(57)【要約】  本発明は薬に関するものであり、悪性固形腫瘍細胞のアポトーシスのポリシグナル活性化のための方法であって、環状ｉＲＧＤリガンドを含む表面修飾ＭＳ２ファージビリオンによるタリウム塩の標的化送達によって行なわれ、該リガンドは、インテグリンａｖｂ３およびａｖｂ５に対して高い親和性を有するものであり、シェルとコアに共有結合されており、該コアはゲノムＲＮＡおよびタリウム塩を含むものである方法に関する。本発明により、生物体の健常細胞に対する望ましくない副作用を最小限に抑えつつ、限局性および転移性の悪性固形腫瘍細胞塊に対して複雑で効率的な長期間の細胞毒性作用がもたらされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性固形腫瘍（ＭＳＴ）の細胞のアポトーシスを活性化させる方法であって、前記活性化はＭＳＴ細胞およびその栄養血管へのタリウム塩の標的化送達によって行なわれ、前記標的化送達を確実にするため、自身に共有結合された環状ｉＲＧＤリガンドを含む膜と、ゲノムＲＮＡおよびタリウム塩を含むコアとからなるＭＳ２ファージの表面修飾ビリオンを形成し、前記細胞内への前記ビリオンの侵入を、ａｖｂ３およびａｖｂ５インテグリンを伴うリガンド−受容体相互作用によって確実にする方法。
【請求項２】
ＭＳ２ファージの前記修飾ビリオンの前記コアがゲノムＲＮＡおよびＴｌ同位体の塩を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＳＴを治癒させるために使用され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＭＳＴを診断するために使用され得る、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＭＳＴ細胞へのタリウム塩の前記標的化送達が経口または経鼻で行なわれる、請求項１、３または４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、限局性および転移性の悪性固形腫瘍（ＭＳＴ）の細胞の蓄積部へのタリウム塩の送達に適した標的化化学療法に関する。そしてさらに具体的には、一価のタリウムの塩を送達するためにリガンドで修飾されており、細胞のアポトーシスを誘導し、かつその細胞から薬物耐性タンパク質ポンプによって除去されず、その後の治療目的のためのバクテリオファージを得て使用することに関する。本明細書に記載の事柄、物質および様式は、ＭＳＴの治癒および／または予防にその用途が見出されよう。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の記載
現在、ロシア連邦では、ヒト化抗体調製物が腫瘍の標的化化学療法に使用されている（Ｇａｒｉｎ  Ａ．Ｍ．，Ｂａｚｉｎ  Ｉ．Ｓ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔｓ．Ｍｏｓｃｏｗ，２００９）。
【０００３】
しかしながら、腫瘍細胞に対する種々の化学療法剤の他の標的化送達系が懸命に考案されているが、これらは、概して非常に毒性が高い（米国特許出願公開第２００９００４７３１８号、同第２０１３０２８７８５３号）。化学療法剤は、例えば、ウイルス様粒子内（米国特許第８３２４１４９号、米国特許出願公開第２００８０２７４９０５号）またはＲＮＡ含有バクテリオファージのビリオン内（米国特許第５６７７１２４号、同第６１５９７２８号、米国特許出願公開第２０１００１６７９８１号；Ｃａｒｌｅｅ  Ｅ．Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃａｒｇｏｓ  ｂｙ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／／ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１１  Ｊｕｌｙ  ２６；５（７）：５７２９−５７４５およびＪｅｆｆ  Ｅ．Ｇｌａｓｇｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｓｍｏｌｙｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｓｉｄｅ  ＭＳ２  Ｖｉｒａｌ  Ｃａｐｓｉｄｓ／／ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１２  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２３；６（１０）：８６５８−８６６４；略号ＡＣＳはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙを意味する）にカプセル封入される。かかるアプローチのおかげで、ＭＳＴ細胞の破壊の保証と同時に生物体全体の毒性調製物への曝露の低減という考えが実行されている。
【０００４】
標的化送達の手段に関してＲＮＡ含有バクテリオファージ、特にＭＳ２に対する注目は、ビリオンの組織化の容易性およびヒトおよび哺乳動物の細胞の表面にビリオンに特異的な受容体がないこと（これにより、これらの生物体の細胞内へのその侵入が排除される）によって説明される。研究者らは、天然状態でのこの「偶然性」を２つの連続的な修飾によって解決を試みている。第１に、化学療法剤のカプセル封入のための条件の考案を試みている（Ｐａｖｅｌ  Ｐｌｅｖｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｍｅｒ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２／／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９，ｖ．１８（５），ｐｐ．１６５３?１６６１およびＪｅｆｆ  Ｅ．Ｇｌａｓｇｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｓｍｏｌｙｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｓｉｄｅ  ＭＳ２  Ｖｉｒａｌ  Ｃａｐｓｉｄｓ／／ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１２  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２３；６（１０）：８６５８−８６６４）。第２に、ビリオン表面を修飾し、したがって、ＭＳ２バクテリオファージ粒子に、該表面上に吸収され（リガンド−受容体相互作用により）、次いで悪性細胞の細胞質内に侵入する能力を付与する（米国特許第５５３４２５７号；米国特許出願公開第２０１３００１７２１０号；Ｓｔａｃｙ  Ｌ．Ｃａｐｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＳ２  Ｖｉｒａｌ  Ｃａｐｓｉｄｓ／／Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２７；１３５（８）：３０１１−３０１６）。
【０００５】
しかしながら、修飾ウイルスをベースにして標的化送達系を作出するための上記の研究者らの取り組みは、種々の毒性化学療法剤の分子を細胞から除去するというＭＳＴ細胞の遺伝的に決定された能力のため、障害されている（Ｓｔａｖｒｏｖｓｋａｙａ  Ａ．Ａ．，Ｔ．Ｐ．Ｓｔｒｏｍｓｋａｙａ．Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＢＣ  Ｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ／／Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ），２００８，ｖ．７３（５），ｐｐ．５９２−６０４）。化学療法剤を細胞から除去する能力は、薬物耐性タンパク質またはＭＤＲ（多剤耐性）タンパク質（Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｗｉｌｋｅｎｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＡＢＣ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ／／Ｆ１０００Ｐｒｉｍｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１５，７：１４−２３）によって実行される。
【０００６】
このこととともに、カリウムイオンに特異的なチャネルからＭＳＴ細胞の細胞質内に浸透した放射性の一価同位体２０１Ｔｌは該細胞質から除去されないことに注目されたい（Ｊｅａｎ  Ｃ．Ｍａｕｂｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ−Ｔｅｂｏｒｏｘｉｍｅ  ｉｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ−Ｓｅｓｔａｍｉｂｉ  ａｎｄ  Ｔｈａｌｌｉｕｍ−２０１／／Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ１９９３，ｖ．３４（１１），ｐｐ．１９４９−１９５２；Ｂｒｉｓｍａｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｍｄｒ１−Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｋ５６２  Ｃｅｌｌｓ／／Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９５；ｖ．３６（１）：ｐｐ．８７−９０；Ｍ．Ｆｕｋｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ／／Ｃａｎｃｅｒ  １９９９，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，ｖ．８６（８），ｐｐ．１４７０−１４７９）。
【０００７】
直接的な実験（Ｓｐｅｎｓｅｒ  ＰＳ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｔｈａｌｌｉｕｍ  Ｓａｌｔｓ  ｏｎ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  Ｃｏｒｄ−Ｇａｎｇｌｉａ−Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ／／Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７３，ｖ．５８（１），ｐｐ．７９−９５）により、培養細胞に対する一価のタリウムの塩の毒性レベルは１ｐｇ以内（正常なＨＥＫ２９３細胞株の場合）および４０ｐｇ以内（Ｕ２５１膠芽細胞腫細胞の場合）であることが示されている。Ｘ線構造解析データ（Ａｉｌｏｎｇ  Ｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＨＤＶ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ／／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍａｒｃｈ  ２００７，ｖ．１５（１），２８１−２８７）によれば、一価のタリウムイオンは、２０個の負荷ビリオンを吸収した後、ＭＳ２ファージ粒子内部（内部半径は１０ｎｍ）のゲノムＲＮＡと相互作用し、該細胞に対して致死濃度になる。この計算を、一価のカチオンがＭＤＲタンパク質への曝露に対して耐性であるタリウム塩のＭＳＴ細胞への標的化送達系の作出のための根拠として使用した。本発明により、ＭＳＴの標的化化学療法の際の治療上および診断上のニーズに対する解決策を提案する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９００４７３１８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３０２８７８５３号明細書
