(57)【要約】  配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて配列特異的生物検出及び／又は表現型判定を達成するための材料及び方法が、本明細書に開示される。また、配列特異的に微生物を検出し、及び／又は表現型を判定するための関連するキット、培養物、及び細胞も開示される。
2018520640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌剤感受性表現型の機序を決定するための方法であって、
−  少なくとも１つの抗菌剤に対して感受性でない少なくとも１つの微生物を含む試料を提供する工程と、
−  前記試料に抗菌剤を接触させる工程であって、前記抗菌剤は１つ以上の微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めることができる、前記工程と、
−  前記少なくとも１つの微生物を、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する少なくとも１つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物と接触させる工程と、
−  前記微生物が前記抗菌剤及び前記オリゴヌクレオチド分子と接触しているときに、微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、微生物の抗菌剤感受性表現型の機序を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、前記オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、前記抗菌剤に対する抗菌剤感受性表現型の機序に関連しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、前記オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、前記抗菌剤に対する抗菌剤感受性表現型の機序に関連していることを示す、前記工程と
を含む、方法。
【請求項２】
レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子（ＮＲＴＰ）が微生物内に前記レポーター核酸分子を挿入し、かつ前記レポーター分子が生存能力の検出可能な指標を提供するような条件下で、前記試料をＮＲＴＰと接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レポーター核酸分子が発光分子をコードする遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＲＴＰは、
宿主細菌細胞と、
前記宿主細菌細胞内にあり、非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む第１の核酸構築体であって、ここで、前記非機能性パッケージング開始部位配列は、ＮＲＴＰ内へのバクテリオファージゲノムのパッケージングを防止する、前記第１の核酸構築体と、
前記宿主細菌細胞内にあり、かつ前記第１の核酸構築体から離れて存在し、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、ＮＲＴＰへの前記レポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列とを含む第２の核酸構築体であって、ここで、第２の核酸構築体上の機能性の第２のパッケージング開始部位配列は、前記第１の核酸構築体上のバクテリオファージゲノム内の非機能性パッケージング開始部位配列を補完する、前記第２の核酸構築体と、
を含む細菌細胞パッケージングシステムから製造される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド−ＰＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する前記少なくとも１つの特定核酸配列が、ｂｌａKPC-3遺伝子、ｂｌａNDM-1遺伝子、ｂｌａSHV-18遺伝子、及びｖａｎＣ遺伝子からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、腸内細菌科（family Enterobacteriaceae）、エンテロコッカス属（genus Enterococcus）、又はカンジダ属（genus Candida）の微生物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗菌剤がβ−ラクタム又はバンコマイシンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
非感受性表現型に関与する機序を決定するための方法であって、
−  カルバペネムに対して感受性でない腸内細菌科微生物を含む試料を提供する工程と、
−  前記試料をカルバペネムと接触させる工程と、
−  前記腸内細菌科微生物を、カルバペネム耐性に関連する遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド分子と接触させる工程と、
−  前記腸内細菌科微生物がカルバペネム及びオリゴヌクレオチド分子と接触しているとき、前記腸内細菌科微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、前記腸内細菌科微生物のカルバペネム非感受性の機序を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる遺伝子が、カルバペネム非感受性の機序に関連しないことを示し、検出可能な指標の欠如は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる遺伝子が、カルバペネム非感受性の機序に関連していることを示す、前記工程と
を含む、方法。
【請求項１０】
レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子（ＮＲＴＰ）が腸内細菌科微生物内に前記レポーター核酸分子を挿入し、かつ前記レポーター分子が生存能力の検出可能な指標を提供するような条件下で、前記試料をＮＲＴＰと接触させる工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーター核酸分子が発光分子をコードする遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＮＲＴＰは、
宿主細菌細胞と、
前記宿主細菌細胞内にあり、非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む第１の核酸構築体であって、ここで、前記非機能性パッケージング開始部位配列は、ＮＲＴＰ内へのバクテリオファージゲノムのパッケージングを防止する、前記第１の核酸構築体と、
前記宿主細菌細胞内にあり、かつ前記第１の核酸構築体から離れて存在し、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、ＮＲＴＰへの前記レポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列とを含む第２の核酸構築体であって、ここで、第２の核酸構築体上の機能性の第２のパッケージング開始部位配列は、前記第１の核酸構築体上のバクテリオファージゲノム内の非機能性パッケージング開始部位配列を補完する、前記第２の核酸構築体と、
を含む細菌細胞パッケージングシステムから製造される、
請求項１０又は１１のに記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチド分子が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド−ＰＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からなる群より選択される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチド分子が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的生物を検出するように設計されたアッセイにおいて、潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の量を低下させる方法であって、
−  標的生物を検出するように設計されたアッセイにおいて、潜在的に交差反応性又は干渉性である少なくとも１つの生物を含む試料を提供する工程と；
−  前記交差反応性又は干渉性である生物を、潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の生存能力に関与する少なくとも１つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物と接触させる工程であって、潜在的に交差反応性又は干渉性の前記特定核酸配列は前記生物に固有であり、前記潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の生存能力を失わせる、前記工程と
を含む、前記方法。
【請求項１６】
レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子（ＮＲＴＰ）が微生物内に前記レポーター核酸分子を挿入し、かつ前記レポーター分子が標的生物の生存能力の検出可能な指標を提供するような条件下で、前記試料をＮＲＴＰと接触させる工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記レポーター核酸分子が発光分子をコードする遺伝子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド−ＰＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からなる群より選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＮＲＴＰは、
宿主細菌細胞と、
前記宿主細菌細胞内にあり、非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む第１の核酸構築体であって、ここで、前記非機能性パッケージング開始部位配列は、ＮＲＴＰ内へのバクテリオファージゲノムのパッケージングを防止する、前記第１の核酸構築体と、
前記宿主細菌細胞内にありかつ前記第１の核酸構築体から離れて存在し、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、ＮＲＴＰへの前記レポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列とを含む第２の核酸構築体であって、ここで、第２の核酸構築体上の機能性の第２のパッケージング開始部位配列は、前記第１の核酸構築体上のバクテリオファージゲノム内の非機能性パッケージング開始部位配列を補完する、前記第２の核酸構築体と
を含む、細菌細胞パッケージングシステムから製造される、
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的生物が腸内細菌科の生物である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の生存能力に関与する前記少なくとも１つの特定核酸配列がｍｕｒＡ遺伝子である、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
細胞レポーターシステムは、非標的生物との交差反応及び微生物干渉を示すことがある。例えば糞便試料中の大腸菌（E. coli）を検出するために腸内細菌科細菌（Enterobacteriaceae）のレポーターが使用される場合、肺炎桿菌（K. pneumoniae）のような腸内細菌科の他の種は、交差反応性シグナルを生成して偽陽性の結果をもたらすことがある。さらに試料中に存在し得る緑膿菌（P. aeruginosa）、アシネトバクター・バウマンニ（A.baumannii）、及びステノトロホモナス・マルトフィリア（S. maltophilia）などの他の細菌科の種は、微生物の干渉をもたらして偽陰性結果を与え得る。
【０００２】
抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）は、抗菌剤に対する微生物の応答を測定し、抗菌剤に対してその微生物が感受性であるか非感受性であるかを決定するために使用される。抗菌剤に対する微生物の応答は様々な機序（mechanism）によるものであり、そのすべてが同じ応答又は表現型を与える。例えば、カルバペネム耐性腸内細菌科微生物（ＣＲＥ）において、カルバペネム系抗生物質に対する耐性は、異なる遺伝子又は遺伝子変異体（ｂｌａNDM-1、ｂｌａKPC、ｂｌａIMP、ｂｌａVIM、ｂｌａCMYなどを含む）によってコードされる種々のカルバペネマーゼに起因し、並びに非カルバペネマーゼβ−ラクタマーゼの過剰発現のようなカルバペネマーゼの欠如にもかかわらずカルバペネム非感受性表現型をもたらす状況、及びカルバペネムの細胞への取り込みの低下をもたらす突然変異（例えばポーリン突然変異(porin mutaions)）に起因する可能性がある。
【０００３】
ＡＳＴは、共通の表現型応答を付与する種々な耐性機序を区別することができない。例えば、腸内細菌科微生物のメロペネムに対する応答を試験して、その腸内細菌科微生物がメロペネムに対して耐性であることが判明した場合、このアッセイから、この耐性がｂｌａNDM-1又はｂｌａKPCに起因するか又は他のカルバペネム耐性機序に起因するかどうかを決定することはできない。
【０００４】
微生物に抵抗性表現型を付与する機序に関する限定された情報を提供するために、ＡＳＴの拡張が開発されている。例えば、アモキシシリンを用いて腸内細菌科微物に対してＡＳＴ検査を行う場合、その微生物がアモキシシリンに対して耐性であるが、β−ラクタマーゼ阻害剤であるクラブラン酸の存在下ではアムモシシリンに対して感受性であることが見出された場合、この結果は、β−ラクタマーゼがアモキシシリン耐性表現型に関係していることを示し得る。しかしこの技術は、β−ラクタマーゼの役割を示すのみであり、特異的なβ−ラクタマーゼの本体は示すものではない。
【０００５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅技術は、生物に耐性表現型を付与し得る特異的遺伝子の存在を測定するために使用することができる。しかしこれらの技術は、生きた生物と生きていない生物とを区別することができず、偽陽性の結果を導き、また検出された遺伝子が発現しているかどうかを判定することができず、従って抗菌剤に対する生物の表現型応答を決定できず、従って一般的に抗菌剤感受性を決定することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの制限のために、生物に表現型応答を付与する根底にある機序を決定する手段が必要である。ある表現型を付与する根底にある具体的な機序の本体は、疫学的分析及び他の関連する分析のための重要な情報となり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
抗菌剤感受性表現型の機序を決定するための方法が本明細書に開示され、この方法は以下の工程を含む：
少なくとも１つの抗菌剤に対して感受性でない少なくとも１つの微生物を含む試料を提供する工程；
前記試料に抗菌剤を接触させる工程であって、前記抗菌剤は１つ以上の微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めることができる、前記工程；
