(57)【要約】  自閉症及び自閉症スペクトラム症の検出及び治療のための組成物及び方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）大きな患者コホートのゲノムワイド関連解析を使用して同定された自閉症又はＡＳＤ患者に存在し、表ＩＩに列挙されているＣＮＶを含む複数の核酸を提供すること、
ａ）患者から試料を得るため及びそれから核酸を単離するための手段、
ｂ）標的ポリヌクレオチド中の少なくとも１つの欠失を含有するＣＮＶの存在又は不在を同定するために好適な試薬及び前記同定から報告を作成するための手段
を含む、自閉症又は自閉症スペクトラム症を発症する傾向を検出するための方法における使用のためのキット。
【請求項２】
標的ポリヌクレオチドが検出の前に増幅される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記ＣＮＶの存在を同定する工程が、特異的ハイブリダイゼーションの検出、対立遺伝子サイズの測定、制限断片長多型分析、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション分析、単塩基プライマー伸長反応及び増幅されたポリヌクレオチドの配列決定からなる群から選択されるプロセスを実施することによって前記核酸を分析するために好適な試薬をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記試料からＤＮＡを単離するために好適な試薬を含有する、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
ヒト対象の単離された細胞からＣＮＶ含有ポリヌクレオチドを単離するための試薬を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
ａ）請求項１に記載の少なくとも１つのＣＮＶを含む核酸配列を発現している細胞を提供すること、
ｂ）工程ａ）のＣＮＶに対応する同族野生型配列を発現する細胞を提供すること、
ｃ）工程ａ）及びｂ）の細胞を試験薬剤と接触させること、並びに
ｄ）前記薬剤が工程ａ）の細胞のニューロンのシグナル伝達及び／又は形態を工程ｂ）のものと比較して変更するかどうかを分析すること、それによりニューロンのシグナル伝達及び形態を変更する薬剤を同定すること
を含む、ニューロンのシグナル伝達及び／又は形態を変更する薬剤を同定するための方法。
【請求項７】
自閉症又はＡＳＤ表現型と関連する少なくともコピー数多型（ＣＮＶ）を有すると決定されたヒト対象での自閉症又はＡＳＤを治療する方法であって、前記少なくとも１つのＣＮＶは表２に記載のＣＮＶからなる群から選択され、前記ＣＮＶの存在によって悪影響を受けるシグナル伝達経路において有効であることが知られている少なくとも１つの薬剤の治療有効量を前記ヒト対象に投与することを含む、方法。
【請求項８】
前記ＣＮＶ含有遺伝子が、ＡＴＰ１０Ａ、ＧＡＢＲＡ５、ＧＡＢＲＢ３、ＧＡＢＲＧ３、ＧＧＴＬＣ２、ＨＢＩＩ−５２−４５、ＨＢＩＩ−５２−４６、ＩＰＷ、ＬＯＣ６４８６９１、ＬＯＣ９６６１０、ＭＡＧＥＬ２、ＭＩＲ６５０、ＭＫＲＮ３、ＮＣＲＮＡ００２２１、ＮＤＮ、ＯＣＡ２、ＯＲ４Ｓ２、ＰＡＲ−ＳＮ、ＰＡＲ１、ＰＡＲ５、ＰＯＭ１２１Ｌ１Ｐ、ＰＲＡＭＥ、ＳＮＯＲＤ１０７、ＳＮＯＲＤ１０８、ＳＮＯＲＤ１０９Ａ、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ、ＳＮＯＲＤ１１５−１１、ＳＮＯＲＤ１１５−２９、ＳＮＯＲＤ１１５−３６、ＳＮＯＲＤ１１５−４３、ＳＮＯＲＤ１１５−４４、ＳＮＯＲＤ１１５−４８、ＳＮＯＲＤ６４、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＵＲＦ、ＵＢＥ３Ａ、ＺＮＦ２８０Ａ、ＺＮＦ２８０Ｂからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、ＧＡＢＡシグナル伝達を変化させ、かつ、表３又は表４に列挙されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子がＧＡＢＲＡ５、ＧＡＢＲＡ３、ＧＡＢＲＢ３からなる群から選択され、前記薬剤がトピラミード（topiramide）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）患者から試料を得る及びそれから核酸を単離するために好適な試薬；
ｂ）工程ａ）の核酸を増幅するために好適な試薬；
ｃ）既知の配列の核酸を工程ｂ）の増幅された核酸と共に含むマイクロアレイ、それにより標的ポリヌクレオチド中の少なくとも１つの欠失を含有し、表ＩＩに列挙されるＣＮＶの存在又は不在を同定すること、前記ＣＮＶが存在する場合、前記患者が自閉症及び／又は自閉症スペクトラム症を発症する増加した危険性を有することを示すレポートを作成するための手段
を含む、自閉症又は自閉症スペクトラム症を発症する傾向を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年７月９日出願のＰＣＴ／ＵＳ１２／４５９５９号の§３７１出願である２０１４年１月７日出願の米国特許出願第１４／１３１３５９号の一部継続出願であり、それぞれ２０１１年７月７日及び２０１２年５月１５日出願の米国仮特許出願第６１／５０５３５２号及び第６１／６４６９７１号の優先権を主張する。それぞれの内容全体は、本明細書に完全に記載されたものとして出典明示により援用される。
【０００２】
３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ）に従って、国立保健研究所から許可番号ＮＩＨ  Ｔ３２  ＧＭ００８６２８、ＲＣ２  ＭＨ０８９９２４、ＮＩＨＤ０７０４５４及びＮＩＭＨ８７６３６で資金の一部が提供されて行われた記載の本発明に米国政府が一定の権利を有することは一般に認められている。
【０００３】
発明の分野
本発明は、遺伝学の分野並びに自閉症及び自閉症スペクトラム症の診断及び治療に関する。
【背景技術】
【０００４】
いくつかの刊行物及び特許文献は、本発明が属する最先端技術を記載するために明細書の全体を通じて引用される。これらの引用のそれぞれは、全体が記載されたのと同様に本明細書に出典明示により援用される。
【０００５】
自閉症（ＭＩＭ［２０９８５０］）は、社会的行動及びコミュニケーション能力における異常を特徴とし、異常な反復運動及び他の行動の障害のパターンに関して傾向を有する重度で比較的一般的な精神神経系障害である。現在の有病率概算は、自閉症について人口の〜０．２％、ＡＳＤについて人口の０．９％である（MMWR Surveill Summ. 2009）。世界的に男性は女性の４倍多く罹患する２。このように自閉症は、成人期に至り、社会に莫大な経済的負担をかける原因不明の主要な公衆衛生上の問題を有する。自閉症の最も顕著な特性は社会性及びコミュニケーションの欠如である。前者は、社交性の低減（社会的相互作用を探す又は関心払う傾向の低減）、社会的ルールの認知の欠如、社会的模倣及び象徴的行動の困難、快適さを与える及び探すことに並びに他者との社会的関係の形成における障害、アイコンタクトなどの非言語性コミュニケーションの使用不全、他者の心理的及び感情的状況の認知の欠如、相互関係の欠如及び他者との経験の共有不全において現れる。コミュニケーション欠如は、言語の遅延又は欠如、他者との会話を開始する又は維持する能力の低下並びに言語の常同性又は反復的使用として現れる。自閉症の小児は、同様の知能の同等者よりも自由遊びに参加する頻度が少なく、低い発達レベルであることが示されている。罹患した小児の社会性欠如のマーカーは、月齢１２−１８ヵ月の早期に現れ、自閉症が神経発達障害であることを示唆している。自閉症が社会的及び感情的な機能を支配する神経系の発達不全に由来することが示唆されている。社会的及び認知的発達は一般集団では高度に相関しているが、社会性の障害の程度は自閉症を有する個体においてはＩＱと十分には相関しない。逆のことが、社会的発達が認知機能よりも優れているダウン症候群及びウィリアムズ症候群において見られる。両方の例は、社交性の複雑な要因を示している。
【０００６】
自閉症の最も一般的な形態の病因は、いまだ不明である。１９４３年の疾患の最初の記載においてＫａｎｎｅｒは、罹患した小児の両親でのよく似た特性（ｔｒａｉｔ）を観察した後に育児法の自閉症の発症への影響を示唆した。実験データはいくつかの環境仮説を支持しない一方で、この障害への強い遺伝的影響に対する証拠は増えている。罹患した個体の兄弟姉妹での自閉症の率は８．６％であり、一般人口からの２１５倍増加が示された（Ritvo等、(1989) Am J Psychiatry 146(8):1032-6）。双生児研究は、一卵性及び二卵性双生児一致率における有意差を実証し、前者は、非自閉症一卵性双生児の大部分が軽度に関連した社会性及びコミュニケーション性異常を示して双生児ペアの６０％で一致した。社会性、言語的及び認知的困難もコントロールの親族と比較して自閉症個体の親族において見出された。自閉症の遺伝率は＞９０％であると推定された。
【０００７】
自閉症の遺伝的基礎は、細胞遺伝学的研究、連鎖解析及び候補遺伝子分析の３種の相補的手法を使用して過去１０年間に広範に研究された、概説（Freitag, C.M.等、(2010) Eur Child Adolesc Psychiatry 19(3):169-78、Vorstman等、(2006) Mol. Psychiatry 11:18-28、Veenstra-VanderWeele及びCook、(2004) Mol. Psychiatry 9: 819-32）を参照されたい。自閉症における染色体異常についての探索は、多数の染色体での末端及び中間部の欠失、均衡がとれた及びとれていないトランスロケーション、並びに逆位を、最も頻繁に報告されている１５番、７番及びＸ染色体における異常によって明らかにした。細胞遺伝学的研究によって示された領域の重要性は、いくつかの全ゲノムスクリーニングによって複数の自閉症家族において評価された（International Molecular Genetic Study of Autism Consortium、1998）。自閉症易罹患性遺伝子座の存在についての強く一致した証拠が染色体７ｑについて得られ；中程度の証拠が染色体１５ｑ、１６ｐ、１９ｐ及び２ｑ上の遺伝子座について得られ；多数の研究はＸ染色体への連鎖に対する支持を見出さなかった（Lamb等、(2005) Med Genet. 42: 132-137、Lord等、(2000) Autism Dev Disord. 30:205-223、Muhle等、 (2004) Pediatrics 113(5): e472-86）。ＡＧＲＥ試料は、１７ｑ及び５ｐ上の遺伝子座について最も強い証拠を提供した（Yonan等、 (2003) Am J Hum Genet. 73:886-97）。自閉症における多数の候補遺伝子研究は、少数の主な候補にそれらの位置又は機能に関して注目してきた（上記Veenstra-VanderWeele等、2004に概説がある）。Ｊａｍａｉｎ等、((2003) Nat Genet. 34:27-9)は、ＡＳＤに関連する連鎖領域中のニューロリジン、詳細にはＮＬＧＮ３及びＮＬＧＮ４をコードするＸ連鎖遺伝子中に低頻度非同義変異を報告した。自閉症中間形質の遺伝的基礎についての他の証拠は、脆弱Ｘ及びレット症候群などの自閉症と重複する表現型特性を共有する障害の研究からもたらされる。
【０００８】
自閉症の多数の新たに出現した理論は、これらの障害の潜在的な根本的原因としてニューロン結合における変化に注目している。画像研究は局所及び全体的な結合性における変化を明らかにし（Just等、(2004) Brain 127: 1811-1821、Herbert等、(2005) Ann Neurol 55(4): 530-40）、活性依存性皮質発達の発達研究は自閉症が発達の際の阻害性及び興奮性のシナプス結合の不均衡から生じる可能性があることを示唆している（Rubenstein及びMerzenich、(2004; Genes Brain Behav 2(5): 255-67）。ニューロン結合の基本単位はシナプスである；したがって、自閉症がニューロン結合の障害である場合、それはシナプス結合の障害としてニューロンの用語において理解されることが期待される。実際に遺伝学的研究は、シナプス発達及び可塑性に関与するニューロリジン、ＦＭＲＰ及びＭｅＣＰ２などの鍵となるタンパク質における変異が自閉症並びに自閉症特性を有する精神遅滞の２つの形態、詳細には脆弱Ｘ及びレット症候群を有する個体において見出されていることを明らかにしている（Jamain等、2003上記、O'Donnell及びWarren、(2002) Annu Rev Neurosci 25: 315-38）。したがって、遺伝的異常とニューロンのレベルでの（体内）表現型との間の連鎖の模索は、正当で実りあるものであると考えられる。さらに、例えば直接的な白質トラクトグラフィーによって、又は特徴的な電気活動における観察可能な遅延によって明らかになるそのようなニューロン結合異常は、ＡＳＤの行動性及び臨床所見に直接連鎖している場合があり、これらのニューロンレベル表現型を行動の神経相関として解釈できるようにする。
【０００９】
全体として今日までに実施され、上で考察された連鎖分析研究は、多数の理由、とりわけ連鎖分析手法が中程度の影響を有する共通の遺伝的変異体を同定することが一般に不得手である一般的問題により、自閉症の遺伝的決定因子を同定することにおいて限定的な成功しか達成していない（Hirschhorn及びDaly, (2005) Nat Rev Genet 6(2): 95-108）。この問題は、多様な表現型が複数の遺伝的及び環境的因子の間の相互作用の最終結果によって決定される自閉症、スペクトラム症において強調され、同定されたいずれの具体的な遺伝的変異体も疾患についての危険性全体にわずかにしか寄与しないと考えられる。
【００１０】
新たなコピー数多様性（ＣＮＶ）と自閉症との関連を報告する最初の研究の１つにおいて（Science (2007) Apr 20;316(5823):445-9）、Ｓｅｂａｔ及び共同研究者は、ＣＮＶが疾患のある種の症例の根底にある可能性があることを示唆している。実際に彼らの知見の重要性はＣＮＶがＡＳＤの遺伝的変異のごく一部について少なくとも原因になっている可能性があることを示唆している他の研究において要約されている（Pinto等、Nature. 2010 Jul 15;466(7304):368-72、Glessner等、Nature. 2009 May 28;459(7246):569-73）。しかし、これらの遺伝的欠損は低頻度であり、集合的に自閉症についての遺伝的危険性のわずかな割合を説明しているにすぎず、未知の頻度及びエフェクトサイズの追加的な遺伝子座の存在を示唆している。
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは、いくつかの大きな患者コホートにゲノムワイド関連解析を実施し、自閉症及びＡＳＤに関連するコピー数多様性を担持する多数の標的遺伝子を成功裏に同定した。したがって本発明により、自閉症又は自閉症スペクトラム症を発症する傾向を検出するための方法の実施のためにキットが提供される。例示的キットは、患者から試料を得るため及び試料を標的ポリヌクレオチド中に少なくとも１つの欠失を含有するＣＮＶの存在又は不在について検査するための手段を含み、ここでＣＮＶが存在する場合、患者は自閉症及び／又は自閉症スペクトラム症を発症する危険性が増加している。好ましい実施形態では欠失含有ＣＮＶは、表ＩＩに提供されるＣＮＶの群から選択される。別の実施形態ではキットは、前記ＣＮＶの存在を検出する工程を実施するための試薬を含み、さらに特異的ハイブリダイゼーションの検出、対立遺伝子サイズの測定、制限断片長多型分析、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション分析、単一塩基プライマー伸長反応及び増幅されたポリヌクレオチドの配列決定からなる群から選択されるプロセスを実施するための具体的な試薬を含む。
【００１２】
別の態様では本発明は、ニューロンのシグナル伝達及び／又は形態を変える薬剤を同定するための方法を提供する。例示的方法は、表２に列挙する少なくとも１つのＣＮＶを発現している細胞及びＣＮＶ含有配列に対応する同族野生型配列を発現する細胞を提供すること、両細胞型を試験薬剤と接触させること並びに、薬剤がＣＮＶを含む細胞のニューロンのシグナル伝達及び／又は形態を遺伝子変異を欠いているものと比較して変更するかどうかを分析することを伴い、それによりＣＮＶ含有細胞においてニューロンのシグナル伝達及び形態を変更する薬剤を同定することを含む。ＣＮＶが欠失である場合、そのようなＣＮＶをコードするベクターは、好適な長さの欠失の影響を受ける領域に隣接する核酸を、ＣＮＶ含有核酸での細胞のクローニング及び形質転換を可能にするように含有する。
【００１３】
同様に提供されるのは、自閉症又はＡＳＤ表現型に関連する少なくともコピー数多型（ＣＮＶ）を有すると決定されたヒト対象において自閉症又はＡＳＤを治療する方法であって、前記少なくとも１つのＣＮＶは表２に記載のＣＮＶからなる群から選択され、前記ＣＮＶの存在によって有害な影響を受けるシグナル伝達経路において有効であることが知られる少なくとも１つの薬剤の治療有効量を前記ヒト対象に投与することを含む方法。好ましい実施形態では患者はＡＴＰ１０Ａ、ＧＡＢＲＡ５、ＧＡＢＲＢ３、ＧＡＢＲＧ３、ＧＧＴＬＣ２、ＨＢＩＩ−５２−４５、ＨＢＩＩ−５２−４６、ＩＰＷ、ＬＯＣ６４８６９１、ＬＯＣ９６６１０、ＭＡＧＥＬ２、ＭＩＲ６５０、ＭＫＲＮ３、ＮＣＲＮＡ００２２１、ＮＤＮ、ＯＣＡ２、ＯＲ４Ｓ２、ＰＡＲ−ＳＮ、ＰＡＲ１、ＰＡＲ５、ＰＯＭ１２１Ｌ１Ｐ、ＰＲＡＭＥ、ＳＮＯＲＤ１０７、ＳＮＯＲＤ１０８、ＳＮＯＲＤ１０９Ａ、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ、ＳＮＯＲＤ１１５−１１、ＳＮＯＲＤ１１５−２９、ＳＮＯＲＤ１１５−３６、ＳＮＯＲＤ１１５−４３、ＳＮＯＲＤ１１５−４４、ＳＮＯＲＤ１１５−４８、ＳＮＯＲＤ６４、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＵＲＦ、ＵＢＥ３Ａ、ＺＮＦ２８０Ａ、ＺＮＦ２８０Ｂからなる群から選択される少なくとも１つのＣＮＶ含有遺伝子の存在又は不在について検査される。さらに別の実施形態ではＣＮＶは、ＧＡＢＡシグナル伝達のために重要な遺伝子に属すると決定され、薬剤は表３又は表４に列挙されている。特に好ましい実施態様ではＣＮＶは、ＧＡＢＡシグナル伝達を変更し、薬剤はトピラミード（ｔｏｐｉｒａｍｉｄｅ）である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本研究の設計を示す図である。この２段階設計では、２０７６症例対コントロール４７５４例が発見コホート（段階１）において使用され、１１５９症例対コントロール２５４６例が複製コホート（段階２）について使用された。使用されたすべての試料は最低限の品質管理測定基準を通過しているが、ＰｅｎｎＣＮＶの初期設定の品質要求が発見コホート（最良の品質）を複製コホート（品質が劣る）から区別するために使用された。
【図２】本明細書で開示のＡＳＤ関連ＣＮＶＲによって破壊される遺伝子経路のクラスを示すグラフである。反復ＣＮＶＲによって破壊されるエクソンを有するすべての遺伝子は、経路の濃縮の有意性を確実にするためにＩｎｇｅｎｕｉｔｙに提出された。
【図３】症例（赤）対コントロール（青）におけるコピー数欠損の濃縮を強調するＧＡＢＡＲ−Ａファミリーの第１の程度のインタラクトームの模式図である。
【図４】疾患における特異的経路欠損への標的化療法のための検査及び治療モデルを示す図である。一般検査及び治療モデルは、黒で示され、分子診断が標的化介入から利益を得やすい欠損経路を有する集団を遺伝的に定義するために使用される。ＨＥＲ２特異的乳がんに対する標的化介入としてのトラスツズマブの例は青で示され、欠損ＧＡＢＡＲ−Ａ経路のためにＡＳＤを標的するように開発されている行動プログラム及び新規療法の推定は赤で示されている。
【図５】ヨーロッパ由来又はアフリカ由来集団でのＡＳＤのＧＷＡＳによるＣＮＶＲの有意性を示す図である。マンハッタンプロットは、ゲノムの各ＣＮＶＲについて関連の−ｌｏｇ１０転換Ｐ値を示している。隣接染色体は赤色と青色で交互に示されている。アフリカ人において複製されている（Ｐ＜＝０．００１）ヨーロッパ人において発見された領域（Ｐ＜＝０．０００１）は染色体バンドで標識された黒矢印で強調されている。ヨーロッパ人におけるＧＷＡＳ４，６３４症例対コントロール４，７２６例は最上部に示され、アフリカ人におけるＧＷＡＳ３１２症例対コントロール４，１７３例は下に示されている。
【図６】遺伝子のｍＧｌｕＲネットワークでの最適なＣＮＶＲの濃縮を示す図である。ネットワークのノードは、それらの遺伝子名で表示され、赤及び緑は欠失及び重複をそれぞれ表し、灰色のノードはＣＮＶデータを欠いている。暗色及び明色は、それぞれ症例及びコントロールでの濃縮を表している。ネットワークを定義する遺伝子はひし形で示され、一方すべての他の遺伝子は丸で示されている。青線は相互作用の証拠を示している。
【図７】ＣＡＬＭ１ネットワークでの最適なＣＮＶＲの濃縮を示す図である。ＣＡＬＭ１によって定義される第１の程度の方向付け相互作用ネットワークが示されている。
【図８】研究設計の略図である。ＡＳＤ及びｍＧｌｕＲネットワークにおいて遺伝子変化を有する小児（ｍＧｌｕＲ＋ＡＳＤ）は、ＡＳＤを有するがｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子の異常性を有さない小児（ｍＧｌｕＲ−ＡＳＤ）と比べて症候性ＡＳＤをさらに有しやすい。Ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
疫学調査は、自閉症、成人期に至る多様な表現型発現を表す小児における一般的精神神経系障害の病原性における遺伝的因子に確信的に関与した。小さなゲノム欠失及び挿入を担持する多数の低頻度の新たなコピー数変異体（ＣＮＶ）を含むいくつかの遺伝的決定因子がＡＳＤと関連すると既に報告されている。これらの遺伝子変異は、疾患の表現型所見の小さなサブセットについての原因となっている可能性がある。関与しているゲノム領域は、ＮＲＸＮ１、ＮＬＧＮ３、ＳＨＡＮＫ３及びＡＵＴＳ２を含むいくつかの遺伝子において報告された多様性を有して高度に不均一であると今日までに考えられている。
【００１６】
疾患についての個体の遺伝的危険性を予測することは、新規介入及びストリームライン療法の手法の開発を促進できる。期待される機能的ＣＮＶを同定するために本発明者らは、３Ｋ罹患症例及び７Ｋコントロールにわたって分析するために自閉症患者の種々の大きなコホートを多数の神経学的に正常なコントロールと組み合わせた。２段階ゲノムワイド関連設計では本発明者らは２６６ゲノムワイドで統計的に有意な（混合Ｐ＜＝２．７６ｘ１０−８）異なるＣＮＶ領域（ＣＮＶＲ）を明らかにした。
【００１７】
これらの頑強なＣＮＶＲによって破壊されたエクソンを有する３８遺伝子は、神経学的疾患、行動及び発達障害に影響を与える遺伝子ネットワークにおいて最も濃縮されている。ＧＡＢＡＲ−Ａ受容体シグナル伝達は、ＧＡＢＲＡ５、ＧＡＢＲＢ３、及びＧＡＢＲＧ３遺伝子において症例で濃縮された欠損が同定されたＡＳＤにおいて最も重要な破壊された古典的経路である。さらにＧＡＢＡＲ−Ａ受容体ファミリーの第１の程度の遺伝子インタラクトームのネットワーク分析は、神経学的に正常なコントロールと比較した場合にＡＳＤ症例がそのような経路欠損について有意に濃縮されていることを示唆している（Ｐ＜＝２．１ｘ１０−２１、ＯＲ＝９．９）。
【００１８】
まとめると本発明者らが同定したＣＮＶＲは、治療介入のための重要な標的を提供できるＧＡＢＡＲ−Ａシグナル伝達に関与する遺伝子を含む複数の新規遺伝子及びシグナル伝達経路に影響を与える。
【００１９】
