(57)【要約】カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿って、カナジンの誘導体であるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を産生する、遺伝子操作された非植物細胞を提供する。ノスカピノイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞の培養方法と、医薬組成物も提供する。2018500002.tif 000014
2018500002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体、及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿って、カナジンの誘導体であるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を産生する、遺伝子操作された非植物細胞であって、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の量が、その非植物細胞内で産生されるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の量よりも多い、前記遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２】
カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素をコードする１つ以上の異種コード配列を含む、請求項１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３】
カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する２つ以上の酵素をコードする異種コード配列を含む、請求項２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４】
カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する２つの異なる酵素をコードする異種コード配列を含む、請求項３に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項５】
カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する４つ以上の異なる酵素をコードする異種コード配列を含む、請求項３に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項６】
前記少なくとも１つの酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の化合物を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物に変換する、請求項２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項７】
前記化合物が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される、請求項６に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項８】
カナジンをノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素が、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＰＹ８２Ｘ１、ＡＴ１、６ＯＭＴ、ＣＸＥ１、ＣＸＥ２、ＳＤＲ１、ＭＴ２、及びＭＴ３からなる群より選択される、請求項２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項９】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、フタリドイソキノリンアルカロイドである、請求項８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項１０】
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンヘミアセタールである、請求項９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項１１】
前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＣＸＥ１を含み、前記ＣＸＥ１が４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンをナルコトリンヘミアセタールに変換する、請求項１０に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項１２】
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコチンヘミアセタールである、請求項１１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項１３】
前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＭＴ２及びＭＴ３を含み、前記ＭＴ２及びＭＴ３がナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する、請求項１２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項１４】
前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＭＴ２及び６ＯＭＴを含み、前記ＭＴ２及び６ＯＭＴがナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する、請求項１２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項１５】
前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素が４’ＯＭＴを含み、前記４’ＯＭＴがナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する、請求項１２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項１６】
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコトリンである、請求項９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項１７】
前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＳＤＲ１を含み、前記ＳＤＲ１がナルコトリンヘミアセタールをナルコトリンに変換する、請求項１６に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項１８】
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がノスカピンである、請求項９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項１９】
前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＭＴ２及びＭＴ３を含み、前記ＭＴ２及びＭＴ３がナルコトリンをノスカピンに変換する、請求項１８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２０】
前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＭＴ２及び６ＯＭＴを含み、前記ＭＴ２及び６ＯＭＴがナルコトリンをノスカピンに変換する、請求項１８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２１】
前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素が４’ＯＭＴを含み、前記４’ＯＭＴがナルコトリンをノスカピンに変換する、請求項１８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２２】
前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＳＤＲ１を含み、前記ＳＤＲ１がナルコチンヘミアセタールをノスカピンに変換する、請求項１８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２３】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物がプロトベルベリン生成物である、請求項８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２４】
前記プロトベルベリン生成物が、１−ヒドロキシカナジン、Ｎ−メチルカナジン、Ｎ−メチル−オフィオカルピン、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジン、ナルコトリナール、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、及び１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンからなる群より選択される、請求項２３に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２５】
前記プロトベルベリン生成物が１−ヒドロキシカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＣＹＰ８２Ｙ１を含み、前記ＣＹＰ８２Ｙ１がカナジンを１−ヒドロキシカナジンに変換する、請求項２４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２６】
前記プロトベルベリン生成物がＮ−メチルカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＴＮＭＴを含み、前記ＴＮＭＴがカナジンをＮ−メチルカナジンに変換する、請求項２４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２７】
前記プロトベルベリン生成物がＮ−メチル−オフィオカルピンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＣＹＰ８２Ｘ２を含み、前記ＣＹＰ８２Ｘ２がＮ−メチルカナジンをＮ−メチル−オフィオカルピンに変換する、請求項２４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２８】
前記プロトベルベリン生成物が１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＣＹＰ８２Ｙ１を含み、前記ＣＹＰ８２Ｙ１がＮ−メチルカナジンを１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジンに変換する、請求項２４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項２９】
前記プロトベルベリン生成物がナルコトリナールであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＣＹＰ８２Ｘ１を含み、前記ＣＹＰ８２Ｘ１が１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジンをナルコトリナールに変換する、請求項２４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３０】
前記プロトベルベリン生成物が１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＣＹＰ８２Ｘ２を含み、前記ＣＹＰ８２Ｘ２が１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジンを１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンに変換する、請求項２４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３１】
前記プロトベルベリン生成物が１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＡＴ１を含み、前記ＡＴ１が１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンに変換する、請求項２４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３２】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリノゲンジアール、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、及び３−Ｏ−アセチルパパベロキシンからなる群より選択される、請求項１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３３】
前記プロトベルベリン生成物がナルコトリノゲンジアールであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＣＹＰ８２Ｘ１を含み、前記ＣＹＰ８２Ｘ１が１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンをナルコトリノゲンジアールに変換する、請求項３２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３４】
前記プロトベルベリン生成物が４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＣＹＰ８２Ｘ１を含み、前記ＣＹＰ８２Ｘ１が１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンを４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンに変換する、請求項３２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３５】
前記プロトベルベリン生成物が３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＭＴ２及びＭＴ３を含み、前記ＭＴ２及びＭＴ３が４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを３−Ｏ−アセチルパパベロキシンに変換する、請求項３２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３６】
前記プロトベルベリン生成物が３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素がＭＴ２及び６ＯＭＴを含み、前記ＭＴ２及び６ＯＭＴが４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを３−Ｏ−アセチルパパベロキシンに変換する、請求項３２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３７】
前記プロトベルベリン生成物が３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素が４’ＯＭＴを含み、前記４’ＯＭＴが４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを３−Ｏ−アセチルパパベロキシンに変換する、請求項３２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３８】
微生物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、及び酵母細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項３９】
酵母細胞である、請求項３８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４０】
レチクリン産生細胞である、請求項１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４１】
前記レチクリン産生細胞が、ＰＴＰＳ、ＳｅｐＲ、ＰＣＤ、ＱＤＨＰＲ、ＤＨＦＲ、ＴｙｒＨ、ＮＣＳ、ＤＯＤＣ、ＣＹＰ８０Ｂ１、ＣＰＲ、６ＯＭＴ、４’ＯＭＴ、ＣＮＭＴ、ＡＲＯ４、ＡＲＯ７、ＡＲＯ１０、及びＴＫＬ１を産生するためのコード配列を含み、各コード配列が、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、請求項４０に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４２】
ＴｙｒＨ、４’ＯＭＴ、及びＮＣＳのうちの少なくとも１つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも１つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、請求項４１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４３】
前記レチクリン産生細胞が、ＢＢＥ、Ｓ９０ＭＴ、ＭＴ１、ＣＡＳ、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＣＸＥ１、ＳＤＲ１、ＭＴ２、及びＭＴ３のうちの少なくとも１つを産生するための少なくとも１つの異種コード配列を含み、各コード配列が、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、請求項４０に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４４】
ＴｙｒＨ、４’ＯＭＴ、及びＮＣＳのうちの少なくとも１つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも１つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、請求項４０に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４５】
ＣＹＰ８２Ｘ２及びＭＴ１のうちの少なくとも１つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも１つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのノスカピンの産生が増大する、請求項４０に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４６】
少なくとも１つの変異酵素をコードする少なくとも１つの異種配列を含む、請求項１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの変異酵素が、ＣＹＰ８２Ｙ１のＮ末端変異体、ＣＹＰ８２Ｘ２変異体、ＣＹＰ８２Ｘ１変異体からなる群より選択される、請求項４６に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４８】
少なくとも１つのプロモーターをコードする少なくとも１つの異種配列を含む、請求項１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのプロモーターが、ＨＸＴ７、ＡＤＨ１、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＰＹＫ１、ＴＥＦ１、ＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＰＵＴ１、ＣＩＴ２、及びＧＰＤからなる群より選択される、請求項４８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項５０】
免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、ＤｎａＪタンパク質、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）９４、結合タンパク質（ＢｉＰ）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、サイクロフィリン、及びカルネキシンからなる群より選択される１つ以上の植物シャペロンを含む、請求項１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項５１】
前記酵素の１つ以上が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の一区画に空間的に局在化し、前記区画が、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜、ペルオキシソーム、及びペリプラズムからなる群より選択される、請求項１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項５２】
前記１つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の外側に空間的に局在化する、請求項５１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項５３】
前記１つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の内側に空間的に局在化する、請求項５１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項５４】
少なくとも１つの修飾酵素をコードする少なくとも１つの異種コード配列を含む、請求項１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項５５】
前記少なくとも１つの修飾酵素が、ハロゲナーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、及びオキシドレダクターゼからなる群より選択される、請求項５４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
【請求項５６】
以下の工程を含む、カナジンの下流にあるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を有する生成物流の形成方法：
ａ．カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体、及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿って、カナジンの誘導体であるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞を培養する工程であって、前記遺伝子操作された非植物細胞が、カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの異種配列を含む、工程；ならびに
ｂ．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を細胞物質から分離する工程であって、それによって前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を有する生成物流がもたらされる、工程。
【請求項５７】
前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記少なくとも１つの酵素の量が、その遺伝子操作されていない非植物細胞内の前記少なくとも１つの酵素の量よりも多い、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
カナジンをノスカピノイド生成物に変換する前記代謝経路に関与する前記少なくとも１つの酵素が、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＰＹ８２Ｘ１、ＡＴ１、６ＯＭＴ、ＣＸＥ１、ＣＸＥ１、ＳＤＲ１、ＭＴ２、及びＭＴ３からなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、フタリドイソキノリンアルカロイドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコチンヘミアセタール、ナルコトリン、及びノスカピンからなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコトリンヘミアセタールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＣＹＰ８２Ｘ１及びＣＸＥ１のうちの少なくとも１つを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコチンヘミアセタールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＭＴ２、ＭＴ３、６ＯＭＴ、及びＣＸＥ１のうちの少なくとも１つを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がナルコトリンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＣＸＥ１及びＳＤＲ１のうちの少なくとも１つを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記フタリドイソキノリンアルカロイド生成物がノスカピンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＭＴ３、６ＯＭＴ、ＣＸＥ１、及びＳＤＲ１のうちの少なくとも１つを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物がプロトベルベリン生成物である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
前記プロトベルベリン生成物が、１−ヒドロキシカナジン、Ｎ−メチルカナジン、Ｎ−メチル−オフィオカルピン、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、ナルコトリナール、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、及び１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンからなる群より選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記プロトベルベリン生成物が１−ヒドロキシカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞がＣＹＰ８２Ｙ１を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記プロトベルベリン生成物がＮ−メチルカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞がＴＮＭＴを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記プロトベルベリン生成物がＮ−メチル−オフィオカルピンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＴＮＭＴ及びＣＹＰ８２Ｘ２のうちの少なくとも１つを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記プロトベルベリン生成物が１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＴＮＭＴ及びＣＹＰ８２Ｙ１のうちの少なくとも１つを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
前記プロトベルベリン生成物がナルコトリナールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１、及びＣＹＰ８２Ｘ１のうちの少なくとも１つを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記プロトベルベリン生成物が１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１、及びＣＹＰ８２Ｘ２のうちの少なくとも１つを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
前記プロトベルベリン生成物が１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、及びＡＴ１のうちの少なくとも１つを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ノルコトリノゲンジアール、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、及び３−Ｏ−アセチルパパベロキシンからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項７５】
前記プロトベルベリン生成物がノルコトリノゲンジアールであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、及びＣＹＰ８２Ｘ１のうちの少なくとも１つを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記プロトベルベリン生成物が４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＡＴ１、及びＣＹＰ８２Ｘ１のうちの少なくとも１つを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記プロトベルベリン生成物が３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、前記遺伝子操作された非植物細胞が、ＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＭＴ３、及び６ＯＭＴのうちの少なくとも１つを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記遺伝子操作された非植物細胞がレチクリン産生細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項７９】
前記レチクリン産生細胞が、ＰＴＰＳ、ＳｅｐＲ、ＰＣＤ、ＱＤＨＰＲ、ＤＨＦＲ、ＴｙｒＨ、ＮＣＳ、ＤＯＤＣ、ＣＹＰ８０Ｂ１、ＣＰＲ、６ＯＭＴ、４’ＯＭＴ、ＣＮＭＴ、ＡＲＯ４、ＡＲＯ７、ＡＲＯ１０、及びＴＫＬ１を産生するためのコード配列を含み、各コード配列が前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ＴｙｒＨ、４’ＯＭＴ、及びＮＣＳのうちの少なくとも１つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも１つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記レチクリン産生細胞が、ＢＢＥ、Ｓ９０ＭＴ、ＭＴ１、ＣＡＳ、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＡＴ、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＣＸＥ１、ＳＤＲ１、ＭＴ２、及びＭＴ３のうちの少なくとも１つを産生するための少なくとも１つの異種コード配列を含み、各コード配列が前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
ＴｙｒＨ、４’ＯＭＴ、及びＮＣＳのうちの少なくとも１つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも１つ、前記レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、前記レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記遺伝子操作された非植物細胞が、少なくとも１つの変異酵素をコードする少なくとも１つの異種配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも１つの変異酵素が、ＣＹＰ８２Ｙ１のＮ末端変異体、ＣＹＰ８２Ｘ２変異体、ＣＹＰ８２Ｘ１変異体からなる群より選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記遺伝子操作された非植物細胞が、少なくとも１つのプロモーターをコードする少なくとも１つの異種配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項８６】
前記少なくとも１つのプロモーターが、ＨＸＴ７、ＡＤＨ１、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＰＹＫ１、ＴＥＦ１、ＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＰＵＴ１、ＣＩＴ２、及びＧＰＤからなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記遺伝子操作された非植物細胞が、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、ＤｎａＪタンパク質、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）９４、結合タンパク質（ＢｉＰ）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、サイクロフィリン、及びカルネキシンからなる群より選択される１つ以上の植物シャペロンを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項８８】
前記酵素の１つ以上が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の一区画に空間的に局在化し、前記区画が、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜、ペルオキシソーム、及びペリプラズムからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項８９】
前記１つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の外側に空間的に局在化する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記１つ以上の酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内の前記区画の内側に空間的に局在化する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記遺伝子操作された非植物細胞が、少なくとも１つの修飾酵素をコードする少なくとも１つの異種コード配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項９２】
前記少なくとも１つの修飾酵素が、ハロゲナーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、及びオキシドレダクターゼからなる群より選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記遺伝子操作された非植物細胞が、微生物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、及び酵母細胞の群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項９４】
前記遺伝子操作された非植物細胞が酵母細胞である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記遺伝子操作された非植物細胞をインビトロ条件下で培養する、請求項５６に記載の方法。
【請求項９６】
前記遺伝子操作された非植物細胞をインビボ条件下で培養する、請求項５６に記載の方法。
【請求項９７】
前記生成物流が、リグニン、フラボノイド、フェナントレノイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルフィン、ナルセイン、テバオール、及び花粉の群より選択される５ｐｐｍ超の分子を含まない、請求項５６に記載の方法。
【請求項９８】
前記生成物流が、検出可能な量の農薬を含まない、請求項５６に記載の方法。
【請求項９９】
前記生成物流が、非植物細胞の少なくとも一部分を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項１００】
前記非植物細胞が、遺伝子操作された非植物細胞である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、検出可能な量で前記生成物流中に存在する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて検出可能である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、質量分析法を用いて検出可能である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、分光法を用いて検出可能である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
少なくとも液液抽出を用いて、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を前記生成物流から回収する、請求項５６に記載の方法。
【請求項１０６】
発酵プロセスが完了した直後に、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を回収する、請求項５６に記載の方法。
【請求項１０７】
以下を含む医薬組成物：
カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体、及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿ったカナジンの誘導体である、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物；ならびに
非植物細胞の少なくとも一部分。
【請求項１０８】
前記非植物細胞が、遺伝子操作された非植物細胞である、請求項１０７に記載の医薬組成物。
【請求項１０９】
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、検出可能な量で前記生成物流中に存在する、請求項１０７に記載の医薬組成物。
【請求項１１０】
前記非植物細胞の前記部分が、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて検出可能である、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１１】
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、質量分析法を用いて検出可能である、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１２】
前記非植物細胞の前記少なくとも一部分が、分光法を用いて検出可能である、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１３】
リグニン、フラボノイド、フェナントレノイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルフィン、ナルセイン、テバオール、及び花粉の群より選択される５ｐｐｍ超の分子を含まない、請求項１０７に記載の医薬組成物。
【請求項１１４】
検出可能な量の農薬を含まない、請求項１０７に記載の医薬組成物。
【請求項１１５】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ノスカピンを含む、請求項１０７に記載の医薬組成物。
【請求項１１６】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンを含む、請求項１０７に記載の医薬組成物。
【請求項１１７】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコチンヘミアセタールを含む、請求項１０５に記載の医薬組成物。
【請求項１１８】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、ナルコトリンヘミアセタールを含む、請求項１０５に記載の医薬組成物。
【請求項１１９】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを含む、請求項１０７に記載の医薬組成物。
【請求項１２０】
前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを含む、請求項１０７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年１１月１７日に提出された米国特許仮出願第６２／０８０，６１０号と、２０１５年１月２３日に提出された米国特許仮出願第６２／１０７，２３８号と、２０１５年５月４日に提出された米国特許仮出願第６２／１５６，７０１号と、２０１５年５月８日に提出された米国特許仮出願第６２／１５９，１２２号と、２０１５年６月１１日に提出された米国特許仮出願第６２／１７４，４７５号に基づく優先権を主張するものであり、これらの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所により付与された契約番号ＡＴ００７８８６の下で、米国政府からの援助によって行われたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示は、遺伝子操作された宿主細胞内での、ノスカピノイドなどの様々なベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の生成方法を提供する。本開示は更に、遺伝子操作された宿主細胞内で産生された様々なノスカピノイドの組成物を提供する。
