(57)【要約】  本発明は、腫瘍の治療および／または阻止において使用するためのアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、および、また、（改善された）腫瘍退縮特性（ｔｕｍｏｒ−ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有するアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を産生するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、ゲノムの外来ＲＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ＲＮＡ）を含まないことを特徴とする、腫瘍の治療および／または阻止における使用のための、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項２】
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、野生型のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）であることを特徴とする、請求項１に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項３】
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、自然変異体であることを特徴とする、請求項１に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項４】
その野生型形態から出発して、宿主動物および／または宿主細胞中で連続継代（ｓｅｒｉａｌ  ｐａｓｓａｇｅ）することによって、製造されることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項５】
腫瘍が、癌腫、黒色腫、細胞腫、リンパ腫または肉腫を含むかまたは、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項６】
癌腫が、肛門癌、気管支癌、肺癌、子宮体癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆嚢癌（ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、精巣癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、喉頭癌、食道癌（ｏｅｓｏｐｈｏｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、膵臓腫瘍、咽頭癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫および子宮頸癌、を含む、または、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項７】
肉腫が、血管肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、悪性線維性組織球腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｍａ）、神経原性肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、を含むまたは、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項８】
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、旧世界アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、好ましくは、Ｉｐｐｙウイルス、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ＭｏｂａｌａウイルスおよびＭｏｐｅｉａウイルス、を含むまたは、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項９】
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、リンパ球性脈絡髄膜炎であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項１０】
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、新世界アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、好ましくは、Ａｌｌｐａｈｕａｙｏウイルス（Ａｌｌｐａｈｕａｙｏ  ｖｉｒｕｓ）、アマパリウイルス（Ａｍａｐａｒｉ  ｖｉｒｕｓ）、ベアキャニオンウイルス（Ｂｅａｒ  Ｃａｎｙｏｎ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃｈａｐａｒｅウイルス（Ｃｈａｐａｒｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃｕｐｉｘｉウイルス（Ｃｕｐｉｘｉ  ｖｉｒｕｓ）、Ｆｌｅｘａｌウイルス（Ｆｌｅｘａｌ  ｖｉｒｕｓ）、グアナリトウイルス（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ  ｖｉｒｕｓ）、フニンウイルス（Ｊｕｎｉｎ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃａｎｄｉｄ＃１（Ｃａｎｄｉｄ  Ｎｏ．１）、ラテンウイルス（Ｌａｔｉｎｏ  ｖｉｒｕｓ）、マチュポウイルス（Ｍａｃｈｕｐｏ  ｖｉｒｕｓ）、オリベロスウイルス（Ｏｌｉｖｅｒｏｓ  ｖｉｒｕｓ）、パラナウイルス（Ｐａｒａｎａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｐｉｃｈｉｎｄｅウイルス（Ｐｉｃｈｉｎｄｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ｐｉｒｉｔａｌウイルス（Ｐｉｒｉｔａｌ  ｖｉｒｕｓ）、サビアウイルス（，  Ｓａｂｉａ  ｖｉｒｕｓ）、タカリベウイルス（Ｔａｃａｒｉｂｅ  ｖｉｒｕｓ，）、タミアミウイルス（Ｔａｍｉａｍｉ  ｖｉｒｕｓ）およびホワイトウォーターアロヨウイルス（Ｗｈｉｔｅｗａｔｅｒ  Ａｒｒｏｙｏ  ｖｉｒｕｓ）、を含むまたは、からなる群から選択される、ことを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項１１】
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、フニンウイルス、特に、Ｃａｎｄｉｄ＃１株、であることを特徴とする、請求項１乃至７および１０のいずれか１項に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項１２】
フニンウイルス、特に、Ｃａｎｄｉｄ＃１株が、核酸配列、特に、配列番号１の配列のＳ−リボ核酸配列またはアンビセンスの配列、および、核酸配列、特に、配列番号２のＬ−リボ核酸配列またはアンビセンスの配列、を有することを特徴とする、請求項１０または１１に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項１３】
フニンウイルス、特に、Ｃａｎｄｉｄ＃１株は、核酸配列、特に、配列番号３の配列のＳ−リボ核酸配列またはアンビセンスの配列、および、核酸配列、特に、配列番号４のＬ−リボ核酸配列またはアンビセンスの配列、を有することを特徴とする、請求項１０または１１に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）。
【請求項１４】
薬物が、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）および、好ましくは薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、腫瘍の治療および／または阻止に使用するための薬剤。
【請求項１５】
腫瘍退行または改善された腫瘍退行特性を有するアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、特に、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、を調製するためのインビトロ方法であって、以下の工程を含む方法。
ａ）樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）または腫瘍細胞を、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）で感染させる工程、
ｂ）感染させた樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）または感染させた腫瘍細胞において、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を培養する工程、および
ｃ）感染した樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）または感染した腫瘍細胞から、培養したアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）または培養したサブセットを単離する工程。
【請求項１６】
工程ａ）を実施する前に、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、宿主動物中で連続継代（ｓｅｒｉａｌ  ｐａｓｓａｇｅ）に付された、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）であることを特徴とする、請求項１５に記載のインビトロの方法。
【請求項１７】
ａ）乃至ｃ）の工程の配列を、１回乃至１０００回、特に１０回乃至１００回、好ましくは３０回乃至６０回、繰り返されることを特徴とする、請求項１５または１６に記載のインビトロ方法であって、新たな腫瘍細胞、好ましくは、同じタイプ、が各繰り返しのために使用される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野および従来技術
本発明は、腫瘍の治療および／または阻止において使用するためのアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、および、また、（改善された）腫瘍退縮特性（ｔｕｍｏｒ−ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有するアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を産生するための方法に関する。
アレナウイルスは、ヒトの病原性、多形性（ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ）ＲＮＡウイルスのファミリーに属する。これらのウイルスを伴う疾患は、動物、主に、げっ歯類、における、それらの天然のリザーバーである故、人畜共通感染症に属する。人畜共通感染症（ＺＯＯＮＯＳＥＳ）は、動物からヒトに，および，その逆に，ヒトから動物に感染することができる疾患を指す。
