(57)【要約】  本発明は、概して、目的タンパク質の増加した発現をもたらす核酸および遺伝子改変を有する細菌細胞、ならびにこれらを作製および使用する方法に関する。
2018505686.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’方向に、目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸配列に作動可能に連結された５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）核酸配列を含むＤＮＡ分子であって、５’ＵＴＲは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ａｐｒＥプロテアーゼ遺伝子から得られ、前記５’ＵＴＲは、前記５’ＵＴＲが作動可能に連結される前記ＧＯＩに対して異種である、ＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記５’ＵＴＲは、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥ遺伝子から得られる、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記５’ＵＴＲは、配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記５’ＵＴＲは、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記５’ＵＴＲは、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記５’ＵＴＲは、配列番号１７と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット。
【請求項８】
請求項７に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種である、請求項８、１０または１１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記目的の遺伝子は、酵素をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１６】
前記目的の遺伝子は、野生型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種酵素または変異型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種酵素をコードする、請求項１５に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１７】
前記酵素は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される、請求項１５に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１８】
前記酵素は、アミラーゼまたはプルラナーゼである、請求項１５に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１９】
配列番号３および１１〜１６からなる群から選択される配列と９０％の配列同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項２０】
配列番号３および１１〜１６からなる群から選択される配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項２１】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において目的タンパク質の発現を増加させる方法であって、好適な培地中で修飾バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を増殖させて前記目的タンパク質を発現させるステップを含み、前記修飾バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、５’から３’方向に、少なくとも（ｉ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のａｐｒＥ−５’ＵＴＲ、と（ｉｉ）前記目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む発現カセットを含むベクターで形質転換され、前記目的タンパク質の前記発現は、前記目的タンパク質をコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたａｐｒＥ−５’ＵＴＲを含まない親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞から発現された同じ目的タンパク質の発現に対して少なくとも５％だけ増加される、方法。
【請求項２２】
増幅のために５０ｐｐｍ以下のクロラムフェニコールを用いて、修飾バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞で目的タンパク質の発現を増加させる方法であって、好適な培地中で修飾バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を増殖させて前記目的タンパク質を発現させるステップを含み、前記修飾バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、５’から３’方向に、（ｉ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のａｐｒＥ−５’ＵＴＲと、（ｉｉ）前記目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む発現カセットを含むベクターで形質転換され、前記目的タンパク質の前記発現は、前記目的タンパク質をコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたａｐｒＥ−５’ＵＴＲを含まない親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞から発現された同じ目的タンパク質の発現に対して少なくとも５％である、方法。
【請求項２３】
前記ａｐｒＥ−５’ＵＴＲは、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
リボソームＲＮＡ遺伝子由来のプロモータをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記リボソームＲＮＡ遺伝子プロモータは、Ｐ１  ｒｒｎＢ、Ｐ１  ｒｒｎＩ、Ｐ２  ｒｒｎＩ、Ｐ１  ｒｒｎＥ、Ｐ２  ｒｒｎＥおよびＰ３  ｒｒｎＥからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
リボソームタンパク質遺伝子由来のプロモータをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記リボソームタンパク質遺伝子プロモータは、ＰｒｐｓＤ、Ｐ１  ｒｐｓＪ、Ｐ２  ｒｐｓＪおよびＰｒｐｏＤからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＬＡＴ（ＡｍｙＬ）遺伝子由来のプロモータをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記目的タンパク質を前記培地から回収するステップをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記目的タンパク質は、前記細菌から分泌される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記目的タンパク質は、前記細菌内に蓄積する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記目的タンパク質は、野生型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種酵素または変異型バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種酵素である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記目的タンパク質は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される酵素である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記酵素は、アミラーゼまたはプルラナーゼである、請求項３２又は請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年２月１９日に出願された現在係属中の米国仮特許出願第６２／１１８，３８２号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表の参照
「ＮＢ４０１７８ＷＯＰＣＴ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイル配列表の電子提出の内容は、２０１５年２月１７日に作成され、サイズは２７ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、概して、目的タンパク質の増加した発現をもたらす遺伝子改変を有する細菌細胞、ならびにこうした細胞を作製および使用する方法に関する。本発明の態様は、目的タンパク質の増加した発現をもたらす遺伝子改変を有する、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種などのグラム陽性微生物を含む。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子工学により、工業用バイオ反応器として、細胞工場として、および食品発酵において使用される微生物が改善されてきた。多くのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌を含むグラム陽性微生物が非常に多くの有用なタンパク質および代謝物の製造に使用されている（例えば、Ｚｕｋｏｗｓｋｉ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ｖａｌｕａｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，”：Ｄｏｉ  ａｎｄ  ＭｃＧｌｏｕｇｌｉｎ（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｉ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ．Ｍａｓｓ  ｐｐ  ３１１−３３７［１９９２］を参照）。工業で汎用されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌としては、限定はしないが、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。一般的な工業環境（とりわけ、例えば、洗剤用の酵素、バイオマス燃料生産）で使用される以外に、それらはＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）のステータスが与えられているため、これらのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌種は、食品および医薬品工業で使用するタンパク質を製造するための天然の候補である。グラム陽性微生物で産生されるタンパク質の例としては、限定はしないが、酵素、例えば、アミラーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ（またはセリン）プロテアーゼ、およびプルラナーゼが挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細菌宿主細胞でのタンパク質産生の理解が進んでいるとはいえ、目的タンパク質を高レベルで発現する新しい組み換え菌株の開発が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明は、組み換え（すなわち、遺伝子改変された）細菌（宿主）細胞、および目的タンパク質をコードする目的の遺伝子の増加した発現のための方法に関する。いくつかの他の実施形態では、本発明は、本開示の組み換え（修飾）細菌宿主細胞における１つまたは複数の目的タンパク質の増加した産生に関する。また別の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の目的タンパク質を発現および／または産生する細菌宿主細胞を修飾する方法に関する。いくつかの他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する驚くべき予想外の結果に関し、これらの結果は、特定の強力な５’ＵＴＲを目的の遺伝子と作動可能に組み合わせて使用することにより、目的の遺伝子のより高度な発現が達成されることを立証するものである。
【０００７】
従って、いくつかの実施形態では、本発明は、５’から３’方向に、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および目的の異種遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ分子に関する。他の実施形態では、本発明は、５’から３’方向に、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と目的の異種遺伝子のコード領域とを含むＤＮＡ分子に関し、ここで、５’ＵＴＲは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のａｐｒＥプロテアーゼ遺伝子から得られる。別の実施形態では、５’ＵＴＲは、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥ遺伝子から得られる。
【０００８】
従って、いくつかの実施形態では、目的の遺伝子を発現するのに使用するための本開示の５’ＵＴＲは、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ−５’ＵＴＲから得られる。いくつかの他の実施形態では、目的の遺伝子を発現するのに使用するための本開示の５’ＵＴＲは、配列番号２、配列番号９、配列番号１０または配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含む、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ−５’ＵＴＲから得られる。いくつかの他の実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号２、配列番号９、配列番号１０または配列番号１７に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、上記ＤＮＡ配列のいずれかを含むベクターに関する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、上に開示したＤＮＡ配列のいずれかを含むベクターを含む宿主細胞に関する。別の態様では、宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種である。別の態様では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される。別の態様では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。別の態様では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株である。
