(57)【要約】両親媒性ペプチドを抗原に共有結合させて抗原複合体組成物を形成することを含む免疫応答を増強する方法が提供され、被験者に抗原複合体を投与することを含む。そして、両親媒性螺旋構造を有する新規な抗原複合体も提供され、抗原送達の能力が改善され得る。【選択図】図７Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性ペプチドを抗原に結合させて抗原複合体組成物を形成するステップと、
前記抗原複合体を被験者に投与するステップと、を含むことを特徴とする、免疫応答を増強する方法。
【請求項２】
前記両親媒性ペプチドは、４〜４５個のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記両親媒性ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記両親媒性ペプチドは、Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／またはＡ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフを含むアミノ酸配列を含み、
Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれアルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から個々に選択され、
Ｂ１は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され、
Ｂ２は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、
Ｂ３は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され、
Ｂ４は、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択され、
Ｂ５は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）およびセリン（Ｓ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記両親媒性ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原はＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エボラウイルス、ヘモフィルスインフルエンザ菌ｂ型、ピロリ菌、単純ヘルペスウイルス１型および２型、マラリア原虫、麻疹ウイルス、中東呼吸症候群コロナウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、百日咳菌、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、破傷風菌、結核菌、西ナイルウイルス、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、クロストリジウム・ディフィシル、髄膜炎菌とサルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカからなる群から選択される病原性因子の一部であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原は、オリゴ糖、ポリペプチド、タンパク質、多糖、ペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記被験者は温血動物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗原複合体組成物であって、
Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／またはＡ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフと、
前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフのＮ末端に結合する第１のペプチドと、
前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフのＣ末端に連結する第２のペプチドと、
前記第１のペプチドまたは前記第２のペプチドに共有結合する抗原と、
を含み、
Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４はそれぞれアルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から個々に選択され、
Ｂ１は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され、
Ｂ２は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、
Ｂ３は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され、
Ｂ４は、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択され、
Ｂ５は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）及びセリン（Ｓ）からなる群から選択され、
前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフ、前記第１のペプチドおよび前記第２のペプチドは、両親媒性螺旋二次構造を形成することを特徴とする、抗原複合体組成物。
【請求項１０】
前記第１のペプチドは０〜２０個のアミノ酸を含み、前記第２のペプチドは０〜２０個のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項９に記載の抗原複合体組成物。
【請求項１１】
前記抗原は、オリゴ糖、ポリペプチド、タンパク質、多糖、ペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の抗原複合体組成物。
【請求項１２】
抗原複合体組成物を被験体に投与することを含む抗原送達を改善する方法であって、
前記抗原複合体組成物は、
Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／またはＡ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフと、
前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフのＮ末端に結合する第１のペプチドと、
前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフのＣ末端に連結する第２のペプチドと、
前記第１のペプチドまたは前記第２のペプチドに共有結合する抗原とを含み、
Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４はそれぞれアルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から個々に選択され、
Ｂ１は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され、
Ｂ２は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、
Ｂ３は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され、
Ｂ４は、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択され、
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）及びセリン（Ｓ）からなる群から選択され、
前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフ、前記第１のペプチドおよび前記第２のペプチドは、両親媒性ヘリックス二次構造を形成することを特徴とする、抗原送達を改善する方法。
【請求項１３】
前記第１のペプチドは０〜２０個のアミノ酸を含み、前記第２のペプチドは０〜２０個のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原は、オリゴ糖、ポリペプチド、タンパク質、多糖、ペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
両親媒性ペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、両親媒性ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１４年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０９０，１８０号の優先権を主張するものであり、その全ての開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明の例示的な実施例は、免疫応答を改善する方法に関する。特に、本発明の例示的な実施例は、両親媒性螺旋二次構造の抗原複合体を使用することによって免疫応答を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
感染性のために必要とされる多くの微生物タンパク質は、微生物感染メカニズムに関する広範囲な研究を介して鑑定され、可能性のある候補ワクチンとして指定されている。これらの候補ワクチンは、病原性微生物由来のペプチド、タンパク質、糖タンパク質、および多糖類など様々な分子タイプを含む。しかし、合成または精製によって作られたこれらの候補は抗原性が低いため、有効なワクチンとして利用することができない。
【０００４】
よって、これらの候補ワクチンの抗原性を増加できる幾つかの方法が知られている。例えば、ワクチン製剤にアジュバントを添加する、またはこれらの候補ワクチンを免疫原に融合することによって、これらの候補ワクチンの抗原性を増加する。しかしながら、アジュバントはよく注射部位の腫れまたは痛みを起こす自然免疫を誘導する。さらに、個体群が特定なアジュバント成分に対する反応のばらつきは、高用量のアジュバント添加による重篤な有害事件とワクチン接種の混合結果を引き起こす。
【０００５】
