(57)【要約】【構成】本発明はＲ、Ｒ１およびＲ２が水素、アリール基、縮合アリール基、ヘテロアリール基、飽和炭素環式基、部分飽和炭素環式基、飽和ヘテロ環式基、部分飽和ヘテロ環式基、Ｃ１−１０アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、ヘテロアリールアルキル基、ヘテロアリールアルケニル基、アルケニルアルキル基、アルキニルアルキル基、カルボシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、ニトロアルキル基、シアノアルキル基、アセトアミドアルキル基、およびアシルオキシアルキル基から選択される式Ｆの化合物を提供する。また、本発明はこの化合物の製造方法を提供する。2018503633.tif 000060【選択図】
2018503633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式で示される化合物であって、
2018503633.tif 000056
Ｒ、Ｒ１およびＲ２が水素、アリール基、縮合アリール基、ヘテロアリール基、飽和炭素環式基、部分飽和炭素環式基、飽和ヘテロ環式基、部分飽和ヘテロ環式基、Ｃ１−１０アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、ヘテロアリールアルキル基、ヘテロアリールアルケニル基、アルケニルアルキル基、アルキニルアルキル基、カルボシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、ニトロアルキル基、シアノアルキル基、アセトアミドアルキル基、およびアシルオキシアルキル基から選択されることを特徴とする化合物。
【請求項２】
式Ｉの一つかそれ以上の化合物の有効量を投与することを特徴とする子宮頸部癌の治療方法。
【請求項３】
請求項１に記載の式の一つかそれ以上の化合物の有効量を投与することを特徴とする肺癌の治療方法。
【請求項４】
請求項１に記載の式の一つかそれ以上の化合物の有効量を投与することを特徴とする乳癌の治療方法。
【請求項５】
請求項１に記載の式の一つかそれ以上の化合物の有効量を投与することを特徴とする脳癌の治療方法。
【請求項６】
請求項１に記載の式の一つかそれ以上の化合物の有効量を投与することを特徴とするメラノーマの治療方法。
【請求項７】
請求項１に記載の式の一つかそれ以上の化合物の有効量を投与することを特徴とする結腸癌の治療方法。
【請求項８】
請求項１に記載の式の一つかそれ以上の化合物の有効量を投与することを特徴とする頭頸部癌の治療方法。
【請求項９】
請求項１に記載の式の一つかそれ以上の化合物の有効量を投与することを特徴とする腫瘍転移の治療方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の式の一つかそれ以上の化合物、当該化合物の製薬上許容される塩および／または溶媒和物、および製薬上許容される基剤を有することを特徴とする製薬組成物。
【請求項１１】
Ｒ＝ＨまたはＲ＝Ｍｅの請求項１に記載の式の化合物を製造する方法であって、シアノアセトアミドまたはその合成上の等価物、およびトリエチルオルトホルメートまたはトリエチルオルトアセテートまたはその合成上の等価物、並びに好適な塩基および溶剤の存在中で、
次式ＩＩの化合物であって、
2018503633.tif 000057
Ｒ２が水素、アリール基、縮合アリール基、ヘテロアリール基、飽和炭素環式基、部分飽和炭素環式基、飽和ヘテロ環式基、部分飽和ヘテロ環式基、Ｃ１−１０アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、アリールアルケニル基、ヘテロアリールアルキル基、ヘテロアリールアルケニル基、カルボシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、ニトロアルキル基、シアノアルキル基、アセトアミドアルキル基、およびアシルオキシアルキル基から選択される化合物を次式ＩＩＩの化合物であって、
2018503633.tif 000058
Ｒ１が水素、アリール基、縮合アリール基、ヘテロアリール基、飽和炭素環式基、部分飽和炭素環式基、飽和ヘテロ環式基、部分飽和ヘテロ環式基、Ｃ１−１０アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、ヘテロアリールアルキル基、ヘテロアリールアルケニル基、カルボシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、ニトロアルキル基、シアノアルキル基、アセトアミドアルキル基、およびアシルオキシアルキル基から選択される化合物と反応させて、請求項１に記載の式の一つかそれ以上の化合物を生成する工程を有することを特徴とする製造方法。
【請求項１２】
Ｒ≠ＨおよびＲ≠Ｍｅの請求項１に記載の式の化合物の製造方法において、好適な塩基および溶剤の存在中において、次式の化合物であって、
2018503633.tif 000059
Ｒ１およびＲ２が水素、アリール基、縮合アリール基、ヘテロアリール基、飽和炭素環式基、部分飽和炭素環式基、飽和ヘテロ環式基、部分飽和ヘテロ環式基、Ｃ１−１０アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、ヘテロアリールアルキル基、ヘテロアリールアルケニル基、カルボシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、ニトロアルキル基、シアノアルキル基、アセトアミドアルキル基、およびアシルオキシアルキル基から選択される化合物を、Ｒがアリール基、縮合アリール基、ヘテロアリール基、飽和炭素環式基、部分飽和炭素環式基、飽和ヘテロ環式基、部分飽和ヘテロ環式基、Ｃ１−１０アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、ヘテロアリールアルキル基、ヘテロアリールアルケニル基、アルケニルアルキル基、アルキニルアルキル基、カルボシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、ニトロアルキル基、シアノアルキル基、アセトアミドアルキル基、およびアシルオキシアルキル基から選択されるカルボン酸エチル（ＲＣＯ２Ｅｔ）またはメチル（ＲＣＯ２Ｍｅ）エステルと反応させて、請求項１に記載の式の一つかそれ以上の化合物を生成する工程を有することを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年１１月１６日に出願された特許出願Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．１３/６７８，９８７の一部継続出願である。
本発明は抗癌剤としての合成リジジン類似体（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒｉｇｉｄｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ）、合成リジジン類似体の塩、溶媒和物（ｓｏｌｖａｔｅｓ）およびプロドラッグ、並びに成リジジン類似体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、米国の第２の死亡原因である。癌は、抑制の効かない異常細胞成長及び増殖を特徴とする１００以上の疾病のクラスである。抗癌剤は、数ある癌撲滅手段のうちの一つである。抗癌剤は、癌闘病のために単独で使用してもよく、他の治療方法と併用することもできる。癌発症率は、平均寿命が延びているため、将来も高くなると考えられ、従って新規な抗癌剤の開発は、創薬業界のトッププライオリティである。１９８１年〜２００６年の間に開発された新規な抗癌剤のうち完全合成のものは、約２０％に過ぎず、従って新規な天然化合物は、現在治療に使用されている抗癌剤以上に効力があり、より選択的な抗癌剤を創薬する卓越した創薬源になっている。