【特許文献３】米国特許第８３２４１４９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８０２７４９０５号明細書
【特許文献５】米国特許第５６７７１２４号明細書
【特許文献６】米国特許第６１５９７２８号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１００１６７９８１号明細書
【特許文献８】米国特許第５５３４２５７号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１３００１７２１０号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇａｒｉｎ  Ａ．Ｍ．，Ｂａｚｉｎ  Ｉ．Ｓ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔｓ．Ｍｏｓｃｏｗ，２００９
【非特許文献２】Ｃａｒｌｅｅ  Ｅ．Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃａｒｇｏｓ  ｂｙ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／／ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１１  Ｊｕｌｙ  ２６；５（７）：５７２９−５７４５
【非特許文献３】Ｊｅｆｆ  Ｅ．Ｇｌａｓｇｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｓｍｏｌｙｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｓｉｄｅ  ＭＳ２  Ｖｉｒａｌ  Ｃａｐｓｉｄｓ／／ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１２  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２３；６（１０）：８６５８−８６６４
【非特許文献４】Ｐａｖｅｌ  Ｐｌｅｖｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｍｅｒ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２／／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９，ｖ．１８（５），ｐｐ．１６５３?１６６１
【非特許文献５】Ｓｔａｃｙ  Ｌ．Ｃａｐｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＳ２  Ｖｉｒａｌ  Ｃａｐｓｉｄｓ／／Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２７；１３５（８）：３０１１−３０１６
【非特許文献６】Ｓｔａｖｒｏｖｓｋａｙａ  Ａ．Ａ．，Ｔ．Ｐ．Ｓｔｒｏｍｓｋａｙａ．Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＢＣ  Ｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ／／Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ），２００８，ｖ．７３（５），ｐｐ．５９２−６０４
【非特許文献７】Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｗｉｌｋｅｎｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＡＢＣ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ／／Ｆ１０００Ｐｒｉｍｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１５，７：１４−２３
【非特許文献８】Ｊｅａｎ  Ｃ．Ｍａｕｂｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ−Ｔｅｂｏｒｏｘｉｍｅ  ｉｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ−Ｓｅｓｔａｍｉｂｉ  ａｎｄ  Ｔｈａｌｌｉｕｍ−２０１／／Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ１９９３，ｖ．３４（１１），ｐｐ．１９４９−１９５２
【非特許文献９】Ｂｒｉｓｍａｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｍｄｒ１−Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｋ５６２  Ｃｅｌｌｓ／／Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９５；ｖ．３６（１）：ｐｐ．８７−９０
【非特許文献１０】Ｍ．Ｆｕｋｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ／／Ｃａｎｃｅｒ  １９９９，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，ｖ．８６（８），ｐｐ．１４７０−１４７９
