(57)【要約】  例えば、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエ（肺炎桿菌）の腸内細菌の線毛アドヘシンＦｉｍＨの結合ポケットからマンノースを移動させる方法と抗体組成物を用いて、細菌の単層がマンノース被覆表面に付着することを妨害もしくは防止する、または多層バイオフィルムが形成されるのを妨害もしくは防止することができる。このように、本発明の抗体組成物を諸方法で用いて、数ある用途の中でも、細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止する、もしくは元に戻すことが可能であり、例えば尿路病原性大腸菌などの細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨを発現する腸内細菌による細胞の感染を阻害するもしくは防止することが可能であり、それを必要とする対象において細菌感染症を処置することが可能であり、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するもしくは防止することが可能である。【選択図】図１２
2018515517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）線毛アドヘシンＦｉｍＨを特異的に認識して、結合し、および尿路病原性大腸菌による表面のコロニー形成を防止することができる抗体を含む組成物であって、前記抗体が
（ａ）配列番号１、配列番号３およびこれと少なくとも９０％同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域であって、前記軽鎖可変領域が、ＱＮＶＳＮ  （配列番号１の残基２７〜３１）またはＱＮＩＶＨＮＮＧＮＴＹ（配列番号３の残基２７〜３７）を含むＣＤＲ１配列と、ＳＡＳ（配列番号１の残基４９〜５１）またはＫＶＳ（配列番号３の残基５５〜５７）を含むＣＤＲ２配列と、ＱＱＮＳＳＦＰＦＴ（配列番号１の残基８８〜９６）またはＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号３の残基９４〜１０２）を含むＣＤＲ３配列とを含む、軽鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号２、配列番号４およびこれと少なくとも９０％同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域が、ＧＹＡＦＳＳＹＷ（配列番号２の残基２６〜３３）またはＧＹＴＳＴＮＹＷ（配列番号４の残基２６〜３３）を含むＣＤＲ１配列と、ＩＹＰＲＤＧＤＴ（配列番号２の残基５１〜５８）またはＩＮＰＴＳＧＹＴ（配列番号４の残基５１〜５８）を含むＣＤＲ２配列と、ＥＶＧＲＧＦＹＧＭＤＹ（配列番号２の残基９７〜１０７）またはＡＲＧＶＩＲＤＦ（配列番号４の残基９７〜１０７）を含むＣＤＲ３配列とを含む、重鎖可変領域
を含む組成物。
【請求項２】
前記抗体が１未満のＩＣ５０でマンノース被覆表面への細菌接着を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１または３と少なくとも９５％同一性を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号２または４と少なくとも９５％同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１、３、５および６からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号２、４、６および８からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号２である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体が異種配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体誘導体、ベニヤ抗体、二重特異性抗体、抗体誘導体、組換えヒト抗体、キメラ抗体または抗体フラグメントの１つまたは複数である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
キャリアをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
尿路病原性大腸菌による細胞の感染症を阻害または防止する方法であって、尿路病原性大腸菌に感染した組織に投与し、前記細胞を請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物の有効量と接触させ、それによって前記細胞の感染症を阻害または防止することを含む、方法。
【請求項１４】
必要とする対象において細菌感染症を処置する方法であって、前記対象は尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエに感染しており、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象の細菌感染症を処置することを含む、方法。
【請求項１５】
前記細菌感染症が大腸炎または敗血症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
対象において炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置または防止する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象のＩＢＤを処置または防止することを含む、方法。
【請求項１７】
前記投与することが皮下投与、局所投与、経皮投与、静脈内投与、経口投与または結腸内投与による、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエの線毛アドヘシンＦｉｍＨの結合ポケットからマンノースを移動させる方法であって、前記結合ポケットを請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年５月１３日出願の米国特許仮出願第６２／１６０，８５２号および２０１５年８月２４日出願の米国特許仮出願第６２／２０８，９１３号の利益を主張し、それぞれの全内容は参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の承認
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第Ｒ２１ＡＩ１０３８４６の下、米国政府支援により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されたシーケンスリストへの参照
ファイルサイズ１５ｋｂの「ＵＷ５９ＷＯＵ２＿ＳＬ」と名付けられたシーケンスリストのＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、２０１６年５月１２日に作成され、本出願とともにＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子提出された。シーケンスリストは、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
本発明は、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエ（肺炎桿菌）を含む腸内細菌の線毛アドヘシンＦｉｍＨの結合ポケットからマンノースを移動させる方法と抗体組成物とに関する。本方法および抗体組成物を用いて、細菌の単層がマンノース被覆表面に付着することを妨害もしくは防止する、または多層バイオフィルムが形成されるのを妨害もしくは防止することができる。このように、本発明の抗体組成物を諸方法で用いて、数ある用途の中でも、細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止する、もしくは元に戻すことが可能であり、例えば尿路病原性大腸菌などの細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨを発現する腸内細菌による細胞の感染を阻害するもしくは防止することが可能であり、それを必要とする対象において細菌感染症を処置することが可能であり、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するもしくは防止することが可能である。
【背景技術】
【０００５】
受容体−リガンドの相互作用は、細胞シグナリング、細胞接着および病原体付着に関与する最も基本的な生物学的現象の１つである。これらの相互作用の抗体系阻害物質または低分子系阻害物質は、種々の予防的意味あいおよび治療的意味あい、例えば予防ワクチンの開発にとって非常に重要である。現在まで２種類の一般的な型の阻害機構が記載されている。オルソステリック阻害物質は、リガンドと結合ポケットを直接競合し、したがってそれらの受容体−阻害活性は競合性がある（Ｓｗｉｎｎｅｙ、２００４）。対照的に、アロステリック阻害物質は、リガンド結合ポケットから離れた部位との相互作用を介してそれらの効果を発揮し、非競合的に阻害を達成する（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、２００２）。非競合阻害は内因性リガンドに対して感受性が低く、したがって一般に薬理学的により効果的である（Ｓｗｉｎｎｅｙ、２００６）。
【０００６】
ＦｉｍＨは、大腸菌や腸内細菌の１型線毛と呼ばれる毛状構造の表面の先端に組み込まれる、３０ｋＤａのレクチン様タンパク質である（Ｊｏｎｅｓら、１９９５）。ＦｉｍＨは、末端が露出しているマンノースを保有する糖タンパク質に特異性を示し、大腸菌の尿路病原性菌株の毒性にとって重要である（Ｃｈｅｎら、２００９；Ｃｏｎｎｅｌｌら、１９９６；Ｋｉｓｉｅｉｕｓら、１９８９；Ｋｒｏｇｆｅｌｔら、１９９０；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２０００）。ＦｉｍＨには、線毛ロッドにアドヘジンを固定するＣ末端ピリンドメインと、マンノース結合に関与するＮ末端レクチンドメインの２つのドメインがある（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙｒ、１９９９）。レクチンドメイン内の結合ポケットは、それぞれマンノースに対して低親和性（ＫＤ＝２９８μＭ）と高親和性（ＫＤ＝１．２μＭ）のオープン構造からタイト構造の間をシフトする（Ａｐｒｉｋｉａｎら、２００７；Ｌｅ  Ｔｒｏｎｇら、２０１０；Ｔｃｈｅｓｎｏｋｏｖａら、２００８）。レクチンドメインの低親和性（不活性の）状態は、結合ドメインのβ−シート内でフィンガートラップ様ねじれを維持するピリンドメインとのレクチンドメインの相互作用によってアロステリックに安定する（Ｌｅ  Ｔｒｏｎｇら、２０１０）。高親和性（活性の）状態は、リガンド結合および／またはレクチンドメインの分離によって誘導され、分離は、流動条件下で細菌接着中の力によって促進される。ＦｉｍＨ様力活性化接着は、異なる細菌種ならびに真核細胞のいくつかの他の接着システムに記載されている。例えば、インテグリン（Ｃｈｅｎら、２０１２）またはＰ／Ｌセレクチン（Ｐｈａｎら、２００６）の様なタンパク質は、剪断力下で不活性構造と活性構造との間をシフトする。
【０００７】
ＦｉｍＨのマンノース−結合ポケットには２つのオルタナティブ構造が存在し、受容体−リガンド相互作用の生物学において広範な現象、例えば基質および生成物への酵素結合に反映される。実際に、１００年の歴史がある「鍵と鍵穴」モデルの相互作用機構は、現在、受容体タンパク質と酵素の大多数ではないにしても多数にとって柔軟性がなさすぎると考えられている。リガンド結合ポケットは一般的に可動性ループ上に残基で構成され、リガンドに対してそれぞれ比較的高親和性と低親和性（測定不能なことが多い）で、活性構造から不活性構造に動的にシフトすることがわかっている（Ａｖｌａｎｉら、２００７；Ｋｉｍら、２０１３；Ｍａら、２０１４；Ｍｅｌｃｈｅｒら、２００９；Ｓｏｏｎｙａａｒａｃｈｃｈｉら、２０１０）。一般に、リガンド結合活性ポケットは、リガンドを含まない不活性ポケットよりも収縮した形状が想定され、したがって対応する受容体コンフォーマーは一般的にオープン状態対閉鎖（またはタイト）状態と呼ばれる（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９７；Ｌｅｂｏｎら、２０１１；Ｍｅｌｃｈｅｒら、２００９；ＷａｇｎｅｒおよびＣｚａｊｋｏｗｓｋｉ、２００１）。そのようなポケットダイナミクスによる受容体が十分に研究された例の一部としては、マルトース結合タンパク質などのアロステリックタンパク質（Ｄｕａｎら、２００１；Ｑｕｉｏｃｈｏら、１９９７；Ｓｐｕｒｌｉｎｏら、１９９１）およびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が挙げられる（Ｌｅｂｏｎら、２０１１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１；ＷａｇｎｅｒおよびＣｚａｊｋｏｗｓｋｉ、２００１）。
【０００８】
２つの一般的モデルは、受容体結合ポケットの構造上でリガンドの影響を述べるために提案されている。「誘導適合」モデルにおいて、リガンドが不活性状態に結合した後だけに該ポケットの活性状態が想定されるが、「構造選択」モデルにおいて、リガンドがない場合、不活性状態と活性状態が共存するが、活性状態はリガンド結合によって安定する（Ｃｓｅｒｍｅｌｙら、２０１０；Ｇｉａｎｎｉら、２０１４；Ｈａｔｚａｋｉｓ、２０１４）。これらの２つのモデルを統合するより複雑なモデルのリガンド−受容体認識も考えられる（Ｓｉｌｖａら、２０１１）。すべてのモデルは、リガンドと結合ポケットの不活性状態との初期の弱い相互作用を可能にし、この弱い相互作用は、強い結合活性状態においてリガンドと相互作用する受容体残基のサブセットだけを必要とすることが繰り返し示されている（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９７；Ｌｅｂｏｎら、２０１１；Ｍｅｌｃｈｅｒら、２００９；Ｓｉｌｖａら、２０１１）。
【０００９】
リガンドと結合ポケットとの部分的な相互作用は、残りの残基を放置し、該残基は、ポケットが活性状態にあるとき、リガンドと相互作用するだけであり、理論上、追加の化合物に自由に結合できる。そのような化合物は、活性状態へのポケットの切り換えを妨害することによって阻害物質として潜在的に作用する可能性がある。そのような阻害物質は、リガンドと同時に結合することができないオルソステリック阻害物質または結合ポケットから離れて結合しなければならないアロステリック阻害物質のいずれの容認されている定義にも適合しない。その代わりに、そのような阻害物質がリガンドの隣に結合するので、該阻害物質はパラステリック阻害物質として分類されることが可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
バイオフィルム形成を妨害するため、病原性感染症を処置するため、ならびに汚染された生物医学装置による感染を予防するために、ＦｉｍＨ活性を阻害する有効手段の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＦｉｍＨ活性を驚くべき程度の効力で阻害する方法および組成物を提供することによってこれらの必要性およびその他を満たす。知られている２つの阻害物質のカテゴリーのいずれにも分類されない、大腸菌のマンノース結合アドヘシンＦｉｍＨに対する阻害性モノクローナル抗体の一種を本明細書に記載する。アロステリック阻害物質のように、この抗体は非競合阻害を発揮するが、オルソステリック阻害物質のようにリガンド結合ポケット内に結合する。しかし、後者の阻害物質とは異なり、ポケットがリガンドマンノースによって占有されているときでも、この抗体は結合ポケットをオープンの不活性構造に転換させる。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、尿路原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の線毛アドヘシンＦｉｍＨを特異的に認識し、結合する抗体を含み、尿路病原性大腸菌によって表面のコロニー形成を防止することができる組成物を提供する。一実施形態において、この抗体は軽鎖可変領域を含み、任意選択で重鎖可変領域、またはこれをコードするポリヌクレオチド（複数可）を含む。一般的な一実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１、配列番号３およびこれと少なくとも９０％同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。軽鎖可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のうちの１つ、２つまたは３つを含む。ＣＤＲ１配列は、ＱＮＶＳＮ（配列番号１の残基２７〜３１）またはＱＮＩＶＨＮＮＧＮＴＹ（配列番号３の残基２７〜３７）を含む。ＣＤＲ２配列は、ＳＡＳ（配列番号１の残基４９〜５１）またはＫＶＳ（配列番号３の残基５５〜５７）を含む。ＣＤＲ３配列は、ＱＱＮＳＳＦＰＦＴ（配列番号１の残基８８〜９６）またはＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号３の残基９４〜１０２）を含む。一般的な一実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号２、配列番号４およびこれと少なくとも９０％同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のうちの１つ、２つまたは３つを含む。ＣＤＲ１配列は、ＧＹＡＦＳＳＹＷ（配列番号２の残基２６〜３３）またはＧＹＴＳＴＮＹＷ（配列番号４の残基２６〜３３）を含む。ＣＤＲ２配列は、ＩＹＰＲＤＧＤＴ（配列番号２の残基５１〜５８）またはＩＮＰＴＳＧＹＴ（配列番号４の残基５１〜５８）を含む。ＣＤＲ３配列は、ＥＶＧＲＧＦＹＧＭＤＹ（配列番号２の残基９７〜１０７）またはＡＲＧＶＩＲＤＦ（配列番号４の残基９７〜１０７）を含む。一実施形態において、軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１（ＱＮＩＶＨＮＮＧＮＴＹ、配列番号３の残基２７〜３７）、ＣＤＲ２（ＫＶＳ、配列番号３の残基５５〜５７）およびＣＤＲ３（ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ、配列番号３の残基９４〜１０２）を含み、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１（ＧＹＴＳＴＮＹＷ、配列番号４の残基２６〜３３）、ＣＤＲ２（ＩＮＰＴＳＧＹＴ、配列番号４の残基５１〜５８）およびＣＤＲ３（ＡＲＧＶＩＲＤＦ、配列番号４の残基９７〜１０７）を含む。
