(57)【要約】本開示は、薬物コンジュゲート組成物と、これを調製および使用するための組成物および方法とを提示する。一部の実施形態では、本発明は、ターゲティング部分に連結されたシステイン含有ドメイン（ＣＣＤ）、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）、およびペプチド切断部分を、システイン残基に架橋された、薬理学的に活性なペイロード薬物と共に含む結果として、標的組織と関連するプロテアーゼにより切断しうる組成物をもたらす、ターゲティングコンジュゲート組成物に関する。本発明はまた、ターゲティングコンジュゲート組成物を作製する方法、およびターゲティングコンジュゲート組成物を使用する方法も提供する。
2018500049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも６つのアミノ酸残基を含むシステイン含有ドメイン（ＣＣＤ）であって、
ａ．前記ＣＣＤが少なくとも１つのシステイン残基を有し；
ｂ．前記ＣＣＤが少なくとも１つのシステイン以外の残基を有し、前記システイン以外の残基の少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される、３〜６種類のアミノ酸から選択され；
ｃ．アミノ酸がシステインでもセリンでもない限り、３連続アミノ酸が同一でなく；
ｄ．グルタミン酸残基が、システイン残基に隣接しない
ことを特徴とするシステイン含有ドメイン。
【請求項２】
６〜約１４４個の間のアミノ酸残基と、１〜約１０個の間のシステイン残基とを有する、請求項１に記載のＣＣＤ。
【請求項３】
少なくとも１つのシステイン残基が、前記ＣＣＤのＮまたはＣ末端から９アミノ酸残基以内に位置する、請求項１または請求項２に記載のＣＣＤ。
【請求項４】
前記ＣＣＤ配列が、表６に明示された配列から選択される配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一である、先行する請求項のいずれか一項に記載のＣＣＤ。
【請求項５】
前記ＣＣＤを、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に融合させており、前記ＸＴＥＮが、
ａ．前記ＣＣＤの分子量の少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍である分子量を有し；
ｂ．１００〜約１２００個の間のアミノ酸を有し、アミノ酸残基の少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される、４〜６種類のアミノ酸から選択され；
ｃ．（１）アミノ酸がセリンでない限り、前記ＸＴＥＮ配列が、同一である３連続アミノ酸を含有しないか、（２）前記ＸＴＥＮ配列の少なくとも９０％が、それらの各々が１２個のアミノ酸残基を含む非重複配列モチーフからなり、いずれか２連続アミノ酸残基が、前記配列モチーフの各々において、２回を超えて生じないか；または（３）前記ＸＴＥＮ配列が３未満の平均部分配列スコアを有するように、実質的に非反復的であり；
ｄ．ＧＯＲアルゴリズムにより決定される９０％を超えるランダムコイルの形成を有し；
ｅ．チョウ−ファスマンアルゴリズムにより決定される２％未満のアルファヘリックスおよび２％のベータシートを有し；
ｆ．ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムにより解析されると、予測されるＴ細胞エピトープを欠き、前記ＸＴＥＮ配列内のエピトープについての、前記ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによる予測が、−９の閾値スコアに基づく
ことを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載のＣＣＤを含む融合タンパク質。
【請求項６】
前記配列モチーフが、表９に明示された配列からなる群より選択される、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＸＴＥＮが、表１０または表１１に明示された配列の群より選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するか、またはそれと同一である、請求項５または請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
少なくとも第１のターゲティング部分（ＴＭ）をさらに含み、前記ターゲティング部分が、標的組織と会合したリガンドに特異的に結合することが可能である、請求項５から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ＴＭを、前記ＣＣＤのＮ末端またはＣ末端に接合した、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｎ末端からＣ末端に、
ａ．（ＴＭ）−（ＣＣＤ）−（ＸＴＥＮ）；または
ｂ．（ＸＴＥＮ）−（ＣＣＤ）−（ＴＭ）
として構成された、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＴＭを、組換えにより、前記ＣＣＤに融合させた、請求項９または請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＴＭを、表１２に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列を使用して、前記ＣＣＤにコンジュゲートさせた、請求項９または請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記標的組織の前記リガンドが、腫瘍、がん細胞、または炎症状態を伴う組織と会合している、請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
１または複数の薬物または生物活性タンパク質をさらに含み、各薬物または生物活性タンパク質を、前記ＣＣＤのシステイン残基のチオール基にコンジュゲートさせた、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記標的組織が、腫瘍またはがん細胞であり、前記薬物が、表１４および表１５の薬物からなる群より選択される細胞傷害薬である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記標的組織が、腫瘍またはがん細胞であり、前記薬物が、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａからなる群より選択される細胞傷害薬である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記薬物が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記薬物が、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記薬物が、メルタンシン（ＤＭ１）である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記標的組織が、腫瘍またはがん細胞であり、前記生物活性タンパク質が、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択される、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
少なくとも前記第１のＴＭが、ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される、請求項８から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
少なくとも前記第１のターゲティング部分が、ｓｃＦｖである、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ｓｃＦｖが、モノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨが、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択されるＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させた、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ｓｃＦｖを、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨとして構成した、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ｓｃＦｖが、表１９に明示された抗体の群より選択される抗体に由来する、重鎖ＣＤＲセグメントである、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲセグメントである、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、前記重鎖ＣＤＲと、ＦＲとを、ＦＲ１−ＨＣＤＲ１−ＦＲ２−ＨＣＤＲ２−ＦＲ３−ＨＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で一体に融合させ、かつ、前記軽鎖ＣＤＲと、ＦＲとを、ＦＲ１−ＬＣＤＲ１−ＦＲ２−ＬＣＤＲ２−ＦＲ３−ＬＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で一体に融合させており、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列であって、前記軽鎖セグメントを、前記重鎖セグメントに融合させるリンカー配列をさらに含み、ここで前記ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨとして構成された、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
第２のｓｃＦｖを含み、前記第２のｓｃＦｖが、第１のｓｃＦｖと同一であり、前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖを、組換えにより、ＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳ、およびＧＳＰからなる群より選択されるリンカーにより、直列に融合させており、前記ｓｃＦｖを、組換えにより、前記ＣＣＤのＮ末端またはＣ末端に融合させた、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
第２のｓｃＦｖを含み、前記第２のｓｃＦｖが、前記標的組織と会合した第２のリガンドに特異的に結合することが可能であり、（ｉ）前記第２のリガンドが、前記第１のｓｃＦｖが結合するリガンドと異なり、（ｉｉ）前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖを、組換えにより、ＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳ、およびＧＳＰからなる群より選択されるリンカーにより、直列に融合させており、（ｉｉｉ）前記ｓｃＦｖを、組換えにより、前記ＣＣＤのＮ末端またはＣ末端に融合させた、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
前記第２のｓｃＦｖが、モノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨが、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択されるＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させた、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
前記第２のｓｃＦｖを、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨとして構成した、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
前記第２のｓｃＦｖが、表２０に明示された抗体の群より選択される抗体に由来する、重鎖ＣＤＲセグメントである、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲセグメントである、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、および会合させたフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、前記重鎖ＣＤＲおよびＦＲセグメントを、ＦＲ１−ＨＣＤＲ１−ＦＲ２−ＨＣＤＲ２−ＦＲ３−ＨＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で一体に融合させ、かつ、前記軽鎖ＣＤＲおよびＦＲセグメントを、ＦＲ１−ＬＣＤＲ１−ＦＲ２−ＬＣＤＲ２−ＦＲ３−ＬＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で一体に融合させており、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列であって、前記軽鎖セグメントを、前記重鎖セグメントに融合させるリンカー配列をさらに含む、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
少なくとも前記第１のＴＭが、ホレート、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、アスパラギニルグリシルアルギニン（ＮＧＲ）、およびアルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）からなる群より選択される、請求項８から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
少なくとも前記第１のＴＭが、非タンパク質性である、請求項８から２０に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
少なくとも前記第１のＴＭが、ホレートである、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
ａ．前記標的組織が、炎症状態を有し；
ｂ．前記薬物が、デキサメタゾン、インドメタシン、プレドニゾロン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、フルオシノニド、フルランドレノリド、プロピオン酸ハロベタゾール、酢酸ジフロラゾン、およびデスオキシメタゾンからなる群より選択され；
ｃ．前記ターゲティング部分が、ＴＮＦ、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−６受容体、α４インテグリンサブユニット、ＣＤ２０、およびＩＬ−２１受容体からなる群より選択されるリガンドに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖである、
請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記ｓｃＦｖが、モノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨが、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択されるＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させた、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
ペプチド切断部分（ＰＣＭ）をさらに含み、前記ＰＣＭを、１つ、２つ、またはそれを超える哺乳動物プロテアーゼにより切断することが可能である、請求項５から３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
ペプチド切断部分（ＰＣＭ）をさらに含み、前記ＰＣＭを、１つ、２つ、またはそれを超える哺乳動物プロテアーゼにより切断することが可能であり、前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、
ａ．（ＴＭ）−（ＣＣＤ）−（ＰＣＭ）−（ＸＴＥＮ）；
ｂ．（ＸＴＥＮ）−（ＰＣＭ）−（ＣＣＤ）−（ＴＭ）；
ｃ．（ＸＴＥＮ）−（ＰＣＭ）−（ＴＭ）−（ＣＣＤ）；または
ｄ．（ＣＣＤ）−（ＴＭ）−（ＰＣＭ）−（ＸＴＥＮ）
として構成された、請求項８から３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
第１のＸＴＥＮと同一な第２のＸＴＥＮをさらに含み、前記第１のＸＴＥＮおよび前記第２のＸＴＥＮのいずれも、三量体の架橋剤を使用して、前記ＰＣＭのＮまたはＣ末端にコンジュゲートさせた、請求項３６または請求項３７に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
前記ＰＣＭが、表８に明示された配列の群より選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはそれと同一であるペプチド配列を含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
前記哺乳動物プロテアーゼが、前記標的組織と共局在化している、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
前記哺乳動物プロテアーゼが、前記標的組織により分泌される細胞外プロテアーゼであるか、または腫瘍細胞外マトリックスの成分である、請求項４０に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
前記哺乳動物プロテアーゼが、表７に明示されたプロテアーゼからなる群より選択される、請求項３６から４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
前記哺乳動物プロテアーゼが、メプリン、ネプリリシン（ＣＤ１０）、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ−１、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ）、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２８（ＭＤＣ−Ｌ）、トロンボスポンジンモチーフを伴うＡＤＡＭ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ１）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストロメリシン１）、ＭＭＰ−７（マトリリシン１）、ＭＭＰ−８（コラゲナーゼ２）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ＭＭＰ−１０（ストロメリシン２）、ＭＭＰ−１１（ストロメリシン３）、ＭＭＰ−１２（マクロファージエラスターゼ）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ３）、ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２３（ＣＡ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２６（マトリリシン２）、ＭＭＰ−２７（ＣＭＭＰ）、レグマイン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＸ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、セクレターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミン、トロンビン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ、ＫＬＫ３）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、エラスターゼ、トリプターゼ、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、ＤＥＳＣ１、ヘプシン（ＨＰＮ）、マトリプターゼ、ナトリプターゼ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４（ＣＡＰ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、カリクレイン関連ペプチダーゼ（ＫＬＫファミリー）、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、およびＫＬＫ１４からなる群より選択される、請求項３６から４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
前記融合タンパク質の、前記薬物分子と、前記ＣＣＤの前記システイン残基との間のコンジュゲーション反応を実施すると、コンジュゲート生成物の異質な集団が得られるが、この場合、完全にコンジュゲートしたＣＣＤ−薬物コンジュゲート生成物が、ピーク分離≧６を達成することが可能であり、ａ）前記融合タンパク質が、３つ〜９つの間のシステイン残基を伴うＣＣＤを含む、６００個またはそれを超える累積アミノ酸残基を有するポリペプチドを含み；ｂ）前記異質なコンジュゲート生成物が、前記ＣＣＤに連結された、少なくとも１つ、２つ、および３つ、またはそれを超えるペイロードの混合物を有し；ｃ）前記コンジュゲーション生成物が、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件下で解析される、請求項１４から４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
前記ＣＣＤが、３つのシステイン残基を有する、表６の配列であり、前記融合タンパク質が、少なくとも８００個の累積アミノ酸残基を有する、請求項４４に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
前記ＣＣＤが、９つのシステイン残基を有する、表６の配列であり、前記融合タンパク質が、少なくとも８００個の累積アミノ酸残基を有する、請求項４４に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
前記標的組織のプロテアーゼにより前記ＰＣＭが切断されると、前記ＸＴＥＮが、前記融合タンパク質から放出されるが、この場合、薬物または生物活性タンパク質を連結した、前記ターゲティング部分および前記ＣＣＤが、放出ターゲティング組成物として、一体に接合されたままである、請求項４０から４６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
前記放出ターゲティング組成物の分子量が、切断されていない前記融合タンパク質と比較して、最大で４分の１、最大で５分の１、最大で６分の１、最大で７分の１、最大で８分の１、最大で１０分の１である分子量を有する、請求項４７に記載の放出ターゲティング組成物。
【請求項４９】
前記放出ターゲティング組成物の流体力学半径が、切断されていない前記融合タンパク質と比較して、最大で４分の１、最大で５分の１、最大で６分の１、最大で７分の１、最大で８分の１、最大で１０分の１である、請求項４７に記載の放出ターゲティング組成物。
【請求項５０】
切断されていない前記融合タンパク質と比較して、前記標的組織のリガンドに対して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または１００倍である結合アフィニティーを有する、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の放出ターゲティング組成物。
【請求項５１】
約１０−４Ｍ未満、または約１０−５Ｍ未満、または約１０−６Ｍ未満、または約１０−７Ｍ未満、または約１０−８Ｍ未満、または約１０−９Ｍ未満、または約１０−１０Ｍ未満、または約１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満の前記リガンドに対する結合アフィニティー定数（Ｋｄ）を有する、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の放出ターゲティング組成物。
【請求項５２】
前記結合アフィニティーが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される、請求項５０または請求項５１に記載の放出ターゲティング組成物。
【請求項５３】
前記放出ターゲティング組成物の細胞傷害が、切断されていない前記融合タンパク質の細胞傷害と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて前記リガンドを保有する標的細胞に対して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または１００倍であり、ここで細胞傷害は、ＩＣ５０の計算により決定される、請求項４７から５２のいずれか一項に記載の放出ターゲティング組成物。
【請求項５４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、増殖阻害を、前記放出ターゲティング組成物または前記融合タンパク質への曝露後、２４〜７２時間の間に、同等の条件下で決定する場合に、前記リガンドを保有する標的細胞の増殖を、切断されていない前記融合タンパク質による増殖の阻害と比較して、少なくとも２０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％強く阻害する、請求項４７から５３のいずれか一項に記載の放出ターゲティング組成物。
【請求項５５】
前記リガンドと、前記ＰＣＭを切断することが可能な共局在化プロテアーゼとを保有する標的組織を有する対象への、治療有効量の前記融合タンパク質のボーラス用量の投与後に、前記プロテアーゼにより放出された前記放出ターゲティング組成物が、前記標的組織内に、切断されていない前記融合タンパク質と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または１００倍である濃度まで蓄積することが可能である、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項５６】
前記標的組織が、腫瘍である、請求項５５に記載の融合タンパク質。
【請求項５７】
前記投与が、投与の７〜２１日後に、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％の、前記腫瘍の体積の低減を結果としてもたらす、請求項５６に記載の融合タンパク質。
【請求項５８】
前記投与が、投与の７〜２１日後に、前記ＰＣＭを含まず、同等の用量で投与された融合タンパク質と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％大きな、前記腫瘍の体積の低減を結果としてもたらす、請求項５６に記載の融合タンパク質。
【請求項５９】
前記対象が、マウス、ラット、ウサギ、サル、およびヒトからなる群より選択される、請求項５５から５８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６０】
表５のコンジュゲートからなる群より選択される、ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項６１】
Ｎ末端からＣ末端に、
ａ．（ＴＭ）−（ＣＣＤ）−（ＰＣＭ）−（ＸＴＥＮ）；または
ｂ．（ＸＴＥＮ）−（ＰＣＭ）−（ＣＣＤ）−（ＴＭ）
として構成されており；薬物分子を、前記ＣＣＤの各システイン残基に連結した、請求項６０に記載のターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項６２】
（ａ）表５の構築物であって、前記構築物のアミノ酸配列を含む構築物、または（ｂ）変異体配列を含む変異体構築物であって、前記変異体配列は、前記構築物の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、変異体構築物を含み、前記構築物が、化学式Ｉ
【化１０１】
2018500049.tif 000163
［式中、ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］の構造を有する、ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項６３】
（ａ）表５の構築物であって、前記構築物のアミノ酸配列を含む構築物、または（ｂ）変異体配列を含む変異体構築物であって、前記変異体配列は、前記構築物の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、変異体構築物を含み、前記構築物が、化学式ＩＩ
【化１０２】
2018500049.tif 000164
［式中、ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］の構造を有する、ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項６４】
（ａ）表５の構築物であって、前記構築物のアミノ酸配列を含む構築物、または（ｂ）変異体配列を含む変異体構築物であって、前記変異体配列は、前記構築物の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、変異体構築物を含み、前記構築物が、化学式ＩＩＩ
【化１０３】
2018500049.tif 000165
［式中、ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］の構造を有する、ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項６５】
（ａ）表５の構築物であって、前記構築物のアミノ酸配列を含む構築物、または（ｂ）変異体配列を含む変異体構築物であって、前記変異体配列は、前記構築物の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、変異体構築物を含み、前記構築物が、化学式ＩＶ
【化１０４】
2018500049.tif 000166
［式中、ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］の構造を有する、ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項６６】
化学式Ｉ：
【化１０５】
2018500049.tif 000167
の構造に従い構成された、ターゲティングコンジュゲート組成物であって、ここで
ａ．ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｂ．ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；
ｃ．ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；
ｄ．薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、前記ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である、
ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項６７】
化学式ＩＩ：
【化１０６】
2018500049.tif 000168
の構造に従い構成された、ターゲティングコンジュゲート組成物であって、ここで
ａ．ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｂ．ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；
ｃ．ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択され；
ｄ．ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；
ｅ．薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、前記ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である、
ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項６８】
化学式ＩＩＩ：
【化１０７】
2018500049.tif 000169
の構造に従い構成された、ターゲティングコンジュゲート組成物であって、ここで
ａ．ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｂ．ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；
ｃ．ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択され；
ｄ．ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；
ｅ．薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、前記ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である、
ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項６９】
化学式ＩＶ：
【化１０８】
2018500049.tif 000170
の構造に従い構成された、ターゲティングコンジュゲート組成物であって、ここで
ａ．ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｂ．ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；
ｃ．ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；
ｄ．薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、前記ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である、
ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項７０】
化学式Ｖ：
【化１０９】
2018500049.tif 000171
の構造に従い構成された、ターゲティングコンジュゲート組成物であって、ここで
ａ．ＴＭ１は、ＶＬおよびＶＨ配列を含む第１のｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｂ．ＴＭ２は、前記第１のｓｃＦｖと異なる、第２のｓｃＦｖであり、前記ＴＭ２は、ＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０内の配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｃ．ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；
ｄ．ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；
ｅ．薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、前記ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である、
ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項７１】
化学式ＶＩ：
【化１１０】
2018500049.tif 000172
の構造に従い構成された、ターゲティングコンジュゲート組成物であって、ここで
ａ．ＴＭ１は、ＶＬおよびＶＨ配列を含む第１のｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｂ．ＴＭ２は、前記第１のｓｃＦｖと異なる、第２のｓｃＦｖであり、前記ＴＭ２は、ＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０内の配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｃ．ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；
ｄ．ＰＣＭは、表８のＰＣＭからなる群より選択され；
ｅ．ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；
ｆ．薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、前記ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である、
ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項７２】
化学式ＶＩＩＩ：
【化１１１】
2018500049.tif 000173
の構造に従い構成された、ターゲティングコンジュゲート組成物であって、ここで
ａ．ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｂ．ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；
ｃ．ＰＣＭは、表８のＰＣＭからなる群より選択され；
ｄ．ＣＬは、表２５の架橋剤からなる群より選択される架橋剤であり；
ｅ．ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；
ｆ．薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、前記ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である、
ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項７３】
化学式Ｘ：
【化１１２】
2018500049.tif 000174
の構造に従い構成された、ターゲティングコンジュゲート組成物であって、ここで
ａ．ＴＭ１は、ＶＬおよびＶＨ配列を含む第１のｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｂ．ＴＭ２は、前記第１のｓｃＦｖと異なる、第２のｓｃＦｖであり、前記ＴＭ２は、ＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０内の配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、前記リンカーを、組換えにより、前記ＶＬと前記ＶＨとの間に融合させており；
ｃ．ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；
ｄ．ＰＣＭは、表８のＰＣＭからなる群より選択され；
ｅ．ＸＴＥＮは、表１１に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一である、システイン操作ＸＴＥＮであり；
ｆ．薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、前記ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数であり；
ｇ．ｙは、前記ＸＴＥＮのシステイン残基の数と等しい整数である、
ターゲティングコンジュゲート組成物。
【請求項７４】
請求項１４から４７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項６０から７３のいずれか一項に記載のターゲティングコンジュゲート組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項７５】
乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肝臓癌、肺がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、食道癌、線維肉腫、絨毛癌、卵巣がん、子宮頸癌、喉頭癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、胃がん、前立腺がん、腎細胞癌、カポジ肉腫、星状細胞腫、黒色腫、扁平上皮がん、基底細胞癌、頭頸部がん、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、尿路癌、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、神経膠芽腫、膵臓がん、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（PＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、リンパ芽球性疾患、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、尋常性座瘡、喘息、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏性反応、炎症性腸疾患、クローン病、骨盤腹膜炎、再灌流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植片拒絶、血管炎、乾癬、線維筋痛症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、変形性関節症、強皮症、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される対象における疾患を処置するための、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
前記医薬組成物を含む前記対象を処置するための医薬レジメンにおける使用のための、請求項７５に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
前記医薬レジメンが、前記疾患を有する前記対象において、有益な効果を達成するのに必要とされる、医薬組成物の量を決定するステップをさらに含む、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
対象における疾患を処置する方法であって、１、または２、または３、または４回、またはそれを超える治療有効用量の請求項７４に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するレジメンを含む、方法。
【請求項７９】
前記疾患が、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肝臓癌、肺がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、食道癌、線維肉腫、絨毛癌、卵巣がん、子宮頸癌、喉頭癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、胃がん、前立腺がん、腎細胞癌、カポジ肉腫、星状細胞腫、黒色腫、扁平上皮がん、基底細胞癌、頭頸部がん、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、尿路癌、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、神経膠芽腫、および膵臓がんからなる群より選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
投与される前記医薬組成物が、ターゲティング部分を含み、前記ターゲティング部分が、前記疾患の腫瘍に対する特異的結合アフィニティーを有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
投与される前記医薬組成物が、ターゲティング部分を含み、前記ターゲティング部分が、表２、表３、表４、表１８、および表１９に明示された標的の群より選択される標的に対する特異的結合アフィニティーを有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記投与が、がんと関連する、少なくとも１つ、２つ、または３つのパラメータの、非処置対象と比較して、少なくとも１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％大きな改善を結果としてもたらし、前記パラメータが、前記がんの進行までの時間、再発までの時間、局所再発の発見までの時間、限局転移の発見までの時間、遠隔転移の発見までの時間、症状の発症までの時間、疼痛、体重、入院、疼痛薬物適用要件の増大までの時間、サルベージ化学療法の要請までの時間、サルベージ手術の要請までの時間、サルベージ放射線治療の要請までの時間、処置失敗までの時間、および生存時間からなる群より選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
投与された前記用量が、前記対象における腫瘍サイズの減少を結果としてもたらす、請求項８０または請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
腫瘍サイズの前記減少が、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、またはそれを超える、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
腫瘍サイズの前記減少を、投与後少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、または投与後少なくとも約３０日以内に達成する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
投与された前記用量が、前記対象における腫瘍の静止を結果としてもたらす、請求項８０または請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
腫瘍の静止を、投与後少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、または投与後少なくとも約３０日以内に達成する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記レジメンが、７日ごと、または１０日ごと、または１４日ごと、または２１日ごと、または３０日ごとの、前記治療有効用量の投与を含む、請求項７８から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記医薬組成物を、対象における治療有効用量レジメンを使用して投与し、前記治療有効用量レジメンが、表２、表３、表４、表１８、および表１９に明示された標的の群より選択される標的を保有する腫瘍細胞に対する、増殖阻害効果を結果としてもたらす、請求項８０または請求項８１に記載の方法。
【請求項９０】
前記医薬組成物の、融合タンパク質またはターゲティングコンジュゲート組成物が、対象に投与されると、少なくとも少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時間、または少なくとも約１０日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約３０日間より長い終末半減期を呈示する、請求項７８に記載の方法。
【請求項９１】
がん腫瘍を伴う対象における処置の頻度を低減する方法であって、請求項７４に記載の医薬組成物を、前記医薬組成物のための治療有効用量レジメンを使用して、前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項９２】
前記投与が、前記対象における腫瘍サイズの減少を結果としてもたらし、腫瘍サイズの前記減少が、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、またはそれを超える、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
がん腫瘍サイズの減少を結果としてもたらす前記レジメンが、７日ごと、または１０日ごと、または１４日ごと、または２１日ごと、または３０日ごと、または毎月の、治療有効用量の前記医薬組成物の投与である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
がん腫瘍サイズの減少を結果としてもたらす前記レジメンが、コンジュゲート組成物に連結されていない、対応するペイロード薬物の治療有効用量レジメンと比較して、３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍である対象における投与間隔を有する、請求項９２または請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてがん細胞を処置する方法であって、がん細胞の細胞培養物に、有効量の、請求項１４から４６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項６０から７３のいずれか一項に記載の標的コンジュゲート組成物を投与するステップを含み、前記投与が、前記がん細胞に対する細胞傷害効果を結果としてもたらす、方法。
【請求項９６】
前記がん細胞が、標的を有し、前記コンジュゲート組成物のＴＭが、これに対する結合アフィニティーを有する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記標的が、表２、表３、表４、表１８、および表１９に明示された標的からなる群より選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記培養物が、前記コンジュゲート組成物のＰＣＭを切断することが可能なプロテアーゼを含む、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記がん細胞が、表１８の細胞系からなる群より選択される、請求項９５から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記コンジュゲート組成物の前記細胞傷害効果が、前記コンジュゲート組成物の前記ＴＭに対するリガンドを有さないがん細胞を使用して認められる細胞傷害効果と比較して大きい、請求項９５から９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
（ａ）請求項５から４６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載のポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した組換え調節配列とを含む発現ベクター。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の発現ベクターを含む単離宿主細胞。
【請求項１０４】
原核生物である、請求項１０３に記載の宿主細胞。
【請求項１０５】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１０４に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１４年１１月１１日に出願された米国仮出願第６２／０７８，１７１号；２０１５年２月２３日に出願された米国仮出願第６２／１１９，４８３号；および２０１５年８月２８日に出願された米国仮出願第６２／２１１，３７８号の利益を主張する；これら全ては、参考として本明細書に援用される。この出願は、２０１５年１１月１１日に出願された米国仮出願第６２／２５４，０７６号（これは、参考として本明細書に援用される）に関する。
【背景技術】
【０００２】
承認されている多くのがん治療薬は、腫瘍細胞のほか、正常細胞も死滅させる細胞傷害薬である。これらの細胞傷害薬の治療的利益は大部分、腫瘍細胞の感受性が、正常細胞より大きいことに依存し、これにより、許容されない副作用を結果としてもたらすことのない用量を使用して、臨床応答を達成することを可能とする。しかし、これらの非特異的薬物の本質的に全ては、正常組織に対して、何らかの損傷を結果としてもたらし、これにより、処置が制限されることが多い。
【０００３】
細胞リガンドに結合する抗体または他の分子に連結された細胞傷害薬であって、一般に、「ＡＤＣ」（抗体−薬物コンジュゲート）という頭字語で呼ばれる細胞傷害薬の使用は、細胞傷害薬をがん細胞に選択的に送達することにより、治療指数（または治療ウィンドウ）をさらに増大させることを意図する。ＡＤＣは、大きな将来性を約束するが、承認された薬物の数は、依然として少なく、それらの製造は、複雑かつ高価（マウスモノクローナル抗体のヒト化、およびこのような抗体をヒト化するのに典型的に要請される突然変異の数の大きさ）であり、多くの薬物、例えば、ＡＤＣ中の、ｓｃＦｖなど、抗体断片の使用による薬物動態は、不十分である。加えて、抗体ベースのＡＤＣのサイズも、このような組成物が、充実性腫瘍またはがん細胞を宿す組織および臓器に浸透する能力に関して、制約となる。
【０００４】
治療剤の半減期の延長は、治療用タンパク質であれ、治療用ペプチドであれ、治療用低分子であれ、治療剤自体に対する特殊な処方または修飾を要請することが多い。ＰＥＧ化、治療剤への抗体断片またはアルブミン分子の付加など、従来の修飾法には、いくつかの深刻な欠陥がある。これらの修飾形態は、ラージスケールで調製しうるが、これらの従来の方法は一般に、資材費用の大きさ、製造工程の複雑さ、および最終生成物の純度の低さを問題としている。目標となる実体の均質性まで精製することは、不可能ではないにせよ、困難であることが多い。これは、同じ数または質量のポリエチレングリコールを保有するＰＥＧ化薬剤の均質な集団を作出するように、反応自体を正確に制御することができない、ＰＥＧ化に特に当てはまる。さらに、これらのＰＥＧ化薬剤の代謝物は、重度の副作用を有しうる。例えば、ＰＥＧ化タンパク質は、動物モデルにおいて、腎尿細管の空胞化を引き起こすことが観察されている（Bendele,  A.、Seely,  J.、Richey,  C.、Sennello,  G.、およびShopp,  G.、Short  communication:  renal  tubular  vacuolation  in  animals  treated  with  polyethylene-glycol-conjugated  proteins、Toxicol.  Sci.、１９９８年、４２巻、１５２〜１５７頁）。腎臓から除去されるＰＥＧ化タンパク質またはそれらの代謝物は、腎臓内に蓄積し、糸球体による正常な濾過に干渉するＰＥＧ水和物の形成を引き起こす場合もある。加えて、動物およびヒトは、ＰＥＧに対する抗体を作るように誘導されうる（Sroda,  K.ら、Repeated  injections  of  PEG-PE  liposomes  generate  anti-PEG  antibodies、Cell.  Mol.  Biol.  Lett.、２００５年、１０巻、３７〜４７頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Bendele,A.ら、Toxicol.Sci.、１９９８年、４２巻、１５２〜１５７頁
【非特許文献２】Sroda,K.ら、Cell.Mol.Biol.Lett.、２００５年、１０巻、３７〜４７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、腫瘍またはがん性組織に浸透し、かつ／またはこれらに付着し、細胞傷害性化合物を、がん細胞に送達しうるほか、全般的な治療指数が改善されるように、半減期が十分であり、選択性も増強された抗がん剤に対する大きな必要が、依然として存在する。
【０００７】
一部の態様では、本発明は、１または複数の延長組換えポリペプチド配列（ＸＴＥＮ）と、１または複数のペプチド切断部分（ＰＣＭ）と、１または複数のターゲティング部分（ＴＭ）と、ペイロード薬物の１または複数の分子とを含み、コンジュゲート組成物が、プロテアーゼに曝露されると、ＰＣＭが切断されうる、ターゲティングコンジュゲート組成物を開示する。本発明はまた、開示されるコンジュゲート組成物を疾患の処置において使用する処置方法にも関する。
【０００８】
本明細書で開示される組成物および方法は、治療薬として有用であるだけでなく、また、候補治療剤の前臨床開発および臨床開発のための調査研究ツールとしても、特に有用である。一部の態様では、本発明は、この必要に、部分的に、ペイロードペプチド、タンパク質、および低分子のほか、ある特定のリガンドを保有する組織をターゲティングし、標的組織または標的細胞に近接すると、プロテアーゼにより切断することが可能な、ペプチジル切断部分を有するターゲティング部分を伴うターゲティングコンジュゲート組成物を作出することにより、取り組む。ターゲティングコンジュゲート組成物は、終末半減期の延長、ターゲティング送達、および健常組織に対する毒性の、非コンジュゲート生成物と比較した低減を含む、１または複数の側面において優れている。
【０００９】
切断型コンジュゲート組成物の実施形態は、本明細書で開示される特性の、１もしくは複数または任意の組合せを呈示しうることが、とりわけ想定される。処置方法は、本明細書で開示される特性の、１もしくは複数または任意の組合せを呈示しうることが、さらにとりわけ想定される。
【００１０】
一態様では、本開示は、システイン含有ドメイン（ＣＣＤ）を提示する。一部の実施形態では、ＣＣＤは、少なくとも６つのアミノ酸残基を含み、このドメインは、（ａ）ＣＣＤが少なくとも１つのシステイン残基を有し；（ｂ）ＣＣＤが少なくとも１つのシステイン以外の残基を有し、システイン以外の残基の少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される、３〜６種類のアミノ酸から選択され；（ｃ）アミノ酸がシステインでもセリンでもない限り、３連続アミノ酸が同一でなく；（ｄ）グルタミン酸残基が、システイン残基に隣接しないことを特徴とする。一部の実施形態では、ＣＣＤは、６〜約１４４個の間のアミノ酸残基と、１〜約１０個の間のシステイン残基とを有する。一部の実施形態では、ＣＣＤは、少なくとも２つのシステイン残基を含み、任意の２つの隣接するシステインは、１５個を超えない、システイン以外のアミノ酸残基により隔てられている。一部の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基は、ＣＣＤのＮまたはＣ末端から９アミノ酸残基以内に位置する。一部の実施形態では、ＣＣＤ配列は、表６に明示された配列から選択される配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一である。
【００１１】
一態様では、本開示は、本明細書で開示される、任意のＣＣＤを含む融合タンパク質を提示する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に融合させたＣＣＤを含み、ＸＴＥＮは、（ａ）ＣＣＤの分子量の少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍である分子量を有し；（ｂ）１００〜約１２００個の間のアミノ酸を有し、アミノ酸残基の少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される、４〜６種類のアミノ酸から選択され；（ｃ）（１）アミノ酸がセリンでない限り、ＸＴＥＮ配列が、同一である３連続アミノ酸を含有しないか、（２）ＸＴＥＮ配列の少なくとも９０％が、それらの各々が１２個のアミノ酸残基を含む非重複配列モチーフからなり、いずれか２連続アミノ酸残基が、配列モチーフの各々において、２回を超えて生じないか；または（３）ＸＴＥＮ配列が３未満の平均部分配列スコアを有するように、実質的に非反復的であり；（ｄ）ＧＯＲアルゴリズムにより決定される９０％を超えるランダムコイル形成を有し；（ｅ）チョウ−ファスマンアルゴリズムにより決定される２％未満のアルファヘリックスおよび２％のベータシートを有し；（ｆ）ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムにより解析されると、予測されるＴ細胞エピトープを欠き、ＸＴＥＮ配列内のエピトープについての、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによる予測が、−９の閾値スコアに基づくことを特徴とする。一部の実施形態では、配列モチーフは、表９に明示された配列からなる群より選択される。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、表１０または表１１に明示された配列の群より選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するか、またはそれと同一である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも第１のターゲティング部分（ＴＭ）をさらに含み、ターゲティング部分は、標的組織と関連するリガンドに特異的に結合することが可能である。一部の実施形態では、ＴＭを、ＣＣＤのＮ末端またはＣ末端に接合する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ａ）（ＴＭ）−（ＣＣＤ）−（ＸＴＥＮ）；または（ｂ）（ＸＴＥＮ）−（ＣＣＤ）−（ＴＭ）として構成されている。一部の実施形態では、ＴＭを、組換えにより、ＣＣＤに融合させる。一部の実施形態では、ＴＭを、表１２に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列を使用して、ＣＣＤにコンジュゲートさせる。一部の実施形態では、標的組織のリガンドは、腫瘍、がん細胞、または炎症状態を伴う組織と関連する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１または複数の薬物または生物活性タンパク質をさらに含み、各薬物または生物活性タンパク質を、ＣＣＤのシステイン残基のチオール基にコンジュゲートさせる。一部の実施形態では、標的組織は、腫瘍またはがん細胞であり、薬物は、表１４および表１５の薬物からなる群より選択される細胞傷害薬である。一部の実施形態では、標的組織は、腫瘍またはがん細胞であり、薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン（nemorubicin）、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン（rachelmycin）、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシン（tubulysin）Ｂ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ（ranpirnase）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａからなる群より選択される細胞傷害薬である。一部の実施形態では、薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。一部の実施形態では、薬物は、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。一部の実施形態では、薬物は、メルタンシン（mertansine）（ＤＭ１）である。一部の実施形態では、標的組織は、腫瘍またはがん細胞であり、生物活性タンパク質は、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン（bouganin）、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択される。一部の実施形態では、少なくとも第１のＴＭは、ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される。一部の実施形態では、少なくとも第１のターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、モノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択されるＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％��もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させている。一部の実施形態では、ｓｃＦｖを、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨとして構成する。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、表１９に明示された抗体の群より選択される抗体に由来する、重鎖ＣＤＲセグメントである、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲセグメントである、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、およびフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、重鎖ＣＤＲと、ＦＲとを、ＦＲ１−ＨＣＤＲ１−ＦＲ２−ＨＣＤＲ２−ＦＲ３−ＨＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で一体に融合させ、かつ、軽鎖ＣＤＲと、ＦＲとを、ＦＲ１−ＬＣＤＲ１−ＦＲ２−ＬＣＤＲ２−ＦＲ３−ＬＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で一体に融合させており、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列であって、軽鎖セグメントを、重鎖セグメントに融合させるリンカー配列をさらに含み、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨとして構成されている。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第２のｓｃＦｖを含み、第２のｓｃＦｖは、第１のｓｃＦｖと同一であり、第１および第２のｓｃＦｖを、組換えにより、ＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳ、およびＧＳＰからなる群より選択されるリンカーにより、直列に融合させており、ｓｃＦｖを、組換えにより、ＣＣＤのＮ末端またはＣ末端に融合させている。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第２のｓｃＦｖを含み、第２のｓｃＦｖは、標的組織と関連する第２のリガンドに特異的に結合することが可能であり、（ｉ）第２のリガンドは、第１のｓｃＦｖが結合するリガンドと異なり、（ｉｉ）第１および第２のｓｃＦｖを、組換えにより、ＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳ、およびＧＳＰからなる群より選択されるリンカーにより、直列に融合させており、（ｉｉｉ）ｓｃＦｖを、組換えにより、ＣＣＤのＮ末端またはＣ末端に融合させている。一部の実施形態では、第２のｓｃＦｖは、モノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択されるＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させている。一部の実施形態では、第２のｓｃＦｖを、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨとして構成する。一部の実施形態では、第２のｓｃＦｖは、表２０に明示された抗体の群より選択される抗体に由来する、重鎖ＣＤＲセグメントである、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖ＣＤ��セグメントである、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、および関連するフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、重鎖ＣＤＲおよびＦＲセグメントを、ＦＲ１−ＨＣＤＲ１−ＦＲ２−ＨＣＤＲ２−ＦＲ３−ＨＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で一体に融合させ、かつ、軽鎖ＣＤＲおよびＦＲセグメントを、ＦＲ１−ＬＣＤＲ１−ＦＲ２−ＬＣＤＲ２−ＦＲ３−ＬＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で一体に融合させており、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列であって、軽鎖セグメントを、重鎖セグメントに融合させるリンカー配列をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも第１のＴＭは、ホレート、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、アスパラギニルグリシルアルギニン（ＮＧＲ）、およびアルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）からなる群より選択される。一部の実施形態では、少なくとも第１のＴＭは、非タンパク質性である。一部の実施形態では、少なくとも第１のＴＭは、ホレートである。一部の実施形態では、（ａ）標的組織は、炎症状態を有し；（ｂ）薬物は、デキサメタゾン、インドメタシン、プレドニゾロン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、フルオシノニド、フルランドレノリド、プロピオン酸ハロベタゾール、酢酸ジフロラゾン、およびデスオキシメタゾンからなる群より選択され；（ｃ）ターゲティング部分は、ＴＮＦ、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−６受容体、α４インテグリンサブユニット、ＣＤ２０、およびＩＬ−２１受容体からなる群より選択されるリガンドに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、モノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択されるＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させている。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ペプチド切断部分（ＰＣＭ）をさらに含み、ＰＣＭを、１つ、２つ、またはそれを超える哺
乳動物プロテアーゼにより切断することが可能である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ペプチド切断部分（ＰＣＭ）をさらに含み、ＰＣＭを、１つ、２つ、またはそれを超える哺乳動物プロテアーゼにより切断することが可能であり、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ａ）（ＴＭ）−（ＣＣＤ）−（ＰＣＭ）−（ＸＴＥＮ）；（ｂ）（ＸＴＥＮ）−（ＰＣＭ）−（ＣＣＤ）−（ＴＭ）；（ｃ）（ＸＴＥＮ）−（ＰＣＭ）−（ＴＭ）−（ＣＣＤ）；または（ｄ）（ＣＣＤ）−（ＴＭ）−（ＰＣＭ）−（ＸＴＥＮ）として構成されている。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１のＸＴＥＮと同一な第２のＸＴＥＮをさらに含み、第１および第２のＸＴＥＮのいずれも、三量体の架橋剤を使用して、ＰＣＭのＮまたはＣ末端にコンジュゲートさせる。一部の実施形態では、ＰＣＭは、表８に明示された配列の群より選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはそれと同一であるペプチド配列を含む。一部の実施形態では、哺乳動物プロテアーゼは、標的組織と共局在化している。一部の実施形態では、哺乳動物プロテアーゼは、標的組織により分泌される細胞外プロテアーゼであるか、または腫瘍細胞外マトリックスの成分である。一部の実施形態では、哺乳動物プロテアーゼは、表７に明示されたプロテアーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、哺乳動物プロテアーゼは、メプリン、ネプリリシン（ＣＤ１０）、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ−１、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ）、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２８（ＭＤＣ−Ｌ）、トロンボスポンジンモチーフを伴うＡＤＡＭ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ１）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストロメリシン１）、ＭＭＰ−７（マトリリシン１）、ＭＭＰ−８（コラゲナーゼ２）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ＭＭＰ−１０（ストロメリシン２）、ＭＭＰ−１１（ストロメリシン３）、ＭＭＰ−１２（マクロファージエラスターゼ）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ３）、ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２３（ＣＡ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２６（マトリリシン２）、ＭＭＰ−２７（ＣＭＭＰ）、レグマイン（legumain）、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＸ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、セクレターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミン、トロンビン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ、ＫＬＫ３）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、エラスターゼ、トリプターゼ、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、ＤＥＳＣ１、ヘプシン（ＨＰＮ）、マトリプターゼ、ナトリプターゼ（natriptase）２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４（ＣＡＰ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、カリクレイン関連ペプチダーゼ（ＫＬＫファミリー）、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、およびＫＬＫ１４からなる群より選択される。一部の実施形態では、融合タンパク質の、薬物分子と、ＣＣＤのシステイン残基とのコンジュゲーション反応を実施すると、コンジュゲート生成物の異質な集団が得られるが、この場合、完全にコンジュゲートしたＣＣＤ−薬物コンジュゲート生成物は、ピーク分離≧６を達成することが可能であり、ａ）融合タンパク質は、３つ〜９つの間のシステイン残基を伴うＣＣＤを含む、６００個またはそれを超える累積アミノ酸残基を有するポリペプチドを含み；ｂ）異質なコンジュゲート生成物は、ＣＣＤに連結された、少なくとも１つ、２つ、および３つ、またはそれを超えるペイロードの混合物を有し；ｃ）コンジュゲーション生成物は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件下で解析される。一部の実施形態では、ＣＣＤは、３つのシステイン残基を有する、表６の配列であり、融合タンパク質は、少なくとも８００個の累積アミノ酸残基を有する。一部の実施形態では、ＣＣＤは、９つのシステイン残基を有する、表６の配列であり、融合タンパク質は、少なくとも８００個の累積アミノ酸残基を有する。一部の実施形態では、標的組織のプロテアーゼによりＰＣＭが切断されると、ＸＴＥＮは、融合タンパク質から放出されるが、この場合、薬物または生物活性タンパク質を連結した、ターゲティング部分およびＣＣＤは、放出ターゲティング組成物として、一体に接合されたままである。一部の実施形態では、放出ターゲティング組成物の分子量は、切断されていない融合タンパク質と比較して、最大で４分の１、最大で５分の１、最大で６分の１、最大で７分の１、最大で８分の１、最大で１０分の１である分子量を有する。一部の実施形態では、放出ターゲティング組成物の流体力学半径は、切断されていない融合タンパク質と比較して、最大で４分の１、最大で５分の１、最大で６分の１、最大で７分の１、最大で８分の１、最大で１０分の１である。一部の実施形態では、放出ターゲティング組成物は、切断されていない融合タンパク質と比較して、標的組織のリガンドに対して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または１００倍である結合アフィニティーを有する。一部の実施形態では、放出ターゲティング組成物は、約１０−４Ｍ未満、または約１０−５Ｍ未満、または約１０−６Ｍ未満、または約１０−７Ｍ未満、または約１０−８Ｍ未満、または約１０−９Ｍ未満、または約１０−１０Ｍ未満、または約１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満のリガンドに対する結合アフィニティー定数（Ｋｄ）を有する。一部の実施形態では、結合アフィニティーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される。一部の実施形態では、放出ターゲティング組成物の、リガンドを保有する標的細胞に対する細胞傷害作用は、細胞傷害作用を、ＩＣ５０の計算により決定する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、切断されていない融合タンパク質の細胞傷害作用と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または１００倍である。一部の実施形態では、放出ターゲティング組成物は、ｉｎ  ｖ���ｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、前記増殖阻害を、放出ターゲティング組成物または融合タンパク質への曝露後、２４〜７２時間の間に、同等の条件下で決定する場合に、リガンドを保有する標的細胞の増殖を、切断されていない融合タンパク質による増殖の阻害と比較して、少なくとも２０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％強く阻害する。一部の実施形態では、リガンドと、ＰＣＭを切断することが可能な共局在化プロテアーゼとを保有する標的組織を有する対象への、治療有効量の融合タンパク質のボーラス用量の投与後に、プロテアーゼにより放出された放出ターゲティング組成物は、標的組織内に、切断されていない融合タンパク質と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または１００倍である濃度まで蓄積することが可能である。一部の実施形態では、標的組織は、腫瘍である。一部の実施形態では、投与は、投与の７〜２１日後に、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％の、腫瘍の体積の低減を結果としてもたらす。一部の実施形態では、投与は、投与の７〜２１日後に、ＰＣＭを含まず、同等の用量で投与された融合タンパク質と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％大きな、腫瘍の体積の低減を結果としてもたらす。一部の実施形態では、対象は、マウス、ラット、ウサギ、サル、およびヒトからなる群より選択される。
【００１２】
一態様では、本開示は、ターゲティングコンジュゲート組成物を提示する。一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、表５のコンジュゲートからなる群より選択される。一部の実施形態では、組成物は、Ｎ末端からＣ末端に、（ａ）（ＴＭ）−（ＣＣＤ）−（ＰＣＭ）−（ＸＴＥＮ）；または（ｂ）（ＸＴＥＮ）−（ＰＣＭ）−（ＣＣＤ）−（ＴＭ）として構成されており；薬物分子を、ＣＣＤの各システイン残基に連結している。
【００１３】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、（ａ）表５の構築物であって、構築物のアミノ酸配列を含む構築物、または（ｂ）変異体配列を含む変異体構築物であって、構築物のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である変異体配列を含む変異体構築物を含み、構築物は、化学式Ｉ：
【化１】
2018500049.tif 000003
［式中、ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］の構造を有する。
【００１４】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、（ａ）表５の構築物であって、構築物のアミノ酸配列を含む構築物、または（ｂ）変異体配列を含む変異体構築物であって、構築物のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である変異体配列を含む変異体構築物を含み、構築物は、化学式ＩＩ：
【化２】
2018500049.tif 000004
［式中、ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］の構造を有する。
【００１５】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、（ａ）表５の構築物であって、構築物のアミノ酸配列を含む構築物、または（ｂ）変異体配列を含む変異体構築物であって、構築物のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である変異体配列を含む変異体構築物を含み、構築物は、化学式ＩＩＩ：
【化３】
2018500049.tif 000005
［式中、ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］の構造を有する。
【００１６】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、（ａ）表５の構築物であって、構築物のアミノ酸配列を含む構築物、または（ｂ）変異体配列を含む変異体構築物であって、構築物のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である変異体配列を含む変異体構築物を含み、構築物は、化学式ＩＶ：
【化４】
2018500049.tif 000006
［式中、ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］の構造を有する。
【００１７】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式Ｉ：
【化５】
2018500049.tif 000007
［式中、（ａ）ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｂ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；（ｃ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；（ｄ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］
の構造に従い構成する。
【００１８】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式ＩＩ：
【化６】
2018500049.tif 000008
［式中、（ａ）ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｂ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；（ｃ）ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択され；（ｄ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；（ｅ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］
の構造に従い構成する。
【００１９】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式ＩＩＩ：
【化７】
2018500049.tif 000009
［式中、（ａ）ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｂ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；（ｃ）ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択され；（ｄ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；（ｅ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］
の構造に従い構成する。
【００２０】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式ＩＶ：
【化８】
2018500049.tif 000010
［式中、（ａ）ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｂ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；（ｃ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；（ｄ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］
の構造に従い構成する。
【００２１】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式Ｖ：
【化９】
2018500049.tif 000011
［式中、（ａ）ＴＭ１は、ＶＬおよびＶＨ配列を含む第１のｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｂ）ＴＭ２は、第１のｓｃＦｖと異なる、第２のｓｃＦｖであり、ＴＭ２は、ＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０内の配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｃ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；（ｄ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；（ｅ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］
の構造に従い構成する。
【００２２】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式ＶＩ：
【化１０】
2018500049.tif 000012
［式中、（ａ）ＴＭ１は、ＶＬおよびＶＨ配列を含む第１のｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｂ）ＴＭ２は、第１のｓｃＦｖと異なる、第２のｓｃＦｖであり、ＴＭ２は、ＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０内の配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｃ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；（ｄ）ＰＣＭは、表８のＰＣＭからなる群より選択され；（ｅ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；（ｆ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］
の構造に従い構成する。
【００２３】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式ＶＩＩＩ：
【化１１】
2018500049.tif 000013
［式中、（ａ）ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｂ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；（ｃ）ＰＣＭは、表８のＰＣＭからなる群より選択され；（ｄ）ＣＬは、表２５の架橋剤からなる群より選択される架橋剤であり；（ｅ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；（ｆ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数である］
の構造に従い構成する。
【００２４】
一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式Ｘ：
【化１２】
2018500049.tif 000014
［式中、（ａ）ＴＭ１は、ＶＬおよびＶＨ配列を含む第１のｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｂ）ＴＭ２は、第１のｓｃＦｖと異なる、第２のｓｃＦｖであり、ＴＭ２は、ＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨは、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０内の配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；（ｃ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；（ｄ）ＰＣＭは、表８のＰＣＭからなる群より選択され；（ｅ）ＸＴＥＮは、表１１に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一である、システイン操作ＸＴＥＮであり；（ｆ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい整数であり；（ｇ）ｙは、ＸＴＥＮのシステイン残基の数と等しい整数である］
の構造に従い構成する。
【００２５】
一態様では、本開示は、医薬組成物を提示する。一部の実施形態では、医薬組成物は、本開示の多様な態様のうちのいずれかに関するものを含めて、本明細書で開示される多様な実施形態のうちのいずれかに従う融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、本開示の多様な態様のうちのいずれかに関するものを含めて、本明細書で開示される多様な実施形態のうちのいずれかに従うターゲティングコンジュゲート組成物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象における疾患を処置するための医薬組成物であり、疾患は、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肝臓癌、肺がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、食道癌、線維肉腫、絨毛癌、卵巣がん、子宮頸癌(cervical  carcinoma)、喉頭癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、胃がん、前立腺がん、腎細胞癌、カポジ肉腫、星状細胞腫、黒色腫、扁平上皮がん、基底細胞癌、頭頸部がん、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、尿路癌、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、神経膠芽腫（glioblastomoa）、膵臓がん、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＰＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、リンパ芽球性疾患、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、尋常性座瘡、喘息、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏性反応、炎症性腸疾患、クローン病、骨盤腹膜炎、再灌流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植片拒絶、血管炎、乾癬、線維筋痛症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、変形性関節症、強皮症、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象を処置するための医薬レジメンであって、医薬組成物を含むレジメンにおける使用のための医薬組成物である。一部の実施形態では、医薬レジメンは、疾患を有する対象において、有益な効果を達成するのに必要とされる、医薬組成物の量を決定するステップをさらに含む。
【００２６】
一態様では、本開示は、対象における疾患を処置する方法を提示する。一部の実施形態では、方法は、本開示の多様な態様のうちのいずれかに関するものを含めて、本明細書で開示される多様な実施形態のうちのいずれかに従う１、もしくは２、もしくは３、もしくは４回、またはそれを超える治療有効用量の医薬組成物を投与するレジメンを含む。一部の実施形態では、疾患は、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肝臓癌、肺がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、食道癌、線維肉腫、絨毛癌、卵巣がん、子宮頸癌、喉頭癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、胃がん、前立腺がん、腎細胞癌、カポジ肉腫、星状細胞腫、黒色腫、扁平上皮がん、基底細胞癌、頭頸部がん、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、尿路癌、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、神経膠芽腫、および膵臓がんからなる群より選択される。一部の実施形態では、投与される医薬組成物は、ターゲティング部分を含み、ターゲティング部分は、疾患の腫瘍に対する特異的結合アフィニティーを有する。一部の実施形態では、投与される医薬組成物は、ターゲティング部分を含み、ターゲティング部分は、表２、表３、表４、表１８、および表１９に明示された標的の群より選択される標的に対する特異的結合アフィニティーを有する。一部の実施形態では、投与は、がんと関連する、少なくとも１つ、２つ、または３つのパラメータの、非処置対象と比較して、少なくとも１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％大きな改善を結果としてもたらし、パラメータは、がんの進行までの時間、再発までの時間、局所再発（local  recurrence）の発見までの時間、限局転移の発見までの時間、遠隔転移の発見までの時間、症状の発症までの時間、疼痛、体重、入院、疼痛薬物適用要件（pain  medication  requirement）の増大までの時間、サルベージ化学療法の要請までの時間、サルベージ手術の要請までの時間、サルベージ放射線治療の要請までの時間、処置失敗までの時間、および生存時間からなる群より選択される。一部の実施形態では、投与された用量は、対象における腫瘍サイズの減少を結果としてもたらす。一部の実施形態では、腫瘍サイズの減少は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、またはそれを超える。一部の実施形態では、腫瘍サイズの減少を、投与後少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、または投与後少なくとも約３０日以内に達成する。一部の実施形態では、投与された用量は、対象における腫瘍の静止を結果としてもたらす。一部の実施形態では、腫瘍の静止を、投与後少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、または投与後少なくとも約３０日以内に達成する。一部の実施形態では、レジメンは、７日ごと、または１０日ごと、または１４日ごと、または２１日ごと、または３０日ごとの、治療有効用量の投与を含む。一部の実施形態では、医薬組成物を、対象における治療有効用量レジメンを使用して投与し、治療有効用量レジメンは、表２、表３、表４、表１８、および表１９に明示された��的の群より選択される標的を保有する腫瘍細胞に対する、増殖阻害効果を結果としてもたらす。一部の実施形態では、医薬組成物の、融合タンパク質またはターゲティングコンジュゲート組成物は、対象に投与されると、少なくとも少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時間、または少なくとも約１０日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約３０日間より長い終末半減期を呈示する。
【００２７】
一態様では、本開示は、がん腫瘍を伴う対象における処置の頻度を低減する方法を提示する。一部の実施形態では、方法は、医薬組成物を、医薬組成物のための治療有効用量レジメンを使用して、対象に投与するステップを含む。医薬組成物は、本開示の多様な態様のうちのいずれかに関するものを含めて、本明細書で開示される多様な実施形態のうちのいずれかに従う任意の医薬組成物でありうる。一部の実施形態では、投与は、対象における腫瘍サイズの減少を結果としてもたらし、腫瘍サイズの減少は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、またはそれを超える。一部の実施形態では、がん腫瘍サイズの減少を結果としてもたらすレジメンは、７日ごと、または１０日ごと、または１４日ごと、または２１日ごと、または３０日ごと、または毎月の、治療有効用量の医薬組成物の投与である。一部の実施形態では、がん腫瘍サイズの減少を結果としてもたらすレジメンは、コンジュゲート組成物に連結されていない、対応するペイロード薬物の治療有効用量レジメンと比較して、３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍である対象における投与間隔を有する。
【００２８】
一態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてがん細胞を処置する方法を提示する。一部の実施形態では、方法は、がん細胞の細胞培養物に、有効量の、本開示の多様な態様のうちのいずれかに関するものを含めて、本明細書で開示される多様な実施形態のうちのいずれかに従う融合タンパク質を投与するステップを含み、投与は、がん細胞に対する細胞傷害効果を結果としてもたらす。一部の実施形態では、方法は、がん細胞の細胞培養物に、有効量の、本開示の多様な態様のうちのいずれかに関するものを含めて、本明細書で開示される多様な実施形態のうちのいずれかに従うターゲティングコンジュゲート組成物を投与するステップを含み、投与は、がん細胞に対する細胞傷害効果を結果としてもたらす。一部の実施形態では、がん細胞は、標的を有し、コンジュゲート組成物のＴＭは、これに対する結合アフィニティーを有する。一部の実施形態では、標的は、表２、表３、表４、表１８、および表１９に明示された標的からなる群より選択される。一部の実施形態では、培養物は、コンジュゲート組成物のＰＣＭを切断することが可能なプロテアーゼを含む。一部の実施形態では、がん細胞は、表１８の細胞系からなる群より選択される。一部の実施形態では、コンジュゲート組成物の細胞傷害効果は、コンジュゲート組成物のＴＭに対するリガンドを有さないがん細胞を使用して認められる細胞傷害効果と比較して大きい。
【００２９】
一態様では、本開示は、単離核酸を提示する。一部の実施形態では、単離核酸は、（ａ）本開示の多様な態様のうちのいずれかに関するものを含めて、本明細書で開示される多様な実施形態のうちのいずれかに従う融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、および／または（ｂ）（ａ）に従うポリヌクレオチドの相補体を含む。
【００３０】
一態様では、本開示は、発現ベクターを提示する。一部の実施形態では、発現ベクターは、本明細書で開示される多様な態様および実施形態のうちのいずれかに従うポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した組換え調節配列とを含む。
【００３１】
一態様では、本開示は、宿主細胞を提示する。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書で開示される多様な態様および実施形態のうちのいずれかに従う発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核生物である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００３２】
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが、具体的かつ個別に指し示された場合と同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本発明の特色および利点は、例示的な実施形態を明示する、次の詳細な説明および添付の図面を参照することによりさらに説明することができる。
【００３４】
【図１】図１は、ペイロードとのコンジュゲーションに適したＸＴＥＮの模式図を示す。図１Ａは、異なる長さの未改変のＸＴＥＮを示す。図１Ｂは、チオール側鎖を備える内部システインを備えるシステイン操作ＸＴＥＮを示し；その下は、反応性Ｎ末端アミノ基を備えるＸＴＥＮであり；その下は、チオール反応基を備えるＮ末端システインを備えるＸＴＥＮである。図１Ｃは、複数の内部システインを備えるシステイン操作ＸＴＥＮ（左）および複数の反応性アミノ基を備えるリシン操作ＸＴＥＮ（右）を示す。図１Ｄは、操作されたチオールおよびアミノ基を備えるＸＴＥＮの３つの変種を示す。
【００３５】
【図２】図２は、一級アミノ基と反応して安定アミドＸＴＥＮ−ペイロード産物を生じる、ＮＨＳ−エステルおよびその水溶性アナログであるスルホ−ＮＨＳ−エステルを利用するコンジュゲーション反応を示す。
【００３６】
【図３】図３は、種々のコンジュゲーション反応を示す。図３Ａは、チオール基およびＮ−マレイミドを利用したコンジュゲーション反応を示す。マレイミド基は、反応混合物のｐＨがｐＨ６．５〜７．５の間である場合、スルフヒドリル基と特異的に反応し、安定チオエーテル結合を形成し、この反応は不可逆的である。図３Ｂは、ハロアセチルを利用したコンジュゲーション反応を示す。最も一般的に使用されるハロアセチル試薬は、生理的ｐＨでスルフヒドリル基と反応するヨードアセチル基を含有する。スルフヒドリルとヨードアセチル基との反応は、ＸＴＥＮ−ペイロードにおける安定チオエーテル結合を生じる、チオールによるヨウ素の求核置換によって進行する。図３Ｃは、ピリジルジスルフィドを利用したコンジュゲーション反応を示す。ピリジルジスルフィドは、幅広いｐＨ範囲にわたって（最適ｐＨは４〜５である）スルフヒドリル基と反応して、ペイロードにＸＴＥＮを連結するジスルフィド結合を形成する。
【００３７】
【図４】図４（図４Ａおよび図４Ｂ）は、ゼロ長さの架橋剤を利用するコンジュゲーション反応を示し、この架橋剤は、ある分子（ペイロード等）のカルボキシル官能基を別の分子（ＸＴＥＮ等）の一級アミンに直接的にコンジュゲートするために使用される。
【００３８】
【図５】図５は、アジドへのアルキンのヒュスゲン（Huisgen）１，３−双極子環化付加を利用して、示されている通り、１，４−二置換（disubsituted）−１，２，３−トリアゾールを形成するクリックコンジュゲーション反応を示す。
【００３９】
【図６】図６は、チオール−エン反応と称されるフリーラジカル反応またはチオールマイケル付加と称されるアニオン反応によって進行し得る、チオ−エンに基づく化学を使用するコンジュゲーション反応を示す。
【００４０】
【図７】図７は、ヒドラジドおよびアルデヒドの間の反応に基づく化学を利用して、ＸＴＥＮ−ペイロードにおける例示されたヒドラゾン結合をもたらすコンジュゲーション反応を示す。
【００４１】
【図８】図８は、酵素によるライゲーションを利用したコンジュゲーション反応を示す。図８Ａ：トランスグルタミナーゼは、ペイロードペプチドまたはタンパク質のグルタミンのγ−カルボキサミド基およびリシン操作ＸＴＥＮにおけるリシンのε−アミノ基（またはＮ末端アミノ基）の間のイソペプチド結合の形成を触媒し、これにより、ＸＴＥＮおよびペイロードの間に分子間または分子内架橋を創出する酵素である。図８Ｂは、酵素により創出されたＸＴＥＮ−ペイロード組成物を示し、これは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のソルターゼ（sortase）Ａトランスペプチダーゼ酵素を利用して、タンパク質１の短い５アミノ酸認識配列ＬＰＸＴＧのトレオニンおよびグリシン残基の間での切断を触媒し、これはその後に、タンパク質１のＮ末端オリゴグリシン求核剤にアシル断片を転移する。オリゴグリシンを含有するようにタンパク質２に官能基を持たせることにより、２種のタンパク質の酵素によるコンジュゲーションが、部位特異的様式で達成されて、所望のＸＴＥＮ−ペイロード組成物をもたらす。
【００４２】
【図９】図９は、ターゲティング部分、ペイロードまたは他のＸＴＥＮ反応物に連結するための反応物として使用される種々のＸＴＥＮ−架橋剤前駆体セグメントを示す。図９Ａは、１Ｂが、右に描かれた前駆体の残りの反応基を表すと示すことが意図される。図９Ｂは、ＸＴＥＮにコンジュゲートされた複数の（左）または単一の（右）ペイロードＡ分子のいずれかを備える同様の反応性前駆体を示す。
【００４３】
【図１０】図１０は、ペイロードまたは他のＸＴＥＮ反応物に連結するための反応物として使用される、架橋剤の２個の反応基または取り込まれたアミノ酸の反応基を備えるＸＴＥＮ−架橋剤前駆体セグメントの例証的な並べ替えを示す。１Ｂおよび２Ｂは、他の図では、同様の番号の反応基と反応する反応基を表す；１と１および２と２等。
【００４４】
【図１１】図１１は、種々の反応物の例および図面の他の箇所に例示される配置の命名法を示すことが意図される。図１１Ａは、Ｎ末端に異なる反応基をそれぞれ備える、反応性ＸＴＥＮセグメント前駆体の種々の形態を示す。図１１Ｂは、２、３または４個の反応基を備える種々の架橋剤を示す。第１の事例において、二価架橋剤は、「２」および「１」によって表される、２種類の異なる反応基と反応するヘテロ官能基リンカーである。残る３種は、同じ反応基の二価、三価および四価架橋剤を表す。図１１Ｃは、２個のＸＴＥＮセグメント前駆体の反応産物の命名法を例示する。上のバージョンでは、１Ａが１Ｂと反応して、１ＡＲ−１ＢＲによって示される架橋剤の残基を備える、Ｎ末端で連結された二量体ＸＴＥＮを創出した一方、下のバージョンも、２ＡＲ−２ＢＲによって示される架橋剤の残基を備える、Ｎ末端で連結された二量体ＸＴＥＮである。しかし、同じアプローチを使用して、ターゲティング部分をＸＴＥＮもしくはＣＣＤにコンジュゲートすることもできる、またはペイロード薬物をＣＣＤにコンジュゲートすることができる。
【００４５】
【図１２】図１２は、種々のＸＴＥＮ前駆体セグメントの創出を例示する。図１２Ａは、ＸＴＥＮポリペプチドを作製し、続いて２Ｂ−１Ａ架橋剤により架橋剤とＮ末端を反応させ、Ｎ末端１Ｂ（例えば、アルファアミノ酸）と１Ａを反応させて、反応基２Ｂを備えるＸＴＥＮ前駆体２を創出するステップを示す。図１２Ｂは、ＸＴＥＮの２Ｂ反応基への２Ａ反応基を備える２個の架橋剤の逐次付加を示し、これはＸＴＥＮ前駆体４をもたらし、続いてＸＴＥＮ前駆体４を、反応性１Ｂおよび架橋剤の１Ａの間でＮ末端において架橋剤と反応させ、反応基４Ｂおよび３Ｂを備えるＸＴＥＮ前駆体５をもたらす。斯かる事例において、続いてＸＴＥＮ−前駆体５は、２個のターゲティングコンジュゲート融合タンパク質を３Ｂに、また、ターゲティング部分を４Ｂにコンジュゲートするための骨格反応物として機能することができる。
【００４６】
【図１３】図１３は、２個のペイロードを備える二重特異性コンジュゲートの種々の配置を例示する。図１３Ａは、それぞれ１分子の２種のペイロードを備える配置を例示する一方、図１３Ｂは、複数コピーの一方または両方のペイロードを備える種々の配置を例示する。
【００４７】
【図１４】図１４は、ターゲティング部分、ＸＴＥＮおよびペイロードが連結されたＣＣＤを含むコンジュゲートの例を示す。ターゲティング部分は、ペプチド、ペプトイドまたは受容体リガンドとなることができる。図１４Ａは、ターゲティング部分にコンジュゲートされたＣＣＤ−ＸＴＥＮの単一の融合タンパク質を示す。ＣＣＤは、システイン残基にコンジュゲートされた３個のペイロードを有する。図１４Ｂは、２個のＣＣＤ−ＸＴＥＮ融合タンパク質（ＰＣＭ−ＴＭ−ＣＣＤ−薬物ペイロードを含むことができる）の末端にコンジュゲートされたＴＭのコンジュゲートを示し、この場合、ペイロードは、ＣＣＤのシステイン残基にコンジュゲートされている。
【００４８】