【０００２】
少なくとも８つのアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、ヒトに病気を引き起こすことが知られている。典型的なものは、無菌性髄膜炎（ａｓｅｐｔｉｃ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）と出血熱（ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ）である。ヒトにおいて、疾患を誘発することができる既知のウイルスは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＬＣＭＶ）、グアナリトウイルス（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＧＴＯＶ）、フニンウイルス（Ｊｕｎｉｎ  ｖｉｒｕｓ）（ＪＵＮＶ）、ラッサウイルス（Ｌａｓｓａ  ｖｉｒｕｓ）（ＬＡＳＶ）、ルジョウイルス（Ｌｕｊｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＬＵＪＶ）、マチュポウイルス（Ｍａｃｈｕｐｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＣＶ）、サビアウイルス（Ｓａｂｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＡＢＶ）およびホワイトウォーター  アロヨ  ウィルス（Ｗｈｉｔｅｗａｔｅｒ  Ａｒｒｏｙｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＷＷＡＶ）である。
【０００３】
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、一般的に、２つのグループ、すなわち、旧世界（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ）アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）および新世界（Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ）アレナウイルス、に分けられる。これらのグループは、地理的にも、および遺伝子的にも異なる。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のような旧世界アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、例えば、ヨーロッパ、アジアおよびアフリカ諸国のような東半球の国で発見されている。これとは対照的に、新世界アレナウイルスは、例えば、アルゼンチン、ボリビア、ベネズエラ、ブラジルおよび米国のような西半球の国で発見されている。
【０００４】
ウイルスファミリーの名前は、ウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎｓ）内の砂質リボソームの構造（ｓａｎｄｙ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を記述するために、ラテン語のａｒｅｎｏｓｕｓ（砂）とアリーナ（砂）に由来する。アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）のウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）（ｖｉｒｉｏｎｓ）は、円形から不規則な形状を有し、そして、種および試験材料の調製に依存して、５０ナノメートル乃至３００ナノメートル、通常、１１０ナノメートル乃至１３０ナノメートルの間の直径を有する。８ナノメートル乃至１０ナノメートルの長さのこん棒（ｃｌｕｂ）型糖タンパク質の突起（ｓｐｉｋｅ）が、ウイルスのエンベロープに埋め込まれている。個々の突起は、ウイルスエンベロープタンパク質（ｖｉｒａｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の四量体からなる。
【０００５】
ウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）は、また、螺旋状の対称性を有する、２つの閉じたリング状のカプシド（ｔｗｏ  ｃｌｏｓｅｄ−ｒｉｎｇ  ｃａｐｓｉｄｓ）を含む。カプシド（ｃａｐｓｉｄｓ）の長さは、４５０ナノメートル乃至１３００ナノメートルの間で変化する。ウイルスＲＮＡ（リボ核酸）ポリメラーゼ（Ｌタンパク質）の１分子が、それらのそれぞれに結合している。
【０００６】
各カプシド（ｃａｐｓｉｄｓ）は、混合された（すなわち、アンビセンス、＋／−）極性を有する（ｍｉｘｅｄ（ｉ．ｅ．ａｍｂｉｓｅｎｓｅ，＋／−）ｐｏｌａｒｉｔｙ）、一本鎖ＲＮＡのいずれか１つの分子を含む。２つの一本鎖ＲＮＡ分子は、ウイルスのゲノムを表す。それらは、Ｌ（大）およびＳ（小）と呼ばれ、そして、約７．５ｋｂ（キロベース）または３．５ｋｂ（キロベース）の大きいである。カプシド（ｃａｐｓｉｄｓ）は閉環型であるが、ＲＮＡ鎖は直線状であり、そして、したがって環状ではない。ＲＮＡの３’末端の１９乃至３０塩基長の配列は、両方の鎖上に存在し、そして、ウイルスファミリー内でも保存されている。
【０００７】
非常に例外的な形態学的には、ウイルス粒子に、それらの「砂状」の外観を与える、ウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）内で細胞リボソームの数を変える存在（ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ）である。同様に、精製されたウイルス調製物においては、
多様なウイルスのｍＲＮＡ（リボソームに結合したメッセンジャーリボ核酸）およびウイルスのゲノムの完全な相補鎖のように、いくつかの異なる細胞ＲＮＡ（リボソームＲＮＡも含む）および、またウイルスＲＮＡの複製形態も見出された。これらの非ゲノムＲＮＡは、上述のカプシド（ｃａｐｓｉｄｓ）の全て外側で、様々な量で見出される。
【０００８】
ワクチン接種ベクターとしての、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の使用が知られている。顕著な例は、アルゼンチンの出血熱に対して使用された、ワクチン接種ウイルスＣａｎｄｉｄ＃１である。これは、フニンウイルスのワクチン接種変異体である。
【０００９】
ＷＯ２００９／０８３２１０  Ａ１号から知られているのは、すなわち、遺伝的に改変されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）粒子（ウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ））、とりわけ、例えば、黒色腫、前立腺癌、乳癌および肺癌のような腫瘍性疾患の治療のための、複製欠陥（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ）の使用である。
【００１０】
「強力なＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の誘導のための、複製欠損リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス  ベクターの開発」（ネイチャーメディシン、第１６巻、第３号、２０１０年３月、３３９から３４５頁；ＤＯＩ：１０．１０３８／Ｎｍ．２１０４）の出版物において、このようなウイルス粒子の潜在的適用領域として、癌免疫療法が挙げられている。
さらに、ＷＯ２００６／００８０７４  Ａ１は、固形腫瘍の遺伝子治療のための、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）糖タンパク質で偽型化された（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）された、レトロウイルスのウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）を産生する、パッケージング細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）の使用を開示する。
【００１１】
先行技術に記載されている腫瘍の治療方法は、遺伝子工学によって製造するのが非常に複雑である、ウイルス粒子の使用に基づいている。
遺伝子療法の治療方法の場合には、遺伝子操作されたウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）またはウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）を産生するパッケージング細胞で、腫瘍組織の治療的に有効な形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）を適切に達成することは、しばしば可能ではない。
【００１２】
目的と解決策
したがって、本発明は、先行技術と比較して、腫瘍、特に、癌腫および肉腫のための、より単純で、そして、特に、より効率的な治療の解決策を提供するという目的に基づく。
この目的は、独立請求項１に記載のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、請求項１４に記載の薬剤によって、および、また、独立請求項１５に記載のインビトロ方法により、本発明に従って達成される。好ましい実施形態は、従属請求項に定義されている。全ての特許請求の範囲の文言は、本明細書において、明細書の記載内容に参照として組み込まれる。本発明の目的を達成する、本発明の追加の主題は、明細書に開示されている。
【００１３】
第一の態様によれば、本発明は、ヒトまたは動物における、腫瘍、好ましくは悪性腫瘍の治療および／または阻止における使用のための、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）に関する。
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、好ましくは、ゲノムの外来ＲＮＡを含まない、すなわち、任意のゲノムの外来ＲＮＡを含まない、ことを特徴とする。換言すれば、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）のゲノムは、外来ＲＮＡを含まないことが好ましいか、好ましくは外来ＲＮＡを含まない。
【００１４】
本発明の文脈において、表現「ゲノム外来ＲＮＡ」は、野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）のゲノムまたは野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の変異体（変異アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ））のゲノム、特に、野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の天然の変異体（天然変異アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ））のゲノムには、起こらないか、または、存在しない、ＲＮＡ（リボ核酸）またはＲＮＡ配列を意味することを意図する。外来ＲＮＡの例は、人工または合成ＲＮＡ分子、生物のＲＮＡおよび他のウイルス由来のＲＮＡである。