【００１３】
一部の実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１または３と少なくとも９５％の同一性を有する。軽鎖可変領域のアミノ酸配列の代表的な例としては、配列番号１、３、５および７からなる群が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３である。
【００１４】
一部の実施形態において、重鎖可変領域配列のアミノ酸配列は、配列番号２または４と少なくとも９５％の同一性を有する。重鎖可変領域のアミノ酸配列の代表的な例としては、配列番号２、４、６、８からなる群が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４である。
【００１５】
一実施形態において、抗体は尿路病原性大腸菌ＦｉｍＨのマンノース結合ポケット内で結合する。一般的な一実施形態において、抗体は、配列番号１４に示すＦｉｍＨアミノ酸配列のアミノ酸残基１３３〜１４２内で結合する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号１４のＩ５２、Ｎ１３５、Ｎ１３６、Ｙ１３７、Ｎ１３８、Ｄ１４０および配列番号１４のＦ１、Ｎ４６、Ｉ５２、Ｄ５４、Ｑ１３３、Ｎ１３５およびＮ１３６から選択される高次構造エピトープに結合する。一実施形態において、抗体は約１５ｎＭ未満のＩＣ５０で、細菌接着を阻害する。別の実施形態において、抗体は１ｎＭ未満のＩＣ５０で、細菌接着を阻害する。特定の一実施形態において、抗体は約１４ｎＭのＩＣ５０で、細菌接着を阻害する。別の特定の実施形態において、抗体は約０．４ｎＭのＩＣ５０で、細菌接着を阻害する。
【００１６】
特定の一実施形態において、抗体はＦｉｍＨのマンノース結合ポケット内で結合し、それによってＦｉｍＨへの結合をマンノースと競合する。別の特定の実施形態において、抗体はＦｉｍＨのマンノース結合ポケット内で結合し、それによって非競合的にポケットに結合したマンノースを、例えばポケットの側面に結合することによって放出する。これらの様式において、抗体は、マンノース被覆表面への細菌の付着と、マンノース被覆表面にすでに付着している細菌の解離の両方を防止することができる。抗体を用いて、マンノース被覆表面への細菌の単層の付着を妨害もしくは防止する、または多層バイオフィルムの形成を妨害もしくは防止することができる。本発明は、尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカもしくはクレブシエラ・ニューモニエおよび他の１型線毛発現細菌などの腸内細菌の線毛アドヘシンＦｉｍＨの結合ポケットからマンノースを移動させる方法を提供する。一般的な一実施形態において、この方法は、結合ポケットを本発明の組成物と接触させることを含む。
【００１７】
一部の実施形態において、抗体は異種配列をさらに含む。異種配列の例としては、ポリペプチド、抗体、エピトープのすべてもしくは一部をコードする配列、または自然条件下で、記載された配列に隣接して発見されない他の部分のすべてもしくは一部をコードする配列が挙げられるがこれらに限定されない。そのような異種部分は、記載された配列または分子の溶解度、送達、免疫原性、有効性、検出または同定を改善するために役立つことがある。一部の実施形態において、異種配列は不活性配列または無関係な配列である。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体誘導体、ベニヤ抗体、二重特異性抗体、抗体誘導体、組換えヒト抗体、キメラ抗体または抗体フラグメントの１つまたは複数であり得る。一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。このように、一部の実施形態において、本発明の抗体組成物は、記載された抗体をコードする核酸分子を含む。一部の実施形態において、１つの核酸分子が抗体全体またはその機能的フラグメントをコードするが、他の実施形態において、抗体の複数の部分、領域および／またはフラグメントをコードする別々の核酸分子が提供される。
【００１８】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、キャリアをさらに含む。キャリアは、薬学的に許容されるキャリアまたは抗体組成物の使用を容易にする他のキャリアであり得る。本発明はさらに、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器を収容するように区画化されているパッケージまたは容器を含み、各容器（複数可）は上記方法で使用される別々のエレメント（例えば抗体、キャリア）の１つを含むキットを提供する。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止するまたは元に戻す方法を提供する。腸内細菌の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｋ．ニューモニエ（肺炎桿菌）、Ｋ．オキシトカ（クレブシエラ・オキシトカ）、シゲラ（赤痢菌）、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラが挙げられるがこれらに限定されるものではない。表面は、生体表面または非生体表面であり得る。腸内細菌によるコロニー形成が可能な生体表面の例としては、粘膜上皮表面が挙げられるが、これらに限定されるものではない。腸内細菌によるコロニー形成が可能な非生体表面の例としては、カテーテルおよび挿管器具が挙げられるが、これらに限定されるものではない。方法は、一般的に、表面を本発明の抗体を含む組成物と接触させることを含む。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨを発現する腸内細菌、例えば尿路病原性大腸菌による細胞の感染を阻害するまたは防止する方法を提供する。本方法は、腸内細菌、例えば尿路病原性大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｋ．オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラに感染した組織に投与することを含む。本方法は、細胞を本発明の組成物の有効量と接触させ、それによって細胞の感染を阻害するまたは防止することを含む。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、必要とする対象において細菌感染症を処置する方法であって、該対象は大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｋ．オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラなどの腸内細菌に感染している、方法を提供する。一部の実施形態において、腸内細菌は、尿路疾患性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエである。本方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を対象に投与し、それによって対象の細菌感染症を処置することを含む。一部の実施形態において、細菌感染は大腸炎または敗血症である。本方法によって処置される感染症のさらなる代表的な例としては、挿管患者における換気肺炎を含む肺炎、尿道カテーテルと血液ラインカテーテルを含むカテーテル関連感染症、新生児髄膜炎、膣内コロニー形成と尿道周囲コロニー形成に起因するものを含む尿路感染症、および創傷感染症が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するまたは防止する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を対象に投与し、それによって対象におけるＩＢＤを処置または予防することを含む。一実施形態において、投与することは、皮下投与、局所投与、経皮投与、静脈内投与、経口投与または結腸内投与による。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ｍＡｂ９２６とｍＡｂ４７５の阻害活性を示す。異なる濃度の抗ＦｉｍＨ抗体の存在下でＦｉｍＨｗｔ発現大腸菌と表面固定化酵母マンナンとの結合。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝５の独立した実験）である。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア６版を用いて、近似曲線から算出した。＊＊  Ｐ≦０．００５（ｔ検定）。
【図２】抗体結合に対するマンノースの影響を示す。１％（５２ｍＭ）マンノースの非存在下および存在下で、線毛ＦｉｍＨｗｔへのｍＡｂ４７５（Ａ）結合およびｍＡｂ９２６（Ｂ）結合の用量反応曲線。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェア６版を使用して、示された近似線から別々に、ｍＡｂごとに算出した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３の独立した実験）で示す。
【図３】阻害抗体ｍＡｂ９２６とｍＡｂ４７５は、ＦｉｍＨのマンノース結合ポケットと異なって重複しているエピトープを認識する。ｍＡｂ９２６のエピトープは、ｍＦｉｍＨレクシンドメインの活性（Ａ）高次構造と不活性（Ｄ）高次構造の結晶構造上に位置した。ｍＡｂ９２６エピトープ残基のＣα原子を黒い球体として示す。自然のアロステリック結合部位（残基Ｖ２８、Ｖ３０、Ｓ１１４とＡ１１５）（Ｌｅ  Ｔｒｏｎｇら、２０１０）は明るい灰色の球体として示し、Ｄ−マンノースは黒いスティックとして示す。ｍＡｂ２１のエピトープは、濃い灰色の球体として示す。（ＢおよびＥ）ｍＡｂ９２６とｍＡｂ４７５のエピトープとともにＦｉｍＨ結合ポケットの詳細な描写をスティックとして示す。ｍＡｂ９２６エピトープ残基には下線を引き、ｍＡｂ４７５エピトープ残基は太字体で示す。これらの２つのエピトープの重複する残基は、下線を引き、太字体で示す。Ｄ−マンノースとの直接水素結合に関与するが、どちらかのモノクローナル抗体エピトープの一部ではないＤ４７残基は、イタリック体で示す。（ＣおよびＦ）それぞれ活性および不活性のＦｉｍＨ構造におけるマンノース接触アミノ酸残基間の相対距離を示す。Ｄ−マンノース（濃い灰色のスティック）の結晶化位置および計算的に結合した位置（テキストを参照されたい）も示す。示した距離は、Ｄ−マンノースリガンドと水素結合を形成することが知られている（Ｈｕｎｇら、２００２）残基側鎖の重原子間を測定した。活性構造と不活性構造のＰＤＢコードは、それぞれ１ＵＷＦと３ＪＷである。１ＵＷＦにおいて、Ｄ−マンノースの位置は、本来の結晶構造のブチルα−Ｄ−マンノシドの糖環との整列によって決定した。
【図４】ＦｉｍＨ構造に対する抗体結合の影響を示す。１％（５２ｍＭ）マンノース、５０μｇ／ｍＬのｍＡｂ４７５またはｍＡｂ９２６とともに事前処置した後の活性状態特異的ｍＡｂ２１（ビオチン化）と線毛ＦｉｍＨｗｔとの結合（Ａ）および活性状態特異的ｍＡｂ２１（ビオチン化）と線毛ＦｉｍＨＡ１８８Ｄとの結合（Ｂ）。（Ｃ）ｍＡｂ４７５またはｍＡｂ９２６を添加してから６０分後のｍＡｂ２１−ＦｉｍＨＡ１８８Ｄ複合体からのｍＡｂ２１（ビオチン化）の溶離。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３の独立した実験）で示す。＊＊  Ｐ≦０．００５、＊＊＊  Ｐ≦０．０００５（ｔ検定）。
【図５】ＦｉｍＨに結合した抗体に対するマンノースの影響は、表面プラズモン共鳴によって判定した。ＦｉｍＨｗｔとともにＣＭ５チップに固定化した線毛と、濃度５０ｎＭでのｍＡｂ９２６との結合（Ａ）および濃度１００ｎＭでのｍＡｂ４７５との結合（Ｂ）を３００秒間進行させておき、次いでマンノースを含まないまたは１％含んだ（それぞれ黒い曲線と灰色の曲線）ランニング緩衝液を矢印で示した時点でフローセルに６００秒間注入した。テストした二つ組の各抗体と条件（＋／−マンノース）を示す。
【図６】低親和性構造安定化モノクローナル抗体の比較を示す。（Ａ）０．０１％（０．５２ｍＭ）マンノースの存在下で活性状態特異的ｍＡｂ２１（ビオチン化）と、無処置線毛ＦｉｍＨｗｔまたはｍＡｂ９２６処置線毛ＦｉｍＨｗｔおよびｍＡｂ４７５処置線毛ＦｉｍＨｗｔとの結合。（Ｂ）抗体−ＦｉｍＨ複合体をＰＢＳまたは８％（４４０ｍＭ）マンノースで１時間処置した後に保持されていたＦｉｍＨｗｔ結合抗体のレベル。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３の独立した実験）である。＊＊＊  Ｐ≦０．０００５（ｔ検定）。
【図７】マウスにおいてマンナン被覆表面の大腸菌ＵＴ１８９および膀胱感染症によって形成されたバイオフィルムに対するｍＡｂ９２６とｍＡｂ４７５の影響を示す。（Ａ）１％マンノースまたは５０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体の存在下で大腸菌ＵＴ１８９によるバイオフィルム形成。データ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４の独立した実験）は、マンノースまたは抗体の非存在下で形成されたバイオフィルムのレベルと比較して示す（破線）。＊＊  Ｐ≦０．００５、＊＊＊  Ｐ≦０．０００５（１標本ｔ検定）。（Ｂ）１％マンノースまたは５０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体の存在下で、１６時間形成された大腸菌ＵＴ１８９バイオフィルムの解離。データ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３の独立した実験）は、ＰＢＳの存在下で解離したバイオフィルムのレベルを比較して示す（破線）。バイオフィルムは、クリスタルバイオレット染色法を使用して定量化した。＊＊＊  Ｐ≦０．０００５（ｔ検定）。（Ｃ）経尿道感染から２４時間後、マウスの膀胱から回収した大腸菌ＵＴ１８９。マウス膀胱への投与に先立ち、細菌をＰＢＳ、ｍＡｂ４７５、ｍＡｂ９２１６またはｍＡｂ２１とともに１時間プレインキュベートした。水平バーは、平均（群当たりのマウスｎ＝５または６）を示す。示したデータセットのＰ値は、マン・ホイットニー両側検定を使用して決定した。
【図８】マウスにおける大腸菌感染に対する受動免疫化および能動免疫化の効果を示す。抗原投与から１４日間にわたる非糖尿病マウス（Ａ）および糖尿病マウス（Ｂ）の異なる群の尿中の大腸菌ＣＦＴ０７３（ｌｏｇ１０／１０μＬ）の推定平均計数。動物に、示したモノクローナル抗体（１５０μｇ／マウス）またはＬＤ抗原（１５μｇ／マウス）でそれぞれ受動的にもしくは能動的に免疫した、またはフロイント不完全アジュバントだけで免疫した（ＩＦＡ、モック）。（Ｃ）ＡおよびＢで示したデータの統計有意性。
【図９】抗大腸菌ＦｉｍＨ抗体によるクレブシエラＦｉｍＨの認識を示す。ｍＡｂ４７５およびｍＡｂ９２６と、大腸菌およびクレブシエラ線毛ＦｉｍＨとの結合。異なるＦｉｍＨ変種体（ＦｉｍＨｗｔおよびＦｉｍＨＳ６２Ａ変異体）を保有する１型線毛を、異なる濃度のモノクローナル抗体（５０および５μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。データは代表的な一実験からの二つ組の平均±ＳＤで示す。
【図１０】ｍＡｂ９２６およびｍＡｂ４７５の阻害活性を示す。１％マンノースまたは５０μｇ／ｍＬの抗ＦｉｍＨ抗体の存在下で、ＦｉｍＨｗｔ発現クレブシエラ・ニューモニエおよびＦｉｍＨＳ６２Ａ発現クレブシエラ・ニューモニエと、表面固定化ＲＮａｓｅＢとの結合。データは平均±ＳＤ（ｎ＝２の独立した実験）である。
