(57)【要約】本発明は、小分子−タンパク質複合体を封入し、生理的条件下での小分子−タンパク質複合体の形成を確実にする一方、精製および同定の間、前記小分子−タンパク質複合体を保護する、ウイルス様粒子に関する。本発明はさらに、小分子−タンパク質複合体の単離および同定のための、このようなウイルス様粒子の使用に関する。
2018517397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む人工ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：
（ａ）ＶＬＰ形成ポリペプチド；
（ｂ）互いに共有結合的につながる二つの小分子を含む融合構成物であって、第１の小分子はＶＬＰ形成ポリペプチドと相互作用し、第２の小分子は、ＶＬＰ形成ポリペプチドとは異なる、少なくとも一つのポリペプチドと相互作用する、融合構成物；および
（ｃ）（ｂ）の第２の小分子と相互作用するポリペプチド。
【請求項２】
ＶＬＰ形成ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項１記載の人工ＶＬＰ。
【請求項３】
ＶＬＰ形成ポリペプチドがＨＩＶ ｐ５５ ＧＡＧタンパク質を含む融合タンパク質である、請求項１または２記載の人工ＶＬＰ。
【請求項４】
小分子−タンパク質相互作用の検出のための、請求項１から３のいずれかに記載の人工ＶＬＰの使用。
【請求項５】
小分子−タンパク質相互作用を検出する方法であって、以下を含む方法：
１）細胞中にＶＬＰ形成ポリペプチドを発現させる；
２）互いに共有結合的につながる二つの小分子を含む融合構成物を、前記ＶＬＰ形成ポリペプチドに補充する、ここで第１の小分子はＶＬＰ形成ポリペプチドと相互作用し、第２の小分子は、ＶＬＰ形成ポリペプチドとは異なる、少なくとも一つのポリペプチドと相互作用する；
３）ポリペプチドを、（２）の融合構成物の第２の小分子と相互作用させる；
４）ＶＬＰを単離する；および
５）封入された複合体を分析する。
【請求項６】
ＶＬＰをアフィニティークロマトグラフィーによって単離する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
封入された複合体を質量分析によって分析する、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
ＶＬＰ形成ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＶＬＰ形成ポリペプチドがＨＩＶ ｐ５５ ＧＡＧタンパク質を含む融合タンパク質である、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、小分子−タンパク質複合体を封入し、生理的条件下での小分子−タンパク質複合体の形成を確実にする一方、精製および同定の間、前記小分子−タンパク質複合体を保護する、ウイルス様粒子に関する。本発明はさらに、小分子−タンパク質複合体の単離および同定のための、このようなウイルス様粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質−タンパク質相互作用などの分子間相互作用は実質的に全ての細胞内プロセスに必須の要素である。細胞内の二以上の化合物の結合は、シグナル伝達の調節、遺伝子転写の制御、および細胞の複製またはアポトーシスの促進を含む、多様な効果を持ち得る。いくつかのヒト疾患は分子間相互作用の機能不全に関連する。
【０００３】
研究者は分子間相互作用を同定する試みの中でいくつかの手法を開発してきた。タンパク質−タンパク質相互作用の検出における主要なブレークスルーは、遺伝学的な手法の導入によって得られ、中でも酵母ツーハイブリッド法(Fields and Song, 1989)は最も重要な手法である。この技術は広く用いられるようになったが、いくつかの欠点がある。融合タンパク質は核への移行を必要とするが、これは常に明白なわけではない。内因的な転写活性の性質を持つタンパク質は偽陽性の信号を生じ得る。さらに、リン酸化などのタンパク質の二次修飾に依存する相互作用は容易に検出できない。
【０００４】
一以上のこれらの問題を解決するため、いくつかの代替のシステムが開発されてきた。
ファージディスプレイに基づく方法は核移行を回避できる。WO9002809は、繊維状ファージなどのファージの表面に結合タンパク質をディスプレイする方法を記述する。ここで、結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列はファージ内にパッケージされている。標的分子を認識する結合タンパク質を有するファージを単離し、増幅する。例えばWO9220791、WO9710330およびWO9732017に記述されるように、ファージディスプレイの手法のいくつかの改善が提案されてきた。
【０００５】
しかしながら、これら全ての方法はファージディスプレイの方法論に固有の困難に苦しむ：タンパク質をファージ表面に露出する必要があるため、生理的に関連のない環境に曝されることになる。さらに、ファージライブラリーのスクリーニング時に、ファージ間の競合が起こり、結果として親和性の高いバインダーが選択される。
【０００６】
タンパク質−タンパク質相互作用の検出における主要な改善は、いわゆるＭａｐｐｉｔシステムを記述するWO0190188に開示された。サイトカイン受容体に基づくこの方法は、哺乳類細胞中のタンパク質−タンパク質相互作用の信頼できる検出を可能にするだけでなく、修飾に依存するタンパク質相互作用および小さな化合物を介する複雑な３種複合のタンパク質−タンパク質相互作用を検出できる(Caligiuri et al., 2006)。しかしながら、非常に有用であるが、このシステムは感度が制限され、いくつかの弱い相互作用は検出できない。さらに、これは膜に基づくシステムであるため、核の相互作用は通常検出されない。最近、いくつかのこれらの欠点を解決する、細胞質内相互作用のトラップが述べられてきた(WO2012117031)。しかしながら、これら全ての「遺伝子的な」システムは、相互作用のパートナー両方の過剰発現に頼っており、これは相互作用のパートナーの濃度の人為的な増加による偽陽性の信号をもたらし得る。