抗癌剤源としての植物由来天然物
【０００３】
植物は癌治療物として長い歴史をもち、その起源はコスのヒポクラテスが子宮癌の治療にｄａｆｆｏｄｉｌ  Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｏｅｔｉｃｕｓ  Ｌ．から得たオイルを使用した紀元前４世紀に遡る。幾種類かの植物由来化合物は、治療に使用されている最も優れた抗がん剤に属する。例示すると、ビンカアルカロイド類（ｖｉｎｃａ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）（図１）およびビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、並びにタクサネスタクソール（ｔａｘａｎｅｓ  ｔａｘｏｌ：図１）およびこれの半合成類似体ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）がある。ビンカアルカロイド類は、臨床使用まで進んだ最初の植物由来の抗癌剤であり、１９５０年代に始めて日日草（Ｍａｄａｇａｓｃａｒ  ｐｅｒｉｗｉｎｋｌｅ）から単離されている。
【０００４】
他の多くの植物由来化合物もより効力があり、毒性のより低い抗癌剤発見の先導役として使用されている。例示すると、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）（図２）、即ち植物ポドフィルムから単離された抗有糸分裂剤、およびカンプトテシン（図２）、即ち伝統的な漢方薬に広く使用されている樹木であるカンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ）から単離されたトポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）阻害剤がある。ポドフィロトキシンおよびカンプトテシン自体は毒性が酷く、水溶性が悪いためいずれも臨床試験に合格しなかったが、臨床に使用されているいくつかの抗癌薬の開発において先導的な薬剤になっている。例を挙げると、ポドフィロトキシンテニポシド、エトポシド（図２）およびエトポシドホスフェートの三種類の半合成誘導体があり、またカンプトテシ類似体のトポテカン（図２）およびイリノテカンがあり、いずれも現在各種の癌の治療に臨床使用されている。
抗癌剤源としての海洋由来天然物
【０００５】
植物由来抗癌剤に加えて、新規な抗がん剤の、比較的新しい発見源として海洋天然化合物が（ｍａｒｉｎｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）ある。例を挙げると、水性菌類、シアノバクテリア、海綿および被嚢類から単離された天然物がある。シアノバクテリアは、ほぼ３００種の新規アルカロイド類を生成する新規な生理活性剤の豊かなソースであり、これらアルカロイド類は捕食動物を追い払う毒素として生成されることが多い。シアノバクテリアから誘導される海洋アルカロイド類は既に特徴がかなり明らかになっており、各種の癌細胞株に対して各種の作用機序を示すアルカロイド類である。これら癌細胞株の作用機序についていくつか実例を挙げると、Ｇ１における細胞周期停止、アクチンまたはチューブリンの分子標的化、およびヒストン脱アセチル化阻害（ＨＤＡＣ）がある。一般的に、真菌類は潜在的に有望な抗癌作用を示す広範にわたる二次代謝生成物を産生するが、これらアルカロイド類の多くの作用機序（ＭＯＡ）については、十分に理解されていない。
【０００６】
海綿（ｍａｒｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｅｓ）および被嚢類（ｔｕｎｉｃａｔｅｓ）については、現在までに最も興味深く、また有用な海洋由来アルカロイド類のうち幾種類かを産生することが証明されている。確認された化合物の多くは、臨床試験レベルに達し、ＭＯＡの定義についてもきわめて十分に確立されている。これらＭＯＡの多くは、植物由来天然物であるタキソールおよびカンプトテシンと同様である。例を挙げると、抗チューブリン活性の強いヘミステアリンおよびその合成類似体Ｅ７９７４、およびトポイソメラーゼＩＩ（ＴＯＰ  ＩＩ）を阻害するｍａｋａｌｕｖａｍｉｎｅ類（マカルバミン類）がある。被嚢類については、かなり以前から癌治療の主要な化合物源として知られている。なかでも、ラメラリン類および関連するピロール誘導アルカロイド類は、傑出した海洋由来アルカロイド群であり、いずれも細胞毒性などの生物学的活性、多剤耐性の逆転（ＭＤＲ）、ＨＩＶ−１インテグラーゼ阻害、抗生物質活性、ヒトアルドース還元酵素阻害、免疫調節、耐酸化剤活性などに将来性がある。海洋由来ピロール誘導アルカロイド類は、その魅力的な新規構造、複雑な生物学的特性、および天然源から多量に得る難しさに照らして、有機化学者や医薬品化学者から大きな注目を浴びている。現在、幾種類かの海洋天然物が臨床実験レベルにあり、一つの薬剤、トラベクテジンが欧州において最初の海洋由来抗癌剤として最近承認された。
潜在的に新規な抗がん剤としてのリジジン
【０００７】
海洋由来天然物は精力的に調査されているが、これ以外にも十分に調査されていないきわめて多数の有効な医薬剤が存在する。これらの内には、沖縄やニューギニア付近で発見された被嚢類Ｅｕｄｉｓｔｏｍａ  ｃｆ．ｒｉｇｉｄａから単離された海洋アルカロイド類リジジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（図３）およびＥがある。これらのリジジンは、天然源から利用できる機会が少ないため、調査の行き届いていない天然物ではあるが、いくつかの興味のある生物学的特性を備えている。報告によれば、これらリジジンは癌細胞株に対して細胞毒性を示し、一方リジジンＡについては、カルモジュリン拮抗活性を備えていることが判明している。
【０００８】
リジジンはピロール[２，３−ｄ]ピリミジン環系を取り込み、この環系はＰＭＳ（ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）と考えられる。ＰＭＳは分子骨格であり、これら骨格は表面的には多種多様なターゲットの配位子として作用できる。ピロール[２，３−ｄ]ピリミジン環系はプリン骨格と類似なもので、リジジン類に加えて、ヌクレオシド抗癌抗生物質であるツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、トヨカマイシン（ｔｏｙｏｃａｍｙｃｉｎ）、サンギバマイシン（ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ）などのいくつかの他の天然物における共通なモチーフでもある。このように、リジジン類は複数の生物学的活性に対する潜在的可能性が高い海洋アルカロイド類のいまだ利用されざるクラスである。
【０００９】
以前、本発明者は、海洋アルカロイド類リジジン類の効率のよい合成につながる３成分化学反応を発見した（図４）。これら天然物に関しては、増殖抑制活性が弱く、またカルモジュリン拮抗活性も弱いという報告があるが、単離量が不十分な上効率のよい化学合成法がないため、生物学的特性についてはほとんど研究がなされていない。本発明者は効率のよい合成法を開発し、これによって生物学的研究のために十分な量を調製できるようになった。
【００１０】
これらの合成したアルカロイド類を幾種類かの癌細胞株に対して評価したところ、増殖抑制活性が非常に弱く（＞１００マイクロモルＩＣ５０値）であることが判明した。この結果、上記の合成方法を新規な４成分反応に変更すると、以前には知られていなかったヒポキサンチン様骨格をもつリジジン類似体を調製できることを発見した（図５に示した３つの代表的な考えられる化合物を参照）。
【００１１】
