(57)【要約】本発明は、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）を用いた循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）上のＳＴＥＡＰ１の検出に基づいて前立腺がんを診断するための方法を提供する。本発明は、前立腺がん、特に転移性去勢抵抗性前立腺がん（ｍＣＲＰＣ）を有する患者における、予後及びＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法の有効性を決定するための方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＣを用いて被験者の前立腺がんを診断するための方法であって：
ａ）被験者から採取された血液試料由来のＣＴＣを同定すること；
ｂ）ＣＴＣを、ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する抗体、ＣＤ４５に特異的に結合する抗体、及びサイトケラチンに特異的に結合する抗体と接触させること；
ｃ）ＣＴＣをＤＡＰＩで染色すること；並びに
ｄ）ＤＡＰＩ染色及び結合した抗体を、シグナルを強化するためのチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）プロトコールを用いて検出すること
を含み、サイトケラチン及び前立腺特異的マーカーを発現し、ＤＡＰＩ染色を呈し、且つＣＤ４５を発現しないＣＴＣの存在により、被験者が前立腺がんを有することが予測される、方法。
【請求項２】
抗ＳＴＥＡＰ１抗体が、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９を有するハイブリドーマ細胞により生成される１５Ａ５抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
がん細胞上のＳＴＥＡＰ１の発現レベルを決定することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＳＴＥＡＰ１の発現レベルに基づいてがん細胞をグレード付けすること、及び各グレードのがん細胞のパーセンテージを決定することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
各グレードのグレードスコアを、前記グレードのがん細胞のパーセンテージに、前記グレードの前立腺特異的マーカーの発現レベルを表す固有のグレード数を乗じることにより計算すること、及びすべてのグレードスコアを合算してＨスコアを取得することをさらに含み、Ｈスコアにより被験者の前立腺がんのステージが示される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
がん細胞が、上皮由来のがん細胞に特異的に結合するリガンドを含む捕獲組成物を用いて血液試料から同定される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
リガンドが、がん細胞上に優勢に発現される上皮抗原に特異的に結合する抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上皮抗原が上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
同定されたがん細胞が、血液試料から分離された細胞分画に富んでいる、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞分画が磁場の下で分離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
捕獲組成物中のリガンドが、磁性粒子（例えば、コロイド状磁性粒子、例えば、コロイド状磁性ナノ粒子）に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リガンドがＥｐＣＡＭ抗体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体が、≦１０００ｎＭのＫＤでＳＴＥＡＰ−１に結合する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、抗ＣＤ４５抗体、及び／又は抗サイトケラチン抗体が、検出可能な標識にコンジュゲートされる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前立腺がんに罹患している被験者におけるＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法の有効性を予測する方法であって：
ａ）被験者から採取された血液試料由来のＣＴＣを同定すること；
ｂ）ＣＴＣを、ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する抗体、ＣＤ４５に特異的に結合する抗体、及びサイトケラチンに特異的に結合する抗体と接触させること；
ｃ）ＣＴＣをＤＡＰＩで染色すること；並びに
ｄ）ＤＡＰＩ染色及び結合した抗体を、シグナルを強化するためのチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）プロトコールを用いて検出すること
を含み、サイトケラチン及びＳＴＥＡＰ１を発現し、ＤＡＰＩ染色を呈し、且つＣＤ４５を発現しないＣＴＣの存在により、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣの有効性が予測される、方法。
【請求項１６】
前立腺がんに罹患している被験者におけるＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法への応答を、シグナルを強化するためのチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）プロトコールを用いて監視する方法であって：
ａ）第１群のＣＴＣを、ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する抗体、ＣＤ４５に特異的に結合する抗体、及びサイトケラチンに特異的に結合する抗体と接触させること並びに細胞をＤＡＰＩで染色することであって、第１群のがん細胞が、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療前に被験者から採取された第１の血液試料に由来するものである、こと；
ｂ）ＳＴＥＡＰ１及びサイトケラチンを発現し、ＤＡＰＩで染色される第１群中のＣＴＣの数を決定すること；
ｃ）第２群のＣＴＣを、ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する抗体、ＣＤ４５に特異的に結合する抗体、及びサイトケラチンに特異的に結合する抗体と接触させること並びに細胞をＤＡＰＩで染色することであって、第２群のがん細胞が、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療の間に又は後で被験者から採取された第２の血液試料に由来するものである、こと；
ｄ）ＳＴＥＡＰ１及びサイトケラチンを発現し、ＤＡＰＩで染色される第２群中のがん細胞の量を決定すること；
ｅ）ｂ）で決定されたＳＴＥＡＰ１及びサイトケラチンを発現し、且つＤＡＰＩで染色されるＣＴＣの量を、ｄ）で決定されたものと比較すること
を含み、ＣＴＣの量の減少及び／又はＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣの減少により、被験者における前立腺がん治療法への応答が示される、方法。
【請求項１７】
ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣが、細胞傷害性剤に共有結合する抗ＳＴＥＡＰ１抗体を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞傷害性剤が、毒素、化学療法剤、薬物部分、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、抗生物質、放射性同位体、及び核酸分解酵素から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＡＰＩ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ４５、及びサイトケラチンのシグナルが、ＦＡＣＳを用いて検出される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＡＰＩ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ４５、及びサイトケラチンのシグナルが、免疫組織化学を用いて検出される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月２１日出願の米国仮出願第６２／１５０７２４号の優先権の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、腫瘍学及びがん診断の分野に関し、さらに詳細には、前立腺がんのスクリーニング、ステージ分類、及び治療監視のための組成物と方法に関する。特定の実施態様では、本発明は、前立腺がんのための新規の予後予測及び診断試験と治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
前立腺がんは、男性において最も一般的ながんの一つである。早発性の前立腺がんの多くは症候がなく成長が遅いが、一部の前立腺がんはもっと悪性で、痛みを伴い、致死性である。現在、主に二種類の非侵襲的スクリーニング試験が男性の前立腺がんの検出のために利用可能である。一つはデジタル直腸指診（ＤＲＥ）であり、これは医師がグローブをはめた指を直腸に挿入し、前立腺を触診することにより前立腺の異常を検出することを可能にし、もう一つは前立腺表面抗原検査（ＰＳＡ検査）であり、これは血液試料中のＰＳＡ抗原のレベルを測定する。ＦＤＡは男性の前立腺がんの検出を助けるためのＤＲＥを伴うＰＳＡ検査を承認したが、ＰＳＡ試験が実際に延命に寄与するかどうかは不明であり、この試験はスクリーニングにおいて議論をかもしている。特に、米国予防医学専門委員会は最近、ＰＳＡスクリーニングが前立腺がんの死亡率をまったく又はほとんど低下させない一方で、不要な痛みと副作用を生じさせる治療又は試験に帰結するという発見に基づき、健常な男性におけるＰＳＡスクリーニングに反対を表明した（例えば、R. Chou et al, Ann. Intern. Med., October 7, 2011 E-375; Djulbegovic et al, BMJ 2010, 341: c4543）。前立腺がんの最も決定的な診断は生検であり、これは、疑いのある患者から前立腺の小片を除去して腫瘍細胞の存在について顕微鏡試験を行う。このような手順は明らかにいささか侵襲性であり、早期のスクリーニング及び検出においてあまり望ましくない。したがって、ＰＳＡスクリーニングは死亡率を低下させることができず、生検は侵襲性であるという最近の発見の観点から、前立腺がんの診断及び予後予測において信頼性の高い結果をもたらすことのできる薬剤及び方法の開発に対する大きな需要が依然として存在している。
【０００４】
他の多くの種類のがんと同様に、前立腺がん患者の主な死因は原発腫瘍ではなく転移である。いくつかの原発腫瘍細胞は原発組織から離れて循環に入りうる。これら細胞は循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）と呼ばれる。ＣＴＣは、身体の適切な部位に播種されると、検出が困難な、しかし二次腫瘍へと進行すると命を脅かしうる転移性コロニーへと発達しうる。
【０００５】
ＣＴＣの検出及び列挙は、複数の理由により患者のケアにとって重要である。ＣＴＣは、原発腫瘍の前に検出可能であることがあり、したがって早期の段階での診断を可能にする。それらは治療法に応答して減少するので、ＣＴＣを列挙することができれば、所与の治療レジメンの効果を監視することが可能になる。さらに、ＣＴＣ診断法は、アジュバント設定において測定可能な疾患を有さない患者における再発を監視するためのツールとして使用することができる。例えば、ＣＴＣは、乳房切除術の８〜２２年後の乳がん患者の３６％に、明らかに微小転移から存在することが分かった（単一の腫瘍細胞の堆積又は腫瘍性細胞の極めて小さなクラスター）。Meng et al., Clin. Can. Res. 1024）: 8152-62, 2004。しかしながら、ＣＴＣ診断法は、伝統的な診断テストではできないがんの検出を約束するものであり、現行の方法は特定の腫瘍マーカーを検出するための感受性により限界を有する（例えば、ＳＴＥＡＰ１）。
【０００６】
