(57)【要約】  本発明は、β−カテニンの細胞核への輸送を調節するＷｎｔ経路の重要な新規成分および癌治療に対する新規な治療アプローチの発見に関する。本明細書に開示されるのは、細胞核に送達されるβ−カテニンの量に影響を与えるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路のこれまで知られていなかった必須成分である。このβ−カテニンシグナル伝達の細胞内インヒビター（ＩＢＳ）は、Ｄｋｋ３遺伝子のエクソン３に隣接する第２の転写開始部位から転写され、早期マウス発生に必要とされる。ＩＢＳはβ−ＴｒＣＰとの複合体内に核に向かうことになっているβ−カテニンを捕捉し、そのβ−カテニンはアクチン細胞骨格と結合し、核移行には利用することができない。【選択図】  図１
2018535695.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−カテニンシグナル伝達の単離された組換えヒトインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体。
【請求項２】
β−カテニンシグナル伝達のインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体を含む融合タンパク質。
【請求項３】
β−カテニンシグナル伝達の単離された組換えヒトインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質で形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
β−カテニンシグナル伝達のインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項５】
β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス。
【請求項６】
β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え導入遺伝子。
【請求項７】
β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項８】
その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記癌は癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌または腫瘍は乳癌または乳房の腫瘍である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌または腫瘍は前立腺癌または前立腺の腫瘍である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記癌は癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌または腫瘍は卵巣癌または卵巣の腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌または腫瘍は膵臓癌または膵臓の腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法はさらに前記対象に第２の活性抗腫瘍剤を含む医薬組成物を投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の活性抗腫瘍剤は小分子、化学療法剤、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、抗体、抗体−薬物複合体、アプタマーまたは核酸分子から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の活性抗腫瘍剤はパクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドーパ、ウレドーパ、アルトレートアミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、トリメチローロメラミン、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン、スポンギスタチン、クロラムブシル、クロマファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキセート、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキセート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エルフォルミチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、レンチナン、ロニダミン、メイタンシン、アンサミトシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、ロリジンＡ、アングイジン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、ドキセタキセル、クロラムブシル、ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン、テニポシド、エダトレキセート、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロナート、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン、ならびにそれらの薬学的に許容し得る塩または誘導体から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
その必要がある対象において腫瘍抑制効果を誘導する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
β−カテニンシグナル伝達のインヒビター（ＩＢＳ）タンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質による腫瘍抑制治療に対する癌の患者の感受性を確立する方法。
【請求項２２】
前記癌は癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にヒトＤＫＫ３ｂタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
前記癌または腫瘍は癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
その必要がある対象において炎症性の疾患または状態を治療する方法であって、前記対象にヒトＤＫＫ３ｂタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
前記炎症性の疾患または状態は炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸器疾患、アテローム性動脈硬化症、乾癬、皮膚炎、再狭窄、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症性ショック、関節リウマチ、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、疼痛、眼の炎症性疾患、セリアック病、リー症候群、グリセロールキナーゼ欠損症、家族性好酸球増加症、常染色体劣性痙性運動失調症、咽頭の炎症性疾患、結核、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、珪肺症および塵肺症から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害するための使用に適した医薬組成物であって、ヒトＤＫＫ３ｂタンパク質および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
炎症性の疾患または状態を治療するための使用に適した医薬組成物であって、ヒトＤＫＫ３ｂタンパク質および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【連邦資金による研究開発に関する声明】
【０００１】
連邦資金による研究開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所から付与された助成金番号ＤＫ０３８７７２およびＤＫ０６００５１に基づく政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【関連出願の相互参照】
【０００２】
優先権主張および関連特許出願
本出願は、２０１５年１０月１９日に出願された米国仮出願第６２／２４３，６１２号、２０１６年１月２１日に出願された同第６２／２８１，７０２号、および２０１６年８月２９日に出願された同第６２／３８０，５２５号の優先権の利益を主張し、その各々の全内容は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、概して、抗腫瘍性および抗炎症性の治療剤および方法に関する。より詳細には、本発明は、β−ＴｒＣＰ  Ｅ３ユビキチン活性のＤＫＫ３ｂ調節に基づき、およびβ−カテニンの細胞核への輸送を調節するＷｎｔ経路の新たに同定された成分に基づく新規な治療剤に関する。本発明はまた、癌および腫瘍を治療するための、ならびに炎症性の疾患および状態を治療するためのそれらに基づいた医薬組成物および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−３（ＤＫＫ３）の発現抑制は多くのヒト癌の特徴であり、発現レベルは腫瘍の病原性に（例えば、前立腺癌および卵巣癌において）反比例する。分泌型糖タンパク質のＤｉｃｋｋｏｐｆファミリーは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の重要な調節因子として初期の後生動物に最初に出現した４つのメンバーから構成される。（Ｋａｗａｎｏら、２００３  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６、２６２７〜２６３４；Ｇｕｄｅｒら、２００６  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３３、９０１〜９１１；Ｍｏｎａｇｈａｎら、１９９９  Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  ８７、４５〜５６；Ｎｉｅｈｒｓ、２００６  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５、７４６９〜７４８１。）３つのファミリーメンバーＤＫＫ１、ＤＫＫ２およびＤＫＫ４は、Ｗｎｔ受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄのＬＲＰ５／６サブユニットに結合することによってＷｎｔシグナル伝達をブロックする。（Ｚｏｒｎ、２００１  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＣＢ  １１、Ｒ５９２〜５９５；Ａｈｎら、２０１１  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ２１、８６２〜８７３；Ｃｈｅｎｇら、２０１１  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８、１２０４〜１２１０。）別個に進化した、残りのファミリーメンバーであるＤＫＫ３は、他のファミリーメンバーに見出される２つのシステインリッチなドメインを保持するが、Ｗｎｔ受容体活性化は調節しない。（Ｇｕｄｅｒら、２００６  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３３、９０１〜９１１；Ｆｅｄｄｅｒｓら、２００４  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ２１４、７２〜８０；Ｋｒｕｐｎｉｋら、１９９９  Ｇｅｎｅ  ２３８、３０１〜３１３；Ｍａｏら、２００３  Ｇｅｎｅ  ３０２、１７９〜１８３；Ｗｕら、２０００  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＣＢ  １０、１６１１〜１６１４。）
【０００５】
腫瘍サプレッサー遺伝子であるＤＫＫ３は、大部分の癌においてエクソン２に位置するＣｐＧアイランドの過剰メチル化によってサイレンシングされ、ＤＫＫ３の消失の程度は腫瘍浸潤に直接関連する。ＤＫＫ３はＷｎｔ結合をブロックすることが構造的に不可能であるにもかかわらず、前記ファミリーで最もよく知られた腫瘍サプレッサーである。（Ｖｅｅｃｋら、２０１２  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８２５、１８〜２８；Ｆｕｊｉｉら、２０１４  Ａｃｔａ  Ｍｅｄ  Ｏｋａｙａｍａ  ６８、６３〜７８。）ＤＫＫ３の異所性過剰発現はβ−カテニンによってドライブされる癌細胞増殖を遅らせるが、ＤＫＫ３作用のメカニズムは未だ知られていない。驚くべきことに、よく確立された分泌型ＤＫＫ３アイソフォームを破壊する、マウスＤｋｋ３遺伝子の標的化欠失では、ＤＫＫ３とＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路との直接的な関連を示すことはできなかった。Ｄｋｋ３ｔｍ１Ｃｎｉ突然変異マウスは生存可能であり、繁殖力があり、癌感受性の増加を示さず、β−カテニンシグナル伝達欠損を示さない。（Ｇｏｔｚｅら、２０１０  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２６、２５８４〜２５９３；Ｖｅｅｃｋら、２００４  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９１、７０７〜７１３；Ｇｕら、２０１１  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １７、３８１０〜３８１７；Ｌｅｅら、２００９  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２４、２８７〜２９７；Ｙｕｅら、２００８  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２９、８４〜９２；Ｈｓｉｅｈら、２００４  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３、９１８３〜−９１８９；Ｉｄｅｌら、２００６  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６、２３１７〜２３２６。）このＤｋｋ３遺伝子突然変異体も、他のＤｉｃｋｋｏｐｆ欠失突然変異体またはＷｎｔ／β−カテニン経路の突然変異体の表現型をコピーできない。（Ｌｅｗｉｓら、２００８  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３５、１７９１〜１８０１；Ｐｉｅｔｉｌａら、２０１３  Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  １２、２０４〜２１４；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、２００６  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３３、２１４９〜２１５４；Ｌｉら、２００５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７、９４５〜９５２；Ｋｅｒｋｅｌａら、２００８  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１８、３６０９〜３６１８；Ｘｉｅら、２０１１  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ４９、９８〜１０２；Ｓｉｅｂｅｒら、２００４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４、８８７６〜８８８１；Ｃｈｉａら、２００９  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８１、１３５９〜１３６８；Ｇｕａｒｄａｖａｃｃａｒｏら、２００３  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ４、７９９〜８１２；Ｎａｋａｙａｍａら、２００３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００、８７５２〜８７５７。）
【０００６】
β−トランスデューシンリピート含有タンパク質（β−ＴｒＣＰ）は、増殖、分化およびアポトーシスを含む腫瘍形成と密接に関連する細胞プロセスにおける役割を有するユビキチン−プロテアソームシステム（ＵＰＳ）の重要な調節分子である。β−ＴｒＣＰ調節異常およびその基質の異常なタンパク質分解に関連する癌は、乳房、結腸、肝臓、膵臓、黒色腫、胃および前立腺において見出される。（Ｆｒｅｓｃａｓら、２００８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ８、４３８〜４４９；Ｍｉｙａｍｏｔｏら、２０１５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４９（６２５４）：１３５１〜６；Ｆｏｎｇら、２０１５  Ｎａｔｕｒｅ  ５２５（７５７０）：５３８〜４２。）
【０００７】
β−ＴｒＣＰは、ＳおよびＧ２のＤＮＡ損傷応答チェックポイントで重要な役割を果たし、その主な機能はＤＮＡ障害を修復する時間を可能にする細胞周期停止に関与することである。さらに、哺乳動物タンパク質β−ＴｒＣＰおよびそのショウジョウバエ相同体スライム（Ｓｌｉｍｂ）は、３つの重要なシグナルトランスダクション経路、ＮＦ−κＢ、Ｗｎｔおよびヘッジホッグに関与している。（Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９９９  Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３：５０５〜５１０。）
【０００８】
