(57)【要約】  本発明は、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、およびグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸を生産するための組み換え微生物および方法に関する。
2018503388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１７または配列番号１８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するキメラポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の配列同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｄ）配列番号９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子；
である、少なくとも１つの組み換え遺伝子を含む、組み換え宿主細胞であって、
ここで、組み換え宿主細胞は、細胞培養液において、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を生産することが可能である、
前記組み換え宿主細胞。
【請求項２】
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドが、配列番号１１の残基９３、９９、１１４、１４４、１４８、１５２、１９５、１９６、１９９、２１１、２１３、２２１、２８６、３８４、４２６、４３８、または４６６で少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドを含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３】
ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドが、配列番号７の残基２１、４８、４９、８４、８６、８７、９１、９２、９５、１２２、３３４、または３３４で少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項４】
ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドが、配列番号９の残基２３、２６、５５、１４６、２５７、２８３、および３３７で少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項５】
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドが、配列番号１１のＰ９３Ｖ、Ｓ９９Ｉ、Ｓ１１４Ｆ、Ｔ１４４Ｋ、Ｔ１４４Ｌ、Ｔ１４４Ｍ、Ａ１４８Ｋ、Ｍ１５２Ｔ、Ｌ１９５Ｇ、Ｌ１９５Ｃ、Ｌ１９５Ｓ、Ｌ１９５Ｎ、Ｌ１９５Ｖ、Ｖ１９６Ｐ、Ｋ１９９Ｃ、Ｌ２１１Ｈ、Ｌ２１１Ｍ、Ｌ２１１Ｉ、Ｌ２１１Ｃ、Ｌ２１１Ｔ、Ｌ２１３Ｅ、Ｓ２２１Ｉ、Ｖ２８６Ｃ、Ｖ２８６Ｎ、Ｖ２８６Ｓ、Ｇ３８４Ｗ、Ｇ３８４Ｋ、Ｇ３８４Ｙ、Ｅ４２６Ｇ、Ｅ４３８Ｈ、３４３８ＭまたはＡ４６６Ｖを含むＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド変異体の１以上を含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項６】
ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドが、配列番号７のＱ２１Ｌ、Ｑ２１Ｔ、Ｑ２１Ｖ、Ｆ４８Ｓ、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｒ、Ｆ４８Ｑ、Ｆ４８Ｗ、Ｆ４８Ｔ、Ｉ４９Ｖ、Ｓ８４Ｇ、Ｓ８４Ａ、Ｓ８４Ｔ、Ｓ８４Ｃ、Ｓ８４Ｐ、Ｓ８４Ｎ、Ｓ８４Ｖ、Ｐ８６Ｒ、Ｐ８６Ｇ、Ｉ８７Ｈ、Ｉ８７Ｐ、Ｉ８７Ｍ、Ｉ８７Ｙ、Ｌ９１Ｋ、Ｌ９１Ｒ、Ｌ９１Ｔ、Ｌ９２Ｆ、Ｌ９２Ｉ、Ｌ９２Ｍ、Ｉ９５Ｋ、Ｆ１２２Ｓ、Ｌ３３４ＳまたはＬ３３４Ｍを含むＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド変異体の１以上を含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項７】
ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドが、配列番号９のＱ２３Ｈ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ１４６Ｇ、Ｈ１５５Ｌ、Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２５３Ｗ、Ｔ２８４Ｇ、Ｓ２８３Ｎ、Ｋ３３７ＰまたはＴ５５Ｋを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド変異体の１以上を含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項８】
（ａ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｆ）ｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｈ）ＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする遺伝子；
である、少なくとも１つの組み換え遺伝子をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞であって、
ここで、組み換え宿主細胞が、細胞培養液において、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を生産することが可能である、
前記組み換え宿主細胞。
【請求項９】
（ａ）ＧＧＰＰＳポリペプチドが、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、または配列番号１１６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｂ）ＣＤＰＳポリペプチドが、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号４２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｃ）ＫＳポリペプチドが、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、または配列番号５２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｄ）ＫＯポリペプチドが、配列番号６０、配列番号６２、配列番号１１７、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、または配列番号７６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｅ）ＣＰＲポリペプチドが、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｆ）ＫＡＨポリペプチドが、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、または配列番号１１４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｇ）ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドが、配列番号４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｈ）ＥＵＧＴ１１ポリペプチドが、配列番号１６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含む、
請求項８に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１０】
細胞培養液が、
（ａ）組み換え宿主細胞によって生産された、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物、
（ｂ）グルコース、フルクトースおよび／またはスクロース；および／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素原礎培地（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１１】
組み換え宿主が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１２】
細菌細胞が、エスケリキア（Escherichia）細胞、ラクトバシラス（Lactobacillus）細胞、ラクトコッカス（Lactococcus）細胞、コルネバクテリウム（Cornebacterium）細胞、アセトバクター（Acetobacter）細胞、アシネトバクター（Acinetobacter）細胞、またはシュードモナス（Pseudomonas）細胞を含む、請求項１１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１３】
真菌細胞が酵母細胞を含む、請求項１１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１４】
酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、アシュビア・ゴシピ（Ashbya gossypii）、シバリンドネラ・ジャディニ（Cyberlindnera jadinii）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、クルイヴェロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）、アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）、キサントフィロミセス・デンドロラス（Xanthophyllomyces dendrorhous）、またはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）種からの細胞である、請求項１３に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１５】
酵母細胞がサッカロミセス属（Saccharomycete）である、請求項１４に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１６】
酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエ種からの細胞である、請求項１５に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１７】
培地において１以上の遺伝子が発現される条件下で請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞を成長させることを含む、細胞培養液においてステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を生産する方法であって、
ここで、少なくとも１つの遺伝子が組み換え遺伝子である；
ここで、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物が組み換え宿主細胞によって生産される、
前記方法。
【請求項１８】
１以上の遺伝子が恒常的に発現され、および／または１以上の遺伝子の発現が誘導される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）配列番号１１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド；
（ｂ）配列番号１７または配列番号１８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するキメラポリペプチド；
（ｃ）配列番号７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の配列同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；および／または
（ｄ）配列番号９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；
の１以上を使用する、植物に由来する成分または合成ステビオールまたはステビオールグリコシドの全細胞生物変換を含む、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を生産するための方法であって、
ここで、少なくとも１つのポリペプチドが組み換えポリペプチドである、
前記方法。
【請求項２０】
全細胞が、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組み換え宿主細胞が、ある温度で一定期間、発酵槽において成長され、ここで当該温度および期間は、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の生産を促進する、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）配列番号１１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド；
（ｂ）配列番号１７または配列番号１８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するキメラポリペプチド；
（ｃ）配列番号７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の配列同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；および／または
（ｄ）配列番号９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド
の１以上および植物に由来する成分または合成ステビオールまたはステビオールグリコシドを反応混合物に添加すること、
ここで、少なくとも１つのポリペプチドが組み換えポリペプチドである；および
反応混合物においてステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を合成すること
を含む、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を生産するためのin vitroの方法。
【請求項２３】
ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を単独または組み合わせて細胞培養液から単離することをさらに含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
単離工程が、
（ａ）ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を単独または組み合わせて含む細胞培養液を提供すること；
（ｂ）細胞培養液の固相から細胞培養液の液相を分離して、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を単独または組み合わせて含む上清を得ること；
（ｃ）充填カラムにおいて吸着樹脂を提供することを含む、１以上の吸着樹脂を提供すること；および
（ｄ）工程（ｂ）の上清を１以上の吸着樹脂と接触させて、少なくとも一部のステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を単独または組み合わせて得、それによってステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を単独または組み合わせて単離すること
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を単独で、またはステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を含む組成物を回収することをさらに含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
回収された組成物が、ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に対して、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物について濃縮され、および、植物に由来するステビア抽出物に対して、低減されたレベルの非ステビオールグリコシドのステビア植物に由来する成分を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞培養液が、
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞によって生産された、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上、
（ｂ）グルコース、フルクトース、および／またはスクロース；および／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、および／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
反応混合物が、
（ａ）反応混合物において生産された、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上；
（ｂ）ＵＧＴポリペプチド；
（ｃ）ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／またはＮ−アセチルグルコサミン；および／または
（ｄ）反応バッファーおよび／または塩
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
組み換え宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を含む、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
細菌細胞が、エスケリキア細胞、ラクトバシラス細胞、ラクトコッカス細胞、コルネバクテリウム細胞、アセトバクター細胞、アシネトバクター細胞、またはシュードモナス細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
真菌細胞が酵母細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピ、シバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイヴェロミセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロラス、またはカンジダ・アルビカンス種からの細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
酵母細胞がサッカロミセス属である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエ種からの細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞または請求項１７〜３４のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、
（ａ）ステビオールグリコシドが、１３−ＳＭＧ、１９−ＳＭＧ、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ、ジグリコシル化トリグリコシル化ステビオール、テトラグリコシル化ステビオール、ペンタグリコシル化ステビオール、ヘキサグリコシル化ステビオール、ヘプタグリコシル化ステビオール、および／またはその異性体を含む；
（ｂ）グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物が、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、および／またはその異性体を含む；および／または
（ｃ）グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物が、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、および／またはその異性体を含む、
前記組み換え宿主細胞または方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組み換え宿主細胞または方法であって、ここで、
（ａ）ジグリコシル化ステビオールが、表１の化合物２．２３を含む；
（ｂ）トリグリコシル化ステビオールが、表１の化合物３．１および／または化合物３．３４を含む；
（ｃ）テトラグリコシル化ステビオールが、表１の化合物４．２６および／または化合物４．３３を含む；
（ｄ）ペンタグリコシル化ステビオールが、表１の化合物５．２２、化合物５．２４、および／または化合物５．２５を含む；
（ｅ）ヘキサグリコシル化ステビオールが、表１の化合物６．１および／または化合物６．２３を含む；
（ｆ）ヘプタグリコシル化ステビオールが、表１の化合物７．２、化合物７．５、および／または化合物７．１３を含む；
（ｇ）グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物が、表１の化合物ＫＡ３．１、化合物ＫＡ３．２、および／または化合物ＫＡ２．７を含む；および／または
（ｈ）グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物が、表１の化合物ＫＬ３．６とともに共溶出される化合物ＫＬ２．８および／または化合物ＫＬ３．１を含む、
前記組み換え宿主細胞または方法。
【請求項３７】
（ａ）化合物４．２６が、構造：
【化１】
2018503388.tif 000103
を有し、
（ｂ）化合物５．２２が、構造：
【化２】
2018503388.tif 000104
を有し、
（ｃ）化合物６．１が、構造：
【化３】
2018503388.tif 000105
を有し、
（ｄ）化合物７．２が、構造：
【化４】
2018503388.tif 000106
を有し、
（ｅ）化合物７．５が、構造：
【化５】
2018503388.tif 000107
を有し、
（ｆ）化合物ＫＡ３．１が、構造：
【化６】
2018503388.tif 000108
を有し、
（ｇ）化合物ＫＡ３．２が、構造：
【化７】
2018503388.tif 000109
を有し、および
（ｈ）化合物ＫＬ３．１が、構造：
【化８】
2018503388.tif 000110
を有する、
請求項３６に記載の組み換え宿主細胞または方法。
【請求項３８】
組成物が、ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に対して、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、またはその異性体について濃縮されたステビオールグリコシド組成を有し、および、植物に由来するステビア抽出物に対して、低減されたレベルの非ステビオールグリコシドのステビア植物に由来する成分を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞によって生産されたステビオールグリコシド組成物または請求項１７〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞；および
（ｂ）組み換え宿主細胞によって生産された、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上；
を含む、細胞培養液であって、ここで、１以上のステビオールグリコシドが、培養液の少なくとも１ｍｇ／リットルの濃度で存在する、前記細胞培養液。
【請求項４０】
（ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞によって生産された、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、エタノール、および／またはグリセロール；および／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、および／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含む、細胞培養液。
【請求項４１】
（ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞によって生産された、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、エタノール、グリセロール、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／またはＮ−アセチルグルコサミン；および／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、および／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含む、細胞ライセート。
【請求項４２】
（ａ）反応混合物において生産された、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上；
（ｂ）ＵＧＴポリペプチド；
（ｃ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、エタノール、グリセロール、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／またはＮ−アセチルグルコサミン；および／または
（ｄ）反応バッファーおよび／または塩
を含む、反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
本発明の分野
この開示は、組み換え宿主におけるステビオールグリコシドおよびステビオールグリコシド前駆体の組み換え生産に関する。特に、この開示は、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド（Ｒｕｂｕ）、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ジグリコシル化ステビオール、トリグリコシル化ステビオール、テトラグリコシル化ステビオール、ペンタグリコシル化ステビオール、ヘキサグリコシル化ステビオール、ヘプタグリコシル化ステビオール、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、および／またはその異性体を含むステビオールグリコシドの組み換え宿主における生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の記載
甘味料は、食品、飲料、または製菓産業において最も一般的に使用される成分としてよく知られている。甘味料は、生産の間に最終的な食品中に取り込まれ得るか、または、適切に希釈されたとき、卓上用の甘味料またはパン焼きにおける砂糖の家庭用の代替品として独立して使用され得る。甘味料は、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、および蜂蜜などの天然甘味料ならびにアスパルテーム、サッカリン、およびスクラロースなどの人工甘味料を含む。ステビア抽出物は、多年生灌木ステビア・レバウディアナから単離され、抽出され得る天然甘味料である。ステビアは、ステビア抽出物の商業的生産のために、南アメリカおよびアジアにおいて一般的に成育される。様々な程度まで精製されたステビア抽出物は、食品およびブレンドにおける高い強度の甘味料として、または卓上用の甘味料として単独で商業的に使用される。
【０００３】
ジテルペンステビオールおよび様々なステビオールグリコシドを含むいくつかのステビオールグリコシドの化学構造は、図１に示される。ステビア植物の抽出物は、一般に甘いフレーバーに寄与するステビオールグリコシドを含むが、各ステビオールグリコシドの量はしばしば変化し、とりわけ種々の生産バッチ間で変化する。
【０００４】
ステビア植物からのステビオールグリコシドの回収および精製は、労働集約的であり、非効率的であることが証明されたことから、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭなどの所望のステビオールグリコシドの高い収量を蓄積し得る組み換え生産システムについて需要が残っている。商業的使用のための組み換え宿主におけるステビオールグリコシドの改善された生産についてもまた需要が残っている。さらに、１以上の特定のステビオールグリコシドを生産するための、特定の基質に対して選択的な酵素を同定することについて需要が残っている。いくつかの側面において、より高収量のステビオールグリコシドを生産するための、１９−Ｏグリコシル化活性を有する酵素の触媒能を増加させる需要が残っている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の概要
本発明が先行技術を超える所定の利点および進歩を提供することは、上記背景に対するものである。
【０００６】
ここで開示されるこの発明は、特定の利点または機能性に限定されないが、本発明は、
（ａ）配列番号１１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１７または配列番号１８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するキメラポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の配列同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｄ）配列番号９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、組み換え宿主細胞は、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を細胞培養液において生産することが可能である、
である少なくとも１つの組み換え遺伝子を含む、組み換え宿主細胞を提供する。
【０００７】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドは、配列番号１１の残基９３、９９、１１４、１４４、１４８、１５２、１９５、１９６、１９９、２１１、２１３、２２１、２８６、３８４、４２６、４３８、または４６６で少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドを含む。
【０００８】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは、配列番号７の残基２１、４８、４９、８４、８６、８７、９１、９２、９５、１２２、３３４、または３３４で少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含む。
【０００９】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、配列番号９の残基２３、２６、５５、１４６、２５７、２８３、および３３７で少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含む。
【００１０】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドは、配列番号１１のＰ９３Ｖ、Ｓ９９Ｉ、Ｓ１１４Ｆ、Ｔ１４４Ｋ、Ｔ１４４Ｌ、Ｔ１４４Ｍ、Ａ１４８Ｋ、Ｍ１５２Ｔ、Ｌ１９５Ｇ、Ｌ１９５Ｃ、Ｌ１９５Ｓ、Ｌ１９５Ｎ、Ｌ１９５Ｖ、Ｖ１９６Ｐ、Ｋ１９９Ｃ、Ｌ２１１Ｈ、Ｌ２１１Ｍ、Ｌ２１１Ｉ、Ｌ２１１Ｃ、Ｌ２１１Ｔ、Ｌ２１３Ｅ、Ｓ２２１Ｉ、Ｖ２８６Ｃ、Ｖ２８６Ｎ、Ｖ２８６Ｓ、Ｇ３８４Ｗ、Ｇ３８４Ｋ、Ｇ３８４Ｙ、Ｅ４２６Ｇ、Ｅ４３８Ｈ、３４３８ＭまたはＡ４６６Ｖを含む１以上のＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド変異体を含む。
【００１１】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは、配列番号７のＱ２１Ｌ、Ｑ２１Ｔ、Ｑ２１Ｖ、Ｆ４８Ｓ、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｒ、Ｆ４８Ｑ、Ｆ４８Ｗ、Ｆ４８Ｔ、Ｉ４９Ｖ、Ｓ８４Ｇ、Ｓ８４Ａ、Ｓ８４Ｔ、Ｓ８４Ｃ、Ｓ８４Ｐ、Ｓ８４Ｎ、Ｓ８４Ｖ、Ｐ８６Ｒ、Ｐ８６Ｇ、Ｉ８７Ｈ、Ｉ８７Ｐ、Ｉ８７Ｍ、Ｉ８７Ｙ、Ｌ９１Ｋ、Ｌ９１Ｒ、Ｌ９１Ｔ、Ｌ９２Ｆ、Ｌ９２Ｉ、Ｌ９２Ｍ、Ｉ９５Ｋ、Ｆ１２２Ｓ、Ｌ３３４ＳまたはＬ３３４Ｍを含む１以上のＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド変異体を含む。
【００１２】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、配列番号９のＱ２３Ｈ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ１４６Ｇ、Ｈ１５５Ｌ、Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２５３Ｗ、Ｔ２８４Ｇ、Ｓ２８３Ｎ、Ｋ３３７ＰまたはＴ５５Ｋを含む１以上のＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド変異体を含む。
【００１３】
一側面において、ここで開示される組み換え宿主細胞は、
（ａ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｆ）ｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｈ）ＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、組み換え宿主細胞は、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を細胞培養液において生産することが可能である、
である少なくとも１つの組み換え遺伝子をさらに含む。
【００１４】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、
（ａ）ＧＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、または配列番号１１６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｂ）ＣＤＰＳポリペプチドは、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号４２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｃ）ＫＳポリペプチドは、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、または配列番号５２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｄ）ＫＯポリペプチドは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号１１７、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、または配列番号７６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｅ）ＣＰＲポリペプチドは、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｆ）ＫＡＨポリペプチドは、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、または配列番号１１４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｇ）ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、配列番号４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｈ）ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、配列番号１６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１５】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、細胞培養液は、
