(57)【要約】  本開示は、一又は複数の抗Ｄ因子抗体変異体を含む抗体−ポリマーコンジュゲート、それらの産生、並びに、過剰な又は制御されていない補体活性化に関連する疾患及び障害の治療のための組成物及び医薬の調製におけるそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一又は複数のポリオールに共有結合的に連結されている一又は複数の抗Ｄ因子抗体変異体を含むコンジュゲートであって、
コンジュゲートの少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体変異体が、参照抗Ｄ因子抗体の超可変領域（ＨＶＲ）内に少なくとも１つの標的アスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）残基の置換を含み、標的Ａｓｐ残基が異性化しやすいとして同定され、置換がＡｓｐからグルタミン酸（Ｅ又はＧｌｕ）への置換であり、各抗体変異体が、参照抗Ｄ因子抗体と比較して、Ｄ因子との結合親和性の顕著な損失なく、改善された安定性を示し、
ポリオールが、マルチアーム型ポリオールである、コンジュゲート。
【請求項２】
Ａｓｐ残基が、Ａｓｐ−Ｘａａモチーフ内に存在し、ＸａａがＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
標的Ａｓｐ残基が、Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフの第１のＡｓｐである、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
コンジュゲートの少なくとも１つの抗体変異体が、参照抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内に更なる少なくとも１つのＡｓｐ残基からセリン（Ｓ又はセリン）への置換を更に含み、得られる抗体変異体が、参照抗Ｄ因子抗体と比較して、低い負電荷を有し、改善された溶解度を示す、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
コンジュゲートの少なくとも１つの抗体変異体が、参照抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内に脱アミド化しやすいアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基からの一又は複数のセリンの置換を更に含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
参照抗Ｄ因子抗体が、配列番号３の軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
参照抗Ｄ因子抗体が、配列番号４の重鎖可変ドメイン配列を更に含む、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
参照抗Ｄ因子抗体が、配列番号１の軽鎖配列及び配列番号２の重鎖配列を含む、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
参照抗Ｄ因子抗体が、配列番号１の軽鎖配列並びに配列番号３４−５３及び１１５からなる群から選択される重鎖配列を含む、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
コンジュゲートの少なくとも１つの抗体変異体が、配列番号１１の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列及び配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列を含む、請求項８又は請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
抗体変異体が、配列番号１３の軽鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｌ３）配列を更に含む、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
コンジュゲートの少なくとも１つの抗体変異体が、配列番号１４の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列及び配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列を含む、請求項８又は請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
抗体変異体が、配列番号１５の重鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｈ３）配列を更に含む、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
一又は複数のポリオールに共有結合的に連結されている一又は複数の抗Ｄ因子抗体変異体を含むコンジュゲートであって、
コンジュゲートの少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体変異体が、参照抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内に一又は複数の位置での置換を含み、前記参照抗Ｄ因子抗体が、配列ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号５）を含む軽鎖ＨＶＲ−１、配列ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号６）を含む軽鎖ＨＶＲ−２、配列ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号７）を含む軽鎖ＨＶＲ−３、配列ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号８）を含む重鎖ＨＶＲ−１、配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号９）を含む重鎖ＨＶＲ−２、及び配列ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１０）を含む重鎖ＨＶＲ−３を含み、前記置換が、（ａ）配列番号５の位置５のアミノ酸がＳである（ａ、ｂ及びｃは配列番号２２に開示される）、（ｂ）配列番号５の位置７のアミノ酸がＥである、（ｃ）配列番号５の位置８のアミノ酸がＳである、（ｄ）配列番号９の位置１３のアミノ酸がＥである（配列番号２３）、（ｅ）配列番号７の位置４のアミノ酸がＥである（配列番号２４）、又は（ｆ）配列番号１０の位置５のアミノ酸がＳである（配列番号２５）置換のうちの一又は複数であり、
ポリオールが、マルチアーム型ポリオールである、コンジュゲート。
【請求項１５】
前記置換が、
（ｉ）置換（ｂ）−（ｄ）、
（ｉｉ）置換（ｂ）−（ｅ）、
（ｉｉｉ）置換（ａ）−（ｄ）、並びに
（ｉｖ）置換（ａ）−（ｄ）及び（ｆ）
からなる群から選択される、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
変異体が、配列番号５４−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項１４又は請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
一又は複数のポリオールに共有結合的に連結されている一又は複数の抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートであって、
コンジュゲートの少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体が、
ａ）配列番号１６、１８又は１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む抗Ｄ因子抗体、及び
ｂ）配列番号１７又は２０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む抗Ｄ因子抗体
からなる群から独立して選択され、
ポリオールが、マルチアーム型ポリオールである、コンジュゲート。
【請求項１８】
コンジュゲートの少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体が、配列番号１６、１８又は１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列及び配列番号１７又は２０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１９に由来し、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１７に由来する、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１９に由来し、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２０に由来する、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体が、配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項１７から２０の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
一又は複数のポリオールに共有結合的に連結されている一又は複数の抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートであって、
コンジュゲートの少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体が、
配列番号１１又は１４の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６の配列を有するＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７又は１３の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む可変軽鎖、並びに配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｈ１、配列番号９又は１２の配列を有するＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１０又は１５の配列を有するＨＶＲ−Ｈ３を含む可変重鎖を有し、
ポリオールが、マルチアーム型ポリオールである、コンジュゲート。
【請求項２３】
コンジュゲートの各抗Ｄ因子抗体が、
（ｉ）配列番号１４の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６の配列を有するＨＶＲ−Ｌ２及び配列番号７の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む可変軽鎖と、配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列を有するＨＶＲ−Ｈ２及び配列番号１０の配列を有するＨＶＲ−Ｈ３を含む可変重鎖と、を有する抗Ｄ因子抗体、並びに、
（ｉｉ）配列番号１４の配列を有する配列番号ＨＶＲ−Ｌ１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号６の配列を有するＨＶＲ−Ｌ２及び配列番号７の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む可変軽鎖と、配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列を有するＨＶＲ−Ｈ２及び配列番号１５の配列を有するＨＶＲ−Ｈ３を含む可変重鎖を有する抗Ｄ因子抗体、
からなる群から独立して選択される、請求項２２に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体が、配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を有する、請求項２２又は請求項２３に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
一又は複数のポリオールに共有結合的に連結されている一又は複数の抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートであって、
コンジュゲートの少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体が、
（ｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗Ｄ因子抗体、
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗Ｄ因子抗体、
（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗Ｄ因子抗体、
（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗Ｄ因子抗体、
（ｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖並びに配列番号７５−９２及び１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗Ｄ因子抗体、
（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗Ｄ因子抗体、
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗Ｄ因子抗体、並びに
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖並びに配列番号９３−１１０及び１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗Ｄ因子抗体
からなる群から選択され、
ポリオールが、マルチアーム型ポリオールである、コンジュゲート。
【請求項２６】
コンジュゲートの少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体が、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗Ｄ因子抗体である、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
コンジュゲートの少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗Ｄ因子抗体である、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ−ＣＳＨ及びその組合せからなる群から選択される抗体断片である、請求項１から２７の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
コンジュゲートの少なくとも１つの抗体断片が、Ｃ’末端に１つのシステイン残基を含む、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
コンジュゲートの少なくとも１つの抗体断片が、Ｃ’末端に配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
コンジュゲートの少なくとも１つの抗体断片が、Ｃ’末端に配列番号１１１−１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
ポリオールが、システイン残基の遊離スルフヒドリル基において、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの少なくとも１つに共有結合的に連結されている、請求項１から３１の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
システイン残基が操作されたシステインである、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
システイン残基が、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体の定常ドメインに存在する、請求項３２又は請求項３３に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
システイン残基が、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のＣ’末端に存在する、請求項３２から３４の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
コンジュゲートが、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの少なくとも２つを含み、ポリオールが、システイン残基の遊離スルフヒドリル基において、各抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に共有結合的に連結されている、請求項３２から３５の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
抗体変異体のうちの少なくとも１つが、参照抗Ｄ因子抗体の定常ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含み、アミノ酸残基がＣｙｓで置換されている、請求項１から１６の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
ポリオールが、置換されたシステイン残基の遊離スルフヒドリル基において、抗体変異体に共有結合的に連結されている、請求項３７に記載のコンジュゲート。
【請求項３９】
ポリオールが、リジン残基の遊離アミノ基において、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの少なくとも１つに共有結合的に連結されている、請求項１から３８の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４０】
リジン残基が、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体の定常ドメイン内に存在する、請求項３９に記載のコンジュゲート。
【請求項４１】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの少なくとも２つが、ポリオールに共有結合的に連結されている、請求項１から４０の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４２】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの少なくとも３つが、ポリオールに共有結合的に連結されている、請求項４１に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの少なくとも４つが、ポリオールに共有結合的に連結されている、請求項４２に記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの少なくとも５つが、ポリオールに共有結合的に連結されている、請求項４３に記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの少なくとも６つが、ポリオールに共有結合的に連結されている、請求項４４に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの少なくとも７つが、ポリオールに共有結合的に連結されている、請求項４５に記載のコンジュゲート。
【請求項４７】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの８つが、ポリオールに共有結合的に連結されている、請求項４６に記載のコンジュゲート。
【請求項４８】
マルチアーム型ポリオールが、ダイマー、テトラマー、ヘキサマー及びオクタマーからなる群から選択される、請求項１から４７の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４９】
マルチアーム型ポリオールがオクタマーである、請求項４８に記載のコンジュゲート。
【請求項５０】
ポリオールがポリエチレングリコールである、請求項１から４９の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５１】
ポリエチレングリコールが、約５００Ｄ−約３００，０００Ｄの重量平均分子量を有する、請求項５０に記載のコンジュゲート。
【請求項５２】
ポリエチレングリコールが、約２０，０００Ｄ−約６０，０００Ｄの重量平均分子量を有する、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【請求項５３】
ポリエチレングリコールが、約４０，０００Ｄの重量平均分子量を有する、請求項５２に記載のコンジュゲート。
【請求項５４】
ポリエチレングリコールが、一般式（Ｉａ）：
2018536650.tif 000053
（式中、各ｍは独立して３−２５０の整数であり、ｎは１−１０の整数であり、各Ｒ１は独立して、存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して水素又は末端反応性基である）の構造を有し、少なくとも１つのＲ２が、末端反応性基であり、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に共有結合的に連結されている、請求項５０から５３の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５５】
ポリエチレングリコールが、一般式（Ｉｂ）：
2018536650.tif 000054
（式中、各ｍは独立して３−２５０の整数であり、各Ｒ１は独立して、存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して水素又は末端反応性基である）の構造を有し、少なくとも１つのＲ２が、末端反応性基であり、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に共有結合的に連結されている、請求項５０から５３の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５６】
ポリエチレングリコールが、一般式（ＩＩａ）：
2018536650.tif 000055
（式中、各ｍは独立して３−２５０の整数であり、ｎは１−１０の整数であり、各Ｒ１は独立して、存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して水素又は末端反応性基である）の構造を有し、少なくとも１つのＲ２が、末端反応性基であり、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に共有結合的に連結されている、請求項５０から５３の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５７】
ｎが６である、請求項５６に記載のコンジュゲート。
【請求項５８】
ポリエチレングリコールが、一般式（ＩＩＩａ）：
2018536650.tif 000056
（式中、各ｍは独立して３−２５０の整数であり、ｎは１−１０の整数であり、各Ｒ１は独立して、存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して水素又は末端反応性基である）の構造を有し、少なくとも１つのＲ２が、末端反応性基であり、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に共有結合的に連結されている、請求項５０から５３の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５９】
ｎが２である、請求項５８に記載のコンジュゲート。
【請求項６０】
ｎが４である、請求項５８に記載のコンジュゲート。
【請求項６１】
ｎが６である、請求項５８に記載のコンジュゲート。
【請求項６２】
ポリエチレングリコールが、一般式（ＩＶａ）：
2018536650.tif 000057
（式中、各ｍは独立して３−２５０の整数であり、各Ｒ１は独立して、存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して水素又は末端反応性基である）の構造を有し、少なくとも１つのＲ２が、末端反応性基であり、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に共有結合的に連結されている、請求項５０から５３の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６３】
ｍが５０−２００の整数である、請求項５４から６２の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６４】
ｍが１００−１５０の整数である、請求項６３に記載のコンジュゲート。
【請求項６５】
少なくとも１つのＲ１が結合基であり、Ｒ１及びＲ２がまとめると、
2018536650.tif 000058
並びにその組合せからなる群から選択され、式中、各ｉは独立して０−１０の整数であり、ｊは０−１０の整数である、請求項５４から６４の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６６】
各Ｒ２が独立してチオール反応性基、アミノ反応性基及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５４から６５の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６７】
各Ｒ２が独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド及びパラ−ニトロフェニルカーボネートからなる群から選択される、請求項６６に記載のコンジュゲート。
【請求項６８】
Ｒ２がマレイミドである、請求項６７に記載のコンジュゲート。
【請求項６９】
Ｒ１及びＲ２がまとめると、
2018536650.tif 000059
であり、ｉは０−１０の整数であり、ｊは０−１０の整数である、請求項５４から６８の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７０】
Ｒ２基のうちの少なくとも７つが、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの１つに共有結合的に連結されている、請求項５４から５８又は請求項６１から６９の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７１】
Ｒ２基のうちの８つが、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体のうちの１つに共有結合的に連結されている、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項７２】
ポリエチレングリコールが、一般式（Ｉｂ）：
2018536650.tif 000060
（式中、各ｍは独立して３−２５０の整数であり、各Ｒ１は独立して、存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して、水素又は末端反応性基である）の構造を有し、少なくとも１つのＲ２が、末端反応性基であり、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に共有結合的に連結されている、請求項２６又は請求項２７に記載のコンジュゲート。
【請求項７３】
Ｒ１及びＲ２がまとめると、
2018536650.tif 000061
であり、ｉは０−１０の整数であり、ｊは０−１０の整数である、請求項７２に記載のコンジュゲート。
【請求項７４】
ｉが２であり、ｊが２である、請求項７３に記載のコンジュゲート。
【請求項７５】
コンジュゲートが、少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体をマルチアーム型ポリオールに共有結合的に連結することによって調製される、請求項１から７４の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７６】
マルチアーム型ポリオールが、ダイマー、テトラマー、ヘキサマー及びオクタマーからなる群から選択される、請求項７５に記載のコンジュゲート。
【請求項７７】
ポリオールがポリエチレングリコールである、請求項７５又は請求項７６に記載のコンジュゲート。
【請求項７８】
請求項１から７７の何れか一項に記載のコンジュゲートを含む薬学的製剤。
【請求項７９】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体の濃度が、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌである、請求項７８に記載の薬学的製剤。
【請求項８０】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体の濃度が、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌである、請求項７９に記載の薬学的製剤。
【請求項８１】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体の濃度が、少なくとも３００ｍｇ／ｍｌである、請求項８０に記載の薬学的製剤。
【請求項８２】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体の濃度が、約５０ｍｇ／ｍｌ−約３００ｍｇ／ｍｌである、請求項７８に記載の薬学的製剤。
【請求項８３】
請求項７８から８２の何れか一項に記載の薬学的製剤及び患者の硝子体内に製剤を送達するための手段を含み、それにより、製剤の効果が長期間にわたり患部で維持される、眼内送達用長時間作用性送達デバイス。
【請求項８４】
対象における補体関連障害の治療用医薬の製造における、請求項７８から８２の何れか一項に記載の製剤、又は請求項８３に記載のデバイスの使用。
【請求項８５】
補体関連障害が全身性障害である、請求項８４に記載の使用。
【請求項８６】
補体関連障害が眼性疾患である、請求項８５に記載の使用。
【請求項８７】
眼性疾患が、ドライ型及びウエット型（非滲出性及び滲出性）を含む加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル−リンダウ病、眼性ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生及び網膜血管新生からなる群から選択される、請求項８６に記載の使用。
【請求項８８】
眼性疾患が、中期ドライ型ＡＭＤ及び地図状萎縮（ＧＡ）からなる群から選択される、請求項８７に記載の使用。
【請求項８９】
療法における使用のための請求項１から７７の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９０】
対象における補体関連障害を治療する方法における使用のための請求項１から７７の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９１】
対象における全身性補体関連障害を治療する方法における使用のための請求項１から７７の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９２】
補体関連障害が補体関連の眼性症状である、請求項９１に記載のコンジュゲート。
【請求項９３】
補体関連の眼性症状が、ドライ型及びウエット型（非滲出性及び滲出性）を含む加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル−リンダウ病、眼性ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生及び網膜血管新生からなる群から選択される、請求項９２に記載のコンジュゲート。
【請求項９４】
補体関連の眼性症状が、中期ドライ型ＡＭＤ及び地図状萎縮（ＧＡ）からなる群から選択される、請求項９２に記載のコンジュゲート。
【請求項９５】
対象に、有効量の、請求項１から７７の何れか一項に記載のコンジュゲート又は請求項７８から８２の何れか一項に記載の薬学的製剤を投与することを含む、対象における補体関連障害を治療する方法。
【請求項９６】
補体関連障害が全身性障害である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
補体関連障害が補体関連の眼性症状である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
補体関連の眼性症状が、ドライ型及びウエット型（非滲出性及び滲出性）を含む加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル−リンダウ病、眼性ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生及び網膜血管新生からなる群から選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
補体関連の眼性症状が、中期ドライ型ＡＭＤ及び地図状萎縮（ＧＡ）からなる群から選択される、請求項９７に記載のコンジュゲート。
【請求項１００】
移植可能なポート送達システムを用いてコンジュゲート又は薬学的製剤を投与することを含む、請求項９５から９９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
コンジュゲート又は薬学的製剤を硝子体内投与によって投与することを含む、請求項９５から１００の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
硝子体内投与が、狭口径ニードルを通じてなされる、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
狭口径ニードルが、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３又は２２ゲージである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
個体に更なる治療剤を投与することを更に含む、請求項９５から１０３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
更なる治療剤が、ＡＮＧ２アンタゴニスト、ＴＩＥ２アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び補体第２成分アンタゴニストからなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
更なる治療剤が抗ＡＮＧ２抗体である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
更なる治療剤が抗ＴＩＥ２抗体である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
更なる治療剤が、ＶＥＧＦトラップ及び抗ＶＥＧＦ抗体からなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
更なる治療剤が、補体第２成分アンタゴニストであり、補体第２成分アンタゴニストが、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９からなる群から選択される補体成分を阻害する、請求項１０４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮出願第６２／２４９，０２０号及び２０１５年１１月４日に出願された米国仮出願第６２／２５０，９６５号の優先権の利益を主張し、これら両出願の全内容を出典明示により援用する。
【０００２】
配列表
本出願は、アスキーフォーマットで電子的に提出され、全内容が出典明示により本願に援用される配列表を含む。２０１６年１０月２７日に作成された前記アスキーコピーはＰ３３０４４−ＷＯ．ｔｘｔという名称であり、１７２，１６４バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
治療抗体の開発は、人類の薬剤の長い歴史における革命の時代を意味する。３０を超える抗体がヒトの治療のために承認され、２５０を上回る抗体が、がん、自己免疫疾患、炎症、心血管疾患、感染症及び眼性疾患を含む広範囲にわたる主要な疾患のために世界中において臨床開発されている。過去１０年間にわたり、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ及びアダリムマブなどのブロックバスター薬の成功により、モノクローナル抗体製造品の市場が指数関数的に成長し、推進されてきた。これらの第１世代抗体療法が多数の患者に利益をもたらす一方で、抗体技術の進歩及び作用機序の深い理解が、更に良好な有効性を示し、かつ副作用の少ない改良型抗体への道を開いた。
【０００４】
抗体療法の開発の成功及び有用性は、有機及び無機小分子である伝統的な薬剤と比較し、多くの固有の問題を提起する。抗体の生物物理学的な特性は、全てのタンパク質と同様、それらの作用の重要な決定的要素であり、発現、精製、製剤、貯蔵、送達、薬物動態、免疫原性及び投薬計画に関し、治療法開発において無視できない影響を及ぼす。多くの特徴の中でも、タンパク質の安定性は、候補抗体の品質及び有効な治療薬としてのその好適性を規定する主要な特徴である。
【０００５】
タンパク質療法はしばしば、望ましい有効性を達成するために、高用量のタンパク質を患者に送達することを必要とする。一方、特定の投与経路では、送達時間、ボリューム及び物理的な力などが規定されており、そのような場合、前記高用量のタンパク質は高濃度（例えば少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ）の製剤である必要がある。しかしながら、高度に濃縮されたタンパク質製剤は、安定性、溶解度、粘性及び他のタンパク質特性に関して特有の問題を提起する。
【０００６】
タンパク質は不安定となり得、様々な物理的及び化学分解経路を経て分解する。物理的不安定性は、主に２つの経路、すなわち変性及び凝集を経て生じ、一方、化学不安定性は、多くの経路、例えば脱アミド化、異性化、架橋、酸化及び断片化を経て生じ得る。抗体の不安定性は、活性薬物量の減少及びインビボ有効性の低下、治療薬のバッチ間変動の増加を生じさせ、またおそらく最も重要な点として、患者において凝集物及び分解物に対する免疫原性を生じさせるため、薬剤開発において望ましくない。Wang et al (2007) J. Pharm. Sci. 96: 1-26、Moore et al (1980) J Clin Endocrinology & Metabolism 51: 691-697、Rosenberg et al (2006) AAPSJ 8: E501-7、Joubert et al (2011) J Biol Chem 286: 25118-25133、Joubert et al (2012) J Biol Chem(2012) 286:25266-79。
【０００７】
抗体は大型のマルチドメインタンパク質であり、それらの安定性及び凝集傾向に関与する因子は複雑であり、多くの外因性条件、例えば温度、ｐＨ、濃度、イオン強度及び物理的ストレスが含まれる。タンパク質自体の一次配列は、同様に重要である。Ｆｃ領域は、その性質上、特定のアイソタイプの抗体間でほぼ同一であるにもかかわらず、Ｆａｂ領域は大きく異なる。故に、主にＦａｂ配列の相違及び抗体特有の抗原特異性に起因し、安定性及び凝集傾向に顕著な変動が抗体間で生じる。Lowe et al. (2011) Adv. Protein Chem. Struct Biol. 84:41-61。
【０００８】
補体系は、免疫複合体のクリアランス、並びに感染因子、外来抗原、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞への免疫応答において中心的な役割を果たす。しかしながら、補体はまた病理学的炎症及び自己免疫疾患にも関与する。したがって、補体カスケードの過剰な又は制御されない活性化の阻害は、そのような疾患及び症状を有する患者に臨床的な利益を提供し得ると考えられる。
【０００９】
前記補体系には、古典的経路、マンノース結合性レクチン経路及び副経路と称される３つの異なる活性化経路が包含される。V.M. Holers In Clinical Immunology: Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391。古典経路は、通常、抗原抗体複合体の形成によって活性化される、カルシウム／マグネシウム依存性のカスケードである。マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）経路は、病原体上の炭水化物構造へのＭＢＬの結合によって開始され、Ｃ２及びＣ４を切断するＭＢＬプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）の活性化が起こり、その結果活性型のＣ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ａ及びＣ４ｂが形成される。副経路は、特定の感受性表面（例えば酵母及び細菌の細胞壁多糖類、並びに特定の生体高分子材料）へのＣ３の蓄積及び活性化によって活性化されるマグネシウム依存性カスケードである。補体経路の活性化は、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ及びＣ５ａアナフィラトキシン及びＣ５ｂ−９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の補体系タンパク質の生物活性断片を生成させ、それが白血球化学走性、マクロファージ、好中球、血小板、マスト細胞及び内皮細胞の活性化、血管透過性、細胞崩壊並びに組織損傷などの炎症性作用を媒介する。
【００１０】
Ｄ因子は、補体副経路の活性化に不可欠な、特異性の高いセリンプロテアーゼである。それはＣ３ｂに結合するＢ因子を切断し、副経路Ｃ３／Ｃ５転換酵素の活性成分であるＣ３ｂ／Ｂｂ酵素を生成する。ヒトにおいてその血漿濃度が非常に低い（１．８μｇ／ｍｌ）ため、Ｄ因子は阻害のための適切な標的となり得、それは補体副経路の活性化のための律速酵素であることが示されている。P.H. Lesavre and H.J. Muller-Eberhard. (1978) J. Exp. Med. 148: 1498-1510、J.E. Volanakis et al. (1985) New Eng. J. Med. 312: 395-401。
【００１１】
補体活性化の下方制御は、動物モデル及びエクスビボでの研究において、例えば、全身性紅斑性狼瘡及び糸球体腎炎、関節リウマチ、心肺バイパス及び血液透析、臓器移植における超急性拒絶反応、心筋梗塞、再灌流障害、及び成人性呼吸促迫症候群など、幾つかの疾患徴候の治療に効果的であることが証明されている。更に、熱傷、重篤な喘息、アナフィラキシーショック、腸炎症、じん麻疹、血管浮腫、脈管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎及びシェーグレン症候群などの他の炎症性症状及び自己免疫／免疫性複合病もまた、補体活性化に密接に関係している。
【００１２】
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、視力に対し顕著な影響を及ぼす中心網膜の進行性慢性疾患である。Lim et al. (2012) Lancet 379:1728。前記疾患の後期の形態は、先進国において視力喪失の主要原因である。４０歳以上の白色人種集団の場合、早期ＡＭＤの有病率は６．８％、進行したＡＭＤは１．５％と推定されている。de Jong (2006) N. Engl. J. Med. 355: 1474。後期ＡＭＤの有病率は、８０歳を過ぎると１１．８％まで上昇し、年齢と共に劇的に増加する。２種類のＡＭＤ（非滲出性（ドライ型）及び滲出性（ウエット型）ＡＭＤ）が存在する。一般性の高いドライ型ＡＭＤは、中心網膜（網膜黄斑）の下に存在する網膜色素上皮（ＲＰＥ）、及びＲＰＥ上の沈着物（ドルーゼン）における、萎縮性及び肥大性の変化を伴う。進行したドライ型ＡＭＤは、地図状萎縮（ＧＡ）を含む、回復不能な視力喪失を伴う顕著な網膜損傷をもたらし得る。更に、ドライ型ＡＭＤを有する患者は、ウエット型の形態へ進行する場合もあり得、その際、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭｓ）と呼ばれる異常な血管が、網膜下で発達し、体液及び血液を漏出させ、その結果、網膜内部及び下部において、失明をもたらす円板状の瘢痕を生じさせる。
【００１３】
新生血管形成（血管新生）を標的とする薬物は、ウエット型ＡＭＤの治療のための大黒柱的存在であった。抗ＶＥＧＦＡ抗体断片であるラニビズマブは、ウエット型ＡＭＤに罹患する患者の視力改善に非常に効果的であると判明している。最近の研究は、補体カスケードにおけるＡＭＤとキータンパク質との間の関係に関与しており、また特定の補体成分を標的とする多くを治療する方法がドライ型ＡＭＤの治療のために開発されている。Ｄ因子上のエキソサイトへの結合を通じてＤ因子及び補体副経路を強力に阻害するヒト化抗Ｄ因子のＦａｂ断片（ａＦＤ、ランパリズマブ；ＦＣＦＤ４５１４Ｓ）は、現在、ドライ型ＡＭＤに関連するＧＡの治療のために臨床開発中である。Katschke et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12886。最近のフェーズＩＩ臨床治験では、ランパリズマブの月１回の硝子体内注入が、進行したドライ型ＡＭＤを有する患者のＧＡ病変の進行を効果的に遅延させることが示されている。
【００１４】
眼は、多くの特有の生物物理学的及び解剖学的な特性を有するため、眼内への薬物送達をより困難にする。例えば、血液網膜関門は、眼を感染から保護するが、同時に、特に眼の後上葉区の疾患に向けられた薬物の透過を困難にする防御機構である。したがって、薬物のオンサイトでの生物学的利用能（例えば眼内の滞留時間）を達成、維持するよう高用量投与を行い、有効性を改善することがしばしば望まれる。一方、眼内後部の限られたスペースでは送達される薬物のボリュームが抑えられ、そのため、薬物の高濃度製剤による送達が要求される。
【００１５】
眼性疾患患者はまた、治療薬の長時間作用性／徐放性放出による送達による利益を受け得る。頻繁でない投薬により改善された便宜が前記患者に提供され、感染率の減少及び臨床的有効性の増加という潜在的利益がもたれされる。高用量薬の徐放により、薬物の副作用の最小化も可能となり得る。長時間作用性送達に用いられる２つの有望系は、ＰＬＧＡベースの固体の移植、及び移植可能なポート送達系（ＰＤＳ）である。両系は、長期間にわたりゼロに近い放出動態を提供する可能性を有する。ＰＬＧＡ移植の場合、タンパク質性の薬物は疎水性ポリマーマトリックスに封入され、薬物の放出は前記ポリマーの緩慢な加水分解を経てなされる。放出速度は、薬物のローディング、ポリマーの疎水性又はポリマーの分子量の変更により制御できる。ＰＤＳは、チタンフリットを含む多孔性金属膜によって硝子体への放出を制御する、補充可能なデバイスである。リザーバーのボリュームが小さいため、ＰＤＳでの有効な送達のためには、高いタンパク質濃度が必要となる。
【００１６】
薬物が置かれる条件は、使用する送達系によって変化する。固体のＰＬＧＡ移植片への充填のためには、凍結乾燥又は噴霧乾燥された薬物が用いられる。移植片は、熱溶融押出工程を用いて産生されるが、その際、薬物は９０℃近い温度に短時間曝露される。薬物は、放出期間の間、固体の状態で残存するが、ＰＬＧＡの分解により、薬物は低ｐＨ環境に曝露され得る。対照的に、ＰＤＳで送達される薬物は液体状で高濃度に維持され、生理的イオン強度及びｐＨの面で還元的環境としての特徴を明らかにする硝子体に曝露される。
【００１７】
高濃度及び長時間作用性送達に加えて、又はその代替として、タンパク質性薬物を、天然又は合成ポリマー、例えばポリシアリル化、ヘス（ＨＥＳ）化（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ、ヒドロキシエチル澱粉とのコンジュゲーション）及びペグ（ＰＥＧ）化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）などと、共有結合的にコンジュゲートし、翻訳後修飾を行うことによって、薬物の生物学的利用能（例えば眼内滞留時間）の向上を実現又は促進することができる。Chen et al (2011) Expert. Opin. Drug Deliv. 8:1221-36、Kontermann (2009) BioDrugs 23:93-109。ペグ（ＰＥＧ）化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）（タンパク質へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの共有結合）は、特に抗体断片治療薬の半減期の延長に有用な確立された技術である。Jevsevar et al. (2010) Biotech. J. 5:113-128。
【００１８】
このように、高い安定性を有し、幾つかの実施態様では高濃度製剤及び／又は長時間作用性送達に適する、抗Ｄ因子抗体（並びにそのコンジュゲート）に対する強いニーズが存在する。
【発明の概要】
【００１９】
本開示は、一部には、抗体内の同定されたホットスポットへの標的化アミノ酸置換により、前記抗体の安定性及び治療薬としての全体的力価を効果的に改善できるという発見に基づく。マルチアーム型ポリマー、例えばマルチアーム型ポリオールへのかかる抗体のコンジュゲーションにより、非コンジュゲート抗体と比較し、硝子体液半減期、眼房水半減期及び／又は網膜半減期が改善され得る。
【００２０】
幾つかの態様において、本開示は、一又は複数のマルチアーム型ポリオールに共有結合的に連結されている一又は複数の抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体変異体を含むコンジュゲートに関する。特定の実施態様において、前記ポリオールは８アーム型（すなわちオクタマー）ポリオールである。幾つかの実施態様において、前記ポリオールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。特定の実施態様において、前記ＰＥＧは、後述する一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）又は（ＩＶａ）何れかの構造を有し得る。
【００２１】
本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗Ｄ因子抗体変異体は、安定性が改善されている。前記抗Ｄ因子抗体変異体は、参照抗Ｄ因子抗体の超可変領域（ＨＶＲ）内に、少なくとも１つの標的アスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）残基の置換を含み、前記標的Ａｓｐ残基は異性化しやすいとして同定され、前記置換はＡｓｐからグルタミン酸（Ｅ又はＧｌｕ）への置換であり、また前記参照抗Ｄ因子抗体と比較して、前記抗Ｄ因子抗体変異体はＤ因子との結合親和性の顕著な損失なく、改善された安定性を示す。幾つかの態様において、置換の対象となる前記標的Ａｓｐ残基は、Ａｓｐ−Ｘａａモチーフ内に存在し、ＸａａがＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである。幾つかの態様において、前記標的Ａｓｐ残基は、Ａｓｐ−Ａｓｐ（ＤＤ）モチーフの第１のＡｓｐである。幾つかの態様において、前記抗Ｄ因子抗体変異体は、参照抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内に更なるＡｓｐ部位において一又は複数の置換を含み、前記置換は前記抗体全体の電荷を低下させるＡｓｐからＳｅｒｉｎｅ（Ｓ又はＳｅｒ）への置換であり、それによって前記抗体の溶解度が改善される。幾つかの態様において、前記抗Ｄ因子抗体変異体は、脱アミド化しやすいとして同定されたアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）部位において一又は複数の置換を含み、前記置換は、前記抗体の脱アミド化が減少又は除去するＡｓｎからＳｅｒへの置換である。
【００２２】
幾つかの実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体変異体はＦａｂ断片であり、前記Ｆａｂ断片の重鎖のＣ末端がアミノ酸「ＣＤＫＴＨＴ」、「ＣＤＫＴＨＬ」、「ＣＤＫＴＨ」、「ＣＤＫＴ」、「ＣＤＫ」又は「ＣＤ」で終わる。幾つかの実施態様において、前記Ｆａｂ断片の前記重鎖の前記Ｃ末端は、ＸがＴ以外のいかなるアミノ酸でもある配列「ＣＤＫＴＨＸ」で終わる。前記Ｃ末端のトランケーション及び／又は突然変異により、耐熱性又は発現を損なうことなく、前記Ｆａｂに対するＡＨＡの反応性が減少又は除去され得る。幾つかの実施態様において、Ｆａｂ断片の前記重鎖の前記Ｃ末端は、アミノ酸「ＣＤＫＴＨＴＣ」、「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ」、「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＳ」、「ＣＤＫＴＨＴＳＰＰＣ」、「ＣＤＫＴＨＴＡＰＰＣ」、「ＣＤＫＴＨＴＳＧＧＣ」又は「ＣＹＧＰＰＣ」で終わる。幾つかのかかる実施態様において、前記Ｃ末端アミノ酸の遊離システインは、例えばＰＥＧなどのポリマーへのコンジュゲーションに供され得る。幾つかの実施態様において、Ｆａｂ断片は配列番号５４（「ＣＤＫＴＨＴ」で終わる）、５５−６６（「ＣＤＫＴＨＬ」、「ＣＤＫＴＨＴＣ」、「ＣＰＰＣ」、「ＣＰＰＳ」、「ＳＰＰＣ」、「ＡＰＰＣ」、「ＳＧＧＣ」、「ＣＹＧＰＰＣ」、「ＣＤＫＴＨ」、「ＣＤＫＴ」、「ＣＤＫ」又は「ＣＤ」で終わる）及び１１６（「ＣＤＫＴＨＸ」で終わる）からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、Ｆａｂは配列番号６７（「ＶＥＲＫ」で終わる）の重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含むＩｇＧ２  Ｆａｂ断片である、又は配列番号６８（「ＶＥＲＫＣ」で終わる）の重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含むＩｇＧ２  Ｆａｂ−Ｃ断片である。幾つかの実施態様において、Ｆａｂは配列番号６９−７３（「ＫＹＧＰＰ」、「ＫＹＧＰ」、「ＫＹＧ」、「ＫＹ」又は「Ｋ」で終わる）からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含むＩｇＧ４  Ｆａｂ断片である、又は配列番号７４（「ＫＹＧＰＰＣ」で終わる）の重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含むＩｇＧ４  Ｆａｂ−Ｃ断片である。前記Ｃ末端のトランケーティング及び／又は突然変異の代替として、元々存在する抗ヒンジ抗体（ＰＥ−ＡＨＡ）による反応を回避するために、ＰＥ−ＡＨＡ反応を示さないという理由から、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４  Ｆａｂ断片を用いてもよい。
