(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡ損傷および／または細胞老化を処置または予防するための、ホメオタンパク質、または該タンパク質をコードする組換えベクターの使用に関する。特に、本発明は、パーキンソン病の処置のためのＥｎｇｒａｉｌｅｄの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性障害の処置および／または予防に使用されるホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体。
【請求項２】
前記ホメオタンパク質が、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質、Ｇｂｘ２およびＬｈｘ９からなる群から選択される、請求項１に規定の使用のための、請求項１に記載のホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体。
【請求項３】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および眼または耳に影響を及ぼす変性疾患からなる群から選択される、請求項１または２に規定の使用のための、請求項１または２に記載のホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体。
【請求項４】
前記神経変性障害がパーキンソン病である、請求項３に規定の使用のための、請求項３に記載のホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体。
【請求項５】
前記ホメオタンパク質がＥｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に規定の使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体。
【請求項６】
前記Ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質が、ＳＮｐｃ領域中に直接投与される、請求項５に規定の使用のための、請求項５に記載のホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体。
【請求項７】
前記ホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体が、一度で投与される、請求項１〜５のいずれか一項に規定の使用のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体。
【請求項８】
前記ホメオタンパク質が、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質であり、前記ＤＮＡ損傷関連疾患または前記ＤＮＡ損傷関連障害が、筋萎縮性側索硬化症である、請求項１または２に規定の使用のための、請求項１または２に記載のホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体。
【請求項９】
前記ホメオタンパク質が、Ｇｂｘ２タンパク質であり、前記ＤＮＡ損傷関連疾患または前記ＤＮＡ損傷関連障害が、ハンチントン病である、請求項１または２に規定の使用のための、請求項１または２に記載のホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体。
【請求項１０】
前記ホメオタンパク質が、Ｌｈｘ９タンパク質であり、前記ＤＮＡ損傷関連疾患または前記ＤＮＡ損傷関連障害が、ハンチントン病である、請求項１または２に規定の使用のための、請求項１または２に記載のホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ損傷および／または細胞老化に関連する症状を処置または予防するための、より詳細には、ＤＮＡ損傷関連疾患または障害、および加齢に関連する疾患または障害、とりわけ神経変性障害の予防および／または処置のための、ホメオタンパク質、または該タンパク質をコードする組換えベクターの使用に関する。特に、本発明は、パーキンソン病の処置におけるＥｎｇｒａｉｌｅｄの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢過程の研究は重要である。その理由として、一つには、多くの疾患または症状、例えば、いくつか挙げると、癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、緑内障、心血管疾患が、高齢者の間でより多く見られ、これらの多くは、有効な予防法または処置法が未だにないからである。莫大な文献が加齢過程の理解に寄与してきたが、当該過程を完全に理解することは依然として大きな課題である。世界中の高齢者の人口増加、およびそれに伴う健康管理の負担及び費用の増加を考えると、加齢に関連する疾患または障害の予防または処置用の老化防止剤の有効な発見に導く加齢過程の研究が、ますます重要になっている。
【０００３】
細胞のＤＮＡは、外因性および内因性の遺伝毒性ストレス（例えば、酸化ストレス、有毒な副産物、ミトコンドリア機能の低下）による、絶え間のない脅威下にあり、当該ストレスは、塩基の修飾または誤取込みによってＤＮＡを修飾して、ＤＮＡ損傷をもたらす。ＤＮＡ損傷は、一本鎖の切断および二本鎖の切断等の、ＤＮＡ構造の物理的異常である。ＤＮＡ損傷は、特定の酵素によって認識され得るので、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）によって正確に修復され得る。この天然のＤＮＡ修復能力が喪失すると、細胞の機能不全および細胞死に至る虞がある遺伝的不安定性を生じる。ＤＮＡ損傷がクロマチン変化（これ自体、ＤＮＡ修復機構へのアクセスを与えるのに必要である）を誘導するので、クロマチンリモデリング経路およびＤＤＲ経路が相互に関連していることが、さらに示されている（Ｓｏｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４６，７２２−７３４）。
【０００４】
ＤＮＡ損傷の蓄積が、加齢の過程に、そして、運動失調、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、およびパーキンソン病等の神経変性障害を含む、加齢に関連する疾患の発症に関連付けられている（Ｃａｎｕｇｏｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，１２，５７８−５８７およびＭａｄａｂｈｕｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎｅｕｒｏｎ  ８３，２６６−２８２）。
【０００５】
加えて、虚血およびアルツハイマー病等の神経変性障害において、ニューロンは、サイクリン−Ａ等の細胞周期マーカーを発現する、異常な細胞周期活性を呈し、そして程度の限られたＤＮＡリモデリングを経験する。この挙動は、ヒトではニューロンが、発達中に最終的に分化して、これらの事象の発症前の数十年間、休止したままであることを考慮すると、注目に値する。基本的な機構はあまり理解されていないが、これらの活性が、ニューロン死において、早期に貢献する役割を果たすことを、複数の系列の証拠が示唆している（Ａｎｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１，２５，５４４６−５４）。
【０００６】
前記ＤＮＡ損傷、および細胞周期への再進入が、神経疾患でのアポトーシスにおける共通した経路を構成し得ることがさらに示されている（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｔｓａｉ，２００９，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  ＡＣＡＤ  Ｓｃｉ．，１１７０，６７４−９またはＰｉｚａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．，４３，９８５−９９４）。
【０００７】
したがって、ＤＮＡ修復を促進し、ＤＮＡ損傷および／もしくは細胞の老化に関連する障害を予防かつ／または処置することができ、かつ／または細胞周期を調節することができる新しい治療薬の開発が、強く必要とされている。
【０００８】
ホメオタンパク質、またはホメオドメインタンパク質は、形態形成に関与する細胞の移動過程および分化過程において主要な役割を果たす転写因子である。これは、ヘリックス／ターン／ヘリックス構造を有するＤＮＡ結合ドメインであるホメオドメインの６０アミノ酸の配列の存在によって特徴付けられる。ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアンテナペディアタンパク質の単離ドメインは、培養中のニューロンの膜を横切って、核内に蓄積して、神経突起成長を促進することが示されている（欧州特許第０４８５５７８号明細書）。ホメオドメインは、高度に保存されており、そして内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）特性を多数のホメオタンパク質に付与する（Ｓｐａｔａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．６５，９０−１０４）。
【０００９】
Ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１およびＥｎｇｒａｉｌｅｄ−２）は、類似の生物学的活性を有するホメオタンパク質であり、以降、総括的用語Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ（ヒトについてはＥＮ、またはマウスについてはＥｎ１／２）で総称する。新生児および成体では、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄは、黒質緻密部（ＳＮｐｃ、パーキンソン病で変性する）および腹側被蓋野（ＶＴＡ）を含む、小脳顆粒細胞および中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）核内で発現される。Ｅｎ１／２は、中脳の発達、中脳内の、中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロンの発達において重要な役割を果たす（Ｊｏｙｎｅｒ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １２，１５−２０）。Ｅｎ１／２はまた、中脳の腹側部におけるＳＮｐｃおよびＶＴＡに位置する成体ｍＤＡニューロンの生存において重複した役割を果たす（Ａｌｂｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，３２２９−３２３６）。このため、パーキンソン病におけるＤＡニューロンの喪失の予防または処置のために提案された。国際公開第２０１３／１２８２３９号パンフレットにおいて、中脳内注入によるＥｎ１／２の局所投与により、ＤＡニューロンによるＤＡ合成および関連する運動活性が増大することが報告された。Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２７８，５２、Ａｂｓｔｒａｃｔ，  Ｂｒｕｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３８  ：９４−９８，２００５およびＡｌｖａｒｅｚ−Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １４：１２６０−１２６６，２０１１は、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄが転写因子であるだけでなく、核内で転写されるミトコンドリアｍＲＮＡの翻訳を増強する翻訳レギュレータであることを報告している。そして、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ形質導入が、ミトコンドリア複合体Ｉの２つのタンパク質、Ｎｄｕｆｓ１およびＮｄｕｆｓ３の翻訳を上方制御し、かつＡＴＰ合成を増大させることが示された（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １４：１２６０−１２６６，２０１１、Ｓｔｅｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２も参照）。また、国際公開第２００７／０９９２２７号パンフレットにおいて、マウスへのＥｎ１／２の全身投与が、線条体におけるＤＡ代謝回転の増大を誘導し、これは、ドーパミンレベルを変更せずに、ＤＡ代謝産物である３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）の産生の増大によって反映されることが示されている。
【００１０】
