(57)【要約】  本発明は、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する方法であって、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップを含み、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する該ステップは、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップを含む、方法を対象とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵ブロスのバイオマスから目的タンパク質を精製する方法であって、
A)場合により、目的タンパク質を含む発酵ブロスを希釈するステップ、及び
B)発酵ブロスのバイオマスから目的タンパク質を精製するステップ
を含み、
該発酵ブロスのバイオマスから目的タンパク質を精製する該ステップは、
aa)目的タンパク質の可溶化及び/又はバイオマスからの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液とバイオマスとを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップ、ここで目的タンパク質の可溶化及び/又はバイオマスからの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、
a)目的タンパク質のpI値を上回るpH値、又は
b)目的タンパク質のpI値を下回るpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度の、これらの条件下で正に荷電した化合物
を含み、これにより、目的タンパク質は、バイオマスから洗浄溶液中に可溶化及び/又は放出され、並びに
bb)バイオマスから目的タンパク質を含む洗浄溶液を分離するステップを含む、
前記方法。
【請求項２】
発酵ブロスのバイオマスから目的タンパク質を精製するステップが、該1つ以上の洗浄ステップと同時に起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的タンパク質が、希釈されていない発酵ブロスのバイオマスから精製される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
発酵ブロスのpH値の調整が、発酵ブロスのバイオマスからの目的タンパク質の精製前に行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
発酵ブロスのバイオマスからの目的タンパク質の精製前に、発酵ブロスの導電率が、発酵ブロスの1〜100mS/cmの導電率へと、これらの条件下で正に荷電した化合物を添加することによって調整される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
目的タンパク質の可溶化及び/又はバイオマスからの目的タンパク質の脱離を促進する洗浄溶液の条件の1つが、目的タンパク質のpI値を上回る洗浄溶液のpH値を含み、洗浄溶液のpH値が、少なくとも0.2pH値単位、目的タンパク質のpI値を上回る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
目的タンパク質の可溶化及び/又はバイオマスからの目的タンパク質の脱離を促進する洗浄溶液の条件の1つが、目的タンパク質のpI値を下回る洗浄溶液のpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度のこれらの条件下で正に荷電した化合物を含み、洗浄溶液のpH値が、少なくとも0.2pH値単位、目的タンパク質のpI値を下回る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
目的タンパク質の可溶化及び/又は目的タンパク質の脱離を促進する条件が、pH7.0〜pH13.0、好ましくはpH8.5〜pH12.0のpH値を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
目的タンパク質の可溶化及び/又は目的タンパク質の脱離を促進する洗浄溶液の条件が、pH4.0〜pH9.5、好ましくはpH4.0〜pH8.0のpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度のこれらの条件下で正に荷電した化合物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
正に荷電した化合物が塩のカチオンであり、好ましくは、塩のカチオンが一価若しくは二価カチオン、好ましくは、ナトリウム、カルシウム若しくはマグネシウムカチオンであるか、又は、正に荷電した化合物が、目的タンパク質のpI値を上回るpI値を有するアミノ酸、ペプチド若しくはタンパク質であるか、又はそれらの組み合わせである、請求項７又は９に記載の方法。
【請求項１１】
バイオマスからの目的タンパク質の精製が、ろ過によって、好ましくは精密ろ過によって、又は遠心分離によって、好ましくはデカンター遠心分離若しくはディスクスタック遠心分離によって達成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
バイオマスからの目的タンパク質の精製が、クロスフローろ過、好ましくは管状モジュールを用いた、プレートモジュールを用いた、若しくは中空糸を用いたクロスフローろ過、又はデッドエンドろ過、好ましくは、ドラムろ過、ディスクフィルター、ベルトフィルター、若しくはフィルタープレスからなる群から選択される方法によって達成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
洗浄溶液が、緩衝溶液、塩溶液、精密ろ過ろ液、限外ろ過ろ液、遠心分離液、水及び任意の他のプロセスストリームからなる群から選択される少なくとも1つの溶液を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
発酵ブロスが、目的タンパク質を発現する微生物の発酵から得られる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
微生物が、原核生物又は真核生物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
原核生物が、バチルス(Bacillus)細胞、好ましくは、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、又はバチルス・レンタス(Bacillus lentus)のバチルス細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質が酵素である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
酵素が、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、フィターゼ、及びセルラーゼ、好ましくはアミラーゼ又はプロテアーゼ、好ましくはスブチリシンからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
液体タンパク質製剤の調製のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する方法であって、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップを含み、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する該ステップは、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップを含む、方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
有用物質の、これらの物質を生産する選択された微生物の培養による生物工学的生産は、現在、工業上かなり重要である。特に、発酵によるタンパク質、特に洗浄及び/又は清浄活性酵素だけでなく、薬理学的に活性なタンパク質の工業的生産は、過去数十年にわたって増加している。
【０００３】
発酵産物が市販品に組み込まれるためには、発酵プロセスの完了後に発酵ブロスの粒子状物質（粒状物質）からの精製が通常必要とされる。しかし、培養ブロスからの発酵産物の回収、特に目的タンパク質の回収は、発酵産物のかなりの量が可溶化形態にはなく、発酵ブロス中の粒子状物質に付着し、大幅な収率損失をもたらすという事実によってしばしば妨げられる。
【０００４】
目的タンパク質の溶解性を改善し、発酵ブロス中の粒子状物質、特にバイオマスへの目的タンパク質の結合を減少させるための種々の方法が当技術分野に存在する。
【０００５】
US6582606には、サビナーゼを含む発酵ブロスのpH5.2への調整、及び発酵ブロスの100％希釈後のCaCl2及び活性炭の添加を含む精製方法が記載される。細菌細胞は、その後の単純な精密ろ過によって除去された。
【０００６】
WO2011003784は、発酵ブロスの600％希釈並びにCaCl2及びリン酸ナトリウムの添加に続いて、発酵ブロスのpHをpH6.5〜pH10.5に調整することによって、発酵ブロスからアミラーゼ又はプロテアーゼを精製する方法を開示する。細菌細胞は、その後の遠心分離によって分離されると記載される。細胞除去後のタンパク質溶液を処理するためのさらなる手段として、WO2011003784は、さらなる精製、例えば、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、抽出、噴霧乾燥、蒸発、沈殿又は結晶化による精製を示唆する。
【０００７】
WO0043502A2には、細胞の除去前に培養ブロスのpHを約9.5〜約13のpH値に調整するステップを含む、培養ブロスからグリコシダーゼ又はペプチダーゼを回収する方法が開示される。WO0043502A2には、アミラーゼの精製が記載され、ここで、培養ブロスのサンプルは水で200％(w/w)希釈され、凝集剤が補充され、サンプルのpHはpH10.5に調整される。続いて、バイオマスは遠心分離によって除去され、上清中のアミラーゼ活性は、酵素精製前の発酵ブロス中の酵素活性と比較して80％であると決定された。
【０００８】
WO2008110498A1は、発酵ブロス中のプロテアーゼ結晶及び/又はプロテアーゼ沈殿物を可溶化する方法を記載する。WO2008110498A1では、スブチリシンプロテアーゼは、a)発酵ブロスを300％(w/w)希釈するステップ; b)3％(w/w)のCaCl2(36％(w/w))を添加するステップ; 及びc)発酵ブロスのpH値をpH4.5又は4.2のいずれかのpH値に調整するステップを適用することによって可溶化される。その後、バイオマスは、遠心分離によって除去された。
【０００９】
したがって、全ての公知の方法は、良好なタンパク質収率を達成するために、細胞の除去前に水を用いた発酵ブロスの大幅な希釈を必要とする。
【００１０】
さらに、工業規模での発酵後にタンパク質を精製するための従来技術の方法のいずれも、目的タンパク質の可溶化及び/又は発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する条件下での発酵ブロスの粒子状物質の洗浄を開示していない。代わりに、発酵ブロスからの大規模タンパク質精製のための当技術分野において記載される全ての方法は、発酵ブロスから細胞を除去する前に、目的タンパク質の可溶化及び/又は発酵ブロス中の粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する発酵ブロスの条件の調整を必要とする。これにより、回収プロセスは複雑になり、作業及び費用がかかり、連続的プロセスは可能にならない。
【００１１】
したがって、大規模タンパク質精製のための従来技術は、タンパク質精製前の発酵ブロスの大幅な希釈の必要性と通常組み合わされた、連続的精製プロセスを可能とせず、不十分な収率をもたらす複雑な多段階手順を特徴とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第6582606号