【図１５】図１５は、コンビナトリアルＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮコンジュゲートライブラリーの創出の例を示す。ペイロードＡ、Ｂ、Ｃは、反応基１Ａを保有するＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮにコンジュゲートされ、１セットのＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ−前駆体セグメントをもたらす。ペイロードＥ、ＦおよびＧは、反応基１Ｂを保有するＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮにコンジュゲートされて、第２のセットのＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ−前駆体セグメントをもたらす。これらのセグメントをコンビナトリアルコンジュゲーションに付し、続いて反応物から精製する。この操作は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ検査に直ちに付すことができるコンビナトリアル産物の形成を可能にする。この場合、反応基１Ａおよび１Ｂは、二重特異性架橋剤ありまたはなしのＸＴＥＮのアルファ−アミノ基である。一例において、１Ａはアジドであり、１Ｂはアルキンであるまたは逆もまた同じであるが、ペイロードは、ＸＴＥＮにおけるチオール基を介してＸＴＥＮに取り付けられる。ＰＣＭドメインは、示されているＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ分子において任意選択である。
【００４９】
【図１６】図１６は、２種のペイロードの間の比を最適化するコンビナトリアルＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮコンジュゲートライブラリーの創出の例を示す。各ライブラリーメンバーは、異なる比のペイロードＡおよびペイロードＥを保有する。ＰＣＭドメインは、示されているＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ分子において任意選択である。検査後に、望ましい（desireable）候補が、ターゲティングコンジュゲート組成物に取り込まれる。
【００５０】
【図１７】図１７は、ターゲティング部分およびペイロードの組合せを創出するコンビナトリアルＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮコンジュゲートライブラリーの創出の例を示す。ターゲティング部分は、反応基１Ａを保有するＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮにコンジュゲートされる。ペイロードＥ、ＦおよびＧは、反応基１Ｂを保有するＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮにコンジュゲートされる。これらのセグメントを、コンビナトリアルコンジュゲーションに付して、各ライブラリーメンバーがターゲティング部分およびペイロードを含むコンビナトリアル産物の形成を可能にする。ペイロードおよびコンジュゲーション基を保有する全ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮセグメントは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ検査に直ちに付すことができるコンビナトリアル産物として精製することができる。ＰＣＭドメインは、示されているＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ分子において任意選択である。検査後に、望ましい候補が、ターゲティングコンジュゲート組成物に取り込まれる。
【００５１】
【図１８−１】図１８は、標的細胞と相互作用するターゲティングコンジュゲート組成物の模式的な例を示す。図１８Ａは、ＸＴＥＮが、融合タンパク質としてＣＣＤおよびターゲティング部分に融合されたままであり、多くのがん細胞において過剰発現される標的受容体に結合する例を示す。受容体結合は、細胞に対し毒性であるペイロードＡの内部移行と、続くタンパク質分解および細胞内遊離をもたらす。図１８Ｂは、ＸＴＥＮが、ＰＣＭの切断によって放出され、ターゲティング部分およびペイロードが連結されたＣＣＤを含むその結果生じた断片が、多くのがん細胞において過剰発現される標的受容体に結合する構築物設計を示す。受容体結合は、細胞に対し毒性であるペイロードＡの内部移行と、続くタンパク質分解および細胞内遊離をもたらす。
【図１８−２】図１８は、標的細胞と相互作用するターゲティングコンジュゲート組成物の模式的な例を示す。図１８Ａは、ＸＴＥＮが、融合タンパク質としてＣＣＤおよびターゲティング部分に融合されたままであり、多くのがん細胞において過剰発現される標的受容体に結合する例を示す。受容体結合は、細胞に対し毒性であるペイロードＡの内部移行と、続くタンパク質分解および細胞内遊離をもたらす。図１８Ｂは、ＸＴＥＮが、ＰＣＭの切断によって放出され、ターゲティング部分およびペイロードが連結されたＣＣＤを含むその結果生じた断片が、多くのがん細胞において過剰発現される標的受容体に結合する構築物設計を示す。受容体結合は、細胞に対し毒性であるペイロードＡの内部移行と、続くタンパク質分解および細胞内遊離をもたらす。
【００５２】
【図１９−１】図１９は、実施例７に記載されている通りのＣＣＤ−ＸＴＥＮ構築物の完全精製プロセスを示す。図１９Ａは、カチオン交換捕捉ステップ後の、ＣＣＤ−ＸＴＥＮの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン毎の材料を次に示す：レーン１：マーカー；レーン２：カチオン交換カラムロード；レーン３〜５：カチオン交換カラムフロースルー／洗浄画分１〜３；レーン６：カチオン交換カラム溶出；レーン７：カチオン交換ストリップ。図１９Ｂは、アニオン交換研磨ステップ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン毎の材料を次に示す：レーン１：マーカー；レーン２：アニオン交換カラムロード（トリプシン消化後）；レーン３：アニオン交換カラムフロースルー；レーン４〜１２：アニオン交換カラム溶出画分Ｅ１〜Ｅ９。
【図１９−２】図１９は、実施例７に記載されている通りのＣＣＤ−ＸＴＥＮ構築物の完全精製プロセスを示す。図１９Ａは、カチオン交換捕捉ステップ後の、ＣＣＤ−ＸＴＥＮの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン毎の材料を次に示す：レーン１：マーカー；レーン２：カチオン交換カラムロード；レーン３〜５：カチオン交換カラムフロースルー／洗浄画分１〜３；レーン６：カチオン交換カラム溶出；レーン７：カチオン交換ストリップ。図１９Ｂは、アニオン交換研磨ステップ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン毎の材料を次に示す：レーン１：マーカー；レーン２：アニオン交換カラムロード（トリプシン消化後）；レーン３：アニオン交換カラムフロースルー；レーン４〜１２：アニオン交換カラム溶出画分Ｅ１〜Ｅ９。
【００５３】
【図２０−１】図２０は、実施例８に記載されている通りのＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ構築物の完全精製プロセスを示す。図２０Ａは、カチオン交換捕捉ステップ後の、ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン毎の材料を次に示す：レーン１：マーカー；レーン２：カチオン交換カラムロード；レーン３〜５：カチオン交換カラムフロースルー／洗浄画分１〜３；レーン６：カチオン交換溶出；レーン７：カチオン交換カラムストリップ。図２０Ｂは、アニオン交換研磨ステップ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン毎の材料を次に示す：レーン１：マーカー；レーン２：アニオン交換カラムロード（トリプシン消化後）；レーン３：アニオン交換カラムフロースルー；レーン４〜１７：アニオン交換カラム溶出画分Ｅ１〜Ｅ１４；レーン１８：マーカー；レーン１９：アニオン交換カラムロード（トリプシン消化後）；レーン２０〜３３：アニオン交換カラム溶出画分Ｅ１５〜Ｅ２４；レーン３４：アニオン交換カラムストリップ。
【図２０−２】図２０は、実施例８に記載されている通りのＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ構築物の完全精製プロセスを示す。図２０Ａは、カチオン交換捕捉ステップ後の、ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン毎の材料を次に示す：レーン１：マーカー；レーン２：カチオン交換カラムロード；レーン３〜５：カチオン交換カラムフロースルー／洗浄画分１〜３；レーン６：カチオン交換溶出；レーン７：カチオン交換カラムストリップ。図２０Ｂは、アニオン交換研磨ステップ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン毎の材料を次に示す：レーン１：マーカー；レーン２：アニオン交換カラムロード（トリプシン消化後）；レーン３：アニオン交換カラムフロースルー；レーン４〜１７：アニオン交換カラム溶出画分Ｅ１〜Ｅ１４；レーン１８：マーカー；レーン１９：アニオン交換カラムロード（トリプシン消化後）；レーン２０〜３３：アニオン交換カラム溶出画分Ｅ１５〜Ｅ２４；レーン３４：アニオン交換カラムストリップ。
【００５４】
【図２１】図２１は、３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮおよび３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮを合成するための実験の結果を描写する。図２１Ａは、実施例１１に記載されている通り、＞９５％純度を実証する、３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮの分析的Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣトレースである。図２１Ｂは、実施例１２に記載されている通り、＞９５％純度を実証する、３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮの分析的Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣトレースである。
【００５５】
【図２２】図２２は、実施例１５に記載されている通り、ＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮを合成するための実験の結果を描写する。図２２Ａは、＞９５％純度を実証する、ＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮの分析的Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣトレースである。図２２Ｂは、分子量マーカー（レーン１）、ＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ（レーン２）およびＣｙｓ−ＸＴＥＮとのＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ反応のマレイミド反応性評価（レーン３）による、非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルである。
【００５６】
【図２３】図２３は、実施例１８に記載されている通り、ａＨＥＲ２ターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを合成するための実験の結果を描写する。図２３Ａは、分子量マーカー（レーン１）ならびにａＨＥＲ２−ＸＴＥＮおよびＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮの反応に由来する精製されたａＨＥＲ２ターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲート（レーン２）による非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルである。図２３Ｂは、ａＨＥＲ２ターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの純度およびインタクト質量を実証する、ＥＳＩ−ＭＳデータである。図２３Ｃは、ａＨＥＲ２ターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの単量体純度を実証する、分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータである。
【００５７】
【図２４】図２４は、実施例１９に記載されている通り、ＰＣＭを備えるａＨＥＲ２ターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを合成するための実験の結果を描写する。図２４Ａは、分子量マーカー（レーン１）ならびにａＨＥＲ２−ＸＴＥＮおよびＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮの反応に由来する、ＰＣＭを備える精製されたａＨＥＲ２ターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲート（レーン２）による非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルである。図２４Ｂは、ａＨＥＲ２ターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの純度およびインタクト質量を実証するＥＳＩ−ＭＳデータである。図２４Ｃは、ＰＣＭを備えるａＨＥＲ２ターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの単量体純度を実証する分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータである。
【００５８】
【図２５】図２５は、実施例１６に記載されている通り、ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−３ｘ−ＤＭ１コンジュゲートを合成するための実験の結果を描写する。図２５Ａは、分子量マーカー（レーン１）および精製されたａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−３ｘＤＭ１コンジュゲート（レーン２）による非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルである。図２５Ｂは、ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−３ｘＤＭ１の純度およびインタクト質量を実証するＥＳＩ−ＭＳデータである。図２５Ｃは、ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−３ｘＤＭ１の単量体純度を実証する分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータである。
【００５９】
【図２６】図２６は、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の安定性試験に由来する試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。実施例２９に記載されている通り、ラット血漿（図２６Ａ）、ラット腎臓ホモジネート（図２６Ｂ、左）およびＰＢＳ緩衝液（図２６Ｂ、右）において最大７日間、３７℃でＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４をインキュベートした。０時間、４時間、２４時間、７日目に試料を取り出し、ＸＴＥＮをメタノール沈殿によって抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと続くＳｔａｉｎｓ−ａｌｌによる染色によって解析した。全長ＸＴＥＮ８６４の位置を矢印で示す。
【００６０】
【図２７】図２７は、実施例３０に記載されている通りに行われた、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の近紫外円二色性スペクトルを示す。
【００６１】
【図２８】図２８は、アルゴリズムＢｌｏｃｋＳｃｏｒｅの論理流れ図の模式図である（実施例３２）。図中、次の説明文が適用される：ｉ、ｊ  −  配列全体を通して実行される制御ループにおいて使用されるカウンター；ＨｉｔＣｏｕｎｔ  −  この変数は、部分配列がブロックにおける同一部分配列に遭遇する回数を記録するカウンターである；ＳｕｂＳｅｑＸ  −  この変数は、冗長性に関してチェックされている部分配列を保持する；ＳｕｂＳｅｑＹ  −  この変数は、それに対してＳｕｂＳｅｑＸがチェックされる部分配列を保持する；ＢｌｏｃｋＬｅｎ  −  この変数は、使用者に決定されるブロックの長さを保持する；ＳｅｇＬｅｎ  −  この変数は、セグメントの長さを保持する。プログラムはハードコード化されて、長さ３、４、５、６、７、８、９および１０の部分配列のスコアを作成する；ブロック  −  この変数は、長さＢｌｏｃｋＬｅｎのストリングを保持する。ストリングは、インプットＸＴＥＮ配列由来の文字で構成されており、ｉカウンターの位置によって決定される；ＳｕｂＳｅｑＬｉｓｔ  −  これは、作成された部分配列スコアの全てを保持するリストである。
【００６２】
【図２９】図２９は、実施例１７に記載されている通り、ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−３ｘ−ＭＭＡＥコンジュゲートを合成するための実験の結果を描写する。図２９Ａは、分子量マーカー（レーン１）および精製されたａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−３ｘＭＭＡＥコンジュゲート（レーン２）による非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルである。図２９Ｂは、ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−３ｘＭＭＡＥの純度およびインタクト質量を実証するＥＳＩ−ＭＳデータである。
【００６３】
【図３０】図３０は、実施例２０に記載されている通り、ホレートターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを合成するための実験の結果を描写する。図３０Ａは、ホレート−ＡＨＨＡＣおよびＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮの反応に由来する、精製されたホレートターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの分析的Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣトレースである。図３０Ｂは、分子量マーカー（レーン１）および精製されたホレートターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲート（レーン２）による非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルである。
【００６４】
【図３１】図３１は、実施例２１に記載されている通り、ＰＣＭを備えるホレートターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを合成するための実験の結果を描写する。図３１Ａは、ホレート−ＡＨＨＡＣおよびＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮの反応に由来する、ＰＣＭを備える精製されたホレートターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの分析的Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣトレースである。図３１Ｂは、分子量マーカー（レーン１）およびＰＣＭを備える精製されたホレートターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲート（レーン２）による非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルである。
【００６５】
【図３２】図３２は、実施例１０に記載されている通り、３ｘ−ＭＭＡＥ−ＸＴＥＮを合成するための実験に由来する分析的Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ結果を描写する。
【００６６】
【図３３】図３３は、実施例１１に記載されている通りに３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮおよび実施例１０に記載されている通りに３ｘ−ＭＭＡＥ−ＸＴＥＮを合成するための実験の結果を描写する。図３３Ａは、ＣＣＤ−ＸＴＥＮまたはシステイン操作ＸＴＥＮへの薬物ペイロードのコンジュゲーションのためのスキームを示す。図３３Ｂは、ＣＣＤ−ＸＴＥＮまたはシステイン操作ＸＴＥＮへの薬物コンジュゲーションのための分析的Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣトレースを描写する。
【００６７】
【図３４−１】図３４は、ＰＣＭドメインが任意選択である、ターゲティング部分−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ−ペイロードコンジュゲートの異なるフォーマットを描写する。取り付けられたＸＴＥＮは、対象への投与後の、組成物の全身性半減期の延長に役立つ。組成物が、腫瘍微小環境に存在する場合、過剰発現された腫瘍のプロテアーゼは、ＰＣＭ（存在するのであれば）を切断し、末端ＸＴＥＮを放出し、ペイロードを連結したＣＣＤに融合されたターゲティング部分を保有するより小型の残るセグメントのより優れた浸透をもたらす。図３４Ａは、組成物からＸＴＥＮを放出するＰＣＭにおけるタンパク質切断後にターゲティング部分（ＴＭ１）と共に残るであろう、ＣＣＤに取り付けられた１個または複数のペイロードＡ分子を示す。図３４Ｂは、組成物からのＸＴＥＮのタンパク質切断を伴わず、ターゲティング部分（ＴＭ１）およびＸＴＥＮと共に残るであろう、ＣＣＤに取り付けられた１個または複数のペイロードＡ分子を示す。図３４Ｃは、ターゲティング部分およびペイロードが連結されたＣＣＤを保有するより小型のＮ末端セグメントのより優れた浸透をもたらす、ＰＣＭの切断後に放出され得る多価架橋剤によってＰＣＭに取り付けられた変動する数のＸＴＥＮを示す。図３４Ｄは、薬物動態、腫瘍浸透ならびにペイロードおよびターゲティング部分の遮蔽を調整する目的のために（後者の特性は、図３５においても例示されている）、ＰＣＭの切断後に放出されるＸＴＥＮの長さが、ターゲティングコンジュゲート組成物において変動され得ることを示す。
【図３４−２】図３４は、ＰＣＭドメインが任意選択である、ターゲティング部分−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ−ペイロードコンジュゲートの異なるフォーマットを描写する。取り付けられたＸＴＥＮは、対象への投与後の、組成物の全身性半減期の延長に役立つ。組成物が、腫瘍微小環境に存在する場合、過剰発現された腫瘍のプロテアーゼは、ＰＣＭ（存在するのであれば）を切断し、末端ＸＴＥＮを放出し、ペイロードを連結したＣＣＤに融合されたターゲティング部分を保有するより小型の残るセグメントのより優れた浸透をもたらす。図３４Ａは、組成物からＸＴＥＮを放出するＰＣＭにおけるタンパク質切断後にターゲティング部分（ＴＭ１）と共に残るであろう、ＣＣＤに取り付けられた１個または複数のペイロードＡ分子を示す。図３４Ｂは、組成物からのＸＴＥＮのタンパク質切断を伴わず、ターゲティング部分（ＴＭ１）およびＸＴＥＮと共に残るであろう、ＣＣＤに取り付けられた１個または複数のペイロードＡ分子を示す。図３４Ｃは、ターゲティング部分およびペイロードが連結されたＣＣＤを保有するより小型のＮ末端セグメントのより優れた浸透をもたらす、ＰＣＭの切断後に放出され得る多価架橋剤によってＰＣＭに取り付けられた変動する数のＸＴＥＮを示す。図３４Ｄは、薬物動態、腫瘍浸透ならびにペイロードおよびターゲティング部分の遮蔽を調整する目的のために（後者の特性は、図３５においても例示されている）、ＰＣＭの切断後に放出されるＸＴＥＮの長さが、ターゲティングコンジュゲート組成物において変動され得ることを示す。
【図３４−３】図３４は、ＰＣＭドメインが任意選択である、ターゲティング部分−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ−ペイロードコンジュゲートの異なるフォーマットを描写する。取り付けられたＸＴＥＮは、対象への投与後の、組成物の全身性半減期の延長に役立つ。組成物が、腫瘍微小環境に存在する場合、過剰発現された腫瘍のプロテアーゼは、ＰＣＭ（存在するのであれば）を切断し、末端ＸＴＥＮを放出し、ペイロードを連結したＣＣＤに融合されたターゲティング部分を保有するより小型の残るセグメントのより優れた浸透をもたらす。図３４Ａは、組成物からＸＴＥＮを放出するＰＣＭにおけるタンパク質切断後にターゲティング部分（ＴＭ１）と共に残るであろう、ＣＣＤに取り付けられた１個または複数のペイロードＡ分子を示す。図３４Ｂは、組成物からのＸＴＥＮのタンパク質切断を伴わず、ターゲティング部分（ＴＭ１）およびＸＴＥＮと共に残るであろう、ＣＣＤに取り付けられた１個または複数のペイロードＡ分子を示す。図３４Ｃは、ターゲティング部分およびペイロードが連結されたＣＣＤを保有するより小型のＮ末端セグメントのより優れた浸透をもたらす、ＰＣＭの切断後に放出され得る多価架橋剤によってＰＣＭに取り付けられた変動する数のＸＴＥＮを示す。図３４Ｄは、薬物動態、腫瘍浸透ならびにペイロードおよびターゲティング部分の遮蔽を調整する目的のために（後者の特性は、図３５においても例示されている）、ＰＣＭの切断後に放出されるＸＴＥＮの長さが、ターゲティングコンジュゲート組成物において変動され得ることを示す。
【図３４−４】図３４は、ＰＣＭドメインが任意選択である、ターゲティング部分−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ−ペイロードコンジュゲートの異なるフォーマットを描写する。取り付けられたＸＴＥＮは、対象への投与後の、組成物の全身性半減期の延長に役立つ。組成物が、腫瘍微小環境に存在する場合、過剰発現された腫瘍のプロテアーゼは、ＰＣＭ（存在するのであれば）を切断し、末端ＸＴＥＮを放出し、ペイロードを連結したＣＣＤに融合されたターゲティング部分を保有するより小型の残るセグメントのより優れた浸透をもたらす。図３４Ａは、組成物からＸＴＥＮを放出するＰＣＭにおけるタンパク質切断後にターゲティング部分（ＴＭ１）と共に残るであろう、ＣＣＤに取り付けられた１個または複数のペイロードＡ分子を示す。図３４Ｂは、組成物からのＸＴＥＮのタンパク質切断を伴わず、ターゲティング部分（ＴＭ１）およびＸＴＥＮと共に残るであろう、ＣＣＤに取り付けられた１個または複数のペイロードＡ分子を示す。図３４Ｃは、ターゲティング部分およびペイロードが連結されたＣＣＤを保有するより小型のＮ末端セグメントのより優れた浸透をもたらす、ＰＣＭの切断後に放出され得る多価架橋剤によってＰＣＭに取り付けられた変動する数のＸＴＥＮを示す。図３４Ｄは、薬物動態、腫瘍浸透ならびにペイロードおよびターゲティング部分の遮蔽を調整する目的のために（後者の特性は、図３５においても例示されている）、ＰＣＭの切断後に放出されるＸＴＥＮの長さが、ターゲティングコンジュゲート組成物において変動され得ることを示す。
【００６８】
【図３５】図３５は、ターゲティング部分（ＴＭ１）がプロテアーゼ放出可能ＸＴＥＮ（複数可）および／または化合物配置の立体障害によって遮蔽されている、ターゲティングコンジュゲート組成物構築物（contruct）の異なるフォーマットを例示する。これらの例証的な配置において、ＴＭ１は、腫瘍微小環境におけるＰＣＭ切断後にのみ露出され、そのリガンドに到達可能になる。逆に、がん標的の高い発現を有するが、それ以外ではプロテアーゼを欠如するまたはその発現が低い正常組織は、腫瘍微小環境に観察されるプロテアーゼ過剰発現の欠如により温存されるであろう。図３５Ａは、単一のプロテアーゼ切断可能ＸＴＥＮに連結された構築物設計を示す。図３５Ｂは、より優れた遮蔽効果を達成するために、複数のプロテアーゼ切断可能ＸＴＥＮに連結された構築物設計を示す。
【００６９】
【図３６Ａ】図３６は、ＣＣＤ−ＸＴＥＮにコンジュゲートされたホレートターゲティング部分（図３６Ａ）またはＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮにコンジュゲートされたホレートターゲティング部分（図３６Ｂ）を備えるホレートターゲティングＸＴＥＮ−コンジュゲートの化学構造および配列を例示し、この場合、ＭＭＡＥの分子（図３６Ｃ）は、ＣＣＤのＺ改変されたシステイン残基にコンジュゲートされている。
【図３６Ｂ】図３６は、ＣＣＤ−ＸＴＥＮにコンジュゲートされたホレートターゲティング部分（図３６Ａ）またはＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮにコンジュゲートされたホレートターゲティング部分（図３６Ｂ）を備えるホレートターゲティングＸＴＥＮ−コンジュゲートの化学構造および配列を例示し、この場合、ＭＭＡＥの分子（図３６Ｃ）は、ＣＣＤのＺ改変されたシステイン残基にコンジュゲートされている。
【図３６Ｃ】図３６は、ＣＣＤ−ＸＴＥＮにコンジュゲートされたホレートターゲティング部分（図３６Ａ）またはＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮにコンジュゲートされたホレートターゲティング部分（図３６Ｂ）を備えるホレートターゲティングＸＴＥＮ−コンジュゲートの化学構造および配列を例示し、この場合、ＭＭＡＥの分子（図３６Ｃ）は、ＣＣＤのＺ改変されたシステイン残基にコンジュゲートされている。
【００７０】
【図３７】図３７は、１個の単一骨格ＸＴＥＮにおける、複数コピーのＰＣＭ−ＴＭ１−ＣＣＤ−ペイロード−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ２構築物または複数コピーのＰＣＭ−ＴＭ１−ＣＣＤ−ペイロード構築物のコンジュゲーションを示す。図３７Ａは、３個の反応基（ＩＢ）を含有するＸＴＥＮ１を示し、図３７Ｂは、３コピーのペイロードＡを保有するＣＣＤセグメントおよびＸＴＥＮ２に融合されたターゲティング部分（ＴＭ１）に融合されたＰＣＭ配列において反応基（１Ａ）を含有する融合タンパク質を示し；図３７Ｃは、３コピーのペイロードＡを保有するＣＣＤセグメントに融合されたターゲティング部分（ＴＭ１）に融合されたＰＣＭ配列において反応基（１Ａ）を含有する融合タンパク質を示す。図３７Ｄは、複数コピーのプロテアーゼ放出可能ＴＭ１−ＣＣＤ−３ｘ＿ペイロードＡ−ＸＴＥＮ２コンジュゲートを保有する１個のＸＴＥＮ骨格配列を備える、図３７Ａおよび図３７Ｂの最終コンジュゲートの反応産物を示す一方、図３７Ｅは、複数コピーのプロテアーゼ放出可能ＴＭ１−ＣＣＤ−３ｘ＿ペイロードＡコンジュゲートを保有する１個のＸＴＥＮ骨格配列を備える、図３７Ａおよび図３７Ｃの最終コンジュゲートの反応産物を示す。最終コンジュゲートのＴＭ１は、遮蔽されているが、構築物は、ＸＴＥＮによって付与される増強された透過性および保持（ＥＰＲ）効果により、正常組織よりも腫瘍組織に浸潤する可能性が高い。
【００７１】
【図３８】図３８は、腫瘍細胞等、標的細胞の微小環境中のプロテアーゼによって切断され得る配列を有するプロテアーゼ切断部分（ＰＣＭ）によってＸＴＥＮ骨格にコンジュゲートされた、ＣＣＤおよび連結された毒素ペイロードに融合されたターゲティング部分の融合タンパク質を含むターゲティングコンジュゲート組成物の切断、結合およびプロセシングの模式的な例を示す。コンジュゲートが、ＰＣＭを切断することができるプロテアーゼを過剰発現する腫瘍の微小環境（microenviroment）中に存在する場合、ＴＭ１（細胞傷害性ペイロードＡを連結したＣＣＤに融合される）を備える切断されたコンジュゲートの成分は、がん細胞において過剰発現される標的受容体に結合する。受容体結合は、結合された融合タンパク質コンジュゲートの内部移行と、続くタンパク質分解および細胞に対し毒性であるペイロードＡの細胞内遊離をもたらす。
【００７２】
【図３９】図３９は、１個の単一骨格ＸＴＥＮにおける、複数コピーの反応性ＰＣＭ−ＴＭ１−ＣＣＤ−ペイロード−ＸＴＥＮ２（図３９Ｂ）または反応性ＰＣＭ−ＴＭ１−ＣＣＤ−ペイロード（図３９Ｃ）分子のコンジュゲーションを示す。図３９Ａは、３個の反応基（ＩＢ）および薬物を腫瘍組織に近接させるターゲティング部分（ＴＭ２）を含有する骨格ＸＴＥＮを描写する。図３９Ｄは、この場合は３コピーのプロテアーゼ放出可能ＴＭ１−ＣＣＤ−３ｘ＿ペイロードＡ−ＸＴＥＮ２コンジュゲートを保有する１個のＴＭ２ターゲティング分子を備える最終コンジュゲート構築物を描写する。図３９Ｅは、この場合は３コピーのプロテアーゼ放出可能ＴＭ１−ＣＣＤ−３ｘ＿ペイロードＡコンジュゲートを保有する１個のＴＭ２ターゲティング分子を備える最終コンジュゲート構築物を描写する。
【００７３】
【図４０】図４０は、腫瘍細胞等、標的細胞において選択的作用を発揮するプロテアーゼ切断部分（ＰＣＭ）によって骨格ＸＴＥＮに連結されたターゲティング部分および毒素ペイロードを含む、図３９のコンジュゲートの切断、結合およびプロセシングの模式的な例を示す。この場合、ＸＴＥＮ骨格における第２のターゲティングドメイン（ＴＭ２）が、分子全体を腫瘍に近接させるが、内部移行はしない。この構成は、腫瘍に発現されるプロテアーゼが、ＰＣＭにおいて作用して、これにより、インタクト組成物の遮蔽効果からの放出によりＴＭ１−ＣＣＤ−ペイロード＿Ａコンジュゲート（conjuate）を放出および「活性化」するのに十分な、腫瘍微小環境中の滞留時間を可能にする。
【００７４】
【図４１】図４１は、選択的な様式で、ＸＴＥＮ−コンジュゲートにおける活性部分の効力を減少させ続いて回復するための作用機序の模式図を示す。プロテアーゼ活性を欠如する（またはそれが減少した）血液および他の正常で健康な組織において、図４１ＡのＸＴＥＮ−コンジュゲートは、大部分はインタクトなままであり、長い血清半減期および活性部分の受容体を有する正常組織に対する低い親和性を維持する。プロテアーゼレベルが上昇した炎症組織において、プロテアーゼは、ＰＣＭを切断し（図４１Ｂ）、炎症組織の近接部でペイロードを遊離させ、これにより、その薬理学的作用を発揮する効力および能力を回復させるであろう。
【００７５】
【図４２】図４２は、複数コピーのプロテアーゼ放出可能活性部分（図４２Ｂ）または活性部分−ＸＴＥＮ２融合タンパク質（図４２Ｃ）を保有する１個の親ＸＴＥＮ骨格（図４２Ａ）のコンジュゲーションを示す。どちらの場合でも、図４１に記載されている通り、活性部分は、炎症組織における過剰発現されたプロテアーゼが、これを遊離させるまで遮断されている。
【００７６】
【図４３−１】図４３は、プロテアーゼ活性化可能抗体断片の異なるフォーマットを描写する。図４３Ａは、可変軽鎖に連結された可変重鎖（またはその逆もまた同じ）として方向付けられたｓｃＦｖを描写する；図４３Ｂは、ｓｃＦｖの一方または両方の末端に融合された、種々の長さのプロテアーゼ切断可能ＸＴＥＮを描写する。ｓｃＦｖの親和性は、ＸＴＥＮ融合により損なわれており、標的組織におけるプロテアーゼ切断後に回復される。図４３Ｃは、可変軽鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３等、非必須ＣＤＲへのプロテアーゼ切断可能ＸＴＥＮの挿入を描写する。挿入されたＸＴＥＮセグメントは、ｓｃＦｖの全体的フォールディングに影響を与えないが、他のＣＤＲに遮蔽効果を生じ、これにより、プロテアーゼ切断まで、その標的へのｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ融合体の結合を妨害する。図４３Ｄは、ｓｃＦｖへのプロテアーゼ切断可能ＸＴＥＮの末端融合およびＣＤＲ挿入の種々の並べ替えを描写する。
【図４３−２】図４３は、プロテアーゼ活性化可能抗体断片の異なるフォーマットを描写する。図４３Ａは、可変軽鎖に連結された可変重鎖（またはその逆もまた同じ）として方向付けられたｓｃＦｖを描写する；図４３Ｂは、ｓｃＦｖの一方または両方の末端に融合された、種々の長さのプロテアーゼ切断可能ＸＴＥＮを描写する。ｓｃＦｖの親和性は、ＸＴＥＮ融合により損なわれており、標的組織におけるプロテアーゼ切断後に回復される。図４３Ｃは、可変軽鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３等、非必須ＣＤＲへのプロテアーゼ切断可能ＸＴＥＮの挿入を描写する。挿入されたＸＴＥＮセグメントは、ｓｃＦｖの全体的フォールディングに影響を与えないが、他のＣＤＲに遮蔽効果を生じ、これにより、プロテアーゼ切断まで、その標的へのｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ融合体の結合を妨害する。図４３Ｄは、ｓｃＦｖへのプロテアーゼ切断可能ＸＴＥＮの末端融合およびＣＤＲ挿入の種々の並べ替えを描写する。
【００７７】
【図４４】図４４は、ペプチジル切断部分におけるＭＭＰ−９酵素の作用を決定するためのアッセイの結果を示す。ＰＬＧＬＡＧ切断部位を備える１０μＭのＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓを、２０ｕＬ反応液において０．１ｎｇ／μＬのＭＭＰ−９と共にインキュベートした。反応液を３７℃で最大１時間インキュベートし、２０ｍＭとなるようＥＤＴＡを添加して消化を停止することにより、１０分間間隔でアリコートを集めた。切断された産物の百分率を決定するための試料の解析をＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣにより行った（図４４Ａ）。２種の陰性対照もアッセイに含まれた：１種は、ＭＭＰ−９の非存在下で消化が起こらなかったことを確認するためのものであり、１種は、酵素原活性化において利用される化学物質であるＡＰＭＡ単独の存在下で消化が起こらなかったことを確認するためのものである（図４４Ｂ）。
【００７８】
【図４５】図４５は、実施例９に記載されている通り、タンパク質切断部分ＢＳＲＳ−１を含むＸＴＥＮのタンパク質切断アッセイの結果を示す。図４５Ａは、ＭＴＳＰ−１、ｕＰＡ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７により消化されたＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮのＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイの結果であり、図中、消化された産物は、切断されていない出発材料と比較して、より小さい見かけ上の分子量で泳動される。図４５Ｂは、消化前および後の試料のＲＰＣ１８  ＨＰＬＣ解析の結果を示し、保持時間の明らかなシフトが見られる。
【００７９】
【図４６】図４６は、ＴＭ１が、組換えにより組成物に連結されている、または融合タンパク質にコンジュゲートされている、コンジュゲート組成物の配置を描写する。図４６Ａは、ＸＴＥＮ、ペプチジル切断部分（ＰＣＭ）、ＣＣＤおよびＮ末端のＴＭ１を含む融合タンパク質を含むコンジュゲート組成物の配置を描写し、図中、ＴＭ１、ＣＣＤ、ＰＣＭおよびＸＴＥＮは全て、組換えポリペプチドとして連結されており、ペイロードＡの３個の同一分子は、ＣＣＤのシステイン残基において融合タンパク質にコンジュゲートされている。図４６Ｂは、図４６Ａと同じ成分を有するが、成分のＮからＣ末端への配向性が反転された組成物を描写する。図４６Ｃは、ＸＴＥＮ、ペプチジル切断部分（ＰＣＭ）、ＣＣＤを含む融合タンパク質を含み、ＴＭ１がＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ融合タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている（矢印は、コンジュゲーションの部位を示す）コンジュゲート組成物の配置を描写する。
【００８０】
【図４７】図４７は、ＴＭ１が、組換えにより組成物に連結された、または融合タンパク質にコンジュゲートされたコンジュゲート組成物の配置を描写する。図４７Ａは、ペプチジル切断部分（ＰＣＭ）、ターゲティング部分（ＴＭ１）およびＣＣＤの融合タンパク質にコンジュゲートされたＸＴＥＮを含むコンジュゲート組成物の配置を描写する。３分子のペイロードＡが、ＣＣＤのシステイン残基において融合タンパク質にコンジュゲートされている。図４７Ｂは、ペプチジル切断部分（ＰＣＭ）にコンジュゲートされた、表１０の配列からなる群より選択されるＸＴＥＮを含むコンジュゲート組成物の配置を描写し、図中、ＰＣＭ配列は、ＣＣＤにコンジュゲートされたターゲティング部分（ＴＭ１）に連結された表７のＰＣＭ配列からなる群より選択される。３分子のペイロードＡが、ＣＣＤのシステイン残基にコンジュゲートされている。矢印は、コンジュゲーションの部位を示す。
【００８１】
【図４８】図４８は、ＴＭ１が、組換えにより組成物に連結された、または融合タンパク質にコンジュゲートされたターゲティングコンジュゲート組成物の配置を描写する。図４８Ａは、三量体架橋剤に連結されたＸＴＥＮの２個の同一分子と、ｉ）ペプチジル切断部分（ＰＣＭ）；ｉｉ）ＰＣＭおよびＣＣＤの間に組換えにより連結されたターゲティング部分（ＴＭ１）；ならびにｉｉｉ）ＣＣＤのシステイン残基において融合タンパク質にコンジュゲートされた３分子のペイロードＡを備えるＣＣＤを含む融合タンパク質を含むコンジュゲート組成物の配置を描写する。矢印は、コンジュゲーションの部位を示す。図４８Ｂは、図４８Ａと同じであるが、ＴＭ１が、ＰＣＭに組換えにより連結され、ＣＣＤにコンジュゲートされた一般的配置を描写する。
【００８２】
【図４９】図４９は、ＴＭ１が、組換えにより組成物に連結された、または融合タンパク質にコンジュゲートされたターゲティングコンジュゲート組成物の配置を描写する。図４９Ａは、ＸＴＥＮ骨格と；ｉ）ペプチジル切断部分（ＰＣＭ）；ｉｉ）３個の融合タンパク質のそれぞれにおいてＰＣＭおよびＣＣＤに組換えにより連結されたターゲティング部分（ＴＭ１）；ｉｉｉ）ＣＣＤ；ならびにそれぞれ３分子のペイロードＡがＣＣＤのシステイン残基において３個の融合タンパク質のそれぞれにコンジュゲートされた９分子のペイロードＡを含む、融合タンパク質の３個の同一分子とを含む、コンジュゲート組成物の配置を描写する。矢印は、コンジュゲーションの部位を示す。図４９Ｂは、図４９Ａと同じであるが、ＴＭ１が、ＰＣＭに組換えにより連結され、ペイロードＡ分子を有するＣＣＤにコンジュゲートされた一般的配置を描写する。
【００８３】
【図５０】図５０は、ターゲティングコンジュゲート組成物の配置を描写する。図５０Ａは、（ａ）ＰＣＭおよび３個のペイロードＡ分子を有するＣＣＤに組換えにより連結された、骨格ＸＴＥＮおよびターゲティング部分（ＴＭ２）を含む第１の融合タンパク質；（ｂ）ｉ）ペプチジル切断部分（ＰＣＭ）；ｉｉ）ＴＭ２とは異なる標的に結合するターゲティング部分（ＴＭ１）；ｉｉｉ）ＣＣＤ；および（ｃ）それぞれ３分子のペイロードＡがＣＣＤのシステイン残基において３個の融合タンパク質のそれぞれにコンジュゲートされた９分子のペイロードＡを含む、ＸＴＥＮのシステイン残基にコンジュゲートされた融合タンパク質の３個の同一分子を含むコンジュゲート組成物の配置を描写する。矢印は、コンジュゲーションの部位を示す。図５０Ｂは、図５０Ａと同じであるが、ＴＭ１が、ＰＣＭに組換えにより連結され、ペイロードＡ分子を有するＣＣＤにコンジュゲートされた一般的配置を描写する。
【００８４】
【図５１】図５１は、免疫グロブリン分子、ならびにｉ）ＸＴＥＮ；ｉｉ）ペプチジル切断部分（ＰＣＭ）；ｉｉｉ）ＣＣＤ；およびｉｖ）それぞれ３分子のペイロードＡがＣＣＤのシステイン残基において融合タンパク質のそれぞれにコンジュゲートされたペイロードＡの３個の同一分子を含む融合タンパク質を含む２分子の切断可能コンジュゲート組成物を含む、コンジュゲート組成物の配置を描写する。矢印は、免疫グロブリンへの融合タンパク質のコンジュゲーションの部位を示す。
【００８５】
【図５２】図５２は、ＰＣＭを切断することができるプロテアーゼと反応させた（ハサミで示す）図４６のコンジュゲート組成物と、その結果得られる反応産物を描写する。図５２Ａ（ＴＭ１の組換えによる取り付け）および図５２Ｂ（ＴＭ１のコンジュゲートによる取り付け）は両者共に、ＰＣＭにおける切断の位置と、組成物の残り部分からのかさ高いＸＴＥＮの放出を描写し、分子サイズが大幅に減少され、ＸＴＥＮの遮蔽効果から自由になったこの残り部分は、標的組織に結合し、そこにペイロード薬物を送達することができる。
【００８６】
【図５３】図５３は、ＰＣＭを切断することができるプロテアーゼと反応させた（ハサミで示す）図４７のコンジュゲート組成物と、反応産物を描写する。図５３Ａ（ＴＭ１の組換えによる取り付け）および図５３Ｂ（ＴＭ１のコンジュゲートによる取り付け）は両者共に、ＰＣＭにおける切断の位置と、組成物の残り部分からのかさ高いＸＴＥＮの放出を描写し、分子サイズが大幅に減少され、ＸＴＥＮの遮蔽効果から自由になったこの残り部分は、標的組織に結合し、そこにペイロード薬物を送達することができる。
【００８７】
【図５４】図５４は、ＰＣＭを切断することができるプロテアーゼと反応させた（ハサミで示す）図４８のコンジュゲート組成物と、その結果得られる反応産物を描写する。図５４Ａ（ＴＭ１の組換えによる取り付け）および図５４Ｂ（ＴＭ１のコンジュゲートによる取り付け）は両者共に、ＰＣＭにおける切断の位置と、組成物の残り部分からのかさ高いＸＴＥＮの放出を描写し、分子サイズが大幅に減少され、ＸＴＥＮの遮蔽効果から自由になったこの残り部分は、標的組織に結合し、そこにペイロード薬物を送達することができる。
【００８８】
【図５５】図５５は、ＰＣＭを切断することができるプロテアーゼと反応させた（ハサミで示す）図４９のコンジュゲート組成物と、その結果得られる反応産物を描写する。図５５Ａ（ＴＭ１の組換えによる取り付け）および図５５Ｂ（ＴＭ１のコンジュゲートによる取り付け）は両者共に、ＰＣＭにおける切断の位置と、組成物の残り部分からの２分子のＸＴＥＮのかさ高い二量体（互いに連結される）の放出を描写し、分子サイズが大幅に減少され、ＸＴＥＮの遮蔽効果から自由になったこの残り部分は、標的組織に結合し、そこにペイロード薬物を送達することができる。
【００８９】
【図５６】図５６は、ＰＣＭを切断することができるプロテアーゼと反応させた（ハサミで示す）図５０のコンジュゲート組成物と、その結果得られる反応産物を描写する。図５６Ａ（ＴＭ１の組換えによる取り付け）および図５６Ｂ（ＴＭ１のコンジュゲートによる取り付け）は両者共に、ＰＣＭにおける切断の位置と、組成物の残り部分からのかさ高いＸＴＥＮの放出を描写し、各ＣＣＤに３分子のペイロード薬物が連結されたＣＣＤに連結されたＴＭ１が３分子であるこの残り部分は、標的組織に結合し、そこにペイロード薬物を送達することができる。
【００９０】
【図５７】図５７は、ＰＣＭを切断することができるプロテアーゼと反応させた（ハサミで示す）図５１のコンジュゲート組成物と、その結果得られる反応産物を描写する。
【００９１】
【図５８】図５８は、実施例３５に記載されている通り、ＫＢ細胞におけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験の結果を描写する。
【００９２】
【図５９】図５９は、実施例６１に記載されている通り、ＫＢ細胞におけるＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験の結果を描写する。
【００９３】
【図６０】図６０は、実施例３６に記載されている通り、ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦのＰＫを決定するための実験の結果を描写する。
【００９４】
【図６１】図６１は、実施例３６に記載されている通り、ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦのＭＴＤを決定するための実験の結果を描写する。
【００９５】
【図６２】図６２は、実施例３６に記載されている通り、ＫＢ異種移植マウスモデルにおけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦの有効性を決定するための実験の結果を描写する。
【００９６】
【図６３】図６３は、実施例３６に記載されている通り、ＫＢ異種移植マウスモデルにおけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦの安全性を決定するための実験の結果を描写する。
【００９７】
【図６４】図６４は、実施例３６に記載されている通り、ＫＢ異種移植マウスモデルにおけるＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦの有効性を決定するための実験の結果を描写する。
【００９８】
【図６５】図６５は、実施例３６に記載されている通り、ＫＢ異種移植マウスモデルにおけるＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦの安全性および耐容性を決定するための実験の結果を描写する。
【００９９】
【図６６】図６６は、ＸＴＥＮ；各ＰＣＭ配列が異なる配列であるＴＭ１−ＸＴＥＮ−ＰＣＭ−ＣＣＤ融合タンパク質配列に組み込まれた３個の異なるペプチジル切断部分（ＰＣＭ１、ＰＣＭ２、ＰＣＭ３；ＢＳＲＳ１とまとめて表す）；ＣＣＤ；ＸＴＥＮに融合されたターゲティング部分（ＴＭ１）の分子；およびペイロードＡがＣＣＤのシステイン残基にコンジュゲートされた３分子のペイロードＡを含む、コンジュゲート切断可能組成物の配置を描写する。本図は、組成物を３種の異なるプロテアーゼによって切断することができ、いずれか１種のプロテアーゼによる切断は、異なる反応産物をもたらすが、全て組成物からのかさ高いＸＴＥＮの放出をもたらすことを模式的に実証する。
【０１００】
【図６７】図６７は、実施例３７に記載されている通り、２６ｎｍｏｌ／ｋｇで投薬された４種の異なる構築物の示されている処置群の血漿濃度を示す。
【０１０１】
【図６８】図６８は、実施例３７に記載されている通り、４６０ｎｍｏｌ／ｋｇで投薬された図６７によるものと同じ４種の構築物の処置群の血漿濃度を示す。
【０１０２】
【図６９】図６９は、実施例３７に記載されている通り、２６ｎｍｏｌ／ｋｇで投薬された２種の示されている処置群の組織濃度を示し、図６９Ａは２４時間目の結果を示し、図６９Ｂは７２時間目の結果を示す。
【０１０３】
【図７０】図７０は、実施例３７に記載されている通り、４６０ｎｍｏｌ／ｋｇで投薬された２種の示されている処置群の組織濃度を示し、図７０Ａは２４時間目の結果を示し、図７０Ｂは７２時間目の結果を示す。
【０１０４】
【図７１】図７１は、実施例３７に記載されている通り、２６ｎｍｏｌ／ｋｇで投薬された２種の示されている処置群の組織濃度を示し、図７１Ａは２４時間目の結果を示し、図７１Ｂは７２時間目の結果を示す。
【０１０５】
【図７２】図７２は、実施例３７に記載されている通り、４６０ｎｍｏｌ／ｋｇで投薬された２種の示されている処置群の組織濃度を示し、図７２Ａは２４時間目の結果を示し、図７２Ｂは７２時間目の結果を示す。
【０１０６】
【図７３】図７３は、実施例３７に記載されている通り、２４および７２時間の間隔における示されている２種のターゲティング構築物の腫瘍および血漿濃度を示す。
【０１０７】
【図７４】図７４は、実施例３８に記載されている通り、３種の示されている処置群および対照の経時的な腫瘍体積データを示す。
【０１０８】
【図７５】図７５は、実施例３８に記載されている通り、３種の示されている処置群および対照の経時的な体重データを示す。
【０１０９】
【図７６】図７６は、実施例３９に記載されている通り、各２ｍｇ／ｋｇで投薬された５種の処置群の血漿濃度を示す。
【０１１０】
【図７７】図７７は、実施例３９に記載されている通り、各２ｍｇ／ｋｇで投薬された５種の処置群の血漿濃度を示す。
【０１１１】
【図７８】図７８は、実施例４０に記載されている通り、そのリガンドに対する２種のターゲティング構築物の結合を示す。
【０１１２】
【図７９−１】図７９は、実施例４１に記載されている通り、葉酸の存在および非存在下におけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択的活性を決定するための実験の結果を描写する；図７９ＡはＪＥＧ−３の結果を示し、図７９ＢはＳＷ６２０の結果を示し、図７９ＣはＳＫ−ＢＲ−３の結果を示す。
【図７９−２】図７９は、実施例４１に記載されている通り、葉酸の存在および非存在下におけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択的活性を決定するための実験の結果を描写する；図７９ＡはＪＥＧ−３の結果を示し、図７９ＢはＳＷ６２０の結果を示し、図７９ＣはＳＫ−ＢＲ−３の結果を示す。
【図７９−３】図７９は、実施例４１に記載されている通り、葉酸の存在および非存在下におけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択的活性を決定するための実験の結果を描写する；図７９ＡはＪＥＧ−３の結果を示し、図７９ＢはＳＷ６２０の結果を示し、図７９ＣはＳＫ−ＢＲ−３の結果を示す。
【０１１３】
【図８０】図８０は、実施例４２に記載されている通り、２種の処置群の経時的な腫瘍体積データを示す。
【０１１４】
【図８１】図８１は、実施例４２に記載されている通り、２種の処置群の経時的な体重データを示す。
【０１１５】
【図８２】図８２は、実施例４２に記載されている通り、３種の処置群の経時的な腫瘍体積データを示す。
【０１１６】
【図８３−１】図８３は、実施例４４に記載されている通り、トラスツズマブの存在および非存在下におけるＣＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＥおよび抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験の結果を描写する；図８３ＡはＳＫ−ＢＲ−３の結果を示し、図８３ＢはＢＴ４７４の結果を示し、図８３ＣはＨＣＣ１９５４の結果を示し、図８３ＤはＮＣＩ−Ｎ８７の結果を示し、図８３ＥはＳＫ−ＯＶ−３の結果を示す。
【図８３−２】図８３は、実施例４４に記載されている通り、トラスツズマブの存在および非存在下におけるＣＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＥおよび抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験の結果を描写する；図８３ＡはＳＫ−ＢＲ−３の結果を示し、図８３ＢはＢＴ４７４の結果を示し、図８３ＣはＨＣＣ１９５４の結果を示し、図８３ＤはＮＣＩ−Ｎ８７の結果を示し、図８３ＥはＳＫ−ＯＶ−３の結果を示す。
【図８３−３】図８３は、実施例４４に記載されている通り、トラスツズマブの存在および非存在下におけるＣＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＥおよび抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験の結果を描写する；図８３ＡはＳＫ−ＢＲ−３の結果を示し、図８３ＢはＢＴ４７４の結果を示し、図８３ＣはＨＣＣ１９５４の結果を示し、図８３ＤはＮＣＩ−Ｎ８７の結果を示し、図８３ＥはＳＫ−ＯＶ−３の結果を示す。
【０１１７】
【図８４−１】図８４は、実施例４４に記載されている通り、トラスツズマブの存在および非存在下におけるＣＸＴＥＮ４３２−３ｘＤＭ１および抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験の結果を描写する；図８４ＡはＳＫ−ＢＲ−３の結果を示し、図８４ＢはＢＴ４７４の結果を示し、図８４ＣはＨＣＣ１９５４の結果を示し、図８４ＤはＮＣＩ−Ｎ８７の結果を示し、図８４ＥはＳＫ−ＯＶ−３の結果を示す。
【図８４−２】図８４は、実施例４４に記載されている通り、トラスツズマブの存在および非存在下におけるＣＸＴＥＮ４３２−３ｘＤＭ１および抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験の結果を描写する；図８４ＡはＳＫ−ＢＲ−３の結果を示し、図８４ＢはＢＴ４７４の結果を示し、図８４ＣはＨＣＣ１９５４の結果を示し、図８４ＤはＮＣＩ−Ｎ８７の結果を示し、図８４ＥはＳＫ−ＯＶ−３の結果を示す。
【図８４−３】図８４は、実施例４４に記載されている通り、トラスツズマブの存在および非存在下におけるＣＸＴＥＮ４３２−３ｘＤＭ１および抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験の結果を描写する；図８４ＡはＳＫ−ＢＲ−３の結果を示し、図８４ＢはＢＴ４７４の結果を示し、図８４ＣはＨＣＣ１９５４の結果を示し、図８４ＤはＮＣＩ−Ｎ８７の結果を示し、図８４ＥはＳＫ−ＯＶ−３の結果を示す。
【０１１８】
【図８５】図８５は、実施例４５に記載されている通り、ＮＣＩ−Ｎ８７における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７、プロテアーゼ処理したおよび未処理の抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための実験の結果を描写する。
【０１１９】
【図８６】図８６は、実施例４８に記載されている通り、ＸＴＥＮの好中球エラスターゼ（ＮＥ）消化を示す。レーン毎の材料を次に示す：レーン１：マーカー；レーン２：未消化ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４；レーン３：３７℃で１：１０００モル比のＮＥと共に２時間インキュベートされたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４；レーン４：３７℃で１：１００モル比のＮＥと共に２時間インキュベートされたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４。
【０１２０】
【図８７】図８７は、ｓｃＦｖおよびコンカテネート配置の模式図提示を示す。図８７Ａは、Ｎ末端からＣ末端の配向性で、描写されたフレームワークまたはＣＤＲ可変セグメントのＶＬ−リンカー−ＶＨまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ成分を有するｓｃＦｖの２種の配置を示す。図８７Ｂは、Ｎ末端からＣ末端への配向性で、ＣＣＤ、ＰＣＭおよびＸＴＥＮ配列に融合されたＦＲＬ４またはＦＲＨ４セグメントを有するコンカテネート融合タンパク質の２種の配置を示す。図８７Ｃは、Ｎ末端からＣ末端への配向性で、ＰＣＭ、ＣＣＤおよびＦＲＬ１またはＦＲＨ１セグメントに融合されたＸＴＥＮ配列を有するコンカテネート融合タンパク質の２種の配置を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
本発明の実施形態を記載する前に、このような実施形態は、例だけを目的として提示されるものであり、本明細書で記載される、本発明の実施形態に対する、多様な代替物を、本発明を実施するのに援用しうることを理解されたい。ここで、本発明から逸脱せずに、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到するであろう。
【０１２２】
そうでないことが規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と同様または同等の方法および材料を使用しうるが、下記では、適切な方法および材料を記載する。利益相反の場合は、定義を含む本特許明細書により管理する。加えて、材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定的であることを意図するものではない。ここで、本発明から逸脱せずに、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到するであろう。
【０１２３】
定義
本出願の文脈では、以下の用語は、そうでないことが明示されない限り、それらに帰せられた意味を有する。
【０１２４】
本明細書および特許請求の範囲を通して使用される、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」という用語は、後続において上限が具体的に言明される場合を除き、それらが、「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１または複数」、または「複数」の、言及された構成要素またはステップを意味するという趣旨で使用される。したがって、本明細書で使用される「ペイロード」とは、「少なくとも第１のペイロード」を意味するが、複数のペイロードを含む。任意の単一の薬剤の量の場合のように、組合せの操作可能な限界およびパラメータは、本開示に照らして、当業者に公知であろう。
【０１２５】
本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように、互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、修飾アミノ酸を含む場合があり、非アミノ酸により中断される場合がある。用語はまた、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識化構成要素とのコンジュゲーションなど、他の任意の操作により修飾されたアミノ酸ポリマーも包摂する。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、Ｄ光学異性体およびＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含むがこれらに限定されない、自然および／または非自然もしくは合成アミノ酸を指す。標準的な１文字コードまたは３文字コードを使用して、アミノ酸を表示する。
【０１２７】
「薬理学的に活性」の薬剤は、対象に送達されることが所望される、任意の薬物、化合物、組成物、または混合物、例えば、有益なことが多い、何らかの薬理学的効果であって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて裏付けられうる効果をもたらすか、またはもたらすことが期待される治療剤、診断剤、または薬物送達剤を含む。このような薬剤は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、および低分子の合成化合物、またはこれらの類似体を含みうる。
【０１２８】
「天然Ｌアミノ酸」という用語は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）のＬ光学異性体形態を意味する。
【０１２９】
配列に適用され、本明細書で使用される「非自然発生の」という用語は、哺乳動物において見出される野生型または自然発生配列との対応物を有さないか、それと相補的でないか、またはそれに対する高度の相同性を有さないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、非自然発生のポリペプチドまたは断片は、適切にアラインされる場合、天然配列と比較して、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％を超えないか、なおまたはそれ未満のアミノ酸配列の同一性を共有しうる。
【０１３０】
「親水性」および「疎水性」という用語は、物質が水に対して有するアフィニティーの程度を指す。親水性物質が、水に対して強いアフィニティーを有し、水中で溶存するか、水と混じり合うか、または水により湿潤する傾向があるのに対し、疎水性物質は、水に対するアフィニティーを実質的に欠き、水を反発させ、これを吸収しない傾向があり、水中で溶存しないか、水と混じり合わないか、または水により湿潤しない傾向がある。アミノ酸は、それらの疎水性に基づき特徴付けることができる。いくつかのスケールが開発されている。例は、Levitt,  Mら、J  Mol  Biol（１９７６年）１０４巻：５９頁により開発されたスケールであり、これは、Hopp,  TPら、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A（１９８１年）７８巻：３８２４頁において列挙されている。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、およびグルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、およびグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンである。
【０１３１】
生物活性タンパク質に適用される場合の「断片」とは、治療および／または生物活性のうちの少なくとも一部を保持する生物活性タンパク質の切断形態である。生物活性タンパク質に適用される場合の「変異体」とは、生物活性タンパク質の治療および／または生物活性のうちの少なくとも一部を保持する、天然の生物活性タンパク質に対する配列相同性を伴うタンパク質である。例えば、変異体タンパク質は、基準の生物活性タンパク質と比較した、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列の同一性を共有しうる。本明細書で使用される場合、「生物活性タンパク質の変異体」という用語は、意図的に、例えば、部位指向突然変異誘発、コード遺伝子の合成、挿入により、または偶発的に、突然変異を介して修飾されているが、活性を保持するタンパク質を含む。
【０１３２】
「配列変異体」という用語は、それらの天然の配列または元の配列と比較して、１または複数のアミノ酸挿入、欠失、または置換により修飾されたポリペプチドを意味する。挿入は、タンパク質の一方もしくは両方の末端に位置する場合もあり、かつ／またはアミノ酸配列の内部領域内に位置する場合もある。非限定的な例は、生物学的に活性なペイロードタンパク質の配列内の、ＸＴＥＮ配列の挿入である。別の非限定的な例は、ＸＴＥＮ内のアミノ酸の異なるアミノ酸による置換である。欠失変異体では、本明細書で記載されるポリペプチド内の１または複数のアミノ酸残基を除去する。したがって、欠失変異体は、ペイロードポリペプチド配列の全ての断片を含む。置換変異体では、ポリペプチドの、１または複数のアミノ酸残基を除去し、代替残基で置きかえる。一態様では、置換は、保存的性質である。
【０１３３】
「部分」という用語は、薬物分子の官能基または大型のポリペプチドに接合されるターゲティングペプチドなど、大型の組成物の構成要素または大型の組成物に組み込むことを意図する構成要素を意味する。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「末端のＸＴＥＮ」とは、ペイロードが、ペプチドまたはポリペプチドである場合に、ペイロードのＮもしくはＣ末端に、またはペイロード内に融合させたＸＴＥＮ配列を指す。
【０１３５】
「ペプチジル切断部分」または「ＰＣＭ」という用語は、１または複数のプロテアーゼにより認識および切断されうる、切断型コンジュゲート組成物内の切断配列であって、ＸＴＥＮコンジュゲートからの、ペイロード、ＸＴＥＮ、またはＸＴＥＮコンジュゲートの部分の放出を実行する切断配列を指す。本明細書で使用される場合、「哺乳動物プロテアーゼ」とは、通常、哺乳動物の体液、細胞、または組織内に存在するプロテアーゼを意味する。ＰＣＭ配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、対象における標的組織または哺乳動物細胞系内に存在するか、またはそれと近位の、多様な哺乳動物プロテアーゼにより切断されるように操作することができる。規定された切断部位を認識することが可能である、他の同等のプロテアーゼ（内因性または外因性）を活用することができる。ＰＣＭ配列は、活用されるプロテアーゼに照らして調整および微調整することができ、リンカーアミノ酸を組み込んで、隣接するポリペプチドに接合しうることが、とりわけ想定される。
【０１３６】
第２のポリペプチドに連結される第１のポリペプチドに言及する場合の「〜内に」という用語は、第１または第２のポリペプチドのＮ末端を、第２または第１のポリペプチドのＣ末端のそれぞれにつなぐ連結のほか、第１のポリペプチドの、第２のポリペプチドの配列への挿入を包摂する。例えば、ＸＴＥＮを、ペイロードポリペプチド「内に」連結する場合、ＸＴＥＮは、Ｎ末端、Ｃ末端に連結することもでき、ペイロードポリペプチドの任意の２つのアミノ酸の間に挿入することもできる。
【０１３７】
本明細書で提示される対象組成物に適用される「活性」とは、受容体への結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、細胞性もしくは生理学的応答、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより測定されるのであれ、臨床効果により測定されるのであれ、組成物のペイロード構成要素について当技術分野で一般に公知の効果を含むがこれらに限定されない、作用または効果を指す。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「ＥＬＩＳＡ」という用語は、本明細書で記載される、または本明細書以外でも、当技術分野で公知の酵素免疫測定アッセイを指す。
【０１３９】
「宿主細胞」とは、本明細書で記載される細胞または細胞培養物など、対象ベクターのレシピエントでありうるか、または対象ベクターのレシピエントとなっている、個別の細胞または細胞培養物を含む。場合によって、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉを含みうる、原核生物である。他の場合、宿主細胞は、酵母、非ヒト哺乳動物細胞、またはヒト由来細胞でありうる、真核細胞である。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含む。子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して、元の親細胞と必ずしも完全に同一（全ＤＮＡ相補体の形状またはゲノムにおいて）であるわけではない。宿主細胞は、本発明のベクターをｉｎ  ｖｉｖｏにおいてトランスフェクトされた細胞を含む。
【０１４０】
本明細書で開示される、多様なポリペプチドについて記載するのに使用される場合の「単離」とは、その天然環境の成分から識別され、分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。その天然環境の夾雑成分は、ポリペプチドの診断的または治療的使用に干渉することが典型的であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含みうる材料である。当業者に明らかである通り、非自然発生のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、その自然発生の対応物から区別する「単離」を要請しない。加えて、「濃縮」、「分離」または「希釈」された、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、単位体積当たりの分子の濃度または数が一般に、その自然発生の対応物の濃度または数を超えるという点で、その自然発生の対応物と区別される。一般に、組換え手段により作製され、宿主細胞内で発現させたポリペプチドは、「単離」されていると考えられる。
【０１４１】
「単離」核酸とは、ポリペプチドコード核酸の天然供給源中で、通例会合している、少なくとも１つの夾雑核酸分子から識別および分離される核酸分子である。例えば、単離ポリペプチドコード核酸分子は、それが天然で見出される形態または状況以外の形態または状況にある核酸分子である。したがって、単離ポリペプチドコード核酸分子は、天然細胞内に存在する特異的ポリペプチドコード核酸分子と区別される。しかし、単離ポリペプチドコード核酸分子は、細胞内に含有されるポリペプチドコード核酸分子であって、通例、ポリペプチドを発現させ、例えば、天然細胞の場所とは異なる、染色体内または染色体外の場所にある核酸分子を含む。
【０１４２】
「キメラ」タンパク質は、配列内の、自然発生の位置とは異なる位置における、少なくとも１つの領域を含む、少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。領域は通常、個別のタンパク質内に存在していてもよく、融合ポリペプチド内で一体とされ、または通常、同じタンパク質内に存在するが、融合ポリペプチド内では、新たな配置に置かれる。キメラタンパク質は、例えば、化学的合成により、またはペプチド領域が、所望の関係においてコードされるポリヌクレオチドを創出し、翻訳することにより創出することができる。
【０１４３】
本明細書では、「融合させた」および「融合」を互換的に使用し、２つまたはそれを超えるペプチドまたはポリペプチド配列を、組換え手段により、一体に接合することを指す。「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」とは、天然では、自然に連結されていない、第２のアミノ酸配列に連結された第１のアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が、連続し、リーディングフェーズまたはインフレームにあることを意味する。「インフレームの融合」とは、元のＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持する形で、連続的な長いＯＲＦを形成するように、２つまたはそれを超えるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を接合することを指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが、ポリペプチド配列の転写に影響を及ぼす場合、ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結されている。こうして、結果として得られる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに対応する、２つまたはそれを超えるセグメントを含有する、単一のタンパク質（このセグメントは、天然では通常、そのように接合されていない）である。
【０１４５】
本明細書では、「架橋すること」、「コンジュゲートする」、「連結する」、「連結すること」、および「〜に接合された」は、互換的に使用され、２つの異なる分子の、化学反応による、共有結合的接合を指す。下記でより完全に記載される通り、架橋は、１または複数の化学的反応において生じうる。
【０１４６】
本明細書で使用される「コンジュゲーションパートナー」という用語は、コンジュゲーション反応において連結されうるか、または連結される、個別の構成要素を指す。
【０１４７】
「コンジュゲート」という用語は、コンジュゲーションパートナーを、互いに、共有結合的に連結する結果として形成される、異質な分子、例えば、ＸＴＥＮ分子に共有結合的に連結された生物活性ペイロード、または反応性ＸＴＥＮに共有結合的に連結された架橋剤を指すことを意図する。
【０１４８】
「架橋剤」および「リンカー」および「架橋剤」とは、２つまたはそれを超える実体を共有結合的に接合するのに使用される化学的実体を意味するように、互換的に、かつ、それらの最も広範な文脈において使用される。例えば、本明細書で、実体について規定される通り、架橋剤は、２つ、３つ、４つ、もしくはそれを超えるＸＴＥＮを接合するか、またはペイロードを、ＸＴＥＮに接合する。架橋剤は、長さゼロの低分子の反応生成物、ホモまたはヘテロ二官能性および多官能性の架橋剤化合物、２つのクリック化学反応物の反応生成物を含むがこれらに限定されない。当業者は、架橋剤とは、反応物の架橋の後で残存する、共有結合させた反応生成物を指しうることを理解するであろう。架橋剤はまた、まだ反応していないが、別の実体と反応することが可能である、１または複数の反応物も含みうる。
【０１４９】
ポリペプチドの文脈では、「直鎖状配列」または「配列」とは、アミノ末端から、カルボキシル末端への方向における、ポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、この場合、配列内で互いと隣り合う残基は、ポリペプチドの一次構造において連続する。「部分配列」とは、一方向または両方向で、さらなる残基を含むことが公知である、ポリペプチドの部分の直鎖状配列である。
【０１５０】
「異種」とは、比較される実体の残余と、遺伝子型的に顕著に異なる実体に由来することを意味する。例えば、その天然のコード配列から除去され、天然の配列以外のコード配列に作動的に連結されたグリシンリッチ配列は、異種グリシンリッチ配列である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される、「異種」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較される実体の残余のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、遺伝子型的に顕著に異なる実体に由来することを意味する。
【０１５１】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、単一の核酸のほか、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体である、複数の核酸を包摂する、任意の長さのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することが可能であり、公知であるかまたは未知である、任意の機能を果たしうる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連結解析から規定される、複数の遺伝子座（単数の遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリーの前または後で付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素により中断することができる。ポリヌクレオチドは標識化構成要素とのコンジュゲーションなどにより、重合化の後でさらに修飾することができる。
【０１５２】
「ポリヌクレオチドの相補体」という用語は、それが、基準配列と、完全な忠実性でハイブリダイズできるように、基準配列と比較して、相補的な塩基配列および逆の配向性を有するポリヌクレオチド分子を表す。
【０１５３】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」とは、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、および／またはライゲーションステップ、ならびに宿主細胞内の組換えタンパク質の発現を結果としてもたらす他の手順を含みうる、組換えステップの多様な組合せの生成物であることを意味する。
【０１５４】
本明細書では、「遺伝子」および「遺伝子断片」という用語を互換的に使用する。これらの用語は、転写および翻訳された後で、特定のタンパク質をコードすることが可能である、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、ポリヌクレオチドが、コード領域の全体またはそのセグメントをカバーしうる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有する限りにおいて、ゲノムＤＮＡの場合もあり、ｃＤＮＡの場合もある。「融合遺伝子」とは、一体に連結された、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドからなる遺伝子である。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「コード領域」または「コード配列」とは、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなる、ポリヌクレオチドの部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないことが典型的であるが、コード領域の部分として考えうるのに対し、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写のターミネーター、イントロンなどは、コード領域の部分ではない。コード領域の境界は、５’末端における開始コドンであって、結果として生じるポリペプチドのアミノ末端をコードする開始コドンと、３’末端における翻訳終止コドンであって、結果として得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする終止コドンとにより決定されることが典型的である。本発明の、２つまたはそれを超えるコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物内、例えば、単一のベクター上、または個別のポリヌクレオチド構築物内、例えば、個別の（異なる）ベクター上に存在しうる。したがって、この場合、単一のベクターは、単一のコード領域だけを含有する場合もあり、２つまたはそれを超えるコード領域を含む場合もあり、例えば、単一のベクターは、下記で記載される、結合性ドメインＡおよび結合性ドメインＢを個別にコードしうる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明の結合性ドメインをコードする核酸に融合させているのであれ、融合させていないのであれ、異種コード領域をコードしうる。異種コード領域は、限定せずに述べると、分泌シグナルペプチドまたは機能的な異種ドメインなど、特化したエレメントまたはモチーフを含む。
【０１５６】
「下流」という用語は、基準ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写の起点に後続する配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の起始部位の下流に位置する。
【０１５７】
「上流」という用語は、基準ヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域または転写の起点の５’側に位置する配列に関する。例えば、大半のプロモーターは、転写の起始部位の上流に位置する。
【０１５８】
「相同性」または「相同」または「配列同一性」とは、２つもしくはそれを超えるポリヌクレオチド配列の間、または２つもしくはそれを超えるポリペプチド配列の間の、配列類似性または配列互換性を指す。２つの異なるアミノ酸配列の間の配列同一性、類似性、または相同性を決定するのに、ＢｅｓｔＦｉｔなどのプログラムを使用する場合、デフォルトの設定を使用することもでき、ｂｌｏｓｕｍ４５またはｂｌｏｓｕｍ８０など、適切なスコアリングマトリックスを選択して、同一性、類似性、または相同性のスコアを最適化することもできる。相同なポリヌクレオチドは、本明細書で規定される厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであることが好ましく、これらの配列と比較して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、なおより好ましくは９９％の配列同一性を有する。相同なポリペプチドは、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５〜９９％同一である、配列同一性を有することが好ましい。
【０１５９】
ポリ核酸に適用される「ライゲーション」とは、２つの核酸断片または遺伝子の間でホスホジエステル結合を形成し、それら一体に連結する工程を指す。ＤＮＡ断片または遺伝子を、一体にライゲーションするには、ＤＮＡの末端が、互いに適合しなければならない。場合によって、末端は、エンドヌクレアーゼ消化の後で、直接適合性となる。しかし、エンドヌクレアーゼ消化の後で一般にもたらされる粘着末端を、まず、平滑末端に転換して、それらをライゲーションに適合性とすることが必要でありうる。
【０１６０】
「厳密な条件」または「厳密なハイブリダイゼーション条件」という用語は、ポリヌクレオチドが、その標的配列に、他の配列を検出可能に超える程度に強く（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件に対する言及を含む。一般に、ハイブリダイゼーションの厳密性は、部分的に、洗浄ステップを実行する温度および塩濃度に言及しながら表される。厳密な条件とは、典型的に、塩濃度を、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）とし、温度を、短いポリヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）には、少なくとも約３０℃であり、長いポリヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドを超える）には、少なくとも約６０℃とする条件である（例えば、「厳密な条件」とは、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中、３７℃のハイブリダイゼーションと、０．１倍濃度のＳＳＣ／１％のＳＤＳ中、６０℃〜６５℃で、１５分間ずつの３回の洗浄とを含みうる）。代替的に、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度を使用することができる。ＳＳＣ濃度は、約０．１〜２倍濃度のＳＳＣで変動させることができ、ＳＤＳは、約０．１％で存在する。このような洗浄温度は、典型的に、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特異的配列の熱的溶融点より約５℃〜２０℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、標的配列の５０％が、完全にマッチさせたプローブとハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下）である。核酸ハイブリダイゼーションのためのＴｍおよび条件を計算するための式は周知であり、Sambrook,  J.ら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、２００１年において見出すことができる。ブロッキング試薬を使用して、非特異的ハイブリダイゼーションをブロッキングすることが典型的である。このようなブロッキング試薬は、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの、せん断処理され、変性させたサケ精子ＤＮＡを含む。また、約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶媒も、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのためなど、特定の状況下で使用することができる。これらの洗浄条件において有用な変異体は、当業者にたやすく明らかであろう。
【０１６１】
ポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント」、「配列同一性の百分率」、および「同一性％」という用語は、標準化されたアルゴリズムを使用してアラインされた、少なくとも２つのポリヌクレオチド配列の間の残基マッチの百分率を指す。このようなアルゴリズムは、２つの配列の間のアライメントを最適化し、したがって、２つの配列について、より有意味な比較を達成するために、比較される配列内に、標準化され、再現可能な方式でギャップを挿入することができる。パーセント同一性は、規定されたポリヌクレオチド配列の全長にわたり測定することもでき、より短い長さにわたり、例えば、より大型の、規定されたポリヌクレオチド配列から取り出された断片、例えば、少なくとも４５、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０、または少なくとも４５０連続残基の断片の長さにわたり測定することもできる。このような長さは、例示的なものであるにすぎず、本明細書の表、図、または配列表に示された配列により裏付けられる、任意の断片長を使用して同一性百分率を測定しうる長さについて記載しうることが理解される。配列同一性の百分率は、２つの最適にアラインされた配列を、比較ウィンドウにわたり比較し、マッチさせた位置（両方のポリペプチド配列内で、同一な残基が生じる位置）の数を決定し、マッチさせた位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率をもたらすことにより計算する。異なる長さの配列を比較する場合、最も短い配列が、比較ウィンドウの長さを規定する。配列同一性を計算する場合は、保存的置換を考慮に入れない。
【０１６２】
本明細書で同定されるポリペプチド配列に関する「パーセント同一性」とは、配列をアラインし、必要な場合は、ギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成するが、保存的置換は、配列同一性の部分として考慮せず、これにより、最適のアライメントを結果としてもたらした後における、クェリー配列内の、第２の基準ポリペプチド配列またはその部分のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基の百分率として規定される。アミノ酸配列の同一性パーセントを決定することを目的とするアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、公表されているコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術範囲内にある多様な方式で達成することができる。当業者は、アライメントを測定するのに適切なパラメータであって、比較される配列の全長にわたり、最適のアライメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。パーセント同一性は、規定されたポリペプチド配列の全長にわたり測定することもでき、より短い長さにわたり、例えば、より大型の、規定されたポリヌクレオチド配列から取り出された断片、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、または少なくとも１５０連続残基の断片の長さにわたり測定することもできる。このような長さは、例示的なものであるにすぎず、本明細書の表、図、または配列表に示された配列により裏付けられる、任意の断片長を使用して同一性百分率を測定しうる長さについて記載しうることが理解される。
【０１６３】
ポリヌクレオチド配列の文脈で使用される「反復性」とは、例えば、所与の長さの同一なヌクレオチド配列の頻度など、配列内部の相同性の程度を指す。例えば、反復性は、同一な配列の頻度を解析することにより測定することができる。
【０１６４】
一般に、マーカー（例えば、プロテアーゼまたはＴＭによりターゲティングされるリガンド）は、それが、非標的細胞または非標的組織と比較して、標的細胞内もしくは標的組織内、その上、またはそれに近接して、高頻度または高濃度で生じる場合、標的細胞または標的組織「と関連する」か、またはそれ「と共局在化する」と考えることができる。例えば、マーカーは、それが、標的組織周囲の体液中に、標的組織からより遠隔の体液中に見出されるより高濃度で生じる場合、標的組織と関連すると考えることができる。一部の実施形態では、標的細胞と関連するマーカーは、非標的細胞より高レベルで標的細胞により発現される。一部の実施形態では、標的組織と関連するマーカーは、非標的組織内の細胞より高レベルで、標的組織内の１または複数の細胞により発現される。しかし、マーカーがこのような細胞または組織と関連するために、標的細胞または標的組織により、マーカーを発現させる必要はない。例えば、炎症性マーカーは、特定の炎症組織と関連しうるが、組織に動員される免疫細胞により発現されうる。同様に、感染組織内で、高頻度で生じる微生物抗原は、微生物に由来するが、このような感染組織と関連すると考えられる。一部の実施形態では、マーカーは、マーカーが、疾患または状態を伴う個体において、疾患または状態を伴わない個体より高頻度または高レベルで生じるように、疾患または状態と関連する。
【０１６５】
本明細書で使用される「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが、遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生する工程を指す。発現は、限定せずに述べると、ポリヌクレオチドの、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または他の任意のＲＮＡ産物への転写と、ｍＲＮＡの、ポリペプチドへの翻訳とを含む。発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡの場合もあり、転写物から翻訳されたポリペプチドの場合もある。本明細書で記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシングを伴う核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解性切断を伴うポリペプチドをさらに含む。
【０１６６】
「ベクター」または「発現ベクター」は、互換的に使用され、好ましくは、適切な宿主内で自己複製する核酸分子であって、挿入された核酸分子を、宿主細胞に移入し、かつ／または宿主細胞間で転送する核酸分子を指す。用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの、細胞への挿入のために主に機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主に機能する、ベクターの複製、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、上記の機能のうちの１つを超える機能をもたらすベクターも含まれる。「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞に導入されると、ポリペプチドに転写および翻訳されうるポリヌクレオチドである。「発現系」とは通例、所望の発現産物をもたらすように機能しうる発現ベクターからなる、適切な宿主細胞を含意する。
【０１６７】
ポリペプチドに適用される「血清分解抵抗性」とは、典型的に、血清または血漿中のプロテアーゼを伴う、血液またはその成分中の分解に抗するポリペプチドの能力を指す。血清分解抵抗性は、タンパク質を、ヒト（または、適切な場合、マウス、ラット、サル）の血清または血漿と、典型的に、約３７℃で、典型的に、ある範囲の日数（例えば、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６日間）にわたり組み合わせることにより測定することができる。これらの時点についての試料を、ウェスタンブロットアッセイにかけることができ、タンパク質を、抗体により検出する。抗体は、タンパク質内のタグに対する抗体でありうる。タンパク質が、ウェスタンブロット上で、単一のバンドを示し、タンパク質のサイズが、注入されたタンパク質のサイズと同一であれば、分解は、生じなかった。この例示的な方法では、ウェスタンブロットまたは同等の技法により判定して、タンパク質の５０％が分解されている時点が、タンパク質の血清分解半減期または「血清半減期」である。
【０１６８】
本明細書では、「ｔ１／２」、「半減期」、「終末半減期」、「消失半減期」、および「循環半減期」という用語を互換的に使用し、本明細書で使用される通り、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして計算される終末半減期を意味する。Ｋｅｌとは、ｌｏｇ濃度対時間曲線の終点直線部分の線形回帰により計算される、終点消失速度定数である。半減期とは、投与された物質であって、生物内に滞留する物質の半分の数量が、正常な生物学的過程により代謝されるかまたは消失するのに要請される時間を指すことが典型的である。所与のポリペプチドのクリアランス曲線を、時間の関数として構築する場合、曲線は通例、急速なα相および長いβ相を伴う二相型である。ヒトにおける、ヒト抗体の、典型的なβ相半減期は、２１日間である。
【０１６９】
「能動的クリアランス」とは、タンパク質を循環から除去する、濾過以外の機構を意味し、細胞、受容体により媒介される、循環からの除去、代謝、またはタンパク質の分解を含む。
【０１７０】
「見かけの分子量係数」および「見かけの分子量」とは、特定のアミノ酸またはポリペプチド配列により呈示される、見かけの分子量の相対的な増大または減少の尺度に言及する、類縁の用語である。見かけの分子量は、サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または同様の方法を使用して、球状タンパク質の標準物質と比較することにより決定され、「見かけのｋＤ」単位で測定される。見かけの分子量係数とは、見かけの分子量と、実際の分子量との比であり、後者は、アミノ酸組成に基づき、組成物中の各種のアミノ酸の計算分子量を加えることにより、またはＳＤＳ電気泳動ゲル内の、分子量標準物質との比較による推定により予測される。代表的タンパク質についての、見かけの分子量および見かけの分子量係数の両方の決定については、実施例で記載する。
【０１７１】
「流体力学半径」または「ストークス半径」という用語は、それが、溶液中を移動し、溶液の粘度の抵抗を受ける実体であると仮定することにより測定される、溶液中の分子の有効半径（ｎｍ単位のＲｈ）である。本発明のこれらの実施形態では、ＸＴＥＮポリペプチドの流体力学半径の測定は、より直感的な尺度である「見かけの分子量係数」と相関する。タンパク質の「流体力学半径」は、水溶液中のその拡散速度のほか、高分子のゲル内を泳動するその能力にも影響を及ぼす。タンパク質の流体力学半径は、その分子量により決定されるほか、形状および稠密性を含むその構造によっても決定される。流体力学半径を決定するための方法は、米国特許第６，４０６，６３２号および同第７，２９４，５１３号において記載されている通り、サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用による方法など、当技術分野で周知である。大半のタンパク質は、タンパク質が、最も小さな流体力学半径と共に有しうる、最も稠密な三次元構造である、球状構造を有する。一部のタンパク質は、ランダムで開放型の、非構造化または「直鎖状」のコンフォメーションを採用し、結果として、同様の分子量の、典型的な球状タンパク質と比較して、はるかに大きな流体力学半径を有する。
【０１７２】
「生理学的条件」とは、生存宿主における条件のセットのほか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける条件であって、温度、塩濃度、ｐＨを含み、生存対象のこれらの条件を模倣する条件を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける使用のための、生理学的に関与性の条件の宿主が確立されている。一般に、生理学的緩衝液は、生理学的濃度の塩を含有し、約６．５〜約７．８であり、好ましくは約７．０〜約７．５の範囲の中性のｐＨに調整されている。Sambrookら（２００１年）では、様々な生理学的緩衝液が列挙されている。生理学的に関与性の温度は、約２５℃〜約３８℃、好ましくは約３５℃〜約３７℃の範囲である。
【０１７３】
「ペイロードの単一原子残基」とは、対象のＸＴＥＮまたはＸＴＥＮ−リンカー組成物との反応の後で、ＸＴＥＮに化学的に連結される、ペイロードの原子であり、典型的に、硫黄、酸素、窒素、または炭素原子を意味する。例えば、ペイロードの原子残基は、ペイロード内のシステインチオール反応性基の硫黄残基の場合もあり、ペプチドまたはポリペプチドまたは低分子ペイロードのアミノ反応性基の窒素分子の場合もあり、ペプチド、タンパク質、または低分子もしくは合成の有機薬物の、炭素もしくは酸素残基または反応性のカルボキシルもしくはアルデヒド基の場合もあろう。
【０１７４】
「反応性基」とは、第２の反応性基にカップリングさせうる化学的構造である。反応性基の例は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基である。一部の反応性基は、第２の反応性基との、直接のコンジュゲーションまたは架橋剤を介するコンジュゲーションを容易とするように活性化させることができる。本明細書で使用される場合、反応性基は、それが、化学的反応に参与する能力を有する限りにおいて、ＸＴＥＮ、架橋剤、アジド／アルキンクリック化学反応の反応物、またはペイロードの部分でありうる。反応させると、コンジュゲーション結合は、ペイロードまたは架橋剤またはＸＴＥＮ反応物の残基を連結する。
【０１７５】
「制御放出剤」、「徐放剤」、「デポ製剤」、および「持続放出剤」は、本発明のポリペプチドの放出の持続時間を、ポリペプチドを、薬剤の非存在下で投与する場合の、放出の持続時間と比べて延長することが可能な薬剤を指すように、互換的に使用される。本発明の異なる実施形態は、異なる放出速度を有する結果として、異なる治療量をもたらしうる。
【０１７６】
本明細書で使用される「ペイロード」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、または対象に投与される場合に裏付けられうる、生物学的、薬理学的、または治療活性もしくは有益な効果を有する、任意のタンパク質、ペプチド配列、低分子、薬物、または組成物を指す。ペイロードはまた、イメージングまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける診断目的で使用されうる分子も含む。ペイロードの例は、サイトカイン、酵素、ホルモン、血液凝固因子、および増殖因子、化学療法剤、抗ウイルス化合物、毒素、抗がん薬、細胞傷害薬、放射性化合物、および造影剤を含むがこれらに限定されないが、本発明の一部の態様の文脈では、とりわけ、本発明の組成物を、標的組織に局在化させる目的で、もっぱら、受容体またはリガンドに結合するように使用される、ターゲティング部分、抗体、抗体断片、または有機低分子化合物を除外する。
【０１７７】
本明細書で使用される「ターゲティング部分」（「ＴＭ」と略記される）という用語はとりわけ、細胞表面受容体または抗原または糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、あるいは標的組織もしくは細胞内またはその表面上に存在しうる結合性部位などの標的リガンドに対する特異的結合アフィニティーを有する、抗体、抗体断片、表１に列挙される類別の結合性分子、またはペプチド、ホルモン、もしくは有機分子を含むことを意図する。一部の実施形態では、ＴＭは、非タンパク質性である。ホレートなど、非タンパク質ＴＭの非限定的な例を、本明細書に提示する。
【０１７８】
本明細書では、「抗原」、「標的抗原」、および「免疫原」という用語は、抗体、抗体断片、または抗体断片ベースの分子が結合するか、またはそれに対する特異性を有する、構造または結合決定基を指すように、互換的に使用される。
【０１７９】
本明細書で使用される「アンタゴニスト」という用語は、本明細書で開示される天然のポリペプチドの生物活性を、部分的または完全に遮断するか、阻害するか、または中和する、任意の分子を含む。ポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、天然のポリペプチドを、候補アンタゴニスト分子と接触させるステップと、通常、天然のポリペプチドと関連する、１または複数の生物活性の検出可能な変化を測定するステップとを含みうる。本発明の文脈では、アンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、または生物活性タンパク質の作用を減殺する、他の任意の分子を含みうる。
【０１８０】
「標的」とは、細胞表面受容体、抗原、糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、あるいは標的組織もしくは細胞内またはその表面上に存在しうる結合性部位など、ターゲティング部分のリガンドを指す。
【０１８１】
「標的組織」とは、がんまたは炎症性状態などであるがこれらに限定されない、疾患状態の原因または部分である組織を指す。罹患標的組織の供給源は、体内の臓器、腫瘍、がん性細胞、骨、皮膚、疾患状態に寄与するサイトカインまたは因子を産生する細胞を含む。
【０１８２】
「既知組成培地」とは、培養物中の細胞の生存および／または増殖に必要な、栄養上およびホルモン上の要求物を、培地の成分が既知であるように含む培地を指す。従来、既知組成培地は、増殖および／または生存に必要な、栄養および増殖因子を添加することにより調合されている。既知組成培地は、典型的に、以下の類別：ａ）全ての必須アミノ酸であり、通例、２０種のアミノ酸の基本セットにシステインを加えたアミノ酸；ｂ）通例、グルコースなど、炭水化物の形態である、エネルギー供給源；ｃ）ビタミンおよび／または低濃度で要求される他の有機化合物；ｄ）遊離脂肪酸；ならびにｅ）有機化合物と規定される微量元素、または通例、マイクロモル範囲の、極めて低濃度で要求されることが典型的な、自然発生の元素のうちの１または複数に由来する少なくとも１つの成分をもたらす。既知組成培地にはまた、任意選択で、以下の類別：ａ）１または複数のマイトジェン剤；ｂ）例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸などの、塩および緩衝液；ｃ）例えば、アデノシンおよびチミジン、ヒポキサンチンなどの、ヌクレオシドおよび塩基；ならびにｄ）タンパク質および組織の加水分解物のうちのいずれかに由来する１または複数の成分を補充することもできる。
【０１８３】
「アゴニスト」という用語は、最も広義で使用され、本明細書で開示される天然のポリペプチドの生物活性を模倣する、任意の分子を含む。適切なアゴニスト分子は、とりわけ、アゴニスト抗体または抗体断片、天然のポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機低分子などを含む。天然のポリペプチドのアゴニストを同定するための方法は、天然のポリペプチドを、候補アゴニスト分子と接触させるステップと、通常、天然のポリペプチドと関連する、１または複数の生物活性の検出可能な変化を測定するステップとを含みうる。
【０１８４】
「阻害定数」または「Ｋｉ」は、互換的に使用され、酵素−阻害剤複合体の解離定数、または阻害剤の、酵素に対する結合アフィニティーの逆数を意味する。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置すること」または「和らげること」または「緩和すること」は、互換的に使用され、薬物または生物薬剤を投与して、治療的利益を達成するか、既存の状態を治癒させるか、もしくはその重症度を軽減するか、または予防的利益を達成し、状態の発症の可能性もしくは重症度もしくは発生を防止するかもしくは低減することを意味する。治療的利益とは、対象が、依然として基礎状態に罹患している可能性があるにも拘らず、対象において改善が観察されるように、処置される基礎状態、または基礎状態と関連する生理学的症状のうちの１もしくは複数の根絶または緩和を意味する。
【０１８６】
本明細書で使用される「治療効果」または「治療的利益」とは、本発明のポリペプチドの投与から生じる、ヒトもしくは他の動物における疾患の軽減、緩和、もしくは防止を含むがこれらに限定されない生理学的効果、またはヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的福利を他の形で増強する生理学的効果であって、生物活性タンパク質が所有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の生理学的効果を指す。予防的利益のために、組成物を、特定の疾患、状態、または疾患の症状を発症する危険性がある対象（例えば、Ａ型血友病と診断された対象における出血）に投与する場合もあり、この疾患の診断がなされていなかった場合であってもなお、疾患の生理学的症状のうちの１または複数を報告する対象に投与する場合もある。
【０１８７】
本明細書で使用される「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、薬物または生物活性タンパク質の量であって、単独で、またはポリペプチド組成物の一部として、１回の投与または反復投与で対象に投与される場合に、疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔａｔｅ）または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の、任意の症状、側面、測定されるパラメータ、または特徴に対して、任意の検出可能で有益な効果を及ぼすことが可能である量を指す。このような効果は、有益であることを絶対に必要とするわけではない。治療有効量の決定は、とりわけ、本明細書で提示される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１８８】
本明細書で使用される「治療有効用量レジメン」という用語、は、単独で、またはポリペプチド組成物の一部として、生物活性タンパク質の連続的に投与される複数回の投与（すなわち、少なくとも２回またはそれを超える）のためのスケジュールであって、投与を、治療有効量で施す結果として、疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔａｔｅ）または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の、任意の症状、側面、測定されるパラメータ、または特徴に対して、持続的で有益な効果をもたらすスケジュールを指す。
【０１８９】
Ｉ）一般的技法
本発明の実施は、そうでないことが指し示されない限り、当技術分野の技術範囲内にある、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、遺伝学、および組換えＤＮＡの従来の技法を援用する。それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Sambrook,  J.ら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、２００１年；「Current  protocols  in  molecular  biology」、F.  M.  Ausubelら編、１９８７年；「Methods  in  Enzymology」シリーズ、Academic  Press、San  Diego、CA.；「PCR2:  a  practical  approach」、M.J.  MacPherson、B.D.  Hames、およびG.R.  Taylor編、Oxford  University  Press、１９９５年；「Antibodies,  laboratory  manual」、Harlow,  E.およびLane,  D.編、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、１９８８年；「Goodman  &  Gilman's  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics」、１１版、McGraw-Hill、２００５年；ならびにFreshney,  R.I.、「Culture  of  Animal  Cells:  A  Manual  of  Basic  Technique」、４版、John  Wiley  &  Sons、Somerset、NJ、２０００年を参照されたい。