加えて、ＣＴＣは、転移性癌を有する患者における循環性腫瘍細胞の存在／数は無増悪生存（ＰＦＳ）及び全生存（ＯＳ）の両方と相関していることが示されているため、それらの予測に使用することができる。例えば、Cristofanilli et al., J. Clin. Oncol. 23（1）: 1420-1430, 2005; Cristofanilli et al., N. Engi. J. Med. 351（8）: 781-791, 2004参照。しかしながら、ＣＴＣ診断法の感受性を強化する必要性が存在するために、ＰＦＳを決定するために特定の腫瘍マーカー（例えば、ＳＴＥＡＰ１）を検出するＣＴＣ検査の感受性を強化する必要もある。
【０００７】
臨床治験において、前立腺がん及びその他多数のための、承認された治療オプションが存在する。治療オプションには、限定されないが、症候が現れる及び／又は変化するまでいずれの治療も行わない能動的観察及び監視、外科手術（例えば、恥骨後前立腺切除、会陰前立腺切除、骨盤内リンパ節郭清、及び前立腺の経尿道切除）、放射線療法（例えば、外照射療法、進行内照射療法、及び／又はアルファ放射体放射線療法）、ホルモン療法（例えば、黄体ホルモン放出アゴニスト、エンザルタミドのような、副腎がアンドロゲンをつくることを防ぐ薬物である抗アンドロゲン、睾丸摘出術、及びエストロゲン）、化学療法（例えば、アビラテロン、ビカルタミド、カバジタキセル、カソデックス、デガレリクス、ドセタキセル、エンザルタミド、酢酸ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、ミトキサントロン塩酸塩、プレドニゾン、シプロイセルＴ、及びラジウム２２３ジクロライド）、生物学的療法、及びビスホスホネート療法が含まれる。
【０００８】
特に生物学的療法に関して、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞傷害性の治療指数を高めることを約束するため、特に興味深い。ＳＴＥＡＰ１は、転移性去勢抵抗性前立腺がん（ｍＣＲＰＣ）に過剰発現するもので、臨床開発においてＡＤＣの標的である。しかしながら、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法に応答するであろう患者を同定するためにコンパニオン診断が必要である。同様に、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法に応答する患者を同定するためにコンパニオン診断が必要である。したがって、新規の患者治療を最適化及び開発するために、引き続きＡＤＣ療法の有効性を予測するためのコンパニオン診断が必要である。
【０００９】
ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法の恩恵を受ける可能性が最も高い患者を同定するために、ＣＬＩＡ認定ＩＨＣアッセイを用いてアーカイブの腫瘍組織及び／又は新規に取得された腫瘍組織において、並びにＥＰＩＣプラットフォームを用いて血中の循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）に対して、ＳＴＥＡＰ１発現を予測バイオマーカーとして用いた。特に、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法の有効性を予測及び評価するために、ＳＴＥＡＰ１陽性ＣＴＣを同定するための感受性を高めた新規の多チャネル診断及び予後予測検査が開発され、本明細書に開示された。したがって、本明細書に開示されるＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ  ＣＴＣアッセイの恩恵は、１）新規アッセイが、旧式のアッセイには検出するための感受性がなかったＳＴＥＡＰ１＋ｍＣＲＰＣ患者を検出することができること、２）新規アッセイが、侵襲性で痛みを伴う生検を行うことなく、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法の候補であるＳＴＥＡＰ１＋ｍＣＲＰＣ患者を検出できること、３）新規アッセイが、侵襲性で痛みを伴う生検を行うことなく治療期間中最初にＳＴＥＡＰ１の発現を監視できることである。
【発明の概要】
【００１０】
一態様において、本発明は、ＣＴＣを用いて被験者の前立腺がんを診断するための方法を提供し、この方法は：ａ）被験者から採取された血液試料からＣＴＣを同定すること；ｂ）ＣＴＣを、ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する抗体、ＣＤ４５に特異的に結合する抗体、及びサイトケラチンに特異的に結合する抗体と接触させること；ｃ）ＣＴＣを、ＤＡＰＩで染色すること；並びにｄ）シグナルを強めるためのチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）プロトコールによりＤＡＰＩ染色及び結合抗体を検出することを含み；サイトケラチン及び前立腺特異的マーカーを発現し、ＤＡＰＩ染色を呈し、且つＣＤ４５を発現しないＣＴＣの存在が、被験者が前立腺がんを有していることを示す。
【００１１】
特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ１抗体は、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９を有するハイブリドーマ細胞により生成される、１５Ａ５抗体である。
【００１２】
特定の実施態様では、方法は、がん細胞上でのＳＴＥＡＰ１の発現レベルを決定することをさらに含む。
【００１３】
特定の実施態様では、方法は、ＳＴＥＡＰ１の発現レベルに基づいてがん細胞をグレード付けすること、及び各グレードのがん細胞のパーセンテージを決定することをさらに含む。特定の実施態様では、方法は、各グレードのグレードスコアを、前記グレードのがん細胞のパーセンテージに、前記グレードの前立腺特異的マーカーの発現レベルを表す固有のグレード数を乗じることにより計算すること、及びすべてのグレードスコアを合算してＨスコアを取得することをさらに含み、Ｈスコアは被験者の前立腺がんのステージを示す。
【００１４】
特定の実施態様では、がん細胞は、上皮由来のがん細胞に特異的に結合するリガンドを含む捕獲組成物を用いて血液試料から同定される。特定の実施態様では、リガンドは、がん細胞上で優勢に発現される上皮抗原に特異的に結合する抗体である。特定の実施態様では、上皮抗原は上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。
【００１５】
特定の実施態様では、同定されたがん細胞は、血液試料から分離された細胞分画に富んでいる。特定の実施態様では、細胞分画は、磁場の下で分離される。特定の実施態様では、捕獲組成物中のリガンドは、磁性粒子（例えば、コロイド状磁性粒子、例えば、コロイド状磁性ナノ粒子）に結合する。特定の実施態様では、リガンドはＥｐＣＡＭ抗体を含む。
【００１６】
特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、≦１０００ｎＭのＫＤでＳＴＥＡＰ−１に結合する。
【００１７】
特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、抗ＣＤ４５抗体、及び／又は抗サイトケラチン抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートしている。
【００１８】
一態様では、本発明は、前立腺がんに罹患している被験者におけるＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法の有効性を予測する方法を提供し、この方法は：ａ）被験者から採取された血液試料からＣＴＣを同定すること；ｂ）ＣＴＣを、ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する抗体、ＣＤ４５に特異的に結合する抗体、及びサイトケラチンに特異的に結合する抗体と接触させること；ｃ）ＣＴＣをＤＡＰＩで染色すること；並びにｄ）シグナルを強めるためのチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）プロトコールによりＤＡＰＩ染色及び結合抗体を検出することを含み；サイトケラチン及びＳＴＥＡＰ１を発現し、ＤＡＰＩ染色を呈し、且つＣＤ４５を発現しないＣＴＣの存在がＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣの有効性を示す。
【００１９】
一態様では、本発明は、前立腺がんに罹患している被験者におけるＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法への応答を、シグナルを強めるためのチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）プロトコールを用いて監視する方法を提供し、この方法は：ａ）第１群のＣＴＣを、ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する抗体、ＣＤ４５に特異的に結合する抗体、及びサイトケラチンに特異的に結合する抗体と接触させ、細胞をＤＡＰＩで染色することであって、第１群のがん細胞が、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療の前に被験者から採取された第１の血液試料に由来している、接触させ染色すること；ｂ）第１群においてＳＴＥＡＰ１及びサイトケラチンを発現しＤＡＰＩで染色されるＣＴＣの数を決定すること；ｃ）第２群のＣＴＣを、ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する抗体、ＣＤ４５に特異的に結合する抗体、及びサイトケラチンに特異的に結合する抗体と接触させ、細胞をＤＡＰＩで染色することであって、第２群のがん細胞が、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療の間に又は後で被験者から採取された第２の血液試料に由来している、接触させ染色すること；ｄ）第２群においてＳＴＥＡＰ１及びサイトケラチンを発現しＤＡＰＩで染色されるがん細胞の量を決定すること；並びにｅ）ｂ）で決定されたＳＴＥＡＰ１及びサイトケラチンを発現しＤＡＰＩで染色されるＣＴＣの量と、ｄ）で決定されたものとを比較することを含み、ＣＴＣの量の減少及び／又はＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣの減少が、被験者における前立腺がん治療法への応答を示す。
【００２０】
特定の実施態様では、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣは、細胞傷害性剤に共有結合した抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を含む。特定の実施態様では、細胞傷害性剤は、毒素、化学療法剤、薬物部分、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、抗生物質、放射性同位体、及び核酸分解酵素から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＳＴＥＡＰ１が正常な前立腺上皮と大部分の原発性前立腺腫瘍に高度に発現されることを示している。図１Ａは、複数の組織におけるＳＴＥＡＰ１のアフィメトリクスシグナルを示している。
【図１Ｂ−Ｃ】ＳＴＥＡＰ１が正常な前立腺上皮と大部分の原発性前立腺腫瘍に高度に発現されることを示している。図１Ｂは、ＳＴＥＡＰ１の発現が前立腺がんの転移において維持されることを示している。原発性前立腺腺癌の３７／４２（８８％）がＩＨＣ  ＳＴＥＡＰ１陽性であり、転移性前立腺腺癌の２４／２８（８６％）がＩＨＣ  ＳＴＥＡＰ１陽性であった。図１Ｃは、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣの頑強な前臨床活性を示している。
【図２】組織及び血液中のＳＴＥＡＰ１レベルを測定するための、生体試料収集プランと方法の模式図である。具体的には、図は、病歴、治療、及び進行の過程にわたる包括的な組織及び血液収集プランを示している。
【図３Ａ】ＳＴＥＡＰ１高発現腫瘍を有する患者が、試験において最大のＰＳＡ減少及び最長の参加期間を呈する傾向があることを示している。ベースラインレベルと比較して≧５０％のＰＳＡ応答が、ＳＴＥＡＰ１  ＩＨＣ  ３＋腫瘍を有する患者において最大の頻度で観察されたことが示されている。
【図３Ｂ】ＳＴＥＡＰ１高発現腫瘍を有する患者が、試験において最大のＰＳＡ低下及び最長の参加期間を呈する傾向があることを示している。ＳＴＥＡＰ１  ＩＨＣ  ３＋腫瘍を有する患者に、＞６ヶ月の試験期間が最も多く観察されたことが示されている。
【図４】ＰＳＡ減少とＣＴＣ変換との相関を示している。ベースラインからの最良のＰＳＡ減少は、予後的に望ましくない７．５ｍｌの血液中≧５ＣＴＣ／というカウントから、望ましい＜５ＣＴＣ／７．５ｍｌへのＣＴＣ変換を呈した患者に観察された。
【図５】ＳＴＥＡＰ１の発現がアーカイブ試料及びベースライン試料において安定であることを示している。ＩＨＣにより測定したＳＴＥＡＰ１レベルは、一例を除くすべての症例においてアーカイブ試料と比較してベースライン生検で同様又はより高かった。