【特許文献２】国際公開第2011003784号パンフレット
【特許文献３】国際公開第0043502号パンフレット(A2)
【特許文献４】国際公開第2008/110498号パンフレット(A1)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、発酵法によって得られる目的タンパク質の精製プロセスを容易にすること、特に、連続的精製プロセスを可能にするために、並びに、結晶化及び沈殿に起因する、及び発酵ブロスの粒子状物質へのタンパク質の結合に起因する、精製プロセス中のタンパク質の損失を低下させるために、精製プロセスを改善することが、当技術分野において必要であった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
記載された課題に対する解決法は、本発明により提供され、これは、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する方法であって、目的タンパク質の可溶化及び/又はバイオマスからの目的タンパク質の脱離を促進する条件が、1つ以上の洗浄ステップにおいて適用される、方法を対象とする。
【００１５】
特に、本発明は、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する方法であって、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップを含み、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する該ステップは、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップを含む、方法を対象とする。
【００１６】
目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、
a)目的タンパク質のpI値を上回るpH値、又は
b)目的タンパク質のpI値を下回るpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度の、これらの条件下で正に荷電した化合物
を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明及び本明細書に含まれる実施例を参照することによって、より容易に理解し得る。
【００１８】
定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される用語は、当業者による従来の使用にしたがって理解されるべきである。
【００１９】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、「a」又は「an」は、それが使用される文脈に応じて、1つ以上を意味し得ることを理解されたい。したがって、例えば、「細胞(a cell)」への言及は、少なくとも1つの細胞を使用できることを意味し得る。
【００２０】
本出願にわたって、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の全て及び全体においてこれらの刊行物に引用される参考文献の開示は、本発明が関係する技術水準をより完全に説明するために、参照により本出願に組み込まれる。
【００２１】
用語「精製」又は「精製すること」は、少なくとも1つの成分、例えば目的タンパク質が、少なくとも別の成分、例えば発酵ブロスの粒子状物質から分離され、異なる区画又は相に移されるプロセスを指し、ここで、異なる区画又は相は必ずしも物理的障壁によって分離される必要はない。そのような異なる区画の例は、ろ過膜又は布によって分離された2つの区画、すなわち、ろ液及び保持液(retentate)である。このような異なる相の例は、それぞれ、ペレット及び上清、又はケーキ及びろ液である。
【００２２】
用語「脱離」は、別の分子又は物質、例えば発酵ブロスの粒子状物質に共有結合又は非共有結合(例えば、イオン又は疎水性相互作用によって)された分子、例えば目的タンパク質が、前記分子と前記他の分子又は物質との間の結合を切断するか又は緩めることによって、前記他の分子又は物質から放出されるプロセスを指す。したがって、発酵ブロスの粒子状物質に結合した目的タンパク質の精製は、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の最初の脱離を必要とする。
【００２３】
用語「洗浄」は、ある体積の洗浄溶液が、粒子状物質又は粒子状物質を含む溶液に添加され、同じ又は同様の体積の液体が、得られた溶液から後に又は同時に除去されるプロセスのために本明細書で使用される。したがって、用語「洗浄」は、目的タンパク質を含む溶液へのある体積の洗浄溶液の同時添加、及び目的タンパク質を含む溶液からの同じ若しくは同様の体積の液体の除去、並びに洗浄溶液中の粒子状物質の懸濁及びその後の同じ若しくは同様の体積の液体の除去を含む。したがって、粒子状物質を含む発酵ブロスについて、用語「洗浄」は、粒子状物質を含む発酵ブロスの液相のある部分の、洗浄溶液による置換を含み、この洗浄溶液は、特定の物質を含む発酵ブロスの元の液相の一部の除去の前、後又は同時に添加される。洗浄溶液の添加と、同じ又は同様の体積の元の液体の除去との組み合わせにより、洗浄ステップは、洗浄ステップ前の元の体積に関して作業体積の正味の増加に関連していない。これに関連して、「連続的な洗浄ステップ」は、同量の溶液の同時添加及び除去により、洗浄ステップ中の作業体積を一定に保つことによって特徴付けられる。同じ理解が、用語「粒子状物質を洗浄溶液と接触させること」に適用されるものとする。したがって、発酵ブロスの又は発酵ブロス中の粒子状物質の洗浄は、発酵ブロスの又は発酵ブロス中の粒子状物質からの目的タンパク質の精製と同時に又はその前に起こり得る。
【００２４】
用語「洗浄」とは対照的に、用語「希釈」は、ある体積の液体が、化合物の溶液、例えば、目的タンパク質を含む溶液に添加され、それによって、作業体積を増加させ、得られた溶液から同じ又は同様の体積の液体を後に除去することなく、溶液中の前記化合物の濃度の低下をもたらすプロセスを記載する。したがって、例えば、発酵ブロスへの液体、例えば水の添加、及びその後の目的タンパク質の精製(目的タンパク質の精製前に同じ又は同様の体積の液体を除去することなく、しかし、例えば、添加された液体及び発酵ブロスの液体部分の組み合わされた体積を除去して)は、希釈ステップとみなされ、洗浄ステップとはみなされない。
【００２５】
用語「希釈されていない発酵ブロス」は、かなりの量の希釈剤を添加する前の、発酵プロセスを行った後の発酵ブロスを指す。したがって、用語「希釈されていない発酵ブロス」はまた、例えば発酵ブロスの特定のパラメータの適合(例えばpH調整又は導電率調整に起因した希釈)に起因して、わずかに希釈されている発酵ブロスも包含する。いずれの場合も、用語「希釈されていない発酵ブロス」は、20％(w/w)、好ましくは10％(w/w)以上希釈されている発酵ブロスを含まない。
【００２６】
用語「工業規模での発酵」(大規模発酵とも称される)は、20リットル以上の発酵槽容積を用いる発酵プロセスを指す。
【００２７】
分子の「pI値」(pH(I)又はIEP値とも略記する)という用語は、本明細書で使用される場合、分子の、特にアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の等電点を指すものとし、これは、特定の分子が正味の電荷を持たないpH値である。実験的pI値及び計算されたpI値がわずかに異なる可能性があるため、本明細書における用語「pI値」は、計算されたpI値を指す。pI値は、例えば、Bjellqvistら1993に記載されるように個々のアミノ酸のpK値を用いることによって、又はhttp://web.expasy.org/compute_pi/のようなウェブベースのインターフェースを用いることによって計算することができる。
【００２８】
発酵ブロスの又は発酵ブロス中の「粒子状物質」(本明細書では発酵ブロスの又は発酵ブロス中の固形物又は固体部分とも称される)という用語は、目的タンパク質の精製前に発酵ブロス中に含まれ、当業者に公知の条件下で遠心分離又はろ過によって発酵ブロスの残りから分離することができる任意の不溶性物質を意味するものとする。発酵ブロスの又は発酵ブロス中の粒子状物質の例は、バイオマス、すなわち死細胞及び/又は生細胞、不溶性培地成分、例えば複合窒素又は複合炭素源の不溶性成分、塩、凝集剤又はろ過助剤である。
【００２９】
用語「正に荷電した化合物」は、正に荷電した化合物を含むそれぞれの溶液の条件下で、正の正味電荷を有する化合物、例えばペプチド又はタンパク質を記載するものとするが、カチオン及びアニオンを含む化合物(例えば塩)内のカチオンも記載し、この化合物は、したがって、正味電荷を持たないが、前記化合物を溶液中にもたらすと、アニオン及びカチオンが解離し、それと同時に正に荷電した化合物を放出する。
【００３０】
用語「バイオマス」は、発酵の間に繁殖（増殖）した微生物の死細胞及び/又は生細胞、好ましくは非破砕細胞を記載するものとする。
【００３１】
詳細な説明
本発明は、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する方法であって、
発酵ブロスの粒子状物質、好ましくはバイオマスから目的タンパク質を精製するステップを含み、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する該ステップは、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップを含み、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、
a)目的タンパク質のpI値を上回るpH値、又は
b)目的タンパク質のpI値を下回るpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度の、これらの条件下で正に荷電した化合物
を含む、方法を対象とする。
【００３２】
理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、タンパク質のpI値に近いpHでは、タンパク質は、正味の電荷を持たず、よって溶解性が低い傾向があると考える。対照的に、タンパク質のpI値を下回るpHでは、タンパク質は全体的な正の電荷を有し、タンパク質のpI値を上回るpHでは、タンパク質は全体的な負の電荷を有する。両方の条件、すなわち正及び負の正味電荷は、タンパク質が凝集する傾向を低下させる、すなわちタンパク質回収に正の影響を与える。しかしながら、発酵ブロス中の粒子状物質の大部分、そして最も重要なこととして細胞バイオマスは、正味の負電荷を有するため、正の正味電荷を有するタンパク質は、発酵ブロスの粒子状物質に結合する傾向があり、その後のタンパク質の分離中に失われる可能性がある。目的タンパク質の粒子状物質への結合は、正に荷電した化合物の添加によって防ぐことができる。驚くべきことに、本発明者らは、発酵ブロスの処理中に洗浄ステップでタンパク質回収に正の影響を与える条件を適用することが、発酵ブロスの処理前にこれらの条件を未処理の又は希釈しただけの発酵ブロスに適用することよりも、優れていることを見出した。
【００３３】
本発明は、工業規模での任意の発酵、例えば少なくとも20リットル、好ましくは少なくとも50リットル、より好ましくは少なくとも300リットル、さらに好ましくは少なくとも1000リットルの培養培地を有する任意の発酵に有用であり得る。実際の発酵がどのように実施されているかは、本発明の精製方法にとってどちらかとえいえば非本質的である。したがって、発酵時間、pH、消泡剤又は他の具体的な発酵条件は、当技術分野で公知の標準的な条件にしたがって適用され得る。好ましくは、発酵条件は、目的タンパク質の最大収率を得るように調整される。発酵培地は、例えばWO 98/37179に記載されるような最小培地であってもよく、又は発酵培地は、複合窒素及び炭素源を含む複合培地であってもよく、複合窒素源は、WO 2004/003216に記載されるように部分的に加水分解されてもよい。発酵は、バッチ、反復バッチ、フェドバッチ、反復フェドバッチ又は連続的発酵プロセスとして行ってよい。フェドバッチプロセスでは、構造的及び/又は触媒的要素の1つ以上を含む化合物は、発酵の開始前に培地に添加されず、構造的及び/又は触媒的要素の1つ以上を含む化合物の全てが発酵プロセスの間に供給されるか、あるいは、構造的及び/又は触媒的要素の1つ以上を含む化合物の一部が、発酵の開始前に培地に添加され、構造的及び/又は触媒的要素の1つ以上を含む化合物の残りの部分が発酵プロセスの間に供給される。供給のために選択される化合物は、発酵プロセスに一緒に供給されてもよいし、又は互いに別々に供給されてもよい。反復フェドバッチ又は連続的発酵プロセスでは、完全開始培地を発酵中に追加的に供給する。開始培地は、構造的要素供給(複数可)と一緒に又は別々に供給することができる。反復フェドバッチプロセスでは、バイオマスを含む発酵ブロスの一部を一定時間間隔で除去し、一方、連続的プロセスでは、発酵ブロスの一部の除去は連続的に起こる。これにより、発酵プロセスは、取り出した発酵ブロスの量に対応する新鮮な培地の一部で補充される。本発明の好ましい実施形態では、フェドバッチ発酵プロセスが好ましい。