【００１１】
一態様では、目的の遺伝子は、酵素をコードする。別の態様では、酵素は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される。
【００１２】
本開示のいくつかの他の実施形態では、ＤＮＡ分子は、実施例１に記載の核酸配列、配列番号３（すなわち、配列番号３は、ネイティブＬＡＴプロモータ、ネイティブＬＡＴ５’ＵＴＲ、ネイティブＬＡＴシグナルペプチド配列およびネイティブＬＡＴ転写ターミネータと一緒に、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ＬＡＴ）遺伝子を含むＬＡＴ発現カセットである）と９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１３】
他の実施形態では、ＤＮＡ分子は、実施例２に記載の核酸配列、配列番号１１（すなわち、配列番号１１は、バチルス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）プルラナーゼ（ＰＵＬ）に作動可能に連結された配列番号２のａｐｒＥ−５’ＵＴＲを含み、ここで、プルラナーゼのＮ−末端１０４アミノ酸は欠失されており、本明細書において「ＰＵＬｍ１０４」と称する）と９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１４】
また別の実施形態では、ＤＮＡ分子は、実施例３に記載する核酸配列、配列番号１２（すなわち、配列番号１２は、５’から３’方向に、ｒｒｎｌＰ２プロモータ（配列番号２０）、これと作動可能に組み合わせたａｐｒＥ−５’ＵＴＲ（配列番号２）、これと作動可能に組み合わせた完全長ＬＡＴ  ＯＲＦ（すなわち、ＬＡＴシグナルペプチドおよび成熟ＬＡＴポリペプチドをコードする）を含む）と９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１５】
いくつかの他の実施形態では、ＤＮＡ分子は、実施例３に記載の核酸配列、配列番号１３（すなわち、配列番号１３は、５’から３’方向に、ｒｒｎｌＰ２プロモータ（配列番号２０）、これと作動可能に組み合わせたａｐｒＥ−５’ＵＴＲ（配列番号２）、これと作動可能に組み合わせたＬＡＴシグナルペプチド、これと作動可能に組合せたＰＵＬｍ１０４をコードするＯＲＦを含む）と９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１６】
いくつかの他の実施形態では、ＤＮＡ分子は、実施例４に記載の核酸配列、配列番号１４（すなわち、配列番号１４は、５’から３’方向に、ＬＡＴプロモータ、これと作動可能に組み合わせたａｐｒＥ−５’ＵＴＲ（配列番号２）、これと作動可能に組み合わせたＬＡＴシグナルペプチド、これと作動可能に組み合わせた成熟ＡｍｙＳ変異型ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む）と９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１７】
いくつかの他の実施形態では、ＤＮＡ分子は、実施例４に記載の核酸配列、配列番号１５（すなわち、配列番号１５は、５’から３’方向に、ＬＡＴプロモータ、これと作動可能に組み合わせたａｐｒＥ−５’ＵＴＲ（配列番号９；「Ｖ２ａｐｒＥ−５’ＵＴＲ」とも呼ばれる）、これと作動可能に組み合わせたＬＡＴシグナルペプチド、これと作動可能に組み合わせた成熟ＡｍｙＳ変異型ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む）と９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１８】
また別の実施形態では、ＤＮＡ分子は、実施例４に記載の核酸配列、配列番号１６（すなわち、配列番号１６は、５’から３’方向に、ＬＡＴプロモータ、これと作動可能に組み合わせたａｐｒＥ−５’ＵＴＲ（配列番号１０；「Ｖ３ａｐｒＥ−５’ＵＴＲ」とも呼ばれる）、これと作動可能に組み合わせたＬＡＴシグナルペプチド、これと作動可能に組み合わせた成熟ＡｍｙＳ変異型ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む）と９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１９】
具体的な実施形態では、ＤＮＡ分子は、配列番号１１の核酸配列を含む。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細菌において目的タンパク質の発現を増加させる方法に関し、これは、好適な培地中で形質転換バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細菌を増殖させて目的タンパク質を発現させるステップを含み、ここで、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細菌は、目的タンパク質をコードするＤＮＡと、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細菌のａｐｒＥプロテアーゼ遺伝子由来の５’ＵＴＲとを含む発現カセットを含むベクターで形質転換され、目的タンパク質の発現は、ａｐｒＥ−５’ＵＴＲを含まない発現カセットで形質転換されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細菌からの目的タンパク質の発現と比較して増加する。別の態様では、目的タンパク質を培地から回収する。一態様では、目的タンパク質は、細胞外に分泌される。別の態様では、目的タンパク質は、細胞内に蓄積する。
【００２１】
別の態様では、ＤＮＡ分子は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥ−５’ＵＴＲを含む。
【００２２】
別の態様では、ＤＮＡ分子は、リボソームＲＮＡ遺伝子由来のプロモータをさらに含む。別の態様では、リボソームＲＮＡ遺伝子プロモータは、Ｐ１  ｒｒｎＢ、Ｐ１  ｒｒｎＩ、Ｐ２  ｒｒｎＩ、Ｐ１  ｒｒｎＥ、Ｐ２  ｒｒｎＥおよびＰ３  ｒｒｎＥからなる群から選択される。別の態様では、ＤＮＡ分子は、リボソームタンパク質遺伝子由来のプロモータをさらに含む。別の態様では、リボソームタンパク質遺伝子プロモータは、ｒｐｓＤ、Ｐ１  ｒｐｓＪ、Ｐ２  ｒｐｓＪおよびシグマ因子プロモータｒｐｏＤからなる群から選択される。別の態様では、プロモータは、ＬＡＴ遺伝子由来のプロモータを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、相同性タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、異種タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、酵素である。いくつかの実施形態では、酵素は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本方法は、目的タンパク質を回収するステップをさらに含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本方法は、目的タンパク質が改変グラム陽性菌細胞により発現されるような条件下で改変グラム陽性菌細胞を培養するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、目的タンパク質を回収するステップをさらに含む。
【００２６】
本発明の態様は、前述した方法によって産生される改変グラム陽性菌細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】プラスミドｐＩＣａｔＨ−ＬＡＴｏｒｉ１を示す。
【図２】ベクターｐＨＰＬＴ−Ｂｌｉｃｈ−ｉｎｔ−カセットのマップを示す。
【図３】ベクターｐＫＢ３６０−ＡｐｒＥ−ＷＴ−ＡｍｙＳ変異体のマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の組成物および方法を詳細に説明する前に、以下の用語を明瞭化のために定義する。定義されていない用語および略語は、当該技術分野で用いられているその一般的な意味を付与すべきである。本明細書で別段の定義がなされていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。別段の記載がない限り、本開示の実施は、分子生物学、タンパク質工学、および微生物学で一般に使用されている普通の技術を含む。本明細書に記載するものと類似のまたは均等な任意の方法および材料が本開示の実施に有用であるが、一部の好適な方法および材料を本明細書に記載する。直後に定義する用語は、本明細書を全体として参照することにより、さらに詳しく説明される。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、文脈中に明らかな別段の記載がない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数形を含む。別段の記載がない限り、核酸配列は、５’から３’方向に、左から右に記載され；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に、左から右に記載される。反対の記載がなければ、本開示が、本明細書に記載する特定の方法、プロトコル、および試薬に限定されないことは理解されるであろう。
【００３０】
本明細書全体を通して与えられる全ての最大の数量的限界は、より小さい数量的限界が本明細書に明示的に記載されているのと同様に、より小さい全ての数量的限界を含むことが意図される。本明細書全体を通して与えられる全ての最小の数量的限界は、より大きい数量的限界が本明細書に明示的に記載されているのと同様に、より大きい全ての数量的限界を含む。本明細書全体を通して与えられる全ての数量的範囲は、より狭い数量的範囲が本明細書に明示的に記載されているのと同様に、より狭い全ての数量的限界を含む。
【００３１】
数値に関して本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、文脈中に別段の具体的定義がなされていない限り、その数値の＋／−０．５の範囲を指す。例えば、「約６のｐＨ値」という語句は、そのｐＨ値の別段の具体的定義がなされていない限り、５．５〜６．５のｐＨ値を指す。
【００３２】
別段の定義がなされていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本組成物および本方法が属する技術分野において、通常の知識を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本組成物および本方法を実施または試験する際に、本明細書に記載のものに類似のまたは均等な方法および材料を使用することができるが、ここで、代表的な、説明に役立つ方法および材料を記載する。
【００３３】
本明細書中に引用する刊行物および特許は全て、個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同様に、参照により本明細書に組み込まれ、また、関連して刊行物が引用される方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も出願日前の開示に対するものであり、先行発明であるとの理由で、本組成物および本方法がそのような刊行物に先行する資格がないことを承認していると解釈されるべきではない。さらに、記載される公開日は、実際の公開日と異なる場合もあるため、個別に確認する必要があり得る。
【００３４】
Ａ．定義
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、新たに導入された核酸配列の宿主または発現ビヒクルとして作用する能力を有する細胞を指す。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、例えば、グラム陽性宿主細胞バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種である。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」または「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種」は、当業者に周知の通りの「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属に属する全ての種を含み、限定はしないが、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられる。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、引き続き分類学的再構成を経ていることが認識されている。従って、この属は、再分類された種、例えば、限定はしないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称される「バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」などの生物を含む。酸素の存在下での耐性内生胞子の産生がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の典型的な特徴とみなされるが、この特徴は、近年名付けられたアリサイクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス属（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アニューリニバチルス属（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス属（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス属（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス属（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス属（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス属（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス属（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス属（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびビルジバチルス属（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にも適用される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、およびそれらの断片もしくは部分、ならびにゲノムまたは合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡを指し、これらは、センスもしくはアンチセンス鎖のいずれにも関係なく、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよい。遺伝コードの同義性の結果として、様々なヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されるであろう。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、細胞中に複製することができ、新たな遺伝子もしくはＤＮＡセグメントを細胞中に運ぶことができる任意の核酸を指す。従って、この用語は、様々な宿主細胞間の輸送のために設計された核酸構築物を指す。「発現ベクター」は、外来細胞において異種ＤＮＡ断片を組み込みかつ発現する能力を有するベクターを指す。多くの原核および真核ベクターが市販されている。「ターゲティングベクター」は、それが形質転換される細胞の染色体内の領域と相同的であり、かつその領域で相同組換えを駆動することができるポリヌクレオチド配列を含むベクターである。ターゲティングベクターは、相同組換えにより細胞の染色体に突然変異を導入する上で有用である。一部の実施形態では、ターゲティングベクターは、他の非相同的配列を含み、これは、例えば末端に付加される（すなわち、スタッファー配列またはフランキング配列）。末端は、ターゲティングベクターが、閉じた環、例えばベクター内への挿入などを形成するように閉じていてもよい。適切なベクターの選択および／または構築は当業者の知識の範囲内である。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「プラスミド」は、ベクターとして用いられ、多くの細菌および真核生物中で染色体外自己複製遺伝子エレメントを形成する環状二本鎖ＤＮＡ構築物を指す。一部の実施形態では、プラスミドは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
【００４０】
本明細書で定義されるとき、「ＬＡＴアミラーゼ」という用語は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ「ＡｍｙＬ」を指し、従って、これらの用語は置き換え可能に使用され得る。
【００４１】
「精製された」または「単離された」または「濃縮された」は、生体分子（例えば、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド）が、それが天然で結合している天然の構成成分の一部または全部からそれを分離することにより、その天然の状態から改変されていることを意味する。こうした単離または精製は、最終組成物中の不要な全細胞、細胞残屑、不純物、外性タンパク質、または酵素を除去するためのイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈殿もしくはその他のタンパク質塩沈殿、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動または勾配による分離などの当該技術分野で認識される分離技術によって達成することができる。さらには、続いて別の利益を付与する成分、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨを調節するための化合物、またはその他の酵素もしくは化学物質を精製または単離された生体分子組成物に添加することも可能である。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、用語「増大した」、「向上した」および「増加した」は、目的の生体分子（例えば、目的タンパク質）の発現に関して言うとき、本明細書で置き換え可能に用いられ、生体分子の発現が、本明細書の教示に従って改変されてはいないが、ほぼ同じ増殖条件下で増殖させた対応する宿主株（例えば、野生型および／または親株）における発現レベルを上回ることを示す。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「発現」という用語は、タンパク質に適用されるとき、遺伝子の核酸配列に基づいてタンパク質が産生されるプロセスであり、従って転写および翻訳の両方を含む。
【００４４】
細胞へポリヌクレオチドの導入に関連して本明細書で使用される場合、用語「導入された」は、細胞にポリヌクレオチドを輸送するのに好適な任意の方法を指す。こうした導入のための方法として、限定はしないが、プロトプラスト融合、トランスフェクション、形質転換、共役、および形質導入などが挙げられる（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，”ｉｎ  Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ｐａｇｅｓ  ５７−７２，［１９８９］を参照）。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「形質転換された」および「安定に形質転換された」という用語は、ポリヌクレオチド配列が人の介入により導入された細胞を指す。ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに組み込むことができるか、または少なくとも２つの世代にわたって維持されるエピソームプラスミドとして存在し得る。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「選択可能マーカー」または「選択マーカー」という用語は、宿主細胞で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指し、その核酸を含む宿主の選択を容易にする。そのような選択可能マーカーの例としては、限定はされないが、抗微生物剤が挙げられる。従って、「選択可能マーカー」という用語は、宿主細胞が導入ＤＮＡを取りいれたか、または何らかの他の反応が起こったことを示す遺伝子を指す。通常、選択可能マーカーは、形質転換中に外来性の配列を受け取っていない細胞から外来性ＤＮＡを含む細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性または代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。本発明に有用な他のマーカーとしては、限定はされないが、トリプトファンなどの栄養要求性マーカー、およびβ−ガラクトシダーゼなどの検出マーカーが挙げられる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「プロモータ」は、下流遺伝子の転写を指令するように機能する核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、プロモータは、標的遺伝子が発現される宿主細胞に対して適切である。プロモータは、他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と一緒に、所与の遺伝子を発現する必要がある。一般に、転写および翻訳調節配列として、限定はしないが、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたは活性化配列が挙げられる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「機能的に結合された」または「作動可能に連結された」は、既知もしくは所望の活性を有する調節領域または機能性ドメイン、例えば、プロモータ、ターミネータ、シグナル配列もしくはエンハンサー領域が標的（例えば、遺伝子もしくはポリペプチド）に、調節領域または機能性ドメインがその既知もしくは所望の活性に従って上記標的の発現、分泌もしくは機能を制御することができるように結合または連結されていることを意味する。
【００４９】
用語「遺伝子改変」または「遺伝子変化」は、組換え細胞を記載するために使用されるとき、その細胞が親細胞と比較して少なくとも１つの遺伝的相違を有することを意味する。１つまたは複数の遺伝的相違は、染色体突然変異（例えば、別のものによる染色体領域の挿入、欠失、逆転、置換（例えば、異種プロモータによる染色体プロンプタの置換）など）および／または染色体外ポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）の導入であってよい。一部の実施形態では、染色体外ポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体に組み込むことにより、安定したトランスフェクタント／形質転換体を作製することができる。
【００５０】
遺伝子の「不活化」は、遺伝子の発現、またはそのコードされる生体分子の活性が阻止されるか、またはそうでなければその既知の機能を発揮することができないことを意味する。不活化は、任意の好適な手段、例えば、前述した通りの遺伝子改変によって起こり得る。一実施形態では、不活化遺伝子の発現産物は、タンパク質の生物活性に相応の変化を伴う短縮タンパク質である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、不活化は、欠失によって行われる。いくつかの実施形態では、欠失の標的とされた領域（例えば、遺伝子）は、相同組み換えによって欠失される。例えば、欠失の標的とされた領域に相同な配列が各側に存在する選択マーカーを有する入来（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）配列を含むＤＮＡコンストラクトが使用される（ここで、これらの配列は、本明細書において、「相同ボックス」と呼ばれ得る）。ＤＮＡコンストラクトが宿主染色体の相同配列と並び、ダブルクロスオーバー事象で、欠失の標的とされた領域が宿主染色体から切り出される。
【００５２】
「挿入」または「付加」は、天然に存在する配列、または親配列と比較して、それぞれ１つ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が付加されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変化である。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置き換えによって生じる。
【００５４】
遺伝子を変異させる方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、限定はされないが、部位特異的変異、ランダム変異の生成、およびギャップ二本鎖法が挙げられる（例えば、米国特許第４，７６０，０２５号明細書；Ｍｏｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：６４６［１９８４］；およびＫｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：９４４１［１９８４］を参照）。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「相同遺伝子」は、異なるものの、通常、関連する種の１対以上の遺伝子を指し、それらは、互いに対応し、かつ同一であるか、または非常に類似している。この用語は、種分化（すなわち、新しい種の開発）によって分離される遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、および遺伝子複製によって分離された遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「オルソログ」および「オルソロガス遺伝子」は、種分化によって共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）から生じた、異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持している。オルソログの同定は、新しく配列が決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の高い予測に使用される。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「パラログ」および「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内での複製に関係する遺伝子を指す。オルソログが進化の過程を通して同じ機能を保持し、一方、パラログは、いくつかの機能は多くは元の機能に関連するものの、新しい機能を生じる。パラログ遺伝子の例としては、限定はされないが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼおよびトロンビン（これらはいずれも、セリンプロテイナーゼであり、同じ種において同時に発生する）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「相同性」は、配列の類似性または同一性を指し、好ましくは同一性である。この相同性は、当該技術分野で知られた標準的な手法によって決定される（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０］；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；ならびにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５［１９８４］を参照）。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「アナログ配列」は、遺伝子の機能が、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８から示される遺伝子と実質的に同じ配列である。さらに、アナログ遺伝子は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８遺伝子の配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。あるいは、アナログ配列は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の領域で見られる７０〜１００％の遺伝子のアライメントを有し、かつ／またはバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の染色体の遺伝子と一致する領域で見られる少なくとも５〜１０の遺伝子を有する。さらなる実施形態では、上記特性の２つ以上が配列に当てはまる。アナログ配列は、既知のシーケンスアライメント法で決定される。一般に使用されるアライメント法はＢＬＡＳＴであるが、上記および下記に示すように、他の方法も配列の決定に使用される。
【００６０】
