(57)【要約】  本発明の開示は、テンプレート化されたアセンブリ反応体を同定し、濃縮し、及び評価するための方法及びキットを対象とする。いくつかの実施形態は、テンプレート化アセンブリ反応体を合成すること、そのテンプレート化アセンブリ反応体を標的核酸に相補的形成をさせること、テンプレート化アセンブリ反応を実施すること、及びそのテンプレート化アセンブリ反応体に相補的形成をした標的核酸を同定することによって、テンプレート化アセンブリ標的を同定する方法を開示する。テンプレート化アセンブリ反応体のライブラリー、テンプレート化アセンブリ標的を同定するキット、及び化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的誘発（ＣＬＯＳＥ）産物のライブラリーから濃縮された、一対のテンプレート化アセンブリ標的をまた、開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テンプレート化アセンブリ標的を同定する方法であって、テンプレート化アセンブリ反応体の第一集団、及び相応するテンプレート化アセンブリ反応体の第二集団を合成し、ここでそのテンプレート化アセンブリ反応体の第一及び第二集団が、オリゴヌクレオチド配列を含み、テンプレート化アセンブリ反応体の両集団を、標的核酸に相補的形成をさせ、テンプレート化アセンブリ反応を実施し、ここで前記相補的形成をしたテンプレート化アセンブリ反応体の第一集団、及び前記相補的形成をした相応するテンプレート化アセンブリ反応体の第二集団が、テンプレート化アセンブリを受け、及びテンプレート化アセンブリを受けた、前記テンプレート化アセンブリ反応体の第一または第二集団のいずれかと相補的形成をしたその標的核酸を同定し、ここで前記相補的形成をした標的核酸が、前記テンプレート化アセンブリ標的であることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記テンプレート化アセンブリ反応体の第一及び第二集団を合成するステップが、約７から約３０ヌクレオチド鎖長の不規則なオリゴヌクレオチド配列の合成をさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記テンプレート化アセンブリ反応体の第一及び第二集団を合成するステップがさらに、約７から約３０ヌクレオチド鎖長の遺伝子特異配列の合成を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項４】
前記テンプレート化アセンブリ反応体が、前記オリゴヌクレオチド配列に隣接する５′または３′プライミング部位を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５】
前記テンプレート化アセンブリ反応体の集団を、前記標的核酸に相補的形成をさせるステップに先立ち、前記標的核酸を取得することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６】
前記標的核酸を取得するステップがさらに、標的サンプルから核酸を単離することを含む、請求項５に記載の前記方法。
【請求項７】
前記標的サンプルが、細胞集団、腫瘍、組織、及び臓器の少なくとも１つである、請求項６に記載の前記方法。
【請求項８】
前記標的核酸が、それらの天然の二次配列を維持している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項９】
テンプレート化アセンブリ反応体の両集団を、前記標的核酸に相補的形成をさせるステップがさらに、非結合のテンプレート化アセンブリ反応体を除去することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１０】
非結合のテンプレート化アセンブリ反応体を除去する前記ステップが、酵素による消化、限外濾過またはゲルサイズ排除クロマトグラフィーの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の前記方法。
【請求項１１】
前記テンプレート化アセンブリ反応を実施するステップが、クリック化学反応、シュタウディンガー還元、非トレースレス・シュタウディンガー連結反応、トレースレス・シュタウディンガー連結反応、トレースレス・ホスフィノフェノール・シュタウディンガー連結反応、トレースレス・ホスフィノメタンチオール・シュタウディンガー連結反応、ネイティブ化学連結反応、及びバイオオルソゴナル化学反応の少なくとも１つを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１２】
前記標的核酸を同定するプテップがさらに、テンプレート化アセンブリを受けることに失敗した、前記相補的形成をしたテンプレート化アセンブリ反応体の第一集団、及び補的形成をした相応するテンプレート化アセンブリ反応体の第二集団を除去することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１３】
前記標的核酸を同定するステップがさらに、前記相補的形成をした標的核酸を増幅することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１４】
前記標的核酸を同定するステップがさらに、前記相補的形成をした標的核酸の配列を解析することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１５】
少なくともテンプレート化アセンブリ反応体の第一及び第二集団を含む、テンプレート化アセンブリ標的を同定するための、テンプレート化アセンブリ反応体のライブラリーであって、ここでそのテンプレート化アセンブリ反応体が、テンプレート化アセンブリ反応における反応に対応した、オリゴヌクレオチド配列及び修飾を含む、前記ライブラリー。
【請求項１６】
前記テンプレート化アセンブリ反応体がさらに、前記オリゴヌクレオチド配列に隣接する５′または３′プライミング部位のいずれかを含む、請求項１５に記載の前記ライブラリー。
【請求項１７】
前記テンプレート化アセンブリ反応体の第一集団における修飾がさらに、５′−アジド基を含み、前記テンプレート化アセンブリ反応体の第二集団における修飾がさらに、３′−アルキン基を含む、請求項１５に記載の前記ライブラリー。
【請求項１８】
前記テンプレート化アセンブリ反応体の第一集団における修飾がさらに、５′−アルキン基を含み、前記テンプレート化アセンブリ反応体の第二集団における修飾がさらに、３′−アジド基を含む、請求項１５に記載の前記ライブラリー。
【請求項１９】
前記テンプレート化アセンブリ反応が、クリック化学反応、シュタウディンガー還元、非トレースレス・シュタウディンガー連結反応、及びネイティブ化学連結反応（ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）から成る群から選ばれる、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の前記ライブラリー。
【請求項２０】
前記修飾が、トレースレス・ホスフィノフェノール・シュタウディンガー連結反応またはトレースレス・ホスフィノメタンチオール・シュタウディンガー連結反応のいずれかから選ばれた、トレースレス・シュタウディンガー連結反応に特異的である、請求項１９に記載の前記ライブラリー。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチド配列が、約７から約３０ヌクレオチド鎖長の不規則配列を含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の前記ライブラリー。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチド配列が、約７から約３０ヌクレオチド鎖長の遺伝子特異的配列を含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の前記ライブラリー。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチド配列がさらに、ヌクレアーゼ耐性のホスホジエルテル骨格またはヌクレアーゼ耐性の糖モイエティーを含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の前記ライブラリー。
【請求項２４】
テンプレート化アセンブリ標的を同定するためのキットであって、相応するテンプレート化アセンブリ反応体及び試薬として修飾されたオリゴヌクレオチド配列を含む、テンプレート化アセンブリ標的の同定に対応したオリゴヌクレオチドのライブラリーを含む、前記キット。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチド配列がさらに、５′、３′、または５′及び３′プライミング部位を含む、請求項２４に記載の前記キット。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチド配列がさらに、テンプレート化アセンブリに対応した５′または３′修飾を含む、請求項２４または請求項２５に記載の前記キット。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチド配列が、約５から約１００ヌクレオチド鎖長の不規則配列を含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の前記キット。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチド配列が、約５から約１００ヌクレオチド鎖長の遺伝子特異配列を含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の前記キット。
【請求項２９】
化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的誘発（ＣＬＯＳＥ）産物のライブラリーからの、一対のテンプレート化アセンブリ標的の濃縮法であって、細胞核酸標的への空間的近接位よるテンプレート化アセンブリを介して、化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドのライブラリーを取得すること、  連結反応したオリゴヌクレオチド−細胞核酸標的のライブラリーを増幅すること、及び連結反応したオリゴヌクレオチド−細胞核酸標的を選択的に濃縮することを含み、ここで前記連結反応標的が、対象となる異常細胞の病理に、または前記細胞核酸標的への不連続な相補的形成に関連して選択される、前記濃縮法。
【請求項３０】
連結反応した標的を選択的に濃縮する前記ステップがさらに、一致した対象となる正常細胞から誘導される、連結反応した標的を除去することを含む、請求項２９に記載の前記濃縮法。
【請求項３１】
化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的誘発（ＣＬＯＳＥ）産物のライブラリーから濃縮した、一対のテンプレート化アセンブリ標的であって、細胞核酸テンプレートへの相補的形成を介した、それらの空間的近接位よって、化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドを含む、前記一対のテンプレート化アセンブリ標的。
【請求項３２】
前記ＣＬＯＳＥライブラリーが、前記化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドの短いＰＣＲ産物の二本鎖を含む、請求項３１に記載の前記テンプレート化アセンブリ標的。
【請求項３３】
前記ＣＬＯＳＥライブラリーが、増幅された化学的連結反応産物のライブラリーを含む、請求項３１または請求項３２に記載の前記テンプレート化アセンブリ標的。
【請求項３４】
前記ＣＬＯＳＥライブラリーが、増幅された再配列した化学的連結反応産物のライブラリーを含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の前記テンプレート化アセンブリ標的。
【請求項３５】
前記細胞核酸テンプレートが、既知のがん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子、細胞周期レギュレータ及びメディエーター、転写レギュレータ及びメディエーター、翻訳レギュレータ及びメディエーター、テロメラーゼ、細胞骨格成分、及びキナーゼに対応するゲノムまたは発現遺伝子などを含む、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の前記テンプレート化アセンブリ標的。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが、正常細胞から誘導されたＣＬＯＳＥライブラリーとの比較で、異常細胞から誘導されたＣＬＯＳＥライブラリーにおいて特異的に濃縮される、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の前記テンプレート化アセンブリ標的。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドが、異常細胞及び一致していない対象となる正常細胞から個別に誘導された連結反応標的に対して、選択的に濃縮される、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の前記テンプレート化アセンブリ標的。
【請求項３８】
テンプレート化アセンブリに対応した、一対の化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的誘発（ＣＬＯＳＥ）産物を評価する方法であって、テンプレート化アセンブリ反応体としての一対のＣＬＯＳＥ産物を修飾すること、前記一対の修飾されたＣＬＯＳＥ産物を、対象となる標的異常細胞に形質導入すること、及び前記一対の修飾されたＣＬＯＳＥ産物のテンプレート化アセンブリを選別することを含む、前記方法。
【請求項３９】
前記の対を修飾するステップが、前記ＣＬＯＳＥ産物にピレン基を追加することを含む、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４０】
前記ピレン基が、ピレンマレイミドである、請求項３９に記載の前記方法。
【請求項４１】
前記の対を修飾するステップが、前記ピレン及びマレイミド間のスペーサーアーム含む、請求項４０に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の開示は、テンプレート化されたアセンブリ標的の同定、濃縮、及び評価を提供する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤開発の目標は、隣接する正常細胞またはその患者の健康全般に対して毒性リスクを伴わずに、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、自己免疫反応を産生している細胞、及びその他の調節または機能不全細胞などの、病原性細胞に特異的な、強力な生物学的薬剤による治療介入を送達することである。残念ながら、これらの薬剤の開発は、極めて困難である。
【０００３】
正常細胞への毒性を軽減する一方で、病原性細胞に対しては強力な治療介入の送達を可能にするために浮上してきた方法は、病原性細胞に特異的な分子マーカーに対して標的化する治療学である。標的化治療学は、制約された場合においては、驚くべき臨床結果を示したが、しかし現在、標的化治療に対して利用可能なマーカーの欠如により、それらの応用には限界がある。多数の病原性細胞の種類に対して、タンパク質マーカーを発見することは、極めて難しく、及び多くの場合は不可能である。
【０００４】
ｓｉＲＮＡなどの、既存の核酸標的化治療は、潜在的に危険な遺伝子の発現を下方調整できるが、しかし強力な細胞毒性のまたは細胞増殖抑制性の治療介入を送達せず、及びしたがって、その危険な細胞自体を排除するのに特に効果的なわけではない。
【０００５】
そのような理由から、既存治療介入の非力な効果ではなく及び／または重度の副作用が無い、高度に標的化された治療法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の開示は、テンプレート化されたアセンブリ標的を同定し、濃縮し、及び評価するための方法及びキットを対象とする。
【０００７】
いくつかの実施形態は、テンプレート化アセンブリ反応体の第一集団及び相応するテンプレート化アセンブリ反応体の第二集団を合成することを含む、テンプレート化アセンブリ標的を同定する方法を対象としており、ここでそのテンプレート化アセンブリ反応体の第一及び第二集団が、オリゴヌクレオチド配列を含み、核酸を標的化するために、両方のテンプレート化アセンブリ反応体が、相補的形成をし、テンプレート化アセンブリ反応を行うことを含み、ここでその相補的形成をした、テンプレート化アセンブリ反応体の第一集団及びその相補的形成をした、相応するテンプレート化アセンブリ反応体の第二集団が、テンプレート化アセンブリを受け、及びテンプレート化アセンブリを受けたテンプレート化アセンブリ反応体の第一または第二集団のいずれかと相補的形成をした標的核酸を同定し、ここでその相補的形成をした標的核酸が、当該テンプレート化アセンブリ標的である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、テンプレート化アセンブリ反応体の第一及び第二集団の合成は、約５から約１００のヌクレオチド鎖長または約７から約３０のヌクレオチド鎖長の、不規則なもしくは遺伝子特異なオリゴヌクレオチド配列を合成することを含むことができる。当該テンプレート化アセンブリ反応体はまた、ヌクレアーゼ耐性ホスホジエステル骨格またはヌクレアーゼ耐性糖モイエティーを含むことができる。当該テンプレート化アセンブリ反応体は、そのオリゴヌクレオチド配列に隣接する５′または３′のプライミング部位を含むことができる。当該テンプレート化アセンブリ反応体はまた、対応する集団上に、５′−アジド及び３′−アルキン基、５′−アルキン及び３′−アジド基、ならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びシクロオクチンなどの、修飾を含むことができる。この修飾は、トレースレスのホスフィノフェノール・シュタウディンガー連結反応またはトレースレスのホスフィノメタンチオール・シュタウディンガー連結反応のいずれかから選ばれる、トレースレスのシュタウディンガー連結反応に対して特異的であり得る。このテンプレート化アセンブリ反応体はまた、少なくとも６つの炭素原子などの、スペーサーまたはリンカーを含むことができる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、当該方法は、当該テンプレート化アセンブリ反応体の集団の当該標的核酸への相補的形成に先立ち、その標的核酸を獲得することを含むことができる。標的サンプルから核酸を単離することをまた、当該方法に含むことができる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、当該標的サンプルは、細胞集団、腫瘍、組織、または臓器の少なくとも１つであり得る。当該標的核酸はまた、それらの自然な二次構造を維持することができる。当該標的核酸はまた、既知のがん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子、細胞周期レギュレータ及びメディエーター、転写レギュレータ及びメディエーター、翻訳レギュレータ及びメディエーター、テロメラーゼ、細胞骨格成分、及びキナーゼに対応するゲノムまたは発現遺伝子などの、細胞核酸テンプレートを含むことができる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、テンプレート化アセンブリ反応体の両集団の当該標的核酸への相補的期形成には、結合していないテンプレート化アセンブリ反応体を除去することを含むことができる。結合していないテンプレート化アセンブリ反応体の除去にはまた、酵素的な消化、限外濾過、またはゲルサイズ排除クロマトグラフィー、もしくはそれらの任意の組み合わせによって、その結合していない反応体を除去することを含むことができる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、当該テンプレート化アセンブリ反応は、クリック化学反応、シュタウディンガー還元、非トレースレス・シュタウディンガー連結反応、トレースレス・シュタウディンガー連結反応、トレースレス・ホスフィノフェノール・シュタウディンガー連結反応、トレースレス・ホスフィノメタンチオール・シュタウディンガー連結反応、ネイティブ化学連結反応、及びバイオオルソゴナル化学反応、またはそれらの任意の組み合わせの、少なくとも１つであり得る。
【００１３】
いくつかの実施形態において、当該標的核酸の同定には、テンプレート化アセンブリを受けることがなかった、当該相補的形成のテンプレート化アセンブリ反応体の第一集団及びその相補的形成の相応するテンプレート化アセンブリ反応体の第二集団を除去することを含むことができる。未反応のテンプレート化アセンブリ反応体からの反応したテンプレート化アセンブリ反応体の微小コンパートメント化、及び／またはその相補的形成をした標的核酸の増幅にはまた、その同定を含んで良い。さらに、その相補的形成をした標的核酸の配列解析を、その標的核酸を同定するために利用することができる。
【００１４】
本発明の開示はまた、少なくともテンプレート化アセンブリ反応体の第一及び第二集団を含む、テンプレート化アセンブリ標的の同定に対応した、テンプレート化アセンブリ反応体のライブラリーを対象としており、ここでそのテンプレート化アセンブリ反応体が、オリゴヌクレオチド配列及びテンプレート化アセンブリ反応における反応に対する修飾を含む。相応するテンプレート化アセンブリ反応体及び試薬として修飾されたオリゴヌクレオチド配列を有するテンプレート化アセンブリ標的を同定するための、オリゴヌクレオチドのライブラリーを含んだ、テンプレート化アセンブリ反応体を同定するキットをまた、開示する。さらに、細胞核酸テンプレートへの相補的形成を介して、それらの空間的近接のために化学連結反応したオリゴヌクレオチドを有する、化学連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的に励起された（ＣＬＯＳＥ）産物のライブラリーから濃縮された、一対のテンプレート化アセンブリ標的を含む。
【００１５】
本発明の開示はまた、細胞核酸標的への空間的近接のために、テンプレート化アセンブリを介して化学連結反応したオリゴヌクレオチドのライブラリーを取得すること、その連結反応したオリゴヌクレオチド−細胞核酸標的のライブラリーを増幅すること、及び連結反応したオリゴヌクレオチド−細胞核酸標的を選択的に濃縮することを含んで、化学連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的に励起された（ＣＬＯＳＥ）産物のライブラリーから、一対のテンプレート化アセンブリ標的を濃縮する方法を対象としており、ここでその連結反応した標的が、対象となる異常細胞の病理または当該細胞核酸標的への不連続な相補的形成に関連して、選択される。当該方法はまた、一致した対象となる正常細胞から誘導される、連結反応した標的を除去することを含むことができる。
【００１６】
細胞核酸テンプレートへの相補的形成を介して、それらの空間的近接のために化学連結反応したオリゴヌクレオチドを含んで、化学連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的に励起された（ＣＬＯＳＥ）産物のライブラリーから濃縮された、一対のテンプレート化アセンブリ標的もまた、含まれる。当該ＣＬＯＳＥライブラリーは、増幅された化学連結反応産物のライブラリーまたは増幅され再配列した化学連結反応産物のライブラリーからなどの、その化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドの短いＰＣＲ産物の２本鎖から作ることができる。そのオリゴヌクレオチドは、正常細胞から誘導されたＣＬＯＳＥライブラリーとの比較で、異常標的細胞から誘導されたＣＬＯＳＥライブラリーにおいて特異的に濃縮できる。当該オリゴヌクレオチドは、対象となる一致した正常細胞ではなく、対象となる異常細胞から特異的に誘導された、連結反応した標的に選択的に濃縮できる。
【００１７】
本発明の開示はまた、テンプレート化アセンブリ反応体としての一対のＣＬＯＳＥ産物を修飾すること、その一対の修飾されたＣＬＯＳＥ産物を、対象となる標的異常細胞に導入すること、及びその一対の修飾されたＣＬＯＳＥ産物のテンプレート化アセンブリを選別することを含む、テンプレート化アセンブリに対応した、一対の化学連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的に励起された（ＣＬＯＳＥ）産物を評価する方法を対象とする。当該ＣＬＯＳＥ産物はまた、ピレンマレイミドなどの、及び／またはピレンとマレイミドとの間のスペーサーアームを含んで、ピレン基を添加することによって修飾され得る。
【００１８】
本開示の上記の特徴、利点及び目的が明確になり、詳細に理解され得るように、添付図面を、本明細書に含めた。これらの図面は、本明細書の一部を成す。しかしながら、当該添付図面は、本開示のいくつかの実施形態を説明しており、及び本請求項の範囲を限定すると考えられるべきではないことに、留意する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄについて、図１Ａは、不規則なデカマー・オリゴヌクレオチド（ＲＤＯ）、Ｐ１：プライマー部位１、Ｎ１０：不規則デカマー経路、Ｍｅ−Ｃ：５−メチルデオキシシチジン残基、Ａｋ：３′−プロパルギル基の形態での３′−末端アルキン、図１Ｂは、ＲＤＯ２、Ｐ２：  プライマー部位２、Ｎ１０：不規則デカマー経路、Ａｚ：５′−末端アジド基、図１Ｃは、そのプライマー部位に相補的な２′−Ｏ−メチル・オリゴヌクレオチドと相補的形成をしたＲＤＯ１（ＲＤＯ１：Ｐ１Ｃ）、Ｐ１：  プライマー部位１、Ｎ１０：不規則デカマー経路、Ａｋ：３′−プロパルギル基の形態での３′−末端アルキン、及び図１Ｄは、そのプライマー部位に相補的な２′−Ｏ−メチル・オリゴヌクレオチドと相補的形成をしたＲＤＯ２（ＲＤＯ２：Ｐ２Ｃ）、Ｐ２：  プライマー部位１、Ｎ１０：不規則デカマー経路、Ａｚ：５′−末端アジド基とする、概略構成を説明しており、ＣＬＯＳＥライブラリーとの関連では、ＲＤＯ１及びＲＤＯ２を、便宜上、「左」（Ｌ）及び「右」（Ｒ）オリゴヌクレオチドと呼ぶ。
【図１Ｂ】図１Ａの続き。
【図１Ｃ】図１Ｂの続き。
【図１Ｄ】図１Ｃの続き。
【図２】Ｓ１及びＳ２は、その元の不規則デカマーの総集団から選択されたデカマーの二次集団を意味するが、そのいずれかの不連続（立体配座的に決定された）部位の直線（連続）部位上において、ＲＤＯ集団からの特定オリゴヌクレオチドの標識化された５′−及び３′−末端の、代表的な相補的形成−介在の空間配置を示す。
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、５′−及び３′−末端で別々に標識化された不規則デカマー集団からの特定オリゴヌクレオチドの間での、産生的及び非産生的な相補的形成を示す代表的な略図である。図３Ａは、産生的で、５′−アジド及び３′−アルキン修飾集団の両方から、図３Ｂは、非産生的で、５′−アジド修飾集団だけから、及び図３Ｃは、非産生的で、３′−アルキン修飾集団だけからである。
【図３Ｂ】図３Ａの続き。
【図３Ｃ】図３Ｂの続き。
【図４】同じパターンの同数の不規則オリゴヌクレオチド（Ｒｎｄ１〜Ｒｎｄ１７）との比較における、ＣＬＯＳＥクローン（Ｃ１〜Ｃ１９）の代表例を示す。ＣＬ１＝ＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１）、ＴＴＡＡＡＧＴＧＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２）、ＣＬ２＝ＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３）、ＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号４）、ＣＬ３＝ＡＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号５）、  ＴＴＣＧＣＧＴＣＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号６）、  ＣＬ４＝ＴＣＴＴＴＴＡＣＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号７）、ＴＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号８）、ＣＬ５＝ＡＣＡＣＣＣＴＣＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号９）、ＴＡＣＣＴＴＣＴＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１０）、ＣＬ６＝ＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１１）、ＴＴＧＴＧＧＡＴＧＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１２）、ＣＬ８＝ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１３）、ＴＣＧＴＣＴＧＣＧＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１４）、ＣＬ９＝ＴＴＣＡＡＴＧＧＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１５）、  ＴＴＡＣＣＣＡＧＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１６）、ＣＬ１０＝ＡＴＣＡＡＣＣＣＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１７）、ＴＧＴＡＴＴＣＧＣＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１８）、ＣＬ１１＝ＡＣＧＣＣＧＡＴＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１９）、ＴＧＧＣＡＧＴＣＧＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２０）、ＣＬ１２＝ＡＣＣＴＡＡＣＡＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２１）、ＴＴＣＡＴＣＣＧＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２２）、ＣＬ１３＝ＴＴＧＡＡＣＧＡＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２３）、ＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２４）、ＣＬ１４＝ＡＴＡＧＡＡＧＧＧＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２５）、  ＴＴＡＧＧＣＣＡＡＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２６）、ＣＬ１５＝ＣＣＡＡＣＴＧＴＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２７）、  ＴＡＧＧＣＧＧＴＴＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２８）、ＣＬ１６＝ＣＣＣＧＧＣＣＴＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２９）、ＴＴＣＣＴＡＧＣＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３０）、ＣＬ１７＝ＡＡＡＣＣＧＡＣＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３１）、  ＴＡＴＧＣＴＧＴＣＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３２）、ＣＬ１９＝ＡＴＴＣＧＣＣＣＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３３）、ＴＣＣＧＣＴＴＣＧＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３４）、である。
【図５】異常細胞源からのＣＬＯＳＥライブラリーと対応する正常細胞からのＣＬＯＳＥライブラリーの代表的な比較減法を示す。Ｐ１〜Ｐ４は、個別のプライミング部位を示し、Ｓ１及びＳ２は、元の不規則領域からの、異常細胞から選択されたデカマー経路を示し、Ｓ３及びＳ４は、元の不規則領域からの、対応する正常細胞から選択されたデカマー経路を示す。
【図６】固相ストレプトアビジン上での選択、及び過剰な遊離ビオチンでの溶出によって精製された、デスチオビオチン化「トップ」鎖（初期ＣＬＯＳＥライブラリーの鎖に対応している）を取得するための、代表的な手順を示す。