【０００４】
本発明の一態様は、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体及び／またはノスカピノイドの誘導体を産生する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。例では、遺伝子操作された宿主細胞は、カナジンを出発化合物として用いてよく、これを遺伝子操作された宿主細胞に加えてよい。別の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、該細胞によってノルラウダノソリンまたはチロシンなどの前駆体から産生されるカナジンを用いてよい。更なる例では、遺伝子操作された宿主細胞は、チロシンからノスカピノイドを産生するように遺伝子操作された酵母細胞から、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体及び／またはノスカピノイドの誘導体をデノボ産生してよく、この場合のチロシンは、酵母細胞内で自然に産生される。更なる例では、遺伝子操作された宿主細胞は、チロシンなどの前駆体化合物の類縁体を用いて形成されるノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体、ノスカピノイドの官能化誘導体及び／またはノスカピノイドの誘導体を産生してよい。
【０００５】
例では、本発明の態様は、カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿って、カナジンの誘導体であるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞であって、その遺伝子操作された非植物細胞内で産生されるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の量が、その非植物細胞内で産生されるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の量よりも多い遺伝子操作された非植物細胞を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された非植物細胞は、カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素をコードする１つ以上の異種コード配列を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子操作された非植物細胞は、カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に関与する２つ以上の酵素をコードする異種コード配列を含む。加えて、いくつかの実施形態では、その遺伝子操作された非植物細胞は、カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に関与する２つの異なる酵素をコードする異種コード配列を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子操作された非植物細胞は、カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に関与する４つ以上の異なる酵素をコードする異種コード配列を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも１つの酵素は、遺伝子操作された非植物細胞内の化合物をベンジルイソキノリンアルカロイド生成物に変換する。いくつかの実施形態では、その化合物は、その遺伝子操作された非植物細胞内で産生される。いくつかの実施形態では、カナジンをノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＰＹ８２Ｘ１、ＡＴ１、６ＯＭＴ、ＣＸＥ１、ＣＸＥ２、ＳＤＲ１、ＭＴ２、及びＭＴ３からなる群より選択される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、フタリドイソキノリンアルカロイドである。いくつかの実施形態では、フタリドイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコトリンヘミアセタールであり、更なる実施形態では、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＣＸＥ１を含み、このＣＸＥ１は、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンをナルコトリンヘミアセタールに変換する。いくつかの実施形態では、フタリドイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコチンヘミアセタールであり、更なる実施形態では、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＭＴ２とＭＴ３を含み、このＭＴ２とＭＴ３は、ナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する。いくつかの実施形態では、この代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＭＴ２と６ＯＭＴを含み、このＭＴ２と６ＯＭＴは、ナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する。いくつかの実施形態では、この代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、４’ＯＭＴを含み、この４’ＯＭＴは、ナルコトリンヘミアセタールをナルコチンヘミアセタールに変換する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、フタリドイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコトリンであり、更なる実施形態では、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＳＤＲ１を含み、このＳＤＲ１は、ナルコトリンヘミアセタールをナルコトリンに変換する。いくつかの実施形態では、フタリドイソキノリンアルカロイド生成物は、ノスカピンであり、更なる実施形態では、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＭＴ２とＭＴ３を含み、このＭＴ２とＭＴ３は、ナルコトリンをノスカピンに変換する。いくつかの実施形態では、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＭＴ２と６ＯＭＴを含み、このＭＴ２と６ＯＭＴは、ナルコトリンをノスカピンに変換する。いくつかの実施形態では、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、４’ＯＭＴを含み、この４’ＯＭＴは、ナルコトリンをノスカピンに変換する。いくつかの実施形態では、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＳＤＲ１を含み、このＳＤＲ１は、ナルコチンヘミアセタールをノスカピンに変換する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、プロトベルベリン生成物である。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、１−ヒドロキシカナジン、Ｎ−メチルカナジン、Ｎ−メチル−オフィオカルピン、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジン、ナルコトリナール、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン及び１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、１−ヒドロキシカナジンであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＣＹＰ８２Ｙ１を含み、このＣＹＰ８２Ｙ１は、カナジンを１−ヒドロキシカナジンに変換する。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、Ｎ−メチルカナジンであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＴＮＭＴを含み、このＴＮＭＴは、カナジンをＮ−メチルカナジンに変換する。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、Ｎ−メチル−オフィオカルピンであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＣＹＰ８２Ｘ２を含み、このＣＹＰ８２Ｘ２は、Ｎ−メチルカナジンをＮ−メチル−オフィオカルピンに変換する。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジンであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＣＹＰ８２Ｙ１を含み、このＣＹＰ８２Ｙ１は、Ｎ−メチルカナジンを１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジンに変換する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、ナルコトリナールであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＣＹＰ８２Ｘ１を含み、このＣＹＰ８２Ｘ１は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジンをナルコトリナールに変換する。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＣＹＰ８２Ｘ２を含み、このＣＹＰ８２Ｘ２は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジンを１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンに変換する。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＡＴ１を含み、このＡＴ１は、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンに変換する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコトリノゲンジアール、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン及び３−Ｏ−アセチルパパベロキシンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、ナルコトリノゲンジアールであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＣＹＰ８２Ｘ１を含み、このＣＹＰ８２Ｘ１は、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンをナルコトリノゲンジアールに変換する。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＣＹＰ８２Ｘ１を含み、このＣＹＰ８２Ｘ１は、１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンを４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンに変換する。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＭＴ２とＭＴ３を含み、このＭＴ２とＭＴ３は、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを３−Ｏ−アセチルパパベロキシンに変換する。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＭＴ２と６ＯＭＴを含み、このＭＴ２と６ＯＭＴは、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを３−Ｏ−アセチルパパベロキシンに変換する。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、その代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、４’ＯＭＴを含み、この４’ＯＭＴは、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを３−Ｏ−アセチルパパベロキシンに変換する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、微生物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞及び酵母細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、レチクリン産生細胞である。いくつかの実施形態では、レチクリン産生細胞は、ＰＴＰＳ、ＳｅｐＲ、ＰＣＤ、ＱＤＨＰＲ、ＤＨＦＲ、ＴｙｒＨ、ＮＣＳ、ＤＯＤＣ、ＣＹＰ８０Ｂ１、ＣＰＲ、６ＯＭＴ、４’ＯＭＴ、ＣＮＭＴ、ＡＲＯ４、ＡＲＯ７、ＡＲＯ１０、及びＴＫＬ１を産生するためのコード配列を含み、各コード配列は、そのレチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、ＴｙｒＨ、４’ＯＭＴ、及びＮＣＳのうちの少なくとも１つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも１つ、レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する。いくつかの実施形態では、レチクリン産生細胞は、ＢＢＥ、Ｓ９０ＭＴ、ＭＴ１、ＣＡＳ、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＣＸＥ１、ＳＤＲ１、ＭＴ２、及びＭＴ３のうちの少なくとも１つを産生するための少なくとも１つの異種コード配列を含み、各コード配列は、レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、ＴｙｒＨ、４’ＯＭＴ、及びＮＣＳのうちの少なくとも１つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも１つ、レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８２Ｘ２及びＭＴ１のうちの少なくとも１つを産生するコード配列の少なくとも１つの追加のコピーが、レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、レチクリン産生細胞内でのノスカピンの産生が増大する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、少なくとも１つの変異酵素をコードする少なくとも１つの異種配列を含む。いくつかの実施形態では、この少なくとも１つの変異酵素は、ＣＹＰ８２Ｙ１のＮ末端変異体、ＣＹＰ８２Ｘ２変異体、ＣＹＰ８２Ｘ１変異体からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、少なくとも１つのプロモーターをコードする少なくとも１つの異種配列を含む。いくつかの実施形態では、この少なくとも１つのプロモーターは、ＨＸＴ７、ＡＤＨ１、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＰＹＫ１、ＴＥＦ１、ＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＰＵＴ１、ＣＩＴ２、及びＧＰＤからなる群より選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、ＤｎａＪタンパク質、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）９４、結合タンパク質（ＢｉＰ）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、サイクロフィリン、及びカルネキシンからなる群より選択される１つ以上の植物シャペロンを含む。いくつかの実施形態では、酵素の１つ以上は、遺伝子操作された非植物細胞内の一区画に空間的に局在化し、この区画は、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜、ペルオキシソーム、及びペリプラズムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、その１つ以上の酵素は、遺伝子操作された非植物細胞内の区画の外側に空間的に局在化する。いくつかの実施形態では、その１つ以上の酵素は、遺伝子操作された非植物細胞内の区画の内側に空間的に局在化する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、少なくとも１つの修飾酵素をコードする少なくとも１つの異種コード配列を含む。いくつかの実施形態では、この少なくとも１つの修飾酵素は、ハロゲナーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、及びオキシドレダクターゼからなる群より選択される。
【００１５】
本発明の別の態様は、カナジンの下流にあるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を有する生成物流の形成方法を提供する。この方法は、カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に沿って、カナジンの誘導体であるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞を培養する工程を含み、この遺伝子操作された非植物細胞は、カナジンまたはカナジンの類縁体をノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの異種配列を含む。この方法は、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を細胞物質から分離する工程も含み、それによってベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を有する生成物流がもたらされる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞内の少なくとも１つの酵素の量は、その遺伝子操作されていない非植物細胞内のその少なくとも１つの酵素の量よりも多い。いくつかの実施形態では、カナジンをノスカピノイド生成物に変換する代謝経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＰＹ８２Ｘ１、ＡＴ１、６ＯＭＴ、ＣＸＥ１、ＣＸＥ１、ＳＤＲ１、ＭＴ２、及びＭＴ３からなる群より選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、フタリドイソキノリンアルカロイドである。いくつかの実施形態では、フタリドイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコチンヘミアセタール、ナルコトリン、及びノスカピンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、フタリドイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコトリンヘミアセタールであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＣＹＰ８２Ｘ１及びＣＸＥ１のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、フタリドイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコチンヘミアセタールであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＭＴ２、ＭＴ３、６ＯＭＴ及びＣＸＥ１のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、フタリドイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコトリンであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＣＸＥ１及びＳＤＲ１のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、フタリドイソキノリンアルカロイド生成物は、ノスカピンであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＭＴ３、６ＯＭＴ、ＣＸＥ１及びＳＤＲ１のうちの少なくとも１つを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、プロトベルベリン生成物である。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、１−ヒドロキシカナジン、Ｎ−メチルカナジン、Ｎ−メチル−オフィオカルピン、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、ナルコトリナール、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、及び１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、１−ヒドロキシカナジンであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＣＹＰ８２Ｙ１を含む。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、Ｎ−メチルカナジンであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＴＮＭＴを含む。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、Ｎ−メチル−オフィオカルピンであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＴＮＭＴ及びＣＹＰ８２Ｘ２のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−カナジンであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＴＮＭＴ及びＣＹＰ８２Ｙ１のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、ナルコトリナールであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１及びＣＹＰ８２Ｘ１のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１、及びＣＹＰ８２Ｘ２のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２及びＡＴ１のうちの少なくとも１つを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、ノルコトリノゲンジアール、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン及び３−Ｏ−アセチルパパベロキシンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、ノルコトリノゲンジアールであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２及びＣＹＰ８２Ｘ１のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＡＴ１、及びＣＹＰ８２Ｘ１のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、プロトベルベリン生成物は、３−Ｏ−アセチルパパベロキシンであり、遺伝子操作された非植物細胞は、ＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＭＴ３及び６ＯＭＴのうちの少なくとも１つを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、レチクリン産生細胞である。いくつかの実施形態では、このレチクリン産生細胞は、ＰＴＰＳ、ＳｅｐＲ、ＰＣＤ、ＱＤＨＰＲ、ＤＨＦＲ、ＴｙｒＨ、ＮＣＳ、ＤＯＤＣ、ＣＹＰ８０Ｂ１、ＣＰＲ、６ＯＭＴ、４’ＯＭＴ、ＣＮＭＴ、ＡＲＯ４、ＡＲＯ７、ＡＲＯ１０、及びＴＫＬ１を産生するためのコード配列を含み、各コード配列は、そのレチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、ＴｙｒＨ、４’ＯＭＴ、及びＮＣＳのうちの少なくとも１つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも１つ、レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する。いくつかの実施形態では、レチクリン産生細胞は、ＢＢＥ、Ｓ９０ＭＴ、ＭＴ１、ＣＡＳ、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＡＴ、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＣＸＥ１、ＳＤＲ１、ＭＴ２、及びＭＴ３のうちの少なくとも１つを産生するための少なくとも１つの異種コード配列を含み、各コード配列は、そのレチクリン産生細胞の染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、ＴｙｒＨ、４’ＯＭＴ、及びＮＣＳのうちの少なくとも１つを産生するコード配列の追加のコピーが少なくとも１つ、レチクリン産生細胞の染色体に組み込まれており、それによって、レチクリン産生細胞内でのレチクリンの産生が増大する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、少なくとも１つの変異酵素をコードする少なくとも１つの異種配列を含む。いくつかの実施形態では、この少なくとも１つの変異酵素は、ＣＹＰ８２Ｙ１のＮ末端変異体、ＣＹＰ８２Ｘ２変異体、ＣＹＰ８２Ｘ１変異体からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、少なくとも１つのプロモーターをコードする少なくとも１つの異種配列を含む。いくつかの実施形態では、この少なくとも１つのプロモーターは、ＨＸＴ７、ＡＤＨ１、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＰＹＫ１、ＴＥＦ１、ＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＰＵＴ１、ＣＩＴ２、及びＧＰＤからなる群より選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、ＤｎａＪタンパク質、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）９４、結合タンパク質（ＢｉＰ）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、サイクロフィリン、及びカルネキシンからなる群より選択される１つ以上の植物シャペロンを含む。いくつかの実施形態では、酵素の１つ以上は、遺伝子操作された非植物細胞内の一区画に空間的に局在化し、その区画は、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜、ペルオキシソーム、及びペリプラズムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、この１つ以上の酵素は、遺伝子操作された非植物細胞内の区画の外側に空間的に局在化する。いくつかの実施形態では、この１つ以上の酵素は、遺伝子操作された非植物細胞内の区画の内側に空間的に局在化する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、少なくとも１つの修飾酵素をコードする少なくとも１つの異種コード配列を含む。いくつかの実施形態では、この少なくとも１つの修飾酵素は、ハロゲナーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、及びオキシドレダクターゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、微生物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞及び酵母細胞の群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、インビトロ条件下で培養する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された非植物細胞は、インビボ条件下で培養する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、生成物流は、リグニン、フラボノイド、フェナントレノイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルフィン、ナルセイン、テバオール及び花粉の群から選択される５ｐｐｍ超の分子を含まない。いくつかの実施形態では、生成物流は、検出可能な量の農薬を含まない。いくつかの実施形態では、生成物流は、非植物細胞の少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、非植物細胞は、遺伝子操作された非植物細胞である。いくつかの実施形態では、非植物細胞の少なくとも一部分は、検出可能な量で生成物流中に存在する。いくつかの実施形態では、非植物細胞の少なくとも一部分は、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて検出可能である。いくつかの実施形態では、非植物細胞の少なくとも一部分は、質量分析法を用いて検出可能である。いくつかの実施形態では、非植物細胞の少なくとも一部分は、分光法を用いて検出可能である。いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、少なくとも液液抽出を用いて前記生成物流から回収する。いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、発酵プロセスが完了した直後に回収する。
【００２５】
本発明の更なる態様は、カナジンまたはカナジンの類縁体を、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体及びノスカピノイドの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含むノスカピノイド生成物に変換する代謝経路沿いの、カナジンの誘導体であるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、非植物細胞の少なくとも一部分も含む。いくつかの実施形態では、この非植物細胞は、遺伝子操作された非植物細胞である。いくつかの実施形態では、非植物細胞の少なくとも一部分は、検出可能な量で生成物流中に存在する。いくつかの実施形態では、非植物細胞のこの部分は、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて検出可能である。いくつかの実施形態では、非植物細胞の少なくとも一部分は、質量分析法を用いて検出可能である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、非植物細胞の少なくとも一部分は、分光法を用いて検出可能である。いくつかの実施形態では、この組成物は、リグニン、フラボノイド、フェナントレノイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルフィン、ナルセイン、テバオール及び花粉の群から選択される５ｐｐｍ超の分子を含まない。いくつかの実施形態では、この組成物は、検出可能な量の農薬を含まない。いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、ノスカピンを含む。いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコトリンを含む。いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコチンヘミアセタールを含む。いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、ナルコトリンヘミアセタールを含む。いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを含む。いくつかの実施形態では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物は、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを含む。
【００２７】
本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、出発化合物から、対象となるノスカピノイドまたはその前駆体への合成経路に関与する様々な酵素の異種コード配列を含んでよい。また、遺伝子操作された宿主細胞の異種コード配列によってコードされる酵素の活性を促進する培養条件下で、その遺伝子操作された宿主細胞を培養することによって、ノスカピノイド、その誘導体及び／またはその前駆体を産生させる方法も提供する。本発明の態様は更に、本発明の方法で使用される組成物、例えば宿主細胞、出発化合物及びキットなどを含む。
【００２８】
参照による援用
本明細書で言及される全ての文献、特許及び特許出願は、個々の文献、特許及び特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に示されている。本発明の特徴と利点に対する理解は、本発明の原理が用いられている例示的な実施形態を示している下記の詳細な説明と添付の図面を参照することによって深まる。
【００３０】
【図１】植物における生化学的同定に基づき、カナジンをノスカピンに変換する生合成スキームを示している。
【図２Ａ】本発明の実施形態に従って、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における生化学的な特徴付けに基づき、カナジンをノスカピンに変換する生合成スキームを示している。
【図２Ｂ】本発明の実施形態に従って、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における生化学的な特徴付けに基づき、カナジンをノスカピンに変換するとともに、副産物を産生する別の生合成スキームを示している。
【図３】本発明の実施形態に従って、遺伝子操作された酵母株によって培地に分泌された化合物の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）解析から得たＥＩＣ（抽出イオンクロマトグラフ）の波形を示している。
【図４−１】図４は、本発明の実施形態に従って、図３に記載される化合物のポジティブイオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルＭＳ／ＭＳフラグメンテーションを示している。
【図４−２】図４−１の続きを示している。
【図５】本発明の実施形態に従って、パパヴェル・ソムニフェルム （Papaver somniferum）またはハナビシソウ（Eschscholzia californica）のいずれかに由来するＴＮＭＴを発現しているとともに、カナジンの存在下で増殖させた酵母から、Ｎ−メチルカナジンをインビボで合成したものを示している。
【図６】本発明の実施形態に従って、ＰｓＴＮＭＴの存在下または非存在下で、様々なプロモーターの下流で、様々な型のＣＹＰ８２Ｙ１を発現させるとともに、カナジンの存在下で増殖させた酵母から得られたインビボアッセイの結果を示している。
【図７】本発明の実施形態に従って、ＰｓＴＮＭＴとＣＹＰ８２Ｙ１Ａの存在下で、様々なプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＰＤ、ＰＧＫ１、ＨＸＴ７）の下流で、ＣＹＰ８２Ｘ２を発現させたとともに、カナジンの存在下で増殖させた酵母から得られたインビボアッセイの結果を示している。
【図８】本発明の実施形態に従って、ＰｓＴＮＭＴとＣＹＰ８２Ｙ１Ａの存在下で、ＣＹＰ８２Ｘ２とＰｓＡＴ１を有するかまたは有さない状態で、様々なプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＰＤ、ＰＧＫ１、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＨＸＴ７）の下流で、野生型（ＷＴ）を発現させたとともに、カナジンの存在下で増殖させた酵母から得られたインビボアッセイの結果を示している。
【図９】本発明の実施形態に従って、ノルラウダノソリンをノスカピンに変換する生合成スキームを示している。
【図１０】本発明の実施形態に従って、遺伝子操作されたノスカピン産生酵母株によって培地に分泌された化合物のＬＣ−ＭＳ解析から得たＥＩＣ（抽出イオンクロマトグラフ）の波形を示している。
【図１１】本発明の実施形態に従って、ノスカピンをノルラウダノソリンから生合成することを示している。
【図１２】本発明の実施形態に従って、ノスカピンをチロシンから生合成する経路を示している。
【図１３】本発明の実施形態に従って、酵母において、ノスカピンをデノボ産生させたことをＬＣ−ＭＳ解析して得られたＥＩＣ（抽出イオンクロマトグラフ）の波形を示している。
【図１４】本発明の実施形態に従って、酵母においてノスカピノイドをデノボ産生させる例示的な生合成の概略を示している。
【図１５】本発明の実施形態に従って、酵母においてノスカピノイドをデノボ産生させる別の例示的な生合成の概略を示している。
【図１６】本発明の実施形態に従って、グルコースを４−ＨＰＡ、ドーパミン及び３，４−ＤＨＰＡに変換する生合成スキームを示している。
【図１７】本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをノルコクラウリン経由でレチクリンに変換する生合成スキームを示している。
【図１８】本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをノルラウダノソリン経由でレチクリンに変換する生合成スキームを示している。
【図１９】本発明の実施形態による、テトラヒドロビオプテリンの合成、再利用及びサルベージ経路の例を示している。
【図２０】本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをプロトベルベリン、フタリドイソキノリン及びベルベリンアルカロイド生成物に変換する生合成スキームを示している。
【図２１】本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをノスカピン、ノスカピノイド及びフタリドイソキノリンアルカロイド生成物に変換する生合成スキームを示している。
【図２２】本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをサンギナリン及びベンゾフェナントリジンアルカロイドに変換する生合成スキームを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
本開示は、遺伝子操作された宿主細胞内での、ノスカピノイドなどの様々なベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の生成方法を提供する。本開示は更に、遺伝子操作された宿主細胞内で産生される様々なノスカピノイドの組成物を提供する。
【００３２】
ノスカピノイドは、ヒトのがんを治療するための化学療法剤として関心の高い新種の高水溶性微小管調節抗がん剤である。ノスカピノイドは、フタリドイソキノリンアルカロイドとして特徴付けられる化合物を含むアヘンアルカロイド種である。腫瘍特異性と腫瘍退縮性が向上しているとともに、正常組織への毒性がほとんど見られないかまたは見られない数多くのノスカピノイドが合成されてきた。コンピュータによる設計と構造活性相関研究の助けによる、様々な時点におけるノスカピノイドの骨格構造の連続した合成修飾に基づき、ノスカピノイドは、修飾によって様々な「世代」に分類される。ノスカピンは、５０年超にわたり鎮咳剤として広く用いられてきたノスカピノイド化合物であり、植物で自然に作られる。ノスカピンは、多くのノスカピノイド化合物の原料となる親化合物である。ノスカピンががんを治療する機能は、１９９８年に示された。がんの治療に必要な投与量は、鎮咳剤として機能する際よりもかなり多いが（がんの治療では１，０００〜２，２５０ｍｇ／日に対して、咳の治療では４５〜２００ｍｇ／日）、ノスカピンの副作用は、従来の化学療法薬よりも少ない。ノスカピンは、チューブリン二量体１つ当たり１つのノスカピン分子という化学量で、チューブリンに結合する。しかしながら、チューブリンを脱重合させるか（ノコダゾール、コルヒチン及びビンカアルカロイド）または過重合させる（パクリタキセル）他のチューブリン結合性化学療法剤とは異なり、ノスカピンの抗がん活性は、アポトーシスを引き起こす独自の微小管結合様式を通じて、微小管の動態を安定化させることに起因し得る。薬理学的観点から、ノスカピンは、微小管結合薬として多くの利点を有し、多剤耐性がん細胞株に対して有効であり、正常分裂細胞とは別に、がん細胞に作用し、薬物動態プロファイルが改善されており、顕著な副作用もない。
【００３３】
本発明の態様について更に詳細に説明する前に、本発明が、記載されている具体的実施形態に限定されず、したがって、当然ながら、本発明は変更し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用されている専門用語は、具体的実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するものとしては意図されていないことも理解されたい。
【００３４】