薬物がタンパク質結合について内因性小分子と競合しなければならないことから、多数の良好な薬物は、複数の薬物結合部位を有する大きな遺伝子ファミリーを標的化する。実施例ＩＩＩで本発明者らは、薬物療法に適している可能性がある潜在的な追加的遺伝的標的を見出すために１２，５４４名の神経学的に正常なコントロールと比較してＡＳＤを有する患者６，７４２名において欠損遺伝子ファミリー相互作用ネットワーク（ＧＦＩＮ）を探索する。本発明者らは、実施例Ｉにおいて記載し、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）及び統合失調症に影響を与えることが以前観察された、代謝型グルタメート受容体（ＧＲＭ）ＧＦＩＮにおける構造的欠損の有意な濃縮（Ｐ＜＝２．４０ｘ１０−９、１．８倍濃縮）を見出している。同様に、既にがんに関与している遺伝子のＭＸＤ−ＭＹＣ−ＭＡＸネットワークは、ニューロンのシナプスで電圧非依存性カルシウム活性化活動電位を調節するカルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）遺伝子相互作用ネットワーク（Ｐ＜＝４．１６ｘ１０−４、１４．４倍濃縮）と同様に、顕著に濃縮されている（Ｐ＜＝３．８３ｘ１０−２３、２．５倍濃縮）。結論として本発明者らは、治療介入のための多数の新規翻訳的標的を提供する複数の欠損遺伝子ファミリー相互作用が自閉症の根底にあることを見出している。
【００２０】
定義：
「コピー数多型（ＣＮＶ）」は、個体のジェノタイプにおける具体的な遺伝子のコピー数を指す。ＣＮＶは、ヒト表現型のダイバーシティの主な遺伝成分を表す。遺伝的障害への易罹患性は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）だけでなく、ＣＮＶを含む構造的及び他の遺伝的変異にも関連することが知られている。ＣＮＶは、１キロベース（ｋｂ）以上であるＤＮＡ断片に関するコピー数変化を表す（Feuk等、2006a）。本明細書に記載のＣＮＶは、以後のＣＮＶ分析の複雑性を最少化するために転位因子（例えば〜６ｋｂ  ＫｐｎＩ反復）の挿入／欠失から生じる変異体を含まない。したがって用語ＣＮＶは、大規模コピー数変異体（ＬＣＶ；Iafrate等、2004）、コピー数多型（ＣＮＰ；Sebat等、2004）及び中間体サイズ変異体（ＩＳＶ；Tuzun等、2005）などの既に導入された用語は包含するが、レトロポゾン挿入はしない。
【００２１】
「一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）」は、ＤＮＡ中の単一の塩基がその位置での通常の塩基と異なっている変化を指す。これらの一塩基変化は、ＳＮＰ又は「スニップ（ｓｎｉｐ）」と呼ばれる。数百万個のＳＮＰがヒトゲノム中にカタログされている。鎌形赤血球を生じるなどのいくつかのＳＮＰは、疾患の原因になる。他のＳＮＰはゲノムにおける通常の多様性である。
【００２２】
本明細書において使用される用語「遺伝子変異」は、野生型又は参照配列からの１つ又は複数の核酸分子の変化を指す。遺伝子変異は、非限定的に既知の配列の核酸分子からの塩基対置換、少なくとも１つのヌクレオチドの付加及び欠失を含む。
【００２３】
本明細書において使用される用語「固体マトリクス」は、ビーズ、微小粒子、マイクロアレイ、マクロタイトレーションウエル若しくは試験管の表面、試験紙又はフィルターなどの任意の形態を指す。マトリクスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストラン又はアガロースであってよい。
【００２４】
句「から本質的になる」は具体的なヌクレオチド又はアミノ酸に関する場合、所与の配列番号の特性を有する配列を意味する。例えばアミノ酸配列を参照して使用される場合、句は配列自体並びに、配列の機能性及び新規特性に影響を与えない分子修飾を含む。
【００２５】
本明細書において使用される「標的核酸」は、複合体核酸混合物中に存在する核酸の予め定義された領域であって、定義された野生型領域が自閉症と関連する場合もしない場合もある少なくとも１つの既知のヌクレオチド多様性を含有する、領域を指す。核酸分子は、ｃＤＮＡクローニング若しくはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然供給源から単離されてよく又は手動合成されてよい。核酸分子は、トリエステル合成法によって手動で又は自動ＤＮＡ合成機を使用して合成されてよい。
【００２６】
本発明において使用される核酸に関して、用語「単離された核酸」はしばしば用いられる。ＤＮＡに適用される場合この用語は、それが由来する生物体の天然に存在するゲノム中で直近（５’及び３’方向で）である配列から分けられたＤＮＡ分子を指す。例えば「単離された核酸」は、プラスミド若しくはウイルスベクターなどのベクターに挿入された、又は原核生物若しくは真核生物などのゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含んでよい。「単離された核酸分子」は、ｃＤＮＡ分子も含んでよい。ベクターに挿入された単離された核酸分子は、時に本明細書において組換え核酸分子とも称される。
【００２７】
ＲＮＡ分子に関して用語「単離された核酸」は、上に定義の単離されたＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ分子を主に指す。代替的に用語は、天然状態（すなわち細胞又は組織中）で関連しているＲＮＡ分子から十分に分けられた、「実質的に純粋な」形態で存在するなどのＲＮＡ分子を指す場合がある。
【００２８】
核酸に関して用語「濃縮」の使用によって特異的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が、正常細胞又は配列が採取された細胞においてよりも目的の細胞又は溶液に存在する総ＤＮＡ又はＲＮＡにおいて顕著に高い割合（２−５倍）を構成することが意味される。これは、存在する他のＤＮＡ若しくはＲＮＡの量の選択的低減によって、又は特異的ＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列の量の選択的増加によって、又は２つの組合せによって、ヒトによってもたらされる。しかし「濃縮」は他のＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列が存在しないことを意味せず、単に目的の配列の相対量が顕著に増加しているだけであることは注目されるべきである。
【００２９】
ヌクレオチド配列が精製された形態であることはいくつかの目的のためにも有利である。核酸を参照する場合用語「精製された」は、完全に純粋（均一な調製物など）である必要はなく、むしろそれは、配列が天然環境においてよりも比較的純粋であることの指標を表している（天然レベルと比べて、このレベルは例えばｍｇ／ｍｌにおいて少なくとも２−５倍大きいべきである）。ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的な均一性にまで精製されている場合がある。これらのクローンから得られる特許請求されるＤＮＡ分子は、総ＤＮＡから又は総ＲＮＡから直接得られてよい。ｃＤＮＡクローンは天然に存在せず、むしろ好ましくは部分的に精製された天然に存在する物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作を介して得られる。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーのコンストラクションは合成物質（ｃＤＮＡ）の作製を含み、純粋な個々のｃＤＮＡクローンは、合成ライブラリーからｃＤＮＡライブラリーを保持している細胞のクローン選択によって単離できる。したがってｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーのコンストラクション及び異なるｃＤＮＡクローンの単離を含むプロセスは、天然メッセージのおよそ１０−６倍精製をもたらす。それにより少なくとも１桁、好ましくは２又は３桁、より好ましくは４又は５桁の大きさの精製が明示的に企図される。
【００３０】
用語「実質的に純粋」は、少なくとも５０−６０重量％で目的の化合物（例えば核酸、オリゴヌクレオチドなど）を含む調製物を指す。より好ましくは調製物は、少なくとも７５重量％、最も好ましくは９０−９９重量％で目的の化合物を含む。純度は、目的の化合物に適する方法によって測定される。
【００３１】
用語「相補的」は、複数の好都合な相互作用を互いに形成できる２個のヌクレオチドを記載する。例えばアデニンは、それらが２個の水素結合を形成できることからチミンに相補的である。同様にグアニンとシトシンとは、それらが３個の水素結合を形成できることから相補的である。したがって核酸配列が次の塩基、チミン、アデニン、グアニン及びシトシンの配列を含有する場合、この核酸分子の「相補体」は、チミンの代わりにアデニン、アデニンの代わりにチミン、グアニンの代わりにシトシン及びシトシンの代わりにグアニンを含有する分子である。相補体が親核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含有できることから、そのような相補体はその親分子に高親和性で結合できる。
【００３２】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して用語「特異的にハイブリダイズする」は、一般に当該技術分野で使用される予め決定した条件下でのそのようなハイブリダイゼーションを可能にする十分に相補的な配列の２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の関連を指す（時に「実質的に相補的」と呼ばれる）。具体的には用語は、非相補的配列の一本鎖核酸を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に排除して、本発明の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指す。例えば特異的ハイブリダイゼーションは、任意の自閉症特異的マーカー遺伝子又は核酸にハイブリダイズするが、他のヌクレオチドにハイブリダイズしない配列を指す場合がある。同様に「特異的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、神経特異的な特異的マーカー、本明細書に含まれる表に示す自閉症特異的マーカーなど、だけにハイブリダイズできる。多様な相補性の一本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする好適な条件は、当該技術分野において周知である。
【００３３】
例えば、特異的配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシー条件を算出するための１つの一般式は下に記載される（Sambrook等、 Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory (1989)：
Ｔｍ＝８１．５”Ｃ＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二重鎖の＃ｂｐ
【００３４】
上の式の例示として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミド、ＧＣ含有量４２％及び平均プローブサイズ２００ベースを使用して、Ｔｍは５７”Ｃである。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは相同性の１％減少ごとに１−１．５”Ｃ減少する。それにより、約７５％より大きな配列同一性を有する標的は、４２”Ｃのハイブリダイゼーション温度を使用して観察される。
【００３５】
ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、主に溶液の塩濃度及び温度に依存する。一般にプローブとその標的とのアニーリング速度を最大にするために、ハイブリダイゼーションはハイブリッドの算出されたＴｍよりも２０−２５℃低い塩及び温度条件で通常実行される。洗浄条件は、標的に対するプローブの同一性の程度に関して可能な限りストリンジェントであるべきである。一般に洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍよりもおよそ１２−２０℃低く選択される。本発明の核酸に関して、中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃でのハイブリダイゼーション、並びに２Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ、５５℃、１５分間での洗浄として定義される。高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションは６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃でのハイブリダイゼーション、並びに１Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ、６５℃、１５分間での洗浄として定義される。非常に高いストリンジェンシーなハイブリダイゼーションは６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃でのハイブリダイゼーション、並びに０．１Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ、６５℃、１５分間での洗浄として定義される。
【００３６】
本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ以上、好ましくは３つを超えるリボ又はデオキシリボヌクレオチドを含む核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、種々の因子及びオリゴヌクレオチドの具体的な適用及び使用に依存する。プローブ及びプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、３ヌクレオチドから核酸分子の完全長の任意の長さであってよく、３からポリヌクレオチドの完全長までのすべての可能な数の近接する核酸を明確に含む。好ましくはオリゴヌクレオチドは、少なくとも長さ約１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも長さ１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも長さ約２０ヌクレオチドである。
【００３７】
本明細書において使用される用語「プローブ」は、プローブに相補的な配列を有する核酸にアニーリングできる又は特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸を、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれでも精製制限酵素消化において天然に生じた又は合成的に産生されたかに関わらず指す。プローブは、一本鎖又は二本鎖のいずれでもよい。プローブの正確な長さは、温度、プローブの供給源及び使用方法を含む多数の因子に依存する。例えば診断的応用のために標的配列の複雑性に依存してオリゴヌクレオチドプローブは、典型的には１５−２５個以上のヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有してもよい。本明細書のプローブは、具体的な標的核酸配列のさまざまな鎖に相補的であるように選択され、検出可能な標識を含んでも含まなくてもよい。これは、プローブが予め決定した条件設定の下でそれらそれぞれの標的鎖に「特異的にハイブリダイズ」又はアニールできるように十分に相補的でなければならないことを意味する。したがってプローブ配列は、標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。例えば非相補的ヌクレオチド断片は、標的鎖に相補的であるプローブ配列の残り部分でプローブの５’又は３’末端に結合できる。代替的に非相補的塩基又はより長い配列は、プローブ配列が標的核酸と特異的にアニールするようにその配列に十分な相補性を有する条件で、プローブ中に散在されてよい。
【００３８】
本明細書において使用される用語「プライマー」は、適切な環境に置かれた場合に鋳型依存性核酸合成のイニシエーターとして機能的に作用できる、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか、一本鎖又は二本鎖のいずれか、生物学的系に由来する、制限酵素消化によって生成される又は合成的に産生されるのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す。好適な核酸鋳型、核酸の好適なヌクレオシド三リン酸塩前駆体、ポリメラーゼ酵素、好適な補助因子並びに好適な温度及びｐＨなどの条件で存在する場合、プライマーは、プライマー伸長産生物を得るためのポリメラーゼの作用又は類似の活性によるヌクレオチドの付加によってその３’末端で伸長できる。プライマーは、具体的な条件及び適用の必要条件に応じて長さが変化する場合があり、検出可能に標識されてもされなくてもよい。例えば診断的応用において、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には長さがヌクレオチド１５−２５個以上である。プライマーは、所望の伸長産生物の合成を準備するために、すなわち、ポリメラーゼ又は類似の酵素による合成の開始における使用のための好適な近位でプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するために十分な手段で所望の鋳型鎖とアニールできるように、所望の鋳型に十分に相補性でなければならない。プライマー配列は、所望の鋳型の正確な相補体を表すことは要求されない。例えば非相補性ヌクレオチド配列は、他の相補性プライマーの５’末端に結合できる。代替的に非相補性塩基は、伸長産生物の合成のために鋳型プライマー複合体を機能的に提供するためにプライマー配列が所望の鋳型鎖の配列と十分な相補性を有する条件で、オリゴヌクレオチドプライマー配列中に散在されてよい。好適な配列相同性を有し、ＣＮＶ含有核酸に特異的にハイブリダイズするプローブ及びプライマーは、生物学的試料中のそのような核酸の存在を検出することに有用である。
【００３９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、その開示全体が本明細書に出典明示により援用される米国特許第４６８３１９５号、第４８００１９５号及び第４９６５１８８に記載されている。
【００４０】
用語「ベクター」は、細胞に感染、トランスフェクト又は形質転換でき、独立して若しくは宿主細胞ゲノム内で複製できる一本又は二本鎖環状核酸分子に関する。環状二本鎖核酸分子は制限酵素での処置によって切断され、それにより直鎖化される場合がある。ベクターの種別、制限酵素及び制限酵素によって標的化されるヌクレオチド配列の知識は、当業者に容易に利用可能であり、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ又はウイルスなどの任意のレプリコンを含み、それに別の遺伝的配列又は要素（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）が結合配列又は要素の複製がもたらされるように結合できる。本発明の核酸分子は、ベクターを制限酵素で切断し、２片を合わせてライゲーションすることによってベクターに挿入されてよい。
【００４１】
多数の技術が発現コンストラクトの原核又は真核生物生物体への形質転換、トランスフェクション又は形質導入を促進するために当業者に利用可能である。用語「形質転換」「トランスフェクション」及び「形質導入」は、核酸及び／又は発現コンストラクトを細胞又は宿主生物に挿入する方法を指す。これらの方法は、宿主細胞外膜若しくは壁を目的の核酸分子に透過性にするために細胞を高濃度の塩、電場又は界面活性剤で処置すること、マイクロインジェクション、ＰＥＧ融合など種々の技術を含む。
【００４２】
用語「プロモーター要素」は、ベクター中に組み込まれており、好適な細胞の内部にあると、転写因子及び／又はポリメラーゼ結合並びに続いてベクターＤＮＡの部分のｍＲＮＡへの転写を促進できるヌクレオチド配列を記載する。一実施態様では本発明のプロモーター要素は、自閉症特異的マーカー核酸分子の５’末端に後者がｍＲＮＡに転写されるように先行している。次いで宿主細胞機構はｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳する。
【００４３】
当業者は、核酸ベクターがプロモーター要素及び自閉症特異的マーカー遺伝子核酸分子以外の核酸要素を含有できることを認識する。これらの他の核酸要素は、これだけに限らないが、複製開始点、リボソーム結合部位、薬物耐性酵素若しくはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列及び分泌シグナル、局所化シグナル又はポリペプチド精製のために有用なシグナルをコードする核酸配列を含む。
【００４４】
「レプリコン」は、任意の遺伝的要素、例えばプラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージ又はウイルスであり、それ自体の制御下で大規模に複製できる。レプリコンは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれであってもよく、一本鎖又は二本鎖であってよい。
【００４５】
「発現オペロン」は、宿主細胞又は生物体においてポリペプチドコード配列の発現を促進するプロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えばＡＴＧ又はＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写及び翻訳制御配列を有することができる核酸セグメントを指す。
【００４６】
本明細書において使用される用語「レポーター」、「レポーター系」、「レポーター遺伝子」又は「レポーター遺伝子産物」は、発現された場合に、例えば生物学的アッセイ、イムノアッセイ、放射イムノアッセイによって又は比色分析、フルオロジェニック、化学発光又は他の方法によって容易に測定できるレポーターシグナルを産生する産生物をコードする遺伝子を核酸が含む作動可能な遺伝子系を意味する。核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、直鎖状又は環状、一本鎖又は二本鎖、アンチセンス又はセンス極性のいずれであってもよく、レポーター遺伝子産物の発現のために必要な制御要素に作動可能に連結されている。必要とされる制御要素は、レポーター系の性質及びレポーター遺伝子がＤＮＡ又はＲＮＡの形態のいずれであるかによって変化し、これだけに限らないがプロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどの要素を含むことができる。
【００４７】
導入された核酸は、レシピエント細胞又は生物体の核酸に（共有結合的に連結されて）組み込まれても組み込まれなくてもよい。例えば細菌、酵母、植物及び哺乳動物細胞では導入された核酸は、プラスミドなどのエピソーム要素又は独立したレプリコンとして維持される場合がある。代替的に導入された核酸は、レシピエント細胞又は生物体の核酸に組み込まれ、その細胞又は生物体中で安定に維持され、さらにレシピエント細胞又は生物体の子孫細胞又は生物体に伝えられる又は遺伝する場合がある。最終的に導入された核酸は、一過性にだけレシピエント細胞又は宿主生物中に存在してよい。
【００４８】
用語「選択マーカー遺伝子」は、発現された場合に形質転換細胞に抗生物質耐性などの選択可能な表現型を付与する遺伝子を指す。
【００４９】
