(57)【要約】  本発明は、TSC22D4活性又は発現のオリゴヌクレオチド阻害剤、並びに該オリゴヌクレオチド阻害剤の、哺乳動物における、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム及び／又は糖尿病の予防、治療及び／又は調節のための、及び／又はインスリン感受性の向上のための使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの以下の配列：
5'-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3'（配列番号1）；
5'-GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3'（配列番号2）；
5'-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3'（配列番号3）；
それらのアンチセンス配列又はそれらの機能的多様体を含む、干渉リボ核酸、PNA（プロテイン核酸）又はLNA（ロックド核酸）であるオリゴヌクレオチドから選択されるTSC22D4の発現及び／又は生物学的活性の阻害剤。
【請求項２】
前記干渉リボ核酸が、低分子干渉リボ核酸（siRNA）若しくは低分子ヘアピン型リボ核酸（shRNA）若しくはマイクロリボ核酸（miRNA）又はそれらの組み合わせである、請求項1に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記siRNAは、19ヌクレオチドから30ヌクレオチドの間の長さを有する、請求項1又は2に記載の阻害剤。
【請求項４】
前記siRNAが、配列番号1〜配列番号3による配列からなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項５】
前記のそれらの機能的多様体が、少なくとも1つの修飾又は置換ヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項6に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞又は組換え肝細胞。
【請求項８】
請求項1〜5のいずれか一項に記載の阻害剤、請求項6に記載の組換えベクター及び請求項7に記載の組換え細胞の少なくとも1つを、医薬品に許容可能な担体と一緒に含む、医薬組成物。
【請求項９】
経口投与、直腸内投与、経粘膜投与、経皮投与、腸内投与、非経口投与、筋内投与、髄腔内投与、直接脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与、鼻内投与、眼内投与又は皮下投与のための医薬組成物である、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
疾患の予防、調節及び／又は治療において使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載の阻害剤、請求項6に記載の組換えベクター、請求項7に記載の組換え細胞又は請求項8若しくは9に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記疾患が、インスリン抵抗性、高血圧、脂質異常症、冠動脈疾患、メタボリックシンドローム及び／又は1型若しくは2型糖尿病から選択される、請求項10に記載の使用のための、及び／又は腫瘍性疾患の状況におけるインスリン感受性を改善するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載の阻害剤、請求項6に記載の組換えベクター、請求項7に記載の組換え細胞又は請求項8若しくは9に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
インスリン抵抗性症候群が、食餌誘発性インスリン抵抗性及び／又は肥満誘発性インスリン抵抗性である、請求項11に記載の使用のための、請求項1〜5のいずれか一項に記載の阻害剤、請求項6に記載の組換えベクター、請求項7に記載の組換え細胞又は請求項8若しくは9に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項1〜5のいずれか一項に記載の阻害剤、請求項6に記載の組換えベクター、請求項7に記載の組換え細胞又は請求項8若しくは9に記載の医薬組成物を含む、又は、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の阻害剤、請求項6に記載の組換えベクター、請求項7に記載の組換え細胞又は請求項8若しくは9に記載の医薬組成物、及び適切なバッファー及び賦形剤並びに使用のための説明書と一緒に含む、治療用キット。
【請求項１４】
インスリン抵抗性、高血圧、脂質異常症、冠動脈疾患、メタボリックシンドローム及び／又は1型若しくは2型糖尿病から選択される疾患の予防、調節及び／又は治療において使用するための、及び／又は腫瘍性疾患の状況におけるインスリン感受性を改善するための、請求項13に記載の治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TSC22D4活性又は発現のオリゴヌクレオチド阻害剤、並びに該オリゴヌクレオチド阻害剤の、哺乳動物における、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム及び／又は糖尿病の予防、治療及び／又は調節のための、及び／又はインスリン感受性の向上のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおいては、過度の脂質貯蔵と除去の低下とが組み合わさることで、過体重並びにインスリン抵抗性、心血管合併症及び脂質異常症を含む関連併存症が引き起こされ（非特許文献1）、現在、それらを世界中で15億人を超える人々が患っている（非特許文献2）。まさに、インスリン抵抗性は、いわゆるメタボリックシンドロームの根本要素であり、最終的には代謝機能不全、例えばブドウ糖不耐性、膵β細胞不全、そして最終的に2型糖尿病の発症に至る。
【０００３】
インスリン分泌障害（β細胞）、肝ブドウ糖産生増加（肝臓）及び末梢（筋肉）ブドウ糖利用低下は、2型糖尿病の発症及び進行に関わる旧来からの一次欠陥であるとみなされる。最終的にインスリン分泌低下を招くβ細胞不全は、現在では、2型糖尿病の自然史の当初考えられていたよりもずっと初期に起こることが知られている。さらに、2型糖尿病の病態生理のより十分な理解により、古典的な三徴候（triad）を超える、目下、前兆となる八徴候（ominousoctet）と呼ばれるその他の病因学的メカニズムが明らかになっている。β細胞、肝臓及び筋肉に加えて、その他の病因学的メカニズムには、脂肪細胞インスリン抵抗性（脂肪分解増加）、インクレチン分泌／感受性低下（胃腸）、グルカゴン分泌増加（α細胞）、ブドウ糖再吸収増加（肝臓）及び神経伝達物質機能不全に起因する中枢神経系インスリン抵抗性（脳）が含まれる。現在、2型糖尿病の管理は、血糖（空腹時及び食後）及びヘモグロビンA（1c）の低下によるグルコース制御に的を絞っている。しかしながら、治療の目標は、疾患の進行及び起こり得る治療の失敗を遅らせることにあるべきである。治療は、その疾患の既知の病原性撹乱（pathogenic disturbances）（すなわち、β細胞機能悪化の縮小及びインスリン感受性の向上）を標的とすべきである。近年、治療戦略は、2型糖尿病の一因となる多くの欠陥に作用し、疾患の進行を鈍らせることによって持続的なブドウ糖制御を提供する新規の治療オプションの開発に的を絞っている。2型糖尿病の最適な管理には、様々な作用メカニズムを有する多数の薬剤を併用する治療の早期開始が含まれるべきである（非特許文献3）。
【０００４】
特に、肝臓、骨格筋及び脂肪組織を含む主要な代謝器官のインスリン作用に対する不感受性は、疾患の進行に本質的に寄与し、最終的には糖尿病性晩期合併症を抑制するための薬理学的介入が必要となる。このように、効果的かつ安全なインスリン抵抗性改善（insulin sensitization：インスリン感受性亢進）は、抗糖尿病治療において相変わらず魅力的な目標及び目的である。