【０１９０】
宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）など、市販の培地は、真核細胞を培養するのに適する。加えて、哺乳動物の宿主細胞は、血清を欠くが、特定の細胞型の生存および／または増殖に必要な、ホルモン、増殖因子、または他の任意の因子を補充した既知組成培地中で増殖させることができる。細胞の生存を支援する既知組成培地は、生存率、形状、代謝能を維持し、潜在的に、細胞の分化能を維持する一方で、細胞の増殖を促進する既知組成培地は、細胞の増殖または複製に必要な全ての化学物質をもたらす。当技術分野では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける宿主細胞の生存および増殖を統御する、一般的なパラメータが十分に確立されている。異なる細胞培養物系において制御されうる物理化学的パラメータは、例えば、ｐＨ、ｐＯ２、温度、および浸透圧である。細胞の栄養要求物は通例、最適の環境をもたらすように開発された、標準的な培地処方中で提供されている。栄養物は、いくつかの類別：アミノ酸およびそれらの誘導体、炭水化物、糖、脂肪酸、複合脂質、核酸誘導体、ならびにビタミンに分けることができる。細胞の代謝を維持するための栄養物以外に、大半の細胞はまた、以下の群：ステロイド、プロスタグランジン、増殖因子、脳下垂体ホルモン、および血清非含有培地中で増殖するペプチドホルモンのうちの少なくとも１つに由来する、１または複数のホルモンも要求する（Sato,  G.  H.ら、「Growth  of  Cells  in  Hormonally  Defined  Media」、Cold  Spring  Harbor  Press、N.Y.、１９８２年）。ホルモンに加えて、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生存および増殖のためのトランスフェリン（血漿中鉄輸送タンパク質）、セルロプラスミン（銅輸送タンパク質）、および高密度リポタンパク質（脂質担体）など、輸送タンパク質を要求しうる。最適のホルモンまたは輸送タンパク質のセットは、各細胞型に応じて変動するであろう。これらのホルモンまたは輸送タンパク質の大半は、外因的に添加されているか、または、稀な場合には、特定の因子を要求しない突然変異体細胞系が見出されている。当業者は、過度の実験を伴わずに、細胞培養物を維持するために要求される他の因子を知るであろう。
【０１９１】
原核宿主細胞を増殖させるための増殖培地は、栄養培養液（液体栄養培地）またはＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）を含む。適切な培地は、既知組成培地および非既知組成培地を含む。一般に、培地は、細菌の増殖に必要とされるグルコースなどの炭素供給源、水、および塩を含有する。培地はまた、アミノ酸および窒素の供給源、例えば、牛肉または酵母の抽出物（非既知組成培地中）または公知の数量のアミノ酸（既知組成培地中）も含みうる。一部の実施形態では、増殖培地は、ＬＢ培養液、例えば、ＬＢ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｂｒｏｔｈまたはＬＢ  Ｌｅｎｎｏｘ  ｂｒｏｔｈである。ＬＢ培養液は、ペプトン（酵素による、カゼインの消化生成物）、酵母抽出物、および塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、抗生剤を含む選択培地を使用する。この培地中では、抗生剤に対する耐性を所有する、所望の細胞だけが増殖する。
【０１９２】
ＩＩ）ＸＴＥＮおよびターゲティング細胞傷害性コンジュゲート組成物
本発明は部分的に、標的細胞に、薬物構成要素を取り込ませ、これにより、薬理学的効果を及ぼすように、腫瘍もしくはがん細胞または炎症性組織など、標的組織に選択的に結合することが可能な薬物ペイロードを含む、ターゲティングコンジュゲート組成物であって、薬物動態および薬学的特性の遮蔽および増強を付与する、１または複数のＸＴＥＮを含む組成物に関する。本発明は、対象組成物に、ある特定の特性を付与するために、組成物のいくつかの異なる構成を想定する。第１の種類の構成では、コンジュゲート組成物は、システイン残基を散在させた親水性アミノ酸を含む第１の短いポリペプチド部分（本明細書の以下では、システイン含有ドメインまたはＣＣＤと称する）を、前記第１の部分より長い、ＸＴＥＮポリペプチドを含む第２の部分、および標的組織と関連するリガンドに特異的に結合することが可能であるターゲティング部分（ＴＭ）を含む第３の部分、およびＣＣＤのシステイン残基にコンジュゲートさせた、薬理学的に活性な薬物または生物薬剤（標的細胞リガンドを保有する細胞を死滅させることが可能な細胞傷害薬、または抗炎症薬を含む）に融合させた融合タンパク質を含み、ターゲティング部分は、標的細胞に結合し、内部化され、分解され、その薬理学的効果を及ぼすように、薬物または生物薬剤を放出する。第２の種類の構成では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、前出の構成要素に加えて、組換えにより、ＣＣＤとＸＴＥＮとの間に挿入される、プロテアーゼ切断部分（ＰＣＭ）であって、標的組織と会合するか、またはそれに近接する哺乳動物プロテアーゼにより切断することが可能なＰＣＭも有する。このような場合、組成物が、標的組織または細胞に近接するか、またはそれに結合すると、ＸＴＥＮが、プロテアーゼの作用により、組成物から放出され、ＴＭおよびＣＣＤを有する放出ターゲティング組成物であって、薬物を接続した放出ターゲティング組成物が、溢出し、標的組織に浸透し、ターゲティング部分のリガンドを保有する細胞により取り込まれることがより良好に可能となるように、構築物の残りの部分（本明細書の下記では、残りの部分を、「放出ターゲティング組成物」と称するが、これは、ＣＣＤに融合させるかまたは連結した、１または複数のターゲティング部分と、ＣＣＤに連結された薬物または生物薬剤とを含む）のサイズと、ＸＴＥＮにより付与された遮蔽効果とを、大幅に低減し、このとき、分子の内部のプロセシングにより、放出された薬物は、それらの薬理学的効果を及ぼす（例えば、前出の工程の概略的表示については、図１８、３８、および４０を参照されたい）。こうして、第２の種類を、組成物が、遮蔽ＸＴＥＮを放出し、放出ターゲティング組成物が、インタクトな組成物より活性が大きくなり、より選択的であり、より良好に溢出することが可能であり、より良好に標的組織に浸透することが可能であり、遮蔽効果および／または立体障害の喪失に起因して、高結合アフィニティーを有するという意味で、プロドラッグの形態として活用されるように設計する。ＸＴＥＮの遮蔽およびバルキング効果のために、インタクトな組成物は、正常組織（標的組織と比較して、ＴＭのリガンドである受容体を有する頻度が低い）と相互反応するか、またはそれに結合する可能性が低く、健常臓器および組織内の正常血管系から溢出する可能性が低い結果として、従来の化学療法薬または生物薬剤と比較して、毒性が小さく、副作用が小さいことは、これらの組成物の利点である。インタクトな組成物が、標的組織と会合して共局在化することが見出されるプロテアーゼにより切断されると、放出ターゲティング組成物は、もはや遮蔽されず、その完全な結合アフィニティーの潜在力を再獲得し、そのはるかに小さなサイズのために、より容易に溢出し、標的組織に浸透しうる。このような組成物は、がんおよびある特定の炎症性疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の疾患の処置において有用である。本発明は、さらなる構成を想定し、前出の変化形であって、２つもしくはこれを超えるターゲティング部分（同一な場合もあり、異なるリガンドをターゲティングする場合もある）、組成物の遮蔽効果をさらに増大させ、かつ／または組成物の分子質量を増大させる、２またはそれを超えるＸＴＥＮ、異なるＣＣＤに連結された、２つもしくはこれを超える種類の薬物分子、または２つもしくはこれを超えるＰＣＭを伴う構築物を含む変化形を含む。一部の実施形態では、ＣＣＤ、ＸＴＥＮ、およびＰＣＭ（存在する場合）は、融合タンパク質として作製するのに対し、ＴＭは、組換えにより、または化学的コンジュゲーションにより、構築物に接合することができる。他の実施形態では、ＴＭ、ＣＣＤ、およびＰＣＭ（存在する場合）は、融合タンパク質として作製するのに対し、１または複数のＸＴＥＮは、組換えにより、または化学的コンジュゲーションにより、構築物に接合することができる。いずれの場合にも、薬物または生物薬剤ペイロードは、下記でより完全に記載される通り、ＣＣＤに化学的にコンジュゲートさせる。
【０１９３】
１．細胞傷害性ペイロード、ターゲティング部分、およびペプチド切断部分に連結されたコンジュゲート
一態様では、本発明は、薬理学的に活性の低分子または生物薬剤（例えば、生物活性タンパク質）にコンジュゲートさせたシステイン含有ドメイン（ＣＣＤ）、１または複数のＸＴＥＮ、１または複数のターゲティング部分（ＴＭ）、および１または複数のペプチド切断配列（ＰＣＭ）を含み、組換えにより一体に連結するか、または一部の構成要素を、組成物にコンジュゲートさせたターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。本発明は、本開示の、多様な概略的図面に例示される構成を含むがこれらに限定されない、対象組成物における使用のための多様な構成を想定する。構成は、接続される、大型のＸＴＥＮ構成要素による、ＴＭおよび／または細胞傷害性ペイロード薬物の遮蔽（その非限定的な例を、図３４、３５、３７、および３９に示す）、薬物動態の増強を付与し、正常組織への溢出を低減する、分子量および流体力学半径の増大、ならびに、接合されたＴＭおよびＣＣＤ−ペイロードコンジュゲート（「放出ターゲティング組成物」）を含む放出構成要素が、溢出し、標的組織に浸透する能力が増強され（その非限定的な例を、図５２〜５７に示す）、ターゲティング部分が、その完全な結合アフィニティー潜在力を再獲得し（放出されたＸＴＥＮの遮蔽効果が失われた後で）、これにより、接続されたペイロード薬物を、標的細胞に選択的に送達して、その薬理学的効果を及ぼすように、大型のＸＴＥＮを放出する、ＰＣＭの切断後に後続する、分子サイズおよび流体力学半径の低減を含む、ある特定の特性を、結果として得られる組成物に付与するように設計する。別の態様では、構成の設計はまた、効力、安全性、および有効性を増大させるために、ＴＭとペイロード薬物との多様な順列のコンビナトリアル組成物を作製する、費用効果的方法であって、その非限定的な例を、図１５〜１７に示す方法を提供する能力ももたらす。
【０１９４】
別の態様では、ＣＣＤと、連結された薬物ペイロードと、ＸＴＥＮと、標的組織に対する結合アフィニティーを伴うＴＭとを有するが、ＰＣＭを欠くターゲティングコンジュゲート組成物を提供することは、本発明の目的である。組織への浸透が制限的因子ではない適用（例えば、血液がんまたは漏出性血管系を伴う罹患組織における）、または適切なプロテアーゼが産生されない障害では、ＰＣＭを伴わないターゲティングコンジュゲート組成物であっても、標的組織のリガンドに結合する能力を有し、これにより、薬物ペイロードを送達する結果として、所望の薬理学的効果をもたらしながら、やはり、接続されたＸＴＥＮにより付与される、薬物動態特性増強の利益を有することが想定される。
【０１９５】
さらに別の態様では、上記で記載された構成要素の全てを有するが、第２の異なる薬物ペイロードを含むように構成される結果として、複数の薬理学的効果を及ぼしうる、二官能性組成物をもたらし、これにより、全般的な治療効果を増大させる、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供することは、本発明の目的である。一般に、このような組成物は、下記でより完全に記載される通り、２つまたは３つのＣＣＤと、融合させたＰＣＭと、分枝状または多量体の構成で配置されたＸＴＥＮとを含むであろう。
【０１９６】
別の態様では、組成物の意図された標的ではない、組織または細胞との非特異的相互作用を低減するか、または消失させ、これにより、所望されない毒性または副作用を低減するために、ペイロードおよび／またはＴＭを、複数のＸＴＥＮ構成要素により遮蔽するように、複数コピーのＴＭ、ＣＣＤ、および連結されたペイロード、ならびにＸＴＥＮの構成で設計されたターゲティングコンジュゲート組成物を提供することは、本発明の目的である。当業者は、本発明の一部の組成物が、ＴＭおよび／またはペイロードを、バルキーなＸＴＥＮ分子の間の接続点と近位に配置することによる立体障害であって、長い可撓性ＸＴＥＮポリペプチドの、可撓性の非構造化特徴が、組成物に係留されることにより、ＴＭおよびペイロード構成要素の近傍で振動し、動くことから、組成物と、組織または細胞との間で、ある程度の保護をもたらすことが可能であるという意味における立体障害のほか、個々のＴＭおよびペイロード構成要素のサイズと比較した、大きな分子質量（ＸＴＥＮの実際の分子量および非構造化ＸＴＥＮの大きな流体力学半径の公知の特性の両方が寄与する）に起因して、インタクトな組成物が、細胞または組織に浸透する能力の低減を含む機構の組合せにより、非特異的相互作用のこの低減を達成することを察知するであろう。しかし、これらの組成物は、ＰＣＭを切断することが可能なプロテアーゼを保有または分泌する標的組織または細胞に近接すると、ＴＭおよび連結されたペイロードが、プロテアーゼの作用により、ＸＴＥＮのバルクから放離され、立体障害の障壁を除去し、標的細胞に自由に結合し、それにより内部化され、接続されたペイロード薬物または生物薬剤の薬理学的効果を及ぼすように設計される。対象組成物は、治療用または毒性ペイロードの、細胞、組織、または臓器への選択的送達が所望される、様々な状態の処置において使用される。一実施形態では、標的組織は、白血病、リンパ腫、または腫瘍でありうる、がんである。別の実施形態では、標的組織は、臓器内に局在化される場合もあり、対象において全身化される場合もある、炎症領域である。抗炎症薬または生物薬剤を含む組成物を、尋常性座瘡、喘息、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏性反応、炎症性腸疾患、クローン病、骨盤腹膜炎、再灌流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植片拒絶、血管炎、乾癬、線維筋痛症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、変形性関節症、強皮症、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される疾患の処置において使用しうることが想定される。
【０１９７】
本発明は、対象組成物における使用のための、多様なターゲティング部分であって、抗体、ｓｃＦＶなどであるがこれらに限定されない抗体断片、および表１に明示された抗体模倣体を含むがこれらに限定されない抗体模倣体のほか、疾患または代謝もしくは生理学的異常と関連するリガンドまたは受容体であって、本明細書で記載される、ホレート、アスパラギニルグリシルアルギニン類似体（ＮＧＲ）、アルギニルグリシルアスパラギン酸類似体（ＲＧＤ）、およびＬＨＲＨ類似体などであるがこれらに限定されないリガンドまたは受容体に結合することが可能なペプチドおよび合成分子を含むターゲティング部分を想定する。ＰＣＭを含む、本発明の組成物の一部は、組成物の最も広範な治療ウィンドウ（最小有効用量と、最大耐量との最大の差違により規定される）をもたらすために、標的組織のプロテアーゼの位置、ならびにターゲティングすることを意図しない、健常組織内の、同じプロテアーゼの存在、ならびに健常組織内にも標的リガンドは存在するが、非健常標的組織内のリガンドの存在が高度であることを検討することにより設計する。最も広範な治療ウィンドウを達成するために、本発明の一部の実施形態は、組成物のＴＭを、組成物内の内部の位置（末端の位置ではなく）であって、ＴＭが、それを取り囲むＸＴＥＮにより、部分的に遮蔽されうる位置に置く組成物を提供することが、とりわけ想定される（例えば、リガンドが、健常組織および非健常標的組織のいずれにおいても見出されるが、後者において高濃度で見出される場合）。同様に、最も広範な治療ウィンドウを達成するために、本発明の一部の実施形態は、ペイロードの、健常組織に対する影響を軽減するために、組成物が、標的組織のプロテアーゼと接触するか、または標的細胞により内部化されるまで、ペイロード薬物が、組成物から放出されないように、細胞傷害性ペイロードを、ＸＴＥＮにより遮蔽するか、またはＰＣＭにより、ＣＣＤに連結した組成物を提供することが、とりわけ想定される。
【０１９８】
逆に、健常組織内の標的リガンドの存在が低度である場合、本発明は、ターゲティングコンジュゲート組成物が、非健常標的組織に効率的に到達し、その中に特異的に蓄積されうるように、ＴＭを、組成物内に高数で、またはＸＴＥＮにより遮蔽される可能性が低い位置（組成物のＮまたはＣ末端など）に組み込む構成実施形態を提供する。
【０１９９】
好ましい実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、ＰＣＭが、１または複数の組織関連プロテアーゼにより切断され、組成物のＸＴＥＮから切断されて離脱した後でも、ＴＭとペイロードが、互いとつながったままである結果として得られる効果により、ＴＭおよび接合されたＣＣＤ−ペイロード断片（「放出ターゲティング組成物」）の小さな質量が、標的組織に浸透し、ＴＭの細胞リガンドに結合し、次いで、ペイロードの薬理学的効果を及ぼすために、罹患細胞内に内部化される（図１８Ｂ、３８、および４０を参照されたい）ことがより効果的に可能となるように設計する。一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、２つまたはそれを超える異なる細胞外プロテアーゼであって、各々が、組成物を、接合されたＣＣＤ−ペイロード部分に連結されたＴＭを含む断片であり、リガンドに結合し、標的組織内に内部化され、そこで、ペイロードが、その薬理学的効果を及ぼす断片に切断することが可能な、細胞外プロテアーゼの基質であるＰＣＭにより設計する。他の一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、各ＰＣＭが、組成物を、ＴＭを含有する断片、またはペイロードを含む断片、またはペイロードに連結されたＴＭを含む断片であって、リガンドに結合し、標的組織内に内部化され、そこで、ペイロードが、その薬理学的効果を及ぼす断片に切断することが可能な、異なる細胞外プロテアーゼの基質である、第１および第２のＰＣＭにより設計する。前出の実施形態は、ある特定の罹患標的組織が、１つを超えるプロテアーゼを発現させることが可能であり、異なるプロテアーゼの影響を受けやすい、異なるＰＣＭの、組成物への選択的導入により、結果として得られる組成物が、健常組織と比べて、罹患組織に近接すると、切断される可能性が高いという事実を利用する。このような実施形態では、健常組織に対する影響を、ＴＭおよび／もしくはペイロードが、隣接するＸＴＥＮにより遮蔽される組成物の設計により、または標的組織および標的組織の関連するプロテアーゼに到達するまで、ＴＭおよび／もしくはペイロード構成要素が、構築物内のそれらの位置による立体障害を受けるように設計することにより低下させることが察知されるであろう。
【０２００】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＴＭと、システイン含有ドメイン（ＣＣＤ）と、標的組織と関連する１または複数のプロテアーゼの基質である、ペプチド切断部分（ＰＣＭ）とを含む、短い第１の部分を有し、ＰＣＭが、組換えにより、ＸＴＥＮ配列を含む長い第２の部分に連結され、構築物を、２つの領域：ＣＣＤおよび連結された薬物ペイロードを、ターゲティング部分の１または複数の分子に接合した（例えば、組換えにより、またはコンジュゲーションにより）第１の領域と、ＸＴＥＮを含む第２の領域とに分離する、単一の融合タンパク質を含む、切断型ターゲティングコンジュゲート組成物を提示する。結果として得られる組成物の非限定的な例を、図４６〜５１に概略的に描示する。構築物は、Ｎ末端からＣ末端への多様な構成であって、（ＴＭ）−（ＣＣＤ）−（ＰＣＭ）−（ＸＴＥＮ）；（ＸＴＥＮ）−（ＰＣＭ）−（ＣＣＤ）−（ＴＭ）；（ＸＴＥＮ）−（ＰＣＭ）−（ＴＭ）−（ＣＣＤ）；および（ＣＣＤ）−（ＴＭ）−（ＰＣＭ）−（ＸＴＥＮ）を含む構成となるように、設計することができる。前出についての一実施形態では、ＣＣＤ配列は、表６に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一であり、ＰＣＭは、表８に明示された配列から選択される配列であり、ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である。対象組成物についての一部の実施形態では、ＴＭの１または複数の分子は、抗体断片である。一実施形態では、ＴＭの１または複数の分子は、表１９に明示された抗体に由来するか、または表１９のＶＬおよびＶＨ配列に由来するｓｃＦＶである。ターゲティングコンジュゲート組成物についての別の実施形態では、ＴＭの１または複数の分子は、非タンパク質性であるか、または低分子受容体リガンドである。一部の実施形態では、１または複数の非タンパク質ＴＭは、ホレートである。ターゲティングコンジュゲート組成物についての別の実施形態では、ＴＭの１または複数の分子は、ＬＨＲＨ（表２２の類似体を含む）である。ターゲティングコンジュゲート組成物についての別の実施形態では、ＴＭの１または複数の分子は、ＲＧＤもしくはＲＧＤ類似体またはＮＧＤもしくはＮＧＤ類似体である。ターゲティングコンジュゲート組成物についての別の実施形態では、薬物ペイロードは、表１４〜１７のペイロードの群より選択される。ターゲティングコンジュゲート組成物についての別の実施形態では、組成物は、各々が、表１４〜１７のペイロードの群より選択される、２つの異なるペイロードを含む。別の実施形態では、ペイロードは、表１６のペイロードの群より選択されるタンパク質などの生物活性タンパク質である。他の実施形態では、ターゲティング組成物のペイロードは、細胞傷害薬であり、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａからなる群より選択される。前出についての一実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、ＭＭＡＦである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、メイタンシンである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、パクリタキセルである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素である。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、ＭＭＡＥである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、メルタンシン（ＤＭ１）である。他の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａからなる群より選択される２つの異なる細胞傷害薬を含む。
【０２０１】
ターゲティングコンジュゲート組成物についての一実施形態では、組成物のペプチド切断部分（ＰＣＭ）を、表８に明示された配列の群より選択する。所与の組成物のＰＣＭは、組織と関連する１または複数のプロテアーゼの基質である配列を有し、この場合、前記組織上の抗原、マーカー、または受容体はまた、この組成物のＴＭのリガンドでもあることが、とりわけ想定される。このような実施形態では、ＴＭのリガンドへの結合は、ターゲティングコンジュゲート組成物を、組織関連プロテアーゼと近接させ、このとき、組成物は、切断され、これにより、前記組織と近位において、または前記組織内で、細胞傷害性ペイロードを放出する結果として、薬物構成要素の薬理学的効果をもたらす。薬物が細胞傷害薬である一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、前記組織リガンドを含む細胞系を伴う、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、細胞系が前記組織リガンドを含まない場合の組成物の毒性と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍の毒性を呈示する。別の実施形態では、組成物は、組織リガンドを含む細胞系を伴い、標的組織関連プロテアーゼが存在する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、アッセイがプロテアーゼを有さない場合の組成物の毒性と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍の毒性を呈示する。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、ＰＣＭが切断される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、ＰＣＭが切断されない場合の組成物の毒性と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍の毒性を呈示する。別の実施形態では、細胞傷害性化合物を含む、放出ターゲティング組成物（ＴＭおよびＣＣＤを含む）であって、組成物から切断され、放出された、放出ターゲティング組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、切断されていないインタクトな組成物と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍である濃度で、標的細胞に内部化される。別の実施形態では、インタクトなターゲティングコンジュゲート組成物は、対象に投与されると、組成物に連結されておらず、同等の方式で対象に投与される細胞傷害薬と比較して、１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍長い終末半減期を呈示する。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、対象に投与されると、少なくとも約３日間、または少なくとも約���日間、または少なくとも約１０日間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約３０日間の終末半減期を呈示する。
【０２０２】
別の態様では、本発明は、システイン残基を有するＸＴＥＮ骨格にコンジュゲートさせた、複数のターゲティングコンジュゲート組成物（例えば、表１１の配列）を提供する。結果として得られる組成物の多様な構成の非限定的な例を、図３７〜４０、４９、および５０に概略的に描示する。一実施形態では、組成物は、「骨格」として用いられる、システイン残基を含む第１のＸＴＥＮを含み、１または複数の融合タンパク質を、順に、ターゲティング部分に融合またはコンジュゲートさせたＰＣＭと、薬物ペイロードを保有するＣＣＤとを含む、骨格ＸＴＥＮのシステインに連結している（図３７を参照されたい）。前出の実施形態の別の構成では、融合タンパク質は、骨格ＸＴＥＮに接続された融合タンパク質の各々のＣＣＤのＣ末端に接続された、別のＰＣＭおよびＸＴＥＮをさらに含む。別の実施形態では、組成物は、システイン残基を含む第１のＸＴＥＮを含み、ターゲティング部分を、「骨格」として用いられるＸＴＥＮのＮまたはＣ末端に、組換えにより融合させるか、またはコンジュゲーションにより連結しており、１または複数の融合タンパク質を、順に、ターゲティング部分に融合またはコンジュゲートさせたＰＣＭと、薬物ペイロードを保有するＣＣＤとを含む、骨格ＸＴＥＮのシステインに連結している（図３９を参照されたい）。前出の実施形態の別の構成では、融合タンパク質は、骨格ＸＴＥＮに接続された融合タンパク質の各々のＣＣＤのＣ末端に接続された、別のＰＣＭおよびＸＴＥＮをさらに含む。前出の組成物では、第１のＸＴＥＮは、表１１のＸＴＥＮ配列から選択される配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％を呈示するか、またはそれと同一である。前出のターゲティングコンジュゲート組成物についての別の実施形態では、１または複数の副次的融合タンパク質のＸＴＥＮは、表１０のＸＴＥＮ配列から選択される配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である。前出の実施形態では、組成物は、ＴＭ、ＰＣＭ、およびＣＣＤ、ならびにコンジュゲートさせた薬物分子を含む、融合タンパク質の、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つを含み、副次的融合タンパク質を、本明細書の下記で記載される架橋剤を使用して、ＸＴＥＮのシステイン残基のチオールに連結する。組成物についての一実施形態では、ＴＭの１または複数の分子は、表１９の抗体またはＶＬおよびＶＨに由来するｓｃＦｖなどの抗体断片である。別の実施形態では、ＴＭの１または複数のＴＭ分子は、非タンパク質性であるかまたは他の低分子受容体リガンドである。一部の実施形態では、１または複数の非タンパク質ＴＭは、ホレートである。別の実施形態では、１または複数のＴＭ分子は、ＬＨＲＨである。ターゲティングコンジュゲート組成物についての別の実施形態では、融合タンパク質のＣＣＤのシステイン残基にコンジュゲートさせた、１または複数の細胞傷害性ペイロードは、同一であり、表１５のペイロードの群より選択される。ターゲティングコンジュゲート組成物についての別の実施形態では、融合タンパク質のＣＣＤのシステイン残基にコンジュゲートさせた、１または複数の細胞傷害性ペイロードは、同一であり、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａからなる群より選択される。前出についての一実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、ドキソルビシンである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、ＭＭＡＥである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、ＭＭＡＦである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、メイタンシンである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、パクリタキセルである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素である。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、メルタンシン（ＤＭ１）である。他の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、別個の融合タンパク質のＣＣＤのシステイン残基にコンジュゲートさせ、その後、骨格ＸＴＥＮにコンジュゲートさせた、２つの異なる細胞傷害薬であって、各細胞傷害薬が、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａからなる群より選択される細胞傷害薬を含む。
【０２０３】
ターゲティングコンジュゲート組成物についての一実施形態では、ペプチド切断部分（ＰＣＭ）は、表８に明示された配列の群より選択される。ターゲティングコンジュゲート組成物についての別の実施形態では、組成物のＰＣＭは、組織と関連するプロテアーゼの基質であり、この場合、前記組織上の抗原、マーカー、または受容体はまた、組成物のＴＭのリガンドでもある。このような実施形態では、ＴＭのリガンドへの結合は、細胞傷害薬または生物薬剤を保有するターゲティングコンジュゲート組成物を、組織関連プロテアーゼと近接させ、このとき、組成物は、切断され、これにより、低分子質量を、前記組織内に内部化することが可能となるように、組織と近位において、細胞傷害性ペイロードを含む構成要素を放出する結果として、細胞傷害性構成要素について当技術分野で公知の薬理学的効果をもたらす。一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、前記組織リガンドを含む細胞系を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、細胞系が前記組織リガンドを含まない場合の組成物の毒性と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍の毒性を呈示する。別の実施形態では、組成物は、標的組織関連プロテアーゼが存在するｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、アッセイが前記標的組織関連プロテアーゼを含まない場合の組成物の毒性と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍の毒性を呈示する。別の実施形態では、組成物は、ＰＣＭが切断される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、ＰＣＭが切断されない場合の組成物の毒性と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍の毒性を呈示する。別の実施形態では、細胞傷害性化合物を含む、ターゲティングコンジュゲート組成物のＴＭ−ＣＣＤ断片（放出ターゲティング組成物）であって、組成物から切断され、放出されるＴＭ−ＣＣＤ断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、インタクトな組成物と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍である濃度で、標的細胞に内部化される。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、対象に投与されると、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されておらず、同等の方式で対象に投与される、対応する細胞傷害薬と比較して、１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍長い終末半減期を呈示する。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲー���組成物は、対象に投与されると、少なくとも約３日間、または少なくとも約７日間、または少なくとも約１０日間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約３０日間の終末半減期を呈示する。別の実施形態では、本発明は、対象に投与されると、標的組織と共局在化したプロテアーゼにより切断され、細胞傷害性化合物を含むＴＭ−ＣＣＤ断片（放出ターゲティング組成物）を放出し、そこからの放出ターゲティング組成物が、インタクトな組成物と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍である濃度まで、リガンドを保有する標的組織に内部化される、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、対象に投与されると、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されておらず、同等の方式で対象に投与される、対応する細胞傷害薬と比較して、１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍長い終末半減期を呈示する。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、対象に投与されると、少なくとも約３日間、または少なくとも約７日間、または少なくとも約１０日間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約３０日間の終末半減期を呈示する。
【０２０４】
別の態様では、本発明は、第１および第２の領域を含むターゲティングコンジュゲート組成物であって、各領域が、そのＮ末端において、組織と関連するプロテアーゼの基質であるペプチド切断部分（ＰＣＭ）に連結され、ＰＣＭが、組成物を、２つの領域：ＣＣＤを、表１０のＸＴＥＮ配列から選択される配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である非修飾ＸＴＥＮに融合させた、第１の領域と、第２の非修飾ＸＴＥＮに融合させたＣＣＤを含み、ＸＴＥＮが、表１０のＸＴＥＮ配列から選択される配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である、第２の領域とに分離しており、第２のＣＣＤが、第２のＣＣＤのシステイン残基にコンジュゲートさせた、１または複数の細胞傷害性ペイロードをさらに含み、第１のＣＣＤのシステイン残基にコンジュゲートさせた、１または複数のターゲティング部分（ＴＭ）をさらに含むターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。結果として得られる組成物の非限定的な例を、図３４および３５に概略的に描示する。本段落の前出の組成物についての一実施形態では、ＰＣＭにコンジュゲートさせたＴＭは、抗体の群に由来するｓｃＦｖであるか、または表１９の抗体のＶＬおよびＶＨに由来するｓｃＦｖである。前出についての別の実施形態では、第２のＣＣＤにコンジュゲートさせたＴＭは、非タンパク質性であるか、または低分子受容体リガンドである。一部の実施形態では、１または複数の非タンパク質ＴＭは、ホレートである。前出についてのさらに別の実施形態では、第２のＣＣＤにコンジュゲートさせたＴＭは、本明細書で記載されるＬＨＲＨ類似体である。前出の組成物についての一実施形態では、ペプチド切断部分（ＰＣＭ）は、表８に明示された配列の群より選択される。前出の組成物についての別の実施形態では、組成物のＰＣＭは、組織と関連するプロテアーゼの基質であり、この場合、前記組織上の抗原、マーカー、または受容体はまた、組成物のＴＭのリガンドでもある。前出の組成物についての別の実施形態では、第１のＣＣＤにコンジュゲートさせた、１または複数の細胞傷害性ペイロードは、同一であり、表１５のペイロードの群より選択される。本段落の前出の組成物についての別の実施形態では、第１のＣＣＤにコンジュゲートさせた、１または複数の細胞傷害性ペイロードは、同一であり、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａからなる群より選択される。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、ＭＭＡＦである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、メイタンシンである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、パクリタキセルである。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素である。前出についての別の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、ＭＭＡＥである。本段落の前出の組成物についての他の実施形態では、組成物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａからなる群より選択される２つの異なる細胞傷害薬を含み、１つの薬物を、第１のＣＣＤに連結し、第２の薬物を、第２のＣＣＤに連結し、ＴＭを、構築物の末端に融合させている。このような実施形態では、ＴＭのリガンドへの結合は、組成物を、組織関連プロテアーゼと近接させ、このとき、組成物のＰＣＭは、切断され、これにより、前記組織と近位において、細胞傷害性ペイロードを含むＣＣＤを放出するか、または前記組織内に内部化された細胞傷害性ペイロードを含むＣＣＤを放出する結果として、細胞傷害性構成要素について当技術分野で公知の薬理学的効果をもたらす。この実施形態では、切断された組成物は、前記組織リガンドを含む細胞系を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、細胞系が前記組織リガンドを含まない場合の組成物の毒性と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、ま���は４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍の毒性を呈示する。別の実施形態では、この組成物は、前記組織リガンドを含む細胞系を伴い、組織関連プロテアーゼの存在下にある、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、細胞系が前記組織リガンドおよび組織関連プロテアーゼを含まない場合の組成物の毒性と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍の毒性を呈示する。加えて、組成物は、ＰＣＭが切断される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞細胞傷害アッセイにおいて、ＰＣＭが切断されない場合の組成物の毒性と比較して、少なくとも約２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍の毒性を呈示する。組成物に融合させたＸＴＥＮの存在の結果として、組成物は、対象に投与されると、組成物に連結されておらず、同等の方式で対象に投与される対応する細胞傷害薬と比較して、１０倍、または２０倍、または３０倍、または４０倍、または５０倍、または１００倍長い終末半減期を呈示する。実施形態では、組成物は、対象に投与されると、少なくとも約３日間、または少なくとも約７日間、または少なくとも約１０日間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約３０日間の終末半減期を呈示する。
【０２０５】
別の態様では、本発明は、表２、３、４、１９、および１９に明示された標的からなる群より選択される標的に方向付けられた、少なくとも１つのターゲティング部分であって、ＣＣＤ、ＰＣＭ、およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質に融合させたターゲティング部分を含み、ＣＣＤのシステイン残基にコンジュゲートさせた、細胞傷害性ペイロードの１または複数の分子をさらに含む、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。組成物についての一実施形態では、ＴＭは、表１９の抗体またはＶＬおよびＶＨ配列に由来するｓｃＦＶである。別の実施形態では、ＴＭは、ＣＣＤのＮまたはＣ末端にコンジュゲートさせたホレートである。別の実施形態では、ＴＭは、ＣＣＤのＮまたはＣ末端にコンジュゲートさせたＬＨＲＨである。前出の組成物では、細胞傷害性ペイロード分子は、同一であり、表１４〜１７のペイロードの群より選択される。前出の組成物についての別の実施形態では、１または複数の細胞傷害性ペイロードは、同一であり、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａからなる群より選択される。
【０２０６】
他の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａからなる群より選択される２つの異なる細胞傷害薬を含み、所与の組成物の各ＣＣＤが、同一な細胞傷害薬だけを含むように、各種の細胞傷害薬を、融合タンパク質の異なるＣＣＤにコンジュゲートさせている。
【０２０７】
図３４〜３７、４１、４２、および４６〜５１で例示される通り、対象のターゲティングコンジュゲート組成物は、１つ、２つ、３つ、もしくは４つ、またはそれを超える融合タンパク質分子が、１または複数のターゲティング部分に連結されて、異なる価数を有しうる。したがって、ターゲティングコンジュゲート組成物は、ペイロードおよびターゲティング部分を連結したＣＣＤを含む、１つ、２つ、３つ、もしくは４つ、またはそれを超える融合タンパク質を含みうる。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【０２０８】
本発明の対象のターゲティングコンジュゲート組成物のターゲティング部分を方向付けうる、想定されるさらなる標的は、表３に列挙される腫瘍関連抗原を含む。一実施形態では、本発明は、表３の腫瘍関連抗原および表２、表４、または表１９のがん標的リガンドのうちの１または複数に結合することが可能な、１または複数のターゲティング構成要素を含む、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【０２０９】
特定の実施形態では、本発明は、１つ、２つ、またはそれを超えるターゲティング部分と、異なるＣＣＤにコンジュゲートさせた、１つ、２つ、またはそれを超える種類の薬物と、１つ、２つ、またはそれを超えるＸＴＥＮとを含むターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。具体的なターゲティングコンジュゲート組成物についての非限定的な実施形態を、表５に提示するが、ここで、名づけられた組成物は、：ｉ）ターゲティング部分；ｉｉ）ＣＣＤ；ｉｉｉ）ＰＣＭ配列；ｉｖ）表１０のＸＴＥＮ配列；およびｖ）薬物（この場合、薬物分子は、対応するＣＣＤの各システインに連結される）という、指定された構成要素を有する。列挙されたコンジュゲート内の、表５のＸＴＥＮ配列に関して、ＸＴＥＮは、表１０に記載されている、ＸＴＥＮのＡＥ、ＡＦ、およびＡＧ変異体を包摂しうることが、とりわけ意図され；例えば、ＸＴＥＮ８６４は、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、およびＡＧ８６４を含む。一実施形態では、表５のターゲティングコンジュゲート組成物を、下記の化学式ＩＩに従い構成する。別の実施形態では、表５のターゲティングコンジュゲート組成物を、下記の化学式ＩＩＩに従い構成する。当業者により察知される通り、開示される構成要素の他の組合せ、ならびにそれぞれの指定される構成要素の異なる数または比、ならびにペイロードをコンジュゲートさせた、異なるＸＴＥＮ配列、ならびに本明細書で記載される、異なるターゲティング部分が、表中の実例で指し示される該当物の代用となりうることが、とりわけ想定される。例えば、本発明は、所与のＣＣＤに接続される薬物分子の数は、１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、または７つ、または８つ、または９つ、またはそれを超えることが可能であり、ＣＣＤは、薬物部分をコンジュゲートさせる、対応する数のシステイン残基を有することを想定する。さらに、本発明は、対象組成物に接続されるターゲティング部分の数は、１つ、または２つ、または３つ、またはそれを超えることが可能であり、これらを、同様に、組成物中の、Ｎ末端のアミノ基に融合させるか、または組成物中の、対応する数のシステインもしくはリシン残基にコンジュゲートさせることを想定する。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１２】
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【表５−１３】
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【表５−１４】
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【表５−１５】
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【表５−１６】
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【０２１０】
２．システイン含有ドメイン
別の態様では、本発明は、１または複数のシステイン残基を含む、長さの短いポリペプチドであって、ペイロードを、システイン残基のチオール基に連結する架橋剤（下記でより完全に記載される）を使用して、本明細書で記載される薬物または生物薬剤ペイロードをコンジュゲートさせる、対象組成物のためのポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、システイン含有ドメインまたは「ＣＣＤ」とは、比較的長さの短いポリペプチドであり、少なくとも６つのアミノ酸残基を含むことが典型的である。一部の実施形態では、ＣＣＤは、６〜約１４４アミノ酸の間、および１〜約１０個の間、またはそれを超えるシステイン残基を有する。ＣＣＤ内の、システインの、システイン以外の残基に対する比は、大半の自然発生のペプチドおよびタンパク質よりも大きいことが典型的である。ターゲティング部分と、ＸＴＥＮと、任意選択で、プロテアーゼ切断部分とを含み、連結されたペイロード薬物または生物活性タンパク質を保有するＣＣＤを、ターゲティング部分に近接して配置して、組み込まれた十分な数のペイロード分子を、ターゲティング部分が結合しうるリガンドを保有する細胞に送達することを、より十分に確保するように、融合タンパク質を、特異的に構成した、本開示の対象組成物への組込みのためのＣＣＤを提供することは、本発明の目的である。ＸＴＥＮは、血中のタンパク質分解性切断はそれほど受けやすくない（下記の実施例２９および４８、ならびに図２９および４８で裏付けられる）が、それにもかかわらず、対象に投与された、ＸＴＥＮを含む組成物が、時間経過にわたり、タンパク質分解により、最終的に切断および分解されるように、好中球エラスターゼ、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−９など、ある特定のプロテアーゼの影響は受けやすい。意図された数の、連結されたペイロードの、標的組織への送達を最適化するために、いくつかのＣＣＤポリペプチドを設計して、最大で１０個のシステイン残基を、親水性アミノ酸と共に散在させた、短い配列を用意した。一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのシステイン以外の残基を含み、システイン以外の残基が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される、３〜６種類のアミノ酸から選択される対象組成物への組込みのためのＣＣＤを提供する。一実施形態では、ＣＣＤは、１つのシステイン残基と、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される、３〜６種類のアミノ酸から選択される、最大で９つのシステイン以外の残基とを有する。別の実施形態では、対象組成物のＣＣＤは、３つのシステイン残基と、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される、３〜６種類のアミノ酸からなる群より選択される、最大で３９のシステイン以外の残基とを有し、システイン残基は、連続する場合もあり、別のシステイン残基から、最大で１５個のシステイン以外の残基により隔てられる場合もある。別の実施形態では、対象組成物のＣＣＤは、９つのシステイン残基と、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される、最大で１３５個のシステイン以外の残基とを有し、ＣＣＤ配列中、２つのシステイン残基が連続することはなく、各システイン残基は、別のシステイン残基から、最大で１５個のシステイン以外の残基により隔てられうる。別の実施形態では、対象組成物のＣＣＤは、１〜９つのシステイン残基と、６〜１４４個の間の全残基（このうち、システイン以外の残基は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される３〜６種類である）とを有し、この場合、システイン残基は、ＣＣＤのＮまたはＣ末端から２〜９残基以内に位置する。別の実施形態では、対象組成物のＣＣＤは、３つ〜９つのシステイン残基と、１４〜１４４個の間の全残基（このうち、システイン以外の残基は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される３〜６種類である）とを有し、任意の２つのシステイン残基は、１５個を超えない、システイン以外の残基により隔てられている。別の実施形態では、本発明は、表６に明示された配列からなる群より選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を伴う配列を有する対象組成物への組込みのためのＣＣＤを提供する。別の実施形態では、本発明は、表６に明示された配列からなる群より選択される対象組成物への組込みのためのＣＣＤを提供する。別の実施形態では、本発明は、表６に明示された配列からなる群より選択される配列を有するＣＣＤを含む融合タンパク質であって、本明細書で開示されるターゲティング部分に融合させた融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、表６に明示された配列からなる群より選択される配列を有するＣＣＤを含む融合タンパク質であって、本明細書で開示されるターゲティング部分と、ＸＴＥＮとの間に融合させた融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、表６に明示された配列からなる群より選択される配列を有するＣＣＤを含む融合タンパク質であって、本明細書で開示されるターゲティング部分と、ＰＣＭとの間に融合させた融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される、表５に明示された配列、ターゲティング部分、ＰＣＭ、およびＸＴＥＮからなる群より選択される配列を有するＣＣＤを含む融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される、表６に明示された配列、ＰＣＭ、およびＸＴＥＮからなる群より選択される配列を、ＣＣＤのＮまたはＣ末端にコンジュゲートさせたターゲティング部分と併せて有するＣＣＤを含む融合タンパク質を提供する。
【０２１１】
対象組成物への組込みのためのＣＣＤであって、コンジュゲーション反応の後における組成物であり、ＣＣＤに組み込まれたシステイン残基の各々にコンジュゲートさせた、十分な数の、意図されたペイロード薬物または生物薬剤分子を有する組成物の分子を回収する能力を増強するＣＣＤを提供することは、本発明の別の目的である。本発明は、ＨＰＬＣ解析において、ＣＣＤ−ＸＴＥＮ融合タンパク質の薬物コンジュゲートは、異なる数の薬物分子を有するコンジュゲートの間の、著明に改善されたピーク分離をもたらすという驚くべき発見を利用する。差違は、システイン残基を、配列にわたり均一に拡散して組み込んだＸＴＥＮ（例えば、表１１のシステイン操作ＸＴＥＮ）を、システイン操作ＸＴＥＮと同じ数のアミノ酸を伴うＣＣＤと融合させた、表１０のＸＴＥＮの融合タンパク質と対比して比較する反応生成物中で見ることができる。それぞれのポリペプチドを、所与のペイロードをシステインに連結するコンジュゲーション反応にかけたところ、ＨＰＬＣ解析において、ＸＴＥＮとＣＣＤとの融合タンパク質の反応生成物は、コンジュゲートが不完全な反応生成物に対応するピークであって、完全にコンジュゲートした反応生成物のピークに最も近接するピークと対比した、完全にコンジュゲートした反応生成物に対応するピークに関して、システイン含有ＸＴＥＮコンジュゲートの反応生成物の対応するピークの分離と比較して著明に大きなピーク分離を示した。言い換えると、ターゲティングコンジュゲート組成物に組み込まれる、ペイロード薬物または生物活性タンパク質をコンジュゲートさせたＣＣＤを含む組成物は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー上の、異質なコンジュゲーション反応生成物のピークの間の分離であって、ＣＣＤを含まない、対応する長さのＸＴＥＮの全長にわたり、システイン残基をより均一に分布させた組成の反応生成物より大きな分離を達成することが可能である。
【０２１２】
完全にコンジュゲートした生成物のピークの間の分離であって、次に近くのコンジュゲートが不完全な生成物に対する分離は、数学的に規定することができる。本明細書で使用される場合、「ピーク分離」は、以下：
ピーク分離＝（ｔＲ２−ｔＲ１）／ＦＷＨＭ
［式中、
ｔＲ２：逆相ＨＰＬＣによる、完全にコンジュゲートした生成物のピークの保持時間；
ｔＲ１：逆相ＨＰＬＣによる、完全にコンジュゲートした生成物のピークに最も近接するコンジュゲートが不完全なピークの保持時間；および
ＦＷＨＭ：完全にコンジュゲートした生成物のピークの半値全幅］
の通りに規定されるが、この場合、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件は、以下：
ＨＰＬＣカラムは、Ｃ４−ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ、型番：２１４ＴＰ５４１５  ＶｙｄａｃＣ４）である
溶出法：１ｍｌ／分で４５分間にわたる、５〜５０％の緩衝液Ｂ
緩衝液Ａ：Ｈ２Ｏ中に０．１％のＴＦＡ
緩衝液Ｂ：アセトニトリル中に０．１％のＴＦＡ
の通りである。
【０２１３】
一部の実施形態では、本発明は、融合タンパク質の、薬物分子と、ＣＣＤのシステイン残基とをコンジュゲーションすると、コンジュゲート生成物の異質な集団が得られるが、この場合、完全にコンジュゲートしたＣＣＤ−薬物コンジュゲート生成物が、ピーク分離≧６を達成することが可能であり、ａ）融合タンパク質が、３つ〜９つの間のシステイン残基を伴うＣＣＤを含む、６００個またはそれを超える累積アミノ酸残基を有するポリペプチドを含み；ｂ）異質なコンジュゲート生成物が、ＣＣＤに連結された、少なくとも１つ、２つ、および３つ、またはそれを超えるペイロードの混合物を有し；ｃ）コンジュゲート生成物の異質な集団が、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件下で解析される、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。前出についての一実施形態では、融合タンパク質のＣＣＤは、３つのシステイン残基を有する、表６の配列であり、融合タンパク質は、少なくとも８００個の累積アミノ酸残基を有する。前出についての別の実施形態では、融合タンパク質のＣＣＤは、９つのシステイン残基を有する、表６の配列であり、融合タンパク質は、少なくとも８００個の累積アミノ酸残基を有する。
【表６−１】
2018500049.tif 000041
【表６−２】
2018500049.tif 000042
【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
2018500049.tif 000045
【０２１４】
３．ペプチド切断部分
一態様では、本発明は、対象における標的組織であって、その非限定的な例が、がん、腫瘍、または炎症性応答に関与する組織もしくは臓器である標的組織と関連するプロテアーゼの基質である、１または複数のペプチド切断部分（ＰＣＭ）を含む、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。ＰＣＭを含む組成物が、標的組織関連プロテアーゼと近接すると、組成物のペイロード（ＸＴＥＮ配列のある部分を伴うかまたは伴わない）、またはＴＭ（ＸＴＥＮ配列のある部分を伴うかまたは伴わない）に連結されたペイロードが、組成物から放出されるように、ペイロードを含むターゲティングコンジュゲート組成物における使用のために特異的に構成されたペプチド切断部分（ＰＣＭ）を提供することは、本発明の目的である。ターゲティングコンジュゲート組成物の設計は、結果として得られる断片の分子量の低減によるのであれ、切断されて離脱する、これらを挟むバルキーなＸＴＥＮによる立体障害の低減によるのであれ、結果として得られる放出構成要素であって、ＴＭおよび／またはペイロードを含む放出構成要素が、標的組織に付着するか、または標的組織に浸透する増強された能力を有するような設計である。
【０２１５】
ヒト癌腫内の間質は、細胞外マトリックスと、白血球、内皮細胞、線維芽細胞、および筋線維芽細胞など、多様な種類の非癌腫細胞とからなる。腫瘍関連間質は、新血管形成のほか、並置された癌腫細胞の増殖および浸潤も刺激することにより、腫瘍の増殖を能動的に支援する。がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）と称することが多い、間質性線維芽細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の組成を動的に改変し、これにより、腫瘍細胞の浸潤および後続の転移性コロニー形成を容易とするそれらの能力に起因して、腫瘍の進行において、特に重要な役割を有する。特に、当技術分野では、プロテアーゼが、腫瘍血管新生、浸潤、細胞外マトリックスのリモデリング、および転移を含む悪性の進行に寄与する重要な成分であることが公知であり、この場合、プロテアーゼは、タンパク質分解性相互作用の、広範な多方向性ネットワークの一部として機能する。
【０２１６】
悪性腫瘍の要件は、周囲の正常組織に浸透し、遠隔部位に播種するために、血管系を獲得するそれらの能力であるので、腫瘍は、複数の酵素クラス；例えば、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ならびにセリン、トレオニン、システイン、およびアスパラギン酸プロテアーゼに由来する細胞外エンドプロテアーゼの発現の増大に、大きく依拠する。しかし、プロテアーゼの役割は、組織の浸潤および血管新生に限定されない。これらの酵素はまた、増殖因子活性化、細胞の接着、細胞の生存、および免疫監視においても、主要な役割を有する。例えば、ＭＭＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、増殖因子、細胞表面受容体、細胞接着分子、またはケモカインを切断するそれらの能力の帰結として、腫瘍細胞の挙動に対して影響を与えることが可能である。総体として、腫瘍関連プロテアーゼの作用は、がんの表現型の進化において、著明な力を表す。
【０２１７】
正常組織と、腫瘍組織との間における、多くのこのようなタンパク質分解性酵素の示差的発現を検討することで、この示差的発現を、腫瘍に近接するか、またはそれと共局在化する化学療法剤を半選択的に活性化させるか、または変更する手段として活用することができる。本明細書で使用される場合、「共局在化」とは、プロテアーゼが、腫瘍に隣接して、または腫瘍内で、最高濃度にあり、腫瘍からの距離が増大するにつれて、濃度が減少することを意味する。この点で、セリンプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼは、細胞外腫瘍環境内のそれらの活性の上昇、および短いペプチド配列を選択的かつ特異的に切断するそれらの能力の両方に起因して、ターゲティングされた、示差的薬物送達のための候補である。具体的には、非罹患組織と比べた、腫瘍内のエンドプロテアーゼ活性の増大を利用して、特異的ペプチド配列を含み、強力な抗がん治療薬を有するプロドラッグ化合物であって、その後、放出される結果として、腫瘍において高レベルの活性の薬剤をもたらし、正常な健常組織内では、低度または陰性の薬物レベルをもたらす、プロドラッグ化合物を活性化させることができる。このようなプロドラッグがん治療薬の選択的送達の帰結として、これらの薬剤に要請される活性の共時的な低減、ならびに肝臓、心臓、および骨髄を含む、正常組織に対する毒性の低減の両方がもたらされ、これにより、このような化合物の治療指数が大幅に改善される。
【０２１８】
一部の実施形態では、本発明は、ＰＣＭを含むターゲティングコンジュゲート組成物であって、標的組織関連プロテアーゼにより切断されると、ペイロードを含む断片を放出し、ペイロードを含む断片が、前記組織内に、ＰＣＭを含まない組成物と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍である濃度まで浸透することが可能であるターゲティングコンジュゲート組成物を含む。他の実施形態では、本発明は、ＰＣＭを含むターゲティングコンジュゲート組成物であって、標的組織関連プロテアーゼにより切断されると、ペイロードおよびＴＭを含む、放出ターゲティング組成物断片を放出し、放出ターゲティング組成物が、ＰＣＭを含まない、対応する組成物と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍である速度で、前記組織内に浸透することが可能であるターゲティングコンジュゲート組成物を含む。前出についての一実施形態では、その放出後における、放出ターゲティング組成物断片は、結果として得られる分子量であって、プロテアーゼにより切断されていない、インタクトなターゲティングコンジュゲート組成物の、最大で４分の１、最大で５分の１、最大で６分の１、最大で７分の１、最大で８分の１、最大で１０分の１である分子量を有する。前出についての別の実施形態では、その放出後における放出ターゲティング組成物は、結果として得られる流体力学半径であって、プロテアーゼにより切断されていない、インタクトなターゲティングコンジュゲート組成物の、最大で４分の１、最大で５分の１、最大で６分の１、最大で７分の１、最大で８分の１、最大で１０分の１である流体力学半径を有する。対象のターゲティングコンジュゲート組成物の実施形態では、組織関連プロテアーゼによる切断は、ペイロードを含む断片であって、断片のサイズの、インタクトな組成物と比べた低減のために、腫瘍などの組織を、より有効に浸透することが可能である断片を結果としてもたらし、その結果として、前記組織または細胞内のペイロードの薬理学的効果をもたらすことが、とりわけ想定される。また、ターゲティングコンジュゲート組成物のＰＣＭを、特異的組織をターゲティングすることを意図する組成物中の、その標的組織または細胞により産生されることが公知の特異的プロテアーゼを伴う使用のために設計することも、とりわけ想定される。一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物のＰＣＭは、標的組織により分泌される細胞外プロテアーゼであって、表７のプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞外プロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物のＰＣＭは、標的組織により分泌される細胞外プロテアーゼであって、表８に明示された配列の群を含むがこれらに限定されない細胞外プロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＰＣＭは、細胞内に位置する細胞内プロテアーゼであって、表７のプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内プロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＰＣＭは、がんである組織と関連するプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＰＣＭは、がん性腫瘍と関連するプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＰＣＭは、白血病などのがんと関連するプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＰＣＭは、炎症性組織と関連するプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。
【０２１９】
一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物のＰＣＭは、表７に明示されたプロテアーゼの群からなる群より選択される、少なくとも１つのプロテアーゼの基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、メタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびセリンプロテアーゼからなる群より選択される、少なくとも１つのプロテアーゼの基質である。別の実施形態では、ＰＣＭは、メプリン、ネプリリシン（ＣＤ１０）、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ−１、ディスインテグリン／メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ）、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２８（ＭＤＣ−Ｌ）、トロンボスポンジンモチーフを伴うＡＤＡＭ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ１）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストロメリシン１）、ＭＭＰ−７（マトリリシン１）、ＭＭＰ−８（コラゲナーゼ２）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ＭＭＰ−１０（ストロメリシン２）、ＭＭＰ−１１（ストロメリシン３）、ＭＭＰ−１２（マクロファージエラスターゼ）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ３）、ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２３（ＣＡ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２６（マトリリシン２）、ＭＭＰ−２７（ＣＭＭＰ）、レグマイン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＸ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、セクレターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミン、トロンビン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ、ＫＬＫ３）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、エラスターゼ、トリプターゼ、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、ＤＥＳＣ１、ヘプシン（ＨＰＮ）、マトリプターゼ、マトリプターゼ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４（ＣＡＰ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、カリクレイン関連ペプチダーゼ（ＫＬＫファミリー）、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、およびＫＬＫ１４からなる群より選択される、少なくとも１つのプロテアーゼの基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、ＡＤＡＭ１７の基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、ＢＭＰ−１の基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、カテプシンの基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、システインプロテアーゼの基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、ＨｔｒＡ１の基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、レグマインの基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、ＭＴ−ＳＰ１の基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、メタロプロテイナーゼの基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、好中球エラスターゼの基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、トロンビンの基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）の基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、ＴＭＰＲＳＳ３の基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、ＴＭＰＲＳＳ４の基質である。一部の実施形態では、ＰＣＭは、ｕＰＡの基質である。一実施形態では、ＰＣＭは、表８に明示された配列の群より選択される切断配列を含む。別の実施形態では、切断型コンジュゲート組成物のＰＣＭは、第１の切断配列、および前記第１の切断配列と異なる第２の切断配列を含み、この場合、各配列は、表８に明示された配列の群より選択され、第１および第２の切断配列を、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンから選択される、１つ〜６つのアミノ酸により、互いと連結している。別の実施形態では、切断型コンジュゲート組成物のＰＣＭは、第１の切断配列、前記第１の切断配列と異なる第２の切断配列、および第３の切断配列を含み、この場合、各配列は、表８に明示された配列の群より選択され、第１および第２および第３の切断配列は、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンから選択される、４つ〜６つのアミノ酸により、互いと連結している。他の実施形態では、本発明は、１つ、２つ、または３つのＰＣＭを含む、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。ターゲティングコンジュゲート組成物の複数のＰＣＭをコンカテネートして、複数のプロテアーゼにより切断されうる、ユニバーサル配列を形成しうることが具体的に意図される。このような組成物は、複数のプロテアーゼを発現させる罹患標的組織により、よりたやすく切断され、結果として得られる断片であって、ＴＭおよび／またはペイロード薬物を保有する断片は、標的組織によりたやすく浸透し、ペイロード薬物の薬理学的効果を及ぼす結果がもたらされることが想定される。
【表７−１】
2018500049.tif 000046
【表７−２】
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【０２２０】
ある特定の実施形態では、本発明は、表８に明示された配列の群より選択される、少なくとも第１の切断配列を含む、対象のターゲティングコンジュゲート組成物における使用のために意図されるＰＣＭ組成物を提供する。一部の実施形態では、ＰＣＭ組成物の配列は、１）配列をコードする核酸を、ＸＴＥＮまたはターゲティング部分をコードする核酸配列またはその核酸配列内にたやすく連結しうる結果として、融合タンパク質として発現させ、回収しうる配列をもたらしうること；および２）結果として得られる融合タンパク質が、本明細書で記載される標的組織のプロテアーゼの基質として用いられうることを含む、ある特定の特性を念頭に置いて設計する。一実施形態では、ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択される、ペプチジル切断配列に対する、少なくとも約９０％の同一性、もしくは少なくとも約９３％の同一性、もしくは少なくとも約９４％の同一性、もしくは少なくとも約９５％の同一性、もしくは少なくとも約９６％の同一性、もしくは少なくとも約９７％の同一性、もしくは少なくとも約９８％の同一性、もしくは少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である。
【表８−１】
2018500049.tif 000048
【表８−２】
2018500049.tif 000049
【表８−３】
2018500049.tif 000050
【表８−４】
2018500049.tif 000051
【表８−５】
2018500049.tif 000052
【表８−６】
2018500049.tif 000053
↓は、切断部位を指し示す
特殊なアミノ酸の略号:
Cit:  シトルリン(Citrilline);Cha:β-シクロヘキシルアラニン;Hof:ホモフェニルアラニン;Nva:アミノスベリン酸;Dpa:D-フェニルアラニン;Nle:ノルロイシン;Smc:S-メチルシステイン
*スラッシュの前、間、または後における、複数アミノ酸の列挙は、その位置において代用しうる、代替的なアミノ酸を指し示し;「-」は、任意のアミノ酸で、中欄に指し示した、対応するアミノ酸を代用しうることを指し示す
**  xは、プロリン以外の、任意のL-アミノ酸である
Hyは、任意の疎水性L-アミノ酸である
γは、結合が、ガンマカルボキシ連結であることを指し示す
【０２２１】
ＩＩＩ）ターゲティングコンジュゲート組成物のＸＴＥＮ
本発明は部分的に、ターゲティングコンジュゲート組成物における使用のために操作された、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）配列に関する。このような組成物は、融合タンパク質を創出するための融合パートナーとしてのほか、ターゲティングコンジュゲート組成物を創出する試薬コンジュゲーションパートナーとしても有用である。加えて、組成物を創出する方法を提供することは、本発明の目的である。
【０２２２】
実例を目的として述べると、対象組成物を創出するための、１または複数の融合パートナーであって、他のＸＴＥＮ、ＰＣＭ、ターゲティング部分、または低分子ペイロードにコンジュゲートさせるＣＣＤを含む融合パートナーに連結するか、または融合させる結果として、ターゲティングコンジュゲート組成物をもたらすことが可能なＸＴＥＮを特異的に操作して、結果として得られる組成物に、可溶性の増強、薬物動態特性の増強、溢出を低減する、質量および流体力学半径の増大のほか、他の点では健常な組織との所望されない相互作用、および結果として生じる副作用または毒性を低減する遮蔽効果も含む、ある特定の特性を付与する。場合によって、ＸＴＥＮは、ターゲティング部分への連結のために、規定された数の反応性のアミノ酸を組み込むか、または多価構築物の創出を可能とするように設計するが、この場合、ＸＴＥＮは、複数の融合タンパク質を接続する骨格、または架橋剤もしくはアジド／アルキン反応物を介して、三価もしくは四価のリンカーへのコンジュゲーションを可能とする骨格として用いられる。本発明はまた、対象組成物の創出における使用のための、このような操作ＸＴＥＮポリマーを創出する方法も提供する。
【０２２３】
別の態様では、本発明は、単量体および多量体構成の創出における、反応物であるコンジュゲーションパートナーとして有用な、規定された数の架橋剤またはアジド／アルキン反応物を含むＸＴＥＮポリマーのほか、このような反応物を調製する方法も提供する。架橋剤またはアジド／アルキン反応物を含むＸＴＥＮを、ターゲティング部分、他のＸＴＥＮ、または他の融合タンパク質のコンジュゲーションにおける反応物として使用して、標的組織に対する示差的毒性を含む、所望の物理的、薬学的、ターゲティング、および薬理学的特性を達成するのに使用される、特異的に設計されたコンジュゲート組成物を結果としてもたらす。
【０２２４】
別の態様では、本発明は、健常組織と比較した、罹患標的組織に対する示差的毒性を含む、ターゲティング、薬学的、薬物動態、および薬理学的特性を増強した組成物をもたらすように、異なる融合タンパク質またはターゲティング部分の組合せを、規定された数で、単量体または多量体構成において含む、ＸＴＥＮの組成物を提供する。このようなペイロードに連結されたこのような組成物は、対象に投与されると、疾患の防止、処置、または緩和において有用性を有することが可能であり、ペイロードの薬理学的または生物学的効果に起因して有益な応答をもたらしうる。
【０２２５】
４．ＸＴＥＮ：延長組換えポリペプチド
一態様では、本発明は、組換え融合により、または架橋剤反応物を介して、１または複数のターゲティング部分、ペプチジル切断部分、ＣＣＤ、または前出の構成要素を有する融合タンパク質に連結する、融合パートナーまたはコンジュゲーションパートナーとして有用であるＸＴＥＮポリペプチド組成物であって、ＣＣＤに連結された薬物または生物薬剤ペイロードと組み合わされる結果として、ターゲティングコンジュゲート組成物をもたらすＸＴＥＮポリペプチド組成物を提供する。
【０２２６】
一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、非自然発生の、実質的な非反復配列であって、生理学的条件下における二次または三次構造が低度であるか、またはそれを有さない非反復配列を伴うポリペプチドである。ＸＴＥＮは、約３６〜約１０００個またはそれを超えるアミノ酸であって、それらの大部分または全体が、小型の親水性アミノ酸であるアミノ酸を有することが典型的である。本明細書で使用される場合、「ＸＴＥＮ」はとりわけ、全抗体または抗体断片（例えば、単鎖抗体およびＦｃ断片）を除外する。ＸＴＥＮポリペプチドは、それらが多様な役割で用いられ、ターゲティング部分、別のＸＴＥＮ、または他の融合パートナーに接合するか、連結するか、または融合させると、ある特定の所望の特性を付与する点で、融合パートナーとして、およびコンジュゲーションパートナーとして有用である。結果として得られる組成物は、ＸＴＥＮに連結されていない、対応するペイロードまたはターゲティング部分と比較した薬物動態特性、物理化学的特性、薬理学的特性の増強、ならびに毒性学的特性および薬学的特性の改善など、特性が増強されており、ペイロードまたはターゲティング部分が使用されることが当技術分野で公知であるある特定の状態の処置において有用となっている。
【０２２７】
ＸＴＥＮの非構造化特徴および物理化学的特性は部分的に、典型的に、４〜６種類の親水性アミノ酸に偏向的に限定された、全般的なアミノ酸組成、定量可能な、実質的に非反復的な設計でのアミノ酸の連結、ならびに結果として得られるＸＴＥＮポリペプチドの長さおよび／または構成から生じる。本明細書で開示されるＸＴＥＮの特性が、表１０および１１の例示的な配列であって、様々な範囲の長さの中に、同様の特性を有し、それらが連結されるペイロードまたはターゲティング部分に対して、それらの多くが実施例に記録されている、特性の増強を付与する配列の多様性により証拠立てられる通り、絶対の一次アミノ酸配列と結びつかないことは、ＸＴＥＮには一般的であるが、天然のポリペプチドには一般的でない、有利な特色である。実際、本発明の組成物は、表１０および１１で具体的に数え上げられたＸＴＥＮに限定されないことが、とりわけ想定され、むしろ、実施形態は、それらが、下記で記載されるＸＴＥＮの特性を呈示するので、表１０および１１の配列に対する、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む。このようなＸＴＥＮは、タンパク質であるよりも、非タンパク質性の親水性ポリマー（ポリエチレングリコールまたは「ＰＥＧ」など）に、より類似する特性を有することが確立されている。一部の実施形態では、本発明のＸＴＥＮは、以下の有利な特性：ある特定の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）と同様の特性であって、それらを、コンジュゲーションパートナーとして特に有用とする特性である、規定された均一の長さ（所与の配列について）、コンフォメーション的可撓性、二次構造の低減または欠如、高度なランダムコイルの形成、高度な水溶性、高度なプロテアーゼ抵抗性、低免疫原性、哺乳動物の受容体に対する低度な結合、規定された帯電度、および流体力学（またはストークス）半径の増大のうちの１または複数を呈示する。
【０２２８】
対象の融合タンパク質およびコンジュゲートのＸＴＥＮ構成要素は、ポリマーの長さを延長しているにも拘らず、生理学的条件下で、変性させたペプチド配列と同様に挙動するように設計する。「変性」とは、溶液中のペプチドの状態であって、ペプチド骨格のコンフォメーション的自由度が大きいことを特徴とする状態について記載する。大半のペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下または高温下で、変性コンフォメーションを採用する。変性コンフォメーションにあるペプチドは、例えば、特徴的な円偏向二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、ＮＭＲにより決定される通り、射程距離の長い相互作用の欠如を特徴とする。本明細書では、「変性コンフォメーション」と、「非構造化コンフォメーション」とを、同義に使用する。一部の実施形態では、本発明は、生理学的条件下で、二次構造を大部分が欠く、変性配列に類似するＸＴＥＮ配列を提供する。他の場合、ＸＴＥＮ配列は、生理学的条件下で二次構造を実質的に欠く。この文脈で使用される「大部分が欠く」とは、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の５０％未満が、本明細書で記載される手段により測定または決定される二次構造に寄与することを意味する。この文脈で使用される「実質的に欠く」とは、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または少なくとも約９９％が、アルゴリズムまたは分光光度アッセイを含む、本明細書で記載される方法により測定または決定される二次構造に寄与しないことを意味する。
【０２２９】
当技術分野では、対象のＸＴＥＮの物理化学的特性を決定および確認するための、十分に確立された様々な方法およびアッセイが公知である。このような特性は、二次または三次構造、可溶性、タンパク質の凝集、安定性、絶対および見かけの分子量、純度および均一性、溶融特性、夾雑、ならびに水分含量を含むがこれらに限定されない。このような特性を測定する方法は、解析用遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＨＰＬＣ−逆相、光分散、キャピラリー電気泳動、円偏向二色性、示差的走査比色法、蛍光、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ除外、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定、およびＵＶ／可視光分光法を含む。特に、二次構造は、分光光度法により、例えば、「ｆａｒ−ＵＶ」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）内の円偏向二色性分光法により測定することができる。アルファ−ヘリックスおよびベータシートなどの二次構造エレメントは各々、これらの構造エレメントの欠如と同様、ＣＤスペクトルの特徴的な形状および強度をもたらし、ＸＴＥＮについての例示的なＣＤアッセイを、実施例に提示するが、これは、ＸＴＥＮが二次構造を欠くという結論を裏付ける。二次構造はまた、米国特許出願公開第２００３０２２８３０９Ａ１号において記載されている、周知のチョウ−ファスマンアルゴリズム（Chou,  P.  Y.ら（１９７４年）、Biochemistry、１３巻：２２２〜４５頁）およびガルニエ−オスグソープ−ロブソンアルゴリズム（「Ｇｏｒアルゴリズム」）（Garnier  J、Gibrat  JF、Robson  B.（１９９６年）、GOR  method  for  predicting  protein  secondary  structure  from  amino  acid  sequence、Methods  Enzymol、２６６巻：５４０〜５５３頁）など、ある特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズムを介して、ポリペプチド配列について予測することもできる。所与の配列について、アルゴリズムは、例えば、アルファ−ヘリックスまたはベータシートを形成する、配列の残基の合計および／もしくは百分率、またはランダムコイル（二次構造を欠く）の形成を結果としてもたらすことが予測される配列の残基の百分率として表される通り、何らかの二次構造が存在するか、二次構造は存在しないかを予測しうる。ポリペプチド配列は、例えば、インターネット上の、fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1のサイトを使用する、チョウ−ファスマンアルゴリズム、およびnpsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.htmlにおけるＧｏｒアルゴリズム（いずれも、２０１５年１０月３０日にアクセスした）を使用して解析することができる。ランダムコイルは、コンフォメーション依存的に鎖長により計量される内在的粘度測定（Tanford,  C.、Kawahara,  K.およびLapanje,  S.（１９６６年）、J.  Biol.  Chem.、２４１巻、１９２１〜１９２３頁）を使用することによる方法のほか、サイズ除外クロマトグラフィー（Squire,  P.  G.、Calculation  of  hydrodynamic  parameters  of  random  coil  polymers  from  size  exclusion  chromotography  and  comparison  with  parameters  by  conventional  methods、Journal  of  Chromatography、１９８１年、５，４３３〜４４２頁）による方法を含む様々な方法により決定することができる。さらなる方法は、Arnauら、Prot  Expr  and  Purif（２００６年）、４８巻、１〜１３頁において開示されている。
【０２３０】
一実施形態では、対象のコンジュゲート内で使用されるＸＴＥＮ配列は、チョウ−ファスマンアルゴリズムにより決定される、０％〜約５％未満の範囲のアルファ−ヘリックス百分率を有する。別の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、チョウ−ファスマンアルゴリズムにより決定される、０％〜約５％未満の範囲のベータシート百分率を有する。一実施形態では、コンジュゲートのＸＴＥＮ配列は、チョウ−ファスマンアルゴリズムにより決定される、０％〜約５％未満の範囲のアルファ−ヘリックス百分率、および０％〜約５％未満の範囲のベータシート百分率を有する。一実施形態では、コンジュゲートのＸＴＥＮ配列は、約２％未満のアルファ−ヘリックス百分率、および約２％未満のベータシート百分率を有する。組成物のＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムにより決定される、高度のランダムコイルの形成を有する。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムにより決定される、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％のランダムコイルの形成を有する。一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物のＸＴＥＮ配列は、チョウ−ファスマンアルゴリズムにより決定される、０％〜約５％未満の範囲のアルファ−ヘリックス百分率、および０％〜約５％未満の範囲のベータシート百分率と、ＧＯＲアルゴリズムにより決定される、少なくとも約９０％のランダムコイルの形成とを有する。別の実施形態では、開示される組成物のＸＴＥＮ配列は、チョウ−ファスマンアルゴリズムにより決定される、約２％未満のアルファ−ヘリックス百分率、および約２％未満のベータシート百分率と、ＧＯＲアルゴリズムにより決定される、少なくとも約９０％のランダムコイルの形成とを有する。別の実施形態では、組成物のＸＴＥＮ配列は、円偏向二色性により測定される二次構造を実質的に欠いている。
【０２３１】
ターゲティングコンジュゲート組成物を創出するのに使用される構成要素に連結されるＸＴＥＮについての選択基準は一般に、ＸＴＥＮの物理化学的特性およびコンフォメーション構造についての属性に関し、これらの属性を使用して、薬学的、薬理学的、および薬物動態特性の増強を、組成物に付与する。
【０２３２】
１．非反復配列
対象のコンジュゲート組成物の実施形態に含まれる、対象のＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復的であることが、とりわけ想定される。一般に、反復的なアミノ酸配列は、コラーゲンおよびロイシンジッパーなど、天然の反復配列により例示される通り、凝集するか、または高次構造を形成する傾向がある。これらの反復的なアミノ酸はまた、結晶構造または偽晶構造を結果としてもたらす接触点を形成する傾向もありうる。これに対し、非反復配列が凝集する傾向が低ければ、帯電アミノ酸の頻度が比較的低い、長配列のＸＴＥＮの設計が可能となるが、長配列のＸＴＥＮは、配列が反復的であり、帯電アミノ酸の頻度が高ければ、凝集する可能性が高くなるであろう。対象のＸＴＥＮの非反復性は、以下の特色の１または複数を評価することにより観察することができる。一実施形態では、実質的に非反復的なＸＴＥＮ配列は、アミノ酸がセリンでない限り、アミノ酸種類が同一である、配列内の３連続アミノ酸を有さず、この場合、３つを超えない連続アミノ酸は、セリン残基である。別の実施形態では、下記でより完全に記載される通り、本発明は、実質的に非反復的なＸＴＥＮ配列であって、配列の８０〜９９％が、１２個のアミノ酸残基のモチーフから構成され、モチーフが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される、４、５、または６種類のアミノ酸からなり、いずれか１つのモチーフ内のいずれか２連続アミノ酸残基の配列が、配列モチーフ内で、２回を超えて反復されないＸＴＥＮ配列を提供する。別の実施形態では、本発明は、実質的に非反復的なＸＴＥＮ配列であって、配列の少なくとも約９０％が、１２個のアミノ酸残基のモチーフからなり、モチーフが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される、４、５、または６種類のアミノ酸からなり、いずれか１つのモチーフ内のいずれか２連続アミノ酸残基の配列が、配列モチーフ内で、２回を超えて反復されないＸＴＥＮ配列を提供する。別の実施形態では、本発明は、実質的に非反復的なＸＴＥＮ配列であって、配列の少なくとも約９０％が、表９に明示された配列からなる群より選択される、１２個のアミノ酸残基のモチーフからなるＸＴＥＮ配列を提供する。別の実施形態では、本発明は、実質的に非反復的なＸＴＥＮ配列であって、配列の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または１００％が、表９に明示されたＡＥ配列からなる群より選択される、１２個のアミノ酸残基のモチーフからなるＸＴＥＮ配列を提供する。別の実施形態では、本発明は、実質的に非反復的なＸＴＥＮ配列であって、配列の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または１００％が、表９に明示されたＡＦ配列からなる群より選択される、１２個のアミノ酸残基のモチーフからなるＸＴＥＮ配列を提供する。別の実施形態では、本発明は、実質的に非反復的なＸＴＥＮ配列であって、配列の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、または１００％が、表９に明示されたＡＧ配列からなる群より選択される、１２個のアミノ酸残基のモチーフからなるＸＴＥＮ配列を提供する。
【０２３３】
ポリペプチドまたは遺伝子の反復度は、コンピュータプログラムもしくはアルゴリズムにより、または当技術分野で公知の他の手段により測定することができる。本発明に従い、本明細書では、ＸＴＥＮなど、特定のポリペプチドの反復度の計算において使用されるアルゴリズムについて開示し、アルゴリズムにより解析される配列の例を提示する（下記の実施例を参照されたい）。一実施形態では、所定の長さのポリペプチドの反復性を、式Ｉ：
【化１３】
2018500049.tif 000054
［式中、
ｍ＝（ポリペプチドのアミノ酸の長さ）−（部分配列のアミノ酸の長さ）＋１；および
カウントｉ＝配列ｉ内の、各固有の部分配列の累積発生回数］
により与えられる公式に従い計算することができる（本明細書の下記では、「部分配列スコア」と称する）。
【０２３４】
前出の式を適用して、ＸＴＥＮなど、ポリペプチドの反復性を定量化し、設定された長さの中で、長さ「ｓ」の固有の部分配列が出現する回数（「カウント」）を、所定の長さの配列内の部分配列の絶対数で除した商を決定することにより、所定のアミノ酸の長さ「ｎ」の配列を、反復性について解析する、部分配列スコアをもたらす、「ＳｅｇＳｃｏｒｅ」と称するアルゴリズムが開発された。所与の任意のポリペプチドの部分配列スコアは、固有の部分配列の絶対数、および所定の長さの配列内で、各固有の部分配列（異なるアミノ酸配列を意味する）が、どのくらいの頻度で出現するかに依存するであろう。
【０２３５】
本発明の文脈では、「部分配列スコア」とは、２００連続アミノ酸のＸＴＥＮポリペプチドにわたる、各固有の３マーのフレームの発生回数の合計を、２００アミノ酸の配列内の、固有の３マー部分配列の絶対数で除した商を意味する。２００連続アミノ酸の反復および非反復ポリペプチドから導出された、このような部分配列スコアの例を、実施例３２に提示する。一実施形態では、本発明は、１つのＸＴＥＮを含み、ＸＴＥＮが、１２未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、最も好ましくは５未満の部分配列スコアを有する、ＸＴＥＮコンジュゲートを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも２つのＸＴＥＮを含み、各個別のＸＴＥＮが、１０未満、または９未満、または８未満、または７未満、または６未満、または５未満、またはそれ未満の部分配列スコアを有する、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも３つの連結されたＸＴＥＮを含み、各個別のＸＴＥＮが、１０未満、または９未満、または８未満、または７未満、または６未満、または５未満、またはそれ未満の部分配列スコアを有する、ＸＴＥＮ組成物を提供する。本明細書で記載されるＸＴＥＮ組成物についての実施形態では、部分配列スコアが１０またはそれ未満（すなわち、９、８、７など）であるＸＴＥＮを、実質的に非反復的と特徴付ける。
【０２３６】
別の実施形態では、任意の長さのポリペプチドの平均反復性を、式ＩＩ：
【化１４】
2018500049.tif 000055
［式中、
ｎ＝（ポリペプチドのアミノ酸の長さ）−（ブロックのアミノ酸の長さ）＋１；
ｍ＝（ブロックのアミノ酸の長さ）−（部分配列のアミノ酸の長さ）＋１；および
カウントｉ＝ブロックｉ内の、各固有の部分配列の累積発生回数］
により与えられる公式に従い計算することができる（本明細書の下記では、「平均部分配列スコア」と称する）。
【０２３７】
異なる長さのポリペプチドの反復性を比較しうるように、前出の式を実装して、ＸＴＥＮなど、ポリペプチドの平均反復性を定量化する、「ＢｌｏｃｋＳｃｏｒｅ」と称する、第２のアルゴリズムが開発された。図２８は、ＢｌｏｃｋＳｃｏｒｅアルゴリズムの論理流れ図を描示する。ＢｌｏｃｋＳｃｏｒｅ（または同様の設計もしくは目的のアルゴリズム）のために、対象のポリペプチド配列を、長さの等しい、一連の重複セグメントであって、ポリペプチド（本明細書の下記では、「ブロック」と称する）の長さより短い重複セグメントとして処理することができる。各ブロックは、長さの等しい、一連の重複セグメントであって、ブロック（本明細書の下記では、「部分配列」と称する）の長さより短い重複セグメントとして処理することができる。ＢｌｏｃｋＳｃｏｒｅアルゴリズムでは、まず、ＳｅｇＳｃｏｒｅアルゴリズムを、ポリペプチド内の、個別の重複ブロックの各々に適用して、部分配列スコアのアレイを創出し、次いで、ポリペプチドのブロックの全てについて、部分配列スコアの平均を決定することにより、スコア（本明細書の下記では、「平均部分配列スコア」と称する）を決定する。例えば、２００アミノ酸残基の長さのポリペプチドは、合計１６５個の３６アミノ酸重複「ブロック」および１９８個の３マーアミノ酸「部分配列」を有するが、各ブロック内に見出される、固有の３マー部分配列（３アミノ酸の、固有の特異的配列を意味する）の数は、ブロック内の反復性の量に依存し、高度な反復性のブロックを伴うポリペプチドは一般に、少数の固有の３マー部分配列を有するであろう。ＢｌｏｃｋＳｃｏｒｅにより、または前出の式ＩＩの、ポリペプチドへの適用により生成される平均部分配列スコアは、反復度と、２つの変数である、１）アミノ酸残基単位のブロックの長さ、および２）アミノ酸残基単位の部分配列の長さに割り当てられた値とを反映する。本発明は、「部分配列」という変数が、３〜約１０アミノ酸残基のペプチド長であることが可能であり、「ブロック」という変数が、約２０〜約８００アミノ酸残基のペプチド長でありうることを想定する。好ましい方法では、かつ、以下の実施形態に適用される通り（そうでないことが注記される場合を除き）、ポリペプチドの「平均部分配列スコア」とは、前出の式ＩＩまたはＢｌｏｃｋＳｃｏｒｅアルゴリズムの、ポリペプチド配列への適用であって、ブロック長を３６アミノ酸に設定し、部分配列長を３アミノ酸に設定する適用により決定する。
【０２３８】
一部の実施形態では、本発明は、１または複数のＸＴＥＮを含むターゲティングコンジュゲート組成物であって、各ＸＴＥＮが、３またはそれ未満、より好ましくは２未満の平均部分配列スコアを有する、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、２つのＸＴＥＮを含むターゲティングコンジュゲート組成物であって、少なくとも１つのＸＴＥＮが、３またはそれ未満、より好ましくは２未満の平均部分配列スコアを有する、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも３つのＸＴＥＮを含むターゲティングコンジュゲート組成物であって、各個別のＸＴＥＮが、３またはそれ未満、より好ましくは２未満の平均部分配列スコアを有する、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。本明細書で記載されるターゲティングコンジュゲート組成物についてのこれらの実施形態では、平均部分配列スコアが３またはそれ未満である、組成物のＸＴＥＮ構成要素は、「実質的に非反復的」である。
【０２３９】
絶対の一次配列ではなく、ＸＴＥＮ内で主要な、特定の種類のアミノ酸と併せた、本発明のＸＴＥＮの非反復的特徴が、ＸＴＥＮおよび結果として得られるターゲティングコンジュゲート組成物の、物理化学的および生物学的特性の増強のうちの１または複数を付与することが確立されている。したがって、表１０および１１の配列は、例示的なものであり、限定的であることを意図するものではないが、表１０および１１の配列に対する、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列は、ＸＴＥＮの特性の増強を呈示する。これらの特性の増強は、宿主細胞内のＸＴＥＮタンパク質の高度の発現、ＸＴＥＮをコードする遺伝子の遺伝子安定性の増大を含み、結果として得られるターゲティングコンジュゲートの、ＸＴＥＮにコンジュゲートさせていない反復配列を有する、ペイロードまたはタンパク質と比較して、より高度な可溶性、凝集する傾向の低下、および薬物動態の増強を付与する。これらの特性の増強は、製造効率の増大、最終生成物の均一性の増大、資材費用の低廉化を可能とし、かつ／または、場合によって、１００ｍｇ／ｍｌを超える、極高タンパク質濃度を含有する、対象組成物の医薬調製物の製剤化を容易とする。加えて、コンジュゲートのＸＴＥＮポリペプチド配列は、哺乳動物に投与された場合の免疫原性を低減するか、または実質的に消失させるために、内部反復性が低度となるように設計する。大部分が、グリシン、セリン、およびグルタミン酸など、３つのアミノ酸だけに限定された、短い反復モチーフからなるポリペプチド配列は、これらの配列内の、予測されるＴ細胞エピトープの非存在にも拘らず、哺乳動物に投与されると、比較的高度な抗体力価を結果としてもたらしうる。タンパク質凝集物、架橋免疫原、および反復炭水化物を含む、反復エピトープを伴う免疫原は、高度に免疫原性であり、例えば、Ｂ細胞の活性化を引き起こす、Ｂ細胞受容体の架橋を結果としてもたらしうることが示されているので、これは、ポリペプチドの反復的性質により引き起こされている可能性がある（Johansson,  J.ら（２００７年）、Vaccine、２５巻：１６７６〜８２頁；Yankai,  Z.ら（２００６年）、Biochem  Biophys  Res  Commun、３４５巻：１３６５〜７１頁；Hsu,  C.  T.ら（２０００年）、Cancer  Res、６０巻：３７０１〜５頁）；Bachmann  MFら、Eur  J  Immunol.（１９９５年）、２５巻（１２号）：３４４５〜３４５１頁）。
【０２４０】
２．例示的な配列モチーフおよびＸＴＥＮセグメント
本発明は、融合およびコンジュゲーションパートナーとして使用されるＸＴＥＮであって、複数単位の短い配列またはモチーフを含み、モチーフのアミノ酸配列が実質的に非反復的であるＸＴＥＮを包摂する。非反復的特性は、ＸＴＥＮ配列を創出するように多量体化される、配列モチーフの小規模なライブラリーを使用する「構成単位」法を使用してもなお、満たすことができる。ＸＴＥＮ配列は、４つの異なる種類の配列モチーフという、少数の複数単位からなりうるが、モチーフ自体が、一般に、非反復的アミノ酸配列からなるため、全般的なＸＴＥＮ配列は、配列を実質的に非反復的とするように設計される。
【０２４１】
本開示の対象組成物における使用のためのＸＴＥＮの長さの範囲は、限定的なものではなく、ＸＴＥＮは、３６〜１５００個またはそれを超える、任意の数のアミノ酸残基を含むことが可能であり、本発明の実施形態により包摂されうることが具体的に意図される。
【０２４２】
一実施形態では、ＸＴＥＮは、アミノ酸残基の少なくとも９０％、または９１％、または９２％、または９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または少なくとも９９％が、実質的に非反復的な配列内に配置された、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される、４〜６種類のアミノ酸である配列を含む。一実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される、４、５、または６種類のアミノ酸から構成される。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または９１％、または９２％、または９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または少なくとも９９％は、非重複配列モチーフからなり、モチーフの各々は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される、４〜６種類のアミノ酸からなる、１２個のアミノ酸残基を有し、全長ＸＴＥＮ内のいずれか１つのアミノ酸種類の含量は、４０％、または３０％、または約２５％、または約１７％、または約１２％、または約８％を超えない。さらに他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％は、非重複配列モチーフからなり、モチーフの各々は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる１２個のアミノ酸残基を有する。
【０２４３】
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも約１００〜約１２００個ずつのアミノ酸残基、または累積的に、約２００〜約２０００個のアミノ酸残基の、１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、もしくは４つの、実質的に非反復的なＸＴＥＮ配列を含むターゲティングコンジュゲート組成物であって、配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％が、表９のアミノ酸配列から選択される、複数単位の、４つまたはそれを超える非重複配列モチーフからなるターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。本段落の上記で記載した実施形態では、ＸＴＥＮに組み込まれる、モチーフまたはモチーフの一部は、少なくとも３６個、少なくとも４２個、少なくとも７２個、少なくとも１４４個、少なくとも２８８個、少なくとも５７６個、少なくとも８６４個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個のアミノ酸残基、または任意の中間の長さのＸＴＥＮを達成するように、本明細書で記載される方法を使用して、選択およびアセンブルすることができる。対象組成物のＸＴＥＮへの組込みに有用な、ＸＴＥＮ配列の非限定的な例を、表１０および１１に提示する。表１０または表１１に関して言及される、指定された配列が、それぞれの表において明示された配列を有するのに対し、例えば、ＡＥ１４４配列への一般化された言及は、１４４個のアミノ酸残基を有する、任意のＡＥ配列を包摂することを意図するか、または、例えば、ＡＧ８６４配列への一般化された言及は、８６４個のアミノ酸残基を有する、任意のＡＧ配列を包摂することを意図することなどが意図される。
【表９】
2018500049.tif 000056
【表１０−１】
2018500049.tif 000057
【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１０−１３】
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【表１０−１４】
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【表１０−１５】
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【表１０−１６】
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【０２４４】