用語「動作可能に連結された」は、コード配列の発現のために必要な調節配列がＤＮＡ分子中でコード配列の発現に影響を与えるようにコード配列に対して好適な位置に位置付けられていることを意味する。この同じ定義は、時に、発現ベクター中の転写単位及び他の転写制御要素（例えばエンハンサー）の配置に適用される。
【００５０】
用語「組換え生物体」又は「トランスジェニック生物体」は、遺伝子又は核酸分子の新規組合せを有する生物体を指す。遺伝子又は核酸分子の新規組合せは、当業者に利用可能な核酸操作技術の幅広いアレイを使用して生物体に導入することができる。用語「生物体」は、少なくとも１つの細胞を含む任意の生物に関する。生物体は、１つの真核細胞と同様に単純であっても哺乳動物のように複雑であってもよい。したがって句「組換え生物体」は、組換え細胞並びに真核生物及び原核生物体を包含する。
【００５１】
用語「単離されたタンパク質」又は「単離され、精製されたタンパク質」は、本明細書において時に使用される。この用語は、本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を主に指す。代替的にこの用語は、それが天然で関連している他のタンパク質から十分に分けられ、それにより「実質的に純粋」な形態で存在するタンパク質を指す場合がある。「単離された」は、他の化合物若しくは材料との人工若しくは合成混合物又は、例えば不完全な精製、安定剤の付加若しくは例えば免疫原性調製物若しくは薬学的に許容される調製物への化合のために存在する場合がある、基本的活性を干渉しない不純物の存在を排除することを意味しない。
【００５２】
「特異的結合対」は、相互に具体的な特異性を有し、通常状態で他の分子より優先して相互に結合する、特異的結合メンバー（ｓｂｍ）及び結合パートナー（ｂｐ）を含む。特異的結合対の例は、抗原と抗体、リガンドと受容体及び相補的ヌクレオチド配列である。当業者は、多数の他の例を承知している。さらに用語「特異的結合対」は、特異的結合メンバーと結合パートナーとのいずれか又は両方が大きな分子の一部を含む場合も適用できる。特異的結合対が核酸配列を含む実施態様では、それらはアッセイ条件下で相互にハイブリダイズする長さであり、好ましくは１０ヌクレオチド長より長い、より好ましくは１５又は２０ヌクレオチド長より長い。
【００５３】
「試料」又は「患者試料」又は「生物学的試料」は、具体的な分子、好ましくは下に提供される表に示されるマーカーなどの自閉症特異的マーカー分子について検査され得る試料を一般に指す。試料は、これだけに限らないが細胞、血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、胸膜液などを含む体液を含むことができる。
【００５４】
用語「薬剤」及び「検査化合物」は、本明細書において互換的に用いられ、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子又は、細菌、植物、真菌若しくは動物（具体的には哺乳動物）細胞若しくは組織などの生体材料から作られた抽出物を記す。生物学的巨大分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体及び、ＳＮＰ及び／若しくは本明細書に記載のＣＮＶ含有核酸又はそれらのコードタンパク質の活性を調節する能力を示す任意の核酸に基づく分子を含む。薬剤は、以下に記載のスクリーニングアッセイに含めることによって潜在的生物活性について評価される。
【００５５】
自閉症及び自閉症スペクトラム症の発症についての傾向を診断するための自閉症関連ＣＮＶＳ及び／又はＳＮＰＳの使用方法
これだけに限らないが下に提供する表に列挙する自閉症関連ＣＮＶ及び／又はＳＮＰ含有核酸は、本発明により種々の目的のために使用される場合がある。自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰを含有するＤＮＡ、ＲＮＡ又はその断片は、自閉症特異的マーカーの存在及び／又は発現を検出するためのプローブとして使用できる。自閉症特異的マーカー核酸がそのようなアッセイのためのプローブとして利用できる方法は、これだけに限らないが（１）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（２）サザンハイブリダイゼーション（３）ノーザンハイブリダイゼーション及び（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのアソート増幅反応を含む。
【００５６】
さらに、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰを検出するためのアッセイはこれだけに限らないが体液（血液、尿、血清、胃洗浄を含む）、任意の種類の細胞（脳細胞、白血球、単核細胞などの）又は身体組織を含む任意の種類の生物学的試料で実施できる。そのような検出方法は、例えばサザン及びノーザンブロッティング、ＲＦＬＰ、直接配列決定及び参照核酸配列を含むマイクロアレイへの増幅産生物のハイブリダイゼーションが続くＰＣＲ増幅を含む場合がある。
【００５７】
前述の考察から、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸、同じ物を発現するベクター、自閉症ＣＮＶ／ＳＮＰ含有マーカータンパク質及び本発明の抗自閉症特異的マーカー抗体が、身体組織、細胞又は体液中で自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰを検出するために使用でき、自閉症ＳＮＰ含有マーカータンパク質発現を自閉症の発症に関与する遺伝的及びタンパク質相互作用を評価する目的で変更できることが観察できる。
【００５８】
自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰをスクリーニングすることについて大部分の実施態様では、試料中の自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸は、試料中に存在する他の配列と比較して鋳型の量を増加させるために最初に例えばＰＣＲを使用して増幅される。これは、標的配列をそれらが試料中に存在する場合に高い感度で検出できるようにする。この初期工程は当該技術分野においてますます重要になっている高感受度アレイ技術を使用することによって回避できる。代替的に新規検出技術は、この限界を克服しわずか１μｇ程度の全ＲＮＡを含有する少量の試料の分析を可能にできる。伝統的蛍光技術とは対照的に共鳴光散乱（ＲＬＳ）技術を使用して、複数の読み取りがビオチン標識されたハイブリダイズ標的及び抗ビオチン抗体を使用して少量のｍＲＮＡを検出できる。ＰＣＲ増幅への別の代替法は、シグナル対ノイズ比を増加させ、バックグラウンド干渉を低減するための平面導波技術（ＰＷＧ）を含む。両技術は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から市販されている。
【００５９】
したがって前述のいずれの技術も自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰマーカー発現を検出及び定量するため、したがって自閉症又は自閉症スペクトラム症を診断するために使用できる。
【００６０】
キット及び製造品
前述の任意の産生物は、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ特異的マーカーポリヌクレオチド又は遺伝子チップに固定された１つ若しくは複数のそのようなマーカー、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、標識、前記標識は検出可能であり任意選択的にオリゴヌクレオチド、ポリペプチド若しくは抗体マーカー又はレポーターに動作可能に連結されている、薬学的に許容される担体、生理的に許容される担体、使用説明書、容器、投与のための容器、アッセイ基質又はそれらの任意の組合せを含有できるキットに組み込まれてよい。
【００６１】
好ましい実施態様ではキットは、本明細書に記載の遺伝子変異を含む核酸を担持する生物学的試料中に存在する核酸を同定するための試薬を含有する。ＣＮＶが欠失である場合、プローブ又はプライマーは、ＣＮＶが存在するかどうかを評価するために影響を受ける領域に隣接するように設計される。
【００６２】
治療剤の開発のために自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰを使用する方法
本明細書で同定されたＣＮＶ及びＳＮＰが自閉症の病因と関連していることから、そのようなＣＮＶ／ＳＮＰを含有する遺伝子及びそれらにコードされた産生物の活性を調節する薬剤を同定するための方法は、この状態に関連する種々の障害の治療のために有効な治療剤の生成をもたらすはずである。
【００６３】
表１に提供するデータから見られるとおり、いくつかの染色体は治療剤の合理的な設計のためにそれらの活性を調節する好適な標的を提供する領域を含有している。これらの領域に対応する小ペプチド分子は、コードされたタンパク質の活性を有効に調節する治療剤の設計に利益をもたらすために使用できる。
【００６４】
分子モデル化は、ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸によってコードされるタンパク質の活性部位に結合する能力を有する具体的な有機分子の同定をコンホメーション又は機能のために必要な鍵となるアミノ酸残基に基づいて促進する。コンビナトリアル化学手法は、最も高い活性を有する分子を同定するために使用され、次いでこれらの分子の反復はさらなるスクリーニングサイクルのために開発される。
【００６５】
薬物スクリーニングアッセイにおいて用いられるポリペプチド又は断片は、溶液中で遊離、固体支持体に付けられている又は細胞内にあるのいずれでもよい。薬物スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチド又は断片を発現する組換えポリヌクレオチドで安定に形質転換されている真核生物又は原核宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイで利用する。そのような細胞は、生細胞又は固定された形態のいずれでも、標準結合アッセイのために使用できる。例えばポリペプチド若しくは断片と検査される薬剤との間の複合体の形成は決定でき、又はポリペプチド若しくは断片と既知の基質との間の複合体の形成が検査される薬剤によってどの程度干渉されるかを検討できる。
【００６６】
薬物スクリーニングのための別の技術は、コードされるポリペプチドに対して好適な結合親和性を有する化合物のためのハイスループットスクリーニングを提供し、Ｇｅｙｓｅｎ、ＰＣＴ公開出願国際公開第８４／０３５６４号、１９８４年９月１３日出願に詳述されている。簡潔に述べると、上に記載のものなどの多数のさまざまな小ペプチド検査化合物が、プラスチックピン又は他のものの表面などの固体基質上に合成される。ペプチド検査化合物は、標的ポリペプチドと反応され、洗浄される。結合したポリペプチドは、次いで当該技術分野で周知の方法によって検出される。
【００６７】
薬物スクリーニングのためのさらなる技術は、宿主真核細胞株又は、非機能性又は変化した自閉症関連遺伝子を有する細胞（上に記載のものなど）の使用を含む。これらの宿主細胞株又は細胞は、ポリペプチドレベルで欠損がある。宿主細胞株又は細胞は薬物化合物の存在下で増殖される。細胞代謝の速度、細胞形態及び／又は宿主細胞の受容体シグナル伝達における変化は、欠損細胞において化合物がこれらのパラメーターのいずれかを変更できるかどうかを決定するために測定される。本発明における使用のために企図される宿主細胞は、これだけに限らないが細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び植物細胞を含む。自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰをコードするＤＮＡ分子は、そのような発現によって付与される細胞の表現型を評価するために、そのような宿主細胞に単一で又は組合せで導入されてよい。ＤＮＡ分子を導入するための方法も当該技術分野の当業者に周知である。そのような方法は、その開示が本明細書に出典明示により援用されるAusubel1等編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY、N.Y. 1995に記載されている。
【００６８】
本発明の新規ＤＮＡ配列を発現するように改変できる多種多様な発現ベクターが入手可能である。本明細書において例示的する具体的ベクターは、単に例示的であり本発明の範囲を限定することを目的としない。発現方法は、Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual or Current Protocols in Molecular Biology 16.3-17.44 (1989)によって記載されている。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）での発現方法は、Current Protocols in Molecular Biology (1989)においても記載されている。
【００６９】
本発明を実施することにおける使用のために好適なベクターは、ｐＮＨベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．、１１０９９  Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｄ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．９２０３７）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、５６５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７１１）及びｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．０８８５４）などの原核ベクターを含む。本発明を実施することにおいて有用な真核生物ベクターの例は、ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ及びｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１５８８  Ｓｏｒｒｅｎｔｏ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｄ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．９２１２１）；ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５＆Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３又はｐＡＣ３６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのバキュロウイルスベクター；及びＹＲＰ１７、ＹＩＰ５及びＹＥＰ２４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）並びにｐＲＳ４０３及びｐＲＳ４１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）などの酵母ベクター；ｐＨＩＬ−Ｄ１（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  Ｃｏ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、Ｏｋｌａ．７４００４）などのピキアベクター；ＰＬＮＣＸ及びｐＬＰＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などのレトロウイルスベクター；並びにアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスベクターを含む。
【００７０】
本発明の発現ベクターにおける使用のためのプロモーターは、原核又は真核細胞において作動可能であるプロモーターを含む。原核細胞において作動可能であるプロモーターは、ラクトース（ｌａｃ）制御要素、バクテリオファージラムダ（ｐＬ）制御要素、アラビノース制御要素、トリプトファン（ｔｒｐ）制御要素、バクテリオファージＴ７制御要素及びそれらのハイブリッドを含む。真核細胞において作動可能であるプロモーターは、エプスタイン・バーウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターなどのバキュロウイルスプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーターなどのピキアプロモーター、並びにｇａｌ４誘導性プロモーター及びＰＧＫ構成的プロモーターなどのサッカロミセス属プロモーター並びにニューロン特異的血小板由来増殖因子プロモーター（ＰＤＧＦ）、Ｔｈｙ−１プロモーター、ハムスター及びマウスプリオンプロモーター（ＭｏＰｒＰ）並びにグリア細胞での導入遺伝子の発現のためのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を含む。
【００７１】
付加的に本発明のベクターは形質転換宿主細胞の選択を促進する多数の種々のマーカーの任意の１つを含有してよい。そのようなマーカーは、温度感受性、薬物耐性又は宿主生物の表現型特性に関連する酵素に関連する遺伝子を含む。
【００７２】
本発明の自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ又はその機能性断片を発現している宿主細胞は、自閉症の発症を調節する能力について潜在的化合物又は薬剤をスクリーニングするための系を提供する。それにより一実施態様では本発明の核酸分子は、ニューロンのシグナル伝達及びニューロン細胞コミュニケーション並びに構造に関連する細胞代謝の状況を調節する薬剤を同定するためのアッセイにおける使用のための組換え細胞株を作製するために使用されてよい。同様に本明細書で提供されるのは、ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸によってコードされるタンパク質の機能を調節できる化合物についてスクリーニングするための方法である。
【００７３】
別の手法は、ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸によってコードされたポリペプチドの断片をファージ表面に発現するために操作されたファージディスプレイライブラリーの使用を含む。そのようなライブラリーは次いで発現されるペプチドと化学的ライブラリーの成分との間の結合親和性が検出できる条件下でコンビナトリアル化学的ライブラリーと接触させられる。米国特許第６０５７０９８号及び第５９６５４５６号は、そのようなアッセイを実施するための方法及び装置を提供する。
【００７４】
合理的な薬物設計の目標は、目的の生物学的に活性なポリペプチドの又はそれらが相互作用する小分子（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤）の構造的アナログを、例えばポリペプチドのさらに活性な若しくは安定な形態である又は例えばポリペプチドの機能をインビボで増強する若しくは干渉する薬物を作り出すために、産生することである。例えばHodgson, (1991) Bio/Technology 9:19-21を参照されたい。上に考察の一手法では、目的のタンパク質又は例えばタンパク質基質複合体の三次元構造は、Ｘ線結晶学によって、核磁気共鳴によって、コンピューターモデル化によって又は最も典型的には、手法の組合せによって解析される。頻度は低いものの、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づくモデル化によって得られる場合がある。合理的な薬物設計の例は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発である（Erickson等、 (1990) Science 249:527-533）。付加的に、ペプチドは、アラニン走査によって分析されてよい（Wells、(1991) Meth. Enzym. 202:390-411）。この技術ではアミノ酸残基はＡｌａによって置き換えられ、ペプチドの活性へのその影響が決定される。ペプチドのそれぞれのアミノ酸残基はペプチドの重要な領域を決定するためにこの様式で分析される。
【００７５】
機能性アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原理的にはこの手法は、続く薬物設計が基づくことができるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）をもたらす。
【００７６】
機能的で、薬理的に活性な抗体への抗イデオタイプ抗体（抗イディオ）を生成することによってタンパク質結晶化を完全に回避できる。鏡像の鏡像として、抗イディオの結合部位は元の分子のアナログであると予測される。そのため抗イディオは、ペプチドの化学的に又は生物学的に産生されたバンクのバンクからペプチドを同定及び単離するために使用されてよい。選択されたペプチドは、次いで療法用として作用する。
【００７７】
したがって、例えば改善されたポリペプチド活性若しくは安定性を有する、又はポリペプチド活性の阻害剤、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する薬物を設計できる。本明細書に記載のＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸配列を利用できることから、コードされたポリペプチドの十分な量をＸ線結晶学などの分析的研究を実施するために利用可能にできる。付加的に本明細書で提供するタンパク質配列の知識は、Ｘ線結晶学の代わりに又は付加的にコンピューターモデル化技術を用いるものを導く。
【００７８】
別の実施態様では自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸を利用できることは、本発明の自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰを保有している実験用マウス株の作出を可能にする。本発明の自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰを発現しているトランスジェニックマウスは、ＳＮＰ含有核酸によってコードされるタンパク質の自閉症の発症及び進行における役割を検討するモデル系を提供する。実験用マウスに導入遺伝子を導入する方法は、当該技術分野の当業者に知られている。３種の一般的方法は：１．目的の外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターの早期胚への組込み；２．新たに受精した卵の前核へのＤＮＡの注入；及び３．遺伝的に操作された胚性幹細胞の早期胚への組込みを含む。上に記載のトランスジェニックマウスの産生は、標的タンパク質が種々の細胞の代謝及びニューロンのプロセスにおいて担う役割の分子的解明を促進する。そのようなマウスは、全動物モデルにおける推定治療薬を研究するためのインビボスクリーニングツールを提供し、本発明により包含される。
【００７９】
用語「動物」は、本明細書においてヒトを除くすべての脊椎動物を含んで使用される。それは、胚性及び胎生段階を含むすべての発達の段階における個体動物も含む。「トランスジェニック動物」は、標的化組換え又はマイクロインジェクション又は組換えウイルスでの感染によってなどの細胞内レベルでの計画的な遺伝子操作によって直接的又は間接的に変更された又は受け取った遺伝情報を保持している１つ又は複数の細胞を含有する任意の動物である。用語「トランスジェニック動物」は、古典的交雑又はインビトロ受精を包含することを意味しないが、１つ又は複数の細胞が組換えＤＮＡ分子によって変更された又はそれを受け取った動物を包含して意味する。この分子は、所定の遺伝子座に特異的に標的化されてよく、染色体内に無作為に組み込まれてよく又はそれは染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。用語「生殖細胞株トランスジェニック動物」は、遺伝子変異又は遺伝情報が生殖系列細胞に導入され、それにより遺伝情報を子孫に移行する能力を付与されているトランスジェニック動物を指す。そのような子孫がその変化又は遺伝情報のいくらか又はすべてを実際に保有する場合、それらもトランスジェニック動物である。