【０００５】
転写補因子複合体は、肝臓及び白色脂肪組織（WAT）を含む様々な組織における代謝プログラムの連係における重要なチェックポイントとして特定されている（レビューについては、非特許文献4を参照のこと）。
【０００６】
Kester HAらは（非特許文献5において）、TGF-β刺激クローン-22（TSC-22）が、進化の過程で高度に保存されたロイシンジッパーを含むタンパク質をコードすることを記載している。
【０００７】
さらに、Jonesらは（非特許文献6において）、悪液質の分子的アウトプット経路として、転写因子であるトランスフォーミング増殖因子β1刺激クローン（TSC）22 D4の肝臓内レベルが癌悪液質において増大したことを記載している。健全な肝臓においてTSC22D4の高い悪液質レベルを模擬することで、肝臓VLDL放出及び脂質生成遺伝子の阻害が引き起こされ、そして通常の食餌条件及び高脂肪食餌条件の両方で全身性VLDLレベルが低減された。したがって、肝臓TSC22D4活性は、癌悪液質を含む代謝消耗性疾患を伴う被験者における末梢エネルギー欠乏についての分子的な根拠を表し得る。
【０００８】
Kulozik, Ph.ら（非特許文献7）は、転写補因子であるトランスデューシンβ様（TBL）1の肝臓内発現の減退が、一遺伝子性及び複遺伝子性の脂肪肝マウスモデルの共通の特徴であることを記載している。健全なマウスにおけるTBL1遺伝子発現の肝臓特異的除去によって、通常の食餌条件及び高脂肪食餌条件の両方で高トリグリセリド血症及び肝臓脂肪症が促された。TBL1発現レベルが、ヒトの患者における肝臓脂肪含量と逆相関することも分かったので、肝臓TBL1/TBLR1補因子活性の欠如は、肥満及びメタボリックシンドロームを伴う被験者における肝臓脂肪症についての分子的な根拠を表し得る。
【０００９】
Berriel Diaz, M.ら（非特許文献8）は、肝臓内TG蓄積の動員を抑制することによって、肝臓内でのRIP140の誘導が、飢餓、敗血症又は癌悪液質における肝臓脂肪症についての分子的な根拠をもたらすことを記載している。肝臓内RIP140転写活性の阻害は、それにより、これらの状態の治療における魅力的な補助的スキームを提供するかもしれない。
【００１０】
Fareseらは（非特許文献9において）、肝臓内での脂肪の過剰な沈着（肝臓脂肪症）が、しばしば肝臓インスリン抵抗性を伴うことを記載している。
【００１１】
抗糖尿病薬及び／又はインスリン抵抗性改善薬の主なクラスには、スルホニル尿素、メトホルミン、チアゾリジンジオン、α-グルコシダーゼ阻害剤、インクレチンミメティックス及びジペプチジル-ペプチダーゼ4阻害剤が含まれるが、それらは全て、厳しい制約を伴う（レビューについては、非特許文献10を参照のこと）。
【００１２】
2型糖尿病の病因におけるインスリン抵抗性の主要な役割にもかかわらず、効果的かつ安全なインスリン抵抗性改善剤は、未だに存在しない。確かに、チアゾリジンジオン系統の最新の薬剤は、適度な効力プロファイルを示すが、体重増加、心不全リスクの増加、膀胱癌リスクの増加の可能性及び心筋梗塞リスクの増加を含む、かなりの副作用を伴うため、例えばロシグリタゾンは最近の市場から撤退に追いやられている。
【００１３】
特許文献1は、インスリン抵抗性及び／又はブドウ糖不耐性に関連する疾患の治療及び／又は予防において有用な試剤を同定するためのスクリーニング方法であって、試剤がVps34シグナル伝達経路及び／又はPI3K-C2P（RhoIota3Kappa-02beta）シグナル伝達経路を阻害する能力を調査する工程を含む、方法を開示している。同様に、特許文献2は、レチノール結合タンパク質4（RBP4）の活性を調節する分子を調べる方法を開示し、そして該方法のインスリン抵抗性の治療における使用が記載されている。また、インスリン抵抗性及び関連状態を、RBP4活性の調節を検出することによって診断する方法も記載されている。
【００１４】
特許文献3は、プロテインキナーゼRNA様小胞体キナーゼ（PERK）遺伝子若しくはその機能的多様体の阻害剤、若しくはPERKタンパク質若しくはその機能的多様体の阻害剤を投与することにより動物の身体におけるインスリン抵抗性症候群を治療又は予防する方法、又はプロテインキナーゼRNA様小胞体キナーゼ（PERK）遺伝子若しくはその機能的多様体の阻害剤、若しくはPERKタンパク質若しくはその機能的多様体の阻害剤を投与することによりFOXOファミリーの転写因子（Foxo 1、3a、4及び6）の活性を低下させる方法に関する。
【００１５】
特許文献4は、一般的に、TSC22D4活性又は発現の調節剤、特に阻害剤、並びに該調節剤の、哺乳動物における、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム及び／又は糖尿病の予防、治療及び／又は調節のための、及び／又はインスリン感受性の向上のための使用について言及している。特許文献4は、更に、これらの調節剤を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【００１６】
TSC22D4指向性のshRNA又はmiRNA構築物のウイルスでの送達による実験的ノックダウンは、糖尿病動物の代謝状態を効果的に改善することが分かったが、異なる技術による送達にあたって、様々な種においてTSC22D4の効果的かつ特異的なノックダウンに適したsiRNA構築物は、まだ特定されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第2013/076501号
【特許文献２】国際公開第2005/059564号
【特許文献３】国際公開第2012/158123号
【特許文献４】国際公開第2014/202602号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Langin D. In and out: adipose tissue lipid turnover in obesity anddyslipidemia. Cell Metab. 2011 Nov 2; 14(5):569-70
【非特許文献２】Finucane MM, et al. National, regional, and global trends inbody-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveysand epidemiological studies with 960 country-years and 91 million participants.Lancet. 2011 Feb 12; 377(9765):557-67
【非特許文献３】DeFronzo RA.,Current issues in the treatment of type 2 diabetes. Overview of newer agents:where treatment is going. Am J Med. 2010 Mar;123(3 Suppl):S38-48
【非特許文献４】Sommerfeld A, Krones-Herzig A, Herzig S. Transcriptional co-factorsand hepatic energy metabolism. Mol Cell Endocrinol. 2011 Jan 30;332(1-2):21-31
【非特許文献５】Transforming growth factor-beta-stimulated clone-22 is a member of afamily of leucine zipper proteins that can homo- and heterodimerize and hastranscriptional repressor activity. J Biol Chem. 1999 Sep 24;274(39):27439-47
【非特許文献６】Transforming growth factor-beta1 Stimulated Clone-22 D4 is a molecularoutput of hepatic wasting metabolism. EMBO Mol Med. 2013 Feb; 5(2):294-308