【非特許文献１１】Ｓｐｅｎｓｅｒ  ＰＳ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｔｈａｌｌｉｕｍ  Ｓａｌｔｓ  ｏｎ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  Ｃｏｒｄ−Ｇａｎｇｌｉａ−Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ／／Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７３，ｖ．５８（１），ｐｐ．７９−９５
【非特許文献１２】Ａｉｌｏｎｇ  Ｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＨＤＶ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ／／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍａｒｃｈ  ２００７，ｖ．１５（１），２８１−２８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の本質
本発明は、一価のタリウムの塩が充填されたＭＳ２ファージ表面修飾ビリオンを用いた、ＭＳＴ細胞および該細胞に栄養供給している血管の内皮への一価のタリウムの塩の標的化送達の作出を目的とするものである。
【００１１】
米国特許出願公開第２０１３／０２５１６３０号，ＰＣＴ／ＤＫ２０１１／０５０４７９、ＥＰ２６５１４４７Ａ１およびＣＡ２８２１０２４Ａ１ならびにＷＯ２０１５０６１５９２Ａ１（出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６２００７）は、本発明に最も近い類似の発明である。いずれの出願も、リポソームナノ粒子内に導入された金属の放射性核種または医薬組成物の腫瘍細胞への標的化送達様式を説明したものである。しかしながら、これらの出願とは異なり、本出願は、ＭＳ２バクテリオファージの表面修飾粒子を用いた、一価のタリウム（放射性のものを含む）のイオンの送達様式を説明したものである。
【００１２】
種々の毒性化学療法剤をＭＳ２バクテリオファージに組み込む様式は；例えば、米国特許第６１５９７２８号または米国特許出願公開第２０１００１６７９８１号において知られている。しかしながら、前記の参考文献は、バクテリオファージまたはそのウイルス様粒子内への一価のタリウムのカプセル封入様式およびＭＳＴ細胞への一価のタリウムの標的化送達を説明したものではない。
【００１３】
ＭＳＴ細胞およびその血管に対する種々の化学物質化合物の標的化送達様式が知られている（米国特許出願公開第２００９０２４６１３３号、同第２０１４０１８６２６５号、同第２０１５０００４６８８号）；しかしながら、この目的のためのＭＳ２ファージの表面修飾ビリオンの使用は説明されていない。
【００１４】
刊行物（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．Ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ／／Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００２  Ｆｅｂ；ｖ．２（２）：ｐｐ．８３−９０；Ｋ．Ｎ．Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｔｕｍｏｒｓ／／Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ８  ２００９，ｖ．１６（３），ｐｐ．５１０−５２０）に、ＭＳＴ細胞の受容体および該細胞に栄養供給している血管の受容体とリガンド−受容体機構に従って相互作用するような、ＭＳ２ファージの表面修飾ウイルス様粒子を得る方法の記載がみられ得る。それでも、これらの刊行物には、かかるウイルス粒子に一価のタリウムの塩を充填する方法は記載されていない。
【００１５】
多くの特許および特許出願に、ＭＳ２バクテリオファージまたはそのウイルス様粒子の表面修飾の方法が説明されている（米国特許第５６９８４２４号；米国特許第５５３４２５７号；米国特許第５４７０５７３号；米国特許第５６９８４２４号；米国特許出願公開第２００９００５４２４６号；米国特許出願公開第２０１４０１０６９８２号；米国特許出願公開第２０１３０１４９３３６号；ロシア連邦特許第２５２６５７０号）。しかしながら、これらはすべて、もっぱら、特定の免疫反応を得ることを目的としたもの、例えばＭＳＴの免疫療法を目的としたものである。かかる研究および特許は、ファージディスプレイ（Ｍｃ  Ｃａｆｆｅｒｔｙ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ／／Ｎａｔｕｒｅ  ６  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９０，ｖ．３４８，ｐｐ．５５２−５５４；米国特許第５８２１０４７号；米国特許第５７０２８９２号）との類似物であり、本出願と関連しているものではない。
【００１６】
診断様式または個体のＭＳＴの可視化の予後診断方法として放射性のタリウム塩（２０１Ｔｌ，ソ連特許第１０８８５５８号）を適用する様式が知られている。同様の外国特許（米国特許出願公開第２０１４００３７５４１号；米国特許出願公開第２０１３０３２４８４７Ａ１号；米国特許第４７６４５９８号；米国特許第４４４６１２３号）が知られている。これらの例はすべて、無毒性である臨床適用のための体外から（ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒａｌｌｙ）導入される診断用調製物の調製方法を説明したものである。しかも、１回に導入される一価のタリウムの量は１０〜１００ｐｇ／ｋｇまたはｈＬＤ５０＝１．５ｍｇ／ｋｇの１０−６である（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｔｈａｌｌｉｕｍ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ／／Ｕ．Ｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００９）。