【０００７】
上述の遺伝子的なタンパク質−タンパク質相互作用の検出方法の代替として、質量分析（ＭＳ）に基づくプロテオミクスを組み合わせた生化学または同時精製の戦略(Paul et al., 2011; Gingras et al., 2007)を用いることができる。同時精製の戦略において、通常、界面活性剤に基づく溶解のプロトコルによって、細胞のホモジネートを調製し、その後（二重の）タグの手法(Gavin et al., 2002)を用いて、または特異的な抗体を経由して(Malovannaya et al., 2011)捕捉する。そして実際の分析を行う前に、主として現代のＭＳ装置の感度を補償するため、細胞の構成物の「スープ」から抽出したタンパク質複合体は、いくつかの洗浄の工程を生き延びなければならない。洗浄の程度または利用できる緩衝液およびそれらのストリンジェンシーについて、明確なガイドラインはない。ほとんどの溶解および洗浄のプロトコルは実際には純粋に経験的であり、相互作用のモデルを用いて最適化された。それゆえ、これらの工程中の因子の減少（偽陰性）、または細胞の完全性の減少による偽の相互作用の可能性（偽陽性）を推測することは困難である。代謝標識を用いる戦略は、精製マトリックスに固着するタンパク質間および、ベイトタンパク質に特異的に結合するタンパク質間の分離を可能とする。精製条件および使用するＭＳ装置の感度に依存して、ゲルを含まないＡＰ−ＭＳ実験における溶出分画中の1000を超えるタンパク質を例外なく発見する(www.crapome.org)。
【０００８】
小分子で標的タンパク質を同定する古典的な方法は、小分子を添加する「精製ハンドル(purification handle)」の使用に頼っている。ビオチン群は通常、リンカーを介して分子の許容できる部位に優先的に、小分子を修飾するために用いられる。そして修飾した小分子は、可溶化液におけるストレプトアビジンビーズを用いる古典的なプルダウン法によって、結合する分子を捕捉するために用いられる。最近の実施では、Ongおよびその同僚が、小分子に特異的に結合するタンパク質を決定するための、代謝標識（細胞培養中の安定同位体標識−ＳＩＬＡＣ）に基づく定量的なプロテオミクスの使用を記述する。著者は小分子とビーズとの直接的な化学的結合によって調製した「小分子ビーズ」を用いた(Ong et al., 2009)。Bantscheffおよびその同僚は、広範なキナーゼ阻害剤の一団をマトリックスと結合する方法を記述した。カイノームの重要な部分と結合するために、このマトリックスを細胞の可溶化液と共にインキュベートした。候補のキナーゼ阻害剤の濃度を増加することによって、標的および標的外のキナーゼが同定できる(Bantscheff et al., 2007)。この手法の主な制限は、キナーゼファミリー以外の広範な特異的な阻害剤の欠乏であり、このことは他のタンパク質標的ファミリーのための戦略への変換を困難にしている。加えて、キナーゼファミリー以外の標的外のものは容易に同定できない。別の非常に最近の開発は、小分子の結合によるタンパク質の熱安定性の変化を評価するための熱プロファイリングである。タンパク質は、リガンドの結合または翻訳後修飾に影響される温度に依存して、凝集する傾向がある。Savitskiおよびその同僚は、定量的なプロテオミクスの手法を用いるプロテオームワイド(proteome-wide)方式でこの分析を行い、種々の小分子における既知および新規の標的を同定できた(Savitski et al., 2014)。
【０００９】
最近、タンパク質の生理的環境でのタンパク質−タンパク質相互作用を評価することを可能にする、同時精製の技術がWO2013174999に開示された。複合体を、ヒト細胞から出芽する人工ウイルス様粒子（ＶＬＰ）内に、ｐ５５ ＧＡＧタンパク質を介してトラップする。この複合体は、濃縮処理中、いわゆる「ウイルストラップ(Virotrap)粒子」内で保護される。しかしながらウイルストラップは、操作の条件付きの方法においてさえ、従来未知の小分子−タンパク質相互作用を同定しない。
生理的条件下で小分子−タンパク質複合体を封入し、それによって生理的に関連のある小分子−タンパク質相互作用を評価することは好都合である。
【発明の概要】
【００１０】
生理的に関連のある条件下で従来未同定の小分子−タンパク質相互作用を単離するための溶液を見出すことができるかどうかを評価するため、我々は種々の単離プロトコルを評価した。
【００１１】
驚くべきことに、最近記述されたウイルストラップのプロトコル(WO2013174999)に由来する新規の方法が、小分子をその生理的な結合パートナーと共に、ヒト細胞から出芽するＶＬＰ内へトラップするためにも使用できることを発見した。複合体の非常に穏やかな濃縮は、生理的環境において関連する小分子−タンパク質相互作用の同定を確実にする。
【００１２】
第１の態様において、本明細書は以下を含む人工ウイルス様粒子を提供する：
（ａ）ＶＬＰ形成ポリペプチド；
（ｂ）互いに共有結合的につながる二つの小分子を含む融合構成物、ここで第１の小分子はＶＬＰ形成ポリペプチドと相互作用し、第２の小分子は、ＶＬＰ形成ポリペプチドとは異なる、少なくとも一つのポリペプチドと相互作用する；および
（ｃ）（ｂ）の第２の小分子と相互作用するポリペプチド。
【００１３】
特別な実施態様において、ＶＬＰ形成ポリペプチドは融合タンパク質である。さらなる特別な実施態様において、ＶＬＰ形成ポリペプチドはＨＩＶ ｐ５５ ＧＡＧタンパク質を含む融合タンパク質である。
