(57)【要約】ライム病の異なる段階で発現するボレリアタンパク質に由来するＴ細胞エピトープ含有領域を含む合成ペプチドと、ＬＤを有すると疑われる対象由来の全血試料をインビトロで接触させること、および、ペプチドによる刺激に応答して産生されるＴ細胞免疫応答インジケーター（例えば、インターフェロン−γ）を決定することによってＬＤ特異的活性化Ｔ細胞を間接的に検出することを含む、ライム病（ＬＤ）を検出、診断および予後予測するための組成物および方法を提供する。また、ＬＤ治療を受けているＬＤ患者由来の全血試料を、ライム病の異なる段階で発現するボレリアタンパク質の特定のＴ細胞エピトープ領域を含むペプチドに暴露させ、そして、Ｔ細胞免疫応答インジケーター（例えば、インターフェロン−γ）が存在しないことから、試料中にボレリア特異的活性化Ｔ細胞が含まれていないことを確認する、ＬＤ治療を受けているＬＤ患者におけるＬＤスピロヘータ除去を予測する方法も開示する。
2018536429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の組成物および第２の組成物から選択されるライム病を診断または予後予測するための組成物であって、ここで：
（Ｉ）第１の組成物は、
（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの単離ＦｌａＢペプチド；
（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ＤｂｐＢペプチド；
（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ｐ６６ペプチド；および
（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つまたは２つの単離ＯｓｐＣペプチドを含み、前記組成物は、ライム病に関連するボレリア菌種に感染した対象から得られた全血と接触させた後に、Ｔ細胞による二次インビトロ免疫応答を誘発することができ；ならびに、
（ＩＩ）第２の組成物は、
（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、５つの単離ＦｌａＢペプチド；
（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ＤｂｐＢペプチド；
（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ｐ６６ペプチド；および
（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される２つの単離ＯｓｐＣペプチドを含む、
第１の組成物および第２の組成物から選択されるライム病を診断または予後予測するための組成物。
【請求項２】
前記組成物が少なくとも、
（ａ）各ペプチドを少なくとも約１ナノグラムずつ含むが、各ペプチドの量は約１００ナノグラムを超えず、
（ｂ）各ペプチドを少なくとも約１００、２００、３００、または４００ナノグラムずつ含むが、各ペプチドの量は約５００ナノグラムを超えず、
（ｃ）各ペプチドを少なくとも約５００、６００、７００、８００、または９００ナノグラムずつ含むが、各ペプチドの量は約１０００ナノグラムを超えず、
（ｄ）各ペプチドを少なくとも約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９マイクログラムずつ含むが、各ペプチドの量は約２マイクログラムを超えず、または
（ｅ）各ペプチドを少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８または９マイクログラムずつ含むが、各ペプチドの量は約１０マイクログラムを超えない、
のうちのいずれか１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
対象のライム病を検出する方法、または対象におけるライム病の治療の有効性をモニタリングする方法であって、
（Ａ）第１のテストインキュベーション混合物を得るために、（ｉ）ライム病であることまたはライム病を有するリスクがあることが知られている対象から第１の時点で得られた第１の生体試料（ここで前記生体試料はＴ細胞と抗原提示細胞を含んでいる）と、（ｉｉ）ライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物、をインビトロで接触させること、
（Ｂ）Ｔ細胞免疫応答インジケーターの生成を刺激するために前記ペプチド組成物中に存在するボレリアＴ細胞エピトープの前記Ｔ細胞による特異的認識に十分な条件および時間で前記第１のテストインキュベーション混合物をインキュベートすること；
（Ｃ）前記第１のテストインキュベーション混合物のＴ細胞免疫応答インジケーターの第１のレベルを検出することを含み、
ここで、前記対象におけるボレリア感染の存在は、（Ｃ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第１のレベルが、前記第１の生体試料にライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物を加えずにインキュベートした第１の対照インキュベーションから得られた第１の対照レベルよりも高いことで示され、
かつ、ライム病を診断するまたは予後予測するための前記ペプチド組成物は、
（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの単離ＦｌａＢペプチド；
（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ＤｂｐＢペプチド；
（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ｐ６６ペプチド；および
（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つまたは２つの単離ＯｓｐＣペプチドを含み、
それによって対象におけるライム病を検出するか、または前記対象におけるライム病の治療の有効性をモニタリングする、前記対象のライム病を検出する方法、または前記対象におけるライム病の治療の有効性をモニタリングする方法。
【請求項４】
前記第１の時点が、ライム病治療の前記対象への投与前である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ライム病を診断するまたは予後予測するための前記ペプチド組成物が、
（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、５つの単離ＦｌａＢペプチド；
（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ＤｂｐＢペプチド；
（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ｐ６６ペプチド；および
（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される２つの単離ＯｓｐＣペプチド、を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
請求項３または４に記載の方法であって、
（Ｄ）第２のテストインキュベーション混合物を得るために、（ｉ）第１の時点よりも遅く、かつ、ライム病の治療を対象に投与した後に対象から得られた第２の生体試料（ここでこの生体試料はＴ細胞と抗原提示細胞を含んでいる）と、（ｉｉ）ライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物、をインビトロで接触させること、
（Ｅ）Ｔ細胞免疫応答インジケーターの生成を刺激するために前記ペプチド組成物中に存在するボレリアＴ細胞エピトープの前記Ｔ細胞による特異的認識に十分な条件および時間で第２のテストインキュベーション混合物をインキュベートすること；および
（Ｆ）第２のテストインキュベーション混合物のＴ細胞免疫応答インジケーターの第２のレベルを検出することをさらに含み、
ここで、対象におけるボレリア感染の存在は、（Ｆ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第２のレベルが、第２の生体試料にライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物を加えずにインキュベートした第２の対照インキュベーションから得られた第２の対照レベルよりも高いことで示され、
かつ、ライム病治療の有効性は、（Ｆ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第２のレベルが、（ｃ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第１のレベルよりも低いことで示される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
ライム病を診断するまたは予後予測するための前記ペプチド組成物が、
（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、５つの単離ＦｌａＢペプチド；
（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ＤｂｐＢペプチド；
（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ｐ６６ペプチド；および
（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、２つの単離ＯｓｐＣペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種の病原性ボレリア菌種による感染を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記病原性ボレリア菌種が、ヒトに対する病原性をもつ、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒトに対する病原性をもつボレリア菌種が、ボレリア・ブルグドルフェリ、狭義のボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・アゼフェリ、ボレリア・ガリニ、ボレリア・バレイシアナ、ボレリア・スピルマニ、ボレリア・ビセッティ、ボレリア・ルシタニアおよびボレリア・ババリエンシスから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ライム病の治療が、抗生物質を対象に投与することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗生物質が、テトラサイクリン；オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、もしくはミノサイクリン；ペニシリン；アモキシシリンもしくはペニシリン；セファロスポリン；セファクロール、セフブペラゾン、セフミノクス、セフタキシム、セフォテタン、セフメタゾール、セフォキシチン、セフロキシムアキセチル、セフロキシムアセチル、セフチンもしくはセフトリアキソン；マクロライド類；アジスロマイシン、クラリスロマイシンまたはエリスロマイシンから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料が、全血、脳脊髄液、または滑液の少なくとも１つを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体試料が、（ａ）全血、（ｂ）全血の細胞画分、（ｃ）単離された末梢血白血球、または（ｄ）単離された末梢血単核細胞の少なくとも１つを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞免疫応答インジケーターが、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＦＮ−γが、Ｔ細胞によって放出される可溶性ＩＦＮ−γである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞免疫応答インジケーターが、Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞サイトカインの発現のうちの少なくとも１つを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｔ細胞サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞サイトカインの発現が、Ｔ細胞によって放出される可溶性Ｔ細胞サイトカインとして検出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞サイトカインが、結合剤と前記Ｔ細胞サイトカインの検出可能な特異的結合を決定することによって検出される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合剤が、前記Ｔ細胞サイトカインに特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの抗体が、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの抗体が、固相に固定されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ライム病が、少なくとも１つの病原性ボレリア菌種による感染を含むものである、請求項６に記載の方法。
【請求項２６】
前記病原性ボレリア菌種が、ヒトに対する病原性をもつものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヒトに対して病原性をもつボレリア菌種が、ボレリア・ブルグドルフェリ、狭義のボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・アゼフェリ、ボレリア・ガリニ、ボレリア・バレイシアナ、ボレリア・スピルマニ、ボレリア・ビセッティ、ボレリア・ルシタニア及びボレリア・ババリアンシスから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ライム病の治療が、抗生物質を対象に投与することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗生物質が、テトラサイクリン；オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、もしくはミノサイクリン；ペニシリン；アモキシシリンもしくはペニシリン；セファロスポリン；セファクロール、セフブペラゾン、セフミノクス、セフタキシム、セフォテタン、セフメタゾール、セフォキシチン、セフロキシムアキセチル、セフロキシムアセチル、セフチンもしくはセフトリアキソン；マクロライド類；アジスロマイシン、クラリスロマイシンまたはエリスロマイシンから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生体試料が、全血、脳脊髄液、または滑液の少なくとも１つを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項３１】
前記生体試料が、（ａ）全血、（ｂ）全血の細胞画分、（ｃ）単離された末梢血白血球、または（ｄ）単離された末梢血単核細胞の少なくとも１つを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔ細胞免疫応答インジケーターが、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＩＦＮ−γが、Ｔ細胞によって放出される可溶性ＩＦＮ−γである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｔ細胞免疫応答インジケーターが、Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞サイトカインの発現のうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｔ細胞サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γから選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｔ細胞サイトカインの発現が、前記Ｔ細胞によって放出される可溶性Ｔ細胞サイトカインとして検出される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γから選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｔ細胞サイトカインが、結合剤と前記Ｔ細胞サイトカインの検出可能な特異的結合を決定することによって検出される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記結合剤が、前記Ｔ細胞サイトカインに特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの抗体が、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの抗体が、固相に固定されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の時点よりも遅く、かつ、ライム病の前記治療を前記対象に投与した後である、互いに異なる複数の第２の時点で、工程（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）を繰り返すことを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項４３】
複数の第２の時点には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の時点が含まれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
第１の核酸組成物および第２の核酸組成物から選択される組成物であって、
（Ｉ）第１の核酸組成物は、
（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの単離ＦｌａＢペプチド；
（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ＤｂｐＢペプチド；
（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ｐ６６ペプチド；および
（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つまたは２つの単離ＯｓｐＣペプチド；をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含み、
ここで、ＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６およびＯｓｐＣペプチドは、ライム病に関連するボレリア種に感染した対象から得られた全血と接触させると、Ｔ細胞による二次インビトロ免疫応答を誘発することができ；
（ＩＩ）第２の核酸組成物は、
（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、５つの単離ＦｌａＢペプチド；
（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ＤｂｐＢペプチド；
（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ｐ６６ペプチド；および
（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、２つの単離ＯｓｐＣペプチド；をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含み、
ここで、ＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６およびＯｓｐＣペプチドは、ライム病に関連するボレリア種に感染した対象から得られた全血と接触させると、Ｔ細胞による二次インビトロ免疫応答を誘発することができる、第１の核酸組成物および第２の核酸組成物から選択される組成物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の核酸組成物を含んでいる１つ以上の核酸ベクターを含む、ベクター組成物。
【請求項４６】
請求項４５に記載のベクター組成物を含んでいる、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
配列表に関する記述
この出願に関する配列表は、紙の写しの代わりにテキスト形式で提供され、参照することにより本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は７７００２５＿４６６ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは１２．３ＫＢで、２０１６年９月１４日に作成し、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出した。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、一般に、ライム病を診断し、ライム病治療の有効性を評価するための組成物および方法に関する。より具体的には、複数のボレリアポリペプチド抗原に由来し、ライム病の異なる段階で発現される複数のＴ細胞エピトープ含有ペプチドの組み合わせであって、ボレリア特異的Ｔ細胞応答性に関する高感度な二次インビトロ免疫応答アッセイで使用するためのＴ細胞エピトープ含有ペプチドの組み合わせを提供する。
【０００３】
関連技術の説明
ライム病は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、ボレリア・ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、および他のボレリア菌種を含むボレリア菌種の病原性スピロヘータによって引き起こされるダニ媒介性感染症である。感染性微生物はダニの唾液から咬傷に伝染し、臨床的に定義された病気の３つの段階のうちの最初の「早期限局（ｅａｒｌｙ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）」期は、典型的には、ダニ咬まれてから２週間以内に現れる。早期局在段階は、紅斑移行部位（ＥＭ）、すなわちダニの咬傷部位の紅斑性皮膚病変を伴うことが多いが、必ずしもそうではない。病気は、血液および／またはリンパ循環を介して伝染性のボレリア細菌が全身に広がり、さらなる皮膚病変、疲労、筋肉痛、関節痛、神経学的および心臓の症状のうちの１つ以上を伴うことがある、第２の「初期播種（ｅａｒｌｙ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ）」期に進行する。未治療の場合、この疾患は、関節炎、脳脊髄炎および／または末梢神経障害、ならびに慢性的なライム病を含む潜在的な他の症状を特徴とする「後期（ｌａｔｅ  ｓｔａｇｅ）」のライム病にさらに進行し得る。米国では毎年、約２５，０００〜３０，００例のライム病が報告されており、未報告の例も含めると、ＣＤＣは、その発生率この１０倍にも達すると推定している。この他に、ヨーロッパやアジアでも症例が報告されている（ライトら、２０１２、アメリカン・ファミリー・フィジシャン（Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）８５：１０８６；シャピロ、２０１４、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）３７０：１７２４）。