【００１５】
（当業者の理解に従って）、本発明の文脈において、表現「野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）」は、そのゲノムが天然に存在する遺伝的に正常な形態である、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を意味すると理解される。
（当業者の理解に従って）、本発明の文脈において、表現「野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の変異体」または「変異されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）」は、野生型ゲノムと比較して、そのゲノムが、自発の、すなわち、天然に誘導された、改変または変異原によって誘導された改変を含む、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を意味すると理解される。
したがって、（当業者の理解に従って）、本発明の文脈において、表現「野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の天然変異体」または「天然に変異されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）」は、野生型ゲノムと比較して、そのゲノムが、自発の、すなわち、天然に誘導された、改変を含む、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を意味すると理解される。
【００１６】
自然変異アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、好ましくは、継代、特に、以下でより詳細に説明される、連続継代（ｓｅｒｉａｌ  ｐａｓｓａｇｅ）によって製造することができる。
本発明は、ゲノムの外来ＲＮＡのないアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、腫瘍退縮を達成することが可能である、という驚くべき発見に基づいている。腫瘍退縮は、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）によって引き起こされる、先天性および適応性免疫細胞の活性化または刺激に起因する。活性化された免疫細胞は、それによって、腫瘍に対抗または撃退する、インターフェロン−αおよびインターフェロン−γのような抗腫瘍性サイトカインを増加分泌する。さらなる驚くべき発見は、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、腫瘍の発現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）の場合に、抗腫瘍性サイトカインの有意に増加した分泌を引き起こすという認識である。ゲノムの外来ＲＮＡのないアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、したがって、腫瘍治療における使用に適している。これは、動物実験によって、本出願人によって首尾よく確認された。この目的のために、とりわけ、ヒト腫瘍の増殖が可能なマウスを使用した。
【００１７】
さらなる実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、また、非ゲノムの外来ＲＮＡを含まない。本発明の文脈において、表現「非ゲノムの外来ＲＮＡ」は、野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）または野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の変異体（変異アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ））、特に、野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の天然の変異体（天然変異アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ））には、起こらないか、または、存在しない、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）ゲノム以外のＲＮＡまたはＲＮＡ配列を意味することを意図する。換言すれば、本実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、全体として、如何なる外来ＲＮＡ、すなわち、いかなる、ゲノムの外来ＲＮＡも、非ゲノムの外来ＲＮＡ、を含まない。
【００１８】
好ましい実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）である。
さらなる実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、野生型アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の天然の変異体、すなわち、自然変異アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）である。
【００１９】
天然の変異体または自然変異アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、好ましくは、宿主動物および／または宿主細胞における、継代、特に、複数の継代によって生成される。
天然の変異体または自然変異のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、特に好ましくは、宿主動物および／または宿主細胞中で連続継代することにより製造される。
本発明に従って提供されるアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、従って、好ましくは、宿主動物および／または宿主細胞中で、その野生型から出発して、継代によって、好ましくは、連続継代によって製造されるアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）である。
【００２０】
先の段落で述べた宿主動物は、好ましくは、げっ歯類、特に、マウスである。前の段落で述べた宿主細胞は、他方、好ましくは、樹状細胞または腫瘍細胞である。
本発明の文脈において、当業者の理解に従って、用語「継代」は、宿主動物および／または宿主細胞へ、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の複数の通常の導入を意味すると理解される。本発明の文脈において、当業者の理解に従って、表現「連続継代」は、異なる宿主動物、好ましくは、同じタイプの、および／または異なる細胞、好ましくは同じタイプの細胞へのアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の複数の通常の導入を意味すると理解される。環境の複数の変更（宿主動物および／または宿主細胞）のせいで、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、それによって、腫瘍退縮の観点から、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）のゲノムにおいて生じる有利な突然変異の可能性を増加させる、増加した適応圧力（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）または突然変異偏向（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）に付される。
【００２１】
更なる実施態様では、腫瘍は、癌腫、黒色腫、芽細胞腫、リンパ腫および肉腫を含むまたは、からなる群から選択される。
本発明の文脈においては、（当業者の理解に従って）、用語「癌腫」は、上皮起源の悪性腫瘍を意味することを意図する。
本発明の文脈においては、（当業者の理解に従って）、用語「肉腫」は、中胚葉起源（ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ  ｏｒｉｇｉｎ）の悪性腫瘍を意味することを意図する。
本発明の文脈においては、（当業者の理解に従って）、用語「黒色腫」は、メラニン細胞起源の悪性腫瘍を意味することを意図する。
本発明の文脈においては、（当業者の理解に従って）、用語「リンパ腫」は、リンパ起源の悪性腫瘍を意味することを意図する。
本発明の文脈においては、（当業者の理解に従って）、用語「芽細胞腫」は、胚起源の悪性腫瘍を意味することを意図する。
【００２２】
好ましい実施形態において、「癌腫」は、肛門癌、気管支癌、肺癌、子宮体癌、胆嚢癌、肝細胞癌、精巣癌、結腸直腸癌、喉頭癌、食道（ｏｅｓｏｐｈｏｇｅａｌ）癌、胃癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、膵臓腫瘍、咽頭癌、前立腺癌、甲状腺癌および子宮頸癌を含む、または、からなる群から選択される。
好ましい実施形態において、「肉腫」は、血管肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、悪性線維性組織球腫、神経原性肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫を含む、または、からなる群から選択される。
さらなる実施形態で、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、好ましくは、Ｉｐｐｙウイルス（ＩＰ−ＰＹＶ）、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ｍｏｂａｌａウイルス（ＭＯＢＶ）およびＭｏｐｅｉａウイルス（ＭＯＰＶ）を含むか、または、からなる群から選択される、旧世界アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）である。
【００２３】
特に好ましい実施形態において、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、好ましくは、ＷＥ、アームストロング、クローン１３およびＤｏｃｉｌｅを含む、または、からなる群から選択される株である。
さらなる実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、好ましくは、Ａｌｌｐａｈｕａｙｏウイルス（ＡＬＬＶ）、Ａｍａｐａｒｉ（アマパリ）ウイルス（ＡＭＡＶ）、Ｂｅａｒ  Ｃａｎｙｏｎ（ベアー・キャニオン）ウイルス（ＢＣＮＶ）、Ｃｈａｐａｒｅウイルス、Ｃｕｐｉｘｉウイルス（ＣＰＸＶ）、Ｆｌｅｘａｌウイルス（ＦＬＥＶ）、Ｇｕａｎａｒｉｔｏ（グアナリト）ウイルス（ＧＴＯＶ）、Ｊｕｎｉｎ（フニン）ウイルス（ＪＵＮＶ）、Ｌａｔｉｎｏ（ラテン）ウイルス（ＬＡＴＶ）、Ｍａｃｈｕｐｏ（マチュポ）ウイルス（ＭＡＣＶ）、Ｏｌｉｖｅｒｏｓ（オリベ）ウイルス（ＯＬＶＶ）、Ｐａｒａｎａ（パラナ）ウイルス（ＰＡＲＶ）、Ｐｉｃｈｉｎｄｅウイルス（ＰＩＣＶ）、Ｐｉｒｉｔａｌウイルス（ＰＩＲＶ）、Ｓａｂｉａ（サビア）ウイルス（ＳＡＢＶ）、Ｔａｃａｒｉｂｅ（タカリベ）ウイルス（ＴＣＲＶ）、Ｔａｍｉａｍｉ（タミアミ）ウイルス（ＴＡＭＶ）およびＷｈｉｔｅｗａｔｅｒ  Ａｒｒｏｙｏ（ホワイトウォーターアロヨ）ウイルス（ＷＷＡＶ）を含むか、または、からなる群から選択される、新世界アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）である。