【００１４】
小分子−タンパク質相互作用の検出のための、人工ＶＬＰの使用もまた提供される。
さらなる実施態様において、小分子−タンパク質相互作用を検出するための方法を提供する、ここでこの方法は以下を含む：
（１）細胞中にＶＬＰ形成ポリペプチドを発現させる；
（２）互いに共有結合的につながる二つの小分子を含む融合構成物を前記のＶＬＰ形成ポリペプチドに補充する、ここで第１の小分子はＶＬＰ形成ポリペプチドと相互作用し、第２の小分子は、ＶＬＰ形成ポリペプチドとは異なる、少なくとも一つのポリペプチドと相互作用する；
（３）ポリペプチドを（２）の第２の小分子と相互作用させる；
（４）ＶＬＰを単離する；および
（５）封入された複合体を分析する。
【００１５】
特別な実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーに基づく方法でＶＬＰを単離する。
特徴的な実施態様において、質量分析に基づく方法で封入された複合体を分析する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１：小分子−タンパク質をトラップする方法の一般的な概観。ＧＡＧ−ｅＤＨＦＲ融合タンパク質（１）（すなわち、ＶＬＰ形成ポリペプチド）の発現は、膜直下の多量体化（２）およびそれに続く細胞からのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の出芽（３）をもたらす。その後、生理条件下でタンパク質複合体を精製する方法を提供する、共複合体(co-complex)ＭＳ分析（４）によって、ＶＬＰを精製および分析してもよい。ＶＬＰ生成中の小分子融合構成物の添加は結果として、小分子融合構成物とＧＡＧ−ｅＤＨＦＲ融合タンパク質との結合および小分子と相互作用するタンパク質のＶＬＰ内へのトラップをもたらす。
【００１７】
【図２】図２：小分子−タンパク質相互作用をトラップするための、ＶＬＰ形成ポリペプチドＧＡＧ−ｅＤＨＦＲの使用のスキーム。限定されない例として、標的の相互作用するタンパク質複合体を、小分子融合構成物であるメトトレキサート（ＭＴＸ）−ＰＥＧ−シンバスタチンを経由して、ＧＡＧ−ｅＤＨＦＲ融合タンパク質に補充する。
【図３】図３：本研究で用いる種々の小分子融合構成物の化学構造。
【００１８】
【図４】図４：ＭＴＸ−ＰＥＧ６−タモキシフェン分子とＨＳＤ１７Ｂ４との間の相互作用において得られたＭＡＳＰＩＴ信号の用量反応曲線。ルシフェラーゼ活性を、小分子融合物なしで処理した対照試料と比較して、誘導倍率として表す。エラーバーはテクニカルトリプリケート(technical triplicate)の標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
定義
本発明は特別な実施態様に対して、および特定の図に関連して記述されるが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲にのみ限定される。特許請求の範囲におけるいかなる引用の記載も、範囲を限定するものとして構成されていない。描画された図は模式的であるのみで、非限定的である。図において、いくつかの要素のサイズは誇張されていることがあり、縮尺を説明する目的で描画されていない。用語「含む」は本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、他の要素または工程を除外しない。例えば「ａ」または「ａｎ」のように、単数名詞を指す際に不定または定冠詞を使用する場合、他に明確な記述がない限り、これは複数のその名詞を含む。
【００２０】
さらに、本明細書内および特許請求の範囲内における、第１、第２、第３などの用語は、同様の要素間を区別するために使用し、連続的または経時的な順序で記述する必要はない。そのように使用されるこの用語は適切な状況下で可換であり、本明細書に記述する発明の実施態様は、本明細書で記述または説明した順序と別の順序で操作できることが理解される。
【００２１】
下記の用語または定義は単に、本発明の理解を助けるために提供される。本明細書で明確に定義しない限り、本明細書で用いる全ての用語は、本発明の当業者が用いる意味と同じ意味を持つ。当分野の定義および用語について、専門家は特に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989);およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)を参照する。本明細書で与えられる定義は、当業者に理解されるよりも狭い範囲を持つように解釈されるべきではない。
【００２２】
本明細書において、「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、少なくともウイルス粒子を形成するポリペプチドを含むが、好ましくはウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを持たない粒子である。本明細書において、「ウイルス様粒子を形成するポリペプチド」または「ＶＬＰ形成ポリペプチド」は、当業者に知られており、ウイルス粒子の構築および、好ましくは細胞における前記粒子の出芽を可能とするポリペプチドまたはタンパク質である。ＶＬＰを形成するタンパク質はＶＬＰを形成するのに十分であり、ＶＬＰ内には通常一以上の（通常同一の）ＶＬＰを形成するタンパク質がある。特徴的な実施態様において、ＶＬＰ形成ポリペプチドはＶＬＰを形成するタンパク質と、別のタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質サブユニットとの融合タンパク質である。特に、本明細書で記述するＶＬＰはウイルス性の遺伝物質を含まないと予想されるため、それらは非感染性である。ポリペプチドはアミノ酸の重合体を指し、分子の特定の長さを指さない。この用語はまた、天然に生じるアミノ酸のグリコシル化、リン酸化およびアセチル化などの、ポリペプチドの修飾を含み、一以上の天然に生じるアミノ酸の非天然類似体への置換を含む。