【０００４】
ボレリア菌種抗原性タンパク質の発現パターンの変化はライム病の進行を伴い、また、慢性ライム病の原因となる可能性のある免疫回避メカニズムの基礎となると考えられている（例えば、ドレクトラら、２０１３、プロスワン（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ）８（７）：ｅ６８７９９；シュミットら、２０１１、微生物学の新境地（Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）２：１４１；サロら、２０１１、米国感染症学会誌（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）２０４：６５；リアンら、２００４、米国感染症学会誌７２：５７５９；アベレル、２００７、ドイツ皮膚科学会誌（Ｊ．Ｄｔｓｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｇｅｓ．）５（５）：４０６）。
【０００５】
ライム病（ＬＤ）の効果的な治療は、ボレリア菌種による早期感染を正確に検出することにかかっている。いくつかの例では、病気がまだ早期限局期にある場合、特徴的な紅斑性移行部（ＥＭ）皮膚病変が存在することで、十分に正確な診断が可能となる（例えば、ナデルマンら、１９９６、アメリカン・ジャーナル・オブ・メディシン（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．）１００：５０２−５０８）。しかしながら、相当数の患者が、ＥＭ病変を発症しないか、あるいは発疹が検出されないままであるか、または誤認されている。このような例では、抗ボレリアＩｇＭおよび／またはＩｇＧ抗体応答を検出するための、従来より行われている血清検査が、病気を確認するために最も広く使用される（例えば、ダットワイラーら、２０１０、臨床感染症（Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ）５０：５２１−５２２；ジョンソンら、１９９６、米国感染症学会誌１７４：３４６）。
【０００６】
現在、標準的な治療コース（例えば、抗生物質の処方）の投与後に、ＬＤの治療が成功したか否かを正確に予測することができる臨床検査はない。ボレリア感染によって惹起された循環抗体は、感染を排除するための抗生物質治療が成功した後も、何年も持続する可能性がある。したがって、ボレリア特異的抗体試験の有用性は限定的である。例えば、ボレリア菌種スピロヘータは、複数の哺乳類組織に定着し、関節および／または筋肉痛または一般的な倦怠感など、多くの非特異的な臨床的異常を引き起こすことがある。これらの症状は、持続的なボリビア感染によるものではない類似の臨床症状と区別することが難しく、かなりの混乱と医療費の増加を招く可能性がある。従って、ＬＤの治療後に、病原性ボレリア菌種のスピロヘータが効果的に排除されたことを臨床的に確認することができることは極めて有用であろう。
【０００７】
国際公開第２０１３／１１６６６８号には、ボレリア菌種に応答して生成された抗体によって認識されるペプチド抗原が記載されている。しかし、抗ボレリア抗体は、通常、感染後数週間に検出可能なレベルでは産生されないため、ＬＤの早期症例の多くが見逃されている。前述したように、ライム病スピロヘータ感染に応答して産生される抗体のレベルは、ボレリアスピロヘータを排除する抗生物質治療などの治療が成功した後も、感染後数年間上昇したままであり得る。したがって、抗ボレリア抗体の応答を決定することは、病原性のボレリア菌種の診断試験としては、感度も信頼性も低く、ボレリア感染の治療後の予後試験としてはほとんど役に立たない。
【０００８】
ボレリア感染はまた、Ｔ細胞免疫応答を誘発し得る。グリックシュタインら（２００３、感染と免疫（Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．）７１：６０５１）およびダットワイラーら（１９８８、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン３１９：１４４１）は、ボレリア・ブルグドルフェリに暴露されたヒト対象が、病気の早期限局期におけるＥＭを伴う炎症性サイトカインの存在によって明らかな、激しく持続的なＴ細胞応答を生じることを示した。このＴ細胞応答は、検出可能なレベルで測定できる抗体応答に先行して起こった。例えば、ライム病スピロヘータに応答して活性化されたＴ細胞は、確かに、インターフェロンγを産生した（エケルフェルトら、１９９９、臨床および実験免疫学（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１１５：４９８；シカンドら、１９９９、臨床および診断研究免疫学（Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）６：４４５）。活性化されたＴ細胞は、２つの患者集団、すなわち（ｉ）ＬＤの症状が現れていないが、血中から抗ボレリア抗体が検出可能であった患者、および（ｉｉ）ボレリア感染の特徴的な臨床的徴候を示した患者（すなわち、ＬＤ症状）、において同程度の発現率を示した（エケルフェルトら、１９９９）。国際公開第２０１２／０３９６１４号パンフレットでは、固定され、簡単に分画されたボレリア細胞全体と一緒にインキュベートした後のボレリア感染個体から得られた末梢白血球によって誘発された、インビトロにおけるＴ細胞サイトカインの応答が記載されている。しかしながら国際公開第２０１２／０３９６１４号パンフレットには、ボレリア病原体がＴ細胞によって認識される可能性のあるボレリア感染の特定の段階（例えば、早期局所、早期播種、後期播種）を特定する開示はなく、そのような応答を誘発することができるボレリア抗原も、Ｔ細胞によって認識される任意のボレリア抗原性エピトープの構造も含まれていない。したがって、初期のＬＤにおけるＴ細胞免疫応答の有意性および特異性は分かっていない。特に、ＬＤの病因において、Ｔ細胞によって認識される特異的なボレリア菌種抗原が分かっていない場合、また、ボレリア特異的Ｔ細胞エピトープが知られていない場合に関して、未解明のままである。
【０００９】
ＬＤを早期にかつより高感度で検出することや、ＬＤの投与治療の治療効果をモニタリングする能力などを含む、ライム病の、より良い診断および予後評価の必要性が依然として残っていることが明白である。ここで開示する本発明の態様は、これらのニーズに対処し、他の関連する利点を提供するものである。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書中に開示される本発明の特定の態様によれば、第１の組成物および第２の組成物から選択されるライム病を診断または予後予測するための組成物が提供され、ここで：（Ｉ）第１の組成物は、（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの単離ＦｌａＢペプチド；（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ＤｂｐＢペプチド；（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ｐ６６ペプチド；および（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つまたは２つの単離ＯｓｐＣペプチドを含み、この組成物は、ライム病に関連するボレリア菌種に感染した対象から得られた全血と接触させた後に、Ｔ細胞による二次インビトロ免疫応答を誘発することができ；ならびに、
【００１１】
（ＩＩ）第２の組成物は、（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、５つの単離ＦｌａＢペプチド；（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ＤｂｐＢペプチド；（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ｐ６６ペプチド；および（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、２つの単離ＯｓｐＣペプチドを含む。
【００１２】
特定のさらなる態様では、この組成物は少なくとも、（ａ）各ペプチドを少なくとも約１ナノグラムずつ含むが、各ペプチドの量は約１００ナノグラムを超えず、（ｂ）各ペプチドを少なくとも約１００、２００、３００、または４００ナノグラムずつ含むが、各ペプチドの量は約５００ナノグラムを超えず、（ｃ）各ペプチドを少なくとも約５００、６００、７００、８００、または９００ナノグラムずつ含むが、各ペプチドの量は約１０００ナノグラムを超えず、（ｄ）各ペプチドを少なくとも約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９マイクログラムずつ含むが、各ペプチドの量は約２マイクログラムを超えず、または（ｅ）各ペプチドを少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８または９マイクログラムずつ含むが、各ペプチドの量は約１０マイクログラムを超えない、のうちのいずれか１つである。
【００１３】
本発明の別の態様では、対象のライム病を検出する方法、または対象におけるライム病の治療の有効性をモニタリングする方法が提供され、この方法は、（Ａ）第１のテストインキュベーション混合物を得るために、（ｉ）ライム病であることまたはライム病を有するリスクがあることが知られている対象から第１の時点で得られた第１の生体試料（ここでこの生体試料はＴ細胞と抗原提示細胞を含んでいる）と、（ｉｉ）ライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物、をインビトロで接触させること、（Ｂ）Ｔ細胞免疫応答インジケーターの生成を刺激するために前記ペプチド組成物中に存在するボレリアＴ細胞エピトープの前記Ｔ細胞による特異的認識に十分な条件および時間で第１のテストインキュベーション混合物をインキュベートすること；（Ｃ）第１のテストインキュベーション混合物のＴ細胞免疫応答インジケーターの第１のレベルを検出することを含み、ここで、対象におけるボレリア感染の存在は、（Ｃ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第１のレベルが、第１の生体試料にライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物を加えずにインキュベートした第１の対照インキュベーションから得られた第１の対照レベルよりも高いことで示され、かつ、ライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物は、（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの単離ＦｌａＢペプチド；（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ＤｂｐＢペプチド；（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ｐ６６ペプチド；および（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つまたは２つの単離ＯｓｐＣペプチドを含み、それによって対象におけるライム病を検出するか、または対象におけるライム病の治療の有効性をモニタリングする。
【００１４】
特定のさらなる態様では、第１の時点とは、ライム病治療の対象への投与前である。
【００１５】
特定の関連する態様では、ライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物は、（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、５つの単離ＦｌａＢペプチド；（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ＤｂｐＢペプチド；（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ｐ６６ペプチド；および（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、２つの単離ＯｓｐＣペプチド、を含む。
【００１６】
前述した方法のさらに特定の態様において、本方法は、（Ｄ）第２のテストインキュベーション混合物を得るために、（ｉ）第１の時点よりも遅く、かつ、ライム病の治療を対象に投与した後に対象から得られた第２の生体試料（ここでこの生体試料はＴ細胞と抗原提示細胞を含んでいる）と、（ｉｉ）ライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物、をインビトロで接触させること、（Ｅ）Ｔ細胞免疫応答インジケーターの生成を刺激するために前記ペプチド組成物中に存在するボレリアＴ細胞エピトープの前記Ｔ細胞による特異的認識に十分な条件および時間で第２のテストインキュベーション混合物をインキュベートすること；および（Ｆ）第２のテストインキュベーション混合物のＴ細胞免疫応答インジケーターの第２のレベルを検出することをさらに含み、ここで、対象におけるボレリア感染の存在は、（Ｆ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第２のレベルが、第２の生体試料にライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物を加えずにインキュベートした第２の対照インキュベーションから得られた第２の対照レベルよりも高いことで示され、かつ、ライム病治療の有効性は、（Ｆ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第２のレベルが、（ｃ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第１のレベルよりも低いことで示される。
【００１７】
なおさらなる特定の態様では、ライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物は、（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、５つの単離ＦｌａＢペプチド；（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ＤｂｐＢペプチド；（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ｐ６６ペプチド；および（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、２つの単離ＯｓｐＣペプチド、を含む。
【００１８】
前述した方法いずれかの特定の態様では、ライム病は、少なくとも１種の病原性ボレリア菌種による感染を含み、特定のさらなる態様では、病原性ボレリア菌種は、ヒトに対する病原性をもつ。なおさらなる特定の態様では、ヒトに対する病原性をもつボレリア菌種は、ボレリア・ブルグドルフェリ、狭義のボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・アゼフェリ、ボレリア・ガリニ、ボレリア・バレイシアナ、ボレリア・スピルマニ、ボレリア・ビセッティ、ボレリア・ルシタニアおよびボレリア・ババリエンシスから選択される。
【００１９】
前述した方法いずれかの特定の態様では、ライム病の治療は、抗生物質を対象に投与することを含む。特定のさらなる態様では、抗生物質は、テトラサイクリン；オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、もしくはミノサイクリン；ペニシリン；アモキシシリンもしくはペニシリン；セファロスポリン；セファクロール、セフブペラゾン、セフミノクス、セフタキシム、セフォテタン、セフメタゾール、セフォキシチン、セフロキシムアキセチル、セフロキシムアセチル、セフチンもしくはセフトリアキソン；マクロライド類；アジスロマイシン、クラリスロマイシンまたはエリスロマイシンから選択される。
【００２０】
前述した方法いずれかの特定の態様では、生体試料は、全血、脳脊髄液、または滑液の少なくとも１つを含む。前述した方法いずれかの特定の態様では、生体試料は、（ａ）全血、（ｂ）全血の細胞画分、（ｃ）単離された末梢血白血球、または（ｄ）単離された末梢血単核細胞の少なくとも１つを含む。
【００２１】
前述した方法いずれかの特定の態様においてＴ細胞免疫応答インジケーターは、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）である。特定のさらなる態様においてＩＦＮ−γは、Ｔ細胞によって放出される可溶性ＩＦＮ−γである。前述した方法いずれかの特定の態様においてＴ細胞免疫応答インジケーターは、Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞サイトカインの発現のうちの少なくとも１つを含む。特定のさらなる態様では、Ｔ細胞サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γから選択される。特定の態様では、Ｔ細胞サイトカインの発現は、Ｔ細胞によって放出される可溶性Ｔ細胞サイトカインとして検出される。特定のさらなる態様では、Ｔ細胞サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γから選択される。特定の態様では、Ｔ細胞サイトカインは、結合剤とＴ細胞サイトカインの検出可能な特異的結合を決定することによって検出される。特定のさらなる態様では、結合剤は、Ｔ細胞サイトカインに特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む。特定のさらなる態様において、少なくとも１つの抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体から選択される。特定の態様において、少なくとも１つの抗体は、固相に固定される。
【００２２】
前述した方法いずれかの特定の態様では、ライム病は、少なくとも１つの病原性ボレリア菌種による感染を含む。特定の態様では、病原性ボレリア菌種はヒトに対する病原性をもつ。特定のさらなる態様において、ヒトに対して病原性をもつボレリア菌種は、ボレリア・ブルグドルフェリ、狭義のボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・アゼフェリ、ボレリア・ガリニ、ボレリア・バレイシアナ、ボレリア・スピルマニ、ボレリア・ビセッティ、ボレリア・ルシタニア及びボレリア・ババリアンシスから選択される。
【００２３】
前述した方法（例えば、第２の生体試料に関する工程（Ｄ）〜（Ｆ）を含む方法）の特定のさらなる態様では、ライム病の治療は、抗生物質を対象に投与することを含む。特定のさらなる態様では、抗生物質は、テトラサイクリン；オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、もしくはミノサイクリン；ペニシリン；アモキシシリンもしくはペニシリン；セファロスポリン；セファクロール、セフブペラゾン、セフミノクス、セフタキシム、セフォテタン、セフメタゾール、セフォキシチン、セフロキシムアキセチル、セフロキシムアセチル、セフチンもしくはセフトリアキソン；マクロライド類；アジスロマイシン、クラリスロマイシンまたはエリスロマイシンから選択される。特定の態様では、生体試料は、全血、脳脊髄液、または滑液の少なくとも１つを含む。特定の態様では、生体試料は、（ａ）全血、（ｂ）全血の細胞画分、（ｃ）単離された末梢血白血球、または（ｄ）単離された末梢血単核細胞の少なくとも１つを含む。特定の態様では、Ｔ細胞免疫応答インジケーターは、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）であり、特定のさらなる態様においてでは、ＩＦＮ−γは、Ｔ細胞によって放出される可溶性ＩＦＮ−γである。特定の態様では、Ｔ細胞免疫応答インジケーターは、Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞サイトカインの発現のうちの少なくとも１つを含み、特定のさらなる態様では、Ｔ細胞サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γから選択される。特定の態様では、Ｔ細胞サイトカインの発現は、Ｔ細胞によって放出される可溶性Ｔ細胞サイトカインとして検出される。特定の態様では、Ｔ細胞サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γから選択される。特定のさらなる態様では、Ｔ細胞サイトカインは、結合剤とＴ細胞サイトカインの検出可能な特異的結合を決定することによって検出される。特定のさらなる態様では、結合剤は、Ｔ細胞サイトカインに特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む。特定のさらなる態様において、少なくとも１つの抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体から選択される。特定のさらなる態様において、少なくとも１つの抗体は、固相に固定される。特定のさらなる態様では、この方法は、第１の時点よりも遅く、かつ、ライム病の治療を対象に投与した後である、互いに異なる複数の第２の時点で、工程（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）を繰り返すことを含む。特定のさらなる態様において、複数の第２の時点には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の時点が含まれる。
【００２４】
別の態様に目を向けると、第１の核酸組成物および第２の核酸組成物から選択される組成物が提供され、（Ｉ）第１の核酸組成物は、（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの単離ＦｌａＢペプチド；（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ＤｂｐＢペプチド；（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ｐ６６ペプチド；および（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つまたは２つの単離ＯｓｐＣペプチド；をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含み、ここで、ＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６およびＯｓｐＣペプチドは、ライム病に関連するボレリア種に感染した対象から得られた全血と接触させると、Ｔ細胞による二次インビトロ免疫応答を誘発することができ；および、
