(57)【要約】本発明は、スーパーオキシドジスムターゼに特異的に結合し阻害する、および／もしくはカタラーゼに特異的に結合し阻害する、ならびに／またはスーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼに結合し阻害する、具体的には、腫瘍性疾患の治療における使用のための、単一ドメインVHHフラグメントに関連する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スーパーオキシドジスムターゼおよび／もしくはカタラーゼ、ならびに／またはスーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼに特異的に結合する抗原結合構築物であって、腫瘍性疾患の治療における使用のための単一ドメインVHHフラグメントであることを特徴とする抗原結合構築物。
【請求項２】
特異的に、スーパーオキシドジスムターゼに結合し阻害する、および／もしくはカタラーゼに結合し阻害する、ならびに／またはスーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼに結合し阻害する、請求項１に記載の使用のための抗原結合構築物。
【請求項３】
特異的に、スーパーオキシドジスムターゼに結合するが阻害しない、および／もしくはカタラーゼに結合するが阻害しない、ならびに／またはスーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼに結合するが阻害しない、請求項１に記載の使用のための抗原結合構築物。
【請求項４】
さらにマーカーを有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための抗原結合構築物。
【請求項５】
細胞毒性薬に結合されることができることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための抗原結合構築物。
【請求項６】
細胞毒性薬に結合されたことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための抗原結合構築物。
【請求項７】
標的生物における抗原結合構築物の滞留時間を変化させる構成成分に結合されたことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための抗原結合構築物。
【請求項８】
SEQ ID番号：15〜51から選ばれる、少なくとも1つのCDR配列を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための抗原結合構築物。
【請求項９】
SEQ ID番号：15〜51から選ばれる、少なくとも2つのCDR配列を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための抗原結合構築物。
【請求項１０】
SEQ ID番号：15〜51から選ばれる、少なくとも3つのCDR配列を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための抗原結合構築物。
【請求項１１】
少なくとも1つの、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原結合構築物を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
抗原結合構築物が、カタラーゼに特異的に結合し、該カタラーゼを阻害することを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
抗原結合構築物が、スーパーオキシドジスムターゼに特異的に結合し、該スーパーオキシドジスムターゼを阻害することを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つの、カタラーゼに特異的に結合し、該カタラーゼを阻害する抗原結合構築物、および、少なくとも１つの、スーパーオキシドジスムターゼに特異的に結合し、該スーパーオキシドジスムターゼを阻害する抗原結合構築物を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
腫瘍治療剤、特にタキソールをさらに含むことを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
腫瘍性疾患の治療における使用のための、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトカタラーゼまたはヒトSOD1を中和する抗原結合構築物、具体的には単一ドメインVHHフラグメント（ナノボディ）が、腫瘍のアポトーシスをもたらす細胞内ROS強制シグナル経路の再活性化において、軽鎖および重鎖部分からなる標準的な組換えにより作製され、それぞれカタラーゼまたはSOD1を中和する効果を示すFabフラグメントまたはモノクローナル抗体より100倍を超える高い効率を与えるという、予期せぬ発見に基づく。カタラーゼまたはSODに対し単一ドメインVHHフラグメントを適用すると、細胞内ROSシグナル伝達を活性化し、細胞のアポトーシスに至る。2つの保護酵素の1つに対する単一ドメインVHHフラグメントは、カタラーゼおよびSODの保護効果が部分的に重複しており、また相互に関係しているにもかかわらず、ROSシグナル伝達からの腫瘍細胞の保護を取り除くのに十分である。これは、SODは部分的な保護効果を実現するのみであるが、SODの阻害は、上昇した濃度で存在するスーパーオキシドアニオンによるカタラーゼの間接的な阻害をもたらすという事実に基づく。SODまたはカタラーゼの阻害によって引き起こされるシグナル経路の性質は異なる。カタラーゼの阻害は、NO／ペルオキシ亜硝酸塩およびHOCl経路の逐次活性化を可能にするが、SODの阻害は、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路の再活性化のみをもたらす。SODおよびカタラーゼに対する単一ドメインVHHフラグメントは、相乗的に協働し、また、好ましい実施態様における前記相乗効果は、混成分子において強まるという発見には、高い治療的意義がある。この基礎に関して、SODもしくはカタラーゼまたは両方の抗原に結合する抗原結合構築物による腫瘍治療の有利な形態が開示される。
【背景技術】
【０００２】
数年前に、活性酸素種および活性窒素種（合わせて活性酸素（ROS）と略される）が、それらの間接的な変異原性作用に加えて、特異的なシグナル機能も発揮することが発見された（非特許文献１）。この発見の認知は、ある一定のROSは逆の生物学的効果を頻繁に引き起こすという事実により、特に複雑であった。
【０００３】
特許文献１には、腫瘍細胞の保護的膜性カタラーゼの阻害は、細胞内ROSシグナル伝達の再活性化をもたらし、その結果として、腫瘍細胞の選択的細胞死に至ることが開示されている。保護的カタラーゼの阻害は、膜性SODの阻害によっても間接的に達成される。これは、SODの阻害後は、隣接している膜性NADPHオキシダーゼにより生成したスーパーオキシドアニオンが、もはやH2O2に変換されないためである。このようにして、カタラーゼの活性中間体であるCompound I（CATFeIV=O.+）を、一電子移動によって不活性中間体であるCompound II（CATFeIV=O）に変換し、さらに、活性カタラーゼ（CATFeIII）を不活性Compound III（CATFeIIIO2.-）に変換する遊離スーパーオキシドアニオンが、局所的に十分な高濃度で存在する。これら二つの反応により、カタラーゼの活性が効果的に阻害される（非特許文献２および３）。
【０００４】
しかしながら最近では、多段階腫瘍形成におけるROSの役割に対してかなり明確な図式を描くことができ、その知識は、新規で選択的な腫瘍治療法を確立するための方法を示すことができる。これらは非特許文献４〜６で要約される。
１）ROSの変異原性作用は、“腫瘍イニシエーション”の標準的段階に寄与する。
２）ROSは、詳細に説明された基本的な機序はないが、“腫瘍プロモーション”の段階に非常に重要である。そのため、既知の腫瘍プロモーターの多くはROSレベルの上昇を誘導し、ROSを特異的に除去することにより、大部分の腫瘍プロモーターの効果が阻害される。
３）細胞の悪性形質転換は、通常は、膜性NADPHオキシダーゼ（NOX1）の発現をもたらす。この酵素の持続的な活動は、悪性細胞の増殖と形質転換された状態の維持との両方に対して非常に重要である。NOX1は細胞外スーパーオキシドアニオンを生成し、そのジスムターゼ生成物であるH2O2は、細胞に対して自己分泌型増殖刺激剤となる。
４）しかしながら、細胞外スーパーオキシドアニオンの生成は、形質転換細胞のアポトーシスを選択的に誘導するシグナル経路を制御する細胞内ROSの生成の基礎にもなる。ここで、以下に詳細に説明される“HOClシグナル経路”および“NO／ペルオキシ亜硝酸塩シグナル経路”は特に重要である。
したがって、形質転換細胞における特異的ROS依存的アポトーシス誘導が、悪性細胞の有望な除去機構として考察される。
５）腫瘍が良好に発達するには、ROSを産生する悪性細胞が、細胞増殖に必要な自己分泌型ROS産生に影響することなく、ROSシグナル経路の破壊的影響から自分自身を保護することが必要である。これは、これまで研究されたすべての腫瘍系において通常見出され、構成型NOX1活性および膜性カタラーゼの並列的な活性により特徴付けられた腫瘍細胞の表現型をもたらす。さらに、膜性スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）により、ROSシグナル伝達のさらなる調節が生じる。
６）これらの膜性保護酵素の選択的阻害は、腫瘍細胞においてROS依存的選択的アポトーシス誘導を可能にし、大きな治療可能性を有する。
【０００５】
上記に簡単に要約され、以下にさらに説明されるが、相互作用が原因で一般に非常に複雑で、予測することが困難であるメカニズムを考慮して、本発明は、具体的には、腫瘍治療に用いることができる、広い意味における抗原結合構築物を開示する。したがって、本発明の目的は、スーパーオキシドジスムターゼもしくはカタラーゼ、または両方の酵素、すなわちスーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼに特異的に結合し、好ましくは阻害する抗原結合構築物、すなわちナノボディとも呼ばれる単一ドメインVHHフラグメントである。
【０００６】
特許文献２は、SOD１に対する単一ドメイン抗体およびALS（筋萎縮性側索硬化症）の治療におけるその使用を開示する。ここでは、ALSを患う患者における病原性SOD1のレベルは、SOD１に対する単一ドメイン抗体により低下し、好ましい効果が達成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】EP 11170076.1
【特許文献２】WO 2014/191493
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Bauer et al., Chimica, 62, 1-9, 2008.
【非特許文献２】Kono Y and Fridovich I: Superoxide radical inhibits catalase. J Biol Chem 257: 5751-5754, 1982.
【非特許文献３】Shimizu N, Kobayashi K and Hayashi K: The reaction of superoxide radical with catalase. Mechanism of the inhibition of catalase by superoxide radical. J Biol Chem 259: 4414-4418, 1984.
【非特許文献４】Bauer G. Tumor cell protective catalase as a novel target for rational therapeutic approaches based on specific intercellular ROS signaling. Anticancer Res. 32: 2599-2624, 2012.
【非特許文献５】Bauer G. Targeting extracellular ROS signaling of tumor cells. Anticancer Res. 34: 1467-1482, 2014.