（ａ）組み換え宿主細胞によって生産されたステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物、
（ｂ）グルコース、フルクトースおよび／またはスクロース；および／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素原礎培地（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含む。
【００１６】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、組み換え宿主は、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を含む。
【００１７】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、細菌細胞は、エスケリキア（Escherichia）細胞、ラクトバシラス（Lactobacillus）細胞、ラクトコッカス（Lactococcus）細胞、コルネバクテリウム（Cornebacterium）細胞、アセトバクター（Acetobacter）細胞、アシネトバクター（Acinetobacter）細胞、またはシュードモナス（Pseudomonas）細胞を含む。
【００１８】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、真菌細胞は酵母細胞を含む。
【００１９】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、アシュビア・ゴシピ（Ashbya gossypii）、シバリンドネラ・ジャディニ（Cyberlindnera jadinii）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、クルイヴェロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）、アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）、キサントフィロミセス・デンドロラス（Xanthophyllomyces dendrorhous）、またはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）種からの細胞である。
【００２０】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、酵母細胞はサッカロミセス属（Saccharomycete）である。
【００２１】
ここで開示される組み換え宿主細胞の一側面において、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ種からの細胞である。
【００２２】
本発明は、ここで開示される組み換え宿主細胞を、１以上の遺伝子が発現される条件下で、培地において成長させることを含む、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を細胞培養液において生産する方法であって；
ここで、少なくとも１つの遺伝子は組み換え遺伝子である；
ここで、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物は組み換え宿主細胞によって生産される、
である、前記方法もまた提供する。
【００２３】
ここで開示される方法の一側面において、１以上の遺伝子は恒常的に発現され、および／または１以上の遺伝子の発現は誘導される。
【００２４】
本発明は、
（ａ）配列番号１１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド；
（ｂ）配列番号１７または配列番号１８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するキメラポリペプチド；
（ｃ）配列番号７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の配列同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；および／または
（ｄ）配列番号９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；
ここで、少なくとも１つのポリペプチドは組み換えポリペプチドである、
の１以上を使用する、植物に由来する成分または合成ステビオールまたはステビオールグリコシドの全細胞生物変換を含む、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を生産するための方法もまた提供する。
【００２５】
ここで開示される方法の一側面において、全細胞はここで開示される組み換え宿主細胞である。
【００２６】
ここで開示される方法の一側面において、組み換え宿主細胞は、発酵槽においてある温度で一定期間成長され、ここで温度および一定期間は、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の生産を促進する。
【００２７】
本発明は、
（ａ）配列番号１１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド；
（ｂ）配列番号１７または配列番号１８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するキメラポリペプチド；
（ｃ）配列番号７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の配列同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；および／または
（ｄ）配列番号９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、
および植物に由来する成分または合成ステビオールまたはステビオールグリコシドの１以上を反応混合物へ添加すること；
ここで、少なくとも１つのポリペプチドは組み換えポリペプチドである；および
（ｂ）反応混合物において、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を合成すること
を含む、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を生産するためのin vitroの方法もまた提供する。
【００２８】
一側面において、ここで開示される方法は、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を、単独または組み合わせて、細胞培養液から単離することをさらに含む。
【００２９】
ここで開示される方法の一側面において、単離工程は、
（ａ）ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を単独または組み合わせて含む細胞培養液を提供すること；
（ｂ）細胞培養液の固相から細胞培養液の液相を分離して、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を単独または組み合わせて含む上清を得ること；
（ｃ）１以上の吸着樹脂を提供すること（充填カラムにおいて吸着樹脂を提供することを含む）；および
（ｄ）ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の少なくとも一部を単独または組み合わせて得、それによってステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を単独または組み合わせて単離するために、工程（ｂ）の上清を１以上の吸着樹脂に接触させること
を含む。
【００３０】
一側面において、ここで開示される方法は、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を単独で回収すること、またはステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物を含む組成物を回収することをさらに含む。
【００３１】
ここで開示される方法の一側面において、回収された組成物は、ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に対してステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物について濃縮され、植物に由来するステビア抽出物に対して低減されたレベルの非ステビオールグリコシドのステビア植物に由来する成分を有する。
【００３２】
ここで開示される方法の一側面において、細胞培養液は、
（ａ）ここで開示される組み換え宿主細胞によって生産されたステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上、
（ｂ）グルコース、フルクトース、および／またはスクロース；および／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、および／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含む。
【００３３】
ここで開示される方法の一側面において、反応混合物は、
（ａ）反応混合物において生産されたステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上；
（ｂ）ＵＧＴポリペプチド；
（ｃ）ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／またはＮ−アセチルグルコサミン；および／または
（ｄ）反応バッファーおよび／または塩
を含む。
【００３４】
ここで開示される方法の一側面において、組み換え宿主細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を含む。
【００３５】
ここで開示される方法の一側面において、細菌細胞は、エスケリキア細胞、ラクトバシラス細胞、ラクトコッカス細胞、コルネバクテリウム細胞、アセトバクター細胞、アシネトバクター細胞、またはシュードモナス細胞を含む。
【００３６】
ここで開示される方法の一側面において、真菌細胞は、酵母細胞を含む。
【００３７】
ここで開示される方法の一側面において、酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピ、シバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイヴェロミセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロラス、またはカンジダ・アルビカンス種からの細胞である。
【００３８】
ここで開示される方法の一側面において、酵母細胞はサッカロミセス属である。
【００３９】
ここで開示される方法の一側面において、酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ種からの細胞である。
【００４０】
ここで開示される組み換え宿主および方法の一側面において、
（ａ）ステビオールグリコシドは、１３−ＳＭＧ、１９−ＳＭＧ、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ、ジグリコシル化トリグリコシル化ステビオール、テトラグリコシル化ステビオール、ペンタグリコシル化ステビオール、ヘキサグリコシル化ステビオール、ヘプタグリコシル化ステビオール、および／またはその異性体を含む；
（ｂ）グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物は、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、および／またはその異性体を含む；および／または
（ｃ）グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物は、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、および／またはその異性体を含む。
【００４１】
ここで開示される組み換え宿主および方法の一側面において、
（ａ）ジグリコシル化ステビオールは、表１の化合物２．２３を含む；
（ｂ）トリグリコシル化ステビオールは、表１の化合物３．１および／または化合物３．３４を含む；
（ｃ）テトラグリコシル化ステビオールは、表１の化合物４．２６および／または化合物４．３３を含む；
（ｄ）ペンタグリコシル化ステビオールは、表１の化合物５．２２、化合物５．２４、および／または化合物５．２５を含む；
（ｅ）ヘキサグリコシル化ステビオールは、表１の化合物６．１および／または化合物６．２３を含む；
（ｆ）ヘプタグリコシル化ステビオールは、表１の化合物７．２、化合物７．５、および／または化合物７．１３を含む；
（ｇ）グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物は、表１の化合物ＫＡ３．１、化合物ＫＡ３．２、および／または化合物ＫＡ２．７を含む；および／または
（ｈ）グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物は、表１の化合物ＫＬ３．６とともに共溶出される化合物ＫＬ２．８および／または化合物ＫＬ３．１を含む。
【００４２】
ここで開示される組み換え宿主および方法の一側面において、
（ａ）化合物４．２６は、構造：
【化１】
2018503388.tif 000003
を有し、
（ｂ）化合物５．２２は、構造：
【化２】
2018503388.tif 000004
を有し、
（ｃ）化合物６．１は、構造：
【化３】
2018503388.tif 000005
を有し、
（ｄ）化合物７．２は、構造：
【化４】
2018503388.tif 000006
を有し、
（ｅ）化合物７．５は、構造：
【化５】
2018503388.tif 000007
を有し、
（ｆ）化合物ＫＡ３．１は、構造：
【化６】
2018503388.tif 000008
を有し、
（ｇ）化合物ＫＡ３．２は、構造：
【化７】
2018503388.tif 000009
を有し、
（ｈ）化合物ＫＬ３．１は、構造：
【化８】
2018503388.tif 000010
を有する。
【００４３】
ここで開示される組み換え宿主および方法の一側面において、
（ａ）トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸は、構造：
【化９】
2018503388.tif 000011
を有する化合物を含み、
（ｂ）ペンタグリコシル化ステビオールは、構造：
【化１０】
2018503388.tif 000012
を有する化合物を含み、
（ｃ）ヘキサグリコシル化ステビオールは、構造：
【化１１】
2018503388.tif 000013
を有する化合物を含み、
（ｄ）ヘプタグリコシル化ステビオールは、構造：
【化１２】
2018503388.tif 000014
を有する化合物を含む。
【００４４】
本発明は、ここで開示される組み換え宿主細胞またはここで開示される方法によって生産されたステビオールグリコシド組成物もまた提供し、ここで組成物は、ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に対してＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、またはその異性体について濃縮されたステビオールグリコシド組成を有し、植物に由来するステビア抽出物に対して低減されたレベルの非ステビオールグリコシドのステビア植物に由来する成分を有する。
【００４５】
本発明は、
（ａ）ここで開示される組み換え宿主細胞；および
（ｂ）組み換え宿主細胞によって生産されたステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上；
ここで、ステビオールグリコシドの１以上は、培養液の少なくとも１ｍｇ／リットルの濃度で存在する
を含む細胞培養液もまた提供する。
【００４６】
本発明は、
（ａ）ここで開示される組み換え宿主細胞によって生産されたステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、エタノール、および／またはグリセロール；および／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、および／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含む細胞培養液もまた提供する。
【００４７】
本発明は、
（ａ）ここで開示される組み換え宿主細胞によって生産されたステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、エタノール、グリセロール、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／またはＮ−アセチルグルコサミン；および／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、および／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含む細胞ライセートもまた提供する。
【００４８】
本発明は、
（ａ）反応混合物において生産されたステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の１以上；
（ｂ）ＵＧＴポリペプチド；
（ｃ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、エタノール、グリセロール、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／またはＮ−アセチルグルコサミン；および／または
（ｄ）反応バッファーおよび／または塩
を含む反応混合物もまた提供する。
【００４９】
本発明のこれらのおよび他の特徴および利点は、付随する請求項と一緒になされた以下の詳細な記載からより完全に理解されるであろう。請求項の範囲は、その詳述によって定義され、本記載に示された特徴および利点の特定の議論によって定義されないことに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
図面の簡潔な記載
本発明の実施態様の以下の詳細な記載は、以下の図面と併せて読まれたときに最も理解され得、ここで同様の構造は同様の参照数字で示され、ここで：
【００５１】
【図１】図１は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）、ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、およびｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドを使用して、酵母においてゲラニルゲラニル二リン酸からステビオールを生産するための、操作された生合成経路の模式図を示す。
【００５２】
【図２】図２は、好適なウリジン５’−ジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素によって触媒される代表的なステビオールグリコシドグリコシル化反応およびいくつかのステビオールグリコシド化合物の化学構造を示す。
【００５３】
【図３】図３は、ＫＯによって触媒されるステビオール経路工程について、ステビオール合成中間体、ｅｎｔ−カウレノール、およびその生物変換産物、ｅｎｔ−カウレン酸を、潜在的なグリコシル化副産物（モノ−、ジ−、および／またはトリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノールおよびモノ−、ジ−、またはトリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸）と併せて示す。
【００５４】
【図４Ａ】図４Ａは、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号７）を欠失したステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株による、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、およびｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を示す。例６を参照。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号７）を欠失したステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株による、１９−ＳＭＧの蓄積を示す。例６を参照。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号７）を欠失したステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株による、ステビオール、ステビオール＋２Ｇｌｃ（＃２３）、およびステビオール＋３Ｇｌｃ（＃３４）の蓄積を示す。例６を参照。
【００５５】
【図５】図５は、ＵＧＴ８５Ｃ２変異体を含む細菌ライセートによる、ステビオールのルブソシドへの変換を示す。細菌ライセートは、ステビオールを用いて２４ｈインキュベートされた。例７を参照。
【００５６】
【図６Ａ】図６Ａは、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照のステビオールグリコシドを生産する株（黒色のバー）と比較した、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌを発現するステビオールグリコシドを生産する株（灰色のバー）におけるＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、１３−ＳＭＧ、およびルブソシドの生産を示す。例９を参照。
【図６Ｂ】図６Ｂは、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株（黒色のバー）と比較した、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌを発現するステビオールグリコシドを生産する株（灰色のバー）における１，２−ビオシド、ルブソシド（Ｒｕｂｕ）、ＲｅｂＧ、およびＲｅｂＥの生産を示す。例９を参照。
【図６Ｃ】図６Ｃは、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株（黒色のバー）と比較した、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌを発現するステビオールグリコシドを生産する株（灰色のバー）における定量可能なステビオールグリコシド（１３−ＳＭＧ＋１，２−ビオシド＋Ｒｕｂｕ＋ＲｅｂＧ＋ＲｅｂＢ＋ＲｅｂＡ＋ＲｅｂＥ＋ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）およびＲｅｂＤ、さらにＲｅｂＭの力価の生産を示す。例９を参照。
【図６Ｄ】図６Ｄは、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株（黒色のバー）と比較した、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌを発現するステビオールグリコシドを生産する株（灰色のバー）における、トリグリコシル化ステビオール分子（ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１））、テトラグリコシル化ステビオール分子（ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６））、３種のペンタグリコシル化ステビオール分子（ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）、およびステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５））、２種のヘキサグリコシル化ステビオール分子（ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３））、および２種のヘプタグリコシル化ステビオール分子（ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）およびステビオール＋７Ｇｌｃ（＃１３））の生産を示す。例９を参照。
【００５７】
【図７Ａ】図７Ａは、ＮＭＲによって明らかにされた、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸（Ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１および２））、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ＋１ＧｌｃＮＡｃ、およびトリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール（ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１））の構造を示す。例６、８、および９を参照。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＮＭＲによって明らかにされた、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）およびステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の構造を示す。例６、８、および９を参照。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＮＭＲによって明らかにされた、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体４）およびステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体５）の構造を示す。例６、８、および９を参照。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＮＭＲによって明らかにされた、ステビオール＋４Ｇｌｃ＋１ＧｌｃＮＡｃ（＃１１）およびステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）の構造を示す。例６、８、および９を参照。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＮＭＲによって明らかにされた、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）およびステビオール＋７Ｇｌｃ（＃１４）の構造を示す。例６、８、および９を参照。
【００５８】
【図８Ａ−Ｃ】図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８Ｄ−Ｆ】図８Ｄ、８Ｅ、および８Ｆは、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８Ｇ−Ｉ】図８Ｇ、８Ｈ、および８Ｉは、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ＋１ＧｌｃＮＡｃについて、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８Ｊ−Ｌ】図８Ｊ、８Ｋ、および８Ｌは、ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８Ｍ−Ｐ】図８Ｍ、８Ｎ、８Ｏ、および８Ｐは、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８Ｑ−Ｔ】図８Ｑ、８Ｒ、８Ｓ、および８Ｔは、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８Ｕ−Ｘ】図８Ｕ、８Ｖ、８Ｗ、および８Ｘは、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体４）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８Ｙ−ＡＢ】図８Ｙ、８Ｚ、８ＡＡ、および８ＡＢは、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体５）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８ＡＣ−ＡＦ】図８ＡＣ、８ＡＤ、８ＡＥ、および８ＡＦは、ステビオール＋４Ｇｌｃ＋１ＧｌｃＮＡｃ（＃１１）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８ＡＧ−ＡＪ】図８ＡＧ、８ＡＨ、８ＡＩ、および８ＡＪは、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８ＡＫ−ＡＮ】図８ＡＫ、８ＡＬ、８ＡＭ、および８ＡＮは、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【図８ＡＯ−ＡＲ】図８ＡＯ、８ＡＰ、８ＡＱ、および８ＡＲは、ステビオール＋７Ｇｌｃ（＃１４）について、１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）を示す。例６、８、および９を参照。
【００５９】
【図９Ａ】図９Ａは、ＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエにおけるｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、およびｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を示す。例８を参照。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエにおける、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８）、および、ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（＃６）とともに共溶出されるｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を示す。例８を参照。
【００６０】
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＲｅｂＤを生産するＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエにおける、１，２−ステビオシド、ＲｅｂＧ、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の蓄積を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＲｅｂＭを生産するＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエにおける、１，２−ステビオシド、ＲｅｂＧ、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の蓄積を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエにおける、１３−ＳＭＧ、１，２−ビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、およびＲｅｂＭの蓄積を示す。例８を参照。
【００６１】
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｓ．セレビシエ ステビオールグリコシド生産株における、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８）、および、ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（＃６）とともに共溶出されるｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を示す（対照株は、３コピーの野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号９）を含んだ；変異体株は２コピーの野生型ＵＧＴ７６Ｇ１および１コピーのＵＧＴ７６Ｇ１変異体含んだ）。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエ ステビオールグリコシド生産株における、すべてのレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸（ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）＋ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）＋ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２））を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエ ステビオールグリコシド生産株における、すべてのレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール（ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（＃６）とともに共溶出されるｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）、および、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８））を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエ ステビオールグリコシド生産株における、１，２−ビオシド、１，２−ステビオシド、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）、およびステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体５）の蓄積を示す。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、ＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエ ステビオールグリコシド生産株における、１３−ＳＭＧ、１，２−ビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、およびＲｅｂＭの蓄積を示す。例８を参照。
【００６２】
当業者は、図における要素は、簡便性および明確性のために図示され、必ずしも縮尺に合わせて描かれたものではないことを理解するであろう。例えば、図におけるいくつかの要素の寸法は、本発明の実施態様（単数または複数）の理解の改善を助けるために、他の要素に対して誇張されたものであり得る。
【００６３】
本発明の詳細な記載
本発明を詳細に記載する前に、多数の用語が定義されるであろう。ここで使用されるとおり、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に規定しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「核酸」への参照は１以上の核酸を意味する。
【００６４】
「好ましくは」、「一般的に」および「典型的に」のような用語は、請求項に記載の発明の範囲を限定するために、または請求項に記載の発明の構造または機能に対して所定の特徴が重大、必須、またはさらに重要であることを意味するためにここでは用いられないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の実施態様において用いられ得るか、または用いられ得ない、代替的または追加の特徴を強調することを意図するにすぎない。
【００６５】
本発明を記載し、定義する目的のために、用語「実質的に」は、任意の定量的な比較、値、測定、または他の表現に寄与し得る不確実性の固有の程度を表わすためにここで用いられることに留意されたい。用語「実質的に」もまた、問題の主題の基本的な機能における変化をもたらすことなく、定量的な表示が記載される参照から変わり得る程度を表わすためにここで用いられる。
【００６６】