【００２５】
（ＩＩ）第２の核酸組成物は、（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、５つの単離ＦｌａＢペプチド；（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ＤｂｐＢペプチド；（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ｐ６６ペプチド；および（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、２つの単離ＯｓｐＣペプチド；をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含み、ここで、ＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６およびＯｓｐＣペプチドは、ライム病に関連するボレリア種に感染した対象から得られた全血と接触させると、Ｔ細胞による二次インビトロ免疫応答を誘発することができる。別の態様では、上記の第１の核酸組成物および／または上記の第２の核酸組成物を含む１つ以上の核酸ベクターを含むベクター組成物が提供される。別の態様では、上記のベクター組成物を含む宿主細胞が提供される。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の局面および態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって明らかになるであろう。本明細書で参照されている、および／または出願データシートに記載されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献の全ては、あたかもそれぞれが個別に参照により組み込まれているかのように、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の局面および態様は、本発明のなおさらなる態様を提供するために、様々な特許、出願および刊行物の概念を使用するよう、必要に応じて変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、治療の前および治療後約６０日目に採取した血液試料中のペプチドプール（配列番号１〜３３）によって二次インビトロＴ細胞が活性化された後のＩＦＮ−γの検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ここで開示する本発明の態様は、驚くほど好感度なライム病（ＬＤ）診断および予後予測を可能にする、定義されたペプチドの天然に存在しない組み合わせを含む人工組成物に関する。したがって、本明細書に記載されるように、現在開示されている病原性ボレリア菌種に由来する、フラジェリン（ＦｌａＢ）［配列番号１−５］、デコリン結合タンパク質（ＤｂｐＢ）［配列番号６〜１８］、共通抗原（ｐ６６）［配列番号１９〜３１］、および細胞表層タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）［配列番号３２〜３３］のペプチド領域、またはその変異体ペプチドそれぞれのうちの１つ以上のペプチドを含むペプチドの組み合わせを含む組成物を提供する。本明細書において初めて開示されることであるが、各ペプチドは、ボレリア菌種特異的Ｔ細胞エピトープを含む。また、対象におけるライム病を診断する方法、および対照の治療後に、病原性ボレリア菌種の排除をモニタリングするための方法など、関連する方法も提供する。
【００２９】
ＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、およびＯｓｐＣが、ライム病の進行において異なる段階（通常、早期限局期、早期播種期階および後期播種期と呼ばれる）で発現することが知られていることを考慮すると、本記載のペプチドの組み合わせは自然に生じることはなく、そのため、感染した宿主の免疫系がそのような組み合わせに自然に曝されることはない。例えば、ＯｓｐＣは、感染初期の早期限局期にボレリア菌種細菌によって発現され、ＤｂｐＢおよびｐ６６は、ボレリア感染の播種後に発現され、ＦｌａＢは、後期播種期および初期限局期に発現される。本開示のペプチド混合物はまた、抗原提示細胞によってインビボで提示され、ボレリア菌種によって天然に加工される抗原断片とは異なる人工ペプチドを含有してもよい。さらに、現在開示されているＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、およびＯｓｐＣペプチドはすべて、天然においては、ある１個の病原性ボレリア菌種にだけ見出されるものではなく、したがって１人のライム病患者の免疫系だけが直面するものとは考えられない。したがって、本発明の態様は、予期せずに、ライム病を有するかまたは有すると疑われる広範囲の対象におけるライム病の早期検出を可能にする。またこの検出は、対象由来のＴ細胞が本組成物に対して引き起こす二次インビトロ応答を検出することによって達成することができる。
【００３０】
以下に記載するように、例えば、ＬＤ対象由来のＴ細胞を含む全試料は、たとえある種の試料のＴ細胞がＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６およびＯｓｐＣの４つすべてのペプチドに応答しない場合でも、本明細書に記載のＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、およびＯｓｐＣボレリアＴ細胞エピトープ含有ポリペプチドのうちの少なくとも１つ（表１および２）から選択される少なくとも１つのペプチドに反応した。さらに、ＬＤ対象由来のＴ細胞を含む全試料は、ＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６およびＯｓｐＣの４種すべてから選択される少なくとも１つのペプチドを含むペプチド混合物に応答した。したがって、非限定的な理論によれば、本態様は、対象が感染している可能性のある病原菌が特定のボレリア菌種であるかに関わらず、また、Ｔ細胞が得られたときの疾患進行の段階（早期限局、早期播種、または後期播種）にかかわらず、試料中のボレリア菌種特異的Ｔ細胞を迅速かつ高感度に検出することができる。本態様はさらに、これまでにはなかった、ライム病の全ての期に存在する代表的なエピトープを含むボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドの組み合わせを提供することによって、その対象がＬＤに罹っているかどうかが分からない例においてさえも、試料中のボレリア特異的Ｔ細胞を検出することを可能にする。本開示の態様は、病原性をもつ種々のボレリア菌種のうちのいずれかによって生じる可能性のあるライム病の検出に有用であり、種々のボレリア菌種としては、ヒトに対しても病原性を有する、ボレリア・ブルグドルフェリ、狭義のボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・アゼフェリ、ボレリア・ガリニ、ボレリア・バレイシアナ、ボレリア・スピルマニ、ボレリア・ビセッティ、ボレリア・ルシタニアおよびボレリア・ババリエンシスなどが挙げられる（ライトら、２０１２、アメリカン・ファミリー・フィジシャン８５：１０８６；シャピロ、２０１４、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン３７０：１７２４；シュッツェルら、２０１２、微生物学会誌（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１９４（２）：５４５を参照のこと）。
【００３１】
本明細書に記載されているように、ＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、およびＯｓｐＣ（例えば、表２に記載の配列番号１〜３３）それぞれに由来する、開示のボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドのうちの少なくとも１つの組み合わせを含有している本発明の組成物は、個々の構成ペプチドいずれかの特徴、または、付随して発現されるペプチドの任意のサブセット（本明細書で提供するＦｌａＢ［配列番号１〜５］、ＤｂｐＢ［配列番号６〜１８］、ｐ６６［配列番号６〜１８］およびＯｓｐＣ［配列番号３２〜３３］ペプチドの少なくとも１つを含まない）の特徴とは大きく異なる特徴を有する。本発明の組成物は驚くことに、個々の構成ペプチド（またはＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、もしくはＯｓｐＣペプチの少なくとも１つを欠く不完全なサブセット）が誘発する応答よりも、ＬＤ罹患対象（早期ＬＤを含む）に由来するＴ細胞によるより強力な二次インビトロ免疫応答を誘発し、これにより、ＬＤの早期検出を含む検出のための前例のない感度を提供する。したがって、単に本明細書に記載の個々の構成ペプチドのいずれか（または不随して発現されるボレリア菌種ポリペプチドに由来するわずかなペプチドだけを含むがＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、もしくはＯｓｐＣペプチの少なくとも１つを欠く、ペプチドの不完全なセット）に対する二次インビトロＴ細胞応答をアッセイするだけで、ＬＤの早期検出が可能となり、本態様は、ボリビア菌種の天然に生じるサブコンビネーションのいずれかを用いたより有用な方法を提供する。
【００３２】
したがって本開示の組成物は、天然に存在しない組み合わせでボレリア特異的Ｔ細胞エピトープを含む、ボレリア菌種のＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、およびＯｓｐＣペプチドまたはその変異体を含む組成物であり、特定の態様において本開示の組成物は、本明細書に記載の利点を達成するために（およびさらに非限定的な理論により）、ボレリア菌種のＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、およびＯｓｐＣペプチドまたはその変異体を、天然には存在しない量比で含む。
【００３３】
したがって、本明細書では、ライム病スピロヘータタンパク質それぞれに含まれる特定の領域に曝されたことで活性化されたＴ細胞によって産生された免疫応答インジケーター（例えば、インターフェロン−γ）を検出する試験を提供することにより、ＬＤを有するかまたは有すると疑われる対象におけるライム病（ＬＤ）の存在を確認するための、これまでに知られているいかなる方法とも異なる方法を開示する。本明細書では、ボレリア菌種のタンパク質抗原であるＦｌａＢ（ジェンバンク受入番号ＡＣＩ４９６７９．１）、ＤｂｐＢ（ジェンバンク受入番号ＡＡＣ７００２９．１）、ｐ６６（ジェンバンク受入番号ＡＡＣ６６９４９．１）、およびＯｓｐＣ（ジェンバンク受入番号ＡＢＱ４２９８３．１）それぞれに含まれる特定のＴ細胞反応性エピトープについて説明し、また、非限定的な理論によれば、特定のＴ細胞反応性エピトープは、Ｔ細胞の直線状抗原性ペプチドエピトープによる認識の結果、本発明の組成物および方法において使用できると考えられる。
【００３４】
この戦略に基づくＬＤ試験は、少なくとも２つの重要な利点をもたらすと考えられている。第１に、活性化されたＴ細胞は抗体産生性Ｂ細胞よりも急速に増殖するので、この試験は他の抗体検出試験と比較して、病原性ボレリア感染の初期においても非常に高感度な試験となり得る。
【００３５】
第２に、ライム病スピロヘータに応答して産生される抗体のレベルは、通常、治療が成功したか否かに関わらず、数ヶ月から数年の間上昇したままであるが、Ｔ細胞の調節は通常、誘発性刺激（例えば感染病原体）を除去した後のＴ細胞の活性化レベルの緩和として顕れる。したがって、本開示の予後予測法は、ＬＤの一連の治療経過によって病原性ボレリア感染が軽減されたか（例えば、適切な対照と比較して統計的に有意な様式で減少した）または除去されたかに関する優れた評価を提供し得る。このような利点は、Ｔ細胞が通常、ボレリア感染の解消後は短期間のみ活性化されたままであるために生じると考えられる。そのため、本明細書に記載の組成物との二次的なインビトロ負荷に応答して、ＬＤ治療後のＬＤ患者から得られた試料中に存在するＴ細胞によって、高まったＴ細胞免疫応答インジケーター（例えば、活性化Ｔ細胞によるインターフェロンγの放出）のレベルを検出できないこともまた、治療が成功したことを正確に予測するものとなり得る。
【００３６】
本明細書に記載されるように、ペプチド混合物に含まれる、臨床的に重要な各ボレリア菌種（例えば、ボレリア・ガリニ、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・ブルグドルフェリＢ３１）のタンパク質に基づく特定のペプチドを、二次インビトロ免疫応答において、それらがＬＤ患者から得られた活性化Ｔ細胞によってインターフェロン−γ産生を誘導する能力（Ｔ細胞免疫応答インジケーターの例）に関して評価した。コンセプトの証明として、ボレリア菌種特異的Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドからなるこのようなペプチド混合物が、ライム病特異的活性型Ｔ細胞によってインターフェロン−γを誘導する能力を、ボレリア・ブルグドルフェリ感染初期の患者から得た血液を使って特に評価した。また、抗生物質治療の直前にＬＤ患者から採取したＴ細胞によって産生されたインターフェロン−γのレベルを、抗生物質治療が効果的だったＬＤ患者の治療後およそ６０日目に採取したＴ細胞によって産生されたインターフェロン−γのレベルと比較した。
【００３７】
ボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド。
特定の態様において本開示は、第１の組成物および第２の組成物から選択されるライム病を診断または予後予測するための組成物が提供され、ここで：
（Ｉ）第１の組成物は、（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの単離ＦｌａＢペプチド；（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ＤｂｐＢペプチド；（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ｐ６６ペプチド；および（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つまたは２つの単離ＯｓｐＣペプチドを含み、この組成物は、ライム病に関連するボレリア菌種に感染した対象から得られた全血と接触させた後に、Ｔ細胞による二次インビトロ免疫応答を誘発することができ；ならびに、
【００３８】
（ＩＩ）第２の組成物は、（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、５つの単離ＦｌａＢペプチド；（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ＤｂｐＢペプチド；（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１３の単離ｐ６６ペプチド；および（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、２つの単離ＯｓｐＣペプチドを含む。
【００３９】
本明細書で想定される特定の態様において使用されるボレリアＴ細胞エピトープを含むボレリア菌種のＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、またはＯｓｐＣペプチドは、ＦｌａＢペプチドに関しては、配列番号１〜５に記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つ、ＤｂｐＢペプチドに関しては配列番号６〜１８のいずれか１つの、ｐ６６ペプチドに関しては配列番号１９〜３１のいずれか１つ、およびＯｓｐＣペプチドに関しては配列番号３２〜３３のいずれか１つを含む場合があり、特定の他の態様は、配列番号１〜３３のペプチドのうちの少なくとも１つと、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同で、かつ、少なくとも１種の病原性ボレリア菌種応答性のＴ細胞によって特異的に認識されるアミノ酸配列を有するボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド変異体を含む場合があり、ここで、少なくとも１種の病原性ボレリア菌種はヒトに対する病原性を有するものであり、このようなボレリア菌種には、これらには限定されないが、ボレリア・ブルグドルフェリ、狭義のボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・アゼフェリ、ボレリア・ガリニ、ボレリア・バレイシアナ、ボレリア・スピルマニ、ボレリア・ビセッティ、ボレリア・ルシタニアおよびボレリア・ババリエンシスが含まれ得る。
【００４０】
配列番号１〜３３のボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドを表１に示す。
【表１】
2018536429.tif 000003
2018536429.tif 000004
【００４１】
配列番号１〜３３に示したペプチドいずれかのようなボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドのボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド変異体は、配列番号１〜３３に示される天然の（例えば、野生型、または優性または天然に存在する対立遺伝子型の）ボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド配列に、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加、欠失および／または置換を含み得る。変異体は、天然のボレリア菌種のＴ細胞エピトープ含有ポリペプチド配列領域中の対応する部分、例えば、本明細書の表２で、ボレリアポリペプチド抗原であるボレリア・ブルグドルフェリＦｌａＢ（ジェンバンク受入番号ＡＣＩ４９６７９．１）、ボレリア・ブルグドルフェリＤｂｐＢ（ジェンバンク受入番号ＡＡＣ７００２９．１）、ボレリア・ブルグドルフェリｐ６６（ジェンバンク受入番号ＡＡＣ６６９４９．１）、およびボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＣ（ジェンバンク受入番号ＡＢＱ４２９８３．１）に由来するＴ細胞エピトープを含むことを最初に示した領域のアミノ酸配列と、好ましくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示す。パーセント同一性は、ペプチド変異体の配列を完全長ポリペプチドの対応する部分と比較することによって容易に決定することができる。対応する部分は、確立された方法に従って、例えば、配列同一性つまり配列相同性を示す配列領域を整列させることによって、容易に同定することができる。配列に挿入または欠失もしくは保存的置換、または短いミスマッチ領域などがある場合は、必要に応じて、短い配列ギャップが生じる可能性がある。配列比較のための技術には、ＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム（アルチュル、分子生物学会誌（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２１９：５５５−５６５、１９９１；ヘニコフおよびヘニコフ、米国科学アカデミー紀要、８９：１０９１５−１０９１９、１９９２）など、当業者に周知のコンピューターアルゴリズムがあり、これはＮＣＢＩウェブサイト（インターネット上でのＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴを参照のこと）で利用可能である。デフォルトまたはカスタムパラメータを使用できる。
【００４２】
さらに、当該技術分野では、当業者が特定のポリペプチドの機能的変異体を確認するために、タンパク質またはペプチドの三次元構造を予測することを可能にするコンピューターアルゴリズムも利用可能である。例えば、３次元構造の全てまたは一部が、１つ以上の修飾、置換、付加、欠失および／または挿入によって実質的に改変されていない変異体を同定することができる。（例えば、シーメイヤーら、２０１４バイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ．）３０：３１２８；ラーマンら、２０１０サイエンスエクスプレス（ＳｃｉｅｎｃｅＥｘｐｒｅｓｓ）２０１０年２月４号１０．１１２６／サイエンス．１１８３６４９；グリベンコら、２００９米国科学アカデミー紀要１０６：２６０１；ブラッドレイら、サイエンス３０９：１８６８−１８７１（２００５）；シュエラー−ファーマンら、サイエンス３１０：６３８（２００５）；ディエツら、米国科学アカデミー紀要１０３：１２４４（２００６）；ドッドソンら、ネイチャー４５０：１７６（２００７）；Ｑｉａｎら、ネイチャー４５０：２５９（２００７）；ベイカー，２０１４生化学学会活動報告（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．）４２：２２５；コレイアら、２０１４ネイチャー５０７：２０１；キングら、２０１４米国科学アカデミー紀要１１１：８５７７；ロシュら、２０１２プロスワン７（５）：ｅ３８２１９；チャンら、２０１３酵素学における手法（Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）５２３：２１；クーリーら、２０１４生命工学の最新知見（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）３２：９９；オメアラら、２０１５化学理論と計算学雑誌（Ｊ．Ｃｈｅｍ．ＴｈｅｏｒｙＣｏｍｐｕｔ．）１１：６０９；パクら、２０１５ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）２３：１１２３；ベイルら、２０１５タンパク質の科学（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．）ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．２７４８電子出版ＰＭＩＤ２６１７４１６３；パクら、２０１５タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏｔ．２４８６２電子出版ＰＭＩＤ２６２０５４２１；リンら、２０１５米国科学アカデミー紀要ｐｉｉ：２０１５０９５０８電子出版ＰＭＩＤ２６３９６２５５を参照のこと）。このようにして当業者は、特定のボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド変異体またはその機能的断片が、少なくとも１種の病原性ボレリア種種反応性のＴ細胞によって特異的に認識され得るのに十分なエピトープ構造を保持するかどうかを容易に決定することができる。
【００４３】
ボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４つの連続したアミノ酸のペプチドであってよく、特定の態様では、通常、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５または５０以下のアミノ酸長を有する。特定の好ましい態様では、ボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドの長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続したアミノ酸となる場合がある。
【００４４】
Ｔ細胞エピトープとは、通常は、エピトープをＴ細胞レセプターに提示する適切な主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子またはクラスＩＩ分子に関する状況で、抗原のＴ細胞受容体（「Ｔ細胞レセプター」）によって特異的に認識され得る抗原の構造領域を指すと理解される。約８〜１３アミノ酸長のＴ細胞エピトープ含有ペプチドは、典型的には、ＭＨＣクラスＩ分子によってＣＤ８  Ｔ細胞受容体に提示され；約１５〜２５アミノ酸長さのＴ細胞エピトープ含有ペプチドは、典型的には、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってＣＤ４  Ｔ細胞受容体に提示される。Ｔ細胞レセプターの特異性は絶対的ではない代りに無差別的であるとみなされる。すなわち所与のＴ細胞レセプターは、特定のＴ細胞エピトープの構造と、密接に関連した一定範囲のエピトープ構造を特異的に認識することができる。Ｔ細胞によって適切に提示されたＴ細胞エピトープの特異的認識は、本明細書に記載されるようなＴ細胞免疫応答インジケーター（例えば、ＩＦＮ−γの放出などの、Ｔ細胞によるサイトカイン放出）の刺激を生じることによって検出可能になる。したがって、ボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドとは、インビボでＴ細胞が予備刺激されているボレリア菌種の抗原とは同一でない場合も含めて、二次インビトロ免疫応答において、ボレリア菌種抗原を認識するように予備刺激された（例えば、活性化された）Ｔ細胞を刺激することができるペプチド抗原を指し得る。
【００４５】
本明細書で提供されるボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドおよびその変異体である機能的断片の設計、産生および試験のための方法論は、当該技術分野で知られている既存の方法を少し改変することで、例えば、文献において詳細に説明されているウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術を利用することで、全て入手することができる。例えば、サンブルックら、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験の手引き（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）第二版；マニアティスら、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験の手引き（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（１９８２）；ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実践的なアプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．グローバー編）；オリゴヌクレオチドの合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｎ．ガイト編、１９８４）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（Ｂ．ヘイムズおよびＳ．ヒギンズ編１９８５）；転写と翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（Ｂ．ヘイムズおよびＳ．ヒギンズ編、１９８４）；動物細胞の培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）（Ｒ．フレシュニー編、１９８６）；パーバル、分子クローニングの実践的ガイド（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８４）を参照のこと。
【００４６】
「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本明細書においては互換的に使用され、任意の特定の長さに限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、ホルミル化、およびシグナル配列の付加または欠失などの修飾を除外しない。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸鎖を意味し、ここで、各鎖はペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、非共有結合および／または共有結合した複数の鎖を含む場合があり；天然に存在する、具体的には非組換え細胞によって、または遺伝的に改変された細胞もしくは組換え細胞によって産生される天然のタンパク質の配列を有し；天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然の配列に対して１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換を有する分子を含む。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、１本のアミノ酸鎖（「モノマー」と呼ばれる）または複数のアミノ酸鎖（「マルチマー」と呼ばれる）を含み得る。「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」と言う用語は、特に、本開示のペプチド、または本明細書に記載のペプチドに対して１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換を有する配列を包含する。
【００４７】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、その物質が元の環境（例えば、天然に存在する場合には自然環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然に存在するポリペプチドまたは核酸は単離されていないが、天然系の共存する物質の一部または全部から分離された同じポリペプチドまたは核酸は、単離されていると言える。そのような核酸はベクターの一部であってもよく、および／またはそのような核酸またはポリペプチドは、組成物（例えば、細胞溶解物）の一部であってもよく、さらに、そのようなベクターまたは組成物はその核酸またはポリペプチドの天然の環境の一部ではなく単離されていてもよい。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。遺伝子は、コード領域、コード領域の前後の「リーダー（ｌｅａｄｅｒ）およびトレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）」領域、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００４８】
本明細書でいう「単離タンパク質（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」、「単離ポリペプチド（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」および「単離ペプチド（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、対象のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドが、（１）天然で通常見られる、少なくともいくつかの他のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを含まないこと；（２）同一源由来の（例えば同種由来の）他のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを本質的に含まないこと；（３）異なる種由来の細胞によって発現されること；（４）天然では付随しているポリヌクレオチド、脂質、糖質またはその他の物質の少なくとも５０％から分離されていること；（５）天然では結合している可能性のある単離されたタンパク質、単離されたペプチドもしくは単離されたポリペプチドの一部と、（共有相互作用または非共有相互作用で）結合していないこと；（６）天然では結合していないポリペプチドと（共有相互作用または非共有相互作用で）操作可能に結合していること；または（７）天然には存在しないこと、を意味する。そのような単離されたタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡによってコードされ得るか、または人工ペプチドおよびタンパク質合成に関する多くのよく知られている化学のいずれか、またはそれらの任意の組合せによる合成起源であり得る。特定の態様において、単離されたタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、その使用（治療、診断、予防、研究またはその他）を妨害するその天然の環境で見出されるタンパク質またはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
【００４９】
「ペプチド断片」または「ポリペプチド断片」は、天然由来のまたは組換え的に生産されたポリペプチドに、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失または置換を有する、単量体または多量体であり得るペプチドまたはポリペプチドを指す。本明細書中で使用する場合、「連続する（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）アミノ酸」は、開示されるアミノ酸配列の中断されていない直線部分に対応する、共有結合で繋がったアミノ酸を指す。特定の態様では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約１００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含む可能性がある。当然のことながら、特定の態様では、断片は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００アミノ酸長のアミノ酸配列を有する。
【００５０】
特定の好ましい態様では、『アミノ酸およびペプチドの合成（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）』（ジョーンズ、Ｊ．、２００２オックスフォード大学出版、米国、ニューヨーク）、ラメーカーズら（２０１４化学学会誌レビュー（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．）４３：２７４３）、バーゼルら（２０１３ケムバイオケム（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．）１４：１０３２）、チャンドルデュら（２０１３モレキュールズ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）１８：４３７３）、および／またはメイドら（２００４有機化学に関するベイルスタイン・ジャーナル（ＢｅｉｌｓｔｅｉｎＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）１０：１１９７）に記載されているようないくつもの確立された方法論のいずれかに従って、本明細書に記載のペプチド（例えば、ボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド）が完全に人工的に化学合成されたものであることを想定する。例えば、メリフィールド法または他の固相ペプチド合成技術をベースとし、それらにさらに改良を加えた手動のまたは好ましくは自動の固相ペプチド合成技術（例えば、メリフィールド、１９６３米国化学学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）８５：２１４９；ミッチェルら、１９７８有機化学学会誌（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）４３：２４８５；アルベリシオ、Ｆ．（２０００）．固相合成（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）：実践ガイド（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ）（第一版）．ボカラトン：ＣＲＣ出版；ニルソンら、２００５生物物理・生体分子構造学年会誌（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．）３４；シュノルツァーら、臨床薬理・治療学雑誌（Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＲｅｓ．Ｔｈｅｒａｐ．）１３（１−２）：３１；リーら２０１３モレキュールズ１８：９７９７）が、ペプチド合成技術において慣習的に行われており、本明細書に記載のペプチドを化学的に合成するために使用され得る。
【００５１】
ポリペプチドまたはペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（またはリーダー）配列を含む場合があり、これはタンパク質の翻訳と同時にまたは翻訳後に、タンパク質の移行を促す。ポリペプチドまたはペプチドは、ポリペプチドの合成、精製または同定（例えばポリ−Ｈｉｓ）を容易にするため、またはポリペプチドまたはペプチドの固相支持体への結合を促進するためにリンカーまたは他の配列にインフレームで融合している場合もある。融合ドメインポリペプチドは、Ｎ−末端および／またはＣ−末端でポリペプチドまたはペプチドに連結され得、非限定的な例として、当業者によく知られている、Ｉｇ定常領域配列もしくはその一部などの免疫グロブリン由来配列；ヒスタグ（例えば、ヘキサヒスチジンまたは他のポリヒスチジン）、ＦＬＡＧ（登録商標）もしくはｍｙｃもしくは他のペプチド親和性タグなどの親和性タグ；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくはその変異体（例えば、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、他のエクオリンもしくはその誘導体など）または他の検出可能なポリペプチド融合ドメイン、その酵素もしくは部分（例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））または他の既知の酵素検出および／またはレポーター融合ドメインなどの検出可能なポリペプチド部分；が挙げられる。
【００５２】
ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の組換え発現のためのシステムは当技術分野で知られており、特定の態様では、本明細書に記載のペプチドを産生するために使用され得る。例えば、大腸菌組換えタンパク質発現系などの特定の細菌発現系は、Ｎ末端ホルミル化メチオニンを有するポリペプチド産物を生じる。従っていくつかの状況では、組換え産生されたペプチドは、Ｎ−末端メチオニン残基（これは、未修飾メチオニンまたはホルミル−メチオニンまたは別のメチオニン類似体、変異体、模倣体または誘導体であってもよい）、場合により、所望のペプチド配列（例えば、ボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド）の直前にあって開始メチオニンとも呼ばれる、を含む。したがって、本明細書に記載のボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドのうちの１つまたは複数が、Ｎ末端メチオニン（例えば、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンとして）を含有する形で生成され、そして当技術分野で受け入れられている技術によって、Ｎ末端メチオニンを切断して新生ポリペプチド産物からそれを除去することができる酵素であるメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）も発現している宿主細胞中で組換え的に発現させることができる。例えば、ナタラジャンら、２０１１プロスワン６（５）：ｅ２０１７６；シェンら、１９９３米国科学アカデミー紀要９０：８１０８；シェンら、１９９７タンパク質工学（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．）１０：１０８５を参照のこと。あるいは、ＭＡＰ酵素自体を組換え的に産生するか（例えばツナサワら、１９９７生物科学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１２２：８４３；ブラッドショーら、１９９８生化学における最新知見（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈ．Ｓｃｉ．）２３：２６３；ベン−バサーら、１９８７微生物学雑誌（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１６９：７５１）、または購入するか（シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ、例えば、カタログ番号Ｍ６４３５）して、合成後の本ペプチドからＮ末端メチオニンを除去するために使用してもよい。
【００５３】
特定の好ましい態様によれば、ボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドは、配列番号１〜３３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含んでいる少なくとも５個以上で、かつ、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７または６個を超えないポリペプチドを含むかもしくはそれらと構造的特徴が近い配列同一性を共有するか、または構造特徴を共有しているペプチド、ポリペプチドまたはペプチド模倣物を含む場合があり、ここで、ボレリアＴ細胞エピトープを含むペプチドは、少なくとも１種の病原性ボレリア菌種、好ましくはヒトに対する病原性を有するボレリア種（このようなボレリア菌種には、これらには限定されないが、ボレリア・ブルグドルフェリ、狭義のボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・アゼフェリ、ボレリア・ガリニ、ボレリア・バレイシアナ、ボレリア・スピルマニ、ボレリア・ビセッティ、ボレリア・ルシタニアおよびボレリア・ババリエンシスが含まれ得る）と反応するＴ細胞によって特異的に認識され得る。このようなＴ細胞反応性を決定するためのアッセイ方法は、本明細書に記載されており、本明細書に初めて開示されるボレリアＴ細胞エピトープ含有タンパク質およびペプチドの同定を除けば、一般に当該分野においても知られている。
【００５４】
当該分野で一般的に言及されているように、そして本明細書中で使用する場合、配列同一性と配列相同性は同じ意味で用いられる場合があり、一般に、候補配列と参照配列を整列させ、必要に応じて、パーセンテージで表す配列同一性を最大にするためにギャップを導入した後の、場合によっては保存的置換を配列同一性の一部として考慮しなかったときの、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸のそれぞれと同一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを指す。特定の態様では、本明細書に開示されているようなペプチドの変異体、例えば、ボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチド（例えば配列番号１〜３３のいずれか１つのペプチド）は、配列番号１〜３３のいずれか１つのペプチド配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、もしくは９４％、または少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸残基（またはそのようなペプチドをコードしているポリヌクレオチド中のヌクレオチド）を共有している。そのような配列同一性は、前述したもののようなよく知られている配列分析アルゴリズムであって、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、Ｂｅｓｔｆｉｔ、ＢＬＡＳＴなどのウィスコンシン大学コンピューター遺伝学グループ（マジソン、ウィスコンシン）から入手可能なアルゴリズムを使って決定することができる。
【００５５】
「天然のまたは非天然のアミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質（例えば、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ））を生合成するための基本単位となる、天然に生じる一般的なアミノ酸のいずれをも含み、また、天然に生じるかもしくは合成されたものであるかに関わらず、修飾された、誘導体化された、鏡像異性的な、稀少なおよび／または一般的でないアミノ酸、例えば、例えば、Ｎ−ホルミルメチオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デスモシン、イソデスモシン、ε−Ｎ−メチルリジン、ε−Ｎ−トリメチルリジン、メチルヒスチジン、デヒドロ酪酸、デヒドロアラニン、(−アミノ酪酸、アラニン、ρ−アミノ酪酸、ホモシステイン、ホモセリン、シトルリン、オルニチンや、「タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸原典（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ）」（ホワイト、Ｊ．Ｓ．およびホワイト、Ｄ．Ｃ．、２００２、ヒューマンプレス、トトワ、ニュージャージー）または「アミノ酸およびペプチド合成」（ジョーンズ、Ｊ．、２００２オックスフォード大学出版、米国、ニューヨーク）または「非天然アミノ酸（Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）、化学物質ファイル（ＣｈｅｍＦｉｌｅｓ）１巻、５号（２００１フルカ試薬社；シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ）もしくは「非天然アミノ酸ＩＩ、化学物質ファイル２巻、４号」（２００２フルカ試薬社；シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ）に記載されているような、天然源から単離されていてもよい、および／または化学的に合成されたアミノ酸であってもよいアミノ酸が含まれる。天然および／または非天然アミノ酸のさらなる説明は、例えば、コティア、２００３アメリカ化学学会誌（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．）３６：３４２；マルオカら、２００４米国科学アカデミー紀要１０１：５８２４；ランドキストら、２００１オーガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）３：７８１；タンら、２００２有機化学学会誌６７：７８１９；ロスマンら、２００３有機化学学会誌６８：６７９５；クレブスら、２００４化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１０：５４４；グッドマンら、２００１バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）６０：２２９；サバットら、２０００オーガニック・レターズ２：１０８９；Ｆｕら、２００１有機化学学会誌６６：７１１８；およびウルビーら、１９９４分子生物学における手法（Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）３５：２４９に見られる。本明細書では、標準的な３文字略語および１文字記号を用いて、天然および非天然アミノ酸を指す。