【００８０】
遺伝情報の変化は、レシピエントが属する動物種に外来性である若しくは具体的な個体レシピエントだけに外来性である場合がある、又はレシピエントによって既に保有されている遺伝情報である場合がある。最後の場合、変更された又は導入された遺伝子は、天然の遺伝子とは異なって発現される場合がある。そのような変更された又は外来遺伝情報は、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有ヌクレオチド配列の導入を包含する。
【００８１】
標的遺伝子を変更するために使用されるＤＮＡは、これだけに限らないが、ゲノム供給源からの単離、単離されたｍＲＮＡ鋳型由来ＤＮＡ調製物、直接合成又はこれらの組合せを含む多種多様な技術によって得ることができる。
【００８２】
導入遺伝子の導入のための標的細胞の好ましい種類は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養された着床前胚から得ることができる（Evans等、 (1981) Nature 292:154-156、Bradley等、(1984) Nature 309:255-258、Gossler等、(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83:9065-9069）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションなどの標準的技術によって又はレトロウイルス介在形質導入によってＥＳ細胞に効率的に導入できる。得られた形質転換ＥＳ細胞は、非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わされてよい。導入されたＥＳ細胞は、その後胚を形成（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）し、生じるキメラ動物の生殖系列に寄与する。
【００８３】
個体遺伝子及びそれらの発現産生物の寄与を決定する問題への１つの手法は、全能性ＥＳ細胞（上に記載のものなど）において野生型遺伝子を選択的に不活性化するための挿入カセットとして単離された自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ遺伝子を使用し、次いでトランスジェニックマウスを作出することである。遺伝子標的化トランスジェニックマウスの生成における遺伝子標的化ＥＳ細胞の使用は、記載されており、他所に概説されている（Frohman等、(1989) Cell 56:145-147、Bradley等、(1992) Bio/Technology 10:534-539）。
【００８４】
技術は、特異的変化を染色体対立遺伝子に挿入するための標的化相同組換えを使用して、任意の遺伝領域を所望の変異に不活性化する又は変更するために利用可能である。しかし、１００％に達する頻度で生じる相同染色体外組換えと比較して、相同プラスミド染色体組換えは、元々１０−６から１０−３の頻度で検出されるだけであると報告された。非相同プラスミド染色体相互作用は、匹敵する相同挿入よりも１０５倍から１０２倍大きなレベルで生じてさらに頻繁である。
【００８５】
マウスＥＳ細胞での標的化組換えの低い割合を克服するために、種々の戦略が低頻度相同組換えを検出又は選択するために開発された。相同的な変化事象を検出するための１つの手法には、形質転換体細胞のプールを相同挿入についてスクリーニングするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、続いて個々のクローンをスクリーニングすることがある。代替的にマーカー遺伝子が相同挿入が生じた場合だけ活性であるようにコンストラクトされ、これらの組換えを直接選択されるようにする、正の遺伝子選択手法が開発された。相同組換えを選択するために開発された最も強力な手法の１つは、変更の直接選択が存在しない遺伝子のために開発された正負選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（ＰＮＳ））法である。ＰＮＳ法は、マーカー遺伝子がそれ自体のプロモーターを有することから高レベルでは発現されない標的化遺伝子についてさらに効率的である。非相同組換えは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用し、ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）又は（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄアラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）などの有効なヘルペス薬物でその非相同挿入を反対に選択することによって反対に選択される。この対抗選択によって生存している形質転換体における相同組換えの数を増加させることができる。自閉症関連ＳＮＰ含有核酸を標的化挿入カセットとして利用することは、自閉症関連ＳＮＰ核酸によってコードされたポリペプチドに対して免疫学的に特異的な抗体への免疫反応性の獲得によって例えば可視化され、成功した挿入物を検出するための手段を提供し、したがって、所望のジェノタイプを有するＥＳ細胞のスクリーニング／選択を促進する。
【００８６】
本明細書において使用されるノックイン動物は、内因性マウス遺伝子が、例えば本発明のヒト自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有遺伝子で、置き換えられているものである。そのようなノックイン動物は、自閉症の発症を研究するための理想的なモデル系を提供する。
【００８７】
本明細書において使用される自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸、その断片又は自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ融合タンパク質の発現は、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰのすべて又は一部をコードする核酸配列が、コードされたタンパク質の具体的な組織又は細胞型での発現を方向付ける調節配列（例えばプロモーター及び／又はエンハンサー）に動作可能に連結されているベクターを使用して、「組織特異的様式」又は「細胞型特異的様式」で標的化されてよい。そのような制御要素は、インビトロ及びインビボ両方の適用のために有利に使用できる。組織特異的タンパク質を方向付けるためのプロモーターは、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。
【００８８】
本発明の自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰをコードする核酸配列は、トランスジェニック動物における発現のために種々の異なるプロモーター配列に動作可能に連結されてよい。そのようなプロモーターは、これだけに限らないが、米国特許第５８７７３９９号及びBorchelt等、 Genet. Anal. 13(6) (1996) p159-163において記載のハムスター及びマウスプリオンプロモーター（ＭｏＰｒＰ）などのプリオン遺伝子プロモーター；米国特許第５６１２４８６号及び第５３８７７４２号に記載のラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター；米国特許第５８１１６３３号に記載の血小板由来増殖因子Ｂ遺伝子プロモーター；米国特許第５８４９９９９号に記載の脳特異的ジストロフィンプロモーター；Ｔｈｙ−１プロモーター；ＰＧＫプロモーター；ＣＭＶプロモーター；ニューロン特異的血小板由来増殖因子Ｂ遺伝子プロモーター；並びにグリア細胞での導入遺伝子の発現のためのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターを含む。
【００８９】
本発明のトランスジェニックマウスの使用方法も本明細書において提供される。自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰを含有する核酸又はそのコードタンパク質が導入されたトランスジェニックマウスは、例えば自閉症の発症を調節できるものを同定するための治療剤をスクリーニングするためのスクリーニング方法を開発するために有用である。
【００９０】
医薬品及びペプチド療法
本明細書に記載の自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰがニューロンのシグナル伝達及び脳構造において担う役割の解明は、自閉症の治療及び診断のために有用な薬学的組成物の開発を促進する。これらの組成物は、上記の物質の１つに加えて薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含むことができる。そのような材料は、無毒性であるべきであり、活性成分の有効性に干渉するべきでない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与の経路、例えば経口、静脈内、皮膚又は皮下、鼻腔、筋肉内、腹腔内経路に依存する場合がある。
【００９１】
個体に与えられるものがポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子又は本発明による他の薬学的に有用な化合物であるかどうかに関わらず、投与は、好ましくは「予防有効量」又は「治療有効量」においてであり（場合によって、予防は治療的であると考えられる場合がある）、これは個体に利益を示すために十分である。
【００９２】
次の材料及び方法は、本発明の実施を促進するために提供される。
【００９３】
研究設計及び品質管理
ＰｅｎｎＣＮＶがすべてのジェノタイプの試料にわたってＣＮＶを定義するために使用された。複数のチップ型でのジェノタイピングによって導入された混合ＳＮＰ含有量からの潜在的チップトゥーチップバイアスを管理するために、５５０Ｋ、６１０Ｋ、６６０Ｋ及び１Ｍ  Ｉｌｌｕｍｉｎａチップにわたる５５０Ｋ接合部ＳＮＰからのＣＮＶ判定だけが考慮された。低品質の試料は：
１．＃ＣＮＶ＞１００
２．ＳＤ  ＬＲＲ＞０．３
３．｜ＧＣＷＦ｜＞０．０２
に基づいて試料ごとに排除した。
【００９４】
統計解析
分析の各段階についてゲノムは、「コア」ＣＮＶゲノム領域の即時同定を促進するＣＮＶによって影響を受ける症例及びコントロールの明確なセットを定義するＣＮＶ領域（ＣＮＶＲ）にセグメント化された。これらのＣＮＶＲは、複数の検査についての補正後にＰ＜＝０．０１のアルファを有して、フィッシャー直接検定によって２段階設計で関連について検査された。
【００９５】
ネットワーク分析
インジェニュイティパスウェイ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ）分析は、反復ＣＮＶＲによって破壊されたエクソンを有する遺伝子内でネットワーク及び古典的経路における濃縮を見出すために使用された。フィッシャー直接検定並びに症例／コントロール標識の１０００個の無作為並べ替え検定を遺伝子のＧＡＢＡＲファミリーの一次インタラクトームの濃縮を計測するために使用した。
【００９６】
次の実施例は、本発明の特定の実施態様を例示するために提供される。それらはいかなる点でも本発明を限定することを目的としない。
【実施例】
【００９７】
実施例Ｉ
疾患について個体のゲノム危険性を定量する能力は、新規介入の開発を促進でき、医療行為を改善できる。小さなゲノム欠失及び挿入を担持する多数の低頻度コピー数変異体（ＣＮＶ）が自閉症スペクトラム症（ＡＳＤ）において記載されてきた。これらの機能性であると考えられる要素を同定するために、本発明者らは、自閉症患者の種々の大きなコホートと多数の神経学的に正常なコントロールとを、３Ｋ罹患症例及び７Ｋコントロールにわたって分析するために組み合わせた。２段階ゲノムワイド関連設計で、本発明者らは２６６ゲノムワイドの統計的に有意に（混合Ｐ＜＝２．７６ｘ１０−８）異なるＣＮＶ領域（ＣＮＶＲ）を明らかにした。
【００９８】
これらの頑強なＣＮＶＲによって破壊されたエクソンを有する３８遺伝子は、神経学的疾患、行動及び発達障害に影響を与える遺伝子ネットワークにおいて最も濃縮されている。ＧＡＢＡＲ−Ａ受容体シグナル伝達は、症例に濃縮された欠損がＧＡＢＲＡ５、ＧＡＢＲＢ３及びＧＡＢＲＧ３遺伝子にあることから、ＡＳＤにおいて破壊された最も重要な古典的経路であることが見出された。さらに、ＧＡＢＡＲ−Ａ受容体ファミリーの第１の程度の遺伝子インタラクトームのネットワーク分析は、ＡＳＤ症例は、神経学的に正常なコントロールと比較した場合に経路欠損が有意に濃縮されている（Ｐ＜＝２．１ｘ１０−２１、ＯＲ＝９．９）ことを示唆している。
【００９９】
まとめると本発明者らが同定したＣＮＶＲは、新規治療剤開発のために重要である可能性があるＧＡＢＡＲ−Ａシグナル伝達に関与する遺伝子を含む複数の新規遺伝子及びシグナル伝達経路に影響を与える。
【０１００】
結果
全体で、関連がない３８７１症例をコントロール７７６８例と比較した。試料は５ヵ所の独立した場所から調達され、次のとおり分けられた：
2018500001.tif 000002
【０１０１】
全体で、３２２５症例及びコントロール７３００例が品質管理を通過し、ＣＮＶ分析のために使用された。これらの個体は、ＰｅｎｎＣＮＶの初期設定品質要求に基づいて発見（段階１）及び複製（段階２）コホートに分類された。この２段階設計では、２０７６症例対コントロール４７５４例が発見コホートにおいて使用され、１１５９症例対コントロール２５４６例が複製コホートにおいて使用された。図１を参照されたい。
【０１０２】
発見段階では、分析に使用された５５０Ｋ  ＳＮＰについてのボンフェローニ補正後に３５３個の有意なＣＮＶＲ（名目Ｐ＜＝１．８ｘ１０−８）が同定され、３５３個の検査した有意な発見領域についての補正後２６６個の有意なＣＮＶＲ（名目Ｐ＜＝２．９ｘ１０−５）が複製された。最も顕著に関連したＣＮＶＲは、ＡＳＤについてのいくつかの魅力的で新規の候補遺伝子を強調している。
【０１０３】
最も興味深いのは、ＧＡＢＲＢ３−ＧＡＢＡ−Ａ受容体、ベータ３での症例に特有の２５個の重複である（Ｐ＜＝１．４２ｘ１０−１３、ＯＲ＝ｉｎｆ）。これは、ＧＡＢＡが主な阻害的神経伝達物質であり、プラダーウィリー／アンジェルマン症候群臨界領域（１５ｑ１１−１３）内に位置していることから魅力的な候補遺伝子であり、その変異は自閉症を有する数名の個体において記載されている。さらにこれはヨーロッパ人及びアフリカ人集団にわたって有意であることが見出された（それぞれＰ＜＝６．４４ｘ１０−５及び１．８２ｘ１０−５）；ＧＡＢＲＢ３多型と自閉症（Buxbaum等、2002）並びにＧＡＢＲＡ４及びＧＡＢＲＢ１（Collins等、2006）の間の関連。Ｇａｂｒｂ３遺伝子欠損マウスは、障害がある社会的及び探索的行動、非選択的注意の欠如及び小脳小葉の発育不全：自閉症スペクトラム症の潜在的モデルを示す（DeLorey、Sahbaie、Hashemi、Homanics、& Clark、2008）。
【０１０４】
本発明者らは頑強なＣＮＶＲによって破壊されるエクソンを含む３８個の遺伝子ＡＴＰ１０Ａ、ＧＡＢＲＡ５、ＧＡＢＲＢ３、ＧＡＢＲＧ３、ＧＧＴＬＣ２、ＨＢＩＩ−５２−４５、ＨＢＩＩ−５２−４６、ＩＰＷ、ＬＯＣ６４８６９１、ＬＯＣ９６６１０、ＭＡＧＥＬ２、ＭＩＲ６５０、ＭＫＲＮ３、ＮＣＲＮＡ００２２１、ＮＤＮ、ＯＣＡ２、ＯＲ４Ｓ２、ＰＡＲ−ＳＮ、ＰＡＲ１、ＰＡＲ５、ＰＯＭ１２１Ｌ１Ｐ、ＰＲＡＭＥ、ＳＮＯＲＤ１０７、ＳＮＯＲＤ１０８、ＳＮＯＲＤ１０９Ａ、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ、ＳＮＯＲＤ１１５−１１、ＳＮＯＲＤ１１５−２９、ＳＮＯＲＤ１１５−３６、ＳＮＯＲＤ１１５−４３、ＳＮＯＲＤ１１５−４４、ＳＮＯＲＤ１１５−４８、ＳＮＯＲＤ６４、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＵＲＦ、ＵＢＥ３Ａ、ＺＮＦ２８０Ａ、ＺＮＦ２８０Ｂを見出した。これらの遺伝子は、神経学的疾患、行動及び発達障害に影響を与える遺伝子ネットワークにおいて最も濃縮されており、ＧＡＢＡＲ−Ａ受容体シグナル伝達は、ＧＡＢＲＡ５、ＧＡＢＲＢ３及びＧＡＢＲＧ３遺伝子中の症例で濃縮された欠損に関連して、ＡＳＤにおいて破壊された最も重要な古典的経路であることが見出された。図２及び表２を参照されたい。
【０１０５】
最終的に本発明者らは、ＧＡＢＡＲ−Ａファミリーの第１段階インタラクトームを同定し、神経学的に正常なコントロールと比較した場合にＡＳＤ症例が症例中の経路欠損について有意に濃縮されていることを見出した。遺伝的経路欠損を担持する症例の約３％に対してコントロールの０．０３％（Ｐ＜＝２．１ｘ１０−２１、ＯＲ＝９．９）、症例では遺伝子１２１個の内１７個（１４％）の濃縮に対してコントロールでは遺伝子１２１個の内９個（７％）の濃縮。症例（赤）に対してコントロール（青）で濃縮された遺伝子を示すネットワークを図３に示す。
2018500001.tif 000003
【０１０６】
実施例ＩＩ
自閉症及びＡＳＤの治療のための有効な治療剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
本明細書上記の情報は、自閉症又は自閉症スペクトラム症を発症する易罹患性の増加を診断する及び治療介入のために患者に臨床的に適用できる。本発明の好ましい実施態様は、明細書に記載の情報の患者への臨床適用を含む。マイクロアレイを含む診断用組成物及び方法は、自閉症又はＡＳＤを発症する易罹患性を評価するために、患者由来の核酸中において本明細書に記載の遺伝子変異を同定するために設計されてよい。これは、患者が診療所に来院後に行われ、患者は採血され、本明細書に記載の診断方法を使用して、臨床医はＣＮＶを実施例Ｉに記載及び表ＩＩに示すとおり検出できる。任意選択的に評価の前に増幅されてよい患者試料から得られた情報は、自閉症又はＡＳＤを発症する易罹患性が増加している又は減少している患者を診断するために使用される。本発明の診断方法を実施するためのキットも本明細書で提供される。そのようなキットは、本明細書で提供する少なくとも１つのＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸及び上に記載の患者試料を評価するために必要な試薬を含むマイクロアレイを含む。
【０１０７】
遺伝子に関連する自閉症／ＡＳＤの同一性及び患者結果は、変異体が存在することを示し、ＡＳＤを発症する変化した危険性を保有する者を同定する。本明細書で提供する情報は、以前可能であったよりも疾患進行の早い時期での治療介入を可能にする。同様に本明細書上に記載のとおり、本明細書に記載のＣＮＶ含有遺伝子はこの神経学的疾患の治療のために有効な新規治療剤の開発のための新規標的を提供する。
【０１０８】
本明細書で提供する情報は、検査及び治療手法において用いることもできる。比較的一般的であるがＡＳＤはまだ比較的究明中であり、特に農村部では、地域の小児科医がこれらの障害及びそれらの治療の定義が続いている氾濫する研究についての知識が十分でない場合がある。全般的に見て、ＡＳＤに対する治療の主力は行動療法のままである。ＡＳＤの多様な表現型所見に特異的に応じる行動療法の多数の異なる種類があり、すべての場合において早期の介入はより良い結果と相関する。したがって、詳細なＡＳＤサブタイプの早期診断は、早期行動介入（及び極端な場合での精神薬理的管理）及び小児の可能性及び生活の質を最大化するために必須である。
【０１０９】
乳がんを例示（ａｎａｌｏｇｙ）として使用する薬理ゲノミクスの展望から、トラスツズマブ（ＨＥＲ２発現がん細胞を標的化するモノクローナル抗体）は、乳がんに対する治療を改革し、恐らくそれは個別化された療法の既知の最良の例である（図４）。トラスツズマブ及びがんに対する他の個別化された療法以前は患者は、根治的乳房切除術、放射線照射及び化学療法などの有効性が低く、重度の望ましくない副作用を有する比較的粗雑な介入を受けていた。トラスツズマブが欠損ＨＥＲ２タンパク質に結合する場合、それはＨＥＲ２タンパク質が乳房中の原因となる細胞から未制御に再産生されることを妨げ、乳がん患者の生存率を増加させる。トラスツズマブは、ＨＥＲ２発現がん細胞においてだけ有効であり、それにより患者は、彼らのがんが治療に応答するかどうかを決定するために遺伝的検査を受けなければならない。実際に標的化療法についてのこの検査及び治療モデルは、いまや乳がん治療についてのゴールドスタンダードである。
【０１１０】
近年、次世代配列決定（ＮＧＳ）を２０組の両親と子どもの配列決定されたエクソームを分析することによって孤発性家族におけるＡＳＤの遺伝的病因を研究するために用いた（O'Roak等2011）。これらの研究は、ＡＳＤを有する孤発性家族において機能性の新規変異を担持する神経伝達に関与する４個の魅力的な候補遺伝子（ＦＯＸＰ１、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＳＣＮ１Ａ及びＬＡＭＣ３）を明らかにした。わずか６０エクソーム程度がＡＳＤの原因となる４つの低頻度の妥当な機能性変異の同定を促進できるという概念は、多数の試料のＮＧＳがさらに一般的になると、ＡＳＤの原因となる低頻度変異のゲノムランドスケープが臨床医の利益にまで相当に拡張され、患者にも同様になることを示唆する。がん細胞の分子遺伝学のより良い理解が乳房の治療及び他のがん治療を改革したのと同様に、ＡＳＤの原因となる低頻度変異を同定するための分解能の改善は、ＡＳＤ及びそれらの詳細な遺伝サブタイプの診断において臨床医を補助できるより良い診断率を有する分子検査の開発を促進する。
【０１１１】
ＡＳＤの原因となる孤発性遺伝的変異を精査するより良い分子診断により、患者の特異的分子欠損を治療する個別化された手法が現実的なものとなる。ＡＳＤへのこの種の最先端の薬理ゲノミクス手法は、トラスツズマブがＨＥＲ２＋乳がん患者に対して行うように遺伝的に定義された応答者集団を標的化する薬物に対する検査及び治療モデルの開発を促進する（図４）。実際ＳＳＲＩは、セロトニン系が欠損であるＡＳＤの低頻度症例に対して有効であることが既に証明されており、研究はＮＬＧＮ／ＮＲＸＮ経路、ニューロン細胞接着経路、グルタメート受容体経路及び宿主の他の神経生理的経路を及び孤発性症例において欠損であると示されているネットワークを機能不全にすることから、ＡＳＤに対する類似の治療をすぐに定義する。
【０１１２】
実施例１で上に記載のとおりＣＮＶ分析によってＧＡＢＡＲ−Ａ経路に既に関与しており、本発明者らは、ＡＳＤを有する患者における原因となる神経遺伝的欠損を救う可能性があるこのシグナル伝達経路に作用する多数の薬物候補を同定し続けた（表３及び４）。トピラマートは、ＧＡＢＡＲ−Ａ経路でアゴニストとして作用するそのような１つの候補である。ＧＡＢＡＲ−Ａ経路それ自体に実施例１で本発明者らが行ったのと全く同じように、本発明者らはトピラマート自体の第１の程度のインタラクトームを定義し、ＡＳＤ症例は、神経学的に正常なコントロールと比較した場合に症例において経路欠損が有意に濃縮されていることを見出した。コントロールの８．３％に対して症例の約２０．７％が遺伝的経路欠損を担持しており、統計的有意差（Ｐ＜＝１．５ｘ１０−４４  ＯＲ＝２．９）はＧＡＢＡＲ−Ａ経路に遺伝的欠損を担持するＡＳＤを有する患者を治療することにトピラマート自体が有効である可能性があるという本発明者らの仮説を支持している（図４）。
