(57)【要約】  本発明は、全体として、フィターゼ酵素活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする新規でかつ改良された核酸配列、およびかかる酵素を宿主細胞において効果的に発現させるための方法に関する。第１の態様において、本発明は、ｉ）フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列を含む、またはｉｉ）フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列に対して少なくとも８３％の配列同一性を有する、単離された核酸分子に関する。本発明はまた、上記の単離された核酸分子を含む、発現構築物またはベクターに関する。本発明はさらに、フィターゼ酵素活性を有するタンパク質の製造方法であって、以下：ａ）宿主細胞に、以下：ｉ）前記宿主細胞において機能的である発現調節因子；およびｉｉ）前記因子に作動可能に連結された本発明による核酸分子；を含むベクターを導入するステップ、ｂ）ステップａ）で得られた宿主細胞を、前記タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、および場合により、ｃ）ステップｂ）で製造された前記タンパク質を、前記細胞培養物から回収するステップを含む方法に関する。本発明はさらに、本発明による方法によって得られたタンパク質、および動物飼料用添加物を製造するためのその使用に関する。
2018500928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列を含む、または
ｉｉ）フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列に対して少なくとも８３％の配列同一性を有する、
単離された核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子は、Ｎ末端シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
宿主細胞生物に対してコドンが最適化された突然変異をさらに含む、請求項１または２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記宿主細胞生物は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｓ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子は、コドンが最適化された突然変異が少なくとも５０存在するという点で、対応する野生型ヌクレオチドコード配列と相違する、請求項３または４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
対応する野生型核酸配列のコドンの少なくとも５０％が、前記宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変されている、請求項３から５までのいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記単離された核酸分子中のすべてのコドンが、前記宿主細胞生物に最も好まれるコドンに改変されている、請求項３から６までのいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号３による、フィターゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする、請求項１から７までのいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記核酸配列の発現調節因子に作動可能に連結された請求項１から８までのいずれか１項に記載の核酸配列を含む、発現構築物。
【請求項１０】
前記発現調節因子は、宿主細胞において機能的であるプロモーターと、場合により終止配列と、を含む、請求項９に記載の発現構築物。
【請求項１１】
前記宿主細胞は、真菌細胞である、請求項９または１０に記載の発現構築物。
【請求項１２】
前記真菌細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項１１に記載の発現構築物。
【請求項１３】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の核酸分子または請求項９から１２までのいずれか１項に記載の発現構築物を含む、ベクター。
【請求項１４】
フィターゼの酵素活性を有するタンパク質を製造する方法であって、以下：
ａ）宿主細胞に、以下：
ｉ）前記宿主細胞において機能的である発現調節因子；および
ｉｉ）前記因子に作動可能に連結される、請求項１または２に定義される核酸分子；
を含むベクターを導入するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた宿主細胞を、前記タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、ならびに場合により、
ｃ）ステップｂ）で製造された前記タンパク質を、前記細胞培養物から回収するステップ
を含む方法。
【請求項１５】
前記発現調節因子は、宿主細胞において機能的であるプロモーターと、場合により終止配列と、を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞は、酵母細胞である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵母細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質の発現を、メタノール発現系を用いて行う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｄ）で回収されるタンパク質は、少なくとも１０００Ｕｎｉｔｓ／Ｌのフィターゼ活性を有する、請求項１４から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記回収ステップは、ａ）分泌された前記タンパク質を培地から分離するステップおよび／またはｂ）前記タンパク質を前記宿主細胞から分離するステップを含む、請求項１４から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１４から２０までのいずれか１項に記載の方法によって得られたタンパク質。
【請求項２２】
請求項２１に記載のタンパク質または請求項１４から２０までのいずれか１項に記載の方法によって製造されたタンパク質の、動物飼料用添加物を製造するための使用。
【請求項２３】
請求項２１に記載のタンパク質を含む、または請求項１４から２０までのいずれか１項に記載の方法によって製造されたタンパク質を含む、動物飼料用添加物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、フィターゼの酵素活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする新規でかつ改良された核酸配列、およびかかる酵素を宿主細胞において効果的に発現させるための方法に関する。
【０００２】
第１の態様において、本発明は、ｉ）フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列を含む、またはｉｉ）フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列に対して少なくとも７８％の配列同一性を有する、単離された核酸分子に関する。
【０００３】
本発明はまた、上記の単離された核酸分子を含む発現構築物またはベクターに関する。本発明はさらに、フィターゼの酵素活性を有するタンパク質の製造方法であって、以下：
ａ）宿主細胞に、以下：
ｉ）前記宿主細胞において機能的である発現調節因子；および
ｉｉ）前記因子に作動可能に連結された、本明細書で定義される核酸分子；
を含むベクターを導入するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた宿主細胞を、前記タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、ならびに場合により、
ｃ）ステップｂ）で製造された前記タンパク質を、前記細胞培養物から回収するステップ
を含む方法に関する。
【０００４】
本発明はさらに、本発明による方法によって得られたタンパク質、および動物飼料用添加物を製造するためのその使用に関する。
【０００５】
発明の背景
本発明は、全体として、フィターゼの酵素活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする新規な核酸分子と、フィターゼ活性を有するこのようなタンパク質を宿主細胞において効果的に製造するための方法に関する。本発明はまた、本発明による方法によって得られたポリペプチドまたはタンパク質、ならびに動物飼料用添加物の加工における活性成分としてのおよび／または土壌由来の有機材料のリン酸を遊離させるためのその使用に関する。
【０００６】
元素のまたは純粋なリン（Ｐ）は、自然界では非常に稀であり、通常は、動物組織および植物組織の炭素をベースとする有機基に結合したリン酸基（ＰＯ４３−）を含む分子の一部として見出される。
【０００７】
しかし、リン（Ｐ）は、植物および動物にとって重要な栄養素の一つである。Ｐは重要な植物多量栄養素の一つであり、植物の乾燥重量の約０．２％を占める。これは、例えば核酸、リン脂質およびＡＴＰといった重要な分子の成分の一つであり、したがって、この栄養素を確実に供給しなくては、植物は成長することができない。無機リンは、植物によって吸収および取り込みされうる唯一のリン供給源である。土壌においては無機リンの利用可能性が低いため、農業従事者は、多量栄養素Ｐを利用可能にしなければならない。
【０００８】
動物もリンを栄養素として必要としており、これは一般に、例えば食物中の無機リンの形態で、または食物を構成する有機リンの様々な成分の分解によって、供給されることができる。
【０００９】
フィチン酸またはフィテートは、植物、例えば穀類、豆類、脂肪種子におけるリンの主要な貯蔵形態であり、その値は１〜５重量％の範囲である。イノシトール６リン酸（ＩＰ６）とも呼ばれる「フィチン酸」またはその塩である「フィテート」は、飽和環状酸である。さらに、フィチン酸は典型的にはキレート化し、それによって、ある種の重要なマイナーミネラル、例えば亜鉛および鉄が吸収されなくなり、そしてそれほどではないにせよ、マクロミネラル、例えばカルシウムおよびマグネシウムも吸収されなくなる。フィチンとは、具体的には、フィチン酸のカルシウム塩またはマグネシウム塩の形態を指す。フィチン酸の代謝産物は、低級イノシトールポリリン酸と呼ばれる。例は、イノシトール５リン酸（ＩＰ５）、イノシトール４リン酸（ＩＰ４）およびイノシトール３リン酸（ＩＰ３）である。穀類およびマメ科植物に含まれるリンの３分の２超が、フィテートの形態で存在する。
【００１０】
ヒトまたは非反芻動物（単胃動物）はフィテートを消化することができないため、直接食される場合には、フィテートは、イノシトールの適切な供給源でもホスフェートの適切な供給源でもない。特に、非反芻動物は、フィテート分子中のイノシトールからリン酸を切り離すのに必要とされる消化酵素であるフィターゼを有していないため、フィテートの形態で存在するリンおよびイノシトールを非反芻動物にとって生物学的に利用可能となるようにすることはできない。フィテートの形態で存在するリンは、単胃動物によって摂取される植物起源のリンの約２０〜４０％を占める。
【００１１】
フィテートは非反芻動物には吸着されないため、吸収されないフィテートは、通常は胃腸管を通過し、これによって糞堆肥中のリンの量が増加する。過剰なリンの排出は、環境上および生態学上の問題、例えば富栄養化を招きうる。リンによる土壌汚染は、農業において、特に単胃動物を伴う集中的農業の分野において、深刻な問題を引き起こす。
【００１２】
さらに、小腸内の腸内細菌叢における微生物の中にはフィチン酸を加水分解しうるものもあるが、リンは少量しか吸収されない。一方で、フィテートは、動物の栄養に必要な必須の金属イオン、例えばカルシウム、銅または亜鉛をキレート化することができ、それによってその栄養価が低下するため、過剰のフィテートは、抗栄養因子の効果を有する。
【００１３】
上記の欠点を回避するために、動物飼料には一般には無機リンが富化されたが、これによって今度は畜産コストが増加した。これらの欠点を緩和するための最近になって考案されたもう１つのアプローチは、フィターゼを直接添加することである。このフィターゼによってフィテートの加水分解が触媒され、それによって有機リンが遊離してこれが利用可能となり、そして動物飼料に使用することができるようになる。
【００１４】