【図７】正常細胞のバックグラウンドが欠乏したＣＬＯＳＥクローンの濃縮のために、正常細胞ＲＮＡ源に対応するＣＬＯＳＥクローンの代表的選択を示し、デスチオビオチン化トップ鎖を、本明細書に記述のように調合する。
【図８Ａ】特定ＣＬＯＳＥデカマー（Ａ１及びＡ２）候補のピレンによる標識化、及び励起−蛍光発生の代表的な図説であり、図７Ａは、３′−または５′−末端−ＳＨ基への、ピレンマレイミドの化学連結、及び図７Ｂは、相補的形成誘導の空間的近接からのエキシマー蛍光発光を示す。
【図８Ｂ】特定ＣＬＯＳＥデカマー（Ａ１及びＡ２）候補のピレンによる標識化、及び励起−蛍光発生の代表的な図説であり、図７Ａは、３′−または５′−末端−ＳＨ基への、ピレンマレイミドの化学連結、及び図７Ｂは、相補的形成誘導の空間的近接からのエキシマー蛍光発光を示す。
【図９】供給源のＲＮＡテンプレートレベルと相関している、特定ＣＬＯＳＥクローンの相対レベルの定量化に対応した、代表的なＱＰＣＲを説明し、上段は、相補的形成での近接によって選択された、初期ＣＬＯＳＥクローンの化学連結反応した集団であり、Ｃｕ（Ｉ）触媒の作用によるトリアゾール連結、及び２つの特定デカマー領域のＡ１及びＡ２を描写しており、中段は、Ｐ２への相補体からの第二サイクル拡張、及び５′−蛍光及び３′クエンチヤーを伴ってアニール処理されたＱＰＣＲプローブを示す、特定Ａ１／Ａ２クローンであり、下段は、鎖の置換、及びその蛍光の抑制を解き放ち、ならびに蛍光の定量化を可能にするためのプローブの消化を伴った、その伸長（中段の図のように）の完了を示す。
【図１０】特定デカマー領域であるＡ１及びＡ２を伴った、単一候補のＣＬＯＳＥ対に対応した、代表的なデジタルＰＣＲを描写しており、標的ＲＮＡとの相補的形成及びＣｕ（Ｉ）触媒の作用による化学連結反応後に、その標的ＲＮＡにおいて、化学連結反応したダイマーの数が、テンプレート分子の数と接近しており、その連結反応産物が、過剰モルのプライマーとプローブでコンパートメント化されることによって、デジタルＰＣＲに対応して調合され、及び増幅時の、ＰＣＲに関連する緩衝液及び酵素条件（Ｔａｑ１  ＤＮＡポリメラーゼ、その他の回路図記号、及び蛍光発生のプロセス）、連結ダイマーを受け有するコンパートメント、及びその標的ダイマーとプライマーならびにプローブとの一致が、蛍光シグナルを生み出し、したがって、（＋）シグナルコンパートメントを網羅すると、元々存在するダイマーの数、及び同様におおまかなテンプレート分子の数と同じになる。
【図１１】＋／−ＤＮａｓｅ処理のＣＬＯＳＥ／ＲＮＡ相補的形成の代表的ゲル評価を描写する。レーン１は、ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド＋ＲＮＡテンプレート＋ＤＮａｓｅ、レーン２は、ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド＋ＤＮａｓｅ無しのＲＮＡテンプレート、レーン３は、テンプレート無しのＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド＋ＤＮａｓｅ、レーン４は、テンプレート無し及びＤＮａｓｅ無しのＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドであり、その結果は、テンプレートの存在（レーン２及び４）に関わらず、持ち越されたＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの存在を示したが、ＲＮＡテンプレートが存在する場合だけはＤＮａｓｅ処理後（レーン１対レーン３）に観察されたバンドがあり、化学連結反応したＣＬＯＳＥダイマーに対して期待された大きさに相当するレーン１（増幅させたＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド＋ＲＮＡテンプレート＋ＤＮａｓｅ）のバンドを取り出し、利用可能な収率を増加させるために、元のプライマーで再増幅させた。
【図１２】ＲＮＡ／非相補的形成のＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの分離に対応した、ＰＥＧ試験の代表的なゲル解析（２％寒天）を描写する。レーン１〜３は、ＭＵ８９ＲＮＡに加えて、２′−Ｏ−メチル保護鎖でアニール処理されたＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド、レーン４〜６は、ＭＵ８９ＲＮＡに加えて、保護鎖の無いＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド、レーン１及び４は、最終ＰＥＧペレット（２ｘ沈殿物）、レーン２及び５は、第一ＰＥＧ上清、及びレーン３ならびに６は、第二ＰＥＧ上清を示す。
【図１３】単一ＰＥＧ沈殿物及びＤＮａｓｅステップを伴う、代表的なＣＬＯＳＥプロセスの概略形態を描写する。
【図１４】代表的なＣＬＯＳＥ部位の命名規則を描写する。テンプレート上の不連続部位に相補的形成をしたＬ−及びＲ−ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドは、それらの互いに直線的に向き合った（「ｅｎｄｏ」形態）、または互いに反対に向いた（「ｅｘｏ」形態）化学修飾末端のいずれかを有することができ、いくつかの形態は、１）Ｌ及びＲ部位間の距離（前述のＮ配列）、２）Ｎ及び隣接配列の柔軟性、及び３）空間的近接を促進する二次構造に依存して、エフェクターの部分的な反応性を高める可能性がある。
【図１５】二次構造ループ内の、代表的不連続「ｅｎｄｏ」対「ｅｘｏ」部位を描写する。仮に、相補的形成がループ内であれば、ｅｘｏ形態の末端は、空間的に接合し得るが、一方で従来型のｅｎｄｏの配向性は、活性が乏しい。
【図１６】「ｅｎｄｏ」対「ｅｘｏ」形態で評価した、代表的な不連続構造を描写している。利用した条件下では、テンプレートの無い状態においては、著しいクリック反応は、観察されなかった。
【図１７】ループ形態上の、代表的な「ｅｘｏ」クリックの依存性を描写している。本明細書の「ｃｏｎｔｒｏｌ（対照）」配列は、ループ形成を促すＧ−Ｃ経路が非自己相補配列で置き換えられたため、ループは形成できない。利用した条件下では、テンプレートの無い状態においては、著しいクリック反応は、観察されなかった。
【図１８】図１９に使用した、ステムループのテンプレートの代表的な構造を描写している。
【図１９】テンプレート鎖上の不連続部位への相補的形成に従うクリック反応の代表的な実例を示す。ステムループのオリゴヌクレオチドの概略図は、図１８に示されている。バンドは、そのテンプレート鎖（３０−ｍｅｒｓ）からの、識別可能なクリック連結された産物（２０−ｍｅｒｓ）の位置を示す。
【図２０】野生型及び変異ＨＰＶテンプレート上でアニール処理された、代表的なピレン標識化オリゴヌクレオチドのＰｙｅＴＯ．１及びＰｙｅＴＯ．２を示す。その野生型配列（ＨＰＶ−１）に対応する当該オリゴヌクレオチドは、１つの塩基（図中四角で囲まれたｄＡ残基）によって、それらが即座に並列になるＨＰＶ−０テンプレートとは異なり、互いに置き換えられ、ＨＰＶ−２及びＨＰＶ−３に対しては、その置換は、各々２つ及び３つのｄＡ残基（図中四角で囲まれた）である。ＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号８９）、ＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３５）、ＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号９０）、ＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号９１）、ＵＣＣＡＧＡＵＧＵＣＵＵＵＧＣ−ピレン（ＳＥＱ  ＩＤ番号３６）、ピレン−ＵＵＵＣＵＵＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号８８）。
【図２１】等量モルでの特定テンプレート、ＨＰＶ−０、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−２、及びＨＰＶ−３上におけるピレンエキシマー蛍光発光の誘導を示す。ＨＰＶ−Ｓｃｒ＝ＨＰＶ−０配列から不規則に混合したテンプレート。ＮＴ＝テンプレート無し。
【図２２】代表的なＣＬＯＳＥ交差ソフトウェアの原理をフローチャートで描写しており、各ＣＬＯＳＥクローン配列に対応するプロセス経路を示している。
【図２３】代表的なＣＬＯＳＥ交差ソフトウェアの原理を描写している。
【図２４】代表的なＣＬＯＳＥ交差ソフトウェア原理である、ヒットの例示を描写している。特定のＣＬＯＳＥクローンで、ＣＬＯＳＥ交差ソフトウェアから、ＰＬＸＮＡ３配列を見出し、ここでそのＣＬＯＳＥ一致は、ＥＸＯ形態においてであり（そのような場合においては、Ｌ−ＣＬＯＳＥ一致が、Ｒ−ＣＬＯＳＥ一致より、標的ＲＮＡ配列の５′末端により近接している）、このＣＬＯＳＥ配列は、ＥＸＯまたはＥＮＤＯ形態のいずれにおいても、標準的な相補体で、これらの試験に使用した１０−ｍｅｒのクリック・オリゴヌクレオチドに置き換えられた。利用した条件下では、テンプレートの無い状態においては、著しいクリック反応は、観察されなかった。
【図２５】標的テンプレートが、エフェクター部分でモル過剰の場合、テンプレート漸増効果の代表的な概略図を描写している。
【図２６】ピレン蛍光発光を伴う、テンプレート漸増効果の代表的な実例を描写している。ＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３５）、ＵＣＣＡＧＡＵＧＵＣＵＵＵＧＣ−ピレン（ＳＥＱ  ＩＤ番号３６）、ピレン−ＵＵＵＣＵＵＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号８８）。
【図２７】生体外での、ＲＮＡテンプレートを伴うテンプレート漸増効果の代表的な実例を描写している。ＭＵ８９ＲＮＡ対クリック・オリゴヌクレオチドに割り当てられた比率は、約１５００塩基の推定平均ＲＮＡサイズに基づいている。ＧＡＡＡＵＡＧＡＵＧＧＵＣＣＡＧＣＵＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３７）、ＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３８）。
【図２８】代表的な標的指向ＣＬＯＳＥである、発現した転座の略図事例を描写しており、ここで２つの正常な転写産物は、効果的に融合しており、直線状の連続配列として標的化され得る、ただ１つの可能な接合配列がある一方で、より高い次元のＲＮＡの折り込み及び二次構造によって介在される空間的近接を介して形成された、多数の潜在的なＣＬＯＳＥ部位がある。
【図２９】ビオチン化ボトム鎖の除去と組み合わされた、代表的な非対称ＰＣＲを描写している。
【図３０】代表的な標的指向ＣＬＯＳＥの原理を描写しており、当該プローブが、相補的形成をする配列を有するＣＬＯＳＥ構成体を「引き出す（ｐｕｌｌｓ  ｏｕｔ）」。これらは、必ずしも必要ではないが、連続したＬｅｆｔ（左）及びＲｉｇｈｔ（右）ＣＬＯＳＥセグメントを含んで良く、したがって、不連続部位は、直線的な相補的形成プローブによって、見出されて良い。
【図３１】標的指向ＣＬＯＳＥに対応したプローブとして使用した、代表的なＢＣＲ−ＡＢＬセグメント（１３３８塩基、ＳＥＱ  ＩＤ番号３９）を描写している。黒文字は、ＢＣＲ配列、灰色文字は、ＡＢＬ配列（ＧＡＧＴＴＣＡＡ／ＡＡＧＣＣＣＴＴ、ＳＥＱ  ＩＤ番号４４で結合）であり、関連する増幅プライマーに対応するプライマー部位は、下線が引いてある。
【図３２】図３２Ａ及び３２Ｂは、標的指向ＣＬＯＳＥ、及びＢＣＲ−ＡＢＬプローブを伴って得られたクローンの例示、ならびにＢＣＲ−ＡＢＬに対する候補の例示（ゲル略図：レーンＡ：図中□で囲まれた領域、標的細胞の全ＲＮＡ上で連結反応した、１本鎖ＣＬＯＳＥダイマーとの相補的形成後の長い１本鎖プローブ、したがって低分子バンドで、遊離の過剰ＣＬＯＳＥ配列の、相補的形成配列を伴う２本鎖ＣＬＯＳＥクローンを有しており、レーンＢ：長いプローブ分子を欠いた対照サンプルで、図中□で囲まれた領域で、低分子バンドで、遊離の過剰ＣＬＯＳＥ配列のプローブ配列に対して、同じ可動性の対照ゲル領域である）、及びＢＣＲ−ＡＢＬ選択の２サイクルから得られた、Ｋ５６２ＲＮＡからのクローン化ＣＬＯＳＥクローンの２つの例示に対する、各々の代表的ゲル精製法を描写している。各々に対して、第一配列は、グレーで示した介在ＣＴダイマーを伴った実際のＣＬＯＳＥ２２−ｍｅｒｓを示し（ｄＢＢｃ２−０１＝ＡＴＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＴＧ、ＳＥＱ  ＩＤ番号４０に対応し、ｄＢＢｃ２−０８＝ＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴ、ＳＥＱ  ＩＤ番号４１に対応する）、これらの鎖に対する逆相補体（ｄＢＢｃ２−０１＝ＣＡＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＴ、ＳＥＱ  ＩＤ番号４２に対応し、ｄＢＢｃ２−０８＝ＡＧＧＡＧＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＴＣＡ、ＳＥＱ  ＩＤ番号４３に対応する）は、ＢＣＲ−ＡＢＬプローブに対して（＋）鎖、または全ＲＮＡ転写産物に相当し、下線が引かれた太文字は、以下の配位（集積された８７０３塩基のＢＣＲ−ＡＢＬ完全鎖長の転写産物、そのプローブ範囲は、２７６６〜４１０３に配位する）を伴った、ＢＣＲ／ＡＢＬ一致を示し、そのＮ値は、Ｌ及びＲ一致の最接近末端間の距離に相当する。
【図３３Ａ】末端アジド及びシクロオクチン基を有するＲＤＯ、Ｐ１、Ｐ２は、各々プライマー部位１及び２、Ｎ１０は、不規則なデカマー経路、ＣＯＴは、３′−末端修飾シクロアルキン、Ａｚは、５′−末端アジド基である、代表的な概略構造を描写している。
【図３３Ｂ】末端アジド及びシクロオクチン基を有するＲＤＯ、Ｐ１、Ｐ２は、各々プライマー部位１及び２、Ｎ１０は、不規則なデカマー経路、ＣＯＴは、３′−末端修飾シクロアルキン、Ａｚは、５′−末端アジド基である、代表的な概略構造を描写している。
【図３４】図３４Ａ及び３４Ｂは、当該標的ＲＮＡ鎖、５′アジドのＡＺ、５′シクロオクチンのＣＯＴの二次構造からもたらされる、相補的形成介在の空間的近接位によって進められた、各々代表的な「ｕｎｎａｔｕｒａｌ（非天然）」５′−５′（頭部対頭部、Ａ）、及び３′−３′（尾部対尾部、Ｂ）の化学連結反応を描写している。
【図３５】５′クリック基（アジド、ＡＺ及びシクロアルキン、ＣＯＴ）、初期の不規則領域（Ｎ１及びＮ２）、ＰＣＲプライマー部位（Ｐ１及びＰ２）、及び制限部位／プライマー領域（Ａ１及びＡ２）を有する、代表的な１本鎖オリゴヌクレオチドを描写している。Ｓ１及びＳ２は、元の不規則デカマーの総集団から選択されたデカマーの二次集団を意味しており、またＲＮＡ二次構造の空間的近接位よる相補的形成からもたらされた、頭部対頭部で化学連結反応したクリック産物である。
【図３６】図３６Ａ及び３６Ｂは、５′−５′クリック反応性に対応して、可能性のある５′構造を描写している。図３６Ａは、アルキン基を支持する５′ヘキシニル修飾、図３６Ｂは、アジドモイエティーへの３炭素スペーサーによって結合されたＮ−ヒドロキシルスクシンイミドを伴う、５′アミノ基（その５′ヒドロキシルからの６炭素スペーサーを有する）の反応を介して与えられた５′アジド基であり、アミド連結上のそれに続く形成を伴う。
【図３７】ポリメラーゼ伸長による、２本鎖５′−５′化学連結反応産物の代表的な産生、及びそれに続く制限エンドヌクレアーゼＡｇｅＩでの再切断を示す（Ｓ１及びＳ２は、元来の不規則デカマーの総集団から選択されたデカマーの二次集団を意味する）。
【図３８】５′―メチル−ｄＣＴＰを組み込んで、及びＡ１領域への相補的セグメントを使用した、代表的な伸長を説明している。その結果得られた伸長された２本鎖のヘミメチル化領域が、灰色の網掛け背景で示されており、Ｓ１及びＳ２は、元来の不規則デカマーの総集団から選択されたデカマーの二次集団を意味している。
【図３９】５′−５′化学連結反応の２本鎖産物の、生体外微小コンパートメントへの分配を示す代表的な略図である。ここで、各断片は、制限酵素Ｅ２（特定の実施形態においては、ＡｇｅＩ）によって、最初に開裂されている。
【図４０】非連結反応の５′標識化２本鎖の、微小コンパートメントへの代表的な分配を描写している。ここで、その５′シクロアルキン修飾鎖は、そのＡ２領域において、制限酵素Ｅ２（特定の実施形態においては、ＡｇｅＩ）で事前に開裂されている。
【図４１】微小コンパートメント内での、５′−５′連結の、代表的なＸｍａＩ切断（特定の実施形態において）及び再連結反応を示す。
【図４２】微小コンパートメント中での、ＸｍａＩによって開裂された５′−５′連結反応産物（特定の実施形態において）の、不可逆的で増幅可能な再配列の終点に達するまでのサイクルの代表的な説明である。
【図４３】３′クリック基（アジド及びアルキン）、初期の不規則領域（Ｎ１及びＮ２）、ＰＣＲプライマー部位（Ｐ１及びＰ２）、及び制限部位／プライマー領域（Ａ１及びＡ２）を有する、代表的な１本鎖オリゴヌクレオチドの図解である。Ｓ１及びＳ２は、元の不規則デカマーの総集団から選択されたデカマーの二次集団を意味しており、またＲＮＡ二次構造の空間的近接位よる相補的形成からもたらされた、尾部対尾部で化学連結反応したクリック産物である。
【図４４】図４４Ａ及び４４Ｂは、３′−３′クリック反応性に対応して、可能性のある３′構造を描写している。図４４Ａは、シクロアルキン基を支持する３′修飾、図４４Ｂは、アジドモイエティーへの３炭素スペーサーによって結合されたＮ−ヒドロキシルスクシンイミドを伴う、３′−アミノ基（その３′−ヒドロキシルからの６炭素スペーサーを有する）の反応を介して与えられた３′−アジド基であり、アミド連結上のそれに続く形成を伴う。
【図４５】ポリメラーゼ伸長による、２本鎖３′−３′化学連結反応産物の代表的な産生、及びそれに続く制限エンドヌクレアーゼＡｇｅＩでの再切断を示す。Ｓ１及びＳ２は、元来の不規則デカマーの総集団から選択されたデカマーの二次集団を意味する。
【図４６】５′−メチル−ｄＣＴＰを組み込んで、及びＡ２領域への相補的セグメントを使用した、代表的な伸長を示している。その結果得られた伸長された２本鎖のヘミメチル化領域が、灰色の網掛け背景で示されており、Ｓ１及びＳ２は、元来の不規則デカマーの総集団から選択されたデカマーの二次集団を意味している。
【図４７】３′−３′化学連結反応の２本鎖産物の、生体外微小コンパートメントへの分配の代表的な略図である。ここで、各断片は、制限酵素Ｅ２（特定の実施形態においては、ＡｇｅＩ）によって、最初に開裂されている。
【図４８】非連結反応の３′−クリック−標識化２本鎖の、微小コンパートメントへの代表的な分配を略図化している。ここで、その３′−アルキン修飾鎖は、そのＡ２領域において、制限酵素Ｅ２（特定の実施形態においては、ＡｇｅＩ）で事前に開裂されている。
【図４９】微小コンパートメント内での、３′−３′連結の、ＸｍａＩ切断（特定の実施形態において）及び再連結反応の代表的な略図である。
【図５０】微小コンパートメント中での、ＸｍａＩによって開裂された（特定の実施形態において）３′−３′連結反応産物の、不可逆的で増幅可能な再配列の終点に達するまでの、代表的なサイクルを示す。
【図５１】非ポリメラーゼの読み出し可能な５′−及び３′−クリック基（各々シクロアルキン及びアジド）、初期の不規則領域（Ｎ１及びＮ２）、ＰＣＲプライマー部位（Ｐ１及びＰ２）、及び制限部位／プライマー領域（Ａ１及びＡ２）を有する、代表的な１本鎖オリゴヌクレオチドを説明している。Ｓ１及びＳ２は、元の不規則デカマーの総集団から選択されたデカマーの二次集団を意味しており、またＲＮＡ二次構造の空間的近接位よる相補的形成からもたらされた、頭部対尾部で化学連結反応した（直接的には増幅可能ではない）クリック産物である。
【図５２Ａ】図５２Ａ及び５２Ｂ、５２Ｃ、及び５２Ｄは、５′−３′クリック反応性に対応して、可能性のある５′及び３′構造を描写しており、ここではポリメラーゼ読み出しに対する要求は無い。図５２Ａは、代表的な５′−シクロアルキン及び５′−アジド修飾を示し、ここでは、ポリメラーゼ読み出しの必要は無く、５′及び３′−修飾のクリック修飾オリゴヌクレオチドは、前述の代表的修飾のいずれかのシクロアルキン−アジドの組み合わせ、例えば、図５２Ａ／Ｃによって代表される５′及び３′構造を有する対のオリゴヌクレオチドを有することができ、図５２Ｂは、代表的な５′−シクロアルキン及び５′−アジド修飾を示し、ここでは、ポリメラーゼ読み出しの必要は無く、５′及び３′−修飾のクリック修飾オリゴヌクレオチドは、前述の代表的修飾のいずれかのシクロアルキン−アジドの組み合わせ、例えば、図５２Ｂ／Ｄによって代表される５′及び３′構造を有する対のオリゴヌクレオチドを有することができ、図５２Ｃは、代表的な３′−シクロアルキン及び３′−アジド修飾を示し、ここでは、ポリメラーゼ読み出しの必要は無く、５′及び３′−修飾のクリック修飾オリゴヌクレオチドは、前述の代表的修飾のいずれかのシクロアルキン−アジドの組み合わせ、例えば、図５２Ａ／Ｃによって代表される５′及び３′構造を有する対のオリゴヌクレオチドを有することができ、及び図５２Ｄは、代表的な３′−シクロアルキン及び３′−アジド修飾を示し、ここでは、ポリメラーゼ読み出しの必要は無く、５′及び３′−修飾のクリック修飾オリゴヌクレオチドは、前述の代表的修飾のいずれかのシクロアルキン−アジドの組み合わせ、例えば、図５２Ｂ／Ｄによって代表される５′及び３′構造を有する対のオリゴヌクレオチドを有することができる。
【図５２Ｂ】図５２Ａの続き。
【図５２Ｃ】図５２Ｂの続き。
【図５２Ｄ】図５２Ｃの続き。
【図５３】図５３Ａ及び５３Ｂは、ヌクレアーゼ耐性のために修飾された、ポリメラーゼ読み出し可能ではない５′−及び３′−クリック基を伴う１本鎖オリゴヌクレオチド領域の代表的な略図であり、点状の背景で示す。図５３Ａは、その非修飾領域が、正常なＤＮＡ骨格、及び制限酵素による開裂が可能な塩基と共に保持されており、その３′部位は、修飾された骨格を伴った３つの修飾塩基によって伸長され、図５３Ｂは、その非修飾領域が、正常なＤＮＡ骨格、及び制限酵素による開裂が可能な塩基と共に保持されており、その３′部位は、修飾された骨格を伴った３つの修飾塩基によって伸長される。
【図５４】ポリメラーゼ伸長による２本鎖５′−３′化学連結反応産物の代表的な産生、及びそれに続く制限エンドヌクレアーゼＡｇｅＩでの再切断を図解している。Ｓ１及びＳ２は、元の不規則デカマーの総集団から選択されたデカマーの二次集団を意味している。
【図５５】５′−３′化学連結反応した２本鎖産物の、生体外微小コンパートメントへの代表的な分配を示している。ここで、各断片は、制限酵素Ｅ２（特定の実施形態においては、ＡｇｅＩ）によって、最初に開裂されている。
【図５６】非連結反応の５′／３′クリック標識化２本鎖の、微小コンパートメントへの分配の代表的な略図である。ここで、その５′アジド修飾鎖は、そのＡ２領域において、制限酵素Ｅ２（特定の実施形態においては、ＡｇｅＩ）で事前に開裂されている。
【図５７】微小コンパートメント内での、５′−３′連結の、ＸｍａＩ切断（特定の実施形態において）及び再連結反応の代表的な略図である。
【図５８】微小コンパートメント中での、ＸｍａＩによって開裂された（特定の実施形態において）５′−３′連結反応産物の、不可逆的で増幅可能な再配列の終点に達するまでの、代表的なサイクルを示す。
【図５９】特定の配列を増幅し及び同定するために、分子に特異的な再配列を可能にする生体外コンパートメント化の能力の代表的な試験を描写している。ステップ１の検証モデルは、５′アジドを有する２つ、及び５′の直鎖状アルキンを有する２つの、合計で４つのオリゴヌクレオチドを作り（Ｃｕ（Ｉ）介在のクリックケ化学で結合が可能になる）、各々が、特定のマーカー配列を有するように設計され、及び異なる増幅が可能になる。
【図６０】５′−５′オリゴヌクレオチド結合に対応した、酵素による再配列プロセスの代表的な実例を描写している。予想したサイズの産物は、切断及び再連結反応の両方が適用された場合にだけ形成され、非常に類似した再配列は、３′−３′の増幅または「ｕｎｒｅａｄａｂｌｅ（読み出し不可能）」な５′−３′結合を可能にする。
【図６１】精製したトップバンド（取り出したゲルバンド）の５′−５′化学連結反応付加体の代表的な試験を描写しており、相応する未精製物質のサンプルを並行して試験する。
【図６２】全てのトップバンドの５′−５′付加体産物での増幅産物を可能にするように設計された、代表的な酵素（ＡｇｅＩ、ＸｍａＩ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）の試験利用を描写している。
【図６３】良好なＩＶＣのための、モデルとなるオリゴヌクレオチド検出システムの代表的な原理を描写している。この場合、２本鎖５′−５′付加体は、ＩＶＣでの試験に対応して、ＡｇｅＩで事前に切断されており、そのためＸｍａＩ及びリガーゼのみが、その再配列を完成させるために必要とされる。
【図６４】直接（単一分子）か特定交差か、特定の再配列を検出するように設計された代表的な試験プライマーを描写している。酵素による再配列を受ける２つの異なる５′−５′産物の混合物に対しては、特定のプライマー対が、各々の直接産物、または特定の交差産物だけを特定できなくてはならない。
【図６５】ＰＣＲ誘導による人工的な交差を伴わない、予備形成された再配列を伴う再配列指向プライマーの、代表的な試験特異性を描写している。ＢＨ、ＦＨ＝ＢＨ及びＦＨ付加体が、別々の直接再配列、ＢＨ＋ＦＨｒｅａｒｒ＝ＢＨ及びＦＨ産物が同時に存在して実行される再配列プロセス（したがって、交差再配列が可能になる）、ＢＨ＋ＦＨＭｉｘ＝別々に実行されるＢＨ及びＦＨ付加体の再配列、及び次いで、ＰＣＲに先立って共に混合、ＢＨ＋ＦＨ  Ａｇｅ＝ＡｇｅＩのみで切断されるＢＨ及びＦＨ付加体、及びＰＣＲの前に混合、ｃｏ＝対照テンプレート無しである。
【図６６】生体外コンパートメント化試験における、代表的な入れ子形式になったＰＣＲ結果を描写している。検出可能な交差産物は、観察されなかった（縦向きの白い矢印）。
【図６７】環状化及び逆ＰＣＲによる、５′−３′結合の代表的なＣＬＯＳＥ増幅を描写している。これは、直接読み出しが、大きな非トレースレス産物の形成のために不可能な場合に適用する。このアプローチに伴う潜在的な問題は、正しい情報を交差させるかもしない、離れた分子間での交差連結反応であり（環状化よりむしろ）、これは、低い濃度での再連結反応段階を実施することによって、最小化できる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の開示は、テンプレート化されたアセンブリ反応物を同定し、濃縮し、及び評価するための方法及びキットを対象とする。
【００２１】
ここで、本明細書に開示の装置及び方法の構造、機能、製造、及び使用原理の全体的な理解を提供するために、特定の例示的な実施形態を記述する。これら実施形態の１つ以上の例示は、添付の図面に説明されている。当業者は、特に本明細書で記述され、及び添付図面で説明される装置ならびに方法は、非限定的な例示としての実施形態であり、及び本発明の開示の範囲は、当該請求項によってのみ定義されること理解されよう。１つの例示的な実施形態に関連して説明されまたは記述される特徴は、任意のその他の実施形態の特徴と組み合わされて良い。そのような修正及び変更は、本発明の開示の範囲内に含まれることを意図している。
【００２２】
本明細書に引用される全ての出版物、特許及び特許出願は、前述または後述かにかかわらず、その全体が参照として、本明細書に組みこまれている。この明細書及び添付の請求項に使用する、単数形の「ａ」「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、その文脈が明確に、別段に指示しない限り、複数参照をも含む。本開示に使用される用語は、当業者に一般に受け入れられる標準的な定義に付随する。いずれかのさらなる説明が必要な場合において、いくつかの用語が、以下に解説されている。
【００２３】
本明細書で使用する用語「ａｂｏｕｔ（約）」は、例えば、これら手順での故意ではない誤差を介して、その製造、原料、または組成物もしくは試薬の純度などにおける差異を介して、現実の測定または取り扱い手順を介して発生し得る数量の変動を指す。通常、本明細書で使用する用語「ａｂｏｕｔ（約）」は、示された値の１／１０で、例えば±１０％で、指示される値の数量または範囲より、大きいかまたは少ないことを意味する。例えば、約３０％の濃度値は、２７％から３３％の濃度を意味することができる。用語「ａｂｏｕｔ（約）」はまた、そのような変動が、先行技術で実施された既知の値を含まない限りは等価である、として当業者に認められる変動を指す。用語「ａｂｏｕｔ（約）」によって実施される各値もしくは値の範囲はまた、示された絶対値または値の範囲の実施形態を含むことを意図している。用語「ａｂｏｕｔ（約）」によって修正されるか否かにかかわらず、当該請求項で列挙される定量値には、その列挙された値と等価の値、例えば、発生する可能性があるが、しかし当業者によって等価であると認められるような値の数値変動を含む。
【００２４】
語句「ａｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（活性エフェクター構造）」及び「ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（エフェクター構造）」は、本明細書では互換的に使用され、及び望ましい効果を引き起こす、テンプレート化アセンブリ産物の活性部分を指す。
【００２５】
本明細書で使用する用語「ｂａｓｅ（塩基）」は、プリンまたはピリミジン基、もしくは人工的な類似体を含む分子を指し、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ（ワトソン・クリック）またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ（フーグスティーン）結合相互作用を介して、相当する他の塩基と結合対を形成する。塩基はさらに、オリゴマーなどの、１つのポリマー中に、共にある複数塩基の共有結合を促進する基を含む。非限定的例示には、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド核酸残基、またはモルホリノ残基を含む。
【００２６】
本明細書で使用する用語「ｂｉｎｄ（結合）」、「ｂｉｎｄｓ（結合する）」、「ｂｉｎｄｉｎｇ（結合している）」、及び「ｂｏｕｎｄ（結合された）」は、互いに近接している２つの分子間の安定的な相互作用を指す。当該用語には、化学結合（直接的な結合、または中間体構造を介して結合のいずれか）などの物理的な相互作用と共に、静電気引力、水素結合、及びファンデルワールス／分散力などの、非物理的相互作用及び原子間引力を含む。
【００２７】
本明細書で使用する語句「ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（生体共役反応化学）」は、通常の官能基を、穏やかな条件下で共に連結し、複数モイエティー化合物の分子構造を促す、化学合成戦略及び試薬を指す。
【００２８】
本明細書で使用する「ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｌｉｇａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ（空間的に誘導された、化学連結反応したオリゴヌクレオチド）」は、標的核酸テンプレートへの相補的形成を介して、それらの空間的近接の結果として、化学的に連結された一対のオリゴヌクレオチドを指す。
【００２９】
本明細書で使用する「ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐａｒｔｉａｌ  ｍｏｉｅｔｙ（エフェクター部分モイエティー）」は、核酸テンプレート化アセンブリによって形成された産物において、エフェクター構造の化学構造に寄与する、テンプレート化されたアセンブリ反応体の一部分を指す。エフェクター部分モイエティーは、その反応体の異なる部分であって良く、またはその核酸認識モイエティー及び／またはその選択的反応モイエティーの一部もしくは全部を含み、またはそれらから成る。
【００３０】
用語「ｌｉｎｋｅｒ（リンカー）」及び「ｓｐａｃｅｒ（スペーサー）」は、本明細書では互換的に使用され、そのテンプレート化アセンブリ反応体におけるオリゴヌクレオチド配列に隣接する分子を指す。リンカーは、追加のオリゴヌクレオチド配列、ペプチド、ペプチド模倣構造の非活性部分、薬剤の非活性部分、または２０ｋＤａ未満のその他の生物活性化合物であり得る。リンカーは、分岐状のまたは非分岐状の共有結合した分子鎖から構成されて良い。
【００３１】
本明細書で使用する用語「ｎｏｎ−ｔｒａｃｅｌｅｓｓ  ｂｉｏ−ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（非トレースレスのバイオオルソゴナル化学）」は、選択的反応モイエティーの一部分または全部が、その産物構造に保持されているところの、選択的反応モイエティーを関与させる反応を指す。
【００３２】
本明細書で使用する語句「ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｏｉｅｔｙ（核酸認識モイエティー）」は、標的核酸への配列に特異的な結合を促すオリゴヌクレオチドを指す。核酸認識モイエティーの例示は、標的核酸に結合するオリゴヌクレオチド配列である。