この発明によれば、当業者によく知られている方法が、遺伝子発現コンストラクトおよび組み換え細胞を構築するために使用され得る。これらの方法は、in vitroの組み換えＤＮＡ技術、合成技術、in vivoの組み換え技術、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を含む。例えば、Green & Sambrook, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al., 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA)に記載された技術を参照。
【００６７】
当業者によって理解されるとおり、文脈に依存して、一本鎖または二本鎖のいずれかの実施態様において、ここで使用されるとおり、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その誘導体、またはその組み合わせを含む核酸を指すように互換的に使用され得る。
【００６８】
ここで使用されるとおり、用語「微生物」、「微生物宿主」、「微生物宿主細胞」、「組み換え宿主」、および「組み換え宿主細胞」は、互換的に使用され得る。ここで使用されるとおり、用語「組み換え宿主」は、ゲノムが少なくとも１つのＤＮＡ配列によって増大した宿主を指すように意図される。かかるＤＮＡ配列は、天然に存在しない遺伝子、通常ＲＮＡに転写されないか、またはタンパク質に翻訳（「発現され」）ないＤＮＡ配列、および宿主に導入することが望まれる他の遺伝子またはＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない。典型的には、ここで記載される組み換え宿主のゲノムは、１以上の組み換え遺伝子の安定的な導入を通じて増大されることが理解されるであろう。一般に、導入されたＤＮＡは、ＤＮＡの受け手である宿主において元から存在していないが、所与の宿主からＤＮＡセグメントを単離すること、およびその後そのＤＮＡの１以上の追加のコピーを同じ宿主に導入すること、例えば、遺伝子の産物の生産を増強するか、または遺伝子の発現パターンを変更することは、この開示の範囲内である。いくつかの例において、導入されたＤＮＡは、例えば相同組み換えまたは部位特異的な変異誘発によって、内因性遺伝子またはＤＮＡ配列を改変するか、または置き換えさえもするであろう。好適な組み換え宿主は、微生物を含む。
【００６９】
ここで使用されるとおり、用語「組み換え遺伝子」は、同一もしくは同様な遺伝子またはＤＮＡ配列がすでにかかる宿主において存在し得るか否かに拘らず、受け手の宿主中へ導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を指す。この文脈における「導入された」または「増大された」は、人為的に導入または増大されたことを意味することが当該技術分野において知られる。したがって、組み換え遺伝子は、別の種からのＤＮＡ配列であり得るか、または同一の種を起源とするかもしくは同一の種において存在するが、組み換え方法によって宿主中へ取り込まれて組み換え宿主を形成するＤＮＡ配列であり得る。宿主中へ導入された組み換え遺伝子は、形質転換された宿主において通常存在するＤＮＡ配列と同一であり得、１以上の追加のコピーのＤＮＡを提供するために導入され、それによって、そのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変された発現を可能にすることが理解されるであろう。いくつかの側面において、当該組み換え遺伝子は、ｃＤＮＡによってコードされる。他の実施態様において、組み換え遺伝子は、合成であり、および／またはＳ．セレビシエにおける発現のためにコドン最適化されている。
【００７０】
ここで使用されるとおり、用語「操作された生合成経路」は、ここで記載される組み換え宿主において生じる生合成経路を指す。いくつかの側面において、生合成経路の１以上の工程は、未改変の宿主において天然に生じない。いくつかの実施態様において、遺伝子の異種バージョンは、遺伝子の内因性バージョンを含む宿主中へ導入される。
【００７１】
ここで使用されるとおり、用語「内因性」遺伝子は、特定の生物、組織、または細胞を起源とし、特定の生物、組織、または細胞内で生産されるか、または合成される遺伝子を指す。いくつかの実施態様において、内因性遺伝子は、酵母の遺伝子である。いくつかの実施態様において、遺伝子は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．セレビシエ株Ｓ２８８Ｃを含むが、これに限定されない）に対して内因性である。いくつかの実施態様において、内因性の酵母の遺伝子は、過剰発現される。ここで使用されるとおり、用語「過剰発現」は、野生型の生物における遺伝子発現のレベルよりも高いレベルの生物における遺伝子の発現を指すために使用される。例えば、Prelich, 2012, Genetics 190:841-54を参照。いくつかの実施態様において、内因性の酵母の遺伝子（例えば、ＡＤＨ）は、欠失される。例えば、Giaever & Nislow, 2014, Genetics 197(2):451-65を参照。ここで使用されるとおり、用語「欠失」、「欠失された」、「ノックアウト」および「ノックアウトされた」は、もはや生物（Ｓ．セレビシエを含むが、これに限定されない）において発現されないように操作された内因性遺伝子を指すために互換的に使用され得る。
【００７２】
ここで使用されるとおり、用語「異種配列」および「異種コーディング配列」は、組み換え宿主以外の種に由来する配列を記載するために使用される。いくつかの実施態様において、組み換え宿主はＳ．セレビシエ細胞であり、異種配列はＳ．セレビシエ以外の生物に由来する。異種コーディング配列は、例えば、異種配列を発現する組み換え宿主とは異なる原核微生物、真核微生物、植物、動物、昆虫、または真菌に由来し得る。いくつかの実施態様において、コーディング配列は、宿主に天然の配列である。
【００７３】
「選択可能なマーカー」は、宿主細胞の栄養要求性を補完する任意の数の遺伝子の１つであり得るか、抗生物質耐性を提供し得るか、または変色をもたらし得る。遺伝子代替ベクターの線状化されたＤＮＡフラグメントは、次いで、当該技術分野においてよく知られている方法（下記を参照）を使用して細胞中へ導入される。ゲノム中への線状フラグメントの統合および遺伝子の破壊は、選択マーカーに基づいて決定され得、例えば、ＰＣＲまたはサザンブロット分析によって実証され得る。選択におけるその使用に続いて、選択可能なマーカーは、例えば、Cre-LoxPシステム（例えばGossen et al., 2002, Ann. Rev. Genetics 36:153-173およびU.S. 2006/0014264を参照）によって、宿主細胞のゲノムから除去され得る。代替的には、遺伝子代替ベクターは、遺伝子の一部を含んで破壊されるように構築され得、ここで、当該部分が任意の内因性遺伝子プロモーター配列を欠き、何もコードしないか、または遺伝子のコーディング配列の不活性のフラグメントをコードする。
【００７４】
ここで使用されるとおり、用語「変異体」および「突然変異体」は、特定のタンパク質の野生型の配列と比較して、１以上のアミノ酸で改変されたタンパク質の配列を記載するために使用される。
【００７５】
ここで使用されるとおり、用語「不活性のフラグメント」は、遺伝子の全長コーディング配列から生産されたタンパク質の、例えば、約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のフラグメントである。遺伝子のかかる一部は、既知のプロモーター配列が遺伝子配列に作動可能に連結されないが、終止コドンおよび転写停止配列が遺伝子配列の部分に作動可能に連結されるようにベクターにおいて挿入される。このベクターは、その後、遺伝子配列の部分において線状化され、細胞中へ形質転換され得る。単一の相同組み換えを経て、この線状化されたベクターは、次いでその不活性化によって遺伝子の内因性の対応するものにおいて統合される。
【００７６】
ここで使用されるとおり、用語「ステビオールグリコシド」は、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）（CAS # 58543-16-1）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）（CAS # 58543-17-2）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）（CAS # 63550-99-2）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）（CAS # 63279-13-0）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）（CAS # 63279-14-1）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）（CAS # 438045-89-7）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）（CAS # 1220616-44-3）、ルブソシド（CAS # 63849-39-4）、ズルコシドＡ（CAS # 64432-06-0）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）（MassBank Record: FU000332）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、１，２−ステビオシド（CAS # 57817-89-7）、１，３−ステビオシド（ＲｅｂＧ）、１，２−ビオシド（MassBank Record: FU000299）、１，３−ビオシド、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ジグリコシル化ステビオール、トリグリコシル化ステビオール、テトラグリコシル化ステビオール、ペンタグリコシル化ステビオール、ヘキサグリコシル化ステビオール、ヘプタグリコシル化ステビオール、および／またはその異性体を指す。図２を参照；Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, 2007, prepared by Harriet Wallin, Food Agric. Org.もまた参照。図２、図７、図８、および表１を参照；Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, 2007, prepared by Harriet Wallin, Food Agric. Org.もまた参照。グリコシル化ステビオール化合物は、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ラムノース、および／またはキシロース部分の１以上を含み得る。ここで記載される方法によって生産され得るステビオールグリコシドの非限定的な例は、表１、図７、および図８において示される。
【００７７】
ここで使用されるとおり、用語「グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物」は、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレノールまたはトリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノールを指す。ここで使用されるとおり、用語「グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物」は、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸またはトリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸を指す。図７、図８、および表１を参照。グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物およびグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物は、グルコース、ＧｌｃＮＡｃ、ラムノース、および／またはキシロース部分の１以上を含み得る。ここで記載される方法によって生産され得るグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物およびグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物の非限定的な例は、表１、図７、および図８において示される。
【００７８】
ここで使用されるとおり、用語「ステビオールグリコシド前駆体」および「ステビオールグリコシド前駆体化合物」は、ステビオールグリコシド生合成経路における中間体化合物を指すために使用される。ステビオールグリコシド前駆体は、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ｅｎｔ−コパリル−二リン酸、ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール（kaurenal）、ｅｎｔ−カウレン酸、およびステビオールを含むが、これらに限定されない。図１を参照。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシド前駆体は、ステビオールグリコシド化合物それ自体である。例えば、１９−ＳＭＧ、ルブソシド、ステビオシド、およびＲｅｂＥは、ＲｅｂＭのステビオールグリコシド前駆体である。図２を参照。ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体は、in vivo（すなわち、組み換え宿主において）、in vitro（すなわち、酵素的に）、または全細胞生物変換によって生産され得る。ここで使用されるとおり、用語「生産する」および「蓄積する」は、in vivo、in vitro、または全細胞生物変換によるステビオールグリコシドおよびステビオールグリコシド前駆体の合成を記載するために互換的に使用され得る。
【００７９】
ここで使用されるとおり、用語「細胞培養液」は、宿主細胞の成長を支持し得るか、または支持し、酵母宿主細胞（これに限定されない）を含む液体を指すために使用され得る。細胞培養液の成分は、例えば、宿主細胞によって生産された、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物、グルコース、フルクトース、スクロース、微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素原礎培地（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含み得る。
【００８０】
ここで使用されるとおり、用語「細胞ライセート」は、溶解された細胞（すなわち、膜が化学的または機械的に破壊されている細胞）の成分を含む流体を指すために使用され得る。細胞ライセートは、宿主細胞によって生産されたステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物、グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、ＧｌｃＮＡｃ、微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、および／またはアミノ酸をさらに含み得る。いくつかの側面において、細胞ライセートは、Ｓ．セレビシエ細胞ライセートなどの酵母細胞ライセートまたは大腸菌（E. coli）細胞ライセートなどの細菌細胞ライセートである。
【００８１】
ここで使用されるとおり、用語「反応混合物」は、in vitroの反応を行うための溶液を指す。反応混合物の成分は、ステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール化合物、グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸化合物、ＵＧＴポリペプチドなどのポリペプチド、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、ＧｌｃＮＡＣ、バッファー、および／または塩を含み得るが、これらに限定されない。
【００８２】
組み換えステビオールグリコシドを生産するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．セレビシエ）株は、WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227、およびWO 2014/122328に記載される。全細胞生物変換、およびin vitroによって組み換え宿主においてステビオールグリコシドを生産する方法もまた、WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227、およびWO 2014/122328に記載される。
【００８３】
いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体は、組み換え宿主におけるステビオールグリコシド生合成経路に関与する１以上の酵素の発現を通じてin vivoで生産される。例えば、ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＣＤＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＯポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子、ＣＰＲポリペプチドをコードする遺伝子、およびＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子の１以上を発現するステビオールを生産する組み換え宿主は、ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体をin vivoで生産し得る。例えば、図１および２を参照。当業者は、これら遺伝子の１以上が、宿主に対して内因性であり得ることを理解するであろう（ただし、これら遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施態様において、すべて）は、組み換え宿主中へ導入された組み換え遺伝子である）。
【００８４】
ここで記載された組み換え宿主は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリルジロリン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；および／またはＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に変換することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子を含み得る。ＧＧＰＰＳポリペプチドは、ＦＰＰおよびＩＰＰからＧＧＰＰを合成し得る。ＣＤＰＳポリペプチドは、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリルジロリン酸を合成し得る。ＫＳポリペプチドは、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸からｅｎｔ−カウレンを合成し得る。ＫＯポリペプチドは、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成し得る。ＫＡＨポリペプチドは、ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成し得る。ＣＰＲポリペプチドは、ＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に変換し得る。
【００８５】
別の例において、ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＣＤＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＯポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子、およびＣＰＲポリペプチドをコードする遺伝子を発現する組み換え宿主は、ステビオールをin vivoで生産し得る。例えば、図１を参照。当業者は、１以上のこれら遺伝子が、宿主に対して内因性であり得ることを理解するであろう（ただし、これらの遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施態様において、すべて）は組み換え宿主中へ導入された組み換え遺伝子である）。
【００８６】
別の例において、ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＣＤＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＯポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子、ＣＰＲポリペプチドをコードする遺伝子、および１以上のＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現する組み換え宿主は、ステビオールグリコシドをin vivoで生産し得る。例えば、図１および２を参照。当業者は、１以上のこれら遺伝子が宿主に対して内因性であり得ることを理解するであろう（ただし、これら遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施態様において、すべて）は、組み換え宿主中へ導入された組み換え遺伝子である）。
【００８７】
いくつかの側面において、ＧＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号２０（配列番号１９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号２２（配列番号２１に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号２４（配列番号２３に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号２６（配列番号２５に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号２８（配列番号２７に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号３０（配列番号２９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号３２（配列番号３１に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、または配列番号１１６（配列番号１１５に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００８８】
いくつかの側面において、ＣＤＰＳポリペプチドは、配列番号３４（配列番号３３に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号３６（配列番号３５に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号３８（配列番号３７に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号４０（配列番号３９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、または配列番号４２（配列番号４１に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施態様において、ＣＤＰＳポリペプチドは葉緑体輸送ペプチドを欠損する。
【００８９】
いくつかの側面において、ＫＳポリペプチドは、配列番号４４（配列番号４３に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号４６（配列番号４５に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号４８（配列番号４７に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号５０（配列番号４９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、または配列番号５２（配列番号５１に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９０】
いくつかの実施態様において、組み換え宿主はＣＤＰＳ−ＫＳポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの側面において、ＣＤＰＳ−ＫＳポリペプチドは、配列番号５４（配列番号５３に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号５６（配列番号５５に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、または配列番号５８（配列番号５７に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９１】
いくつかの側面において、ＫＯポリペプチドは、配列番号６０（配列番号５９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号６２（配列番号６１に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号１１７（配列番号６３または配列番号６４に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号６６（配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号６８（配列番号６７に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号７０（配列番号６９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号７２（配列番号７１に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号７４（配列番号７３に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、または配列番号７６（配列番号７５に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９２】
いくつかの側面において、ＣＰＲポリペプチドは、配列番号７８（配列番号７７に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号８０（配列番号７９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号８２（配列番号８１に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号８４（配列番号８３に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号８６（配列番号８５に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号８８（配列番号８７に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号９０（配列番号８９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、または配列番号９２（配列番号９１に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９３】
いくつかの側面において、ＫＡＨポリペプチドは、配列番号９４（配列番号９３に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号９７（配列番号９５または配列番号９６に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号１００（配列番号９８または配列番号９９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６（配列番号１０５に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号１０８（配列番号１０７に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号１１０（配列番号１０９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、配列番号１１２（配列番号１１１に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）、または配列番号１１４（配列番号１１３に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る）に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９４】
いくつかの実施態様において、組み換え宿主は、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする核酸（配列番号７）、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする核酸（配列番号９）、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする核酸（配列番号４）、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする核酸、および／またはＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする核酸（配列番号１６）を含む。いくつかの側面において、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド（配列番号１１）またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド（配列番号１３）であり得る。いくつかの側面において、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは配列番号５または配列番号６に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは配列番号８に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは配列番号３に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドは配列番号１０に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチドは配列番号１２に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは配列番号１４または配列番号１５に示されたヌクレオチド配列によってコードされ得る。当業者は、これらの遺伝子の発現が特定のステビオールグリコシドを生産するために必要であり得るが、１以上のこれらの遺伝子が宿主に対して内因性であり得ることを理解するであろう（ただし、これらの遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施態様において、すべて）は組み換え宿主中へ導入された組み換え遺伝子である）。特定の実施態様において、ステビオールを生産する組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする外因性の核酸を含む。
【００９５】
別の特定の実施態様において、ステビオールを生産する組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、およびＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする外因性の核酸を含む。さらに別の特定の実施態様において、ステビオールを生産する組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、およびＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする外因性の核酸を含む。さらに別の特定の実施態様において、ステビオールを生産する組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２（とりわけＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＵＧＴ９１Ｄ２ｍ、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ、およびその機能的ホモログを含む）、およびＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする外因性の核酸を含む。さらに別の特定の実施態様において、ステビオールを生産する組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２、および／またはＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む。さらに別の特定の実施態様において、ステビオールを生産する組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＣＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２、および／またはＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む。
【００９６】
いくつかの実施態様において、組み換え宿主は、以下を含む：（ａ）ステビオールグリコシドの１９−ＯグルコースのＣ２’のベータ１，２グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ２’のベータ１，２グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｃ）ステビオールグリコシドの１９−ＯグルコースのＣ３’のベータ１，３グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｄ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ３’のベータ１，３グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｅ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ６’のベータ１，６グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｆ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏジグルコシド部分の１，３−グルコースのＣ６’のベータ１，６グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｇ）ステビオールまたはステビオールグリコシドの１３−ＯＨのグルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｈ）ステビオールまたはステビオールグリコシドのＣ−１９カルボキシルのグルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｉ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ２’のベータ１，２ラムノシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｊ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ２’のベータ１，２キシロシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｏ）ステビオールグリコシドの１９−ＯグルコースのＣ２’へのベータ１，２ＧｌｃＮＡｃ転移が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｋ）ステビオールグリコシドの１９−ＯグルコースのＣ２’へのベータ１，３ＧｌｃＮＡｃ転移が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｌ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ２’へのベータ１，３ＧｌｃＮＡｃ転移が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｍ）ステビオールまたはステビオールグリコシドのＣ−１９カルボキシルへのＧｌｃＮＡｃ転移が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｎ）カウレン酸またはカウレノールのＣ−１９カルボキシルのグルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｏ）カウレン酸グリコシドまたはカウレノールグリコシドの１９−ＯグルコースのＣ２’のベータ１，２グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｐ）カウレン酸のベータ１，２ジグルコシドのベータ１，２グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｑ）カウレン酸のベータ１，２ジグルコシドのベータ１，２ＧｌｃＮＡｃ転移が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｒ）カウレン酸グリコシドまたはカウレノールグリコシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ３’のベータ１，３グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；および／または（ｓ）ステビオールグリコシドの１９−Ｏジグルコシド部分のＣ６’の１，３−グルコースのベータ１，６グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子。