【００２３】
本明細書における「二つの小分子を含む融合構成物」は互いに共有結合的につながる二つの小分子を含む。ここで第１の小分子は、ＶＬＰ形成ポリペプチドと相互作用する「補充要素」として機能し、言及される。第２の小分子は「ベイト」として機能し、言及され、ウイルス様粒子を形成するポリペプチドとは異なる少なくとも一つのポリペプチド（「プレイ」ポリペプチド）と相互作用する。「小分子」は、１０，０００ダルトンまたはそれよりも低い分子量を持つ、天然または合成の、低分子量の有機化合物である。「相互作用する」とは通常、限定されないが、「結合する」を意味する。注意すべきことは、相互作用は間接的でもよい。ＶＬＰに補充される融合構成物に関する、用語「補充される」は、融合構成物の補充要素をＶＬＰ形成ポリペプチドと相互作用および／または結合させることを指す。
【００２４】
第１の態様において、以下を含む人工ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する：
（ａ）ＶＬＰ形成ポリペプチド；
（ｂ）互いに共有結合的につながる二つの小分子を含む融合構成物、ここで第１の小分子（「補充要素」）はＶＬＰ形成ポリペプチドと相互作用し、第２の小分子（「ベイト」）は、ＶＬＰ形成ポリペプチドとは異なる、少なくとも一つのポリペプチドと相互作用する；および
（ｃ）（ｂ）の第２の小分子（「ベイト」）と相互作用するポリペプチド（「プレイ」）。
【００２５】
ＶＬＰは多数のウイルスに由来し得る。このような粒子の例は当分野で記述されており、限定されないが、パルボウイルス科（アデノ随伴ウイルスなど）、レトロウイルス科（ＨＩＶなど）、フラビウイルス科（Ｃ型肝炎ウイルスなど）、オルトミクソウイルス科（インフルエンザウイルスなど）、およびラブドウイルス科（水疱性口内炎ウイルスなど）を含むウイルス科に由来する粒子を含む。この粒子は通常、エンベロープまたはカプシドなどのウイルス構造タンパク質を含み、結果としてウイルス様粒子の自己組織化をもたらす。
【００２６】
特徴的な実施態様において、ＶＬＰ形成ポリペプチドは融合タンパク質である。従って、これらの実施態様においては、このようなウイルス構造タンパク質をそのまま用いるのではなく、タンパク質（またはその機能的な部分）を別のポリペプチドと融合させる。このように、ウイルス粒子を形成するポリペプチドは、通常（必ずではないが）二つの異なるタンパク質に由来する、二つの異なるポリペプチドドメインを含む（または、からなる）。
【００２７】
特別な実施態様において、前記ＶＬＰ形成ポリペプチドは、修飾が粒子の形成を阻害しない限り、天然に生じるＶＬＰを形成するタンパク質の修飾型でもよい。本明細書における修飾または機能性フラグメントは、本発明における小分子−タンパク質複合体を封入可能なウイルス様粒子を未だ形成できる、修飾または機能性フラグメントである。修飾の例は、例えば、欠失および／または変異を含む。バックグラウンドのタンパク質のリストを最小化することを目的とする、ＶＬＰ形成ポリペプチドと宿主タンパク質との結合を減少する欠失および／または変異が特に予想される。
【００２８】
ＶＬＰ形成ポリペプチドはＨＩＶ ｐ５５ ＧＡＧタンパク質であることが特に予想される。さらなる特別な実施態様において、ＶＬＰ形成ポリペプチドはＨＩＶ ｐ５５ ＧＡＧタンパク質を含む融合タンパク質である。好ましくは、ｐ５５ ＧＡＧタンパク質と融合するポリペプチドはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、さらに好ましくは大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅＤＨＦＲ）を含む。
【００２９】
人工ＶＬＰは、互いに共有結合的につながる二つの小分子を含む融合構成物を含む。二つの小分子は通常、１０，０００ダルトンまたはそれよりも低い分子量の化合物から独立に選択される。特に、融合構成物は、それぞれが５，０００ダルトンまたはそれよりも低い分子量の二つの化合物を含む。特に、小分子は２，０００ダルトンまたはそれよりも低い分子量の化合物を含む。特に、小分子は１，０００ダルトンまたはそれよりも低い分子量、最も特別な場合、５００ダルトンまたはそれよりも低い分子量の化合物を含む。
【００３０】
補充要素がＶＬＰ形成ポリペプチドと結合し、通常ウイルス様粒子内に一以上のＶＬＰ形成ポリペプチドがあるので、ＶＬＰ内に一以上の融合構成物があり得る。通常、二つの小分子を含む融合構成物は、ＶＬＰ内で同一である（そのため、同様のプレイタンパク質を同定できる）が、そうでなくてもよい。融合構成物は補充要素として働く小分子を含み、ベイトとして働く小分子を含み、ここで両分子は共有結合的に結合している。融合構成物内で用いる共有結合のリンカーの性質および長さは本発明に重要でない（ＶＬＰ内への取り込みを妨害しない限り）。融合構成物内の分子間の共有結合性のリンカーとして、ポリエチレングリコールの使用が本明細書で特に予想される。
【００３１】
本明細書における小分子の補充要素は、小分子のベイトをその生理的な結合パートナーと共に、直接的または間接的にＶＬＰ内へ補充する化合物である。通常、ＶＬＰ形成ポリペプチドとの結合によって、これはなされる。言い換えると、小分子の補充要素はＶＬＰ形成ポリペプチドと親和性を持ち、ＶＬＰ形成ポリペプチドと相互作用（または結合）できる。
【００３２】
ＶＬＰ形成ポリペプチドは融合タンパク質であることが特に予想されるため、小分子の補充要素は天然のＶＬＰ形成ポリペプチドとの親和性を必要としないが、異なるタンパク質との親和性を持ち得る。これは、補充要素およびＶＬＰ形成ポリペプチドの選択において、より高い柔軟性を許容する。これらの実施態様において、ＶＬＰ形成ポリペプチドの融合タンパク質のパートナーは、小分子融合物の補充要素と相互作用する。