【非特許文献７】Hepatic deficiency in transcriptional co-factor TBLI promotes liversteatosis and hypertriglyceridemia. 2011 Cell Metab. 13: 389-400
【非特許文献８】Nuclear receptor co-factor RIP140 controls lipid metabolism duringwasting in mice. 2008. Hepatology 48: 782-791
【非特許文献９】The problem of establishing relationships between hepatic steatosisand hepatic insulin resistance. Cell Metab. 2012 May 2;15(5):570-3
【非特許文献１０】Moller, Metabolic disease drug discovery- "hitting thetarget" is easier said than done. Cell Metab. 2012 Jan 4;15(1):19-24
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
背景技術における上記欠点に鑑みて、本発明の課題は、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム及び／又は糖尿病を予防、治療及び／又は調節するための、及び／又はインスリン感受性を向上させるための新規の治療戦略を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第1の態様においては、上記課題は、少なくとも1つの以下の配列：
5'-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3'（配列番号1）；
5'-GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3'（配列番号2）；
5'-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3'（配列番号3）；
それらのアンチセンス配列又はそれらの機能的多様体を含む、干渉リボ核酸、PNA（プロテイン核酸）又はLNA（ロックド核酸）であるオリゴヌクレオチドから選択されるTSC22D4の発現及び／又は生物学的活性の阻害剤を準備することによって解決される。
【００２１】
mhD4-siRNA1：（NM_030935.3_siRNA_1024; ORF）
センス：5'-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3'（配列番号1）；
アンチセンス：5'-UAAACAUCCACACACGUCCdTdT-3'（配列番号4）；
GC：47 %（TT-オーバーハングを含まない）
【００２２】
mD4-siRNA2：（NM_023910.6_siRNA_993; ORF）
センス：GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3'（配列番号2）；
アンチセンス：AUCUCUCUCGUAAACAUCCdTdT-3'（配列番号5）；
GC：42.1 %（TT-オーバーハングを含まない）
【００２３】
mhD4-siRNA3：
センス：5'-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3'（配列番号3）；
アンチセンス：5'-GCAAACAUGAGGUGGGACUdTdT-3'（配列番号6）；
GC：52.6 %（TT-オーバーハングを含まない）
【００２４】
近年、本発明者らによって、転写制御因子であるトランスフォーミング増殖因子β1刺激クローン22D4（TSC22D4）が肝臓インスリン感受性及び全身性インスリン感受性を制御することが実証された。TSC22D4の肝臓特異的な欠損は、耐糖能及びインスリン感受性を大幅に改善し、野生型マウスにおける高インスリン血症を阻止する。健全な動物におけるTSC22D4シストロームのChlP-Seq解析と高処理量TSC22D4ターゲットトランスクリプトーム研究との組み合わせにより、インスリンシグナル伝達経路の主ノードが、TSC22D4によって、なかでも注目すべきはリポカリン13が直接的又は間接的に標的とされることが明らかになった。
【００２５】
実際に、マウス初代肝細胞及び野生型マウスにおけるTSC22D4のダウンレギュレーション又は過剰発現により、AKt/PKBキナーゼのSer473でのリン酸化とGSK3βのSer9でのリン酸化とによって、それぞれ急性インスリン曝露に呼応して測定されるような、細胞内インスリンシグナル伝達経路のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションが引き起こされた。興味深いことに、糖尿病db/dbマウスにおけるTSC22D4の肝臓内不活性化は、これらの動物においてブドウ糖不耐性及びインスリン抵抗性を改善し、血糖をほぼ健康なレベルにまで正常化した。糖尿病動物における代謝状態の全体的な改善に合わせて、炎症性サイトカイン及びレジスチンの血中濃度は、肝臓特異的TSC22D4欠損を伴うマウスにおいて大幅に低下した。
【００２６】
TSC22D4指向性のshRNA又はmiRNA構築物のウイルスでの送達による実験的ノックダウンは、糖尿病動物の代謝状態を効果的に改善することが分かったが、異なる技術による送達にあたって、様々な種においてTSC22D4の効果的かつ特異的なノックダウンに適したsiRNA構築物は、まだ特定されていない。
【００２７】
肝癌細胞におけるTSC22D4の不活性化は、細胞成長を高めずに、むしろ増殖を低下させ、そのことは、TSC22D4のインスリン抵抗性改善機能が、罹患した細胞又は器官において癌易罹患性の増加をもたらさないことを示唆している。さらに、TSC22D4の肝臓内不活性化は、低血糖症も引き起こさない。
【００２８】
「阻害剤」は、触媒反応における触媒（非生物学的触媒又は酵素のどちらでも）の効力を低減し得る物質である。本明細書において言及される阻害剤は、酵素活性の効力を低下させることができ、また本明細書において言及される阻害剤は、酵素の発現の効力を低下させることができる。本発明においては、好ましい阻害剤は、オリゴヌクレオチドである。
【００２９】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、一般的に、干渉リボ核酸（iRNA）又はプロテイン核酸（PNA）又はロックド核酸（LNA）を指す。用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的に、19より多くのヌクレオチドサブユニットが共有結合されてできた一本鎖ヌクレオチドポリマーを指す。以下でも更に説明されるように、好ましくは、19から100の間のヌクレオチド単位が存在し、最も好ましくは19から50の間のヌクレオチド単位が結合されている。
【００３０】
ヌクレオチドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース又はそれらの修飾誘導体、例えば2'-O-メチルリボースであってよい。オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合又はオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを抑制しないその他の希有な若しくは天然に存在しない結合によって結合され得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、通常ではないヌクレオチド又は非ヌクレオチド部を有してよい。
【００３１】