さらに、これら化合物を幾種類かの癌細胞株に対して評価したところ、きわめて低い濃度で顕著な、予期しないほど強い増殖抑制作用があることが判明した。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、海洋アルカロイド類リジジンの新規なヒポキサンチン様類似体に関する。
【００１３】
即ち、本発明の一態様は、式Ｉの化合物を包含する。
2018503633.tif 000003
式Ｉにおいて、Ｒ１およびＲ２は水素、アリール基、縮合アリール基（ｆｕｓｅｄ  ａｒｙｌ）、ヘテロアリール基、飽和炭素環式基、部分飽和炭素環式基、飽和ヘテロ環式基、部分飽和ヘテロ環式基、Ｃアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、ヘテロアリールアルキル基、ヘテロアリールアルケニル基、カルボシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、ニトロアルキル基、シアノアルキル基、アセトアミドアルキル基、およびアシルオキシアルキル基から選択する。
【００１４】
各アルキル基、各アリール基、各シクロアルキル基または各ヘテロアリール基において、一つかそれ以上の利用できる水素は適宜フッ素によって置換でき、得られる化合物、あるいはこの化合物の製薬上許容できる塩、溶媒和物あるいはプロドラッグも本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
本発明の別の態様では、式Ｉの化合物は（アイソトープトレーサーまたはマーカーとしても知られている）アイソトープラベルを有する。従って、本発明は、一つかそれ以上の原子が２Ｈ、  ３Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１２３Ｉ、１８Ｆなどのアイソトープラベルで置換された式Ｉの化合物をも包含する。
【００１６】
本発明の別の態様では、本発明は、上記の式Ｉの一つかそれ以上の化合物、および／またはこの化合物の製薬上許容できる塩、溶媒和物および／またはプロドラッグ、および製薬上許容できる特にナノ粒子、リポソーム、マイクロバブル、ハイドロコロイドビーズなどの基剤（ｃａｒｒｉｅｒ）を有する製薬組成物を包含する。
【００１７】
本発明の別の態様では、本発明は、癌治療のために式Ｉの一つかそれ以上の化合物、および／またはこの化合物の製薬上許容できる塩、溶媒和物および／またはプロドラッグ、および製薬上許容できる基剤を有する製薬組成物を包含する。
【００１８】
本発明の更なる態様では、本発明は、上記の式Ｉの一つかそれ以上の化合物、および／またはこの化合物の製薬上許容できる塩、溶媒和物および／またはプロドラッグの有効量を必要とする対象者に投与する癌治療方法を包含する。
【００１９】
本発明の更なる態様では、本発明は、シアノアセトアミドまたはその合成等価物、およびトリエチルオルトホルメートまたはその合成等価物、並びに好適な塩基および溶剤を使用する条件で、即ちこれらの存在下で式ＩＩの化合物（式中Ｒ２は水素、アリール基、縮合アリール基、ヘテロアリール基、飽和炭素環式基、部分飽和炭素環式基、飽和ヘテロ環式基、部分飽和ヘテロ環式基、Ｃアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、ヘテロアリールアルキル基、ヘテロアリールアルケニル基、カルボシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、ニトロアルキル基、シアノアルキル基、アセトアミドアルキル基、およびアシルオキシアルキル基から選択される）を、
2018503633.tif 000004
式ＩＩＩの化合物（式中Ｒ１は水素、アリール基、縮合アリール基、ヘテロアリール基、飽和炭素環式基、部分飽和炭素環式基、飽和ヘテロ環式基、部分飽和ヘテロ環式基、Ｃアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、ヘテロアリールアルキル基、ヘテロアリールアルケニル基、カルボシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、カルボキシアルキル基、ニトロアルキル基、シアノアルキル基、アセトアミドアルキル基、およびアシルオキシアルキル基から選択する）と反応させて、
2018503633.tif 000005
式Ｉの化合物を生成する式Ｉの化合物の製造方法を包含する。
2018503633.tif 000006
好適な溶剤の実例は、なかんずく、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトニトリル、ＤＭＦであり、好ましい塩基の実例は、なかんずく、Ｋ２ＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｃｓ２ＣＯ３、ＤＢＵ、ＮａＯＨ、ＫＯＨである。
【００２０】
本発明の他の特徴および作用効果については、以下の詳細な説明から明らかになるはずである。なお、詳細な説明および本発明の具体的な実施態様を示す具体的な実施例は、例示のみを目的としている。この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内での各種変更および一部修正は当業者にとって自明なはずである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
以下添付図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
【図１】パクリタキセルおよびビンブラスチンの構造を示す図である。
【図２】植物由来抗癌剤およびこれらの臨床に使用される誘導体を示す図である。
【図３】リジジンＡ、Ｂ、ＣおよびＤの構造を示す図である。
【図４】天然リジジン合成に至る、以前発見された合成経路を示す図である。
【図５】ヒポキサンチン様リジジン類似体の合成に至る本発明の４成分反応の例示的な実施態様を示す図である。
【図６】Ｒｉｇ８で２４時間治療したヒーラ細胞を使用した細胞周期分析を示すグラフであり、エラーバーは三重実験間の標準偏差を示す。
【図７】ＲＩＧ８におけるアポトーシス誘導を示す図である。
【図８】リジジンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの構造、並びに７−デアザヒポキサンチン（Ａ）および新規なＣ２−置換  ７−デアザヒポキサンチン（Ｂ）に基づくこれらの合成類似体の構造を示す図である。
【図９】０．３μＭのＭＴＴ熱量評価関連Ｇｌ５０値における細胞死を示すＵ３７３神経膠芽腫およびＳＫＭＥＬメラノーマ細胞に対する２２の細胞イメージングを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明で使用するほとんどの用語は当業者にとって理解が容易な用語であると考えられるが、用語“溶媒和物”、“プロドラッグ”および“癌（がん）”についてここでさらに定義したい。本発明で使用する用語“溶媒和物”は本発明の化合物、あるいはこの化合物の製薬上許容できる塩を意味し、好適な溶剤の分子が結晶格子に取り込まれていることを意味する。本発明の化合物にはプロドラッグも含まれるが、これは一般的に、本発明の化合物の機能的誘導体であって、これら誘導体が生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で、概念上の誘導先化合物に容易に転換し得ることを意味する。本発明化合物のプロドラッグは、ヒドロキシアルキル基やアミノ基が利用できる通常のエステル類である。最後に、用語“癌”は細胞の制御の効かない分裂および細胞の他の組織に浸潤できる能力によって特徴付けられる疾病や障害のクラスを意味する。
【実施例】
【００２３】
以下の非限定的な実施例によって本発明を説明する。
【００２４】
式Ｉの化合物（１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オンの一般的な調製方法：