ＸＴＥＮが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される、４、５、もしくは６種類のアミノ酸からなる、そのアミノ酸の１００％未満、または表９の配列モチーフもしくは表１０および表１１のＸＴＥＮ配列からなる配列の１００％未満を有する、一部の実施形態では、ＸＴＥＮの他のアミノ酸残基は、他の１４個の天然Ｌアミノ酸のいずれかから選択されるが、ＸＴＥＮ配列が、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の親水性アミノ酸を含有するように、親水性アミノ酸から優先的に選択される。グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）以外の、個々のアミノ酸またはアミノ酸の短い配列を、ＸＴＥＮに組み込んで、コードヌクレオチドによる制限部位の組込みを可能とするか、あるいはシステインもしくはリシンアミノ酸の組入れ、または切断配列の組込みにより、ペイロード構成要素への連結を容易とすることなどに必要とされる特性を達成することができる。下記でより完全に記載される、例示的な一実施形態として、ＸＴＥＮは、１〜約２０個、または１〜約１５個、または１〜約１０個、または１〜約５個、または９つ、または３つ、または２つのシステイン残基、または単一のシステイン残基を組み込むが、この場合、反応性のシステインを、本明細書で記載される、架橋剤またはターゲティング部分または他のＸＴＥＮへの連結のために活用する。これらの実施形態では、リシンおよび／またはシステイン残基の組込みは、その他の点では、本明細書で記載される、ＸＴＥＮの根本的な特性に影響を及ぼさない。リシンおよび／またはシステイン残基を伴う、前出のＸＴＥＮについての具体的な実施形態を、表１１に明示する。グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）でないＸＴＥＮアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列を通して散在させるか、配列モチーフ内もしくは配列モチーフ間に配置するか、あるいはＮもしくはＣ末端において、またはその近傍などにおける、ＸＴＥＮ配列の、１または複数の短い連なりにおいて濃縮する。疎水性アミノ酸は、ポリペプチドに構造を付与するので、本発明は、コンジュゲーション構築物内で活用されるＸＴＥＮ内の疎水性アミノ酸の含量が、典型的に、ＸＴＥＮに組み込まれる全アミノ酸の５％未満、または２％未満、または１％未満であることを前提とする。ＸＴＥＮの構築において選択されない疎水性残基は、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンを含む。加えて、ＸＴＥＮ配列が、以下のアミノ酸：メチオニン（酸化を回避するため）、アスパラギン、およびグルタミン（脱アミド化を回避するため）の、５％未満もしくは４％未満もしくは３％未満もしくは２％未満もしくは１％未満を含有するか、または含有しないように設計することができる。他の実施形態では、コンジュゲーション構築物内で使用されるＸＴＥＮ構成要素内の、メチオニンおよびトリプトファンのアミノ酸含量は、典型的に、５％未満、または２％未満、最も好ましくは１％未満である。他の実施形態では、対象のＸＴＥＮコンジュゲートのＸＴＥＮは、全ＸＴＥＮ配列の１０％未満の、正の電荷を伴うアミノ酸残基、または約７％未満、または約５％未満、または約２％未満の、正の電荷伴うアミノ酸残基を有する配列を有し、メチオニンおよびトリプトファン残基の合計は、全ＸＴＥＮ配列の２％未満であり、アスパラギンおよびグルタミン残基の合計は、全ＸＴＥＮ配列の５％未満であろう。
【０２４５】
３．システイン操作ＸＴＥＮ配列およびリシン操作ＸＴＥＮ配列
別の態様では、本発明は、対象組成物への組込みのためのＸＴＥＮであって、規定された数のシステインまたはリシン残基を組み込んだＸＴＥＮである、それぞれ、「システイン操作ＸＴＥＮ」および「リシン操作ＸＴＥＮ」を提供する。システインのチオール基またはリシンのイプシロンアミノ基と、操作ＸＴＥＮにコンジュゲートさせる、ペイロード、ターゲティング部分、または架橋剤上の反応性基との間のコンジュゲーションを可能とするように、規定された数のシステインおよび／またはリシン残基を伴うＸＴＥＮを提供することは、本発明の目的である。前出についての一実施形態では、本発明のリシン操作ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮのＣ末端またはその近傍に優先的に配置される、単一のリシン残基を有する。前出についての別の実施形態では、本発明のシステイン操作ＸＴＥＮは、１〜約２０個の間のシステイン残基、または約１〜約１０個のシステイン残基、または約１つ〜約５つのシステイン残基、または１つ〜約３つのシステイン残基、または９つのシステイン残基、または３つのシステイン残基、または２つのシステイン残基、または代替的に単一のシステイン残基だけを有する。前出のリシンおよび／またはシステイン含有ＸＴＥＮの実施形態を使用して、対象における疾患の処置において有用である、対象のターゲティングコンジュゲート組成物を創出するのに使用される、ペイロード、ターゲティング部分、１または複数のＸＴＥＮ（架橋剤またはペイロードまたはターゲティング部分を連結している場合がある）を含むコンジュゲートを、構築することができる。一実施形態では、システイン操作ＸＴＥＮは、ＰＣＭを切断することが可能なプロテアーゼと共局在化する標的組織に近接すると、連結された個々のターゲティングコンジュゲート融合タンパク質が放出されるように、ＰＣＭを使用して、個々のターゲティングコンジュゲート融合タンパク質を連結しうる骨格担体として用いられるであろう。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物の、全般的な分子量およびサイズを増大させるために、システイン操作ＸＴＥＮを使用して、多価構築物を結果としてもたらす、共通の架橋剤に連結された、２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるＸＴＥＮを保有する構成を作製する。対象のターゲティングコンジュゲート組成物内で、操作ＸＴＥＮ構成要素に連結される、ペイロード、ターゲティング部分、または別のＸＴＥＮの最大の分子数は、ＸＴＥＮに組み込まれる、反応性の側鎖基（例えば、末端のアミノまたはチオール）を伴う、リシン、システイン、または他のアミノ酸の数により決定されることが理解されるであろう。
【０２４６】
一実施形態では、本発明は、システイン操作ＸＴＥＮ遺伝子を創出するように、ＸＴＥＮ（例えば、表１０のＸＴＥＮ）の１または複数のアミノ酸をコードするヌクレオチドを、システインアミノ酸で置きかえた、システイン操作ＸＴＥＮを提供する。別の実施形態では、本発明は、システイン操作ＸＴＥＮ遺伝子を創出するように、１または複数のシステインアミノ酸をコードするヌクレオチドを、ＸＴＥＮコード遺伝子に挿入した、システイン操作ＸＴＥＮを提供する。他の場合、１または複数のシステインをコードするコドンを含む、約９〜約１４アミノ酸の、１または複数のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドを、インフレームで、ＸＴＥＮモチーフまたは全長ＸＴＥＮをコードする他のオリゴと連結して、システイン操作ＸＴＥＮ遺伝子を創出する。ＸＴＥＮ遺伝子の創出時に、１または複数のシステインを、ＸＴＥＮ配列に挿入する、前出についての一実施形態では、本明細書で記載される方法を使用して、または標準的な分子生物学法により、システインをコードするヌクレオチドを、ＸＴＥＮ内で使用されるアミノ酸をコードするコドンに連結して、規定された位置においてシステインを伴う、システイン−ＸＴＥＮモチーフを創出し、その後、モチーフを、全長システイン操作ＸＴＥＮをコードする遺伝子にアセンブルすることができる。例えば、単一のシステインをコードするヌクレオチドを、表９から選択されるモチーフをコードするＤＮＡに付加するような場合、結果として得られるモチーフは、１３アミノ酸を有するが、２つのシステインを組み込むならば、１４アミノ酸を有するモチーフなどが結果としてもたらされるであろう。他の場合、システインモチーフは、規定された位置において、システインをコードするヌクレオチドを、ＸＴＥＮ内で使用される、１または複数のアミノ酸残基（例えば、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ａ）をコードするヌクレオチドに連結することにより、新たに創出し、所定の長さおよび数のシステインアミノ酸とし、その後、コードモチーフを、他のＸＴＥＮをコードするモチーフ配列と共に、本明細書で記載される、全長ＸＴＥＮをコードする遺伝子にアニールさせることによりアセンブルすることができる。リシン操作ＸＴＥＮを活用して、本発明のコンジュゲートを作製する場合は、上記で記載した手法を、システインの代わりにリシンをコードするコドンで実施する。こうして、前出により、約９〜１４個のアミノ酸残基を含み、かつ、１または複数の反応性のアミノ酸、すなわち、システインまたはリシンを有しうる、新たなＸＴＥＮモチーフを創出することができる。単一のシステインまたはリシンを含有する操作ＸＴＥＮにおける使用に適するモチーフの非限定的な例は、
ＧＧＳＰＡＧＳＣＴＳＰ
ＧＡＳＡＳＣＡＰＳＴＧ
ＴＡＥＡＡＧＣＧＴＡＥＡＡ
ＧＰＥＰＴＣＰＡＰＳＧ
ＧＧＳＰＡＧＳＫＴＳＰ
ＧＡＳＡＳＫＡＰＳＴＧ
である。しかし、本発明は、ＸＴＥＮへの組込みのための異なる長さのモチーフを想定する。
【０２４７】
一実施形態では、本開示は、ペイロード、ターゲティング部分、または別のＸＴＥＮへの連結のための、単一のＣ末端リシンを伴うＸＴＥＮ配列を提示する。別の実施形態では、本開示は、１〜９個のシステイン残基を伴うＸＴＥＮであって、複数のシステインを伴う配列を、ＸＴＥＮの全長にわたり散在させたＸＴＥＮを提示する。１または複数のシステインまたはリシン残基を伴うＸＴＥＮをコードする遺伝子を、既存のＸＴＥＮモチーフまたはセグメントから構築するような場合、遺伝子は、長さの短いＸＴＥＮおよび長さの長いＸＴＥＮの両方をコードする、既存の「構成単位」ポリヌクレオチド：例えば、ＡＥ３６、ＡＥ４８、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ４３２、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＭ４８、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＧ８６４であって、インフレームで、システインおよび／またはリシン含有モチーフをコードするヌクレオチドと融合させうる、「構成単位」ポリヌクレオチドを連結することにより、設計し、組み立てることができ、代替的に、従来のＰＣＲ法または本明細書で記載されるＰＣＲ法を使用して、システインおよび／またはリシンコードヌクレオチドを、ＸＴＥＮ配列をコードする既存の遺伝子にＰＣＲ増幅することができる。例えば、既存の全長ＸＴＥＮ遺伝子を、１または複数の反応性のシステインまたはリシン残基をコードするヌクレオチドで修飾する場合、システインまたはリシンをコードし、ＸＴＥＮの１または複数の短い配列に対する部分的な相同性を呈示し、それらとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを創出する結果として、システインまたはリシンコドンによる、ＸＴＥＮ遺伝子の既存のコドンの組換えイベントおよび置換をもたらすことができる。システインまたはリシンをコードするオリゴヌクレオチドは、公知のＸＴＥＮ配列に沿った異なる地点において、所与の配列セグメントとハイブリダイズするように設計して、ＸＴＥＮコード遺伝子へのそれらの挿入を可能とすることができる。こうして、本発明は、ＸＴＥＮ配列内の制限部位の選択と、所与の位置に適切であり、システインまたはリシンをコードするオリゴヌクレオチドの設計であって、同じＸＴＥＮ配列内の複数の挿入を結果としてもたらす、オリゴヌクレオチドの設計の使用を含む設計とにより、ＸＴＥＮ配列内の異なる位置に、システインまたはリシンを挿入した、複数ＸＴＥＮ遺伝子構築物を創出しうることを想定する。ＸＴＥＮの公知の配列、および本発明の方法の適切な使用を検討する中で、１または複数のこのようなオリゴヌクレオチドを設計および選択することにより、全長ＸＴＥＮに挿入される、置換された反応性のシステインまたはリシン残基の潜在的な数を推定し、次いで、結果として得られたＸＴＥＮ遺伝子をシークェンシングすることにより確認することができる。
【０２４８】
システイン操作ＸＴＥＮおよびリシン操作ＸＴＥＮの非限定的な例を、表１１に提示する。こうして、一実施形態では、本発明は、最適にアラインされる場合、表１１に明示された配列からなる群より選択される配列または配列の断片に対する、少なくとも約８０％の配列同一性、もしくは少なくとも約９０％、もしくは約９１％、もしくは約９２％、もしくは約９３％、もしくは約９４％、もしくは約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有するか、またはそれと同一であるＸＴＥＮ配列を提供する。しかし、システインまたはリシン残基を包摂するＸＴＥＮを創出する、システインまたはリシン操作法の適用を、前出の実施形態の正確な組成または組成同一性の範囲に制約することが意図されるわけではない。当業者により察知される通り、ＸＴＥＮ内に組み込まれるシステインまたはリシン残基の正確な位置および数は、記載される通り、本発明から逸脱しない限り、変動させることができる。
【表１１−１】
2018500049.tif 000073
【表１１−２】
2018500049.tif 000074
【表１１−３】
2018500049.tif 000075
【表１１−４】
2018500049.tif 000076
【表１１−５】
2018500049.tif 000077
【表１１−６】
2018500049.tif 000078
【表１１−７】
2018500049.tif 000079
【表１１−８】
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【表１１−９】
2018500049.tif 000081
【０２４９】
別の態様では、本開示は、ターゲティング部分のＣ末端において、融合タンパク質に組み込まれ、架橋剤および結果として得られるＴＭ−リンカーの、ＣＣＤのＮ末端、ＸＴＥＮのＮ末端、または表１１のシステイン操作ＸＴＥＮのシステイン残基へのコンジュゲーションを可能とするように設計された、単一のシステイン残基を含有する、規定された長さの、いくつかのＸＴＥＮリンカーを提示する。ターゲティング部分の、ＣＣＤまたは他のＸＴＥＮへのコンジュゲーションのために活用される（よって、リンカーとしてのそれらの役割）反応性チオールの導入は、対象のターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチド構成要素、すなわち、ＣＣＤ、ＰＣＭ、およびＸＴＥＮに融合させたターゲティング部分を含む、単一の融合タンパク質を創出する代替法を可能とする。場合によって、ＸＴＥＮリンカーは、組成物の加工中のターゲティング部分−リンカー融合タンパク質の回収を可能とするＨ８タグと共に設計される。ＸＴＥＮリンカーの非限定的な例を、表１２に提示し、このようなターゲティング部分−リンカーを含む、例示的なターゲティングコンジュゲート構築物を、下記の実施例に提示する。
【表１２】
2018500049.tif 000082
【０２５０】
本発明の設計、選択、および調製法は、求電子官能基と反応性である、操作ＸＴＥＮの創出を可能とする。本明細書で提示される対象のコンジュゲートを作製する方法は、ペイロード分子またはターゲティング部分分子を、指示された部位において、定量的な方式で付加した、ターゲティングコンジュゲート組成物の創出を可能とする。ペイロード、ターゲティング部分、および他のＸＴＥＮは、下記でより完全に記載される通り、ＣＣＤ、ＸＴＥＮのＮまたはＣ末端に、チオール反応性試薬により、システイン操作ＸＴＥＮに、アミン反応性試薬により、本開示のリシン操作ＸＴＥＮに、およびＣＣＤまたはＸＴＥＮのＮ末端のアルファアミノ基に、部位特異的かつ効率的に連結することができ、次いで、例えば、実施例でより具体的に記載される、非限定的な方法を使用して、精製され、特徴付けられる。
【０２５１】
４．配列の長さ
別の態様では、本発明は、組成物への組込みのための、様々な長さのＸＴＥＮであって、ＸＴＥＮ配列の長さが、組成物内で達成される特性または機能に基づき選び出されるＸＴＥＮを提供する。例えば、ＸＴＥＮは、組成物内の担体として使用されるが、その場合、本発明は、非反復的で、非構造化ポリペプチドの長さを増大させることにより、ＸＴＥＮの非構造化性が増強され、これに対応して、ＸＴＥＮ担体を含む構築物の物理化学的および薬物動態特性が増強されるという発見を利用する。一般に、組成物に組み込まれた累積長さが約４００残基より長い、単量体または多量体としてのＸＴＥＮは、短い累積長さ、例えば、約２８０残基より短い累積長さと比較して、長い半減期を結果としてもたらす。実施例でより完全に記載される通り、ＸＴＥＮの長さの相応な増大は、単一ファミリーの配列モチーフ（例えば、表９の４つのＡＥモチーフ）の順序の反復により創出される場合であってもなお、長さがより短いＸＴＥＮと比較して、ＧＯＲアルゴリズムにより決定される、高百分率のランダムコイルの形成、またはチョウ−ファスマンアルゴリズムにより決定される、アルファ−ヘリックスもしくはベータシートの含量の低減を伴う配列を結果としてもたらす。加えて、非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さを増大させることは、実施例において記載される通り、配列の長さが短い、非構造化ポリペプチドパートナーを伴うポリペプチドと比較して、終末半減期が大幅に延長された構築物を結果としてもたらす。ＸＴＥＮが、主に担体として用いられる、一部の実施形態では、本発明は、２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるＸＴＥＮを含むターゲティングコンジュゲート組成物であって、ＸＴＥＮタンパク質の、ＸＴＥＮ配列の累積の長さが、約１００、２００、４００、５００、６００、８００、９００、または１０００〜約３０００アミノ酸残基を超え、構築物が、対象に投与されると、ＸＴＥＮに連結されておらず、同等の用量で投与されるペイロードと比較して、薬物動態特性の増強を呈示するターゲティングコンジュゲート組成物を包摂する。前出についての一実施形態では、２つまたはそれを超えるＸＴＥＮ配列は各々、表１０、表１１のいずれか１つから選択される配列に対する、少なくとも約８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％、またはそれを超える同一性を呈示し、存在する場合、担体配列の残りは、少なくとも９０％の親水性アミノ酸を含有し、全般的な配列の約２％未満は、疎水性または芳香族アミノ酸またはシステインからなる。ターゲティングコンジュゲート組成物の薬物動態特性の、組成物に連結されていないペイロードと比較した増強については、下記でより完全に記載する。
【０２５２】
５．正味電荷
他の実施形態では、ＸＴＥＮポリペプチドは、ＸＴＥＮ配列内の、正味電荷を伴い、低百分率の疎水性アミノ酸を含有するか、または疎水性アミノ酸を含有しないアミノ酸残基の組込みにより付与される非構造化特徴を有する。全般的な正味電荷および正味電荷密度は、ＸＴＥＮ配列内の、正または負に帯電したアミノ酸の含量を改変することにより制御され、ポリペプチド内のアミノ酸であって、これらの残基の電荷であり、反対の電荷により相殺される電荷を超えた帯電状態に寄与するアミノ酸の百分率として表されることが典型的な正味電荷を伴う。一部の実施形態では、コンジュゲートのＸＴＥＮの正味電荷密度は、残基１つ当たりの電荷＋０．１を上回る場合もあり、−０．１を下回る場合もある。本明細書における、タンパク質またはペプチドの「正味電荷密度」とは、タンパク質内のアミノ酸の総数で除した正味電荷を意味する。他の実施形態では、ＸＴＥＮの正味電荷は、約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、もしくは約２０％、またはそれを超えうる。正味電荷に基づくと、一部のＸＴＥＮは、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、なおまたは６．５の等電点（ｐＩ）を有する。一実施形態では、ＸＴＥＮは、１．５〜４．５の間の等電点を有し、生理学的条件下で、負の正味電荷を保有するであろう。
【０２５３】
ヒトまたは動物における大半の組織および表面は、負の正味電荷を有するので、一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列を、負の正味電荷を有するように設計して、ＸＴＥＮを含有する組成物と、血管、健常組織、または多様な受容体など、多様な表面との間の非特異的相互作用を最小化する。特定の理論に束縛されずに述べると、ＸＴＥＮは、負の正味電荷を個別に保有し、ＸＴＥＮポリペプチドの配列にわたり分布する、ＸＴＥＮポリペプチドの個々のアミノ酸の間の静電性反発に起因して、開放型のコンフォメーションを取りうる。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列を、セリン、アラニン、トレオニン、プロリンまたはグリシンなど、他の非帯電残基により隔てられた、少なくとも９０％〜９５％の帯電残基により設計し、これにより、より均一な電荷の分布、良好な発現、または精製挙動をもたらす。ＸＴＥＮの長い配列の長さにおける、負の正味電荷の、このような均一の分布はまた、ポリマーの非構造化コンフォメーションにも寄与し、これは、流体力学半径の効果的な増大を結果としてもたらしうる。好ましい実施形態では、対象のＸＴＥＮの負の電荷を、グルタミン酸残基の組込みにより付与する。一般に、グルタミン酸残基には、ＸＴＥＮ配列にわたり、均一の間隔を置く。場合によって、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ  ２０ｋＤａ当たり、約１０〜８０、または約１５〜６０、または約２０〜５０個のグルタミン酸残基を含有することが可能であり、これは、帯電残基を伴うＸＴＥＮであって、酷似するｐＫａを有するＸＴＥＮを結果としてもたらすことができ、これにより、生成物の電荷均質性を増大させ、その等電点を明確にし、結果として得られるターゲティングコンジュゲート組成物の物理化学的特性を増強し、こうして、精製手順を単純化することができる。例えば、負の電荷を伴うＸＴＥＮが所望される場合、ＸＴＥＮは、グルタミン酸の組込みに起因して、約１７％の正味電荷を有する、ＡＥファミリー配列だけから選択される場合もあり、所望の程度の正味電荷をもたらすように、表９の、様々な比率のグルタミン酸含有モチーフを含む場合もある。一実施形態では、表１０のＸＴＥＮ配列を、さらなるグルタミン酸残基を含むように修飾して、所望の負の正味電荷を達成することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ配列が、約１％、２％、４％、８％、１０％、１５％、１７％、２０％、２５％、なおまたは約３０％のグルタミン酸を含有するＸＴＥＮを提供する。場合によって、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ  ２０ｋＤａ当たり、約１０〜８０、または約１５〜６０、または約２０〜５０個のグルタミン酸残基を含有することが可能であり、これは、帯電残基を伴うＸＴＥＮであって、酷似するｐＫａを有するＸＴＥＮを結果としてもたらすことができ、これにより、生成物の電荷均質性を増大させ、その等電点を明確にし、結果として得られるＸＴＥＮコンジュゲート組成物の物理化学的特性を増強し、こうして、精製手順を単純化することができる。一実施形態では、本発明は、負の正味電荷を達成するために、グルタミン酸に加えて、最大で５％のアスパラギン酸残基の、ＸＴＥＮへの組込みを想定する。
【０２５４】
特定の理論に束縛されずに述べると、ターゲティングコンジュゲート組成物のＸＴＥＮであって、高度な負の正味電荷を伴うＸＴＥＮは、血管、組織、または多様な受容体など、多様な、負に帯電した表面との非特異的相互作用が小さいことが期待され、これはさらに、能動的クリアランスの低減に寄与するであろう。逆に、ターゲティングコンジュゲート組成物のＸＴＥＮであって、正味電荷が低度な（または正味電荷を伴わない）ＸＴＥＮは、表面との高度な相互作用を有し、これにより、会合したコンジュゲートの、血管系または組織における活性が強化されうると考えられる。
【０２５５】
他の実施形態では、正味電荷が所望されない場合、ＸＴＥＮは、例えば、正味電荷を有さない、表９のＡＧモチーフなど、ＡＧ  ＸＴＥＮ構成要素から選択することができる。別の実施形態では、ＸＴＥＮは、所与の使用に最適とみなされる正味電荷を有するか、または所与の物理化学的特性を維持するために、様々な比率のＡＥおよびＡＧモチーフを含みうる。
【０２５６】
本発明の組成物のＸＴＥＮは一般に、正に帯電したアミノ酸を有さないか、または低含量の、正に帯電したアミノ酸を有する。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、約５％未満、または約２％未満、または約１％未満の、正の電荷を伴うアミノ酸残基を有しうる。しかし、本発明は、リシンなど、正の電荷を伴う規定された数のアミノ酸を、ＸＴＥＮに組み込んで、リシンのイプシロンアミンと、ＸＴＥＮ骨格にコンジュゲートさせる、ペイロード上の反応性基または架橋剤との間のコンジュゲーションを可能とする構築物を想定する。前出についての一実施形態では、対象のコンジュゲートのＸＴＥＮは、約１〜約１０個の間のリシン残基、または約１つ〜約５つのリシン残基、または約１つ〜約３つのリシン残基、または、代替的に、単一のリシン残基だけを有する。前出のリシン含有ＸＴＥＮを使用して、ターゲティング部分、または対象における状態の処置に有用なペイロードを含むコンジュゲートであって、ＸＴＥＮ構成要素に連結されるペイロード薬剤の分子の最大数が、反応性の側鎖基（例えば、末端のアミン）を伴うリシンであって、ＸＴＥＮに組み込まれたリシンの数により決定されるコンジュゲートを構築することができる。
【０２５７】
６．低免疫原性
別の態様では、本発明は、低度の免疫原性を有するか、または実質的に非免疫原性である、ＸＴＥＮ組成物を提供する。いくつかの因子、例えば、非反復配列、非構造化コンフォメーション、高度な可溶性、低度な自己凝集または自己凝集の欠如、配列内の低度なタンパク質分解性部位またはその欠如、およびＸＴＥＮ配列内の低度なエピトープまたはその欠如が、ＸＴＥＮの低免疫原性に寄与しうる。
【０２５８】
コンフォメーションエピトープは、タンパク質抗原の、複数の非連続アミノ酸配列からなる、タンパク質表面の領域により形成される。タンパク質の正確なフォールディングは、これらの配列を、十分に規定された、安定的な空間構成、またはエピトープに導き、これが、宿主の体液性免疫系により「非自己」と認識される結果として、タンパク質に対する抗体の産生、または細胞媒介性免疫応答の活性化がもたらされうる。後者の場合、個体における、タンパク質に対する免疫応答は、その個体のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性の機能である、Ｔ細胞エピトープの認識により大きく影響される。Ｔ細胞の表面上の、コグネイトのＴ細胞受容体による、ＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の係合は、ＣＤ４分子など、ある特定の他の共受容体の架橋形成と併せて、Ｔ細胞内の活性化状態を誘導しうる。活性化は、サイトカインの放出をもたらし、抗体を産生するＢ細胞など、他のリンパ球をさらに活性化させるか、または完全な細胞性免疫応答としてのキラーＴ細胞を活性化させる。
【０２５９】
ＡＰＣ（抗原提示細胞）の表面における提示のために、所与のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの能力は、いくつかの因子、とりわけ、その一次配列に依存する。一実施形態では、低度の免疫原性は、抗原提示細胞内の抗原プロセシングに抵抗するＸＴＥＮ配列を設計し、かつ／またはＭＨＣ受容体に十分に結合しない配列を選び出すことにより達成する。本発明は、ＭＨＣ  ＩＩ受容体との結合を低減するほか、Ｔ細胞受容体または抗体の結合のためのエピトープの形成を回避する結果として、低度の免疫原性をもたらすように設計された、実質的に非反復的なＸＴＥＮポリペプチドを提供する。免疫原性の回避は、少なくとも部分的に、ＸＴＥＮ配列のコンフォメーション的可撓性；すなわち、アミノ酸残基の選択および順序に起因する、二次構造の欠如の結果に帰せられうる。例えば、水溶液中または生理学的条件下でコンパクトにフォールディングされるコンフォメーションであって、コンフォメーションエピトープを結果としてもたらしうるコンフォメーションに適応する傾向が小さい配列が、特に興味深い。ＸＴＥＮを含むポリペプチドの投与であって、従来の治療慣行および投与法を使用する投与は一般に、ＸＴＥＮ配列に対する中和抗体の形成を結果としてもたらさず、また、コンジュゲート内のペイロードの免疫原性も低減するであろう。
【０２６０】
一実施形態では、対象ポリペプチド内で活用されるＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細胞により認識されるエピトープを、実質的に含まなくてよい。免疫原性が低度なタンパク質を作出することを目的とする、このようなエピトープの消失については、既に開示されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９８／５２９７６、ＷＯ０２／０７９２３２、およびＷＯ００／３３１７を参照されたい。ヒトＴ細胞エピトープのアッセイについては、記載されている（Stickler,  M.ら（２００３年）、J  Immunol  Methods、２８１巻：９５〜１０８頁）。Ｔ細胞エピトープまたは非ヒト配列を発生させることなく、オリゴマー化されうる、ペプチド配列が特に興味深い。これは、これらの配列の直接的なリピートを、Ｔ細胞エピトープの存在、およびヒトでない、６〜１５マー、特に９マーの配列の発生について調べ、次いで、ＸＴＥＮ配列の設計を変更して、エピトープ配列を消失させるか、または破壊することにより達成する。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＭＨＣ受容体に結合することが予測されるＸＴＥＮのエピトープの数を制限することにより、実質的に非免疫原性である。ＭＨＣ受容体に結合することが可能なエピトープの数の低減により、Ｔ細胞活性化ならびにＴ細胞ヘルパー機能の潜在的可能性の共時的な低減、Ｂ細胞活性化の低減、または抗体産生の上方調節および低減がなされる。低度の予測されるＴ細胞エピトープは、例えば、ＴＥＰＩＴＯＰＥなどのエピトープ予測アルゴリズムにより決定することができる（Sturniolo,  T.ら（１９９９年）、Nat  Biotechnol、１７巻：５５５〜６１頁）。タンパク質内の所与のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Sturniolo,  T.ら（１９９９年）、Nature  Biotechnology、１７巻：５５５頁）において開示されている通り、そのペプチドフレームの、複数の最も一般的なヒトＭＨＣ対立遺伝子への結合についてのＫｄ（解離定数、アフィニティー、オフ速度）の対数である。スコアは、少なくとも２０ｌｏｇ、約１０〜約−１０（１０ｅ１０Ｋｄ〜１０ｅ−１０Ｋｄのバインディングな制約に対応する）の範囲であり、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆなど、ＭＨＣ上のペプチド提示中に、アンカー残基として用いられる、疎水性アミノ酸を回避することにより低減することができる。一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物に組み込まれたＸＴＥＮ構成要素は、約−５、もしくは−６、もしくは−７、もしくは−８、もしくは−９のＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値スコア、または−１０のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアにおいて、予測されるＴ細胞エピトープを有さない。本明細書で使用される場合、「−９」のスコアは、−５のスコアより厳密なＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値である。
【０２６１】
７．流体力学半径の増大
別の態様では、融合パートナーとして有用な対象のＸＴＥＮは、ＸＴＥＮを伴わないペイロードと比較した、対応する、見かけの分子量の増大を、ターゲティングコンジュゲート組成物に付与する特性である、高流体力学半径を有する。実施例４４で詳述される通り、ＸＴＥＮを、治療用タンパク質配列に連結する結果として、ＸＴＥＮに連結されていない治療用タンパク質と比較して、増大した流体力学半径、増大した見かけの分子量、および増大した見かけの分子量係数を有しうる組成物がもたらされる。例えば、半減期の延長が所望される治療適用では、高流体力学半径を伴う、１または複数のＸＴＥＮを、ターゲティングコンジュゲート組成物に融合させるか、または連結した組成物は、組成物の流体力学半径を、約３〜５ｎｍ（約７０ｋＤａの見かけの分子量に対応する）の糸球体小孔サイズを超えて、効果的に大きくしうる（Caliceti、２００３年、Pharmacokinetic  and  biodistribution  properties  of  poly(ethylene  glycol)-protein  conjugates、Adv  Drug  Deliv  Rev、５５巻：１２６１〜１２７７頁）結果として、循環タンパク質の腎クリアランスの低減をもたらし、対応する終末半減期の延長および他の薬物動態特性の増強をもたらす。タンパク質の流体力学半径は、その分子量のほか、形状または稠密性を含む、その構造によっても付与される。特定の理論に束縛されずに述べると、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ内に組み込まれた帯電残基の、個々の電荷の間の静電性反発に起因するほか、配列内の特定のアミノ酸により付与される、固有の可撓性であって、二次構造を付与する潜在的可能性を欠く可撓性のために、開放型のコンフォメーションを採用しうる。ＸＴＥＮポリペプチドの開放型で、延長型の、非構造化コンフォメーションは、典型的な球状タンパク質など、二次または三次構造を有する、同等な配列の長さおよび／または分子量のポリペプチドと比較して、相応の、より大きな流体力学半径を有する。当技術分野では、米国特許第６，４０６，６３２号および同第７，２９４，５１３号において記載されている通り、サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用によるなど、流体力学半径を決定するための方法が周知である。実施例５１は、ＸＴＥＮの長さの増大が、それらが接続されるタンパク質であって、ｓｃＦｖを含むタンパク質に対して、流体力学半径、見かけの分子量、および／または見かけの分子量係数の相応な増大を結果としてもたらし、こうして、見かけの分子量または流体力学半径について所望されるカットオフ値に照らした、ターゲティングコンジュゲート組成物の微調整を許容することを裏付ける。したがって、ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮを伴うターゲティングコンジュゲート組成物を、結果として得られる組成物が、少なくとも約５ｎｍ、または少なくとも約８ｎｍ、または少なくとも約１０ｎｍ、または約１２ｎｍ、または約１５ｎｍ、または約２０ｎｍ、または約３０ｎｍ、またはそれを超える流体力学半径を有しうるように構成することができる。実施例４４で詳述される通り、例えば、２８８、５７６、または８６４個のアミノ酸残基を有するＸＴＥＮに直接連結された（他の成分である、ＣＣＤおよびＰＣＭを伴わずに）抗Ｈｅｒ２のｓｃＦｖは、決定された流体力学半径として、６．７、８．６、および９．９を結果としてもたらしたが、これらの全ては、腎尿細管につて公知の小孔サイズより大きい。前出の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物内のＸＴＥＮにより付与される、大きな流体力学半径は、結果として得られるコンジュゲートのクリアランスの低減、終末半減期の増大、および平均滞留時間の延長をもたらしうる。実施例で記載される通り、ＸＴＥＮ含有組成物の分子量が、サイズ除外クロマトグラフィー解析から導出される場合、低度な二次構造に起因する、ＸＴＥＮの開放型のコンフォメーションは、それらが組み込まれるコンジュゲートの、見かけの分子量の増大を結果としてもたらす。一実施形態では、本発明は、見かけの分子量の増大は、所与の長さの単一のＸＴＥＮを連結することによるだけでなく、相応に短い長さの２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるＸＴＥＮを、下記でより完全に記載され、図面で例示される通り、直鎖状に、または三量体もしくは四量体の分枝状構成として連結することによってもまた達しうるという発見を活用する。一部の実施形態では、ペイロードを含むＸＴＥＮおよび１または複数のＸＴＥＮは、少なくとも約４００ｋＤ、または少なくとも約５００ｋＤ、または少なくとも約７００ｋＤ、または少なくとも約１０００ｋＤ、または少なくとも約１４００ｋＤ、または少なくとも約１６００ｋＤ、または少なくとも約１８００ｋＤ、または少なくとも約２０００ｋＤの、見かけの分子量を呈示する。したがって、ターゲティングコンジュゲート組成物は、組成物の実際の分子量の約１．３倍、または約２倍、または約３倍または約４倍、または約８倍、または約１０倍、または約１２倍、または約１５倍、または約２０倍である、見かけの分子量を呈示する。一実施形態では、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれかの、単離ターゲティングコンジュゲート組成物は、生理学的条件下における見かけの分子量係数であって、約１．３、もしくは約２、もしくは約３、もしくは約４、もしくは約５、もしくは約６、もしくは約７、もしくは約８、もしくは約１０を超えるか、または約１５を超える見かけの分子量係数を呈示する。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、生理学的条件下で、組成物の実際の分子量と比べて、約３〜約２０であるか、または約５〜約１５であるか、または約８〜約１２であるか、または約９〜約１０である、見かけの分子量係数を有する。一般に、対象のターゲティングコンジュゲート組成物の見かけの分子量の増大は、能動的クリアランスの低減、腎クリアランスの低減、および毛細管と静脈との接合部を介する喪失の低減を含む因子の組合せにより、組成物の薬物動態特性を増強する。
【０２６２】
８．ＸＴＥＮの発現を増大させるための組成物
別の態様では、本発明は、対象構築物の融合タンパク質をコードする、ポリ核酸配列を含む構築物と、さらなるコードポリヌクレオチドのヘルパー配列を、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端に付加するか、または対象組成物の融合タンパク質部分をコードする配列の５’末端に付加して、細菌など、形質転換された宿主細胞内の融合タンパク質の発現を増強し、容易とする構築物を作製する方法とを提供する。このようなコードヘルパー配列の例を、表１３および実施例に示す。一実施形態では、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列構築物であって、表１３から選択される配列であり、本明細書で記載されるターゲティングコンジュゲート組成物の融合タンパク質部分のＮ末端に連結された配列に対する、少なくとも約９０％の配列同一性を有するヘルパー配列を含む、ポリヌクレオチド配列構築物を提供する。本発明は、ポリペプチドおよびＸＴＥＮの実質的に均質な調製物を、高発現レベルで作製する方法において有用な構築物をコードする発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、本発明は、ターゲティングコンジュゲート組成物の融合タンパク質部分を含むポリペプチドの、実質的に均質な集団を作製するための方法であって、発酵反応が、６００ｎｍの波長で少なくとも１３０の光学密度に到達するとき、約２ｇ／Ｌを超えるか、または約３ｇ／Ｌを超えるか、または約４ｇ／Ｌを超えるか、または約５ｇ／Ｌを超えるか、または約６ｇ／Ｌを超えるか、または１リットル当たり約７グラム（７ｇ／Ｌ）を超えるポリペプチドが、宿主細胞の粗発現生成物の構成要素として産生されるように、ポリペプチドを発現させるのに有効な条件下で、融合タンパク質配列に融合させたヘルパー配列（ここで、ヘルパー配列は、表１３に明示された配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する）を含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において培養するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、方法は、ポリペプチドのアフィニティータグを、クロマトグラフィー基質に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを、第１のクロマトグラフィー基質に吸着させるステップと；ポリペプチドを溶出させ、回収するステップと；ポリペプチドの第２のアフィニティータグ（存在する場合）を、クロマトグラフィー基質に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを、第２のクロマトグラフィー基質に吸着させるステップと；ポリペプチドを溶出させるステップと；実質的に均質なポリペプチド調製物を回収するステップとをさらに含む。他の実施形態では、本発明は、本明細書で記載される対象組成物の融合タンパク質と、第１および第２のアフィニティータグと、ヘルパー配列とを含むポリペプチドの、実質的に均質な集団を作製するための方法であって、発酵反応が、６００ｎｍの波長で少なくとも１３０の光学密度に到達するとき、ポリペプチド産物を発現させるのに有効な条件下、宿主細胞の乾燥重量１グラム当たり約１０ミリグラム（ｍｇ／ｇ）を超えるか、または少なくとも約１５ｍｇ／ｇ、または少なくとも約２０ｍｇ／ｇ、または少なくとも約２５ｍｇ／ｇ、または少なくとも約３０ｍｇ／ｇ、または少なくとも約４０ｍｇ／ｇ、または少なくとも約５０ｍｇ／ｇの前記ポリペプチドの濃度で、ＸＴＥＮおよび第１および第２のアフィニティータグを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において培養するステップを含む方法を提供する。前出についての一実施形態では、方法は、ポリペプチドの第１のアフィニティータグを、クロマトグラフィー基質に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを、第１のクロマトグラフィー基質に吸着させるステップと；ポリペプチドを溶出させ、回収するステップと；ポリペプチドの第２のアフィニティータグを、クロマトグラフィー基質に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを、第２のクロマトグラフィー基質に吸着させるステップと；ポリペプチドを溶出させるステップと；実質的に均質なポリペプチド調製物を回収するステップとをさらに含む。
【表１３】
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【０２６３】
ＩＶ）ペイロード
本発明は部分的に、１または複数のペイロード分子を含む、ターゲティングコンジュゲート組成物に関する。対象組成物を、生物活性ペプチド、タンパク質、薬理学的に活性の低分子、およびイメージング用低分子ペイロードのほか、これらの種類のペイロードの組合せを含む、多種多様なペイロード分子に連結する結果として、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える種類のペイロードを伴う組成物をもたらしうることが想定される。より特定すると、活性のペイロードは、低分子薬物、生物活性タンパク質（ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、組換えタンパク質、抗体、および糖タンパク質）、ステロイドなどを含むがこれらに限定されない、いくつかの構造クラスのうちの１つに当てはめることができる。一部の実施形態では、本発明は、外因的に投与された治療用および診断用ペイロードの終末半減期の延長のほか、治療指数の改善、ならびにこのようなペイロードにより、それを必要とする対象における健常組織に引き起こされる副作用および損傷の低減のいずれにおいても、長年にわたり感じられてきた必要に取り組む。
【０２６４】
本発明の対象組成物への連結における使用のための、薬理学的に活性のペイロード薬剤の機能的なクラスの非限定的な例は、以下：抗炎症薬、抗がん剤、細胞傷害薬、抗新生物剤、診断剤、造影剤、および放射性イメージング剤のうちのいずれか１または複数でありうる。一部の好ましい実施形態では、ペイロードは、表１４〜１７に明示された薬物からなる群より選択される、１または複数の薬物および／または生物薬剤を含むがこれらに限定されない、細胞傷害剤または抗がん剤である。他の好ましい実施形態では、ペイロードは、表１７に明示された薬物からなる群より選択される、１または複数の薬物を含むがこれらに限定されない、抗炎症剤である。
【０２６５】
ターゲティングコンジュゲート組成物のためには、ペイロードは、天然のアミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、アルデヒド基、ケトン基、アルケン基、アルキン基、アジド基、アルコール基、複素環を含むがこれらに限定されない、適切に反応性の官能基を所有するか、または、代替的に、本明細書で記載されるコンジュゲーション法、もしくは、それ以外に、このような反応性基をコンジュゲートさせるために有用であることが当技術分野で公知の方法のうちのいずれかを使用して、本発明のＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ架橋剤、またはＸＴＥＮ−クリック化学反応の反応物にカップリングさせるのに適する、前出の反応性基のうちの少なくとも１つを含有するように修飾された、薬理学的に活性の薬剤でありうることが、とりわけ想定される。特異的官能性部分およびそれらの反応性については、Organic  Chemistry、２版、Thomas  Sorrell、University  Science  Books、Herndon、VA（２００５年）において記載されている。さらに、反応性基を含有するか、または反応性基を含有するように修飾された任意のペイロードはまた、コンジュゲーション後に、ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ架橋剤、またはＸＴＥＮ−クリック化学反応の反応物が連結される残基も含有することが理解されるであろう。
【０２６６】
ＸＴＥＮポリマー、ＸＴＥＮ架橋剤、またはＸＴＥＮ−クリック化学反応の反応物への共有結合的接続に適する例示的なペイロードは、生物活性タンパク質および薬理学的に活性の低分子薬物を含む。本発明の組成物に適する例示的な薬物は、The  Physician's  Desk  Reference（ＰＤＲ）および米国医薬品局（ＦＤＡ）により維持されているThe  Orange  Book所収の、公式米国薬局方、公式米国ホメオパシー薬局方、または公式国民医薬品集に明示されている通りに見出すことができる。好ましい薬物は、必要とされる反応性の官能基を有する薬物またはコンジュゲーションのための反応性の官能基をもたらすように、たやすく誘導体化することができ、ＸＴＥＮにコンジュゲートさせたときに、非コンジュゲートペイロードの薬理学的活性の少なくとも一部を保持する薬物である。
【０２６７】
１．ペイロードとしての薬物
本発明の一態様では、ターゲティングコンジュゲート組成物のための薬物ペイロードであって、本明細書で記載されるＣＣＤへのコンジュゲーションのための薬物ペイロードは、本明細書で記載されるか、あるいは表１４〜１７に明示された化合物、またはその薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体もしくはアゴニストからなる群より選択される、１または複数の薬物または生物薬剤から選択される、１または複数の薬剤である。一実施形態では、ペイロードは、表１５に明示された薬物からなる群より選択される、１または複数の細胞傷害剤である。一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物への組込みのためのペイロードは、表１７に明示された薬物からなる群より選択される、１または複数の抗炎症剤である。別の実施形態では、ペイロードは、表１６に明示された生物薬剤からなる群より選択される、１または複数の生物薬剤である。一部の実施形態では、薬物を、本明細書で記載される、対象のＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ架橋剤、またはＸＴＥＮ−クリック化学反応の反応物へのコンジュゲーションのための反応性基を導入するように誘導体化する。別の実施形態では、コンジュゲーションのための薬物を、リンカーを、対象への投与の後で、循環または細胞内プロテアーゼにより切断し、これにより、薬物ペイロードを、コンジュゲートから離脱させることが可能な、バリン−シトルリン−ＰＡＢなどであるがこれらに限定されない、切断性リンカーを導入するように誘導体化する。
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１５】
2018500049.tif 000089
【表１６】
2018500049.tif 000090
【表１７】
2018500049.tif 000091
【０２６８】
２．ペイロードとしての核酸
本発明はまた、ペイロードとしての核酸の、ＸＴＥＮコンジュゲート内の使用も想定する。一実施形態では、本発明は、ペイロードが、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム核酸、ＲＮＡ干渉核酸、およびアンチジーン核酸からなる群より選択される、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。当技術分野では、治療薬として使用されるこのような核酸が公知である（Edwin  Jarald、Nucleic  acid  drugs:  a  novel  approach、African  Journal  of  Biotechnology、３巻（１２号）：６６２〜６６６頁、２００４年；Joanna  B.  Opalinska、Nucleic-acid  therapeutics:  basic  principles  and  recent  applications、Nature  Reviews  Drug  Discovery、１巻：５０３〜５１４頁、２００２年）。
【０２６９】
Ｖ）ターゲティング部分およびこのような組成物を作製する方法
１．ターゲティング部分としての抗体断片
本発明は部分的に、１または複数の延長組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」）に組換えにより融合させるか、またはそれらに化学的にコンジュゲートさせた抗体または抗体に由来する抗体断片を含む、ターゲティング部分（ＴＭ）を含む、ターゲティングコンジュゲート組成物に関する。特に、本発明は、疾患、障害、または状態の処置において有用である、このようなＴＭを含み、ターゲティング部分を、疾患、障害、または状態に関与するか、これらと関連するか、またはこれらをモジュレートする、抗原、リガンド、または受容体に方向付けうる一方で、ＸＴＥＮ担体部分を、上記でより完全に記載した通り、ターゲティングコンジュゲート組成物上のペイロード構成要素を介して、所望の半減期または薬学的特性の増強を付与するように設計しうる、単離ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、同じまたは異なる標的に対する結合アフィニティーを有しうる結果として、それぞれ、多価または多特異性ターゲティング部分をもたらす、第２のターゲティング部分または複数のターゲティング部分をさらに含みうる。本発明は、いくつかの異なる形態および構成の、ターゲティング部分およびＸＴＥＮを提供する。本明細書で開示される実施形態のターゲティングコンジュゲート組成物は、本明細書で詳述される特性および／または実施形態の、１もしくは複数または任意の組合せを呈示する。
【０２７０】
一般に、対象のターゲティングコンジュゲート組成物のターゲティング部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて使用されるか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて活用される場合、所与の標的組織または細胞に対する結合特異性を呈示する。２つまたはそれを超えるターゲティング部分を含む、対象のターゲティングコンジュゲート組成物は、それぞれの結合部位に対する結合アフィニティーを伴うターゲティング部分の選択的組込みにより、同じ標的エピトープに結合するように設計することもでき、同じ標的上の異なるエピトープに結合するように設計することもでき、異なる標的に結合するように設計することもできる。
【０２７１】
対象のターゲティングコンジュゲート組成物のターゲティング部分を方向付けうる標的は、サイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、サイトカイン受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、細胞表面受容体または抗原、ホルモンまたは同様の循環タンパク質もしくはペプチド、オリゴヌクレオチド、あるいは酵素基質、あるいは有機低分子、ハプテンまたは薬物を含む。標的は一般に、疾患、障害、または状態と関連する。本明細書で使用される場合、「疾患、障害、または状態と関連する標的」とは、標的を、疾患細胞もしくは非健常組織により発現もしくは過剰発現させること、標的が、疾患、障害、もしくは状態を引き起こすか、もしくはそのメディエーターであるか、もしくはその副産物であること、または標的が一般に、疾患、障害、もしくは状態を伴う対象において、健常組織もしくは対象と比較して、高濃度で見出されること、または標的が、対象における疾患、障害、もしくは状態の領域内もしくはそれと近位のベースライン濃度より高濃度で見出されることを意味する。標的はまた、正常組織と対比した、罹患組織における過剰存在または数量（例えば、ＥＧＦＲ  ＶＩＩＩ変異体）は問わないが、疾患、障害、または状態と関連する、顕著に異なるエピトープ、リガンド、または化学的実体でもありうる。前出の非限定的な例は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の増幅またはそのタンパク質産物の過剰発現に起因して、乳がんの約３０パーセントに関与する標的である、ＨＥＲ２である。乳がんにおけるＨＥＲ２受容体の過剰発現は、疾患再発の増大および予後の悪化と関連し、ヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は、ＨＥＲ２受容体を発現させる乳がんの処置において使用されている（例えば、米国特許第４，７５３，８９４号を参照されたい）。
【０２７２】
一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物の１または複数のターゲティング部分は、腫瘍もしくはがん細胞上で発現することが公知であるか、または腫瘍もしくはがんと別の形で関連する、１または複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）またはリガンドに対する結合アフィニティーを有しうる。腫瘍関連抗原は、当技術分野で公知であり、がんの診断および治療に有効な細胞標的であると一般に考えられている。特に、研究者らは、１または複数の特定の種類のがん細胞の表面上で、１または複数の正常非がん性細胞上と比較して、特異的に発現するＴＡＡを同定しようと努め、抗体ベースの治療を介する破壊のために、がん細胞を特異的にターゲティングする能力を生み出してきた。一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物の１または複数のターゲティング部分は、表２、表３、表４、または表１８の標的から選択されるがこれらに限定されない、標的およびリガンドに対する結合アフィニティーを有する。
【０２７３】
下記でより完全に記載される通り、ターゲティング部分は、抗体、抗体断片、受容体、免疫グロブリン様結合性ドメイン、ペプチド、アプタマーの配列に由来するかまたは基づく場合もあり、完全に合成の場合もある。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、非タンパク質性であり、その非限定的な例は、本明細書に提示される。ターゲティング部分は、１または複数の機能的な抗原結合性部位を含むことが可能であり、後者は、ターゲティング部分を「多特異性」とする。ターゲティング部分の「抗原結合性部位」とは、標的抗原に、抗原結合性部位が由来する親抗体または受容体の結合アフィニティーの少なくとも一部で結合することが可能である抗原結合性部位である。抗原結合性部位はそれ自体、ターゲティング部分内に一体に連結された、１つを超える結合性ドメインからなりうる。「結合性ドメイン」とは、抗原またはリガンドに付着することが可能であるが、抗原またはリガンドに、実際に結合し、かつ／またはこれを封鎖するのに、さらなる結合性ドメインを要請しうるポリペプチド配列を意味する。抗体に由来するＣＤＲは、結合性ドメインの例である。本明細書を通して、「抗体」を、ターゲティング部分（ＴＭ）の原型的な例として使用するが、限定的であることを意図するものではない。
【０２７４】
本発明のターゲティングコンジュゲート組成物の結合アフィニティーおよび／または他の生物学的活性を測定する方法は、本明細書で開示される方法または当技術分野で一般に公知の方法でありうる。加えて、ターゲティング部分の物理化学的特性を測定して、標的結合の程度、可溶性、構造、および安定性の保持を確認することができる。ターゲティング部分の、標的に対する結合特徴の決定を可能とするアッセイであって、結合解離定数（Ｋｄ、Ｋｏｎ、およびＫｏｆｆ）、リガンド−受容体複合体の解離半減期のほか、遊離標的と比較して、結合標的の生物学的活性を変更する、ターゲティング部分の活性（ＩＣ５０値）を含むアッセイを行う。本明細書で使用される「Ｋｄ」という用語は、当技術分野で公知の通り、特定の抗体−抗原間相互作用の解離定数を指すことを意図し、ターゲティング部分の、そのコグネイトリガンドに対する結合アフィニティーのパラメータとして、対象組成物に適用されよう。本明細書で使用される「Ｋｏｎ」という用語は、当技術分野で公知の通り、抗体の、抗原への会合であって、抗体／抗原複合体を形成する会合についての、オン速度定数を指すことを意図する。本明細書で使用される「Ｋｏｆｆ」という用語は、当技術分野で公知の通り、抗体の、抗体／抗原複合体からの解離についての、オフ速度定数を指すことを意図する。「ＩＣ５０」という用語は、リガンドアゴニストの最大の生物学的応答の半分を阻害するのに必要とされる濃度を指し、一般に、競合的結合アッセイにより決定される。
【０２７５】
フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴などの技法を使用して、結合イベントを検出することができる。アッセイは、可溶性の抗原または受容体分子を含む場合もあり、細胞が発現させる受容体への結合を決定する場合もある。このようなアッセイは、増殖、細胞死、アポトーシス、および細胞の遊走についてのアッセイを含む、細胞ベースのアッセイを含みうる。対象組成物の、標的リガンドに対する結合アフィニティーは、米国特許第５，５３４，６１７号において記載されている、チップに結合させた受容体もしくはターゲティング部分を伴うＢｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ、またはＥＬＩＳＡアッセイなどの結合アッセイもしくは競合的結合アッセイ、本明細書の実施例に記載されるアッセイ、ラジオレセプターアッセイ、または当技術分野で公知の他のアッセイを使用してアッセイすることができる。次いで、van  Zoelenら、Trends  Pharmacol  Sciences（１９９８年）、１９巻（１２号）：４８７頁により記載されているスキャッチャード解析などの標準的な方法、または当技術分野で公知の他の方法を使用して、結合アフィニティー定数を決定することができる。加えて、それらが、ターゲティング部分への組入れに適するように、それらが、親抗体またはその一部と同じ結合特異性およびアフィニティーを有するかどうかを決定する競合的ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用して、ターゲティング部分の配列変異体のライブラリーを、対応する天然または親抗体と比較することができる。このようなアッセイの結果を、ターゲティング部分の配列を修飾する繰り返しの工程に続いて、所望の特性を伴う特異的構築物を選択する工程を誘導する、結合アッセイおよび物理化学的特徴付けアッセイにおいて使用することができる。
【０２７６】
本発明は、１または複数のターゲティング部分の、標的リガンドに対する結合アフィニティーが、ＸＴＥＮに結合させていない親抗体または親結合部分の、標的受容体またはリガンドに対するアフィニティーの、少なくとも約１％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％、またはそれを超えうる、単離ターゲティング部分を提供する。一実施形態では、対象のターゲティングコンジュゲート組成物の、１または複数のターゲティング部分と、１または複数の標的リガンドとの間のＫｄは、約１０−４Ｍ未満、代替的に約１０−５Ｍ未満、代替的に約１０−６Ｍ未満、代替的に約１０−７Ｍ未満、代替的に約１０−８Ｍ未満、代替的に約１０−９Ｍ未満、または約１０−１０Ｍ未満、または約１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満である。前出の実施形態では、ターゲティング部分の、標的に対する結合アフィニティーは、「特異的」であると特徴付けられるであろう。本発明は、それぞれのターゲティング部分に対する結合アフィニティーが、独立に、前出の値の範囲の間にありうる、２つまたはそれを超えるターゲティング部分を含む、ターゲティングコンジュゲート組成物を想定する。当業者は、ターゲティングコンジュゲート組成物のＴＭ構成要素が、組成物および／または組成物のペイロードを、組成物が投与される対象において、健常組織もしくは健常細胞と比較して、標的組織もしくは細胞に、選択的もしくは偏向的に送達するか、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合は、標的細胞の近傍に選択的もしくは偏向的に送達するように意図されることを理解するであろう。本段落の前出の実施形態の一部では、対象のターゲティングコンジュゲート組成物の、１または複数のターゲティング部分は、表２、表３、表４、表１８、または表１９の標的に特異的に結合する。
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【表１８−３】
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【０２７７】
一実施形態では、本発明は、単一の標的に結合することが可能なターゲティング部分を含む、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。別の実施形態では、本発明のターゲティング部分は、多特異性であり、ターゲティング部分は、少なくとも２つの異なる標的抗原もしくはリガンド（「二官能性」または「多特異性」）、または同じ標的上の異なるエピトープに特異的に結合する。多価ターゲティング部分は、所望の薬理学的応答を、より良好にもたらすために、それらが、異なる「親」抗体に由来する異種結合性ドメインを組み込むことが可能であり、２つの異なるリガンドまたは抗原に結合しうる、例えば、標的細胞表面上の受容体の二量体化により、細胞シグナル伝達、または、代替的に、細胞死、または１もしくは複数の標的の生物学的機能のモジュレートをもたらすという点で、二官能性となるように設計することができる。細胞死をもたらす多特異性ターゲティング部分は、アポトーシスまたは壊死を誘発することによるのであれ、送達される細胞傷害性ペイロードの効果によるのであれ、特に、腫瘍性疾患の処置において有用であることが期待される。多価の二官能性ターゲティング部分に適すると想定される標的対の非限定的な例は、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２およびＥｒｂ２Ｂ；ＶＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ、ＣＤ２０およびＣＤ３、ＣＤ１３８およびＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ１３８、ＣＤ４０およびＣＤ２０、ＣＤ１３８およびＣＤ４０、ＣＤ３８およびＣＤ４０、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、ＴＮＦαおよびＩＬ−２３、ＴＮＦαおよびＩＬ−１３、ＴＮＦおよびＩＬ−１８、ＴＮＦおよびＩＬ−１２、ＴＮＦおよびＩＬ−１ベータ、ＴＮＦおよびＭＩＦ、ＴＮＦおよびＩＬ−１７、ならびにＴＮＦおよびＩＬ−１５、ＴＮＦおよびＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ、ＩＬ−１３およびＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＬ−２５、ＩＬ−１３およびＴＡＲＣ、ＩＬ−１３およびＭＤＣ、ＩＬ−１３およびＭＩＦ、ＩＬ−１３およびＴＧＦ−β、ＩＬ−１３およびＬＨＲアゴニスト、ＩＬ−１３およびＣＬ２５、ＩＬ−１３およびＳＰＲＲ２ａ、ＩＬ−１３およびＳＰＲＲ２ｂ、ＩＬ−１３およびＡＤＡＭ８、ならびにＴＮＦαおよびＰＧＥ４、ＩＬ−１３およびＰＥＤ２、ＴＮＦおよびＰＥＧ２、ＣＤ１９およびＣＤ２０、ＣＤ８およびＩＬ−６、ＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＮＯ２、ＣＳＰＧおよびＲＧＭ  Ａ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、ＩＬ−１２およびＴＷＥＡＫ、ＩＬ−１３およびＡＤＡＭ８、ＩＬ−１３およびＣＬ２５、ＩＬ−１３およびＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１３およびＩＬ−２５、ＩＬ−１３およびＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＬＨＲアゴニスト、ＩＬ−１３およびＭＤＣ、ＩＬ−１３およびＭＩＦ、ＩＬ−１３およびＰＥＤ２、ＩＬ−１３およびＳＰＲＲ２ａ、ＩＬ−１３およびＳＰＲＲ２ｂ、ＩＬ−１３およびＴＡＲＣ、ＩＬ−１３およびＴＧＦ−β、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β、ＭＡＧおよびＲＧＭ  Ａ、ＮｇＲおよびＲＧＭ  Ａ、ＮｏｇｏＡおよびＲＧＭ  Ａ、ＯＭＧｐおよびＲＧＭ  Ａ、ＲＧＭ  ＡおよびＲＧＭ  Ｂ、Ｔｅ３８およびＴＮＦα、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦαおよびＩＬ−１３、ＴＮＦαおよびＩＬ−１５、ＴＮＦαおよびＩＬ−１７、ＴＮＦαおよびＩＬ−１８、ＴＮＦαおよびＩＬ−１ベータ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２３、ＴＮＦαおよびＭＩＦ、ＴＮＦαおよびＰＥＧ２、ＴＮＦαおよびＰＧＥ４、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦ、ＴＮＦαおよびＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦαおよびＢｌｙｓ、ＴＮＦαおよびＧＰ１３０、ＴＮＦαおよびＣＤ２２；ならびにＴＮＦαおよびＣＴＬＡ−４を含む。
【０２７８】
ターゲティングコンジュゲート組成物のターゲティング部分は、当技術分野で公知の多様なモノクローナル抗体の、１または複数の断片に由来しうる。このようなモノクローナル抗体の非限定的な例は、抗ＴＮＦ抗体（米国特許第６，２５８，５６２号）、抗ＩＬ−１２および／または抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体（米国特許第６，９１４，１２８号）；抗ＩＬ−１８抗体（ＵＳ２００５／０１４７６１０Ａ１）、抗ＲＡＮＫＬ（米国特許第７，４１１，０５０号）、抗Ｃ５、抗ＣＢＬ、抗ＣＤ１４７、抗ｇｐ１２０、抗ＶＬＡ４、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ４０Ｌ、抗Ｉｄ、抗ＩＣＡＭ−１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＤ２、抗ＥＧＦＲ、抗ＴＧＦ−ベータ２、抗Ｅ−セレクチン、抗Ｆａｃｔ  ＶＩＩ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ｆｇｐ、抗ＣＤ１１／１８、抗ＣＤ１４、抗ＩＣＡＭ−３、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２３、抗ベータ２−インテグリン、抗アルファ４ベータ７、抗ＣＤ５２、抗ＨＬＡ  ＤＲ、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２０、抗ＭＩＦ、抗ＣＤ６４（ＦｃＲ）、抗ＴＣＲアルファベータ、抗ＣＤ２、抗Ｈｅｐ  Ｂ、抗ＣＡ  １２５、抗ＥｐＣＡＭ、抗ｇｐ１２０、抗ＣＭＶ、抗ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ３３、抗ＨＬＡ、抗ＶＮＲインテグリン、抗ＩＬ−１アルファ、抗ＩＬ−１ベータ、抗ＩＬ−１受容体、抗ＩＬ−２受容体、抗ＩＬ−４、抗ＩＬ４受容体、抗ＩＬ５、抗ＩＬ−５受容体、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−９、抗ＩＬ−１３、抗ＩＬ−１３受容体、抗ＩＬ−１７、および抗ＩＬ−２３（Presta  LG.、２００５年、Selection,  design,  and  engineering  of  therapeutic  antibodies、J  Allergy  Clin  Immunol.、１１６巻：７３１〜６頁；およびDepartment  of  Pathology、Cambridge  UniversityのウェブサイトのM.Clarkのホームページにおいて、オンラインで公表されている、Clark,  M.、「Antibodies  for  Therapeutic  Applications」、Department  of  Pathology、Cambridge  University、UK、２０００年１０月１５日を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【０２７９】
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ヒトにおける使用について承認された治療用モノクローナル抗体、または疾患、障害、もしくは状態についての、臨床試験もしくは確立された前臨床モデルにおいて有効性が裏付けられた抗体の１または複数の断片に由来する。このようなモノクローナル抗体の非限定的な例を、表１９に提示する。このような治療用抗体は、多くのリンパ腫、白血病、および一部の自己免疫障害の処置において使用される、キメラ抗ＣＤ２０抗体である、リツキシマブ（ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（例えば、米国特許第５，７３６，１３７号を参照されたい）；慢性リンパ球性白血病のための使用について承認されており、濾胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、関節リウマチ、および再発寛解型多発性硬化症については、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅにより開発中の、抗ＣＤ２０抗体である、オファツムマブ；非ホジキンまたはホジキンリンパ腫のために、Ｎｏｖａｒｔｉｓにより開発された抗ＣＤ４０抗体である、ルカツムマブ（ＨＣＤ１２２）（例えば、米国特許第６，８９９，８７９号を参照されたい）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎにより開発された抗体であって、ＣＤ２０を発現させる細胞に結合して、非ホジキンリンパ腫を処置する抗体である、ＡＭＥ−１３３、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．により開発された抗体であって、ＣＤ２０を発現させる細胞に結合して、免疫型血小板減少性紫斑病を処置する抗体である、ベルツズマブ（ｈＡ２０）、低悪性度のＢ細胞リンパ腫の処置のために、Ｉｎｔｒａｃｅｌにより開発された、ＨｕｍａＬＹＭ、および関節リウマチを処置するために、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、オクレリズマブ（例えば、米国特許出願第２００９０１５５２５７号を参照されたい）、乳がんを処置するのに承認されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体であって、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗体である、トラスツズマブ（例えば、米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗Ｈｅｒ２二量体化阻害剤抗体であって、前立腺がん、乳がん、および卵巣がんの処置における使用のための抗体である、ペルツズマブ（例えば、米国特許第４，７５３，８９４号を参照されたい）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現型ＫＲＡＳ野生型転移性結腸直腸がんおよび頭頸部がんを処置するのに使用される抗ＥＧＲＦ抗体であって、ＩｍｃｌｏｎｅおよびＢＭＳにより開発された抗体である、セツキシマブ（米国特許第４，９４３，５３３号；ＰＣＴ  ＷＯ９６／４０２１０を参照されたい）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１、およびＨｅｒ１としてまたも公知である）に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体であって、転移性結腸直腸がんを処置するために、Ａｍｇｅｎにより現在市販されている抗体である、パニツムマブ（米国特許第６，２３５，８８３号を参照されたい）；Ｇｅｎｍａｂにより開発された完全ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であって、頭頸部の扁平上皮癌を処置するために、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を指向する抗体である、ザルツムマブ（例えば、米国特許第７，２４７，３０１号を参照されたい）；Ｂｉｏｃｏｎ、ＹＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｕｂａ、およびＯｎｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｕｒｏｐｅにより開発された、ＥＧＦＲに対するキメラ抗体であって、頭頸部の扁平上皮癌、鼻咽頭がん、および神経膠腫の処置における使用のための抗体である、ニモツズマブ（例えば、米国特許第５，８９１，９９６号；米国特許第６，５０６，８８３号を参照されたい）；Ｂａｙｅｒ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａにより市販されている、ＣＤ５２に対するヒト化モノクローナル抗体であって、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、およびＴ細胞リンパ腫の処置のための抗体である、アレムツズマブ；Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎにより開発された抗ＣＤ３抗体であって、臓器移植を伴う患者における急性拒絶を軽減するのに施される免疫抑制性生物薬剤として使用される抗体である、ムロモナブ−ＣＤ３；細胞傷害性キレート剤であるチウキセタンに連結し、これに放射性同位元素を接続した抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の一部の形態のための処置として、ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧにより開発された抗体である、イブリツモマブチウキセタン；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈにより開発された、抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体であって、急性骨髄性白血病を処置するのに使用される抗体である、ゲムツズマブオゾガマイシン；プラーク形成を伴う、中程度〜重度の乾癬における炎症を制御するのに使用される、Ｂｉｏｇｅｎにより開発された抗ＬＦＡ−３  Ｆｃ融合体である、アレファセプト；血小板膜上のＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する抗体のＦａｂ断片から作製され、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｌｉｌｌｙにより、血小板凝集阻害剤として開発され、冠動脈手順中およびその後で主に使用される、アブシキシマブ；Ｔ細胞のＩＬ−２受容体のα鎖（ＣＤ２５）に対するマウス−ヒトキメラモノクローナル抗体であって、Ｎｏｖａｒｔｉｓにより開発され、臓器移植における拒絶を防止するのに使用される抗体である、バシリキシマブ；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅにより開発された、パリビズマブ；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎにより開発された抗ＴＮＦアルファ抗体である、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、Ａｂｂｏｔｔにより開発された抗ＴＮＦアルファ抗体である、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、Ｃｅｌｌｔｅｃｈにより開発された抗ＴＮＦアルファ抗体である、ＨＵＭＩＣＡＤＥ、Ｉｍｍｕｎｅｘ／Ａｍｇｅｎにより開発された抗ＴＮＦアルファ  Ｆｃ融合体である、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）、Ａｂｇｅｎｉｘにより開発された抗ＣＤ１４７抗体である、ＡＢＸ−ＣＢＬ、Ａｂｇｅｎｉｘにより開発された抗ＩＬ８抗体である、ＡＢＸ−ＩＬ８、Ａｂｇｅｎｉｘにより開発された抗ＭＵＣ１８抗体である、ＡＢＸ−ＭＡ１、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発中の抗ＭＵＣ１である、ペムツモマブ（Ｒ１５４９、９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発された抗ＭＵＣ１抗体である、Ｔｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発された、ＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発された、ＨｕＢＣ−１、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発された、Ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ（ＡＳ１４０７）、Ｂｉｏｇｅｎにより開発された、細胞接着分子α４インテグリンに対するヒト化モノクローナル抗体の、抗アルファ４ベータ１（ＶＬＡ４）および抗アルファ４ベータ７抗体である、ＡＮＴＥＧＲＥＮ（ナタリズマブ）、Ｂｉｏｇｅｎにより開発された抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体である、ＶＬＡ−１  ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎにより開発された抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体である、ＬＴＢＲ  ｍＡｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより開発された抗ＴＧＦ−β２抗体である、ＣＡＴ−１５２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＡｂｂｏｔｔにより開発された抗ＩＬ−１２抗体である、Ｊ６９５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＧｅｎｚｙｍｅにより開発された抗ＴＧＦβ１抗体である、ＣＡＴ−１９２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより開発された抗エオタキシン１抗体である、ＣＡＴ−２１３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．により開発された抗Ｂｌｙｓ抗体である、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−Ｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．により開発された抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体である、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍＡｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗ＶＥＧＦ抗体である、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ、ｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体である、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗組織因子抗体である、Ａｎｔｉ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ（ＡＴＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗ＩｇＥ抗体である、ＸＯＬＡＩＲ（オマリズマブ）、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発されたＭＬＮ−０２抗体（旧称：ＬＤＰ−０２）、Ｇｅｎｍａｂにより開発された抗ＣＤ４抗体である、ＨＵＭＡＸ  ＣＤ４（登録商標）、中外製薬株式会社により開発された抗ＩＬ６Ｒ抗体である、トシリズマブ（tocilizuma）、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎにより開発された抗ＩＬ１５抗体である、ＨＵＭＡＸ−ＩＬ１５、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘにより開発された、ＨＵＭＡＸ−Ｉｎｆｌａｍ、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘおよびＯｘｆｏｒｄ  ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓにより開発された抗ヘパラナーゼＩ抗体である、ＨＵＭＡＸ−Ｃａｎｃｅｒ、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎにより開発された、ＨＵＭＡＸ−Ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｇｅｎｍａｂにより開発された、ＨＵＭＡＸ−ＴＡＣ、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、ＩＤＥＣ−１３１、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ４抗体である、ＩＤＥＣ−１５１（クレノリキシマブ）、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅ���ｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ８０抗体である、ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ２３である、ＩＤＥＣ−１５２、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）抗体、Ｉｍｃｌｏｎｅにより開発された抗イディオタイプ抗体である、ＢＥＣ２、Ｉｍｃｌｏｎｅにより開発された抗ＫＤＲ抗体である、ＩＭＣ−１Ｃ１１、Ｉｍｃｌｏｎｅにより開発された抗ｆｌｋ−１抗体である、ＤＣ１０１、Ｉｍｃｌｏｎｅにより開発された、抗ＶＥカドヘリン抗体、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体である、ＣＥＡ−ＣＩＤＥ（ラベツズマブ）、黒色腫の処置における使用のために、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｅｑｕｉｂｂにより開発された抗ＣＴＬＡ４抗体である、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された抗ＣＤ２２抗体である、Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された、ＡＦＰ−Ｃｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された、ＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された、ＬｋｏＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された、ＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ、Ｍｅｄａｒｅｘにより開発された抗ＣＴＬＡ４抗体である、ＭＤＸ−０１０、Ｍｅｄａｒｅｘにより開発された抗ＣＤ３０抗体である、ＭＤＸ−０６０、Ｍｅｄａｒｅｘにより開発された、ＭＤＸ−０７０、Ｍｅｄａｒｅｘにより開発された、ＭＤＸ−０１８、ＭｅｄａｒｅｘおよびＩｍｍｕｎｏ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓにより開発された抗Ｈｅｒ２抗体である、ＯＳＩＤＥＭ（ＩＤＭ−１）、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂにより開発された抗ＣＤ４抗体である、ＨＵＭＡＸ（登録商標）−ＣＤ４、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂにより開発された抗ＩＬ１５抗体である、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＭｅｄａｒｅｘおよびＣｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊにより開発された抗ＴＮＦａ抗体である、ＣＮＴＯ  １４８、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊにより開発された抗サイトカイン抗体である、ＣＮＴＯ  １２７５、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓにより開発された抗細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体である、ＭＯＲ１０１およびＭＯＲ１０２、Ｍｏｒｐｈ
ｏＳｙｓにより開発された抗線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）抗体である、ＭＯＲ２０１、Ｐｆｉｚｅｒにより開発された抗ＣＴＬＡ−４抗体である、トレメリムマブ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓにより開発された抗ＣＤ３抗体である、ビジリズマブ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓにより開発された抗ガンマインターフェロン抗体である、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓにより開発された抗ａ５β１インテグリンである、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓにより開発された抗ＩＬ−１２である、ＨＵＺＡＦ、Ｘｏｍａにより開発された抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体である、ＩＮＧ−１、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＮｏｖａｒｔｉｓにより開発されたヒト化抗ＩｇＥ抗体である、ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）（オマリズマブ）、ならびにＸｏｍａにより開発された抗ベータ２インテグリン抗体である、ＭＬＮ０１（本段落内の上記で引用された抗体についての参考文献の全ては、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）を含むがこれらに限定されない。上記の抗体の配列は、公表されているデータベース、特許、または参考文献から得ることができる。加えて、このようなモノクローナル抗体配列に由来するＶＨおよびＶＬ配列の非限定的な例を、表１９に提示する。ＶＬおよびＶＨ配列を、ｓｃＦｖまたは他のこのような抗体断片組成物として、組換えにより連結するのに適する例示的なリンカーを、表１９に提示するが、本発明はまた、ｓｃＦｖを作出するための、当技術分野で公知のリンカーの使用も想定する。
【表１９−１】
2018500049.tif 000095
【表１９−２】
2018500049.tif 000096
【表１９−３】
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【表１９−４】
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【表１９−５】
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【表１９−６】
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【表１９−７】
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【表１９−８】
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【表１９−９】
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【表１９−１０】
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【表１９−１１】
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【表１９−１２】
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【表１９−１３】
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【表２０】
2018500049.tif 000108
【０２８０】
（ｉ）例示的なターゲティング部分
以下の節は、例示的なターゲティング部分およびターゲティングコンジュゲート組成物内のそれらの使用についての非限定的なリストおよび記載を提示する。
【０２８１】
抗Ｈｅｒ２：
【０２８２】
一実施形態では、本発明は、単離抗Ｈｅｒ２ターゲティング部分を提供する。「抗Ｈｅｒ２」とは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体（ｅｒｂＢ−２タンパク質としてもまた知られる）の細胞外ドメインに特異的に結合するターゲティング部分であって、抗体、抗体断片、断片二量体、トラップ、およびＨＥＲ２／ｅｒｂＢ−２タンパク質の細胞外ドメインに対する結合アフィニティーを伴う他のポリペプチドを含むがこれらに限定されないターゲティング部分を意味する。好ましい実施形態では、抗Ｈｅｒ２ターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。ＨＥＲ２コード遺伝子は、第１７染色体のバンドｑ２１上に見出され、４．８ｋｂのメッセンジャーＲＮＡ（ＭＲＮＡ）を発生させ、ＨＥＲ２遺伝子によりコードされるタンパク質は、１８５，０００ドルトンである。正常対象では、ＨＥＲ２受容体に結合するリガンドは、他の受容体との二量体化を促進する結果として、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路およびＭＡＰＫ経路のシグナル伝達および活性化をもたらす。
【０２８３】
乳がんの約２５％では、ＨＥＲ２遺伝子が、各腫瘍細胞核内で、第１７染色体のコピー数と比べて、２倍〜２０倍を超えて増幅される。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、タンパク質発現を駆動し、結果として生じる、腫瘍細胞表面における受容体の数の増大は、受容体の活性化を促進し、シグナル伝達、過剰な細胞分裂、および腫瘍の形成をもたらす（Hicks,  DGら、HER2+  breast  cancer:  review  of  biologic  relevance  and  optimal  use  of  diagnostic  tools、Am  J  Clin  Pathol.（２００８年）、１２９巻（２号）：２６３〜７３頁）。
【０２８４】
ＸＴＥＮとの融合パートナーとして使用される、抗Ｈｅｒ２ターゲティング部分は、対象に投与されると、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の細胞外セグメントの細胞外ドメインに結合し、生物活性ペイロードを、標的組織に送達することにより、治療的有用性を有する組成物を創出する。加えて、このような結合は、受容体の二量体化、および結果として生じる、ＥＧＦＲ内在的チロシンキナーゼ機能の活性化に干渉することが可能であり（Yardenら、Biochemistry、（１９８８年）、２７巻、３１１４〜３１１８頁；Schlessinger、Biochemistry、（１９８８年）、２７巻、３１１９〜３１２３頁）、受容体が結合状態にある細胞は、細胞周期のＧ１期中に止まるので、腫瘍細胞の増殖を低減するほか、血管新生も抑制する結果がもたらされる。
【０２８５】
本発明の１つの目的は、腫瘍細胞上で発現するｅｒｂＢ−２タンパク質に特異的に結合し、正常ヒト細胞には実質的に結合せず、ｅｒｂＢ−２を発現させるがんの処置もしくは防止、またはｅｒｂＢ−２を発現させる腫瘍細胞の検出に活用されうる、１または複数の結合部分を含む、新規の抗Ｈｅｒ２ターゲティング部分を提供することである。ヒト化ＨＥＲ２抗体の可変ドメインのＣＤＲおよびＦＲ残基については、Carterら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８９巻：４２８５頁（１９９２年）において報告されている。一実施形態では、抗Ｈｅｒ２  ＴＭ組成物は、コンジュゲート組成物に連結された、単一の抗Ｈｅｒ２ターゲティング部分を含む。別の実施形態では、抗Ｈｅｒ２組成物は、同じ場合もあり、ｅｒｂＢ−２タンパク質の異なるエピトープに結合する場合もある、第１および第２の抗Ｈｅｒ２ターゲティング部分を含む。一実施形態では、コンジュゲート組成物の、抗Ｈｅｒ２ターゲティング部分構成要素は、コンジュゲート組成物に連結された、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の細胞外セグメントのドメインＩＶに結合することが可能なトラスツズマブの、１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０２８６】
本発明の別の実施形態は、患者に、ＨＥＲ２受容体の機能を阻害することが可能な治療有効量の抗Ｈｅｒ２ターゲティングコンジュゲート組成物を投与し、細胞傷害性ペイロードを、腫瘍細胞に送達し、これにより、細胞の死をもたらすことにより、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関する。別の実施形態では、本発明は、ｅｒｂＢ−２受容体を過剰発現させる腫瘍を処置および／または防止するための方法であって、治療有効量の抗Ｈｅｒ２コンジュゲート組成物であり、同一である場合もあり、顕著に異なり、ｅｒｂＢ−２タンパク質の異なるエピトープに結合する場合もある、第１および第２の抗Ｈｅｒ２結合部分を含み、ＨＥＲ２受容体の機能を阻害することが可能な、抗Ｈｅｒ２コンジュゲート組成物の投与を含む方法を提供する。ＴＭのこのような組合せは、会合させたペイロード薬剤の、標的腫瘍への、より選択的な送達を結果としてもたらし、個別のＴＭを、同じ全体濃度で伴うコンジュゲートの細胞傷害活性の合計について期待されるより良好な細胞傷害活性を呈示することが好ましい。加えて、投与されるコンジュゲート組成物のうちの１または複数は、放射性核種にコンジュゲートさせることができる。
【０２８７】
抗ｃＭｅｔ：
【０２８８】
別の実施形態では、本発明は、単離抗ｃＭｅｔターゲティング部分を提供する。「抗ｃＭｅｔ」とは、Ｍｅｔまたは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体に特異的に結合するターゲティング部分を意味する。ＭＥＴは、胚の発生および創傷治癒に不可欠なチロシンキナーゼ活性を有する肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）またはｃＭｅｔをコードするがん原遺伝子である。ＨＧＦによる結合および刺激がなされると、ＭＥＴは、総体として浸潤性の増殖をもたらす、いくつかの生物学的応答を誘導する。がんにおけるＭＥＴの異常な活性化は、異常に活性なＭＥＴが、腫瘍の増殖、血管新生、および腫瘍に栄養物を供給する新血管の形成を誘発し、がんが、他の臓器（転移）に拡散する、予後不良と相関する。ＭＥＴは、腎臓、肝臓、胃、乳腺、および脳のがんを含む、多くの種類のヒト悪性腫瘍において、調節異常である。抗ｃＭＥＴは、ＨＧＦ受容体に特異的に結合するターゲティング部分であって、ＨＧＦに対するアンタゴニストとして用いられるターゲティング部分でありうる。好ましい実施形態では、抗ｃＭＥＴターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。抗ｃＭＥＴは、対象に投与されると、ＭＥＴ発現腫瘍を処置するための予防的または治療的有用性を有する、融合タンパク質コンジュゲート組成物を創出する融合パートナーとして使用することができる。一実施形態では、コンジュゲート組成物の抗ｃＭＥＴ構成要素は、抗体である、ＭｅｔＭａｂまたはＰＲＯ１４３９６６の、１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ｃＭｅｔおよびそれらの配列に対する抗体については、米国特許第５，６８６，２９２号；ＵＳ６，４６８，５２９；ＵＳ７，４７６，７２４；および米国特許出願公開第２００７００９２５２０号において記載されている。
【０２８９】
抗ＩＬ６Ｒ：
【０２９０】
別の実施形態では、本発明は、単離抗ＩＬ６Ｒターゲティング部分を提供する。「抗ＩＬ６Ｒ」とは、ＩＬ−６受容体に特異的に結合するターゲティング部分を意味する。好ましい実施形態では、抗ＩＬ６Ｒターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。抗ＩＬ６Ｒは、ＩＬ−６に対するアンタゴニストとして用いられうる。抗ＩＬ６Ｒは、対象に投与されると、関節炎またはクローン病などの炎症性状態のための予防的または治療的有用性を有する、コンジュゲート組成物を創出する融合パートナーとして使用することができる。トシリズマブは、中程度〜重度の関節リウマチにおいて、臨床有用性を有することが示され、ＦＤＡにより承認されている。一実施形態では、コンジュゲート組成物の抗ＩＬ６Ｒ構成要素は、トシリズマブの、１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＩＬ−６Ｒに対する抗体については、米国特許第５，６７０，３７３号、同第５，７９５，９６５号、同第５，８１７，７９０号、および同第７，４７９，５４３号において記載されている。
【０２９１】
抗ＩＬ１７：
【０２９２】
別の実施形態では、本発明は、単離抗ＩＬ１７ターゲティング部分を提供する。「抗ＩＬ１７」とは、サイトカインである、ＩＬ−１７に特異的に結合するターゲティング部分を意味する。好ましい実施形態では、抗ＩＬ１７ターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。ＩＬ−１７は、ジスルフィド連結された、約３２ｋＤａのホモ二量体のサイトカインであって、ＣＤ４＋活性化メモリーＴ細胞だけにより合成および分泌されるサイトカイン（Fossiezら、Int.  Rev.  Immunol.、１６巻：５４１〜５５１頁（１９９８年）において総説されている）である。インターロイキン（ＩＬ−１７）は、例えば、関節リウマチを伴う患者の滑液中で発現する、炎症促進性Ｔ細胞サイトカインである。ＩＬ−１７は、ＴＮＦおよびＩＬ−１など、多様なサイトカインの強力な誘導剤であり、ＩＬ−１７は、ＴＮＦおよびＩＬ−１との相加作用、なおまたは相乗作用を有することが示されている。抗ＩＬ１７は、対象に投与されると、関節炎またはクローン病または多発性硬化症などの炎症性状態のための予防的または治療的有用性を有する、コンジュゲート組成物を創出する融合パートナーとして使用することができる。ＬＹ２４３９８２１は、経口ＤＭＡＲＤに付加したところ、関節リウマチの徴候および症状の改善において有用性を示した抗体である。一実施形態では、ターゲティング部分の抗ＩＬ６Ｒ構成要素は、ＬＹ２４３９８２１の、１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗ＩＬ１７抗体については、米国特許出願第２００５０１４７６０９号および同第２００８０２６９４６７号、ならびにＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００７／０７０７５０号において記載されている。
【０２９３】
ＩＬ１７Ｒ：
【０２９４】
別の実施形態では、本発明は、単離ＩＬ１７Ｒターゲティング部分を提供する。「ＩＬ１７Ｒ」とは、サイトカインであるＩＬ−１７に、その受容体として、特異的に結合するターゲティング部分を意味する。好ましい実施形態では、ＩＬ１７Ｒターゲティング部分は、ＩＬ−１７受容体の可溶性形態である。研究は、Ｔ細胞を、ＩＬ−１７受容体ポリペプチドの可溶性形態と接触させたところ、ＰＨＡ、コンカナバリンＡ、および抗ＴＣＲモノクローナル抗体により誘導される、Ｔ細胞の増殖およびＩＬ−２の産生が阻害されたことを示している（Yaoら、J.  Immunol.、１５５巻：５４８３〜５４８６頁［１９９５年］）。インターロイキン（ＩＬ−１７）は、ＴＮＦおよびＩＬ−１など、多様なサイトカインの強力な誘導剤である、炎症促進性Ｔ細胞サイトカインであるので、ＩＬ１７Ｒは、ＩＬ−１７に結合し、これを中和する、コンジュゲート組成物を創出する融合パートナーとして使用することができる。ＩＬ１７Ｒは、対象に投与されると、関節リウマチまたはクローン病などの炎症性状態のための治療的有用性を有しうる。ＩＬ１７受容体および相同体は、米国特許第５，８６９，２８６号において記載されている通り、クローニングされている。
【０２９５】
抗ＩＬ１２：
【０２９６】
別の実施形態では、本発明は、単離抗ＩＬ１２ターゲティング部分を提供する。「抗ＩＬ１２」とは、サイトカインである、ＩＬ−１２に特異的に結合し、場合によって、ＩＬ−２３に特異的に結合するターゲティング部分を意味する。好ましい実施形態では、抗ＩＬ１２ターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。生物活性のＩＬ−１２は、３５（ｐ３５）および４０（ｐ４０）ｋＤの、共有結合的に連結された２つのサブユニット（後者は、ＩＬ−２３として公知である）から構成されるヘテロ二量体として存在する。ＩＬ−１２は、炎症性応答の重要な部分であり、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からの、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の産生を刺激し、ＩＬ−４に媒介される、ＩＦＮ−γの抑制を低減するサイトカインである。ＩＬ−１２を産生するＴ細胞は、ＩＬ−１２の活性と関連する共受容体である、ＣＤ３０を有する。ＩＬ−１２は、また、自己免疫および乾癬、ＩＬ−１２を産生するＴリンパ球と幹細胞角化細胞との間の相互作用とも連関しており、重要である。ウステキヌマブは、中程度〜重度の尋常性乾癬の処置における有用性を裏付け、ＦＤＡにより承認されている、抗ＩＬ１２／２３抗体である。抗ＩＬ−１２は、ＸＴＥＮとの融合パートナーであって、乾癬、関節リウマチ、またはクローン病などであるがこれらに限定されない、炎症性状態を患う対象に投与されると、治療的有用性を有する、融合タンパク質組成物を創出する融合パートナーとして使用することができる。一実施形態では、コンジュゲート組成物の抗ＩＬ１２構成要素は、抗体であるウステキヌマブの、１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＩＬ−１２に対する抗体およびそれらの使用については、米国特許第７，２７９，１５７号において記載されている。
【０２９７】
抗ＩＬ２３：
【０２９８】
別の実施形態では、本発明は、単離抗ＩＬ２３ターゲティング部分を提供する。「抗ＩＬ２３」とは、サイトカインである、ＩＬ−２３に特異的に結合するターゲティング部分を意味する。好ましい実施形態では、抗ＩＬ２３ターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。ＩＬ−２３とは、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットからなる因子に与えられた名称であり、感染に対する炎症性応答の重要な部分である、炎症促進性サイトカインである。ＩＬ−２３は、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ９の上方調節を促進し、血管新生を増大させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を低減する。ＩＬ−２３は、乾癬、多発性硬化症、および炎症性腸疾患において役割を果たすことが裏付けられている。ウステキヌマブは、乾癬における有用性を裏付けている、抗ＩＬ２３抗体である。抗ＩＬ−２３は、ＸＴＥＮとの融合パートナーであって、乾癬、関節リウマチ、またはクローン病などであるがこれらに限定されない、炎症性状態を患う対象に投与されると、治療的有用性を有する、融合タンパク質組成物を創出する融合パートナーとして使用することができる。一実施形態では、コンジュゲート組成物の抗ＩＬ２３構成要素は、抗体であるウステキヌマブの、１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＩＬ−２３に対する抗体については、米国特許第７，４９１，３９１号および同第７，２４７，７１１号において記載されている。
【０２９９】
ＣＴＬＡ４：
【０３００】
別の実施形態では、本発明は、単離ＣＴＬＡ４ターゲティング部分を提供する。「ＣＴＬＡ４」とは、抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６に特異的に結合し、Ｂ７に特異的に結合しうるターゲティング部分を意味する。好ましい実施形態では、ＣＴＬＡ４ターゲティング部分は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインである。ＣＴＬＡ４ターゲティング部分は、関節リウマチ、乾癬、および臓器移植における炎症性状態などであるがこれらに限定されない、炎症性状態を患う対象に投与されると、治療的有用性を有する、コンジュゲート組成物を創出する融合パートナーとして使用することができる。ベラタセプトは、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに連結された、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ断片からなる融合タンパク質であって、移植片生存の延長をもたらすことにおける有効性を示した融合タンパク質である。一実施形態では、コンジュゲート組成物のＣＤ８０および／またはＣＤ８６結合性構成要素は、ベラタセプトに由来する、１または複数の結合性ドメインを含む。ＣＴＬＡ４組成物のクローニングおよび使用については、米国特許第５，４３４，１３１号、同第５，７７３，２５３号、同第５，８５１，７９５号、同第５，８８５，５７９号、同第７，０９４，８７４号、および同第７，４３９，２３０号において記載されている。
【０３０１】
抗ＣＤ３：
【０３０２】
別の実施形態では、本発明は、単離抗ＣＤ３ターゲティング部分を提供する。「抗ＣＤ３」とは、ＣＤ３  Ｔ細胞受容体に特異的に結合するターゲティング部分を意味する。好ましい実施形態では、抗ＣＤ３ターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。Ｔ細胞共受容体は、４つの顕著に異なる鎖；ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖からなる、タンパク質複合体である。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として公知の分子およびζ鎖と会合して、Ｔリンパ球内で、活性化シグナルを発生させる。抗ＣＤ３モノクローナル抗体は、一過性のＴ細胞枯渇およびＣＤ３／Ｔ細胞受容体複合体の抗原変調により、免疫応答を抑制する。例えば、Ｔ細胞媒介型自己免疫性インスリン依存性糖尿病の自発モデルである、成体非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスの抗ＣＤ３処置により、糖尿病をもたらす自己免疫過程を阻害することができる。疾患および障害を処置する抗ＣＤ３抗体の使用については、例えば、米国特許第４，５１５，８９３号において記載されている。一実施形態では、コンジュゲート組成物のＣＤ３結合性構成要素は、抗体であるムロモナブ−ＣＤ３の、１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０３０３】