いくつかの免疫原は、潜在的なワクチン候補と融合して抗原性を増加させるために使用されるように開発されている。例えば、Ｂ型肝炎コア抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｃｏｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｃＡｇ）、百日咳毒素ＣｙａＡ、および大腸菌由来の外毒素は、異なるメカニズムによって付着タンパク質の抗原性を増加させるために使用されている。しかしながら、これらの免疫原のサイズが大きいので、異種タンパク質の挿入または融合は、融合タンパク質の適切な折りたたみを妨害することがある。また、ミスフォールドタンパク質は、いくつかの手順でリフォールディングすることができますが、実際に製造コストの増加につながる。したがって、タンパク質の折りたたみを干渉せず、融合タンパク質の高抗原性を可能にする小さなペプチドが非常に望まれている。
【０００６】
一方、特異的免疫応答において、エフェクターＴ細胞応答は、記憶Ｔ細胞および記憶Ｂ細胞の確立にとって重要である。エフェクターＴ細胞応答の１つは、２型ヘルパーＴ細胞応答であって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したＴ細胞抗原決定基によって刺激される。これらの抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合し、細胞表面に輸出されるエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）経路で処理された抗原から由来する。したがって、抗原提示細胞中のエンドソーム経路への抗原の送達は、２型Ｔヘルパー応答またはＴｈ２応答を刺激するための基準である。Ｔｈ２応答は、ＩｇＧ１サブタイプに向かうＩｇＧクラススイッチを増強することによって特徴付けられる。一方、Ｔｈ１応答は、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３に向かうＩｇＧのクラススイッチを増強する。したがって、ＩｇＧ１力価とＩｇＧ２ｑ／ＩｇＧ３力価との間の比は、特異的免疫原によって誘導されるＴエフェクター応答のタイプの代用マーカーとして使用することができる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は一種の免疫応答を増強する方法を提供し、両親媒性ペプチドを抗原に結合させて抗原複合体組成物を形成するステップと、抗原複合体を被験者に投与するステプとを含む。
【０００８】
一つ実施例では、本発明は一種の免疫応答を増強する方法を提供し、両親媒性ペプチドは４〜４５個のアミノ酸を含むことができる方法を提供する。
【０００９】
一つ実施例では、本発明は一種の免疫応答を増強する方法を提供し、前記両親媒性ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列番号３の配列を有することができる。
【００１０】
別の実施例では、本発明は一種の免疫応答を増強する方法を提供し、前記両親媒性ペプチドはＡ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／またはＡ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフのアミノ酸配列を含み、そのうち、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４はアルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群からそれぞれ選択され；Ｂ１は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され；Ｂ２は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され；Ｂ３は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され；Ｂ４は、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択され；Ｂ５は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）およびセリン（Ｓ）からなる群から選択される。
【００１１】
別の実施例では、本発明は一種の免疫応答を増強する方法を提供し、前記両親媒性ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。
【００１２】
別の実施例では、本発明は一種の免疫応答を増強する方法を提供し、前記抗原は、Ａ型インフルエンザウイルス（Ｔｙｐｅ  Ａ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型インフルエンザウイルス（Ｔｙｐｅ  Ｂ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型インフルエンザウイルス（Ｔｙｐｅ  Ｃ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  Ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）、ヘモフィルスインフルエンザ菌Ｂ型（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅ  ｂ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、単純ヘルペスウイルス１型および２型（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １  ａｎｄ  ２）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、中東呼吸症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、流行性耳下腺炎ウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ，）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）及びサルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ）からなる群の病原性因子の一部である。
【００１３】
別の実施例では、本発明は一種の免疫応答を増強する方法を提供し、前記抗原は、オリゴ糖、ポリペプチド、タンパク質、多糖、ペプチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１４】
別の実施例では、本発明は一種の免疫応答を増強する方法を提供し、そのうち、被験者は温血動物である。
【００１５】
本発明は一種の抗原複合体組成物を提供し、そのうち、Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／またはＡ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフと、前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフのＮ末端に結合する第１のペプチドと、前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフのＣ末端に連結する第２のペプチドと、前記第１のペプチドまたは前記第２のペプチドに共有結合する抗原と、を含み、そしてＡ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、アルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）からなる群からそれぞれ選択され、Ｂ１は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）及バリン（Ｖ）からなる群から選択され、Ｂ２は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、Ｂ３は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され、Ｂ４は、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択され、そしてＢ５は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）およびセリン（Ｓ）からなる群から選択され；且つ前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／またはＡ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフ、前記第一ペプチド及び前記第二ペプチドは両親媒性螺旋二次構造を形成する。
【００１６】
別の実施例では、本発明は前記抗原複合体組成物を提供し、前記第１ペプチドは０〜２０個のアミノ酸を含むことができ、且つ前記第２ペプチドは０〜２０個のアミノ酸を含むことができる。
【００１７】
別の実施例では、本発明は前記抗原複合体組成物を提供し、前記抗原は、オリゴ糖、ポリペプチド、タンパク質、多糖、ペプチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
本発明は、一種の抗原複合体組成物を提供し、その抗原複合体組成物は、Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／またはＡ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフと、前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフのＮ末端に結合する第１のペプチドと前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフのＣ末端に連結する第２のペプチドと、前記第１のペプチドまたは前記第２のペプチドに共有結合する抗原とを含み、そのうち：Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４はそれぞれアルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から個々に選択され、Ｂ１は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され、Ｂ２は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、Ｂ３は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択され、Ｂ４は、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択され、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）及びセリン（Ｓ）からなる群から選択され、且つ前記Ａ１Ｂ１Ｂ２Ａ２および／または前記Ａ３Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ａ４モチーフ、前記第１のペプチドおよび前記第２のペプチドは、両親媒性螺旋二次構造を形成する。