前記試料に、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する少なくとも１つの特定核酸配列（specific nucleic acid sequence）を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物を接触させる工程であって、任意選択的に、オリゴヌクレオチド分子が核酸配列を阻害する、前記工程；及び
前記微生物が抗菌剤及びオリゴヌクレオチド分子と接触しているときに、微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、微生物の抗菌剤感受性表現型の機序を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、抗菌剤に対する抗菌剤感受性表現型の機序に関連しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、抗菌剤に対する抗菌剤感受性表現型の機序に関連していることを示す、前記工程。
他の方法、組成物、システム、培養物、分子、及びキットも、本明細書において同様に記載される。
【０００８】
また、抗菌剤感受性表現型の機序を決定するための方法も本明細書に開示され、この方法は以下の工程を含む：
少なくとも１つの抗菌剤に対して感受性でない少なくとも１つの微生物を含む試料を提供する工程であって、前記試料はさらに、１つ以上の微生物の生存能力を殺滅し、その増殖を阻害し、又はその生存能力を弱めることができる抗菌剤と、抗菌剤に対する感受性のない表現型に関与する少なくとも１つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物とを含む、前記工程；及び
微生物が抗菌剤及びオリゴヌクレオチド分子と接触しているときに、微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、微生物の非感受性表現型の機序を決定する工程であって、検出可能な指標の存在は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、抗菌剤に対する非感受性表現型の機序に関連しないことを示し、検出可能な指標の欠如は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、抗菌剤に対する非感受性表現型の機序に関連していることを示す、前記工程。
【０００９】
いくつかの態様において、化合物はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。いくつかの態様において、化合物はペプチド−ＰＮＡである。いくつかの態様において、ペプチドはオリゴヌクレオチド分子の微生物への取り込みを促進する。いくつかの態様において、ＰＮＡは遺伝子の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を標的とする。いくつかの態様において、ペプチド−ＰＮＡはβ−ラクタム耐性遺伝子又はバンコマイシン耐性遺伝子を標的とする。いくつかの態様において、ペプチド−ＰＮＡは、ｂｌａKPC-3遺伝子、ｂｌａNDM-1遺伝子、ｂｌａSHV-18遺伝子、ｖａｎＣ遺伝子を標的とする。
【００１０】
また、非感受性表現型に関与する機序を決定するための方法が本明細書に開示され、この方法は以下の工程を含む：
カルバペネムに対して感受性でない腸内細菌科微生物を含む試料を提供する工程；
前記試料に腸内細菌科微生物を接触させる工程；
前記試料を、カルバペネム耐性に関連する遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド分子と接触させる工程；
腸内細菌科微生物がカルバペネム及びオリゴヌクレオチド分子と接触しているとき、腸内細菌科微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、腸内細菌科微生物のカルバペネム非感受性の機序を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる遺伝子が、カルバペネム非感受性の機序に関連しないことを示し、検出可能な指標の欠如は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる遺伝子が、カルバペネム非感受性の機序に関連していることを示す、前記工程。
【００１１】
目的の生物の存在を決定するための方法が本明細書に開示され、この方法は以下の工程を含む：
目的の少なくとも１つの生物を含む可能性のある試料を提供する工程；
前記試料を、生物体の生存能力に関与する少なくとも１つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物と接触させる工程であって、前記特定核酸配列が前記生物に対して固有である、前記工程；及び
前記生物が前記オリゴヌクレオチド分子と接触している場合に、前記生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて前記生物の存在を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、目的の生物が前記試料中に存在しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、目的の生物が前記試料中に存在し得ることを示す、前記工程。
【００１２】
また目的の生物の存在を決定するための方法が本明細書に開示され、この方法は以下の工程を含む：
目的の少なくとも１つの生物を含む可能性のある試料と、前記生物の生存活性に関連する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１種の化合物とを提供する工程であって、前記特定核酸配列は前記生物に対して固有である、前記工程；及び；
前記生物が前記オリゴヌクレオチド分子と接触している場合に、前記生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて前記生物の存在を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、目的の生物が前記試料中に存在しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、目的の生物が前記試料中に存在し得ることを示す、前記工程。
【００１３】
また目的の生物の存在を決定するための方法が本明細書に開示され、この方法は以下の工程を含む：
目的の少なくとも１つの生物を含む可能性のある試料を提供する工程；
前記試料の第１の部分に、生物の生存能力に関与する少なくとも１つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物を接触させる工程であって、前記特定核酸配列は前記生物に固有である、前記工程；
前記生物がオリゴヌクレオチド分子と接触している場合に、前記生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて前記試料の第１の部分中の前記生物の存在を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、目的の生物が前記試料中に存在しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、目的の生物が前記試料中に存在し得ることを示す、前記工程；及び
前記生物に関連する生存活性の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、前記オリゴヌクレオチド分子を含まない試料の第２の部分における生物の存在を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、目的の生物が前記試料中に存在し得ることを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、目的の生物が前記試料中に存在しないことを示す、前記工程。
【００１４】
また、標的生物を検出するように設計されたアッセイにおいて、潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の量を低下させる方法が開示され、この方法は以下の工程を含む：
標的生物を検出するように設計されたアッセイにおいて、潜在的に交差反応性又は干渉性である少なくとも１つの生物を含む可能性のある試料を得る工程；
前記交差反応性又は干渉性である生物に、潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の生存能力に関与する少なくとも１つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物を接触させる工程であって、前記特定核酸配列は前記生物に固有である、前記工程；及び
生物の生存能力を失わせる工程。
いくつかの態様において、潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の生存能力に関与する前記少なくとも１つの特定核酸配列は、ｍｕｒＡ遺伝子である。
【００１５】
本明細書に開示される全ての方法の特定の態様は、以下の通りである：
いくつかの態様において、化合物はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。いくつかの態様において、化合物はペプチド−ＰＮＡである。いくつかの態様において、前記ペプチドは、微生物へのオリゴヌクレオチド分子の取り込みを促進する。いくつかの態様において、ＰＮＡは遺伝子の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を標的とする。いくつかの態様において、ペプチド−ＰＮＡは、β−ラクタム耐性遺伝子又はバンコマイシン耐性遺伝子を標的とする。いくつかの態様において、ペプチド−ＰＮＡは、ｂｌａKPC-3遺伝子、ｂｌａNDM-1遺伝子、ｂｌａSHV-18遺伝子、ｖａｎＣ遺伝子を標的とする。
【００１６】
いくつかの態様において、試料に、オリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物を接触させることは、微生物に、オリゴヌクレオチド分子を含むベクターを導入することを含む。
【００１７】
いくつかの態様においてオリゴヌクレオチド分子はＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。いくつかの態様において、ｃｒＲＮＡは微生物内内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムから発現される。いくつかの態様において、ｃｒＲＮＡはｂｌａNDM-1遺伝子又はｂｌａSHV-18遺伝子又は転写体を標的とする。
【００１８】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１９】
いくつかの態様において化合物は、センス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、アンチセンス鎖はアンチセンス分子を含む。いくつかの態様においてｄｓＲＮＡの各鎖は、８〜４９ヌクレオチドの長さ（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドの長さ）であり、任意選択的に各鎖は３’Ｔ又はＴＴを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において化学修飾されたヌクレオチドは、２’修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様において２’修飾ヌクレオチドは、２’−メチル置換ヌクレオチド又は２’−アミノ置換ヌクレオチドである。
【００２０】
いくつかの態様において、特定核酸配列は、ＤＮＡ配列又はｍＲＮＡ配列である。
【００２１】
いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標の存在は、微生物が生存可能であることを示す。いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標の欠如は、微生物が生存可能でないことを示す。
【００２２】
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、試料に、微生物中の抗菌剤に対する抗菌剤非感受性に関与する第２の特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む第２の化合物を接触させることをさらに含む。
【００２３】
いくつかの態様において、微生物は原核生物又は真核生物である。
【００２４】
いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標は、微生物の増殖、微生物に関連するマーカー、又は微生物に関連する検出可能なシグナルである。
【００２５】
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、レポーター分子が微生物中に入り、生存能力の検出可能な指標を提供するような条件下で、試料に、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を接触させることをさらに含む。いくつかの態様において、レポーターシステムは、リポソームに基づくレポーターシステム、ファージに基づくレポーターシステム、又は非複製性の形質導入粒子に基づくレポーターシステムである。
【００２６】
いくつかの態様において、少なくとも１つの微生物は、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む。
【００２７】
いくつかの態様において、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子（ＮＲＴＰ）が微生物内にレポーター核酸分子を挿入するような、かつ前記レポーター分子が生存能力の検出可能な指標を提供するような条件下で、試料にＮＲＴＰを接触させることをさらに含む方法が、本明細書にさらに開示される。
【００２８】
いくつかの態様において、ＮＲＴＰは、
宿主細菌細胞と、
前記宿主細菌細胞内にあり、非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む第１の核酸構築体(first nucleic acid construct)であって、ここで、前記非機能性パッケージング開始部位配列は、ＮＲＴＰ内へのバクテリオファージゲノムのパッケージングを防止する、前記第１の核酸構築体と、
前記宿主細菌細胞内にありかつ前記第１の核酸構築体から離れて存在し、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、ＮＲＴＰへの前記レポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列とを含む第２の核酸構築体であって、ここで、前記第２の核酸構築体上の機能性の第２のパッケージング開始部位配列は、前記第１の核酸構築体上のバクテリオファージゲノム内の非機能性パッケージング開始部位配列を補完する、前記第２の核酸構築体と
を含む、細菌細胞パッケージングシステムから製造される。
【００２９】
いくつかの態様において、レポーター核酸分子は、発光分子をコードする遺伝子である。いくつかの態様において、遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。
【００３０】
いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標を検出することは、レポーター分子の存在又は欠如を検出することを含む。いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標を検出することは、レポーター分子が介在する反応の存在又は欠如を検出することを含む。他の態様において、生存能力の検出可能な指標を検出することは、レポーター分子のコンフォメーション、活性、又は他の特性（例えば、蛍光、又は他の分子と結合するか又は相互作用をする能力）を検出することを含む。
【００３１】
いくつかの態様において、微生物は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、又はカンジダ属（Candida）の微生物である。
【００３２】
いくつかの態様において、微生物は、エシェリヒア属（Escherichia）、マイコバクテリア属（Mycobacterium）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、リステリア属（Listeria）、クロストリジウム属（Clostridium）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、リケッチア属（Rickettsia）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ゼノラブデス属（Xenorhabdus）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、ボルデテラ属（Bordetella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、アエロモナス属（Aeromonas）、アクチノバチルス属（Actinobacillus）、パスツレラ属（Pasteurella）、ビブリオ属（Vibrio）、レジオネラ属（Legionella）、バチルス属（Bacillus）、カルトリクス属（Calothrix）、メタノコッカス属（Methanococcus）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）、クラミジア属（Chlamydia）、ナイセリア属（Neisseria）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、又はエルシニア属（Yersinia）のものである。
【００３３】
いくつかの実施態様において、抗菌剤はβ−ラクタム又はバンコマイシンである。
【００３４】
いくつかの実施態様において、抗菌剤は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、アミノグリコシド、フルオロキノロン、リンコサミド、ポリミキシン、テトラサイクリン、マクロライド、オキサゾリジノン、ストレプトグラミン、リファマイシン、又はグリコペプチドの群又はクラスのものである。
【００３５】
いくつかの実施態様において、抗菌剤は、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム、ピペルシリン−タゾバクタム、オキサシリン、ペニシリン、セファゾリン、セフェピム、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフタロリンフォサミル、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、アミカシン、ゲンタマイシン、ゲンタマイシンシナジー、ストレプトマイシンシナジー、トブラマイシンシ、トブラマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、クリンダマイシン、コリスチン、ダプトマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、リネゾリド、ニトロフラントイン、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、リファンピン、チゲサイクリン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、ホスホマイシン、セフォキシチン、テトラサイクリン、モキシフロキサシン、又はテディゾリドである。
【００３６】
特定の態様において、微生物は腸内細菌科のものであり、抗菌剤はカルバペネムである。
【００３７】
いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標を検出することは、微生物の増殖を観察することを含み、ここで、任意選択的に増殖は細胞培養を用いて観察される。
【００３８】
いくつかの態様において、化合物はさらにリポソームを含む。
【００３９】
いくつかの態様において、試料を抗菌剤と接触された後に、試料は化合物たお接触される。いくつかの態様において、試料は化合物と接触された後に、試料は抗菌剤と接触されるか、又は試料は化合物及び薬剤と同時に接触される。
【００４０】
いくつかの態様において、試料、化合物、及びレポーター核酸は、任意の順序で又は同時に互いに接触される。
【００４１】
また抗菌剤に感受性でない微生物に対する非感受性表現型の機序を決定するためのキットが本明細書に開示され、このキットは以下を含む：
１つ以上の微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めるｃことができる抗菌剤；
抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む化合物；及び
微生物が抗菌剤及びオリゴヌクレオチド分子と接触している場合、微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、抗菌剤に対して感受性ではない微生物の非感受性表現型の機序を決定するために、抗菌剤及びオリゴヌクレオチド分子を使用するための説明書であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、オリゴヌクレオチド分子によって標的化された特定核酸配列が、抗菌剤に対する非感受性表現型の機序に関連しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、オリゴヌクレオチド分子によって標的化された特定核酸配列が、抗菌剤に対する非感受性表現型の機序に関連することを示す、前記説明書。
【００４２】
また目的の生物の存在を決定するためのキットが本明細書に開示され、このキットは以下を含む：
前記生物の生存能力に関与する特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む化合物であって、前記特定核酸配列が前記生物に固有である上記化合物；及び
前記生物がオリゴヌクレオチド分子と接触している場合、生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如基づいて生物の存在を決定するためにオリゴヌクレオチド分子を使用するための説明書であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、目的の生物が試料中に存在しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、目的の生物が試料中に存在し得ることを示す、前記説明書。
【００４３】
また少なくとも１つの抗菌剤に感受性ではない単離された微生物が本明細書に開示され、ここで抗菌剤は以下を含む：
１つ以上の微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めることができる抗菌剤；
抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する少なくとも１つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物；及び
任意選択的に、レポーターは、マーカー、検出可能なシグナル、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子、又はレポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子（ＮＲＴＰ）である、レポーター。
【００４４】
また、本明細書に開示される微生物の製造方法であって、前記微生物に抗菌剤を接触させる工程と、前記微生物にオリゴヌクレオチド分子を含む化合物を接触させる工程と、前記微生物にレポーターを接触させる工程を含む、本明細書に開示される微生物の製造方法が本明細書に開示される。
【００４５】
また少なくとも１つの抗菌剤に感受性でない微生物を含むインビトロ細胞培養物が本明細書に開示され、この細胞培養物は以下をさらに含む：
１つ以上の微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めることができる抗菌剤；
前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物；及び
レポーター、任意選択的に、レポーターは、マーカー、検出可能シグナル、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子、又はレポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子（ＮＲＴＰ）である上記レポーター。
【００４６】
また、細胞培養物の製造方法であって、培養物に抗菌剤を接触させる工程と、培養物にオリゴヌクレオチド分子を含む化合物を接触させる工程と、及び培養物にレポーターを接触させる工程とを、上記方法が本明細書に開示される。
【００４７】
また本明細書には、以下を含む単離された生物が開示される：
生物の生存能力に関与する少なくとも１つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物であって、前記特定核酸配列は前記生物に固有である、前記化合物；及び
レポーター、任意選択的にレポーターは、マーカー、検出可能シグナル、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子、又はレポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子（ＮＲＴＰ）である。
【００４８】
本明細書にはまた、単離された生物の製造方法であって、前記生物にオリゴヌクレオチド分子を含む化合物を接触させる工程と、前記生物にレポーターを接触させる工程とを、含む、前記方法が開示される。
【００４９】
本明細書にはまた、生物を含むインビトロ細胞培養物が開示され、この生物は以下をさらに含む：
生物の生存能力に関与する少なくとも１つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの化合物であって、前記特定核酸配列は前記生物に固有である前記化合物；及び
レポーター、任意選択的にレポーターは、マーカー、検出可能シグナル、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子、又はレポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子（ＮＲＴＰ）である前記レポーター。
【００５０】
本明細書にはまた、インビトロ細胞培養物の製造方法であって、前記培養物にオリゴヌクレオチド分子を含む化合物を接触させる工程と、前記培養物にレポーターを接触させる工程とを含む、前記方法が開示される。
【００５１】
本明細書に開示される全てのキット及び全ての単離された微生物の具体的な態様は、以下の通りである：
いくつかの態様において、化合物はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。いくつかの態様において、化合物はペプチド−ＰＮＡである。いくつかの態様において、ペプチドは、オリゴヌクレオチド分子の微生物への取り込みを促進する。いくつかの態様において、ＰＮＡは遺伝子の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を標的とする。いくつかの態様において、ペプチド−ＰＮＡは、β−ラクタム耐性遺伝子又はバンコマイシン耐性遺伝子を標的とする。いくつかの態様において、ペプチド−ＰＮＡは、ｂｌａKPC-3遺伝子、ｂｌａNDM-1遺伝子、ｂｌａSHV-18遺伝子、ｖａｎＣ遺伝子を標的とする。
【００５２】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド分子はＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。いくつかの態様において、ｃｒＲＮＡは微生物内内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムから発現される。いくつかの態様において、ｃｒＲＮＡはｂｌａNDM-1遺伝子又はｂｌａSHV-18遺伝子又は転写体を標的とする。
【００５３】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５４】
いくつかの態様において化合物は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、アンチセンス鎖はアンチセンス分子を含む。いくつかの態様においてｄｓＲＮＡの各鎖は、８〜４９ヌクレオチドの長さ（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドの長さ）であり、任意選択的に各鎖は３’Ｔ又はＴＴを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において化学修飾されたヌクレオチドは、２’修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様において２’修飾ヌクレオチドは、２’−メチル置換ヌクレオチド又は２’−アミノ置換ヌクレオチドである。
【００５５】
いくつかの態様において、特定核酸配列は、ＤＮＡ配列又はｍＲＮＡ配列である。
【００５６】
いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標の存在は、微生物が生存可能であることを示す。いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標の欠如は、微生物が生存可能でないことを示す。
【００５７】
いくつかの態様において、微生物は原核生物又は真核生物である。
【００５８】
いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標は、微生物の増殖、微生物に関連するマーカー、又は微生物に関連する検出可能シグナルである。
【００５９】
いくつかの態様において、少なくとも１つの微生物は、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む。
【００６０】
いくつかの態様において、キットは、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子（ＮＲＴＰ）をさらに含む。
【００６１】
いくつかの態様においてＮＲＴＰは、
宿主細菌細胞と、
前記宿主細菌細胞内にあり、非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む第１の核酸構築体であって、前記非機能性パッケージング開始部位配列は、ＮＲＴＰ内へのバクテリオファージゲノムのパッケージングを防止する、前記第１の核酸構築体と、
前記宿主細菌細胞内にありかつ前記第１の核酸構築体から離れて存在し、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、ＮＲＴＰへの前記レポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列とを含む第２の核酸構築体であって、ここで、第２の核酸構築体上の機能性の第２のパッケージング開始部位配列は、前記第１の核酸構築体上のバクテリオファージゲノム内の非機能性パッケージング開始部位配列を補完する、前記第２の核酸構築体と