【００３３】
一定のタンパク質と親和性を持つ多くの小分子が当業者に知られており、融合タンパク質が未だ効率的にＶＬＰを形成する条件においては、結合ペア（補充要素／ＶＬＰ形成ポリペプチドの融合タンパク質のパートナー）の性質は重要ではない。特別な実施態様において、小分子の補充要素は、メトトレキサート（ＭＴＸ）およびトリメトプリム（ＴＭＰ）からなる群から選択される。特徴的な実施態様において、小分子の補充要素はＭＴＸではない。特徴的な実施態様において、二つの小分子を含む融合構成物はＭＴＸに基づく融合構成物ではない。
【００３４】
融合構成物のもう一つの小分子であるベイト分子は、相互作用するポリペプチドを引きつけるために用いる。ベイト分子の結合パートナーは既知（例として修飾したタンパク質において、相互作用を確認するためなど）または未知（例えば、一定の小分子薬剤の標的を同定する場合）でよい。特徴的な実施態様において、ベイト分子の結合パートナー（プレイタンパク質）は未知である。特徴的な実施態様において、小分子のベイトは既知であり、相互作用するプレイタンパク質は未知である。小分子とそのプレイタンパク質との間の相互作用は、共有結合的または非共有結合的でよく、直接的または間接的でよい。特徴的な実施態様において、小分子ベイトと相互作用するプレイタンパク質との間の相互作用は直接的である。特別な実施態様において、ポリペプチドのベイトは未知であり、既知の小分子のベイトと結合する。
【００３５】
特徴的な実施態様において、以下からなる人工ＶＬＰを提供する：
（ａ）ＶＬＰ形成ポリペプチド；
（ｂ）互いに共有結合的につながる二つの小分子を含む融合構成物、ここで第１の小分子（「補充要素」）はＶＬＰ形成ポリペプチドと相互作用し、第２の小分子（「ベイト」）は、ＶＬＰ形成ポリペプチドとは異なる、少なくとも一つのポリペプチドと相互作用する；および
（ｃ）（ｂ）の第２の小分子（「ベイト」）と相互作用するポリペプチド（「プレイ」）。
【００３６】
非常に特徴的な実施態様において、小分子のベイトはＦＫ５０６ではない。小分子の融合構成物および相互作用するポリペプチドに加えて、ウイルス様粒子は、小分子−タンパク質複合体に補充される他の化合物を含んで良く、ここで全ての化合物は共に一つの複合体を形成する。特別な実施態様において、上述のＶＬＰは二つの分子間相互作用を封入する、すなわち、ＶＬＰ形成ポリペプチドと二つの小分子を含む融合構成物との間の分子間相互作用および前記融合構成物とプレイタンパク質との間の分子間相互作用である。非常に特徴的な実施態様において、上述のＶＬＰは三つの分子間相互作用を封入しない、すなわち、最大で上述の二つの分子間相互作用である。非常に特徴的な実施態様において、前記分子間相互作用は非共有結合的な相互作用である。特徴的な実施態様において、前記分子間相互作用は、限定されないがリン酸化などの、翻訳後修飾のきっかけとならない。いくつかの実施態様において、小分子のベイトと相互作用するプレイポリペプチドは生理的条件で単離されたポリペプチド、すなわち天然に生じるポリペプチドまたはその部分であり、融合タンパク質ではない。特別な実施態様において、プレイポリペプチドは融合タンパク質であり、ここで未知のプレイポリペプチドは既知の（融合のパートナーの）タンパク質と融合し、融合のパートナーのタンパク質はベイトとして働かない。いくつかの実施態様において、相互作用するポリペプチドは融合構成物のベイト小分子と相互作用する唯一のパートナーである。しかしながら、一以上の同一のタンパク質を一つのＶＬＰ内に含むこともでき（例えば融合構成物が一以上の同一のタンパク質と相互作用する場合）、ここで各プレイタンパク質はベイトと直接的に相互作用する。いくつかの実施態様において、二以上の異なるタンパク質の複合体を一つのＶＬＰ内に含み、ここで前記異なるタンパク質はベイトと直接的および／または間接的に相互作用する。
【００３７】
プレイタンパク質は、内在性タンパク質であってもよく、ＶＬＰを生成する細胞中に、発現プラスミドによる遺伝子導入またはＲＮＡの遺伝子導入によって与えられてもよく、また組換えタンパク質として直接添加されてもよい。注意すべきことは、一つのバイト小分子はいくつかのプレイポリペプチドと結合でき得る。従って、ＶＬＰ内で第２の小分子と相互作用するポリペプチド（「プレイ」）を指す場合、「ａ」は一以上であることを明確に意味する。実際、たとえ単一種の融合構成物を用いても、同じＶＬＰ内に種々のポリペプチドがあり得る。
【００３８】
ＶＬＰ形成ポリペプチド（または通常、多数のそれ）は、中空の粒子からなるウイルス構造を形成し、それは小分子の融合構成物および相互作用する（プレイ）ポリペプチドをトラップする。特別な実施態様において、小分子の融合物は前記ウイルス構造に係留され(anchored)、小分子の融合物およびプレイポリペプチドによって形成する複合体をウイルス様粒子内部へ捕捉することを確実にする。好ましくは、小分子の融合物の係留はＶＬＰ形成ポリペプチドに直接なされ、いかなる独立したリンカー分子も含まない。「独立したリンカー分子」は、本発明において、一方でウイルス粒子を形成するタンパク質と、他方で融合タンパク質と、非共有結合的に結合する分子である。
【００３９】
本明細書で提供するＶＬＰは、特に天然および／または生理的条件における、小分子−タンパク質相互作用の検出に特に有用である。従って、本発明の別の態様において、本明細書で記述する人工ウイルス様粒子の使用は、小分子−タンパク質相互作用の検出のために提供される。
【００４０】
