1.26 (d, J= 6.8 Hz, 6Η)。
【実施例２】
【００７０】
５’−ヘキシンホスホロアミド（８）の合成（図２）
フラスコ中、ＤＣＭ１０ｍＬで化合物７（ヘキス−５−イン−１−オール、１．４ｍＬ）を溶解し、この溶液にＮ，Ｎ-ジイソプロピルアミン（１．８２ｍＬ）を加えた。無水条件下、別のフラスコ内にて、ホスフィニル化試薬  ビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）シアノエチルホスフィン（当量の化合物７に対して１．５当量）をＤＭＣ（ｍｍｏｌホスフィンに対して２ｍＬ）で希釈し、ＭｅＣＮ中の０．４５Ｍの１Ｈ−テトラゾール（当量の化合物７に対して０．５当量のテトラゾール）を加え、５分間振とうした。次に、活性化させたホスフィニル化試薬の溶液を、室温にてよく撹拌させた化合物７の溶液に加え、ＴＬＣ分析で反応が完結するまで、室温下で撹拌した。過剰のホスフィンを消去するために、エタノールを加え、反応混合物を３０分間更に撹拌し、ロータリーエバポレーターで乾燥させた。得られた生成物をシリカゲルで精製し、０．８ｇのホスホロアミダイト８を得た。31P NMR (CDCI3, 121.5 mHz) δ147.0 (s)。
【実施例３】
【００７１】
複合体化したオリゴヌクレオチドの合成（表１及び図３）
２’−ＡＣＥ保護ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ−１．１、ＯＤＮ−２、ＯＤＮ−３．１、ＯＤＮ−４、ＯＤＮ−５、ＯＤＮ−７及びＯＤＮ−８）を、ＭｅｒＭａｄｅ合成機（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国、テキサス、アーウィング）で、ポリスチレン固相担体と、２’−ビス（アセトキシエトキシ）メチルエーテル（２’−ＡＣＥ）ホスホロアミダイトを用い、化学合成した。ＯＤＮ−２及びＯＤＮ−４には、アミノメチル化したポリスチレン担体６（実施例１参照）を使用した。また、ＯＤＮ−５には、５’−ヘキシンホスホロアミダイト８を用いた。合成サイクル完了後、担体上のオリゴヌクレオチドは、室温下Ｎａ２Ｓ２溶液で処理し、続けて水で洗浄した。４０％のＮ−メチルアミン（ＮＭＡ）水溶液を用い、オリゴヌクレオチドを担体から切り出し、５５℃で加温し、凍結乾燥した。得られた粗ＲＮＡを脱塩し、ＨＰＬＣで精製し、精製した試料をＵＰＬＣ及びＥＳＩ−ＭＳで同定確認した。
【００７２】
ＯＤＮ−１．２及びＯＤＮ−３．２：
ＤＭＦ中でアジド酢酸ＮＨＳエステル（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ）を合成後、凍結乾燥した３’−アミノアルキル修飾オリゴヌクレオチド（２’−ＡＣＥ保護ＯＤＮ−１．１またはＯＤＮ−３．１）に、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３バッファー中で加えた。得られたアジド標識オリゴヌクレオチドを脱塩し、逆相ＨＰＬＣで精製した。
【００７３】
Ｃｕ（Ｉ）存在下の結合反応：
５’−ヘキシン修飾オリゴヌクレオチド（２’−ＡＣＥ保護ＯＤＮ−５）（５０ｍｍｏｌ）を水と２Ｍ  ＴＥＡＡバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。続いて、３’−アジド標識オリゴヌクレオチド（２’−ＡＣＥ保護ＯＤＮ−３．２）（７５ｍｍｏｌ，ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ保存溶液）を加えた。アスコルビン酸５ｍＭ保存溶液（１７５μＬ）を加え、アルゴンにて溶液を脱気した。予め調製したＣｕ（ＩＩ）−ＴＢＴＡ溶液（８７μＬ）（５５％ＤＭＳＯ  １０ｍＭ）を先の反応混合物に加えた。この混合物を室温下終夜放置して反応させた。同じ結合反応条件で、ＯＤＮ−２またはＯＤＮ−４を、ＯＤＮ−５と結合させ、２個の異なる標的遺伝子を標的にする合成ｓｇＲＮＡを合成できる。
【００７４】
結合させたオリゴヌクレオチド（２’−ＡＣＥ保護ＯＤＮ−６）を、アセトンを用いて沈殿させた。得られたペレット状生成物をアセトンで洗浄、乾燥し、逆相ＨＰＬＣにて精製した。ダーマコンの２’−脱保護バッファー（１００ｍＭの酢酸−ＴＥＭＥＤ，ｐＨ３．４−３．８）を添加し、室温下３０分インキュベーションして２’−ＡＣＥ基を除去した。結合させたＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ−６）を、エタノール沈殿にて脱塩し、使用に供した。
【表１】
2018515142.tif 000003
表１．オリゴヌクレオチド類の合成
なお、Ｌは以下の構造を表す。
【化１】
2018515142.tif 000004