を含む、細菌細胞パッケージングシステムから製造される。
【００６２】
いくつかの態様において、レポーター核酸分子は、発光分子をコードする遺伝子である。いくつかの態様において、遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。
【００６３】
いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標を検出することは、レポーター分子の存在又は欠如を検出することを含む。いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標を検出することは、レポーター分子が介在する反応の存在又は欠如を検出することを含む。他の態様において、生存能力の検出可能な指標を検出することは、レポーター分子のコンフォメーション、活性、又は他の特性（例えば、蛍光、又は他の分子と結合するか又は相互作用をする能力）を検出することを含む。
【００６４】
いくつかの態様において、微生物は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、又はカンジダ属（Candida）のものである。
【００６５】
いくつかの態様において、微生物は、エシェリヒア属（Escherichia）、マイコバクテリア属（Mycobacterium）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、リステリア属（Listeria）、クロストリジウム属（Clostridium）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、リケッチア属（Rickettsia）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ゼノラブデス属（Xenorhabdus）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、ボルデテラ属（Bordetella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、アエロモナス属（Aeromonas）、アクチノバチルス属（Actinobacillus）、パスツレラ属（Pasteurella）、ビブリオ属（Vibrio）、レジオネラ属（Legionella）、バチルス属（Bacillus）、カルトリクス属（Calothrix）、メタノコッカス属（Methanococcus）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）、クラミジア属（Chlamydia）、ナイセリア属（Neisseria）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、又はエルシニア属（Yersinia）のものである。
【００６６】
いくつかの実施態様において、抗菌剤はβ−ラクタム又はバンコマイシンである。
【００６７】
いくつかの実施態様において、抗菌剤は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、アミノグリコシド、フルオロキノロン、リンコサミド、ポリミキシン、テトラサイクリン、マクロライド、オキサゾリジノン、ストレプトグラミン、リファマイシン、又はグリコペプチドの群又はクラスのものである。
【００６８】
いくつかの実施態様において、抗菌剤は、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム、ピペラシリン−タゾバクタム、オキサシリン、ペニシリン、セファゾリン、セフェピム、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフタロリンフォサミル、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、アミカシン、ゲンタマイシン、ゲンタマイシンシナジー、ストレプトマイシンシナジー、トトブラマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、クリンダマイシン、コリスチン、ダプトマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、リネゾリド、ニトロフラントイン、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、リファンピン、チゲサイクリン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、ホスホマイシン、セフォキシチン、テトラサイクリン、モキシフロキサシン、又はテディゾリドである。
【００６９】
特定の態様において、微生物は腸内細菌科のものであり、抗菌剤はカルバペネムである。
【００７０】
いくつかの態様において、生存能力の検出可能な指標を検出することは、微生物の増殖を観察することを含み、ここで、任意選択的に増殖は細胞培養を用いて観察される。
【００７１】
いくつかの態様において、化合物はさらにリポソームを含む。
【００７２】
また本明細書には、腸内細菌科におけるカルバペネム非感受性に関与する遺伝子の発現を阻害するためのペプチド核酸（ＰＮＡ）分子であって、配列番号２又は配列番号３のヌクレオチド配列を含む、ＰＮＡ分子が開示される。
【００７３】
また本明細書には、腸内細菌科におけるバンコマイシン非感受性に関与する遺伝子の発現を阻害するためのＰＮＡ）分子であって、配列番号６のヌクレオチド配列を含む、ＰＮＡ分子が開示される。
【００７４】
また本明細書には、カンジダにおける内部転写されたスペーサー領域の発現を阻害するためのアンチセンス分子であって、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９のヌクレオチド配列を含む、アンチセンス分子が開示される。
【００７５】
本開示のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付図面を参照してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】大腸菌（E. coli）の増殖に対する大腸菌特異的ペプチド−ＰＮＡの作用を示す。
【図２】肺炎桿菌（K. pneumoniae）の増殖に対する大腸菌特異的ペプチド−ＰＮＡの作用を示す。
【図３】腸内細菌科の発光レポーターを使用する、大腸菌及び肺炎桿菌からの発光シグナルに対する大腸菌特異的ペプチド−ＰＮＡの作用を示す。
【図４】大腸菌１２８９０１１、１２８９０１２、１２８９０１４、及び１２８９０１８についての典型的なメロペネム／ペプチド−ＰＮＡディスク拡散結果の例を示す。
【図５】ペプチドＰＮＡ細胞レポーターＡＳＴアッセイの結果の例を示し、＋はレポーターアッセイが陽性結果を与え、−はレポーターアッセイが陰性結果を与えたことを示す。
【図６】ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９細胞レポーターＡＳＴアッセイの結果の例を示し、＋はレポーターアッセイが陽性結果を与え、−はレポーターアッセイが陰性結果を与えたことを示す。
【図７】ＶＲＥ細胞レポーターアッセイの結果の例を示し、＋はレポーターアッセイが陽性結果を与え、−はレポーターアッセイが陰性結果を与えたことを示す。
【図８】各種を標的とする２’−ＯＭｅ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を製造するために使用することができるＩＴＳ２配列のリストを含む。
【図９】カンジダ属菌種の同定に使用されるＡＯＮの組み合わせについてのアッセイ構成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
（発明の詳細な説明）
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に示すように定義される。
【００７８】
本明細書中で使用される「レポーター核酸分子」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含むヌクレオチド配列をいう。レポーター核酸分子は、天然に存在していても、人工又は合成の分子であってもよい。いくつかの実施態様において、レポーター核酸分子は宿主細胞に対して外因性であり、外来性核酸分子の一部（例えばプラスミド又はベクター）として宿主細胞に導入され得る。他の実施態様において、レポーター核酸分子は、レポーター分子（例えば、レポーター酵素、タンパク質）をコードするレポーター遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、レポーター核酸分子は、「レポーター構築体」又は「核酸レポーター構築体」と呼ばれる。
【００７９】
「レポーター分子」又は「レポーター」は、生物に検出可能又は選択可能な表現型を付与する分子（例えば核酸由来又はアミノ酸由来）をいう。検出可能な表現型は、例えば、発色性、蛍光性、又は発光性であり得る。レポーター分子は、発光反応を仲介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）をコードするレポーター遺伝子、比色反応を仲介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）をコードする遺伝子、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）をコードする遺伝子、親和性ペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）をコードする核酸分子、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）をコードする遺伝子から、発現することができる。レポーター分子は、細胞内への核酸分子又は外来配列（プラスミド）の取り込みを成功させるためのマーカーとして使用することができる。レポーター分子はまた、標的遺伝子、標的核酸分子、標的細胞内分子、又は細胞の存在を示すために使用してもよい。レポーター分子は、細胞の生存能力を示すために使用することもできる。あるいは、レポーター分子は核酸、例えばアプタマー又はリボザイムでもよい。
【００８０】
いくつかの態様において、レポーター核酸分子は、プロモーターに機能できる形で結合している。他の態様において、プロモーターは、他の細胞ではなく特定の細胞（例えば特定の種）におけるプロモーターの活性に基づくレポーターシステムの反応性及び交差反応性に寄与するように選択又は設計することができる。特定の態様において、レポーター核酸分子は複製開始点を含む。他の態様において、標的細胞内のレポーター核酸分子の複製が、他の細胞ではなく特定の細胞（例えば特定の種）における複製開始点の活性に基づいてレポーターシグナル生成に寄与するか又はレポーターシグナル生成に必要とされる場合、複製開始点の選択は、レポーターシステムの反応性及び交差反応性に同様に寄与し得る。いくつかの実施態様においてレポーター核酸分子は、ウイルス複製中に子孫ウイルス中にパッケージングされ得るレプリコン（例えばコンカテマーＤＮＡとして）を形成する。他の態様においてレポーター核酸分子は、レポーターシステムの反応性及び交差反応性に同様に寄与し得るレポーター遺伝子の転写又は翻訳に影響を及ぼす因子（例えば、特異的リボソーム結合部位、コドン使用）を含む。
【００８１】
本明細書で使用される「転写体 (transcript)」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型配列又は遺伝子から転写されたある長さのヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指す。転写体は、ＲＮＡ鋳型から転写されたｃＤＮＡ配列、又はＤＮＡ鋳型から転写されたｍＲＮＡ配列でもよい。転写体は、タンパク質コード性又は非コード性でもよい。転写体はまた、遺伝子操作された核酸構築体から転写され得る。
【００８２】
本明細書中で使用される「標的転写体(target transcript)」は、標的遺伝子の転写中に形成されるものを含む標的細胞によって天然に形成されるＤＮＡ配列又はｍＲＮＡ、及び一次転写産物のＲＮＡプロセッシングの生成物であるｍＲＮＡの、ヌクレオチド配列の一部をいう。標的転写体は、細胞性転写体又は天然に存在する転写体と呼ぶこともできる。
【００８３】
核酸分子又は外来配列（例えば、プラスミド、ベクター、構築体）を指す場合、「細胞に導入する」とは、当業者に理解されるように、細胞への取り込み又は吸収を促進することを意味する。核酸構築体又は転写体の吸収又は取り込みは、支援されない拡散性又は活性な細胞プロセスを介して、又はバクテリオファージ、ウイルス、形質導入粒子、リポソーム、ポリマー、ウイルス様粒子、及び弾道手段の使用を介する補助物質又はデバイスによって行われる。この用語の意味は、インビトロの細胞に限定されない。核酸分子はまた「細胞に導入され」てもよく、ここで細胞は生きている生物の一部である。そのような場合、細胞への導入には生物への送達が含まれる。例えばインビボ送達のために、核酸分子、構築体、又はベクターを組織部位に注射するか、又は全身的に投与することができる。細胞へのインビトロ導入法には、形質転換、エレクトロポレーション、形質導入、及びリポフェクションなどの当該分野で公知の方法が含まれる。さらなるアプローチは、本明細書に記載されているか、又は当技術分野で公知である。
【００８４】
「抗菌剤感受性表現型の機序(mechanism for the antimicrobial susceptibility phenotype)」とは、抗菌剤に対して微生物に耐性又は感受性を付与することに関与する１つ以上の機序（例えば、１つ以上の遺伝子、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質）を指す。
【００８５】
本明細書中で使用される用語「分子」は、特に限定されないが、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などを含む任意の化合物を意味し、そのような化合物は天然又は合成であり得る。
【００８６】
「オリゴヌクレオチド分子」は、特定の標的核酸配列に結合する核酸を含む分子を指す。オリゴヌクレオチド分子は、一本鎖分子、二本鎖分子、アンチセンス分子、二本鎖ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、ＤＮＡｉなどを含む。典型的にはオリゴヌクレオチド分子は、標的核酸配列（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）に特異的に結合する。特定核酸配列へのオリゴヌクレオチド分子の結合は、典型的には、例えば核酸配列の発現の低下を介して、核酸配列の阻害をもたらす。特定核酸配列へのオリゴヌクレオチド分子の結合は、核酸配列の遮断又は破壊をもたらし得る。
【００８７】
「アンチセンス分子」は、ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合して遺伝子発現を阻害するアンチセンス活性を示す分子を指す。アンチセンス分子は一般に、その標的ＤＮＡ又はＲＮＡに対する相補的配列を有する核酸オリゴマーを含む。アンチセンス分子の例には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＭＯ）オリゴマーが含まれる。
【００８８】
「抗菌剤」は、１つ以上の微生物を死滅させ、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めることができる化合物を指す。抗菌剤には、抗生物質、抗真菌剤、抗原虫剤、抗ウイルス剤、及び他の化合物が含まれる。