β−ＴｒＣＰは最も特徴づけられた哺乳動物のＦボックスタンパク質の１つである。前記Ｆボックスタンパク質はＳＣＦリガーゼ複合体（Ｓｋｐ、Ｃｄｃ５３／Ｃｕｌ１、Ｆボックス）の特異性のメカニズムをもたらす。前記Ｆボックスタンパク質が前記複合体に標的基質を集めることによって、Ｅ２酵素がユビキチン−Ｅ１複合体から標的基質タンパク質にユビキチンを移すことが可能になる。β−ＴｒＣＰは数百の潜在的な基質を標的とすることによって多様な経路で機能する。（Ｌｏｗ、２０１４  Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．  １６：７（３５６）。）顕著な例には以下が含まれる：（１）β−ＴｒＣＰはＨＩＶ−１因子、Ｖｐｕとのその相互作用を介してＣＤ４の分解をもたらす；（２）β−ＴｒＣＰは、分解のためにリン酸化されたＩκＢａを標的とすることにより、ＮＦ−κＢを活性化する；（３）β−ＴｒＣＰはリン酸化β−カテニンの標的分解によるＷｎｔシグナルトランスダクションを調整する；（４）β−ＴｒＣＰはＣｄｃ２５二重特異性ホスファターゼ、続いてクラスピンおよびＷＥＥ１を標的とすることにより、ＤＮＡ損傷応答チェックポイントを調節する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
癌ならびに炎症性の疾患および状態のための新規な治療剤および治療方法が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、β−ＴｒＣＰ  Ｅ３ユビキチン活性のＤＫＫ３ｂ調節に基づき、およびβ−カテニンの細胞核への輸送を調節するＷｎｔ経路の新たに同定された成分に基づく新規な治療剤の予期せぬ発見に基づく。本発明はまた、癌および腫瘍を治療するための、ならびに炎症性の疾患および状態を治療するためのそれらに基づく医薬組成物および使用方法に関する。
【００１１】
ＷｎｔアンタゴニストのＤｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）ファミリーのメンバーは、Ｗｎｔ誘導性受容体のアセンブリを中断することによって、軸方向のパターニングおよび細胞運命決定に関与する。Ｗｎｔ受容体活性化をブロックしない１つのファミリーメンバーであるＤｋｋ３のエピジェネティックなサイレンシングは癌に関連しており、その異所性発現は癌の増殖を止める。本明細書には、細胞核に送達されるβ−カテニンの量を支配する、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路のこれまでに知られていない必須成分が開示される。このβ−カテニンシグナル伝達の細胞内インヒビター（ＩＢＳ）は、Ｄｋｋ３遺伝子のエクソン３に隣接する第２の転写開始部位から転写され、早期マウス発生に必要とされる。
【００１２】
ＩＢＳはβ−ＴｒＣＰとの複合体内に核に向かうことになっているβ−カテニンを捕捉し、そのβ−カテニンはアクチン細胞骨格と結合し、核移行には利用できない。これにより、細胞内で最も研究されたシグナルトランスダクション経路の１つに新たな調節の局面が加えられる。本発明は、多くの癌において細胞増殖をドライブする調節不全のβ−カテニンシグナル伝達を停止するための新規で全く未開発の治療標的を提供する。
【００１３】
一態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達の単離された組換えヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体に関する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体を含む融合タンパク質に関する。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達の単離された組換えヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質で形質転換された宿主細胞に関する。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスに関する。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え導入遺伝子に関する。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビター、またはその変異体もしくはその融合タンパク質、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において腫瘍抑制効果を誘導する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質による腫瘍抑制治療に対する癌の患者の感受性を確立する方法に関する。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において腫瘍抑制効果を誘導する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にヒトＤＫＫ３ｂタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。治療され得る癌または腫瘍の例示としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌が挙げられる。
【００２７】
特定の好ましい実施形態では、本明細書に開示される癌を治療する方法は、さらに前記対象に第２の活性抗腫瘍剤を含む医薬組成物を投与することを含む。前記第２の活性抗腫瘍剤は小分子、化学療法剤、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、抗体、抗体−薬物複合体、アプタマーまたは核酸分子であってもよい。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において炎症性の疾患を治療するかまたは炎症性の疾患を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において炎症性の疾患または状態を治療する方法であって、前記対象にヒトＤＫＫ３ｂタンパク質またはその変異体もしくはその融合タンパク質を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００３０】
例示的な炎症性の疾患または状態には、当該分野で公知の炎症またはアレルギープロセスによって特徴付けられる任意の疾患または状態が含まれ、例えば、炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸器疾患、アテローム性動脈硬化症、乾癬、皮膚炎、再狭窄、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症性ショック、関節リウマチ、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、疼痛、眼の炎症性疾患、セリアック病、リー症候群、グリセロールキナーゼ欠損症、家族性好酸球増加症、常染色体劣性痙性運動失調症、咽頭の炎症性疾患、結核、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、珪肺症および他の塵肺症が挙げられる。
【００３１】
特定の好ましい実施形態では、本明細書に開示される炎症性の疾患または状態を治療する方法は、さらに前記対象に第２の活性抗炎症剤を含む医薬組成物を投与することを含む。前記第２の活性抗炎症剤は小分子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、抗体、抗体−薬物複合体、アプタマーまたは核酸分子であってもよい。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、概して、癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害するための使用に適した医薬組成物であって、ヒトＤＫＫ３ｂタンパク質またはその変異体もしくはその融合タンパク質、および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物に関する。
【００３３】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００３４】
さらに別の態様では、本発明は、概して、炎症性の疾患または状態を治療するための使用に適した医薬組成物であって、ヒトＤＫＫ３ｂタンパク質またはその変異体もしくはその融合タンパク質、および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、分泌型の細胞透過性ＩＢＳ分子の機能的ドメインの構成を示す。分泌前＿ｃｐＩＢＳは、ＳＲＰによって認識される膜貫通残基（グレーで示す）のタンパク質分解切断前の翻訳産物のプロ形態である。成熟＿ｃｐＩＢＳは、膜貫通ＳＲＰ残基の放出後に保持される可変残基、細胞透過性ドメイン（ｃｐ）およびＩＢＳの可変ドメインから構成される。
【００３６】
【図２】図２は、異なるＰＴＥＮ＿ｃｐ＿ＩＢＳ変異体を有するＣＨＯ細胞からの異なる使用済み培地の存在下でのβ−カテニンシグナル伝達を示す。データは３つのウェルの平均＋／−ＳＥである。
【００３７】
【図３】図３は、分泌型ＳｃｐＩＢＳ突然変異体の模式図を示す。ＳＲＰ、シグナル認識粒子ドメイン；ｃｐ、細胞透過性ドメイン；Ｎ−１、必要とされるＮ末端アミノ酸１〜１０；Ｃ−１、システインリッチドメイン１；Ｃ−２、システインリッチドメイン２；Ｃｔ、必要とされるＣ末端アミノ酸２７０〜２８０。
【００３８】
【図４】図４は、細菌で発現された折り畳まれていない細胞透過性（ｃｐ）ＩＢＳ分子の機能ドメインの略図を示す。ｃｐＩＢＳは、１１残基長の合成ｃｐドメインのヒトＩＢＳのコード配列との融合タンパク質である。ｃｐＩＢＳ１２２はＣ末端に付加された残基２７０〜２８０を伴うＩＢＳの残基１〜１２２から構成される。
【００３９】
【図５】図５は、分泌型ＳｃｐＩＢＳ突然変異体の模式マップを示す。ｃｐ、細胞透過性ドメイン；Ｎ−１、必要とされるＮ末端アミノ酸１〜１０；Ｃ−１、システインリッチドメイン１；Ｃ−２、システインリッチドメイン２；Ｃｔ、必要とされるＣ末端アミノ酸２７０〜２８０。
【００４０】
【図６】図６は、Ｄｋｋ３遺伝子座に由来する複数の転写物の同定を示す。ａ．野生型およびＤｋｋ３ｔｍ１Ｃｎｉ突然変異マウスにおけるＤｋｋ３遺伝子（ＮＣ＿００００７３．６）の模式図。Ｄｋｋ３（ＮＭ＿０１５４８１４）およびＤ２ｐ２９（ＡＦ２４５０４０）のイニシエータメチオニンを矢印で示す。ｂ．Ｄｋｋ３＋／＋およびＤｋｋ３ｔｍ１Ｃｎｉマウスの脳におけるＤＫＫ３アイソフォームのイムノブロット分析。ｃ．野生型およびＤｋｋ３ｔｍ１Ｃｎｉにおける全脳ＲＮＡにおけるエクソン２およびエクソン３転写物を含有するＤｋｋ３の定量的ＰＣＲ分析。矢印はＰＣＲプライマー部位を示す（エラーバーは３つの個々のＳＥを表す）。ｄ．ラットＤｋｋ３のイントロン２の概略図：ルシフェラーゼ構築物はプロモーター局在化に使用される。矢印はエクソン３の上流のイントロン２セグメントの方向および位置を示す（エラーバーは３つの独立した実験のＳＥを表す）。ｅ．ラットアストロサイトＤｋｋ３遺伝子のエクソン３に隣接する約１３０ｎｔのイントロン２に結合したＲＮＡ  ｐｏｌ  ２およびＴＢＰのクロマチン免疫沈降（エラーバーは３つの独立した実験のＳＥを表す）。
【００４１】
【図７】図７は、ＺＦＮ遺伝子編集Ｄｋｋ３ＣＦＰ／＋マウスのＤｋｋ３遺伝子におけるＴＳＳ２の生物学的分析を示す。ａ．ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害は、遺伝子編集細胞においてＴＳＳ２駆動（ｄｒｉｖｅｎ）ＣＦＰを増加させる。ｂ．Ｃ５７Ｂｌ６ｊおよび非近交系ＣＤ１マウスにおけるＤｋｋ３ＣＦＰ対立遺伝子の表現型比。ｃ．Ｄｋｋ３ＣＦＰ／＋マウスの代表的組織におけるＴＳＳ２駆動ＣＦＰ発現。
【００４２】
【図８】図８は、細胞増殖およびアポトーシスのＩＢＳ調節を示す。ａ．ＰＣ３細胞増殖に対するＩＢＳおよびＤＫＫ３の効果の比較（エラーバーは３つの独立した実験のＳＥを表す）。ｂ．ＩＢＳは細胞周期のＧ０／Ｇ１期で細胞増殖を停止させる（エラーバーは３つの独立した実験のＳＥを表す）。ｃ．細胞透過性ＩＢＳ（ＴＡＴ−ＩＢＳ）が開始する細胞消失は、ＪＮＫ活性の阻害によってブロックされ、細胞周期停止とは無関係である（エラーバーは３つの独立した実験のＳＥを表す）。ｄ．ＴＡＴ−ＩＢＳは、ＰＣ３細胞におけるＪＮＫ経路の活性化によって、プロアポトーシス切断カスパーゼ３を誘導した。
【００４３】
【図９】図９は、ＩＢＳおよびβ−カテニンシグナル伝達を示す。ａ．ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＡＴ−ＩＢＳとトランスフェクトされたＦｌａｇ−ＩＢＳの細胞分布の比較。ｂ．ＩＢＳは基準細胞増殖を変化させることなくＷｎｔ／β−カテニン刺激細胞増殖をブロックする（データは４つの密接に一致する（±１０％）独立実験の平均を表す）。白抜きのバーは０日目；着色したバーは３日目。ｃ．ＴＡＴ−ＩＢＳは、一次および二次のβ−カテニン依存性遺伝子発現に拮抗する（エラーバーは３つの独立した実験のＳＥを表す）。ｄ．ＴＡＴ−ＩＢＳはβ−カテニン依存性の悪性細胞移動を阻害する（エラーバーは３つの独立した実験のＳＥを表す）。
【００４４】
【図１０】図１０は、ＩＢＳ、βＴｒＣＰおよびβ−カテニンシグナル伝達経路間の分子相互作用の特徴付けを示す。ａ．ＨＥＫ２９３細胞におけるエピトープ標識βＴｒＣＰ、ＩＢＳおよび構成的に活性なＳ３３Ｙ変異体β−カテニンの発現レベル。ｂ．ＩＢＳと相互作用するβＴｒＣＰおよびβ−カテニンの共免疫沈降。個々のエピトープ標識標的を免疫沈降させ、エピトープ特異的抗体を用いたイムノブロットにより分析した。ｃ．ＩＢＳは天然の転写活性β−カテニンと相互作用するが、ホスホ−β−カテニンまたはＧＳＫ３βとは相互作用しない。ｄ．ＩＢＳは細胞質の増加と核の取り込みをブロックし、マイクロフィラメントに結合したβ−カテニンを増加させるが、全細胞含量を安定化させる（データは３つの独立した実験の平均±ＳＥである）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−ファロイジンを用いてアクチン細胞骨格を可視化した。ｅ．ＴＡＴ−ＩＢＳによる核関連β−カテニンの迅速なクリアランス。（エラーバーは３つの独立した実験のＳＥを表す。）カッコ内の数字は各時点での細胞数を示す。
【００４５】
【図１１】図１１は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路におけるＩＢＳの新規な調節的役割の模式図を示す。ＤＳＨ、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ；ＧＳＫ３β、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ；ＣＫ１、カゼインキナーゼ１；ＰＰ２Ａ、プロテインホスファターゼ２Ａ；ＡＰＣ、大腸腺腫症タンパク質；βＴｒＣＰ、β−トランスデューシンリピート含有タンパク質。
【００４６】
【図１２】図１２は、表１．本研究で使用したプライマーを示す。
【００４７】
【図１３】図１３は、表２．ＺＦＮ遺伝子編集Ｄｋｋ３ＣＦＰマウス（ファウンダー＃１９）のオフターゲット分析を示す。マウスＣ５７ｂｌ６ゲノムＧＲＣｍ３８。
【００４８】
【図１４】図１４は、マウスアストロサイトにおけるＤｋｋ３アイソフォームの比較を示す。ａ．ＤＫＫ３およびＤ２ｐ２９のアミノ酸配列の配置構造。ｂ．アストロサイトにおけるＤＫＫ３アイソフォームに対するフリンタンパク質分解の効果。画像分析ソフトウェア（Ｏｄｙｓｓｅｙ、ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して、個々のＤＫＫ３バンドを測定し、データをチューブリンに対して正規化した。データは３つの独立した細胞調製物／フリン消化物を表す。
【００４９】
【図１５】図１５は、ラットアストロサイトにおけるＤｋｋ３転写物のエクソン特異的ｑＰＣＲ分析を示す。Ｄｋｋ３エクソン２およびエクソン３プライマーセットの検証。Ｄｋｋ３  ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに対して標準化した。３つの独立した実験からのデータ（平均±ＳＥ）。
【００５０】
【図１６】図１６は、Ｄｋｋ３遺伝子のイントロン２におけるＺＦＮ標的を示す。ａ．エクソン３に対する標的配列の配列および位置。ｂ．エピトープ標識ＺＦＮの完全なアミノ酸配列。
【００５１】
【図１７】図１７は、マウスＤｋｋ３遺伝子のＺＦＮ仲介遺伝子編集の模式図を示す。ａ．野生型Ｄｋｋ３遺伝子座の最初の４つのエクソンの構成。ＴＳＳ１、転写開始部位１；ＴＳＳ２、転写開始部位２。ｂ．ＨＲドナーの模式図。ｃ．遺伝子編集Ｄｋｋ３ＣＦＰ遺伝子座の模式図。ジェノタイピングＰＣＲプライマーを矢印で示した（表１）。Ｄｋｋ３ＣＦＰマウスのＺＦＮ標的遺伝子座でのＣＦＰ挿入のアガロースゲルの確認。
【００５２】
【図１８】図１８は、Ｄｋｋ３ＣＦＰマウスの致死的表現型のＳｏｘ２プロモーター−Ｃｒｅレスキューを示す。ａ．Ｄｋｋ３ＣＦＰ遺伝子座の模式図。矢尻はＰＣＲプライマーＤＫＳＦおよびＤＫＳＲの位置を示す。ｂ．Ｃｒｅ組換え後のＤｋｋ３ＣＦＰ遺伝子座の概略図。ｃ．Ｄｋｋ３ｗｔ遺伝子座の模式図。ｄ．代表的ホモ接合体遺伝子編集（＃１３１）、野生型（＃５８６）、および異型接合体遺伝子編集（＃７８１）の６週齢のマウスＤＮＡから作製したＰＣＲ産物のアガロースゲル分析。
【００５３】
【図１９】図１９は、ＭＥＦにおけるＤｋｋ３  ＴＳＳ２の二対立遺伝子挿入転換によるＩＢＳの消失の影響を示す。ａ．ＭＥＦは１６日齢のヘテロ接合Ｄｋｋ３ＣＦＰ／＋胚から調製し、野生型Ｄｋｋ３対立遺伝子をＺＦＮおよびｍＣｈｅｒｒｙ  ＨＲドナーで再編集した。ＣＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの両方を発現する、二対立遺伝子編集されたＩＢＳノックアウトのＤｋｋ３ＣＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ細胞をＦＡＣＳによって単離した。ホモ接合Ｄｋｋ３ＣＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ細胞に存在するＤＫＫ３アイソフォームのイムノブロット分析。ｂ．野生型およびＩＢＳノックアウトＭＥＦＳに存在するＤｋｋ３転写物のｑＰＣＲ分析。転写産物の存在量は、ＧＡＰＤＨを対照として用いたＤＤＣＴ法により測定した。データは３つのディッシュの平均値±標準誤差を表す。ｃ．野生型およびＩＢＳノックアウトＭＥＦＳに存在するｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＤ１転写物のｑＰＣＲ分析。転写産物の存在量は、ＧＡＰＤＨを対照として用いたＤＤＣＴ法により測定した。データは３つのディッシュの平均値±標準誤差を表す。