微生物フィターゼの使用は、フィチン酸からのリンの利用可能性を高める目的で、動物飼料での使用が現在認められている。例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ＤＳＭ  １４２２３）により生成される６−フィターゼは、欧州委員会規則（ＥＣ）Ｎｏ．２５５／２００５により、鶏の肥育、鶏の産卵、七面鳥の肥育、豚および雌豚の肥育に関して認可されている。これらのフィターゼは極めて弱く不安定であり、５．０〜７．５のｐＨで最大の活性を示すため、胃内の低いｐＨ値（ｐＨ２〜３）に起因して活性がかなり低下して制限される。フィターゼ酵素はまた、過剰の基質（フィテート）および生成物（無機リン）ならびに高温によって強度に阻害されることが知られている（Ｐｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｋｈｏｎ，１９９３）。
【００１５】
合成フィターゼは、フィチン酸を加水分解することにより低割合のリン酸エステルを含む無機オルトリン酸（５リン酸エステルないし１リン酸エステルが中間生成物である）と遊離ミオイノシトールとを生成させうるホスホモノエステラーゼである（Ｎａｙｉｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｒｋａｋｉｓ，  １９８６；  Ｌａｓｚｔｉｔｙ  ａｎｄ  Ｌａｓｚｔｉｔｙ，  １９８８；  Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，  １９９５）。ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ（１９７６）により、動物および微生物において単離された３−フィターゼ（ＥＣ  ３．１．３．８）が認められている（Ｒｅｄｄｙ  ａｎｄ  ｃｏｌ．，  １９８２；  Ｌａｓｚｔｉｔｙ  ａｎｄ  Ｌａｓｚｔｉｔｙ，  １９８８）。
【００１６】
外因性のフィターゼは、微生物、例えば真菌および酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ））ならびに細菌（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ））において発見されている。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ）から得られるフィターゼは、フィターゼ分子の加水分解の特定の順序に従い、すなわち３位からリン酸基を遊離させた後、次の順序で、すなわち４位、５位、６位および２位の順で続く（Ｖｅｎｅｋａｍｐら、１９９５）。これらの酵素は、異なるｐＨ２．５およびｐＨ５．５で活性を示す。ｐＨ２．５での活性は、ｐＨ５．５での活性よりも有効性が約４０％低いが、このｐＨ５．５での活性は重要である。なぜならば、リン吸収の大部分が、ｐＨ５．５を有する小腸で生じるためである（Ｐｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｋｈｏｎ，１９９３）。
【００１７】
アスペルギルス・フィクム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍｍ）により生成されるフィターゼは、精製された糖タンパク質であり、温度およびｐＨに応じて変化する酵素活性を有する。この酵素の最適温度は、６０℃〜７０℃である。しかし、６８℃で１０分間で、６０％までの活性の損失が観察された（Ｎａｓｉ，１９９０）。熱安定性のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酵素は、ペレット化プロセスに対して耐性があり、その活性は少なくとも５０００ＦＴＵ／ｇであると報告されている。（Ｎａｓｉ、１９９０）。
【００１８】
国際公開第２０１１／１４１６１３号（ＷＯ  ２０１１／１４１６１３  Ａ２）には、フィターゼ活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）の新規な単離された遺伝子、宿主酵母細胞、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるその取得方法、および動物飼料用添加物の加工における活性成分としての該酵素の使用が記載されている。国際公開第２０１１／１４１６１３号（ＷＯ  ２０１１／１４１６１３）には、胃（ｐＨ３．５）と腸管（ｐＨ７．０）とのｐＨ差に対して感受性を示さず、かつ広いｐＨ範囲にわたってその活性を維持したフィターゼについて報告されている。この国際公開第２０１１／１４１６１３号（ＷＯ  ２０１１／１４１６１３）に記載のフィターゼは、改善された熱安定性を有することが報告されている。
【００１９】
しかし、このセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）フィターゼ野生型タンパク質の発現レベルが低いことが、なおも、大規模なタンパク質製造に関する障害となっている。宿主細胞においてフィターゼタンパク質の改善された効果的な発現を導く因子および条件を特定することが、なおも強く求められている。従来技術では、フィターゼ活性を有するタンパク質を、体積当たりにおよび時間の経過に伴ってより多く効率的に製造しうる手段および方法は、なおも存在していない。したがって、コスト効率が高くそして信頼性の高い方法を提供すべく、工業規模での製造の条件を改善することが、なおも強く求められている。
【００２０】
発明の概要
上記目的は、本明細書に記載のおよび特許請求の範囲に記載の本発明による方法ならびに手段によって解決される。本発明は、これらの要求に対処して、フィターゼ活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）の新規な単離された核酸分子を提供する。本発明はさらに、本発明による単離された遺伝子を宿主細胞において効果的に発現させ、次いで精製するための方法を提供する。
【００２１】
第１の態様において、本発明は、
ｉ）フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列を含む、または
ｉｉ）フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列に対して少なくとも８３％の配列同一性を有する、
単離された核酸分子に関する。
【００２２】
さらなる好ましい一実施形態において、単離された核酸分子は、フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００２３】
さらに別の好ましい実施形態において、核酸分子は、Ｎ末端シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない。
【００２４】
さらなる好ましい一実施形態において、単離された核酸分子は、宿主細胞生物に対してコドンが最適化された突然変異をさらに含む。
【００２５】
さらなる好ましい一実施形態において、宿主細胞生物は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｓ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００２６】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、核酸分子は、コドンが最適化された突然変異が少なくとも５０存在するという点で、対応する野生型ヌクレオチドコード配列と相違する。
【００２７】
さらなる好ましい一実施形態において、対応する野生型核酸配列のコドンの少なくとも５０％が、宿主細胞生物に最も好まれるコドンに改変されている。
【００２８】
好ましい一実施形態において、単離された核酸分子中のすべてのコドンが、宿主細胞生物に最も好まれるコドンに改変されている。
【００２９】
さらに好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号３によるフィターゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする。
【００３０】
第２の態様において、本発明は、前記核酸配列の発現調節因子（elements regulating the expression）に作動可能に連結された上述の単離された核酸分子を含む発現構築物に関する。
【００３１】
好ましい一実施形態において、前記発現構築物において、発現調節因子は、宿主細胞において機能的であるプロモーターと、場合により終止配列と、を含む。
【００３２】
さらなる好ましい一実施形態によれば、前記宿主細胞は、真菌細胞である。
【００３３】
さらに好ましい一実施形態において、真菌細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００３４】
第３の態様において、本発明は、前記核酸分子または発現構築物を含むベクターに関する。
【００３５】
第４の態様において、本発明は、フィターゼの酵素活性を有するタンパク質を製造する方法であって、以下：
ａ）宿主細胞に、以下：
ｉ）前記宿主細胞において機能的である発現調節因子；および
ｉｉ）前記因子に作動可能に連結され、かつ本明細書で定義されるフィターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
を含むベクターを導入するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた宿主細胞を、前記タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、ならびに場合により、
ｃ）ステップｂ）で製造された前記タンパク質を、前記細胞培養物から回収するステップ
を含む方法に関する。
【００３６】
さらなる一実施形態において、発現調節因子は、宿主細胞において機能的であるプロモーターと、場合により終止配列と、を含む。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞である。
【００３８】
さらなる特定の一実施形態において、酵母細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００３９】
本発明のさらに好ましい実施形態において、タンパク質の発現は、メタノール発現系を用いて行われる。
【００４０】
さらに別の好ましい実施形態において、ステップｄ）で回収されるタンパク質は、少なくとも１０００Ｕｎｉｔｓ／Ｌのフィターゼ活性を有する。
【００４１】
さらなる好ましい一実施形態において、前記回収ステップは、ｉ）分泌された前記タンパク質を培地から分離するステップおよび／またはｉ）前記タンパク質を前記宿主細胞から分離するステップを含む。
【００４２】
第５の態様において、本発明は、本発明による方法によって得られたタンパク質に関する。
【００４３】
さらなる一態様において、本発明は、本発明によるタンパク質または本明細書に記載の方法によって製造されたタンパク質の、動物飼料用添加物を製造するための使用に関する。
【００４４】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載のタンパク質を含む、または本明細書に記載の方法によって製造されたタンパク質を含む、動物飼料用添加物に関する。
【００４５】
以下の図面は、本発明の実施形態の例示であり、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲の限定を意味するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、変性アクリルアミドゲルによるフィターゼＡｐｐＡｓ−ｒ最適タンパク質の分子量測定（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：メタノール誘導なしの培養培地（レーン１）；メタノールを含む培養培地中のフィターゼＡｐｐＡｓ−ｒの発現（レーン２）；メタノールを含む培養培地中のフィターゼＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａの発現（レーン３）；ＭＷマーカー（レーン４）を示す。
【図２】図２は、温度（℃）に応じたフィターゼＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａタンパク質の酵素活性（％）および耐熱性の測定を示す。
【図３】図３は、ｐＨに応じたフィターゼＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａタンパク質の酵素活性の測定を示す。
【図４】図４は、ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａの酵素活性に対する、プロテアーゼペプシン（塗りつぶし菱形）およびトリプシン（塗りつぶし四角）の影響を示す。
【図５】図５は、ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａフィターゼ活性の経時的な保持を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、元のセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼ配列の野生型のヌクレオチド配列（配列番号２）と、Ｎ末端シグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含まないセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）ヌクレオチド配列（配列番号８）と、を示す。Ｎ末端シグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号４）は、灰色で強調表示されている。