【００２４】
特に好ましい実施形態において、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、フニンウイルス、特に、Ｃａｎｄｉｄ＃１（Ｃａｎｄｉｄ  Ｎｏ．１）である。
さらなる実施形態では、フニンウイルス、特にＣａｎｄｉｄ＃１（Ｃａｎｄｉｄ  Ｎｏ．１）株は、塩基配列、特に、（配列リストの）配列番号１の、Ｓ−リボ核酸配列またはアンビセンス配列を有する。
さらなる実施形態では、フニンウイルス、特に、Ｃａｎｄｉｄ＃１（Ｃａｎｄｉｄ  Ｎｏ．１）株は、塩基配列、特に、（配列リストの）配列番号２の、Ｌ−リボ核酸配列またはアンビセンス配列を有する。
【００２５】
さらなる実施形態では、フニンウイルス、特に、Ｃａｎｄｉｄ＃１（Ｃａｎｄｉｄ  Ｎｏ．１）株は、塩基配列、特に、（配列リストの）配列番号３の、Ｓ−リボ核酸配列またはアンビセンス配列を有する。
さらなる実施形態では、フニンウイルス、特に、Ｃａｎｄｉｄ＃１（Ｃａｎｄｉｄ  Ｎｏ．１）株は、塩基配列、特に、（配列リストの）配列番号４の、Ｌ−リボ核酸配列またはアンビセンス配列を有する。
さらなる実施形態では、上述した、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶウイルス）は、塩基配列、特に、（配列リストの）配列番号５の、Ｓ−リボ核酸配列またはアンビセンス配列を有する。
さらなる実施形態では、上述した、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶウイルス）は、塩基配列、特に、（配列リストの）配列番号６の、Ｌ−リボ核酸配列またはアンビセンス配列を有する。
さらなる実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、腫瘍溶解物、器官溶解物、尿または血液から単離される。
【００２６】
代替の実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、細胞培養培地、特に、ヒト腫瘍細胞株から単離される。
さらなる実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、ウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）の形態、すなわち、細胞外にあるアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）粒子の形態で投与されるためである。
さらなる実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、局所、特に、筋肉内、腹腔内または皮下投与のために、提供、好ましくは調製される。換言すれば、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、局所、特に、筋肉内、腹腔内または皮下投与のための、さらに実施形態において使用される。
【００２７】
好ましくは、局所投与のために、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、１ＰＦＵ（プラーク形成単位）／ｋｇ体重〜１０１２ＰＦＵ／ｋｇ体重、特に、１０２ＰＦＵ／ｋｇ体重〜１０６ＰＦＵ／ｋｇ、好ましくは、１０３ＰＦＵ／ｋｇ体重〜１０５ＰＦＵ／ｋｇ体重の用量で提供され、好ましくは、調製される。換言すれば、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、好ましくは、局所投与のために、１ＰＦＵ（プラーク形成単位）／ｋｇ体重〜１０１２ＰＦＵ／ｋｇ体重、特に、１０２ＰＦＵ／ｋｇ体重〜１０６ＰＦＵ／ｋｇ体重、好ましくは、１０３ＰＦＵ／ｋｇ体重〜１０５ＰＦＵ／ｋｇ体重で使用される。
【００２８】
代替の実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、全身的に、特に、静脈内投与で提供され、好ましくは調製される。換言すれば、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、全身的、特に、静脈内投与の代替的な実施形態で使用される。
好ましくは、全身投与のために、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、１ＰＦＵ／ｋｇ体重〜１０１２ＰＦＵ／ｋｇ体重、特に、１０２ＰＦＵ／ｋｇ体重〜１０６ＰＦＵ／ｋｇ体重、好ましくは、１０３ＰＦＵ／ｋｇ体重〜１０５ＰＦＵ／ｋｇ体重の用量で、提供され、好ましくは調製される。換言すれば、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、１ＰＦＵ／ｋｇ体重〜１０１２ＰＦＵ／ｋｇ体重、特に、１０２ＰＦＵ／ｋｇ体重〜１０６ＰＦＵ／ｋｇ体重、好ましくは、１０３ＰＦＵ／ｋｇ体重〜１０５ＰＦＵ／ｋｇ体重の用量で、好ましくは全身投与のために、使用される。
【００２９】
第２の態様によれば、本発明は、腫瘍、特に悪性腫瘍の治療および／または阻止に使用するための医薬に関する。
薬剤は、本発明の第一の態様により、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を有するという事実によって、特に、特徴付けられる。
医薬は、好ましくは、薬学的に許容される担体をさらに含む。担体は、特に、水、生理食塩水、緩衝液および細胞培養培地を含む、または、からなる群から選択することができる。
さらなる実施形態では、薬剤は、また、活性成分をも含む。活性成分は、特に、細胞増殖抑制剤、抗体および／またはサイトカインであり得る。
薬剤、特に、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）および、また腫瘍、のさらなる特徴および利点に関しては、繰り返しを避けるために、完全に本明細書の開示を参照する。
【００３０】
第三の態様によれば、本発明は、腫瘍退行、すなわち腫瘍撃退／対抗特性（ｔｕｍｏｒ−ｒｅｐｅｌｌｉｎｇ／ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）または改善された腫瘍退行特性を有する、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の製造方法に関する。
腫瘍は、好ましくは、悪性腫瘍、好ましくは、癌腫、黒色腫、芽細胞腫、リンパ腫または肉腫である。したがって、本方法は、好ましくは、（改良された）癌腫−、黒色腫−、芽細胞腫−、リンパ腫−または肉腫−退行（ｒｅｇｒｅｓｓｉｖｅ）特性を有する、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を製造する方法である。
この方法は、以下のステップを含む。
ａ）樹状細胞または腫瘍細胞を、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）で感染すること、
ｂ）感染した樹状細胞または感染した腫瘍細胞のアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を培養すること、および
ｃ）感染した樹状細胞または感染した腫瘍細胞から、培養されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、または、培養されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の部分（ｓｕｂｓｅｔ）を単離すること。
ａ）乃至ｃ）のステップの手順（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）はまた、樹状細胞または腫瘍細胞における、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の（単一の）継代（ｐａｓｓａｇｅ）と呼ぶことができる。
好ましい実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、工程ａ）を実施する前に、宿主動物中で連続継代に付されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）である。
【００３１】
さらなる詳細および利点については、参照は、本発明の第４の態様の文脈で行われた、対応する説明を参照することができる。
さらなる実施形態において、樹状細胞または腫瘍細胞は、細胞培養物（樹状細胞培養物または腫瘍細胞培養物）の形態である。
腫瘍細胞は、好ましくは、悪性腫瘍細胞、特に、癌腫、黒色腫、芽細胞腫、リンパ腫または肉腫細胞である。
【００３２】
癌腫は、肛門癌細胞、気管支癌細胞、肺癌細胞、子宮癌細胞、胆嚢癌細胞、肝癌細胞、精巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、喉頭癌細胞、食道（ｏｅｓｏｐｈｏｇｅａｌ）癌細胞、胃癌細胞（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）、肺癌細胞（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）、腎癌細胞（ｒｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）、卵巣癌細胞、膵臓腫瘍細胞、咽頭癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞および子宮頸癌細胞を含むかまたはからなる群から選択できる。
【００３３】
肉腫は、血管肉腫細胞、軟骨細胞、ユーイング肉腫細胞、線維肉腫細胞、カポジ肉腫細胞、脂肪肉腫細胞、平滑筋肉腫細胞、悪性線維性組織球腫細胞、神経原性肉腫細胞、骨肉腫細胞および横紋筋肉腫細胞を含むかまたは、からなる群から選択することができる。
さらなる実施形態では、腫瘍細胞は、不死化された免疫細胞、特に、不死化したマクロファージである。
【００３４】
樹状細胞または腫瘍細胞は、好ましくは、細胞に、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を加えることによって、工程ａ）に従って、感染させる。
好ましい実施形態において、工程ａ）乃至ｃ）の手順は、新たな、特に、非感染の樹状細胞、好ましくは同じ型のもの、または新規な、特に、非感染の腫瘍細胞、好ましくは、同じタイプ（同じ腫瘍タイプ）を用いて繰り返された。
特に好ましい実施形態では、工程ａ）乃至ｃ）の手順が何度も繰り返される。好ましい方法によって、新規の、特に、非感染の樹状細胞、好ましくは同じ型、または、新規の、特に、非感染の腫瘍細胞、好ましくは、同じ型が、各繰り返しに使用される。
【００３５】
工程ａ）乃至ｃ）の手順は、好ましくは、１回乃至１００００回、特に、１０回乃至１０００回、好ましくは、３０回乃至６０回反復される。ここで、新たな、特に、感染していない樹状細胞、好ましくは同じ型、または、新規な、特に、非感染の腫瘍細胞、好ましくは同じ型、が各反復に使用される。