【００３３】
用語「ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（オリゴヌクレオチド配列）」及び「ｏｌｉｇｏｍｅｒ（オリゴマー）」は、本明細書では互換的に使用され、及びその単位のいくつかまたは全部が、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン塩基対相互作用を形成でき、二本鎖または多重鎖構造において核酸への配列に特異的な結合が可能な塩基である、複数単位から構成される分子を指す。非限定的な例示には、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸オリゴマー、及びモルホリノオリゴマーを含む。
【００３４】
本明細書で使用する用語「ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ（病原性細胞）」は、ウイルスに感染した細胞、腫瘍細胞、及び微生物に感染した細胞、または、限定されないが、アレルギー、アナフィラキシー、炎症及び自己免疫性を含む疾患を、誘発または媒介する分子を産生する細胞などの、疾患または異常状態を引き起こすまたは促進することができる細胞を指す。
【００３５】
本明細書で使用する場合の語句「ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ（薬学的に許容される）」は、生物学的に許容される、または許容されない生物学的影響を引き起こすこと、またはその組成物のその他成分を伴った許容されない方法において相互作用することが無いように、組成物に組み込まれ患者に投与され得る、そうでない場合には許容されない物質を指す。
【００３６】
用語「ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｓａｌｔ（薬学的に許容される塩）」は、哺乳類などの患者への投与が許容されている、塩基または酸から調合される塩を意味する（例えば、所定の投薬計画に対して、許容され得る哺乳類への安全性を有する塩）。
【００３７】
本明細書で使用する用語「ｓａｌｔ（塩）」には、薬学的に許容される無機酸及び塩基から誘導された塩、及び薬学的に許容される有機酸及び塩基から誘導された塩、ならびにそれらの誘導体及びそれらの変異体を含むことができる。
【００３８】
本明細書で使用する用語「ｓａｍｐｌｅ（サンプル）」は、核酸のテンプレート化アセンブリが発生して良い場所に、テンプレート化アセンブリ反応体が投与され得る、任意のシステムを指す。非限定的な例示には、生きた細胞、固定または保存された細胞、有機体の全身、組織、腫瘍、溶解物、または体外試験システムを含む。
【００３９】
語句「ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｏｉｅｔｙ（選択的反応モイエティー）」は、相応するテンプレート化アセンブリ反応体との化学反応を介するなどの、産物形成が可能な、テンプレート化アセンブリ反応体の一部分を指す。例えば、選択的反応モイエティーは、相応する選択的反応モイエティーと容易に反応できるが、天然の生体分子とは容易には反応しない。
【００４０】
語句「ｓｅｔ  ｏｆ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｒｅａｃｔａｎｔｓ（一組の相応する反応体）」または「ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔａｎｔｓ（相応するテンプレート化アセンブリ反応体）」は、本明細書では、テンプレート化アセンブリ反応での役割を果たすために、単一の標的テンプレート上で一体となる、テンプレート化アセンブリ反応体を指す。
【００４１】
本明細書の任意の実施形態において、「ｓｕｂｊｅｃｔ（対象物）」は、培養中の、または生きた有機体の生体内の細胞などの、細胞であり得る。いくつかの実施形態において、当該対象物は、微生物であり得る。いくつかの実施形態において、当該対象物は、より大きな有機体から取得されたサンプルから誘導された、またはそれに含まれる細胞であり得る。例えば、当該対象物は、生検の手順によって有機体から取得されたサンプルに含まれる細胞であり得、その方法は、その有機体上で実施され得る。いくつかの実施形態において、当該対象物は、有機体から取得された前駆細胞の子孫（細胞分裂による）であり得る。対象物はまた、哺乳類であり得る。対象物の例示には、非限定的に、ヒト、馬、サル、犬、猫、マウス、ラット、牛、豚、ヤギ、及び羊を含むことができる。いくつかの実施形態において、「ｓｕｂｊｅｃｔｓ（対象物）」は一般に、ヒトの患者である。
【００４２】
本明細書で使用する用語「ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ（スーパー抗原）」は、特定の可変（Ｖ）領域を発現する、Ｔ細胞の幅広い部分集団を結合する抗原を指す。
【００４３】
本明細書で使用する語句「ｔｒａｃｅｌｅｓｓ  ｂｉｏ−ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（トレースレスのバイオオルソゴナル化学）」は、自然発生の結合、例えばアミドが、その産物構造から選択的反応モイエティーの一部分または全部を除去することによって形成されるところの、選択的反応モイエティーを関与させる反応を指す。
【００４４】
本明細書で使用する語句「ｔａｒｇｅｔ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ（標的コンパートメント）」は、細胞、ウイルス、組織、腫瘍、溶解物、その他の生物学的構造、空間領域、または標的核酸、もしくは非標的コンパートメントと比べて異なる量の標的核酸を含むサンプルを指す。
【００４５】
語句「ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（標的核酸配列）」及び「ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（標的核酸）」は、互換的に使用され、及び核酸テンプレート化アセンブリに対して、テンプレートとして作用することを意図された単位または核酸の配列を指す。
【００４６】
語句「ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（テンプレート化アセンブリ）」、「ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（テンプレート化アセンブリ反応）」及び「ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（核酸テンプレート化アセンブリ）」は、本明細書では互換的に使用され、及び産物構造、または標的核酸上の構造の合成を指し、そのため、その標的核酸に結合した場合、近接で組み立てられるテンプレート化アセンブリ反応体によって、産物形成が促進され得る。
【００４７】
本明細書で使用する語句「ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ（テンプレート化アセンブリ連結反応産物）」は、１つ以上の核酸テンプレート化アセンブリ反応体の相互作用、結合または反応によって形成される産物構造または構造を指す。
【００４８】
本明細書で使用する語句「ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔａｎｔ（テンプレート化アセンブリ反応体）」は、配列に特異的な方法で標的核酸を結合し、テンプレート化アセンブリ反応中に産物形成に参加する、オリゴヌクレオチド配列を指す。
【００４９】
塩、水和物、それらの溶媒和物、または化学修飾を受けた、及び同じ生物活性または生物活性の欠乏、及び／またはテンプレート化アセンブリ反応体として機能する能力、もしくはテンプレート化アセンブリ反応体と調和した方法において機能を維持するその他の分子などの、「ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（誘導体）」または「ａｎａｌｏｇｓ（類似体）」もまた、本明細書に含まれる。
【００５０】
標的化されたテンプレートアセンブリは、特定の核酸配列などの、１つ以上の標的が存在する場合、望ましい化学構造を生み出す。本開示の方法及びキットは、特定の遺伝子テンプレートの同定、解析、または発見を可能にする。本開示の方法及びキットはまた、想定外の毒性を避け、特定の活性を高めるためのテンプレート化アセンブリによって標的化された、特定の核酸配列を同定する。本開示の方法及びキットはさらに、テンプレート化アセンブリに対応して、特定の核酸配列を濃縮及び評価する。標的細胞に固有の核酸配列を同定することによって、テンプレート標的を欠いた正常細胞などの、非標的細胞に対する毒性を誘発することなく、自己破棄、またはその他の細胞による免疫療法破壊などによる直接的な介入を、これら特異細胞に集中することが可能になる。
【００５１】
テンプレート化アセンブリ標的の同定には、テンプレート化アセンブリ反応体を合成すること、テンプレート化アセンブリ反応体を標的核酸に相補的形成をさせること、テンプレート化アセンブリ反応を実行すること、及びそのテンプレート化アセンブリ反応体と相補的形成をした標的核酸を同定すること、に対応した方法及びキットを含むことができる。
【００５２】
本明細書で使用する語句「テンプレート化アセンブリ反応体」は、配列に特異的な方法で標的核酸に結合し、及びテンプレート化アセンブリ反応中での産物形成に参加する、オリゴヌクレオチド配列を指す。このテンプレート化アセンブリ反応体は、オリゴヌクレオチド配列などの、核酸認識モイエティーを含むことができる。米国特許出願番号６１／８３１，１３３は、その全体を参照として本明細書に組み入れるが、標的化された治療を生み出すための、核酸認識モイエティー、選択的反応モイエティー、及びエフェクター部分モイエティーを含む、標的化されたテンプレート化アセンブリ反応体を開示している。本発明の開示において、当該テンプレート化アセンブリ反応体は、エフェクター部分モイエティーを必要としないが、しかし含んでも良い。標的核酸の同定、解析、または発見は、米国特許出願番号６１／８３１，１３３に開示されるように、エフェクター機能の産生を必要としないが、それゆえに少なくとも核酸認識モイエティー及び選択的反応モイエティーの存在が、当該テンプレート化アセンブリ反応体に含まれる。いくつかの実施形態において、テンプレート化アセンブリ反応体の第一集団、及び相応するテンプレート化アセンブリ反応体の第二集団が開示され、ここでその第一集団は、その第二集団と比べて、異なるオリゴヌクレオチド配列またはオリゴヌクレオチド配列の異なるライブラリーを含む。いくつかの実施形態において、テンプレート化アセンブリ反応体の第一集団、及び相応するテンプレート化アセンブリ反応体の第二集団が開示され、ここでその第一集団は、その第二集団とは異なる、特定のオリゴヌクレオチド配列及び化学修飾を含む。
【００５３】
オリゴヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の複数の方法によって合成されて良い。ヌクレオチドに基づくオリゴヌクレオチド配列は、ホスホラミダイト化学を使用した、溶液または固相において合成されて良い。ペプチド核酸はまた、当技術分野で公知の複数の方法を使用した、溶液または固相において合成されて良い。モルホリノ合成の多様な方法がまた、利用可能であろう。上記オリゴヌクレオチド配列の種類のいずれもが、様々な市販元から完全に合成されて、入手されて良い。
【００５４】
当該オリゴヌクレオチド配列は、核酸または核酸類似体などの、塩基対形成単位の配列を含んで良い。当該オリゴヌクレオチド配列は、複数単位で作られて良く、ここでその単位のいくつかまたは全てが、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン塩基対相互作用を形成し、二本鎖または多重鎖構造において、標的核酸に、配列特異的に結合できる塩基である。
【００５５】
語句「ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（核酸）」は、当技術分野では公知である。本明細書で使用する「ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（核酸）」は一般に、ヌクレオチドを含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの誘導体もしくは類似体の分子（すなわち、らせん構造）を指す。ヌクレオチドには、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデシンの「Ａ」、グアニンの「Ｇ」、チミンの「Ｔ」、またはシトシンの「Ｃ」）、またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシルの「Ｕ」またはＣ）に見出される自然発生のプリンもしくはピリミジン塩基を含む。語句「ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（核酸）」または「ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＲＮＡ分子）」は、「ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（核酸）」の亜属としての用語「ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（オリゴヌクレオチド）」及び「ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ポリヌクレオチド）」を包含する。
【００５６】
当該オリゴヌクレオチド配列は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート変性ヌクレオチド、２′−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロック核酸ヌクレオチド  （ＬＮＡ）、ペプチド核酸  （ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ）、プソイドウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２′−デオキシイノシンヌクレオチド、塩基対形成が可能なその他の核酸類似体、またはそれらの組み合わせであって良い。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチド配列には、核酸を含み、及びｍＲＮＡ標的に相補的形成を行う。
【００５７】
市販の誘導体塩基が、完全なテンプレート化アセンブリ反応体の合成を促進するために、生体共役反応化学の標準的な技術を使用して、その他のモエイティー上の活性な官能基と共役が可能な、非限定的に、アミン、ヒドラジド、チオール、カルボン酸、イソシアネート、アルデヒドなどの官能基を導入するために、組み込まれて良い。
【００５８】
当該オリゴヌクレオチド配列はまた、特異化された単位に組み込まれ、それらと相互作用または結合して良い。例えば、テンプレート化アセンブリ反応体を使用した場合、オリゴヌクレオチド配列を含んで、生きた細胞または溶解物中などにおける、標準的なＤＮＡまたはＲＮＡを分解する可能性のあるヌクレアーゼの存在下で、核酸耐性塩基を、当該オリゴヌクレオチド配列に組み入れることが望ましいであろう。いくつかの非限定的な例示には、ホスホロチオエート塩基、２′−Ｏ−アルキル化または  ２′−ハロゲン化ＲＮＡ塩基、ロック核酸、ペプチド核酸、モルホリノまたはこれらの少なくとも１つを含むキメラを含むことができる。ＲＮａｓｅのＨ活性に依存するアンチセンスのプローブとは異なり、当該オリゴマーの内部塩基は、標的ＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅＨの加水分解を誘発しないことが必要である。したがって、当該オリゴヌクレオチド配列におけるいずれの位置においても、ＲＮａｓｅＨを誘発する塩基への要求は無い。
【００５９】
当該テンプレート化アセンブリ反応体は、不規則配列または遺伝子特異の配列である、オリゴヌクレオチド配列を含むように、合成され得る。いくつかの実施形態において、当該テンプレート化アセンブリ反応体は、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド配列を介して、標的核酸に結合できる。当該オリゴヌクレオチド配列は、１つ以上の標的核酸に相補的な連続または不連続配列であり得る。語句「ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（標的核酸配列）」及び「ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（標的核酸）」は、互換的に使用され、及び核酸テンプレート化アセンブリに対応した標的またはテンプレートとして機能することを意図された、配列の単位または核酸を指す。
【００６０】
当該オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸上の相補的形成部位に相補性であることによって遺伝子特異的であり得、標的核酸への配列特異的な結合を可能にする。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸に相補性の、連続した配列である。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチド配列は、その配列が、非標的核酸に存在することが知られている配列と類似していないように選択される。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチド配列には、その標的核酸内に見出される１つ以上の変異を含み、当該テンプレート化アセンブリ反応体の、その標的核酸への特異的な結合を可能にし、しかしその変異を含まない非標的核酸への結合は可能にしない。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチド配列は、ステムループ構造を伴って、標的核酸との望ましい結合の相互作用における可能な改善を伴って合成されて良い。
【００６１】
当該オリゴヌクレオチド配列はまた、不規則配列であり得る。この不規則なオリゴヌクレオチド配列には、不規則配列に前述の塩基対形成する単位または特異化された単位のいずれをも含むことができる。
【００６２】
当該オリゴヌクレオチド配列は、約５から約１００のヌクレオチド鎖長であり得る。いくつかの実施形態において、当該不規則または遺伝子特異的な配列は、約５から約１００のヌクレオチド鎖長であり得る。当該オリゴヌクレオチド配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のヌクレオチド鎖長のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチド配列は、約５から約３０のヌクレオチド鎖長、約７から約２５のヌクレオチド鎖長、または約７から約１５のヌクレオチド鎖長であり得る。
【００６３】
当該オリゴヌクレオチド配列は、不規則であるか遺伝子特異であるかにかかわらず、そのオリゴヌクレオチド配列の鎖長のどこにおいても、約５から約１００塩基の鎖長を有する標的核酸に、相補的であり得る。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチド配列は、約５から約５０塩基鎖長、約５から約４０塩基鎖長、または約１０から約３０塩基鎖長の範囲におけるヌクレオチド配列鎖長を有する標的核酸に、相補的であり得る。
【００６４】
当該オリゴヌクレオチド配列はまた、化学的特性与えるために、最適化され得る。オリゴヌクレオチド配列の鎖長は、その相補的配列の融解及びアニール温度などの、化学的特性に基づいて選択され得る。融解温度、Ｔｍは、所定のオリゴヌクレオチド配列の全ての分子の５０％が、二本鎖に相補的形成され、及び５０％が、一本鎖として存在する時点での、摂氏で表された温度として定義される。アニール温度は、その融解温度に比べて、一般に５℃低い。
【００６５】
当該オリゴヌクレオチド配列のＴｍは、当該テンプレート化アセンブリ反応体が使用される条件温度の、約１０℃下から約４０℃上の範囲であり得る。例えば、仮にテンプレート化アセンブリ反応体が、３７℃で使用される場合、そのオリゴヌクレオチドは、２７℃から７７℃の予想Ｔｍを伴って設計されて良い。いくつかの実施形態において、当該テンプレート化アセンブリ反応体は、おおよそ３７℃で使用され得て、及び当該オリゴヌクレオチド配列のＴｍは、約３７℃から約５２℃の範囲であるように設計され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、その標的核酸に結合するためのＴｍが、類似の非標的核酸に結合するためのＴｍとは、実質的に異なるように設計され得る。例えば、当該オリゴヌクレオチド配列は、それが結合する標的核酸上の相補的形成部位が、変異部位を含むように設計されて良い。いくつかの実施形態において、当該標的核酸を結合する当該オリゴヌクレオチド配列のＴｍが、そのテンプレート化アセンブリ反応体が、使用される温度で、または上回っており、一方当該非標的核酸を結合する当該オリゴヌクレオチド配列のＴｍが、そのテンプレート化アセンブリ反応体が、使用される温度以下である。当該オリゴヌクレオチド配列はその結果、その変異標的配列に結合するが、その非標的、非変異配列には結合しないであろう。
【００６７】
当該オリゴヌクレオチド配列のＴｍは、当該テンプレート化アセンブリ反応体が使用される条件温度の、約１０℃下から約４０℃上の範囲であり得る。例えば、仮にテンプレート化アセンブリ反応体が、３７℃で使用される場合、そのオリゴヌクレオチド配列は、２７℃から７７℃の予想Ｔｍを伴って設計されて良い。いくつかの実施形態において、当該テンプレート化アセンブリ反応体は、おおよそ３７℃で使用され得て、及び当該オリゴヌクレオチド配列のＴｍは、約３７℃から約５２℃の範囲であるように設計され得る。
【００６８】
当該テンプレート化アセンブリ反応体はまた、当該オリゴヌクレオチド配列に隣接する、５′及び／または３′プライミング部位を含むことができる。このプライミング部位は、当該オリゴヌクレオチド配列に直接的に隣接することができ、またはリンカー配列によって、そのオリゴヌクレオチド配列から離され得る。本分野で通常使用されるプライマー配列が、含まれ得る。そのような例示には、非限定的に、Ｍ１３、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、ＶＦ２、ＶＲ、それらの修飾型、それらの相補的配列、及びそれらの逆配列を含んで良い。さらに、カスタムプライマー配列もまた、含まれる。
【００６９】
当該テンプレート化アセンブリ反応体はまた、リンカーまたはスペーサーなどの中間体を含むことができる。このリンカーは、１から５０ヌクレオチド鎖長の範囲にある追加のオリゴヌクレオチド配列であり得る。このリンカーはまた、ペプチド、ペプチド模倣構造体の非活性部分、薬剤の非活性部分、または２０ｋＤａ未満であるその他の生理活性化合物であり得る。リンカーは、分岐状のまたは非分岐状の共有結合した分子鎖から構成されて良い。いくつかの実施形態において、当該リンカーは、少なくとも６炭素原子のスペーサーである。
【００７０】
当該テンプレート化アセンブリ反応体はまた、選択的反応モイエティーなどの、テンプレート化アセンブリ反応において活性なオリゴヌクレオチドに隣接する、修飾を含むことができる。テンプレート化アセンブリ反応に対するそのような修飾は、米国特許出願番号６１／８３１，１３３に開示されており、その全体を参照として、本明細書に組み入れる。いくつかの実施形態において、当該修飾は、当該オリゴヌクレオチド配列に隣接している。本明細書で使用する「ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（隣接配列）」は、例えば、１から５の塩基対内、または近接内から、例えば、５から２０の塩基対内の、そのオリゴヌクレオチド配列のすぐそばの領域を指し得る。
【００７１】
当該修飾は、生物学的には不活性であり得る。特に、１つのオリゴヌクレオチド配列上の修飾は、他のオリゴヌクレオチド配列上の相応する修飾と、容易に相互作用できるが、しかし自然な生体分子とは、容易には相互作用しないであろう。この点が、相応するテンプレート化アセンブリ反応体が組み立てられた場合に、当該テンプレート化アセンブリ反応が形成されることを保証することである。これは、その環境に発生した非特異的な反応に対する予防対策でもあり、及び意図しない産物の形成を防ぐ。
【００７２】
選択的反応モイエティー、テンプレート化アセンブリ反応における反応性に対応した修飾の例示には、バイオオルソゴナル反応モイエティーの添加を含むことができる。このバイオオルソゴナル反応モイエティーには、アジドとアルキン間の「ｃｌｉｃｋ（クリック）」  反応、アジドとホスフィン間のトレースレスまたは非トレースレスのシュタウディンガー反応、チオエステルとチオール間の天然の化学連結反応を受けることができるそれらの基を、含むことができる。さらに、このバイオオルソゴナルモイエティーには、アジド、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリル酸化物、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾール、クアドリシクラン、及びそれらの誘導体のいずれでもあり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、テンプレート化アセンブリ反応体の第一集団及びテンプレート化アセンブリ反応体の第二集団を開示する。この第一集団には、１つの修飾を含むことができ、及びこの第二集団には、相応する修飾を含むことができる。例えば、当該第一集団には、そのテンプレート化アセンブリ反応体上にアジドを含むことがき、当該第二集団には、そのテンプレート化アセンブリ反応体上にアルキンを含むことでき、そのため当該第一及び第二集団は、連結反応産物を生み出すためのクリック反応において、反応することができる。
【００７４】
テンプレート化アセンブリ反応における反応性に対応する複数修飾は、本明細書に開示の方法及びキットにおいて使用され得て、いくつかの非限定的な例示には、以下が含まれる。
【００７５】
アジド−アルキン「Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（クリック化学）」を含み、クリック化学は、典型的な条件下の普通の生体分子との、アジドでもアルキンでもない反応として、非常に選択的である。Ｒ−Ｎ３形態のアジド、及びＲ−Ｃ≡ＣＨ形態の末端アルキンまたはＲ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ形態の内部アルキンは、互いに容易に反応し、１，２，３−トリアゾールの形態で、Ｈｕｉｓｇｅｎ（ヒュスゲン）環化付加反応産物を生み出す。
【化１】
2018500892.tif 000002
【００７６】
アジドに基づくテンプレート化アセンブリ反応体は、その二次構造：Ｒ−Ｎ３を有し、ここでＲは、化学リンカー、核酸認識モイエティー、またはエフェクター部分モイエティーである。アジド及びアジド誘導体は、市販の試薬から、容易に調合される。
【００７７】
アジドはまた、エフェクター部分モイエティーの合成中に、そのエフェクター部分モイエティーに導入され得る。いくつかの実施形態において、アジド基は、標準的なペプチド合成法を使用した、エフェクター部分モイエティーペプチドの合成中に、市販のアジド誘導の標準アミノ酸またはアミノ酸類似体の組み込みによって、ペプチドから成るエフェクター部分モイエティーに導入される。アミノ酸は、α−アミノ基をアジドで置換して誘導されて良く、以下の形態の構造を有する。
【化２】
2018500892.tif 000003
ここでＲは、標準的なアミノ酸または非標準的なアミノ酸類似体の側鎖である。
【００７８】
市販製品には、アミノ酸側鎖としてのアジドを官能基として導入でき、以下の形態の構造をもたらす。
【化３】
2018500892.tif 000004
ここでＡは、標準的なアミノ酸または非標準的なアミノ酸類似体の側鎖における、任意の原子及びその置換基である。
【００７９】
アジドはまた、ジアゾ再配列法により、ペプチド上のアミノ基をアジドに転換することによって、合成後のエフェクター部分モイエティーペプチドに導入されて良い。生体共役反応化学もまた、市販の誘導アジドを化学リンカー、核酸認識モイエティー、または適切な反応基を含むエフェクター部分モイエティーに結合するために使用できる。
【００８０】
標準的なアルキンは、アジドの組み込みと同様の方法で、テンプレート化アセンブリ反応体に組み込むことができる。アルキン官能化ヌクレオチド類似体は、市販されており、核酸認識モイエティーの合成時に、アルキン基の直接的な組み込みを可能にする。同様に、アルキン誘導アミノ酸類似体は、標準的なペプチド合成法によって、エフェクター部分モイエティーに組み込まれて良い。さらに、生体共役反応化学と互換的な、多官能性アルキンは、適切な官能基または側鎖を介して、その他のモイエティーへのアルキンの組み込みを促進するために使用されて良い。
【００８１】
アジド活性化アルキン「クリック化学」：標準的なアジド−アルキン化学反応は、通常は銅（Ｉ）などの触媒を必要とする。触媒濃度での銅（Ｉ）は、多数の生態系に有毒であり、標準的なアジドーアルキン化学反応は、生きた細胞への使用には限界がある。活性化アルキンに基づく銅を含まないクリック化学システムは、有毒触媒を回避する。
【００８２】
活性化アルキンはしばしば、シクロオクチンの形態をとり、ここでそのシクロオクチル基への組み込みは、そのアルキンに環状ひずみを持ち込む。
【化４】
2018500892.tif 000005
【００８３】
ヘテロ原子または置換基は、そのシオクロオクチル環の多様な位置に組み込まれて良く、そのアルキンの反応性を変化させ、またはその化合物にその他の代替の化学的性質を与える。当該環の多様な位置はまた、当該シクロオクチンの核酸テンプレート化アセンブリモイエティーまたはリンカーへの結合に対する、接合点としての役割を果たす。当該環のこれらの位置またはその置換基は、任意でさらに、アクセサリー基で誘導される。
【００８４】
複数のシクロオクチンが、標準的な生体共役反応化学のプロトコルでの使用に適した複数の誘導体型を含んで、市販されている。市販のシクロオクチン誘導ヌクレオチドは、核酸認識モイエティーの合成中に、その選択的反応モイエティーの簡便な組み込みを促進させるように援助できる。
【化５】
2018500892.tif 000006
【００８５】
シクロオクチン−アジドに基づくバイオオルソゴナル化学は、以下の一般構造のテンプレート化アセンブリ産物を生み出す。
【化６】
2018500892.tif 000007
【００８６】
アジド−ホスフィノフェノール・シュタウディンガー化学：アジドとホスフィンまたはＮ２を欠いた亜リン酸塩との間の急速反応に基づく、シュタウディンガー還元もまた、バイオオルソゴナル反応を代表する。シュタウディンガー反応において、共有結合がその反応体間で形成される、シュタウディンガー連結反応は、核酸テンプレート化アセンブリにおける使用に適している。そのシュタウディンガー連結反応の非トレースレス及びトレースレスの両方において、それらの反応で形成される産物の化学構造に、任意の多様化が可能である。
【００８７】
非トレースレス・シュタウディンガー連結反応：標準的なシュタウディンガー連結反応は、アジドと、トリフェニルホスフィンなどのフェニル置換ホスフィンとの間の非トレースレス反応であり、ここでメチルエステルなどの、そのホスフィン上の求電子的捕獲の置換基は、ホスフィンオキシドによって連結された連結反応産物を生み出すために、その反応のアザ−イリド中間体で再配列する。テンプレート化アセンブリ反応体Ａ及びＢによって形成されるシュタウディンガー連結反応産物の例示は、以下の構造を有して良い。
【化７】
2018500892.tif 000008
【００８８】
求電子的捕獲を行うフェニル置換ホスフィンはまた、容易に合成され得る。誘導体型は、商業的に入手可能であり、及びテンプレート化アセンブリ反応体に組み入れるのに適している。
【化８】
2018500892.tif 000009
【００８９】
トレースレス・シュタウディンガー連結反応：いくつかの実施形態において、トレースレス・シュタウディンガー連結反応が可能なホスフィンは、選択的反応モイエティーとして利用して良い。トレースレス反応において、そのホスフィンは、アザ−リド中間体の再配列中に、遊離基として作用し、通常は自然なアミド結合の形態で、連結反応を作る。トレースレス・シュタウディンガー連結反応が可能な化合物は一般に、チオエステル誘導のホスフィンまたはエステル誘導のホスフィンの形態をとる。
【化９】
2018500892.tif 000010
トレースレス・シュタウディンガー連結反応に対応する、エステル誘導ホスフィンである。
【化１０】
2018500892.tif 000011
トレースレス・シュタウディンガー連結反応に対応する、チオエステル誘導ホスフィンである。
【００９０】