【００１７】
本発明は、生物体の毒性物質への毒性曝露を排除するがＭＳＴ細胞の破壊は保証する一価のタリウムの標的化送達の必要性を満たすことを目的とするものである（ｉｎ  ａｉｍｅｄ  ａｔ）。一価のタリウムの標的化送達のためのこの方法論は以下の利点、例えば、適用の容易性、ＭＳＴ増殖ゾーンにおけるより良好な検出、有効な検出、無毒性、ビリオンからの一価のタリウムの制御放出、適用されるタリウム用量の低減および該物質の容易な作出を有する。その他に、本発明における物質は皮膚および粘膜の表面を刺激しないものである。
【００１８】
本発明の概要
本発明の一態様では、ＭＳ２ファージビリオンまたはそのウイルス様粒子を調製し、続いて、該ビリオンまたは該粒子の表面を環状リガンドで修飾して一価のタリウム塩を充填することを含む、一価のタリウムの塩の標的化送達様式であって、この調製様式は、ビリオンが物理的または生化学的に破壊される前に該ビリオンからの該金属イオンの「流出」を許容しないようなものである様式を提案する。
【００１９】
関連する態様において、本発明では、一価のタリウムの同位体２０１Ｔｌの塩の標的化送達様式を提案する。
【００２０】
その好ましい変形例では、ＭＳＴ細胞の受容体と相互作用できる環状ポリペプチドはそのリガンドであり、最も好ましい変形例では、ｉＲＧＤがそのリガンドである。該リガンドは、化学的にコンジュゲートさせて共有結合を形成したものであってもよく、Ａタンパク質の遺伝子配列との結合によって結合させたものであってもよい。
【００２１】
好ましい変形例では、一価のタリウムの塩は、ハロゲン塩、酢酸塩、硝酸塩、硫酸塩、炭酸塩の群から選択される。
【００２２】
本発明により、表面が環状リガンドによって修飾されたＭＳ２ファージビリオンまたはそのウイルス様粒子が潜在的に、皮膚外皮から非損傷的に侵入できる物質を提案する。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細説明および添付の図面を参照すると明らかとなろう。この他に、以下に示す種々の参考文献（これらには、いくつかの手順がより詳細に記載されている）は、参照のために全体が本明細書に含められる。
【００２４】
本発明の実施のこの態様および他の態様ならびに変形例を以下により詳細に、添付の実施例および図を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ａ．ＭＳ２ファージ粒子の電気泳動による分離：空のもの（左側端の移動跡）ならびに一部タリウムが充填されたもの（真ん中の移動跡）または限界までタリウムが充填されたもの（右側端のもの）。  Ｂ．ＴＩＮＯ３が充填されたＭＳ２ファージ粒子の電子顕微鏡写真。Ｃ．ＭＳ２ファージ粒子（対照）の顕微鏡写真。スケール表示線は１ｎｍである。
【図２】ＭＳ２ファージ粒子に一価のタリウムの塩（ＴＩＮＯ３で例示）を充填することの有効性の図表。Ａ．ファージ粒子の充填はファージストックの塩濃度に依存。Ｂ．塩の量に関する「粒子内に導入分」／ストックに添加分の比率。
【図３】充填されたＭＳ２ファージ粒子からの経時的な塩の「流出」の図表。図表２および３に示したデータは、プログラムＳｔａｔｉｓｔｉｃａ  １２（р＜０．０１）またはスチューデントの検定を用いて解析した。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊р＜０．００１。
【図４】タリウムを含む（集合−解離によって充填した）ＭＳ２バクテリオファージの最高濃度画分は最重量のものであり（下側の画分）、タリウムを含む（乾燥によって充填した）ＭＳ２バクテリオファージ画分を上側に示し、さらに上側には、タリウムを含んでいない野生型ＭＳ２バクテリオファージ画分を示す。
【図５】ビリオンの表面がリガンドで修飾されたＭＳ２ファージ粒子に曝露された腫瘍細胞の凝集塊。左側．ＶＥＧＦなしの環境で増殖させた細胞。右側．ＶＥＧＦありの環境で増殖させた細胞。
【図６】タリウムが充填されたＭＳ２ファージビリオンの細胞内への侵入。左側．ＶＥＧＦなしの環境で増殖させた細胞。右側．ＶＥＧＦありの環境で増殖させた細胞（核内の楕円形の内包物は蓄積されたタリウムである）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の実施
提案する様式は、既存の技術レベルに基づいて以下の作用シーケンスによって実現することができる。
【００２７】
まず、調製手順を行なう；該手順は、特に、例えば、米国特許第８３６７６２１号、同第６３９９３０７号、同第６８０３３７９号；米国特許出願公開第２０１３０３４３９８９号、同第２０１００３２２８６２号、同第２０１５００４４６６５号に記載されたものであり、その実施により、本発明に従う用途が見出され得るようなナノ粒子が得られた。さらに、米国特許第６１８０３８９号および米国特許出願公開第２００４００２８６９４号、同第２０１４００４５９１５号、同第２０１４０３１４６６４号、同第２０１４０３４１９３８号に記載のナノ材料ベースのナノ粒子も、本発明によるファージの修飾ビリオンの核として考慮される。
【００２８】
高力価のＭＳ２ファージを得ることと同時に、ＭＳ２ファージビリオンの表面の修飾に使用する環状ペプチドの独自の合成方法を考案するための化学反応を行なった。
【００２９】
本発明の一部の変形例では、ファージの修飾ビリオンは２０１Ｔｌ放射性核種を含むものであり得、これは通常、一価のタリウムの塩、例えば塩化物、ヨウ化物または臭化物として使用される。標識のインジケータとしての放射性核種の使用はこの分野でよく知られており、それらは、本発明の枠組みの範囲内の使用のために当分野の専門家により容易に適合させることができる。放射性核種は、該塩を充填するためにファージの修飾ビリオンを解離−集合させる場合に、および導入する塩のタグとして使用され得る。