【非特許文献６】Bauer G. Increasing the endogenous NO level causes catalase inactivation and reactivation of intercellular apoptosis signaling specifically in tumor cells. Redox Biol. 6: 353-371, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明による抗原結合構築物は、カタラーゼまたはSODに対する単一ドメインVHHフラグメントである。ここでは、同一のアポトーシス誘発効果は、VHHとFabフラグメントとは異なる構造（1本鎖対2本鎖）のため、50％だけの濃度差が予期されるにも関わらず、相当する通常のFabフラグメントの1パーセント未満の濃度で実現される。効果におけるこの劇的な相違は、カタラーゼまたはSODを中和するすべての単一ドメインVHHフラグメントについて認められ、したがって、それらの特徴を示すものである。これは、標準的なFabフラグメントおよび単一ドメインVHHフラグメントに対する結合速度論と結合可逆性との間で、使用によるフラグメントの効果および著しく改良された治療可能性についての広範囲に及ぶ因果関係とともに、今までのところ認識されず、また予測することのできない基本的な相違があるはずであることを示す。この発見を説明する基礎として、標準的なFabフラグメント（免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の抗原結合部分から成る）と単一ドメイン抗体のVHHフラグメント（重鎖の抗原結合部分のみから成る）との間におけるエピトープの同定の相違を用いることができる。標準的なFabフラグメントは特異的エピトープに結合し、ある程度はそのエピトープを含み、結合は、Fabフラグメントの空間構造と表面電荷により決められるが、単一ドメインVHHフラグメントは栓の形状を有しており、この形状は、形状と電荷に関して相補的な標的分子の陥凹に適合する（Muyldermans S. Nanobodies: Natural single domain antibodies. Ann. Rev. Biochem. 82: 775-797, 2013）。本願で開示される、カタラーゼまたはSODを効果的に阻害する単一ドメインVHHフラグメントは、これらの酵素に特徴的であって基質分子を活性中心に通過させる漏斗状部位に結合することが想定される。このような結合の後、酵素の立体構造の変化が誘導され、逆反応、すなわち単一ドメインVHHフラグメントと抗原との間の結合が終了することが効果的に抑制されると考えられる。このようにして、生物物理学的パラメータであり、直接反応および逆反応の反応定数により決定される“親和性”は、逆反応が起こらないために大幅に増大する。たとえ結合が同じ効率で起こるとしても、実際に、通常のFabフラグメントよりもより効率的に、単一ドメインVHHフラグメントによる中和効果が達成される。特有の酵素の阻害において、単一ドメインVHHフラグメントのこの本質的な効果は、いまだに記述されておらず、予期されないものである。
【００１０】
ある単一ドメインVHHフラグメントが、カタラーゼまたはSODについての阻害効果を実現するということは、その結合が、酵素の活性中心とは異なる部位で起こるという事実によっては排除されることはない。しかし、タンパク質内での既知のアロステリック遠隔効果により、酵素活性の阻害効果が実現される。本発明によると、作用連鎖の変動に対する結果により、酵素のアロステリック阻害を引き起こす領域に対する単一ドメインVHHフラグメントの親和性は、標準的なFabフラグメントにより達成されるものより著しく高いことが推測される。したがって、本発明は、酵素の活性中心に直接結合する単一ドメインVHHフラグメントに限定されない。
【００１１】
その一方で、人工的に製造された抗体フラグメントの構造に関しては、膨大な種類の異なる構造があることに留意すべきである。ホリガーらの論文（Holliger et al. (2005), Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 9, 1126-1136）において、抗原結合分子のさまざまな構造が説明されている。本発明において用いられるVHH単一ドメインフラグメントに加えて、Fabフラグメント、単鎖Fv、二重特異性抗体、ミニボディ、三重特異性抗体などの数多くの他の構造が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明において用いられる単一ドメイン抗体フラグメントは、ラクダ科（ラクダ、ラマ、アルパカ）の抗体分子に由来する。天然表現型におけるこれらの抗体はFc部分（CH2およびCH3を伴う）を有するが、それぞれCDRを伴うVHH部分を有する2本の重鎖から成る。ラクダ科の抗体は軽鎖を持たない。これらのVHH部分は、単一ドメインVHHフラグメントまたはナノボディと呼ばれる。
【００１３】
本発明による単一ドメインVHHフラグメントは、それ自体が用いられるか、または、ある目的を達成するために化学的に修飾される。本発明による単一ドメインVHHフラグメントは、共有化学結合またはイオン相互作用もしくはファンデルワールス力などの他の化学的相互作用により、有益な効果を有する他の構成成分と結合することができる。これらは、リガンドおよび／または受容体などの、特異的な細胞に結合する生物学的に活性な分子との複合体であってもよい。本発明による単一ドメインVHHフラグメントは、放射性核種や発色酵素などの画像形成材料に結合させることも可能である。本発明による分子は、体内において延長された滞留時間をもたらす分子に結合させてもよく、例えば、ポリエチレングリコールなどのより大きな高分子に結合させることにより達成される。単一ドメインVHHフラグメントの修飾についてのさまざまな適用可能な選択肢は、アイヤーらの総説（Eyer et al., Veterinarni Medicina (2012), 9, 439-531）に開示されている。参照はこの文献目録に明確に用意される。
【００１４】
構造によって、1つおよび同一のハイブリッド分子がカタラーゼおよびSODに同時に結合することを排除することができるが、さらに好ましい実施態様において、相乗効果を“自己濃縮”するハイブリッド分子が説明される。これは、このハイブリッド分子の効果を、意図された効果を実現するためには、一般に両方の標的構造に結合しなければならない標準的な二重特異性抗体と区別する。
【００１５】
本発明の実質的な態様は、抗原結合構築物が、それぞれの標的分子（スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼ）に特異的に結合するだけではなく、それらを阻害するということである。前記の態様は、当業者に周知の標準法により試験される。適切な試験モデル、例えば所望の標的分子（カタラーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ）を細胞表面に発現する腫瘍細胞において、または精製したSODまたはカタラーゼを加えた試験系において、それぞれの酵素に対する基質が添加されるか、または細胞により生成される。次に、遊離体の消費または産物の生成が、適切な測定法により測定される。ここで、例えば、腫瘍細胞のROS依存的アポトーシスの誘導などの生物学的プロセスが、パラメータとして用いられる方法も適用することができる。前記の、一般に非常に高感度な生物学的方法の有意味性に対する必要条件は、試験される酵素により分解される基質が、測定された生物学的効果を伴って制御可能であり、定量的な状況にあることである。これは、SODおよびカタラーゼに対して特に問題である。例えば、SODは、細胞内ROSシグナル伝達に必要なスーパーオキシドアニオンをH2O2に代謝し、HOCI依存的なアポトーシス誘導に必要なスーパーオキシドアニオンとHOClとの間の相互作用を抑制する。
【００１６】
したがって、単一ドメインVHHフラグメントまたはFabフラグメント（対照）が介在するSODの阻害は、外因的に加えられたHOCIによる腫瘍細胞のアポトーシス誘導が、試験系として用いられるという事実により測定することができる。HOClは、HOClと活動的なヒドロキシラジカルの生成をもたらすスーパーオキシドアニオンとの間の相互作用に基づいて、アポトーシスを濃度依存的に誘導する（Bauer G. HOCl-dependent singlet oxygen and hydroxyl radical generation modulate and induce apoptosis of malignant cells. Anticancer Res 33: 3589-3602, 2013）。前記のアポトーシス誘導は、適切な濃度で外因的に加えられたSODにより完全に阻害される。すなわち、単一ドメインVHHフラグメントまたはFabフラグメントの中和効果は、アポトーシスの阻害が、試験される単一ドメインVHHフラグメントまたはFabフラグメントにより再度解除されるかどうかを確認することにより判定される。前記の試験系を定量的に用いるには、当業者が熟知しているいくつかの単純なステップと連結することが必要である。第1のステップにおいて、妥当な試験時間（1〜2時間）内に有意に定量化できるアポトーシスシグナルを生成する、市販のHOCl（または培養液中でHOClを十分に形成する次亜塩素酸ナトリウム）の濃度を決定する。経験が示すように、0.1〜1 mMのHOCl濃度が適切である。パラメータは、アポトーシス細胞の百分率（位相差顕微鏡により直接測定される）、または、市販されており、ミトコンドリア代謝活性を測定することにより細胞生存率を測定する3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT）試験が適切である。第2のステップでは、選択されたHOCl濃度の効果を完全に阻害するのに十分なSOD濃度を決定する。経験が示すように、これには5〜50 U/mLのSOD濃度が適切である。前記決定の正確性は、Cu/Zn-SODによるHOCl効果の阻害は、それ自身最適曲線として表されるため、特に重要であり、また、最適阻害効果を達成することは、試験の有意味性に対して必須である。最初の二つのステップが十分に実行されると、単一ドメインVHHフラグメントまたはFabフラグメントの阻害効果の実際の試験を行うことができる。このために、選択された濃度の試験されるフラグメントは、前もってステップ#2で決定された至適濃度のSODと共に20分間プレインキュベーションする。続いて、前記混合物を試験細胞に添加する。その後HOClを加え、アポトーシス誘導を測定する。SODの最適阻害とその結果としての中和効果の明確な結果は、SODの阻害効果が少なくとも90％付近まで消失する、すなわち、アポトーシス誘導が、SOD無添加でのアポトーシス誘導より10％程度低いのみということが達成されるという条件において得られる。SOD無添加でのアポトーシス誘導の比較値が、少なくとも50％に達することを特徴とするSODの阻害効果が達成される場合、SODの有意な阻害がある。そのような知見の意味は、次の試験で、単一ドメインVHHフラグメントまたはFabフラグメントの濃度を増加させることにより、さらに調べることができる。単一ドメインVHHフラグメントまたはFabフラグメントの濃度を増加させれば、SODの有意な阻害がある場合、アポトーシス誘導が回復増大することが期待される。
【００１７】
カタラーゼに対する単一ドメインVHHフラグメントまたはFabフラグメントの中和効果の測定に対して、H2O2のアポトーシス誘導作用およびカタラーゼのH2O2分解に基づく試験系が適切である。ここでは、細胞試験系として、良性細胞および悪性細胞の両方を使用することができる。選択された細胞系で、アポトーシス誘導を定量的に測定できることが必要であるのみである。H2O2供給源として、H2O2産生グルコースオキシダーゼ（GOX）が、H2O2の直接添加に比較して好ましい。これは、（細胞の培養液からのグルコースを用いて）GOXによる連続的なH2O2の産生が、非常に正確なH2O2流動の調整を可能にするためである。試験系は、カタラーゼが介在するGOXによるアポトーシス誘導の阻害、およびカタラーゼを中和する単一ドメインVHHフラグメントおよびFabフラグメントによるアポトーシス誘導の回復に基づく。第1のステップにおいて、適切な時間（1〜2時間）内にアポトーシスを有意に阻害するGOX濃度が決定される。このためには、一般に細胞系に依存して、0.1〜40 mU/mLのGOX濃度が必要である。第2のステップにおいて、GOXにより得られる効果を無効にするのに十分なヒトカタラーゼ濃度が決定される。経験が示すように、このために必要なカタラーゼの濃度範囲は、20 U/mL未満である。GOXおよびカタラーゼの適切な濃度の決定に成功した後、単一ドメインVHHフラグメントおよびFabフラグメントのカタラーゼ中和効果の測定についての実際の実験を行うことができる。このためには、選択された濃度のカタラーゼを、選択された濃度の試験される単一ドメインVHHフラグメントおよびFabフラグメントと共に20分間プレインキュベーションする。続いて、前記混合物を、適切であるとして決定した濃度のGOXと共に細胞に添加し、アポトーシス誘導を測定する。単一ドメインVHHフラグメントまたはFabフラグメントについての信頼性のある中和効果は、GOX介在性のアポトーシス誘導に関するカタラーゼの阻害効果が、少なくとも90％付近まで消失した場合に、すなわち、カタラーゼ無添加の対照標品において示される、アポトーシス誘導値が90％に達した場合に得られる。カタラーゼの阻害効果の消失が少なくとも50％に達した場合、試験された単一ドメインVHHフラグメントまたはFabフラグメントの有意な阻害効果が推測される。次の試験において前記フラグメントの濃度を増加させることにより、この知見をさらに調べることができる。
【００１８】
ここにリストされた試験方法における対照として、まったく異なる抗原に結合する抗原結合構築物が用いられる。実際の試験においては、詳しく前述した通り、調べられる各構築物を反応混合物に添加し、カタラーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼの酵素活性が阻害されるのか、または阻害されないのかを測定する。この目的のためには、平均的な当業者が容易に精通する種々の試験モデルを用いることができる。この知見は、抗原結合構築物が、どのように標的酵素（それぞれカタラーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ）に結合することができるのかを決定するのに重要である。
【００１９】