【００１９】
一つ実施例では、本発明は抗原送達を改善する方法を提供し、そのうち、前記第１のペプチドは０〜２０個のアミノ酸を含み、前記第２のペプチドは０〜２０個のアミノ酸を含むことができる。
【００２０】
一つ実施例では、本発明は抗原送達を改善する方法を提供し、そのうち、前記抗原は、オリゴ糖、ポリペプチド、タンパク質、多糖、ペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２１】
本発明は、一種の両親媒性ペプチドを提供し、その両親媒性ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１１のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
これらおよび他の目的によって、本発明の利点および特徴は以下に明らかになるであろう。詳細な説明、実施例および本明細書のいくつかの図面を参照することにより、本発明の性質をより明確に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明の例示的な実施例は、以下の詳細な説明および本発明の様々な実施例の添付図面からより完全に理解されるであろうが、本発明を特定の実施形態に限定するものではなく、説明と理解のためのものである。
【００２４】
【図１Ａ】図１Ａに示されるのは、精製されたＨｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ１−ＧＦＰおよびＡＨ２−ＧＦＰタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）の結果である。
【図１Ｂ】図１Ｂに示されるのは、ＥＬＩＳＡによって測定されたＨｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ１−ＧＦＰまたはＡＨ２−ＧＦＰで免疫化したマウス由来の血清調製物の抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価の結果である。完全フロイントアジュバント（０日目）または不完全フロイントアジュバント（１４、２８および４２日目）で乳化した後、腹腔内注射によりマウスを免疫化するため、Ｈｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ１−ＧＦＰまたはＡＨ２−ＧＦＰ融合タンパク質の５０μｇタンパク質が使用される。追加免疫用量の７日後（２１、３５および４９日目）に血清を採取する（Ｎ＝５）。
【図２Ａ】図２Ａに示されるのは、完全フロイントアジュバント中に乳化した各Ｈｉｓ−ＧＦＰまたはＡＨ２−ＧＦＰタンパク質２０μｇで免疫したマウスからの血清調製物の抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価の結果である。これらのマウスを０日目に腹腔内注射により免疫化し、７、１４、２１、２８および３５日目に血清を収集して、ＥＬＩＳＡで測定する。幾何平均力価は、Ｌｏｇ４（Ｎ＝５）で示す。
【図２Ｂ】図２Ｂに示されるのは、不完全フロイントアジュバント中に乳化した各Ｈｉｓ−ＧＦＰまたはＡＨ２−ＧＦＰタンパク質２０μｇで免疫したマウスからの血清調製物の抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価の結果である。これらのマウスを０日目に腹腔内注射により免疫化し、７、１４、２１、２８および３５日目に血清を収集して、ＥＬＩＳＡで測定する。幾何平均力価は、Ｌｏｇ４（Ｎ＝５）で示す。
【図２Ｃ】図２Ｃに示されるのは、２０μｇの各Ｈｉｓ−ＧＦＰまたはＡＨ２−ＧＦＰタンパク質を１０μｇのＴＬＲ５リガンドであるフラジェリンとともに免疫化したマウス由来の血清調製物の抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価の結果である。これらのマウスを０日目に腹腔内注射により免疫化し、７、１４、２１、２８および３５日目に血清を収集して、ＥＬＩＳＡで測定する。幾何平均力価は、Ｌｏｇ４（Ｎ＝５）で示す。
【図２Ｄ】図２Ｄに示されるのは、２０μｇの各Ｈｉｓ−ＧＦＰまたはＡＨ２−ＧＦＰタンパク質のみで免疫したマウス由来の血清調製物の抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価の結果である。これらのマウスを０日目に腹腔内注射により免疫化し、７、１４、２１、２８および３５日目に血清を収集して、ＥＬＩＳＡで測定する。幾何平均力価は、Ｌｏｇ４（Ｎ＝５）で示す。
【図３】図３に示されるのは、２０μｇの各Ｈｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ２−ＧＦＰまたはＡＨ２Ｍ３−ＧＦＰタンパク質で免疫したマウス由来の血清調製物の抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価の結果である。マウスを０日目および１４日目に筋肉注射により２回免疫化される。幾何平均力価は、Ｌｏｇ４（Ｎ＝５）で示す。
【図４Ａ】図４Ａに示されるのは、マウスの血漿ＩＬ−６量の測定結果である。マウスに筋肉内注射により５０μｇのＡＨ２−ＧＦＰ、５０μｇのＧＦＰ、２０μｌのＰＢＳ、１０μｇのフラジェリンまたは１μｇのフラジェリンを注射する。注射２時間後、麻酔下で心臓穿刺により採血した血液から血漿を用意する。血漿ＩＬ−６レベルを、標準曲線（Ｎ＝５）と比較することによってサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量する。
【図４Ｂ】図４Ｂに示されるのは、マウスの血漿ＭＣＰ−１レベルの測定結果である。マウスに筋肉内注射により５０μｇのＡＨ２−ＧＦＰ、５０μｇのＧＦＰ、２０μｌのＰＢＳ、１０μｇのフラジェリンまたは１μｇのフラジェリンを注射する。注射２時間後、麻酔下で心臓穿刺により採血した血液から血漿を用意する。血漿ＭＣＰ−１レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定し、標準曲線（Ｎ＝５）と比較することによって定量する。
【図４Ｃ】図４Ｃに示されるのは、細胞アポトーシスに対する両親媒性螺旋ペプチドの効果を測定した結果である。６ウェルプレート上で増殖させたＭＤＣＫ細胞を、２４時間、１０μＭ、３０μＭまたは１００μＭ濃度のＡＨ２、ＡＨ２Ｍ３またはＵｄｏｒｎペプチドで２４時間処理し、ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎで培養し、フローサイトメーターで分析する。各実験群からの３つの試料でＳｕｂＧ１断片を計算して平均する。
【図５】図５に示されるのは、ＧＦＰ、ＡＨ２−ＧＦＰ、ＡＨ３−ＧＦＰまたはＡＨ５−ＧＦＰ融合タンパク質で免疫したマウス由来の血清の抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価の結果である。２週間の間隔をおいて各２０ｍｇの種々のタンパク質を２回筋肉注射することによりマウスを免疫する。２８日目の抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価を比較に使用する。幾何平均力価は、Ｌｏｇ４（Ｎ＝５）で示す。
【図６Ａ】図６Ａに示されるのは、精製ＭＡＧＥ−Ａ３、ＡＨ２−ＭＡＧＥ−Ａ３、ｍ２ｅＸ５およびＡＨ２−ｍ２ｅＸ５のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色の結果である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＡＨ２を添加することによる抗ＭＡＧＥ−Ａ３および抗ｍ２ｅＸ５  ＩｇＧ力価の刺激を示す。マウスは、０日目および１４日目に２０μｇのＭＡＧＥ−Ａ３、２０μｇのＡＨ２−ＭＡＧＥ−Ａ３、８μｇのｍ２ｅＸ５または８μｇのＡＨ２−ｍ２ｅＸ５融合タンパク質で筋肉内注射することにより免疫化される。２８日目に血清を集めて、ＭＡＧＥ−Ａ３またはｍ２ｅＸ５タンパク質のいずれかに対するＩｇＧ力価を測定した。幾何平均力価は、Ｌｏｇ４（Ｎ＝５）で示す。
【図７Ａ】図７Ａは、抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価の線図を示す。マウスは、０日目及び１４日目に２０μｇの各Ｈｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ２−ＧＦＰ、ＮＳＰ１−ＧＦＰ、ＧＲＫ５−ＧＦＰ、ＨＡｆｐ２３−ＧＦＰおよびＡＨ１−ＧＦＰを筋肉内注射により免疫化される。抗ＧＦＰ  ＩｇＧの力価を検出するために、０、１４及び２８日目に採取した血清をＥＬＩＳＡに使用する。幾何平均力価はＬｏｇ４（Ｎ＝５）で示す。
【図７Ｂ】図７Ｂに示されるのは、一次免疫化後２８日目に抗ＧＦＰ  ＩｇＧの力価の棒グラフである。マウスは、０日目と１４日目に、２０μｇの各Ｈｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ２−ＧＦＰ、ＮＳＰ１−ＧＦＰ、ＧＲＫ５−ＧＦＰおよびＨＡｆｐ２３−ＧＦＰを筋肉内注射により免疫化される。２８日目の血清の抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価を比較のために使用されている。幾何平均力価は、Ｌｏｇ４（Ｎ＝５）で示す。
【図８Ａ】図８Ａに示されるのは、細胞結合およびＡＨ２ペプチドと融合したＧＦＰタンパク質の内在化の結果である。精製されたＨｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ１−ＧＦＰおよびＡＨ２−ＧＦＰ融合タンパク質は、２００μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレート中で培養したＭＤＣＫ細胞とともに４時間培養した後に、２００  μｌのＰＢＳで２回洗浄する。細胞に取り付けたＧＦＰ融合タンパク質の量は、その後、蛍光光度計により測定する。４つの別々のウェルからの蛍光レベルは、定量及び統計分析のために使用される。