２．５ｍｌのＥｔＯＨと２．５ｍｌのＲＣ（ＯＥｔ）３（Ｒ＝ＨまたはＣＨ３）との混合物中Ｎ−（２−オキソ−２−置換）メタンスルホンアミド（０．６７６ｍｍｏｌ）、選択された、または適切なアルデヒド（０．８７９ｍｍｏｌ）およびシアノアセトアミド（０．０７２ｇ、０．８７９ｍｍｏｌ）の溶液に、粒子状の無水Ｋ２ＣＯ３（０．０５２ｇ、０．３７２ｍｍｏｌ）を一度に添加した。混合物を窒素で５分間パージし（ｐｕｒｇｅ）、窒素雰囲気下２４時間還流処理した。ピロールの生成はＴＬＣによって制御した。その後、反応温度を１５０℃まで高くし、反応混合物を１０時間再加熱し、同時にエタノールを蒸発させた。次に、混合物を室温に冷却し、生成した沈殿物をろ過によって回収し、フィルターを使用してＥｔＯＨ（２ｍＬ）およびジエチルエーテルで洗浄した。母液を蒸発させ、残留物をＭｅＯＨ/ＣＨ２Ｃｌ２＝１/４０〜１/２０勾配でカラムクロマトグラフィー処理した。
【００２５】
実施例１：６−ベンゾイル−５−（３，５−ジブロモフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ８）：
2018503633.tif 000007
【００２６】
実施例２：６−ベンゾイル−５−（５−ブロモピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ９）：
2018503633.tif 000008
【００２７】
実施例３：５−（３，５−ジブロモフェニル）−６−（４−メトキシベンゾイル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ１０）：
2018503633.tif 000009
【００２８】
実施例４：６−（４−（ベンジルオキシ）ベンゾイル）−５−（３，５−ジブロモフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ１１）：
2018503633.tif 000010
【００２９】
実施例５：５−（３，５−ジブロモフェニル）−６−（４−フルオロベンゾイル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ１３）：
2018503633.tif 000011
【００３０】
実施例６：６−（４−ブロモベンゾイル）−５−（３，５−ジブロモフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ１４）：
2018503633.tif 000012
【００３１】
実施例７：６−（４−メトキシベンゾイル）−５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ１９）：
2018503633.tif 000013
【００３２】
実施例８：６−ベンゾイル−５−（６−ブロモピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ３０）：
2018503633.tif 000014
2018503633.tif 000015
【００３３】
実施例９：６−ベンゾイル−５−（６−ヨード−４，５−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ３１）：
2018503633.tif 000016
【００３４】
実施例１０：６−ベンゾイル−５−（３−ブロモ−４，５−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ３２）：
2018503633.tif 000017
【００３５】
実施例１１：６−ベンゾイル−５−（３−ブロモフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ３３）：
2018503633.tif 000018
2018503633.tif 000019
【００３６】
実施例１２：６−ベンゾイル−５−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ３４）：
2018503633.tif 000020
【００３７】
実施例１３：６−ベンゾイル−５−フェニル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ３５）：
2018503633.tif 000021
【００３８】
実施例１４：６−ベンゾイル−５（３−ヨードフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ３６）：
2018503633.tif 000022
【００３９】
実施例１５：６−ベンゾイル−５−（２，６−ジクロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ４０）：
2018503633.tif 000023
【００４０】
実施例１６：６−ベンゾイル−５−（ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ４１）：
2018503633.tif 000024
2018503633.tif 000025
【００４１】
実施例１７：６−ベンゾイル−５−（３−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ４２）：
2018503633.tif 000026
【００４２】
実施例１８：３−（６−ベンゾイル−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−５−イル）ベンゾニトリル（Ｒｉｇ４３）：
2018503633.tif 000027
【００４３】
実施例１９：６−（４−ヒドロキシベンゾイル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（Ｒｉｇ４５）：
2018503633.tif 000028
抗癌活性
【００４４】
（ａ）細胞培養
１０％のＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｍｇ/ＬのペニシリンＧ、１００ｍｇ/Ｌのストレプトマイシン、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１．５ｇ/Ｌの重炭酸ナトリウムおよび４．５ｇ/Ｌのグルコース（これらはいずれもＳｉｇｍａ製）を補給したＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でヒトＴ−細胞白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２、Ｅ６−１クローン）を培養した。また、１０％のＦＢＳ、１００ｍｇ/ＬのペニシリンＧ、および１００ｍｇ/Ｌのストレプトマイシンを補給したＤＭＥＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でヒト子宮頸部癌細胞株ヒーラ（ＨｅＬａ）（ＡＴＣＣ  Ｓ３）を培養し、そして１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１％のＧｌｕｔａＭａｘＴＭ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ/ｍＬのペニシリン、１００μｇ/ｍＬ  のストレプトマイシンおよび１０％のＦＢＳを補給したＤＭＥＭ中でＭＣＦ−７（ヒト乳癌）細胞を培養した。１０％のＦＢＳ、１００ｍｇ/ＬのペニシリンＧおよび１００ｍｇ/Ｌのストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ−１６４０培地でヒト子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡおよびＭＥＳ−ＳＡ/Ｄｘ５細胞を培養した。すべての細胞を５％のＣＯ２で加湿した雰囲気中３７℃でインキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。他の細胞株についても上記と同様に維持した。