Ｏｔｘ２（ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２）は、ビコイド型ホメオドメインを含有する別のホメオタンパク質である（Ｓｉｍｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ  １２，２７３５−２７４７）。これは、Ｏｔｘタンパク質ファミリに属し、脳胚形成中に基本的な役割を果たす（Ａｃａｍｐｏｒａ  ｅｔ  ａｌ，１９９５；Ｓｉｍｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。また、Ｏｔｘ２は、網膜の形成、ならびに成体網膜神経節細胞の生存および生理に関与することも示されている（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１３；Ｔｏｒｅｒｏ  Ｉｂａｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。ゆえに、インビトロ培養での成体網膜神経節ニューロン（ＲＧＣ）の生存を向上させるための、そしてまた、ＲＧＣの変性をインビボで予防または処置するための、ビコイドファミリの、特にＯｔｘ２等のＯｔｘファミリのホメオタンパク質の使用が提案された（国際公開第２００９／１０６７６７号パンフレット）。
【００１１】
本発明者らは今回、ホメオタンパク質が、ＤＮＡ損傷およびクロマチンリモデリングから細胞を保護し、ＤＮＡ鎖の切断数を減少させ、核および核小体の全ヘテロクロマチンマークを回復させて、細胞周期を調節し、かつ老化様興奮毒性（アポトーシスを含む）から細胞を保護することができることを示した。特に、本発明者らは、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄが、ＳＮｐｃ領域に投与された場合に、強い酸化ストレスによって起こる細胞死に至る損傷を修復することができることを示した。特に、本発明者らは、急性酸化ストレスのモデルにおいて、ヘテロクロマチンマークを回復させる（核小体の完全性が挙げられる）ことによって、そして二本鎖切断を消滅させることによって、抗アポトーシス経路を活性化して、長期生存を促進する。これらの結果により、ホメオタンパク質、特にＥｎｇｒａｉｌｅｄを、ＤＮＡ損傷が生じる病理、例えばパーキンソン病に用いることを提唱することができる。
【００１２】
本発明によれば、用語「ＤＮＡ損傷」は、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ鎖の切断（一本鎖および二本鎖）、ならびに核および核小体のヘテロクロマチン崩壊をまとめて網羅する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】欧州特許第０４８５５７８号明細書
【特許文献２】国際公開第２００７／０９９２２７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００９／１０６７６７号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓｏｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４６，７２２−７３４
【非特許文献２】Ｃａｎｕｇｏｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，１２，５７８−５８７
【非特許文献３】Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎｅｕｒｏｎ  ８３，２６６−２８２
【非特許文献４】Ａｎｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１，２５，５４４６−５４
【非特許文献５】Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｔｓａｉ，２００９，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  ＡＣＡＤ  Ｓｃｉ．，１１７０，６７４−９
【非特許文献６】Ｐｉｚａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．，４３，９８５−９９４
【非特許文献７】Ｓｐａｔａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．６５，９０−１０４
【非特許文献８】Ｊｏｙｎｅｒ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １２，１５−２０
【非特許文献９】Ａｌｂｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，３２２９−３２３６
【非特許文献１０】Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２７８，５２
【非特許文献１１】Ａｂｓｔｒａｃｔ，  Ｂｒｕｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３８  ：９４−９８，２００５
【非特許文献１２】Ａｌｖａｒｅｚ−Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １４：１２６０−１２６６，２０１１
【非特許文献１３】Ｓｔｅｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２
【非特許文献１４】Ｓｉｍｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ  １２，２７３５−２７４７
【非特許文献１５】Ａｃａｍｐｏｒａ  ｅｔ  ａｌ，１９９５；Ｓｉｍｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，２００２
【非特許文献１６】Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１３
【非特許文献１７】Ｔｏｒｅｒｏ  Ｉｂａｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明は、ＤＮＡ損傷および／または細胞老化の処置または予防のための少なくとも１つのホメオタンパク質、またはそのペプチド誘導体の使用に関する。本発明はさらに、ＤＮＡ損傷および／または細胞老化に関連する症状の処置または予防のための、より詳細には、ＤＮＡ損傷関連疾患または障害、および加齢に関連する疾患または障害の予防および／または処置のための少なくとも１つのホメオタンパク質、またはそのペプチド誘導体の使用に関する。
【００１６】
これ以外にも、本発明は、ＤＮＡ損傷および／または細胞老化の処置または予防のための、そしてＤＮＡ損傷および／または細胞老化に関連する症状の処置または予防のための、より詳細には、ＤＮＡ損傷関連疾患または障害、および加齢に関連する疾患または障害の予防および／または処置のための前記タンパク質またはペプチドをコードする組換えベクターの使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書中で用いられる用語「ホメオタンパク質」および「ホメオドメインタンパク質」は、同義語であり、当該技術においてこれらの名称で一般的に知られている遺伝子産物、タンパク質、およびポリペプチドを指す。当該用語は、見出される場合には、あらゆる生物、特に動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは、ヒト以外の哺乳動物を含む哺乳動物、さらにより好ましくはヒトの遺伝子産物、タンパク質、およびポリペプチドを包含する。より詳細には、「ホメオタンパク質」は、ホメオドメインを含むタンパク質に関する。ホメオタンパク質として、天然ホメオタンパク質および組換えホメオタンパク質、または合成ホメオタンパク質が挙げられる。
【００１８】
本発明は、天然のホメオタンパク質（対立遺伝子体を含む）、ならびにその天然に存在しない変異体、合成ホメオタンパク質、断片、ならびにホメオタンパク質、その断片または変異体の全てまたは一部を含む融合タンパク質を包含する。好ましくは、本発明のホメオタンパク質は、完全長のホメオドメインを含む。特定の実施形態によれば、本発明によるホメオタンパク質は、転写リプレッサドメインに融合した単離ホメオドメイン（融合タンパク質）を、または場合によってはアクチベータドメインに融合した単離ホメオドメインを含む。リプレッサドメインまたはアクチベータドメインは、ホメオドメインと同じタンパク質、ホメオタンパク質ファミリの別のタンパク質、またはホメオタンパク質ファミリに由来しないタンパク質に由来してよい。融合タンパク質は、完全長のホメオタンパク質とは異なる。
【００１９】
集団中に存在し得るホメオタンパク質実体の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者であれば、変化（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸の１つまたは複数の欠失、付加、および／もしくは置換）が、ランダムな突然変異誘発、または標的突然変異誘発をもたらす古典的技術または組換え技術を用いて、突然変異によって導入され得ることをさらに認識するであろう。本発明での使用に適した変異体は、好ましくは、対応する天然のホメオタンパク質のアミノ酸配列との相同性の程度が高いアミノ酸配列がある。一実施形態において、本発明で用いられる変異型ホメオタンパク質のアミノ酸配列は、対応する天然の配列と少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％、さらにより好ましくは少なくとも約９９％同一である。
【００２０】
アミノ酸（または核酸）配列間の同一性パーセントは、当業者に知られている標準的な方法を用いて判定され得る。例えば、２つのアミノ酸配列間の相同性のパーセンテージを判定するために、配列は、最適な比較のためにアラインされる。次いで、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基が比較される。最適なアラインメントのために、アミノ酸配列の一方または双方にギャップが導入され得、そして比較のために、非相同配列が無視され得る。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占有されている場合、これらの配列はその位置にて同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、最適なアラインメントのために導入されるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較、ならびに同一性パーセントおよび類似性パーセントは、数学的アルゴリズムを用いて判定され得る。
【００２１】
本発明での使用に適したホメオタンパク質変異体は、対応する天然ホメオタンパク質に関して、生物学的に活性であり、かつ本明細書中に記載される活性の少なくとも１つを保持する。天然のホメオタンパク質の所与の機能が、例えば生物学的活性の低下を示す変異体により、ある程度正または負に影響され得るが、好ましくは、ＤＮＡ損傷および／またはクロマチン変化に及ぶ作用は、保存されている。所与の機能に必須であるアミノ酸が、当該技術において知られている方法によって、例えば部位特異的突然変異誘発によって、同定され得る。例えば、機能的変異体の一クラスにおいて、１つまたは複数のアミノ酸残基が、保存的に置換される。「保存的アミノ酸置換」は、天然のポリペプチド中のアミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリが、当該技術において定義されている。典型的には、置換基が、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒ；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ；アミド残基ＡｓｎおよびＧｉｎ；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ；または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの中で互いに存在する場合、置換が保存的であるとみなされる。
【００２２】
本発明に従って用いられるタンパク質は、当業者に知られている従来の技術によって、特に、適切な細胞系（真核生物または原核生物）での組換えＤＮＡの発現によって、または固相合成もしくは液相合成によって、調製され得る。より詳細には、タンパク質およびその誘導体は、通常、当該タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡポリヌクレオチドから生産されて、当業者に知られているあらゆる手段（ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによる核酸配列の増幅、相同プローブとのハイブリダイゼーションによるゲノムＤＮＡライブラリのスクリーニング、または全体的もしくは部分的化学合成が挙げられる）によって、得られる。組換えベクターは、当該技術において知られている従来の組換えＤＮＡ技術および遺伝子工学技術によって構築されて、宿主細胞中に導入される。ＤＮＡポリヌクレオチドは、真核生物または原核生物の発現ベクター中にクローニングされ、そして、組換えベクターにより改変された細胞内で産生されたタンパク質は、あらゆる適切な手段によって、特にアフィニティクロマトグラフィによって精製される。ペプチドおよびその誘導体は、通常、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９６４，８５：２１４９−２１５４）によって最初に記載されたＦｍｏｃ技術に従って固相合成されて、逆相高速液体クロマトグラフィによって精製される。