抗ＣＤ４０：
【０３０４】
別の実施形態では、本発明は、単離抗ＣＤ４０ターゲティング部分を提供する。「抗ＣＤ４０」とは、細胞表面受容体である、ＣＤ４０に特異的に結合するターゲティング部分を意味する。好ましい実施形態では、抗ＣＤ４０ターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。ＣＤ４０とは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）により活性化すると、免疫応答のほか、細胞の増殖および生存のシグナル伝達においても役割を果たす、細胞表面受容体である。ＣＤ４０は一般に、多発性骨髄腫およびリンパ腫など、Ｂ細胞性悪性腫瘍において過剰発現し、活性化する。抗ＣＤ４０は、多様ながん、特に、Ｂ細胞性悪性腫瘍を患う対象に投与されると、治療的有用性を有しうる、コンジュゲート組成物を創出する融合パートナーとして使用することができる。一実施形態では、コンジュゲート組成物の抗ＣＤ４０構成要素は、抗体であるルカツムマブの、１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗ＣＤ４０抗体については、米国特許第７，４４５，７８０号、ならびに米国特許出願第２００７０１１０７５４号および同第２００８０２５４０２６号において記載されている。
【０３０５】
抗ＴＮＦアルファ：
【０３０６】
別の実施形態では、本発明は、単離抗ＴＮＦアルファターゲティング部分を提供する。「抗ＴＮＦアルファ」とは、サイトカインである、ＴＮＦアルファに特異的に結合するターゲティング部分を意味する。好ましい実施形態では、抗ＴＮＦアルファターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。ＴＮＦアルファまたはカヘキシンとは、全身性炎症に関与する炎症促進性サイトカインであり、急性期反応を刺激するサイトカイン群のメンバーである。ＴＮＦの主要な役割は、免疫細胞の調節にある。ＴＮＦは主に、マクロファージにより産生されるが、また、リンパ系細胞、マスト細胞、内皮細胞、心筋細胞、脂肪組織、線維芽細胞、および神経組織によっても産生される。リポ多糖およびインターロイキン１（ＩＬ−１）に応答して、大量のＴＮＦが放出される。ＴＮＦは、関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、および不応性喘息などの自己免疫障害に関与しており、敗血症性ショック、および急性炎症性応答の他の重篤な形態、ならびにＳＩＲＳにおいて役割を果たす。抗ＩＬ−ＴＮＦアルファは、関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、および不応性喘息を含む、多種多様な炎症性障害において治療的有用性を有しうる、コンジュゲート組成物を創出する融合パートナーとして使用することができる。インフリキシマブおよびエタネルセプトなどの抗ＴＮＦアルファ抗体は、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、関節リウマチ、および潰瘍性大腸炎における有効性を示している。一実施形態では、コンジュゲート組成物の抗ＴＮＦアルファ構成要素は、インフリキシマブまたはエタネルセプトの、１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）または結合性領域を含む。抗ＴＮＦ抗体については、米国特許第６，７９０，４４４号において記載されており、ＴＮＦ受容体を含むキメラ抗体については、米国特許第５，６０５，６９０号において記載されている。
【０３０７】
本発明は、前出で言及した、例示的なターゲティング部分の結合性領域が、配列変異体である、ターゲティング部分組成物を提供する。例えば、多様なアミノ酸の欠失、挿入、および置換を、ターゲティング部分内に施して、ターゲティング部分の結合活性または薬理学的特性に関して、本発明の精神から逸脱せずに、変異体を創出しうることが察知されるであろう。ポリペプチド配列内のアミノ酸についての保存的置換の例を、表２１に示す。しかし、ターゲティング部分の配列同一性が、本明細書で言及または開示される特異的配列と比較して１００％未満である、ターゲティング部分についての実施形態では、本発明は、所与のターゲティング部分の所与のアミノ酸残基についての、他の１９個の天然Ｌアミノ酸のうちのいずれかの置換であって、ターゲティング部分またはターゲティング部分の結合性領域の配列であり、隣接するアミノ酸残基を含む配列内の任意の位置にありうる置換を想定する。いずれか１つの置換が、結合活性の所望されない変化を結果としてもたらす場合は、代替的なアミノ酸のうちの１つを援用し、本明細書で記載される方法（例えば、実施例のアッセイ）により、または例えば、その内容がその全体において参照により組み込まれる、米国特許第５，３６４，９３４号において明示されている、保存的および非保存的突然変異についての技法およびガイドラインのうちのいずれかを使用して、または当技術分野で一般に公知の方法を使用して、構築物タンパク質を査定することができる。加えて、変異体は、例えば、１または複数のアミノ酸残基を、ターゲティング部分について言及または開示されるアミノ酸配列であって、言及または開示されるターゲティング部分の結合活性、例えば、表２、３、４、１８、または１９の標的に結合する能力の全てではないにせよ、一部を保持するアミノ酸配列のＮまたはＣ末端において、付加するか、または欠失させたポリペプチドを含みうる。
【表２１】
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【０３０８】
（ｉｉ）ターゲティング部分の例示的な形態
以下の節は、ターゲティング部分の例示的な形態についての非限定的なリストおよび記載を提示する。
【０３０９】
本明細書で使用される、１または複数の「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされる、１または複数のポリペプチドからなるターゲティング部分を指し、完全モノクローナル抗体、少なくとも２つの完全抗体またはその断片から形成された多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、および抗体断片である、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、ならびに、それらが、所望の生物活性、例えば、標的リガンドまたは抗原に対する結合アフィニティーを呈示する限りにおいて、合成ＴＭの他の形態をカバーするように、最も広義において使用される。
【０３１０】
免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する、重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成については周知である。
【０３１１】
「モノクローナル」という用語は、抗体または断片の実質的に均質な集団から得られる、ターゲティング部分である、抗体または抗体断片の特徴を指し示し、特定の方法による抗体の作製を要請するとは解釈されないものとする。例えば、本発明の方法に従い創出されるモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature、２５６巻：４９５頁（１９７５年）により初めて記載されたハイブリドーマ法により作製しうるが、それらはまた、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により作製され、哺乳動物または非哺乳動物宿主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させる合成物でもありうる。不死化細胞の、細菌細胞による置換は、大量の、本発明の結合性融合タンパク質分子を調製するための手順を大幅に簡素化する。さらに、組換え産生系は、テーラーメイドの抗体およびその断片、なおまたは特異的属性についてスクリーニングするライブラリーを作製する能力をもたらす。例えば、結合機能と、エフェクター機能とを新たに組み合わせたキメラ分子、ヒト化抗体、および二官能性の結合性融合タンパク質を含む、新規の抗原結合性分子を作製することが可能である。さらに、変異体を配列に導入し、抗体を産生する配列を細胞から単離する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（Saiki,  R.  K.ら、Science、２３９巻、４８７〜４９１頁（１９８８年））の使用は、特異性を単離しうる時間スケールを迅速化する大きな潜在的可能性を有する。増幅されたＶＨおよびＶＬ遺伝子は、細菌または哺乳動物細胞内の発現のために、ベクターに直接クローニングすることができる（Orlandi,  R.ら、１９８９年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８６巻、３８３３〜３８３７頁；Ward,  E.  S.ら、１９８９年、前出；Larrick,  J.  W.ら、１９８９年、Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.、１６０巻、１２５０〜１２５５頁；Sastry,  L.ら、１９８９年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８６巻、５７２８〜５７３２頁）。次いで、細菌から分泌される可溶性抗体断片を、本明細書で記載される結合アッセイ、または当技術分野で公知の他のアッセイにおいてスクリーニングして、適用に適うのに十分な結合活性を伴う構築物を選択することができる。
【０３１２】
本明細書におけるモノクローナル抗体は具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の第１の種に由来する抗体内の、対応する親配列と同一であるか、またはそれに対する高度の相同性を有するのに対し、鎖の残余は、第２の種に由来する抗体内の配列と同一であるか、またはそれに対する高度の相同性を有する「キメラ」抗体であって、結果として得られる抗体が、所望の生物活性、例えば、標的抗原またはリガンドに対する結合アフィニティーを呈示する（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrisonら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８１巻：６８５１〜４８５５頁（１９８４年））キメラ抗体を含む。
【０３１３】
「ヒト化」という用語は、それらが、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むが、それ以外では、ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含むという点で、キメラである断片を含む、抗体の形態を意味する。ヒト化とは、非ヒト免疫グロブリン薬および非ヒトアミノ酸配列を含有する他の生物薬剤に対する有害な免疫反応を軽減する方法である。非ヒト抗体をヒト化するための方法については、当技術分野で記載されている。ヒト化抗体は、非ヒト（例えば、マウスの、ラット、または非ヒト霊長動物）である供給源に由来し、標的リガンドに対する所望の特異性およびアフィニティーを有するＶＬまたはＶＨ鎖の可変ドメインから取り出されることが典型的である、１または複数のアミノ酸残基を含有することが好ましい。ヒト化は本質的に、非ヒト超可変領域配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換すること（グラフティング）による、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同作業者（Jonesら、Nature、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Riechmannら、Nature、３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）；Verhoeyenら、Science、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））の方法に従い実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、ヒト可変ドメインの全部または一部が、非ヒト種に由来する対応する配列により置換されたキメラ抗体（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）である。実際には、ヒト化抗体は、一部の超可変ＣＤＲ残基と、おそらくは、一部のＦＲ残基とを、齧歯動物（または他の非ヒト種、例えば、非ヒト霊長動物）抗体内の類似の部位に由来する残基で置換したヒト抗体であることが典型的である。一実施形態では、ヒト化抗体は、例えば、結合アフィニティーまたは他の何らかの特性を増大させるように、レシピエント抗体内またはドナー抗体内に見出されない残基を含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、この場合、超可変ループ（ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンの配列に由来する配列に対応するか、またはそれを有し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体から作製されるｓｃＦｖの場合、可変軽鎖と、可変重鎖とを、表２０のリンカーまたは表１０のＸＴＥＮの断片でありうる、リンカーにより連結することが典型的である。ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、好ましくは、ヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部を含みうる。
【０３１４】
対象組成物のターゲティング部分は、ヒト化抗体に由来しうる。組成物内で使用される、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選び出しは、抗体の免疫原性を低減するのに極めて重要である。例えば、レシピエントにおいて免疫応答を誘発する可能性が低く、かつ、グラフトされた齧歯動物配列を受容して、親齧歯動物抗体の、生理化学的特性を受け継いだ、機能的な抗体を形成する可能性が最も高い、ヒト可変ドメイン配列を選択するために、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のセットに照らしてアラインすることができる。対応する方式で、齧歯動物の配列と最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として使用することができる（Simsら、J.  Immunol、１５１巻：２２９６頁（１９９３年）；Chothiaら、J.  Mol.  Biol.、１９６巻：９０１頁（１９８７年））。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる（Carterら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８９巻：４２８５頁（１９９２年）；Prestaら、J.  Immnol.、１５１巻：２６２３頁（１９９３年））。
【０３１５】
さらなる特性は、ターゲティング部分は、ヒト化されうるが、抗原に対する高アフィニティーおよび他の好適な生物学的特性を保持するということである。この目標を達成するために、好ましい方法に従い、ヒト化ターゲティング部分を、親配列およびヒト化配列についての三次元モデルに続き、試験を使用する、親配列および多様な概念的ヒト化生成物についての、解析工程の繰り返しにより調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者は熟知している。選択された候補免疫グロブリン配列の、可能な三次元コンフォメーション構造を例示および提示する、コンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示についての精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における、残基の、可能性の高い役割についての解析、すなわち、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析を可能とする。このようにして、標的抗原に対するアフィニティーの増大など、所望の特徴を達成しうるように、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して、レシピエントおよびドナーからＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一実施形態では、連結された重鎖可変ドメインを含む配列を、重鎖定常ドメインに連結し、かつ、連結された軽鎖可変ドメインを含む配列を、軽鎖定常ドメインに連結した、ターゲティング部分構築物を創出する（この実施形態では、融合タンパク質と称する）。定常ドメインは、それぞれ、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインであることが好ましい。前出についてのさらなる実施形態では、ターゲティング部分は、結合性融合タンパク質の二量体化を可能とし、次いで、ＣＣＤ領域のＮ末端に連結しうるために、免疫グロブリンヒンジ領域の一部または全部を含むように設計することができる。代替的な実施形態では、結合性融合タンパク質は、ヒンジを伴わないが、短縮されているが、構築物に長い終末半減期を付与するために、ＦｃＲｎの結合を保持する、ＣＨ２ドメインを伴う、部分Ｆｃを組み込むように設計することができる。さらに別の実施形態では、結合性融合タンパク質は、ヒンジを伴わないが、ＣＨ３ドメインを介して二量体化しうる、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを伴う部分Ｆｃを組み込むように設計することができる。本明細書の本段落の上記で記載した実施形態では、コンジュゲート組成物の残りのポリペプチド構成要素を、結果として得られるターゲティングコンジュゲート組成物の１または複数の特性を増強するように、ターゲティング部分のＮまたはＣ末端に連結することができる。
【０３１６】
「抗体断片」とは、完全抗体の部分、または合成もしくはキメラ対応物、好ましくは完全抗体の抗原結合性または可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２  断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂｃ断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂｃ断片、ドメイン抗体（ＶＨＨ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ダイアボディー、個別の抗体軽鎖、個別の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子との間のキメラ融合体などの分子を含む。
【０３１７】
「Ｆａｂ断片」とは、抗原に結合する抗体の領域を指す。Ｆａｂ断片は、重鎖および軽鎖の各々の、１つの定常ドメインと、１つの可変ドメインとの、ジスルフィド連結されたヘテロ二量体からなる。これらの可変ドメインは、各単量体のアミノ末端において、パラトープ（抗原結合性部位）を形作る。Ｆａｂ断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて作出することができる。例えば、酵素であるパパインを使用して、免疫グロブリン単量体を、２つのＦａｂ断片と、Ｆｃ断片とに切断することができる。酵素であるペプシンは、ヒンジ領域の下方で切断するので、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片が形成される。下記でより完全に記載される通り、重鎖の可変領域と、軽鎖の可変領域とを、一体に融合させて、親免疫グロブリンの元の特異性を保持する、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を形成することができる。
【０３１８】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる、２つの明らかに顕異する種類の１つに割り当てることができる。
【０３１９】
「可変」という用語は、可変ドメイン部分の配列が、抗体間で大幅に異なり、各特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合特異性を付与するという事実を指す。可変性は、軽鎖および重鎖可変ドメインのいずれにおいても、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメント、すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３において、高頻度で生じる。特に、抗体に由来するＣＤＲ領域を、対象組成物のターゲティング部分に組み込むこともでき、また、１または複数の抗体から個別に選択して、結合性ドメインを創出することもできる。可変ドメインのうちの、より高度に保存された部分を、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼び、これもまた、ＣＤＲ配列と組み合わせた場合、ターゲティング部分に組み込むことができる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、ループを形成する３つのＣＤＲによりつなげられた、βシート構成を採用することが典型的な、４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域により、近接して一体に保持されており、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する（Kabatら、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号、Ｉ巻、６４７〜６６９頁（１９９１年）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害作用など、多様なエフェクター機能を呈示するか、またはこれに参与する。
【０３２０】
単鎖可変断片によるターゲティング部分
【０３２１】
一態様では、本発明は、単鎖可変断片による結合性融合タンパク質組成物を提供する。「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体の１つのＶＨドメインおよび１つのＶＬドメインを含み、これらのドメインが、単一のポリペプチド鎖内に存在し、ドメインの間のポリペプチドリンカーにより一般に接合され、これにより、ｓｃＦｖが、抗原への結合に所望される構造を形成することを可能とする抗体断片を意味する。当技術分野では、ｓｃＦｖを作製するための方法が公知である（例えば、米国特許第６，８０６，０７９号；Birdら（１９８８年）、Science、２４２巻：４２３〜４２６頁；Hustonら（１９８８年）、PNAS、８５巻：５８７９〜５８８３頁；Pluckthun、The  Pharmacology  of  Monoclonal  Antibodies、１１３巻、RosenburgおよびMoore編、Springer-Verlag、New  York、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい）。２つのｓｃＦｖを、単一のポリペプチド内でタンデムに組み合わせて、価数または特異性の増大を付与しうるｓｃＦｖ間融合体を形成することができる。代替的に、２つのｓｃＦｖを、非共有結合的に接合して、ダイアボディーを形成することができる。
【０３２２】
本発明のｓｃＦｖ結合性融合タンパク質組成物の結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨの構成を有しうる。一実施形態では、次いで、ターゲティング部分を、ＣＣＤ、ＰＣＭ、およびＸＴＥＮに融合させ、任意選択で、第２のＸＴＥＮおよびＰＣＭ配列を、結果として得られる融合タンパク質であって、少なくとも以下の構造順列（Ｎ末端からＣ末端に）；ＸＴＥＮ−ＰＣＭ−ＣＣＤ−ＶＨ−リンカー−ＶＬ；ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ；ＸＴＥＮ−ＰＣＭ−ＣＣＤ−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ；ＸＴＥＮ−ＰＣＭ−ＣＣＤ−ＶＬ−リンカー−ＶＨ；ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ；ＸＴＥＮ−ＰＣＭ−ＣＣＤ−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮを有する融合タンパク質のＮまたはＣ末端に連結する。別の実施形態では、上記の任意の形態にある、２つの同一なまたは顕著に異なるｓｃＦｖを接合することができる。別の実施形態では、ｓｃＦｖを、ＸＴＥＮのＮ末端、またはＸＴＥＮの１もしくは複数のシステインもしくはリシン残基において、ＸＴＥＮにコンジュゲートさせるであろう。融合タンパク質についての前出の実施形態では、長い担体であるＸＴＥＮは、表１０のいずれか１つから選択される配列の断片でありうる、またはそれに対する少なくとも約８０％の配列同一性、もしくは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を呈示する配列を含みうる。ｓｃＦｖについての前出の実施形態では、本発明は、叙述的に記載されるのであれ、表１９を含む多様な表中に列挙されるのであれ、名指される抗体に由来するＶＬおよびＶＨ鎖を、配列ＧＳＧＥＧＳＥＧＥＧＧＧＥＧＳＥＧＥＧＳＧＥＧＧＥＧＥＧＳＧまたは表２０の配列など、適切なリンカーにより連結されたｓｃＦｖに組み込んだ組成物であって、ｓｃＦｖを、組換えにより、ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ融合タンパク質に融合させる構成要素として用いうるか、またはＰＣＭを、コンジュゲート組成物の構成要素として化学的にコンジュゲートさせた組成物を想定および包摂する。一実施形態では、本発明は、表１９のモノクローナル抗体に由来する、コンジュゲート組成物のためのｓｃＦｖ  ＴＭであって、対応するＶＬおよびＶＨ配列が、このようなモノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ配列に対する、少なくとも約８０％の配列同一性、または８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するｓｃＦｖ  ＴＭを提供する。別の実施形態では、本発明は、表１９のモノクローナル抗体について列挙されたＶＨおよびＶＬ配列に由来する、ターゲティングコンジュゲート組成物のためのｓｃＦｖ  ＴＭであって、ＴＭのＶＬおよびＶＨ配列が、このようなモノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ配列に対する、少なくとも約８０％の配列同一性、または８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有し、ＶＬおよびＶＨ配列が、結果としてｓｃＦｖをもたらすように、ｓｃＦｖ組成物のための、表２０のリンカー配列または当技術分野で公知のリンカーにより連結されるｓｃＦｖ  ＴＭを提供する。
【０３２３】
本発明はまた、従来の抗体またはｓｃＦｖにおいて見出される６つのＣＤＲより少数のＣＤＲを使用して構築されたｓｃＦｖターゲティング部分も包摂する。一実施形態では、ｓｃＦｖは、下記で記載される、適切なリンカーを散在させた、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、およびＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の可能な順列の中で、５つ、４つ、または３つのＣＤＲ領域を含む。このようなｓｃＦｖ順列の代表的な構成を、図４３に示す。一実施形態では、本発明は、表１９のモノクローナル抗体に由来する、ターゲティングコンジュゲート組成物のためのｓｃＦｖ  ＴＭであって、対応するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、およびＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、このようなモノクローナル抗体の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、およびＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列に対する、少なくとも約８０％の配列同一性、または８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するｓｃＦｖ  ＴＭを提供する。別の実施形態では、本発明は、表１９のモノクローナル抗体について列挙されたＶＨおよびＶＬ配列のうちの、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、およびＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列に由来する、ターゲティングコンジュゲート組成物のためのｓｃＦｖ  ＴＭであって、ＴＭのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、およびＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、このようなモノクローナル抗体の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、およびＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列に対する、少なくとも約８０％の配列同一性、または８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するｓｃＦｖ  ＴＭを提供する。
【０３２４】
ターゲティング部分の構成要素を接合するのに活用されるリンカーの性質は、可撓性であることが好ましい。一実施形態では、ｓｃＦｖターゲティング部分の抗原結合性部位を形成する、ＶＬおよびＶＨ結合性ドメインを接合するリンカーは、約１〜約３０アミノ酸残基の長さを有しうる。別の実施形態では、リンカーは、約３０〜約２００個のアミノ酸残基、または約４０〜約１４４個のアミノ酸残基、または約５０〜約９６個のアミノ酸残基を有しうる。ターゲティング部分との関連で、本明細書の上記で記載した実施形態のうちのいずれかでは、リンカーは、ＸＴＥＮ配列または表２０のリンカー配列に由来する配列でありうる。別の実施形態では、リンカーは、残基の少なくとも８０％が、アミノ酸である、グリシン、セリン、および／またはグルタミン酸から構成される配列であって、配列ＧＳＧＥＧＳＥＧＥＧＧＧＥＧＳＥＧＥＧＳＧＥＧＧＥＧＥＧＳＧ、またはその一部もしくは多量体に対する、約８０〜１００％の配列同一性を伴う配列などであるがこれらに限定されない配列でありうる。
【０３２５】
一実施形態では、本発明は、２つまたはそれを超えるｓｃＦｖターゲティング部分を含むコンジュゲート組成物を提供する。一実施形態では、２つまたはそれを超えるｓｃＦｖターゲティング部分は、同一でありうる。別の実施形態では、２つまたはそれを超えるｓｃＦｖターゲティング部分は、異なる場合があり、異なる標的（例えば、表１８〜１９の、２つまたはそれを超える標的）に結合する場合もあり、同じ標的上の異なるエピトープに結合する場合もある。前出の実施形態では、２つまたはそれを超えるｓｃＦｖターゲティング部分は、ＸＴＥＮ配列または表２０のリンカー配列の断片を含みうる、リンカー配列により接合することができる。
【０３２６】
２．ターゲティング部分としての、タンパク質、ホルモン、および有機分子
別の態様では、本発明は、ターゲティング部分として用いられる抗体以外の分子であって、標的組織または細胞に由来するリガンドに対する、特異的結合アフィニティーを伴う、タンパク質、ペプチド、ホルモン、非タンパク質性分子、または有機分子でありうる分子に共有結合的に連結されたＸＴＥＮを含む、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。一実施形態では、抗体以外のターゲティング部分は、がん細胞上で発現する細胞表面受容体に対するリガンドである。別の実施形態では、抗体以外のターゲティング部分は、炎症細胞上で発現する細胞表面受容体に対するリガンドである。別の実施形態では、抗体以外のターゲティング部分は、がん細胞上で発現する黄体形成ホルモン放出ホルモン受容体に対するリガンドである。別の実施形態では、ターゲティング部分は、がん細胞をターゲティングする、黄体形成ホルモン放出ホルモンの１または複数の分子である。別の実施形態では、抗体以外のターゲティング部分は、がん細胞上で発現するホレート受容体に対するリガンドである。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物のターゲティング部分は、がん細胞をターゲティングする、ホレートの１または複数の分子である。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物のターゲティング部分は、ＣＴＬＡ４の１または複数の分子である。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物のターゲティング部分は、アスパラギニルグリシルアルギニン（ＮＧＲ）またはその類似体の１または複数の分子である。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物のターゲティング部分は、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）またはその類似体の１または複数の分子である。
【０３２７】
「黄体形成ホルモン放出ホルモン」または「ＬＨＲＨ」とは、ＧＮＲＨ１遺伝子によりコードされるヒトタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｐ０１１４８）であって、視索前野／前視床下部内で、９２アミノ酸のプレプロホルモンから、配列ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を有する直鎖状デカペプチド最終生成物にプロセシングされるヒトタンパク質のほか、天然のペプチドの生物活性の少なくとも一部を有する、その種変異体および合成変異体を意味する。ＬＨＲＨは、脳下垂体／生殖腺軸の調節、したがって、生殖において枢要的役割を果たす。ＬＨＲＨは、脳下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞上の高アフィニティー受容体への結合を介して、その効果を及ぼし、その後、ＦＳＨおよびＬＨを放出する。ＬＨＲＨは、視床下部および脳下垂体の外部の臓器において見出され、高百分率の、ある特定のがん組織が、ＬＨＲＨ結合部位を有し、性ステロイドが、乳がんおよび前立腺がんの発症に関与しているため、ＬＨＲＨアゴニストによるホルモン療法が、エストロゲン依存性乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、およびアンドロゲン依存性前立腺癌などの性ステロイド依存性状態の処置について、承認または検討されている。半減期は、４分間未満であることが報告されているため、半減期の延長が要請されている（Redding  TWら、The  Half-life,  Metabolism  and  Excretion  of  Tritiated  Luteinizing  Hormone-Releasing  Hormone  (LH-RH)、Man.  J  Clin  Endocrinol.  Metab.（１９７３年）、３７巻：６２６〜６３１頁）。したがって、本発明は、上記で記載したがんの処置において有用な、ターゲティングコンジュゲート組成物内の選択的ターゲティング部分としての、ＬＨＲＨの使用を想定する。
【０３２８】
特定の実施形態では、本発明は、表２２から選択される、１または複数のＬＨＲＨターゲティング構成要素と、表１４〜１７から選択される、１または複数の薬物構成要素とを含むターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。前出の実施形態では、ＬＨＲＨを、第１のＸＴＥＮに連結することができ、これを、本明細書で記載される、多様な構成実施形態を使用して、薬物構成要素をコンジュゲートさせた、１または複数のＸＴＥＮに連結する。代替的に、ＬＨＲＨおよび薬物構成要素を、単量体のＸＴＥＮにコンジュゲートさせることができる。
【表２２】
2018500049.tif 000110
【０３２９】
本明細書では、「ホレート」および「葉酸」を、プテロイル−Ｌ−グルタミン酸、ビタミンＢ９、フォラシン、および（２Ｓ）−２−［（４−｛［（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル］アミノ｝フェニル）ホルムアミド］ペンタン二酸としてもまた公知の化学物質を意味するように、互換的に使用する。ホレートは、ホレート受容体として公知の細胞受容体のリガンドである。ホレート受容体アルファとは、ヒトでは、ＦＯＬＲ１遺伝子によりコードされるタンパク質である（Campbell  IGら（１９９１年））。ホレート結合性タンパク質は、卵巣がんのマーカーである（Cancer  Res、５１巻（１９号）：５３２９〜５３３８頁）。多くのがん細胞は、葉酸に対する要求が大きく、ホレート受容体を過剰発現させる。この遺伝子によりコードされるホレート受容体は、ホレート受容体（ＦＯＬＲ）ファミリーのメンバーであり、メンバーは、葉酸およびいくつかの還元性葉酸誘導体に対する高アフィニティーを有し、５−メチルテトロヒドロホレートの、細胞の内側への送達を媒介する。卵巣、乳腺、腎臓、肺、結腸直腸、および脳を含むいくつかの腫瘍が、ホレート受容体を過剰発現させうる。したがって、本発明は、上記で記載したがんの処置において有用な、ターゲティングコンジュゲート組成物内の選択的ターゲティング部分としての、ホレートの使用を想定する。
【０３３０】
本明細書では、「アルギニルグリシルアスパラギン酸」または「ＲＧＤ」を、Ｌ−アルギニン、グリシン、およびＬ−アスパラギン酸からなるトリペプチドを意味するように、互換的に使用する。ＲＧＤは、細胞認識において一般的なトリペプチド配列であり、インテグリンのリガンドである。ＲＧＤを含有するペプチドは、インテグリン−リガンド間相互作用の阻害剤として作用することが可能であり、アポトーシスを誘導しうる。ＲＧＤペプチドは、血管新生、細胞増殖、および細胞遊走を制御することが公知の腫瘍マーカーである、インテグリンアルファＶベータ３と相互作用しうる（Mol.  Pharmaceutics（２０１２年）、９巻：２９６１〜２９７３頁）。ビトロネクチン受容体である、インテグリンアルファＶベータ３は、黒色腫、神経膠腫、卵巣がん、前立腺がん、および乳がんを含む、いくつかの悪性腫瘍に関与している。加えて、骨転移を伴う、ほぼ全ての乳がん腫瘍が、インテグリンアルファＶベータ３を高度に発現させている。したがって、本発明は、がんの処置において有用な、ターゲティングコンジュゲート組成物内の選択的ターゲティング部分としての、ＲＧＤの使用を想定する。ターゲティングコンジュゲート組成物内のターゲティング部分として有用な、例示的なＲＧＤ類似体は、ＲＧＤｃ、ｃＲＧＣ、環状（ＲＧＤｙＫ）、環状（ＲＧＤｆＫ）、環状（ＲＧＤｆＣ）、環状（ＲＧＤｆ（Ｎ−Ｍｅ）ｖ）、および環状（ＣＧｉｓｏＤＧＲＧ）を含む。本発明はまた、前出のＲＧＤ類似体を、短いＸＴＥＮ断片内に、ターゲティング部分として組み込んだ組成物も想定する。
【０３３１】
本明細書では、「アスパラギニルグリシルアルギニン」または「ＮＧＲ」を、アスパラギン、グリシン、およびアルギニンのトリペプチドを意味するように、互換的に使用する。ＮＧＲは、ファージディスプレイにより選択されたトリペプチド配列であって、腫瘍細胞の細胞膜上のアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮまたはＣＤ１３）受容体を認識することにより、腫瘍血管系を特異的にターゲティングする配列である。ＡＰＮに結合すると、ＮＧＲペプチドは、エンドソーム経路を介して、細胞に内部化される。ＡＰＮは、腫瘍新生血管系内でもっぱら発現するわけではないが、ＮＧＲペプチドは、他のＡＰＮ発現組織ではなく、腫瘍血管内で発現するＡＰＮを特異的にターゲティングする（Cancer  Res.（２００２年）、６２巻：８６７〜８７４頁）。乳がん、結腸がん、非小細胞肺がん、および膵臓がんを含む、いくつかの悪性腫瘍について、ＡＰＮ発現の増大が注目されている（Cancer  Sci.（２０１１年）、１０２巻：５０１〜５０８頁）。加えて、腫瘍におけるＡＰＮの発現が高度な症例の多くは、生存の不良と相関する。したがって、本発明は、がんの処置において有用な、ターゲティングコンジュゲート組成物内の選択的ターゲティング部分としての、ＮＧＲの使用を想定する。ターゲティングコンジュゲート組成物内のターゲティング部分として有用な、例示的なＮＧＲ類似体は、ＮＧＲ、ＧＮＧＲＧ、環状（ＮＧＲ）、環状（ｋＮＧＲＥ）、およびＣＮＧＲＣ（環状ジスルフィド）を含む。本発明はまた、前出のＮＧＲ類似体を、短いＸＴＥＮ断片内に、ターゲティング部分として組み込んだ組成物も想定する。
【０３３２】
ＶＩ）ＸＴＥＮ架橋剤およびこのような組成物を作製する方法
本発明は部分的に、本明細書で記載されるようにペイロードをコンジュゲートさせるコンジュゲーションパートナーとして有用な、ＸＴＥＮ架橋剤コンジュゲート組成物の、高度に精製された調製物に関する。本発明はまた、ＸＴＥＮ架橋剤のコンジュゲーションパートナーを使用して、１または複数のＸＴＥＮに連結されたペイロードの、高度に精製された調製物にも関する。本発明は、本明細書で記載されるＸＴＥＮのうちのいずれかを、ペイロードと連結することにより形成されるターゲティングコンジュゲート組成物を製作する、組成物および方法のほか、ＸＴＥＮを、架橋剤とコンジュゲートさせることにより形成される組成物を作製する、反応性の組成物および方法、または本明細書で記載される他の化学的方法を包摂する。「ＣＣＤコンジュゲート」、「ＣＣＤ架橋剤」、「ＸＴＥＮコンジュゲート」、および「ＸＴＥＮ架橋剤」という用語は、反応物であるコンジュゲーションパートナーのコンジュゲーションの後で残存する、連結された反応生成物であって、架橋剤、クリック化学反応の反応物、または本明細書で記載される他の方法の反応生成物を含む反応生成物を包摂することが具体的に意図される。
【０３３３】
一部の実施形態では、対象のコンジュゲートを創出するのに活用されるＣＣＤおよびＸＴＥＮは、表５、表１０、または表１１における配列のうちのいずれか１つから選択される、１または複数のＣＣＤまたはＸＴＥＮであって、直接または本明細書で開示される架橋剤を介して、ペイロード構成要素に連結されうるＣＣＤまたはＸＴＥＮを含む。一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を創出するのに活用されるＣＣＤは、表５から選択されるＣＣＤ配列と比較して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＣＤを含む。他の実施形態では、対象のコンジュゲートを創出するのに活用される１または複数のＸＴＥＮは個別に、同等の長さの配列と最適にアラインされる場合、表１０もしくは表１１から選択されるＸＴＥＮまたはその断片と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列を含む。一実施形態では、対象のコンジュゲートは、それらが、第１および第２のＸＴＥＮ配列を含むという点で、多量体であり、この場合、ＸＴＥＮは、同じであるかまたは異なり、各々は個別に、同等の長さの配列と最適にアラインされる場合、表１０もしくは表１１から選択されるＸＴＥＮまたはその断片と比較して、少なくとも約９０％の配列同一性、または代替的に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列を含む。別の実施形態では、対象のコンジュゲートは、それらが、第１、第２、または第３のＸＴＥＮ配列を含むという点で、多量体であり、この場合、ＸＴＥＮは、同じであるかまたは異なり、各々は個別に、同等の長さの配列と最適にアラインされる場合、表１０もしくは表１１から選択されるＸＴＥＮまたはその断片と比較して、少なくとも約９０％の配列同一性、または代替的に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列を含む。さらに別の実施形態では、対象のコンジュゲートは、それらが、３、４、５、６、またはそれを超えるＸＴＥＮ配列を含むという点で、多量体であり、この場合、ＸＴＥＮは、同じであるかまたは異なり、各々は個別に、表１０もしくは表１１から選択されるＸＴＥＮまたはその断片と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列を含む。多量体のコンジュゲートでは、ＸＴＥＮ配列内の残基の累積の長さは、約１００〜約３０００、または約４００〜約１０００アミノ酸残基を超え、ＸＴＥＮは、配列または長さが同一な場合もあり、異なる場合もある。本明細書で使用される場合、累積の長さは、１つを超えるＸＴＥＮを、コンジュゲートに組み込む場合の、アミノ酸残基による全長を包摂することを意図する。
【０３３４】
本発明は、低分子ペイロード薬物に共有結合的に連結される結果として、コンジュゲートをもたらすＣＣＤおよび／またはＸＴＥＮのほか、ペイロードである生物活性タンパク質（ペプチドまたはポリペプチドを包摂する）に共有結合的に連結されたＣＣＤまたはＸＴＥＮの組成物であって、他の構成要素（例えば、ターゲティング部分およびＰＣＭ）と共に、ターゲティングコンジュゲート組成物を結果としてもたらす、ＣＣＤまたはＸＴＥＮの組成物も作製する、組成物および方法を包摂する。別の態様では、本発明は、１または複数のＣＣＤまたはＸＴＥＮの組成物であって、１または複数の薬物のペイロード、１または複数のターゲティング部分、および１または複数のペプチジル切断部分（ＰＣＭ）に連結される結果として、本発明のターゲティングコンジュゲート組成物をもたらす、ＣＣＤまたはＸＴＥＮの組成物を提供する。特に、本発明は、ペイロード薬物および／またはタンパク質の投与が有用である疾患または状態の処置において有用な、このようなターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。一部の実施形態のターゲティングコンジュゲート組成物は一般に、以下の構成要素：１）ＸＴＥＮ；２）ＣＣＤ；３）架橋剤；４）ペイロード、５）ターゲティング部分、および、任意選択で、５）構成要素を、組換えにより融合させるか、あるいは、直接、または本明細書で記載される市販の架橋剤などの架橋剤の使用により、もしくはクリック化学反応の反応物の使用により、もしくは、場合によって、本明細書で記載されるリンカーの使用を伴わずに、ＣＣＤまたはＸＴＥＮ内の反応性基と、ペイロードとの間のコンジュゲーションにより創出されうるものにより、化学的にコンジュゲートさせるＰＣＭのうちの１または複数を含む。しかし、前出の種類の組成物のうちの一部の場合には、組成物は、構成要素が、そうでなくとも化学的に反応性であるという前提で、架橋剤の使用を伴わずに創出することができる。
【０３３５】
ＣＣＤまたはＸＴＥＮの、ペイロードおよびターゲティング部分へのコンジュゲーションは、ＣＣＤまたはＸＴＥＮに連結されていないペイロードと比較して、結果として得られる組成物に、いくつかの利点を付与する。下記でより完全に記載される通り、特性の増強の非限定的な例は、全般的な可溶性および代謝安定性の増大、循環中のタンパク質分解の受けやすさの低減、免疫原性の低減、皮下投与または筋内投与された場合の吸収速度の低減、腎臓によるクリアランスの低減、毒性の低減と共時的な、ターゲティング部分による、標的組織との相互作用の増強、ペイロードのターゲティング送達、ＰＣＭの切断により放出されるまでの、ＸＴＥＮの遮蔽効果による、ペイロード構成要素の毒性の低減、および薬物動態特性の増強を含む。特に、一部の実施形態に従う対象組成物は、それらが、ペプチジル切断部分が基質であるプロテアーゼを産生する標的組織と近接して、またはこの中における、ターゲティング送達（組成物中のターゲティング部分の組入れにより達成される）およびペイロードの放出（組成物中のペプチジル切断部分の組入れにより達成される）と併せた、ＸＴＥＮの遮蔽効果と立体障害との組合せにより達成される、治療指数の増強および毒性または副作用の低減を示すように設計されることが、とりわけ想定される。加えて、組成物は、それらの設計およびＸＴＥＮへの連結により、ＸＴＥＮに連結されていない、対応するペイロードと比較して、薬物動態特性が増強される、例えば、Ｃｍａｘが低下し、この結果として、ペイロードの有害作用の低減がもたらされ、総体として、対象に投与されたコンジュゲーション組成物が、治療活性をもたらす時間の延長が結果としてもたらされるように、皮下または筋内注射の後において、終末半減期は、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または１００倍延長され、曲線下面積（ＡＵＣ）は、増大し（例えば、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、またはそれを超えて）、分布容量は低下し、吸収は緩徐化する（同様の経路により投与しなければならない、市販のペイロード形態と比較した利点）ことが想定される。一部の実施形態では、コンジュゲーション組成物は、投与されるターゲティングコンジュゲート組成物が、皮下または筋内投与された場合、血液循環系に入った後であってもなお、デポ剤として作用するように、活性ペイロードの持続放出を可能とする切断配列（上記でより完全に記載した）を含む。ターゲティングコンジュゲート組成物は、本明細書で開示される特性の改善の、１もしくは複数または任意の組合せを呈示しうることが、とりわけ想定される。これらの特性の増強の結果として、ターゲティングコンジュゲート組成物は、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されておらず、かつ、同等の方式で投与されるペイロードと比較した、投与頻度の減少、投与のいっそうの微調整、および／または毒性の低減を可能とする。このようなターゲティングコンジュゲート組成物は、本明細書で記載される通り、ペイロードの、それを必要とする対象への投与の影響を受けるか、これにより緩和されるか、または防止されることが、当技術分野で公知の、ある特定の状態を処置するのに有用である。
【０３３６】
１．コンジュゲーションのための架橋剤反応物
別の態様では、本発明は、架橋剤にコンジュゲートさせる結果として、ターゲティングコンジュゲート組成物を調製するのに活用しうる、ＣＣＤ架橋剤およびＸＴＥＮ架橋剤コンジュゲートをもたらすＣＣＤまたはＸＴＥＮに関する。特に、本明細書で記載されるＣＣＤ架橋剤およびＸＴＥＮ架橋剤コンジュゲートパートナーは、当技術分野で公知の通り、本明細書で記載される構成要素間の反応に利用可能であり、これに適する、少なくとも１つのチオール、アミノ、アミノオキシ、カルボキシル、アルデヒド、アルコール、アジド、アルキンまたは他の任意の反応性基を保有する、ペイロード薬剤へのコンジュゲーションに有用である。
【０３３７】
別の態様では、本発明は、架橋剤にコンジュゲートさせる結果として、ターゲティングコンジュゲート組成物を調製するのに活用しうる、ペイロード架橋剤コンジュゲートをもたらすペイロードに関する。特に、本明細書で記載されるペイロード架橋剤パートナーは、当技術分野で公知の通り、本明細書で記載される構成要素間の反応に利用可能であり、これに適する、少なくとも１つのチオール、アミノ、アミノオキシ、カルボキシル、アルデヒド、アルコール、アジド、アルキンまたは他の任意の反応性基を保有する、ＣＣＤまたはＸＴＥＮへのコンジュゲーションに有用である。
【０３３８】
実質的に均質なＸＴＥＮの調製物を含む、ＣＣＤおよびＸＴＥＮの例示的な実施形態については、上記で記載した。本発明は、ペイロードをコンジュゲートさせうるプラットフォームとしてさらに用いられるＣＣＤおよびＸＴＥＮであって、それらが、下記で記載される他の特性の中でも、ある特定の、所望の薬物動態、化学的、および薬学的特性を組成物に付与する「担体」として用いられるような、ＣＣＤおよびＸＴＥＮを提供する。他の実施形態では、本発明は、ペプチドまたはポリペプチドのペイロードをコードする遺伝子に連結しうる、ＣＣＤまたはＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドであって、発現ベクターに組み込むことが可能であり、対象の組換え融合タンパク質の発現および回収に適する宿主に組み込みうるポリヌクレオチドを提供する。
【０３３９】
一部の実施形態では、本明細書の上記で記載したＣＣＤまたはＸＴＥＮ構成要素を操作して、規定された数の反応性のアミノ酸残基であって、架橋剤と反応させうるか、またはペイロードにコンジュゲートさせるのに使用しうる反応性基をさらに含有しうるアミノ酸残基を組み込む。一実施形態では、本発明は、１または複数のシステイン残基を含むＣＣＤであって、その各々が反応性チオール基を含有するシステインを、架橋剤にコンジュゲートさせる結果として、ＣＣＤ架橋剤コンジュゲートをもたらすか、またはチオール反応性ペイロードにコンジュゲートさせる結果として、ＣＣＤ−ペイロードコンジュゲートをもたらすＣＣＤを提供する。別の実施形態では、本発明は、表１１の配列などのシステイン操作ＸＴＥＮであって、その各々が反応性チオール基を含有するシステインを、架橋剤にコンジュゲートさせる結果として、ＸＴＥＮ架橋剤コンジュゲートをもたらすか、またはチオール反応性ペイロードにコンジュゲートさせる結果として、ＸＴＥＮ−ペイロードコンジュゲートをもたらすＸＴＥＮを提供する。別の実施形態では、本発明は、α−アミノ基を伴うＸＴＥＮまたはリシン操作ＸＴＥＮであって、その各々が正に帯電した親水性ε−アミノ基を含有するリシンを、架橋剤にコンジュゲートさせる結果として、ＸＴＥＮ架橋剤コンジュゲートをもたらすか、またはアミン反応性ペイロードにコンジュゲートさせる結果として、ＸＴＥＮ−ペイロードコンジュゲートをもたらすＸＴＥＮを提供する。システイン操作ＸＴＥＮについてのこれらの実施形態では、システイン操作ＸＴＥＮの各々は、コンジュゲーションに利用可能である約１〜約１００個のシステインアミノ酸、または１〜約５０個のシステインアミノ酸、または１〜約４０個のシステインアミノ酸、または１〜約２０個のシステインアミノ酸、または１〜約１０個のシステインアミノ酸、または１〜約５個のシステインアミノ酸、または９つのシステイン、または３つのシステイン、または単一のシステインアミノ酸を含む。リシン操作ＸＴＥＮについてのこれらの実施形態では、リシン操作ＸＴＥＮの各々は、コンジュゲーションに利用可能である約１〜約１００個のリシンアミノ酸、または１〜約５０個のリシンアミノ酸、または１〜約４０個のリシン操作アミノ酸、または１〜約２０個のリシン操作アミノ酸、または１〜約１０個のリシン操作アミノ酸、または１〜約５個のリシン操作アミノ酸、または単一のリシンを含む。別の実施形態では、操作ＸＴＥＮは、前出の範囲または数のシステイン残基およびリシン残基の両方を含む。別の実施形態では、本発明は、各々が、約１〜約１０個のシステインアミノ酸、または１〜約１０個のシステインアミノ酸、または１つ〜約３つのシステインアミノ酸を含むＣＣＤを提供する。一実施形態では、本発明は、その各々が反応性チオール基を含有する組込みシステインを、架橋剤にコンジュゲートさせる結果として、ＣＣＤ架橋剤コンジュゲートをもたらすＣＣＤを提供する。
【０３４０】
一般に、システインチオール基は、求電子コンジュゲーション試薬に対して、アミンまたはヒドロキシル基より、反応性が大きい（具体的には、求核性が大きい）。加えて、システイン残基は一般に、所与のタンパク質内に、少数で見出されるので、同じタンパク質内で、複数のコンジュゲーションを結果としてもたらす可能性が低い。システイン残基は、リガンドへの共有結合的接続を形成するように、または新たな分子内ジスルフィド結合を形成するように、遺伝子操作法により、タンパク質に導入されている（Betterら（１９９４年）、J.  Biol.  Chem.、１３巻：９６４４〜９６５０頁；Bernhardら（１９９４年）、Bioconjugate  Chem.、５巻：１２６〜１３２頁；Greenwoodら（１９９４年）、Therapeutic  Immunology、１巻：２４７〜２５５頁；Tuら（１９９９年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci  USA、９６巻：４８６２〜４８６７頁；Kannoら（２０００年）、J.  of  Biotechnology、７６巻：２０７〜２１４頁；Chmuraら（２００１年）、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA、９８巻（１５号）：８４８０〜８４８４頁；米国特許第６，２４８，５６４号）。
【０３４１】
一実施形態では、本発明は、架橋剤にコンジュゲートさせたシステイン操作ＸＴＥＮまたはＣＣＤを含み、架橋剤が、スルフヒドリル反応性ホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋剤から選択される単離組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、架橋剤によりコンジュゲートさせたリシン操作ＸＴＥＮを含み、架橋剤が、アミン反応性ホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋剤から選択される単離組成物を提供する。架橋とは一般に、２つまたはそれを超える分子を、共有結合により、化学的に連結する工程を指す。工程はまた、タンパク質および他の生物分子を伴うその使用に言及して、コンジュゲーションまたはバイオコンジュゲーションとも呼ばれる。例えば、反応性の結合部位を保護もしくは曝露するか、機能を不活化させるか、または官能基を変化させて、架橋のための新たな標的を創出するために、タンパク質を、修飾して、タンパク質上およびペプチド上のＮおよびＣ末端、ならびにアミノ酸側鎖を変更することができる。
【０３４２】
一態様では、本発明は、ＸＴＥＮポリマーへの部位特異的コンジュゲーションのための方法であって、化学的に活性のアミノ酸残基またはそれらの誘導体（例えば、Ｎ末端のα−アミン基、リシンのε−アミン基、システインのチオール基、Ｃ末端のカルボキシル基、グルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシル基）を使用して達せられる方法を提供する。一級α−アミノ基およびε−アミノ基との反応に適する官能基は、クロロシアヌレート、ジクロロトレアジン、トレジレート、ベンゾトリアゾールカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、トリクロロフェニルカーボネート、アルデヒド、混合無水物、カルボニルイミダゾール、イミドエステル、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルおよびペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルである（Harris,  J.  M.、Herati,  R.  S.、Polym.  Prepr.（Am.  Chem.  Soc.、Div.  Polym.  Chem）、３２巻（１号）、１５４〜１５５頁（１９９１年）；Herman,  S.ら、Macromol.  Chem.  Phys.、１９５巻、２０３〜２０９頁（１９９４年）；Roberts,  M.  J.ら、Advanced  Drug  Delivery  Reviews、５４巻、４５９〜４７６頁（２００２年））。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ−エステルおよびそれらの水溶性類似体であるスルホ−ＮＨＳ−エステル）は一般に、タンパク質コンジュゲーションのために使用される（図２を参照されたい）。ＮＨＳ−エステルは、生理学的ｐＨにおける、比較的効率的なカップリングにより、一級アミンとの反応時に、安定的なアミド生成物をもたらす。コンジュゲーション反応は典型的に、５０〜２００ｍＭのリン酸緩衝液、重炭酸／炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、またはホウ酸緩衝液（７〜９の間のｐＨ）中、４℃〜室温で、０．５〜２時間にわたり実施する。ＮＨＳ−エステルは通例、タンパク質に対する２〜５０倍のモル過剰量で使用する。試薬の濃度は、０．１〜１０ｍＭで変動させうるが、最適のタンパク質濃度は、５０〜１００μＭであることが典型的である。
【０３４３】
別の方法では、ＸＴＥＮポリペプチドが、単一のＮ末端のα−アミノ基だけを有する場合は、ＸＴＥＮを、意図的に組み込まれたリシン残基の、さらなるε−アミノ基を含有するように操作することができる（その例示的な配列を、表１１に提示する）。α−アミノ基とε−アミノ基とは、異なるｐＫａ値：Ｎ末端のアミノ酸のα−アミノ基については、約７．６〜８．０、リシンのε−アミノ基については、約１０〜１０．５を有する。ｐＫａ値のこのような著明な差違を、アミノ基の選択的修飾のために使用することができる。全ての一級アミンの脱プロトン化は、ｐＨ８．０を上回るｐＨで生じる。この環境では、異なるアミンの求核特性が、それらの反応性を決定する。脱プロトン化されると、求核性の大きなリシンのε−アミノ基が一般に、求電子剤に対して、α−アミノ基より反応性が大きい。他方、低ｐＨ（例えば、ｐＨ６）では、酸性の強いα−アミノ基が一般に、ε−アミノ基より強く脱プロトン化され、反応性の順序は、逆転する。例えば、ＦＤＡ承認薬であるＮｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグラスチム）は、２０ｋＤａのＰＥＧ−アルデヒドの共有結合的接続により修飾された顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。タンパク質のＮ末端のアミノ酸の特異的修飾は、α−アミノ基の、内部リシンのε−アミノ基と比較した低ｐＫａを利用することにより達せられた（Molineaux,  G、Curr.  Pharm.  Des.、１０巻、１２３５〜１２４４頁（２００４年）、米国特許第５，８２４，７８４号）。
【０３４４】
システイン残基を含むＣＣＤおよびＸＴＥＮポリペプチドは、本明細書で記載される組換え法（例えば、実施例を参照されたい）を使用して、または当技術分野で公知の標準的な方法により、遺伝子操作することができる。チオール基へのコンジュゲーションは、架橋剤により接合した単一のコンジュゲート種の形成をもたらす、高度に特異的な反応を使用して実行することができる。システインチオール基との反応に適する官能基は、Ｎ−マレイミド、ハロアセチル、およびピリジルジスルフィドである。マレイミド基は、反応混合物のｐＨが、ｐＨ６．５〜７．５の間である場合に、スルフヒドリル基と特異的に反応し、可逆的ではない、安定的なチオエーテル連結を形成する（図３を参照されたい）。中性のｐＨでは、マレイミドは、スルフヒドリルと、アミンとの場合の１，０００倍の速さで反応するが、ｐＨが、８．５を超えて上昇すると、反応は、一級アミンを強く選択する。マレイミドは、チロシン、ヒスチジン、またはメチオニンとは反応しない。反応溶液については、チオールは、カップリング部位について競合するので、マレイミドと共に使用される反応緩衝液から除去しなければならない。反応物中の過剰のマレイミドは、反応の終了時において、遊離チオールを添加することによりクェンチングしうるが、ＥＤＴＡを、カップリング緩衝液中に組み入れて、スルフヒドリルの酸化を最小化することができる。
【０３４５】
別の実施形態では、本発明は、ＣＣＤまたはＸＴＥＮまたはペイロードのスルフヒドリル基を架橋して、対象のコンジュゲートを調製するのに有用である、ハロアセチル試薬の使用を想定する。最も一般に使用されるハロアセチル試薬は、生理学的ｐＨでスルフヒドリル基と反応する、ヨードアセチル基を含有する。ヨードアセチル基の、スルフヒドリルとの反応は、ヨウ素の、チオールによる求核置換であって、安定的なチオエーテル連結をもたらす求核置換により進行する（図４を参照されたい）。スルフヒドリル基の数に対してわずかに過剰のヨードアセチル基を、ｐＨ８．３で使用することにより、スルフヒドリル選択性を確保する。大過剰のヨードアセチル基を使用する場合、ヨードアセチル基は、他のアミノ酸と反応する可能性がある。イミダゾールは、ヨードアセチル基と、ｐＨ６．９〜７．０で反応しうるが、インキュベーションは、１週間より長期間にわたり継続しなければならないことが典型的である。ヒスチジル側鎖およびアミノ基は、それぞれ、ｐＨ５およびｐＨ７を上回る、非プロトン化形態で、ヨードアセチル基と反応する。別の実施形態では、スルフヒドリル基に有用な架橋剤は、ピリジルジスルフィドである。ピリジルジスルフィドは、スルフヒドリル基と、広範なｐＨ範囲にわたり（最適のｐＨは、４〜５である）反応して、ＣＣＤまたはＸＴＥＮを、ペイロードに連結するジスルフィド結合を形成する（図５を参照されたい）。ジスルフィドとして、これらの試薬を使用して調製されるコンジュゲートは、切断性である。反応中に、分子の−ＳＨ基と、２−ピリジルジチオール基との間で、ジスルフィド交換が生じる。結果として、ピリジン−２−チオンが、放出される。これらの試薬は、架橋剤として使用することができ、スルフヒドリル基を、タンパク質に導入するのに使用することができる。ジスルフィド交換は、生理学的ｐＨで実施しうるが、反応速度は遅い。
【０３４６】
活性の合成ペプチドまたはポリペプチドを含むターゲティングコンジュゲート組成物は、化学的に活性のアミノ酸残基またはそれらの誘導体；例えば、Ｎ末端のα−アミノ基、リシンのε−アミノ基、システインのチオール基、Ｃ末端のアミノ酸のカルボキシル基、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル基を使用して調製することができる。各ペプチドは、一次アミノ酸配列のいかんに関わらず、Ｎ末端のα−アミノ基を含有する。必要な場合、Ｎ末端のα−アミノ基は、活性のペプチド／ポリペプチドの化学合成時に、保護（ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ／ｂｌｏｃｋｅｄ）したままにすることができる。合成ペプチド／ポリペプチドは、天然の場合もあり、コンジュゲーションのために特異的に置換する場合もある、リシンのさらなるε−アミノ基を含有しうる。
【０３４７】
システインは一般に、天然ペプチドおよびタンパク質配列中で、リシンほど夥多ではないので、コンジュゲーションのための部位としてのシステインの使用は、反応における、ＸＴＥＮ架橋剤分子への複数コンジュゲーションの可能性を低減する。システインの使用はまた、コンジュゲーション時の、ペプチド／タンパク質の不活化の可能性も低減する。さらにまた、システイン部位へのコンジュゲーションは、十分に規定された形で実行しうることが多く、単一分子種のポリペプチドコンジュゲートの形成をもたらす。場合によって、システインは、コンジュゲートさせるペプチドのアミノ酸配列内に非存在であってもよい。このような場合、システイン残基は、組換えにより、または標準的な方法を使用する合成により、ペプチドのＮまたはＣ末端に付加することができる。代替的に、選択されたアミノ酸を、システインに化学または遺伝子修飾することができる。一例として述べると、セリンのシステインへの修飾は、保存的突然変異と考えられる。システインを欠くペプチドにチオール基を導入する別の手法は、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート）、ＳＡＴＰ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート）、ＳＡＴ−ＰＥＯ４−Ａｃ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチル（チオテトラエチレングリコール））、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート）（下記でより完全に記載される）など、チオール化試薬を使用する、リシンε−アミノ基の化学修飾である。ペプチドに固有のチオール基を導入したら、上記で記載した、Ｎ−マレイミド、ハロアセチル、およびピリジルジスルフィドなどのスルフヒドリル反応性基を含有する化合物により、選択的に修飾することができる。
【０３４８】
ＣＣＤまたはＸＴＥＮポリペプチドと、ペプチド、タンパク質、または低分子の薬物ペイロードとの間のコンジュゲーションは、例えば、R.  F.  Taylor（１９９１年）、「Protein  immobilization.  Fundamentals  and  Applications」、Marcel  Dekker  Inc.、N.Y.；G.  T.  Hermansonら（１９９２年）、「Immobilized  Affinity  Ligand  Techniques」、Academic  Press、San  Diego；G.  T.  Hermanson（２００８年）、「Bioconjugate  Techniques」、２版、Elsevier,  Inc.；S.  S.  Wong（１９９１年）、「Chemistry  of  Protein  Conjugation  and  Crosslinking」、CRC  Press、Boca  Ratonにおいて記載されている方法など、当技術分野で公知であり、利用可能な方法に従い、市販されている、長さゼロの架橋剤化合物、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性の架橋剤化合物、および多官能性の架橋剤化合物を含む、様々な連結化学反応により達成することができる。本開示のコンジュゲートの調製における使用に適する架橋剤は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＰｉｅｒｃｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＰｒｏｔｅｏＣｈｅｍ、Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓなどの業者から市販されている。架橋剤についての好ましい実施形態は、チオール反応性官能基またはアミノ反応性官能基を含む。例示的な架橋剤のリストを、表２３に提示する。
【表２３】
2018500049.tif 000111
【０３４９】
架橋剤の非限定的な例は、ＢＭＢ（１，４−ビス−マレイミドブタン）、ＢＭＤＢ（１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン）、ＢＭＨ（ビス−マレイミドヘキサン）、ＢＭＯＥ（ビス−マレイミドエタン）、ＢＭＰＨ（Ｎ−（β−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド）、ＢＭＰＳ（Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＢＭ（ＰＥＧ）２（１，８−ビス−マレイミドジエチレン−グリコール）、ＢＭ（ＰＥＧ）３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）、ＢＳ２Ｇ（ビス（スルホスクシンイミジル）グルタレート）、ＢＳ３（スルホ−ＤＳＳ）（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）、ＢＳ［ＰＥＧ］５（ビス（ＮＨＳ）ＰＥＧ５）、ＢＳ（ＰＥＧ）９（ビス（ＮＨＳ）ＰＥＧ９）、ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス（２−［スクシンイミドキシカルボニルオキシ］エチル）スルホン）、Ｃ６−ＳＡＮＨ（Ｃ６−スクシンイミジル４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン）、Ｃ６−ＳＦＢ（Ｃ６−スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＰＤＰＢ（１，４−ジ−（３’−［２’ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ブタン）、ＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタレート）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシミジルプロピオネート）、ロマント試薬）、ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタルタレート）、ＤＴＭＥ（ジチオビス−マレイミドエタン）、ＤＴＳＳＰ（スルホ−ＤＳＰ）（３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート））、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート））、ＥＭＣＡ（Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸）、ＥＭＣＨ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＫＭＵＡ（Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸）、ＫＭＵＨ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート））、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド）、ＳＢＡＰ（スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート）、ＳＦＢ（スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート）、ＳＨＴＨ（スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタレート）、ＳＩＡ（Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＭ［ＰＥＧ］２（ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マ��イミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］４（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）、ＳＭ（ＰＥＧ）６（ＮＨＳ−ＰＥＧ６−マレイミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］８（ＮＨＳ−ＰＥＧ８−マレイミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］１２（ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−マレイミド）、ＳＭ（ＰＥＧ）２４（ＮＨＳ−ＰＥＧ２４−マレイミド）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチレート）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、ＳＰＢ（スクシンイミジル−（４−ソラーレン−８−イルオキシ）ブチレート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、スルホ−ＤＳＴ（スルホジスクシンイミジルタルトレート）、スルホ−ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホ−スクシンイミジルスクシネート））、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ（Maleimidobutryloxy））スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（スルホスクシンイミジル６−（α−メチル−α−［２−ピリジルジチオ］−トルアミド）ヘキサノエート）、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＳＩＡＢ（スルホスクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート）、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＴＭＥＡ（トリス−（２−マレイミドエチル）アミン）、ＴＳＡＴ（トリス−（スクシンイミジルアミノトリアセテート））である。
【０３５０】
一部の実施形態では、架橋試薬を使用するＣＣＤコンジュゲートまたはＸＴＥＮコンジュゲートは、非天然スペーサーアームを導入する。しかし、天然のペプチド結合が好ましい場合、本発明は、カルボキシレート基の活性化を介して作用する、長さゼロの架橋剤を使用して実行されうる反応を提供する。それらの実施形態では、反応選択性を達成するために、第１のポリペプチドは遊離Ｃ末端のカルボキシル基だけを含有しなければならず、全てのリシン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸側鎖は、保護するが、第２のペプチド／タンパク質では、Ｎ末端のα−アミンが、唯一の利用可能な非保護アミノ基でなければならない（任意のリシン、アスパラギン、またはグルタミンが保護されることを要請する）。このような場合、表１０のＸＴＥＮ  ＡＧファミリーの配列であって、ＸＴＥＮコンジュゲートまたはＸＴＥＮ架橋剤内の第１のポリペプチドとして、グルタミン酸を伴わない配列の使用が好ましい。したがって、一実施形態では、本発明は、ＡＧ  ＸＴＥＮ配列を含み、組成物を、長さゼロの架橋剤を使用して、ペイロードにコンジュゲートさせた、ＸＴＥＮ架橋剤およびＸＴＥＮコンジュゲートを提供する。実施形態において活用される、例示的な長さゼロの架橋剤は、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド）およびＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を含むがこれらに限定されず、この場合、架橋剤を使用して、１つの分子（ペイロードなど）のカルボキシル官能基を、その官能基を伴うペイロードなど、別の分子の一級アミンに直接コンジュゲートさせる（図６を参照されたい）。スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）は、コンジュゲーションのための触媒として使用し、反応効率を増大させる（Grabarek  Z、Gergely  J.  Zero-length  crosslinking  procedure  with  the  use  of  active  esters（１９９０年）、Anal.  Biochem.、１８５巻（１号）、１３１〜１３５頁）。ＥＤＣは、カルボン酸基と反応し、カルボキシル基を活性化させて、活性のＯ−アシルイソ尿素中間体を形成し、反応混合物中のアミノ基へのカップリングを可能とする。Ｏ−アシルイソ尿素中間体は、水溶液中で不安定であることから、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して、中間体の安定性を増大させない限り、２ステップコンジュゲーション手順では無効となる。この中間体は、一級アミンと反応して、アミド誘導体を形成する。架橋反応は通例、ｐＨ４．５〜５の間で実施し、多くの適用のために、数分間を要請するに過ぎない。しかし、反応の収率は、４．５〜７．５のｐＨで同様である。ＥＤＣの加水分解は、カップリング中の競合反応であり、温度、ｐＨ、および緩衝液組成に依存する。４−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）は、有効なカルボジイミド反応緩衝液である。リン酸緩衝液は、ＥＤＣの反応効率を減殺するが、ＥＤＣの量を増大させることにより、効率の減殺を補完することができる。トリス、グリシン、および酢酸緩衝液は、コンジュゲーション緩衝液として使用することができない。
【０３５１】
本開示はまた、ターゲティングコンジュゲート組成物の３つの構成要素であって、化学式ＶＩＩＩ、下記、または図３４Ｃで描示される構成要素などの構成要素のうち、２つのＸＴＥＮを、三価架橋剤により、融合タンパク質に連結する結果として、三量体のコンジュゲートをもたらす組成物も提示する。本発明はまた、化学式Ｉ〜ＶＩＩの融合タンパク質の３つの分子を、三量体の架橋剤を使用して、融合タンパク質のシステイン操作ＸＴＥＮ構成要素により連結する構成も想定する。三量体の架橋剤は、標準的なコンジュゲーション法を使用して、表２４に記載された、多様な反応性側鎖基を伴う合成ペプチドである、Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２またはＡｃ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＮＨ２に基づき創出することができる。
【表２４】
2018500049.tif 000112
【０３５２】
他の実施形態では、スペーサーアーム（直鎖状または分枝状）と、タンパク質または他の分子上の特異的官能基（例えば、一級アミン、スルフヒドリルなど）に接続することが可能である、２つまたはそれを超える反応性末端とからなる架橋剤を含む、広範な群にわたる架橋剤を使用して、ＣＣＤまたはＸＴＥＮと、ペイロードとを、コンジュゲートさせることができる。直鎖状架橋剤は、ホモ二官能性の場合もあり、ヘテロ二官能性の場合もある。ホモ二官能性架橋剤は、１ステップの反応手順でタンパク質を架橋するのに使用される、２つの同一な反応性基を有する。アミン反応性ホモ二官能性架橋剤の非限定的な例は、ＢＳ２Ｇ（ビス（スルホスクシンイミジル）グルタレート）、ＢＳ３（スルホ−ＤＳＳ）（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）、ＢＳ［ＰＥＧ］５（ビス（ＮＨＳ）ＰＥＧ５）、ＢＳ（ＰＥＧ）９（ビス（ＮＨＳ）ＰＥＧ９）、ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス（２−［スクシンイミドキシカルボニルオキシ］エチル）スルホン）、ＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタレート）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシミジルプロピオネート）（ロマント試薬）、ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタルタレート）、ＤＴＳＳＰ（スルホ−ＤＳＰ）（３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート））、ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート））、スルホ−ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホ−スクシンイミジルスクシネート））である。
【０３５３】
加えて、ＣＣＤコンジュゲートおよび／またはＸＴＥＮコンジュゲートおよび／またはＣＣＤ架橋剤および／またはＸＴＥＮ架橋剤組成物を創出する組成物および方法において援用されるホモ二官能性架橋剤の例は、ＢＭＢ（１，４−ビス−マレイミドブタン）、ＢＭＨ（ビス−マレイミドヘキサン）、ＢＭＤＢ（１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン）、ＢＭＯＥ（ビス−マレイミドエタン）、ＢＭ（ＰＥＧ）２（１，８−ビス−マレイミドジエチレン−グリコール）、ＢＭ（ＰＥＧ）３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）、ＤＰＤＰＢ（１，４−ジ−（３’−［２’ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ブタン）、ＤＴＭＥ（ジチオビス−マレイミドエタン）などのスルフヒドリル反応性薬剤である。
【０３５４】
ペイロードへの後続のコンジュゲーションのための、ＣＣＤ架橋剤およびＸＴＥＮ架橋剤コンジュゲートを創出するためには、逐次的な反応を制御しうるので、ヘテロ二官能性架橋剤が好ましい。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの異なる反応性基を有するので、組成物中のそれらの使用は、逐次的な２ステップコンジュゲーションを可能とする。ヘテロ二官能性試薬を、より不安定な基を使用して、第１のタンパク質と反応させる。一実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤の、ＣＣＤまたはＸＴＥＮ内の反応性基へのコンジュゲーションは、それぞれ、ＣＣＤ架橋剤またはＸＴＥＮ架橋剤コンジュゲートを結果としてもたらす。反応を完了させ、反応しなかった過剰な架橋剤を除去した後で、修飾されたタンパク質（ＸＴＥＮ架橋剤など）を、架橋剤の第２の反応性基と相互反応するペイロードに添加する結果として、ＣＣＤコンジュゲートまたはＸＴＥＮコンジュゲートをもたらすことができる。最も一般に使用されるヘテロ二官能性架橋剤は、一方の末端にアミン反応性基を含有し、他方の末端にスルフヒドリル反応性基を含有する。したがって、これらの架橋剤は、システインもしくはリシン操作ＸＴＥＮ、またはＸＴＥＮのＮ末端のアルファ−アミノ基を伴う使用に適する。ヘテロ二官能性架橋剤の非限定的な例は、ＡＭＡＳ（Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル）、ＢＭＰＳ（Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート））、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＢＡＰ（スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート）、ＳＩＡ（Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＭ［ＰＥＧ］２（ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マレイミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］４（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）、ＳＭ（ＰＥＧ）６（ＮＨＳ−ＰＥＧ６−マレイミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］８（ＮＨＳ−ＰＥＧ８−マレイミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］１２（ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−マレイミド）、ＳＭ（ＰＥＧ）２４（ＮＨＳ−ＰＥＧ２４−マレイミド）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチレート）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）���ルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（スルホスクシンイミジル６−（α−メチル−α−［２−ピリジルジチオ］−トルアミド）ヘキサノエート）、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＳＩＡＢ（スルホスクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート）、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）である。アミン含有分子およびスルフヒドリル含有分子の共有結合的コンジュゲーションを可能とするヘテロ二官能性架橋剤の例は、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）である。スルホ−ＳＭＣＣとは、ＳＭＣＣの水溶性の類似体であって、最大で１０ｍＭの濃度の水性緩衝液中で調製されうる類似体である。この架橋剤のスペーサーアーム内のシクロヘキサン環は、マレイミド基の加水分解の速度を、この環を含有しない同様の試薬と比較して減少させる。この特色は、ＳＭＣＣまたはスルホ−ＳＭＣＣによりマレイミドを活性化させたＣＣＤまたはＸＴＥＮを、スルフヒドリル含有分子への、その後のコンジュゲーションのために、凍結乾燥させ、保存することを可能とする。したがって、一実施形態では、本発明は、最適にアラインされる場合、表１１に明示された配列からなる群より選択される配列または配列の断片に対する、少なくとも約８０％の配列同一性、もしくは少なくとも約９０％、もしくは約９１％、もしくは約９２％、もしくは約９３％、もしくは約９４％、もしくは約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有するか、またはそれらと同一であるＸＴＥＮを有し、ＸＴＥＮのα−アミノ基またはリシン操作ＸＴＥＮのε−アミンに連結された、スルホ−ＳＭＣＣの１または複数の架橋剤を有するＸＴＥＮ架橋剤を提供する。別の実施形態では、本発明は、最適にアラインされる場合、表１０に明示された配列からなる群より選択される配列または配列の断片に対する、少なくとも約８０％の配列同一性、もしくは少なくとも約９０％、もしくは約９１％、もしくは約９２％、もしくは約９３％、もしくは約９４％、もしくは約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％の配列同一性を有するか、またはそれらと同一であるＸＴＥＮを有し、ＸＴＥＮのＮ末端のアミノ基に連結された、１つのスルホ−ＳＭＣＣを有するＸＴＥＮ架橋剤を提供する。前出で記載されたヘテロ二官能性架橋剤は、単一のアミンおよび単一のシステインを介して、２つの分子をコンジュゲートさせる。特殊な種類の架橋剤が、タンパク質内���ジスルフィド架橋への部位特異的コンジュゲーションのために開発された（Balan  S.ら、Site-specific  PEGylation  of  protein  disulfide  bonds  using  a  three-carbon  bridge（２００７年）、Bioconjugate  Chem.、１８巻、６１〜７６頁；Brocchini  S.ら、Disulfide  bridge  based  PEGylation  of  proteins（２００８年）、Advanced  Drug  Delivery  Reviews、６０巻、３〜１２頁）。まず、リンカーを、アミン特異的４−［２，２−ビス［ｐ−トリルスルホニル）メチル］アセチル）安息香酸−ＮＨＳエステルとして合成する。この分子を、ＣＣＤまたはＸＴＥＮのアミノ基に共有結合的に接続して、それぞれ、ＣＣＤ−Ｂｉｓ（スルホン）またはＸＴＥＮ−Ｂｉｓ（スルホン）をもたらすことができる。後者の分子の、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．８中のインキュベーションは、トルエンスルフィン酸の消失を結果としてもたらして、ＸＴＥＮ−α，β−不飽和β’−モノスルホンを発生させる。結果として得られる分子は、ジスルフィド架橋含有ペイロードタンパク質と、部位特異的な形で反応するであろう。第１のステップでは、ジスルフィド架橋を、還元により、２つのチオールに転換する。第２のステップでは、ＣＣＤ−モノスルホンまたはＸＴＥＮ−モノスルホンにより、２つのシステインをビスアルキル化する結果として、化学的に安定な３炭素架橋をもたらす。同じα，β−不飽和β’−モノスルホンを、ジスルフィド架橋に由来する２つのチオール基へのコンジュゲーションのためだけでなく、また、ポリヒスチジンタグへのコンジュゲーションのためにも使用することができる（Cong  Y.ら、Site-specific  PEGylation  at  histidine  tags（２０１２年）、Bioconjugate  Chem.、２３巻、２４８〜２６３頁）。
【０３５５】
スルホ−ＳＭＣＣを伴う架橋剤組成物を使用するコンジュゲーションは通例、２ステップ工程で実施する。一実施形態では、アミン含有タンパク質を、例えば、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ＝１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）または同等のアミン非含有緩衝液およびスルフヒドリル非含有緩衝液のコンジュゲーション緩衝液中、ｐＨ６．５〜７．５で調製する。ＥＤＴＡの、１〜５ｍＭまでの添加は、二価金属をキレート化し、これにより、スルフヒドリル含有タンパク質内のジスルフィドの形成を低減する一助となる。アミン含有タンパク質の濃度は、使用される架橋剤のモル過剰量を決定する。一般に、＜１ｍｇ／ｍｌのタンパク質試料は、４０〜８０倍のモル過剰量の架橋剤を活用し、１〜４ｍｇ／ｍｌのタンパク質試料は、２０倍のモル過剰の架橋剤を活用し、５〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質試料は、５〜１０倍のモル過剰量の架橋剤を活用する。反応混合物（アミン含有タンパク質および架橋剤）を、室温で３０分間または４℃で２時間にわたりインキュベートし、次いで、過剰な架橋剤を、コンジュゲーション緩衝液で平衡化させた脱塩カラムを使用して除去する。ＣＣＤ架橋剤またはＸＴＥＮ架橋剤を調製する場合は、組成物をこの地点で保つ。ＣＣＤ架橋剤またはＸＴＥＮ架橋剤を、ペイロードにコンジュゲートさせる実施形態では、スルフヒドリル含有ペイロードと、架橋剤コンジュゲートとを、最終コンジュゲートに所望のモル比（ＣＣＤまたはＸＴＥＮの分子１つ当たり１または複数のアミノ基にコンジュゲートさせた、期待される架橋剤の数を考慮に入れた）に対応し、ペイロード上に存在する単一のスルフヒドリル基と符合するモル比で混合する。反応混合物を、室温で３０分間または４℃で２時間にわたりインキュベートする。コンジュゲーション効率は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、それに続く、タンパク質染色、または逆相ＨＰＬＣもしくはカチオン／アニオン交換クロマトグラフィーなど、適切な解析用クロマトグラフィー法により推定することができる。
【０３５６】
一実施形態では、本発明は、多価である架橋剤を使用して創出されるコンジュゲート組成物であって、組成をＡｃ−（Ｌｙｓ＊−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）ｎ−Ｌｙｓ＊−ＮＨ２（式中、ｎ＝１、２、３、４、５などであり、Ｌｙｓ＊は、アジド、マレイミド、ヨードアセチル、ブロモアセチルなどに修飾されたε−アミノ基を伴うリシンである）とする合成ペプチドを使用して、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超えるＸＴＥＮを有する組成物を結果としてもたらすコンジュゲート組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、多価である架橋剤を使用して創出されるコンジュゲート組成物であって、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超える異なるペイロードに連結された、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超えるＸＴＥＮを有する組成物を結果としてもたらすコンジュゲート組成物を提供する。多価三官能性架橋剤の非限定的な例は、「Ｙ字型」のスルフヒドリル反応性ＴＭＥＡ（トリス−（２−マレイミドエチル）アミン）およびアミン反応性ＴＳＡＴ（トリス−（スクシンイミジル（succimimidyl）アミノトリアセテート）である。反応性部分の任意の組合せは、直鎖状であれ、分枝状であれ、多価組成物のための足場ポリマーを使用して設計することができる。特定の理論に束縛されずに述べると、三官能性リンカーにより連結された３つのＸＴＥＮを有するコンジュゲート組成物（ペイロードは、組み込まれたシステイン残基を介して、ＣＣＤに連結される）は、構築物の各「アーム」に、一価ＸＴＥＮ組成物と比較して、相応に短いＸＴＥＮを活用することが可能であり、この場合、同じ数のペイロードを、各ＣＣＤの組み込まれたシステイン残基に連結すると、結果として得られる三量体のターゲティングコンジュゲート組成物は、単量体のＸＴＥＮコンジュゲート組成物と同等の見かけの分子量および流体力学半径を有するが、より小さい粘度を有し、組成物の、小口径の注射針を介する対象への投与を支援し、同等数のＸＴＥＮアミノ酸を有する単量体の組成物と比較した、組成物の立体障害の低減および可撓性の増大のために、ペイロードからの、等しいかまたは良好な効力をもたらすであろう。
【０３５７】
架橋剤は、「ホモ二官能性」または「ヘテロ二官能性」として分類することができるが、この場合、ホモ二官能性架橋剤は、２つまたはそれを超える同一な反応性基を有し、同様の官能基を含有する分子をランダムに連結または重合する１ステップの反応手順において使用され、ヘテロ二官能性架橋剤は、それぞれの標的官能基を有する分子の単一ステップのコンジュゲーションを可能とするか、または所望されない重合化または自己コンジュゲーションを最小化する逐次的（２ステップ）コンジュゲーションを可能とする、異なる反応性基を有する。ＣＣＤ架橋剤またはＸＴＥＮ架橋剤を、後続の反応のための組成物として調製および単離する、好ましい実施形態では、ＣＣＤ架橋剤またはＸＴＥＮ架橋剤は、ヘテロ二官能性架橋剤に連結され、後続の反応に利用可能な、少なくとも１つの反応性基を有する。
【０３５８】
一実施形態では、本発明は、切断性架橋剤を活用して、ジスルフィド結合によりコンジュゲートさせたコンジュゲート組成物を提供する。切断は、β−メルカプトエタノール、ＤＴＴ、ＴＣＥＰなどのジスルフィド結合還元剤により実行することが典型的であるが、このような組成物は、内因性還元剤（システインおよびグルタチオンなど）を伴う条件により、徐放的な方式で、内因的に切断性であることが、とりわけ想定される。以下はこのような架橋剤の非限定的な例である：ＤＰＤＰＢ（１，４−ジ−（３’−［２’ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ブタン）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシミジルプロピオネート）（ロマント試薬）、ＤＴＭＥ（ジチオビス−マレイミドエタン）、ＤＴＳＳＰ（スルホ−ＤＳＰ）（３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート））、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（スルホスクシンイミジル６−（α−メチル−α−［２−ピリジルジチオ］−トルアミド）ヘキサノエート）、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート）。別の実施形態では、ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス（２−［スクシンイミドキシカルボニルオキシ］エチル）スルホン）を含むＸＴＥＮコンジュゲートを、アルカリ条件下で切断することができる。別の実施形態では、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタルタレート）およびＢＭＤＢ（１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン）を含むＸＴＥＮコンジュゲートを、過ヨウ素酸酸化により切断することができる。ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート））およびスルホ−ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホ−スクシンイミジルスクシネート））は、ヒドロキシルアミンにより切断されるが、活性のペイロードが、コンジュゲートから放出されるように、内因的に切断されることが期待される。
【０３５９】
一般に、上記で記載したコンジュゲーション試薬は、架橋剤が、アミン、スルフヒドリル、およびカルボキシルなど、他の場合には、安定的な不活性基と反応性であることを仮定する。他の実施形態では、本発明は、生体ポリマー一般に対しては、安定的で不活性であるが、互いに対しては高度に反応性である、２つの官能基による、ＣＣＤ、ＸＴＥＮ、およびペイロードの個別の修飾に基づく、異なるコンジュゲーション法を提供する。いくつかの直交反応は、クリック化学反応という概念の下に群分けされ、これは、良好な安定特性を有し、したがって、個別の反応における、ペイロードとの後続のコンジュゲーションのための試薬として特に適する、ＸＴＥＮ−アジド／アルキン反応物をもたらす（Kolb  H.C.、Finn  M.G.、Sharpless  K.B.、Click  chemistry:  diverse  chemical  function  from  a  few  good  reactions（２００１年）、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  Engl.、４０巻（１１号）、２００４〜２０２１頁）。一般に、クリック化学反応は、（１）アルキン−アジド；（２）「エン」−チオール、および（３）アルデヒド−ヒドラジドを伴う反応を包摂する反応概念として使用され、本発明は、３つ全ての使用を想定する。一例は、図７に示される、１，４−ジ置換−１，２，３−トリアゾールを形成する、アルキンの、アジドへのヒュイスゲン１，３−双極子環化付加である。アジドおよびアルキン部分は、Ｎ末端のα−アミノ基、リシンのε−アミノ基、およびシステインのスルフヒドリル基の化学修飾により、ペプチド／タンパク質もしくは薬物ペイロードまたはＸＴＥＮに導入することができる。表２５は、コンジュゲート組成物の作製における使用のために想定される、クリック化学反応の反応物であって、意図されたコンジュゲート（ＣＣＤ、ＸＴＥＮまたはペイロード）の１つの構成要素を、表の反応物１と反応させ、第２の構成要素（ＣＣＤ、ＸＴＥＮ、またはペイロード）を、表のアジド反応物２と反応させる反応物の非限定的な例を提示する。例えば、１つの分子を、３−プロパルギルオキシプロパン酸、ＮＨＳエステル、アセチレン−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−ＮＨＳエステル、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル、シクロオクチン（ＣＯＴ）−ＰＥＧ２−ＮＨＳエステル、ＣＯＴ−ＰＥＧ３−ＮＨＳエステル、ＣＯＴ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル、ＣＯＴ−ＰＥＧ２−ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ＣＯＴ−ＰＥＧ３−ＰＦＰエステル、ＣＯＴ−ＰＥＧ４−ＰＦＰエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ２−ＮＨＳエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ３−ＮＨＳエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ２−ＰＦＰエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ３−ＰＦＰエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ４−ＰＦＰエステルなどのアミン反応性アルキンを使用して、アルキン部分で修飾する。代替的に、分子を、アセチレン−ＰＥＧ４−マレイミド、ＤＢＣＯ−マレイミド、またはＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドなどのスルフヒドリル反応性アルキンで修飾する。第２の分子を、アジド−ＰＥＧ２−ＮＨＳエステル、アジド−ＰＥＧ３−ＮＨＳエステル、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル、アジド−ＰＥＧ２−ＰＦＰエステル、アジド−ＰＥＧ３−ＰＦＰエステル、アジド−ＰＥＧ４−ＰＦＰエステルまたはアジド−ＰＥＧ４−マレイミドで修飾する。アジドおよびアルキン部分は、互換的に使用することができ、生物学的に固有であり、安定であり、生体分子および水性環境に対して不活性である。混合されると、アジドおよびアルキン反応物は、副反応を伴わずに、不可逆的な共有結合を形成する（Moses  J.E.およびMoorhouse  A.D.、The  growing  applications  of  click  chemistry（２００７年）、Chem.  Soc.  Rev.、３６巻、１２４９〜１２６２頁；Breinbauer  R.およびKoehn  M.、Azide-alkyne  coupling:  a  powerful  reaction  for  bioconjugate  chemistry（２００３年）、ChemBioChem、４巻（１１号）、１１４７〜１１４９頁；Rostovtsev  V.V.、Green  L.G.、Fokin  V.V.、Sharpless  K.B.、A  stepwise  Huisgen  cycloaddition  process:  copper(I)-catalyzed  regioselective  "ligation"  of  azides  and  terminal  alkynes（２００２年）、Angew  Chem  Int  Ed  Engl.、４１巻（１４号）、２５９６〜２５９９頁）。一実施形態では、本発明は、第２のＸＴＥＮにコンジュゲートさせた第１のＸＴＥＮを含むコンジュゲートを提供するが、この場合、第１のＸＴＥＮを、表２５のアルキン反応物１に連結し、第２のＸＴＥＮを、表２５のアジド反応物２に連結し、次いで、第１のＸＴＥＮと第２のＸＴＥＮとを、アルキン反応物１とアジド反応物２とを反応させるのに有効な条件下で連結する結果として、ＸＴＥＮ−ＸＴＥＮコンジュゲートをもたらす。別の実施形態では、本発明は、ペイロードにコンジュゲートさせた第１のＣＣＤを含むコンジュゲートを提供するが、この場合、ＣＣＤを、表２５のアルキン反応物１に連結し、ペイロードを、表２５のアジド反応物２に連結し、次いで、ＣＣＤとペイロードとを、アルキン反応物１とアジド反応物２とを反応させるのに有効な条件下で連結する結果として、ＣＣＤ−ペイロード−コンジュゲートをもたらす。別の実施形態では、本発明は、ペイロードにコンジュゲートさせた第１のＣＣＤを含むコンジュゲートを提供するが、この場合、ＣＣＤを、表２５のアジド反応物２に連結し、ペイロードを、表２５のアルキン反応物１に連結し、次いで、ＣＣＤとペイロードとを、アルキン反応物１とアジド反応物２とを反応させるのに有効な条件下で連結する結果として、ＣＣＤ−ペイロードコンジュゲートをもたらす。前出の実施形態では、反応を実行する条件は、本明細書で記載される条件であるか、またはこのような反応物のコンジュゲーションのための、当技術分野で公知の反応条件である。本発明はまた、前出のコンジュゲートの多様な組合せ；例えば、構成要素が、クリック化学反応の反応物により連結され、１つのＣＣＤが、クリック化学反応を使用して、ＣＣＤにコンジュゲートさせた、ペイロードの１または複数の分子をさらに含む、ＣＣＤ−ペイロードコンジュゲート、構成要素が、クリック化学反応の反応物により連結され、１つのＣＣＤが、クリック化学反応を使用して、ＣＣＤにコンジュゲートさせた、第１のペイロードの１または複数の分子をさらに含み、ＸＴＥＮが、クリック化学反応を使用して、ＸＴＥＮにコンジュゲートさせた、第２のペイロードの１または複数の分子をさらに含む、ＸＴＥＮ−ＣＣＤコンジュゲートも想定する。当業者には、これらの組合せに対するさらなる変更がたやすく明らかであろう。
【表２５】
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【０３６０】
一部の実施形態では、ＸＴＥＮコンジュゲートと、ＣＣＤコンジュゲートとを、チオール−エン反応と称するフリーラジカル反応、またはチオールマイケル付加と称するアニオン反応により進行する、チオ−エンベースのクリック化学反応（Hoyle  C.  E.およびBowman  C.N.、Thiol-ene  click  chemistry（２０１０年）、Angew.  Chem.  Int.  Ed.、４９巻、１５４０〜１５７３頁）を使用してコンジュゲートさせる。特に、チオールマイケル付加は、ペイロードがタンパク質であるターゲティングコンジュゲート組成物により良好に適すると考えられる（Pounder  R.  J.ら、Metal  free  thiol-maleimide  ‘Click’  reaction  as  a  mild  functionalisation  strategy  for  degradable  polymers（２００８年）、Chem  Commun  （Camb）、４１巻、５１５８〜５１６０頁）。少なくとも１つの分子は、遊離チオール基を含有する必要があるので、ペイロードがシステインを含有しない場合は、ＣＣＤを活用することができる。代替的に、チオール基は、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート）、ＳＡＴＰ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート）、ＳＡＴ−ＰＥＯ４−Ａｃ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチル（チオテトラエチレングリコール））、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート）などのチオール化試薬を使用して、ＸＴＥＮ、ＣＣＤ、またはペイロードペプチド／タンパク質の、Ｎ末端のα−アミノ基またはリシンのε−アミノ基を化学修飾することにより導入することができる。当技術分野では、このような方法が公知である（Carlsson  J.ら（１９７８年）、Biochem.  J.、１７３巻、７２３〜７３７頁；Wang  D.ら（１９９７年）、Bioconjug.  Chem.、８巻、８７８〜８８４頁；Traut  R.  R.ら（１９７３年）、Biochemistry、１２巻（１７号）、３２６６〜３２７３頁；Duncan,  R.  J.  S.ら（１９８３年）、Anal.  Biochem.、１３２巻、６８〜７３頁；米国特許第５，７０８，１４６号）。チオールマイケル付加反応の第２の成分は、（メト）アクリレート、マレイミド、α，β−不飽和ケトン、フマル酸エステル、アクリロニトリル、ケイ皮酸、およびクロトン酸における電子不足炭素間二重結合など、電子不足炭素間二重結合を伴う試薬を要請する。Ｎ−マレイミドは一般に、スルフヒドリル反応性官能基として使用され、上記で記載した、ＡＭＡＳ（Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル）、ＢＭＰＳ（Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル）、および他の架橋剤など、市販のヘテロ二官能性架橋剤を使用して、Ｎ末端のα−アミノ基またはＬｙｓのε−アミノ基の修飾を介して、ペイロード、ＣＣＤ、またはＸＴＥＮ分子に導入することができる。結果として得られる２つの分子であって、それぞれ、遊離チオールおよびマレイミド部分を含有する分子は、マイルドな条件下で、安定的な共有結合を形成する結果として、マレイミドにより連結されたコンジュゲートをもたらす。