【図８Ｂ】図８Ｂに示されるのは、蛍光顕微鏡によってＧＦＰ融合タンパク質の検出の結果である。ＧＦＰ融合タンパク質とともに４時間培養した細胞を洗浄して、蛍光顕微鏡でＧＦＰ融合タンパク質を検出するために使用される。ＧＦＰチャンネルから得られた画像は、ＧＦＰ信号の位置を示すために、同じフィールドにＤＩＣ画像と併合する。
【図８Ｃ】図８Ｃに示されるのは、共焦点顕微鏡を使用して、内在化されたＧＦＰ融合タンパク質の検出結果である。ＡＨ２−ＧＦＰタンパク質は、培養されたＭＤＣＫ細胞とともに２００／ｍｌの濃度で４時間培養する。ＡＨ２−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在は、その後、共焦点顕微鏡を使用して検出する。
【図８Ｄ】図８Ｄに示されるのは、透過型電子顕微鏡を使用して内在ＡＨ２ペプチドの識別結果である。ＡＨ２ペプチドにコンジュゲートする１０ｎｍサイズの金ナノ粒子は、１０μＭのＡＨ２ペプチドと混合して、培養されたＭＤＣＫ細胞とともに４時間培養し、ＴＥＭによる観察のため固定される前に処理される。ＡＨ２ペプチドによって形成された小胞は、「Ｖ」でマークされている。サイズバーは０．５μｍである。
【図８Ｅ】図８Ｅに示されるのは、ＴＥＭによってＡＨ２ペプチド／脂質複合体の識別結果を示す。ＴＥＭの下で、ＡＨ２ペプチドが形成する小胞の内側には、矢印が指すように、網状結構が存在する。サイズバーは０．５μｍである。
【図８Ｆ】図８Ｆにおいて、矢印が指すのは、ＡＨ２ペプチドによって形成された網状構造であり、ＡＨ２ペプチドにコンジュゲートする金ナノ粒子および膜が細胞外に分泌されることである。サイズバーは０．５μｍである。
【図８Ｇ】図８Ｇにおいて、矢印が指すのは、ＡＨ２ペプチドによって形成された網状構造であり、ＡＨ２ペプチドにコンジュゲートする金ナノ粒子および膜は、複数の小胞体（ＭＶＢ）構造に封入されることである。サイズバーは０．５μｍである。
【図９Ａ】図９Ａに示されるのは、ＦＩＴＣで標識される合成両親媒性ペプチドの細胞結合および内在化分析の結果である。異なるＡ型インフルエンザウイルス株からのＭ２タンパク質の螺旋の両親媒性に対応するペプチドは合成され、蛍光光度計に検出する前に、培養されたＭＤＣＫ細胞とともに４時間培養され、そして洗浄する。配列番号４は、Ｈ１Ｎ１からのものである。配列番号５は、Ｈ５Ｎ１からのものである。ＡＨ４、ＤＲＬＦＦＫＣＶＹＲＬＦＫＨＧＬＫＲＧは、Ｈ３Ｎ２からのものである。配列番号６は、Ｈ７Ｎ９からのものである。各データは、４つの重複試料から定量される（Ｎ＝４）。
【図９Ｂ】図９Ｂに示されるのは、ＧＦＰ融合タンパク質の細胞結合分析の結果である。セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）から由来するＮｓｐ１タンパク質の第２４５−２６４個のアミノ酸残基の両親媒性ペプチド、Ｎｓｐ１と、Ｇタンパク質共役型タンパク質キナーゼ５の第５４６−５６５個のアミノ酸残基から由来の両親媒性ペプチド、Ｇｒｋ５と、血ヘマグルチニンの融合ヘアピンペプチド由来の両親媒性ペプチド、ＨＡｆｐ２３とを、ＤＮＡ組換え技術を使用してｐＥＴ２８ａベクターでのＧＦＰに融合させる。ＧＦＰ融合タンパク質を発見し、精製し、蛍光光度計で検出する前に、培養されたＭＤＣＫ細胞とともに４時間培養して、そして洗浄する。各データは、４つの重複試料から定量される（Ｎ＝４）。
【図１０Ａ】図１０Ａに示されるのは、細胞結合および内在化活性を提供する可能性のあるペプチド配列のアラインメントである。Ｇｒｋ５、ＡＨ２、ＡＨ３、ＡＨ５、ＳＷＳ−ＡＨ、ＴＹＬＣＶ−ＡＨ、ＡＮＭＶ−ＡＨ及びＡＨＶ−ＡＨからのペプチド配列は、ＲＬＦＫ／ＲＬＦＦＫモチーフを示すために整列される。
【図１０Ｂ】図１０Ｂに示されるのは、胞結合および内在化分析に使用される対応するＡＨ２、ＡＮＭＶ−ＡＨ、ＴＹＬＣＶ−ＡＨ、ＳＷＳ−ＡＨ及びＡＨＶ−ＡＨ配列合成ペプチドの輸送結果である。全てのペプチドは、ＦＩＴＣフルオロフォアで標識されたＮ末端である。ＭＤＣＫ細胞は、１０μＭの試験したペプチドのそれぞれとともに４時間培養したあとに、ＰＢＳで２回洗浄して、蛍光光度計で検出する。背景蛍光は、ＰＢＳ陰性対照を使用して差し引きする。
【図１１Ａ】図１１Ａに示されるのは、ＧＦＰ融合タンパク質を装填する細胞からの蛍光レベルの減衰である。ＭＤＣＫ細胞は、ＡＨ２−ＧＦＰ、ＧＲＫ５−ＧＦＰまたはＳＷＳ−ＧＦＰタンパク質と共に４時間培養して、それから洗浄して、０．４Ｕのトロンビンで２０分間消化する。トロンビン処理後、細胞をＰＢＳで洗浄して、いずれかを蛍光光度計（４時間）で検出するまたはさらに２４時間（４＋２４時間）の培養を続けて、そして洗浄して検出する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂに示されるのは、培地中の分泌されたＧＦＰ融合タンパク質の検出結果である。４＋２４時間のグループの培養細胞から除去された培地は、蛍光計で蛍光レベルを測定するように使用される。平行ＰＢＳ対照からの培地は、背景蛍光を定義するように使用される。背景蛍光は各グループから差し引く。
【図１２Ａ】図１２Ａに示されるのは、定義された抗ＧＦＰ  ＩｇＧの力価である。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスは、０日目と１４日目に２０μｇのＨｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ２−ＧＦＰまたはＡＨ１−ＧＦＰのそれぞれを筋肉内注射により免疫化される。一次免疫後２８日目に血清を採取して、全抗ＧＦＰ  ＩｇＧの力価を測定する（Ｎ＝５）。
【図１２Ｂ】図１２Ｂに示されるのは、定義された抗ＧＦＰ  ＩｇＧサブクラスの力価である。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスは、０日目と１４日目に２０μｇのＨｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ２−ＧＦＰまたはＡＨ１−ＧＦＰのそれぞれを筋肉内注射により免疫化される。一次免疫後２８日目に血清を採取して、ＧＦＰに対するＩｇＧサブクラスの力価を測定する（Ｎ＝５）。ＨＲＰとコンジュゲートするヤギ抗マウスＩｇＧ１、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂまたはヤギ抗マウスＩｇＧ３の二次抗体は、ＥＬＩＳＡ分析に使用される。
【図１２Ｃ】図１２Ｃに示されるのは、ＳＷＳ−ＧＦＰ融合タンパク質によって誘導抗ＧＦＰ  ＩｇＧサブクラス力価の測定結果である。 ＢＡＬＢ／ｃマウスは、後肢の大腿部に２０  μｇＨｉｓ−ＧＦＰまたはＳＷＳ−ＧＦＰを筋肉内注射により免疫化される。一次免疫後１４日目に血清を採取して、抗ＧＦＰ  ＩｇＧまたはＩｇＧのサブクラスの力価を測定する（Ｎ＝５）。結果はＬｏｇ４で示されている（Ｎ＝５）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の例示的な実施例は、両親媒性螺旋構造を有する抗原複合体を使用して、免疫応答を改善する方法の文脈において本明細書に記載されている。
【００２６】
当業者であれば、例示的な実施例と以下の詳細な説明は単なる例示であり、決して限定的であることを意図するものではないことを理解するであろう。他の実施例において、当業者は本発明が開示する利益を容易に想到し得る。添付の図面に説明されるものは、例示的な実施例の詳細な実施方式を参照する。同じ符号は、同一または同様の部品を参照するために図面及び以下の詳細な説明全体を通して使用されている。
【００２７】
本明細書で使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」とは、冠詞の文法上の目的語の一つまたは複数（すなわち、少なくとも１つの）の意味である。一例として、「要素」とは一つの要素または１つ以上の要素のことを意味する。
【００２８】
「被験者」という用語は、免疫応答を有する、または必要と見なされる脊椎動物を指すことができる。被験者は、霊長類などの哺乳動物など、すべての温血動物が含まれる。被験者は、ネコ、イヌ、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットを含みます豚、など）を含む。このように、獣医学的用途および医療製剤も、本明細書中で企図される。
【００２９】
本明細書で使用される「抗原複合体」とは、種々の両親媒性ペプチドおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなホストと生体適合性外因性分子、からなる組換えタンパク質を指す。外因性分子は、例えば、これらに限定されないが、オリゴ糖、ポリペプチド、タンパク質、多糖、ペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
【００３０】
本発明で使用される「両親媒性螺旋構造」、「両親媒性ペプチド」、「両親媒性分子」または「両親媒性螺旋」という用語は、分子、特にアミノ酸からなるペプチドがα螺旋を形成し、疎水性要素および親水性要素の両方を有することを示す。両親媒性ペプチドは、例えば、ウイルスのゲノム、タンパク質結合受容体キナーゼからの短い染色体画分および融合ペプチドドメインから得られるアミノ酸の配列を含む。
【００３１】
関連する実施形態において、両親媒性ペプチドは、例えば、ウイルスのゲノム、タンパク質結合受容体キナーゼおよび融合ペプチドドメインからの短い染色体画分が含まれる。代表的な両親媒性ペプチドは表１に示す。
【表１】
2018500389.tif 000003
〔材料と方法〕
【００３２】
まずは、クローニング技術を使用して融合タンパク質を得る。次いで、タンパク質を精製後、ポリミキシン樹脂（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｒｅｓｉｎ）を使用してエンドトキシンを除去し、エンドトキシンレベルが５ＥＵ／ｍｇ未満のタンパク質調製物を得る。これらの精製タンパク質をマウスに注射して免疫化を誘導する。さらに、マウス血清を、タンパク質注入の７、１４、２１、２８および３５日後にＥＬＩＳＡによる抗体力価測定のために分離する。各ステップの詳細なプロトコルは以下のとおりである。
〔エンドトキシンフリータンパク質の発見と精製〕
〔タンパク質発現〕
【００３３】
ベクターエンコーディング標的タンパク質ｐＥＴ２８ａを熱ショックを使用してＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入。熱ショック導入の手順は次のとおりである。