抗原結合構築物が触媒中心またはその近傍に結合しない場合のほとんどで、酵素活性は阻害されないか、または実質的に阻害されないと考えられる。しかしながら、抗原結合構築物が触媒中心または立体状の近傍に直接結合する場合、または、結合が触媒中心から遠く離れているにもかかわらず、通常の酵素反応がもはや自由には成り行かないようなアロステリック効果を介して標的酵素の高次構造を変化させる場合、反応物はもはや酵素と反応せず、転換はもはや自由には起こらない。生化学系における絶対値の定量は常に変動するので、そのような試験は、好ましくは1つの試験で行う。そこでは、同一状態で同一量の細胞が異なる試験条件に置かれ、発表することが可能になる。本発明の目的において、それぞれの酵素の触媒活性（または、それぞれの酵素集団の全体活性）が、適当量の抗原結合構築物の添加により、少なくとも50％近くに、好ましくは少なくとも70％近くに、特に好ましくは少なくとも90％近くに減少する場合に、スーパーオキシドジスムターゼおよび／またはカタラーゼの阻害が得られる。
【００２０】
本発明のさらなる実施態様において、カタラーゼおよび／またはスーパーオキシドジスムターゼに結合し、かつこれらの酵素を阻害しないか、または部分的にだけ阻害する抗原結合構築物、好ましくはナノボディが提供される。また、これらの抗原結合構築物は有利に用いることができ、例えば、前記構築物は、マーカーとして役立つ構成成分に結合することができるように、または結合するように設計される。例えば、この構成成分が適切な検出系において対応するシグナルを与えるマーカーであれば、腫瘍細胞は標識される。また、これらの構築物は、細胞毒性薬に結合させることもでき、または、前記細胞毒性薬に結合させることができるように、もしくは、任意に、標的組織内で前記細胞毒性効果器にそれ自体結合するように構成することができる。
【００２１】
さらに好ましい実施態様において、ある抗原結合構築物がカタラーゼおよび／またはスーパーオキシドジスムターゼを阻害し、他の構築物は、スーパーオキシドジスムターゼおよび／またはカタラーゼを阻害しないか、または部分的にだけ阻害する混合物が用いられる。この混合物は、2つの異なる抗原結合構築物を含むハイブリッド分子であってもよい。
【００２２】
本発明による抗原結合単一ドメインVHHフラグメントは、好ましくは遺伝子工学により産生され、完全抗体のようにFc部分を持たない。この単一ドメインVHHフラグメントは、軽鎖を欠いていることにより標準的なFabフラグメントと異なる。すなわち、これらは抗体の重鎖の抗原結合部分のみである。
【００２３】
本発明の範囲内で、遺伝子工学により、好ましい抗原結合フラグメントが製造され、配列決定される。配列は本願明細書中に開示される。構築物のCDR領域は、抗原結合配列に対して特に重要である。いわゆる“相補性決定領域”（以下、簡単にCDRと表示）は、免疫グロブリンの可変鎖の非常に特異的な部分である。前記CDR領域は、免疫グロブリンのフレームワーク配列内に組み込まれており、その特異性を決定し、免疫グロブリンが結合する特異的抗原との接触を成立させる。CDR領域は免疫グロブリンの最も可変的な部分であり、これらの分子の多様性に実質的に寄与している。重鎖および軽鎖を有する免疫グロブリンにおいては、6つのCDR領域がある。しかしながら、本発明による好ましい単一ドメインVHHフラグメントの場合のように、免疫グロブリンが1つの鎖のみから成る場合、3つのCDR領域がある。
【００２４】
一般に、CDR領域は、結合特異性が維持される場合、ほとんど変化せずに存在するということが重要である。しかしながら、小さな突然変異は、抗体結合構築物の機能性に悪影響を与えないということが重要である。このことは、CDRの構造が、アミノ酸の交換によっては悪影響を受けない場合に特に当てはまる。そのようなアミノ酸交換は、新たに挿入されたアミノ酸が、置換されたアミノ酸に極めてよく似ている場合、起こり得る。したがって、好ましい実施態様において、抗原結合フラグメントは、本願の範囲内で開示されたCDR領域を有し、または、せいぜい少数のアミノ酸において、実質的に変化せず、または結合性および結合特異性が減少した、それぞれ開示されたCDR配列と異なる。
【００２５】
本発明の範囲内で、カタラーゼおよび／またはスーパーオキシドジスムターゼを阻害するか、または阻害しないが、それらには結合するような構築物からの系統である、抗原結合単一ドメインVHHフラグメントのCDR領域が開示される。好ましい実施態様において、本発明による単一ドメインVHHフラグメント（ナノボディ）は、少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つの、最も好ましくは少なくとも3つのCDR領域を含み、カタラーゼおよび／またはスーパーオキシドジスムターゼを阻害する構築物に由来するCDR領域が特に好ましい。
【００２６】
本発明による構築物は、治療への応用が意図される場合、好ましくはヒト化される。ここでは、フレームワーク配列は、ヒトフレームワーク材料で置換されるか、または、非ヒト配列は、突然変異によりヒト配列に変更されるが、結合特性は維持される。
【００２７】
治療的に使用できる生物学的分子（ここではナノボディ）の開発に対して、アミノ酸配列の変更はしばしば不可避である。この分子はヒトに由来せず、もともとはラクダ科に由来するため、外来性のエピトープが生じる可能性がある。そのような抗体反応は、治療で使用される抗体フラグメントの効果を中和する。これらの障害を避けるために、治療的に使用される分子はヒト化される。抗体または抗体フラグメントのヒト化は、本専門領域において周知の技術である。通常は、当初の分子に最も類似性が高いと考えられるヒトフレームワーク配列（骨格）が探される。次に、CDR領域が、当初のナノボディから切り取られ、ヒト配列中に移植される。ここでは、アミノ酸配列の若干の改変が成されることが避けられないものではない
【００２８】
実質的な特徴は、抗体の結合部分に対する抗原の結合部位は、CDR配列により決定されるということである。ヒト化において、抗原結合部分の有利な特徴を維持する目的で、3つのCDR配列のうち1つまたは2つを多少改変する必要があるかもしれない。したがって、本発明による単一ドメインVHHフラグメントは、本願において開示されるように、少なくとも1つの、好ましくは2つの、特に好ましくは3つのCDR配列を含むことを特徴とする。
【００２９】
このように、本発明の目的は、少なくとも1つの、好ましくは2つの、特に好ましくは3つの、SEQ ID番号により特徴付けられた下記CDR領域を有する単一ドメインVHHフラグメントである。これらは、SEQ ID番号19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29および30を持つ配列である。SODに結合するクローンに由来するさらに好ましいCDR配列は、SEQ ID番号31、32、33、34、35、36、37、38および39を持つCDRである。また、SEQ ID番号40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50および51を持つCDR配列も好ましい。
【００３０】
さらに好ましい実施態様において、本発明による構築物は、さらにマーカーを提供する。その使用のためには、構築物が、標的酵素をその機能において阻害する必要はない。むしろ、十分な親和性を持った特異的結合で十分である。そのような結合は、ヒトカタラーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼが適切な担体に結合され、酵素と単一ドメインVHHフラグメントとの複合体が、一般的な検出法により検出されるという標準的なELISA系で測定することができる。一方で、マーカーは、診断意見に至るため、所望の腫瘍細胞を標識することに用いることができる。他方で、マーカーは、他の効果器に対して、腫瘍細胞を標識することにも役立つ。例えば、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する効果器に結合するマーカーとして、構築物を使用し得る。そのようなマーカーの一例は、細胞傷害性T細胞のCD3受容体と反応する抗CD3部分である。かかる抗CD3部分は、例えば、CD3受容体に対する抗体の抗原結合部分である。
【００３１】
本発明のさらなる実施態様において、本発明による抗原結合構築物は、細胞毒性薬に結合させることができるように構成してもよい。細胞毒性薬として、例えば、種々の起源、例えば細菌、真菌または植物に由来する種々の毒素が知られている。好ましくは、毒素は、2〜3例を挙げると、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、またはストレプトリジンである。
【００３２】
さらなる実施態様において、本発明による抗原結合構築物は、異なる形式の結合および結合可能性によって細胞毒性薬に結合される。これらは、共有結合などの頑丈な化学結合およびイオン相互作用またはファンデルワールス力でもよい。
【００３３】
さらなる実施態様において、本発明による抗原結合構築物は、放射性同位体であってもよく、または放射性同位体に強固に結合されることもあり得る。該放射性同位体は、腫瘍細胞に極めて接近して放射性同位体を送達することにより、腫瘍細胞の診断的検出に役立つ、または本発明による抗原結合構築物の細胞傷害効果を亢進する。好ましくは、副作用をできるだけ低減するため、比較的短く放射するのみという治療への応用において、かかる同位体が使用される。さらに、同位体の半減期は、身体および環境への負担を許容範囲に留めるため、比較的短くあるべきである。好ましくは、イットリウム-90、レニウム-186またはエルビウム-169が用いられる。
【００３４】
さらなる実施態様において、本発明による抗原結合構築物は、種々の結合および結合可能性によって着色剤に結合される。これらは、共有結合などの頑丈な化学結合およびイオン相互作用またはファンデルワールス力でよい。着色剤は、異なる一般的な方法により検出することができる。かかる構築物は、診断目的で使用することができる。
【００３５】
さらなる実施態様において、本発明による抗原結合構築物を少なくとも1つ含む医薬組成物が開示される。該医薬品は、好ましくは、腫瘍性疾患の治療、特に胃がんの治療に使用される。
【００３６】
本発明による医薬組成物は、カタラーゼに特異的に結合し、かつ阻害する抗原結合構築物を少なくとも1つ含む。他の実施態様において、本発明による医薬組成物は、スーパーオキシドジスムターゼに特異的に結合し、かつ阻害する抗原結合構築物を少なくとも1つ含む。さらなる実施態様において、医薬組成物は、カタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼの両方に結合し、かつ両方の標的酵素を阻害するハイブリッド分子を含む。
【００３７】
抗SOD単独ではNO／ペルオキシ亜硝酸塩経路を再活性化するが、抗カタラーゼはHOCl経路を誘導するのに対して、該ハイブリッド分子の相乗効果は、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路のみを再活性化するということは、驚くべきことであり、予期しないことである。該ハイブリッド分子によるNO／ペルオキシ亜硝酸塩経路のみの再活性化は、将来の応用に対する優位性を意味する。これは、より単純なNO／ペルオキシ亜硝酸塩経路は、特に、用量効果関係について求められる定常相の幅を考慮すると、NO代謝の付加的な調節により、さらに最適化すべきものであるためである。
【００３８】
抗SOD、または抗SODおよび抗CATからのハイブリッド分子によるNO／ペルオキシ亜硝酸塩経路のみの再活性化のさらなる利点は、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路の過程におけるシグナル化学（ill. 1-4）に起因して、遊離H2O2は存在しないということである。これは、H2O2が、腫瘍細胞の生存に関して、治療効果に対し有害である増殖刺激効果を有するので、望ましいことである。抗SOD、または抗カタラーゼおよび抗SODからのハイブリッド分子の治療的使用についての前記利点の原理は、本明細書において開示されたものであり、EP 11170076.1には開示されていないものであり、予期しない効果を有する。この効果は、進歩性の存在を示す。
【００３９】
本発明のさらに好ましい実施態様において、少なくとも1つの本発明の抗原結合構築物が、抗腫瘍活性を有する有効成分と共に使用される。抗腫瘍効果を有する種々の有効成分が知られている。特に本組成物において提示される化学療法剤として、タキソール、シスプラチン、エンドスタチン、オキサリプラチン、エトポシドまたはコルヒチンなどの薬物の名前を挙げることができるが、これは、例としてほんのわずかの有効成分の名前を挙げるものである。好ましくは、タキソールが用いられる。
【００４０】
本発明による抗原結合構築物は、遺伝子工学により製造することができる単一ドメインVHHフラグメントである。
【００４１】
抗原結合構築物における個々のフラグメントの正確な分子配列は、所望の機能、すなわちカタラーゼおよび／またはスーパーオキシドジスムターゼへの結合およびこれらの阻害が維持される限りは、重要性は付随的である。
【００４２】
本発明による抗原結合構築物は、分子生物学的方法で製造される。これらは、天然に存在する抗体またはFabフラグメントを簡易な（酵素的な）切断により製造したものではない。さらに理解を深めるため、抗体の構造を簡単に要約する。例えば、IgG型の抗体は、2本のFabフラグメントと1本のFcフラグメントから成る。各Fabフラグメントは軽鎖と重鎖とから成り、重鎖は可変部（VH）と定常部（CH1）に分けられ、軽鎖は可変部（VL）と定常部（CL）に分けられる。次に、抗原結合に関係のあるCDR（相補性決定領域）1〜6を含む可変部VHおよびVLが、特に興味深い。Fabフラグメントの結合特性は、個々のCDR領域を空間的に配列するフレームワーク構造に埋め込まれたCDR領域により決定される。
【００４３】
抗原結合構築物は、単一ドメインVHHフラグメント（ナノボディ）である。ナノボディは、結合に関係する抗体の重鎖部分のみを含み、細菌性細胞において非常に高発現させることができる（Muyldermans S. Nanobodies: Natural single-domain antibodies. Ann. Rev. Biochem. 82: 775-797, 2013）。
【００４４】
遺伝子工学の様々な方法を活用して、多数の抗原結合構築物を製造することができる。このために用いられる方法は、非常に多様であり、当業者に周知である。一般的に、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、またはラクダ、アルパカなど）を所望の抗原で免疫して進められる。ラクダおよびアルパカは、生まれながらに通常の抗体に加えて、重鎖のみで構成されたIgGを持つので、確立された選択的スクリーニング法と組み合わせてこれらの動物を使用すると、核酸配列をコードする単一ドメイン抗体を取得することができる。次に、適切な免疫細胞（例えばB細胞）から、核酸配列を単離することができる。この核酸配列は、例えばファージディスプレイと呼ばれる適切な方法により、さらに最適化される。次に、これらの方法を用いて、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合構築物分子が得られる。このような関係において、具体的には、構築物は、好ましくは探索する分子のみに結合し、より具体的には前記分子（SODまたはカタラーゼ）のエピトープのみに結合するということを意味する。