【００９７】
いくつかの側面において、ＥＵＧＴ１１（配列番号１４／配列番号１５、配列番号１６）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号１０、配列番号１１）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１２、配列番号１３）、その変異体、またはそのキメラタンパク質は、ステビオールグリコシドの１９−ＯグルコースのＣ２’のベータ１，２グルコシル化を触媒する。例示的なＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体配列は、配列番号１、２、１１８〜１２１、１２３、および１９１〜２１４に示される。いくつかの側面において、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号１０、配列番号１１）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１２、配列番号１３）、その変異体、またはそのキメラタンパク質は、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ２’のベータ１，２グルコシル化を触媒する。例示的なＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体配列は、配列番号１、２、１１８〜１２１、１２３、および１９１〜２１４に示される。例示的なＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ＥＵＧＴ１１キメラタンパク質配列は、配列番号１７および配列番号１８に示される。いくつかの側面において、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号８、配列番号９）、その変異体、またはそのキメラタンパク質は、ステビオールグリコシドの１９−ＯグルコースのＣ３’のベータ１，３グルコシル化および／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ３’のベータ１，３グルコシル化を触媒する。例示的なＵＧＴ７６Ｇ１変異体配列は、配列番号１８１〜１９０および２１７〜２２０に示される。いくつかの側面において、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号５／配列番号６、配列番号７）、その変異体、またはそのキメラタンパク質は、ステビオールまたはステビオールグリコシドの１３−ＯＨのグルコシル化を触媒する。例示的なＵＧＴ８５Ｃ２変異体配列は、配列番号１２７および１４７〜１８０に示される。いくつかの側面において、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号３、配列番号４）、その変異体、またはそのキメラタンパク質は、ステビオールまたはステビオールグリコシドのＣ−１９カルボキシルのグルコシル化を触媒する。いくつかの側面において、ＥＵＧＴ１１（配列番号１４／配列番号１５、配列番号１６）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号１０、配列番号１１）、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号３、配列番号４）、および／またはＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号８、配列番号９）は、ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−Ｇｌｃ−ＮＡｃ）を基質として受け入れ得る。いくつかの側面において、ＵＧＴ７４Ｇ１はｅｎｔ−カウレノールおよびｅｎｔ−カウレン酸をグリコシル化する；ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、その後、１，３−または１，２−連結のいずれかによって追加のグルコースまたはＧｌｃＮＡｃ部分を付加して、トリグリコシル化化合物を形成する。図３、７および８を参照。
【００９８】
いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体は、ステビオールグリコシド前駆体のステビオールグリコシド経路にin vitroで関与する１以上の酵素との接触を通じて生産される。例えば、ステビオールをＵＧＴポリペプチドと接触させることは、ステビオールグリコシドのin vitroでの生産をもたらし得る。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシド前駆体は、上流のステビオールグリコシド前駆体の、ステビオールグリコシド経路にin vitroで関与する１以上の酵素との接触を通じて生産される。例えば、ｅｎｔ−カウレン酸をＫＡＨ酵素と接触させることは、ステビオールのin vitroでの生産をもたらし得る。
【００９９】
いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、全細胞生物変換によって生産される。全細胞生物変換を生じさせるために、ステビオールグリコシド経路に関与する１以上の酵素を発現する宿主細胞は、細胞においてステビオールグリコシド前駆体を取り込み、改変する；in vivoでの改変後、ステビオールグリコシドは、細胞において残存し、および／または培地中へ分泌される。例えば、ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主細胞は、細胞においてステビオールを取り込み、ステビオールをグリコシル化し得る；in vivoでのグリコシル化後、ステビオールグリコシドは、培地中へ分泌され得る。いくつかの実施態様において、細胞は、改変される基質を取り込むか、または改変された産物を分泌するように透過処理される。
【０１００】
いくつかの実施態様において、ステビオール、１以上のステビオールグリコシド前駆体、および／または１以上のステビオールグリコシドは、２以上の宿主の共培養によって生産される。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシド経路に関与する１以上の酵素を発現する１以上の各宿主は、ステビオール、１以上のステビオールグリコシド前駆体、および／または１以上のステビオールグリコシドを生産する。例えば、ＧＧＰＰＳ、ＣＤＰＳ、ＫＯ、ＫＳ、ＫＡＨ、および／またはＣＰＲを含む宿主および１以上のＵＧＴを含む宿主は、１以上のステビオールグリコシドを生産する。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、１，２−ステビオシドおよびＲｅｂＤなどのステビオールグリコシドを、組み換え宿主において、または全細胞生物変換によって、in vitroで生産するために好適なポリペプチドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１２、配列番号１３）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｖ２８６Ｃ（配列番号１）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｇ３８４Ｗ（配列番号２）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｍ（配列番号１１８）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ１９５Ｇ（配列番号１１９）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｖ１９６Ｐ（配列番号１２０）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｈ（配列番号１２１）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１３Ｅ（配列番号１９１）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｓ２２１Ｙ（配列番号１９２）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｅ４３８Ｈ（配列番号１９３）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｍ１５２Ｔ（配列番号１９４）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｃ（配列番号１９５）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ１９５Ｓ（配列番号１９６）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ１９５Ｖ（配列番号１９７）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｖ２８６Ｓ（配列番号１９８）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｓ２２１Ｓ（配列番号１９９）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｐ９３Ｖ Ｍ１５２Ｇ（配列番号２００）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｓ９９Ｉ（配列番号２０１）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｔ１４４Ｋ Ｐ２０１Ｐ（配列番号２０２）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｔ１４４Ｌ（配列番号２０３）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｔ１４４Ｍ（配列番号２０４）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ａ１４８Ｋ Ｌ２１１Ｉ（配列番号２０５）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ１９５Ｎ（配列番号２０６）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｋ１９９Ｃ（配列番号２０７）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｍ Ｅ４２６Ｇ Ａ４６６Ｖ（配列番号２０８）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｔ Ｉ３０３Ｉ（配列番号２０９）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｖ２８６Ｎ（配列番号２１０）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｓ１１４Ｆ Ｖ２８６Ｓ（配列番号２１１）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｇ３８４Ｋ（配列番号２１２）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｇ３８４Ｙ（配列番号２１３）；ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｅ４３８Ｍ（配列番号２１４）；およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ１９５Ｃ（配列番号１２３）を含む、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号１０、配列番号１１）の機能的ホモログを含む。例３を参照。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、有用なＵＧＴ９１Ｄ２ホモログは、１以上のアミノ酸置換を残基１９５、１９６、２１１、２８６、および３８４で有し得る。表２を参照。有用なＵＧＴ９１Ｄ２ｅホモログの非限定的な例は、（配列番号１１について）置換を、残基９３で（例えば、残基９３でバリン）；９９で（例えば、残基９９でイソロイシン）、１１４で（例えば、残基１１４でフェニルアラニン）；１４４で（例えば、残基１４４でリジン、ロイシン、またはメチオニン）；１４８で（例えば、残基１４８でリジン）；１５２（例えば、残基１５２でスレオニン）；１９５で（例えば、残基１９５でグリシン、システイン、セリン、アルギニン、またはバリン）；１９６で（例えば、残基１９６でプロリン）；１９９で（例えば、残基１９９でシステイン）；２１１で（例えば、残基２１１でメチオニン、ヒスチジン、スレオニン、システイン、またはイソロイシン）；２１３で（例えば、２１３でグルタミン酸）；２２１で（例えば、残基２２１でイソロイシン）；２８６で（例えば、残基２８６でアラニン、システイン、アスパラギン、またはセリン）；３８４で（例えば、残基３８４でトリプトファン、リジン、またはチロシン）；４２６で（例えば、残基４２６でグリシン）；４３８で（例えば、残基４３８でヒスチジンまたはメチオニン）；または４６６で（例えば、残基４６６でバリン）有する、ポリペプチドを含む。例３を参照。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体は、サイレント変異を含む。例えば、いくつかの実施態様において、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体は、残基１３０、残基２０１、または残基２２１（これらに限定されない）の残基でサイレント変異を含む。例３を参照。
【０１０４】
いくつかの実施態様において、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体（ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｖ２８６Ｃ（配列番号１）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｇ３８４Ｗ（配列番号２）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ１９５Ｖ（配列番号１９７）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｖ２８６Ｓ（配列番号１９８）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｔ１４４Ｋ Ｐ２０１Ｐ（配列番号２０２）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｔ Ｉ１３０Ｉ（配列番号１８４）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｓ１１Ｆ Ｖ２８６Ｓ（配列番号２１１）、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｅ４３８Ｍ（配列番号２１４）に限定されない）は、ルブソシドに対して選択的であり、１，２−ステビオシドの優先的な蓄積を伴う。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体（ＵＧＴＤ１Ｄ２ｅ Ｐ９３Ｖ Ｍ１５２Ｇ（配列番号２００）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｓ９９Ｉ （配列番号２０１）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｔ１４４Ｌ（配列番号：２０３）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ａ１４８Ｋ Ｌ２２１Ｉ（配列番号２０５）、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｇ３８４Ｋ（配列番号２１２）に限定されない）は、ＲｅｂＡに対して選択的であり、ＲｅｂＤの優先的な蓄積を伴う。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体（残基２１１で変異を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体（例えば、配列番号１１８のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｍ）に限定されない）は、ルブソシドの１，２−ステビオシドへの変換およびＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換を触媒し、１，２−ステビオシドの優先的な蓄積を伴う。例３ならびに表２および３を参照。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ルブソシド、および／または１，２−ステビオシドなどのステビオールグリコシドを組み換え宿主において生産するために好適なポリペプチドは、Ｃｈｉｍ＿３（配列番号１７）またはＣｈｉｍ＿７（配列番号１８）などのＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ−ＥＵＧＴ１１キメラ酵素を含む。例４および表５を参照。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、Ｃｈｉｍ＿７（配列番号１８）は、ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅと比較してより効率的にルブソシドを１，２−ステビオシドへ変換する。いくつかの実施態様において、Ｃｈｉｍ＿７（配列番号１８）は、ルブソシドの供給された量を完全に消費する。いくつかの実施態様において、Ｃｈｉｍ＿７（配列番号１８）は、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１２、配列番号１３）よりもＲｅｂＡに対して１．７５倍高い活性を実証する。いくつかの実施態様において、Ｃｈｉｍ＿３（配列番号１７）は、ルブソシドを１，２−ステビオシドへ選択的に変換する。例４および表５を参照。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ−ＥＵＧＴ１１キメラ酵素（Ｃｈｉｍ＿２（配列番号１２２）；Ｃｈｉｍ＿４（配列番号１２４）；Ｃｈｉｍ＿５（配列番号１２５）；Ｃｈｉｍ＿６（配列番号１２６）；Ｃｈｉｍ＿７（配列番号１８）；Ｃｈｉｍ＿８（配列番号１２８）；Ｃｈｉｍ＿９（配列番号１２９）；Ｃｈｉｍ＿１０（配列番号１３０）；Ｃｈｉｍ＿１１（配列番号１３１）；Ｃｈｉｍ＿１２（配列番号１３２）；Ｃｈｉｍ＿１３（配列番号１３３）；Ｃｈｉｍ＿１４（配列番号１３４）など）は、ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体を生産するために使用される。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、有用なＵＧＴ８５Ｃ２ホモログは、残基２１、４８、４９、８４、８６、８７、９１、９２、９５、１２２、３０４、および３３４で１以上のアミノ酸置換を有し得る。表７を参照。有用なＵＧＴ８５Ｃ２ホモログの非限定的な例は、（配列番号７について）残基２１（例えば、残基２１でリジン、スレオニン、またはバリン）、４８（例えば、残基４８でセリン、ヒスチジン、チロシン、アルギニン、グルタミン、またはトリプトファン）、４９（例えば、残基４９でバリン）、８４（例えば、残基８４でグリシン、アラニン、スレオニン、システイン、プロリン、バリン、またはアスパラギン）、８６（例えば、残基８６でアルギニンまたはグリシン）；８７（例えば、残基８７でヒスチジン、プロリン、メチオニンまたはチロシン）；９１（例えば、残基９１でリジン、アルギニン、またはスレオニン）；９２（例えば、残基９２でフェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、またはリジン）；１２２（例えば、残基１２２でセリン）；３０４（例えば、残基３０４でセリン）；および３３４（例えば、残基３３４でセリンまたはメチオニン）で置換を有するポリペプチドを含む。配列番号１２７および１４７〜１８０、ステビオールの変換よりも１９−ＳＭＧの変換を優先的に触媒する分析されたＵＧＴ８５Ｃ２変異体についての表７Ａ、１９−ＳＭＧの変換よりもステビオールの変換を優先的に触媒するＵＧＴ８５Ｃ２変異体についての表７Ｂ、および１９−ＳＭＧおよびステビオールの変換を触媒する追加のＵＧＴ８５Ｃ２変異体についての表７Ｃを参照。例５もまた参照。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、シネココッカス（Synechococcus）種ＧＧＰＰＳポリペプチド（配列番号１９、配列番号２０）をコードする組み換え遺伝子、切断されたトウモロコシ（Z. mays）ＣＤＰＳポリペプチド（配列番号３９、配列番号４０）をコードする組み換え遺伝子、シロイヌナズナ（A. thaliana）ＫＳポリペプチド（配列番号５１、配列番号５２）をコードする組み換え遺伝子、組み換えＳ．レバウディアナＫＯポリペプチド（配列番号５９、配列番号６０）をコードする組み換え遺伝子、シロイヌナズナＡＴＲ２ポリペプチド（配列番号９１、配列番号９２）をコードする組み換え遺伝子、イネ（O. sativa）ＥＵＧＴ１１ポリペプチド（配列番号１４／配列番号１５、配列番号１６）をコードする組み換え遺伝子、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチド（配列番号９３、配列番号９４）をコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８ポリペプチド（配列番号８５、配列番号８６）をコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド（配列番号３、配列番号４）をコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド（配列番号８、配列番号９）をコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド（配列番号１０、配列番号１１）をコードする組み換え遺伝子、配列番号６７に示されたヌクレオチド配列（配列番号１１７に示されたアミノ酸配列に対応）によってコードされた組み換えＫＯ遺伝子、および（配列番号７７、配列番号７８）をコードする組み換えＣＰＲ１遺伝子を含む、ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株は、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）、１９−ＳＭＧ、ステビオール、ステビオール＋２Ｇｌｃ（＃２３）、およびステビオール＋３Ｇｌｃ（＃３４）を蓄積するが、ｅｎｔ−カウレノールグリコシドを蓄積しない。例６および図４Ａ〜４Ｃを参照。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、ＵＧＴ８５Ｃ２のＳ８４Ｖ Ｆ４８Ｓ、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｒ、Ｆ４８Ｑ、Ｆ４８Ｔ、Ｆ４８Ｓ、Ｉ４９Ｖ、Ｐ８６Ｒ、Ｐ８６Ｇ、およびＦ１２２Ｓ変異体は、ステビオールと比較して１９−ＳＭＧに対して選択的である（表７Ａ）。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ８５Ｃ２のＳ８４Ｔ、Ｉ８７Ｍ Ｉ８７Ｐ、Ｉ８７Ｙ、Ｌ９１Ｋ、Ｌ９１Ｒ、Ｌ９１Ｔ、Ｌ９２Ｍ、およびＩ９５Ｋ変異体は、１９−ＳＭＧと比較してステビオールに対して選択的である（表７Ｂ）。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドを生産する宿主におけるＵＧＴ８５Ｃ２ Ｔ３０４Ｓ（配列番号１２７）の発現は、ＵＧＴ８５Ｃ２ Ｔ３０４Ｓ（配列番号１２７）を発現しないステビオールグリコシドを生産する宿主と比較して、ステビオールグリコシドの蓄積を増加させる。例５を参照。
【０１１１】
いくつかの実施態様において、ＵＧＴ８５Ｃ２またはＵＧＴ８５Ｃ２変異体を含む細胞ライセートは、基質についてステビオールまたは１９−ＳＭＧのいずれかに優先性を示す。いくつかの側面において、基質としてステビオールを使用することにより、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｔ、Ｉ４９Ｖ、Ｓ８４Ａ、およびＬ９２Ｆ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、４０ｍｉｎ未満のインキュベート期間の間、高い活性を示し、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｔ、およびＩ４９Ｖ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、４０ｍｉｎを超えるインキュベート期間の間、高い活性を示す（表８Ａ）。基質として１９−ＳＭＧを使用することにより、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｔ、Ｉ４９Ｖ、およびＳ８４Ａ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、４０ｍｉｎ未満のインキュベート期間の間、高い活性を示し、Ｆ４８Ｈ、Ｉ４９Ｖ、Ｓ８４Ａ、Ｓ８４Ｖ、Ｌ９１Ｋ、およびＬ９２Ｆ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体ならびに野生型ＵＧＴ８５Ｃ２は、４０ｍｉｎを超えるインキュベート期間の間、高い活性を示す（表８Ｂ）。いくつかの側面において、Ｌ９１Ｋ、Ｌ９１Ｒ、およびＬ９２Ｆ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、高い１３−ＳＭＧ／ルブソシド比率を示す一方、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｔ、Ｐ８６Ｇ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、低い１３−ＳＭＧ／ルブソシド比率を示す。例７を参照。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、有用なＵＧＴ７６Ｇ１ホモログは、残基２３、２６、５５、１４６、２５７、２８３、および３３７で１以上のアミノ酸置換を有し得る。例４を参照。有用なＵＧＴ７６Ｇ１ホモログの非限定的な例は、（配列番号９について）残基２１（例えば、残基２１でリジン、スレオニンまたはバリン）、残基２３（例えば、残基２３でヒスチジン）；残基２６（例えば、残基２６でトリプトファン）；残基５５（例えば、残基５５でリジン）；残基１４６（例えば、残基１４６でグリシン）；残基２５７（例えば、残基２５７でグリシン）；残基２８３（例えば、残基２８３でアスパラギン）；および残基３３７（例えば、残基３３７でプロリン）で置換を有するポリペプチドを含む。配列番号１８１〜１９０を参照。表９ならびに例８および９を参照。
【０１１３】
いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株においてＲｅｂＤまたはＲｅｂＭの蓄積を増加させるＵＧＴ７６Ｇ１変異体の発現（参照によってその全体において取り込まれているWO 2014/122227を参照）は、ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株における野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号９）の発現と比較して、１３−ＳＭＧ、１，２−ビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＧ（１，３−ステビオシド）、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の蓄積を変更する。図６、１０、１１Ｄ、および１１Ｅならびに例８および９を参照。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、Ｓ．セレビシエにおけるＲｅｂＤレベルを増加させるＵＧＴ変異体の発現は、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、１，２−ステビオシド、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、およびステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）の増加された蓄積、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）、およびＲｅｂＧ（１，３−ステビオシド）の減少された蓄積もまたもたらす。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）の発現は、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）の増加された蓄積、１，２−ステビオシド、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の減少された蓄積をもたらす。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２５３Ｗ（配列番号１８６）の発現は、１，２−ステビオシドおよびステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の減少された蓄積をもたらす。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ ２８４Ｇの発現は、１，２−ステビオシドおよびステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の増加された蓄積、ＲｅｂＧ、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の減少された蓄積をもたらす。図１０および例８を参照。
【０１１５】
いくつかの実施態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、およびＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）の蓄積を減少させる。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、そのすべてが、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株と比較して、ＲｅｂＤの生産を増加させ、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）の蓄積を減少させる。いくつかの実施態様において、ＲｅｂＭの生産を増加させるＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）の発現は、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）の蓄積を増加させる。図１１Ｄおよび例８を参照。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株と比較して、ステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の蓄積を増加させる。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）の発現は、ステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の蓄積を減少させる。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株と比較して、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を増加させる。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）の発現は、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を減少させる。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体５）の蓄積を増加させる。図１１Ｄおよび例８を参照。
【０１１７】
いくつかの実施態様において、ＵＧＴ変異体またはＵＧＴキメラポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主は、ＵＧＴ変異体またはＵＧＴキメラポリペプチドをコードする遺伝子を発現しない宿主に対して、増加されたレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸および／またはｅｎｔ−カウレノールを生産する。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ変異体またはＵＧＴキメラポリペプチドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ−ＥＵＧＴ１１キメラポリペプチドをコードする遺伝子、ＵＧＴ８５Ｃ２変異体をコードする遺伝子、および／またはＵＧＴ７６Ｇ１変異体をコードする遺伝子を含む。
【０１１８】
いくつかの実施態様において、ＵＧＴ変異体またはＵＧＴキメラポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主は、ＵＧＴ変異体またはＵＧＴキメラポリペプチドをコードする遺伝子を発現しない宿主に対して、減少されたレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸および／またはｅｎｔ−カウレノールを生産する。いくつかの実施態様において、ＵＧＴ変異体またはＵＧＴキメラポリペプチドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ−ＥＵＧＴ１１キメラポリペプチドをコードする遺伝子、ＵＧＴ８５Ｃ２変異体をコードする遺伝子、および／またはＵＧＴ７６Ｇ１変異体をコードする遺伝子を含む。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８）、および、ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（＃６）とともに共溶出されるｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）のレベルは、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２５３Ｗ（配列番号１８６）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ２８４Ｇ（配列番号１８７）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｋ３３７Ｐ（配列番号１８９）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ５５Ｋ（配列番号１９０）を発現するＳ．セレビシエ株と比較して、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号９）を発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株において変更される。図９、図１１Ａ〜１１Ｃ、および例８を参照。