１日目の午後３時に、１ｎｇのプラスミドを５０μｌの解凍されたコンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）と混合し、氷上で１０分間培養した後、４２℃の熱ショックを４０秒間かけて培養する。熱ショック後、混合物を１分間氷上に保った後、１ｍｌのＬＢを添加し、次に２２０ｒｐｍで３７℃で１時間振盪する。その後、細菌を１３０００ｒｐｍで１分間遠心沈殿する。細菌ペレットを１００μｌのＬＢに再懸濁し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレーティングし、３７℃で培養する。
【００３４】
２日目、午前１０時に、プレート上に１００個未満のコロニーが存在するはずである。１つのコロニーを選択し、３ｍｌのＬＢ／アンピシリン培地に接種し、３７℃／２２５ｒｐｍでインキュベートする。午前１２時までに、３ｍｌの培養物を５００ｍｌのＬＢ／アンピシリン培地に移し、培養の増殖を分光光度計で監視する。ＯＤ６００が０．５〜０．７に達したとき、タンパク質発現を誘導するために１ｍＭ  ＩＰＴＧを培養物に添加する。タンパク質誘導の３時間後に培地を収穫する。細菌を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって遠心沈殿する。上清を除去し、ペレットをさらに処理するために保持する。
〔タンパク質の精製〕
【００３５】
タンパク質精製およびゲル濾過のための緩衝液：２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ（ＧＦ緩衝液）。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂精製用：ＧＦ中の細菌溶解（溶解緩衝液）用の５ｍＭイミダゾール、洗浄用のＧＦ中の１０ｍＭイミダゾール（洗浄緩衝液）、タンパク質溶出用のＧＦ中の２００ｍＭイミダゾール（溶出緩衝液）。５００ｍｌのＬＢ培養液からの細菌ペレットをボルテックスにより４０ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁させ、次いで超音波ソニケーター（Ｍｉｓｏｎｉｘ  ３０００）を使用して１０Ｓ／５Ｓオフサイクルで５分間溶解する。再懸濁された細菌は、超音波処理の間に、氷水に保たれる。Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターを使用して４℃で１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して不溶性破片を除去する。標的タンパク質を含む上清を、Ｑｉａｇｅｎからの２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂を含むポリプロピレンカラムに通す。標的タンパク質がＮｉ−ＮＴＡ樹脂に結合した後、カラムをベッド容量の洗浄緩衝液（２０ｍｌ）の１０倍で洗浄する。洗浄後、５ｍｌの溶出緩衝液を使用して標的タンパク質を溶出させる。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して精製した標的タンパク質を、ＡＫＴＡプライム上のＧＥ（ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ）のゲル濾過カラムを使用してさらに精製する。
〔ゲル濾過〕
【００３６】
研究中のタンパク質を精製するために、３つのプログラムが設定される。プログラム３０：標的タンパク質のゲル濾過精製に使用される。プログラム３３：ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇの現場清掃用の、１２０  ｍｌ  ０．５Ｍ  ＮａＯＨを使用する。流速は０．８ｍｌ／分である。プログラム３４：現場洗浄後のカラムを平衡するために、１５０ｍｌのＧＦ緩衝液を使用する。２回のタンパク質精製後にカラムを洗浄する。タンパク質試料を保持するために、５ｍｌの試料ループを機械ＡＫＴＡプライムに接続する。試料ループをまず２５ｍｌのＧＦ緩衝液を使用して洗浄して、前の精製で残留タンパク質を除去する。試料ループに標的タンパク質をロードする前に、０．５ｍｌのＧＦ緩衝液をＮｉ−ＮＴＡ精製タンパク質に添加する。タンパク質溶液を５ｍｌ注射器に入れて、試料ループに充填する。溶出された標的タンパク質の対応する画分のガラス管を、精製前に毎回新しく交換する。ゲル濾過実験で使用される全ての緩衝液は、滅菌および不純物を除去するために０．２μｍフィルターユニットを通して濾過する。これらの緩衝液をさらに１０分間真空脱気する。ＵＶ２８０によって監視される標的タンパク質を含有するＦＰＬＣ画分を集めて、共にプールされる。プールされたタンパク質溶液を、第１のＮｉ−ＮＴＡカラムと同じベッド容積を有する第２のＮｉ−ＮＴＡカラムによって濃縮される。第２のＮｉ−ＮＴＡカラムからタンパク質を溶出させた後、タンパク質濃度をＢＣＡ法で測定する。最も高いタンパク質濃度を有する２つの画分をプールし、１Ｌ  ＰＢＳに対して一晩透析する。透析後、Ｇ−ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＥｎｄｏｔｏｘｉｎＯＵＴＴＭ樹脂を使用して内毒素汚染物質を除去する。ポリプロピレンカラムは、１．５ｍｌの標的タンパク質を充填する前に、４ｍＬのＥｎｄｏｔｏｘｉｎＯＵＴＴＭ樹脂を充填し、１％のデオキシコール酸ナトリウムを有する５倍のベッドボリュームのＬＲＷと、５倍のベッドボリュームのＬＲＷと、５ベッドボリュームのＰＢＳ／ＬＲＷとで洗浄される。標的タンパク質の完全充填後、樹脂によるエンドトキシンの完全吸収のために、カラムを低温室に１時間置く。タンパク質は、最初の画分を０．５ｍｌでそれからの画分を１ｍｌでの段階的な添加によって溶出させる。タンパク質は第３から第６画分で溶出される。
〔ＬＡＬ（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）分析〕
【００３７】
エンドトキシンレベルは、ＡＣＣ社（Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ、Ｉｎｃ．）により提供されるピロテル−ラル（ＰＹＲＯＴＥＬＬ−Ｔ  ＬＡＬ）で測定する。凍結乾燥粉末で供給された各ＬＡＬ試薬は、まず５ｍｌのＬＲＷに溶解され、次に小容量に分注され、−８０℃で保存される。ピロテール−Ｔを使用する典型的な濁度分析において、エンドトキシン標準品を含む１００μｌの試料をマイクロプレートに適用する。反応動力は、ＶＩＣＴＯＲ３蛍光リーダーを使用して３７℃でＯＤ４０５によって測定する。各読み取りの間の経過時間は７０秒であり、読み取りは６０回を繰り返す。試料とブランクとの間のＯＤ４０５の差が０．１に達するに必要な時間を記録し、エンドトキシン標準と比較して、試料中のエンドトキシン単位を決定する。エンドトキシン活性の記録を０．１に達した時間（秒）に対してプロットし、対数トレンド線を標準曲線として使用される。タンパク質試料中の識別されたエンドトキシン活性を、ＢＣＡ分析によって決定されるタンパク質濃度とさらに組み合わせて、特定のエンドトキシン活性（ＥＵ／ｍｇ）を決定する。すべてのタンパク質試料における特異的エンドトキシン活性の上限は５ＥＵ／ｍｇである。
〔アジュバント不要のマウスの免疫化〕
【００３８】
免疫処置に使用されるマウスは、すべて６〜８週齢である。麻酔することなく、マウスを尾から２〜３ｍｍの尾を切って採血する。ピペットマンを使用して血液を採取し、尾部に時々マッサージする。毎回の採血は約１００μｌの血液を採取する。血液を室温で２時間放置した後、微量遠心分離機で２０００ｒｐｍ、１０分間の遠心沈殿を行い、血清をマイクロチューブに集める。残りの赤血球を、マイクロ遠心分離機で２０００ｒｐｍ、１０分間で除去する。血清をＥＬＩＳＡ分析で使用する前に−８０℃で保存する。マウスの尾の出血は、加熱したはんだごてと、親指と人差し指で尾の先端を押すことによって止められる。一次免疫化のために、２０μｇの精製タンパク質を後肢の大腿部に筋肉内注射する。免疫化後１４日目に尾部で採血し、ブースター剤と同量の精製タンパク質を同じ手順で注射する。
〔抗体力価を決定するためのＥＬＩＳＡ分析〕
【００３９】
コーティング緩衝液でＧＦＰタンパク質を希釈し、１０μｇ／ｍｌの濃度のＧＦＰを含むＥＬＩＳＡプレートの適切なウェルをコートする。プレートを接着性プラスチックで覆い、４℃で一晩培養する。３００μｌの洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。コーティングされたウェルの非特異的結合部位をブロックするために、２００μｌのブロッキング緩衝液を添加する。プレートを粘着性プラスチックで覆い、３７℃で１時間培養する。３００μｌの洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。一次抗体または抗血清をブロッキング緩衝液で希釈し、１００μｌの希釈抗体をプレートの各ウェルに加える。プレートを接着性プラスチックで覆い、３７℃で１時間培養する。３００μｌの洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。ブロッキング緩衝液でＨＲＰ結合二次抗体を希釈し、１００μｌの希釈二次抗体をプレートの各ウェルに加える。プレートを粘着性プラスチックで覆い、３７℃で３０分間培養する。３００μｌの洗浄緩衝液でプレートを５回洗浄する。マルチチャンネルピペットで１ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）試薬を添加する。十分な発色の後、１００μｌの停止緩衝液をウェルに加える。４５０ｎｍを使用して各ウェルの吸光度を読み取る。ＭＡＧＥ−Ａ３およびｍ２ｅＸ５に対する抗体力価を測定する場合、ヒスチジンタグを有するＭＡＧＥ−Ａ３およびｍ２ｅＸ５を使用して、プレートを１０μｇ／ｍｌ濃度でコートする。コーティング緩衝液は、ｐＨ９．４の０．２Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液を有する。洗浄緩衝液は、１Ｘ  ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有する。ブロッキング緩衝液は、１００ｍｌの洗浄緩衝液中に１ｇ  ＢＳＡを有する。ストップ緩衝液には２Ｍの硫酸を有する。
〔蛍光標識ペプチドおよびＧＦＰ融合タンパク質内在化およびリサイクル分析〕
【００４０】