【図１１】ＲＮａｓｅＢ被覆表面にクレブシエラ・ニューモニエによって形成されたバイオフィルムに対するｍＡｂ９２６とｍＡｂ４７５の効果を示す。（Ａ）１％マンノースまたは５０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体の存在下でクレブシエラによるバイオフィルム形成。データ（平均±ＳＤ、ｎ＝３の独立した実験）。（Ｂ）１％マンノースまたは５０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体の存在下で、１４時間形成されたクレブシエラバイオフィルムの解離。データ（平均±ＳＤ、ｎ＝３の独立した実験）。バイオフィルムは、クリスタルバイオレット染色法を使用して定量化した。＊  Ｐ≦０．０５、＊＊＊  Ｐ≦０．０００５（１標本ｔ検定）。
【図１２】ＦｉｍＨのレクチンドメイン（ＬＤ）に対する異なる種類の抗体の模式図を示す。（Ａ）オルソステリック抗体。（Ｂ）アロステリック抗体。（Ｃ）パラステリック抗体。ＬＤ上の三角形インデントはマンノース結合部位を表し、黒い三角形はマンノースリガンドを表す。斜線部分は、それぞれオルソステリック、アロステリックおよびパラステリック抗体のための機能的エピトープを表す。
【図１３】ｍＡｂ４７５とｍＡｂ９２６の可変重鎖領域と可変軽鎖領域の配列を示す。（Ａ）ｍＡｂ４７５（配列番号１、２）およびｍＡｂ９２６（配列番号３、４）の軽鎖可変領域（配列番号１、３）および重鎖可変領域（配列番号２、４）のアミノ酸配列の配列比較。（Ｂ）ｍＡｂ４７５とｍＡｂ９２６の生殖系列起源。ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔソフトウェアによって判定した相補性決定領域（ＣＤＲ、輪郭を描いた）の位置およびモノクローナル抗体の生殖系列起源。抗体（ｍＡｂ４７５、配列番号１６、１８；ｍＡｂ９２６配列番号１７、１９）の軽鎖可変領域（配列番号１６〜１７）および重鎖可変領域（配列番号１８〜１９）のＮ末端から最初の８アミノ酸は免疫グロブリン遺伝子増幅および配列決定で使用された順方向プライマーの配列と重複しており、したがって、生殖系列起源として示す。
【図１４】ＦｉｍＨｗｔによるＣＭ５チップ固定化線毛への抗体結合のプラズモン共鳴測定を示す。（Ａ）ｍＡｂ９２６の結合。（Ｂ）ｍＡｂ４７５の結合。実験データ（黒い曲線）をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア２．０．４版（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１結合モデルとフィッティングさせた。二つ組の各濃度を示す。
【図１５】ＦｉｍＨ受容体へのマンノースおよび抗体の競合結合（明るい灰色の領域）対非競合結合（濃い灰色の領域）のモデルを示す。ＲはＦｉｍＨ受容体を示し、Ａは抗体を示し、Ｍはマンノースを示す。ＫＤとＫＤ（Ａ）はそれぞれの平衡解離定数であり、αは協同因子を示す。
【図１６】阻害性モノクローナル抗体はＦｉｍＨへの互いの結合に干渉する。ビオチン化ｍＡｂ４７５（Ａ）およびビオチン化ｍＡｂ９２６（Ｂ）と、ＦｉｍＨ（ＦｉｍＨｗｔ：（１８６−２０１）ＦｏｃＨ、（Ａｐｒｉｋｉａｎら、２００７））の高親和性変種との結合をＰＢＳまたは示した抗体とともにプレインキュベートした。データは、同様の設定で行われた複数の実験の代表的な一実験から三つ組の平均±ＳＤを示す。
【図１７】ＦｉｍＨ結合ポケットの活性構造および不活性構造におけるリガンド接触残基間の距離を示す。すべての距離はÅで示し、ＦｉｍＨの活性コンフォーマー（ＰＤＢ  １ＵＷＦ）と不活性コンフォーマー（ＰＤＢ  ３ＪＷＮ）の示した残基の重原子間をＰｙＭｏｌで測定した。
【図１８】線毛ＦｉｍＨからのモノクローナル抗体への結合とモノクローナル抗体からの解離を示す。（Ａ）ｍＡｂ８２４とＦｉｍＨｗｔでのＣＭ５チップ固定化線毛との結合をＳＰＲによって記録した。濃度２００ｎＭでｍＡｂ８２４は、２つの平行チャネル中で３００秒間、結合させておいた。矢印で示した時点で、ランニング緩衝液（黒い曲線）または１％マンノースを含めたランニング緩衝液（灰色の曲線）のいずれかを６００秒にわたり注入した。各状態（＋／−マンノース）の単一複製を示す。（Ｂ）ＰＢＳ中での１〜４時間のインキュベーション後に、ＥＬＩＳＡによって判定したＦｉｍＨｗｔ結合抗体の解離。データは平均±ＳＤ（ｎ＝２の独立した実験）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、大腸菌のマンノース結合アドヘシンで、知られている阻害物質の２つのカテゴリーにいずれにも入らないＦｉｍＨに対する１種類の阻害モノクローナル抗体の驚くべき予想外の発見に基づいている。アロステリック阻害物質のように、この抗体は非競合阻害を発揮するが、オルソステリック阻害物質のようにリガンド結合ポケット内で結合する。しかし、後者とは異なり、ポケットがリガンドマンノースによって占有されているときでも、この抗体は結合ポケットをオープンで不活性の構造に転換させる。
【００２５】
本明細書に記載するように、異なる抗ＦｉｍＨ抗体の阻害機構を比較し、阻害のパラステリックモデルと整合する異なる方法で接着機能を阻止する抗体を説明する。オルソステリック抗体と比較して、パラステリック抗体は細菌接着、表面結合バイオフィルム、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコロニー形成に対してより強力な阻害物質であり、パラステリック阻害物質のデザインは、抗接着予防戦略および治療戦略の開発に向けて極めて強力なアプローチを潜在的に意味することを示している。
【００２６】
本発明の抗体は、０．４ｎＭもの低さのＩＣ５０で細菌接着を阻害する。本明細書では、腸内細菌、例えば尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエの線毛アドヘシンＦｉｍＨの結合ポケットからマンノースを移動させる方法と抗体組成物を説明する。本発明の抗体はＦｉｍＨのマンノース結合ポケット内で結合し、ＦｉｍＨへの結合をマンノースと競合することができ、またはポケットに結合したマンノースを非競合的に、例えばポケットの横側に結合することによって放出することができる。このように、抗体は、マンノース被覆表面への細菌の付着を防止することができ、マンノース被覆表面にすでに付着している細菌を解離することもできる。この抗体を用いて、マンノース被覆表面への細菌の単層の付着を妨害もしくは防止する、または多層バイオフィルムの形成を妨害もしくは防止することができる。このように本発明の抗体組成物を方法で用いて、細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止する、もしくは元に戻すことが可能であり、例えば尿路病原性大腸菌などの細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨを発現する腸内細菌による細胞の感染を阻害するもしくは防止することが可能であり、それを必要とする対象において細菌感染症を処置することが可能であり、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するもしくは防止することが可能である。
【００２７】
定義
本明細書で用いる場合、「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および所望の抗原結合活性を示す限り抗体フラグメントを指す。「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体の一部を含み、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性抗体、線形抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）および抗体フラグメントから形成されている多特異的抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「特異的に結合する」とは、抗体と特異的なタンパク質または標的との結合であって、タンパク質の異種集団の間に存在する結合を指す。したがって、特定の免疫アッセイ条件下で存在するとき、抗体は、ＦｉｍＨなどの特定のタンパク質標的に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に相当量で結合しない。
【００２９】
本明細書で用いる場合、アミノ酸配列に関して、「同一の」とは、整列させた配列中の任意の特定のアミノ酸残基の位置で、そのアミノ酸残基が整列させた配列間で同一であることを意味する。本明細書で用いる場合「類似性」または「配列類似性」という用語は、整列させた配列中の任意の特定の位置で、そのアミノ酸残基が配列間で類似した種類であることを示す。例えば、ロイシンはイソロイシン残基またはバリン残基に対して置換することができる。この種の置換は、保存的置換と呼ぶことができる。好ましくは、任意のアミノ酸残基の保存的置換が所定のアミノ酸残基に含まれ、無修飾抗体と比較すると、これらの変化が前述の抗体の結合特異性または機能活性に影響を及ぼさない。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「対応する位置」とは、２つの配列間の最大配列同一性を可能にするために２つの配列を整列させると、第１の配列において、その位置と同じ位置で特定されたアミノ酸残基に対応する位置で第２の配列中に存在するアミノ酸残基を指す。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「本質的にからなる」または「本質的にからなっている」とは、ポリペプチドは、追加の特徴または記載のもの以上のエレメント有し得ることを意味するが、ただし追加の特徴またはエレメントが記載された結合特異性を有する抗体もしくは抗体フラグメントの能力に物質的に影響しないことを条件とする。ポリペプチドを含む抗体もしくは抗体フラグメントは、その標的に結合し、その機能活性を示す抗体もしくは抗体フラグメントの能力に干渉しない追加の特徴またはエレメント、例えばマンノース被覆表面への細菌接着を妨害するまたは防止することを有し得る。抗体の免疫原性を低下させるために、そのような修飾をアミノ酸配列に導入することができる。例えば、特定された配列から本質的になるポリペプチドは、配列のどちらかの端または両端で１、２、３、４、５またはそれ以上の追加アミノ酸、欠失アミノ酸、または置換アミノ酸を含み得るが、ただしこれらのアミノ酸が、抗体もしくは抗体フラグメントのその標的に結合し、その生物活性を示すことにおける役割に干渉する、阻害する、阻止するまたは妨げることがないことを条件とする。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「異種」配列または「異種」分子とは、記載された配列または分子に関連して自然起源でない部分を指す。異種分子の代表的な例としては、ポリペプチド、抗体、エピトープ、ポリヌクレオチド、小分子または薬物が挙げられるがこれらに限定されるものではない。そのような異種部分は、記載された配列または分子の溶解度、送達、免疫原性、有効性、検出または同定を改善するために役立つことがある。一部の実施形態において、異種配列は不活性配列または無関係な配列である。本発明の抗体に関与する部分は、１つまたは複数の官能基で化学的に修飾されることができるが、ただし、そのような官能基がＦｉｍＨに結合する抗体もしくは抗体フラグメントの能力に干渉することなく、マンノース被覆表面への細菌接着を妨害するまたは防止することを条件とする。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「腸内細菌」（または腸内細菌科）とは、細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨを発現するグラム陰性菌を指す。腸内細菌の例としては、大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｋ．オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「炎症性腸疾患」（またはＩＢＤ）とは、結腸および小腸の炎症状態を指し、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容されるキャリア」とは、活性成分と組み合わせると、成分が生物活性を保持することができ、対象の免疫系と反応しない任意の物質が含まれる。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水などの標準医薬的キャリア、油／水エマルジョンなどの乳剤、および種々の湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。噴霧剤または非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸塩緩衝生理的食塩水または生理食塩水（０．９％）である。
【００３６】
そのようなキャリアを含む組成物は、周知の従来法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｎａｒｏ  １９９０））によって調製される。
【００３７】
本明細書で用いる場合、状態を「防止する」または「処置する」こととは、状態を示す症状を減少させるもしくは阻害する、または発症を遅延させる、または状態の重症度を低下させることを意味する。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「アジュバント」とは、免疫応答を促進するために当技術分野で通常使用されているアジュバント類が含まれる。一部の実施形態において、例えばポリヌクレオチドワクチンの使用で、ヘルパーペプチドまたはサイトカインなどのアジュバントはポリヌクレオチドをコードするアジュバントを介して提供されることが可能である。
【００３９】
本明細書で用いる場合「ａ」または「ａｎ」は、明らかに別途示されない限り、少なくとも１つを意味する。
【００４０】
本明細書で用いる場合、用語「含む」もしくは「含まれる」または「含む」もしくは「含んでいる」などの変化は、記載される項目の包含もしくは項目の群を意味するが、いずれの他の項目もしくは項目の群を除外しない。
【００４１】
本発明の方法と用途
一実施形態において、細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨを発現する腸内細菌による表面のコロニー形成を阻害する、防止するまたは元に戻す方法を提供する。腸内細菌の例としては、大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｋ．オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラが挙げられるがこれらに限定されるものではない。表面は、生体表面または非生体表面であり得る。腸内細菌によるコロニー形成が可能な生体表面の例としては、粘膜上皮表面が挙げられるが、これらに限定されるものではない。腸内細菌によるコロニー形成が可能な非生体表面の例としては、カテーテルおよび挿管器具が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本方法は、一般的に、本発明の抗体を含む組成物と該表面を接触させることを含む。
【００４２】
一実施形態において、本発明は、細菌１型線毛アドヘシンＦｉｍＨ、例えば尿路病原性大腸菌を発現する腸内細菌による細胞の感染を阻害するまたは防止する方法を提供する。本方法は、腸内細菌、例えば尿路病原性大腸菌または大腸菌の他の種、Ｋ．ニューモニエ、Ｋ．オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラに感染した組織に投与することを含む。本方法は発明の組成物を有効量で細胞に接触させ、それによって細胞の感染を阻害するか、防止することを含む。
【００４３】
一実施形態において、本発明は、必要とする対象において細菌感染症を処置する方法であって、該対象は大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｋ．オキシトカ、シゲラ、セラチア菌種、エンテロバクター菌種、シトロバクターおよびエドワージェラなどの腸内細菌に感染している、方法を提供する。一部の実施形態において、腸内細菌は尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカまたはクレブシエラ・ニューモニエである。本明細書に記載のように、本方法は対象に組成物の有効量を投与し、それによって対象において細菌感染症を処置することを含む。一部の実施形態において、細菌感染症は大腸炎または敗血症である。本方法によって処置される感染症のさらなる代表的な例としては、挿管患者における換気肺炎を含む肺炎、尿道カテーテルと血液ラインカテーテルを含むカテーテル関連感染症、新生児髄膜炎、膣内コロニー形成と尿道周囲コロニー形成に起因するものを含む尿路感染症、および創傷感染症が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００４４】