有用なアルゴリズムの一例がＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連する配列の群からマルチプルシーケンスアライメントを作成する。それはまた、アライメントの作成に使用するクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアライメント法の簡略化を用いる（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３５：３５１−３６０［１９８７］）。この方法はＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐが記載したものと類似している（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３［１９８９］）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、初期設定ギャップウエイト３．００、初期設定ギャップ長ウエイト０．１０、および加重エンドギャップを含む。
【００６１】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｔｓｃｈｕｌらにより記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，［１９９０］；およびＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７［１９９３］）である。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−４８０［１９９６］を参照）である。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、そのほとんどがデフォルト値に設定されている。調節可能なパラメータは、下記の値に設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  ＳおよびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動的値であり、具体的配列の構成および目的の配列を検索する具体的データベースの構成に応じて、プログラム自体により決定される。しかし、感度を高めるために値を調節してもよい。アミノ酸配列同一性の値（％）は、マッチする同一残基の数を、アラインメントした領域内で「より長い」配列の残基の総数で割ることにより決定される。「より長い」配列は、アラインメントした領域で最も多くの実際の残基を有するものである（アラインメントスコアを最大にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されたギャップは無視する）。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、本明細書において同定されているアミノ酸またはヌクレオチド配列に関する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、最大パーセントの配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、目的配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドの割合として定義され、いかなる同類置換も配列同一性の一部として考慮しない。
【００６３】
「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（または「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列と特定の同一性を有する実在物を意味するであろう。相同配列は、従来の配列アライメントツール（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＡＳＴなど）を使用して、対象配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。別段の規定がなければ、ホモログは、通常、対象アミノ酸配列と同じ活性部位残基を含むであろう。
【００６４】
配列アライメントを行い、配列の同一性を決定する方法は、当業者に知られており、過度の実験をせずとも行うことができ、同一性の値を明確に算出することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡＬＩＧＮ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい。配列のアライメントおよび配列同一性の決定に多くのアルゴリズムを利用することができ、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４の類似性探索法；Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）；ならびにＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０を参照）が挙げられる。
【００６５】
これらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラムも利用可能であり、限定はされないが、ＡＬＩＧＮもしくはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、またはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０−４８０（１９９６））；あるいはＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）で利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ；ならびにＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬが挙げられる。当業者は、アライメントを測定するために、比較する配列の長さ全体で最大限のアライメントを達成するのに必要なアルゴリズムも含めて、適切なパラメータを決定することができる。好ましくは、配列同一性は、プログラムにより決定されたデフォルトパラメータを用いて決定する。特に、配列同一性は、デフォルトパラメータと共に、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）を用いて決定することができる。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野で知られた塩基対合により、核酸鎖を相補鎖と接合させるプロセスを指す。
【００６７】
核酸配列は、２つの配列が中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下でお互いに特異的にハイブリダイズする場合、対照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシーは、通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こり、「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約５〜１０℃低い温度で起こり；「中間ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍより約１０〜２０℃低い温度で起こり；そして「低ストリンジェンシー」はＴｍより約２０〜２５℃低い温度で起こる。機能上、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性、またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ、一方、中間または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列ホモログを同定または検出するために用いることができる。
【００６８】
中〜高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当該技術分野でよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でハイブリダイゼーションし、続いて２ＸＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、室温で２回洗浄し、さらに、０．１ＸＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、４２℃で２回洗浄することが挙げられる。中ストリンジェント条件の例としては、２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で終夜インキュベートし、続いて１ＸＳＳＣ中、約３７〜５０℃でフィルターを洗浄することが挙げられる。プローブ長などの因子を適合させるために必要な温度、イオン強度などの調節の仕方は、当業者であれば知っている。
【００６９】
「組み換え体」という用語は、生物学的構成要素または組成物（例えば、細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクターなど）に関連して使用されるとき、それらの生物学的構成要素または組成物が天然では見られない状態のものであることを示す。換言すれば、生物学的構成要素または組成物は、人の介入によって天然状態が変えられている。例えば、組み換え細胞は、天然の親（すなわち、非組み換え）細胞中には存在しない１つ以上の遺伝子を発現する細胞、１つ以上の天然遺伝子を天然親細胞と異なる量で発現する細胞、および／または１つ以上の天然遺伝子を天然親細胞と異なる条件下で発現する細胞を包含する。組み換え核酸は、天然配列と１つ以上のヌクレオチドが異なっている、異種配列（例えば、異種プロモータ、非天然または変異シグナル配列をコードする配列など）に機能可能に結合している、イントロンを欠いている、および／または単離された形態にあり得る。組み換えポリペプチド／酵素は、天然配列と１つ以上のアミノ酸が異なっている、トランケートされるか、もしくはアミノ酸の内部欠失を有する、天然細胞に見られない態様で（例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターが細胞中に存在することにより、ポリペプチドを過剰発現する組み換え細胞から）発現する、および／または単離された形態にあり得る。いくつかの実施形態では、組み換えポリヌクレオチド、またはポリペプチド／酵素が、その野生型の相手と同一の配列を有するが、非天然形態（例えば、単離、または富化された形態）であることが強調されている。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「標的配列」という用語は、入来配列が宿主細胞ゲノム内に挿入されることが望ましい配列をコードする宿主細胞中のＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は野生型機能遺伝子またはオペロンをコードし、一方、他の実施形態では、標的配列は変異機能遺伝子またはオペロンまたは非機能遺伝子またはオペロンをコードする。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「フランキング配列」は、対象配列の上流または下流にある配列を指す（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃでは、遺伝子ＢがＡおよびＣ遺伝子配列にフランキングされている）。一実施形態では、入来配列の両側に相同ボックスがフランキングしている。他の実施形態では、入来配列および相同ボックスは両側にスタッファー配列がフランキングしている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側（３’または５’）にのみ存在するが、ある実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各相同ボックスの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の配列に相同である。これらの配列は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体に新しいコンストラクトが組み込まれ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の一部が入来配列により置換されることを目的とする。一実施形態において、選択マーカーの５’および３’末端は、不活化染色体断片の一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側（３’または５’）にのみ存在するが、ある実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、「増幅性マーカー」、「増幅性遺伝子」および「増幅ベクター」という用語は、適当な増殖条件下で遺伝子の増幅を可能にする遺伝子をコードする遺伝子またはベクターを指す。
【００７３】
「鋳型特異性」は、酵素を選択することにより、殆どの増幅技術において達成される。増幅酵素は、その使用条件下で、核酸の異種混合物中、核酸の特定の配列のみを処理する酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−１  ＲＮＡがレプリカーゼの特異的鋳型である（例えば、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：３０３８［１９７２］を参照）。その他の核酸は、この増幅酵素によっては複製されない。同様に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自体のプロモータにストリンジェントな特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２２８：２２７［１９７０］を参照）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの場合、連結接合部分にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とテンプレートとの間に不整合が存在すると、この酵素は２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結しない（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０［１９８９］を参照）。最後に、ＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼは、高温で機能する能力を有するため、結合する配列に高い特異性を示すことが分かっており、そのため、プライマーにより確定され、高温が標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利に作用し、非標的配列とのハイブリダイゼーションには有利でない熱力学的条件を生じさせる。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「増幅性核酸」という用語は、任意の増幅方法により増幅され得る核酸を指す。「増幅性核酸」は、通常、「サンプルテンプレート」を含むと考えられる。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、「サンプルテンプレート」という用語は、「標的」（下記に定義）の存在を分析するサンプルから生じる核酸を指す。