【図６】ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ治療がＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣを枯渇させることを示している。伝統的プロトコール（非増幅）及び新規シグナル増幅プロトコール（増幅プロトコール）を用いてＣＴＣの表面上におけるＳＴＥＡＰ１の発現を測定する二つの新規４色ＩＦベースアッセイが開発された。
【図７】Ａ及びＢは、１ｍｌ当たりのＣＴＣの総数／ｍｌとＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣの数の減少が、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療後に観察されたことを示している。
【図８】Ａ及びＢは、ＣＴＣ上のＳＴＥＡＰ１発現レベルの免疫蛍光に基づく検出を示している。
【図９Ａ】シグナル増幅プロトコール（チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）プロトコール）がコントロール細胞においてＳＴＥＡＰ１  ＣＴＣアッセイのダイナミックレンジを増大させることを示している。図９Ａは、ＳＴＥＡＰ１シグナルは増幅プロトコールにより８．１倍に増加するが背景は２．４倍しか増加しないことを示している。
【図９Ｂ】シグナル増幅プロトコール（チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）プロトコール）がコントロール細胞においてＳＴＥＡＰ１  ＣＴＣアッセイのダイナミックレンジを増大させることを示している。図９Ｂは、増幅プロトコールが、伝統的な非増幅プロトコールでは同定できないＳＴＥＡＰ１＋患者を同定できることを示している。
【図１０】ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療の結果、総ＣＴＣ／ｍＬ及びＳＴＥＡＰ＋ＣＴＣカウントの両方が減少した患者の症例研究を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．定義
本明細書において交換可能に使用される用語「腫瘍」又は「がん」は、腫瘍性又は悪性の細胞の成長、増殖、又は転移を特徴とするいずれかの医学的状態を指し、固形がん及び白血病などの非固形がんの両方を含む。
【００２３】
本明細書において使用される用語「前立腺がん」又は「前立腺腫瘍」は、前立腺組織に由来するがん又は腫瘍を指す。
【００２４】
疾患（例えばがん又は腫瘍）の文脈における用語「ステージ」は、疾患の重症度を示す疾患の進行状態を指す。
【００２５】
本明細書において使用される用語「ステージ分類」は、疾患が進行した特定のステージを同定することを指す。
【００２６】
用語「診断」（及びその文法的変化形、例えば「診断すること」又は「診断的」）は、分子的又は病理的な状態、疾患又は病態の同定、例えばがんの同定を指すか、或いは特定の治療レジメンの恩恵を受けうるがん患者の同定を指す。
【００２７】
用語「予後予測」（及びその文法的変化形、例えば「予後予測すること」又は「予後予測的」）は、がん治療法といった治療の恩恵を受ける可能性の予測に言及する。
【００２８】
用語「予測」又は「予測する」は、本明細書においては、患者が特定の抗前立腺がん治療法に好意的に又は非好意的に応答する可能性に言及するために使用される。一実施態様では、予測又は予測することは、そのような応答の範囲に関する。一実施態様において、予測又は予測することは、患者が、治療（例えば特定の治療剤を用いた治療）の後で、疾患の進行なしに一定の期間、生存又は改善するかどうか、及び／又は生存又は改善する可能性に関する。
【００２９】
用語「恩恵を受ける」は、最も広い意味で使用され、いずれかの望ましい効果を指し、特に本明細書に定義される臨床的恩恵を含む。
【００３０】
「個体」又は「被験者」とは、哺乳動物である。哺乳動物は、限定しないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。特定の実施態様において、個体又は被検者はヒトである。
【００３１】
ＳＴＥＡＰ−１とも呼ばれる前立腺１の６回膜貫通上皮抗原という用語は、前立腺組織に優勢に発現される細胞表面抗原を指し、複数のがん細胞株において上方制御される。Hubert et al.(1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(25), 14523-8。例示的なヒトＳＴＥＡＰ−１は、２００７年１０月２６日出願の米国特許出願公開第２００９／０２８００５６号に開示された配列番号１アミノ酸配列を有する（前記特許文献は参照により本明細書に包含される）。
【００３２】
用語「抗ＳＴＥＡＰ−１抗体」及び「ＳＴＥＡＰ−１に結合する抗体」は、ＳＴＥＡＰ−１を標的とする際に診断剤として抗体が有用であるように、十分な親和性でＳＴＥＡＰ−１に結合可能な抗体を指す。一実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の、無関係な、非ＳＴＥＡＰ−１タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＳＴＥＡＰ−１への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、異なる種由来のＳＴＥＡＰ−１に保存されているＳＴＥＡＰ−１のエピトープに結合する。
【００３３】
用語「ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ」は、抗ＳＴＥＡＰ１抗体−薬物コンジュゲートを指す。
【００３４】
用語「ＣＴＣ」は、循環性腫瘍細胞を指す。ＣＴＣは、異なる固形悪性腫瘍を有する患者の循環中に存在する上皮起源の細胞である。それらは、原発腫瘍のクローンに由来し、悪性である。（Fehm et al., Clin. Cancer Res. 8: 2073-84, 2002参照。）詳細には、ＣＴＣは原発腫瘍から脈管系中に投じられ、血流を循環し、重要な遠隔器官におけるその後の転移の「種」として機能し、がん関連死の大多数を引き起こすメカニズムをトリガする可能性がある。さらに、ＣＴＣが癌腫のがん進行に関する独立した診断と考えられることを示す証拠が文献に蓄積している（Beitsch & Clifford, Am. J. Surg. 180 （6） 446-49, 2000 （乳房）; Feezor et al., Ann. Oncol. Surg. 9 （10） 944-53, 2002（結腸直腸）；Ghossein et al., Diagn. Mol. Pathol. 8 （4） 165-75, 1999（メラノーマ、前立腺、甲状腺）；Glaves, Br. J. Cancer 48: 665-73, 1983（肺）；Matsunami et al., Ann. Surg. Oncol. 10 （2） 171-5, 2003（胃）；Racila et al., 1998; Pantel et al., 1999）。
【００３５】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、別途指示がない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって表される。親和性は、本明細書に記載したものを含め、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的且つ例示的な実施態様は、以下で説明される。
【００３６】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００３７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００３８】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックする。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００３９】
本明細書において使用される用語「抗体１５Ａ５」は、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９を有するハイブリドーマ細胞株によって生成されるマウスモノクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を指す。ハイブリドーマ細胞株の微生物寄託情報は以下の通りである：ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−１２２５９；寄託日：２０１１年１１月１７日；及び寄託材料：抗体１５Ａ５を生成するハイブリドーマ１５Ａ５．１．１．１（７２８４とも表記する）。
【００４０】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４１】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００４２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、集団を構成する個々の抗体は同一である、及び／又は同じエピトープに結合するが、これは、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している、可能性のある変異体抗体は含まない。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法及びその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
【００４３】
「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している二つの同一の軽鎖と二つの同一の重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、これには三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、これには一つの定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、二つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００４４】
本明細書で用いられる「細胞傷害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性剤は、限定しないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、トトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又は変異体を含む）を含む。本発明に適した細胞傷害性剤の非限定的な例は、米国特許出願公開第２００９／０２８００５６号（２００７年１０月２６日出願）に記載のものを含み、この特許文献は参照により本発明に包含される。例えば、特定の実施態様では、細胞傷害性剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
【００４５】
「システイン操作抗体」又は「システイン操作抗体変異体」は、その一又は複数の残基がシステイン残基で置換された抗体である。システイン操作抗体のチオール基は、薬物部分にコンジュゲートして（例えば、リンカーを介して）チオＭａｂＴＭ抗体（即ち、ａ  チオＭａｂＴＭ薬物コンジュゲート（ＴＤＣ））を形成することができる。特定の実施態様において、置換される残基が抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせ、本明細書中でさらに記載されるように免疫コンジュゲートを作るために使用することができる。例えば、チオＭａｂＴＭ抗体は、軽鎖（例えば、カバット番号付けによるＧ６４Ｃ、Ｋ１４９Ｃ、Ｒ１４２Ｃ、及びＶ２０５Ｃ）又は重鎖（例えば、カバット番号付けによるＤ１０１Ｃ、Ａ１１８Ｃ、Ｖ１８４Ｃ又はＴ２０５Ｃ）中における非システイン天然残基のシステインへの単一突然変異を有する抗体である。特定の実施例では、チオＭａｂＴＭ抗体は、各完全長抗体（即ち、二つの重鎖及び二つの軽鎖を有する抗体）が二つの改変されたシステイン残基を有するような重鎖又は軽鎖中の単一のシステイン突然変異を有する。特定の実施態様では、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣはＳＴＥＡＰ１チオＭａｂＴＭ抗体である。特定の実施態様では、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣは、ＭＭＡＥにコンジュゲートした重鎖Ａ１１８Ｃ置換を有するＳＴＥＡＰ１チオＭａｂＴＭ抗体である。
【００４６】
