(57)【要約】  本発明は、方法を提供し、この中で当該方法は、粒子へ付着した少なくとも１つの細菌株の集団を含むバイオフィルムを形成し、この中で、当該バイオフィルムは、それを必要とする対象によって摂取された時、当該対象の腸で少なくとも５日間コロニー形成するよう構成され、当該方法は、ａ．細菌の少なくとも１つの株を含む集団を得ること、ｂ．粒子を含有する成長培地に細菌の少なくとも１つの株を含む集団を接種すること、ｃ．当該粒子を、当該粒子へ付着するよう細菌の少なくとも１つの株の集団に十分な時間、少なくとも１つの細菌株を含む集団とともにインキュベートすること、およびｄ．当該粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株を含む集団を成長培地中で、バイオフィルムを形成するのに十分な時間培養することを含む。【選択図】なし
2018517430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法であって、
バイオフィルムを形成し、
前記バイオフィルムは粒子へ付着した少なくとも１つの細菌株の集団を含み、
前記バイオフィルムは、前記バイオフィルムを必要とする対象によって摂取される時、前記対象の腸で少なくとも５日間コロニー形成するよう構成され、前記方法は、
ａ．細菌の少なくとも１つの株を含む集団を得ること、
ｂ．細菌の少なくとも１つの株を含む前記集団を、粒子を含有する成長培地へ接種すること、
ｃ．前記粒子へ付着させるために、細菌の少なくとも１つの株の前記集団に対して十分な時間、前記粒子を少なくとも１つの細菌株を含む前記集団とともにインキュベートすること、および
ｄ．前記粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株を含む前記集団を成長培地中で、バイオフィルムを形成するのに十分な時間培養すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の前記集団は、フロー条件下で前記成長培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の前記集団は、静置条件下で前記成長培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の前記集団はまず、静置条件下で前記成長培地中で培養された後、フロー条件下で前記成長培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の前記集団は、嫌気性条件下で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の前記集団は、好気性条件下で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子は多孔性であり、種子、リン酸二カルシウム、およびセルロースからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの細菌株を含む前記集団は、腸細菌叢に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの細菌株を含む前記集団は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの細菌株を含む前記集団は、アセトバクター・ポモルム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｏｒｕｍ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法によって形成される前記バイオフィルムは、前記消化管における前記細菌バイオフィルムのｐＨ依存性標的指向化放出のために構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオフィルムは、細菌の２つ以上の株を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それらの全体的な内容が全体として参照により本明細書により組み込まれる２０１５年５月１１日出願の米国仮特許出願番号第６２／１５９，８４６号、および２０１５年５月１１日出願の米国仮特許出願番号第６２／１５９，８４９号に対する優先権を請求する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、消化管における細菌のバイオフィルムのｐＨ依存性標的指向化放出のために構成されたバイオフィルム形態における細菌の少なくとも１つの株を成長および封入するためのシステムおよび方法に関する。
【発明の概要】
【０００３】
一実施形態において、本発明は、方法を提供し、
この中で、当該方法はバイオフィルムを形成し、
この中で、当該バイオフィルムは、粒子へ付着した少なくとも１つの細菌株の集団を含み、
この中で、当該バイオフィルムは、それを必要とする対象によって摂取された時、当該対象の腸で少なくとも５日間コロニー形成するよう構成され、当該方法は、
ａ．細菌の少なくとも１つの株を含む集団を得ること、
ｂ．粒子を含有する成長培地に細菌の少なくとも１つの株を含む集団を接種すること、
ｃ．当該粒子を、当該粒子へ付着するよう細菌の少なくとも１つの株の集団に十分な時間、少なくとも１つの細菌株を含む集団とともにインキュベートすること、および
ｄ．当該粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株を含む集団を成長培地中で、バイオフィルムを形成するのに十分な時間培養することを含む。
【０００４】
一実施形態において、粒子へ付着した少なくとも１つの細菌株の集団を含むバイオフィルムは、動物の腸において認められるｐＨで、少なくとも１つの細菌株を放出するよう構成された化合物を用いて封入される。
【０００５】
一実施形態において、動物の腸において認められるｐＨで少なくとも１つの細菌株を放出するよう構成された化合物は、アルギン酸塩である。
【０００６】
一実施形態において、粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団は、フロー条件下で成長培地中で培養される。
【０００７】
一実施形態において、粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団は、静置条件下で成長培地中で培養される。
【０００８】