【００８９】
「生存能力の検出可能な指標(detectable indication of viability)」とは、観察することができ、例えば対照細胞と比較した場合に、細胞が多かれ少なかれ生存可能であるか、又は生存能力が影響を受けるかどうかを示す、細胞に関連する指標であり、ここで対照細胞は、異なる事典の同じ細胞でも別の細胞でもよい。例としては、１つ以上のシグナル、１つ以上のレポーター、１つ以上のマーカー、その増殖又は欠如、光（例えば、ルシフェラーゼによって放出される光）又はその欠如などが含まれる。
【００９０】
ウイルスに基づくレポーター又はバクテリオファージに基づくレポーターは、レポーター遺伝子がそのゲノムに挿入されるように改変されたウイルス又はバクテリオファージをそれぞれ指すことができる。
【００９１】
「形質導入粒子」は、非ウイルス核酸分子を細胞に送達することができるウイルスを指す。ウイルスは、バクテリオファージ、アデノウイルスなどでもよい。形質導入粒子レポーターは、ウイルス又はバクテリオファージに基づくレポーターと同義であり得る。
【００９２】
「非複製性形質導入粒子(non-replicative transduction particle)」（ＮＲＴＰ）は、非ウイルス核酸分子を細胞に送達することができるウイルスを意味するが、それ自身の複製ウイルスゲノムを形質導入粒子にパッケージングしない。ウイルスは、バクテリオファージ、アデノウイルスなどでもよい。ＮＲＴＰ及びその作製方法は、２０１４年３月１３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６５３６号に詳細に記載されている。
【００９３】
「プラスミド」は、細胞内の染色体ＤＮＡとは物理的に離れており、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる小さなＤＮＡ分子である。最も一般的には細菌中の小さな円形の二本鎖ＤＮＡ分子として見出され、プラスミドは古細菌及び真核生物に存在することがある。プラスミドはレプリコンと考えられ、適切な宿主内で自律的に複製することができる。
【００９４】
「ベクター」は、遺伝物質を細胞に運ぶためのビヒクルとして使用することができる核酸を含む分子であり、そこで、組み込み、複製、及び/又は発現されることができる。
【００９５】
「ウイルス」は、他の生物の生きた細胞の中でしか複製しない小さな感染性の物質である。ウイルス粒子（ビリオンとして知られている）は、２つ又は３つの部分を含む：ｉ）遺伝情報を運ぶＤＮＡ又はＲＮＡ分子のいずれかから作られた遺伝物質。ｉｉ）この核酸を保護するタンパク質コート；ある場合には、ｉｉｉ）タンパク質コートを取り囲む脂質のエンベロープ。細菌に感染するウイルスに言及する場合、「ウイルス」、「ファージ」、及び「バクテリオファージ」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００９６】
「特異的結合(Specific binding)」とは、環境中の他の分子との結合よりも優先して、２つの分子が互いに結合する能力を指す。典型的には「特異的結合」は、反応における偶発的な結合より、少なくとも２倍、より典型的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍又はそれ以上のものを識別する。典型的には、解離定数によって定量される特異的結合反応の親和性（affinity）又は結合活性（avidity）は、約１０-7Ｍ又はそれ以上（例えば、約１０-8Ｍ、１０-9Ｍ又はそれ以上）の強さである。
【００９７】
「改善する(ameliorating)」という用語は、疾患状態の治療、例えばその予防、重症度又は進行の軽減、寛解又は治癒を含む、治療上有益な結果を指す。
【００９８】
用語「イン・サイチュ（in situ）」とは、生きている生物とは別に増殖している生きた細胞、例えば組織培養中で生育している細胞内で起きるプロセスを指す。
【００９９】
「インビボ」という用語は、生体内で起きるプロセスを指す。
【０１００】
本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、特に限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含む。
【０１０１】
「微生物」という用語は、古細菌（Archaea）ドメイン、真正細菌（Bacteria ）ドメイン、及び真核細胞（Eucarya）ドメイン由来の原核及び真核微生物種を意味し、後者は、酵母及び糸状菌、原生動物、藻類、又は高等原生生物（Protista）を含む。用語「微生物細胞」及び「微生物（microbe）」は、用語微生物（microorganism）と互換的に使用される。
【０１０２】
「マーカー」という用語は、特に限定されないが、脂質、リポタンパク質、タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ペプチド、核酸、遺伝子、及びオリゴヌクレオチドを、それらの関連複合体、代謝産物、突然変異体、変種、多型体、修飾物、断片、サブユニット、分解産物、要素、及び他の分析物、又は試料由来の測定値を含む。マーカーはまた、突然変異したタンパク質、突然変異した核酸、コピー数の変化、及び／又は転写変異体を含み得る。
【０１０３】
「試料」という用語は、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引物、洗浄試料、掻爬、外科的切開、拭き取り、又は介入若しくは当技術分野で公知の他の手段を含む手段によって、環境又は被験者から採取された体液の、単細胞、又は複数の細胞、又は細胞の断片、又はアリコートを含むことができる。
【０１０４】
「被験体」という用語は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロの、細胞、組織、又は生物、ヒト又は非ヒト（男性又は女性）を包含する。
【０１０５】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、及び「Ｕ」は、それぞれ一般にグアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを塩基として含むヌクレオチドを表す。「Ｔ」及び「ｄＴ」は、本明細書では互換的に用いられ、核酸塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシリボチミンをいう。しかし用語「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」又は「デオキシリボヌクレオチド」はまた、以下でさらに詳細に説明するように、修飾ヌクレオチド又は代用置換部分を指すことができることを理解されたい。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えることなく、他の部分によって置換され得ることを十分に承知している。例えば、特に限定されないが、イノシンをその塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成し得る。従ってウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、ヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含むヌクレオチドによって置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、実施態様である。
【０１０６】
本明細書中で使用される用語「相補的」は、当業者に理解されるように、第２のヌクレオチド配列と比較して第１のヌクレオチド配列を説明する時、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、ある条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし２本鎖構造を形成する能力を指す。相補的配列はまた、互いに結合するものとしても記載され、結合親和性により特徴付けられる。
【０１０７】
例えば、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする（例えばアニールする）場合、第１のヌクレオチド配列は第２のヌクレオチド配列に対して相補的であると記述することができる。ハイブリダイゼーション条件には、アニーリング及び／又は洗浄工程のための温度、イオン強度、ｐＨ、及び有機溶媒濃度が含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件という用語は、第１のヌクレオチド配列が、その標的配列、例えば第２のヌクレオチド配列に優先的にハイブリダイズし、その他の配列には、より低い程度でしかハイブリダイズしないか又は全くハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は配列依存性であり、異なる環境パラメータの下では異なる。
【０１０８】
一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでのヌクレオチド配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、完全に一致した標的配列に、第１のヌクレオチド配列の５０％が（規定されたイオン強度及びｐＨの下で）ハイブリダイズする温度である。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、例えば、Tijssen（1993）Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, chap. 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” Elsevier, N.Y. (“Tijssen”) に見いだされる。生体内で遭遇する可能性のある生理学的に関連する状態などの他の状態も該当することがある。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件のセットを決定することができるであろう。
【０１０９】
これは、第１及び第２のヌクレオチド配列の全長にわたって、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとの塩基対形成を含む。本明細書においてこのような配列は、互いに「完全に相補的」と称することができる。しかし本明細書において、第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得るか、又は、これらの最終用途に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイゼーションの際に１つ以上の、しかし一般的には４、３、又は２以下のミスマッチ塩基対を形成する。しかし２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、相補性の決定に関してそのようなオーバーハングをミスマッチと見なしてはならない。例えば、長さが２１ヌクレオチドの１つのオリゴヌクレオチドと長さが２３ヌクレオチドのもう１つのオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ（より長いオリゴヌクレオチドは、短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む）も、本明細書に記載の目的において「完全に相補的」と称することができる。
【０１１０】
本明細書で使用される「相補的」配列はまた、ハイブリダイズする能力に関する上記要件が満たされている限り、非ワトソン−クリック塩基対及び/又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を、含むか又はそれらから完全に形成されてもよい。そのような非ワトソン−クリック塩基対には、特に限定されないが、Ｇ：Ｕウォブル（Wobble）又はフーグシュタイン（Hoogstein）塩基対形成が含まれる。
【０１１１】
本明細書において「相補的」、「完全に相補的」、及び「実質的に相補的」という用語は、これらの使用の文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡの２本の鎖の間、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間、一本鎖ＲＮＡ配列又は一本鎖ＤＮＡ配列の相補鎖の間の塩基の一致に関して使用することができる。
【０１１２】
本明細書で使用される「二本鎖構造」は、２つの逆平行の及び実質的に相補的な核酸配列を含む。２つの転写体の間、転写体内の２つの領域の間、又は転写体と標的配列との間の核酸構築体中の相補配列は、「二本鎖構造」を形成することができる。一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載されているように、それぞれの鎖又は両方の鎖は、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド、及び／又は修飾ヌクレオチドを含むこともできる。二本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、又はこれらは別々のＲＮＡ分子であってもよい。２つの鎖が１つのより大きな分子の一部であり、従って、二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれの他の鎖の５’末端との間にヌクレオチドの中断されない鎖によって連結されている場合、連結しているＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。２つの鎖が、二本鎖構造を形成する一方の鎖の３  ’末端とそれぞれの他の鎖の５’末端との間にヌクレオチドの中断の中断されない鎖以外の手段によって共有結合している場合、連結している構造は「リンカー」と呼ばれる．ＲＮＡ鎖は、同じか又は異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、二本鎖の最短鎖中のヌクレオチド数から、２本鎖に存在するオーバーハングを差し引いた数である。一般に、二本鎖構造は、長さが１５〜３０、又は２５〜３０、又は１８〜２５、又は１９〜２４、又は１９〜２１、又は１９、２０、又は２１塩基対である。ある実施態様において、二本鎖は１９塩基対の長さである。別の実施態様において、二本鎖は２１塩基対の長さである。２つの異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて使用する場合、二本鎖の長さは同一であっても異なっていてもよい。
【０１１３】
本明細書で使用される用語「相補性の領域」は、本明細書で定義されるように、配列、例えば標的配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性の領域が標的配列と完全に相補的でない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容され、そして存在する場合は、一般に末端領域内で、例えば５’及び／又は３’末端の例えば、６、５、４、３、又は２ヌクレオチド以内にある。
【０１１４】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈においてパーセント「同一性」という用語は、後述の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ又は当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つ又は目視検査を使用して測定して、最大の一致について比較又は整列された場合、同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列をいう。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域、例えば機能ドメイン上に存在し得るか、あるいは比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。