また用語「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書においては、当該技術分野で既知のオリゴヌクレオチドの核酸類似体、例えばロックド核酸（LNA）又はそれらの混合物を指し得る。用語「オリゴヌクレオチド」には、天然に存在するヌクレオ塩基、糖及びヌクレオシド間（骨格）結合から構成されるオリゴヌクレオチドだけでなく、同様に機能するか又は特定の改善された機能を有する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。完全に又は部分的に修飾された又は置換されたオリゴヌクレオチドは、しばしば、そのようなオリゴヌクレオチドの幾つかの望ましい特性、例えば細胞膜を透過する能力、細胞外及び細胞内のヌクレアーゼに対する良好な耐性、核酸標的に対する高い親和性及び特異性等のため本来の形よりも好ましい。このようにオリゴヌクレオチドを修飾する方法は、当該技術分野で既知である。
【００３２】
時にオリゴヌクレオチドミメティックと呼ばれる幾つかのオリゴヌクレオチドにおいては、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格は、新規のグループと置き換えられている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。1つのそのようなオリゴマー化合物、つまり優れたハイブリダイゼーション特性を有することが分かったオリゴヌクレオチドミメティックは、プロテイン核酸（PNA）と呼ばれる。PNA化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置き換えられている。ヌクレオ塩基は保持され、骨格のアミド部のアザ窒素原子へと直接的又は間接的に結合される。
【００３３】
更なる一変更形態には、2'-ヒドロキシル基が糖環の3'又は4'炭素原子に結合されることにより、二環式の糖部を形成しているロックド核酸（LNA）が含まれる。その結合は、好ましくは2'酸素原子と4'炭素原子とを架橋するメチレン(-CH2-)n基であり、ここで、nは1又は2である。用語「LNA」とは、一般的に、LNAモノマーとも呼ばれる1つの二環式のヌクレオシド類似体を含むヌクレオチド、又は1つ以上の二環式のヌクレオシド類似体を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【００３４】
干渉リボ核酸が、低分子干渉リボ核酸（siRNA）若しくは低分子ヘアピン型リボ核酸（shRNA）若しくはマイクロリボ核酸（miRNA）又はそれらの組み合わせである、本発明による阻害剤が好ましい。
【００３５】
siRNAが、19ヌクレオチドから30ヌクレオチドの間の長さを有する、本発明による阻害剤が更に好ましい。
【００３６】
一態様においては、生体活性剤は、「RNA干渉（RNAi）」を利用する。RNAiは、二本鎖RNA（dsRNA）又はsiRNAによって開始される配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程である。RNAiは、ショウジョウバエ、線虫類、菌類及び植物類のような多数の生物において見られ、抗ウイルス防御、トランスポゾン活性の調節及び遺伝子発現の制御に関与していると考えられている。RNAiの間に、dsRNA又はsiRNAは、標的mRNAの分解を誘発し、結果的に配列特異的に遺伝子発現が阻害される。本明細書で使用される場合に、「低分子干渉RNA」（siRNA）は、TSC22D4の遺伝子を標的とするヌクレオチドのRNA二本鎖である。「RNA二本鎖」とは、RNA分子の2つの領域間での相補的対合によって形成される構造物を指す。siRNAは、そのsiRNAの二本鎖部分のヌクレオチド配列が、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的である遺伝子を「標的」とする。幾つかの実施形態においては、siRNAの二本鎖の長さは、30ヌクレオチド未満である。幾つかの実施形態においては、該二本鎖は、29ヌクレオチド長、28ヌクレオチド長、27ヌクレオチド長、26ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、11ヌクレオチド長又は10ヌクレオチド長であってよい。幾つかの実施形態においては、その二本鎖の長さは、19ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長である。siRNAのRNA二本鎖部分は、ヘアピン構造の部分であってよい。二本鎖部分の他に、ヘアピン構造は、その二本鎖を形成する2つの配列の間に位置するループ部分を含み得る。ループの長さは様々であってよい。幾つかの実施形態においては、該ループは、5ヌクレオチド長、6ヌクレオチド長、7ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、9ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、11ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長又は13ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、3'及び／又は5'オーバーハング部分を含んでもよい。幾つかの実施形態においては、該オーバーハングは、3'及び／又は5'オーバーハングであり、0ヌクレオチド長、1ヌクレオチド長、2ヌクレオチド長、3ヌクレオチド長、4ヌクレオチド長又は5ヌクレオチド長である。siRNAは、核酸配列によってコードされてよく、かつ該核酸配列は、プロモーターを含んでもよい。該核酸配列は、ポリアデニル化シグナルを含んでもよい。幾つかの実施形態においては、ポリアデニル化シグナルは、合成の最小ポリアデニル化シグナルである。
【００３７】
本明細書で使用される場合に、用語「siRNA」とは、RNA干渉経路に指向する又はそれを媒介することができる約19ヌクレオチドから50ヌクレオチドの間のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含むリボ核酸（RNA）又はRNA類似体を指す。これらの分子の長さは様々であってよく、該分子は、アンチセンス鎖における、それらの標的メッセンジャーRNA（mRNA）に対する様々な度合いの相補性を有してよい。用語「siRNA」には、2つの別々の鎖の二本鎖、すなわち二本鎖RNAが含まれるだけでなく、二本鎖領域からなるヘアピン構造を形成し得る一本鎖が含まれる。siRNAは、約19ヌクレオチドから50ヌクレオチドの間の、又は約25ヌクレオチドから50ヌクレオチドの間の、又は約30ヌクレオチドから50ヌクレオチドの間の、又は約35ヌクレオチドから50ヌクレオチドの間の、又は約40ヌクレオチドから50ヌクレオチドの間の長さを有してよい。一実施形態においては、siRNAは、19ヌクレオチドから30ヌクレオチドの間の長さを有する。
【００３８】
siRNAの、その標的mRNAの活性をダウンレギュレートするための利用は、当該技術分野で既知である。幾つかの実施形態においては、mRNA分解は、相補配列を有する標的mRNAを開裂するRNAエンドヌクレアーゼAgo2を含むRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に、siRNAのアンチセンス鎖又はガイド鎖が指向する場合に生ずる。したがって、siRNAは、PERK遺伝子上の様々な長さの任意の部分に相補的であってよい。siRNAは、TSC22D4遺伝子のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖に相補的であってもよい。したがって、siRNA処理は、TSC22D4遺伝子をサイレンシングすることにより、TSC22D4タンパク質を下流で枯渇させるために使用することができる。
【００３９】
本明細書で使用される用語「shRNA」とは、RNAiを起こすことが可能であり、かつパッセンジャー鎖、ループ及びガイド鎖を有する単分子RNAを指す。パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、互いに本質的に相補的であってよい。用語「shRNA」には、限定されるものではないが、修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド間結合、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド及びそれらのヌクレオチドの類似体を含む、リボヌクレオチド部とは異なる部分を含む核酸も含まれ得る。