一実施形態において、粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団はまず、静置条件下で成長培地中で培養された後、フロー条件下で成長培地中で培養される。
【０００９】
一実施形態において、粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団は、嫌気性条件下で培養される。
【００１０】
一実施形態において、粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団は、好気性条件下で培養される。
【００１１】
一実施形態において、粒子は、多孔性であり、種子、リン酸二カルシウム、粘土、砂およびセルロースからなる群から選択される。
【００１２】
一実施形態において、少なくとも１つの細菌株を含む集団は、腸細菌叢に由来する。
【００１３】
一実施形態において、少なくとも１つの細菌株を含む集団は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）である。
【００１４】
一実施形態において、少なくとも１つの細菌株を含む集団は、アセトバクター・ポモルム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｏｒｕｍ）である。
【００１５】
一実施形態において、当該方法によって形成されるバイオフィルムは、消化管における細菌性バイオフィルムのｐＨ依存性標的指向化放出のために構成される。
【００１６】
一実施形態において、当該バイオフィルムは、細菌の２つ以上の株を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の一部の実施形態による方法により使用されるフローシステムを示す、本発明の例示的な実施形態の図を示す。
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｃは、本発明の一部の実施形態による方法によって生じるバイオフィルムに関する一部の例示的な実施形態の画像を示す。
【図２−２】図２Ａ〜図２Ｃは、本発明の一部の実施形態による方法によって生じるバイオフィルムに関する一部の例示的な実施形態の画像を示す。
【図２−３】図２Ａ〜図２Ｃは、本発明の一部の実施形態による方法によって生じるバイオフィルムに関する一部の例示的な実施形態の画像を示す。
【図２−４】図２Ａ〜図２Ｃは、本発明の一部の実施形態による方法によって生じるバイオフィルムに関する一部の例示的な実施形態の画像を示す。
【図３】図３は、本発明に関する一部の実施形態によるバイオフィルムの酸性耐性を示す。
【図４】図４は、本発明に関する一部の実施形態による別のバイオフィルムの酸性耐性を示す。
【図５】図５は、本発明に関する一部の実施形態によるバイオフィルムの凍結乾燥に対する耐性を示す。
【図６】図６は、本発明に関する一部の実施形態による別のバイオフィルムの酸性耐性を示す。
【図７】図７は、示される組成を用いた、動物モデルの腸でコロニー形成するための本発明に関する一部の実施形態によるバイオフィルムの能力を示す。
【図８】図８は、本発明に関する一部の実施形態によるバイオフィルムからの細菌のｐＨ依存性放出を示す。
【図９】図９は、動物モデルの腸でコロニー形成するための本発明に関する一部の実施形態による別のバイオフィルムの能力を示す。
【図１０】図１０は、他の方法を用いて形成された他のバイオフィルムと比較した、動物モデルの腸でコロニー形成するための本発明に関する一部の実施形態による別のバイオフィルムの能力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
開示の明確性のために、および制限としてではなく、本発明の詳細な説明は、本発明のある特定の特長、実施形態または出願を説明または例証する以下の部分節へと分割される。
【００１９】
本明細書および特許請求の範囲のいたるところで、以下の用語は、別段の明確な記載がない限り、本明細書に明白に関係する意味を取る。本明細書で使用される「一実施形態において」および「一部の実施形態において」という句は、同じ実施形態（複数可）を指すとは必ずしも限らないが、そうであることがある。さらに、本明細書で使用される「別の実施形態において」および「一部の他の実施形態において」という句は、異なる実施形態を指すとは必ずしも限らないが、そうであることがある。したがって、以下に説明するように、本発明の種々の実施形態は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、容易に組み合わされ得る。
【００２０】
さらに、本明細書で使用される場合、「または」という用語は、包括的「または」演算子であり、別段の明確な記載がない限り「および／または」という用語と等価である。「を基にした」という用語は、排他的ではなく、別段の明確な記載がない限り、説明されていない追加の因子を基にすることができる。さらに、本明細書のいたるところで、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味には複数の参照が含まれる。「における（ｉｎ）」という意味には、「における（ｉｎ）」および「に関する（ｏｎ）」が含まれる。
【００２１】
一部の実施形態において、本発明は、消化管における細菌バイオフィルムのｐＨ依存性標的指向化放出のために構成される、バイオフィルムの形態で細菌の少なくとも１つの株を成長させるおよび封入するためのシステムおよび方法に関する。
【００２２】
一実施形態において、本発明は方法を提供し、
この中で、当該方法はバイオフィルムを形成し、
この中で、当該バイオフィルムは、粒子へ付着した少なくとも１つの細菌株の集団を含み、
この中で、当該バイオフィルムは、それを必要とする対象によって摂取される時、当該対象の腸で少なくとも５日間コロニー形成するよう構成され、当該方法は、
ａ．細菌の少なくとも１つの株を含む集団を得ること、
ｂ．粒子を含有する成長培地に細菌の少なくとも１つの株を含む集団を接種すること、
ｃ．当該粒子を、少なくとも１つの細菌株を含む集団とともに、当該粒子へ付着するよう細菌の少なくとも１つの株の集団に対して十分な時間インキュベートすること、および
ｄ．当該粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株を含む当該集団を成長培地中で、バイオフィルムを形成するのに十分な時間培養すること
を含む。
【００２３】