【００５６】
他の非天然アミノ酸またはアミノ酸類似体は当該分野でよく知られており、また、これらに限定されないが、非天然ＬもしくはＤ誘導体（上述したまたは本明細書のどこかに記載のペプチドおよび／またはペプチド模倣物中に存在するＤ−アミノ酸など）、蛍光標識したアミノ酸、並びに具体例として、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、３−ヨード−チロシン、Ｏ−プロパルギル−チロシン、ホモグルタミン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、セレノシステイン、アルキンフェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−（２−プロピニル）−Ｌ−チロシン、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ホモプロパグリグリン、アジドホモアラニン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、および、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、トリフルオロロイシン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、Ｄ−ノルロイシン（ｄＮｌｅもしくはＤ−Ｎｌｅ）、５−フルオロ−トリプトファン、パラ−ハロ−フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン（ホモ−Ｐｈｅ）、セレノ−メチオニン、エチオニン、Ｓ−ニトロソ−ホモシステイン、チア−プロリン、３−チエニル−アラニン、ホモ−アリル−グリシン、トリフルオロイソロイシン、トランスおよびシス−２−アミノ−４−ヘキセン酸、２−ブチニル−グリシン、アリル−グリシン、パラ−アジド−フェニルアラニン、パラ−シアノ−フェニルアラニン、パラ−エチニル−フェニルアラニン、ヘキサフルオロロイシン、１，２，４−トリアゾール−３−アラニン、２−フルオロ−ヒスチジン、Ｌ−メチルヒスチジン、３−メチル−Ｌ−ヒスチジン、β−２−チエニル−Ｌ−アラニン、β−（２−チアゾリル）−ＤＬ−アラニン、ホモプロパルギルグリシン（ＨＰＧ）およびアジドホモアラニン（ＡＨＡ）などが挙げられる。
【００５７】
特定の態様では、例えばフェニルアラニンもしくはトリプトファンまたはその類似体において見られるような、芳香族環系が存在する時にその構造から当業者が容易に認識できる芳香族側鎖を含む天然または非天然アミノ酸が存在してもよく、そのような他の天然または非天然アミノ酸は、典型的には、水素および炭素のみからなる６〜１９個の炭素原子を含む芳香族単環式または多環式炭化水素環系の形態で、環系は部分的にまたは完全に飽和していてもよく、かつ、これに限定されるものではないが、フルオレニル、フェニルおよびナフチルのような基などの基として存在していてもよい。
【００５８】
特定の態様では、例えばアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンもしくはメチオニンまたはそれらの類似体に見られるような、疎水性側鎖（例えば、典型的には生理学的環境中に非極性であるもの）が存在する時にその構造から当業者が容易に認識できる疎水性側鎖を含む天然または非天然アミノ酸が存在してもよい。特定の態様では、例えばリシン、アルギニンまたはヒスチジンまたはそれらの類似体に見られるような、塩基性（例えば、典型的には極性であり、生理学的環境では正電荷を有する）が存在する場合にその構造から当業者が容易に認識できる塩基性側鎖を含む天然または非天然アミノ酸が存在してもよい。
【００５９】
特定の態様では、本明細書に開示されるペプチドは、ペプチドの生物学的活性が維持される限り、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸を含み得る（例えば、ボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドは、本明細書に記載のＴ細胞免疫応答インジケーターとして生成される刺激によって明らかなように、ライム病に関連するボレリア種に感染した対象由来のＴ細胞によって引き起こされる二次インビトロ免疫応答によって認識され得る）。このペプチドはまた、特定の態様では、翻訳後または合成後に起こる既知の天然のおよび人工の共有的な化学修飾を含んでいてもよく、このような修飾を生じる反応としては、グリコシル化（例えば、アスパラギン残基でのＮ結合型オリゴ糖付加、セリンまたはトレオニン残基でのＯ結合型オリゴ糖付加、糖化など）、脂肪族のアシル化、アセチル化、ホルミル化、ペグ化を挙げることができる。本明細書に開示されるペプチドはさらに、アミノ酸欠失、あるいは１つ以上のアミノ酸残基への他の天然アミノ酸残基もしくは非天然アミノ酸残基の付加、または１つ以上のアミノ酸残基と他の天然アミノ酸残基もしくは非天然アミノ酸残基との置換を含み得る類似体、対立遺伝子および対立遺伝子変異体を含む場合がある。
【００６０】
ペプチド類似体や非ペプチド類似体はペプチド模倣薬またはペプチド模倣薬と呼ばれ、医薬産業において知られている（ファウシャー、創薬における進歩（Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．）１５：２９（１９８６）；エバンズら、薬学会誌（Ｊ．Ｍｅｄ．）３０：１２２９（１９８７））。これらの化合物は、１つ以上の非天然アミノ酸残基、１つ以上の化学修飾部分（例えば、グリコシル化、ペグ化、蛍光、放射能または他の部分）、および／または１つ以上の非天然のペプチド結合（例えば、還元ペプチド結合：−ＣＨ２−ＮＨ２−）を含む場合がある。ペプチド模倣体は、コンピューターを使った分子モデリング、ランダムなまたは部位特異的な突然変異誘発、ＰＣＲに基づく戦略、化学的突然変異誘発などを含む様々な方法によって開発することができる。
【００６１】
前述したように、特定の態様はまた、ペプチド模倣体または「人工」ポリペプチドにも関する。このようなポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換、１つ以上の改変または人工的なペプチド結合、１つ以上の化学的部分（ポリエチレングリコール、グリコシル化、検出可能な標識、または他の部分など）、および／または１つ以上の非天然アミノ酸を含み得る。ペプチド模倣物の合成は、当該分野でよく知られており、そのような方法の例としては、化学的突然変異誘発、点突然変異誘発もしくは複数部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲシャッフリング、改変されたアミノアシルｔＲＮＡもしくはアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の使用、アンバーサプレッサーのような停止コドンの使用、４または５塩基対コドンの使用、または他の手段によって天然に生じるタンパク質またはポリペプチドを変化させることが挙げられ得る。
【００６２】
表２は、配列番号１〜３３（表３に示される）のボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドの全長または一部を得るかまたは誘導するもととなった、ボレリアの菌種、提供源タンパク質の識別番号、アミノ酸配列領域を示している。
【表２】
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【表３】
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【００６３】
本明細書で開示の組成物に関してここで想定される特定の態様では表３に示すペプチドの任意の組み合わせを使用してもよく、特に好ましい態様では、開示の４つのボレリアポリペプチド領域ＦｌａＢ（配列番号１〜５）、ＤｂｐＢ（配列番号６〜１８）、ｐ６６（［配列番号１９〜３１）およびＯｓｐＣ（配列番号３２〜３３）のそれぞれに由来する少なくとも１つのペプチドが存在する。複数のペプチドの相対量、および前記１つ以上のペプチドの絶対量は、当業者によく知られているように、特定の免疫化学的方法、免疫学的方法および／または生化学的方法論により、組成物が使用される試験のデザインや具体的な技術に応じて変わり得る。特定の態様において、限定ではなく例示としてであるが、組成物は、少なくとも約１ナノグラムずつであり、かつ、約１００ナノグラムを超えない量の各ペプチドを含み得る。特定の態様では、組成物は、少なくとも約１００、２００、３００、または４００ナノグラムであり、かつ、約５００ナノグラムを超えない量の各ペプチドを含み得る。特定の態様では、組成物は、少なくとも約５００、６００、７００、８００、または９００ナノグラムであり、かつ、約１０００ナノグラムを超えない量の各ペプチドを含み得る。特定の態様では、組成物は、少なくとも約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９マイクログラムであり、かつ、約２マイクログラムを超えない量の各ペプチドを含み得る。特定の態様では、組成物は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８または９マイクログラムであり、かつ、約１０マイクログラムを超えない量の各ペプチドを含み得る。
【００６４】
ライム病の診断または予後予測のための方法
本明細書で開示の通り、特定の態様では、対象におけるライム病を検出するため、または対象におけるライム病治療の有効性をモニタリングするための組成物および方法を提供し、この組成物および方法は部分的に、ここで同定したボレリア菌種ＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６およびＯｓｐＣタンパク質領域（例えば、表２および３）のそれぞれに由来するボレリア特異的Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドを少なくとも１つ含んでいるペプチド混合物が、実質的にすべてのＬＤ患者由来のＴ細胞が、二次インビトロ免疫応答において、本明細書で提供するＴ細胞免疫応答インジケーター（例えばインターフェロンγの放出）を生成することによって反応する組成物をもたらすという発見に基づいている。
【００６５】
したがって、これらのおよび関連する態様では、対象におけるボレリア特異的抗体の出現を検出することが可能な時点よりも疾患の進行の早い時点で、対象のＬＤを検出することを可能にする。さらに、また前述の通り、本開示は、ＬＤ治療がうまくいった後も数ヶ月から数年にわたって高レベルで血中に残存し、そのため、成功したボレリアスピロヘータ根絶の効果を覆い隠してしまう可能性のある検出可能なボレリア特異的抗体の評価とは異なり、ボレリアスピロヘータを根絶するためのＬＤ治療が成功している対象から得られたＴ細胞を循環させることによって引き起こされる検出可能なボレリア特異的Ｔ細胞応答性が低下していることに基づく、ＬＤ治療の有効性を評価することを可能にする。
【００６６】
したがって特定の態様では、対象のライム病を検出する方法、または対象におけるライム病の治療の有効性をモニタリングする方法が提供され、この方法は、（Ａ）第１のテストインキュベーション混合物を得るために、（ｉ）ライム病であることまたはライム病を有するリスクがあることが知られている対象から第１の時点で得られた第１の生体試料（ここでこの生体試料はＴ細胞と抗原提示細胞を含んでいる）と、（ｉｉ）ライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物、をインビトロで接触させること、（Ｂ）Ｔ細胞免疫応答インジケーターの生成を刺激するために前記ペプチド組成物中に存在するボレリアＴ細胞エピトープの前記Ｔ細胞による特異的認識に十分な条件および時間で第１のテストインキュベーション混合物をインキュベートすること；（Ｃ）第１のテストインキュベーション混合物のＴ細胞免疫応答インジケーターの第１のレベルを検出することを含み、ここで、対象におけるボレリア感染の存在は、（Ｃ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第１のレベルが、第１の生体試料にライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物を加えずにインキュベートした第１の対照インキュベーションから得られた第１の対照レベルよりも高いことで示され、かつ、ライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物は、ここで同定されたボレリア菌種のＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６およびＯｓｐＣタンパク質領域（例えば、表２および３）それぞれに由来する少なくとも１つのボレリア特異的Ｔ細胞エピトープ含有ペプチド、例えば、
【００６７】
（ａ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＦｌａＢペプチド、または配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの単離ＦｌａＢペプチド；（ｂ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列を有するＤｂｐＢペプチド、または配列番号６〜１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ＤｂｐＢペプチド；（ｃ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列を有するｐ６６ペプチド、または配列番号１９〜３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の単離ｐ６６ペプチド；および（ｄ）それぞれがボレリアＴ細胞エピトープを含み、かつ、配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列を有するＯｓｐＣペプチド、または配列番号３２〜３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその１つ以上の変異体からから選択される、１つまたは２つの単離ＯｓｐＣペプチドを含むペプチド混合物を含み、それによって対象におけるライム病を検出するか、または対象におけるライム病の治療の有効性をモニタリングする。
【００６８】
特定の好ましい態様では、第１の時点とは、ライム病治療の対象への投与前である。
【００６９】
さらに特定態様において、本方法は、（Ｄ）第２のテストインキュベーション混合物を得るために、（ｉ）第１の時点よりも遅く、かつ、ライム病の治療を対象に投与した後に対象から得られた第２の生体試料（ここでこの生体試料はＴ細胞と抗原提示細胞を含んでいる）と、（ｉｉ）ライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物、をインビトロで接触させること、（Ｅ）Ｔ細胞免疫応答インジケーターの生成を刺激するために前記ペプチド組成物中に存在するボレリアＴ細胞エピトープの前記Ｔ細胞による特異的認識に十分な条件および時間で第２のテストインキュベーション混合物をインキュベートすること；および（Ｆ）第２のテストインキュベーション混合物のＴ細胞免疫応答インジケーターの第２のレベルを検出することをさらに含み、ここで、対象におけるボレリア感染の存在は、（Ｆ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第２のレベルが、第２の生体試料にライム病を診断するまたは予後予測するためのペプチド組成物を加えずにインキュベートした第２の対照インキュベーションから得られた第２の対照レベルよりも高いことで示され、かつ、ライム病治療の有効性は、（Ｆ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第２のレベルが、（ｃ）で検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第１のレベルよりも低いことで示される。
【００７０】
そのため、これらおよびいくつかの関連する態様では、第１の時点は、ライム病の所与の治療を対象に投与する前であり、第２のまたはそれ以降の時点は、ＬＤに対する所与の治療を対象に投与した後であり得、例えば、検出されるＴ細胞免疫応答インジケーターの第２のレベルの低下（例えば、適切な対照と比較したときの統計学的に有意な減少）に反映されるような治療の有効性が決定できる。非限定的な理論として、そのような結果は、Ｔ細胞免疫応答インジケーターの刺激生成についてアッセイした場合に、ＬＤ治療後の対象においてボレリア感染が実質的に除去されたことに起因して第２の試料ではＴ細胞反応性が負に調節されたおよび／またはなくなった結果、第２またはそれ以降の時点で、第２の生体試料のボレリア特異的Ｔ細胞反応性が第１の時点よりも低いレベルであることを意味し得る。
【００７１】
このようにして、ＬＤに関連するボレリア感染の重篤度は、１つまたは第２のもしくはそれ以降の時点の経過のような様々な期間にわたってモニタリングすることで対象のボレリア病原菌負荷の顕性のインジケーターであるＴ細胞免疫応答インジケーターによって反映される病気の進行を評価できること、また、ＬＤに対する１つ以上の治療の有効性も評価できることが理解されるであろう。場合によっては、対象におけるボレリア特異的Ｔ細胞活性をモニタリングするために、対象から得られた複数の生体試料を、連続する第２およびそれ以降の時点にわたって繰り返し試験することが望ましい場合がある。したがって、特定の態様では、ここに記載の接触する、インキュベートする、および検出する工程は、対象のＬＤを長期間モニタリングすることが望ましい状況においては何回繰り返しても良い。例えば、それぞれが様々な間隔で隔てられている、例えば、数日、数週間、数ヶ月、または数年の間隔で隔てられている、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０回、またはそれ以上などの時点にわたって繰り返すことができる。
【００７２】
そのため、本明細書に記載の特定の態様では、ライム病の治療に使用するのに適切であるとして当該分野で知られている１つ以上の抗生物質化合物、例えば、病原性ボレリア菌種に対して、例えば本明細書で言及するいずれものボレリア菌種、特にヒトに対する病原性を有するボレリア菌種に対して、有効な活性プロファイルを有する抗生物質に基づく抗生物質化合物に関連する組成物および／または方法が想定される。医学分野の当業者に理解されるように、「治療する」および「治療」という用語は、対象（すなわち、ヒトであってもヒト以外の動物であってもよい患者、宿主）の疾患、障害または状態の医学的管理を指す（例えば、ステッドマン医学大辞典を参照のこと）。
【００７３】
抗生物質は当該分野で知られており、典型的には、ある種の微生物によって産生された化合物から製造され、別の種の微生物を殺す薬剤、または同一または類似の化学構造および作用機序を有する合成生成物、例えば、そのような薬物を局所的に使用した場合に生体内または生体の表面上の微生物を破壊する薬剤である。
【００７４】
ライム病の治療に適切であることが当該技術分野で知られている抗生物質には、テトラサイクリン類（オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリン）；ペニシリン類（アモキシシリンまたはペニシリン）；セファロスポリン類（セフタキシム、セフタゾール、セフメタゾール、セフォキシチン、セフロキシムアキセチル、セフロキシムアセチル、セフチンまたはセフトリアキソン）；マクロライド類（アジスロマイシン、クラリスロマイシン、またはエリスロマイシン）のうちの１つ以上が含まれるが、これに限定されるものではない（例えば、キャメロンら、２０１４抗感染性治療における最新の知見（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｔｈｅｒ．）１２（９）：１１０３−１１３５；シャピロ、２０１４ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン３７０（１８）：１７２４−３１；ライトら、２０１２アメリカン・ファミリー・フィジシャン８５：１０８６を参照のこと）。臨床的に有用なこれらのおよび他の抗生物質の一覧（例えば、ワシントン大学医学部、内科治療のためのワシントンマニュアル（第３２版）、２００７年、リッピンコット、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス、フィラデルフィア、ＰＡ；ハウザー、ＡＬ、臨床医のための抗生物質の基礎、２００７年、リッピンコット、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス、フィラデルフィア、ＰＡ）が利用可能であり、当業者に知られている。
【００７５】
本明細書に記載の方法で使用するために、生体試料を、本開示のＴ細胞免疫応答インジケーターの有無およびレベルを決定するために、対象から得ることができる。適切な生体試料としては、例えば、全血試料、または脳脊髄液試料、または滑液試料を挙げることができ、そのいずれも、当業者が認識するようなライム病を発症する危険性があると疑われる対象（例えば、ヒトまたは動物対象、好ましい態様ではヒト）、例えば、ダニに咬まれた患者、または遊走性紅斑を臨床的に呈する患者、または１つ以上のライム病危険因子を有する患者から得ることができる（例えば、シャピロ、２０１４ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン３７０：１７２４；ライトら、２０１２アメリカン・ファミリー・フィジシャン８５：１０８６を参照のこと）。特定の態様では、生体試料は、全血（場合により抗凝固剤を含む）、または全血の細胞画分、または単離された末梢血白血球、または単離された末梢血単核細胞の少なくとも１つを含み得る。生体試料は、ＬＤ治療を対象に投与する前の第１の時点で対象から得てもよく、この生体試料は、診断的におよび／またはベースライン（すなわち、治療前）データを確立するための対照として有用であり得る；ＬＤ治療の対象に投与した後の１回以上の第２のもしくはそれ以降の時点からも、さらに、対象から生体試料を得ることができる。