化学リンカーまたはアクセサリー基は、上記構造のＲ基へ、置換基として任意で結合されて良く、核酸認識モイエティーまたはその反応体への追加の官能性の導入に対応する、結合点を与える。
【００９１】
トレースレス・ホスフィノフェノール・シュタウディンガー連結反応：非トレースレス・シュタウディンガー・フェニルホスフィン化合物との比較で、トレースレス・ホスフィノフェノール上の求電子的捕獲エステルの配向性は、そのフェニル基に対して逆である。これは、アジドとの反応を引き起こす、トレースレス・シュタウディンガー連結反応を可能にし、ホスフィンオキシドを含有せずに、その産物に自然なアミド結合を生み出す。
【化１１】
2018500892.tif 000012
【００９２】
このトレースレス・シュタウディンガー連結反応は、仮に第四級アミンなどの、適切な親水性基が、そのフェニルホスフィンに結合されるならば、有機性の共溶媒を含まない水媒体中で、実施されて良い。Ｗｅｉｓｂｏｒｄ及びＭａｒｘ（２０１０）による文献は、水溶性ホスフィノフェノールの調合を記述しており、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）などのエステル賦活剤などのカルボジイミドを使用した、温和なＳｔｅｇｌｉｃｈ（シュテークリヒ）・エステル化を介して、カルボン酸（ペプチドのＣ末端など）を含む、望ましいエフェクター部分モイエティーを持たせることができる。このアプローチは、以下の形態のテンプレート化アセンブリ反応体の合成を促進する。
【化１２】
2018500892.tif 000013
水溶性ホスフィノフェノールに基づく、トレースレス・テンプレート化アセンブリ反応体構造である。
【００９３】
トレースレス・ホスフィノメタンチオール・シュタウディンガー連結反応：ホスフィノメタンチオールは、トレースレス・シュタウディンガー連結反応を介在するホスフィノフェノールの代替品を代表する。一般に、ホスフィノメタンチオールは、トレースレス・シュタウディンガー連結反応の介在において、ホスフィノフェノールと比較して、良好な反応動力学を有する。米国特許出願番号２０１０／００４８８６６及びＴａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）による文献は、以下の形態の水溶性ホスフィノメタンチオールを記述している。
【化１３】
2018500892.tif 000014
【００９４】
これらの化合物は、トレースレス・バイオオルソゴナル反応基としての使用に適したチオエステルを形成するために、活性化エステルの形態で、ペプチドまたはその他の搭載物質を含んで良い。
【化１４】
2018500892.tif 000015
水溶性ホスフィノメタンチオール・トレースレス・シュタウディンガーバイオオルソゴナル化学に基づく、テンプレート化アセンブリ反応体構造である。
【００９５】
ネイティブ化学連結反応：ネイティブ化学連結反応は、チオエステルとチオール及びアミンを有する化合物との間の反応に基づく、バイオオーソゴナルなアプローチである。この古典的なネイティブ化学連結反応は、以下のように、Ｃ末端チオエステルを有するペプチドとＮ末端システインを有する別のペプチドとの間の反応である。
【化１５】
2018500892.tif 000016
【００９６】
ネイティブ化学連結反応は、ペプチド、または内部システイン残基もしくは仮に非標準アミノ酸を利用する場合には、その他のチオール含有残基を含む、ペプチド模倣体を産生するトレースレス反応を介在するために利用されて良い。
【００９７】
Ｎ末端システインは、標準的なアミノ酸合成法によって組み込まれて良い。末端チオエステルは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの試薬を使用した、チオールを伴う活性エステルの濃縮、または「Ｓａｆｅｔｙ−Ｃａｔｃｈ（安全捕捉）」支持レジンの使用を介した、ペプチド合成中での導入を含む、当技術分野で公知の複数の方法によって生み出されて良い。
【００９８】
その他のテンプレート化アセンブリ反応モイエティー：任意の適切なバイオオルソゴナル反応化学が、それが、複雑な生物環境において、高度に選択的な方法で、効果的に反応に介在する限り、テンプレート化アセンブリ反応体の合成に利用されて良い。適切であろう互換的なバイオオルソゴナル化学の、最近開発された非限定的な例示は、水媒体中でバイオオルソゴナル反応を効果的に介在する、テトラジンとノルボルネン及びトランス−シクロオクテンなどの多様なアルキンとの間の反応である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、当該テンプレート化アセンブリ反応体はまた、一組の相応するテンプレート化アセンブリ反応体が、テンプレート化アセンブリ反応に関与する場合などに、エフェクター部分モイエティーを含むことができ、活性なエフェクター産物が、生み出され得る。このエフェクター部分モイエティーは、一組の相応するテンプレート化アセンブリ反応体が、テンプレート化反応に関与する場合などに、活性エフェクター構造の一部分であり得て、それらのエフェクター部分モイエティーは、組み合わされ、そのテンプレート化アセンブリ連結反応産物において、望ましい活性エフェクター構造を生み出す。したがって、当該エフェクター部分モイエティーは、当該活性エフェクター構造の化学構造に寄与する。当該エフェクター部分モイエティーは、当該テンプレート化アセンブリ反応体の個別部分であり得る、または当該核酸認識モイエティーの一部分または全部、もしくは当該選択的反応モイエティーの一部分または全部を含んで良い。語句「ａｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（活性エフェクター構造）」及び「ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（エフェクター構造）」は、本明細書では互換的に使用され、及び望ましい効果を引き出すテンプレート化アセンブリ産物の活性部分を指す。
【０１００】
当該エフェクター部分構造は、その活性エフェクター構造に関連する、標的化された活性またはあるレベルの活性を保持していない。いくつかの実施形態において、当該エフェクター部分モイエティーは、その活性エフェクター構造に比べて、実質的に不活性である。いくつかの実施形態において、個別のエフェクター部分モイエティーは、別々の活性を保持することができるが、しかしそのエフェクター部分モイエティーが共に結合して、それらが個別には保持していない活性を作り出す。例えば、２つの異なる抗体を結合する（１つのエフェクター部分構造に、各々結合する）、二価のエフェクター構造は、例えば、診断評価に対応した、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出に対して適切なエフェクターを作る。いくつかの実施形態において、当該エフェクター部分モイエティーは共に、発光などの、テンプレート化アセンブリ反応を検出できる、シグナルを作り出す。
【０１０１】
テンプレート化アセンブリ標的の同定には、そのテンプレート化アセンブリ反応体の標的核酸への相補的形成を含むことができる。
【０１０２】
対象となる供給源からの、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸は、そのオリゴヌクレオチド配列を選択的に結合する、当該テンプレート化アセンブリ反応体と相補的形成を行うことができる。標的核酸は、標準的なワトソン・クリック、ヒュスゲンまたは逆ヒュスゲン結合の相補的基準に従うオリゴヌクレチドとの塩基対形成が可能の場合、そのオリゴヌクレチドに対して「ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ｓ）（相補体（複数可））」であり、またはそれに対して「ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ（相補性）」である。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ（相補性）」及び「ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ｓ）（相補体（複数可））」は、仮に全てのヌクレオチドが、相手のヌクレオチドと塩基対を組むわけではない場合でも、連続、半連続または不連続のヌクレオチドの可能性がある、標的核酸の一本鎖または二本鎖と相補的形成が可能な、連続したまたは半連続のヌクレオチド（例えば、１つ以上のヌクレオチドモイエティーが、その分子に存在しない）の配列を含む、オリゴヌクレチドを指す。いくつかの実施形態において、「ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ（相補性）」核酸は、そのオリゴヌクレオチド配列の約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％まで、及びそれらから誘導可能な任意の範囲が、相補的形成時に、一本鎖または二本鎖の標的核酸と塩基対形成が可能である、配列を含む。いくつかの実施形態において、用語「ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ（相補性）」は、厳密な条件下で、標的核酸の一本鎖または二本鎖と、相補的形成が可能であるオリゴヌクレチドを指し、そのことは、当業者には理解されよう。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、「ｐａｒｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ（部分相補性の）」核酸には、厳密ではない条件下で、一本鎖または二本鎖の核酸へ相補的形成が可能な配列を含み、またはそのヌクレオチド配列の約７０％が、相補的形成時に、一本鎖または二本鎖の核酸と塩基対の形成が可能である配列を含む。
【０１０５】
相補的形成に先立って、核酸テンプレート化反応体へ修飾されたオリゴヌクレチドは、一時的な熱変成ステップ（２分／８０℃）に供せられる。このサンプルは、相補的なオリゴヌクレオチドにより、標的核酸の利用可能な経路への相補的形成を実行する条件に、暴露される。
【０１０６】
任意の核酸は、少なくともいくつかの配列情報が利用可能であり、そのオリゴヌクレオチドに直接または間接に結合するのに十分に与えられた、核酸テンプレート化アセンブリに対して、利用可能な標的核酸であり得る。核酸認識モイエティー単位のいくつかの非限定的な例示には、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸オリゴマー、及びモルホリノオリゴマーを含むことができる。標的核酸配列またはオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定的な例示には、ｍＲＮＡ、ゲノムまたはオルガネラＤＮＡ、エピソームまたはプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、または任意のその他の生物学的もしくは人工的核酸配列を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、当該標的核酸は、標的コンパートメント中に存在できるが、非標的コンパートメント中には存在しない。この実施形態の例示には、病原性または疾患細胞に存在するが、しかし健康な細胞には存在しない核酸配列を含む。本明細書で使用する語句「ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ（病原性細胞）」は、ウイルスに感染した細胞、腫瘍細胞、及び微生物に感染した細胞などの、病気のまたは異常な状態を引き起こすもしくは促進することが可能な細胞を指す。
【０１０８】
任意の細胞、ウイルス、組織、空間領域、溶解物、または標的核酸を含むサンプルのその他の二次成分が、当該標的核酸を提供できる。当該標的核酸を含む標的コンパートメントには、非限定的に、病原性細胞、がん細胞、ウイルス、ウイルスや他の病原体に感染した宿主細胞、または適応もしくは先天的免疫系の細胞などの自己免疫、移植拒絶反応、またはアレルギー反応に寄与している免疫系の細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ウイルスまたはウイルスに感染した細胞に存在できるが、健康な細胞には存在しない。ウイルスのいくつかの非限定的な例示には、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、または逆転写ウイルスを含むことができる。いくつかの実施形態において、標的核酸は、腫瘍またはがん細胞に存在できるが、健康な細胞には存在しない。がんのいくつかの非限定的な例示には、ヒト乳頭腫ウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ（エプスタイン・バール）ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトＴリンパ好性ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどの腫瘍ウイルスによって引き起こされるものを含むことができる。いくつかの実施形態において、標的核酸は、感染体または微生物、もしくは感染体または微生物に感染した細胞に存在できるが、健康な細胞には存在しない。感染体または微生物のいくつかの非限定的な例示には、ウイルス、細菌、菌類、原生生物、プリオン、または真核生物寄生虫を含むことができる。
【０１０９】
標的核酸配列はまた、断片、がん遺伝子、突然変異遺伝子、腫瘍ウイルス遺伝子などの遺伝子の部分または一部、ウイルス核酸配列、微生物核酸配列、特異的発現遺伝子及びその核酸遺伝子産物であり得る。
【０１１０】
ウイルス特異の標的核酸のいくつかの非限定的な例示には、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、または逆転写ウイルスに存在する配列を含むことができる。がん特異の核酸のいくつかの非限定的な例示には、非限定的にヒト乳頭腫ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトＴリンパ好性ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスを含む、オンコウイルスから誘導される配列を含むことができる。がん特異の標的核酸の例示には、変異ｒａｓ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＡＢＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、またはＳＲＣ遺伝子などの変異型がん遺伝子、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＭＤＭ１、ＭＤＭ２、ＡＴＭ、ＲＢ１、ＲＢＬ１、ＲＢＬ２、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＷＴ１、ＩＲＦ１、ＣＤＫ２ＡＰ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＴＲＩＭ３、ＢＲＣＡ１、またはＢＲＣＡ２遺伝子などの変異型腫瘍抑制遺伝子、及びがん細胞に発現する遺伝子を含むことができ、ここでその遺伝子は、変異していなくとも、または遺伝子組み換えが行われていても良いが、がん胎児性抗原などの投与の時点で、サンプルの健康細胞に発現はしない。
【０１１１】
当該標的核酸は、当該テンプレート化アセンブリ反応体のオリゴヌクレオチドの、その標的核酸への相補的形成の前に、取得され得る。当該標的核酸はさらに、細胞集団、腫瘍、または臓器などの標的サンプルから単離され得る。当該標的核酸はまた、細胞全体の溶解物に存在し得て、及びその他の細胞物質を分離または単離することができる。いくつかの実施形態において、当該標的核酸の自然な二次構造は、相補的形成の前に維持されている。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、当該標的核酸は、その標的コンパートメント中に、非標的コンパートメントと比べて、異なる量または濃度で存在できる。例示には、非限定的に、ｍｙｃ、テロメラーゼ、ＨＥＲ２、またはサイクリン依存キナーゼなどの、健康細胞に比べてがん細胞中に異なるレベルで発現された遺伝子を含むことができる。いくつかの実施形態において、当該標的核酸の配列は、標的対非標的コンパートメントにおいて、少なくとも１．５倍または２倍異なって特異的に発現された遺伝子であり得る。これらのいくつかの例示には、非限定的に、標的ＲＮＡ分子が、免疫グロブリンイプシロン重鎖配列を含む、タイプＩアレルギー反応の介在に関連する遺伝子、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質様プロインスリン誘導ペプチド、及び糖尿病誘発のＣＤ８＋Ｔ細胞から誘導される、αまたはβ可変領域を含む、クローン的に特異なｍＲＮＡとの関連で、自己抗原を認識する特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）などの、Ｔ細胞二次集団に発現した遺伝子、非限定的にＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、ＩＦＮ−ガンマ、ＯＳＭ、及びＬＩＦを含む、炎症反応の悪化を通して、その産生が、有害な結果をもたらすサイトカイン、を含むことができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的コンパートメント及び非標的コンパートメントの許容される二次グループに存在するが、非標的コンパートメントの異なるまたは個別の二次グループには存在しない。いくつかの非限定的な例示には、がん−精巣抗原、サバイビン、前立腺特異的抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ−フェトプロテイン、及びその他のがん−胎児たんぱく質などの、がん細胞及び健康細胞の限定された部類に発現した遺伝子を含むことができる。また、多数の組織及び臓器は、重篤な疾患に直面して、健康な生活にとって不可欠ではない。例えば、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１及びｇｐ１００などのメラニン細胞抗原は、正常なメラニン細胞と同様に、多数の悪性黒色腫に発現し、及びこれらの抗原を標的とする治療は、腫瘍及び正常なメラニン細胞の両方を破壊でき、白斑をもたらすが、しかし主要な腫瘍の減少をももたらす。同様に、精巣、卵巣、子宮などの生殖器官は、これら器官に腫瘍が発生した場合、外科的に除去され、乳房及び前立腺などの関連機関も同様に、標的となる可能性があり、及びこれら器官の正常細胞の破壊も、治療の許容範囲の結果となるであろう。さらに、チロキシン及びインスリンなどのホルモンを産生するいくつかの細胞は、関連するペプチドまたはタンパク質と置き換えられ得て、これら器官の腫瘍の存在下にあるかもしれない正常細胞の潜在的標的化を可能にしてしまう。
【０１１４】
標的核酸は、また、従来同定されていない、新規の配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のサンプルは、そのサンプルの遺伝子構成を決定するために、次世代配列解析、全トランスクリプトーム（ＲＮＡ−ｓｅｑ）または全ゲノム配列解析、マイクロアレイプロファイリング、遺伝子発現（ＳＡＧＥ）のシリアル解析などの配列解析によって評価され得る。標的核酸配列は、標的コンパートメントにそれらが存在するものとして、非標的コンパートメントには存在しないものとして、または非標的コンパートメントに比べて、標的コンパートメントに異なる量もしくは濃度で存在するものとして同定され得る。この方法によって同定される配列はしたがって、標的核酸としての役割を果たすことができる。
【０１１５】
当該テンプレート化アセンブリ反応体のオリゴヌクレオチド配列は、厳密性を変えた相補的形成の条件下で、相補的形成を行うことができる。語句「ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（相補的形成条件）」は、そのオリゴヌクレオチドが、通常は、全細胞溶解物などの、核酸の複雑な混合物における、その標的核酸と相補的形成をするが、その他の配列とは相補的形成をしない条件を指す。相補的形成条件は、配列依存であり、及び異なる環境においては、相違するであろう。より長い配列は、特により高い温度で相補的形成を行う。核酸の相補的形成に対応した詳細な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に、見出される。一般に、相補的形成条件は、定められたイオン強度のｐＨで、特定配列に対する熱溶解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低く選択される。このＴｍは、その標的に対して相補的であるオリゴヌクレチドの５０％が、平衡状態（その標的核酸が過剰に存在し、Ｔｍで、そのプローブの５０％が、平衡状態になっている）で、その標的核酸に相補的形成を行う温度（定められたイオン強度、ｐＨ、及び核濃度下における）である。
【０１１６】
オリゴヌクレチドを伴うテンプレート化アセンブリ反応体は、相補的形成時の過剰な標的核酸中に存在できる。いくつかの実施形態において、当該オリゴヌクレオチドは、約１０〜１００倍過剰な標的核酸中に存在できる。当該オリゴヌクレオチドは、約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、３００倍、またはその間の任意の量で過剰な標的核酸中に存在できる。
【０１１７】
標的テンプレートに対して、過剰なオリゴヌクレオチド配列（エフェクター部分）を伴うテンプレート化アセンブリ反応体が許容される一方で、その逆の状況（過剰な標的テンプレート）は、テンプレート化アセンブリの効果を減らす可能性がある。この「ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ（テンプレート漸増）効果は、ＲＮＡ標的分子内の適切な特定部位の同定と同様に、テンプレートレベルの量が、非常に有用であることを示す。ＲＮＡ標的の非常に低いレベルもまた、テンプレート化アセンブリの応用の観点からは、非生産的である可能性がある。したがって、標的部位への接近の効果を含む、定常状態のテンプレートレベル及びその他の要因によって影響される、特定テンプレートに対する理想的な範囲が存在して良い。
【０１１８】
相補的形成条件は、その塩濃度が、約１．０Ｍのナトリウムイオン濃度未満で、通常は、ｐＨ７．０から８．３で、約０．０１から１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（またはその他の塩）であり、及びその温度が、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃、及び長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを上回る）に対しては少なくとも約６０℃であるような条件であり得る。相補的形成条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成されて良い。選択的または特定の相補的形成に対しては、陽性シグナルは、少なくとも２回のバックグラウンドでの、任意で１０回のバックグラウンドの相補的形成である。例示的な相補的形成、相補的形成条件は、６５℃での０．２倍ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴った、５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳを使用した４２℃での培養、または５倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳを使用した６５℃での培養の条件であり得る。そのような相補的形成及び洗浄ステップは、例えば、５、１０、１５、３０、６０、９０分間、またはそれ以上の時間で実行され得る。例示的な実施形態において、そのような相補的形成及び洗浄ステップは、２〜１６時間の間に実行され得る。
【０１１９】
過剰な非結合のテンプレート化アセンブリ反応体はまた、相補的形成後に除去され得る。この結合していないテンプレート化アセンブリ反応体は、非限定的に、酵素消化、限外濾過、またはゲルサイズ−排除クロマトグラフィーなどの、当技術分野で通常使用される方法によって、除去され得る。
【０１２０】
相補的形成はまた、連続して実行され得る。いくつかの実施形態において、テンプレート化アセンブリ反応体の第一集団は、標的核酸に相補的形成が行われる。その第一集団の過剰な非結合のテンプレート化アセンブリ反応体は、除去され得る。次いで、相応するテンプレート化アセンブリ反応体の第二集団が、その第一集団が相補的形成をされている標的核酸に、相補的形成が行われる。その第二集団の過剰な非結合のテンプレート化アセンブリ反応体は、除去され得る。
【０１２１】
核酸テンプレート化アセンブリは、テンプレート化アセンブリ連結反応産物を生み出すために、２つ以上のテンプレート化アセンブリ反応体を、近接位に持ち込む。本明細書で使用する語句「ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ（テンプレート化アセンブリ連結反応産物）」は、１つ以上の核酸テンプレート化アセンブリ反応体の相互作用、結合または反応によって形成された、産物構造または構造を指す。テンプレート化アセンブリ連結反応産物は、望ましい生物活性を産生することができる、活性エフェクター産物を含んで良い。テンプレート化アセンブリ連結反応産物の形成は、標的核酸を伴う相補的形成及びアニーリングなどの結合相互作用を介した、位置及び／または方向特異的な方法で組み立てられた、個別のテンプレート化アセンブリ反応体によって、促進される。テンプレート化アセンブリ反応に関与するために、単一の標的テンプレート上で一体となるテンプレート化アセンブリ反応体を、本明細書では「ｓｅｔ  ｏｆ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｒｅａｃｔａｎｔｓ（一組の相応する反応体）」または「ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔａｎｔｓ（相応するテンプレート化アセンブリ反応体）」と呼ぶ。一組の相応するテンプレート化アセンブリ反応体は、核酸標的テンプレートの空間的近接位へ、配列特異の方法で結合し、及び活性エフェクター構造を含んだ、テンプレート化アセンブリ連結反応産物を生み出すために、互いに容易に反応する。
【０１２２】
当該テンプレート化アセンブリ反応は、非限定的に、クリック化学反応、シュタウディンガー化学、非トレースレス・シュタウディンガー連結反応、トレースレス・シュタウディンガー連結反応、ネイティブ化学連結反応、及びその他のテンプレートアセンブリ反応などの反応であり得る。いくつかの実施形態において、当該テンプレート化アセンブリ反応は、トレースレス・ホスフィノフェノール・シュタウディンガー連結反応、またはトレースレス・ホスフィノメタンチオール・シュタウディンガー連結反応のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、クリック反応が、実施できる。
【０１２３】
テンプレート化アセンブリ反応はさらに、米国特許出願番号６１／８３１，１３３に開示され、その全体を、参照として、本明細書に組み入れる。
【０１２４】
過剰な非結合テンプレート化アセンブリ反応体はまた、テンプレート化アセンブリ後に除去され得る。当該非結合テンプレート化アセンブリ反応体は、非限定的に、酵素消化、限外濾過、またはゲルサイズ−排除クロマトグラフィーなどの、当技術分野で通常使用される方法によって、除去され得る。
【０１２５】
当該標的核酸の同定には、反応または未反応のテンプレート化アセンブリ反応体を増幅すること、反応または未反応のテンプレート化アセンブリ反応体の選択的開裂、未反応のテンプレート化アセンブリ反応体から、反応したテンプレート化アセンブリ反応体を、微小コンパートメント化すること、及びテンプレート化アセンブリ反応体からオリゴヌクレオチドを配列解析することの、任意のものまたはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１２６】
当該標的核酸の同定は、その特定オリゴヌクレオチドによって運ばれたプライミング部位と相補的なプライマーを伴って、相補的に反応したテンプレート化アセンブリ（ＣＬＯＳＥ）反応体の増幅によって、実施できる。トリアゾール産物の形成を伴った、特定のテンプレート化アセンブリ反応を介した、化学的に結合された一対のテンプレート化アセンブリ反応体（各々が別々に修飾されたものからの一対）だけが、ＰＣＲによって、その反応体間で産生された、特定連結の効力によって潜在的に増幅可能である。
【０１２７】
標的ＲＮＡ配列内で連続している、テンプレート化アセンブリに対応したエフェクター部分サイトに加えて、非連続（不連続）標的部位も、もしそれらが、折り畳まれたＲＮＡの二次構造、またはその他の高次の構造的配置によって、空間的近接に持ち込まれるならば、効果的である。そのような二次構造的モチーフの非限定的な例示には、ステムループ、ループ内の内部サイト、及び偽結節を含む。
【０１２８】
当該テンプレート化アセンブリ反応体からのオリゴヌクレオチドは、空間的近接の方法で、標的核酸と相補的形成を行うことは可能だが、増幅可能なテンプレート化アセンブリ反応連結を促進することはできない。これは、その相補的形成が、非生物学的に増幅が可能な５′−５′または３′−３′末端を並置する場合、もしくはそのテンプレート化アセンブリ反応体の５′−及び３′−修飾末端間でのテンプレート化アセンブリ反応が、そのサイズまたは構造がポリメラーゼと互換的ではない産物をもたらす場合に、発生する。
【０１２９】
その反応したテンプレート化アセンブリ反応体、または反応した産物の開裂もまた、実施され得る。未反応産物に対する反応産物の制限消化には、プライマー部位またはそのオリゴヌクレオチド配列に隣接したリンカー配列に人工的に組み入れられた部位を利用できる。反応及び未反応産物もまた、メチル化に特異的な酵素によって、差別化され得る。いくつかの実施形態において、５−メチルシトシンのヘミメチル化に感受性のある開裂酵素が、使用できる。いくつかの実施形態において、その反応産物は、ポリメラーゼ伸長を介して、二本鎖に作られ得る。その結果得られる二本鎖は、そのプライマー部位またはリンカー配列における制限部位を認識する酵素で、開裂され得る。
【０１３０】
その開裂された反応産物もまた、近接で相補的形成された配列間での連結情報を保持するために、酵素的に連結反応され得、増幅が可能であり得る。
【０１３１】
生体外のコンパートメント化もまた、未反応鎖を個別的に単離されたコンパートメントに封じ込め、誤った増幅シグナル（元のテンプレート化アセンブリ反応体からもたらされていないシグナル）を与えるかもしれない、その他の未反応鎖との連結反応または反応を防ぐことによって、未反応のテンプレート化アセンブリ反応体から、テンプレート化アセンブリ反応の連結産物を単離するために利用できる。
これらの条件は、任意の混和溶液の適切な組み合わせから作り出されるエマルジョンを形成することによって、達成が可能である。親水性溶媒は、ミクロまたはコロイドサイズの「ａｑｕｅｏｕｓ（水性）」液滴を形成する。「Ｄｒｏｐｌｅｔｓ（液滴）」はまた、本明細書では「ｍｉｃｒｏｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ（微小コンパートメント）」と呼ばれる。コロイド中の水性液滴は、エマルジョンの形成に適した任意の親水性物質から形成され得て、安定形態において、生化学成分を含み、及び望ましい反応が引き起こされる環境を与える。
【０１３２】
このエマルジョンは、１つ以上の界面活性試薬（界面活性剤）の添加によって、安定化されて良い。これらの界面活性剤は、乳化剤と呼ばれ、及び層の分離を防ぐ（または少なくとも遅らせる）ために、親水性／疎水性界面で作用する。オイル及び多数の乳化剤などの、多数の疎水性溶液が、二相エマルジョンの生成に利用され得て、最近の集大成では、１６，０００を超える界面活性剤が網羅されており、その中の多数が、乳化剤として使用され（Ａｓｈ，Ｍ．ａｎｄ  Ａｓｈ，Ｉ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ．Ｇｏｗｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ：Ａｌｄｅｒｓｈｏｔ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ  （１９９３）、ａｎｄ  Ｓｃｈｉｃｋ，Ｎｏｎｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎ．Ｙ．（１９９６））、ソルビタンモノオレート（ＳＰＡＮ（商標）８０、ＩＣＩ））、及びポリオキシエチレンソルビタン（ＴＷＥＥＮ（商標）８０、ＩＣＩ））などがある。
【０１３３】