【００２３】
より好ましい実施形態によれば、当該用語は、以下のアミノ酸配列（ホメオドメイン）を含むタンパク質およびポリペプチドを示す：
ＲＲＲＫＲＴＡ−ＹＴＲＹＱＬＬＥ−ＬＥＫＥＦＬＦ−ＮＲＹＬＴＲＲＲＲＩ  ＥＬＡＨＳＬ−ＮＬＴＥＲＨＩ  ＫＩＷＦＱＮ−ＲＲＭ  Ｋ−ＷＫＫＥＮ
［典型的な挿入部位が、ダッシュと共に示される］（配列番号１）（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅｏｂｏｘ．ｂｉｏｓｃｉ．ｋｉ．ｓｅ／参照）。
【００２４】
本発明に用いられ得るホメオタンパク質の非限定的な例として、成体ニューロンの異なるサブセットにおいて発現される全てのホメオタンパク質、例えば、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１またはＥｎｇｒａｉｌｅｄ−２）、ビコイドファミリ、特にＯｔｘ２のようなＯｔｘサブファミリ由来のホメオタンパク質、ｐａｉｒｅｄファミリ（Ｐａｘ）、Ｌｈｘファミリ由来のタンパク質、例えばＬｈｘ９、およびＧｂｘ２が挙げられる。
【００２５】
ホメオタンパク質の遺伝子配列および推定されるアミノ酸配列が、当該技術において周知であり、配列データベース内で入手可能である。
【００２６】
例示的なＥｎ１／２タンパク質またはポリペプチドとして、マウスＥｎ１／２タンパク質、または一次アミノ酸配列（配列番号２）：ｍｕｓＥｎ１：ＮＰ＿０３４２６３（４０１ａａ）
ＭＥＥＱＱＰＥＰＫＳＱＲＤＳＧＬＧＡＶＡＡＡＡＰＳＧＬＳＬＳＬＳＰＧＡＳＧＳＳＧＳＤＧＤＳＶＰＶＳＰＱＰＡＰＰＳＰＰＡＡＰＣＬＰ  ＰＬＡＨＨＰＨＬＰＰＨＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＱＨＬＡＡＰＡＨＱＰＱＰＡＡＱＬＨＲＴＴＮ  ＦＦＩＤＮ  ＩＬＲＰＤＦＧＣＫＫＥＱＰＬＰ  ＱＬＬＶＡＳＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＳＲＶＥＲＤＲＧＱＴＧＡＧＲＤＰＶＨＳＬＧＴＲＡＳＧＡＡＳＬＬＣＡＰＤＡＮＣＧＰＰＤＧＳ  ＱＰＡＴＡＶＧＡＧＡＳＫＡＧＮＰＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＶＡＡＡＡＡＡＡＳＫＰＳＤＳＧＧＧＳＧＧＮＡＧＳＰＧＡＱＧＡ  ＫＦＰＥＨＮＰＡＩ  ＬＬＭＧＳＡＮＧＧＰＶＶＫＴＤＳＱＱＰＬＶＷＰＡＷＶＹＣＴＲＹＳＤＲＰＳＳＧＰＲＴＲＫＬＫＫＫＫＮＥＫＥＤＫ  ＲＰＲＴＡＦＴＡＥＱＬＱＲＬＫＡＥＦＱＡＮＲＹＩＴＥＱＲＲＱＴＬＡＱＥＬＳＬＮＥＳＱＩ  ＫＩＷＦＱＮ  ＫＲＡＫＩＫＫＡＴＧＩ  ＫＮＧＬＡＬ  Ｈ  ＬＭ  ＡＱＧ  ＬＹ  Ｎ  Ｈ  ＳＴＴＴＶＱＤ  ＫＤ  ＥＳ  Ｅ
を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
例示的なＧｂｘ２タンパク質またはポリペプチドとして、マウスＧｂｘ２タンパク質、または一次アミノ酸配列（配列番号３）：ｍｕｓＧｂｘ２：ＮＰ＿０３４３９２（最長変異体、３４８ａａ）
ＭＳＡＡＦＰＰＳＬＭＭ  ＭＱＲＰＬＧＳＳＴＡＦＳＩ  ＤＳＬＩＧＳＰＰＱＰＳＰＧＨＦＶＹＴＧＹＰＭ  ＦＭ  ＰＹＲＰＷＬＰＰＰＰＰＰＰＰ  ＡＬＰＱＡＡＬＱＰＡＬＰＰＡＨＰＨＨＱＩ  ＰＳＬＰＴＧＦＣＳＳＬＡＱＧＭＡＬＴＳＴＬＭＡＴＬＰＧＧＦＳＡＳＰＱＨＱＥＡＡＡＡＲＫ  ＦＡＰＱＰＬＰＧＧＧＮ  ＦＤＫＡＥＡＬＱＡＤＡＥＤＧＫＡＦＬＡＫＥＧＳＬＬＡＦＳＡＡＥＡＶＱＡＳＬＶＧＡＶＲＧＱＧＫＤＥＳＫＶＥ  ＤＤＰＫＧＫＥＥＳＦＳＬＥＳＤＶＤＹＳＳＤＤＮＬＰＧＱＴＡＨＫＥＥＤＰＧＨＡＬＥＥＴＰＱＳＧＧＡＡＧＳＴＴＳＴＧＫＮＲＲＲＲＴＡ  ＦＴＳＥＱＬＬＥＬＥＫＥＦＨＣＫＫＹＬＳＬＴＥＲＳＱＩＡＨＡＬＫＬＳＥＶＱＶＫＩＷＦＱＮＲＲＡＫＷＫＲＶＫＡＧＮＡＮＳＫＴＧＥＰＳ  ＲＮＰＫＩＷＰＩ  ＰＶＨＶＳＲＦＡＩ  ＲＳＱＨＱＱＬＥＱＡＲＰ
を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
例示的なＬｈｘ９タンパク質またはポリペプチドとして、マウスＬｈｘ９タンパク質、または一次アミノ酸配列（配列番号４）：ｍｕｓＬｈｘ９：ＮＰ＿００１０３６０４２（最長変異型、３９７ａａ）
ＭＥＩＶＧＣＲＡＥＮＮＳＣＰＦＲＰＰＡＭＬＦＨＧＩＳＧＧＨＩＱＧＩＭＥＥＭＥＲＲＳＫＴＥＡＲＬＴＫＧＴＱＬＮＧＲＤＡＧＭＰＰＬ  ＳＰＥＫＰＡＬＣＡＧＣＧＧＫＩＳＤＲＹＹＬＬＡＶＤＫＱＷＨＬＲＣＬＫＣＣＥＣＫＬＡＬＥＳＥＬＴＣＦＡＫＤＧＳＩＹＣＫＥＤＹＹＲＲＦＳ  ＶＱＲＣＡＲＣＨＬＧＩＳＡＳＥＭＶＭＲＡＲＤＳＶＹＨＬＳＣＦＴＣＳＴＣＮＫＴＬＴＴＧＤＨＦＧＭＫＤＳＬＶＹＣＲＡＨＦＥＴＬＬＱ  ＧＥＹＰＰＱＬＳＹＴＥＬＡＡＫＳＧＧＬＡＬＰＹＦＮＧＴＧＴＶＱＫＧＲＰＲＫＲＫＳＰＡＬＧＶＤＩＶＮＹＮＳＧＣＮＥＮＥＡＤＨＬＤＲ  ＤＱＱＰＹＰＰＳＱＫＴＫＲＭＲＴＳＦＫＨＨＱＬＲＴＭＫＳＹＦＡＩＮＨＮＰＤＡＫＤＬＫ
を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
例示的なＥｎ１タンパク質またはポリペプチドとして、ヒトＥＮ１タンパク質、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ  ５３５０２．２もしくはＮＣＢＩ  ＮＰ＿００１４１７．３の注釈が付いた一次アミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
例示的なＥｎ２タンパク質またはポリペプチドとして、ヒトＥＮ２タンパク質、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ  ５３５０４．２もしくはＮＣＢＩ  ＮＰ＿００１４１８．２の注釈が付いた一次アミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
例示的なＧｂｘ２タンパク質またはポリペプチドとして、ヒトＧｂｘ２タンパク質、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＡＷ７１０８４．１の注釈が付いた一次アミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
例示的なＬｈｘ９タンパク質またはポリペプチドとして、ヒトＬｈｘ９タンパク質、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０１４４３４．１もしくはＮＰ＿０６４５８９．２の注釈が付いた一次アミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ホメオタンパク質は、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１またはＥｎｇｒａｉｌｅｄ−２）、またはその、リプレッサドメインもしくはアクチベータドメインに融合されたホメオドメインを含む融合タンパク質である。融合ドメインは、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質、または別のタンパク質、例えば先で定義されたホメオタンパク質由来であってもよい。Ｅｎｇｒａｉｌｅｄリプレッサドメインは、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１アミノ酸配列の１位〜２９８位に位置するドメイン、またはそのサブドメイン、例えばｅｈ１ドメイン（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２アミノ酸配列の４６位〜６７位）であってもよい。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、前記ホメオタンパク質は、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１またはＥｎｇｒａｉｌｅｄ−２）、およびビコイドファミリのホメオタンパク質とは異なる。本発明の別の好ましい実施形態によれば、前記ホメオタンパク質は、先で定義された、リプレッサドメインに融合されたホメオドメインを含む融合タンパク質である。
【００３５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、前記ホメオタンパク質は、脊椎動物のホメオタンパク質である。
【００３６】
本発明に従って用いられるホメオタンパク質または関連するコーディング核酸配列は、ＤＮＡ損傷、特にＤＮＡ鎖切断、特にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）、形成およびクロマチンリモデリング、特にクロマチン弛緩、とりわけ、ストレス因子または加齢によって誘導されるものから、細胞をインビボで保護することができる。ストレス因子は、特に、酸化ストレスまたは興奮毒性ストレスを指す。
【００３７】
ＤＮＡ損傷に対するホメオタンパク質の作用は、ニューロンまたは特定のタイプのニューロン（例えば、中脳ＤＡニューロンまたはＲＧＣ）に制限されないので、例えば運動ニューロン、線維芽細胞、上皮細胞といった他のタイプの細胞に利用され得る。
【００３８】
本明細書中で用いられる用語「ＤＮＡ損傷関連障害」は、神経変性障害および神経変性疾患、例えば癌、老化、および、酸化ストレス、発癌物質、毒素、フリーラジカル（酸素ラジカル等）、またはＤＮＡ損傷放射線（電離放射線およびＵＶ放射線等）への曝露に起因する、ＤＮＡへの損傷によって引き起こされる他の障害を含む。本発明の実施には機構の理解は必要とされないが、本発明に従うホメオタンパク質の投与は、ＤＮＡ損傷を防止し、ＤＮＡ損傷の影響を阻害し、ＤＮＡ鎖の切断数を減少させ、かつ／またはＤＮＡ損傷に対する細胞の修復応答を刺激すると考えられる。
【００３９】
特別な実施形態によれば、ＤＮＡ損傷は、ＤＮＡ鎖切断またはＤＮＡの化学修飾（例えばアルキル化）等の染色体機能不全の形態をとり得る。好ましい実施形態によれば、ＤＮＡ損傷は、一本鎖切断および二本鎖切断が挙げられるＤＮＡ鎖切断、好ましくは二本鎖切断を意味する。
【００４０】
好ましい実施形態によれば、用語「ＤＮＡ損傷関連障害」は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、およびパーキンソン病と一緒に、運動失調症が挙げられる、神経変性状態に関する。しかしながら、重要な病理学的特徴は、ＤＮＡ損傷である。ゆえに、ＤＮＡ損傷を抑制もしくは制限し、かつ／またはＤＮＡ鎖の切断量を減少させることで、ニューロン細胞死を減少させ、かつ／またはＤＮＡ損傷に関連する神経障害を処置／予防する方法が提供される。
【００４１】
したがって、特別な実施形態によれば、本発明は、ニューロン細胞におけるＤＮＡ損傷の抑制用の医薬の製造、およびＤＮＡ損傷に関連する神経学的障害の処置のための、少なくとも１つのホメオタンパク質もしくはそのペプチド誘導体、または前記タンパク質／ペプチドをコードする組換えベクターの使用に関する。本発明はさらに、ＤＮＡ損傷に関連する神経障害の処置の前記方法に関する。
【００４２】
本発明の別の特別な実施形態によれば、前記変性疾患は、神経変性疾患、特にパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、および眼または耳（すなわち、視覚または聴覚）に影響を及ぼす変性疾患、例えば緑内障である。好ましい実施形態において、前記神経変性障害はパーキンソン病である。
【００４３】
本発明の別の特別な実施形態によれば、前記変性疾患は、特定のあらゆるタイプのニューロンの喪失と関連せず、またはこれに起因しない。例えば、前記変性疾患は、筋ジストロフィまたは早老症からなる群から選択され得る。
【００４４】
別の好ましい実施形態によれば、用語「加齢に関連する疾患または障害」は、例えば、腎機能障害、後弯症、椎間板ヘルニア、虚弱、脱毛、難聴、視力喪失（失明または視力障害）、筋肉疲労、皮膚疾患、皮膚母斑、糖尿病、メタボリックシンドローム、およびサルコペニアを含む。視力喪失は、対象に以前に視力があった場合の、視力の欠如を指す。視力の程度、および視力に基づく視力の喪失を記載するための、様々な尺度が開発されている。また、加齢に関連する疾患および症状として、例えば、以下に限定されないが、以下の症状のうちの１つまたは複数を処置する皮膚疾患が挙げられる：しわ（表面の細かいしわが挙げられる）；色素沈着過剰；瘢痕；ケロイド；皮膚炎；乾癬；湿疹（脂漏性湿疹が挙げられる）；酒さ；白斑；尋常性魚鱗癬；皮膚筋炎；光線性角化症。
【００４５】
別の特別な実施形態によれば、本発明は、細胞、より詳細には神経細胞中のＤＮＡ鎖の切断量を減少させる医薬の製造のための、少なくとも１つのホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体の使用に関する。
【００４６】
別の特別な実施形態によれば、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾患または障害、および加齢に関連する疾患または障害の処置および／または予防用の医薬の製造のための、ホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体の使用に関し、前記ホメオタンパク質はＥｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質であり、ＤＮＡ損傷に関連する前記疾患または前記障害はパーキンソン病である。
【００４７】