工程ａ）乃至ｃ）の手順の複数の繰り返しをすることで、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、絶えず、新しい環境、すなわち、新たな樹状細胞または腫瘍細胞に適応することを余儀なくされる。この永久的な適応圧力（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）は、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の腫瘍退行特性を製造または改善することができる突然変異の発生に有利に働く。
工程ｂ）に従って、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の培養中、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）ゲノムの複製およびアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）が、樹状細胞または腫瘍細胞内で起こる。
工程ｂ）に従って、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ））は、好ましくは、標準的な細胞培養条件下で培養される。
【００３６】
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、好ましくは、１分乃至１年の期間、特に、１０時間乃至１ヶ月、好ましくは２４時間乃至７２時間にわたって、樹状細胞または腫瘍細胞において、培養される。
工程ｃ）に従って、培養されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、好ましくは細胞培養上清から単離される。
好ましくは、工程ｃ）に従って単離する前に、樹状細胞または腫瘍細胞は、特定の特性に従って、好ましくは細胞選別装置によって選別され、そして、引き続き培養される。選別された細胞は、好ましくは２４時間にわたって培養される。
さらなる実施形態では、この方法は、以下のステップをさらに含む：
ｄ）単離されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）のクローニング、および
ｅ）単離されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）のシークエンシング。
本方法、特に、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）および、また腫瘍、のさらなる特徴および利点に関しては、本明細書を参照する。
【００３７】
第４の態様によれば、本発明は、腫瘍退行、すなわち、腫瘍撃退／対抗作用（ｔｕｍｏｒ−ｒｅｐｅｌｌｉｎｇ／ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）特性または改善された腫瘍退行特性を有する、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の製造方法に関する。
腫瘍は、好ましくは、悪性腫瘍、好ましくは、癌腫、黒色腫、芽細胞腫、リンパ腫または肉腫である。したがって、この方法は、好ましくは、（改良された）癌腫−、黒色腫−、芽細胞腫−、リンパ腫−または肉腫−退行特性を有する、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を産生するための方法である。
【００３８】
この方法は、以下の工程を含む。
ａ）腫瘍を有する宿主動物を、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）で、感染する工程
ｂ）感染した宿主動物において、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を培養する工程、および
ｃ）感染した宿主動物からの、培養されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）または培養されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の部分を単離する工程。
工程ａ）乃至ｃ）の手順はまた、宿主動物におけるアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の（単一の）継代として言及することができる。
【００３９】
好ましい実施形態では、工程ａ）を実施する前に、腫瘍組織を宿主動物に移植する。
代替的な実施形態では、腫瘍を自発的に発生する、遺伝的に改変された宿主動物が使用される。
げっ歯類、特に、好ましくはマウスは、宿主動物として使用することができる。例えば、ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスまたはＬｏｘＰ−Ｔａｇマウスを、宿主動物として使用することができる。Ｎｏｄ  ＳＣＩＤマウスでは、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）突然変異が、ＮＯＤ（非肥満糖尿病）タイプと組み合わされる。ＳＣＩＤ突然変異についてホモ接合性であるマウスでは、機能的Ｔ細胞またはＢ細胞は形成されない。この免疫不全により、これらの動物は、異種体細胞、例えば移植された腫瘍に耐性を示す（ｔｏｌｅｒａｔｉｎｇ）のに非常に適している。
【００４０】
宿主動物は、工程ａ）に従って、例えば、全身、特に、静脈内、または局所、例えば、皮下の、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の投与によって、感染させることができる。
具体的には、宿主動物は、宿主動物の腫瘍へのアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の投与、好ましくは注射によって感染させることができる。
好ましい実施形態において、工程ａ）乃至ｃ）の手順は、新規の、特に、感染していない宿主動物、好ましくは同じ型の宿主動物を用いて繰り返される。
特に好ましい実施形態では、工程ａ）乃至ｃ）の手順が何度も繰り返される。新規な、特に、非感染宿主動物、好ましくは同じ型のものが、好ましくは各反復のために使用される。換言すると、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、宿主動物、好ましくは、同じタイプ、の中で、連続継代に付される場合、本発明によれば好ましい。
【００４１】
工程ａ）乃至ｃ）の手順は、好ましくは、１回乃至１０００回、特に、１０回乃至１００回、好ましくは３０回乃至６０回繰り返され、ここで、新規な、特に、感染していない宿主動物、好ましくは同じタイプ、が各繰り返しに使用される。
工程ａ）乃至ｃ）の手順の複数の繰り返しをすることで、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、絶えず、新たな環境、すなわち、新しい宿主動物に適応することを余儀なくされる。この永久的な適応圧力は、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の腫瘍退行特性を、製造または改善することができる突然変異の発生に有利に働く。
【００４２】
工程ｂ）に従って、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の培養中、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）のゲノムの複製およびアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）は、宿主動物内で発生する。
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、宿主動物において、１分乃至５００日の期間、特に、１０分乃至１００日、好ましくは、１時間乃至３０日間、好ましくは培養される。
好ましい実施形態では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、宿主動物の、尿、血液、腫瘍、または器官溶解物から単離される。
さらなる実施形態では、この方法は、以下の工程をさらに含む：
ｄ）工程ｃ）に従って単離した、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）で、樹状細胞または腫瘍細胞を感染する工程、
ｅ）感染した樹状細胞または感染した腫瘍細胞において、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の培養工程、および
ｆ）感染した樹状細胞または感染した腫瘍細胞から、培養したアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）または培養したアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の部分（ｓｕｂｓｅｔ）を単離する工程。
【００４３】
工程ｄ）乃至ｆ）の手順はまた、樹状細胞または腫瘍細胞における、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の（単一の）継代と呼ぶことができる。
樹状細胞または腫瘍細胞は、工程ｄ）、好ましくは、細胞に、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を添加することによって、感染される。
好ましい実施形態において、工程ｄ）乃至ｆ）の手順は、新たな、特に、非感染の樹状細胞、好ましくは同じ型のもの、または、新規な、特に、非感染の腫瘍細胞、好ましくは同じタイプ（同じ腫瘍タイプ）を用いて繰り返すことができる。
特に、好ましい実施形態では、工程ｄ）乃至ｆ）の手順が何度も繰り返される。好ましくは、新規の、特に、非感染の樹状細胞、好ましくは同じタイプ、または、新規の、特に、非感染腫瘍細胞、好ましくは同じ型、が各繰り返しに使用される。換言すれば、もし、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）が、さらに、樹状細胞、好ましくは同じタイプ、または、腫瘍細胞、好ましくは同じタイプにおいて、連続継代に付される場合、本発明によれば、特に好ましい。
【００４４】
工程ｄ）乃至ｆ）の手順は、好ましくは、１回乃至１０００回、特に、１０回乃至１００回、好ましくは３０回乃至６０回繰り返される。ここで、新規な、特に、感染していない樹状細胞、好ましくは同じタイプ、または、新規な、特に、感染していない腫瘍細胞、好ましくは同じタイプが、好ましくは、各繰り返しに使用される。
宿主動物、好ましくは、同じタイプ、における、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の連続継代と、樹状細胞、好ましくは、同じタイプ、腫瘍細胞、好ましくは、同じタイプ、における、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の連続継代との組み合わせは、（改善された）腫瘍退行特性を有するアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を製造するため、特定の方法において、さらに増加した適応圧力または突然変異の偏向（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）のせいで、好ましい。
アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、樹状細胞または腫瘍細胞において、好ましくは、１分乃至５００日の期間にわたって、特に、１０分乃至１００日、好ましくは１時間乃至３０日培養される。
好ましくは、樹状細胞または腫瘍細胞を、好ましくは細胞選別装置を用いて、特定の特性に従って選別し、そして、続いて、工程ｆ）に従って単離する前に培養する。選別された細胞は、好ましくは２４時間にわたって培養される。
【００４５】
さらなる実施形態では、この方法は、以下の工程をさらに含む：
ｇ）工程ｆ）に従って、単離されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）をクローニングする工程、および、
ｈ）単離されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）を配列決定する。
あるいは、工程ｃ）に従って単離されたアレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、クローニングされ、そして、続いて配列決定されることを、本発明に従って提供することができる。
本方法の他の特徴および利点に関して、特に、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、腫瘍およびまた、樹状細胞および腫瘍細胞に関しては、また不必要な繰り返しを避けるために、上記の記述全体に対して、参照される。
【００４６】
本発明のさらなる特徴および利点は、実施例、関連する図および特許請求の範囲の形態で、好ましい実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。以下に記載される実施形態は、単なる例示のためのものであり、そして、本発明のより良い理解のためのものであり、決して限定的であると理解されるべきではない。
【００４７】
実施例
１．方法および材料
１．１  マウス
他に言及しない限り、使用したマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド由来（ｆｒｏｍ  ａ  Ｃ５７ＢＬ／６  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）であった。Ｍａｐ３ｋ１４ａｌｙ／ａｌｙ  マウスは、ＮＦ−κＢシグナルを欠き、そして、したがって、非常に免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ）されている。Ｉｒｆ３  ｘ  Ｉｒ７−／−マウスは、インターフェロンを何ら産生しない。ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスには適応免疫系がない。したがって、これらのマウスにおいて、ヒト腫瘍を増殖させることが可能である。ＬｏｘＰ−Ｔａｇマウスは、自然発生的に肝腫瘍を発症する。
【００４８】
１．２  細胞株および試薬
ＭＯＰＣ細胞は、マウスの咽頭癌細胞（ｏｒｏｐｈａｒｙｎｘ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）である。Ｍｃ３８はマウス結腸癌細胞である。Ｒａｗ細胞（Ｒａｗ  ｃｅｌｌｓ）は、不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）マクロファージである。Ａ４３１は、ヒト肺癌細胞である。Ｓｗ４０は、ヒト結腸癌細胞であり、ヒーラは、ヒト子宮頸癌細胞である。初代マクロファージは、Ｍ−ＣＳＦによって、骨髄前駆細胞から培養した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、２ミリモル／ＬのＬ−グルタミンおよび１００Ｕ／ミリリットルのペニシリンを含む、ダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。すべての細胞は、５％のＣＯ２で培養した。
【００４９】
１．３  ウイルス
ＬＣＭＶ株ＷＥは、Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ教授（実験免疫学、チューリッヒ、スイス）の研究室から入手し、そして、Ｌ９２９細胞で増殖させた（ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ）。アルゼンチン出血熱の弱毒生ワクチン＃１（Ｃａｎｄｉｄ＃１）は、Ｐａｕｌａ  Ｃａｎｎｏｎ教授（南カリフォルニア大学）から入手した。
【００５０】
１．４  腫瘍増殖と治療
約５×１０５腫瘍細胞（１００マイクロリットル中）を、６〜１２週齢のマウスの右脇腹（ｒｉｇｈｔ  ｆｌａｎｋ）に皮下注射した。最長の腫瘍径を、測定した。マウスは、２×１０４のＰＦＵ  ＬＣＭＶ−ＷＥまたはアルゼンチン出血熱の弱毒生ワクチン＃１（Ｃａｎｄｉｄ＃１）（１００−２００マイクロリットル中）の腫瘍周囲への注射によって処置された。
【００５１】
１．５  腫瘍血管の形態計測分析（Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｖｅｓｓｅｌｓ）
形態計測分析（Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、内皮細胞マーカーＣＤ３１を染色した、連続凍結切片（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｆｒｏｚｅｎ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を用いて行った。微小血管の密度（ＭＶＤ）の定量は、３つの腫瘍切片の平均値を用いて計算した。ＭＶＤは、腫瘍面積あたりの血管数として算出された。
【００５２】
１．６  低酸素症（ｈｙｐｏｘｉａ）の検出
低酸素腫瘍領域（Ｈｙｐｏｘｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｉｏｎｓ）は、腫瘍移植動物に、ピモニダゾールを、３０分間、注射後、ピモニダゾール付加物の形成によって検出された。腫瘍切片を、製造業者の説明書（ファルマシア  ナチュール  インターナショナル社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｎａｔｕｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．））に従って、Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１  ｐｌｕｓキットを用いて染色した。
【００５３】
１．７  ＩＦＮ−αＥＬＩＳＡ
血清ＩＦＮ−αレベルを、製造業者のデータ（リサーチ・ダイアグノスティック  ＲＤＩ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＲＤＩ）、フランダース、ニュージャージー州）に従って、ＥＬＩＳＡにより決定した。
【００５４】
１．８  統計解析
平均値は、不対両側スチューデントｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ  ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて比較した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。統計学的有意性のレベルは、ｐ＜０．０５に設定した。
【００５５】
２．調査
２．１
不死化マクロファージ（腫瘍細胞）および、一次骨髄（ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ）から生成されたマクロファージ（）を、ＬＣＭＶ（ＷＥ株）に感染させた。複製は、２４時間後に測定した（ｎ＝３）。
ＬＣＭＶ（ＷＥ株）は、不死化した細胞、および健康な細胞の両方で複製することを示すことができた。得られた結果を、図１に、グラフで示す。
図１は、以下の凡例（ｌｅｇｅｎｄ）を有する。
縦軸：ＬＣＭＶ（ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ミリリットル）
横軸：腫瘍細胞／健康マクロファージ（初代（ｐｒｉｍａｒｙ））
【００５６】
２．２
ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５×１０５ＭＯＰＣ細胞（３日目）で処置した。マウスの一群は、さらに、腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｌｙ）を、２×１０４ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（ＷＥ株）で処理した（０日目）。腫瘍の成長を観察した。
ＬＣＭＶによる処理は、ほぼ完全な腫瘍退縮を引き起こしたことを示すことができた。得られた結果を、図２に、グラフで示す。
図２は、以下の凡例（ｌｅｇｅｎｄ）を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
【００５７】
２．３
ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５×１０５  ＭＣ３８細胞（３日目）で処置した。マウスの一群は、さらに、腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｌｙ）を、２×１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（ＷＥ株）で処理した（０日目）。腫瘍の成長を観察した。
ＬＣＭＶによる処理が、顕著な腫瘍退縮を引き起こしたことを示すことができた。得られた結果を、図３に、グラフで示す。
図３は、以下の凡例を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
【００５８】
２．４
自然に（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ）発症した肝癌を有する、約９ヶ月齢のＬｏｘＰ−ＴＡｇマウス（ｎｉｎｅ  ｍｏｎｔｈ  ｏｌｄ  ＬｏｘＰ−ＴＡｇ  ｍｉｃｅ）を、２×１０６  ＰＦＵ  ＬＣＭＶで静脈内感染または未処理のままにした。腫瘍結節（ｔｕｍｏｒ  ｎｏｄｅｓ）（直径＞＝３ｍｍ）を、６日目（ｎ＝３）および２０日目（ｎ＝４〜５）に、肉眼で定量した。
ＬＣＭＶによる処理が、有意に癌性肝臓結節（ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｕｓ  ｌｉｖｅｒ  ｎｏｄｅｓ）の数を減少させたことを示すことができた。得られた結果を、図４に、グラフで示す。
図４は、以下の凡例を有する。
縦軸：肝臓結節（数）
横軸：時間
【００５９】
２．５
ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）に、５×１０５  ＭＯＰＣ細胞（３日目）またはＬＣＭＶ（ＷＥ株）２×１０４  ＰＦＵ（０日目）または、両方、５×１０５  ＭＯＰＣ細胞（３日目）および２ｘ１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（０日目）を皮下注射した。血清試料は、３日目に回収し、そして、ＩＦＮ−α−ＥＬＩＳＡを行った。