当該オリゴヌクレオチドの配列は、非限定的に、化学分解法（Ａ．Ｍ．Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８０，６５，４９９−５６０）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法・  飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（Ｐｉｅｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，３１９１−３１９６）、アルカリホスファターゼ及びエキソヌクレアーゼ消化における質量分析（  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，２９０，３４７−３５２）などを含む、任意の適切な配列解析法を使用して、決定及び検証され得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、当該標的核酸は、その反応したまたは未反応のテンプレート化アセンブリ反応体を増幅すること、及びその反応したテンプレート化アセンブリ反応体からのオリゴヌクレオチドの配列解析を行うことによって、同定され得る。
【０１３５】
テンプレート化アセンブリ反応体の濃縮法をまた、開示する。その濃縮は、病理学、疾患状態、対象となる異常な細胞、または特定の細胞核酸標的と関連性のあるテンプレート化アセンブリ標的を伴う、反応したテンプレート化アセンブリ反応体に対して選択できる。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的誘発（ＣＬＯＳＥ）産物のライブラリーからの一対のテンプレート化アセンブリエフェクターの濃縮には、細胞核酸標的に、空間的近接位であるためテンプレート化アセンブリを通して化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドのライブラリーを取得すること、連結反応したオリゴヌクレオチド−細胞核酸標的のライブラリーを増幅すること、及び連結反応したオリゴヌクレオチド−細胞核酸標的を、選択的に濃縮することを含み、ここでその連結反応した標的は、対象となる異常細胞の病理学、またはその細胞核酸標的への不連続な相補的形成に関連して、選択される。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、細胞ＲＮＡ標的源へ相補的形成を行ったテンプレート化アセンブリエフェクターは、それまでの観察で公知である、特定の標的ＲＮＡに向けて濃縮され得る。そのような標的指向濃縮は、空間的近接ＣＬＯＳＥエフェクターの化学連結反応後に、適用されて良く、本明細書では「ｔａｒｇｅｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＣＬＯＳＥ（標的指向ＣＬＯＳＥ）」という。この望ましい標的指向濃縮は、全細胞ＲＮＡを結合するＣＬＯＳＥライブラリーの小集団と、その対象となる標的に対応した特定核酸プローブ配列との間の相補的形成によって、達成可能である。そのような相補的形成は、当該ＣＬＯＳＥ二次ライブラリーとプローブの両方が、適切な相補性の一本鎖の状態になる場合に、最も効果的である。
【０１３８】
本明細書で使用する「ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｌｉｇａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ（空間的に誘発された、化学的に連結反応したオリゴヌクレオチド）」は、標的核酸テンプレートへ、相補的形成を介したオリゴヌクレオチドの空間的近接の結果として、化学的に連結反応した一対のオリゴヌクレオチドを指す。
【０１３９】
大規模のＣＬＯＳＥコレクションは、ＣＬＯＳＥライブラリーと呼ばれ、基本的形態、再配列形態、または増幅形態であり得る。基本ＣＬＯＳＥライブラリーには、空間的に可能になった反応からもたらされたテンプレート化アセンブリ反応の化学産物を含む。増幅ＣＬＯＳＥライブラリーは、読み取り可能な化学連結反応点を伴った基本ライブラリーのＰＣＲから、直接または間接に誘導され得て、ここでＰＣＲは、再配列のライブラリーで達成されるように、プライミング部位の操作によって、可能になった。いくつかの実施形態において、このＣＬＯＳＥ産物には、その化学連結反応したオリゴヌクレオチドの短いＰＣＲ産物の二本鎖を含む。当該ＣＬＯＳＥ産物の増幅は、特定オリゴヌクレオチドによって持ち込まれたプライミング部位に相補性であるプライマーで、化学連結反応したオリゴヌクレオチドの増幅によって、実施され得る。当該テンプレート化アセンブリ反応を介して、化学的に結合したオリゴヌクレオチド対（各々個別に修飾された集団の一対）だけが、ＰＣＲによって、そのオリゴヌクレチド間で産生された連結の効力によって、潜在的に増幅される。
【０１４０】
過剰な、非結合テンプレート化アセンブリ反応体もまた、テンプレート化アセンブリ後に除去できる。この非結合テンプレート化アセンブリ反応体は、非限定的にポリエチレンテグリコール８０００（ＰＥＧ）を伴う連続沈殿法、酵素消化、限外濾過、またはゲル排除クロマトグラフィーなどの、当技術分野で通常使用される方法によって、除去できる。
【０１４１】
比較減法もまた、当該ＣＬＯＳＥライブラリーの連結反応したオリゴヌクレオチド対を濃縮するために使用できる。当該ＣＬＯＳＥライブラリーからの標的細胞または組織から誘導された連結反応オリゴヌクレオチド対は、異なる細胞または組織から誘導された連結反応オリゴヌクレオチド対より濃く濃縮され得る。いくつかの実施形態において、異常標的細胞から誘導された連結反応オリゴヌクレオチド対は、正常標的の対応部分から誘導された連結反応オリゴヌクレオチド対より濃く濃縮され得る。いくつかの実施形態において、対象となる異常細胞からの連結反応した標的は、対象となる正常細胞から誘導された連結反応した標的を除去することによって、濃縮され得る。異常標的細胞及び正常細胞から誘導された、連結反応したオリゴヌクレチド対のライブラリー間での比較選別が効果的でもよく、ここでビオチン化された正常細胞は、固相ストレプトアビジン結合によって、相補的形成後に除去される。比較減法の後に残された連結反応したオリゴヌクレチド対はさらに、同定のために加工され得る。
【０１４２】
テンプレート化アセンブリに対応した、一対の化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的誘発（ＣＬＯＳＥ）産物の評価法をまた、開示する。テンプレート化アセンブリ反応体としての、この一対のＣＬＯＳＥ産物は、他のテンプレート化アセンブリ反応体上の相応する修飾と容易に相互作用するために、修飾され得るが、天然の生体分子とは容易に相互作用しない。この修飾は、テンプレート化アセンブリ反応において、テンプレート化アセンブリ反応における、選択的反応モイエティーの反応性などの、反応性を付与できる。選択的反応モイエティーの例示には、バイオオルソゴナル反応モイエティーの添加を含むことができる。いくつかの実施形態において、ピレンマレイミドなどのピレン基は、当該ＣＬＯＳＥ産物に添加され得る。
【０１４３】
前述と同様に、当該ＣＬＯＳＥ産物はまた、５′及び／または３′プライミング部位、及び／またはリンカーもしくはスペーサーなどの中間体を含むことができる。当該ＣＬＯＳＥ産物はまた、本明細書で記述される同定に対応して、加工され得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、当該テンプレート化アセンブリ標的を同定するための、テンプレート化アセンブリ反応体のライブラリーを開示する。このライブラリーには、テンプレート化アセンブリ反応体を含むことができる。いくつかの実施形態において、このライブラリーには、テンプレート化アセンブリ反応体の第一及び第二集団を含み、ここでそのテンプレート化アセンブリ反応体には、テンプレート化アセンブリ反応における反応に対応した、オリゴヌクレオチド配列及び修飾を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、ライブラリーは、化学的に連結反応したオリゴヌクレオチドの空間的誘発（ＣＬＯＳＥ）産物を含む。このライブラリーはまた、相補的形成を介した細胞核酸テンプレートへのオリゴヌクレオチドの空間的近接位よって化学連結反応した、オリゴヌクレチドを含むように濃縮された、少なくとも一対のテンプレート化アセンブリ標的を含む。当該ＣＬＯＳＥライブラリーには、増幅された化学連結反応産物のライブラリー、正常細胞と比較した異常細胞から誘導された、濃縮されたオリゴヌクレチドを含む。
【０１４６】
本明細書に記述のキットは、対象となる細胞における、新規のテンプレート部位の発見に使用できる。これらは、標的ＲＮＡテンプレートの連続セグメント内の直鎖状部位、同じ標的テンプレートの不連続（立体配座的に使用可能な）部位、または高次の核酸もしくは特定細胞内で形成される核タンパク質複合体を介して、並置されたそれぞれのテンプレート内の部位であり得る。
【０１４７】
対象となる細胞に特異的なテンプレート部位は、本明細書に記述のキット及び方法で、同定され得、その他の細胞の大きなバックグラウンド内の、そのような対象となる細胞の存在を同定するための、診断基準として利用され得る。例えば、血、尿、腹水、髄液、気管支洗浄、経口洗浄液及び痰、細胞診検体、組織生検または臓器、胆汁、糞便、または他の体液もしくは部位においてである。
【０１４８】
検出が蛍光に基づく実施形態において、キットには、そのテンプレート化アセンブリ反応体の連結反応で、蛍光シグナルを生み出すテンプレート化アセンブリ反応体、例えば、ピレンエキシマー、及び蛍光検出試薬を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットには、そのテンプレート化アセンブリ反応体と、非限定的に、ＥＬＩＳＡなどの、酵素読み出しに対応した検出試薬との連結反応において、酵素反応を触媒する、テンプレート化アセンブリ反応体を含むことができる。
【０１４９】
一組の相応するテンプレート化アセンブリ反応体の診断試験評価及びその対象物が、採用されて良い。この評価は、テンプレート化アセンブリ反応体の特定の一組が、所定対象物において、エフェクター構造を産生する成分であり得るかどうかを決定する役割を果たす可能性がある。これは、もしそのテンプレート化アセンブリ反応体が、以前に利用されていない場合、またはもし現在のサンプルが、以前のサンプルと非常に異なる場合、例えば、そのサンプルが、以前のサンプルと比較してより低いレベルの標的核酸を含む場合などには、有用であろう。当該キット及び診断はまた、サンプル中の標的核酸の有無、またはサンプル中の標的核酸の存在量を検出できる。当該キット及び診断はまた、核酸標的が、テンプレート化アセンブリ反応に利用可能かどうかの決定、サンプル中の核酸標的の二次構造についての情報を与えるのに有用であろう。いくつかの実施形態において、そのテンプレート化アセンブリ反応体の、標的核酸を同定する能力が、決定され得る。
【０１５０】
当該キット及び診断には、当該相応するテンプレート化アセンブリ反応体に、１つのサンプルまたは複数サンプルで接触することを含むことができる。首尾よく達成されたテンプレート化アセンブリ反応によって産生された活性の、簡易的な生体外読み出しによる同定もまた、含まれる。そのような読み出しには、非限定的に、サンドイッチ酵素結合免疫吸着及びホスファターゼアッセイ、リン光法、免疫蛍光法、生物発光法などを実施して良い。
【０１５１】
生体外のサンドイッチスタイル診断評価アッセイを実践するために、以下のステップが、実行され得る。１つまたは複数サンプルを、生体外アッセイを行う対象物から取得できる。任意で、標的コンパートメントサンプル（例えば、腫瘍生検）及び非標的コンパートメントの陰性対照サンプル（例えば、健康細胞のサンプル）を取得する。サンプルは、核酸を放出するために、使用を容易にする、またはそのアッセイの感度を高める、適切な緩衝液に溶解されて良い。テンプレート化アセンブリ反応体を、そのサンプルまたは溶解物に投入できる。標的核酸が存在する場合、テンプレート化アセンブリ連結反応産物が形成される。
【０１５２】
連結反応産物は次いで、固定された補足分子によって、結合され得る。この分子は、マイクロタイタープレートなどの容器に、または、アッセイ媒体と混合された寒天ビーズや磁性ビーズなどの基板上に固定化されて良い。サンプル材料及び非連結反応体は、除去され得、固定化された複合体が、洗浄され得る。そのテンプレート化アセンブリ連結反応産物の使用可能な部分に特異的な検出分子が、その固定化された複合体と共に培養され得、適切な検出読み出しが、実施され得る。いくつかの実施形態において、その検出分子、補足分子、またはその両方の特異性が、そのテンプレート化アセンブリ反応が起こる前の、いずれのテンプレート化アセンブリ反応体にも存在しない、テンプレート化アセンブリ連結反応産物上の構造を選択的に検出し、そのためそのテンプレート化アセンブリ連結反応産物が、捕捉及び／または検出され得る。例えば、その補足分子の特異性が、開始時のテンプレート化アセンブリ反応体に存在しないエフェクター産物構造を選択的に検出し、テンプレート化連結反応産物だけが、捕捉され及び検出されることを保証する。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、当該検出分子の特異性が、１つのテンプレート化アセンブリ反応体上の構造を、選択的に検出でき、その捕捉分子の特異性が、異なるテンプレート化アセンブリ反応体上の構造を、選択的に検出でき、そのためテンプレート化アセンブリ連結反応産物が、両構造を含み、したがって検出される。単一化合物を含んだ一組のテンプレート化アセンブリ反応体は、この実施形態と互換性が無くて良い。
【０１５４】
本明細書に開示する対象物質が、より効果的に理解されるように、実施例を、以下に提供する。これらの実施例は、説明目的だけのためにあり、及びいかなる方法においても、当該請求対象事項を限定するとの解釈はない、と理解されるべきである。
【実施例】
【０１５５】
実施例１：事前に結合されたプライマー部位を有するオリゴヌクレチド間で、増幅可能な連結を産生するテンプレート化アセンブリ反応体の、ライブラリーを利用した、サンプルからのテンプレート化アセンブリ標的配列または構造の同定（実例）
２つのＲＤＯ集団を合成した。ホスホラミダイトに基づく合成中に、不規則領域を、ｄＡ対ｄＣ対ｄＧ対ｄＴの比率で、２５対２５対２５対２５で構成する。１つの合成集団は、それに続く５′−アジド基への化学変換に対する５′−ヨウ素ｄＴ修飾、及びこの末端からの望ましくないポリメラーゼ伸長を防ぐために設計された、３′−リン酸基で封止された、ＰＣＲプライマーに対する３′−プライミング部位を有する。その他は、ＰＣＲプライマーに対する５′プライミング部位、及び３′−５−メチル−Ｃアルキン修飾（プロパルギル基）を有する。これらのオリゴヌクレオチドの構成を、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄに描写する。  
【０１５６】
対象となる細胞源からのＲＮＡを、不規則オリゴヌクレオチド配列と、相補的形成させた。１つの原則は、各ライブラリーからの特定構成体による、細胞ＲＮＡの使用可能な経路への相補的形成に依存することである。両ライブラリーからの２つのオリゴヌクレオチドを、適切な空間的近接で、ＲＮＡ配列へアニールする場合、クリック反応が適切である。結果もたらされるそのような近接鎖の化学的結合は、以降のそれらの増幅及び同定を可能にする。相補的形成に先立って、その修飾されたオリゴヌクレチドを、一時的な熱変成ステップ（２分／８０℃）に供するが、これは、自然な二次構造を保持する必要があるため、そのＲＮＡ標的には適用しない。全細胞の溶解物をまた、同じ方法で選択でき、ここでプロテアーゼ及びＲＮａｓｅ阻害剤を、内因性の自然に折り畳まれたＲＮＡまたはリボ核タンパク質を保護するために使用する。
【０１５７】
ＲＮＡは、非限定的に、Ｑｉａｇｅｎ社及びＮｏｒｇｅｎ社などの商業サプライヤーからのキットを含む、任意の標準的な手順によって調合できる。
【０１５８】
ＲＮＡは、穏やかな条件下で得られた、全細胞質溶解液の形態で調合できる。そのような条件は、非限定的に、浸透圧溶解の例では、ｐＨ７．４の２０ｍＭのトリス緩衝液、１０ｍＭのＮａＣｌ、及び３ｍＭのＭｇＣｌ２の低張緩衝液を伴って達成できる。細胞の溶解は、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を伴うプロテアーゼ阻害剤カクテルによって、及びまた（非限定的に）マウスのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）などの、酸化低感受性リボヌクレアーゼ阻害剤の存在において、タンパク質を保護する場合に、実施する必要がある。
【０１５９】
互いにモル量で５０対５０の混合物において、１５００塩基のその細胞ＲＮＡの平均分子量を推定することによって計算された、及び１〜１０マイクログラムの開始ＲＮＡを伴った、１０〜１００倍過剰なＲＮＡ量の存在下で、同時に不規則に化学的修飾された集団を伴って、当該ＲＮＡ−オリゴヌクレチドの相補的形成を実施する。相補的形成は、２〜１６時間の間に達成できる。相補的形成は、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス緩衝液、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオエリトリトール、及び２．４単位／ｍｌのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）中で実施できる。
【０１６０】
その相補的形成が終了したら、非結合オリゴヌクレチドを、ＰＥＧ沈殿、限外濾過またはゲルサイズ排除クロマトグラフィーによって、除去する（細胞ＲＮＡへ相補的形成を行った不規則オリゴヌクレチドは、その条件が、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖の持続性に有利に働く限り、そのＲＮＡと共に精製する）。
【０１６１】
互換的な手順において、非結合オリゴヌクレチドは、ＤＮａｓｅＩでの処理によって、枯渇し、ここで相補的形成を成したＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖は、ＤＮａｓｅＩの作用に鈍感であり、相補的形成をしていないプライマー部位Ｐ１及びＰ２は、２′−Ｏ−メチル相補性鎖を伴う二本鎖によって保護される（図１Ｃ、図１Ｄ）。このＤＮａｓｅＩ処理は、その他の精製法と、またはそれに続くＰＥＧ沈殿、限外濾過またはゲルサイズ排除クロマトグラフィーにおいて、互換的に使用できる。
【０１６２】
次いで、Ｃｕ（Ｉ）クリック触媒反応を、５０〜１００μｌ容量において、３０〜６０分／２５℃で実施する。このステップが完了するまでは、可能な限り厳しいＲＮａｓｅの無い条件、及び適切なＲＮａｓｅ阻害剤を使用して、その標的細胞ＲＮＡの構造的な完全性を維持することが最善である。Ｃｕ（Ｉ）クリック触媒は、市販のキットで、または当技術分野で公知の個別成分で、実施できる。あるいは、そのＣｕ（Ｉ）成分を、非限定的に、化合物のＴＢＴＡ、ＴＨＰＴＡ、ＢＴＴＡＡ及びＢＴＴＥＳ（Ｂｅｓａｎｃｅｎｅｙ−Ｗｅｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１１，５０，８０５１−８０５６）を含む、特定のキレートを使用して、送達できる。
【０１６３】
そのＣｕ（Ｉ）触媒作用クリック反応の完了後、その調合物を、小さな使い捨てのスピンカラム（Ｂｉｏｒａｄ社、またはＰｉｅｒｃｅ社）を使用してもっとも簡単に、銅イオンを取り除いて、脱塩する。
【０１６４】
次いで、その元の不規則集団から選択された特定のオリゴヌクレチドによって持ち込まれた、プライミング部位と合致するプライマーを伴って、ＰＣＲを実施する。化学的に結合したオリゴヌクレチド対（各々が個別に修飾された集団からの一対）だけが、このＰＣＲプロセスによって、使用された特定の５′−アジド／３′−アルキンオリゴヌクレチドによって産生された「ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（生体適合性の）」トリアゾール連結の効力によって、潜在的に増幅可能である（図２）。そのような接合は、連続部位または標的ＲＮＡ折り畳みによって並置された部位のいずれかによって、促進される（図２）。産物は、正しい方向で標的テンプレートにアニールされた、ＣＬＯＳＥオリゴヌクレチドによってのみ、形成できる（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ）。
【０１６５】
実施例２：ＣＬＯＳＥライブラリーの高容量配列解析及び差異化バイオインフォマティク解析（想定事例）
本明細書では、細胞ＲＮＡテンプレートへの相補的形成を介した、オリゴヌクレチドの空間的近接の結果として、化学的に連結反応させられた、オリゴヌクレチドの任意の１対を、便宜上、空間的に誘発されて、化学的に連結反応したオリゴヌクレチドを意味する、接頭語ＣＬＯＳＥによって表す。大規模なＣＬＯＳＥコレクションを、ＣＬＯＳＥライブラリーと呼び、基本的形態、再配列形態、または増幅形態であり得る。
【０１６６】
基本的ＣＬＯＳＥライブラリーには、空間的に可能な反応から直接もたらされる、クリック化学反応の化学産物を含む。したがって、増幅ＣＬＯＳＥライブラリーは、読み出し可能な化学連結反応点を有する基本的ライブラリーのＰＣＲから、直接または間接のいずれかで誘導され、ここでＰＣＲは、再配列ライブラリーを伴って達成するように、プライミング部位を操作することによって可能になる。
【０１６７】
任意の増幅されたＣＬＯＳＥライブラリー（直接または間接のいずれか）は、そのＰＣＲプライマー及び使用されたプライミング部位によって定められる、化学連結反応のオリゴヌクレチド、及び本来連結されていた空間的に近接の、一対のオリゴヌクレチドの短い二本鎖の大規模なコレクションである。
【０１６８】
対象となる異常細胞に対するそれらの正常な対応部分からの増幅ＣＬＯＳＥライブラリーは、直接、配列解析及びバイオインフォマティク解析を受けることができる。候補分野を狭めるために、より焦点を絞ったアプローチでは、差異分を比較除去する相補的形成を取り入れる。
【０１６９】
基本的ＣＬＯＳＥライブラリーのＰＣＲ増幅産物に対応するバンドは、ゲルから取り出し、クローン化する。
【０１７０】
ＣＬＯＳＥのクローン化のいくつかの実施形態において、取り出されたバンドを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを伴う増幅からもたらされた、１−塩基５′ｄＡオーバーハングによって、クローン化する。そのような５′ｄＡ−ＣＬＯＳＥ断片を、１塩基５′ｄＴオーバーハングを有するプラスミドベクターに、クローン化する。適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主における多数のプラスミドクローンを、ミニスケール調合物として単離し、そのＣＬＯＳＥ挿入からの上流及び下流のプライマーを伴う、従来からの自動化配列解析に供した。ＣＬＯＳＥ挿入の読み通しが完了するように、間隔を十分にとって配置された。
【０１７１】
配列解析されたＣＬＯＳＥクローンは、期待された構造で一様であり、（＋）鎖２２−ｍｅｒのダイマー（元の一本鎖オリゴヌクレオチドに対応する）（ＬからＲ、図１Ａ，１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄ）は、５′Ｎ１０−ＣＴ−Ｎ１０である。一連の任意に選択されたＣ
ＬＯＳＥクローン配列を、同じパターンの不規則に生み出された配列と比較した（図４）。このＣＬＯＳＥシリーズは、純粋に不規則に基づくものに期待したより、著しく高いＧＣ含有量を有し、その相補的形成に基づく選択手順が、より高いＧＣレベルによって与えられた、より優れた安定性に有利に働いたことを示唆していた。
【０１７２】
ＣＬＯＳＥクローン化のいくつかの実施形態において、取り出されたバンドを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のプロトコルに従う、次世代配列解析に対応して調合する。ＣＬＯＳＥクローン化のいくつかの実施形態において、取り出されたバンドを、非限定的に、ピロシーケンス法、ＡＢＩ  ＳＯＬｉＤシーケンス法、  Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  シーケンス法、及びＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンス法を含む、その他のＮｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（次世代配列解析）プロトコルに従う、次世代配列解析に対応して調合する。
【０１７３】
異常細胞源からの多数のＣＬＯＳＥクローンを、配列解析した場合には、それらの分化状態、及び細胞発現の表現型、遺伝子型、及び多型の分配の点から、可能な限りその異常細胞標的と厳密に一致するように、正常細胞からの対応するデータを伴って、蓄積された配列データを比較することが賢明である。この解析は、コンピュータによる比較減法に相当する。
【０１７４】
配列データは、異常細胞からの対象のＣＬＯＳＥライブラリーに対して使用された方法との一致により、増幅されたＣＬＯＳＥライブラリーからのＣＬＯＳＥクローン配列に一致した正常細胞から、取得する。
【０１７５】
対象となる異常細胞及び一致した正常細胞からの一組のＣＬＯＳＥ配列を、バイオインフォマティク解析に供する。各ＣＬＯＳＥ配列の（＋）鎖は、その元のオリゴヌクレオチドによる、３′−（５−メチル）−ｄＣ−プロパルギル、及び５′−ｄＴ−アジド基の間の化学連結反応点に対応している（増幅後）、ＣＴジヌクレオチドによって分離された２つのデカマー経路として定義できる。
【０１７６】
候補となるＣＬＯＳＥクローンを却下する選択基準には、対象となる細胞のいずれかのデカマー経路と発現したまたはゲノムの配列との間にいかなる著しい一致も見いだせないことを含む。「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（著しさ）」とは、いずれかの経路と、少なくとも７０％の一致があると、本明細書では定める。
【０１７７】
対象となる異常細胞源からのＣＬＯＳＥ配列対は、クローン化されたＣＬＯＳＥライブラリー（従来からのクローン化及び配列解析によって）の無作為の取り上げからの、それらの出現頻度によって順位付けされる。
【０１７８】
手順ガイドラインとしての頻度順位付け基準を使用して、異常細胞源からのＣＬＯＳＥ対を、対応する正常細胞源からのＣＬＯＳＥ対に対して選別する。その正常細胞源との一致が同定された場合、異常細胞からの一致しているＣＬＯＳＥ対を、さらに解析から外す。
【０１７９】
特別な対象である異常なＣＬＯＳＥ配列対を知らせるためのその他基準には、１）対象となる異常細胞の病理学と潜在的に関連する、ＣＬＯＳＥ対一致配列を構成するデカマー配列のいずれかまたは両方、または２）そのＣＬＯＳＥ対一致が、同じＲＮＡ鎖上、または別々のＲＮＡ鎖上で、不連続に発生していると同定される場合がある。
【０１８０】
腫瘍細胞に対して潜在的に注目される配列には、非限定的に、既知のがん遺伝子または腫瘍サプレッサーに対応するゲノムまたは発現した遺伝子、細胞周期のレギュレータ及びメディエーター、転写レギュレータ及びメディエーター、翻訳レギュレータ及びメディエーター、テロメラーゼ、細胞骨格成分、及びキナーゼを含む。
【０１８１】
実施例３：物理的なＣＬＯＳＥライブラリーの比較減法を介した、対象となる細胞に特異的な配列または構造を同定するための、ＣＬＯＳＥライブラリーの活用（想定事例）
比較減法は、異常標的細胞及び正常細胞から誘導された連結反応したオリゴヌクレチド対のライブラリー間で有効であり、ここでビオチン化正常細胞が、固相ストレプトアビジン結合による相補的形成後に、除去される。
【０１８２】
本明細書に開示のプロトコルに従って取得された、増幅ＣＬＯＳＥライブラリーを、対象となる異常細胞から誘導する。
【０１８３】
その対象となる異常細胞と同系統及びその分化状態と可能な限り厳密に一致する正常細胞を、選定する。非限定的な例示には、メラノーマ細胞、正常なメラノサイト、Ｂリンパ腫、正常なＢ細胞、Ｔリンパ腫、及び通常のＴ細胞を含む。
【０１８４】
ＣＬＯＳＥライブラリーを、一致した対象となる正常細胞から取得する。そのようなライブラリーを、初期のオリゴヌクレオチドにおける異なるプライミング部位（Ｐ３、Ｐ４）の使用を除いて、その相応する異常細胞に対するのと同じ方法で用意する必要がある（図５）。また、その最終増幅ステップに使用するプライマーは、５′−ビオチン基を有する必要があり、それによってその増幅されたＣＬＯＳＥ産物自体を、両方の鎖上でビオチン化する（図５）。
【０１８５】
ＰＣＲ反応から取得する場合、正常及び異常ＣＬＯＳＥライブラリーの両方を、フェノール抽出し、０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５倍容積のエタノールを使用して沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、２０μｌのＴＥに再溶解させる。次いで、正常のビオチン化増幅ＣＬＯＳＥライブラリーを、異常細胞からの対応部分の非ビオチン化ライブラリーと、正常対異常ＣＬＯＳＥ産物が１０対１の比率で混合する。その混合したライブラリーを、９５℃で１０分間の変成を行い、及び次いで室温へ、ゆっくりと冷却する。
【０１８６】
その再相補的形成の産物を次いで、全てのビオチン化鎖を固定し及び除去するために、過剰な固相ストレプトアビジンで処理する。非限定的な実施形態において、その固相ストレプトアビジンは、磁性ストレプトアビジン結合ビーズまたはストレプトアビジン寒天であって良い。任意の固相ストレプトアビジン基質の結合容量は、ビオチン化オリゴヌクレオチドの総モル数の少なくとも１０倍過剰にある必要がある。
【０１８７】
次いで、相応する正常細胞ライブラリーからのビオチン化オリゴヌクレオチドで相補的形成していない、異常細胞ＣＬＯＳＥライブラリーからのオリゴヌクレオチドによって構成される非結合の非ビオチン化残部から、その固相ストレプトアビジン基質を分離する。磁性ストレプトアビジン結合ビーズを使用する実施形態において、磁性分離剤が、固相ストレプトアビジンの選択を完成させる。ストレプトアビジン寒天を使用する分離の実施形態において、当該固相ストレプトアビジンを、５０００ｇ／１０分の遠心分離によって分離する。
【０１８８】
次いで可溶相物質のサンプルを、当該対象となる異常細胞源からのＣＬＯＳＥライブラリーに特異的なプライマーを使用して、増幅する（図５）。次いでその再増幅で濃縮されたＣＬＯＳＥライブラリーを、その元の正常細胞ＣＬＯＳＥライブラリーに対する比較減法の第二サイクルに供する。次いでその再増幅で濃縮されたＣＬＯＳＥライブラリーを、その元の正常細胞ＣＬＯＳＥライブラリーに対する比較減法の第三サイクルに供する。次いでその再増幅で濃縮されたＣＬＯＳＥライブラリーを、配列解析に供する。
【０１８９】
実施例４：ＲＮＡ選択を介した、対象となる細胞に特異的な配列または構造を同定するための、ＣＬＯＳＥライブラリーの活用（想定事例）
あるいは、異常細胞に限定されたオリゴヌクレオチド対を、正常細胞ＲＮＡ源との交差した相補的形成対（異常細胞自体から誘導された集団内の）の結合を介して、選択して良い。
【０１９０】
本明細書のプロトコルにしたがって取得した増幅ＣＬＯＳＥライブラリーは、対象となる異常細胞から誘導する。
【０１９１】
プライマーＰ１が、５′−デスチオビオチン修飾を持ち、プライマーＰ２が未修飾の場合、ＣＬＯＳＥライブラリーを再増殖する（図６）。そのヘミ−デスチオビオチン化増幅ＣＬＯＳＥライブラリーを、９５℃／１０分で変性し、次いで過剰な固相ストレプトアビジン基質と共に培養する。その固相ストレプトアビジン基質を、トリス緩衝生理食塩水で３回洗浄し、次いでその結合したデスチオビオチン鎖を、５ｍＭの遊離ビオチンで溶出する（図６）。その溶出液を脱塩し、及び過剰な遊離ビオチンを、ゲルサイズ排除クロマトグラフィーで除去する。
【０１９２】
このデスチオビオチン化鎖は、異常ＲＮＡを伴った元の相補的形成から取得した、初期ＣＬＯＳＥライブラリーと同じセンス鎖に相当する。対象となる異常細胞と一致した正常細胞を選ぶ。全ＲＮＡ調合物を、その正常細胞源から単離する。
【０１９３】
遊離デスチオビオチン化鎖を変性し（８０℃／５分）、異常細胞誘導ＲＮＡとの、元のＣＬＯＳＥライブラリーそれ自体の相補的形成の場合と同じ時間で、その細胞ＲＮＡ調合物との相補的形成を可能にする。ＲＮＡ調合物は、その変性ＣＬＯＳＥライブラリーの添加の前に、加熱処理は行わない。ＲＮＡ調合物は、デスチオビオチン化鎖より２倍過剰のモルであり、平均分子量が１５００塩基の細胞ＲＮＡとの推定により計算した。このプロセスを、図７に示す。
【０１９４】
この相補的形成したＲＮＡ−ＣＬＯＳＥライブラリー構成体を、非結合のＣＬＯＳＥライブラリー構成体から、ゲルサイズ排除クロマトグラフィーによって分離する。非結合ＣＬＯＳＥライブラリーのサンプルを、再増幅し、上記に開示したと同じ条件下で加工し、その結果、デスチオビオチン化鎖の増幅された選択集団を得る（図７）。
【０１９５】
遊離デスチオビオチン化鎖を、上記に開示した条件と同じ条件下で、同じ正常ＲＮＡ標的と相補的形成を行う。その相補的形成されたＲＮＡ−ＣＬＯＳＥライブラリー構成体を、非結合のＣＬＯＳＥライブラリー構成体から、ゲルサイズ排除クロマトグラフィーによって分離する。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、その非結合ＣＬＯＳＥライブラリーのサンプルを、正常（非ビオチン化）プライマーと再増幅し、選択された二本鎖の増幅された集団を形成する。いくつかの実施形態において、その非結合ＣＬＯＳＥライブラリーのサンプルを再増幅し、上記に開示した条件と同じ条件下で加工し、その結果、デスチオビオチン化鎖の増幅された二次選択集団を得る。同じ正常細胞ＲＮＡ標的との相補的形成において、非結合のデスチオビオチン化鎖を選択し、次いで正常（非ビオチン化）プライマーと再増幅し、選択された二本鎖の増幅された二次集団を形成する。この増幅された非結合ＣＬＯＳＥライブラリーを、配列解析に供する。