一部の実施形態において、粒子へ付着させるための細菌の少なくとも１つの株の集団に対して十分な時間は、２時間〜１２時間である。一部の実施形態において、粒子へ付着させるための細菌の少なくとも１つの株の集団に対して十分な時間は、２時間である。一部の実施形態において、粒子へ付着させるための細菌の少なくとも１つの株の集団に対して十分な時間は、４時間である。一部の実施形態において、粒子へ付着させるための細菌の少なくとも１つの株の集団に対して十分な時間は、６時間である。一部の実施形態において、粒子へ付着させるための細菌の少なくとも１つの株の集団に対して十分な時間は、８時間である。一部の実施形態において、粒子へ付着させるための細菌の少なくとも１つの株の集団に対して十分な時間は、１０時間である。一部の実施形態において、粒子へ付着させるための細菌の少なくとも１つの株の集団に対して十分な時間は、１２時間である。
【００２４】
一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、１２時間〜４８時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、１２時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、１４時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、１６時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、１８時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、２０時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、２２時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、２４時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、２６時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、２８時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、３０時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、３２時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、３４時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、３６時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、３８時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、４０時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、４２時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、４４時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、４６時間である。一部の実施形態において、バイオフィルムを形成するのに十分な時間は、４８時間である。
【００２５】
一部の実施形態において、粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団は、成長培地中でフロー条件下で培養される。本明細書で使用される場合、「フロー条件」という用語は、表面に付着した細菌に関する培地の移動を指し、培地の移動は、細菌にかかる剪断力を発揮する。
【００２６】
いかなる特定の理論に制限されるよう意図することなく、フロー条件下で粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団を培養することは、成長するバイオフィルムにかかる等しい緩徐な剪断力をつくり、バイオフィルムの迅速な作製を亢進する（例えば、典型的な静置成長法と比較してより短期間で）。一部の実施形態において、流動システムは、成長するバイオフィルムへの新鮮培地の導入、および細菌老廃物の除去を可能にする。
【００２７】
一部の実施形態において、フロー条件は、１０ｍｌ／時〜１００ｍｌ／時の流量を含む。一部の実施形態において、フロー条件は、２０ｍｌ／時の流量を含む。一部の実施形態において、フロー条件は、３０ｍｌ／時の流量を含む。一部の実施形態において、フロー条件は、４０ｍｌ／時の流量を含む。一部の実施形態において、フロー条件は、５０ｍｌ／時の流量を含む。一部の実施形態において、フロー条件は、６０ｍｌ／時の流量を含む。一部の実施形態において、フロー条件は、７０ｍｌ／時の流量を含む。一部の実施形態において、フロー条件は、８０ｍｌ／時の流量を含む。一部の実施形態において、フロー条件は、９０ｍｌ／時の流量を含む。一部の実施形態において、フロー条件は、１００ｍｌ／時の流量を含む。一部の実施形態において、フロー条件は、１０ｍｌ／時の流量を含む。
【００２８】
一部の実施形態において、フロー条件は、９０〜１５０ｒｐｍで細菌の培養物を振盪することを含む。一部の実施形態において、フロー条件は、１００ｒｐｍで細菌の培養物を振盪することを含む。一部の実施形態において、フロー条件は、１１０ｒｐｍで細菌の培養物を振盪することを含む。一部の実施形態において、フロー条件は、１２０ｒｐｍで細菌の培養物を振盪することを含む。一部の実施形態において、フロー条件は、１３０ｒｐｍで細菌の培養物を振盪することを含む。一部の実施形態において、フロー条件は、１４０ｒｐｍで細菌の培養物を振盪することを含む。一部の実施形態において、フロー条件は、１５０ｒｐｍで細菌の培養物を振盪することを含む。
【００２９】
一部の実施形態において、フロー条件下で粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団を培養することは結果的に、典型的な方法と比較して短期間で頑強なおよび健常なバイオフィルムを産生することになる（例えば、５、１０、２０、２５、５０％未満の時間だがこれらに限定されない）。一部の実施形態において、結果として生じるバイオフィルムは、他の培養方法と比較した時、過酷な条件に対する回復力が亢進し、本明細書でさらに詳述される。
【００３０】