【０１２０】
いくつかの実施態様において、ＲｅｂＤレベルを増加させるＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエ株もまた、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現するＳ．セレビシエ株と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）およびｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を増加させるが、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を減少させる。いくつかの実施態様において、ＲｅｂＤレベルを増加させるＵＧＴ７６Ｇ１変異体もまた、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８）の蓄積を増加させるが、ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（＃６）とともに共溶出されるｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を減少させる。いくつかの実施態様において、ＲｅｂＭのレベルを増加させる変異体である、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）の発現は、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）およびｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を減少させる。図９および例８を参照。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、すべてのレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸（ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）＋ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）＋ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２））は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、およびＵＧＴ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）を発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株において増加される。いくつかの実施態様において、すべてのレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール（ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（＃６）とともに共溶出されるｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）、および、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８））は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、およびＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）を発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株において変更される。図１１Ｂおよび１１Ｃならびに例８を参照。
【０１２２】
いくつかの実施態様において、ＵＧＴ変異体（ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、および／またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅの変異体に限定されない）は、生産されたステビオールグリコシドの、in vitroで、宿主におけるin vivoで、および／または全細胞生物変換によって生産されたＧｌｃＮＡｃ化合物およびその異性体に対する比率を変更する。例示的なＧｌｃＮＡｃの構造は、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ＋１ＧｌｃＮＡｃおよびステビオール＋４Ｇｌｃ＋１ＧｌｃＮＡｃ（＃１１）を含む。例えば、図７Ａ、７Ｄ、８Ｇ〜８Ｉ、および８ＡＣ〜８ＡＦならびに例６、８、および９を参照。
【０１２３】
いくつかの実施態様において、in vivo、in vitro、または全細胞生物変換によって生産されたステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体組成物は、とりわけステビア植物からのステビア抽出物よりも少ない混入物または少ない任意の特定の混入物を含む。混入物は、異臭に寄与する植物に由来する化合物を含む。潜在的な混入物は、色素、脂質、タンパク質、フェノール類、糖類、スパスレノールおよび他のセスキテルペン類、ラブダンジテルペン類、モノテルペン類、デカン酸、８，１１，１４−エイコサトリエン酸、２−メチルオクタデカン、ペンタコサン、オクタコサン、テトラコサン、オクタデカノール、スチグマステロール、β−シトステロール、α−アミリン、β−アミリン、ルペオール、β−アミリンアセタート、五員環トリテルペン類、センタウレジン(centauredin)、ケルセチン(quercitin)、エピ−アルファ−カジノール(epi-alpha-cadinol)、カリオフィレン類(carophyllenes)および誘導体、ベータ−ピネン、ベータ−シトステロール、およびジベレリン類を含み得る。
【０１２４】
ここで使用されるとおり、用語「検出可能な量」、「検出可能な濃度」、「測定可能な量」および「測定可能な濃度」は、曲線下面積（ＡＵＣ）、μＭ／ＯＤ６００、ｍｇ／Ｌ、μＭ、またはｍＭで測定されたステビオールグリコシドのレベルを指す。ステビオールグリコシドを生産する（すなわち、すべての、上清の、および／または細胞内のステビオールグリコシドレベル）は、一般に当業者に利用可能な技術（例えば、これらに限定されないが、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、紫外−可視分光法／分光光度法（ＵＶ−Ｖｉｓ）、質量分析（ＭＳ）、および核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ））によって検出され得、および／または分析され得る。
【０１２５】
ここで使用されるとおり、用語「検出不可能な濃度」は、低すぎるために、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＵＶ−Ｖｉｓ、ＭＳ、またはＮＭＲなどの技術によって測定および／または分析され得ない化合物のレベルを指す。いくつかの実施態様において、「検出不可能な濃度」の化合物は、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体組成物において存在しない。
【０１２６】
ここで使用されるとおり、用語「または」および「および／または」は、組み合わせにおける複数の成分または互いに排他的な複数の成分を記載するために用いられる。例えば、「ｘ、ｙ、および／またはｚ」は、「ｘ」単独。「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、およびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙおよびｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指し得る。いくつかの実施態様において、「および／または」は、組み換え細胞が含む外因性の核酸を指すために使用され、ここで、組み換え細胞は、ある群から選択された１以上の外因性の核酸を含む。いくつかの実施態様において、「および／または」は、ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体の生産を指すために使用される。いくつかの実施態様において、「および／または」は、ステビオールグリコシドの生産を指すために使用され、ここで、１以上のステビオールグリコシドが生産される。いくつかの実施態様において、「および／または」は、ステビオールグリコシドの生産を指すために使用され、ここで、１以上のステビオールグリコシドは、１以上の以下の工程を通じて生産される：組み換え微生物を培養すること、組み換え微生物において１以上のステビオールグリコシドを合成すること、および／または１以上のステビオールグリコシドを単離すること。
【０１２７】
機能的ホモログ
上記のポリペプチドの機能的ホモログは、組み換え宿主においてステビオールグリコシドを生産することにおける使用にもまた好適である。機能的ホモログは、参照ポリペプチドに対して配列類似性を有し、１以上の参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能（単数または複数）を実施するポリペプチドである。機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドであり得、配列類似性は、収束的または発散的な進化的事象が原因であり得る。よって、機能的ホモログは、時として文献においてホモログ、またはオルソログ、またはパラログと指される。野生型コーディング配列の突然変異体によってコードされたポリペプチドなどの天然に生じる機能的ホモログの変異体は、それら自体機能的ホモログであり得る。機能的ホモログもまたポリペプチドのコーディング配列の部位特異的な変異誘発を介するか、または種々の天然に生じるポリペプチドのコーディング配列からのドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）によって作製され得る。ここで記載される機能的ポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は、知られたものであり、とりわけ、定向進化技術、部位特異的な変異誘発技術およびランダム変異誘発技術を含み、ポリペプチドの特定の活性を増加させること、基質特異性を変更すること、発現レベルを変更すること、細胞内位置を変更すること、または所望の様式においてポリペプチド−ポリペプチド相互作用を改変することに有用であり得る。かかる改変されたポリペプチドは、機能的ホモログであるものと考えられる。用語「機能的ホモログ」は、時として機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
【０１２８】
機能的ホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチドの配列アラインメントの分析によって同定され得る。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチドの配列のデータベースにおけるクエリ(query)を実行することは、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのホモログを同定し得る。配列分析は、参照配列としてＵＧＴアミノ酸配列を使用する非重複データベースのＢＬＡＳＴ、相互ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析に関与し得る。アミノ酸配列は、いくつかの例において、ヌクレオチド配列から推測される。４０％より大きな配列同一性を有するデータベースにおけるこれらのポリペプチドは、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドとしての適合性のさらなる評価のための候補である。アミノ酸配列の類似性は、別の１つの疎水性残基の置換または別の１つの極性残基の置換などの保存的アミノ酸置換を可能にする。所望される場合、かかる候補の手検測は、候補の数を狭めてさらに評価するために実施され得る。手検測は、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドにおいて存在するドメイン（例えば、保存された機能的ドメイン）を有すると思われるこれら候補を選択することによって実行され得る。いくつかの実施態様において、核酸およびポリペプチドは、ＢＬＡＳＴ分析を使用するよりはむしろ発現レベルに基づくトランスクリプトームデータから同定される。
【０１２９】
保存された領域は、領域を繰り返し配列であるステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの一次アミノ酸配列内に位置付けることによって同定され得、いくつかの二次構造（例えば、ヘリックスおよびベータシート）を形成し、正または負に荷電したドメインを確立し、またはタンパク質のモチーフまたはドメインを表わす。例えば、様々なタンパク質のモチーフおよびドメインについてコンセンサス配列を記載するワールドワイドウェブ上のPfamウェブサイト（sanger.ac.uk/Software/Pfam/ and pfam.janelia.org/）を参照。Pfamデータベースに含まれた情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997)；およびBateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999)に記載される。保存された領域もまた密接に関係する種からの同一または関係するポリペプチドの配列をアラインメントすることによって決定され得る。密接に関係する種は、好ましくは同一ファミリーからのものである。いくつかの実施態様において、２つの種々の種からの配列のアラインメントは、かかるホモログを同定することに適当である。
【０１３０】
典型的に、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドは、保存された領域を同定することに有用である。関係するポリペプチドの保存された領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。いくつかの実施態様において、保存された領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
【０１３１】
例えば、組み換え宿主においてステビオールを生産するために好適なポリペプチドは、ＵＧＴの機能的ホモログを含む。
【０１３２】
例えば、ＵＧＴの基質特異性を改変するための方法は、当業者に知られており、部位特異的／合理的な変異誘発アプローチ、ランダム定向進化アプローチ、およびランダム変異誘発／飽和技術が酵素の活性部位近傍で実行される組み合わせを含むが、これらに限定されない。例えば、Osmani et al., 2009, Phytochemistry 70: 325-347を参照。
【０１３３】
候補配列は、典型的には参照配列の長さの８０％〜２００％、例えば、参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００％である長さを有する。機能的ホモログポリペプチドは、典型的には参照配列の長さの９５％〜１０５％、例えば、参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０％、または任意の範囲である長さを有する。参照核酸またはポリペプチドに対して任意の候補核酸またはポリペプチドの同一性（％）は、以下のとおり決定され得る。参照配列（例えば、ここで記載される核酸配列またはアミノ酸配列）は、コンピュータープログラムClustal Omega（バージョン１．２．１、デフォルトパラメータ）を使用して１以上の候補配列にアラインメントされ、これは、それらの全長にわたって実施される核酸またはポリペプチド配列のアラインメント（グローバルアラインメント）を可能にする。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(13):3497-500。
【０１３４】
Clustal Omegaは、参照と１以上の候補配列との間のベストマッチを計算し、それらをアラインメントし、これにより、同一性、類似性および相違が決定され得る。１以上の残基の間隙は、参照配列、候補配列、または両方中へ挿入され得、配列アラインメントを最大化する。核酸配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、以下のデフォルトパラメータが使用される：文字の大きさ：２；ウィンドウの大きさ：４；点数化方法：パーセンテージ；上対角線(top diagonal)の数：４；および間隙ペナルティ：５。核酸配列の複数のアラインメントのために、以下のパラメータが使用される：間隙オープンペナルティ：１０．０；間隙エクステンションペナルティ：５．０；および重み変化(transition)：有。タンパク質配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、以下のパラメータが使用される：文字の大きさ：１；ウィンドウの大きさ：５；点数化方法：パーセンテージ；上対角線の数：５；間隙ペナルティ：３。タンパク質配列の複数のアラインメントのために、以下のパラメータが使用される：重みマトリクス：blosum；間隙オープンペナルティ：１０．０；間隙エクステンションペナルティ：０．０５；親水性間隙：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；残基特異的な間隙ペナルティ：オン。Clustal Omegaのアウトプットは、配列間の関係性を反映する配列アラインメントである。Clustal Omegaは、例えば、ワールドワイドウェブ上のベイラー医科大学の検索起動サイト（searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html）および欧州バイオインフォマティクス研究所サイト（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）で行われ得る。
【０１３５】
参照配列に対する候補核酸またはアミノ酸配列の同一性（％）を決定するために、配列はClustal Omegaを使用してアラインメントされ、アラインメントにおける同一マッチの数は参照配列の長さによって除され、結果は１００で乗される。同一性の値（％）は、最も近い１０分の１に四捨五入され得ることに留意されたい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は、７８．１に四捨五入されるが、一方７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は７８．２に四捨五入される。
【０１３６】
機能的なＵＧＴタンパク質は、酵素によって実施された酵素活性に関与しない追加のアミノ酸を含み得ることが理解されるであろう。いくつかの実施態様において、ＵＧＴタンパク質は融合タンパク質である。用語「キメラ」、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、「融合酵素」、「融合コンストラクト」、「キメラタンパク質」、「キメラポリペプチド」、「キメラコンストラクト」、および「キメラ酵素」は、種々のタンパク質をコードする２以上の遺伝子を一緒にすることを通じて操作されたタンパク質を指すようにここで互換的に使用され得る。いくつかの実施態様において、ＵＧＴポリペプチドをコードする核酸配列は、続く操作（例えば、精製または検出）、分泌、またはコードされたポリペプチドの局在化を促進するように設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列において、コードされたタグがポリペプチドのカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかに位置するように挿入され得る。コードされたタグの非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ）、およびFlag（商標）タグ（Kodak, New Haven, CT）を含む。タグの他の例は、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグを含む。
【０１３７】
いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、ドメインスワッピングによって変更されたタンパク質である。ここで使用されるとおり、用語「ドメインスワッピング」は、第一タンパク質のドメインを第二タンパク質のドメインで置き換えるプロセスを記載するために使用される。いくつかの実施態様において、第一タンパク質のドメインおよび第二タンパク質のドメインは、機能的に同一であるか、または機能的に同様である。いくつかの実施態様において、第二タンパク質のドメインの構造および／または配列は、第一タンパク質のドメインの構造および／または配列とは異なる。いくつかの実施態様において、ＵＧＴポリペプチドはドメインスワッピングによって変更される。
【０１３８】
ステビオールおよびステビオールグリコシド生合成核酸
ここで記載されるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するために好適な１以上の制御領域に対してセンスの向きで作動可能に連結されたそのポリペプチドのコーディング配列を含む。多くの微生物は、多シストロン性ｍＲＮＡからの複数の遺伝子産物を発現することが可能であるため、複数のポリペプチドは、所望された場合、それらの微生物の単一の制御領域の制御下で発現され得る。コーディング配列および制御領域は、制御領域が配列の転写または翻訳を調節するために有効であるように制御領域およびコーディング配列が位置付けられるとき、作動可能に連結されるものと考えられる。典型的には、コーディング配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位は、単シストロン性遺伝子のための制御領域の下流の１のヌクレオチドと約５０のヌクレオチドとの間に位置付けられる。
【０１３９】
多くの場合において、ここで記載されるポリペプチドについてのコーディング配列は、組み換え宿主以外の種において同定され、すなわち、異種核酸である。したがって、組み換え宿主が微生物である場合、コーディング配列は、他の原核または真核微生物、植物または動物からのものであり得る。しかしながら、いくつかの場合において、コーディング配列は、宿主に由来し、その生物中へ導入されている配列である。天然配列は、外因性核酸に連結された非天然配列（例えば、組み換え核酸コンストラクトにおいて天然配列に隣接する非天然の制御配列など）の存在によって天然に生じる配列としばしば区別され得る。さらに、安定的に形質転換された外因性核酸は、典型的には天然配列が見出される位置以外の位置で統合される。「制御領域」は、転写または翻訳産物の転写または翻訳開始および速度、ならびに安定性および／または可動性(mobility)に影響するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。制御領域は、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、停止配列、ポリアデニル化配列、イントロン、およびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。制御領域は、典型的には、少なくともコア（基礎的）プロモーターを含む。制御領域もまた、エンハンサー配列、上流要素または上流活性化領域（ＵＡＲ）などの少なくとも１つのコントロール要素を含み得る。制御領域は、制御領域およびコーディング配列を位置付けることによってコーディング配列に作動可能に連結され、これにより、制御領域は配列の転写または翻訳の調節に有効である。例えば、コーディング配列およびプロモーター配列を作動可能に連結するために、コーディング配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの下流の１のヌクレオチドと約５０のヌクレオチドとの間に位置付けられる。しかしながら、制御領域は、翻訳開始部位の上流の約５，０００ヌクレオチド、または転写開始部位の上流の約２，０００ヌクレオチドものところで位置付けられ得る。
【０１４０】
含まれる制御領域の選択は、いくつかの因子（効率性、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および所定の培養段階の間の優先的な発現を含むが、これらに限定されない）に依存する。制御領域をコーディング配列に対して適切に選択し、位置付けることによってコーディング配列の発現を調節することは、当業者に日常的な事項である。１よりも多い制御領域（例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、および誘導性要素）が存在し得ることは理解されるであろう。
【０１４１】
１以上の遺伝子は、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシドを生産する個別の側面に有用である「モジュール」における組み換え核酸コンストラクトにおいて組み合わされ得る。モジュール、特に多シストロン性モジュールにおいて複数の遺伝子を組み合わせることは、様々な種におけるモジュールの使用を促進する。例えば、ステビオール生合成遺伝子クラスター、またはＵＧＴ遺伝子クラスターは、多シストロン性モジュールにおいて組み合わされ得、これにより、好適な制御領域の挿入後、モジュールは幅広い種へ導入され得る。別の例として、ＵＧＴ遺伝子クラスターは、各ＵＧＴコーディング配列が別個の制御領域に作動可能に連結されてＵＧＴモジュールを形成するように組み合わされ得る。かかるモジュールは、単シストロン性発現が必要であるか、または所望されるそれらの種において使用され得る。ステビオールまたはステビオールグリコシドの生産に有用な遺伝子に追加して、組み換えコンストラクトは、典型的には、複製開始点、および適切な種におけるコンストラクトの維持のための１以上の選択可能なマーカーもまた含有する。
【０１４２】
遺伝子コードの縮重のため、多数の核酸が特定ポリペプチドをコードし得、すなわち、多くのアミノ酸について、アミノ酸のコドンとして働く１よりも多いヌクレオチドの三つ組が存在することが理解されるであろう。したがって、所与のポリペプチドについてコーディング配列におけるコドンは、その宿主（例えば、微生物）の適切なコドンバイアス表を使用して、特定宿主における最適な発現が得られるように改変され得る。単離された核酸として、これら改変された配列は、精製された分子として存在し得、組み換え核酸コンストラクトのモジュールを構築することにおける使用のためのベクターまたはウイルス中へ取り込まれ得る。
【０１４３】
いくつかの場合において、代謝中間体をステビオールまたはステビオールグリコシド生合成に転向させるために内因性ポリペプチドの１以上の機能を阻害することが望ましい。例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドを生産するをさらに増加させるために、例えば、スクアレンエポキシダーゼを下方調節することによって、酵母株におけるステロールの合成を下方制御することが望ましいものであり得る。別の例として、所定の内因性遺伝子産物（例えば、ここで議論される二次代謝産物またはホスファターゼからグルコース部分を除去するグリコヒドロラーゼ）の分解性の機能を阻害することが望ましいものであり得る。かかる場合において、ポリペプチドまたは遺伝子産物を過剰発現する核酸は、株中へ形質転換される組み換えコンストラクトにおいて含まれ得る。代替的に、変異誘発は、機能を増加または増強させるために望ましい遺伝子において突然変異体を生成するように使用され得る。
【０１４４】
宿主微生物
組み換え宿主は、ステビオールグリコシドを生産するためのポリペプチドを発現するために使用され得る。多数の原核生物および真核生物は、ここで記載される組み換え微生物（例えば、グラム陰性細菌、真菌（すなわち、酵母）、哺乳動物、昆虫、植物、および藻類細胞など）を構築することにおける使用のために好適である。ステビオールグリコシドを生産する株としての使用のために選択された種および株は、どの生産遺伝子が株に対して内因性であるか、およびどの遺伝子が存在しないかを決定するために第一に分析される。内因性の対応するものが株において存在しない遺伝子は、失われた機能（単数または複数）を供給するために次いで株中へ形質転換される、１以上の組み換えコンストラクトにおいて有利に組み立てられる。
【０１４５】
典型的には、組み換え微生物は、ある温度（単数または複数）である期間、発酵槽において成長させられ、ここで、温度および期間はステビオールグリコシドの生産を促進する。構築され、本発明によって提供される遺伝子操作された微生物は、とりわけ、ケモスタット、バッチ、フェドバッチ培養、半連続的発酵（ドローアンドフィル、連続灌流発酵、および連続灌流細胞培養など）を含む従来の発酵プロセスを使用して培養され得る。方法において使用される特定の微生物に依存して、イソペンテニル生合成遺伝子ならびにテルペンシンターゼおよびシクラーゼ遺伝子などの他の組み換え遺伝子もまた存在し得、発現され得る。基質および中間体（例えば、イソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、ＧＧＰＰ、ｅｎｔ−カウレンおよびｅｎｔ−カウレン酸など）のレベルは、公開された方法による分析のための培地から試料を抽出することによって決定され得る。
【０１４６】
本方法における使用の炭素源は、ステビオールグリコシドの成長および／または生産を促進する組み換え宿主細胞によって代謝され得る任意の分子を含む。好適な炭素源の例は、スクロース（例えば、糖蜜において見出されるもの）、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオースまたは他のグルコース含有ポリマーを含むが、これらに限定されない。酵母を宿主として用いる実施態様において、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、およびグルコースなどの炭素源は、好適である。炭素源は、培養の期間終始、宿主生物に提供され得るか、または代替的に、別のエネルギー源（例えば、タンパク質など）の存在下、ある期間、生物は成長させられ、次いでフェドバッチ段階の間、炭素のみの源が提供され得る。
【０１４７】
組み換え微生物が、前記期間、培養において成長させられた後（ここで、温度および期間はステビオールグリコシドの生産を促進する）、ステビオールおよび／または１以上のステビオールグリコシドは、次いで当該技術分野において既知の様々な技術を使用して培養から回収され得る。いくつかの実施態様において、透過処理剤は、供給物が宿主中へ入ることおよび産物が外に出ることを助けるために添加され得る。例えば、培養された微生物の粗製ライセートは、上清を得るために遠心分離され得る。得られた上清は、次いでクロマトグラフィーカラム（例えばＣ−１８カラムなど）に適用され、水で洗浄されて親水性化合物が除去され、その後、関心の化合物（単数または複数）がメタノールなどの溶媒によって溶出され得る。化合物（単数または複数）は、次いで分取ＨＰＬＣによってさらに精製され得る。WO 2009/140394もまた参照。
【０１４８】
ここで議論される様々な遺伝子およびモジュールが、単一の宿主よりはむしろ２以上の組み換え宿主において存在し得ることが理解されるであろう。複数の組み換え宿主が使用されるとき、それらは混合された培養において成長させられ、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシドを蓄積し得る。
【０１４９】
代替的には、２以上の宿主は、各々、別個の培地において成長させられ得、第一培地の産物（例えば、ステビオールなど）は、第二培地中へ導入されて、後続の中間体または最終産物（例えば、ＲｅｂＡなど）へ変換され得る。第二、または最終的な宿主によって生産された産物は、次いで回収される。いくつかの実施態様において、組み換え宿主が、培地以外の栄養源を使用し、発酵槽以外のシステムを用いることによって成長させられることもまた理解されるであろう。
【０１５０】
例示的な原核種および真核種は、より詳細に以下に記載される。しかしながら、他の種が好適であり得ることが理解されるであろう。例えば、好適な種は、アガリクス(Agricus)、アスペルギルス(Aspergillus)、バシラス(Bacillus)、カンジダ(Candida)、コルネバクテリウム、エレモテシウム(Eremothecium)、エスケリキア、フザリウム(Fusarium)／ジベレラ(Gibberella)、クルイヴェロミセス(Kluyveromyces)、ラエティポルス(Laetiporus)、レンチナス(Lentinus)、ファフィア(Phaffia)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、ピキア(Pichia)、フィスコミトレラ(Physcomitrella)、ロドトルラ(Rhodotorula)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、スファセロマ(Sphaceloma)、キサントフィロミセス(Xanthophyllomyces)またはヤロウイア(Yarrowia)などの属にあるものであり得る。かかる属からの例示的な種は、レンチナス・チグリヌス(Lentinus tigrinus)、ラエティポルス・スルフレウス(Laetiporus sulphureus)、ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、ピキア・パストリス、シバリンドネラ・ジャディニ、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)、ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・ムシラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa)、ファフィア・ロドジマ(Phaffia rhodozyma)、キサントフィロミセス・デンドロラス、フザリウム・フジクロイ(Fusarium fujikuroi)／ジベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)、カンジダ・ウチルス(Candida utilis)、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・アルビカンス、およびヤロウイア・リポリティカを含む。
【０１５１】
いくつかの実施態様において、微生物は、エスケリキア細菌細胞（例えば、大腸菌細胞など）；ラクトバシラス細菌細胞；ラクトコッカス細菌細胞；コルネバクテリウム細菌細胞；アセトバクター細菌細胞；アシネトバクター細菌細胞；またはシュードモナス細菌細胞などの原核生物であり得る。
【０１５２】
いくつかの実施態様において、微生物は、ジベレラ・フジクロイ、クルイヴェロミセス・ラクティス、シゾサッカロミセス・ポンベ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、ヤロウイア・リポリティカ、アシュビア・ゴシピ、またはＳ．セレビシエなどの子嚢菌であり得る。
【０１５３】
いくつかの実施態様において、微生物は、ブラケスレア・トリスポラ(Blakeslea trispora)、ドナリエラ・サリナ(Dunaliella salina)、ヘマトコッカス・プルビアリス(Haematococcus pluvialis)、クロレラ(Chlorella)種、ワカメ、ヒジキ、マコンブ、セネデスムス・アルメリエンシス（Scenedesmus almeriensis）種などの藻類細胞であり得る。
【０１５４】
いくつかの実施態様において、微生物は、ブラケスレア・トリスポラ、ドナリエラ・サリナ、ヘマトコッカス・プルビアリス、クロレラ種、ワカメ、ヒジキ、マコンブ、セネデスムス・アルメリエンシスなどのシアノバクテリア細胞であり得る。
【０１５５】
サッカロミセス種
サッカロミセスは、合成生物学において広く使用される土台(chassis)の生物であり、組み換え微生物プラットフォームとして使用され得る。例えば、突然変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよびＳ．セレビシエについて利用可能な他の情報のライブラリーが存在し、様々なモジュールの合理的な設計が産物収量を増強させることを可能にする。組み換え微生物を作製することについての方法は既知である。
【０１５６】
アスペルギルス種