ＧＦＰ融合タンパク質内在化活性を、９６ウェルプレートの１つのウェルに４×１０４個のＭＤＣＫ細胞を最初にプレーティングすることによって試験し、各試料を４回試験する。２日目に、２００μｇ／ｍｌのＧＦＰ融合タンパク質を培地に加え、４時間培養する。培養した後、培地を除去し、２００μｌのＰＢＳで３回洗浄する。内在化したＧＦＰ融合タンパク質の量を蛍光光度計で測定する。蛍光標識されたペプチドについては、内在化分析におけるペプチドの濃度は１０μＭである。培地へのＧＦＰ融合タンパク質リサイクルの効率を評価するために、細胞を先に上記のようにＧＦＰ融合タンパク質と共に最初に培養する。ＰＢＳで洗浄後、０．４単位のトロンビンを含む１００μｌのＰＢＳを使用して、原形質膜の細胞外表面に結合する両親媒性ペプチドからのＧＦＰを切断する。トロンビン消化は、３７℃の培養で２０分間行った。その後、細胞を再び２００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、次いで新鮮な培養培地中で２４時間培養する。培養液に再循環させたＧＦＰ融合タンパク質を、蛍光レベルの検出のための培地８０μｌを除去し、背景蛍光を較正するために並行して設置されるＰＢＳ対照を使用して測定する。
〔血漿サイトカインレベル測定〕
【００４１】
血液サイトカインレベルを検出するために、まずはマウスに実験用タンパク質を筋肉内に注射する。注射の２時間後、１０μｌの０．５Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡを予め装填した注射器で心穿刺により血液を採取する前にマウスを麻酔する。収集した血液を、卓上型遠心分離機で２０００ｒｐｍで２０分間遠心沈殿する。収集した血漿を２０μｌに等分し、ドライアイス上で急速凍結する。血漿サイトカインレベルは、米国のｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの標準液を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。マウスＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ（Ｃａｔ＃８８−７０６４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を使用してＩＬ−６レベルを検出する。マウスＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏキット（Ｃａｔ＃８８−７３９１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を使用してＭＣＰ−１を検出する。検出手順は、製造元の標準プロトコルに従う。
〔フローサイトメーターによる細胞アポトーシス分析〕
【００４２】
ＭＤＣＫ細胞を、３×１０Ｅ５細胞／ウェルで６ウェルプレート上にプレーティングする。プレーティングの２４時間後、ペプチドを１０μＭ濃度で適用し、トリプシン消化による細胞収穫の前に２４時間培養する。アポトーシスに起因する浮遊細胞を、培地を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって収集する。トリプシン消化および培地から集めた細胞を合わせて、１×１０５個の細胞を３ｍｌ  ７０％エタノールに−２０℃の冷凍庫で一晩固定する。固定後、細胞を洗浄して、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で１００μｇのＲＮａｓｅＡの存在下、４℃の冷室で３０分間染色した後に、フローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で分析する。サブＧ１画分を計算し、アポトーシス細胞と指名する。
〔透過型電子顕微鏡〕
【００４３】
ＭＤＣＫ細胞を、ウェル当たり３×１０５細胞の密度で６ウェルプレートにＡＣＬＡＲ埋め込み膜上にプレーティングする。一晩培養した後、ＡＨ２ペプチドを１０μＭに添加する前に培地の一部を除去し、ＡＨ２ペプチドとコンジュゲートする１０ｎｍ金ナノ粒子を５０μｌ添加する。使用したＡＨ２とコンジュゲートする１０ｎｍ金ナノ粒子の濃度は４．７８×１０１２／ｍｌである。４時間の培養後、細胞を室温で無血清培地で洗浄した後、２．５％グルタルアルデヒド／０．１％タンニン酸／０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に室温で３０分間固定する。次に、細胞を０．１Ｍカコジル酸緩衝液ｐＨ７．２／０．２Ｍスクロース／０．１％ＣａＣｌ２中で室温で５分間洗浄する。その後、細胞を１％ＯｓＯ４／０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に室温で３０分間固定する。次いで、細胞をｄｄＨ２Ｏ室温で３回、毎回５分間洗浄する。細胞を室温で３０分間１％ウラニルアセテートでさらに染色し、その後ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄する。次いで、細胞を脱水し、６０度で２４時間重合させることによりＥＰＯＮに包埋する。そして、埋め込まれた細胞を透過型電子顕微鏡下で観察するために切片化する。
【実施例１】
【００４４】
両親媒性螺旋ペプチドは、融合抗原に対する体液性免疫を刺激する。融合した抗原に対する体液性免疫を刺激する両親媒性螺旋の効果を評価するために、ＨＣＶ  ＮＳ３（ＡＨ１）およびＡ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＭ２タンパク質（ＡＨ２）由来の両親媒性螺旋ペプチドを、それらの融合タンパク質の高溶解度に基づいて選択する。オリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲ反応に用いてこれらの２つのペプチドのコード配列を生成させ、緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰを含むｐＥＴ２８ａベクターにクローニングする。両親媒性螺旋ペプチドおよびＧＦＰ融合タンパク質を細菌発現システムを使用して発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを使用して精製する。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂から溶出したタンパク質を、ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのゲル濾過を使用してさらに精製する。ゲルろ過カラムから溶出されたタンパク質を、１０ＫのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５によって濃縮する。タンパク質調製物中に混入した内毒素を、Ｇ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＥｎｄｏｔｏｘｉｎＯＵＴＴＭ樹脂を使用して除去する。
【００４５】
アジュバント反応において、両親媒性螺旋ペプチドが抗体産生を刺激する能力は、標準的な完全不完全フロイントアジュバントのパラダイムをかいして最初に試験される。一次免疫中に、１ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質を乳化するまで１：１の体積比で完全フロイントアジュバントと混合する。５０μｇのタンパク質を、各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹部に、各タンパク質を５匹のマウスに腹腔内注射する。ブースター剤は、不完全フロイントアジュバントと１：１容量比で混合するタンパク質と同じ経路で１４、２８日目および４２日目に投与する。その結果は図５に示されるような、ＡＨ１−ＧＦＰおよびＡＨ２−ＧＦＰの両方が、ＧＦＰ単独よりも多くの抗ＧＦＰ抗体を刺激する。
【実施例２】
【００４６】
インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＭ２タンパク質由来のＡＨ２ペプチドは、アジュバント非依存性抗体産生増強を誘導する。ＡＨ２−ＧＦＰを最初に発現させ、５ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンレベルを含むように精製する。次いで、精製したＡＨ２−ＧＦＰタンパク質を、ａ）完全フロイントアジュバント、ｂ）不完全フロイントアジュバント、ｃ）フラジェリンまたはｄ）ＰＢＳと組み合わせてマウスを免疫化するために使用する。対照タンパク質は、５ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンレベルを有するように発現および精製されたＨｉｓ−ＧＦＰである。エマルジョンまたは混合物の形態のタンパク質５０μｇを、各群５匹のマウスの１匹に注入し、抗ＧＦＰ抗体レベルを、ＧＦＰタンパク質コーティングを使用してＥＬＩＳＡによって監視する。注射後０、７、１４、２１、２８、３５日目に採取した血清を使用する。結果によると、フロイント完全アジュバントで乳化されたタンパク質については、ＡＨ２−ＧＦＰとＨｉｓ−ＧＦＰとの間の抗ＧＦＰ  ＩｇＧレベルは有意差がないことを示唆している（図２Ａ）。フロイント不完全アジュバントで乳化されたタンパク質について、ＡＨ２−ＧＦＰはＨｉｓ−ＧＦＰと比較して７日目に有意な高抗ＧＦＰ  ＩｇＧレベルを誘導した。この抗ＧＦＰ  ＩｇＧ産生レベルの差は、３５日目まで続く（図２Ｂ）。０μｇのフラジェリンと混合されるタンパク質の場合、抗ＧＦＰ  ＩｇＧレベルは、注射後１４日で有意な差を示し始め、注射後３５日まで継続した（図２Ｃ）。ＡＨ２−ＧＦＰおよびＨｉｓ−ＧＦＰをＰＢＳとともに注射すると、抗ＧＦＰ  ＩｇＧ産生は注射後１４日目に有意な差を示し始め、３５日目まで継続した（図２Ｄ）。これらの結果は、ＡＨ２ペプチド配列単独の添加が、抗原、ＧＦＰに対するより高い抗体産生を誘導するのに十分であることを示す。
【実施例３】
【００４７】
ＡＨ２ペプチドの疎水性残基は、マウスにおいて抗ＧＦＰ  ＩｇＧの産生を増強するために必要とされる。抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価の増強に対するＡＨ２ペプチドの疎水性残基の影響を試験するために、３つの疎水性アミノ酸４Ｆ、８Ｉおよび１２Ｆでアラニン（ＡＨ２Ｍ３）を置換する突然変異（ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を作成する。ＡＨ２Ｍ３の完全な配列は以下の通り：ＤＲＬＡＳＫＳＡＹＲＩＡＫＨＧＬＫＲＧ。得られたタンパク質ＡＨ２Ｍ３−ＧＦＰを発現させ、精製し、マウスを免疫化するために使用する。ＡＨ２−ＧＦＰを陽性対照として使用する。結果は、３つの疎水性アミノ酸をアラニンで置換することにより、融合タンパク質が抗ＧＦＰ  ＩｇＧ産生を増強する能力を有意に減少させることを示した（図３）。したがって、ＡＨ２−ＧＦＰ融合タンパク質が体液性免疫を刺激するためには、両親媒性螺旋の完全性が重要である。また、ＡＨ２融合によって刺激された抗体力価は、一次免疫後少なくとも５ヶ月間持続し、ＡＨ２ペプチド融合によって活性化された体液性免疫が長期間続くことを示唆している。
【実施例４】
【００４８】