【０１９７】
実施例５：プリンエキシマー蛍光による、ＣＬＯＳＥ誘導配列または構造候補の評価：分子近接の確認及び複製数の定量化、ならびにデカマー成分の最適化（想定事例）
上記に開示した方法（または任意のそれらの組み合わせ）を介して同定されたＣＬＯＳＥ候補、または個別に誘導された部位の任意の候補対は、高いレベルのテンプレート化アセンブリを進める、最大の潜在性を有する有する特定候補に焦点を当てることが可能な方法で、それらの活性及び有効性を確認する必要がある。分子近接の単独測定法は、ピレン分子間のエキシマー蛍光の誘出である。
【０１９８】
上記開示の方法を適用（またはそれらの任意の組み合わせ）する場合、ＣＬＯＳＥ対候補の各デカマー成分は、相補的形成が可能であると同定された細胞テンプレートを有するであろう。このＣＬＯＳＥ技術の適用を介して同定された既知のテンプレートに基づいて、そのデカマー対のいずれかまたは両方を伸長することは、少なくとも小集団の場合においては有用であり、デカマー対が相補的形成の標的とするテンプレートの相補的配列によって決定される。伸長は、加熱による二本鎖の安定化を介して、細胞内テンプレート化を助ける。そのように伸長され最適化された候補をもまた、評価する。
【０１９９】
ＣＬＯＳＥ対を共に構成する、個別のデカマー配列を、別々に再合成し、及びピレン基で標識化する（図８Ａ及び８Ｂ）。ピレン標識化は、末端チオール基を合成したＤＮＡ（各場合において適切な、還元ジスルフィドとしての、５′−または３′−末端で）に組み入れることによって有効になり、その後ピレンマレイミドを伴うＳＨ基と反応する。
【０２００】
そのピレン基は、非限定的に、ピレン−４−マレイミドを含む、ピレン及びマレイミドモイエティー間のスペーサーアームを伴うピレンマレイミドによって、互換的に添加され得る。ピレン付加の部位は、元来使用されたＣＬＯＳＥ法の種類に基づく。上記方法のいくつかで同定されたＣＬＯＳＥ対に対して、その最初のアジド及びアルキン修飾の各々で使用したのと同じ５′−及び３′−末端に、ピレン修飾を加える（図１Ａ〜１Ｄ）。上記方法のいくつかで同定されたＣＬＯＳＥ対は、そのデカマー経路間に隣接配列を含むので、これら種類の対を、その厳密に初期の配列、またはその初期の隣接配列の無いデカマー経路に結合されたピレン基で評価する。
【０２０１】
ピレン修飾のＣＬＯＳＥデカマーを、相補的なＤＮＡテンプレートへの、生体外での相補的形成時の蛍光の変化によって評価する（図８Ａ及び８Ｂ）。エキシマーとモノマー（ｅ／ｍ）発光スペクトル間の比率を、変化させた配列不一致の度合いを伴う対照テンプレート配列を使用して、蛍光分光計で測定する。励起波長は、３３５ｎｍ、モノマーピーク発光波長は、３７５〜４１０ｎｍ、エキシマー発光のピークは  、４８０ｎｍである。
【０２０２】
細胞内選別に対応して、ヌクレアーゼ耐性ホスホジエステル骨格または糖モイエティーを有するＣＬＯＳＥデカマーの類似体上で、ピレン修飾を実行する。これには、非限定的に、２′−Ｏ−メチル−ヌクレオチド及びホスホチオエート・ヌクレオチドを含む。
【０２０３】
ヌクレアーゼ修飾及びピレン標識化ＣＬＯＳＥデカマーを、対象となる標的異常細胞、及び正確な標的テンプレートを欠いた、一致した正常の対応部分の対照細胞にも、形質転換する。エキシマー形成に対応する蛍光を、蛍光顕微鏡検査法によって評価し、及び蛍光分光分析によって定量化する。
【０２０４】
陽性のエキシマーシグナルが、そのＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド対の空間的近接を裏付け、それらの相対シグナル強度によって、相対的な転写産物レベルを与える。近接性及びその結果としてテンプレート複製数の両者の組み合わせとしてのシグナル強度は、エフェクター部分構造を備えている異なるＣＬＯＳＥデカマー間の、相対的潜在テンプレート化アセンブリーレベルに対する測定基準を与える。
【０２０５】
実施例６：ＱＰＣＲ増幅による、ＣＬＯＳＥ誘導配列または構造候補の評価：分子近接の確認、及び複製数の定量化、ならびにデカマー構成の最適化（想定事例）
個別に誘導された部位のＣＬＯＳＥ候補または任意の候補対を、それらの有効性に対して確認でき、クリック連結反応及びＱＰＣＲによって、それらの標的テンプレートの相対存在量が評価できる。さらに、上記に開示したアプローチと同じアプローチを、各候補対の最適化に適用できる。デカマー対を、ＣＬＯＳＥライブラリーから取得した場合、既知の標的テンプレート配列に基づく伸長もまた、同じ方法で評価できる。
【０２０６】
個別の特定ＣＬＯＳＥ候補を、互換的な一組のプライマー部位（図１Ａ〜１Ｄに示す、Ｐ１及びＰ２）で、再合成する。多重化を開始するいくつかの実施形態において、最高５つまでの個別の候補ＣＬＯＳＥデカマーのオリゴヌクレオチド対を、各々に対して、異なるプライマー部位で再合成する（Ｐ１．１／Ｐ２．１、Ｐ１．１／Ｐ２．２、Ｐ１．３／Ｐ２．３、Ｐ１．４／Ｐ２．４、及びＰ１．５／Ｐ２．５）。
【０２０７】
個別ＣＬＯＳＥ候補の各対を、ＲＮＡ調合物またはＲＮＡ及びリボヌクレオタンパク質を含む細胞質溶解液、及び相補的形成後に除去された過剰オリゴヌクレオチドと、別々に培養する。各調合物を、ＲＮａｓｅから保護する条件下で、Ｃｕ（Ｉ）触媒を伴ったクリック化学連結反応に供し、次いで脱塩する。Ｃｕ（Ｉ）クリック介在連結反応及び脱塩後、調合物を、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅ１ｆ、及びＲＮａｓｅＩＩＩで処理する。
【０２０８】
次いで調合物サンプルを、図９に示し、及びＫｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００６，４，７７９−７９２によって記述されるように、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）に供する。ＱＰＣＲプローブは、１５〜２０塩基の鎖長で、及びプライマーＰ１領域の一部分、１つのデカマーの全て、全てのＣＬＯＳＥクローンと相補的な架橋ＣＴジヌクレオチド、及び第二デカマーの最大５塩基までと相補性である。（図９、Ｓ２）特定プローブ長は、選択されたデカマー領域（またプローブ特異性を与える）の塩基成分によって決定し、そのためそのプローブの標的二本鎖のＴｍは、標準的な塩の条件下で、少なくとも６２℃である。各プローブは、５′−蛍光色素及び３′−クエンチヤーを備え、そのため標準的なＴａｑＭａｎ化学によって定量化できる。
【０２０９】
結合された５′−蛍光色素は、非限定的に、ＦＡＭ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、Ｃｙ５（商標）、Ｃｙ３（商標）、ＨＥＸ（商標）、ＪＯＥ（商標）、またはＲＯＸ（商標）であって良い。結合された３′−クエンチャーは、非限定的に、ＢＨＱ１（商標）、ＢＨＱ２（商標）、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）−ＦＱ、またはＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＲＱであって良い。ＱＰＣＲ読み出し（閾値サイクル数）を、ハウスキーピング遺伝子（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）の複合パネル、または任意の小集団もしくはそれらの組み合わせからの、相応するシグナルに対して正規化する。相対的に正規化されたＱＰＣＲ値を、各候補プライマーに対して取得し、ここで値は、近接促進のクリック化学連結反応を可能にする、元のテンプレート複製数に対して比例する。
【０２１０】
最初に相補的形成を成した特定候補ＣＬＯＳＥ対は、多重化を設定する。多重化実験において、特定ＣＬＯＳＥデカマーの最大で５つまでの個別対を、上記のＲＮＡまたは全細胞溶解液の標的と相補的形成を行うために、同時に添加する。
【０２１１】
その多重化調合物を、上記のように処理する。化学連結反応の特定ＣＬＯＳＥ対の多重化された一組を、単一決定におけるＱＰＣＲに対して使用し、ここで各ＣＬＯＳＥ対それ自体を、各場合における特定デカマー領域に対応した個別プローブによって、連結反応対に特異的なプローブクエンチャーの組み合わせの使用によって、定める。多重化決定内での各個別標的の相対レベルを、各場合における特定蛍光マーカーから導き、正常なハウスキーピング遺伝子の対照サンプルの相応するレベルに関連させる。
【０２１２】
実施例７：デジタル増幅によるＣＬＯＳＥ誘導候補または構造の評価：分子的近接及び複製数の定量化、及びデカマー構成の最適化（想定事例）
独立して誘導された部位のＣＬＯＳＥ候補または任意の候補対を、それらの効力に対して確認でき、クリック連結反応及びデジタルＰＣＲによって、それらの標的テンプレートの絶対存在量に対して評価できる。前述のように、テンプレート漸増の可能性による標的転写発現レベルを測定することが望ましい。さらに、本明細書の記述と同じアプローチを、各候補対の最適化に適用できる。デカマー対を、ＣＬＯＳＥライブラリーから取得した場合には、既知の標的テンプレート配列（本明細書に記述のように）に基づく伸長もまた、同じ方法で評価できる。
【０２１３】
個別の特定ＣＬＯＳＥ候補を、互換的な一組のプライマー部位（図１Ａ〜１Ｄに示す、Ｐ１及びＰ２）を伴って、再合成する。いくつかの実施形態において、多重化を開始する場合、最高５つまでの個別の候補ＣＬＯＳＥデカマーのオリゴヌクレオチド対を、各々に対して、異なるプライマー部位で再合成する（Ｐ１．１／Ｐ２．１、Ｐ１．１／Ｐ２．２、Ｐ１．３／Ｐ２．３、Ｐ１．４／Ｐ２．４、及びＰ１．５／Ｐ２．５）。
【０２１４】
各調合物を、ＲＮａｓｅから保護する条件下で、Ｃｕ（Ｉ）触媒を伴ったクリック化学連結反応に供し、脱塩し、及びＲＮａｓｅで処理する。次いで、各々の特定場合で別々に誘導された調合物のサンプルを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、１．５ｍＭの塩化マグネシウム含む標準ＰＣＲ緩衝液、同種プライマー、及び各標的化された対のデカマーの蛍光定量化に対応した、特定二重標識化プローブを伴う、デジタルＰＣＲに対応した異なるコンパートメントに、分子的に分配する（図１０）。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、デジタルＰＣＲに対応したコンパートメントの分子的コンパートメント化を、微小コンパートメントによって達成し、非限定的に、各々Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ａｎｄ  ＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からのＱＸ１００及びＲａｉｎＤｒｏｐ  ｓｙｓｔｅｍｓ社によって市販されているものを含む、商業的に入手可能な技術の適用を介して有効にする。いくつかの実施形態において、デジタルＰＣＲに対応したコンパートメントの分子的コンパートメント化を、マイクロ流体チャンバーによって達成し、非限定的に、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（ＢｉｏＭａｒｋ  ｓｙｓｔｅｍ社）として市販されているものを含む、商業的に入手可能な技術の適用を介して有効にする。
【０２１６】
コンパートメント化された標的、プライマー、プローブ、及びその他の増幅成分の各調合物を、加熱増幅に供し、そのため特定の蛍光シグナルが、標的の増幅が起こった場所で発生し、シグナルは、活性コンパートメントのデジタル測定値、及び次にそれらが含まれる個別の標的分子の定量化を与える。コンパートメント加工、蛍光測定及びそれに続く標的数の網羅を、製造者の仕様及び指示に従って実施する。
【０２１７】
最初に相補的形成をした特定ＣＬＯＳＥ対は、多重化を設定する。多重化実験において、特定ＣＬＯＳＥデカマーの最大で５つまでの個別対を、上記のＲＮＡまたは全細胞溶解液の標的と相補的形成を行うために、同時に添加する。相補的形成を行うサンプルの加工、及びＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの増幅を、前述のように実行する。
【０２１８】
ＣＬＯＳＥデカマーの多重化された化学連結反応対を含む、組み合わされたサンプル（相補的形成によって選択された）を、デジタルＰＣＲ増幅及び解析によって各特定標的を決定するために、個別アッセイに分割する。個別標的を、固有のプライマーの組み合わせ及び固有の蛍光プローブ標識によって、同定する。
【０２１９】
その相補的形成レベルにおいては、多重化を実施するが、デジタルＰＣＲ解析は、１プレックスのレベルで行う。
【０２２０】
ＣＬＯＳＥデカマーの多重化された化学連結反応対を含む、組み合わされたサンプル（相補的形成によって選択された）を、多重化されたデジタルＰＣＲによって解析し、ここでは前述のように特定された成分に加えて、各特定プライマー対（各ＣＬＯＳＥ標的に対して定められた）、及び各蛍光標識化プローブもまた、存在する。
【０２２１】
各デジタルコンパートメントは、複数のプライマー及びプローブを含むが、各コンパートメント内での特異性は、プライマーとプローブ間での配列一致、及び各場合に存在する単一のＣＬＯＳＥ化学連結反応標的分子によって生み出される。
【０２２２】
このデジタルＰＣＲ増幅及び解析は、前述のように特異的であり、前述のように特異的な器具に対する製造者の仕様及び指示書に従って、それらの個別の発光波長の効力によって区別できるなどの、複数蛍光シグナルを同時解析するさらなる特徴を伴っている。
【０２２３】
多重化を、相補的形成レベル、及びデジタルＰＣＲ解析のレベルの両方において実施する。
【０２２４】
実施例８：非相補的形成ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの除去のためのＤＮａｓｅ処理、及びクローン化ならびに配列解析のフォローアップ（実例）
アジド及びアルキン修飾のＣＬＯＳＥライブラリーを、細胞ＲＮＡ標的（ＭＵ８９）と、３２℃で１６時間をかけ、相補的形成をさせた。２００ｐｍｏｌで２０μｌの各ＣＬＯＳＥライブラリー（事前に、それらのプライミング部位領域に対して、２′−Ｏ−Ｍｅ相補性オリゴヌクレオチドでアニール処理した）を、２０μｇのＭＵ８９ＲＮＡまたは非テンプレート対照サンプルを共に培養した。全成分を、予備加熱ステップの無い培養に先立って、混合した。
【０２２５】
その相補的形成後に、各サンプルを、２８℃で４時間の＋／−ＤＮａｓｅ処理を行い、その後フェノール伸長、脱塩（ｐＨ７．４の１０ｍＭのトリス緩衝液中の、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐ６  Ｓｐｉｎカラム）、及び沈殿を実施した。ペレット化、洗浄、及び乾燥の後、各サンプルを、標準的なＴＨＰＴＡクリック反応に供した。
【０２２６】
簡単に説明すると、０．１５５ＭのＮａＣｌ中に、２０μｌで７０ｍＭのトリス（３ヒドロキシルプロピルトリアゾリル・メチル）  アミン（ＴＨＰＴＡ）、０．１５５ＭのＮａＣｌ中に、４μｌで５００ｍＭのＮａ−アスコルビン酸塩、０．１５５ＭのＮａＣｌ中に、２μｌで１００ｍＭのＣｕＳＯ４を順に添加した予備混合物を用意し、この予備混合物の２．６μｌを、クリック反応のための各々のチューブに添加し、このようにして、その最終容積を、１倍のリン酸緩衝生理食塩水中に５０μｌにした。チューブを、３０分／０℃（氷上）、及び次いで２時間／２５℃の培養を行った。その培養時間の最後で、チューブ内容物を、前述のＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐ６カラムを通して脱塩し、各々の０．５μｌ（１／１００）を、そのＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドのプライミング部位と一致しているプライマーと共に、ＰＣＲ増幅に供した。そのＰＣＲサイクルは、６０℃の最終温度、及びその最終タッチダウン温度で２２サイクルを伴う、タッチダウン増幅戦略を使用した。
【０２２７】
産物を、１５％のアクリルアミドゲル上で解析した（図１１、レーン１：ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド＋ＲＮＡテンプレート＋ＤＮａｓｅ、レーン２：ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド＋ＤＮａｓｅ無しのＲＮＡテンプレート、レーン３：テンプレート無しのＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド＋ＤＮａｓｅ、レーン４：テンプレート無し及びＤＮａｓｅ無しのＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド）。結果は、テンプレートの存在に関係なく（レーン２及び４）、持ち越されたＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの存在を示したが、ＲＮＡテンプレートが存在する場合だけは、ＤＮａｓｅ処理後に観察されたバンドであった（レーン１対レーン３）。化学連結されたＣＬＯＳＥダイマーに対して期待された大きさに相当するレーン１（増幅させたＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド＋ＲＮＡテンプレート＋ＤＮａｓｅ）のバンドを取り出し、及び利用可能な収率を増加させるために、元のプライマーで再増幅した。
【０２２８】
産物を、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）でクローン化し、個別のプラスミドクローンを、そのクローン化断片の挿入点の上流及び下流にプライマーと共に配列した。配列を、ＢＬＡＳＴ検索を介して、ヒトのトランスクリプトームと比較した。解析した３１クローンの内、各モノマーＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの２つのデカマー不規則領域に相当する領域内の≧１６／２０塩基が、特定細胞ＲＮＡとの一致を示した。
【０２２９】
元のＭＵ８９黒色腫細胞源における候補細胞ＲＮＡの発現を、各候補ＲＮＡ標的に特異的なプライマーを伴ったＰＣＲで試験した。ＲＮＡである、ＮＯＬ９、ＯＴＵＢ１（転写変異体２）、ＢＲＣＡ２、ＭＡＰＫＡＰＫ２、及びＡＬＰＫ１（転写変異体１及び２）が、ＭＵ８９において発現し、さらなるＣＬＯＳＥ解析に対する初期候補として浮上した。
ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド：
１）ＴＲＴ−ＡＫ：ＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＡＡＣＣＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＭｅ−プロパルギル（ＳＥＱ  ＩＤ番号４５）、
２）ＡＺＣ−ＴＲＴ−ｎ２：アジド−ｄＴ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＧＴＧＡＴＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＡ−ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ番号４６）。
連結反応したＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの増幅に対応するプライマー：
１）Ｔｒｚ．Ｆ：ＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＡＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ番号４７）、
２）Ｔｒｚ．Ｒ−ｎ２：ＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ
番号４８）。
２′−Ｏ−メチル骨格を伴うプロテクター・オリゴヌクレオチド：
１）ＴｒｚＦｃｏ−２ＯＭ：ＵＧＧＧＵＵＡＵＧＧＡＧＧＵＧＧＡＧＡＵＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号４９）、
２）ＴｒｚＲ−ｎ２−２ＯＭ：ＵＡＣＣＡＣＣＵＣＣＡＣＣＵＡＵＣＡＣＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ番号５０）。
【０２３０】
実施例９：逐次ＰＥＧ沈殿による、非相補的形成ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの除去のためのプロトコル（実例）
２ＭのＮａＣｌの存在下において、３．２％ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ）が、ほとんど全ての非相補的形成ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの除去に有用であった。簡単に説明すると、黒色腫細胞株ＭＵ８９  ＲＮＡ（９．０μｇ、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ簡易プロトコルによって調合される）を、２′−Ｏ−Ｍｅプライマー部位保護鎖（図８参照）の等量モルで予備アニール処理された、２００ｐｍｏｌのＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド（各オリゴヌクレオチドＴＲＴ−ＡＫ及びＡＺ−ＴＲＴ−ｎ２の２００ｐｍｏｌ（図８参照））、または２００ｐｍｏｌのいかなる予備アニール処理された保護鎖をも持たない同じＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドと、混合した。各調合物（５０μｌの最終容積）を、ｐＨ８．３の５０ｍＭトリス緩衝液、２．５ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌ、４０単位のマウスＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で構成し、４０％ＰＥＧストックから、その最終構成が３．２％ＰＥＧ添加（４μｌ）になるようにした。氷上で３０分後、微小遠心管において、チューブを１０分間／最大速度（≧１４ｋ  ｒｐｍ）で遠心分離した。得られた上清を、注意深く除去し、及び保持し、ならびにペレットを、同じ緩衝液、塩、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びＰＥＧ濃度を含む新鮮な溶液（５０μｌ）に再溶解した。氷上でさらに３０分後、チューブを前述のように遠心分離し、上清を除去及び保持し、ならびに最終ペレットを、５０μｌのＴＥに再溶解した。
【０２３１】
その最終ペレット及び第一ならびに第二上清（５μｌ、各々の１／１０）のサンプルを、２％寒天ゲル上で試験した（図１２）。結果は、（非相補的形成の）オリゴヌクレオチドの大多数が、そのＭＵ８９ＲＮＡから分離され、及び第一上清中に見出されたことを示した。
【０２３２】
実施例１０：単一ＰＥＧ沈殿及びＤＮａｓｅＩ処理による、非相補的形成ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの除去のためのプロトコル（実例）
ＣＬＯＳＥ加工の他の実施形態において、単一ＰＥＧ沈殿及びＤＮａｓｅＩ処理の組み合わせが、非相補的形成ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの大部分の除去に効果的であった。このプロトコルに対して、当該ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドのプライミング部位を、相補性２′−Ｏ−メチル鎖（実施例８に示すように）との相補的形成によるＤＮａｓｅＩ攻撃から守ることが、最も重要である。標的細胞ＲＮＡ（実施例１で詳細に実施したが、３０℃での実施が最も一般的である）との相補的形成体を、実施例９と同じ塩及び緩衝条件で、３．２％ＰＥＧでの沈殿に供した。これに続いて、実施例８と同じ条件で、クリック反応を実施し（常に、クリック試薬無しで同じように処理した平行対照サンプルを伴って）、次いで脱塩した。次いで、２８℃の１倍ＲＱ  ＤＮａｓｅＩ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中に４時間で、ＤＮａｓｅ処理を実施した。次いで、ＰＣＲ解析（実施例８に示す）に先立って、サンプルをフェノール抽出し、２０μｇのグリコーゲン／０．３Ｍの酢酸ナトリウム／３倍容積のエタノールで沈殿させ、ペレット化し、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、及び２５μｌのＴＥ緩衝液中で、再構成した。そのＤＮａｓｅＩ処理の終了まで、全ての処理を、０．６単位／ｍｌのマウスのリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下で実施した。このプロセスの全体を、図１３に略図で示す。得られた結果を、図１１と比較した結果、当該ＰＥＧ／ＤＮａｓｅ処理の組み合わせが、非相補的形成ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの除去に有効であった。
【０２３３】
実施例１１：不連続ＣＬＯＳＥ部位の異形態の定義及び解析（実例）
当該ＣＬＯＳＥプロセスの適用には、最初の標的ＲＮＡ配列に関して、それらが不連続である場合、特異的な潜在部位を特別に定める必要がある。Ｌ−及びＲ−ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド（図１）は、連続した相補的形成部位、または標的配列において不連続であるが、近接した空間にある部位のいずれかからの、介在ＣＴ配列を有する、２２−ｍｅｒを形成する（図１４）。後者に関しては、テンプレートに沿った、相補的形成のＬ−及びＲ−ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの位置は、空間的近接部位をもたらすことができる二次構造類が重要である。ここで、ＣＬＯＳＥ  Ｌ−及びＲ−オリゴヌクレオチドが、互いに向き合った（連続した部位にとっては、普通の方向性）エフェクター３′及び５′末端を有する配置を、「Ｅｎｄｏ」構成と呼び、反対の方向性（エフェクター３′及び５′末端が、互いに離れた向き）を、「Ｅｘｏ」構成と呼ぶ（図１４）。多数の場合において、Ｅｘｏ構成は、官能性エフェクター基が、互いに向き合ってはいないので、反応性を促進させることができないであろう。しかしながら、特定の二次構造の状況下にある標的部位の位置は、Ｅｎｄｏ構成よりＥｘｏ構成が有利に働く可能性がある。これは、相補的形成部位が、適切な大きさの標的テンプレートのループ内に存在する（図１５）場合であり、そこでは、ＥｘｏよりむしろＥｎｄｏの方向性が、空間的に離れている。これを、自己相補性の内部領域を介したループ構造をとるように設計された、エフェクター部分（アルキン及びアジドクリック基を有する単鎖オリゴヌクレオチド）及び長鎖オリゴヌクレオチドのモデルで最初に試験した。その結果形成されたループ構造内に、これらのオリゴヌクレオチドは、Ｅｘｏ（「ループ−Ｅｘｏ１」）またはＥｎｄｏ（「ループ−Ｅｎｄｏ１」）構成のいずれかに配置された、クリック・オリゴヌクレオチドに対する相補性部位を有していた。クリック・オリゴヌクレオチド（５′−アジド及び３′−直鎖状アルキン標識化鎖の各々に対して５０ｐｍｏｌ）及びループテンプレート（５０ｐｍｏｌ）を、２５μｌで１Ｍの緩衝液（ｐＨ７．５で１０ｍＭのトリス緩衝液、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオエリトリトール）中で、８０℃で２分間加熱し、室温まで冷却することによって、最初にアニール処理した。
【０２３４】
各アニール化物（２０ｐｍｏｌ）からの十個の（合計１０）μｌを、ＴＨＰＴＡを伴うＣｕ（Ｉ）クリック触媒下に、またはクリック触媒の無い同量の緩衝液中に置いた。０．１５５ＭのＮａＣｌ中に、２０μｌで７０ｍＭのトリス（３ヒドロキシルプロピルトリアゾリル・メチル）  アミン（ＴＨＰＴＡ）、０．１５５ＭのＮａＣｌ中に、４μｌで５００ｍＭのＮａ−アスコルビン酸塩、及び０．１５５ＭのＮａＣｌ中に、２μｌで１００ｍＭのＣｕＳＯ４を順に添加した予備混合物を用意した。次いで、この予備混合物の２．６μｌを、クリック反応のための各々のチューブに添加し、このようにして、その最終容積を、１倍のリン酸緩衝生理食塩水中に５０μｌにした。
【０２３５】
チューブを、３０分／０℃（氷上）、次いで２５℃で２時間の培養を行った。培養期間の最後で、チューブを、前述のＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐ６カラムを通して脱塩し、２０μｇのグリコーゲン（Ｓｉｇｍａ社）で沈殿させた。遠心分離後、ペレットを、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、及び５μｌのＴＥ中に再溶解した。各（１μｌ）サンプルを、１５％の尿素変性ゲル上で試験を行い、ＳＹＢＲ−ゴールドで染色した。結果は、その直鎖状テンプレート上でのテンプレート化から、期待通りのクリック連結反応産物が発生したことを示した（図１６、レーン２、そのクリック反応の無い対照サンプルのレーン１との比較で）。対応するクリックバンドは、元の予測を支持して、そのループ−Ｅｘｏ１（図１６、レーン４）に見出されたが、そのループ−Ｅｎｄｏ１（図１６、レーン６）にはごくわずかに見出された。追加実験は、その自己相補性領域が、自己相互作用配列に最小限で置き換わった場所での対照サンプルのオリゴヌクレオチドによって、当該Ｅｘｏ構成のクリック活性は、そのループ二次構造に依存していたことを示した。アニーリングに続いて、クリック反応を、上記と同じ方法で実施し、ゲルの結果は、自己相補性ループを伴ったＥｘｏ構成からのクリック産物のバンド（レーン４、図１７）を示し、その自己相補性が除去された場合には産生しない（レーン６、図１７）ことを示した。図１７におけるループオリゴヌクレオチド（ループ−Ｅｘｏ２）は、その自己相補性領域と比べた、クリック相補部位の位置決めの点で、図１６で使用したもの（ループ−Ｅｘｏ１）とは異なっており、ループ−Ｅｘｏ１を伴う、そのクリック相補性部位は、その自己相補性領域から１塩基であり、ループ−Ｅｘｏ２を伴うそれは、５塩基に増加していた。にもかかわらず、Ｅｘｏ−クリック活性は、依然として観察された。
図１６に対応したオリゴヌクレオチド配列：
【化１６】
2018500892.tif 000017
Ｅｘｏ構成における、クリック・オリゴヌクレオチド１及び２に対応する、相補性部位を有するループ形成テンプレート（「ループ−Ｅｘｏ１」、６２−ｍｅｒ）：
【化１７】
2018500892.tif 000018
Ｅｎｄｏ構成における、クリック・オリゴヌクレオチド１及び２に対応する、相補性部位を有するループ形成テンプレート（「ループ−Ｅｎｄｏ１」、６２−ｍｅｒ）：
【化１８】
2018500892.tif 000019
図１７に対応するオリゴヌクレオチド配列：
５′−アジド及び３′−アルキンオリゴ、及び直鎖状テンプレート：図１６に示す。
Ｅｘｏ構成における、クリック・オリゴヌクレオチド１及び２に対応する、相補性部位を有するループ形成テンプレート（「ループ−Ｅｘｏ２」、６０−ｍｅｒ）：
【化１９】
2018500892.tif 000020
自己相補性領域の無い、ループ−Ｅｘｏ２に対応する対照オリゴヌクレオチド（「Ｃｔｒｌ−Ｅｘｏ２、６０−ｍｅｒ」）：
【化２０】
2018500892.tif 000021
【０２３６】
下線の配列は、自己相補性が、ループ形成を可能にするＧＣ領域を示す。太文字の配列は、上記のクリック・オリゴヌクレオチド１及び２と相補性である部位を示す。
【化２１】
2018500892.tif 000022
【０２３７】
実施例１２：ステムループを介した、空間的近接であるが不連続の相補的形成部位を伴う生体外クリック反応（実例）
クリック標識化されたオリゴヌクレオチド（モデルエフェクター部分）と相補性部位が、その標的テンプレートにおけるステムループの形成を介して、空間的近接の状態にあり、そのためその相補的形成部位が、そのループの外側にある場合の、追加試験を実施した。生体外クリック反応に対応するテンプレート配列を、ステムループ構造が、その様な構造を持たない適切な対照配列と共に室温で形成されて、そこでは、そのクリック・オリゴヌクレオチドは、Ｅｎｄｏ構成で相補的形成を行うように設計した（図１８）。
【０２３８】
クリック・オリゴヌクレオチド（５′−アジド及び３′−直鎖状アルキン標識化鎖の各々に対して５０ｐｍｏｌ）及び多様なテンプレート（５０ｐｍｏｌ）を、２５μｌで１Ｍの緩衝液（ｐＨ７．５で１０ｍＭのトリス緩衝液、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオエリトリトール）中で、８０℃で２分間加熱し、及び室温まで冷却することによって、最初にアニール処理した。