図１に関して、本発明の一部の実施形態によるフローシステムを示す本発明の例示的な実施形態の図を示す。図１に関して、当該システムには、バイオフィルムの培養のための固体粒子、成長培地源、容器の内外に成長培地を導くチューブ、およびチューブを通じて培地を移動させるポンプを含有する容器が含まれる。容器からの流体出口は、再利用のために培地貯蔵器へと戻ることができ、または排液することができる。一部の実施形態において、このフローシステムは、閉鎖型、開放型、または半閉鎖型であることができる。図１における時計回りに移動する矢印は、フロー方向を表し、説明目的のためにのみある。
【００３１】
一部の実施形態において、粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団は、成長培地中で静置条件下で培養される。本明細書で使用される場合、「静置条件」という用語は、細菌に発揮される剪断力がない培養条件を指す。
【００３２】
一部の実施形態において、粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団は、成長培地中でまず静置条件下で培養された後、成長培地中でフロー条件下で培養される。
【００３３】
一部の実施形態において、粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団は、嫌気性条件下で培養される。本明細書で使用される場合、「嫌気性条件」という用語は、遊離酸素または結合酸素の非存在を含む培養条件を指す。
【００３４】
一部の実施形態において、粒子へ付着した細菌の少なくとも１つの株の集団は、好気性条件下で培養される。本明細書で使用される場合、「好気性条件」という用語は、遊離酸素または結合酸素の存在を含む培養条件を指す。
【００３５】
粒子
一部の実施形態において、粒子は、多孔性であり、種子、リン酸二カルシウム、粘土、砂、およびセルロースからなる群から選択される。
【００３６】
一部の実施形態において、種子は、ザクロ種子、およびパッションフルーツ種子からなる群から選択される。一部の実施形態において、種子は粉砕される。
【００３７】
一部の実施形態において、セルロース粒子は、商標名ＡＶＩＣＥＬ（登録商標）の元で販売されるセルロースを含む。一部の実施形態において、セルロース粒子は、商標名ＳＯＬＫＡ（登録商標）の元で販売されるセルロースを含む。
【００３８】
一部の実施形態において、複数の粒子は、本発明の一部の実施形態によるバイオフィルムを形成する方法において使用される。一部の実施形態において、粒子は、直径５ミクロン〜１ｃｍに及ぶ。一部の実施形態において、粒子は、直径５ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径１０ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径１５ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径２０ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径３０ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径４０ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径５０ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径６０ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径７０ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径８０ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径９０ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径１００ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径２００ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径３００ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径４００ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径５００ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径６００ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径７００ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径８００ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径９００ミクロンである。一部の実施形態において、粒子は、直径１ｃｍである。
【００３９】
細菌株
一部の実施形態において、少なくとも１つの細菌株を含む集団は、腸内細菌叢に由来する。
【００４０】
一部の実施形態において、少なくとも１つの細菌株を含む集団は、生菌株である。本明細書で使用される場合、「生菌の」という用語は、微生物の成長を刺激する細菌株、特に有益な特性を有するもの（腸内細菌叢のものなど）を指す。
【００４１】
一部の実施形態において、少なくとも１つの細菌株を含む集団は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）である。
【００４２】
一部の実施形態において、少なくとも１つの細菌株を含む集団は、アセトバクター・ポモルム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｏｒｕｍ）である。
【００４３】
一部の実施形態において、当該方法によって形成されるバイオフィルムは、消化管における細菌バイオフィルムのｐＨ依存性標的指向化放出のために構成される。
【００４４】
一部の実施形態において、当該バイオフィルムは、細菌の２つ以上の株を含む。
【００４５】
図２Ａは、本発明の方法によって生じるバイオフィルムの一部の例示的な実施形態の画像を示す。一部の実施形態において、生菌を成長させるのに適した固体粒子のうちのいくつかのタイプはすでに検査されており、その結果を本明細書に示す。図２Ａは、例えば、パッションフルーツ種子、ザクロ粉砕種子、ベントナイト粘土、砂粒子、白土、ＳＯＬＫＡ繊維、リン酸二カルシウム（ＤＣＰ）、ＡＶＩＣＥＬなど、異なる固体粒子上で成長したラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）バイオフィルムの顕微鏡画像を示す。白土は例外として、細菌は、すべての粒子タイプ上で成長する。