【０１１３】
本明細書に記載の個別化された薬物設計への合理的な手法は、特異的に破壊された遺伝的経路を救うことによってＡＳＤを有する患者において正常な神経生理学を回復させ、有害な副作用を誘起する薬物に彼らを曝露することを回避するはずである。ＡＳＤの膨大な臨床的及び遺伝的不均一性を考慮すると、本発明者らが本明細書で概説した早期の個々に合わせた精神薬理ゲノミクス的介入は包括的行動プログラムとの組合せで、これらの重荷となる疾患を罹患している患者の予後及び展望を改善する。
2018500001.tif 000004
2018500001.tif 000005
2018500001.tif 000006
2018500001.tif 000007
【０１１４】
実施例ＩＩＩ
代謝型グルタメート受容体及び他の遺伝子ファミリー相互作用ネットワークの自閉症への影響
高度に遺伝性であるにも関わらず圧倒的多数のファミリー研究は、ＡＳＤを単純なメンデル障害として分類せず、むしろ複合的特性（ｔｒａｉｔ）と一致する臨床的及び遺伝的な不均一性を示すことを示唆している［１３］。実際近年の研究は、ＡＳＤが表現型的に収束する４００に上る異なる遺伝的及びゲノム障害を含む可能性があることを推定している［１４、１５］。単一ヌクレオチド多型などの一般的変異体は、ＡＳＤ易罹患性に寄与していると考えられるが、個々に見るとそれらの効果は小さいように考えられる［１６］。しかし、ＡＳＤが、低頻度又は家族で分離されるが、一般集団にあまり一般化できない「個別」の高度に浸透性の変異から生じる可能性があることの証拠が増加している［１７−１９］。多数遺伝子が関与しており、それによりクロマチンリモデル化、代謝、ｍＲＮＡ翻訳及びシナプス機能に関与しており、ニューロン及びシナプスホメオスタシスに影響を与える共通経路又は遺伝的ネットワークに収束しそうにない［１６］。
【０１１５】
そのような注目すべき表現型及びジェノタイプ不均一性は、ＡＳＤ中の変異の個別の性質とカップリングした場合、治療可能性を有する新たな遺伝的危険因子の同定を妨害する。しかしＡＳＤに関与している多くの低頻度遺伝子欠損が遺伝子ファミリーに属していることは注目に値する。例えばシナプス後ニューロリジン（ＮＬＧＮ）遺伝子ファミリー［２０］及びそれらのシナプス前ニューレキシン（ＮＲＸＮ）分子相互作用パートナー［２１，２２］の両方の複数のメンバーに影響を与える低頻度欠損がＡＳＤを有する患者において長い間報告されている。追加的に、その後、重要な機能的役割を有する多数の他の欠損遺伝子ファミリーは、脳中のユビキチン（ＵＢＥＡ）コンジュゲーション［２３］、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体シグナル伝達［２４−２７］及びカドヘリン／プロトカドヘリン（ＣＤＨ）細胞間結合タンパク質［２８］を含んで十分に特徴を明らかにされている。さらに電圧開口型カルシウムチャネル（ＣＡＣＮＡ）中の複数の欠損は統合失調症において見出されており［２９］、代謝型グルタメート（ＧＲＭ）受容体シグナル伝達の欠損ネットワークは、ＡＳＤと高度に一致する２つの精神神経系障害、ＡＤＨＤ［３０］及び統合失調症［３１−３６］の両方において見出された。同様に、近年の全エクソーム配列から同定された重要な欠損遺伝子の圧倒的多数は遺伝子ファミリーに属している［１７−１９］。
【０１１６】
多数の研究は、ＡＳＤにおいて欠損遺伝的ネットワークを見出し［２１，２３，３７−４０］（概説のために［１６］を参照されたい）、本発明者らは新規の潜在的な治療標的のために、濃縮されている可能性がある新規ネットワークを明らかにし、特異的欠損遺伝子ファミリーを関連付けることによって本研究においてこれらを補足した。タンパク質上の薬物結合部位は、通常機能的必要性の外に存在し［３３］、遺伝子ファミリーは、その効果を発揮するための所与の薬物に対する追加的結合部位を提示する遺伝子重複事象に由来する。最良の薬物はタンパク質上の結合部位について内因性の小分子と競合することによってそれらの活性を達成する［４１］、したがって多数の良好な薬理学的遺伝子標的は、大きな遺伝子ファミリー内にある。実際におよそ半分の薬理学的遺伝子標的は、わずか６個の遺伝子ファミリー：Ｇ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、セリン／スレオニン及びチロシンプロテインキナーゼ、亜鉛メタロペプチダーゼ、セリンプロテアーゼ、核内ホルモン受容体並びにホスホジエステラーゼ［４１］に入る。さらに多数の大きな遺伝子ファミリーは、神経伝達の非常に複雑で進化的に保存されたプロセスを調和させるようにシナプス前及びシナプス後ニューロン末端に局在化されており［４２］、自閉症脳においてさまざまな程度に損なわれていると考えられている［４３］。したがって本発明者らは、遺伝子ファミリーによって定義される欠損相互作用ネットワークを濃縮することによって本発明者らがＡＳＤに対するさらに有効な薬物標的を選択できると仮定した。
【０１１７】
次の材料及び方法は、実施例ＩＩＩの実施を促進するために提供される。
【０１１８】
倫理的記載
本明細書において示される研究は、ｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＩＲＢ（ＣＨＯＰ  ＩＲＢ＃：ＩＲＢ０６−００４８８６）によって承認されている。数名の患者及びその家族は、ＣＨＯＰアウトリーチ診療所を通じて採用された。書面のインホームドコンセントは、参加者又はその両親からＩＲＢ承認同意書を使用してプロジェクトへの登録に先立って得た。研究に関与しないことを選んだ個体又は家族に対する区別はなかった。すべてのデータは、匿名で分析され、すべての臨床調査はヘルシンキ宣言に示された原則に従って実施した。
【０１１９】
試料、ジェノタイピング及び民族性の影響
試料はｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａからの試料からｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＣＡＧ）バイオレポジトリーの一環として回収されたＤＮＡから選択した。すべての小児はＡＳＤの地区診断を受けていた（ｎ＝５３９）。このコホートは、ＡＳＤを有するいずれの小児も含み、併存する遺伝的症候群の存在について選別されなかった。
【０１２０】
臨床特徴づけ：
ｍＧｌｕＲ状態に盲検である医師がｍＧｌｕＲネットワークＣＮＶを有するすべての患者（ｎ＝６２）、ｍＧｌｕＲ  ＣＮＶを有さない患者１００名及び２２ｑ試料（ｎ＝７８）のすべての患者についてカルテ審査を行った。患者はＡＳＤの地区診断の資料が不十分である場合は排除された。この診断の妥当性は本研究の一部としては評価しなかった。患者は、彼らが少なくとも１つの総合病歴及び医師による身体的記述を有さない場合にも排除された。併存する医学的状態、臨床遺伝子検査及び画像データは再調査された。小児は、ＡＳＤに加えて構造的欠損若しくは一般人口の１％未満に生じる医学的状態及び／又は臨床検査に基づく遺伝的症候群の診断を有する場合に「症候性ＡＳＤ」と分類された。臨床アレイで良性又は「バリアント」所見であると予測された遺伝的異常は、それらが前述の臨床的異常に基づく基準に合致しない限り「症候性ＡＳＤ」として分類されなかった。資料化された構造的異常を有さず（しかし顕著な発達遅延）、臨床遺伝子検査を受けていない２名の患者は、研究アレイでの大きな欠失の存在に基づいて「症候性ＡＳＤ」として分類した。
【０１２１】
症例の大多数（６，７４２例の内５，０４９例）及びすべてのコントロール（１２，５４４例）は、Ｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  （ＣＨＯＰ）のｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって５５０Ｋ、６１０Ｋ、６６０Ｋ及び１Ｍマーカーを含むＨｕｍａｎＨａｐ  ＢｅａｄＣｈｉｐの種々の反復にわたるＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＩＩ  プラットフォームを使用してゲノムワイド範囲でジェノタイピングした。ＡＧＰコンソーシアムによって１，６９３症例をジェノタイピングした。すべての症例及びコントロールのおよそ５０％は、以前公開された大きなＡＳＤ研究［２１，２３，２８，４４］から再使用した。すべての症例はＡＤＩ−Ｒ／ＡＤＯＳによって診断され、自閉症スペクトラム症についての標準的基準を満たしていた。重複試料は、１４０Ｋ非相関ＳＮＰにわたる状態測定（ＩＢＳ＞＝０．９）によって、ペア毎の高い同一性を有するすべての対の試料の単一連鎖クラスター化によって定義されたクラスターから最良の品質の固有の試料を選択することによって（ＱＣ試料に使用されたジェノタイピング統計学に基づいて）除去した。試料の民族性は、１４０Ｋ非相関ＳＮＰの同じサブセットでの主成分分析によって推定される最初の１０個の固有ベクトルの教師付きｋ平均分類（ｋ＝３）によって推察した。本発明者らは、ｔｈｅ  Ｒ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ［６５］によって実行されたｋ平均分類を鍛えるために、ＨａｐＭａｐ３［４５］及び祖先の大陸が既知であるヒトゲノムダイバーシティパネル［４６］試料を使用した。
【０１２２】
ＣＮＶ影響及び関連
本発明者らは、ジェノタイピング蛍光強度（Ｌｏｇ  Ｒ比）、ＳＮＰマイナー対立遺伝子（Ｂ対立遺伝子頻度）の集団頻度、及び隠れマルコフモデルへのＳＮＰ間隔を含む複数の値を組み合わせるＰｅｎｎＣＮＶアルゴリズムでＣＮＶを判定した［６６］。用語「ＣＮＶ」は、個体ＣＮＶ判定を表し、一方「ＣＮＶＲ」は対象にわたって共有される集団レベル多様性を指す。ＣＮＶ分析での試料参入のための品質管理閾値は、ＳＮＰにわたる高判定率（判定率＞＝９５％）、正規化された強度の低い標準偏差（ＳＤ＜＝０．３）、低い完全ゲノムウェーブ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｗａｖｅ）アーチファクト（｜ＧＣＷＦ｜＜＝０．０２）及び少数のＣＮＶ判定（＃ＣＮＶ＜＝１００）を含んだ。ＣＮＶの平均スパンとして定義される症例とコントロールとの間のＣＮＶ負荷でのゲノムワイド差異及び有意性の推定は、ＰＬＩＮＫを使用してコンピューター処理した［６７］。ＣＮＶＲは、個体ＣＮＶのゲノム境界に基づいて定義され、症例とコントロールとの間のＣＮＶＲ頻度における差異の有意性は、フィシャー直接検定を使用して各ＣＮＶＲで評価した。
【０１２３】
遺伝子ファミリー相互作用ネットワーク（ＧＦＩＮ）定義及び関連
並べ替え検定によってすべての遺伝子ファミリー相互作用ネットワーク（ＧＦＩＮ）を順位付けするために実施例Ｉからの以前の研究を進展させた。具体的には本発明者らは、遺伝子のファミリーによって定義される方向付けられた第２の程度の遺伝子相互作用ネットワークとしてＧＦＩＮを定義した。本発明者らは、公式ＨＵＧＯ［４８］遺伝子命名法に基づいて少なくとも２つのメンバーを含む２，６１１個の遺伝子ファミリーを見出し、１，７３２ＧＦＩＮをヒトインタラクトームデータベース［６８］を通じて評価された３つの異なる酵母ツーハイブリッド生成データセット［４９−５１］からの混合ヒトインタラクトームデータを使用して生成した。本発明者らは、以前記載された方法［３０］での定義されたＣＮＶを有する１，５５７ＧＦＩＮについて累積ネットワーク濃縮の濃縮を算出した。各ＧＦＩＮについて本発明者らは、Ｎ遺伝子の無作為セットに由来する１０００個の第２の程度の遺伝子相互作用ネットワークの並べ替え検定によってその濃縮を定量した、ここでＮは所与の遺伝子ファミリーのメンバーの数である。本発明者らが注目したＣＮＶが低頻度であることから、本発明者らは、複数のＧＦＩＮ検定についての補正後に有意なｐｙ並べ替え検定を達成するためには力不足であった。しかし本発明者らは、名目上有意であるすべてのＧＦＩＮを報告した。
【０１２４】
ＣＮＶ品質管理：
不十分な質のＳＮＰアレイを含む試料は、典型的に偽陽性の比率が相当に増加していることから、ＣＮＶ判定から除外した。ジェノタイピング判定率＞９８％、ＬＲＲ（ＬＲＲ＿ｓｄ）の標準偏差＜０．３５、ＧＣウェーブ因子（ＧＣＷＦ）が−０．２と０．２との間である及び、試料についてのＣＮＶ判定の総数が＜１００である試料だけ、ＰａｒｓｅＣＮＶ基準に基づいてＣＮＶを視覚的に検証（Glessner等Plos One、2013）した。
【０１２５】
ＣＮＶアノテーション
症候性ＡＳＤ領域について、ゲノム座標はＢｅｔａｎｃｕｒ（2011 Brain Res）によって記載されたものであった。ヒトインタラクトームデータベースからＣｙｔｏｓｃａｐｅによって生成されたＧＲＭ／ｍＧｌｕＲネットワークは、遺伝子座標についてＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ定義を使用してＥｌｉａ等（2012 Nat Genet）によって記載された。ＣＮＶ判定は、既知の症候性領域及びＧＲＭネットワーク遺伝子との重複について分析した。臨床細胞遺伝学的臨床検査によって検出されたすべての症候性の異常は、対応するＳＮＰアレイで確認した。
【０１２６】
統計解析
群比較をフィシャー直接検定及びカイ二乗試料分布を既に記載のとおり使用して行った。
【０１２７】
ＣＮＶの実験的検証
本発明者らが同定した重要なＣＮＶＲを市販のｑＰＣＲ  Ｔａｑｍａｎプローブを使用してＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００ｓｙｓｔｅｍを実行して検証した。データファイル１は、１２１個の異なるゲノムプローブを使用して、ＤＮＡが利用可能であった８５個の異なる試料にわたって本発明者らが検査した２５１個の反応を列挙した。欠失について本発明者らの感度＝０．６５、特異性＝１．００、ＮＰＶ＝１．００及びＰＰＶ＝０．８８であった。重複について本発明者らの感度＝０．６８、特異性＝０．９９、ＮＰＶ＝０．９４及びＰＰＶ＝０．９１であった。
【０１２８】
結果
本実施例において本発明者らは、自閉症を有する患者において遺伝子ファミリータンパク質相互作用ネットワークを破壊する構造変異体の大きな全ゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）からの結果を記載する。本発明者らは、ＡＳＤにおいて複数の欠損ネットワークを、最も注目すべきはＡＳＤを有する患者の６％に至る代謝型グルタメート受容体（ｍＧｌｕＲ）シグナル伝達経路中の低頻度コピー数変異体（ＣＮＶ）（実施例Ｉで上に記載のとおり）を見出す。欠損ｍＧｌｕＲシグナル伝達は、ＡＳＤと高度に一致する２つの一般的な精神神経系障害、ＡＤＨＤ［３０］及び統合失調症［３１−３６］の両方において見出された。さらに本発明者らは、がんに関与しているＭＡＸ二量体化タンパク質（ＭＸＤ）ネットワーク及びニューロン組織において活性であるカルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）遺伝子相互作用ネットワークなどの他の魅力的な候補を見出している。自閉症の原因となることを本発明者らが見出した多数の欠損遺伝子ファミリー相互作用は、さらに有効な治療介入を生み出すための多数の新たな解釈の機会を提示する。
【０１２９】
ＡＳＤの原因となる欠損遺伝的ネットワークを同定し、包括的に特徴を明らかにするために本発明者らは、自閉症を有する患者において濃縮されているコピー数多型（ＣＮＶ）についての大規模ゲノム関連研究を実施した。既に公開された大きなＡＳＤ研究［２１、２３、２８、４４］からの罹患症例をｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａから最近採用された症例と組み合わせることによって、本発明者らは、ＡＳＤにおける低頻度病原性ＣＮＶについての今日までで最大の研究の１つを遂行した。つまり、ＡＳＤを有する患者からのジェノタイピング試料６，７４２個をＴｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＣＨＯＰ）で採用された神経学的に正常なコントロール１２，５４４例からのものと比較した。
これらの症例は、自閉症についての既知の症候性の原因を有する患者を排除するために神経発達の専門家によってそれぞれスクリーニングされた。ジェノタイピングをＡＳＤ症例の大部分について及びすべてのコントロールについてＣＨＯＰで実施した。試料重複を除去するためにデータをきれいにし、ＣＮＶについて標準的ＱＣを実施した後に、本発明者らは、ＨａｐＭａｐ３［４５］及びヒトゲノムダイバーシティパネル［４６］由来の集団によって定義されたトレーニングセットを使用して大陸祖先についての５，６２７罹患症例及び９，６４４例の疾患を有さないコントロールを最初に推察した（表５）。このＱＣ基準を使用して本発明者らは、ＣＮＶを判定の感度及び特異性がＰＣＲによってアッセイした１２１個の異なるゲノム領域にわたって、それぞれおよそ７０％及び１００％であると概算した（方法を参照されたい）。すべての民族にわたる症例対コントロールにおいてＣＮＶの負荷の増加があった、統計的有意差（Ｐ＜＝０．００１）はヨーロッパ人（それぞれ６３．３対５４．５Ｋｂ）及びアフリカ人（それぞれ７０．４対４８．０Ｋｂ）由来集団において大きい。
【０１３０】
次いで本発明者らは、最大検出力のために複数民族全体の発見コホート（５，６２７症例対コントロール９，６４４例）にわたる全体の有意性の続く測定値を伴ってヨーロッパ由来データセット（４，６０２症例対コントロール４，７２２例；Ｐ＜＝０．０００１）において発見され、アフリカ人祖先の独立したＡＳＤデータセットにおいて反復された（３１２症例対コントロール４，１６９例；Ｐ＜＝０．００１）全民族ＣＮＶ領域（ＣＮＶＲ）について探索した（図５、表６）。これらの選択基準に基づいて、プラダーウィリー／アンジェルマン症候群（１５ｑ１１−１３）臨界領域において複数の重複を担持し、２２ｑ１１欠失症候群よりも特に小さいが複数の欠失がディジョージ症候群（２２ｑ１１）臨界領域において検出された２つの大きな周知のＡＳＤ危険性遺伝子座が出現した。染色体５ｑ１１上のポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼファミリー８（ＰＡＲＰ８）中に欠失を担持する第３の遺伝子座も発見された。ＰＡＲＰ８は、オランダ人集団においてＡＳＤとの関連で以前同定されたが［４７］、ヨーロッパ由来及びアフリカ由来集団にわたるその全民族分布については記載されていなかった。
【０１３１】
本発明者らは、プラダーウィリー／アンジェルマン症候群（１５ｑ１１−１３）臨界領域、ディジョージ症候群（２２ｑ１１）臨界領域及び新規ＰＡＲＰ８（５ｑ１１）領域に局在化されたメンバーを含む遺伝子ファミリーに由来する遺伝的相互作用ネットワークをＡＤＨＤに以前適用された方法［３０］を使用して検討した。しかし顕著なＣＮＶＲを担持する最も重要な遺伝子は遺伝子ファミリーにほとんどクラスター化されなかった。結果として本発明者らは、遺伝子ファミリー相互作用ネットワーク（ＧＦＩＮ）についての探索を広げ、自閉症において濃縮されたＣＮＶを有するＧＦＩＮについてゲノム全体を探索した。すべての遺伝子ファミリーについて本発明者らは、ＧＦＩＮを複数の重複したメンバーによって生じた遺伝的相互作用ネットワークとして定義した。本発明者らは、標準的ＨＵＧＯ［４８］遺伝子名をＡＳＤと関連するネットワーク欠損の濃縮について探索した１，７３２個のＧＦＩＮを定義するために使用した。しかし、ＡＳＤ症例では疾患を有さないコントロールを超えるＣＮＶ負荷の先天性過剰があることから（表５）、大きなＧＦＩＮがそれらのサイズ及び複雑度の増加だけの長所によって、症例欠損の顕著な濃縮を示すことが期待される。したがって各ＧＦＩＮについて、本発明者らは、ＧＦＩＮサイズ及び複雑度について管理するためにネットワーク遺伝子の１，０００個の無作為セットについて症例濃縮のネットワーク並べ替え検定を使用した。この手法で本発明者らは、コントロールを超える症例における任意の先天性過剰ＣＮＶ負荷に由来する統計的アーチファクト及び本発明者らが利用したヒトインタラクトームデータに固有である可能性がある他の原因不明のバイアス［４９−５１］を最少化することによって、ＡＳＤに関連するネットワーク欠損を確実に同定した。
2018500001.tif 000008
2018500001.tif 000009
2018500001.tif 000010
2018500001.tif 000011
【０１３２】
ＧＦＩＮ１，７３２個の内、ＡＳＤにおける遺伝的欠損の濃縮のために本発明者らは、定義されたＣＮＶを含む１，５５７個のＧＦＩＮを順位付けるためにネットワーク並べ替え検定を使用した。その内の最上位ＧＦＩＮ（表７）は、グルタミン酸神経伝達に影響を与える遺伝子のＧＲＭファミリーによって定義された代謝型グルタメート受容体（ｍＧｌｕＲ）経路であった。ＧＲＭファミリーは、８個のメンバーを含有し、そのすべては、累積的に発生する２７９個の遺伝子のＧＦＩＮヒトインタラクトームに定義された（図６）。遺伝子のＧＲＭファミリーに関するこのＧＦＩＮで、本発明者らはヨーロッパ由来ＡＳＤ症例の５．８％（２６５／４６０２）対民族的に合致したコントロールの３％のみ（１５３／４７２２）においてＣＮＶ欠損を１．８倍濃縮の頻度で見出した（ＰＦｉｓｈｅｒ＜＝２．４０Ｅ−０９）。１，０００無作為ネットワーク並べ替えによって本発明者らは、統計的にも有意である（Ｐｐｅｒｍ＜＝０．０５）症例でのｍＧｌｕＲ経路における過剰な濃縮を見出した。追加的に本発明者らのｍＧｌｕＲネットワーク内の情報価値のある遺伝子の６９．２％（１２４／１８１）は症例でＣＮＶの過剰を示した。しかし、このネットワーク全体の有意性に寄与する最も重要なＣＮＶＲを担持する成分遺伝子は、症例に固有のｍＧｌｕＲ受容体（ＧＲＭ１、ＧＲＭ３、ＧＲＭ５、ＧＲＭ７、ＧＲＭ８）の特異的サブセットにわたってＣＮＶ欠損過剰の傾向がある（データ未記載）が、重複したｍＧｌｕＲ遺伝子自体（ＧＲＭ１、ＧＲＭ３、ＧＲＭ４、ＧＲＭ５、ＧＲＭ６、ＧＲＭ７及びＧＲＭ８）が個々に有意性を達成しないことを明らかにする。
【０１３３】
ＣＮＶの多数の広範な研究は、グルタミン酸シグナル伝達経路内の遺伝子をＡＳＤ［２１，２３，３７−４０］及びＳＮＰ［５２，５３］の病因に関連付け、ＧＲＭ８のＣＮＶ重複［５４］は、ヒトにおける以前にＡＳＤとの関連で報告された。さらに近年の機能研究は、症候性自閉症の２つの異なる形態、節性硬化症及び脆弱Ｘのマウスモデルにおいて、自閉症表現型が各症候群について反対方向でのＧＲＭ５の調節によって回復されたことを実証し、ＧＲＭ５機能活性が症候性自閉症におけるシナプス病態の軸を決定する中心であることを示唆している［５５］。ｍＧｌｕＲシグナル伝達における低頻度欠損に関連する本発明者らのＧＲＭネットワークの知見も脆弱Ｘ及び結節性硬化症の外のＡＳＤに寄与し、本発明者らは機能性ｍＧｌｕＲシナプス病態がＡＳＤの中間形質の６％程度の原因となる場合があるｍＧｌｕＲ経路内の何百もの欠損遺伝子でなくても非常に多くから開始できることを推察する（表７）。
追加的に本発明者らは、ＡＤＨＤ、自閉症スペクトラム内で高く同時発生する精神神経系障害、におけるｍＧｌｕＲの重要性［３０，５６］を近年実証した。しかし、ｍＧｌｕＲ受容体（ＧＲＭ）それ自体の中の欠損がネットワーク全体の有意性に寄与する最も重要なコピー数欠損であるＡＤＨＤとは対照的に、本発明者らは、成分ＧＲＭのＡＳＤ欠損がｍＧｌｕＲ経路の全体の有意性に中程度にだけ寄与することを見出した。それにもかかわらず、本発明者らが症例に固有だとして同定し濃縮したＧＲＭ１、ＧＲＭ３、ＧＲＭ５、ＧＲＭ７及びＧＲＭ８内の欠損は、本発明者らが、ＡＤＨＤにおいて病原性であると同定した同じＧＲＭであり、グルタミン酸シグナル伝達に影響を与える場合がある。
【０１３４】