【００４５】
（ｂ）ＭＴＴアッセイ
式Ｉの化合物の増殖抑制特性を評価するために、ＭＴＴアッセイを使用してミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を測定した。細胞株については、４×１０細胞/ウェルをトリプシン処理し、マイクロプレートに播種することによって調製した。処理前に、すべての化合物を１００ｍＭか、あるいは２５ｍＭの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中において再構成した。細胞を処理前に０．００４〜１００μＭの範囲にある濃度で２４時間成長させ、２００μＬ培地中で４８時間インキュベートした。血清を含まない培地（５ｍｇ/ｍＬ）中２０μＬのＭＴＴ試薬を各ウェルに添加し、さらに２時間インキュベートした。培地を除去し、生成したホロマザン結晶を１００μＬのＤＭＳＯに再溶解し、４９０ｎｍの波長でＴｈｅｒｍｏｍａｘ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅプレートリーダーを使用して光学密度（ＯＤ）を測定した。実験については、４通り行い、各化合物について細胞株ごとに少なくとも実験を２回繰り返した。０．１％のＤＭＳＯで処理した細胞をネガティブコントロールとして使用し、酸化フェニルヒ素（ＰＡＯ）をポジティブキリングコントロール（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。
【００４６】
（ｃ）細胞周期評価
細胞周期に対する類似体の作用を評価するため、細胞周期分析を行った。７０〜８０％のコンフルエントなヒーラ細胞をトリプシン処理し、２×１０５細胞/ウェルの初期密度で、１０％のＦＢＳ、１００ｍｇ/ＬのペニシリンＧおよび１００ｍｇ/Ｌのストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ中において６つのウェルプレートに播種した。細胞を一夜接着させてから、０．１〜１０μＭの範囲の濃度において式Ｉの化合物で処理した。２４時間後、ＤＭＥＭで細胞を三回洗浄し、トリプシン処理し、ペレット化し、１０μＭ（２μＬ/ｍＬ）のｖｙｂｒａｎｔオレンジ色素を含有する培地の２００μＬに再懸濁した。標識化用溶液中のサンプルをファルコンチューブに移し、ウォーターバス中３７℃で３０分間インキュベートした。次に、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアで走るＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣｓｃａｎフローサイトメーターを使用してサンプルを分析した。付録Ｂに記載されているパラメーターを使用する４８８ｎｍのレーザーを使用し、１０，０００イベントを集め、分析した。０．１％のＤＭＳＯで処理した細胞をネガティブコントロールとして使用し、コルヒチンで処理した細胞をポジティブコントロールとして使用した。
【００４７】
（ｄ）アポトーシス評価
２４のウェルプレート中で２×１０のＪｕｒｋａｔ細胞/ｍＬをプレート培養し、必要な化合物で処理し、必要な時間数の間インキュベートした。細胞を４００Ｇで１分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、ＨＨＢ（ＨＨＢ１ｍＬにつき３μＬのＣａＣｌ２（１．５Ｍ）、ＨＨＢ１ｍＬについて２μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）のヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）およびＨＨＢ１ｍＬについて２０μＬのＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）中のＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウム溶液のサンプル１００ｍＬに細胞を再懸濁した。標識化溶液中のサンプルをファルコンチューブに移し、３７℃において２０分間ウォーターバス中でインキュベートした。次に、次に、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアで走るＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣｓｃａｎフローサイトメーターを使用してサンプルを分析した。結果については、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣ陽性アポトーシス細胞の％として表にまとめた。
【００４８】
（ｅ）結果
ＭＴＴアッセイ：増殖抑制活性
式Ｉの合成化合物の、ヒトヒーラ子宮頚部癌およびＭＣＦ−７乳腺癌を始めとする癌細胞株パネルに対する増殖抑制活性を評価した。これら類似体の多くは臨床的に使用されている抗がん剤のナノモル効力（ｎａｎｏｍｏｌａｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ）、特徴を示した。その結果を表１に示す。さらに、選択した化合物は結腸癌細胞株、頭頸部癌細胞株だけでなく腫瘍転移から誘導した細胞に対しても同様なレベルの活性を示した（表１Ａ）。
【００４９】
[表１]
2018503633.tif 000029
ａ：表に示した化合物を使用した治療４８時間後に、２つの独立した実験からのＤＭＳＯコントロール±ＳＤに対する癌細胞の生存率が５０％低減するために必要な濃度。なお、各実験は８通り行い、ＭＴＴアッセイによって評価を行った。
[表１Ａ]
2018503633.tif 000030
ａ：ＭＴＴアッセイによって評価したように表に示した化合物を使用した治療４８時間後に、ＤＭＳＯコントロールに対する癌細胞の生存率が５０％低減するために必要な濃度。なお、ＭＴＴアッセイによって評価を行い、ｂＮＤは評価を行わなかったことを示す。
【００５０】
重要なことは、グリオーマ、メラノーマ、非小細胞肺癌やその他の多くの癌は、暗い予後（ｄｉｓｍａｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｅｓ）に関係があることが知られていることである。即ち、グリオーマおよびメラノーマの発症数が増加しているが、これはここ数年間の改良治療選択肢に対応していない。従って、現在の治療法に対する反応が鈍い癌を撲滅するために必要な新タイプの薬剤に対する切迫性が増している。このため、最も効力のある化合物Ｒｉｇ８、Ｒｉｇ９およびＲｉｇ３５を使用して、ヒトＵ３７３膠芽腫（ＧＢＭ、星状膠細胞腫）細胞株、ヒトＨｓ６８３退形成乏突起神経膠腫、ヒトＡ５４９非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株、ヒトＳＫＭＥＬ−２８およびマウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞株に対して試験を行った。結果を表２に示す。即ち、式１の化合物が予後の暗い癌を表す細胞株に対して強い活性を示すことを発見したが、この発見は将来きわめて有望である。
【００５１】
[表２]
表２：式Ｉの最も効力のある化合物の、予後の暗い癌を表す癌細胞株に対する増殖抑制性
2018503633.tif 000031
ａ：表に示した化合物を使用した治療４８時間後に、２つの独立した実験からのＤＭＳＯコントロール±ＳＤに対する癌細胞の生存率が５０％低減するために必要な濃度。なお、各実験は８通り行い、ＭＴＴアッセイによって評価を行った。
【００５２】