【００４６】
図２Ｂは、パッションフルーツ粉砕種子、ザクロ粉砕種子、および砂の上でアセトバクター・ポモルム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｏｒｕｍ）のバイオフィルム成長を示す、本発明の方法によって生じるバイオフィルムの一部の例示的な実施形態の画像を示す。アセトバクター・ポモルム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｏｒｕｍ）は、ザクロ粉砕種子の上で成長し、バイオフィルムを形成した。しかしながら、砂の上では観察された成長はほんのわずかであった。アセトバクター・ポモルム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｏｒｕｍ）は、パッションフルーツ種子の上では成長しなかった。検査した他の細菌種、例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種は、図２Ｃに示すように、検査した固体粒子の上では成長しなかった。
【００４７】
理論によって結び付けられることなく、様々な粒子は、孔径、表面の粗さ、粒子において入手可能な栄養物質、粘性、表面帯電など、種々の種類の粒子上に付着して成長する種々の細菌の能力に影響し得る、細菌の成長する区別できる微小環境を提供する。
【００４８】
本発明の方法の一部の実施形態において、当該方法は、
【００４９】
生菌の少なくとも２つの株（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などだがこれらに限定されない）を含有するバイオフィルムを生じ、ここで、当該バイオフィルムは、少なくとも２つの異なる粒子の組み合わせ（例えば、パッションフルーツ種子、ザクロ粉砕種子、などだがこれらに限定されない）を用いて生じる。一部の実施形態において、このような組み合わせをつくるために、成長条件（および例えば、粒子（複数可）のタイプだがこれに限定されない）は、バイオフィルムを生じるうえでの使用のための株（複数可）により選択される。例示的な実施形態において、２つの細菌株が結局、バイオフィルムを生じるよう組み合わされるであろう場合、細菌株の各々は、各株の成長に最も適した粒子を用いて成長するであろう。一部の実施形態において、２つ以上の細菌株を個別に成長させる時、細菌株は、封入過程の間に組み合わされる。
【００５０】
処置
一部の実施形態において、バイオフィルムは、それを必要とする動物へ、バイオフィルムを用いて動物の腸にコロニー形成するよう投与される。
【００５１】
一部の実施形態において、粒子へ付着した少なくとも１つの細菌株の集団を含むバイオフィルムは、動物の腸において認められるｐＨで少なくとも１つの細菌株を放出するよう構成された化合物を用いて封入される。
【００５２】
一部の実施形態において、動物の腸において認められるｐＨで少なくとも１つの細菌株を放出するよう構成された化合物は、アルギン酸塩である。
【００５３】
一部の実施形態において、動物の腸において認められるｐＨは、ｐＨ８である。
【００５４】
一部の実施形態において、バイオフィルムは、それを必要とする動物へ、腸にコロニー形成するのに十分な量で投与される。一部の実施形態において、コロニー形成は、動物の糞便中に投与後少なくとも５日間存在する細菌の少なくとも１つの集団の存在によって確認される。
【００５５】
一部の実施形態において、バイオフィルムに由来するコロニー形成した細菌は、哺乳類動物の腸に少なくとも１週間（２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間などだがこれらに限定されない）存在することができる。一部の実施形態において、バイオフィルムに由来するコロニー形成した細菌は、哺乳類動物の腸内で持続可能であり、すなわち、３日後に死滅することはない。
【００５６】
一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０４〜２×１０９個で、１〜５日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０４〜２×１０６個で、１〜５日間である。
【００５７】
一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０４個で、５日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０５個で、５日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０６個で、５日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０７個で、５日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０８個で、５日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０９個で、５日間である。
【００５８】
一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０４個で、４日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０５個で、４日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０６個で、４日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０７個で、４日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０８個で、４日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０９個で、４日間である。
【００５９】