【００５４】
【図２０】図２０は、ＳｃｐＩＢＳおよびβ−カテニンシグナル伝達のドメイン構成を示す。
【００５５】
【図２１】図２１は、ＩＢＳタンパク質の必須ドメインの蓄積された突然変異／欠失／短縮評価を示す。
【００５６】
【図２２】図２２は、β−カテニンシグナル伝達に対するＤＫＫファミリーのＮ−１ドメインの効果を示す。
【００５７】
【図２３−１】図２３は、ＴＡＴ−ＩＢＳは一次および二次β−カテニンおよびＮＦ−κＢ依存性遺伝子発現に拮抗する。Ａ）ＴＡＴ−ＩＢＳはＷｎｔ−１トランスフェクションによって刺激されたＨＥＫ２９３細胞（陰影付きバー）中のＮＦ−κＢ（ｐ６５）−応答性プロモーター駆動ルシフェラーゼレポーターをブロックする。Ｂ）ＴＡＴ−ＩＢＳはＷｎｔ−１刺激によって抑制される上皮分化のレポーターであるＥｌｆ３−ルシフェラーゼの転写活性を回復させる。Ｃ）（ＵＭＭＣ  １２−４０ＰＲ２に既に開示されたデータ。）ＴＡＴ−ＩＢＳはＷｎｔ−１刺激細胞におけるＥ−カドヘリン（ＣＤＨ１）−プロモーター活性を回復させる（中央の図）。ＴｏｐＦｌａｓｈおよびＥ２Ｆ−ルシフェラーゼレポーターは、それぞれβ−ＴｒＣＰ基質、β−カテニンおよびＥ２Ｆに依存する（上および下の図）。ＴＡＴ−ＩＢＳは両方のレポーターのＷｎｔ−１刺激による転写活性化をブロックする。
【図２３−２】同上
【００５８】
【図２４】図２４には、ＩＢＳがマイクロフィラメント結合β−ＴＲＣＰ基質を増加させることが示される。ＳＯＡＳ−２細胞をＧＳＫ３インヒビター、ＬｉＣｌで刺激して、β−カテニンおよび模倣Ｗｎｔ−１経路活性化を安定化させた。細胞溶解物の未処理およびＩＢＳ処理マイクロフィラメント画分は、短期間（９０分）のＩＢＳ置換により、マイクロフィラメントに結合したβ−ＴｒＣＰ、Ｅｒｋ１／２、ＮＦ−κＢおよびｐ３８タンパク質複合体が得られることを示す。したがって、ＩＢＳ、β−ＴｒＣＰおよびβ−ＴｒＣＰ標的基質の間に形成される阻害複合体は、核の取り込みを妨害し、ＩＢＳによるβ−ＴｒＣＰ基質シグナル伝達のサイレンシングの分子基盤を特徴付ける。
【００５９】
定義
以下の定義は、当業者によって一般的に理解される概念の要約として提供され、本明細書に開示される主題の理解のために提供される。この定義は本発明または本明細書の特許請求の範囲を限定するように意図されるものではない。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、エピトープまたは抗原決定基に結合することができる分子を指す。この用語は一本鎖抗体を含む完全抗体およびその抗原結合断片を含むことを意味する。前記抗体は任意の動物由来であり得る。好ましくは、前記抗体は哺乳動物、例えば、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマなど、または他の適切な動物である。抗体はポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原を認識し得る。この用語は、例えば、免疫グロブリンの抗原結合断片、重鎖の可変領域および／または定常領域、軽鎖の可変領域および／または定常領域、相補性決定領域（ｃｄｒ）、およびフレームワーク領域を含む活性断片を含む。この用語には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製物、ならびにハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体分子、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ）断片を含む調製物；Ｆｖ分子（例えば、非共有結合ヘテロ二量体）、二量体および三量体抗体断片構築物；ミニボディ、ヒト化抗体分子、およびこのような分子から得られた任意の機能的断片を含み、そのような断片は特異的結合を保持する。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体という用語は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位およびヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいた分子の残りの免疫グロブリン構造を有する分子を意味する。前記抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全可変ドメインか、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域にグラフトされた相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含み得る。抗原結合部位は、野生型であってもよく、または例えばヒト免疫グロブリンにさらに近づくように修飾された１つ以上のアミノ酸置換によって修飾されてもよい。ヒト化抗体のいくつかの形態は、全てのＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体由来の６つのＣＤＲの全てを含むヒト化マウス抗体）を保存する。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して修飾された１つ以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、６）を有する。
【００６２】
抗体結合の文脈において、「特異的に結合する」という用語は、特異的エピトープに対する抗体の高い結合活性および／または高い親和性の結合を意味する。したがって、１つのエピトープ（「第１のエピトープ」）に特異的に結合し、別のエピトープ（「第２のエピトープ」）には結合しない抗体は「特異的抗体」である。第１のエピトープに特異的な抗体は、２つのエピトープが相同性または他の類似性を共有する場合、第２のエピトープと交差反応して結合し得る。ポリヌクレオチドの文脈において、「特異的に結合する」という用語は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション反応およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション反応の両方のストリンジェンシーを増加させる条件は、当該分野において広く知られており、公開されている（Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（２００１））。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体によって結合され得る分子を意味する。抗原はさらに、免疫系によって認識され、および／またはＢリンパ球および／またはＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、これは、少なくとも特定の場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含有するか、またはＴｈ細胞エピトープに連結し、アジュバント中で投与されることが必要とされる可能性がある。抗原は１つまたは複数のエピトープ（Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープ）を有することができる。上記の特異的反応は、抗原が好ましくは対応する抗体またはＴＣＲと通常高度に選択的な方法で反応し、他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体またはＴＣＲと反応しないことを示すことを意味する。また、本明細書で使用する抗原はいくつかの個々の抗原の混合物であってもよい。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「エピトープ」という用語は、個々の抗体またはＴ細胞受容体による認識の基本的な要素または最小単位を意味するため、前記抗体またはＴ細胞受容体が結合する特定のドメイン、領域または分子構造を意味する。抗原は多数のエピトープからなっていてもよく、ハプテンは通常少数のエピトープを有し得る。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は本明細書では互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。それらは二本鎖配列および一本鎖配列の両方を含むことができ、ウイルス、原核生物および真核生物源由来のｃＤＮＡ；ｍＲＮＡ；ウイルス（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）または原核生物源由来のゲノムＤＮＡ配列；ＲＮＡｉ；ｃＲＮＡ；アンチセンス分子；リボザイム；および合成ＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列を取り込む。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」という用語は、哺乳動物細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合し、それに作動可能に連結された下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域を意味する。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）があり得る。真核生物プロモーターはしばしば「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むが、必ずしもそうではない。プロモーターは、核酸分子に天然に連続しているものおよび核酸分子に天然には連続しないものを含む。さらに、「プロモーター」という用語は、誘導性プロモーター、ｃｒｅ−ｌｏｘプロモーターなどの条件的に活性なプロモーター、構成的プロモーター、および組織特異的プロモーターを含む。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、「トランスフェクトされた」という用語は、リポフェクタミンなどの任意の付随する促進剤の使用の有無にかかわらず、導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを有することを意味する。当該分野で公知のトランスフェクションのための方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、およびリポフェクションが含まれる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子の発現」は、核酸分子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。前記遺伝子産物は遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるペプチドまたはポリペプチドであり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ；および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質を含む。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、任意の（複数の）組換えベクターまたは（複数の）単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るか、またはこのレシピエントである個々の細胞または細胞培養物をいう。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、前記子孫は、必ずしも自然の、偶然のまたは故意の突然変異および／または変化のために元の親細胞と完全に同一でなくてもよい（形態学的にまたは全ＤＮＡ相補的に）。宿主細胞はインビボまたはインビトロで本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドでトランスフェクションされたかまたは感染された細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ぶことができる。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「生物学的に活性な」実体、または「生物学的活性」を有する実体という用語は、天然に存在する分子の構造的、調節的または生化学的機能、または代謝もしくは生理学的プロセスに関連するかまたは付随する任意の機能を有する実体である。生物学的に活性なポリヌクレオチド断片は、本発明のポリヌクレオチドの活性と類似しているが必ずしも同一ではない活性を示すものである。前記生物学的活性は、改善された所望の活性または減少した望ましくない活性を含むことができる。例えば、ハイブリダイゼーションなどの別の分子との分子相互作用に参加する場合、疾患状態を緩和する上で治療上の価値がある場合、免疫応答を誘導する上で予防的な価値を有する場合、例えば、ポリヌクレオチド分子に固有のものとして検出することができるか、またはポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして使用することができるポリヌクレオチドの生物学的に活性な断片などの分子の存在を決定する上で診断的および／または予後的な価値を有する場合、実体は生物学的活性を示す。生物学的に活性なポリペプチドまたはその断片には、生物学的反応に関与できるものが含まれる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「（複数の）炎症状態」という用語は、関節リウマチ、変形性関節症、若年性特発性関節炎、乾癬、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、大腸炎）、エンドトキシン駆動疾患状態（例えば、バイパス手術後の合併症または例えば、慢性心不全に寄与する慢性エンドトキシン状態）、ならびに関節の疾患などの軟骨を含む関連疾患を含む状態の群を指す。特に、この用語は、関節リウマチ、変形性関節症、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息）および炎症性腸疾患を指す。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、「癌」という用語は、通常は調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、または表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽腫および白血病が含まれるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮細胞癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌および頭頸部癌が含まれる。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「腫瘍」という用語は、任意の悪性細胞または腫瘍性細胞を指す。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用され、最小長に限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義内に含まれる。全長タンパク質およびその断片の両方がこの定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対して、欠失、付加および置換（天然には一般に保存的）などの修飾を含むタンパク質を指してもよい。これらの修飾は故意であっても偶発的であってもよい。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「受容体」という用語は、リガンドと呼ばれる別の分子と相互作用することができるタンパク質または糖タンパク質またはその断片を指す。このリガンドは生化学的または化学的な化合物の任意のクラスに属することができる。このリガンドは通常、受容体に結合すると、通常、シグナルトランスダクション経路の開始などの細胞応答を開始する細胞外分子である。受容体は必ずしも膜結合タンパク質である必要はない。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、核酸分子に関する、「組換え体」という用語は、その起源または操作のために、天然ではそれらと関連するポリヌクレオチドの全部または一部と関連していない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成および／または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。「組換え体」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。宿主細胞に関して使用される「組換え体」という用語は、組換えポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を意味する。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、「組換えウイルス」という語句は、ヒトの手によって遺伝子改変されたウイルスを指す。前記語句は当該分野で既知の任意のウイルスを包含する。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞または生物に遺伝物質を伝達するために使用される作用物質（例えば、プラスミドまたはウイルス）を指す。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで構成されていてもよい。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」という用語は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子と同じ細胞内にある場合、標的遺伝子の発現を減少するかまたは阻害することができる（すなわち、干渉ＲＮＡの配列に相補的なｍＲＮＡの分解を仲介することにより）二本鎖ＲＮＡ（すなわち、二重鎖ＲＮＡ）を指す。