【００２３】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗体変異体を生成するのに用いられる前記参照抗Ｄ因子抗体は、配列番号３の軽鎖可変ドメイン配列、配列番号４の重鎖可変ドメイン配列、又はその両方を含む。その後、得られる抗体変異体は、配列番号１１の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列及び配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列を含み得る、又は配列番号１３の軽鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｌ３）配列を含み得る、又は配列番号１４の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列及び配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列を含み得る、又は配列番号１５の重鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｈ３）配列を含み得る。
【００２４】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗Ｄ因子抗体変異体は、参照抗Ｄ因子抗体の変異体であり、前記参照抗Ｄ因子抗体は、配列番号１の軽鎖配列及び配列番号２の重鎖配列を含み、また前記変異体は、前記参照抗Ｄ因子抗体に対して以下の配列修飾を含む：配列番号１１の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列及び配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列。かかる変異体は、後述する実施例中において「ＴＭ」変異体（ＡＦＤ．ｖ６）と称される（表１参照）。
【００２５】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗Ｄ因子抗体変異体は、参照抗Ｄ因子抗体の変異体であり、前記参照抗Ｄ因子抗体が配列番号１の軽鎖配列及び配列番号３４−５３及び１１５からなる群から選択される重鎖配列を含み、また前記変異体は、前記参照抗Ｄ因子抗体に対して以下の配列修飾を含む：配列番号１１の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列及び配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列。かかる変異体は、「修飾ＴＭ」変異体と称される。これらの修飾ＴＭ変異体は、前記ＴＭ変異体と異なり、配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインを含む。
【００２６】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗Ｄ因子抗体変異体は、参照抗Ｄ因子抗体の変異体であり、前記参照抗Ｄ因子抗体が配列番号１の軽鎖配列及び配列番号２の重鎖配列を含み、また前記変異体は、前記参照抗Ｄ因子抗体に対して以下の配列修飾を含む：配列番号１１の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列、配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列及び配列番号１３の軽鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｌ３）配列。かかる変異体は、後述する実施例中において「ＴＭ．Ｄ９２Ｅ」変異体（ＡＦＤ．ｖ７）と称される（表１参照）。
【００２７】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗Ｄ因子抗体変異体は、参照抗Ｄ因子抗体の変異体であり、前記参照抗Ｄ因子抗体は、配列番号１の軽鎖配列及び配列番号３４−５３及び１１５からなる群から選択される重鎖配列を含み、また前記変異体は、前記参照抗Ｄ因子抗体に対して以下の配列修飾を含む：配列番号１１の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列、配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列及び配列番号１３の軽鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｌ３）配列。かかる変異体は、「修飾ＴＭ．Ｄ９２Ｅ」変異体と称される。これらの修飾ＴＭ．Ｄ９２Ｅ変異体は、前記ＴＭ．Ｄ９２Ｅ変異体と異なる、配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインを含む。
【００２８】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗Ｄ因子抗体変異体は、参照抗Ｄ因子抗体の変異体であり、前記参照抗Ｄ因子抗体は、配列番号１の軽鎖配列及び配列番号２の重鎖配列を含み、また前記変異体は、前記参照抗Ｄ因子抗体に対して以下の配列修飾を含む：配列番号１４の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列及び配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列。かかる変異体は、後述する実施例中において「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）と称される（表１参照）。幾つかの実施態様において、前記「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）は、配列番号２６の軽鎖配列及び配列番号２７の重鎖配列を含む。幾つかの実施態様において、前記「ＳＩＥＳＤ」変異体のＣｙｓ修飾バージョンは、配列番号２６の軽鎖配列及び配列番号３０の重鎖配列を含む。幾つかの実施態様において、前記「ＳＩＥＳＤ」変異体のＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−修飾バージョンは、配列番号２６の軽鎖配列及び配列番号３１の重鎖配列を含む。幾つかの実施態様において、前記「ＳＩＥＳＤ」変異体の修飾バージョンは、配列番号２６の軽鎖配列及び配列番号７５−９２及び１１７からなる群から選択される重鎖配列を含む。
【００２９】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗Ｄ因子抗体変異体は、参照抗Ｄ因子抗体の変異体であり、前記参照抗Ｄ因子抗体は、配列番号１の軽鎖配列及び配列番号３４−５３及び１１５からなる群から選択される重鎖配列を含み、また前記変異体は、前記参照抗Ｄ因子抗体に対して以下の配列修飾を含む：配列番号１４の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列及び配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列。かかる変異体は、「修飾ＳＩＥＳＤ」変異体と称される。これらの修飾ＳＩＥＳＤ変異体は、前記ＳＩＥＳＤ変異体と異なり、配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインを含む。
【００３０】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗Ｄ因子抗体変異体は、参照抗Ｄ因子抗体の変異体であり、前記参照抗Ｄ因子抗体は、配列番号１の軽鎖配列と配列番号２の重鎖配列を含み、また前記変異体は、前記参照抗Ｄ因子抗体に対して以下の配列修飾を含む：配列番号１４の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列、配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列及び配列番号１５の重鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｈ３）配列。かかる変異体は、後述する実施例中において「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）と称される（表１参照）。幾つかの実施態様において、前記「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）は、配列番号２８の軽鎖配列及び配列番号２９の重鎖配列を含む。幾つかの実施態様において、前記「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体のＣｙｓ修飾バージョンは、配列番号２８の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含む。幾つかの実施態様において、前記「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体のＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−修飾バージョンは、配列番号２８の軽鎖配列及び配列番号３３の重鎖配列を含む。幾つかの実施態様において、前記「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体の修飾バージョンは、配列番号２８の軽鎖配列及び配列番号９３−１１０及び１１８からなる群から選択される重鎖配列を含む。
【００３１】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗Ｄ因子抗体変異体は、参照抗Ｄ因子抗体の変異体であり、前記参照抗Ｄ因子抗体は、配列番号１の軽鎖配列及び配列番号３４−５３及び１１５からなる群から選択される重鎖配列を含み、また前記変異体は、前記参照抗Ｄ因子抗体に対して以下の配列修飾を含む：配列番号１４の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列、配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列及び配列番号１５の重鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｈ３）配列。かかる変異体は、「修飾ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体と称される。これらの修飾ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ変異体は、前記ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ変異体と異なり、配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインを含む。
【００３２】
幾つかの態様において、本開示は、参照抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内に一又は複数の置換を含む一又は複数の抗Ｄ因子抗体変異体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの態様において、前記参照抗Ｄ因子抗体は、以下のＨＶＲ配列を含む：
ＨＶＲ−Ｌ１：ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号５）；
ＨＶＲ−Ｌ２：ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号６）；
ＨＶＲ−Ｌ３：ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号７）；
ＨＶＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号８）；
ＨＶＲ−Ｈ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号９）；及び
ＨＶＲ−Ｈ３：ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１０）。
その対応する変異体は、以下の置換のうちの一又は複数を含む：
（ａ）  配列番号５のＤ５Ｓ、
（ｂ）  配列番号５のＤ７Ｅ、
（ｃ）  配列番号５のＤ８Ｓ（ａ、ｂ及びｃは配列番号２２で示される）、
（ｄ）  配列番号９のＤ１３Ｅ（配列番号２３）、
（ｅ）  配列番号７のＤ４Ｅ（配列番号２４）、又は
（ｆ）  配列番号１０のＮ５Ｓ（配列番号２５）。
幾つかの実施態様において、前記参照抗Ｄ因子抗体は、配列番号５４−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む。
【００３３】
幾つかの態様において、前記変異体は、上記の置換（ｂ）−（ｄ）を組み合わせたものである。別の態様において、前記変異体は、上記の置換（ｂ）−（ｅ）を組み合わせたものである。別の態様において、前記変異体は、上記の置換（ａ）−（ｄ）を組み合わせたものである。別の態様において、前記変異体は、上記の置換（ａ）−（ｄ）及び（ｆ）を組み合わせたものである。別の態様において、前記変異体は、上記の置換（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の一又は複数を含み、更に、配列番号５４−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む。別の態様において、前記変異体は、以下からなる群から選択される置換を含み：上記の置換（ｂ）−（ｄ）、上記の置換（ｂ）−（ｅ）、上記の置換（ａ）−（ｄ）、及び上記の置換（ａ）−（ｄ）及び（ｆ）、前記変異体は更に、配列番号５４−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む。
【００３４】
幾つかの態様において、本開示は、配列番号１６、１８又は１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む一又は複数の抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の態様において、本開示は、配列番号１７又は２０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、配列番号５４−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含んでもよい。別の態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、配列番号１６、１８又は１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、及び配列番号１７又は２０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。例えば、前記抗Ｄ因子抗体は、配列番号１６の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列及び配列番号１７の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む前記「ＴＭ」変異体（ＡＦＤ．ｖ６）、配列番号１８の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列及び配列番号１７の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む前記「ＴＭ．Ｄ９２Ｅ」変異体（ＡＦＤ．ｖ７）、配列番号１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列及び配列番号１７の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む前記「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）か、又は配列番号１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列及び配列番号２０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む前記「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）であってもよい。
【００３５】
別の態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、配列番号１６、１８又は１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、配列番号１７又は２０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列、並びに配列番号５４−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む。例えば、前記抗Ｄ因子抗体は、配列番号１６の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、配列番号１７の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列、並びに配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む前記「ＴＭ」変異体（ＡＦＤ．ｖ６）の修飾バージョン、配列番号１８の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、配列番号１７の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列、並びに配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む前記「ＴＭ．Ｄ９２Ｅ」変異体（ＡＦＤ．ｖ７）の修飾バージョン、配列番号１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、配列番号１７の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列、並びに配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む前記「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）の修飾バージョン、又は、配列番号１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、配列番号２０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列、並びに配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む前記「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）の修飾バージョンであり得る。
【００３６】
幾つかの実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、配列番号１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、並びに配列番号３０、３１、７５−９２及び１１７からなる群から選択される重鎖配列を含む前記「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）の修飾バージョンである。幾つかの実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、配列番号２６の軽鎖配列、並びに配列番号３０、３１、７５−９２及び１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖配列を含む前記「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）の修飾バージョンである。別の実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、配列番号１９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、並びに配列番号３２、３３、９３−１１０及び１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖配列を含む前記「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）の修飾バージョンである。幾つかの実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、配列番号２８の軽鎖配列、並びに配列番号３２、３３、９３−１１０及び１１８からなる群から選択される重鎖配列を含む前記「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）の修飾バージョンである。
【００３７】
幾つかの態様において、本開示は、配列番号１１又は１４の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６の配列を有するＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７又は１３の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む可変軽鎖と、配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｈ１、配列番号９又は１２の配列を有するＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１０又は１５の配列を有するＨＶＲ−Ｈ３を含む可変重鎖とを有する一又は複数の抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、配列番号５４−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を更に含んでもよい。例えば、前記抗Ｄ因子抗体は、以下の６つのＨＶＲ配列を含む前記「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）：ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号１４）、ＨＶＲ−Ｌ２（配列番号６）、ＨＶＲ−Ｌ３（配列番号７）、ＨＶＲ−Ｈ１（配列番号８）、ＨＶＲ−Ｈ２（配列番号１２）及びＨＶＲ−Ｈ３（配列番号１０）、又は、以下の６つのＨＶＲ配列を含む前記「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）：ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号１４）、ＨＶＲ−Ｌ２（配列番号６）、ＨＶＲ−Ｌ３（配列番号７）、ＨＶＲ−Ｈ１（配列番号８）、ＨＶＲ−Ｈ２（配列番号１２）及びＨＶＲ−Ｈ３（配列番号１５）であってもよい。幾つかの実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、以下の６つのＨＶＲ配列：ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号１４）、ＨＶＲ−Ｌ２（配列番号６）、ＨＶＲ−Ｌ３（配列番号７）、ＨＶＲ−Ｈ１（配列番号８）、ＨＶＲ−Ｈ２（配列番号１２）及びＨＶＲ−Ｈ３（配列番号１０）を含み、更に、配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む、前記「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）の修飾バージョンであってもよい。別の実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、以下の６つのＨＶＲ配列：ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号１４）、ＨＶＲ−Ｌ２（配列番号６）、ＨＶＲ−Ｌ３（配列番号７）、ＨＶＲ−Ｈ１（配列番号８）、ＨＶＲ−Ｈ２（配列番号１２）及びＨＶＲ−Ｈ３（配列番号１５）を含み、更に、配列番号５５−７４及び１１６からなる群から選択される重鎖定常ドメインのアミノ酸配列を含む、前記「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）の修飾バージョンであってもよい。
【００３８】
幾つかの態様において、本開示は、検出可能なＡｓｐ異性化のない一又は複数の抗Ｄ因子抗体変異体を含むコンジュゲートに関し、前記変異体は、異性化を除去する又は低下させる方法によって作製され、前記方法は、（ａ）参照抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内にＡｓｐ異性化しやすい一又は複数のＡｓｐ残基を同定するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で同定された前記Ａｓｐ残基をＧｌｕで置換するステップ、（ｃ）得られた候補変異体をＡｓｐ異性化の有無に関してスクリーニングするステップ、及び（ｄ）それらから検出可能なＡｓｐ異性化を有しない変異体を選抜するステップを含む。幾つかの態様において、上記の方法は、脱アミド化を除去する又は低下させる方法と組み合わされ、前記方法は、（ａ）参照抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内における脱アミド化しやすい一又は複数のＡｓｎ残基を同定するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で同定された前記Ａｓｎ残基をＳｅｒで置換するステップ、（ｃ）得られた候補変異体を脱アミド化の有無に関してスクリーニングするステップ、及び（ｄ）それらから脱アミド化が低下した又は除去された変異体を選抜するステップを含む。別の態様において、異性化を除去する又は低下させる方法は、以下によって、抗体の全電荷を低下させる方法と組み合わされ、後者の方法は、（ａ）参照抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内における一又は複数の負に荷電したアミノ酸残基Ｄ又はＥを選抜するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で選抜された前記残基をＳｅｒで置換するステップ、（ｃ）得られた候補変異体を溶解度に関してスクリーニングするステップ、（ｄ）それらから前記参照抗Ｄ因子抗体と比較し溶解度が改善されていた変異体を選抜するステップを含む。
【００３９】
幾つかの態様において、本開示は、本発明で開示される一又は複数の抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体及び一又は複数のマルチアーム型ポリオールを含むコンジュゲートに関し、前記コンジュゲートは、前記抗Ｄ因子抗体又は本発明で開示される抗体変異体のうちの少なくとも１つを前記ポリオールに共有結合的に連結することによって調製される。幾つかの実施態様において、前記マルチアーム型ポリオールはＰＥＧである。幾つかの実施態様において、前記ＰＥＧはオクタマーである。幾つかの実施態様において、前記ＰＥＧは、本発明で示す一般式（Ｉａ）（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）又は（ＩＶａ）の構造を有する。
【００４０】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートは、安定性が改善された抗Ｄ因子抗体変異体を含む一方で、参照抗Ｄ因子抗体と比較し、前記Ｄ因子との結合親和性が維持されている。幾つかの態様において、前記抗体は、少なくとも約１０−９から１０−１２Ｍの結合親和性でＤ因子と結合する。幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記抗体には、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体が含まれる。
【００４１】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗体は、抗体断片（例えば抗原結合断片）である。前記抗体断片は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、又は抗体断片から形成した多重特異性抗体であってもよい。
【００４２】
本開示の別の態様において、本開示には、本開示のコンジュゲートを含む組成物が含まれる。別の態様において、本開示は、本明細書に記載のように、本開示のコンジュゲートを担体との組合せで含む組成物に関する。任意選択的には、前記担体は薬学的に許容される担体である。
【００４３】
幾つかの態様において、本開示は、本明細書に記載の前記コンジュゲートを治療的有効濃度で含む薬学的製剤を含む。幾つかの態様において、前記薬学的製剤は、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、約１００から約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１００から約２００ｍｇ／ｍＬ、約１００から約３００ｍｇ／ｍＬ、約１００から約４００ｍｇ／ｍＬ、約１００から約５００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４００ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも約５００ｍｇ／ｍＬの濃度で、前記抗体又は抗体変異体を含む。幾つかの態様において、前記製剤中の前記抗体又は抗体変異体の濃度は、約２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００ｍｇ／ｍＬである。幾つかの態様において、前記製剤の前記抗体又は抗体変異体の濃度は、約４５０ｍｇ／ｍＬ未満である。
【００４４】
本開示の別の態様は、本開示のコンジュゲート又は薬学的製剤の、過剰な又は制御されない補体活性化に関連する障害の治療のための使用である。一実施態様において、本開示は、対象における補体関連障害を治療する方法に関し、前記方法は、前記対象に、本開示のコンジュゲート又は薬学的製剤を投与することを含む。前記障害には、心肺バイパス術間の補体活性化、急性心筋梗塞後の虚血再灌流、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、圧挫、多臓器不全、血液量減少ショック、腸の虚血又は他の虚血を生じさせるイベントに起因する補体活性化が含まれる。補体活性化はまた、重篤な熱傷、内毒血症、敗血症性ショック、成人性呼吸促迫症候群、血液透析、アナフィラキシーショック、重篤な喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球性貧血、連鎖球菌感染後糸球体腎炎及び膵炎などの炎症性症状とも関係することが示されている。前記障害は、薬物副作用、薬物アレルギー、ＩＬ−２誘導による脈管漏出症候群又はＸ線撮影造影剤アレルギーの結果である場合がある。一実施態様において、前記補体関連障害は全身性障害である。それには、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、関節リウマチ、アルツハイマー病及び多発性硬化症などの自己免疫疾患が含まれ得る。別の実施態様において、補体活性化はまた移植片拒絶反応とも関係する。別の実施態様において、補体活性化はまた、眼性疾患（全ての眼性症状及び疾患は、補体の古典経路及び副経路などの、補体が関与する病理）又は、例えば、限定されないが黄斑変性疾患（例えば全ての段階の加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（ドライ型及びウエット型（非滲出性及び滲出性）を含む））、糖尿病性網膜症及び他の虚血関連網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル−リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生及び網膜血管新生などの補体関連の眼性症状とも関係する。一例において、補体関連の眼性症状には、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出性（例えば中期のドライ型ＡＭＤ又は地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出性の（例えばウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びブドウ膜炎が含まれる。更なる例において、非滲出性ＡＭＤでは、硬性ドルーゼン、軟性ドルーゼン、地図状萎縮及び／又は色素クランピングが存在する場合がある。別の例において、補体関連の眼性症状には、早期ＡＭＤ（例えば多数の小サイズ〜一又は複数の拡張されていない中間サイズのドルーゼンを含む）、中期ＡＭＤ（例えば拡張された中間サイズのドルーゼン〜一又は複数の大サイズのドルーゼンを含む）、及び進行したＡＭＤ（例えば地図状萎縮又は進行したウエット型ＡＭＤ（ＣＮＶ））などの加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）が含まれる。更なる例において、中期ドライ型ＡＭＤでは、大サイズのコンフルエントなドルーゼンが含まれる場合がある。更なる例において、地図状萎縮では、光受容体及び／又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）の損失が含まれる場合がある。更なる例において、地図状萎縮の領域は、大小何れかであってもよく、及び／又は、網膜黄斑の領域又は末梢網膜のいずれにも存在し得る。一例において、前記補体関連の眼性症状は中期ドライ型ＡＭＤである。一例において、前記補体関連の眼性症状は地図状萎縮である。一例において、前記補体関連の眼性症状はウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。一実施態様において、前記コンジュゲート又は薬学的製剤は、移植可能なポート送達系を使用して投与される。一実施態様において、前記コンジュゲート又は薬学的製剤は、硝子体内投与によって投与される。一実施態様において、前記方法又は使用は更に、前記対象にＨＴＲＡ１アンタゴニスト、ＡＮＧ２アンタゴニスト、ＴＩＥ２アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、又は前記Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８又はＣ９補体成分の一又は複数のアンタゴニストなどの更なる治療剤を投与することを含む。
【００４５】
別の態様において、本開示は、本開示のコンジュゲートを含むキットを提供する。幾つかの実施態様において、本開示は、本開示のコンジュゲートと、使用説明書とを含むキットを提供する。幾つかの実施態様において、本開示は、本開示のコンジュゲート及び前記コンジュゲートを投与して補体関連障害を治療するための使用説明書を含むキットに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、本開示の一又は複数のコンジュゲートを含む組成物を含む第１の容器と、バッファーを含む第２の容器とを含むキットを提供する。幾つかの実施態様において、前記バッファーは薬学的に許容される。幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートを含む組成物は、担体を更に含み、幾つかの実施態様において、それは薬学的に許容される。幾つかの実施態様において、キットは更に、対象に前記組成物（例えば一又は複数の抗体、又はその抗体断片（例えば抗原結合断片）を含む前記コンジュゲート）を投与するための使用説明書を含む。幾つかの実施態様において、キットは更に、前記キットの使用説明書を含む。
【００４６】
幾つかの態様において、本開示は、補体関連障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品に関する。幾つかの実施態様において、本開示は、（ａ）容器、（ｂ）前記容器のラベル、及び（ｃ）前記容器に含まれる、本開示のコンジュゲートを含む組成物を含む製造品に関し、前記容器の前記ラベルは、前記組成物が補体関連障害の治療、予防及び／又は診断に使用できることを示す。
【００４７】
幾つかの態様において、本開示は、補体関連の眼性症状などの疾患の治療的及び／又は予防処置用の医薬の調製への、本開示のコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様において、本開示は、対象における補体関連の眼性症状などの補体関連障害を治療する方法に関し、前記方法は、前記対象に本開示のコンジュゲート又は薬学的製剤を投与することを含む。幾つかの実施態様において、前記補体関連の眼性症状は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出性（例えば中期ドライ型ＡＭＤ又は地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出性の（例えばウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びブドウ膜炎から選択される。一例において、前記補体関連の眼性症状は中期ドライ型ＡＭＤである。一例において、前記補体関連の眼性症状は地図状萎縮である。一例において、前記補体関連の眼性症状はウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【００４８】
幾つかの態様において、本開示は、補体関連の眼性症状などの疾患の治療的及び／又は予防処置用の医薬の調製への、本開示の製造品の使用を提供する。幾つかの実施態様において、前記補体関連の眼性症状は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出性（例えば中期ドライ型ＡＭＤ又は地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出性の（例えばウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びブドウ膜炎から選択される。一例において、前記補体関連の眼性症状は中期ドライ型ＡＭＤである。一例において、前記補体関連の眼性症状は地図状萎縮である。一例において、前記補体関連の眼性症状はウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【００４９】
幾つかの態様において、本開示は、補体関連の眼性症状などの疾患の治療的及び／又は予防処置用の医薬の調製への、本開示のキットの使用を提供する。幾つかの実施態様において、前記補体関連の眼性症状は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出性（例えば中期ドライ型ＡＭＤ又は地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出性の（例えばウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びブドウ膜炎から選択される。一例において、前記補体関連の眼性症状は中期ドライ型ＡＭＤである。一例において、前記補体関連の眼性症状は地図状萎縮である。一例において、前記補体関連の眼性症状はウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【００５０】
幾つかの態様において、本開示は、一又は複数のＤ因子アンタゴニストを含み、更に、ＨＴＲＡ１アンタゴニスト、ＡＮＧ２アンタゴニスト、ＴＩＥ２アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、又は一又は複数のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９補体成分のアンタゴニストを含むコンジュゲートを含む製剤を提供する。幾つかの実施態様において、前記Ｄ因子アンタゴニストは抗Ｄ因子抗体である。更なる実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体変異体である。幾つかの実施態様において、前記ＨＴＲＡ１アンタゴニストは抗ＨＴＲＡ１抗体である。別の実施態様において、前記ＡＮＧ２アンタゴニストは抗ＡＮＧ２抗体である。別の実施態様において、前記ＴＩＥ２アンタゴニストは抗ＴＩＥ２抗体である。別の実施態様において、前記ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体である。別の実施態様において、Ｃ２及び／又はＣ４及び／又はＣ５補体成分の前記アンタゴニストは、抗Ｃ２及び／又は抗Ｃ４及び／又は抗Ｃ５抗体である。
【００５１】
幾つかの態様において、過剰な又は制御されない補体活性化に関連する障害を有するヒト対象における、前記過剰な又は制御されない補体活性化に関連する障害の治療は、前記対象に、一又は複数のＤ因子アンタゴニストを含むコンジュゲートなどの治療化合物の有効量を投与することを含み、更に、前記対象に、ＨＴＲＡ１アンタゴニスト、ＡＮＧ２アンタゴニスト、ＴＩＥ２アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、又は一又は複数のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９補体成分のアンタゴニストなどの第２の治療化合物の有効量を投与することを含む。幾つかの実施態様において、前記Ｄ因子アンタゴニストは抗Ｄ因子抗体である。幾つかの実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体変異体である。幾つかの実施態様において、前記ＨＴＲＡ１アンタゴニストは抗ＨＴＲＡ１抗体である。別の実施態様において、前記ＡＮＧ２アンタゴニストは抗ＡＮＧ２抗体である。別の実施態様において、前記ＴＩＥ２アンタゴニストは抗ＴＩＥ２抗体である。別の実施態様において、前記ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体である。別の実施態様において、Ｃ２及び／又はＣ４及び／又はＣ５補体成分の前記アンタゴニストは、抗Ｃ２及び／又は抗Ｃ４及び／又は抗Ｃ５抗体である。
【００５２】
幾つかの態様において、前記Ｄ因子アンタゴニストと何れかの第２の治療化合物とを含む前記コンジュゲートの前記投与は、例えば一つの組成物として、又は同じ若しくは異なる投与経路を用いて２つ以上の異なる組成物として、同時に実施することができる。或いは、又はそれに加えて、前記投与は、何らかの順序において、経時的に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】参照抗Ｄ因子抗体ＷＴの（ａＦＤ．ＷＴ）及びその選抜された変異体のアミノ酸配列（ＷＴの軽鎖及び重鎖配列）を表す図である。前記可変ドメイン内のＨＶＲを下線で示す。前記変異体の残基の置換を太字で示す。
【図１Ｂ】参照抗Ｄ因子抗体ＷＴ（ａＦＤ．ＷＴ）及びその選抜された変異体のアミノ酸配列（軽鎖軽鎖及び重鎖可変ドメインのアラインメント）を表す図である。前記可変ドメイン内のＨＶＲを下線で示す。前記変異体の残基の置換を太字で示す。
【図１Ｃ】参照抗Ｄ因子抗体ＷＴ（ａＦＤ．ＷＴ）及びその選抜された変異体のアミノ酸配列（ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の軽鎖及び重鎖配列、並びにＣｙｓ修飾ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−修飾ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の重鎖配列）を表す図である。前記可変ドメイン内のＨＶＲを下線で示す。前記変異体の残基の置換を太字で示す。Ｃｙｓ及びＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号２１）修飾をイタリックで示す。
【図１Ｄ】参照抗Ｄ因子抗体ＷＴ（ａＦＤ．ＷＴ）及びその選抜された変異体のアミノ酸配列（ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の軽鎖及び重鎖配列、並びにＣｙｓ修飾ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）及びＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−修飾ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の重鎖配列）を表す図である。前記可変ドメイン内のＨＶＲを下線で示す。前記変異体の残基の置換を太字で示す。Ｃｙｓ及びＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号２１）修飾をイタリックで示す。
【図２Ａ】所定の条件下（ｐＨ５．５のバッファー中１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂタンパク質濃度）での、様々な抗体Ｆａｂ断片の長期間にわたる抗原結合能を示す図である。
【図２Ｂ】所定の条件下（ＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での、様々な抗体Ｆａｂ断片の長期間にわたる抗原結合能を示す図である。
【図２Ｃ】所定の条件下（図２ＣはＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での、様々な抗体Ｆａｂ断片の長期間にわたる抗原結合能を示す図である。
【図３Ａ】所定の条件下（ｐＨ５．５のバッファー中１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂタンパク質濃度）での、様々な抗体Ｆａｂ断片の時間経過に伴う分解を、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）による主ピークの測定により示す図である。
【図３Ｂ】所定の条件下（ＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での、様々な抗体Ｆａｂ断片の時間経過に伴う分解を、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）による主ピークの測定により示す図である。
【図４Ａ】所定の条件下（ｐＨ５．５のバッファー中１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂタンパク質濃度）での、様々な抗体Ｆａｂ断片の時間経過に伴う異性化及び脱アミド化を示す図である。
【図４Ｂ】所定の条件下（ＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での、様々な抗体Ｆａｂ断片の時間経過に伴う異性化及び脱アミド化を示す図である。
【図５】所定の条件下（ＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるモノマーのピーク測定値から決定される長期間にわたる様々な抗体のＦａｂ断片の凝集を示す図である。
【図６】ｐＨ６及び低いイオン強度（２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６）中、〜１００  ｍｇ／ｍｌ）におけるａＦＤ．ＷＴ、ＡＦＤ．ｖ２、ＡＦＤ．ｖ６及びＡＦＤ．ｖ８の溶解度を示す図である。
【図７】ｐＨ６及び低いイオン強度（２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６）中、〜１００ｍｇ／ｍｌ）における抗体のＦａｂ断片の溶解度を示す図である。ａＦＤ．ＷＴの不溶度は、透析を経たＰＢＳ（塩（ＮａＣｌ）含有バッファー）への交換により逆転する。
【図８】ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中、ａＦＤ．ＷＴでは２２７ｍｇ／ｍｌ、ＡＦＤ．ｖ８では２６９ｍｇ／ｍｌ、及びＡＦＤ．ｖ１４．では３４４ｍｇ／ｍｌでの、抗体Ｆａｂ断片の溶解度を示す図である。
【図９】２−８℃で３週間のインキュベートの前に、ＰＢＳ中のＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で測定した凝集体のパーセンテージを示す。
【図１０Ａ】３７℃の熱ストレス下、長期間にわたる、高濃度（２７２ｍｇ／ｍＬ）のＡＦＤ．ｖ８製剤（２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ５．５）の抗原結合能を示す図である。陰影が付された領域は、測定値における前記±１０％標準誤差を意味する。
【図１０Ｂ】３７℃の熱ストレス下、長期間にわたる、高濃度（２７２ｍｇ／ｍＬ）のＡＦＤ．ｖ８製剤（２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ５．５）の化学的及び物理的安定性を示す図である。前記Ｎ１０１及びＥ９５はカバット番号付けによる。
【図１１】ウサギへの硝子体内注入後の、抗体Ｆａｂ断片の薬物動態を示す図である。
【図１２】ｐＨ５．５のバッファー中、抗体Ｆａｂ断片の粘性の、タンパク質濃度依存性を示す図である。
【図１３Ａ】ヘキサグリセロール（ＨＧＥＯ）コア（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ社）を含むマルチアーム型ＰＥＧのＭＡＬＤＩ解析を示す図である。
【図１３Ｂ】トリペンタエリスリトール（ＴＰ）コア（８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）を含むマルチアーム型ＰＥＧのＭＡＬＤＩ解析を示す図である。
【図１４Ａ】２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸塩、ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ（イソクラティック勾配）での、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの精製の結果を示す図である（ＳＥＣカラムの最初のクロマトグラム）。
【図１４Ｂ−Ｃ】２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸塩、ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ（イソクラティック勾配）での、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの精製の結果を示す図である（図１４Ｂ：６００ｍＬから１１００ｍＬでのピーク展開、図１４Ｃ：図１４Ｂで示す精製の間に回収したクロマトグラム画分のＭＡＬＳプロファイル）。
【図１５Ａ】２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸塩、ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ（イソクラティック勾配）での、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いたＳＥＣによる、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマーの精製の結果を示す図である（ＳＥＣカラムの最初のクロマトグラム）。
【図１５Ｂ−Ｃ】２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸塩、ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ（イソクラティック勾配）での、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いたＳＥＣによる、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマーの精製の結果を示す図である（図１５Ｂ：２９００−３６００ｍＬでの図１５Ａのクロマトグラムの展開、図１５Ｃ：図１５Ｂに示す精製の間に回収したクロマトグラム画分のＭＡＬＳプロファイル）。
【図１６Ａ−Ｂ】ＰＢＳ（ｐＨ７．４）での、セファクリルＳ−４００ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いたＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマーの解析結果を示す図である（図１６Ａ：カラムの最初のクロマトグラム、図１６Ｂ：図１６ＡのクロマトグラムのＭＡＬＳプロファイル）。
【図１７Ａ】２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸塩、ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ（イソクラティック勾配）での、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いたＳＥＣによるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧＥＯオクタマーの精製、それに続く、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．２５ｍＬ／分での、セファクリルＳ−４００ＨＲを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＳ特徴解析の結果を示す図である（ＳＥＣ  Ｓ−４００カラムの最初のクロマトグラム）。