【図６Ｂ】図６Ｂは、最適化された／改良されたセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼ（ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ／最適フィターゼ）のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、図６Ａの翻訳された配列（上方の配列）と図６Ｂの翻訳された配列（下方の配列）との間でのアミノ酸配列の比較を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、図６Ａの遺伝子配列（上方の配列）と図６Ｂの遺伝子配列（下方の配列）とのヌクレオチドの比較を示す。
【図７】図７は、野生型フィターゼおよび改良されたフィターゼ（最適フィターゼ）の発現プロファイルを示す。
【図８】図８は、改良されたフィターゼ（最適フィターゼ）および野生型フィターゼの経時（ｈ）的なフィターゼ生成（Ｕｎｉｔｓ／Ｌ）の比較を表すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
実施形態の詳細な説明
本発明は、全体として、フィターゼの酵素活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする新規でかつ改良された核酸配列、およびかかる酵素を宿主細胞において効果的に発現させるための方法に関する。
【００４８】
本発明を特定の実施形態に関して説明するが、この説明は限定的な意味で解釈されるべきではない。
【００４９】
本発明の例示的な実施形態を詳細に説明する前に、本発明を理解する上で重要な定義を示す。
【００５０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合に、「ａ」および「ａｎ」の単数形には、文脈上別段の明確な指示がない限り、それぞれの複数形も含まれる。
【００５１】
本発明の文脈において、「約」および「おおよそ」なる用語は、当該の特徴の技術的効果を依然として保証するものと当業者が理解する精度の間隔を示す。この用語は、典型的には、示された数値から±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、さらにより好ましくは±５％の偏差を示す。
【００５２】
「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる用語は、限定的ではないものと理解されるべきである。本発明において、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」なる用語は、「〜を構成要素とする（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」なる用語の好ましい一実施形態であると考えられるべきである。以下で、ある群が少なくともある特定の数の実施形態を含むものと定義される場合に、このことは、好ましくはこれらの実施形態のみからなる群も包含されることを意味する。
【００５３】
さらに、本明細書におけるおよび特許請求の範囲における「第１の」、「第２の」、「第３の」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」などの用語は、類似の要素を区別するために使用されるものであって、必ずしも逐次的な順序または時系列で記述するために使用されるものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で互換的であり、本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載または例示された順序とは異なる順序で実施されうるものと理解されるべきである。
【００５４】
「第１の」、「第２の」、「第３の」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」、「ｉ」、「ｉｉ」などの用語が、方法または使用またはアッセイの複数のステップに関する場合には、本明細書の上記または下記の適用において別段の指示がない限り、これらの複数のステップの間の時間または時間間隔は一貫しておらず、すなわち、これらの複数のステップは同時に実施されてもよいし、かかるステップの間に、数秒間、数分間、数時間、数日間、数週間、数か月間またさらには数年間の時間間隔があってもよい。
【００５５】
本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、試薬などは変更可能であるため、本発明はこれらに限定されるものではないと理解されるべきである。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。他に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。
【００５６】
上記目的は、本明細書に記載のおよび特許請求の範囲に記載の本発明による方法および手段によって解決される。本発明は、これらの要求に対処して、フィターゼ活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）の単離された遺伝子を得るための手段および方法を提供する。本発明はさらに、本発明による単離された遺伝子を宿主細胞において効果的に発現させ、次いで精製するための方法を提供する。
【００５７】
本明細書で使用される場合に、「遺伝子」なる用語は、ゲノム内に位置するとともに、発現の制御、すなわちコード部分の転写および翻訳の制御に関与する調節核酸配列を含みうる所定の領域を指す。遺伝子はさらに、他の５’非翻訳配列および３’非翻訳配列ならびに終止配列も含みうる。存在しうるさらなる要素は、例えばイントロンである。
【００５８】
本発明によるフィターゼ活性を有するタンパク質をコードする「単離された核酸分子」とは、ポリペプチドをコードする核酸の天然の供給源において元々会合している少なくとも１つの混在した核酸分子から特定されかつ分離される核酸分子を指す。ポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、天然に見出される形態または状態とは異なる。
【００５９】
したがって、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在しかつポリペプチドをコードする他の特定の核酸分子と区別することができる。しかし、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子には、細胞中に含まれるポリペプチドコード核酸分子であって、元々は、例えば該核酸分子が天然の細胞とは異なる染色体位置にあるポリペプチドを発現するものが包含される。
【００６０】
本明細書で使用される場合に、「突然変異」なる用語は、「突然変異体」の由来となる野生型のポリペプチドまたは核酸分子に対するポリペプチドまたは核酸分子におけるいかなる変更をも意味し、これには例えば、単一もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチドの変更、またはヌクレオチドおよびアミノ酸の双方の変更が含まれることができ、これには例えば、点突然変異、ヌル突然変異、フレームシフト突然変異が含まれ、そして、天然または非天然のヌクレオチドもしくはアミノ酸またはそれらの類似体を含みうる１つ以上の核酸またはアミノ酸の欠失または挿入または置換が含まれることができる。
【００６１】
本明細書で使用される場合の「核酸」または「核酸分子」とは、総じて、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖のいずれかの形態のポリマーを指す。この用語には、参照核酸と類似の結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸が包含されうる。特定の核酸配列には、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補的配列もが暗示的に包含されうる。「核酸」、「核酸配列」または「ポリヌクレオチド」なる用語は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用されることもできる。
【００６２】
本明細書で使用される「本発明の核酸」または「本発明の核酸分子」なる用語は、単独で使用されることもでき、また本明細書に記載の組成物または方法において使用されることもできる、ヌクレオチドの配列を示す。これらの用語は、本明細書で挙げられるフィターゼ活性を有するセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）由来のタンパク質またはポリペプチドの配列番号２によるコード配列全体を指す。さらに、これらの用語は、機能的タンパク質断片をコードする核酸、上記タンパク質のコード配列または機能的断片を含むベクター、および本明細書で言及される核酸の誘導体であって、１以上、例えば１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１〜５、１〜３、２または１のヌクレオチドの改変、すなわち欠失、付加、逆位などを有するが、それにもかかわらず、配列番号２によるセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼに関して記載されるフィターゼ活性を実質的に有するポリペプチドをコードする誘導体をも指す。本発明の核酸の機能的誘導体は、野生型ポリペプチドと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを上回るフィターゼ活性を有するフィターゼポリペプチドをコードする。
【００６３】
さらに、上記に示したように、「本発明の核酸」または「本発明の核酸分子」なる用語は、本明細書に記載の核酸を含むベクターをも指す。これらのベクターは、本明細書に記載の核酸の効率的な転写および翻訳を可能にする調節配列を含みうる。
【００６４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる用語には、これらに限定されるものでないが例えば、グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化といった修飾を含むポリマーも含まれうる。
【００６５】
本明細書で使用される「単離されたポリペプチド」なる用語は、本明細書に開示される様々なポリペプチドを示すとともに、その天然の環境の成分から特定および分離および／または回収されたポリペプチドをも意味する。しかし通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップにより準備される。
【００６６】
第１の態様において、本発明は、
ｉ）フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列を含む、または
ｉｉ）フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１によるヌクレオチド配列に対して少なくとも７８％の配列同一性を有する、
単離された核酸分子に関する。
【００６７】
本発明は、（ａ）フィターゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含む、単離された、合成または組換えの核酸分子を提供し、その際、この核酸は、配列番号１の核酸（ポリヌクレオチド）配列に対して少なくとも約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを上回るまたは完全な（１００％）配列同一性を有する配列を含む。さらなる好ましい一実施形態において、単離された核酸分子は、フィターゼをコードする配列番号１によるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００６８】
配列番号１とは、フィターゼ活性を有するセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）由来のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列を指す。この改良または最適化されたフィターゼヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を、本明細書では「ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ」または「最適フィターゼ」（配列番号１）と呼び、これを図６Ｂに示す：
配列番号１
【化１】
2018500928.tif 000003
【００６９】
本発明の一態様は、宿主細胞におけるタンパク質の発現を増強および改善するためのセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）野生型遺伝子配列における適切な突然変異を特定しかつ提供することである。突然変異が行われていないまたは改変されていない野生型ヌクレオチド配列は、国際公開第２０１１／１４１６１３号（ＷＯ  ２０１１／１４１６１３  Ａ２）に記載されており、ここに本明細書の一部を構成するものとして国際公開第２０１１／１４１６１３号（ＷＯ  ２０１１／１４１６１３  Ａ２）の内容を援用するものとし、この野生型ヌクレオチド配列を、本明細書では配列番号２と呼ぶ（図６Ａ参照）：