したがって、干渉ＲＮＡは、２つの相補鎖によってまたは単一の自己相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子との実質的または完全な同一性を有してもよく、またはミスマッチ領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含んでいてもよい。干渉ＲＮＡの配列は全長標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。干渉ＲＮＡには、長さが約１５〜６０、１５〜５０、または１５〜４０（二重鎖）ヌクレオチド、より典型的には長さが約１５〜３０、１５〜２５、または約１９〜２５（二重鎖）ヌクレオチドの干渉ＲＮＡなどの「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」が含まれる。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、用語「試料」は、ヒト、動物由来の試料、または研究試料、例えば、細胞、組織、器官、流体、気体、エアロゾル、スラリー、コロイドまたは凝固物質を指す。前記「試料」は、例えば、ヒトまたは動物から除去することなく、インビボで試験してもよく、またはインビトロで試験してもよい。前記試料は、例えば組織学的方法によって、処理した後、試験することができる。「試料」はまた、例えば、流体もしくは組織試料を含む細胞または流体もしくは組織試料から分離された細胞を指す。「試料」はまた、ヒトまたは動物から新たに採取した細胞、組織、器官または流体、または処理したかまたは保存した細胞、組織、器官または流体を指してもよい。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、「単離された」または「実質的に単離された」分子（例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチド）という用語は、自然界よりも高い濃度で存在するように操作されたか、その天然環境から取り出されたものを指す。例えば、少なくとも１０％、または２０％、または４０％、または５０％、または７０％、または９０％の天然で関連する非対象抗体物質が除去されている場合、対象抗体は単離され、精製され、実質的に単離され、または実質的に精製されている。例えば、生きている動物に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然の状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いる。さらに、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離されたＲＮＡ分子には、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子のインビボまたはインビトロのＲＮＡ複製産物が含まれる。単離された核酸分子はさらに合成的に産生された分子を含む。加えて、組換え宿主細胞に含まれるベクター分子も単離されている。したがって、全ての「単離された」分子を「精製」する必要はない。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、用語「精製された」とは、分子に関して使用される場合、精製された分子の濃度が、その自然環境、またはそれが産生されるか、見出されるかまたは合成される環境においてそれが関連する分子に対して増加していることを意味する。天然に関連する分子には、タンパク質、核酸、脂質および糖が含まれるが、一般に、精製される分子の完全性を維持するためまたは精製を容易にするために添加される水、緩衝液および試薬は含まれない。この定義によれば、その汚染物質と比較して、物質は５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％純粋である。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、開示された化合物の「投与」は、本明細書に記載された任意の適切な製剤または投与経路を用いて、本明細書に記載の化合物またはそのプロドラッグまたは他の薬学的に許容し得る誘導体の対象への送達を包含する。
【００８４】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」または「治療上有効な量」とは、以下に説明する、これに限定されないが、疾患治療を含む、意図された適用を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物または医薬組成物の量を意味する。いくつかの実施形態において、その量は癌細胞の成長または転移の検出可能な死滅または阻害に有効な量であり；腫瘍のサイズまたは数；または癌のレベル、ステージ、進行または重症度の他の尺度を含む。いくつかの実施形態では、その量は炎症状態を緩和するか、軽減するかまたは排除するのに有効な量である。
【００８５】
治療的に有効な量は、意図される適用、または治療される対象および疾患状態、例えば、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、治療される疾患、投与様式、および患者の体重と年齢、および年齢に依存して変わる可能があり、これは当業者によって容易に決定され得る。この用語はまた、標的細胞において特定の応答、例えば、細胞移動の減少を誘導するであろう用量に適用される。具体的な用量は、例えば、選択される特定の化合物、対象の種およびそれら（彼ら）の年齢／現在の健康状態または健康状態のリスク、追跡すべき投与計画、疾患の重篤度、他の薬剤と組み合わせてそれが投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織、およびそれをその中に担持する物理的送達システムに依存して変わることになる。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、「治療」または疾患または障害を「治療する」という用語は、そのような状態が起こる前または後にそのような状態を軽減、遅延、または改善する方法を指す。治療は疾患および／または基礎をなす病理の１つ以上の効果または症状を対象とすることができる。治療は、これらに限定されないが、治療的有用性および／または予防的有用性を含む、有用なまたは所望の結果を得ることを目的とする。治療的有用性とは、治療される基礎疾患の根絶または改善を意味する。また、治療的有用性は基礎疾患に関連する１つ以上の生理学的徴候の根絶または改善により達成され、その結果、患者は依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、その患者において改善が観察される。予防的有用性のために、特定の疾患を発症するリスクのある患者に、または疾患の１つ以上の生理学的症状を示す患者に、この疾患の診断がなされていない可能性がある場合でも、前記医薬化合物および／または組成物を投与することができる。治療は任意の減少であり得、疾患または疾患の症状の完全な切除であり得るが、これらに限定されない。同等の治療していない対照と比較して、このような減少または予防の程度は、任意の標準的な技術によって測定されるように、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「治療効果」は、本明細書に記載されているような治療的有用性および／または予防的有用性を指す。予防効果は疾患または状態の出現の遅延または排除、疾患または状態の症状の発症の遅延または排除、疾患または状態の進行の遅延、停止または逆転、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、開示される化合物の「薬学的に許容し得る形態」には、これらに限定されないが、開示される化合物の薬学的に許容し得る塩、水和物、溶媒和物、異性体、プロドラッグおよび同位体標識された誘導体が含まれる。一実施形態では、「薬学的に許容し得る形態」には、これらに限定されないが、開示される化合物の薬学的に許容し得る塩、異性体、プロドラッグおよび同位体標識された誘導体が含まれる。いくつかの実施形態において、「薬学的に許容し得る形態」には、これらに限定されないが、開示される化合物の薬学的に許容し得る塩、立体異性体、プロドラッグおよび同位体標識された誘導体が含まれる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容し得る」賦形剤、担体または希釈剤は、１つの臓器または身体の一部から他の臓器または身体の一部に対象の医薬品を担持するかまたは輸送する際に関連する、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を意味する。各担体は製剤の他の成分と適合しかつ患者に有害ではないという意味で「許容し得る」ものでなければならない。薬学的に許容し得る担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下のものが含まれる：糖、例えば乳糖、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末のトラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばカカオバターおよび坐薬ワックス；油、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油；グリコール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチル、ラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張性生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；および医薬製剤に使用される他の非毒性適合物質。湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、防腐剤および酸化防止剤も前記組成物中に存在しうる。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を意味し、これは特定の治療のレシピエントとなる。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、本明細書では、ヒト対象に関して互換的に使用される。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
本発明は、Ｄｋｋ３遺伝子座によってコードされる細胞質タンパク質である、ＤＫＫ３ｂがβ−ＴｒＣＰ基質の輸送を調節するという予期せぬ発見に基づく。本発明はまた、β−カテニンの細胞核への輸送を調節するＷｎｔ経路の重要な新規成分である、β−カテニンシグナル伝達の細胞内インヒビター、および癌治療に対する新規な治療アプローチの発見に関する。本発明はさらに、それらに基づく新規な癌治療剤および治療方法に関する。本発明はさらに、β−ＴｒＣＰ基質の活性を示すバイオマーカーまたはコンパニオン診断薬に関する。
【００９２】
Ｄｋｋ３ノックアウトマウス（Ｄｋｋ３ｔｍ１Ｃｎｉ）における正常なβ−カテニンシグナル伝達により、本発明者らはラットのアストロサイトにおける動的なマイクロフィラメントに基づく細胞内輸送を示す約３０ｋＤａのＤＫＫ３アイソフォーム（Ｄ２ｐ２９）の生物学的関連性を再検討することとなった。（Ｉｄｅｌら、２００６  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６、２３１７〜２３２６；Ｌｅｏｎａｒｄら、２０００  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５、２５１９４〜２５２０１；Ｓｔａｃｈｅｌｅｋら、２００１  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６、３５６５２〜３５６５９。）アミノ酸配列の配置構造により、分泌型ＤＫＫ３とＤ２ｐ２９（以下、Ｄｋｋ３ｂと呼ぶ）はＮ末端でシグナルペプチド配列およびＮ−グリコシル化部位を含む７１個のアミノ酸が異なることが明らかとなった（図１４ａ）。他のファミリーメンバーに関する以前の研究は、分泌小胞におけるフリン依存性タンパク分解プロセシングが細胞内で観察される複数のＤＫＫ３の種の原因であることを示唆していた。（Ｎｉｅｈｒｓ、２００６  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５、７４６９〜７４８１。）しかしながら、アストロサイトにおけるフリン依存性タンパク質分解の直接分析により、約３０ｋＤａアイソフォームはより大きなＤＫＫ３タンパク質のタンパク質分解副生成物ではなかったことが明らかになった（図１４ｂ）。
【００９３】
本明細書中に開示されるように、Ｄｋｋ３遺伝子座は、Ｗｎｔ調節破壊複合体のβ−カテニン核移行のダウンストリームを直接的に阻害する第２の重大な細胞内タンパク質をコードする。
【００９４】
新たに発見されたＤｋｋ３遺伝子産物は、細胞内で最も研究されたシグナルトランスダクション経路の１つに新しい次元の調節を加えるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達軸における必須要素である。β−カテニンの核侵入に関するゲートキーパーとして、ＩＢＳは、シグナル伝達カスケードにおける近位節におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に影響する新しい治療様式の創造のための魅力的な標的であり、癌におけるこの主要経路への介入のための治療的展望を広げる。
【００９５】
ＤＫＫ３は、機能的Ｗｎｔリガンド化受容体のアセンブリを中断することによってＷｎｔ／β−カテニン経路を調節する、分泌型糖タンパク質の古くからのファミリーの誤解されたメンバーである。（Ｎｉｅｈｒｓ、２００６  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５、７４６９〜７４８１；Ｖｅｅｃｋら、２０１２  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８２５、１８〜２８。）ＤＫＫ３は明確な腫瘍サプレッサーである唯一のファミリーメンバーであり、豊富で多様な文献がＤＫＫ３、β−カテニン経路、および腫瘍抑制と関連付けている。（Ｖｅｅｃｋら、２０１２  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８２５、１８〜２８。）しかしながら、ＤＫＫ３がＷｎｔ受容体のアセンブリをブロックできないことにより、この腫瘍サプレッサーの生物学を理解するうえでの難問が提示されることになる。（Ｎｉｅｈｒｓ、２００６  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５、７４６９〜７４８１；Ｆｕｊｉｉら、２０１４  Ａｃｔａ  Ｍｅｄ  Ｏｋａｙａｍａ  ６８、６３〜７８。）Ｄｋｋ３遺伝子座が、β−カテニン輸送を直接調節する重要な細胞内タンパク質である、第二の遺伝子産物、ＩＢＳをコードすることが発見されたことにより、β−カテニンシグナル伝達経路のこの重要な成分の分子機能に関する長年の混乱が解決される。ＩＢＳは、Ｗｎｔリガンドとは無関係であり（図１１）、胚発生に必須であるβ−カテニンシグナル伝達経路における新しいレベルの調節を提供する。ＩＢＳは、Ｗｎｔ調節分解複合体の下流に位置し、そこでＩＢＳはβ−カテニンの核への輸送を調節し、β−カテニンをアクチン細胞骨格に向け直すことによってβ−カテニンをタンパク質分解から保護する能力を有する。ＩＢＳは、ミオシンモーターおよびアクチン繊維を用いて、アストロサイトの原形質膜の核周囲空間と細胞質表面との間を迅速に往復する。（Ｓｔａｃｈｅｌｅｋら、２００１  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６、３５６５２〜３５６５９；Ｓｔａｃｈｅｌｅｋら、２０００  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５、３１７０１〜３１７０７。）ＩＢＳのこの細胞内循環は、β−カテニンを細胞核の近傍からその原形質膜リザーバーに戻して再配置し、以前に認識されていなかった調節ループのアームを閉鎖することができる機能的シャトルサービスを提供し得る。Ｗｎｔ／β−カテニン経路のこの新規で必須な成分は、分化、系統指定、多能性および発癌に関与する調節経路に影響を及ぼす重要な新しい制御点を提供する、増殖前のβ−カテニンシグナル伝達分子に直接拮抗する。
【００９６】
本明細書に開示するように、ＤＫＫ３ｂはより広範に作用して、β−カテニンに加えて、ＮＦ−κＢ、ｐ３８およびＥｒｋ１／２を含む、他のβ−ＴｒＣＰ標的基質を調節する（図２３および図２４）。これは細胞内で最も研究されたユビキチン−プロテアソームシステム（ＵＰＳ）の１つに新たな調節の次元を追加する。本発明は、増殖、分化、炎症およびアポトーシス経路を含む腫瘍形成に密接に関連する細胞プロセスを停止するための新規な治療的介入を提供する。β−ＴｒＣＰ基質の分解および核侵入のモジュレーターとして、ＤＫＫ３ｂは重要な癌への介入のための新薬の創造にとって魅力的な標的である。
【００９７】
Ｎ末端細胞透過性ペプチドに融合されたＤＫＫ３ｂ、本発明者らはＴＡＴ−ＩＢＳ（別名ｃｐＩＢＳ）と称するタンパク質構築物は、プロモーター−ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されるように、β−ＴｒＣＰ標的基質の核移行に依存するプロモーター要素の活性を調節する（図２３）。Ｗｎｔ−１はＮＦ−κＢ（図２３Ａ）、β−カテニン、およびＥ２Ｆ（図２３Ｃ）転写因子タンパク質によって調節される転写を刺激する。ＴＡＴ−ＩＢＳ処理はこのＷｎｔ−１誘導刺激をブロックする。対照的に、Ｗｎｔ−１は、上皮細胞分化の２つのバイオマーカー、Ｅ−カドヘリン（図２３Ｃ）およびＥｌｆ３（図２３Ｂ）のプロモーター要素からの転写をダウンレギュレーションする。ＴＡＴ−ＩＢＳ処理はこれらの２つの上皮遺伝子転写物のＷｎｔ−１誘導抑制をブロックする。
【００９８】
ＴＡＴ−ＩＢＳは、少なくとも部分的に、細胞質マイクロフィラメントでの隔離を仲介することによって、β−ＴｒＣＰ標的基質の核移行を阻害する。本発明者らは、ＩＢＳが核の取り込みをブロックし、マイクロフィラメントに結合したβ−カテニンを増加させると同時に、全細胞含有量を安定化することを以前に示した（ＵＭＭＣ  １２−４０ＰＲ２）。本明細書に、ＮＦ−κＢ、ｐ３８およびＥｒｋ１／２タンパク質もＩＢＳ依存性複合体の細胞質マイクロフィラメントに結合することが開示される（図２）。この隔離により、これらのβ−ＴｒＣＰ標的基質の核移行が防止されるため、ＩＢＳによるβ−ＴｒＣＰ標的基質シグナル伝達のサイレンシングのための分子基盤が画定される。