【００７６】
Ｔ細胞免疫応答インジケーターの検出
【００７７】
インビトロ抗原特異的Ｔ細胞応答は、通常、記載のある多くの測定可能なＴ細胞機能的パラメーター（例えば、増殖、サイトカインの発現、サイトカインの生合成、サイトカインの放出、変化した細胞表面マージャーの表現型など）として観察され、適切な状況で同族抗原（例えば、免疫適合性抗原提示細胞によって提示される場合、Ｔ細胞を刺激または活性化するために使用される抗原）に曝露されたＴ細胞と、代わりに構造的に異なるまたは無関係な対照抗原に曝露した同じ供給源集団に由来するＴ細胞との間で生じるＴ細胞応答を比較することで決定される。同族抗原に対する応答が対照抗原に対する応答よりも統計学的に有意に高いことは、抗原に対して特異的であることを意味する。
【００７８】
二次インビトロボレリア菌種特異的免疫応答のレベルは、本明細書に記載されているおよび／または当技術分野で日常的に実施されている多数の免疫学的方法のいずれか１つによって決定することができる。二次インビトロボレリア菌種特異的免疫応答のレベルは、Ｔ細胞含有生体試料および抗原提示細胞の由来となった対象（例えばライム病に罹っていることが疑われる対象）に、本明細書に記載のライム病治療のいずれか１つを投与する前および投与後を含む、１つ以上の時点で決定され得る。
【００７９】
実施例に記載したように、ボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチド（例えば、本明細書に開示の配列番号１〜３３のＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、およびＯｓｐＣペプチドのうちの１つ以上、またはその変異体）を含む診断または予後予測のための本開示の組成物が、ライム病に関連するボレリア菌種感染初期の対象に由来するＴ細胞と抗原提示細胞を含んでいる生物学資料により、テストインキュベーションにおいてインビトロで、Ｔ細胞免疫応答インジケーターの検出可能な生成を刺激可能なことが示された。検出されたＴ細胞免疫応答インジケーターのレベルは、ボレリア菌種ペプチド組成物を含んでいない以外はテストインキュベーションと同様の対照インキュベーション中で生物試料をインキュベートすることで得られた、インジケーターの対照レベルよりも高かった。
【００８０】
したがって、本明細書で提供されるようなＴ細胞免疫応答指標のレベルの高まりは、特定の態様において、Ｔ細胞および抗原提示細胞を本明細書に記載のボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド組成物（ＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６、ＯｓｐＣ）とＴ細胞による特異的な抗原認識に十分な条件で十分な時間インキュベートした後に検出可能なインジケーターのレベルが、適切な対照条件（例えば、ボレリアペプチド組成物が存在しない）において検出可能なインジケーターのレベルに対する統計的に有意な増加という形をとる。
【００８１】
これに限定するものではなく一例として、好ましい態様では、Ｔ細胞をボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド組成物で刺激することによって生成されるＴ細胞免疫応答インジケーターは、インビトロでのインキュベーション後にＴ細胞によって誘導、発現および／または放出される、少なくとも１つのＴ細胞サイトカインである。好ましくは、Ｔ細胞サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γから選択される。特定の好ましい態様では、放出されたＩＦＮ−γは、Ｔ細胞をボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド組成物で刺激することによって生成されるＴ細胞免疫応答インジケーターである。しかしながら、想定される態様はこれに限定されるものではなく、そのため、本明細書に記載のボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド組成物に対する二次インビトロ抗原特異的応答を高めるその能力に関し、本明細書に記載したように、生体試料を評価するための多種多様な方法論が含まれ得る。様々なアッセイ構成および技術が当該分野で知られており（例えば免疫学の最新手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（２００９））、本開示に基づく本方法に使用することができる。従って、サイトカインのレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色、および／またはフローサイトメトリーを含む、本明細書に記載され、当技術分野で実施される方法に従って決定することができる。
【００８２】
好ましい態様においてＴ細胞免疫応答インジケーターとは、試料と本明細書に記載のボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチド組成物をインキュベートする工程の間に生体試料のＴ細胞から放出されたＩＦＮ−γであり、放出されたＩＦＮ−γのレベルは、結合剤とＴ細胞サイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ）との間の検出可能な特異的結合の決定によりＩＦＮ−γを検出する、多数のインビトロ技術のいずれかによって免疫化学的に決定される。従って、結合剤は、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む場合があり、この抗体は、少なくとも１つのモノクローナル抗体を含んでいても、または代わりにポリクローナル抗体を含んでいてもよい。特定の態様によれば、Ｔ細胞免疫応答インジケーターは、Ｔ細胞によって放出され、固相に固定化された抗体への結合によって検出されるサイトカインである。
【００８３】
ＩＦＮ−γに関する代表的なイムノメトリック（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイには、ＱＵＡＮＴＩＦＥＲＯＮ（登録商標）（セレスティス社（Ｃｅｌｌｅｓｔｉｓ）、カーネギー、ビクトリア、オーストラリアから入手可能）があり、これは、結核に関して広く使用されている試験においてＩＦＮ−γ検出の代表格として確立されており（例えば、パイら、２００４ランセット感染症（Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ）４：７６１）、これによるＩＦＮ−γの定量的検出は、結核抗原の代わりに本明細書に記載のボレリア抗原を用いることで、本明細書における使用に適用可能である（例えば、ユンら、２０１４臨床微生物学雑誌（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）５２：９０；ベルクナップら、２０１４実験薬学の臨床講義（Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．）３４：３３７；ファーガソンら、２０１５移植（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）９９：１０８４；ルアンら２０１４臨床リウマチ学（Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．）電子出版ＰＭＩＤ２５３７６４６６も参照のこと）。
【００８４】
抗体が検出可能なレベルで抗原と、好ましくは約１０4Ｍ-1以上、または約１０5Ｍ-1以上、約１０6Ｍ-1、約１０7Ｍ以上、または１０8Ｍ-1以上の親和定数Ｋａで反応する場合、結合パートナーまたは抗体は、目的の抗原（例えば、検出可能なＴ細胞免疫応答インジケーターとしてアッセイされるサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ）に対して「免疫特異的（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」「特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ）」もしくは「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄ）」と言える。その同族抗原に対する抗体の親和性は一般的に、解離定数ＫＤとしても表され、抗体は目的の抗原に、約１０-4Ｍ以下、約１０-5Ｍ、約１０-6Ｍ以下、１０-7Ｍ以下、または１０-8Ｍ以下で特異的に結合している場合に、特異的に結合していると言える。
【００８５】
結合パートナー、つまり抗体の親和性は、従来技術、例えば、スキャッチャードらが記載の方法（ニューヨーク科学アカデミー年会誌（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）５１：６６０（１９４９））および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、バイオセンサー、ピスカタウェイ、ニュージャージー）などの一般的に使用されている技術によって容易に測定することができる。表面プラズモン共鳴の場合には、標的分子を固相に固定化し、フローセルに沿って移動する移動相中で、結合パートナー（つまりリガンド）に曝露する。リガンドが固定化された標的に結合すると、局所的な屈折率が変わることでＳＰＲ角の変化が生じ、これを、反射光の強度の変化を検出することによって、リアルタイムでモニタリングすることができる。ＳＰＲシグナルの変化速度を分析して、結合反応の会合および解離相の見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比によって、見かけの平衡定数（親和性）が分かる（例えば、ウォルフら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５３：２５６０−２５６５（１９９３）を参照のこと）。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、特異的抗原の２つ以上のエピトープを認識する抗原特異的抗体の集団から得られる抗体を指す。「抗原」または「免疫原」は、適応免疫系によって認識されるペプチド、脂質、多糖またはポリヌクレオチドを指す。抗原は、自己または非自己分子であり得る。抗原の例には、細菌細胞壁成分、花粉およびｒｈ因子が含まれるが、これらには限定されない。特異的抗体によって、または特異的Ｔ細胞レセプターによって特異的に認識される抗原の領域が、「エピトープ」または「抗原決定基」である。１つの抗原が、複数のエピトープを有する場合もある。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。さらに、異なるエピトープを指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原のたった１つのエピトープを指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成され得るという利点がある。「モノクローナル」という修飾語は、特定の方法のいずれかによる抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、クーラーら、ネイチャー、２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製されてもよく、または細菌、真核生物の動物または植物細胞を使った組換えＤＮＡ法を用いて作製されてもよい（例えば、米国特許第４、８１６、５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、クラックソンら、ネイチャー、３５２：６２４−６２８（１９９１）およびマークスら、分子生物学雑誌２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を使って、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００８８】
核酸およびポリヌクレオチド
本明細書で提供されるようなボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ポリペプチドおよびペプチド、ならびにコードしている核酸分子およびベクターは、実質的に純粋もしくは均一の形態で、あるいは核酸の場合には、所望の機能を有するポリペプチドをコードしている配列以外には、提供源の核酸または遺伝子を実質的に含まない形態で、単離および／または精製され得る。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいてもよく、また、完全にもしくは部分的に合成されたものであってもよい。本明細書に記載のヌクレオチド配列への言及は、特定された配列を有するＤＮＡ分子を包含し、そうでないことが文脈から明らかでないかぎり、ＵがＴで置換される特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【００８９】
したがって、本発明はさらに、特定の態様において、配列番号１〜３３に記載のアミノ酸配列を有するボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドのいずれかをコードする単離された核酸を提供する。
「作動可能に連結された」という用語は、用語が適用される構成要素が、適切な条件下でそれらの固有の機能を実行することができる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」転写制御配列は、制御配列の転写活性と適合する条件下でタンパク質コード配列が発現するように、それに連結されている。
【００９０】
本明細書で使用される「制御配列」という用語は、それらが連結または作動可能に連結されるコード配列の発現、プロセシングまたは細胞内局在に影響を与え得るポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存する場合がある。特定の態様では、原核生物の転写制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み得る。他の特定の態様では、真核生物の転写制御配列は、転写因子、転写エンハンサー配列、転写終結配列およびポリアデニル化配列に関する１つ以上の認識部位を含むプロモーターを含み得る。特定の態様において、「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」と言う用語は、一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。特定の態様では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得る。このような修飾には、ブロモウリジン、アラビノシドおよび２’、３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロセレノエート、ホスホロアニテロエート、ホスホラニレートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾などの塩基修飾が含まれ得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的には、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡを含む。
【００９２】
「天然に生じるヌクレオチド（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。「修飾されたヌクレオチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド結合（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」という用語には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニレート、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合が含まれる。例えば、その開示内容が、いかなる目的のためにも参照により本明細書に組み込まれる、ラプランシェら、１９８６、核酸研究（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１４：９０８１；ステックら、１９８４、米国化学学会誌１０６：６０７７；ステインら、１９８８、核酸研究１６：３２０９；ゾンら、１９９１、抗がん剤の設計（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）、６：５３９；ゾンら、１９９１、オリゴヌクレオチドおよび類似体（Ｏｌｉｇｎｏｎｕｃｌｅｏｔｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）：実践的なアプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、８７−１０８頁（Ｆ．エックスタイン編）、オックスフォード大学出版、オックスフォード、英国；ステックら、米国特許第５，１５１，５１０号；ウールマンおよびペイマン、１９９０、ケミカルレビューズ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、９０：５４３を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの検出またはそのハイブリダイゼーションを可能にする検出可能な標識を含む場合がある。
【００９３】
「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指すために使用される。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、挿入された異種核酸配列の発現を指示および／または制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現には、転写、翻訳、およびイントロンが存在する場合にはＲＮＡスプライシングなどのプロセスが含まれるが、これには限定されない。
【００９４】
当業者に理解されるように、ポリヌクレオチドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するかまたは発現するように適合された、ゲノム配列、外来ゲノムおよびプラスミドコード配列、および遺伝子操作されたより小さな遺伝子セグメントを含み得る。そのようなセグメントは、自然から単離されたものであっても、当業者によって人工的に改変されたものであってもよい。
【００９５】
さらに当業者によって認識されているように、ポリヌクレオチドは一本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても、二本鎖であってもよく、また、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）であっても、ＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含み、ＤＮＡ分子に一対一で対応するＨｎＲＮＡ分子も、イントロンを含まないｍＲＮＡ分子も含み得る。その他のコード配列または非コード配列は、本開示によるポリヌクレオチド内に存在してもよいが、必ずしもそうである必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または担体材料に連結されていてもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドは天然配列を含んでいてもよく、またはそのような配列の変異体もしくは誘導体をコードする配列を含んでいてもよい。
【００９６】
したがって、これらおよび関連する態様によれば、本開示はまた、ボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。特定の態様では、本明細書に記載のペプチドおよびそのようなポリヌクレオチドの相補体をコードするポリヌクレオチド配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドが提供される。
【００９７】
他の関連する態様においてポリヌクレオチド変異体は、本明細書に記載のボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と実質的に同一であり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法（例えば、以下に記載されるような標準的パラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して、本明細書に記載のボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドをコードしている配列などの参照ヌクレオチド配列（例えばそのアミノ酸配列として配列番号１〜３３のペプチドを有する）と比較したときに、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドであり得る。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置決定などを考慮に入れて、これらの値を適宜調整し、２つのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはペプチドの対応する同一性を決定することができることを理解している。
【００９８】
別の態様では、中程度から高ストリンジェントな条件下で、本明細書中に提供されるボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドもしくはその変異体、またはその断片、あるいは相補的配列をコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドが提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野においてはよく知られている。本明細書で提供されるポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するのに適する適度なストリンジェント条件の例を挙げると、その例示には、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄；５×ＳＳＣ中、５０℃〜６０℃で一晩ハイブリダイズ；続いて０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれで、６５℃で２０分間２回洗浄することが含まれる。当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液の塩含有量および／またはハイブリダイゼーションが行われる温度を変更するなどで、容易に操作できることを知っている。例えば、別の態様において、適度に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、ハイブリダイゼーションの温度が、例えば６０℃〜６５℃または６５℃、７０℃まで上げることを除いて、前述したような条件が含まれる。
【００９９】