配列番号２
【化２】
2018500928.tif 000004
【００７０】
配列番号１による最適化されたセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼのヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列において２１１の点突然変異または改変が存在している点で、配列番号２による野生型ヌクレオチド配列と相違する。
【００７１】
配列番号１による最適化されたセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼのヌクレオチド配列は、野生型配列のＮ末端ペプチドシグナル配列をコードする配列番号４によるヌクレオチド配列を含まない。上記に示した配列番号２による野生型フィターゼ配列におけるシグナルペプチド配列は、灰色で強調表示されている。
【００７２】
シグナルペプチド配列を有しない野生型コード配列を、本明細書では配列番号８と呼ぶ。
【００７３】
配列番号１の配列と配列番号２の配列との配列の比較を、図６Ｅに示す。配列アライメントにおける各ミスマッチは、元の配列に関するヌクレオチドが別のヌクレオチドに変更された、突然変異されたまたは改変された位置に相当する。
【００７４】
図６Ｅによる配列アライメントを参照すると、配列番号１による最適化されたセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼのヌクレオチド配列は、このヌクレオチド配列における２１１の点突然変異または改変の点で、配列番号８による野生型ヌクレオチド配列と相違する。
【００７５】
配列番号１によるヌクレオチド配列の発現は、図６Ｃに示すセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼのポリペプチド配列をもたらす（配列番号３）。配列番号３は、成熟フィターゼタンパク質のポリペプチド配列に相当する。図６Ｄの配列アラインメントにおいて見られるように、配列番号１の翻訳されたポリペプチド配列と、配列番号２の翻訳されたポリペプチド配列とは、１００％の同一性を有しており、すなわち、配列番号１において示された２１１の突然変異のいずれによっても、結果として、コードされるアミノ酸のうちの１つの交換も生じなかった。
【００７６】
好ましくは、本発明の意味における「改変」または「突然変異」なる用語は、野生型配列のヌクレオチド位置の変更を指し、これは、所与のアミノ酸のコドンの変更により、コードされるアミノ酸の交換が生じることがなく、したがって、コドンを調節するまたはコドンを最適化するヌクレオチドの交換を指す。
【００７７】
認識されるように、コドン最適化は、一般に、所与の核酸配列の発現が行われる、すなわち対応するタンパク質への翻訳が行われる特定の宿主生物におけるコドンの使用に基づく。本明細書に記載のセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼタンパク質をコードする核酸のコドン最適化では、コドンの相対頻度、最適化されたＧＣ含量およびｍＲＮＡの不安定性が考慮される。
【００７８】
一般に、「パーセント同一性」（％）とは、２つの配列（ＤＮＡ、アミノ酸など）間の類似性の定量的測定値の一つを指す。所与の配列について、密接に関連する種は、より関連性の低い種よりも高いパーセント同一性を有することが予想され、したがって、ある程度のパーセント同一性は、類縁性を示す。パーセント同一性は、ペア内の一致の数に１００を乗じ、これを、整列した領域（ギャップ含む）の長さで除すことによって算出される。同一性のスコアリングでは、完全一致がカウントされるだけであり、アミノ酸同士の類似度は考慮されない。算出の際には、内部ギャップのみを長さに含め、配列末端のギャップは長さに含めない。
【００７９】
パーセント同一性＝（一致×１００）／整列した領域の長さ（ギャップ含む）。
【００８０】
本明細書で特定されるフィターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１による核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」とは、最大のパーセント配列同一性を達成すべく、配列を整列させ、そして必要に応じてギャップを導入した後の配列番号１による核酸配列中のヌクレオチドと同一である、候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージと定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的での整列は、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いることにより、従来技術の範囲内の様々な方法で達成されることができる。
【００８１】
例えば、パーセント核酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定されることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖよりダウンロード可能であり、またアメリカ国立衛生研究所（メリーランド州ベセスダ）より得ることもできる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２ではいくつかの検索パラメータが使用され、そうした検索パラメータのすべてが、例えばｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ  ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ  ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ  ｆｏｒ  ｆｉｎａｌ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５およびｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２のデフォルト値に設定されている。
【００８２】
ここで、所与の核酸配列の長さ、すなわちＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ配列（配列番号１）の長さが、比較核酸配列の長さと等しくない場合には、パーセント同一性は以下のように算出される。
【００８３】
１．ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ（配列番号１）が、比較ＤＮＡよりも短い：
ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（長さ＝１４ｎｔ）
比較ＤＮＡ                    ＮＮＮＮＮＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（長さ＝１６ｎｔ）
（配列の長さは、例示的なものである）
％核酸配列同一性＝（例えばＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２によって決定されるこれら２つの核酸配列間で同一に一致するヌクレオチドの数）×１００÷（ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ核酸配列のヌクレオチドの全数）＝６×１００÷１４＝４２．９％。
【００８４】
２．ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ（配列番号１）が、比較ＤＮＡよりも長い：
ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（長さ＝１２ｎｔ）
比較ＤＮＡ                    ＮＮＮＮＮＮＸＸＸＹＹ（長さ＝９ｎｔ）
（配列の長さは、例示的なものである）
％核酸配列同一性＝（例えばＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２によって決定されるこれら２つの核酸配列間で同一に一致するヌクレオチドの数）×１００÷（ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ核酸配列のヌクレオチドの全数）＝４×１００÷１２＝３３．３％。
【００８５】
したがって、参照配列（ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ核酸配列）の長さによって、整列した領域の長さが決まる。この原則はポリペプチド配列の比較にも適用されうることが理解されよう。
【００８６】
本明細書で使用される場合の「フィターゼ活性を有するタンパク質」または「フィターゼ」なる表現はいずれも、フィチン酸（ＩＰ６）またはフィテートからのリン酸基の解離を触媒するメソイノシトールヘキサホスフェートホスホヒドロラーゼを指す。この酵素反応の結果、遊離リン酸基と、イノシトールリン酸のエステル（ＩＰ５〜ＩＰ１）とが生じる。一般に、フィターゼは２つの群に分類されることができ、すなわち、イノシトール環のＣ１もしくはＣ３に位置するリン酸基の加水分解を開始する、微生物もしくは真菌フィターゼ（ＥＣ  ３．１．３．８）または３−フィターゼか、あるいは、好ましくはイノシトール環のＣ６に位置するリン酸基の加水分解を開始する、植物フィターゼ（ＥＣ  ３．１．３．２６）または６−フィターゼに分類されることができる。
【００８７】
したがって、本明細書で使用される場合の「フィターゼ活性」とは、フィチン酸（ＩＰ６）またはフィテートからのリン酸基の加水分解の酵素反応を指す。一実施形態において、酵素フィターゼ活性とは、配列番号２によるセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）タンパク質に関して記載したフィターゼ活性である。
【００８８】
本発明では、フィターゼ活性を測定することも企図される。例えば、フィターゼ活性は、国際公開第２０１１／１４１６１３号（ＷＯ  ２０１１／１４１６１３  Ａ２）に記載のまたは本明細書の例３に記載のアッセイを用いて測定されることができ、その際、バナジン酸−モリブデン酸法を用いて、フィターゼ酵素により遊離された遊離リン酸またはリンの濃度を測定することにより、比活性を評価した。
【００８９】
この方法は、ＡＰＨＡ標準法４５００−Ｐ  Ｃに基づく。酸中で、オルトリン酸イオンがモリブデン酸アンモニウムおよびバナジン酸アンモニウムと反応して黄色のリンバナドモリブデン酸アンモニウムが作られ、これを４１５ｎｍで測光分析することができる。黄色の強度は、リン酸濃度に比例する。しかし本発明では、フィターゼ活性を測定または決定するための、当業者のルーチンの範囲内である他の方法またはアッセイも想定される。別の方法は、モリブデンブルー法である。酸性培地中で、オルトリン酸塩がモリブデン酸アンモニウムと結合して、モリブドリン酸が作られる。還元剤を用いると、これはリン−モリブデンブルー化合物を形成する。色素強度の測光を、８８０ｎｍで行うことができる。
【００９０】
特定の一態様において、本発明は、Ｎ末端シグナル配列および／または開始メチオニンを有しておらず、かつ、本明細書で上記に記載したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる、核酸配列を提供する。
【００９１】
セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）野生型遺伝子のＮ末端シグナルペプチド配列は、配列番号４によるヌクレオチド配列によって、および配列番号５によるアミノ酸配列によって、定義される。
【００９２】
配列番号４：
【化３】
2018500928.tif 000005
【００９３】
配列番号５：
【化４】
2018500928.tif 000006
【００９４】
本発明の発明者らは、２６ＡＡシグナルペプチドを含む図６に示す完全長のセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）野生型フィターゼ遺伝子（配列番号２）の発現によって不安定なタンパク質が生じ、このタンパク質が発現後に急速に消失したことを観察した。したがって本発明の発明者らは、２６ＡＡシグナルペプチドを省くことによって、増強された発現が生じることを観察した（例１参照）。
【００９５】