並べ替え検定によって最も高く順位付けされたＧＦＩＮの内、ＭＡＸ二量体化タンパク質（ＭＸＤ）ＧＦＩＮ（ＰＦｉｓｈｅｒ＜＝３．８３ｘ１０−２３、濃縮＝２．５３、Ｐｐｅｒｍ＜＝０．０４２）が最も濃縮された。遺伝子のＭＸＤファミリーは、細胞増殖、分化及びアポトーシスを調節するベーシックヘリックスループヘリックスロイシンジッパー（ｂＨＬＨＺ）転写因子のＭＹＣ／ＭＡＸネットワークと相互作用するタンパク質をコードし［ＭＩＭ６０００２１］［５７］；ＭＸＤ−ＭＹＣ−ＭＡＸネットワークが種々の種類のがんにおいて調節不全であることからＭＸＤ遺伝子は重要な腫瘍抑制遺伝子候補である［５８］。興味深いことに自閉症と特定の種類のがんとの間に疫学的連携が報告されており［５９］、抗がん療法はシナプスＮＬＧＮタンパク質レベルの制御を通じてマウスにおいてＡＳＤ表現型を調節することが近年示されている［６０］。ＭＸＤ  ＧＦＩＮ有意性に寄与する成分遺伝子の内、ＰＡＲＰ１０（Ｐ＜＝４．０６ｘ１０−１１、ＯＲ＝２．０４）及びＵＢＥ３Ａ（１．５０ｘ１０−６、ＯＲ＝ｉｎｆ）における重複は最も顕著に濃縮される（データ未記載）。本発明者らがＰＡＲＰ８を民族にわたって以前の記載と同様に有意であると見出したことは注目に値し（表６）、本発明者らはＡＳＤでのＵＢＥ３Ａにおける構造的欠損の重要性を以前記載した［２３］。
【０１３５】
明らかにされた他の注目に値する顕著なＧＦＩＮｓは、ＰＯＵクラス５ホメオボックス（ＰＯＵ５Ｆ）ＧＩＦＮ（ＰＦｉｓｈｅｒ＜＝２．９６ｘ１０−１７、濃縮＝２．３、Ｐｐｅｒｍ＜＝０．００８）及びＳＷＩ／ＳＮＦ関連、マトリクス関連、クロマチンのアクチン依存性制御因子、サブファミリーｃ（ＳＭＡＲＣＣ）ＧＦＩＮ（ＰＦｉｓｈｅｒ＜＝１．２２ｘ１０−９、濃縮＝１．９、Ｐｐｅｒｍ＜＝０．０３５）である。遺伝子のＰＯＵ５ＦファミリーはＰＯＵホメオドメインを含有する転写因子をコードし、胚性発達、特に早期胚発生の際のそれらの役割は実証されており、胚性幹細胞多能性のために必要である。ＳＭＡＲＣＣ遺伝子ファミリーの成分遺伝子は、タンパク質のＳＷＩ／ＳＮＦファミリーのメンバーであり、そのメンバーはヘリカーゼ及びＡＴＰａｓｅ活性を示し、これらの遺伝子の周囲のクロマチン構造を変化させることによって特定の遺伝子の転写を調節すると考えられている。最も興味深いことに遺伝子のＫＩＡＡファミリーは、最上位ＧＦＩＮに位置付けられている（ＰＦｉｓｈｅｒ＜＝３．１２ｘ１０−２３、濃縮＝１．６、Ｐｐｅｒｍ＜＝０．０４０）。ＫＩＡＡ遺伝子はカズサｃＤＮＡ配列決定プロジェクトにおいて同定され［６１］、新たな大きなヒトｃＤＮＡから予測されたが、それらの機能は不明である。
【０１３６】
本発明者らは、遺伝子ファミリーのいくつかの成分メンバーが、それらがＡＳＤにおいてＣＮＶ欠損について濃縮されている相互作用遺伝子パートナーに高度に関係していることからＧＦＩＮの有意性に偏って寄与することも仮定した。したがって本発明者らは、１，７３２個の遺伝子ファミリーをそれらの１５，３５２個の成分に分解し、その重複した遺伝子１，２１８個はゲノムワイドネットワーク並べ替えによって有意性について検査するためのデータを含む定義されたネットワークを有した。カルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）遺伝子相互作用ネットワークは、１，０００個の無作為遺伝子ネットワークでのＣＮＶ欠損についての症例濃縮のネットワーク並べ替え検定によって最も高く順位付けられ（表８、図７）、ＡＳＤのための新規で魅力的な候補遺伝子を表している。ＣＡＬＭ１ネットワークで本発明者らは、ＣＮＶ欠損を症例の１４／４６１８対コントロールの１／４７２６だけで見出し（Ｐｆｉｓｈｅｒ＜＝４．１６ｘ１０−４、濃縮＝１４．３７、Ｐｐｅｒｍ＜＝０．００２）、これらの欠損はＣＡＬＭ１インタラクトーム中にＣＮＶを担持する遺伝子の９０％（９／１０）が症例において濃縮されたように分配された。ＣＡＬＭ１ネットワーク有意性に寄与する（データ未記載）最も重要なＣＮＶＲの綿密な調査は、単一の遺伝子でそれ自体が重要であったものはないことを明らかにし、代わりに、唯一の遺伝子（ＰＴＨ２Ｒ）の例外を伴い、それぞれが症例に固有のＣＮＶＲタグ化された高度に浸透性の低頻度欠損に寄与することを明らかにした。カルモジュリンは、カルシウム調節タンパク質のファミリーの原型であり、そのおよそ２０個のメンバーが見出されている。カルモジュリンは、多数の酵素、イオンチャネル並びにキナーゼ及びホスファターゼを含む他のタンパク質のＣａ２＋媒介協調のために使用される４個のカルシウム結合ドメインを定義する１４９個のアミノ酸を含有し、その機能は、増殖及び細胞周期制御並びにシグナル伝達並びに神経伝達物質の合成及び放出における役割を含む［ＭＩＭ１１４１８０］［５７］。
【０１３７】
とりわけ高く順位付けされた第１の程度の遺伝子相互作用ネットワークは、核内受容体共役因子１（ＮＣＯＲ１；Ｐｆｉｓｈｅｒ＜＝１．１１ｘ１０−６、濃縮＝１３．３７、Ｐｐｅｒｍ＜＝０．００４）及びＢＣＬ２−関連アタノ遺伝子（ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ）１（ＢＡＧ１；Ｐｆｉｓｈｅｒ＜＝２．１８ｘ１０−４、濃縮＝１５．４０、Ｐｐｅｒｍ＜＝０．０１４）ネットワークであった。ＮＣＯＲ１は、ヒストンデアセチラーゼのＤＮＡプロモーター領域への動員を通じてＤＮＡ発現の下方制御において核内受容体を補助すると考えられる転写共制御タンパク質であり、神経幹細胞での主な制御因子である［５１］。がん遺伝子ＢＣＬ２は、アポトーシス経路をブロックする膜タンパク質であり、ＢＡＧ１はＢＣＬ２関連アタノ遺伝子（ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ）を形成し、増殖因子受容体と抗アポトーシス機構との間の関連性を表す。ＢＡＧ１遺伝子は、アルツハイマー病を含む神経変性加齢性疾患に関与している［６２、６３］。
【０１３８】
要約としてＡＳＤにおける変異の個別の性質、及び低頻度高度浸透性の遺伝子欠損の累積的寄与は、重要な経路欠損を発見し、優先順位を付ける本発明者らの力を後押しする。結果として本発明者らの包括的で不偏の分析的手法は、ＡＳＤの根底にある病因に寄与する特異的欠損のある生物学的経路の多様な集合を同定した。構造的欠損について強く濃縮されたＧＦＩＮの内、最も濃縮されていたのは遺伝子のＭＸＤファミリーのものであり、がん病態形成に関与しており［５８］それによりＡＳＤを伴う特定のがんの報告された併発を探究するための具体的な遺伝子欠損を提供する［５９］。最も高く順位付けられた成分重複遺伝子相互作用ネットワークは、ニューロンシナプスでの電圧非依存性カルシウム活性化作用電位を制御することにおいて重要である、ＣＡＬＭ１中及びその複数の相互作用パートナーでの欠損を含む。さらに本発明者らは、他の精神神経系疾患において欠損であると以前示されたｍＧｌｕＲ経路を定義するＧＲＭに対してＧＦＩＮ内の欠損について顕著な濃縮を見出した［２９，３０］。一方特異的ｍＧｌｕＲ遺伝子ファミリーメンバーは、症候性ＡＳＤの根底にあることが示されており［５５］、本発明者らの知見は、ｍＧｌｕＲシグナル伝達における低頻度欠損もＧＲＭ遺伝子に対するＧＦＩＮ全体にわたって特発性自閉症に寄与することを示唆している。
【０１３９】
結果として、ＧＲＭ及びＣＡＬＭ重複遺伝子によって定義されたものと同様にＡＳＤにおける欠損であると予測される特異的ニューロン経路に加えて、本発明者らは、ＡＳＤに関連すると考えられるＭＸＤ経路特異的形態などの完全に新規の生物学的経路を関連付ける［５９］。神経発達疾患のためのより良い治療についての満たされていない要求を考えると［６４］、本発明者らが報告した欠損遺伝的相互作用ネットワークの機能的にさまざまなセットは、ＡＳＤ及び精神神経系疾患スペクトラムにわたる標的化治療介入のための魅力的な遺伝的バイオマーカーを提示する。
【０１４０】
実施例ＩＩＩのための参考文献
1.  Muhle R, Trentacoste S V, Rapin I (2004) The genetics of autism. Pediatrics 113: e472-86. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15121991. Accessed 4 June 2011.
2.  Fombonne E (2003) The prevalence of autism. JAMA 289: 87-89. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=12503982.
3.  Prevalence of autism spectrum disorders--autism and developmental disabilities monitoring network, 14 sites, United States, 2002. (2007). MMWR Surveill Summ Morb Mortal Wkly report Surveill Summ / CDC 56: 12-28. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17287715. Accessed 6 June 2011.
4.  Prevalence of autism spectrum disorders - Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network, United States, 2006. (2009). MMWR Surveill Summ Morb Mortal Wkly report Surveill Summ / CDC 58: 1-20. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20023608. Accessed 21 February 2011.
5.  Blumberg SJ, Ph D, Bramlett MD (2013) Changes in Prevalence of Parent-reported Autism Spectrum Disorder in School-aged U . S . Children: 2007 to 2011 - 2012. Hyattsville, MD 20782. Available: http://www.cdc.gov/nchs/data/nhsr/nhsr065.pdf.
6.  Kim YS, Leventhal BL, Koh Y-J, Fombonne E, Laska E, et al. (2011) Prevalence of Autism Spectrum Disorders in a Total Population Sample. Am J Psychiatry. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21558103. Accessed 11 May 2011.
7.  Folstein SE, Rosen-Sheidley B (2001) Genetics of autism: complex aetiology for a heterogeneous disorder. Nat Rev Genet 2: 943-955. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11733747. Accessed 6 June 2011.
8.  Folstein S, Rutter M (1977) Infantile autism: a genetic study of 21 twin pairs. J Child Psychol Psychiatry 18: 297-321. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/562353. Accessed 16 May 2011.
9.  Steffenburg S, Gillberg C, Hellgren L, Andersson L, Gillberg IC, et al. (1989) A twin study of autism in Denmark, Finland, Iceland, Norway and Sweden. J Child Psychol Psychiatry 30: 405-416. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2745591. Accessed 7 February 2011.
10.  Bailey A, Le Couteur A, Gottesman I, Bolton P, Simonoff E, et al. (1995) Autism as a strongly genetic disorder: evidence from a British twin study. Psychol Med 25: 63-77. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7792363. Accessed 11 January 2011.
11.  Ozonoff S, Young GS, Carter A, Messinger D, Yirmiya N, et al. (2011) Recurrence risk for autism spectrum disorders: a baby siblings research consortium study. Pediatrics 128: e488-95. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3164092&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 3 March 2012.
12.  Constantino JN, Zhang Y, Frazier T, Abbacchi AM, Law P (2010) Sibling recurrence and the genetic epidemiology of autism. Am J Psychiatry 167: 1349-1356. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2970737&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 12 March 2012.
13.  Kolevzon A, Smith CJ, Schmeidler J, Buxbaum JD, Silverman JM (2004) Familial symptom domains in monozygotic siblings with autism. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 129B: 76-81. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15274045. Accessed 6 June 2011.
14.  Betancur C (2011) Etiological heterogeneity in autism spectrum disorders: more than 100 genetic and genomic disorders and still counting. Brain Res 1380: 42-77. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21129364. Accessed 14 July 2012.
15.  Iossifov I, Ronemus M, Levy D, Wang Z, Hakker I, et al. (2012) De novo gene disruptions in children on the autistic spectrum. Neuron 74: 285-299. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22542183. Accessed 16 July 2012.
16.  Huguet G, Ey E, Bourgeron T (2013) The genetic landscapes of autism spectrum disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet 14: 191-213. Available: http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-genom-091212-153431. Accessed 23 January 2014.
17.  Sanders SJ, Murtha MT, Gupta AR, Murdoch JD, Raubeson MJ, et al. (2012) De novo mutations revealed by whole-exome sequencing are strongly associated with autism. Nature 485: 237-241. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22495306. Accessed 31 January 2013.
18.  Neale BM, Kou Y, Liu L, Ma'ayan A, Samocha KE, et al. (2012) Patterns and rates of exonic de novo mutations in autism spectrum disorders. Nature 485: 242-245. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22495311. Accessed 31 January 2013.
19.  O'Roak BJ, Vives L, Girirajan S, Karakoc E, Krumm N, et al. (2012) Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations. Nature 485: 246-250. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3350576&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 30 January 2013.
20.  Jamain S, Quach H, Betancur C, Rastam M, Colineaux C, et al. (2003) Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet 34: 27-29. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1925054&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 26 April 2011.
21.  Pinto D, Pagnamenta AT, Klei L, Anney R, Merico D, et al. (2010) Functional impact of global rare copy number variation in autism spectrum disorders. Nature 466: 368-372. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20531469. Accessed 15 July 2010.
22.  Szatmari P, Paterson AD, Zwaigenbaum L, Roberts W, Brian J, et al. (2007) Mapping autism risk loci using genetic linkage and chromosomal rearrangements. Nat Genet 39: 319-328. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17322880. Accessed 21 May 2011.
23.  Glessner JT, Wang K, Cai G, Korvatska O, Kim CE, et al. (2009) Autism genome-wide copy number variation reveals ubiquitin and neuronal genes. Nature 459: 569-573. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19404257. Accessed 14 July 2010.
24.  Buxbaum JD, Silverman JM, Smith CJ, Greenberg DA, Kilifarski M, et al. (2002) Association between a GABRB3 polymorphism and autism. Mol Psychiatry 7: 311-316. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11920158. Accessed 7 October 2011.
25.  Collins AL, Ma D, Whitehead PL, Martin ER, Wright HH, et al. (2006) Investigation of autism and GABA receptor subunit genes in multiple ethnic groups. Neurogenetics 7: 167-174. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1513515&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 28 October 2010.
26.  Ma DQ, Whitehead PL, Menold MM, Martin ER, Ashley-Koch a E, et al. (2005) Identification of significant association and gene-gene interaction of GABA receptor subunit genes in autism. Am J Hum Genet 77: 377-388. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1226204&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
27.  Matsunami N, Hadley D, Hensel CH, Christensen GB, Kim C, et al. (2013) Identification of Rare Recurrent Copy Number Variants in High-Risk Autism Families and Their Prevalence in a Large ASD Population. PLoS One 8: e52239. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3544904&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 2 February 2013.
28.  Wang K, Zhang H, Ma D, Bucan M, Glessner JT, et al. (2009) Common genetic variants on 5p14.1 associate with autism spectrum disorders. Nature 459: 528-533. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2943511&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 2 April 2011.