【００４０】
miRNAは、それらの標的mRNAをダウンレギュレートする。用語「miRNA」は、一般的に、一本鎖分子を指すが、具体的な実施形態においては、同じ一本鎖分子の別の領域に対して又は別の核酸に対して部分的に（鎖長全体にわたって10 %から50 %の間の相補性）、本質的に（鎖長全体にわたって50 %超であるが、100 %未満の相補性）又は完全に相補的である領域又は追加の鎖を含んでもよい。このように、核酸は、1つ以上の相補鎖若しくは自己相補鎖を含む分子、又は1つの分子を含む特定の配列の「相補物」を包含し得る。例えば、前駆miRNAは、100 %以下の相補性である自己相補性領域を有してよい。本発明のmiRNAプローブ又は核酸は、それらの標的に少なくとも60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %又は100 %相補的であってよい。
【００４１】
siRNAが、配列番号1〜配列番号3による配列、それらのアンチセンス配列からなる、本発明による阻害剤が最も好ましい。
【００４２】
また、機能的多様体が、少なくとも1つの修飾又は置換ヌクレオチドを含む、本発明による阻害剤も好ましい。用語「機能的多様体」には、断片、縮重した核酸暗号を基礎とする多様体又は化学的誘導体も含まれる。機能的多様体は、置換核酸が、置き換えられる核酸と類似した構造的特性又は化学的特性を有する、保存的変化を有してよい。機能的多様体は、1つ以上の核酸の欠失及び／又は挿入を有してもよい。機能的多様体は、少なくとも部分的に、その生物学的活性、例えばTSC22D4遺伝子の機能を保持するか、又は生物学的活性の改善さえも示すと理解される。
【００４３】
修飾オリゴヌクレオチドの例には、限定されるものではないが、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド（上記参照）及びヘテロ原子骨格、特に-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-及び-O-N(CH3)-CH2-CH2-（式中、本来のホスホジエステル骨格は、-O-P-O-CH2-として表される）を有するオリゴヌクレオシドが含まれる。また、モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドを使用することもできる。干渉リボ核酸として使用される修飾オリゴヌクレオチドは、1つ以上の置換された糖部を有してもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下：OH、F、O-アルキル、S-アルキル若しくはN-アルキル、O-アルケニル、S-アルケニル若しくはN-アルケニル、O-アルキニル、S-アルキニル若しくはN-アルキニル又はO-アルキル-O-アルキルのうちの1つを含み、ここで、上記アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換された又は非置換のC1〜C10アルキル又はC2〜C10アルケニル及びアルキニルであってよい。具体的な例には、限定されるものではないが、O[(CH2)nO]mCH3、0(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及びO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2（式中、n及びmは、1から約10までである）が含まれる。その他のオリゴヌクレオチドの例は、2'位に以下：C1〜C10低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリール若しくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基及び同様の特性を有するその他の置換基のうちの1つを含む。1つの例示的な変更形態には、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH2CH2OCH3、これはまた2'-O-(2-メトキシエチル)又は2'-MOEとしても知られている）、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。
【００４４】
その際、もう一つの態様は、本発明によるオリゴヌクレオチドを含む、組換えベクターに関する。一般的に、オリゴヌクレオチドは、発現のためにプラスミドのような発現ベクター中に挿入される。必要であれば、オリゴヌクレオチドは、所望の宿主によって認識される適切な転写及び翻訳調節制御ヌクレオチド配列に結合されてよいが、そのような制御は、一般的に発現ベクターにおいて利用することができる。その際、ベクターは、宿主へと標準的な技術によって導入される。
【００４５】
哺乳類細胞内でsiRNAを発現するベクターは、一般的に、siRNAの構造を模擬している短ヘアピンRNAの発現を駆動するためにRNAポリメラーゼIIIプロモーターを使用する。このヘアピンをコードする挿入物は、短いスペーサー配列によって隔離された2つの逆向き反復配列を有するように設計されている。1つの逆向き反復配列は、siRNAを標的とするmRNAに相補的である。3'末端に付加されるチミジンの連なりは、pol III転写終結部位として働く。細胞内に入ると、該ベクターは、標的遺伝子のサイレンシングを誘導するヘアピンRNAを構成的に発現する。
【００４６】
その他の適切なベクターには、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、レトロウイルス及びレンチウイルス又はそれぞれの発現系が含まれる（例えばCatanotto, D. et al.(2002) Functional siRNA expression fromtransfected PCR products. RNA 8, 1454-1460; Barton, G.M. et al. (2002)Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc Natl AcadSci USA. 99(23):14943-5. Abbas-Terki, T. et al.(2002) Lentiviral-mediated RNAinterference. Hum.Gene Ther. 13, 2197-2201,及びXia, H. etal. (2002) siRNA-mediate gene silencing in vitro and in vivo. Nat.Biotechnol.20,1006-1010を参照のこと）。
【００４７】
一般的に、宿主は全てではないがベクターによって形質転換されることとなる。したがって、形質転換された宿主細胞の選択が必要とされることとなる。1つの選択技術は、発現ベクター中に、形質転換された細胞における選択可能な特徴、例えば抗生物質耐性をコードするDNA配列を、任意の必要な制御エレメントと一緒に導入することを含む。あるいは、そのような選択可能な特徴のための遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するために使用される別のベクター上に存在してよい。本発明のオリゴヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞を、次に十分な時間にわたって当業者に既知の適切な条件下で、本明細書に開示される教示を考慮して培養することで、ポリペプチドを発現させ、次いで該ポリペプチドを回収することができる。
【００４８】
その他の例は、文献中に、例えばYang J.ら（Design, preparation and applicationof nucleic acid delivery carriers." Biotechnol Adv. 2014Jul-Aug;32(4):804-17）において見出すことができる。