【０３６１】
他の実施形態では、ＸＴＥＮコンジュゲート、ＸＴＥＮ−ＸＴＥＮコンジュゲート、およびＣＣＤコンジュゲートを、Ｇａｎｇｕｌｙらにより記載されており（Ganguly  T.ら、The  hydrazide/hydrazone  click  reaction  as  a  biomolecule  labeling  strategy  for  M(CO)3  (M  =  Re,  99mTc)  radiopharmaceuticals（２０１１年）、Chem.  Commun.、４７巻、１２８４６〜１２８４８頁）、図７において示されている反応など、ヒドラジドとアルデヒドとの間の反応に基づくクリック化学反応を活用して創出する。例えば、ＣＣＤは、アルデヒド基を有するペイロードと混合されて、所望のＣＣＤ−ペイロードコンジュゲートをもたらす、ヒドラジンまたはヒドラジドを有するように修飾することができる。一実施形態では、本発明は、少なくとも１つのヒドラジンまたはヒドラジドを導入したＣＣＤであって、安定的であると考えられるので、標的ペイロードへのコンジュゲーションのための試薬として適するＣＣＤをもたらすように、α−Ｎ末端アミノ基、または、代替的に、１または複数のリシンのε−アミノ基を修飾したＣＣＤを提供する。結果として得られるビス−アリールヒドラゾンであって、芳香族ヒドラジンおよび芳香族アルデヒドから形成されるビス−アリールヒドラゾンは、９２℃および２．０〜１０．０（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ，Ｉｎｃ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ、型番Ｓ−９０１０−１）にわたる広範なｐＨ値まで安定である。反応における脱離基は、水であり、結合を安定させるのに、還元剤（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム）は要請されない。ヒドラジン／ヒドラジドまたはアルデヒド部分により修飾された分子は、水性環境において良好な安定性を有し、特殊な取扱いを要請することなく、活性を保つ。ＣＣＤ分子のアミノ基は、ＳＡＮＨ（スクシンイミジル４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン）、Ｃ６−ＳＡＮＨ（Ｃ６−スクシンイミジル４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン）、ＳＨＴＨ（スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタレート塩酸塩）などのＮＨＳ−エステル／ヒドラジドにより修飾する。典型的な反応では、タンパク質を、修飾緩衝液（１００ｍＭのリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中、１〜５ｍｇ／ｍｌの溶液として調製し、修飾剤を、５〜２０倍のモル過剰中に添加し、反応を、室温で２時間にわたり実行する。別個に、ペイロード分子を、同様の条件下で、ＮＨＳ−エステル／アルデヒドＳＦＢ（スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート）またはＣ６−ＳＦＢ（Ｃ６−スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート）により修飾する。次いで、両方の修飾分子を、コンジュゲーション緩衝液（１００ｍＭのリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中で脱塩する。結果として得られる構成要素を、限界量の１モル当量タンパク質、および夥多に使用されうる、１．５〜２モル当量タンパク質を使用して、併せて混合する。１００ｍＭのリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中に、１００ｍＭのアニリンの触媒緩衝液を添加して、アニリンの最終濃度を、１０ｍＭまで調整し、反応を、室温で２時間にわたり実行する。
【０３６２】
別の実施形態では、ＣＣＤ−ペイロードまたはＸＴＥＮ−ペイロードコンジュゲートを、アルデヒドと、一級アミノ基との間の反応と、それに続く、形成されたシッフ塩基の、水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元により作製することができる。方法における第１のステップとして、ＣＣＤ分子、または一級α−アミノ基を伴うＸＴＥＮもしくはε−アミノ基を伴うＬｙｓ含有ＸＴＥＮなどのＸＴＥＮ分子を、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２など、アミン非含有カップリング緩衝液中の典型的なアミン−ＮＨＳ化学反応を使用して、ＮＨＳ−エステル／アルデヒドＳＦＢ（スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート）、Ｃ６−ＳＦＢ（Ｃ６−スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート）またはＳＦＰＡ（スクシンイミジル４−ホルミルフェノキシアセテート）により修飾する。結果として得られる修飾アルデヒド分子を、この時点で、ＸＴＥＮまたはＣＣＤ架橋剤組成物として保持することもでき、ターゲティングコンジュゲート組成物を創出する試薬として使用することもできる。ターゲティングコンジュゲート組成物を作製するには、修飾アルデヒド−ＣＣＤ（ＰＣＭおよびＸＴＥＮもまた、融合タンパク質として含みうる）を、反応性のアミノ基を伴うペイロード、および、２０〜１００ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムなど、マイルドな還元剤と混合する。反応混合物を、室温で最大６時間にわたり、または４℃で一晩にわたりインキュベートする。次いで、反応しなかったアルデヒド基を、５０〜５００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４および２０〜１００ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムで保護し、コンジュゲートさせ、精製したコンジュゲートの分離を可能とする。
【０３６３】
他の実施形態では、本発明は、ペプチドまたはタンパク質ペイロードを含むコンジュゲートであって、ペイロードを、ペイロードのペプチド／タンパク質のＣ末端の、アシルアジドの反応性に基づく化学的ライゲーションを介してコンジュゲートさせるコンジュゲートを提供する。例として述べると、ペプチドまたはタンパク質を、ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）樹脂による固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して作製する場合、最終ペプチドを、様々な求核試薬により、樹脂から切断して、多様なＣ末端の官能基を伴うペプチドへのアクセスをもたらすことができる。一実施形態では、方法は、ペプチドまたはタンパク質のヒドラジドをもたらす、ペプチジル／タンパク質樹脂のヒドラジン分解を含む。次いで、結果として得られるアシルヒドラジドの、亜硝酸ナトリウムまたはｔｅｒｔ−ブチルニトライトによる、希塩酸中の窒素化の結果として、アシルアジドの形成をもたらす。結果として得られるカルボニルアジド（またはアシルアジド）は、ＸＴＥＮまたはＣＣＤの一級アミンと反応して、安定的なアミド結合を形成する結果として、コンジュゲートをもたらしうる、活性化カルボキシレート基（エステル）である。代替的な実施形態では、一級アミンは、ＸＴＥＮまたはＣＣＤのＮ末端のα−アミンの場合もあり、ＸＴＥＮ配列内の操作リシン残基の、１または複数のε−アミンの場合もあろう。コンジュゲーション反応では、アジド官能基は、脱離基である。アミン基によるコンジュゲーション反応は、電子不足カルボニル基における、求核試薬の攻撃により生じる（Meienhofer,  J.（１９７９年）、The  Peptides:  Analysis,  Synthesis,  Biology、１巻、Academic  Press：N.Y.；ten  Kortenaar  P.  B.  W.ら、Semisynthesis  of  horse  heart  cytochrome  c  analogues  from  two  or  three  fragments（１９８５年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８２巻、８２７９〜８２８３頁）。
【０３６４】
別の実施形態では、本発明は、酵素的ライゲーションにより調製される、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。トランスグルタミナーゼとは、ペイロードペプチドまたはタンパク質のグルタミンのγ−カルボキサミド基と、リシン操作ＸＴＥＮ内のリシンのε−アミノ基との間のイソペプチド結合の形成を触媒し、これにより、ＸＴＥＮとペイロードとの間の分子間架橋または分子内架橋を創出する（図９を参照されたい）結果として、組成物をもたらす酵素である（Lorand  L、Conrad  S.M.、Transglutaminases（１９８４年）、Mol.  Cell  Biochem.、５８巻（１〜２号）、９〜３５頁）。ライゲーションのために使用されて成功している酵素の非限定的な例は、因子ＸＩＩＩａ（Schense  J.C.、Hubbell  J.A.、Cross-linking  exogenous  bifunctional  peptides  into  fibrin  gels  with  factor  XIIIa（１９９９年）、Bioconjug.  Chem.、１０巻（１号）：７５〜８１頁）、および組織トランスグルタミナーゼ（Collier  J.H.、Messersmith  P.B.、Enzymatic  modification  of  self-assembled  peptide  structures  with  tissue  transglutaminase（２００３年）、Bioconjug.  Chem.、１４巻（４号）、７４８〜７５５頁；Davis  N.  E.、Karfeld-Sulzer  L.  S.、Ding  S.、Barron  A.  E.、Synthesis  and  characterization  of  a  new  class  of  cationic  protein  polymers  for  multivalent  display  and  biomaterial  applications（２００９年）、Biomacromolecules、１０巻（５号）、１１２５〜１１３４頁）である。グルタミン基質の配列であるＧＱＱＱＬは、組織トランスグルタミナーゼに対して高特異性を有することが公知である（Hu  B.H.、Messersmith  P.B.、Rational  design  of  transglutaminase  substrate  peptides  for  rapid  enzymatic  formation  of  hydrogels（２００３年）、J.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻（４７号）、１４２９８〜１４２９９頁）。組織トランスグルタミナーゼの配列特異性は、アシルアクセプター（リシン）に対して、アシルドナー（グルタミン）に対するほど厳密ではなかった（Greenberg  C.  S.、Birckbichler  P.  J.、Rice  R.  H.、Transglutaminases:  multifunctional  cross-linking  enzymes  that  stabilize  tissues（１９９１年）、FASEB  J.、１９９１年、５巻、３０７１〜３０７７頁）。
【０３６５】
酵素により創出されるターゲティングコンジュゲート組成物についての代替的な実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに由来するソルターゼＡトランスペプチダーゼ酵素を使用して、タンパク質１のトレオニン残基とグリシン残基との間の、短い５アミノ酸の認識配列である、ＬＰＸＴＧの切断を触媒し、その後、アシル断片を、タンパク質１のＮ末端のオリゴグリシン求核試薬に転移させる（図８を参照されたい）。タンパク質２を官能化して、オリゴグリシンを含有させることにより、２つのタンパク質を、酵素により、部位特異的にコンジュゲートさせる結果として、所望のターゲティングコンジュゲート組成物をもたらすことが可能である。ソルターゼ認識部位（ＬＰＸＴＧ）を保有する（ポリ）ペプチドは、標準的な分子生物学のクローニングプロトコールを使用して、たやすく作製することができる。認識部位のＸ位にグルタミン酸を導入することは、この残基がソルターゼＡの天然基質内に一般に見出されるので、好都合である（Boekhorst  J.、de  Been  M.W.、Kleerebezem  M.、Siezen  R.  J.、Genome-wide  detection  and  analysis  of  cell  wall-bound  proteins  with  LPxTG-like  sorting  motifs（２００５年）、J.  Bacteriol.、１８７巻、４９２８〜４９３４頁）。高レベルのアシル転移は、基質のＣ末端（Popp  M.  W.、Antos  J.M.、Grotenbreg  G.M.、Spooner  E.、Ploegh  H.L.、Sortagging:  A  versatile  method  for  protein  labeling（２００７年）、Nat.  Chem.  Biol.、３１１巻、７０７〜７０８頁）および可撓性ループ（Popp  M.  W.、Artavanis-Tsakonas  K.、Ploegh  H.L.、Substrate  filtering  by  the  active-site  crossover  loop  in  UCHL3  revealed  by  sortagging  and  gain-of-function  mutations（２００９年）、J.  Biol.  Chem.、２８４巻（６号）、３５９３〜３６０２頁）の両方に、ソルターゼ切断部位を置くことにより、達成することができる。Ｃ末端において標識されたタンパク質のためには、最小限のＬＰＥＴＧタグ内のグリシンを、Ｃ末端に置かないことが重要であり、このグリシンを、少なくとも１つのさらなるＣ末端アミノ酸を伴うペプチド連結内に置かなければならない。加えて、切断部位のＣ末端に、追加のグリシンを付加して、ＬＰＥＴＧＧをもたらすことにより、良好な連結を達成する（Pritz  S.、Wolf  Y.、Kraetke  O.、Klose  J.、Bienert  M.、Beyermann  M.、Synthesis  of  biologically  active  peptide  nucleic  acid-peptide  conjugates  by  sortase-mediated  ligation（２００７年）、J.  Org.  Chem.、７２巻、３９０９〜３９１２頁；Tanaka  T.、Yamamoto  T.、Tsukiji  S.、Nagamune  T.、Site-specific  protein  modification  on  living  cells  catalyzed  by  sortase（２００８年）、Chembiochem、９５巻、８０２〜８０７頁）。ソルターゼ媒介型ペプチド転移に適合性の求核試薬には、遊離アミノ末端を伴う、グリシン残基の連なりという単一の構造的要請がなされる。ペプチド転移の成功は、１つ〜５つのいずれかのグリシンを含有する求核試薬により達成しうるが、好ましい実施形態では、２つまたは３つのグリシンが存在する場合に、最大の反応速度が得られる。
【０３６６】
コンジュゲーション化学反応の多様な実施形態について、タンパク質間コンジュゲーションとの関係で記載してきたが、本発明を実施する場合、標的低分子薬物内に存在する、アミン、スルフヒドリル、カルボキシルなどの官能基に適用可能なコンジュゲーション方法における、ターゲティングコンジュゲート組成物のペイロード部分は、低分子薬物でありうることが、とりわけ意図される。当業者は、その官能基が通例、アミノ、スルフヒドリル、およびカルボキシル基に限定される、タンパク質およびペプチドと比較して、なおより広範な化学的技法を適用しうることを理解するであろう。薬物ペイロードを、一級アミノ基、アミノキシ、ヒドラジド、ヒドロキシル、チオール、チオレート、スクシネート（ＳＵＣ）、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルブタノエート（ＳＢＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、ベンゾトリアゾールカーボネート（ＢＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ｐ−ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）を含むがこれらに限定されない官能基を介して、ＸＴＥＮにコンジュゲートさせることができる。薬物分子ペイロードの、他の適切な反応性の官能基は、アセタール、アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、およびブチルアルデヒド）、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、酸ハロゲン化物、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレートを含む。
【０３６７】
ペイロードとしての薬物を伴う、ＸＴＥＮコンジュゲートについての一部の実施形態では、薬物分子を、薬物およびＸＴＥＮまたはＣＣＤへの結合のための、２つの反応性の部位を有する架橋剤により、リシンもしくはシステイン操作ＸＴＥＮ（表１１の配列など）または表６のＣＣＤに接続する。好ましい架橋剤基は、コンジュゲートから切断された場合に、循環中の加水分解に対して比較的安定的であり、生体分解性であり、非毒性である架橋剤基である。加えて、架橋剤の使用により、コンジュゲートが、薬物と、ＣＣＤまたはＸＴＥＮとの間に、なおより大きな可撓性を伴う潜在的可能性をもたらすこともでき、ＣＣＤまたはＸＴＥＮが、薬理作用団およびその結合部位の間の結合に干渉しないように、薬物と、ＣＣＤまたはＸＴＥＮとの間に、十分な空間をもたらすこともできる。一実施形態では、架橋剤は、ＣＣＤまたはＸＴＥＮ上に存在する求核基と反応性の求電子基を有する反応性部位を有する。好ましい求核試薬は、チオール、チオレート、および一級アミンを含む。リシン操作ＸＴＥＮ、またはシステインを含むシステイン操作ＸＴＥＮもしくはＣＣＤの求核基のヘテロ原子は、架橋剤上の求電子基と反応性であり、架橋剤単位に対する共有結合を形成する結果として、架橋剤コンジュゲートをもたらす。架橋剤に有用な求電子基は、マレイミドおよびハロアセトアミド基を含むがこれらに限定されず、ＸＴＥＮへの接続に好都合な部位をもたらす。別の実施形態では、架橋剤は、コンジュゲーションが、ＸＴＥＮ架橋剤またはＣＣＤ架橋剤とペイロード薬物との間に生じる結果として、コンジュゲートをもたらすことができるように、薬物上に存在する求電子基と反応性である求核基を有する反応性部位を有する。薬物上の有用な求電子基は、ヒドロキシル、チオール、アルデヒド、アルケン、アルカン、アジド、およびケトンカルボニル基を含むがこれらに限定されない。架橋剤の求核基のヘテロ原子は、薬物上の求電子基と反応し、共有結合を形成しうる。架橋剤上の有用な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドを含むがこれらに限定されない。薬物上の求電子基は、架橋剤への接続に好都合な部位をもたらす。
【０３６８】
特定の実施形態では、対象のリシン操作ＸＴＥＮのリシンイプシロンアミノ基への、薬物のコンジュゲーションは、反応性である、薬物−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド反応物、または薬物−スクシンイミジルプロピオネートもしくは薬物−スクシンイミジルブタノエートなどのエステル、または他の薬物−スクシンイミドコンジュゲートを活用する。代替的に、対象のリシン操作ＸＴＥＮのリシン残基を使用して、２−イミノチオランとの反応を介して、遊離スルフヒドリル基を導入することができる。代替的に、対象リシン操作ＸＴＥＮのターゲティング物質であるリシンを、活性の薬物剤とのコンジュゲーションに利用可能な遊離ヒドラジドまたはアルデヒド基を有する、ヘテロ二官能性試薬に連結することができる。反応性エステルは、生理学的ｐＨでコンジュゲートさせうるが、反応性の小さな誘導体は、より高いｐＨ値を要請することが典型的である。不安定なタンパク質ペイロードを使用する場合は、低温もまた、援用することができる。低温度条件下では、コンジュゲーション反応のために、長い反応時間を使用することができる。
【０３６９】
別の特定の実施形態では、本発明は、対象のリシン操作ＸＴＥＮのリシン残基とのアミノ基コンジュゲーションを伴う、ＸＴＥＮコンジュゲートであって、コンジュゲーションを、Ｎ末端のアミノ酸のα−アミノ基のｐＫａ値（約７．６〜８．０）と、リシンのε−アミノ基のｐＫａ（約１０）との間の差違により容易とするコンジュゲートを提供する。末端のアミノ基のコンジュゲーションは、反応性の薬物−アルデヒド（薬物−プロピオンアルデヒドまたは薬物−ブチルアルデヒドなど）を援用することが多いが、これらは、アミンに対してより選択的であり、したがって、例えば、ヒスチジンのイミダゾール基と反応する可能性が低い。加えて、アミノ残基は、コハク酸無水物もしくは他のカルボン酸無水物、またはＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、またはｐ−ニトロフェニルクロロホルメートと反応して、それぞれ、活性化したスクシンイミジルカーボネート、イミダゾールカルバメート、またはｐ−ニトロフェニルカーボネートをもたらす。これらの薬剤による誘導体化には、リシニル残基の電荷を反転させる効果がある。薬物−アルデヒドの、対象のＸＴＥＮの末端のアミノ基へのコンジュゲーションは、リシン残基のε−アミノ基のｐＫａと、タンパク質のＮ末端の残基のα−アミノ基のｐＫａとの間の差違を利用することを可能とするｐＨで調製された、適切な緩衝液中で行うことが典型的である。実施形態の方法では、カップリングのための反応は、約ｐＨ７〜約８の範囲のｐＨを使用する。リシンイプシロンアミノ基のコンジュゲーションに有用な方法については、米国特許第４，９０４，５８４号および米国特許第６，０４８，７２０号において記載されている。
【０３７０】
ターゲティングコンジュゲート組成物の創出において使用される、活性化法および／またはコンジュゲーション化学反応は、ポリペプチドの反応性基のほか、薬物部分（例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、アルケン、アルカン、アジドなどである）の官能基、薬物−架橋剤反応物の官能基、またはＸＴＥＮ架橋剤もしくはＣＣＤ架橋剤反応物の官能基に依存する。薬物コンジュゲーションは、組み込まれたシステイン残基またはリシン残基上の、特異的な操作接続基など、操作ＸＴＥＮポリペプチドまたはＣＣＤ上の全ての利用可能な接続基へのコンジュゲーションに方向付けることができる。コンジュゲーションを、適切な反応性部位に方向付けるように、反応物を制御するために、本発明は、コンジュゲーション反応時における保護基の使用を想定する。「保護基」とは、ある特定の反応条件下で、分子内の特定の化学的に反応性の官能基の反応を防止または遮断する部分である。保護基は、保護される、化学的に反応性である基の種類、ならびに援用される反応条件、ならびに分子内のさらなる反応性基の存在に応じて変動するであろう。保護されうる官能基の非限定的な例は、カルボン酸基、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、およびカルボニル基を含む。カルボン酸およびヒドロキシルのための代表的な保護基は、エステル（ｐ−メトキシベンジルエステルなど）、アミド、およびヒドラジドを含み、アミノ基のためには、カルバメート（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルなど）、およびアミド；ヒドロキシル基のためには、エーテルおよびエステル；チオール基のためには、チオエーテルおよびチオエステル；カルボニル基のためには、アセタールおよびケタールなどを含む。このような保護基は、当業者に周知であり、例えば、T.  W.  GreeneおよびG.  M.  Wuts、Protecting  Groups  in  Organic  Synthesis、３版、Wiley、New  York、１９９９年、およびその中で引用されている参考文献において記載されている。コンジュゲーションは、１ステップで達成することもでき、本明細書で開示される架橋剤または薬物分子上の反応性の官能基に連結される、ポリペプチドのシステインまたはリシン残基へのコンジュゲーションに有用であることが当技術分野で公知の架橋剤を使用する、反応中間体架橋剤の添加を介するなど、段階的に達成することもできる（例えば、ＷＯ９９／５５３７７において記載されている通り）。
【０３７１】
本発明の一部の実施形態では、架橋剤を、システイン操作ＸＴＥＮまたはＣＣＤにコンジュゲートさせる方法は、任意のシステインジスルフィド残基を還元して、高度に求核性のシステインチオール基（−ＣＨ２ＳＨ）を形成するように、ＸＴＥＮまたはＣＣＤを、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤であらかじめ処理することを前提としうる。還元剤は、その後、脱塩によるなど、従来の任意の方法により除去する。こうして、還元されたＸＴＥＮまたはＣＣＤは、例えば、Klussmanら（２００４年）、Bioconjugate  Chemistry、１５巻（４号）、７６５〜７７３頁のコンジュゲーション法に従い、マレイミドまたはα−ハロカルボニルなど、求電子官能基により、薬物−リンカー化合物または架橋剤試薬と反応する。架橋剤または薬物の、システイン残基へのコンジュゲーションは、ｐＨ６〜９の適切な緩衝液中、４℃〜２５℃の様々な温度で、最大約１６時間にわたり行うことが典型的である。代替的に、システイン残基を誘導体化することができる。当技術分野では、適切な誘導体化剤および方法が周知である。例えば、システイニル残基は、最も一般に、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体をもたらす。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（４−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【０３７２】
場合によって、コンジュゲーションは、可能な限り多くの、利用可能な接続基を、薬物分子または薬物−リンカー分子と反応させることを目標とする条件下で実施する。これは、ポリペプチドに対して、適切なモル過剰の薬物により達成される。活性化させた薬物分子または薬物−リンカー分子の、ポリペプチドに対する典型的なモル比は、最大で約２００〜１または最大で約１００〜１など、最大で約１０００〜１である。しかし、場合によって、比は、最大で約５０〜１、１０〜１または５〜１など、やや低い場合もある。また、等モル比も使用することができる。
【０３７３】
好ましい実施形態では、本開示のターゲティングコンジュゲート組成物は、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されていない、対応するペイロードと比較して、薬理学的活性の少なくとも一部を保持する。一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されていないペイロードの薬理学的活性の、少なくとも約１％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を保持する。
【０３７４】
一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、ジスルフィド結合の還元、ｐＨ依存性の放出を含む、リンカーの非特異的もしくは酵素的加水分解、または表６のプロテアーゼを含む、外因性もしくは内因性プロテアーゼにより、ペイロードを体内に放出するように設計することができる。高分子は、受容体媒介型エンドサイトーシス、吸着性エンドサイトーシス、または液相エンドサイトーシスを介して、細胞に取り込まれうる（Jain  R.K.、Transport  of  molecules  across  tumor  vasculature（１９８７年）、Cancer  Metastasis  Rev.、６巻（４号）、５５９〜５９３頁；Jain  R.K.、Transport  of  molecules,  particles,  and  cells  in  solid  tumors（１９９９年）、Ann.  Rev.  Biomed.  Eng.、１巻、２４１〜２６３頁；Mukherjee  S.、Ghosh  R.N.、Maxfield  F.R.、Endocytosis（１９９７年）、Physiol.  Rev.、７７巻（３号）、７５９〜８０３頁）。ターゲティングコンジュゲート組成物が細胞に取り込まれると、ペイロードは、エンドソーム内（ｐＨ５．０〜６．５）およびリソソーム内（ｐＨ４．５〜５．０）の低ｐＨ値によるほか、リソソーム内の酵素（例えば、エステラーゼおよびプロテアーゼ）によっても放出されうる。酸感受性架橋剤の例は、チオール保有担体にカップリングさせうる、６−マレイミドドカプロイルヒドラゾン（6-maleimidodocaproyl  hydrazone）である。ヒドラゾンリンカーは、ｐＨ値＜５において迅速に切断され、コンジュゲートの内部化に続く、エンドソームおよびリソソームの酸性ｐＨにおける、ペイロードの放出を可能とする（Trail  P.A.ら、Effect  of  linker  variation  on  the  stability,  potency,  and  efficacy  of  carcinoma-reactive  BR64-doxorubicin  immunoconjugates（１９９７年）、Cancer  Res.、５７巻（１号）、１００〜１０５頁；Kratz  F.ら、Acute  and  repeat-dose  toxicity  studies  of  the  (6-maleimidocaproyl)hydrazone  derivative  of  doxorubicin  (DOXO-EMCH),  an  albumin-binding  prodrug  of  the  anticancer  agent  doxorubicin（２００７年）、Hum.  Exp.  Toxicol.、２６巻（１号）、１９〜３５頁）。臨床において承認されたｍＡｂ−薬物コンジュゲートである、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標））は、ＣＤ３３に対するヒト化ｍＡｂであるＰ６７．６を含有し、細胞傷害性の抗生剤であるカリケアマイシンに化学的に連結された、薬物−抗体コンジュゲートである。抗体と薬物との間のリンカーは、２つの不安定な結合：ヒドラゾンと、立体障害を受けるジスルフィドとを組み込む。酸感受性ヒドラゾン結合が、実際の切断部位であることが示されている（Jaracz  S.、Chen  J.、Kuznetsova  L.V.、Ojima  I.、Recent  advances  in  tumor-targeting  anticancer  drug  conjugates（２００５年）、Bioorg.  Med.  Chem.、１３巻（１７号）、５０４３〜５０５４頁）。
【０３７５】
ペイロードを、ジスルフィド結合により連結するターゲティングコンジュゲート組成物では、ペイロードは、不安定リンカー内のジスルフィド結合の還元により放出させることができる。例えば、ｈｕＮ９０１−ＤＭ１は、小細胞肺がんを処置するために、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．により開発された、腫瘍活性化免疫療法用プロドラッグである。プロドラッグは、微小管阻害剤であるメイタンシノイドＤＭ１とコンジュゲートさせた、ヒト化抗ＣＤ５６  ｍＡｂ（ｈｕＮ９０１）からなる。ヒンダードジスルフィド結合を介して、各抗体に、平均３．５〜３．９個のＤＭ１分子を結合させる。ジスルフィド連結は、血液中では安定であるが、ｈｕＭ９０１によりターゲティングされる細胞に入ると、迅速に切断され、こうして、活性のＤＭ１を放出する（Smith  S.V.、Technology  evaluation:  huN901-DM1,  ImmunoGen（２００５年）、Curr.  Opin.  Mol.  Ther.、７巻（４号）、３９４〜４０１頁）。ＤＭ１はまた、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製の抗前立腺特異的膜抗原ｍＡｂである、ＭＬＮ−５９１へもカップリングされている。ＤＭ１は、内部化時における細胞内の薬物の放出を可能とすると同時に、血清安定性をもたらす、ヒンダードジスルフィド結合を介して、抗体に連結されている（Henry  M.  D.ら、A  prostate-specific  membrane  antigen-targeted  monoclonal  antibody-chemotherapeutic  conjugate  designed  for  the  treatment  of  prostate  cancer（２００４年）、Cancer  Res.、６４巻（２１号）、７９９５〜８００１頁）。
【０３７６】
ターゲティングコンジュゲート組成物からのペイロードの放出は、短い切断性ペプチドを、ペイロードと、ＣＣＤまたは操作ＸＴＥＮとの間のリンカーとして使用して、組成物を創出することにより、達成することができる。臨床において評価されているコンジュゲートの例は、ドキソルビシンを、そのアミノ糖を通して、カテプシンＢなど、リソソーム内のプロテアーゼにより切断されるテトラペプチドスペーサーである、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙを介するＨＰＭＡコポリマーに連結した、ドキソルビシン−ＨＰＭＡ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）コンジュゲートである（Vasey  P.A.ら、Phase  I  clinical  and  pharmacokinetic  study  of  PK1  [N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide  copolymer  doxorubicin]:  first  member  of  a  new  class  of  chemotherapeutic  agents-drug-polymer  conjugates（１９９９年）、Clin.  Cancer  Res.、５巻（１号）、８３〜９４頁）。ペプチドリンカーを伴う担体−薬物コンジュゲートであって、開発の臨床段階に到達したコンジュゲートの他の例は、高分子白金錯体である。２つのＨＰＭＡベースの薬物候補は、カテプシンＢ切断性ペプチドスペーサーである、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ、またはトリペプチドスペーサーである、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙを介して錯化剤である、アミノマロン酸白金錯体を結合させた、ＨＰＭＡコポリマー骨格からなった（Rademaker-Lakhai  J.M.ら、A  Phase  I  and  pharmacological  study  of  the  platinum  polymer  AP5280  given  as  an  intravenous  infusion  once  every  3  weeks  in  patients  with  solid  tumors（２００４年）、Clin.  Cancer  Res.、１０巻（１０号）、３３８６〜３３９５頁；Sood  P.ら、Synthesis  and  characterization  of  AP5346,  a  novel  polymer-linked  diaminocyclohexyl  platinum  chemotherapeutic  agent（２００６年）、Bioconjugate  Chem.、１７巻（５号）、１２７０〜１２７９頁）。
【０３７７】
ほぼ例外なく、前立腺組織および前立腺癌内で発現する、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロテアーゼを介して前立腺がんをターゲティングする、高度に選択的な方法が、開発された。パクリタキセルの、新規のアルブミン結合性プロドラッグである、ＥＭＣ−ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＴｙｒＴｙｒＳｅｒＬｅｕ−ＰＡＢＣ−パクリタキセル（ＥＭＣ：ε−マレイミドカプロイル；ＰＡＢＣ：ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）が合成された。このプロドラッグは、水溶性であり、内因性および外因性アルブミンに結合させた。プロドラッグのアルブミン結合形態は、ＰＳＡにより切断され、パクリタキセル−ジペプチドＳｅｒ−Ｌｅｕ−ＰＡＢＣ−パクリタキセルを放出する。ＰＡＢＣ自己消失性リンカーの組込みのために、このジペプチドは、迅速に分解されて、最終的な切断生成物としてのパクリタキセルを放離する（Elsadek  B.ら、Development  of  a  novel  prodrug  of  paclitaxel  that  is  cleaved  by  prostate-specific  antigen:  an  in  vitro  and  in  vivo  evaluation  study（２０１０年）、Eur.  J.  Cancer、４６巻（１８号）、３４３４〜３４４４頁）。
【０３７８】
プロドラッグ送達系におけるそれらの有用性のために、自壊型スペーサーが多大な関心を集めている。いくつかの報告が、単一の切断イベントにより誘発される、ドミノ様鎖断片化を介して、それらの単位の全てを放出しうる、直鎖状自己消失性系またはデンドリマー構造について記載した（Haba  K.ら、Single-triggered  trimeric  prodrugs（２００５年）、Angew.  Chem.  Int.  Ed.、４４巻、７１６〜７２０頁；Shabat  D.、Self-immolative  dendrimers  as  novel  drug  delivery  platforms（２００６年）、J.  Polym.  Sci.、Part  A:  Polym.  Chem.、４４巻、１５６９〜１５７８頁；Warnecke  A.、Kratz  F.、2,4-Bis(hydroxymethyl)aniline  as  a  building  block  for  oligomers  with  self-eliminating  and  multiple  release  properties（２００８年）、J.  Org.  Chem.、７３巻、１５４６〜１５５２頁；Sagi  A.ら、Self-immolative  polymers（２００８年）、J.  Am.  Chem.  Soc.、１３０巻、５４３４〜５４３５頁）。１つの研究では、抗がん剤であるカンプトテシンの４つの分子と、ＰＥＧ５０００の２つの分子とを伴う、自壊型樹状プロドラッグが設計され、合成された。プロドラッグは、生理学的条件下で、ペニシリンＧアミダーゼにより有効に活性化し、遊離カンプトテシンを、反応培地に放出して、細胞増殖の阻害を引き起こした（Gopin  A.ら、Enzymatic  activation  of  second-generation  dendritic  prodrugs:  conjugation  of  self-immolative  dendrimers  with  poly(ethylene  glycol)  via  click  chemistry（２００６年）、Bioconjugate  Chem.、１７巻、１４３２〜１４４０頁）。腫瘍細胞内で過剰発現するプロテアーゼにより切断される特異的酵素基質を組み込めば、高度に効率的な、がん細胞特異的樹状プロドラッグ活性化系を作出することができよう。プロテアーゼにより切断される配列の非限定的な例を、表６に列挙する。
【０３７９】
一部の実施形態では、本発明は、二量体、三量体、四量体、およびより高次のコンジュゲートを含み、本明細書の上記で記載した、不安定リンカーを使用して、ペイロードを、ＸＴＥＮに接続した、ターゲティングコンジュゲート組成物の構成を提供する。前出についての一実施形態では、組成物は、組成物を、標的細胞上のリガンドまたは受容体に送達する、ターゲティング構成要素をさらに含む。別の実施形態では、本発明は、１つ、２つ、３つ、または４つの、個別のコンジュゲート組成物を、不安定リンカーにより、抗体または抗体断片にコンジュゲートさせ、腫瘍および他のがんの多様な処置などであるがこれらに限定されない、臨床適応のターゲティング治療における使用のための可溶性組成物をもたらすコンジュゲートであって、抗体が、ターゲティング構成要素をもたらし、次いで、標的細胞内に内部化されると、不安定リンカーにより、ペイロードを組成物から解離させ、意図される活性（例えば、腫瘍細胞内の細胞傷害作用）を及ぼすコンジュゲートを提供する。
【０３８０】
ＸＴＥＮの非構造化特徴および均一の組成および電荷は、コンジュゲーション反応に続く、ターゲティングコンジュゲート組成物の精製のために利用されうる特性を結果としてもたらす。イオン交換によるターゲティングコンジュゲート組成物の捕捉であって、反応しなかったペイロードおよびペイロード誘導体の除去を可能とする捕捉が、特に有用である。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるコンジュゲートの捕捉が、特に有用である。それらの親水性性質のために、大半のＸＴＥＮポリペプチドは、ＨＩＣ樹脂に対する低度な結合を示し、これにより、ペイロードとカラム材料との間の疎水性相互作用に起因する、ターゲティングコンジュゲート組成物の捕捉、およびコンジュゲーション工程中に、ペイロードへのコンジュゲートに失敗した、非コンジュゲート組成物からのそれらの分離を容易とする。高純度のＸＴＥＮおよびターゲティングコンジュゲート組成物は、大半の化学または天然ポリマー、特にＰＥＧ化されたペイロードと比較して、多大な利益を提供する。大半の化学および天然ポリマーは、ランダムまたは半ランダム重合化により作製される結果として、多くの相同体の発生をもたらす。このようなポリマーは、生成物中の標的実体の画分を増大させる多様な方法により分画することができる。しかし、濃縮後であってもなお、天然ポリマーの大半の調製物およびそれらのペイロードコンジュゲートは、１０％未満の標的実体を含有する。Ｇ−ＣＳＦとのＰＥＧコンジュゲートの例が、［Bagal,  D.ら（２００８年）、Anal  Chem、８０巻：２４０８〜１８頁］に記載されている。この刊行物は、治療的使用について承認されたＰＥＧコンジュゲートであってもなお、１００を超える相同体を含有し、これが、標的実体の少なくとも１０％の濃度で生じることを示す。
【０３８１】
ＰＥＧなど、ランダムポリマーの複雑性は、コンジュゲーションおよび精製時のモニタリングおよび品質管理の多大な妨げである。これに対し、本明細書で記載される方法により精製されたＸＴＥＮは、高レベルの純度および均一性を有する。加えて、本明細書で記載される通りに創出されたコンジュゲートは、約８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える、意図された標的を、意図された構成で含有する結果として、解釈が容易な質量スペクトルおよびクロマトグラムをもたらす。
【０３８２】
５．ターゲティングコンジュゲート組成物の構成
結果として得られる組成物に、微調整された特性を付与するために、ターゲティングコンジュゲート組成物の異なる構成または複数の所与の種類の構成要素を伴う構成を提供することは、本発明の目的である。
【０３８３】
一態様では、本発明は、ＣＣＤ内の各システイン部分にコンジュゲートさせた単一コピーのターゲティング部分、ＣＣＤ、ＸＴＥＮ、ペイロード（例えば、薬物または生物活性タンパク質）と、任意選択のＰＣＭとを有する、単量体のターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。
【０３８４】
一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式Ｉ：
【化１５】
2018500049.tif 000114
［式中、ｉ）ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の抗体に由来するか、あるいは表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；ｉｉ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；ｉｉｉ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；ｉｖ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい］
の構造に従い構成する。
【０３８５】
別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式ＩＩ：
【化１６】
2018500049.tif 000115
［式中、ｉ）ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の抗体に由来するか、あるいは表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；ｉｉ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；ｉｉｉ）ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択され；ｉｖ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；ｖ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい］
の構造に従い構成する。
【０３８６】
別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式ＩＩＩ：
【化１７】
2018500049.tif 000116
［式中、ｉ）ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の抗体に由来するか、あるいは表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；ｉｉ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；ｉｉｉ）ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択され；ｉｖ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；ｖ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい］
の構造に従い構成する。
【０３８７】
別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式ＩＶ：
【化１８】
2018500049.tif 000117
［式中、ｉ）ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の抗体に由来するか、あるいは表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；ｉｉ）ＣＣＤは、表８のＣＣＤからなる群より選択され；ｉｉｉ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；ｉｖ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい］
の構造に従い構成する。
【０３８８】
別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式Ｖ：
【化１９】
2018500049.tif 000118
［式中、ｉ）ＴＭ１と、ＴＭ２とは、各々がＶＬおよびＶＨ配列を含む、異なるｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の第１および第２の抗体に由来するか、あるいは各々が、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される、第１および第２の抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させ、ＴＭ１と、ＴＭ２とを、組換えにより、配列ＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳ、およびＧＳＰからなる群より選択される、親水性アミノ酸の短いリンカーにより、一体に融合させており；ｉｉ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；ｉｉｉ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；ｉｖ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい］
の構造に従い構成する。
【０３８９】
別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式ＶＩ：
【化２０】
2018500049.tif 000119
［式中、ｉ）ＴＭ１と、ＴＭ２とは、各々がＶＬおよびＶＨ配列を含む、異なるｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の第１および第２の抗体に由来するか、あるいは各々が、表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される、第１および第２の抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させ、ＴＭ１と、ＴＭ２とを、組換えにより、配列ＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳ、およびＧＳＰからなる群より選択される、親水性アミノ酸の短いリンカーにより、一体に融合させており；ｉｉ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；ｉｉｉ）ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択され；ｉｖ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；ｉｖ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい］
の構造に従い構成する。
【０３９０】
別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物を、化学式ＶＩＩ：
【化２１】
2018500049.tif 000120
［式中、ｉ）ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の抗体に由来するか、あるいは表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；ｉｉ）ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；ｉｉｉ）ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択され；ｉｖ）ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；ｖ）薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい］
の構造に従い構成する。
【０３９１】
６．組成物の多量体構成
一態様では、本発明は、異なる数のＸＴＥＮパートナーを、数値により規定された構成、例えば、二量体、三量体、四量体、または多量体で、リンカーにより接合させたターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「前駆体」は、中間体または最終組成物をもたらすコンジュゲーション反応中の反応物として使用される構成要素を含むことを意図し、任意の長さのＸＴＥＮセグメント（表１０および１１のＸＴＥＮを含む）、ＸＴＥＮ架橋剤、ＸＴＥＮ−ペイロード−架橋剤セグメント、ＣＣＤ架橋剤、ＣＣＤ−ペイロード、ＣＣＤ−ＸＴＥＮ架橋剤、反応性基を伴うペイロード、リンカー、および本明細書で記載される他のこのような構成要素を含むがこれらに限定されない。
【０３９２】
一部の実施形態では、本発明は、２つのＸＴＥＮ前駆体セグメントを、二価架橋剤により連結する結果として、図１５〜１７で示される二価構成などの二価構成をもたらすコンジュゲートを提供する。二価ＸＴＥＮコンジュゲートについての一実施形態では、各ＸＴＥＮコンジュゲートは、ターゲティング部分、ＣＣＤ、ＰＣＭ、および生物活性ペプチドまたはポリペプチドをさらに含み、各融合タンパク質前駆体セグメントを、Ｎ末端のアルファ−アミノ基により、二価リンカーに連結する結果として、二価コンジュゲートをもたらす、単量体の融合タンパク質でありうる。二価ＸＴＥＮコンジュゲートについての別の実施形態では、各ＸＴＥＮ前駆体セグメントは、ターゲティング部分、ＣＣＤ、ＰＣＭ、および生物活性ペプチドまたはポリペプチドを含み、各融合タンパク質を、Ｃ末端において、二価リンカーに連結する結果として、二価コンジュゲートをもたらす、単量体の融合タンパク質である。二価ＸＴＥＮコンジュゲートについての別の実施形態では、各コンジュゲートは、ＣＣＤ、ＣＣＤ−ＸＴＥＮ融合体、またはＸＴＥＮにコンジュゲートさせた、１または複数のペイロード（ペプチド、ポリペプチド、または薬物でありうる）を含み、各前駆体を、Ｎ末端において、１または複数の、第２の、異なるペイロード分子を含む、他の前駆体に連結する結果として、二価コンジュゲートをもたらす。本段落の前出の実施形態では、リンカーを、第１の前駆体ＸＴＥＮにコンジュゲートさせ、次いで、第２の反応を実行して、前駆体を、第２のＸＴＥＮまたはＣＣＤ−ＸＴＥＮ前駆体の末端の反応性基に接合することなど、異なる手法を使用して、連結される前駆体を創出することができる。代替的に、ＸＴＥＮまたはＣＣＤ−ＸＴＥＮ末端の一方または両方を、前駆体として修飾し、次いで、これらを、クリック化学反応または本明細書に記載されているかもしくは例示されている他の方法により、結果として得られるコンジュゲートの交差部分を架橋する原子をほとんど残さないか、または残さずに、接合させることができる。別の実施形態では、２つのＣＣＤ−ＸＴＥＮまたはＸＴＥＮ前駆体配列を、前駆体ＸＴＥＮ反応物の末端またはその近傍に導入されたシステインまたはチオール基を使用するジスルフィド架橋により連結する結果として、二価ＸＴＥＮコンジュゲートをもたらす。このような方法を使用して、多様な構成を構築することができる。このような二価コンジュゲートの例示的な構成は、以下の通りである。
【０３９３】
一実施形態では、本発明は、化学式ＶＩＩＩ
【化２２】
2018500049.tif 000121
［式中、各出現について独立に、ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の抗体に由来するか、あるいは表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択され；ＣＬは、表２４から選択される三量体の架橋剤であり、各ＸＴＥＮは、同一であり、ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい］
の構造を有する、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。前出の実施形態では、ＸＴＥＮを、表２４の架橋剤を含むがこれらに限定されない、三量体の架橋剤を使用して、融合タンパク質に連結することができる。
【０３９４】
本発明は、四量体構成を伴う、ＸＴＥＮ−リンカーコンジュゲートおよびＸＴＥＮ−リンカー−ペイロードコンジュゲートをさらに提供する。一実施形態では、本発明は、３つのＸＴＥＮ配列を、四価リンカーにより連結する結果として、四量体構成をもたらすコンジュゲートを提供する。一実施形態では、本発明は、化学式ＩＸ
【化２３】
2018500049.tif 000122
［式中、各出現について独立に、ＴＭは、ＶＬおよびＶＨ配列を含むｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の抗体に由来するか、あるいは表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；ＰＣＭは、表８に明示された配列からなる群より選択され；ＣＬは、四価架橋剤であり；各ＸＴＥＮは、同一であり、ＸＴＥＮは、表１０に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一であり；薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しい］
の構造を有する、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。四価リンカーの非限定的な例は、米国特許第７，５２４，８２１号において記載されているリンカーなど、四価（ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ）チオール、四価（ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ）Ｎ−マレイミドリンカーを含む。
【０３９５】
別の実施形態では、本発明は、化学式Ｘ
【化２４】
2018500049.tif 000123
［式中、各出現について独立に、ＴＭ１は、ＶＬおよびＶＨ配列を含む第１のｓｃＦｖであり、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の抗体に由来するか、あるいは表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０に明示された配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；ＴＭ２は、第１のｓｃＦｖと異なる、第２のｓｃＦｖであり、ＴＭ２は、ＶＬおよびＶＨ配列を含み、各ＶＬおよびＶＨは、表１９の抗体に由来するか、あるいは表１９に明示されたＶＬおよびＶＨ配列からなる群より選択される抗体に由来するＶＬおよびＶＨに対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれらと同一であり、表２０の配列からなる群より選択されるリンカー配列をさらに含み、リンカーを、組換えにより、ＶＬとＶＨとの間に融合させており；ＣＣＤは、表６のＣＣＤからなる群より選択され；ＰＣＭは、表８のＰＣＭからなる群より選択され；ＸＴＥＮは、表１１に明示された配列に対する、少なくとも９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、またはそれと同一である、システイン操作ＸＴＥＮであり；薬物は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択され；ｎは、ＣＣＤのシステイン残基の数と等しく；ｙは、ＸＴＥＮのシステイン残基の数と等しい、端点を含む３〜１０の間の整数である］
の構造を有する、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。
【０３９６】
化学式Ｉ〜Ｘの実施形態のＴＭの各ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨとして構成されうる、ＶＬおよびＶＨを有し、化学式Ｖおよび化学式ＶＩの実施形態のＴＭ１およびＴＭ２は各々独立に、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨとして構成しうることが、とりわけ想定される。
【０３９７】
７．４つまたはそれを超えるＸＴＥＮを伴う多価構成
表１１のＸＴＥＮを使用して、システイン操作骨格に連結された、３つまたはそれを超えるＸＴＥＮコンジュゲート分子を含有する組成物であって、ＰＣＭ、ＴＭ、およびＣＣＤの融合タンパク質（ペイロード薬物を連結した）を、ＸＴＥＮのシステイン残基にコンジュゲートさせる結果として、「櫛型」の多価構成をもたらす組成物を想定する。一実施形態では、多価構成のコンジュゲート組成物は、前出の融合タンパク質のＰＣＭのＮ末端を、システイン操作ＸＴＥＮと、システイン操作ＸＴＥＮとの反応に適切なリンカーにより反応させる結果として、最終生成物をもたらすことにより創出する。これらの実施形態では、最終生成物の価数を、ＸＴＥＮに組み込まれた反応性システイン基の数により制御する。加えて、最終生成物は、ＸＴＥＮのＮまたはＣ末端上の第２のターゲティング部分を配置し、これにより、標的細胞上のそのリガンドとの相互作用を改善するように設計しうることが想定される。このような櫛型構成の代表的な概略例を、図３７および３９に示す。
【０３９８】
８．単量体ＸＴＥＮ骨格上の二特異性ペイロード構成
別の態様では、本発明は、単一のシステイン操作ＸＴＥＮ骨格に連結された、２つの異なるペイロード分子を含有する結果として、二価コンジュゲートをもたらすＸＴＥＮコンジュゲートを提供する。一実施形態では、二価構成コンジュゲートを、表１１に具体的に提示されている操作ＸＴＥＮなどの操作ＸＴＥＮを、第１のペイロード薬物の１または複数の分子を接続した、第１のターゲティングコンジュゲート組成物と、システイン操作ＸＴＥＮとの反応に適切な架橋剤により反応させるのに続いて、第２の異なるペイロード薬物の１または複数の分子を接続した、第２のターゲティングコンジュゲート組成物との、リシン操作ＸＴＥＮとの反応に適切な架橋剤による第２の反応の結果として、最終生成物をもたらすことにより創出する。連結されるターゲティングコンジュゲート組成物の数および位置は、反応性チオールまたはアミノ基の配置が決定的である、操作ＸＴＥＮの設計により制御する。一実施形態では、二価コンジュゲートは、操作ＸＴＥＮの、それぞれのシステインおよびリシン残基に連結された、第１のペイロードの１または複数の分子を伴う、第１のターゲティングコンジュゲート組成物の単一分子と、第２のペイロードの１または複数の分子を伴う、第２のターゲティングコンジュゲート組成物の単一分子とを含む。別の実施形態では、二価コンジュゲートは、システイン−リシン操作ＸＴＥＮのシステイン残基に連結された、第１のペイロードの１または複数の分子を伴う、第１のターゲティングコンジュゲート組成物の１つ、または２つ、または３つ、またはそれを超える分子と、システイン−リシン操作ＸＴＥＮの単一のリシンに連結された、第２のペイロードの１または複数の分子を伴う、第２のターゲティングコンジュゲート組成物の単一分子とを含む。別の実施形態では、二価コンジュゲートは、リンカーにより、システイン−リシン操作ＸＴＥＮに連結された、第１のペイロードの１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つの分子と、第２のペイロードの１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つの分子とを含む。
【０３９９】
別の実施形態では、二価構成コンジュゲートは、表１１の操作ＸＴＥＮなど、システインおよびリシン操作ＸＴＥＮを、システイン操作ＸＴＥＮとの反応に適切な第１のリンカーと反応させるのに続いて、リシン操作ＸＴＥＮとの反応に適切なリンカーとの第２の反応を行い、次いで、ＸＴＥＮ架橋剤骨格を、第１のペイロードと、第１のリンカーとの反応が可能なチオール反応性基により反応させるのに続く、第２のペイロードの、第２の架橋剤との反応が可能なアミノ基による反応の結果として、最終生成物をもたらすことにより創出する。
【０４００】
９．ＸＴＥＮ−ペイロード構成のライブラリー
別の態様では、本発明は、ＸＴＥＮ−ペイロードコンジュゲート前駆体のライブラリー、ライブラリーを作製する方法、および図１５〜１６で例示される通り、ペイロードの最適の組合せのほか、ペイロードの最適の比を達成するように、コンビナトリアル法により、ライブラリー前駆体を組み合わせる方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ−ペイロード前駆体のライブラリーを創出するように、本明細書で記載されるペイロードを含む所与のペイロードの１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、もしくは４つ、もしくは５つ、もしくは６つ、もしくは７つ、もしくは８つ、もしくは９つ、もしくは１０またはそれを超える分子に、各々が連結される個々のＸＴＥＮのライブラリーを提供する。方法では、連結される一連のＸＴＥＮ−ペイロード前駆体を、リンカーにさらにコンジュゲートさせ、次いで、その後、コンジュゲーションを実行する条件下で、リンカーと反応することが可能な、他のＸＴＥＮ−ペイロード前駆体と混合し、反応させる結果として、本明細書で記載される構成で、ＸＴＥＮに連結された、多様な順列および比のペイロードのライブラリーをもたらす。次いで、最適の応答または作用をもたらす組成物を決定するために、このようなライブラリーを、所与の臨床適応（例えば、がん、代謝性障害、糖尿病）におけるパラメータを評価するのに適するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいてスクリーニングする。例示的な一実施形態では、前駆体の１つの類型は、表２、表３、表４、表１８、または表１９の腫瘍関連抗原またはリガンドに対する結合アフィニティーを伴う抗体断片またはｓｃＦｖ（例えば、表１９の抗体の抗体断片もしくはｓｃＦｖまたは表１９の抗体に由来する抗体断片もしくはｓｃＦｖ）など、様々なターゲティング部分を含み、前駆体の第２の類型は、表１４〜１７から選択される細胞傷害薬またはペイロードなど、１または複数のペイロードである。連結される前駆体の各類型を、リンカーにさらにコンジュゲートさせ、その後、図１７で例示される通り、コンジュゲーションを実行する条件下で、リンカーと反応することが可能な、他のＸＴＥＮ−ペイロード前駆体と混合し、反応させる結果として、互いとの比を変動させる、多様なターゲティング部分および薬物の順列のライブラリーをもたらす。ＸＴＥＮコンジュゲートは、１つのペイロードの、別のペイロードに対する一定の比（例えば、２つの異なるペイロードの場合、１：１、または１：１．５、または１：２、または１：３、または２：３、または１：４、または１：５または１：９である）を可能とするように設計する。同様の比の範囲は、３つ、４つ、５つ、またはそれを超えるペイロードを含むライブラリーコンジュゲートに適用される。前出についての一実施形態では、かつ、図３７で例示される通り、コンジュゲートは、ＸＴＥＮ骨格と、ＸＴＥＮ−ペイロード構成要素との間に、１または複数のペプチジル切断部分（ＰＣＭ）をさらに含み、ＰＣＭは、ターゲティング部分のリガンドを保有する標的組織と関連するプロテアーゼの基質であり、ターゲティング部分の、リガンドへの結合により、コンジュゲートを、プロテアーゼと近接させる結果として、ＸＴＥＮ−ペイ��ード構成要素の放出、ならびに前記ＰＣＭおよびターゲティング部分を欠く組成物と比較した、標的組織に対する殺滅の増強、または生物学的効果の増強をもたらす。このような場合、放出されたペイロードは、組織の表面において直接作用する場合もあり、内部化され、さらに分解される結果として、本明細書で記載される細胞傷害薬など、ペイロードの放出をもたらす場合もある。
【０４０１】
ＶＩＩ）剤形および医薬組成物
本発明は、本開示のターゲティングコンジュゲート組成物を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書で記載される多様な実施形態から選択されるターゲティングコンジュゲート組成物と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む。
【０４０２】
別の態様では、本発明は、本明細書で記載されるターゲティングコンジュゲート組成物を含むボーラス用量または剤形を提供する。一実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物のボーラス用量または投与量は、ヒト患者の体重について調整された、治療的に有効なボーラス用量を含む。
【０４０３】
他の実施形態では、ボーラス用量または投与量は、（ｉ）それを必要とする対象におけるがんの処置おける使用のためであり；および／または（ｉｉ）皮下投与のために製剤化される。一実施形態では、ボーラス用量または剤形は、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれかのターゲティングコンジュゲート組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
【０４０４】
別の実施形態では、本発明は、パッケージング材料と、前出の実施形態の医薬組成物を含む、少なくとも第１の容器と、医薬組成物ならびに保管および取扱い条件を同定するラベルと、任意選択で、医薬組成物の調製および／または医薬組成物の対象への投与のための指示書のシートとを含むキットを提供する。
【０４０５】
本発明は、医薬組成物を調製する方法であって、実施形態の対象のターゲティングコンジュゲート組成物を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、薬学的に許容される製剤に組み合わせるステップを含む方法を提供する。本発明のターゲティングコンジュゲート組成物は、薬学的に有用な組成物を調製する公知の方法であって、ターゲティングコンジュゲート組成物を、水溶液または緩衝液、薬学的に許容される懸濁液、およびエマルジョンなど、薬学的に許容される担体であるビヒクルと混合させて組み合わせる方法に従い製剤化することができる。非水性溶媒の例は、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油を含む。治療用製剤は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、１６版、Osol,  A.編（１９８０年）において記載されている通り、所望の純度を有する有効成分を、任意選択の、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と、凍結乾燥させた製剤または水溶液の形態で混合することにより、保管のために調製される。医薬組成物は、皮下、注入ポンプによる皮下、筋内、および静脈内を含む、任意の適切な手段または経路により投与することができる。好ましい経路は、レシピエントの疾患および年齢、ならびに処置される状態の重症度と共に変動することが察知されるであろう。浸透圧ポンプを、錠剤、丸剤、カプセル、または植え込み式デバイスの形態の徐放剤として使用することができる。シリンジポンプもまた、徐放剤として使用することができる。このようなデバイスは、それらの内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９７６，６９６号、同第４，９３３，１８５号、同第５，０１７，３７８号、同第６，３０９，３７０号、同第６，２５４，５７３号、同第４，４３５，１７３号、同第４，３９８，９０８号、同第６，５７２，５８５号、同第５，２９８，０２２号、同第５，１７６，５０２号、同第５，４９２，５３４号、同第５，３１８，５４０号、および同第４，９８８，３３７号において記載されている。本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を検討する当業者は、本発明の組成物を持続放出させるためのシリンジポンプを作製しうるであろう。
【０４０６】
別の実施形態では、本発明は、がんまたは炎症状態を含むがこれらに限定されない状態の処置に有用な医薬の作製における使用のための、本明細書で記載される実施形態のうちのいずれかのターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。
【０４０７】
ＶＩＩＩ）処置方法
本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、前出の実施形態のうちのいずれかの治療有効量のターゲティングコンジュゲート組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、方法のターゲティングコンジュゲート組成物は、表１４〜１７から選択される単一種類のペイロードを含む。別の実施形態では、方法は、対象に、表５において明示されている構築物からなる群より選択される、治療有効量のターゲティングコンジュゲート組成物を投与するステップを含む。別の実施形態では、方法は、対象に、実施例において明示されている構築物からなる群より選択される、治療有効量のターゲティングコンジュゲート組成物を投与するステップを含む。
【０４０８】
他の実施形態では、方法は、がんを伴うヒト患者に、少なくとも２つの、体重について調整された、治療的に有効なボーラス用量の、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれかのターゲティングコンジュゲート組成物を投与するステップを含む。前出についての一実施形態では、方法は、がんを伴うヒト患者に、少なくとも２つの、体重について調整された、治療的に有効なボーラス用量のターゲティングコンジュゲート組成物であって、表５において明示されている構築物からなる群より選択されるターゲティングコンジュゲート組成物を投与するステップを含み、前記ボーラス用量の前記投与は、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約１カ月間隔てられる。
【０４０９】
別の実施形態では、方法は、がんを伴うヒト患者に、少なくとも２つの、体重について調整された、治療的に有効なボーラス用量のターゲティングコンジュゲート組成物であって、表５において明示されている構築物からなる群より選択されるターゲティングコンジュゲート組成物を投与するステップを含み、前記体重について調整された、治療的に有効なボーラス用量は、少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約１５ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。
【０４１０】
処置方法において、ターゲティングコンジュゲート組成物のペイロードは、特定の疾患または状態を伴う対象に投与されると、有益な効果を及ぼすことが当技術分野で公知のペイロードである。一実施形態では、組成物のペイロードは、標的組織の細胞に対する細胞傷害効果を介して、それらの治療効果を媒介する。本段落の前出の実施形態では、方法は、がん、がんに対する支持ケア、または炎症、自己免疫疾患、感染性疾患、代謝性疾患、炎症と関連する、筋骨格系疾患、腎臓障害、眼科疾患、疼痛、および呼吸器疾患から選択される疾患の処置または緩和または防止において有用である。より特定すると、がんは、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肝臓癌、肺がん、非小細胞肺がん、中皮腫、結腸直腸がん、食道癌、線維肉腫、絨毛癌、卵巣がん、子宮頸癌、喉頭癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、胃がん、前立腺がん、腎細胞癌、腺癌、カポジ肉腫、星状細胞腫、黒色腫、扁平上皮がん、基底細胞癌、頭頸部がん、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、尿路癌、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、神経膠芽腫、および膵臓がん、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、リンパ芽球性疾患、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫から選択される。
【０４１１】
処置方法についての一部の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物は、皮下投与することもでき、筋内投与することもでき、静脈内投与することもできる。一実施形態では、組成物を、治療有効量を使用して投与する。一実施形態では、治療有効量の２回またはそれを超える連続的投与の実施は、組成物の治療ウィンドウ内の経過時間の、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されておらず、同等の用量を使用して、対象に投与されるペイロードと比較した増大を結果としてもたらす。治療ウィンドウ内の経過時間の増大は、非修飾ペイロードより少なくとも３倍長い場合もあり、代替的に、対応するペイロードまたはＸＴＥＮに連結されていないペイロードより少なくとも４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも約３０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍長い場合もある。
【０４１２】
処置方法についての一実施形態では、治療効果を維持するのに必要とされる用量レジメン下で、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されていない、対応するペイロードと比較して、最大で約２分の１、または最大で約３分の１、または最大で約４分の１、または最大で約５分の１、または最大で約６分の１、または最大で約８分の１、または最大で約１０分の１である、１ｋｇ当たり低モル量のターゲティングコンジュゲート組成物またはターゲティングコンジュゲート組成物を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する。方法についての一部の実施形態では、治療効果は、がんマーカーの存在または濃度、腫瘍のサイズ、腫瘍の静止、腫瘍の数、腫瘍の壊死、体重、サイトカインレベル、血液パラメータ、疼痛、がんの進行までの時間、再発までの時間、局所再発の発見までの時間、限局転移の発見までの時間、遠隔転移の発見までの時間、症状の発症までの時間、入院、疼痛薬物適用要件の増大までの時間、サルベージ化学療法の要請までの時間、サルベージ手術の要請までの時間、サルベージ放射線治療の要請までの時間、処置失敗までの時間、および生存時間などであるがこれらに限定されない、処置または防止される対象の基礎状態と関連することが当技術分野で公知である、測定されるパラメータ、臨床症状、または評価項目である。前出の実施形態では、治療効果を維持するのに要請される時間は、少なくとも約２１日間、または少なくとも約３０日間、または少なくとも約１カ月間、少なくとも約４５日間、少なくとも約６０日間、少なくとも約９０日間、または少なくとも約１２０日間である。
【０４１３】
処置方法についての別の実施形態では、治療効果を維持するのに必要とされる、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されていないペイロードの、対応する１ｋｇ当たりモル量と同等の曲線下面積を維持するのに必要とされる用量レジメン下で、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されていない、対応するペイロードと比較して、少なくとも約２分の１、または少なくとも約３分の１、または少なくとも約４分の１、または少なくとも約５分の１、または少なくとも約６分の１、または少なくとも約８分の１、または少なくとも約１０分の１である、１ｋｇ当たり低モル量のターゲティングコンジュゲート組成物またはターゲティングコンジュゲート組成物を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する。別の実施形態では、ターゲティングコンジュゲート組成物またはコンジュゲートを含む医薬組成物は、対象のルーチンの処置のために、それほど高頻度の投与を要請せず、ターゲティングコンジュゲート組成物または医薬組成物の用量を、約４日ごと、約７日ごと、約１０日ごと、約１４日ごと、約２１日ごと、または約１カ月ごとに、対象に投与し、ターゲティングコンジュゲート組成物により、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されておらず、対象に投与される、対応するペイロードと同等の曲線下面積を達成する。さらに他の実施形態では、有効な血液濃度を維持するのに必要とされる用量レジメン下で、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されていないペイロードの対応する量と比較して、約５％、または約１０％、または約２０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％少ない、１ｋｇ当たりの累積低モル量のターゲティングコンジュゲート組成物を、対象に投与するが、コンジュゲートにより、ターゲティングコンジュゲート組成物に連結されていない、対応するペイロードと、少なくとも同等の曲線下面積を達成する。累積低量とは、少なくとも約１週間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約３０日間、または少なくとも約１カ月間の期間の尺度である。
【０４１４】
一実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてがん細胞を処置する方法であって、がん細胞の培養物に、表２または表３、表４、表１８、または表１９の標的に方向付けられるターゲティング部分と、表１４〜１７の化合物から選択される、１または複数のペイロードとを含む、有効量のターゲティングコンジュゲート組成物を含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、表２、または表３、または表４、表１８、または表１９の標的に方向付けられるターゲティング部分と、表１４〜１７の化合物から選択される、１または複数のペイロードとを含む、有効量のターゲティングコンジュゲート組成物を含む医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。方法についての別の実施形態では、がんは、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肝臓癌、肺がん、非小細胞肺がん、中皮腫、結腸直腸がん、食道癌、線維肉腫、絨毛癌、卵巣がん、子宮頸癌、喉頭癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、胃がん、前立腺がん、腎細胞癌、腺癌、カポジ肉腫、星状細胞腫、黒色腫、扁平上皮がん、基底細胞癌、頭頸部がん、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、尿路癌、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、神経膠芽腫、膵臓がん、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、リンパ芽球性疾患、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。方法についての別の実施形態では、投与は、がんと関連する、少なくとも１つ、２つ、または３つのパラメータの、非処置対象と比較して、少なくとも１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％大きな改善を結果としてもたらし、パラメータは、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）により規定される応答率、がんの進行（再発）までの時間、局所再発の発見、限局転移の発見、遠隔転移の発見、症状の発症、入院、疼痛薬物適用要件の増大、サルベージ化学療法の要請、サルベージ手術の要請、サルベージ放射線治療の要請、処置失敗までの時間、および生存時間の延長からなる群より選択される。
【０４１５】
別の態様では、本発明は、疾患を伴う対象を処置するためのレジメンであって、本明細書で記載される実施形態のうちのいずれかのターゲティングコンジュゲート組成物を含む組成物を含むレジメンを提供する。レジメンについての一実施形態では、レジメンは、ターゲティングコンジュゲート組成物を含む医薬組成物の量であって、患者における治療効果を達成するのに必要とされる量を決定するステップをさらに含む。
【０４１６】
本発明は、本明細書で記載される実施形態のうちのいずれかのコンジュゲートを含む医薬組成物を、有効量で投与される、２回またはそれを超える逐次的投与により投与するステップを含む、罹患対象のための処置レジメンを含み、投与の結果として、疾患と関連する少なくとも１つのパラメータの改善をもたらす、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。
【０４１７】
一部の実施形態では、本発明は、疾患を処置する方法であって、ターゲティングコンジュゲート組成物の実施形態を含む医薬組成物の１、もしくは２、もしくは３、もしくは４回、またはそれを超える治療有効用量を、それを必要とする対象に投与するレジメンを含む方法を提供する。方法についての一実施形態では、疾患は、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肝臓癌、肺がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、食道癌、線維肉腫、絨毛癌、卵巣がん、子宮頸癌、喉頭癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、胃がん、前立腺がん、腎細胞癌、カポジ肉腫、星状細胞腫、黒色腫、扁平上皮がん、基底細胞癌、頭頸部がん、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、尿路癌、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、神経膠芽腫、および膵臓がんからなる群より選択される。方法についての別の実施形態では、投与される医薬組成物は、ターゲティング部分を含み、ターゲティング部分は、疾患の腫瘍に対する特異的結合アフィニティーを有する。方法についての別の実施形態では、投与される医薬組成物は、ターゲティング部分を含み、ターゲティング部分は、表３の腫瘍関連抗原からなる群より選択される腫瘍関連抗原に対する特異的結合アフィニティーを有する。方法についての別の実施形態では、投与された用量は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、またはそれを超える、対象における腫瘍サイズの減少を結果としてもたらす。前出の実施形態では、腫瘍サイズの減少を、投与後少なくとも約７日間、または少なくとも約１０日間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約３０日間以内に達成する。方法についての別の実施形態では、投与された用量は、対象における腫瘍の静止を結果としてもたらし、この場合、静止を、投与後少なくとも約７日間、または少なくとも約１０日間、または少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、または少なくとも約３０日間以内に達成する。本段落の前出の実施形態では、レジメンは、７日ごと、または１０日ごと、または１４日ごと、または２１日ごと、または毎月の治療有効用量の投与を含む。
【０４１８】
別の態様では、本発明は、対象における疾患の処置における使用のための、医薬の調製における使用のためのターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。一実施形態では、本開示は、対象におけるがんの処置における使用のための医薬の調製における使用のための本明細書で開示される実施形態のうちのいずれかのターゲティングコンジュゲート組成物を提示する。前出の実施形態では、がんは、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肝臓癌、肺がん、非小細胞肺がん、中皮腫、結腸直腸がん、食道癌、線維肉腫、絨毛癌、卵巣がん、子宮頸癌、喉頭癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、胃がん、前立腺がん、腎細胞癌、腺癌、カポジ肉腫、星状細胞腫、黒色腫、扁平上皮がん、基底細胞癌、頭頸部がん、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、尿路癌、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、神経膠芽腫、膵臓がん、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＰＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、リンパ芽球性疾患、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。
【０４１９】
ＩＸ）医薬キット
別の態様では、本発明は、コンジュゲート組成物の使用を容易とするキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、本明細書で提示される医薬組成物と、容器と、容器上のラベルまたは容器に添付されたパッケージ添付文書とを含む。適切な容器は、例えば、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料から形成されるボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、対象の処置に有効な製剤としての医薬組成物を保持し、滅菌のアクセスポートを有しうる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグの場合もあり、皮下注射針により穿刺可能な止栓を有するバイアルの場合もある）。パッケージ添付文書は、薬物について承認された適応、承認された適応への使用のための薬物の再構成および／または投与についての指示書、適切な投与量および安全性についての情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を同定する情報を列挙しうる。前出についての別の実施形態では、キットは、医薬組成物に適する希釈剤であって、その使用が、使用者に、対象に送達される適切な濃度をもたらす希釈剤を保有しうる第２の容器を含みうる。別の実施形態では、キットは、少なくとも第１の容器内に、第１の容器：疾患を伴う対象の処置において投与するのに十分な量のコンジュゲート組成物である薬物；ある量の薬学的に許容される担体；対象の組成物に適する希釈剤であって、使用者に、対象に送達される適切な濃度の医薬組成物をもたらす希釈剤を保有しうる第２の容器を、薬物ならびに保管および取扱い条件を同定するラベル、ならびに／または薬物について承認された適応、ならびに承認された適応の処置への使用のための薬物の再構成および／もしくは投与についての指示書、適切な投与量および安全性についての情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を同定する情報についてのシートと併せて含む。
【０４２０】
Ｘ）本発明の核酸配列
本発明は、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチド構成要素と、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチド構成要素をコードするポリ核酸分子と相補的な配列とをコードする単離ポリ核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書で記載される実施形態のうちのいずれかのターゲティングコンジュゲート組成物をコードするポリ核酸、またはポリ核酸の相補体を提供する。
【０４２１】
他の実施形態では、本発明は、ターゲティング部分、ＣＣＤ、ＰＣＭ、およびＸＴＥＮの融合タンパク質であって、本明細書で記載される実施形態のうちのいずれかの単一のポリペプチドとして融合させた融合タンパク質をコードするポリ核酸、またはポリ核酸の相補体を提供する。一実施形態では、ポリ核酸は、表５の構築物からなる群より選択されるタンパク質構成要素、またはポリ核酸の相補体をコードする。
【０４２２】
一実施形態では、本発明は、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチド、またはポリ核酸と相補的な配列であって、それらの相同な変異体を含む配列をコードするポリ核酸を作製する方法を包摂する。一般に、方法は、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を作製し、結果として得られる遺伝子産物を発現させ、構成要素をコードするヌクレオチドをアセンブルするステップと、構成要素をインフレームでライゲーションするステップと、コード遺伝子を、宿主細胞に適切な発現ベクターに組み込むステップと、適切な宿主細胞を、発現ベクターで形質転換するステップと、宿主細胞を、結果として得られる融合タンパク質を、形質転換された宿主細胞内で発現させるか、または融合タンパク質が、形質転換された宿主細胞内で発現することを可能とする条件下で培養し、これにより、融合タンパク質のポリペプチドを作製し、これを、本明細書で記載される方法、または当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製法により回収するステップとを含む。前出についての一実施形態では、宿主細胞は、原核生物である。別の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。分子生物学における標準的な組換え法を使用して、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製する。
【０４２３】
本発明に従い、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチド（またはその相補体）をコードする核酸配列を使用して、適切な宿主細胞内の発現を方向付ける組換えＤＮＡ分子を作出する。いくつかのクローニング戦略は、本発明を実施するのに適し、それらの多くが、本発明の組成物またはその相補体をコードする遺伝子を含む構築物を作出するのに使用される。一実施形態では、クローニング戦略を使用して、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチドを発現させるために、宿主細胞を形質転換するのに使用されるポリペプチドをコードするヌクレオチドを含むターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチドをコードする遺伝子を創出する。別の実施形態では、クローニング戦略を使用して、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチドとのコンジュゲーションのためのペイロード組成物を発現させるために、宿主細胞を形質転換するのに使用されるペイロードをコードするヌクレオチドを含むタンパク質ペイロードをコードする遺伝子を創出する。
【０４２４】
一手法では、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチドに対応するＤＮＡ配列を含有する構築物をまず調製する。このような構築物を調製するための例示的な方法については、実施例に記載する。次いで、構築物を使用して、ＸＴＥＮの発現および回収のための原核宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞を形質転換するのに適する発現ベクターを創出する。発現ベクターの創出、宿主細胞の形質転換、ならびに対象組成物のポリペプチドの発現および回収のための例示的な方法については、実施例に記載する。
【０４２５】
ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチドをコードする遺伝子は、１または複数のステップにおいて、完全な合成により作製することもでき、実施例においてより完全に記載される方法を含む制限酵素媒介型クローニング、ＰＣＲおよびオーバーラップエクステンションなど、酵素による工程と組み合わされた合成により作製することもできる。本明細書で開示される方法を使用して、例えば、所望の配列の個々の構成要素遺伝子をコードするポリヌクレオチドの短い配列をライゲーションすることができる。ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチドをコードする遺伝子は、標準的な遺伝子合成法を使用して、オリゴヌクレオチドからアセンブルされる。遺伝子の設計は、コドン使用およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して実施することができる。次いで、結果として得られる遺伝子を、ペイロードペプチドまたはターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチドをコードする遺伝子とアセンブルし、結果として得られる遺伝子を使用して、宿主細胞を形質転換し、本明細書で記載される、その特性についての査定のために、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチドを作製し、回収する。
【０４２６】
次いで、結果として得られる、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに、個別にクローニングすることができる。核酸配列は、様々な手順により、ベクターに挿入する。一般に、ＤＮＡは、当技術分野で公知の技法を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクターの構成要素は一般に、シグナル配列、複製起点、１もしくは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１または複数を含むがこれらに限定されない。これらの構成要素のうちの１または複数を含有する、適切なベクターの構築では、当業者に公知の、標準的なライゲーション法を援用する。このような技法は、当技術分野で周知であり、学術および特許文献において記載されている。多様なベクターが公開されている。ベクターは、例えば、組換えＤＮＡ手順にかけるのが簡便でありうる、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であることが可能であり、ベクターの選び出しは、それが導入される宿主細胞に依存することが多いであろう。こうして、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が、染色体の複製に依存しないベクター、例えば、プラスミドでありうる。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と併せて複製されるベクターでありうる。
【０４２７】
本発明は、宿主細胞と適合性であり、宿主細胞により認識され、ポリペプチドの発現の制御のために、ポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結した、複製および制御配列を含有する、プラスミド発現ベクターの使用を提供する。ベクターは通常、複製部位のほか、形質転換細胞内の表現型の選択をもたらすことが可能なタンパク質をコードする配列も保有する。このようなベクター配列は、様々な細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。使用されうる、有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体、および合成のＤＮＡ配列のセグメントを含む。「発現ベクター」は、適切な宿主内の、ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現を実行することが可能な、適切な制御配列に作動可能に連結したＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物を指す。要件は、ベクターが、えり抜きの宿主細胞内で、複製可能および生存可能であるということである。所望に応じて、低コピー数ベクターを使用することもでき、高コピー数ベクターを使用することもできる。
【０４２８】
適切なベクターは、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡの派生物、ならびにSmithら、Gene、５７巻：３１〜４０頁（１９８８年）により記載されている、ｃｏｌ  ＥＩ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９など、公知の細菌プラスミド、およびこれらの派生物、ＲＰ４などのプラスミド、ＮＭ９８−９など、ファージＩの多数の派生物のほか、Ｍ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡなど、他のファージＤＮＡなどのファージＤＮＡ；２ミクロンプラスミドまたは２ｍプラスミドの派生物のほか、セントロマーおよび組込み酵母シャトルベクターなどの酵母プラスミド；昆虫または哺乳動物細胞内で有用なベクターなど、真核細胞内で有用なベクター；ファージＤＮＡまたは発現制御配列を援用するように改変されたプラスミドなど、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクターなどを含むがこれらに限定されない。本発明でもまた使用されうる酵母発現系は、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクターなどを含むがこれらに限定されない。ベクターの制御配列は、転写を実行するプロモーター、このような転写を制御する、任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。プロモーターは、えり抜きの宿主細胞内で転写活性を示し、宿主細胞と同種または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる、任意のＤＮＡ配列でありうる。原核宿主を伴う、発現ベクター内の使用に適するプロモーターは、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Changら、Nature、２７５巻：６１５頁（１９７８年）；Goeddelら、Nature、２８１巻：５４４頁（１９７９年）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Goeddel、Nucleic  Acids  Res.、８巻：４０５７頁（１９８０年）；ＥＰ３６，７７６］、およびｔａｃプロモーター［deBoerら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８０巻：２１〜２５頁（１９８３年）］などのハイブリッドプロモーターを含み、全てを、ＣＦＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結する。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、ＣＦＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有しうる。
【０４２９】
ＸＩ）本発明のコンカテネート配列
別の態様では、本発明は、ターゲティングコンジュゲート組成物を作製またはアセンブルするのに有用な、ターゲティングコンジュゲート組成物のポリペプチド構成要素のコンカテネートの融合タンパク質を含む組成物を提供する。図８７ＢおよびＣに例示される通り、表２６および２７の配列のコンカテネート配列は、Ｎ末端からＣ末端への構成において、少なくとも４つの異なる構成：１）ＦＲＨ４配列、ＣＣＤ、ＰＣＭ、および２２８アミノ酸の短いＸＴＥＮ配列；２）ＦＲＬ４配列、ＣＣＤ、ＰＣＭ、および２２８アミノ酸の短いＸＴＥＮ配列；３）２２９アミノ酸の短いＸＴＥＮ配列、ＰＣＭ、ＣＣＤ、およびＦＲＬ１；ならびに４）２２９アミノ酸の短いＸＴＥＮ配列、ＰＣＭ、ＣＣＤ、およびＦＲＨ１を有する融合タンパク質である。ターゲティングコンジュゲート組成物の、組成物内の融合タンパク質コンカテネートであって、コンカテネート配列を、融合タンパク質の、本明細書で開示される実施形態のｓｃＦｖ（対応するＦＲ配列である、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ、またはＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ、またはＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ、またはＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳを控除した）と、表１０または表１１のＸＴＥＮとの間に挿入するコンカテネートを提供することは、本発明の目的である。次いで、結果として得られる融合タンパク質を、表１４〜１７のペイロード薬物または生物薬剤を含むがこれらに限定されない、本明細書で記載される、１または複数のペイロード薬物または生物薬剤にコンジュゲートさせる結果として、ターゲティングコンジュゲート組成物をもたらす。
【０４３０】
一実施形態では、本発明は、表２６に明示された配列の群より選択される配列に対する、少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である配列を含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、表２７に明示された配列の群より選択される配列に対する、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である配列を含む組成物を提供する。
【０４３１】
別の実施形態では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端への配向において、構成要素：１）表１９の抗体に由来するｓｃＦｖであって、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＲＬ３、ＦＲＬ４、表２０に由来するリンカー、ＦＲＨ１、ＣＤＲＨ１、ＦＲＨ２、ＣＤＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＣＲＨ３配列を含むｓｃＦｖを含む第１の領域；２）表２６に由来する配列に対する、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である配列を含む第２の領域；ならびに３）表１０または表１１に明示された配列の群より選択される配列に対する、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一であるＸＴＥＮを含む第３の領域を有する融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【０４３２】
別の実施形態では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端への配向において、構成要素：１）表１９の抗体に由来するｓｃＦｖであって、ＦＲＨ１、ＣＤＲＨ１、ＦＲＨ２、ＣＤＲＨ２、ＦＲＨ３、ＣＲＨ３、ＦＲＨ４、表２０に由来するリンカー、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＣＲＬ３配列を含むｓｃＦｖを含む第１の領域；２）表２６に由来する配列に対する、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である配列を含む第２の領域；ならびに３）表１０または表１１に明示された配列の群より選択される配列に対する、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一であるＸＴＥＮを含む第３の領域を有する融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【０４３３】
別の実施形態では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端への配向において、構成要素：１）表１０または表１１に明示された配列の群より選択される配列に対する、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一であるＸＴＥＮを含む第１の領域；２）表２７に由来する配列に対する、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である配列を含む第２の領域；ならびに３）表１９の抗体に由来するｓｃＦｖであって、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＲＬ３、ＦＲＬ４、表２０に由来するリンカー、ＦＲＨ１、ＣＤＲＨ１、ＦＲＨ２、ＣＤＲＨ２、ＦＲＨ３、ＣＲＨ３、およびＦＲＨ４配列を含むｓｃＦｖを含む第３の領域を有する融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【０４３４】