【００３０】
本発明では、透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）を、ファージビリオンを検出および検査するための方法にした。プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を該粒子の別の検出様式にした；その波により、ガラス上に吸収された修飾ビリオン粒子、例えば、タリウムが充填されたものの検出が可能である（Ｖ．Ｎ．Ｋｏｎｏｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｗａｖｅｓ／／Ｓｅｎｓｏｒｓ  ２０１３，１３（２０），ｐｐ．２５６６２５７８）。蛍光分光法は、一価のタリウムの塩を含有している試料の解析に、その充填および溶出の有効性を調べるために使用され得る（ＤＩ  ＺＨＡＮＧ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｔｈａｌｌｉｕｍ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ＦＬＩＰＲ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＫＣＣ２−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ／／Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ２０１０，ｖ．１５（２）；ｐｐ．１７７−１８４）。その他に、充填および溶出時の該イオンの検出を容易にするために同位体タグが使用され得る。
【００３１】
タリウム塩を含有している材料の操作はすべて、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  Ｃｈｉｅｆ  Ｓｔａｔｅ  Ｓａｎｉｔａｒｙ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎの文書（２００４年１月６日付，Ｎｏ．２５１０／９２−０４−３２）を考慮して実施される。
【００３２】
本発明を以下によって例示する：
【実施例１】
【００３３】
高力価のＭＳ２ファージを、既報の方法に従って得た（Ｋｎｙａｚｈｅｖ  Ｖ．Ａ．，Ｓｉｖｏｖ  Ｉ．Ｇ．，Ｓｅｒｇｉｙｅｎｋｏ  Ｖ．Ｉ．ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｏｎ−Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｖｉｒｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＳ２  Ｐｈａｇｅ／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００２，Ｎｏ．３，ｐｐ．５６−６３）。ゲノムＲＮＡ断片のＲＴ−ＰＣＲによる配列決定（ｓｅｑｕｅｎａｔｉｏｎ）ならびに寒天層を用いた力価の測定を対照として使用した（Ｇｒａｔｉａ  Ａ．Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ／／Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ  １９３６，ｖ．５７，ｐ．６５２）。細胞ライセートを遠心分離（１５０００ｒｐｍ）によって清澄化し、続いて、専門家に知られたとおりにＮａＣｌの存在下でＰＥＧ−６０００沈殿させたあとファージビリオンが濃縮された。また、ファージ調製物を、乾燥Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０を用いた脱水によって濃縮した。
【実施例２】
【００３４】
ＭＳ２ファージへのタリウム塩の充填、およびこのプロセスの制御．
Ａ．真空乾燥により、ファージ調製物とタリウム溶液の混合物を乾燥させた。
【００３５】
Ｂ．解離−集合により：これは、専門家に知られたプロトコル（米国特許第８９８７１７３号）に従って行ない、ファージを、０．２５ＭのＴＭＡＯおよび０．１Ｍのタリウム塩の存在下のＳＴバッファー（５０ｍＭのｔｒｉｓ，１００ｍＭのＮａＣｌ）中に２４時間維持した。次いで、この溶液を１００００ｇで１０分間、遠心分離した。上清みをＰＥＧ−６０００およびＮａＣｌと混合し、それぞれ１２．５％および０．５Ｍの終濃度にした。２時間後、溶液を、４℃での遠心分離（１７８００ｇで４５分間）によって沈殿させた。この沈殿物を最小限量のＳＴバッファーに溶解させ、１００００ｇで１０分間、再度沈殿させた。上清みを分画し、インタクトなＭＳ２ウイルスカプセルに相当する画分を収集し、次いでＳＴバッファー中に４℃で保存した。
【００３６】
Ｃ．カプセル封入されたタリウムの量を、ＰＴＳＡ（ピレン−１，３，６，８−テトラスルホン酸の第４級ナトリウム塩）による蛍光法を用いて制御した（ＤＩ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｔｈａｌｌｉｕｍ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ＦＬＩＰＲ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＫＣＣ２−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ／／Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ２０１０，ｖ．１，ｐｐ．１７７−１８４）。タリウムがカプセル封入されたファージ粒子の洗浄後、ならびに該粒子の沈殿物を熱変性させ、昇温したこの試料をＲＮアーゼでさらに処理した後の試料を得た。
【実施例３】
【００３７】