一方、「バックグラウンドテンプレート」は、サンプルテンプレート以外の核酸に関して用いられ、サンプル内に存在していてもいなくてもよい。バックグラウンドテンプレートは、殆どの場合、故意のものではない。それは、キャリーオーバーの結果、またはサンプルから精製すべき核酸汚染物質の存在によるものであり得る。例えば、検出すべき生物以外の生物由来の核酸は試験サンプル内のバックグラウンドとして存在し得る。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、「プライマー」という用語は、精製制限消化などにおいて自然に生成されるか、合成的に生成されるかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下、適切な温度およびｐＨで）、合成開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。増幅効率を最大にするためには、プライマーは一本鎖であることが好ましいが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長生成物の生成に使用する前にまず、その鎖を分離する処理を行う。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、誘発剤の存在下、伸長生成物の合成を開始するため、十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、および使用方法などの多くの因子に左右される。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、「プローブ」という用語は、精製制限消化などにおいて自然に生成されるか、合成、組み換え、またはＰＣＲ増幅により生成されるかにかかわらず、他の目的のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）を指す。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。本発明で使用されるプローブはいずれも任意の「レポーター分子」で標識されるため、任意の検出システム、例えば、限定はされないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、および酵素をベースとした組織化学的分析）、蛍光、放射性および発光性システムなどにおいて検出されると考えられる。本発明を特定の検出システムまたは標識に限定することは意図されていない。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、「標的」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーによって結合される核酸領域を指す。従って、「標的」は、他の核酸配列から選別されようとするものである。「断片」は、標的配列内の核酸領域と定義される。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、とりわけ、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書および同第４，９６５，１８８号明細書に記載の方法を指し、例えば、クローニングまたは精製することなくゲノムＤＮＡの混合物において標的配列の断片濃度を増加させる方法が挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子改変宿主株」（例えば、遺伝子改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株）は、遺伝子操作された宿主細胞を指し、組み換え宿主細胞とも呼ばれる。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ほぼ同じ増殖条件下で増殖した対応する非改変宿主株中の同じ目的タンパク質の発現および／または産生と比較して、目的タンパク質の発現が増大（増加）している。一部の実施形態では、改変株は、１つまたは複数の固有の染色体領域またはその断片の欠失を有する遺伝子操作バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種であり、ここで、目的タンパク質は、ほぼ同じ増殖条件下で増殖した対応する非改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主株と比較して、発現または産生のレベルが増大している。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、「対応する非改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株」などは、記載される遺伝子改変を含まない宿主株（例えば、本来の（親）および／または野生型株）である。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「染色体の組み込み」という用語は、入来配列が宿主細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））の染色体内に導入されるプロセスを指す。形質転換ＤＮＡのホモログ領域が、染色体の相同領域と整列する。続いて、相同ボックス間の配列がダブルクロスオーバーで入来配列により置換される（すなわち、相同組み換え）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトの不活化染色体断片の相同部分が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の固有染色体領域のフランキング相同領域と整列する。続いて、固有染色体領域が、ダブルクロスオーバーでＤＮＡ構築体により欠失される（すなわち、相同組換え）。
【００８３】
「相同組み換え」は、同一、またはほぼ同一のヌクレオチド配列部位における、２つのＤＮＡ分子間、または対の染色体間のＤＮＡフラグメントの交換を意味する。一実施形態では、染色体組み込みは、相同組み換えである。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、「相同配列」は、比較のために最適に整列させた場合に、他の核酸またはポリペプチド配列に対して１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８８％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する核酸またはポリペプチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、相同配列は８５％〜１００％の配列同一性を有し、一方、他の実施形態では、９０％〜１００％の配列同一性を有し、また、より多くの実施形態では、９５％〜１００％の配列同一性を有する。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」は、ペプチドまたはタンパク質配列、またはそれらの一部を指す。「タンパク質」、「ぺプチド」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用される。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「目的タンパク質」および「目的のポリペプチド」は、所望のおよび／または評価対象のタンパク質／ポリペプチドを指す。一部の実施形態では、目的タンパク質は細胞内タンパク質であり、別の実施形態では、これは分泌されるポリペプチドである。特に、ポリペプチドは酵素を含み、こうした酵素として、限定はしないが、デンプン分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ酵素および植物細胞壁分解酵素から選択されるものがある。さらに具体的には、これらの酵素として、限定はしないが、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼが挙げられる。一部の実施形態では、目的タンパク質は、シグナルペプチド（すなわち、分泌させるタンパク質のアミノ末端伸長部）と融合した分泌ポリペプチドである。ほぼ全ての分泌タンパク質は、アミノ末端タンパク質伸長部を使用するが、これは、膜を介した前駆体タンパク質のターゲティングおよび転位に重要な役割を果たす。この伸長部は、膜移動中またはその後、シグナルペプチダーゼによるタンパク質分解によって除去してもよい。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態では、目的ポリペプチドまたはタンパク質は、ホルモン、抗体、成長因子、受容体などから選択される。本発明に包含されるホルモンとしては、限定はされないが、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、ゴナドトロピンホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリンなどが挙げられる。成長因子としては、限定はされないが、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３）、インターフェロン、コロニー刺激因子などが挙げられる。抗体としては、限定はされないが、抗体を生成するのが望ましい任意の種から直接得られる免疫グロブリンが挙げられる。さらに、本発明は、修飾抗体を包含する。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体もまた、本発明に包含される。特に好ましい実施形態では、抗体はヒト抗体である。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」または「変異体」は、１つ以上のアミノ酸のＣ末端およびＮ末端の一方または両方への付加、アミノ酸配列における１つまたは多くの異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、ポリペプチドの一端もしくは両端での、またはアミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、アミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入、およびこれらの任意の組み合わせにより、前駆体ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチド）から誘導されるポリペプチドを意味する。ポリペプチドの誘導体または変異体の作製は、任意の都合の良い方法で、例えば、天然ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変更して誘導／変異ポリペプチドを生成することにより、そのようなＤＮＡ配列を適切な宿主へ形質転換して誘導／変異ポリペプチドを生成することにより、および改変ＤＮＡ配列を発現させて誘導／変異ポリペプチドを生成することにより、行うことができる。誘導体または変異体としては、さらに、化学的に改変したポリペプチドが挙げられる。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、「異種タンパク質」という用語は、宿主細胞内に天然では存在しないタンパク質またはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、タンパク質をコードする遺伝子は、天然に存在する遺伝子であるが、別の実施形態では、突然変異および／または合成遺伝子を用いてもよい。一部の実施形態では、異種タンパク質をコードするＤＮＡは、天然では異種である５’ＵＴＲと連結しており、これは、５’ＵＴＲと、目的タンパク質をコードするＤＮＡとが、異なる遺伝子または異なる生物学に由来することを意味する。従って、異種という用語は、２つの要素が同じ起源（例えば、種、細胞、核酸など）に由来しないというその最も広い意味で用いられる。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、「相同タンパク質」は、細胞内の天然の、すなわち、細胞内に天然に存在するタンパク質またはポリペプチドを指す。実施形態において、その細胞はグラム陽性細胞であり、一方、特定の実施形態では、細胞はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞である。代替の実施形態において、相同タンパク質は、他の生物、例えば、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などにより生成された天然タンパク質である。本発明は、組み換えＤＮＡ技術により相同タンパク質を産生する宿主細胞を包含する。
【００９１】
Ｂ．非翻訳領域（ＵＴＲ）
非翻訳領域または「ＵＴＲ」は、一般に翻訳されていない、ｍＲＮＡの配列または対応するＤＮＡの配列である。ＵＴＲは、ｍＲＮＡの５’または３’末端にあってよい。５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（リーダ配列またはリーダＲＮＡとしても知られる）は、開始コドンから上流にあるｍＲＮＡの領域である。この領域は、ウイルス、原核生物および真核生物で異なる機構による転写物の翻訳の調節に重要である。非翻訳と呼ばれるが、５’ＵＴＲまたはその一部がタンパク質産物に翻訳されることもある。その後、この産物は、ｍＲＮＡの主要コード配列の翻訳を調節し得る。しかし、他の多くの生物では、５’ＵＴＲは、翻訳を調節する複雑な二次構造を形成するのではなく、非翻訳である。対応するＤＮＡ配列は、一般に、５’または３’ＵＴＲ配列とも呼ばれる。
【００９２】
５’ＵＴＲは、転写開始部位で開始してよく、また、翻訳開始部位もしくはコード領域の第１コドンでまたはその付近で終結してもよい。５’ＵＴＲは、３〜１０ヌクレオチド〜数千ヌクレオチド超で長さが変動する。５’ＵＴＲは、一般に、リボソーム結合部位、シス作用調節エレメント、および他の調節エレメントを含有する。
【００９３】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌由来の様々な遺伝子が５’ＵＴＲを含有する。バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＬＡＴ（α−アミラーゼ）遺伝子は、次の５’ＵＴＲ：
ＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣ（配列番号８）
を含み、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥ遺伝子は、次の５’ＵＴＲ：
ＧＡＣＡＧＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡＧＴＣＴＡＣＴＣＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡ（配列番号２）
を含む。
【００９４】