別の実施形態では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端への配向において、構成要素：１）表１０または表１１に明示された配列の群より選択される配列に対する、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である、ＸＴＥＮを含む第１の領域；２）表２７に由来する配列に対する、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を呈示するか、またはそれと同一である、配列を含む第２の領域；ならびに３）表１９の抗体に由来するｓｃＦｖであって、ＣＤＲＨ１、ＦＲＨ２、ＣＤＲＨ２、ＦＲＨ３、ＣＲＨ３、ＦＲＨ４、表２０に由来するリンカー、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＲＬ３、およびＦＲＨ４配列を含むｓｃＦｖを含む第３の領域を有する融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【０４３５】
他の実施形態では、本発明は、システイン残基に連結された薬物または生物薬剤を伴う、本節の本段落の融合タンパク質を含み、薬物または生物薬剤が、表１４〜１７の薬物または生物薬剤から選択される、ターゲティングコンジュゲート組成物を提供する。前出についての一実施形態では、薬物または生物薬剤は、ドキソルビシン、ネモルビシン、ＰＮＵ−１５９６８２、パクリタキセル、ドセタキセル、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、メイタンシン、メルタンシン（ＤＭ１）、メイタンシノイドＤＭ４、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−カリケアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＤＭ、マイトマイシンＣ、ラケルマイシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、ツブリシンＢ、ツブリシンＭ、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ボルテゾミブ、ｈＴＮＦ、Ｉｌ−１２、ランピルナーゼ、ｈＴＮＦ、ＩＬ−１２、ランピルナーゼ、ヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ウシ膵臓ＲＮアーゼ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ゲロニン、リシンＡ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ラムダ、ウレアーゼ、アマトキシン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、イプシロン−アマニチン、ブーガニン、およびブドウ球菌エンテロトキシンからなる群より選択される。
【表２６−１】
2018500049.tif 000124
【表２６−２】
2018500049.tif 000125
【表２６−３】
2018500049.tif 000126
【表２６−４】
2018500049.tif 000127
【表２６−５】
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【表２６−６】
2018500049.tif 000129
【表２７−１】
2018500049.tif 000130
【表２７−２】
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【表２７−３】
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【表２７−４】
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【表２７−５】
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【表２７−６】
2018500049.tif 000135
【０４３６】
以下は、本発明の組成物、方法、および処置レジメンについての例である。上記で提示した一般的な記載を踏まえ、他の多様な実施形態を実施しうることが理解される。
【実施例】
【０４３７】
（実施例１）
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の構築
【０４３８】
ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６からＡＥ７２、１４４、２８８、５７６および８６４の連続的二量体形成からＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の３７種の異なるセグメントからＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのコレクションを構築した。全３７種の異なる３６アミノ酸セグメントを持つＥ．ｃｏｌｉの培養物を混合し、プラスミドを単離した。このプラスミドプールを、ＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化して、挿入物としての小断片を生産した。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化して、ベクターとしての大断片を生産した。挿入物およびベクター断片をライゲーションして、長さの倍加をもたらし、ライゲーション混合物でＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞を形質転換して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２のコロニーを得た。
【０４３９】
ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのこのライブラリーをＬＣＷ０４０６と命名した。上述と同じプロセスを再度使用して、ＬＣＷ０４０６由来の全クローンを組み合わせて二量体形成させ、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４のライブラリーＬＣＷ０４１０を得た。上述と同じプロセスを再度使用して、ＬＣＷ０４１０由来の全クローンを組み合わせて二量体形成させ、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のライブラリーＬＣＷ０４１４を得た。ライブラリーから２個の単離物ＬＣＷ０４１４．００１およびＬＣＷ０４１４．００２をランダムに採取し、配列決定して、同一性を検証した。上述と同じプロセスを再度使用して、ＬＣＷ０４１４由来の全クローンを組み合わせて二量体形成させ、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のライブラリーＬＣＷ０４１８を得た。本出願人らは、高レベルのＧＦＰ蛍光に関してライブラリーＬＣＷ０４１８由来の９６個の単離物をスクリーニングした。ＰＣＲによる正しいサイズの挿入物および強い蛍光を備える８個の単離物を配列決定し、配列決定および発現データに基づき、将来的な使用のために２個の単離物（ＬＣＷ０４１８．０１８およびＬＣＷ０４１８．０５２）を選択した。
【０４４０】
上述と同じ二量体形成プロセスを使用して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のＬＣＷ０４１８．０１８およびＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のＬＣＷ０４１４．００２を組み合わせることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の特異的なクローンｐＣＷ０４３２を構築した。
【０４４１】
（実施例２）
ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の構築
【０４４２】
二量体形成の数回の連続したラウンドを使用して、本出願人らは、ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメントから開始して、ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４配列のコレクションをアセンブルした。利用した方法および材料は、上述の実施例１のものから適応させた。これらの配列をアセンブルし、ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４由来の数個の単離物を評価したところ、生理的条件下で十分な発現および優れた溶解性を示すことが判明した。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の全長クローンは、優れた溶解性を有し、カニクイザルにおいて６０時間を超える半減期を示した。
【０４４３】
（実施例３）
ＣＸＴＥＮ（１×アミノ、３×チオール−ＸＴＥＮ８６４）の構築
【０４４４】
プライマー対Ｔ７プロモーター＆ＳＡＳＲＳＡＢｓａＩｒｅｖ−ＡＡＣＧ、ＣＩ１−ＡＥ８６４ＢｓａＩｆｏｒ−ＡＡＣＧ＆ＡＥ４３２−ＣＩ２ＢｂｓＩｒｅｖ２およびＣＩ２−ＡＥ４３２ＢｓａＩｆｏｒ２＆ＡＥ＿００３ＳｂｆＩｒｅｖを用いてプラスミドｐＹＳ００７２においてＰＣＲ反応を行って、ＣＩ１、ＣＩ２およびＡＥ−ＳｂｆＩのＰＣＲ産物を得た。正しいサイズのバンドをゲル精製し、挿入物として対応する、適した制限酵素で消化する。
【０４４５】
プラスミドｐＹＳ００７２をＮｄｅＩ／ＳｂｆＩで消化し、ベクターとしての大断片をゲル精製する。上述のベクターと挿入物をライゲーションし、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、ＨＤ２−Ｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４（Ｃ１２、Ｃ４３２、Ｃ８５４）−Ｒ−Ｈ８のタンパク質をコードするｐＣＷ１３０５の正しいクローンに関して配列決定確認によりスクリーニングする。ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を下表２８に提示する。
【表２８−１】
2018500049.tif 000136
【表２８−２】
2018500049.tif 000137
【０４４６】
（実施例４）
ＣＣＤ−ＸＴＥＮの構築
【０４４７】
プライマー対ＡＥ＿００３ＢｓａＩＢｂｓＩｆｏｒ−ＴＧＧＴ＆ＡＥ７１２−ＭｙｃＡｇｅＩｒｅｖを使用して、ｐＣＷ１４７０においてＰＣＲを行って、ＢｓａＩＢｂｓＩ−ＡＥ７１２のＰＣＲ産物を得た。正しいサイズのバンドをゲル精製し、挿入物としてＢｓａＩ／ＡｇｅＩで消化する。挿入物とＢｓａＩ／ＡｇｅＩ消化されたｐＮＬ０３２２ベクターをライゲーションし、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、次のクローニングステップにおけるベクターとしてｐＣＷ１４７１の正しいクローンに関してスクリーニングする。
【０４４８】
プライマー対ＡＥ４２＿３ＣＢｓａＩｆｏｒ＆ＡＥ４２ＢｓａＩｒｅｖ−ＴＧＧＴを使用して、ｐＣＷ１４６６においてＰＣＲを行って、ＡＧＧＴ−ＡＥ４２−ＴＧＧＴのＰＣＲ産物を得た。正しいサイズのバンドをゲル精製し、挿入物としてＢｓａＩで消化する。上述のｐＣＷ１４７１をＢｓａＩ／ＢｂｓＩで消化し、ベクターとして大断片をゲル精製する。ベクターを挿入物とライゲーションし、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、ＨＤ２−Ｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２（Ｃ８、Ｃ２４、Ｃ４０）−ＸＴＥＮ＿ＡＥ７１２−Ｒ−Ｍｙｃ−Ｈ８のタンパク質をコードするｐＣＷ１４７２（ＡＣ１２５５）の正しいクローンに関して配列決定確認によりスクリーニングする。ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を下表２９に提示する。
【表２９−１】
2018500049.tif 000138
【表２９−２】
2018500049.tif 000139
【０４４９】
（実施例５）
ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮの構築
【０４５０】
プライマー対４Ａｆｏｒ＆ＡＥ７１２ＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖを使用して、ＰＣＭ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ７１２−Ｈ８を含有するプラスミドｐＣＷ１４６４においてＰＣＲ反応を行って、ヒスチジンがないＡＥ７１２のＰＣＲ産物を得た。正しいサイズのバンドをゲル精製し、挿入物としてＳｂｆＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでｐＣＷ１４６４を消化し、ベクターとして大断片をゲル精製する。ベクターと、ｐＣＷ１３３０から以前にＢｓａＩ／ＳｂｆＩ消化したＸＴＥＮ断片およびＸＴＥＮ＿ＡＥ７１２のＳｂｆＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したＰＣＲ挿入物をライゲーションする。ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、ｐＣＷ１４６９のコロニーを得て、次のクローニングステップにおけるベクターとして配列決定確認により正しいクローンに関してスクリーニングする。
【０４５１】
プライマー対ＴＥＶ−ＡＥ４２＿３ＣＮｈｅＩｆｏｒ＆ＡＥ４２＿３ＣＢｓａＩｒｅｖを使用して、ｐＣＷ１４６６においてＰＣＲを行って、ＴＥＶ−ＡＥ４２＿３ＣのＰＣＲ産物を得た。正しいサイズのバンドをゲル精製し、挿入物としてＮｈｅＩ／ＢｓａＩで消化する。上述のプラスミドｐＣＷ１４６９をＮｄｅＩ／ＢｓａＩで消化し、ベクターとして大断片をゲル精製する。ベクターと、ＨＤ２−Ｈ８ＮｈｅＩｆｏｒ＆ｒｅｖのアニールされたオリゴヌクレオチドおよびＴＥＶ−ＡＥ４２＿３ＣのＮｈｅＩ／ＢｓａＩ消化されたＰＣＲ挿入物をライゲーションする。ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換して、ＨＤ２−Ｈｉｓ８−ＴＥＶ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２（Ｃ８、Ｃ２４、Ｃ４０）−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ７１２のタンパク質をコードするｐＣＷ１４７０（ＡＣ１２５４）の正しいクローンに関して配列決定確認によりスクリーニングする。ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を下表３０に提示する。
【表３０−１】
2018500049.tif 000140
【表３０−２】
2018500049.tif 000141
【０４５２】
（実施例６）
コンジュゲーションのためのＸＴＥＮの発酵
【０４５３】
コンジュゲーションタンパク質配列のための適切なＸＴＥＮを含有するプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉのグリセロールストックを、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１２５ｍＬのＬＢブロス培地に接種することにより、スターター培養物を調製した。次に、培養物を３７℃で一晩振盪した。このスターター培養物を使用して、Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂコントローラを備える５Ｌガラスジャケット付き容器において、１２．５ｇ硫酸アンモニウム、１５ｇ無水リン酸水素二カリウム、２．５ｇクエン酸ナトリウム二水和物；８．５ｇリン酸ナトリウム一塩基性一水和物；５０ｇ  ＮＺ  ＢＬ４ダイズペプトン（Ｋｅｒｒｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃５Ｘ０００４３）；２５ｇ酵母エキス（Ｔｅｋｎｏｖａ  ＃Ｙ９０２０）；１．８Ｌ水；０．５ｍＬポリプロピレングリコール；２．５ｍＬ微量元素溶液（Ａｍｕｎｉｘ  ｒｅｃｉｐｅ  １４４−１）；１７．５ｍＬ  １Ｍ硫酸マグネシウム；および２ｍＬカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を含有する２Ｌの発酵バッチ培地に接種した。発酵制御設定：ｐＨ＝６．９＋／−０．１；ｄＯ２＝１０％；１２５〜１１８０ｒｐｍの範囲による、スターラーのみのモードでの溶存酸素カスケード；毎分５リットルの９０％酸素の気流；初期温度３７℃；塩基制御１３％水酸化アンモニウム；および酸制御なし。培養６時間後に、３０ｇ／ｈｒ速度の５０％グルコース供給を開始した。培養２０時間後に、２５ｍＬの１Ｍ硫酸マグネシウムおよび３ｍＬの１Ｍ  ＩＰＴＧを添加した。４５時間の合計発酵実行時間の後に、遠心分離により培養物を収集し、全構築物に関して湿重量で０．４５〜１．１キログラムの間の細胞ペレットを得た。さらに使用するまで、ペレットを−８０℃で凍結貯蔵した。発酵の複数の時点における培養試料を採取し、細胞を溶解し、続いて加熱および急速冷却により細胞デブリを凝結させ、遠心分離により清澄化させた可溶性ライセートを調製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルをメーカーの説明書に従ってクーマシー染色により使用した、通常の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。結果は、発酵実行時間の関数としてのＸＴＥＮ融合タンパク質の蓄積を示し、ＸＴＥＮ融合タンパク質構築物は、力価＞１ｇ／Ｌ、見かけ上のＭＷ約１６０ｋＤａによる発酵スケールで表現した（注記：実際の分子量は１００ｋＤａである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察される移動度は、他のＸＴＥＮ含有融合タンパク質に観察されるものに匹敵した）。
【０４５４】
（実施例７）
高密度細菌発酵からのＣＣＤ−ＸＴＥＮの精製
【０４５５】
１．発現
【０４５６】
構築物ＡＣ１２５５（ＭＫＮＰＥＱＡＥＥＱＡＥＥＱＲＥＥＴ−ＳＡＳＲＧＳ−ＣＣＤ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ７１３−ＳＡＳＲＳＡ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ８）を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの制御下でＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１＿ＤＥ３において発現させた。ＯＤ６００がほぼ２．５となるまで、ＡＣ１２５５をＬＢフラスコ内で培養し、２．１ｇ／Ｌグルコースを有する富栄養培地を含有する１０Ｌ発酵槽に移した。バッチフィードの消耗後に、予めプログラムされたグルコース制限プロファイルにおいて７０％ｗ／ｖグルコースを添加した。４０〜５０のＯＤ６００の時点でこの培養物をＩＰＴＧにより誘導し、続いて収集まで１８〜２４時間培養した。遠心分離により細胞をペレットにし、−８０℃で凍結した。
【０４５７】
２．溶解および清澄化
【０４５８】
細胞ペレット（２６００ｇ）を７４００ｍｌの５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４．０に再懸濁した。再懸濁した細胞を１５分間８０℃に加熱し、続いて氷上で３０分間急速に冷却した。ライセートのｐＨを１２Ｍ  ＨＣｌにより３．０に調整し、４℃で撹拌しつつ、ライセートを一晩ｐＨ３．０で貯蔵した。次に、７０００ｒｐｍ、４０分間、４℃の遠心分離２回によりライセートを清澄化し、上清を０．２μｍ濾過した。
【０４５９】
３．カチオン交換捕捉ステップ
【０４６０】
清澄化したライセートを、以前にＮａＯＨで消毒し、Ｍｃｉｌｖａｉｎｅの緩衝液、ｐＨ３．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＣａｐｔｏ  ＳＰ  ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した１Ｌカラムにロードした。３カラム容量のＭｃｉｌｖａｉｎｅの緩衝液、ｐＨ３．０でカラムを洗浄し、５カラム容量の溶出緩衝液（３４％２０ｍＭクエン酸、ｐＨ２．５、６６％４０ｍＭリン酸ナトリウム二塩基性、ｐＨ９．０）で溶出させ、続いて１カラム容量の２０Ｍリン酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０でストリップした。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により画分を解析した（図１９Ａ）。ゲルに基づき、所望の産物を含有した溶出画分をさらなる加工に使用した。
【０４６１】
４．カチオン交換カラム溶出プールのトリプシン消化
【０４６２】
カチオン交換クロマトグラフィー後に、トリプシン消化を使用して、Ｎ−タグおよびＣ−タグを切断除去した。次に、４０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウム／１２Ｍ  ＨＣｌを使用して、プールした画分のｐＨを８．０に調整し、続いてウシトリプシン（Ｓｉｇｍａ）と共に室温で一晩、穏やかに混合しつつインキュベートした（１：５０００酵素／タンパク質質量比）。反応後に、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＤＴＴを添加し、反応混合物を８０℃で１５分間加熱し、続いて温度が１０℃に低下するまで氷上で冷却することにより、トリプシンを不活性化した。
【０４６３】
５．アニオン交換研磨ステップ
【０４６４】
アニオン交換クロマトグラフィーを研磨ステップとして使用して、最終産物から切断されたタグおよびトランケートされた産物を分離した。トリプシン消化後の試料を０．２μｍ濾過し、続いて以前にＮａＯＨで消毒し、２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５で平衡化したＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した１．５７Ｌカラムにロードした。ロード後に、４カラム容量の２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．３５、続いて４カラム容量の２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５、５０ｍＭ  ＮａＣｌでカラムを洗浄した。３回の勾配溶出ステップを適用した：５カラム容量にわたる２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５、５０〜１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、続いて５カラム容量にわたる２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５、１４５〜２０５ｍＭ  ＮａＣｌ、最後に５カラム容量にわたる２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５、２０５〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌ。その後に、０．５カラム容量の２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５、５００ｍＭ  ＮａＣｌでカラムをストリップした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続くＳｔａｉｎｓ−ａｌｌによる染色により、画分を解析した（図１９Ｂ）。ゲルに基づき、製剤化のために溶出Ｅ１〜Ｅ７をプールした。
【０４６５】
７．濃縮および緩衝液交換（製剤化）
【０４６６】
最終ステップとして、Ｂｉｏｍａｘ−５  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ限外濾過カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、プールしたタンパク質を製剤緩衝液（２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５）に緩衝液交換し、最終濃度＞１５ｍｇ／ｍＬとなるよう濃縮した。
【０４６７】
（実施例８）
高密度細菌発酵からのＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮの精製
【０４６８】
１．発現
【０４６９】
構築物ＡＣ１２５４（ＭＫＮＰＥＱＡＥＥＱＡＥＥＱＲＥＥＴ−Ｈｉｓ８−ＳＡＳＲＳＡ−ＴＥＶ−ＣＣＤ１−ＬＳＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ−ＡＥ７１３）を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの制御下でＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１＿ＤＥ３において発現させた。ＯＤ６００がほぼ２．５になるまで、ＬＢフラスコ内でＡＣ１２５５を培養し、２．１ｇ／Ｌグルコースを有する富栄養培地を含有する１０Ｌ発酵槽に移した。バッチフィード消耗後に、予めプログラムされたグルコース制限プロファイルにおいて７０％ｗ／ｖグルコースを添加した。４０〜５０のＯＤ６００の時点でこの培養物をＩＰＴＧにより誘導し、続いて収集まで１８〜２４時間培養した。遠心分離により細胞をペレットにし、−８０℃で凍結した。
【０４７０】
２．溶解および清澄化
【０４７１】
細胞ペレット（４２０４ｇ）を８４００ｍｌの５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４．０に再懸濁した。再懸濁した細胞を１５分間８０℃に加熱し、続いて氷上で３０分間急速に冷却した。ライセートのｐＨを１２Ｍ  ＨＣｌで３．０に調整し、４℃で撹拌しつつ、ライセートを一晩ｐＨ３．０で貯蔵した。次に、７０００ｒｐｍ、４０分間、４℃の遠心分離２回によりライセートを清澄化し、上清を０．２μｍ濾過した。
【０４７２】
３．カチオン交換捕捉ステップ
【０４７３】
清澄化したライセートを、以前にＮａＯＨで消毒し、Ｍｃｉｌｖａｉｎｅの緩衝液、ｐＨ３．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＣａｐｔｏ  ＳＰ  ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した１Ｌカラムにロードした。３カラム容量のＭｃｉｌｖａｉｎｅの緩衝液、ｐＨ３．０でカラムを洗浄し、５カラム容量の溶出緩衝液（３４％２０ｍＭクエン酸、ｐＨ２．５、６６％４０ｍＭリン酸ナトリウム二塩基性、ｐＨ９．０）で溶出させ、続いて１カラム容量の２０Ｍリン酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０でストリップした。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により画分を解析した（図２０Ａ）。ゲルに基づき、所望の産物を含有した溶出画分をさらなる加工に使用した。
【０４７４】
４．カチオン交換カラム溶出プールのＴＥＶプロテアーゼ消化
【０４７５】
カチオン交換クロマトグラフィー後に、ＴＥＶプロテアーゼ消化を使用して、Ｎ−タグを切断除去した。次に、４０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウムを使用して、溶出プールのｐＨをｐＨ８．０に調整し、最終濃度が各１ｍＭに達するようにＤＴＴおよびＥＤＴＡを試料に添加した。続いて、試料をＴＥＶプロテアーゼと共に室温で一晩、穏やかに混合しつつ（１：２０酵素／タンパク質質量比）インキュベートした。反応後に、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＤＴＴを添加し、反応混合物を８０℃で１５分間加熱し、続いて温度が１０℃に低下するまで氷上で冷却することにより、ＴＥＶプロテアーゼを不活性化した。
【０４７６】
５．アニオン交換研磨ステップ
【０４７７】
アニオン交換クロマトグラフィーを研磨ステップとして使用して、最終産物から切断されたタグおよびトランケートされた産物を分離した。ＴＥＶ消化後の試料を０．２μｍ濾過し、続いて以前にＮａＯＨで消毒し、２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５で平衡化したＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した３Ｌカラムにロードした。ロード後に、３カラム容量の２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５および３カラム容量の２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５、４０ｍＭ  ＮａＣｌでカラムを洗浄した。次に、３回の勾配溶出ステップを適用した：３カラム容量にわたる２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５、４０〜９０ｍＭ  ＮａＣｌと、続く５カラム容量にわたる２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５、９０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、最後に８カラム容量にわたる２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５、２００〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌ。続いて、１カラム容量の２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．３５、５００ｍＭ  ＮａＣｌでカラムをストリップした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続くＳｔａｉｎｓ−ａｌｌによる染色により、画分を解析した（図２０Ｂ）。ゲルに基づき、溶出１７〜２２を製剤化のためにプールした。
【０４７８】
７．濃縮および緩衝液交換（製剤化）
【０４７９】
最終ステップとして、Ｂｉｏｍａｘ−５  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ限外濾過カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、プールしたタンパク質を製剤緩衝液（２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５）に緩衝液交換し、最終濃度＞１５ｍｇ／ｍＬとなるよう濃縮した。
【０４８０】
（実施例９）
ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ構築物ＡＣ１２５４の酵素活性化、貯蔵および消化
【０４８１】
本実施例は、表８中のおよび実施例８に先に記載されているＢＳＲＳ１であるＰＣＭ配列を備える上述のＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ構築物ＡＣ１２５４のうち１種を、試験管においてＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、ＭＴＳＰ１およびｕＰＡを含む種々の腫瘍関連のプロテアーゼによって切断することができることを示す。
【０４８２】
１．酵素活性化
【０４８３】
使用したあらゆる酵素は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得た。組換えヒトｕ−プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）および組換えヒトマトリプターゼは、活性化された酵素として提供され、使用まで−８０℃で貯蔵した。組換えマウスＭＭＰ−２、組換えヒトＭＭＰ−７および組換えマウスＭＭＰ−９は、酵素原として供給され、酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）による活性化を必要とした。ＡＰＭＡをまず０．１Ｍ  ＮａＯＨに溶解して、最終濃度１０ｍＭとし、その後、０．１Ｎ  ＨＣｌを使用して、ｐＨを中性に再調整した。２．５ｍＭとなるよう、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５においてＡＰＭＡストックをさらに希釈した。プロＭＭＰを活性化するために、１ｍＭ  ＡＰＭＡおよび１００ｕｇ／ｍＬのプロＭＭＰを３７℃で１時間（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７）または３時間（ＭＭＰ−９）インキュベートした。次に、最終濃度５０％グリセロールに添加された活性化された酵素を−２０℃で数週間貯蔵することができる。
【０４８４】
２．酵素消化
【０４８５】
酵素のパネルを検査して、ＡＣ１２５４（ＣＣＤ１−ＢＳＲＳ１−ＡＥ７１３）に対する各酵素の切断効率を決定した。１０μＭの基質を各酵素と共に次の酵素対基質モル比でインキュベートした：ＭＭＰ−２（１：６８０）、ＭＭＰ−７（１：２００）、ＭＭＰ−９（１：６７１１）、マトリプターゼ（１：１２．５）およびｕＰＡ（１：１２．５）。反応物を３７℃で２時間インキュベートし、その後、ＭＭＰ反応物の場合は２０ｍＭとなるようＥＤＴＡを添加することにより、ｕＰＡおよびマトリプターゼ反応物の場合は８５℃で１５分間加熱することにより消化を停止した。
【０４８６】
３．切断効率の解析
【０４８７】
５μｇの未消化および消化材料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、クーマシーブルーで染色することにより（図４５Ａ）、ならびに８μｇの未消化および消化産物をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣに付すことにより（図４５Ｂ）、切断された産物の百分率を決定するための試料の解析を行った。ＲＰ−ＨＰＬＣにより、１時間の経過にわたるＭＭＰ−９消化の典型的な時間経過は、１０分間間隔で集められた消化反応の試料の解析により観察することができた（図４４Ａ）。２種の陰性対照を含むこともできた：１種は、ＭＭＰの非存在下で消化が起こらなかったことを確認するためのものであり、もう１種は、ＡＰＭＡ単独の存在下で消化が起こらなかったことを確認するためのものである（図４４Ｂ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのため、ＩｍａｇｅＪを使用して、バンド強度を解析し、パーセント切断を決定した。ＰＣＭセグメントにおける種々のプロテアーゼによる切断後に、基質ＣＣＤ１−ＰＣＭ−ＸＴＥＮは、ＣＣＤ１を大部分は含有する小断片と、ＸＴＥＮを含有する他方の断片の２個の断片を生じ、これらは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてより低い見かけ上の分子量で移動するであろう。この結果は、本明細書で検査した全プロテアーゼが、変動する程度の触媒効率で、意図される通りに構築物を切断したことを確認する。
【０４８８】
（実施例１０）
３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ８６４を産生するためのＣＸＴＥＮ８６４へのＩＡ−ＭＭＡＥのコンジュゲーション
【０４８９】
２０５ｍｇのＣＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４（Ａｍ１、Ｃ１２、Ｃ４３２、Ｃ８５４）、下表３１における配列）を、ｐＨ８．０で２０分間、８０℃にて３モル当量のＴＣＥＰで還元した。還元された３ｘ−Ｃｙｓ−ＸＴＥＮを、一晩２５℃で５モル当量のＩＡ−ＭＭＡＥ（無水ＤＭＦに溶解）と反応させた。Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣによりコンジュゲーション効率を評価した。次の公式を使用して、半値全幅（maximium）で割ったこれらのピークの間の保持時間の差としてピーク分離を算出することにより、完全にコンジュゲートされた薬物ロード産物ピーク（この場合は３ｘ−ＭＭＡＥピーク）および完全にコンジュゲートされたピークに最も近い不十分にコンジュゲートされたピーク（この場合は２ｘ−ＭＭＡＥピーク）の間の分離の定量化を決定した：
ピーク分離＝（ｔＲ２−ｔＲ１）／ＦＷＨＭ
（式中、
ｔＲ２：完全にコンジュゲートされた産物ピークの保持時間
ｔＲ１：完全にコンジュゲートされた産物ピークに最も近い不十分にコンジュゲートされたピークの保持時間
ＦＷＨＭ：半値全幅）。
【０４９０】
異なる構築物の分離の比較のための分析的方法：１０μｇ  ＸＴＥＮを含有する反応混合物を、Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ、カタログ＃２１４ＴＰ５４１５、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５ｕｍ粒子径）に注射し、４５分間にわたる１ｍＬ／分の緩衝液Ａ（水における０．１％ＴＦＡ）における５〜５０％緩衝液Ｂ（アセトニトリルにおける０．１％ＴＦＡ）の方法を使用して解析した。
【０４９１】
この方法を使用して、３ｘＭＭＡＥコンジュゲートを作製する場合、ピーク分離が、ＣＸＴＥＮに関して４．５であると決定した（図３３Ｂ）。
【０４９２】
精製のため、混合物をＴＦＡによりｐＨ＜３に酸性化し、最終容量が１３％（ｖ／ｖ）となるようにＤＭＦを添加した。この混合物を２個のアリコートに分割し、それぞれを調製用Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４、Ｖｙｄａｃ、２５０ｍｍ×２２ｍｍ）により精製した。クロマトグラフィー画分をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。所望の産物を含有する画分をプールし、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０で中和し、真空下で濃縮した。限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｖｉｖａｃｅｌｌ  １００、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、３ｘ−ＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ産物を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて製剤化した。Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣにより高純度の最終産物を実証した（＞９５％、図３２）。反応収率を５３．０％と決定した。
【表３１】
2018500049.tif 000142
【０４９３】
（実施例１１）
３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮを産生するためのＣＣＤ−ＸＴＥＮへのＩＡ−ＭＭＡＥのコンジュゲーション
【０４９４】
１２．３ｍＬの２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５における２３６ｍｇのＣＣＤ−ＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ＿ＡＥ７５９（Ａｍ１、Ｃ８、Ｃ２４、Ｃ４０）、下表３３における配列）に、３．０８ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０を添加した。このＣＣＤ−ＸＴＥＮを、３モル当量のＴＣＥＰにより２０分間８０℃で還元した。次に、還元されたＣＣＤ−ＸＴＥＮを１．４ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０で希釈し、２４時間２５℃で６モル当量のＩＡ−ＭＭＡＥ（６．１３ｍＬの無水ＤＭＦに溶解）と反応させた。３０モル当量のグルタチオンにより３０分間２５℃で反応をクエンチした。
【０４９５】
実施例１０に記載されているものと同じ分析的方法を使用して、Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ、カタログ＃２１４ＴＰ５４１５、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５ｕｍ粒子径）によりコンジュゲーションを評価した。３×薬物をロードしたＣＸＴＥＮ（ピーク分離＝４．５、実施例１０を参照）と比較して、３×薬物をロードしたＣＣＤ−ＸＴＥＮの改善されたピーク分離（ピーク分離＝１１．８）が観察された（図３３Ｂ）。
【０４９６】
この混合物をＴＦＡによりｐＨ＜３となるよう酸性化し、最終容量が１３％（ｖ／ｖ）となるようＤＭＦを添加した。所望の３ｘ−ＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ産物を調製用Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４、Ｖｙｄａｃ、２５０ｍｍ×２２ｍｍ）により精製した。クロマトグラフィー画分をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。所望の産物を含有する画分をプールし、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０により中和し、１５０ｍＭ〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌの１０カラム容量の勾配を使用した溶出によりＭａｃｒｏＣａｐ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。クロマトグラフィー画分をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮを有する選択された画分をプールし、限外濾過を使用して２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて製剤化した。高純度の最終産物をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣにより実証した（＞９５％、図２１Ａ）。反応収率を５７．９％と決定し、これは、ＣＸＴＥＮへのＩＡ−ＭＭＡＥのコンジュゲーションにおいて達成される収率（上の実施例１０を参照）よりも優れていた。
【０４９７】
結論：構築物の融合タンパク質へのＣＣＤの取り込みは、ＣＸＴＥＮを利用した構築物と比較して（ピーク分離により決定）所望の完全にコンジュゲートされた産物を回収する能力の増強および全体的により高い産物収率をもたらした。
【０４９８】
（実施例１２）
３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮを産生するためのＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮへのＩＡ−ＭＭＡＥのコンジュゲーション
【０４９９】
ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２（Ａｍ１、Ｃ８、Ｃ２４、Ｃ４０）−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ７１３を、ｐＨ８．０で２０分間８０℃にて３モル当量のＴＣＥＰで還元した。次に、還元されたＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮを、ｐＨ８．０で２日間、２５℃にて６モル当量のＩＡ−ＭＭＡＥと反応させた。３０分間２５℃で３０モル当量のグルタチオンにより反応をクエンチし、Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣによりコンジュゲーションを評価した。この混合物をＴＦＡによりｐＨ＜３となるよう酸性化し、最終容量が１３％（ｖ／ｖ）となるようＤＭＦを添加した。所望の３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ産物を調製用Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４、Ｖｙｄａｃ、２５０ｍｍ×２２ｍｍ）により精製した。クロマトグラフィー画分をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。所望の産物を含有する画分をプールし、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０により中和し、１５０ｍＭ〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌの１０カラム容量の勾配を使用した溶出によるＭａｃｒｏＣａｐ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。クロマトグラフィー画分をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮを有する選択された画分をプールし、限外濾過を使用して２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて製剤化した。Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（＞９５％、図２１Ｂ）およびインタクト質量（＋１２Ｄａの観察されるＥＳＩ−ＭＳ）により、高純度の最終産物を実証した。
【０５００】
（実施例１３）
コンジュゲーションによるヨードアセトアミド−３ｘ−ＤＭ１−ＣＸＴＥＮの調製
【０５０１】
２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５における１．５ｍＬのＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２（Ａｍ１、Ｃ１２、Ｃ２１７、Ｃ４２２）（２８．５ｍｇ、７２５ｎｍｏｌ）システイン操作ＸＴＥＮセグメントのｐＨを、０．０７５ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０で調整した。この３ｘ−Ｃｙｓ−ＸＴＥＮに、０．０６７ｍＬのＩＡ−ＤＭ１（無水ＤＭＦにおける５４ｍＭ）を添加し、追加的なＤＭＦを添加して、ＩＡ−ＤＭ１を完全に可溶化した。反応物を室温で２．５時間インキュベートし、ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。３ｘ−ＤＭ１−ＣＸＴＥＮ産物を調製用ＨＰＬＣ（Ｃ４、Ｖｙｄａｃ、２５０ｍｍ×１０ｍｍ）により精製した。クロマトグラフィー画分をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。３ｘ−ＤＭ１−ＣＸＴＥＮを含有する画分をプールし、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０により中和し、真空下で濃縮した。限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、３ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１３５ｍＭ  ＮａＣｌにおいて３ｘ−ＤＭ１−ＣＸＴＥＮ産物を製剤化した。０．０１ｍＬのＳＩＡ（無水ＤＭＦにおける５０ｍＭ）と０．４５ｍＬの３ｘ−ＤＭ１−ＣＸＴＥＮ（４．１ｍｇ、９９ｎｍｏｌ）および０．０２３ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０との室温２時間の反応により、３ｘ−ＤＭ１−ＣＸＴＥＮのＮ末端をヨードアセトアミドに変換した。限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）による２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１３５ｍＭ  ＮａＣｌにおける製剤化の際に過剰ＳＩＡを除去した。
【０５０２】
（実施例１４）
コンジュゲーションによるヨードアセトアミド−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮの調製
【０５０３】
２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５における１ｍＬのＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２（Ａｍ１、Ｃ１２、Ｃ２１７、Ｃ４２２）（３０．４ｍｇ）システイン操作ＸＴＥＮセグメントのｐＨを、０．２７ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０で調整した。この３ｘ−Ｃｙｓ−ＸＴＥＮに、ＩＡ−ＭＭＡＥ（無水ＤＭＦにおける５モル当量、６４．６ｍｇ／ｍＬ）を添加し、追加的な０．３ｍＬ  ＤＭＦを添加して、混合物にＩＡ−ＭＭＡＥを完全に可溶化した。この反応物を２５℃で４時間インキュベートし、Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ産物を２個のアリコートに分割し、それぞれを調製用ＨＰＬＣ（Ｃ４、Ｖｙｄａｃ、２５０ｍｍ×１０ｍｍ）により精製した。クロマトグラフィー画分をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮを含有する画分をプールし、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０により中和し、真空下で濃縮した。限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、３ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ産物を製剤化した。０．１５ｍＬのＳＩＡ（無水ＤＭＦにおける１０モル当量、２００ｍＭ）と１５ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおける３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ（１２６ｍｇ、２９４０ｎｍｏｌ）との２５℃で１．５時間の反応により、３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮのＮ末端をヨードアセトアミドに変換した。限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｖｉｖａｃｅｌｌ  １００、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）による２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０における製剤化の際に、過剰ＳＩＡを除去した。ＥＳＩ−ＭＳ（計算値ＭＷ４３，０２４．５Ｄａ、実測値ＭＷ４３，０２２．０Ｄａ）の結果および８７．４％のモデルシステイン含有ペプチドＨＣＫＦＷＷ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｈ−３５２４）とのＩＡ反応性は、最終産物の高純度および反応性を実証した。
【０５０４】
（実施例１５）
ＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮまたはＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮの調製
【０５０５】
３０ｍｇの３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ（実施例１１から）または３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ（実施例１２から）を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．３％（ｖ／ｖ）ＤＭＦにおいて１０モル当量ＳＭＣＣ（ＤＭＦに溶解）と１時間２５℃の温度で反応させた。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用した限外濾過により過剰ＳＭＣＣを除去した。Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（＞９５％、図２２Ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２２Ｂ）により高純度の産物を実証した。モデルシステイン含有ＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８（Ａｍ１、Ｃ２８３））との反応により、ＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮおよびＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ反応性をそれぞれ評価した。ＭＣＣ反応性の結果は、高収率のマレイミド産物を示した（図２２Ｂ）。
【０５０６】
（実施例１６）
ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−３ｘ−ＤＭ１コンジュゲートを作製するための３ｘ−ＤＭ１−ＣＸＴＥＮへのａＨＥＲ２−ＸＴＥＮのコンジュゲーション
【０５０７】
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおける１０ｍＬのａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ３０４（Ｃ２９６）−Ｈ８（１５３ｍｇ、２７２２ｎｍｏｌ）を、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰで１．５時間、室温にて還元した。２．５ｍＬをそれぞれ４個の脱塩カラム（ＧＥ、ＰＤ−１０）にロードし、それぞれ３．５ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにより（合計１４ｍＬ）溶出させることにより、過剰ＴＣＥＰを除去した。還元されたａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ３０４（Ｃ２９６）−Ｈ８（１５３ｍｇ、２７２２ｎｍｏｌ）のシステイン側鎖を、総容量２８ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて、ホウ酸ナトリウム緩衝液でｐＨを８．５に調整して、２５℃で一晩、ＩＡ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ（１８５３ｎｍｏｌ、実施例１３を参照）のＮ末端ヨードアセトアミドと反応させた。反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。Ｃｕ（ＩＩ）を負荷した固定化金属親和性クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ、１５０ｍＬ、５０ｍｍ直径）に混合物をロードした。未反応のＩＡ−３ｘ−ＤＭ１−ＣＸＴＥＮをフロースルーにおいて除去した。ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０における１０ｍＭ〜１００ｍＭイミダゾールにより溶出させた。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。所望のコンジュゲートを有する画分をプールし、１８カラム容量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０における１５０ｍＭ〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌの勾配における溶出によるＭａｃｒｏＣａｐ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１００ｍＬ、５０ｍｍ直径）上で精製した。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ａＨＥＲ２ターゲティングＣＸＴＥＮ−３ｘ−ＤＭ１コンジュゲートを有する選択された画分をプールし、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｖｉｖａｃｅｌｌ  １００、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用してＰＢＳにおいて製剤化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２５Ａ）、ＥＳＩ−ＭＳ（図２５Ｂ）およびＨＩＣ（図２５Ｃ）解析の結果は、高純度の最終産物を実証した。
【表３２】
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【０５０８】
（実施例１７）
ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−３ｘ−ＭＭＡＥコンジュゲートを作製するための３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮへのａＨＥＲ２−ＸＴＥＮのコンジュゲーション
【０５０９】
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおける１０ｍＬのａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ３０４（Ｃ２９６）−Ｈ８（１５３ｍｇ、２７２２ｎｍｏｌ）を、１．５時間、室温にて０．５ｍＭ  ＴＣＥＰで還元した。２．５ｍＬをそれぞれ４個の脱塩カラム（ＧＥ、ＰＤ−１０）にロードし、それぞれ３．５ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出させることにより（合計１４ｍＬ）、過剰ＴＣＥＰを除去した。還元されたａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ３０４（Ｃ２９６）−Ｈ８（１５３ｍｇ、２７２２ｎｍｏｌ）のシステイン側鎖を、総容量２０ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて、ホウ酸ナトリウム緩衝液でｐＨを８．５に調整して、２５℃で一晩、ＩＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ（２７２２ｎｍｏｌ、実施例１４を参照）のＮ末端ヨードアセトアミドと反応させた。反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。この混合物を、Ｃｕ（ＩＩ）を負荷した固定化金属親和性クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ、１５０ｍＬ、５０ｍｍ直径）にロードした。未反応のＩＡ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＸＴＥＮをフロースルーにおいて除去した。ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０における１０ｍＭ〜１００ｍＭイミダゾールにより溶出させた。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。所望のコンジュゲートを有する画分をプールし、１４カラム容量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０における１５０ｍＭ〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌの勾配における溶出により、ＭａｃｒｏＣａｐ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１００ｍＬ、５０ｍｍ直径）上で精製した。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−３ｘ−ＭＭＡＥコンジュゲートを有する選択された画分をプールし、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｖｉｖａｃｅｌｌ  １００、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用してＰＢＳにおいて製剤化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２９Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳ（図２９Ｂ）解析の結果は、高純度の最終産物を実証した。
【０５１０】
（実施例１８）
ａＨＥＲ２ターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを作製するためのＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮへのａＨＥＲ２−ＸＴＥＮのコンジュゲーション
【０５１１】
１ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおけるａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４４（Ｃ３６）−Ｈ８（１０．２ｍｇ、３１５ｎｍｏｌ）を、１．５時間、室温にて１ｍＭ  ＴＣＥＰで還元した。脱塩カラム（ＧＥ、ＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐ  Ｇ−２５）により過剰ＴＣＥＰを除去し、１．５ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて溶出させた。還元されたａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４４（Ｃ３６）−Ｈ８（１０．２ｍｇ、３１５ｎｍｏｌ）のシステイン側鎖を、総容量２．５ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて、２５℃で２時間、ＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ（１３ｍｇ、１７８ｎｍｏｌ、実施例１５を参照）のＮ末端マレイミドと反応させた。反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。この反応混合物を、６．５ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で希釈し、Ｃｕ（ＩＩ）を負荷した固定化金属親和性クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ、９ｍＬ、１５ｍｍ直径）にロードした。未反応のＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮをフロースルーにおいて除去した。ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０における１０ｍＭ〜１００ｍＭイミダゾールにより溶出させた。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。所望のコンジュゲートを有する画分をプールし、１０カラム容量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０における１５０ｍＭ〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌの勾配を使用した溶出により、ＭａｃｒｏＣａｐ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＬ、１６ｍｍ直径）上で精製した。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを有する選択された画分をプールし、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用してＰＢＳにおいて製剤化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２３Ａ）、ＥＳＩ−ＭＳ（図２３Ｂ）およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図２３Ｃ）解析の結果は、高純度の最終産物を実証した。
【表３３】
2018500049.tif 000144
【０５１２】
（実施例１９）
ＰＣＭを備えるａＨＥＲ２ターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを作製するためのＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮへのａＨＥＲ２−ＸＴＥＮのコンジュゲーション
【０５１３】
２ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおけるａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４４（Ｃ３６）−Ｈ８（２０．４ｍｇ、６３０ｎｍｏｌ）を、１．５時間、室温にて０．７５ｍＭ  ＴＣＥＰで還元した。脱塩カラム（ＧＥ、ＰＤ−１０）により過剰ＴＣＥＰを除去し、３．５ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて溶出させた。還元されたａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４４（Ｃ３６）−Ｈ８（２０．４ｍｇ、６３０ｎｍｏｌ）のシステイン側鎖を、総容量７．３ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて、２５℃で２時間、ＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ（３０ｍｇ、４０３ｎｍｏｌ、実施例１５を参照）のＮ末端マレイミドと反応させた。反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。この混合物を１２．７ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で希釈し、Ｃｕ（ＩＩ）を負荷した固定化金属親和性クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ、２０ｍＬ、２７ｍｍ直径）にロードした。未反応のＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮをフロースルーにおいて除去した。ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０における１０ｍＭ〜１００ｍＭイミダゾールにより溶出させた。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。所望のコンジュゲートを有する画分をプールし、１０カラム容量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０における１５０ｍＭ〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌの勾配を使用した溶出により、ＭａｃｒｏＣａｐ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２５ｍＬ、１６ｍｍ直径）上で精製した。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ＰＣＭを備える純粋なａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを有する選択された画分をプールし、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用してＰＢＳにおいて製剤化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２４Ａ）、ＥＳＩ−ＭＳ（図２４Ｂ）およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図２４Ｃ）解析の結果は、高純度の最終産物を実証した。
【表３４】
2018500049.tif 000145
【０５１４】
（実施例２０）
ホレートターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを作製するためのＩＡ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮへのホレート−ＡＨＨＡＣのコンジュゲーション
【０５１５】
総容量１．８ｍＬの２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて、２５℃で一晩、ホレート−ＡＨＨＡＣ（３モル当量）のシステイン側鎖と反応させて、３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ（１８．１ｍｇ、実施例１１を参照）のＮ末端を、ＳＩＡ（１０モル当量）によりヨードアセトアミドに変換した。この反応混合物を、Ｃｕ（ＩＩ）を負荷した固定化金属親和性クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ、２０ｍＬ、２７ｍｍ直径）にロードした。未反応のＩＡ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮをフロースルーにおいて除去した。ホレートターゲティングＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ８．０における５０ｍＭイミダゾールにより溶出させた。クロマトグラフィー画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。所望のコンジュゲートを有する画分をプールし、ＴＦＡによりｐＨ＜３となるよう酸性化し、続いて調製用ＨＰＬＣ（Ｃ４、Ｖｙｄａｃ、２５０ｍｍ×１０ｍｍ）により精製した。クロマトグラフィー画分をＭＡＬＤＩおよびＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。ホレートターゲティングＸＤＣを含有する画分をプールし、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０により中和し、真空下で濃縮した。産物を、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４、３ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用してＰＢＳにおいて製剤化した。産物の純度をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（図３０Ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３０Ｂ）により実証した。
【０５１６】
（実施例２１）
ＰＣＭを備えるホレートターゲティングＣＣＤ−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを作製するためのＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮへのホレート−ＡＨＨＡＣのコンジュゲーション
【０５１７】
ＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮ（３３．５ｍｇ、実施例１５を参照）を、総容量４．３ｍＬの２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて、２５℃で一晩、ホレート−ＡＨＨＡＣ（３モル当量）のシステイン側鎖と反応させた。この反応混合物を、Ｃｕ（ＩＩ）を負荷した固定化金属親和性クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ、２０ｍＬ、２７ｍｍ直径）にロードした。未反応のＭＣＣ−３ｘ−ＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＰＣＭ−ＸＴＥＮをフロースルーにおいて除去した。ＰＣＭを備えるホレートターゲティングＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ８．０における５０ｍＭイミダゾールにより溶出させた。クロマトグラフィー画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳにより解析した。所望のコンジュゲートを有する画分をプールし、ＴＦＡによりｐＨ＜３となるよう酸性化し、続いて調製用ＨＰＬＣ（Ｃ４、Ｖｙｄａｃ、２５０ｍｍ×１０ｍｍ）により精製した。クロマトグラフィー画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。ホレートターゲティングＸＤＣを含有する画分をプールし、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０により中和し、真空下で濃縮した。産物を、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、３ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用してＰＢＳにおいて製剤化した。産物の純度をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ（図３１Ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３１Ｂ）により実証した。
【０５１８】
（実施例２２）
Ｎ末端によって連結された単一特異性ＸＴＥＮ前駆体からの二重特異性コンジュゲートの調製
【０５１９】
本実施例は、ＮからＮ末端への配置で２個の異なるＸＴＥＮ−ペイロード前駆体を連結することによる、ＸＴＥＮ−コンジュゲート組成物の創出について記載する；一方はペイロードＡを備え、もう一方はペイロードＢを備え、二重特異性コンジュゲートをもたらす。
【０５２０】
第１のステップとして、複数のシステインを含有するＸＴＥＮ分子（システイン操作ＸＴＥＮ）を上述の通りに調製し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて製剤化する。ペイロードＡ−マレイミドを、水溶液の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、ＤＭＦもしくはＤＭＣＯまたは試薬溶解性に応じた他のいずれか適切な溶媒に溶解する。ペイロードＡ−マレイミドを、ＸＴＥＮよりも２〜６モル過剰でシステイン操作ＸＴＥＮに添加し、１時間２５℃でインキュベートする。改変の完了をＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターする。その結果得られるペイロードＡ−ＸＴＥＮコンジュゲートを、調製用Ｃ４−Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、夾雑物および未反応の成分から精製する。ペイロードＡ−ＸＴＥＮコンジュゲートを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて製剤化する。次に、１０〜５０モル過剰のジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−ＮＨＳエステルまたはＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルをＸＴＥＮに添加し、１〜２時間２５℃でインキュベートすることにより、ペイロードＡ−ＸＴＥＮコンジュゲートをさらに改変する。改変の完了を分析的Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターする。コンジュゲーション効率が低い場合（例えば、＜９０％）または複数の非特異的産物が形成される場合、ＤＢＣＯ−ペイロードＡ−ＸＴＥＮコンジュゲートは、調製用Ｃ４−Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製する。有意な副生物がなく、ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステルコンジュゲーションの効率が高い場合（＞９０％）、ＤＢＣＯ−ペイロードＡ−ＸＴＥＮコンジュゲートは、１０〜３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心分離機を使用した緩衝液交換、アセトニトリル沈殿またはアニオン交換クロマトグラフィーにより過剰試薬から精製する。
【０５２１】
第２のＸＴＥＮ−ペイロード前駆体を創出するために、ペイロードＢ−マレイミドを、水溶液の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、ＤＭＦもしくはＤＭＣＯまたは試薬溶解性に応じた他のいずれか適切な溶媒に溶解する。ペイロードＢ−マレイミドを、ＸＴＥＮ濃度よりも２〜６モル過剰で第２のシステイン含有ＸＴＥＮに添加し、１時間２５℃でインキュベートする。改変の完了を分析的Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターする。その結果得られるペイロードＢ−ＸＴＥＮコンジュゲートを、調製用Ｃ４−Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して夾雑物および反応物から精製する。ペイロードＢ−ＸＴＥＮコンジュゲートを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて製剤化する。アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステルを、１０〜５０モル過剰でペイロードＢ−ＸＴＥＮに添加し、１〜２時間２５℃でインキュベートする。改変の完了をＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターする。コンジュゲーション効率が低い場合（例えば、＜９０％）または複数の非特異的産物が形成される場合、アジド−ペイロードＢ−ＸＴＥＮコンジュゲートは、調製用Ｃ４−Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製される。有意な副生物がなく、ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステルコンジュゲーションの効率が高い場合（＞９０％）、アジド−ペイロードＢ−ＸＴＥＮコンジュゲートは、１０〜３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心分離機を使用した緩衝液交換、アセトニトリル沈殿またはアニオン交換クロマトグラフィーにより、過剰試薬から精製される。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０緩衝液、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて、等（equil）モル比の精製および濃縮されたＤＢＣＯ−ペイロードＡ−ＸＴＥＮおよびアジド−ペイロードＢ−ＸＴＥＮタンパク質を混合し、２５℃で１時間またはそれよりも長く反応が完了するまでインキュベートすることにより、最終産物を創出する。改変の完了をＣ４またはＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターする。必要に応じて、二重特異性コンジュゲートのペイロードＡ−ＸＴＥＮ−ペイロードＢを、調製用（preparatiove）ＲＰ−ＨＰＬＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはアニオン交換クロマトグラフィーにより精製する。
【０５２２】
（実施例２３）
Ｎ末端によって連結された単一特異性ＸＴＥＮ前駆体からの三量体コンジュゲートの調製
【０５２３】
単一特異性ＸＴＥＮ−ペイロード前駆体は、ＸＴＥＮ分子に連結されたペイロードＡのＮ末端融合体として調製されることになる；例えば、これはＡＥ１４４からＡＥ８９０に及ぶ長さで、Ｃ末端に単一のシステインを含有する。精製された前駆体を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−（２−マレイミドエチル）アミン（ＴＭＥＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．＃３３０４３）において製剤化し、ＤＭＳＯまたはＤＭＦに溶解する。前駆体（架橋剤よりも４〜６モル過剰）およびＴＭＥＡ試薬を混合し、１時間２５℃でインキュベートする。改変の完了をＣ４もしくはＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣまたはサイズ排除クロマトグラフィーによりモニターする。その結果得られる三価ペイロードＡ−ＸＴＥＮコンジュゲートを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アニオン交換クロマトグラフィーまたは調製用Ｃ４−Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣにより、タンパク質反応物または部分的産物混合物から精製する。
【０５２４】
（実施例２４）
ホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ血清安定性
【０５２５】
安定性の尺度として、ホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを、定期的な間隔でアリコートを除去して解析まで−８０℃で貯蔵しつつ、３７℃で最大２週間、正常ヒト、カニクイザルおよびマウス血漿において独立してインキュベートする。遊離薬物の量または経時的なホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの統合性のいずれかにより、ホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの安定性を評価する。遊離薬物は、ＨＰＬＣおよび／またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量化する一方、インタクトホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの量は、ＸＴＥＮ／薬物および／またはホレート／薬物ＥＬＩＳＡを使用して決定する。
【０５２６】
ＲＰ−ＨＰＬＣ解析のため、血漿試料をアセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理して、タンパク質を沈殿させる。可溶性画分を真空下で蒸発させ、ローディング溶液に再溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析する。公知薬物標準と比較して、特定の薬物に特異的な波長のＵＶ吸収により分析物を検出した。例えば、ドキソルビシンは、４８０ｎｍで検出される。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析のため、血漿試料は、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理されて、タンパク質を沈殿させるであろう。可溶性画分は、真空で蒸発され、ローディング溶液に再溶解され、ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析されるであろう。分析物は、三連四重極タンデム質量分析によりインライン（in-line）検出および定量化されるであろう。親イオン−娘イオンのペアは、薬物毎に実験的に決定されるであろう。較正標準は、公知量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することにより調製され、実験的試料と並行して処理されるであろう。定量的ＥＬＩＳＡのため、ＥＬＩＳＡにおけるホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートに対する抗体の最適濃度は、十字交差（criss-cross）系列希釈解析を使用して決定される。コンジュゲートの１成分を認識する適切な捕捉抗体が、４℃の一晩のインキュベーションにより９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングされる。ウェルをブロッキングし、洗浄し、それぞれ変動的な希釈で血清安定性試料をウェルに添加して、コーティングされた抗体によるホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの最適な捕捉を可能にする。洗浄後に、コンジュゲートの別の成分を認識する検出抗体を添加し、プレートに捕捉されたコンジュゲートに結合させる。次に、ウェルを再度洗浄し、続いてストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（ビオチン化バージョンの検出抗体と相補的）または適切な二次抗体−西洋わさびペルオキシダーゼ（非ビオチン化バージョンの検出抗体と相補的）のいずれかを添加する。適切なインキュベーションおよび最終洗浄ステップ後に、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、プレートを４５０ｎＭで読み取る。次に、関連する血漿型におけるホレート−ＸＴＥＮ−薬物により調製された較正曲線に対して比色分析的応答を比較することにより、インタクトコンジュゲートの濃度を時点毎に計算する。次に、ｌｏｇ濃度対時間の線形回帰解析を使用して、ヒト、カニクイザル（cyno）およびマウス血清におけるコンジュゲートの減衰のｔ１／２を定義する。
【０５２７】
（実施例２５）
ａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８コンジュゲートの調製
【０５２８】
０．５ｍＬの２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５における１×−アミノ，１×−チオール−ＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４（Ａｍ１、Ｃ１２）、１２４ｎｍｏｌ）を、２０ｕＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８により中和した。次に、このＸＴＥＮのチオールを、３モル当量のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８  Ｃ５マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃Ａ２０３４１、３７２ｎｍｏｌ、０．０３７２ｍＬの１０ｍＭの無水ＤＭＦ溶液）と反応させた。この反応物を室温で２時間インキュベートし、コンジュゲーションをＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。混合物をＴＦＡによりｐＨ＜３となるよう酸性化し、所望のＸＴＥＮ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８産物を調製用Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ＃００Ｇ−４００５−Ｎ０、２５０ｍｍ×１０ｍｍ）により精製した。クロマトグラフィー画分をＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。所望の産物を含有する画分をプールし、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０により中和し、真空下で濃縮した。ＸＴＥＮ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８を有する選択された画分をプールし、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて製剤化した。Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（＞９８％）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびインタクト質量（＋１３Ｄａの観察されるＥＳＩ−ＭＳ）により、高純度の最終産物を実証した。０．４ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおけるＸＴＥＮ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（５１．７ｎｍｏｌ）のＮ末端アミンを、室温で暗所にて２時間、１０モル当量のＳＩＡ（無水ＤＭＦにおける５１７ｎｍｏｌ、４９ｍｇ／ｍＬ）を使用して、ヨードアセトアミドに変換した。過剰ＳＩＡを限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）により除去した。
【０５２９】
０．２ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおけるａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４４（Ｃ３６）−Ｈ８（２ｍｇ、６３ｎｍｏｌ）を、１．５時間、室温にて０．２５ｍＭ  ＴＣＥＰで還元した。過剰ＴＣＥＰを脱塩カラム（ＧＥ、ＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐ  Ｇ−２５）により除去し、１．５ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて溶出させた。この還元されたａＨＥＲ２−ＸＴＥＮを、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）により２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおける０．０９ｍＬとなるよう濃縮した。還元されたａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４４（Ｃ３６）−Ｈ８（２ｍｇ、６４ｎｍｏｌ）のシステイン側鎖を、０．００５５ｍＬの０．４Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ９．９５の添加によりおよそｐＨ９で、ＩＡ−ＸＴＥＮ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおける５１．７ｎｍｏｌ、０．２６ｍＬ）のＮ末端ヨードアセトアミドと反応させた。この反応物を一晩２５℃でインキュベートし、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりチェックした。反応混合物を３ｍＬとなるよう２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０で希釈し、Ｃｕ（ＩＩ）を負荷した固定化金属親和性クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ、３ｍＬ、１５ｍｍ直径）にロードした。未反応のＩＡ−ＸＴＥＮ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８をフロースルーにおいて除去した。２０ｍＭリン酸塩ｐＨ８．０における２５ｍＭ〜１００ｍＭイミダゾールにより、ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−フルオロフォアコンジュゲートを溶出させた。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。所望のコンジュゲートを有する画分をプールし、１０カラム容量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０における１５０ｍＭ〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌの勾配を使用した溶出により、ＭａｃｒｏＣａｐ  Ｑ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＬ、１６ｍｍ直径）上で精製した。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ａＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ−フルオロフォアコンジュゲートを有する選択された画分をプールし、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、ＰＢＳにおいて製剤化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびインタクト質量（＋１６Ｄａの観察されるＥＳＩ−ＭＳ）の結果は、高純度の最終産物を実証した。
【０５３０】
（実施例２６）
ａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏイメージング
【０５３１】
ａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートのターゲティングおよび体内分布効率を調査するための代用として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８タグ付きａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ分子を使用する。実験は、ＩＶＩＳ  ５０光学イメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）によるｉｎ  ｖｉｖｏと、続くｅｘ  ｖｉｖｏの蛍光イメージングを使用して、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞の皮下成長した異種移植片を有するヌードマウスにおいて行われるであろう。簡潔に説明すると、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を有する雌ｎｕ／ｎｕマウスに、高または低用量のａＨＥＲ２−ＸＴＥＮ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８および対応する用量の非ターゲティングＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８タグ付きＸＴＥＮ対照の１回の静脈内注射を与える。注射前にならびにその後の注射後およそ８、２４、４８および７２時間目に、生きた麻酔下の動物において、ＩＶＩＳ  ５０光学イメージングシステムを使用して、全身スキャンを取得する。最終時点７２時間目における動物全体における蛍光の分布の測定後に、腫瘍ならびに肝臓、肺、心臓、脾臓および腎臓を含む健康臓器を切除し、これらの蛍光をイメージングシステムにより登録および加工する。ＣＣＤチップの小および中間ビニングを使用し、露光時間を最適化して、画像中の各マウスにおいて観察可能なシグナルから少なくとも数千カウントを得て、ＣＣＤチップの飽和を回避する。定量化のために画像を正規化するために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８スペクトル領域のためのバックグラウンド励起および発光フィルターを使用して、バックグラウンド蛍光画像を取得する。蛍光の強度は、異なる色として表現し、青色は最低強度を反映し、赤色は最高強度を示し、その結果得られる画像を使用して、コンジュゲートおよび対照の取り込みを評価する。
【０５３２】
（実施例２７）
ホレート−ＸＴＥＮ−Ｃｙ５．５コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏイメージング
【０５３３】
ホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートのターゲティングおよび体内分布効率を調査するための代用として、Ｃｙ５．５蛍光タグ付きホレート−ＸＴＥＮ分子を使用する。実験は、ＩＶＩＳ  ５０光学イメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）によるｉｎ  ｖｉｖｏと、続くｅｘ  ｖｉｖｏの蛍光イメージングを使用して、ホレート受容体陽性腫瘍細胞の皮下成長した異種移植片を有するヌードマウスにおいて行われるであろう。培養培地は、高いホレート含量を含有するため、このようなマウスに移植するべきホレート受容体陽性腫瘍細胞は、抗生物質なしの５〜１０％熱失活ＦＣＳを含有するホレート不含細胞培養培地において育成されるであろう。同様に、通常の齧歯動物固形飼料は、高濃度の葉酸を含有する；本試験において使用されるヌードマウスは、血清中ホレート濃度を減少させるために、腫瘍植え込みに先立つ２週間およびイメージング解析の継続時間において、ホレート不含食餌により維持されるであろう。
【０５３４】
簡潔に説明すると、ホレート受容体陽性腫瘍細胞を有する雌ｎｕ／ｎｕマウスに、高または低用量のホレート−ＸＴＥＮ−Ｃｙ５．５および対応する用量の非ターゲティングＣｙ５．５タグ付きＸＴＥＮ対照の１回の静脈内注射を与える。注射前にならびにその後の注射後およそ８、２４、４８および７２時間目に、生きた麻酔下の動物において、ＩＶＩＳ  ５０光学イメージングシステムを使用して、全身スキャンを取得する。最終時点７２時間における動物全体における蛍光の分布の測定後に、腫瘍ならびに肝臓、肺、心臓、脾臓および腎臓を含む健康臓器を切除し、これらの蛍光をイメージングシステムにより登録および加工する。蛍光薬剤の波長にマッチするように、Ｃｙ５．５励起（６１５〜６６５ｎｍ）および発光（６９５〜７７０ｎｍ）フィルターを選択する。ＣＣＤチップの小および中間ビニングを使用し、露光時間を最適化して、画像中の各マウスにおいて観察可能なシグナルから少なくとも数千カウントを得て、ＣＣＤチップの飽和を回避する。定量化のために画像を正規化するために、Ｃｙ５．５スペクトル領域のためのバックグラウンド励起および発光フィルターを使用して、バックグラウンド蛍光画像を取得する。蛍光の強度は、異なる色として表現し、青色は最低強度を反映し、赤色は最高強度を示し、その結果得られる画像を使用して、コンジュゲートおよび対照の取り込みを評価する。
【０５３５】
（実施例２８）
ホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを評価するためのヒト臨床治験設計
【０５３６】
ターゲティング化学療法は、全身性化学療法の有効性を増大し、その副作用を減少することを目標とした現代のアプローチである。葉酸やビタミンＢ９としても公知のホレートは、ヌクレオチド生合成のために全ての生細胞によって要求される重要な栄養素であり、ある特定の生物学的経路における補助因子として機能する。ホレート受容体は、急速に分裂する悪性病変；特に、卵巣がんおよび非小細胞肺癌を処置するための治療法の開発の焦点である。ホレート受容体発現は、正常卵巣においては無視できる量であるが、上皮卵巣がんのほぼ９０％は、多くの肺腺癌（adenocarinoma）と同様に、ホレート受容体を過剰発現することから、これは、方向付けられた治療法の可能性を開く。ターゲティングペプチド−薬物コンジュゲートを創出するための、≧３薬物分子を有するＸＴＥＮへの≧１コピーのホレートを保有するＸＴＥＮの融合は、治療指数を改善することが予想され、延長された半減期は、最大耐用量（ＭＴＤ）を下回るレベルでの投薬を可能にし、投薬頻度および費用を減少させるであろう（用量当たりの必要とされる薬物を減少）。
【０５３７】
ホレート−ＸＴＥＮ−薬物組成物の臨床評価は、再燃したもしくは難治性進行型腫瘍を有する患者または白金抵抗性卵巣がんおよび他の化学療法の使用が失敗した非小細胞肺癌を患う患者において実行される。臨床治験は、ヒトにおける標準治療法を上回るホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの有効性および利点を決定するために設計される。患者における斯かる試験は、３つの相を含むであろう。まず、第Ｉ相安全性および薬物動態試験が実行されて、ＭＴＤを決定し、ヒトにおける用量規制毒性、薬物動態および予備的薬力学を特徴付ける。これらの初期試験は、再燃したまたは難治性進行型腫瘍を有し、標準の治癒的もしくは対症的方策を使用することができないまたはそれがもはや有効でないもしくは耐容性を示さない、ホレート受容体陽性状態を有する患者において行うことができる。第Ｉ相試験は、ホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの単一のエスカレート用量を使用し、ＭＴＤの決定を可能にするための生化学的、ＰＫおよび臨床パラメータを測定し、投薬量および循環薬物における閾値および最大濃度を確立し、これらは、その後の第ＩＩ相および第ＩＩＩ相治験において使用するべき治療ウィンドウを構成すると共に、将来の試験において追跡するべき潜在的毒性および有害事象を定義するであろう。
【０５３８】
ヒト患者の第ＩＩ相臨床試験は、ホレート受容体陽性白金抵抗性卵巣がん患者集団、多数の化学療法が失敗した非小細胞肺癌患者、および再燃したまたは難治性進行型腫瘍を患う患者において独立して実行されるであろう。この治験は、単独での、および特異的な徴候に用いられる現在の化学療法と組み合わせた、ホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの有効性および安全性を評価するであろう。患者は、標準化学療法剤ありまたはなしで、第Ｉ相試験において決定された用量レベルおよびレジメンで、静脈内投与されるホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを受けるであろう。化学療法剤プラスプラセボを含む対照治療群（arm）が含まれるであろう。一次エンドポイントは、固形腫瘍における応答評価判断基準（ＲＥＣＩＳＴ）によって定義される奏効率となるであろう。二次エンドポイントは、安全性および耐容性、腫瘍増殖停止時間および全生存を含むであろう。
【０５３９】
第ＩＩＩ相有効性および安全性試験は、ホレート受容体陽性白金抵抗性卵巣がん患者、非小細胞肺癌患者、または進行型腫瘍再燃もしくは難治性患者であるがん患者において実行されて、ＲＥＣＩＳＴによって測定される無増悪生存期間等、統計的に有意な臨床エンドポイントに達する能力を検査する。この治験は、４００名を超える患者のプロジェクト登録による二次エンドポイントとして、全生存のために統計的検出力も用いるであろう。有効性成績は、標準統計方法を使用して決定されるであろう。毒性および有害事象マーカーもこの試験において追跡されて、記載された様式で使用される際に、化合物が安全であることを検証する。
【０５４０】
（実施例２９）
組織ホモジネートにおけるＸＴＥＮの生分解
【０５４１】
ラット血漿（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＩＶＴ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）、ラット腎臓ホモジネート（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）またはＰＢＳ緩衝液において最大７日間３７℃で、最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌの精製されたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４タンパク質をインキュベートした。０時点、４時間、２４時間および７日目に試料を取り出し、直ちに凍結し−８０℃で貯蔵し、続いて解析直前に解凍した。メタノール沈殿により試料からＸＴＥＮを抽出した。手短に説明すると、−２０℃で予め冷却したメタノールを２：１の容量比で試料に添加し、ボルテックスにより混合した。この混合物を−２０℃で３０分間維持し、続いて１４，０００ｒｐｍで２０分間、８℃にて遠心分離した。上清を、遠心分離による蒸発に１〜２時間付して試料を完全に乾固させ、続いてメタノール抽出前の本来の容量になるようＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。再構成された試料を、Ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌを使用して染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。結果を図２６に示す。ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４は、血漿およびＰＢＳ緩衝液の両方において、７日間のインキュベーション期間にわたって分解のわずかな徴候しか示さなかった。しかし、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４は、２４時間の間隔までにラット腎臓において急速に分解された。
【０５４２】
（実施例３０）
ＸＴＥＮの二次構造の特徴付け
【０５４３】
円二色性分光法により、二次構造の程度に関して、精製されたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を評価した。ペルチェ熱セルホルダー（Peltier  thermal  cell  holder）を備えるＪａｓｃｏ  Ｊ８５０分光計（Ｊａｓｃｏ，Ｉｎｃ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＭＤ）においてＣＤ分光法を行った。ｐＨ７．２の１３ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液またはｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液における０．２ｍｇ／ｍＬとなるよう、タンパク質の濃度を調整した。光路長０．１ｃｍを備える石英セルを使用して実験を行った。２０℃でＣＤスペクトルを取得した。バンド幅１ｎｍを使用して、３００ｎｍ〜１８０ｎｍの全スペクトルを４回複製して記録した。ＣＤスペクトルは、ｐＨ７．２およびｐＨ４．０の両方において、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の同様のプロファイルを示した（図２７）。このデータは、安定な二次構造の証拠がない、構造不定なポリペプチドのスペクトルと一貫した。
【０５４４】
（実施例３１）
ＸＴＥＮに連結することによる、ペプチドペイロードの溶解性および安定性の増大
【０５４５】
溶解性および安定性の物理化学的特性を増強するＸＴＥＮの能力を評価するために、グルカゴンプラスより短い長さのＸＴＥＮの融合タンパク質を調製し、評価した。中性ｐＨのＴｒｉｓ緩衝食塩水において被験物質を調製し、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ溶液の特徴付けを逆相ＨＰＬＣおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより行って、溶液中でタンパク質が均質であり、凝集していないことを確かめた。表３５にデータを提示する。比較目的で、同じ緩衝液における未改変グルカゴンの溶解限度は、６０μＭ（０．２ｍｇ／ｍＬ）と測定され、この結果は、付加したＸＴＥＮの全ての長さに関して、溶解性の実質的な増大が達成されたことを実証する。重要なことに、ほとんどの場合、グルカゴン−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、標的濃度を達成するために調製し、この得られた構築物の最大溶解限度を決定するために評価しなかった。しかし、ＡＦ−１４４  ＸＴＥＮに連結されたグルカゴンの場合は、溶解性の限界を決定し、ＸＴＥＮに連結されていないグルカゴンと比較して、６０倍の溶解性増大が達成されたという結果を得た。加えて、グルカゴン−ＡＦ１４４を安定性に関して評価し、冷蔵条件下で少なくとも６カ月間、３７℃でおよそ１カ月間（データは示さず）、液体製剤中で安定であることが判明した。
【０５４６】
このデータは、グルカゴン等の生物活性タンパク質への短い長さのＸＴＥＮポリペプチドの連結が、その結果得られる融合タンパク質によるタンパク質の溶解特性を著しく増強し得ると共に、より高いタンパク質濃度において安定性を付与し得るという結論を支持する。
【表３５】
2018500049.tif 000146
【０５４７】
（実施例３２）
反復性に関するポリペプチド配列の解析
【０５４８】
本実施例において、いくつかのＸＴＥＮ配列を含む異なるポリペプチドを、アミノ酸配列における反復性に関して評価した。全体的ポリペプチド内により短い部分配列が出現する回数を定量化することにより、ポリペプチドアミノ酸配列を反復性に関して評価することができる。例えば、２００アミノ酸残基の長さのポリペプチドは、合計１６５個の重複する３６アミノ酸「ブロック」（または「３６マー」）および１９８個の３マー「部分配列」を有するが、特有の３マー部分配列の数は、配列内の反復性の量に依存するであろう。解析のため、次式の適用により得られる平均部分配列スコアを決定することにより、異なるポリペプチド配列を反復性に関して評価した：
平均部分配列スコア＝
【化２５】
2018500049.tif 000147
｛式中、ｎ＝（ポリペプチドのアミノ酸長）−（ブロックのアミノ酸長）＋１；
ｍ＝（ブロックのアミノ酸長）−（部分配列のアミノ酸長）＋１；および
カウントｉ＝ブロックｉ内の各特有部分配列の発生の累積数｝
本実施例の解析において、ブロック長を３６アミノ酸に設定し、部分配列長を３アミノ酸に設定したコンピュータプログラムにおいて前述の式を使用して、表３６のポリペプチドの平均部分配列スコアを決定した。その結果得られる平均部分配列スコアは、ポリペプチド内の反復性の程度の反映である。
【０５４９】