【００４５】
前記抗原結合構築物の他の重要な特徴は、所望の抗原に高感度に結合するということである。高感度にとは、抗原結合構築物が非常に低濃度であっても、所望の抗原または所望のエピトープへの特異的結合が起こるということを意味する。簡単に表現すると、抗原結合構築物が標的抗原に良く結合すればするほど、より高感度になるということである。単一ドメインVHHフラグメントは、標準的なFabフラグメントがそうであるようにはエピトープを包み込まないが、その分子構造に起因して抗原の空間的陥凹に結合するので、あるエピトープの検出能に関して、単一ドメインVHHフラグメントのこれら二つの型により、実質的に相違する結果となる。
【００４６】
本発明による抗原結合構築物は、スーパーオキシドジスムターゼに特異的に結合し、この酵素を阻害する。標的分子であるスーパーオキシドジスムターゼの阻害は、抗原結合構築物が、スーパーオキシドジスムターゼの触媒活性中心（SOD）に結合する、またはこの触媒中心の近接に結合し、酵素の立体阻害をもたらすという事実により達成される。その結果、スーパーオキシドアニオン（SODの代表的かつ特異的な基質）はもはやこの酵素に結合できず、この酵素によるH2O2への触媒的変換が行われない。
【００４７】
同じことはカタラーゼに当てはまる。本発明による抗原結合構築物は、カタラーゼに特異的かつ高感度に結合し、カタラーゼを阻害する。その結果、H2O2のH2O + 1/2 O2への酵素的変換、またはペルオキシ亜硝酸塩のNO2-および1/2 O2への酵素的変換が阻害され、カタラーゼの活性中間体“Compound I”によるNOの酸化が妨げられる。
【００４８】
本願において、以下の一覧に示した略語を使用した。
AEBSF：フッ化4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニル（NADPHオキシダーゼ阻害剤）
3-AT：3-アミノトリアゾール（カタラーゼ阻害剤）
抗CAT：カタラーゼに対する抗体
抗SOD：SODに対する抗体
（図中のスペースの理由により、抗CATおよび抗SODの記号表示は、aCATおよびaSODで置き換える。）
CAT：カタラーゼ
Compound I：式CAT FeIV = O.+のカタラーゼおよび式POD FeIV = O.+のペルオキシダーゼの活性中間体段階。Compound Iは、カタラーゼまたはペルオキシダーゼと1分子の過酸化水素の反応において形成される。カタラーゼも、1分子のペルオキシ亜硝酸塩と共にCompound Iを形成することができる。
Duox：二重オキシダーゼ（NADPHオキシダーゼおよびペルオキシダーゼドメインから成る膜性酵素。ペルオキシダーゼドメインは、プロテアーゼにより切断される。）
FBS： ウシ胎仔血清
FeTPPS：塩化5-, 10-, 15-, 20-テトラキス(4-スルホナトフェニル) ポルフィリナト鉄(III) （ペルオキシ亜硝酸塩分解触媒）
NO：一酸化窒素
NOD：一酸化窒素ジオキシゲナーゼ（NOを硝酸塩に酸化する。）
NOS：NO合成酵素
NOX：NADPHオキシダーゼ（本明細書では、特に膜性NOX-1）
POD：ペルオキシダーゼ（特に、あるペルオキシダーゼの能力は、過酸化水素の存在下、塩素イオンをHOClに酸化することができる。）
PON：ペルオキシ亜硝酸塩
POR：チトクロムP450酸化還元酵素
RAS、RAC：がん遺伝子
ROS：活性酸素種および活性窒素種（スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素、過酸化水素、HOCl、ペルオキシ亜硝酸塩などのラジカル種および非ラジカル種）
siRNA：低分子干渉RNA（定義された遺伝子産物の合成を特異的に減少させる試薬）
SOD：スーパーオキシドジスムターゼ（本明細書では、特にSOD-1（腫瘍細胞からの活性中心にCu++があるもの、および分析目的のための細菌からのMnSOD））
TGF-β：トランスフォーミング増殖因子タイプβ
【図面の簡単な説明】
【００４９】
次の図表示は、先ず、形質転換細胞におけるアポトーシス誘導ROSシグナル経路（模式図１：HOCl経路；模式図２：NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路）をまとめ、次に、これらのシグナル経路に関する膜性カタラーゼおよび膜性SODの腫瘍細胞特異的効果を示す（模式図３および４）。下記の明細書に記載の番号(1)〜(12)はそれぞれ図面の番号
2018505178.tif 000002
に対応する。
【００５０】
【図１】模式図１（HOCl経路）は、NOX1およびDUOX（NOX1関連NOXドメインおよびペルオキシダーゼドメインから成る）の発現に特徴付けられた悪性形質転換細胞の膜を示す。DUOX は正常細胞にも検出されるが、NOX1の発現は、悪性細胞特有の特性を示す。マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の作用により、ペルオキシダーゼドメインが遊離する(1)。NOX1により生成したスーパーオキシドアニオン(2)は、ペルオキシダーゼにより基質(4)として使用されるH2O2 (3)に不均化する。ここで、未変性のペルオキシダーゼ（PODFeIII）から、塩素イオンをHOCl (5)に酸化することのできる反応中間体“Compound I”（PODFeIV=O+）が形成される。マイクロモル範囲の濃度で存在するHOClは、それがスーパーオキシドアニオンと反応して、アポトーシスを誘導するヒドロキシラジカル(6)を生成する場合、傷害効果を発現するだけである。ここで、最終段階は、セラミドの生成を介してアポトーシスのミトコンドリア経路の誘導（示さず）をもたらす、ヒドロキシラジカル(7)による脂質過酸化である。ペルオキシダーゼを上回って相対的に過剰のH2O2がある場合、(8)および(9)に示される反応は、HOClを消費することにより（(8)）、またはその合成を妨げることにより（(9)）、HOClシグナル経路の終結に至る。
【００５１】
【図２】模式図２は、形質転換細胞のNO／ペルオキシ亜硝酸塩シグナル経路を示す。NO合成酵素（NOS）は一酸化窒素（NO）を生成する（(1)）。NOの大部分は、一酸化窒素ジオキシゲナーゼ（NOD）により硝酸塩に変換される(2)。NODは、チトクロムP450依存性酸化還元酵素（POR）により調節される。NOは、高い膜透過性(3)を示し、形質転換細胞の外側で生成されたスーパーオキシドアニオンと反応し、ペルオキシ亜硝酸塩（ONOO-）になる(4)。ペルオキシ亜硝酸塩のプロトン付加により形成されたペルオキシ亜硝酸（ONOOH）(5)は、極めて迅速にNO2およびヒドロキシラジカルに分解する（(6)）。反応順序(7)〜(12)は、NOに対する代替反応選択肢を示しており、全体で消費反応を表し、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路を弱める、または終結する。しかしながら、この消費反応は、NO濃度を増加させることにより、H2O2依存性プロセスを調節する選択肢を示す。
【００５２】
【図３】模式図３は、腫瘍細胞が、膜性カタラーゼ（CAT）を発現させて、H2O2を破壊すること（(3)）によるHOCl合成を防止することにより、効率的にHOClシグナル経路(1)、(2)、(4)〜(6)を抑制することを示す。確かに、膜性SODは、スーパーオキシドアニオンのH2O2への不均化を促進し、これはHOCl経路に影響するが、この効果は、カタラーゼの作用により前記H2O2を分解するという結果をもたらさない。しかしながら、シグナル経路に対して必須のスーパーオキシドアニオンのSOD介在性の濃度減少は、HOClとスーパーオキシドアニオンとの間の相互作用(5)を阻害し、ROSシグナル伝達からの腫瘍細胞の保護を強める。阻害効果の分析により、確かに、SOD単独の効果は明らかに重要であるが、部分的な保護しか示さないのに対して、腫瘍細胞の膜上のカタラーゼは、HOCl合成の完全かつ優位な阻害に対して十分であることが示される。
【００５３】
【図４】模式図４は、NO／ペルオキシ亜硝酸塩シグナル経路からの腫瘍細胞の保護における、膜性カタラーゼおよびSODの複雑な相互作用を要約する。カタラーゼは、NOのNO2への酸化(5)によりペルオキシ亜硝酸塩の生成を妨げ、生成される可能性のあるペルオキシ亜硝酸塩を分解(6)により破壊する。SODは、スーパーオキシドアニオンの除去(4)によりペルオキシ亜硝酸塩の生成を妨げ、また、限定的にペルオキシ亜硝酸塩を破壊することもできる(11)。模式図２に示された消費反応により、反応(10)においてSODにより生成されたH2O2は、NO濃度の追加的な現象に寄与するということも推測される。模式図は、腫瘍細胞が、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路を協調して繰り返し調節することができることを印象的に示す。
【００５４】
以下の図表示５（図５）および６（図６）において、保護的酵素であるカタラーゼおよびSODの複合的な効果の理解に必要である、酵素学的な詳細を要約する。
【００５５】
【図５】模式図５は、カタラーゼによるHOClシグナル経路(1)の阻害は、カタラーゼ中間体“Compound I”（CATFeIV=O+）が最も重要であり、未変性の酵素に再形成されるという二段階機構(2)、(3)によってもたらされることを示す。一方では、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路の阻害(4)が、Compound Iが関与する二段階機構を経て、ペルオキシ亜硝酸塩の分解により、他方では、NOの酸化(8)により起こる。NOの酸化は、カタラーゼのNO依存性阻害と平衡状態にあるが、このカタラーゼ阻害は、比較的高いNO濃度で効果が現れる。
【００５６】
【図６】模式図６は、スーパーオキシドアニオンのH2O2への、SOD介在性の不均化(1)、(2)が、酵素結合Cu++の還元およびCu+の酸化が重要な役割を果たす二段階機構によりもたらされることを示す。スーパーオキシドアニオンの反応は、HOCl 経路に必須のHOClとスーパーオキシドアニオンとの間の相互作用(3)およびペルオキシ亜硝酸塩の生成(4)のいずれも妨げる。また、SODは、反応ステップ(7)〜(9)によってペルオキシ亜硝酸塩を破壊する潜在力を有する。
【００５７】
模式図５および６は、カタラーゼおよびSODが、教科書に記載されている知識と相違して、高選択性反応により特徴付けられるのではなく、むしろ複合的で、部分的に重複する機能を実行することを示す。結局は、このことは、顕著に柔軟で、複雑な生物学的効果をもたらす。
【００５８】
【図７】模式図７は、腫瘍細胞の外側に作用する酵素間の全体状況を示す。膜性NADPHオキシダーゼ（NOX）は、両シグナル経路に必須のスーパーオキシドアニオンを産生する。膜性SODは、スーパーオキシドアニオンのかなりの部分をH2O2に変換する（(1)、(2)）。このことは、ペルオキシ亜硝酸塩の生成の部分的阻害(3)をもたらし、またスーパーオキシドアニオンとHOClとの間の相互作用の部分阻害(4)をもたらす。ここで、HOClは、ペルオキシダーゼ（POD）により生成された（(5)）。さらに、SODもまたペルオキシ亜硝酸塩を分解する（反応順序(6)〜(8)）。カタラーゼは、H2O2の分解(9)によりHOCl合成を妨げ、ペルオキシ亜硝酸塩を分解し、また、NOの酸化(11)によりペルオキシ亜硝酸塩の生成を妨げる。
【００５９】
図表示７に要約された事実は、図表示８（図８）に示された結論をもたらす。これによると、SODはステップ(3)および(4)の部分的保護を達成するだけであるので、膜性カタラーゼの単独阻害（(9)、(10)）は、HOClシグナル経路およびNO／ペルオキシ亜硝酸塩経路の再活性化をもたらす。
【００６０】
一方で、SODの阻害は、アポトーシス誘導シグナル経路の再活性化に十分であるということを想定することはできない。これは、カタラーゼの主要な阻害効果が、それと反対であるためである。しかしながら模式図９（図９）で説明されるように、それは正しいわけではない。この当初は予期されなかった発見を理解するための鍵は、カタラーゼに対するスーパーオキシドアニオンの阻害効果である。SODの阻害後は、スーパーオキシドアニオン濃度の局所的増加が観察されるので（これは、自発的不均化反応によってのみ解消される。）、SODが直接阻害されるのみであれば、カタラーゼに対する間接的阻害効果が得られる。
【００６１】
スーパーオキシドアニオンによってもたらされるカタラーゼ阻害に対する酵素的原理は、模式図１０（図１０）で説明される。一方においては、スーパーオキシドアニオンは、未変性のカタラーゼを不活性Compound III（CATFeIIIO2.-）(1)に変換することができるが、他方では、一電子遷移によりCompound I（CATFeIV=O.+）を不活性のCompound II（CATFeIV=O）に変換し、酵素効果を実質的に阻害する。このようにして、阻害作用に必要な濃度に満たないスーパーオキシドアニオン濃度のSOD介在性の低下が、カタラーゼ活性の確立に寄与する（図１１、模式図１１を参照）ということが理解される。一方、SODの直接阻害は、カタラーゼの間接的阻害を必然的に伴う（図１２、模式図１２）ということが直ちに認識される。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明は、以下の実施例により詳細に説明される。本発明による実験結果は、多くは図で説明される。特に好ましい実施態様の開示配列がある。
【実施例１】
【００６３】
〔構築物および材料の準備〕
以下の実施例は、下記の抗体、Fabフラグメントまたは単一ドメインVHHフラグメントを用いて実施された。
１）ヒトSOD-1（クローンSD-G6）に対するモノクローナル抗体（マウス、IgG1）（管理番号035K4823）。製造業者：シグマアルドリッチ社、シュネルドルフ、ドイツ（対照として）。
２）ヒトカタラーゼに対する組換えヒトFabフラグメント、形式Fab-V5Sx2は、HuCAL（登録商標）ライブラリーより、AbDSerotec社により製造された（EP 859 841およびUS 6,300,064に、詳細に説明されている。）。カタラーゼ阻害作用を有する構築物#AbD15562を使用した（比較）。
３）ヒトSODに対する組換えヒトFabフラグメント、形式Fab-V5Sx2は、HuCAL（登録商標）ライブラリーより、AbDSerotec社により製造された。SOD阻害作用を有する構築物#AbD15660を使用した（比較）。