Ｈａｍｂｒａｅｕｓらは、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥ遺伝子の５８ヌクレオチド長リーダ配列（５’ＵＴＲ）がｍＲＮＡ安定性の決定因子であることを明らかにした（Ｈａｍｂｒａｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）１４８：１７９５−１８０３）。Ｈａｍｂｒａｅｕｓらは、この領域が５’末端でステム−ループ構造を形成し、インタクトなリボソーム結合部位（ＲＢＳ）と一緒にｍＲＮＡの安定性増大をもたらすことを示した。しかし、Ｈａｍｂｒａｅｕｓらは、発現ベクターでの強力な５’ＵＴＲの使用により、目的タンパク質のより高度の発現がもたらされ得ることを研究、教示または示唆しておらず、さらには理解していないため、当業者にそれを説明もしていない。本発明者らは、発現ベクターにおける強力な５’ＵＴＲが修飾宿主細胞での目的タンパク質のより高度な発現を達成することを見出した。
【００９５】
Ｃ．プロモータ
特に、細菌宿主細胞での使用のための好適なプロモータの例として、限定はしないが、例えば、ＰａｍｙＥ、ＰａｍｙＱ、ＰａｍｙＬ、ＰｐｓｔＳ、ＰｓａｃＢ、ＰＳＰＡＣ、ＰＡｐｒＥ、ＰＶｅｇ、ＰＨｐａＩＩプロモータ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・クラウジイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）キシロシダーゼ遺伝子、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ、およびバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子のプロモータが挙げられる。別のプロモータとして、限定はしないが、Ａ４プロモータ、ならびにファージλＰＲまたはＰＬプロモータ、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモータがある。さらには、リボソームタンパク質およびＲＮＡプロモータは、異種タンパク質産生に有用であることが判明している（例えば、国際公開第２０１３／０８６２１９号パンフレットを参照されたい；その開示内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）。以下のプロモータが考慮される。
【００９６】
【表１】
2018505686.tif 000003
【００９７】
【表２】
2018505686.tif 000004
【００９８】
リボソームプロモータを用いたとき、目的の異種タンパク質をコードする核酸配列の予想外に高い発現のレベルは、いくつかの利点を有する。一実施形態では、リボソームプロモータを用いた目的のコード配列の発現により、そのネイティブプロモータからの目的のコード配列の発現と比較して、目的のコード配列の発現レベルの増加が可能になる。より高い発現レベルは、不安定な転写物に特に有用である。
【００９９】
別の実施形態では、リボソームプロモータを用いた目的のコード配列の発現により、リボソームプロモータを含む発現構築物を増幅せずに、目的のコード配列の発現レベルの増加が可能になる。目的のコード配列の高い発現レベルを達成するために、当該技術分野の他の発現構築物を用いた場合、発現構築物の増幅が必要になることが多い。しかしながら、本明細書に記載のリボソームプロモータを用いて達成される発現レベルは、発現構築物の増幅を必要としないことができる（しかし、目的タンパク質のより高度の発現を達成するために増幅を用いてもよい）ほど十分に高い。これはいくつかの利点をもたらす。第１に、宿主株が増幅発現構築物の喪失を被らないために安定する。また、発現構築物を増幅する必要がなければ、株の構築がより効率的である。従って、時間、費用および材料が節約される。
【０１００】
Ｄ．目的のコード配列
本発明により包含されるプロモータは、目的タンパク質をコードする核酸（すなわち、目的のコード配列）に作動可能に連結される。コード配列によりコードされるポリペプチドは、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質もしくはその部分、受容体もしくはその部分、受容体遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）またはその他の二次代謝物であってよい。
【０１０１】
一部の実施形態では、酵素は、細菌または真菌由来のプロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、エステラーゼ、マンナーゼ、カルボヒドラーゼ、ヒドロラーゼ、オシキダーゼ、ペルメアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、エピメラーゼ、タウトメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼなどである。
【０１０２】
他の実施形態では、酵素は、セリン、メタロ、チオールまたは酸性プロテアーゼなどのプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシン）である。セリンプロテアーゼは、以下の文献に記載されている：Ｍａｒｋｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｈｏｎｎｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ３６４：１５３７−１５４０；Ｄｒｅｎｔｈ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１７７−１８１；米国特許第４，７６０，０２５号明細書（ＲＥ  ３４，６０６）、同第５，１８２，２０４号明細書および同第６，３１２，９３６号明細書ならびに欧州特許第０  ３２３，２９９号明細書に記載されている。アルカリプロテアーゼの例として、スブチリシン、特に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの（例えば、スブチリシン、レンツス、アミロリケファシエンス、スブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７およびスブチリシン１６８）が挙げられる。また、本発明で用いることができるプロテアーゼは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１５２０８８号明細書および国際公開第２０１０／０５６６３５号パンフレットにも記載されている。タンパク質分解活性を測定するための手段は、Ｋ．Ｍ．Ｋａｌｉｓｚ，“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ”ＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ａ．Ｆｉｅｃｈｔ  Ｅｄ．１９８８に開示されている。
【０１０３】
他の実施形態では、酵素は、アミラーゼ、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のアミラーゼ（例えば、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬＡＴアミラーゼ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））またはトリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・レエセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））由来のアミラーゼである。細菌および真菌アミラーゼは、例えば、米国特許第８，０５８，０３３号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００１５６８６号明細書、米国特許出願公開第２００９／０３１４２８６号明細書、英国出願英国特許第１０１１５１３．７号明細書、および国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５３０１８号明細書に記載されている。これらの参照文献の各々の明細書は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
他の実施形態では、酵素は、キシラナーゼである。いくつかの実施形態では、キシラナーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、トリコデルマ・レエセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））に由来する。細菌および真菌キシラナーゼは、例えば、国際公開第２００１／０２７２５２号パンフレットおよび米国特許第７，７１８，４１１号明細書に記載されている。これらの参照文献の各々の明細書は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
他の実施形態では、酵素は、フィターゼである。特定の実施形態では、フィターゼは、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、シトロバクター・フロインディ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ））または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する。他の実施形態では、フィターゼは、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ、例えば、ブティアウクセラ・アグレスティス（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ａｇｒｅｓｔｉｓ）フィターゼであってよい。フィターゼは、例えば、国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレット、同第２００６／０３８０６２号パンフレット、同第２００８／０９７６１９号パンフレット、同第２００９／１２９４８９号パンフレット、同第２００６／０３８１２８号パンフレット、同第２００８／０９２９０１号パンフレット、同第２００９／１２９４８９号パンフレット、および同第２０１０／１２２５３２号パンフレットに記載されている。これらの参照文献の各々の明細書は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
一部の実施形態では、酵素は、セルラーゼである。セルラーゼは、セルロース中のβ−Ｄ−グルコシド結合を加水分解する酵素である。セルロース分解酵素は、伝統的に３つの主要クラス：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼおよびβ−グルコシダーゼに分けられている（Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  ５：２５５−２６１（１９８７））。多数のセルラーゼが科学文献に記載されており、これらは当業者に周知である。
【０１０７】
一部の実施形態では、ホルモンは、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、コルチコトロピン放出因子、ソマトスタチン、ゴナドトロピンホルモン、バソプレッシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリンなどである。
【０１０８】
一部の実施形態では、増殖因子は、細胞表面上の受容体に結合して、主に細胞増殖および／または分化を活性化する結果をもたらすタンパク質であり、このような因子として、血小板由来増殖因子、表皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング増殖因子などがある。
【０１０９】
一部の実施形態では、増殖因子は、サイトカインである。サイトカインとして、限定はしないが、コロニー刺激因子、インターロイキン（ＩＬ−１（αおよびβ）、ＩＬ−２〜ＩＬ−１３）ならびにインターフェロン（α、βおよびγ）が挙げられる。
【０１１０】
一部の実施形態では、抗体として、限定はしないが、大量に生産することが望ましい任意の種由来の免疫グロブリンが挙げられ、特に、抗体は、ヒト抗体であるのが好ましい。免疫グロブリンは、任意のクラス、すなわち、Ｇ、Ａ、Ｍ、ＥまたはＤのものであってよい。
【０１１１】
コード配列は、宿主細胞に対してネイティブまたは異種のいずれであってもよい。さらに、コード配列は、完全長タンパク質、または完全長タンパク質の短縮形態をコードし得る。本発明は、特定のコード配列に限定されないが、多数のコード配列を含み、これらは本発明のプロモータに作動可能に連結されている。
【０１１２】
Ｅ．シグナル配列
一部の実施形態では、特に目的のコード配列がセルラーゼ、プロテアーゼまたはデンプン分解酵素などの細胞外酵素をコードする場合、シグナル配列をコード配列のＮ−末端部分に連結してもよい。シグナルを用いてＤＮＡ配列の分泌を促進してもよい。シグナル配列は、宿主生物に対して内在性または外性のいずれであってもよい。シグナル配列は、コードされたポリペプチドと正常に結合しているものであってよい。一部の実施形態では、シグナル配列は、国際公開第２０１１／０１４２７８号パンフレットおよび同第２０１０／１２３７５４号パンフレットに記載されているように、改変または修飾してもよく、これらの明細書は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、シグナル配列は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）セルラーゼ遺伝子由来のシグナル配列を含む。一実施形態では、好ましいシグナル配列は、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）セルラーゼ、ｃｅｌＡである（Ｂｅｎｔｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：１４１−１４７）。しかしながら、当業者であれば、宿主生物に発現および分泌させようとするタンパク質に応じて使用することができる多数のシグナル配列（例えば、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼシグナルペプチド）について知っている。
【０１１３】
Ｆ．ＤＮＡ構築物およびベクター
目的のコード領域を含む本発明の核酸構築物は、確立された標準的方法、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−１８６９により記載のホスホロアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：８０１−８０５により記載の方法により、合成的に調製することができる。核酸構築物は、混合合成およびゲノム起源であってもよく、合成またはゲノムＤＮＡの断片を連結することにより調製してもよい。核酸構築物はまた、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書またはＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９（１９８８），４８７−４９１に記載されているような特定のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により調製してもよい。
【０１１４】