特定の一実施形態において、本発明は、適切な宿主細胞発現系における発現のために最適化されたＡｐｐＡｓ−ｒ配列を示す。最適化された配列は、宿主細胞生物のコドン使用頻度の偏りを考慮したものである。一実施形態において、本明細書に記載のフィターゼ活性を有するタンパク質をコードする所定の核酸配列中の各アミノ酸について、最も好ましいまたは最も頻度の高いコドンが使用される。あるいは、部分的に最適化された配列、すなわち核酸配列のコドンの一部が最も好まれるコドンに適合された配列を、提供すれば十分でありうる。いくつかの実施形態において、ＡｐｐＡｓ−ｒ配列中のいくつかの特定のアミノ酸のコドンを最適化すれば十分である。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態は、野生型ＡｐｐＡｓ−ｒ核酸配列のコドンの、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変されたヌクレオチド配列に関する。さらに好ましい実施形態において、核酸配列中のコドンの、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％または少なくとも５９％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変される。さらに好ましい実施形態において、野生型核酸配列のコドンの、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％または少なくとも６９％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変される。さらに好ましい実施形態において、野生型核酸配列のコドンの、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％または少なくとも７９％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変される。さらに好ましい実施形態において、核酸配列中のコドンの、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％または少なくとも８９％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変される。さらに好ましい態様において、野生型核酸配列のコドンの、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変される。
【００９７】
好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、コドンが最適化された突然変異が存在する点で、対応する配列番号８による野生型フィターゼのヌクレオチドコード配列と相違する。
【００９８】
本発明による「コドンが最適化された突然変異」とは、アミノ酸配列の変更を生じないコード配列へのサイレント突然変異を指す。本発明によるコドンが最適化された突然変異を含む新規なフィターゼのヌクレオチド配列の使用は、従来技術のフィターゼ配列に対して次のような驚くべき技術的利点を有し、すなわち、アミノ酸配列の変更によりフィターゼ活性に悪影響が生じることなく、所与の宿主細胞生物における改善された発現が可能であり、したがって、生じるフィターゼタンパク質の構造または機能が保存される、という利点を有する。
【００９９】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、配列番号８による野生型フィターゼのヌクレオチドコード配列の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変されるヌクレオチド配列に関する。さらに好ましい実施形態において、配列番号８による野生型フィターゼのヌクレオチドコード配列のコドンの、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％または５９％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変される。さらに好ましい実施形態において、配列番号８による野生型フィターゼのヌクレオチドコード配列のコドンの、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％または６９％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変される。さらに好ましい実施形態において、配列番号８による野生型フィターゼのヌクレオチドコード配列のコドンの、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％または７９％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変される。さらに好ましい実施形態において、配列番号８による野生型フィターゼのヌクレオチドコード配列のコドンの、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変される。さらに好ましい実施形態において、配列番号８による野生型フィターゼのヌクレオチドコード配列のコドンの、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が、宿主細胞生物により最も好まれるコドンに改変される。
【０１００】
いくつかの実施形態において、単離された核酸配列は、宿主細胞生物に関してコドンが最適化された突然変異を、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０、含む。
【０１０１】
本発明のなおもさらなる実施形態において、単離された核酸配列は、宿主細胞生物に関してコドンが最適化された突然変異を、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００、含む。
【０１０２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、単離された核酸配列は、宿主細胞生物に関してコドンが最適化された突然変異を、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００または少なくとも２１０、含む。
【０１０３】
最も好ましい実施形態において、単離された核酸配列のすべてのコドンが、宿主細胞生物に関してコドン最適化されている。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、すべてのアミノ酸位置の９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％および９０％が、宿主細胞の最も好まれるコドンを使用する。
【０１０５】
さらなる特定の実施形態において、核酸配列は、メチロトローフ酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるコドン使用頻度の偏りを考慮して最適化されている。さらに以下の例５に記載した特定の実施形態において、元のコドンを１つずつ解析し、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における各アミノ酸についての最も好まれるコドンに変更した。Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるコドン使用頻度の偏りについては、以前に、Ｂａｉら（Ｂａｉ  Ｊ．，  Ｓｗａｒｔｚ  Ｄ．Ｊ．，  Ｐｒｏｔａｓｅｖｉｃｈ  Ｉ．Ｉ．，  Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔｔｅ  Ｃ．Ｇ．，  Ｈａｒｒｅｌｌ  Ｐ．Ｍ．，  Ｈｉｄｅｂｒａｎｄｔ  Ｅ．，  Ｇａｓｓｅｒ  Ｂ．，  Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ  Ｄ．，  Ｗａｒｄ  Ａ．，  Ｃｈａｎｇ  Ｇ．  ａｎｄ  Ｕｒｂａｔｓｃｈ  Ｉ．Ｌ．  （２０１１）  Ａ  ｇｅｎｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｈａｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．  ＰＬｏｓＯｎｅ  ６：１−１５）、Ｓｉｎｃｌａｉｒら（Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ｇ．  ａｎｄ    Ｃｈｏｙ  Ｆ．Ｙ．Ｍ．  （２００２）  Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｂｉａｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２６  ：９６−１０５）およびＨｕａｎｇら（Ｈｕａｎｇ  Ｈ，  Ｙａｎｇ  Ｐ，  Ｌｕｏ  Ｈ，  Ｔａｎｇ  Ｈ，  Ｓｈａｏ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  １，３−１，４−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｂｙ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７８：  ９５−１０３）により記載されている。
【０１０６】
「発現構築物」または「発現カセット」なる用語は、本明細書において互換的に使用されることができ、適切な宿主細胞中での特定のヌクレオチド配列の発現を指示しうる核酸配列を指し、これは、終結シグナルに作動可能に連結される目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。これは、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含む。このコード領域は、通常は目的のタンパク質をコードする。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、これは、その成分の少なくとも１つが、その成分の他のものの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットは、天然に存在するものであってもよいが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。しかし、典型的には、発現カセットは、宿主に対して異種であり、すなわち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は、宿主細胞中に天然には存在せず、形質転換イベントにより宿主細胞または宿主細胞の祖先に導入されている必要がある。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターの、または宿主細胞がある特定の外部刺激に曝されている場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの、制御下にあることができる。一実施形態において、発現ベクターは、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いた発現のために作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む。
【０１０７】
本明細書で使用される場合の「異種」とは、「異なる天然起源の」を意味するか、または非天然状態を表す。例えば、宿主細胞が、別の生物、特に別の種に由来する核酸配列で形質転換された場合に、その核酸配列は、その宿主細胞に対して異種であり、またその核酸配列を保持する宿主細胞の子孫に対しても異種である。同様に、異種とは、同一の天然の元の種類の細胞ではあるが、非天然の状態で存在しており、例えば異なるコピー数で存在するか、または異なる調節因子の制御下に存在する種類の細胞に由来した、およびこうした種類の細胞に挿入されたヌクレオチド配列を指す。
【０１０８】
「調節因子」とは、総じて、ヌクレオチド配列の発現の達成に関与する配列を指す。調節因子は、一般に、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターと、終結シグナルとを含む。これらはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を包含する。原核生物に適した「調節因子」には、例えばプロモーター、場合によりオペレーター配列およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【０１０９】
本明細書で使用される場合の「作動可能に連結された」なる用語は、ある核酸配列が別の核酸配列と機能的な関係にあることを意味する。例えば、プレ配列用または分泌リーダー用のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に作動可能に連結され；また、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合には、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が連続していること、そして分泌リーダーの場合には、連続しておりかつ読み枠内にあることを意味する。エンハンサーは、必ず連続しているとは限らない。連結は、都合のよい制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合には、一般的な慣行にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたは合成オリゴヌクレオチドリンカーが使用される。
【０１１０】