【００９９】
ＴｒＣＰインヒビターは、ボルテゾミブ（デルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ））のようなプロテアソームインヒビターと比較して、毒性を低下させるがより効果的であると証明された可能性が高い。（Ｆｒｅｓｃａｓら、  ２００８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ８、４３８〜４４９。）プロテアソームインヒビターであるボルテゾミブは、多発性骨髄腫の治療に臨床的には有効であるが、有毒な副作用のため、ボルテゾミブが他の癌の適応症に広範に使用されることは制限される。ボルテゾミブのような薬物はプロテアソームによって分解されたタンパク質の大規模で非特異的なプールを安定化させるので、様々な癌の成長を停止するためにβ−ＴｒＣＰなどの特定のユビキチンリガーゼによって特異的なタンパク質のインヒビターを同定することが緊急に必要とされる。
【０１００】
開示された発明は、β−ＴｒＣＰ  Ｅ３ユビキチンリガーゼのＤＫＫ３ｂ調節に基づくユニークな治療アプローチを提供し、腫瘍ならびに炎症性の疾患および状態を治療するためのそれに基づく新規な治療剤および治療法をもたらす。また、種々のβ−ＴｒＣＰ基質の活性は、Ｄｋｋ３ｂ／ＩＢＳ治療のためのバイオマーカーまたはコンパニオン診断薬として使用することができる。例えば、ＩＢＳ治療の前および後の患者から血液細胞を採取することができる。収集した血液細胞中のＮＦ−κＢ活性を刺激するために、ＴＮＦαまたはホルボールエステル（ＰＢＡ）またはリポ多糖（ＬＰＳ）を使用することができる。治療前対治療後の比、ＮＦ−κＢ依存性細胞活性はＤＫＫ３ｂ／ＩＢＳ活性を示すことになる。
【０１０１】
さらに、本明細書には、（１）機能的腫瘍サプレッサーとして分泌されるかまたは細胞透過性線状ポリペプチドとして発現され；かつ／または（２）活性のために最小限必要なドメインを保持する、ｃｐＩＢＳおよび分泌型ｃｐＩＢＳの両方の変異体が開示される。
【０１０２】
ＤＫＫ３遺伝子座は別個の転写開始部位に由来する２つの異なる転写物から２つのタンパク質：ＤＫＫ３−未知の機能の分泌型糖タンパク質、およびＩＢＳ−β−カテニン駆動細胞増殖を調節する細胞内エフェクタータンパク質を産生することが発見された。ＩＢＳは、β−ＴＲＣＰ、ＩＢＳおよびβ−カテニンからなる阻害複合体内にβ−カテニンを捕捉することによって、β−カテニンシグナル伝達をサイレンシングする機能的遺伝子産物である。この複合体はシグナル伝達分子の核移行を防止する。重要なことに、分泌型ＤＫＫ３の発現は、癌細胞増殖またはβ−カテニンシグナル伝達に直接的な生物学的影響を及ぼさない。ＩＢＳのＮ末端に細胞透過性ドメインを融合させ、この融合タンパク質を細菌中で合成することにより、この抗癌タンパク質の治療的送達のためにＩＢＳ変異体を作り出した。折り畳まれていないタンパク質の精製により、生体外で細胞に添加するかまたはインビボで腫瘍を有するマウスに注入すると、迅速かつ選択的に癌細胞の増殖を停止させ、腫瘍細胞のアポトーシスを迅速に開始する線状ポリペプチド鎖を生じる（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１１１８）。
【０１０３】
この細胞内腫瘍サプレッサーの癌細胞の細胞質への送達は、癌細胞成長停止およびアポトーシスを達成するために不可欠である。第１の試みは、細胞透過性ペプチドの変異体−ＴＡＴを融合することによって行われた。（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、１９９９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（５４３３）：１５６９〜７２。）細菌で発現し、折り畳まれていないＴＡＴ−ＩＢＳ（ｃｐＩＢＳ）融合タンパク質の送達は、腫瘍を有するＰＤＸ−マウスにおいてヒト卵巣癌、膵臓癌および結腸癌の成長を停止させ、腫瘍壊死を引き起こした。重要なことに、ｃｐＩＢＳは３５日間を超えて投与した場合、マウスの生物学に影響を与えなかった。
【０１０４】
治療的使用に関してＩＢＳ腫瘍サプレッサーを最適化するために、全長ＩＢＳのＮ末端およびＣ末端からのドメイン欠失によって機能的ドメイン分析を行った。これにより、Ｎ末端の１２２個のアミノ酸およびＣ末端の最後の１０残基が腫瘍サプレッサー機能に必須であることが同定された。Ｃ末端の最後の１０残基へのＩＢＳ１２２の融合は完全に機能する腫瘍サプレッサーを産生した。また、更なる分析により、ａａ１２〜ａａ７０の間の残基は腫瘍サプレッサー活性に必要とされないことが判明した。
【０１０５】
さらに、細胞に入り、ＰＴＥＮシグナル伝達を調節することができる分泌型ＰＴＥＮホスファターゼの最近の同定に基づいて、膜透過性ＩＢＳの生産のための他の手段を研究した。（Ｈｏｐｋｉｎｓら、２０１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：３９９〜４０２。）シグナルペプチド配列（ＥＲ移行のためのシグナル認識粒子により認識される）および細胞透過性ポリアルギニンドメインからなる分泌型ＰＴＥＮタンパク質のＮ末端の６２残基をＩＢＳのＮ末端に融合させ、分泌型ＰＴＥＮ−ｃｐ−ＩＢＳ融合タンパク質の発現をＣＨＯ細胞で行った。ＰＴＥＮ−ｃｐ−ＩＢＳを保有するＣＨＯ細胞からの使用済み培地は、標準的なＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイでβ−カテニンシグナル伝達を完全にサイレンシングした融合ＩＢＳを１００〜２００ｐｇ／ｍＬ分泌した。
【０１０６】
前立腺癌を治療するためのアデノウイルス送達ＤＫＫ３の使用は、この分泌され、過剰発現された外因性タンパク質のＥＲストレス／ＵＰＲ（折り畳まれていないタンパク質応答）応答を開始させてウイルス感染した癌細胞のアポトーシスを生じる能力に依存する（米国特許第８，６５８，６１１号Ｂ２明細書）。分泌型ＤＫＫ３のＮ末端の７４残基も、癌細胞で過剰発現された場合に同じＥＲストレス／ＵＰＲ応答を誘発し、この変異体はＤＫＫ３ファミリーの際立った特徴のいずれかを欠く（米国特許第８，６１８，２７３号Ｂ２明細書）。ＥＲストレス／ＵＰＲ応答は、分泌型タンパク質の過剰発現の最も一般的なアーティファクトの１つである。全長分泌型ＤＫＫ３レンダリングの表現型を模写するための、任意のファミリーの特徴を欠くが、ＤＫＫ３由来の分泌シグナルの能力は、ＤＫＫ３ドメインのいずれもこの適応症に必要とされないことを示している。これはβ−カテニンシグナル伝達のＩＢＳサイレンシングの生物学とは大きく異なる。ＩＢＳは癌細胞における調節不全β−カテニンシグナル伝達をサイレンシングし、結果として、増殖停止およびＪＮＫ仲介アポトーシスを生じる。この生物学を担う分子メカニズムは知られており；ＩＢＳはβ−カテニンシグナル伝達分子の核移行を直接防止する。これは、現在の技術（米国特許第８，６５８，６１１号Ｂ２明細書および同第８，６１８，２７３号Ｂ２明細書）よりも適格で大幅な改善である。記載された新規なＩＢＳ変異体は、β−カテニンシグナル伝達のサイレンシングに必要な２つの生物学的に必須なドメインを単離することによってＩＢＳ作用のユニークな性質を改善し、身体全体にＩＢＳ治療剤を送達する手段を提供する。
【０１０７】
本発明は、分泌型の、細胞透過性ＩＢＳ融合体（ＳｃｐＩＢＳ）または折り畳まれていない線状の細胞透過性ＩＢＳタンパク質（ｃｐＩＢＳ）のいずれかの関連ファミリーを提供する。これらの２つのファミリーは、Ｎ末端融合成分が異なる。これらの分泌型の、折り畳まれたタンパク質の一般的な構成を図１に示す。
【０１０８】
最初の融合構築物は、以下の分泌シグナルペプチドおよび細胞透過性ドメインをコードする分泌型ヒトＰＴＥＮ遺伝子由来のＮ末端の６２残基から構成された：
ＳＲＰ／ＥＲで切断された                                            ＣＰ
ＮＨ２−
ＭＬＥＲＧＧＥＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＰＧＲＧＳＥＳＰＶＴＩＳＲＡＧＮＡＧＥＬＶＳＰＬＬＬＰＰＴＲＲＲＲＲＲＨＩＱＧＰＧＰＶ
１                10                   20                  30
40                  50                   60
【０１０９】
ＳＲＰ配列とｃｐドメインの間の間隔はこの第１パスでは変更されなかった。
【０１１０】
２つのＰＴＥＮ＿ｃｐ＿ＩＢＳ腫瘍サプレッサー構築物をＣＨＯ細胞で合成した。変異体１はＰＴＥＮ＿ｃｐドメインに融合した全長２８１残基長のポリペプチドからなり、変異体２は機能に必要な以下のＣ末端配列−ＡＡＡＬＬＧＧＥＥＩ停止に融合した残基１〜１２２からなるＩＢＳ短縮突然変異体である。
変異体＃
１  ＰＴＥＮ＿ｃｐ＿ＩＢＳ
２  ＰＴＥＮ＿ｃｐ＿ＩＢＳ１２２
【０１１１】
ＣＨＯ細胞を、（１）ＰＴＥＮ−ｃｐ＿ＩＢＳ（ＰｃｐＩＢＳ）および（２）ＰＴＥＮ−ｃｐ＿ＩＢＳ１２２（ＰｃｐＩＢＳ１２２）；２つの非分泌型対照、（３）ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２Ａ−ＩＢＳ  ｍＣ−ＩＢＳおよび（４）ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔ２Ａ−ＩＢＳ１２２；および不活性Ｃ末端欠失突然変異体によって分泌される２つ、（５）ＰＴＥＮ−ｃｐ＿ＩＢＳデルタＣ末およびＰＴＥＮ−ｃｐ＿ＩＢＳ１２２デルタＣ末を含む発現プラスミドでトランスフェクションした。構築物１および２は推定された機能的ＩＢＳ分子を分泌し；構築物３および４は細胞内機能性ＩＢＳを産生するが、そのタンパク質を分泌せず；構築物５および６はＣ末端の１０残基を欠くＩＢＳタンパク質を分泌する−これらは機能に必要である。
【０１１２】
ＣＨＯ細胞における個々の構築物の安定なトランスフェクションをＧ４１８選択によって準備し、Ｇ４１８非存在下での２日間の増殖期間からの使用済み培地を収集した。
【０１１３】
使用したＣＨＯ培地を、β−カテニンシグナル伝達レポーターＴＯＰＦＬＡＳＨ（Ｔｃｆ−ｆＬｕｃ）および対照（Ｅｆ１α−ＲＬｕｃ）を保有するＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞株に加え、細胞を１５ｍＭ  ＬｉＣｌで１６時間刺激した。Ｐｒｏｍｅｇａの二重ルシフェラーゼアッセイを用いて、β−カテニンシグナル伝達に対するＩＢＳの影響を評価した。全長ＩＢＳにおけるａａ２００〜ａａ２５０間のエピトープを認識するＤＫＫ３に関する市販のＥＬＩＳＡアッセイにより、使用したＣＨＯ培地中に存在する１００〜１５０ｐｇ／ｍｌのＰＴＥＮ−ｃｐ＿ＩＢＳが明らかとなった。（図２）
【０１１４】
（１）ＳＲＰ、（２）ｃｐおよびＩＢＳ間の最適距離は、（複数の）融合構築物を保有するＣＨＯ細胞についての使用済み培地のＥＬＩＳＡおよび終点としてＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイによって決定される分泌収率を使用して決定される。
【０１１５】
更なる研究により、ＩＢＳの最初の１０残基も機能に必要であることが示される。残基１１〜６０はランダムコイル：α−ヘリックス；β−プリーツシート形態を有することが予測され、突然変異ＩＢＳの生物活性を変化させることなくそれらが除去／置換または短縮され得ることが示唆される。使用されるＮドメイン突然変異体のファミリーを図３に列挙する。
【０１１６】
天然のＰＴＥＮ要素の代わりに、代替えのＳＲＰおよびｃｐドメインを使用することができる。ＳＲＰドメインは、全ての分泌タンパク質に共通する。同様に、ＰＴＥＮ中のポリアルギニンｃｐドメインは、ｃｐＩＢＳ変異体で使用される最適化された合成ｃｐ要素と交換することができる（下記参照）。
【０１１７】
これらの分泌型の、折り畳まれたタンパク質の一般的な構成を図４に示す。
【０１１８】
ｃｐ＿ＩＢＳ腫瘍サプレッサー構築物の変異体８は、６Ｈｉｓエピトープタグ−ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＧ−からなる５５残基長の合成ｃｐドメインに融合された全長２８１残基長のポリペプチドからなり、変異体２は機能に必要な以下のＣ末端配列−ＡＡＡＬＬＧＧＥＥＩ停止に融合した残基１〜１２２からなるＩＢＳ短縮変異体である。（図５）
【０１１９】
１つの態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達の単離された組換えヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体に関する。
【０１２０】
別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体を含む融合タンパク質に関する。
【０１２１】
さらに別の態様において、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達の単離された組換えヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質で形質転換された宿主細胞に関する。
【０１２２】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
【０１２３】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスに関する。
【０１２４】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え導入遺伝子に関する。
【０１２５】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
【０１２６】
さらに別の態様において、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
【０１２７】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【０１２８】
さらに別の態様において、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
【０１２９】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【０１３０】
本明細書中に開示される方法によって治療され得る癌は、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌からなる群から選択することができる。
【０１３１】
特定の好ましい実施形態において、治療される前記癌または腫瘍は卵巣癌または卵巣の腫瘍である。
【０１３２】
特定の好ましい実施形態では、治療される前記癌または腫瘍は膵臓癌または膵臓の腫瘍である。
【０１３３】
特定の好ましい実施形態において、癌を治療するための本明細書に開示される方法はさらに前記対象に第２の活性抗腫瘍剤を含む医薬組成物を投与することを含む。
【０１３４】
前記第２の活性抗腫瘍剤は小分子、化学療法剤、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、抗体、抗体−薬物複合体、アプタマーまたは核酸分子であってもよい。
【０１３５】
特定の実施形態では、前記第２の活性抗腫瘍剤は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞ベースの療法剤、所望のＣＡＲを安定して発現するように遺伝子改変されたＴ細胞である。（例えば、国際公開第２０１２／０７９０００号Ａ１パンフレット、米国特許出願公開第２０１５／０２８３１７８号Ａ１明細書を参照）。
【０１３６】
特定の実施形態では、前記核酸分子は一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ、ならびにその誘導体または類似体から選択される。特定の実施形態では、前記核酸分子はｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、プラスミド、およびそれらの誘導体または類似体から選択される。
【０１３７】
特定の実施形態では、前記第２の活性抗腫瘍剤はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ベースの療法剤、例えば、ヒト細胞内でタンパク質を産生する身体の自然過程を引き起こすヌクレオチドまたはその類似体からなるｍＲＮＡである。（例えば、米国特許出願第２０１４／０１４７４３２号Ａ１明細書、米国特許出願第２０１４／０１０７１８９号Ａ１明細書を参照。）
【０１３８】