【０１１５】
配列比較のために、典型的には１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次に配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【０１１６】
比較のための配列の最適な整列は、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) の相同性整列アルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的には、Ausubelら、以下参照）により行うことができる。
【０１１７】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの１つの例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公に入手可能である。
【０１１８】
「十分な量」という用語は、所望の効果を生成するのに充分な量、例えば細胞から検出可能なシグナルを生成するのに十分な量を意味する。
【０１１９】
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。治療有効量は、予防が治療とみなされ得るため「予防有効量」であり得る。
【０１２０】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【０１２１】
ＮＲＴＰ及びレポーターアッセイ
非複製性形質導入粒子（ＮＲＴＰ）及びＮＲＴＰを製造する方法は、国際公開第２０１４／１６０４１８号パンフレット及びＵＳ２０１５／０１０４７８７号に記載されている。いくつかの実施態様においてＮＲＴＰは、破壊／補完に基づく方法を用いて細菌細胞パッケージングシステムで製造される。この非複製性形質導入粒子パッケージングシステムは、ウイルス／ファージ製造中にそこからゲノムパッケージングが開始される要素として、ウイルス／ファージパッケージング機序によって認識されるウイルス／バクテリオファージのゲノムの成分中に、突然変異、サイレント突然変異、挿入、又は欠失を導入することに基づく。そのような要素の例としては、ｐａｃ型バクテリオファージのｐａｃ部位配列及びｃｏｓ型バクテリオファージのｃｏｓ部位配列が挙げられる。
【０１２２】
これらのパッケージング開始部位はしばしば、ウイルス／バクテリオファージ製造に必須である遺伝子のコード領域内に見出されるため、突然変異、サイレント突然変異、挿入、又は欠失が導入されると、ウイルス／ファージパッケージング機序によってｐａｃ部位がもはやパッケージング開始部位として認識されない。同時に、サイレント突然変異の場合、突然変異は、その部位がコードされている遺伝子を破壊しない。パッケージング部位配列を非機能性にすることにより、突然変異したウイルス／バクテリオファージは溶解サイクルを受けることができるが、そのゲノムＤＮＡをそのパッケージングユニットにパッケージングすることはできない。
【０１２３】
非機能性パッケージング開始部位配列を有するウイルス／ファージゲノムを用いて溶原化された宿主細菌細胞中に、プラスミドＤＮＡのような外因性レポーター核酸分子を導入することができる。外因性レポーター核酸分子は、天然の機能性パッケージング開始部位配列を含むことができ、パッケージング開始部位配列をコードする遺伝子が破壊される場合、外因性レポーター核酸分子は対応する未変性の機能遺伝子も含む。外因性レポーター核酸分子は宿主細菌細胞に導入され、細胞内で複製され得る。突然変異したウイルス／バクテリオファージが溶解サイクルを受けているとき、発現されたウイルス／ファージパッケージング機序は、機能性パッケージング開始部位配列を有する外因性レポーター核酸分子を、ウイルスパッケージングユニット中にパッケージングする。ウイルス／ファージゲノムは、そのパッケージング開始部位配列が破壊されているため、パッケージングユニットにパッケージングされない。
【０１２４】
従って、本発明は、細胞への導入のためにＮＲＴＰ内にレポーター核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムの使用を企図し、このパッケージングシステムは、
宿主細菌細胞と、
前記宿主細菌細胞内にあり、非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む第１の核酸構築体であって、ここで、前記非機能性パッケージング開始部位配列は、ＮＲＴＰ内へのバクテリオファージゲノムのパッケージングを防止する、前記第１の核酸構築体と、
前記宿主細菌細胞内にありかつ前記第１の核酸構築体から離れて存在し、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、ＮＲＴＰへの前記レポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列とを含む第２の核酸構築体であって、ここで、前記第２の核酸構築体上の機能性の第２のパッケージング開始部位配列は、前記第１の核酸構築体上のバクテリオファージゲノム内の非機能性パッケージング開始部位配列を補完する、前記第２の核酸構築体とを、含む。
【０１２５】
いくつかの実施態様において、構築体（ＮＲＴＰを含む）は、レポーター遺伝子を含むレポーター核酸分子を含む。レポーター遺伝子はレポーター分子をコードすることができ、レポーター分子は検出可能マーカー又は選択マーカーであり得る。特定の実施態様において、レポーター遺伝子は、細胞内で発現された場合に検出可能なシグナルを製造するレポーター分子をコードする。
【０１２６】
特定の実施態様においてレポーター分子は、特に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）又はｍＣｈｅｒｒｙ、ならびに近赤外蛍光タンパク質などの蛍光性レポーター分子でもよい。
【０１２７】
他の実施態様において、レポーター分子は、発光反応を仲介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃなど）であり得る。レポーター分子は、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、比色検出に適した酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、免疫検出に適したタンパク質、例えば親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、アプタマーとして機能するか又は酵素活性（リボザイム）を示す核酸、又は抗生物質耐性遺伝子（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）などの選択可能なマーカーでもよい。当技術分野で公知の他のレポーター分子を、標的核酸又は細胞を検出するためのシグナルを生成するために使用することができる。
【０１２８】
他の態様において、レポーター分子は核酸分子を含む。いくつかの態様において、レポーター分子は、特異的結合活性を有するか又は酵素活性（例えば、アプタザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイム）を示すアプタマーである。
【０１２９】
標的細胞内酵素によってケージ化することができないケージ化基質分子を使用する生存細胞内の細胞内酵素を検出するためのシステムが開示される。
【０１３０】
細胞レポーター核酸分子の送達は、エレクトロポレーション、化学的、遺伝子銃、及びガラスビーズ形質転換、形質導入、トランスフェクション、ベクター、結合を含む種々の手段、特に限定されないが、バクテリオファージ、ウイルス、スフェロプラスト、リポソーム、ウイルス様粒子、脂質−ＤＮＡ複合体、リポプレックス、ポリマー−ＤＮＡ複合体、ポリプレックスなどを含む核酸送達ビヒクルを介する送達を含む手段により行われる。
【０１３１】
オリゴヌクレオチド分子及び抗菌剤感受性機序の決定
本明細書には、生物の本体、及び生物に抗菌剤耐性又は感受性を付与する機序を決定するための方法が開示される。これらの方法は、生物の生存能力及び／又は選択可能な又は生存可能なマーカー／シグナルを生成する能力に連結された生物の特定の機能を抑制することにより、細胞−レポーターシステム中の生物の特定の株及び種から生成されるシグナル、生存能力、及び／又は増殖を抑制することを含む。
【０１３２】
いくつかの実施態様において、生物の特定の株及び種から生成されるシグナル、生存能力、及び／又は増殖の抑制は、非標的生物におけるＤＮＡ又はＲＮＡの標的化によって達成される。これらの非標的生物のシグナル、生存能力、及び／又は増殖を抑制する目的のためのレポーターアッセイの標的ではない生物における核酸分子の標的化は、株及特異的び種特異的な分子が設計によって標的とされるオリゴヌクレオチド制御を用いて達成することができる。この意味において「標的化」は、相補的な配列を介して標的核酸にハイブリダイズすることができる分子を用いて達成される。
【０１３３】
本明細書に開示される例示的な標的は、本出願に記載された非限定的な例であり、これらの例を超えて、遺伝子、転写体、非コードＲＮＡなどを含むオリゴヌクレオチド分子が結合することができる任意の配列標的に拡張することができる。オリゴヌクレオチド分子は、異なる配列を標的とする複数のオリゴヌクレオチド分子を単一のアッセイに組み込むことによって、単一の配列又は複数の配列を標的とするために使用され得る。このように、アッセイは、単一遺伝子、異なる遺伝子、又は単一遺伝子の異なる変異体を標的とすることができる。
【０１３４】
オリゴヌクレオチド分子は、特に限定されないが、核酸オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、ＤＮＡマイナーグルーブ結合ポリアミド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ホスホロチオエート、２’−メトキシ−、２’−メトキシエトキシ−、モルホリノ、ホスホラミデート等を含む任意のタイプであり得る。
【０１３５】
オリゴヌクレオチド分子の送達は、分子の外因的な添加又はそのイン・サイチュ（in situ）発現を介して達成され得る。外因性送達は、ペプチドへの分子の結合、又は、特に限定されないが、リポソームによる送達などを含む他の手段によって促進される。標的生物内でオリゴヌクレオチドを発現するように設計された核酸によって仲介されるイン・サイチュ（in situ）発現は、標的生物中に核酸を送達する任意の手段、例えばエレクトロポレーション、化学的、遺伝子銃、及びガラスビーズ形質転換、形質導入、トランスフェクション、ベクター、結合を含む種々の手段、特に限定されないが、バクテリオファージ、ウイルス、スフェロプラスト、リポソーム、ウイルス様粒子、脂質−ＤＮＡ複合体、リポプレックス、ポリマー−ＤＮＡ複合体、ポリプレックスなどを含む核酸送達ビヒクルを介する送達を含む手段により行われる。
【０１３６】
細胞レポーター核酸分子の送達は、エレクトロポレーション、化学的、遺伝子銃、及びガラスビーズ形質転換、形質導入、トランスフェクション、ベクター、結合を含む種々の手段、特に限定されないが、バクテリオファージ、ウイルス、スフェロプラスト、リポソーム、ウイルス様粒子、脂質−ＤＮＡ複合体、リポプレックス、ポリマー−ＤＮＡ複合体、ポリプレックスなどを含む核酸送達ビヒクルを介する送達を含む手段により行われる。
【０１３７】
アンチセンスＲＮＡ制御は、アンチセンスＲＮＡが別のＲＮＡ分子に結合するプロセスを介して自然界で起こる（１）。アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（２）、及びホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）オリゴマーは、細胞内核酸標的に結合するように設計されている。例えば、天然のアンチセンスＲＮＡ調節（３〜５）と類似の様式で細胞内の遺伝子発現を調節するために、ＰＮＡが使用されている。アンチセンス分子は、特に限定されないが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、ＤＮＡマイナーグルーブ結合ポリアミド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ホスホロチオエート、２’−メトキシ−、２’−メトキシエトキシ−、モルホリノ、ホスホラミデートなどを含む任意のタイプであり得る。アンチセンス分子の送達は、特に限定されないが、リポソームによる送達、ペプチドへの結合、アンチセンス分子を転写するように設計されたＤＮＡ送達ビヒクルを介する送達などにより促進され得る。ペプチド−ＰＮＡペプチドに結合したＰＮＡである。ペプチド−ＰＮＡは、細菌中のＲＮＡ分子を標的とするために使用されており、ここでペプチドは細菌への分子の取り込みを促進するように設計されている（６）。
【０１３８】
アンチセンス分子は、細菌の特定の菌株及び種を標的とするように設計することができる（７）。目的の細菌のゲノムを分析することにより、標的化が細菌の１つの種に特異的であり他の種には特異的ではないような方法で、必須遺伝子を標的とするアンチセンス分子標的のセットを同定することができる。このようにして、アンチセンス分子は、細菌の個々の種を抑制するように調整することができる。
【０１３９】
オリゴヌクレオチド及びオリゴマーは、リポソーム及びペプチドへの結合を含む、細胞への取り込みを促進する様々な機序を介して、細胞内に送達することができる。ペプチド−ＰＮＡはペプチドに結合したＰＮＡである。ペプチドが細菌中への分子の取り込みを促進するように設計されるように、ペプチド−ＰＮＡが細菌中のＲＮＡ分子を標的とするために使用されている（Good, L. and P.E. Nielsen、国際公開第２００２／０２７９４６７号）。
【０１４０】
アンチセンス分子は、細菌の特定の株及び種を標的とするように設計することができる（Mondhe, M., et al., Species-Selective Killing of Bacteria by Antimicrobial Peptide-PNAs. PLoS ONE, 2014. 9(2): p. e89082）。目的の細菌のゲノムを分析することにより、標的化が細菌の１つの種に特異的であり他の種には特異的ではない方法で、必須遺伝子を標的とするアンチセンス分子標的のセットを同定することができる。このようにして、アンチセンス分子は、細菌の特定の個々の種を抑制するように調整することができる。
【０１４１】
ある実施態様において、抗菌剤耐性機序の発現などの標的表現型の発現をノックダウンするように、システムが設計される。オリゴヌクレオチド分子は、耐性遺伝子の転写体を標的とするように設計することができ、その結果、通常抗菌性化合物に対して耐性である微生物が、標的化オリゴヌクレオチドへの暴露により、その化合物に対して感受性になる。
【０１４２】
外因性オリゴヌクレオチドを使用することに加えて、標的化オリゴヌクレオチドは、標的生物に送達されたＤＮＡからインビボで製造され得る。この実施態様においてＤＮＡは、目的の転写体を標的とするように設計されたアンチセンスＲＮＡ分子を転写するように設計される。
【０１４３】