一実施形態において、本発明は、対象において炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するまたは防止する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を対象に投与し、それによって対象においてＩＢＤを処置または予防することを含む。一実施形態において、投与することは、皮下投与、局所投与、経皮投与、静脈内投与、経口投与または結腸内投与による。
【００４５】
本発明の抗体と組成物
一実施形態において、本発明は、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）線毛アドヘシンＦｉｍＨを特異的に認識して結合する抗体またはポリヌクレオチドをコードする抗体を含み、尿路病原性大腸菌によって表面のコロニー形成を防止することができる組成物を提供する。一実施形態において、抗体は軽鎖可変領域、および任意選択で重鎖可変領域を含む。一般的な一実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１、配列番号３およびこれと少なくとも９０％同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。軽鎖可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のうちの１つ、２つまたは３つを含む。ＣＤＲ１配列は、ＱＮＶＳＮ（配列番号１の残基２７〜３１）またはＱＮＩＶＨＮＮＧＮＴＹ（配列番号３の残基２７〜３７）を含む。ＣＤＲ２配列は、ＳＡＳ（配列番号１の残基４９〜５１）またはＫＶＳ（配列番号３の残基５５〜５７）を含む。ＣＤＲ３配列は、ＱＱＮＳＳＦＰＦＴ（配列番号１の残基８８〜９６）またはＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号３の残基９４〜１０２）を含む。一般的な一実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号２、配列番号４およびこれと少なくとも９０％同一の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のうちの１つ、２つまたは３つを含む。ＣＤＲ１配列は、ＧＹＡＦＳＳＹＷ（配列番号２の残基２６〜３３）またはＧＹＴＳＴＮＹＷ（配列番号４の残基２６〜３３）を含む。ＣＤＲ２配列は、ＩＹＰＲＤＧＤＴ（配列番号２の残基５１〜５８）またはＩＮＰＴＳＧＹＴ（配列番号４の残基５１〜５８）を含む。ＣＤＲ３配列は、ＥＶＧＲＧＦＹＧＭＤＹ（配列番号２の残基９７〜１０７）またはＡＲＧＶＩＲＤＦ（配列番号４の残基９７〜１０７）を含む。
【００４６】
一部の実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１または３と少なくとも９５％の同一性を有する。軽鎖可変領域のアミノ酸配列の代表的な例としては、配列番号１、３、５および６からなる群が挙げられるがこれに限定されない。一部の実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３である。
【００４７】
一部の実施形態において、重鎖可変領域配列のアミノ酸配列は、配列番号２または４と少なくとも９５％の同一性を有する。重鎖可変領域のアミノ酸配列の代表的な例としては、配列番号２、４、６、８からなる群が挙げられるがこれに限定されない。一部の実施形態において、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４である。
【００４８】
一実施形態において、抗体は尿路病原性大腸菌ＦｉｍＨのマンノース結合ポケット内で結合する。一般的な一実施形態において、抗体は、配列番号１４に示すＦｉｍＨアミノ酸配列のアミノ酸残基１３３〜１４２内で結合する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号１４のＩ５２、Ｎ１３５、Ｎ１３６、Ｙ１３７、Ｎ１３８、Ｄ１４０および配列番号１４のＦ１、Ｎ４６、Ｉ５２、Ｄ５４、Ｑ１３３、Ｎ１３５およびＮ１３６から選択される高次構造エピトープに結合する。配列番号１４は、Ｋ１２のＦｉｍＨのアミノ酸配列である。配列番号１５は、以下に示すように、ほんの少数の残基で異なるＵＴ１８９のＦｉｍＨのアミノ酸配列である。
【００４９】
Ｋ１２（上段）およびＵＴＩ８９（下段）のＦｉｍＨのアミノ酸配列：
【化１】
2018515517.tif 000003
【００５０】
特定の一実施形態において、抗体はＦｉｍＨのマンノース結合ポケット内で結合し、それによってＦｉｍＨへの結合をマンノースと競合する。別の特定の実施形態において、抗体はＦｉｍＨのマンノース結合ポケット内で結合し、それによって非競合的にポケットに結合したマンノースを、例えばポケットの側面に結合することによって放出する。これらの様式において、抗体はマンノース被覆表面への細菌の付着の防止と、マンノース被覆表面にすでに付着している細菌の解離との両方を行うことができる。抗体を用いて、マンノース被覆表面への細菌の単層の付着を妨害もしくは防止する、または多層バイオフィルムの形成を妨害もしくは防止することができる。本発明は、尿路病原性大腸菌、クレブシエラ・オキシトカもしくはクレブシエラ・ニューモニエなどの腸内細菌の線毛アドヘシンＦｉｍＨの結合ポケットからマンノースを移動させる方法を提供する。一般的な一実施形態において、この方法は、結合ポケットを本発明の組成物と接触させることを含む。
【００５１】
一実施形態において、抗体は約１５ｎＭ未満のＩＣ５０で、細菌接着を阻害する。別の実施形態において、抗体は１ｎＭ未満のＩＣ５０で、細菌接着を阻害する。特定の一実施形態において、抗体は約１４ｎＭのＩＣ５０で、細菌接着を阻害する。別の特定の実施形態において、抗体は約０．４ｎＭのＩＣ５０で、細菌接着を阻害する。
【００５２】
一部の実施形態において、抗体は異種配列をさらに含む。異種配列の例としては、ポリペプチド、抗体、エピトープのすべてもしくは一部をコードする配列、または自然条件下で、記載された配列に隣接して発見されない他の部分のすべてもしくは一部をコードする配列が挙げられるがこれに限定されない。そのような異種部分は、記載された配列または分子の溶解度、送達、免疫原性、有効性、検出または同定を改善するために役立つことがある。一部の実施形態において、異種配列は不活性配列または無関係な配列である。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体誘導体、ベニヤ抗体、二重特異性抗体、抗体誘導体、組換えヒト抗体、キメラ抗体または抗体フラグメントの１つまたは複数であり得る。一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。
【００５３】
本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。このように、一部の実施形態において、本発明の抗体組成は、記載された抗体をコードする核酸分子を含む。一部の実施形態において、１つの核酸分子が抗体全体またはその機能的フラグメントをコードするが、他の実施形態において、抗体の複数の部分、領域および／またはフラグメントをコードする別々の核酸分子が提供される。
【００５４】
一実施形態において、組成物は医薬組成物である。該組成物は、本発明の抗体または該抗体をコードするポリヌクレオチドの治療有効量または予防有効量を含むことができる。
有効量は、細菌接着および／またはバイオフィルム形成を妨害する、または状態、疾患もしくは感染症の症状を軽減するのに十分な量である。一部の実施形態において、本発明の組成物は、キャリアをさらに含む。キャリアは、薬学的に許容されるキャリアまたは抗体組成物の使用を容易にする他のキャリアであり得る。
【００５５】
当業者に知られている任意の適切なキャリアを本発明の医薬組成物に用いることができるが、キャリアの種類は投与方法によって変わる。本発明の組成物は、投与の任意の適切な投与方法用、例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内の投与を含む投与方法用に調製されることができる。非経口投与、例えば皮下注射の場合、キャリアは好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与の場合、上記のキャリアのいずれかまたは固体キャリア、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖および炭酸マグネシウムを用いることができる。
【００５６】
そのような組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、ショ糖もしくはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および／または保存剤も含むことができる。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として調製されることができる。化合物は、既知の方法でリポソーム内にカプセル化されることもできる。
【００５７】
組成物の投与
処置は、予防処置と治療処置が含まれる。予防または処置は、単一時点または複数時点で単回直接注射によって行われることができる。投与は、多部位へほとんど同時に行われることも可能である。患者または対象としては、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタおよびヒツジなどの哺乳動物ならびに他の獣医学対象）が挙げられる。一般的な患者または対象はヒトである。
【００５８】
組成物は、一般的に、ｉｎ  ｖｉｖｏで非経口経路（例えば静脈内、皮下および筋肉内）または口腔内／舌下、直腸、経口、経鼻などの他の従来の直接経路、局所経路（経皮および点眼）、腟経路、肺経路、動脈内経路、腹腔内経路、眼内もしくは鼻腔内経路、または直接特定の組織に投与される。
【００５９】
組成物は、任意の適切な方法で、しばしば薬学的に許容されるキャリアとともに投与される。本発明と関連して細胞を患者に投与する適切な方法が利用可能であり、複数の経路を用いて、特定の組成物を投与することが可能であるが、特定の経路はしばしば別の経路よりもより直接的で効果的な反応をもたらすことができる。
【００６０】
本発明と関連して、患者に投与される用量は、患者において経時的に有益な治療応答をもたらす、または感染症もしくは感染症に起因する疾患を阻害するのに十分でなければならない。このように、組成物は、症状および／または疾患もしくは感染からの合併症を軽減するか、低減するか、治療するか、少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で、患者に投与される。これを達成するのに十分な量を「治療有効用量」と定める。
【００６１】
用量は、生成された組成物の活性および患者の状態によって、ならびに処置される患者の体重または表面積によって決定される。用量の大きさも、特定の患者において特定の組成物の投与に伴ういずれの有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。腸内細菌感染症などの疾患の処置または予防において投与される組成物の有効量を決定する際に、医師は疾患の悪化およびいかなる処置関連毒性も評価する必要がある。
【００６２】
キット
本明細書に記載の方法において使用するためのキットも本発明の範囲内である。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器を収容するように区画化されているパッケージまたは容器を含むことができ、各容器（複数可）には本方法で使用される別々のエレメント（例えば抗体、キャリア）の１つが含まれている。一般的に、キットは本発明の１種または複数種の抗体またはポリヌクレオチドを含む。キットは、１または複数の容器をさらに含み、１種または複数種の抗体をその容器に保管する。本発明のキットには、一般的に、上述の容器と、市販の望ましい材料を含む１または複数の別の容器とを含み、ユーザーの観点から緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用方法に関する添付文書が含まれる。加えて、組成物が特定の治療適用または非治療適用のために使われることを示すために、ラベルを容器面に提示することができ、および使用方法を示すこともできる。使用方法および、または他の情報も、キットに含まれる挿入物に組み入れることができる。
【００６３】
実施例
以下に実施例を示して、本発明を例示し、当業者が同実施例を作製し使用することを支援する。これらの実施例は、その他の方法で本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００６４】
実施例１：抗ＦｉｍＨ抗体ｍＡｂ９２６とｍＡｂ４７５は異なる効率と機構で細菌接着を阻害する
本実施例は、マンノース結合と直接競合するｍＡｂ４７５抗体（Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３）を記載の先行研究において特性を明らかにされた不活性構造においてＦｉｍＨのレクチンドメインに対する抗ＦｉｍＨ阻害抗体の活性をより詳細に述べる。ここで、ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｒｏｃｈｅｔら、２００８；Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら、２０１１）を用いて、ｍＡｂ４７５およびいくつかの他のＦｉｍＨ阻害モノクローナル抗体の生殖系列起源を比較した。これらの抗体の１つ、ｍＡｂ９２６は、ｍＡｂ４７５とは異なる生殖系列起源であり、軽鎖可変領域と重鎖可変領域のアミノ酸配列相同性がそれぞれわずか５６％と７１％であり、３つの相補性決定領域のすべてが非常に多様である（図１３）。したがって、ｍＡｂ９２６とｍＡｂ４７５のＦｉｍＨを阻害する能力をより詳細に比較した。
【００６５】
尿路病原性大腸菌株Ｊ９６の野生型ＦｉｍＨアドヘジン変異体（ＦｉｍＨｗｔ）を発現する１型線毛細菌細胞を種々の濃度の抗体とともにプレインキュベートし、次いでマンノシル化表面に結合させておいた（図１）。ｍＡｂ９２６は、０．４±０．１ｎＭの最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）で細菌接着を阻害し、ｍＡｂ４７５は１４±１ｎＭのＩＣ５０で細菌接着を阻害し、ｍＡｂ９２６の阻害活性がはるかに高いことを示した（図１）。抗体の阻害活性において３２倍の差（Ｐ≦０．００５）が結合親和性の差に反映されたかを判定するために、表面プラズモン共鳴法を用いて、ＦｉｍＨｗｔを保有する精製線毛と抗体との結合の特性を明らかにした。図１４に示すように、ｍＡｂ９２６のＫＤはｍＡｂ４７５のＫＤよりも７倍低かった（それぞれ、０．５８ｎＭ対４．１５ｎＭ）。このように、これらの２つの抗体間のＩＣ５０の差異は、親和性の差異によって説明することができなかった。実際、ｍＡｂ９２６がそのＫＤ濃度で＞５０％阻害を示すが、ｍＡｂ４７５はそのＫＤ濃度で測定可能な阻害を示さない（図１）。さらに、ｍＡｂ９２６がｍＡｂ４７５と比較して会合速度が１７．６倍高く（それぞれ、４９．７対２．８×１０４Ｍ−１ｓ−１）、解離速度が２．５倍高い（それぞれ、２．８９対１．１７×１０−４ｓ−１）が、親和性の差異はｍＡｂ９２６の会合速度が速いことに起因した。ワシントン大学のＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｙ  Ｃｏｒｅにて、ＳＰＲ実験を（抗原基質の別の調製と）並行して行い、結果は、本明細書に報告するものと完全に一致し、我々の分析（表１）に信頼性が増した。阻害アッセイにおいて抗体を細菌とともに１時間プレインキュベートしたので、両抗体とも結合は飽和に達した可能性があった。このように、その時点で、阻害抗体の解離速度の差は、それらの会合速度よりも重要であり、したがってｍＡｂ９２６の有効性の増加は、そのわずかに高い解離速度を考慮すると、さらにいっそう注目に値する。
【００６６】
したがって、総合すると、これらの結果は、ｍＡｂ４７５抗体のそれよりもｍＡｂ９２６の阻害能力がかなり高いことは、これらの２つの抗体の結合反応速度または親和性における差異によって説明できないことを示している。その代わりに、阻害活性の大きな差は、阻害機構におけるなんらかの未知の差を反映するにちがいない。
【００６７】
【表１】
2018515517.tif 000004
【００６８】
＊Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｙ  Ｃｏｒｅ、ＵＷ  Ｓｅａｔｔｌｅで行われたＳＰＲ２測定。実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システム（ＧＥ／Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で行われた。１０ｍＭ、ｐＨ＝２．６のグリシン中のＦｉｍＨｗｔ線毛を、１４分間の接触時間を用いて、１２３１レゾナンスユニット（ＲＵ）でシリーズＳ  ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定した。固定後、流速３０μＬ／分、０μＭから９３８μＭにわたるモノクローナル抗体アナライト濃度を接触時間６０秒と解離時間９００秒を用いて、三つ組でテストした。各実験に続いて、表面を再生させるために、グリシンｐＨ＝１．５を３０秒間３回注入した。得られたデータから基準面シグナルとブランク注入シグンルの両方を減算し、このような方法で「二重参照」反応速度データをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅバージョン２．０）を用いて、すべての濃度にわたり１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに全般的にフィッティングさせた。