本発明のＤＮＡ構築物は、発現ベクターなどのベクターに挿入してもよい。真菌、酵母および細菌におけるポリペプチドのクローニング、形質転換および発現に好適な様々なベクターが当業者に周知である。典型的に、ベクターまたはカセットは、本発明のプロモータ、任意選択でシグナル配列、目的のコード領域およびターミネータ配列を含む。好ましい実施形態では、ベクターは、シグナル配列とターミネータ配列との間に位置する１つまたは複数のクローニング部位を含む。
【０１１５】
Ｇ．形質転換
本発明のベクターは、宿主細胞に形質転換する。一般的形質転換技術は、当該技術分野において公知である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹおよびＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ  １６：５３−５６）。これらの一般的技術のいくつかは、限定はしないが、粒子もしくは遺伝子ガン（微粒子銃）の使用、形質転換プロセス前の糸状真菌細胞壁の透過化（例えば、高濃度のアルカリ、例えば、０．０５Ｍ〜０．４Ｍ  ＣａＣｌ２もしくは酢酸リチウムの使用により）、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、またはアグロバクテリウム（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（米国特許第６，２５５，１１５号明細書）を含み、また、ポリエチレングリコールおよびＣａＣｌ．ｓｕｂ．２によるプロトプラストもしくはスフェロプラストの処理がＣａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６，１９８９およびＰｅｎｔｔｉｌａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ，６３：１１−２２に記載されている。
【０１１６】
細菌のための形質転換および発現方法は、Ｂｒｉｇｉｄｉ，ＤｅＲｏｓｓｉ，Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ，Ｒｉｃｃａｒｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｅｕｚｚｉ，（１９９０），ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５−１３８に開示されている。プロテアーゼ欠失バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株についての好ましい一般的形質転換および発現プロトコルは、Ｆｅｒｒａｒｉら、米国特許第５，２６４，３６６号明細書に提供されている。
【０１１７】
ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）における形質転換および発現は、Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥＴＩＣ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，（１９８５）Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＵＫに見出すことができる。
【０１１８】
他の実施形態において、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）における形質転換および発現は、例えば、米国特許第５，３６４，７７０号明細書；米国特許第６，０２２，７２５号明細書；およびＮｅｖａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，ｉｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ，Ｅｄｓ．Ｌｅｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋａ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．ｐｐ．１２９−１４８に記載されている。
【０１１９】
Ｈ．宿主細胞
本発明に従って使用することができる宿主細胞は、細菌および真菌細胞の両方を含む。好ましい真菌宿主細胞としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞などの糸状真菌細胞が挙げられる。好ましい細菌宿主細胞は、グラム陽性およびグラム陰性細胞の両方を含み、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞が挙げられる。宿主細胞は、限定はしないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびシュードモナス・アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ））、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種（例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ））、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）も含む。
【０１２０】
Ｉ．細胞培養物
宿主細胞および形質転換細胞を従来の栄養培地で培養することができる。形質転換宿主細胞の培地は、プロモータを活性化し、形質転換体を選択するために、必要に応じて修飾してもよい。温度、ｐＨなどの具体的な培養条件は、発現のために選択される宿主細胞に使用されるものであってよく、当業者に明らかであろう。さらに、好ましい培養条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，（１９８２）前掲；Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ，Ｍ  Ｊ．Ｂｉｂｂ，Ｍ  Ｊ．Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｋ  Ｆ  Ｃｈａｔｅｒ，ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ（２０００）ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ．Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＵＫ；Ｈａｒｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＢＡＣＩＬＬＵＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙなどの科学文献で、および／またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／”）から見出すことができる。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞などの真菌宿主細胞の安定な形質転換体は、概して、その高速の増殖速度、または固体培地上にでこぼこではなく、滑らかな輪郭を有する円状コロニーの形成によって不安定な形質転換体から識別することができる。
【０１２１】
Ｊ．発現されたポリペプチドの回収
形質転換宿主細胞により産生されるポリペプチドは、遠心分離もしくは濾過により培地から宿主細胞を分離する、または必要であれば、細胞を破壊し、細胞画分および残屑から上清を取り出すなどの従来の方法によって培地から回収することができる。典型的には、清澄化後、上清または濾過物のタンパク質成分を塩、例えば、硫酸アンモニウムを用いて沈殿させる。次に、沈殿したタンパク質を可溶化した後、様々なクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、およびその他の当該技術分野で承認されている方法によって精製してもよい。
【０１２２】
Ｋ．構築物アセンブリー
１つの一般的実施形態では、本発明は、ＤＮＡ構築物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリングするステップを含み、続いて、構築物が宿主ゲノムに組み込まれるように、この構築物をコンピテント宿主細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞）に直接クローニングする。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＣＲ融合および／または連結を使用してＤＮＡ構築物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリングする。好ましい実施形態では、ＤＮＡ構築物は、非プラスミドＤＮＡ構築物である。別の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、突然変異が導入されているＤＮＡを含む。次に、この構築物を用いて宿主細胞を形質転換する。これに関して、宿主細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））の高度にコンピテントな突然変異体を用いて細胞への構築物の直接クローニングを促進するのが好ましい。例えば、キシロース誘導性プロモータ（Ｐｘｙｌ−ｃｏｍＫ）の制御下でｃｏｍＫ遺伝子を担持するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、本明細書に記載するように、極めて高い効率で確実に形質転換することができる。細胞の形質転換には、当該技術分野で公知のいずれの好適な方法を用いてもよい。形質転換前にＤＮＡ構築物をベクター（すなわち、プラスミド）に挿入することができる。一部の好ましい実施形態では、適切な制限酵素（すなわち、ＤＮＡ構築物を破壊しないもの）を用いて環状プラスミドを切断する。従って、一部の実施形態では、環状プラスミドは、本発明で用途が見出される。しかしながら、代替の実施形態では、線状プラスミドを用いる。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物（すなわち、ＰＣＲ産物）は、プラスミドＤＮＡの存在なしに使用されている。
【０１２３】
本発明およびその利点を詳しく説明するために、以下に具体的な実施例を記載するが、これらが本発明を説明するために提供され、その範囲を限定するものとして何ら解釈すべきではないことは理解されるであろう。
【０１２４】
ＤＮＡコンストラクトがベクターに組み込まれようと、あるいはプラスミドＤＮＡの非存在下に使用されようと、それは微生物を形質転換させるために使用される。適切ないかなる形質転換方法も、本発明で使用されると考えられる。実施形態では、ＤＮＡコンストラクトの少なくとも１つのコピーは、宿主バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明の１種以上のＤＮＡコンストラクトが、宿主細胞の形質転換に使用される。
【実施例】
【０１２５】
以下の実施例は、本発明の特定の実施例および態様を実証し、かつさらに詳しく説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１２６】
以下の実験の開示において、次の略語のいくつかが用いられる：℃（摂氏温度）；ｒｐｍ（毎分の回転数）；μｇ（マイクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｌ（マイクロリットル）；ｍｌ（ミリリットル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈｒ（時間）；ＯＤ２８０（２８０ｎｍにおける光学濃度）；ＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学濃度）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）：Ａｂｓ（吸光度）。
【０１２７】
実施例１
ａｐｒＥ５’ＵＴＲによるバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ＬＡＴ）の産生向上
ネイティブＬＡＴプロモータ、ＬＡＴ５’ＵＴＲ、ＬＡＴシグナルペプチド配列およびＬＡＴ転写ターミネータと共に、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ＬＡＴ）遺伝子を含有する発現構築物を、米国特許第７９６８６９１号明細書に記載される通りにｐＩＣａｔＨベクターのＸｈｏＩ部位にクローニングした。ＬＡＴ発現カセット（ＸｈｏＩ断片）を配列番号１に示す。
【０１２８】
ＬＡＴ前駆体遺伝子は斜体で示し、ＬＡＴ５’ＵＴＲは太字で示す（配列番号１）。
【化１】
2018505686.tif 000005
【０１２９】
米国特許第７，９６８，６９１号明細書に記載の通り、ｐＩＣａｔＨ−ＬＡＴｏｒｉ１プラスミド（図１を参照）をバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株ＢＭＬ７８０のゲノムに形質転換した。切除した後、最大５０ｐｐｍクロラムフェニコールまでの発現カセットの増幅が、ＬＡＴ５’ＵＴＲ株におけるＬＡＴ産生に最適であることが証明された。
【０１３０】
融合ＰＣＲ技術により、ｐＩＣａｔＨ−ＬＡＴｏｒｉ１中のＬＡＴ５’ＵＴＲをバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ５’ＵＴＲで置換した。５’末端に別のグアニンを有するバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ５’ＵＴＲのヌクレオチド配列を配列番号２に記載する。
ＧＡＣＡＧＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡＧＴＣＴＡＣＴＣＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡ
【０１３１】
ａｐｒＥ５’ＵＴＲ（ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片）を含むＬＡＴ発現カセットを配列番号３に示す。ＬＡＴ前駆体遺伝子は斜体で示し、ａｐｒＥ−５’ＵＴＲは太字で示す。
【化２】
2018505686.tif 000006
【０１３２】
ａｐｒＥ−５’ＵＴＲに融合したＬＡＴ（すなわち、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬ）遺伝子を含有するｐＩＣａｔＨプラスミドを形質転換し、前述したように、株ＢＭＬ７８０のゲノムに組み込んだ。切除後、最大２５ｐｐｍクロラムフェニコールまでの増幅が、ａｐｒＥ−５’ＵＴＲ株におけるＬＡＴ産生に最適であることが証明された。
【０１３３】
生産培地（１リットル当たり：１０ｇのデンプン、１０ｇのソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ）、１０ｇの大豆粉、２０ｇのグルコース、３．６ｇの尿素、０．７５ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、２１．７５ｇのＫ２ＨＰＯ４、１７ｇのＫＨ２ＰＯ４、ＭＯＰＳバッファー、微量栄養素；ｐＨ６．８）で両方の株を増殖させることにより、株ＢＭＬ７８０−ＬＡＴ−ＣＡＰ５０（ＬＡＴ５’ＵＴＲ）によるＬＡＴの産生をＢＭＬ７８０−［ａｐｒＥ−５’ＵＴＲ］−ＬＡＴ−ＣＡＰ２５（ａｐｒＥ５’ＵＴＲ）の産生と比較した。Ｉｎｆｏｒｓインキュベータ（３７℃、３００ｒｐｍ）内で６８時間の増殖後、上清中のＬＡＴ活性を、基質としてＣｅｒａｌｐｈａを用いるＭｅｇａｚｙｍｅのα−アミラーゼアッセイキットにより、供給業者（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）の指示に従って決定した。活性、すなわち、生産性の相対数を表３に示す。