別の実施態様において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いることができる：最も典型的にはＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を標的にしてｍＲＮＡに結合してこれを分解することにより、二本鎖ＲＮＡ断片（ｄｓＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれる）が、触媒的に仲介される遺伝子サイレンシングを引き起こすプロセス。ｍＲＮＡ又はＤＮＡへのｄｓＲＮＡ分子鎖のアニーリングは、細胞内のリボヌクレアーゼにより、又はアンチセンス化合物自体による標的ＲＮＡの切断により、二本鎖ＲＮＡ、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖、又は前駆体ｔＲＮＡに似ている二本鎖ＲＮＡの迅速な分解をもたらし得る。
【０１４４】
ＲＮＡｉ経路は多くの真核生物中に見出され、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をｓｉＲＮＡと呼ばれる約２０ヌクレオチドの短い二本鎖断片に切断する酵素Ｄｉｃｅｒによって開始される。各ｓｉＲＮＡは巻き戻されて、２本の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、すなわちパッセンジャー鎖とガイド鎖になる。パッセンジャー鎖は分解され、ガイド鎖はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。転写後遺伝子サイレンシングでは、ガイド鎖塩基はメッセンジャーＲＮＡ分子中の相補的配列と対合し、ＲＩＳＣ複合体の触媒成分であるアルゴノート（Argonaute）と呼ばれるタンパク質によって、切断が誘導される。
【０１４５】
オリゴヌクレオチドと標的転写体との相互作用は、両方の転写体（例えば「キッシング複合体（kissing complex）」）間の、又はループと一本鎖（ｓｓ）領域間の塩基対形成に依存し得る。ある場合には、キッシング複合体の形成は、相互作用の所望の作用を仲介するのに十分であり、他の場合には、１次接触物の増殖は相互作用を引き起こし、所望の作用をもたらす。
【０１４６】
標的オリゴヌクレオチドのインビボ産生を使用する別の実施態様は、外来ＤＮＡに対する防御として細菌中に見出された規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムに基づく（８）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、転写されＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされた標的配列を組み込むことによって、目的のＤＮＡ配列を標的とするように設計することができる。このシステムはまた、トランス活性化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を発現し、Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｃｒＲＮＡにより形成される複合体は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、ｃｒＲＮＡによって標的とされる標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断を形成することを可能にする。この実施態様において、ｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチドはセンス方向又はアンチセンス方向に設計することができ、転写体を標的とする代わりにこのシステムはＤＮＡを標的とし、従って染色体内で又はエピソーム的にコードされる生物特異的ＤＮＡ配列又は抗生物質耐性遺伝子を標的とするように設計される。
【０１４７】
微生物感染症に対する治療薬を開発する目的で、上記技術と同様の技術が当該分野で使用されている（９〜１０）。本明細書にさらに記載されるように、これらの技術は、細菌検出システムを可能にする目的で、及び抗菌剤耐性又は感受性表現型に連結した特異的機序を決定する目的で使用される。
【０１４８】
耐性遺伝子の特異的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を設計することにより、表現型に連結している特異的機序を決定することができる。例えば、微生物が問題の抗菌剤に耐性であると判定され、オリゴヌクレオチド分子の存在下では同じ抗菌剤に対して感受性であると判定された場合、この結果は、オリゴヌクレオチド分子が標的とするように設計された特異的抗菌性遺伝子が、抗菌剤耐性表現型に連結していることを示している。
【実施例】
【０１４９】
実施例１
腸内細菌科微生物のレポーター中の大腸菌由来シグナルの排除
この実施例では、腸内細菌科微生物のレポーターシステムを、大腸菌を標的とするペプチド−ＰＮＡと共に使用した。ペプチド−ＰＮＡを使用しない場合、腸内細菌科のレポーターシステムは、腸内細菌科（肺炎桿菌と大腸菌の両方を含む）からの検出可能なシグナルを生成する。ペプチド−ＰＮＡを添加すると、腸内細菌科のレポーターシステムは、大腸菌を除く腸内細菌科微生物からシグナルを生成した。このシステムは、オリゴヌクレオチドの有無にかかわらず使用することができ、標的生物の存在は、ペプチド−ＰＮＡが無い場合シグナルが存在し、ペプチド−ＰＮＡがある場合にはシグナルが存在しないという結果によって決定することができる。あるいは、大腸菌及び肺炎桿菌の両方を含み得る試料では、オリゴヌクレオチドの存在下でのアッセイの実行は、肺炎桿菌が試料中に存在するかどうかの決定を可能にする。この例では、肺炎桿菌のみを含む試料は、大腸菌も試料中に存在するか否かにかかわらずシグナルを生成し、一方大腸菌のみを含む試料はシグナルを生成しない。このようにして、ペプチド−ＰＮＡを使用して、種特異的細菌検出を達成することができる。
【０１５０】
ペプチド−ＰＮＡは、（７）に従って大腸菌の必須遺伝子を標的とするように設計された。簡単に説明すると、目的の種に存在する必須遺伝子相同体を同定するために、大腸菌及び肺炎桿菌のゲノムを分析した。この分析から、各遺伝子の翻訳開始領域（ＴＩＲ）のリスト、すなわちゲノム中のＴＩＲの２０塩基対（開始コドンに対して−１０〜＋１０塩基）を集めた。遺伝子ホモログ由来の２０塩基対のＴＩＲを整列させ、種間の塩基対ミスマッチの数を決定した。ＴＩＲ内の領域を標的とする９〜１２ｂｐのアンチセンス配列を用いて、ＰＮＡを設計した。ＰＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の予測された熱安定性が決定され、２塩基対を超えるミスマッチのカットオフを用いて、標的種内のＰＮＡの可能な結合部位のゲノム解析を行った。
【０１５１】
この解析から、各ＰＮＡの潜在的結合部位は、例えば１つのＰＮＡが１つの種のホモログに結合するが、他の１つの種のホモログに結合するが他の種のホモログには結合せず、その逆も真である、遺伝子相同体について同定することができる。ｍｕｒＡ遺伝子を標的とする大腸菌特異的ＰＮＡは、配列番号１に記載の配列であることが確認された。従って、この配列を標的とするペプチド−ＰＮＡは、大腸菌ｍｕｒＡに結合するが肺炎桿菌ｍｕｒＡには結合しないと予測される。
【０１５２】
このペプチドは細菌細胞へのＰＮＡの浸透を促進することが証明されているため、（１１）に従ってペプチドＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ（配列番号１０）にＰＮＡを結合させた。すなわち大腸菌ｍｕｒＡ標的化ペプチド−ＰＮＡの配列は以下の通りである：ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ−ｅｇ−ｃｃａｔｔｔａｇｔｔ（ｍｕｒＡ  ＰＮＡ）（ここで、ｅｇは［２−［２−（Ｆｍｏｃ−アミノ）エトキシ］エトキシ］酢酸から得られるエチレングリコールリンカーである）。
【０１５３】
大腸菌及び肺炎桿菌の増殖に対するｍｕｒＡ  ＰＮＡの作用：
大腸菌及び肺炎桿菌の増殖に対するｍｕｒＡ  ＰＮＡの作用を調べた。ｍｕｒＡ  ＰＮＡの存在下で大腸菌及び肺炎桿菌を培養した場合、大腸菌の増殖は弱められたが、肺炎桿菌の増殖は弱められなかった。
【０１５４】
大腸菌及び肺炎桿菌の分離株をＬＢ中で３７℃で一晩増殖させ、翌日１：１００希釈で新鮮なＬＢに継代培養し、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）が０．２になるまで増殖させた。各細菌種の約１０4ＣＦＵの各菌株の接種材料を、５０μＬのＬＢ又は４．５μＭの最終濃度のｍｕｒＡ  ＰＮＡを含むＬＢを含むマイクロプレートの別々のウェルに添加した。ＰＮＡ処理細胞及びＰＮＡ未処理細胞の増殖を評価するために、ＯＤ６００の読み取り値を８時間にわたって測定した。
【０１５５】
図１は、大腸菌の増殖実験の結果を示す。ＰＮＡの存在下では、大腸菌の増殖が弱められた。図２は、肺炎桿菌の増殖実験の結果を示す。ＰＮＡの存在下で、肺炎桿菌の増殖は弱められなかった。これらの結果は、ｍｕｒＡ  ＰＮＡが大腸菌の増殖を特異的に阻害し、肺炎桿菌の増殖を阻害しないことを示す。
【０１５６】
大腸菌及び肺炎桿菌を試験する際の腸内細菌科微生物のレポーターの発光に対するｍｕｒＡ  ＰＮＡの作用：
大腸菌及び肺炎桿菌の分離株をＬＢ中で３７℃にて一晩増殖させ、翌日１：１００希釈で新鮮なＬＢに継代培養し、ＯＤ６００が０．２になるまで増殖させた。各細菌種の約１０4ＣＦＵの各菌株の接種材料を、５０μＬのＬＢ又は４．５μＭの最終濃度のｍｕｒＡ  ＰＮＡを含むＬＢを含むマイクロプレートの別々のウェルに添加した。次に、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６５３６号の実施例１に記載されているように、全てのウェルに１００ｕＬの腸内細菌科微生物の発光レポーター非複製性形質導入粒子を加え、試料を３０℃で２時間インキュベートした。インキュベーション時間後、プレートを、Molecular Devices SpectraMax L マイクロプレートルミノメーターを用いて発光についてアッセイし、発光測定値を読み取りながら、トリデカナールの溶液を各ウェルに注入した。
【０１５７】
図３は、大腸菌及び肺炎桿菌に対する発光実験の結果を示す。ＰＮＡの存在下では、大腸菌によって生成された発光シグナルは弱められたが、肺炎桿菌によって生成された発光シグナルは弱められなかった。これらの結果は、ｍｕｒＡ  ＰＮＡが大腸菌からのシグナル生成を特異的に阻害し、肺炎桿菌からのシグナル生成を阻害せず、腸内細菌科微生物のレポーターシステム及び大腸菌特異的ペプチドを用いて大腸菌と肺炎桿菌とを区別する能力を証明している。
【０１５８】
実施例２
ペプチド−ＰＮＡを用いたＡＳＴ抗菌ディスク拡散試験によるＣＲＥ表現型に連結した特異的カルバペネマーゼの測定
この実施例では、ＣＲＥ表現型に連結した特異的機序を決定するために、ＣＲＥ株にペプチド−ＰＮＡを添加してＡＳＴ抗菌ディスク拡散試験を行った。ペプチド−ＰＮＡを使用しない場合、ＣＲＥはカルバペネム耐性の結果を示す。特定のカルバペネマーゼ遺伝子を標的とするように設計されたペプチド−ＰＮＡを添加し、ＡＳＴ結果がカルバペネム感受性（ＣＳＥ）表現型に変化する場合、これはペプチド−ＰＮＡによって標的とされるカルバペネマーゼ遺伝子が、ＣＲＥ表現型に連結した機序であることを示す。このようにして、ペプチド−ＰＮＡを用いて、細菌の抗菌剤耐性表現型に連結した特異的機序を決定することができる。
【０１５９】
ペプチド−ＰＮＡは、大腸菌のｂｌａKPC-3及びｂｌａNDM-1転写体を標的とするように設計される。簡単に説明すると、ｂｌａKPC-3及びｂｌａNDM-1遺伝子をそれぞれ発現する大腸菌の２つの臨床分離株である大腸菌１２８９０１２及び大腸菌１２８９０１４における標的遺伝子の遺伝子配列を分析して、各遺伝子についてＴＩＲの配列を同定する（表１、配列番号１１及び１２）。ＴＩＲ内の領域を標的とする９〜１２ｂｐのアンチセンス配列を用いて、潜在的なＰＮＡを設計する。この分析から、ｂｌａKPC-3（配列番号２）及びｂｌａNDM-1（配列番号３）遺伝子を標的とするための、ＰＮＡの潜在的結合部位を同定することができる。
【０１６０】
ペプチドＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫは、細菌細胞へのＰＮＡ浸透を容易にすることが証明されているため、（１１）に従って、ＰＮＡをこのペプチドに結合させる。
【０１６１】
ＡＳＴ試験ディスク拡散試験：
ディスク拡散試験は、ＣＬＳＩ−Ｍ０２（１２）に従って行われ、Ｍ１００−Ｓ２２（１３）に従って解釈される。簡単に説明すると、各細菌をメロペネムに対する感受性について試験するために、ミューラー・ヒントン寒天培地（ＭＨＡ）プレートを細菌培養物の懸濁液に浸漬した滅菌綿棒を使用して、０．５マクファーランド（McFarland）標準で接種して、ＭＨＡの全表面がカバーされるようにした。接種したプレートの表面に１０μｇのメロペネムディスクを適用し、３５℃にて周囲空気中で１６〜１８時間インキュベートする。メロペネムディスクの周りの阻害ゾーンの直径が２３ｍｍ以上の場合、細菌株はメロペネムに対して感受性であり、ゾーン直径が１９ｍｍ以下である場合、メロペネムに対して耐性であると判定される。
【０１６２】
大腸菌１２８９０１２，１２８９０１４、ＣＳＥでありカルバペネマーゼを発現しない対照大腸菌１２８９０１８、及びＣＲＥでありＶＩＭカルバペネマーゼを発現する対照株である大腸菌１２８９０１１を、ディスク拡散法によりメロペネム耐性について試験する。図４の第２行は、大腸菌株の典型的なメロペネムディスク拡散結果を示し、ここで１２８９０１１，１２８９０１２、及び１２８９０１４はＣＲＥであり、１２８９０１８はＣＳＥである。
【０１６３】
メロペネム耐性表現型に連結した特異的な機序を決定するために、ｂｌａKPC-3−及びｂｌａNDM-1−ペプチド−ＰＮＡを含む１０μｇのメロペネムディスクを用いて、ディスク拡散試験を行う。ペプチド−ＰＮＡが、大腸菌株におけるメロペネム耐性に連結した特定のカルバペネマーゼを阻害する場合、観察されるゾーン直径は、メロペネムのみを含むディスクに暴露された場合の株のゾーン直径と比較して、低下している。
【０１６４】
図４は、大腸菌１２８９０１１，１２８９０１２，１２８９０１４、及び１２８９０１８についての典型的なメロペネム／ペプチド−ＰＮＡディスク拡散結果を示す。図において、４０１は、ＭＨＡ及び寒天の表面上で増殖した細菌のローン（lawn）を含むシャーレの上面図を示し、４０２は、４０１の表面上に置かれたディスクを示し、４０３は、ディスク４０２の内容物に起因する細菌のローン上に生じるゾーンの直径を示す。
【０１６５】
図の一番上の行は、ペプチド−ＰＮＡ単独では大腸菌株に対して阻害作用を有さないことを証明している。第３行は、１２８９０１１はゾーン径が≧２３ｍｍであるためＣＲＥであることを証明し、ＣＲＥ表現型に連結した機序は、ｂｌａKPC-3ペプチド−ＰＮＡの存在下でゾーンの直径がメロペネム単独の場合と比較して低下していないため、ｂｌａKPC-3ではないこと証明し、１２８９０１２はゾーン直径が低下しているため、ｂｌａKPC-3がＣＲＥ表現型に連結した機序であるＣＲＥであることを証明し、１２８９０１４はゾーン直径が低下していないためＣＲＥであり、ＣＲＥ表現型に連結した機序はｂｌａKPC-3ではないことを証明している。第４行は、１２８９０１１はゾーン直径が≧２３ｍｍであるためＣＲＥであり、ＣＲＥ表現型に連結した機序は、ｂｌａNDM-1ペプチド−ＰＮＡの存在下で、ゾーンの直径がメロペネム単独の場合と比較して低下していないためｂｌａNDM-1ではなく、１２８９０１２はゾーン直径が低下していないためＣＲＥであり、ＣＲＥの表現型に連結した機序はｂｌａNDM-1ではなく、１２８９０１４はゾーン直径が低下しているためＣＲＥであり、ｂｌａNDM-1はＣＲＥ表現型に連結した機序であることを証明している。
【０１６６】