表３６に示す結果は、２または３種のアミノ酸型からなるポリペプチドが、高い平均部分配列スコア、したがって、高い程度の反復性を有する一方、非反復性配列において、それぞれ４〜６種のアミノ酸（すなわち、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、ＰおよびＡ）からなる４型の１２アミノ酸モチーフ（例えば、表９のファミリー由来のモチーフ）のみにより設計されたＸＴＥＮは、３未満の、多くの場合、２未満の平均部分配列スコアを有し、配列全体にわたる低い程度の反復性を反映することを示す。例えば、Ｌ２８８配列は、２種のアミノ酸型を有し、短い高度に反復性のブロック配列を有し、８．５の平均部分配列スコアをもたらす。ポリペプチドＪ２８８は、３種のアミノ酸型を有するが、短い反復性ブロック配列も有し、５．７の平均部分配列スコアをもたらす。Ｙ５７６も、３種のアミノ酸型を有するが、４．７の平均部分配列スコアにおいて反映される通り、内部反復でできていない。Ｗ５７６は、４型のアミノ酸からなるが、ブロック、例えば、「ＧＧＳＧ」によるより高い程度の内部反復性を有し、４．３の平均部分配列スコアをもたらす。ＸＴＥＮ  ＡＤ５７６は、それぞれ４型のアミノ酸からなる４型の１２アミノ酸モチーフからなる。個々のモチーフの低い程度の内部反復性のため、全体的平均部分配列スコアアミノ酸は、２．５である。対照的に、それぞれ低い程度の内部反復性を備える６型のアミノ酸を含有する４モチーフからなるＸＴＥＮは、２未満の平均部分配列スコアを有する。ＸＴＥＮ配列ＡＥ８６４およびＡＧ８６４に関して、プログラムのアウトプットをグラフ化して、配列の長さにわたる反復性における変動性を示した。ＡＥ８６４およびＡＧ８６４に関して、逐次３６マーブロックそれぞれの個々の部分配列スコアを、Ｘ軸における配列におけるアミノ酸数、対、Ｙ軸における対応するブロックの部分配列スコアとしての各ブロックの開始に対応する個々のポイントとしてプロットしたアウトプットは、ＡＥ８６４に関して、１．７の全体的平均部分配列スコアを有する配列が、配列の大半に関して１および２のスコアの間で変動するが、アミノ酸３３０、５０５および７２５の前後で開始するより高い反復性の区域を有することを示した。逆に、部分配列スコアが、反復性の完全欠如を表すスコアである１に近づく、およそ１０ブロックが存在する。同様に、ＡＧ８６４のグラフは、１．９の全体的平均部分配列スコアを有する配列が、配列の大半に関して１．２および２のスコアの間で変動するが、部分配列スコアが３を超えるより高い反復性の４区域を有することを示した。
【０５５０】
結論：この結果は、より長いＸＴＥＮポリペプチドにおける、それぞれ本質的に非反復性である４〜６種のアミノ酸型からなる１２アミノ酸部分配列モチーフの組合せが、３未満の、多くの場合、２未満の全体的平均部分配列スコアによって示される、実質的に非反復性である全体的配列をもたらすことを示す。各部分配列モチーフを配列にわたって複数回使用することができるという事実にもかかわらず、このような事態が生じる。対照的に、より少数のアミノ酸型から創出されるポリマーは、より高い平均部分配列スコアをもたらし、２種のアミノ酸型からなるポリペプチドは、３種のアミノ酸型からなるものよりも高いスコアを有する。
【表３６−１】
2018500049.tif 000148
【表３６−２】
2018500049.tif 000149
【表３６−３】
2018500049.tif 000150
【表３６−４】
2018500049.tif 000151
【表３６−５】
2018500049.tif 000152
【表３６−６】
2018500049.tif 000153
【０５５１】
（実施例３３）
ＫＢ細胞における３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの選択的細胞傷害性
【０５５２】
ホレート受容体を有する細胞を選択的にターゲティングおよび殺傷する能力を評価した。遊離ＭＭＡＥ、非ターゲティング３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮコンジュゲート（毒素に連結されたＸＴＥＮ）およびホレート受容体ターゲティング３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮコンジュゲートの被験物質を、ホレート受容体陽性ＫＢ細胞株を使用したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ抗増殖アッセイにおいて評価した。培養培地は、高い葉酸含量を含有するため、１０％熱失活ウシ胎仔血清を含有する葉酸不含培地において３７℃、５％ＣＯ２にて、細胞生存率実験の開始に先立ち少なくとも７日間、ＫＢ細胞を育成した。この培地は、実験の実行にも利用した。簡潔に説明すると、ウェル当たり１０，０００細胞で、９６ウェルマイクロタイターアッセイプレートにＫＢ細胞を蒔いた。３７℃、５％ＣＯ２の一晩のインキュベーションにより、ＫＢ細胞をプレートに接着させた。次に、消費された培地を除去し、葉酸競合物質を含有するよう指定したウェルに、葉酸を含有するアッセイ培地を与える一方、葉酸競合物質を有するよう指定していないウェルには、アッセイ培地のみを与えた。３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でプレートをインキュベートし、その後、アッセイ培地を吸引し、プレートをアッセイ培地で洗浄した。続いて、葉酸競合物質の存在または非存在下において、遊離ＭＭＡＥ、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮおよび３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮを適切な用量範囲で添加した。次に、２〜４時間、３７℃、５％ＣＯ２でプレートをさらにインキュベートした。次に、培地を除去し、プレートを洗浄し、新鮮培地を導入し、プレートをさらに４８〜７２時間インキュベートさせた。適切なインキュベーション期間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を添加し、ルミノメーターでプレートを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用した４パラメータロジスティック曲線適合を使用して、各被験物質のＩＣ５０を決定した。
【０５５３】
結果：遊離ＭＭＡＥ薬物部分は、０．８ｎＭのＩＣ５０によりＫＢ細胞の高度に強力な殺傷を示した一方、非ターゲティングＸＴＥＮにコンジュゲートされた３コピーのＭＭＡＥは、細胞殺傷の少なくとも３ｌｏｇ減少をもたらした（ＩＣ５０＞１，０００ｎＭ）。有意なことに、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮコンジュゲートへの３コピーのホレートターゲティングドメインの付加は、４．２ｎＭのＩＣ５０により細胞殺傷を回復させた；この活性レベルは、遊離ＭＭＡＥに観察されるものに近い。等しく重要なことに、ターゲティングコンジュゲートへの競合物質としての葉酸の導入は、ＫＢ細胞株における３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの観察される細胞殺傷活性を損なった。ホレート−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートの強力な細胞殺傷からのこのような減少（４．２ｎＭから＞１，０００ｎＭ）は、検出される細胞毒性が、実験条件下で、ＫＢ細胞株に対する薬物コンジュゲートのターゲティング機序としてのホレートの使用により促進されたという結論を支持する。
【０５５４】
（実施例３４）
ＸＴＥＮ１−ＰＣＭ−ＴＭ１−ＸＴＥＮ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞に基づく評価
【０５５５】
実験を行って、組成物を切断して成分を放出することができるプロテアーゼの存在または非存在下で、哺乳動物細胞における細胞傷害性のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける差次的な程度を示すために、設計された配置でＸＴＥＮに全成分が連結された、ホレートターゲティング部分（ＴＭ）、ペプチジル切断配列（ＰＣＭ）および細胞傷害性薬物を含む成分を含むＸＴＥＮ−コンジュゲート組成物の能力を検査した。この実験において、被験ＸＴＥＮ−コンジュゲート組成物は、ＸＴＥＮ１としてのＸＴＥＮ８６４；ＰＣＭの配列としてのＰＬＧＬＡＧ、ＴＭとしてのホレート、第２のＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ２）を使用したＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦとして配置された細胞傷害性薬物としてのＭＭＡＦからなるコンジュゲート＃２であった。対応する対照として、ＸＴＥＮ１（コンジュゲート＃３８５；ＰＬＧＬＡＧ−１ｘホレート−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦ）またはＸＴＥＮ１−ＰＣＭ（コンジュゲート＃３８６；１ｘホレート−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦ）を含有しないコンジュゲートを解析に含めた。ホレート受容体陽性ヒトＫＢ細胞を利用するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ抗増殖アッセイにおいて、全３種のコンジュゲートを検査した。
【０５５６】
手短に説明すると、ホレート不含ＲＰＭＩプラス１０％熱失活ウシ胎仔血清においてＫＢ細胞を育成し、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに１×１０４で蒔いた。３７℃、５％ＣＯ２の一晩のインキュベーションにより、ＫＢ細胞をプレートに付着させた。ある用量範囲で、２連でＭＭＰ−９処理ありおよびなしのコンジュゲート＃２、＃３８６および＃３８５を導入し、３日間、３７℃、５％ＣＯ２にてプレートをインキュベートした。適切なインキュベーション期間の後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、軌道回転（orbital）振盪機において２分間混合した。次に、プレートを９０×ｇで遠心分離し、室温でさらに１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化させた。次に、ルミノメーターで発光シグナルを読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアによりＩＣ５０（最大半量阻害濃度）を計算した。
【０５５７】
結果。表３７に示す結果は、コンジュゲート＃３８６が、０．５４ｎＭのＩＣ５０により強力な細胞傷害活性を示したことを実証した。コンジュゲート＃３８６は、ＰＣＭを含有しないため、ＭＭＰ−９による処理は、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性に影響を与えなかった（０．７３ｎＭのＩＣ５０）。ＭＭＰ−９処理およびＭＭＰ−９未処理コンジュゲート＃３８５；遮蔽効果に関するＰＣＭを含有するがＸＴＥＮ１（ＸＴＥＮ８６４）がない構築物の間の細胞傷害活性に変化は観察されなかった（それぞれ０．９４ｎＭおよび０．７５ｎＭのＩＣ５０）。有意なことに、ＭＭＰ−９処理コンジュゲート＃２は、コンジュゲート＃３８６と均等なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を示したが；ＭＭＰ−９で処理しなかったコンジュゲート＃２は、８分の１の活性であった。このデータは、実験条件下で、ＸＴＥＮが、ＭＭＰ−９によるタンパク質分解に対する遮蔽効果を付与し、プロテアーゼによって切断され得るＰＣＭを備える構築物が、プロテアーゼが存在する場合に増強された程度の細胞傷害性を引き起こすことができることを示唆する。
【表３７】
2018500049.tif 000154
【０５５８】
（実施例３５）
ＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦ、ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦ、ＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性および特異性評価
【０５５９】
４種のコンジュゲート構築物（２種は葉酸（ＦＡ）ターゲティング部分を有し、２種はそれを有さず、全４種は、ＸＴＥＮ＿４３２またはＸＴＥＮ＿８６４にコンジュゲートされた３分子のＭＭＡＦを有する）の細胞傷害活性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて細胞傷害性をもたらす能力に関して比較した。ＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦ、ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦ、ＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦを、競合物質としての遊離葉酸（ＦＡ）の存在および非存在下におけるホレート受容体陽性ＫＢ細胞株を使用したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存率アッセイにおいて評価した（図５８および図５９）。細胞培養培地は、高い葉酸含量を含有するため、ＫＢ細胞を育成し、葉酸不含ＲＰＭＩプラス１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）においてアッセイを行った。手短に説明すると、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに１×１０４個のＫＢ細胞を蒔き、３７℃、５％ＣＯ２の一晩のインキュベーションによりプレートに付着させた。葉酸処理ありおよびなしのＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦおよびＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦコンジュゲート、ならびにＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦコンジュゲートを全て、ＸＴＥＮ４３２シリーズは６００〜０．００２ｎＭまたはＸＴＥＮ８６４シリーズは１００〜０．０２ｎＭ（２連で）の４倍系列希釈用量範囲でプレートに導入し、３日間、３７℃、５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした。適切なインキュベーション期間の後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、軌道回転振盪機においてプレートを２分間混合した。次に、プレートを９０×ｇで遠心分離し、室温でさらに１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化させた。次に、ルミノメーターで発光シグナルを読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアによりＩＣ５０（最大半量阻害濃度）を計算した。
【０５６０】
結果：図５８に示す通り、等モル濃度で投薬されると、ホレートターゲティング部分を備えるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦは、０．６ｎＭのＩＣ５０により高度に強力な殺傷を示した一方、ターゲティング部分がないＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦコンジュゲート構築物は、大幅に、少なくとも３ｌｏｇ低い有効性であり、最小の細胞傷害性（ＩＣ５０＞６００ｎＭ）を生じた。重要なことに、競合物質としての葉酸の添加は、ＫＢ細胞におけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦの観察される細胞殺傷活性を損ない（ＩＣ５０＞６００ｎＭ）、ホレート受容体媒介性細胞傷害性の特異性を実証する（図５８）。ＸＴＥＮ８６４含有コンジュゲートにより、同様の結果を得た。ＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦは、強力な細胞傷害性（１．２ｎＭのＩＣ５０）を示したがこれは葉酸によって阻害され（ＩＣ５０＞１００ｎＭ）、一方、対応する非ターゲティングＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦコンジュゲートは、いかなる有意なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性も保有しなかった（ＩＣ５０＞１００ｎＭ）（図５９）。
【０５６１】
結論：このデータは、実験条件下で、ホレート部分が、ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの細胞傷害活性を増強したホレート受容体媒介性ターゲティング効果を付与することを示唆する。
【０５６２】
（実施例３６）
ＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦ、ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦ、ＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性および安全性評価
【０５６３】
ホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートは、ホレート受容体陽性腫瘍細胞への毒素成分のターゲティング送達に企図される。表１８は、異種移植試験において使用することができる腫瘍系統の例について記載する。一例として、ホレート受容体陽性ヒトＫＢ子宮頸部細胞株を使用して、ホレート−ＸＴＥＮ−薬物構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性および安全性を決定した。ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性および安全性試験を始める前に、雌ｎｕ／ｎｕマウスにおいて２種の試験を行って、（１）ターゲティングＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦおよび対応する非ターゲティングＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦ分子の薬物動態；ならびに（２）ＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦコンジュゲートの最大耐用量（ＭＴＤ）を決定した。両方の試験の結果は、使用するべき適切な用量レベルおよび投薬頻度に関する有効性＆安全性試験の最終設計に寄与した。通常の齧歯動物固形飼料は、高濃度の葉酸（６ｍｇ／ｋｇ固形飼料）を含有するため、これらの試験において使用される全マウスは、試験開始に先立つ２週間および試験継続時間、ホレート欠損食餌において維持して、ヒトの生理的範囲を表すレベルまで血清中ホレート濃度を減少させた。
【０５６４】
１）低ホレート食餌を与えた雌ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦの薬物動態
【０５６５】
６匹の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、単一用量の２ｍｇ／ｋｇのＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦを静脈内注射し、６匹の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、単一用量の２ｍｇ／ｋｇのＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦを静脈内注射した。両群に対して投薬前、投薬１０分、３時間、８時間、１日、２日および３日間後の表示の時点で、血液を採り、血漿に加工した。種々の血漿試料中に存在するＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦの量は、抗ＸＴＥＮ抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して定量化した。ＰＫ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｖ２ソフトウェアを使用して、ＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦの消失半減期は９．１時間と推定され、ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦは１３．７時間と推定された（図６０）。
【０５６６】
２）低ホレート食餌を与えた雌ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦのＭＴＤ
【０５６７】
１群当たり５匹の雌ｎｕ／ｎｕマウスにより単一用量ＭＴＤ実験を行い、１０、２０、５０および１００ｍｇ／ｋｇ（それぞれ０．５、１、２．５および５ｍｇ／ｋｇ  ＭＭＡＦのモル当量）でＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦのＩＶ投与を評価した。総体的な（gross）毒性の尺度として、最初の１週間は毎日、続いて１５日目の試験エンドポイントまで１週間に２回、各動物の体重をモニターした。加えて、いかなる死亡ならびに臨床徴候である起毛、猫背になる行動パターン、呼吸パターン、振戦、痙攣、衰弱、自傷および脱水も記録した。試験中に群平均体重減少が＜２０％であり、処置された動物の間で処置関連死が１０％以下の発生である場合、ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートは、許容される毒性を有すると考えられた。許容される毒性を有する最高用量としてＭＴＤを設定した。ＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦの全レジメンは、１〜６％の最小体重減少により、許容できるほどに耐容性を示し（図６１）；薬物関連の副作用と一貫した臨床徴候を示さなかった。したがって、ＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦのＭＴＤは、＞１００ｍｇ／ｋｇと決定された。
【０５６８】
３）ホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの有効性および安全性解析
【０５６９】
上述の得られたＰＫおよびＭＴＤ結果に基づき、ホレート−ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの有効性および安全性評価のために、次の試験設計を採用した。ホレート含量を減少させるために、ｎｕ／ｎｕマウスに植え込もうとするホレート受容体陽性ＫＢ細胞は、１０％熱失活ウシ胎仔血清を含有する抗生物質なしの葉酸不含細胞培養培地においてまず育成した。同様に、血清中ホレート濃度を減少させるために、異種移植試験において使用されるマウスは、腫瘍植え込みに先立つ２週間および試験継続時間、ホレート欠損食餌において維持した。手短に説明すると、３×１０６個のＫＢ細胞を、ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に皮下注射し、腫瘍を形成させ、そのサイズをノギスにより測定し、０．５×Ｌ×Ｗ２（式中、Ｌ＝ミリメートル単位での最長軸の測定値およびＷ＝ミリメートル単位でのＬに垂直な軸の測定値）として体積を計算した。７５〜１６２ｍｍ３のＫＢ腫瘍サイズを有するマウスを１群当たり８匹の動物の７群にランダム化し、１週間に３回を１週間、表３８に従って、それぞれのＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートを静脈内投与した。
【表３８】
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【０５７０】
試験エンドポイントまで１週間に２回、ノギス測定により腫瘍成長の休止または退縮を決定した。試験のエンドポイントは、腫瘍体積２，０００ｍｍ３または６０日間のいずれか早い方として定義した。腫瘍体積が、試験経過において３回連続した測定でその１日目体積の≦５０％およびこれらの測定の１回または複数で≧１３．５ｍｍ３と決定される場合、部分的退縮（ＰＲ）として動物をスコア化した。腫瘍体積が、試験中の３回連続した測定で＜１３．５ｍｍ３である場合、動物は、完全退縮（ＣＲ）と考えられた。試験の終わりに完全退縮したいずれかの動物は、無腫瘍生存者（ＴＦＳ）としてさらに分類した。総体的な毒性を評価するために、最初の１週間は毎日、続いて試験エンドポイントまで１週間に２回、体重に関して動物を個々にモニターした。窮迫、死亡または有害事象のいかなる臨床徴候も記録した。
【０５７１】
結果：図６２および図６３に示す通り、７９ｍｇ／ｋｇで投与したＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦは、効果的かつ耐容性が良く、２ＰＲ、６ＣＲおよび５ＴＦＳを生じ、目に見える減量がないことが判明した。対照的に、ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦ注射群は、高悪性度腫瘍進行を示し、応答者がなかった（図６２）。３８ｍｇ／ｋｇにおいて、ＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦは、１ＰＲを生じ、有意な体重減少がなかった（図６４および図６５）。しかし、１５１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦコンジュゲートは、高度に効果的であり、８ＴＦＳを有し（図６４）、１１日目までに１２％の最大体重減少により許容される毒性であった（図６５）。非ターゲティングＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦも、ある程度の腫瘍退縮を引き起こし、２ＰＲ、２ＣＲおよび１ＴＦＳを有した（図６４）。しかし、この群は、１１日目までの２０％の最大体重減少により、検査した全コンジュゲートの間で最高の毒性を有した（図６５）。ＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦおよびＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦ群における全動物は、体重を回復し、経時的に正常な状態に戻った（図６５）。
【０５７２】
結論：このデータは、ＫＢ異種移植モデルの文脈内で、ホレートターゲティング部分の存在または非存在およびＸＴＥＮの長さが、ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの性能に有意な影響を有することを強く示唆する。ターゲティング部分を有する薬物コンジュゲートは、その非ターゲティング対応物よりも効果的であり；ＸＴＥＮ８６４含有構築物は、ＸＴＥＮ４３２含有構築物よりも有効であった。
【０５７３】
（実施例３７）
ヒトＢＴ４７４乳癌を有する雌胸腺欠損ヌードマウスにおける抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２、ＸＴＥＮ４３２、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４およびＸＴＥＮ８６４の薬物動態および体内分布解析
【０５７４】
ターゲティングＸＴＥＮおよび別々のＸＴＥＮ分子の薬物動態および体内分布特性を、ヒトＢＴ４７４乳癌を有する雌胸腺欠損ヌードマウスにおいて解析した。同じマウスにおける抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２、ＸＴＥＮ４３２、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４およびＸＴＥＮ８６４の同時発生的評価を可能にするため、また、マウス間の変動を最小化するために、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２、ＸＴＥＮ４３２、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４およびＸＴＥＮ８６４をそれぞれ、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）キレート剤により直交性ランタニド希土類イオンで標識して、それぞれの分子：抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−ホルミウム（Ｈｏ）、ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−ツリウム（Ｔｍ）、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−テルビウム（Ｔｂ）およびＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ＿ルテチウム（Ｌｕ）を得た。次に、２種のターゲティング用量レベル２６ｎｍｏｌ／ｋｇおよび４６０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与するために、全４種の標識されたタンパク質を等モル濃度で混合した。ＨＥＲ２受容体飽和を引き起こさないように、また、ＢＴ４７４腫瘍細胞における利用できるＨＥＲ２結合部位に関する抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏおよび抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｔｂの間の競合を回避するために、２６ｎｍｏｌ／ｋｇ用量を選択した。４６０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量は、他方では、ＨＥＲ２受容体飽和および両方のＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ化（XTENylated）タンパク質の間での競合を引き起こす可能性があった。
【０５７５】
１８匹の雌胸腺欠損ヌードマウスに、１×１０７個のＢＴ４７４（ＡＴＣＣ  ｃａｔ＃ＨＴＢ−２０）ヒト乳がん細胞を側腹部に皮下注射した。その体積が標的範囲２５０〜３５０ｍｍ３に近づいたら、グラフトした腫瘍をモニターし、そのサイズをノギスで測定し、０．５×（Ｌ×Ｗ２）（式中、腫瘍のミリメートル（ｍｍ）単位のＬ＝長さおよびＷ＝幅である）として体積を計算した。０日目と指定される細胞植え込み１カ月後に、適切なＢＴ４７４腫瘍サイズを有する１８匹のマウスのうち１２匹を、１群当たり３匹の動物の４群に選別した。０日目に、１２匹のマウスの個々の腫瘍体積は、１５２〜３８１ｍｍ３に及び、群平均腫瘍体積は、２５６〜２５７ｍｍ３であった。確立されたＢＴ４７４異種移植片を有する６匹のマウスへの２６ｎｍｏｌ／ｋｇの抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏ、ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｔｍ、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−ＴｂおよびＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕ混合物の静脈内投与による処置を０日目に開始した。他の６匹のマウスに、４６０ｎｍｏｌ／ｋｇのタンパク質混合物を注射した。
【０５７６】
薬物動態解析のため、両方の用量群に対し投薬前、投薬３時間、８時間、１日、２日および３日後の定義された時点に、リチウムヘパリン化チューブに血液を採り、血漿に加工した。誘導結合型血漿質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を使用して、それぞれの希土類金属に関して、種々の血漿試料中に存在する抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏ、ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｔｍ、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−ＴｂおよびＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕの量を定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して、２６ｎｍｏｌ／ｋｇおよび４６０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与された標識タンパク質毎の消失半減期を決定した。
【０５７７】
抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−ＨｏのＴ１／２を９．６〜１２．５時間と推定し；ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｔｍは９．２〜１３．０時間；抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｔｂは２３．１〜３１．２時間、ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕは２２．２〜２９．２時間と推定された（図６７および図６８）。予想される通り、ＸＴＥＮの長さは、半減期に決定的な影響を有する；より長い８６４アミノ酸ＸＴＥＮは、２２〜３１時間のＴ１／２をもたらし、対して、より短い４３２アミノ酸ＸＴＥＮは、９〜１３時間のＴ１／２を有した。抗ＨＥＲ２ターゲティングｓｃＦｖの存在は、他方では、血漿曝露にほとんど効果がないと思われる。
【０５７８】
組織体内分布解析のため、各用量レベルから３匹のマウスを２４時間目に屠殺し、別の３匹のマウスを７２時間目に屠殺した。それぞれの終末エンドポイントにおいて、腫瘍、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、膵臓および脳を収集し、ＰＢＳ中で濯ぎ、拭き取って乾かし、秤量し、手早く（snap）凍結した。ＩＣＰ−ＭＳを使用して、各希土類金属により、種々の組織中に存在する抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏ、ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｔｍ、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−ＴｂおよびＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕの量を定量化し、データは、組織１ｇ当たりのパーセント注射用量（％ＩＤ／ｇ）として表現した。
【０５７９】
２６ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて、肝臓および腫瘍における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏの相当な蓄積を除いて、血漿および健康組織における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−ＨｏおよびＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｔｍの両方の濃度減衰が観察された（図６９Ａおよび図６９Ｂ）（脳が、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−ＨｏおよびＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｔｍの最小検出可能レベルを有したことに注目すべきであり、これは、ＸＴＥＮ化タンパク質が、血液脳関門を通過せず、脳に局在化しなかったことを示唆する）。ＨＥＲ２ターゲティングが、非ターゲティング構築物（３±１％ＩＤ／ｇ）と比較して、腫瘍における有効（２５±１５％ＩＤ／ｇ）かつ持続した蓄積をもたらしたことは所望の成績である。抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏが、腎臓に蓄積した理由は現在不明であるが、もっともらしい説明としては、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏが、腎臓により排除され、そして抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ部分の存在により尿細管再吸収に付されたことが挙げられよう。この推論は、非ＨＥＲ２ターゲティングＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｔｍが、排除されると、再吸収されない、または腎臓に蓄積されないという観察によって支持された。おそらく、注射された混合物における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｔｂ構築物由来のＨＥＲ２結合部位に関するある程度の競合により、より低い定量的レベルにもかかわらず、同じ体内分布パターンが、４６０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量レベルで観察された（図７０Ａおよび図７０Ｂ）。
【０５８０】
２６ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて、腫瘍における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｔｂの有意な蓄積およびある程度（extend）のＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕの蓄積を除いて、血漿および健康組織における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−ＴｂおよびＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕの濃度減衰が観察された（図７１Ａおよび図７１Ｂ）。抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｔｂが、腫瘍において強く蓄積するだけではなく（３５±２０％ＩＤ／ｇ）、非ターゲティングＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕよりも優先的でもあった（１１±４％ＩＤ／ｇ）ことが実証されたことは、望ましい予想である。ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕが、その大型のサイズのために、増強された透過性および保持効果により腫瘍に蓄積したことが考えられる。抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏコンジュゲートとは対照的に、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｔｂの腎臓蓄積は観察されなかった。これは、腎臓クリアランスのサイズを超える抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｔｂによって説明することができる。抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−ＴｂおよびＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕの同じ体内分布プロファイルは、４６０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量で観察され、おそらく、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏ構築物由来のＨＥＲ２結合部位に関するある程度の競合により、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｔｂ構築物のより低い定量的レベルに耐えない（with  standing）（図７２Ａおよび図７２Ｂ）。７２時間目に脾臓における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−ＴｂおよびＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕの両方のある程度の明らかな蓄積が存在した理由は現在不明である。
【０５８１】
さらに、より小型の抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏが、２４時間目に、より大型の抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｔｂよりも速く腫瘍に蓄積したことは、予想とも合致した。しかし、経時的に７２時間目に、そのより長い循環半減期により、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ４３２−ＤＯＴＡ−Ｈｏよりも相当に多くの抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｔｂが、腫瘍に蓄積することが判明した（図７３）。
【０５８２】
（実施例３８）
ヒトＢＴ４７４乳がん細胞を有する雌胸腺欠損ヌードマウスにおける抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０の有効性および安全性解析
【０５８３】
胸腺欠損ヌードマウスにおけるＢＴ４７４異種移植モデルにおける抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０薬物コンジュゲートの有効性および安全性評価のために、次の試験設計を利用した。手短に説明すると、１×１０７個のＢＴ４７４細胞を、雌胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に皮下注射し、腫瘍を形成させ、そのサイズをノギスで測定し、０．５×（Ｌ×Ｗ２）（式中、腫瘍のミリメートル（ｍｍ）単位のＬ＝長さおよびＷ＝幅である）として体積を計算した。０日目と指定される細胞植え込み２９日後に、標的とする腫瘍サイズ１００〜２００ｍｍ３を有するマウスを、１群当たり８匹の動物の４群に選別した。０日目に、試験に登録したマウスの個々の腫瘍体積は、１０７〜２７８ｍｍ３に及び、群平均腫瘍体積は、１８３〜１８５ｍｍ３であった。ＰＢＳビヒクル対照、３０、１００および３００ｎｍｏｌ／ｋｇの抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０薬物コンジュゲートの静脈内投与により、０日目に処置を開始した。
【０５８４】
試験エンドポイントまで１週間に３回、ノギス測定により腫瘍成長の休止または退縮を決定した。試験のエンドポイントは、腫瘍体積８００ｍｍ３または３０日間のいずれか早い方として定義した。次の公式により処置群毎にパーセント腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を計算した：（（ビヒクル対照の平均腫瘍体積  −  ＨＥＲ２コンジュゲートの平均腫瘍体積）／ビヒクル対照の平均腫瘍体積）×１００。％ＴＧＩ≧６０％を有する処置群は、治療活性があると考えられる。総体的な毒性の評価として、試験エンドポイントまで１週間に３回、動物を体重に関して個々にモニターした。窮迫、死亡または有害事象のいかなる臨床徴候も記述した。
【０５８５】
予想される通り、ＰＢＳビヒクルを投与されたＢＴ４７４腫瘍を有するマウスに腫瘍阻害は存在せず、ゼロの％ＴＧＩを生じた。対照的に、また、図７４に示す通り、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０薬物コンジュゲートは、評価した全３種の用量において効果的であることが判明し、耐容性が良く、目に見える減量がなかった（図７５）。３０日目に、３０ｎｍｏｌ／ｋｇで投薬された抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０の％ＴＧＩは９０％であり；１００ｎｍｏｌ／ｋｇでは９１％、３００ｎｍｏｌ／ｋｇでは９７％であり；３０ｎｍｏｌ／ｋｇの薬物コンジュゲートが、３００ｎｍｏｌ／ｋｇとほとんど均等な有効性を有することを示唆する。
【０５８６】
上述のデータは、ＢＴ４７４異種移植モデルの文脈内で、３０ｎｍｏｌ／ｋｇもの低さの用量の薬物コンジュゲートで達成可能な有効性により、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０が、高度に効果的かつ安全であることを強く示唆する。
【０５８７】
（実施例３９）
ＰＣＭ含有ＸＴＥＮの薬物動態決定
【０５８８】
雌胸腺欠損ヌードマウスにおいて異なるＰＣＭ配列を有するＸＴＥＮの薬物動態特性を解析した。ＲＳ１（ＭＭＰ−２／９）、ＲＳ２（ＭＭＰ−７）、ＲＳ３（ｕＰＡ）およびＲＳ４（ＭＭＰ−１４）組成物を備えるＰＣＭをまず評価し；続いて、タンデムプロテアーゼ放出部位ＢＳＲＳ１、ＢＳＲＳ２およびＢＳＲＳ３を備えるＰＣＭを試験２において評価した。同じマウスにおけるＸＴＥＮの循環半減期における種々のＲＳ＆ＢＳＲＳ配置の同時発生的解析を可能にすると共に、マウス間の変動を最小化するために、それぞれのＸＴＥＮ−ＲＳおよびＸＴＥＮ−ＢＳＲＳを、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）キレート剤により直交性ランタニド希土類イオンでそれぞれ標識して、２種の試験の支持における対応する分子を得た。
【０５８９】
試験１において、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ１−ＤＯＴＡ−ホルミウム（Ｈｏ）、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ２−ＤＯＴＡ−テルビウム（Ｔｂ）、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ３−ＤＯＴＡ−ツリウム（Ｔｍ）、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ４−ＤＯＴＡ−ユーロピウム（Ｅｕ）および対照ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−ルテチウム（Ｌｕ）を解析した。６匹の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、各２ｍｇ／ｋｇのＸＴＥＮ８６４−ＲＳ１−ＤＯＴＡ−Ｈｏ、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ２−ＤＯＴＡ−Ｔｂ、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ３−ＤＯＴＡ−Ｔｍ、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ４−ＤＯＴＡ−ＥｕおよびＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕを含有する混合物を静脈内注射した。両群間で投薬前、投薬３時間、８時間、１日、２日、３日および４日後の表示の時点において、血液を採り、血漿に加工した。誘導結合型血漿質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を使用して、それぞれの希土類金属に関して、種々の血漿試料中に存在するＸＴＥＮ８６４−ＲＳ１−ＤＯＴＡ−Ｈｏ、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ２−ＤＯＴＡ−Ｔｂ、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ３−ＤＯＴＡ−Ｔｍ、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ４−ＤＯＴＡ−ＥｕおよびＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕの量を定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して、２ｍｇ／ｋｇで投与した標識タンパク質毎の消失半減期を決定した。
【０５９０】
ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ１−ＤＯＴＡ−ＨｏのＴ１／２を２４．７時間と推定し、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ２−ＤＯＴＡ−Ｔｂは２５．３時間、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ３−ＤＯＴＡ−Ｔｍは２６．０時間、ＸＴＥＮ８６４−ＲＳ４−ＤＯＴＡ−Ｅｕは２６．７時間、ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕは２５．０時間と推定した（図７６）。結果は、ＸＴＥＮにおけるＲＳ１、ＲＳ２、ＲＳ３およびＲＳ４組成物の存在が、ＸＴＥＮポリマーのＴ１／２を変更しなかったことを示した。
【０５９１】
試験２において、ＸＴＥＮ８６４−ＢＳＲＳ１−ＤＯＴＡ−Ｔｂ、ＸＴＥＮ８６４−ＢＳＲＳ２−ＤＯＴＡ−Ｈｏ、ＸＴＥＮ８６４−ＢＳＲＳ３−ＤＯＴＡ−Ｔｍ、ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−ＬｕおよびＸＴＥＮ１４４−ＤＯＴＡ−Ｅｕにより、異なるタンデムプロテアーゼ放出部位を含有するＸＴＥＮを評価した；ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕは、非ＢＳＲＳ含有ＸＴＥＮとして機能し、ＸＴＥＮ１４４−ＤＯＴＡ−Ｅｕは、切断された短縮部分を表す。全５種の金属標識タンパク質を２ｍｇ／ｋｇ濃度で混合し、その結果得られた混合物を６匹の雌ｎｕ／ｎｕマウスに静脈内投与した。薬物動態解析のため、６匹のマウスの間で、投薬前、投薬３時間、８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日および７日後の定義された時点において、リチウムヘパリン化チューブに血液を採り、血漿に加工した。ＩＣＰ−ＭＳを使用して、それぞれの希土類金属に関して、種々の血漿試料中に存在するＸＴＥＮ８６４−ＢＳＲＳ１−ＤＯＴＡ−Ｔｂ、ＸＴＥＮ８６４−ＢＳＲＳ２−ＤＯＴＡ−Ｈｏ、ＸＴＥＮ８６４−ＢＳＲＳ３−ＤＯＴＡ−Ｔｍ、ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−ＬｕおよびＸＴＥＮ１４４−ＤＯＴＡ−Ｅｕの量を定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して、２ｍｇ／ｋｇで投与した標識タンパク質毎の消失半減期を決定した。
【０５９２】
ＸＴＥＮ８６４−ＢＳＲＳ１−ＤＯＴＡ−ＴｂのＴ１／２を３２．５時間と推定し；ＸＴＥＮ８６４−ＢＳＲＳ２−ＤＯＴＡ−Ｈｏは３２．６時間；ＸＴＥＮ８６４−ＢＳＲＳ３−ＤＯＴＡ−Ｔｍは３２．５時間、ＸＴＥＮ８６４−ＤＯＴＡ−Ｌｕは３０．６時間と推定した（図７７）。試験１において観察された結果と合致して、試験２におけるデータは、ＸＴＥＮにＢＳＲＳ１、ＢＳＲＳ２またはＢＳＲＳ−３によって表されるようにタンデムに配置されたプロテアーゼ部位も、ＸＴＥＮポリマーのＴ１／２を変更しなかったことを示した。しかし、切断されると、ＸＴＥＮ１４４−ＤＯＴＡ−Ｅｕによって例証される分子は、約１．８時間の極めて短い半減期により急速に排除された。
【０５９３】
（実施例４０）
プロテアーゼ処理および未処理抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４二重特異性分子の結合親和性
【０５９４】
二重特異性抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４構築物を含有するＰＣＭを使用して、ＥｐＣＡＭリガンドに対する結合親和性におけるプロテアーゼ処理の影響を評価した。手短に説明すると、組換え抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４分子を、２時間、３７℃にてＭＭＰ−９で処理したまたは未処理のままとし、次の通り、ＥｐＣＡＭ／タンパク質−ＬサンドイッチＥＬＩＳＡにおいてある用量範囲内で解析した：４℃の一晩のインキュベーションにより、９６ウェルマイクロタイタープレートに組換えヒトＥｐＣＡＭをコーティングした。次に、ウェルをブロッキングし、洗浄し、ある用量範囲のプロテアーゼ処理した抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖおよび未処理の抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４タンパク質を、適切なウェルに添加した。コーティングされたＥｐＣＡＭリガンドによりプロテアーゼ処理した抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖおよびプロテアーゼ未処理の抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４タンパク質を最適捕捉させるための１時間のインキュベーション後に、プレートを再度洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲートしたタンパク質Ｌを添加した。タンパク質−ＬをｓｃＦｖのカッパー軽鎖（light）に結合させた適切なインキュベーション期間の後に、最終洗浄ステップを行い、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加した。ＴＭＢは、ペルオキシダーゼの発色基質である。所望の色強度に達したら、０．２Ｎ硫酸を導入して、反応を停止し、分光光度計を使用して、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定した。生じた色の強度（すなわち、ＯＤ）を、抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖおよび抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４タンパク質の濃度に対してプロットした。最大半量応答（ＥＣ５０）を生じた分析物の濃度は、４−パラメータロジスティック回帰式に由来した。
【０５９５】
図７８に示す通り、プロテアーゼ処理した抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性分子は、ＥｐＣＡＭリガンドに対して、プロテアーゼ未処理のインタクト二重特異性分子（ＥＣ５０  ２８４ｎＭ）と比較して、より強い結合活性を有する（ＥＣ５０  １０６ｎＭ）。データは、ＸＴＥＮ８６４の存在が、そのリガンドに対する抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ部分の結合を少なくとも２．７倍妨げたことを示唆する。
【０５９６】
（実施例４１）
ホレート−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択性評価
【０５９７】
ホレート受容体を有する細胞を選択的にターゲティングおよび殺傷するホレート−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートの能力を、表３９から選択されるホレート受容体陽性および陰性細胞株のパネルに対するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ抗増殖アッセイにおいて、代表的なホレートターゲティングＸＴＥＮ薬物コンジュゲートとしてＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。
【表３９】
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【０５９８】
簡潔に説明すると、ホレート受容体陽性ＫＢ（６００〜０．００２ｎＭ用量範囲、４倍系列希釈）、ＪＥＧ−３（１０００〜０．０２ｎＭ用量範囲、６倍系列希釈）およびＳＷ６２０（１００〜０．０２ｎＭ用量範囲、４倍系列希釈）；ならびにホレート受容体陰性ＳＫ−ＢＲ−３（１００〜０．０２ｎＭ、４倍系列希釈）において、ホレート−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦの選択性評価を検査した。培養培地は、高い葉酸含量を含有したため、１０％熱失活ＦＣＳを補充した葉酸不含ＲＰＭＩにおいて、３７℃、５％ＣＯ２にて、細胞を育成し、アッセイを行った。対数期の細胞を集め、計数し、９６ウェルマイクロタイターアッセイプレートにウェル当たり１×１０４細胞で蒔いた。３７℃、５％ＣＯ２の一晩のインキュベーションにより、細胞をプレートに接着させた。葉酸の存在および非存在下におけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦを、ある用量範囲で、２連で導入し、プレートを３日間インキュベートした。葉酸阻害剤を有する実験的ウェルにおける細胞を、３０分間、３７℃、５％ＣＯ２にて葉酸と共にプレインキュベートし、その後、ホレート−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦを添加した。適切なインキュベーション期間の後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、軌道回転振盪機において２分間混合した。次に、プレートを９０ｇで遠心分離し、室温でさらに１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化させた。次に、ルミノメーターにおいて発光シグナルを読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍまたは均等なソフトウェアによりＩＣ５０（最大半量阻害濃度）を計算した。定量的ＩＣ５０は、ホレート受容体陽性、対、陰性細胞株に対するＦＡ−ＸＴＥＮ−３ｘＭＭＡＦ細胞傷害性選択性の比較を可能にした。
【０５９９】
葉酸阻害剤の非存在下におけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦは、ホレート受容体陽性ＫＢ（０．６ｎＭのＩＣ５０）（図５８）、ＪＥＧ−３（０．４ｎＭのＩＣ５０）（図７９Ａ）およびＳＷ６２０（６．２ｎＭのＩＣ５０）（図７９Ｂ）細胞における選択的で強力な殺傷を示したが、ホレート受容体陰性ＳＫ−ＢＲ−３（ＩＣ５０＞１００ｎＭ）（図７９Ｃ）においては示さなかった。有意なことに、ＫＢ、ＪＥＧ−３およびＳＷ６２０におけるＦＡ−ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＦの細胞傷害性は、葉酸の存在下で抑止され、細胞傷害活性の特異性を示す（図５８、図７９Ａおよび図７９Ｂ）。
【０６００】
（実施例４２）
ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７１３コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性および安全性評価
【０６０１】
実施例３６において観察される有効性および安全性改善のためのホレート−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートをさらに調節するために、次世代ホレートコンジュゲートに次の改変を導入した：（１）ＭＭＡＦ毒素をＭＭＡＥに置き換えた；（２）ＣＸＴＥＮにおいて等間隔をあける代わりに、ホレートターゲティング部分の近くに、Ｎ末端にＭＭＡＥをクラスター形成した；および（３）ＭＭＡＥ毒素クラスターの直ぐ下流にＢＳＲＳ１を設置した。２種のその結果得られたタンパク質であるＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７１３を、低ホレート食餌を与えた雌ｎｕ／ｎｕマウスで確立されたＫＢ異種移植モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。加えて、１週間に３回の注射の代わりに、このパイロット試験においては、単一ボーラス注射のみを用いた。
【０６０２】
０日目と指定されるＫＢ細胞植え込み７日後に、標的とする腫瘍サイズ１００〜２００ｍｍ３を有する、低ホレート食餌を与えたマウスを１群当たり３匹の動物の２群に選別した。０日目に、試験に登録したマウスの個々の腫瘍体積は、８３〜１４７ｍｍ３に及び、２群の群平均腫瘍体積は、１１１±３３および１１１±３０ｍｍ３であった。１２０ｎｍｏｌ／ｋｇ等モル濃度のＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７１３の静脈内投与により、０日目に処置を開始した。これは、両方のタンパク質に対して９ｍｇ／ｋｇのホレート−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートまたは０．２６ｍｇ／ｋｇのＭＭＡＥの投与と均等である（表４０）。
【表４０】
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【０６０３】
試験エンドポイントまで１週間に３回、ノギス測定により腫瘍成長の休止または退縮を決定した。試験のエンドポイントは、腫瘍体積８００ｍｍ３または４２日間のいずれか早い方として定義した。総体的な毒性を評価するために、１週間に３回、動物を体重に関して個々にモニターした。窮迫、死亡または有害事象のいかなる臨床徴候も記録した。
【０６０４】
図８０に示す通り、両方のＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７１３薬物コンジュゲートは、単一ボーラス用量１２０ｎｍｏｌ／ｋｇで、１９〜２１日間腫瘍退縮を誘導することが判明した；その後、両方のコンジュゲートに関して腫瘍再成長を観察した。１群当たりのマウスの数は少ないが、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７１３の腫瘍減少有効性は、スチューデントｔ検定により互いに有意に異ならないと思われた（ｐ＞０．０５）。さらに、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７１３は両者共に、耐容性が良く、目に見える減量がないことが判明した（図８１）。
【０６０５】
有意なことに、図８２に示す通り、また、表４０に反映される通り、１２０ｎｍｏｌ／ｋｇ（すなわち、９ｍｇ／ｋｇ）のＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７１３は、腫瘍退縮および成長の制御において、４５９ｎｍｏｌ／ｋｇ（すなわち、３８ｍｇ／ｋｇ）のＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦよりも大幅に有効であった。
【０６０６】
結論：このデータは、ＫＢ異種移植モデルの文脈内で、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７１３は両者共に、高度に効果的かつ耐容性が良く、有効性は、１２０ｎｍｏｌ／ｋｇの薬物コンジュゲートで達成可能であることを強く示唆する。限られた数の動物によるこのパイロットＫＢ異種移植試験において、ＢＳＲＳ１組成物は、腫瘍退縮における付加的利点を推論しないと思われた。印象的なことに、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７１３の両方は、ＦＡ−ＸＴＥＮ８６４−３ｘＭＭＡＦによって付与されるものよりも相当に低い用量で、腫瘍退縮＆成長を制御することができた。この徹底的な有効性改善を説明することができるいくつかの因子が存在する；（１）ＭＭＡＥは、毒素ペイロードとしてＭＭＡＦよりも有効である；および／または（２）ターゲティング部分の近くのＮ末端における毒素のクラスター形成は、循環中におけるＸＴＥＮの可能なタンパク質切断により、付加的利点を提供することができる。
【０６０７】
（実施例４３）
ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ８６４、ＦＡ−３ｘＤＭ１−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ５−ＸＴＥＮ７１３およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ６−ＸＴＥＮ１３コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性および安全性評価
【０６０８】
先の実施例で評価されたホレート−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートの性能をさらに理解し、これを改善するために、次の試験が実行されて、次の事項に取り組むであろう：（１）２１日間の腫瘍停滞の付与に要求されるＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７の最低用量濃度；（２）ホレートターゲティング部分の近くのＮ末端にクラスター形成されたＭＭＡＥ、対、ＣＸＴＥＮポリマーにおいて等間隔をあけたＭＭＡＥの影響；（３）ＤＭ１は、ＭＭＡＥよりもさらに良い毒素ペイロードとなるか；（４）有効性および安全性マージンの増強のために、ＢＳＲＳ５およびＢＳＲＳ６に対してＢＳＲＳ１を置き換える；ならびに（５）他のｉｎ  ｖｉｖｏホレート受容体陽性異種移植モデル。
【０６０９】
試験１：ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ８６４およびＦＡ−３ｘＤＭ１−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７コンジュゲートが使用されて、疑問１、２および３に取り組むであろう。１００〜２００ｍｍ３の範囲内の腫瘍体積を有する、低ホレート食餌を与えた３５匹の雌ｎｕ／ｎｕマウスは、１群当たり５匹のマウスの７群として、試験に登録されるであろう。０日目と指定される日に、表４１に従ってＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ８６４およびＦＡ−３ｘＤＭ１−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７の静脈内投与により処置を開始する：
【表４１】
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【０６１０】
有効性読み出し情報として、試験エンドポイントまで１週間に３回、ノギス測定により腫瘍退縮および成長を決定する。試験のエンドポイントは、腫瘍体積８００ｍｍ３または３０日間のいずれか早い方として定義される。総体的な毒性の評価として、１週間に３回、体重に関して動物を個々にモニターする。窮迫、死亡または有害事象のいかなる臨床徴候も記述するべきである。
【０６１１】
本出願人らは、２１日間の腫瘍停滞を誘導することができるＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７の用量濃度が、８．９〜０．３ｍｇ／ｋｇの用量範囲内に収まることを予測する。同じ性質および同じ数のＭＭＡＥを有するが位置付けが異なるＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７対ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ８６４の１対１の（head-to-head）比較は、毒素の位置付けが、有効性利点を実際に伝えるか確認するであろう。本出願人らは、Ｎ末端にクラスター形成した毒素が、ＣＸＴＥＮポリマーに沿って等間隔をあけるよう配置された毒素よりも効果的または均等となるが、それよりも確かに有効性が劣ることはないであろうと憶測する。一般に、ＭＭＡＥは、細胞傷害性の誘導においてＤＭ１よりも強力であると考えられる。本出願人らは、ＦＡ−３ｘＤＭ１−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７に対するＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７の直接比較により毒素選択を評価するであろう。等モル濃度で投薬されると、本出願人らは、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７が、腫瘍休止および退縮の誘導においてＦＡ−３ｘＤＭ１−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７１７よりも有効であると予測する。
【０６１２】
試験２：実施例４２に記載されている通りのＢＳＲＳ１の性能の欠如は、使用されているＫＢ異種移植モデルに存在するプロテアーゼの種類およびレベルによって影響されている可能性がある。そのような可能性を回避するために、異なるＢＳＲＳ組成物を有するホレート−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートが、追加的な高ホレート受容体発現異種移植片において検査され、そのような異種移植片として、ＯＶＣＡＲ３、ＩＧＲＯＶ３、ＯＶ−９０、ＮＣＩ−Ｈ２１１０およびＬＸＦＡ−７３７が挙げられるがこれらに限定されない。特に、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７１３は、まずＫＢ、ＯＶＣＡＲおよびＩＧＲＯＶ３異種移植片における腫瘍進行の制御におけるその有効性に関して、ＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ５−ＸＴＥＮ７１３およびＦＡ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ６−ＸＴＥＮ１３によるコンジュゲーションにおいて評価されるであろう。それぞれ異なる比率のプロテアーゼ感受性を保有するＢＳＲＳ１、ＢＳＲＳ５およびＢＳＲＳ６  ＰＣＭが、異なる異種移植片によって表される通り、異なる腫瘍プロテアーゼ環境において異なって挙動し得ることが仮定される。等モル濃度で投薬されると、各異種移植片の文脈において、あるＢＳＲＳは、その他のＢＳＲＳよりも有利となり得る。
【０６１３】
（実施例４４）
抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０、ＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＥ、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＸＴＥＮ７２０およびＸＴＥＮ４３２−３ｘＤＭ１コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性および特異性評価
【０６１４】
抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０および抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＸＴＥＮ７２０の特異的細胞傷害活性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存率アッセイにおいて細胞傷害性をもたらすそれらの能力に関して、それらの対応する非ターゲティングＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＥおよびＸＴＥＮ４３２−３ｘＤＭ１前駆体と比較した。ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＫ−ＯＶ−３およびＨＣＣ１９５４が挙げられるがこれらに限定されないＨＥＲ２発現細胞株のパネルを使用して、競合物質としてのトラスツズマブの存在および非存在下において、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０および抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＸＴＥＮ７２０の特異性をさらに解明した（図８３および図８４）。手短に説明すると、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに１×１０４個のＨＥＲ２陽性細胞を蒔き、３７℃、５％ＣＯ２の一晩のインキュベーションによりプレートに付着させた。トラスツズマブ処理ありおよびなしの抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０および抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＸＴＥＮ７２０コンジュゲート、ならびにＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＥおよびＸＴＥＮ４３２−３ｘＤＭ１コンジュゲートを全て、ある用量範囲内でプレートに導入し（２連で）、３日間、３７℃、５％ＣＯ２にてプレートをインキュベートした。ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＨＣＣ１９５４に関して、１０００〜０．０５ｎＭの用量範囲を包含する３倍系列希釈を用いた；ＮＣＩ−Ｎ８７に関しては、１０００〜０．０６ｎＭ用量範囲の５倍系列希釈；ＳＫ−ＯＶ−３に関しては、５０００〜０．１９ｎＭ用量範囲の４倍系列希釈を用いた。適切なインキュベーション期間の後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、軌道回転振盪機においてプレートを２分間混合した。次に、プレートを９０×ｇで遠心分離し、室温でさらに１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化させた。次に、ルミノメーターにおいて発光シグナルを読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアによりＩＣ５０（最大半量阻害濃度）を計算した。
【０６１５】
結果：図８３および表４２に示す通り、等モル濃度で検査すると、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖターゲティング部分を備える抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０は、ターゲティング部分がないＸＴＥＮ４３２−３ｘＭＭＡＥコンジュゲート構築物よりも有意に高い細胞傷害性殺傷を示した。重要なことに、競合物質としてのトラスツズマブの添加は、検査した細胞株のパネルにおける抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０の観察される細胞殺傷活性を損ない、ＨＥＲ２媒介性細胞傷害性の特異性を実証する。
【表４２】
2018500049.tif 000159
【０６１６】
ＤＭ１含有コンジュゲートにより同様の結果が得られた。抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＸＴＥＮ７２０は、トラスツズマブによって阻害される強い細胞傷害性を示した一方、対応する非ターゲティングＸＴＥＮ４３２−３ｘＤＭ１コンジュゲートは、いかなる有意なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性も保有しなかった（図８４および表４３）。
【表４３】
2018500049.tif 000160
【０６１７】
結論：このデータは、実験条件下で、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ部分が、ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートの細胞傷害活性を増強したＨＥＲ２媒介性ターゲティング効果を付与することを示唆する。さらに、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０および抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＸＴＥＮ７２０の両方が、ＨＥＲ２陽性だがトラスツズマブ抵抗性のＨＣＣ１９５４細胞株において強い細胞傷害活性を発揮し；ＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートが、トラスツズマブ抗体単独よりも有効であることを示す。
【０６１８】
（実施例４５）
抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７および抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性評価
【０６１９】
代表的な高ＨＥＲ２発現細胞株としてＮＣＩ−Ｎ８７細胞株を使用して、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３およびプロテアーゼ処理した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３の細胞傷害活性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存率アッセイにおいて細胞傷害性をもたらすそれらの能力に関して評価した。手短に説明すると、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに１×１０４個のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を蒔き、３７℃、５％ＣＯ２の一晩のインキュベーションによりプレートに付着させた。抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３およびプロテアーゼ処理した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３コンジュゲートを全て、５倍系列希釈した１０００〜０．０６ｎＭ用量範囲でプレートに導入し（２連で）；３日間、３７℃、５％ＣＯ２にてプレートをインキュベートした。適切なインキュベーション期間の後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、軌道回転振盪機においてプレートを２分間混合した。次に、プレートを９０×ｇで遠心分離し、室温でさらに１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化させた。次に、ルミノメーターにおいて発光シグナルを読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアによりＩＣ５０（最大半量阻害濃度）を計算した。
【０６２０】
結果：図８５に示す通り、等モル濃度で検査すると、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７およびＢＳＲＳ１  ＰＣＭ含有インタクト抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３は、同様の細胞傷害活性を示し、それぞれ２．２ｎＭおよび３．１ｎＭのＩＣ５０を生じた。しかし、プロテアーゼ処理後に、切断された抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３は、０．６４ｎＭのＩＣ５０を生じるプロテアーゼ未処理の抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３よりも５倍強い活性を示した（図８５）。
【０６２１】
結論：このデータは、実験条件下で、プロテアーゼ処理した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３が、そのプロテアーゼ未処理の対応物よりも強い細胞傷害活性を付与することを示唆する。
【０６２２】
（実施例４６）
ヒトＢＴ４７４乳癌を有する雌ＳＣＩＤマウスにおける抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３およびカドサイラの有効性および安全性解析
【０６２３】
次の有効性試験を設計して、（１）ＭＭＡＥ対ＤＭ１；（２）抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖターゲティング部分の近くのＮ末端においてクラスター形成したＭＭＡＥ、対、ＣＸＴＥＮポリマーにおいて等間隔をあけたＭＭＡＥの影響；（３）ＢＳＲＳ１の影響；および（４）ベンチマークであるカドサイラと比較した抗ＨＥＲ２−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートの性能の効果を解読する。
【０６２４】
手短に説明すると、１×１０７個のＢＴ４７４細胞を、６８匹の雌胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に皮下注射し、腫瘍を形成させ、そのサイズをノギスで測定し、０．５×（Ｌ×Ｗ２）（式中、腫瘍のミリメートル（ｍｍ）単位のＬ＝長さおよびＷ＝幅である）として体積を計算する。０日目と指定される日に、標的とする腫瘍サイズ１００〜１５０ｍｍ３を有する４８匹のマウスを、６８匹のマウスから選択し、１群当たり８匹の動物の６群に選別する；各群は、およそ均等な平均腫瘍体積を有する。ＰＢＳビヒクル対照、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３およびカドサイラの静脈内投与により、０日目に処置を開始する。
【０６２５】
試験エンドポイントまで１週間に３回、ノギス測定により腫瘍成長の休止または退縮を決定する。試験のエンドポイントは、腫瘍体積１０００ｍｍ３または３０日間のいずれか早い方として定義した。処置群毎にパーセント腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を計算し、％ＴＧＩ≧６０％は、治療活性があると考えられる。総体的な毒性の評価として、試験エンドポイントまで１週間に３回、体重に関して動物を個々にモニターする。窮迫、死亡または有害事象のいかなる臨床徴候も記述する。
【０６２６】
ＰＢＳビヒクルを投与されたＢＴ４７４腫瘍を有するマウスにおいて、腫瘍阻害が観察されないであろうと予想される。ＢＴ４７４異種移植片における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０薬物コンジュゲートにより得られる結果および文献において記述されているカドサイラの性能に基づき、本出願人らは、全５種の薬物コンジュゲート（抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３およびカドサイラ）が、腫瘍停滞または退縮の誘導において、ビヒクルよりも効果的になると予想する。（１）本出願人らは、ＭＭＡＥが、ＤＭ１よりも効果的となることを憶測し、したがって、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０が、腫瘍停滞および／または退縮において抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０よりも優れると予想する。（２）本出願人らは、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７が、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０よりも有効または均等となるが、これに劣るものではないと考える。（３）ＢＳＲＳ１  ＰＣＭが切断されるため、したがって、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３が、対応する抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７コンジュゲートよりも良い性能を示すために、ＢＴ４７４が正しい腫瘍プロテアーゼ環境を提供するかは依然として不明である。（４）等モルで投薬された場合、本出願人らは、一部には全長ＩｇＧよりも優れた腫瘍浸透性を有するｓｃＦｖ−ＸＴＥＮにより、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートのうち１種または複数が、カドサイラよりも優れることを予測する。３０ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて、全５種の薬物コンジュゲート化合物が、耐容性が良く、体重減少がないことも予想される。
【０６２７】
（実施例４７）
ヒトＮＣＩ−Ｎ８７胃癌およびＳＫ−ＯＶ−３卵巣癌を有する雌ＳＣＩＤマウスにおける抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３およびカドサイラの有効性および安全性解析
【０６２８】
ＢＴ４７４以外の腫瘍環境の提示として、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３およびカドサイラを、ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌およびＳＫ−ＯＶ−３卵巣癌においても評価するであろう。
【０６２９】
ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植モデルにおいて、１×１０７個のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を６８匹の雌ＳＣＩＤマウスの側腹部に皮下投与する；一方、ＳＫ−ＯＶ−３モデルにおいて、１ｍｍ３のＳＫ−ＯＶ−３腫瘍断片を雌胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部の皮下に植え込む。０日目と指定される日に、標的とする腫瘍サイズ１００〜１５０ｍｍ３を有する４８匹のマウスを６８匹のマウスから選択し、１群当たり８匹の動物の６群に選別する；各群は、およそ均等な平均腫瘍体積を有する。ＰＢＳビヒクル対照、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３およびカドサイラの静脈内投与により、０日目に処置を開始する。
【０６３０】
試験エンドポイントまで１週間に３回、ノギス測定により腫瘍成長の休止または退縮を決定する。ＮＣＩ−Ｎ８７試験のエンドポイントは、腫瘍体積８００ｍｍ３または３０日間のいずれか早い方として定義される。ＳＫ−ＯＶ−３試験のエンドポイントは、２０００ｍｍ３または３０日間のいずれか早い方として定義される。ＮＣＩ−Ｎ８７およびＳＫ−ＯＶ−３試験の両方において、処置群毎にパーセント腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を計算する。％ＴＧＩ≧６０％を有する処置群は、治療活性があると考えられる。総体的な毒性の評価として、試験エンドポイントまで１週間に３回、体重に関して動物を個々にモニターする。窮迫、死亡または有害事象のいかなる臨床徴候も記述する。
【０６３１】
腫瘍阻害は、ＰＢＳビヒクルを投与された、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＳＫ−ＯＶ−３腫瘍を有するマウスにおいて観察されないであろうと予想される。ＢＴ４７４異種移植片における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ７２０薬物コンジュゲートにより得られる結果ならびにＮＣＩ−Ｎ８７およびＳＫ−ＯＶ−３モデルにおける文献に記述されているカドサイラの性能に基づき、本出願人らは、全５種の薬物コンジュゲート（抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３およびカドサイラ）が、両方の異種移植モデルの腫瘍停滞または退縮の誘導において、ビヒクルよりも効果的になると予想する。（１）ＢＴ４７４モデルと同様に、本出願人らは、ＭＭＡＥが、ＤＭ１よりも有効になることを憶測し、したがって、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０が、腫瘍休止および／または退縮の誘導において、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＤＭ１−ＣＸＴＥＮ７２０よりも良い性能を示すことを予測する。（２）本出願人らは、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７が、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＸＴＥＮ７２０よりも有効または均等に有効となるが、これに劣るものではないと考える。（３）ＢＳＲＳ１  ＰＣＭが切断されるため、よって、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ７５３が、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−３ｘＭＭＡＥ−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ７５７よりも良い性能を示すために、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＳＫ−ＯＶ−３異種移植片のいずれか一方または両方が、正しい腫瘍プロテアーゼ環境を提供するかは依然として不明である。（４）等モルで投薬された場合、本出願人らは、一部には全長ＩｇＧよりも優れた腫瘍浸透性を有するｓｃＦｖ−ＸＴＥＮにより、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートの１種または複数が、カドサイラよりも優れることを予測する。３０ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて、全５種の薬物コンジュゲート化合物が、耐容性が良く、体重減少がないことも予想される。
【０６３２】
ＢＳＲＳ１  ＰＣＭ含有抗ＨＥＲ２−ＸＴＥＮ薬物コンジュゲートが、対応する非ＢＳＲＳ１含有コンジュゲートと比較して、ＢＴ４７４、ＮＣＩ−Ｎ８７またはＳＫ−ＯＶ−３において付加的利点を提供しない可能性がある。実際にそうである場合、ＢＳＲＳ１部分は、他のＰＣＭにより置き換えられ、その結果得られるコンジュゲートは、ＨＥＲ２陽性異種移植片において評価されるであろう。
【０６３３】
（実施例４８）
エラスターゼ消化およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性検査
【０６３４】
幅広い基質特異性を有するセリンプロテアーゼである好中球エラスターゼが、ＸＴＥＮを分解することができることが憶測された。実験を設計して、プロテアーゼ切断に対するＸＴＥＮの感受性を実証した。１０μＭの精製されたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を、１：１０００または１：１００モル比（エラスターゼ：ＸＴＥＮ）のヒト好中球エラスターゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと続くクーマシー染色により、消化前および後の試料を解析した（図８６）。１：１０００モル比の好中球エラスターゼと共にインキュベートする場合、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に部分的な分解が観察され、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４は、１：１００モル比の好中球エラスターゼによって完全に消化された。
【０６３５】
細胞傷害性薬物がＣＣＤにコンジュゲートされたターゲティングコンジュゲート組成物の文脈において、組成物は、ペイロードが通常のシステイン含有ＸＴＥＮにコンジュゲートされ、システインがＸＴＥＮの長さにわたって分散されたターゲティング組成物と比較して、細胞傷害性薬物が、ターゲティング部分とより近くに近接して設計される。設計の原理としては、ＸＴＥＮにおけるプロテアーゼ消化に付される場合、ターゲティングコンジュゲート組成物におけるＣＣＤに連結された薬物分子のより高い百分率が、ＸＴＥＮにおいてより遠位に連結された薬物と比較して、会合するターゲティング部分と連結されたままでいる可能性が高く、ターゲティング部分が、標的腫瘍細胞に結合し、細胞死をもたらす場合、薬物分子が内部移行される確率をより高めるであろうことが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ環境は、ＸＴＥＮを分解し得る多くの種々のプロテアーゼを有するため、ペイロードがＣＣＤに連結されたターゲティングコンジュゲート組成物は、したがって、通常のシステイン含有ＸＴＥＮよりも優れたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性をもたらすであろう。後述する方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの仮説を検査することができる。
【０６３６】
実施例１３および実施例２０に記載されている通り、同様の方法により調製された、ホレート−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ−３ｘＤＭ１（ターゲティングコンジュゲート組成物の代表として、３分子のＤＭ１を含有）およびホレート−ＣＸＴＥＮ−３ｘＤＭ１（ＤＭ１ペイロードがＸＴＥＮにコンジュゲートされたターゲティングＸＴＥＮの代表としての、３分子のＤＭ１を含有）は、１：１０００モル比で３７℃にて、好中球エラスターゼと共にインキュベートされるであろう。実施例３５に記載されている通り、試料は、異なる時点で除去され、分解進行をモニターするためのＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターされ、ホレート受容体を有するＫＢ細胞におけるそれらの殺傷活性に関して細胞に基づくアッセイにおいて評価されるであろう。本出願人らは、ある特定の時点において、試料が、低百分率のホレート−ＣＸＴＥＮ−３ｘＤＭ１が、ホレートにより連結されたＤＭ１薬物の全３個を依然として保持する一方、有意により高い百分率のホレート−ＣＣＤ−ＸＴＥＮ−３ｘＤＭ１が、ホレートにより連結された全３個のＤＭ１薬物を保持する分解レベルに達することを予想する。ホレートなしでＸＴＥＮに連結されたＤＭ１は、細胞に対し毒性がないため、細胞傷害性効果は、ホレートターゲティング部分に連結されたままのＤＭ１によってのみ寄与される。細胞に基づくアッセイにおいてこれらの試料を検査する場合、これは、ホレートおよびその受容体の間の親和性に関してのみ関連するため、本出願人らは、全試料で同様のＩＣ５０を予想するが、組成物のタンパク質分解の結果として、ＤＭ１薬物がホレートから脱落するため、細胞殺傷の百分率は、より低くなると予想されるであろう。
【０６３７】
（実施例４９）
ＦＡ−ＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＡＥ７１７、ＦＡ−ＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ１−ＡＥ７１３、ＦＡ−ＣＣＤ７−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ４−ＡＥ７１７および対応する非ターゲティングコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性評価
【０６３８】
ＦＡ−ＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＡＥ７１７、プロテアーゼ処理および未処理のＦＡ−ＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ１−ＡＥ７１３、プロテアーゼ処理および未処理のＦＡ−ＣＣＤ７−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ４−ＡＥ７１７ならびに対応する非ターゲティング対照ＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＡＥ７１７、ＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ１−ＡＥ７１３およびＣＣＤ７−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ４−ＡＥ７１７の細胞傷害活性を、ホレート受容体陽性ＫＢ細胞株を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて細胞傷害性をもたらす能力に関して比較した。細胞培養における葉酸含量を最小化するために、葉酸不含ＲＰＭＩプラス１０％熱失活ウシ胎仔血清においてＫＢ細胞を育成し、アッセイを行った。手短に説明すると、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに１×１０４個のＫＢ細胞を蒔き、３７℃、５％ＣＯ２の一晩のインキュベーションによりプレートに付着させた。全８種のタンパク質を全て、１９２〜８１ｎＭに及ぶ初期濃度による４倍系列希釈用量範囲としてプレートに導入した。７２時間のインキュベーション後に、メーカーの説明書に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、ルミノメーターにおいて発光シグナルを読み取り；ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアによりＩＣ５０を計算した。
【０６３９】
結果：表４４に示す通り、ＦＡ−ＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＡＥ７１７、ＦＡ−ＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ１−ＡＥ７１３およびＦＡ−ＣＣＤ７−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ４−ＡＥ７１７は全て、それぞれ１．４１±０．１ｎＭ、１．５５ｎＭおよび１．０５ｎＭのＩＣ５０により、同様の強い細胞傷害活性を示した。データは、インタクトＣＣＤおよびＢＳＲＳ配列の導入が、ＫＢ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性に明らかな影響を与えないことを実証した。予想される通り、全ての非ターゲティングＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＡＥ７１７、プロテアーゼ切断非ターゲティングＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ１−ＡＥ７１３およびプロテアーゼ切断非ターゲティングＣＣＤ７−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ４−ＡＥ７１７は、最小の細胞傷害性を示した（ＩＣ５０＞１００ｎＭ）。興味深いことに、プロテアーゼ処理および未処理ＦＡ−ＣＣＤ１−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ１−ＡＥ７１３は、均等な活性を生じた（ＩＣ５０  １．５ｎＭ対１．１±１．７ｎＭ）。同様に、プロテアーゼ処理および未処理ＦＡ−ＣＣＤ７−３ｘＭＭＡＥ−ＢＳＲＳ４−ＡＥ７１７も、匹敵する細胞傷害性を示した（ＩＣ５０  １．０５ｎＭ対２．４±０．９ｎＭ）。
【表４４】
2018500049.tif 000161
【０６４０】
結論：このデータは、記載されている実験条件下で、ＸＴＥＮが、ＫＢ細胞に存在するホレート受容体とホレートターゲティング部分との相互作用を妨げなかったことを示唆する。
【０６４１】
（実施例５０）
Ｈ２９２異種移植モデルにおけるＢＳＲＳ−ＸＴＥＮ８６４の薬物動態および体内分布解析
【０６４２】
ＮＣＩ−Ｈ２９２異種移植片は、ＲＳ３の切断成功のために正しい腫瘍環境を保有することが文献において報告された。全ＢＳＲＳ  ＰＣＭは、ＲＳ３配列を含有する。ｉｎ  ｖｉｖｏ切断のための異なるＢＳＲＳ  ＰＣＭの有効性に関してより十分に評価およびスクリーニングするために、本出願人らは、ＮＣＩ−Ｈ２８９２異種移植モデルを利用して、体内分布試験によりＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４、ＢＳＲＳ２−ＸＴＥＮ８６４、ＢＳＲＳ３−ＸＴＥＮ８６４、ＢＳＲＳ４−ＸＴＥＮ８６４、ＢＳＲＳ５−ＸＴＥＮ８６４およびＢＳＲＳ６−ＸＴＥＮ８６４を評価するであろう。各ＢＳＲＳを有するＸＴＥＮ８６４および非ＢＳＲＳ含有ＸＴＥＮ８６４対照は、２種のランタニド希土類イオンで直交性に標識され、一方の金属をＮ末端に、他方の金属をＢＳＲＳ配列の直ぐ下流に置いた。６種の利用できる希土類金属を使用して、混合物として１群当たり３種のコンジュゲートを評価する。
【０６４３】
手短に説明すると、ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍体積２５０〜３５０ｍｍ３を有する雌ＳＣＩＤマウスの１群当たり３匹のマウスの６群に、１群当たり３種のコンジュゲート（２種は二重標識ＢＳＲＳ−ＸＴＥＮ８６４および１種は二重標識ＸＴＥＮ８６４対照）の混合物を注射するであろう。組織体内分布解析のため、５日目に３匹のマウスを屠殺する。終末エンドポイントにおいて、腫瘍、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、膵臓および脳を収集し、ＰＢＳ中で濯ぎ、拭き取って乾かし、秤量し、手早く凍結する。種々の組織中に存在するそれぞれの金属の量をＩＣＰ−ＭＳによって定量化し、組織１ｇ当たりのパーセント注射用量（％ＩＤ／ｇ）としてデータを表現する。
【０６４４】
ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍環境において切断されるＢＳＲＳに関して、５日目に、１種のみの金属（ＢＳＲＳ配列の直ぐ下流にコンジュゲートする）が、腫瘍試料において検出されるであろう；このＢＲＳＲ−ＸＴＥＮ８６４のＮ末端位置の金属は、数時間のその短い半減期により、５日目までに消失するであろう。Ｈ２９２腫瘍環境によって切断されないＢＳＲＳに関して、両方の金属（すなわち、Ｎ末端位置のおよびＢＳＲＳ配列の下流の）が検出されるであろう。この様式で、ターゲティングＸＴＥＮ−薬物コンジュゲートにおける使用のために、ｉｎ  ｖｉｖｏ機能的ＢＳＲＳを同定することができた。
【０６４５】
（実施例５１）
多様なペイロードにより連結されたＸＴＥＮの分析的サイズ排除クロマトグラフィー
【０６４６】
種々の治療タンパク質および増大する長さの構造不定の組換えタンパク質を含有する融合タンパク質において、サイズ排除クロマトグラフィー解析を行った。例証的なアッセイは、ＴＳＫＧｅｌ−Ｇ４０００  ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを使用し、１ｍｇ／ｍｌ濃度の４０μｇの精製されたグルカゴン融合タンパク質を、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ６．８、１１４ｍＭ  ＮａＣｌにおいて流速０．６ｍｌ／分で分離した。ＯＤ  ２１４ｎｍおよびＯＤ  ２８０ｎｍを使用して、クロマトグラムプロファイルをモニターした。ＢｉｏＲａｄ製のサイズ排除較正標準を使用して、全アッセイに対してカラム較正を行った；マーカーは、サイログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマ−グロブリン（１５８ｋＤａ）、ニワトリオボアルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロビン（myoglobuin）（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を含む。評価した全構築物のＳＥＣ解析に基づき、見かけ上の分子量、見かけ上の分子量因数（計算される分子量に対する見かけ上の分子量の比として表現）および流体力学半径（ｎｍ単位のＲＨ）を表４５に示す。この結果は、５７６アミノ酸またはそれを超える異なるＸＴＥＮの取り込みが、およそ３３９ｋＤａ〜７６０の融合タンパク質の見かけ上の分子量を付与し、８６４アミノ酸またはそれを超えるＸＴＥＮが、およそ８００ｋＤＡを超える見かけ上の分子量を付与することを示す。実際の分子量に対する見かけ上の分子量の比例的増大の結果は、いくつかの異なるモチーフファミリー；すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧおよびＡＭ由来のＸＴＥＮにより創出された融合タンパク質で一貫し、少なくとも４倍の増大および約１７倍もの高さの比であった。その上、種々のペイロードを備える融合タンパク質への５７６アミノ酸またはそれを超えるＸＴＥＮ融合パートナーの取り込みは（およびＹ２８８に融合されたグルカゴンの場合は２８８残基）、７ｎｍまたはそれを超える流体力学半径をもたらし；およそ３〜５ｎｍの糸球体ポアサイズを優に超える。抗Ｈｅｒ２のｓｃＦｖへの３種の異なる長さのＸＴＥＮの付加は、ＸＴＥＮの長さの増大に対し比例的な、見かけ上の分子量および流体力学半径の増大をもたらし、所望の特性に応じてｓｃＦｖの特性を調整することができるが、２８８アミノ酸もの短さのＸＴＥＮにより、流体力学半径が、腎ポアサイズよりも大きくなることを示す。したがって、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質が、減少した腎クリアランスを有し、終末半減期増大に寄与し、対応する非融合生物学的タンパク質または抗体断片と比べて治療または生物学的効果を改善することが予想される。
【表４５】
2018500049.tif 000162
【図１Ａ】
2018500049.tif 000175
【図１Ｂ】
2018500049.tif 000176
【図１Ｃ】
2018500049.tif 000177
【図１Ｄ】
2018500049.tif 000178
【図２】
2018500049.tif 000179
【図３】
2018500049.tif 000180
【図４】
2018500049.tif 000181
【図５】
2018500049.tif 000182
【図６】
2018500049.tif 000183
【図７】
2018500049.tif 000184
【図８】
2018500049.tif 000185
【図９】
2018500049.tif 000186
【図１０】
2018500049.tif 000187
【図１１】
2018500049.tif 000188
【図１２】
2018500049.tif 000189
【図１３】
2018500049.tif 000190
【図１４】
2018500049.tif 000191
【図１５】
2018500049.tif 000192
【図１６】
2018500049.tif 000193
【図１７】
2018500049.tif 000194
【図１８−１】
2018500049.tif 000195
【図１８−２】
2018500049.tif 000196
【図１９Ａ】
2018500049.tif 000197
【図１９Ｂ】
2018500049.tif 000198
【図２０Ａ】
2018500049.tif 000199
【図２０Ｂ】
2018500049.tif 000200
【図２１】
2018500049.tif 000201
【図２２】
2018500049.tif 000202
【図２３】
2018500049.tif 000203
【図２４】
2018500049.tif 000204
【図２５】
2018500049.tif 000205
【図２６】
2018500049.tif 000206
【図２７】
2018500049.tif 000207
【図２８】
2018500049.tif 000208
【図２９】
2018500049.tif 000209
【図３０】
2018500049.tif 000210
【図３１】
2018500049.tif 000211
【図３２】
2018500049.tif 000212
【図３３】
2018500049.tif 000213
【図３４−１】
2018500049.tif 000214
【図３４−２】
2018500049.tif 000215
【図３４−３】
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【図３４−４】
2018500049.tif 000217
【図３５】
2018500049.tif 000218
【図３６Ａ】
2018500049.tif 000219
【図３６Ｂ】
2018500049.tif 000220
【図３６Ｃ】
2018500049.tif 000221
【図３７】
2018500049.tif 000222
【図３８】
2018500049.tif 000223
【図３９】
2018500049.tif 000224
【図４０】
2018500049.tif 000225
【図４１】
2018500049.tif 000226
【図４２】
2018500049.tif 000227
【図４３−１】
2018500049.tif 000228
【図４３−２】
2018500049.tif 000229
【図４４】
2018500049.tif 000230
【図４５】
2018500049.tif 000231
【図４６】
2018500049.tif 000232
【図４７】
2018500049.tif 000233
【図４８】
2018500049.tif 000234
【図４９】
2018500049.tif 000235
【図５０】
2018500049.tif 000236
【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９−１】
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【図７９−２】
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【図７９−３】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３−１】
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【図８３−２】
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【図８３−３】
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【図８４−１】
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【図８４−２】
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【図８４−３】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018500049.tif 000283
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