一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０４個で、３日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０５個で、３日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０６個で、３日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０７個で、３日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０８個で、３日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０９個で、３日間である。
【００６０】
一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０４個で、２日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０５個で、２日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０６個で、２日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０７個で、２日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０８個で、２日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０９個で、２日間である。
【００６１】
一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０４個で、１日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０５個で、１日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０６個で、１日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０７個で、１日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０８個で、１日間である。一部の実施形態において、腸でコロニー形成するのに十分な量は、１日あたり２×１０９個で、１日間である。
【００６２】
一部の実施形態において、十分な量は、単一の粒子上に投与される。あるいは、十分な量は、複数の粒子上に投与される。
【００６３】
一部の実施形態において、十分な量は、食物と混合され、摂取される。
【００６４】
一部の実施形態において、バイオフィルムは、動物へ、バイオフィルムが培養された直後に投与される。あるいは、バイオフィルムは投与前に保存され得る。バイオフィルムは凍結保存され得、またはそれに代わるものとして、凍結乾燥した形態であり得る。
【００６５】
以下の実施例に対する参照が次になされ、当該実施例は、先の説明とともに、非限定的な様式で本発明の一部の実施形態を例証する。
【００６６】
実施例
実施例１：本発明の一部の実施形態によるバイオフィルムの酸性耐性
先に説明したような流動システムにおける固体粒子上で成長したバイオフィルムの回復力を検査した。具体的には、検査した第一のパラメータは酸性耐性であったが、本結果を図３に示す。
【００６７】
Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の一晩培養物を、マトリックス容器の中の２５％ＭＲＳ培地（バイオフィルムの形成を進めるために飢餓条件（すなわち、１００％未満の濃度の成長培地）を使用した）中に浸漬したザクロマトリックス中に接種し、２．５時間放置したままにしておき（すなわち、混合しない）、次にフローシステムを開始した。培地を培地貯蔵器からマトリックス容器へと、ペリスタポンプを用いて、１２ｍｌ／時の速度で５日間の持続期間で移動させた。この培地は再利用しなかった。新鮮培地は培養物に入り、使用した培地を出口で排液した。対照として、プランクトンで成長させた細菌（すなわち、粒子へ付着していない）を使用し、結果的にバイオフィルムの形成がなかった。プランクトン対照について、４〜５コロニーのＬ．プランタルムを１００％ＭＲＳブロス６ｍｌ中へ接種し、３７℃で一晩、インキュベーターの中に放置したままにしておいた。
【００６８】
酸性耐性を検査するために、ＰＢＳを有する一連のバイアルを、上昇するｐＨに対してｐＨ１、２、３にするために前もって調製しておいたＨＣｌ（ストック溶液０．５Ｍ）を用いて調整し、バイオフィルムを有する粒子２グラムをこれらの複数のバイアルへと移し、１時間インキュベートした。細菌を次にＰＢＳ中で洗浄し、５マイクロリットルを図３に示すように播種した。
【００６９】
プランクトン対照については、一晩培養物由来の１００μｌをｐＨバイアル中へと取り、１時間インキュベートし、細菌を次にＰＢＳで洗浄し、５マイクロリットルを図３に示すように播種した。図３に示すように、バイオフィルム細菌は、ｐＨ２で十分残存したので酸性に対するより大きな回復力を示すのに対し、プランクトン細菌は残存しなかった。
【００７０】
いかなる特定の理論に制限されるよう意図することなく、胃の中のｐＨは、約ｐＨ２である。したがって、バイオフィルムを対象へ投与する際、バイオフィルムは対象の胃の環境（すなわち、ｐＨ２）を残存し、対象にコロニー形成する。
【００７１】
実施例２：本発明の一部の実施形態による別のバイオフィルムの酸性耐性
第二のセットの実験を実施し、酸性に対する細菌の回復力（すなわち、バイオフィルムの形態における）が図４において説明され、以下の表１および表２に示されることを実証する。
【００７２】
Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の一晩培養物を、２５％ＭＲＳ培地（飢餓条件）中に浸漬した７グラムのザクロ（ＰＯＭ）種子粒子へと接種し、２．５時間放置したままにしておいた。次に、流動システムを５日間、最高速度（約３８０ｍｌ／時）で培地を移動させるペリスタポンプを用いて実施した。本実験において、培地を再利用して、非流動／静置対照と比較した。プランクトン対照については、４コロニーのＬ．プランタルムを６ｍｌの１００％ＭＲＳブロス中に接種し、３７℃で一晩＋５時間、インキュベーター中に放置した。結果を表１および表２に示す。
【表１】
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【表２】
2018517430.tif 000004
【００７３】
図４に示されるように、プランクトン細菌は、ｐＨの低下へ曝露される時、残存の低下を示した。
【００７４】
実施例３：本発明の一部の実施形態によるバイオフィルムの再構成