29.  Glessner JT, Reilly MP, Kim CE, Takahashi N, Albano A, et al. (2010) Strong synaptic transmission impact by copy number variations in schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 10584-10589. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2890845&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 28 February 2012.
30.  Elia J, Glessner JT, Wang K, Takahashi N, Shtir CJ, et al. (2012) Genome-wide copy number variation study associates metabotropic glutamate receptor gene networks with attention deficit hyperactivity disorder. Nat Genet 44: 78-84. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22138692. Accessed 29 January 2013.
31.  Fujii Y, Shibata H, Kikuta R, Makino C, Tani A, et al. (2003) Positive associations of polymorphisms in the metabotropic glutamate receptor type 3 gene (GRM3) with schizophrenia. Psychiatr Genet 13: 71-76. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12782962. Accessed 24 March 2014.
32.  Li Z-J, Wang B-J, Ding M, Pang H, Sun X-F, et al. (2008) [The association between glutamate receptor gene SNP and schizophrenia]. Fa Yi Xue Za Zhi 24: 369-374, 377. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18979923. Accessed 24 March 2014.
33.  Shibata H, Tani A, Chikuhara T, Kikuta R, Sakai M, et al. (2009) Association study of polymorphisms in the group III metabotropic glutamate receptor genes, GRM4 and GRM7, with schizophrenia. Psychiatry Res 167: 88-96. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19351574. Accessed 24 March 2014.
34.  Ohtsuki T, Koga M, Ishiguro H, Horiuchi Y, Arai M, et al. (2008) A polymorphism of the metabotropic glutamate receptor mGluR7 (GRM7) gene is associated with schizophrenia. Schizophr Res 101: 9-16. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18329248. Accessed 24 March 2014.
35.  Bolonna AA, Kerwin RW, Munro J, Arranz MJ, Makoff AJ (2001) Polymorphisms in the genes for mGluR types 7 and 8: association studies with schizophrenia. Schizophr Res 47: 99-103. Available: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0920996499002352. Accessed 24 March 2014.
36.  Takaki H, Kikuta R, Shibata H, Ninomiya H, Tashiro N, et al. (2004) Positive associations of polymorphisms in the metabotropic glutamate receptor type 8 gene (GRM8) with schizophrenia. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 128B: 6-14. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15211621. Accessed 24 March 2014.
37.  Moreno-De-Luca D, Sanders SJ, Willsey AJ, Mulle JG, Lowe JK, et al. (2013) Using large clinical data sets to infer pathogenicity for rare copy number variants in autism cohorts. Mol Psychiatry 18: 1090-1095. Available: http://dx.doi.org/10.1038/mp.2012.138. Accessed 10 February 2014.
38.  Gilman SR, Iossifov I, Levy D, Ronemus M, Wigler M, et al. (2011) Rare de novo variants associated with autism implicate a large functional network of genes involved in formation and function of synapses. Neuron 70: 898-907. Available: http://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(11)00439-9. Accessed 23 January 2014.
39.  Sakai Y, Shaw CA, Dawson BC, Dugas D V, Al-Mohtaseb Z, et al. (2011) Protein interactome reveals converging molecular pathways among autism disorders. Sci Transl Med 3: 86ra49. Available: http://stm.sciencemag.org/content/3/86/86ra49. Accessed 21 February 2014.
40.  Noh HJ, Ponting CP, Boulding HC, Meader S, Betancur C, et al. (2013) Network topologies and convergent aetiologies arising from deletions and duplications observed in individuals with autism. PLoS Genet 9: e1003523. Available: /pmcc/articles/PMC3675007/?report=abstract. Accessed 28 February 2014.
41.  Hopkins AL, Groom CR (2002) The druggable genome. Nat Rev Drug Discov 1: 727-730. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12209152. Accessed 22 January 2014.
42.  Hadley D, Murphy T, Valladares O, Hannenhalli S, Ungar L, et al. (2006) Patterns of sequence conservation in presynaptic neural genes. Genome Biol 7: R105. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1794582&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 7 February 2013.
43.  Zoghbi HY (2003) Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse? Science 302: 826-830. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14593168. Accessed 29 November 2010.
44.  Anney R, Klei L, Pinto D, Regan R, Conroy J, et al. (2010) A genomewide scan for common alleles affecting risk for autism. Hum Mol Genet. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20663923. Accessed 30 July 2010.
45.  Altshuler DM, Gibbs RA, Peltonen L, Dermitzakis E, Schaffner SF, et al. (2010) Integrating common and rare genetic variation in diverse human populations. Nature 467: 52-58. Available: http://dx.doi.org/10.1038/nature09298. Accessed 18 July 2011.
46.  Cann HM, de Toma C, Cazes L, Legrand M, Morel V, et al. (2002) A human genome diversity cell line panel. Science 296: 261-262. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11954565. Accessed 14 October 2010.
47.  Van der Zwaag B, Franke L, Poot M, Hochstenbach R, Spierenburg HA, et al. (2009) Gene-network analysis identifies susceptibility genes related to glycobiology in autism. PLoS One 4: e5324. Available: http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0005324?imageURI=info:doi/10.1371/journal.pone.0005324.t001. Accessed 16 November 2012.
48.  HUGO Gene Nomenclature Committee Home Page | HUGO Gene Nomenclature Committee (n.d.). Available: http://www.genenames.org/. Accessed 18 February 2013.
49.  Venkatesan K, Rual J-F, Vazquez A, Stelzl U, Lemmens I, et al. (2009) An empirical framework for binary interactome mapping. Nat Methods 6: 83-90. Available: http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.1280. Accessed 31 January 2013.
50.  Rual J-F, Venkatesan K, Hao T, Hirozane-Kishikawa T, Dricot A, et al. (2005) Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature 437: 1173-1178. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16189514. Accessed 6 July 2011.
51.  Hermanson O, Jepsen K, Rosenfeld MG (2002) N-CoR controls differentiation of neural stem cells into astrocytes. Nature 419: 934-939. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12410313. Accessed 18 February 2013.
52.  Li H, Li Y, Shao J, Li R, Qin Y, et al. (2008) The association analysis of RELN and GRM8 genes with autistic spectrum disorder in Chinese Han population. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 147B: 194-200. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17955477. Accessed 12 March 2014.
53.  Serajee FJ, Zhong H, Nabi R, Huq AHMM (2003) The metabotropic glutamate receptor 8 gene at 7q31: partial duplication and possible association with autism. J Med Genet 40: e42. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1735437&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 12 March 2014.
54.  Cusco I, Medrano A, Gener B, Vilardell M, Gallastegui F, et al. (2009) Autism-specific copy number variants further implicate the phosphatidylinositol signaling pathway and the glutamatergic synapse in the etiology of the disorder. Hum Mol Genet 18: 1795-1804. Available: http://hmg.oxfordjournals.org/content/18/10/1795.long. Accessed 13 February 2014.
55.  Auerbach BD, Osterweil EK, Bear MF (2011) Mutations causing syndromic autism define an axis of synaptic pathophysiology. Nature 1. Available: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nature10658. Accessed 1 December 2011.
56.  Elia J, Gai X, Xie HM, Perin JC, Geiger E, et al. (2009) Rare structural variants found in attention-deficit hyperactivity disorder are preferentially associated with neurodevelopmental genes. Mol Psychiatry: 637-646. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19546859.
57.  OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man (n.d.). Available: http://omim.org/. Accessed 18 February 2013.
58.  Nair SK, Burley SK (2003) X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell 112: 193-205. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12553908. Accessed 21 February 2013.
59.  Kao H-T, Buka SL, Kelsey KT, Gruber DF, Porton B (2010) The correlation between rates of cancer and autism: an exploratory ecological investigation. PLoS One 5: e9372. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2826417&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 21 February 2013.
60.  Gkogkas CG, Khoutorsky A, Ran I, Rampakakis E, Nevarko T, et al. (2013) Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature 493: 371-377. Available: http://dx.doi.org/10.1038/nature11628. Accessed 28 January 2013.
61.  Kikuno R, Nagase T, Nakayama M, Koga H, Okazaki N, et al. (2004) HUGE: a database for human KIAA proteins, a 2004 update integrating HUGEppi and ROUGE. Nucleic Acids Res 32: D502-4. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=308769&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 8 February 2013.
62.  Elliott E, Tsvetkov P, Ginzburg I (2007) BAG-1 associates with Hsc70.Tau complex and regulates the proteasomal degradation of Tau protein. J Biol Chem 282: 37276-37284. Available: http://www.jbc.org/content/282/51/37276.short. Accessed 18 February 2013.
63.  Elliott E, Laufer O, Ginzburg I (2009) BAG-1M is up-regulated in hippocampus of Alzheimer's disease patients and associates with tau and APP proteins. J Neurochem 109: 1168-1178. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19317853. Accessed 18 February 2013.
64.  McMahon FJ, Insel TR (2012) Pharmacogenomics and personalized medicine in neuropsychiatry. Neuron 74: 773-776. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22681682. Accessed 8 March 2013.
65.  R Core Team (n.d.) R: A language and environment for statistical computing. Available: http://www.r-project.org/. Accessed 18 February 2013.
66.  Wang K, Li M, Hadley D, Liu R, Glessner J, et al. (2007) PennCNV: an integrated hidden Markov model designed for high-resolution copy number variation detection in whole-genome SNP genotyping data. Genome Res 17: 1665-1674. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2045149&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 30 July 2010.
67.  Purcell S, Neale B, Todd-Brown K, Thomas L, Ferreira MAR, et al. (2007) PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet 81: 559-575. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1950838&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. Accessed 11 February 2013.
68.  Human Interactome Database (n.d.). Available: http://interactome.dfci.harvard.edu/H_sapiens/. Accessed 18 February 2013.
【０１４１】
実施例ＩＶ
症候性自閉症スペクトラム症の遺伝的及び環境的形態におけるｍＧｌｕＲコピー数多型の役割
ｍＧｌｕＲ５を通じて媒介される異常なシグナル伝達は、脆弱Ｘ症候群及び結節性硬化症における自閉症スペクトラム症（ＡＳＤ）の病態生理学に関与する。しかし、症候性ＡＳＤにおける他のｍＧｌｕＲ関連ネットワーク／シグナル伝達遺伝子の役割は不明である。コピー数変異体（ＣＮＶ）が症候性ＡＳＤにおいて濃縮されているかどうかを決定するために、マイクロアレイをＡＳＤを有する小児においてｍＧｌｕＲネットワークＣＮＶを同定するために使用した。本発明者らは、１）ＡＳＤを有する小児でｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子中にＣＮＶを有する及び有さないの間で症候性特性の率が変化するかどうか、並びに２）ｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子中の「第２のヒット」が２２ｑ１１．２欠失症候群を有する小児（全員ＲＡＮＢＰ１のハプロ不全、２２ｑ１１．２領域中にｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子を有する）において、ＡＳＤを有する小児より頻繁に生じるかどうかを決定することを計画した。
【０１４２】
ＡＳＤの親の報告書を有する本発明者らのバイオレポジトリー中の個体（ｎ＝６，４５２）をｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａでのｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｃｏｒｄの臨床評価を利用する親の同意についてスクリーニングした（ｎ＝５３９）。本発明者らの症候性比較コホートは、ＡＳＤの診断を有する者（ｎ＝２５）及びＡＳＤに無関係な者（ｎ＝５０）を含む、過去の医学的及び神経心理学的評価を十分に受けた２２ｑ１１．２欠失症候群を有する小児を含んだ（ｎ＝７５）。
【０１４３】
患者分類（症候性対非症候性）をすべてのｍＧｌｕＲ陽性及び１００個の無作為に選択されたｍＧｌｕＲ陰性症例における盲検医学的カルテ審査を介して行った。
【０１４４】
本明細書下にさらに説明される本発明者らの結果は、健常コントロールの３．２％に対してＡＳＤの１１．５％がｍＧｌｕＲ  ＣＮＶを有したことを示す（ｐ＜０．００１）。症候性ＡＳＤは、ｍＧｌｕＲ  ＣＮＶを有する小児においてさらによく見られた（７２％対１６％、ｐ＜０．００１）。２２ｑ１１．２欠失症候群を有する小児の比較コホート（ＡＳＤを有するｎ＝２５、ＡＳＤを有さないｎ＝５０）、ｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子ＲＡＮＢＰ１について全員ハプロ不全、をｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子中の「第２のヒット」がＡＳＤについての追加的危険性を付与するかどうかを決定するために評価した。２２ｑ１１．２ＤＳ＋ＡＳＤを有する２０％はｍＧｌｕＲシグナル伝達遺伝子中に「第２のヒット」を有し、対して２２ｑ１１．２ＤＳ−ＡＳＤ（ｐ＜０．０１４）では２％であった。結論：本発明者らは、変化したＲＡＮＢＰ１発現が２２ｑ１１．２ＤＳ、サリドマイド胎芽病及び胎児性バルプロエート症候群におけるＡＳＤの間に機構的関連性を提供する可能性があり、一見無関係なＡＳＤの遺伝的及び環境的形態に関連性を提供していることを提案する。
【０１４５】
結果は、脆弱Ｘ症候群及び結節性硬化症における変化した神経学的発達に既に関与しているｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子中のＣＮＶが、自閉症スペクトラム症の多数の他の遺伝的及び環境的形態に関連している可能性があることを示唆している。
【０１４６】
前述の例で考察したとおり、自閉症スペクトラム症（ＡＳＤ）はおよそ１／８８個体で生じ、社会的コミュニケーション及び反復的興味及び活動における障害によって特徴が明らかになる１。症例のおよそ２０％は、同定可能な症候群の情況で生じる２。ＡＳＤを含む遺伝的症候群は、細胞遺伝学的に可視の染色体変化（例えば２１番トリソミー）、ミクロ欠失及びミクロ重複症候群（例えば２２ｑ１１．２欠失症候群［２２ｑ１１．２ＤＳ］；２２ｑ１１．２重複症候群［２２ｑ１１．２ＤｕｐＳ］）並びに一遺伝子性障害（例えば脆弱Ｘ症候群［ＦＸＳ］、結節性硬化症［ＴＳ］）３−１３を含んで不均一である。付加的に、出生前のサリドマイド、バルプロ酸、ミソプロストール、エタノール及び母体内風疹感染への曝露は、ＡＳＤ１４−１９の危険性の上昇に関連している。
【０１４７】
ＡＳＤの特発性及び症候性形態の大部分の形態でのＡＳＤの発症についての機構は理解しにくいままである。近年、代謝型グルタメート受容体５（ｍＧｌｕＲ５）を通じたシグナル伝達はＦＸＳ及びＴＳにおいてＡＳＤの発症に関与していた２０。ＦＸＳでは、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）の異常な産生がｍＧｌｕＲ経路を通じたシグナル伝達の正常な阻害を除去する。結節性硬化症は、シグナル伝達の過剰な阻害をもたらす。Ａｕｅｒｂａｃｈ及び共同研究者（２０１１）は、ＦＸＳ及びＴＳのマウスモデルにおける異常なシナプス学習及び非定型的行動を実証し、２つの株を合わせて繁殖させることによってこれらの影響を元に戻した−両方の変異を担持するマウスは、正常なｍＧｌｕＲシグナル伝達並びにコントロールマウスから識別不能であった学習及び行動を有した２０。他の研究は、ｍＧｌｕＲ５アンタゴニストの投与による脆弱Ｘマウスでの学習及び行動の正常化を実証した２１，２２。付加的に、ＦＸＳ及びＴＳでの認知及び行動の差異についての機構を解明するために、これらの研究は、薬理的治療のための有望な手段を示唆している。
近年の研究は、ｍＧｌｕＲ遺伝子ネットワーク中の遺伝子に影響を与える欠失を含んで２３、２７６個の遺伝子からなる２４ＡＳＤの病因における低頻度ＣＮＶに関与している。症候性ＡＳＤの追加的形態が類似の機構を共有する可能性があるかどうかを決定するために（ｍＧｌｕＲ遺伝子ネットワークの破壊を通じて）、本発明者らはｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａで追跡したＡＳＤを有する小児５３９名（併存遺伝的症候群については選別していない）からのＤＮＡを分析した。
【０１４８】
次の材料及び方法は、実施例ＩＶの実行を促進するために提供される。
【０１４９】
参加者：
本発明者らのバイオレポジトリーからの親の健康に関するアンケートで報告されたＡＳＤを有する患者についての表現型データ（ｎ＝６，４５２）をｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａで臨床的評価を受け、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｃｏｒｄカルテ審査に同意した患者を同定するために評価した。これらの症例からのＤＮＡ（ｎ＝５３９）を表現型及び遺伝型分析のためにさらに選択した。小児をＴｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａで別の目的のために採血を受けた場合にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙのための総合センターへの受け入れのために採用したため、この患者コホートでは少なくとも１つの医学的問題を有する小児の過剰がある。すべての患者の両親は、研究への参加に対して同意し、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＩＲＢ０６−００４８８６）によって承認された。