タキソールやビンブラスチンなどの薬剤は腫瘍治療の初期時にはよく効く薬剤であるが、再発がある時には、腫瘍がｐ−ｇｐの過剰発現のためにこれら薬剤に反応しないことが多い。このような腫瘍の細胞は、多剤耐性（ＭＤＲ）と呼ばれている。そこで、ＭＤＲ癌細胞株における増殖抑制活性について式Ｉの化合物を評価した。即ち、ｐ−ｇｐを過剰発現する子宮肉腫細胞ＭＥＳ−ＳＡ/Ｄｘ５を使用して評価を行った。コントロールとして親薬剤（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｄｒｕｇ）に反応するＭＥＳ−ＳＡ細胞株を使用した。
【００５３】
Ｒｉｇ８およびＲｉｇ３５のデータ並びにコントロールのタキソールおよびビンブラスチンのデータを表３に示す。表３から理解できるように、Ｒｉｇ８およびＲｉｇ３５を使用した親細胞株およびＭＤＲ細胞株の感度変化はごく小さいが、タキソールおよびビンブラスチンは親ＭＥＳ−ＳＡ子宮肉腫細胞と比較した場合、ＭＤＲ細胞に対して効力は約１０００倍低い。これら結果は、式Ｉの化合物はｐ−ｇｐの作用に対して感受性を示さず、潜在的にかなりの臨床上の可能性をもつことを示唆するものである。
【００５４】
[表３]
表３：式Ｉの選択された化合物のＭＤＲ細胞に対する増殖抑制効果
2018503633.tif 000032
【００５５】
細胞周期アッセイ
式Ｉの化合物のさらに抗癌性を評価するために、細胞浸透性ＤＮＡ結合色素Ｖｙｂｒａｎｔ  Ｏｒａｎｇｅを使用して、細胞周期分析を行った。正常な集団では、細胞は細胞周期の３つの主要相の間に分布している。即ち、細胞一つにつき一組の対になった染色体（２ｎ）が存在するＧ０/Ｇ１相、ＤＮＡが分裂準備として合成されたＳ相即ち合成相（この相の期間存在するＤＮＡ量は可変量である）、そして各細胞の染色体が複製（４ｎ）している状態のＧ２/Ｍ相である。このＤＮＡ含有量は、細胞一つにつきＤＮＡ質量に比例する信号を発信するＶｙｂｒａｎｔ  Ｏｒａｎｇｅなどの蛍光ＤＮＡ選択性プローブを使用して測定できる。この色素は、生体細胞内で二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）と相互作用し、結合すると、蛍光体になり、従って細胞が細胞周期の各相を進んでいる間、フローサイトメトリーを使用してＤＮＡ含有量を追跡できる。細胞周期分析については、それぞれＧｌ５０より高い濃度および低い濃度においてＲｉｇ８を使用してヒーラ細胞で行った。コルヒチンは抗有糸分裂薬として知られているため、これをポジティブコントロールとして使用し、ネガティブコントロールとしては０．１％のＤＭＳＯで処理したヒーラ細胞を使用した。図６に、ヒーラ細胞にＲｉｇ８を使用して行った分析の結果を示す。
【００５６】
図６および表４から理解できるように、Ｒｉｇ８によってヒーラ細胞株を使用したＧ２/Ｍ相に投与量依存性細胞周期停止が発現した。
【００５７】
[表４]
表４：ヒーラ細胞を使用したＲｉｇ８のフローサイトメトリー細胞周期分析
2018503633.tif 000033
ａ：２回の独立した実験において表に示した化合物でヒーラ細胞を治療した２４時間後の相対的なＤＮＡ含有量±ＳＤ（％）。なお、各実験は３通り行った。
【００５８】
アポトーシスアッセイ
現在使用されている多くの化学療法剤の抗癌剤効力は、癌細胞にアポトーシスを誘導する能力と強い相関関係があるとの報告があり、従って新規な抗癌剤先導役の主要なスクリーンの多くは、増殖抑制活性をもつ化合物の確認ではなく、むしろアポトーシス誘導性に基づいている。そこで、式Ｉの化合物のフローサイトメトリーＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ/ヨウ化プロピジウムアッセイにおいてＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘導する能力について試験を行った。異なる濃度でＲｉｇ８によって治療した４８時間後のアポトーシス性の細胞のパーセンテージを図７に示す。
【００５９】
既に詳細に述べたように、海洋性アルカロイドリジジンの新規な類似体について、ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン環系を構成するために開発した新規な合成方法を利用して調製した。この合成化合物は膠芽腫、メラノーマや非小細胞肺癌などの薬剤耐性細胞に対してマイクロモル以下（ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）からナノモルの増殖抑制力を示すものであった。上記化合物には、位置Ｃ２が未置換状態の化合物が含まれる（Ａ、図８）。そこで、一連のＣ２−置換−デアザヒポキサンチン類（Ｂ、図８）を調製し、これら化合物の抗癌作用について評価することにした。さらに、このような化合物も多数の癌細胞株に対して効力のある増殖抑制活性をもつことを発見した。
【００６０】
結果
（ａ）Ｃ２−置換−７−デアザヒポキサンチン類の合成およびＳＡＲ
Ｃ２−置換  ７−デアザヒポキサンチン類Ｂの合成への道を開発するため、以前発見された、スルホンアミドアセトフェノン類とアルデヒド類およびシアノアセトアミドとの多成分反応（ＭＣＲ）を利用してピロール１（表５）を調製した。次に、触媒として関連するプリン系について報告があるエタノール中のナトリウムエトキシドを使用する、１と各種の芳香族エステルおよび脂肪族エステルとの反応によってピリミジン環の閉環を行った。目的の７−デアザヒポキサンチン２−１７を得た。なお、その収率は、ほとんどの場合、反応混合物の酸性化後に生成物が析出し、さらに精製する必要がないため、異なるが、いずれも許容範囲である（表５）。
【００６１】
[表５]
表５：Ｃ２−置換−７−デアザヒポキサンチン２−１７の合成および増殖抑制活性
2018503633.tif 000034
2018503633.tif 000035
2018503633.tif 000036
ａ：表に示した化合物を使用した治療４８時間後に、２つの独立した実験からのＤＭＳＯコントロール±ＳＤに対する細胞の生存率が５０％低減するために必要な濃度。なお、各実験は４通り行い、ＭＴＴアッセイによって評価を行った。
ｂ：ｒｅｆ．１３記載の方法で合成。
ｃ：１とＣＯ（ＯＥｔ）２との反応の副生物として得られる。
【００６２】
ヒト子宮頸部腺癌のモデルとしてヒーラ細胞株を使用し、かつ乳腺癌のモデルとしてＭＣＦ−７細胞を使用して、得られた化合物の増殖抑制活性を評価した。各化合物で４８時間細胞を処理し、ＭＴＴ法を使用して細胞生存率を評価した（表５）。結果から、Ｃ２にカルボニル基を含有するリジジン−関連  ７−デアザキサンチン  ２と比較した場合、Ｃ２−置換  ７−デアザヒポキサンチン類の多くが増殖抑制活性を示すことが判明した。この増殖抑制活性は、Ｃ２−アリール（５、６）、Ｃ２−ＯＥｔ（８）および分枝Ｃ２−アルキル（９）については一桁のマイクロモルの二倍であることがわかった。また、線状Ｃ２−アルキル誘導体１０−１２の効力はマイクロモル以下であり、Ｃ２−メチル並びにＣ２−ペンチニル化合物１３および１７はナノモルであった。
【００６３】
（ｂ）Ｃ２−メチル−７−デアザヒポキサンチン類のＭＣＲ系合成およびＳＡＲ
Ｃ２−メチル類似体１３が強い作用を示したため、さらに各種のアルデヒド誘導Ｃ７芳香族基を変更してＣ２−メチル化合物について検討を行った。これら化合物の合成を容易にするために、各種のアルデヒドを使用してメチルスルホンアミドアセトフェノン、シアノアセトアミドおよびトリエチルオルトアセテートの新規な４成分シクロコンデンセーション（ｃｙｃｌｏｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）反応を開発した（表６）。この反応では、ピロロ[２、３−ｄ]ピリジンの全骨格を一つの工程で構築するが、これが成功するかどうかは最適化された温度レジームに依存するものであった。即ち、最初に反応を９０℃に維持して、（表５の１と同様な）中間アミノピロール類を不純物なしに形成し、次に１５０℃に維持して、第４成分のオルトアセテートを反応プロセスに投入し、分子のピリミジン部分を閉環した。