本発明のさらに別の態様は、小分子−タンパク質相互作用を検出する方法であって、以下を含む：（１）細胞中にＶＬＰ形成ポリペプチドを発現させる；（２）互いに共有結合的につながる二つの小分子を含む融合構成物を、前記ＶＬＰ形成ポリペプチドに補充する、ここで第１の小分子はＶＬＰ形成ポリペプチドと相互作用し、第２の小分子は、ＶＬＰ形成ポリペプチドとは異なる、少なくとも一つのポリペプチドと相互作用する；（３）ポリペプチドを（２）の融合構成物の第２の小分子と相互作用させる；（４）ＶＬＰを単離する；および（５）封入された複合体を分析する。特徴的な実施態様において、上述の方法は新規の小分子−タンパク質相互作用、すなわち以前に記述されていない小分子とタンパク質の相互作用を検出する。特別な実施態様において、上述の方法は既知の小分子のベイトと未知のタンパク質との間の相互作用を検出する。前記未知のタンパク質は、例えば、（限定ではないが）ｃＤＮＡライブラリーから表現され得る（限定ではないが）タンパク質ライブラリーによって提供され得る。特徴的な実施態様において、前記タンパク質ライブラリーは小分子のベイトの、１以上の有望な結合パートナーを提供する。特徴的な実施態様において、前記タンパク質ライブラリーは小分子のベイトの、２以上の有望な結合パートナーを提供する。特徴的な実施態様において、前記タンパク質ライブラリーは小分子のベイトの、１０以上の有望な結合パートナーを提供する。特徴的な実施態様において、前記タンパク質ライブラリーは小分子のベイトの、１０２以上の有望な結合パートナーを提供する。特徴的な実施態様において、前記タンパク質ライブラリーは小分子のベイトの、１０３以上の有望な結合パートナーを提供する。特徴的な実施態様において、前記タンパク質ライブラリーは小分子のベイトの、１０４以上の有望な結合パートナーを提供する。特徴的な実施態様において、前記タンパク質ライブラリーは小分子のベイトの、１０５以上の有望な結合パートナーを提供する。特徴的な実施態様において、前記タンパク質ライブラリーは小分子のベイトの、１０６以上の有望な結合パートナーを提供する。特別な実施態様において、単一の小分子ベイトを、タンパク質ライブラリーをスクリーニングするために用いる。特別な実施態様において、単一の小分子ベイトを、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いる。特別な実施態様において、単一の小分子ベイトを、ＯＲＦライブラリーをスクリーニングするために用いる。
【００４１】
好ましくは、前記細胞は哺乳類細胞である。工程１〜３は、結果として内部に複合体を封入するＶＬＰの生成をもたらす。工程１〜３の順序は異なってもよい。例えば、第２の小分子と相互作用するポリペプチドは、融合構成物の第１の小分子とＶＬＰ形成ポリペプチドとの相互作用よりも先に、最初に融合構成物と結合しても良い。ＶＬＰの単離は、例えば精製タグを用いて行ってもよい。シュードタイピングのレンチウイルスベクターに通常用いる膜貫通タンパク質である、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）のタグされたバージョン（例えばＦＬＡＧタグ）を、単純な一工程の精製が可能なプロデューサー細胞中で発現できる。その後通常、単離を、アフィニティークロマトグラフィーまたはタグに対して作られる抗体（例えば、Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体）を用いる同様の方法によって行う。ＶＳＶ−Ｇ自身または表面に存在する他の分子に対して作られる抗体を、ＶＬＰを濃縮するために用いてもよい。ＶＬＰを濃縮する他の方法は、ＶＬＰを含む上清の超遠心、ＶＬＰを含む上清の勾配遠心または沈殿剤を用いる上清からのＶＬＰの沈殿を含む。これらの方法は、ＶＬＰをペレットにするための遠心の工程を必要とする。これらのペレットを再溶解し、分析のために処理してもよい。粒子を濃縮し、精製するための濾過のキットもまた利用できる。
【００４２】
通常、封入された複合体の分析は第２の小分子と相互作用するポリペプチドの同定を伴う。特に、封入された分子複合体の分析は、ＭＳに基づく分析である。特定のポリペプチドが予想される場合、粒子内におけるそのポリペプチドの存在を確かめるため、ウエスタンブロット解析を行ってもよい。いかなる性質の分子間相互作用も本方法で検出できることが、当業者に明らかである。
【００４３】
本発明における細胞および方法について、特別な実施態様、特徴的な形態および物質および／または分子を本明細書で論じてきたが、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、形式上および細部の様々な変化または修飾が施され得ることが理解される。下記の実施例は、特別な実施例をよりよく説明するために提供され、それらは本出願を限定するように考慮されるべきではない。本出願は特許請求の範囲にのみ限定される。
【実施例】
【００４４】
試料と方法
プラスミドの作成
ｐ５５ ＧＡＧ融合構成物を、ｐＣＭＶ−ｄＲ８．７４パッケージングコンストラクト(packaging construct)(Addgene)からのプライマー１（５’−ＣＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧ−３’）およびプライマー２（５’−ＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣＣＧＣＣＴＴＧＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＣ−３’）を用いるｐ５５ ＧＡＧをコードする配列のＰＣＲ増幅および続くＭＡＰＰＩＴシステム(Eyckerman et al., 2001)に用いるＲａｓ発現ベクターである、ｐＭＧ１−ＲａｓにおけるIn-Fusion（商標）反応(Clontech)によって、生成し、結果として強いＳＲａｌｐｈａプロモーター（ｐＭＥＴ７−ＧＡＧ−Ｒａｓ）制御下でｐ５５ ＧＡＧ−ＲＡＳをもたらした。ＣＭＶプロモーター制御下でＶＳＶ−Ｇを発現する、ｐＭＤ２．ＧシュードタイピングベクターはDidier Trono(EPFL, Lausanne, Switzerland)によって快く提供された。ＶＳＶ−Ｇの細胞外側の許容的な部位内にそれぞれのエピトープをコードする配列を導入することによって、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＶＳＶ−ＧおよびｐｃＤＮＡ３−Ｅｔａｇ−ＶＳＶ−Ｇをクローン化した。大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅＤＨＦＲ）をコードする配列を、以前のコンストラクトからｐＭＥＴ７−ＧＡＧプラスミドに導入した(Risseeuw et al., 2013)。小分子融合物の合成は以前に記述された(Risseeuw et al., 2013; Lievens et al., 2014)。