これらの結果から、大腸菌の各株のカルバペネム耐性に連結した根底にある機序は、１２８９０１２ではｂｌａKPC-3、１２８９０１４ではｂｌａNDM-1、１２８９０１１ではｂｌａKPC-3でもｂｌａNDM-1でもないと判定することができる。
【０１６７】
実施例３
ペプチド−ＰＮＡを用いたＡＳＴ細胞レポーター試験によるＣＲＥ表現型に連結した特異的カルバペネマーゼの測定
この例では、実施例２に記載されたＡＳＴ技術が、細胞レポーターアッセイに基づくＡＳＴ試験に拡張される。ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６５３６号の実施例１に記載されている腸内細菌科の細胞レポーターを用い、アッセイを以下のように行う。簡単に説明すると、大腸菌１２８９０１１，１２８９０１２，１２８９０１４、及び１２８９０１８の培養物を調製し、５０μＬのＬＢを含むマイクロウェルプレートのウェルに接種試料５０μＬを接種して、各ウェルが１０4ＣＦＵの細菌の各株を受けるようにする。ウェルのセットは追加の添加物を含まず、別のウェルのセットは５μｇ／ｍＬのメロペネムを含み、別のウェルのセットは５μｇ／ｍＬのメロペネムとｂｌａKPC-3−ペプチド−ＰＮＡを含み、別のウェルのセットは５μｇ／ｍＬのメロペネムとｂｌａNDM-1ペプチド−ＰＮＡを含み、別の２セットのウェルはそれぞれｂｌａKPC-3又はｂｌａNDM-1ペプチド−ＰＮＡのみを含む。またすべてのウェルには腸内細菌科のレポーター１００μＬも加える。次に、試料を３０℃で２時間インキュベートし、次に試料を実施例１に記載したように発光についてアッセイする。
【０１６８】
図５は、細胞レポーターＡＳＴアッセイの結果を示し、＋はレポーターアッセイが陽性結果を与え、−はレポーターアッセイが陰性結果を与えたことを示す。
【０１６９】
第１列は、腸内細菌科のレポーターが全ての大腸菌株について陽性シグナルを与えることを示す。第５列は、ペプチド−ＰＮＡが大腸菌株のいずれにおいても陽性結果を阻害しないことを証明している。第２列は、１２８９０１８以外の大腸菌株のすべてがメロペネムの存在下で陽性シグナルを与え続けるため、１２８９０１８を除いて大腸菌株の全てがＣＲＥであることを証明している。第３列は、１２８９０１１及び１２８９０１４は、メロペネム及びｂｌａKPC-3ペプチド−ＰＮＡの存在下では陽性シグナルを生成し続けるためＣＲＥであり、ＣＲＥ表現型に連結した機序はｂｌａKPC-3ではないことを証明し、１２８９０１２は、メロペネム及びｂｌａKPC-3ペプチド−ＰＮＡの存在下で、もはや陽性シグナルを生成しないためＣＲＥであり、ｂｌａKPC-3はＣＲＥ表現型に連結した機序であることを証明している。第４列は、１２８９０１１及び１２８９０１２は、メロペネム及びｂｌａNDM-1ペプチド−ＰＮＡの存在下では陽性シグナルを生成し続けるため、ＣＲＥであり、ＣＲＥ表現型に連結した機序はｂｌａNDM-1ではなく、１２８９０１４は、メロペネム及びｂｌａNDM-1ペプチド−ＰＮＡの存在下では、もはや陽性シグナルを生成しないためＣＲＥであり、ｂｌａNDM-1はＣＲＥ表現型に連結した機序であることを証明している。
【０１７０】
これらの結果から、大腸菌の各株のカルバペネム耐性表現型に連結した機序は、１２８９０１２ではｂｌａKPC-3であり、１２８９０１４ではｂｌａNDM-1であり、１２８９０１１ではｂｌａKPC-3及びｂｌａNDM-1のいずれでもないと決定することができる。
【０１７１】
実施例４
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＡＳＴ細胞レポーター試験による非感受性表現型に連結した特異的β−ラクタマーゼの測定
この実施例では、実施例３に記載のＡＳＴ技術を改変して、プラスミドにコードされたβ−ラクタマーゼ遺伝子を標的とするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ＣＲＥ表現型に連結した特異的β−ラクタマーゼを測定する。
【０１７２】
ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６５３６号の実施例１に記載の腸内細菌科微生物の細胞レポーターは、それぞれカルバペネム耐性及び伸長β−ラクタム耐性遺伝子であるｂｌａNDM-1及びｂｌａSHV-18遺伝子（表１、配列番号１１及び１３）を標的とする配列を担持するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を有する単一ガイド［１４］ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを担持するレポータープラスミドを用いる設計されている。レポータープラスミドｐＧＷＰ１０００１は、ｃａｓ９遺伝子、ＰL(tetO-1)プロモーターの制御下にあるｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＣＲＩＳＰＲクローニング部位を含むように改変され、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はｂｌａNDM-1（配列番号４）及びｂｌａSHV-18（配列番号５）遺伝子を標的とするように設計され、それぞれをｐＧＷＰ１０００１／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターにクローニングして、ｂｌａNDM-1とｂｌａSHV-18遺伝子を同時に標的とするレポータープラスミドを作製する。
【０１７３】
前記ベクターを使用して、各プラスミドを担持する非複製性形質導入粒子を生成し、これらは、β−ラクタム非感受性の原因となる機序を決定するためのレポーターシステムにおいて使用される。簡単に説明すると、大腸菌１２８９０１８（ｂｌａNDM-1、ｂｌａSHV-18陰性）、１２８９０２３（ｂｌａNDM-1陽性）、１２８９０２７（ｂｌａSHV陽性）、及び１２８９０１１（ｂｌａVIM陽性）の培養物を調製し、これらを使用して、５０μＬのＬＢを含有するマイクロウェルプレートに５０μＬの接種物を加えて、各ウェルに１０4ＣＦＵの細菌の各株が入いるようにする。これらのウェルに、１００μＬの以下のものを加える：ウェルのセットは５μｇ／ｍＬのメロペネムとｂｌａNDM-1標的化ＮＲＴＰを含み、別のセットのウェルは５μｇ／ｍＬのメロペネムとｂｌａSHV-18−ＮＲＴＰを含み、別のセットのウェルは５μｇ／ｍＬのセフタジジムとｂｌａNDM-1標的化ＮＲＴＰを含み、別のセットのウェルは５μｇ／ｍＬのセフタジジムとｂｌａSHV-18−ＮＲＴＰを含む。次に、試料を３０℃で２時間インキュベートし、次に試料を、実施例１で記載されたように発光についてアッセイする。
【０１７４】
図６は、細胞レポーターＡＳＴアッセイの結果を示し、＋はレポーターアッセイが陽性結果を与えたことを示し、−はレポーターアッセイが陰性結果を与えたことを示す。
【０１７５】
第１行は、ＮＲＴＰがアッセイに含まれているかどうかにかかわらず、１２８９０１８株がメロペネムとセフタジジムによって阻害され、従ってｂｌａNDM-1及びｂｌａSHV-18のいずれも担持しない可能性があることを示す。第２行は、１２８９０２３株がｂｌａNDM-1標的化ＮＲＴＰの存在下でのみβ−ラクタムによって阻害され、従ってｂｌａNDM-1遺伝子を有する可能性があることを示す。第３行は、１２８９０２７株がメロペネムの存在下で阻害され、そしてｂｌａSHV-18標的化ＮＲＴＰの存在下でのみ、セフタジジムの存在下でのみ阻害され、従ってｂｌａSHV-18遺伝子を担持する可能性があることを示す。第４行は、アッセイにＮＲＴＰが含まれているにもかかわらず、１２８９０１１株はβ−ラクタムのいずれによっても阻害されず、従って、ｂｌａNDM-1のみによっては仲介されないカルバペネム耐性機序を担持する可能性があることを示す。
【０１７６】
これらの結果から、１２８９０２３株のβ−ラクタム耐性表現型に連結した機序は、ｂｌａNDM-1であり、１２８９０２７株ではｂｌａSHV-18であると判定することができる。
【０１７７】
実施例５
バンコマイシン耐性腸球菌アッセイ
別の実施態様において、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の検出のためのアッセイを開発することができる。
ＶＲＥは、ｖａｎＡ及びｖａｎＢ遺伝子を含む耐性遺伝子を介してバンコマイシン耐性を獲得した腸球菌属菌種からなる。腸球菌属菌種は、他のバンコマイシン耐性遺伝子を担持し、他のバンコマイシン耐性表現型（ＶａｎＣ−１、ｖａｎＣ−２、及びｖａｎＣ−３を含む遺伝子によってコードされるＶａｎＣ表現型）を発現するが、そのような生物はＶＲＥとはみなされない。
【０１７８】
この実施例では、腸球菌細胞レポーターを、バンコマイシン及びｖａｎＣ−２遺伝子発現を標的とするアンチセンス分子と組み合わせて用いる。このアッセイは、ＶＲＥの検出を可能にし、及びバンコマイシン感受性腸球菌（ＶＳＥ）と、ｖａｎＡ又はｖａｎＢ遺伝子ではなくｖａｎＣ−２遺伝子を発現する腸球菌との識別を可能にする。腸球菌レポーターは、腸球菌属菌種に検出可能なシグナルを生成させるように設計されている。ペプチド−ＰＮＡは、ｖａｎＣ−２転写体を標的とするように設計されている。ｖａｎＣ−２遺伝子（表１、配列番号１４）を発現する臨床分離株であるイー・カゼイリフラブス（E. casseliflavus）１２７９０１５中の標的遺伝子の遺伝子配列を分析して、その遺伝子のＴＩＲの配列を同定する。ＴＩＲ内の領域を標的とする９〜１２ｂｐのアンチセンス配列を用いて、潜在的なＰＮＡを設計する。この分析から、ｖａｎＣ−２遺伝子（配列番号６）を標的とするために、ＰＮＡの潜在的結合部位を同定することができる。
【０１７９】
簡単に説明すると、ＶＳＥフェカリス菌（Ｅ. faecalis）１２５９０１２、ｖａｎＡ−陽性ＶＲＥフェカリス菌（E. faecalis）１２５９０１６，ＶＳＥフェシウム菌（E. faecium）１２６９０１１、ｖａｎＢ−陽性ＶＲＥフェシウム菌（E. faecium）１２６９０１４、及びｖａｎＣ−２陽性バンコマイシン非感受性イー・カゼイリフラブス（E. casseliflavus）１２７９０１５の培養物を調製し、これらを使用して、５０μＬのＬＢを含有するマイクロウェルプレートのウェルに５０μＬの接種物を接種して、各ウェルに１０4ＣＦＵ の各細菌株が入るようにした。ウェルのセットは追加の添加物を含まず、別のセットのウェルは５μｇ／ｍＬのバンコマイシンを含み、別のセットのウェルは５μｇ／ｍＬのバンコマイシンとｖａｎＣ−２ペプチド−ＰＮＡを含む。またすべてのウェルに腸球菌レポーター１００μＬも与える。次に、試料を３７℃で２時間インキュベートし、次に試料を実施例１に記載のように発光についてアッセイする。
【０１８０】
図７は、細胞レポーターアッセイの結果を示し、＋はレポーターアッセイが陽性結果を与えたこと示し、−はレポーターアッセイが陰性結果を与えたことを示す。
第１列は、腸球菌レポーターが腸球菌属菌種の全てについて陽性シグナルを与えることを示す。第４列は、ペプチド−ＰＮＡがいずれの菌株においても陽性結果を阻害しないことを証明する。第２列は、ｖａｎ遺伝子を発現する全ての菌株が、陽性シグナルを与え続け、一方、ｖａｎ遺伝子を持たない菌株は陽性シグナルを与えないことを示す。第３列は、ｖａｎＡ又はｖａｎＢ遺伝子を発現する菌株のみが陽性シグナルを与え続けていることを示している。
【０１８１】
従って、これらの結果は、腸球菌レポーターをバンコマイシンとｖａｎＣ−２遺伝子発現を標的とするアンチセンス分子とを組み合わせたそのようなアッセイが、ＶＲＥを検出するために使用できることを証明する。
【０１８２】
実施例６
カンジダレポーターアッセイ
別の実施態様において、カンジダの同定のための菌学的アッセイを開発することができる。
【０１８３】
酵母細胞に検出可能マーカー又は選択マーカーを生成させるように設計された酵母レポーターシステムは、種特異的配列を標的とするアンチセンス分子と組み合わせて適用される。システムが標的種を含む試料に適用される場合、アンチセンス分子は、標的細胞のシグナル、生存能力、及び／又は増殖の抑制を引き起こす。
【０１８４】
レポータープラスミドは、ＧＡＬ１プロモーターの制御下に融合ブイ・ハーベイ（V. harveyi）細菌ルシフェラーゼを含む大腸菌／酵母ベクターｐＬＧ５に基づいている（１５，１６）。前記種特異的アンチセンス分子は、酵母内の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域内の配列を標的とするように設計されている。ＩＴＳは、ｒＲＮＡ成熟中にそこからＩＴＳが切除される転写体上のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列の間に位置する非機能性ＲＮＡのセグメントからなる。カンジダ属菌種の内部転写されたスペーサー領域２（ＩＴＳ２）は、カンジダ（１７）の異なる種を同定するために使用できる配列特異性を示し、アンチセンス分子によるｒＲＮＡ成熟の破壊は殺真菌作用を示す（１８）。図８は、各種を標的とする２’−ＯＭｅ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を製造するために使用されるＩＴＳ２配列のリストを含む。
【０１８５】
それぞれの種を標的とするためのアンチセンス配列は、それぞれの種についてＩＴＳ２配列間の配列整列を行うことによって設計される。整列データに基づいてそれぞれの種に固有の９〜１２ｂｐの配列が選択され、これらの配列候補は潜在的に交差反応性の生物のライブラリーからのゲノムデータ全体について相同性について分析される。この分析から、各標的種に特有の配列候補を選択することができる。
【０１８６】
この分析に基づいて、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、及びカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）（それぞれ配列番号７，８、及び９）についてＡＯＮ配列を設計した。
【０１８７】
簡単に説明すると、カンジダ・アルビカンス５１２００１２、カンジダ・トロピカリス５１６００１４、及びカンジダ・パラプシローシス５１５００１３を、インタクトな細胞形質転換（１６）を介してレポータープラスミド及びＡＯＮで形質転換する。試料を２４時間インキュベートし、実施例１（１９）に記載されたように使用して発光についてアッセイする。
【０１８８】
図９は、カンジダ属菌種の同定に使用されるＡＯＮの組み合わせについてのアッセイの構成を示す。細胞レポーターアッセイの結果が示され、＋はレポーターアッセイが陽性結果を与えたことを示し、−はレポーターアッセイが陰性結果を与えたことを示す。
【０１８９】
第１列は、レポーターがアッセイで試験した全ての生物に対して陽性シグナルを与えることを示す。第２〜５列は、特定の種を標的とするＡＯＮがアッセイに含まれる場合、これらの種を含む試料がアッセイにおいて陰性の結果を与える一方、その種を標的とするＡＯＮがアッセイに存在しない種を含む試料が、陽性の結果を与えることを示す。
【０１９０】
従って、これらの結果は、種特異的ＩＴＳ２由来配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を酵母レポーターと組み合わせたこのようなアッセイを用いると、カンジダの特定の種を検出することができることを証明する。
【０１９１】
本発明は、好ましい実施態様及び様々な代替実施態様を参照して具体的に示され、記載されているが、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、形態と詳細の種々の変更が可能であることを理解するであろう。
【０１９２】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【０１９３】
参考文献
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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