Ａ．オリゼー(A. oryzae)、Ａ．ニガーおよびＡ．スソーヤ(A. sojae)などのアスペルギルス種は、食品生産において広く使用される微生物であり、組み換え微生物プラットフォームとしても使用され得る。ヌクレオチド配列は、Ａ．ニデュランス(A. nidulans)、Ａ．フミガーツス(A. fumigatus)、Ａ．オリゼー、Ａ．クラバタス(A. clavatus)、Ａ．フラバス(A. flavus)、Ａ．ニガーおよびＡ．テレウス(A. terreus)のゲノムについて利用可能であり、合理的な設計および内因性経路の改変によってフラックスを増強させ、産物収量を増加させることを可能にする。アスペルギルス、ならびにトランスクリプトームの検討およびプロテオミクスの検討について代謝モデルが開発された。Ａ．ニガーは、クエン酸およびグルコン酸などの多数の食品成分の工業生産のために培養され、したがって、Ａ．ニガーなどの種は、ステビオールグリコシドを生産するために一般に好適である。
【０１５７】
大腸菌
大腸菌（合成生物学における別の広く使用されるプラットフォーム生物）は、組み換え微生物プラットフォームとしても使用され得る。サッカロミセスと同様に、突然変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよび大腸菌について利用可能な他の情報のライブラリーが存在し、様々なモジュールの合理的な設計が産物収量を増強することを可能にする。サッカロミセスについての上記のものと同様な方法が、組み換え大腸菌微生物を作製するために使用され得る。
【０１５８】
アガリクス、ジベレラ、およびファネロカエテ種
アガリクス、ジベレラ、およびファネロカエテの種は、それらは培養において大量のイソプレノイド生産することが知られていることから、有用であり得る。したがって、大量のステビオールグリコシドを生産するためのテルペン前駆体は、内因性遺伝子によって既に生産される。したがって、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドについての組み換え遺伝子を含むモジュールは、メバロン酸またはＭＥＰ経路遺伝子を導入する必要なく、かかる属からの種中へ導入され得る。
【０１５９】
アークスラ・アデニニボランス（ブラストボトリス・アデニニボランス(Blastobotrys adeninivorans)）
アークスラ・アデニニボランスは、異常な生化学的特性を有する二形性酵母（出芽酵母（パン類製造業者の酵母など）のように４２℃の温度まで成長し、この閾値を超えると糸状の形態で成長する）である。それは、広範囲の基質において成長し得、硝酸塩を同化し得る。それは、天然プラスチックを生産し得る株の生成または環境試料におけるエストロゲンのバイオセンサーの開発にうまく適用されている。
【０１６０】
ヤロウイア・リポリティカ
ヤロウイア・リポリティカは、二形性酵母（アークスラ・アデニニボランスを参照）であり、半子嚢菌類ファミリーに属する。ヤロウイア・リポリティカの全ゲノムは、知られている。ヤロウイア種は好気性菌であり、非病原性であるものと考えられる。ヤロウイアは疎水性基質（例えば、アルカン、脂肪酸、油）を使用することにおいて効率的であり、糖で成長し得る。それは、産業応用に高いポテンシャルを有し、油性微生物である。ヤロウイア・リポリティカは、その乾燥細胞重量のおよそ４０％まで脂質含有量を蓄積し得、脂質蓄積および再移動のためのモデル生物である。例えば、Nicaud, 2012, Yeast 29(10):409-18; Beopoulos et al., 2009, Biochimie 91(6):692-6; Bankar et al., 2009, Appl Microbiol Biotechnol. 84(5):847-65を参照。
【０１６１】
ロドトルラ種
ロドトルラは、単細胞の、着色された酵母である。油性の赤色酵母である、ロドトルラ・グルチニスは、粗製グリセロールから脂質およびカロテノイドを生産することが示された（Saenge et al., 2011, Process Biochemistry 46(1):210-8）。ロドトルラ・トルロイデス(Rhodotorula toruloides)株は、改善されたバイオマスおよび脂質の生産性のための効率的なフェドバッチ発酵システムであることが示された（Li et al., 2007, Enzyme and Microbial Technology 41:312-7）。
【０１６２】
ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）
ロドスポリジウム・トルロイデスは、油性酵母であり、脂質生産経路の操作に有用である（例えば、Zhu et al., 2013, Nature Commun. 3:1112; Ageitos et al., 2011, Applied Microbiology and Biotechnology 90(4):1219-27などを参照）。
【０１６３】
カンジダ・ボイジニ
カンジダ・ボイジニは、（メタノールで成長し得る）メチロトローフの酵母である。ハンセヌラ・ポリモルファおよびピキア・パストリスなどの他のメチロトローフの種のように、それは、異種タンパク質を生産するための優れたプラットフォームを提供する。数グラム範囲の分泌された外来タンパク質の収量が報告されている。計算方法であるＩＰＲＯは、カンジダ・ボイジニのキシロースレダクターゼの補因子の特異性を、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへ実験的に転換する変異を近年予測した。例えば、Mattanovich et al., 2012, Methods Mol Biol. 824:329-58; Khoury et al., 2009, Protein Sci. 18(10):2125-38などを参照。
【０１６４】
ハンセヌラ・ポリモルファ（ピキア・アングスタ（Pichia angusta））
ハンセヌラ・ポリモルファは、メチロトローフの酵母である（カンジダ・ボイジニを参照）。それは広範囲の他の基質でさらに成長し得る；それは熱耐性であり、硝酸塩を同化し得る（クルイヴェロミセス・ラクティスもまた参照）。それは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリンおよびＣ型肝炎の処置のためのインターフェロンアルファ−２ａを生産すること、さらに技術的酵素の範囲にまでに適用されている。例えば、Xu et al., 2014, Virol Sin. 29(6):403-9などを参照。
【０１６５】
クルイヴェロミセス・ラクティス
クルイヴェロミセス・ラクティスは、通常ケフィアの生産に適用される酵母である。それは、いくつかの糖で成長し得、最も重要なことに、乳および乳清において存在するラクトースで成長し得る。それは、チーズを生産するためのキモシン（通常仔牛の胃において存在する酵素）を生産するためにとりわけうまく適用されている。生産は、４０，０００Ｌ規模の発酵槽で行われる。例えば、van Ooyen et al., 2006, FEMS Yeast Res. 6(3):381-92などを参照。
【０１６６】
ピキア・パストリス
ピキア・パストリスはメチロトローフの酵母である（カンジダ・ボイジニおよびハンセヌラ・ポリモルファを参照）。それは、外来タンパク質を生産するための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム要素は、キットとして利用可能であり、それは、タンパク質を生産するためにアカデミアで世界的に使用されている。複合体ヒトＮ−グリカン（酵母グリカンは、ヒトにおいて見出されたものに類似しているが、同一ではない）を生産し得る株に操作がなされてきた。例えば、Piirainen et al., 2014, N Biotechnol. 31(6):532-7を参照。
【０１６７】
フィスコミトレラ種
フィスコミトレラのコケは、懸濁培養において成長させられるとき、酵母または他の真菌培養と同様な特性を有する。この属は、他の種類の細胞において生産することが困難であり得る植物の二次代謝産物を生産するために使用され得る。
【０１６８】
ステビオールグリコシド組成物
ステビオールグリコシドは、種々の食品システムにおいて必ずしも同等なパフォーマンスを有しない。したがって、合成を選択のステビオールグリコシド組成物へ向ける能力を有することが望まれる。ここで記載される組み換え宿主は、特定のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭ）について選択的に濃縮され、一貫性がある味覚プロファイルを有する組成物を生産し得る。ここで使用されるとおり、用語「濃縮された」は、ステビア植物からのステビオールグリコシド組成物（抽出物）と比較して、特定のステビオールグリコシドの増加された割合を有するステビオールグリコシド組成物を記載するために使用される。したがって、ここで記載される組み換え宿主は、所与の食品のための所望の甘味プロファイルを満たすように適合され、バッチ間で一貫性がある各ステビオールグリコシドの割合を有する組成物の生産を促進し得る。いくつかの実施態様において、ここで記載される宿主は、ステビア抽出物において見出される望まれない植物の副産物を生産しないか、またはその低減された量を生産する。したがって、ここで記載される組み換え宿主によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、ステビア植物に由来する組成物と区別可能である。
【０１６９】
ここで開示される組み換え宿主細胞によって生産された個々のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭ）の量は、細胞培養液において、約１〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約１〜約１０ｍｇ／Ｌ、約３〜約１０ｍｇ／Ｌ、約５〜約２０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約５０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約２５〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１，５００ｍｇ／Ｌ、または約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，８００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２，８００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌで蓄積し得ることが理解されるであろう。いくつかの側面において、ここで開示される組み換え宿主細胞によって生産された個々のステビオールグリコシドの量は、細胞培養液において７，０００ｍｇ／Ｌを超え得る。
【０１７０】
ここで開示される組み換え宿主細胞によって生産されたステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭ）の組み合わせの量は、細胞培養液において、約１ｍｇ／Ｌ〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約２００〜約１，５００、少なくとも約２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６，０００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌで蓄積し得ることが理解されるであろう。いくつかの側面において、ここで開示される組み換え宿主細胞によって生産されたステビオールグリコシドの組み合わせの量は７，０００ｍｇ／Ｌを超え得る。一般に、より長い培養時間は、より多量の産物をもたらすであろう。したがって、組み換え微生物は、１日〜７日、１日〜５日、３日〜５日、約３日、約４日、または約５日培養され得る。
【０１７１】
ここで議論される様々な遺伝子およびモジュールが単一の微生物というよりはむしろ２以上の組み換え微生物において存在し得ることが理解されるであろう。複数の組み換え微生物が使用されるとき、それらは、混合された培養において成長されてステビオールおよび／またはステビオールグリコシドを生産し得る。例えば、第一の微生物は、ステビオールグリコシド前駆体を生産するための１以上の生合成遺伝子を含み得るが、第二の微生物は、ステビオールグリコシド生合成遺伝子を含む。第二または最終的な微生物によって生産された産物は、次いで回収される。いくつかの実施態様において、培地以外の栄養源を使用して、および発酵槽以外のシステムを用いることによって、組み換え微生物が成長されることもまた理解されるであろう。
【０１７２】
代替的に、２以上の微生物は、各々、別個の培地において成長され得、例えば、ステビオールなどの第一培地の産物は第二培地中へ導入され、続く中間体へ変換され得るか、またはＲｅｂＡなどの最終産物へ変換され得る。第二または最終的な微生物によって生産された産物は、次いで回収される。いくつかの実施態様において、組み換え微生物が培地以外の栄養源を使用して、および発酵槽以外のシステムを用いることによって成長されることもまた理解されるであろう。
【０１７３】
ここで開示される方法によって得られるステビオールグリコシドおよび組成物は、食品、食事補助サプリメントおよび甘味料組成物を作るために使用され得る。例えば、WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227、およびWO 2014/122328などを参照。
【０１７４】
例えば、実質的に純粋なステビオールまたはＲｅｂＭまたはＲｅｂＤなどのステビオールグリコシドは、アイスクリーム、炭酸飲料、果物ジュース、ヨーグルト、焼き製品、チューインガム、ハードおよびソフトキャンディ、ならびにソースなどの食品に含まれ得る。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、医薬産物、薬用産物、食事補助サプリメントおよび食事栄養補助サプリメントなどの非食品においてもまた含まれ得る。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、農産業およびペット産業の両方のための動物飼料産物にもまた含まれ得る。代替的には、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシドの混合物は、組み換え微生物を別々に培養し、特定のステビオールまたはステビオールグリコシドを各々生産し、各微生物から実質的に純粋な形態のステビオールまたはステビオールグリコシドを回収し、次いで化合物を組み合わせて、所望の割合の各化合物を含む混合物を得ることによって作られ得る。ここで記載される組み換え微生物は、現在のステビア産物と比較して、より正確かつ一貫性がある混合物が得られることを可能にする。
【０１７５】
別の代替において、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、例えば、サッカリン、デキストロース、スクロース、フルクトース、エリスリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチン、またはアセスルファムカリウムなどの他の甘味料と一緒に食品中へ取り込まれ得る。他の甘味料に対するステビオールまたはステビオールグリコシドの重量比は、最終的な食品において満足のいく味を達成するために所望のとおりに変化され得る。例えば、U.S. 2007/0128311などを参照。いくつかの実施態様において、ステビオールまたはステビオールグリコシドは、フレーバー調節剤としてフレーバー（例えば、シトラスなど）とともに提供され得る。
【０１７６】
ここで記載される組み換え微生物によって生産された組成物は、食品中へ取り込まれ得る。例えば、組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、ステビオールグリコシドおよび食品の種類に依存して、乾燥重量ベースで約２０ｍｇのステビオールグリコシド／ｋｇ食品〜約１８００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品に及ぶ範囲の量において食品中へ取り込まれ得る。例えば、組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で５００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、デザート、冷たい製菓（例えば、アイスクリームなど）、乳製品（例えば、ヨーグルトなど）、または飲料（例えば、炭酸飲料など）中へ取り込まれ得る。組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で３００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、焼き製品（例えば、ビスケットなど）中へ取り込まれ得る。組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で１０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、ソース（例えば、チョコレートシロップなど）または野菜製品（例えば、ピクルスなど）中へ取り込まれ得る。組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で１６０ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、パン中へ取り込まれ得る。組み換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で１６００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、ハードまたはソフトキャンディ中へ取り込まれ得る。組み換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で１０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、加工された果物製品（例えば、果物ジュース、果物フィリング、ジャム、およびゼリーなど）中へ取り込まれ得る。いくつかの実施態様において、ここで生産されたステビオールグリコシド組成物は、医薬組成物の成分である。例えば、Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, 2007, prepared by Harriet Wallin, Food Agric. Org.；EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food (ANS), “Scientific Opinion on the safety of steviol glycosides for the proposed uses as a food additive,” 2010, EFSA Journal 8(4):1537；U.S. Food and Drug Administration GRAS Notice 323；U.S Food and Drug Administration GRAS Notice Notice 329；WO 2011/037959；WO 2010/146463；WO 2011/046423；およびWO 2011/056834などを参照。
【０１７７】
例えば、かかるステビオールグリコシド組成物は、９０〜９９重量％のＲｅｂＡおよび検出不可能な量のステビア植物に由来する混入物を有し得、乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇなどで食品中へ取り込まれ得る。
【０１７８】
かかるステビオールグリコシド組成物は、３重量％超のＲｅｂＢを有するＲｅｂＢ濃縮された組成物であり得、食品におけるＲｅｂＢの量が、乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇなどであるように食品中へ取り込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＢ濃縮された組成物は、検出不可能な量のステビア植物に由来する混入物を有する。
【０１７９】
かかるステビオールグリコシド組成物は、３重量％超のＲｅｂＤを有するＲｅｂＤ濃縮された組成物であり得、食品におけるＲｅｂＤの量が、乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇなどであるように食品中へ取り込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＤ濃縮された組成物は、検出不可能な量のステビア植物に由来する混入物を有する。
【０１８０】
かかるステビオールグリコシド組成物は、３重量％超のＲｅｂＥを有するＲｅｂＥ濃縮された組成物であり得、食品におけるＲｅｂＥの量が、乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇなどであるように食品中へ取り込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＥ濃縮された組成物は、検出不可能な量のステビア植物に由来する混入物を有する。
【０１８１】
かかるステビオールグリコシド組成物は、３重量％超のＲｅｂＭを有するＲｅｂＭ濃縮された組成物であり得、食品におけるＲｅｂＭの量が、乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇなどであるように食品中へ取り込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＭ濃縮された組成物は、検出不可能な量のステビア植物に由来する混入物を有する。
【０１８２】
いくつかの実施態様において、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、卓上用の甘味料または「カップ一杯分(cup-for-cup)」の製品中へ取り込まれる。かかる製品は、典型的には、１以上の増量剤、例えば当業者に既知のマルトデキストリンによって適切な甘味レベルまで希釈される。ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、またはＲｅｂＭについて濃縮されたステビオールグリコシド組成物は、例えば、卓上使用のために乾燥重量ベースで１０，０００〜３０，０００ｍｇのステビオールグリコシド／ｋｇ製品で小袋に包装され得る。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドは、in vitro、in vivo、または全細胞生物変換で生産される。
【０１８３】
本発明は、以下の例おいてさらに記載されるであろうが、請求項に記載される本発明の範囲を限定しない。
【０１８４】
例
以下の例は、本発明の特定の実施態様およびその様々な使用の説明である。それらは、説明目的のみのために記載され、本発明を限定するものとして受け取られるべきではない。
【０１８５】
例１．ＬＣ−ＭＳ分析手順
例３および４についてのＬＣ−ＭＳ分析は、加熱されたエレクトロスプレーイオン（ＨＥＳＩ）源を有するTSQ Quantum Access（ThermoFisher Scientific）三重四極質量分析器に連結されたPhenomenex（登録商標）Kinetex Ｃ１８カラム（１５０ｘ２．１ｍｍ、２．６μｍ粒子、１００Å孔径）を備えるAgilent 1200シリーズＨＰＬＣシステム（Agilent Technologies）を使用して行われた。溶出は、溶出液Ｂ（０．１％のギ酸を含むＭｅＣＮ）および溶出液Ａ（０．１％のギ酸を含む水）の移動相を使用し、０．０から１．０ｍｉｎで１０から４０％のＢへ勾配を増加させ、１．０から６．５ｍｉｎで４０から５０％のＢへ増加させ、６．５から７．０ｍｉｎで５０から１００％のＢへ増加させることによって実施された。流速は、０．４ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は３０℃であった。１，２−ステビオシドおよびＲｅｂＤは、ポジティブモードでＳＩＭ（単一イオンモニタリング）を使用して検出された。
【０１８６】
例８および９についてのＬＣ−ＭＳ分析は、ネガティブイオン化モードで操作されるエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を有するWaters ACQUITY TQD三重四極質量分析器に連結されたプレカラム（２．１ｘ５ｍｍ、１．７μｍ粒子、１３０Å孔径）を備えたWaters ACQUITY UPLC（登録商標）BEH Ｃ１８カラム（２．１ｘ５０ｍｍ、１．７μｍ粒子、１３０Å孔径）を有するWaters ACQUITY UPLC（登録商標）（Waters社）において行われた。化合物の分離は、２つの移動相（Ａ（０．１％のギ酸を含む水）およびＢ（０．１％のギ酸を含むＭｅＣＮ））の勾配を使用し、０．３と２．０ｍｉｎとの間で２０％から５０％のＢへ増加させ、２．０１ｍｉｎで１００％のＢまで増加させ、０．６ｍｉｎの間１００％のＢを維持し、０．６ｍｉｎの間再平衡させることによって達成された。流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は５５℃で設定された。ステビオールグリコシドは、ＳＩＭ（単一イオンモニタリング）を使用してモニタリングされ、真正標準に対して比較することによって定量された。検出されたステビオールグリコシドのｍ／ｚトレースおよび保持時間の値については表１を参照。
【表１−１】
2018503388.tif 000015
【表１−２】
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【表１−３】
2018503388.tif 000017
【０１８７】
ＧｌｃＮＡｃ−誘導体、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸を含むステビオールグリコシドは、ここで記載された方法を使用して単離され得る。例えば、発酵後、培養液は、４℃、７０００ｒｐｍで３０ｍｉｎの間、遠心分離されて細胞を除去し得るか、または、細胞は、ろ過によって除去され得る。無細胞ライセートは、例えば、宿主細胞の機械的破壊または酵素的破壊および細胞の破片を除去するための追加の遠心分離によって得られ得る。乾燥された培養液材料の機械的破壊は、超音波処理などによっても行われ得る。溶解または懸濁された培養液材料は、さらなる精製前に分取クロマトグラフィーなどによるミクロンまたはサブミクロンを使用してろ過され得る。発酵培地または無細胞ライセートは、塩などの低分子量の化合物を除去するために任意に処理され得；精製前に任意に乾燥され、水および溶媒の混合物において再溶解され得る。上清または無細胞ライセートは、以下のとおり精製され得る：カラムは、例えば、HP20 Diaion（登録商標）樹脂（Supelco）または他の好適な非極性吸着または逆相クロマトグラフィー樹脂で満たされ得、上清または無細胞ライセートの分量は、カラムへ充填され、水で洗浄されて、親水性成分を除去し得る。ステビオールグリコシド産物は、水における溶媒濃度の段階的な漸増または勾配（例えば、０％→１００％のメタノール）によって溶出され得る。各画分（通過画分を含む）におけるステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、および／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸のレベルは、次いでＬＣ−ＭＳによって分析され得る。画分は、次いで組み合わされ、真空エバポレーターを使用して容量が低減され得る。追加の精製工程（追加のクロマトグラフィー工程および結晶化など）は、所望の場合用いられ得る。
【０１８８】
例２：株操作および発酵
ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株は、WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227、およびWO 2014/122328（各々参照によってそれらの全体において取り込まれる）に記載のとおり構築された。例えば、シネココッカス種ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１９、配列番号２０）、切断されたトウモロコシＣＤＰＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号３９、配列番号４０）、シロイヌナズナＫＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５１、配列番号５２）、組み換えＳ．レバウディアナＫＯポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５９、配列番号６０）、シロイヌナズナＡＴＲ２ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号９１、配列番号９２）、イネＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１４／配列番号１５、配列番号１６）、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号９３、配列番号９４）、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号８５、配列番号８６）、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド（配列番号５／配列番号６、配列番号７）または配列番号７のＵＧＴ８５Ｃ２変異体（または機能的ホモログ）をコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド（配列番号３、配列番号４）または配列番号４のＵＧＴ７４Ｇ１変異体（または機能的ホモログ）をコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド（配列番号８、配列番号９）または配列番号９のＵＧＴ７６Ｇ１変異体（または機能的ホモログ）をコードする組み換え遺伝子、およびＳ．レバウディアナＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド（配列番号１０、配列番号１１）または配列番号１１のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体（または機能的ホモログ）（ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１２、配列番号１３）ポリペプチドなど）をコードする組み換え遺伝子の１以上のコピーを含む酵母株は、ステビオールグリコシドを生産した。
【０１８９】
例３：ＵＧＴ９１Ｄ２ｅの基質特異性の調整
ＵＧＴ９１Ｄ１（GenBank Accession No. AY345980）は、ステビア植物において高度に発現され、機能的ＵＧＴと考えられる。しかしながら、その基質はステビオールグリコシドではない。これは、ＵＧＴ９１Ｄ１がＵＧＴ９１Ｄ２ｅとは異なる基質を有することを示唆する（これは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅとは異なる２２アミノ酸によって定義され得る）。ＵＧＴ９１Ｄ１とは異なる２２アミノ酸のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ部位飽和ライブラリー（ＳＳＬ）スクリーンは、Geneart（登録商標）（Life Technologies）および縮重ＮＮＫプライマーを使用して調製された。
【０１９０】
ＵＧＴ９１Ｄ２ ＳＳＬクローンは、E. coli XJb (DE3) Autolysis（商標）細胞（Zymo Research）において発現された。コロニーは、１５ｇのトリプトン、７．５ｇのＮａＣｌ、７．５ｇの酵母抽出物、１．５ｇのカザミノ酸、３ｇのＭｇＳＯ４を有し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび３３ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールで強化された１ｍＬのＮＺＣＹＭ（ｐＨ７．０）を含む９６深ウェルプレートにおいて３７℃で終夜成長させた。１５０μＬの終夜培養液は、アンピシリン、０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、３ｍＭのＬ−アラビノース、および２％（ｖ／ｖ）のエタノールを有する３ｍＬのＮＺＣＹＭを含む２４深ウェルプレートに移され、２０℃で２０ｈインキュベートされた。細胞はペレット化され、１００μＬの溶解バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、単一の凍結融解サイクルによる３錠／１００ｍＬのComplete mini protease inhibitor cocktail（Roche））および５０μＬのＤＮａｓｅ混合物（１μＬの１．４ｍｇ／ｍＬのデオキシリボヌクレアーゼ（Calbiochem）、１．２μＬの５００ｍＭのＭｇＣｌ２、および４７．８μＬの４ｘＰＢＳバッファー）において溶解された。プレートは、ゲノムＤＮＡの分解を可能にするために、２５℃、５００ｒｐｍで５ｍｉｎの間振とうさせた。プレートは、次いで４℃、４０００ｒｐｍで３０ｍｉｎの間スピンダウンさせた。WO 2013/022989（参照によってその全体において取り込まれる）を参照。
【０１９１】
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体の活性は、基質、ルブソシドおよびＲｅｂＡに対するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体の特異性を評価するためにin vitroで試験された。６μＬのライセートは、２４μＬの反応混合物（最終的な濃度：１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＫＣｌ、３００μＭのウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰＧ）、および１００μＭのルブソシドまたはＲｅｂＡ）で希釈された。反応混合物は３０℃で２４ｈインキュベートされ、１，２−ステビオシドおよびＲｅｂＤの生産は、ＬＣ−ＭＳによって測定された。結果は表２において示される。
【表２】
2018503388.tif 000018
【０１９２】
表２において示されるとおり、ルブソシドおよびＲｅｂＡは、１，２−ステビオシドおよびＲｅｂＤが酵素のルブソシドまたはＲｅｂＡのいずれかとの接触に際して生産されたことから、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１３）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｍ（配列番号１１８）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ１９５Ｇ（配列番号１１９）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｖ１９６Ｐ（配列番号１２０）、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｈ（配列番号１２１）の基質であった。しかしながら、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１３）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｍ（配列番号１１８）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ１９５Ｇ（配列番号１１９）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｖ１９６Ｐ（配列番号１２０）、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｌ２１１Ｈ（配列番号１２１）によって生産された１，２−ステビオシド／ＲｅｂＤの比率は２４．２から１９８．２へ変動し、酵素はいずれかの基質に対して平等に選択的ではないことを示した。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｖ２８６ＣおよびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ Ｇ３８４Ｗ変異体は、ルブソシドに対して選択的であった；ＲｅｂＤはいずれかの変異体のＲｅｂＡとの接触に際して生産されなかった。
【０１９３】