【図１７Ｂ】２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸塩、ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ（イソクラティック勾配）での、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いたＳＥＣによるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧＥＯオクタマーの精製、それに続く、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．２５ｍＬ／分での、セファクリルＳ−４００ＨＲを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＳ特徴解析の結果を示す図である（図１７Ａのクロマトグラム画分のＭＡＬＳプロファイル）。
【図１８Ａ】２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸塩、ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ（イソクラティック勾配）での、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いたＳＥＣによるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧＥＯオクタマーの精製、それに続く東ソーＧ３０００ＰＷカラムを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＳ特徴解析の結果を示す図である（ＳＥＣ  Ｓ−３００カラムの最初のクロマトグラム）。
【図１８Ｂ】２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸塩、ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ（イソクラティック勾配）での、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いたＳＥＣによるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧＥＯオクタマーの精製、それに続く東ソーＧ３０００ＰＷカラムを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＳ特徴解析の結果を示す図である（Ｇ３０００ＰＷカラムを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＳによる、図１８ＡからのＳ−３００画分のレーザー強度のオーバレイ）。
【図１９Ａ】実施例９ａで選抜した画分（図１４に示す）の、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄、５０ＣＶにわたる１Ｍ  ＮａＣｌの１０−２０％勾配での陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）による更なる精製を示す図である（ＣＥＸカラムの最初のクロマトグラム）。
【図１９Ｂ】実施例９ａで選抜した画分（図１４に示す）の、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄、５０ＣＶにわたる１Ｍ  ＮａＣｌの１０−２０％勾配での陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）による更なる精製を示す図である（ＣＥＸカラムからの画分のＳＥＣゲル）。
【図１９Ｃ】実施例９ａで選抜した画分（図１４に示す）の、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄、５０ＣＶにわたる１Ｍ  ＮａＣｌの１０−２０％勾配での陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）による更なる精製を示す図である（図１９Ａのクロマトグラム画分のＭＡＬＳプロファイル）。
【図２０】ＣＥＸ精製後のＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの最終解析ランを示す図である。
【図２１Ａ】前記ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、ＳＥＣ  Ｓ−４００ＨＲカラムを用いたＳＥＣクロマトグラフィー又はＳＥＣ  Ｓ−３００ＨＲカラムを用いたＳＥＣクロマトグラフィーの間で、精製方法の結果を比較した図である（３つの異なる精製カラムを用いたクロマトグラムの積み重ね表示）。
【図２１Ｂ】前記ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、ＳＥＣ  Ｓ−４００ＨＲカラムを用いたＳＥＣクロマトグラフィー又はＳＥＣ  Ｓ−３００ＨＲカラムを用いたＳＥＣクロマトグラフィーの間で、精製方法の結果を比較した図である（３つの異なる精製カラムから得た試料を比較したＳＥＣゲル）。
【図２２Ａ】異なるコアを有するＰＥＧで調製されたＰＥＧ−Ｆａｂコンジュゲートを比較した図である（異なるコアを有するコンジュゲートの精製試料を比較したＳＥＣゲル）。
【図２２Ｂ】異なるコアを有するＰＥＧで調製されたＰＥＧ−Ｆａｂコンジュゲートを比較した図である（異なるコアを用いて調製したコンジュゲートのＭＡＬＳプロファイル）。
【図２３】ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマー及びＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  社製のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＰＴＥ−４００ＭＡ（テトラマー）から調製したＰＥＧ−Ｆａｂコンジュゲートの、ＡＦＤ．ｖ１４濃度の関数としての粘性を示す図である。
【図２４】２０ｍＬのＨｉｓ−Ａｃｅ、ｐＨ６．５及び５０ｍＭのＮａＣｌ、２０℃での、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧＥＯオクタマーの、ＡＦＤ．ｖ１４濃度の関数としての粘性を示す図である。
【図２５Ａ−Ｂ】１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ（図２５Ａ）、及び、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５（図２５Ｂ）での、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの、時間の関数としての熱安定性を示す図である。
【図２６】熱安定性試験におけるＦａｂ断片の徐放及び二量体化を示す図である（コンジュゲートの時間経過に伴うＳＥＣ−ＭＡＬＳ解析）。
【図２７】熱安定性試験におけるＦａｂ断片の徐放二量体化を示す図である（コンジュゲートの時間経過に伴うＣＥ−ＳＤＳ解析）。
【図２８】表面プラスモン共鳴により測定される熱安定性試験の間、Ｄ因子に対するＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの結合能が維持されることを示す図である。
【図２９Ａ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの投与後の、カニクイザル硝子体液中の、時間経過に対するＡＦＤ．ｖ１４の濃度を示す図である（硝子体液中濃度）。
【図２９Ｂ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの投与後の、カニクイザル硝子体液中の、時間経過に対するＡＦＤ．ｖ１４の濃度を示す図である（薬剤の力価を基準とした硝子体液中の濃度データ）。
【図３０Ａ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの投与後の、カニクイザルの眼房水中の、時間経過に対するＡＦＤ．ｖ１４の濃度を示す図である（眼房水中濃度）。
【図３０Ｂ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの投与後の、カニクイザルの眼房水中の、時間経過に対するＡＦＤ．ｖ１４の濃度を示す図である（薬剤の力価を基準とした眼房水中の濃度データ）。
【図３１Ａ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの投与後の、カニクイザル網膜ホモジェネート中の、時間経過に対するＡＦＤ．ｖ１４の濃度を示す図である（網膜中濃度）。
【図３１Ｂ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの投与後の、カニクイザル網膜ホモジェネート中の、時間経過に対するＡＦＤ．ｖ１４の濃度を示す図である（薬剤の力価を基準とした網膜中の濃度データ）。
【図３２Ａ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの硝子体内への注入投与後の、カニクイザル血清中の、時間経過に対するＡＦＤ．ｖ１４の濃度を示す図である（硝子体内注入の場合の血清中濃度）。
【図３２Ｂ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの硝子体内への注入投与後の、カニクイザル血清中の、時間経過に対するＡＦＤ．ｖ１４の濃度を示す図である（硝子体内注入の場合の、薬剤の力価を基準とした血清中濃度）。
【図３２Ｃ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの静脈内への注入投与後の、カニクイザル血清中の、時間経過に対するＡＦＤ．ｖ１４の濃度を示す図である（静脈内投与の場合の血清中濃度）。
【図３３Ａ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの静脈内又は硝子体内注入投与後の、Ｄ因子及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの濃度の比較を示す図である（血清中濃度）。
【図３３Ｂ】薬物動態研究におけるＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの静脈内又は硝子体内注入投与後の、Ｄ因子及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの濃度の比較を示す図である（眼内濃度）。
【図３４Ａ】Ｄ因子依存性のＢ因子活性化に関する、時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイによる阻害曲線を示す図である（非コンジュゲートＦａｂと比較した、Ｆａｂ−テトラマーコンジュゲート）。
【図３４Ｂ】Ｄ因子依存性のＢ因子活性化に関する、時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイによる阻害曲線を示す図である（非コンジュゲートＦａｂと比較した、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー）。
【図３５Ａ】硝子体内投与後の、カニクイザル血清中の全Ｄ因子及び治療剤濃度と比較した、全身性ＡＰの補体価を示す図である（１０ｍｇ／眼  ランパリズマブ（比較データ））。
【図３５Ｂ】硝子体内投与後の、カニクイザル血清中の全Ｄ因子及び治療剤濃度と比較した、全身性ＡＰの補体価を示す図である（２５ｍｇ／眼  ＡＦＤ．ｖ１４）。
【図３５Ｃ】硝子体内投与後の、カニクイザル血清中の全Ｄ因子及び治療剤濃度と比較した、全身性ＡＰの補体価を示す図である（３．９ｍｇ／眼  ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー）。
【図３５Ｄ】硝子体内投与後の、カニクイザル血清中の全Ｄ因子及び治療剤濃度と比較した、全身性ＡＰの補体価を示す図である（７．１ｍｇ／眼  ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマー）。
【図３５Ｅ】硝子体内投与後の、カニクイザル血清中の全Ｄ因子及び治療剤濃度と比較した、全身性ＡＰの補体価を示す図である（１１．８ｍｇ／眼  ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマー）。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
定義
本出願の全体を通じて用いられる用語は、当技術分野の当業者にとり通常の及び典型的な意味として解釈されるものである。しかしながら、以下の用語については、出願人は、以下のとおり定義するものとする。
【００５５】
「抗体」という用語は、最も広義の意味で用いられ、具体的には、抗原結合活性などの所望の生物活性を示す限り、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）及び抗体断片を包含する。抗体（Ａｂ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造的特性を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の標的への結合特異性を示す一方、免疫グロブリンは、標的特異性が欠如する抗体及び他の抗体様の分子を包含する。天然の抗体及び免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンの、通常ヘテロテトラマーの糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、一定数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、明らかに、抗原結合活性を保持する抗体断片を包含する。
【００５６】
「抗体断片」は、インタクトな抗体以外の分子であって、前記インタクトな抗体が結合する抗原と結合する、前記インタクトな抗体の一部を含む分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ−ＳＨ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ−ＳＨ、Ｆａｂ−Ｃ−ＳＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ又はＦ（ａｂ）２、ダイアボディ（複数）、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片に由来する多重特異性抗体が含まれる。
【００５７】
本明細書では、「抗Ｄ因子抗体」は、補体活性化を阻害するか、実質的に減少させる態様でＤ因子と特異的に結合する抗体を意味する。
【００５８】
「Ｄ因子」という用語は、本明細書では天然の配列の、及び変異体のＤ因子ポリペプチドを指す。
【００５９】
本明細書では、「ＡＦＤ．Ａｂ」という用語はあらゆる抗Ｄ因子抗体を指す。
【００６０】
本明細書では、「Ｆａｂ」は、ＣＨ１ドメインを含むか、又は軽鎖定常領域とジスルフィド結合を形成するがＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインを含まないＣＨ１ドメインの大部分を含む、重鎖定常領域を含む抗体を指す。本明細書では、Ｆａｂは前記ヒンジ領域の一又は複数のアミノ酸を含んでもよい。したがって、本明細書では、「Ｆａｂ」という用語にはＦａｂ’抗体が包含される。Ｆａｂは更に非天然アミノ酸（例えばＣ末端システイン）を含んでもよく、その場合には、それはＦａｂ−Ｃと称される場合がある。後述するように、用語Ｆａｂ−Ｃにはまた、Ｃ末端に天然のシステインを含む、ヒンジ領域の天然アミノ酸を含むＦａｂが包含される。幾つかの実施態様において、Ｆａｂは操作されたシステインを含む（すなわち、ＦａｂはＴＨＩＯＭＡＢであってもよい）。
【００６１】
「Ｆａｂ−Ｃ」は、Ｃ末端システインを有するＦａｂを指し、それは、その残基位置に存在する天然システインであってもよく（例えばヒンジ領域由来のシステイン）、又は天然のシステインに対応しないＣ末端に付加されたシステインであってもよい。前記抗Ｄ因子抗体は、当然ながらＡＦＤ．Ｃ抗体を含み、その「Ｃ」とは、前記抗体がＣ末端システインを有するＦａｂであることを示す。非限定的な例示的Ｆａｂ−Ｃ重鎖定常領域には、配列番号５６、５７、５９、６０、６１、６２、６８及び７４の配列が含まれる。
【００６２】
「Ｆａｂ−ＳＨ」は、遊離チオール基を有するＦａｂを指す。幾つかの実施態様において、前記遊離チオール基は、ＦａｂのＣ末端の最後の１０アミノ酸中に位置する。Ｆａｂ−Ｃ抗体は、典型的にはＦａｂ−ＳＨ抗体でもある。更に非限定的なＦａｂ−ＳＨ重鎖定常領域の例では、配列番号５８のアミノ酸配列を有する。典型的には、操作されたシステインを含むＦａｂ（すなわちＴＨＩＯＭＡＢであるＦａｂ）はＦａｂ−ＳＨである。
【００６３】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照。）一つのＶＨ又はＶＬドメインでも、抗原結合特異性を付与するのに十分な場合がある。更に、特定の抗原と結合する抗体に由来するＶＨ又はＶＬドメインを使用して、前記抗原と結合する抗体を単離し、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングしてもよい。Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)、Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００６４】
「可変的である」という用語は、可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性付与に用いられるという事実を指す。しかしながら、前記可変性は、抗体の可変ドメインを通じて均一に分配されていない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの超可変領域と呼ばれる３つの部分に集中している。可変ドメイン中のより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、３つの超可変領域により連結される主にβ−シートの立体配置を採る４つのＦＲを含み、前記超可変領域は、前記β−シート構造を連結するループを形成するか、場合によっては前記β−シート構造の一部を形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲにより近い位置関係に置かれ、他の鎖に由来する超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関係せず、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
【００６５】
抗体のパパイン分解により、「Ｆａｂ」断片と称され、各々が一つの抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片、及び残余の一つの、名前のとおり容易に結晶する能力を表す「Ｆｃ」断片が産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、抗原の架橋が未だ可能な一つのＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００６６】
前記Ｆａｂ断片はまた、軽鎖定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片（Ｆａｂ−Ｃを含む）は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されている点で、Ｆａｂ断片と異なる。遊離チオール基を有する抗体断片は、「−ＳＨ」で示される場合がある。Ｆａｂ’−ＳＨ（Ｆａｂ−Ｃ−ＳＨを含む）は、前記定常ドメインの少なくとも一つのシステイン残基が遊離チオール基を有する、Ｆａｂ’を示す表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものである。他の抗体断片の化学的カップリングも公知である。
【００６７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む、最小限の抗体断片である。この領域は、強固な非共有結合による会合により、１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインのダイマーからなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を画定するのは、この構成においてである。まとめると、前記６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、一つの可変ドメイン（又は抗原特異的な３つの超可変領域のみを含む半分のＦｖ）であっても抗原の認識及び結合能力を有するが、完全な結合部位と比較し親和性が低い。
【００６８】
本明細書で用いられる「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、高い可変性を有する配列を有し、及び／又は、ループ構造を形成する（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの各領域を指す。通常、天然の四鎖型の抗体は、６つのＨＶＲ、すなわち３つのＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及び３つのＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは通常、超可変ループからの、及び／又は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、最も配列可変性が高く、及び／又は抗原認識に関与するのは後者の方である。ＨＶＲ−Ｈ３は、抗体に微細な特異性を付与するという固有の役割を果たすと考えられている。Xu et al. (2000) Immunity 13:37-45、Johnson and Wu (2003) in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J.)を参照。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される前記超可変領域の残基以外の可変ドメインの残基である。本明細書で用いられるＨＶＲ領域は、位置２４−３６（Ｌ１）、４６−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、２６−３５Ｂ（Ｈ１）、４７−６５（Ｈ２）及び９３−１０２（Ｈ３）内に位置するいかなる数の残基も含む。したがって、ＨＶＲには、前記の位置の以下のような残基が含まれる：
Ａ）  ２４−３４（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）、
Ｂ）  Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５及びＨ３の９５−１０２（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）、
Ｃ）  ３０−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、９３−１００ａ−ｊ（Ｈ３）（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)）。
【００６９】
超可変領域は、以下のような「拡大超可変領域」を含む場合がある：ＶＬにおいて２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、並びに、ＶＨにおいて２６−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−６５、４７−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）。これらの各定義における可変ドメインの残基は、Ｋａｂａｔら（上記）の方法に従い番号付けされる。
【００７０】
ＶＨのＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含み、それは抗原と接触する残基である。ＳＤＲは、略称（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ）ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的ａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２とａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８及びＨ３の９５−１０２のアミノ酸残基で生じる（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）。
【００７１】
参照抗体の「抗体変異体」又は「修飾抗体」（また「出発抗体」又は「親抗体」とも称される）は、前記参照／出発抗体とは異なるアミノ酸配列を含み、前記参照抗体の前記アミノ酸残基の一つ以上が修飾されている抗体である。通常、抗体変異体は、前記参照抗体に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。配列同一性（％）は、参照抗体の配列と候補抗体変異体とを、最大限相同となるようにアラインメントした後に、例えばNeedleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970)のアルゴリズムの変形であるFitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1382-1386 (1983)の方法により決定できる。同一性又は類似性は、本明細書では、これらの配列をアラインメントし、必要に応じて、最大限の配列同一性（％）を得るためにギャップを導入した後における、候補変異体配列内の、親抗体の残基と同一である（すなわち同じ残基）又は類似する（すなわち共通の側鎖特性に基づき分類された同じ群のアミノ酸残基を有する、下記参照）アミノ酸残基のパーセンテージと定義される。抗体のアミノ酸配列変異体は、前記抗体をコードするＤＮＡに適切なヌクレオチド変異を導入することによって調製してもよく、又はペプチド合成で調製してもよい。かかる変異体は、目的の抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終的なコンストラクトが望ましい特性を具備する限りにおいて、欠失、挿入及び置換を任意に組み合わせて前記最終的なコンストラクトを得る。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの、抗体の翻訳後プロセスを変化させることができる。抗体の抗体配列変異体を生成させる方法は、例えば、参照により本発明に全開示内容が援用される米国特許第５，５３４，６１５号に記載の、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体の生成方法と同様の方法が適用できる。
【００７２】
抗体などのタンパク質は、それが基本的に完全な立体的構造及び生物活性を保持する場合に、「安定である」といえる。タンパク質の安定性を測定するための様々な解析手法が当該技術分野で利用でき、例えばPeptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)及びJones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90に概説がある。「改善された安定性」を有する抗体変異体は、出発参照抗体と比較し安定である抗体変異体を指す。好ましくは、改善された安定性を有する抗体変異体は、物理的安定性及び／又は化学安定性及び／又は生物活性を改善し、及び／又は前記天然型抗体の免疫原性を低下させることを目的として、特定のアミノ酸残基が変更された天然型（野生型）抗体の変異体である。Walsh (2000) Nat. Biotech. 18:831-3を参照。
【００７３】
「異性化」という用語は、一般に、化合物が化学的に何れかの異性体形状に形質転換する、すなわち、同じ化学組成を有するが異なる構造又は立体配置を有し、それにより、通常、異なる物理的及び化学的特性を有する形状に変化する化学的プロセスを指す。特に本発明で用いられるのはアスパラギン酸異性化であり、それはポリペプチドの一又は複数のアスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）残基がイソアスパラギン酸残基に形質転換するプロセスである。Geiger and Clarke (1987) J. Biol. Chem. 262:785-94。
【００７４】
「脱アミド化」という用語は、一般に、アミド官能基が有機化合物から除去される化学反応を指す。特に本発明で用いられるのはアスパラギンの脱アミド化であり、それはポリペプチドの一又は複数のアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基がアスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）に変化し、すなわち、前記中性アミド側鎖が全体的に酸性の特性を有する残基に変化するプロセスである。Xie and Schowen (1999) J. Pharm. Sci. 88: 8-13を参照。
【００７５】
特定の同定された物理的又は化学的プロセス（例えば異性化又は脱アミド化）を「しやすい」アミノ酸残基は、特定のタンパク質分子内の、前記同定されたプロセス（例えば異性化又は脱アミド化）を受ける傾向を有するとして同定された残基を指す。それらの傾向は、前記タンパク質の一次構造及び／又は立体構造中のそれらの相対的な位置により決定されることが多い。例えば、Ａｓｐ−ＸＸＸモチーフ（ＸＸＸはＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり得る）内の第１のＡｓｐが、その隣接する残基の関与によりＡｓｐ異性化をしやすい一方、同じタンパク質内の他の幾つかのＡｓｐがかかる傾向を示しにくいことが示されている。特定のタンパク質分子内の、特定のプロセスに供される残基を同定するための分析方法は当該技術分野で公知である。例えばCacia et al (1996) Biochem. 35:1897-1903を参照。
【００７６】
本開示の抗Ｄ因子抗体に関する「活性を有する」又は「活性」又は「生物活性」とは、Ｄ因子の生物活性をアンタゴナイズする（部分的又は完全に阻害する）能力のことである。Ｄ因子アンタゴニストの生物活性の一つの例は、補体関連の眼性症状などの、Ｄ因子関連の疾患又は症状の状態、例えば病理に対して顕著な改善をもたらす能力である。前記活性は、適切なモデル動物又はヒト臨床治験を利用した結合アッセイ、副経路溶血アッセイ（例えば副経路補体価又は活性化の阻害を測定するアッセイ）などのインビトロ又はインビボ試験で測定できる。
【００７７】
「補体関連障害」という用語は、最も広義の意味で用いられ、過剰な又は制御されない補体活性化に関連する障害が含まれる。それらには心肺バイパス術の間の補体活性化や、急性心筋梗塞後の虚血再灌流、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、圧挫、多臓器不全、血液量減少性ショック、腸虚血又は他の虚血を引き起すイベントによる補体活性化が含まれる。補体活性化は、重篤な熱傷、内毒血症、敗血症性ショック、成人性呼吸促迫症候群、血液透析などの炎症性症状、アナフィラキシーショック、重篤な喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球性貧血、連鎖球菌感染後糸球体腎炎及び膵炎と関連することも示されている。前記障害は、薬物の副作用、薬物アレルギー、ＩＬ−２誘導による脈管漏出症候群又はＸ線撮影造影剤アレルギーの結果である場合がある。それにはまた、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、関節リウマチ、アルツハイマー病及び多発性硬化症などの自己免疫疾患が含まれる。補体活性化はまた、移植片拒絶反応とも関連する。補体活性化はまた、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症及び他の虚血関連網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル−リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生及び網膜血管新生などの眼性疾患とも関連する。
【００７８】
「補体関連の眼性症状」という用語は、最も広義の意味で用いられ、古典的経路及び副経路、特に副経路において補体が関与する病理を特徴とする全ての眼精症状が含まれる。補体関連の眼性症状には、ドライ型及びウエット型（非滲出性及び滲出性）の形態を含むあらゆる段階の加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病及び他の虚血関連の網膜症などの黄斑変性疾患、並びに、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル−リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生及び網膜血管新生などの他の眼内血管新生性疾患が含まれるが、これらに限定されない。一例において、補体関連の眼性症状には、非滲出性（例えば中期ドライ型ＡＭＤ又は地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出性（例えばＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））のウエット型のＡＭＤなどの加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びブドウ膜炎が含まれる。更なる例において、非滲出性ＡＭＤには、硬性ドルーゼン、軟性ドルーゼン、地図状萎縮及び／又は色素クランピングが存在する場合がある。一例において、補体関連の眼性症状には、早期のＡＭＤ（例えば多数の小サイズ〜一又は複数の拡張されていない中間サイズのドルーゼンを含む）、中期ＡＭＤ（例えば拡張された中間サイズのドルーゼンから一又は複数の大サイズのドルーゼンを含む）、及び進行したＡＭＤ（例えば地図状萎縮又は進行したウエット型ＡＭＤ（ＣＮＶ））などの加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）が含まれる。（Ferris et al., AREDS Report No. 18; Sallo et al., Eye Res., 34(3): 238-40 (2009)、Jager et al., New Engl. J. Med., 359(1): 1735 (2008)を参照）。更なる例において、中期ドライ型ＡＭＤでは、大サイズのコンフルエントなドルーゼンが含まれる場合がある。更なる例において、地図状萎縮では、光受容体及び／又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）の損失が含まれる場合がある。更なる例において、地図状萎縮の領域は、大小いずれのサイズであってもよく、及び／又は、網膜黄斑の領域又は末梢網膜のいずれにも存在し得る。一例において、前記補体関連の眼性症状は中期ドライ型ＡＭＤである。一例において、前記補体関連の眼性症状は地図状萎縮である。一例において、前記補体関連の眼性症状はウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【００７９】
「治療」（及びその文法的活用である「治療する」又は「治療すること」）とは、障害の進行を防止し、又はその病理を変化させる目的で行う介入のことである。したがって、「治療」とは、治療的処置及び治療的若しくは予防的手段を指す。治療を必要とする者には、既に前記障害を有する患者、並びに前記障害を予防しようとする者が含まれる。好ましい治療効果には、限定されないが、疾患の発生又は再発の防止、症候の緩和、疾患のあらゆる直接的又は間接的な病理学的帰結の減少、疾患の進行速度の低下、病態の改善又は緩和、並びに、寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様において、本発明のコンジュゲートは、疾患の発症を遅延させるか、疾患の進行を遅延させるのに用いられる。免疫性関連疾患の治療において、治療剤が免疫応答の構成因子による応答の度合いを直接変化させたり、又は抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬、化学療法薬などの他の治療剤による疾患治療に対する感受性を高めたりすることもある。
【００８０】
補体関連の眼性症状などの疾患の「病理」には、患者の幸福度を損なう全ての現象が含まれる。これには、限定されないが、異常であるか制御されない（好中球、好酸球、単球、リンパ球細胞の）細胞増殖、抗体産生、自己抗体産生、補体産生、隣接する細胞の正常な機能に対する干渉、サイトカインの放出又は異常なレベルでの他の生成物分泌、あらゆる炎症性又は免疫学的応答の抑制又は増悪、細胞空間への炎症細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球細胞）の浸潤などが含まれる。
【００８１】
本明細書で用いられる「哺乳動物」という用語は、哺乳動物と分類されるあらゆる動物のことを指し、限定されないが、ヒト、高等霊長類、家畜及び農場用家畜、動物園用、スポーツ用又はペット用動物（ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ及びフェレット）が含まれる。本開示の幾つかの実施態様において、前記哺乳動物はヒトである。
【００８２】
一又は複数の更なる治療剤との「組合せ」投与には、同時（並列的）投与及びあらゆる順序での連続的投与が含まれる。
【００８３】
「治療的有効量」とは、補体関連の眼性症状などの、標的となる疾患又は症状の症状、例えば病理において顕著な改善を達成するのに必要となる「Ｄ因子アンタゴニスト」の量のことである。
【００８４】
「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列中の、少なくとも一つの既存のアミノ酸残基を、他の異なる「代替」アミノ酸残基で置換することを指す。前記代替残基（複数を含む）は、「天然に存在するアミノ酸残基」（すなわち遺伝暗号によってコードされる残基）であってもよく、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｈｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される。一又は複数の天然に存在しないアミノ酸残基による置換もまた、本明細書のアミノ酸置換の定義に包含される。「天然に存在しないアミノ酸残基」は、上記の天然に存在するアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内で共有結合的に隣接するアミノ酸残基と結合できる残基のことを指す。天然に存在しないアミノ酸残基の例には、Ellman et al., Meth. Enzym, 202: 301-336 (1991)に記載のようなノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び他のアミノ酸残基のアナログが含まれる。かかる天然に存在しないアミノ酸残基の生成においては、Noren et al., Science, 244: 182 (1989)及びEllman et al.（上記）の手順を用いることができる。手短には、これらの手順では、天然に存在しないアミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化し、続いてＲＮＡのインビトロ転写及び翻訳を行う。
【００８５】
「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列への少なくとも一つのアミノ酸の挿入を指す。前記挿入は、通常、１又は２個のアミノ酸残基の挿入からなるが、本願では、より規模の大きい「ペプチド挿入」（例えば約３−約５個、又は最高約１０のアミノ酸残基の挿入）を意図するものである。挿入される残基は、上記で開示したような天然に存在する又は天然に存在しないものであってもよい。
【００８６】
「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも一つのアミノ酸残基の除去を指す。
【００８７】
用語「長時間作用性送達」、「徐放性」及び「徐放」は通常、製剤、剤形、デバイス又は他のタイプの技術を用いて、治療剤の長期間にわたるか又は延長された放出又は生物学的利用能を達成する、送達メカニズムを記載するのに用いられる。それは、前記薬物の長期間にわたるか又は延長された放出又は生物学的利用能を、一般的な循環又は対象に、又は、限定されないが、細胞、組織、器官、関節、領域などの、対象における局所的部位に提供する技術を指す場合がある。更に、これらの用語は、製剤又は剤形からの前記薬物の放出を延長（ｐｒｏｌｏｎｇ／ｅｘｔｅｎｄ）するのに用いられる技術を指す場合、又は、対象における前記薬物の生物学的利用能又は薬物動態又は作用時間を延長（ｐｒｏｌｏｎｇ／ｅｘｔｅｎｄ）するのに用いられる技術を指す場合、又は、製剤によって生じる薬物動態による効果を延長（ｐｒｏｌｏｎｇ／ｅｘｔｅｎｄ）するのに用いられる技術を指す場合がある。「長時間作用性製剤」、「徐放性製剤」又は「徐放製剤」は、長時間作用性送達を提供するのに用いられる薬学的製剤、剤形又は他の技術である。幾つかの態様において、徐放は、薬物の局所的な生物学的利用能（眼内送達の場合には特に眼内での滞留時間）を改善するのに用いられる。「増加した眼内での滞留時間」は、送達された眼薬が、質（活性）に関して、及び量（有効量）に関して、効果を維持する、送達後期間を指す。前記薬物は、ＰＥＧ化などの翻訳後修飾を経て、高い用量及び徐放性に加え、又はその代わりに、インビボ半減期を長期化することができる。
【００８８】
「ポート送達系」という用語は、眼への長期間の治療剤の送達を可能にする、補充可能なリザーバーを有する移植可能な装置を指す。例示的ポート送達系は、参照によって全開示内容を本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１０／０１７４２７２号明細書、並びに米国特許第８２７７８３０号、第８３９９００６号、第８７９５７１２号及び第８８０８７２７号明細書に記載されている。
【００８９】
本明細書で用いられる「ポリオール」という用語は、広義には、多価アルコール化合物を指す。ポリオールは例えば、いかなる水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであってもよく、直鎖状又は分枝状の鎖を有してもよい。好ましいポリオールには、一又は複数のヒドロキシル基部位が、化学基（例えば炭素数１−４のアルキル基）で置換されたものが含まれる。典型的には、前記ポリオールはポリ（アルキレングリコール）、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。しかしながら、当業者であれば、ＰＥＧに関する本明細書に記載のコンジュゲーション技術を用いて、他のポリオール（例えばポリ（プロピレングリコール）及びポリエチレン−ポリプロピレングリコール共重合体）を採用できることを認識する。本開示のポリオールには、当該技術分野で公知の、及び一般に入手可能（例えば市販されている）ものが含まれる。
【００９０】
本明細書で用いられる「コンジュゲート」という用語は、最も広義には、一緒に接続又は連結されることを意味する。複数の分子は、それらはあたかも接続されるかのように作用又は作動するとき、「コンジュゲート」される。特定の実施態様において、「コンジュゲート」は、マルチアーム型ポリオールに共有結合的に結合している抗体（例えば本明細書で詳述される抗体断片）を指す。
【００９１】
「小口径ニードル」又は「狭口径ニードル」は、流動組成物の注入用の約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３又は２２ゲージ以上のニードル、例えば３０ゲージのニードルを指す。幾つかの実施態様において、前記小口径ニードルは、標準サイズの壁を有する。別の実施態様において、前記小口径ニードルは薄い壁を有し、それは粘稠な溶液の場合に好ましいと考えられる。
【００９２】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、これらの配列をアラインメントし、必要に応じて、最大限の配列同一性（％）を得るためにギャップを導入した後における、前記参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一な、候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。なお、前記配列同一性の一部として何らの保存的置換も考慮しない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般公開されているコンピューターソフトウェアを用い、当業者に公知の技術の範囲内で、様々な方法実施できる。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大限のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントするための適当なパラメータを決定できる。しかしながら、本発明の目的では、アミノ酸配列同一性（％）の値は、配列比較用コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社によって作成され、そのソースコードは、米国著作権局（ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９）にユーザー文書と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（南サンフランシスコ、カリフォルニア）から一般公開されおり、又は前記ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０ＤなどのＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変更はない。
【００９３】
ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較に使用する場合、提供されたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する、提供されたアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性（％）（提供されたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して、提供されたアミノ酸配列Ａが有する、又は含む、特定のアミノ酸配列同一性（％）と表現できる）は、以下のとおりに算出される：
画分Ｘ／Ｙ  ×  １００
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２を用い、Ａ及びＢのアラインメントでのプログラムにおいて、同一マッチとして記録されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性（％）は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性（％）と等しくないことが理解される。特に断りのない限り、本明細書で用いられる全てのアミノ酸配列同一性（％）の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて、直前の段落で述べたようにして得られる。
【００９４】
「薬学的製剤」という用語は、そこに含まれる活性成分の生物活性が効果的に発揮される形状であり、それが投与される対象に容認できない程の毒性をもたらす更なる成分を含まない、調製物を指す。
【００９５】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的製剤内の活性成分以外の、対象に対して無毒の成分を指す。薬学的に許容される担体には、バッファー、賦形剤、安定剤又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
ある薬物が一又は複数の他の薬物と「同時に」投与される、とは、同じ治療サイクルにおいて、一又は複数の他の薬物と同じ治療日に投与されること、及び、任意選択的に、一又は複数の他の薬物と同じ時刻に投与されることを指す。
【００９７】
抗Ｄ因子抗体とその変異体
幾つかの態様において、本開示は、一又は複数の抗Ｄ因子抗体又はその変異体を含むコンジュゲートの産生及び使用に関する。本開示のコンジュゲートの形成への使用に適する抗Ｄ因子抗体及びその変異体は、参照により全開示内容が本明細書に援用される米国特許出願第１４／７００８５３号（２０１５年４月３０日出願）に記載されている。
【００９８】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる前記変異体を作成する基礎となる前記親参照抗Ｄ因子抗体は、ヒト化抗Ｄ因子抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野で公知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源に由来する一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトのアミノ酸残基は「インポート」残基と呼ばれることが多く、それは典型的には「インポート」可変ドメインに由来するものである。ヒト化は、基本的にはＷｉｎｔｅｒらの方法に従い（Jones et al. (1986) Nature 321:522-525、Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327、Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536）、げっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列で置換することにより実施できる。したがって、かかる「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）であり、実質的に完全なヒト可変ドメインより少ない程度で、非ヒトの種由来の対応配列によって置換されたものである。実際には、ヒト化抗体は典型的には、幾つかのＣＤＲ残基及びおそらく幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類の抗体の類似部位に由来する残基によって置換されたヒト抗体である。
【００９９】
前記抗体をヒトの治療を目的として使用するとき、使用するヒト（軽鎖及び重鎖）可変ドメインの選択は、幾つかの例では、ヒト化抗体の抗原性及び／又はＨＡＭＡ反応（ヒト抗マウス抗体）を減少させる際に重要である。ＨＡＭＡ反応の減少又は除去は、通常、適切な治療剤の臨床開発において重要な側面である。Khaxzaeli et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst 80:937、Jaffers et al. (1986) Transplantation 41:572、Shawler et al. (1985) J. Immunol. 135:1530、Sears et al. (1984) J. Biol. Response Mod. 3: 138、Miller et al. (1983) Blood 62:988、Hakimi et al. (1991) J. Immunol. 147:1352、Reichmann et al. (1988) Nature 332:323、Junghans et al. (1990) Cancer Res. 50: 1495を参照。本明細書に記載のように、幾つかの態様において、本開示は、ＨＡＭＡ反応が低下するか又は排除されるヒト化抗体を含むコンジュゲートを提供する。これらの抗体の変異体は更に、当該技術分野で公知の常套的方法を使用して得るこができ、その幾つかは更に後述する。いわゆる「最適な」方法によれば、げっ歯類の抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。前記ヒト化抗体に許容される、げっ歯類に最も近いヒトＶドメイン配列、及びその中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）は、同定されている（Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296、Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol.196: 901を参照）。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループに属する全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域が使用される。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体に用いてもよい（Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285、Presta et al. (1993) J. Immunol. 151:2623）。
【０１００】