別の特別な実施形態によれば、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾患または障害、および加齢に関連する疾患または障害の処置および／または予防用の医薬の製造のための、ホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体の使用に関し、前記ホメオタンパク質はＥｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質であり、ＤＮＡ損傷に関連する前記疾患または前記障害は筋萎縮性側索硬化症である。
【００４８】
別の特別な実施形態によれば、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾患または障害、および加齢に関連する疾患または障害の処置および／または予防用の医薬の製造のための、ホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体の使用に関し、前記ホメオタンパク質はＧｂｘ２タンパク質であり、ＤＮＡ損傷に関連する前記疾患または前記障害はハンチントン病である。
【００４９】
別の特別な実施形態によれば、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾患または障害、および加齢に関連する疾患または障害の処置および／または予防用の医薬の製造のための、ホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体の使用に関し、前記ホメオタンパク質はＧｂｘ２タンパク質であり、ＤＮＡ損傷に関連する前記疾患または前記障害はパーキンソン病である。
【００５０】
別の特別な実施形態によれば、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾患または障害、および加齢に関連する疾患または障害の処置および／または予防用の医薬の製造のための、ホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体の使用に関し、前記ホメオタンパク質はＬｈｘ９タンパク質であり、ＤＮＡ損傷に関連する前記疾患または前記障害はハンチントン病である。
【００５１】
別の特別な実施形態によれば、本発明は、ＤＮＡ損傷に関連する疾患または障害、および加齢に関連する疾患または障害の処置および／または予防用の医薬の製造のための、ホメオタンパク質またはそのペプチド誘導体の使用に関し、前記ホメオタンパク質はＬｈｘ９タンパク質であり、ＤＮＡ損傷に関連する前記疾患または前記障害はパーキンソン病である。
【００５２】
これ以外にも、本発明は、タンパク質またはペプチドそれ自体ではなく、前記ホメオタンパク質をコードする組換えベクターの使用に関する。本明細書中で用いられる用語「ベクター」は、宿主細胞または宿主生物内の１つまたは複数の核酸分子の送達、増殖、および／または発現を可能にするのに必須の要素を含有するビヒクル、好ましくは核酸分子またはウイルス粒子を指す。当該用語は、種々の宿主細胞または宿主生物（発現ベクター）における維持用ベクター（クローニングベクター）または発現用ベクター、染色体外ベクター（例えば多コピープラスミド）または組込み型ベクター（例えば、宿主細胞ゲノム中に組み込まれて、宿主細胞が複製する場合に核酸分子の更なるコピーを生成するように設計されている）、ならびにシャトルベクター（例えば、原核宿主および／または真核宿主の双方で機能する）およびトランスファベクター（例えば、ウイルスゲノム中に核酸分子を移す用）を含む。本発明の目的のために、ベクターは、天然に存在する遺伝子源のものであってもよいし、合成または人工の遺伝的要素のものであってもよいし、天然および人工の遺伝的要素の一部の組合せのものであってもよい。
【００５３】
本発明の文脈において、用語「ベクター」は、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むと広く理解されるべきである。本明細書中で用いられる「プラスミドベクター」は、複製可能なＤＮＡ構築物を指す。通常、プラスミドベクターは、プラスミドベクターを有する宿主細胞が、対応する選択的薬物の存在下で、これについて、またはこれに対して選択されることを可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。多様なポジティブ選択マーカー遺伝子およびネガティブ選択マーカー遺伝子が、当該技術において知られている。実例として、抗生物質耐性遺伝子が、対応する抗生物質の存在下で、宿主細胞が選択されることを可能にするポジティブ選択マーカー遺伝子として用いられ得る。本明細書中で用いられる用語「ウイルスベクター」は、ウイルスゲノムの少なくとも１つの要素を含んで、ウイルス粒子中に、またはウイルス粒子にパッケージングされ得る核酸ベクターを指す。用語「ウイルス」、「ビリオン」、「ウイルス粒子」、および「ウイルスベクター粒子」は、適切な細胞または細胞株中に核酸ベクターが導入された場合に、感染性ウイルス粒子の生成を可能にするのに適した条件に従って形成されるウイルス粒子を指すのに、互換的に用いられる。本発明の文脈において、用語「ウイルスベクター」は、核酸ベクター（例えばＤＮＡウイルスベクター）およびその生じたウイルス粒子を含むと広く理解されるべきである。用語「感染性」は、ウイルスベクターが宿主細胞または生物中に侵入してこれらに感染する能力を指す。ウイルスベクターは、複製可能型または複製選択型であってもよいし（例えば、特定の宿主細胞においてより良好に、または選択的に複製するように操作されている）、複製欠陥または複製障害があるように遺伝的に無能にされていてもよい。本発明の文脈において適切なベクターとして、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ））等の原核宿主細胞における発現用のバクテリオファージベクター、プラスミドベクター、またはコスミドベクター；酵母（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））における発現用のベクター；昆虫細胞系（例えばＳｆ９細胞）における発現用のバキュロウイルスベクター；植物細胞系における発現用のウイルスベクターおよびプラスミドベクター（例えば、Ｔｉプラスミド、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）；ならびに高等真核細胞または高等生物における発現用のウイルスベクターおよびプラスミドベクターが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、そのようなベクターは、市販されており（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａその他）、もしくは寄託機関（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．））から入手可能であり、または当業者が利用可能な、そのようなベクターの配列、��織、および生産方法を記載する多数の刊行物の対象となってきた。適切なプラスミドベクターの代表例として、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐｇＷｉｚ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。適切なウイルスベクターの代表例が、種々の異なるウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルス、アルファウイルス、水疱性口内炎ウイルスその他）から生成される。先に記載される用語「ウイルスベクター」は、ベクターＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および生じたそれらのウイルス粒子を包含する。本発明はまた、脂質またはポリマーに複合化されて、粒子構造（例えば、リポソーム、リポプレックス、またはナノ粒子）を形成するベクター（例えばプラスミドＤＮＡ）を包含する。本発明によれば、本発明のベクター内に含まれる核酸分子は、宿主細胞または生物における発現に適した形態にあり、これは、核酸分子が、適切な調節配列の制御下に置かれていることを意味する。本明細書中で用いられる用語「調節エレメント」は、核酸またはその誘導体（すなわちｍＲＮＡ）の複製、転写、スプライシング、翻訳、安定性、および／または輸送が挙げられる、所与の宿主細胞または宿主生物における核酸分子の発現を可能にし、これに寄与し、またはこれを調節するあらゆる要素を指す。当業者であれば、調節配列の選択は、ベクターそれ自体、宿主細胞、所望される発現レベルその他の要因によって決まり得ることを当然理解するであろう。哺乳動物細胞における構成的発現に適したプロモータとして、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモータ、ＲＳＶプロモータ、アデノウイルス主要後期プロモータ、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ、およびＴ７ポリメラーゼプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、本発明の核酸分子の発現を制御する調節エレメントはさらに、転写の適切な開始、調節、および／または終結（例えばポリＡ転写終結配列）、ｍＲＮＡ輸送（例えば核局在化シグナル配列）、プロセシング（例えばスプライシングシグナル）、安定性（例えば、イントロン、ならびに非コーディング５’配列および非コーディング３’配列）、宿主細胞または宿主生物での翻訳（例えば、開始Ｍｅｔ、三部分リーダー配列、ＩＲＥＳリボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列その他）、ならびに精製工程（例えばタグ）のための更なる要素を含んでよいことを当然理解するであろう。
【００５４】
別の態様において、本発明は、対象におけるＤＮＡ損傷関連障害を処置する方法を提供し、当該方法は、必要な対象に、少なくとも１つのホメオタンパク質もしくはそのペプチド誘導体、または前記タンパク質をコードする組換えベクター、および薬学的に許容可能なビヒクルを含む組成物を投与することを含む。
【００５５】
本明細書中で用いられる「薬学的に許容可能なビヒクル」は、薬学的投与に適合する担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、吸収遅延剤、ならびに類似物のいずれかおよび全てを含むことが意図される。
【００５６】
本発明の組成物は、適切には、生理学的ｐＨ、またはわずかに塩基性のｐＨ（例えば、約ｐＨ７〜約ｐＨ９）でのヒトの使用に適切であるように、緩衝化される。適切なバッファとして、リン酸バッファ（例えばＰＢＳ）、重炭酸バッファ、ＨＥＰＥＳバッファおよびＰＩＰＥＳバッファ、ならびに／またはＴｒｉｓバッファが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物はさらに、ヒトまたは動物の使用に適した希釈剤を含んでもよい。希釈剤は好ましくは、等張性、低張性、または弱い高張性であり、そしてイオン強度が比較的低い。代表的な例として、滅菌水、生理食塩水（例えば塩化ナトリウム）、リンガー溶液、グルコース、トレハロース溶液またはサッカロース溶液、ハンク溶液、および他の生理学的に平衡化された塩水溶液が挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓの最新の版参照）。本発明の組成物に含まれる薬学的に許容可能なビヒクルはまた、製造条件下での、そして、凍結温度（例えば、−７０℃、−２０℃）、冷蔵温度（例えば４℃）、または周囲温度での長期保存（すなわち、少なくとも１ヶ月、好ましくは少なくとも１年間）条件下での安定性の保持を可能としなければならない。所望の特性を与える（例えば、製剤のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度を修飾または維持し、ヒトまたは動物の生体中への放出または吸収を修飾または維持し、特定の器官（例えば脳）における血液関門を越える輸送または貫通を促進することが挙げられる）ための、更なる薬学的に許容可能な賦形剤が用いられてもよい。
【００５７】
本明細書中に記載されるホメオタンパク質のいずれか１つを含む組成物が、持続放出または徐放（時限放出または制御放出とも呼ばれる）されるように製剤化されてもよい。そのような組成物は、一般に、周知の技術を用いて調製され得、そして例えば、経口、直腸、皮内、鼻腔内、もしくは皮下移植によって、または所望の標的部位への移植によって、投与され得る。持続放出性製剤は、担体マトリックス中に分散した化合物、および／または速度制御膜で囲まれたリザーバ内に含有された化合物を含有してよい。
【００５８】
組成物は、有利には、少なくとももう１つの医薬品、例えば、成長因子、複合糖（グリコサミノグリカン、ポリシアル酸）、サーチュインもしくはサーチュイン活性化剤、抗コリンエステラーゼ、または逆転写酵素インヒビタ、特にヌクレオシド転写酵素インヒビタを含み得る。
【００５９】
これ以外にも、本発明は、癌処置を受けている対象においてＤＮＡ損傷関連障害を処置または予防する方法に関する。
【００６０】
本発明はさらに、ＤＮＡ損傷応答経路、またはクロマチン変化を処置または予防する方法に関する。
【００６１】