【００６４】
[表６]
表６：Ｃ２−メチル−７−デアザヒポキサンチン１３および１８−２３のＭＣＲ系合成および増殖抑制活性
2018503633.tif 000037
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ａ：表に示した化合物を使用した治療４８時間後に、２つの独立した実験からのＤＭＳＯコントロール±ＳＤに対する細胞の生存率が５０％低減するために必要な濃度。なお、各実験は４通り行い、ＭＴＴアッセイによって評価を行った。
【００６５】
化合物１３および１８−２３の増殖抑制効力について、以前使用されていたヒーラおよびＭＣＦ−７に加えて、予後不良に関係していることが知られているＵ−８７ヒト膠芽腫やＡ５４９ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）癌腫などの癌のインビトロ（生体内、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）モデルを含有したより挑戦的な細胞株パネルで検討を行った。新たに合成した化合物１８−２３はＣ７−フェニル類似体１３よりも劣っていたが、全体としては、一桁のマイクロモル効力を示したピリジン含有化合物２１を除いてマイクロモル以下の効力を保持していた。
【００６６】
（ｃ）定量的ビデオ顕微鏡法
膠芽腫、メラノーマやＮＳＣＬＣ患者の予後が悪いことは、一般にこれら悪性腫瘍の薬剤耐性によるため、７−デアザヒポキサンチン１３および１８−２３がＵ８７ヒト膠芽腫細胞株やＡ５４９ＮＳＣＬＣ癌腫細胞株に対して作用があることは励みになるものであった。チューブリン標的剤は一般にアポトーシスの誘導に対して耐性をもつ癌細胞に対して有効でないため、アポトーシス耐性を示すことが報告されているＵ３７３ヒト膠芽腫細胞やＳＫＭＥＬヒトメラノーマ細胞に対して更に化合物２２を評価した。これら両細胞株において得られた０．３μＭのＭＴＴ系のＧｌ５０値は、この化合物がこれら細胞種において同様な作用レベルを維持していることを示している（表６のＧｌ５０値との比較を参照）。コンピュータ支援位相コントラスト顕微鏡法（定量的ビデオ顕微鏡法）を利用して、これら細胞株におけるこの化合物のインビトロ成長抑制効果に関係する主要な作用機序として細胞死を確認した。
【００６７】
下記の細胞イメージングに示すように（図９）、事実、化合物２２はＵ３７３膠芽腫細胞およびＳＫＭＥＬメラノーマ細胞におけるＭＴＴ系Ｇｌ５０値において評価するさいに、細胞死を誘導することによって癌細胞増殖を抑制した。
実施例
【００６８】
（ａ）合成化学反応
試薬、溶剤および触媒はいずれも商業的供給源（Ａｃｒｏｓ  ＯｒｇａｎｉｃｓおよびＳｉｇｍ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入し、精製せずに使用した。すべての反応は、大気に開放したオーブン乾燥フラスコか、あるいは窒素下オーブン乾燥フラスコ中で行い、あらかじめＴＬＣを被覆（２５０μｍ）したシリカゲル６０  Ｆ２５４ガラスで裏打ちされたプレート（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）上で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってモニターした。可視化についてはＵＶ光で行った。シリカゲル（３２−６３μｍ、６０Åポア径）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ４００分光計に記録した。化学シフト（δ）についてはＴＭＳ内部基準に従ってｐｐｍで示す。略語ｓは一重項（ｓｉｎｇｌｅｔ）、ｄは二重項（ｄｏｕｂｌｅｔ）、ｔは三重項（ｔｒｉｐｌｅｔ）、ｑは四重項（ｑｕａｒｔｅｔ）、ｍ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ）は多重項である。Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２  ＬＣＭＳを用いてＨＲＭＳ分析を行った。合成化合物の９５％以上のの純度は、ＵＰＬＣ/ＭＳ分析によって確認した。
【００６９】
実施例１：２−アミノ−５−ベンゾイル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキシアミド（１）：
ＥｔＯＨ（３ｍｌ）中、Ｎ−メチルスルホンアミドアセトフェノン１３（０．０８４ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ベンズアルデヒド（０．０５５ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）およびシアノアセトアミド（０．０４４ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に粒状の無水Ｋ２ＣＯ３（０．０２８ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を次に１４時間還流した。この後、反応混合物を室温に冷却し、濃縮した。溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２/ＡｃＯＥｔ（２：１）を使用してシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、７４ｍｇの目的のピロール１を得た（収率６１％）。
【００７０】
実施例２：２−アミノ−５−ベンゾイル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキシアミド（１）：
2018503633.tif 000039
【００７１】
デアザヒポキサンチン３−１７の合成の一般的な方法
選択したエチルエステル（１．２８ｍｍｏｌ）およびピロール１（５０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を、金属ナトリウム（３０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（２ｍｌ）に溶解して調製したＥｔＯＨ中のＥｔＯＮａ溶液に添加した。混合物を次に一夜１０時間還流した。この後、反応混合物をＨ２Ｏで希釈し、１ＭのＨＣｌで中和した。得られた析出物をろ過によって回収し、真空下一夜乾燥した。ほとんどの場合生成物デアザヒポキサンチンの純度は９５％以上であったが、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３中５％ＭｅＯＨ）を使用してさらに精製を行った。
表５記載の化合物の選択された確認データ：
【００７２】
実施例３：６−ベンゾイル−２−フェニル−５−フェニル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（３）：
2018503633.tif 000040
【００７３】
実施例４：６−ベンゾイル−２−（２−エトキシカルボニルエチル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（１０）：
2018503633.tif 000041
【００７４】
実施例５：６−ベンゾイル−２−ブチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（１１）：
2018503633.tif 000042
2018503633.tif 000043
【００７５】
実施例６：６−ベンゾイル−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（１３）：
2018503633.tif 000044
【００７６】