【０２３９】
各アニール化物（２０ｐｍｏｌ）からの十個の（合計１０）μｌを、ＴＨＰＴＡを伴うＣｕ（Ｉ）クリック触媒下に、またはクリック触媒の無い同量の緩衝液中に置いた。次いで、実施例１１と同じ方法で、クリック反応を実施した。各（１μｌ）サンプルを、１５％の尿素変性ゲル上で試験を行い、ＳＹＢＲ−ゴールドで染色した（図１９）。
【０２４０】
化学修飾したオリゴヌクレオチドを、ＴｒｉＬｉｎｋ社（５′−アジドオリゴ）またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ウィスコンシン大学バイテクノロジー実験室）（３′−アルキンオリゴ）によって調合した。
図１９に対応したオリゴヌクレオチド配列：
【化２２】
2018500892.tif 000023
【０２４１】
下線の配列は、自己相補性が、ステムループ形成を可能にする領域を示す。太文字の配列は、上記のクリック・オリゴヌクレオチド１及び２と相補性である部位を示す。
【化２３】
2018500892.tif 000024
【０２４２】
実施例１３：特定のテンプレート指向相補的形成により産生される、ピレンエキシマー活性（実例）
ピレンエキシマー蛍光を、標的テンプレート上のＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドの分子的近接を証明するために利用でき、したがって候補標的の検証手段としての役割を果たす。ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）ＲＮＡテンプレートのＤＮＡ複製上のピレン標識化オリゴヌクレオチドの特異性を証明するために、次のプロトコルを使用した。
２′Ｏ−メチル骨格を有するピレンオリゴヌクレオチド：
ＰｙｅＴＯ．１：５′−ピレン−（Ｃ６）−ＵＵＵＣＵＵＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号６４）、
ＰｙｅＴＯ．２：ＵＣＣＡＧＡＵＧＵＣＵＵＵＧＣ−（Ｃ６）−ピレン−３′（ＳＥＱ  ＩＤ番号６５）。
【０２４３】
１００μｌの１倍「Ｐ−ｂｕｆｆｅｒ（Ｐ緩衝液）」（１０倍濃縮ストックの１０μｌとして使用：ｐＨ７．４で２００ｍＭのトリス緩衝液、２５０ｍＭのＮａＣｌ、及び５０ｍＭのＭｇＣｌ２）中で、１ｎｍｏｌのＨＰＶテンプレート（１０μｌ）及びＰｙｅＴＯ．１／ＰｙｅＴＯ．２（各２μｌ）の各々１ｎｍｏｌを混合し、最終的に１００μｌに仕上げた。チューブを、ＰｙｅＴＯ．１／ＰｙｅＴＯ．２オリゴヌクレオチドと、ＨＰＶ−０、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−２、ＨＰＶ−３、ＨＰＶ−Ｓｃｒ（不規則的に  混ざりあったＨＰＶテンプレート）のテンプレート（図２０）との１００μｌ混合物、及びテンプレート無しで、調合した。図２１は、野生型及び変異ＨＰＶテンプレートでアニール処理された、ＰｙｅＴＯ．１及びＰｙｅＴＯ．２を示す。
【０２４４】
各々を、８０℃で２分間加熱し、室温での冷却を可能にした。チューブを、短時間遠心分離し、その内容物を、黒色の９６ウェル・プレートに、１対２の希釈（各ウェルの最終量は５０μｌ）で、添加した。蛍光測定及びＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社の９６ウェルの黒色サイドのプレートに対応したＴｅｃａｎ社の分光光度計セットで読み出しを行った（読み出しは、装置に最適化した蛍光設定を伴った、３３５ｎｍ励起／４８０ｎｍ発光の組み合わせであった）。
【０２４５】
エキシマーに基づく励起及び発光波長に対応した蛍光を観察し、及び特定テンプレートにのみ対応していた（混合及びテンプレートの無い対照サンプルにおいては、シグナルが無かった）。全てのＨＰＶテンプレートが、エキシマー蛍光を励起したが、最良の結果は、５′と３′−標識化オリゴヌクレオチド間で２塩基を伴うものであった。図２１を参照のこと。
【０２４６】
実施例１４：ＣＬＯＳＥ  Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＣＬＯＳＥ横断解析ソフトウェア）による、ＣＬＯＳＥ候補の解析（実例）
ＣＬＯＳＥクローンの同定を促進するために、フリーのオンラインソフトウェアＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）と連携して機能し、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国・国立生物工学情報センター）を介して利用可能になるソフトウェアを、開発した（「ＣＬＯＳＥ  ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＬＯＳＥ横断解析）」）。この新規ソフトウェアは、ＢＬＡＳＴ単独では、十分に適合しない、単一テンプレート上でヒットする、不連続ＣＬＯＳＥの同定に特に必要であった。この基本戦略には、ヒトＲＮＡ−ＳｅｑデータベースのＢＬＡＳＴ検索の目的に対応して、配列化されたＬ−及びＲ−１１−ｍｅｒのＣＬＯＳＥダイマーの個別処理を含んでいる（これは、ＲＮＡテンプレート指向化学連結反応に先立って、Ｌ−及びＲ−ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチド各々の相補的形成の実際状況に匹敵している）。ヒト転写配列間の任意の１１−ｍｅｒ配列を検索する場合、かなりの数の不規則完全一致が期待され（不規則１１−ｍｅｒは、平均で４．１０６塩基ごとに見出されるであろう）、及び仮にその厳密さが、完全一致より少なければ、より多数の結果がもたらされることは、明白である（実際には、ＣＬＯＳＥ連結反応は、オリゴヌクレオチドごとに多数の不完全一致を含むであろう）。これらの第一配列は、最大２０，０００ヒットを提供する設定であり、試験ヒットでは、８／１１以上の一致を含んでいる。次いでこれらの個別ヒット一覧（ＸＭＬファイルとして）を、通常のＲＮＡ−Ｓｅｑのファイル登録に対応してスキャンし、したがって、それらヒットの横断が、特定のＬ−及びＲ−ＣＬＯＳＥクローン配列に対して一致するファイルを見出す。これに続き、このプログラムは、ヒット構造に基づいて選別を実施する。「ｐｌｕｓ／ｍｉｎｕｓ（プラス／マイマス）」ヒットだけが、この状況に関連しており、したがって、その他の全てを排除する（標的ＲＮＡにおける相補性の相補的形成配列が求められるので、当該インプットＣＬＯＳＥ配列は、デフォルトでは「ｐｌｕｓ（プラス）」方向にあり、「ｍｉｎｕｓ（マイナス）」方向のヒットが要求される）。次いで、Ｌ−及びＲ−検索（完全一致に対しては最大２２）の組み合わせに対する一致スコアー、及びさらに「Ｎ  ｖａｌｕｅｓ（Ｎ値）」に基づく２つのレベルで、ヒットのランク付けを実施する。ここでＮ＝当該標的の５′末端に最も近いＣＬＯＳＥ一致配列の５′末端と、当該標的の５′末端に最も遠いＣＬＯＳＥ一致配列の３′末端との間の距離。一方ＲＮＡの折り畳み原理は、一次配列の点では、非常に遠い位置にある部位を近接に持ち込むので、低いＮ値（近接により近い）が、より頻繁であって良い理由であった（完全連続部位は、Ｎ＝０）。代表的なソフトウェアを、フローチャートとして、図２２に描写し、及びまた図２３で説明する。
【０２４７】
ＣＬＯＳＥソフトウェアの横断ファイルヒットの例を、さらに調べた。ＭＵ８９黒色腫細胞ＲＮＡから取得した、増幅したＣＬＯＳＥダイマーライブラリーからの、１つの候補は、ＰＬＸＮＡ３遺伝子からの転写産物であった。この場合、そのＣＬＯＳＥＬ−及びＲ−部位は、Ｅｘｏ構成であり、及びそのＮ値は、たった２４塩基であった。さらに検討するために、同じＰＬＸＮＡ３配列（一本鎖ＤＮＡとして）を、ＰＬＸＮＡ３内のＣＬＯＳＥ部位を、実施例１１及び１２で使用したものと同様に修飾されたクリック・オリゴヌクレオチド１０−ｍｅｒでの置換を除いて、生体外テンプレートのモデルとして試験した。これらを、Ｅｘｏ及びＥｎｄｏ構成で、ＰＬＸＮＡ３から誘導された隣接配列に配置した。そのようなテンプレートを、１０−ｍｅｒのクリック・オリゴヌクレオチドでアニール処理し、及び次いで実施例１のように、クリック触媒の作用試薬を伴って、及びその試薬を伴わずに処理した（図２４）。結果は、クリック反応が、いずれの方向性においても起きたことを示した。したがって、Ｅｘｏ構成において観察されたＣＬＯＳＥ相補的形成は、モデルテンプレートにおけるクリック反応性と、互換性であった。
図２４に対応したオリゴヌクレオチド配列：
【化２４】
2018500892.tif 000025
【０２４８】
太文字の配列は、上記のクリック・オリゴヌクレオチド１及び２と相補性である部位を示す。
【化２５】
2018500892.tif 000026
下線の配列は、ＰＬＸＮＡ３のＣＬＯＳＥヒットに対応する、Ｎ領域に相当する。
【０２４９】
実施例１５：モデルエフェクター部分を伴う、テンプレート漸増効果の証明（実例）
生体分子のエフェクター部分アセンブリにおける過剰な標的テンプレートの効果を、過剰な標的テンプレート上のエフェクター部分の予想される隔離及び希釈が原因で、同じテンプレート上の２つのエフェクター部分対が、付随的にテンプレート化アセンブリを指向する頻度を減らすということを、先験的な論法から推論できる（図２５）。オリゴヌクレオチド・テンプレートに近接で連結した部位へ相補的形成をしているオリゴヌクレオチド間の、空間的近接位対する読み出しとしてのピレン蛍光（実施例５及び１３）を使用して、これを最初に試験した。テンプレートＨＰＶ−１（野生型、図２０）の変動する量を、各ピレン標識化エフェクター・オリゴヌクレオチド（ＰＹＥ−ＴＯ．１、ＰＹＥ−ＴＯ．２、図１４）の一定量の１ｎｍｏｌと混合し、５分／８０℃の加熱及び室温での冷却に供し、及び次いでＴｅｃａｎ社の分光光度計で蛍光を読みだした（実施例１３に示す）。結果は、１対１モル比で蛍光のピークを示し、その後モニターしている間、直線的に減衰した（図２６、８倍エフェクターモル過剰において）。
【０２５０】
代替試験において、クリック標識化オリゴヌクレオチド間のテンプレート化された生体外反応性を利用した。この場合において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、テンプレートの役割を果たし、高濃度のテンプレートが、除去されない限りそのゲル−バンドアッセイの読み出しを干渉するので、及びそのＲＮＡ鎖を、アルカリ加水分解によって容易に除去可能にした。この場合に使用したテンプレート・オリゴヌクレオチドは、以前（実施例１１及び１２）に使用したものと同じ直鎖状ＤＮＡテンプレートのＲＮＡ版であった。以前（実施例１１及び１２）に使用したクリック標識化エフェクターを、各５０ｐｍｏｌで使用し、相補性配列を有するＲＮＡテンプレートの変動量と混合し、最初に２５μｌの１倍Ｍ緩衝液（ｐＨ７．５で１０ｍＭのトリス緩衝液、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオエリトリトール）中でアニール処理した。サンプルを、７０℃で１分加熱し、室温に冷却し、及び実施例１１と同じ方法で、クリック触媒の作用試薬を伴い、及び伴わずに処理をし、その後脱塩した。次いで、対照サンプル以外の全てを、０．２Ｍで７５μｌのＮａＯＨ中で、２０分間／７０℃処理し、１．２Ｍの酢酸（１３．５μｌ）及び１Ｍのトリス緩衝液（３．８μｌ）で中和して、最終容積は１００μｌであった。サンプルを次いで、２０μｇのグリコーゲン及び０．３Ｍの酢酸ナトリウムを伴って、エタノール沈殿（３倍容積）させた。ペレット化及び７０％エタノールでの洗浄後、サンプルを、５μｌのＴＥに再溶解させた。これら調合物の各々の１μｌを、９８％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ中で、９８℃で５分間の変成を行い、及び１５％の変成尿素ゲル上で試験した。ゲル解析は、アルキン加水分解が無い場合、そのＲＮＡテンプレートは可視化でき、その標識化オリゴヌクレオチド間でのクリック反応性を促進するのに効果的であることを示した（図２７）。この実験において、ＭＵ８９ＲＮＡを、特異性対照サンプルとして含め、及びテンプレート化エフェクターアセンブリは、見出されなかった。漸増効果もまた、テンプレートとしてのＲＮＡオリゴヌクレオチドで、明確に証明できた。ここで最適なクリック産物形成が、１０対１のテンプレート対エフェクター比で起こったが、１００対１のテンプレート対エフェクター比では、ほとんど起こらなかった。この一般的な傾向は、これに続く試験においても、再現可能であった。
【０２５１】
この蛍光に基づくアッセイは、等量モルのレベルで、ピークの活性を与えた一方で（図２６）、当該ＲＮＡテンプレート化アセンブリは、少なくとも最大１０対１までのモル比において、より高いテンプレートレベルで改善したことは、注目に値した（図２７）。この明白な乖離は、それぞれのテンプレートの性質に起因する可能性が非常に高い。このピレンに基づくアッセイにおいて、当該ＲＮＡテンプレートが、小さなステムループを形成できるのに対して、当該ＤＮＡテンプレートは、二次構造の形成に対してほとんど傾向を示さない（図２７）。さらに、ＲＮＡ二本鎖は、同種のＤＮＡらせん構造を超えて熱安定性を増加させた。したがって、このＲＮＡテンプレートでのＤＮＡオリゴヌクレオチド・エフェクターのアニール処理は、そのＲＮＡ鎖自体の内部アニール処理と競合し、最適な結果を与えるためには、等量モルを超えたテンプレートの増量の必要性を示した。そうであっても、そのＲＮＡテンプレートレベルが十分に高い場合、その漸増効果は明白であり、産物量を非常に制限する。全体として、理論的な漸増効果（図２５）は、実際の実験システムで明確に証明できるが、しかしエフェクター／テンプレート比それ自体に加えてその他の要因が、テンプレートレベルが、非生産的になるポイントで、影響を及ぼすことができる。
【０２５２】
次に、これらの結果は、候補ＣＬＯＳＥ標的の発現レベルの測定が、重要な付加的実験目標であることを裏付けている（実施例６及び７）。
図２７に対応するオリゴヌクレオチド配列：
【化２６】
2018500892.tif 000027
【０２５３】
太文字の配列は、上記のクリック・オリゴヌクレオチド１及び２と相補性である部位を示す。
【化２７】
2018500892.tif 000028
【０２５４】
実施例１６：ＢＣＲ−ＡＢＬ標的を伴う、標的指向ＣＬＯＳＥ解析（実例）
一般的なＣＬＯＳＥアプローチとは対照的に、標的指向ＣＬＯＳＥは、既知の腫瘍特異的転写産物に焦点を当てる。発現した腫瘍特異的転座は、ＣＬＯＳＥ技術のこの指向形態にとって良いモデルであり、その融合接合部にまたがる両セグメントは、正常な転写産物に対応している。その様な環境において、腫瘍特異の直鎖状連続転座は、本質的に、その接合配列自体に限定される。対照的に、その転写産物の折り畳み（しばしば非常に大きい）は、その転座に固有な複数の不連続部位を産生する潜在性を有する（図２８に図解で示すように）。これらの部位は明らかに、ＣＬＯＳＥ解析によって見出され、テンプレート化アセンブリ標的としての適用を伴う。
【０２５５】
ＢＣＲ−ＡＢＬ転座の転写産物は、慢性骨髄性白血病のマーカー及び推進役（融合ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼの発現を介して）、ならびに特定のその他の形質転換状態として長い間知られてきた。これは、この実施例の実験作業に使用した、白血病細胞株のＫ５６２において強力に発現する。
【０２５６】
Ｋ５６２細胞からの全細胞ＲＮＡを、実施例１のように、ＣＬＯＳＥ解析の実施に使用し、及びその相補的形成後に、非相補的形成ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドを、実施例１０に記載のプロトコルに従って、除去した。次いで増幅したＣＬＯＳＥ化学連結反応ダイマー（グローバルＫ５６２ＲＮＡ上でテンプレート化）を、その元のＣＬＯＳＥライブラリーオリゴヌクレオチドと同じセンス鎖に相当する一本鎖の調合に使用した。これを達成するため、ボトム鎖に対して１０倍過剰なトップ（望ましい）鎖を伴った、非対称ＰＣＲを実施し、またビオチン化した。これらの条件下での３５サイクルの増幅の後、そのボトム鎖をもつ全ての産物（完全二本鎖またはそのボトムプライマーまたは部分伸長産物でアニール処理された一本鎖のいずれをも）を、ストレプトアビジン磁性ビーズ上で除去した。このプロセス及びその有用性を、図２９に示す。
【０２５７】
ＲＮＡ標的に定めた元の細胞と同じセンス鎖における、一本鎖プローブが、次に必要である。その元のＣＬＯＳＥの相補的形成を、ＲＮＡの折り畳みに供したが（したがって、一次塩基配列の点から分けられた部位の、並置が可能になる）、そのような構造が、その標的指向ＣＬＯＳＥ捕捉に対して反復される必要はない。そのＬ−及びＲ−ＣＬＯＳＥ部位が、不連続部位と相補的形成を行う一方で、必要な事の全ては、Ｌ−またはＲ−領域が、その捕捉プローブに結合することである（図３０）。また、全体が天然転写産物の配列を使用することが、不可欠ではない。ＢＣＲ−ＡＢＬの場合において、ＢＣＲ及びＡＢＬの両方に結合しているＣＬＯＳＥクローンが、完全な腫瘍特異性の確立に必要であり、及び非常に長いプローブ（多様なアイソフォームを伴った、＞８ｋｂのもの）を伴うと、ＢＣＲまたはＡＢＬ制限ＣＬＯＳＥクローンを選択する確率が増加するので、その転写産物の切断点領域をまたぐことが不可欠であることを考慮する。その切断点をまたぐ１３３８塩基のＤＮＡプローブ（１３３８プローブ）を、その結果使用した（図３１）。
【０２５８】
正しいセンス鎖に一本鎖を提供するために、その１３３８プローブを、ビオチン化されたボトム鎖を伴った、逆転写Ｋ５６２ＲＮＡから増幅した。その産物のストレプトアビジン磁性ビーズへの結合後に、０．１Ｍの水酸化ナトリウム／５ｍＭのＥＤＴＡで変性（２０秒間）し、その後、２０μｌのグリコーゲン／０．３Ｍの酢酸ナトリウムで急速なエタノール沈殿を行うことによって、望ましいトップ鎖を取得した。ペレット化及び７０％エタノールでの洗浄後、その一本鎖プローブを乾燥し、及びＴＥ緩衝液中で、再構成した。
【０２５９】
当該１３３８プローブ及び一次Ｋ５６２ＲＮＡ選択ＣＬＯＳＥ産物の両者の一本鎖に、３０℃で６時間の相補的形成を行い、その後、非結合ＣＬＯＳＥ断片を分離する必要がある。この場合には、複数の選択肢がある。１つの非限定的なアプローチは、ＰｉｐｐｉｎＰｒｅｐ装置（Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を含む、寒天ゲルを使用することである。これを、図３２Ａに図解で示す。そのようなゲルシステムにおける分離は、ＣＬＯＳＥダイマーオリゴヌクレオチドとプローブ配列間の大きなサイズ差によって、促進する。プローブ及び相補的形成をしたＣＬＯＳＥ鎖は共に移行する。それらの移動は、ＳＹＢＲゴールド染色、それに続くバンド切除及び核酸溶出によって、同定される。その相補的形成プローブを欠いたＣＬＯＳＥ産物からのプローブとして、同じ移動を伴う模擬バンドを、対照サンプルとして含めて良い（図３２Ａ）。
【０２６０】
当該プローブと共に移行するＣＬＯＳＥ産物を、再増幅し、及び上記のように一本鎖物質を調合するために使用した。これは、同じプローブを伴った、第一ラウンドのＣＬＯＳＥ選択一本鎖産物の相補的形成、各サイクルの実行で達成可能な、特異的に相補的形成をする配列の濃縮の進展を進める、標的指向ＣＬＯＳＥサイクルを可能にする。少なくとも２サイクル後に、ＣＬＯＳＥ産物をクローン化し、及び前述の配列解析に供した。
【０２６１】
２サイクル後の結果は、２２の配列化クローン産物を示し、５０％が、ＢＣＲ及びＡＢＬの両配列との一致を示した（残り部分は、ＢＣＲまたはＡＢＬのいずれかとの、しかし両方とではなく、一致を示した）。Ｌ−及びＲ−配列の両方と≧８／１１の一致を伴うクローンの例示をまた、図３２Ａに示す。当該プローブは、転写産物全体の二次部分であり、及びＬ／Ｒ部位は、後者の不連続セグメントと相補的形成をしている可能性があるので、両方が、そのプローブ配列に一致しているとは限らないことに留意されたい。しかしながら、同様に、必要な検証要件は、少なくとも１つのＣＬＯＳＥ配列との一致が、そのプローブの境界内に収まることである。前述の、この条件を満たす候補の例示（図３２Ｂ）は、その接合配列を挟んで不連続であり、及び先に定義したＥｘｏ構成を示す。
【０２６２】
実施例１７：化学連結反応対の増幅を可能にする、非天然の５′−５′連結の処理を介した、サンプルからのテンプレート化アセンブリ標的配列または構造の同定（想定事例）
５′−アジドまたは５′−シクロアルキン基を有するオリゴヌクレオチドの別々の集団を合成し、特定隣接配列を伴う不規則経路を持たせた（図３３Ａ及び３３Ｂに描写）。折り畳まれたＲＮＡ標的構造は、５′−５′または３′−３′末端の間が空間的近接位になり得（図３４Ａ及び３４Ｂ）、非天然鎖の連結を産生するクリック反応性を実現する（図３５、５′−５′に対応して示す）。隣接配列は、各オリゴヌクレオチドの１つの末端でプライミング部位（Ｐ１及びＰ２）、及びその他の末端で、酵素再配列及びダイマー増幅を可能にするための短い領域（「ａｄａｐｔｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ（適応部位）」、Ａ１及びＡ２、図３５）を含む。各適応部位は、別々の制限酵素（図３５のＥ１及びＥ２）に対応した認識部位を含み、ここでその各々に対する認識部位は、異なっているが、各々での二本鎖開裂後に産生されたオーバーハングは、連結反応に対して、相互に互換性がある。Ｅ１及びＥ２開裂によって産生されたＤＮＡ末端の連結反応において、その結果、連結反応したＥ１−Ｅ２産物は、各酵素によって開裂できない。プライマー部位は、Ｅ１及びＥ２に対して選択された認識配列を排除するように設計されている。
【０２６３】
５′−５′化学連結反応の形態は、いかなる核酸ポリメラーゼによっても、直接的には読み出しができないので、もしその活性アジドまたはアルキン基と、その末端５′核酸モイエティーとの間の安定な化学結合の部位が、少なくとも６炭素原子のスペーサーアームまたはスペーサー基によって架橋するならば、上記オリゴヌクレオチドへの５′−アジドまたは５′−シクロアルキン基の化学連結の方法は、重要ではない（図３６Ａ及び３６Ｂ）。いくつかの実施形態において、当該アジド基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応を介した、核酸５′末端へ、及びヘキシニル基の結合を介したアルキン基へ連結する。
【０２６４】
上記構成の５′−アジド及び５′−シクロアルキン修飾のオリゴヌクレオチドの別々の集団を、対象となる細胞からの全ＲＮＡ調合物、または互換的に全細胞ＲＮＡタンパク質調合物で相補的形成させる。モルによって互いに５０対５０の混合で、１５００塩基の細胞ＲＮＡの平均分子量を想定することにより計算したにより、ＲＮＡ存在量に対して１０〜１００倍過剰で、及び１〜１０マイクログラムの開始ＲＮＡと共に、各オリゴヌクレオチド集団と相補的形成を実施する。相補的形成は、２〜１６時間で有効となる。
【０２６５】
相補的形成の後、近接で誘導された、５′−アジド及び引っ張られた５′シクロアルキンモイエティー間の自然な反応、過剰なオリゴヌクレオチドの除去、及び脱塩を、実施した。次いで、調合物を、ＲＮａｓｅＡ及びＡＮａｓｅ１で処理した。その結果得られた調合物には、空間的近接がなく反応が不可能である、過剰な非変化のオリゴヌクレオチド鎖、及び少数の望ましい５′−５′反応産物を含む。
【０２６６】
得られた全てのオリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖である。これは、プライミング部位１（Ｐ１）及び適応部位２（Ａ２）に相補的なフプライマーを使用して達成でき、４つ全てのデオキシヌクレオチド三リン酸、ならびにＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（クレノウ断片）を有する各々が伸長し、そのため各新規鎖は、５′−５′接合点の範囲まで、伸長される（図３７）。
【０２６７】
この伸長された二本鎖の直接開裂が生じた場合、不規則領域の配列が、開裂に使用した酵素に対する制限部位の偶発的な出来事を介して開裂されるのは、望ましくない。このような事情から、代替の実施形態では、５−メチル−デオキシシチジン三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、及びチミジン三リン酸塩から成るデオキシヌクレオチド三リン酸混合物を使用し、そのため５−メチルシトシンに対してヘミメチル化された二本鎖が、その不規則領域への相補体に生み出される。５−メチルシトシンのヘミメチル化に感受性である開裂酵素を、結果的に使用する。また、開裂が生じる適用領域Ａ１及びＡ２においては、ヘミメチル化を防ぐ必要があり、Ａ１領域に相補的な５′−リン酸化鎖は、伸長反応の前に、テンプレートでアニール処理する（適応領域Ａ２は、その非メチル化相補性鎖からのプライミングを介して、非メチル化を維持する。図３８）。プライマー伸長の間に、領域Ａ１への相補性鎖が現れてはならないため、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼなどの、非鎖置換ポリメラーゼを使用する（図３８）。領域Ａ１に相補的な５′−リン酸化鎖と新規の伸長鎖との間に結果として生じた切れ目を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで封止する（図３８）。
【０２６８】
次いで、その結果できた伸長された二本鎖を、制限部位Ｅ２を認識する酵素で、開裂する（図３７）。いくつかの実施形態において、この酵素Ｅ２は、ＡｇｅＩに特異的に対応し、４塩基オーバーハングである５′−ＣＣＧＧを産生する、配列ＡＣＣＧＧＴを認識する。
【０２６９】
後続のステップにおいて、ａ）増幅を可能にする、連結反応介在再配列プロセス中の、近接で相補的形成された配列間の連結情報を保存する、ｂ）開裂された配列が、たがいに対して高濃度にあって、それらの再連結反応を進める、微小環境を維持する、及びｃ）未反応鎖を、個別に単離されたコンパートメントに隔離し、疑似増幅シグナル（近接のテンプレートによって駆動された、元のクリック反応からのものではないシグナル）を与える、それらの連結反応介在の再集合を防ぐ、という条件が課される。これらの条件は、生体外のコンパートメント化によって、達成可能である。
【０２７０】
生体外のコンパートメント化は、二本鎖を与えられ、及びＥ２部位に対応する酵素で開裂された、未反応オリゴヌクレオチド集団及び５′−５′クリック連結反応ダイマーからの個々の分子を含むための、油中水型の微小コンパートメントを作ることによって、達成される。微小コンパートメントは、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９によって記述されるように、精密に制御された攪拌条件下で、望ましい内部成分を添加された、試薬グレードの鉱物油及び洗浄剤から形成する（図３９）。油中水型の微小コンパートメントの形成時において、各コンパートメントが、同じ緩衝組成物（５０ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭのＡＴＰ及び１０ｍＭの酢酸マグネシウムイオンを含む、ｐＨ７．９／２５℃で２０ｍＭのトリス酢酸）、及びタンパク質Ｔ４ＤＮＡリガーゼの少なくとも１つの複製、ならびにＥ１部位を認識するタンパク質制限酵素を受け取るように、それら成分が、過剰に存在する。この微小コンパートメントは、非常に過剰に存在する分子種中にあるので、平均してただ１つの連結反応分子が、各コンパートメントに組み入れられる（図３９）。同様に、非連結反応断片は、微小コンパートメントに共に分配される（図４０）。いくつかの実施形態において、当該Ｅ１制限酵素は、ＸｍａＩであり、ＡｇｅＩと互換的な４塩基オーバーハングの５′−ＣＣＧＧを産生する、配列ＣＣＣＧＧＧを認識する。ＡｇｅＩからのオーバーハング及びＸｍａＩ開裂の連結反応において、もたらされる配列は、ＡＣＣＧＧＧであり、いずれの酵素によっても開裂ができない。
【０２７１】
微小コンパートメントを、２時間／３７℃、及び次いで２時間／２０℃で培養する。個別の５′−５′化学連結反応ダイマーを有する各コンパートメント内において、ＸｍａＩでの開裂の後に、いずれか他のＸｍａＩオーバーハング（元の開裂の逆）との連結反応、または同じコンパートメントに存在する単一のＡｇｅＩ末端との連結反応が続く（図４１）。ＸｍａＩ−ＸｍａＩ再連結反応は、ＸｍａＩによって、再開裂可能であるが、しかしＡｇｅＩ−ＸｍａＩ連結反応は再開裂可能ではなく、及びしたがって各微小コンパートメント中で、必然的に優勢種になる（図４２）。オリゴヌクレオチドが、最初に化学連結反応して、ダイマーになっていないコンパートメント（図３９）は、この再連結反応／再切断サイクルに関与できない。
【０２７２】
次いで、微小コンパートメントを、ジエチルエーテルでの処理によって、破壊する。
ＲＮＡテンプレート上で空間的近接位よって選択された、元の不規則集団からの特定のオリゴヌクレオチド対を、前述の再配列プロセスの効力によって、増幅する。
【０２７３】
実施例１８：化学連結反応対の増幅を可能にする、非天然の３′−３′連結の処理を介した、サンプルからのテンプレート化アセンブリ標的配列または構造の同定（想定事例）
３′−アジドまたは３′−シクロアルキン基を有するオリゴヌクレオチドの別々の集団を合成し、特定隣接配列を伴う不規則経路を持たせる（図４３に示す）。
【０２７４】
３′−３′化学連結反応の形態は、いかなる核酸ポリメラーゼによっても、直接的には読み出しができないので、その活性アジドまたはシクロアルキン基と、その末端３′核酸モイエティーとの間の安定な化学結合の部位が、少なくとも６炭素原子のスペーサーアームまたはスペーサー基によって架橋するならば、前述のオリゴヌクレオチドへの３′−アジドまたは３′−シクロアルキン基の化学連結の方法は、重要ではない（図４４Ａ及び４４Ｂ）。いくつかの実施形態において、当該アジド基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応を介した、核酸３′末端へ、及びヘキシニル基の結合を介したシクロアルキン基へ、連結する。
【０２７５】
上記構成の３′−アジド及び３′−シクロアルキン修飾のオリゴヌクレオチドの別々の集団を、対象となる細胞からの全ＲＮＡ調合物、または互換的に全細胞ＲＮＡタンパク質調合物と相補的形成を行う。モルによって互いに５０対５０の混合で、１５００塩基の細胞ＲＮＡの平均分子量を想定することにより計算した、ＲＮＡ存在量に対して１０〜１００倍過剰で、及び１〜１０マイクログラムの開始ＲＮＡと共に、各オリゴヌクレオチド集団と相補的形成を実施する。相補的形成は、２〜１６時間で効力を発揮する。
【０２７６】
相補的形成の後、近接で誘導された、５′−アジド及び引っ張られた５′シクロアルキンモイエティー間の自然な反応、過剰なオリゴヌクレオチドの除去、及び脱塩を、実施する。その結果得られた調合物には、空間的近接がなく反応が不可能である、過剰な非変化のオリゴヌクレオチド鎖、及び少数の望ましい３′−３′反応産物を含む。
【０２７７】
得られた全てのオリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖である。これは、プライミング部位２（Ｐ２）及び適応部位１（Ａ１）に相補的なプライマーの使用によって効果的であり得て、及び全てで４つのデオキシヌクレオチド三リン酸、及びＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（クレノウ断片）を有する各々を伸長し、そのため各新規鎖は、３′−３′接合点まで、伸長される（図４５）。
【０２７８】
この伸長された二本鎖の直接開裂が生じた場合、不規則領域の配列が、開裂に使用した酵素に対する制限部位の偶発的な出来事を介して開裂されるのは、望ましくない。このような事情から、代替の実施形態では、５−メチル−デオキシシチジン三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、及びチミジン三リン酸塩から成るデオキシヌクレオチド三リン酸混合物を使用し、そのため５−メチルシトシンに対してヘミメチル化された二本鎖が、その不規則領域への相補体に生み出される。いくつかの実施形態において、５−メチルシトシンのヘミメチル化に感受性である開裂酵素を、結果的に使用する。また、開裂が生じる適用領域Ａ１及びＡ２においては、ヘミメチル化を防ぐ必要があり、Ａ２領域に相補的な５′−リン酸化鎖は、伸長反応の前に、テンプレートでアニール処理する（適応領域Ａ１は、その非メチル化相補性鎖からのプライミングを介して、非メチル化を維持する。図１６）。プライマー伸長の間に、領域Ａ１への相補性鎖が置き換えられてはならないので、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼなどの、非鎖置換ポリメラーゼを使用するべきである（図１６）。領域Ａ１に相補的な５′−リン酸化鎖と新規の伸長鎖との間に生じた切れ目を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで封止する（図４６）。
【０２７９】
次いで、その結果できた伸長された二本鎖を、制限部位Ｅ２を認識する酵素で、開裂する。いくつかの実施形態において、この酵素Ｅ２は、ＡｇｅＩに特異的に対応し、４塩基オーバーハングである５′−ＣＣＧＧを産生する、配列ＡＣＣＧＧＴを認識する。
【０２８０】