値の範囲が示されている場合には、その範囲の上限と下限との間の各値（文脈によって明らかに別段に示されない限り、その下限の１０分の１の単位までの値）と、その指定範囲内のいずれかの他の指定値または間の値が本発明に含まれることが分かる。これらの、より小さい範囲の上限と下限は、その小さい範囲に独立して含まれていてよく、本発明にも含まれる。ただし、指定範囲のいずれかの限界値が明確に除外される傾向がある。指定範囲に、限界値の１つまたは両方が含まれる場合、これらの１つまたは両方が除外された範囲も、本発明に含まれる。
【００３５】
特定の範囲は、本明細書では、「約」という用語が前に付された数値で示されている。「約」という用語は、本明細書では、その用語の後に続く精密な数と、その用語の後に続く数に近いかまたは近似である数を文字通り網羅する目的で用いられている。ある数が、具体的に示されている数に近いか、または近似であるかを定める際には、示されていないその近いかまたは近似である数は、その数が示されている文脈において、その具体的に示されている数の実質的な等価値となる数であってよい。
【００３６】
別段の定めがない限り、本明細書で用いられている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験の際には、本明細書に記載されている方法及び材料と類似または同等の任意の方法及び材料を用いることもできるが、以下には、代表的な例示的方法及び材料が説明されている。
【００３７】
「経路誘導体」という用語は、本明細書で使用する場合、親化合物または対照化合物（例えば、本明細書に開示されている化合物）の構造に由来する化学構造を有する化合物であって、少なくとも１つの構造差によって、例えば１つ以上の置換基が付加、除去、修飾及び／または更に置換されていることによって異なっている化合物を指す。構造差は、例えば環化または開環による変換を通じて、親化合物または対照化合物のコアを変更できる。例えば、レチクリンの経路誘導体としては、サルタリジンとテバインが挙げられる。構造差は、いずれかの方法、例えば、化学変換の誘発、酵素触媒反応及び／または自発的な反応によって発生してよい。特に反対の記載がない限り、経路誘導体は、その親化合物または対照化合物を出発物質または中間体として用いて合成する必要がないが、場合によっては、誘導体は、親化合物または対照化合物から合成してもよい。
【００３８】
「類縁体」及び「誘導体」という用語は、本明細書で使用する場合、親化合物または対照化合物との構造差を少なくとも１つ有することによって、例えば１つ以上の置換基が付加、除去、修飾及び／または更に置換されることによって、親化合物または対照化合物（例えば、本明細書に開示されている化合物）の構造とは異なる化学構造を有する化合物を指す。構造差は、例えば環化または開環による変換を通じて、親化合物または対照化合物のコアを変更できる。例えば、Ｎ−メチルカナジン、９−メチル−Ｎ−メチルカナジン及び６−クロロ−カナジンが、カナジンの類縁体である。チロシンの類縁体としては、例えば、α−クロロ−チロシン、α−メチルチロシン及び３−ニトロ−チロシンが挙げられる。構造差は、いずれかの方法、例えば、化学変換の誘発、酵素触媒反応及び／または自発的な反応によって発生さしてよい。特に反対の記載がない限り、類縁体は、その親化合物または対照化合物を出発物質または中間体として用いて合成する必要がないが、場合によっては、類縁体は、親化合物または対照化合物から合成してもよい。
【００３９】
「官能化誘導体」という用語は、本明細書で使用する場合、対照化合物と区別される構造的特徴を有する化合物であって、その区別される特徴が、その化合物の合成に用いた出発物質に存在していた化合物を指す。例えば、３−クロロ−レチクリンは、α−クロロ−Ｌ−チロシンから生成でき、本明細書では、レチクリンの官能化誘導体とみなす。これらの２つの化合物を区別する塩化物が、合成で使用されたとともに、合成の際の一工程によって組み込まれなかった出発物質の特徴であったからである。更なる例としては、６−ヒドロキシ−カナジン（α−ヒドロキシ−Ｌ−チロシンから、宿主細胞に産生させることができる、カナジンの官能化誘導体）と、７−ニトロ−ナルコトリン（３−ニトロ−Ｌ−チロシンから生成される、ナルコトリンの官能化誘導体）が挙げられる。
【００４０】
本明細書で、または添付の特許請求の範囲において使用する場合は、文脈によって明らかに別段に示されない限り、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の指示物が含まれることが留意される。更に、請求項は、いずれかの任意の要素を除外するように書かれていることもあることが留意される。すなわち、この記述は、請求項の要素の列挙に関連して、「単独で」、「のみ」などのような限定用語を使用する際、または「否定的」限定を使用する際の先行詞として機能するように意図されている。
【００４１】
本開示を読んだ当業者には明らかなように、本明細書に説明及び例示されている個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に切り離したり、そのような特徴と容易に組み合わせたりできる別個の構成要素と特徴を有する。示されているいずれの方法も、示されている順番の事象で、または論理的に可能であるいずれかの他の順番で行うことができる。
【００４２】
ノスカピノイド
ノスカピノイド生成物を産生する宿主細胞を提供する。ノスカピノイド生成物には、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体及び／またはノスカピノイドの誘導体が含まれる。いくつかの例では、本発明の遺伝子操作株のような遺伝子操作された宿主細胞株は、いくつかの構造的部類にわたるノスカピノイド生成物及びその修飾物（ベンジルイソキノリンアルカロイド、プロトベルベリン、セコベルビン、フタリドイソキノリンなどが挙げられるが、これらに限らない）を生成するためのプラットフォームを提供する。これらの部類のそれぞれには、その部類のメンバーをもたらし得る遺伝子操作された宿主細胞生合成経路のいずれかの利便的なメンバーの生合成前駆体、中間体及びそれらの代謝物が含まれるように意図されている。化合物の非限定例は、これらの構造的分類のそれぞれについて、後述されている。場合によっては、所定の例の構造は、それ自体がベンジルイソキノリンアルカロイドとして特徴付けられる場合も特徴付けられない場合もある。本発明の化学物質には、単一のエナンチオマー、ラセミ混合物、光学的に純粋な形態、ジアステレオマーの混合物及び中間体混合物を含む全ての考え得る異性体が含まれるように意図されている。
【００４３】
プロトベルベリンとしては、スコウレリン、ケイランチホリン、スチロピン、ナンジニン、ジャトロリジン、ステホリジン、ジスクレタミン、シス−Ｎ−メチルスチロピン、テトラヒドロコルンバミン、パルマチン、テトラヒドロパルマチン、コルンバミン、カナジン、Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシカナジン、ベルベリン、Ｎ−メチル−オフィオカルピン、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン及び１−ヒドロキシ１０−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンを挙げてよいが、これらに限らない。
【００４４】
セコベルビンとしては、４’−Ｏ−デスメチルマクラントアルデヒド、４’−Ｏ−デスメチルパパベロキシン、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、パパベロキシン及び３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを挙げてよいが、これらに限らない。
【００４５】
フタリドイソキノリンとしては、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコチンヘミアセタール、ナルコトリン、ノスカピン、アドルミジン、アドルミン、（＋）または（−）−ビククリン、キャプノイジン、カルルミン、コルレジン、コルルミジン、デクンベニン、５’−Ｏ−デメチルナルコチン、（＋）または（−）−αまたはβ−ヒドラスチン及びヒペクミンを挙げてよいが、これらに限らない。
【００４６】
ノスカピノイドは、ノスカピンの誘導体または類縁体であってよく、したがって、フタリドイソキノリンアルカロイドとして特徴付けてもよい。本主題の宿主細胞内での産生用に、いずれかの利便的なノスカピノイドを標的としてよい。対象となるノスカピン類縁体としては、６’位、９’位、１及び７位の修飾と、６’位の天然のＮ−メチル基の、例えばＮ−エチルアミノカルボニルへの置換と、９’位の、例えばハロ、アリール、アルキル、アジドまたはニトロへの置換と、７位の遊離フェノールを露出させるための位置選択的Ｏ−デメチル化と、１位におけるラクトンの、対応する環状エーテルへの還元とを含むノスカピン化合物（９−ブロモノスカピン、９−ニトロノスカピン及び９−アジドノスカピンという化合物、ならびに、Ｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，２０１２，１８（１）：３０７−３１８及びＬｏｐｕｓ  ａｎｄ  Ｎａｉｋ，“Ｔａｋｉｎｇ  ａｉｍ  ａｔ  ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｔａｒｇｅｔ：Ｎｏｓｃａｐｉｎｏｉｄｓ  ａｓ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，６７（１）２０１５，５６−６２（２０１４年にインターネット上に公開）に記載されている化合物など）が挙げられるが、これらに限らず、上記の文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００４７】
「ノスカピノイド生成物」という用語には、ノスカピノイド、ノスカピノイドの前駆体、ノスカピノイドの代謝物、ノスカピノイドの類縁体、ノスカピノイドの中間体及び／またはノスカピノイドの誘導体が含まれるように意図されている。いくつかの例では、ノスカピノイド誘導体及び／またはノスカピノイドの誘導体は、経路誘導体を含んでよい。いくつかの例では、ノスカピノイド誘導体及び／またはノスカピノイドの誘導体は、官能化誘導体を含んでよい。例では、ノスカピノイド生成物とは、細胞の合成経路において、対象となるノスカピンまたはノスカピノイドの前駆体であってよいいずれかの利便的なプロトベルベリン、セコベルベリンまたはフタリドイソキノリンアルカロイドを指してよく、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、ノスカピン、ナルコトリン、ナルコチンヘミアセタール、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール、Ｎ−メチルオフィオカルピン、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシ−１３−Ｏアセチル−Ｎ−メチルカナジン、ナルコトリノゲンジアール（すなわち、４’−Ｏ−デスメチルパパベロキシン）、ナルコトリナール（すなわち、４’−Ｏ−デスメチルマクラントアルデヒド）及び１−ヒドロキシカナジンが挙げられるが、これらに限らない。場合によっては、ノスカピノイド生成物は、対象となる合成経路において、カナジンまたはカナジンの類縁体の下流にある。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ノスカピンを産生する。特定の事例では、本発明の細胞は、ノスカピンの誘導体を産生する。場合によっては、本発明の細胞は、図２Ａ及び２Ｂに記載されているノスカピン前駆体を産生する。場合によっては、本発明の細胞は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを産生する。特定の実施形態では、本発明の細胞は、１−ヒドロキシカナジンを産生する。場合によっては、本発明の細胞は、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを産生する。場合によっては、本発明の細胞は、Ｎ−メチル−オフィオカルピンを産生する。特定の事例では、本発明の細胞は、４’−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを産生する。特定の実施形態では、本発明の細胞は、ナルコトリナールとナルコトリノゲンジアールを産生する。
【００４９】
ノスカピノイドまたはその前駆体に対する合成経路は、宿主細胞内で生成してよく、いずれかの利便的な出発化合物または物質によって開始させてよい。宿主細胞内で生成する合成経路は、対象となるノスカピノイドの前駆体であるいずれかの利便的な化合物で開始させてよい。所望の出発化合物から標的のアルカロイドが生成されるように、本主題の宿主細胞の合成経路は、いずれかの利便的な上流または下流の合成経路に連結してよい。この出発化合物は、その標的から取り除かれた１つ以上の生合成工程（取り除かれた２つ以上、３つ以上またはいくつかの生合成工程など）である前駆体であってよい。場合によっては、出発化合物自体が、宿主細胞によって産生される。本発明の細胞は、（Ｓ）−Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシ−１３−Ｏアセチル−Ｎ−メチルカナジン、４’−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール及びナルコトリンからなる群より選択される１つ以上のノスカピン前駆体を含む合成経路を介して、カナジンから、対象となるノスカピンまたはノスカピノイドを産生してよい。
【００５０】
ノスカピノイドまたはその前駆体を産生させるための本主題の細胞での使用に、対象となる出発化合物を産生するいずれかの利便的な宿主細胞を適合させてよい。対象となる出発化合物としては、ノルラウダノソリン、カナジン、スコウレリン、テトラヒドロベルベルビン、スチロピン、ケイランチホリン、テトラヒドロパルマチン及び内因性ノスカピノイド経路に存在し得る標的分子のいずれかの他の利便的な前駆体が挙げられるが、これらに限らない。場合によっては、出発化合物は、その化合物を、対象となるノスカピノイドまたはその前駆体に変換する宿主細胞に加える。いくつかの実施形態では、出発化合物は、カナジンである。図２Ａ及び２Ｂは、（Ｓ）−カナジンから始まる、ノスカピン及びその前駆体への合成経路を示している。特定の実施形態では、出発化合物は、ノルラウダノソリンである。図９は、ノルラウダノソリンから始まる、ノスカピン及びその前駆体への合成経路を示している。特定の事例では、出発化合物は、対象となるノスカピノイドまたはその前駆体を産生させる生合成経路を含むように適合されているノルラウダノソリン産生細胞またはカナジン産生細胞によって産生させてよい。特定の実施形態では、出発化合物は、チロシンである。
【００５１】
したがって、出発物質は、非天然物質であってよく、または出発物質は、天然物質であってもよい。宿主細胞に存在する合成経路に基づき、その他の化合物を所望の合成経路における出発物質として用いてもよい。出発物質源は、宿主細胞自体に由来するもの、例えばチロシンであってもよく、または細胞外供給源から出発物質を宿主細胞に追加もしくは添加してもよい。例えば、宿主細胞を液体培養（インビボ環境）で増殖している場合に、その細胞培地に出発物質、例えばチロシンまたはノルラウダノソリンを添加し、それを細胞の中に運んで、所望の産物に変換させてよい。
【００５２】
宿主細胞
上に概説したように、本発明の一態様は、ノスカピノイド生成物を産生する宿主細胞である。本明細書で使用する場合、「ノスカピノイド産生細胞」という用語は、合成経路を介して、出発化合物からノスカピノイド生成物を産生するように遺伝子操作されている細胞を含むように意図されている。本主題の宿主細胞は、いずれかの利便的なノスカピノイド生成物を産生してよく、その生成物としては、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、Ｎ−メチルカナジン、ノスカピン、ナルコトリン、ナルコチンヘミアセタール、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール、Ｎ−メチルオフィオカルピン、１−ヒドロキシ−１３−Ｏアセチル−Ｎ−メチルカナジン、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、ナルコトリノゲンジアール、３−Ｏ−アセチル−パパベロキシン、ナルコトリナール及び１−ヒドロキシルカナジンが挙げられるが、これらに限らない。
【００５３】
いずれかの利便的な細胞を本主題の宿主細胞と方法で用いてよい。場合によっては、宿主細胞は、非植物細胞である。場合によっては、宿主細胞は、微生物細胞として特徴付けられていてもよい。特定の事例では、宿主細胞は、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞または酵母細胞である。本主題のノスカピノイド産生細胞を産生する本主題の細胞を作製する際には、いずれかの利便的なタイプの宿主細胞を用いてよく、例えばＵＳ２００８／０１７６７５４、ＷＯ／２０１２／０３９４３８、ＷＯ２０１３１３６０５７、ＵＳ２０１４０２７３１０９及び２０１４年１１月３日に提出されたＰＣＴ出願番号ＵＳ２０１４／０６３７３８号を参照されたい（これらの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）。
【００５４】
対象となる宿主細胞としては、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）細胞、大腸菌（Escherichia coli）細胞、ストレプトマイセス属（Streptomyces）細胞及びネズミチフス菌（Salmonella typhimuium）細胞などの細菌細胞、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）Ｓ２細胞及びスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、ならびにサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）細胞及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞などの酵母細胞が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの例では、宿主細胞は、酵母細胞または大腸菌（E.coli）細胞である。場合によっては、宿主細胞は、酵母細胞である。場合によっては、宿主細胞は、産生するように遺伝子操作された酵母株に由来するものである。特定の事例では、酵母細胞は、ピキア（Pichia）属に由来する酵母細胞のように、工業的プロセスで用いられる細胞であり、ピキア（Pichia）属としては、ピキア・ファリノサ（P. farinose）、ピキア・アノマーラ（P. anomala）、ピキア・ヒーディ（P. heedii）、ピキア・ギリエルモンディ（P. guilliermondii）、ピキア・クルイベリ（P. kluyveri）、ピキア・メンブラニファシエンス（P. membranifaciens）、ピキア・ノルベゲンシス（P. norvegensis）、ピキア・オメリ（P. ohmeri）、P. pastoris、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）及びピキア・サブペリキュローサ（P. subpelliculosa）が挙げられるが、これらに限らない。
【００５５】
ＵＳ２００８／０１７６７５４、ＷＯ／２０１２／０３９４３８、ＷＯ２０１３１３６０５７、ＵＳ２０１４０２７３１０９及びＳｍｏｌｋｅらによるＰＣＴ出願番号ＵＳ２０１４／０６３７３８号に記載されている宿主細胞のいずれかを、本主題の細胞と方法での使用に適合させてもよい。特定の実施形態では、酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae（S. cerevisiae）種のものであってよい。特定の実施形態では、酵母細胞は、Schizosaccharomyces pombe種のものであってよい。特定の実施形態では、酵母細胞は、Pichia pastoris種のものであってよい。シトクロムＰ４５０タンパク質は、小胞体膜の中に適切に折り畳まれて、それらの活性が保たれるようにできるため、酵母は、宿主細胞として注目されている。例では、シトクロムＰ４５０タンパク質は、対象となるいくつかの生合成経路に関与する。更なる例では、シトクロムＰ４５０タンパク質は、ノスカピノイド生成物の産生に関与する。
【００５６】
本発明で用いられる、対象となる酵母株としては、ＣＥＮ．ＰＫ（遺伝子型：ＭＡＴａ／α  ｕｒａ３−５２／ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１−２８９／ｔｒｐ１−２８９  ｌｅｕ２−３＿１１２／ｌｅｕ２−３＿１１２  ｈｉｓ３  Δ１／ｈｉｓ３  Δ１  ＭＡＬ２−８Ｃ／ＭＡＬ２−８Ｃ  ＳＵＣ２／ＳＵＣ２）、Ｓ２８８Ｃ、Ｗ３０３、Ｄ２７３−１０Ｂ、Ｘ２１８０、Ａ３６４Ａ、Σ１２７８Ｂ、ＡＢ９７２、ＳＫ１及びＦＬ１００が挙げられるが、これらに限らない。特定の事例では、酵母株は、Ｓ２８８Ｃ（ＭＡＴα；ＳＵＣ２  ｍａｌ  ｍｅｌ  ｇａｌ２  ＣＵＰ１  ｆｌｏ１  ｆｌｏ８−１  ｈａｐ１）、ＢＹ４７４１（ＭＡＴα；ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ０；ｕｒａ３Δ０）、ＢＹ４７４２（ＭＡＴα；ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０；ｌｙｓ２Δ０；ｕｒａ３Δ０）、ＢＹ４７４３（ＭＡＴａ／ＭＡＴα；ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ０／ＭＥＴ１５；ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０；ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０）及びＷＡＴ１１またはＷ（Ｒ）（Ｗ３０３−Ｂ株の誘導体（ＭＡＴａ；ａｄｅ２−１；ｈｉｓ３−１１，−１５；ｌｅｕ２−３，−１１２；ｕｒａ３−１；ｃａｎＲ；ｃｙｒ＋）であり、ＷＡＴ１１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼＡＴＲ１を発現し、Ｗ（Ｒ）は、酵母のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼＣＰＲ１を発現する誘導体である）のいずれかである。別の実施形態では、酵母細胞は、Ｗ３０３α（ＭＡＴα；ｈｉｓ３−１１，１５  ｔｒｐ１−１  ｌｅｕ２−３  ｕｒａ３−１  ａｄｅ２−１）である。対象となる更なる酵母株の同一性と遺伝子型は、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ（ｗｅｂ．ｕｎｉ−ｆｒａｎｋｆｕｒｔ．ｄｅ／ｆｂ１５／ｍｉｋｒｏ／ｅｕｒｏｓｃａｒｆ／ｃｏｌ＿ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で見ることができる。
【００５７】
宿主細胞に対する遺伝子改変
本発明の宿主細胞は、ノスカピノイド生成物を産生するための１つ以上の改変（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上またはそれ以上の改変など）を含むように遺伝子操作されていてよい。場合によっては、改変は、遺伝子もしくはその断片の変異、付加もしくは欠失、または遺伝子もしくはその断片の転写調節などの遺伝子改変である。本明細書で使用する場合、「変異」という用語は、基準配列または基準モチーフに対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換を指す。変異は、特異的変異として、本来の遺伝子座で天然型遺伝子に導入されていてよい。場合によっては、変異は、別の遺伝子座における遺伝子組み込みとして導入される追加の遺伝子コピーとして、または２μプラスミドもしくはセントロメアプラスミドなどのエピソーマルベクター上の追加のコピーとして導入される追加の遺伝子コピーとして導入してよい。特定の事例では、酵素の基質阻害コピーは、天然型細胞の転写調節下にある。場合によっては、酵素の基質阻害コピーは、合成プロモーターの制御下に置くことによって、タンパク質の発現の構成的または動的調節を遺伝子操作した状態で導入する。いくつかの例では、１つ以上の改変の対象は、天然型遺伝子であってよい。いくつかの例では、１つ以上の改変の対象は、非天然型遺伝子であってよい。いくつかの例では、非天然型遺伝子は、宿主細胞に挿入してよい。更なる例では、非天然型遺伝子は、宿主細胞に挿入する前に、１つ以上の改変によって改変してもよい。
【００５８】
遺伝子操作された宿主細胞は、１つ以上のノスカピノイド生成物を過剰産生できる。過剰産生とは、コントロール細胞（例えば、非改変細胞）に比べて、細胞のノスカピノイド生成物の産生が改善または増大していることを意味する。産生の改善または増大とは、コントロールがノスカピノイド生成物を産生しない場合に、多少の量のノスカピノイド生成物を産生することと、コントロールが、多少のノスカピノイド生成物を産生する場合に、約１０％以上、例えば約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上（２倍以上、例えば１０倍以上を含む５倍以上）増大することの両方を意味する。
【００５９】
場合によっては、１つ以上（２つ以上、３つ以上または４つ以上など）の改変は、生合成酵素遺伝子における基質阻害緩和型変異、生合成酵素遺伝子における産生阻害緩和型変異、補因子回収促進機構、生合成酵素遺伝子におけるフィードバック阻害緩和型変異及び生合成酵素遺伝子の転写調節の改変、酵素遺伝子における不活化変異から選択してよい。
【００６０】
基質阻害緩和型変異
場合によっては、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞の１つ以上の生合成酵素遺伝子に基質阻害緩和型変異を１つ以上（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上またはそれ以上）含む細胞である。いくつかの例では、その１つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっている（例えば、非改変細胞に存在する）。いくつかの例では、その１つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっていない。本明細書で使用する場合、「基質阻害緩和型変異」という用語は、細胞の基質阻害制御機構を弱める変異を指す。
【００６１】
基質阻害を緩和する変異は、コントロール細胞と比べて、対象となる細胞において調節酵素の阻害を軽減し、調節化合物またはその下流の生合成産物のレベルを向上させる。場合によっては、調節酵素の阻害を緩和するとは、阻害率のＩＣ５０が、２倍以上（３倍以上、５倍以上、１０倍以上、３０倍以上、１００倍以上、３００倍以上、１０００倍以上またはそれ以上など）上昇することを意味する。レベルの向上とは、コントロール細胞における調節化合物またはその下流産物のレベルの１１０％以上（１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上など、例えば、遺伝子操作された宿主細胞における調節化合物またはその下流産物の少なくとも３倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも１０倍以上またはそれ以上）であるレベルを意味する。
【００６２】
ノスカピン産物のレベルの調節を対象としている遺伝子操作された宿主細胞における様々な基質阻害制御機構及び生合成酵素は、基質阻害の緩和を標的としてよい。当該遺伝子操作された宿主細胞は、１つ以上の生合成酵素遺伝子に１つ以上の基質阻害緩和型変異を含んでよい。当該１つ以上の変異は、生合成酵素の調節制御が行われるいずれかの利便的な生合成酵素遺伝子に位置してよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、表１に記載されている遺伝子のうちの１つなどの１つ以上の生合成酵素遺伝子に、１つ以上の基質阻害緩和型変異を含んでよい。
【００６３】
いずれかの利便的な数及びタイプの変異を用いて、基質阻害制御機構を弱めてよい。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その遺伝子操作された宿主細胞内の１つ以上の生合成酵素遺伝子に、基質阻害緩和型変異を１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上または更には１５個以上（基質阻害緩和型変異を１つ、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個など）含んでよい。
【００６４】
補因子回収促進機構
場合によっては、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞の１つ以上の生合成酵素遺伝子に、補因子回収促進機構を１つ以上（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上またはそれ以上など）含む細胞である。いくつかの例では、その１つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっている（例えば、非改変細胞に存在する）。いくつかの例では、１つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっていない。本明細書で使用する場合、「補因子回収促進機構」という用語は、その細胞の補因子回収制御機構を促進する機構を指す。いくつかの例では、回収の対象となる１つ以上の補因子としては、Ｓ−アデノシルメチオニン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、テトラヒドロビオプテリン及びフラビンアデニンジヌクレオチドが挙げられるが、これらに限らない。
【００６５】
ノスカピノイド生成物のレベルの調節を対象としている遺伝子操作された宿主細胞における様々な補因子回収制御機構及び生合成酵素は、補因子回収の促進を標的としてよい。本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、１つ以上の生合成酵素遺伝子に、１つ以上の補因子回収促進機構を含んでよい。いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、表１に記載されている遺伝子のうちの１つなどの１つ以上の生合成酵素遺伝子に、１つ以上の補因子回収促進機構を含んでよい。
【００６６】
いずれかの利便的な数及びタイプの機構を用いて、補因子回収制御機構を促進してよい。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その遺伝子操作された宿主細胞内の１つ以上の生合成酵素遺伝子に、補因子回収促進機構を１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上または更には１５以上（補因子回収促進機構を１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４または１５など）含んでよい。
【００６７】
産生阻害緩和型変異
場合によっては、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞の１つ以上の生合成酵素遺伝子に、産生阻害緩和型変異を１個以上（２個以上、３個以上、４個以上、５個以上またはそれ以上など）含む細胞である。いくつかの例では、１つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっている（例えば、非改変細胞に存在する）。いくつかの例では、その１つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっていない。本明細書で使用する場合、「産生阻害緩和型変異」という用語は、遺伝子操作された宿主細胞の短期的及び／または長期的産生阻害制御機構を弱める変異を指す。短期的産生阻害は、補基質結合部位で競合的結合が見られる、その細胞の制御機構である。長期的な産生阻害は、所望の経路から離れた所で化合物の不可逆的結合が見られる、その細胞の制御機構である。
【００６８】
産生阻害を緩和する変異は、コントロール細胞と比べて、対象となる細胞における調節酵素の阻害を軽減し、調節化合物またはその下流の生合成産物のレベルを向上させる。場合によっては、調節酵素の阻害を緩和するとは、阻害率のＩＣ５０が、２倍以上（３倍以上、５倍以上、１０倍以上、３０倍以上、１００倍以上、３００倍以上、１０００倍以上またはそれ以上など）上昇することを意味する。レベルの向上とは、コントロール細胞における調節化合物またはその下流産物のレベルの１１０％以上（１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上など、例えば、遺伝子操作された宿主細胞における調節化合物またはその下流産物の少なくとも３倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも１０倍以上またはそれ以上）であるレベルを意味する。
【００６９】
ノスカピノイド生成物のレベルの調節を対象としている遺伝子操作された宿主細胞における様々な産生阻害制御機構及び生合成酵素は、産生阻害の緩和を標的としてよい。本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、１つ以上の生合成酵素遺伝子に、１つ以上の産生阻害緩和型変異を含んでよい。その変異は、生合成酵素の調節制御が行われるいずれかの利便的な生合成酵素遺伝子に位置してよい。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、表１に記載されている遺伝子のうちの１つなどの１つ以上の生合成酵素遺伝子に、１つ以上の産生阻害緩和型変異を含んでよい。
【００７０】
いずれかの利便的な数及びタイプの変異を用いて、産生阻害制御機構を弱めてよい。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その遺伝子操作された宿主細胞内の１つ以上の生合成酵素遺伝子に、産生阻害緩和型変異を１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上または更には１５個以上（産生阻害緩和型変異を１つ、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個など）含んでよい。
【００７１】
フィードバック阻害緩和型変異
場合によっては、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞の１つ以上の生合成酵素遺伝子に、フィードバック阻害緩和型変異を１個以上（２個以上、３個以上、４個以上、５個以上またはそれ以上など）含む細胞である。場合によっては、その１つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっている（例えば、非改変細胞に存在する）。これに加えてまたはこの代わりに、いくつかの例では、その１つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっていない。本明細書で使用する場合、「フィードバック阻害緩和型変異」という用語は、遺伝子操作された宿主細胞のフィードバック阻害制御機構を弱める変異を指す。フィードバック阻害は、調節化合物が特定のレベルまで蓄積されたら、調節化合物の合成経路内の酵素を阻害し、それによって、その細胞におけるその化合物の量を平衡させる、その細胞の制御機構である。フィードバック阻害を緩和する変異は、コントロール細胞に比べて、遺伝子操作された宿主細胞において調節酵素の阻害を軽減する。このようにして、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、調節化合物またはその下流の生合成産物のレベルを向上させる。場合によっては、調節酵素の阻害を緩和するとは、阻害率のＩＣ５０が、２倍以上（３倍以上、５倍以上、１０倍以上、３０倍以上、１００倍以上、３００倍以上、１０００倍以上またはそれ以上など）上昇することを意味する。レベルの向上とは、コントロール細胞における調節化合物またはその下流産物のレベルの１１０％以上（１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上など、例えば、宿主細胞における調節化合物またはその下流産物の少なくとも３倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも１０倍以上またはそれ以上）であるレベルを意味する。
【００７２】
対象となるＢＩＡのレベルの調節を対象としている様々なフィードバック阻害制御機構及び生合成酵素は、本発明の宿主細胞における緩和を標的としてよい。本発明の宿主細胞は、その細胞に天然に備わっている１つ以上の生合成酵素遺伝子に、１つ以上のフィードバック阻害緩和型変異を含んでよい。その１つ以上の変異は、生合成酵素の調節制御が行われるいずれかの利便的な生合成酵素遺伝子に位置してよい。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、表１に記載されている遺伝子のうちの１つなどの１つ以上の生合成酵素遺伝子に、１つ以上のフィードバック阻害緩和型変異を含んでよい。
【００７３】
いずれかの利便的な数及びタイプの変異を用いて、フィードバック阻害制御機構を弱めてよい。本明細書で使用する場合、「変異」という用語は、基準配列または基準モチーフに対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換を指す。この変異は、特異的変異として天然型遺伝子に本来の遺伝子座で導入してよい。場合によっては、変異は、別の遺伝子座における遺伝子組み込みとして、または２μプラスミドもしくはセントロメアプラスミドなどのエピソーマルベクター上の追加のコピーとして導入される追加の遺伝子コピーとして導入してよい。特定の事例では、酵素のフィードバック阻害コピーは、天然型細胞転写調節下にある。場合によっては、酵素のフィードバック阻害コピーは、合成プロモーターの制御下に置くことによって、タンパク質の発現の構成的または動的調節を遺伝子操作した状態で導入する。
【００７４】
特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その遺伝子操作された宿主細胞内の１つ以上の生合成酵素遺伝子に、フィードバック阻害緩和型変異を１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上または更には１５個以上（フィードバック阻害緩和型変異を１つ、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個など）含んでよい。
【００７５】
転写調節の改変
本発明の宿主細胞は、その細胞の１つ以上の生合成酵素遺伝子の転写調節の改変を１個以上（改変を２個以上、３個以上、４個以上、５個以上またはそれ以上など）含んでよい。いくつかの例では、その１つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっている。いくつかの例では、その１つ以上の生合成酵素遺伝子は、その細胞に天然に備わっていない。その細胞のいずれかの利便的な生合成酵素遺伝子は、転写調節を標的としてよい。転写調節とは、コントロール細胞（例えば非改変細胞）と比べて、改変細胞における対象となる遺伝子の発現を調節すること、例えば、増減、促進または抑制することを意味する。場合によっては、対象となる遺伝子の転写調節には、発現の増加または促進が含まれる。発現の増加または促進とは、（例えば、いずれかの利便的な遺伝子発現アッセイを用いることによって、）対象となる遺伝子の発現レベルが、コントロール、すなわち、改変していない同じ細胞における発現と比べて、２倍以上、例えば５倍以上、場合によって、２５倍、５０倍または１００倍以上、特定の実施形態では、３００倍以上またはそれ以上上昇することを意味する。あるいは、細胞における対象となる遺伝子の発現が、検出不能なほど低い事例では、発現が、容易に検出可能なレベルまで上昇した場合に、対象となる遺伝子の発現レベルが上昇しているとみなされる。特定の事例では、対象となる遺伝子の転写調節には、発現の減少または抑制が含まれる。発現の減少または抑制とは、対象となる遺伝子の発現レベルが、コントロールと比べて、２倍以上、例えば５倍以上、場合によって、２５倍、５０倍または１００倍以上、特定の実施形態では、３００倍以上またはそれ以上低下することを意味する。場合によっては、発現は、検出不可能なレベルまで低下する。本主題の宿主細胞での使用に適合させてよい、対象となる宿主細胞プロセスの改変は、Ｓｍｏｌｋｅらによる米国特許出願第２０１４０２７３１０９（１４／２１１，６１１）号に記載されており、その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、転写調節の改変には、１つ以上の生合成酵素遺伝子の天然型プロモーターの強力プロモーターへの置換、または強力プロモーターの制御下における、その遺伝子の追加のコピーの発現が含まれていてよい。対象となる遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよい。ただし、そのプロモーターが、宿主細胞において活性を有することができることを条件とする。対象となる遺伝子は、その天然型プロモーターから発現させてよい。これに加えてまたはこの代わりに、対象となる遺伝子は、非天然型プロモーターから発現させてもよい。必須ではないが、このようなプロモーターは、そのプロモーターが用いられる宿主において、中程度から高程度に強力であってよい。プロモーターは、調節されていても、構成的であってもよい。いくつかの実施形態では、グルコース抑制されないか、または培地におけるグルコースの存在によって軽度にしか抑制されないプロモーターを用いてよい。好適なプロモーターは数多く存在し、その例としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｔｓｒ遺伝子（フルクトース二リン酸アルドラーゼをコードする）のプロモーターのような解糖系遺伝子のプロモーター、または酵母S. cerevisiae由来のＧＡＰＤＨプロモーター（グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする）（Ｂｉｔｔｅｒ  Ｇ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６７３  ６８４（１９８７））が挙げられる。対象となる他の強力プロモーターとしては、パン酵母のＡＤＨＩプロモーター（Ｒｕｏｈｏｎｅｎ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：１９３  ２０３（１９９５））、酵母のＰＨＯ５プロモーターのようなリン酸飢餓誘導性プロモーター（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（１９８９）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のアルカリホスファターゼプロモーター（Ｌｅｅ．Ｊ．Ｗ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７：１１２７  １１３３（１９９１））、ＧＰＤ１及びＴＥＦ１が挙げられるが、これらに限らない。対象となる酵母プロモーターとしては、Ｇａｌ１−１０、Ｇａｌ１、ＧａｌＬ、ＧａｌＳ、抑制プロモーターＭｅｔ２５、ｔｅｔＯのような誘導性プロモーターと、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ）、翻訳伸長因子−１−αプロモーター（ＴＥＦ）、シトクロムｃ−オキシダーゼプロモーター（ＣＹＣ１）、ＭＲＰ７プロモーターなどのような構成的プロモーターが挙げられるが、これらに限らない。場合によっては、強力プロモーターは、ＧＰＤ１である。特定の事例では、強力プロモーターは、ＴＥＦ１である。グルココルチコイド、ステロイド及び甲状腺ホルモンのようなホルモンによって誘導可能なプロモーターを含む自律複製型酵母発現ベクターも周知であり、グルコルチコイド応答要素（ＧＲＥ）と甲状腺ホルモン応答要素（ＴＲＥ）が挙げられるが、これらに限らず、例えば、米国特許第７，０４５，２９０号に記載されているプロモーターを参照されたい。αファクター、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨのような構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いてもよい。加えて、いずれかのプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢによるようなもの）を用いて、対象となる遺伝子の発現を駆動することもできる。宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉに特異的ないずれかの利便的なプロモーターを選択してよいことが分かる。場合によっては、エネルギー源を最小限にしながら、産生を最大にするために、プロモーターの選択を利用して、転写、すなわち酵素レベルを最適化してよい。