用語「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、ミレニアム・ファーマ．）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、アストラゼネカ）、Ｓｕｔｅｎｔ（ＳＵ１１２４８、ファイザー）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、ノバルティス）、イマチニブメシレート（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、ノバルティス）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（ノバルティス）、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）、サノフィ）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、グラクソ・スミスクライン）、ロナファルニブ（Ｌｏｎａｆａｒｎｉｂ）（ＳＣＨ  ６６３３６）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）およびゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、アストラゼネカ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、アルキル化剤、例えばチオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラティスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロランブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化塩酸メクロレタミン、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマール（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ  ｇａｍｍａｌｌ）およびカリケアマイシンオメガール（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．（１９９４）３３：１８３〜１８６）；ジネマイシンＡ���含む、ジネマイシン；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６‐  ジアゾ‐  ５‐  オキソ‐  Ｌ‐  ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）、モルフォリノ‐  ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソニビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリーボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、プロマイシン、キラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えばメトトレキサートおよび５‐  フルオロウラシル（５‐  ＦＵ））；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアムニプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカロテストロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；レゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；
２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州プリンストン）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（クレモフォールを含まない）、パクリタキセルのアルブミン処理ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、シャウムベルク、１１１。）およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル；Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、アントニー、仏国）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）（ビノレルビン）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロミチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；上記の任意の薬学的に受容し得る塩、酸または誘導体が含まれる。
【０１３９】
特定の実施形態では、前記第２の抗腫瘍剤は抗体、一本鎖抗体、標的細胞に特異的に結合する抗体断片、モノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、標的細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体断片、キメラ抗体、標的細胞に特異的に結合するキメラ抗体断片、ドメイン抗体、標的細胞に特異的に結合するドメイン抗体断片、リンホカイン、ホルモン、ビタミン、成長因子、コロニー刺激因子、または栄養輸送分子である。あるいは、細胞結合剤はモノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、または標的細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体断片である。
【０１４０】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において腫瘍抑制効果を誘導する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【０１４１】
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質による腫瘍抑制治療に対する癌の患者の感受性を確立する方法に関する。
【０１４２】
特定の好ましい実施形態では、β−カテニンシグナル伝達のインヒビターまたはその融合タンパク質による腫瘍抑制治療のために評価される癌は、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌からなる群から選択される。
【０１４３】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にヒトＤＫＫ３ｂタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。治療され得る前記癌または腫瘍の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌が含まれる。
【０１４４】
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において炎症性の疾患または状態を治療する方法であって、前記対象にヒトＤＫＫ３ｂタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【０１４５】
さらに別の態様では、本発明は、概して、癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害するための使用に適した医薬組成物であって、ヒトＤＫＫ３ｂタンパク質および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物に関する。
【０１４６】
さらに別の態様では、本発明は、概して、炎症性の疾患または状態を治療するための使用に適した医薬組成物であって、ヒトＤＫＫ３ｂタンパク質および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物に関する。
【０１４７】
本明細書中に開示される組成物および方法で治療され得る炎症性の疾患または状態には、当該分野で既知の炎症またはアレルギープロセスによって特徴付けられる任意の疾患または状態が含まれ、例えば炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸器疾患、アテローム性動脈硬化症、乾癬、皮膚炎、再狭窄、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症性ショック、関節リウマチ、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、疼痛、眼の炎症性疾患、セリアック病、リー症候群、グリセロールキナーゼ欠損症、家族性好酸球増加症、常染色体劣性痙性運動失調症、咽頭の炎症性疾患、結核、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、珪肺症および他の塵肺症他が挙げられる。
【０１４８】
さらに、本明細書に開示される方法または組成物によって影響され得る疾患および状態のリストを表３に示す。
（表３）
表３．
加齢                          Chungら、2002;Adlerら、2007;Csizarら、2008
アレルギー                    Cousinsら、2008
頭痛                          Reuterら、2003
疼痛                          Tegederら、2004;Niederberger&Geisslinger、2008
複雑な局所疼痛症候群          Hettneら、2007
心臓肥大                      Purcell&Molkentin、2003;Freundら、2005;Sen&Roy、
2005
筋ジストロフィー（２Ａ型）    Baghdiguianら、1999
筋肉疲労                      Hasselgren、2007
異化障害                      Holmes-McNary、2002
糖尿病、１型                  Ho&Bray、1999;Eldorら、2006
真性糖尿病、２型              Yuanら、2001;Lehrkeら、2004;Chen、2005
肥満                          Gilら、2007
胎児の成長遅延作用            Mammonら、2005
高コレステロール血症          Wilsonら、2000
アテローム性動脈硬化症        Rossら、2001;Li&Gao、2005
心臓疾患                      Valenら、2001
慢性心不全                    Frantzら、2003;Gongら、2007
虚血／再灌流                  Toledo-Pereyraら、2004;Nichols、2004; Ridder&
Schwaninger、2008
ストローク                    Herrmannら、2005
脳動脈瘤                      Aokiら、2007;2009
狭心症                        Ritchie、1998
肺疾患                        Christmanら、2000
嚢胞性線維症                  Pollardら、2005;Carrabinoら、2006;Rottnerら、2007
酸誘発性肺傷害                Madjdpourら、2003
肺高血圧                      Sawadaら、2007
慢性障害肺疾患（ＣＯＰＤ）    Barnes、2002;Rahman&Kilty、2006
ヒアリン膜疾患                Cheahら、2005
腎臓病                        Guijarro&Egido、2001;Camici、2006;Guzik&Harrison、
2007
糸球体疾患                    Zhengら、2005
アルコール性肝疾患            Zima&Kalousova、2005
レプトスピラ症腎臓病          Yangら、2001
腸疾患                        Neurathら、1998
腹膜子宮内膜症                Gonzalez-Ramosら、2007
皮膚疾患                      Bellら、2003
鼻腔炎                        Xuら、2006
無汗性外胚葉異形成−ＩＤ      Puelら、2005
ベーチェット病                Todaroら、2005
色素失調症                    Courtois&Israel、2000
結核                          Zeaら、2006
喘息                          Pahl&Szelenyi、2002
関節炎                        Roshakら、2002;Roman-Blas&Jimenez、2006;Aud&Peng、
2006;Okamoto、2006
クローン病                    Pena&Penate、2002
大腸炎（ラット）              Chenら、2005
眼性アレルギー                Bieloryら、2002
緑内障                        Zhouら、2005
虫垂炎                        Penningtonら、2000
パジェット病                  Linら、2007
膵炎                          Weber&Adler、2001;Grayら、2006
歯周炎                        Nicholsら、2001;Ambiliら、2005
子宮内膜症                    Guo、2006;Celikら、2008
炎症性腸疾患                  Dijkstraら、2002;Atreyaら、2008
炎症性肺疾患                  Park&Christman、2006
敗血症                        Wrattenら、2001;Abraham、2003
シリカ誘発性                  Chen&Shi、2002
睡眠時無呼吸                  Lavie、2003
ＡＩＤＳ（ＨＩＶ−１）        Hiscottら、2001
自己免疫                      Hayashi&Faustman、2000;Bacher&Schmitz、2004
抗リン脂質症候群              Lopez-Pedreraら、2005
狼瘡                          Kammer&Tsokos、2002;Okamoto、2006;Oikonomidouら、
2007
ループス腎炎                  Zhengら、2006、2008
慢性疾患症候群                Maesら、2007
家族性地中海熱                Onen、2005
遺伝性周期性熱症候群          Jeruら、2008
心理社会的ストレス疾患        Bierhausら、2004
神経病理学的疾患              Cechetto、2001;Mattson&Camandola、2001;
Pizzi&Spano、2006
家族性アミロイド性多発ニューロパシー、炎症性ニューロパチー    Mazzeoら、2004
外傷性脳傷害                  Hangら、2005
脊髄損傷                      Brambillaら、2005
パーキンソン病                Soosら、2004、Mogiら、2006
多発性硬化症                  Satohら、2007
リウマチ性疾患                Okamoto、2006;Greethamら、2007
アルツハイマー病              Mattson&Camandola、2001;Collister&Albensi、2005
筋萎縮性側索硬化症            Xuら、2006
ハンチントン病                Khoshnanら、2004
網膜疾患                      Kitaokaら、2004
白内障                        Yang、2006
聴力損失                      Merchantら、2005;Langら、2006
癌                            Gilmoreら、2002;Karinら、2002:Leeら、2007
（http://www.bu.edu/nf-kb/physiological-mediators/diseases/を参照）
【０１４９】
任意の適切な投与経路、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、脳室内、体内、腹腔内、直腸または経口投与を用いることができる。特定の患者のための最も適切な投与手段は、治療される疾患または状態の性質および重症度、または使用される治療の性質および活性化合物の性質に依存することになる。
【０１５０】
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれる。このような固体剤形では、本明細書に記載の化合物またはその誘導体は、少なくとも１つの不活性慣用賦形剤（または担体）、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、または（ｉ）充填剤または増量剤、例えばデンプン、乳糖、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、（ｉｉ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア、（ｉｉｉ）湿潤剤、例えば、グリセロール、（ｉｖ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（ｖ）溶液遅延剤、例えば、パラフィン、（ｖｉ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、（ｖｉｉ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、（ｖｉｉｉ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに（ｉｘ）滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤および丸剤の場合、前記剤形は緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体組成物も、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いて、軟質および硬質ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒剤などの固体剤形は、腸溶コーティングおよび当技術分野で公知の他のものなどのコーティングおよび外殻を用いて調製することができる。
【０１５１】
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容し得るエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。前記活性化合物に加えて、前記液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤などの当該分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでいてもよく、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物などが挙げられる。そのような不活性希釈剤に加えて、前記組成物は湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、または芳香剤などの追加の薬剤を含むこともできる。