ＬＣＭＶは、同時に癌細胞を投与した実験動物において、インターフェロン−γの分泌の劇的増加を引き起こしたことを示すことができた。得られた結果を図５に、グラフで示す。
図５は、以下の凡例を有する。
縦軸：ＩＦＮ−α（ｐｇ／ミリリットル）
【００６０】
２．６
Ｍａｐ３ｋ１４ａｌｙ／ａｌｙマウスおよびＷＴマウスを、５×１０５  ＭＯＰＣ細胞で処置した（３日目）。マウスの一群は、さらに、腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｌｙ）を、２×１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（ＷＥ株）で処理した（０日目）。腫瘍の成長を観察した。
ＬＣＭＶによる治療は、腫瘍退縮を引き起こすことを示すことができた。得られた結果を、図６に、グラフで示す。
図６は、次の凡例を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
【００６１】
２．７
Ｉｒｆ３×Ｉｒ７−／−マウスおよびＷＴマウスを、５×１０５  ＭＯＰＣ細胞で処置した（３日目）。マウスの一群は、さらに、腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｌｙ）を、２×１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（ＷＥ株）で処理した（０日目）。腫瘍の成長を観察した。
ＬＣＭＶによる処理は、腫瘍退縮を引き起こすことを示すことができた。得られた結果を、図７に、グラフで示す。
図７は、次の凡例を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
【００６２】
２．８
ＷＴマウスを、５×１０５  ＭＯＰＣ細胞で処置した（３日目）。マウスの一群は、さらに、腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｌｙ）を、２×１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（ＷＥ株）で処理した（０日目）。腫瘍移植後９日目に、腫瘍は、ＣＤ３１染色で、組織学的（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ）に分析した。微小血管密度（ＭＤＶ）および血管−血管間隔を定量した。
ＬＣＭＶでの処置は、腫瘍血管密度の減少を引き起こしたことを示すことができた。得られた結果を、図８Ａに、グラフで示した。
図８Ａは、以下の凡例を有する。
2018515130.tif 000002
【００６３】
２．９
ＷＴマウスを、５×１０５  ＭＯＰＣ細胞で処置した（３日目）。マウスの一群は、さらに、腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｌｙ）を、２×１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（ＷＥ株）で処理した（０日目）。９日目に、動物に、ピモニダゾールを注射し、そして、腫瘍は、その後、低酸素領域（ｈｙｐｏｘｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ）について組織学的に（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ）分析した。
ＬＣＭＶによる処理は、癌組織中の酸素欠乏を引き起こすことを示すことができた。得られた結果を、図８Ｂに、グラフで示す。
図８Ｂは、次の凡例を有する。
縦軸：低酸素領域／腫瘍（％）
横軸：腫瘍／腫瘍ＬＣＭＶ
【００６４】
２．１０
ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹（ｒｉｇｈｔ  ｆｌａｎｋ）に、５×１０５  ＭＯＰＣ細胞を、皮下注射した（３日目）。０日目に、動物の１群を、右脇腹（同側（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ））、左脇腹（対側（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ））または、静脈内に、２×１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（ＷＥ株）で処理した。腫瘍の成長を観察した。
ＬＣＭＶによる処理は、全身投与でさえも、腫瘍退縮を引き起こしたことを示すことができた。得られた結果を、図９に、グラフで示す。
図９は、以下の凡例を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
【００６５】
２．１１
ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスは、５×１０５  Ａ４３１細胞を皮下注射し（３日目）、そして、その後、未処理のまま、または２×１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（ＷＥ株）で処理した。腫瘍の大きさ（最長径）は、指定日に測定した。腫瘍の大きさが１２ミリメートルに達したとき、マウスを屠殺した。
ＬＣＭＶによる処理は、実験動物の生存率を増加させたことを示すことができた。得られた結果を、図１０に、グラフで示す。
図１０は、以下の凡例を有する。
縦軸：生存（％）
横軸：時間（日）
【００６６】
２．１２
ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスを、５×１０５  Ｓｗ４０細胞で処置した（０日目）。マウスの１群は、さらに、腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｌｙ）を、２×１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（ＷＥ株）または２×１０４  ＰＦＵ  アルゼンチン出血熱の弱毒生ワクチン＃１（Ｃａｎｄｉｄ＃１）で処理した（０日目）。腫瘍の成長を観察した。
ＬＣＭＶとアルゼンチン出血熱の弱毒生ワクチン＃１（Ｃａｎｄｉｄ＃１）を用いた処置は、腫瘍退縮を引き起こしたことを示すことができた。得られた結果を、図１１に、グラフで示す。
図１１は、以下の凡例を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
【００６７】
２．１３
ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスを、５×１０５のＨｅｌａ細胞で処理した（０日目）。マウスの１群は、さらに、腫瘍周囲を（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｌｙ）、２×１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶ（ＷＥ株）で処理した（３日目）。腫瘍の成長を観察した。
ＬＣＭＶによる処理は、腫瘍退縮を引き起こすことを示すことができた。得られた結果を、図１２に、グラフで示す。
図１２は、以下の凡例を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
【００６８】
２．１４
ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスを、５×１０５  ＨｅｐＧ２細胞で処理し（１０日目）、そして、次いで、さらに、腫瘍周囲を（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｌｙ）、２×１０４ＰＦＵ  Ｃａｎｄｉｄ＃１または、なし、で処理した（０日目）。腫瘍の成長を観察した。
Ｃａｎｄｉｄ＃１での処理は、この腫瘍タイプで腫瘍退縮を引き起こすことを示すことができた。得られた結果を、図１３に、グラフで示す。
図１３は、以下の凡例を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
【００６９】
２．１５
初代ヒト細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ）（肝細胞、結腸上皮細胞、メラニン細胞）と、同じ組織源からの腫瘍細胞を、ＬＣＭＶ（ＭＯＩ  １）で感染させた。ウイルスの量は、１、２および３日後に、上清で測定された。
この実験では、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、健康な組織に比べて、腫瘍細胞において複製されることが示された。
図１４は、以下の凡例を有する。
縦軸：細胞培養上清中の感染性ウイルス（対数のプラーク形成単位（ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ））
横軸：時間（日）
【００７０】
２．１６
未処置のままにしたか、または、２×１０６  ＰＦＵ  ＬＣＭＶで静脈内処理した、肩における転移および脇腹における転移（ＭＯＰＣ細胞）を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍径（Ａ）および生存（Ｂ）。
ＬＣＭＶの静脈内治療は、２つの局所の転移に非常に効率的に作用し、そして、従って、生存を延長することを、この実験で示すことができた。
図１５Ａは、以下の凡例を有する。
縦軸：両方の転移の腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
図１５Ｂは、以下の凡例を有する。
縦軸：パーセントでの生存
横軸：時間（日）
【００７１】
２．１７
未処理のままにしたか、または、２×１０４  ＰＦＵ  ＬＣＭＶで、腫瘍内処理した、メラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０細胞）を有する、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍径。
ＬＣＭＶでの局所処理は、メラノーマで非常に効率的であることを、この実験で示すことができた。
図１６は、以下の凡例を有する。
縦軸：メラノーマの腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
【００７２】
２．１８
治療せずに放置されたか、または、２×１０６  ＰＦＵ  ＬＣＭＶで静脈内処理された、ＭＴ／ｒｅｔマウス（内因性メラノーマの発症）のメラノーマの数。
ＬＣＭＶでの全身処理は、メラノーマで非常に効率的であることを、この実験で示すことができた。
図１７は、以下の凡例を有する。
縦軸：メラノーマの数
【００７３】
２．１９
未処理のままにした、または、２×１０６  ＰＦＵ  Ｃａｎｄｉｄ＃１で、腫瘍内で処理した、ヒト線維肉腫（Ｓｗ８７２細胞）を有する、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスの腫瘍径（Ａ）および生存率（Ｂ）。
Ｃａｎｄｉｄ＃１は、線維肉腫の場合も、非常に効果的に作用して、そして、したがって生存を延長することを、この実験で、示すことができた。
図１８Ａは、以下の凡例を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
図１８Ｂは、以下の凡例を有する。
縦軸：パーセントの生存率
横軸：時間（日）
【００７４】
２．２０