【００３４】
好ましくは、発酵ブロスの又は発酵ブロス中の粒子状物質は、バイオマス、複合培地成分、好ましくは複合窒素及び/又は複合炭素源の成分、凝集剤、ろ過助剤、又は発酵ブロス中に存在する任意の固体からなる群から選択される少なくとも1つの成分を含む。好ましくは、発酵ブロスの又は発酵ブロス中の粒子状物質は、バイオマス、好ましくは死細胞及び/又は生細胞、好ましくはインタクトな細胞、好ましくは非溶解細胞を含む。好ましくは、バイオマスは、封入体を含まない。好ましくは、発酵ブロスの又は発酵ブロス中の粒子状物質は、バイオマスと、複合培地成分、好ましくは複合窒素及び/又は複合炭素源の成分、凝集剤、ろ過助剤、又は発酵ブロス中に存在する任意の固体からなる群から選択される1つ以上の成分とを含む。好ましくは、発酵ブロスの又は発酵ブロス中の粒子状物質は、バイオマスである。
【００３５】
本明細書で解決すべき一般的課題、すなわち、ある量の目的タンパク質が溶液中にない場合に目的タンパク質を回収することは、目的タンパク質が比較的高い収率で発現される場合に最も顕著である。結果として、本発明の好ましい実施形態は、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製することであり、ここで、目的タンパク質は、少なくとも2gのタンパク質(乾燥物質)/未処理培養培地1kgの量で、好ましくは少なくとも3gのタンパク質(乾燥物質)/未処理培養培地1kgの量で、より好ましくは少なくとも5gのタンパク質(乾燥物質)/未処理培養培地1kgの量で、より好ましくは少なくとも10gのタンパク質(乾燥物質)/未処理培養培地1kgの量で、さらにより好ましくは少なくとも20gのタンパク質(乾燥物質)/未処理培養培地1kgの量で発現される。
【００３６】
本発明の方法は、未処理の発酵ブロスに、又は限定されないが、例えば温度調整、pH調整、導電率調整、希釈、並びに/又は凝集剤及び/若しくはろ過助剤の添加に最初に供されている発酵ブロスに適用することができる。好ましくは、上記の精製ステップは、限定されないが、例えば温度調整、pH調整、又は導電率調整、希釈に最初に供されている、希釈されていない発酵ブロスに適用される。より好ましくは、上記の精製ステップは、pH調整及び/又は導電率調整及び/又は温度調整に最初に供されている、希釈されていない発酵ブロスに適用される。
【００３７】
好ましくは、発酵ブロスの温度は、精製ステップの開始前に4〜50℃、好ましくは4〜40℃である。
【００３８】
場合により、発酵ブロスは、タンパク質の精製の開始前に希釈される。
【００３９】
したがって、本発明は、発酵ブロスの粒子状物質、好ましくはバイオマスから目的タンパク質を精製する方法であって、
A)場合により、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の精製の開始前に、目的タンパク質を含む発酵ブロスを希釈するステップ、及び
B)発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップ
を含み、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する該ステップは、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップを含み、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、
a)目的タンパク質のpI値を上回るpH値、又は
b)目的タンパク質のpI値を下回るpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度の、これらの条件下で正に荷電した化合物
を含む、方法を対象とする。
【００４０】
これにより、目的タンパク質は、発酵ブロスの粒子状物質から分離される。
【００４１】
したがって、本発明は、発酵ブロスの粒子状物質、好ましくはバイオマスから目的タンパク質を精製する方法であって、
A)場合により、目的タンパク質を含む発酵ブロスを希釈するステップ、及び
B)発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップ
を含み、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する該ステップは、aa)目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップ、ここで目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、
a)目的タンパク質のpI値を上回るpH値、又は
b)目的タンパク質のpI値を下回るpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度の、これらの条件下で正に荷電した化合物
を含み、これにより、目的タンパク質は、粒子状物質から洗浄溶液中に可溶化及び/又は放出される、並びにbb)粒子状物質から目的タンパク質を含む洗浄溶液を分離するステップを含む、方法を対象とする。
【００４２】
本発明の一実施形態では、精製される目的タンパク質を含む発酵ブロスは、目的タンパク質の精製の開始前に、最大5000％(w/w)、好ましくは最大1000％(w/w)、より好ましくは最大500％(w/w)、好ましくは20〜5000％(w/w)、好ましくは20〜1000％(w/w)、好ましくは20〜500％(w/w)、好ましくは10〜5000％(w/w)、より好ましくは10〜1000％(w/w)、特に10〜500％(w/w)、特に20〜700％(w/w)、特に20〜500％(w/w)希釈される。
【００４３】
好ましくは、発酵ブロスの粒子状物質、好ましくはバイオマスから目的タンパク質を精製するステップはまた、水、好ましくは脱イオン水又は部分脱イオン水を用いた1つ以上の洗浄ステップを含む。好ましくは、水を用いた1つ以上の洗浄ステップは、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップの前に適用される。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する方法であって、
A)場合により、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の精製の開始前に、目的タンパク質を含む発酵ブロスを希釈するステップ、及び
B)発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップ
を含み、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する該ステップは、aa)水、好ましくは脱イオン水又は部分脱イオン水を用いた1つ以上の洗浄ステップ、及びその後の、bb)目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップ、ここで目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、
a)目的タンパク質のpI値を上回るpH値、又は
b)目的タンパク質のpI値を下回るpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度の、これらの条件下で正に荷電した化合物
を含み、これにより、目的タンパク質は、粒子状物質から洗浄溶液中に可溶化及び/又は放出される、並びにcc)粒子状物質から目的タンパク質を含む洗浄溶液を分離するステップを含む、方法を対象とする。
【００４４】
好ましくは、該1つ以上の洗浄ステップは、目的タンパク質の可溶化及び/又は発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を可能にするのに十分な時間、適用される。好ましくは、1つ以上の洗浄ステップの間に、粒子状物質を洗浄溶液と、最大1分、最大5分、最大10分、最大15分、最大30分、最大60分、最大2時間、最大3時間、最大4時間、最大5時間、最大10時間、又は最大1日の期間、接触させる。
【００４５】
本発明において、1つ以上の洗浄ステップは、連続的な又は1つ以上の不連続的な洗浄ステップである。好ましくは、1〜3つの洗浄ステップ又は連続的な洗浄ステップが適用される。より好ましくは、1つ以上の洗浄ステップは、連続的な洗浄ステップである。
【００４６】
結果として、本発明の方法は、連続的又は不連続的なプロセスにおいて粒子状物質から目的タンパク質を精製することを可能にする。好ましくは、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する方法は、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む洗浄溶液を用いた連続的な洗浄ステップを好ましくは含む、連続的プロセスである。好ましい実施形態では、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップは、1つ以上の洗浄ステップと同時に起こる。好ましくは、本発明の方法は、連続的な洗浄ステップを含み、目的タンパク質を含む洗浄溶液の、粒子状物質からの分離は、1つ以上の洗浄ステップと同時に起こる。この実施形態では、発酵ブロスのバイオマスから目的タンパク質を精製するステップは、1つ以上の洗浄ステップと同時に起こる。
【００４７】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、発酵ブロスのバイオマスから目的タンパク質を精製する方法であって、
A)場合により、目的タンパク質を含む発酵ブロスを希釈するステップ、及び
B)発酵ブロスのバイオマスから目的タンパク質を精製するステップ
を含み、発酵ブロスのバイオマスから目的タンパク質を精製する該ステップは、aa)目的タンパク質の可溶化及び/又はバイオマスからの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液とバイオマスとを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップ、ここで目的タンパク質の可溶化及び/又はバイオマスからの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、
a)目的タンパク質のpI値を上回るpH値、又は
b)目的タンパク質のpI値を下回るpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度の、これらの条件下で正に荷電した化合物
を含み、これにより、目的タンパク質は、バイオマスから洗浄溶液中に可溶化及び/又は放出され、並びにbb)バイオマスから目的タンパク質を含む洗浄溶液を分離するステップを含み、該1つ以上の洗浄ステップは、連続的な洗浄ステップであり、好ましくは、目的タンパク質を含む洗浄溶液の、粒子状物質からの分離は、該1つ以上の洗浄ステップと同時に起こる、方法に言及する。
【００４８】
1つの具体的な実施形態では、発酵ブロスの液体部分は、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む洗浄溶液を用いた、粒子状物質の連続的な洗浄ステップの前に、発酵ブロスの固体部分から分離される。別の具体的な実施形態では、発酵ブロスの液体部分は、1つ以上の洗浄ステップと同時に、発酵ブロスの固体部分から分離される。