種々の発現系における本発明による最適化されたフィターゼ遺伝子の発現のために適した「発現ベクター」または「発現プラスミド」は、十分に従来技術の範囲内である。例えば酵母ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に適した発現ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、ｐＰＩＣシリーズのベクターが挙げられる。これらのベクターでは、メタノールで誘導可能なＡＯＸ１プロモーターが使用される。発現プラスミドは、発現されるタンパク質の分泌のために、酵母ゲノムおよびシグナル配列に外来ＤＮＡを挿入するための因子を含むことができる。
【０１１１】
本発明による最適化されたフィターゼタンパク質は、任意の適切な宿主細胞タンパク質発現系において発現されることができる。一般的に使用されるタンパク質発現系としては、例えば細菌、酵母、バキュロウイルス／昆虫および哺乳動物細胞に由来するもの、ならびに糸状菌、例えば商業的に重要な真菌であるマイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）に由来するものが挙げられる。適切な細菌系としては、これらに限定されるものではないが例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）が挙げられる。真核生物発現系としては、例えば酵母系、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはクルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。本発明では、他の真菌の発現系の使用も企図され、例えば糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）およびマイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、最近になって多様な工業用酵素の製造に関して記載されたＣ１の使用も企図される。さらなる真核生物発現系としては、例えばバキュロウイルス感染細胞、例えば感染された昆虫細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、ハイファイブ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）株または哺乳類細胞、例えばＨｅＬａおよびＨＥＫ  ２９３が挙げられ、これによっても、酵母または原核細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））を用いた発現が不可能なグリコシル化タンパク質の発現が可能となる。これは、多量のタンパク質の発現に極めて有用な系である。さらなる適切な真核生物発現系としては、溶解性バキュロウイルス発現系の代替物としての非溶解性昆虫細胞発現系、原生動物リーシュマニア・タレントレ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）（非病原性株）発現系および植物系（例えばタバコ）および哺乳動物系、例えばボス・プリミゲニウス（Ｂｏｓ  ｐｒｉｍｉｇｅｎｉｕｓ）（ウシ）、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）、チャイニーズハムスター卵巣、ヒト胚性腎細胞およびベビーハムスター腎臓も挙げられる。
【０１１２】
さらに好ましい一実施形態において、真菌細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である（Ｃｒｅｇｇ  ＪＭ，  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ＪＬ，  Ｓｈｉ  Ｊ，  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＲ  （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０００）．  ”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ”．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６  （１）：  ２３−５２参照）。本明細書に記載のタンパク質の発現に適したピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株としては、例えばＧＳ  １１５、Ｘ３３またはＫＨ７１Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  １６００  Ｆａｒａｄａｙ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ９２００８，  ＵＳＡ）が挙げられる。好ましい一実施形態において、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株は、ＫＨ７１Ｈである。
【０１１３】
本発明の新規なフィターゼヌクレオチド核酸分子の発現のために、該核酸分子または本明細書で例に記載されるような発現構築物を含む適切な発現ベクターに、遺伝子がクローニングされる。
【０１１４】
本発明は、フィターゼの酵素活性を有するタンパク質の製造方法であって、以下：
ａ）宿主細胞に、以下：
ｉ）前記宿主細胞において機能的である発現調節因子；および
ｉｉ）前記因子に作動可能に連結された本明細書で定義される核酸分子；
を含む発現ベクターを導入するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた宿主細胞を、前記タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、ならびに場合により、
ｃ）ステップｂ）で製造された前記タンパク質を、前記細胞培養物から回収するステップ
を含む方法に関する。
【０１１５】
発現ベクターを導入するステップは、一般に「形質転換」として知られており、これは、その周囲から外因性遺伝物質（外因性ＤＮＡ）を直接取り込んで組み込み、そしてこれが１つ以上の細胞膜を通って取り込まれることにより生じる細胞の遺伝的変化として定義される。発現ベクターまたは発現構築物で所与の宿主細胞を形質転換するための方法および最適な条件は、一般に宿主細胞に依存し、かつ従来技術の範囲内である。したがって、当業者は、宿主細胞中で発現を誘導しかつ適切な培地中で宿主細胞を培養するための特定の条件を熟知している。
【０１１６】
「回収」および「精製」なる用語は、本明細書において互換的に使用されることができ、純粋なまたは実質的に純粋な量のポリペプチドを得るべく、発現されたポリペプチドを培養物から分離すること、すなわち、培養物中の宿主細胞の他のタンパク質および／または脂質および／または核酸および／または成分から分離することを指す。本発明の意味においては、前記回収ステップは、ｉ）分泌されたタンパク質を培地から分離すること、および／またはｉ）宿主細胞からタンパク質を分離することを含む。
【０１１７】
特定の一実施形態において、本発明の最適化されたフィターゼタンパク質は、酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で発現される。酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における組換えタンパク質の製造は、他の真核生物および原核生物の発現系に対していくつかの利点を有し、すなわち、高い成長速度、高い細胞密度での発酵、ほぼ無タンパク質の培地における製造；エンドトキシンおよびバクテリオファージ汚染の排除、例えばポリペプチドのフォールディング、グリコシル化、メチル化、アシル化、タンパク質分解の調整および細胞内コンパートメントへの標的化といった多様な翻訳後修飾；および成長培地からの容易な精製といった利点を有する。
【０１１８】
ほとんどのＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現系は、メタノール誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターをベースとする（Ｒｏｍａｎｏｓ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｓｃｏｒｅｒ，  Ｃ．  Ａ．，  ＆  Ｃｌａｒｅ，  Ｊ．  Ｊ．  （１９９２）．  Ｙｅａｓｔ，  ８，  ４２３−４８８参照）。メタノールによる誘導の際に、アルコールオキシダーゼを構成要素とする全可溶性タンパク質の画分は、典型的には３０％に上昇しうる。一般的に使用されるＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクターは、以下の因子を含む：（１）５’−ＡＯＸ１（目的の遺伝子の上流のアルコールオキシダーゼプロモーター）；（２）ＳＩＧ（分泌シグナル配列）；（３）ＭＣＳ（マルチクローニング部位）；（４）ＴＴ（転写終結部位）；（５）ＨＩＳ４（ヒドロキシヒスチジナーゼによる選択のためのマーカー）；（６）Ａｍｐｒ（アンピシリンによる選択のため）；および（７）ＣｏｌＢ１（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド増殖のための複製因子）（Ｌｉ，  Ｐ．  Ｚ．，  Ｇａｏ，  Ｘ．−Ｇ．，  Ａｒｅｌｌａｎｏ，  Ｒ．  Ｏ．，  ＆  Ｒｅｎｕｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｖ．  （２００１）．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ２２，  ３６９−３８０参照）。
【０１１９】
発現Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）にさらに適した市販のベクター系としては、例えばｐＰＩＣＺα  Ａ、ｐＰＩＣＺα  ＢおよびｐＰＩＣＺα  Ｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入したＰｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｋ１７１０−０１またはＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（登録商標）Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｎｏ．  Ｋ１７４０−０１）が挙げられ、これらは、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）を用いた組換えタンパク質の選択をベースとする。
【０１２０】
さらなる一態様において、本発明は、本発明による方法によって得られたタンパク質に関する。本明細書に記載の方法論によって、配列番号３のポリペプチド配列によるコドンが最適化されたセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼタンパク質が製造される。設計されかつ最適化されたセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）遺伝子の発現された遺伝子産物は、最初の２６のアミノ酸を有しない成熟タンパク質に相当し、すなわち、図１中のＳＤＳゲルにおいて分かるように、細胞におけるシグナルペプチドの切断後に、このタンパク質は約４５〜４６ｋＤの分子量を有しており、このことは、同一の発現条件でかつ同一のサンプルローディングで、ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ遺伝子の発現レベルがＡｐｐＡｓ−ｒ遺伝子のそれよりもかなり高いことを示している。
【０１２１】
例５と図７および図８とによって証明される通り、驚くべきことに、コドンが最適化された配列である配列番号１を使用することによって、配列番号２または配列番号８による対応する野生型フィターゼ配列の発現と比較して改善された発現が生じることが判明した。これに関して、例５は、対応する野生型フィターゼ配列の発現が１４３Ｕｎｉｔｓ／Ｌ（Ｕ／Ｌ）を上回らないのに対して、最適フィターゼは、最大で２９９７３Ｕｎｉｔｓ／Ｌの量まで発現されうること実証している。例５は、それぞれの酵母宿主細胞ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるコドン使用頻度を考慮した最適な配列にした突然変異が、増加されたおよび効果的なタンパク質発現に大いに寄与し、その際、発現されたタンパク質の量および発現速度が増加することを実証している。したがって、最適化されたセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）フィターゼ配列の発現によって、大いに改善されたタンパク質の発現が生じた。
【０１２２】
特定の好ましい実施形態において、単離された核酸配列の発現は、本明細書に記載のＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現系中で行われる。
【０１２３】
本発明のなおもさらなる実施形態において、タンパク質発現を、本明細書中で例１または例５において例示的に記載されているようなメタノール発現系を使用して行い、かつ、フィターゼ活性を、例３に記載の酸性培地（ＩＳＯ  ３０００２４：２００９（Ｅ））中でバナジン酸−モリブデン酸法を用いてＵ／Ｌで測定した。