本発明はさらに、日光への曝露またはＤＮＡを損傷させる化学物質への曝露に応じたＤＮＡ損傷を処置または予防する方法に関する。本発明に従う前記方法は、皮膚老化を軽減し、皮膚癌を予防し、かつ美容的外見を向上させることができる。
【００６２】
本発明はさらに、細胞老化の影響の予防または軽減を必要とする対象に、これを実行する方法であって、予防または軽減を必要とする対象に、少なくとも１つの有効量のホメオタンパク質もしくはそのペプチド誘導体、または前記タンパク質をコードする組換えベクターを投与することを含む方法に関する。本発明に従うホメオタンパク質はまた、自然な加齢過程の一部として生じる、または対象が誘引剤もしくは誘引因子（例えば、放射線照射、化学療法、タバコ喫煙、高脂肪食／高糖食、他の環境因子）に曝露されている場合に生じる「加齢に関連する疾患および障害」または「老化」の処置または予防（すなわち、発生の可能性の低減）に有用であり得る。
【００６３】
医学分野の当業者によって理解される用語「処置する」および「処置」は、対象（すなわち患者）の疾患、障害、または症状の医学的管理を指す。一般に、適切な投与レジメンおよび処置レジメンは、治療的利益および／または予防的利益を提供するのに十分な量のホメオタンパク質を提供する。本明細書中に記載されるホメオタンパク質が投与される対象にとっての治療的利益として、例えば、臨床転帰の向上が挙げられ、目的は、前記疾患に関連する不所望の生理学的変化を予防し、もしくは遅らせること、またはそのような疾患の拡大もしくは重症化を予防し、もしくは遅らせることである。本明細書で議論されるように、１つまたは複数のホメオタンパク質の有効性として、以下に限定されないが、処置されるべき疾患に由来し、もしくはこれに関連する症候の減退、軽減、もしくは緩和を含む有益な、もしくは所望の臨床結果；  症候の発症の低減；生活の質の改善；より長い無病状態（すなわち、疾患の診断に基づいた、対象が症候を示すであろう可能性または傾向の縮小）；疾患範囲の縮小；疾患状態の安定化（すなわち、悪化させない）；疾患の進行の遅延または緩徐化；疾患状態の緩和または軽減；および、検出可能か検出不能かに拘らない、寛解（部分的寛解か全体的寛解かに拘らない）；ならびに／または全生存期間が挙げられ得る。本明細書中に記載されるホメオタンパク質の有効性はまた、対象が本発明に従うホメオタンパク質を受けていない場合に予想される細胞生存と比較した、より詳細にはニューロンの、細胞生存の延長を意味し得る。
【００６４】
処置を必要とする対象として、既に疾患または障害に苦しんでいる対象、ならびに疾患または障害を発症しやすい、または発症するリスクのある対象、および疾患、症状、または障害が予防的に処置されるべき対象が挙げられる。対象は、本発明の方法から恩恵を受けることとなる、疾患または障害を発症する素因があってもよいし、特定の年齢であってもよく、本発明の方法を受けることで、ＤＮＡ損傷関連疾患もしくは障害、および／または加齢に関連する疾患もしくは障害が挙げられる疾患の発症を遅延させ、または当該疾患の重篤度を引き下げる臨床的利益が得られるであろう。
【００６５】
ＤＮＡ損傷に関連する疾患もしくは障害、および／または加齢に関連する疾患もしくは障害を処置するための、本発明に従うホメオタンパク質の用量は、対象の状態、すなわち疾患のステージ、疾患によって引き起こされる症候の重篤度、全体的健康状態、ならびに年齢、性別、および体重、ならびに医学分野の当業者に明らかな他の要因によって決まり得る。薬学的組成物は、医学分野の当業者によって決定される、処置されるべき疾患にとって適切な方法で、投与されてよい。ＤＮＡ損傷に関連する疾患もしくは障害、および／または加齢に関連する疾患もしくは障害を処置するためのホメオタンパク質の使用に関連する、本明細書に、そして先に記載される要因に加えて、ホメオタンパク質の適切な投与期間および投与頻度もまた、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度、有効成分の特定の形態、および投与の方法等の要因によって決定され得、または調整され得る。ホメオタンパク質の最適用量が、一般に、実験モデルおよび／または臨床試験を用いて決定され得る。最適用量は、対象のボディマス、体重、または血液量によって決まり得る。効果的な治療を実現するのに十分な最小用量の使用が通常好ましい。本明細書中に記載されるホメオタンパク質の前臨床研究および臨床研究の設計および実施（予防的利益を得るための投与の時期が挙げられる）は、十分に、当業者の技術の範囲内である。２つ以上のホメオタンパク質が投与される場合、各ホメオタンパク質の最適な用量は、いずれかの薬剤が単独の薬剤療法として単独で投与される場合とは異なってよく、例えばその場合よりも少ない。典型的には、前記ホメオタンパク質は、０．００１〜１００μＭ、より好ましくは０．００５〜１００μＭ、有利には０．００５〜１０μＭ、特に有利には０．００１〜０．１０μＭに及ぶ濃度にて用いられてよい。１日に投与されてよいホメオタンパク質の量は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、約５０〜１００ｍｇ／ｋｇ）であってよい。他の実施形態において、１日に投与されてよいホメオタンパク質の量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、または約５００〜１０００ｍｇ／ｋｇである。脳内注射について、ホメオタンパク質は、Ｒｅｋａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）に記載されるように、特にＥｎｇｒａｉｌｅｄについて、１０ｐｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、例えば２５ｐｍｏｌで構成される用量にて投与されてよい。別の実施形態において、ホメオタンパク質は、特にＯｔｘ２について、眼内注射によって投与されてよい。
【００６６】
最適な用量（１日あたり、または１処置コースあたり）は、処置されることになる、ＤＮＡ損傷に関連する疾患もしくは障害、および／または加齢に関連する疾患もしくは障害について異なり得、そして投与経路および／または治療剤レジメンによって異なり得る。
【００６７】
医薬組成物は、経口経路、非経口経路、および局所経路が挙げられるが、これらに限定されないいくつかの経路による投与用に、製剤化される。薬学的に許容可能な担体として、従来用いられている担体がある。
【００６８】
医薬組成物は、それを必要とする対象に、当業者に知られているいくつかの経路のいずれか１つによって送達され得る。非限定的な例として、組成物は、経口的に、静脈内に、腹腔内に、注入（例えばボーラス注入）によって、皮下に、経腸で、直腸に、鼻腔内に、吸入によって、口腔内に、舌下に、筋肉内に、経皮で、皮内に、局所的に、眼内に、膣に、直腸に、もしくは頭蓋内注射によって、またはそれらのあらゆる組合せによって、送達され得る。特定の実施形態において、先に記載される用量の投与は、静脈内、腹腔内を介して、標的組織もしくは標的器官中に直接的に、または皮下経路を介して、なされる。特定の実施形態において、送達方法として、薬物コーティングステントまたは薬物含浸ステントが挙げられ、薬物は、ホメオタンパク質またはそれをコードする核酸である。
【００６９】
神経変性疾患の処置のために、ホメオタンパク質は、局所的に、特に、標的とされる大脳領域中への注射または注入によって、投与されてよい。ホメオタンパク質はまた、放出制御装置、例えば脳内に移植されたカニューレに連結された浸透圧ミニポンプを用いて、投与されてもよい。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態によれば、ホメオタンパク質は、とりわけパーキンソン病の処置のために、ＳＮｐｃ領域中に直接投与される。特に好ましい実施形態において、この手順によって投与されるホメオタンパク質は、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄである。特に好ましい実施形態において、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄの単回注射が、それを必要とする個体に施される。
【００７１】
ゆえに、特定の実施形態において、本発明は、パーキンソン病の処置のための、医薬品としてのＥｎｇｒａｉｌｅｄの使用に関し、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄは、それを必要とする対象のＳＮｐｃ領域内に一度投与される。
【００７２】
また、ホメオタンパク質の投与は、非薬理学的療法と組み合わされてもよい。例えば、パーキンソン病の処置のために、視床下核刺激と組み合わされてもよい。
【００７３】
特許、刊行物、およびデータベースエントリの、先で引用される開示は全て、そのような個々の特許、刊行物、またはエントリがそれぞれ、具体的かつ個別に示されて、参照によって組み込まれているものとして、それらの全体が参照によって本明細書に具体的に組み込まれる。
【００７４】
先の構成に加えて、本発明はまた、以下の図面を参照して、例示的な実施形態に言及する説明から明らかとなろう、他の構成も含む。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】Ｅｎ１＋／−マウスにおけるＤＮＡ損傷およびヘテロクロマチンマークの発現の変化  （Ａ）ＤＮＡ損傷群、クロマチンリモデリング群、およびアポトーシス群に属するＥｎ１＋／−  ＳＮｐｃ  ＴＨ＋ニューロン中の差次的発現遺伝子を、ｐ値によってランク付けする。  （Ｂ）ｗｔマウスのＳＮｐｃ中のＴＨ＋ニューロンが、γ−Ｈ２ＡＸ染色の単一環を示す；Ｅｎ１＋／−  ＴＨ＋ニューロンが、核内に散存する更なるγ−Ｈ２Ａ病巣を示す。スケールバー、１０μｍ。  （Ｃ）ＳＮｐｃにおいて２つを超えるγ−Ｈ２ＡＸ病巣を有するＴＨ＋ニューロンのパーセンテージは、ｗｔにおける２％から、８週齢のＥｎ１＋／−マウスにおける１６％に増大する（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。Ｅｎ１＋／−マウスおよびｗｔマウスのＶＴＡにおけるＴＨ＋ニューロンのγ−Ｈ２ＡＸ染色は、類似している。各条件で１１０〜１６２個のニューロンを数えた。  （Ｄ）核小体周囲、そして核周囲のＨ３Ｋ２７ｍｅ３染色が、Ｅｎ１＋／−ＳＮｐｃ  ｍＤＡニューロンにおいて減少する。スケールバー、１０μｍ。  （Ｅ）点線に沿って蛍光強度を測定することによって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３核小体周囲染色を定量化する（左）。Ｅｎ１＋／−マウスにおいて高密度染色を有する細胞のパーセンテージは、低下する（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定；ｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウスにおいてそれぞれ１２９および１５９個のニューロンを数えた）（右）。  （Ｆ）Ｅｎ１＋／−  ＴＨ＋ニューロンにおける核周囲Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色が、核ラミナ／核原形質の蛍光強度の低下によって示されるように、減少する（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定；３０および３０個のニューロンを、偽条件および６−ＯＨＤＡ条件において数えた）。  （Ｇ）ＤＡＰＩ高密度領域の表面定量化。頻度分布が、Ｅｎ１＋／−マウスにおいて、より小さなＤＡＰＩ高密度領域へのシフトを示す（ｎ＝１６２〜２１１；Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定；３頭のｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウスを分析した）。図Ｓ１および表Ｓ１も参照。