例えば、本明細書に記載の抗体に由来するアミノ酸配列は、前記フレームワーク及び／又は超可変配列（複数を含む）の多様化を行うための出発（親）配列として使用できる。出発超可変配列が連結されている選択されたフレームワーク配列は、本明細書ではアクセプターヒトフレームワークと称する。前記アクセプターヒトフレームワークは、ヒト免疫グロブリン（そのＶＬ及び／又はＶＨ領域）のもの又はそれに由来するものである一方、前記アクセプターヒトフレームワークは、ヒトコンセンサスフレームワーク配列のもの又はそれに由来するものであって、ヒト患者における免疫原性が最小であるか又はないことが示されているフレームワークとしてもよい。本発明の目的に係る「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワークの、又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、ＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、同じアミノ酸配列を含んでもよく、又は既存のアミノ酸配列の変更を含んでもよい。既存のアミノ酸の変更が存在する場合、好ましくは５以下であって好ましくは４以下、又は３以下の、既存のアミノ酸の変更が存在する。幾つかの実施態様において、ＶＨアクセプターヒトフレームワークの配列は、ＶＨヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークの配列は、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に見られるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから行う。通常、前記配列のサブグループは、Ｋａｂａｔらに記載のようなサブグループである。幾つかの実施態様において、前記ＶＬについて、前記サブグループは、Ｋａｂａｔらに記載のようなサブグループカッパＩである。幾つかの実施態様において、前記ＶＨについて、前記サブグループは、Ｋａｂａｔらに記載のようなサブグループＩＩＩである。
【０１０１】
前記アクセプターがヒト免疫グロブリンに由来する場合、ドナーフレームワーク配列をヒトフレームワーク配列のコレクションに存在する様々なヒトフレームワーク配列と共にアラインメントし、アクセプターとして最も相同性の高いフレームワーク配列を選択することにより、ドナーフレームワーク配列への相同性に基づいて選択されるヒトフレームワーク配列を任意選択的に選択することができる。前記アクセプターヒトフレームワークは、公共データベースで利用可能なヒト抗体生殖細胞系の配列のものでも、又はそれに由来するものでもよい。
【０１０２】
幾つかの実施態様において、本発明のヒトコンセンサスフレームワークは、ＶＨサブグループＶＩＩ及び／又はＶＬカッパサブグループＩのコンセンサスフレームワーク配列のものでも、又はそれに由来するものでもよい。
【０１０３】
幾つかの実施態様において、抗Ｄ因子抗体の生成に用いられるヒトフレームワークのテンプレートは、ＶＨ鎖ではＶＩ−４．１ｂ＋（ＶＨ７ファミリー）及びＪＨ４ｄの組合せ、及び／又は、ＶＬ鎖ではＤＰＫ４（ＶκＩファミリー）及びＪＫ２の組合せを含むテンプレートに由来するフレームワーク配列を含んでもよい。
【０１０４】
前記アクセプターの配列は、ヒト免疫グロブリン又はヒトコンセンサスフレームワークに存在するものから選択されるヒトフレームワーク配列と同一であってもよいが、本開示は、前記アクセプター配列が、前記ヒト免疫グロブリン配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対する既存のアミノ酸置換を含んでもよいことを意図している。これらの既存の置換は最小限であるのが好ましく、通常、前記ヒト免疫グロブリン配列又はコンセンサスフレームワーク配列と比較し、４つ、３つ、２つ又は１つのアミノ酸の置換である。
【０１０５】
非ヒト抗体の超可変領域の残基は、ＶＬ及び／又はＶＨアクセプターヒトフレームワークに組み込まれる。例えば、ＫａｂａｔＣＤＲ残基、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ残基、Ａｂｍ残基及び／又は接触残基に対応する残基を組み込んでもよい。任意選択的には、以下の拡大超可変領域の残基が組み込まれる：２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、２６−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−６５、４７−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）。
【０１０６】
幾つかの態様において、前記コンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体は、軽鎖ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。幾つかの態様において、前記参照抗Ｄ因子抗体は、配列番号３の軽鎖可変ドメインを含む。幾つかの態様において、前記参照抗Ｄ因子抗体は、配列番号４の重鎖可変ドメインを含む。
【０１０７】
更に、抗Ｄ因子抗体は、当該抗体がＤ因子と結合する能力を保持する限り、いかなる適切な定常ドメイン配列を含んでもよい。例えば、幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、少なくとも一部の重鎖定常ドメインを含む。幾つかの実施態様において、抗Ｄ因子抗体は、α、δ、ε、γ又はμ重鎖のうちの一つ又はそれらの組合せの重鎖定常ドメインを含む。それらの重鎖定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ（それぞれα、δ、ε、γ及びμと称される重鎖を有する）の５種類が存在する。前記γ及びαのクラスは更に、ＣＨ配列及び機能の比較的軽度の相違を基礎としてサブクラスに分類され、例えば、ヒトでは以下のサブクラスで表される：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２。幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、エフェクター機能（例えば結合親和性）において好ましい効果をもたらすアミノ酸位置での置換を含む重鎖定常ドメインを含む。幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、エフェクター機能（例えば結合親和性）における効果をもたらさないアミノ酸位置での置換を含む重鎖定常ドメインを含む。幾つかの実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体はＩｇＧ型（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）の重鎖定常ドメインを含み、更に１１４（カバット番号付け、ＥＵ番号付けの１１８に相当）、１６８（カバット番号付け、ＥＵ番号付けの１７２に相当）、１７２（カバット番号付け、ＥＵ番号付けの１７６に相当）及び／又は２２８（ＥＵ番号付け）の位置での置換を含む。幾つかの実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、前記ＩｇＧ型（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）の重鎖定常ドメインを含み、更に位置１１４における置換を含み、位置１１４がシステイン（Ｃ）又はアラニン（Ａ）であり、位置１６８がシステイン（Ｃ）又はアラニン（Ａ）であり、位置１７２がシステイン（Ｃ）又はアラニン（Ａ）であり、及び／又は、位置２２８がプロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）又はセリン（Ｓ）である。
【０１０８】
更に、例えば、幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、少なくとも一部の軽鎖定常ドメインを含む。いかなる脊椎動物の種由来の軽鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ及びラムダ鎖と呼ばれる２つの明らかに異なる型のうちの一つに割り当てることができるため、幾つかの実施態様において、前記抗Ｄ因子抗体は、カッパ又はラムダ軽鎖のうちの一つ又はそれらの組合せの軽鎖定常ドメインを含む。幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、エフェクター機能（例えば結合親和性）に対する望ましい効果をもたらすアミノ酸位置での置換を含む軽鎖定常ドメインを含む。幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、エフェクター機能（例えば結合親和性）に対する効果をもたらさないアミノ酸位置での置換を含む軽鎖定常ドメインを含む。幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、前記カッパ型の軽鎖定常ドメインを含み、更に、位置１１０、１４４、１４６及び／又は１６８（カバット番号付け）での置換を含む。幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、前記κ型の軽鎖定常ドメインを含み、更に、位置１１０がシステイン（Ｃ）又はバリン（Ｖ）である位置１１０における置換、位置１４４がシステイン（Ｃ）又はアラニン（Ａ）である位置１４４における置換、位置１４６がイソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）である位置１４６における置換、及び／又は、位置１６８がシステイン（Ｃ）又はセリン（Ｓ）である位置１６８における置換を含む。
【０１０９】
ヒト化抗Ｄ因子抗体を含む親又は参照抗Ｄ因子抗体は、修飾することにより修飾抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体変異体を生成することができる。幾つかの実施態様において、前記修飾抗Ｄ因子抗体及びその変異体は、前記親抗体よりも改善された物理的、化学的、生物学的又は均質的特性を有し得る。
【０１１０】
幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗体は、前記親抗体の超可変領域の一つ以上に、一又は複数のアミノ酸変更（例えば置換）を含む。或いは、又は更に、フレームワーク領域の一又は複数の残基の変更（例えば置換）を、前記親抗体に導入してもよい。修飾されるフレームワーク領域の残基の例には、抗原と直接に非共有結合的に結合するもの（Amit et al., (1986) Science, 233: 747-753）、ＣＤＲの立体配座に相互作用／影響するもの（Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917）、及び／又は、ＶＬ−ＶＨインタフェースに関与するもの（欧州特許第２３９４００Ｂ１号明細書）が含まれる。特定の実施態様において、かかるフレームワーク領域残基のうちの一つ以上の修飾は、抗原への抗体の結合親和性の強化をもたらす。例えば、約１から約５のフレームワークの残基を、本開示のこの実施態様で変更してもよい。修飾するフレームワーク又はＨＶＲ領域の残基の例には、修飾により脱アミノ化変異体（例えばアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基のアスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）への修飾）、酸化変異体（例えばメチオニン（Ｍ又はＭｅｔ）残基及び／又はトリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ）残基のスルホン又はスルフォキシド基への修飾）又はピログルタメート変異体（例えばグルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）残基のピログルタメートへの修飾）が生じる部位が含まれる。修飾されるフレームワーク領域残基又はＨＶＲ領域残基の例には、可能性がある脱アミド化部位（すなわちアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ））、酸化部位（すなわちメチオニン（Ｍ又はＭｅｔ）又はトリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ））又はピログルタメート変換部位（すなわちグルタミン（Ｑ又はＧｌｎ））が含まれ、各部位における修飾により、脱アミド化及び／又は酸化及び／又はピログルタメート変換が防止される。
【０１１１】
脱アミノ化変異体の形成を防止するために、アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）をアラニン（Ａ又はＡｌａ）、グルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）又はセリン（Ｓ又はＳｅｒ）に突然変異させ得る。酸化変異体の形成を防止するために、メチオニン（Ｍｅｔ）又はトリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ）をロイシン（Ｌ）又はイソロイシン（Ｉ）に突然変異させ得る。ピログルタメート変異体の形成を防止するために、グルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）をグルタメート（Ｅ又はＧｌｕ）に突然変異させ得る。（Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)を参照）。或いは、又は更に、フレームワーク領域残基の一又は複数の変更（例えば置換）を、親抗体内のＦｃ領域で行ってもよい。
【０１１２】
かかる修飾抗体を生成するための一つの有用な手順は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれている（Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085）。そこでは、超可変領域残基のうちの一又は複数が、アラニン又はポリアラニン残基と置換され、抗原へのアミノ酸の相互作用に影響が及ぶ。次に、当該置換への機能的感受性を示す超可変領域残基を、置換部位として、更なる又は他の突然変異を導入することにより選抜する。このように、アミノ酸配列の変異を導入するための部位が予備決定される一方で、当該突然変異の性質自体を予備決定する必要はない。このように産生される前記Ａｌａ変異体は、本明細書に記載の生物活性（すなわち結合親和性又は溶血アッセイ）に関してスクリーニングされる。
【０１１３】
前記抗体又はその断片（例えば抗原結合性断片）を更に実質的に修飾し、（ａ）置換された領域における（例えばシート又は螺旋状の立体配座としての）ポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は、（ｃ）側鎖の嵩張り、の維持に対するそれらの効果に顕著な差が生じる置換を選択することによって、生物学的特性を解析できる。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づき、以下の群に分類される：
（１）  疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２）  中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ、
（３）  酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４）  塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５）  鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、及び
（６）  芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１１４】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーをもう一つのクラスのものと交換することを伴う。
【０１１５】
別の実施態様において、修飾のために選択した部位を修飾し、改善された結合親和性を生じさせる修飾をファージディスプレイで選択する。
【０１１６】
アミノ酸配列変異体又は修飾アミノ酸配列をコードする核酸分子は、当該技術分野で公知の種々の方法により調製される。これらの方法としては、限定されないが、事前に調製された親抗体の変異又は非変異バージョンの、オリゴヌクレオチド媒介による、又は部位特異的な突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びカセット突然変異誘発が挙げられる。変異体又は誘導体又は修飾アミノ酸配列を作製する一つの方法は、部位特異的突然変異誘発である（Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488を参照）。
【０１１７】
特定の実施態様において、前記修飾抗体は、置換された一つの超可変領域残基のみを有する。他の実施態様において、親抗体の超可変領域残基のうちの２つ以上、例えば約２から約１０の超可変領域が置換され得る。通常、前記修飾抗体は、前記親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性（上記の「定義」のセクションにて定義）を有するアミノ酸配列を有する。
【０１１８】
前記修飾抗体の産生後、親抗体と比較した当該分子の生物活性を測定する。上記したように、これには前記抗体変異体又はその断片（例えば抗原結合断片）の結合親和性及び／又は他の生物活性の測定が含まれ得る。本開示の幾つかの実施態様においては、修飾抗体のパネルを調製し、抗原（例えばＤ因子又はその断片）に対する結合親和性に関するスクリーニングを行う。この最初のスクリーニングで選抜された一又は複数の抗体変異体又は修飾抗体を、任意選択的に、一又は複数の更なる生物活性アッセイに供し、前記抗体変異体（複数含む）又はその断片（例えば抗原結合断片）が実際に、例えば前臨床研究に有用であるか否かを確認する。
【０１１９】
本明細書に記載の修飾抗Ｄ因子抗体は、しばしば当該修飾抗体の使用目的に応じて、更に修飾してもよい。かかる修飾としては、アミノ酸配列の更なる変更、異種ポリペプチドとの融合、及び／又は以下に詳述するような共有結合的な修飾が挙げられる。アミノ酸配列の変更に関して、修飾の例は上記で詳述したとおりである。例えば、修飾抗体の適切な立体配座の維持に関与しない何れかのシステイン残基を、通常セリンで置換して、当該分子の酸化性安定性を改善し、不適切な架橋結合を防止してもよい。或いは、（特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合）システイン結合（複数含む）を当該抗体に付加して、その安定性を改善してもよい。
【０１２０】
他のアミノ酸変異体は、変更されたグリコシル化パターンを有する。これは、抗体中に存在する一又は複数の糖部分を削除し、及び／又は、抗体中に存在しない一又は複数のグリコシル化部位を付加することにより可能となり得る。抗体又は抗体断片（例えば抗原結合断片）のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型又はＯ結合型である。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖に対して糖部分が連結していることを指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への前記糖部分の酵素的連結のため認識配列である。このように、ポリペプチド内のこれらの何れかのトリペプチド配列の存在により、潜在的なグリコシル化部位が形成される。Ｏ結合型のグリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン、への、糖、すなわちＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのうちの一つの連結を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンを使用してもよい。前記抗体へのグリコシル化部位の付加は、前記のトリペプチド配列（Ｎ結合型のグリコシル化部位）を一又は複数含むようなアミノ酸配列の変更により簡便に実施できる。前記変更は、（Ｏ結合型のグリコシル化部位の場合）元の抗体の配列に対する一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又はそれによる置換によりなされ得る。
【０１２１】
抗Ｄ因子抗体及びその変異体の親和性及び生物活性
抗Ｄ因子抗体において、本明細書で望ましいと同定される特性を有する抗体は、インビトロ又はインビボで、Ｄ因子結合親和性及びＤ因子阻害活性など、望ましい性質に関してスクリーニングされ得る。
【０１２２】
ａ．親和性
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体変異体は、それらが由来する親抗Ｄ因子抗体と競合する。前記親抗Ｄ因子抗体と同じエピトープと結合する抗Ｄ因子抗体変異体も提供される。
【０１２３】
抗Ｄ因子抗体変異体が参照抗Ｄ因子抗体と結合したヒトＤ因子の同じエピトープに対して結合するか否かを判定するため、クロスブロッキングアッセイを行ってもよい（Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)）。或いは、エピトープマッピングを行い、抗Ｄ因子抗体が目的のエピトープと結合するか否かを判定してもよい（Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 1388-1394。抗体親和性は、例えばヒトＤ因子の場合、実施例で詳細に記載される表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイなどの標準的方法を用いて判定してもよい。
【０１２４】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体変異体のＤ因子結合親和性は、それが由来する親抗Ｄ因子抗体のそれと同等である。幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体変異体のＤ因子結合親和性は、親抗Ｄ因子抗体のそれの１０倍、７倍、５倍、２倍又は１倍以内である。
【０１２５】
幾つかの実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が２０ｎＭ（２０ｘ１０−９Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が１０ｎＭ（１０ｘ１０−９Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が１．０ｎＭ（１．０ｘ１０−９Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が０．５ｎＭ（０．５ｘ１０−９Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が１．０ｐＭ（１．０ｘ１０−１２Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が０．５ｐＭ（０．５ｘ１０−１２Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。
【０１２６】
別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が１０．０ｎＭ（１０．０ｘ１０−９Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が５．０ｎＭ（５．０ｘ１０−９Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が１．０ｎＭ（１．０ｘ１０−９Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が０．５ｎＭ（０．５ｘ１０−９Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が５．０ｐＭ（５．０ｘ１０−１２Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が２．０ｐＭ（２．０ｘ１０−１２Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が１．０ｐＭ（１．０ｘ１０−１２Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が０．５ｐＭ（０．５ｘ１０−１２Ｍ）又はそれより優れた抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。
【０１２７】
別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が０．５ｍＭ（０．５ｘ１０−６Ｍ）と０．５ｐＭ（０．５ｘ１０−１２Ｍ）の間である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が１５ｎＭ（１５ｘ１０−９Ｍ）と０．１ｎＭ（０．１ｘ１０−９Ｍ）の間である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が５．５ｎＭ（５．５ｘ１０−９Ｍ）と１ｎＭ（１ｘ１０−９Ｍ）の間である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が０．５ｐＭ（０．５ｘ１０−１２Ｍ）と５０ｐＭ（５ｘ１０−１１Ｍ）の間である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。
【０１２８】
別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が０．５ｍＭ（０．５ｘ１０−６Ｍ）と０．５ｐＭ（０．５ｘ１０−１２Ｍ）の間である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が１０ｎＭ（１０ｘ１０−９Ｍ）と０．０５ｎＭ（０．０５ｘ１０−９Ｍ）の間である抗Ｄ因子抗体又はその抗体変異体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が５．５ｎＭ（５．５ｘ１０−９Ｍ）と１ｎＭ（１ｘ１０−９Ｍ）の間である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が０．５ｐＭ（０．５ｘ１０−１２Ｍ）と５０ｐＭ（５ｘ１０−１１Ｍ）の間である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。
【０１２９】
別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が約１．４ｐＭ（１．４ｘ１０−１２Ｍ）である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が約１．１ｐＭ（１．１ｘ１０−１２Ｍ）である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が約０．１９ｎＭ（０．１９ｘ１０−９Ｍ）である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が約０．０８ｎＭ（０．０８ｘ１０−９Ｍ）である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が約１２．３ｎＭ（１２．３ｘ１０−９Ｍ）である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が約９．０ｎＭ（９．０ｘ１０−９Ｍ）である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。
【０１３０】
別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が約１．４ｐＭ（１．４ｘ１０−１２Ｍ）＋／−０．５である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が約１．１ｐＭ（１．１ｘ１０−１２Ｍ）＋／−０．６である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が約０．１９ｎＭ（０．１９ｘ１０−９Ｍ）＋／−０．０１である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が約０．０８ｎＭ（０．０８ｘ１０−９Ｍ）＋／−０．０１である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその一価の形状の抗体親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）が約１２．３ｎＭ（１２．３ｘ１０−９Ｍ）＋／−２である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。別の実施態様において、本開示は、Ｄ因子に対するその二価形状の抗体親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）が約９．０ｎＭ（９．０ｘ１０−９Ｍ）＋／−１である抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートを提供する。
【０１３１】
別の実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、その一価の形状で約１．４ｐＭ（１．４ｘ１０−１２Ｍ）＋／−２の、Ｄ因子に対する親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）を有し得る。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、その二価の形状で約１．１ｐＭ（１．１ｘ１０−１２Ｍ）＋／−２の、Ｄ因子に対する親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）を有し得る。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、その一価の形状で０．１９ｎＭ（０．１９ｘ１０−９Ｍ）＋／−２の、Ｄ因子に対する親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）を有し得る。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体又はその抗体変異体は、その二価形状で０．０８ｎＭ（０．０８ｘ１０−９Ｍ）＋／−２の、Ｄ因子に対する親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）を有し得る。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、その一価の形状で１２．３ｎＭ（１２．３ｘ１０−９Ｍ）＋／−２の、Ｄ因子に対する親和性（例えばＤ因子に対するＦａｂ断片としての抗体親和性）を有し得る。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートで用いられる抗Ｄ因子抗体は、その二価形状で９．０ｎＭ（９．０ｘ１０−９Ｍ）＋／−２の、Ｄ因子に対する親和性（例えばＩｇＧとしてのＤ因子に対する抗体親和性）を有し得る。
【０１３２】
当該技術分野で確立されているように、リガンドのその受容体に対する結合親和性は、種々の分析方法の何れかを用いて測定でき、種々の定量的数値として表すことができる。したがって、幾つかの実施態様において、結合親和性はＫＤ値として表され、（例えばアビディティ効果が最小化された）固有の結合親和性を反映する。一般に、また好ましくは、結合親和性は、無細胞系であるか細胞が関連する系の設定であるか否かに拘わらず、インビトロで測定される。本明細書に詳細に記載されるように、結合親和性の倍差（ｆｏｌｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を、ヒト化抗体（例えばＦａｂ形状で）の一価の結合親和性値に対する比率として、また、参照／競合抗体（例えばＦａｂ形状）（例えばドナー超可変領域配列を有するマウス抗体）の一価の結合親和性値に対する比率として、同様の分析条件下で結合親和性値を測定することにより、定量化できる。このように、幾つかの実施態様において、結合親和性の倍差は、Ｆａｂの形態の前記ヒト化抗体と前記参照／コンパレータＦａｂ抗体のＫＤ値の比率として測定される。例えば、幾つかの実施態様において、開示（Ａ）の抗体が参照抗体（Ｍ）の親和性より「３倍低い」親和性を有し、次に、Ａに対するＫＤ値が３ｘである場合、ＭのＫＤ値は１ｘとなり、ＭのＫＤに対するＡのＫＤの比率は３：１となる。或いは、幾つかの実施態様において、開示（Ｃ）の抗体が参照抗体（Ｒ）の前記親和性より「３倍高い」親和性を有し、次に、Ｃに対するＫＤ値が１ｘである場合、ＲのＫＤ値は３ｘとなり、ＲのＫＤに対するＣのＫＤの前記比率は１：３となる。本明細書に記載のものを含め、Ｂｉａｃｏｒｅ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及びＥＬＩＳＡなどの、当該技術分野で公知の多くの分析方法の何れかを、結合親和性測定値を得るために使用できる。
【０１３３】
更に、本開示のコンジュゲートで用いられる抗体のＫＤ値は、用いる具体的な分析条件により変化し得る。例えば幾つかの実施態様において、結合親和性測定値は、アッセイにより得ることができ、Ｆａｂ又は抗体を固定し、リガンド（すなわちＤ因子）の結合を測定するか、或いは、Ｆａｂ又は抗体のリガンド（すなわちＤ因子）を固定し、Ｆａｂ又は抗体の結合を測定する。幾つかの実施態様において、結合親和性測定値は、アッセイにより得ることができ、再生条件は、（１）  ｐＨ１．５における１０ｍＭのグリシン又は４ＭのＭｇＣｌ２、及び（２）  １．０のｐＨと７．５のｐＨの間のｐＨ（１．５のｐＨ、５．０のｐＨ、６．０のｐＨ及び７．２のｐＨを含む）を含んでもよい。幾つかの実施態様において、結合親和性の測定は、アッセイにより得ることができ、結合条件は、（１）  ＰＢＳ又はＨＥＰＥＳ−緩衝食塩水、及び（２）  Ｔｗｅｅｎ−２０（すなわち０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）を含んでもよい。幾つかの実施態様において、前記結合親和性の測定は、アッセイにより得ることができ、リガンド（すなわちＤ因子）の供給源が市販の供給源であり得る。幾つかの実施態様において、結合親和性の測定は、アッセイにより得ることができ、（１）Ｆａｂ又は抗体が固定され、リガンド（すなわちＤ因子）の結合を測定し、（２）再生条件がｐＨ７．２における４ＭのＭｇＣｌ２を含み、及び（３）結合条件がＨＥＰＥＳ−緩衝食塩水（ｐＨ７．２）で０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含んでもよい。幾つかの実施態様において、結合親和性の測定は、アッセイにより得ることができ、（１）リガンド（すなわちＤ因子）が固定され、Ｆａｂ又は抗体の結合を測定し、（２）再生条件が、ｐＨ１．５で１０ｍＭのグリシンを含み、（３）結合条件がＰＢＳバッファーを含んでもよい。
【０１３４】
ｂ．生物活性
抗Ｄ因子抗体又はその変異体若しくは断片（例えば抗原結合断片）がＤ因子と結合し、生物学的効果（例えば副経路溶血の阻害）を及ぼし得るか否かを決定するために、実施例２に記載のものを含むウサギＲＢＣを用いた溶結阻害アッセイを用いてもよい。かかる溶血阻害は、標準分析を使用して決定され得る（Kostavasili et al. (1997) J of Immunology 158:1763-72、Wiesmann et al. (2006) Nature 444:159-60を参照）。かかるアッセイにおける補体活性化は、血清又は血漿で行ってもよい。血清又は血漿中のＤ因子の適正濃度（Pascual et al. (1998) Kidney International 34:529-536、Complement Facts Book, Bernard J. Morley and Mark J. Walport, editors, Academic Press (2000)、Barnum et al. (1984) J. Immunol. Methods, 67: 303-309）は、Pascual et al. (1998) Kidney International 34:529-536及びBarnum et al. (1984) J. Immunol. Methods 67:303-309などの参考文献に記載のものを含む、当該技術分野で公知の方法により常套的に決定できる。本開示は、一般に、Ｄ因子が関与する生物活性を阻害できる抗体に関する。例えば１８μｇ／ｍｌの濃度で（血液中のヒトＤ因子のモル濃度の約１．５倍に相当、Ｄ因子に対する抗Ｄ因子抗体のモル比が約１．５：１）、抗体による他の補体価の顕著な阻害を観察することができる（米国特許第６９５６１０７号明細書参照）。
【０１３５】
幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が３０ｎＭ未満のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が１５ｎＭ未満のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が１０ｎＭ未満のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が５ｎＭ未満のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。
【０１３６】
幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が３０ｎＭと２ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が２５ｎＭと７ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が２０ｎＭと１２ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が３０ｎＭと１５ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が１２ｎＭと８ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が７ｎＭと２ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が６ｎＭと３ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が８ｎＭと５ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が５ｎＭと２ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が１０ｎＭと５ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が８ｎＭと２ｎＭの間のＩＣ５５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が７ｎＭと３ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が６ｎＭと４ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が約４．７ｎＭ±０．６ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が約６．４ｎＭ±０．６ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体に関する。別の実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が約３．５ｎＭ±０．５ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が約４．４ｎＭ±１．５ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が約１０．２ｎＭ±０．８ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が約２３．��ｎＭ±５．０ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。
【０１３７】
幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が８０ｎＭ未満のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が５０ｎＭ未満のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が４０ｎＭ未満のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が２０ｎＭ未満のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が１５ｎＭ未満のＩＣ５０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。
【０１３８】
幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が８０ｎＭと１０ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が７５ｎＭと１５ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が７０ｎＭと２０ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が６５ｎＭと２５ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が６０ｎＭと３０ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が５５ｎＭと３５ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が５０ｎＭと４０ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が８０ｎＭと７０ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が５５ｎＭと２５ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。幾つかの実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が１６ｎＭと１２ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が約１４．０ｎＭ±１．０ｎＭのＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が約３８．０ｎＭ±１１．０ｎＭのＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。別の実施態様において、本開示は、抗体のＦａｂ断片が約７２．６ｎＭ±４．８ｎＭのＩＣ９０値で副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。
【０１３９】
幾つかの実施態様において、本開示は、かかる抗体のＦａｂ断片が、抗体対Ｄ因子のモル比約０．０５：１（０．０５）から約１０：１（１０）、又は約０．０９：１（０．０９）から約８：１（８）、又は約０．１：１（０．１）から約６：１（６）、又は約０．１５：１（０．１５）から約５：１（５）、又は約０．１９：１（０．１９）から約４：１（４）、又は約０．２：１（０．２）から約３：１（３）、又は約０．３：１（０．３）から約２：１（２）、又は約０．４：１（０．４）から約１：１（１）、又は約０．５：１（０．５）から約１：２（０．５）、又は約０．６：１（０．６）から約１：３（０．３３）、又は約０．７：１（０．７）から約１：４（０．２５）、又は約０．８：１（０．８）から約１：５（０．２）、又は約０．９：１（０．９）から約１：６（０．１７）において副経路溶血を阻害する抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関する。
【０１４０】
幾つかの実施態様において、本開示は、ヒト化抗Ｄ因子抗体の断片（例えば抗原結合断片）を含むコンジュゲートに関する。本開示の抗体断片は、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ−ＳＨ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ、Ｆａｂ’−Ｃ−ＳＨ、Ｆａｂ’−Ｃ−ＳＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ（複数）、又は抗体断片から形成した多重特異性抗体であってもよい。更なる実施態様において、本開示は、網膜の実質的に全てを透過できるヒト化抗Ｄ因子抗体断片（例えば抗原結合断片）を含むコンジュゲートに関する。更に更なる実施態様において、本開示は、網膜の全ての厚全体を通じて透過できるヒト化抗Ｄ因子抗体断片（例えば抗原結合断片）を含むコンジュゲートに関する。
【０１４１】
幾つかの実施態様において、本開示は、抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関し、そこでは、かかる抗体の非コンジュゲートＦａｂ断片は、単回の硝子体内注入による哺乳動物（例えばヒト）の眼内への投与後、少なくとも３、５、７、１０又は１２日の半減期を有する。別の実施態様において、本開示は、ヒト化抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関し、そこでは、かかる抗体の非コンジュゲートＦａｂ断片は、単回の硝子体内注入による哺乳動物（例えばヒト）の眼内への投与後、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０又は１１５日にわたり、副経路（ＡＰ）補体活性化を阻害する。別の実施態様において、本開示は、ヒト化抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関し、そこでは、副経路（ＡＰ）補体活性化を阻害するかかる抗体の非コンジュゲートＦａｂ断片の濃度が、単回の硝子体内注入による哺乳動物（例えばヒト）の眼内への投与後、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０又は８５日にわたり網膜組織内で維持される。別の実施態様において、本開示は、ヒト化抗Ｄ因子抗体を含むコンジュゲートに関し、そこでは、副経路（ＡＰ）補体活性化を阻害するかかる抗体の非コンジュゲートＦａｂ断片の濃度が、単回の硝子体内注入による哺乳動物（例えばヒト）の眼内への投与後、少なくとも８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０又は１１５日にわたり硝子体液で維持される。
【０１４２】
抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体−ポリマーコンジュゲートの構造
ａ．マルチアーム型ポリマー
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートは、マルチアーム型ポリマーで前記抗体又はその変異体を活用させることにより本明細書に記載の前記抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体を誘導体化することにより作られることができる。いうまでもないが、前記コンジュゲートに望ましいサイズを与えるか、又は本明細書に記載の選択された平均分子量を有するいかなるマルチアーム型ポリマーも、本開示の抗体−ポリマーコンジュゲートの構築への使用に適する。
【０１４３】
医薬への使用に適する多くのポリマーが存在する。Davis et al., Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp. 441-451 (1980)を参照。本開示の全実施態様において、非タンパク質性ポリマーが、本開示のコンジュゲートの形成に用いられる。前記非タンパク質性ポリマーは、通常、親水性合成ポリマー、すなわち天然には見られないポリマーである。しかしながら、天然に存在し、組換え又はインビトロ法により産生されるポリマーが、天然の供給源から単離されたポリマーと同様に有用である場合もある。
【０１４４】
幾つかの態様において、前記抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体は、マルチアーム型ポリオールに前記抗体又はその変異体をコンジュゲートさせる（例えば共有結合的に連結させる）ことにより誘導体化される。このように、幾つかの実施態様において、本開示は、一又は複数のマルチアーム型ポリオールに共有結合的に連結されている、本発明で開示される一若しくは複数の抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体を含むコンジュゲートに関する。使用されるポリオールは、いかなる水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーでもあってもよく、直鎖又は分枝状鎖を有してもよい。適切なポリオールには、化学基（例えば１−４の炭素数のアルキル基）で一又は複数のヒドロキシル部位で置換されているものが含まれる。典型的には、前記ポリオールは、ポリ（アルキレングリコール）、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、ゆえに、説明の便宜のため、以降の説明は、使用されるポリオールがＰＥＧである例示的な実施態様に関するものであり、ポリペプチドへポリオールをコンジュゲートするプロセスを「ＰＥＧ化」と称する。しかしながら、当業者であれば、他のポリオール（例えばポリ（プロピレングリコール）及びポリエチレンポリプロピレングリコール共重合体）が、本明細書に記載のコンジュゲーション技術を用いてＰＥＧ化に使用できることを認識するであろう。
【０１４５】
本開示のコンジュゲートを形成するのに用いられるポリオールは、マルチアーム型ポリオールである。本明細書では、「マルチアーム型ポリオール」とは少なくとも２本のアームが連結したコア構造を含むポリオールを指す。前記マルチアーム型ポリオールは、例えばダイマー（２本のアーム）、テトラマー（４本のアーム）、ヘキサマー（６本のアーム）、オクタマー（８本のアーム）などであってもよい。幾つかの態様において、前記マルチアーム型ポリオールはマルチアーム型ＰＥＧである。
【０１４６】
前記抗Ｄ因子抗体及び抗体変異体のＰＥＧ化で用いられる前記マルチアーム型ＰＥＧの重量平均分子量は適宜変化させることができ、典型的には、約５００から約３００，０００ダルトン（Ｄ）にわたってもよい。幾つかの実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧの重量平均分子量は、約１，０００から約１００，０００Ｄであり、幾つかの実施態様において、約２０，０００から約６０，０００Ｄである。幾つかの実施態様において、ＰＥＧ化は約４０，０００Ｄの重量平均分子量を有するマルチアーム型ＰＥＧで実施される。
【０１４７】
タンパク質のＰＥＧ化のための種々の方法が当該技術分野で公知である。ＰＥＧにコンジュゲートしているタンパク質を産生する具体的な方法としては、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に援用される米国特許第４１７９３３７号、米国特許第４９３５４６５号及び米国特許第５８４９５３５号明細書に記載の方法が挙げられる。典型的には、前記タンパク質は、ポリマー上の末端反応性基に、当該タンパク質のアミノ酸残基の一又は複数を経て、共有結合的に結合される。反応性基を有する前記ポリマーは、活性化又は官能化されたポリマー（例えば官能化されたＰＥＧ）として本明細書で示す。前記反応性基は、前記抗体又は抗体変異体上の遊離スルフヒドリル基又はアミノ基又は他の反応性基と選択的に反応する。前記マルチアーム型ＰＥＧポリマーは、ランダムに、又は部位特異的に、抗体又は抗体変異体上の前記スルフヒドリル基又はアミノ基又は他の反応性基と結合できる。しかしながら、最適な結果を得るためには、前記反応性基が前記抗体上の非常に多くの活性基と反応することを制限し、好ましくは実質的に防止すべく、選択される反応性基のタイプ及び量、並びに使用されるポリマーのタイプを、前記特定の抗体又は抗体変異体に応じて変化させるべきことが理解されるであろう。幾つかの場合、これを十分に制限又は防止できない場合があるため、典型的には、抗体１モルあたり、約０．０５から約１０００モル、又は幾つかの実施態様においては約０．０５から約２００モルの官能化されたポリマーの濃度を採用するのがよい。抗体１モルあたりの官能化されたポリマーの最終的な量は、至適活性を維持し、可能であれば、前記抗体の硝子体液、網膜及び／又は眼房水半減期を最適化するよう適宜調整する。
【０１４８】
前記残基は前記抗体又は抗体変異体のいかなる反応性アミノ酸（例えばＮ末端アミノ酸基）であってもよいが、幾つかの実施態様において、前記反応性アミノ酸はシステインであり、それは例えば、参照により全開示内容を本明細書に援用する国際公開第９９／０３８８７号、国際公開第９４／１２２１９号、国際公開第９４／２２４６６号、米国特許第５２０６３４４号、米国特許第５１６６３２２号及び米国特許第５２０６３４４号に記載のように、その遊離チオール基を通じて、官能化されたポリマーの反応性基に連結される。かかる実施態様において、前記ポリマーは、前記親抗体上の遊離スルフヒドリル又はチオール基と特異的に反応できる少なくとも一つの末端反応性基を含んでもよい。かかる基としては、限定されないが、とりわけマレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド及びパラニトロフェニルカーボネートが挙げられる。前記ポリマーは、選択されたカップリングシステムの化学的性質に適する、米国特許第４１７９３３７号及び米国特許第７１２２６３６号明細書、並びにJevsevar, et al., Biotech J., Vol. 5, pp. 113-128 (2010)に記載のプロトコール及びシステムなど、適切なプロトコールを用いて親抗体にカップリングさせることができる。或いは、前記反応性アミノ酸をリジンとして、その遊離ε−アミノ基を通じて官能化されたポリマーの反応性基に連結させるか（参照により本明細書に援用される国際公開第９３／００１０９号パンフレットを参照）又はグルタミン酸若しくはアスパラギン酸として、アミド結合を通じて前記ポリマーに連結させてもよい。前記ポリマーの反応性基は、次に、タンパク質のアミン又はスルフヒドリル基の例えばα（アルファ）及びε（エプシロン）位と反応させ、共有結合を構築することができる。なお、本開示は、抗体又は抗体断片とポリマーとの間の特定のタイプの結合を利用したコンジュゲートに限られないことはいうまでもない。