【００４９】
好ましくは、液体及び固体部分を含む発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップは、ダイアフィルトレーションステップを含み、ダイアフィルトレーションステップは、本明細書に記載されるように、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む洗浄溶液を用いた、前記洗浄ステップの1つ以上を含む。これらの連続的な又は部分的に連続的なプロセスの使用は、不連続的なプロセスと比較して、大型の貯蔵容器の必要性を低減する。
【００５０】
好ましい実施形態では、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップは、遠心分離ステップを含まず、好ましくは、非連続的遠心分離ステップを含まない。
【００５１】
あるいは、粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップは、例えば遠心分離によって、発酵ブロスから粒子状物質を分離するステップ、及びその後の、発酵ブロスから分離した粒子状物質の1つ以上の洗浄ステップを含む。したがって、好ましい実施形態では、発酵ブロスの粒子状物質、好ましくはバイオマスから目的タンパク質を精製する方法は、
A)場合により、目的タンパク質を含む発酵ブロスを希釈するステップ、
B)発酵ブロスから粒子状物質を分離して、粒子状物質を含む発酵ブロスの固体部分及び発酵ブロスの液体部分を生じさせるステップ、及び
C)目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質を含む発酵ブロスの固体部分とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップを、発酵ブロスの固体部分に適用するステップ
を含み、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、
a)目的タンパク質のpI値を上回るpH値、又は
b)目的タンパク質のpI値を下回るpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度の、これらの条件下で正に荷電した化合物
を含む。
【００５２】
この特定の実施形態では、粒子状物質の除去後の発酵ブロスの液体部分は、好ましくは、1つ以上の洗浄溶液(これを用いて発酵ブロスの固体部分を洗浄した後に回収される)と組み合わされる。
【００５３】
目的タンパク質を含む発酵ブロスは、精製ステップの前に希釈される必要はない。希釈ステップの省略は、時間及びリソースを節約し、貯蔵容器の数及び容積を低減する。さらに、このことは、処理しなければならない水の量を低減する。
【００５４】
したがって、好ましい実施形態では、目的タンパク質は、希釈されていない発酵ブロスの粒子状物質から精製される。好ましくは、精製前に、20％未満、10％未満、5％未満、2％(w/w)未満のみの発酵ブロスの希釈が存在するか、又は全く希釈がない。
【００５５】
したがって、好ましくは、本発明は、発酵ブロスの粒子状物質、好ましくはバイオマスから目的タンパク質を精製する方法であって、
希釈されていない発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップを含み、希釈されていない発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する該ステップは、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の精製と同時に、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップを含み、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、
a)目的タンパク質のpI値を上回るpH値、又は
b)目的タンパク質のpI値を下回るpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度の、これらの条件下で正に荷電した化合物
を含む、方法を対象とする。
【００５６】
好ましい実施形態では、発酵ブロスの粒子状物質の濃度を、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する前に、好ましくは1つ以上の洗浄ステップの前に、好ましくは濃縮によって、好ましくは不完全なろ過によって、又は遠心分離液(centrifugation centrate)の部分的除去と組み合わせた遠心分離によって、増加させる。
【００５７】
好ましくは、発酵ブロスのpH値の調整は、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の精製の開始前に行われる。好ましくは、発酵ブロスのpH値は、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の精製前に、pH7.5〜pH12.5、好ましくはpH8.5〜pH12.0、好ましくはpH8.5〜10.0又はpH4.5〜pH9.5、好ましくはpH4.5〜pH9.0、好ましくはpH5.0〜pH8.5、好ましくは5.5〜8.0に調整される。
【００５８】
回収されるべき目的タンパク質の具体的な特徴に関連して具体的なpHレベルを最適化することは、当業者の一般知識の範囲内である。
【００５９】
好ましくは、発酵ブロスのpH値は、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の精製前に、好ましくは0.2〜0.75、0.2〜1.0、0.2〜2.0、0.2〜3.0、0.2〜4.0、0.5〜1.0、0.5〜2.0、0.5〜3.0、若しくは0.5〜4.0pH値単位、目的タンパク質のpI値を上回る若しくは下回るpH、又は好ましくは少なくとも0.2、少なくとも0.5、少なくとも0.75、少なくとも1.0、少なくとも1.25、少なくとも1.5、少なくとも1.75、少なくとも2.5、少なくとも2.75、少なくとも3.0、少なくとも3.25、少なくとも3.5、少なくとも3.75、若しくは少なくとも4.0pH値単位、目的タンパク質のpI値を上回る若しくは下回るpHに調整される。
【００６０】
好ましい実施形態では、目的タンパク質のpI値は、pH5.5〜pH10.0、好ましくはpH5.5〜7.5、好ましくはpH7.0〜pH10.0、又は好ましくはpH8.0〜pH9.5である。
【００６１】
好ましくは、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の精製の開始前に、発酵ブロスの導電率は、1〜100mS/cm、好ましくは1〜50mS/cm、より好ましくは10mS/cm〜50mS/cm、さらにより好ましくは1〜25mS/cmの発酵ブロスの導電率に、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の精製前に、これらの条件下で正に荷電した化合物を添加することによって調整される。
【００６２】
発酵ブロスの導電率(正に荷電した成分の添加及び場合によりpH調整の後)は、好ましくは、1mS/cm〜100mS/cmの範囲、より好ましくは1mS/cm〜50mS/cmの範囲、より好ましくは10mS/cm〜50mS/cmの範囲、さらにより好ましくは1mS/cm〜25mS/cmの範囲である。導電率は、例えば、導電率計によってモニタリングすることができる。
【００６３】
好ましい実施形態では、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する精製ステップ中に適用される洗浄溶液の条件の1つは、目的タンパク質のpI値を上回る洗浄溶液のpH値を含み、洗浄溶液のpH値は、少なくとも0.2pH値単位、目的タンパク質のpI値を上回る。この実施形態では、好ましくは、洗浄溶液のpHは、好ましくは0.2〜0.75、0.2〜1.0、0.2〜2.0、0.2〜3.0、0.2〜4.0、0.5〜1.0、0.5〜2.0、0.5〜3.0、若しくは0.5〜4.0pH値単位、目的タンパク質のpI値を上回るpH、又は少なくとも0.5、少なくとも0.75、少なくとも1.0、少なくとも1.25、少なくとも1.5、少なくとも1.75、少なくとも2.5、少なくとも2.0、少なくとも2.75、少なくとも3.0、少なくとも3.25、少なくとも3.5、少なくとも3.75、若しくは少なくとも4.0pH値単位、目的タンパク質のpI値を上回るpHに調整される。好ましくは、洗浄溶液のpHは、pH8.5〜pH12.5、好ましくはpH8.5〜pH10.0のpH値を有する。好ましくは、洗浄溶液のpHは、pH5.0〜pH10のpH値を有し、好ましくは目的タンパク質はプロテアーゼ又はアミラーゼである。好ましくは、洗浄溶液のpHは、pH8.5〜pH12.5、好ましくはpH8.5〜pH10.0のpH値を有し、目的タンパク質のpI値は、pH5.5〜pH8.4のpH値におけるものであり、好ましくは目的タンパク質は、プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、又はアミラーゼである。
【００６４】
好ましくは、洗浄溶液のpHは、pH8.5〜pH12.5、好ましくはpH8.5〜pH10.0のpH値を有し、目的タンパク質は、プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、好ましくはpH5.5〜pH8.4のpI値を有するプロテアーゼである。
【００６５】
好ましくは、洗浄溶液のpHは、pH5.5〜pH12.0、好ましくはpH6.0〜pH12.0、好ましくはpH6.0〜pH11.0のpH値を有し、目的タンパク質のpI値は、pH5.0〜pH7.0、好ましくはpH7.0を下回るpH値におけるものであり、目的タンパク質は、アミラーゼである。
【００６６】
好ましい実施形態では、洗浄溶液のpHは、pH8.5〜pH13.0、好ましくはpH8.5〜pH12.0、より好ましくは8.5〜10.0のpH値を有し、1つ以上の洗浄ステップは、4℃〜50℃、好ましくは4℃〜40℃の温度で行われる。
【００６７】
好ましくは、洗浄溶液は、本明細書に記載されるような特性を有する水溶液である。
【００６８】
好ましい実施形態では、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する精製ステップ中に適用される洗浄溶液の条件の1つは、目的タンパク質のpI値を下回る洗浄溶液のpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cm、好ましくは1〜50mS/cm、より好ましくは10〜50mS/cm、さらにより好ましくは1〜25mS/cmの導電率をもたらす濃度のこれらの条件下で正に荷電した化合物を含み、洗浄溶液のpH値は、少なくとも0.2pH値単位、目的タンパク質のpI値を下回る。
【００６９】
この実施形態では、好ましくは、洗浄溶液のpHは、好ましくは0.2〜0.75、0.2〜1.0、0.2〜2.0、0.2〜3.0、0.2〜4.0、0.5〜1.0、0.5〜2.0、0.5〜3.0、若しくは0.5〜4.0pH値単位、目的タンパク質のpI値を下回るpHに調整されるか、又は少なくとも0.2、少なくとも0.5、少なくとも0.75、少なくとも1.0、少なくとも1.25、少なくとも1.5、少なくとも1.75、少なくとも2.0、少なくとも2.5、少なくとも2.75、少なくとも3.0、少なくとも3.25、少なくとも3.5、少なくとも3.75、若しくは少なくとも4.0pH値単位、目的タンパク質のpI値を下回る。この実施形態では、好ましくは、洗浄溶液の導電率(正に荷電した成分の添加及びpH調整の後)は、好ましくは、1mS/cm〜100mS/cmの範囲、より好ましくは1mS/cm〜50mS/cmの範囲、さらにより好ましくは1mS/cm〜25mS/cmの範囲である。
【００７０】
好ましくは、洗浄溶液のpHは、pH4.0〜9.5、好ましくはpH4.5〜pH8.0、好ましくはpH4.5〜pH7.5、好ましくはpH4.5〜6.0、好ましくはpH4.5〜pH5.5、好ましくは5.0〜5.5のpH値を有する。
【００７１】