【００６９】
実施例２：マンノースは、ｍＡｂ４７５と直接競合するがｍＡｂ９２６結合とは競合しない
本実施例は、可溶性マンノースの存在下でＦｉｍＨに結合するｍＡｂ４７５とｍＡｂ９２６の能力を比較する。図２Ａに示すように、マンノースは、ｍＡｂ４７５結合を強く阻害し、その結合曲線が抗体のより高い濃度へかなりのシフトを示している。ｍＡｂ４７５の半数効果濃度（ＥＣ５０）は、可溶性マンノースの存在下で１７９倍増加した。対照的に、ｍＡｂ９２６の結合は、マンノースによってはるかに少ない程度の影響を受け、結合曲線が比較的小さい右方向シフトを示し、ｍＡｂ９２６のＥＣ５０において６．２倍増加した（図２Ｂ）。
【００７０】
マンノースと抗体の競合対非競合間の相互作用を識別するために、抗体結合の観察されたＥＣ５０比の値を、受容体への２つのリガンド結合のモデルのＥＣ５０比と比較した（Ｅｈｌｅｒｔ、１９８８）。このモデルに基づいて、マンノースと抗体は、それらの相対濃度と親和性によってＦｉｍＨ上の同じ部位への結合を競い合うことが可能であり、または協調性因子α（Ｋｅｎａｋｉｎ、２００４）によって変化した親和性で受容体に同時に結合することが可能である（図１５）。競合結合の算出したＥＣ５０比（材料および方法を参照されたい）は１７５±３０であった。これは実験的に決定したｍＡｂ４７５のＥＣ５０比（１７９）と整合しており、抗体が直接の競合者であることが確信された。このように、ＦｉｍＨへのｍＡｂ４７５とマンノースの結合は、同時ではなく、相互排他的であり、構造的に同じ部位への結合を意味しており、我々がこれまでに報告したｍＡｂ４７５エピトープの決定（Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３）と整合している。しかし、マンノースによってｍＡｂ９２６のＥＣ５０が６．２倍変化することは、競合阻害モデルによって説明できないが、代わりにマンノースが非競合的に結合するｍＡｂ９２６を阻害することを示しており、ＦｉｍＨへの抗体とマノースとの同時結合と整合する。
【００７１】
ｍＡｂ９２６のマンノースリガンドとの非競合的な関係は、ｍＡｂ４７５とは異なり、ｍＡｂ９２６によるＦｉｍＨ活性の阻害が直接的なオルソステリック機構によるものではないことを示している。しかし、それはむしろ、抗体とリガンドの結合のための遠位部位を構造上含む必要があるアロステリック阻害物質によって発揮される機構により似ている。
【００７２】
阻害性ｍＡｂ４７５とｍＡｂ９２６は、活性ＦｉｍＨ構造のマンノース結合ポケット内で重複するが異なったエピトープを認識する。次に、ＦｉｍＨ中のｍＡｂ９２６結合エピトープを部位特異的変異誘発（表２）によって判定し、それをｍＡｂ４７５エピトープの位置と、高親和性（活性）マンノース結合構造で結晶化されたレクチンドメイン（図３Ａ）に従って定められたアドヘシンのマンノース相互作用残基とで比較した。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
＊ＦｉｍＨ（ＦｉｍＨｗｔ（１８６−２０１）Ｆｏｃｈ）のレクチンドメイン中の異なる変異を有する精製した同質遺伝子線毛とｍＡｂ９２６との結合を材料および方法に記載のようにテストした。モノクローナル抗体結合（またＦｉｍＨ結晶構造上に群がっている）を＞２５％減少させた、予測されるｍＡｂ９２６エピトープ残基の変異を太字体で示す。
【００７５】
ＦｉｍＨ中の位置５２、１３５〜１３８、１４０の変化はｍＡｂ９２６結合を抑制した（表２および表３）。これらの位置は、レクチンドメインの上部、すなわちマンノース結合ポケットが配置されるβバレルの側面に位置する小さいエピトープ（図３Ａ、黒い球体）を形成する。このエピトープ位置は、レクチンドメインの自然のアロステリック部位を含むドメイン−ドメイン相互作用界面の向かい側にある（図３Ａ、明るい灰色の球体）（Ｌｅ  Ｔｒｏｎｇら、２０１０）。ｍＡｂ９２６エピトープ中の６の残基のうちの３つ、Ｉ５２、Ｎ１３５、Ｎ１３６はｍＡｂ４７５エピトープ（位置１、４６、５２、５４、１３３、１３５、１３６を含む）の一部でもある（表３および図３Ｂ）（Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３）。ｍＡｂ９２６とｍＡｂ４７５のエピトープの予測される構造重複も、ｍＡｂ９２６とｍＡｂ４７５が互いにＦｉｍＨとの結合を強く交差干渉するという事実によって実験的に裏づけられている（図１６）。
【００７６】
表２．ＦｉｍＨポケット残基と、ｍＡｂ９２６エピトープおよびｍＡｂ４７５エピトープとの間の重複。
結合ポケットの活性および不活性構造においてマンノースリガンドと、水素結合形成ＦｉｍＨアミノ酸との間の距離も示す。
【００７７】
【表３】
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【００７８】
両抗体のエピトープは、マンノース結合ポケットと重複し（表３および図３Ｂ）、特にリガンドと１１の水素結合を形成する７つの側鎖残基のネットワークと重複する（Ｈｕｎｇら、２００２）。しかし、ｍＡｂ４７５エピトープは、該ポケットの少なくとも３つの異なる領域（４６〜５４ループ、１３３〜１４２ループおよびＮ末端）上に位置し、リガンドと総計９の水素結合を形成するこれらのマンノース相互作用残基のうちの総計５を含む（Ｈｕｎｇら、２００２；Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３）。これに対して、ほぼ全ｍＡｂ９２６エピトープは、ループ１３３〜１４２によって形成されるポケットの片側だけに限定され、１３５と１４０のわずかに２つの残基がマンノースと総計３つの水素結合を形成する。構造データと整合し、リガンドとの水素結合に直接関与する残基（Ｎ１３５とＤ１４０）または間接的に関与する残基（Ｎ１３８）の変異は実質的にリガンド結合を減少させる（Ｈｕｎｇら、２００２；Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３；Ｎｉｌｓｓｏｎら、２００６ｂ）が、ｍＡｂ９２６エピトープ残基に残存する変異はマンノースとの相互作用には影響を及ぼさないか、またはわずかな影響を及ぼす（Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３）。
【００７９】
このように、ｍＡｂ４７５エピトープと対照的に、ｍＡｂ９２６を非競合的に阻害するエピトープは、活性ＦｉｍＨのマンノース結合ポケットと重複するが、大部分は該ポケットのただ１つのループに限定される。しかし、ｍＡｂ９２６エピトープの２つの残基がマンノースリガンドとの水素結合のネットワークに寄与しているので、マンノース結合に対してｍＡｂ９２６のある程度の阻害効果を期待することは妥当と思われ、上記に報告する結果と整合する。
【００８０】
実施例３：ｍＡｂ９２６エピトープは不活性ＦｉｍＨにおいてマンノース相互作用残基からシフトする
活性ＦｉｍＨにおいてｍＡｂ９２６エピトープとマンノース結合残基との重複が抗体の阻害能力を説明するが、ｍＡｂ９２６阻害の非競合性を説明していない。したがって、レクチンドメインがよりねじれた構造であることが想定され、ピリンドメインと相互作用する、代替のＦｉｍＨ構造（３ＪＷＮ）に着目した（図３Ｄ）。この構造はマンノースリガンドの非存在下で得られ、その結合ポケットはオープンで低親和性（すなわち不活性）の構造である。
【００８１】
不活性ＦｉｍＨ構造はリガンドの非存在下で得られたので、まず、結合ポケットのオープン立体配置でのマンノースの潜在的な位置を判定した。マンノースは、活性１ＵＷＦ構造中に存在する座標を用い、続いてＣＨＡＲＭＭとＰＡＲＡＭ２２の力場を用いるエネルギー最小化によって３ＪＷＮ結晶構造のポケットに結合させた。表３と図３Ｅに示すように、マンノースは、活性ＦｉｍＨと、７のマンノース相互作用残基のうちの５、すなわちＰｈｅ１、Ａｓｎ４６、Ａｓｐ４７、Ａｓｐ５４およびＧｌｎ１３３の側鎖との１１の水素相互作用のうちの８を保持するオープンポケットにおいて位置をとることが予測される（Ｈｕｎｇ、ら  ２００２）。興味深いことに、不活性結合ポケットでのこれらの５の残基は、活性ＦｉｍＨでのように互いに対して本質的に同じ位置を保持し（図３Ｃと３Ｆ）、距離シフトが０．１〜１Å（平均０．４４Å±０．３）である（図１７）。マンノースのこの位置は、活性ポケットまたは変異によって不活性化したＦｉｍＨの分解結晶構造の分子動力学シミュレーションを使用した以前の試験によっても裏づけられている（Ｈｕｎｇら、２００２；ＮＩｌｓｓｏｎら、２００８）。
【００８２】
マンノースの予測される位置によって、活性構造においてマンノースと相互作用する２つの残基、すなわちＡｓｎ１３５とＡｓｐ１４０は、オープン結合ポケットにおいてマンノースとの接触を失うと思われる（図３Ｅと表３）。代替のＦｉｍＨ構造において、これらの２つの残基も互いに対して、および他の５のマンノース相互作用残基に対してかなりシフトし（図３Ｆ）、シフトは１．２〜７．７Å（平均３．９±２．２Å）であった（図１７）。
【００８３】
したがって、不活性ＦｉｍＨにおいて予測されるマンノース位置に基づいて、活性構造においてマンノースと水素結合を形成するｍＡｂ９２６エピトープ残基は、不活性構造におけるリガンドから比較的さらに離れてシフトされる。このように、活性ＦｉｍＨポケットにおいてｍＡｂ９２６エピトープの一部がマンノースによって占有されるが、不活性ＦｉｍＨにおいて全ｍＡｂ９２６エピトープは潜在的に抗体に到達可能である。
【００８４】
実施例４：ｍＡｂ９２６は不活性構造から活性構造へのＦｉｍＨの転換を阻止する
ＦｉｍＨのマンノース結合ポケットが他のレクチンドメインとアロステリックに結合するので、ＦｉｍＨの構造上でｍＡｂ９２６抗体とｍＡｂ４７５抗体の効果を比較した。このために、ＦｉｍＨの活性構造だけを認識するｍＡｂ２１抗体を用いた。ｍＡｂ２１エピトープ（図３Ａ、濃い灰色の球体）は、マンノース結合ポケットから遠位に、ドメイン間の界面、すなわち推定される自然のアロステリック部位（図３Ａ、薄い灰色の球体）の近くに位置している（Ｌｅ  Ｔｒｏｎｇら、２０１０）。
【００８５】
図４Ａに示すように、ｍＡｂ４７５およびマンノースと線毛ＦｉｍＨｗｔとが結合することによって、活性構造特異的ｍＡｂ２１の結合によって判定されるように、不活性構造から活性構造に転換される。対照的に、ｍＡｂ９２６はそのような転換を誘導できなかった。次いで、同じ実験を、ＦｉｍＨ突然変異体を用いて行った。該突然変異体は、レクチンドメインとのその相互作用を干渉するピリンドメイン中にＡ１８８Ｄ変異を有し、ＦｉｍＨｗｔと対照的に、マンノースの非存在下でさえもＦｉｍＨを活性状態で維持する（Ｔｃｈｅｓｎｏｋｏｖａら、２００８）。ｍＡｂ９２６を用いてＦｉｍＨＡ１８８Ｄ線毛を事前処置することにより、ｍＡｂ２１によるその認識を完全に消失させた（図４Ｂ）。ここでも、その後のｍＡｂ２１結合を強化したｍＡｂ４７５を用いる事前処置とは際だって対照的だった。さらに、まずＦｉｍＨＡ１８８ＤをｍＡｂ２１で事前処置し、続いて阻害性モノクローナル抗体とともにインキュベートすると、ｍＡｂ４７５はｍＡｂ２１結合を安定させたが、ｍＡｂ９２６はアドヘシンから活性状態特異的抗体をほぼ完全に移動させた（図４Ｃ）。
【００８６】
このように、ｍＡｂ９２６は、レクチンドメインの不活性構造から活性構造へのシフトを誘発することができないＦｉｍＨポケットに結合しているだけでなく、反対に活性構造から離れるシフトを誘発する。
【００８７】
実施例５：マンノースはＦｉｍＨからｍＡｂ９２６を移動させることはできるが、ｍＡｂ４７５を移動させることはできない
本実施例において、非競合阻害モデルによって予測されるように、可溶性マンノースとｍＡｂ９２６が同時に結合ポケットと相互作用することが可能かどうかを評価した。もしマンノースとｍＡｂ９２６がともにＦｉｍＨに結合すれば、その場合、マンノースはＦｉｍＨと抗体との予備形成された複合体に結合でき、不安定化することができるはずで、ｍＡｂ９２６の解離速度がより高くなると仮定した。対照的に、ＦｉｍＨに結合したｍＡｂ４７５ではこれは起こってはならない。なぜならば、この競合抗体はマンノースがポケットに接近するのを完全に防止し、マンノースのｍＡｂ４７５−ＦｉｍＨ複合体に対する影響はわずかであるからだ。換言すれば、抗体結合の後のマンノースの影響は、その結合の前／結合中の影響と正反対である（図２）。したがって、マンノースリガンドの抗体−ＦｉｍＨ複合体に対する影響を、表面プラズモン共鳴を使用して測定した。
【００８８】
まず、ＦｉｍＨｗｔ線毛で被覆した表面をｍＡｂ９２６またはｍＡｂ４７５に結合させておき、次いで抗体−ＦｉｍＨ複合体を高濃度（１％）の可溶性マンノースとともに、およびマンノースなしでランニング緩衝液に曝した。図５に示すように、ＦｉｍＨからのｍＡｂ９２６の解離速度は、マンノースの存在下で劇的に増加した。同時に、マンノースは、観測時間にわたって、ｍＡｂ４７５とＦｉｍＨの間の複合体の安定性に有意な影響を及ぼさなかった。
【００８９】
これらの結果は、可溶性マンノースを添加することでＦｉｍＨ−ｍＡｂ９２６複合体の安定性が影響を受け、したがって抗体とリガンドが同時にＦｉｍＨに結合できるにちがいなく、それらの相互作用の非競合性と整合することを示している。対照的に、マンノースおよびｍＡｂ４７５とＦｉｍＨとの同時相互作用については、その抗体の直接的オルソステリック阻害機構と整合するそのような証拠はない。このように、予備形成された抗体−ＦｉｍＨ複合体へのマンノースの影響は、複合体形成に対する抗体の影響と正反対だった。
【００９０】
実施例６：ｍＡｂ９２６は、ＦｉｍＨの低親和性状態をアロステリックに安定させるｍＡｂ８２４と異なる
ｍＡｂ９２６がＦｉｍＨの低親和性構造を安定させることが判明したことを考慮し、我々独自のパネル（Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３）由来のいずれの抗体に類似の活性があるかどうかを判定した。実際に、複数種の抗体のうちの１種、ｍＡｂ８２４も、可溶性マンノースの存在下で活性状態特異的ｍＡｂ２１とＦｉｍＨｗｔとの結合を防止することができる（図６Ａ）、すなわちｍＡｂ８２４がｍＡｂ９２６に類似するアドヘシンの低親和性状態を安定させることが判明した。しかし、後者とは異なり、ｍＡｂ８２４は、マンノース結合ポケット（残基Ｇ７９、Ｓ８０、Ｙ８２、Ｐ９１；表４）から離れて位置するエピトープを認識し、ＦｉｍＨの低親和性構造の安定化がアロステリック機構、すなわちリガンドから離れた機構によって生じることを示唆した。ＳＰＲ実験においてマンノースがＦｉｍＨｗｔからｍＡｂ８２４を移動させることができなかったが（図１８Ａ）、ｍＡｂ８２４抗体の結合の場合、抗原表面を再生させることが困難なため、ｍＡｂ８２４を用いたＳＰＲ試験を確実に行うことができなかった。したがって、可溶性マンノースの存在下でｍＡｂ９２６−ＦｉｍＨｗｔ複合体とｍＡｂ８２４−ＦｉｍＨｗｔ複合体の安定性はＥＬＩＳＡによって測定した。ｍＡｂ９２６とは異なり、ｍＡｂ８２４はリガンドが高濃度（８％）でもＦｉｍＨｗｔから移動されない。特に、マンノースの非存在下で両抗体は、ＰＢＳとともに４時間インキュベーションすると、同じレベルでＦｉｍＨに結合した（図１８Ｂ）。
【００９１】
【表４】
2018515517.tif 000007
2018515517.tif 000008
【００９２】
＊ＦｉｍＨｗｔのレクチンドメイン中に異なる変異を有する精製した同質遺伝子線毛とｍＡｂ８２４との結合を材料および方法に記載のようにテストした。モノクローナル抗体結合（またＦｉｍＨ結晶構造上に群がっている）を＞２５％減少させた、予測されるｍＡｂ８２４エピトープ残基の変異を太文字で示す。
【００９３】
これらの結果は、抗体によるＦｉｍＨの低親和性構造の安定化がアロステリック機構によって達成し得るが、アロステリック機構によってもたらされないマンノースリガンドｍＡｂ９２６結合の間の干渉のユニークな特性をパラステリック機構がもたらすことができることを示唆した。
【００９４】
実施例７：ｍＡｂ９２６は、バイオフィルム面を解離し、尿路感染症を予防することにおいて競合抗体ｍＡｂ４７５より優れている