実施例７：６−ベンゾイル−２−（ジフルオロメチル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（１５）：
2018503633.tif 000045
【００７７】
実施例８：６−ベンゾイル−５−フェニル−２−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（１６）：
2018503633.tif 000046
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【００７８】
デアザヒポキサンチン１３および１８−２３の合成の一般的な方法
ＥｔＯＨ（２．５ｍＬ）およびＭｅＣ（ＯＥｔ）３（２．５ｍＬ）の混合物中、Ｎ―（２−オキソ−２−アリールエチル）メタンスルホンアミド（０．６７６ｍｍｏｌ）、選択したアルデヒド（０．８７９ｍｍｏｌ）およびシアノアセトアミド（０．０７２ｇ、０．８７９ｍｍｏｌ）の溶液に粒状の無水Ｋ２ＣＯ３（０．０５２ｇ、０．３７２ｍｍｏｌ）を一度に添加した。混合物をＮ２で５分間パージし、次に窒素雰囲気下９０℃で２４時間加熱した。中間体のピロールの生成をＴＬＣでモニターした。この後、反応温度を１５０℃に高め、反応混合物を３〜６時間加熱した。混合物を室温に冷却し、得られた析出物をろ過によって回収し、ＥｔＯＨ（２ｍＬ）およびＥｔ２Ｏ（２ｍＬ）で洗浄し、目的の７−デアザヒポキサンチン１３および１７−２３を得た。母液の蒸発および残留物のＭｅＯＨ/ＣＨ２Ｃｌ２＝１/４０〜１/２０勾配でのカラムクロマトグラフィーによる精製によって追加量の生成物を得た。
表２記載の化合物の確認データ
【００７９】
実施例９：６−ベンゾイル−５−（３−クロロフェニル）−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（１７）：
2018503633.tif 000048
【００８０】
実施例１０：６−ベンゾイル−５−（３−ブロモフェニル）−２−メチル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（１８）：
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【００８１】
実施例１１：６−ベンゾイル−５−（３−フルオロフェニル）−２−メチル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（１９）：
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【００８２】
実施例１２：６−ベンゾイル−２−メチル−５−（ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（２０）：
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【００８３】
実施例１３：６−ベンゾイル−５−（５−ブロモピリジン−３−イル）−２−メチル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（２１）：
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【００８４】
実施例１４：６−ベンゾイル−５−（３，５−ジブロモフェニル）−２−メチル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（２２）：
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【００８５】
実施例１５：６−ベンゾイル−２−（ペント−４−イニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]−ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（２３）：
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【００８６】
（ｂ）細胞培養
ヒト癌細胞株については、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ＵＫ）およびｔｈｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給したＤＭＥＭでヒト子宮頸部腺癌ヒーラ細胞を培養した。また、１０％のＦＢＳを補給したＲＰＭＩでヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞を培養した。Ｕ８７細胞およびＵ３７３細胞については、ＤＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ  ｃｏｄｅ  １２−１３６Ｆ、Ｖｅｒｖｉｅｒ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で培養し、ＳＫＭＥＬ−２８細胞およびＡ５４９細胞については、１０％の熱不活性化ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ、ＦＢＳ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ｃｏｄｅ  ＤＥ１４−８０１Ｆ）を補給したＰＲＭＩ培地（Ｌｏｎｚａ  ｃｏｄｅ  １２−１１５Ｆ）で培養した。細胞培地には、４ｍＭのグルタミン（Ｌｏｎｚａ  ｃｏｄｅ  ＢＥ１７−６０５Ｅ）、１００μｇ/ｍＬのゲンタマイシン（Ｌｏｎｚａ  ｃｏｄｅ  １７−５１８２）およびペニシリン−ストレプトマイシン（２００単位/ｍｌおよび２００μｇ/ｍｌ）（Ｌｏｎｚａ  ｃｏｄｅ  １７−６０２Ｅ）を補給した。すべての細胞株をＴ２４フラスコで培養し、３７℃、９５％の湿度および５％のＣＯ２で維持成長させた。
【００８７】
（ｃ）増殖抑制特性
合成した化合物の増殖抑制性を評価するために、ＭＴＴアッセイを使用した。各細胞株をトリプシン処理し、４×１０３の細胞/ウェルを９６−ウェルプレートに播種して、細胞株を評価した。細胞の処理前に、１００ｍＭの濃度か、あるいは５０ｍＭの濃度のいずれかですべての化合物をＤＭＳＯに溶解した。細胞を２４時間成長させ、次に０．０４〜１００μＭの範囲にある濃度において化合物で処理し、２００μＬの培地中で４８時間インキュベートした。血清を含有しない培地（５ｍｇ/ｍＬ）中、２０μＬのＭＴＴ試薬を各ウェルに添加し、さらに２時間インキュベートした。培地を取り出し、生成したホルマザン結晶を２００μＬのＤＭＳＯに再溶解した。Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅプレートリーダーを使用してＡ４９０を測定した。実験は４通り行い、各細胞株に対して化合物毎に少なくとも２回繰り返した。０．１％のＤＭＳＯで処理した細胞をコントロールとして使用し、ポジティブキリングコントロールとして１μＭのフェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）を使用した。
【００８８】
ｄ）定量的ビデオ顕微鏡法
ヒトＵ３７３膠芽腫細胞およびＳＫＭＥＬメラノーマ細胞の生存性に対する化合物２２の効果について、上記したように、コンピュータ支援位相コントラスト顕微鏡法を使用して生体内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で確認した。
【００８９】
いうまでもなく、本発明は明細書および添付図面における具体的な開示に決して制限されるものではなく、一部変更などは特許請求の範囲に包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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