用語「治療」及び「処置」は、治療的処置及び予防的処置の両方を含み、その目的は、がんの発生又は転移などの望ましくない生理学的変化又は障害を予防する、又は遅延させる（軽減する）ことである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果は、限定しないが、症候の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の状態の安定（即ち、悪化以外）、疾患進行の遅延又は速度低下、病態の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は完全な）を含み、検出可能であるか否かを問わない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存と比較して、生存期間の延長も意味しうる。治療を必要とする者には、既にその状態若しくは状態を有している者、並びに、その状態若しくは状態を有し易い者、又はその状態若しくは状態を予防すべき者が含まれる。
【００４７】
用語「治療的有効量」は、哺乳動物の疾患又は障害を治療するために有効な薬物の量を指す。がんの場合、治療的有効量の薬物は、がん細胞数を減少させ；腫瘍の大きさを縮小させ；末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害し（即ち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害し（即ち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖をある程度阻害し；及び／又はがんに関連する一又は複数の症候をある程度緩和することができる。薬剤は、増殖を防ぎ、及び／又は既存のがん細胞を死滅させうる範囲で、細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性でありうる。がん治療法に関し、有効性は、例えば、無増悪期間（ＴＴＰ）を評価すること及び／又は奏功率（ＲＲ）を決定することにより測定することができる。
【００４８】
用語「がん」及び「がん性」は、無秩序な細胞増殖によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す又は説明する。「腫瘍」は、一又は複数のがん性細胞を含む。がんの例には、限定されないが、ガルシノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病若しくはリンパ性腫瘍が挙げられる。このようながんのより具体的な例には、扁平上皮細胞がん（例えば、上皮性扁平上皮細胞がん）、小細胞肺がんを含む肺がん、非小細胞肺がん（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜のがん、肝細胞がん、消化管がんを含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ又はｓｔｏｍａｃｈ）がん、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳癌、大腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌腫、陰茎癌、及び頭頸部がんが含まれる。
【００４９】
「ＳＴＥＡＰ１発現がん」は、その細胞表面に存在するＳＴＥＡＰ１タンパク質を有する細胞を含むものである。「ＳＴＥＡＰ１発現がん」は、抗ＳＴＥＡＰ１抗体がそれに結合でき、がんに対する治療効果を有するように、その細胞の表面に十分なレベルのＳＴＥＡＰ１を生成するものである。
【００５０】
「ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ」は、細胞傷害性部分にコンジュゲートしているＳＴＥＡＰ１抗体を指す。特定の実施態様では、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣは、固有のシステイン残基でのジスルフィド結合を用いて細胞傷害性部分にコンジュゲートした１５Ａ５抗ＳＴＥＡＰ１抗体である。特定の実施態様では、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣは、固有のシステイン残基でのジスルフィド結合を用いてＭＭＡＥ部分にコンジュゲートした１５Ａ５抗ＳＴＥＡＰ１抗体である。特定の実施態様では、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣは、チオＭａｂＴＭ抗体が、改変されたシステイン残基でのジスルフィド結合を用いて細胞傷害性部分にコンジュゲートした１５Ａ５抗ＳＴＥＡＰ１抗体である、チオＭａｂＴＭ抗体（抗ＳＴＥＡＰ１チオＭａｂＴＭ抗体）である。特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ１チオＭａｂＴＭ抗体はＭＭＡＥにコンジュゲートしている。特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ１チオＭａｂＴＭ抗体は、重鎖Ａ１１８Ｃに改変されたシステイン残基を有する。
【００５１】
抗原受容体を「過剰発現する」がんは、その細胞表面に、同じ組織型の非がん性細胞と比較して、ＳＴＥＡＰ１のような有意に高いレベルの受容体を有するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写若しくは翻訳の増加により生じうる。受容体の過剰発現は、細胞の表面上に存在する受容体タンパク質のレベル上昇を評価することにより（例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣにより）診断又は予後予測アッセイにおいて決定することができる。これに代えて又は加えて、例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；国際公開第９８／４５４７９号参照）、サザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、細胞内の受容体コード化核酸のレベルを測定することができる。
【００５２】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定される場合、９５％以上又は９９％以上の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 （2007）を参照のこと。
【００５３】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００５４】
「抗ＳＴＥＡＰ−１抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一又は複数の核酸分子を指し、これには、単一のベクター又は別々のベクター中のこのような核酸分子、及び宿主細胞の一又は複数の位置に存在するこのような核酸分子が含まれる。
【００５５】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように結合されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００５６】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。
【００５７】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【００５８】
ＩＩ．方法
本明細書に開示される方法は、侵襲的、外科的生検を行うことなく、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法の恩恵を受けるであろう患者を同定することができ、且つ疾患の進行とＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法の有効性を監視することができるという未だ満たされていない需要を満たす。この方法は、侵襲性で痛みを伴う生検を行うことなく、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法のよい候補となる患者及びＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法に応答するであろう患者の検出及び選択を可能にする。またこの方法は、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療の間に、ＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣ及びＳＴＥＡＰ１の発現を頻繁に監視することを可能にする。頻繁な監視により、外科的生検ではその侵襲性により可能でない、用量調節及び個別化が可能となる。したがって、本明細書に開示される方法は、ＡＤＣ治療法が特異的バイオマーカーに焦点を当てたものであり、その特異的バイオマーカーのレベルを、ＡＤＣ療法の前、最中及び後に監視及び検出することができると有利であるため、ＡＤＣ療法のために特に重要である。
【００５９】
一態様では、本発明は、被験者から採取した血液試料を用いた被験者における前立腺がんの診断又はステージ分類のための方法を提供する。特に、本発明は、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）が一又は複数の前立腺特異的マーカーを発現するかどうかを決定することによる被験者における前立腺の診断又はステージ分類のための方法を提供する。特定の実施態様では、本発明は、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ療法（即ち、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療）を受けているか又はこれから受ける被験者における前立腺がんの診断又はステージ分類のための方法を提供する。
【００６０】
本明細書に提供される方法では、ＣＴＣが、一又は複数の前立腺特異的マーカーの発現について分析される。ＣＴＣ上の前立腺特異的マーカーの検出は、前立腺がんの診断及びステージ分類に関してさらなる情報を提供する。特定の実施態様では、前立腺特異的マーカーはＳＴＥＡＰ１である。
【００６１】
特定の実施態様では、ＣＴＣは、四つのマーカー：サイトケラチン（ＣＫ）、ＣＤ４５、ＤＡＰＩ、及びＳＴＥＡＰ１について分析される。ＣＫはＣＴＣを検出するために使用される上皮マーカーである。ＣＤ４５は、白血球細胞マーカーであり、ＤＡＰＩは核マーカーである。ＳＴＥＡＰ１は前立腺がんのマーカーである。特定の実施態様では、ＳＴＥＡＰ１陽性ＣＴＣは、ＳＴＥＡＰ１＋／ＣＫ＋／ＤＡＰＩ＋シグネチャーを用いて同定される。
【００６２】
特定の実施態様では、本発明は、被験者における前立腺がんの診断又はステージ分類のための方法を提供し、この方法は：ａ）上皮由来のがん細胞を、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と接触させることであって、がん細胞が被験者から採取された血液試料に由来するものである、接触させること；ｂ）ＤＡＰＩ染色とＣＫ及びＣＤ４５発現について細胞をさらにスクリーニングすること、ｃ）がん細胞のいずれかが前立腺特異的マーカーであるＣＤ４５及びＣＫを発現するかどうかを決定することを含み、前立腺特異的マーカーであるＣＫ及びＤＡＰＩによる染色を発現するがん細胞の存在が、被験者が前立腺がんを有することを予測する。特定の実施態様では、上皮由来のがん細胞はＣＴＣである。特定の実施態様では、前立腺特異的マーカーはＳＴＥＡＰ１である。
【００６３】
特定の実施態様では、診断及び予後予測アッセイは増幅プロトコールを用いる。増幅プロトコールは、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）プロトコールであり、これは、細胞への使途において高分解能シグナル増幅を達成するために、例えば、色素（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ）と組み合わせて使用することができる。ＴＳＡは、標的タンパク質の高密度標識化を生じさせるためにホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の触媒活性を利用する酵素媒介性の検出方法である。
【００６４】
用語「上皮由来のがん細胞」は、少なくとも一つの上皮マーカーを発現するがん細胞を指す。本明細書において使用される用語「マーカー」は、特定の型の細胞に優勢に発現され、そのような細胞を他の型の細胞から区別することを助ける抗原分子を指す。例えば、上皮マーカーは、上皮細胞上に広く発現されるが、通常は白血球上に見られない抗原分子とすることができる。上皮由来のがん細胞は、腫瘍マーカー、例えば、腫瘍細胞上に優勢にみられるが、正常細胞上にはそれ程頻繁に見られない抗原分子も発現しうる。特定の実施態様では、上皮由来のがん細胞はＣＴＣを含む。
【００６５】
特定の実施態様では、上皮由来のがん細胞は、がん細胞においても優勢に見られる少なくとも一つの上皮マーカーを発現する。このような上皮マーカーの検出は、上皮由来のがん細胞を示す。特定の実施態様では、このような上皮マーカーは上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。