【０１２４】
好ましい実施形態において、本発明による方法は、改善された発現をもたらし、その際、タンパク質は、本明細書に記載の方法を用いて測定した場合に、少なくとも２５０Ｕ／Ｌ、少なくとも５００Ｕ／Ｌ、少なくとも７５０Ｕ／Ｌまたは少なくとも１０００Ｕ／Ｌのフィターゼ活性を有する。
【０１２５】
好ましい実施形態において、本発明による方法によって、改善された発現が生じ、その際、タンパク質は、本明細書に記載の方法を用いて測定した場合に、少なくとも１５００Ｕ／Ｌ、少なくとも２０００Ｕ／Ｌ、少なくとも２５００Ｕ／Ｌ、少なくとも３０００Ｕ／Ｌ、少なくとも３５００Ｕ／Ｌ、少なくとも４０００Ｕ／Ｌ、少なくとも４５００Ｕ／Ｌ、少なくとも５０００Ｕ／Ｌ、少なくとも５５００Ｕ／Ｌ、少なくとも６０００Ｕ／Ｌ、少なくとも６５００Ｕ／Ｌ、少なくとも７０００Ｕ／Ｌ、少なくとも７５００Ｕ／Ｌ、少なくとも８０００Ｕ／Ｌ、少なくとも８５００Ｕ／Ｌ、少なくとも９０００Ｕ／Ｌ、少なくとも９５００Ｕ／Ｌまたは少なくとも１００００Ｕ／Ｌのフィターゼ活性を有する。さらに別の好ましい実施形態において、本発明による方法によって、改善された発現が生じ、その際、タンパク質は、本明細書に記載の方法を用いて測定した場合に、少なくとも１１０００Ｕ／Ｌ、少なくとも１２０００Ｕ／Ｌ、少なくとも１３０００Ｕ／Ｌ、少なくとも１４０００Ｕ／Ｌ、少なくとも１５０００Ｕ／Ｌ、少なくとも１６０００Ｕ／Ｌ、少なくとも１７０００Ｕ／Ｌ、少なくとも１８０００Ｕ／Ｌ、少なくとも１９０００Ｕ／Ｌまたは少なくとも２００００Ｕ／Ｌのフィターゼ活性を有する。
【０１２６】
さらに、例３において、最適化されたセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）のフィターゼ配列を、温度、ｐＨ、プロテアーゼの存在および経時的なフィターゼ活性の保持に応じたフィターゼ活性に関して分析した。驚くべきことに、例３の結果によって、本発明による方法によって得られた、コドンが最適化されたセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）のフィターゼタンパク質が、改善されたフィターゼ活性を有する特に安定なタンパク質を生じることが判明した。
【０１２７】
本発明によってさらに、動物飼料用添加物を製造するための、本発明による、または本明細書に記載の方法によって製造された、タンパク質の使用が企図される。
【０１２８】
本明細書に記載の方法によって発現される最適化されたフィターゼタンパク質は、以下の特性を有する：
ａ）約４５〜４７ｋＤａの、好ましくは約４６ｋＤａの、分子量；
ｂ）２．０〜９の、好ましくは２．５〜８の、さらにより好ましくは３．０〜７の、そして最も好ましくは３．３〜５．８の、ｐＨ最適値；
ｃ）４０℃〜５５℃の、好ましくは５０℃の、酵素活性；
ｄ）５００Ｕ／ｍｇ超の、好ましくは６００Ｕ／ｍｇ超の、７００Ｕ／ｍｇ超の、８００Ｕ／ｍｇ超の、９００Ｕ／ｍｇ超のまたは１０００Ｕ／ｍｇ超の、より好ましくは約１１２０±１５０Ｕ／ｍｇの、高い比活性；
ｅ）プロテアーゼに対する高い耐性、好ましくはペプシンおよびトリプシンに対する耐性；
ｆ）９．３の等電点。
【０１２９】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載のタンパク質を含む、または本明細書に記載の方法によって製造されたタンパク質を含む、動物飼料用添加物に関する。この添加物は、固体ベースまたは液体ベースで適切に調製されることができる。この添加物は、一般に固体もしくは液体の添加物調製物に使用され、または一般に動物飼料の調製に使用される他の酵素調製物をさらに含むことができる。この動物飼料用添加物は、同化と、フィテートからの遊離リンの酵素による遊離とに十分な有効量のフィターゼを含むことができる。
【０１３０】
例
例１：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現
１．発現ベクターの構築
成熟タンパク質のコード領域を単離するために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
【化５】
2018500928.tif 000007
【０１３１】
成熟タンパク質のコード領域を、これらのオリゴヌクレオチドＳｅｒｒＦおよびＳｅｒｒＲを用いて増幅した。増幅産物をアガロースゲル上で可視化し、予想サイズのバンドを切り出し、このゲルから、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ  Ｋｉｔ  （Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてＤＮＡを抽出した。
【０１３２】
精製されたＤＮＡを、オリゴヌクレオチドによって生成されたＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩの制限部位を介してベクターｐＰＩＣＺα  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）に挿入した。ＳｅｒｒＦにおけるＥｃｏＲＩ制限部位およびＳｅｒｒＲにおけるＸｂａＩ制限部位は、太字で強調表示されている。挿入された精製ＤＮＡを含むこの構築物をＤＨ５α細胞に形質転換し、続いてこれを、２５μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎを含むＬＢ培地上にプレーティングした。陽性のコロニーを採取し、得られたベクターを配列決定に供した。酵母の形質転換のためのＤＮＡを得ることを目的として、正確な配列を有する陽性クローンを大量に培養した。
【０１３３】
２．酵母の形質転換およびタンパク質の発現
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＨ７１Ｈ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＹＰＤ培地で培養し、形質転換のために調製した。プラスミドｐＰＩＣＺα  Ａ  ＡｐｐＡｓ−ｒ  １０μｇを、ＰｍｅＩ制限酵素によって直線化し、リチウム／ポリエチレンを含むストックによって酵母細胞に導入した。
【０１３４】
形質転換された酵母細胞を、１００μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎを含むＹＰＤＺ培地上にプレーティングした。このＺｅｏｃｉｎによって、遺伝子Ｓｈ  ｂｌｅ（この遺伝子Ｓｈ  ｂｌｅの産物によって、Ｚｅｏｃｉｎに対する耐性がもたらされる）を宿主染色体ＤＮＡに組み込んだコロニーを選択することができた。遺伝子Ｓｈ  ｂｌｅを組み込んだ形質転換体のみが、ＹＰＤＺ培地で成長しうる。２日後、これらの形質転換体を播種し、グリセロールを含有する最少培地（ＢＭＧＹ）で２４時間培養し、次いで、これらの酵母を遠心分離（２，５００ｇ、３分間）により回収し、フィターゼ遺伝子の発現の誘導のために０．５％メタノールを含む培地（ＢＭＭＹ）中に再懸濁させた。
【０１３５】
３．形質転換体のフィターゼ活性の定量化
合計で６１の形質転換体を、酸性培地（ＩＳＯ  ３０００２４：２００９（Ｅ））中でモリブデン酸−バナジン酸法を用いてフィターゼ活性に関して解析し、かつ定量化した。
【０１３６】
１，１６０μｌの基質溶液（２５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液中の５ｍＭ  フィチン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）を、酵素の希釈溶液４０μｌに添加した。反応を、３７℃で３０分間行った。続いて、反応を停止させるため、この溶液に、停止液（硝酸１４％；ヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物３．３％、バナジン酸塩０．０７８％）８００μｌを加えた。対照として、不活性化のために、酵素の希釈溶液にこの停止液を添加し、次いで、これを基質溶液に添加した。１０分後、黄色の色強度を４１５ｎｍで定量化し、酵素溶液の活性とそれぞれの対照溶液の活性とを定量化した。フィターゼ活性の１単位は、１分間当たり１μｍｏｌのリンを遊離する酵素の量と定義される。メタノール誘導の２日後に、６１の形質転換体のうち６つが、培養培地中で１０〜５５Ｕ／ｍｌ生成された。得られた遺伝子は、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子である。このフィターゼ活性を有するポリペプチドを、ＡｐｐＡｓ−ｒと命名した。
【０１３７】
例２：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現されたＡｐｐＡｓ−ｒポリペプチドの精製
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において生成されたフィターゼを精製するために、５５Ｕ／ｍｌの活性を有する形質転換体を培養し、最適な条件で誘導した。メタノールを用いた誘導の４日後に、前例と同一の方法を用いてフィターゼ活性を測定したところ、上清の活性は１６３Ｕ／Ｌであった。この上清は、１４，１００×ｇで５分間の遠心分離により得たものである。沈殿した細胞を廃棄した。
【０１３８】
この上清は、ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（５０，０００  ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｕｄｉｕｍ））を用いた遠心分離により得たものである。その後、濃縮溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液（０．２５Ｍ、ｐＨ５．５）で透析した。最後に、透析に使用したのと同一の緩衝液を用いたゲルろ過（セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００）を使用して、フィターゼを精製した。
【０１３９】
例３：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現されたＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａの特性決定
１．分子量の測定
フィターゼＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａの分子量を、変性アクリルアミドゲルを用いて決定した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。図１に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【０１４０】
１）第１のレーンは、対照標準（メタノール誘導なしの培養培地）に相当し、
２）第２のレーンは、メタノールを含む培養培地中でのフィターゼＡｐｐＡｓ−ｒの発現に相当し、
３）第３のレーンは、メタノールを含む培養培地中でのフィターゼＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａの発現に相当し、かつ
４）第４のレーンは、分子量マーカーに相当する。
【０１４１】
レーン１、２および３に、同一の体積のサンプルをロードした。
【０１４２】
図１から分かるように、ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａの分子量は約４６ＫＤａであり、これは、クローニングされたＤＮＡ配列に由来するポリペプチド配列の推定分子量と一致する。また、このＳＤＳゲルからは、同一の発現条件でかつ同一のサンプルローディングで、ＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａの遺伝子の発現レベルがＡｐｐＡｓ−ｒ遺伝子のそれよりも大いに高いことも分かる。
【０１４３】
２．温度に応じたＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａの酵素活性の測定
図２から分かるように、酵素活性は温度とともに変化する。最適な温度を、ｐＨ５．５で測定した。このｐＨは、ＩＳＯ  ３０００２４：２００９  （Ｅ）により要求される通りのｐＨである。３５℃〜８５℃の温度範囲で、活性を試験した。５０℃で、最大活性が測定された。図２に示すように、６０℃で１０分後に、酵素は依然としてその活性の４０％を保持する。
【０１４４】
３．ｐＨに応じたＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａの酵素活性の測定
フィターゼ活性に対するｐＨの影響を、以下の緩衝液を用いて試験した：ｐＨ１．５〜３．５についてはグリシンＨＣｌ；ｐＨ３．５〜６．０については酢酸ナトリウム；ｐＨ６．０〜８．５についてはＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．５〜１０．０についてはグリセリン−ＮａＯＨ。いずれの緩衝液も、ＩＧＰＡＬ  ０．０５％を含有していた。
【０１４５】
図３から分かるように、酵素活性はｐＨとともに変化する。ｐＨ５．０で最大活性が観察された。ｐＨ４．０では依然として７０％の活性が維持されるのに対して、ｐＨ５．５では８０％超の活性が維持される。