【００４９】
本明細書に記載される核酸のクラス（例えば、オリゴヌクレオチド及び／又はベクター）のそれぞれは、多くの方法によって細胞中に導入することができる。脂質媒介性トランスフェクションにおいて、細胞は、核酸と脂質又はポリマー試薬との間の非共有結合複合体をエンドサイトーシスによって取り込む。エレクトロポレーションは、細胞の形質膜中に核酸が入り込む破壊又は小孔を与えるために短時間の電気的パルスを利用するものである。これらの方法の両方とも、ウイルスベクターを除くあらゆるRNAi核酸を効果的に送達する。ウイルスベクターの送達は、細胞の相応のウイルスによる、通常はヘルパーウイルスを用いた感染によってのみ行われる。所望の細胞系統のウイルスによる感染は、siRNA又はshRNAを導入して、遺伝子発現をノックダウンする。
【００５０】
その際、本発明のもう一つの態様は、本発明によるオリゴヌクレオチド又は本発明による組換えベクターを含む、組換え細胞、好ましくは組換え肝細胞に関する。本発明による「細胞」は、原核細胞又は真核細胞であってよい。本発明による「細胞」は、好ましくは、限定されるものではないが、肝細胞から選択される。哺乳類細胞は、好ましくはヒト、ウサギ、マウス又はラットから選択することができる。好ましくは、該細胞は、ヒト細胞、例えば肝細胞である。用語「細胞」には、動物モデルの細胞も含まれる。また、細胞は、組織培養の一部であってもよい。
【００５１】
本発明の課題は、また、上記の本発明による少なくとも1種の阻害剤を、少なくとも1種の医薬品に許容可能な賦形剤と一緒に製剤化する工程を含む、医薬組成物の製造方法によって解決される。医薬組成物の担体及び／又は賦形剤は、製剤のその他の成分と相溶性であり、かつその受容者に対して有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。
【００５２】
その際、本発明の別の態様は、本発明による阻害剤、本発明による組換えベクター及び本発明による組換え細胞の少なくとも1つを、医薬品に許容可能な担体と一緒に含む、医薬組成物に関する。上記医薬組成物が、経口投与、直腸内投与、経粘膜投与、経皮投与、腸内投与、非経口投与、筋内投与、髄腔内投与、直接脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与、鼻内投与、眼内投与又は皮下投与のための医薬組成物である、本発明による医薬組成物が好ましい。
【００５３】
その際、本発明の別の態様は、疾患の予防、調節及び／又は治療において使用するための、本発明による阻害剤、本発明による発現ベクター、本発明による組換え細胞又は本発明による医薬組成物に関する。
【００５４】
インスリン抵抗性症候群は、広い臨床スペクトルを構成し、インスリン抵抗性と関連したあらゆる異常症として定義される。インスリンに対する抵抗性、糖尿病、高血圧、脂質異常症及び心血管疾患のような異常症が、インスリン抵抗性症候群を構成する。
【００５５】
インスリン抵抗性症候群は、食餌誘発性インスリン抵抗性及び／又は肥満誘発性インスリン抵抗性であってよい。食餌誘発性インスリン抵抗性とは、インスリンに対する抵抗性が、飽和脂肪及び炭水化物の多い食餌によって誘発されることを意味する。肥満誘発性インスリン抵抗性とは、インスリンに対する抵抗性が、肥満への遺伝的素因又は食習慣による肥満によって誘発されることを意味する。
【００５６】
したがって、本発明のもう一つの態様は、インスリン抵抗性、高血圧、脂質異常症、冠動脈疾患、メタボリックシンドローム及び／又は1型若しくは2型糖尿病から選択される疾患の予防、調節及び／又は治療において使用するための、及び／又は例えば腫瘍性疾患の状況におけるインスリン感受性のようなインスリン感受性を改善するための、本発明による阻害剤、本発明による発現ベクター、本発明による組換え細胞又は本発明による医薬組成物に関する。好ましくは、インスリン抵抗性症候群は、食餌誘発性インスリン抵抗性及び／又は肥満誘発性インスリン抵抗性である。
【００５７】
さらに、上記課題は、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム及び／又は糖尿病から選択される疾患の治療及び／又は予防を必要とする被験体において該疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、本発明による阻害剤又は本発明による医薬組成物の有効量を、上記の治療及び／又は予防を必要とする被験体へと投与する工程を含む、方法によって解決される。
【００５８】
開示される方法は、インスリン抵抗性症候群によって引き起こされる以下の状態：インスリン抵抗性、高血圧、脂質異常症、2型糖尿病又は冠動脈疾患のいずれか1つを治療するために使用することができる。
【００５９】
本発明における用語「予防」は、疾患を伴う患者の状態の悪化、又は健康な被験体及び／又は病気の被験体の損傷若しくは死に導く可能性が高い有害な事象の発生を妨げることを目的とする医学的介入と理解されるものとする。上記の「治療及び／又は予防を必要とする患者（patient in need thereof）」は、限定されるものではないが、インスリン抵抗性症候群に関連した疾患、特にインスリン抵抗性、高血圧、脂質異常症、2型糖尿病又は冠動脈疾患を患うあらゆる動物又はヒトであってよい。好ましくは、その治療及び／又は予防を必要とする被験体は、ヒトである。
【００６０】
さらに、上記課題は、本発明による阻害剤、本発明による組換えベクター、本発明による組換え細胞又は本発明による医薬組成物を、任意に適切なバッファー及び賦形剤並びに使用のための説明書と一緒に含む、治療用キットによって解決される。
【００６１】
さらに、上記課題は、インスリン抵抗性、高血圧、脂質異常症、冠動脈疾患、メタボリックシンドローム及び／又は1型若しくは2型糖尿病から選択される疾患の予防、調節及び／又は治療において使用するための、及び／又は例えば腫瘍性疾患の状況におけるインスリン感受性のようなインスリン感受性を改善するための、本発明による治療用キットによって解決される。
【００６２】
近年、本発明者らによって、転写制御因子であるトランスフォーミング増殖因子β1刺激クローン22D4（TSC22D4）が肝臓インスリン感受性及び全身性インスリン感受性を制御することが実証された。TSC22D4の肝臓特異的な欠損は、耐糖能及びインスリン感受性を大幅に改善し、野生型マウスにおける高インスリン血症を阻止する。健全な動物におけるTSC22D4シストロームのChlP-Seq解析と高処理量TSC22D4ターゲットトランスクリプトーム研究との組み合わせにより、インスリンシグナル伝達経路の主ノードが、TSC22D4によって、なかでも注目すべきはリポカリン13が直接的又は間接的に標的とされることが明らかになった。実際に、マウス初代肝細胞及び野生型マウスにおけるTSC22D4のダウンレギュレーション又は過剰発現により、AKt/PKBキナーゼのSer473でのリン酸化とGSK3βのSer9でのリン酸化とによって、それぞれ急性インスリン曝露に呼応して測定されるような、細胞内インスリンシグナル伝達経路のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションが引き起こされた。
【００６３】
興味深いことに、糖尿病db/dbマウスにおけるTSC22D4の肝臓内不活性化は、これらの動物においてブドウ糖不耐性及びインスリン抵抗性を改善し、血糖をほぼ健康なレベルにまで正常化した。糖尿病動物における代謝状態の全体的な改善に合わせて、炎症性サイトカイン及びレジスチンの血中濃度は、肝臓特異的TSC22D4欠損を伴うマウスにおいて大幅に低下した。
【００６４】
肝癌細胞におけるTSC22D4の不活性化は、細胞成長を高めずに、むしろ増殖を低下させ、そのことは、TSC22D4のインスリン抵抗性改善機能が、罹患した細胞又は器官において癌易罹患性の増加をもたらさないことを示唆している。さらに、TSC22D4の肝臓内不活性化は、低血糖症も引き起こさない。
【００６５】