好ましくは、洗浄溶液のpHは、pH5.0〜pH8.0、好ましくはpH5.5〜pH8.0のpH値を有する。この実施形態は、特に、セリンプロテアーゼが、プロテアーゼを安定化させ、プロテアーゼのタンパク質分解活性を低下させるpH範囲で機能することを可能にする。
【００７２】
好ましくは、洗浄溶液のpHは、pH4.0〜pH5.5、好ましくはpH4.5〜pH5.0のpH値を有する。この実施形態は、特に、アミラーゼの精製を可能にする。
【００７３】
好ましくは、この実施形態では、洗浄溶液のpHは、pH4.0〜pH8.0、好ましくはpH5.5〜pH8.0のpH値を有し、好ましくは、洗浄溶液のpHは、少なくとも0.2、少なくとも0.5、少なくとも0.75、少なくとも1.0、少なくとも1.25、少なくとも1.5、少なくとも1.75、少なくとも2.0、少なくとも2.5、タンパク質のpIを下回り、洗浄溶液の導電率(正に荷電した成分の添加及びpH調整の後)は、好ましくは、1mS/cm〜100mS/cmの範囲、さらに好ましくは1mS/cm〜50mS/cmの範囲、より好ましくは1mS/cm〜25mS/cmの範囲であり、目的タンパク質のpI値は、pH5.5〜pH12、好ましくはpH5.5〜pH7.5、好ましくはpH8.2〜pH12、好ましくはpH6.5〜pH8.4のpH値におけるものであり、好ましくは目的タンパク質は、プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、又はアミラーゼである。
【００７４】
好ましくは、この実施形態では、洗浄溶液のpHは、pH5.0〜pH8.0のpH値を有し、洗浄溶液の導電率(正に荷電した成分の添加及びpH調整の後)は、好ましくは、1mS/cm〜100mS/cmの範囲、さらに好ましくは1mS/cm〜50mS/cmの範囲、より好ましくは1mS/cm〜25mS/cmの範囲であり、目的タンパク質は、プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、好ましくはpH8.2〜pH12.0のpI値を有するプロテアーゼである。
【００７５】
好ましくは、洗浄溶液のpHは、pH4.0〜pH7.0、好ましくはpH4.0〜pH5.5のpH値を有し、洗浄溶液の導電率(正に荷電した成分の添加及びpH調整の後)は、好ましくは、1mS/cm〜100mS/cmの範囲、さらに好ましくは1mS/cm〜50mS/cmの範囲、より好ましくは1mS/cm〜25mS/cmの範囲であり、目的タンパク質のpI値は、pH5.5〜pH7.5のpH値におけるものであり、目的タンパク質は、アミラーゼである。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明は、発酵ブロスの粒子状物質、好ましくはバイオマスから目的タンパク質を精製する方法であって、
A)場合により、目的タンパク質を含む発酵ブロスを希釈するステップ、及び
B)発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップ
を含み、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する該ステップは、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の精製と同時に、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップを含み、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、目的タンパク質のpI値を上回るpH値を含み、目的タンパク質の可溶化及び/又は目的タンパク質の脱離を促進する条件は、pH7.5〜pH13.0、好ましくはpH8.0〜pH12.0、より好ましくはpH8.5〜pH10.0のpH値を含み、好ましくは、目的タンパク質は、プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、又はアミラーゼである、方法を対象とする。
【００７７】
好ましい実施形態では、本発明は、発酵ブロスの粒子状物質、好ましくはバイオマスから目的タンパク質を精製する方法であって、
A)場合により、目的タンパク質を含む発酵ブロスを希釈するステップ、及び
B)発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製するステップ
を含み、発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する該ステップは、発酵ブロスの粒子状物質からの目的タンパク質の精製と同時に、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する1つ以上の条件を含む、洗浄溶液と粒子状物質とを接触させることを含む、1つ以上の洗浄ステップを含み、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からの目的タンパク質の脱離を促進する条件の1つは、目的タンパク質のpI値を下回るpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす(導く)濃度のこれらの条件下で正に荷電した化合物を含み、目的タンパク質の可溶化及び/又は目的タンパク質の脱離を促進する洗浄溶液の条件は、pH4.0〜pH9.5、好ましくはpH4.5〜pH9.0、より好ましくはpH5.0〜pH8.5のpH値、及び洗浄溶液の1〜100mS/cmの導電率をもたらす濃度のこれらの条件下で正に荷電した化合物を含み、好ましくは、目的タンパク質は、プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、又はアミラーゼである、方法を対象とする。
【００７８】
好ましくは、上記の正に荷電した化合物は塩のカチオンであり、好ましくは、塩のカチオンは一価若しくは二価カチオン、好ましくは、ナトリウム、カルシウム若しくはマグネシウムカチオンであるか、又は、正に荷電した化合物は、目的タンパク質のpI値を上回るpI値を有するアミノ酸、ペプチド若しくはタンパク質であるか、又はそれらの組み合わせである。
【００７９】
塩の好適なカチオンは、Li、Na、K、Mg、Ca、Al、Fe、若しくはNH4カチオン又はそれらの組み合わせのカチオンである。塩の好ましいカチオンは、ナトリウムカチオン、カルシウムカチオン、アンモニアカチオン若しくはマグネシウムカチオン又はそれらの組み合わせである。カチオンを含む塩の好ましいアニオンは、リン酸アニオン、硫酸アニオン、硝酸アニオン、酢酸アニオン、及び/又は塩化物アニオン、ギ酸アニオン、炭酸アニオンである。好ましい実施形態では、正に荷電した化合物の添加のために、NaCl、Na2SO4、CaCl2又はMgCl2、NH4SO4、酢酸Na、ギ酸Na又はそれらの組み合わせが使用される。
【００８０】
好ましい実施形態では、粒子状物質からの目的タンパク質の精製は、ろ過によって、好ましくは精密ろ過によって、又は遠心分離によって、好ましくはデカンター遠心分離若しくはディスクスタック遠心分離によって達成される。
【００８１】
好ましい実施形態では、粒子状物質からの目的タンパク質の精製は、連続的ろ過又は連続的遠心分離によって達成される。
【００８２】
好ましくは、粒子状物質からの目的タンパク質の精製は、クロスフローろ過、好ましくは管状モジュールを用いた、プレートモジュールを用いた、若しくは中空糸を用いたクロスフローろ過、又はデッドエンドろ過、好ましくは、ドラムろ過、ディスクフィルター、ベルトフィルター、若しくはフィルタープレスからなる群から選択される方法によって達成される。
【００８３】
別の好ましい実施形態では、洗浄溶液は、緩衝溶液、塩溶液、精密ろ過ろ液、限外ろ過ろ液、遠心分離液、水及び任意の他のプロセスストリーム（処理液）からなる群から選択される少なくとも1つの溶液を含む。下流プロセスストリームの使用により、既存のストリームが再利用されるため、リソースが節約される。さらに、洗浄溶液としての下流プロセスストリームの使用により、タンパク質の残留量が、通常、後に回収されるこれらのプロセスストリームに含まれるため、目的タンパク質の収率が増加する。
【００８４】
好ましい実施形態では、洗浄溶液は、緩衝溶液である。適切な緩衝溶液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液又はギ酸緩衝液である。
【００８５】
好ましくは、発酵ブロスは、目的タンパク質を発現する微生物の発酵から得られ、好ましくは微生物は原核生物又は真核生物である。
【００８６】
好ましくは、微生物は、細菌、古細菌、真菌細胞、酵母細胞又は真核細胞である。
【００８７】
有用な原核生物は、グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌などの細菌細胞である。好ましい有用なグラム陽性細菌としては、以下に限定されないが、バチルス(Bacillus)細胞、例えば、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウシイ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・ジャウツス(Bacillus Jautus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、枯草菌(Bacillus subtilis)、及びバチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)が挙げられる。最も好ましくは、原核生物は、バチルス(Bacillus)細胞、好ましくは、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、又はバチルス・レンタス(Bacillus lentus)のバチルス細胞である。
【００８８】
いくつかの他の好ましい細菌としては、放線菌目(order Actinomycetales)、好ましくは、ストレプトマイセス(Streptomyces)、好ましくはストレプトマイセス・スフェロイデス(Streptomyces spheroides)(ATTC 23965)、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス(Streptomyces thermoviolaceus)(IFO 12382)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)又はストレプトマイセス・ムリヌス(Streptomyces murinus)又はストレプトベルチシラム・ベルチシリウムssp.ベルチシリウム(Streptoverticillum verticillium ssp. verticillium)の株が挙げられる。他の好ましい細菌としては、ロドバクター・スファエロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドモナス・パルストリ(Rhodomonas palustri)、ストレプトコッカス・ラクティス(Streptococcus lactis)が挙げられる。さらなる好ましい細菌としては、ミクソコッカス(Myxococcus)に属する株、例えばM.ビレッセンス(M. virescens)が挙げられる。
【００８９】
好ましいグラム陰性細菌は、大腸菌(Escherichia coli)及びシュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、好ましくはシュードモナス・プロシニア(Pseudomonas purrocinia)(ATCC 15958)又はシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)である。
【００９０】