【０１４９】
本開示のコンジュゲートを調製するための適切な官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、従来公知の様々な反応により産生できる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ−ＮＨＳ−ＰＥＧ）は、Buckmann and Merr, Makromol. Chem., Vol. 182, pp. 1379-1384 (1981)の方法に従い、ＰＥＧ−モノメチルエーテルから、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応により調製できる。更に、ＰＥＧ端末ヒドロキシ基は、例えば臭化チオニルとの反応によりＰＥＧ−Ｂｒを形成し、続いて過剰なアンモニアによるアミノ分解によりＰＥＧ−ＮＨ２を形成することにより、アミノ基に変換することができる。前記ＰＥＧ−ＮＨ２は、次に、標準的なカップリング試薬（例えばＷｏｏｄｗａｒｄの試薬（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋ））を用いて、目的の抗体又は抗体変異体とコンジュゲートすることができる。更に、ＰＥＧの末端ＣＨ２ＯＨ基を、例えばＭｎＯ２による酸化によりアルデヒド基に変換することができる。前記アルデヒド基は、シアノボロヒドリドなどの試薬による還元的アルキル化により、抗体又は抗体変異体とコンジュゲートさせることができる。
【０１５０】
幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートを調製するのに用いられるマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉ）の構造を有する：
2018536650.tif 000002
式中、各ｍは前記ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さ又はサイズを意味し、独立して約４５から約１０００、又は約３から約２５０、又は約５０から約２００、又は約１００から約１５０の整数であり、ｎは約１から約１０の整数である。
【０１５１】
幾つかの実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧは、ｎが１である一般式（Ｉ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはテトラマーである。別の実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧは、ｎが２である一般式（Ｉ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはヘキサマーである。別の実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧは、ｎが３である一般式（Ｉ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはオクタマーである。
【０１５２】
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するのに用いられるマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩ）の構造を有する：
2018536650.tif 000003
式中、各ｍは前記ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さ又はサイズを意味し、独立して約４５から約１０００に、又は約３から約２５０、又は、約５０から約２００、又は約１００から約１５０の整数であり、ｎは約１から約１０の整数である。
【０１５３】
幾つかの実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧは、ｎが２である一般式（ＩＩ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはテトラマーである。別の実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧは、ｎが４である一般式（ＩＩ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはヘキサマーである。別の実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧは、ｎが６である一般式（ＩＩ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはオクタマーである。
【０１５４】
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するのに用いられるマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩ）の構造を有する：
2018536650.tif 000004
式中、各ｍは前記ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さ又はサイズを意味し、独立して約４５から約１０００、又は約３から約２５０、又は約５０から約２００、又は約１００から約１５０の整数であり、ｎは約１から約１０の整数である。
【０１５５】
幾つかの実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧは、ｎが２である一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはテトラマーである。別の実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧは、ｎが４である一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはヘキサマーである。別の実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧは、ｎが６である一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはオクタマーである。
【０１５６】
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するのに用いられるマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶ）の構造を有する：
2018536650.tif 000005
式中、各ｍは前記ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さ又はサイズを意味し、独立して約４５から約１０００、又は約３から約２５０、又は約５０から約２００、又は約１００から約１５０の整数である。
【０１５７】
一般式（Ｉ）から（ＩＶ）の何れかの構造を有するマルチアーム型ＰＥＧは、上記の技術の何れかを用いて、例えば前記抗体（例えば抗体断片）との反応又はコンジュゲーションに適する末端反応性基を連結して官能化して、官能化されたマルチアーム型ＰＥＧを産生してもよい。しかしながら、他の実施態様において、前記マルチアーム型ＰＥＧは、例えば参照により全開示内容を本明細書に援用する米国特許第７１２２６３６号明細書に記載のように、前記ＰＥＧと連結される抗体又は抗体変異体の一又は複数のアミノ酸残基と反応する多官能性架橋剤を通じて、前記抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に共有結合的に連結されてもよい。
【０１５８】
他の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するのに用いられるマルチアーム型ＰＥＧは、少なくとも一つの末端反応性基を含む官能化されたマルチアーム型ＰＥＧである。前記末端反応性基は、本開示のコンジュゲートを形成するために、抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に直接コンジュゲートすることができる。幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有する：
2018536650.tif 000006
式中、各ｍは前記ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さ又はサイズを意味し、独立して約４５から約１０００、又は約３から約２５０、又は約５０から約２００、又は約１００から約１５０の整数であり、ｎは約１から約１０の整数であり、各Ｒ１は独立して存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して水素又は末端反応性基であり、少なくとも一つのＲ２は末端反応性基である。幾つかの実施態様において、Ｒ２は、チオール反応性基、アミノ反応性基及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１５９】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが１から３の整数である一般式（Ｉａ）の構造を有する。幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが１である一般式（Ｉａ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはテトラマーである。別の実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが２である一般式（Ｉａ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはヘキサマーである。別の実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが３である一般式（Ｉａ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはオクタマーである。
かかる実施態様において、前記オクタマーは、一般式（Ｉｂ）の構造を有する：
2018536650.tif 000007
式中、ｍ、Ｒ１及びＲ２は、上記で定義されるとおりである。具体的には、一実施態様において、各ｍは、前記ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さ又はサイズを意味し、独立して約４５から約１０００、又は約３から約２５０、又は約５０から約２００、又は約１００から約１５０の整数であり、各Ｒ１は独立して存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して水素又は末端反応性基であり、少なくとも一つのＲ２は末端反応性基である。幾つかの実施態様において、Ｒ２は、チオール反応性基、アミノ反応性基及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１６０】
一般式（Ｉｂ）の構造を有するマルチアーム型ＰＥＧは、トリペンタエリスリトール（ＴＰ）コア構造を有し、本明細書ではＴＰオクタマーとも称する。
【０１６１】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の構造を有し、式中、各Ｒ１は、存在するとき、同じか又は異なり、
Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000008
及びそれらの組合せからなる群から選択され、式中、各ｉは独立して０−１０の整数であり、ｊは０−１０の整数であり、Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである。幾つかの実施態様において、各Ｒ１は結合基である。
【０１６２】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の構造を有し、
式中、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000009
であり、ｉ、ｊ及びＲ２は本明細書で定義されるとおりである。
幾つかの実施態様において、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000010
であり、ｉは２であり、ｊは２又は３であり、Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである。
【０１６３】
幾つかの態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の構造を有し、式中、各Ｒ２はマレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド及びパラニトロフェニルカーボネートからなる群から独立して選択される。幾つかの実施態様において、各Ｒ２は独立して、ブロモアセテート、ヨードアセテート、クロロアセテート及びそれらの組合せからなる群から選択されるハロアセテートである。幾つかの実施態様において、各Ｒ２は独立して、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、クロロアセトアミド及びそれらの組合せからなる群から選択されるハロアセトアミドである。幾つかの実施態様において、Ｒ２はマレイミドである。
【０１６４】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、各Ｒ２がマレイミドである一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の構造を有する。
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000011
であり、ｉ及びｊは上記のとおり定義される。一実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000012
であり、ｉは２であり、ｊは２である。
【０１６５】
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するのに用いられる官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し：
2018536650.tif 000013
式中、各ｍは、前記ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さ又はサイズを意味し、独立して約４５から約１０００、又は約３から約２５０、又は約５０から約２００、又は約１００から約１５０の整数であり、ｎは約１から約１０の整数であり、各Ｒ１は独立して存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して水素又は末端反応性基であり、少なくとも一つのＲ２は末端反応性基である。幾つかの実施態様において、Ｒ２は独立してチオール反応性基、アミノ反応性基及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１６６】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが２から６の整数である一般式（ＩＩａ）の構造を有する。
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが３である一般式（ＩＩａ）の構造を有する。別の実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが２である一般式（ＩＩａ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはテトラマーである。別の実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが４である一般式（ＩＩａ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはヘキサマーである。別の実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが６である一般式（ＩＩａ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはオクタマーである。一般式（ＩＩａ）の構造を有するオクタマーは、ヘキサグリセリン（ＨＧ）コア構造を有し、本明細書ではＨＧオクタマーとも称する。
【０１６７】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、各Ｒ１は、存在するとき、同じであるか又は異なり、
Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000014
及びそれらの組合せからなる群から選択され、各ｉは独立して０約１０の整数であり、ｊは０約１０の整数であり、Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである。幾つかの実施態様において、各Ｒ１は結合基である。
【０１６８】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000015
であり、ｉ、ｊ及びＲ２は本明細書で定義されるとおりである。幾つかの実施態様において、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000016
であり、ｉは２であり、ｊは２又は３であり、Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである。
【０１６９】
幾つかの態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、各Ｒ２は独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド及びパラニトロフェニルカーボネートからなる群から選択される。幾つかの実施態様において、各Ｒ２は独立して、ブロモアセテート、ヨードアセテート、クロロアセテート及びその組合せからなる群から選択されるハロアセテートである。幾つかの実施態様において、各Ｒ２は独立して、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、クロロアセトアミド及びそれらの組合せからなる群から選択されるハロアセトアミドである。幾つかの実施態様において、Ｒ２はマレイミドである。
【０１７０】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、各Ｒ２がマレイミドである一般式（ＩＩａ）の構造を有する。幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000017
であり、ｉ及びｊは上記のとおり定義される。幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000018
であり、ｉは２であり、ｊは２である。
【０１７１】
別の態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し：
2018536650.tif 000019
式中、各ｍは、前記ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さ又はサイズを意味し、独立して約４５から約１０００、又は約３から約２５０、又は約５０から約２００、又は約１００から約１５０の整数であり、ｎは約１から約１０の整数であり、各Ｒ１は独立して、存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して水素又は末端反応性基であり、少なくとも一つのＲ２は末端反応性基である。幾つかの実施態様において、Ｒ２はチオール反応性基、アミノ反応性基及びそれらの組合せからなる群から独立して選択される。
【０１７２】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが２から６の整数である一般式（ＩＩＩａ）の構造を有する。幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが２である一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはテトラマーである。別の実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが４である一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはヘキサマーである。別の実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、ｎが６である一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、前記マルチアーム型ＰＥＧはオクタマーである。一般式（ＩＩＩａ）の構造を有するオクタマーは、ヘキサグリセロール（ＨＧＥＯ）コア構造を有し、本明細書ではＨＧＥＯオクタマーとも称する。
【０１７３】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、各Ｒ１は、存在するとき、同じであるか又は異なり、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000020
及びそれらの組合せからなる群から選択され、各ｉは独立して０−１０の整数であり、ｊは０−１０の整数であり、Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである。幾つかの実施態様において、各Ｒ１は結合基である。
【０１７４】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000021
であり、ｉ、ｊ及びＲ２は本明細書で定義されるとおりである。幾つかの実施態様において、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000022
であり、ｉは２であり、ｊは２又は３であり、Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである。
【０１７５】
幾つかの態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、各Ｒ２は独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド及びパラニトロフェニルカーボネートからなる群から選択される。幾つかの実施態様において、各Ｒ２は独立して、ブロモアセテート、ヨードアセテート、クロロアセテート及びそれらの組合せからなる群から選択されるハロアセテートである。幾つかの実施態様において、各Ｒ２は独立して、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、クロロアセトアミド及びそれらの組合せからなる群から選択されるハロアセトアミドである。幾つかの実施態様において、Ｒ２はマレイミドである。
【０１７６】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、各Ｒ２がマレイミドである一般式（ＩＩＩａ）の構造を有する。幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000023
であり、ｉ及びｊは上記のとおり定義される。幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000024
であり、ｉは３であり、ｊは２である。
【０１７７】
別の態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し：
2018536650.tif 000025
式中、各ｍは、前記ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さ又はサイズを意味し、独立して約４５から約１０００、又は約３から約２５０、又は約５０から約２００、又は約１００から約１５０の整数であり、各Ｒ１は独立して、存在しないか又は結合基であり、各Ｒ２は独立して水素又は末端反応性基であり、少なくとも一つのＲ２は末端反応性基である。幾つかの実施態様において、Ｒ２はチオール反応性基、アミノ反応性基及びそれらの組合せからなる群から独立して選択される。
【０１７８】
一般式（ＩＶａ）の構造を有するマルチアーム型ＰＥＧは、ブタンジオールコア構造を有し、本明細書ではＤＸオクタマーとも称する。
【０１７９】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、式中、各Ｒ１は、存在するとき、同じであるか又は異なり、
Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000026
及びそれらの組合せからなる群から選択され、各ｉは独立して０−１０の整数であり、ｊは０−１０の整数であり、Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである。幾つかの実施態様において、各Ｒ１は結合基である。
【０１８０】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000027
であり、ｉ、ｊ及びＲ２は、本明細書で定義されるとおりである。幾つかの実施態様において、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000028
であり、ｉは２であり、ｊは２又は３であり、Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである。
【０１８１】
幾つかの態様において、各Ｒ２は、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド及びパラニトロフェニルカーボネートからなる群から独立して選択される。幾つかの実施態様において、各Ｒ２は独立して、ブロモアセテート、ヨードアセテート、クロロアセテート及びそれらの組合せからなる群から選択されるハロアセテートである。幾つかの実施態様において、各Ｒ２は独立して、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、クロロアセトアミド及びそれらの組合せからなる群から選択されるハロアセトアミドである。幾つかの実施態様において、Ｒ２はマレイミドである。
【０１８２】
幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、各Ｒ２がマレイミドである一般式（ＩＶａ）の構造を有する。幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000029
であり、ｉ及びｊは上記のとおり定義される。幾つかの実施態様において、前記官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は、まとめると、
2018536650.tif 000030
であり、ｉは３であり、ｊは２である。
【０１８３】
本開示のコンジュゲートを調製するのに用いられるマルチアーム型ＰＥＧは、好ましくはＰＥＧ鎖（アーム）長の多分散性が低い。具体的には、前記コンジュゲートを調製するのに用いられるマルチアーム型ＰＥＧの多分散性が高いと、幾つかの例では、最終的なコンジュゲートの分析が困難となる場合があり、具体的には、ＰＥＧあたりの抗体（例えばＦａｂ）数の正確な測定がより困難及び不正確となる。したがって、前記コンジュゲートを形成するのに用いられる前記ＰＥＧは、典型的には、約１から約１．３５の範囲内の多分散性（当該技術分野で公知の方法を使用して測定される）を有し、様々な実施態様においては、約１から約１．２５、約１から約１．２、約１から約１．１５、約１から約１．１、約１．０５又は約１の多分散性を有する。
【０１８４】
本開示での使用に適する他の官能化されたマルチアーム型ＰＥＧは、米国特許出願公開第２０１１／０２８６９５６号及び米国特許出願公開第２０１５／００７３１５５号明細書に記載されており、参照により、両文献の全開示内容を本明細書に援用する。
【０１８５】
本開示での使用に適する官能化マルチアーム型ＰＥＧは、多くの業者から購入できる。例えば、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国）は、マレイミド官能化ＰＥＧオクタマー（例えば８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ及び８ＡＲＭ（ＨＧ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ）並びにテトラマーを販売している。ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ社も、マレイミド官能化ＰＥＧオクタマー（例えばＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ、ＳｕｎｂｒｉｇｈｔＲ  ＤＸ−４００ＭＡ）並びにテトラマー（例えばＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＰＴＥ−４００ＭＡ）を販売している。かかるオクタマー及びテトラマーは、４０，０００Ｄの平均分子量を含む種々の分子量で利用できる。
【０１８６】
ｂ．コンジュゲート
幾つかの実施態様において、本開示は、本発明で開示される一又は複数の抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体、及び一又は複数のマルチアーム型ポリオールを含むコンジュゲートに関し、前記コンジュゲートは、少なくとも一つの抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体を前記ポリオールに共有結合的に連結することにより調製される。幾つかの実施態様において、前記マルチアーム型ポリオールはＰＥＧである。幾つかの実施態様において、前記ＰＥＧはオクタマーである。幾つかの実施態様において、前記ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）又は（ＩＶａ）の構造を有する。
【０１８７】
本開示のコンジュゲートは、各マルチアーム型ＰＥＧにコンジュゲートする抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体の数により特徴を明らかにすることができる。これを本明細書では「ファビレーション（ｆａｂｙｌａｔｉｏｎ）」又は「ファビレーション度（ｄｅｇｒｅｅ）」と称する。各ＰＥＧにコンジュゲートする抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体の数は、以下のような種々の要因により変化し得る：
１）ＰＥＧ中のアーム数
２）ＰＥＧ上の末端反応性基の数及び／又は反応性
３）ＰＥＧのコア構造、並びに／又は
４）ＰＥＧ化反応条件。
【０１８８】
一つの好ましい実施態様において、本開示のコンジュゲートは、少なくとも一つの抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートは、少なくとも２つの抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートは、少なくとも３つの抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートは、少なくとも４つの抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートは、少なくとも５つの抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートは、少なくとも６つの抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。別の実施態様において、前記コンジュゲートは、少なくとも７つの抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートは、８つの抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートは、５−８個の抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートは、６−８個の抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。別の実施態様において、本開示のコンジュゲートは、７−８個の抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体がＰＥＧに共有結合的に連結されている８アーム型ＰＥＧを含む。
【０１８９】
幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートは、一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）又は（ＩＶａ）の何れか一つの構造を有するマルチアーム型ＰＥＧを含む。かかる実施態様において、少なくとも一つのＲ２は、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に共有結合的に連結されている。幾つかの実施態様において、一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）又は（ＩＶａ）の何れか一つの構造を有するマルチアーム型ＰＥＧは、オクタマーであり、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は８つ全てのＲ２基は、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体に共有結合的に連結されている。
【０１９０】
幾つかの態様において、本開示のコンジュゲートには、前記マルチアーム型ポリオールが親抗体上の特定の部位（複数含む）に共有結合的に結合している種が含まれ、すなわち、ポリマーは、前記親抗体又は抗体断片の、特定の領域又は特定のアミノ酸残基又は残基を標的として結合している。標準的な突然変異誘発技術を用いて、前記親抗体又は抗体断片における潜在的ＰＥＧ化部位の数及び／又は位置を変更することができる。このように、アミノ酸置換がシステイン及びリジンなどのアミノ酸による導入又は置換である限りにおいて、本開示の抗Ｄ因子抗体及びその変異体は、天然の抗Ｄ因子配列（図１に示す）より多い又は少ない潜在的ＰＥＧ化部位の数を含むことができる。
【０１９１】
上記のように、ポリマーの部位特異的なコンジュゲーションは、最も一般的には、親抗体又は抗体断片中のシステイン残基への結合により実施できる。かかる実施態様において、カップリング化学は、例えば、親抗体中のジスルフィド架橋のではない、システイン残基の遊離スルフヒドリル基を利用することができる。
【０１９２】
幾つかの実施態様において、親抗体（複数含む）に天然に存在する一又は複数のシステイン残基は、ポリマーのコンジュゲーションのための結合部位として用いられる。他の実施態様において、前記抗体又は抗体変異体の上の遊離アミノ基は、２イミノチオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）でチオール化されることができ、次に、Pedley, et al., Br. J. Cancer, Vol. 70, pp. 1126-1130 (1994)に記載のように、例えばマレイミド官能化ＰＥＧとカップリングすることができる。別の実施態様において、一又は複数のシステイン残基（複数含む）は、特定の結合部位（複数含む）を提供するために、前記親抗体又はポリマーの選択された部位（複数含む）に操作される。
【０１９３】
システイン操作抗体は、既に報告されている（全開示内容を本明細書に援用する米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号明細書、及びJunutula, J. R., et al, J. Immunol Methods, Vol. 332(l-2), pp. 41-52 (2008)参照）。幾つかの実施態様において、システイン操作抗体を親抗体とすることができる。これらは特定の位置で、典型的には定常ドメイン（例えばＣＬ又はＣＨ１）において、遊離システインを有する抗体断片の調製に有用である。システインを含むよう操作された親抗体を、本明細書では「チオＭａｂ」と称し、産生方法に関係なく、かかるシステイン操作抗体から産生されたＦａｂ断片を、本明細書では「チオＦａｂ」と称する。既報のように（米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号、及びJunutula, J. R., et al, J. Immunol Methods, Vol. 332(l-2), pp. 41-52 (2008)）、置換された（「操作された」）システイン（Ｃｙｓ）残基を有する変異体を、新たに導入された操作後システインのチオール基の反応性に関して評価する。前記チオール反応性値は、０−１．０の範囲の相対的数値であり、いかなるシステイン操作抗体でも測定できる。チオール反応性基を有することに加え、チオＭａｂは、それらが抗原結合能力を保持するように選択されるべきである。システイン操作抗体の設計、選択及び調製は、既に詳細に報告されている（参照により本明細書に援用する国際公開第２０１１／０６９１０４号参照）。幾つかの実施態様において、操作後システインは、重鎖又は軽鎖の定常ドメインに導入される。このように、前記システイン操作抗体は、それらに対応する野生型の親抗体の抗原結合能力を保持しており、ゆえに抗原に特異的に結合することができる。
【０１９４】
幾つかの態様において、本開示は、抗体断片−ポリマーコンジュゲートに関し、前記抗体断片はＦａｂであり、前記ポリマーは、通常であれば軽鎖及び重鎖を連結する鎖間ジスルフィド結合を形成しているＦａｂ断片の軽鎖又は重鎖内の一又は複数のシステイン残基と結合する。
【０１９５】
別の態様において、本開示は、抗体断片−ポリマーコンジュゲートに関し、前記抗体断片はＦａｂ−Ｃであり、前記ポリマーは、前記Ｆａｂ−Ｃ断片のヒンジ領域を標的として結合する。幾つかの実施態様において、前記抗体断片のヒンジ領域に天然に存在する一又は複数のシステイン残基は、前記ポリマーとの結合に用いられる。別の実施態様において、一又は複数のシステイン残基は、ポリマーのための特異的な結合部位を提供するために、Ｆａｂ−Ｃ断片のヒンジ領域に操作される。幾つかの実施態様において、本発明で開示される抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は、Ｃ’末端に一つのシステインを付加することで修飾され、一つの結合部位がポリマーのコンジュゲーションのために提供される。別の実施態様において、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は、Ｃ’末端に４つの更なる残基（Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号２１））を付加することで修飾され、２つの結合部位がポリマーのコンジュゲーションのために提供される。更に別の実施態様において、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は、Ｃ’末端に４つの更なる残基（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ）（配列番号１１１）を付加することで修飾され、一つの結合部位がポリマーのコンジュゲーションのために提供される。更に別の実施態様において、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は、Ｃ’末端に４つの更なる残基（Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号１１２））を付加することで修飾され、一つの結合部位がポリマーのコンジュゲーションのために提供される。更に別の実施態様において、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は、Ｃ’末端に４つの更なる残基（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号１１３））を付加することで修飾され、一つの結合部位がポリマーのコンジュゲーションのために提供される。更に別の実施態様において、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は、Ｃ’末端に４つの更なる残基（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号１１４））を付加することで修飾され、一つの結合部位がポリマーのコンジュゲーションのために提供される。更に別の実施態様において、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は、Ｃ’末端が「ＣＹＧＰＰＣ」で修飾され、一つの結合部位がポリマーのコンジュゲーションのために提供される。
【０１９６】
ＰＥＧ化の程度及び部位は、官能化されたＰＥＧとタンパク質との相対濃度やｐＨなどの反応条件を調節することによっても操作できる。望ましいＰＥＧ化の程度を得るための適切な条件は、経験的に、標準的なＰＥＧ化反応の前記パラメータを変更することにより決定できる。
【０１９７】
抗Ｄ因子抗体及び抗体変異体のＰＥＧ化は、いかなる簡便な方法によっても実施できる。適切なＰＥＧ化条件は国際公開第２０１１／０６９１０４号及び国際公開第０３／０２９４２０号に記載されており、両文献の開示内容を本明細書に援用する。
【０１９８】
ｃ．特徴づけ及び活性
前記ＰＥＧ化タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、ペプチドマッピング、液体クロマトグラフィー−質量分析及びインビトロ生物学的アッセイにより特徴を明らかにすることができる。ファビレーションの程度は、典型的には最初にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示される。１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、典型的には溶離バッファー（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ）中で行う。どの残基がＰＥＧ化されているかを示すため、トリプシンやＬｙｓＣプロテアーゼなどのプロテアーゼを用いたペプチドマッピングを実施できる。このように、ＰＥＧ化及び非ＰＥＧ化抗体の試料をＬｙｓ−Ｃプロテアーゼなどのプロテアーゼで消化し、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣなどの技術により分離することができる。産生されたペプチドのクロマトグラフィーパターンを、抗Ｄ因子ポリペプチド用に事前に決定されたペプチドマップと比較することができる。
【０１９９】
各ピークを次に質量分析し、前記ピークに見られるコンジュゲートのサイズを測定できる。前記コンジュゲーションで用いたＰＥＧ、及びピークに見られるコンジュゲートのサイズに応じて、ＰＥＧにコンジュゲートしている抗体又はその変異体の数を推定できる。ＰＥＧ基にコンジュゲートした断片は通常、注入後、ＨＰＬＣカラム上に保持されず、クロマトグラフから消失する。クロマトグラフからのかかる消失は、特定の断片がＰＥＧ化しており、すなわち少なくとも一つのＰＥＧ化可能なアミノ酸残基を含んでいる筈であることを示すものである。ＰＥＧ化された抗Ｄ因子抗体及び抗体変異体は更に、当該技術分野で公知の方法を用いて、Ｄ因子と相互作用する能力及び他の生物活性についてアッセイされ得る。
【０２００】
ＰＥＧ化は抗体医薬の物理的及び化学的性質を変化させ、限定されないが以下のような改善された薬物動態学的作用をもたらし得る：安定性の改善、免疫原性の低下、流体力学半径（ＲＨ）の増加、及び／又は、循環半減期の増加（及び眼内の滞留時間の増加）。
【０２０１】
幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートは、単回の硝子体内注入を経て哺乳動物（例えばヒト）の眼内へ投与した後の半減期が、対応する非コンジュゲート抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体と比較し増加する。幾つかの実施態様において、前記半減期の増加は、対応する非コンジュゲート抗Ｄ因子抗体又は抗体変異体の半減期に対して、少なくとも１．４倍、又は少なくとも１．５倍、又は少なくとも１．８倍、又は少なくとも２倍である。
【０２０２】
幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートは、当該技術分野で公知の方法を使用して測定したとき、約３ｎｍから約３０ｎｍ以上、又は約５ｎｍから約２５ｎｍの流体力学半径（ＲＨ）を有する場合があり、また幾つかの実施態様においては、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ又はそれ以上である場合がある。
【０２０３】
幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートは、（例えば生理的条件に曝露されたときの）月あたりの結合能（例えばｆＤ−結合能）の損失（％）により特徴を明らかにする安定性が、当該技術分野で公知の方法を使用して測定したとき、約１５％、約１２％、約１０％、８％又はそれ以下を示す場合がある。
【０２０４】
幾つかの実施態様において、本開示のコンジュゲートは、実施例で詳述するような、Ｄ因子依存的なＢ因子活性化を示す時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ用いて決定される一定のＩＣ５０力価値を示し得る。幾つかの実施態様において、前記コンジュゲートは、約２５ｐＭから約１０ｎＭ、又は約２５ｐＭから約５ｎＭ、又は約２５ｐＭから約１ｎＭ、又は約２５ｐＭから約７５０ｐＭ、又は約２５ｐＭから約５００ｐＭのＩＣ５０値でＤ因子依存的にＢ因子の活性化を阻害する。
【０２０５】
幾つかの実施態様において、前記コンジュゲートは、小口径ニードルによる投与に適する粘性を有する。幾つかの実施態様において、前記コンジュゲートの粘性は、１５０−２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で８００ｃＰ未満、７００ｃＰ未満、６００ｃＰ未満、５００ｃＰ未満、４００ｃＰ未満、３００ｃＰ未満、２００ｃＰ未満、１００ｃＰ未満、５０ｃＰ未満又は３０ｃＰ未満である。幾つかの実施態様において、前記コンジュゲートの粘性は、２００ｍｇ／ｍｌの濃度で３００ｃＰ未満である。
【０２０６】
薬学的製剤
本開示のコンジュゲートを用いた治製剤は、貯蔵のため、凍結乾燥剤又は水溶液として調製されてもよく、その際には、望ましい純度の前記コンジュゲートと、当該技術分野で典型的に使用される任意の「薬学的に許容される」担体、賦形剤又は安定剤（全てをまとめて「賦形剤」と称する）とを混合することにより調製される。例えば、緩衝剤、安定剤、防腐剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤及び他の種々の添加剤が挙げられる。（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed. (1980)を参照）。かかる添加剤は、使用される投与量及び濃度において、レシピエントに無毒でなければならない。
【０２０７】
緩衝剤は、生理的条件に近い範囲にｐＨを維持する補助をする。それらは、約２ｍＭから約５０ｍＭにわたる濃度が好ましい。本開示において用いられる適切な緩衝剤としては、有機及び無機酸、並びにそれらの塩が挙げられ、例えばクエン酸バッファー（例えばクエン酸一ナトリウム−クエン酸ニナトトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物等）、コハク酸バッファー（例えばコハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物等）、酒石酸バッファー（例えば酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物等）、フマル酸バッファー（例えばフマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物等）、フマル酸バッファー（例えばフマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物等）、グルコン酸バッファー（例えばグルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物等）、シュウ酸バッファー（例えばシュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物等）、乳酸バッファー（例えば乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸、乳酸カリウム混合物等）、並びに酢酸バッファー（例えば酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物等）が挙げられる。更に、リン酸バッファー、ヒスチジンバッファー及びトリスなどのトリメチルアミン塩なども挙げられる。
【０２０８】
微生物の増殖を遅延させるため、防腐剤を添加してもよく、０．２％−１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加し得る。本開示において用いられる適切な防腐剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化（例えば塩化、臭化、ヨウ化）ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（例えばメチル又はプロピルパラベン）カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールが挙げられる。
【０２０９】
「安定剤」としても知られている等張剤は、本開示の液体組成物の等張度を維持するために添加されてもよく、多価糖アルコール、好ましくは、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトール等の三価若しくはそれ以上の糖アルコールが例示される。
【０２１０】
安定剤は、充填剤から、治療剤を可溶化したり、変性を防止したり、又は容器壁への付着を防止する幅広い機能を発揮する賦形剤のカテゴリーを指す。典型的な安定剤としては、多価糖アルコール（上記で列挙）、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等のアミノ酸、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール等の有機糖又は糖アルコール（イノシトール等のサイクリトールを含む）、ポリエチレングリコール、アミノ酸ポリマー、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤、低分子量ポリペプチド（すなわち＜１０の残基）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース等の単糖類、ラクトース、マルトース、スクロース等の二糖類、ラフィノース等の三糖類、デキストラン等の多糖類が挙げられる。安定剤は、活性タンパク質重量部あたり０．１から１０，０００重量部の範囲で存在させてもよい。
【０２１１】
タンパク質性の治療剤が、撹拌により凝集するのを防止するのと同時に、前記治療剤の可溶化を補助するために、非イオン性界面活性剤又は洗剤（別名「湿潤剤」）を添加してもよく、またそれにより、前記製剤が、前記タンパク質の変性を生じることなく剪断面のストレスに曝露されることを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０等）、ポロキサマー（１８４、１８８等）、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０等）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在させてもよい。
【０２１２】
その他の賦形剤としては、充填剤（例えば澱粉）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）及び共溶媒が挙げられる。本発明の製剤は、治療しようとする具体的な徴候に応じて、必要に応じて一又は複数の活性成分を含有してもよい。幾つかの実施態様において、前記活性成分は、相互に悪影響を与えない補完的な活性を示す。例えば、更に免疫抑制剤を提供するのが望ましい場合がある。かかる分子は、意図する目的に対して効果的な量を組合せて存在させる。前記活性成分はまた、それぞれ、例えばヒドロキシメチルセルロース、又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによる、例えばコアセルベーション法、又は界面重合により調製したマイクロカプセル中、コロイド状ドラッグデリバリーシステム（例えばリポソーム、アルブミン微小球状体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はメイクロエマルジョン中にトラップしてもよい。かかる技術は、Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980)に開示されている。
【０２１３】