アルギン酸塩において成長および捕捉したバイオフィルムは乾燥後に収集した。Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を２５ｍｌの１００％ＭＲＳ＋２ｇｒのＰＯＭの中で室温で４日間成長させ、バイオフィルムを形成した。プランクトン対照のために、Ｌ．プランタルムを２５ｍｌの１００％ＭＲＳの中で室温で４日間成長させた。ＰＯＭ＋バイオフィルムの一試料および対照を連続希釈においてＭＲＳプレート上に播種した。各々の別の試料を簡潔に遠心分離し、５ｍｌの凍結乾燥緩衝液中に再懸濁し、２４時間凍結乾燥させ、２５ｍＬのＭＲＳ中に懸濁した。この段階（凍結乾燥後だがさらなる成長の前）で、試料を連続希釈によって播種した。試料の残りをさらに４８時間成長させておき、再度播種した。図５に示すように、固体粒子上でバイオフィルムとして成長した細菌は、耐性の亢進および凍結乾燥に対する残存（すなわち、乾燥後の再構成）を示した。
【００７５】
実施例４：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞の酸耐性
大腸菌株ＤＨ５αの酸耐性を３つの条件下で検査した。
１．プランクトン−振盪機において２０ｍｌのＬＢ開始剤中で大腸菌を２３℃で５日間成長させた。
２．バイオフィルム静置−異なるマトリックス２ｇｒを有する２０ｍｌのＬＢ中で大腸菌を静置条件下で３７℃で５日間成長させた。
３．バイオフィルムフロー−およそ１２ｍｌ／時の新鮮２５％ＬＢの速度でＤＣＰを含有するカラムフローシステム中で室温で５日間大腸菌を成長させた。試料をカラムの上部（空気の面に近い）およびカラムの下部から採取した。
【００７６】
大腸菌株ＤＨ５α開始剤を３７℃での振盪で一晩成長させた。開始剤からの１００μｌを以下へ移した。
１．２ｇｒのアビセル＋２０ｍｌのＬＢ−バイオフィルム静置培養用。
２．２ｇｒのソルカ繊維＋２０ｍｌのＬＢ−バイオフィルム静置培養用。
３．３ｇｒのＤＣＰ＋２０ｍｌのＬＢ−バイオフィルム静置培養用。
４．２０ｍｌのＬＢ−プランクトン培養用。
【００７７】
２ｍｌの一晩経過開始剤を２０ｍｌのＬＢへ移し、フローシステムのカラムに接種した。フローを２時間停止し、大腸菌をＤＣＰへ付着させておいた。２時間後、フローを室温で５日間オンにした。
【００７８】
５日間のインキュベーション後、静置実験由来のマトリックスの各々（ＤＣＰ、アビセルおよびソルカ）からの試料ならびにカラムの上部を形成するＤＣＰからの試料およびカラムの下部を形成するＤＣＰからの試料を採取し、５つの異なるエッペンドルフチューブ（「エッペンドルフ」）へと挿入した。この試料をＰＢＳで１回緩徐に洗浄した。
【００７９】
各試料から、次の量のマトリックスを２つのバイアルへと取った。
１．静置ＤＣＰ−０．０２ｇｒ
２．静置アビセル−０．０３ｇｒ
３．静置ソルカ−０．０２ｇｒ
４．フローＤＣＰ上部−０．０３ｇｒ
５．フローＤＣＰ下部−０．０３ｇｒ
【００８０】
各エッペンドルフの内容物をＰＢＳ×１で１回緩徐に洗浄した。各対のエッペンドルフ（各試料由来）について、１ｍｌのＰＢＳ×１（ｐＨ＝７．４）または１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ＝２）を添加した。エッペンドルフを横にして室温で１時間インキュベートした。次に、エッペンドルフを１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。１ｍｌのＰＢＳ×１を各エッペンドルフへ添加し、そのエッペンドルフをフルパワーで３０秒間ボルテックスして、細菌をマトリックスから遊離させた。
【００８１】
プランクトン培養物の取り扱い：１ｍｌの培養物をエッペンドルフへ移し、最大速度で２分間遠心分離した。上清を廃棄し、１ｍｌのＰＢＳを添加した。これ由来の１００μｌを以下へ添加した。
１．１ｍｌのＰＢＳ×１（ｐＨ７．４）含有エッペンドルフ
２．１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ＝２）含有エッペンドルフ
【００８２】
このエッペンドルフを横にして室温で１時間インキュベートし、このインキュベーション後、１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。１００μｌのＰＢＳ×１を各エッペンドルフへ添加した。
【００８３】
生存数計数：
各エッペンドルフからの１０μｌを９０μｌのＰＢＳ×１へ移した。７回の１：１０連続希釈を実施した。各希釈物からの３μｌをＬＢプレート上に播種し、インキュベーター中で一晩放置した。
【００８４】
計算は、プランクトンについての個／ｍｌ、または個／ｇｒを保有するよう次の通りとした。
【００８５】
マトリックスについて：コロニー数×１０希釈回数×３３３．３３×（１／採取ｇｒ）
【００８６】
プランクトンについて：コロニー数×１０希釈回数×３３３．３
【００８７】
本実験における材料はすべて、滅菌のためにオートクレーブ処理した。以下の表および図６に示す結果は、バイオフィルムが静置条件において細菌の酸耐性を亢進し、フロー条件におけるより大きな亢進を呈したことを実証する。
【表３】
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【表４】
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【００８８】
実施例５：本発明の一部の実施形態による組成物を用いたネズミ腸のコロニー形成
バイオフィルムとして成長した細菌が腸でコロニー形成する能力の亢進を示すかどうかを検査するために、バイオフィルムを先に説明する通り調製し、バイオフィルムをヌードマウスへ給餌した。マウス糞便中の細菌の存在を検査した。結果を図７に示す。
プロトコル：
１．６匹の無菌マウス
２．ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）をマトリックス上に成長させる。
３．マウス用の挽いた食餌を滅菌済みマトリックスのみと混合する（互いに挽いている）。
４．マウス用の挽いた食餌をマトリックス上のＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）バイオフィルムと混合する（互いに挽いている）。
５．マウス用の挽いた食餌をアルギン酸ビーズにおけるＬ．プランタルムバイオフィルムと混合する。
６．生死染色キット（生菌の存在を判定するため）。
７．対照マウス用のマトリックスをオートクレーブ処理。
８．マウスを３つの群へと分けた（各群２匹）：
ａ．対照−食餌＋マトリックスのみを供給されたマウス。