【０１５０】
カルテ審査：
対象選択及び無作為化プロセス：ｍＧｌｕＲ  ＣＮＶを有するすべての患者（ｎ＝６２）及びｍＧｌｕＲ  ＣＮＶを有さない患者１００名をカルテ審査のために無作為に選択した。この手順をｍＧｌｕＲ  ＣＮＶを有するすべての患者が適切なサイズの比較コホートで詳細なカルテ審査を受けることを確実にするために選択した。３ステッププロセスを盲検のカルテ審査を確実にするために行った。１６２枚のカルテの選択は、ＣＮＶデータを利用できるがｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｃｏｒｄ（ＣＫ）を利用できない遺伝学者によって行った。ＣＮＶデータもｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｃｏｒｄも利用できない別の著者が盲検で、患者ＩＤを無作為化した（ＲＴＳ）。最終的にｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｃｏｒｄを利用できるが、ｍＧｌｕＲ状態（ＴＬＷ）に盲検である医師がＡＳＤ診断及び他の医学的併存症の存在の記述についてカルテを再検討した。
【０１５１】
ＡＳＤ：
カルテをＡＳＤの診断を確認し、各患者について医学的併存症を決定するためにも再調査した。ＡＳＤの診断は、後ろ向きカルテ審査、ゴールドスタンダードの研究装置であったことからカルテにおいて確認した（例えば自閉症）。
【０１５２】
医学的併存症：
構造的先天性欠損、遺伝子検査及び医学的状態を各患者について記録した。症例は、彼らがＡＳＤ及び一般集団において１％未満で生じる医学的状態又は構造的先天性欠損（例えば口蓋裂）の存在を有する場合に「症候性ＡＳＤ」として分類した。この基準は、ＡＳＤ及び他の医学的問題が同時には高度に生じにくい患者のサブセットを定義するために確立された−一般集団の１／８８でのＡＳＤのベースライン率及び＜１％で生じる医学的状態を有する、組み合わされた両方が偶然生じる可能性は、およそ０．００１％である。図８を参照されたい。
【０１５３】
ジェノタイピングアレイ及びＣＮＶ判定：
ＡＳＤを有する対象からのＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａからのｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ６１０−Ｑｕａｄ又はＨｕｍａｎ  Ｈａｐ５５０ＳＮＰアレイでそれぞれジェノタイピングした。２２ｑ１１ＤＳコホートについて対象をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＳＮＰアレイ（Ｈｕｍａｎ６１０−Ｑｕａｄ  ｖ１．０若しくはＨｕｍａｎ  Ｈａｐ５５０）又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ６．０ＳＮＰアレイのいずれかで分類した。クラスター化及びＳＮＰ判定を規格化された強度（すなわちＬｏｇ−Ｒ比又はＬＲＲ）及びＢ−対立遺伝子頻度（ＢＡＦ）を生成するＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して実施した。ＣＮＶ判定を波形補正［ＰＭＩＤ：１８７８４１８９］に続いてＰｅｎｎＣＮＶアルゴリズム［ＰＭＩＤ：１７９２１３５４］を使用して実施した。簡潔には、ＰｅｎｎＣＮＶはＣＮＶを検出するためにＬＲＲ、ＢＡＦからの情報及びアレイの特性（例えば隣接するＳＮＰ間の距離）を組み込む隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を使用する。
【０１５４】
ＣＮＶ品質管理：
質の悪いＳＮＰアレイを含む試料は、典型的に擬陽性の割合が相当に増加することから、ＣＮＶ判定から除外した。ジェノタイピング判定率＞９６％、ＬＲＲ（ＬＲＲ  ｓｄ）の標準偏差＜０．４、ＧＣ−波因子（ｗａｖｅ  ｆａｃｔｏｒ）（ＧＣＷＦ）が波形補正後に−０．２から０．２の間であり、試料についてのＣＮＶ判定の合計数＜１００であるそれらの試料が、分析に含まれた。
【０１５５】
ＣＮＶアノテーション：
症候性ＡＳＤ領域について、ゲノム座標はＢｅｔａｎｃｕｒによって記載されたものであった［ＰＭＩＤ：２１１２９３６４］。ヒトインタラクトームデータベースからＣｙｔｏｓｃａｐｅによって生成されたＧＲＭ／ｍＧｌｕＲネットワークは、Ｅｌｉａ等［ＰＭＩＤ：２２１３８６９２］によって、遺伝子座標のためのＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ定義を使用して記載された（ＵＣＳＣ遺伝子）。Ｃｙｔｏｓｃａｐｅからのこのネットワークは、ｍＧｌｕＲ＋対ｍＧｌｕＲ−サブセットを定義するために使用された。２２ｑ１１ＤＳコホート分析のための追加的ＧＲＭ／ｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子は、８個のＧＲＭ遺伝子の第１の程度の相互作用ネットワークに基づいて、プログラムＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ分析（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．／Ｑｉａｇｅｎ；Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）及びＫｅｌｌｅｈｅｒ等［ＰＭＩＤ：２２５５８１０７］において記載されたグループＩ  ｍＧｌｕＲシグナル伝達経路をコードする遺伝子を使用して同定された。ＣＮＶ判定は、既知の症候性領域への重複及びＧＲＭネットワーク遺伝子について分析された。臨床的細胞遺伝学臨床検査によって検出されたすべての症候性異常を対応するＳＮＰアレイで確認した。
【０１５６】
結果
ｍＧｌｕＲネットワークコピー数多様性（ＣＮＶ）は、非症候性ＡＳＤと比較して症候性ＡＳＤにおいて広く認められている。
ｍＧｌｕＲネットワークにおけるＣＮＶは、非症候性ＡＳＤを有する患者の１６％と比較して症候性ＡＳＤを有する患者の７４％において見出された（ｐ＜０．００１）。症候性ＡＳＤを有する患者におけるｍＧｌｕＲ  ＣＮＶのほとんど（７５％）が大きな臨床的に重要なＣＮＶに含まれた。ｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子が２２ｑ１１．２領域（ＲＡＮＢＰ１）及び２１番染色体（ＡＰＰ  ＧＲＩＫ１  ＭＸ１  ＰＣＢＰ３  ＳＥＴＤ４）上に存在することから、２２ｑ１１．２ＤＳ、２２ｑ１１．２ＤｕｐＳ又は２１番トリソミーの存在下でＡＳＤを有する患者は、症候性ＡＳＤ＋ｍＧｌｕＲネットワーク変化を有する患者の１５名（３３％）であった。観察された細胞遺伝学的変化の残りは、非重複欠失又は重複の個体であった。分析は、２１番トリソミー、２２ｑ１１．２ＤＳ及び２２ｑ１１．２ＤｕｐＳを有する小児を除外した後に反復された（既にＡＳＤと関連付けられた本研究における小児の症候群）。彼らの除外後に効果は有意のままであった（ｐ＜０．００１）。
【０１５７】
２２ｑ１１．２欠失症候群における自閉症スペクトラム症はｍＧｌｕＲ経路における「第２のヒット」と関連する。
比較コホートとして、２２ｑ１１．２ＤＳを有し、ＡＳＤを有する（ｎ＝２５）及びＡＳＤを有さず（ｎ＝５０）、高密度マイクロアレイ評価（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ６．０、Ｉｌｌｕｍｉｎａ５００Ｋ及びＩｌｌｕｍｉｎａ６１０Ｑのいずれか）及び臨床発達評価（並行研究を通じて登録され、ｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ、ＩＲＢ０７−００５３５２によって承認された）を完了した小児からのデータを２２ｑ１１．２領域の外で第２のｍＧｌｕＲネットワークヒットの存在について検討した。「第２のヒット」、２２ｑ１１．２領域の外のｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子の欠失は、ＡＳＤを有する患者の２０％（５／２５）において及びＡＳＤを有さない者の２％（１／５０）だけにおいて見出された（ｐ＜０．０１４）。
【０１５８】
考察：
先の研究は、ｍＧｌｕＲ５を通じた異常なシグナル伝達（多すぎる又は少なすぎるのいずれでも）がＦＸＳ及びＴＳでの異常な神経発達（及びＡＳＤの可能性）についての基礎となる可能性があることを実証した。本発明者らのデータは、ｍＧｌｕＲネットワークの撹乱が症候性ＡＳＤの細胞遺伝学的に異なる形態において見られるＡＳＤの率の上昇の原因である可能性があることを示唆している。ｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子は、２２ｑ１１．２領域及び染色体２１において見出され、ダウン症候群及び２２ｑ１１．２ＤＳの両方におけるＡＳＤの有病率の上昇に関与する可能性がある。しかし２１番トリソミー又は２２ｑ１１．２  ＤＳを有するすべての患者は、ｍＧｌｕＲネットワークに変化を担持しており、領域外の第２のヒットがＡＳＤ表現型の発現のために必要である可能性を示唆している。
【０１５９】
２２ｑ１１．２欠失症候群、２２ｑ１１．２重複症候群、サリドマイド胎芽病及び胎児性バルプロエート症候群における自閉症スペクトラム症
２２ｑ１１．２ＤＳは、ヒトにおける最も一般的なミクロ欠失症候群であり、４，０００個体に１個体で生じる。典型的欠失は、およそ３Ｍｂにわたり、およそ４５遺伝子を含み、多様な医学的及び行動障害を生じる（表９）２５−２８。ＡＳＤはおよそ２０％において及び精神病は２５％５、９において生じる。２２ｑ１１．２ＤｕｐＳは２２ｑ１１．２ＤＳにおいて見られるのと同じ型の先天性欠損及び医学的併存症を低い率（本発明者らの臨床コホートにおける６０名を超える患者では）だが生じる。文献２９又は本発明者らのコホートにおいて２２ｑ１１ＤｕｐＳでは精神病の症例はない。４歳以後の発達評価の資料を有する本発明者らの症例ではＡＳＤの有病率は２７％であり、２２ｑ１１．２ＤＳを有する小児における率よりわずかに高い。
【０１６０】
妊娠時のサリドマイド曝露は、非常に低頻度であるいくつか（例えばアザラシ肢症、放射線障害）を含む２２ｑ１１．２ＤＳにおいてすべて報告されている種々の先天性欠損を生じる（表９）。Ｍｉｌｌｅｒ及びＳｔｒｏｍｌａｎｄは、早期胚発生の際のサリドマイドへの曝露に続くＡＳＤの危険性の上昇を報告した１６。本研究は、妊娠時にサリドマイドに曝露された成人に行われた精神科医による前向き評価、先天性欠損及び関連する特性を記述する医師による評価を含んだ。サリドマイド曝露後のＡＳＤのすべての症例は耳の異常を有し、受精２４−２８日後の間の曝露を示唆している。この時期に曝露された個体の内、ＡＳＤの率は２７％であった。小児の付加的コホートでの本研究の反復は、妊婦へのサリドマイドの使用が１９６０年代に広く制限されたことから不可能であり、したがって追加的症例は入手できない。サリドマイド胎芽病における多数の先天性欠損の原因についていくつかの機構が提案されたが、サリドマイドの催奇性効果の動物実験は顕著な種差のため制限されてきた。１９６０年代にサリドマイドが広く使用された理由の１つは、ヒトにおいて高度に催奇性であるレベルでの動物における催奇性の欠如である。これは、サリドマイドが特に催奇性ではない動物において又はヒトにおいて使用されるよりさらに高い用量で使用されて研究が行われたことから、サリドマイドの催奇性機構を決定する研究者の能力に著しい制限を生じた。立法における近年の変化は、ヒト細胞を使用する今までに類をみないヒト胚性幹細胞で完了する研究、及び１９５０年代及び１９６０年代にサリドマイドを摂取した女性によって経験されたものに類する用量を許容した３０。本研究はＭｅｇａｎａｔｈａｎ及び共同研究者によって実施され（２０１２）、サリドマイドの催奇性効果がＲＡＮＢＰ１を通じて媒介される可能性があることを提案した３０。
バルプロ酸（ＶＰＡ）は、抗痙攣薬、気分安定剤として、及び片頭痛を予防するために広く使用されている。妊娠時のＶＰＡへの曝露は、いくつかの先天性欠損の率の上昇を生じ、そのすべては２２ｑ１１．２ＤＳにおいて報告され、その大部分はサリドマイド胎芽病において見られる（表９）。表９は、２２ｑ１１．２ＤＳ、サリドマイド胎芽病及び胎児性バルプロエート症候群において見られる先天性欠損を比較する。２２ｑ１１．２ＤＳにおいて見られるすべての先天性欠損と曝露症候群との比較は、本発明者らがサリドマイド胎芽病又は胎児性バルプロエート症候群に影響を与えるとは考えない多数の追加的遺伝子の欠失を２２ｑ１１．２ＤＳが含むことから行わなかった。構造的欠損に加えて、子宮内でＶＰＡに曝露された小児は、ＡＳＤを発症する危険性が上昇している１９，３１，３２。自閉症のげっ歯類モデルは、子宮内でのＶＰＡへの曝露を自閉症及び異常な行動の神経解剖学的特性のいくつかを再現するために使用した３３−３５。そのヒストンデアセチラーゼ阻害剤としての作用により、ＶＰＡは多数の遺伝子の発現に影響を与える。相同性に基づいて、ＲａｎＢＰ１  ｍＲＮＡの発現低下がＶＰＡ処置ラットにおいて予測される。さらに近年の研究は、ｍＧｌｕＲアンタゴニストで処置したＶＰＡ曝露マウスにおいて非定型的
行動の回復を示した３６。
2018500001.tif 000012
【０１６１】
結論
ｍＧｌｕＲネットワークにおいて遺伝子の乱れが、２２ｑ１１．２ＤＳ、２２ｑ１１．２ＤｕｐＳ、２１番トリソミー及び多数の他の一見無関係の染色体変化を含む症候性ＡＳＤのさまざまな形態を有する患者において高率で見出された。さらに、２２ｑ１１．２ＤＳを有する小児において、ｍＧｌｕＲネットワークにおける「第２のヒット」の存在は、ＡＳＤを有する小児の２０％において、ＡＳＤを有さないものでは２％でだけ同定された（ｐ＜０．０１４）。重要なことに、全員自閉症表現型を有する４名の小児が、ＲＡＮＢＰ１遺伝子近傍に小さな欠失を有した。一方ＲＡＮＢＰ１の発現レベルは、検査が可能であった１個体では影響を与えていなかったが（データ未記載）、これらの非定型的欠失は、ＲＡＮＢＰ１タンパク質の制御不全を生じて遺伝子機能に影響を与える場合があった。
【０１６２】
まとめるとこれらのデータはｍＧｌｕＲネットワークの制御不全を、ＡＳＤを発症する傾向を増加させる許容的因子であるとして関連付ける。ネットワーク中の第２の遺伝子に影響を与えるＣＮＶを有するＡＳＤの有病率における著しい増加は、複数の点でのｍＧｌｕＲシグナル伝達の撹乱が必要であることを示唆している。本研究が配列差異の評価を含んでいないことから、ＣＮＶがｍＧｌｕＲネットワーク遺伝子における変化の一部だけを表していることに注目することは重要であり、したがってこれらの知見は「氷山の一角」を表している可能性がある。ｍＧｌｕＲネットワークの撹乱がＡＳＤの危険性を付与していると考えられる一方で、追加的な遺伝的又は環境的ストレス要因が個々の小児がＡＳＤを発症するためには必要であると考えられる。
【０１６３】
著しい類似性が先天性欠損並びに２２ｑ１１．２欠失症候群、胎児性バルプロエート症候群及びサリドマイド胎芽病において見られる自閉症スペクトラム症の率の上昇のプロファイルにおいて存在する。サリドマイド及びＶＰＡの両方がＲＡＮＢＰ１  ｍＲＮＡの発現低下を生じることから、２２ｑ１１．２欠失症候群での遺伝子のハプロ不全を模倣して、症候群にわたる共通の催奇性プロファイルを含むことは妥当である。さらに、Ｐａｒｏｎｅｔｔ等３７のＲａｎｂｐ１ノックアウトマウスモデルからの結果も２２ｑ１１．２ＤＳとＲＡＮＢＰ１の発現に影響を与える出生前曝露との神経学的因果関係におけるＲＡＮＢＰ１の重要性についての本発明者らの仮説を支持している。これらの研究において（Ｒａｎｂｐ１（−／−）ホモ接合体）、皮質での基底前駆細胞プールの増殖は妨害され、皮質厚の劇的な低減及び出生時の皮質での実質的に少ないニューロンを生じる。ＲＡＮＢＰ１機能の消失から生じる変化は、より大きな２２ｑ１１．２欠失を有するマウスにおいて見られるものと類似しており、Ｒａｎｂｐ１のハプロ不全が２２ｑ１１ＤＳでの皮質回路の破壊に寄与する可能性があることを示唆している。Ｒａｎｂｐ１のハプロ不全を有するマウスの神経発達表現型に取り組む将来の研究は、ｍＧｌｕＲ経路の変化がＡＳＤの危険性の増加を導く機構を解明する補助となることが期待される。
【０１６４】
実施例ＩＶのための参考文献
1.  Prevalence of Autism Spectrum Disorders - Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network, 14 Sites, United States, 2008. at <http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/ss6103a1.htm?s_cid=ss6103a1_w>
2.  Gurrieri, F. Working up autism: the practical role of medical genetics. in Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 160, 104-110 (2012).
3.  Christian, S. L. et al. Novel submicroscopic chromosomal abnormalities detected in autism spectrum disorder. Biol. Psychiatry 63, 1111 (2008).
4.  Gillberg, C. Chromosomal disorders and autism. J. Autism Dev. Disord. 28, 415-425 (1998).
5.  Fine, S. E. et al. Autism spectrum disorders and symptoms in children with molecularly confirmed 22q11. 2 deletion syndrome. J. Autism Dev. Disord. 35, 461-470 (2005).
6.  Lo-Castro, A. et al. Association of syndromic mental retardation and autism with 22q11. 2 duplication. Neuropediatrics 40, 137-140 (2009).
7.  Motavalli Mukaddes, N. & Herguner, S. Autistic disorder and 22q11. 2 duplication. World J. Biol. Psychiatry 8, 127-130 (2007).
8.  Ramelli, G. P. et al. Microduplication 22q11. 2 in a child with autism spectrum disorder: clinical and genetic study. Dev. Med. Child Neurol. 50, 953-955 (2008).
9.  Vorstman, J. A. et al. The 22q11. 2 deletion in children: high rate of autistic disorders and early onset of psychotic symptoms. J. Am. Acad. Child Adolesc. Psychiatry 45, 1104-1113 (2006).
10.  Mazzocco, M. M., Kates, W. R., Baumgardner, T. L., Freund, L. S. & Reiss, A. L. Autistic behaviors among girls with fragile X syndrome. J. Autism Dev. Disord. 27, 415-435 (1997).
11.  Brown, W. T. et al. Fragile X and autism: a multicenter survey. Am. J. Med. Genet. 23, 341-352 (1986).
12.  Gillberg, J. C., Gillberg, C. & Ahlsen, G. Autistic behaviour and attention deficits in tuberous sclerosis: a population-based study. Dev. Med. Child Neurol. 36, 50-56 (1994).
13.  Jeste, S. S., Sahin, M., Bolton, P., Ploubidis, G. B. & Humphrey, A. Characterization of autism in young children with tuberous sclerosis complex. J. Child Neurol. 23, 520-525 (2008).
14.  Nanson, J. L. Autism in fetal alcohol syndrome: a report of six cases. Alcohol. Clin. Exp. Res. 16, 558-565 (1992).
15.  Bandim, J. M., Ventura, L. O., Miller, M. T., Almeida, H. C. & Costa, A. E. S. Autism and Mobius sequence: an exploratory study of children in northeastern Brazil. Arq. Neuropsiquiatr. 61, 181-185 (2003).
16.  Stromland, K., Nordin, V., Miller, M., Akerstrom, B. & Gillberg, C. Autism in thalidomide embryopathy: a population study. Dev. Med. Child Neurol. 36, 351-356 (1994).
17.  Chess, S. Autism in children with congenital rubella. J. Autism Child. Schizophr. 1, 33-47 (1971).
18.  Chess, S. Follow-up report on autism in congenital rubella. J. Autism Child. Schizophr. 7, 69-81 (1977).
19.  Christensen, J. et al. Prenatal Valproate Exposure and Risk of Autism Spectrum Disorders and Childhood AutismPrenatal Valproate and Autism. JAMA 309, 1696-1703 (2013).
20.  Auerbach, B. D., Osterweil, E. K. & Bear, M. F. Mutations causing syndromic autism define an axis of synaptic pathophysiology. Nature 480, 63-68 (2011).
21.  Thomas, A. M., Bui, N., Perkins, J. R., Yuva-Paylor, L. A. & Paylor, R. Group I metabotropic glutamate receptor antagonists alter select behaviors in a mouse model for fragile X syndrome. Psychopharmacology (Berl.) 219, 47-58 (2012).
22.  Choi, C. H. et al. Pharmacological reversal of synaptic plasticity deficits in the mouse model of fragile X syndrome by group II mGluR antagonist or lithium treatment. Brain Res. 1380, 106-119 (2011).
23.  Gai, X. et al. Rare structural variation of synapse and neurotransmission genes in autism. Mol. Psychiatry 17, 402-411 (2011).
24.  Elia, J. et al. Genome-wide copy number variation study associates metabotropic glutamate receptor gene networks with attention deficit hyperactivity disorder. Nat. Genet. 44, 78-84 (2011).
25.  Bassett, A. S. et al. Practical Guidelines for Managing Patients with 22q11.2 Deletion Syndrome. J. Pediatr. 159, 332-9.e1 (2011).
26.  Goodship, J., Cross, I., LiLing, J. & Wren, C. A population study of chromosome 22q11 deletions in infancy. Arch. Dis. Child. 79, 348-351 (1998).
27.  Du Montcel, S. T., Mendizabai, H., Ayme, S., Levy, A. & Philip, N. Prevalence of 22q11 microdeletion. J. Med. Genet. 33, 719 (1996).
28.  Oskarsdottir, S., Vujic, M. & Fasth, A. Incidence and prevalence of the 22q11 deletion syndrome: a population-based study in Western Sweden. Arch. Dis. Child. 89, 148-151 (2004).
29.  Brunet, A. et al. Failure to detect the 22q11. 2 duplication syndrome rearrangement among patients with schizophrenia. Behav. Brain Funct. 4, (2008).
30.  Meganathan, K. et al. Identification of thalidomide-specific transcriptomics and proteomics signatures during differentiation of human embryonic stem cells. Plos One 7, e44228 (2012).
31.  Rasalam, A. D. et al. Characteristics of fetal anticonvulsant syndrome associated autistic disorder. Dev. Med. Child Neurol. 47, 551-555 (2005).
32.  Moore, S. J. et al. A clinical study of 57 children with fetal anticonvulsant syndromes. J. Med. Genet. 37, 489-497 (2000).
33.  Ingram, J. L., Peckham, S. M., Tisdale, B. & Rodier, P. M. Prenatal exposure of rats to valproic acid reproduces the cerebellar anomalies associated with autism. Neurotoxicol. Teratol. 22, 319-324 (2000).
34.  Tomasz Schneider, R. P. Behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid: animal model of autism. Neuropsychopharmacology 30, 80-89 (2004).
35.  Rodier, P. M., Ingram, J. L., Tisdale, B., Nelson, S. & Romano, J. Embryological origin for autism: developmental anomalies of the cranial nerve motor nuclei. J. Comp. Neurol. 370, 247-261 (1996).
36.  Mehta, M. V., Gandal, M. J. & Siegel, S. J. mGluR5-antagonist mediated reversal of elevated stereotyped, repetitive behaviors in the VPA model of autism. Plos One 6, e26077 (2011).
37.  Paronett, E.M., Meechan, D., Karpinsky, B.A., LaMantia, A-S., Maynard (T.M.)  Submitted, personal communication.  Ranbp1, deleted in DiGeorge/22q11.2 deletion syndrome, is a microcephaly gene.
【０１６５】
本発明の特定の好ましい実施態様は、上に記載され、具体的に例示されているが、本発明がそのような実施態様に限定されることは目的とされない。種々の改変が次の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲及び精神から逸脱することなくなされうる。
【図１】
2018500001.tif 000013
【図２】
2018500001.tif 000014
【図３】
2018500001.tif 000015
【図４】
2018500001.tif 000016
【図５】
2018500001.tif 000017
【図６】
2018500001.tif 000018
【図７】
2018500001.tif 000019
【国際調査報告】
2018500001.tif 000020