本実施例は、マンノース被覆表面に形成される大腸菌バイオフィルムに対する阻害抗体の効果を、１型線毛を発現するモデル尿路病原性菌株ＵＴ１８９（Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１５）によって評価する。ｍＡｂ４７５とｍＡｂ９２６の両抗体（ならびに可溶性マンノース）は、マンノース被覆表面での増殖前に大腸菌に添加されると、該表面で大腸菌バイオフィルムが形成されることを防止し（Ｐ＜０．００５）、バイオフィルム形成がマンノース特異的細菌接着に依存することを示している（図７Ａ）。しかし、まず一晩、マンノース被覆表面で表面バイオフィルムを形成させておき、次いで抗体（またはマンノース）を添加すると、ｍＡｂ４７５または可溶性マンノースのいずれも表面付着バイオフィルムの実質的な解離を生じさせなかった（図７Ｂ）。対照的に、ｍＡｂ９２６はバイオフィルム（バイオフィルム減少ｍＡｂ９２６の９３％対ｍＡｂ４７５の１２％、Ｐ＜０．０００５）を効果的に溶解した。我々の以前の細菌接着アッセイ（Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３）の結果と一致して、活性状態特異的抗体のｍＡｂ２１はバイオフィルム形成を強化し、マンノース被覆表面上に形成されたバイオフィルムの溶解が減少した（図７ＡおよびＢ）。
【００９５】
次いで、これらの抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの大腸菌感染を阻止する能力について比較した。図７Ｃに示すように、膀胱カテーテルによってマウスに接種する前に、大腸菌ＵＴ１８９をｍＡｂ９２６とともにインキュベーションすることで、膀胱でのコロニー形成をｍＡｂ４７５よりも効果的に阻止した。ｍＡｂ９２６を用いて事前処置した大腸菌ＵＴ１８９で感染させたマウスの膀胱から回収した細菌の減少は８３％であった（図７Ｃ）が、ｍＡｂ４７５による阻害は５２％であった（Ｐ＝０．００８７）。ｍＡｂ２１によって生じた細菌量のわずかな減少は、統計的有意性に達成しなかった（Ｐ＝０．１５０８）。
【００９６】
このように、尿路病原性大腸菌によるバイオフィルムの解離および膀胱感染症の防止などの最も生理学的に適切なアッセイにおいて、非競合的に阻害するｍＡｂ９２６は、競合的に阻害するｍＡｂ４７５よりもより効果的である。
【００９７】
ｍＡｂ９２６には、マウスにおいて、抗原投与（ＵＰＥＣ菌株、ＵＴ１８９）（図７Ｃ）で用いた細菌とともに膀胱に経尿道的に投与されると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細菌接着を阻止し、膀胱でのコロニー形成を減少させる優れた効力があることを示した。
【００９８】
また、マウスの腹膜腔に抗体ｍＡｂ９２６を受身移入したときの、異なるＵＰＥＣ菌株のＣＦＴ０７３に対するｍＡｂ９２６の保護効果を評価した。ＣＦＴ０７３大腸菌の抗原投与の１日前と１日後に腹腔内注射を完了した（ワクチン候補に関するＡ０７試験、契約番号第ＨＨＳＮ２７２２０１００００４０Ｉ、タスクオーダー第ＨＨＳＮ２７２００００５、Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ）。この試験において、受身移入したｍＡｂ９２６（ＦｉｍＨ  ＬＤｍｕｔに対して産生された）の効果を受身投与されたｍＡｂ２１抗体（ＦｉｍＨ  ＬＤｗｔに対して産生された）の作用と比較し、ならびにこれらに対してモノクローナル抗体が産生された２種類の抗原（ＬＤｗｔとＬＤｍｕｔ）による能動免疫化の効果を比較した。受身移入のための抗体混合物は、５０μＬ量の無菌ＨＢＳ中にマウス投与当たり１５０μｇとして調製した。抗体の効果を、それぞれ非糖尿病および糖尿病のＣ５７Ｂ１／６マウスを含む２つのマウスモデルで評価した。フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）だけを注射したマウスを各モデルの対照（モック）群として用いた。細菌抗原投与から２４時間後に開始し、１４日間にわたり毎日、マウス尿の細菌量を分析した。
【００９９】
図８ＡおよびＣに示すように、ｍＡｂ９２６による非糖尿病マウスの受動免疫化は、抗原投与後１日目に開始したモック群と比較すると、尿中の細菌数の有意な減少となったが、ｍＡｂ２１ではこの減少が見られず、細菌数の推定平均ｌｏｇ１０はモック群マウス２．５８±０．３対ｍＡｂ９２６とｍＡｂ２１マウス１．３１±０．５および２．４７±０．５であり、それぞれＰ＝０．００９とＰ＝０．８０１であった。類似の傾向は、抗原投与後にテストした１４日間中１０日間存在し続けた（図８ＡおよびＣ）。１日目と３日目、ｍＡｂ９２６処置したマウスの推定細菌数も、ｍＡｂ２１で処置したマウスの細菌数と比較すると、有意に低かった（それぞれ、ｌｏｇ１０  １．３１±０．５と０．９９±０．４対２．４７±０．５と１．８９±０．４、Ｐ＝０．０１８とＰ＝０．０１９）。モノクローナル抗体の尿道内投与に関してこれまでに観察されたように、ｍＡｂ２１の腹腔内注射は、モック群と比較して、細菌クリアランスがいくぶん良好な結果となったが、この処置の効果（ＬＤｗｔによる能動免疫化と類似して）統計的有意性に達成しなかった（図８ＡおよびＣ）。次に、ｍＡｂ９２６の受身移入の効果は、ＬＤｍｕｔによる能動免疫化の効果と酷似しており、これに対してｍＡｂ９２６は両処置によって誘発され、モック群と比較して、尿中の細菌レベルの有意な減少をもたらし、感染のクリアランスが良好であった（図８ＡおよびＣ）。さらに、ｍＡｂ９２６の受身移入も、糖尿病マウスにおいて細菌数が減少した（図８ＢおよびＣ）。しかし、このモデルにおいて、すべての処置群からのマウスは、平均して非糖尿病マウスよりも尿中の細菌数がはるかに高く、これは抗原投与後テストした全期間にわたり当てはまった（図８ＢおよびＣ）。ｍＡｂ９２６による受動免疫化（またはＬＤｍｕｔによる能動免疫化）は、モック群と比較して尿中の細菌数が有意に減少したが、これらの処置について経時的に細胞数の有意な減少はなかった（図８ＢおよびＣ）。
【０１００】
実施例８：ｍＡｂ９２６は、相同体ＦｉｍＨアドヘシンを発現する他の腸内細菌に対して活性である
クレブシエアラ・ニューモニエ（肺炎桿菌）は、しばしば尿路感染症、敗血症または気道感染症を引き起こす重要な日和見病原体である。大腸菌と同様に、クレブシエアラ・ニューモニエは、マンノース特異的１型線毛を発現し、ＦｉｍＨアドヘシンはアミノ酸配列レベルで大腸菌ＦｉｍＨと７２〜８４％同一である。配列アライメントによって、ｍＡｂ４７５とｍＡｂ９２６のエピトープがアミノ酸変化によって標的にされないが、クレブシエラ結合ポケット内の１３２位（ＲからＨ）にアミノ酸置換が存在すると、間接的に抗体結合に影響を及ぼし得ることが明らかとなった。これは特にｍＡｂ４７５に関し、そのエピトープは１３３位からの近隣の残基、すなわち大腸菌においてリガンド認識にとって重要な残基、を含む。実際、クレブシエラＦｉｍＨは大腸菌とは対照的に、末端に露出されたモノマンノース残基に結合する能力の低下を示すように、ＦｉｍＨアドヘシンの微細特異性が多少異なっている。
【０１０１】
抗体結合の分析は、両方の抗大腸菌ＦｉｍＨ抗体がクレブシエラＦｉｍＨを認識することを示した（図９）。ｍＡｂ９２６は両方のＦｉｍＨアドヘシンへの同じレベルの結合を示したが、クレブシエラＦｉｍＨ変異体に結合したｍＡｂ４７５は大腸菌ＦｉｍＨへの結合よりも低いレベルであった。ｍＡｂ４７５およびｍＡｂ９２６とともにクレブシエラ細胞のインキュベーションは、マンノースリガンド被覆プレート（ＲＮａｓｅＢ）への細菌接着をかなり減少させ、ｍＡｂ９２６はｍＡｂ４７５の阻害効果を実質的に凌駕する（図１０）。次に、ｍＡｂ９２６がクレブシエラによってバイオフィルムの形成を阻止することができるか、またはすでに形成されているバイオフィルムに影響を及ぼすことができるかどうかをテストした。図１１Ａに示すように、ｍＡｂ９２６は、３８〜６７％の阻害を引き起こす可溶性マンノースよりも効力がある２つの異なるクレブシエラＦｉｍＨ変異体によってバイオフィルムの形成を効果的に阻害した（７６〜８６％の阻害、Ｐ＜０．０００５）。同様に、１４時間経過したバイオフィルムを、マンノースまたはｍＡｂ２１を含まずに、ｍＡｂ９２６とともにインキュベーションすると、バイオフィルムの有意な（Ｐ＝０．０００５）不安定化を引き起こした（図１１Ｂ）。
【０１０２】
このように、非競合的に阻害するｍＡｂ９２６は、相同体ＦｉｍＨアドヘシンを発現するクレブシエラの接着およびバイオフィルム形成を阻止するのに効果的であり、したがってこの抗体は他の腸内細菌に起因する感染症に対して有望な抗感染症薬になり得る。
【０１０３】
実施例９：新規のパラステリック機構を介して細菌接着の阻害と回復の両方のためのリガンド結合部位のわずかに１つのループへの抗体結合の有意性
受容体タンパク質のリガンド結合部位エピトープを標的にする抗体を作製することは、防御抗体または治療抗体の開発における主要目的である。これらの抗体は、リガンドと直接競合することによって受容体結合機能を阻止すると思われる。定義上、発生する競合阻害の場合、結合ポケットは阻害物質結合の時点でリガンドによって占有されることができない（図１２Ａ）。したがって、そのようなオルソステリック阻害物質は、ポケットからのリガンドの解離を誘発することによってリガンド結合を元に戻すことができなく、高濃度の内因性リガンドの存在下で効果がない。これはオルソステリック阻害物質の有用性を限定している。結合したリガンドを解離することが可能な唯一の阻害物質は、リガンド結合ポケットより遠位に位置する部位からの構造変化のシグナリングによって結合が弱い不活性受容体状態を誘発するアロステリックな性質を持ったものと考えられる（図１２Ｂ）。しかし、アロステリック阻害物質のデザインは、高次構造の制御が未知であり、存在しないかまたは複雑であるタンパク質の場合、問題になる。
【０１０４】
受容体タンパク質のリガンド結合部位が、ポケット内のリガンド結合に干渉する（オルソステリック阻害物質のように）が、われわれがパラステリック（リガンドの隣に）阻害と呼ぶ機構を介して非競合的（アロステリック阻害物質のように）に干渉する強力な阻害抗体に対してエピトープを提供することを我々は本明細書で示した。アロステリック阻害物質は、ポケット近くに結合する（Ｌｕｏら、２００４；Ｍｕｋｕｎｄら、２０１３；Ｗｕら、２００７）がしかし、パラステリック阻害物質とは異なり、リガンド相互作用ポケット残基自体を結合しないことが記載されている。「パラステリク阻害」という用語はこれまでは、阻害物質とリガンドが、オルソステリック阻害物質とアロステリック阻害物資についてそれぞれ予想されるように完全に重複する、または遠位部位で結合するよりもむしろ互いに極めて接近して結合し得るという理論的可能性を少なくとも強調することが示唆されていた（Ｄｉｓｓｉｎｇら、１９９３）。その研究はプリン調節物質によるＡＣＰ１の酵素活性の調節に焦点を合わせていたが、阻害の構造的詳細または機構詳細は検討されてなかった。パラステリック抗体の際だった明らかな特性の１つは、リガンドと同時に結合ポケットに結合し、活性状態へのその転換を防止することであることを我々は本明細書で示す（図１２Ｃ）。このように、パラステリック概念も、ポケットの不活性状態を安定化することができるが、リガンドと同時に結合しない、ヒトＧタンパク質共役受容体について示されるものなどのインバースアゴニストの概念と異なる（Ｊａａｋｏｌａら、２００８；Ｌａｂｏｎら、２０１１）。
【０１０５】
パラステリック阻害は、広範囲にわたる受容体に潜在的に適用できる。結合ポケットの高次構造ダイナミクスは、すべてのリガンド−結合タンパクの本質的な特性であると考えられている（Ｂｏｅｈｒら、２００９；Ｇｏｈら、２００４；Ｈｅｎｚｌｅｒ−ＷｉｌｄｍａｎおよびＫｅｒｎ、２００７）。結合ポケットの少なくとも２つの異なる構造状態、すなわちリガンドと強力に結合する活性状態と、リガンドと比較的弱く結合する不活性状態とが受容体タンパク質に存在すると提唱される。多くの場合または大多数の場合でも、活性状態のポケットは、不活性状態と比較してリガンドの周辺を締める。例えば、マルトース結合タンパク質の２つのドメインは親和性を高めるために密接して結合しており（Ｑｕｉｏｃｈｏら、１９９７；Ｓｐｕｒｌｉｎｏら、１９９１）、アデニル酸キナーゼの結合部位上の「蓋」は基質出口を防止するために閉鎖し（Ｗｏｌｆ−Ｗａｔｚら、２００４）、植物ホルモンアブシジン酸受容体の「ゲート」はホルモンリガンドの周りで閉鎖し（Ｎｉｌｓｓｏｎら、２００８）、およびβアドレナリン受容体の結合ポケットはカテコラミンの周りで収縮する（Ｌｅｂｏｎら、２００１；Ｗａｒｎｅら、２０１１）。同様に、種々の受容体タンパク質のリガンド結合ループは、ＮＭＲおよびＦＲＥＴ分析によって高度に柔軟であることが明らかになった（Ｋｉｍら、２０１３；Ｔａｎｇら、２００７）。これは、パラステリック阻害物質が潜在的に、よりゆるやかな結合オープンポケットにリガンドと同時に結合することが可能であり、多くの異なる受容体−リガンド系においてポケットがしっかりと閉まるのを防ぐことを示唆している。特に、これらの受容体の多くは、本来アロステリックではない、局在的な高次構造ダイナミクスだけを受け、したがってパラステリック機構はアロステリック機構よりもより広範囲の受容体に適用できるはずである。異なるＦｉｍＨ状態に関する多量の蓄積された構造および機能データと種々の高次構造特異的モノクローナル抗体が入手可能なので、ＦｉｍＨをプロトコル分子として使用する、活性状態と不活性状態の間の高次構造シフトのダイナミクスを調べる、および種々の種類の阻害物質と構造調節物質をテストする機会が提供されている。
【０１０６】
ｍＡｂ９２６阻害機構への洞察を得るために、我々は、マンノースなしで得られるオープンマンノース結合ポケットを含む不活性ＦｉｍＨの結晶構造（Ｌｅ  Ｔｒｏｎｇら、２０１０）に着目した。不活性構造をロックすることについての我々の以前の試験は、ＦｉｍＨのオープンポケットがマンノースと相互作用する能力を多少保持していることを示唆した（Ｌｅ  Ｔｒｏｎｇら、２０１０）。また、他の試験ではマンノース結合残基、Ｇｌｎ１３３〜Ａｓｎ、のうちの１つの変異がＦｉｍＨの結合機能を実質的除去したが、マンノースは依然としてこの変異体と共結晶化することが可能であることが明らかになった（Ｈｕｎｇら、２００２）。後者の構造では、マンノースは、野生型の活性ポケット中でのように、リガンドから離れてシフトしたＮ１３５とＤ１４０の残基を除いて、すべての結合残基と同じ相互作用を保持した。これは、後者の残基が柔軟なポケットループ上にあるという我々の結論を裏づけた。我々のモデルに対するさらなる裏づけは、Ｆ１とＤ５４の残基（すなわち柔軟なルプープ上にない残基）がリガンドと最強の相互作用を形成することを予測した以前の分子動力学シミュレーションによって提供されている（Ｎｉｌｓｓｏｎら、２００８）。このように、１３３〜１４０ループの動的性質を指し示す我々のモデルは、これまでの試験と整合する。
【０１０７】
リガンドがすでに結合している場合、ｍＡｂ９２６（または一般的に任意のパラステリック阻害物質）がそのエピトープに接近するために、結合ポケットが活性構造から不活性構造にシフトを遂げなければならないかどうかは依然として不明である。ＦｉｍＨの場合、ｍＡｂ９２６エピトープを保有するポケットの１３２〜１４０ループは一時的に付着マンノースから離れてシフトすることもある。実際、マルトース結合タンパク質の本来の開口速度がリガンド解離を決定することが最近明らかになった（Ｓｅｏら、２０１４）。ｍＡｂ９２６作用の別の可能性のあるシナリオは、マンノース結合残基Ｎ１３５とＤ１４０を含まないエピトープの一部を介して、ＦｉｍＨのマンノース占有ポケットの活性構造へのその中間結合を含み得る。次に、結合の可能な中間ステップは、柔軟なループの全開を促進することが可能であり、したがって活性状態を非活性化する。実際、リガンドとの水素結合に関与することなく、ポッケット間隙の外側に面していないｍＡｂ９２６エピトープ残基（Ｉ５２、Ｎ１３６、Ｙ１３７）の変異体は、マンノースリガンド結合を減少することもなく、またはそれに最小限の影響を及ぼしただけであり（Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３）、これらの残基が、ポケットがリガンドによって占有されていたとしても、抗体との相互作用のために利用でき得ることを示唆している。ｍＡｂ９２６の阻害作用の構造詳細および他の潜在的なパラステリック阻害物質の構造詳細を解明するためにさらなる試験が必要である。
【０１０８】
ＦｉｍＨにおけるレクチンドメインとピリンドメインの相互作用が結合ポケットの不活性構造をアロステリックに促進するが、可溶性ピリンドメインはアドヘシンの低親和性状態を安定させることはできなかった（Ａｐｒｉｋｉａｎら、２００７）。しかし、本試験において、結合ポケットから離れて位置するエピトープを結合することによって、ＦｉｍＨｗｔが低親和性から高親和性にシフトするのを明らかにアロステリックに防止するように見える抗体ｍＡｂ８２４を見いだした。このエピトープは、スイッチの構造経路において重要な領域であり得るＦｉｍＨのレクチンドメインの間隙シートの側面に位置するが、ｍＡｂ８２４の作用の詳細はさらなる調査を必要とする。重要なことに、ｍＡｂ９２６とは異なり、ｍＡｂ８２４が可溶性マンノースによってＦｉｍＨから移動されることはなく、ＦｉｍＨにおけるリガンド誘発構造シフトによってｍＡｂ８２４の構造安定化効果が圧倒されないことを示唆している。少なくとも一部の受容体タンパク質において、不活性構造に結合しているアロステリック抗体は受容体タンパク質のリガンド誘発活性によって移動されることもあり、反対に活性化構造に結合しているリガンドはアロステリック阻害抗体によって移動され得ることを予想することは妥当と思われる。しかし、アロステリック抗体は、誘発された解離の問題に影響を及ぼす可能性のあるパラステリック抗体とはある意味で根本的に異なる。アロステリック抗体は、結合部位と異なる部位に結合し、比較的弱く結合する（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、２００２）。これは、抗体エピトープが不活性構造にあり得るが、結合部位は活性構造にあることを意味する。対照的に、我々の定義によるパラステリック抗体には、ある程度結合部位と重複するエピトープがあり、そのため結合反応速度は抗体が結合する場合、およびその逆の場合も変化するはずである。我々は、この差が、マンノースによってｍＡｂ８２４がＦｉｍＨから移動されないことを説明すると解釈するが、この問題に取り組むためにはｍＡｂ８４２についてより詳細にわたる試験が必要である。このように、ＦｉｍＨに結合するｍＡｂ９２６にはレクチンドメインに対するアロステリック効果があるが、マンノース結合のその阻害はアロステリック機構それ自体によるのではなく、ｍＡｂ８２４または他の受容体リガンド相互作用系に記載される他の古典的なアロステリック阻害物質によって発揮される作用とは基本的に異なる（Ｄｏｅｒｎら、２００９；Ｈｉｎｏら、２０１２；Ｌｕｏら、２００４）。