後続のステップにおいて、ａ）増幅を可能にする、連結反応介在再配列プロセス中の、近接で相補的形成された配列間の連結情報を保存する、ｂ）開裂された配列が、たがいに対して高濃度にあって、したがってそれらの再連結反応を進める、微小環境を維持する、及びｃ）未反応鎖を、個別に単離されたコンパートメントに隔離し、疑似増幅シグナル（近接のテンプレートによって駆動された、元のクリック反応からのものではないシグナル）を与える、それらの連結反応介在の再集合を防ぐ、という条件が課される。これらの条件は、生体外のコンパートメント化によって、達成可能である。
【０２８１】
生体外のコンパートメント化は、油中水型の微小コンパートメントを作ることによって達成され、未反応オリゴヌクレオチド集団、及び二本鎖を与えられ、ならびにＥ２部位に対応する酵素で開裂された、３′−３′クリック連結反応ダイマーからの個々の分子を含む。微小コンパートメントは、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９によって記述されるように、精密に制御された攪拌条件下で、望ましい内部成分を添加された、試薬グレードの鉱物油及び洗浄剤から形成される（図４７）。油中水型の微小コンパートメントの形成時において、各コンパートメントが、同じ緩衝組成物（５０ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭのＡＴＰ及び１０ｍＭの酢酸マグネシウムイオンを含む、ｐＨ７．９／２５℃で２０ｍＭのトリス酢酸）、及びタンパク質Ｔ４ＤＮＡリガーゼの少なくとも１つの複製、ならびにＥ１部位を認識するタンパク質制限酵素を受け取るように、それら成分が、過剰に存在する。この微小コンパートメントは、非常に過剰に存在する分子種中にあるので、平均してただ１つの連結反応分子が、各コンパートメントに組み入れられる（図４７）。同様に、非連結反応断片も、微小コンパートメントに分配される（図４８）。この非限定的な実施形態において、当該Ｅ１制限酵素は、ＸｍａＩであり、ＡｇｅＩと互換的な４塩基オーバーハングの５′−ＣＣＧＧを産生する、配列ＣＣＣＧＧＧを認識する。ＡｇｅＩからのオーバーハングとＸｍａＩ開裂との連結反応において、もたらされる配列は、ＡＣＣＧＧＧであり、いずれの酵素によっても開裂ができない。
【０２８２】
微小コンパートメントを、２時間／３７℃、及び次いで２時間／２０℃で培養する。個別の３′−３′化学連結反応ダイマーを有する各コンパートメント内において、ＸｍａＩでの開裂の後に、いずれか他のＸｍａＩオーバーハング（元の開裂の逆）との連結反応、または同じコンパートメントに存在する単一のＡｇｅＩ末端との連結反応が続く（図４９）。ＸｍａＩ−ＸｍａＩ再連結反応は、ＸｍａＩによって、再開裂可能であるが、ＡｇｅＩ−ＸｍａＩ連結反応は再開裂可能ではなく、したがって各微小コンパートメント中で、必然的に優勢種になる（図５０）。オリゴヌクレオチドが、最初に化学連結反応して、ダイマーになっていないコンパートメント（図４８）は、この再連結反応／再切断サイクルに参加できない。
【０２８３】
次いで、微小コンパートメントを、ジエチルエーテルでの処理によって、破壊する。
ＲＮＡテンプレート上で空間的近接位よって選択された、元の不規則集団からの特定のオリゴヌクレオチド対を、前述の再配列プロセスの効力によって、増幅する。
【０２８４】
実施例１９：オリゴヌクレオチド対間の化学連結反応が、直接のポリメラーゼ読み通しと互換的でない、５′−３′連結の処理を介した、サンプルからのテンプレート化アセンブリ標的配列または構造の同定（想定事例）
いくつかの場合において、ポリメラーゼによる直接の読み通しが不可能なクリック基との、５′−３′近接連結に対応した選別は、有用または重要である。これに関連して、１）事前に活性化されたクリック反応体（例えば、鎖状シクロオクチンで）を使用する場合、Ｃｕ（Ｉ）触媒の必要性を回避すること、及び２）事前に活性化されたクリック反応体が、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在に対する要求が存在する場合、困難または不可能である、生体細胞内の選別に利用できることという少なくとも２つの主要因を、取り扱い可能である。
【０２８５】
５′−及び３′−クリック基を有するオリゴヌクレオチドの個別集団を合成する。ポリメラーゼ読み通しに対する要求は無いので、（５′−シクロアルキン＋３′−アジド）または（５′−アジド＋３′−シクロアルキン）のいずれか一組の集団を、利用できる。全てのオリゴヌクレオチドが、特定隣接配列を伴う不規則経路を有する（図５１に示す）。隣接配列は、酵素による再配列及びダイマーの増幅を可能にするための、各オリゴヌクレオチドの片方の末端にプライマー部位（Ｐ１及びＰ２）を、その他の末端に、短い領域（「ａｄａｐｔｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ（適応部位）」、Ａ１及びＡ２）を構成要素として持ち、酵素転位およびダイマーの増幅を可能にする。各適応部位は、個別の制限酵素（図５１のＥ１及びＥ２）に対する認識部位を含み、そこで各々のその認識部位は、異なっているが、各々による二本鎖開裂後に産生されるオーバーハングは、連結反応に対して互いに互換的である。Ｅ１及びＥ２による開裂によって産生されたＤＮＡ末端の連結反応において、得られる連結反応Ｅ１−Ｅ２産物は、いずれの酵素によっても開裂されない。プライマー部位は、Ｅ１及びＥ２から選択された認識配列を排除するように設計する。
【０２８６】
実施例４において、いかなる核酸ポリメラーゼによっても直接的に読み出し可能である、５′−３′化学連結反応に対する要求は無いので、もしその活性アジドまたはアルキン基と、その末端核酸モイエティーとの間の安定な化学結合の部位が、少なくとも６炭素原子のスペーサーアームまたはスペーサー基によって架橋するならば、前述のオリゴヌクレオチドへのアジドまたはシクロアルキン基の化学連結の方法は、重要ではない（図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃ、及び５２Ｄ）。いくつかの実施形態において、当該アジドモイエティーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応を介した、核酸５′末端または３′末端のいずれかと、及び付加されたシクロオクチン基の形態で、核酸５′末端または３′末端のいずれかへのアルキンモイエティーと連結する。
【０２８７】
上記構成のアジド及びアルキン修飾のオリゴヌクレオチドの別々の集団を、対象となる細胞からの全ＲＮＡ調合物、または互換的に全細胞ＲＮＡタンパク質調合物で相補的形成させる。モルによって互いに５０対５０の混合で、１５００塩基の細胞ＲＮＡの平均分子量を想定した計算により、ＲＮＡ存在量に対して１０〜１００倍過剰で、及び１〜１０マイクログラムの開始ＲＮＡと共に、各オリゴヌクレオチド集団と相補的形成を実施する。相補的形成は、２〜１６時間で達成される。
【０２８８】
Ｃｕ（Ｉ）触媒の必要性を無くすように、アジドと非常に近接にある、引っ張られたアルキン基間で加速された反応性の結果として、クリック反応性が、直接的に生じる。
【０２８９】
当該Ｃｕ（Ｉ）触媒の要求を回避することを前提として、細胞内相補的形成に対応して、標識化したオリゴヌクレオチド集団を、生体細胞に導入する。増幅が可能になる望ましい再配列を有効にするために、制限酵素による開裂の必要性がある場合を除いて、ヌクレアーゼ耐性ホスホジエルテル骨格または糖モイエティーを伴って、ハイブリッド・オリゴヌクレオチドを合成する（図５３Ａ及び５３Ｂ）。全てのオリゴヌクレオチド末端（クリック基で封止されたものを含む）を、修飾されたセグメントから構成する。これらが、制限部位を含むＡ１及びＡ２を構成要素とする場合、正常塩基及び骨格を伴うそのＡ１及びＡ２を、エクソ核酸の攻撃を抑止するために、修飾された骨格を伴う３塩基によって伸長する。これらオリゴヌクレオチドの修飾セグメントには、非限定的に、２′−Ｏ−メチル−ヌクレオチド、及びホスホチオエート・ヌクレオチドを含む。
【０２９０】
いくつかの実施形態において、部分的ヌクレアーゼ耐性・オリゴヌクレオチドを、非限定的に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＦｕｇｅｎｅを含む、市販の形質導入試薬によって、対象となる標的細胞に導入する。
【０２９１】
相補的形成の後で、本方法は、リボヌクレアーゼでの処理に関して、実施例２のように進める。細胞内選別が行われる実施形態において、細胞を破壊し、ＲＮａｓｅ及びプロテアーゼの両方での処理に供す。プロテアーゼ処理には、非限定的に、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（プロテイナーゼＫ）を含む。処理後、ゲルサイズ排除クロマトグラフィーによって、低分子量産物を枯渇させる。
【０２９２】
その結果得られた調合物には、空間的近接の欠如を介し反応することが不可能であった、過剰な未変化オリゴヌクレオチド鎖、及び望ましい５′−３′反応産物を含む。得られた全てのオリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖であった。これは、適応部位１（Ａ１）及び適応部位２（Ａ２）に相補的なプライマーを使用して、達成でき、全てで４つのデオキシヌクレオチド三リン酸、ならびにＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（クレノウ断片）を有する各々が伸長し、そのため各新規鎖は、５′−３′接合点から、またはその範囲まで、伸長される（図５４）。
【０２９３】
修飾された核酸が、細胞内選別に対応して使用される実施形態において、そのプライマー伸長手順を、修正する。リボースモイエティーが、２′−Ｏ−メチル誘導体として修飾される場合、上述と同じＡ１及びＡ２プライマーを使用し、クレノウ断片の代わりに、逆転写酵素を伸長目的に使用して良い。
【０２９４】
この伸長された二本鎖の直接開裂が生じた場合、不規則領域の配列が、開裂に使用した酵素に対する制限部位の偶発的な出来事を介して開裂されるのは、望ましくない。このような事情から、５−メチル−デオキシシチジン三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、及びチミジン三リン酸塩から成るデオキシヌクレオチド三リン酸混合物を使用し、そのため５−メチルシトシンに対してヘミメチル化された二本鎖が、その不規則領域への相補体に生み出される。いくつかの実施形態において、５−メチルシトシンのヘミメチル化に感受性である開裂酵素を、結果的に使用する（適応領域Ａ１及びＡ２は、非メチル化相補性鎖からのプライミングを介して、非メチル化を維持する。図５４）。
【０２９５】
次いで、その結果できた伸長された二本鎖を、制限部位Ｅ２を認識する酵素で、開裂する。この非限定的な例示において、この酵素Ｅ２は、ＡｇｅＩに特異的に対応し、４塩基オーバーハングである５′−ＣＣＧＧを産生する、配列ＡＣＣＧＧＴを認識する。
【０２９６】
後続のステップにおいて、ａ）増幅を可能にする、連結反応介在再配列プロセス中の、近接で相補的形成された配列間の連結情報を保存する、ｂ）開裂された配列が、その他と比べて高濃度にあって、したがってそれらの再連結反応を進める、微小環境を維持する、及びｃ）未反応鎖を、個別に単離されたコンパートメントに隔離し、疑似増幅シグナル（近接のテンプレートによって駆動された、元のクリック反応からのものではないシグナル）を与える、それらの連結反応介在の再集合を防ぐ、という条件が課される。これらの条件は、生体外のコンパートメント化によって、達成可能である。
【０２９７】
生体外のコンパートメント化は、油中水型の微小コンパートメントを作ることによって達成され、未反応オリゴヌクレオチド集団、及び二本鎖を与えられ、ならびにＥ２部位に対応する酵素で開裂された、５′−３′クリック連結反応ダイマーからの個々の分子を含む。微小コンパートメントは、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９によって記述されるように、精密に制御された攪拌条件下で、望ましい内部成分を添加された、試薬グレードの鉱物油及び洗浄剤から形成される（図５５）。油中水型の微小コンパートメントの形成時において、各コンパートメントが、同じ緩衝組成物（５０ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭのＡＴＰ及び１０ｍＭの酢酸マグネシウムイオンを含む、ｐＨ７．９／２５℃で２０ｍＭのトリス酢酸）、及びタンパク質Ｔ４ＤＮＡリガーゼの少なくとも１つの複製、ならびにＥ１部位を認識するタンパク質制限酵素を受け取るように、それら成分が、過剰に存在する。この微小コンパートメントは、非常に過剰に存在する分子種中にあるので、平均してただ１つの連結反応分子が、各コンパートメントに組み入れられる（図５５）。同様に、非連結反応断片も、微小コンパートメントに分配される（図５６）。いくつかの実施形態において、当該Ｅ１制限酵素は、ＸｍａＩであり、ＡｇｅＩと互換的な４塩基オーバーハングの５′−ＣＣＧＧを産生する、配列ＣＣＣＧＧＧを認識する。ＡｇｅＩからのオーバーハングとＸｍａＩ開裂との連結反応において、もたらされる配列は、ＡＣＣＧＧＧであり、いずれの酵素によっても開裂ができない（図５７）。
【０２９８】
微小コンパートメントを、２時間／３７℃、及び次いで２時間／２０℃で培養する。個別の５′−３′化学連結反応ダイマーを有する各コンパートメント内において、ＸｍａＩでの開裂の後に、他のＸｍａＩオーバーハング（元の開裂の逆）との連結反応、または同じコンパートメントに存在する単一のＡｇｅＩ末端との連結反応のいずれかが続く。ＸｍａＩ−ＸｍａＩ再連結反応は、ＸｍａＩによって、再開裂可能であるが、しかしＡｇｅＩ−ＸｍａＩ連結反応はそうではなく、したがって各微小コンパートメント中で、必然的に優勢種になる（図５８）。未反応オリゴヌクレオチドを含むコンパートメントを、その他の潜在的に連結反応が可能な分子から、コンパートメント化する（図５６）。
【０２９９】
次いで、微小コンパートメントを、ジエチルエーテルでの処理によって、破壊する。ＲＮＡテンプレート上で空間的近接位よって選択された、元の不規則集団からの特定のオリゴヌクレオチド対を、前述の再配列プロセスの効力によって、増幅する。
【０３００】
実施例１９の別の実施形態において、微小コンパートメントとの「ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ（情報伝達）」は、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００６，３，５６１−５７０によって記述されているように、ナノサイズ液滴によって、達成される。
【０３０１】
実施例２０：モデルシステムでのＣＬＯＳＥ再配列プロセスの封じ込めに対応する、生体外コンパートメント化の検証（実例）
酵素による再配列プロセス、及び単一分子の再配列を含むための生体外コンパートメント化の能力は、その結果として各ＣＬＯＳＥダイマーに組み込まれた情報を保持するものだが、この両方を実証することが望まれていた。これにアプローチする最も効果的な方法は、その配列を互いに区別できるように提供する、特定のクリック標識化オリゴヌクレオチドを使用することであった。
実施例２０に対応するオリゴヌクレオチド配列（Ａ〜Ｄ）：
【化２８】
2018500892.tif 000029
ここで「Ａｚｉｄｅ（アジド）」は、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド中間体を介して結合したアジド基であり、及び「ｈｅｘｙｎｙｌ（ヘキシニル）」は、６炭素の直鎖状スペーサーによって、ＤＮＡキャリアーから分離されたアルキンを意味する。下線の配列は、制限部位を示し、ＡはＮｃｏＩ、ＢはＸｂａＩ、ＣはＢａｍＨＩ、ＤはＡｓｐ７１８Ｉである。太文字の配列は、実施例１７、１８、及び１９で、不規則化された領域に対応している。配列ＣＴＣＣＡＴＡＡＣＣＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ番号７５）及びＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ番号７６）は各々、増幅に対応して切り取られた、順（センス鎖）及び逆（アンチセンス鎖）プライマー部位である。
【０３０２】
モデルのオリゴヌクレオチドＡ〜Ｄは、制限部位の消化によって（二本鎖として）、または各オリゴヌクレオチドに特異的に伸長されたプライマーを伴ったＰＣＲ増幅によって、互いに区別できる。
【０３０３】
当該モデルの第一段階において、オリゴヌクレオチドＡ〜Ｄの４つ全ての可能なアジド−アルキンの組み合わせを、高濃度（１０ｐｍｏｌ／μｌ、５０μｌ容積）で混合し、実施例１のように、同様の反応後の脱塩を伴って、非テンプレート化で触媒支援のクリック反応に供した。変性アクリルアミドゲルの反応を試験した際、より高い見掛け分子量（モノマー分子量の約２倍）での「ｔｏｐ（トップ）」バンド、及び元のバンドよりやや遅い移動性を伴う「ｂｏｔｔｏｍ（ボトム）」バンドの、二相性のクリック特異的バンドパターンを、再現性良く観察した。トップ及びボトムの両バンドを、分取ゲルから切除によって精製し、レーン飽和を避けるために複数のレーンを粉砕し（図５９）、及びオリゴヌクレオチドを拡散させ、その後沈殿及び再構成と続けた。
【０３０４】
この時点では、どちらかまたは両方のバンドが、増幅を可能にする酵素再配列プロセスを受けることができるかどうかをテストする必要があると判断された（実施例１７、１８、及び１９）。フリーのソリューションソフトウェアでこのプロセスを実行すると、各クリック分子からの情報を保持しないが、酵素要件は一定であり、この場合の成功はまた、その再配列プロセス自体を実証する。トップ及びボトムの両バンドのサンプルは、クレノウＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ断片、ｄＮＰＴｓ、および適切なプライマーで、最初に二重鎖を提供した。
モデルまたは実際の５′−５′ライブラリーのオリゴヌクレオチド二本鎖を提供するためのプライマー：
Ｅ１−Ｅｘｔ：ＧＧＡＴＣＡＣＣＧＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ番号７７）、
Ｔｒｚ．Ｒ：ＧＣＣＴＣＴＡＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ番号７８）。
【０３０５】
次いでこの二本鎖調合物を、ＸｍａＩ及びＡｇｅＩを伴いまたは伴わず、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを伴いまたは伴わずに処理した。これに続いて、サンプルを、プライマーＴｒｚ．Ｆ（ＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＡＡＣＣＣＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ番号７９）、及びＴｒｚ．Ｒ（上記）で増幅し、ならびに非変性アクリルアミドゲル上で試験した。予想サイズ（６８ｂｐ）のバンドは、トップ及びボトムの両調合物に観察されたが、制限酵素による消化と  再連結反応の両方の後にのみ、計画された再配列プロセスを完全に支持していた（図６０）。トップ及びボトムの両バンドは、５′−５′付加体であることが結論づけられ、高速移行のボトムバンドは、自己折り畳みの変性耐性形態である可能性が最も高かった。このモデルプロセスの継続のために、そのトップバンドを使用した。そのボトムバンドより明確に低い収率ではあったが、そのトップバンドを、未反応モノマーから、はるかに簡単に除去した。
【０３０６】
したがって、４つの可能な  ５′−５′付加体（図５９）のサンプルは、変性ゲル上で本質的に純粋であることが示された（図６１）。これらのサンプル（１ｐｍｏｌ）を、上記のクレノウ酵素で伸長し、次いでＸｍａＩ／ＡｇｅＩ及びＴ４ＤＮＡリガーゼを伴う再連結反応で試験を行った。それぞれの付加体に加えて、異種成分オリゴヌクレオチドを伴った、２つの付加体混合物もまた、その再配列試験に含めた。これらは、付加体ＢＨ＋ＦＨ（それぞれ元のオリゴヌクレオチドＡ／Ｂ及びＣ／Ｄの５′−５′接合に対応している）、及び付加体ＤＨ＋ＨＨ（それぞれ元のオリゴヌクレオチドＡ／Ｄ及びＣ／Ｂの５′−５′接合に対応している）であった。酵素処理の後、すべての付加物調合物は、増幅可能な物質であることが示されたが（図６０と同じプロセス及びプライマーで）、しかし酵素無しで観察されたものはなかった（図６２）。
【０３０７】
この時点で、不自然な化学連結反応からのＣＬＯＳＥ情報の欠如を伴わずに、分子固有の再配列を可能にする、ＩＶＣの成功を評価するために、モデルのオリゴヌクレオチド検出システムを使用することが可能になった。このシステムの原理を、図６３に図解で示す。特定の  ５′−５′付加物を、分離して保持する場合、均質な溶液中にまたは成功した微小コンパートメント化を介して、再配列可能な１つだけの産物が、利用可能になる。しかしながら、仮に同じ構成の異なる付加体が、混合される場合（または仮にそのＩＶＣが、不適切な場合）、その連結反応ステップ中に、異なる付加体間の交差が起きて、特定の５′−５′ＣＬＯＳＥオリゴヌクレオチドに含まれる情報を破壊するであろう。仮にそれぞれの元のオリゴヌクレオチド配列（Ａ−Ｄ）に特異的なＰＣＲプライマーが設計できるならば、多様なプライマーの組み合わせでの増幅パターンは、付加体再配列の状態を、直接的に示すであろう。
【０３０８】
元のクリック標識化オリゴヌクレオチドＡ−Ｄに対して、望ましい特異性を有するプライマーを設計した。ここでは、特異的なプライマー対が、特定の直接的な（単位分子）再配列、または特定の交差産物を増幅することを、意図していた。例えば、当該ＢＨ付加体に対しては、再配列後、その望ましいプライマーが、Ｂ−Ａ配列だけを増幅し、同様に当該ＢＨ付加体に対しては、正しいプライマーは、Ｄ−Ｃ配列だけを特異的に増幅する必要がある。そのＢＨ及ぶＦＨ付加体を混合する場合、望ましい特異的なプライマーの組み合わせに対して、Ｂ−Ｃ、及ぶＤ−Ａの、２つの可能な交差産物が形成できる。そのような混合物内では、その交差産物と同様に、その「ｄｉｒｅｃｔ（直接）」産物も形成可能であることに留意の必要がある。
【０３０９】
そのＢＨ及びＦＨ付加体の調合物を、それらが、二本鎖を形成した後で使用し、及び再配列のためにＡｇｅＩ／ＸｍａＩ／ＤＮＡリガーゼ処理に供した。これらを、単一付加物としておよび混合物として（ＢＨ＋ＦＨ付加物）高い感度で実施した。このＢＨ及びＦＨ付加体の直接再配列に特異的であるように設計したプライマー対は、要求を満たしていた（同質再配列、または当該ＢＨ＋ＦＨ混合物だけから見られる産物である）ことが判った（図６４）。この２つの可能性のある交差プライマー対の内、１つ（Ｂ−Ｃ交差に対して）は、低いが検出可能な交差特異性（ＢＨ単独による産物を示して）を示したが、しかしその他の交差プライマー対（Ｄ−Ａ）は、高い特性を示した（図６４）。いずれのプライマー対も、交差の有無を証明するのに十分なため、このプライマーを、さらに使用した。
【０３１０】
再配列及び交差試験に対応するオリゴヌクレオチド配列：これらは、Ａ−Ｄ再配列のいずれの組み合わせをも増幅する、一般プライマーＴｒｚ．Ｆ及びＴｒｚ．Ｒ（上記）の伸長であった。
直接ＢＨ再配列に特異的なプライマー：
【化２９】
2018500892.tif 000030
直接ＦＨ再配列に特異的なプライマー：
【化３０】
2018500892.tif 000031
ＢＨ−ＦＨ交差再配列＃１（Ｂ−Ｃ）に特的なプライマー：
Ｔｒｚ．Ｆ＋Ｔｅ／Ｔｒｚ．Ｒ＋Ａｅ（上記）、
ＢＨ−ＦＨ交差再配列＃２（Ｄ−Ａ）に特的なプライマー：
Ｔｒｚ．Ｆ＋Ａｅ／Ｔｒｚ．Ｒ＋Ｃｅ（上記）。
太字の配列は、Ｔｒｚ．Ｆ及びＴｒｚ．Ｒの３′末端を超えた伸長に対応している。
【０３１１】
追加の対照試験もまた実施することが望ましく、ここでそれぞれ再配列したＢＨ及びＦＨ付加体のサンプルを、ＰＣＲ（これは、このＢＨ及びＦＨ付加体を、それ自体の再配列プロセス前に混合した反応とは異なり、ここでは、図６４に示すように、交差が促進される）の直前に、別々に混合した。この一組の第二対照サンプルで、人工のＰＣＲ効果を介したこのシステムにおいて、交差が生じるかどうかを試験する。そのようなＰＣＲ誘導の交差効果が、発生しなかったことを見出した（図６５）。
【０３１２】
この確認されたプライマー特異性を伴って、当該モデルオリゴヌクレオチドを使用して、生体外コンパートメント化の試験を実行することができた。ここで、ＡｇｅＩ（実施例１７、図３９）及びＸｍａＩ／Ｔ４ＤＮＡリガーゼ／緩衝液／１ｍＭのＡＴＰで予備切断した、二本鎖の５′−５′付加体を、エマルジョン形成に必要なオイル及び界面活性剤と混合した、（ＡｇｅＩでの予備切断は、このエマルジョン混合物への含有に対する、酵素への要件を簡素化する）。ＸｍａＩ及びＴ４ＤＮＡリガーゼの両方が、１ｍＭのＡＴＰの存在下での１倍のＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）中で活性であったことが、最初に示されたので、したがって、エマルジョン形成に対応した混合に使用した。もしエマルジョン及びコンパートメント化が成功すれば、再配列が、そのエマルジョン自体の中で進行することが可能になった後は、予備切断されたＢＨ及びＦＨ付加体が、最初に存在しても、検出の必要がある交差産物は存在しない。
【０３１３】
エマルジョン混合物を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を省略したことを除き、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，２４．６．１−２４．６．１２の方法によって、調合した。エマルジョン自体を、９５０μｌの鉱物油（分子生物学グレード、Ｓｉｇｍａ社）、４５μｌのＳｐａｎ−８０（Ｓｉｇｍａ社）及び５μｌのＴｗｅｅｎ−８０（Ｓｉｇｍａ社）に相当するエマルジョン混合物として、粘度の高い液体を吐出するために、常にポジティブディスプレイスメント方式ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ社）を使用した方法に従って、作り出した。ＡｇｅＩ−予備切断付加体（事前に決めた量で）または対照サンプルの５０μｌの混合物を、ＸｍａＩ及びＴ４ＤＮＡリガーゼを含み、１ｍＭのＡＴＰを伴う、１倍のＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中で、調合した（エマルジョン形成の直前に、酵素だけを添加し、及び全ての調合物を、０℃の氷上で冷やし続けた）。エマルジョン混合物を、１３ｍｌのチューブに収め（１７Ｘ９５ｍｍ、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、及び９．５Ｘ９．５ｍｍのスピンバー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の添加前に冷やし、ならびに氷ベアリングフラスコに含まれている１３ｍｌのチューブ中で混合し、及び１１５０ｒｐｍ  で２分間、Ｃｏｒｎｉｎｇ社のＰＣ−４１０Ｄ攪拌機で遠心分離した。これに続いて、冷やした付加体／緩衝液／酵素の混合物（５０μｌ）を、回転しているエマルジョンの上層にゆっくり添加し（１０Ｘ５μｌ分割量）、その後、遠心分離をさらに１０分間続けた。いくつかの試験において、その後に、微小液滴サイズを均質化するために、追加の超音波処理のステップを行った。破壊の間チューブを冷やしながら、中強度で３秒間の超音波破壊を５ラウンド行った。次いで、そのエマルジョンを、注意深く２ｍｌチューブに移し、及び３０℃で１時間、さらに２５℃で４時間の培養を行った。５０μｌ容積で、対照反応を、上記のように用意したが、乳化処理には供しなかった。培養期間の最後に、そのエマルジョンを、ジエチルエーテルで破壊した。最初に、５００μｌのトリス緩衝生理食塩水を、各チューブに加え（次いで氷上に保持した、非乳化の対照サンプルを含む）、次いで、段階を分けて、各回で２分／１３，０００ｒｐｍの遠心分離を伴って、１倍の０．５ｍｌのエーテル、２倍の１．０ｍｌエーテル、１倍の０．５ｍｌエーテルの抽出手順を使用した。全ての水相中の物質（非乳化の対照サンプルを含む）を次いで、４０μｇのグリコーゲン／０．３Ｍの酢酸ナトリウム／３倍容積のエタノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、及び１０μｌのＴＥ中で再構成した。
【０３１４】
各々エマルジョン介在のコンパートメント化を伴ったまたは伴わない酵素再配列条件下で、それぞれＢＨ及びＦＨ付加体（ＡｇｅＩｄｅ予備切断）の「ｈｉｇｈ  ｃｏｎｓｅｎｔｒａｔｉｏｎ（高濃度）」としての５．１０９分子、及び「ｌｏｗ  ｃｏｎｓｅｎｔｒａｔｉｏｎ（低濃度）」としての１０８分子のインプットで、試験を実施した。
【０３１５】
検出感度を高めるために、乳化後産物の解析に、入れ子形式のプライマー戦略を使用した。上記再配列特異性プライマーに対して、一組の第一ラウンドプライマーの各５′を使用した。
Ｔｒｚ．Ｆ＋Ｔ：ＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＡＡＣＣＣＡＴ（上記配列、Ｔｒｚ．Ｆ＋Ｔｅの上流）（ＳＥＱ  ＩＤ番号８４）、
Ｔｒｚ．Ｒ＋Ｃ：ＧＣＣＴＣＴＡＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣ（上記配列、Ｔｒｚ．Ｒ＋Ｃｅの上流）（ＳＥＱ  ＩＤ番号８５）、
Ｔｒｚ．Ｆ＋Ａ：ＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＡＡＣＣＣＡＡ（上記配列、Ｔｒｚ．Ｆ＋Ａｅの上流）（ＳＥＱ  ＩＤ番号８６）、
Ｔｒｚ．Ｒ＋Ａ：ＧＣＣＴＣＴＡＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＡ（上記配列、Ｔｒｚ．Ｒ＋Ａｅの上流）（ＳＥＱ  ＩＤ番号８７）。
【０３１６】
そのような実験結果を、図６６に示す。期待したように、たとえ低濃度付加体であっても、コンパートメント化が無い状態で、ＢＨ及びＦＨの両再配列産物が、交差バンドを伴って観察された（レーンＬ−Ｃｔ，図６６）。高濃度付加体を、乳化のためにスピン及び超音波の両方に供し、また明確な交差バンドを示した（レーンＨ−Ｓｃ、図６６）。しかしながら、低濃度付加体混合物は、乳化に対してスピンのみか、またはスピン＋超音波に供したかに関わらず、交差の証拠がなく、直接ＢＨ及びＦＨ再配列産物のバンドだけを示した。
【０３１７】
以下のことが結論付けられた。１）このモデルシステムは、生体外微小コンパートメント内における、再配列プロセス封じ込めに対する検証試験であった。２）多量の付加体混合物は、そのＩＶＣプロセスを飽和状態にすることができ、非コンパートメント化物質を存続させ、及び交差を生じさせることができる。及び３）適切な量（１０８分子またはそれ以下）の付加体混合物は、そのＩＶＣによって含有され得、分子特異の再配列が、検出され得る。
【０３１８】
実施例２１：環状化及び逆ＰＣＲによる、ＣＬＯＳＥ５′−３′結合クローンの増幅（想定事例）
非増幅可能な５′−３′ＣＬＯＳＥ接合（しかし５′−５′または３′−３′ではない）の場合において、微小コンパートメント化に加えて、互換的な戦略が存在する。ここで、接合したＣＬＯＳＥの一本鎖の５′及び３′末端は、定義された配列であり、そのため各々に対する相補的オリゴヌクレオチドを、アニール処理でき、したがって、自己連結反応の目的に対応した５′−オーバーハングを与える（末端に定められた配列を有するＣＬＯＳＥクローンは、自己環状化を生じるのに適切な長さである）。酵素による環状化において、プライマーＰ１及びＰ２（図６７）は、その不規則領域内に持ち込まれた情報（各ＣＬＯＳＥクローンに特異的な配列）を含んで、逆増幅を可能にする。
【０３１９】
この環状化は、望ましい分子内環状化とは対照的に、分子間連結反応の可能性を最小限に抑えるために、低濃度で実行される必要がある。
【０３２０】
本明細書に記載されたものに加えて、記載された主題の様々な修正が、前述の説明から、当業者には明らかであろう。そのような修正もまた、付随の請求項の範囲内に収まることを意図している。本出願に載った各参照（非限定的に、学術文献、米国及び米国以外の特許、特許出願の広報、国際特許出願の広報、遺伝子バンク登録番号などを含む）は、その全体を参照として、本明細書に組み入れる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
2018500892.tif 000091
【図５２Ｃ】
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【図５２Ｄ】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
2018500892.tif 000100
【図６０】
2018500892.tif 000101
【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
2018500892.tif 000106
【図６６】
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【図６７】
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【配列表】
2018500892000001.app
【国際調査報告】
2018500892.tif 000109
2018500892.tif 000110
2018500892.tif 000111