インビボ投与のために用いられる製剤は、無菌でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜により容易に実施できる。徐放性調製物として調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、前記抗体又は抗体変異体又はそれらの断片（例えば抗原結合断片）を含む固形疎水性ポリマーの半透明マトリックスが挙げられ、当該マトリックスは、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態に形成される。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸塩の共重合体、非分解性のエチレン−酢酸ビニル共重合体、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）などの分解可能な乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロリドとから構成される注射可能なミクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日以上にわたる分子の放出を可能にする一方、特定のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。封入された抗体が長期間封入体中に残留するとき、それらは３７℃で水分に曝露される結果、変性又は凝集を生じ、その結果、生物活性が損失し、免疫原性の変化も生じ得る。関与するメカニズムに応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば凝集メカニズムが、チオジスルフィド交換反応を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが解った場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加剤の使用、及び特異的なポリマーマトリックス組成物の開発により、安定化が可能となり得る。
【０２１４】
眼性疾患又は症状の予防又は治療のための、本開示のコンジュゲートは、典型的には、眼内（ｏｃｕｌａｒ、ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ）及び／又は硝子体内注入、及び／又は強膜近傍（ｊｕｘｔａｓｃｌｅｒａｌ）注入、及び／又はテノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）注入、及び／又は脈絡膜上腔（ｓｕｐｅｒｃｈｏｒｏｉｄａｌ）注入、及び／又は点眼及び／又は軟膏の形態での局所投与により投与される。本開示のかかるコンジュゲートは、種々の方法により、例えばデバイス及び／又はデポーとして硝子体内に送達されることができ、それにより、硝子体への化合物の遅延放出を可能にする。かかる方法としては、例えばIntraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)などの参考文献に記載されているものが挙げられる。一例において、デバイスは、長期間にわたり前記化合物を放出する、ミニポンプ（ｍｉｎ  ｐｕｍｐ）及び／又はマトリックス及び／又は受動拡散システム及び／又は封入セルの形状とし得る（Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)）。他の投与方法を用いてもよく、限定されないが、局所、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内及び病巣内投与が挙げられる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。
【０２１５】
眼投与、眼内投与又は硝子体内投与のための製剤は、当該技術分野で公知の方法及び成分を使用することにより調製できる。効果的な治療のための主な要件は、眼内への適切な浸透である。薬物を局所的に送達できる眼の正面側の疾患とは異なり、網膜疾患はより部位特異的なアプローチを必要とする。点眼及び軟膏が眼の後部に浸透することはまれであり、血液網膜関門が、全身的に投与された薬物の眼組織への浸透を防止する。したがって、通常では、網膜疾患（例えばＡＭＤ及びＣＮＶ）の治療のために選択される薬物送達方法は、硝子体内への直接注入である。硝子体内注入は通常、患者の症状、並びに送達される薬物の特性及び半減期に応じて一定の間隔で繰り返される。眼内（例えば硝子体内）へ浸透させるためには、通常、小さいサイズの分子が好ましい。一実施態様において、狭口径ニードルを使用した硝子体内投与を行う。一実施態様において、前記狭口径ニードルは、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３又は２２ゲージである。
【０２１６】
補体関連の眼性症状（例えばＡＭＤ又はＣＮＶ）の治療有効性は、眼内疾患を評価する際に一般に用いられる様々なエンドポイントで測定できる。例えば、視力喪失を評価することができる。視力喪失は、限定されないが、例えば、ベースラインから所定の時点までの最大視力矯正（ＢＣＶＡ）の平均変化により測定すること（例えば、ＢＣＶＡは、４メートルの試験距離における、ＥＴＤＲＳ（Ｅａｒｌｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  Ｓｔｕｄｙ）視力表及び評価に基づく）、ベースラインと比較し、所定の時点における、１５以下の文字の識字能力を失う対象の比率を測定すること、ベースラインと比較し、所定の時点における、１５以上の文字の識字能力を得る対象の比率を測定すること、所定の時点における、スネレン視標で２０／２０００の視力以下の対象の比率を測定すること、ＮＥＩ  ＶＦＱ（Ｖｉｓｕａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）を測定すること、所定の時点における、ＣＮＶのサイズ及び（例えばフルオレセイン血管撮影法などにより）ＣＮＶの漏出量を測定することにより評価できる。例えば眼評価は、限定されないが、例えば眼試験、眼圧測定、視力測定、細隙灯圧測定、眼内炎症評価等により実施できる。
【０２１７】
特定の障害又は症状の前記治療に効果的な抗体又はその抗体変異体の量は、前記障害又は症状の性質に依存し、また標準的な臨床技術により測定できる。可能な場合、最初にインビトロで、次に、ヒトにおける試験の前に、有用な動物モデルシステムにおいて、用量反応曲線及び本開示の薬学的組成物を決定するのが望ましい。
【０２１８】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体及びコンジュゲートは、前記製剤中、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４７５ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも５００ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を提供する態様で製剤化し得る。幾つかの実施態様において、前記製剤中の抗体は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬの量である。幾つかの実施態様において、前記製剤中の抗体は、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬの量である。幾つかの実施態様において、前記製剤中の抗体は、少なくとも３００ｍｇ／ｍＬの量である。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体及びコンジュゲートは、前記製剤中、約５０ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬ又は約２５０ｍｇ／ｍＬから約３７５ｍｇ／ｍＬの抗体の濃度を提供する態様で製剤化し得る。
【０２１９】
幾つかの実施態様において、治療的なポリペプチド、抗体、又はその抗体変異体、又はその断片（例えば抗原結合断片）を含むコンジュゲートの水溶液は、皮下注射により投与される。別の実施態様において、治療的なポリペプチド、抗体、又はその抗体変異体、又はその断片（例えば抗原結合断片）を含むコンジュゲートの水溶液は、硝子体内注入により投与される。各用量は、眼あたり約０．３ｍｇから約３０ｍｇの範囲であり得る。
【０２２０】
皮下投与の投薬計画は、疾患の種類、疾患の重症度及び治療剤に対する対象の感受性などの多くの臨床的因子に依存し、月一回から一日一回までと変更され得る。
【０２２１】
製造品及びキット
本開示の他の実施形態は、本開示の抗体、又はその変異体、又はその断片（例えば抗原結合性断片）が標的とする症状の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品である。例えば、本開示は、補体関連障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品に関する。前記製造品は、容器と、当該容器上の、又はそれに関連するラベル又は添付文書とを含む。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。前記容器は、種々の材料（例えばガラス又はプラスチック）から製造され得る。前記容器は、前記補体関連の症状の治療、予防及び／又は診断に効果的である組成物を保持するものであり、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば前記容器は、皮下注射用ニードルにより穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。前記組成物中の少なくとも一つの活性剤は、本開示の抗Ｄ因子抗体コンジュゲートである。前記ラベル又は添付文書は、前記組成物が特定の症状の治療、予防及び／又は診断に有用であることを示す。
【０２２２】
添付文書は、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれる説明書のことを指し、かかる治療用製剤の使用に関する指示、使用方法、投薬量、投与方法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含むものである。幾つかの実施態様において、前記ラベル又は添付文書は、前記組成物が、例えば年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）などの、前記で列挙した症状（眼性障害を含む）などの補体関連障害を治療するために用いられることを示す。前記ラベル又は添付文書は更に、患者に前記抗体組成物を投与するための指示を含む。
【０２２３】
更に、前記製造品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストローズ溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器を更に含んでもよい。それは更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードル及びシリンジなど、商業的観点、及びユーザーの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０２２４】
別の実施態様において、例えば補体関連障害の治療、予防及び／又は診断のために、補体関連の溶血アッセイのために、細胞からのＤ因子ポリペプチドの精製又は免疫沈降のために、等、様々な目的に有用なキットも提供される。Ｄ因子ポリペプチドの単離及び精製のため、前記キットは、ビーズ（例えばセファロースビーズ）にカップリングさせた抗Ｄ因子抗体を含んでもよい。インビトロで、例えばＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットで、Ｄ因子ポリペプチドを検出及び定量化するための前記抗体を含むキットが提供できる。前記製造品と同様、前記キットは、容器と、当該容器上の、又はそれに関連したラベル又は添付文書を含む。前記容器は、少なくとも一つの抗Ｄ因子抗体を含む本開示のコンジュゲートを含む組成物を保持する。更に、例えば希釈剤及びバッファー、コントロール抗体を含む容器を含めてもよい。前記ラベル又は添付文書は、前記組成物の説明、並びに目的のインビトロ使用又は検出のための指示を提供するものであり得る。前記ラベル又は添付文書は、（例えば前記抗体又はその抗体断片（例えば抗原結合断片）を対象に投与する際の指示を提供するものであり得る。
【０２２５】
治療的使用
本開示のコンジュゲートは、哺乳動物を処置するのに用いられ得る。幾つかの実施態様において、前記コンジュゲートは、例えば前臨床データを得るために、ヒト以外の哺乳動物に投与される。処置を受ける典型的なヒト以外の哺乳動物としては、前臨床研究に供される、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯動物及び他の哺乳動物が挙げられる。かかる哺乳動物は、前記抗体を用いる処置を受ける疾患用の確立された動物モデルであってもよく、又は、目的の前記抗体の毒性研究用のものであってもよい。これらの実施態様の各々において、用量漸増研究を前記哺乳動物に対して行ってもよい。
【０２２６】
前記コンジュゲートは、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内投与、並びに、必要な場合には局所免疫抑制的処置のため病巣内投与など、適切な手段で投与される。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。更に、前記コンジュゲートは、特に前記抗体又はその抗体変異体又はその断片（例えば抗原結合断片）の用量を漸減させるパルス注入による投与に適する。幾つかの実施態様において、前記投薬は注入により行われ、一部には、投与が一時的か慢性的かに応じて静脈注入か皮下注入により行われる。一実施態様において、狭口径ニードルを使用して硝子体内に投与する。一実施態様において、前記狭口径ニードルは、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３又は２２ゲージである。一実施態様において、前記投薬は移植可能なポート送達系を使用して行われる。
【０２２７】
疾患の予防又は治療の際には、前記コンジュゲートの適切な投薬量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、前記抗体の投与が予防目的か治療目的か、過去の療法、患者の病歴及び前記抗体に対する反応、並びに主治医の裁量に依存する。
【０２２８】
疾患の種類及び重症度に応じて、コンジュゲートは、例えば一又は複数の異時投与又は連続的注入により、約１から約２５ｍｇ／眼（すなわち、一つの眼球の治療と仮定し、約０．０１５ｍｇ／ｋｇから約０．３６ｍｇ／ｋｇ）で前記抗体が患者に提供されるのに十分な量で投与され得る。上記の要因に応じて、前記コンジュゲートの典型的な毎日投与量は、約１から約２０ｍｇ／眼若しくはそれ以上、又は約１から約１５ｍｇ／眼若しくはそれ以上の範囲で前記抗体を提供するのに十分な量であると考えられる。少なくとも数日にわたる反復投与の場合、症状に応じて、病徴の望ましい抑制が生じるまで、前記治療を継続する。しかしながら、他の投与計画が有用な場合がある。この治療の進捗は、従来公知の技術及びアッセイにより容易にモニターされる。例示的投薬計画は、国際公開第９４／０４１８８号で開示される。
【０２２９】
前記コンジュゲート組成物は、医学行動規範と整合する方法で処方され、投薬され、投与され得る。この文脈において考慮すべき点としては、処置しようとする具体的な障害、処置しようとする具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画及び医療施術者公知の他の留意事項が挙げられる。投与される前記コンジュゲートの「治療的有効量」は、かかる考慮すべき点に依存し、疾患又は障害を予防、改善又は治療するのに必要最小限の量である。前記コンジュゲートは、目下のところ問題となる障害の予防又は治療に用いられる一又は複数の薬剤と共に任意選択的に処方されるが、そうである必要はない。他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体又はその抗体変異体又はその断片（例えば抗原結合断片）の量、障害又は治療の種類、並びに上記の他の要因に依存する。これらは通常、上記で使用されたのと同じ投薬量及び投与経路で、又は、従来の投薬量の１から９９％で用いられる。
【０２３０】
本明細書で開示される抗体は、Ｄ因子をそれらの標的として認識し、これらの抗体を含む前記コンジュゲートは、対象における補体媒介性の（補体関連の）障害の処置に用いられ得る。これらの障害は、過剰な又は制御されない補体活性化と関係する。それらの例としては、心肺バイパス術の間の補体活性化や、急性心筋梗塞後の虚血再灌流、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、圧挫、多臓器不全、血液量減少性ショック及び腸虚血による補体活性化が含まれる。これらの障害にはまた、重篤な熱傷、内毒血症、敗血症性ショック、成人性呼吸促迫症候群、血液透析、アナフィラキシーショック、重篤な喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球性貧血、溶連菌感染後糸球体腎炎及び膵臓炎などの炎症性の疾患又は症状が含まれる。前記障害は、薬物の副作用、薬物アレルギー、ＩＬ−２誘導による脈管漏出症候群又はＸ線撮影造影剤アレルギーの結果である場合がある。前記障害は全身性である場合がある。それにはまた、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、関節リウマチ、アルツハイマー病及び多発性硬化症などの自己免疫疾患が含まれる場合もある。補体活性化は、移植片拒絶反応とも関係する。最近、補体活性化は、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症及び他の虚血関連網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル−リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生及び網膜血管新生などの眼性疾患との間の強い相関関係が見出されている。一実施態様において、前記補体関連障害は補体関連の眼性症状である。一実施態様において、前記補体関連の眼性症状は、ドライ型及びウエット型（非滲出性及び滲出性）の形態を含む加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連の網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル−リンダウ病、前記眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生及び網膜血管新生からなる群から選択される。一実施態様において、前記補体関連の眼性症状は、中期のドライ型ＡＭＤ又は地図状萎縮（ＧＡ）から選択される。
【０２３１】
Ｄ因子アンタゴニストを含むコンジュゲートは単独で、又は少なくとも一つの第２の治療的化合物との併用で投与され得る。前記コンジュゲート及び任意の第２の治療的化合物の投与は、同時に行うことができ、例えば、同じ又は異なる投与経路を用いて、一つの組成物又は二つ以上の異なる組成物として実施できる。或いは、又は更に、前記投与は、いかなる順序においても経時的に実施できる。特定の実施態様において、数分から、数日、数週間〜数カ月にわたる投与間隔を、前記二つ以上の組成物の間に置いてもよい。例えば、前記Ｄ因子アンタゴニストを含む前記コンジュゲートを最初に投与し、続いて前記第２の治療的化合物を投与してもよい。しかしながら、前記第２の治療的化合物を同時投与すること、又は前記コンジュゲートより前に投与することも包含される。一例において、前記Ｄ因子アンタゴニストは抗Ｄ因子抗体である。更なる例において、前記抗Ｄ因子抗体は本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体変異体である。幾つかの実施態様において、前記第２の治療的化合物は、ＨＴＲＡ１アンタゴニスト、ＡＮＧ２アンタゴニスト（例えば米国特許出願公開第２００９／０３０４６９４Ａ１号で開示される抗ＡＮＧ２抗体等）、ＴＩＥ２アンタゴニスト（例えば米国特許第６３７６６５３号で開示される抗ＴＩＥ２抗体等）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば２０１５年２月２６日に特許された米国特許第６８８４８７９号で開示されるＶＥＧＦアンタゴニスト等、国際公開第９８／４５３３１号で開示されるベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体、国際公開第２００５／０１２３５９号及び国際公開第２００５／０４４８５３号で開示されるＧ６又はＢ２０のシリーズの抗体（例えばＧ６−３１、Ｂ２０−４．１）、並びに第２の補体成分アンタゴニスト、から選択される。一例において、前記第２の治療的化合物は、ＨＴＲＡ１アンタゴニスト、ＡＮＧ２アンタゴニスト、ＴＩＥ２アンタゴニスト又はＶＥＧＦアンタゴニストである。更なる例において、前記ＨＴＲＡ１アンタゴニストは抗ＨＴＲＡ１抗体である。別の実施態様において、前記ＡＮＧ２アンタゴニストは抗ＡＮＧ２抗体である。別の実施態様において、前記ＴＩＥ２アンタゴニストは抗ＴＩＥ２抗体である。幾つかの実施態様において、前記ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦトラップ（アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））及び抗ＶＥＧＦ抗体（例えばベバシズマブ（アバスチン（登録商標））又はラナビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）））などから選択される。
【０２３２】
本発明で開示される抗Ｄ因子抗体を含む前記コンジュゲートとの併用投与に適する他の治療剤は、前記古典的又は補体副経路の様々なメンバーのアンタゴニスト（補体阻害剤）である。このように、本発明で開示される前記コンジュゲートは、前記Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９補体成分の一又は複数のアンタゴニストと組み合わせて投与され得る。幾つかの実施態様において、本発明で開示される抗Ｄ因子を含む前記コンジュゲートは、前記Ｃ２及び／又はＣ４及び／又はＣ５補体成分のアンタゴニスト（例えば抗Ｃ２及び／又は抗Ｃ４及び／又は抗Ｃ５抗体）と組み合わされる。かかる抗体は当該技術分野で公知であり、及び／又は市販されている。抗Ｃ５抗体であるエクリズマブ（Ａｌｅｘｉｏｎ社、チェシャー、ＣＴ、米国）は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）及び非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の治療への使用が承認されている。他の補体阻害剤は、例えば米国特許出願公開第２００５／００３６９９１Ａ１号パンフレットで開示されている。このように、本発明で開示される抗Ｄ因子抗体を含む前記コンジュゲートは、有効量の一又は複数の、限定されないが、抗Ｃ２及び抗Ｃ５抗体などの補体阻害剤と組み合わせて、また任意選択的に、少なくとも一つの更なるＤ因子アンタゴニスト／抗体と組み合わせて、投与され得る。
【０２３３】
幾つかの実施態様において、補体媒介性の障害を有するヒト対象における補体媒介性の障害のための本開示の処置は、前記対象に有効量の、前記Ｄ因子アンタゴニストを含むＤ因子アンタゴニスト又はコンジュゲートなどの治療化合物を投与することを含み、更に、前記対象に有効量の第２の治療的化合物を、すなわち、ＨＴＲＡ１アンタゴニスト、ＡＮＧ２アンタゴニスト、ＴＩＥ２アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は前記Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９の一又は複数の補体成分のアンタゴニストを投与することを含む。一例において、前記Ｄ因子アンタゴニストは抗Ｄ因子抗体であり、前記コンジュゲートは、一又は複数の抗Ｄ因子抗体を含む。更なる例において、前記抗Ｄ因子抗体は、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体変異体であり、前記コンジュゲートは、一又は複数の抗Ｄ因子抗体変異体を含む。一例において、前記ＨＴＲＡアンタゴニストは抗ＨＴＲＡ１抗体である。別の例では、前記ＡＮＧ２アンタゴニストは抗ＡＮＧ２抗体である。別の例では、前記ＴＩＥ２アンタゴニストは抗ＴＩＥ２抗体である。別の例では、前記ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体である。別の実施態様において、前記Ｃ２及び／又はＣ４及び／又はＣ５補体成分のアンタゴニストは、抗Ｃ２及び／又は抗Ｃ４及び／又は抗Ｃ５抗体である。一例において、前記補体媒介性の障害は補体関連の眼性症状である。一例において、前記眼性障害は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（非滲出性（例えば中期ドライ型ＡＭＤ又は地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出性（例えばウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））、糖尿病性網膜症（ＤＲ））を含む）、眼内炎及びブドウ膜炎である。一例において、前記補体関連の眼性症状は中期のドライ型ＡＭＤである。一例において、前記補体関連の眼性症状は地図状萎縮である。一例において、前記補体関連の眼性症状はウエット型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【０２３４】
本発明の併用投与には、別々の製剤又は単回投与用の薬学的製剤を用いた共投与、及び任意の順序での連続的な投与が含まれ、その際、一般に、一定の時間間隔が存在するが、両方の（又は全ての）活性剤は同時に各々の生物活性を及ぼす。
【実施例】
【０２３５】
以下の実施例は例示として提供されるものであり、限定を目的とするものではない。実施例に記載の市販の薬剤は、特に明記しない限り、製造業者の指示に従い用いた。以下の実施例、及び明細書の全体を通じてＡＴＣＣ寄託番号により同定される細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209）から得たものである。
【０２３６】
実施例１：抗Ｄ因子抗体変異体の生成
ランパリズマブ、すなわち、Ｄ因子の液蔬菜との結合を通じて強力にＤ因子及び補体活性化第２経路を阻害するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ断片は、現在地図状萎縮（ＧＡ）（進行したドライ型ＡＭＤの形態）の処置のために現在臨床試験が行われている。ランパリズマブ（ＦＣＦＤ４５１５Ｓ、以下「ａＦＤ」）は抗体のＦａｂ断片であり、２１４残基の軽鎖（配列番号１）及び２２３残基の重鎖（配列番号２）を含む。
【０２３７】
ＧＡにおけるフェーズＩＩヒト臨床治験の結果は、ａＦＤの月一回の硝子体内注入で治療効果が得られることを示す一方で、更に良好な有効性を達成するために、より多い薬用量を用いることへのインセンティブが存在する。一方、投薬を頻繁に行わないことにより、便宜の改善が患者に提供され、感染率の減少という潜在的利益を有し、臨床的有効性を増加させ、進行度の高くないドライ型形状のＡＭＤを有する患者の治療を容易にし得る。
【０２３８】
前記野生型ａＦＤ（ＷＴ）の、特に低ｐＨ条件下及び／又は中性ｐＨ下での高い濃度における物理的及び化学安定性を更に改善するための努力がなされた。それにより異性化しやすい残基として、軽鎖のアスパラギン酸残基Ａｓｐ−３０及び重鎖のＡｓｐ−６２が同定された（図１Ａ）。Ａｓｐの異性化には脱水による環状のイミド中間体（Ａｓｕ）の形成が含まれるが、それは通常ｐＨ＜８で長持ちし、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）の塩基性ピークとして検出される。前記環状中間体の形成は低ｐＨで促進される。前記環状中間体の加水分解によるＡｓｐ又はＩｓｏ−Ａｓｐの形成は、出発物質と同じ荷電状態を生じさせ、ゆえにＩＥＣにより検出できないが、高ｐＨでより加速される。Ａｓｐ−６２（カバット番号付けに従えばＡｓｐ−６１）の異性化は、それがＦａｂ：ｆＤ複合体の結晶構造中ではＤ因子と接触していないため、力価に影響を及ぼすとは考えられない。Katschke et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12886を参照。Ａｓｐ−３０は、軽鎖の残基Ａｓｐ−３２及びＡｓｐ−９２と共に、Ｄ因子上で静電的に塩基性残基と接触する。Ａｓｐ−３０の異性化は非常に急速で、観察される抗体の能力喪失の原因と考えられる。Ａｓｐ残基３２及び９２の異性化はｆＤ−結合に影響を及ぼすと考えられるが、その速度は非常に遅いことが知られている。前記環状イミドの形成、又は続く３０番目のイソアスパラギン酸への加水分解は、静電的相互作用の混乱を通じて、抗原結合に負のインパクトを与えると考えられる。単離された塩基性画分の抗原結合性の測定値により、前記環状中間体の形態では完全な活性を有し、結合損失の原因としてのｉｓｏ−ａｓｐ形成と整合することが示唆される。
【０２３９】
重鎖のＡｓｎ−１０３（カバット番号付けに従えばＡｓｎ−１０１）は、脱アミド化に影響されやすく、その反応は、弱酸性ｐＨ（６−７）よりも中性条件でより高い速度で進行する。脱アミド化は、ＩＥＣの酸性ピークの出現として検出することができる。Ａｓｎの脱アミド化は、Ａｓｐ異性化と同様、環状Ａｓｕ中間体形成を経て進行する。しかしながら、ＡｓｎからのＡｓｕの形成は、Ａｓｕが加水分解されてＡｓｐ又はＩｓｏ−Ａｓｐを形成する高ｐＨでのみ起こるため、通常、酸性ピークだけが検出される。Ａｓｎ−１０３の側鎖は、Ｄ因子の残基Ａｒｇ−１７２と水素結合を形成する。抗原結合の際の、この部位の脱アミド化又は環状イミド中間体（Ａｓｕ）の形成による効果は知られていない。
【０２４０】
ａＦＤ．ＷＴは、典型的なヒト化ＦａｂのｐＩ（ｐＩ  ８−９）より低いｐＩ（７．１）を有する。ＣＤＲ−Ｌ１（図１Ａ）の組成の関係で、ＶＬドメインにおける負電荷クラスターが生じる。特に低ｐＨ及び低イオン強度において、これらの特徴は分子の溶解度に影響を及ぼし得る。更に、ａＦＤ．ＷＴの高濃度製剤は、中性ｐＨ及び生理的イオン強度であっても、３７℃で速い速度で非共有結合性ダイマーを形成する傾向を有し得る。
【０２４１】
ａＦＤ．ＷＴの幾つかの変異体を、安定性改善のために産生した。キットに添付のプロトコールに従い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ）突然変異誘発キットを使用し、部位特異的突然変異誘発により点突然変異を導入した。必要となるコドン改変を特定するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。設計通りの変更を有するプラスミドを同定し、ＤＮＡ配列決定により確認した。小スケール発現及び精製のため、ＤＮＡで大腸菌６４Ｂ４株を形質転換した。シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍＬのカルベネシリン（メディアプレップコードＡ３２３２）を含む５ｍＬのＬＢ培地（メディアプレップコードＡ２００８）に植菌し、３７℃のＩｎｎｏｖａインキュベータ内で２００ＲＰＭで振盪しながら、１４ｍＬの培養試験管中で一晩増殖させた。これらの培養液を用いて、１Ｌのバッフル付き振盪フラスコ中の、５０μｇ／ｍＬのカルベネシリンを含む２５０ｍＬの完全大豆かす（ｓｏｙ  ｃｒａｐ）培地（メディアプレップコードＡ４５６４）に植菌した。培養液を３０℃、２００ＲＰＭで一晩振盪して増殖させ、次に遠心分離により回収した。細胞ペレットをＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅメディア（インビトロゲン社）を使用して溶解させ、製造業者により供給されるプロトコールに従い、ＧｒａｖｉｔｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア社）上でＦａｂを精製した。Ｆａｂのラージスケール産生のため、形質転換細胞の１０Ｌの培養物から得た細胞ペーストを抽出バッファー中に懸濁させ、マイクロフルイダイザーを使用してホモジナイズした。プロテインＧ−セファロース又はカッパ−セレクトによりイムノアフィニティークロマトグラフィーによりＦａｂを捕捉し、低ｐＨバッファーで溶出させた。前記低ｐＨ溶出液をｐＨ５に調整し、Ｓ−セファロースカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィーにより更に精製した。前記で精製されたタンパク質の性質を質量分析により確認し、プールされた画分を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、透析濾過を経てＰＢＳバッファー（ｐＨ７．３）（本明細書では「ＰＢＳ」と称し、８ｍＭのリン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、２ｍＭのリン酸第１カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ）、にバッファー交換した。
【０２４２】
実施例２：抗Ｄ因子抗体変異体の生理活性
有望な単一及び組合せ変異体を用いて、Ｄ因子（ｆＤ）結合親和性及びＤ因子活性の阻害能力を試験した。
【０２４３】
ａ．表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）測定値によるＤ因子との結合親和性
固定化されているａＦＤ．ＷＴへの、Ｄ因子及びその変異体の結合動態及び結合定数ＫＤを、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置を用い、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）測定により測定した。製造業者により提供されるプロトコールに従い、抗ｈｕＦａｂ捕捉（ＧＥヘルスケア社、Ｃａｔ．  ＃  ２８−９５８３−２５）を用いて、抗体Ｆａｂ断片をＳｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５センサーチップに固定した。２倍希釈系列で０．３９ｎＭから２５ｎＭまでヒトＤ因子の濃度を変化させた溶液を注入した６０μＬアリコートについて記録したセンサーグラムから結合動態を算出した。流速は３０μＬ／分、ランニングバッファーはＨＢＳ−Ｐ＋、分析温度は２５℃、リアルタイムでの比較セル減算を採用し、Ｄ因子注入後の解離を１０分間追跡した。ランニングバッファーの注入において観察されたセンサーグラムの減算後、ＢｉａＥｖａｌソフトウェアｖ４．１（ＧＥヘルスケア社）を用い、１：１モデルに従いデータを解析し、動態及び結合定数を算出した。
2018536650.tif 000031
【０２４４】
ａＦＤ．ＷＴの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ；配列番号３）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ；配列番号４）の位置に基づき、突然変異体を命名、番号付けする。野生型残基の一文字コード、続いて配列位置、続いて置換されたアミノ酸の一文字コード、により表す。同じドメイン上の複数の変化は、コロンで区切る。
【０２４５】
表１で示すように、ａＦＤ．ＷＴは、ＳＰＲ法で測定できる限界（〜１０ｐＭ  ＫＤ）において、ｆＤに対する高い親和性を有する。ＣＤＲ−Ｌ１のアスパラギン酸残基２８、３０及び３１は、ｆＤに対する親和性への目立った効果なしに、それぞれＳｅｒ、Ｇｌｕ及びＳｅｒで個々に置換できた（表１）。対照的に、ＳｅｒによるＣＤＲ−Ｌ１  Ａｓｐ３２の置換は、個々に行った場合も（ＡＦＤ．ｖ４）、又はＤ２８Ｓ及びＤ３１Ｓ突然変異体（ＡＦＤ．ｖ５）と組み合わせた場合も、ｆＤ−結合の顕著な喪失をもたらした。野生型分子と同等のｆＤ親和性が、ＶＬ−Ｄ３０Ｅ、Ｄ３１Ｓ及びＶＨ−Ｄ６２Ｅを組み合わせた三重突然変異体（「ＴＭ」（ＡＦＤ．ｖ６））において、並びに更にＶＬ−Ｄ９２ＥをＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）に加えた四重突然変異体（ＴＭ．Ｄ９２Ｅ（ＡＦＤ．ｖ７））において測定され。ＶＨ−Ｄ６２Ｅは、ｆＤ−結合に対する目立った効果なしに異性化を受け得る置換部位であり、ＶＬ−Ａｓｐ９２は、異性化の速度が遅い、抗原との接触残基である。ＶＬ−Ｄ２８Ｓ、Ｄ３０Ｅ、Ｄ３１Ｓ及びＶＨ−Ｄ６２Ｅを組み合わせた四重突然変異体「ＳＩＥＳＤ」（ＡＦＤ．ｖ８）は、ｆＤに対する親和性の喪失が少なかった（〜２倍）。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の場合、ＶＬ−Ｄ９２Ｅ置換によりｆＤに対する親和性の更なる喪失がもたらされた（ＡＦＤ．ｖ１０（表１のＳＩＥＳＤ．Ｄ９２Ｅ）を参照）。
【０２４６】
脱アミド化の潜在的部位は、他の残基への置換により試験した。ＶＬ−Ｎ３４及びＶＨ−Ｎ５２は共結晶構造においてｆＤと接触しているが、これらのいずれの部位も、中性ｐＨ条件下において顕著な脱アミド化速度を示さない。これらの部位のＳｅｒ置換は、親和性の喪失をもたらした（表１；  ＡＦＤ．ｖ９及びＡＦＤ．ｖ１１）。ＶＨ残基Ａｓｎ−１０３はｆＤと接触し、ＰＢＳ中で計測可能な脱アミド化速度を示す。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の場合、Ａｓｐ又はＳｅｒによるＡｓｎ−１０３の置換は、ｆＤに対する親和性の喪失が小さく、許容されるものであった（ＡＦＤ．ｖ１２（ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｄ）及びＡＦＤ．ｖ１４（ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ）を参照）（表１）。Ａｓｎ−１０３のＧｌｎ置換は、結合親和性の低下が大きかった（ＡＦＤ．ｖ１３（ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｑ）を参照）（表１）。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）と同様、ＶＬ−Ｄ９２Ｅを前記五重突然変異体ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）に加えたＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ．Ｄ９２Ｅ（ＡＦＤ．ｖ１５）は、ｆＤに対する親和性が更に４倍減少した。
【０２４７】
ｂ．Ｄ因子阻害アッセイ
ａＦＤ．ＷＴ及び変異体を用いて、副経路（ＡＰ）溶血アッセイを用いてＤ因子誘導性の補体活性化を阻害する能力を試験した。ウサギ赤血球（Ｅｒ）を用いた前記ＡＰ溶血アッセイは、過去に報告されている。Pangburn (1998), Methods. Enzymol. 162:639、Katschke et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:10473。Ｅｒ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ社）を０．５％のウシ皮膚ゼラチン／ベロナールバッファー（ＧＶＢ）で３回洗浄し、再懸濁した。ａＦＤの希釈液を２×希釈系列で調製し、９６ウェルポリプロピレンプレートに添加した。Ｅｒ懸濁液をＧＶＢ／０．１Ｍ  ＥＧＴＡ／０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２と混合し、前記プレートに添加した。補体活性化は、古典経路を経由するいかなる補体活性化も回避するため、Ｃ１ｑを低減させたヒト血清の添加により開始させた（ＣｏｍｐＴｅｃｈ；  ＧＶＢで１：３希釈）。室温での３０分間のインキュベート後、１０ｍＭのＥＤＴＡ／ＧＶＢ溶液を添加して反応を停止させた。前記プレートを遠心分離し、上清を移した。前記上清の吸光度を４１２ｎｍで測定した。最大に対する５０％阻害を生じさせるＡＦＤ．Ａｂ濃度（ＩＣ５０）を、非直鎖回帰分析により測定した。
2018536650.tif 000032
【０２４８】
表２で示すように、変異体ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）、ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）及びＴＭ．Ｄ９２Ｅ（ＡＦＤ．ｖ７）は、ｆＤ依存的な補体活性化活性を阻害する能力を有し、ＩＣ５０測定値における±３０％の標準誤差はあったが、当該能力はａＦＤ．ＷＴと同等であった。
【０２４９】
ｃ．長期間にわたる結合能
ＳＰＲはまた、所定の条件下での時間経過に伴うＡＦＤ．Ａｂ変異体のｆＤへの全結合量の測定にも用いた。これらの測定の標準誤差は±１０％である。図２Ａは、ｐＨ５．５で、ａＦＤ．ＷＴ並びにＡＦＤ．Ａｂ変異体Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）及びＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）において、１カ月間で結合性の喪失が約４０％であったが、一方で、長期間（７０日）の経過においても、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の場合には結合性の喪失が約１５％程度と小さかったことを示す。比較として、抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ断片（ａＶＥＧＦ）は、７０日以上にわたり結合性の喪失を示さなかった。ｐＨ７．４の条件への塩の添加は、ａＦＤ．ＷＴ及びａＶＥＧＦの場合、結合性喪失を加速すると考えられた（データ示さず）。図２Ｂで示すように、ＰＢＳの存在下では（Ｆａｂタンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍｌ）、Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）及びＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）は、ａＦＤ．ＷＴで観察される場合と同等の、結合性喪失率を示した。３７℃で１０週後の結合性喪失は、ａＦＤ．ＷＴでは約３０％であり、抗Ｄ因子のＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）及びＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）変異体では２０％であった。３７℃で１０週後の結合性喪失は、ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓではわずか１０％であり（ＡＦＤ．１４；図２Ｂ）、実験誤差を超えるものではなく、また同じ条件下でａＶＥＧＦの場合に観察された結果に等しかった。ＰＢＳ中の１００ｍｇ／ｍＬのＦａｂ濃度での熱ストレス試験をＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）において繰り返し、７０日に及ぶデータを収集した。図２Ｃで示すように、７０日における結合性喪失は、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）では１０％未満だった。
【０２５０】
実施例３．改善された安定性を有する抗Ｄ因子抗体変異体
上記の親和性アッセイに基づき、幾つかの抗Ｄ因子抗体変異体を単独及び組合せで選択し、更なる安定性分析を行った。
【０２５１】
ａ．溶解度
最初に、試料を低イオン強度及びｐＨ６における溶解度について試験した。最初に、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０遠心濾過ユニットを用いて、試料を〜１００  ｍｇ／ｍＬの濃度で、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ５バッファー）を用い調製した。ｐＨ５及び低イオン強度を有するこれらの溶液は、目視検査により混濁を示さなかった。試料を１０分間１４，０００ｘｇで遠心分離し、あらゆる不溶性物質をペレット化した。ペレットは観察されず、溶液中のタンパク質濃度をＵＶ吸光度測定値により決定した。試料（〜１ｍＬ）を１０Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ社）のＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセットに置き、４℃で一晩、２０ｍＭのＨｉｓバッファー（ｐＨ６）１Ｌで透析し、続いて混濁の有無を目視検査した。撮影した溶液の写真を図６に示す。ｐＨ６及び低イオン強度条件（２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６）中、〜１００ｍｇ／ｍｌ）では、ａＦＤ．ＷＴ及びＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）の溶液は顕著に混濁していたが、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）溶液は混濁が少なく、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の溶液は透明だった（図６）。上記のように遠心分離した後、ａＦＤ．ＷＴ及びＡＦＤ．ｖ２ではかなりのペレットが、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）では少量のペレットが視覚的に観察され、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）ではペレットが存在しなかった。上清中のタンパク質濃度をＵＶ吸光度測定値により決定した（表３）。ａＦＤ．ＷＴ及びＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）は５０ｍｇ／ｍｌより低い溶解度を示し、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）では１００ｍｇ／ｍＬに近い溶解度を示し、またＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）はこれらの条件下で完全に可溶性だった。ｐＨ５での開始濃度に対するｐＨ６での透析後のＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）のタンパク質濃度の減少が少なかったことは、ペレットが遠心分離後に観察されなかったことから、ＡＦＤ．ｖ８の沈殿よりもむしろ透析による希釈の影響を反映するものである。
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【０２５２】
更なる変異体ＡＦＤ．ｖ３、ＡＦＤ．ｖ１２、ＡＦＤ．ｖ１３及びＡＦＤ．ｖ１４を用いて、無塩での溶解度試験を行った。４℃で一晩のｐＨ６バッファーによる透析、及び３７℃でのインキュベートの後、ａＦＤ．ＷＴ以外の全てのタンパク質溶液は透明であった（図７）。３７℃インキュベート及び遠心分離後のタンパク質濃度の測定（表４）により、全ての変異体がａＦＤ．ＷＴよりも溶解度が高かったことが示された。その後ＰＢＳ（ｐＨ７．３）塩（ＮａＣｌ）含有バッファーで透析したとき、ａＦＤ．ＷＴ（図７、上列）の前記混濁溶液は透明になり、それは、前記沈殿が、塩の添加及び／又はｐＨの上昇に対して可逆的であることを示唆するものであった（図７、下列）。ＡＦＤ．ｖ３に関する溶解度データは、単一のアミノ酸変化Ｄ３１Ｓ（一つの負荷電残基の除去）により溶解度の上昇がもたらされることを示すものである。ＡＦＤ．ｖ８、ＡＦＤ．ｖ１２、ＡＦＤ．ｖ１３及びＡＦＤ．ｖ１４における更なるアミノ酸変化も溶解度を上昇させる。
2018536650.tif 000034
【０２５３】
ａＦＤ．ＷＴ、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）をまた、生理的ｐＨ（ｐＨ７．３）及びイオン強度の条件下での溶解度に関し試験した。生理的ｐＨ及びイオン強度下での溶解度試験のため、試料をＰＢＳで一晩透析し、次に、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０遠心濾過ユニットを使用して、２２７−３７２ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。４℃で一晩インキュベートした後、試料の混濁の有無を視覚的に観察し、一部では遠心分離してタンパク質を沈殿除去し、タンパク質濃度をＵＶ吸光度測定値により決定した（表５で示す）。遠心沈殿法の前に、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の溶液が透明だったのに対して、ａＦＤ．ＷＴ試料は混濁していた（図８に示すａＦＤ．ＷＴ、ＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４）。ＡＦＤ．ｖ１４の濃度は、写真（図８）中の溶液では３４４ｍｇ／ｍＬであり、更に３７２ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。ＡＦＤ．ｖ８の濃度は、図８の溶液では２６９ｍｇ／ｍｌであった。ａＦＤ．ＷＴの濃度は、図８の溶液では２２７ｍｇ／ｍＬであった。遠心分離後、ａＦＤ．ＷＴ溶液ではペレットが観察されたが、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の溶液ではペレットが観察されなかった。タンパク質濃度のデータ（表５）は、沈殿が観察される前に、ａＦＤ．ＷＴのみがＰＢＳ中で２２７ｍｇ／ｍＬまで濃縮されることができるが、溶解度の限界値が、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）（≧２６９ｍｇ／ｍＬ）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）（≧３７２ｍｇ／ｍＬ）ではより高いことを示唆するものであった。沈殿が２６９ｍｇ／ｍＬのＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）で観察されなかったため、溶液を更に濃縮する試みをこれ以上行わず、これが、この変異体のＰＢＳ中での溶解度の下限値である。同様に、ＰＢＳ中のＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の溶解度の下限値は３７２ｍｇ／ｍＬである。ＰＢＳ中のＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の２６９ｍｇ／ｍＬの溶液は、２−８℃で４週間のインキュベート後、透明なままだった。同様に、２−８℃で３週間のインキュベート後のＰＢＳ中のＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の３７２ｍｇ／ｍＬの溶液では、目立った混濁の増加が全く見られなかった。この濃度では、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（図９）を使用した測定の結果、凝集（％）の変化が非常に小さく、２−８℃、３週間で０．９％から２．１％への増加であった（インキュベートより３週間前のＳＥＣデータ（０．９％の凝集）を図９に示す。インキュベートの３週間後のＳＥＣデータは示さず）。
2018536650.tif 000035
【０２５４】
変異体ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の溶解度を、ｐＨ５．５（２０ｍＭのＨＣｌ  ｐＨ５．５）のバッファーでも比較し、またＮａＣｌの濃度を変化させ、硝子体内注入を経て投与される薬物に用いられる製剤を代表させた。約１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の溶液を調製し、試験バッファーで透析した。これらの溶液を次に、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０遠心濾過ユニットを使用して濃縮した。それにより得られた、常温で明らかに透明な溶液の濃度を表６に示す。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）は、ｐＨ５．５及び低いＮａＣｌ濃度で高い溶解度（最高３１４ｍｇ／ｍＬ）を有する。１００ｍＭのＮａＣｌの添加では、２７８ｍｇ／ｍＬまでＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の濃度を増加させることができた。
2018536650.tif 000036
【０２５５】
ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）は、ａＦＤ．ＷＴと比較し負荷電残基が２つ少ないにもかかわらず、画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）（Salas-Solano et al, J. Sep Sci, 35(22): 3124 (2012)）による測定では、これらの電荷の変化は、ｐＩを顕著に変化させない（表５）。タンパク質は、前記ｐＩの付近のｐＨ値では溶解度が最小であると考えられる（Green, A.A., J. Biol. Chem., 93: 517-542 (1931)）。ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の場合、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）での溶解度増加はｐＩ変化と相関していない。むしろ、ＬＣ−ＣＤＲ−Ｌ１（ＶＬ−Ｄ２８ＳとＤ３１Ｓ）のＡｓｐからＳｅｒへのアミノ酸変化は、分子表面の電荷分布を変化させると考えられる。
【０２５６】
ｂ．異性化及び脱アミド化
長時間作用性送達系で見られ得る種々の条件への変異体の曝露を模倣するため、抗体を３７℃で数週間、ｐＨ及び塩条件を変化させて負荷をかけた。
具体的には、抗体を以下の５つの異なる製剤組成で評価した：
製剤１：１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ２．５の１０ｍＭのリン酸バッファー、
製剤２：１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５の１０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ、
製剤３：１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４の１０ｍＭのリン酸塩バッファー（「低塩」）、
製剤４：１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４のＰＢＳ（「高塩」：  １０ｍＭのリン酸塩、１３７ｍＭのＮａＣｌ）、及び
製剤５：１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４  ＰＢＳ。
【０２５７】