【０１３４】
【表３】
2018505686.tif 000007
【０１３５】
実施例２
ａｐｒＥ５’ＵＴＲによるプルラナーゼＰＵＬｍ１０４の産生向上
ＰＵＬｍ１０４は、Ｎ−末端１０４アミノ酸が欠失したバチルス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）プルラナーゼである。ＰＵＬｍ１０４を産生するバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株の構築は、米国特許第８３５４１０１号明細書に記載されている。米国特許第８３５４１０１号明細書に記載されている最良の産生株は、ａｍｙＬ（ＬＡＴ）５’ＵＴＲを含有するＢＭＬ７８０−ＰＵＬｍ１０４−Ｏｒｉ１−ＣＡＰ７５であった。
【０１３６】
ａｍｙＬ（ＬＡＴ）５’ＵＴＲは、以下に概説するように、ａｐｒＥ５’ＵＴＲで置換した。まず、プラスミドｐＨＰＬＴ−Ｂｌｉｃｈ−ｉｎｔ−カセットをＤＮＡ２．０．Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって合成により構築した。このプラスミドの設計は、ベクターｐＨＰＬＴ（米国特許第５８７１５５０号明細書）、ベクターｐＩＣａｔＨ（米国特許第８３５４１０１号明細書）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥ５’ＵＴＲ、ＵＴＲ  Ｖ２またはＵＴＲ  Ｖ３に基づいた（配列については以下の表））。ベクターｐＨＰＬＴ−Ｂｌｉｃｈ−ｉｎｔ−カセットのマップは、図２に示す。
【０１３７】
５’ａｐｒＥ  ＵＴＲ−ＰＵＬｍ１０４発現カセットのＤＮＡ配列を以下に示す（５’ＵＴＲは下線で示す）（配列番号１１）。
【化３】
2018505686.tif 000008
【０１３８】
【表４】
2018505686.tif 000009
【０１３９】
次に、鋳型としてｐＨＰＬＴ−Ｂｌｉｃｈ−ｉｎｔ−カセット（１ｎｇ／μｌ）を用いて、プライマーＰＵＬｍ１０４−Ｖｅｃｔｏｒ−ＲＶ（ＣＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣ（配列番号４）およびＰＵＬｍ１０４−Ｖｅｃｔｏｒ−ＦＷ（ＣＧＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＧＡＧＧ（配列番号５））でＰＣＲを実施した。２回目のＰＣＲは、鋳型としてＢＭＬ７８０−ＰＵＬｍ１０４−Ｏｒｉ１−ＣＡＰ７５の細胞材料を用いて、プライマーＰｕｌＭ１０４−Ａｓｓｂｌ．−ＦＷ（ＣＡＧＣＴＡＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣ（配列番号６））およびＰｕｌＭ１０４−Ａｓｓｂｌ．−ＲＶ（ＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＧＴＧＧＴＣＣＧＧＧＣＴＧ（配列番号７））で実施した。いずれのＰＣＲもＮＥＢ  Ｑ５標準プロトコル、２６サイクルに従って実施した。
【０１４０】
ＰＵＬｍ１０４断片をカラム精製し、まず、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で完全に消化し、次にＮｈｅＩ（ＮＥＢ）で部分的に消化した。ベクター断片もカラム精製し、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した。ベクターおよびＰＵＬｍ１０４消化混合物の両方を再度精製した後、ＲｏｃｈｅＴ４ラピッドライゲーションキット（♯１１６３５３７９００１）を用いて連結した。ＲＣＡ増幅（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）後、ＲＣＡ産物をコンピテントバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に形質転換し、５ｐｐｍクロラムフェニコールと１０ｐｐｍネオマイシンとを含有するＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｔｉｏｎ寒天（Ｄｉｆｃｏ）上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、形質転換プレートからの２４ｃｆｕを、５ｐｐｍクロラムフェニコールと１０ｐｐｍネオマイシンとを含有する新鮮なＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｔｉｏｎ寒天プレート上で２回反復して複製し、一晩インキュベートした。翌朝、１００ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ５中の０．１％ＡＺＣＬ−プルランを含有する１％寒天の層でプレートを被覆した。プレートを３７℃で３時間インキュベートし、ハロ陽性（プルラナーゼ陽性）をレプリカプレートから採取し、５ｐｐｍクロラムフェニコールと１０ｐｐｍネオマイシンとを含有する１０ｍｌのＴＳＢに増殖させた。２ｍｌの培養物を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、３０μｌのＤＮＡプレップをＮｏｔＩおよびＡｐａＩにより消化した。５’反復配列−ｃａｔＨ−ＰＵＬｍ１０４発現カセットを含有する４ｋｂ断片をゲルから精製し、自己連結させ（Ｔ４リガーゼＲｏｃｈｅ）、ＲＣＡ増幅した後、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株ＢＭＬ７８０に形質転換した。７．５ｐｐｍのクロラムフェニコールを含有するＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｔｉｏｎ寒天上での選択後、前述したように、ＡＺＣＬ−プルラン被覆法を用いてプルラナーゼ活性について形質転換体を確認した。４プルラナーゼ陽性クローン中の発現カセットの配列をＤＮＡ配列決定により確認した（ＢａｓｅＣｌｅａｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。発現カセットは、米国特許第８３５４１０１号明細書に記載のように増幅した。２５ｐｐｍクロラムフェニコールまでの増幅は、ａｐｒＥ５’ＵＴＲ株におけるプルラナーゼ生産に最適であることが証明され、ＢＭＬ７８０−［ａｐｒＥ−５’ＵＴＲ］−ＰＵＬｍ１０４−Ｏｒｉ１−ＣＡＰ２５株をさらなる試験で使用した。
【０１４１】
生産培地（実施例１を参照）で両方の株を増殖させることにより、株ＢＭＬ７８０−ＰＵＬｍ１０４−Ｏｒｉ１−ＣＡＰ７５（ＬＡＴ５’ＵＴＲ）によるＰＵＬｍ１０４の産生をＢＭＬ７８０−［ａｐｒＥ−５’ＵＴＲ］−ＰＵＬｍ１０４−Ｏｒｉ１−ＣＡＰ２５（ａｐｒＥ５’ＵＴＲ）の産生と比較した。Ｉｎｆｏｒｓインキュベーションシェーカでの６８時間の増殖（３００ｐｐｍ、３７℃）後、上清中のプルラナーゼ活性を、基質としてレッド−プルランを用いるＭｅｇａｚｙｍｅのプルラナーゼアッセイにより、供給業者（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）の指示に従って決定した。活性、すなわち生産性の相対数を表４に示す。５’ａｐｒＥ  ＵＴＲのバージョン２および３は、同等のタンパク質産生を示した。
【０１４２】
【表５】
2018505686.tif 000010
【０１４３】
実施例３
リボソームＲＮＡプロモータと共にａｐｒＥ５’ＵＴＲを用いる目的タンパク質の産生向上
リボソームＲＮＡプロモータ（例えば、Ｐ１  ｒｒｎＢ、Ｐ１  ｒｒｎＩ、Ｐ２  ｒｒｎＩ、Ｐ１  ｒｒｎＥ、Ｐ２  ｒｒｎＥまたはＰ３  ｒｒｎＥ）またはリボソームタンパク質プロモータ（例えば、ＰｒｐｓＤ、Ｐ１  ｒｐｓＪ、Ｐ２  ｒｐｓＪ）またはシグマ因子プロモータ（例えば、ＰｒｐｏＤ）、ａｐｒＥ５’ＵＴＲ、本明細書に記載する好適なシグナル配列（例えば、ＬＡＴ、ａｐｒＥ、ＣＢＨ１、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）セルラーゼ遺伝子シグナル配列）、本明細書に記載する目的の好適な遺伝子ならびに転写ターミネータを含む発現構築物は、好適なベクター（例えば、ｐＩＣａｔＨ）の好適な制限部位（例えば、ＸｈｏＩ）にクローニングする。発現カセットを配列番号１２および１３に示す。
【０１４４】
目的の遺伝子を含有するプラスミドベクターを好適な細菌株（例えば、前述した株ＢＭＬ７８０）のゲノムに形質転換して組み込む。
【０１４５】
生産培地（例えば、１リットル当たり：１０ｇのデンプン、１０ｇのソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ）、１０ｇの大豆粉、２０ｇのグルコース、３．６ｇの尿素、０．７５ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、２１．７５ｇのＫ２ＨＰＯ４、１７ｇのＫＨ２ＰＯ４、ＭＯＰＳバッファー、微量栄養素；ｐＨ６．８）で株を増殖させることにより、細菌株による目的タンパク質の産生を様々な対照株と比較する。Ｉｎｆｏｒｓインキュベータ（３７℃、３００ｒｐｍ）内で６８時間の増殖後、上清中のタンパク質活性を決定する。
【０１４６】
ｒｒｎＩ  Ｐ２プロモータ（バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来）は小文字で示す。ａｐｒＥ５’ＵＴＲは太字かつ下線で示す。成熟コード鎖は斜体で示す。ストップ（ＳＴＯＰ）コドンは太字で示す。転写ターミネータを保持する配列は下線で示す。
【０１４７】
ｒｒｎＩ  Ｐ２プロモータ−ａｐｒＥ５’ＵＴＲ−ＬＡＴシグナルペプチド−成熟ＬＡＴ発現構築物を以下に示す（配列番号１２）。
【化４】
2018505686.tif 000011
【０１４８】
ｒｒｎＩ  Ｐ２プロモータ−ａｐｒＥ５’ＵＴＲ−ＬＡＴシグナルペプチド−成熟ＰＵＬｍ１０４発現構築物を以下に示す（配列番号１３）。
【化５】
2018505686.tif 000012
【化６】
2018505686.tif 000013
【０１４９】
実施例４
ａｐｒＥ５’ＵＴＲおよびその変異体を用いたゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼ変異体の産生向上
標準的バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）組込みベクター、すなわち、ＬＡＴ（バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬ）プロモータの下流にゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡｍｙＳ）変異体遺伝子を含有するｐＫＢ３６０−ＣａｔＨにおいて、ＬＡＴ５’−ＵＴＲ配列をＡｐｒＥ−ＷＴ  ５’−ＵＴＲおよびＡｐｒＥ−Ｖ２−５’−ＵＴＲまたはＡｐｒＥ−Ｖ３−５’−ＵＴＲにより置換した（概略的プラスミドマップについては図３を参照）。発現カセットの配列を以下に示す。
【０１５０】
ＬＡＴプロモータは小文字で示し；ａｐｒＥ５’ＵＴＲは太字かつ下線で示し；ＬＡＴシグナルペプチドは小文字かつ下線で示し；ＡｍｙＳ変異体の成熟鎖は斜体で示し；ストップ（ＳＴＯＰ）コドンは太字で示し；転写ターミネータを保持する配列は下線で示す。
【０１５１】
ＬＡＴプロモータ−ａｐｒＥ５’ＵＴＲ−ＬＡＴシグナルペプチド−成熟ＡｍｙＳ変異体（配列番号１４）：
【化７】
2018505686.tif 000014
【０１５２】
ＬＡＴプロモータ−Ｖ２＿５’ＵＴＲ−ＬＡＴシグナルペプチド−成熟ＡｍｙＳ変異体（配列番号１５）：
【化８】
2018505686.tif 000015
【０１５３】
ＬＡＴプロモータ−Ｖ３＿５’ＵＴＲ−ＬＡＴシグナルペプチド−成熟ＡｍｙＳ変異体（配列番号１６）：
【化９】
2018505686.tif 000016
【０１５４】
形質転換後、プラスミドをバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体上のｃａｔ遺伝子座に組み込んだ。続いて、ベクター配列の切除により、染色体中に組み込まれたｃａｔ−ＬＡＴ−５’ＵＴＲ−ＡｍｙＳ変異体発現カセットのみを残すことにより、「ループアウト（ｌｏｏｐ−ｏｕｔ）」株を取得した。次に、これらの株にクロラムフェニコール濃度の段階的な増加（ｃａｐ５、ｃａｐ２５、ｃａｐ５０、ｃａｐ７５μｇ／ｍｌ）に付すことにより、発現カセットを増幅した。分泌されたアミラーゼ活性を測定し、表５に示す。
【０１５５】
【表６】
2018505686.tif 000017
【０１５６】
さらに、増幅後に発現カセットのコピー数を測定し、アミラーゼ産生と比較し、それらを表６にまとめる。
【０１５７】
【表７】
2018505686.tif 000018
【０１５８】
このように、ａｐｒＥ５’ＵＴＲまたはその変異体を含む発現カセットは、ＬＡＴ５’ＵＴＲと比較して、アミラーゼの同等の産生および分泌を達成するのにより少量のクロラムフェニコール濃度を必要とすることを認めることができる。換言すれば、より高い発現力価を達成するためにより少ない増幅が必要とされる。
【０１５９】
上述の組成物および方法は、明瞭な理解のために図面および実施例を通していくらか詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、一定の変更形態および修正形態がなされ得ることは、本明細書に記載の教示に照らせば当業者に容易に明らかである。
【０１６０】
従って、先の記述は単に本組成物および方法の原理を説明したものである。本明細書に明示的に記載または示されていないが、本発明の組成物および方法の原理を具体化し、かつ本発明の趣旨および範囲に含まれる各種配置を当業者が考案できるであろうことは認識されるであろう。さらに、本明細書に記載の実施例および条件付き文言は全て、本組成物および本方法の原理、ならびに本発明者らによって技術の進展に寄与する概念について読者の理解を促進することを主に意図しており、またそのような具体的に記載された実施例および条件に限定されないと解されるべきである。さらに、本組成物および本方法の原理、態様および実施形態、ならびにそれらの具体的実施例を述べている本明細書中の全ての記述は、それらの構造的均等物および機能的均等物の両方を包含するものとする。さらに、そのような均等物には、現在知られている均等物、および将来開発される均等物、すなわち、構造に関わりなく同じ機能を有するように開発されるあらゆる要素がいずれも含まれるものとする。従って、本組成物および本方法の範囲は、本明細書に示され、記載されている例示の実施形態に限定されるものではない。
【図１】
2018505686.tif 000019
【図２】
2018505686.tif 000020
【図３】
2018505686.tif 000021
【配列表】
2018505686000001.app
【国際調査報告】
2018505686.tif 000022
2018505686.tif 000023
2018505686.tif 000024
2018505686.tif 000025
2018505686.tif 000026