【００４５】
ＶＬＰの生成および分析
質量分析のため、５個のフラスコ（７５ｃｍ２）に１０７個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、翌日ポリエチレンイミン試薬を用いてフラスコ毎に全１５μｇのＤＮＡを遺伝子導入した。フラスコ毎に下記のＤＮＡ量を用いた：７．５μｇのＧＡＧ−ｅＤＨＦＲ、５．４μｇのモックベクター(mock vector)ならびに２．１μｇのｐＭＤ２．ＧおよびｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＶＳＶ−Ｇの５０／５０の混合物。遺伝子導入後すぐに、１μＭの濃度の産生性の細胞に小分子融合物を添加した。細胞におけるこの化学物質の効果を制御するため、対照実験において、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）の同様の希釈物を添加した。３２時間後に細胞の上清を回収し、細胞のデブリを除去するため、４５０ｘｇで３分間遠心した。その後清澄な上清を０．４５μｍのフィルター(Millipore)で濾過した。１０μｇのANTI-FLAG（登録商標）ＢｉｏＭ２−ビオチン抗体(Sigma-Aldrich（登録商標）)と共にあらかじめ組み込まれている全１００μｌのMyOne（商標）ストレプトアビジンＴ１ビーズ(Life Technologies)を用いて、タグされた粒子を結合した。２時間の縦回転によって、粒子を結合させた。全ての上清を３つの連続する結合の工程で処理した。ビーズ−粒子複合体を洗浄緩衝液（ＴＷＢ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で一度洗浄し、その後ＦＬＡＧペプチド（ＴＷＢ中で２００μｇ／ｍｌ）で溶出し、終濃度０．１％のＳＤＳの添加によって溶解した。５分後、ＨｉＰＰＲ界面活性剤除去スピンカラム(Pierce, Thermo Scientific)でＳＤＳを除去し、次に煮沸し、０．５μｇのシークエンスグレード(sequence-grade)トリプシン(Promega)で一晩消化した。酸性化後（終濃度０．１％ＴＦＡ）、ナノＬＣでペプチドを分離し、Q Exactive装置(Thermo Scientific)で直接解析した。ＭＡＳＣＯＴアルゴリズム(Version 2.4.1. Matrix Science)を用いて、ＨＩＶ−１、ＥＧＦＰ、ＶＳＶ−ＧおよびＦＬＡＧ−ＶＳＶ−Ｇのタンパク質配列を補完する、ヒトおよびウシのSWISSPROTの目録（２０１３＿０２公開）に対して９９％の信頼度で、探索を行った。
【００４６】
実施例１：シンバスタチンバインダーのウイルストラッピング
シンバスタチンバインダーについてのスクリーニングのため、細胞にＧＡＧ−ｅＤＨＦＲコンストラクトを遺伝子導入し、遺伝子導入後すぐに細胞をＭＴＸ−ＰＥＧ６−シンバスタチン分子で処理した。４つのＤＭＳＯの対照実験と共に、全５つの生物学的反復を行った。１９の対照試料、４つのＤＭＳＯの試料および他の小分子の試料（例えば、５つのシンバスタチン試料におけるタンパク質のリストを、全２９の試料に対して検証した）において発見された全てのタンパク質（単一のペプチドで同定されたタンパク質を含む）の除去後、候補の相互作用物質のリストを得た。対照試料は、バックグラウンドのタンパク質と見なすことができ、実際の試料によって得られたタンパク質のリストから引くことができるタンパク質のリストを生成するための、無関係のタンパク質を用いる多くの成功したウイルストラップ実験である。
【００４７】
各小分子の条件において、タンパク質（それらの遺伝子名で注釈をつける）の２つのリストを報告した。表の左部（「全タンパク質」）は、バックグラウンドのタンパク質の除去後に得た、一度同定された全てのタンパク質（したがって単一のペプチドで同定されたタンパク質も含む）を含む。表の右部（「＞１のペプチドで同定されたタンパク質」）は、高い信頼度（各タンパク質が少なくとも２つの修飾したペプチドで同定された）で同定されたタンパク質のみを含む。単一のペプチドによる複数の実験で同定された、いくつかの再現したタンパク質はこのリストから除外される（例えば２度の反復実験において低い信頼度で同定されたＰＹＧＭ）。
【００４８】
シンバスタチンにおいて、スタチンファミリー分子の主要な標的である、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（遺伝子名：ＨＭＧＣＲ）が、全５つの生物学的反復実験において、同定された。加えて、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＬＥ）が、少なくとも２つのペプチドにおいて、３つの実験で同定された。この酵素はステロール生合成経路の下流の重要な構成要素であり、ＨＭＧＣＲと直接相互作用し得る。ＨＭＧＣＲタンパク質の既知の相互作用パートナーであるＵＢＩＡＤ１(Nickerson et al., 2013)は、少なくとも２つのペプチドにおいて１つの実験で同定された。ＳＡＲＭ１はシンバスタチンの新規な標的タンパク質であり得る。