全ての溶液は０．０２％のＰＳ２０を含み、それらを３７℃でインキュベートし、２週間毎にサンプリングした。前記低塩条件（ｐＨ２．５、５．５と７．４）を用い、液体製剤中での化学的分解に対する影響を評価した。ＰＢＳを用い、ヒト硝子体のｐＨ及びイオン強度を模倣した。更に、１０ｍＭのリン酸（ｐＨ７．４）をＰＢＳの条件と比較し、化学的及び物理的安定性に対するイオン強度の影響を解析した。前記ＰＢＳ試料では、硝子体の交換を模倣するため、インキュベートの間、定期的にバッファー交換した。野生型ＡＦＤ（「ＷＴ」又は「ａＦＤ．ＷＴ」）及びａＶＥＧＦでは、全５種の条件で評価した。Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）及びＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）変異体では、４番目以外は、全ての製剤で試験した。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）では、製剤２及び５で試験した。
【０２５８】
化学分解の定量により、酸性ピークの形成により特徴を明らかにする脱アミド化、並びに、塩基性ピークとして検出され、長持ちするスクシンイミド（Ａｓｕ）中間体の形成により特徴を明らかにする異性化の脱水段階を解析した。陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＳＡＸ−１０カラム）（ＩＥＣ）を用い、異なる製剤における、抗体試料内の、Ａｓｎが脱アミド化され、Ａｓｐが脱水された分子種の出現を定量化した。
【０２５９】
試験した全ての条件において、試験した抗体の中でもａＦＤ．ＷＴは、主ピークの喪失及び塩基性ピークの増加の率が最も高い。これは、ａＶＥＧＦ、Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）が全て、ａＦＤ．ＷＴと比較し顕著に低い主ピークの喪失率を示すｐＨ５．５において最も顕著である（図３Ａを参照）。ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）は、ｐＨ５．５において、ａＶＥＧＦと同様の率の最も遅い主ピーク喪失率を示し（図３Ａ）、またＰＢＳ中ではａＶＥＧＦよりも更に遅い（図３Ｂ）。図４Ｂで示すように（ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中、１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂ）、Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）は、ａＦＤ．ＷＴに対して塩基性ピークの形成率が約半分であり、一方ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．１４）ではごくわずかな塩基性ピークの形成が見られる。対照的に、図４Ｂで示すように（ＰＢＳ（ｐＨ  ７．３）中、１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂ）、ａＦＤ．ＷＴ及びＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）の酸性ピークの形成率は、ＰＢＳ条件では同等であり、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）及びＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）での測定結果より約２倍遅い。ＰＢＳ中でのＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の酸性ピークの形成は、基本的にごくわずかである。
【０２６０】
ｃ．凝集
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用い、試験した抗体の凝集体及びモノマーの形成を定量化した。ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ２０００（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉ社）カラムを用いた。製造業者の指示（www.tskgel.com）に基づく材料及び条件を用いた。
【０２６１】
３７℃における、ＰＢＳ中に製剤化した１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂを含む試験抗体に関する、ＳＥＣデータに基づく、時間経過におけるモノマー形成（％）を図５に示す。ａＦＤ．ＷＴは、１カ月あたり３−４％で、モノマーピーク画分の減少を示す。ａＦＤ．ＷＴと比較し、陰電荷の変化を有しないＡＦＤ．ｖ２（Ｄ３０Ｅ）は、モノマー喪失率は同程度である。ＡＦＤ．ｖ６、ＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４は、モノマー喪失率が減少している。０日目のモノマー含有量の違いは、精製された調製物の均質性の若干の変動を反映するものである。Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）及びＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）の凝集率は、１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、ｐＨ５．５及び７．４（無塩）で同等であった。ｐＨ７．４における塩の添加は、ＡＦＤ．Ａｂ変異体の凝集率に影響を及ぼさないが、一方でａＶＥＧＦの場合は凝集率が２倍となる。ＰＢＳ中で、１０ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬへの濃度増加により、全ての試験試料で凝集率が増加したため（表７）、当該凝集はタンパク質濃度依存的である。１０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．４、無ＮａＣｌ）中の１０ｍｇ／ｍＬの濃度、及びＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍＬの濃度では、凝集が最も少なかった（表７）。ＰＢＳ中の１００ｍｇ／ｍＬの濃度では、３７℃において、ａＦＤ．ＷＴ及びＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）におけるモノマー喪失（それぞれ４０日間で５．８％及び７．３％）は、ＰＢＳ中の１００ｍｇ／ｍＬのａＶＥＧＦ、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）のそれ（それぞれ４０日間で１．８％、１．５％、０．７％及び１．５％）と比較し非常に大きかった。これらのデータは、ＡＦＤ．ｖ６、ＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４が、ａＦＤ．ＷＴ及びＡＦＤ．ｖ２と比較し凝集が少なく、それらがインビボで免疫原性を示す傾向が、療法において適切である程度に低いことを示唆する。
2018536650.tif 000037
【０２６２】
ｐＨ依存的に形成される断片化を検出するため、５０μｍの内径を有する無コーティング溶融シリカキャピラリー（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を装着したＢｅｃｋｍａｎ  ＰＡ８００システムを使用し、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）を実施した。Ｑ１２６９５と同様の自動制御で、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＮＸｐ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｒｏｂｏｔを用い、試料を調製した。１５秒間、５ｋＶの電圧で試料を前記キャピラリーに注入し、次に３０分間、１５ｋＶの電圧で泳動させた。全試料を室温で泳動させた。全ての試験抗体の電気泳動結果は、ａＦＤ．ＷＴのそれと類似している。ｐＨ２．５の場合にのみ、顕著な断片化が観察された。高い分子量種が観察された条件はなく、形成されるいかなる凝集体もＳＤＳで分離可能で、共有結合的な連結ではないことを示唆する。
【０２６３】
上記の安定性試験の結果は、抗Ｄ因子の三重（ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６））及び四重（ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８））突然変異変異体が、ａＦＤ．ＷＴ又はＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）よりも有意に改善された化学安定性を有することを示す。この系において、ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．１４）は、ｐＨ５．５及びＰＢＳ中で最も高い化学安定性を有し、ａＶＥＧＦの安定性と類似している。異性化及び脱アミド化の部位がいずれも除去されることで、ｆＤ結合親和性が維持されつつ、中性ｐＨにおける溶解度が増加した。上記の知見に基づくと、本明細書に記載の選択された抗Ｄ因子変異体、特にＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）変異体は、例えばポート送達システム（ＰＤＳ）デバイスなどの、高濃度製剤で、かつ長時間作用性の送達に適する。例えばポート送達システムなどの、永久的で補充可能な長期作動性デバイスを用いる送達は、生理的なｐＨ（〜７．３）及びイオン強度（〜１５０ｍＭのＮａＣｌ）の条件下で、高濃度で製剤化され得、凝集体形成の傾向が低いことが要求され得る。
ＨＶＲ配列のリストを示す（変異体中の置換を下線で示す）。
2018536650.tif 000038
【０２６４】
実施例４：ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の高濃度製剤の安定性
上記の安定性試験結果に基づき、ＡＦＤ．ｖ８を用い、低イオン強度、ｐＨ５．５バッファー中で、熱（３７℃）ストレス試験を行い、高濃度製剤への適合性を評価した。約１００ｍｇ／ｍＬのＡＦＤ．ｖ８の溶液を調製し、２０ｍＭの塩酸ヒスチジン（Ｈｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ５．５）で透析し、次にＡｍｉｃｏｎ  ＹＭ−１０遠心濾過ユニットを用いて濃縮した。前記濾過ユニットの除去後のタンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度測定値により、２７２ｍｇ／ｍＬと決定した。滅菌済みＳｐｉｎ−Ｘ（Ｃｏｓｔａｒ社）遠心チューブフィルターを用い、１００μＬのアリコートを０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターで濾過した。スナップキャップ付きエッペンドルフチューブ内の濾過液をパラフィン封入し、３７℃に維持した温暖な部屋に置いた。０、１、２、４及び８カ月の所定の時期にチューブを取り出し、貯蔵バッファー（１０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ５．５、１０％のトレハロース、０．０１％のポリソルベート２０）を９００μＬ添加して１０倍希釈し、分析実行まで約−７０℃で冷凍保存した。試料を用い、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）により電荷変異体の生成を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により凝集体の存在を、表面プラスモン共鳴音（ＳＰＲ）測定値により抗原結合能の維持、またペプチドマッピングにより可変ドメインの特異的な化学的変化を、それぞれ解析した。ＩＥＣは実施例３（段落［００２９２］）に記載のように、ＳＥＣは実施例３（段落［００２９４］）に記載のように実施した。ＳＰＲ及びペプチドマッピングは後述のように実施した。
【０２６５】
ａ．ペプチドマッピング
ＡＦＤ．ｖ８の試料を、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中で、１ｍｇ／ｍＬまで、ＲＣＭバッファー（６ＭのグアニジンＨＣｌ、３６０ｍＭのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．６）で希釈した。２０ｍＭの最終濃度となるよう１Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、次に１時間３７℃でインキュベートし、還元反応を開始させた。還元の後、５０ｍＭの最終濃度となるように１Ｍのヨード酢酸（ＩＡＡ）を添加し、１５分間室温、暗所でインキュベートし、アルキル化反応を実施した。還元及びアルキル化された試料を、Ｇ−２５  Ｍｉｎｉｔｒａｐカラムを用いて、消化バッファー（２５ｍＭのトリス、２．０ＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．２）でバッファー交換した。トリプシン  対  タンパク質比率１：４０（質量）でトリプシンを添加し、消化物を４時間３７℃でインキュベートし、反応を完了させた。
【０２６６】
ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計と連結させたＷａｔｅｒｓ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ａｃｑｕｉｔｙを用い、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析を行った。１０μｇのトリプシン消化された試料を、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＣＳＨカラムにロードし、以下のＬＣ条件で分析した：
移動相Ａ−Ｈ２０中の０．１％のＦＡ
移動フェーズＢ−ＡＣＮ中の０．１％のＦＡ
カラム温度：７７℃
流速：０．２ｍＬ／分。
2018536650.tif 000039
【０２６７】
ＭＳ分析のために、ＦＴＭＳ（フーリエ変換ＭＳ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ）を用い、３５Ｋの分解能で完全ＭＳ１スキャン検出を行った。完全ＭＳ１スキャン（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎはオフ）で検出されたトップの８つのイオンを選択し、データ依存的ＭＳ２スキャンにおけるＨＣＤ断片化を行い、それを前記ＦＴＭＳを用いて検出した。抽出されたイオンクロマトグラフ、並びに天然の及び翻訳後修飾ペプチドの定量を含む下流のデータ分析を、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＸＣａｌｉｂｕｒソフトウェアを使用し実施した。
【０２６８】
ｂ．ＳＰＲ測定値による結合活性
固定化されているヒトＤ因子との結合における機能的活性を、ＳＰＲ測定値により評価した。Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５センサーチップをＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ１（ＧＥヘルスケア社）に装着し、前記製造業者のプロトコールに従い、１Ｘランニングバッファーで初期化し、７０％のグリセロールで標準化した。アミンカップリングキットを用いて、製造業者により提供される材料及び提案されるプロトコールに従い、前記センサーチップ表面を抗原とのアミン結合のために活性化した。前記センサーチップのフローセル上に、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中のｆＤ（２．４ｍｇ／ｍＬ）の希釈により調製した、１００μｇ／ｍＬのｆＤを含む溶液を注入し、ヒトＤ因子（ｆＤ）を共有結合的に固定させた。流速は１０μＬ／分であり、７０μＬの量を用いて注入した。これにより、複数の実験にわたり、約５０００共鳴単位（ＲＵ）の典型的なｆＤの結合密度が得られた。未反応のアミンカップリング部位を、７０μＬの１Ｍのエタノールアミンの注入によりブロックした。
【０２６９】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００評価用ソフトウェアの較正依存的な濃度分析ルーチンを用い、ＡＦＤの抗原結合活性濃度を測定した。標準から５μｇ／ｍＬにまで質量ベースで希釈し、続いて連続２倍希釈系列により２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６及び０．０７８μｇ／ｍＬの試料を産生し、無負荷のＡＦＤの標準曲線を作成した。重量ベースの希釈により試験試料を調製し、約０．５、１．０又は１．５μｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得た。１Ｘランニングバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＰＳ２０）を使用し、全試料（２００μＬ量）を調製した。２５℃に維持され、１Ｘランニングバッファーで初期化したセンサーチップにより、６０μＬのアリコートを、１０μＬ／分の流速で特異性抗原の表面上に注入した。特定の抗原と結合した抗体を、前記試料注入が終了する頃のＳＰＲシグナルから測定した。各結合サイクルの終わりに、１０ｍＭのＧｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）を３０μＬ注入して、抗体−抗原複合体を解離させ、結合した抗体を溶出させた。出発物質の標準曲線を用い、４パラメータ関数を用い、抗体濃度に対するＳＰＲシグナルの相関を求め、データ分析した。前記標準曲線から算出されたパラメータを用いて、観察されたＳＰＲシグナルに基づく試験試料の抗原結合性濃度を算出した。この濃度と吸光度測定値で決定されたタンパク質濃度との比が、結合比率（分数）又は結合（％）となる。
【０２７０】
ｃ．結果
この熱ストレス試験の結果は、ＡＦＤ．ｖ８が高濃度製剤中で安定な分子であることを示す。８０％超の抗原結合能が、３７℃で４カ月後にも維持されていた（図１０Ａ）。４カ月後においてもごくわずかな凝集体形成しか起こらず、タンパク質はＳＥＣによるとほぼ１００％モノマーであった（図１０Ｂ）。酸性種が約１５％に増加し（図１０Ｂ、酸性（％）−ＩＥＣ）、塩基性種が約２０％に増加していた（図１０Ｂ、塩基性（％）−ＩＥＣ）ことから示されるように、若干の化学的変化が４カ月後で生じていた。３７℃で８カ月後、酸性及び塩基性種の更なる増加、モノマー含量の低下及びＤ因子結合能の低下が見られた。ペプチドマッピングは、前記酸性種が主にＣＤＲ−Ｈ３のＡｓｎ−１０３（カバット番号付けに従えばＡｓｎ−１０１）の脱アミド化から生じ（図１０Ｂ、ＣＤＲ−Ｈ３  Ｎ１０１の脱アミノ化（％））、一方、塩基性変異体では、重鎖のＮ末端のピログルタミン酸形成（図１０Ｂ、ＨＣ−Ｅ１スクシンイミド（％））及びＣＤＲ−Ｈ３の残基Ｇｌｕ−９９（カバット番号付けに従えばＧｌｕ−９５）の異性化（図１０Ｂ、ＣＤＲ−Ｈ３  Ｅ９７の異性化（％））から生じることを示唆する。Ａｓｎ−１０３及びＧｌｕ−９９（カバット番号付けに従えばそれぞれＡｓｎ−１０１及びＧｌｕ−９５）は、ランパリズマブとＤ因子との共結晶構造中でＤ因子と接触しているが（Katschke KJ, Jr., Wu P, Ganesan R, Kelley RF, Mathieu MA, Hass PE, Murray J, Kirchhofer D, Weismann C, van Lookeren Campange M, "Inhibiting alternative pathway complement activation by targeting the factor D exosite"、J. Biol. Chem. (2012) 287:12886-92）、重鎖のＮ末端はそうではないため、Ａｓｎ−１０３の脱アミド化及びＧｌｕ−９９の異性化は、モノマー含有量の減少と同様に、８カ月後におけるＤ因子との結合性喪失に直接影響すると考えられる。にもかかわらず、これらの化学的及び物理的変化の速度が遅いこと、低温では更なる速度減少が予想されることを考え合わせると、ＡＦＤ．ｖ８の高濃度液体製剤は、２−８℃での保存、又は約−２０℃での凍結が、許容される貯蔵期限を提供するものと考えられる。
【０２７１】
実施例５：ウサギにおけるＡＦＤ．ｖ８／ｖ１４のｐＫ
ウサギにおける、ＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４のインビボｐＫ試験を実施した。ヒト化抗体は、反復投与すると、又は製剤の持続的送達により曝露量が増加すると、ウサギにとり免疫原性となるため、単回投与実験からｐＫパラメータを決定した。
【０２７２】
前記動物の飼育は、ジェネンテック社の動物のケア及び使用委員会（Genentech Institutional Animal Care and Use Committee）ガイドラインに従い行った。ナイーブなニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギ（オス４１匹、投薬時の体重３．１ｋｇ〜４．１ｋｇ、約４月齢）を投与群として割り当て、チャールズリバー・ラボラトリーズ社において試験アイテムを投与した。
【０２７３】
ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）、ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）又はラニビズマブを、ウサギの両眼の硝子体内注入により単回投与し、最大２７日間観察した。局所用抗生物質（トブラマイシン眼軟膏）を、処置の前日及び注入直後と二回両眼に塗布し、また注入後の後日に二度（１及び２日目に安楽死させた動物を除く）塗布した。投薬前に、散瞳点眼液（１％のトロピカミド）を各眼に塗布し、完全に瞳孔を拡張させた。処置の前、及びその間、イソフルラン／酸素ガスで動物を鎮静化した。またアルカイン（０．５％）を注入前に各眼に投与した。滅菌水（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）で１：１０，０００（ｖ／ｖ）に希釈したベンザルコニウムクロライド（Ｚｅｐｈｉｒａｎ（商標））で結膜をフラッシュした。
【０２７４】
投薬直前に、層流フード下でシリンジを充填した。３０μＬの硝子体内への単回注入（０．３ｍｇ用量）により、全ての動物の両眼にＦａｂを投与した。滅菌された１００μＬサイズの３０ゲージｘ１／２’’のニードルを装着したＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｌｕｅｒ  Ｌｏｃｋシリンジを用いて、委員会認定の獣医眼科医により用量を投与された。臨床投薬を模倣するため、下側頭の四半部（すなわち前記動物に向かって左右の眼それぞれの５時と７時の位置）に眼内投与した。処置の直後に、細隙灯生体鏡検査及び／又は間接検眼により眼を検査した。
【０２７５】
全ての動物は、ペントバルビタールナトリウムの静注による麻酔後、腋窩又は大腿部の動脈切開により全採血した。眼房水、硝子体液及び網膜組織を採取し、液体窒素中で急速に凍結させ、約８０℃で保存した。５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ＭのＮａＣｌでホモジナイズし、網膜中の抗体Ｆａｂを抽出した。試験物質の硝子体内及び網膜内濃度の測定は、後述するようにＧＲＩＰ  ＥＬＩＳＡで行った。ＬＬＯＱ以下の値は、薬物動態学的分析で、又は図示若しくは要約目的で使用しなかった。薬物動態学的パラメータは、名目時間及び用量に関し、ノンコンパートメント分析で測定した（Phoenix WinNonlin, Pharsight Corp, Mountain View, CA）。
【０２７６】
本明細書に示す例外を除き、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）、ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）及びラニビズマブの分析は、一般的な免疫グロブリン薬物動態的（ＧＲＩＰ）ＥＬＩＳＡで行った。ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、０．５Ｍの炭酸／重炭酸バッファー（ｐＨ  ９．６）で１０００ｎｇ／ｍＬまで希釈し、４℃で一晩のインキュベートにより、３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社、Ｎｅｐｔｕｎｅ，ＮＪ）上へコーティングした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したＰＢＳで１−２時間のインキュベートしブロッキングした。これと以降全てのインキュベートは、穏やかに撹拌しながら室温で行った。アッセイバッファー（ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、１５ｐｐｍのプロクリン、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、０．２５％のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．３５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４））で、４０−０．６２５ｎｇ／ｍＬの、ＡＦＤ．ｖ８、ＡＦＤ．ｖ１４又はラニビズマブの連続希釈により、標準曲線を作成した。ウサギの硝子体又は網膜のホモジェネート後試料を、アッセイバッファーでそれぞれ最低１：１００又は１：５０で希釈した。前記希釈された標準、コントロール及び試料を次に、１−２時間、洗浄後の前記プレート上でインキュベートした。洗浄ステップ後、プレートに結合したＡＦＤ．ｖ８、ＡＦＤ．ｖ１４又はラニビズマブを、アッセイ希釈剤（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０＋１０ｐｐｍのプロクリン）で８３．３ｎｇ／ｍＬまで希釈したＨＲＰコンジュゲート＝ヒツジ抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）で１．５時間のインキュベートし、検出した。最終的な洗浄後、テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ社、Ｐａｓａｄｅｎａ，ＭＤ）を添加し１０−１５分間発色させ、１Ｍのリン酸で反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ社、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、４５０ｎｍの吸光度について（参照波長６２０ｎｍ）、前記プレートを分析した。ＡＦＤ．ｖ８、ＡＦＤ．ｖ１４又はラニビズマブの濃度は、社内のＥｘｃｅｌベースのソフトウェアを用いて、それぞれの標準曲線の４パラメータ回帰により算出した。硝子体又は網膜ホモジェネートにおける最小限希釈を考慮すると、ウサギ硝子体又は網膜ホモジェネートにおける、ＡＦＤ．ｖ８、ＡＦＤ．ｖ１４又はラニビズマブの最小限の定量化可能な濃度は、それぞれ６２．５ｎｇ／ｍＬ又は３１．２５ｎｇ／ｍＬであった。
【０２７７】
０．３ｍｇのＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）、ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）又はコンパレータ用量のラニビズマブ（抗ＶＥＧＦ）の硝子体内注入において観察された時間依存的濃度曲線を図１１に示す。
【０２７８】
ノンコンパートメントモデルを用いた硝子体のデータの分析は、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）がラニビズマブと非常に類似したクリアランス特性を有することを示すものであった。ＡＵＣパラメータに反映されるように、３つの眼内区画（硝子体液、眼房水及び網膜）では、全３種のタンパク質は非常に類似する曝露量を提供するものであった。ラニビズマブで算出されたＰＫパラメータは、ウサギに関する以前の研究結果と整合していた（Gaudrealt et al, Retina, 27:1260-6 (2007)）。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）はいずれも、これらの分子の開発に適する標的非依存的な眼クリアランス特性を示す。
【０２７９】
実施例６：ＡＦＤ．ｖ８／ｖ１４の粘性
硝子体内投与にとり低い粘性が重要であるため、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の粘性を、ｐＨ５．５（低塩バッファー）中、タンパク質濃度を変化させて測定した。粘度測定は、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製の、２５℃に温度制御された円錐状及びプレート状レオメーターにて、１０００ｓ−１の剪断速度を用いて行った。
【０２８０】
ａＦＤ．ＷＴ、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）は、２００ｍｇ／ｍＬ超の濃度であっても、硝子体内注入にとって許容される粘度（＜３０ｃＰ）で、タンパク質濃度依存的な同様の粘性プロファイルを示した（図１２）。
【０２８１】
実施例７．ポリマーコンジュゲーションによる抗Ｄ因子抗体変異体の更なる修飾
上記の実施例で記載したａＦＤ．ＷＴ及び変異体は、Ｆａｂ断片である。それらの軽鎖及び重鎖（ＶＬ及びＶＨ）の可変ドメインは、図１Ｂで示すように配列間で変動するが、それらの定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は同じままである。特に、重鎖のＣＨ１ドメインは、図１Ａ（配列番号２）、図１Ｃ（配列番号２７）及び図１Ｄ（配列番号２９）で示すようにスレオニン残基で終わる。ＰＥＧ化などのポリマーコンジュゲーションのためのＡＦＤ．Ａｂ変異体を調製するため、Ｆａｂ断片の重鎖を、Ｆａｂ’相対物のヒンジ領域由来の最初のシステイン残基を付加することにより更に修飾して（例えばＡＦＤ．ｖ８のＣｙｓ修飾ＨＣ（Ｆａｂ−Ｃ）（配列番号３０）、及びＡＦＤ．ｖ１４のＣｙｓ修飾ＨＣ（Ｆａｂ−Ｃ）（配列番号３２））、付加した当該システインをＰＥＧポリマーの結合部位として用いる。したがって、得られた断片は、マルチアーム型ＰＥＧの１本のアームとコンジュゲートできる。前記Ｆａｂ断片の重鎖はまた、Ｆａｂ’相対物のヒンジ領域由来の最初の４つの残基（すなわちＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ）（配列番号２１）を付加することにより修飾され（例えばＡＦＤ．ｖ８のＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−修飾ＨＣ（配列番号３１）、及びＡＦＤ．ｖ１４のＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−修飾ＨＣ（配列番号３３））、付加された２つのＣｙｓが両方ともＰＥＧとの結合部位として用いられ、２つのＰＥＧ分子の取り付けできる修飾ＡＦＤ．Ａｂ  Ｆａｂ断片が得られる。
【０２８２】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）突然変異誘発キットを使用して、キット内のプロトコールに従い、前記Ｃｙｓ修飾及びＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−修飾変異体を調製した。必要なコドン改変をコードするオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。操作による変化を有するプラスミドを同定し、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。小スケール発現のため、大腸菌株６４Ｂ４株をＤＮＡで形質転換した。シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍＬのカルベネシリン（メディア予習コードＡ３２３２）を含む５ｍＬのＬＢ培地（メディアプレップのコードＡ２００８）に植菌し、３７℃のＩｎｎｏｖａインキュベータ内で２００ＲＰＭで振盪しながら、１４ｍＬの培養試験管中で一晩増殖させた。これらの培養液を用いて、１Ｌのバッフル付き振盪フラスコ中の、５０μｇ／ｍＬのカルベネシリンを含む２５０ｍＬの完全大豆かす（ｓｏｙ  ｃｒａｐ）培地（メディアプレップコードＡ４５６４）に植菌した。培養液を３０℃、２００ＲＰＭで一晩振盪して増殖させ、次に遠心分離により回収した。細胞ペレットをＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅメディア（インビトロゲン社）を使用して溶解させ、実施例１に記載のようにＦａｂ−Ｃを精製した。Ｆａｂ−Ｃのラージスケール産生のため、形質転換細胞の１０Ｌの培養物から得た細胞ペーストを抽出バッファー中に懸濁させ、マイクロフルイダイザーを使用してホモジナイズし、実施例８に記載のようにＦａｂ−Ｃを精製した。
【０２８３】
実施例８：ＡＦＤ．ｖ１４コンジュゲートの調製
実施例７で調製したＣｙｓ修飾ＨＣ（配列番号３２）を含む前記ＡＦＤ．ｖ１４変異体（ここでは「Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４変異体」又は「ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ」と称する）を、様々なコア構造を有する市販のマレイミド官能化マルチアーム型ＰＥＧとコンジュゲートした。
【０２８４】
ａ．  マレイミド官能化マルチアーム型ＰＥＧ
表８に詳細に示すマレイミド官能化マルチアーム型ＰＥＧを、コンジュゲーション反応に用いた：
2018536650.tif 000040
2018536650.tif 000041
【０２８５】
８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）及びＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ（ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ社）を用い、ＴＰコア又はＨＧＥＯコアを含むＰＥＧオクタマーの均質性を比較するために、ＭＡＬＤＩを使用して分析した。結果はを図１３Ａ及び１３Ｂに示す。
【０２８６】
図１３Ａ及び１３Ｂから分かるように、ＴＰコアを含む８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬは、ＨＧＥＯコアを含むＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡより均質であった。
【０２８７】
ｂ．Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４変異体とマレイミド官能化マルチアーム型ＰＥＧとのコンジュゲーション
実施例７で調製したＣｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４変異体を、Ｇａｍｍａ  Ｐｌｕｓ樹脂を使用して捕捉し、５倍カラム量の６．５ｍＭのＧＳＨ（ｐＨ８．５）で洗浄し、Ｃ−端末システインのブロックを除去し、Ｆａｂ−Ｃダイマー構造を破壊し、続いて０．１Ｍの酢酸（ｐＨ２．９）で溶出した。Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４モノマーを、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１１４）中、ＳＰセファロース高性能強カチオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア社）を用い、更に１９時間単離し、エンドトキシンを除去した。２０倍カラム量にわたり、０−２０％の、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０＋１ＭのＮａＣｌ）の濃度勾配で溶出を実施した。ブロックを除去されたＣ−端末システインを有するモノマーのＦａｂ−Ｃを次に、１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を用いてｐＨ６．５に滴定し、ＰＥＧ化用に調製した。前記Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４  Ｆａｂ−Ｃを次に、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＥＤＴＡ）中で、約５ｍｇ／ｍＬの濃度で、マレイミド官能化マルチアーム型ＰＥＧとコンジュゲートさせた。前記Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４変異体は、Ｆａｂ−Ｃダイマー化に起因するシステイン反応性の喪失を最小化するため、更なる濃縮を行わなかった。室温に平衡化した後、前記マレイミド官能化マルチアーム型ＰＥＧを２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に再懸濁し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度とした。マレイミド開環を回避するため、ｐＨを６以下に維持した。ＰＥＧを可溶化した後、Ｆａｂ−Ｃプールに、ＰＥＧ：Ｆａｂ−Ｃが０．１１２５：１のモル比となるよう添加した。前記混合物を次に、穏やかに振盪しながら室温で一晩静置した。翌日、コンジュゲート効率（＃  Ｆａｂ／ＰＥＧ）をＳＥＣ−ＭＡＬＳにより確認した。
【０２８８】
実施例９：ＡＦＤ．ｖ１４コンジュゲートの精製及び特性づけ
実施例８で調製した前記コンジュゲートを精製し、ＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して分析し、ＰＥＧ化を確認し、異なるＰＥＧコア構造におけるコンジュゲート効率を測定した。別途指示がない限り、コンジュゲート効率は、３００×８ｍｍのＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０４を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、イソクラティック条件下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を使用した０．８ｍＬ／分のランで測定した。モル質量は、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のインライン静的マルチアングルレーザー光散乱（Ｍｕｌｔｉ−Ａｎｇｌｅ  ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（ＭＡＬＳ）を使用し測定した。準弾性光散乱（Ｑｕａｓｉ−Ｅｌａｓｔｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＱＥＬＳ）（９９．０°の測定による単一光子計測モジュール、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用い、光子相関分光法により、流体半径（ＲＨ）を測定した。生データは、Ｗｙａｔｔ社の独自のＡｓｔｒａソフトウェアを使用して加工し、その際、モル質量及びＲＨ定数はリツキシマブ標準を使用して設定した。
【０２８９】
ａ．Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４−８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬコンジュゲート
実施例８で調製したＣｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４−８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬコンジュゲート（ＴＰコア構造を含む）（以下「ＡＦＤ．ｖ１４  ＴＰコンジュゲート」又は「ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー」）を、２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸（ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、イソクラティック勾配）にて、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ（ＧＥヘルスケア社）カラム上で、ＳＥＣを使用して精製した。モル質量及びコンジュゲート効率は、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のインライン静的マルチアングルレーザー光散乱（Ｍｕｌｔｉ−Ａｎｇｌｅ  ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（ＭＡＬＳ）及びＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０４を使用し測定した（図１４Ｃ）。生データは、Ｗｙａｔｔ社の独自のＡｓｔｒａソフトウェアを使用して加工し、その際、モル質量定数はリツキシマブ標準を使用して設定した。モル質量は、各ＰＥＧに連結したＡＦＤ．ｖ１４変異体の平均数の推定に用いた。結果を図１４Ａ、１４Ｂ及び１４Ｃ、並びに表９に示す。
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【０２９０】
表９から分かるように、ＴＰコアを有するマルチアーム型ＰＥＧオクタマーによるＣｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４変異体（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ）のコンジュゲーションにより、８Ｆａｂ／ＰＥＧを含むコンジュゲートが産生し、ＴＰコアを含むＰＥＧオクタマーとの良好なコンジュゲート効率が得られることが示された（例えば、コンジュゲーションにより８Ｆａｂ／ＰＥＧが約４５％回収）。
【０２９１】
ｂ．Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４−８ＡＲＭ−ＰＥＧ−ＭＡＬコンジュゲート
実施例８で調製したＣｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４−８ＡＲＭ−ＰＥＧ−ＭＡＬコンジュゲート（ＨＧコア構造（ＪｅｎＫｅｍ社）を含む）（以下「ＡＦＤ．ｖ１４  ＨＧコンジュゲート」又は前記「ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマー」）を、２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸（ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、イソクラティック勾配）にて、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ（ＧＥヘルスケア社）カラム上で、ＳＥＣを使用して精製した。モル質量及びコンジュゲート効率を、東ソーＧ３０００ＰＷカラム及びＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のインライン静的ＭＡＬＳインライン静的ＭＡＬＳを使用して測定した。準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）（９９．０°の測定による単一光子計測モジュール、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用い、光子相関分光法により、流体半径（ＲＨ）を測定した。生データは、Ｗｙａｔｔ社の独自のＡｓｔｒａソフトウェアを使用して加工し、その際、モル質量定数はリツキシマブ標準を使用して設定した。モル質量は、各ＰＥＧに連結したＡＦＤ．ｖ１４変異体の数の推定に用いた。結果を図１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃ、並びに表１０に示す。
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【０２９２】
表１０から分かるように、ＨＧコアを含むＰＥＧオクタマーによるＣｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４変異体（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ）のコンジュゲーションにより、８Ｆａｂ／ＰＥＧを含むコンジュゲートが産生した。８Ｆａｂ／ＰＥＧを含むコンジュゲートの回収（約２０％の回収）は、しかしながら、前記ＴＰコアを用いて回収された８Ｆａｂ／ＰＥＧを含むコンジュゲートの約半分のコンジュゲート量であった。ＨＧコアを有するコンジュゲーションはまた、ＴＰコアの場合において観察されたよりも多く、５−７Ｆａｂ／ＰＥＧを有するコンジュゲートが産生され、また凝集体も顕著に多かった。
【０２９３】
推定ファビレーション（Ｆａｂｙｌａｔｉｏｎ）及びＲＨ測定値の改善を目論むべく、Ｓ−３００精製後に得られた画分を含む生成物をプールし、代わりに、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．２５ｍＬ／分のランにて、１０／３００  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ（ＧＥヘルスケア社）カラム上でのＳＥＣ−ＭＡＬＳにより分析した。モル質量及びＲＨは、上記のように測定した。ＳＥＣ及びＭＡＬＳの結果を図１６Ａ及び１６Ｂに示す。
【０２９４】
８ＡＲＭ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（ＨＧコア）を用いて調製され、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲを使用して分析した前記コンジュゲートは、１２．２ｎｍ（±４．５％）の平均ＲＨ、３４０．３ｋＤａ（±８．９％）の平均モル質量及び平均６．４個のＦａｂ／ＰＥＧを有していた。
【０２９５】
ｃ．Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４−ＨＧＥＯ−４００ＭＡコンジュゲート
実施例８で調製したＣｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４−ＨＧＥＯ−４００ＭＡコンジュゲート（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ  ＰＥＧを含む）（以下「ＡＦＤ．ｖ１４  ＨＧＥＯコンジュゲート」又は「ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧＥＯオクタマー」）を、２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸（ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、イソクラティック勾配）中、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ（ＧＥヘルスケア社）カラム上でのＳＥＣにより精製した。モル質量、コンジュゲート効率及びＲＨは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ＨＲを用い、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２５ｍＬ／分のランにより、上記のように測定した。
【０２９６】
結果を図１７Ａ及び１７Ｂに示す。Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ−４００ＭＡ  ＰＥＧ（ＨＧＥＯコア）を使用して調製した前記コンジュゲートは、１５．２ｎｍ（±４．５％）の平均ＲＨ、４２３．８ｋＤａ（±１０．６％）の平均モル質量及び平均８．２個のＦａｂ／ＰＥＧを有していた。
【０２９７】
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲカラム上でのＳＥＣを用いてＡＦＤ．ｖ１４  ＨＧＥＯコンジュゲートを精製した後、モル質量及びコンジュゲート効率を、上記のように、東ソーＧ３０００ＰＷカラム及びＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のインライン静的ＭＡＬＳインライン静的ＭＡＬＳを使用して測定した。モル質量は、各ＰＥＧに連結したＡＦＤ．ｖ１４変異体の数の推定に用いた。この分析結果を、図１８Ａ及び１８Ｂ、並びに表１１に示す。
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【０２９８】
表１１から分かるように、ＨＧＥＯコアを含むＰＥＧオクタマーによるＣｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４変異体（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ）のコンジュゲーションにより、８Ｆａｂ／ＰＥＧを含むコンジュゲートが産生した。ＨＧＥＯコアによるコンジュゲーションはまた、ＴＰコアの場合で観察されたものより多くの、５−６Ｆａｂ／ＰＥＧを含むコンジュゲートが産生した。結果的に、ＴＰコアと比較し、ＨＥＧＯコアによるコンジュゲーションは、より多くの凝集体形成及び低いコンジュゲート効率をもたらした。
【０２９９】
実施例１０：ＡＦＤ．ｖ１４コンジュゲートの富化
製剤の粘性を有意に増加させることなく、硝子体内用の製剤中のＦａｂ濃度を増加させる一つの方法は、製剤中の高度にファビレート（ｆａｂｙｌａｔｅｄ）されたコンジュゲートのパーセンテージを上昇させることである。本実施例では、陽イオン交換クロマトグラフィーを用い、高度にファビレートされたコンジュゲートの濃縮を行った。
【０３００】
実施例９ａで記載したＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーのＳＥＣ精製から得た画分Ｂ４−Ｂ７（８Ｆａｂ／ＰＥＧの推定ファビレーション）をプールし（約４５％の回収）、ＳＰセファロース高性能強カチオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア社）を用いて、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１１４による洗浄）により、１９時間、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を行いエンドトキシンを除去し、続いて５０倍カラム量（ＣＶ）にわたり、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０＋１ＭのＮａＣｌ）を使用し、１０−２０％のグラジェント溶出を行った。上記のように、Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱを使用したＳＥＣ−ＭＡＬＳ＋ＱＥＬＳにより画分を分析した。結果を図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ及び表１２に示す。
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【０３０１】
ＳＰセファロース樹脂上のＣＥＸの後で得られたコンジュゲート含有画分をプールし、３００×８ｍｍのＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱを使用し、イソクラティック条件下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を使用し、０．８ｍＬ／分のランにより分析した。モル質量及びＲＨは上記のように測定した。ＭＡＬＳの結果を図２０に示す。
【０３０２】
富化の後、８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ（ＴＰコア）を用いて調製したコンジュゲートを得、それは１０．５ｎｍ（±２．５％）の平均ＲＨ、４０７．１ｋＤａ（±０．２％）の平均モル質量及び平均７．８個のＦａｂ／ＰＥＧを有していた。
【０３０３】
上記のＴＰコンジュゲートの陽イオン交換クロマトグラフィー精製後に得られたコンジュゲートを含有する画分をプールし（ＣＥＸプール）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ（ＧＥヘルスケア社）を用いたＳＥＣ後に得られたプール画分（実施例９ａを参照）（Ｓ３００プール）、並びに、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ  （ＧＥヘルスケア社）を用い、２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸（ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、イソクラティック勾配）によるＳＥＣ後に得られたプール画分（データ示さず）（Ｓ４００プール）、と比較した。前記プール画分をキャピラリーＳＤＳゲル電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）に供し、その結果を図２１Ａ及び２１Ｂに示す。
【０３０４】
図２１Ａ及び２１Ｂから分かるように、Ｓ−３００及びＳ−４００樹脂による精製の結果は同様であった。しかしながら、ＣＥＸを用いたコンジュゲートの富化は明らかに８Ｆａｂ／ＰＥＧを含むコンジュゲートの量を富化した一方、低分子及び高分子量の夾雑物を除去した。
【０３０５】
実施例１１：ＰＥＧコアの比較