４）（本発明による）ヒトカタラーゼに対する組換え単一ドメインVHHフラグメントは、商業供給業者と提携して製造された。
製造は、獣医師の監督下、アルパカをヒトカタラーゼ（ヒト赤血球から精製したカタラーゼ[EC 1.11.16]、カタログ番号C 3556、をシグマ社（シュネルドルフ）より得た。）で免疫し、この動物のB細胞からRNAを取得し、逆転写、大腸菌によるクローニング、およびファージディスプレイ技術による単離によって行った。ヒトカタラーゼに結合する単一ドメインVHHフラグメントをコードするクローンを、適切なELISAにおいて上清を検査することにより選択した。次に、HeinzelmannとBauerにより記述された細胞培養系（Heinzelmann S. and Bauer G. Multiple protective functions of catalase against intercellular apoptosis-inducing ROS signaling of human tumor cells, Biol. Chem. 391, 675-693, 2010）を用いることにより、カタラーゼに結合する単一ドメインVHHフラグメントのどれが実際にカタラーゼを阻害し、細胞のROS依存性アポトーシス誘導として発現されるのかを検査した。単一ドメインVHHフラグメントで、ヒトカタラーゼに結合し、これを中和するaCATcb0972とaCATcb0974、および、ヒトカタラーゼに結合するが、これを中和しないaCATcb0973とaCATcb0975を使用した。単一ドメインVHHフラグメントを内在するクローンは、標準法により配列決定し、またアミノ酸配列はそれから決定した。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様は、以下の配列を有する。
抗原結合フラグメントの配列は、DNAおよびタンパク質の両レベルで分析し、抗原結合領域（CDR）を決定した。以下において、アミノ酸配列のみを記載する。これらの抗原結合領域は、抗原結合フラグメントの特異性に対して重要である。
本発明の好ましい実施態様において、抗原結合構築物、特に単一ドメインVHHフラグメントまたはナノボディは、少なくとも1つのCDR配列を、好ましくは、少なくとも2つの、また最も好ましくは、3つのCDR配列を含む。
【００６５】
以下において、タンパク質レベルでのCDR配列が説明される。全配列において、それぞれの位置は下線で与えられる。
cb 0972（カタラーゼに結合し中和する）：
タンパク質配列（SEQ ID NO:10）：
MAQVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASERTFNTYGMGWFRQAPGKEREFVATISWSGDSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNANSEYGDSYWGQGTQVTVSSKKKHHHHHH
タンパク質レベルでのCDR配列：
CDR1：RTFNTYGMG（SEQ ID NO:19）
CDR2：TISWSGDSTYYADSVKG（SEQ ID NO:20）
CDR3：NSEYGDSY（SEQ ID NO:21）
cb 0973（カタラーゼに結合するが、中和しない）：
タンパク質配列（SEQ ID NO:11）：
MAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFIFNTYSMRWGRQAPGKGLEWVSSISTGGYSTYADSVKGRFTISRDNAKNLVYLQMNSLKPEDTAVYYCGWGAFVRGERPQGQGTQVTVSSKKKHHHHHH
タンパク質レベルでのCDR配列：
CDR1：FIFNTYSMR（SEQ ID NO:22）
CDR2：SISTGGYSTYADSVKG（SEQ ID NO:23）
CDR3：GAFVRGERP（SEQ ID NO:24）
cb 0974（カタラーゼに結合し中和する）：
タンパク質配列（SEQ ID NO:12）：
MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSIASMGWYRQAPGKQRDLVATITSDGSTKYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSVKPEDAAVYYCNADADDLEPGSYDYDYWGQGTQVTVSSKKKHHHHHH
タンパク質レベルでのCDR配列：
CDR1：SIFSIASMG（SEQ ID NO:25）
CDR2：TITSDGSTKYADSVKG（SEQ ID NO:26）
CDR3：DADDLEPGSYDYDY（SEQ ID NO:27）
cb 0975（カタラーゼに結合するが、中和しない）：
タンパク質配列（SEQ ID NO:13）：
MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASASIFSIYVMAWYRQAPGKQRELVATVTSGGATNYANSVKGRFTISRDNAKNTMDLQMNSLKPEDTAVYYCNAEDYYDYGLSRSKIYWGQGTQVTVSSKKKHHHHHH
タンパク質レベルでのCDR配列：
CDR1：SIFSIYVMA（SEQ ID NO:28）
CDR2：TVTSGGATNYANSVKG（SEQ ID NO:29）
CDR3：EDYYDYGLSRSKIY（SEQ ID NO: 30）
【００６６】
５）ヒトSOD1に対する組換え単一ドメインVHHフラグメントは、商業供給業者と提携して製造された。
製造は、獣医師の監督下、アルパカをヒトSOD1（ヒト赤血球から精製したSOD1 = Cu/ZnSOD [EC 1.15.1.1]、カタログ番号S 9636、をシグマ社（シュネルドルフ）より得た。）で免疫し、この動物のB細胞からRNAを取得し、逆転写、大腸菌によるクローニング、およびファージディスプレイ技術による単離によって行った。ヒトSOD1に結合する単一ドメインVHHフラグメントをコードするクローンを、適切なELISAにおいて上清を検査することにより選択した。次に、HeinzelmannとBauerにより記述された細胞培養系（Multiple protective functions of catalase against intercellular apoptosis-inducing ROS signaling of human tumor cells, Biol. Chem. 391, 675-693, 2010）を用いることにより、SODに結合する単一ドメインVHHフラグメントのどれが実際にSODを阻害し、使用した腫瘍系において、細胞のROS依存性アポトーシス誘導として発現されるのかを検査した。これは、SODの阻害により酵素的不均化がないため、遊離スーパーオキシドアニオン濃度が劇的に増加し、並行してカタラーゼの間接的阻害をもたらすためである。以下において、これは、ROS依存性アポトーシス誘導として発現される。さらなる対照試験において、組換え単一ドメインVHHフラグメントによるSODの特異的阻害は、Bauer 2013（HOCl-dependent singlet oxygen and hydroxyl radical generation modulate and induce apoptosis of malignant cells. Anticancer Res 33: 3589-3602, 2013）に記載の通り、外部から加えられたHOClによるアポトーシス誘導に対して、このフラグメントの効果が増大することが調べられたという事実により確認された。ヒトSOD1に結合し、かつ中和する単一ドメインVHHフラグメントaSODcb0989、および、ヒトSOD1に結合するが、これを中和しない同フラグメントaSODcb0987とaSODcb0991を使用した。
【００６７】
単一ドメインVHHフラグメントを内在するクローンは、標準法により配列決定し、またアミノ酸配列はそれから決定した。本発明の好ましい実施態様は、以下の配列を有する。
〔抗SOD VHH〕
cb 0987（SODに結合するが、中和しない）：
タンパク質配列（SEQ ID NO:14）：
MAQVQLVESGGGIVQPGGSLRLSCVASESISEIDAMYWHRQAPGKERELVAGITNDGTRYYADSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLKFEDTAMYYCAALPNPPPGYWGQGTQVTVSSKKKHHHHHH
タンパク質レベルでのCDR配列：
CDR1：SISEIDAMY（SEQ ID NO:31）
CDR2：GITNDGTRYYADSVKG（SEQ ID NO:32）
CDR3：LPNPPPGY（SEQ ID NO:33）
cb 0989（SODに結合し中和する）：
タンパク質配列（SEQ ID NO:15）
MAQVQLVESGGGLVQSGGSLTLSCTASGFTISNYPMTWVRQAPGKGLEWVSRINSGGDRTLYADSVKGRFTVSRDNARNTMYLQMNNLKPEDTGLYFCADSGAGWRYWGQGTQVTVSSKKKHHHHHH
タンパク質レベルでのCDR配列：
CDR1：FTISNYPMT（SEQ ID NO: 34）
CDR2：RINSGGDRTLYADSVKG（SEQ ID NO:35）
CDR3：SGAGWRY（SEQ ID NO:36）
cb 0991（SODに結合するが、中和しない）：
タンパク質配列（SEQ ID NO:16）：
MAQVQLVESGGGIVQPGGSLRLSCVASESISDIDAMYWHRQAPGKRRELVAGITNDGTEYFADSVKGRFAISRDNTKSSLYLQMNSLKLEDTAMYYCATLPNPPPGYWGQGTQVTVSSKKKHHHHHH
タンパク質レベルでのCDR配列：
CDR1：SISDIDAMY（SEQ ID NO:37）
CDR2：GITNDGTEYFADSVKG（SEQ ID NO:38）
CDR3：LPNPPPGY（SEQ ID NO:39）
リンカーによりクローンcb 0972（カタラーゼを中和する）とクローンcb 0989（SODを中和する）とを結合することにより、二重特異性ハイブリッド単一ドメインVHHフラグメントcb 1081（抗CAT抗SOD）およびcb 1082（抗SOD抗CAT）を遺伝子工学により製造した。
〔二重特異性抗カタラーゼ-SOD VHH〕
cb 1081：
タンパク質配列（SEQ ID NO:17）：
MAQVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASERTFNTYGMGWFRQAPGKEREFVATISWSGDSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNANSEYGDSYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAQVQLVESGGGLVQSGGSLTLSCTASGFTISNYPMTWVRQAPGKGLEWVSRINSGGDRTLYADSVKGRFTVSRDNARNTMYLQMNNLKPEDTGLYFCADSGAGWRYWGQGTQVTVSSKKKHHHHHH
タンパク質レベルでのCDR配列：
CAT CDR1：RTFNTYGMG（SEQ ID NO:40）
CAT CDR2：TISWSGDSTYYADSVKG（SEQ ID NO:41）
CAT CDR3：NSEYGDSY（SEQ ID NO:42）
SOD CDR1：FTISNYPMT（SEQ ID NO:43）
SOD CDR2：RINSGGDRTLYADSVKG（SEQ ID NO:44）
SOD CDR3：SGAGWRY（SEQ ID NO:45）
〔二重特異性抗SOD-カタラーゼ VHH〕
cb 1082：
タンパク質配列（SEQ ID NO: 18）：
MAQVQLVESGGGLVQSGGSLTLSCTASGFTISNYPMTWVRQAPGKGLEWVSRINSGGDRTLYADSVKGRFTVSRDNARNTMYLQMNNLKPEDTGLYFCADSGAGWRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAQVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASERTFNTYGMGWFRQAPGKEREFVATISWSGDSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNANSEYGDSYWGQGTQVTVSSKKKHHHHHH
タンパク質レベルでのCDR配列：
SOD CDR1：FTISNYPMT（SEQ ID NO:46）
SOD CDR2：RINSGGDRTLYADSVKG（SEQ ID NO:47）
SOD CDR3：SGAGWRY（SEQ ID NO:48）
CAT CDR1：RTFNTYGMG（SEQ ID NO:49）
CAT CDR2：TISWSGDSTYYADSVKG（SEQ ID NO:50）
CAT CDR3：NSEYGDSY（SEQ ID NO:51）
【００６８】
NADPHオキシダーゼ阻害剤であるフッ化4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニル（AEBSF）、カタラーゼ阻害剤である3-アミノトリアゾール（3-AT）、HOClスカベンジャーであるタウリン、一重項酸素スカベンジャーであるヒスチジン、およびグルコースオキシダーゼ（GOX）は、シグマ社（シュネルドルフ、ドイツ）より得た。
ペルオキシ亜硝酸塩および“ペルオキシ亜硝酸塩分解触媒”（機能性ペルオキシ亜硝酸塩スカベンジャー）であるFeTPPS：塩化5-, 10-, 15-, 20-テトラキス(4-スルホナトフェニル) ポルフィリナト鉄(III) （FeTPPS）は、カルビオケム社（メルクバイオサイエンシズGmbH、シュヴァルバッハ／Ts、ドイツ）から得た。
【００６９】
これらの活性成分の正確な説明は、公表文献のHeinzelmannとBauer（2010, Multiple protective functions of catalase against intercellular apoptosis-inducing ROS signaling of human tumor cells, Biol. Chem. 391, 675-693）、およびBechtelとBauer（2009, Catalase protects tumor cells against apoptosis induction by intercellular ROS signaling, Anticancer Res 29: 4541-4557）で見出される。
【実施例２】