【０１５２】
本明細書中に開示された材料、組成物、および成分は、開示された方法および組成物のために使用され得るか、それらと共に使用され得るか、それらの調製に使用され得るか、またはそれらの生成物であり得る。これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個体および集合的な組合せおよび置換の具体的な参照は明示的に開示されない可能性があるが、本明細書でそれぞれが具体的に考慮されかつ記載されていることが理解される。例えば、ある方法が開示され、論じられ、その方法において含まれる多数の分子に対してなされ得る多数の変更が論じられる場合、具体的にそれとは逆に指示されない限り、前記方法のそれぞれの全ての組み合わせおよび置換、および可能な変更が具体的に考慮される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に考慮されかつ開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法におけるステップを含むが、これらに限定されない、本開示の全ての態様に適用される。したがって、実行可能な追加のステップが多岐に渡る場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示された方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせで実行され得ること、およびそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットのそれぞれが具体的に考慮されており、開示されているとみなされるべきである。
【実施例】
【０１５３】
Ｄｋｋ３ｔｍ１Ｃｎｉ突然変異マウスを、生物学的に重要なＣｐＧアイランドを有しかつ分泌型ＤＫＫ３のシグナルペプチド配列およびＮ−グリコシル化部位を含むＮ末端の７１アミノ酸をコードするＤｋｋ３遺伝子のエクソン２を破壊することによって発生させた（図６ａ）。（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２００２  Ｇｅｎｅ  ２８２、１５１〜１５８；Ｌｏｄｙｇｉｎら、２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、４２１８〜４２２７；Ｓａｔｏら、２００７  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２８、２４５９〜２４６６。）対照の野生型脳膜は両方のＤＫＫ３アイソフォームを有しており、グリコシル化ＤＫＫ３は存在する全ＤＫＫ３の約７５％であり、ＤＫＫ３ｂは約２５％であった（図６ｂ、図１４ｂ）。
【０１５４】
ＤＫＫ３ｔｍ１Ｃｎｉマウス由来の脳膜は、エクソン２の標的突然変異に起因するグリコシル化ＤＫＫ３の予想された消失を示した。しかしながら、ＤＫＫ３ｂは存在するだけでなく約２倍増加し（図６ｂ）、より小さな３０ｋＤａアイソフォームは、より大きなＤＫＫ３のタンパク質分解断片ではなく、エクソン２におけるＣｐＧアイランドのエピジェネティックな修飾がＤＫＫ３ｂ発現に影響を与え得る可能性を高めたことが確認された。
【０１５５】
転写物分析により、ＤＫＫ３ｂがより長いＤＫＫ３遺伝子産物とは異なるｍＲＮＡによってコードされ、Ｄｋｋ３遺伝子のイントロン２内に位置するプロモーターによってドライブされることが確認された。ＤＫＫ３ｂのイニシエータメチオニンは、カエルからヒトまでの脊椎動物Ｄｋｋ３遺伝子のエクソン３における最初のコドンであり、６ｋｂまでのイントロンでエクソン２から分離されている（図６ａ）。ラットアストロサイトＤｋｋ３  ｍＲＮＡのエクソン特異的ｑＰＣＲは、全ての転写物がエクソン３コドンを含むが、これらの転写物の約６０％のみがエクソン２コドンを有することを示した（図１５）。Ｄｋｋ３ｔｍ１Ｃｎｉマウス脳由来の全ＲＮＡは、エクソン３コドンを有する容易に検出可能なＤｋｋ３転写物を示したが、エクソン２コドンを有するＤｋｋ３転写物を欠いていた（図６ｃ）。
【０１５６】
Ｄｋｋ３ｔｍ１Ｃｎｉ突然変異マウスはＤｋｋ３遺伝子のイントロン２の全てを保持し、エクソン３からの転写を開始することができる潜在的な転写調節要素を、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって同定した。強力なプロモーター活性がイントロン２に見出され、漸進的な欠失研究で、エクソン３に隣接する２５０ヌクレオチドに機能的プロモーター（ＴＳＳ２）を配置した（図６ｄ）。プロモーター活性に必要なＴＡＴＡボックスは、ラットＤｋｋ３遺伝子のエクソン３から−３５ヌクレオチド５’に位置した（図６ｄ）。マウスおよびヒトのＤｋｋ３遺伝子において、推定上のＴＡＴＡボックス要素はエクソン３から−９０ヌクレオチドに位置する。ラットアストロサイトＤＮＡのクロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）により、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩに結合したＤｋｋ３遺伝子中のＴＳＳ２（図６ｅ）およびアストロサイトにおけるＴＳＳ２での第２の転写開始前複合体の形成を示すＴＢＰが示された。このＴＳＳ２はｍＲＮＡの転写を開始し、エクソン３はその最初のコードエクソンであり、得られた転写物はＥＲ内在化、グリコシル化および分泌に必要なドメインを欠く約３０ｋＤａの細胞内タンパク質（ＤＫＫ３ｂ）をコードする。
【０１５７】
Ｄｋｋ３ｂはインビボでのＤｋｋ３遺伝子機能を担う
ＤＫＫ３ｂの生物学的意義を、人工ヌクレアーゼおよび相同組換えを用いた標的遺伝子編集によってマウスで評価した。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ、図１６ａ、ｂ）を用いて、Ｄｋｋ３遺伝子のＴＳＳ２とエクソン３の間にｌｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）レポーターを挿入した（ＨＲ、図１７）。（Ｇｕｐｔａら、２０１２  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９、５８８〜５９０。）イントロン２のこの破壊は、ＴＳＳ１駆動（ｄｒｉｖｅｎ）ＤＫＫ３発現を維持するが、ホモ接合動物におけるＤＫＫ３ｂの選択的機能欠損をもたらすはずのＣＦＰレポーターに続くＴＳＳ２駆動転写を終結させる。マウス胚における適用の前に、ＺＦＮ仲介ドナーＤＮＡ挿入の効率を、Ｃｅｌ−Ｉアッセイおよび一本鎖オリゴヌクレオチドの組換え相同修復（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｐａｉｒ）を用いてＣ５７Ｂｌ／６ｊマウスから単離した不死のＣ８Ｄ１Ａ細胞で検証した（データは示さず）。ＣＦＰ  ＨＲカセットのＺＦＮ仲介挿入は、不死化Ｃ８Ｄ１Ａ細胞株においてＣＦＰの弱い発現をもたらし、Ｄｋｋ３遺伝子座での（複数の）ＣｐＧアイランドの過剰メチル化によってＤｋｋ３発現はサイレンシングされる（図７ａ）。（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２００２  Ｇｅｎｅ  ２８２、１５１〜１５８；Ｔｓｕｊｉら、２０００  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６８、２０〜２４；Ｘｉａｎｇら、２０１３  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７、１２３６〜１２４６。）遺伝子編集Ｃ８Ｄ１Ａｃｆｐ／＋レポーター細胞においてＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性が阻害された場合、ＣＦＰ発現は＞５倍増加し、Ｄｋｋ３ｂ発現に関してＴＳＳ２駆動ＣＦＰ置換が実証される（図７ａ）。
【０１５８】
ＺＦＮＤｋｋ３ｂ  ｍＲＮＡおよび線状ＨＲドナーＤＮＡをＣ５７Ｂ１６マウス受精卵に注入して、Ｄｋｋ３ｂノックインマウスを作製した。１つの細胞胚を注入した６５匹のうち３５匹（５４％）が生存仔を産み、ＨＲ修復標的遺伝子座を囲む約３．２ｋｂのＤｋｋ３遺伝子のＤＮＡ配列決定により、３つのファウンダー（８．６％）が保存された天然のスプライスジャンクションを有するＤｋｋ３遺伝子のエクソン３から上流のｌｏｘＰに挟まれたＣＦＰレポーターが挿入された３５ヌクレオチドを有していたことが確認された（図１７ｂ、ｃ）。野生型の雄のＤｋｋ３ＣＦＰ／＋雌への交配からのＦ１子孫（ファウンダー＃１９）は、単一の分離対立遺伝子に特徴的なメンデル遺伝様式を示した（図７ｂ）。ファウンダー＃１９において１０の最も高い可能性で予測された候補標的部位についてオフターゲット突然変異は見出されなかった（図１４、表２）。（Ｆｉｎｅら、２０１４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２、  ｅ４２。）ＴＳＳ２駆動ＣＦＰは、Ｄｋｋ３ＣＦＰ／＋マウス全体にわたって発現され（図７ｃ）、Ｄｋｋ３遺伝子のＴＳＳ２活性の遍在性を示した。
【０１５９】
生存ホモ接合Ｄｋｋ３ＣＦＰ／ＣＦＰ子孫が産まれなかったため、ＤＫＫ３ｂは胚生存に必須である。ＤＫＫ３ｂの発現が胚移植の前またはその近くで生存に必須であることを示す４．５日（ｎ＝１７の胚）の早期にホモ接合Ｄｋｋ３ＣＦＰ／ＣＦＰ胚は見出されなかった。この結果はＤｋｋ３ｔｍ１Ｃｎｉマウスのものと著しく異なり、Ｄｋｋ３ｂ転写物を生成する少なくとも１つの野生型Ｄｋｋ３対立遺伝子が生存に必要であることが示される（図７ｂ）。単一の分離Ｄｋｋ３ＣＦＰ対立遺伝子に対する致死的表現型の浸透度が、ＣＤ１バックグラウンドのアウト・クロスで確認された（図７ｂ）。Ｄｋｋ３ＣＦＰ突然変異の致死的表現型は、Ｄｋｋ３遺伝子座に残った単一の３４ｂｐのｌｏｘＰ認識部位を残して、未受精卵母細胞におけるｌｏｘＰに挟まれたＣＦＰカセットを切除するＳｏｘ２プロモーター駆動Ｃｒｅリコンビナーゼによって取り出された（図１８）。（Ｈａｙａｓｈｉら、２００２  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ２、９３〜９７；Ｈａｙａｓｈｉら、２００３  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３７、５１〜５３。）Ｄｋｋ３デルタＣＦＰ／＋をＤｋｋ３ＣＦＰ／＋と交配させることにより、２対立遺伝子の遺伝子編集Ｄｋｋ３デルタＣＦＰ／ＣＦＰ子孫が得られ（図１８）、胚の致死率は（複数の）密接に連結したｃｉｓ遺伝子欠陥ではなく、ＤＫＫ３ｂ発現の喪失に直接起因することが確認された。
【０１６０】
Ｄｋｋ３ＣＦＰ／＋マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の生体外遺伝子編集により、Ｄｋｋ３ｂ発現の選択的破壊が確認された。２回目のＺＦＮ開始のＨＲ修復により、ＣＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの両方を発現する細胞を用いてＴＳＳ２  Ｄｋｋ３遺伝子座での２対立遺伝子突然変異を生じるＤｋｋ３ＣＦＰ／＋  ＭＥＦの野生型Ｄｋｋ３の対立遺伝子にｍＣｈｅｒｒｙレポーターを導入した。ＦＡＣＳ単離Ｄｋｋ３ＣＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ  ＭＥＦは約６５ｋＤａのグリコシル化ＤＫＫ３タンパク質を発現したが、３０ｋＤａのＤＫＫ３ｂを欠いていた（図１９ａ）。エクソン特異的ｑＰＣＲは、分泌型Ｄｋｋ３転写物の発現およびＤｋｋ３ｂ転写物の選択的欠損を確認した（図１９ｂ）。ＤＫＫ３ｂ欠乏Ｄｋｋ３ＣＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ細胞におけるβ−カテニン依存性ｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＤ１発現の検討により、ｃ−Ｍｙｃ  ｍＲＮＡの８８倍の増加およびサイクリンＤ１  ｍＲＮＡの１６０倍の増加が示された（図１９ｃ）。これらのデータにより、遺伝子編集戦略（ｉ）細胞内ＤＫＫ３ｂの発現を選択的に排除したこと；（ｉｉ）分泌型ＤＫＫ３の発現を保存したこと；および（ｉｉｉ）β−カテニン依存性遺伝子発現の劇的な増加をもたらしたことが確認される。Ｄｋｋ３遺伝子座のこの独特の細胞内遺伝子産物をその分泌形態（ＤＫＫ３）から区別し、そのβ−カテニン経路への機能的影響を確認するために、このタンパク質にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビター（ＩＢＳ）という名称を付ける。
【０１６１】
ＩＢＳはβ−カテニンシグナル伝達を調整する
ＩＢＳとＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の関係を、細胞増殖、プロモーター駆動レポーターアッセイ、および細胞移動分析によって定義した。Ｔｅｔ誘導性ＩＢＳまたはＤＫＫ３構築物の限定された抗生物質誘導を用いて、過剰発現の不都合な影響を回避した。ＩＢＳは細胞周期のＧ０／Ｇ１期（図８ｂ）でＰＣ３細胞増殖を停止させ（図８ａ）、誘導の２４〜３６時間までにＩＢＳ発現細胞をほぼ完全に消失させた（図８ａ）。以前の過剰発現研究とは異なり、制御されたＤＫＫ３発現はＰＣ３細胞増殖の速度を変化させなかった（図８ａ、ｂ）。（Ｖｅｅｃｋら、２０１２  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８２５、１８〜２８；Ｈｓｉｅｈら、２００４  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３、９１８３〜９１８９；Ａｂａｒｚｕａら、２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、９６１７〜９６２２；Ｅｄａｍｕｒａら、２００７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １４、７６５〜７７２。）
【０１６２】
癌細胞におけるＤＫＫ３の過剰発現は、ｃ−Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）仲介アポトーシスを開始させる。（Ａｂａｒｚｕａら、２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、９６１７〜９６２２；Ｋａｗａｓａｋｉら、２００９  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６、６５〜７２。）ＩＢＳとＪＮＫインヒビター、ＴＡＴ−ＪＢＤを、それぞれＴＡＴ融合タンパク質およびペプチドとしてＰＣ３細胞に導入し、３日後に細胞増殖を測定した。（Ｐａｉｎら、２００８  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２４３、１２４〜１３７。）ＴＡＴ−ＩＢＳは増殖を停止させ、初期細胞集団の＞７５％の消失をもたらしたが（図８ｃ）、ＴＡＴ−ＩＢＳと共にＪＮＫインヒビターを添加することにより、ＩＢＳ誘発増殖停止を変化させることなく細胞消失を防いだ（図８ｃ）。ＴＡＴ−ＩＢＳ処理細胞では切断カスパーゼ３のプロアポトーシスレベルが上昇し、この増加はＪＮＫ活性の阻害によってブロックされた（図８ｄ）。これらのデータにより、ＩＢＳがＤｋｋ３遺伝子座に事前に関連する抗増殖活性およびプロアポトーシス活性を有することが実証される。（Ｖｅｅｃｋら、２０１２  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８２５、１８〜２８；Ａｂａｒｚｕａら、２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、９６１７〜９６２２。）
【０１６３】
次いで、不死化ＨＥＫ２９３細胞において、基本細胞増殖およびＷｎｔ刺激細胞増殖に対するＩＢＳの影響を調べた（図９ａ）。基本細胞増殖はＩＢＳに影響されなかったが、３日間の実験期間中のＷｎｔ刺激細胞増殖は、ＩＢＳの量を増加しながら過渡的にトランスフェクトした細胞において徐々に減速した（図９ｂ）。ＴＡＴ−ＩＢＳによるより強いサイレンシングは、このレギュレーターの細胞単層への普遍的な送達の可能性が高い。試験した最高濃度では、ＴＡＴ−ＩＢＳは、基本細胞増殖を変えることなくＷｎｔ刺激細胞増殖を完全に排除した（図９ｂ）。
【０１６４】
一次および下流プロモーター−ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、ＩＢＳとβ−カテニン駆動遺伝子発現との相互作用を調べた。細胞をＷｎｔ１およびプロモーター駆動ルシフェラーゼ構築物で同時トランスフェクションし、ＴＡＴ−ＩＢＳで２４時間処理した。ＷｎｔはＴｃｆ−ルシフェラーゼレベルで６５倍の増加を刺激し、ＴＡＴ−ＩＢＳはこの標準的なβ−カテニンレポーターの発現を完全に阻止した（図９ｃ）。細胞接着（ＥＣａｄ）を低下させ、細胞周期の進行（Ｅ２Ｆ）を促進する２つの下流のβ−カテニン調整経路を調整するＩＢＳの能力も調べた。ＷｎｔはＥ−Ｃａｄプロモーター活性を９０％抑制し、ＩＢＳはＷｎｔ依存性サイレンシングを逆転させ、プロモーター活性を基本レベルまで回復させた（図９ｃ）。（Ｊａｍｏｒａら、  ２００３  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２、３１７〜３２２；Ｌｉら、２００７  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６、６１９４〜６２０２。）同様に、ＷｎｔはＥ２Ｆプロモーター活性を６倍増加させ、ＩＢＳはＥ２Ｆプロモーターをベースラインまで低下させた（図９ｃ）。運動性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いて、β−カテニン依存性細胞移動に対するＩＢＳの効果を調べた。ＩＢＳは悪性細胞移動を＞６０％遅らせた（図９ｄ）。まとめると、これらのデータにより、ＩＢＳはβ−カテニンシグナル伝達の複数の局面を調整することが示される。
【０１６５】
ＩＢＳはβ−カテニンの核移行をブロックする