【００６６】
上皮由来のがん細胞は、被験者から採取された血液試料由来のものである。血液試料は、ヒトの血液に由来するいずれかの試料、例えば、血漿試料、血清試料、全血、又は特定の薬剤、例えば抗凝固剤で治療された血液とすることができる。血液試料は、被験者から直接採取することができるか、又は被験者から試料を収集する機関から取得することができる。
【００６７】
特定の実施態様では、がん細胞は、捕獲組成物を用いて血液試料から同定される。特定の実施態様では、捕獲組成物は、上皮由来のがん細胞に特異的に結合するリガンドを含む。特定の実施態様では、リガンドは、がん細胞上に優勢に発現される上皮抗原に特異的に結合する抗体である。特定の実施態様では、上皮抗原はＥｐＣＡＭである。
【００６８】
本明細書において使用される用語「同定する」又は「同定」は、上皮由来のがん細胞を、血液試料中の残りの成分から実質的に区別することを指す。例えば、上皮由来のがん細胞は、捕獲組成物により結合又は捕獲され、残りの成分は結合又は捕獲されない。
【００６９】
同定されたがん細胞は、血液試料中の残りの成分から分離されてもされなくともよい。特定の実施態様では、同定されたがん細胞は、試料中の他の成分から分離も又は濃縮もされない。例えば、血液試料、例えば血清試料は、スライドにローディングされ、捕獲組成物を用いて同定され、分離又は濃縮工程なしで、さらに他の試薬と接触させる。
【００７０】
特定の実施態様では、同定されたがん細胞は、血液試料から分離された細胞分画に富んでいる。本明細書において使用される表現「富んでいる／濃縮された」は、細胞分画中において同定されたがん細胞の密度が血液試料中より高いことを指す。いずれかの適切な技術を用いて細胞分画を分離することができる。当技術分野で一般的に用いられる技術には、限定されないが、例えば、がん細胞が、がん細胞の分離を可能にする捕獲組成物との複合体を形成した後での、重力分離、磁気分離又は親和性分離が含まれる。重力分離の場合、捕獲組成物は、遠心沈殿して同定されたがん細胞の濃縮を可能にする粒子又はビーズに結合することができる。磁気分離の場合、捕獲組成物は、適切な磁場において分離することのできる磁性粒子に結合しうる。親和性分離の場合、捕獲組成物は、スライドのようなデバイス上に固定化されて、同定された細胞の捕獲を可能にする。
【００７１】
特定の実施態様では、細胞分画は、磁場の下で分離される。特定の実施態様では、捕獲組成物中のリガンドは磁性粒子に結合する。
【００７２】
本明細書に開示される方法に適切な磁性粒子は、当技術分野において既知の方法を用いて調製することができる。例えば、米国特許第５５９７５３１号、同第５６９８２７１号、及び同第６３６５３６２号、並びにLiberti et al, In Fine Particles Science and Technology, 777-90, E. Pelizzetti （ed.） （1996）に記載される手順を参照されたい。簡単に説明すると、磁性粒子は、ポリマー又はタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン及びカゼイン）で被覆される磁性コア（例えば酸化鉄）を含む。磁性粒子の磁気質量及びサイズは、磁性粒子が磁気応答性であるが、免疫蛍光検出といった細胞分析技術には実質的に見えないように、制御することができる。磁性粒子の適切なサイズは、２００ｎｍ未満であり、好ましくは適切なサイズ分布は例えば９０〜１５０ｎｍにわたる。粒子の磁気質量は７０〜９０％であってよい。
【００７３】
特定の実施態様では、磁性粒子はコロイド状である。このようなコロイド状磁性粒子は、溶液中において長期にわたり実質的に安定であり、重力下で又は印加される磁場の非存在下で凝集する性質を有さない。特定の実施態様では、磁性粒子はコロイド状ナノ粒子である。
【００７４】
捕獲組成物中のリガンドは、当技術分野において既知の任意の適切な方法を用いて磁性粒子に結合させることができる。例えば、捕獲組成物は、ヘテロ二機能性リンカー、例えばスクシンイミジルプロピオノ−ジチオピリジン（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ））を用いて磁性粒子に直接結合させることができる。別の例として、ビオチン化抗体を含む捕獲組成物を、ストレプトアビジンにコンジュゲートした磁性粒子に結合させてもよい。捕獲組成物及び磁性粒子を、結合をもたらすことのできる他のコンジュゲート対、例えば、アビジン−ビオチン、プロテインＡ−抗体Ｆｃ、受容体−リガンド、及びレクチン−糖（炭水化物）を用いて導入してもよい。
【００７５】
特定の実施態様では、捕獲組成物は、磁性コロイド状ナノ粒子に結合したＥｐＣＡＭ抗体を含む。特定の実施態様では、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）系（Ｖｅｒｉｄｅｘ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて、同定された細胞で濃縮された細胞分画を分離することができる。
【００７６】
上皮由来のがん細胞は、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と接触させる。本明細書において使用される用語「前立腺特異的」は、マーカーが主に前立腺組織に見られ、前立腺組織又は細胞を他の組織又は細胞から実質的に区別することを示す。特定の実施態様では、前立腺特異的マーカーは、前立腺細胞の表面又は膜マーカーである。特定の実施態様では、前立腺特異的マーカーは、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ−１）（例えばHubert et al., （1999） ProC. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14523-14528参照）、前立腺に特異的な膜抗原（ＰＳＭ）（例えば、Israeli, R. S. et al., （1993） Cancer Res. 53, 227-230参照）、前立腺癌腫瘍抗原（ＰＣＴＡ−１）（例えば、Su, Z. Z. et al., （1996） ProC. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7252-7257参照）、及び前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（例えば、Reiter, R. E. et al. （1998） ProC. Natl. Acad. Sci USA 95, 1735-1740参照）からなる群より選択される。例示的なヒトＳＴＥＡＰ−１は、２００７年１０月２６日出願の米国特許出願公開第２００９／０２８００５６号に開示された配列番号１アミノ酸配列を有する（前記特許文献は参照により本明細書に包含される）。
【００７７】
特定の実施態様では、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体は抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を含む。特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、≦１０００ｎＭのＫＤでＳＴＥＡＰ−１に結合する。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体とすることができ、例えば、ヒツジ抗体、ウサギ抗体、又はマウス抗体といったいずれかの適切な種の抗体とすることができる。
【００７８】
特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体はマウスのモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９を有するハイブリドーマ細胞により生成される、１５Ａ５である。特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、抗体１５Ａ５が結合するものと実質的に同じエピトープに結合する抗体である。
【００７９】
特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は第１の検出可能な標識とコンジュゲートする。任意の適切な検出可能標識を使用することができる。特定の実施態様では、検出可能標識は、中でも、例えばフルオロフォアＡＦ−４８８、シアニン色素の誘導体、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、フィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）といった蛍光性標識である。抗体を検出可能標識にコンジュゲートさせる方法は当技術分野で既知であり、例えば、Hermanson, G. T., BioConjugate techniques, Academic Press, 2008が参照される。
【００８０】
特定の実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体はコンジュゲートされない。非コンジュゲート抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、検出可能標識（例えば第１の検出可能標識）にコンジュゲートした二次抗体を用いて検出することができる。このような二次抗体は、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体とは異なる種において産生されたいずれかの抗体でよく、当技術分野で一般に用いられるように、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の定常領域を認識する。
【００８１】
特定の実施態様では、がん細胞は、上皮由来のがん細胞の検出を可能にする一又は複数の試薬を用いて同定される。
【００８２】
特定の実施態様では、試薬は、上皮マーカーに特異的に結合するリガンドを含む。特定の実施態様では、上皮マーカーはＥｐＣＡＭではない。特定の実施態様では、上皮マーカーはサイトケラチンである。サイトケラチンは、上皮細胞に一般的に発現されるタンパク質の群であり、上皮組織の細胞骨格内にケラチン含有フィラメントを形成する。
【００８３】
特定の実施態様では、上皮マーカーに特異的に結合するリガンドは抗サイトケラチン抗体であり、第２の検出可能標識にコンジュゲートしていてもよい。任意の適切な検出可能標識、例えば、フィコエリトリンといった蛍光性標識を使用することができる。
【００８４】
特定の実施態様では、試薬は、細胞を非細胞成分から区別する細胞特異的色素をさらに含む。例えば、細胞核を染色する色素を使用することができる。特定の実施態様では、色素は４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である。
【００８５】
特定の実施態様では、試薬は、白血球マーカーに特異的に結合するリガンドをさらに含む。白血球マーカーは、白血球上に広く発現されるが非白血球上には一般に発現されないものとして選択され、例えば、ＣＤ４５は適切な白血球マーカーである。特定の実施態様では、白血球マーカーに特異的に結合するリガンドは、第３の検出可能標識にコンジュゲートさせる。例えば、このリガンドは、アロフィコシアニンにコンジュゲートした抗ＣＤ４５抗体とすることができる。抗ＣＤ４５抗体による同定された細胞の染色は、白血球を上皮由来のＣＴＣから除外するために役立ちうる。
【００８６】
複数の検出可能標識（色素を含む）が一つの試験に使用される場合、試料中に存在する他のいずれかの検出可能シグナルに実質的に干渉することなく各標識が独立して検出可能であるように、検出可能標識が選択されることが好ましい。例えば、検出可能標識（色素を含む）は、検出条件下で異なる色を示す異なる蛍光性分子である。
【００８７】
検出は、任意の適切な方法、例えば、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、光ファイバー走査式サイトメトリー、又はレーザー走査式サイトメトリーにより実施することができる。
【００８８】
特定の実施態様では、がん細胞は、細胞特異的色素並びに上皮マーカー、前立腺特異的マーカー及び白血球マーカーについて異なって標識された抗体又はリガンドで染色した後で、蛍光顕微鏡法の下で可視化される。細胞特異的色素、上皮マーカー及び前立腺特異的マーカーに陽性であるが、白血球マーカーに陰性の細胞は、前立腺特異的マーカーを発現する上皮由来のがん細胞として分類される。このような細胞は、フローサイトメトリーを用いて分析してもよい。例えば、Cruz, I., et al., Am J Clin Pathol, Vol. 123: 66-74 （2005）参照。
【００８９】