TSC22D4指向性のshRNA又はmiRNA構築物のウイルスでの送達による実験的ノックダウンは、糖尿病動物の代謝状態を効果的に改善することが分かったが、異なる技術による送達にあたって、様々な種においてTSC22D4の効果的かつ特異的なノックダウンに適したsiRNA構築物は、まだ特定されていない。この問題を克服するために、本発明者らは、本明細書に開示されるマウスHepa1.6肝癌細胞並びにヒトHuh7肝癌細胞を使用したin vitroノックダウン研究において、TSC22D4のmRNA配列に指向される様々なsiRNAを特定し、機能的に試験及び検証をした。
【００６６】
以下の図面、配列及び実施例は、本発明を単に例証することを目的とするものであって、本発明の範囲を、実施例に記載される本発明の具体的な実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。本発明の目的のために、本書で引用される全ての参考文献は、引用することにより本明細書の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】マウス肝癌細胞における、色分けされた選択されたTSC22D4指向性のsiRNAのノックダウン効率を示している。相対mRNAレベルが示されている。全てのその他の試験されたsiRNA配列は、これらの実験において如何なる有意なTSC22D4ノックダウンも示さなかった（図示せず）。
【図２】マウスHepa1-6肝癌細胞中にトランスフェクションした場合のマウスTSC22D4に対するmhD4-siRNA1のノックダウン効率を示している。相対mRNAレベルが示されている。
【図３】ヒトHuh7肝癌細胞中にトランスフェクションした場合のヒトTSC22D4に対するmhD4-siRNA1のノックダウン効率を示している。相対mRNAレベルが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
配列番号1〜配列番号6は、本発明によるオリゴヌクレオチド配列を示している。
【実施例】
【００６９】
組換えウイルス
TSC22D4若しくは非特異的shRNAをU6プロモーターの制御下で発現するアデノウイルス、又はTSC22D4のcDNAをCMVプロモーターの制御下で発現するアデノウイルスを、BLOCK-iTアデノウイルスRNAi発現システム（Invitrogen、ドイツ、カールスルーエ）を使用してクローニングした。ウイルスは、動物に注射する前に、以前より記載（Herzig S, Hedrick S, Morantte I, Koo SH, Galimi F, Montminy M. CREBcontrols hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPAR-gamma.Nature. 2003; 426: 190-193. Herzig S, Long F, Jhala US, Hedrick S, Quinn R,Bauer A, Rudolph D, Yoon C, Puigserver P, Spiegelman B, et al. CREB regulateshepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature. 2001; 413: 179-183）される通りに、塩化セシウム法によって精製し、10 %のグリセロールを含有するリン酸緩衝生理食塩水に対して透析した。対照miRNA又はTSC22D4特異的miRNAを肝細胞特異的プロモーターの制御下でコードするAAVを、以前より記載（Rose AJ, Frosig C, Kiens B,Wojtaszewski JF, Richter EA. Effect of endurance exercise training on Ca2+calmodulin-dependent protein kinase II expression and signaling in skeletalmuscle of humans. J Physiol. 2007; 583: 785-795）される通りに確立した。
【００７０】
動物実験
雄の8週齢〜12週齢のC57Bl/6及び10週齢のdb/dbマウスを、CharlesRiver Laboratories（ベルギー、ブリュッセル）から取得し、12時間の明−暗サイクルで規則的に無制限の食餌を与えて維持した。インスリン耐性試験及び耐糖能試験の前に、動物を4時間にわたって絶食させた。それ以外は、動物に制約なしに給餌し、水へのアクセスを自由にした。アデノウイルス注射のために、組換えウイルス当たりに1〜2×109プラーク形成単位（pfu）を、尾静脈注射を介して投与した。AAV実験のために、尾静脈を介して5×1011のウイルスを注射した。それぞれの実験において、6匹〜12匹の動物に、同じ処置を施し、そして示された絶食条件（18時間の絶食）、無作為給餌条件又は給餌条件（18時間の絶食に続いて6時間の再給餌）下で解析した。肝臓、精巣上体脂肪体及び腹部脂肪体並びに腓腹筋を含む器官を、特定の時間後に採集し、重さを量り、急速冷凍し、更なる解析に使用した。総体脂肪含量は、Echo MRI身体組成アナライザ（Echo Medical Systems、米国、ヒューストン）によって測定した。動物の取扱い及び実験は、NIHガイドラインに従って行い、地方自治体によって認可されたものであった。
【００７１】
インスリン耐性試験のために、1 mL当たり1 Uのインスリンのストック溶液を、0.9 %の塩化ナトリウムを使用して調製した。マウスを、実験前に4時間にわたって絶食させた。全ての動物の体重を測定し、血糖値をカミソリ刃で尾を切断することによって測定した。血液滴を、血糖値測定器のスリップ上に落とし、測定した。C57Bl/6には体重1 kg当たり1Uのインスリンを、そしてdb/dbマウスには体重1 kg当たり1.5 Uのインスリンを、腹腔内注射した。血糖値を、20分後、40分後、60分後、80分後及び120分後にモニターした。
【００７２】
耐糖能試験のために、20 %ブドウ糖のストック溶液を、0.9 %の塩化ナトリウムを使用して調製した。マウスを、実験前に4時間にわたって絶食させた。全ての動物の体重を測定し、血糖値をカミソリ刃で尾を切断することによって測定した。血液滴を、血糖値測定器のスリップ上に落とし、測定した。5 μL/gの20 %ブドウ糖溶液を、C57Bl/6マウス及びdb/dbマウスに腹腔内注射した。血糖値を、20分後、40分後、60分後、80分後及び120分後にモニターした。
【００７３】
定量的Taqman RT-PCR
トータルRNAを、均質化したマウス肝臓又は細胞溶解物からQiazol試薬（Qiagen、ドイツ、ヒルデン）を使用して抽出した。cDNAを、M-MuLV酵素及びオリゴdTプライマー（Fermentas、ドイツ、ザンクト・レオン＝ロート）を用いて逆転写によって調製した。cDNAを、アッセイ−オン−デマンドキット及びABIPRISM 7700配列検出装置（Applied Biosystems、ドイツ、ダルムシュタット）を使用して増幅させた。RNA発現データは、TATA-ボックス結合タンパク質（TBP）RNAのレベルに正規化した。
【００７４】
ヒトTSC22D4のmRNA発現を、定量的リアルタイムRT-PCRによって蛍光サーマルサイクラー（temperature cycler）中でTaqManアッセイを用いて測定し、そして蛍光は、ABI PRISM 7000配列検出装置（Applied Biosystems、ドイツ、ダルムシュタット）で検出した。トータルRNAを、TRIzol（Lifetechnologies、ニューヨーク州、グランドアイランド）を使用して単離し、1 μgのRNAを、標準的な試薬（LifeTechnologies、ニューヨーク州、グランドアイランド）を用いて逆転写した。各々のRT-PCRから、2 μlを、26 μlのPCR反応においてstratagene（カリフォルニア州、ラホヤ）社製のBrilliant SYBR green QPCR Core試薬キットを用いて製造元の指示に従って増幅させた。試料を、ABI PRISM 7000配列検出装置中で初期変性のために95℃で10分間にわたってインキュベートし、引き続き各サイクルが95℃で15秒間、60℃で1分間及び72℃で1分間からなる40サイクルのPCRサイクルを行った。ヒトTSC22D4及びObp2a（LCN13）（それぞれ、Hs00229526_m1及びHs01062934_g1によって測定される）（Applied Biosystems、ドイツ、ダルムシュタット）のmRNA発現を、HPRT1についてのプレミックスされたアッセイオンデマンド（Hs01003267_m1）（Applied Biosystems、ドイツ、ダルムシュタット）によって測定されるヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1（HPRT1）のmRNA発現に対して計算した。特定の転写物の増幅は、各々のPCRの終わりにおける融解曲線プロファイル（試料を68℃へと冷却し、95℃にゆっくりと加熱しつつ蛍光を測定する）によって確認した。PCRの特異性を、増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供することによって更に検証した。