【００７７】
不活化変異
本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞の酵素に対する不活化変異を１個以上（２個以上、３個以上、４個以上、５個以上またはそれ以上など）含んでよい。１個以上の不活化変異を含むことで、遺伝子操作された宿主細胞の合成経路のフラックスを改変して、対象となるＢＩＡ、またはＢＩＡを導く所望の酵素もしくは前駆体のレベルを向上できる。いくつかの例では、１つ以上の不活化変異は、その細胞に天然に備わっている酵素に対するものである。これに加えてまたはこの代わりに、１つ以上の不活化変異は、その細胞に天然に備わっていない酵素に対するものである。本明細書で使用する場合、「不活化変異」とは、細胞の遺伝子または調節ＤＮＡ配列に対する１つ以上の変異であって、その変異によって、対象となるその遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性が不活化される変異を意味する。場合によっては、その遺伝子は、その細胞に天然に備わっている。場合によっては、その遺伝子は、不活化されるとともに、宿主細胞によって産生される、対象となるＢＩＡの合成経路の一部であるか、またはその合成経路に連結している酵素をコードする。場合によっては、不活化変異は、対象となる遺伝子を制御する調節ＤＮＡ配列に位置する。特定の事例では、不活化変異は、遺伝子のプロモーターに対するものである。いずれかの利便的な変異（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を用いて、対象となる遺伝子または調節ＤＮＡ配列を不活化してよい。「不活化される」または「不活化する」とは、変異遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性が、非変異のコントロール遺伝子によって発現されるコントロールタンパク質と比べて、１０％以上（２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上など）低下することを意味する。場合によっては、そのタンパク質は、酵素であり、不活化変異によって、その酵素の活性が低下する。
【００７８】
いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞に天然に備わっている酵素に、不活化変異を含む。いずれかの利便的な酵素が、不活化の標的となっていてよい。対象となる酵素としては、表１に記載されている酵素であって、遺伝子操作された宿主細胞の合成経路におけるその活性が、ノスカピノイド生成物のレベルを低下させる傾向がある酵素を挙げてよいが、これらに限らない。
【００７９】
異種コード配列
場合によっては、例えば本明細書に記載されているように、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、本発明の遺伝子操作された宿主細胞が所望のノスカピノイド生成物を産生できるようにする活性をコードする異種コード配列を１個以上（２個以上、３個以上、４個以上、５個以上など）有する。本明細書で使用する場合、「異種コード配列」という用語は、その宿主生物に通常存在しないとともに、その宿主細胞において、適切な条件下で発現できるペプチドもしくはタンパク質、またはその等価なアミノ酸配列、例えば酵素をコードするかまたは最終的にコードするいずれかのポリヌクレオチドを示す目的で用いる。したがって、「異種コード配列」には、宿主細胞に通常存在するコード配列が多コピー含まれ、その結果、その宿主細胞が、その細胞に通常存在しない追加のコピーのコード配列を発現している。異種コード配列は、ＲＮＡもしくはそのいずれかのタイプ、例えばｍＲＮＡ、ＤＮＡもしくはそのいずれかのタイプ、例えばｃＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドであってよい。対象となるコード配列としては、コード配列、イントロン、プロモーター領域、３’ＵＴＲ及びエンハンサー領域などの機構を含む完全長転写ユニットが挙げられるが、これらに限らない。
【００８０】
異種コード配列に対応するために、本発明の遺伝子操作された宿主細胞を改変して、１つ以上の遺伝的変更を有するようにしてもよい。天然型宿主ゲノムの変更としては、ゲノムを改変して、所望の経路を妨げ得る特定のタンパク質の発現を低下または喪失させることが挙げられるが、これに限らない。このような天然型タンパク質の存在により、その経路の中間体または最終産物の１つが、所望の経路において有用でない代謝物またはその他の化合物に素早く変換されることがある。したがって、天然型酵素の活性を低下させるか、または完全に喪失させれば、産生された中間体は、所望の産物に組み込むのに更に容易に利用可能になる。場合によっては、多剤応答性に関与するタンパク質（ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター、多剤耐性（ＭＤＲ）ポンプ及び関連転写因子が挙げられるが、これらに限らない）におけるように、タンパク質の発現の喪失が重要となり得る。
【００８１】
本発明の宿主細胞を改変して、所望の活性または特性をもたらす様々な植物タンパク質を含むようにしてよい。酵素、シャペロン、補因子などのように、対象となるノスカピノイドまたはその前駆体の合成に関係するいずれかの利便的な植物タンパク質を遺伝子操作された宿主細胞において用いてよい。場合によっては、本発明の宿主細胞は、植物シャペロンタンパク質を含む。この植物シャペロンは、宿主細胞において、対象となる酵素の作用を促進でき、それによって、対象となるノスカピノイドまたはその前駆体の産生を向上させる。対象となる植物シャペロンとしては、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、ＤｎａＪタンパク質、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）９４、結合タンパク質（ＢｉＰ）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、サイクロフィリン、及びカルネキシンが挙げられるが、これらに限らない。
【００８２】
異種コード配列としては、植物においてノスカピノイド生成物の産生を通常担う酵素をコードする配列（野生型または等価配列のいずれか）が挙げられるが、これらに限らない。場合によっては、異種配列がコードする酵素は、１−ＢＩＡ経路における酵素のいずれかであってよく、いずれかの利便的な供給源に由来してよい。特定の合成経路の異種コード配列によってコードされる酵素の選択と数は、所望の産物に基づき選択してよい。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、異種コード配列を１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上または更には１５個以上（異種コード配列を１つ、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個など）含んでよい。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「異種コード配列」という用語には、ペプチドまたは酵素のコード部、すなわち、ペプチドまたは酵素のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列と、完全長転写ユニットのコード部、すなわち、イントロンとエキソンを含む遺伝子と、酵素をコードするかまたはその等価なアミノ酸配列をコードする「コドン最適化」配列、トランケート配列またはその他の形態の改変配列（ただし、等価なアミノ酸配列は、機能性タンパク質を産生することを条件とする）も含まれる。このような等価なアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失を有してよく、その欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端または内部である。トランケート体は、本明細書に示されている触媒能を有する場合に限り、想定される。経路内での代謝物の移動を促すために、２つ以上の酵素の融合も想定される。ただし、触媒活性が保たれることを条件とする。
【００８４】
機能可能な断片、変異体またはトランケート体は、モデリング及び／またはスクリーニングによって同定してよい。場合によっては、これは、例えば、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または内部領域を段階的に欠失させてから、得られた誘導体の所望の反応に関する活性について、元の配列と比べて解析することによって実現される。該当する誘導体が、この能力において機能する場合、その酵素の適切な等価誘導体を構成するとみなされる。遺伝子操作された宿主細胞において所望の生物学的活性が得られるように、対象となるいずれかの利便的な酵素を変異させるかまたは遺伝子操作してよい。場合によっては、変異酵素を遺伝子操作して、その酵素の正しいフォールディングを促す。特定の事例では、変異酵素を遺伝子操作して、非変異酵素と比べて、その酵素の所望の活性または特性を高める。特定の事例では、変異酵素を遺伝子操作して、非変異酵素と比べて、その酵素の望ましくない活性または特性を低下させる。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の変異酵素をコードする１つ以上の異種コード配列を含む。場合によっては、変異酵素は、ＣＹＰ８２Ｙ１のＮ末端変異体である。ＣＹＰ８２Ｙ１のＮ末端を遺伝子操作して、その酵素の正しいフォールディングを促してよい。図６は、様々なＣＹＰ８２Ｙ１酵素変異体を用いて、ノスカピノイド前駆体の産生を増大させることを示している。いくつかの事例では、第１の酵素のＮ末端タグを第２の酵素のＮ末端タグに置換することを通じて、第１の酵素の活性を向上させる。
【００８５】
本発明の態様は、様々な酵素の天然型アミノ酸配列と等価であるアミノ酸配列をコードする異種コード配列にも関する。「等価」であるアミノ酸配列は、その特定のアミノ酸配列と同一でないが、所望の目的で用いたときに、その特定のアミノ酸配列の類似の活性と比べて、タンパク質の生物学的活性に本質的には影響を及ぼさない少なくともいくつかのアミノ酸変化（欠失、置換、逆位、挿入など）を含むアミノ酸配列として定義する。等価配列には、元のアミノ酸配列とは異なる特性を有するように遺伝子操作及び／または進化させた配列も含まれるように意図されている。対象となる可変特性としては、触媒活性、基質特異性、選択性、安定性、溶解性、局在性などが挙げられる。特定の実施形態では、「等価」アミノ酸配列の特定のアミノ酸配列に対する同一性は、アミノ酸レベルで少なくとも８０％〜９９％であり、いくつかの事例では、その同一性は、アミノ酸レベルで少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％及びそれ以上、特定の事例では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％である。場合によっては、アミノ酸配列は同一であってよいが、例えば、宿主生物のコドン使用頻度を最適化するなどのために、ＤＮＡ配列が改変されている。
【００８６】
場合によっては、各タイプの酵素の発現は、追加の遺伝子コピー（すなわち、多コピー）によって向上し、これにより、中間体の蓄積及び／またはノスカピノイド生成物の産生が増大する。本発明の実施形態は、単一または複数の酵素の複数種変異体の同時発現を通じて、宿主細胞においてノスカピノイド生成物の産生を増大させることを含む。場合によっては、単一または複数の酵素の追加の遺伝子コピーは、宿主細胞に含まれている。宿主細胞における、酵素に対する多コピーの異種コード配列を含め、いずれかの利便的な方法を用いてよい。
【００８７】
いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素に対する異種コード配列を多コピー（２個以上、３個以上、４個以上、５個以上または更には１０個以上のコピーなど）含む。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、１つ以上の酵素に対する異種コード配列を多コピー（２個以上、３個以上、４個以上などを多コピーなど）含む。場合によっては、酵素に対する多コピーの異種コード配列は、宿主細胞と比べて異なる２個以上の起源生物に由来する。例えば、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、１つの異種コード配列を多コピー含んでよく、その各コピーは、異なる起源生物に由来する。すなわち、各コピーは、異種コード配列によってコードされる、対象となる酵素の種間差に基づき、明示配列の多少の違いを含んでよい。
【００８８】
特に断りのない限り、異種コード配列は、ＧＥＮＢＡＮＫに報告されているとおりである。対象となる酵素のリストは、表１に示されている。本発明の宿主細胞は、列挙されている酵素であって、いずれかの供給源由来の酵素をいずれかに組わせたものを含んでよい。別段の定めのない限り、本明細書に開示されている受託番号は、ＧｅｎＢａｎｋを指す。いくつかの受託番号は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＳＧＤ）を指し、このデータベースは、ワールドワイドウェブ上で、ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇで入手可能である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、対象となる１つ以上の酵素（例えば、本明細書に記載されているようなもの）をコードする１つ以上の異種コード配列を含む。対象となる酵素としては、表１に記載されている酵素が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、本発明の細胞は、テトラヒドロプロトベルベリンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＮＭＴ）をコードする異種コード配列を含む。場合によっては、本発明の細胞は、Ｎ−メチルカナジン１−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ８２Ｙ１）をコードする異種コード配列を含む。場合によっては、本発明の細胞は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン１３−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ８２Ｘ２）をコードする異種コード配列を含む。特定の事例では、本発明の細胞は、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン３−Ｏアセチルトランスフェラーゼ（ＰｓＡＴ１）をコードする異種コード配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンシンターゼ（ＣＹＰ８２Ｘ１）をコードする異種コード配列を含む。場合によっては、本発明の細胞は、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ（ＰｓＣＸＥ１）をコードする異種コード配列を含む。特定の事例では、本発明の細胞は、ノスカピンシンターゼ（ＰｓＳＤＲ１）をコードする異種コード配列を含む。場合によっては、本発明の細胞は、ＰｓＭＴ３及びＰｓ６ＯＭＴより選択される１つ以上の酵素をコードする異種コード配列を１個以上（例えば２個以上）含む。場合によっては、本発明の細胞は、ＰｓＭＴ３、Ｐｓ６ＯＭＴ及びＰｓＭＴ２より選択される１つ以上の酵素をコードする異種コード配列を１個以上（例えば２個以上）含む。特定の事例では、本発明の細胞は、酵素のＰｓＭＴ３及びＰｓＭＴ２をコードする異種コード配列を含む。特定の事例では、本発明の細胞は、酵素のＰｓ６ＯＭＴ及びＰｓＭＴ２をコードする異種コード配列を含む。特定の実施形態では、本発明の細胞は、酵素のＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１及びＣＹＰ８２Ｘ２をコードする異種コード配列を含む。異種コード配列は、いずれかの利便的な方法を用いて、宿主細胞内で発現させてよい。場合によっては、異種コード配列は、低コピーコンストラクトから発現させる。場合によっては、本発明の細胞は、P. somniferum及びE. californicaより選択される起源生物に由来する異種コード配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、対象となる酵素（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を欠損している。特定の実施形態では、本発明の細胞は、ＰｓＭＴ２、ＰｓＭＴ３、Ｐｓ６ＯＭＴ、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＴＮＭＴまたはＥｃＴＮＭＴ、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＡＴ１及びＣＹＰ８２Ｙ１より選択される１つ以上の酵素を欠損している。特定の実施形態では、本発明の細胞は、ＰｓＭＴ２、ＰｓＭＴ３、Ｐｓ６ＯＭＴ、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＴＮＭＴ、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＡＴ１及びＣＹＰ８２Ｙ１より選択される２つ以上（３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上または９つ以上）の酵素を欠損している。本主題の細胞から除外するために、本明細書に記載されている酵素の２つ以上をいずれかに組み合わせたものを選択してよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＰｓＭＴ３酵素を含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、Ｐｓ６ＯＭＴ酵素を含む。場合によっては、本発明の細胞は、ホモ二量体またはヘテロ二量体（例えば、本明細書に記載されているいずれかの２つの利便的な酵素からなる二量体）である酵素を含む。特定の事例では、本発明の細胞は、ＰｓＭＴ２＋ＭＴ３のヘテロ二量体酵素を含む。特定の事例では、本発明の細胞は、ＰｓＭＴ２＋６ＯＭＴのヘテロ二量体酵素を含む。
【００９１】
場合によっては、本発明の宿主細胞は、ＣＰＲ酵素に対する異種コード配列を含む。本主題の宿主細胞において、いずれかの利便的なＣＰＲ酵素を用いてよい。特定の事例では、ＣＰＲ酵素は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｐ４５０レダクターゼ（ＡＴＲ）、例えばＡＴＲ１、またはP. somniferum由来のＣＰＲ酵素（ＰｓＣＰＲ）である。本発明の細胞は、その細胞においてノスカピンを誘導体化させる１つ以上の酵素を用いて、対象となるノスカピノイドを産生してよい。特定の実施形態では、本発明の細胞は、Ｐ４５０、ハロゲナーゼ、グリコシラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、短鎖デヒドロゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼ及びプレニルトランスフェラーゼより選択される１つ以上の酵素に対する１つ以上の異種コード配列を含む。
【００９２】
本発明の細胞は、ノルラウダノソリン由来のノスカピノイドまたはその前駆体を産生してよい。図９は、ノルラウダノソリンから始まる、ノスカピン及びその前駆体への合成経路を示している。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＴＮＭＴ、ＰｓＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ３、ＰｓＭＴ２、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、Ｓ９ＯＭＴ、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＡｔＡＴＲ１及びＣＹＰ７１９Ａより選択される１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種コード配列を含む。異種コード配列は、いずれかの利便的な方法を用いて、細胞内で発現させてよい。対象となる発現方法は、対象となる酵素及び対象となる細胞産物などの様々な要因に応じて様々であり、染色体への組み込み、ＹＡＣからの発現、低コピープラスミドからの発現及び高コピープラスミドからの発現が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、本発明の細胞は、ＹＡＣからＴＮＭＴ、ＰｓＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２を発現させる。特定の実施形態では、本発明の細胞は、ＹＡＣからＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ３を発現させる。特定の実施形態では、本発明の細胞は、ＹＡＣからＣＹＰ８２Ｘ２、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２、ＰｓＡＴ１、ＴＮＭＴを発現させる。特定の事例では、本発明の細胞は、低コピープラスミドからＣＹＰ８２Ｙ１及びＣＹＰ８２Ｘ１を発現させる。場合によっては、本発明の細胞は、高コピープラスミドからＳ９ＯＭＴを発現させる。いくつかの事例では、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＡｔＡＴＲ１及びＣＹＰ７１９Ａが、本発明の細胞の染色体に組み込まれている。場合によっては、ＴＮＭＴ、ＰｓＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ３、ＰｓＭＴ２、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、Ｓ９ＯＭＴ、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＡｔＡＴＲ１及びＣＹＰ７１９Ａが、本発明の細胞の染色体に組み込まれている。場合によっては、ＲｎＰＴＰＳ、ＲｎＳｅｐＲ、ＲｎＰＣＤ、ＲｎＱＤＨＰＲ、ＲｎＤＨＦＲ、ＲｎＴｙｒＨ、ＣｊＮＣＳ、ＰｐＤＯＤＣ、ＥｃＣＹＰ８０Ｂ１、ＰｓＣＰＲ、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＡＲＯ４（Ｑ１６６Ｋ）、ＡＲＯ７（Ｔ２２６Ｉ）、ＡＲＯ１０、ＴＫＬ１、ＴＮＭＴ、ＰｓＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ３、ＰｓＭＴ２、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、Ｓ９ＯＭＴ、ＰｓＢＢＥ及びＣＹＰ７１９Ａが、本発明の細胞の染色体に組み込まれている。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明の宿主細胞（例えば酵母株）は、１つ以上の酵素をその細胞内の一区画に局在化することによって、対象となるノスカピノイドまたはその前駆体を選択的に産生するように遺伝子操作されている。細胞のいずれかの利便的な区画または構造は、対象となる酵素の局在化を標的としてよい。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、その酵母細胞内の一区画に空間的に局在化する酵素を含み、その区画は、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜、ペルオキシソーム、及びペリプラズムから選択される。場合によっては、酵素は、ＥＲ標的配列をそのタンパク質のＮ末端に融合することによって、酵母小胞体に局在化する。特定の事例では、対象となる酵素は、酵母細胞内の区画の外側に空間的に局在化する。場合によっては、対象となる酵素は、酵母細胞内の区画の内側に空間的に局在化する。
【００９４】
場合によっては、酵素を宿主細胞内に配置して、この酵素によって生成される化合物が、自発的に転位するか、またはその化合物を望ましくない代謝物に変換し得る局在化酵素に達する前に、別の酵素によって所望の代謝物に変換されるようにしてよい。２つの酵素の空間的距離は、それらの酵素の１つが化合物に直接作用して、望ましくない代謝物を生成させるのを防ぐとともに、望ましくない最終産物（例えば、望ましくないオピオイド副産物）の産生を制限するように、選択してよい。特定の実施形態では、本明細書に記載されている酵素のいずれか（単独で、または第２の酵素と併せてのいずれか）は、宿主細胞内のいずれかの利便的な区画（細胞小器官、小胞体、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜またはペリプラズムが挙げられるが、これらに限らない）に局在化してよい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明の宿主細胞は、局在化タグを含む酵素の１つ以上を含む。いずれかの利便的な局在化タグを用いてよい。場合によっては、局在化タグは、酵素のＮ末端及び／またはＣ末端に結合されているペプチド配列である。タグを酵素に結合させるには、いずれかの利便的な方法を用いてよい。場合によっては、局在化タグは、内因性酵母タンパク質に由来する。このようなタグは、様々な酵母の細胞小器官（小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア（ＭＴ）、細胞膜（ＰＭ）及び液胞（Ｖ）が挙げられるが、これらに限らない）へルーティングできる。特定の事例では、タグは、テールアンカー型のタンパク質内に由来する膜貫通ドメインを含むか、またはこのドメインに由来する。いくつかの実施形態では、局在化タグは、細胞小器官の外側に酵素を配置する。特定の実施形態では、局在化タグは、細胞小器官の内側に酵素を配置する。
【００９６】
場合によっては、各タイプの酵素の発現は、追加の遺伝子コピー（すなわち、多コピー）を通じて向上し、これにより、中間体の蓄積を増大させ、最終的には、ノスカピノイド及び／またはノスカピノイド前駆体の産生が増大する。本発明の実施形態は、単一または複数の酵素の複数種変異体の同時発現を通じて、宿主細胞内でのノスカピノイドの産生を増大させることを含む。場合によっては、単一または複数の酵素の追加の遺伝子コピーは、宿主細胞に含まれている。宿主細胞における、酵素に対する多コピーの異種コード配列を含め、いずれかの利便的な方法を用いてよい。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明の宿主細胞は、酵素に対する異種コード配列を多コピー（２個以上、３個以上、４個以上、５個以上または更には１０個以上のコピーなど）含む。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、１つ以上の酵素に対する異種コード配列を多コピー（２個以上、３個以上、４個以上などの多コピーなど）含む。場合によっては、本発明の宿主細胞は、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２及びＰｓＭＴ３より選択される酵素をコードする異種コード配列を多コピー含む。特定の事例では、本発明の宿主細胞には、酵素のＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１及びＰｓＭＴ３をコードする異種コード配列のそれぞれが多コピー含まれている。
【００９８】
場合によっては、酵素に対する多コピーの異種コード配列は、その宿主細胞と比べて異なる２つ以上の起源生物に由来する。例えば、本発明の宿主細胞は、１つの異種コード配列を多コピー含んでよく、その各コピーは、異なる起源生物に由来している。特定の事例では、それらのコピーは、P. somniferumとE. californicaという起源生物に由来する。したがって、各コピーは、異種コード配列によってコードされる、対象となる酵素の種間差に基づき、明示配列の多少の違いを含んでよい。場合によっては、本発明の宿主細胞は、ある酵素をそれぞれコードするとともに、その宿主細胞と比べて異なる起源生物にそれぞれ由来する複数の異種コード配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明の宿主細胞は、その宿主細胞と比べて異なる２つ以上の起源生物に由来する酵素のコピーを含む。特定の実施形態では、本発明の細胞は、ＴＮＭＴ酵素をそれぞれコードする２個以上の異種コード配列を含む。場合によっては、本発明の宿主細胞は、ＴＮＭＴをそれぞれコードするとともに、異なる起源生物に由来する２個以上の異種コード配列を含む。特定の事例では、ＴＮＭＴ酵素に対する起源生物は、P. somniferumとE. californicaから選択する。
【００９９】
本発明の遺伝子操作された宿主細胞培地をサンプリングして、ノスカピノイド生成物の産生についてモニタリングしてよい。ノスカピノイド生成物は、いずれかの利便的な方法を用いて観察及び測定してよい。対象となる方法としては、ＬＣ−ＭＳ法（例えば、本明細書に記載されているようなもの）が挙げられるが、これらに限らず、この方法では、対象となるサンプルは、既知量の標準化合物と比較することによって解析する。加えて、ノスカピノイド生成物を観察及び／または測定できる他の方法も存在する。ＢＩＡを観察及び／または測定する代替的方法の例としては、ＧＣ−ＭＳ、ＵＶ−ｖｉｓ分光法、ＮＭＲ、ＬＣ−ＮＭＲ、ＬＣ−ＵＶ、ＴＬＣ、キャピラリー電気泳動などが挙げられる。例えばｍ／ｚ及びＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンによって同一性を確認してもよいとともに、既知の保持時間のＬＣの波形ピークによって、及び／または既知量の標準化合物の対応するＬＣ−ＭＳ解析を参照することによるＥＩＣ  ＭＳのピーク解析によって、その化合物の定量または測定を行ってもよい。
【０１００】
方法
プロセス工程
上に概説したように、本発明の態様は、ノスカピノイド生成物の調製方法を含む。すなわち、本発明の態様は、宿主細胞の改変部（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を１つ以上、機能的に発現させて、その細胞が、対象となる出発化合物をノスカピノイド生成物に変換させるようにする条件下で、遺伝子操作された宿主細胞を培養する工程を含む。また、１つ以上の異種コード配列を機能的に発現させて、対象となる出発化合物をノスカピノイド生成物に変換させるように、タンパク質の産生に適する条件下で、遺伝子操作された宿主細胞を培養する工程を含む方法も提供する。例では、この方法は、ノスカピノイド生成物の調製方法であって、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を培養する工程と、その細胞培養液に出発化合物を加える工程と、その細胞培養液からノスカピノイド生成物を回収する工程を含む方法である。
【０１０１】
特定の事例では、この細胞内で産生されるノスカピノイドは、後で、その細胞内で、それ自体が、対象となる下流のベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）に変換される中間体または出発物質として利用される。いずれかの利便的なＢＩＡは、本明細書に記載されているノスカピノイド産生細胞によって産生させてよい。本主題の方法での使用に適合させてよい、対象となるＢＩＡ産生細胞としては、ＳｍｏｌｋｅらによってＵＳ２０１４０２７３１０９に記載されているものが挙げられるが、これらに限らず、その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。すなわち、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＢＩＡをノスカピノイドから産生させるのに十分な条件下で、宿主細胞を培養する工程と、そのＢＩＡを細胞培養液から回収する工程を更に含む。
【０１０２】
発酵培地は、好適な炭素基質を含んでよい。本開示の方法を行うのに適する炭素源には、多種多様な炭素含有基質を含めてよい。好適な基質としては、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）またはこれらの組み合わせを挙げてよいが、これらに限らない。場合によっては、再生可能な供給原料から得られる未精製混合物を用いてもよい（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽）。場合によっては、炭素基質は、１炭素基質（例えば、メタノール、二酸化炭素）または２炭素基質（例えば、エタノール）であってよい。別の事例では、他の炭素含有化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミン及びアミノ酸を用いてよい。
【０１０３】
ノスカピノイド生成物を産生させるには、遺伝子操作された宿主細胞を培養するためのいずれかの利便的な方法を用いてよい。用いる具体的なプロトコールは、例えば、遺伝子操作された宿主細胞、異種コード配列、対象となる酵素、対象となるＢＩＡなどに応じて様々であり得る。本発明の細胞は、その細胞が１つ以上の異種機能性酵素を発現できる環境などのいずれかの利便的な環境に存在していてよい。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、酵素の発現を促す条件下で、かつノスカピノイド生成物をインビボで産生させるのに利用可能な適切な基質を用いて培養する。いくつかの実施形態では、機能性酵素は、ノスカピノイド生成物をインビトロ条件下で産生するための遺伝子操作された宿主から抽出する。場合によっては、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、多細胞宿主生物に戻す。本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、いずれかの増殖期（定常期及び対数増殖期などが挙げられるが、これらに限らない）にあってもよい。加えて、培養自体は、連続培養であっても、バッチ培養であってもよい。
【０１０４】
細胞は、適切な発酵培地において、１４〜４０℃の温度で増殖させてよい。細胞は、いずれかの利便的な速度（例えば２００ｒｐｍ）で振とうしながら増殖させてよい。細胞は、好適なｐＨで増殖させてよい。発酵の際の好適なｐＨの範囲は、ｐＨ５〜９であってよい。発酵は、好気条件、嫌気条件または微好気条件下で行ってよい。いずれかの好適な増殖培地を用いてよい。好適な増殖培地としては、合成限定（ＳＤ）最小培地または酵母エキス・ペプトン・デキストロース（ＹＥＰＤ）の豊富な培地などの一般的な市販の調製済み培地を挙げてよいが、これらに限らない。その微生物に適切ないずれかのその他の豊富な増殖培地、限定増殖培地、または合成増殖培地を用いてもよい。
【０１０５】
細胞は、本質的にいずれのサイズ及び形の容器で培養してもよい。本開示の方法を行うのに適する容器の例としては、マルチウェルシェイクプレート、試験管、フラスコ（バッフル付き及びバッフル無し）ならびにバイオリアクターを挙げてよいが、これらに限らない。培養液の体積は、１０マイクロリットルから１０，０００リットル超までに及んでよい。
【０１０６】
アルカロイドの産生のために望ましい形で、代謝を調節することが知られている作用剤を増殖培地に添加することを含んでもよい。非限定例では、カタボライトリプレッションを調節するために、環状アデノシン２’３’一リン酸を増殖培地に添加してよい。
【０１０７】
特定の細胞種に対するいずれかの利便的な細胞培養条件を用いてよい。特定の実施形態では、１つ以上の改変を含む宿主細胞は、標準的な条件または容易に最適化される条件下で、標準的な細胞培養培地と助剤を用いて培養する。一例としては、プラスミド保持のための選択圧が不要なときの標準的な増殖培地は、２０ｇ／Ｌの酵母エキスと、１０ｇ／Ｌのペプトンと、２０ｇ／Ｌのデキストロース（ＹＰＤ）を含んでよい。プラスミドを含む宿主細胞は、１．７ｇ／Ｌの酵母窒素ベースと、５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムと、２０ｇ／Ｌのデキストロースを含む合成完全（ＳＣ）培地であって、増殖と選択に必要な適切なアミノ酸を添加した培地で増殖させる。誘導性酵素発現に有用であり得る代替的な炭素源としては、スクロース、ラフィノース及びガラクトースが挙げられるが、これらに限らない。細胞は、実験室において、容器、例えば試験管またはフラスコ内で、１〜１０００ｍＬ以上に及ぶ体積で、いずれかの利便的な温度（例えば３０℃）において、いずれかの利便的な速度（例えば２００ｒｐｍ）で振とうしながら増殖させる。
【０１０８】
例えば工業的プロセスの一部として、更に大きい発酵容器での増殖のために、培養体積を増大させてよい。工業的発酵プロセスは、閉鎖バッチ条件、流加条件もしくは連続ケモスタット条件、またはいずれかの好適な発酵様式で行ってよい。場合によっては、本発明の細胞は、全細胞触媒として基板上に固定して、アルカロイド産生のための発酵条件下に置いてよい。
【０１０９】
バッチ発酵は、閉鎖システムであり、このシステムでは、培地の組成は、発酵の開始時に設定し、発酵プロセス中には変更しない。発酵の開始時に、所望の生物を培地に播き込む。場合によっては、バッチ発酵は、ｐＨ及び酸素濃度（ただし、炭素ではない）などの要因を制御するために、上記システムに変更を加えながら行う。このタイプの発酵システムでは、当該システムのバイオマスと代謝物組成は、発酵にわたって連続的に変化する。細胞は典型的には、遅滞期から対数増殖期（高増殖速度）に移り、続いて定常期（増殖速度が低下または停止する）になり、最終的に死滅期に至る（未処置のままの場合）。
【０１１０】
連続発酵は、開放システムであり、そのシステムでは、バイオリアクターに規定の発酵培地が連続的に加えられるとともに、処理する目的で、等量の発酵培地が容器から連続的に除去される。連続発酵システムは概して、定常状態の増殖条件を保持するように作動させて、除去される培地による細胞損失を、発酵における増殖速度によって平衡させなければならないようにする。連続発酵は概して、細胞が一定の高い細胞密度である条件で行う。連続発酵により、標的産物の濃度及び／または細胞の増殖に影響を及ぼす１つ以上の要因の調節を可能にする。
【０１１１】
液体培地としては、上記の添加成分を有する富栄養培地または合成規定培地を挙げてよいが、これらに限らない。培地成分は、水に溶解させ、熱、圧力、ろ過、放射線、化学物質またはこれらのいずれかの組み合わせによって滅菌してよい。いくつかの培地成分は、別に調製して、滅菌してから、発酵容器内で組み合わせてもよい。発酵を通じて一定のｐＨを保つ助けとなるように、培地を緩衝化してよい。
【０１１２】
発酵にわたって、温度、溶存酸素、ｐＨ、攪拌、通気速度及び細胞密度を含むプロセスパラメーターをモニタリングまたは制御してよい。例えば、発酵プロセスの温度は、培地に浸漬した温度プローブによってモニタリングしてよい。培養温度は、ジャケット温度を調節することによって、設定点に制御してよい。水を外付けチラーで冷却してから、バイオリアクターのコントロールタワーに流入させて、容器内の設定温度に保つのに必要な温度で、ジャケットまで循環させてよい。
【０１１３】
加えて、発酵プロセスでは、ガス流量パラメーターをモニタリングしてよい。例えば、ガスは、スパージャーを通じて培地に流入させてよい。本開示の方法に適するガスとしては、圧縮空気、酸素及び窒素を挙げてよい。ガス流量は、一定の速度にしても、溶存酸素の設定点を保つように調節してもよい。
【０１１４】
培地のｐＨもモニタリングしてよい。例では、ｐＨは、容器内側で培地に浸漬したｐＨプローブによってモニタリングしてよい。ｐＨ制御が効果的である場合、ｐＨは、各溶液を培地に、必要な速度で添加する酸ポンプ及び塩基ポンプによって調節してよい。ｐＨを制御するのに用いる酸溶液は、硫酸または塩酸であってよい。ｐＨを制御するのに用いる塩基溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化アンモニウムであってよい。
【０１１５】
更に、培地に浸漬した溶存酸素プローブによって、培地において溶存酸素をモニタリングしてよい。溶存酸素の調節が効果的である場合、酸素レベルは、攪拌速度を増減させることによって調節してよい。溶存酸素レベルは、ガス流速を増減させることによって調節してもよい。このガスは、圧縮空気、酸素または窒素であってよい。