本明細書の他の箇所に記載されているように、代表的なボレリア菌種のＴ細胞エピトープ含有ペプチド（例えば、配列番号１〜３３またはその変異体）の３次元構造は、選択された天然のまたは非天然のアミノ酸の１つ以上を置換、付加、欠失または挿入するなどの一般に行われている方法論を介して決定され、そのように誘導された構造変異体が本開示の種の空間充填特性を保持するかどうかを決定する目的で、事実上モデル化することができる。例えばボレリア特異的Ｔ細胞認識が維持されるような、ペプチド内の適切なアミノ酸置換（またはアミノ酸配列をコードする適切なポリヌクレオチド）を決定するための様々なコンピュータプログラムが当業者に知られている。
【０１００】
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはその断片は、コード配列自体の長さやそのコード配列自体にかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせることができ、そのため、それらの全長は大きく異なる可能性がある。従って、ほぼどのような長さの核酸断片も用いることができるが、本開示のボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドを産生するための、目的の組換えＤＮＡプロトコールにおける調製および使用の容易さによって、全長は好ましくは制限される。例えば、その全長が約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対等の例示的なポリヌクレオチドセグメント（全ての中間長を含む）が有用であると考えられる。
【０１０１】
ポリヌクレオチド配列を比較するために、以下に記載するように２つの配列中のヌクレオチド配列が最大に一致するように整列させたときに、２つ配列が同じである場合２つの配列は「同一」であると言える。２つの配列間の比較は、典型的には、部分的な領域の配列類似性を同定および比較するために比較ウインドウにわたる配列を比較することによって行われる。本明細書で使用する「比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」は、少なくとも約２０個の連続した位置、通常は３０〜約７５、４０〜約５０のセグメントを指し、２つの配列を適切に整列させた後に、同じ数の連続した一を有する参照配列と配列を比較することができる。
【０１０２】
比較のために配列を適切に整列させることは、レーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）スイートのバイオインフォマティクスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ社、マジソン、ウィスコンシン）のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを用い、デフォルトパラメータを使用して行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されているいくつかのアライメントスキームを具体化したものである：デイホフ、Ｍ．Ｏ．（１９７８）タンパク質の進化的変化のモデル−遠方の関係を検出するための行列。デイホフ、Ｍ．Ｏ．（編）タンパク質の配列および構造の地図（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、米国国立生物医学研究財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、ワシントンＤＣ、５巻、３号、３４５−３５８頁；ハインＪ．、アライメントおよび系統発生に関する統一アプローチ（Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ）６２６−６４５頁（１９９０）；酵素学における手法１８３巻、アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア；ヒギンズ、Ｄ．Ｇ．シャープ、Ｐ．Ｍ．、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）；マイヤーズ、Ｅ．Ｗ．およびミュラーＷ．、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７（１９８８）；ロビンソン、Ｅ．Ｄ．、統合理論（Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ）１１：１０５（１９７１）；サントウ、Ｎ．ネス、Ｍ．、分子生物学と進化（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．）４：４０６−４２５（１９８７）；スニース、Ｐ．Ｈ．Ａ．ソカル、Ｒ．Ｒ．、計量分類学（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ）、フリーマンプレス、サンフランシスコ、カリフォルニア（１９７３）；ウィルバー、Ｗ．Ｊ．ａおよびリップマン、Ｄ．Ｊ．、米国科学アカデミー紀要８０：７２６−７３０（１９８３）に記載されている。
【０１０３】
あるいは、比較のために配列を適切に整列させることは、スミスおよびウォーターマン、応用数学（Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ）２：４８２（１９８１）の部分的同一性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、ニードルマンおよびウンシュ、分子生物学会誌４８：４４３（１９７０）の同一性整列アルゴリズム（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、ピアソンおよびリップマン、米国科学アカデミー紀要８５：２４４４（１９８８）と同様の方法を検索することによって、コンピューターに実装されているアルゴリズム（ウィスコンシン、ジェネティクスソフトウェアパッケージ、ジェネティクス・コンピューター・グループ、５７５サイエンス通り、マジソン、ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に入っているＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴ）によって、または目視によって、行うことができる。
【０１０４】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、アルチュルら、核酸研究、２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびアルチュルら、分子生物学会誌、２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。２つ以上のポリヌクレオチド間の配列同一性の割合を決定するために、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、例えば本明細書に記載のパラメーターで使用することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立バイテクノロジー情報センターを通じて一般に入手可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターＭ（一致する残基の対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致の残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算することができる。各方向のワードヒットの延長は、累積アライメントスコアが最大到達値から量Ｘだけ減少したとき；配列させた残基のネガティブスコアが１つ以上蓄積し、累積スコアがゼロ以下になったとき；またはいずれかのシーケンスの終わりに達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ヘニコフおよびヘニコフ、米国科学アカデミー紀要、８９：１０９１５（１９８９）を参照）、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、両方の鎖の比較を用いる。
【０１０５】
特定の態様では、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって比較することによって決定され、ここで比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列を適切に整列させるための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０％以下、通常５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基が生じる位置の数を決定し、一致する位置の数を求め、一致した位置の数を参照配列内の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、算出される。
【０１０６】
遺伝コードの縮重の結果、本明細書に記載のボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が存在することは、当業者には理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、本明細書に記載のボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドをコードする天然または元のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列との配列同一性が最少である。本開示では、言うまでも無く、コドン使用頻度の違いによって変化し得るポリヌクレオチドが明確に想定される。特定の態様では、哺乳動物発現のためにコドン最適化された配列が特に企図される。
【０１０７】
したがって、本発明の別の態様では、部位特異的突然変異誘発のような突然変異誘発手法を使用して、本明細書に記載のボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドの変異体および／または誘導体を調製することができる。このアプローチでは、ポリペプチド配列をコードしている、基礎となるポリヌクレオチドの突然変異誘発によって、そのポリペプチド配列を特異的に修飾することができる。これらの技術は、ポリヌクレオチドに１つ以上のヌクレオチド配列の変化を導入することによって配列変異体を調製および試験するための、例えば上記の考慮事項の１つまたは複数を組み込むなどの、直接的なアプローチである。
【０１０８】
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列と十分な数の隣接するヌクレオチドを使用して突然変異体を産生させ、変異を起こした欠失接合部の両側に安定な二本鎖を形成するのに十分な大きさと配列複雑性をもつプライマー配列をもたらすことを可能にする。突然変異誘発は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善、変更、減少、改変、または他の方法で変化させるために、および／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性、または一次配列を改変するために、選択されたポリヌクレオチド配列において行われ得る。
【０１０９】
特定の関連する態様によれば、本明細書に記載の１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞；ボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドまたはその変異体をコードする核酸；および、コード産物の製造方法（それをコードする核酸からの発現を含む）が提供される。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することで簡便に達成され得る。発現による産生に続いて、ボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドは、任意の適切な技術によって単離および／または精製され、次いで所望の目的に使用され得る。
【０１１０】
種々の異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングし、発現させるための系はよく知られている。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞などが挙げられる。一般的に好ましい細菌宿主は大腸菌である。大腸菌のような原核細胞におけるペプチドの組換え発現は、当技術分野において十分に確立されており、培養中の真核細胞での発現もまた確立されている。
【０１１１】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じてその他の配列を含む適切な調節配列を含む好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、例えばファージ、またはファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験の手引き（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）：第４版、グリーンおよびサンブルック、２０１２、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨークを参照されたい。核酸の操作、例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、およびタンパク質の分析のための多くの既知の技術およびプロトコールは、分子生物学の最新手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アウスベルら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、２０１５、またはその改訂版において詳しく説明されている。
【０１１２】
「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載のボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドの１つ以上をコードする核酸配列が導入された、またはそれを導入することができる細胞であり、さらに、本明細書に記載の任意のボレリアＴ細胞エピトープ含有ペプチドをコードする遺伝子のような、目的の選択された遺伝子を発現するか、または発現することができる細胞を指す。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が元の親と形態学的にまたは遺伝的に同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫を含む。したがって、そのような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法も想定される。導入には、利用可能な技術を採用することができる。真核細胞の場合、適切な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルスを用いる、例えばワクシニア、または昆虫細胞については、バキュロウイルスを用いる形質導入が挙げられる。細菌細胞の場合、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれ得る。導入に続いて、例えば、遺伝子を発現させるための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こすかまたは可能にすることができる。一態様では、核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込まれる。組込みは、標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることによって促進され得る。
【０１１３】
本発明はまた、特定の態様では、特定のポリペプチド、例えば本明細書に記載のボレリア菌種Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドなどを発現させるために、発現系において前述したもののような構築物を使用することを含む方法も提供する。「形質導入」という用語は、１つの細菌から別の細菌へ、通常はファージによって遺伝子を導入することを指すために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞配列の獲得および伝達も指す。「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性または外来性のＤＮＡの取り込みを指すために使用され、外来性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合、細胞は「トランスフェクト」されていると言える。多くのトランスフェクション技術が当該分野でよく知られており、また、本明細書に開示されている。例えば、グリーンおよびサンブルック、分子クローニング：実験の手引き：第４版、２０１２、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク；分子生物学の最新手法、アウスベルら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、２０１５、またはその改訂版を参照のこと。このような技術を用いて、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。
【０１１４】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴における変化を指し、細胞は、新しいＤＮＡを含むように改変された場合に形質転換されたと言える。例えば、細胞はその天然状態から遺伝的に改変された場合に、形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入の後、導入（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ）ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることによって細胞のＤＮＡと再結合し得るか、または複製されないエピソーム要素として一時的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立に複製され得る。細胞分裂に伴ってＤＮＡが複製された場合、細胞は安定に形質転換されたと考えられる。核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質に関連して使用される場合、「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」または「天然（ｎａｔｉｖｅ）」という用語は、天然に見出され、ヒトによって操作されていない物質を指す。同様に、本明細書で使用される「天然に存在しない（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」または「非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）」は、天然には見出されないか、またはヒトによって構造的に修飾されているかもしくは合成された物質を指す。
【０１１５】
本発明のいくつかの態様の実施には、そうでないことが明記されていない限り、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術における当業者の技術範囲内の従来の方法が用いられ、およびそのような方法の多くを、以下に、例示のための目的で説明する。また、このような技術は文献中で十分に説明されている。例えば、グリーンおよびサンブルック、分子クローニング：実験の手引き：第４版、２０１２、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク；分子生物学の最新手法、アウスベルら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、２０１５；分子生物学の最新手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）または免疫学の最新手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、（２００９）；アウスベルら、分子生物学の手短なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第３版、ワイリー・アンド・サンズ、１９９５；サンブルックおよびラッセル、分子クローニング：実験の手引き（第３版、２００１）；マニアティスら、分子クローニング：実験の手引き（１９８２）；ＤＮＡクローニング：実践的なアプローチ、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．グローバー編）；オリゴヌクレオチドの合成（Ｎ．ガイト編、１９８４）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｂ．ヘイムズおよびＳ．ヒギンズ編、１９８５）；転写と翻訳（Ｂ．ヘイムズおよびＳ．ヒギンズ編、１９８４）；動物細胞の培養（Ｒ．フレシュニー編、１９８６）；パーバル、分子クローニングの実践的ガイド（１９８４）などの参考文献を参照のこと。
【０１１６】
本明細書に記載の各態様は、そうでないことが明記されていない限り、他のすべての態様に準用される。
【０１１７】