微生物は、真菌細胞であってもよい。「真菌」は、本明細書で使用される場合、子嚢菌門(Ascomycota)、担子菌門(Basidiomycota)、ツボカビ門(Chytridiomycota)、及び接合菌門(Zygomycota)並びに卵菌門(Oomycota)及び不完全菌類(Deuteromycotina)及び全ての栄養胞子形成菌を含む。子嚢菌門の代表的なグループとしては、例えば、ニューロスポラ(Neurospora)、ユーペニシリウム(Eupenicillium)(=ペニシリウム(Penicillium))、エメリセラ(Emericella)(=アスペルギルス(Aspergillus))、ユーロチウム(Eurotium)(=アスペルギルス(Aspergillus))、ミセリオフトラ(Myceliophthora)、C1、及び以下に記載される真正酵母が挙げられる。担子菌門の例としては、キノコ、サビ菌、及び黒穂病菌が挙げられる。ツボカビ門の代表的なグループとしては、例えば、アロマイセス(Allomyces)、ブラストクラジエラ(Blastocladiella)、コエロモマイセス(Coelomomyces)、及び水生菌類が挙げられる。卵菌門の代表的なグループとしては、例えば、サプロレグニオミセトウス(Saprolegniomycetous)水生菌類(水カビ)、例えばアクリア(Achlya)が挙げられる。栄養胞子形成菌の例としては、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、カンジダ(Candida)、及びアルテルナリア(Alternaria)が挙げられる。接合菌門の代表的なグループとしては、例えば、リゾプス(Rhizopus)及びムコール(Mucor)が挙げられる。
【００９１】
いくつかの好ましい真菌は、不完全菌亜門(subdivision Deuteromycotina)、不完全糸状菌綱(class Hyphomycetes)、例えば、フザリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、トリコデルマ(Tricoderma)、ミロセシウム(Myrothecium)、ベルチシルム(Verticillum)、アルスロマイセス(Arthromyces)、カルダリオマイセス(Caldariomyces)、ウロクラジウム(Ulocladium)、エムベリシア(Embellisia)、クラドスポリウム(Cladosporium)又はドレシュレラ(Dreschlera)、特にフザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)(DSM 2672)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、トリコデルマ・レシイ(Trichoderma resii)、ミロセシウム・ベルカナ(Myrothecium verrucana)(IFO 6113)、ベルチシルム・アルボアトルム(Verticillum alboatrum)、ベルチシルム・ダーリエ(Verticillum dahlie)、アルスロマイセス・ラモスス(Arthromyces ramosus)(FERM P-7754)、カルダリオマイセス・フマゴ(Caldariomyces fumago)、ウロクラジウム・カルタルム(Ulocladium chartarum)、エムベリシア・アリ(Embellisia alli)又はドレシュレラ・ハロデス(Dreschlera halodes)に属する株を含む。
【００９２】
他の好ましい真菌は、担子菌亜門(subdivision Basidiomycotina)、担子菌綱(class Basidiomycetes)、例えば、コプリヌス(Coprinus)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、コリオルス(Coriolus)又はトラメテス(Trametes)、特にコプリヌス・シネレウスf.ミクロスポルス(Coprinus cinereus f. microsporus)(IFO 8371)、コプリヌス・マクロリズス(Coprinus macrorhizus)、ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)(例えば、NA-12)又はトラメテス(Trametes)(以前はポリポルス(Polyporus)と称された)、例えば、T.ベルシコロル(T. versicolor)(例えば、PR4 28-A)に属する株を含む。
【００９３】
さらに好ましい真菌は、接合菌亜門(subdivision Zygomycotina)、ミコラセアエ綱(class Mycoraceae)、例えば、リゾプス(Rhizopus)又はムコール(Mucor)、特にムコール・ヒエマリス(Mucor hiemalis)に属する株を含む。
【００９４】
真菌宿主細胞は、酵母細胞であってもよい。「酵母」は、本明細書で使用される場合、子嚢胞子形成酵母(ascosporogenous yeast)(エンドミセス目(Endomycetales))、担子胞子形成酵母(basidiosporogenous yeast)、及び不完全菌類(Fungi Imperfecti)(ブラストミセテス(Blastomycetes))に属する酵母を含む。子嚢胞子形成酵母は、スペルモフトラセアエ(Spermophthoraceae)科及びサッカロミセタセアエ(Saccharomycetaceae)科に分けられる。後者は、4つの亜科、すなわち、シゾサッカロミコイデアエ(Schizosaccharomycoideae)(例えば、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属)、ナドソニオイデアエ(Nadsonioideae)、リポミコイデアエ(Lipomycoideae)、及びサッカロミコイデアエ(Saccharomycoideae)(例えば、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ピキア(Pichia)属、及びサッカロミセス(Saccharomyces)属)から構成される。担子胞子形成酵母は、ロイコスポリジウム(Leucosporidium)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、スポリジオボルス(Sporidiobolus)属、フィロバシジウム(Filobasidium)属、及びフィロバシジエラ(Filobasidiella)属を含む。不完全菌類に属する酵母は、2つの科、すなわち、スポロボロミセタセアエ(Sporobolomycetaceae)(例えば、スポロボロミセス(Sporobolomyces)属及びブレラ(Bullera)属)及びクリプトコッカセアエ(Cryptococcaceae)(例えば、カンジダ(Candida)属)に分けられる。別の実施形態では、真菌宿主細胞は、糸状真菌細胞である。
【００９５】
宿主細胞はまた、真核生物、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は植物細胞であってもよい。
【００９６】
本発明の方法は、あらゆる目的タンパク質の回収に適用できる。
【００９７】
好ましくは、目的タンパク質は、酵素、特に、酸化還元酵素(EC 1)、トランスフェラーゼ(EC 2)、加水分解酵素(EC 3)、リアーゼ(EC 4)、イソメラーゼ(EC 5)又はリガーゼ(EC 6)(国際生化学分子生物学連合の命名委員会の酵素命名法勧告(1992)にしたがうEC番号付け(1993〜1999年に発行されたその補遺を含む))と分類される酵素である。
【００９８】
最も好ましくは、酵素は、加水分解酵素(EC 3)、好ましくはグリコシダーゼ(EC 3.2)又はペプチダーゼ(EC 3.4)である。特に好ましい酵素は、アミラーゼ(特にα-アミラーゼ(EC 3.2.1.1))、セルラーゼ(EC 3.2.1.4)、ラクターゼ(EC 3.2.1.108)、マンナナーゼ(EC 3.2.1.25)、リパーゼ、フィターゼ(EC 3.1.3.8)、及びプロテアーゼからなる群から選択される酵素; 特に、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、フィターゼ及びセルラーゼからなる群から選択される酵素、好ましくは、アミラーゼ又はプロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ(EC 3.4.21)である。最も好ましいのはセリンプロテアーゼである。好ましい実施形態では、目的タンパク質は、洗剤酵素である。
【００９９】
特に好ましい実施形態では、以下の加水分解酵素が好ましい:
プロテアーゼ: 好適なプロテアーゼは、細菌又は真菌由来のものを含む。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルス(Bacillus)由来のもの、例えばスブチリシンノボ(subtilisin Novo)、スブチリシンカールスバーグ(subtilisin Carlsberg)、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168(WO 89/06279に記載される)である。好ましくは、スブチリシンプロテアーゼは、Asp32、His64及びSer221(スブチリシンBPN’番号付け)から構成される触媒三残基を使用するセリンプロテアーゼであり、好ましくは、スブチリシンプロテアーゼのpI値は、pH7.0〜pH10.0、好ましくはpH8.0〜pH9.5である。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン(例えば、ブタ又はウシ由来のもの)、並びにWO 89/06270及びWO 94/25583に記載されるフザリウム(Fusarium)プロテアーゼである。
【０１００】
有用なプロテアーゼの例は、WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、及びWO 98/34946に記載される変異体、特に以下の位置の1つ以上に置換を有する変異体である: 27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235及び274。
【０１０１】
さらなる有用なプロテアーゼは、WO2012080201及びWO2013060621に記載される。
【０１０２】
さらに好ましいプロテアーゼは、DE102012215642A1の配列番号1によるプロテアーゼ及びその変異体であり、好ましい変異体は、3、4、99、194及び199位(DSM5483由来のアルカリプロテアーゼの番号付けを使用する)に1つ以上の変異を含み、好ましくは、以下の変異の1つ以上を含み: S3T、V4I、R99E、V194M、及びV199I、好ましくは、S3T、V4I、R99E、及びV199I、より好ましくは、R99E、又はR99Eを、S3T、V4I、及びV199Iからなる群から選択される2つのさらなる変異と組み合わせて、好ましくは、R99E、又はS3T、V4I、V194M、及びV199I、又はS3T、V4I及びV199Iを有するDE102012215642A1の配列番号1を含む。さらに好ましいプロテアーゼは、DE102012215642A1の配列番号2によるプロテアーゼ及びその変異体であり、好ましい変異体は、99位における変異、及び99位と100位の間の挿入を含み、挿入は、アスパラギン酸(Asp、D)残基である。この実施形態では、好ましくは、99位における変異は、S99Aである。さらに好ましいプロテアーゼ変異体は、変異S3T、V4I及びV205Iを含む、DE102011118032A1の配列番号7、又は変異S3T、V4I、V193M、V199I、及びL211D(DSM5483由来のアルカリプロテアーゼの番号付けを使用する)を含む、DE102011118032A1の配列番号8である。
【０１０３】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Alcalase(商標)、Savinase(商標)、Primase(商標)、Duralase(商標)、Esperase(商標)、及びKannase(商標)(Novozymes A/S)、Maxatase(商標)、Maxacal(商標)、Maxapem(商標)、Properase(商標)、Purafect(商標)、Purafect OxP(商標)、FN2(商標)、及びFN3(商標)(Genencor International Inc.)を含む。
【０１０４】