【０１１６】
発酵プロセスにおいては、攪拌速度もモニタリングしてよい。例では、スターラーモーターによって攪拌装置を駆動させてよい。スターラー速度は、発酵を通じて一定のｒｐｍに設定しても、設定の溶存酸素レベルを保つために動的に調節してもよい。
【０１１７】
加えて、発酵プロセスでは、濁度をモニタリングしてもよい。例では、濁度プローブを用いて、細胞密度を測定してもよい。あるいは、サンプルをバイオリアクターから採取して、そのサンプルを分光光度計で解析することによって、細胞密度を測定してよい。更に、サンプルは、時間間隔を置いて、滅菌サンプリング装置を通じて、バイオリアクターから除去してよい。サンプルは、宿主細胞によって産生されるアルカロイドについて解析してよい。サンプルは、他の代謝物と糖、培地成分の枯渇、または細胞の密度についても解析してよい。
【０１１８】
別の例では、発酵プロセス中に、供給原料パラメーターをモニタリングしてもよい。具体的には、外部ポンプを用いて、発酵物に、糖と他の炭素源、栄養源及び補因子を含む供給原料を加えてよい。発酵中に、その他の成分（消泡剤、塩、キレート化剤、界面活性剤及び有機液体が挙げられるが、これらに限らない）を加えてもよい。
【０１１９】
宿主細胞内での異種ポリヌクレオチドの発現を最適化するいずれかの利便的なコドン最適化法を、本主題の宿主細胞と方法での使用に適合させてよく、例えば、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，３４６−３５３（参照により、その全体が援用される）を参照されたい。
【０１２０】
本主題の方法は、出発化合物を細胞培養液に加えることも含んでよい。いずれかの利便的な添加方法を、本主題の方法での使用に適合させてよい。細胞培養液には、対象となる出発物質（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を十分な量、例えば、出発化合物をｍＭからμＭ単位の量（約１〜５ｍＭなど）を添加してよい。添加する出発物質の量、タイミング及び添加速度、加える物質の形態などは、様々な要因に応じて変化し得ることが分かる。出発物質は、そのまま加えても、好適な溶媒（例えば、細胞培養培地、水または有機溶媒）に事前に溶解させてもよい。出発物質は、添加時の細胞培地の希釈を最小限に抑えるために、濃縮形態（例えば、所望の濃度に対して１０倍）で添加してもよい。出発物質は、１つ以上のバッチで加えても、または長期間（例えば、数時間または数日）にわたる連続添加によって加えてもよい。
【０１２１】
発酵培地から産生物を単離する方法
本主題の方法は、ノスカピノイド生成物を細胞培養液から回収することも含んでよい。いずれかの利便的な分離及び単離方法（例えば、クロマトグラフィー法または沈殿法）を、本主題の方法での使用に適合させて、ノスカピノイド生成物を細胞培養液から回収してよい。ろ過法を用いて、細胞培養液の不溶分から溶解分を分離してよい。場合によっては、液体クロマトグラフィー法（例えば、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー）を用いて、対象となるノスカピノイド生成物を細胞培養液の他の溶解性成分から分離してよい。場合によっては、抽出法（例えば、液体抽出、ｐＨに基づく精製、固相抽出、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換など）を用いて、ノスカピノイド生成物を細胞培養液の他の成分から分離してよい。
【０１２２】
産生されたアルカロイドは、当該技術分野で知られている方法を用いて、発酵培地から単離してよい。発酵の直後に（または場合によっては発酵中に）、所望の産物の１回目の回収のために、数多くの回収工程を行ってよい。これらの工程を通じて、アルカロイド（例えばノスカピノイド生成物）を細胞、細胞破片及び老廃物から分離してよく、その他の栄養源、糖及び有機分子は、使用済み細胞培地に残っていてよい。このプロセスを用いて、ノスカピノイド生成物を豊富に含む生成物を得てよい。
【０１２３】
一例では、ノスカピノイド生成物を有する生成物流は、遺伝子操作された酵母細胞と、栄養源及び水を含む供給原料とをバッチ反応器に供給することによって形成させる。具体的には、遺伝子操作された酵母細胞を少なくとも約５分の期間にわたってインキュベートして、ノスカピノイド生成物と細胞物質を含む溶液を産生させることによって、遺伝子操作された酵母細胞を発酵させてよい。遺伝子操作された酵母細胞を発酵させたら、少なくとも１つの分離ユニットを用いて、ノスカピノイド生成物を細胞物質から分離して、ノスカピノイド生成物を含む生成物流を得てよい。具体的には、その生成物流は、ノスカピノイド生成物とともに、清澄化酵母培地などの追加の成分を含んでよい。加えて、ノスカピノイド生成物は、１つ以上のノスカピノイド化合物のような１つ以上のノスカピノイド生成物を含んでよい。
【０１２４】
異なる方法を用いて、ノスカピノイド生成物を含むバイオリアクター培地から細胞を除去してよい。例では、細胞は、経時的な沈降によって除去してよい。この沈降プロセスは、冷やすか、またはシリカなどの清澄剤を加えることによって加速させてよい。続いて、反応器の最上部から使用済み培地を吸い上げるか、または反応器の底から細胞をデカントしてよい。あるいは、細胞は、フィルター、膜またはその他の有孔材に通してろ過することによって除去してもよい。細胞は、遠心分離、例えば連続流遠心分離によって、または連続抽出装置を用いることによって除去してもよい。
【０１２５】
いくらかの貴重なノスカピノイド生成物が細胞の内部に存在する場合、細胞を透過処理するかまたは溶解させてよく、上記の方法のいずれかによって、細胞破片を除去してよい。細胞を透過処理するのに用いる薬剤としては、有機溶媒（例えばＤＭＳＯ）または塩（例えば酢酸リチウム）を挙げてよいが、これらに限らない。細胞を溶解させる方法としては、ドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤を加えること、またはビーズミリングまたは超音波処理による機械的破砕を挙げてよい。
【０１２６】
ノスカピノイド生成物は、水性培地と不混和性である有機液体を加えることによって、液液抽出を通じて、清澄化使用済み培地から抽出してよい。例では、他の処理工程に加えて、液液抽出の使用を用いてよい。好適な有機液体の例としては、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸エチル、クロロホルム、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、オレイン酸メチル、トルエン、オレイルアルコール、酪酸エチルが挙げられるが、これらに限らない。有機液体は、水性培地の体積の１０％ほどまで、または水性培地の１００％ほどまで加えてもよい。
【０１２７】
場合によっては、有機液体は、発酵の開始時または発酵中のいずれかの時点に加えてよい。この抽出発酵プロセスは、ノスカピノイド生成物を有機相に連続的に除去することによって、宿主細胞からのノスカピノイド生成物の収量を向上させることができる。
【０１２８】
攪拌によって、有機相が水性培地とエマルションを形成することがある。これらの２つの相を別々の層に分離させる方法としては、乳化破壊剤もしくは核剤を加えること、またはｐＨを調節することを挙げてよいが、これらに限らない。例えば円錐板型連続遠心分離によって、エマルションを遠心分離して、２つの相を分離してもよい。
【０１２９】
あるいは、抽出後に有機相を物理的に除去できるように、有機相を水性培地から単離してもよい。例えば、溶媒を膜に内包してもよい。
【０１３０】
例では、吸着法を用いて、ノスカピノイド生成物を発酵培地から抽出してよい。例では、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ４などの樹脂、または吸着によってノスカピノイド生成物を除去する別の薬剤を加えることによって、ノスカピノイド生成物を清澄化使用済み培地から抽出してよい。続いて、有機溶媒を用いて、ノスカピノイド生成物をその樹脂から放出させてよい。好適な有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、酢酸エチルまたはアセトンが挙げられるが、これらに限らない。
【０１３１】
ろ過を用いて、ノスカピノイド生成物を発酵培地から抽出してもよい。高いｐＨでは、ノスカピノイド生成物は、バイオリアクター内で結晶のような沈殿物を形成し得る。この沈殿物は、フィルター、膜またはその他の有孔材に通してろ過することによって、直接除去してよい。この沈殿物は、遠心分離及び／またはデカントによって回収してもよい。
【０１３２】
上記の抽出法は、インサイチュ（バイオリアクター内）で行っても、エクスサイチュ（例えば、バイオリアクターから流出した培地が通過して、抽出剤と接触し、再びリアクター容器に再循環する外部ループ内）で行ってもよい。あるいは、バイオリアクター容器から除去した清澄化培地を用いて、発酵を終了させた後に抽出法を行ってもよい。
【０１３３】
本主題の方法は、ノスカピノイドまたはその前駆体を細胞培養液から回収することも含んでよい。いずれかの利便的な分離及び単離方法（例えば、塩基性条件下での有機溶媒抽出、固相抽出、クロマトグラフィー法または沈殿法）を、本主題の方法での使用に適合させて、対象となるノスカピノイドまたはその前駆体を細胞培養液から回収してよい。ろ過法を用いて、細胞培養液の不溶分から溶解分を分離してよい。場合によっては、液体クロマトグラフィー法（例えば逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー）を用いて、ノスカピノイドまたは前駆体を細胞培養液の他の溶解性成分から分離する。特定の事例では、ノスカピノイド産生細胞（例えば、本明細書に記載されているようなもの）は、ノスカピノイドを対象となる下流のＢＩＡに変換する。すなわち、対象となるいずれかのＢＩＡであって、産生されるＢＩＡの回収にも、上記の方法のいずれかを適用してよい。
【０１３４】
対象となるノスカピノイドまたはその前駆体を産生させることを目的とする、宿主細胞の遺伝子操作方法も含まれる。ＤＮＡの宿主細胞への挿入は、いずれかの利便的な方法を用いて行ってよい。その方法を用いて、異種コード配列を宿主細胞に挿入して、宿主細胞が、酵素を機能的に発現して、対象となる出発化合物を対象となる生成物のノスカピノイドまたはその前駆体に変換するようにする。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、異種コード配列（例えば、本明細書に記載されているようなもの）の１つ以上に対する１つ以上のプロモーターを含む。本主題の宿主細胞と方法では、いずれかの利便的なプロモーターを用いてよい。異種コード配列の発現を駆動するプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよい。ただし、そのプロモーターが、宿主細胞において活性を有することができることを条件とする。異種コード配列は、その天然型プロモーターから発現させてよく、あるいは、非天然型プロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターは、そのプロモーターを使用する宿主において、力が低くても高くてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の強力プロモーターを含む。プロモーターは、調節されていても、構成的であってもよい。特定の実施形態では、グルコース抑制されないか、または培地におけるグルコースの存在によって軽度にしか抑制されないプロモーターを使用する。対象となるプロモーターとしては、B. subtilisのｔｓｒ遺伝子（フルクトースビスリン酸アルドラーゼをコードする）のプロモーターのような解糖系遺伝子のプロモーター、または酵母のS. cerevisiae（グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする）由来のＧＡＰＤＨプロモーター、パン酵母のＡＤＨ１プロモーター、酵母のＰＨＯ５プロモーターのようなリン酸飢餓誘導性プロモーター、B. licheniformis由来のアルカリホスファターゼプロモーター、Ｇａｌ１−１０、Ｇａｌ１、ＧａｌＬ、ＧａｌＳのような酵母誘導性プロモーター、抑制プロモーターＭｅｔ２５、ｔｅｔＯ、及びグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ１）、翻訳伸長因子−１−αプロモーター（ＴＥＦ）、シトクロムｃ−オキシダーゼプロモーター（ＣＹＣ１）、ＭＲＰ７プロモーター、ＧＡＬ１、ＨＸＴ７、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＰＹＫ１、ＴＥＦ１などのような構成的プロモーターが挙げられるが、これらに限らない。グルココルチコイド、ステロイド及び甲状腺ホルモンのようなホルモンによって誘導可能なプロモーターを含む自律複製型酵母発現ベクターを用いてもよく、グルコルチコイド応答要素（ＧＲＥ）と甲状腺ホルモン応答要素（ＴＲＥ）が挙げられるが、これらに限らない。これらの例及びその他の例は、米国特許第７，０４５，２９０号に記載されており、この特許は、引用されている参考文献も含め、参照により援用される。αファクター、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨのような構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む追加のベクターを用いてもよい。加えて、いずれかのプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢによるようなもの）を用いて、遺伝子の発現を駆動することもできる。宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ．に対して、いずれかの利便的で適切なプロモーターを選択してよい。エネルギー源を最小限にしながら、産生を最大にするために、プロモーターの選択を利用して、転写、すなわち酵素レベルを最適化することもできる。
【０１３６】
場合によっては、本発明の細胞は、ＨＸＴ７、ＡＤＨ１、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＰＹＫ１及びＴＥＦ１より選択される１つ以上の強力プロモーターを含む。特定の実施形態では、本発明の細胞は、ＣＹＰ８２Ｙ１またはＣＹＰ８２Ｙ１変異体をコードする１つ以上の異種コード配列を含み、ＨＸＴ７プロモーターを含む。特定の事例では、本発明の細胞は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを産生する。特定の事例では、本発明の細胞は、１−ヒドロキシカナジンを産生する。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＣＹＰ８２Ｘ２またはＣＹＰ８２Ｘ２変異体をコードする１つ以上の異種コード配列を含み、ＨＸＴ７プロモーターを含む。特定の事例では、本発明の細胞は、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを産生する。場合によっては、本発明の細胞は、ＣＹＰ８２Ｘ２またはＣＹＰ８２Ｘ２変異体をコードする１つ以上の異種コード配列を含み、ＰＧＫ１及びＧＰＤより選択される１つ以上のプロモーターを含む。特定の実施形態では、本発明の細胞は、Ｎ−メチル−オフィオカルピンを産生する。場合によっては、本発明の細胞は、ＣＹＰ８２Ｘ１またはＣＹＰ８２Ｘ１変異体をコードする１つ以上の異種コード配列を含み、ＨＸＴ７プロモーターを含む。特定の実施形態では、本発明の細胞は、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを産生する。
【０１３７】
本主題の宿主細胞と方法では、いずれかの利便的なベクターを用いてよい。対象となるベクターとしては、酵母及びその他の細胞で使用されるベクターが挙げられる。酵母ベクターは、組み込み型ベクター（ＹＩｐ）、自律複製型高コピー数ベクター（ＹＥｐ）、自律複製型低コピー数ベクター（ＹＣｐ）及び大きな断片をクローニングするベクター（ＹＡＣ）という４つの一般的なカテゴリーに分けることができる。ベクターＤＮＡは、いずれかの利便的なトランスフォーメーションまたはトランスフェクション技法を介して、原核細胞または真核細胞に導入できる。
【０１３８】
アルカロイドを豊富に含む溶液からの生成物の精製方法
次の精製工程は、当該技術分野で知られている方法を用いて、ノスカピノイド生成物を豊富に含む発酵後溶液を処理して、対象となる個々の産生種を高純度で回収することを含んでよい。
【０１３９】
一例では、有機相で抽出したノスカピノイド生成物を水溶液に移してよい。場合によっては、その有機溶媒を熱及び／または真空によって蒸発させてよく、得られた粉末を好適なｐＨの水溶液に溶解させてよい。更なる例では、ノスカピノイド生成物の水相への抽出を促進する、好適なｐＨの水溶液を加えることによって、ノスカピノイド生成物を有機相から抽出してよい。続いて、デカント、遠心分離または別の方法によって、その水相を除去してよい。
【０１４０】
例えば好適なキレート化剤で処理することによって、上記ノスカピノイド生成物含有溶液を更に処理して、金属を除去してよい。ノスカピノイド生成物含有溶液を更に処理して、沈殿によって、タンパク質及びＤＮＡのような他の不純物を除去してよい。一例では、ノスカピノイド生成物含有溶液は、エタノール、メタノール、アセトンまたはイソプロパノールのような適切な沈殿剤で処理する。代替的な例では、ＤＮＡとタンパク質は、透析によって、または汚染性生物学的高分子から、それよりも小さいアルカロイドを分離するその他のサイズ排除法によって除去してよい。
【０１４１】
更なる例では、ノスカピノイド生成物を含む溶液は、当該技術分野で知られている方法を用いて、連続的なクロスフローろ過によって、高純度まで抽出してよい。
【０１４２】
上記溶液が、ノスカピノイド生成物の混合物を含む場合には、当該技術分野で知られている方法を用いて、その溶液に対して酸塩基処理を行って、個々のノスカピノイド生成物種を得てよい。このプロセスでは、その水溶液のｐＨを調節して、個々のノスカピノイド生成物を沈殿させる。
【０１４３】
高純度の小規模調製では、ノスカピノイド生成物は、液体クロマトグラフィーによって、単一工程で精製してよい。
【０１４４】
酵母由来アルカロイドＡＰＩと植物由来ＡＰＩとの比較
清澄化酵母培地（ＣＹＣＭ）は、複数の不純物を含み得る。清澄化酵母培地を真空及び／または熱によって脱水して、アルカロイドを豊富に含む粉末を得てよい。この生成物は、ケシがら濃縮物（ＣＰＳ）に類似しており、このＣＰＳは、ケシ栽培国から輸出され、ＡＰＩメーカーによって購入されている。本発明の目的においては、ＣＰＳは、所望のアルカロイド生成物を最終的に更に精製できるいずれかのタイプの精製植物抽出物の代表的な例である。表２と表３に、これらの２つの生成物中の不純物であって、ＣＹＣＭまたはＣＰＳのいずれかに特有であり得るか、またはこれらの両方に存在し得る不純物が明らかにされている。いくつかのノスカピノイド生成物は、色素を不純物として有し得るが、他のノスカピノイド生成物は、色素そのものとして分類されることがある。したがって、これらのノスカピノイド生成物は、色素以外の不純物に基づき、不純物について評価してよい。加えて、いくつかの例では、発酵プロセスを用いて産生されるノスカピノイド生成物は、そのノスカピノイド生成物を産生させるための発酵プロセスで用いる１つ以上の細胞の一部を含んでよい。例えば、酵母を用いてノスカピノイド生成物を産生させる場合、その酵母細胞の一部が、ノスカピノイド生成物に含まれることがある。当業者であれば、これらの不純物のサブセットについて、未知の起源の産物を解析することによって、その産物が、酵母に由来するのかまたは植物の産生宿主に由来するのか判断できる。
【０１４５】
ＡＰＩグレードの医薬成分は、高精製分子である。したがって、植物または酵母起源のＡＰＩ（表２及び表３に示されているものなど）を示し得る不純物は、ＡＰＩ段階の産物においては存在できない。当然ながら、本発明の酵母株から得られるＡＰＩ産物の多くは概して、従来型の植物由来ＡＰＩと区別できないことがある。しかしながら、場合によっては、従来のアルカロイド化合物に対しては、化学合成アプローチを用いて、化学修飾が行われていることがあり、このような化学修飾を必要とする植物ベース産物中に、化学的不純物として現れ得る。例えば、化学的誘導体化によって、化学合成プロセスに関連する一連の不純物が生じることが多くなり得る。特定の状況では、これらの修飾は、酵母産生プラットフォームにおいて生物学的に行ってもよく、それによって、化学的誘導体化と関連する不純物のいくつかが、酵母由来産物に存在しないようになる。具体的には、化学的誘導体化生成物から得られるこれらの不純物は、化学合成プロセスを用いて生成されるＡＰＩ生成物に存在し得るが、酵母由来産物を用いて生成されるＡＰＩ生成物には存在しないようになり得る。あるいは、酵母由来産物を化学由来生成物と混合する場合には、生じる不純物が存在し得るが、化学由来生成物のみを含むか、または化学由来生成物を主に含むＡＰＩで予測される量よりも少なくなり得る。この例では、当業者であれば、これらの不純物のサブセットについて、ＡＰＩ生成物を解析することによって、その生成物が、酵母産生宿主に由来するのかまたは従来型の化学誘導体化経路に由来するのか判断できる。
【０１４６】
生合成されたＡＰＩに存在し得るが、化学誘導体化したＡＰＩに存在し得ない不純物の非限定例としては、ノスカピノイド生成物を産生させるために用いる非植物細胞の一部を挙げてよい。例では、生合成されたＡＰＩは、その酵母細胞内でノスカピノイド生成物を発酵させるために用いる酵母細胞の一部を含み得る。加えて、酵母由来化合物と植物由来化合物の両方に対して、化学合成アプローチを通じて化学修飾を行う場合には、その化学合成プロセスに付随する同じ不純物が、生成物中において予測することができる。このような状況では、出発物質（例えば、ＣＹＣＭまたはＣＰＳ）を上記のように解析してよい。
【０１４７】
宿主細胞の遺伝子操作方法
ノスカピノイド生成物の産生を目的とする、宿主細胞の遺伝子操作方法も含まれる。ＤＮＡの宿主細胞への挿入は、いずれかの利便的な方法を用いて行ってよい。その方法を用いて、異種コード配列を遺伝子操作された宿主細胞に挿入して、宿主細胞が酵素を機能的に発現して、対象となる出発化合物をノスカピノイド生成物に変換するようにする。
【０１４８】
本主題の遺伝子操作された宿主細胞と方法では、いずれかの利便的なプロモーターを用いてよい。異種コード配列の発現を駆動するプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよい。ただし、そのプロモーターが、遺伝子操作された宿主細胞において活性を有することを条件とする。異種コード配列は、その天然型プロモーターから発現させてもよく、あるいは、非天然型プロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターは、そのプロモーターが用いられる宿主において、低程度から高程度に強力であってよい。プロモーターは、調節されていても、構成的であってもよい。特定の実施形態では、グルコース抑制されないか、または培地におけるグルコースの存在によって軽度にしか抑制されないプロモーターを使用する。対象となるプロモーターとしては、B. subtilisのｔｓｒ遺伝子（フルクトースビスリン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター領域をコードする）のプロモーターのような解糖系遺伝子のプロモーター、またはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＧＡＰＤＨまたはＴＤＨ３）をコードする酵母S. cerevisiae遺伝子由来のプロモーター、パン酵母のＡＤＨ１プロモーター、酵母のＰＨＯ５プロモーターのようなリン酸飢餓誘導性プロモーター、B. licheniformis由来のアルカリホスファターゼプロモーター、Ｇａｌ１−１０、Ｇａｌ１、ＧａｌＬ、ＧａｌＳのような酵母誘導性プロモーター、抑制プロモーターＭｅｔ２５、ｔｅｔＯ、及びグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ）、翻訳伸長因子−１−αプロモーター（ＴＥＦ）、シトクロムｃ−オキシダーゼプロモーター（ＣＹＣ１）、ＭＲＰ７プロモーターなどのような構成的プロモーターなどが挙げられるが、これらに限らない。グルココルチコイド、ステロイド及び甲状腺ホルモンなどのホルモンによって誘導可能なプロモーターを含む自律複製型酵母発現ベクターも用いてよく、グルコルチコイド応答要素（ＧＲＥ）と甲状腺ホルモン応答要素（ＴＲＥ）が挙げられるが、これらに限らない。これらの例及びその他の例は、米国特許第７，０４５，２９０号に記載されており、この特許は、引用されている参考文献も含め、参照により援用される。αファクター、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨなどの構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む追加のベクターを用いてよい。加えて、いずれかのプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢによるようなもの）を用いて、遺伝子の発現を駆動することもできる。宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉに対して、いずれかの利便的で適切なプロモーターを選択してよい。エネルギー源を最小限にしながら、産生を最大にするために、プロモーターの選択を利用して、転写、すなわち酵素レベルを最適化してもよい。
【０１４９】
本主題の遺伝子操作された宿主細胞と方法では、いずれかの利便的なベクターを用いてよい。対象となるベクターとしては、酵母及びその他の細胞で使用されるベクターが挙げられる。酵母ベクターのタイプは、組み込み型ベクター（ＹＩｐ）、自律複製型高コピー数ベクター（ＹＥｐまたは２μプラスミド）、自律複製型低コピー数ベクター（ＹＣｐまたはセントロメアプラスミド）及び大きな断片をクローニングするベクター（ＹＡＣ）という４つの一般的なカテゴリーに分けることができる。ベクターＤＮＡは、いずれかの利便的なトランスフォーメーションまたはトランスフェクション技法を介して、原核細胞または真核細胞に導入する。別の起源のＤＮＡ（例えば、ＰＣＲで生成した二本鎖ＤＮＡ産物、または合成した二本鎖もしくは一本鎖オリゴヌクレオチド）を用いて、ゲノムに組み込むことによって、酵母を遺伝子操作してもよい。いずれかの単一のトランスフォーメーションイベントには、宿主細胞の遺伝子改変を行うために、１つまたはいくつかの核酸（ベクター、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ断片）を含めてよい。
【０１５０】
有用性
例えば上記のような、本発明の遺伝子操作された宿主細胞と方法は、様々な用途で用いられる。対象となる用途としては、研究用途と治療用途が挙げられるが、これらに限らない。本発明の方法は、ノスカピノイド生成物を産生させるいずれかの利便的な用途を含む多種多様な用途で用いられる。
【０１５１】
本主題の遺伝子操作された宿主細胞と方法は、様々な治療用途で用いられる。対象となる治療用途としては、ノスカピノイド生成物を含む医薬生成物を調製する用途が挙げられる。本明細書に記載されている遺伝子操作された宿主細胞は、ノスカピノイド生成物を産生する。本主題の宿主細胞を用いて、カナジンを含め、対象となるＢＩＡの産生に使用できる単純で安価な出発物質から、対象となるノスカピノイド生成物を産生させるとともに、ノスカピノイド最終産物を産生させてよい。すなわち、本主題の宿主細胞は、治療上活性なノスカピノイド生成物を供給するのに用いられる。
【０１５２】
場合によっては、ノスカピノイド化合物の化学合成は、収量が低く、実用的な大規模生産手段ではない場合に、本発明の遺伝子操作された宿主細胞と方法は、工業規模の量のノスカピノイド生成物を生成するのに用いられる。特定の事例では、本発明の宿主細胞と方法は、治療用製品のためのノスカピノイド生成物を迅速に生成できるようにする例えば５，０００〜２００，０００リットルの容量のバイオリアクター（発酵槽）を含む発酵設備で用いられる。このような用途としては、セルロース、デンプン及び遊離糖のような発酵性の炭素源から、ノスカピノイド生成物を工業規模で生成することを挙げてよい。
【０１５３】
本主題の遺伝子操作された宿主細胞と方法は、様々な研究用途で用いられる。本主題の宿主細胞と方法を用いて、様々なノスカピノイド生成物の生合成経路に対する様々な酵素の作用を解析してよい。加えて、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、まだ証明されていない治療上の機能において、対象となる生物活性を試験するのに用いられるノスカピノイド生成物を産生するように遺伝子操作してよい。場合によっては、様々な酵素をコードする様々な異種コード配列を含むように宿主細胞を遺伝子操作することによって、ノスカピノイド生成物に対する高収量の生合成経路が明らかになる。特定の事例では、研究用途として、対象となる治療用分子であって、後で更に化学的に修飾または誘導体化して、所望の生成物にする分子のため、または対象となる治療的活性の向上についてのスクリーニングのためのスカピノイド生成物を産生させることが含まれる。場合によっては、宿主細胞株を用いて、上記のような経路における、対象となる酵素活性をスクリーニングし、これらの株内で産生される代謝物の変換を介して、酵素の発見につなげることがある。本主題の宿主細胞と方法は、植物特有の代謝物に対する産生プラットフォームとして用いてよい。
【０１５４】
本主題の遺伝子操作された宿主細胞と方法は、植物特有の代謝物に対する産生プラットフォームとして用いてよい。本主題の宿主細胞と方法は、薬剤ライブラリーの作成と植物酵素の発見のためのプラットフォームとして用いてもよい。例えば、本主題の遺伝子操作された宿主細胞と方法は、プロトピンのような興味深い骨格分子を産生する酵母株を採取して、更に、コンビナトリアル生合成を通じて、または化学的手段によって、その化合物の構造を官能化することによって、天然物ベース薬剤のライブラリーの作成に用いてよい。このようにして、薬剤ライブラリーを作ることによって、いずれかの潜在的なドラッグヒットは、大規模な培養と産生に適している産生宿主と既に関連付けられている。別の例として、本主題のこれらの遺伝子操作された宿主細胞と方法は、植物酵素の発見に用いてよい。本主題の宿主細胞は、植物ＥＳＴライブラリーを発現させて、新たな酵素活性を同定するために、所定の代謝物の明瞭なバックグラウンドを提供する。本主題の宿主細胞と方法は、酵母において植物酵素を機能的に発現させるとともに、その活性を向上させるための発現方法と培養条件を提供する。
【０１５５】
キットとシステム
本発明の態様は更に、キットとシステムを含み、そのキットとシステムは、本発明の方法で用いられる１つ以上の成分、例えば、本明細書に記載されているような遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、異種コード配列、ベクター、培地などを含んでよい。いくつかの実施形態では、本主題のキットは、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載されているようなもの）と、出発化合物、異種コード配列及び／または異種コード配列を含むベクター、ベクター、増殖用供給原料、発現システムでの使用に適する成分（例えば、細胞、クローニングベクター、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、二方向性プロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）など）、ならびに培地より選択される１つ以上の成分とを含む。
【０１５６】
本明細書に記載されている成分のいずれか、例えば、１つ以上の改変を含む宿主細胞、出発化合物、培地などをキットに搭載してよい。異種コード配列、クローニングベクター及び発現システムを作製及び使用する際の使用に適する様々な成分を本主題のキットで用いてよい。キットは、試験管、緩衝液など、及び使用説明書も含んでよい。キットの様々な試薬成分は、別々の容器に存在してよく、あるいは、所望に応じて、それらの成分の一部または全部を事前に合わせて、１つの容器内の試薬混合物にしてもよい。
【０１５７】
ノスカピノイド生成物を産生させるためのシステムも提供し、このシステムは、１つ以上の改変（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を含む遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、培地、発酵槽及び発酵装置、例えば、宿主細胞の増殖条件を保つのに適する装置、サンプリング及びモニタリング装置、ならびに成分などを含んでよい。本主題のシステムでは、酵母細胞の大規模発酵での使用に適する様々な成分を用いてよい。
【０１５８】
場合によっては、本発明のシステムは、遺伝子操作された宿主細胞の大規模発酵と、発酵させた宿主細胞によって産生されたノスカピノイド生成物のモニタリング及び精製のための成分を含む。特定の実施形態では、発酵槽内の遺伝子操作された宿主細胞が１つ以上の所望のノスカピノイド生成物を産生する条件下で、本発明のシステムに、１つ以上の出発化合物（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を加える。場合によっては、この宿主細胞は、ノスカピノイド生成物（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を産生する。
【０１５９】
場合によっては、本発明のシステムは、本主題の宿主細胞によって産生された１つ以上のノスカピノイド生成物化合物をモニタリング及びまたは解析するプロセスを含む。例えば、本明細書に記載されているようなＬＣ−ＭＳ解析システム、クロマトグラフィーシステム、または例えば本明細書に記載されているように、サンプルを解析して、標準物質と比較できるいずれかの利便的なシステム。発酵前または発酵中に、いずれかの利便的な時点に、サンプリングと解析によって、発酵培地をモニタリングしてよい。出発化合物のノスカピノイド生成物への変換が完了したら、発酵を停止してよく、ノスカピノイド生成物の精製を行ってよい。したがって、場合によっては、本主題のシステムは、そのノスカピノイド生成物が産生される宿主細胞培地から、ノスカピノイド生成物を精製するのに適する精製成分を含む。精製成分には、発酵によって生成されるノスカピノイド生成物を精製するのに用いてよいいずれかの利便的な手段が含まれ、シリカクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体抽出及びｐＨ抽出法が挙げられるが、これらに限らない。場合によっては、本主題のシステムは、１つ以上の出発化合物をシステムに投入後、対象となるノスカピノイド発酵産物を産生及び単離させる。
【０１６０】
下記の実施例は、本発明の作製方法と使用方法の完全な開示と説明を当業者に提供する目的で示されており、本発明者が本発明とみなす範囲を限定することは意図されていないとともに、下記の実験が、実施した全てまたは唯一の実験であることを表すようには意図されていない。用いた数字（例えば、量、温度など）に関しては正確になるように努めたが、いくらかの実験誤差と偏差を考慮されたい。別段の定めのない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
【実施例】
【０１６１】
実験
ノスカピン及び合成中間体、ならびに様々なノスカピノイドの産生のための遺伝子操作された酵母Saccharomyces cerevisiae
本発明の酵母株は、トランスフォーメーションを行って、ノスカピンと誘導体を産生できる。これらの株が産生できる化合物の例は、Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、ノスカピン、ナルコトリン、ナルコチンヘミアセタール、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール、Ｎ−メチルオフィオカルピン、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジン、ナルコトリノゲンジアール、１−ヒドロキシカナジン及びナルコトリナールであり、それらのうち、１−ヒドロキシルカナジン、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコトリンヘミアセタール、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジン、ナルコトリノゲンジアール、ナルコトリナールは、これまで同定されたことはない。加えて、本発明の酵母細胞は、ノスカピンの生合成経路を修正し、酵素機能を特徴付け、異種の経路の再構築を実施して、植物の天然産物の生合成に対する効率的かつ正確なアプローチを作ることによって遺伝子操作されている。
【０１６２】
実施例１：カナジンからノスカピン、合成中間体及び誘導体を合成する酵母株
１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、ノスカピン、ナルコトリン、ナルコチンヘミアセタール、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール、Ｎ−メチルオフィオカルピン、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジン、ナルコトリノゲンジアール、ナルコトリナール、１−ヒドロキシカナジンのようなプロトベルベリン及びフタリドイソキノリンアルカロイドを産生する酵母株を作製した。
【０１６３】
図２Ａ及び２Ｂは、カナジンからノスカピンへの合成経路を示している。この経路には、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、Ｎ４’ＯＭＴの酵素活性が含まれる。このノスカピン生合成経路は、様々なノスカピン合成中間体と誘導体を産生するように、酵母において遺伝子操作した。
【０１６４】
１．１）Ｎ−メチルカナジンをカナジンから生成するために、ＡＴＲ１が染色体に組み込まれている酵母株において、P. somniferum由来のテトラヒドロプロトベルベリンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＮＭＴ）（ＰｓＴＮＭＴ）またはE. californica由来のテトラヒドロプロトベルベリンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＥｃＴＮＭＴ）を低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミドまたは染色体に組み込まれている）から発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１６５】
１．２）１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンをカナジンから生成するために、P. somniferum由来のＣＹＰ８２Ｙ１を、上記のＮ−メチルカナジン産生株において、低コピープラスミド上で発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１６６】
１．３）１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを生成するために、P. somniferum由来のＣＹＰ８２Ｘ２を上記の１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン産生株において、低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミドまたは染色体に組み込まれている）から発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１６７】
１．４）１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンを生成するために、P. somniferum由来のＰｓＡＴ１を上記の１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン産生株において、低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミド、ＹＡＣ、または染色体に組み込まれている）から発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１６８】
１．５）４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを生成するために、P. somniferum由来のＣＹＰ８２Ｘ１を上記の１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジン産生株において、低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミドまたはＹＡＣ）から発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１６９】
１．６）ナルコトリンヘミアセタールを生成するために、P. somniferum由来のＰｓＣＸＥ１を上記の４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン産生株において、低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミドまたはＹＡＣ）から発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１７０】
１．７）ナルコトリンを生成するために、P. somniferum由来のＰｓＳＤＲ１を上記のナルコトリンヘミアセタール産生株において、低コピーコンストラクト（例えば低コピープラスミドまたはＹＡＣ）からから発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１７１】
１．８）ノスカピンを生成するために、P. somniferum由来のＰｓＭＴ３またはＰｓ６ＯＭＴとＰｓＭＴ２を上記のナルコトリン産生株において、低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミドもしくはＹＡＣ、または染色体に組み込まれている）から共発現させる（図１０）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。Ｔｆ６ＯＭＴは、ナルコトリンをノスカピンに変換しない。
【０１７２】
１．９）１−ヒドロキシカナジンを生成するために、ＡＴＲ１が染色体に組み込まれた酵母株において、P. somniferum由来のＣＹＰ８２Ｙ１を低コピープラスミドから発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１７３】