ＭＳ２ファージとその修飾変形型の比較．
Ａ．ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動法の使用：これは、教本に適合させて（Ｍｏｓｃｏｗ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈａｇｅ，Ｍｏｓｃｏｗ，２００７）、２％ポリアクリルアミドゲルとアガロース中で、専門家に知られた条件下で行なった。
【００３８】
Ｂ．ショ糖平衡密度勾配遠心法の使用：
５から５０％まで（重量／容量）のショ糖密度勾配を試験管（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）内で、方法（Ｂｒａｋｋｅ  Ｍ．Ｋ．Ｄｅｎｓｉｔｙ−Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｋ  Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ  ａｎｄ  Ｈ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；１９６７：９３−１１８）に従って形成した。ファージ試料を１ｍｌの冷リン酸バッファー（ｐＨ＝９．０）中に懸濁させ、ショ糖勾配液上に重層し、８５０００ｇで６時間、遠心分離した。
【００３９】
Ｃ．透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）の使用：
銀造影（４５分間，Ａｕｒｉｏｎ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ）をファージ粒子の可視化に使用した。検出後、これを、１％（質量／容量）の四酸化オスミウム（リン酸バッファー中）を用いて１時間、行ない、フィルターをリン酸バッファー中で１０分間洗浄した。フィルターを挿入部から取り出し、３〜５ｍｍ×２ｍｍのサイズの２つのセグメントを無作為に切り出した。これらのセグメントを３０〜１００％エタノール中で脱水し、最後にＥｐｏｎ樹脂中に配した。７０〜８０ｎｍ幅のＤｉａｔｏｍｅダイヤモンドナイフを用いて極薄切片を作製し、次いでこれを、Ｐｉｏｌｏｆｏｒｍで覆った銅メッシュ上に配した。このメッシュを酢酸ウラニル中で３５分間、対比染色し、メッシュをクエン酸鉛中に７分間浸漬させることにより３回洗浄し、３回洗浄した。メッシュを、ＪＥＭ−１４００透過型電子顕微鏡（８０ｋＶの加速電圧で、×８０００の倍率で操作）を用いて観察した。
【００４０】
Ｄ．ＳＰＲ法の使用：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、Ｅｖａ  ２．０機器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｃｂｉｏｓｅｎ−ｓｏｒｓ．ｃｏｍ，ロシア連邦特許第２３４１７８５号、同第２４４２１４２号）を用いて検査した。色素５−カルボキシテトラメチルアミノローダミンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエーテル（０．１μＭ，ｋｅｘ＝５７５ｎｍ；ｋｅｍ＝６０５ｎｍ）と混合した抗ＭＳ２  ＩｇＧの溶液（１０μｇ／ｍｌ）を０．１ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５．５）中に保存した。ＩｇＧをガラスに結合させる標準的な手順を、３，３−ジエトキシプロピル−トリエトキシシランを用いて、既報の手順（ロシア連邦特許第６８１８３７号）に従って実施した。ガラス表面上の反応しなかった基をｐＨ＝８．５の１Ｍエタノールアミンで、完全に不活化するまでブロックした。検査はすべて、３００μｌ／分の体積流速で３回行なった。ファージを含む試料を「ファージ」バッファー中で１：１００および／または１：５０に希釈した。各測定後、表面を１００ｍＭ  ＮａＯＨ溶液で還元し、次いでランニング「ファージ」バッファーで洗浄した。
【００４１】
ＩｇＧと色素のモル比により、抗ＭＳ２  ＩｇＧのおかげでガラスに結合された色素（米国特許第５８００９９６号）の蛍光により、チップ表面に結合されたタンパク質の最大量を評価することが可能になる。
【実施例４】
【００４２】
ペプチドでのファージ粒子の表面の修飾．
Ａ．構造（ＮＨ２）ＧＧＧＣＲＧＤＫ／ＲＧＰＤ／ＥＣ（ＣＯＯＨ）を有するペプチドの合成
このペプチドは、固相ペプチド合成法を使用して、Ｆｍｏｃ−アミノ酸から進めて、自動ペプチド合成装置４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを用いて、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）残基（ｒｅｓｉｄｕｕｍ）が結合された樹脂上で合成した。以下のアミノ酸誘導体：Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを使用した。Ｆｍｏｃ−保護基を、伸長中のペプチド鎖のＮ末端のαアミノ基から、Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２２％溶液の４−メチルピペリジンを用いて除去した（Ａｌｅｓｈｉｎａ  Ｙｅ．Ｙｕ．，Ｐｙｎｄｙｋ  Ｎ．Ｖ．，Ｍｏｙｓａ  Ａ．Ａ．，Ｓａｎｚｈａｋｏｖ  Ｍ．Ａ．，Ｋｈａｒｙｂｉｎ  Ｏ．Ｎ．，Ｎｉｋｏｌａｙｅｖ  Ｙｅ．Ｎ．，Ｋｏｌｅｓａｎｏｖａ  Ｙｅ．Ｆ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐ−ａｍｙｌｏｉｄ  ５ＲＨＤＳＧＹ１０  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｉｓｏｍｅｒｓ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，ｖ．５４，Ｎｏ．２，１５４−１６６）。