別法として、がん細胞は、ガラススライドの表面上に堆積させて、細胞特異的色素、上皮マーカー及び前立腺特異的マーカーに陽性であるが白血球マーカーに陰性の細胞について走査してもよい（例えば、Marrinucci, D. et al., Human Pathology, Vol. 38, No. 3, 514-519 （2007）参照）。同様に、ガラススライド上に堆積させた同定された細胞は、レーザー走査技術を用いて分析してもよい（例えば、Pachmann, K. et al., Breast Cancer Research, Vol. 7, No. 6, R975-R979 （2005）参照）。 
【００９０】
特定の実施態様では、方法は、前立腺特異的マーカーを発現するがん細胞の量を決定することをさらに含み、このような量は被験者における前立腺がんのステージを示す。腫瘍のサイズ及び／又は攻撃性を末梢血中の腫瘍細胞の数と相関させるための仮定が行われた。例えば、直径１ｍｍの腫瘍を有する患者が血液１００ｍｌ当たり約６個の腫瘍細胞という末梢血中の腫瘍細胞頻度を有しうることが報告されている（例えば、米国特許第６３６５３６２号参照）。腫瘍サイズの増大がこの頻度に比例すると仮定して、被験者のがんのステージを示すための基準を確立することができるであろう。特定の実施態様では、早期ステージ又は転移性の前立腺がんと診断された患者由来の臨床的血液試料を使用して、このような患者の末梢血中のがん細胞の統計レベルを決定し、それにより今後の検出及び分析のための基準を提供することができる。
【００９１】
特定の実施態様では、方法は、がん細胞上の前立腺特異的マーカーの発現レベルを決定することをさらに含む。いくつかの前立腺特異的マーカーは、腫瘍増殖、転移及び／又はがんのステージ進行の結果としてその発現レベルが上方制御される抗原である。このような前立腺特異的マーカーには、限定されないが、ＳＴＥＡＰ−１、ＰＳＭＡ、ＰＣＴＡ−１、及びＰＳＣＡが含まれる。がん細胞上における前立腺特異的マーカーの発現レベルは、任意の適切な方法、例えば、前立腺特異的マーカーに対応する蛍光シグナルの強度を決定することにより、決定することができる。
【００９２】
特定の実施態様では、方法は、前立腺特異的マーカーの発現レベルに基づいてがん細胞をグレード付けすること、及び各グレードのがん細胞のパーセンテージを決定することをさらに含む。特定の実施態様では、高レベル、中程度のレベル、及び低レベルの前立腺特異的マーカーを発現するがん細胞がそれぞれグレード付けされる。「高レベル」、「中程度のレベル」、及び「低レベル」の基準は、例えば、マーカーの既知の発現レベルを有する樹立細胞株を用いて決定することができる。例えば、ＬＢ５０細胞株は、高レベルのＳＴＥＡＰ−１を発現することが知られており、ＬｎＣＡＰｎｅｒ細胞株は中程度のレベルのＳＴＥＡＰ−１を発現することが知られており、ＰＣ３細胞株は、低レベルのＳＴＥＡＰ−１を発現することが知られている。したがって、ＬＢ５０細胞株に匹敵する又はＬＢ５０細胞株より高いＳＴＥＡＰ−１発現レベルを有することが検出されているがん細胞は、「高レベル」にグレード付けされる。同様に、「中程度のレベル」は、そのＳＴＥＡＰ−１発現レベルがＬｎＣＡＰｎｅｒ細胞株に匹敵する又はＬｎＣＡＰｎｅｒ細胞株より高いがＬＢ５０細胞株より低いがん細胞に割り付けられる。ＰＣ３細胞株に匹敵する又はＰＣ３細胞株より低いＳＴＥＡＰ−１発現レベルを有するものは、「低レベル」にグレード付けされる。
【００９３】
各グレードのがん細胞の数を、さらに決定することができる。特定の実施態様では、各グレードのがん細胞のパーセンテージを計算することができる。高レベルのグレードのがん細胞のパーセンテージが高い程、前立腺がんのステージが進行していることが示される。同様に、早期ステージの前立腺がんは、高レベルのグレードにおいてそれよりも低いがん細胞のパーセンテージを示しうる及び／又は低レベルのグレードにおいてそれよりも高いがん細胞のパーセンテージを示しうる。
【００９４】
特定の実施態様では、方法は、各グレードのグレードスコアを、前記グレードのがん細胞のパーセンテージに、前立腺特異的マーカーの発現レベルに基づいてそのグレードに割り付けられた固有のグレード数を乗じることにより計算すること、及びすべてのグレードスコアを合算してＨスコアを取得することをさらに含み、Ｈスコアは被験者の前立腺がんのステージを示す。例えば、グレード数３は高レベルのグレードに、２は中程度のレベルのグレードに、１は低レベルのグレードに、それぞれ割り付けられ、０から３００のＨスコア範囲が規定される。Ｈスコアが高い程、高レベルのグレードの細胞が多いこと、即ち  前立腺がんのステージが進行していることが示され、Ｈスコアが低い程、低レベルのグレードの細胞が多いこと、即ち比較的早期ステージの前立腺がんであることが示される。
【００９５】
いくつかの実施態様では、方法は、マーカーの存在及び／又はマーカーの存在の頻度を決定することをさらに含む。いくつかの実施態様では、マーカーの存在は、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降法、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化セルソーティング（「ＦＡＣＳ」）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、定量的血液ベースアッセイ（例えば血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素活性アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザン分析、定量的実時間ＰＣＲ（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）及びその他増幅式検出方法を含むポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ解析、遺伝子発現プロファイリング、及び／又は遺伝子発現の連続分析（「ＳＡＧＥ」）、並びにタンパク質、遺伝子、及び／又は組織アレイ分析によって実施することのできる多種多様なアッセイにより決定される。いくつかの実施態様では、マーカーの存在は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により決定される。いくつかの実施態様では、マーカーはＰＴＥＮである。いくつかの実施態様では、ＣＴＣは三倍体である。いくつかの実施態様では、ＣＴＣは、ＰＴＥＮ損失を有する三倍体である。いくつかの実施態様では、ＣＴＣは、ＣＥＰ１０  ＦＩＳＨにより三倍体であると決定される。いくつかの実施態様では、ＣＴＣは、ＰＴＥＮ  ＦＩＳＨによりＰＴＥＮ損失を含むと決定される。
【００９６】
別の態様では、本発明は、被験者における前立腺がん治療法の有効性を予測する方法も提供し、この方法は：ａ）上皮由来のがん細胞を、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と接触させることであって、がん細胞が被験者から採取された血液試料に由来するものである、接触させること；及びｂ）がん細胞のいずれかが前立腺特異的マーカーを発現するかどうかを決定することを含み、前立腺特異的マーカーを発現するがん細胞の存在が、被験者において前立腺がん治療法の有効性を示す。
【００９７】
特定の前立腺特異的マーカーは、前立腺がん治療の治療標的としてもよい。したがって、ＣＴＣ上におけるこのようなマーカーの発現レベル、及びこのようなレベルの変化は、そのようなマーカーを標的とする治療法の有効性を示すことができる。
【００９８】
特定の実施態様では、方法は、前立腺特異的マーカーを発現するがん細胞の量を決定すること、及び／又はがん細胞上における前立腺特異的マーカーの発現レベルを決定することをさらに含む。例えば、早期相臨床治験でのベースラインとしての治療前試料に由来するがん細胞上における前立腺特異的マーカー（例えばＳＴＥＡＰ−１）の発現レベルは、特定の閾値を上回る前立腺特異的マーカーの発現が前立腺がん治療法（例えばＳＴＥＡＰ−１抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に基づく治療法）の臨床活性を示すかどうかを決定するために、無増悪期間、ＰＳＡの変化、患者に報告された骨痛、全生存他といった臨床エンドポイントに関連付けることができる。がん細胞における前立腺特異的マーカー（例えばＳＴＥＡＰ−１）の発現レベルの動的変化（即ち治療後の試料における下方制御）は、このような変化が治療活性を示すかどうかを決定するための臨床成績の指標と相関させることもできる。このような方法は、前立腺がん治療法（例えばＳＴＥＡＰ−１  ＡＤＣに基づく治療法）の患者を選択するために使用されうる予測バイオマーカーの候補として、アッセイを認定し、続いて確証的な第ＩＩＩ相試験において予測的バリデーションを行ううえで、第１の工程として使用することができる。
【００９９】
別の態様では、本発明は、被験者の前立腺がん治療法に対する応答を監視する方法も提供し、この方法は：ａ）第１群の上皮由来のがん細胞を、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と接触させることであって、第１群のがん細胞が被験者から採取された第１の血液試料である、接触させること；ｂ）前立腺特異的マーカーを発現する第１群におけるがん細胞の量及び／又はがん細胞における前立腺特異的マーカーの発現レベルを決定すること；ｃ）第２群の上皮由来のがん細胞を、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と接触させることであって、第２群のがん細胞が、前立腺がん治療法の試験期間の後で被験者から採取された第２の血液試料である、接触させること；ｄ）前立腺特異的マーカーを発現する第２群におけるがん細胞の量及び／又はがん細胞における前立腺特異的マーカーの発現レベルを決定すること；並びにｅ）ｂ）で決定された前立腺特異的マーカーを発現するがん細胞の量及び／又は前立腺特異的マーカーの発現レベルと、工程ｄ）の同量及び／又はレベルとを比較することを含み、前立腺特異的マーカーを発現するがん細胞の量の変化及び／又はがん細胞における前立腺特異的マーカーの発現レベルの上昇が、被験者の前立腺がん治療法に対する応答を予測する。特定の実施態様では、前立腺特異的マーカーはＳＴＥＡＰ−１である。
【０１００】
ＩＩＩ．抗体
別の態様では、本発明は、抗体１５Ａ５が結合するのと実質的に同じエピトープに結合する抗体を提供し、抗体１５Ａ５は、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９を有するハイブリドーマ細胞により生成される。
【０１０１】
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体は、ＳＴＥＡＰ−１への結合について１５Ａ５抗体と競合する。競合アッセイは、ＳＴＥＡＰ−１への結合について抗ＳＴＥＡＰ−１抗体１５Ａ５と競合する抗体を同定するために用いられる。
【０１０２】
代表的な競合アッセイでは、ＳＴＥＡＰ−１に結合する第一の標識抗体と、ＳＴＥＡＰ−１への結合について第一の抗体と競合する能力について試験される第二の非標識抗体とを含む溶液中において、固定化したＳＴＥＡＰ−１をインキュベートする。第二の抗体はハイブリドーマ上清に存在してもよい。コントロールとして、固定化ＳＴＥＡＰ−１が、第一の標識抗体を含むが第二の非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体のＳＴＥＡＰ−１への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化されたＳＴＥＡＰ−１に結合した標識の量が測定される。固定化ＳＴＥＡＰ−１に結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ＳＴＥＡＰ−１への結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane （1988） Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 （Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【０１０３】
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、≦１０００ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）のＳＴＥＡＰ−１に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０１０４】