１．１０）Ｎ−メチル−オフィオカルピンを生成するために、P. somniferum由来のＣＹＰ８２Ｘ２を上記のＮ−メチルカナジン産生株において、低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミドまたはＹＡＣ）から発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１７４】
１．１１）ナルコトリナールを生成するために、P. somniferum由来のＣＹＰ８２Ｘ１を上記の１−ヒドロキシル−Ｎ−メチルカナジン産生株において、低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミドまたはＹＡＣ）から発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１７５】
１．１２）ナルコトリノゲンジアールを生成するために、P. somniferum由来のＣＹＰ８２Ｘ１を上記の１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン産生株において、低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミドまたはＹＡＣ）から発現させる（図３及び４）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１７６】
１．１３）３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを生成するために、P. somniferum由来のＰｓＭＴ３またはＰｓ６ＯＭＴとＰｓＭＴ２を上記の４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン産生株において、低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミドもしくはＹＡＣ、または染色体に組み込まれている）から共発現させる（図１０）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表Ｉに含まれている。
【０１７７】
１．１４）ナルコチンヘミアセタールを生成するために、P. somniferum由来のＰｓＭＴ３またはＰｓ６ＯＭＴとＰｓＭＴ２を上記のナルコトリンヘミアセタール産生株において、低コピーコンストラクト（例えば、低コピープラスミドもしくはＹＡＣ、または染色体に組み込まれている）から共発現させる（図１０）。各酵素のその他の考え得る変異体は、表１に含まれている。
【０１７８】
１．１５）より多くのノスカピン類縁体を生成するために、特定の酵素または特定の酵素セットをノスカピン産生株から除去する。一例は、ヒドラスチンを合成するために、ＰｓＭＴ２、ＰｓＭＴ３またはＰｓ６ＯＭＴとＣＹＰ８２Ｙ１を上記のノスカピン産生株から取り除くことである。加えて、カナジン以外の異なる基質を上記のノスカピン産生株に供給して、より多くのノスカピン類縁体をもたらす。その基質としては、（Ｓ）−スコウレリン、（Ｓ）−テトラヒドロベルベルビン、（Ｓ）−スチロピン、（Ｓ）−ケイランチホリン及び（Ｓ）−テトラヒドロパルマチンが挙げられるが、これらに限らない。
【０１７９】
１．１６）より多くのノスカピノイドを生成するために、修飾酵素を上記の株と共発現させる。ノスカピン（または中間体）産生株に組み込む酵素の例としては、Ｐ４５０、ハロゲナーゼ、グリコシラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、プレニルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限らない。一例は、哺乳動物肝臓Ｐ４５０  ＣＹＰ２Ｄ６が、カナジンのメチレンジオキシル架橋を壊して、９，１０−ジメトキシ−６，８，１３，１３ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−イソキノリノ［３，２−ａ］イソキノリン−２，３−ジオールをもたらすことができることである。
【０１８０】
実施例２：酵母におけるノスカピン、合成中間体及び誘導体の生合成を最適化する方策
遺伝子操作された酵母株の関連の中で、プロトベルベリンとフタリドイソキノリンアルカロイドの産生を最適化するツールと方法を開発した。３つのＰ４５０、すなわち、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１及びＣＹＰ８２Ｘ２の酵素活性をノスカピンと中間体の両方に対して最適化した。遺伝子操作された酵母株内での標的ノスカピンまたはノスカピノイドの最適な産生を得るために、細胞小器官ルーティングツールキットを用いて、Ｐ４５０、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、短鎖デヒドロゲナーゼ及びカルボキシルエステラーゼを含むタイプの酵素を再配置して、それらの酵素間の相互作用を最適化する。
【０１８１】
２．１）より多くのＮ−メチルカナジンを生成するために、様々な種に由来するＴＮＭＴ酵素の変種を酵母内で発現させる。図５は、S. cerevisiaeで発現させた異なるＴＮＭＴ変種から得られたＮ−メチルカナジンの産生量の測定値を示している。このデータによって、特定のＴＮＭＴ酵素変種が、他の変種よりも高いレベルのＮ−メチルカナジンを産生させることが示されている。
【０１８２】
２．２）カナジンからより多くの１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを生成するために、ＣＹＰ８２Ｙ１のＮ末端を遺伝子操作して、その酵素の正しいフォールディングを促した。図６は、異なるＣＹＰ８２Ｙ１のＮ末端変異体を用いて、異なる温度（２５℃及び３０℃）で、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを産生させたときの測定値を示している。３０℃で培養して、同じプロモーター（ＧＡＬ１プロモーター）によって調節するとき、ＣＹＰ８２Ｙ１の活性は、Ｎ末端タグをＭＳＨのＮ末端タグで置換することによって向上する（ＣＹＰ８２Ｙ１Ａ）。２５℃で培養して、ＧＰＤプロモーターによって調節するとき、ＣＹＰ８２Ｙ１及びＣＹＰ８２Ｙ１Ａの活性は、同程度である。これらのデータは、ＭＳＨのＮ末端タグが、S. cerevisiaeにおいて、溶解性ＣＹＰ８２Ｙ１の形成を促すことを意味する。
【０１８３】
２．３）カナジンからより多くの１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを生成するために、ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子の上流の異なるタイプのプロモーターを試験することを通じて、ＣＹＰ８２Ｙ１の最適な転写調節を決定する。図６は、異なるプロモーターによって調節したＣＹＰ８２Ｙ１を用いて、異なる温度（２５℃及び３０℃）で、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを産生させたときの測定値を示している。培養温度が高い方が、後期ＨＸＴ７（強力）プロモーターとＡＤＨ１（ＨＸＴ７ｐよりも比較的弱い）プロモーターによって調節したときに、ＣＹＰ８２Ｙ１の活性が最も高い。３０℃で培養すると、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＰＹＫ１、ＴＥＦ１プロモーターのように、増殖初期に活性化される強力プロモーターは、効力が弱い。対して、遺伝子操作された酵母株を２５℃で培養すると、ＨＸＴ７と強力プロモーターによって調節されるＣＹＰ８２Ｙ１の活性は、大体同じレベルである。対して、ＣＹＰ８２Ｙ１をＡＤＨ１と弱いＣＹＣ１プロモーターによって調節すると、１４−ヒドロキシル−Ｎ−メチルカナジンの産生量は低い。
【０１８４】
２．４）より多くの１−ヒドロキシカナジンを生成するために、全てのＣＹＰ８２Ｙ１変異体と様々なプロモーター−ＣＹＰ８２Ｙ１の組み合わせについて、S. cerevisiaeにおいて２５℃で調べる。１−ヒドロキシカナジンの合成のために、ＣＹＰ８２Ｙ１Ａの上流にＨＸＴ７プロモーターを組みわせる。１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンの生合成では、ＨＸＴ７プロモーターによって調節するときには、ＣＹＰ８２Ｙ１とＣＹＰ８２Ｙ１Ａが、２５℃において同程度の効率性を示すのに対して、ＣＹＰ８２Ｙ１Ａは、１−ヒドロキシカナジンの生合成では、ＣＹＰ８２Ｙ１の２倍ほど効率的である（図６）。
【０１８５】
２．５）より多くの１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを生成するために、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子の上流で、異なるタイプのプロモーターを試験することを通じて、ＣＹＰ８２Ｘ２の最適な転写調節を決定する。図７は、異なるプロモーターによって調節したＣＹＰ８２Ｘ２を用いて、２５℃で１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを産生したときの測定値を示している。ＣＹＰ８２Ｙ１と同様に、ＨＸＴ７プロモーターによって、高レベルの１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンの産生が得られる。更に、追加のコピーのＣＹＰ８２Ｘ２を遺伝子操作された酵母株で発現させる。１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンの量が限られているときには、ＣＹＰ８２Ｘ２は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンに変換するのに効率的なので、ＣＹＰ８２Ｘ２の変換速度は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンの酵母細胞からの流出速度ほど速くないことが提示されている。したがって、ＴＮＭＴを遺伝子操作された酵母株内に再配置して、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンの合成を遅らせる。また、ＣＹＰ８２Ｘ２とＣＹＰ８２Ｙ１を更に遺伝子操作して、小胞体の同じ側に配置し、ＣＹＰ８２Ｘ２の１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンへのアクセスを増大させる。
【０１８６】
２．６）より多くのＮ−メチル−オフィオカルピンを生成するために、ナルコトリノゲンジアール産生株において、様々なプロモーター−ＣＹＰ８２Ｘ２の組み合わせも試験されている。図７は、異なるプロモーターによって調製したＣＹＰ８２Ｘ２を用いて、２５℃で、Ｎ−メチル−オフィオカルピンを産生させたときの測定値を示している。この酵素が、その天然の基質１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンで機能しているときとは異なり、ＣＹＰ８２Ｘ２は、ＰＧＫ１とＧＰＤプロモーターから発現させると、Ｎ−メチル−オフィオカルピンの合成に対して、より高い活性を示す。
【０１８７】
２．７）より多くの４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを生成するために、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子の上流で、異なるタイプのプロモーターを試験することを通じて、ＣＹＰ８２Ｘ１の最適な転写調節を決定する。異なるプロモーターの下流で、ＣＹＰ８２Ｘ１を発現する様々な酵母株において、２５℃で、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンの産生を測定する。ＨＸＴ７、ＡＤＨ１及びＣＹＣ１プロモーターによって、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンの高い合成レベルが得られる（図８）。
【０１８８】
２．８）より多くのナルコトリナールとナルコトリノゲンジアールを生成するために、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子の上流で、異なるタイプのプロモーターを試験することを通じて、ＣＹＰ８２Ｘ１の最適な転写調節を決定する。ナルコトリナールまたはナルコトリノゲンジアールの産生を測定し、各ペア間で比較する。ナルコトリナールの合成では、ＣＹＰ８２Ｘ１をＰＧＫ１によって調節したときの方が、ＣＹＰ８２Ｘ１の活性が高い（図８）。
【０１８９】
２．９）ノスカピン産生株内での３つの異種の植物Ｐ４５０の発現の際に、酵母の発現ストレスを減らすように、酵母増殖の増大、溶解性植物Ｐ４５０のレベルの上昇、ノスカピンの産生の増大のために、選択的植物シャペロンを発現させる。用いる植物シャペロンとしては、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、ＤｎａＪタンパク質、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）９４、結合タンパク質（ＢｉＰ）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、サイクロフィリン、及びカルネキシンが挙げられる。
【０１９０】
２．１０）より多くのノスカピンを生成するために、下流酵素（ＣＹＰ８２Ｘ２、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２及びＰｓＭＴ３またはＰｓ６ＯＭＴを含む）の追加のコピーを遺伝子操作された酵母株において発現させる。また、遺伝子操作された酵母株内でのノスカピンの産生レベルは、酵母におけるノスカピン生合成酵素の局在を最適化することによって向上する。植物生合成酵素の最適な局在形態は、その天然の状況を模倣する。律速工程を、異なる細胞小器官、またはその前工程の酵素の近くに再局在させる。様々な組み合わせの共局在と、多数の生合成酵素について調査する。
【０１９１】
２．１１）より多くのノスカピン中間体を生成するために、ヒドラスチス・カナデンシス（Hydrastis canadensis）、ディセントラ・ククラリア（Dicentra cucullaria）及びアドルミア・フンゴサ（Adlumia fungosa）のような他の植物種由来の下流の生合成酵素の変種の効率を、遺伝子操作された酵母株において、P. somniferum由来のものと比較する。加えて、非天然基質を最終的なノスカピン類縁体に効率的に変換できるように、いくつかの下流酵素も遺伝子操作して、より柔軟な基質特異性を示すようにする。
【０１９２】
実施例３：ノルラウダノソリンからノスカピンを合成する酵母株
酵母を遺伝子操作して、遺伝子操作された酵母株内に、６つの追加の酵素的工程、特に、酵素のＰｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、Ｓ９ＯＭＴ及びＣＹＰ７１９Ａによって触媒される酵素的工程を含めて、ノスカピンをカナジンから生成する。植物天然産物を生合成するための遺伝子操作された酵母株は、遺伝子操作して酵母株に組み込んだ異種の酵素的工程を最大で１５個含む（図９）。例では、酵母における追加の８つの酵素を遺伝子操作して、ノルラウダノソリンからレチクリンを生成してよい。更なる例では、酵母における追加の６つの酵素を遺伝子操作して、ノスカピンをカナジンから生成してよい。
【０１９３】
ノスカピンをノルラウダノソリンから生成するために、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＡｔＡＴＲ１及びＣＹＰ７１９Ａが染色体に組み込まれているカナジン産生株において、ＴＮＭＴ、ＰｓＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２、ＰｓＭＴ３をＹＡＣから発現させ、ＣＹＰ８２Ｙ１とＣＹＰ８２Ｘ１を低コピープラスミドから発現させ、Ｓ９ＯＭＴを高コピープラスミドから発現させる。加えて、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＡｔＡＴＲ１、ＣＹＰ７１９Ａ、ＴＮＭＴ、Ｓ９ＯＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２及びＰｓＡＴ１が染色体に組み込まれている。各酵素のその他の考え得る変異体は、表Ｉに含まれている。ノスカピンの産生の増大のために、ＣＹＰ８２Ｘ１及び／またはＳ９ＯＭＴの追加のコピーを低コピープラスミドから発現させる（図１１）。
【０１９４】
実施例４：デノボでノスカピンを合成する酵母株
酵母を遺伝子操作して、遺伝子操作された酵母株内に１３個の追加の酵素的工程、特に、酵素のＲｎＰＴＰＳ、ＲｎＳｅｐＲ、ＲｎＰＣＤ、ＲｎＱＤＨＰＲ、ＲｎＤＨＦＲ、ＲｎＴｙｒＨ、ＣｊＮＣＳ、ＰｐＤＯＤＣ、ＥｃＣＹＰ８０Ｂ１、ＡＲＯ４（Ｑ１６６Ｋ）、ＡＲＯ７（Ｔ２２６Ｉ）、ＡＲＯ１０及びＴＫＬ１によって触媒される酵素的工程を含めて、ノスカピンをノルラウダノソリンから生成する。植物天然産物を生合成するための遺伝子操作された酵母株は、遺伝子操作して酵母株に組み込んだ異種の酵素的工程を最大で２８個含む（図９）。
【０１９５】
ノスカピンをデノボで生成するために、ｚｗｆ１を欠失させたかまたはさせていないレチクリン産生酵母株の３つの異なる遺伝子座（ｌｅｕ２、ｔｒｐ１及びｈｉｓ３）の染色体に、ＰｓＢＢＥ、ＰｓＭＴ１（ＰｓＳ９ＯＭＴ）、ＣｊＣＡＳ、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰＳＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２及びＰｓＭＴ３を組み込む。また、レチクリンのデノボ合成のための酵母株であって、ＲｎＴｙｒＨ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＣｊＮＣＳの追加のコピーがｚｗｆ１遺伝子座またはＹＰＬ２５０Ｃ遺伝子座の染色体のいずれかに組み込まれている酵母株の染色体に、ＲｎＰＴＰＳ、ＲｎＳｅｐＲ、ＲｎＰＣＤ、ＲｎＱＤＨＰＲ、ＲｎＤＨＦＲ、ＲｎＴｙｒＨ、ＣｊＮＣＳ、ＰｐＤＯＤＣ、ＥｃＣＹＰ８０Ｂ１、ＰｓＣＰＲ、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＡＲＯ４（Ｑ１６６Ｋ）、ＡＲＯ７（Ｔ２２６Ｉ）、ＡＲＯ１０及びＴＫＬ１を組み込んで、レチクリンの産生を増大させる。各酵素のその他の考え得る変異体は、表Ｉに含まれている。（図１３）
【０１９６】
実施例５：ノスカピノイドをデノボで合成する酵母株
ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、セコベルベリン及びフタリドイソキノリンアルカロイドの官能化誘導体を合成するために、チロシンを１つのチロシン類縁体または１つのチロシン類縁体セットに置き換えた合成培地で、ノスカピン産生酵母を培養する。官能化誘導体とは、本明細書で使用する場合、対照化合物と区別される構造的特徴を有する化合物であって、その区別される特徴が、その化合物の合成に用いた出発物質に存在していた化合物を指す。例えば、３−クロロ−レチクリンは、α−クロロ−Ｌ−チロシンから生成でき、これらの２つの化合物を区別する塩化物が、合成で使用されたとともに、合成の際の一工程によって組み込まれなかった出発物質の特徴であったため、本明細書では、レチクリンの官能化誘導体とみなす。更なる例としては、６−ヒドロキシ−カナジン（宿主細胞によって、α−ヒドロキシ−Ｌ−チロシンから産生させることができる、カナジンの官能化誘導体）と、７−ニトロ−ナルコトリン（３−ニトロ−Ｌ−チロシンから生成される、ナルコトリンの官能化誘導体）が挙げられる。同様に、ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、セコベルベリン及びフタリドイソキノリンアルカロイドの官能化誘導体を、チロシンの類縁体などの出発物質から生成してよい。更なる例では、１つ以上の遺伝子セットを取り出して、特定の官能化誘導体群を蓄積する。
【０１９７】
ノスカピノイドをデノボで生成するために、ＲｎＴｙｒＨ、Ｐｓ４’ＯＭＴ及びＣｊＮＣＳの追加のコピーがｚｗｆ１遺伝子座またはＹＰＬ２５０Ｃ遺伝子座のいずれかで染色体に組み込まれているとともに、ＧＡＰＤＨ、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＴＲＰ１及びＰｓＭＴ１の追加のコピーがｕｒａ３遺伝子座で染色体に組み込まれている状態で、酵母株を遺伝子操作して、ＰｓＢＢＥ、ＰｓＭＴ１（ＰｓＳ９ＯＭＴ）、ＣｊＣＡＳ、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰＳＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２、ＰｓＭＴ３、ＲｎＰＴＰＳ、ＲｎＳｅｐＲ、ＲｎＰＣＤ、ＲｎＱＤＨＰＲ、ＲｎＤＨＦＲ、ＲｎＴｙｒＨ、ＣｊＮＣＳ、ＰｐＤＯＤＣ、ＥｃＣＹＰ８０Ｂ１、ＰｓＣＰＲ、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＡＲＯ４（Ｑ１６６Ｋ）、ＡＲＯ７（Ｔ２２６Ｉ）、ＡＲＯ１０及びＴＫＬ１を発現させる。チロシンを含まないが、１つのチロシン類縁体または１つのチロシン類縁体セットを含む合成培地で、遺伝子操作されたノスカピン産生株を培養し、このチロシン類縁体としては、α−置換Ｌ−チロシン（例えばα−メチルＬ−チロシン、スキーム１）と、３−置換Ｌ−チロシン（例えば、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、スキーム２）が挙げられるが、これらに限らない。ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、セコベルベリン及びフタリドイソキノリンアルカロイドの官能化誘導体は、ノスカピン生合成経路に沿って蓄積される。場合によっては、ベンジルイソキノリン、プロトベルベリンまたはセコベルベリンアルカロイドの更なる官能化誘導体を蓄積するために、特定の下流酵素または特定の下流酵素セットをノスカピン産生株から除去する。
【０１９８】
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【０１９９】
図面の説明
図１は、本発明の実施形態に従って、植物における生化学的同定に基づき、カナジンをノスカピンに変換する生合成スキームを示している。破線の矢印は、立証されていない酵素的工程を示している。実線の矢印は、酵母における異種発現を通じて（ＰｓＭＴ１、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＰｓＳＤＲ１）、またはP. somniferumにおけるウイルス誘導ジーンサイレンシング（ＶＩＧＳ）を通じて（ＰｓＭＴ１、ＣＹＰ７１９Ａ２１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＭＴ２、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１）のいずれかで立証されている酵素的工程を示している。P. somniferumにおいて、ＰｓＭＴ１、ＣＹＰ７１９Ａ２１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１及びＰｓＭＴ２を不活化すると、それに従って、（Ｓ）−カナジン、（Ｓ）−Ｎ−メチルカナジン、ナルコトリナール、パパベロキシン、ナルコチンヘミアセタール及びナルコトリンが蓄積される。
【０２００】
図２Ａは、本発明の実施形態に従って、Saccharomyces cerevisiaeにおける生化学的な特徴付けに基づき、カナジンをノスカピンに変換する生合成スキームを示している。
【０２０１】
図２Ａ及び２Ｂは、ノスカピンをカナジンから合成するための改変済み生合成経路を示している。図２Ａは、ノスカピンを生合成するための主要経路を示しており、図２Ｂは、その主要経路と、副産物を産生する経路を示している。図２Ａで見られるように、また、酵母における生化学的な特徴付けによれば、ＣＹＰ８２Ｘ２は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンの合成後の酵素的工程を触媒する。その後、ＰｓＡＴ１がアセチル基を付加して、１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンをもたらしてから、ＣＹＰ８２Ｘ１がＣ−Ｎ結合の切断を触媒して、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンを合成する。ＰｓＣＸＥ１とＰｓＳＤＲ１が、上で示したように機能して、ナルコトリンを４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンから合成する。ＣＹＰ８２Ｙ１は、（Ｓ）−カナジン上で機能して、１−ヒドロキシカナジンを生成できる。Ｎ−メチルオフィオカルピンは、ＣＹＰ８２Ｘ２の活性により、Ｎ−メチルカナジンから合成できる。ナルコトリナールは、ＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｙ１及びＣＹＰ８２Ｘ１の存在下で、カナジンから合成される。ＣＹＰ８２Ｘ１を１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン産生株に導入すると、ナルコトリノゲンジアールが産生される。
【０２０２】
図２Ｂは、本発明の実施形態に従って、Saccharomyces cerevisiaeにおける生化学的な特徴付けに基づき、カナジンをノスカピンに変換するとともに、副産物を産生する別の生合成スキームを示している。
【０２０３】
図３は、本発明の実施形態に従って、遺伝子操作された酵母株によって培地に分泌された化合物の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）解析から得たＥＩＣの波形を示している。具体的には、図３は、ノスカピン、中間体及び誘導体の産生量のＬＣ−ＭＳの波形を示している。図３は、本発明の遺伝子操作された酵母株によって培地に分泌された化合物の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ）解析を示している。全てのアッセイは、２５０μＭのカナジン（Ｓ体とＲ体のラセミ混合物）の存在下で７２時間増殖させた酵母から、インビボで行った。培地を遠心分離によって細胞ペレットから分離して、ＬＣ−ＭＳによって解析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑカラム（３．０×５０ｍｍ  １．８マイクロメートル）とＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑガードカラム（２．１×１２．５ｍｍ  ５マイクロメートル）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣに接続したＡｇｉｌｅｎｔ６３２０  Ｉｏｎ  Ｔｒａｐ（エレクトロスプレーキャピラリー電圧：−３．５ｋＶ、加熱キャピラリー温度：３５０℃、シースガス：窒素）によって、ポジティブイオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルを得た。ＬＣ分離方法は、７分でＨ２Ｏ：ＣＨ３ＯＨ  ８０：２０〜４０：６０というグラジエント溶離と、１分でＣＨ３ＯＨが１００％になるグラジエント溶離と、最後に、流速が０．５ｍＬ分−１の４分間のアイソクラティック溶離であった。いずれの溶媒も、０．１％酢酸であった。
【０２０４】
図４は、本発明の実施形態に従って、図３に記載されている化合物のポジティブイオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルＭＳ／ＭＳフラグメンテーションを示している。図３について説明したように、ポジティブイオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルを得た。また、フラグメンテーション振幅１．００Ｖで、４０ミリ秒、ヘリウムをバックグラウンドガスとして用いて、所定の前駆体イオンのＭＳ／ＭＳ質量スペクトルを得た。
【０２０５】
図５は、本発明の実施形態に従って、P. somniferumまたはEschscholzia californicaのいずれかに由来するＴＮＭＴを発現するとともに、カナジンの存在下で増殖させた酵母から、Ｎ−メチルカナジンをインビボで合成したものを示している。アッセイは、P. somniferumまたはE. californicaのいずれかに由来するＴＮＭＴを発現するとともに、２５０μＭのカナジン（Ｓ体とＲ体のラセミ混合物）の存在下で７２時間、３０℃で増殖させた酵母から、インビボで行った。図３について説明したように、ポジティブイオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルを得た。産物の抽出イオンクロマトグラムと、分子イオンの抽出イオンクロマトグラムをプロットし、手作業で積分した。エラーバーは、３つの生物学的複製物のＳ．Ｄ．である。
【０２０６】
図６は、本発明の実施形態に従って、ＰｓＴＮＭＴの存在下または非存在下で、様々なプロモーターの下流で、異なる型のＣＹＰ８２Ｙ１を発現させるとともに、カナジンの存在下で増殖させた酵母から得られたインビボアッセイの結果を示している。アッセイは、２５０μＭのカナジン（Ｓ体とＲ体のラセミ混合物）の存在下で７２時間増殖させた酵母から、インビボで行った。酵母は、ＰｓＴＮＭＴの存在下または非存在下で、様々なプロモーターの下流で、異なる型のＣＹＰ８２Ｙ１を発現する。図３について説明したように、ポジティブイオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルを得た。産物の抽出イオンクロマトグラムと、分子イオンの抽出イオンクロマトグラムをプロットし、手作業で積分した。エラーバーは、３つの生物学的複製物のＳ．Ｄ．である。Ａは、ＰｓＴＮＭＴが染色体に組み込まれている酵母株において、異なる温度（２５℃及び３０℃）で、様々なプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＰＤ、ＴＰＩ１、ＴＥＦ１、ＰＧＫ１、ＰＹＫ１、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＨＸＴ７プロモーター）の下流の異なる型のＣＹＰ８２Ｙ１（１．ＣＹＰ８２Ｙ１タグのＮ末端が他のＥＲ結合タンパク質のＮ末端に置き換えられている。２．他のＥＲ結合タンパク質のＮ末端タグがＣＹＰ８２Ｙ１に直接タグ化されている）によって、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを産生させたことを示している。Ｂは、ＰｓＴＮＭＴの組み込まれたS. cerevisiaeであって、ＨＸＴ７プロモーターまたはＴＰＩ１１プロモーターの下流で、ＣＹＰ８２Ｙ１またはＣＹＰ８２Ｙ１Ａ（Ｎ末端タグがＭＳＨのＮ末端タグに置き換えられたＣＹＰ８２Ｙ１）を発現するS. cerevisiaeにおいて、２５℃で、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンまたは１−ヒドロキシカナジンのいずれかを産生させたことを示している。
【０２０７】
図７は、本発明の実施形態に従って、ＰｓＴＮＭＴとＣＹＰ８２Ｙ１Ａの存在下で、様々なプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＰＤ、ＰＧＫ１、ＨＸＴ７）の下流で、ＣＹＰ８２Ｘ２を発現させるとともに、カナジンの存在下で増殖させた酵母から得られたインビボアッセイの結果を示している。アッセイは、２５０μＭのカナジン（Ｓ体とＲ体のラセミ混合物）の存在下で７２時間増殖させた酵母から、インビボで行った。酵母は、ＰｓＴＮＭＴとＣＹＰ８２Ｙ１Ａの存在下で、様々なプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＰＤ、ＰＧＫ１、ＨＸＴ７プロモーター）の下流で、ＣＹＰ８２Ｘ２を発現する。図３について説明したように、ポジティブイオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルを得た。産物の抽出イオンクロマトグラムと、分子イオンの抽出イオンクロマトグラムをプロットし、手作業で積分した。エラーバーは、３つの生物学的複製物のＳ．Ｄ．である。
【０２０８】
図８は、本発明の実施形態に従って、ＰｓＴＮＭＴとＣＹＰ８２Ｙ１Ａの存在下で、ＣＹＰ８２Ｘ２とＰｓＡＴ１を有するかまたは有さない状態で、様々なプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＰＤ、ＰＧＫ１、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＨＸＴ７）の下流で、野生型（ＷＴ）を発現させたるともに、カナジンの存在下で増殖させた酵母から得られたインビボアッセイの結果を示している。アッセイは、２５０μＭのカナジン（Ｓ体とＲ体のラセミ混合物）の存在下で７２時間増殖させた酵母から、インビボで行った。酵母は、ＰｓＴＮＭＴとＣＹＰ８２Ｙ１Ａの存在下で、ＣＹＰ８２Ｘ２とＰｓＡＴ１を有するかまたは有さない状態で、ＧＡＬ１、ＨＸＴ７、ＡＤＨ１、ＣＹＣ１、ＧＰＤ、ＴＥＦ１及びＰＧＫ１プロモーターの下流で、野生型ＣＹＰ８２Ｘ１を発現する。図３について説明したように、ポジティブイオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルを得た。産物の抽出イオンクロマトグラムと、分子イオンの抽出イオンクロマトグラムをプロットし、手作業で積分した。エラーバーは、３つの生物学的複製物のＳ．Ｄ．である。
【０２０９】
図９は、本発明の実施形態に従って、ノルラウダノソリンをノスカピンに変換する生合成スキームを示している。
【０２１０】
図１０は、３−Ｏ−アセチル−パパベロキシン、ナルコチンヘミアセタール及びノスカピンのＬＣ−ＭＳの波形を示している。具体的には、図１０は、本明細書に記載されているような方法を用いて、遺伝子操作された酵母株によって培地に分泌された化合物のＥＩＣ−ＬＣＭＳ解析を示している。
【０２１１】
図１１は、本発明の実施形態に従って、ノルラウダノソリンからノスカピンを生合成することを示している。Ａは、ノスカピンの標準物質（黒）とノスカピン産生株ＣＳＹＮ１６の培地（赤）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示している。Ｂは、異なる発現カセット群（ＣＳＹＮ１６は、染色体から発現するＡｔＡＴＲ１、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＰｓＳ９ＯＭＴ、ＣｊＣＡＳ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＡＴ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＴＮＭＴ、ＰｓＭＴ２、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１及びＰｓＭＴ３であり、ＣＳＹＮ１７＿１は、染色体から発現するＡｔＡＴＲ１、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＴｆＳ９ＯＭＴ、ＣｊＣＡＳ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＡＴ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２、ＰｓＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１及びＰｓＭＴ３と、低コピープラスミドから発現するＣＹＰ８２Ｘ２であり、ＣＳＹＮ１７＿２は、染色体から発現するＡｔＡＴＲ１、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＴｆＳ９ＯＭＴ、ＣｊＣＡＳ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＡＴ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２、ＰｓＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１及びＰｓＭＴ３と、低コピープラスミドから発現するＰｓＳ９ＯＭＴであり、ＣＳＹＮ１８は、染色体から発現するＡｔＡＴＲ１、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＴｆＳ９ＯＭＴ、ＣｊＣＡＳ、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＡＴ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２、ＰｓＴＮＭＴ、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１及びＰｓＭＴ３と、低コピープラスミドから発現するＣＹＰ８２Ｘ２、ＰｓＳ９ＯＭである）を有する遺伝子操作株から解析したノスカピン力価を示している。Ｃは、ノスカピン産生酵母株ＣＳＹＮ１８のｍ／ｚ＋＝２８８（黒）及び４１４（赤）のＥＩＣを示している。バーは、５つの生物学的複製物の平均値±１ｓ．ｄ．を表しており、エラーバーは、それらの複製物の標準偏差を表している。
【０２１２】
図１２は、本発明の実施形態に従って、ノスカピンをチロシンから生合成する経路を示している。
【０２１３】
図１３は、本発明の実施形態に従って、酵母内でノスカピンをデノボ産生させたことを示す図を示している。
【０２１４】
図１４は、本発明の実施形態に従って、酵母内でノスカピノイドをデノボ産生させる例示的な生合成の概略を示している。Ｎ４’ＯＭＴは、ＭＴ２とＭＴ３のヘテロ二量体を表している。
【０２１５】
図１５は、本発明の実施形態に従って、酵母内でノスカピノイドをデノボ産生させる別の例示的な生合成の概略を示している。Ｎ４’ＯＭＴは、ＭＴ２とＭＴ３のヘテロ二量体を表している。
【０２１６】
図１６は、本発明の実施形態に従って、グルコースを４−ＨＰＡ、ドーパミン及び３，４−ＤＨＰＡに変換する生合成スキームを示している。
【０２１７】
図１７は、本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをノルコクラウリン経由でレチクリンに変換する生合成スキームを示している。
【０２１８】
図１８は、本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをノルラウダノソリン経由でレチクリンに変換する生合成スキームを示している。
【０２１９】
図１９は、本発明の実施形態による、テトラヒドロビオプテリンの合成、再利用及びサルベージ経路の例を示している。
【０２２０】
図２０は、本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをプロトベルベリン、フタリドイソキノリン及びベルベリンアルカロイド生成物に変換する生合成スキームを示している。
【０２２１】
図２１は、本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをノスカピン、ノスカピノイド及びフタリドイソキノリンアルカロイド生成物に変換する生合成スキームを示している。
【０２２２】
図２２は、本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをサンギナリン及びベンゾフェナントリジンアルカロイドに変換する生合成スキームを示している。
【０２２３】
（表１）酵母内の遺伝子操作された合成経路の構成成分として用いる遺伝子
2018500002.tif 000004
2018500002.tif 000005
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【０２２４】
（表２）ケシがら濃縮物と清澄化酵母培養培地に存在し得る不純物の比較
2018500002.tif 000012
【０２２５】
（表３）清澄化酵母培養培地（ＣＹＣＭ）に存在する分子の別個の基
2018500002.tif 000013
【０２２６】
酵素リストの考察
宿主細胞は、対象となるＢＩＡ及び／または対象となる酵素を産生するための１つ以上の改変（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上またはそれ以上の改変など）を含むように遺伝子操作されていてよい。表１には、遺伝子操作された宿主細胞において、対象となるＢＩＡ及び／または対象となる酵素を産生させるように、１つ以上の改変によって影響を受け得る例示的な遺伝子のリストが示されている。
【０２２７】
表１に示されているような遺伝子の改変を用いて、増殖に必要な最小限の栄養源を含む培地が供給されている遺伝子操作された宿主細胞から、対象となるＢＩＡを産生させてよい。この最少培地は、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミン及び塩を含んでよい。例えば、表１に示されているような遺伝子の改変を用いて、糖が供給されている遺伝子操作された宿主細胞から、対象となるＢＩＡを産生させてよい。加えて、表１に示されているような１つ以上の遺伝子の改変を用いて、製薬のために、遺伝子操作し得る宿主細胞の生合成プロセスを増強してよい。
【０２２８】
加えて、これらの改変を用いて、遺伝子操作された宿主細胞において、対象となるＢＩＡ及び／または対象となる酵素を産生させることは、その遺伝子によって産生され得る酵素を単に同定することからは容易には明らかにならない。具体的には、本明細書に記載されているように、酵母細胞などの宿主細胞において再構築された合成経路は、天然においては単一の生物内で連動しない様々な酵素を含む。加えて、本明細書で論じられている酵素のいくつかは、天然の状況では、ＢＩＡの生合成のためには作用しない。更に、本明細書に記載されている酵素のいくつかは、酵母細胞などの特定の宿主細胞において機能するようには進化されておらず、連動するように進化されていない。これらの事例では、酵母などの宿主細胞での合成ＢＩＡ経路の状況においては、経路を通って下流のＢＩＡ最終産物を産生させるために、上記酵素が、十分なフラックスを有するのに十分な活性を示すかは不明であろう。
【０２２９】
例えば、植物酵素は、酵母などの異種微生物宿主において、機能的に発現するのが困難であることが多い。多くの事例では、それらの酵素は、ミスフォールディングしたり、宿主細胞内で正確に局在化しなかったり、及び／または誤って処理されたりすることがある。酵母と植物との間でタンパク質の翻訳と処理に違いがあることにより、これらの酵素の酵母宿主における活性が検出不能なまで実質的に低下し得る。これらの課題は一般に、シトクロムＰ４５０などの内膜局在酵素において生じ、これらは、ＢＩＡ経路で強く現れる。酵母を遺伝子操作して複雑なＢＩＡを産生させる際には、低下した酵素活性でも、本質的な課題をもたらし得る（所望のＢＩＡ産物の高レベルの蓄積を確保するためには、各工程で十分な活性が必要となる）。