【０１０９】
ｍＡｂ９２６による非競合阻害のモデルは、抗体とリガンドがＦｉｍＨに同時に結合することができる、すなわち少なくとも一時的なＦｉｍＨ−マンノース−ｍＡｂ９２６複合体を形成することを示す。これは、マンノースがｍＡｂ９２６によって占有されたＦｉｍＨポケットに接近するが、ｍＡｂ４７５によって占有された該ポケットには接近することはなく、ｍＡｂ９２６の結合が解除されることが観察によって実験的に裏づけられている。３者複合体が形成される方法および該複合体が不安定な理由についての正確な機構は不明であるが、リガンド結合に起因する構造の歪みまたは立体障害が原因で抗体がＦｉｍＨから溶離される可能性がある。次いで、相反的に、受容体がリガンドによってすでに占有されている場合、ｍＡｂ９２６の共結合特性は、リガンドに結合解除をさせる。実際、ｍＡｂ４７５抗体の比較的少ない影響と比較して、または高濃度の可溶性マンノースでさえ比較すると、マンノース被覆表面に形成された細菌バイオフィルムは、ｍＡｂ９２６によってのみ効果的に解離されることが可能であることが観察された。我々の知る限りでは、ｍＡｂ９２６は、細菌バイオフィルムを溶解することを示した唯一の抗体である。
【０１１０】
結合部位が重複するにもかかわらず阻害物質ｍＡｂ９２６とマンノースリガンドとの明らかな同時結合の現象により、オルソステリック阻害物質およびアロステリック阻害物質の両方とは異なったものなり、新規のリガンド結合阻害のパラステリック機構を定めるための理論的根拠を提供する。パラステリック阻害物質のオルソステリック阻害物資に対する利点は、前者が結合ポケットからの結合解除においてより強力であり、かつ高濃度の内因性リガンドの存在下でより効果的であることである。いずれの効果も、競合阻害物質ｍＡｂ４７５と比較してｍＡｂ９２６によるかなり強力な阻害、およびＦｉｍＨが媒介するマウス膀胱でのコロニー形成を阻止するｍＡｂ９２６の優れた能力を説明することができる。リガンドは結合したｍＡｂ９２６とともに結合ポケットに入り、実際に抗体を移動させることができることを示したが、これは、極めて高い非生理的濃度でのみ生じ、リガンド結合阻害物質としての抗体の有効性を損なうことはないだろう。多くの細菌アドヘジンはＦｉｍＨに類似したせん断力が増強した接着を媒介し（Ｄｉｎｇら、２０１０；Ｇｅｏｒｇｅら、２００６；Ｎｉｌｓｓｏｎら、２００６ａ；Ｔｃｈｅｓｎｏｋｏｖａら、２０１０）、アドへジンも構造変化を遂げることがあり得、パラステリック阻害の候補になり得ることを示唆している。パラステリック阻害物質のアロステリック阻害物質に対する利点は、パラステリック阻害の有効性がアロステリック部位とリガンド結合部位との弱い結合によって限定されることはなく、かつパラステリック阻害は受容体がアロステリックであることを必要としないことである。アロステリック部位の位置についての知識が不足しているため、合理的設計についての問題点が存在するアロステリック阻害物質と比較すると、パラステリック阻害物質の開発はタンパク質がアロステリックであるか否かにかかわらず、規定されたリガンド結合部位を有する任意のタンパク質に対してより広範囲に適用でき得る。
【０１１１】
ｍＡｂ９２６のエピトープは、高度に保存されているように見える。種々の起源（腸管、腸管外および周辺）の大腸菌の４２７１菌株から４８８の異なるｆｉｍＨアレルにおけるエピトープ領域の配列解析により、４８８アレルのうちわずか１アレル（５菌株）がエピトープ位置の１つＤ１４０に変異性があることが明らかになった。しかし、このアレルは、極めてまれであり（＞４，０００分離菌から５菌株中に存在）、ｍＡｂ９２６が多種多様な大腸菌分離菌に対して広範囲に効力があり得ることを示している。さらに、この抗体は、クレブシエラ・ニューモニエの接着とバイオフィルムの形成を効果的に阻止した。しばしば尿路感染症、敗血症または気道感染症を引き起こす重要な日和見病原体であるクレブシエラ・ニューモニエは、マンノース特異的１型線毛を発現し、ＦｉｍＨアドヘシンは大腸菌ＦｉｍＨと７２〜８４％（アミノ酸配列レベルで）同一である。クレブシエラＦｉｍＨの結合ポケットは、大腸菌といくぶん異なっているが、大腸菌と比較すると、ｍＡｂ９２６のエピトープは依然として元のまま維持されおり、解析された＞５４０クレブシエラ菌株から１００を超える異なるＦｉｍＨアレルで同一である。これは、ｍＡｂ９２６が相同体ＦｉｍＨアドヘシンを発現する他の腸内細菌に対しても強力な阻害物質であり得ることを示唆した。
【０１１２】
総合すると、我々の調査結果は、リガンド結合部位のただ１つのループに結合する抗体には、新規のパラステリック機構を介して細菌接着の阻害と回復の両方に極めて効果的な可能性があることを示唆している。細菌アドヘジンの結合ポケットサイドループは、そのような可能性を有する抗体の生成の良好な標的であるように見える。ｍＡｂ９２６エピトープが主に単一ループによって形成されていることを観察することにより、このループは合成環状ペプチドを用いたパラステリック抗体の誘発のための良好な候補免疫原になる。ループ形状エピトープは、本来のエピトープを十分に模倣するだけでなく、免疫原として極めて高い安定性を示す環状形で合成されると、その構造特性のために、合成ペプチド系ワクチンとして極めて効力があることが示された（Ｈｏｏｇｅｒｈｏｕｔら、１９９５；Ｍｉｓｕｍｉら、２００３）。
【０１１３】
実施例１０：モノクローナル抗体の産生と精製
マウス抗体ｍＡｂ４７５ｍ、ｍＡｂ８２４、ｍＡｂ９２６およびｍＡｂ２１を産生するハイブリドーマ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，＃１００８２１４７）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ，３１５１４０−１２２）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｒｏ，＃１１３６０）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｌｏｎｚａ）中で増殖させた。抗体は、メーカーの推奨に従い、タンパク質Ｇ−アガロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ハイブリドーマ細胞培地上清から精製し、続いて１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＦＰＬＣ精製を行った。すべてのＦＰＬＣ精製ステップは、ＨＢＳ中で行い、最終濃度５〜１０ｍｇ／ｍＬの抗体を４℃で保存した。
【０１１４】
実施例１１：モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列決定
完全ｍＲＮＡを、ＲＮａｓｅミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１０４）を用いてハイブリドーマ細胞から単離し、続いてｃＤＮＡ合成をＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）とオリゴｄＴプライマー（Ｑｉａｇｅｎ）によって行った。可変領域を、以下のプライマーを用いて、２０μＬのＲＴ反応容量から２μＬを用いてＰＣＲ増幅させた。
順方向：
ＶＬ４（ｍＡｂ４７５）：ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ（配列番号９）；
ＶＬ５（ｍＡｂ９２６）：ＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡ（配列番号１０）；
ＶＨ１（ｍＡｂ４７５とｍＡｂ９２６）：ＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧ（配列番号１１）；ならびに
逆方向：
ＶＬｒ（ｍＡｂ４７５とｍＡｂ９２６）：ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ（配列番号１２）；および
ＶＨ３ｒ（ＩｇＧ１特異的）：ＡＧＧＣＴＴＡＣＴＡＧＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＴ（配列番号１３）。
【０１１５】
精製ＰＣＲ産物をＧｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ）による配列決定に委ねた。
抗ＦｉｍＨ抗体の生殖系列起源を、ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔソフトウェア（オンラインで利用可能）（Ｂｒｏｃｈｅｔら、２００８；Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら、２０１１）を用いてそれらの軽鎖と重鎖の可変領域配列に基づいて判定した。
【０１１６】
実施例１２：抗体エピトープマッピング
ｍＡｂ９２６エピトープとｍＡｂ８２４エピトープのマピングを前述のように行った（Ｋｉｓｉｅｌａ、ら  ２０１３）。手短に言うと、ＦｉｍＨのＬＤに異なる変異を保有する精製した同質遺伝子線毛を認識する能力についこれらの抗体をテストした。親の（変異してない）線毛を基準として用い、それに対して抗体とすべての他の変異体線毛との結合を正規化した。ｍＡｂ９２６とｍＡｂ８２４のエピトープをそれぞれ、高親和性ＦｉｍＨ変異体（ＦｉｍＨｗｔ：（１８６〜２０１）Ｆｏｃｈ）（Ａｐｒｉｋｉａｎら、２００７）と低親和性ＦｉｍＨ変異体（ＦｉｍＨｗｔ）を用いて位置づけた。
【０１１７】
実施例１３：細菌株
大腸菌臨床分離株ＵＴＩ８９および異なる構造ＦｉｍＨ変種を有する１型線毛を発現する大腸菌Ｋ１２の組換え株は、前述した（Ａｐｒｉｋｉａｎら、２００７；Ｌｉｕら、２０１２；Ｔｃｈｅｓｎｏｋｏｖａら、２００８）。手短に言うと、大腸菌Ｋ１２の組換え株（ＡＡＥＣ１９１Ａ）は、大腸菌株Ｋ１２由来の全ｆｉｍ遺伝子集団を含有するｐＰＫＬ１１４プラスミドを保有するが、不活性ｆｉｍＨ遺伝子を有する。１型線毛発現のために、ｐＰＫＬ１１４プラスミド含有細菌をｆｉｍＨ遺伝子の異なるアレルを保有する同質遺伝子ｐＧＢ２−２４ベースのプラスミドで形質転換させた。ＡＡＥＣ１９１Ａ組換え株も用いて、ＦｉｍＨ野生型（ＦｉｍＨｗｔ）とＳ６２Ａ変異体（ＦｉｍＨＳ６２Ａ）を含むクレブシエア・ニューモニエＦｉｍＨ（Ｓｔａｈｌｈｕｔら、２００９）を保有する１型線毛を生成した。異なるｆｉｍＨ変異体で補完したクレブシエア・ニューモニエｆｉｍＨ変異体は前述した（Ｓｔｒｕｖｅら、２００８）。
【０１１８】
実施例１４：ＥＬＩＳＡアッセイ
マイクロタイタープレート・ウェルに、０．０２ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液中の精製線毛（Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３）を０．１ｍｇ／ｍＬ（特に明記しない限り）の濃度で、３７℃で１時間、被覆した。これらのウェルをＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳに溶解した０．２％ＢＳＡで２０分間クエンチした。マンノースのモノクローナル抗体に対する効果をテストするために、５２ｍＭのα−メチル−Ｄ−マンノピラノシド（αｍｍ、以下「マンノ−ス」と呼ぶ）の非存在下または存在下で段階希釈した純粋な抗体とともに固定化線毛をインキュベートした。結合した抗体を、１：５，０００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出した。反応液を３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ＫＰＬ）を用いて展開させ、吸光度を６５０ｎｍで読み取った。各抗体それぞれに対して、Ｐｒｉｓｍソフトウェア６．０版（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて非線形回避曲線フィッティングによってＥＣ５０値を決定した。
【０１１９】
アドヘシン構造に対する抗体の影響をテストするために、固定化線毛を５０μｇ／ｍＬの純粋な抗体、または５２ｍＭのマンノースとともに１時間インキュベートし、次いで０．５μｇ／ｍＬのビオチン化ｍＡｂ２１をウェルに加えた。洗浄後、ビオチン化モノクローナル抗体の結合を１：５，０００に希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出した。一部の実験において、まず、表面固定化線毛を０．５μｇ／ｍＬのビオチン化モノクローナル抗体とともに（５２ｍＭノマンノースの非存在下または存在下で）インキュベートし、続いて精製モノクローナル抗体５０μｇ／ｍＬとともに１時間インキュベートした。
【０１２０】
ＦｉｍＨ−抗体複合体の安定性に対するリガンドの影響をテストするために、まず、０．４μｇ／ｍＬの濃度で抗体を表面固定化線毛に結合させ、続いて８％マンノースまたはＰＢＳとともに１〜４時間インキュベートした。
【０１２１】
実施例１５：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ＦｉｍＨｗｔへのｍＡｂ９２６、ｍＡｂ４７５およびｍＡｂ８２４の結合に続いて１％（ｗ／ｖ）マンノースの非存在または存在によるＳＰＲ分析を２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを用い、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）のランニング緩衝液（ＲＢ）中で行った。標準アミンカップリング反応を使用して、約２０００ＲＵのＦｉｍＨｗｔ線毛を２０μｇ／ｍＬで１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）中で、シリーズＳ  ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の２つのフローセルにアミン結合させた。２つの基準面は、タンパク質を添加せずに、フローセルを活性化、不活性化することによって調製した。単一濃度で二つ組（１つはｍＡｂ８２４用）サンプルを、Ｔ１００コントロールソフトウェア（２．０．４版）の「デュアル」インジェクションコマンドを用い、インジェクション１を５分間、インジェクション２を１０分間、最終解離時間を１分間で、１０μＬ／分の流速でインジェクトした。モノクローナル抗体単独の曲線は、モノクローナル抗体をインジェクトし、続いてＲＢをインジェクトすることよって作成し、次いでＲＢの後ＲＢのデュアルインジェクションを差し引くことによって二重参照した（Ｍｙｓｚｋａ、１９９９）。モノクローナル抗体＋マンノース曲線は、モノクローナル抗体（マンノースを含まないＲＢ中で）をインジェクトし、続いて１％マンノースを含むＲＢをインジェクトすることによって作成し、次いでＲＢの後１％マンノースを含むＲＢのデュアルインジェクションを差し引くことによって二重参照した。最適再生は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を流速５０μＬ／分で、３０秒パルスのインジェクションを１回（ｍＡｂ９２６の場合）または２回（ｍＡｂ４７５の場合）のいずれか、続いて２分間の緩衝液安定相によって達成された。ｍＡｂ８２４サンプル結合のための最適再生条件がわからなかったため、２つのＦｉｍＨｗｔ線毛表面の生成が必要であり、各々ｍＡｂ８２４インジェクションを１回だけ行った。ｍＡｂ８２４結合表面にできるだけ密接に適合させ、ならびに比較のための対照を用意するために、マンノースを含む、および含まないｍＡｂ９２６とｍＡｂ４７５のインジェクションをｍＡｂ８２４のインジェクションに先立って各ＦｉｍＨｗｔ線毛表面で行った。センサーグラムをＳｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア２．０ｂ版（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で二重参照し、テキストファイルとして保存し、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア６版で再プロットした。
【０１２２】