ｂ．バイオフィルム−食餌＋マトリックス上のバイオフィルムを供給されたマウス。
ｃ．バイオフィルムアルギン酸塩−食餌＋アルギン酸ビーズにおけるマトリックス上のバイオフィルムを供給されたマウス。
９．対応する食餌を７日間（Ｄ１〜Ｄ７）マウスに供給。
１０．８日後（Ｄ８）、９日後（Ｄ９）、１０日後（Ｄ１０）、１１日後（Ｄ１１）、１２日後（Ｄ１２）、１３日後（Ｄ１３）および１４日後（Ｄ１４）に糞便を試料採取。
１１．糞便試料中のＬ．プランタルムの存在をチェック。
１２．腸におけるＬ．プランタルムのバイオフィルムを撮影するために腸内部から切片を採取し、指定の染色キットを用いて生死について染色する。
【００８９】
図７は、細菌がマウスの腸でコロニー形成したことを示す。マウスの腸は、バイオフィルムに由来する細菌が３日間を超えて、実際、最長１４日間だがこれに限定せず、コロニー形成した。
【００９０】
実施例６：本発明の一部の実施形態による組成物由来の細菌のｐＨ依存性放出
ＤＣＰ上に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むバイオフィルムを、ＤＣＰを４％アルギン酸塩中のバイオフィルムと混合して、当該材料を有する液滴を２％ＣａＣｌ２溶液中へ滴下し、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を含むバイオフィルムを当該アルギン酸ビーズの上部に成長させることによって、アルギン酸塩中に封入した。結果として生じる組成物を次に、先の実施例１により処理した。結果を図８に示す。
【００９１】
ビーズをｐＨ＝２の溶液中へ挿入した時、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のみを放出した。ｐＨ＝８で、大腸菌およびＬ．プランタルムを当該ビーズから放出した。
【００９２】
実施例７：本発明の一部の実施形態によるＣ．ミヌタ（Ｃ．ｍｉｎｕｔａ）を含む組成物を用いたネズミ腸のコロニー形成
ザクロ種子上にＣ．ミヌタを含むバイオフィルムを、食餌と混合した本実験の１日後に２×１０７個の濃度で、特定病原体除去マウスへ１回付与した。糞便中のＣ．ミヌタの％について、糞便を１（生菌処理前）、２、４、７、１１および１５日後にチェックした。
【００９３】
動物を次の通り処理した（処理群当たり３匹）：
１．対照−食餌のみ（６ｇｒ）
２．対照−ザクロ粒（３ｇｒ）のみと混合した食餌（３ｇｒ）
３．実験−ザクロ粒（３ｇｒ）上のＣ．ミヌタバイオフィルムと混合した食餌（３ｇｒ）
【００９４】
本実験の初日に、ザクロ粒上のバイオフィルム中にある２×１０７のＣ．ミヌタ細胞（Ｃ．ミヌタ）、ザクロ粒（ＰＯＭのみ）または食餌のみ（ＨＦＤ）を特定病原体除去マウスに投与した。糞便試料を生菌処理前（１日後）、生菌処理の２日後、４日後、７日後、１１日後および１５日後に採取し、１６Ｓ配列決定へ送った。各糞便試料中の細菌の全体的な集団におけるＣ．ミヌタの百分率を算出した。結果を図９に示す。これらのデータは、糞便試料中のＣ．ミヌタの存在によって明らかにされるように、本実験が終了する時、Ｃ．ミヌタを含むバイオフィルムが最長１５日間マウスの腸にコロニー形成することができたことを示す。
【００９５】
実施例８：本発明の一部の実施形態による組成物を用いたネズミ腸のコロニー形成−他の方法との比較
Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を含むバイオフィルムを以下の条件概略により成長させ、１日当たり２×１０９個の濃度で特定病原体除去マウスに５日間ほど１回付与した。この時点の後、マウスに食餌のみをさらに５日間供給した。
【００９６】
動物を次の通り処置した（処置群当たり２匹）：
１．対照−食餌のみ
２．対照−粒子を有する食餌（ザクロ粒ＰＯＭ）のみ。
３．プランクトンＬ．プランタルムをＭＲＳブロス中で３７℃で振盪しながら一晩成長させた。
４．ザクロ粒（ＰＯＭ）上でのバイオフィルム静置−細菌を有する５ｇｒの粒子（およそ１０６個／日）（ＤＥ２０２０１３１０３２０４において説明される方法による）
５．ザクロ粒（ＰＯＭ）上でのバイオフィルムフロー−細菌を有する１．５ｇｒの粒子。
６．ザクロ粒（ＰＯＭ）上にあり凍結乾燥したバイオフィルムフロー−細菌を有する１．５ｇｒの粒子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，１４，３２１４−３２２２において説明される方法による）。
７．市販の生菌補助剤−１日当たり２錠を５日間
【００９７】
ラクトバチルスの量を、５日後（試料採取の最終日）、３日後および５日後（試料採取の終了後３および５日間）に採取したマウスの糞便のコロニー数を用いて定量化した。結果を図１０に示す。これらのデータは、本発明の方法により形成されたＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｍ）を含むバイオフィルムが、糞便試料中のＬ．プランタルムの存在によって明らかにされるように、本実験を終了する時、最長５日間マウスの腸にコロニー形成することができたことを示す。しかしながら、ＤＥ２０２０１３１０３２０４、またはＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，１４，３２１４−３２２２において説明される方法によって形成される組成物は、最長５日間、マウスの腸でコロニー形成することはできなかった。
【００９８】
本文書のいたるところで引用される公開物は、それらの内容が全体として参照により本明細書により組み込まれる。本発明の種々の態様は、実施例および好ましい実施形態に対する参照によって先に例証してきたが、本発明の範囲が上述の説明によってではなく、特許法の原理の下に適切に解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されることは認識されるであろう。
【図１】
2018517430.tif 000007
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018517430.tif 000016
【図８】
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【図９】
2018517430.tif 000018
【図１０】
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【国際調査報告】
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