【０２３０】
加えて、酵母のようないくつかの宿主細胞には、ＢＩＡ経路における初期前駆体の多く（すなわち、チロシンからノルコクラウリンまでの中間体）に作用し得る内因性酵素／経路が存在するので、これらの競合内因性経路を考慮すると、かなりのＢＩＡ産生量を得るには、異種の経路を通るフラックスが十分であるかは、容易に分からない場合がある。例えば、酵母におけるエーリッヒ経路（Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４：２２５９−６６、Ｌａｒｒｏｙ，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１４３−１４４：２２９−３８、Ｌａｒｒｏｙ，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：５７３８−４５）は、初期ＢＩＡ経路における中間体の多くを望ましくない生成物に変換するとともに、フラックスをその合成経路から迂回させるように作用する主要内因性経路である。
【０２３１】
更に、本明細書で論じられ、表１に示されているような酵素の多くは、天然型植物宿主において、空間的調節を含む極めて特殊な調節策の下で機能することができ、これらは、異種酵母宿主に導入されると、失われることがある。加えて、植物は、酵母細胞とは非常に異なる生化学的環境をもたらし、その環境下では、酵素は、ｐＨ、レドックス状態、ならびに基質、補基質、補酵素及び補因子の利用性を含め、機能するように進化されている。天然型宿主と異種酵母宿主との間で生化学的環境と調節策が違うことを考慮すると、酵素が、酵母環境の状況において、実質的な活性を示すかは不明であり、更に、酵素が連動して、糖のような単純な前駆体を複雑なＢＩＡ化合物に導くかも不明である。経路の多くは、多くの反応工程（＞１０）を有し、その結果、それらの工程が効率的でないと、所望の下流産物の蓄積が期待されないため、酵母宿主において酵素の活性を保持することが、特に重要である。
【０２３２】
加えて、天然型植物宿主では、これらの経路における関連代謝物は、様々なタイプの細胞と組織にわたって局在化し得る。いくつかの例では、生合成に特化し得るタイプの細胞と、代謝物の蓄積のために合成され得るタイプの細胞が存在する。このタイプの細胞特化性は、異種酵母宿主内の経路を発現すると喪失し得、これらの代謝物の細胞上での毒性を制御する際に、重要な役割を果たし得る。したがって、これらの化合物の毒性によって悪影響を受けることなく、これらの代謝物を生合成及び蓄積するように、酵母をうまく遺伝子操作できるかは不明である。
【０２３３】
一例としては、天然型植物宿主では、酵素のＢＢＥは、動的な細胞内局在性を有することが報告されている。具体的には、酵素のＢＢＥはまず、ＥＲで始まり、続いて、液胞にソーティングされる（Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｆａｃｃｈｉｎｉ．２００１．Ｐｌａｎｔａ．２１３：８８８−９７）。植物においてＢＢＥがＥＲと関連すること（Ａｌｃａｎｔａｒａ，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３８：１７３−８３）により、ＢＢＥ活性に最適な塩基性ｐＨ（ｐＨ約８．８）が得られることが示唆されている（Ｚｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｆａｃｃｈｉｎｉ．２００８．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５９：７３５−６９）。別の例として、サンギナリンの生合成が、植物細胞内の特殊な小胞において行われるという証拠が存在するが（Ａｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．１９８６．Ｐｌａｎｔａ．１６７：３１０−２０）、その中間体の一部のみが小胞内に蓄積する。これは、他の酵素の活性及び／または毒作用からサンギナリンを隔離するように行われてよい。
【０２３４】
別の例として、モルフィナン経路分岐における生合成酵素はいずれも、師部（植物内の維管束組織の一部である）に局在する。師部では、経路酵素は更に、全ての植物に共通の篩部要素と、特殊な二次代謝物を生成する特定の植物のみに存在する特殊なタイプの細胞である乳管という２つのタイプの細胞に分けることができる。上流酵素（すなわち、ＮＣＳからＳａｌＡＴまで）は主に篩部要素にあり、下流酵素（すなわち、Ｔ６ＯＤＭ、ＣＯＲ、ＣＯＤＭ）は大部分が乳管にある（Ｏｎｏｙｏｖｗｅ，ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．２５：４１１０−２２）。加えて、ノスカピン生合成経路の最終工程は、乳管で行われることが発見された（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｆａｃｃｈｉｎｉ．２０１４．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７７：１７３−８４）。この区画化は、中間体を単離または輸送し、最適なｐＨをもたらし、補因子の供給を高めることによって、生合成を調節するのに非常に重要と考えられているが、ケシの乳管微小環境の性質は依然として研究中である（Ｚｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｆａｃｃｈｉｎｉ．２００８．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５９：７３５−６９）。更に、いくつかの酵素は、植物の二次代謝に共通の多酵素複合体または代謝チャネルとして機能し得ることが予測されている（Ｋｅｍｐｅ，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７０：５７９−８９、Ａｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１５５９−６６）。生合成酵素を異なる宿主から組み合わせたり、及び／または異種酵母細胞において組み換え発現させたりするときには、これらの複合体またはチャネルが、天然型宿主における場合のように形成されるかは、不明である。更なる例では、キクバオウレン（Coptis japonica）において、ベルベリンは、根の組織で生合成されてから、特殊なＡＴＰ結合カセット輸送タンパク質の作用を介して、根茎内に蓄積される（Ｓｈｉｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．９１：１０９−１６）。ケシにおいては、モルフィナンアルカロイドが、ラテックス（乳管細胞の細胞質）内に蓄積される（Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．１９６７．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６：２３５５−６３）。
【０２３５】
更に、これらの考察がなくても、本明細書に記載されている経路のいくつかの工程における植物酵素が、まだ特徴付けされていない場合もある。例えば、チロシンを、初期のベンジルイソキノリンアルカロイド骨格ノルコクラウリンに変換することは、まだ特徴付けられていない。加えて、ナルコトリンのノスカピンへの変換は、本明細書に記載されているように、最近特徴付けられたに過ぎない。したがって、本明細書に記載されている経路のいくつかの工程では、ＢＩＡを生合成する際に天然では通常連動しない酵素活性を併せること、または再構築経路で利用するために、ゲノム配列情報から新たな酵素活性を同定することによって、代替的な生合成スキームを作成した。
【０２３６】
例えば、天然では連動せず、この経路の状況においてまたは植物酵素とともに機能するように進化されなかった少なくとも５つの哺乳動物酵素と１つの細菌酵素を組み合わせることによって、チロシンのドーパミンへの二工程変換を実現させてよい。これらの事例では、天然では化合物の生合成のために進化しなかった酵素を用いて、異種微生物宿主とこの経路の状況において当該酵素が有効に機能するかは不明である。別の例として、ナルコトリンのノスカピンへの変換を担う酵素は未知であった。植物内研究によって、この変換に関与するＰｓＭＴ２が示されているが、ＰｓＭＴ２自体は、ナルコトリンをメチル化して、ノスカピンをもたらすことができない。本明細書に論じられているような新規の酵素複合体は、酵母内と、合成ＢＩＡ経路の状況で、このＯ−メチル化反応を行う。Ｐｓ６ＯＭＴとＰｓＭＴ３との高い配列類似性により、植物では、機能的なＰｓＭＴ２／ＰｓＭＴ３酵素複合体を発見するのは困難であったであろう。酵母における明確な酵素バックグラウンドにより、本明細書に示されているように、考え得るナルコトリン４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼとして、ＰｓＭＴ２／ＰｓＭＴ３ヘテロ二量体が発見される。
【０２３７】
対象となるＢＩＡ及び／または対象となる酵素を産生させるための改変の対象である遺伝子の例は、以下に論じられている。加えて、それらの遺伝子は、対象となるＢＩＡ及び／または対象となる酵素の生成に用いる経路を示している一連の図の文脈で論じられている。
【０２３８】
［ＴＬＫ１］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のトランスケトラーゼの発現を改変できる。トランスケトラーゼは、ＴＫＬ１遺伝子によってコードされる。例では、トランスケトラーゼは、図１６で参照したように、フルクトース−６−リン酸＋グリセルアルデヒド−３−リン酸⇔キシルロース−５−リン酸＋エリトロース−４−リン酸という反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＫＬ１遺伝子の構成的過剰発現を含めるようにしてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＫＬ１遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴＫＬ１遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴＫＬ１遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。ＴＫＬ１遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＴＫＬ１遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。
【０２３９】
［ＺＷＦ１］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの発現を改変できる。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、ＺＷＦ１遺伝子によってコードされる。例では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、図１６で参照したように、グルコース−６−リン酸→６−ホスホグルコノラクトンという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＺＷＦ１遺伝子のコード領域を欠損させてよい。あるいは、不活化変異を導入するなどによって、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＺＷＦ１遺伝子の機能性を無力化してよい。
【０２４０】
［ＡＲＯ４］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼの発現を改変できる。ＤＡＨＰシンターゼは、ＡＲＯ４遺伝子によってコードされる。例では、ＤＡＨＰシンターゼは、図１６で参照したように、エリトロース−４−リン酸＋ホスホエノールピルビン酸→ＤＡＨＰという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、ＡＲＯ４遺伝子を改変して、１つ以上のフィードバック阻害緩和型変異を導入してよい。具体的には、フィードバック阻害緩和型変異（例えばＡＲＯ４ＦＢＲ）は、特異的変異として天然型ＡＲＯ４遺伝子に本来の遺伝子座において、遺伝子組み込みとして別の遺伝子座に導入される追加のコピーとして、または２μｍまたはセントロメアプラスミドのようなエピソーマルベクター上の追加のコピーとして導入してよい。変異のＡＲＯ４ＦＢＲにおける「ＦＢＲ」という識別子は、フィードバック耐性変異体及び変異を指す。遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞であるときなどには、ＤＡＨＰシンターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、天然型酵母転写調節下にあってよい。あるいは、合成プロモーターの制御下に置くことによって、タンパク質の発現の構成的または動的な調節を遺伝子操作した状態で、ＤＡＨＰシンターゼ酵素のフィードバック阻害コピーを遺伝子操作された宿主細胞に組み込んでよい。場合によっては、ＡＲＯ４遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeに由来してよい。場合によっては、そのＡＲＯ４遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。ＡＲＯ４遺伝子に対する改変の例としては、フィードバック阻害耐性変異、Ｋ２２９ＬまたはＱ１６６Ｋが挙げられる。
【０２４１】
［ＡＲＯ７］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のコリスメートムターゼの発現を改変できる。コリスメートムターゼは、ＡＲＯ７遺伝子によってコードされる。例では、コリスメートムターゼは、図１６で参照したように、コリスメート→プレフェネートという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、ＡＲＯ７遺伝子を改変して、１つ以上のフィードバック阻害緩和型変異を導入してよい。具体的には、フィードバック阻害緩和型変異（例えばＡＲＯ７ＦＢＲ）は、天然型ＡＲＯ７遺伝子に対する本来の遺伝子座における特異的変異として、遺伝子組み込みとして別の遺伝子座に導入される追加のコピーとして、または２−μｍまたはセントロメアプラスミドのようなエピソーマルベクター上の追加のコピーとして導入してよい。変異のＡＲＯ７ＦＢＲにおける「ＦＢＲ」という識別子は、フィードバック耐性変異体及び変異を指す。遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞であるときなどには、コリスメートムターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、天然型酵母転写調節下にあってよい。あるいは、合成プロモーターの制御下に置くことによって、タンパク質の発現の構成的または動的な調節を遺伝子操作した状態で、コリスメートムターゼ酵素のフィードバック阻害コピーを遺伝子操作された宿主細胞に組み込んでよい。場合によっては、ＡＲＯ７遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeに由来してよい。場合によっては、そのＡＲＯ７遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。ＡＲＯ７遺伝子に対する改変の例としては、フィードバック阻害耐性変異またはＴ２２６Ｉが挙げられる。
【０２４２】
［ＡＲＯ１０］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のフェニルピルベートデカルボキシラーゼの発現を改変できる。フェニルピルベートデカルボキシラーゼは、ＡＲＯ１０遺伝子によってコードされる。例では、フェニルピルベートデカルボキシラーゼは、図１６で参照したように、ヒドロキシフェニルピルベート→４−ヒドロキシフェニルアセテート（４ＨＰＡ）という反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＲＯ１０の構成的過剰発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＲＯ１０遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＡＲＯ１０遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＡＲＯ１０遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。ＡＲＯ１０遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＡＲＯ１０遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。
【０２４３】
［ＡＲＯ９］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素の芳香族アミノトランスフェラーゼの発現を改変できる。芳香族アミノトランスフェラーゼは、ＡＲＯ９遺伝子によってコードされる。例では、芳香族アミノトランスフェラーゼは、図１６で参照したように、ヒドロキシフェニルピルベート＋グルタメート→チロシン＋α−ケトグルタレートという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＲＯ９遺伝子の構成的過剰発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＲＯ９遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＡＲＯ９遺伝子のコピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＡＲＯ９遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。ＡＲＯ９遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＡＲＯ９遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。
【０２４４】
［ＴｙｒＨ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のチロシンヒドロキシラーゼの発現を改変できる。チロシンヒドロキシラーゼは、ＴｙｒＨ遺伝子によってコードされる。例では、チロシンヒドロキシラーゼは、図１６及び１７で参照したように、チロシン→Ｌ−ＤＯＰＡという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＴｙｒＨ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＴｙｒＨ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴｙｒＨ遺伝子のコピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴｙｒＨ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。ＴｙｒＨ遺伝子は、ヒト（Homo sapiens）、ラット（Rattus norvegicus）、マウス（Mus musculus）または別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＴｙｒＨ遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。
【０２４５】
［ＤＯＤＣ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のＬ−ＤＯＰＡデカルボキシラーゼの発現を改変できる。Ｌ−ＤＯＰＡデカルボキシラーゼは、ＤＯＤＣ遺伝子によってコードされる。例では、Ｌ−ＤＯＰＡデカルボキシラーゼは、図１６及び１７で参照したように、Ｌ−ＤＯＰＡ→ドーパミンという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＤＯＤＣ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＤＯＤＣ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＤＯＤＣ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＤＯＤＣ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。ＤＯＤＣ遺伝子は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ラット（Rattus norvegicus）または別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＤＯＤＣ遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。
【０２４６】
［ＮＣＳ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のノルコクラウリンシンターゼの発現を改変できる。ノルコクラウリンシンターゼは、ＮＣＳ遺伝子によってコードされる。例では、ノルコクラウリンシンターゼは、図１７で参照したように、４ＨＰＡ＋ドーパミン→（Ｓ）−ノルコクラウリンという反応を触媒する。具体的には、図１７は、本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをノルコクラウリン経由でレチクリンに変換する生合成スキームを示している。図１７には、酵素のＴｙｒＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＤＯＤＣ（ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ）、ここで論じられているようなＮＣＳ（ノルコクラウリンシンターゼ）、６ＯＭＴ（６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）、ＣＮＭＴ（コクラウリンＮ−メチルトランスフェラーゼ）、ＣＹＰ８０Ｂ１（シトクロムＰ４５０  ８０Ｂ１）、ＣＰＲ（シトクロムＰ４５０  ＮＡＤＰＨレダクターゼ）、４’ＯＭＴ（３’ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）、Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）及び４−ＨＰＡ（４−ヒドロキシフェニルアセチルアルデヒド）を用いることが示されている。図１７に示されている酵素のうち、４−ＨＰＡとＬ−チロシンは、酵母において天然に合成される。示されている他の代謝物はいずれも、酵母においては天然には産生されない。加えて、Ｌ−チロシンのＬ−ＤＯＰＡへの変換を触媒するものとしてＴｙｒＨが示されているが、本明細書に記載されているように、他の酵素を用いて、この工程を行ってもよい。例えば、チロシナーゼを用いて、Ｌ−チロシンのＬ−ＤＯＰＡへの変換を行ってもよい。加えて、シトクロムＰ４５０オキシダーゼのような他の酵素を用いて、Ｌ−チロシンのＬ−ＤＯＰＡへの変換を行ってもよい。このような酵素は、Ｌ−ＤＯＰＡ及びＬ−チロシンを含め、関連するＢＩＡ前駆体化合物上で、オキシダーゼ活性を示すことができる。
【０２４７】
加えて、ノルコクラウリンシンターゼは、図１８で参照したように、３，４−ＤＨＰＡ＋ドーパミン→（Ｓ）−ノルラウダノソリンという反応を触媒する。具体的には、図１８は、本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをノルラウダノソリン経由でレチクリンに変換する生合成スキームを示している。図１８には、酵素のＴｙｒＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＤＯＤＣ（ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ）、ｍａｏＡ（モノアミンオキシダーゼ）、ＮＣＳ（ノルコクラウリンシンターゼ）、６ＯＭＴ（６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）、ＣＮＭＴ（コクラウリンＮ−メチルトランスフェラーゼ）、４’ＯＭＴ（３’ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）、Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）及び３，４−ＤＨＰＡ（３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド）を用いることが示されている。図１８に示されている酵素のうち、Ｌ−チロシンは、酵母において天然に合成される。図１８に示されている他の代謝物は、酵母においては天然には産生されない。
【０２４８】
遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＮＣＳ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＮＣＳ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＮＣＳ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＮＣＳ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。加えて、ノルコクラウリンシンターゼは、Ｎ末端のトランケートを有してよい。場合によっては、ＮＣＳ遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＮＣＳ遺伝子は、Coptis japonica、Papaver somniferum、ハカマオニゲシ（Papaver bracteatum）、キバナカラマツソウ（Thalicitum flavum）、コリダリス・サキシコラ（Corydalis saxicola）または別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＮＣＳ遺伝子は、天然の遺伝子と８０％類似していてよい。
【０２４９】
［６ＯＭＴ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの発現を改変できる。ノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、６ＯＭＴ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、ノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、図１７で参照したように、ノルコクラウリン→コクラウリンという反応を触媒する。別の例では、ノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、ノルラウダノソリン→３’ヒドロキシコクラウリンという反応と、図１８に示されている反応など、本明細書に詳述されている他の反応を触媒する。加えて、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞における６ＯＭＴ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞における６ＯＭＴ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、６ＯＭＴ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞内で６ＯＭＴ遺伝子を過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。６ＯＭＴ遺伝子は、P. somniferum、T. flavum、Coptis japonicaまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、６ＯＭＴ遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。
【０２５０】
［ＣＮＭＴ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のコクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現を改変できる。コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、ＣＮＭＴ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、図１７で参照したように、コクラウリン→Ｎ−メチルコクラウリンという反応を触媒する。別の例では、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、３’ヒドロキシコクラウリン→３’ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリンという反応を触媒してよい。別の例では、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、図１８に示されている反応など、本明細書に詳述されている他の反応を触媒してよい。加えて、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＮＭＴ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＮＭＴ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＮＭＴ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞内でＣＮＭＴ遺伝子を過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。ＣＮＭＴ遺伝子は、P. somniferum、T. flavum、Coptis japonicaまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＣＮＭＴ遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。
【０２５１】
［４’ＯＭＴ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素の４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの発現を改変できる。４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、４’ＯＭＴ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、図１７で参照したように、３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン→レチクリンという反応を触媒する。別の例では、４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、図１８に示されている反応など、本明細書に詳述されている他の反応を触媒する。加えて、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞における４’ＯＭＴ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞における４’ＯＭＴ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、４’ＯＭＴ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞内で４’ＯＭＴ遺伝子を過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。４’ＯＭＴ遺伝子は、P. somniferum、T. flavum、Coptis japonicaまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、４’ＯＭＴ遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。
【０２５２】
［ＣＹＰ８０Ｂ１］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のシトクロムＰ４５０  ８０Ｂ１の発現を改変できる。シトクロムＰ４５０  ８０Ｂ１は、ＣＹＰ８０Ｂ１遺伝子によってコードされる。例では、シトクロムＰ４５０  ８０Ｂ１は、図１７で参照したように、Ｎ−メチルコクラウリン→３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリンという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるシトクロムＰ４５０  ８０Ｂ１遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるシトクロムＰ４５０  ８０Ｂ１遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、シトクロムＰ４５０  ８０Ｂ１遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、シトクロムＰ４５０  ８０Ｂ１遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＣＹＰ８０Ｂ１遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。シトクロムＰ４５０  ８０Ｂ１遺伝子は、P. somniferum、E. californica、T. flavumまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＰ４５０  ８０Ｂ１遺伝子は、天然の遺伝子と７７％類似していてよい。
【０２５３】
［ＰＴＰＳ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素の６−ピルボイルテトラヒドロビオプテリン（ＰＴＰ）シンターゼの発現を改変できる。ピルボイルテトラヒドロビオプテリンシンターゼは、ＰＴＰＳ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、６−ピルボイルテトラヒドロビオプテリンシンターゼは、図１９で参照したように、ジヒドロネオプテリン三リン酸→ＰＴＰという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＰＴＰＳ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＰＴＰＳ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＰＴＰＳ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＰＴＰＳ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＰＴＰＳ遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＰＴＰＳ遺伝子は、Rattus norvegicus、Homo sapiens、Mus musculusまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＰＴＰＳ遺伝子は、天然の遺伝子と８０％類似していてよい。
【０２５４】
［ＳｅｐＲ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のセピアプテリンレダクターゼの発現を改変できる。セピアプテリンレダクターゼは、ＳｅｐＲ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、セピアプテリンレダクターゼは、図１９で参照したように、ＰＴＰ→ＢＨ４という反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＳｅｐＲ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＳｅｐＲ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳｅｐＲ遺伝子コピーを１つ、複数または追加組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳｅｐＲ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＳｅｐＲ遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＳｅｐＲ遺伝子は、Rattus norvegicus、Homo sapiens、Mus musculusまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＳｅｐＲ遺伝子は、天然の遺伝子と７２％類似していてよい。
【０２５５】
［ＰＣＤ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素の４ａ−ヒドロキシテトラヒドロビオプテリン（プテリン−４α−カルビノールアミン）デヒドラターゼの発現を改変できる。４ａ−ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼは、ＰＣＤ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、４ａ−ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼは、図１９で参照したように、４ａ−ヒドロキシテトラヒドロビオプテリン→Ｈ２Ｏ＋キノノイドジヒドロプテリジンという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＰＣＤ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＰＣＤ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＰＣＤ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＰＣＤ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＰＣＤ遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＰＣＤ遺伝子は、Rattus norvegicus、Homo sapiens、Mus musculusまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＰＣＤ遺伝子は、天然の遺伝子と７９％類似していてよい。
【０２５６】
［ＱＤＨＰＲ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のキノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼの発現を改変できる。キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼは、ＱＤＨＰＲ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼは、図１９で参照したように、キノノイドジヒドロプテリジン→ＢＨ４という反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＱＤＨＰＲ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＱＤＨＰＲ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＱＤＨＰＲ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＱＤＨＰＲ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＱＤＨＰＲ遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＱＤＨＰＲ遺伝子は、Rattus norvegicus、Homo sapiens、Mus musculusまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＱＤＨＰＲ遺伝子は、天然の遺伝子と７５％類似していてよい。
【０２５７】
［ＤＨＦＲ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のジヒドロフォレートレダクターゼの発現を改変できる。ジヒドロフォレートレダクターゼは、ＤＨＦＲ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、ジヒドロフォレートレダクターゼは、図１９で参照したように、７，８−ジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）→５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）という反応を触媒する。この反応は、図１７に示されているように、チロシンをＬ−ＤＯＰＡに変換する際の補基質として、ＢＨ４を回収するのに有用であり得る。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＤＨＦＲ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＤＨＦＲ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＤＨＦＲ遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＤＨＦＲ遺伝子は、Rattus norvegicus、Homo sapiensまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＤＨＦＲ遺伝子は、天然の遺伝子と７７％類似していてよい。
【０２５８】