悪性細胞を用いて行った生体外研究により、ＩＢＳ作用の分子メカニズムに対する重要な手がかりがもたらされた。ＤＫＫ３の過剰発現は核関連β−カテニンを減少させ、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、ＤＫＫ３がβ−カテニンに結合するＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼサブユニットである細胞質βＴｒＣＰと相互作用することが見出された。（Ｌｅｅら、２００９  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２４、２８７〜２９７；Ｙｕｅら、２００８  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２９、８４〜９２。）細胞内ＩＢＳの発見に先立ち、β−カテニン輸送に影響を与える細胞質複合体を形成することができるＤＫＫ３エフェクターは知られていなかった。
【０１６６】
外因性のエピトープ標識ＩＢＳ、βＴｒＣＰおよびβ−カテニンの構成的に活性なＳ３３Ｙ変異体を用いて共沈研究を行った（図１０ａ）。βＴｒＣＰおよびＩＢＳの両方がＦｌａｇ−Ｓ３３Ｙβ−カテニンと共沈降したが、対照ＩｇＧ沈殿物はエピトープ標識標的を欠いていた（図１０ｂ）。Ｍｙｃ−βＴｒＣＰ免疫沈降物も、Ｓ３３Ｙβ−カテニンおよびＩＢＳを含み、ＨＡ−ＩＢＳ免疫沈降物は、Ｓ３３Ｙβ−カテニン、およびβＴｒＣＰを含んでいた（図１０ａ）。３つのパートナーのうちの２つだけがＨＥＫ２９３細胞で発現された場合、相互作用は観察されなかった（図１０ｂ〜ｄ）。ＨＡ−ＩＢＳ発現細胞において、抗ＨＡ免疫複合体は、天然の非リン酸化β−カテニンを沈降させたが、リン酸化β−カテニンまたはＧＳＫβを沈降させず、ＩＢＳが破壊複合体の成分ではなかったこと（図１０ｅ）および核輸送に向けられるβ−カテニンはＩＢＳ：βＴｒＣＰ複合体と相互作用したことが示された。
【０１６７】
核β−カテニンレベルに対するＩＢＳ：βＴｒＣＰ：β−カテニン複合体の生物学的影響を、天然ＩＢＳを欠くＨｅＬａ細胞およびＳＯＡＳ−２細胞で評価した。（Ｎｉｅｈｒｓ、２００６  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５、７４６９〜７４８１；Ｓａｔｏら、２００７  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２８、２４５９〜２４６６。）細胞をＧＳＫ３インヒビター、ＬｉＣｌ、および核画分、細胞質ゾル画分およびマイクロフィラメント画分に分離された細胞溶解物で刺激した。ＬｉＣｌ刺激により、細胞質および核におけるβ−カテニンの予想される蓄積がもたらされた（図１０ｆ）。短期間のＩＢＳ置換は、β−カテニンの総細胞含量をほぼ３倍増加させ、細胞質レベルおよび核レベルの両方を減少させ、マイクロフィラメントにβ−カテニンを再分布させた（図１０ｄ）。ＩＢＳはＳＯＡＳ−２細胞におけるアクチン細胞骨格の構成に影響を及ぼさない。核β−カテニンのＩＢＳ依存性喪失は、ＩＢＳ置換後３０分以内に迅速に始まり、最大抑制に６０分で達した。ＩＢＳで抑制された核β−カテニンレベルは、未処理の対照の約３分の１で３時間維持された（図１０ｇ）。したがって、ＩＢＳ：βＴｒＣＰと非リン酸化β−カテニンとの間に形成される阻害複合体は、核の輸送を中断し、ＩＢＳによるβ−カテニンシグナル伝達のサイレンシングのための分子基盤を規定する。
【０１６８】
分泌型ＳｃｐＩＢＳの一般化
最初の研究は、分泌型ＰＴＥＮタンパク質から「借りた」ＳＲＰ−ｃｐの使用に基づいていた。より一般的な事例では、本発明者らは、ＥＲ膜においてＳＲＰ受容体（トランスロコン）と係合する任意の分泌認識ペプチドドメインが、分泌のためにＥＲ膜を横切って成長するポリペプチド鎖を移動させるために必要とすることに気付いた。さらに、本発明者らは、静電的相互作用によって融合タンパク質を細胞表面に「付着させる」ために必要な細胞透過性ドメイン−ポリカチオン性α−ヘリックス−を一般化できることに気付いた。さらに、本発明者らは、精製エピトープタグ−６ｈｉｓ−およびこれらの精製助剤を除去するための酵素切断部位を兼ねるＦＬＡＧエピトープを含めた。ＳｃｐＩＢＳの一般的な構成を図２０に図示する。
【０１６９】
アズロシジン（カチオン抗菌タンパク質ＣＡＰ３７またはヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）および実験室のＭＴＤ細胞透過性ドメイン由来のＳＲＰを用いて、原理の証明を行った。
【０１７０】
データは、ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイの結果を示す。ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター細胞を、３つの異なる分泌型ＳｃｐＩＢＳを発現するＣＨＯ細胞からの馴化培地で１６時間、ＬｉＣｌの存在下で処理した。データは８回の反復の平均±ＳＥである。
【０１７１】
図２１の概略図は、ＩＢＳタンパク質の必須ドメインの蓄積された突然変異／欠失／短縮評価を表す。全ての突然変異／欠失／短縮を、Ｔ２Ｃ要素による自己切断可能なレポーターとしてＮ末端に結合させたｍＣｈｅｒｒｙまたはＧＦＰのいずれかとの共シストロン構築物としてｐｃＤＮＡ３発現ベクターに挿入した。ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター細胞中で一時的にトランスフェクションされると、核局在化蛍光タンパク質および細胞質ＩＢＳ突然変異体が単一の転写産物から産生される。２つのタンパク質は翻訳中に分離する。
【０１７２】
ＩＢＳ分子は、４つの異なる機能的ドメインを有する。
機能に必要とされる２０残基長のＮ末端。
機能に必要とされるＮ１の５０残基長のシステインリッチドメイン。
Ｃ１の約７０残基長のシステインリッチドメインは、機能を変えることなく排除することができる。
機能に必要とされる２０残基長のＣ末端。
【０１７３】
チャートはボックス内にドメインをマッピングし、システイン残基を黒色、緑色または白色バーとして、コネクタによって推定ジスルフィド架橋を示し、赤色でＮ末端およびＣ末端での負に荷電したキー残基を示す。
【０１７４】
Ｎ１  Ｃｙｓ突然変異はアラニンまたはアスパラギン酸のいずれかに変異したシステイン残基を選択した。ジスルフィド架橋は突然変異によるベータカテニンシグナル伝達のサイレンシングに影響を与えずに排除された。
【０１７５】
Ｅ−Ｇ変異体
最も端にあるＮ末端で３つのグルタミン酸突然変異体をグリシンに突然変異させた。これはＩＢＳ分子を不活性化した。
Ｎ末変異体
２０残基のＮ末端の排除によりＩＢＳ分子は不活性化された。
【０１７６】
Ｎ−末端の２０残基の保持により、次の５０残基（２１〜７１）を排除しても、ベータカテニンシグナル伝達のＩＢＳサイレンシングに影響はなかった。
【０１７７】
Ｃ末突然変異体
ＩＢＳの最後の２０残基の排除は前記タンパク質を不活性化した。
【０１７８】
Ｃ１ドメインを含む残基１２５〜２６０の排除は、ベータカテニンシグナル伝達のＩＢＳサイレンシングに影響を及ぼさなかった。
【０１７９】
Ｎ末／Ｃ末欠失
Ｎ末端の２０残基、Ｎ１ドメインおよびＣ末端の２０残基からなる突然変異体ＩＢＳは、完全長ＩＢＳと同じＴＯＰＦＬＡＳＨサイレンシング活性を有していた。
【０１８０】
ＤＫＫファミリーのＮ−１ドメインのβ−カテニンシグナル伝達に対する影響の比較
ＩＢＳのＮ−１ドメインは、β−カテニンシグナル伝達のサイレンシングに必要な重大なドメインである。全てのＤＫＫファミリーメンバーのＮ−１ドメインの配置により、全てのファミリーメンバーにおけるこのドメインがＩＢＳのＮ−１ドメインのように機能し得る可能性を高める重要な組織的保存が明らかになった。ＩＢＳ機能に対するＤＫＫファミリーのＮ−１ドメインの影響を評価するために、ＤＫＫ１、ＤＫＫ２およびＤＫＫ４のＮ−１ドメインをＩＢＳのＮ−１ドメイン（ＤＫＫ３ｂ）と交換し、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＴｏｐＦｌａｓｈレポーター細胞で同時シストトロニックＧＦＰ−Ｔ２Ａ−ＩＢＳとして一過性トランスフェクションによって発現させた。β−カテニンシグナル伝達のＩＢＳサイレンシングに対するドメイン置換の影響を、ＬｉＣｌ刺激レポーター細胞で評価した。データは５回の独立したトランスフェクションの３回の平均±ＳＥを示す。（図２２参照。）
【０１８１】
任意の適切な投与経路、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、脳室内、体内、腹腔内、直腸または経口投与を用いることができる。特定の患者のための最も適切な投与手段は、治療される疾患または状態の性質および重症度、または使用される治療の性質および活性化合物の性質に依存することになる。
【０１８２】
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれる。このような固体剤形では、本明細書に記載の化合物またはその誘導体は、少なくとも１つの不活性慣用賦形剤（または担体）、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、または（ｉ）充填剤または増量剤、例えばデンプン、乳糖、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、（ｉｉ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア、（ｉｉｉ）湿潤剤、例えば、グリセロール、（ｉｖ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（ｖ）溶液遅延剤、例えば、パラフィン、（ｖｉ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、（ｖｉｉ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、（ｖｉｉｉ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに（ｉｘ）滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤および丸剤の場合、前記剤形は緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体組成物も、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いて、軟質および硬質ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒剤などの固体剤形は、腸溶コーティングおよび当技術分野で公知の他のものなどのコーティングおよび外殻を用いて調製することができる。
【０１８３】
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容し得るエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。前記活性化合物に加えて、前記液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤などの当該分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでいてもよく、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物などが挙げられる。そのような不活性希釈剤に加えて、前記組成物は湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、または芳香剤などの追加の薬剤を含むこともできる。
【０１８４】
本明細書中に開示された材料、組成物、および成分は、開示された方法および組成物のために使用され得るか、それらと共に使用され得るか、それらの調製に使用され得るか、またはそれらの生成物であり得る。これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個体および集合的な組合せおよび置換の具体的な参照は明示的に開示されない可能性があるが、本明細書でそれぞれが具体的に考慮されかつ記載されていることが理解される。例えば、ある方法が開示され、論じられ、その方法において含まれる多数の分子に対してなされ得る多数の変更が論じられる場合、具体的にそれとは逆に指示されない限り、前記方法のそれぞれの全ての組み合わせおよび置換、および可能な変更が具体的に考慮される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に考慮されかつ開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法におけるステップを含むが、これらに限定されない、本開示の全ての態様に適用される。したがって、実行可能な追加のステップが多岐に渡る場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示された方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせで実行され得ること、およびそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットのそれぞれが具体的に考慮されており、開示されているとみなされるべきである。
【０１８５】
本発明の特定の化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性体形態で存在し得る。本発明は、シスおよびトランス異性体、Ｒ−およびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（D）−異性体、（L）−異性体、それらのラセミ混合物、およびそれらの他の混合物を含む全てのこのような化合物が本発明の範囲に含まれるとして考慮される。追加の不斉炭素原子はアルキル基などの置換基に存在していてもよい。全てのそのような異性体、ならびにそれらの混合物は、本発明に含まれることが意図される。
【０１８６】
様々な異性体比のいずれかを含む異性体混合物を本発明に従って利用することができる。例えば、２つの異性体のみが混合される場合、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、９９：１、または１００：０の異性体比を含む混合物が本発明によって意図される。当業者であれば、類似の比がより複雑な異性体混合物について考慮されることを容易に理解するであろう。
【０１８７】
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが所望される場合、不斉合成によって、またはキラル補助剤による誘導によってそれを調製することができ、得られたジアステレオマー混合物を分離し、補助基を切断して純粋な所望のエナンチオマーを提供する。あるいは、分子がアミノなどの塩基性官能基またはカルボキシルなどの酸性官能基を含む場合、ジアステレオマー塩が適切な光学活性酸または塩基で形成され、続いて当技術分野で周知の分画結晶化またはクロマトグラフィー方法によって形成されたジアステレオマーを分割し、その後純粋なエナンチオマーを回収する。
【０１８８】
本出願人の開示は、図面を参照して好ましい実施形態において本明細書に記載され、図中、同様の番号は同じまたは類似の要素を表す。本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、または同様の言語に関する参照は、前記実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じての表現「一実施形態では」、「実施形態では」、および類似の言語が出てくれば、必ずしもそうではないが、全て同じ実施形態を指す。
【０１８９】
本出願人の開示の記載された特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。以下の説明では、本発明の実施形態の完全な理解をもたらすために多数の特定の詳細が列挙される。しかしながら、当業者は、特定の詳細の１つ以上を用いずに、または他の方法、構成要素、材料などを用いて、本出願人の組成物および／または方法を実施できることを認識するであろう。他の例では、周知の構造、材料、または操作は、本開示の態様を不明瞭にすることを避けるために、詳細には示されていないかまたは記載されていない。
【０１９０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参照を含む。
【０１９１】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料も、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで記載する。本明細書で列挙する方法は、開示された特定の順序に加えて、論理的に可能な任意の順序で実施することができる。
【０１９２】
参照による援用
特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文献への参照および引用は、本開示においてなされている。全てのそのような文献は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。本明細書において参照により援用されると言われているが、本明細書に明示的に記載された既存の定義、言及または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその一部分は、援用された材料と本発明の開示材料の間で矛盾が生じない範囲のみ援用される。矛盾が生じた場合、その矛盾は本開示を好ましい開示として支持して解決されるべきである。
【０１９３】
均等物
代表的な実施例は、本発明の説明を助けることを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、またそのように解釈されるものでもない。実際に、本明細書に示され説明されたものに加えて、本発明の様々な変更および多くのそのさらなる実施形態は、本明細書に含まれる実施例ならびに科学的文献および特許文献への参照を含む、本明細書の全内容から当業者に明らかになるであろう。前記実施例は、その様々な実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合させることができる重要な追加情報、例示および指針を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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