リパーゼ: 好適なリパーゼは、細菌又は真菌由来のものを含む。有用なリパーゼの例としては、フミコラ(Humicola)(異名サーモマイセス(Thermomyces))由来、例えば、EP 258 068及びEP 305 216に記載のH.ラヌギノサ(H. lanuginosa)(T.ラヌギノサス(T. lanuginosus))由来、又はWO 96/13580に記載のH.インソレンス(H. insolens)由来のリパーゼ、シュードモナス(Pseudomonas)リパーゼ、例えば、P.アルカリゲネス(P. alcaligenes)又はP.シュードアルカリゲネス(P. pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、P.セパシア(P. cepacia)(EP 331 376)、P.スタッツェリ(P. stutzeri)(GB 1,372,034)、P.フルオレッセンス(P. fluorescens)、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.) 株SD 705(WO 95/06720及びWO 96/27002)、P.ウィスコンシネンシス(P. wisconsinensis)(WO 96/12012)由来のもの、バチルス(Bacillus)リパーゼ、例えば、枯草菌(B. subtilis)(Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360)、B.ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)(JP 64/744992)又はB.プミルス(B. pumilus)(WO 91/16422)由来のものが挙げられる。
【０１０５】
他の例は、WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079及びWO 97/07202に記載されるものなどのリパーゼ変異体である。
【０１０６】
好ましい市販のリパーゼ酵素は、Lipolase(商標)及びLipolase Ultra(商標)(Novozymes A/S)を含む。
【０１０７】
アミラーゼ: 好適なアミラーゼ(α及び/又はβ)は、細菌又は真菌由来のものを含む。化学修飾変異体又はタンパク質改変変異体が含まれる。アミラーゼとしては、例えばバチルス(Bacillus)、例えば、GB 1,296,839により詳細に記載されるB.リケニフォルミス(B. licheniformis)の特殊株から得られるα-アミラーゼが挙げられる。
【０１０８】
有用なアミラーゼの例は、WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、及びWO 97/43424に記載される変異体、特に以下の位置の1つ以上に置換を有する変異体である: 15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、及び444。
【０１０９】
市販のアミラーゼは、Duramyl(商標)、Termamyl(商標)、Fungamyl(商標)及びBANT(商標)(Novozymes A/S)、Rapidase(商標)及びPurastar(商標)(Genencor International Inc.から)である。
【０１１０】
セルラーゼ: 好適なセルラーゼは、細菌又は真菌由来のものを含む。化学修飾変異体又はタンパク質改変変異体が含まれる。好適なセルラーゼとしては、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、フミコラ(Humicola)属、フザリウム(Fusarium)属、チエラビア(Thielavia)属、アクレモニウム(Acremonium)属由来のセルラーゼ、例えば、U.S. Pat. Nos. 4,435,307、U.S. 5,648,263、U.S. 5,691,178、U.S. 5,776,757及びWO 89/09259に開示されるフミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)及びフザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)から生産される真菌セルラーゼが挙げられる。
【０１１１】
特に好適なセルラーゼは、カラーケアの利点を有するアルカリ又は中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940に記載されるセルラーゼである。他の例は、WO 94/07998、EP 0 531 315、U.S. Pat. Nos. 5,457,046、U.S. 5,686,593、U.S. 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307及びPCT/DK98/00299に記載されるものなどのセルラーゼ変異体である。
【０１１２】
市販のセルラーゼは、Celluzyme(商標)、及びCarezyme(商標)(Novozymes A/S)、Clazinase(商標)、及びPuradax HA(商標)(Genencor International Inc.)、及びKAC-500(B)(商標)(Kao Corporation)を含む。
【０１１３】
酸化還元酵素: 本発明にしたがって処理することができる酸化還元酵素は、ペルオキシダーゼ、及びオキシダーゼ、例えばラッカーゼを含む。
【０１１４】
ペルオキシダーゼ: ペルオキシダーゼ活性を示す酵素は、酵素分類(EC 1.11.1.7)に含まれる任意のペルオキシダーゼ酵素、又はそれに由来する、ペルオキシダーゼ活性を示す任意の断片であってもよい。
【０１１５】
特に、組換え技術により生産されたペルオキシダーゼが好ましく、例えば、コプリヌス属の種(Coprinus sp.)、特にWO 92/16634によるC.マクロリズス(C. macrorhizus)若しくはC.シネレウス(C. cinereus)由来のペルオキシダーゼ、又はそれらの変異体、例えば、WO 93/24618及びWO 95/10602に記載の変異体が好ましい。
【０１１６】
ラッカーゼ及びラッカーゼ関連酵素: 本発明の文脈では、ラッカーゼ及びラッカーゼ関連酵素は、酵素分類(EC 1.10.3.2)に含まれる任意のラッカーゼ酵素、酵素分類(EC 1.10.3.1)に含まれる任意のカテコールオキシダーゼ酵素、酵素分類(EC 1.3.3.5)に含まれる任意のビリルビンオキシダーゼ酵素、又は酵素分類(EC 1.14.18.1)に含まれる任意のモノフェノールモノオキシゲナーゼ酵素を企図する。
【０１１７】
微生物ラッカーゼ酵素は、細菌又は真菌(糸状真菌及び酵母を含む)に由来してよく、好適な例としては、アスペルギルス(Aspergillus)、ニューロスポラ(Neurospora)、例えば、アカパンカビ(N. crassa)、ポドスポラ(Podospora)、ボトリチス(Botrytis)、コリビア(Collybia)、フォメス(Fomes)、レンチヌス(Lentinus)、プレウロツス(Pleurotus)、トラメテス(Trametes)、例えば、T.ビローサ(T. villosa)及びT.ベルシコロル(T. versicolor)、リゾクトニア(Rhizoctonia)、例えば、R.ソラニ(R. solani)、コプリヌス(Coprinus)、例えば、C.プリカチリス(C. plicatilis)及びC.シネレウス(C. cinereus)、プサチレラ(Psatyrella)、ミセリオフトラ(Myceliophthora)、例えば、M.サーモフィラ(M. thermophila)、シタリジウム(Scytalidium)、ポリポルス(Polyporus)、例えば、P.ピンシツス(P. pinsitus)、フレビア(Phlebia)、例えば、P.ラジタ(P. radita)(WO 92/01046)、又はコリオルス(Coriolus)、例えば、C.ヒルスツス(C. hirsutus)(JP 2-238885)の株から誘導できるラッカーゼが挙げられ、特に、トラメテス(Trametes)、ミセリオフトラ(Myceliophthora)、シタリジウム(Schytalidium)又はポリポルス(Polyporus)から得ることができるラッカーゼが挙げられる。
【０１１８】
さらに、組換えDNA技術又は化学修飾によって作製された、目的タンパク質のタンパク質改変変異体が特に興味深い。
【０１１９】
本発明の方法から得られる精製されたプロテアーゼは、当技術分野で公知の方法によってさらに処理してもよい。例えば、プロテアーゼは、さらなるろ過、例えば、限外ろ過及び精密ろ過、抽出、脱色、クロマトグラフィ、脱臭、噴霧乾燥、蒸発、沈殿又は結晶化及び遠心分離を含むがこれらに限定されない従来の手順によって、回収してもよい。
【０１２０】
本発明の発酵ブロスの粒子状物質から目的タンパク質を精製する方法は、液体タンパク質製剤の調製に使用することができる。好ましくは、液体タンパク質製剤は、タンパク質濃縮物、好ましくは1つ以上の酵素安定剤を含む安定化酵素製剤である。別の実施形態では、液体タンパク質製剤は、洗剤製剤である。したがって、本発明の方法を使用して、洗剤製剤を調製することができる。好ましい実施形態では、目的タンパク質は、洗剤酵素であり、液体タンパク質製剤は、洗剤酵素、1つ以上の洗剤、1つ以上の酵素安定剤及び場合により1つ以上の他の洗剤酵素を含む洗剤製剤である。
【０１２１】
本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定することを意図したものではない以下の実施例においてさらに説明される。
【実施例】
【０１２２】
以下の実施例は、本発明を説明するためにのみ役立つ。当業者に明らかである多くの可能な変形も本発明の範囲内に入る。
【０１２３】
他に記載がない限り、以下の実験は、微生物の培養による化学物質の遺伝子工学及び発酵生産に使用される標準的な装置、方法、化学物質及び生化学物質を適用することによって実施された。Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)及びChmiel et al. (Bioprocesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)も参照のこと。
【０１２４】
[実施例１]
pI値を下回るpHを用いた洗浄
プロテアーゼ含有発酵ブロスを、変異R99E(DSM5483由来のアルカリプロテアーゼの番号付けを使用する)を含むDE102012215642A1の配列番号1に例えば記載されるバチルス・レンタス(Bacillus lentus)DSM 5483由来のアルカリプロテアーゼ酵素を生産するバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)を培養することによって得た。
【０１２５】
プロテアーゼを、遠心分離又は他の手段によるバイオマスの事前の除去なしに、1つのチャネルを有する管状モジュールを用いた精密ろ過膜及び4容量のダイアフィルトレーション洗浄溶液を用いて、1.3barの膜間差圧で、希釈されていない発酵ブロスのダイアフィルトレーションによって精製した。ダイアフィルトレーション洗浄溶液を、それぞれ、pH=6について10mM酢酸ナトリウム(NaOAc)で、pH=7.5について酢酸アンモニウム(NH4OAc)で緩衝化し、pHをpH6又はpH7.5のいずれかに調整し、洗浄溶液の導電率をNa2SO4で15mS/cmに調整した。異なる発酵ブロスのプロテアーゼ活性は、5％CV(変動係数又は相対標準偏差)の範囲内であった。
【０１２６】
【表１】
2018536418.tif 000002
【０１２７】
表1に示すデータから、精密ろ過中に、プロテアーゼのpI(pI＝pH8.3)を下回るpH、すなわちpH7.5を有するダイアフィルトレーション洗浄溶液を、導電率15mS/cmを有する正に荷電した化合物、例えばNa2SO4と組み合わせて使用する場合、精密ろ過保持液に対するプロテアーゼの損失は平均6.2％であることが導き出せる。ダイアフィルトレーション洗浄溶液のpHをpH6.0にさらに低下させると、精密ろ過保持液に対するプロテアーゼの損失は平均5％にさらに低下する。
【０１２８】
したがって、表1のデータは、ダイアフィルトレーション洗浄溶液のpHを目的タンパク質のpI(pIはここではpH8.3)を下回り低下させると、正に荷電した化合物(この場合は最大15mS/cmの導電率のNa2SO4)がダイアフィルトレーション洗浄溶液に含まれる場合、精密ろ過ステップにおけるプロテアーゼの損失は低下する(すなわち、精製プロセスにおける目的タンパク質の収率は増加する)ことを実証する。