【０１４６】
４．酵素活性に対するプロテアーゼの影響
プロテアーゼに対する耐性を調べるために、精製されたＡｐｐＡｓ−ｒ  ｏｐｔｉｍａ（１．６ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃で、５ｍｇ／ｍｌのペプシンまたは５０ｍｇ／ｍｌのトリプシンと共にインキュベートした。異なるインキュベーション時間（５分間；１０分間；１５分間；３０分間および６０分間）でのインキュベーション後、残ったフィターゼ活性をサンプルにおいて定量化した。図４に見て取れるように、ペプシンと共にインキュベーションした１時間後に、フィターゼＡｐｐＡｓ−ｒはその初期活性の７０％超（７３％）を保持し、トリプシンと共にインキュベーションした１時間後に、フィターゼＡｐｐＡｓ−ｒはその初期活性の９０％超（９５％）を保持した。このことは、試験されたフィターゼが、プロテアーゼの活性に対して高度に耐性を有することを示しており、このことは、動物飼料への使用に極めて有益でありうる。
【０１４７】
５．経時的なフィターゼ活性の維持
経時的なＡｐｐＡｓ−ｒフィターゼの活性を調べるために、基質の添加後の異なる時点で、１分間当たりの比活性を測定した。図５から導き出すことができるように、ＡｐｐＡｓ−ｒは、その比活性が経時的に増加するという点で、大部分のフィターゼと相違する。ＡｐｐＡｓ−ｒは、基質添加の少なくとも８時間後以内には依然として活性であり、４時間半後にはその初期比活性が倍増する（図５）。こうした経時的に増加しかつ持続される活性は、他のいかなるフィターゼに関しても記載されたことがない。このことは、極めて重要な論点である。なぜならば、動物の消化には通常は３０分超かかり、したがって酵素ができるだけ長期間活性を保つことが要求されるためである。この経時的に増加しかつ持続される活性は、液体供給に関しても重要でありうる。したがって、このことによって、比較的少量の酵素の使用により、飼料中でフィテートの形態で存在する大部分のリンを遊離させることができる。
【０１４８】
６．比活性の測定
比活性を調べるために、濃縮されかつ精製されたＡｐｐＡｓ−ｒフィターゼの濃度をローリー法を用いて測定し、比活性を、３７℃でｐＨ４．７５でモリブデン酸−バナジン酸法により評価した。精製されたＡｐｐＡｓ−ｒの得られた比活性は、１，１２３±１１２Ｕ／ｍｇであった。
【０１４９】
例４：土壌からの有機材料のリン酸の遊離
フィターゼの長期活性ゆえ、土壌中の有機材料から無機リンを遊離させるその能力を調べることが重要であった。このアッセイの結果は、肥料用添加物の調製に有用であると考えられた。このアッセイのために５つの土壌サンプルを採取した。各サンプル２．５ｇを計量し、酢酸塩緩衝液中に再懸濁させ、０．２５ｇサンプル／ｍｌの最終濃度を算出し、調整した。これらのサンプルを、周囲温度で撹拌しながら２０分間インキュベートした。これらのサンプルを酢酸塩緩衝液で１／１０に希釈した後、各サンプル１．２ｍｌに土壌１００ｇ当たり１Ｕ当量のフィターゼＡｐｐＡｓ−ｒを加え、２５℃で２４時間インキュベートした。その結果、リンの遊離が、５３．６±２７．８ｍｇリン／１００ｇ土壌であり、したがって土壌の遊離リン酸が２３．４±１８．１％増加したことが判明した。
【０１５０】
例５：野生型フィターゼ遺伝子と改変フィターゼ遺伝子（最適フィターゼ）との比較発現
本発明の発明者らは、２６ＡＡシグナルペプチドを含む図６に示す完全長のセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）野生型フィターゼ遺伝子（配列番号２）の発現によって不安定なタンパク質が生じ、このタンパク質が、発現後に急速に消失したことを観察した。したがって本発明の発明者らは、２６ＡＡシグナルペプチドを省く（配列番号８）ことによって、増強された発現が生じることを観察した（例１参照）。
【０１５１】
この観察から出発して、例１に記載の成熟セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）野生型フィターゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＰＩＣＺαについて、このヌクレオチド配列を、宿主細胞におけるフィターゼタンパク質の改善された発現という点でどのようにさらに改変させうるかについて、さらに評価した。
【０１５２】
改良されたＡｐｐＡｓ−ｒ配列を得るために、元のコドンを１つずつ解析し、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における各アミノ酸についての最も好まれるコドンに変更した。Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるコドン使用頻度の偏りについては、以前に、Ｂａｉら（Ｂａｉ  Ｊ．，  Ｓｗａｒｔｚ  Ｄ．Ｊ．，  Ｐｒｏｔａｓｅｖｉｃｈ  Ｉ．Ｉ．，  Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔｔｅ  Ｃ．Ｇ．，  Ｈａｒｒｅｌｌ  Ｐ．Ｍ．，  Ｈｉｄｅｂｒａｎｄｔ  Ｅ．，  Ｇａｓｓｅｒ  Ｂ．，  Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ  Ｄ．，  Ｗａｒｄ  Ａ．，  Ｃｈａｎｇ  Ｇ．  ａｎｄ  Ｕｒｂａｔｓｃｈ  Ｉ．Ｌ．  （２０１１）  Ａ  ｇｅｎｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｈａｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．  ＰＬｏｓＯｎｅ  ６：１−１５）、Ｓｉｎｃｌａｉｒら（Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ｇ．  ａｎｄ    Ｃｈｏｙ  Ｆ．Ｙ．Ｍ．  （２００２）  Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｂｉａｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２６  ：９６−１０５）およびＨｕａｎｇら（Ｈｕａｎｇ  Ｈ，  Ｙａｎｇ  Ｐ，  Ｌｕｏ  Ｈ，  Ｔａｎｇ  Ｈ，  Ｓｈａｏ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  １，３−１，４−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｂｙ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７８：  ９５−１０３）により記載されている。
【０１５３】
配列番号１において、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における最も高い使用頻度を解析し、特定し、かつ適用した。配列番号１において、Ｎ末端シグナルペプチド配列をコードする配列を含まない野生型コード配列（配列番号８）の２１１のすべてのコドンを最適化した。この評価では、触媒活性を有するタンパク質、例えばホスファターゼおよびキナーゼをコードするいくつかのＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）遺伝子において、文献に記載のコドン使用頻度がある程度保存されていたことも考慮する。
【０１５４】
配列番号１により示される最適化されたコドンを含む改変されたフィターゼポリヌクレオチドを、遺伝子合成により得た。この改変されたフィターゼポリヌクレオチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（スペイン国）より購入し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩの制限部位を介してベクターｐＰＩＣＺα  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）に挿入した。
【０１５５】
ＡｐｐＡｓ−ｒＯｐ遺伝子を含む得られたプラスミドを、例１と同様にＰｍｅＩ制限酵素で消化して直線化し、リチウム／ポリエチレンを含むストックによって酵母細胞に形質転換した。
【０１５６】
設計されかつ最適化されたセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）遺伝子の発現された遺伝子産物は、最初の２６のアミノ酸を有しない成熟タンパク質に相当し、すなわち、図１中のＳＤＳゲルにおいて分かるように、細胞におけるシグナルペプチドの切断後に、このタンパク質は約４５〜４６ｋＤの分子量を有する。
【０１５７】
例１に記載の成熟セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）野生型フィターゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＰＩＣＺαから出発して、本発明の発明者らは、宿主細胞におけるフィターゼタンパク質の改善された発現をもたらすことができるこのヌクレオチド配列における点突然変異を評価および試験した。野生型フィターゼ配列（配列番号２）と比較して、図６Ｂ中に存在する２１１の点突然変異（配列番号１）は、酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における効果的かつ安定な発現に寄与したことが観察された。図６Ｃに、最適フィターゼ配列（配列番号１）と野生型フィターゼ配列（配列番号２）との配列アライメントを示す。ミスマッチは、元の遺伝子配列に対して行われた点突然変異を示す。この点突然変異では、宿主細胞である酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において好ましく使用されるコドンが採用される。配列番号１および配列番号２の翻訳された成熟タンパク質のアライメントを示す図６Ｄから分かるように、２１１の突然変異はサイレントであり、すなわち、これらの突然変異のいずれによっても、フィターゼポリペプチドにおいて異なるアミノ酸は生じない。
【０１５８】
突然変異を行って配列番号１としたことが、酵母タンパク質の発現に対して実際に影響を及ぼすのか否かを調べるために、改変されたヌクレオチド配列を、例１と同一の条件下で発現させた。発現プロファイルを調べるために、メタノール発現の０時間後、１９時間後、３１時間後、４３時間後、５５時間後、６７時間後、７９時間後および９１時間後の時点でサンプルを採取した。例３に記載の通り、酸性培地（ＩＳＯ  ３０００２４：２００９  （Ｅ））中でモリブデン酸−バナジン酸法を用いてフィターゼ活性を測定した。例３のＡｐｐＡｓ−ｒを、比較例として使用した。
【０１５９】
結果を表１にまとめる。この比較例のデータを、図８によるグラフに対数で表す。このグラフは、Ｕｎｉｔｓ／Ｌで表した活性を時間（ｈ）に対して示したものである。
【０１６０】
図８に、野生型フィターゼＡｐｐｓＡＳ−ｒ（比較例）の発現プロファイルを青色（塗りつぶし菱形）に示し、最適な配列の発現プロファイルを赤（塗りつぶし四角）に示す。グラフから分かるように、野生型フィターゼ遺伝子の発現は、最適ではない。誘導の４０時間後に、最初の測定可能な生成物が現れる。９１時間後、飽和曲線は、１４３Ｕ／Ｌの最大活性を示している。驚くべきことに、改変されたフィターゼ遺伝子配列（最適な配列）の発現は、タンパク質発現の最初の数時間以内に直ちに測定可能なフィターゼ遺伝子産物を示し、これは、遺伝子発現の誘導の約２０〜３０時間後に飽和に達する。９０時間後には、フィターゼ生成は２００倍超であった。生成におけるこの増加は、予想外であった。
【０１６１】
このように、例５は、各酵母宿主細胞ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるコドン使用頻度を考慮した最適の配列となるように行われた突然変異が、実際に、増加されかつ効果的なタンパク質発現に寄与したことを実証している。
【０１６２】
【表１】
2018500928.tif 000008
【図１】
2018500928.tif 000009
【図２】
2018500928.tif 000010
【図３】
2018500928.tif 000011
【図４】
2018500928.tif 000012
【図５】
2018500928.tif 000013
【図６Ａ】
2018500928.tif 000014
【図６Ｂ】
2018500928.tif 000015
【図６Ｃ】
2018500928.tif 000016
【図６Ｄ】
2018500928.tif 000017
【図６Ｅ−１】
2018500928.tif 000018
【図６Ｅ−２】
2018500928.tif 000019
【図７】
2018500928.tif 000020
【図８】
2018500928.tif 000021
【配列表】
2018500928000001.app
【国際調査報告】
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2018500928.tif 000023
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