アミノ酸は、伸長中のペプチド鎖に（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）を除く）、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスファートで１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび２，４，６−コリジンの存在下にて、合成装置のマニュアルに記載のＦａｓｔＭｏｃ手順に従って予備活性化させることにより結合させた。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）は、活性化剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下でジイソプロピルカルボジイミドを使用するインサイチュでの活性化により結合させた。合成が終了した後、ペプチドを樹脂から、トリフルオロ酢酸、トリ−（イソプロピル）−シラン、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオールおよび水の混合物（容量比は９４：１：２．５：２．５）で処理することにより切り離し、メチルターシャリーブチルエーテルを用いて沈殿させた。ペプチド沈殿物を１０パーセントの水とアセトニトリル（０．１％のトリフルオロ酢酸含有）に溶解させ、得られた溶液を精製（Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８カラム，２１．２×２５０ｍｍ，７μｍ，トリフルオロ酢酸の０．１％水溶液中におけるアセトニトリル濃度勾配でのＨＰＬＣ法を使用）に供した。標的ペプチドを含む画分を収集し、真空蒸気加熱（ｓｔｅａｍ）し、次いで、Ａｃｍ−保護基をシステイン残基（ｒｅｓｉｄｕａ）から除去すると同時に、既知の方法論に従ってジスルフィド結合を形成した（Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ／／Ｉｎ：Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｅｄｓ．Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）。ペプチドを、同じカラムを用いたＨＰＬＣによってもう１回精製し、標的ペプチド画分を真空蒸気加熱した。
【００４３】
Ｂ．合成されたペプチド調製物の純度を、質量分析による解析とともに電気粉砕（ｅｌｅｃｔｒｏｐｕｌｖｅｒｉｚａｔｉｏｎ）イオン化およびイオントラップ法を用いた検出、ならびに分析用ＨＰＬＣにより、既報のプロトコルに従って確認した（Ｍ．Ｈ．Ｖ．Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｓ．Ｍｕｌｌｅｒ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９９９，ｐｐ．８８−９０）。
【００４４】
Ｃ．ペプチドを、専門家に知られた標準的な手順に従ってジメチルアジピミデート（ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）を用いてファージ粒子にコンジュゲートさせた（Ｍ．Ｈ．Ｖ．Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｓ．Ｍｕｌｌｅｒ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９９９，ｐｐ．８８−９０）。
【実施例５】
【００４５】
タリウムが充填された修飾ビリオンに対する内皮細胞塊および他の細胞塊の感受性ならびに修飾ビリオンによる該細胞の凝集の測定．
内皮細胞の細胞塊をＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｅｎｔｅｒのコレクションから入手し、ロシア連邦特許第２３５９０３０号および同第２４９３２５１号に従って複製した。インテグリンの形成を内皮細胞およびＭＳＴ細胞の表面上に、内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を用いて、既報の手順（ロシア連邦特許第２３７７０１７号）に従って誘導した。細胞を、既報の手順（米国特許第５４０１６３６号；米国特許第５５４１４１７号）に従って凝集させた。タリウムが充填されたＭＳ２ファージビリオンの侵入を、蛍光顕微鏡検査（ＰＴＳＡ色素を使用）により、既報の手順（ロシア連邦特許第２３０５２７０号）に従って検出した。
【実施例６】
【００４６】
一価のタリウムの塩が充填された修飾ビリオンに対する動物の感受性の測定．
この実験は、自然光の状況で標準的な飼料（ＧＯＳＴ  Ｒ  ５０２５８−９２）を与える飼育器条件下に維持した１３０匹の白色の非近交系ラット（両性，体重２００〜４００ｇ）および２６３匹の白色の非近交系マウス（両性，体重１７〜３６ｇ）で、方法論マニュアルおよび規範的文献：ＧＯＳＴ  Ｒ  ５１０００．３−９６  ａｎｄ  ５１０００．４−９６；ｒｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ（１９９７）；ＲＦ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ’ｓ  Ｏｒｄｅｒによって２００３年６月１９日付，Ｎｏ．２６７で承認されたロシア連邦の実験実施規則（ＧＬＰ）に従って行なった。
【００４７】
第１および第２の場合において、累積係数を、式：Ｃ＝ＬＤ５０／ＬＤ５０（式中、ＬＤ５０は、物質の反復導入時の平均総致死用量であり；ＬＤ５０は、物質の単回導入時の致死用量であり；Ｃｃｕｍは累積係数である）に従って計算した。
【図１】
2018535246.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2018535246.tif 000009