未処理のままにした、または、腫瘍内で、２×１０６  ＰＦＵ  ＬＣＭＶで処理した、ヒト咽頭癌（ｈｕｍａｎ  ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＦａＤｕ細胞）を有する、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスの腫瘍径（Ａ）および生存率（Ｂ）。
ＬＣＭＶは、ヒト咽頭癌（ｈｕｍａｎ  ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の場合にも、非常に効果的に作用し、そして、従って、生存を延長することを、この実験で示すことができた。
図１９Ａは、以下の凡例を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
図１９Ｂは、以下の凡例を有する。
縦軸：パーセントの生存率
横軸：時間（日）
【００７５】
２．２１
Ｔ細胞の機能に影響を与える、腫瘍特異的Ｔ細胞（ＰＤ−１、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体）の受容体の発現。腫瘍特異的Ｔ細胞は、さらに、ＬＣＭＶを用いて、または、用いずに、腫瘍内で処理された、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有する、マウスの血液に由来する。
ＬＣＭＶは、腫瘍特異的Ｔ細胞に、ポジティブに影響を与えることを、この実験で示すことができた。
図２０は、以下の凡例を有する。
縦軸：異なる受容体の発現の能力（平均蛍光強度（（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）））
【００７６】
２．２２
腫瘍特異的Ｔ細胞（ＯＴ１細胞）を用いて、または、用いずに、そして、さらに、腫瘍内で、ＬＣＭＶ（２×１０６  ＰＦＵ）を用いて、または、用いずに、処理された、マウスの皮下リンパ腫（ＥＬ４細胞）を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍径（Ａ）および生存率（Ｂ）。
ＬＣＭＶが、Ｔ細胞療法と相乗的に作用することを、この実験で示すことができた。
図２１Ａは、以下の凡例を有する。
縦軸：腫瘍径（センチメートル）
横軸：時間（日）
図２１Ｂは、以下の凡例を有する。
縦軸：パーセントの生存率
横軸：時間（日）
【００７７】
２．２３
腫瘍内で、ＬＣＭＶ（２×１０４  ＰＦＵ）を用いて、処理された、マウス咽頭癌（ＭＯＰＣ細胞）（ｍｕｒｉｎｅ  ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  （ＭＯＰＣ  ｃｅｌｌｓ））を有する、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＰＤ−１欠損マウス（Ｐｄｃｄ１−／−マウス）の生存。
ＬＣＭＶが、ＰＤ−１遮断と相乗的に作用することを、この実験で示すことができた。
図２２は、以下の凡例を有する。
縦軸：パーセントの生存率
横軸：時間（日）
【００７８】
一般的な説明で述べた配列番号１乃至６の核酸配列は、次の配列リストに開示される核酸配列に対応する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＬＣＭＶ（ＷＥ株）は、不死化した細胞、および健康な細胞の両方で複製することを示す。
【図２】ＬＣＭＶによる処理は、ほぼ完全な腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。
【図３】ＬＣＭＶによる処理が、顕著な腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。
【図４】ＬＣＭＶによる処理が、有意に癌性肝臓結節（ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｕｓ  ｌｉｖｅｒ  ｎｏｄｅｓ）の数を減少させたことを示す。
【図５】ＬＣＭＶは、同時に癌細胞を投与した実験動物において、インターフェロン−γの分泌の劇的増加を引き起こしたことを示す。
【図６】ＬＣＭＶによる治療は、腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。
【図７】ＬＣＭＶによる処理は、腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。
【図８Ａ】ＬＣＭＶでの処置は、腫瘍血管密度の減少を引き起こしたことを示す。
【図８Ｂ】ＬＣＭＶによる処理は、癌組織中の酸素欠乏を引き起こしたことを示す。
【図９】ＬＣＭＶによる処理は、全身投与でさえも、腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。
【図１０】ＬＣＭＶによる処理は、実験動物の生存率を増加させたことを示す。
【図１１】ＬＣＭＶとアルゼンチン出血熱の弱毒生ワクチン＃１（Ｃａｎｄｉｄ＃１）を用いた処置は、腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。
【図１２】ＬＣＭＶによる処理は、腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。
【図１３】Ｃａｎｄｉｄ＃１での処理は、この腫瘍タイプで腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。
【図１４】アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は、健康な組織に比べて、腫瘍細胞において複製されたことを示す。
【図１５Ａ】ＬＣＭＶの静脈内治療は、２つの局所の転移に非常に効率的に作用し、そして、従って、生存を延長したことを示す。
【図１５Ｂ】ＬＣＭＶの静脈内治療は、２つの局所の転移に非常に効率的に作用し、そして、従って、生存を延長したことを示す。
【図１６】ＬＣＭＶでの局所処理は、メラノーマで非常に効率的であったことを示す。
【図１７】ＬＣＭＶでの全身処理は、メラノーマで非常に効率的であったことを示す。
【図１８Ａ】未処理のままにした、または、２×１０６  ＰＦＵ  Ｃａｎｄｉｄ＃１で、腫瘍内で処理した、ヒト線維肉腫（Ｓｗ８７２細胞）を有する、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスの腫瘍径を示す。Ｃａｎｄｉｄ＃１は、線維肉腫の場合も、非常に効果的に作用して、そして、したがって生存を延長したことを示す。
【図１８Ｂ】未処理のままにした、または、２×１０６  ＰＦＵ  Ｃａｎｄｉｄ＃１で、腫瘍内で処理した、ヒト線維肉腫（Ｓｗ８７２細胞）を有する、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスの生存率を示す。Ｃａｎｄｉｄ＃１は、線維肉腫の場合も、非常に効果的に作用して、そして、したがって生存を延長したことを示す。
【図１９Ａ】未処理のままにした、または、腫瘍内で、２×１０６  ＰＦＵ  ＬＣＭＶで処理した、ヒト咽頭癌（ｈｕｍａｎ  ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＦａＤｕ細胞）を有する、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスの腫瘍径を示す。ＬＣＭＶは、ヒト咽頭癌（ｈｕｍａｎ  ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の場合にも、非常に効果的に作用し、そして、従って、生存を延長したことを示す。
【図１９Ｂ】未処理のままにした、または、腫瘍内で、２×１０６  ＰＦＵ  ＬＣＭＶで処理した、ヒト咽頭癌（ｈｕｍａｎ  ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＦａＤｕ細胞）を有する、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスの生存率を示す。ＬＣＭＶは、ヒト咽頭癌（ｈｕｍａｎ  ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の場合にも、非常に効果的に作用し、そして、従って、生存を延長したことを示す。
【図２０】ＬＣＭＶは、腫瘍特異的Ｔ細胞に、ポジティブに影響を与えたことを示す。
【図２１Ａ】腫瘍特異的Ｔ細胞（ＯＴ１細胞）を用いて、または、用いずに、そして、さらに、腫瘍内で、ＬＣＭＶ（２×１０６  ＰＦＵ）を用いて、または、用いずに、処理された、マウスの皮下リンパ腫（ＥＬ４細胞）を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍径を示す。ＬＣＭＶが、Ｔ細胞療法と相乗的に作用したことを示す。
【図２１Ｂ】腫瘍特異的Ｔ細胞（ＯＴ１細胞）を用いて、または、用いずに、そして、さらに、腫瘍内で、ＬＣＭＶ（２×１０６  ＰＦＵ）を用いて、または、用いずに、処理された、マウスの皮下リンパ腫（ＥＬ４細胞）を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率を示す。ＬＣＭＶが、Ｔ細胞療法と相乗的に作用したことを示す。
【図２２】ＬＣＭＶが、ＰＤ−１遮断と相乗的に作用したことを示す。
【図１】
2018515130.tif 000003
【図２】
2018515130.tif 000004
【図３】
2018515130.tif 000005
【図４】
2018515130.tif 000006
【図５】
2018515130.tif 000007
【図６】
2018515130.tif 000008
【図７】
2018515130.tif 000009
【図８Ａ】
2018515130.tif 000010
【図８Ｂ】
2018515130.tif 000011
【図９】
2018515130.tif 000012
【図１０】
2018515130.tif 000013
【図１１】
2018515130.tif 000014
【図１２】
2018515130.tif 000015
【図１３】
2018515130.tif 000016
【図１４】
2018515130.tif 000017
【図１５Ａ】
2018515130.tif 000018
【図１５Ｂ】
2018515130.tif 000019
【図１６】
2018515130.tif 000020
【図１７】
2018515130.tif 000021
【図１８Ａ】
2018515130.tif 000022
【図１８Ｂ】
2018515130.tif 000023
【図１９Ａ】
2018515130.tif 000024
【図１９Ｂ】
2018515130.tif 000025
【図２０】
2018515130.tif 000026
【図２１Ａ】
2018515130.tif 000027
【図２１Ｂ】
2018515130.tif 000028
【図２２】
2018515130.tif 000029
【配列表】
2018515130000001.app
【国際調査報告】
2018515130.tif 000030
2018515130.tif 000031
2018515130.tif 000032
2018515130.tif 000033
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