【００７０】
〔siRNAによる遺伝子ノックアウト〕
図２２に記載された、siRNA技術を用いる特異的遺伝子ノックアウトによる分析について、以下のsiRNA（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）から得た。）を適用した。
Ａ）対照siRNA（“siCo”）、（カタログ番号1022076）
配列：   r(UUCUCCGAACGUGUCACGU)dTdT（センス）（SEQ ID NO:1）
ACGUGACACGUUCGGAGAA)dTdT（アンチセンス）（SEQ ID NO:2）
製造者は、siCoがいかなる既知の遺伝子の発現にも影響しないことを見出している。
Ｂ）下記に対するノックダウン用の“高性能検証siRNA”
FAS受容体（“siRNA FAS R.”）（Hs_FAS_7_高性能（HP）検証siRNA、カタログ番号SI02654463、標的配列：AAG GAG TAC ACA GAC AAA GCC)（SEQ ID NO:3）
カスパーゼ-8（“siRNA CASP8”）（Hs_CASP8_11_ HP検証siRNA、カタログ番号SI02661946、標的配列：AAG AGT CTG TGC CCA AAT CAA）（SEQ ID NO:4）
カスパーゼ-9（“siRNA CASP-9”）（Hs_CASP9_7_ HP検証siRNA、カタログ番号SI02654610、標的配列：CAG TGA CAT CTT TGT GTC CTA）（SEQ ID NO:5）
Ｃ）ヒトNOX1に対するHP siRNA（“siRNA NOX1”）
標的配列：CCG ACA AAT ACT ACT ACA CAA（SEQ ID NO:6）
Ｄ）ヒトiNOS2に対するsiRNA（siiNOS）
標的配列：CTG GGC CGT GCA AAC CTT CAA（SEQ ID NO:7）
【００７１】
対照siRNAに加えて、図２７に示された対照試験について、
ヒトカタラーゼに対するsiRNA（MKN-45細胞用）、Hs_CAT_4_HP siRNA、カタログ番号SI00027713、標的配列：CCG GAT CTC ACT TGG CGG CAA（SEQ ID NO:8）、および、
マウスカタラーゼに対するsiRNA（208F細胞および208Fsrc3細胞用）、HP Mm_Cat_4_HP siRNA、カタログ番号SI00941976、標的配列：CCC AAT AGG AGA TAA ACT TAA（SEQ ID NO:9）、
が使用された。
【００７２】
siRNAを用いる遺伝子導入技術は、HeinzelmannとBauer、2010年（上記の引用）に詳細に記載されている。遺伝子導入効率は95％を上回った。遺伝子導入の24時間後、それぞれの遺伝子機能に対し、“機能ノックダウン”が完了したことを確認する対照試験を行った。これは、特異的siRNAが、分析された遺伝子産物の新規合成を効率的に抑制したこと、およびsiRNA投与前の遺伝子産物の自然分解が、検出限界以下で起こったことを意味する。
【００７３】
ヒト胃がん株MKN-45は、10％非働化ウシ胎仔血清ならびに40 U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、10μg/mLネオマイシン、10 U/mLモロナール（抗真菌抗菌剤）および280μg/mLグルタミンを追加したRPMI 1640培養液で維持した。ヒト神経芽細胞腫株SHEP、ならにに正常ラット線維芽細胞（208F）およびsrcがん遺伝子で形質転換したこの細胞の子孫（208Fsrc3）は、5％非働化ウシ胎仔血清ならびに40 U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、10μg/mLネオマイシン、10 U/mLモロナールおよび280μg/mLグルタミンを追加したイーグル最小必須培養液（EMEM）で維持した。細胞株とその培養の詳細は、HeinzelmannとBauer（2010年）およびBechtelとBauer（2009年）の研究において見出される。
【実施例３】
【００７４】
〔腫瘍細胞における自己分泌型ROS調節アポトーシス誘導の分析における標準標品〕
図１３〜２４に示される実験は、HeinzelmannとBauer（2010年）により実施された方法に基づく、アポトーシス誘導に対する標準標品を用いて行った。用いた腫瘍細胞は、至適に生育した半密閉培養から採取し、遠心分離し、新鮮培養液に静置した。試験は、12500個のMKN-45細胞／100μL培養液または10000個のSHEP細胞／100μL培養液とした96ウェル細胞培養プレートで行った。MKN-45細胞は浮遊状態で増殖し、SHEP細胞は接着する。SHEP細胞を用いる試験は、細胞が成長すると直ちに開始した。カタラーゼまたはSODを阻害する単一ドメインVHHフラグメントを、濃度を増加させながら添加することにより、腫瘍細胞自身のROSシグナルからの腫瘍細胞の保護が無効となった。ここでは、細胞を37℃で培養すると、細胞による細胞外スーパーオキシドアニオン産生に基づいて、NO／ペルオキシ亜硝酸塩シグナル経路およびHOCl経路（MKN-45細胞）、または、SHEP細胞の場合は、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路のみが始動し得る。シグナル経路の分析は、NADPHオキシダーゼ阻害剤（AEBSF）、HOClスカベンジャーであるタウリン、ペルオキシ亜硝酸塩スカベンジャーであるFeTPPSおよび一重項酸素スカベンジャーであるヒスチジンを適用することにより行った。単一ドメインVHHフラグメントを代えた比較実験において、組換えヒトFabフラグメントまたはモノクローナル抗体を適用した。これは、それぞれの図において示される。
【００７５】
2つの標品は、アポトーシス細胞の割合を、本文中で示した時間で位相差倒立顕微鏡を用いて調べた。標準的アポトーシス判定基準は、核の凝縮、核の断片化および膜小疱形成など、HeinzelmannとBauer（2010年）に記述され、実証されたものを用いた。アポトーシスの特徴の存在は、1つの標品あたり、少なくとも250の無作為に選択した細胞で調べた。
【００７６】
並行対照実験、例えば、Bauerら（Bauer G, Bereswill S, Aichele P and Glocker E. Helicobacter pylori protects oncogenically transformed cells from reactive oxygen species-mediated intercellular induction of apoptosis, Carcinogenesis 35: 1582-1591, 2014, Supplement）の研究において実証されるように、適用した形態学的判定基準が、DNA断片化（TUNEL反応により測定）またはアネキシンV結合性陽性などのアポトーシス判定基準と相関することが確認された。
【実施例４】
【００７７】
〔カタラーゼに対する単一ドメインVHHフラグメントによる、アポトーシス誘導ROSシグナル伝達に対する腫瘍細胞の特異的感作〕
本発明の範囲において多くの試験が実施され、図１３〜３０に要約される試験結果が得られた。
図１３は、MKN-45胃がん細胞における、カタラーゼに対する単一ドメインVHHフラグメントによる特異的アポトーシス誘導を示す。
MKN-45細胞を、自己分泌型アポトーシス誘導に対する標準条件下で、ヒトカタラーゼに結合するが阻害しない単一ドメインVHHフラグメント（aCATcb0973、aCATcb0975）およびヒトカタラーゼに結合し阻害する単一ドメインVHHフラグメント（aCATcb0972、aCATcb9074）の一定濃度と混合し、37℃、5％CO２で3.5時間さらに培養した。並行して、同一条件下で、ヒトカタラーゼを中和するヒトカタラーゼに対する（軽鎖および重鎖から成る）組換えヒトFabフラグメント（Abd aCAT15562）を適用した。その後、アポトーシス細胞（2つの標品）の割合を、上記の標準的アポトーシス判定基準に従って測定した。
【００７８】
図１３Ａは、カタラーゼを阻害する単一ドメインVHHフラグメントのみが腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、カタラーゼに結合するが阻害しない単一ドメインVHHフラグメントはアポトーシスを誘導しないことを示す。ここでは、効果は、HeinzelmannとBauer（2010年）の研究においてカタラーゼ阻害剤3-アミノトリアゾールについて記述されたように、最適曲線の形状で表される。最適曲線が落ち込んだ後、アポトーシス誘導の第二の増強がある。軽鎖および重鎖から成る組換えFabフラグメントAbd aCAT 15562の添加も、引き続く第二の増強を伴う最適曲線の形状で表されるアポトーシス誘導をもたらすが、最適作用を達成するには、カタラーゼを阻害する単一ドメインVHHフラグメントと比較して約250倍高いモル濃度のAbd aCAT 15562が必要である。これは、本発明による構築物の優れた効力により明確となる。
【００７９】
胃がん細胞株MKN-45におけるヒトカタラーゼを阻害する単一ドメインVHHフラグメントおよび標準的なFabフラグメントの添加は、抗体濃度に関する最適曲線形においてアポトーシス誘導をもたらす。誘導過程の特異性は、カタラーゼに結合するが、これを中和しない単一ドメインVHHフラグメントが、アポトーシス誘導を起こさないという事実により明確となる（図１３）。すなわち、感作に対して、抗体がカタラーゼに結合するのみでは十分ではない。カタラーゼの機能の特異的阻害は、感作に必須であるように見える。単一ドメインVHHフラグメントが、標準的なFabフラグメントより強いアポトーシス誘導作用を持つという知見は、注目に値し、予期しないことである。これら2グループのフラグメントの構造の相違により、標準的なFabフラグメントは、単一ドメインVHHフラグメントと比較して、同一効果を達成するためには2倍の濃度を適用しなければならないことが予想された。しかしながら、この相違は、約500（モル基準では250）の倍数を作り出した。
【実施例５】
【００８０】
〔カタラーゼに結合する単一ドメインVHHフラグメントの効果と胃がん細胞の阻害〕
図１４は、胃がん細胞のMKN-45株において、カタラーゼを中和する単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0972が、NO／ペルオキシ亜硝酸塩およびHOCl経路を介して、特異的ROSシグナル伝達を誘導することを示す。
【００８１】
アポトーシス誘導のための標準標品に、100μMのNOX1阻害剤AEBSF、50 mMのHOClスカベンジャーであるタウリン（TAU）、25μMのペルオキシ亜硝酸塩スカベンジャーであるFeTPPSまたは 2 mMの一重項酸素スカベンジャーであるヒスチジン（HIS）存在下、一定濃度の単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0972を添加した。対照標品は、並行して阻害剤非存在下で実施した。37℃、5％CO2で3.5時間後、アポトーシス細胞の割合を測定した。
【００８２】
図１４は、単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0972（カタラーゼに結合し阻害する）が、最適曲線形および引き続く第二の増強において、アポトーシスを誘導することを示す。アポトーシス誘導は、単一ドメインVHHフラグメントの全濃度範囲において、NOX1阻害剤AEBSFにより阻害される。HOClスカベンジャーであるタウリンは、最適曲線の左濃度範囲では阻害しないが、最適曲線のその上の全範囲でアポトーシスの強い阻害をもたらす。単一ドメインVHHフラグメントの6.2 pg/mLからの濃度範囲において、アポトーシスの第二の増強は、タウリンにより阻害されない。ペルオキシ亜硝酸塩スカベンジャーであるFeTPPSは、最適曲線の左部分においてのみ強い阻害をもたらし、次に、アポトーシス誘導の最適曲線を定常曲線に変化させる。一重項酸素スカベンジャーであるヒスチジンは、アポトーシス誘導を起こさないが、最適曲線を定常曲線に変化させる。
【００８３】
すなわち、図１４は、単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0972のアポトーシス誘導効果が、実際にROSシグナル伝達の再活性化により引き起こされることを証明する。これは、スーパーオキシドアニオン産生がAEBSFにより阻害される場合、すべての適用濃度でアポトーシス誘導の完全な阻害が起こるためである。さらに、図１４で示された結果は、アポトーシス誘導の至適範囲（0〜6.2 pg/mL）が、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路およびHOCl経路の連なりにより特徴付けられることを示す。aCATcb0972の0.09と0.18 pg/mLの範囲において、ペルオキシ亜硝酸塩スカベンジャーであるFeTPPSによる阻害があるが、HOClスカベンジャーであるタウリンによる阻害はない。これは、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路の過程を示す。Fabフラグメントの0.75 pg/mLから、FeTPPSによる実質的な阻害はないが、タウリンによる非常に強い阻害がある。これは、HOCl経路の過程を証明する。予想されるように、0.37 pg/mLでは、両方のシグナル経路は重複する。高濃度の単一ドメインVHHフラグメントによるアポトーシス誘導の新たな増強は、
１）スーパーオキシドアニオンの産生、および、
２）カタラーゼ阻害の程度、および、HOClスカベンジャーとペルオキシ亜硝酸塩スカベンジャーのどちらによっても影響されないこと、
によって決まる。
したがって、それはH2O2の単独効果であり、特異的ROSシグナル経路の効果ではない。
【００８４】
アポトーシス誘導の最適曲線が、一重項酸素スカベンジャーであるヒスチジンおよびペルオキシ亜硝酸塩スカベンジャーであるFeTPPSにより定常曲線へ変化することは、単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0872の濃度が > 0.75 pg/mLでは、一重項酸素が役割を果たすように見えるということを示す。一重項酸素は、H2O2とペルオキシ亜硝酸塩との反応から生じる。一重項酸素は、カタラーゼを不活性化することができることも知られている。したがって、H2O2の利用可能度が増大すると、図１に示される副反応(8)および(9)が引き起こされ、それによりHOClが消費されるか、HOClがあまり合成されないようになる。このようにして、最適曲線の右部分でのアポトーシス誘導の低下が引き起こされる。
【実施例６】
【００８５】
〔SODに対する単一ドメインVHHフラグメントによる、アポトーシス誘導ROSシグナル伝達に対する腫瘍細胞の特異的感作〕