見かけの反応速度と平衡結合定数を判定するために、ＦｉｍＨｗｔ線毛を上述の通り１３００ＲＵの密度にアミン結合し、活性化／不活性化表面を参考として用いた。アナライトの２倍段階希釈を１２．５ｎＭ（ｍＡｂ９２６）または２００ｎＭ（ｍＡｂ４７５）で開始し、緩衝液ブランクを順不同にインジェクトし、二つ組で、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰ中、３０μＬ／分の流速で、７００秒の結合と１２００秒の解離で行った。表面は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の５０μＬ／分で３０秒のインジェクションを１回（ｍＡｂ９２６）または３０秒のインジェクションを２回（ｍＡｂ４７５）のいずれかに続いて緩衝液安定化を２分間行うことで再生させた。二重参照データを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア２．０．４版（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１結合モデルとフィッティングさせた。
【０１２３】
実施例１６：細菌接着
０．０２ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．６に溶解した２０μｇ／ｍＬの酵母マンナンまたはＲＮａｓｅＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でマイクロタイター９６ウェルプレートを被覆した。ウェルをＰＢＳに溶解した０．２％ウシ血清アルブミン溶液（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２０分間クエンチさせた。まず、ＦｉｍＨアドヘシンを発現する細菌（ＯＤ＝１またはＯＤ＝２）を異なる濃度のモノクローナル抗体とともに３７℃で１時間プレインキュベートし、次いでさらに１時間、リガンド被覆表面に接着させておいた。ＰＢＳで十分に洗浄した後、プレートを乾燥させて、結合した細菌を室温（ＲＴ）で０．１％クリスタルバイレット（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で２０分間染色した。ウェルを水で洗浄して、５０％エタノールをウェルに添加した。吸光度を６００ｎｍで測定した。
【０１２４】
実施例１７：バイオフィルム形成アッセイ
０．０２ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．６に溶解した２０μｇ／ｍＬの酵母マンナンまたはＲＮａｓｅＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でマイクロタイター９６ウェルプレートを被覆した。３ｍＬのＬＢ培地中で一晩増殖させた細菌株を遠心して、最小必須培地（ＭＥＭ，Ｄｉｆｃｏ）で１回洗浄した。ＭＥＭに懸濁させた細菌懸濁液を最終濃度ＯＤ＝０．２で、５２ｍＭマンノースまたは５０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体の非存在下および存在下でマンナン被覆ウェルに添加し、振盪させずに室温で１６時間インキュベートした。細菌接着アッセイについて上述したように、ＰＢＳで洗浄した後、形成されたバイオフィルムを０．１％（ｖ／ｖ）のクリスタルバイオレット（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で染色した。バイオフィルム解離のために、マンナンを被覆したマイクロタイタープレート上で大腸菌ＵＴ１８９によって１６時間生成されたバイオフィルムをＰＢＳで３回洗浄し、１％マンノースまたは５０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体の非存在下または存在下で、室温で穏やかに振盪させながらインキュベートした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、上述のようにバイオフィルムを検出するために染色した。
【０１２５】
実施例１８：抗体の経尿道注入によるマウス実験
他で記載のように、１０〜１１週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの感染を行った（Ｋｉｓｉｅｌａら、２０１３）。手短に言うと、細菌をＬＢ培地中で振盪させずに４８時間増殖させ、回収し、ＰＢＳで２回洗浄して、１ｍＬ当たり１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）の最終濃度でＰＢＳに再懸濁させた。接種に先立ち細菌を５００μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を用い３７℃で１時間、前処置した。マウスにケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、ＰＢＳに溶解したモノクローナル抗体で前処置した細菌液２５マイクロリットルをカテーテルからマウスの膀胱に経尿道的に接種した。２４時間後に、マウスを犠牲にして、膀胱を無菌的に摘出し、１ｍＬのＰＢＳでホモジナイズした。段階希釈液を播種し、膀胱当たりの総細菌量を算出した。統計的有意性をマン・ホィットニー両側検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア６版、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を用いて決定した。
【０１２６】
実施例１９：受動免疫用の非糖尿病および糖尿病マウスモデル
Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて糖尿病状態を、腹腔内注射によるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を用いる４日間の処置によって誘発した。１００匹のＣ５７Ｂ１／６マウスの群を糖尿病状態について１０匹からなる５群および非糖尿病状態について１０匹からなる５群にそれぞれ無作為に分けた。各病態の一群に、アジュバント単独（モック）、１５μｇのＬＤｍｕｔまたは１５μｇのＬＤｗｔを（抗原注射の４週間と１週間前に）皮下に注射し、他の２群に１５０μｇのｍＡｂ９２６またはｍＡｂ２１を腹腔内注射によって（抗原投与の１日前と１日後に）投与した。イソフルラン麻酔下で尿道内カテーテル留置によってマウスにＣＦＴ０７３  ＵＰＥＣ菌株（各マウスに１×１０６ｃｆｕ／５０μＬ）を用いて抗原を投与した。細菌抗原の投与から２４時間後に開始し１４日間にわたり毎日マウス尿中の細菌量を分析した。ゲノム細菌量は、ｑＰＣＲによって各尿サンプル（１０μＬ）中で定量化した。データの統計分析は、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｅｑｕａｔｉｏｎモデル（ＧＥＥ）（ＳＴＡＴＡソフトウェア、ＳｔａｔａＣｏｒｐ．のｘｔｇｅｅコマンド、２０１５、Ｓｔａｔｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ：リリース１４版。Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ：ＳｔａｔａＣｏｒｐ  ＬＰ）を用いて行った。全体的に見て、１４日間にわたり１００匹のマウスに対して１４００回の観察を行った。総計１，４００回のうち２３７回の観察をはずし（尿が提出されてなかった）、以降の分析から除外した。マウスＩＤは、パネル変数、マウス間で許容される相互作用による予測変数としての処置の種類と日数、結果変数としての大腸菌の計数としてセットした。不等分散性と非線形性を説明するために、対数変換大腸菌計数の分析を行った。ｌｏｇ１０変換のために、ゼロ計数（大腸菌が検出されなかった）は、値１に置き換えた。糖尿病マウスと非糖尿病マウスに関するデータを別々にフィッティングした。Ｗａｌｄ検定を使用して、ナイーブ標準誤差を用いた回帰母数の推論を算出した。糖尿病マウスからの細菌計数について、残差分析は、独立変数からの従属変数の分布の正規性の要求を満たすために本試験から除外した影響力のない外れ値（尿中の大腸菌ＤＮＡが時々ないことを表した）の存在を示した。外れ値の除外後、６１７回（最初の６７３回から、９１．６％）の観察を同じモデルを使用して分析した。
【０１２７】
実施例２０：タンパク質構造のモデリングと可視化
ＦｉｍＨの不活性構造の結合部位にα−Ｄ−マンノースを結合させるために、レクチンドメインの結晶構造（残基１〜１５８、ＰＤＢコード：３ＪＷＮ）をＦｉｍＨレクチンドメインの高親和性構造（ＰＤＢコード：１ＵＷＦ）上に整列させ、続いて残基１〜６と４４〜４８のＲＭＳＤ（平均二乗偏差）の最小化を行った。次いで、１ＵＷＦ構造に存在するマンノースの座標を用いて、低親和性構造中のＬＤとリガンドとの間の複合体を作成した。次いで、プログラムＣＨＡＲＭＭ  １３（Ｂｒｏｏｋｓら、２００９）およびＰＡＲＡＭ２２力場（ＭａｃＫｅｒｒｅｌｌら、１９９８）を使用して、全システムを減圧下での最急降下最小化の１００ステップと、誘電連続体における共役勾配最小化の５００ステップとにかけた。公開されている構造データ（Ｂｏｕｃｋａｅｒｔら、２００５；Ｈｕｎｇら、２００２；Ｗｅｌｌｅｎｓら、２００８）に基づいて、マンノース環は、マンノシル化リガンド（すなわち、α−Ｄマンノース、マンノースまたはオリゴマンノース基質のアルキル誘導体）の性質に関係なく、ポケット内で同じ位置を保持し、水素結合の同じネットワークを作成する。したがって、単純にするために、α−Ｄマンノースのマンノース環だけをモデル化し、ＦｉｍＨ構造で示す。
【０１２８】
ＩＵＷＦ構造において、α−Ｄマンノースを、本来の結晶構造のマンノース残基の糖環との整列によってモデル化した。モノクローナル抗体エピトープに関連するアミノ酸残基の空間分布および水素結合を形成する原子と、３ＪＷＮ構造および１ＵＷＦ構造中のマンノースリガンドとの間の距離を分子可視化ソフトウェアプログラムＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＬＣ）を使用して測定した。
【０１２９】
実施例２１：統計分析とデータ分析
すべての値は、特に明記しない限り、平均およびＳＥＭとして表示する。統計有意性は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア６．０版（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を用いて両側スチューデント検定によって決定した。
【０１３０】
マンノースの存在下で抗体による受容体占有は以下の式から算出した。
【０１３１】
【数１】
2018515517.tif 000009
【０１３２】
式中、αはマンノースおよび抗体のための協同係数であり、［Ｍ］はマンノース濃度であり、ＫＤはその平衡定数である。最強の可能な負の協同性（マンノースと抗体が直接の競合者である場合）の場合、α＝０および
【数２】
2018515517.tif 000010
である。
【０１３３】
マンノースと線毛ＦｉｍＨｗｔの解離定数が２９８±５０μＭであり（Ｔｃｈｅｓｎｏｋｏｖａら、２００８）、および抗体結合をマンノースの５２ｍＭ濃度でテストしたので、競合結合の予想されるＥＣ５０比は１７５±３０である。
【０１３４】
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［５０］Ｐｈａｎ，Ｕ．Ｔ．，Ｔ．Ｔ．Ｗａｌｄｒｏｎ，およびＴ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ２００６，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７（８）：８８３−９．
［５１］Ｑｕｉｏｃｈｏ，Ｆ．Ａ．，Ｊ．Ｃ．Ｓｐｕｒｌｉｎｏ，およびＬ．Ｅ．Ｒｏｄｓｅｔｈ，１９９７，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５（８）：９９７−１０１５．
［５２］Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．，ら，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ  ４６９（７３２９）：１７５−８０．
［５３］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｐ，およびＡｌｆｏｎｓｏ  Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ，１９９０，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  Ｖｏｌｕｍｅ  １８ｔｈ  ｅｄ：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．
［５４］Ｓｅｏ，Ｍ．Ｈ．，ら，２０１４，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：３７２４．
［５５］Ｓｉｌｖａ，Ｄ．Ａ．，ら，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ７（５）：ｅ１００２０５４．
［５６］Ｓｏｏｒｉｙａａｒａｃｈｃｈｉ，Ｓ．，ら，２０１０，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４０２（４）：６５７−６８．
［５７］Ｓｐｕｒｌｉｎｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｇ．Ｙ．Ｌｕ，およびＦ．Ａ．Ｑｕｉｏｃｈｏ，１９９１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６（８）：５２０２−１９．
［５８］Ｓｔａｈｌｈｕｔ，Ｓ．Ｇ．，ら，２００９，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９１（２１）：６５９２−６０１．
［５９］Ｓｔｒｕｖｅ，Ｃ．，Ｍ．Ｂｏｊｅｒ，およびＫ．Ａ．Ｋｒｏｇｆｅｌｔ，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６（９）：４０５５−６５．
［６０］Ｓｗｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｃ．，２００４，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ３（９）：８０１−８．
［６１］Ｓｗｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｃ．，２００６，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ６（５）：４６１−７８．
［６２］Ｔａｎｇ，Ｃ．，Ｃ．Ｄ．Ｓｃｈｗｉｅｔｅｒｓ，およびＧ．Ｍ．Ｃｌｏｒｅ，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  ４４９（７１６５）：１０７８−８２．
［６３］Ｔｃｈｅｓｎｏｋｏｖａ，Ｖ．，ら，２００８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３（１２）：７８２３−３３．
［６４］Ｔｃｈｅｓｎｏｋｏｖａ，Ｖ．，ら，２０１０，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７６（２）：４８９−５０２．
［６５］Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ａ．，およびＣ．Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｉ，２００１，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１（１）：６７−７４．
［６６］Ｗａｒｎｅ，Ｔ．，ら，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ  ４６９（７３２９）：２４１−４．
［６７］Ｗｅｌｌｅｎｓ，Ａ．，ら，２００８，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３（４）：ｅ２０４０．
［６８］Ｗｏｌｆ−Ｗａｔｚ，Ｍ．，ら，２００４，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１（１０）：９４５−９．
［６９］Ｗｕ，Ｙ．，ら，２００７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４（５０）：１９７８４−９．
【０１３５】
本出願全体を通して種々の刊行物が参照されている。本発明が関連する技術水準をより完全に記述するために、これらの刊行物のその全体における開示は、参照により本出願に本明細書によって組み込まれている。
【０１３６】
前述から、本発明の特定の実施形態が例示目的のために本明細書に記載されているが、種々の修正は本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われることが可能である。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲を除いて、限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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