【図２】６−ＯＨＤＡ注射直後のＳＮｐｃ  ＴＨ＋ニューロン中のＤＮＡ損傷およびクロマチン変化  （Ａ、Ｂ）ｗｔマウスのＳＮｐｃ中に注射した６−ＯＨＤＡは、６時間後に、ＴＨ＋ニューロンの約２５％において、γ−Ｈ２ＡＸ病巣を出現させる（ｎ＝３〜６；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。Ｅｎ１＋／−マウスは、感受性がより高く、ニューロンの５０％が、複数のγ−Ｈ２ＡＸ病巣を示す（ｎ＝３〜６；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定；１３０、２１０、および１４６個のニューロンを、各条件についてそれぞれ数えた）。スケールバー、１０μｍ。６−ＯＨＤＡ注射は、ｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウスにおいてそれぞれ、ＴＨ＋ニューロンの約３０％および６０％の喪失を引き起こす（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。注射してない対側を基準とする。各条件において、１５３４〜２０３４個のニューロンを数えた。  （Ｃ）中脳切片を、γ−Ｈ２ＡＸ、Ｈ３ｋ２７ｍｅ３、およびＴＨについて染色して、共焦点顕微鏡法によって分析した。核小体周囲、そして核周囲のＨ３Ｋ２７ｍｅ３染色が、６−ＯＨＤＡ注射直後に減少する。注射の６時間後に、マウスを分析した。スケールバー、１０μｍ。  （Ｄ）図１Ｅ、図１Ｆのように定量化した核小体周囲、そして核周囲の高密度Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色を示すＴＨ＋ニューロンのパーセンテージは、６−ＯＨＤＡ注射マウスにおいて、劇的に低下した（左）（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定；１４８および９１個のニューロンを、偽条件および６−ＯＨＤＡ条件でそれぞれ数えた）。ＴＨ＋ニューロンにおける核周囲Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色もまた、６−ＯＨＤＡ注射直後に減少する（右）（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定；４０および４７個のニューロンを、偽条件および６−ＯＨＤＡ条件でそれぞれ数えた）。  （Ｅ）中脳切片を、ｙ−Ｈ２ＡＸ、ヌクレオリン、およびＴＨについて染色して、共焦点顕微鏡法によって分析した。偽注射したマウスにおけるヌクレオリン核小体局在化が、６−ＯＨＤＡ注射の６時間後に失われる。ＮＣＬ、ヌクレオリン。スケールバー、１０μｍ。  （Ｆ）核小体ヌクレオリンを有するＴＨ＋ニューロンのパーセンテージは、６−ＯＨＤＡ注射直後に有意に低下する（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定；１６１および９７個のニューロンを、偽条件および６−ＯＨＤＡ条件でそれぞれ数えた）。ＮＣＬ、ヌクレオリン。  （Ｇ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析したｐｒｅ−４５Ｓ  ｒＲＮＡは、ＳＮｐｃ精製核中で、６−ＯＨＤＡ注射後に上方制御される（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  （Ｈ）ヌクレオリンおよびＴＨについて染色した中脳切片（１年齢の動物由来）を、共焦点顕微鏡法によって分析した。ヌクレオリンは、ｗｔ  ＴＨ＋ニューロンにおいて核小体の局在化を示す一方、Ｅｎ１＋／−マウスにおいて、ＴＨ＋ニューロンの４０％が、拡散した染色パターンを示す（矢印）。スケールバー、５０μｍ。点線の矩形領域のより高倍率の画像を、右端のパネルに示す。スケールバー、１０μｍ。核小体ヌクレオリンを有するＴＨ＋ニューロンのパーセンテージは、Ｅｎ１＋／−マウスにおいて有意に低下した（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定；ｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウスにおいてそれぞれ９９および８７個のニューロンを数えた）。ＮＣＬ、ヌクレオリン。図Ｓ２も参照。
【図３】Ｅｎｇｒａｉｌｅｄは、ＴＨ＋細胞を、６−ＯＨＤＡ誘導細胞死から救済する  （Ａ）ＳＮｐｃ中に６−ＯＨＤＡを注射したマウスに、３０分後に偽またはＥｎ２を再注射して、２４時間後に分析した。偽注射と比較して、Ｅｎ２注射は、同側ＳＮｐｃにおける６−ＯＨＤＡ誘導ＴＨ細胞喪失を防止する。スケールバー、５００μｍ。  （Ｂ）Ｅｎ２の保護作用を、注射の６時間、２４時間、および７日後の同側ＳＮｐｃ対対側ＳＮｐｃでのＴＨ＋細胞カウントの比率によって、評価した（ｎ＝３〜５；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  数えたニューロン数は、条件ごとに１６７０〜２２７５個に及んだ。  （Ｃ）６−ＯＨＤＡ注射マウスにおけるＥｎ２によるＴＨ＋ニューロンレスキューは、２４時間後にサイクリンＡの消失と並行する。スケールバー、１００μｍ。  （Ｄ）Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３についての免疫染色が、Ｅｎ２注射後に、段階的回復を示す。核小体ヌクレオリンの回復は、２４時間後にほぼ完了する。γ−Ｈ２ＡＸ病巣を有するＴＨ＋ニューロンのパーセンテージは、注射の２４時間〜７日後に正常に戻る。各分析について、ｎ＝３。一元配置ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｅｔｔ検定を行った（対偽）。数えたニューロン数は、各条件について１０２〜１５０個に及んだ。  （Ｅ）選択した遺伝子の発現は、注射の６時間後に分析した６−ＯＨＤＡ／偽マウスおよび６−ＯＨＤＡ／Ｅｎ２マウスのＳＮｐｃにおいて、アポトーシスおよび細胞周期に関連した（ｎ＝５；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  （Ｆ）Ｏｔｘ２は、ＴＨ＋ニューロンを、６−ＯＨＤＡ誘導細胞死から保護する。６−ＯＨＤＡ注射の３０分後にＯｔｘ２を注射して、２４時間後にマウスを分析した。Ｅｎ２注射（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）について、保護作用を評価した。数えたニューロン数は、各条件について１２６８〜１４９５個に及んだ。図Ｓ３も参照。
【図４】ＲＮＡ−ｓｅｑ分析は、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ抗アポトーシス活性を明らかにする  （Ａ、Ｂ）ＤＮＡ損傷、クロマチンリモデリング、アポトーシス、および細胞周期に関連する、６−ＯＨＤＡ対６−ＯＨＤＡ／Ｅｎ２の、ＳＮｐｃ中の差次的発現遺伝子を、ｐ値によってランク付けする。  （Ｃ）６−ＯＨＤＡおよび６−ＯＨＤＡ／Ｅｎ２のＳＮｐｃにおける、選択した遺伝子の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確認する（ｎ＝５；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  （Ｄ）左のパネル：６−ＯＨＤＡおよび６−ＯＨＤＡ／Ｅｎ２の、ＳＮｐｃにおけるｑＲＴ−ＰＣＲによって、Ｇａｄｄ４５ｂ転写物およびＰｍｌ転写物を６時間後に測定した（シクロヘキシミド、ＣＨＸの注射；ｎ＝５；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。右のパネル：８週齢のｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウスのＳＮｐｃ中のＧａｄｄ４５ｂ転写物（ｎ＝４；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  （Ｅ）偽、６−ＯＨＤＡ／偽、および６−ＯＨＤＡ／Ｅｎ２由来の中脳切片を、ｐ−ＪＮＫおよびＴＨについて染色して、共焦点顕微鏡法によって分析した。スケールバー、５０μｍ。点線の矩形のより高倍率の画像を、右端のパネルに示す。スケールバー、１０μｍ。  （Ｆ）Ｅｎ２は、ｐ−ＪＮＫ染色したＳＮｐｃ  ＴＨ＋ニューロンのパーセンテージを有意に低下させる（ｎ＝３；一元配置ＡＮＯＶＡに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定；分析したニューロン数は、各条件について２２７および３５１個に及んだ）。図Ｓ４も参照。
【図Ｓ１】図１に関連する。Ｅｎ１＋／−マウスのｍＤＡニューロンにおける遺伝子発現の変化  （Ａ）ｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウス由来のＳＮｐｃを、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析のために、レーザで顕微解剖した（ｌａｓｅｒ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ）。読取り総数および差次的発現遺伝子総数（ｐ＜０．０５）を示す。Ｅｎ１＋／−  ＳＮｐｃ中のＥｎ１発現の減少が、ＲＮＡ−ｓｅｑによって確認された。  （Ｂ）ＲＮＡ−ｓｅｑデータ分析（Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ）が、ｗｔ同腹仔とＥｎ１＋／−同腹仔間のＤＮＡ損傷およびクロマチンリモデリングに関与するオントロジ遺伝子サブグループにおける有意な富化を明らかにする（ｐ＜０．００５）。Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｐａｔｈｗａｙｓを用いた分析はまた、アポトーシス関連遺伝子の差次的発現を示した。  （Ｃ）Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏによる機能実験のＥｎｇｒａｉｌｅｄゲイン由来のＲＮＡ−ｓｅｑデータの分析。富化した遺伝子サブグループ（ｐ＜０．０１）が示される（ｎ＝５）。  （Ｄ）ｗｔおよびＥｎ１＋／−  ＳＮｐｃの、Ｐａｔｈｗａｙ  ＳｔｕｄｉｏによるＲＮＡ−ｓｅｑ分析における差次的発現転写因子を、ｐ値によってランク付けする。  （Ｅ）ＤＮＡ損傷、クロマチンリモデリング、およびアポトーシスに関連する選択遺伝子の発現の変化を、６週齢のｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウス由来のＳＮｐｃ  ＲＮＡを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによって確認する（ｎ＝３〜６；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  （Ｆ）ＳＮｐｃにおいて２つを超えるγ−Ｈ２ＡＸ病巣を有するＴＨ＋ニューロンのパーセンテージは、ｗｔにおける５％から、２４週齢のＥｎ１＋／−マウスにおける１７％に増大する（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定；１０７および９４個のニューロンを、ｗｔ条件およびＥｎ１＋／−条件においてそれぞれ数えた）。  （Ｇ）Ｅｎ１＋／−マウスのＳＮｐｃ中のＬＩＮＥ−１転写物を、ｑＲＴ−ＰＣＲ増幅によって、ｗｔと比較して分析した（ｎ＝５；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  （Ｈ）活性化カスパーゼ−３陽性ＴＨ＋ニューロンが、Ｅｎ１＋／−マウス（８週齢）のＳＮｐｃ中で検出される。スケールバー、５０μｍ。
【図Ｓ２】図２に関連する。６−ＯＨＤＡを注射したマウスにおけるＴＨ細胞死およびクロマチン変化  （Ａ）ウェスタンブロット分析が、６−ＯＨＤＡを注射した同側ＳＮｐｃ（ｎ＝３）において、６時間後のＴＨタンパク質レベルの５０％の減少を示す。  （Ｂ）６−ＯＨＤＡを注射したＳＮｐｃにおいて、ＴＨおよびＥｎ１のｍＲＮＡのレベル（６時間後）が、それぞれ７０および５０％減少している（ｎ＝６；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  （Ｃ）活性化されたカスパーゼ−３が、６−ＯＨＤＡを注射した側のＴＨ＋ニューロン中で６時間後に検出されるが、反対側では検出されない。スケールバー、１００μｍ。  （Ｄ）γ−Ｈ２ＡＸ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、およびＴＨについての中脳切片の三重免疫染色は、偽条件下でのＤＡＰＩとのＨ３Ｋ９ｍｅ３の共局在が、６−ＯＨＤＡを注射したマウスにおいて失われていることを示す。同様に、偽注射したマウスのＴＨ＋ニューロンにおけるＤＡＰＩとのＭｅＣＰ２共局在が、６−ＯＨＤＡを注射したマウスにおいて失われている。スケールバー、１０μｍ。  （Ｅ）６−ＯＨＤＡを注射したマウスにおいて、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３マーカーまたはＭｅＣＰ２マーカーが高濃度であるＴＨ＋ニューロンのパーセンテージは、有意に減少する（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。数えたニューロン数は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３について１６１（偽）および９７（６−ＯＨＤＡ）であり、ＭｅｃＰ２について１５０（偽）および１２８（６−ＯＨＤＡ）であった。  （Ｆ）６−ＯＨＤＡを注射したマウスのＳＮｐｃにおけるＴＨ＋ニューロン中の核周囲ラミンＢ２染色の喪失。スケールバー、２０μｍ。  （Ｇ）偽注射または６−ＯＨＤＡ注射したマウスにおけるＴＨ＋ニューロン中のＤＡＰＩ高密度領域の表面定量化。偽注射した対照と比較して、相対頻度分布は、６−ＯＨＤＡを注射したマウスのＴＨ＋ニューロンにおいて、より小さなＤＡＰＩ高密度領域へのシフトを示す（ｎ＝１３７〜１７７；Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定；１条件あたり３頭）。  （Ｈ）６−ＯＨＤＡ注射または偽注射したマウスのＳＮｐｃ由来の全ＲＮＡを用いて、ｐ５３  ｍＲＮＡおよびｐ２１  ｍＲＮＡを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化した（ｎ＝６；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  （Ｉ）６−ＯＨＤＡを注射したＳＮｐｃ中の反復要素のより高い発現。全ＳＮｐｃ  ＲＮＡを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによって分析したＬＩＮＥ−１転写物のレベルが、６−ＯＨＤＡを注射したマウスにおいて、増大する。