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下において、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原でＦａｂを平衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体でコートされたプレートと結合した抗原を捕獲することによって、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例えば、Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881（1999）を参照）。アッセイ条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）で一晩コーティングし、その後２％（ｗ／ｖ））のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで２〜５時間室温（およそ２３℃）でブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ  ＃２６９６２０）において、目的のＦａｂの段階希釈液と１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を混合する（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 （1997）の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次いで目的のＦａｂを一晩インキュベートする。しかしながら、インキュベーションは、平衡状態に達したことを確認するためにさらに長時間（例えば約６５時間）続けてもよい。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。次いで、溶液を除去し、０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を含むＰＢＳでプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭガンマ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計測する。最大結合の２０％以下が得られるＦａｂの濃度が、競合結合測定に用いるために選択される。
【０１０５】
別の実施態様によれば、〜１０の反応単位（ＲＵ）に固定された抗原ＣＭ５チップを有する２５℃でのＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈した後で、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために、１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃、及び約２５μｌ／分の流速で、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ  ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 （1999）を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、会合速度は、分光計、例えば流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される漸増濃度の抗原の存在下において、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定することができる。
【０１０６】
また、動態結合測定は、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）において実施することができる。例えば、すべての洗浄、希釈及び測定は、１０００ｒｐｍでプレートを搖動させてオクテットバッファー（０．２％のドデシルマルトシド、又はＤＤＭ、−ＰＢＳ）において実施される。ストレプトアビジンバイオセンサーは、オクテットバッファー中において１０分間平衡化され、次いでビオチン化ＳＴＥＡＰ−１を（オクテットバッファー中において１：８に希釈された１％のＤＤＭ中のウイルス溶解物から）５分間充填し、１０分間洗浄される。結合相の間に、リガンドでコートされたストレプトアビジンチップを抗ＳＴＥＡＰ−１抗体断片に１０分間浸漬する（８回連続の二倍希釈、５００又は５０ｎＭで開始）。Ａｂ−ＳＴＥＡＰ−１複合体の解離は、オクテットバッファーのみを含むウェル中において６００秒間測定することができる。ＫＤ、Ｋａ及びＫｄは、グローバルフィッティングによる１：１結合モデルを用いるオクテット評価ソフトウェアｖ６．３により決定される。
【０１０７】
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体には、限定されないが、マウス抗体、ヒツジ抗体、及びウサギ抗体が含まれる。特定の実施態様では、抗体はマウスのモノクローナル抗体である。
【０１０８】
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体は、抗体１５Ａ５のＣＤＲ領域の少なくとも一つを含む。抗体のＣＤＲ領域は、当技術分野で既知の方法を用いて決定することができる。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）。）重鎖可変領域のＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci.  13:1619-1633 （2008）参照。）特に断らない限り、可変ドメイン内のＣＤＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、上掲のKabat et al.に従って番号付けされる。
【０１０９】
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体は、抗体１５Ａ５の重鎖可変領域の少なくとも一つ、又は抗体１５Ａ５の軽鎖可変領域の少なくとも一つを含む。
【０１１０】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 （2007）参照。）抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に特異的に結合する抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 （1993）; Clarkson et al., Nature 352:624-628 （1991）参照。
【０１１１】
本明細書において提供される抗体の抗体断片も、本発明により包含される。特定の実施態様において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定しないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに下記の他の断片を含む。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 （2003）を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えばThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., （Springer-Verlag, New York）, pp. 269-315 （1994）のPluckthunを参照。また、国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１１２】
ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 （2003）、及びHollinger et al., ProC. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 （1993）を参照。  また、トリアボディ及びテトラボディがHudson et al., Nat. Med.9:129-134 （2003）に記載されている。
【０１１３】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば米国特許第６２４８５１６号を参照）。
【０１１４】
抗体断片は、本明細書に記載のように、組換え宿主細胞（例えば大腸菌又はファージ）による産生の他、インタクトな抗体のタンパク質消化を含むがこれらに限定されない、種々の技術により作製できる。
【０１１５】
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体は抗体１５Ａ５又はその抗原結合断片である。
【０１１６】
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体は、検出可能標識にさらにコンジュゲートする。適切な標識には、限定されないが、直接検出される標識又は部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識）、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。このような標識の例には、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼを、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化するために過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
【０１１７】
ＩＶ．核酸及び宿主細胞
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組み換え方法及び組成物を用いて生成することができる。一実施態様では、本明細書に記載される抗ＳＴＥＡＰ−１抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードしうる。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む一又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクターを含む（例えば、同ベクターで形質転換されている）。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、上述のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を作製する方法が提供される。
【０１１８】
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の組み換え生産のために、例えば上述のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために、一又は複数のベクターに挿入される。そのような核酸は、容易に単離可能であり、従来の手順を用いて（例えば抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０１１９】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核細胞を含む。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌内で生成されうる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号及び同第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体断片の発現について記載している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003）, pp. 245-254も参照のこと）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離し、さらに精製することができる。
【０１２０】
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす真菌株及び酵母株を含めた糸状菌又は酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 （2004）, and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 （2006）参照。
【０１２１】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。
【０１２２】
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号、及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照のこと。
【０１２３】
脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 （1977）に記載された２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 （1980）に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 （1982）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216（1980））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ）, pp. 255-268 （2003）を参照。