SODに対する単一ドメインVHHフラグメントによる、MKN-45胃がん細胞における特異的アポトーシス誘導を図１５に示す。アポトーシス細胞の割合がX軸にプロットされる。
MKN-45細胞を、自己分泌型アポトーシス誘導に対する標準条件下で、ヒトSOD1に結合するが阻害しない単一ドメインVHHフラグメント（aSODcb0987、aSODcb0991）およびヒトSODに結合し阻害する単一ドメインVHHフラグメント（aSODcb0989）の一定濃度と混合し、37℃、5％CO２で3.5時間さらに培養した。並行して、同一条件下で、ヒトカタラーゼを中和するヒトカタラーゼに対する（軽鎖および重鎖から成る）組換えFabフラグメント（Abd aSOD15660）を適用した。その後、アポトーシス細胞（2つの標品）の割合を、上記の標準的アポトーシス判定基準に従って測定した。
【００８６】
図１５Ａは、SODを阻害する単一ドメインVHHフラグメントが腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、SODに結合するのみの単一ドメインVHHフラグメントはアポトーシスを誘導しないことを示す。ここでは、効果は、広範な最適曲線の形状で表される。アポトーシス誘導の最適曲線は、標準的なFabフラグメントAbD aSOD 15660によっても達成される（図１５Ｂ）。しかしながら、これについて同じ効果を達成するためには、単一ドメインVHHフラグメントの濃度と比較して、250倍高い濃度が必要である。
【００８７】
すなわち、図１５は、抗体がSODに結合することは、感作に対して十分ではないことを示す。SODの機能の特異的阻害は、感作に対して必須であるように見える。膜性SODの特異的阻害は、アポトーシスをもたらすROSシグナル伝達を再活性化するのに十分であるということは注目に値する。中和単一ドメインVHHフラグメントは、標準的な中和Fabフラグメントより強いアポトーシス誘導作用を持つという知見は、注目に値し、予期しないことである。これら2グループのフラグメントの構造の相違により、標準的なFabは、単一ドメインVHHフラグメントと比較して、同一効果を達成するためには2倍の濃度を適用しなければならないことが予想された。しかしながら、この相違は、約250の倍数を作り出した。
【００８８】
図１６は、胃がん細胞のMKN-45株において、SODを中和する単一ドメインVHHフラグメントaSODcb0989が、もっぱらNO／ペルオキシ亜硝酸塩を介して、特異的ROSシグナル伝達を誘導することを示す。
【００８９】
アポトーシス誘導のための標準標品に、100μMのNOX1阻害剤AEBSF、25μMのペルオキシ亜硝酸塩スカベンジャーであるFeTPPS、50 mMのHOClスカベンジャーであるタウリン（TAU）または2 mMの一重項酸素スカベンジャーであるヒスチジン（HIS）存在下、一定濃度の単一ドメインVHHフラグメントaSODcb0989を添加した。対照標品は、並行して阻害剤非存在下で実施した。37℃、5％CO2で3.5時間後、アポトーシス細胞の割合を測定した。
【００９０】
図１６は、胃がん細胞のMKN-45株において、SODを中和する単一ドメインVHHフラグメントが、最適曲線形と、その後に続く示された第二の増強において、アポトーシスを誘導することを示す。アポトーシス誘導は、全濃度範囲において、AEBSFにより阻害される。すべての最適範囲はFeTPPSにより阻害されるが、タウリンでは阻害されない。ヒスチジンは、最適曲線の右側面の低下を、部分的にかなり排除する。
【００９１】
すなわち、図１６は、aSODcb0989により誘導される腫瘍細胞におけるアポトーシスが、スーパーオキシドアニオン依存的過程により持続的に確実に誘導されるが、これは、（aCATcb0972とは対照的に）NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路のみであり、HOClシグナル伝達はほとんど影響しないことを証明する。このことは、FeTPPSによる完全阻害とタウリンによる阻害の消失によっても実証される。この結果は、SOD効果が存在しないと仮定すると、明らかに、十分なH2O2がHOCl経路で利用できないということを示す。NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路は、膜性カタラーゼにより非常に効率的に阻害されるので、図１６に示される結果から、単一ドメインVHHフラグメントによるSOD阻害は、カタラーゼの間接的阻害をもたらすはずであるということが結論付けられる。aSODcb0989およびaCATcb0972により再活性化されるシグナル経路の質が異なるということは、aSODcb0989の効果がカタラーゼとの交差反応であり、したがって、aSODcb0989の効果の特異性を裏付けるという理論的仮定を排除するものである。
【実施例７】
【００９２】
〔単一ドメインVHHフラグメントと標的細胞との間の関係性〕
図１７は、カタラーゼまたはSODに対する単一ドメインVHHフラグメントが、標的細胞の密度に関して、異なる要求をするということを示す。
【００９３】
アポトーシス誘導の標品を、標準細胞密度（12500細胞／100μL）に加えて、低細胞密度（4000細胞／100μL）のものと単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0972またはaSODcb0989の濃度を上げたものでも調製し、37℃、5％CO2で4時間培養した。その後、アポトーシス細胞の割合を測定した。
【００９４】
図１７は、カタラーゼに対する単一ドメインVHHフラグメントによるアポトーシス誘導は、高密度でだけであれば至適様式で進むが、SODに対する単一ドメインVHHフラグメントの適用においては、標的細胞が低密度で存在する場合、その効果はそれほど減弱しないことを示す。この相違は、再活性化されたシグナル経路の質が異なることの証拠を与え、特に、SODの阻害は、好んでNO／ペルオキシ亜硝酸塩経路を再活性化するが、これは、この経路がHOClシグナル経路と同じ程度にまでは高細胞密度に依存しないためであるという事実と一致する。
【実施例８】
【００９５】
〔カタラーゼおよびSODに対する単一ドメインVHHフラグメントの相乗効果〕
図１８は、同時に適用したカタラーゼおよびSODに対する単一ドメインVHHフラグメントの特筆すべき相乗効果を示す。
【００９６】
MKN-45細胞を用いるアポトーシス誘導のための標準標品を、濃度を上げながらのカタラーゼを中和する単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0972のみ、および、これと、0.005 pg/mLのSODを中和する単一ドメインVHHフラグメントaSODcb0989または、SODには結合するが、これを中和しない単一ドメインVHHフラグメントaSODcb0987と組み合わせたものと混合した（Ａ）。補完実験（Ｂ）においては、濃度を上げながらのaSODcb0989のみ、または、これと、0.005 pg/mLのカタラーゼを中和する単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0972と組み合わせたものと混合した。すべての標品は、37℃、5％CO2で3.5時間培養した。その後、アポトーシス細胞の割合を測定した。
【００９７】
図１８は、予備実験で既に測定した濃度依存的アポトーシス誘導効果が、aCATcb0972およびaSODcb0989の両方により確かめられることを示す。単独ではアポトーシス誘導に十分ではない低濃度のそれぞれ補完的な単一ドメインVHHフラグメントの組み合わせ（すなわち、濃度を上げながらのaCAT中のaSOD、および濃度を上げながらのaSOD中のaCAT）は、アポトーシス誘導において特筆すべき相乗効果をもたらす。該相乗効果の特異性は、相乗効果が、SODに結合するが中和しない単一ドメインVHHフラグメントの投与では現れないという事実により証明される（図１８Ａ）。
【００９８】
すなわち、図１８は、カタラーゼまたはSODに対する単一ドメインVHHフラグメントの組み合わせは、非常に強力な相乗効果をもたらすことを示す。この効果を最適に用いる場合、単一ドメインVHHフラグメントの必要な濃度は、大幅に減少することがあり得る。
【実施例９】
【００９９】
〔化学療法剤との相乗効果〕
図１９は、カタラーゼまたはSODを中和する単一ドメインVHHフラグメントが、それぞれ、確立された化学療法剤であるタキソールと強い相乗効果を引き起こすことを示す。
【０１００】
MKN-45細胞を用いるアポトーシス誘導のための標準標品を、濃度を上げながらのタキソールのみ、または、これと、カタラーゼを中和するaCATcb0972、SODを中和するaSODcb0989およびSODに結合するが中和しないaSODcb0987と組み合わせたものと混合し、37℃、5％CO2で4時間培養した。その後、アポトーシス細胞の割合を測定した。
【０１０１】
図１９は、タキソールが、濃度依存的に腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導することを示す。
ここで、至適効果は、1100 ng/mLの濃度範囲で見出された。この効果は予期されたものであった。カタラーゼまたはSODのどちらかを阻害する単一ドメインVHHフラグメントとの組み合わせにおいて、タキソール依存性の最適曲線は、驚くべきことに、低濃度範囲に大幅に変位した。至適効果は、0.17 ng/mLと0.5 ng/mLとの間であった。必要濃度が1000分の1未満になるという、この目覚ましい変位は、それぞれの標的構造（カタラーゼまたはSOD）をも中和する単一ドメインVHHフラグメントによってのみ達成され、単なる結合は、いかなる促進効果も引き起こさなかった。
【０１０２】
最初に図１９に示された効果は、これまで知られていなかった腫瘍細胞に対するタキソールの効果とROSシグナル伝達との間の機能的関連を証明するものであるので、非常に興味深い。SODまたはカタラーゼに対する単一ドメインVHHフラグメントとの相乗効果の出現は、有効成分と適切に組み合わせることにより、全体で資源を節約し、それによって治療経費の削減を手にすることを提案し、また、タキソールに起因する副作用を低減または回避する、さらには、単一ドメインVHHフラグメントの可能性のある副作用を回避する機会を開く。
【実施例１０】
【０１０３】
〔カタラーゼまたはSODを中和する単一ドメインVHHフラグメントからのハイブリッド分子による、アポトーシス誘導ROSシグナル伝達に対する腫瘍細胞の特異的感作〕
図２０は、単一ドメインVHHフラグメントaCATおよびaSODの間の相乗効果が、一ハイブリッド分子に集めることができることを示す。
【０１０４】
MKN-45細胞を用いるアポトーシス誘導のための標準標品を、濃度を上げながらのカタラーゼを中和するaCATcb0972、SODを中和するaSODcb0989、２つの可能な配列にあるaCATcb0972およびaSODcb0989からのハイブリッド分子、および、対照として、カタラーゼに対する通常の中和モノクローナル抗体（シグマ社）と混合し、37℃、5％CO2で3.5時間培養した。その後、アポトーシス細胞の割合を測定した。
【０１０５】
図２０は、個別に添加された単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0972およびaSODcb0989の組み合わせで観察される相乗効果が、ハイブリッド分子に実際に集めることができることを示す。ここでは、aCATaSODの配列が、逆の配列より少しずつ優れているように見える。個別に適用された単一ドメインVHHフラグメントの至適効果は、約170 fg/mLの濃度範囲にあるが、ハイブリッド分子による至適効果は、0.24 fg/mLで既に達成された。この特筆すべき活性は、111 ng/mLで至適効果を発現する通常のモノクローナル抗体の著しく低い活性と対立する。図において、SODまたはカタラーゼを中和する標準的な組換えFabフラグメントについてのデータは、明確にするために含まれていない。これらの至適効果は、0.1〜0.3 ng/mLの範囲にある。
【０１０６】
すなわち、図２０から、
１）単一ドメインVHHフラグメントの活性は、予想外にも、通常のモノクローナル抗体または通常の組換えFabフラグメントの活性よりはるかに高いこと、および、
２）単一ドメインVHHフラグメントからハイブリッド分子が作り出される場合、活性のさらに非常に明確な増加が実現されること、
が確認される。
【実施例１１】
【０１０７】
図２１は、胃がん細胞のMKN-45株において、単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0972およびaSODcb0989からのハイブリッド分子は、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路を介して、特異的ROSシグナル伝達だけを誘導することを示す。
【０１０８】
アポトーシス誘導のための標準標品に、100μMのNOX1阻害剤AEBSF、25μMのペルオキシ亜硝酸塩スカベンジャーであるFeTPPS、50 mMのHOClスカベンジャーであるタウリン（TAU）または2 mMの一重項酸素スカベンジャーであるヒスチジン（HIS）存在下、一定濃度のハイブリッド分子aCATaSODを添加した。対照標品は、並行して阻害剤非存在下で実施した。37℃、5％CO2で3時間後、アポトーシス細胞の割合を測定した。
【０１０９】
図２１は、腫瘍細胞において、ハイブリッド分子aCATaSODが、ROSシグナル伝達の再活性化を介してアポトーシスを誘導することを裏付ける。これは、この過程が、AEBSFによるスーパーオキシドアニオンの合成阻害により、完全に抑えられるためである。さらに、ハイブリッド分子により再活性化されたアポトーシス誘導は、FeTPPSによる完全阻害はあるが、タウリンによる阻害はないので、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路だけであるということが明らかである。次に、一重項酸素スカベンジャーは、最適曲線の右側の落ち込みについて、減弱効果を有する。NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路が支配的であることは、以前の結果からは予想外であり、予測不可能である。
【実施例１２】
【０１１０】
図２２は、siRNAに基づく分析により、ハイブリッド分子により誘導され、アポトーシスを生じるROSシグナル伝達の特異性を裏付ける。
【０１１１】
MKN-45は、NOX1、iNOS2、カスパーゼ-9、FAS受容体またはカスパーゼ-8に対する24 nMのsiRNAを用いて遺伝子導入された。対照標品は、無関係な対照siRNAを用いて遺伝子導入された。37℃で24時間後、細胞を新鮮培養液中に取り、一定濃度のハイブリッド分子aCATaSODと混合した。4時間後、アポトーシス細胞の割合を測定した。