【実施例４】
【００７５】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１穴あたり１０００細胞密度で９６穴プレートに播種した。翌日、ｃｒＲＮＡ（４２ｍｅｒ，５’−ＧＵＧＵＡＵＵＵＵＧＡＣＣＵＡＣＧＡＡＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（７４ｍｅｒ，５’−ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４）、または３個の合成ｓｇＲＮＡ類の８１ｍｅｒ（ＯＤＮ−８）、９９ｍｅｒ（ＯＤＮ−７）及び結合した９９ｍｅｒ（ＯＤＮ−６）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，及び１ｍＭから１００μＭＥＤＴＡに、個々に再懸濁させた。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを共に加えて複合体を形成し、無菌の１Ｘ  ｓｉＲＮＡバッファー（ダーマコン、Ｂ−００２００−ＵＢ−１００）を用い、このＲＮＡを５μＭまで希釈した。最終濃度２５ｎＭのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（各々２５ｎＭのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）または合成ｓｇＲＮＡを、遺伝子導入に使用した。ＤｈａｒｍａＦＥＣT１遺伝子導入試薬（ダーマコン、＃Ｔ−２００１−０３）を用いて、２５ｎＭ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体または合成ｓｇＲＮＡを用いて、細胞に遺伝子を導入した。
【００７６】
ＰｈｕｓｉｏｎＨＦバッファー（ＴｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃−５１８Ｌ）中、プロテイナーゼＫ及びＲＮアーゼＡで５６℃、２０分、続いて９６℃、５分、熱不活性化して直接細胞溶解し、遺伝子導入から７２時間後に、ゲノムＤＮＡを単離した。標的遺伝子ＰＰＩＢの開裂部位に隣接するプライマーを用いてＰＣＲを行った。５００ｎｇのＰＣＲ生成物を、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ，＃Ｍ０３０２Ｌ）と２５分間、３７℃で処理し、２％アガロースゲル上で試料を分離した。各試料の編集パーセント（挿入欠失）は、ＩｍａｇｅＪを用いて算出した。
【００７７】
図４に示すように、結合させた合成ｓｇＲＮＡ（表１のＯＤＮ−６として標識した９９ｍｅｒ）は、Ｔ７Ｅ１ミスマッチ検出アッセイで示されたように、遺伝子編集の活性を有する（レーンＤ及びＥ）。また、図４に示すように、数個のコントロールＲＮＡ分子：レーンＡは９９ｍｅｒの合成ＲＮＡ（非結合）、レーンＢは８１ｍｅｒの合成ＲＮＡ（非結合）であって、両者ともに遺伝子編集の活性を有する。８１ｍｅｒは９９ｍｅｒと同じｃｒＲＮＡ（３４個のヌクレオチド）を有するが、一方、その配列はｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端から切り縮められている。なお、ｔｒａｃｒＲＮＡ（５−ＧＵＧＵＡＵＵＵＵＧＡＣＣＵＡＣＧＡＡＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２）。
結合体生成物（レーンＤ）の未精製バッチ及び精製バッチ（レーンＥ）の両者ともに、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（レーンＣ）に比較して有意な編集機能を提供する。結合反応の前駆体は、レーンＦで示すように編集機能をもたない。２０ｍｅｒの標的化配列（５’−ＧＵＧＵＡＵＵＵＵＧＡＣＣＵＡＣＧＡＡＵ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５）を設計し、ヒトＰＰＩＢ遺伝子、ｃｈｒ１５：６４，４５４，３３４−６４，４５４，３５３のエクソン２の起点を標的にする。
【００７８】
本出願に引用した全ての文献は、本明細書の内容から逸脱しない範囲で、その全体を引用して、ここに組み入れるものとする。
【図１】
2018515142.tif 000005
【図２】
2018515142.tif 000006
【図３】
2018515142.tif 000007
【図４】
2018515142.tif 000008
【配列表】
2018515142000001.app
【国際調査報告】
2018515142.tif 000009
2018515142.tif 000010
2018515142.tif 000011