ＡＨ２−ＧＦＰ融合タンパク質は、自然免疫を活性化することと無関係に体液性免疫応答を刺激する。ＡＨ２ペプチドが最初に生得免疫応答を活性化することによって体液性免疫応答を誘導するかどうかを試験するために、ＡＨ２−ＧＦＰ融合タンパク質の筋肉内注射の２時間後の末梢血炎症性サイトカインレベルをＥＬＩＳＡを使用して測定する。エンドトキシンレベルが５ＥＵ／ｍｇ未満のＨｉｓ−ＧＦＰおよびＡＨ２−ＧＦＰタンパク質調製物をマウス当たり５０μｇの量で５匹のマウスに筋肉内注射する。自然免疫応答を誘導することが知られているＴＬＲ５リガンドフラジェリンを、１０μｇ／マウスまたは１μｇ／マウス用量の陽性対照として使用される。適切な麻酔下で筋肉内注射の２時間後に心臓穿刺により血液を採取する。採血に使用した注射器には、血液凝固を避けるために０．５Ｍ  ＥＤＴＡ１０μｌを予め装填する。採取した血液をエッペンドルフでマイクロ遠心分離機を介して２０００ｒｐｍ、２０分間遠心して血漿を調製する。収集した血漿を２０μｌ／チューブに等分し、保存のためにドライアイス上で凍結する。室温で解凍した血漿を１２倍に希釈し、各血漿サンプルを２つ分用意して、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡによってＩＬ−６またはＭＣＰ−１サイトカインレベルを決定する。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入するＥＬＩＳＡキットは、マウスＩＬ−６  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：８８−７０６４−８６）およびマウスＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：８８−７３９１  −８６）である。その結果、フラジェリン１０μｇを注入した場合にはそれぞれ１２００ｐｇ／ｍｌおよび３０００ｐｇ／ｍｌのレベルでＩＬ−６およびＭＣＰ−１の両方の高レベルを誘導し、フラジェリン１μｇの場合には、３８０ｐｇ／ｍｌおよび２６００ｐｇ／ｍｌ  を注射する。ＰＢＳ、Ｈｉｓ−ＧＦＰまたはＡＨ２−ＧＦＰ注射について、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１の両方の発現が低かったことから、ＡＨ２−ＧＦＰタンパク質は自然免疫応答を誘導しないことを示唆している。
【００４９】
Ｍ２両親媒性螺旋ペプチドは、Ａ型Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスの特定の株に由来する。ウドーン（ｕｄｏｒｎ）は、細胞膜を穿孔（ｐｏｒｉｎｇ）することによって細胞のアポトーシスを誘導し、細胞膜の完全性を損なうことが示されていた。  ＡＨ２ペプチドが細胞がアポトーシスも誘導するかどうかを試験するために、１０μＭ、３０μＭおよび１００μＭの３つの異なる濃度のＡＨ２ペプチドを収穫前２４時間ＭＤＣＫ細胞とともに培養し、細胞アポトーシスを検出するための染色体ＤＮＡを染色する。細胞アポトーシスレベルは、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）に適用する１分前に、２４時間のエタノール固定およびＲＮＡ分解酵素Ａ処理後に、ＳｙｔｏＸ  ＡＡＤＶ染色後にフローサイトメトリーを使用して測定する。サブＧ１信号を有する細胞のパーセンテージを計算し提示する。結果は、文献に記載された通りの、ウドンペプチドの添加によるＭＤＣＫ細胞アポトーシスを誘導することを示す。ＡＨ２またはＡＨ２Ｍ３によって誘発される細胞アポトーシスのレベルは、ＰＢＳ対照と同様であり、ＡＨ２またはＡＨ２Ｍ３によって誘導される細胞アポトーシスがバックグラウンドレベルと一致することを示唆している。
【実施例５】
【００５０】
インフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１株およびＨ７Ｎ９のＭ２タンパク質由来の両親媒性螺旋ペプチドによる誘導する体液性免疫応答である。Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１およびＨ７Ｎ９株由来のＭ２両親媒性螺旋ペプチド配列を、ｐＥＴ２８ａベクターにおけるＤＮＡ組換えを使用してＧＦＰと融合させる。ＡＨ３−ＧＦＰおよびＡＨ５−ＧＦＰ融合タンパク質発現ベクターを熱ショックによりＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、ＬＢ／Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ）プレート上で増殖させたコロニーを拾い、３ｍｌのＬＢ培養液にプレーティングして、一晩培養する。一晩培養した細菌培養液を５００ｍｌの培養液にさらに接種して、ＯＤ６００が０．５に達するまで２２５ｒｐｍで振とうしながら１５℃で培養する。１ｍＭのＩＰＴＧを加えた後、細菌培養物を融合タンパク質誘導のために同じ条件でさらに一晩培養する。誘導後、細菌を採取し、超音波処理のために溶解緩衝液中に再懸濁して細菌を破壊する。超音波処理後、ＳｏｒｖａｌｌのＳＳ３４ローターを使用して細菌溶解物を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を遠心分離後に集める。可溶性タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂を使用してさらに精製し、精製されたタンパク質の総量をＢＣＡ分析を介して決定する。ＥｎｄｏＦｒｅｅ樹脂の使用により、エンドトキシン汚染を除去する。１ｍｇ／ｍｌ濃度の精製ＡＨ３−ＧＦＰおよびＡＨ５−ＧＦＰ２０μｇを大腿部の尾部に筋肉内注射する。マウスの尾の先端を切ることにより、尾静脈から血液を採取する。収集された血液は、凝固のために数時間にわたって卓上に放置される。その後、血液を２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血清を回収する。血液中の抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価は、１０μｇ／ｍｌの濃度でコーティングするためにＧＦＰタンパク質を使用してＥＬＩＳＡによって測定する。その結果、ＧＦＰタンパク質と並行してＡＨ３またはＡＨ５ペプチドを添加すると、ＡＨ２ペプチドよりもさらに有意な抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価の上昇を誘導することができる（図５）。ＡＨ３およびＡＨ５は、ＡＨ２より高い体液性免疫応答を誘導する活性を有し、保護免疫応答を誘導するために必要なワクチンの総用量を減らすのに有効である可能性がある。結果的に、３つの異なるＡ型インフルエンザ株に由来する両親媒性螺旋ペプチドはすべて、タンパク質抗原と融合したときに体液性免疫応答を刺激する。
【実施例６】
【００５１】
ＡＨ２ペプチドと融合したＭＡＧＥ−Ａ３およびｍ２ｅＸ５タンパク質による体液性免疫の誘導である。Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１株に由来のＡＨ２ペプチドは、ＧＦＰに融合した場合に高い抗ＧＦＰ  ＩｇＧ力価を誘導することが示されている。種々の抗原に対する体液性免疫を刺激するＡＨ２ペプチドの有効性を評価するために、ＡＨ２ペプチドをＤＮＡ組換え技術によってＭＡＧＥ−Ａ３またはｍ２ｅＸ５タンパク質のいずれかと融合させる。ＡＨ２−ＭＡＧＥ−Ａ３およびＡＨ２−ｍ２ｅＸ５タンパク質とそれらのそれぞれの対照タンパク質を発現させて精製する。精製されたタンパク質を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに筋肉内注射により免疫する。体液性免疫応答を、ＥＬＩＳＡを使用して抗ＭＡＧＥ−Ａ３または抗ｍ２ｅＸ５  ＩｇＧ力価を検出することによって監視する。その結果は、ＭＡＧＥ−Ａ３またはｍ２ｅＸ５タンパク質のいずれかへのＡＨ２ペプチドの添加が、ＡＨ２ペプチド融合なしのそれらの参照タンパク質と比較した場合、対応するＩｇＧ力価をそれぞれ５０倍および７倍増加させることを示す。この結果は、ＡＨ２ペプチドおよびその関連両親媒性螺旋ペプチドが、病原性抗原に対する高レベルの体液性免疫を誘導するためのワクチンプラットフォームとして利用できることを示唆している。
【実施例７】
【００５２】
ＧＲＫ５、ＨＡおよびＮＳＰ−１由来の両親媒性螺旋ペプチドはまた、融合タンパク質に対する体液性免疫を刺激する。Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質以外のタンパク質由来の両親媒性螺旋も、融合タンパク質に対する体液性免疫応答を誘導する類似の活性を共有するかどうかを評価するために、本発明者は文献と検索を行い、膜と相互作用する蛍光タンパク質、ＧＦＰと融合するペプチド配列を決定する。３つのペプチド配列が識別された：セムリキ森林ウイルスＮｓｐ１由来のＮｓｐ１タンパク質のアミノ酸残基２４５−２６４に由来する両親媒性螺旋ペプチドと、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ５のアミノ酸残基５４６−５６５に由来のアミノ酸配列Ｇｒｋ５と、ヘマグルチニンの融合ヘアピンペプチドＨＡｆｐ２３。これらのペプチド配列を、ＤＮＡ組換え技術を用いてＧＦＰと融合させ、融合タンパク質を上記のように発現させ、精製した。Ｈｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ２−ＧＦＰ、ＮＳＰ１−ＧＦＰ、ＧＲＫ５−ＧＦＰおよびＨＡｆｐ２３−ＧＦＰ融合タンパク質を使用してマウスを免疫化する。マウス免疫中、０日目および１４日目に各マウスに２０μｇの精製融合タンパク質を筋肉内注射し、各注射の１４日後に血清を採取する。
【００５３】
ＮＳＰ１、ＧＲＫ５、およびＨＡタンパク質からの両親媒性螺旋ペプチドの融合は、それらの全てがモデルタンパク質であるＧＦＰに対する体液性免疫応答を強力に増強する（図７Ａ、７Ｂ）。これらの結果は、両親媒性へリックスの性質を有する短いペプチドの単純な結合が、体液性免疫を誘導する際の抗原の能力を有意に増加させることを示唆している。
【実施例８】
【００５４】