【０１１２】
図２２は、ハイブリッド分子aCATaSODにより引き起こされる最適曲線形におけるアポトーシス誘導が、ミトコンドリア経路を経由するアポトーシスの過程に必須である未変化のNADPHオキシダーゼ（NOX1）、NO合成酵素（iNOS2）およびカスパーゼ-9が利用可能な場合にのみ起こることを示す。これらの各酵素のsiRNA介在性ノックダウンは、ハイブリッド分子により誘発されるアポトーシス誘導を完全に妨げ、したがって、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路と、それに続くミトコンドリアアポトーシスシグナル伝達を経由する、内在するROSシグナル伝達を証明する。他方、ハイブリッド分子によるアポトーシス誘導は、FAS受容体およびその下流のカスパーゼ-8を必要としない。このことは、ミトコンドリアアポトーシス経路の制限された効果を強調し、選択された条件下でのアポトーシス誘導に対する細胞死受容体APO/FASを経由するアポトーシス経路が役割を果たすということを排除する。しかしながら、FAS受容体およびカスパーゼ-8のノックダウンは、アポトーシス誘導曲線の最適上限の低下を妨げる。これは、Bauer（2012年）において述べられているように、FAS受容体およびカスパーゼ-8の関与および一重項酸素関連過程により説明することができ、図２１において実証されたヒスチジンに関する知見と合致する。
【０１１３】
図１３、１５および２０から、腫瘍細胞における最適なアポトーシス誘導に必要な抗体および単一ドメインVHHフラグメントの濃度が決定された（表１）。表１は、標準的な組換えFabフラグメントおよびモノクローナル抗体との比較において、単一ドメインVHHフラグメントの優れた活性を説明する。表２は、ハイブリッド分子の使用により達成することのできる目覚ましい相乗効果を強調する。標準的な組換えFabフラグメントを上回る単一ドメインVHHフラグメントの優れた効果は予測可能ではなく、したがって予期せぬものである。むしろ、現状の知識のために、モル濃度を考慮すれば、標準的な中和Fabフラグメントおよび中和単一ドメインVHHフラグメントは、アポトーシス誘導に関して同じ効果を達成することが予期され、濃度（pg/mL）を考慮すれば、倍数2の差のみで達成されるべきである。活性におけるこの予測不能な劇的な相違は、驚くべきことである。この効果は、治療的使用に対して最適である。
【０１１４】
【表１】
2018505178.tif 000003
【０１１５】
【表２】
2018505178.tif 000004
【０１１６】
値は図１３、１５および２０から得た。通常の組換えFabフラグメントおよびモノクローナル抗体の濃度は、組換え単一ドメインVHHフラグメントと同じ効果を達成するためにはより高くなければならないが、その濃度を先ず決定した。種々のFabフラグメントおよび抗体のモル基準を含めることにより、モル濃度に基づいて関係を決定した。この補正において、標準的なFabフラグメントは、完全なIgG分子のモル質量の3分の1を占め、また単一ドメインVHHフラグメントのモル質量は、標準的なFabフラグメントのモル質量の約半分を占めるという妥当な前提を用いた。
【実施例１３】
【０１１７】
〔ヒト腫瘍細胞に対する、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路を証明する能力があるだけの、カタラーゼまたはSOD中和作用を有する単一ドメインVHHフラグメントの効果〕
先の実施例で使用されたヒト胃がん株MKN-45は、既知の細胞内ROSシグナル伝達（主要経路としてHOClおよびNO／ペルオキシ亜硝酸塩経路、二次経路として塩化ニトリル経路）のあらゆる種類を発現することを特徴とするが、一連の他のヒト腫瘍細胞株において、その膜性カタラーゼが阻害される場合、NO／ペルオキシ亜硝酸塩経路へ限定されることが示される（HeinzelmannとBauer（2010年）；Bauer（2012年））。先の試験において、ある型の各腫瘍は、一様なROSシグナル系を見せるということが見出された。NO／ペルオキシ亜硝酸塩シグナル伝達への制限は、現在までは、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、乳がん、卵巣がん、および小細胞肺がんで観察されるだけである。
【０１１８】
図２３は、NO／ペルオキシ亜硝酸塩シグナル伝達を形成するだけの単一ドメインVHHフラグメントが、腫瘍細胞におけるアポトーシスを再活性化できることを示す。
【０１１９】
100μLの培養液当たり細胞10000個のヒト神経芽細胞腫株SHEPを、一定濃度のカタラーゼを中和する単一ドメインVHHフラグメントaCATcb0972、SODを中和する単一ドメインVHHフラグメントaSOD0989、SODに結合するが中和しない単一ドメインVHHフラグメントaSODcb991およびハイブリッド分子aCATaSODと混合し、37℃、5％CO2で5時間培養した後、アポトーシス細胞の割合を測定した。
【０１２０】
図２３は、カタラーゼおよびSODを中和する単一ドメインVHHフラグメントならびにハイブリッド分子aCATaSODが、神経芽細胞腫株SHEPにおいて濃度依存的にアポトーシスを誘導することを示す。ここでは予想通りに、それぞれは１つの標的構造のみに対するものであるハイブリッド分子は、単一ドメインVHHフラグメントよりさらに効果的であることが示された。高濃度でのSODに結合するが中和しない単一ドメインVHHフラグメントaSODcb0991も、アポトーシス誘導効果を実現するが、このためには、中和する単一ドメインVHHフラグメントより106倍高濃度が必要である。
【０１２１】
すなわち、図２３は、カタラーゼ阻害の後、NO／ペルオキシ亜硝酸塩シグナル伝達が機能するのみの細胞株が、カタラーゼまたはSODに対する単一ドメインVHHフラグメントによりアポトーシスに持ち込まれるということを裏付ける。また、aCATとaSODとの間の相乗効果も現れる。注目すべきは、この細胞株で観察される濃度効果曲線であり、MKN-45細胞株と比較すると、右側面で非常に平坦な、持続性の最適上限の低下が見られる。
【０１２２】
結合するが中和しない単一ドメインVHHフラグメントaSODcb0991により成し遂げられる弱いが有意なアポトーシス誘導は、単一ドメインVHHフラグメントの結合後、SODの内部移行があり、その結果として表面でのSOD濃度が低下し、これは阻害と類似した効果をもたらすという事実により最も良く説明できる。
【０１２３】
図２４は、SHEP細胞に対するaSODcb0989の効果は、NO供与体であるSNPをさらに使用した場合、さらに最適化されることを示す。
【０１２４】
100μLの培養液当たり細胞10000個のヒト神経芽細胞腫株SHEPを、一定濃度のSODを中和する単一ドメインVHHフラグメントaSOD0989と混合した。並行する標品には、NO供与体であるニトロプルシドナトリウムを20μMまたは100μM加え、またはさらなる添加物なしで培養した。37℃、5％CO2で5時間後、アポトーシス細胞の割合を測定した。
【０１２５】
図２４は、NO供与体（これ単独ではアポトーシスを誘導することはできない。）の追加的投与が、アポトーシス誘導の再活性化についての感作をもたらし、また最適曲線における最適上限の右側低下を効果的に弱めるということを示す。これより、アポトーシス誘導の最適曲線を定常曲線に変換する調節方法を確立すべきである。これは、治療的使用の確実性を大きくする結果となる。
【実施例１４】
【０１２６】
〔単一ドメインVHHフラグメントは、もっぱら膜性カタラーゼ（腫瘍細胞に特有であり必須である）を阻害し、細胞内カタラーゼ（正常細胞でも役割を果たす）を阻害しない。〕
図２５および２６は、カタラーゼを中和する単一ドメインVHHフラグメントが、腫瘍細胞の膜性カタラーゼのみを中和し、正常細胞の細胞内カタラーゼに影響を与えないことを示す。
【０１２７】
それぞれ6000個の非形質転換208F細胞、形質転換208Fsrc3細胞およびMKN-45腫瘍細胞を、それぞれ100μLの培養液中に播種し、0.1または1 pg/mLの、カタラーゼを中和するaCATcb0972またはカタラーゼに結合するだけのaCATcb0973と混合した。対照標品は、単一ドメインVHHフラグメント非存在下とした。続いて、示された濃度のグルコースオキシダーゼを添加し、1.5時間後にアポトーシス誘導を測定した。グルコースオキシダーゼ（GOX）は、細胞透過性のH2O2を生成し、その結果、細胞内と膜性の両方のカタラーゼを分解する。十分な濃度では、H2O2は、細胞の悪性状態に関して選択性なくアポトーシスを誘導する（Ivanovas et al., Selective and nonselective apoptosis induction in transformed and nontransformed fibroblasts by exogenous reactive oxygen and nitrogen species. Anticancer Research, 22: 841-856, 2002）。
【０１２８】
図２５Ａは、腫瘍細胞株MKN-45が、正常細胞および形質転換細胞株よりもH2O2から良く保護されることを示す。カタラーゼを中和する単一ドメインVHHフラグメントの存在下、腫瘍細胞は、H2O2の効果について非常に明確に感作されるが、カタラーゼに結合するだけの単一ドメインVHHフラグメントは、感作を起こさない。図２６は、中和する単一ドメインVHHフラグメントが形質転換細胞株に関して感作効果を引き起こすが、正常細胞には影響を及ぼさないことを示す。
【０１２９】
図２５および２６は、悪性細胞に対する単一ドメインVHHフラグメントの特異的効果と、正常細胞は影響を受けないことを裏付ける。ここで、最大効果は腫瘍細胞で認められるが、これは、腫瘍細胞がとりわけ膜性カタラーゼにより保護されるためである。形質転換細胞は、表面に検出可能な量のカタラーゼを持つことが知られているが、腫瘍細胞におけるものより低い局所濃度で存在しており、その結果、ROSシグナル伝達からの保護に対して十分ではない。正常細胞における反応の欠如は、単一ドメインVHHフラグメントが細胞を透過せず、そこに存在するカタラーゼに影響を及ぼさないことを示す。すなわち、単一ドメインVHHフラグメントは膜性カタラーゼに対して特異的に作用し、これは特に腫瘍細胞に対して特徴的である。しかしながら、単一ドメインVHHフラグメントの反応部位に関するこの非常に重要な記載は、正常細部の細胞内カタラーゼの阻害が、実際にH2O2に対する正常細胞の感受性に影響を与えるということを同時に示す場合に、初めて意味を持つ。
【０１３０】
これとともに、対照側面が図２７で扱われる。
図２７は、正常細胞の細胞内カタラーゼのsiRNA介在性ノックダウンが、H2O2に対する正常細胞の感受性を増加させることを示す。
【０１３１】
正常細胞（208F）、形質転換細胞（208Fsrc3）および腫瘍細胞（MKN-45）を、対照siRNA（siCo）およびカタラーゼに対するsiRNA（siCAT）で遺伝子導入し、37℃、5％CO2で24時間保持した。その後、細胞を新鮮培養液中に取り、6000細胞／100μL培養液の細胞密度とした。続いて標品を、濃度を上げながらのGOX（Ａ〜Ｃ）またはペルオキシ亜硝酸塩（PON）（Ｄ〜Ｆ）で処理した。37℃、5％CO2で1.5時間培養後、アポトーシス細胞の割合を測定した。この実験を評価するため、GOXが、細胞透過性が非常に良いH2O2を生成し、その結果、膜性と細胞内の両方のカタラーゼを分解するということを再現しなければならない。一方、外因的に加えたペルオキシ亜硝酸塩は、細胞と接触する場合、細胞膜で反応する。したがって、ペルオキシ亜硝酸塩の作用からの保護は、膜の外側に存在するカタラーゼによってのみ実現される。
【０１３２】
図２７は、腫瘍細胞は、正常細胞または形質転換細胞より、H2O2およびペルオキシ亜硝酸塩から良く保護されていることを裏付ける。さらに図は、siRNA介在性のカタラーゼ分解が、H2O2の効果に対する正常細胞、形質転換細胞および腫瘍細胞の非常に強い感作を起こすことを示す。ペルオキシ亜硝酸塩による処理後は、まったく異なる状況が現れる。すなわち、正常細胞におけるsiRNA介在性のカタラーゼ分解は感作を起こさないが、形質転換細胞および腫瘍細胞においては、強い感作が生じる。これは、悪性細胞、すなわち形質転換細胞および腫瘍細胞の表面にのみ、外因的なペルオキシ亜硝酸塩から保護するカタラーゼが存在することを示す。保護的な膜性カタラーゼの効果は、正常細胞では検出することができない。H2O2を生成するGOXを用いて得られたこの知見は、正常細胞は、機能性の保護的カタラーゼを持ち、この効果は、例えばsiRNA介在性ノックダウンにより検出することができるということを示す。しかしながら図２６に示される実験において、H2O2に対する正常細胞の感作は、カタラーゼを中和する単一ドメインVHHフラグメントを用いては検出することができないので、単一ドメインVHHフラグメントは細胞内では作用しないことが示される。
【実施例１５】
【０１３３】
〔単一ドメインVHHフラグメントについて示されるインビトロ効果は、インビボの腫瘍増殖阻害と相関する。〕
図２８および２９は、免疫不全マウスにおけるヒト結腸がん異種移植の増殖は、単一ドメインVHHフラグメントaSODcb0989の反復投与により阻害されることを示す。
【０１３４】
図２８および２９で行われた実験は、民間認証サプライヤー（オンコテスト社、フライブルク）によって実施された。ヒト結腸がんの異種移植は、適したマウスに移植した。腫瘍が成長し、ある最小サイズに達した後、治療試験を開始した。示された用量（mg/kg体重）でのaSODcb0989または緩衝液を、1週間に2回、静脈内投与した。また腫瘍サイズも、1週間に2回、内径によって測定した。
【０１３５】
先ず、図２８は、対照動物における腫瘍増殖は、非常に明確な蔓延により特徴付けられることを示す。0.03 mg/kgのaSODcb0989を投与した場合、対照とは明確な差は生じない（図２８Ａ）。0.3 mg/kgのaSODcb0989を投与した場合、両群とも非常に強い蔓延が根底にあるが、単一ドメインVHHフラグメント処理群は、対照群と非常に明確に相違する。対照群と処理群との間での腫瘍体積における説明された差は、aSODcb0989による明らかな増殖阻害の発現である。aSODcb0989の用量を0.9 mg/kgにさらに増加させた場合（図２９）、ある動物では増殖阻害は促進されたが、他の動物ではその逆となった。これは、最適形のインビボ用量効果曲線が存在し、図２９に示された実験における条件は、最適上限の阻害に対して、濃度の限界に達していることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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