ＬＩＮＥ−１  ＲＮＡのレベルもまた、ＳＮｐｃ精製核由来のＲＮＡを用いて分析した（ｎ＝３〜５；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図Ｓ３】図２〜図３に関連する。ＴＨニューロン保護に関係するＥｎｇｒａｉｌｅｄ転写活性  （Ａ）マウスに、偽またはＥｎＨＤ−ＶＰ６４をＳＮｐｃ中に片側だけから注入して、７日目に分析した。ＴＨについての中脳切片の免疫染色は、ＥｎＨＤ−ＶＰ６４注入（偽でない）が、同側ＳＮｐｃにおけるＴＨ細胞の喪失を引き起こすことを示す。スケールバー、５００μｍ。  （Ｂ）ＥｎＨＤ−ＶＰ６４誘導ＴＨ細胞喪失を、注入の７日後の同側ＳＮｐｃ対対側ＳＮｐｃでのＴＨ＋細胞カウントの比率を比較することによって、評価した（ｎ＝６；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。数えたニューロン数は、条件ごとに１９０２〜２１１８個に及んだ。  （Ｃ）γ−Ｈ２ＡＸ染色の定量化は、ＳＮｐｃにおいて２つを超えるγ−Ｈ２ＡＸ病巣を有するＴＨ＋ニューロンのパーセンテージが、ＥｎＨＤ−ＶＰ６４注入直後に増大することを示す（ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定；偽条件およびＥｎＨＤ−ＶＰ６４条件においてそれぞれ１３８および１２９個のニューロンを数えた）。  （Ｄ）また、ＲＮＡ−ｓｅｑデータの分析が、Ｅｎ１＋／−マウスのＳＮｐｃ中の核小体組織化および生体発生に関連する、Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙサブグループにおける差次的発現遺伝子を明らかにする（ｐ＜０．１）。  （Ｅ）ｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウス（８週齢の動物）のＳＮｐｃ中のｐｒｅ−４５Ｓ  ｒＲＮＡのレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した（ｎ＝４；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  （Ｆ）Ｅｎｇｒａｉｌｅｄは、６−ＯＨＤＡモデルにおいて、ＴＨ＋ニューロンの生存を促進する。６−ＯＨＤＡ注射の２４時間後（ＴＨ＋ニューロンの大部分が失われている）にＥｎｇｒａｉｌｅｄを注射して、６時間後に回復を評価した場合、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄの生存作用は観察されなかった（ｎ＝３）。
【図Ｓ４】図４に関連する。インビボでの急性酸化ストレス直後のＴＨ＋ニューロン中の細胞周期マーカーの検出、およびインビトロでのＨ２Ｏ２誘導ＤＳＢからのＥｎｇｒａｉｌｅｄ媒介性保護  （Ａ）６−ＯＨＤＡを注射した側のＴＨ＋ニューロン中の、ＰＣＮＡマーカーおよびｐＨ３細胞周期マーカーの検出。スケールバー、２０μｍ。  （Ｂ）中脳切片の免疫染色が、６−ＯＨＤＡを注射したマウスの同側においてのみサイクリンＡを発現するＴＨ＋ニューロンを明らかにする。注射の６時間後に、マウスを分析した。スケールバー、１００μｍ。  （Ｃ）ｐＨ３についてポジティブ染色されたＴＨ＋ニューロンにおける活性化カスパーゼ−３の検出。スケールバー、５０μｍ。  （Ｄ）６−ＯＨＤＡ注射直後にサイクリンＡを発現するＴＨ＋ニューロンのパーセンテージを定量化し（左、ｎ＝３；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）、そしてウェスタンブロット分析によって確認した（右、ｎ＝４；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。  （Ｅ）Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ処置は、中脳ニューロンを、Ｈ２Ｏ２誘導性ＤＳＢから保護する。Ｅ１４．５マウス胚の一次中脳ニューロン培養物を、ＮａＣｌまたはＥｎ１（１５ｎＭ）で２４時間インキュベートした後に、５μＭのＨ２Ｏ２で処理した。細胞をＨ２Ｏ２処理の１時間後に固定して、γ−Ｈ  ２  Ａ  Ｘについて染色して、病巣の数を定量した（ｎ＝６８〜１３７；一元配置ＡＮＯＶＡに続いて、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。中脳ニューロン培養を用いたＨ２Ｏ２誘導ＤＳＢからのＥｎ２媒介性保護を、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  ＣｏｍｅｔＡｓｓａｙキットの指示に従って行ったコメットアッセイによって評価して、ＯｐｅｎＣｏｍｅｔプラグインで分析した（スケールバー、１００μｍ）。コメットテールを有するニューロンの数を定量化した（ｎ＝３９〜４６；一元配置ＡＮＯＶＡに続いて、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。  （Ｆ）偽注射したマウスに対する、Ｅｎ２のＳＮ  ｐｃ中の差次的発現遺伝子。ＤＮＡ損傷、クロマチンリモデリング、アポトーシスに関連する遺伝子を、ｐ値によってランク付けする。
【図５】Ｅｎ１／ＧＢＸ２／ＬＨＸ９  ５．１、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄに対する用量反応；５．２、Ｇｂｘ２に対する用量反応；  ５．３、Ｌｈｘ９に対する用量反応。
【実施例】
【００７６】
実験手順
動物
実験動物のケアおよび使用に関するガイドライン（ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）および欧州指令８６／６０９（ＥＥＣ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）に従って、マウスを処理した。Ｓｗｉｓｓ  ＯＦ１  ｗｔ（Ｊａｎｖｉｅｒ）およびＥｎ１＋／−マウス（Ｈａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，６７９−６８２）を、従来の動物施設において維持した。実験群は、６〜９週齢のマウスからなった。
【００７７】
インビボ処置
６−ＯＨＤＡ注射のために、マウスを定位固定装置に置いて、穿頭孔を頭蓋骨中に、尾側の３．３ｍｍ、およびブレグマの側方の１ｍｍに穿孔した。針を頭蓋骨の表面から４ｍｍ下げて、６−ＯＨＤＡ（２μｌ；０．８μｇ／μｌ  Ｓｉｇｍａ）注射または偽（ＮａＣｌ  ０．９％）注射を、４分間にわたって行った。この手順で、ホメオタンパク質をＳＮｐｃ組織に向ける。Ｅｎｇｒａｉｌｅｄレスキュー実験について、細菌組換えＥｎ２（３００ｎｇ；４μＭ）およびコロミン酸（３μｇ）の溶液（２μｌ）（Ｓｏｎｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７，１０６３−１０７１）、またはビヒクル（ＮａＣｌ  ０．９％）を、６−ＯＨＤＡ注射の３０分後に、同じ座標を用いて注射した。示す場合に、シクロヘキシミド（０．１μｇ／μｌ、ｓｉｇｍａ）を加えた。Ｏｔｘ２タンパク質注射について、３００ｎｇのタンパク質を含有する２μｌの溶液を用いた。分析のために、示す時点にてマウスを殺した。厚さ２ｍｍの凍結冠状切片から１ｍｍの穿孔を行うことによって、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析およびウェスタンブロット分析用のＳＮｐｃ組織を得た。
【００７８】
ＥｎＨＤ−ＶＰ６４について、先の同じ定位座標に配置した４ｍｍ長カニューレに連結した浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ  １００２、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で７日間、マウスに注入した。Ｅｎ−ＶＰ６４（４００ｎＭ、０．９％ＮａＣｌ、または等量の空のプラスミド含有細菌抽出物）およびコロミン酸（１．５μｇ／μｌ）を含有する１００μｌで、ポンプを充填した。
【００７９】
画像の定量化
ＩｍａｇｅＪで画像を分析した。免疫蛍光のために、６０倍の倍率および０．７μｍ厚の連続した焦点面を用いて、全ての定量化を行った。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３核小体パターン分析のために、核小体を通して置かれる線に沿うピクセルの強度のグラフを作成した。核の周辺での、そして核質におけるピクセル密度を測定することによって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３蛍光強度の核周囲／核の比率を判定した。各ＴＨ＋細胞における個々のＤＡＰＩ表面積を測定し、かつこれを、相対頻度分布ヒストグラムとしてプロットすることによって、偽注射したマウスおよび６−ＯＨＤＡ注射したマウスにおけるＤＡＰＩ高密度領域を定量化した。
【００８０】
統計分析
示した適切な検定を用いて、統計的有意性を判定した。データを平均±ＳＥＭとして表す。全ての実験において、＊ｐ＜０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。
【００８１】
ＲＮＡ−ｓｅｑ分析
迅速なＴＨ染色プロトコル（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １４，１７０９−１７２５）を用いて標識したｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウスのＳＮｐｃ中のｍＤＡニューロンを、Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＭＤ７０００、Ｌｅｉｃａ）によって単離した。１群あたり動物４頭由来のサンプルをプールして、オンカラムＤＮＡｓｅ  Ｉ処置用のＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐプロトコルを用いて、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＯＪａｇｅｎ）に続いてＤＮａｓｅ  Ｉを用いて、全ＲＮＡを抽出した。Ｅｃｏｌｅ  Ｎｏｒｍａｌｅ  Ｓｕｐｅｒｉｅｕｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃプラットフォーム（Ｐａｒｉｓ）によって、ｃＤＮＡライブラリの構築（Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２）およびｌｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ−ｓｅｑを行って、ＤＥＳｅｑパッケージ（Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １１，Ｒ１０６）を用いて、ｗｔサンプルとＥｎ１＋／−サンプルとの差次的発現遺伝子のｐ値を算出した。統計的富化について検定するために、標準化した読取りカウントを、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓアルゴリズム（Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に導入した。Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ＯｎｔｏｌｏｇｙコレクションおよびＣｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｐａｔｈｗａｙｓコレクションを、分析のためのＧｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓとして選択した。また、６−ＯＨＤＡ／偽注射および６−ＯＨＤＡ／Ｅｎ２注射の６時間後に収集したｗｔマウスのＳＮｐｃ、およびＳＮｐｃ組織パンチ由来のＳＮｐｃ中の、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ注入後の、Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅで顕微解剖したｍＤＡニューロンから抽出したＲＮＡを用いて、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析を行った（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １４，１２６０−１２６６）。
【００８２】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）に続いてＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ）消化を用いて、ＳＮｐｃ組織由来の全ＲＮＡを抽出した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡ（２００ｎｇ）を転写した。ＳＹＢＲ  −Ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行って、値をＧａｐｄｈおよび／またはＨｐｒｔに対して標準化した。ｄｄＣｔ法を用いてデータを分析した。一部の実験において、ＲＮＡをＳＮｐｃ核から特異的に単離した（Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ）。
【００８３】