ＡＨ２は、融合タンパク質の膜構造としての細胞への重合および内在化を誘導することができる。ＡＨ１−ＧＦＰ、ＡＨ２−ＧＦＰおよびＨｉｓ−ＧＦＰタンパク質を発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を使用して、次いでゲル濾過により精製し、次いでＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂で濃縮する。培養細胞の細胞膜への結合におけるこれらの融合タンパク質の能力を試験するために、２００μｇ／ｍｌの濃度の融合タンパク質を使用して、培養したＭＤＣＫ細胞と培養する。４時間培養後、未結合のＧＦＰ融合タンパク質をＰＢＳ緩衝液を使用して洗い流す。結合したＧＦＰ融合タンパク質を蛍光光度計により検出する。ＰＢＳ単独で培養した細胞を、背景蛍光の較正として使用する。その結果は、ＡＨ２−ＧＦＰの細胞膜へは結合するが、ＡＨ１−ＧＦＰまたはＨｉｓ−ＧＦＰへは結合しない（図８Ａ）。培養細胞へのＧＦＰ融合タンパク質の結合を観察するために、培養したＣＬＩ−５／ｐＥＮＯ１細胞に１００μｇ／ｍｌのタンパク質を添加し、４時間培養する。培養後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで蛍光顕微鏡下で観察する。ＡＨ２−ＧＦＰとともに培養した細胞については、培養の４時間後に細胞上で蛍光観察する。Ｈｉｓ−ＧＦＰで培養する場合、細胞表面上の蛍光スポットは観察されなかった（図８Ｂ）。ＡＨ２−ＧＦＰと４時間培養後に、５０％を超える細胞に蛍光スポットが含まれている。この結果は、ＡＨ２−ＧＦＰ融合タンパク質が培地中に可溶性タンパク質として提供されたときに細胞表面上で重合することができることを示唆している。これらの蛍光スポットの細胞内局在をさらに識別するために、共焦点顕微鏡を使用する。共焦点顕微鏡で観察するところ、これらの蛍光スポットはエンドソーム小胞のように形成され、主に細胞内に位置するが、原形質膜上には存在しなかった（図８Ｃ）。この結果は、ＡＨ２−ＧＦＰ融合タンパク質が細胞の細胞質ゾルに内在化し、小胞様構造を形成することができることを示唆している。本発明者は、培養細胞内に形成された小胞を追跡するために、ＡＨ２の両親媒性螺旋配列に対応する合成ペプチドを培養細胞と培養し、ＡＨ２ペプチドを添加して形成された小胞を追跡するＡＨ２ペプチドと結合した金ナノ粒子とともに培養する。ＡＨ２ペプチドの添加は、細胞の内側でＶと表示された小胞形成を誘導する（図８Ｄ）。これらの小胞の内側に網状構造があり、矢印で指すように、金ナノ粒子はこれらの構造を沿って飾り、これらのメッシュ状構造がリン脂質およびＡＨ２ペプチドによって構成され得ることを示唆している（図８Ｅ）。金ナノ粒子が飾る網状構造のいくつかは、多重ベシクル体（ＭＶＢ）様構造で観察することができ、これらの構造をエンドソーム経路に組み込むことができることを示唆している（図８Ｇ）。また、これらの網状構造は、細胞外空間で観察することができ、１つの指標によると、これらの構造を含む小胞は原形質膜と融合し、これらの構造の培養培地への分泌を引き起こす可能性があることを示唆している（図８Ｆ）。
【実施例９】
【００５５】
３つの異なるＡ型インフルエンザウイルス株およびＧタンパク質共役受容体キナーゼ５由来の両親媒性螺旋ペプチドも、膜出芽および内在化を媒介する。Ａ型インフルエンザウイルス由来の両親媒性螺旋ペプチドは、ウイルス粒子のＥＳＣＲＴ非依存性出芽にとって重要であることが示されている。また、Ｍ２タンパク質由来の合成された両親媒性螺旋ペプチドがコレステロールを含む膜小胞と混合される場合、インビトロ条件下で出芽を媒介することが示されている（Ｒｏｓｓｍａｎ  ＪＳ  ２０１０）。本発明者は、Ｈ１Ｎ１以外のウイルス株由来のＭ２両親媒性螺旋ペプチドも培養細胞への結合において同様の性質を有するかどうかを試験するために、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ９由来の３つのＭ２両親媒性螺旋ペプチドを合成し、それぞれＡＨ３、ＡＨ４およびＡＨ５と命名した。比較すると、これらの３つのペプチドはＡＨ２と同様に膜に結合しないが、それらは全て異なるレベルで細胞に結合し内在化する（図９Ａ）。この結果は、異なるＡ型ウイルス株のＭ２タンパク質の細胞質両親媒性螺旋ペプチドに由来するこれらのペプチドがすべて培養細胞に結合することを示唆している。これは、すべてのＡ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質の相同領域が、融合タンパク質内在化の誘導において同様の特性を共有する１つの指標である。本発明者は、ＧＦＰレポーターに融合させたときに膜と相互作用することが示された両親媒性螺旋ペプチドを識別するために、文献検索を使用して、細胞への結合の同様の特性を共有し、さらに細胞に内在化される他の両親媒性螺旋ペプチドを識別する。この方式を通して、本発明者は、基準に適合する３つの両親媒性螺旋ペプチドＨＡｆｐ２３、Ｇｒｋ５およびＮｓｐ１を識別する。ＨＡｆｐ２３は、ヘマグルチニン融合ドメイン、膜湾曲を誘導することが知られている両親媒性螺旋−ヘアピンに由来するものである。Ｇｒｋ５ペプチドは、Ｇタンパク質共役タンパク質キナーゼ５（Ｇｒｋ５）のアミノ酸残基５４６−５６５に由来し、両親媒性螺旋を形成することが示されており、Ｇｒｋ５タンパク質の原形質膜へのターゲッティングに十分であるものである。Ｎｓｐ１はセムリキ森林ウイルスレプリカーゼタンパク質ｎｓＰ１のアミノ酸残基２４５−２６４に由来し、両親媒性螺旋を形成することも示され、ｎｓＰ１の膜標的化に必要であるものである。遺伝子組換えを使用して、本発明者は、ｐＥＴ２８ａベクター中のＧＦＰコード配列の前にこれらの３つのペプチドのコード配列を組み換える。本発明者は、これらの３種のＧＦＰ融合タンパク質を発現および精製し、それらを培養細胞への結合能力を試験するために細胞結合分析を使用する。結果は、これらの３つの融合タンパク質の中で、Ｇｒｋ５−ＧＦＰのみがＡＨ２−ＧＦＰの活性の約３０％で培養細胞に結合することができることを示している。この分析では、ＨＡｆｐ２３−ＧＦＰおよびＮｓｐ１−ＧＦＰは培養細胞に結合できなかった（図９Ｂ）。
【実施例１０】
【００５６】
本発明者は、ＡＨ２、ＡＨ３、ＡＨ５およびＧｒｋ５の両親媒性螺旋ペプチド配列を比較して、Ｒ−Ｌ／Ｉ／Ｒ−Ｆ−Ｋのコンセンサス配列を有する機能モチーフを識別する。また、ＡＨ２、ＡＨ３およびＡＨ５のアミノ酸２−６には、Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｓ／Ｆ−Ｋの別の同様のモチーフがある。このモチーフが細胞への両親媒性螺旋ペプチドの結合および内在化にとって重要であるかどうかを試験するために、このモチーフの可能な組み合わせを使用してウイルスタンパク質データベースに検索する。このモチーフを含む識別されたタンパク質を、二次構造予測プログラムによってさらに評価する。螺旋構造中このモチーフを含むタンパク質のみが選択される。これらのＲＬＦＫまたはＲＬＦＦＫモチーフを含む４つのペプチド配列は、ＡＮＭＶ−ＡＨ、ＳＷＳ−ＡＨ、ＴＹＬＣＶ−ＡＨおよびＡＨＶ−ＡＨである。対応する配列を有するペプチドを合成し、ＦＩＴＣで標識する。これらのペプチドは、このモチーフの存在が細胞結合および内在化に十分であるかどうかを試験するための分析に使用する。同じペプチド濃度の存在では、ＡＨＶペプチドと比較して、ＡＨＶ−ＡＨ、ＳＷＳ−ＡＨ、ＡＮＭＶ−ＡＨ、ＴＹＬＣＶ−ＡＨペプチドはそれぞれ４０％、２４％、１５％および２５％の活性で細胞に結合する（図１０Ｂ）。この結果は、両親媒性螺旋構造におけるＲＬＦＫ／ＲＬＦＦＫモチーフの存在が、膜への結合および両親媒性螺旋ペプチドならびにその融合抗原の内部移行に十分であることを示唆している。
【実施例１１】
【００５７】
ペプチドを有し、ＲＬＦＦＫ／ＲＬＦＫモチーフと融合したタンパク質のリサイクルは、内在化後に培地に戻る。ＥＭ結果から、ＡＨ２ペプチド誘発膜媒体が原形質膜と融合し、リポタンパク複合体の放出を引き起こすことが示されている。この可能性を試験するために、ＡＨ２、ＧＲＫ５またはＳＷＳ両親媒性ペプチドと融合したＧＦＰを培養ＭＤＣＫ細胞と共に４時間培養し、次いでＰＢＳで洗浄した後、トロンビンで消化して細胞外融合タンパク質からＧＦＰを除去する。消化後、細胞を洗浄し、増殖培地でさらに２４時間培養する。細胞から放出されたＧＦＰ融合タンパク質を、蛍光光度計によって蛍光レベルを測定する。この結果は、２４時間の培養後に、細胞に４０％、４５％および３０％の融合タンパク質が残っていることを示唆している（図１１Ａ）。細胞から放出された融合タンパク質は、培養培地中で識別することができる（図１１Ｂ）。
【実施例１２】
【００５８】
ＡＨ２ペプチドの分極は、Ｔｈ２応答に対する免疫刺激を媒介する。同じく、ＲＬＦＦＫ／ＲＬＦＫモチーフを含むペプチドによって刺激された免疫応答がヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１）またはＴｈ２を有するかどうかを評価するために、免疫後の抗ＧＦＰ  ＩｇＧまたはＩｇＧサブクラスの力価をＥＬＩＳＡによって決定する。ＲＬＦＦＫ／ＲＬＦＫモチーフを含まないＡＨ１ペプチドを対照組として使用する。Ｈｉｓ−ＧＦＰ、ＡＨ１−ＧＦＰおよびＡＨ２−ＧＦＰ融合タンパク質を精製し、免疫応答を誘導するために０日目および１４日目にＢＡＬＢ／ｃ系マウスに筋肉内注射する。２８日目に収集した血清を、ヤギ抗マウス総ＩｇＧ（図１２Ａ）または抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２ａ、抗ＩｇＧ２ｂおよび抗ＩｇＧ３（図１２Ｂ）のいずれかを使用して、ＥＬＩＳＡ分析に使用する。ＩｇＧ１対ＩｇＧ２ａ＋ＩｇＧ３比を比較することにより、結果は、ＡＨ２−ＧＦＰによって誘発される免疫応答がＴｈ２に偏っており、ＡＨ２ペプチドがＴ細胞依存性の体液性免疫を引き起こす可能性があることを示す。
【００５９】
両親媒性螺旋ペプチド中のＲＬＦＫモチーフの存在が、抗原に融合した場合にＴｈ２型Ｔ細胞応答を刺激するのに十分であるかどうかを試験するために、マウス免疫化のためにＳＷＳ−ＧＦＰを発現させ精製する。免疫化後１４日目に、免疫したマウスから血清を採取し、抗ＧＦＰ  ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラスの力価をＥＬＩＳＡによって決定する。図１２Ｃの結果は、ＳＷＳ−ＧＦＰによって誘導されたＩｇＧサブクラスが主にＩｇＧ１であり、Ｔｈ２Ｔ細胞応答がＲＬＦＫモチーフを含むＳＷＳ−ＡＨペプチドの添加によって活性化されることを示唆している。これらの結果は、両親媒性螺旋ペプチド中のＲＬＦＫ／ＲＬＦＦＫモチーフが、抗原提示細胞中のエンドソーム経路に抗原を送達し、Ｔ細胞依存性の体液性免疫を誘導することができる。
【００６０】
本発明の特定の実施形態が示され説明されたが、本発明の開示に基づいて、本発明およびそのより広い局面から逸脱することなく、変更および修正を行うことができることは当業者には明らかであろう。それゆえ、添付の特許請求の範囲は、本発明の例示的な実施形態の真の趣旨および範囲内にあるそのような変更および修正をすべて網羅することを意図している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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