実施例８で調製した、８ＡＲＭ−（ＴＰ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ（ＴＰコア構造を含む）、８ＡＲＭ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（ＨＧコア構造（ＪｅｎＫｅｍ社）を含む）又は前記Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）−ＤＸ−４００ＭＡ  ＰＥＧ（ブタンジオールコア構造を含む；「ＡＦＤ．ｖ１４  ＤＸコンジュゲート」又は「ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＤＸオクタマー」と称する）のいずれかを含むコンジュゲートの特性を、ＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して比較した。ＨＧ及びＤＸコンジュゲートを、２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸（ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、イソクラティック勾配）中、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ（ＧＥヘルスケア社）カラムを用いたＳＥＣにより精製した。ＴＰコンジュゲートの場合、実施例９ａで述べたように、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲによる精製後のプール画分（「ＣＥＸロード」）、並びに、実施例１０で述べたようにＣＥＸ富化後に得られたプール画分（「ＴＰファイナル」）を用いた。モル質量及びコンジュゲーション効率は、Ｗｙａｔｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＭＡＬＳ及び３００×８ｍｍのＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱによる、イソクラティック条件下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を使用した０．８ｍＬ／分のランにより測定した。ＲＨは上記のように測定した。結果を図２２Ａ、２２Ｂ及び表１３に示す。
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【０３０６】
多分散性は当該技術分野で公知の方法を使用して測定し、具体的には、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から市販されているＡｓｔｒａソフトウェアを使用して測定した。
【０３０７】
これらの結果から理解できるように、ＡＦＤ．ｖ１４  ＤＸコンジュゲートは多分散性が低いにもかかわらず、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーほど高いコンジュゲーション効率を提供しなかった。
【０３０８】
実施例１２：ＡＦＤ．ｖ１４コンジュゲートの粘性
低い粘性が硝子体内投与にとり重要であるため、実施例８で調製した、ＰＥＧオクタマー（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国）の８ＡＲＭ（ＨＧ）−ＰＥＧ−ＭＡＬ；ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマー）又はＰＥＧテトラマー（ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ社のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＰＴＥ−４００ＭＡ）のいずれかとコンジュゲートさせたＣｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４変異体（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ）の粘性を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中、タンパク質濃度を変化させて測定した。粘度測定は、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製の、４０℃に温度制御されたコーン及びプレート型レオメーターにて、１０００ｓ−１の剪断速度を用いて行った。結果を図２３に示す。
【０３０９】
図２３から分かるように、テトラマーとのコンジュゲーションと比較し、ＨＧＥＯオクタマーとのＡＦＤ．ｖ１４変異体のコンジュゲーションは、同等の粘性で、高いタンパク質濃度とすることが可能であった。
【０３１０】
異なるタンパク質濃度におけるＡＦＤ．ｖ１４  ＨＧＥＯコンジュゲート（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧＥＯオクタマー）の粘性を、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーのそれと比較した。２０ｍＭのＨｉｓ−Ａｃｅ、５０ｍＭのＮａＣｌの製剤中、ｐＨ６．５において、異なるタンパク質濃度による粘性を測定した。粘度測定は、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製の、２０℃に温度制御されたコーン及びプレート型レオメーターにて、１０００ｓ−１の剪断速度を用いて行った。結果を図２４に示す。
【０３１１】
図２４から分かるように、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーは、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧＥＯオクタマーと比較し、同等のタンパク質濃度で、低い粘性を示した。
【０３１２】
実施例１３：ＡＦＤ．ｖ１４コンジュゲートの熱安定性
長時間作用性送達系にありがちな条件への、ＡＦＤ．ｖ１４コンジュゲートの曝露を模倣するため、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの試料（実施例８で調製）に対し、３７℃で数週間、２つの異なるｐＨ及び塩条件を負荷した。具体的には、以下の製剤においてコンジュゲートを評価した：
【０３１３】
製剤１：１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ、及び、
【０３１４】
製剤２：１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５。
【０３１５】
ヒトの硝子体のｐＨ及びイオン強度を模倣するためにＰＢＳを用いた。１０ｍｇ／ｍＬで、ＰＢＳ又は２０ｍＭのＨｉｓ−酢酸（ｐＨ６．５、５０ｍＭのＮａＣｌ）中に調製したＡＦＤ．ｖ１４−ＴＰコンジュゲート溶液のアリコート（１００μＬ）を、０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）遠心チューブフィルターを用い、濾過滅菌し、次に０、２、４又は８週間（それぞれＴ０、Ｔ２ｗ、Ｔ４ｗ又はＴ８ｗ）、３７℃でインキュベートした。−７０℃で凍結させ、インキュベートを終了させた。解凍後、試料を上記のようにＳｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＳ、ＣＥ−ＳＤＳ、及びｂｉａｃｏｒｅにより分析し、後述するようにｆＤ結合能力を評価した。インキュベーション時間の関数としての、ＣＥ−ＳＤＳにより測定されるコンジュゲートの相対ピーク領域を図２５Ａ及び２５Ｂで示す。同図は、３７℃において１％／週でのコンジュゲートの減少を示唆する。コンジュゲートにおける同様の変化、すなわち遊離Ｆａｂ及びダイマー種の増加は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳにより観察されるとおりである（図２６）。測定での標準誤差（±１０％）より高い結合能の変化が、３７℃におけるコンジュゲートのインキュベートにおいて検出されなかった（図２８）。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、３７℃で８週後、並びにｐＨ６．５で４週後であっても、結合能は安定に保たれていた。
【０３１６】
ａ．ＣＥ−ＳＤＳ分析
材料及び試薬：
ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー試料を使用前に−７０℃から解凍した。シアン化カリウム（ＫＣＮ）及び３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド（ＦＱ）試薬は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）から購入した。一塩基及び二塩基のリン酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びＮ−エチルマレイミドは、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．１Ｍ  水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）及び０．１Ｍ  塩酸（ＨＣｌ）試薬は、Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ社  （Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。交換可能な濾過ゲルは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社  （Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。
【０３１７】
溶液：
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ精製システム（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）により得た脱イオン水（１８．２ＭΩ）を用いて水溶液を調製した。０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．７）反応バッファー及び４％のＳＤＳの溶液を、０．２μｍ膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）で濾過し、使用直前に希釈した。２０ｍＭの蛍光ＦＱの原液を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製し、−２０℃、暗所で保存した。アリコートを解凍し、使用前に水で希釈した。
【０３１８】
ＦＱラベルの手順：
ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー（３００μｇ）の溶液を、ＮＡＰ−５ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケア社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）を用いて、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム反応バッファーでバッファー交換し、製剤中の潜在的な競合成分を除去した。脱塩されたコンジュゲートの２５０μＬアリコートを、３０μＬの１５０ｍＭのＮ−エチルマレイミド／４％ＳＤＳ溶液と混合し、７０℃で５分間インキュベートし、変性条件下でのスルフィドの再シャッフリングをコントロールした（Michels, D.A., Brady, L.J., Guo, A., Balland, A., Anal Chem 2007, 79, 5963-5971を参照）。１０μＬの２．５ｍＭのＦＱ及び３０ｍＭのＫＣＮ試薬を、ＳＤＳ−ＡＦＤ．ｖ１４溶液に添加し、最終溶液を、１％のＳＤＳによる３倍希釈の前に、５０℃で１０分間インキュベートし、反応をクエンチした。還元分析の場合、希釈された試料のアリコートを、７０℃で１０分間、５０ｍＭのＤＴＴとインキュベートた。
【０３１９】
ＣＥ−ＳＤＳ分析：
ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの試料の分離は、４０℃で熱制御されたカートリッジ中の、５０μｍのＩＤ、３１．２ｃｍ（２１ｃｍの有効長）の溶融シリカキャピラリーで実施した（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ，ＵＳＡ）。完全自動化したＢｅｃｋｍａｎ  ＰＡ８００＋システム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）にＬＩＦ検出器を装着し、３２  Ｋａｒａｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１を使用し、装置を制御した。前記ＬＩＦ探知器では、４８８ｎｍの励起を有する３．５ｍＷのＡｒレーザーを使用し、６００±２０ｎｍのバンドパスフィルター（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ社、Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）により放出光を集めた。ネガティブモード（逆極性）で電圧を印加した。試料溶液を、５ｋＶで２５秒間、動電学的に導入し、１７ｋＶで分離した。ランの間、キャピラリーを、０．１ＭのＮａＯＨ、０．１ＭのＨＣｌ及びＢｅｃｋｍａｎゲルバッファーで、それぞれ、５分、１分、１分及び１０分、洗浄した（Michels, et al., Anal Chem 2007, 79, 5963-5971、Michels, et al., Electrophoresis 2012, 33, 815-826を参照）。
【０３２０】
ｂ．結合能力
以下の材料をＧＥヘルスケア社から購入した：Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５センサーチップ（ｃａｔ＃ＢＲ−１００５−３０）、１０×Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ランニングバッファー（ｃａｔ＃ＢＲ−１００６−７１）、０．１ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１．５ＭのＮａＣｌ、０．５％のポリソルベート（登録商標）２０、再生溶液（ｃａｔ＃ＢＲ−１００３−５５）：１０ｍＭのＧｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）、及びアミン結合キット（ｃａｔ＃ＢＲ−１０００−５０）。Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５センサーチップを、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置（ＧＥヘルスケア社）に装着し、前記製造業者のプロトコールに従い、１Ｘランニングバッファーで初期化し、７０％のグリセロールで標準化した。アミンカップリングキットを用いて、製造業者により提供される材料及び提案されるプロトコールに従い、前記センサーチップ表面を抗原とのアミン結合のために活性化した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）によるヒトＤ因子（ｆＤ）（ＰＵＲ＃２０４９１、２．４ｍｇ／ｍＬ）の希釈により調製した、１００μｇ／ｍＬのｆＤを含む溶液を注入し、ｆＤを共有結合的に固定させた。流速は１０μＬ／分であり、７０μＬの量を用いて注入した。これにより、複数の実験にわたり、約５０００共鳴単位（ＲＵ）の典型的なｆＤの結合密度が得られた。未反応のアミンカップリング部位を、７０μＬの１Ｍのエタノールアミンの注入によりブロックした。ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価用ソフトウェアの較正依存的な濃度分析ルーチンを用い、抗体Ｆａｂの抗原結合活性濃度を測定した。原液から５μｇ／ｍＬにまで質量ベースで希釈し、続いて連続２倍希釈系列により２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６及び０．０７８μｇ／ｍＬの試料を産生し、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの標準曲線を作成した。重量ベースの希釈により試験試料を調製し、約０．５、１．０又は１．５μｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得た。１Ｘランニングバッファーを使用し、全試料（２００μＬ量）を調製した。２５℃に維持され、１Ｘランニングバッファーで初期化したセンサーチップにより、６０μＬのアリコートを、１０μＬ／分の流速で特異性抗原の表面上に注入した。特定の抗原と結合した抗体を、前記試料注入が終了する頃のＳＰＲシグナルから測定した。各結合サイクルの終わりに、１０ｍＭのＧｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）を３０μＬ注入して、抗体−抗原複合体を解離させ、結合した抗体を溶出させた。ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの標準曲線を用い、４パラメータ関数を用い、抗体濃度に対するＳＰＲシグナルの相関を求め、データ分析した。前記標準曲線から算出されたパラメータを用いて、観察されたＳＰＲシグナルに基づく試験試料の抗原結合性濃度を算出した。この濃度と吸光度測定値で決定されたタンパク質濃度との比が、結合比率（分数）又は結合（％）となる。
【０３２１】
実施例１４：カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）におけるＡＦＤ．ｖ１４コンジュゲートのＰＫ
実施例８で調製し、実施例９ａ及び１０に記載のように精製した、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーのインビボｐＫ試験を、カニクイザルで実施した。単回投与実験からＰＫパラメータを測定した。非コンジュゲートの未修飾ＡＦＤ．ｖ１４（ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ）をコントロールとして用いた。前記動物の飼育は、ジェネンテック社の動物のケア及び使用委員会（Genentech Institutional Animal Care and Use Committee）ガイドラインに従い行った。
【０３２２】
ａ．試験パラメータ
カニクイザル（２８匹のオス、２ｋｇから４ｋｇ、投薬時の年齢約２−７歳  ）を、４つの投薬群のうちの一つに割り当てた。群１（コントロール）の動物（４匹）には、３０ゲージのニードル（１００μｌの投薬ボリューム）により、ＡＦＤ．ｖ１４を、５ｍｇ／眼（１０ｍｇ／動物）で両眼の硝子体内に単回投与した。群２及び３の動物（各群の１０匹物）には、３０ゲージのニードルを通して、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーを１又は４ｍｇ／眼（２又は８ｍｇ／動物）（それぞれＦａｂ重量ベース）で両眼の硝子体内に投与した（各眼に５０μｌずつを２回注入、１００μｌの全量ボリューム）。動物を鎮静化し（１０ｍｇ／ｋｇのケタミンＨＣｌ、０．５ｍｇ／ｋｇのジアゼパム）、注入前に局所プロパラカイン処置を行った。次に、ＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーを、レンズ後方に向けられたニードルにより、角膜輪部の４ｍｍ後方の強膜及び毛様体扁平部を通して、中部硝子体に投与した。群４の動物（４匹）には、０．４ｍｇ／動物でＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーを単回静脈内ボーラス投与（１ｍＬ）した。静脈内投与の際、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーは、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、１０％のトレハロース及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ｐＨ５．０）として製剤化した。
【０３２３】
眼の組織を群１、２及び３から採取した。群１の１匹の動物（２つの眼）及び群２及び３の各々の２匹の動物（４つの眼）を、以下の投薬後に安楽死させた：群１  −  １日目（２４時間）、２、４及び８日目；群２及び３  −  １日目（２４時間）、４、８、１２及び２０日目。安楽死の後、両眼を摘出し、硝子体液、眼房水及び網膜組織を両眼から採取した。全ての網膜層は、眼を瞬間凍結した日の日後、濾紙を用いて回収した。硝子体液及び眼房水及び網膜組織におけるＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの濃度を測定した。
【０３２４】
全ての血液試料（約１ｍＬ）は、大腿部又は頭部の静脈を経て採取した。ＩＶＴ又はＩＶ投薬後、以下の時期にサンプリングした：群１  −  １時間、６時間、並びに１日（２４時間）、２、３、４、５及び７日；群２及び３  −  １時間、６時間、並びに１日（２４時間）、２、４、６、８、１２及び２０日；群４  −  １時間、６時間、並びに１日（２４時間）、２、４、７、１１、１４、１７、２１、２４及び２８日。採血から１時間以内に、試料を室温で凝固させ、遠心分離により血清を分離し、−６０℃から−８０℃で保存した。
【０３２５】
試験プロトコールの詳細を、表１４に示す。
2018536650.tif 000047
【０３２６】
ｂ．ＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの薬物動態アッセイ
Ｇｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイを用いて、カニクイザル血清、硝子体液、眼房水及び網膜ホモジェネート中のＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーを定量化した。試料を試料バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１５ｐｐｍのプロクリン（シグマアルドリッチ社）、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、０．２５％のＣＨＡＰＳ、５０μｇ／ｍＬのｍｕＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社、Ｃａｔ．  ＃ＳＬＭ６６）、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））中に１：４−１：３０００で希釈した。前記ＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの標準曲線は、試料バッファーで２．０６−１５００ｎｇ／ｍＬにＡＦＤ．ｖ１４又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーを連続希釈することにより作成した。捕捉及び検出試薬として、ＰＢＳ／０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０／０．０２％のＮａＮ３中のビオチンコンジュゲート＝ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＨＣ＋ＬＣ、Ｂｅｔｈｙｌ、Ｃａｔ＃Ａ８０−３１９Ｂ）、及びＲｅｘｘｉｐ  Ｆ（Ｇｙｒｏｌａｂ）中の２５ｎＭのＡｌｅｘａ−抗−ＣＤＲ（クローン２３４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、１００μｇ／ｍＬ適用した。Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００  ＣＤにおいてアッセイを行い、洗浄ステップではＰＢＳ／０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０／０．０２％のＮａＮ３、続いてＧｙｒｏｓ  ｐＨ１１洗浄バッファーを使用した。１％のＰＭＴ設定で、製造業者の説明書に従い、前記装置を作動させ、データ分析を行った。ＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの濃度は、その標準曲線の５パラメータ回帰から決定した。最小限の定量化可能濃度は、カニクイザルの血清、硝子体液、眼房水及び網膜ホモジェネート中のＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーにおいて８．２４ｎｇ／ｍＬ（０．１６ｎＭ）であった。
【０３２７】
硝子体液、眼房水及び網膜のｐＫの結果を、図２９Ａ（硝子体液）及び図２９Ｂ（硝子体液、標準化）、図３０Ａ（眼房水）及び図３０Ｂ（眼房水、標準化）、図３１Ａ（網膜）及び図３１Ｂ（網膜、標準化）、並びに以下の表１５−１７に示す。
2018536650.tif 000048
2018536650.tif 000049
2018536650.tif 000050
【０３２８】
表１５から分かるように、群２（３．５日）及び群３（５日）における硝子体液中での終末相半減期は、非コンジュゲートのＡＦＤ．ｖ１４コントロール（群１）よりも長く、非コンジュゲートのランパリズマブ及びラニビズマブ  Ｆａｂ（約２．３４日）の平均半減期よりも長い。コンジュゲート型ＡＦＤ．ｖ１４を用いた群２及び３の平均ＡＵＣ／ｍｇ投薬（約２０４０）は、非コンジュゲートのランパリズマブ  Ｆａｂ（約１７３３）の平均ＡＵＣ／ｍｇ投薬よりも高い値であった。硝子体での終末相半減期に基づき、４．０ｍｇ／眼の投薬は、１．０ｍｇ／眼の投薬よりもクリアランスが遅かった。表１６及び１７、並びに図３０及び３１から分かるように、非コンジュゲートＦａｂと比較し、長い終末相半減期が、群２及び３（コンジュゲート型ＡＦＤ．ｖ１４）における眼房水及び網膜でも観察された。
【０３２９】
群１−３の血清中ｐＫを図３２Ａ及び３２Ｂ（標準化）に示し、群４の血清ｐＫ中の結果を図３２Ｃに示す。
【０３３０】
図３２Ａ及び３２Ｂから分かるように、群２及び３（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー）の血清ｐＫ曲線は各々平行であるが（図３２Ａ）、用量による標準化後には重複する（図３２Ｂ）。群２及び３では、最終の測定時点まで、血清ＡＵＣは用量に比例している。
【０３３１】
群４の終末相半減期（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー；静脈内投与）は７．５日であり、クリアランスは１５．８ｍＬ／日（５．６４ｍＬ／ｋｇ／日（群４の平均体重は２．８ｋｇ））であった。測定２１、２４及び２８日目、血清中濃度は、群４の４匹のうち３匹で、前記検出限界以下に低下していた。
【０３３２】
ｃ．カニクイザル血清中のＤ因子の薬力学的アッセイ
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、カニクイザルの血清、硝子体液、眼房水及び網膜のホモジェネート中のＤ因子（ｆＤ）を定量化した。マウス抗ヒトＤ因子クローン４６７６（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）をコーティングバッファー（０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍＬに希釈し、３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ＃．  ４６４７１８）中、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで２時間インキュベートし、ブロッキングした。これと以降の全てのインキュベートは、穏やかに撹拌しながら室温で実施した。カニクイザルのｆＤの標準曲線は、試料バッファーで０．０４−５ｎｇ／ｍＬにｆＤを連続希釈することにより作成した（アッセイバッファーには、５００ｎｇ／ｍＬの治療剤ＡＦＤ．ｖ１４及び５０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを補充した）。血清試料及びコントロールを、試料バッファーで最低１：１００まで希釈した。硝子体液、眼房水及び網膜のホモジェネート試料、並びにコントロールを、試料バッファーで最低１：１０まで希釈した。希釈された標準、コントロール及び試料を次に、２時間プレート上でインキュベートし、ＡＦＤ．Ａｂに対するビオチンコンジュゲート＝マウス抗ＣＤＲ  ｍＡｂ（クローン２４２、１μｇ／ｍＬ）を用いて１時間、続いてＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＳＡ−ＨＲＰ（３ｎｇ／ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｃａｔ．＃２１１３０）により１時間反応させ、プレートに結合したｆＤ／ＡＦＤ．Ａｂ複合体を検出した。最終的な洗浄後、テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ社、Ｐａｓａｄｅｎａ，ＭＤ）を添加し１０−１５分間発色させ、１Ｍのリン酸で反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの吸光度について（参照波長６２０ｎｍ）、前記プレートを分析した。ｆＤの濃度は、標準曲線の４パラメータ回帰により算出した。カニクイザル血清中の最小限の定量化可能な濃度は３．９ｎｇ／ｍＬ（０．１６ｎＭ）であった。カニクイザルの硝子体液、眼房水及び網膜ホモジェネートの最小限の定量化可能な濃度は０．３９ｎｇ／ｍｌ（０．０１６ｎＭ）であった。
【０３３３】
群２、３及び４の平均血清中ｆＤ及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー濃度を図３３Ａに示す。図３３Ａから分かるように、血清中のｆＤ濃度は、試験した全ての時点においてＡＦＤ．Ａｂ濃度より高かった。これらの結果は、全身性ＡＰ補体価が全ての群で維持されていることを示す。
【０３３４】
群２及び３の平均の眼内ｆＤ及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー濃度を図３３Ｂに示す。図３３Ｂから分かるように、硝子体液、眼房水及び網膜ホモジェネート中のＡＦＤ．Ａｂ濃度は、試験した全ての時点においてｆＤ濃度より高かった。
【０３３５】
実施例１５：抗Ｄ因子抗体変異体及びコンジュゲートの、Ｄ因子の阻害能力
Ｃｙｓ修飾Ｆａｂ変異体を含むＡＦＤ．Ａｂ変異体又はコンジュゲートのＤ因子の阻害能力は、Ｄ因子依存的なＢ因子活性化の時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイで決定される。
【０３３６】
実施例７で調製したＣｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４変異体（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ）及びＣｙｓ修飾ＨＣ（配列番号３０）を含むＡＦＤ．ｖ８変異体（「Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ８変異体」又は「ＡＦＤ．ｖ８．Ｃ」）を各々、実施例８に記載の処置によりマレイミド官能化マルチアーム型ＰＥＧテトラマー（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＰＴＥ−４００ＭＡ、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ社））とコンジュゲートさせ、（それぞれ、以下「ＡＦＤ．ｖ１４テトラマー」又は「ＡＦＤ．ｖ８テトラマー」と称される）コンジュゲートを形成した。
【０３３７】
ＡＦＤ．Ａｂ  Ｆａｂ変異体、コンジュゲート又はＦａｂコントロールの希釈物を、酵素反応バッファー（ＥＲＢ；  ７５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのトリス、０．００５％のポリソルベート２０、ｐＨ  ７．３）中で４倍濃度で調製し、０．５ｎＭ又は０．２ｎＭのＤ因子（それぞれ１２５ｐＭ又は５０ｐＭ）（ｆＤ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｔｙｌｅｒ，ＴＸ）を含むバッファーか、又はＥＲＢ（酵素なしのコントロール）と混合した。ラニビズマブ（抗ＶＥＧＦ）を陰性対照として用いた。Ｄ因子／ＡＦＤ．Ａｂ又はＤ因子／コンジュゲート混合物（７μｌ／ウェル）を３６４ウェルのＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ  Ｆ  ｐｌｕｓブラックプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に添加し、続いて基質を７μｌ／ウェルで添加した。前記基質は、７μｇ／ｍＬ（４０ｎＭ）のＣ３ｂ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と１μｇ／ｍＬ（１５ｎＭ）のＢ因子（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）の混合物からなるものであった。ＡＦＤ．Ａｂ  Ｆａｂ又はコンジュゲート、酵素、コファクター及び基質を、穏やかに撹拌しながら室温で４５分間インキュベートした。８ｎＭのビオチニル化抗因子Ｂｂ（２Ｆ１２、ＧＮＥ  ＰＲＯ２８２９０９）、４ｎＭのユーロピウムコンジュゲート型抗Ｂａ因子（１Ｃ３のカスタムコンジュゲート、ＧＮＥ  ＰＲＯ２８２９０８、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及び２５ｎＭのストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  ６４７からなる検出試薬カクテル混合物を７μｌ／ウェルを用いて反応を停止させた。前記プレートを、３０分間、暗所にて室温でインキュベートした。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ社、Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用い、３３７ｎｍで励起し、６２０ｎｍのユーロピウム発光及び６６５ｎｍのＡｌｅｘａ蛍光を検出することにより、時間分解蛍光エネルギー移動を検出した。最大に対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を生じさせるＡＦＤ．Ａｂ又はコンジュゲートの濃度を、４パラメータ回帰モデル（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いた非線形回帰アッセイにより決定した。
【０３３８】
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイの阻害曲線を図３４Ａ（表１８）に示す。ランパリズマブは２４ｐＭがＤ因子依存的なｆＢ活性化の阻害のＩＣ５０であり、ＩＣ５０の標準誤差は±２５％である。ＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４のＩＣ５０は、ランパリズマブで測定したのと同等である。図３４Ａ（表１８）を参照。非コンジュゲートＦａｂと比較した、コンジュゲート型Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．Ａｂのバージョン（ＡＦＤ．ｖ８テトラマー及びＡＦＤ．ｖ１４テトラマー）のＩＣ５０の相違は、粘稠性のＰＥＧ化分子を扱うことの困難性が原因と考えられる（図３４Ａ、表１８）。
2018536650.tif 000051
【０３３９】
また、Ｄ因子の阻害に対するＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの効力を、上記の処置を用い、１２５ｐＭのｆＤを添加し、Ｄ因子依存的なＢ因子活性化のＴＲ−ＦＲＥＴ分析により測定した。ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー）のＩＣ５０を、ＡＦＤ．ｖ１４、Ｃｙｓ修飾ＡＦＤ．ｖ１４（「ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ」）及びランパリズマブと比較した。ラニビズマブを陰性対照として用いた。結果を図３４Ｂ及び表１９に示す。
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【０３４０】
ＡＦＤ．ｖ１４  ＴＰオクタマー（Ｓ３００プール及びＣＥＸプール）のＩＣ５０は強力で、非コンジュゲートＦａｂ（ランパリズマブ、ＡＦＤ．ｖ１４、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ）について測定したのと同等である。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたＡＦＤ．ｖ１４  ＴＰオクタマーの濃縮により、より強力な生成物が得られた。
【０３４１】
実施例１６：抗Ｄ因子抗体変異体及びコンジュゲートの、全身補体副経路の活性に対する影響
ランパリズマブは従来、カニクイザルで一過性の全身補体機能を阻害することが示されている（Loyet, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2014, Vol. 351, pp. 527-537を参照）。本実施例において、抗Ｄ因子抗体変異体又はＡＦＤ．Ａｂコンジュゲートの硝子体内投与による、全身補体副経路（ＡＰ）活性に対する影響を、カニクイザルで評価した。
【０３４２】
ａ．カニクイザルの薬物動態学的／薬力学的試験
ＡＦＤ．Ａｂ変異体及びコンジュゲートを、分子の前記薬動学（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）を評価するために、単回ＩＶＴ又はＩＶ投与により、中国起源の雄のカニクイザル（Ｍ．  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に投与した。本試験はＣｏｖａｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で実施した。全ての処置は、米国の農業及び動物福祉に関する規則（９ＣＦＲ３）、実験動物の飼育及び使用、並びに実験動物福祉局のガイドに従い実施した。
【０３４３】
４つの試験を行った。第１（コントロール）の試験（試験１、ｎ＝１０）では、ランパリズマブを、２つの５０μＬのＩＶＴ投薬（１５分間隔）で両眼に投与した。これらの動物は、１０ｍｇ／眼、合計２０ｍｇ／動物で投薬を受けた。投薬前（２日前）及び投薬後の以下の時点で、採血を行った：４５分、並びに２、６、１０、２４、３４、４８、９６、１２０、１５４、１９２、２８８及び３８４時間。２４、４８、１２０、１９２及び３８４時間の採血の後、群あたり２匹の動物を試験から除き、安楽死させて眼のマトリックスを回収した。ランパリズマブコントロール試験は、Loyet, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2014, 351:527-537に記載されている。
【０３４４】
試験２（ｎ＝３）においては、ＡＦＤ．ｖ１４を、２つの５０μＬのＩＶＴ投薬（１５分間隔）で両眼に投与した。これらの動物は、２５ｍｇ／眼、合計５０ｍｇ／動物で投薬を受けた。投薬前（１日及び３日前）及び投薬後の以下の時点で、採血を行った：３０分、並びに２、８、２４、４８及び９６時間。
【０３４５】
試験３（ｎ＝１０）においては、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーを、２つの５０μＬのＩＶＴ投薬（１５分間隔）で、ＡＦＤ．ｖ１４を３．９ｍｇ／眼で両眼に投与し、ＡＦＤ．ｖ１４．の投薬量合計を７．８ｍｇ／動物とした。投薬前（１日及び２日前）及び投薬後の以下の時点で、採血を行った：１、６、２４、４８、７２、９６、１４４、１９２、２８８及び４８０時間。各時点（２４、９６、１９２、２８８及び４８０時間に）で群あたり２匹の動物を試験から除き、安楽死させて眼マトリックスを回収した。
【０３４６】
試験４においては、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマーを、２つの５０μＬのＩＶＴ投薬（１５分間隔）で、ＡＦＤ．ｖ１４を７．１ｍｇ／眼（ｎ＝２）又は１１．８ｍｇ／眼（ｎ＝１）で両眼に投与し、ＡＦＤ．ｖ１４．の投薬量合計を１４．２ｍｇ／動物又は２３．６ｍｇ／動物とした。投薬前（７日及び１日前）及び投薬後の以下の時点で、採血を行った：１、６、２４、９６及び１６８時間。
【０３４７】
全ての試験において、投薬前及び投薬後の血清試料を、ＰＫ及びＰＤ分析用に、大腿静脈を経て各動物から採取した。各時点で、全血を血清分離チューブに採取し、常温で少なくとも２０分間凝固させ、冷却遠心分離を２℃から−８℃で行った。２０分間の遠心分離により血清を回収し、分析を行うまでの間、−６０℃から−８０℃で保存した。
【０３４８】
ｂ．全ＡＦＤ．ｖ１４／コンジュゲートの分析
Ｇｙｒｏｌａｂ  ＸＰアッセイを用いて、カニクイザル血清中のＡＦＤ．ｖ１４、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマーを定量化した。試料を試料バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１５ｐｐｍのプロクリン（シグマアルドリッチ社）、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、０．２５％のＣＨＡＰＳ、５０μｇ／ｍＬのｍｕＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社、Ｃａｔ．  ＃ＳＬＭ６６）、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））中に１：４−１：３０００で希釈した。前記ＡＦＤ．ｖ１４とＡＦＤ．ｖ１４  ＴＰとＨＧコンジュゲート標準曲線は、試料バッファーで２．０６−１５００ｎｇ／ｍＬにＡＦＤ．ｖ１４、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマーを連続希釈することにより作成した。捕捉及び検出試薬として、ＰＢＳ／０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０／０．０２％のＮａＮ３中のビオチンコンジュゲート＝ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＨＣ＋ＬＣ、Ｂｅｔｈｙｌ、Ｃａｔ＃Ａ８０−３１９Ｂ）、及びＲｅｘｘｉｐ  Ｆ（Ｇｙｒｏｌａｂ）中の２５ｎＭのＡｌｅｘａ−抗−ＣＤＲ（クローン２３４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、１００μｇ／ｍＬ適用した。Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００  ＣＤにおいてアッセイを行い、洗浄ステップではＰＢＳ／０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０／０．０２％のＮａＮ３、続いてＧｙｒｏｓ  ｐＨ１１洗浄バッファーを使用した。１％のＰＭＴ設定で、製造業者の説明書に従い、前記装置を作動させ、データ分析を行った。ＡＦＤ．ｖ１４、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマーの濃度は、その標準曲線の５パラメータ回帰から決定した。最小限の定量化可能な濃度は、カニクイザル血清のＡＦＤ．ｖ１４、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマーにおいて８．２４ｎｇ／ｍＬ（０．１６ｎＭ）であった。
【０３４９】
ｃ．カニクイザル血清中のＤ因子の薬力学的アッセイ
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、カニクイザル血清中のＤ因子（ｆＤ）を定量化した。マウス抗ヒトＤ因子クローン４６７６（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）をコーティングバッファー（０．０５Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍＬに希釈し、３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ＃．  ４６４７１８）中、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで２時間インキュベートし、ブロッキングした。これと以降の全てのインキュベートは、穏やかに撹拌しながら室温で実施した。カニクイザルのｆＤの標準曲線は、試料バッファーで０．０４−５ｎｇ／ｍＬにｆＤを連続希釈することにより作成した（アッセイバッファーには、５００ｎｇ／ｍＬの治療剤ＡＦＤ．ｖ１４及び５０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを補充した）。血清試料及びコントロールを、試料バッファーで最低１：１００まで希釈した。希釈された標準、コントロール及び試料を次に、２時間プレート上でインキュベートし、ＡＦＤ．Ａｂに対するビオチンコンジュゲート＝マウス抗ＣＤＲ  ｍＡｂ（クローン２４２、１μｇ／ｍＬ）を用いて１時間、続いてＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＳＡ−ＨＲＰ（３ｎｇ／ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｃａｔ．＃２１１３０）により１時間反応させ、プレートに結合したｆＤ／ＡＦＤ．Ａｂ複合体を検出した。最終的な洗浄後、テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ社、Ｐａｓａｄｅｎａ，ＭＤ）を添加し１０−１５分間発色させ、１Ｍのリン酸で反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの吸光度について（参照波長６２０ｎｍ）、前記プレートを分析した。ｆＤの濃度は、標準曲線の４パラメータ回帰により算出した。カニクイザル血清中の最小限の定量化可能な濃度は３．９ｎｇ／ｍＬ（０．１６ｎＭ）であった。
【０３５０】
ｄ．ＡＰ溶血アッセイ
ＡＦＤ．ｖ１４及びＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーによる、ＡＰ活性を阻害能力を、Ｐａｎｇｂｕｒｎ（Methods Enzymol, 1988, 162:639-653）及びＫａｔｓｃｈｋｅら（J. Biol. Chem., 2009, 284:10473-10479）によりデザインされ、記載されるように、（ヒト又はサル）の血清をウサギ赤血球と結合させる溶血アッセイにより評価した。補体活性化が古典的な補体経路（ＣＰ）を介して生じないことを確実にするため、Ｃ１ｑを枯渇させたヒト血清（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｙｌｅｒ，ＴＸ）を用い、またバッファー中にＥＧＴＡを含有させ、ＣＰ活性に必要なカチオンであるカルシウムをキレート化させた。
【０３５１】
Ｃ１ｑを枯渇させたヒト血清を用い、ＡＰを活性化させた。１０％の、Ｃ１ｑを枯渇させたヒト血清中に存在するｆＤの濃度は、ウェルあたり９．６ｎＭであり、従来報告された血清中のｆＤレベルと一致する値であった（Barnum, et al., J. Immunol. Methods, 1984, 67:303-309、Loyet et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2012, 53:6628-6637）。
【０３５２】
ｅ．ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋Ｈｇオクタマー−処理したカニクイザル血清における、全身ＡＰ活性阻害の測定
ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマー又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの投薬後の全身性ＡＰ活性のあらゆる潜在的阻害の、経時変化及び投薬量への依存性を評価するため、プレートベースのＷＩＥＳＬＡＢ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＡＰ  ＥＬＩＳＡ（このアッセイによるデータを「ＡＰ補体活性（％）」として図３５に示す）又は、上記のインビトロＡＰ溶血アッセイと同様のエクスビボアッセイ（このアッセイによるデータを「溶血相対値（％）」として図３５に示す）を行った。しかしながら、このアッセイでは、外因のＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマー又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの希釈曲線を血清試料に加える代わりに、前記試料自体を連続希釈し、何らかの溶血性活性の阻害が生じた場合、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマー又はＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの注入量に起因するものとした。
【０３５３】
赤血球を調製し、以下の変更を行う以外は、ＡＰ溶血アッセイに関して上述したのと同様にアッセイを行った。最大の溶血に対応する吸光度を決定するため、全溶血コントロールを滅菌水（８０μｌ／ウェル）で調製し、一方他の全てのウェルにはＧＶＢ（５０μｌ）を添加した。カニクイザル血清試料を６ポイント以上で１：１．５で連続希釈し、陰性対照（バッファーのみ）と共に、９６ウェルのＵ字底型ポリプロピレン製プレートに添加した（３０μｌ／ウェル）。全溶血コントロールは、最大（１００％）の溶血を表す。データポイント毎に３回の結果を集計し、最大溶血の平均（％）を、アッセイにおける最終的な血清希釈の回帰曲線に対してプロットした。最大溶血に対する５０％の値（ＡＨ５０）（５０％最大溶血と定義）を、４パラメータ回帰モデルを用いた非線形回帰アッセイで決定した。飽和に達しなかった曲線の場合、前記ＡＨ５０は、上の漸近線を１００％として固定したカーブフィットを用いて推定した。相対溶血値（％）は、［（個々の時点の投薬後ＡＨ５０）／（投薬前ＡＨ５０）］×１００として、個々の時点において算出した。個々の正常なカニクイザル由来の血清のＡＨ５０値は、ＡＨ５０値の全体平均から２倍近くも変動し得る。したがって、各試験動物からの投薬前及び投薬後試料を同じアッセイプレート上で分析し、ＡＰ活性の投薬後の変化が個々の動物のベースライン補体価との直接比較を確実に行った。
【０３５４】
ｆ．結果
全ｆＤ及び治療剤に対する溶血相対値（％）を、図３５Ａ（ランパリズマブ、１０ｍｇ／眼）、図３５Ｂ（ＡＦＤ．ｖ１４、２５ｍｇ／眼）及び図３５Ｃ（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマー、３．９ｍｇ／眼）に示す。ランパリズマブのデータ（図３５Ａ）は、Loyet, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2014, 351:527-537で記載されるように、ランパリズマブの１０ｍｇ／眼でのＩＶＴ投与後に得られた比較データである。図３５Ｂから分かるように、ＡＦＤ．ｖ１４の２５ｍｇ／眼の投与は、一過性の全身ＡＰ活性を阻害し、投与後２４時間には活性がベースラインに戻っており、ランパリズマブで観察された結果と類似している（図３５Ａ）。その代わり、全身性ＡＰ阻害は、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＴＰオクタマーの３．９ｍｇ／眼の投与後には認められなかった（図３５Ｃ）。いかなる特定の理論にも拘束されないが、Ｆａｂ（例えばランパリズマブ及びＡＦＤ．ｖ１４）と比較した、コンジュゲートで得られた眼からのより緩慢なクリアランスは、早い時点でＡＦＤ．ＡｂをｆＤにより飽和状態にさせ、全身的な補体阻害を防止するものと考えられる。
【０３５５】
全ｆＤ及び全コンジュゲートと比較したＡＰ補体活性相対値（％）は、図３５Ｄ（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマー、７．１ｍｇ／眼）及び図３５Ｅ（ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマー、１１．８ｍｇ／眼）で示すとおりである。これらの図から分かるように、ＡＦＤ．ｖ１４．Ｃ＋ＨＧオクタマーの１１．８ｍｇ／眼までのＩＶＴ投薬量では、ごくわずかな全身性補体阻害しか観察されなかった。眼からのより緩慢なクリアランスのため、特に１０時間より前の時点では、コンジュゲート濃度はｆＤのモル濃度以下に維持される。これは、これらの速い時点ではＡＦＤ．Ａｂ  Ｆａｂのモル濃度がｆＤのモル濃度を超え、全身性ＡＰ阻害に至る、ＡＦＤ．Ａｂ  Ｆａｂによる同程度の眼内投薬濃度とは対照的である。
【０３５６】
当業者であれば、常套的実験以上のことを行わなくとも、本明細書に記載の特定の実施形態に対する多くの等価形態を認識し、確認することができる。かかる等価形態は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０３５７】
上記の開示は、理解の便宜を図るため、幾つかの詳細な点については、図及び実施例により記載したが、当該記載及び実施例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許文献及び科学技術文献の開示内容は、参照によりそれらの全部が明確に本明細書に援用される。
【０３５８】
上記の明細書の記載は、当業者が本開示の実施を可能にするのに十分であると考えられる。本開示は、寄託されたコンストラクトにより範囲が限定されることはなく、むしろ、前記寄託された実施態様は本開示の具体的態様を示す一例に過ぎないことを意図したものであり、また機能的に均等であるいかなるコンストラクトも本発明の範囲内である。実際には、本明細書に示され、記載された態様に追加される、本開示に対する様々な修飾は、上記の記載から当業者にとり自明なものとなり、またそれらは添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ−Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ−Ｃ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ−Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018536650.tif 000126
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