［ＣＰＲ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現を改変できる。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、本願を通じて図に記載されている反応のような他の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＰＲ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＰＲ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＰＲ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＰＲ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。ＣＰＲ遺伝子は、E. californica、P. somniferum、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、S. cerevisiae、A. thalianaまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＣＰＲ遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。
【０２５９】
［ＢＢＥ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のベルベリン架橋酵素の発現を改変できる。ベルベリン架橋酵素は、ＢＢＥ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、ベルベリン架橋酵素は、図２０で参照したように、（Ｓ）−レチクリン→（Ｓ）−スコウレリンという反応を触媒する。図２０は、本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをプロトベルベリンアルカロイドに変換する生合成スキームを示している。具体的には、図２０には、酵素のＢＢＥ、ベルベリン架橋酵素、Ｓ９ＯＭＴ（スコウレリン９−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）、ＣＡＳ（カナジンシンターゼ）、ＣＰＲ（シトクロムＰ４５０レダクターゼ）及びＳＴＯＸ（テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ）を用いることが示されている。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＢＢＥ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＢＢＥ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＢＢＥ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＢＢＥ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。ＢＢＥ遺伝子は、Papaver somniferum、アザミゲシ（Argemone mexicana）、Eschscholzia californica、ベルベリス・ストロニフェラ（Berberis stolonifera）、タリクトラム・フラブム亜種グラウカム（Thalictrum flavum subsp.glaucum）、Coptis japonica、パパヴェル属（Papaver spp.）または別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＢＢＥ遺伝子は、天然の遺伝子と９９％類似していてよい。
【０２６０】
［Ｓ９ＯＭＴ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：（Ｓ）−スコウレリン９−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの発現を改変できる。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：（Ｓ）−スコウレリン９−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、Ｓ９ＯＭＴ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：（Ｓ）−スコウレリン９−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、図２０で参照したように、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン＋（Ｓ）−スコウレリン→Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン＋（Ｓ）−テトラヒドロコルンバミンという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＳ９ＯＭＴ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＳ９ＯＭＴ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、Ｓ９ＯＭＴ遺伝子コピーを１つ、複数または追加でコピー組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、Ｓ９ＯＭＴ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、Ｓ９ＯＭＴ遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。Ｓ９ＯＭＴ遺伝子は、Thalictrum flavum subsp.glaucum、Coptis japonica、トウオウレン（Coptis chinensis）、Papaver somniferum、タリクトラム属（Thalictrum spp.）、オウレン（Coptis spp.）、Papaver spp.または別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＳ９ＯＭＴ遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。例では、そのＳ９ＯＭＴ遺伝子は、天然の遺伝子と８０％類似していてよい。
【０２６１】
［ＣＡＳ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素の（Ｓ）−カナジンシンターゼの発現を改変できる。（Ｓ）−カナジンシンターゼは、ＣＡＳ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、（Ｓ）−カナジンシンターゼは、図２０で参照したように、（Ｓ）−テトラヒドロコルンバミン→（Ｓ）−カナジンという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞においてＣＡＳ遺伝子を発現させてよい。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＡＳ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＡＳ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＡＳ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＡＳ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。ＣＡＳ遺伝子は、Thalictrum flavum subsp.glaucum、Coptis japonica、Thalictrum spp.、Coptis spp.または別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＣＡＳ遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。
【０２６２】
［ＴＮＭＴ］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のテトラヒドロプロトベルベリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現を改変できる。テトラヒドロプロトベルベリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、ＴＮＭＴ遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、テトラヒドロプロトベルベリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、図２１で参照したように、カナジン→Ｎ−メチルカナジンという反応を触媒する。図２１は、本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをノスカピン、ノスカピノイド及びフタリドイソキノリンに変換する生合成スキームを示している。具体的には、図２１には、酵素のＢＢＥ（ベルベリン架橋酵素）、Ｓ９ＯＭＴ（スコウレリン９−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）、ＣＡＳ（カナジンシンターゼ）、ＣＰＲ（シトクロムＰ４５０レダクターゼ）、ＴＮＭＴ（テトラヒドロプロトベルベリンシス−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ）、ＣＹＰ８２Ｙ１（Ｎ−メチルカナジン１−ヒドロキシラーゼ）、ＣＹＰ８２Ｘ２（１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン１３−ヒドロキシラーゼ）、ＡＴ１（１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン１３−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ）、ＣＹＰ８２Ｘ１（４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンシンターゼ）、ＣＸＥ１（ナルコチンヘミアセタールシンターゼ）、ＮＯＳ（またはＳＤＲ１）（ノスカピンシンターゼ）、ＭＴ２（ナルコトリン−４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ１）、ＭＴ３（ナルコトリン−４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ２及び６ＯＭＴ（６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）を用いることが示されている。
【０２６３】
別の例では、テトラヒドロプロトベルベリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、図２２で参照したように、スチロピン→シス−Ｎ−メチルスチロピンという反応を触媒する。図２２は、本発明の実施形態に従って、Ｌ−チロシンをサンギナリンとベンゾフェナントリジンアルカロイドに変換する生合成スキームを示している。具体的には、図２２には、酵素のＢＢＥ（ベルベリン架橋酵素）、ＣＦＳ（ケイランチホリンシンターゼ）、ＳＴＳ（スチロピンシンターゼ）、ＴＮＭＴ（テトラヒドロベルベリンＮ−メチルトランスフェラーゼ）、ＭＳＨ（シス−Ｎ−メチルスチロピン１４−ヒドロキシラーゼ）、Ｐ６Ｈ（プロトピン６−ヒドロキシラーゼ）及びＤＢＯＸ（ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼを用いることが示されている。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＮＭＴ遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＮＭＴ遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴＮＭＴ遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴＮＭＴ遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＴＮＭＴ遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＴＮＭＴ遺伝子は、Papaver somniferum、Eschscholzia californica、Papaver bracteatum、Argemone mexicanaまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＴＮＭＴ遺伝子は、天然の遺伝子と１００％類似していてよい。例では、そのＴＮＭＴ遺伝子は、天然の遺伝子と８１％類似していてよい。
【０２６４】
［ＣＹＰ８２Ｙ１］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のＮ−メチルカナジン１−ヒドロキシラーゼの発現を改変できる。Ｎ−メチルカナジン１−ヒドロキシラーゼは、ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、Ｎ−メチルカナジン１−ヒドロキシラーゼは、図２１で参照したように、Ｎ−メチルカナジン→１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。いくつかの例では、ＣＹＰ８２Ｙ１をＮ末端で改変してよい。ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子は、Papaver somniferum、Papaver spp.、エダウチオオバコ（Plantago arenaria）、ラウオルフィア・ヘテロフィラ（Rauwolfia heterophylla）、アドルミア・フンゴサ（Adlumia fungosa）、ヒドラスチス・カナデンシス（Hydrastis canadensis）、スティロメコン・ヘテロフィラ（Stylomecon heterophylla）、ヒペコウム属（Hypecoum）または別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子は、天然の遺伝子と７０〜７８％類似していてよい。
【０２６５】
［ＣＹＰ８２Ｘ２］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素の１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン１３−ヒドロキシラーゼの発現を改変できる。１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン１３−ヒドロキシラーゼは、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン１３−ヒドロキシラーゼは、図２１で参照したように、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン→１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルオフィオカルピン（すなわち、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン）という反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。いくつかの例では、ＣＹＰ８２Ｘ２をＮ末端で改変してよい。ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子は、P. somniferum、Papaver spp、Plantago arenaria、Rauwolfia heterophylla、Adlumia fungosa、Hydrastis Canadensis、Stylomecon heterophylla、ダクティリカプノス・トルロサ（Dactylicapnos torulosa）、グラウシウム・フラブム（Glaucium flavum）、ベルベリス・ラウリナ（Berberis laurina）、ベルベリス・ウルガリス（B. Vulgaris）、コリダリス属（Corydalis spp）、フマリア属（Fumaria spp）、ダクティリカプノス属（Dactylicapnos spp）または別の種に由来してよい。いくつかの例では、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子は、天然の遺伝子と７０〜７７％類似していてよい。別の例では、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子に対してＮ末端遺伝子操作を行ってよい。例では、Ｎ末端遺伝子操作には、Ｎ末端のトランケートを含めてよい。
【０２６６】
［ＣＹＰ８２Ｘ１］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素の４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンシンターゼの発現を改変できる。４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンシンターゼは、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンシンターゼは、図２１で参照したように、１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジン→４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシンという反応を触媒する。加えて、ＣＹＰ８２Ｘ１は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン→４’−Ｏ−デスメチルマクラントアルデヒドという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。いくつかの例では、ＣＹＰ８２Ｘ１をＮ末端で改変してよい。ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子は、Papaver somniferum、Papaver spp.、Plantago arenaria、Rauwolfia heterophylla、Adlumia fungosa、Hydrastis canadensis、Stylomecon heterophylla、Hypecoumまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子は、天然の遺伝子と７１〜７７％類似していてよい。別の例では、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子に対してＮ末端遺伝子操作を行ってよい。例では、Ｎ末端遺伝子操作には、Ｎ末端のトランケートを含めてよい。
【０２６７】
［ＭＴ２及びＭＴ３］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のナルコトリン４’−Ｏ−メチラーゼの発現を改変できる。ナルコトリン４’−Ｏ−メチラーゼは、ＭＴ２遺伝子とＭＴ３遺伝子によってコードされるＯ−メチルトランスフェラーゼ単量体によって形成されるヘテロ二量体である。いくつかの例では、ナルコトリン４’−Ｏ−メチラーゼは、図２で参照したように、ナルコトリン→ノスカピンという反応を触媒する。加えて、ナルコトリン４’−Ｏ−メチラーゼは、ナルコトリンヘミアセタール→ナルコチンヘミアセタールと、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン→３−Ｏ−アセチルパパベロキシンという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＭＴ２遺伝子とＭＴ３遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＭＴ２遺伝子とＭＴ３遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＭＴ２遺伝子コピーとＭＴ３遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＭＴ２遺伝子とＭＴ３遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＭＴ２遺伝子とＭＴ３遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＭＴ２遺伝子とＭＴ３遺伝子は、P. somniferum、Papaver spp、フマリア・パルビフローラ（Fumaria parviflora）、Plantago arenaria、Rauwolfia heterophyllaまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＭＴ２遺伝子は、天然の遺伝子と８０％、ＭＴ３遺伝子は、天然の遺伝子と７９％類似していてよい。いくつかの例では、ＭＴ３をＰｓ６ＯＭＴに置き換えてもよい。
【０２６８】
［ＡＴ１］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素の１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン１３−Ｏアセチルトランスフェラーゼの発現を改変できる。１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン１３−Ｏアセチルトランスフェラーゼは、ＡＴ１遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン１３−Ｏアセチルトランスフェラーゼは、図２で参照したように、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン→１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジンという反応を触媒する。図２は、本発明の実施形態に従って、カナジンをノスカピンに変換する生合成スキームを示している。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＴ１遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＴ１遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＡＴ１遺伝子コピーを１、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＡＴ１遺伝子を遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＡＴ１遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＡＴ１遺伝子は、P. somniferum、Papaver spp、Plantago arenaria、Rauwolfia heterophylla、Adlumia fungosa、Hydrastis Canadensis、Stylomecon heterophylla、ヒペコウム・レプトカルプム（Hypecoum leptocarpum）、Dactylicapnos torulosa、Glaucium flavum、Berberis laurina、B. Vulgaris、Corydalis spp、Fumaria spp、Dactylicapnos sppまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＡＴ１遺伝子は、天然の遺伝子と８１％類似していてよい。
【０２６９】
［ＣＸＥ１またはＣＸＥ２］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のナルコチンヘミアセタールシンターゼの発現を改変できる。ナルコチンヘミアセタールシンターゼは、ＣＸＥ１遺伝子によってコードされる。ＣＸＥ２遺伝子によってコードされる酵素も、ナルコチンヘミアセタールシンターゼとして機能できる。いくつかの例では、ナルコチンヘミアセタールシンターゼは、図２で参照したように、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン→ナルコトリンヘミアセタールと、３−Ｏ−アセチルパパベロキシン→ナルコチンヘミアセタールという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＸＥ１遺伝子またはＣＸＥ２遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＸＥ１遺伝子またはＣＸＥ２遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＸＥ１遺伝子またはＣＸＥ２遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＸＥ１またはＣＸＥ２遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＣＸＥ１遺伝子またはＣＸＥ２遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＣＸＥ１遺伝子またはＣＸＥ２遺伝子は、P. somniferum、Papaver spp、Plantago arenaria、Rauwolfia heterophylla、Adlumia fungosa、Hydrastis Canadensis、Stylomecon heterophylla、Hypecoum leptocarpum、Dactylicapnos torulosa、Glaucium flavum、Berberis laurina、B. Vulgaris、Corydalis spp、Fumaria spp、Dactylicapnos sppまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＣＸＥ１遺伝子またはＣＸＥ２遺伝子は、天然の遺伝子と７８％類似していてよい。
【０２７０】
［ＳＤＲ１］いくつかの例では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、酵素のノスカピンシンターゼの発現を改変できる。ノスカピンシンターゼは、ＳＤＲ１遺伝子によってコードされる。いくつかの例では、ノスカピンシンターゼは、図２で参照したように、ナルコトリンヘミアセタール→ナルコトリンという反応を触媒する。加えて、ノスカピンシンターゼは、ナルコチンヘミアセタール→ノスカピンという反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＳＤＲ１遺伝子の構成的発現を含めてよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、その遺伝子操作された宿主細胞におけるＳＤＲ１遺伝子の発現を合成的に調節してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳＤＲ１遺伝子コピーを１つ、複数または追加で組み込んでよい。これに加えてまたはこの代わりに、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳＤＲ１遺伝子をその遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現させるために、強力プロモーター要素の導入を組み込んでよい。場合によっては、ＳＤＲ１遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のためにコドン最適化されていてよい。ＳＤＲ１遺伝子は、P. somniferum、Papaver spp、Plantago arenaria、Rauwolfia heterophylla、Adlumia fungosa、Hydrastis Canadensis、Stylomecon heterophylla、Hypecoum leptocarpum、Dactylicapnos torulosa、Glaucium flavum、Berberis laurina、B. Vulgaris、Corydalis spp、Fumaria spp、Dactylicapnos sppまたは別の種に由来してよい。いくつかの例では、そのＳＤＲ１遺伝子は、天然の遺伝子と７９％類似していてよい。
【０２７１】
前述の遺伝子の例は、プラスミド（２μ、ＡＲＳ／ＣＥＮ）、ＹＡＣまたはゲノムを含め、宿主細胞において、多種多様なプラットフォームから発現させることができる。加えて、前述の遺伝子配列の例は、天然型であることも、所望の異種宿主（例えばSaccharomyces cerevisiae）での発現のためにコドン最適化されていることもできる。
【０２７２】
例では、遺伝子操作された非植物宿主細胞は、カナジンからノスカピノイドまたはその前駆体を産生する。いくつかの例では、このノスカピノイドまたはその前駆体は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、Ｎ−メチルカナジン、ノスカピン、ナルコトリン、ナルコチンヘミアセタール、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール、Ｎ−メチルオフィオカルピン、１，１３−ジヒドロキシル−Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジン、ナルコトリノゲンジアール、ナルコトリナール及び１−ヒドロキシカナジンからなる群より選択される。更なる例では、この細胞は、ノスカピンを産生してよい。いくつかの例では、この細胞は、（Ｓ）−Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン、１−ヒドロキシ−１３−Ｏ−アセチル−Ｎ−メチルカナジン、４’−Ｏ−デスメチル−３−Ｏ−アセチルパパベロキシン、ナルコトリンヘミアセタール及びナルコトリンからなる群より選択される１つ以上のノスカピン前駆体を含む合成経路を介して、カナジンからノスカピノイドまたはその前駆体を産生してよい。
【０２７３】
いくつかの追加の例では、上記細胞は、１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種コード配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、この１つ以上の異種コード配列は、テトラヒドロプロトベルベリンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＮＭＴ）をコードしてよい。別の例では、この１つ以上の異種コード配列は、Ｎ−メチルカナジン１−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ８２Ｙ１）をコードする。更なる例では、この１つ以上の異種コード配列は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジン１３−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ８２Ｘ２）をコードする。加えて、この１つ以上の異種コード配列は、１，１３−ジヒドロキシル−Ｎ−メチルカナジン１３−Ｏアセチルトランスフェラーゼ（ＰｓＡＴ１）をコードしてよい。いくつかの例では、この１つ以上の異種コード配列は、４’−Ｏ−デスメチル−３−アセチルパパベロキシンシンターゼ（ＣＹＰ８２Ｘ１）をコードする。加えて、いくつかの例では、この１つ以上の異種コード配列は、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ（ＰｓＣＸＥ１）をコードしてよい。
【０２７４】
加えて、上記１つ以上の異種コード配列は、ノスカピンシンターゼ（ＰｓＳＤＲ１）をコードしてよい。別の例では、この１つ以上の異種コード配列は、ＰｓＭＴ３及びＰｓ６ＯＭＴより選択される１つ以上の酵素をコードしてよい。更に、この１つ以上の異種コード配列は、酵素のＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１及びＣＹＰ８２Ｘ２をコードしてよい。いくつかの実施形態では、上記の細胞は、ＣＰＲ酵素に対する異種コード配列を含んでよい。いくつかの例では、ＣＰＲ酵素はＡＴＲ１である。別の例では、その１つ以上の異種コード配列は、低コピーコンストラクトから発現させる。更なる例では、上記の細胞は、ＰｓＭＴ３、Ｐｓ６ＯＭＴ、ＰｓＭＴ２及びＣＹＰ８２Ｙ１より選択される１つ以上の酵素を欠損していてよい。
【０２７５】
場合によっては、上記の細胞は、ノスカピノイドを産生してよいとともに、Ｐ４５０、ハロゲナーゼ、グリコシラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、短鎖デヒドロゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼ及びプレニルトランスフェラーゼより選択される１つ以上の酵素に対する１つ以上の異種コード配列を含んでよい。いくつかの例では、この１つ以上の異種コード配列は、P. somniferum及びE. californicaより選択される起源生物に由来してよい。いくつかの例では、その細胞は、真核細胞である。場合によっては、その真核細胞は、酵母細胞である。更なる例では、その酵母細胞は、S. cerevisiae細胞である。加えて、場合によっては、その細胞は、その細胞と比べて異なる２つ以上の起源生物に由来する１つ以上の酵素を含む。更なる事例では、その細胞は、酵素をそれぞれコードするとともに、その細胞と比べて異なる起源生物にそれぞれ由来する異種コード配列を多数含む。加えて、その細胞は、ＴＮＭＴ酵素をそれぞれコードする２つ以上の異種コード配列を含んでよい。更に、ＴＮＭＴをそれぞれコードするその２つ以上の異種コード配列は、異なる起源生物に由来してよい。いくつかの実施形態では、それらの起源生物は、P. somniferum及びE. californicaから選択してよい。
【０２７６】
いくつかの追加の例では、上記１つ以上の異種コード配列は、１つ以上の変異酵素をコードしてよい。加えて、その１つ以上の変異酵素は、ＣＹＰ８２Ｙ１のＮ末端変異体であってよい。更なる例では、その細胞は、その１つ以上の異種コード配列に対する１つ以上のプロモーターを含んでよい。加えて、いくつかの事例では、その１つ以上のプロモーターは、強力プロモーターを含む。例では、そのプロモーターは、ＨＸＴ７、ＡＤＨ１、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＰＹＫ１、ＴＥＦ１、ＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＧＰＤからなる群より選択してよい。加えて、いくつかの例では、その１つ以上の異種コード配列は、ＣＹＰ８２Ｙ１またはＣＹＰ８２Ｙ１変異体をコードし、その１つ以上のプロモーターは、ＨＸＴ７を含む。場合によっては、その細胞は、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンまたは１−ヒドロキシカナジンを産生してよい。更に、いくつかの例では、その１つ以上の異種コード配列は、ＣＹＰ８２Ｘ２またはＣＹＰ８２Ｘ２変異体をコードし、その１つ以上のプロモーターは、ＨＸＴ７を含む。
【０２７７】
いくつかの追加の事例では、上記の細胞は、１，１３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルカナジンを産生する。加えて、その１つ以上の異種コード配列は、ＣＹＰ８２Ｘ２またはＣＹＰ８２Ｘ２変異体をコードしてよく、その１つ以上のプロモーターは、ＰＧＫ１及びＧＰＤを含む。更に、その細胞は、Ｎ−メチル−オフィオカルピンを産生してよい。その１つ以上の異種コード配列は、ＣＹＰ８２Ｘ１またはＣＹＰ８２Ｘ１変異体をコードしてよく、その１つ以上のプロモーターは、ＨＸＴ７を含む。加えて、その細胞は、４’−Ｏ−デスメチル−２−Ｏ−アセチルパパベロキシンを産生してもよく、またはその細胞は、ナルコトリナールとナルコトリノゲンジアールを産生してもよい。更なる例では、その細胞は、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）、ＤｎａＪタンパク質、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）９４、結合タンパク質（ＢｉＰ）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、サイクロフィリン、及びカルネキシンより選択される１つ以上の植物シャペロンを含んでよい。
【０２７８】
例では、上記細胞は、１つ以上の異種コード配列を多コピー含む。いくつかの例では、その１つ以上の異種コード配列は、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ２、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１及びＰｓＭＴ３より選択される１つ以上の酵素をコードする。加えて、いくつかの例では、１つ以上の異種コード配列の多コピーは、その細胞と比べて異なる２つ以上の起源生物に由来する。更なる例では、これらの酵素の１つ以上は、その酵母細胞内の一区画に空間的に局在化し、その区画は、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、液胞、核、細胞膜、ペルオキシソーム、及びペリプラズムから選択される。加えて、例では、その１つ以上の酵素は、酵母細胞内の区画の外側に空間的に局在化する。更に、例では、１つ以上の酵素は、酵母細胞内の区画の内側に空間的に局在化する。
【０２７９】
更なる例では、上記の細胞は、ノスカピンアルカロイドをノルラウダノソリンから産生してよい。加えて、その細胞は、ＴＮＭＴ、ＰｓＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ３、ＣＹＰ８２Ｙ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、Ｓ９ＯＭＴ、ＰｓＭＴ２、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＣＰＲ１、及びＣＹＰ７１９Ａより選択される１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種コード配列を含んでよい。更に、その細胞は、ＴＮＭＴ、ＰｓＡＴ１、ＣＹＰ８２Ｘ１、ＰｓＣＸＥ１、ＰｓＳＤＲ１、ＰｓＭＴ２をＹＡＣから発現させてよい。加えて、その細胞は、ＣＹＰ８２Ｙ１とＣＹＰ８２Ｘ１を低コピープラスミドから発現させてよい。別の例では、その細胞は、Ｓ９ＯＭＴを高コピープラスミドから発現させてよい。場合によっては、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＢＢＥ、ＣＰＲ１、及びＣＹＰ７１９Ａは、その細胞の染色体に組み込まれている。
【０２８０】
いくつかの例では、ノスカピノイドまたはその前駆体を調製する方法であって、タンパク質の産生に適する条件下で、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養して、ノスカピノイドまたはその前駆体を産生させることを含む方法を提供する。場合によっては、この方法は、細胞培養液からノスカピノイドまたはその前駆体を回収することを更に含んでよい。別の例では、この方法は、ＢＩＡをノスカピノイドから産生させるのに十分な条件下で、上記の細胞を培養する工程と、細胞培養液からＢＩＡを回収する工程を更に含んでよい。更なる例では、この方法は、出発化合物を細胞培養液に添加する工程を更に含んでよい。場合によっては、この出発化合物は、カナジンである。場合によっては、この出発化合物は、ノルラウダノソリンである。加えて、場合によっては、この出発化合物は、チロシンまたはチロシン類縁体である。更なる例では、この方法は、増殖用供給原料を細胞培養液に加えることを更に含んでよい。
【０２８１】
理解の明確化を目的として、実例と実施例によって、上記の発明についてある程度詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱せずに、特定の変更及び改変を行えることは、本発明の教示を鑑みれば、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【０２８２】
すなわち、上記は、本発明の原理を示しているに過ぎない。本明細書には明示的に記載されたりまたは示されたりしていないが、本発明の原理を具現するとともに、その趣旨と範囲内に含まれる様々な構成を当業者が考案できることは明らかであろう。更に、本明細書に示されているいずれの実施例及び特定の用語も、原則として、当該技術分野の進展に対して本発明者が寄与した本発明の原理と概念を理解するように読者を助けることが意図されており、具体的に示されているそのような実施例及び条件に限定されないものとして解釈すべきである。更に、本発明の原理、態様及び実施形態、ならびにその具体例について示している、本明細書内のいずれの記述も、その構造的均等物と機能的均等物の両方を包含するように意図されている。加えて、そのような均等物には、現在知られている均等物と、今後開発される均等物、すなわち、開発されるいずれかの要素であって、構造に関係なく、同じ機能を果たすいずれかの要素の両方が含まれることが意図されている。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示されているとともに記載されている例示的な実施形態に限定されるようには意図されていない。むしろ、本発明の範囲と趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現される。
【図１】
2018500002.tif 000015
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４−１】
2018500002.tif 000019
【図４−２】
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【図５】
2018500002.tif 000021
【図６】
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【図７】
2018500002.tif 000023
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018500002.tif 000026
【図１１】
2018500002.tif 000027
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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