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅの追加の変異体は、ルブソシドまたはＲｅｂＡに対して基質特異性を実証することが上記アッセイを使用して見出された。表３を参照。配列番号２００（Ｐ９３Ｖ Ｍ１５２Ｇ）、配列番号２０１（Ｓ９９Ｉ）、配列番号２０３（Ｔ１４４Ｌ）、配列番号２０５（Ａ１４８Ｋ Ｌ２２１Ｉ）、配列番号２１２（Ｇ３８４Ｋ）の変異体はＲｅｂＡに対して選択的であった。配列番号１９７（Ｌ１９５Ｖ）、配列番号１９８（Ｖ２８６Ｓ）、配列番号２０２（Ｔ１４４Ｋ Ｐ２０１Ｐ（サイレント））、配列番号２０９（Ｌ２１１Ｔ Ｉ１３０Ｉ（サイレント））、配列番号２１１（Ｓ１１４Ｆ Ｖ２８６Ｓ）、配列番号２１４（Ｅ４３８Ｍ）のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体は、ルブソシドに対して選択的であった。
【表３−１】
2018503388.tif 000019
【表３−２】
2018503388.tif 000020
【０１９４】
例４：ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ−ＥＵＧＴ１１キメラ酵素の評価
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ−ＥＵＧＴ１１キメラ酵素は、基質、ルブソシドおよびＲｅｂＡに対する活性を評価するためにin vitroで試験された。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ−ＥＵＧＴ１１キメラは、表４においてプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅およびオーバーラップ伸長ＰＣＲによって作製された。
【表４−１】
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【表４−２】
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【０１９５】
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ−ＥＵＧＴ１１キメラ酵素は、E. coli XJb(DE3) Autolysis（商標）細胞（Zymo Research）において発現された。コロニーは、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを有する５０ｍＬのＮＺＣＹＭ（ｐＨ７．０）において成長させ、ＩＰＴＧ、Ｌ−アラビノース、およびエタノールを有する５００ｍＬのＮＺＣＹＭ中へ再播種された。細胞ライセートの調製は、１５ｍＬの溶解バッファーにおいてなされ、その後、１５０μＬのＤＮａｓｅおよび２００μＬの５００ｍＭのＭｇＣｌ２においてなされた。キメラのＧＳＴタグアフィニティ精製は、４ｘＰＢＳバッファー（５６０ｍＭのＮａＣｌ、１０．８ｍＭのＫＣｌ、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、７．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．３））の１／３の容量をライセート上清へ添加し、その後、グルタチオンセファロース４Ｂ（GE Healthcare）でインキュベートし（２ｈ、４℃）、Poly-Prep（登録商標）クロマトグラフィーカラム（Bio-Rad）上へ充填することによって実行された。ビーズは、１ＸのＰＢＳバッファーで２回洗浄され、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１０ｍＭの低減されたグルタチオンで溶出された。溶出されたタンパク質は、５０％の最終的な濃度までのグリセロールの添加によって安定化された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、NuPAGE（登録商標）4-12 % Bis-Tris 1.0 mmプレキャストゲル（Invitrogen）、NuPAGE MOPS（Invitrogen）ランニングバッファーおよびSimplyBlue SafeStain（Invitrogen）を使用して実行された。生産されたキメラの量は、ImageJソフトウェアを使用してゲルイメージの相対的な染色強度から決定された。
【０１９６】
キメラは、２０μＬの精製されたＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ、ＥＵＧＴ１１、またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ−ＥＵＧＴ１１キメラ酵素（０．０２ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＫＣｌ、３００μＭのウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰＧ）、および１００μＭルブソシドまたはＲｅｂＡを含む８０μＬの反応混合物のすべての容量へ添加することによってスクリーニングされた。反応は、３０℃で２４ｈインキュベートされ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ルブソシド、および１，２−ステビオシドのレベルは、ＬＣ−ＭＳによって測定された。精製されたキメラのすべてが上記アッセイにおいて活性であるとは限らなかった（ルブソシドおよび／またはＲｅｂＡに対する活性を有する酵素については表５を参照）。
【表５】
2018503388.tif 000023
【０１９７】
表５において示されるとおり、Ｃｈｉｍ＿７（配列番号１８）は、ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅと比較して、より効率的にルブソシドを１，２−ステビオシドへ変換した。Ｃｈｉｍ＿７（配列番号１８）は、ＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅとは異なり、ルブソシドの供給された量を完全に消費した。ＥＵＧＴ１１をルブソシドとともにインキュベートするとき、ルブソシドのＣ１９位は、１，２−グリコシル化され、ＲｅｂＥおよび１，２−ステビオシドもまた生産された（表５）。さらに、Ｃｈｉｍ＿７（配列番号１８）は、ＲｅｂＡに対してＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂよりも１．７５倍高い活性を実証した。Ｃｈｉｍ＿３（配列番号１７）は、選択的にルブソシドを１，２−ステビオシドへ変換した；ＲｅｂＡはＣｈｉｍ＿３（配列番号１７）によってＲｅｂＤへ変換されなかった（表５）。
【０１９８】
例５：ＵＧＴ８５Ｃ２変異体の評価
ＵＧＴ８５Ｃ２の３つの相同モデルは、３つのＰＤＢテンプレートの組み合わせ（モデル１：２ＰＱ６、２ＶＣＥ、２Ｃ１Ｘ；モデル２：２ＰＱ６；モデル３：２ＰＱ６、２Ｃ１Ｘ）を使用し、ＵＧＴ８５Ｈ２、ＵＧＴ７２Ｂ１、およびＶｖＧＴ１についての標準設定および配列を使用して（ＰＤＢ２ＰＱ６、ＰＤＢ２ＶＣＥ、およびＰＣＢ２Ｃ１Ｘを参照）、Sybyl-X 2.0（Certara）におけるORCHESTRAモジュールで生成された。モデルジオメトリおよびクオリティは、molprobityおよびProQウェブサーバーで確認された（Chen et al., Acta Crystallographica. section D, Biological Crystallography 66(Pt 1):12-21 (2010)、Davis et al., Nucleic Acids Research 35:W375-83 (2007)、Wallner & Elofsson, Protein Science: A Publication of the Protein Society 12(5):1073-86 (2003)を参照）。フッ素化したＵＤＰＧ糖ドナーアナログＵＤＰ−２ＦＧｌｃは、ステビオール、１３−ＳＭＧ、１９−ＳＭＧ、またはルブソシドのアクセプターの前に、ＰＤＢ：２ＶＣＥからＵＧＴ８５Ｃ２のＵＤＰＧ結合部位中へ取り込まれた。ステビオールおよびステビオールグリコシドは、Sybyl-X small molecule builderを使用して調製され、Surflex Dock suiteを使用して標準GeomX設定で酵素の活性部位中へドッキングさせた。部位飽和ライブラリー（ＳＳＬ）についての部位は、ＰＤＢテンプレートにおいて１００％保存されていないドッキング分析においてリガンドの３Å内ですべての残基を選択することによって決定された。表６を参照。
【表６−１】
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【表６−２】
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【０１９９】
ＳＳＬクローンは、リガンド残基の３Å内であることが予測される表６における３４非保存アミノ酸について生成された。全プラスミド増幅方法の改変されたバージョン（Zheng et al. Nucleic Acids Research 32(14):e115 (2004)）は、オーバーラップＮＮＫプライマーおよびPhusionポリメラーゼとともに使用された。１０μＬのＰＣＲ反応は、１０ＵのＤｐｎＩ（New England Biolabs）によって３７℃で１ｈ処理され、６５℃で２０ｍｉｎ熱失活され、大腸菌ＤＨ５α細胞中へ形質転換された。コロニーはLuria Broth（ＬＢ）＋カナマイシン アガープレート上で選択され、カナマイシンによって強化された４ｍＬのＬＢにおいて成長させた。プラスミドは、GeneJET（商標）ミニプレップキット（Thermo Fisher Scientific）を使用して精製され、配列決定された。
【０２００】
配列が確認された部位飽和ライブラリー（ＳＳＬ）クローンは、E. coli XJb(DE3) Autolysis（商標）細胞（Zymo Research）中へ形質転換され、ＬＢ＋カナマイシン アガープレート上で選択された。単一のコロニーは、３０ｍｇ／Ｌカナマイシンで強化された１ｍＬのＮＺＣＹＭ中へ播種され、３７℃で２００ｒｐｍの軌道振とうをしながら終夜インキュベートされた。５０μＬの終夜培養は、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３ｍＭのアラビノース、および０．１ｍＭのＩＰＴＧで強化された１ｍＬの新しいＮＺＣＹＭ中へ移され、２０℃で２００ｒｐｍの軌道振とうをしながら終夜インキュベートされた。細胞は４℃で３２２０ｇ／１０ｍｉｎでスピンダウンされ、complete Mini EDTA free protease inhibitor cocktail（１錠／２５ｍＬのＧＴバッファー；Roche Diagnostics）を含む５０μＬのＧＴバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２）において再懸濁された。ペレットは４℃で２００ｒｐｍ／５ｍｉｎで軌道振とうによって再懸濁された。細胞は溶解工程の開始前最小１５ｍｉｎの間−８０℃でインキュベートされた。
【０２０１】
細胞は、試料を２５℃まで加熱し、２．３９ｍＬの４ｘＨｉｓ結合バッファー（８０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）を含む２５μＬのＤＮＡｓｅＩ混合を、５０μＬの１．４ｍｇ／ｍＬのDNAse I bovine pancreas（Calbiochem）および６０μＬのＭｇＣｌ２（５００ｍＭ）とともに添加することによって溶解された。ライセートは１．２μｍの９６ウェルろ過プレート（EMD Millipore）を通じてろ過され、１Ｘ結合バッファーであらかじめ２回洗浄された５０μＬのＨｉｓ選択ビーズ（Sigma-Aldrich）を含む別の１．２μｍのろ過プレートへ移された。ライセートおよびビーズは、次いで５００ｒｐｍの軌道振とうによって４℃で２ｈインキュベートされた。プレートは４５０ｇ／２ｍｉｎでスピンダウンされた。通過画分におけるすべてのタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイ試薬（Sigma-Aldrich）を使用して測定され、試料は、試料を遠心分離し、上清を除去し、５０μＬの１ＸＨｉｓ結合バッファーを添加することによって２回洗浄された。溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール）はビーズへ添加され、５００ｒｐｍの軌道振とうをしながら４℃で５ｍｉｎインキュベートされ、タンパク質は９６ウェルＰＣＲプレート（FrameStar 96、4titude）中へ溶出された。精製は通過、洗浄工程および溶出のランニング試料によって、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲルを有するNuPAGE（登録商標）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム（Invitrogen）上で評価された。
【０２０２】
精製されたＵＧＴ８５Ｃ２変異体の活性は測定された。２．０μｇ／ｍＬのＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、反応バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＫＣｌ、Calf Intestinal Alkaline Phosphatase（New England Biolabs）、１２０μＭのＵＤＰＧ、および４０μＭのステビオールまたは４０μＭの１９−ＳＭＧのいずれか）と共に３７℃で２０ｍｉｎインキュベートされた。このアッセイにおいて、ＵＤＰＧにおけるグルコースは、ステビオールまたは１９−ＳＭＧへ転移され；産物はＵＤＰおよび１３−ＳＭＧまたはルブソシドのいずれかであった。ＵＤＰにおけるリン酸は次いでホスファターゼによって放出され、放出されたリン酸の量はマラカイトグリーンプロトコル（Baykov et al., Analytical Biochemistry 171(2):266-70）を使用してＡｂｓ６００で測定された。値は、ブラッドフォード試薬（Sigma-Aldrich）を使用することによって測定された、放出されたすべてのタンパク質によって正規化された。
【０２０３】
候補は、野生型の活性よりも１以上の標準偏差の活性を有するか、または１つの基質に対して５０％未満の活性を有する一方、他方に対して野生型の活性を維持する（例えば、基質特異性を示す）ものが選択された。平均０．９４の野生型ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号７）について、ステビオール試料の１９−ＳＭＧ試料に対するＡｂｓ６００比率は、野生型ＵＧＴ８５Ｃ２がステビオールおよび１９−ＳＭＧの変換を基質の優先性がほとんどないか又は全くなく触媒することを示す。表７Ａは、ステビオールの変換よりも１９−ＳＭＧの変換を優先的に触媒したと分析されたＵＧＴ８５Ｃ２変異体を示し、表７Ｂは１９−ＳＭＧの変換よりもステビオールの変換を優先的に触媒したと分析されたＵＧＴ８５Ｃ２変異体を示し、表７Ｃはいずれかの基質について優先性がほとんどなく１９−ＳＭＧおよびステビオールの変換を触媒したと分析されたＵＧＴ８５Ｃ２変異体を示す。部位飽和ライブラリー（ＳＳＬ）スクリーンによって生成された特定のクローンは、一度よりも多く選択され、表７Ａ〜Ｃにおいて１よりも多いエントリーに対応する。
【表７Ａ】
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【表７Ｂ】
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【表７Ｃ】
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【０２０４】
ＵＧＴ８５Ｃ２の精製されたＳ８４ＶおよびＰ８６Ｒ変異体は、１９−ＳＭＧに対して選択的であった；ＵＧＴ８５Ｃ２ Ｓ８４ＶおよびＵＧＴ８５Ｃ２ Ｐ８６Ｒは、ステビオールに対する活性を実証しなかった（表７Ａ）。精製されたＦ４８Ｓ、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｒ、Ｆ４８Ｑ、Ｆ４８Ｔ、Ｆ４８Ｓ、Ｉ４９Ｖ、Ｐ８６Ｒ、Ｐ８６Ｇ、およびＦ１２２Ｓ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、１９−ＳＭＧに対する選択性もまた示した（表７Ａ）。しかしながら、ＵＧＴ８５Ｃ２の精製されたＳ８４ＴおよびＩ８７Ｍ変異体は、ステビオールに対して選択的であった；ＵＧＴ８５Ｃ２ Ｓ８４ＴおよびＵＧＴ８５Ｃ２ Ｉ８７Ｍは、１９−ＳＭＧに対して活性を実証しなかった（表７Ｂ）。精製されたＩ８７Ｐ、Ｉ８７Ｙ、Ｌ９１Ｋ、Ｌ９１Ｒ、Ｌ９１Ｔ、Ｌ９２Ｍ、およびＩ９５Ｋ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、ステビオールに対する選択性もまた示した（表７Ｂ）。
【０２０５】
例６：ＵＧＴ８５Ｃ２を欠失したステビオールグリコシドを生産する酵母株のキャラクタリゼーション
例２において記載されたステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株の改変されたバージョン、配列番号６７に示されたヌクレオチド配列によってコードされる組み換えＫＯ遺伝子（配列番号１１７に示されたアミノ酸配列に対応）および（配列番号７７、配列番号７８）をコードする組み換えＣＰＲ１遺伝子は、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド（配列番号５／配列番号６、配列番号７）について欠失された。１６の独立クローンは、回収前に、振とう（深ウェルについて４００ｒｐｍ）させながら、合成完全（ＳＣ）培地において３０℃で５日間成長させた。培養試料（細胞除去なし）は、ＬＣ−ＭＳによるすべてのグリコシドレベルの検出のために、ＤＭＳＯの存在下で加熱された。
【０２０６】
図４Ａにおいて示されるとおり、ＵＧＴ８５Ｃ２を欠失した細胞の培養試料は、対照株（ＵＧＴ８５Ｃ２について欠失されていない）と比較して、ｅｎｔ−カウレノールグリコシド（ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（＃６）、またはｅｎｔ−カウレノール＿２Ｇｌｃ（＃８）を蓄積しなかった。この結果は、ＵＧＴ８５Ｃ２がｅｎｔ−カウレノールの１９−Ｏ−グルコシル化の原因であることを示唆する。また、図４Ａにおいて示されるとおり、ＵＧＴ８５Ｃ２を欠失した細胞の培養試料は、ｅｎｔ−カウレン酸グリコシド（ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、およびｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２））を蓄積した。対照試料は１３−ＳＭＧを蓄積した一方、ＵＧＴ８５Ｃ２を欠失した細胞の培養試料は１９−ＳＭＧ、ステビオール、ステビオール＋２Ｇｌｃ（＃２３）、およびステビオール＋３Ｇｌｃ（＃３４）を蓄積した。図４Ｂおよび４Ｃを参照。ステビオール＋２Ｇｌｃ（＃２３）およびステビオール＋３Ｇｌｃ（＃３４）は、おそらく、ステビオールのバックボーンの１９位で結合された２または３のグルコース部分をそれぞれ有する。
【０２０７】
ＮＭＲによって明らかにされた単離されたトリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸の構造は、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノールの構造と併せて、図７Ａにおいて示される。これらの構造は、標準同および異核マルチパルスＮＭＲ実験、１Ｈ、１Ｈ−ＣＯＳＹ、１Ｈ、１Ｈ−ＲＯＥＳＹ、１Ｈ、１３Ｃ−ＨＳＱＣ、および１Ｈ、１３Ｃ−ＨＭＢＣによって解かれた。化合物は６０μＬのＤＭＳＯ−ｄ６において溶解され、２５℃で測定された。これらの化合物のスペクトルは、極低温プローブ（5 mm CPTCI 1H-13C/15N/D Z-GRD Z44909/0010）を備えた800 MHz Bruker Avance instrument（１Ｈについて８００ＭＨｚ、１３Ｃについて２０１ＭＨｚ）上で得られた。さらに、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ＬＣ−ＭＳによって検出された、一般的なｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ、ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体２）、およびｅｎｔ−カウレノール＋Ｇｌｃ＋ＧｌｃＮＡｃ構造に合致した３分子について得られた。これらの化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフトについては図８Ａ〜８Ｌを参照。
【０２０８】
ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、その後、フォワードプライマー（配列番号２１５）およびリバースプライマー（配列番号２１６）およびＰＧＫ１プロモーターを使用してＵＳＥＲベクター中へクローニングされた（ＣｈｒＸＩＩ−１での統合のため）。ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は次いでＵＧＴ８５Ｃ２を欠失したステビオールグリコシドを生産する株中へ統合された。形質転換体は、形質転換プレートから再ストリーキングされた。前培養は、９６深ウェルプレート（ＤＷＰ）における５００μＬの合成完全ＵＲＡ（ＳＣ−ＵＲＡ）培地における再ストリーキングされたプレートからセットアップされ、３０℃、３００ｒｐｍで終夜成長させた。培養は、５０μＬの前培養を５００μＬのＳＣ−ＵＲＡ培地を含む９６ウェルＤＷＰへ移すことによってセットアップされた。
【０２０９】
インキュベートから１日後、培養は、前培養（５００μＬのＳＣ−ＵＲＡにおける５０μＬ）からセットアップされ、Duetzシステムにおいて５日間成長させた（前培養と同じ条件）。ＯＤ６００は１：１０希釈においてプレートリーダー上で測定され、試料は５０μＬの試料を５０μＬの１００％ＤＭＳＯへ移すことによって回収された。混合物は８０℃まで１０ｍｉｎ加熱され、その後スピンダウンされた（４０００ｒｃｆ、４℃、１０ｍｉｎ）。１５μＬの各上清は１０５μＬの５０％ＤＭＳＯ（１：１６の全希釈）とともに混合され、試料はＬＣ−ＭＳによって分析された。
【０２１０】
例７：細胞ライセートにおけるＵＧＴ８５Ｃ２変異体活性の評価
例６からの精製された変異体ＵＧＴ８５Ｃ２のＤＮＡは、XJB autolysis z-competent細胞中へ個々に形質転換された。各形質転換プレートからの３つのコロニーの前培養は、カナマイシン（６００ｍｇ／Ｌ）を含む６００μＬのＬＢ中へ播種され、９６ウェルＤＷＰにおいて２００ｒｐｍ、３７℃で終夜インキュベートされた。タンパク質生産および細胞壁分解は、５０μＬの前培養を、カナマイシン（６００ｍｇ／Ｌ）＋３ｍＬ／Ｌの１Ｍアラビノースおよび１００μＬ／Ｌの１ＭのＩＰＴＧを含む１ｍＬ／ウェルのＮＺＣＹＭ培養液を含む新しい９６ウェルＤＷＰへ移すことによって誘導された。培養は、細胞をペレット化し（４０００ｒｃｆ、５ｍｉｎ、４℃）かつ上清を除去する前に、２０℃、２００ｒｐｍでおよそ２０ｈインキュベートされた。プロテアーゼ阻害剤（cOmplete（商標）, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets, 11836170001 Roche）を有する５０μＬのＧＴバッファーは各ウェルへ添加された。ペレットは４℃、２００ｒｐｍで５ｍｉｎ振とうすることによって再懸濁された。各試料の７５μＬの分量はＰＣＲプレートへ移され、−８０℃で凍結された。ペレットは室温で解凍され、２５μＬ／ウェルのＤＮＡｓｅ混合（プレート毎に２，３９ｍＬの４ｘ結合バッファー＋５０μＬのＤＮＡｓｅＩ（１．４ｍｇ／ｍＬ）＋６０μＬのＭｇＣｌ２（１Ｍ））は、試料がほとんど解凍されたときに添加された。プレートは穏やかに振とうさせながら室温で５ｍｉｎインキュベートされ、その後４０００ｒｃｆで５ｍｉｎ遠心分離された。各上清は活性測定のために新しいＰＣＲプレートへ移された。
【０２１１】
各上清は、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＫＣｌ、３００μＭのＵＤＰグルコース、および１００μＭの基質の最終的な濃度を含むアッセイ反応混合においてインキュベートされた。基質はステビオールまたは１９−ＳＭＧのいずれかであった。精製された野生型ＵＧＴ８５Ｃ２酵素およびＵＧＴ８５Ｃ２細菌ライセートは、陽性対照として使用された。反応は３０℃で（プレート振とう器上で）インキュベートされ、反応は、２０μＬの試料を２０μＬの１００％ＤＭＳＯと混合することによって、２０ｍｉｎ、４０ｍｉｎ、および１９ｈ後に停止された。試料は、６０μＬの５０％のＤＭＳＯを添加することによってさらに希釈され、その後ＬＣ−ＭＳによって分析された。測定された１３−ＳＭＧ、１９−ＳＭＧ、ルブソシド、およびステビオールレベルに対応するＡＵＣ値は、表８Ａ〜Ｃにおいて示される。
【表８Ａ−１】
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【表８Ａ−２】
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【表８Ｂ】
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【表８Ｃ】
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【０２１２】
１９−ＳＭＧおよびルブソシドの蓄積は、ステビオールを基質として使用するＵＧＴ８５Ｃ２変異体活性アッセイにおいて観察されなかった。ステビオールを基質として使用することによって、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｔ、Ｉ４９Ｖ、Ｓ８４Ａ、およびＬ９２Ｆ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、４０ｍｉｎ未満のインキュベート期間の間、高い活性を実証し、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｔ、およびＩ４９Ｖ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、４０ｍｉｎ超のインキュベート期間の間、高い活性を実証した（表８Ａ）。１９−ＳＭＧを基質として使用することによって、Ｆ４８Ｈ、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｔ、Ｉ４９Ｖ、およびＳ８４Ａ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は、４０ｍｉｎ未満のインキュベート期間の間、高い活性を実証し、Ｆ４８Ｈ、Ｉ４９Ｖ、Ｓ８４Ａ、Ｓ８４Ｖ、Ｌ９１Ｋ、およびＬ９２Ｆ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体、ならびに、野生型ＵＧＴ８５Ｃ２は、４０ｍｉｎ超のインキュベート期間の間、高い活性を実証した（表８Ｂ）。ステビオールおよび１９−ＳＭＧの遅い変換は、ＵＧＴ８５Ｃ２ Ｉ８７Ｈについて観察された（表８Ａおよび８Ｂ）。
【０２１３】
１３−ＳＭＧ／ルブソシド比率はＵＧＴ８５Ｃ２変異体について計算された。高い１３−ＳＭＧ／ルブソシド比率はステビオールについてＵＧＴ８５Ｃ２変異体の優先性を示す一方、低い１３−ＳＭＧ／ルブソシド比率は１９−ＳＭＧについてＵＧＴ８５Ｃ２変異体の優先性を示す。Ｌ９１Ｋ、Ｌ９１Ｒ、およびＬ９２Ｆ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は高い１３−ＳＭＧ／ルブソシド比率を実証した一方、Ｆ４８Ｙ、Ｆ４８Ｔ、Ｐ８６Ｇ ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は低い１３−ＳＭＧ／ルブソシド比率を実証した。
【０２１４】
ＵＧＴ８５Ｃ２変異体は２４ｈ後にステビオールをルブソシドへ変換することが見出された。ルブソシドレベル（ＡＵＣ）は図５において示される。アミノ酸４８および４９位における変異は、対照と比較して増加されたレベルのルブソシドを生産した。８６、９１および９２位でアミノ酸の変異を有する変異体は、より低いレベルのルブソシドを生産するように思われる。
【０２１５】
例８：ＵＧＴ７６Ｇ１変異体の評価
ＵＧＴ７６Ｇ１変異体は、ステビオールグリコシド、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、およびトリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸レベルに対する効果を決定するために、例２において記載されるようなステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株の改変されたバージョンにおいて試験された。バックグラウンド株はWO 2014/122227の例９において記載され、ここでＵＧＴ７６Ｇ１の両コピーは選択的マーカーを使用する相同組み換えによって欠失された。株は、染色体レベルで再統合された野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（ＷＴ対照）またはＵＧＴ７６Ｇ１の変異体を含んだ。
【０２１６】
ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、生産されたＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの比率を増加させた。株におけるＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、すべて、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、１，２−ビオシド、１，２−ステビオシド、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＤ、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の増加された蓄積、増加された生産されたＲｅｂＤ／ＲｅｂＭの比率、およびＲｅｂＢおよびＲｅｂＡの減少された蓄積をもたらした。表９Ａ〜９Ｃを参照。具体的には、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、およびＳｔｅｖ３Ｇｌｃ（＃３４）の増加された蓄積をもたらした。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の量を増加させた。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）およびＳｔｅｖ３Ｇｌｃ（＃３４）の量を増加させた。表９Ａ〜９Ｃを参照。
【表９Ａ】
2018503388.tif 000033
【表９Ｂ】
2018503388.tif 000034
【表９Ｃ】
2018503388.tif 000035
【０２１７】
二重ＵＧＴ７６Ｇ１変異体もまた試験された。二重変異体は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１７）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１８）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１９）、およびＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２２０）であった。二重変異体ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１７）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１８）、およびＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１９）は、３つの単一の変異体ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、およびＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）と比較して、増加されたＲｅｂＭ蓄積をもたらした。表９Ａ〜９Ｃを参照。具体的には、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１７）の発現は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）変異体と比較して、ＲｅｂＭおよびステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の量を増加させた。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１８）の発現は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）変異体と比較して、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、およびステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を増加させ、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、１，２−ビオシド、１，２−ステビオシド、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、Ｓｔｅｖ３Ｇｌｃ（＃３４）、ＲｅｂＥ、およびステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）の蓄積を減少させた。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１９）の発現は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）変異体と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）、ＲｅｂＡ、およびＲｅｂＭの蓄積を増加させ、ＲｅｂＥおよびステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を減少させた。表９Ａ〜９Ｃを参照。したがって、相乗効果はＵＧＴ７６Ｇ１二重変異体について観察された。
【０２１８】
ＵＧＴ７６Ｇ１変異体もまた、より高いコピー数のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号１０、配列番号１１）、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号３、配列番号４）、およびＡＴＲ２（配列番号９１、配列番号９２）を含む上記の株の改変されたバージョンにおいて分析された。増加されたＲｅｂＤレベルをもたらすＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現し、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ、ＵＧＴ７６Ｇ Ｔ１４６Ｇ、およびＳ２８３Ｎを含むステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株もまた、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）およびｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を増加させたが、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を減少させた。図９Ａを参照。ＲｅｂＤレベルを増加させるＵＧＴ７６Ｇ１変異体もまた、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８）の蓄積を増加させたが、ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（＃６）とともに共溶出されるｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を減少させた（図９Ｂ）。
【０２１９】
ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ変異体（配列番号１８４）（ＲｅｂＭのレベルを増加させる変異体）の発現は、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）およびｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の減少された蓄積をもたらした（図９Ａ）。ｅｎｔ−カウレノールグリコシドのレベルは、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する株と比較して、ＲｅｂＭのレベルを増加させるＵＧＴ７６Ｇ１変異体の発現に際して、顕著に変更されなかった（図９Ｂ）。