【００４９】
表１：ＭＴＸ−ＰＥＧ６−シンバスタチン小分子融合構成物で同定されたタンパク質。全タンパク質の同定（単一のペプチドの同定を含む）または少なくとも２つのペプチドに同定されたタンパク質を、５つの生物学的反復において再現した同定数と共に示す。
【表１】
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【００５０】
実施例２：タモキシフェンバインダーのウイルストラッピング
タモキシフェンについて、遺伝子導入後の細胞にＭＴＸ−ＰＥＧ６−タモキシフェンを処理する、４つの生物学的反復を行った。ウイルストラッピングおよびＭＳ分析後に得られたタンパク質のリストを、４つのＤＭＳＯの対照、１９の対照実験ならびにＭＴＸ−ＰＥＧ６−シンバスタチンおよびＭＴＸ−ＰＥＧ６−リバーシン（下記参照）において得られたリストに由来する、全３０試料によるタンパク質のリストと検証した。シンバスタチンの実施例（実施例１参照）と同様に、高い信頼度および低い信頼度の両方の同定（表２参照）において、識別子である遺伝子名および４つの実験での検出の再現数を含む表に結果を示した。
【００５１】
表２：ＭＴＸ−ＰＥＧ６−タモキシフェン小分子融合構成物で同定されたタンパク質。全てのタンパク質の同定（単一のペプチドの同定を含む）または少なくとも２つのペプチドに同定されたタンパク質を、４つの生物学的反復において再現した同定数と共に示す。
【表２−１】
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【表２−２】
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タモキシフェンとＨＳＤ１７Ｂ４との間の相互作用を、バイナリＭＡＳＰＩＴアッセイ(binary MASPIT assay)を用いて確認した（実施例４参照）。
【００５２】
実施例３：リバーシンバインダーのウイルストラッピング
リバーシンについて、細胞にＧＡＧ−ｅＤＨＦＲコンストラクトを遺伝子導入し、遺伝子導入後、ＶＬＰ生成中に細胞をＭＴＸ−ＰＥＧ６−リバーシンで処理する、２回の実験を行った。精製およびプロテオミクス解析後、得られたリストを、４つのＤＭＳＯおよび１９の無関係の対照実験、ならびにＭＴＸ−ＰＥＧ６−シンバスタチンおよびＭＴＸ−ＰＥＧ６−タモキシフェンのリストを組み合わせたプロテオームのリストと検証した。
【００５３】
表３：ＭＴＸ−ＰＥＧ６−リバーシン小分子融合構成物で同定されたタンパク質。全てのタンパク質の同定（単一のペプチドの同定を含む）または少なくとも２つのペプチドで同定されたタンパク質を、２回の生物学的反復において再現した同定数と共に示す。
【表３】
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【００５４】
実施例４：ＭＡＳＰＩＴアッセイを用いるタモキシフェンとＨＳＤ１７Ｂ４との間の相互作用の確認
ＭＡＳＰＩＴ技術を用いて、ＨＳＤ１７Ｂ４とタモキシフェンとの結合をさらに確認した。バイナリＭＡＳＰＩＴアッセイを基本的に以前に記述されたように行った(Risseeuw et al., 2013)。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、黒色の組織培養処理された９６ウェルプレート(black tissue-culture treated 96-well plates)に１０．０００細胞／ウェルで１００μＬ培養液（ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ）中に播種し、３７℃、８％ＣＯ２で増殖した。２４時間後、細胞にｐＣＬＧ−ｅＤＨＦＲプラスミド(Risseeuw et al., 2013)、ｐＭＧ１−ＨＳＤ１７Ｂ４コンストラクトおよびｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ルシフェラーゼレセプター(Caligiuri et al., 2006)の組み合わせを遺伝子導入した。ｐＭＧ１−ＨＳＤ１７Ｂ４コンストラクトを、以前に記述されるように(Lievens et al., 2009)、ｈＯＲＦｅｏｍｅのコレクション内のエントリークローン(entry clone)として得られるフルサイズのＨＳＤ１７Ｂ４のＯＲＦの、Gateway適合性ｐＭＧ１プレイデスティネーションベクター(Gateway compatible pMG1 prey destination vector)へのGateway転換(Gateway transfer)によって、生成した。遺伝子導入の２４時間後、細胞を、ＭＴＸ−ＰＥＧ６−タモキシフェンの添加ありまたはなしで、無刺激で放置または１００ｎｇ／ｍｌレプチンで処理した。さらに２４時間後、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(Luciferase Assay System kit)(Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を分析した。
【００５５】
図４に示すように、バイナリＭＡＳＰＩＴアッセイは、ＭＴＸ−ＰＥＧ６−タモキシフェン添加において、用量依存的な様式で増加するルシフェラーゼ活性を示し、タモキシフェンのＨＳＤ１７Ｂ４との相互作用を確認した。
【００５６】
参考文献
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【図１】
2018517397.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018517397.tif 000012
2018517397.tif 000013