生化学および免疫化学ならびに免疫学的アッセイ、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、微生物および哺乳類の細胞および組織の培養および形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）には、標準的な技術を使用することができる。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に達成されているか、または本明細書に記載されているように実施することができる。これらおよび関連する技術および手順は、基本的に、当技術分野でよく知られている従来の方法に従って、ならびに、本明細書で引用し、本明細書全体を通じて議論される、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学および免疫学の技術における多数の一般的なおよびより具体的な参考文献にしたがって実施され得る。例えば、サンブルックら、分子クローニング：実験の手引き、第３版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク；分子生物学の最新手法（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、２００８年７月改訂）；分子生物学の手短なプロトコール：分子生物学の最新手法からの方法一覧（Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン出版アソシエーツおよびワイリー・インターサイエンス；グローバー、ＤＮＡクローニング：Ａ実践的なアプローチ、ＩおよびＩＩ巻（ＩＲＬプレス、オックスフォード大学出版局ＵＳＡ、１９８５）；免疫学の最新手法（ジョンＥ．コリガン、アダＭ．クルイスビーク、デビッドＨ．マーグリーズ、イーサンＭ．シェバック、ウォーレン・ストローバー編、２００１、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク）；リアルタイムＰＣＲ：最新の技術および応用（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）ジュリー・ローガン、キルスタイン・エドワードおよびニック・スタンダーズ編、２００９、カイスター・アカデミック・プレス、ノーフォーク、英国；アナンド、複雑なゲノム分析のための技術（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）、（アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９９２）；グスリーおよびフィンク、酵母の遺伝学および分子生物学に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９９１）；オリゴヌクレオチドの合成（Ｎ．ガイト編、１９８４）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｂ．ヘイムズおよびＳ．ヒギンズ編、１９８５）；転写と翻訳（Ｂ．ヘイムズおよびＳ．ヒギンズ編、１９８４）；動物細胞の培養（Ｒ．フレシュニー編、１９８６）；パーバル、分子クローニングの実践的ガイド（１９８４）；次世代ゲノムシークエンシング（Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ジャニッツ、２００８、ワイリー−ＶＣＨ）；ＰＣＲプロトコール（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（分子生物学の手法）（パク編、第３版、２０１０、ヒューマンプレス）；固定された細胞と酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＲＬプレス、１９８６）；方法論、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（アカデミック・プレス社、ニューヨーク）；Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ｍ．ミラーおよびＭ．Ｐ．キャロス編、１９８７、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局）；ハーロウおよびレーン、抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、（コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９９８）；細胞および分子生物学における免疫学的手法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（メイヤーおよびウォーカー編、アカデミック・プレス、ロンドン、１９８７）；実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ウェイヤーおよびＣ．Ｃ．ブラックウェル編、１９８６）；リオット、エッセンシャル・イムノロジー（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第６版、（ブラックウェル・サイエンティフィック出版、オックスフォード、１９８８）；胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）：方法と手順（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（分子生物学の手法）（クルスタッド・ツルクセン編、２００２）；胚性幹細胞のプロトコール（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）：Ｉ巻：単離と解析（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（分子生物学の手法）（クルスタッド・ツルクセン編、２００６）；胚性幹細胞のプロトコール：ＩＩ巻：分化モデル（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ）（分子生物学の手法）（クルスタッド・ツルクセン編、２００６）；ヒト胚性幹細胞のプロトコール（Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（分子生物学の手法）（クルスタッド・ツルクセン編、２００６）；間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）：方法と手順（分子生物学の手法）（ダーウィンＪ．プロコップ、ドナルドＧ．フィニー、およびブルースＡ．ブネル編、２００８）；造血幹細胞のプロトコール（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（分子薬学の手法）（クリストファーＡ．クルグ、およびクレイグＴ．ジョーダン編、２００１）；造血幹細胞のプロトコール（分子生物学の手法）（ケビンＤ．ブンティン編、２００８）神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）：方法と手順（分子生物学の手法）（レスリーＰ．ウェイナー編、２００８）などを参照のこと。
【０１１８】
特段の定義がある場合を除いて、本明細書に記載の分子生物学、分析化学、合成有機化学、ならびに医学および薬学に関連する命名法および実験手順および技術は、当該技術分野においてよく知られており、かつ、一般的に使用されているものである。組換え技術、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化、送達、ならびに患者の治療に標準的な技術を使用することができる。
【０１１９】
文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語およびその変化形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、「これに限定されない」と同様に、広く、包括的な意味で解釈される。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句に続くものを含み、典型的にはそれらに限定されることを意味する。「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙された要素に関する開示において定義された活動または作用に干渉しないかまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「本質的に〜からなる」という表現は、列挙された要素が必須であるか、または要求されることを示しているが、列挙された要素の活動または動作に影響を及ぼすか否かに関わらず、その他の要素は要求されない、または存在してもしなくてもよいことを示している。
【０１２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形の「１つ（ａ）」、「１種（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容からそうでないことが明らかでない限り、複数の参照物を含む。本明細書の特定の態様で使用されるように、数値の前にあるときの「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、その値プラスまたはマイナス５％、６％、７％、８％または９％の範囲の値が含まれることを示す。他の態様では、数値の前にあるときの「約」または「およそ」という用語は、その値プラスまたはマイナス１０％、１１％、１２％、１３％または１４％の範囲の値が含まれることを示す。さらに他の態様において、数値の前にあるときの「約」または「およそ」という用語は、その値プラスまたはマイナス１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％の範囲の値が含まれることを示す。
【０１２１】
本明細書を通じて、「一態様」または「態様」または「ある局面」を参照することは、その態様に関連した特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの態様に含まれることを意味する。したがって、本明細書の様々な箇所に出現する「一態様において」または「態様において」という表現は、必ずしもすべて同じ態様を指しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の態様において、任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【実施例】
【０１２２】
実施例１．人工的なペプチド組成物に対する二次インビトロＴ細胞応答によるライム病の検出および治療の有効性のモニタリング
この実施例では、個々のボレリア菌種タンパク質の領域に由来し、複数ペプチド混合物に含まれる特異的ペプチドが、ＬＤ患者から得られた活性型Ｔ細胞によるインビトロでのインターフェロン−γ産生を誘導する能力を評価することについて説明する。特に、ボレリア菌種特異的ペプチドからなる混合物が、最初期のＢ．ブルグドルフェリ感染患者から得た血液試料中のライム病特異的活性型Ｔ細胞によるインビトロにおけるインターフェロンγ放出を誘導する能力について試験した。インビトロでのインターフェロン−γ産生のレベルは、抗生物質治療の直前の第１の時点でＬＤ患者から採取したＴ細胞、および患者を効果的に抗生物質で治療してから約６０日後の第２の時点で採取したＴ細胞についてもまた測定した。
【０１２３】
［材料および方法］
ライム病特異的タンパク質ペプチドの選択および調製。ボレリア・フラジェリン（ＦｌａＢ）、デコリン結合タンパク質（ＤｂｐＢ）、共通抗原（ｐ６６）および細胞表層タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）は、哺乳動物に感染すると、異なる時点でボレリア菌種の表面に豊富に発現する。具体的には、ＦｌａＢは、感染の播種後期および早期限局期で多く発現する鞭毛の主要なフィラメントタンパク質である。ＤｂｐＢはダニの摂食行動中および／または感染直後に発現が上昇し、感染の早期限局期に現れるアドヘシンであり、そしてｐ６６は免疫細胞への細菌付着を促進し、感染の蔓延後に発現するインテグリン結合タンパク質である。さらに、ＯｓｐＣの発現は早期限局期に見られ、哺乳動物感染を確立するために必須であると考えられている。また、ＯｓｐＣ特異的抗体は早期ヒトＬＤにおける主要な抗体である。ボレリア菌種ＦｌａＢ、ＤｂｐＢ、ｐ６６およびＯｓｐＣはそれぞれ、ＬＤスピロヘータによる感染に応答して産生される抗体を検出するために信頼性をもって使用されている。
【０１２４】
これらのボレリアタンパク質（表２〜３）の各々から選択されたボレリア特異的ペプチド領域を含むペプチドの混合物が、ライム病スピロヘータに感染した直後のＬＤ患者から得た末梢血試料中のＴ細胞を活性化させる能力について評価した。ＬＤ関連Ｔ細胞を刺激可能性のあるペプチド組成物の特異性を高めるために、最初に、完全長タンパク質配列をＢＬＡＳＴアルゴリズムによって分析して、適切なボレリア特異的領域を同定した（表４）。次に、各タンパク質内の特異的領域から合成ペプチドを合成した。各ペプチドは約１５〜２５アミノ酸長で、１０〜１５個のアミノ末端が重複しているものとした（表３）。
【０１２５】
患者の登録。その後、ダニ曝露およびその後の紅斑性移行（ＥＭ）と一致する特徴を有する皮膚病変の発症を特徴とする初期のライム病が疑われる患者に、概念実証研究への参加を要請した。各ボランティアからインフォームド・コンセントを得て、各対象は、少なくとも１０日間、１日２回１００ｍｇのドキシサイクリンでの治療を必要とする、ライム病の推定診断を得た。ただし、１人の対象（＃６）だけは単回治療とした。
【表４】
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【０１２６】
血液試料の採取と処理。治療前（初期提示）および治療後６０日間の通院中、血液試料を上部が緑色の（リチウム−ヘパリン）チューブに収集し、速やかに処理した。１本のチューブの血液は、遠心分離して血漿を分離し、分離した血漿を取り出し、試験まで−８０℃で保存した。分離した１ｍｌ容量の血液を、表３に示したボレリアペプチド（配列番号１〜３３）を１μｇずつ含む、３３種のボレリアペプチドのプール１０μｌ容量を予め装填した滅菌発熱物質を含まないチューブ（セレスティス社、カーネギー、ビクトリア、オーストラリア）に直ちに移した。さらに、別の１ｍｌ容量の血液を、ペプチドを含まないか（ｎｉｌ）、またはマイトジェン対照を予め装填した分離チューブに加えた。各チューブの内容物をしっかりと混合し、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。
【０１２７】
インターフェロンγの検出。インキュベーション後、３０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞を除去することで血漿を採取し、血漿中のインターフェロン−βのレベルを、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢＧｏｌｄＥＬＩＳＡキット（セレスティス社）を用い、製造業者の説明に従って、免疫化学的に定量した。ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）アッセイは、結核（ＴＢ）患者から得られた血液試料を、得られた二次インビトロ活性型Ｔ細胞（特定のマイコバクテリアへの暴露によって刺激されているＴ細胞）によって産生されたＩＦＮ−γを検出することによって、結核菌の感染を確認するために確立された検定である。本明細書では、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）プラットフォームを、結核菌の代わりに、Ｂ．ブルグドフェリへの感染に応答して活性化されたＴ細胞によって産生されたＩＦＮ−γも検出するために使用した。血漿試料を評価する前に、有意な反応のカットオフ値を、ライム病の病歴または疑いがない８人のボランティア対象由来の血清を試験することにより、最初に決定した。血液を静脈穿刺により採血して凝血塊活性化管に入れ、血清を取り出して直ちに試験した。次いで得られた値の平均を計算し、平均値（０．４５２以上）より大きいＯＤ値＞２の標準偏差を有意（「ａ」）とした。
【０１２８】
ＬＤの血清診断検査。一対（同じ対象からの治療前および治療後）の血漿試料について、抗Ｃ６抗体およびウェスタンブロット反応性についても試験した。抗Ｃ６抗体は、既に記載があるようにＥＬＩＳＡによって検出した（Ｊｏｂｅら、２００８、ボレリア・ブルグドフェリＯｓｐＣのボレリア酸抗体エピトープを使用したペプチド−酵素結合免疫吸着アッセイによる初期ライム病診断の正確性に関する著しい改善（Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｏｒｒｅｌｉａｃｉｄａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＣ．）、臨床およびワクチン免疫学（Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）１５：９８１−９８５）。評価の前に、有意な反応のカットオフ値を、ＬＤの病歴または疑いがないボランティア対象由来の、十分に特徴が分かっている１５の血清を試験することによって決定した。血液を静脈穿刺により採血して凝血塊活性化管に入れ、血清を取り出して直ちに試験した。得られた光学密度（ＯＤ）値の平均（平均ＩｇＭ≧０．５３４、ＩｇＧ≧０．１４０）を計算し、ＯＤ値＞２の標準偏差を有意（「ａ」）とみなした。適切な陽性対照および正常対照血清も、ＥＬＩＳＡプレート上の別々のウェルに含めた。
【０１２９】
市販のキット（マーブロット（Ｍａｒｂｌｏｔ）（商標）、トリニティ・バイオテック、ブレー、ウィックロー、アイルランド）を用い、製造業者の推奨事項に従って、電気的に分離したボレリア抗原に対する血清免疫グロブリンのウエスタンイムノブロット反応性を検出した（モギリアンスキら、２００４、臨床および診断における実験免疫学（Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）１１：９２４）。疾病対策センター（ＣＤＣ、アトランタ、ジョージア、米国）が推奨する基準（ＩｇＭ−２３、３９または４１のバンドのうちの少なくとも２本が検出される、ＩｇＧ−１８、２３、２８、３０、３９、４１、４５、５８、６６、または９３のバンドのうちの少なくとも５本が検出される）を用い、陽性率を決定した。
【０１３０】
結果
研究コホート。合計２１人の患者（１８歳以上）が試験を完了した。それぞれの患者は、シカダニ（Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）に咬まれた形跡があるか調べられるか、または単一または複数の推定紅斑性移行部病変が検出される前の３０日以内にダニ刺咬が確認された。そして、１日だけ抗生物質治療（ドキシサイクリン）を受けた対象＃６を除き、それぞれの対象は、病気の早期段階でスピロヘータをうまく除去するためのおおよそ一般的な治療計画である（コワルスキら、２０１０、臨床感染症５０：５１２−５２０）、少なくとも１０日間のドキシサイクリンによる治療を受けた。治療をさらに効果的なものにするための支援として、回復期の血液試料を提供する時点で各対象にインタビューしたが、異常を訴えた患者はいなかった。
【０１３１】
ＬＤの血清診断検。最初に、各対象からの急性期および回復期の血清を、抗Ｃ６抗体またはウエスタンブロット反応性について評価して、各登録者がＢ．ブルグドルフェリに感染したことを血清診断によって確認した。１０名（４８％）の対象からの急性期血清には、有意なレベルのＩｇＭ抗Ｃ６抗体が含まれており、さらに２名の対象の血清が、回復期の間に抗体陽転した（表５）。加えて、１２人（５７％）の対象由来の急性血清にはＩｇＧ抗Ｃ６抗体が含まれており、ＩｇＧ抗体を産生している８人の患者ではＩｇＭ抗体も産生されていた。さらに、有意なレベルのＩｇＧ抗体が、その他４人の対象（１９％）の回復期血清で検出された。集団所見から、２１人の登録者のうち１７人（８１％）において、ライム病の血清診断検査が提供された。
【０１３２】
対照的に、わずか２名（１０％）の対象からの急性期血清が、Ｂ．ブルグドフェリ感染の確認に関する疾病管理センター（ＣＤＣ）基準を満たすのに十分なＩｇＭ抗体反応性を示した（表６）。さらに、その他４人の対象において、６０日後には応答が確認レベルまで（より反応性のＩｇＭおよびＩｇＧのバンド）上がった。ウエスタンブロットにより、２１人の登録者のうち６人（２９％）のみは、血清診断による確認が得られた。さらに、抗Ｃ６抗体が生成されなかった対象も、ウエスタンブロットによって陰性であった。４人（１９％）の対象では、Ｃ６試験およびウエスタンブロットの結果を組み合わせても、ＬＤの血清診断的確認が得られなかった。さらに意義深いことに、各試験手順によって検出された抗体のレベルは、ＬＤスピロヘータが抗生物質療法によってほぼ確実に排除されたにもかかわらず、治療後の回復期血清において高いことが多かった。したがって、Ｃ６試験またはウエスタンブロット試験は、治療が成功しているかどうかを正確に予測するものだと信頼できるものではなかった。
【表５】
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【表６】
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【０１３３】
ボレリアペプチドプールによるＴ細胞刺激後のインターフェロンγの検出。血清診断（前段を参照）によりＬＤに罹患していることが確認された１７名の対象から、疾患の急性期および回復期に採取した末梢血Ｔ細胞のインターフェロン−γのレベルを、表２に示す３３のボレリアペプチドのプールを使用して、インビトロ刺激後に放出されたＩＦＮ−γの免疫検出によって決定した。抗体検査では、急性期血清の提供源となった１０人（５９％）の対象（表５）のテストインキュベーション混合物において、有意なレベルのインターフェロンγが検出された（表７、急性、「＋」）。さらに、その他の、回復期（表７、回復期）以降の対象ではインターフェロンγ応答は検出されず、試料に含まれる抗体に関するＣ６およびウエスタンイムノブロット試験の所見とは対照的に、最初の１０人の陽性患者でも、インターフェロンγの応答は有意に減少した（ｎ＝４、表７、回復期、"＋"）か、またはＩＦＮ−γ応答はもはや検出不可能であった（ｎ＝６）。
【０１３４】
次いで、抗生物質治療後に採取された血液試料中に、検出可能に活性化されたＴ細胞が存在しないかどうか、つまり、そのようなＬＤの治療後のスピロヘータ除去を意味するかどうかの可能性を（ボレリアペプチドプールに応答するＩＦＮ−γ放出に基づいて）検討した。この問題に対応するために、抗生物質治療の直前に検出されたインターフェロン−γの反応性の平均値（図１、「治療前ＩＦＮ−γ」参照）を、治療後に検出されたインターフェロン−γの反応性の平均値（図１、「治療後ＩＦＮ−γ」）と比較した。治療の投与および症状の臨床的な解消と一致して、反応性の平均値が有意に低下した（ｐ値＝０．０００２）ことが認められた。これらの知見は、本明細書に開示のボレリアペプチドプールに対する二次インビトロ応答におけるＴ細胞によるインターフェロン−γ産生を定量することが、疾患の初期段階においてＬＤを確認するのに有用であるという強力な証拠となった。さらに、活性化されたＴ細胞は、抗生物質療法によってスピロヘータが上手く除去されたのと同時に急速に減少した。このことは、抗生物質治療後に採取したＴ細胞により、本明細書に記載のボレリアペプチドプールに応答して、テストインキュベーション混合物中で生成された検出可能なＩＦＮ−γのレベルの低下によって証明された。
【表７】
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【０１３５】
上述の様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。２０１５年９月２５日に出願された米国特許出願第６２／２３３，１９２号を含む、本明細書で言及するか、および／または出願データシートに列挙された全ての米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。必要に応じて態様の局面を変更し、様々な特許、出願および刊行物の概念を使用して、さらに別の態様を提供することができる。
【０１３６】
態様には、前述の詳細な説明に照らして、これらのおよびこの他の変更を行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示した特定の態様に限定するものと解釈されるべきではなく、そのような特許請求が適用される、想定可能な全ての態様の均等物の全てを含むと解釈される。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されるものではない。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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