【０２２０】
ステビオールグリコシドを生産する株において生産された１３−ＳＭＧ、１，２−ビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＧ（１，３−ステビオシド）、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）のレベルは、図１０Ａ〜１０Ｃにおいて示される。増加されたＲｅｂＤレベルをもたらすＵＧＴ変異体の発現もまた、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、１，２−ステビオシド、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、およびＳｔｅｖｉｏ＋３Ｇｌｃ（＃１）の蓄積を増加させたが、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）、およびＲｅｂＧ（１，３−ステビオシド）の蓄積を減少させた（図１０Ａ）。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）の発現は、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）の増加された蓄積をもたらしたが、１，２−ステビオシド、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の減少された蓄積をもたらした（図１０Ｂ）。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２５３Ｗ（配列番号１８６）の発現は、１，２−ステビオシドおよびステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の減少された蓄積をもたらした（図１０Ｂ）。ＵＧＴ７６Ｇ１ ２８４Ｇの発現は、１，２−ステビオシドおよびステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の増加された蓄積をもたらしたが、ＲｅｂＧ、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の減少された蓄積をもたらした（図１０Ｂ）。図１０Ｃは、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号９）またはＲｅｂＤまたはＲｅｂＭの蓄積を増加させるＵＧＴ７６Ｇ１変異体を発現するＳ．セレビシエにおいて、１３−ＳＭＧ、１，２−ビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、およびＲｅｂＭの蓄積を示す。
【０２２１】
より高いコピー数のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号１０、配列番号１１）、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号３、配列番号４）、およびＡＴＲ２（配列番号９１、配列番号９２）を含むステビオールグリコシドを生産する株は、別個の実験においてさらに試験された。表９Ｄ〜９Ｆにおいて示されるとおり、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）の増加された蓄積をもたらし、生産されたＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの比率を増加させ、１，２−ビオシド、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、ＲｅｂＥ、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の蓄積を減少させた。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、１，２−ビオシド、１，２−ステビオシド、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、Ｓｔｅｖ＋３Ｇｌｃ（＃３４）、ＲｅｂＥ、およびステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）の蓄積を増加させ、生産されたＲｅｂＤ／ＲｅｂＭの比率を増加させ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＡ、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）、およびステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体５）の蓄積を減少させた。具体的には、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）の発現は、ルブソシド、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の増加された蓄積およびＲｅｂＢおよびステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）の減少された蓄積をもたらした。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）の発現は、ルブソシドの増加された蓄積およびＲｅｂＢ、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の減少された蓄積をもたらした。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）の発現は、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の増加された蓄積をもたらした。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、ルブソシドの増加された蓄積およびＲｅｂＢ、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）およびステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の減少された蓄積をもたらした。表９Ｄ〜Ｆを参照。
【表９Ｄ】
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【表９Ｅ】
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【表９Ｆ】
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【０２２２】
ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１７）の発現は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）およびｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を増加させ、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８）およびステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を減少させた。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１８）は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）、ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）、およびステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を増加させ、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８）、１，２−ビオシド、ルブソシド、１，２−ステビオシド、ＲｅｂＥ、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）の蓄積を減少させた。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１９）の発現は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）、ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）、およびステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を増加させ、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８）、１，２−ビオシド、およびステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を減少させた。さらに、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２１９）は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ＲｅｂＤの蓄積を増加させた。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ Ｈ１５５Ｌ（配列番号２２０）の発現は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）と比較して、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を減少させた。表９Ｄ〜Ｆを参照。
【０２２３】
ＵＧＴ７６Ｇ１変異体もまた、余剰コピーのＣＰＲ１（配列番号７７、配列番号７８）、余剰コピーのＳｒＫＡＨｅ１（配列番号９３、配列番号９４）、および余剰コピーのＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号８、配列番号９）またはＵＧＴ７６Ｇ１変異体を含むステビオールグリコシドを生産する株において発現された。ステビオールグリコシド、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、およびトリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸レベルの蓄積は測定された。図１１を参照。
【０２２４】
ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭの蓄積を増加させるＵＧＴ７６Ｇ１変異体もまた、余剰コピーのＣＰＲ１（配列番号７７、配列番号７８）および余剰コピーのＳｒＫＡＨｅ１（配列番号９３、配列番号９４）を含むステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株において発現された。ステビオールグリコシドを生産する対照株は３コピーの野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号９）を含み、変異体含有株は、２コピーの野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号９）および１コピーのＵＧＴ７６Ｇ１変異体を含んだ。図１１Ａは、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号９）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）を発現する生産株における、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８）、およびｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（＃６）とともに共溶出されるｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）のレベルを示す。すべてのレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸（ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）＋ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）＋ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２））は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、およびＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）を発現する生産株において最も顕著に増加し（図１１Ｂ）、すべてのレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール（ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（＃６）とともに共溶出されるｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）、および、ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ（＃８））は、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、およびＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）を発現する生産株について最も顕著に影響を受けた（図１１Ｃ）。
【０２２５】
図１１Ｄおよび１１Ｅは、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号９）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）を発現する生産株における、１，２−ビオシド、１，２−ステビオシド、ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１）、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体５）、１３−ＳＭＧ、ルブソシド、ＲｅｂＧ（１，３−ステビオシド）、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、およびＲｅｂＭの蓄積を示す。
【０２２６】
図１１Ｄにおいて試験されたすべてのＵＧＴ７６Ｇ１変異体は、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）の減少された蓄積を示した。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現（これらすべてがＲｅｂＤの生産を増加させた）は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株と比較して、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）の減少された蓄積をもたらした（図１１Ｄ）。しかしながら、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）変異体の発現（これはＲｅｂＭの生産を増加させた）は、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）の増加された蓄積をもたらした（図１１Ｄ）。
【０２２７】
ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株と比較して、ステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の増加された蓄積をもたらした一方、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）変異体の発現は、ステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）の減少された蓄積をもたらした（図１１Ｄ）。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株と比較して、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の増加された蓄積をもたらした一方、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）変異体の発現は、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の減少された蓄積をもたらした（図１１Ｄ）。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｉ２６Ｗ（配列番号１８２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体５）の増加された蓄積をもたらした（図１１Ｄ）。
【０２２８】
より高いコピー数のＣＰＲ１（配列番号７７、配列番号７８）およびＳｒＫＡＨｅ１（配列番号９３、配列番号９４）を含むステビオールグリコシドを生産する株は、別個の実験においてさらに試験された。表９Ｇ〜９Ｉにおいて示されるとおり、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ＲｅｂＤ、ステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）のレベルを低減した。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ（配列番号１８１）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）、またはＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、各々、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）およびステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）の蓄積を低減した。具体的には、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｔ１４６Ｇ（配列番号１８３）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ＲｅｂＤ、ステビオール＋６Ｇｌｃ（＃２３）、およびステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の量を増加させ、ＲｅｂＧ、ステビオール＋５Ｇｌｃ＃２５の量を低減させた。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ（配列番号１８５）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を増加させ、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）およびステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）の蓄積を低減させた。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ（配列番号１８８）の発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ＲｅｂＤ、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、およびステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を増加させ、ＲｅｂＧおよびステビオール＋５Ｇｌ（＃２５）の蓄積を低減させた。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇ Ｈ１５５Ｌの発現は、単一の変異体ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｌ２５７Ｇと比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の蓄積を低減させた。二重変異体ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｑ２３Ｈ Ｈ１５５Ｌの発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２５）の蓄積を低減させた。二重変異体ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｓ２８３Ｎ Ｈ１５５Ｌの発現は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）の蓄積を低減させた。表９Ｇ〜９Ｉを参照。
【表９Ｇ】
2018503388.tif 000039
【表９Ｈ】
2018503388.tif 000040
【表９Ｉ】
2018503388.tif 000041
【０２２９】
例９：ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ変異体のさらなるキャラクタリゼーション
ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）は、例２および８において記載されたステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株において発現された。図６Ａにおいて示されるとおり、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌを発現する株（灰色のバー）は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株（黒色のバー）と比較して、より高いレベルのＲｅｂＭ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、１３−ＳＭＧ、およびルブソシドを生産した。ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌを発現するステビオールグリコシドを生産する株は、ＲｅｂＤよりも高い力価のＲｅｂＭを生産した（図６Ａ）。
【０２３０】
ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌ（配列番号１８４）を発現する株は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株（黒色のバー）と比較して、より大きいすべてのレベルのステビオールグリコシド（１３−ＳＭＧ＋１，２−ビオシド＋ルブソシド＋ＲｅｂＧ＋ＲｅｂＢ＋ＲｅｂＡ＋ＲｅｂＥ＋ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）およびＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ（灰色のバー）を生産した（図６Ｂ）。したがって、ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌを発現するステビオールグリコシドを生産する株（灰色のバー）は、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株（黒色のバー）と比較して、ステビオールグリコシド生産において２０％の増加、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの力価において１０％の増加を実証した（図６Ｃ）。
【０２３１】
ＵＧＴ７６Ｇ１ Ｈ１５５Ｌを発現する株（灰色のバー）もまた、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する対照株（黒色のバー）と比較して、より少ない量の１，２−ビオシド、１，２−ステビオシド、トリグリコシル化ステビオール分子（ステビオール＋３Ｇｌｃ（＃１））、ペンタグリコシル化ステビオール分子（ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２２）、２つのヘキサグリコシル化ステビオール分子（ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１および＃２３））、およびヘプタグリコシル化ステビオール分子（ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２））を生産したが、テトラグリコシル化分子（ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６））および２つのペンタグリコシル化ステビオール分子（ステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４および＃２５））の量を増加させた（図６Ｄ）。検出された特定のステビオールグリコシドの構造については図１、７、および８を参照。
【０２３２】
本発明を詳細に記載し、その特定の実施態様を参照することによって、添付の請求項に定義される本発明の範囲を逸脱することなく、改変および変更が可能であるであることは明らかであろう。より具体的には、本発明のいくつかの側面がここで特に有利なものとして同定されるが、本発明が必ずしも本発明のこれら特定の側面に限定されないことが意図される。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１０−１３】
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【表１０−１４】
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【表１０−１５】
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【表１０−１６】
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【表１０−１７】
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【表１０−１８】
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【表１０−１９】
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【表１０−２０】
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【表１０−２１】
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【表１０−２２】
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【表１０−２３】
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【表１０−２４】
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【表１０−２５】
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【表１０−２６】
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【表１０−２７】
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【表１０−２８】
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【表１０−２９】
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【表１０−３０】
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【表１０−３１】
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【表１０−３２】
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【表１０−３３】
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【表１０−３４】
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【表１０−３５】
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【表１０−３６】
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【表１０−３７】
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【表１０−３８】
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【表１０−３９】
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【表１０−４０】
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【表１０−４１】
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【表１０−４２】
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【表１０−４３】
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【表１０−４４】
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【表１０−４５】
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【表１０−４６】
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【表１０−４７】
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【表１０−４８】
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【表１０−４９】
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【表１０−５０】
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【表１０−５１】
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【表１０−５２】
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【表１０−５３】
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【表１０−５４】
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【表１０−５５】
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【表１０−５６】
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【表１０−５７】
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【表１０−５８】
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【表１０−５９】
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【表１０−６０】
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【表１０−６１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
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【図８Ｎ】
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【図８Ｏ】
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【図８Ｐ】
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【図８Ｑ】
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【図８Ｒ】
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【図８Ｓ】
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【図８Ｔ】
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【図８Ｕ】
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【図８Ｖ】
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【図８Ｗ】
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【図８Ｘ】
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【図８Ｙ】
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【図８Ｚ】
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【図８ＡＡ】
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【図８ＡＢ】
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【図８ＡＣ】
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【図８ＡＤ】
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【図８ＡＥ】
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【図８ＡＦ】
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【図８ＡＧ】
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【図８ＡＨ】
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【図８ＡＩ】
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【図８ＡＪ】
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【図８ＡＫ】
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【図８ＡＬ】
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【図８ＡＭ】
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【図８ＡＮ】
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【図８ＡＯ】
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【図８ＡＰ】
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【図８ＡＱ】
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【図８ＡＲ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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