【０１２９】
[実施例２]
pI値を上回るpHを用いた洗浄
この実施例では、プロテアーゼのpI値を上回るpHが、ダイアフィルトレーション洗浄溶液中で調整され、追加の正に荷電した化合物が添加されていない(洗浄溶液は10mM NaHCO3のみで緩衝化された)ことを除いて、実施例1と同じ設定が使用されている。異なる発酵ブロスのプロテアーゼ活性は、2％CV(変動係数又は相対標準偏差)の範囲内にあった。
【０１３０】
【表２】
2018536418.tif 000003
【０１３１】
表2に示すデータから、精密ろ過中に、プロテアーゼのpI(pH8.3)を上回るpH、すなわちpH8.5を有するダイアフィルトレーション洗浄溶液を使用する場合、精密ろ過保持液に対するプロテアーゼの損失は6.0％であることが導き出せる。pHをpH9にさらに増加させると、精密ろ過保持液に対するプロテアーゼの損失は、平均4.3％にさらに低下する。
【０１３２】
したがって、表2のデータは、プロテアーゼのpI(pH8.3)を上回ってダイアフィルトレーション洗浄溶液のpHを増加させると、精密ろ過ステップにおける目的タンパク質の損失が低下することを実証する。正に荷電した化合物の添加は必要ではない。
【０１３３】
[実施例３]
単純な希釈と比較した、洗浄の効果
プロテアーゼ含有発酵ブロスを、上に記載されたようにスブチリシンプロテアーゼを生産するバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)を培養することによって得た。
【０１３４】
プロテアーゼを、発酵ブロスの精密ろ過によって精製した。発酵ブロスを、精密ろ過前に洗浄溶液(10mM NaOAc、pH6で緩衝化し、Na2SO4で15mS/cmに導電率を調整した)で希釈するか、又は同量の同種の洗浄溶液で精密ろ過中に洗浄した。異なる発酵ブロスのプロテアーゼ活性は、3.6％CV(表3)及び1.1％CV(表4)の範囲内にあった。
【０１３５】
【表３】
2018536418.tif 000004
【０１３６】
【表４】
2018536418.tif 000005
【０１３７】
表3及び4に示されるデータから、プロテアーゼの可溶化及び/又は粒子状物質からのプロテアーゼの脱離を促進する洗浄溶液を用いた洗浄ステップを、同じタイプの溶液を用いた単純な希釈ステップの代わりに実施する場合、精密ろ過中のプロテアーゼの損失は、それぞれ、39.2％から24.7％(表3)及び28％から4.2％(表4)に低下することが導き出せる。
【０１３８】
したがって、表3及び4のデータは、目的タンパク質の可溶化及び/又は粒子状物質からのタンパク質の脱離を促進する溶液を用いた洗浄ステップが、洗浄溶液と同じ特性を有する希釈剤で発酵ブロスを希釈のみすることよりも優れていることを実証する。
【０１３９】
[実施例４]
脱離条件あり及びなしの洗浄
プロテアーゼ含有発酵ブロスを、実施例1に記載のように得た。
【０１４０】
プロテアーゼを、遠心分離によるバイオマスの事前の除去なしに、1つのチャネル及び3mmの内径を有する管状精密ろ過膜を用いて、希釈されていない発酵ブロスのダイアフィルトレーションによって精製した。精密ろ過中の洗浄は、水(pH7.5)を用いて、又は100mM NaClを有するpH7.5で10mM NaHCO3で緩衝化されたダイアフィルトレーション洗浄溶液を用いて行った。異なる発酵ブロスのプロテアーゼ活性は、10％CVの範囲内にあった。
【０１４１】
【表５】
2018536418.tif 000006
【０１４２】
表5に示されたデータから、水を用いた精密ろ過ステップ中の洗浄は、精密ろ過保持液に対する8％のプロテアーゼ損失をもたらすことが導き出せる。生理食塩水の使用は、精密ろ過保持液に対する3％という低減されたプロテアーゼ損失をもたらす。
【０１４３】
したがって、表5のデータは、精密ろ過中に、タンパク質のpI値(pIはここではpH8.3)を下回るpHを有する洗浄溶液を使用する場合、正に荷電した化合物の添加は、精密ろ過保持液に対するタンパク質損失の低下をもたらすことを実証する。
【０１４４】
同様の実験設定において、プロテアーゼを、遠心分離によるバイオマスの事前の除去なしに、1つのチャネル及び6mmの内径を有する管状精密ろ過膜で、希釈されていない発酵ブロスのダイアフィルトレーションによって精製した。精密ろ過中の洗浄は、1.3barの膜間差圧で、4容量のダイアフィルトレーション洗浄溶液を用いて行った。ダイアフィルトレーション洗浄溶液は、水、10mM NaHCO3、ギ酸ナトリウム(NaForm)若しくはNaOAcで緩衝化された溶液、又は限外ろ過透過液(約17mS/cmの導電率を有する)のいずれかであった。ダイアフィルトレーション洗浄溶液のpHを、表6に示すように調整した。異なる発酵ブロスのプロテアーゼ活性は、7.4％CVの範囲内にあった。
【０１４５】
【表６】
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【０１４６】
表6に示されたデータから、プロテアーゼのpI値(pH8.3)を下回るpHを有する水又は緩衝溶液を用いた精密ろ過ステップ中の洗浄は、精密ろ過保持液に対する約13％のプロテアーゼ損失をもたらすことが導き出せる。生理食塩水の使用は、精密ろ過保持液に対する約4.6％という低減されたプロテアーゼ損失をもたらす。pH9.0、すなわちプロテアーゼのpI値を上回るpH値を有する洗浄溶液の使用は、精密ろ過保持液に対する4.2％という低減されたプロテアーゼ損失をもたらす。規定された洗浄溶液の代わりに、同様の条件を有する限外ろ過透過液(UF透過液)も、精密ろ過保持液に対する3.8％という低減されたプロテアーゼ損失をもたらす。
【０１４７】
したがって、表6のデータは、精密ろ過中に、プロテアーゼのpI値(pH8.3)を下回るpHを有する洗浄溶液を使用する場合、正に荷電した化合物の添加は、精密ろ過保持液に対する目的タンパク質損失の低下をもたらすことを再度実証する。さらに、表6のデータは、タンパク質のpI値を上回るpHを有する洗浄溶液を使用することによって、同様の効果が達成され得ることを示す。この場合、正に荷電した化合物の添加は、この改善されたプロテアーゼ収率を達成するために必要ではない。さらに、示された要件、すなわち目的タンパク質のpI値を上回るpH値又は目的タンパク質のpI値を下回るpH値を満たすが5〜20mS/cmの導電率を有するプロセスストリーム（処理用液）もまた、洗浄溶液として使用することができる。
【０１４８】
[実施例５]
遠心分離沈殿物の洗浄
プロテアーゼ含有発酵ブロスを、実施例1に記載のように得た。
【０１４９】
プロテアーゼを、ビーカー遠心分離機における発酵ブロスの遠心分離によって精製した。1つの実験では、希釈されていない発酵ブロスを遠心分離し、遠心分離沈殿物を、pH6.0を有する10mM NaOAcで緩衝化され、洗浄溶液の最大15mS/cmの導電率まで正に荷電した化合物(Na2SO4)を含む洗浄溶液で洗浄した。別の実験では、発酵ブロスを、同体積のこの溶液で希釈し、続いて遠心分離した。遠心分離沈殿物は、洗浄溶液で洗浄しなかった。両方の場合において、遠心分離沈殿物に対するプロテアーゼ損失を決定した。異なる発酵ブロスのプロテアーゼ活性は、4.3％CVの範囲内にあった。
【０１５０】
【表７】
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【０１５１】
表7に示すデータから、適切な洗浄溶液(pIを下回るpH、及び正に荷電した化合物を含む)による遠心分離沈殿物の洗浄は、遠心分離沈殿物に対する7.8％のプロテアーゼ損失をもたらしたことが導き出せる。遠心分離沈殿物のその後の洗浄ステップなしに、単に洗浄溶液と同じ条件を有する同様の体積の希釈剤で発酵ブロスを希釈すると、遠心分離沈殿物に対する12.9％のプロテアーゼ損失が生じた。
【０１５２】
したがって、表6のデータは、バイオマスの分離前の発酵ブロスの、洗浄溶液による単純な希釈が、タンパク質の損失に関して、遠心分離沈殿物の洗浄ステップより劣ることを実証する。
【０１５３】
[実施例６]
様々な複合窒素源
プロテアーゼ含有発酵ブロスを、様々な複合窒素源を用いて、実施例1に記載されたようにスブチリシンプロテアーゼを生産するバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)を培養することによって得た。
【０１５４】
プロテアーゼを、遠心分離又は他の手段によるバイオマスの事前の除去なしに、1つのチャネルを有する3mm内径を有する管状精密ろ過膜及び4容量のダイアフィルトレーション洗浄溶液を用いて、1.3barの膜間差圧で、希釈されていない発酵ブロスのダイアフィルトレーションによって精製した。ダイアフィルトレーション洗浄溶液を、それぞれ酢酸アンモニウム(NH4OAc)で緩衝化し、pHをpH7.5に調整し、洗浄溶液の導電率をNa2SO4で15mS/cmに調整した。濃縮を行わず、4容量のダイアフィルトレーション洗浄溶液を適用した。異なる発酵ブロスのプロテアーゼ活性は、2.7％CVの範囲内にあった。
【０１５５】
【表８】
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【０１５６】
表8に示すデータから、発酵培地中の様々な複合窒素源、例えばグルテン、コーンスティープリカー又はジャガイモを用いて、pH7.5のpH値(すなわち、プロテアーゼのpI値を下回る)及び15mS/cmの導電率を有するダイアフィルトレーション洗浄溶液を用いる場合、保持液に対する低下したプロテアーゼ損失が達成されることが導き出せる。
【０１５７】
したがって、表8のデータは、発酵ブロスの構成とは無関係に、タンパク質のpI値を下回るpH値を有する洗浄溶液及び正に荷電した化合物を含む洗浄溶液を用いて洗浄ステップを行う場合、目的タンパク質の損失の低下を達成できることを実証する。
【０１５８】
[実施例７]
水による洗浄と、その後のpI値を上回るpH調整
プロテアーゼ含有発酵ブロスを、実施例1に記載されたようにスブチリシンプロテアーゼを生産するバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)を培養することによって得た。プロテアーゼを、ダイアフィルトレーションによって発酵ブロスから精製した。簡潔に述べると、発酵ブロスを精密ろ過に供し、そこでは、保持液を4容量の水で同時に洗浄した。第2の洗浄容量の後、保持液のpHをpH9に調整することによって、pHを脱離条件に調整した。続いて、保持液を2容量の水で洗浄した。
【０１５９】
表9のデータから分かるように、洗浄ステップ中に条件を脱離条件、すなわちタンパク質のpI値を上回るpH値へ調整することは、精密ろ過保持液に対する低いプロテアーゼ損失をもたらす。
【０１６０】
【表９】
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【０１６１】
[実施例８]
水による洗浄と、その後の導電率増加
プロテアーゼ含有発酵ブロスを、実施例1に記載されたようにスブチリシンプロテアーゼを生産するバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)を培養することによって得た。プロテアーゼを、ダイアフィルトレーションによって発酵ブロスから精製した。簡潔に述べると、発酵ブロスを精密ろ過に供し、そこでは、保持液を4容量の洗浄溶液で同時に洗浄し、ここで、洗浄溶液を、洗浄手順の間に、水から、タンパク質のpI値を下回るpH(pH7.5)及び10mS/cm Na2SO4の導電率を有する緩衝液に変更した。試験3及び4では、保持液のpHをpH7.5に調整し、導電率を第2の洗浄容量後に15mS/cmに変更した。続いて、保持液を表10に示すように2容量の洗浄溶液で洗浄した。
【０１６２】
表10のデータから分かるように、洗浄ステップ中に条件を脱離条件、この場合はタンパク質のpI値を下回るpH値へ調整すること及び正のカチオンを添加することは、精密ろ過保持液に対する低いプロテアーゼ損失をもたらす。
【０１６３】
【表１０】
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【国際調査報告】
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