【０１２４】
本明細書では、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９を有するハイブリドーマ細胞株も提供される。ハイブリドーマ細胞株は抗体１５Ａ５を生成する。
【０１２５】
Ｖ．抗体の使用
本明細書において提供される抗体は、前立腺がんの診断試薬の製造に使用することができる。抗体は、診断目的に適した検出可能標識とさらにコンジュゲートし、適切な形態、例えば凍結乾燥させた粉末で、又は適切な溶液の形態で提供される。
【０１２６】
ＶＩ．テストキット
本発明の別の態様では、前立腺ガンの診断又は予後予測に有用な組成物を含むテストキットが提供される。
【０１２７】
本発明はさらに、ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合する抗体を含む、血液試料においてＳＴＥＡＰ−１を発現する前立腺がん細胞の存在を検出するためのテストキットを提供する。
【０１２８】
特定の実施態様では、抗体は第１の検出可能な標識とコンジュゲートする。任意の適切な検出可能標識、例えば蛍光標識を使用することができる。
【０１２９】
特定の実施態様では、抗体は、本明細書において提供される抗ＳＴＥＡＰ−１抗体である。特定の実施態様では、抗体は、抗体１５Ａ５である。
【０１３０】
特定の実施態様では、テストキットはさらに、上皮由来のがん細胞に特異的に結合する第１のリガンドに結合した磁性粒子、上皮マーカーに特異的に結合する第２のリガンド；白血球マーカーに特異的に結合する第３のリガンド、及び細胞を非細胞成分から区別する色素からなる群より選択される一又は複数の組成物を含む。
【０１３１】
特定の実施態様では、第２のリガンドは第２の検出可能標識にコンジュゲートしている、及び／又は第３のリガンドは第３の検出可能標識にコンジュゲートしている。特定の実施態様では、テストキットが複数の検出可能標識（色素を含む）とき、検出可能標識（色素を含む）は、試料中に存在する他のいずれの検出可能シグナルにも実質的に干渉することなく標識が独立して検出されるように選択されることが好ましい。
【０１３２】
特定の実施態様では、第１のリガンド、第２のリガンド及び／又は第３のリガンドは抗体を含む。特定の実施態様では、第１のリガンドは抗ＥｐＣＡＭ抗体を含む。特定の実施態様では、第２のリガンドは抗ケラチン抗体を含む。特定の実施態様では、第３のリガンドは抗ＣＤ４５抗体を含む。
【０１３３】
テストキットはさらに、容器と容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、組成物自体又は病態の診断に有用な別の組成物と組み合わされた組成物を保持する。組成物中の少なくとも一の試薬は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された病態のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のために使用されることを示す。
【実施例】
【０１３４】
ＶＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることが理解される。
【０１３５】
実施例１．ＣＴＣ上でのＳＴＥＡＰ１発現レベルの免疫蛍光に基づく検出
この実施例に示されるように、免疫蛍光に基づくアッセイは、ＣＴＣの表面上におけるＳＴＥＡＰ１の頑強な検出と、治療後のＣＴＣの総数並びにＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣの減少とを実証することができた。
【０１３６】
試料を、本明細書に記載の４チャネルＥｐｉｃ  ＣＴＣプラットフォームを用いて処理及び分析した。転移性去勢抵抗性前立腺がん（ｍＣＲＰＣ）を有する４２名の患者から、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療の前と後に血液試料を収集した。患者の血液試料をＥｐｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓで受領したときに、全血を溶解し、有核細胞（１スライド当たり約３×１０６個）を顕微鏡スライド上に載せ、分析まで−８０℃で凍結した。解凍し、スライドを、サイトケラチン、ＣＤ４５、ＤＡＰＩ、及び１５Ａ５抗ＳＴＥＡＰ１抗体を含む抗体のカクテルで染色し、ＣＴＣ上におけるこのタンパク質バイオマーカーの発現を評価した。抗サイトケラチン抗体、抗ＣＤ４５抗体、及びＤＡＰＩ染色を用いてＣＴＣを同定した。抗ＳＴＥＡＰ１  １５Ａ５抗体を使用してＣＴＣを発現するＳＴＥＡＰ１を検出した。増幅なしの伝統的なプロトコール（「非増幅」）及びシグナル増幅プロトコール（「増幅」）を用いてＣＴＣの表面上のＳＴＥＡＰ１を測定するためのアッセイを開発した。増殖プロトコールは、非増幅のそれぞれ４倍及び５倍高い，シグナル対雑音比及びダイナミックレンジを有する（図８Ａ）。その後、染色されたスライドをスキャンし、得られた画像を多パラメーターデジタル病理学アルゴリズムを用いて分析し、ＣＴＣ候補を検出し、ＳＴＥＡＰ１レベルを定量化した。ＤＡＰＩ（青）、サイトケラチン（赤）、ＣＤ４５（緑）の代表的な１０Ｘ免疫蛍光画像（Marrinucci et al. J Oncol. 2010: 861341（2010）;  Cho et al., Phys Biol. 9: 016001 （2012）; Marrinucci et al., Phys Biol. 9: 016003 （2012））及びＳＴＥＡＰ１（白）チャネルを、ＣＴＣサブタイプ及び周囲の白血球細胞（ＷＢＣ）について示す。４チャネルをマージしたものが、図８Ｂの各画像の一番左に示されている。
【０１３７】
１ｍｌ当たりのＣＴＣの総数の減少、並びにＳＴＥＡＰ１＋の数の減少とＳＴＥＡＰ１−ＣＴＣの減少が、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療後に観察された。特に、ＣＴＣ上でのＳＴＥＡＰ１の発現レベルは１８／４２試料（４３％、３０％〜５７％）において容易に検出可能であり、１症例当たりのＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣは１〜５６％の範囲であった。治療後、ベースラインと比較して、ＳＴＥＡＰ１陽性の患者の割合の減少と、ＳＴＥＡＰ１−ＣＴＣの増加が観察された。
【０１３８】
実施例２．ＡＤＣの予後予測及び有効性を評価するためのＣＴＣアッセイの使用
進行性ｍＣＲＰＣを有する６０名の患者は、０．３から２．８ｍｇ／ｋｇの範囲のＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣを、三週に一度投与された。ＡＤＣ活性を、ＰＳＡの減少により、＞６ヶ月の研究時間において測定した。≧２ｍｇ／ｋｇの用量において、≧５０％のＰＳＡの減少が、１０／４５名（２２％±１２．１）の患者に観察された。ＡＤＣ活性は、ＩＨＣ  ３＋腫瘍を有する患者において最も顕著であった。≧２ｍｇ／ｋｇにおいて、２０／４５名の患者（４４％±１４．５）が、ベースラインにおいて７．５ｍＬ当たり≧５という望ましくないＣＴＣ数を有しており、評価可能と考慮された。１回目の治療サイクル後、望ましくない数から望ましい数へのＣＴＣ変換が１１／２０名の患者（５５％±２１．８）に見られ、ＰＳＡ減少と有意に相関していた（スピアマンの順位ｒ＝０．７４）。ＣＴＣは、ＦＡＣＳにより、１４／２９の試料（４９％±３１−６６％）において、ＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４５−イベントに容易に検出可能なＳＴＥＡＰ１＋シグナルを示した。ＳＴＥＡＰ１＋イベントは、０〜７４％の範囲のＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４５−特性を示し、ＦＡＣＳでソートされたＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４５−イベントは、前立腺がんの推定マーカーＡＲ及びＫＬＫ３に沿ってＳＴＥＡＰ１＋ＲＴ−ＰＣＲ発現を示した。ＥＰＩＣにより、ＳＴＥＡＰ１は１８／４２の試料（４３％±１４．９８）に検出され、範囲はＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣの１〜５６％であった。治療後、ベースラインと比較して、ＳＴＥＡＰ１＋の患者の割合の減少と、ＳＴＥＡＰ１＝ＣＴＣの増加が観察された。１７名の患者がＳＴＥＡＰ１  ＰＥＴ試験に参加した。ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣで治療した１４名の患者のうち、４／１４名（２９％±１２〜５５％）の患者においてＰＳＡに≧５０％の減少があった。治療時間は骨転移ＳＵＶｍａｘと相関していた（ｒ＝０．６３）。高いＳＵＶ転移の８のＰＥＴ誘導生検すべてでＳＴＥＡＰ１  ＩＨＣ  ２＋／３＋が確認された。
【０１３９】
したがって、２＋／３＋腫瘍を有する患者は、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ感受性の予測バイオマーカーとしての組織又は血液中における、ＳＴＥＡＰ１／ＥｐＣＡＭ／ＣＤ４５の発現パターン（上述）又はＳＴＥＡＰ１／ＣＤ４５／ＤＡＰＩの発現パターン（実施例１に記載）に基づいて、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療の恩恵を受ける可能性が最も高いと思われる患者を選択するための代替エンドポイントとしてＣＴＣ上でのＳＴＥＡＰ１発現の値を評価するために、選択することができる。
【０１４０】
実施例３．シグナル増幅プロトコールはＳＴＥＡＰ１  ＣＴＣアッセイのダイナミックレンジを増大させる
ＳＴＥＡＰ１シグナルを、ＳＫＢＲ３（ＳＴＥＡＰ１ネガティブコントロール）及びＬｎＣａＰ（ＳＴＥＡＰ１ポジティブコントロール）前立腺がん細胞株において、増幅プロトコールの存在下及び非存在下において測定した（図９）。ＳＴＥＡＰ＋試料のカットオフはそれぞれ、非増幅プロトコールを用いた場合＞３のシグナル、増幅プロトコールを用いた場合＞８のシグナルであった。非増幅プロトコールは、ＬｎＣａＰ（ポジティブコントロール）細胞株にＳＫＢＲ３（ネガティブコントロール）細胞株の７．６倍のシグナル増加を示した。増幅プロトコールは、ＬｎＣａＰ（ポジティブコントロール）細胞株にＳＫＢＲ３（ネガティブコントロール）細胞株の２５倍のシグナル増加を示した（図９Ａ）。ＳＴＥＡＰ１シグナルを増幅した結果、ＬｎＣａＰ（ポジティブコントロール）細胞株の平均ＳＴＥＡＰ１シグナルが８．１倍に増加したが、背景（即ち、ＳＫＢＲ３ネガティブコントロールシグナル）の増加はわずか２．４倍であった（図９Ａ）。
【０１４１】
また、ＳＴＥＡＰ１増幅プロトコールによりＳＴＥＡＰ１陽性患者が判明し、それにより既存試験より感受性の高い予後予測及び診断試験が提供された（図９Ｂ）。３６の試料のうち、１２／３６（３３％）は非増幅プロトコールを用いた場合にＳＴＥＡＰ１＋であり、１８／３６（５０％）は増幅プロトコールを用いた場合ＳＴＥＡＰ１＋であった（ＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣについてカットオフ＝１）（図９Ｂ）。図９Ｂに示すように、旧式の非増幅プロトコールを用いた場合にＳＴＥＡＰ１−に分類されたであろう７名の患者の試料が、増幅アッセイを用いてＳＴＥＡＰ１＋に分類された。
【０１４２】
ＳＴＥＡＰ１＋試料に関し、増幅アッセイは、ＳＴＥＡＰ１非増幅アッセイと比較して、より多くのＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣ（即ち試料）を検出することができた（図９Ｂ）。したがって、ＳＴＥＡＰ１増幅プロトコールは、伝統的な非増幅プロトコールでは同定されなかったであろう、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ治療の恩恵を受けるであろう患者（例えば、伝統的な非増幅プロトコールを用いた場合には同定されないであろう少数のＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣを有する患者）の同定を可能にする。
【０１４３】
実施例４．ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣ治療は総ＣＴＣ／ｍＬ及びＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣ数の両方を減少させる
血液試料を、ＳＴＥＡＰ１−ＡＤＣによる治療の前、最中、及び後に採取した。図１０に示すように、治療が進行するにつれ、ＳＴＥＡＰ１＋ＣＴＣの数は減少した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
2018517129.tif 000015
2018517129.tif 000016
2018517129.tif 000017