【００７５】
タンパク質解析
タンパク質を、凍結した器官試料又は培養された肝細胞から細胞溶解バッファー中で抽出し（Rose AJ, Frosig C, Kiens B, Wojtaszewski JF, Richter EA. Effect ofendurance exercise training on Ca2+ calmodulin-dependent protein kinase IIexpression and signaling in skeletal muscle of humans. J Physiol. 2007; 583:785-795）、そして20 μgのタンパク質を、4 %〜12 %のSDS-ポリアクリルアミドゲルへとロードし、ニトロセルロース膜上にブロットした。ウェスタンブロットアッセイは、記載（Herzig et al, 2001）される通りにTSC22D4に対して特異的な抗体（Abcam、英国、ケンブリッジ又はSigma、ドイツ、ミュンヘン）、AKT、p-AKT、GSK、p-GSKに対して特異的な抗体（Cell signaling、米国、ダンヴァーズ）又はVCPに対して特異的な抗体（Abcam）を使用して実施した。
【００７６】
プラスミド及びRNA干渉
shRNA実験のために、マウス及びTSC22D4を標的とするオリゴヌクレオチド（配列番号1〜配列番号3）を、pENTR/U6 shRNAベクター（Invitrogen）中にクローニングした。
【００７７】
細胞培養及び一過性トランスフェクションアッセイ
マウス初代肝細胞を、記載（Klingmuller U, Bauer A, Bohl S, Nickel PJ, Breitkopf K, Dooley S,Zellmer S, Kern C, Merfort I, Sparna T, et al. Primary mouse hepatocytes forsystems biology approaches: a standardized in vitro system for modelling ofsignal transduction pathways. IEE Proc Syst Biol. 2006; 153: 433-447）される通りに単離及び培養した。簡潔には、雄の8週齢〜12週齢のC57Bl/6マウスを、体重1 kg当たり100 mgの塩酸ケタミン及び体重1 kg当たり5 mgの塩酸キシラジンの腹腔内注射により麻酔した。腹腔を開いた後に、肝臓を、門脈を介して5分間にわたって37℃で、HANKS I（pH7.4に調整された、1 Lの蒸留H2O、2.5 mMのEGTA、0.1 %のブドウ糖中の、8 gのNaCl、0.4 gのKCl、3.57 gのHepes、0.06 gのNa2HPO4×2 H2O、0.06 gのKH2PO4）にて、そして引き続き5分間〜7分間にわたってHANKS II（pH7.4に調整された、1 Lの蒸留H2O、0.1 %のブドウ糖、3 mg/mLのコラゲナーゼCLSII、5 mMのCaCl2中の、8 gのNaCl、0.4 gのKCl、3.57 gのHepes、0.06 gのNa2HPO4×2 H2O、0.06 gのKH2PO4）にて、肝臓構造の崩壊が観察されるまで灌流させた。肝被膜を除去し、細胞懸濁液を100 μmのメッシュを通じて濾過した。細胞を洗浄し、引き続き細胞の生存率を、トリパンブルー染色によって測定した。1ウェル当たり1000000の生存細胞を、コラーゲンIでコーティングされた6ウェルプレートに播種した。24時間後に、細胞を、感染多重度100で組換えアデノウイルスで感染させた。刺激実験のために、初代肝細胞を、10分間にわたって、100 nM/6ウェルの濃度でPBS（対照媒体）又はインスリンで処理した。細胞を、感染48時間後に採集した。
【００７８】
肝臓TSC22D4のシストローム解析
Chipシーケンシング結果のKEGG経路解析を、有意性によってソートした。インスリンシグナル伝達経路は、有意に制御されることが判明した（p=0.00005）。Chipシーケンシングは、Flag-TSC22D4 cDNAアデノウイルスが注射された雄のC57Bl/6マウスからの肝臓抽出物中で、注射7日後に実施した。
【００７９】
結果
上記配列は、4つの独立した実験（図面参照）に見られるようにマウス及びヒトの両方のTSCについて非常に効果的に作用した。各々の配列に結合された非特異的なdTdTオーバーハングは存在しない。それらの配列は、マウス及びヒトの両方のTSC配列に100 %合致した。
【００８０】
これらの結果に基づいて、本発明による配列（配列番号1〜配列番号3）を、治療目的に使用するための一次候補として選択した。それというのも、該配列は、TSC22D4に対して優れたノックダウン効率を示し、かつマウス、非ヒト霊長類及びヒトを含む様々な種を標的とするからである。それらの配列を同定し、マウスHepa1.6肝癌細胞及びヒトHuh7肝癌細胞を使用したin vitroノックダウン研究において、TSC22D4のmRNA配列に指向される様々なsiRNAを、機能的に試験及び検証をした。特に、mhD4-siRNA1は、TSC22D4に対して優れたノックダウン効率を示し、かつマウス、非ヒト霊長類及びヒトを含む様々な種を標的とした。
【００８１】
mhD4-siRNA1：（NM_030935.3_siRNA_1024; ORF）
センス：5'-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3'（配列番号1）；
アンチセンス：5'-UAAACAUCCACACACGUCCdTdT-3'（配列番号4）；
GC：47 %（TT-オーバーハングを含まない）
【００８２】
mD4-siRNA2：（NM_023910.6_siRNA_993; ORF）
センス：GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3'（配列番号2）；
アンチセンス：AUCUCUCUCGUAAACAUCCdTdT-3'（配列番号5）；
GC：42.1 %（TT-オーバーハングを含まない）
【００８３】
mhD4-siRNA3：
センス：5'-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3'（配列番号3）；
アンチセンス：5'-GCAAACAUGAGGUGGGACUdTdT-3'（配列番号6）；
GC：52.6 %（TT-オーバーハングを含まない）
【符号の説明】
【００８４】
図1
Relative mRNAlevel  相対mRNAレベル
図2
Relative TSC22D4Expression  相対TSC22D4発現
Mouse  マウス
図3
Relative TSC22D4Expression  相対TSC22D4発現
Human  ヒト
【図１】
2018513841.tif 000002
【図２】
2018513841.tif 000003
【図３】
2018513841.tif 000004
【配列表】
2018513841000001.app
【国際調査報告】
2018513841.tif 000005
2018513841.tif 000006
2018513841.tif 000007