方法の補足表：ｑＲＴ−ＰＣＲ分析に用いたプライマーのリスト
（実験手順を参照）
【表１−１】
2018536697.tif 000002
【表１−２】
2018536697.tif 000003
【００８４】
免疫染色
マウスにＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを灌流して、脳を１時間、後固定して、１５％スクロース中で凍結保護した。Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ）中に包埋した組織を、イソペンタンで凍結して、−８０℃にて保存した。ＳＮｐｃのレベルで脳を１８μｍ厚の切片に切断した。免疫蛍光のために、切片を、ＰＢＳ中１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００内に２０分間浸透させて、クエン酸バッファ（１０ｍＭクエン酸、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ６．０）内で１００℃にて２０分間インキュベートした。１時間ブロッキングした後（ＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、組織を、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体（マウス抗Ｙ−Ｈ２ＡＸ、１：２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ニワトリ抗ＴＨ、１：５００、Ａｂｅａｍ；ウサギ抗活性化カスパーゼ３、１：２００、Ａｂｅａｍ；ウサギ抗ヌクレオリン、１：２００、Ｓｉｇｍａ；ウサギ抗フィブリラリン（ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ）、１：２００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；ウサギ抗Ｈ３ｋ２７ｍｅ３、１：２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ウサギ抗Ｈ３ｋ９ｍｅ３、１：２００、Ａｂｅａｍ；Ｅｄｉｔｈ  Ｈｅａｒｄからの寛大な寄贈；ウサギ抗Ｌａｍｉｎ  Ｂ２、１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；ウサギ抗Ｍｅｃｐ２、１：３００、Ａｂｅａｍ；ウサギ抗ＰＣＮＡ、１：２００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；ウサギ抗サイクリンＡ、１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；マウス抗ｐＨ３、１：１００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；マウス抗−ｐ−ＪＮＫ、１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と４℃にて一晩インキュベートした。切片を、適切な二次抗体（４８８抗ニワトリ、６４７抗ニワトリ、４８８抗マウス、５４６抗マウス、および５４６抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と室温にて１時間インキュベートした。標識した切片を共焦点顕微鏡法（ＳＰ５、Ｌｅｉｃａ）によって画像化した。ＴＨ免疫組織化学について、切片を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００内で透過処理して、ＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清（ＴＨに対するウサギポリクローナル抗体（１：１０００；Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を含有する）と４℃にて一晩インキュベートした。切片を、ビオチン化二次抗体で処理して、アビジン−ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）とインキュベートした。ＤＡＢペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質キット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）を用いて、ペルオキシダーゼを明らかにして、Ｎｏｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｅ  ｉ９０顕微鏡で画像化した。
【００８５】
結果
実施例１：Ｅｎ１＋／−マウスのＳＮｐｃ中のｍＤＡニューロン遺伝子発現
顕微解剖したＳＮｐｃに関するＲＮＡ−ｓｅｑ分析を、ｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウスで行った。９８９個の差次的発現遺伝子を有するｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウスにおいて、比較可能な読取りを得た（ｐ＜０．０５）（図Ｓ１Ａ）。全てのニューロンが依然としてＥｎ１＋／−マウスに存在する６週齢の動物に、分析を行った。Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア）は、最も代表的かつ有意な３つの群が、ＤＮＡ修復（ｐ＝０．００２）、クロマチンリモデリング（ｐ＝０．００４）、および転写因子（ｐ＝０．００７）であることを示す；また、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｐａｔｈｗａｙｓ分析は、差次的アポトーシス調節遺伝子を明らかにした（ｐ＝０．０１）（図Ｓ１Ｂ）。
【００８６】
これらのオントロジおよび経路内の遺伝子を、ｐ値の増大によってランク付けした；図１Ａは、読取り数に有意差があるものを強調している。
【００８７】
転写因子遺伝子は、最も豊富な群を代表する（図Ｓ１Ｂ）。図Ｓ１Ｄは、Ｅｎ１＋／−マウスにおいて発現が修飾されたものをｐ値によってランク付けしている。また、ｗｔマウスのＳＮｐｃへのＥｎ２注入は、転写因子遺伝子を修飾するが、ＤＮＡ損傷応答およびクロマチンを修飾するものは非常に少ない（図Ｓ１Ｃ）。ゆえに、これらをさらに、本研究の文脈において調査した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（図Ｓ１Ｅ）は、６週齢のＥｎ１＋／−マウスが、ＤＮＡ損傷、クロマチンリモデリング、およびアポトーシスに関連するいくつかの遺伝子の発現の変化を示すことを確認した。
【００８８】
実施例２：Ｅｎ１＋／−ｍＤＡニューロンにおけるＤＮＡ鎖切断および修飾クロマチンマーク
ＤＮＡ損傷の徴候について、ＤＮＡ鎖切断（ＤＳＢ）マーカーγ−Ｈ２ＡＸ（Ｌｏｂｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ９，６６２−６６９）に従って、Ｅｎ１＋／−マウス（６〜８週齢）のＳＮｐｃ中のｍＤＡニューロンを調べた（Ｌｏｂｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ９，  ６６２−６６９）。これは、ＳＮｐｃ中のＴＨ＋ニューロンの約１６％において、複数のγ−Ｈ２ＡＸ病巣の存在を明らかにした（図１Ｂ、図１Ｃ）。注目すべきは、細胞の１６％が、２４週目に複数のγ−Ｈ２ＡＸ病巣を有するにも拘らず（図Ｓ１Ｆ）、２４〜４８週のＥｎ１＋／−変異体では、重大な死がないことによって示されるように、ＤＳＢは、急速な細胞死に至るのに必須でない。ｗｔマウスでは、ｍＤＡニューロンの約９８％が、核小体の周りに、γ−Ｈ２ＡＸの単一環を示す（図１Ｂ）（また、脳の全体にわたってニューロン中に存在する）。１つのＥｎ１対立遺伝子の喪失に対するＶＴＡ  ｍＤＡニューロンの感受性がより低いことと同調して、γ−Ｈ２ＡＸ染色は、ｗｔマウスおよびＥｎ１＋／−マウスのＶＴＡにおいて、類似した（図１Ｃ）。
【００８９】
Ｅｎ１＋／−マウスはまた、クロマチン変化の徴候がある。図１Ｄ〜図１Ｆに示すように、核小体周囲および核周囲のＨ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｋ２７トリメチル化ヒストンＨ３）染色のパターンは、かなりの割合のＥｎ１＋／−  ＴＨ＋ニューロン中で、変化する。また、ヘテロクロマチンのＤＡＰＩ高密度領域のサイズ分布（Ｇｕｅｎａｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６６，４９３−５０５）は、Ｅｎ１＋／−マウスにおける大スポットのパーセンテージの減少を示す（図１Ｇ）。ヘテロクロマチン変化は、多くの場合、Ｌｏｎｇ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＬＩ  ＮＥ）の発現の変化と、関連する。それに応じて、ＬＩＮＥ発現が、Ｅｎ１＋／−突然変異体のＳＮｐｃ中で増大する（図Ｓ１Ｇ）。アポトーシス遺伝子の誘導（図１Ａ）が、ｗｔ同腹仔では見られなかったＥｎ１＋／−マウスのＳＮｐｃ中のＴＨ  ／活性化カスパーゼ−３共染色によって、確認される（図Ｓ１Ｈ）。
【００９０】
実施例３：急性酸化ストレスに対するＥｎ１＋／−ｍＤＡニューロンの感受性の増強
６−ＯＨＤＡ（ｍＤＡニューロンによって特異的に捕捉されるスーパーオキシド産出薬物）をＳＮｐｃ中に直接注射することによって、急性酸化ストレスをｍＤＡニューロンに加えた。これは、６時間以内に、同側ＳＮｐｃにおいてのみ、ＴＨ＋ニューロンの３５％の喪失を、そして残りのＴＨ＋ニューロンの約２６％において、複数の異常なγ−Ｈ２ＡＸ病巣の形成を誘導した（図２Ａ、図２Ｂ）。ニューロンの喪失は、ＴＨタンパク質およびｍＲＮＡ（また、Ｅｎ１  ｍＲＮＡ）の減少と（図Ｓ２Ａ、図Ｓ２Ｂ）、そして多数の活性化カスパーゼ−３陽性ｍＤＡニューロンの存在と（図Ｓ２Ｃ）、並行していた。Ｅｎ１＋／−マウスに６−ＯＨＤＡを注射すると、６−ＯＨＤＡを注射した側で、γ−Ｈ２ＡＸ病巣を有するＴＨ＋ニューロンのパーセンテージがより高くなり（５１％）、そしてＴＨ＋ニューロンの喪失が並行して増大した（６０％）（図２Ａ、図２Ｂ）。ＥｎＨＤ−ＶＰ６４注入は、実際に、ｍＤＡ細胞死に至り（図Ｓ３Ａ、図Ｓ３Ｂ）、そしてγ−Ｈ２ＡＸ病巣の数が増大する（図Ｓ３Ｃ）。
【００９１】
実施例４：酸化ストレスが、ヘテロクロマチンマークの変化を誘導する
また、ヘテロクロマチンマークが、ｗｔマウスへの６−ＯＨＤＡ注射の６時間後に、修飾される。偽注射したマウスのＴＨ＋ニューロンにおける高密度の核小体周囲の、そして核周囲のＨ３Ｋ２７ｍｅ３染色が、６−ＯＨＤＡを注射したマウスにおいて、拡散した核質染色に変わる（図２Ｃ）。この変化を、核小体において、一直径に沿って核小体周囲の蛍光強度を測定することによって、定量化した（図２Ｄ、左）。同様に、末梢核ラミナと核間質とのＨ３Ｋ２７ｍｅ３蛍光強度の比率は、１．４から１．０に低下した（図２Ｄ、右）。急性６−ＯＨＤＡはまた、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（Ｋ９トリメチル化ヒストンＨ３）染色およびＭｅＣＰ２染色を乱し（図Ｓ２Ｄ、図Ｓ２Ｅ）、正味のラミンＢ２染色が喪失し（図Ｓ２Ｆ）、ＤＡＰＩ高密度スポットのサイズ分布が変化した（図Ｓ２Ｇ）。ＭｅＣＰ２は、メチル化ＣｐＧに結合して、その染色の変化が、グアニンの酸化を反映し得る。
【００９２】
６−ＯＨＤＡ直後の、核小体周囲のγ−Ｈ２ＡＸの喪失によって示唆される核小体ストレス（図２Ａ）が、高密度のヌクレオリン染色による、ｍＤＡ細胞の７０％（偽）から３０％（６−ＯＨＤＡ）への低下によって、確認される（図２Ｅ、図２Ｆ）。この変化は、核小体損傷の徴候であるリボソームｐｒｅ−４５Ｓ  ＲＮＡの強い上方制御を伴った（図２Ｇ）。比較すると、Ｅｎ１＋／−  ＴＨ＋ニューロンにおいて６週目にて正常なヌクレオリン染色は、１年後に破壊の徴候を示す（図２Ｈ）。しかしながら、核小体組織化に関与する遺伝子の発現分析（ＲＮＡ−ｓｅｑ）、およびｐｒｅ−４５Ｓ  ｒＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、６〜８週齢のＥｎ１＋／−マウスにおける核小体生理の変化を示唆している（図Ｓ３Ｄ、図Ｓ３Ｅ）。
【００９３】
実施例５：Ｅｎｇｒａｉｌｅｄは、Ｈ２Ｏ２によって誘導されるＤＳＢの数を減少させる
Ｅｎｇｒａｉｌｅｄが、酸化ストレスによって誘導されるＤＮＡ損傷を調節することができるかを確認するために、ｗｔマウスに６−ＯＨＤＡを片側だけから注射して、３０分後にビヒクル（偽）またはＥｎ２を再注射した。注射の６時間、２４時間、または７日後に、分析を行った。６−ＯＨＤＡ／偽を注射したＳＮｐｃ中のＴＨ＋細胞の２４時間後の劇的な喪失は、６−ＯＨＤＡ／Ｅｎ２を注射したマウスにおいて、非常に引き下げられている（図３Ａ）。Ｅｎ２注射マウスおよび偽注射マウスでは、生存ニューロンのそれぞれ４０％および２０％で、保護が７日目に依然として見られる（図３Ｂ）。６−ＯＨＤＡの２４時間（３０分ではない）後にＥｎ２を注射して、６時間後に分析すると、回復を示さなかったことから、ＴＨ染色は、真の生存に対応しており、ＴＨ再発現には対応していないことが示された（図Ｓ３Ｆ）。
【００９４】
６−ＯＨＤＡ誘導アポトーシスは、細胞周期マーカーの発現と並行している（図Ｓ４Ａ〜図Ｓ４Ｄ）。したがって、注射６時間後のＥｎ２処理ＴＨ＋細胞中で検出されたサイクリンＡ発現は、２４時間後にほぼ消失していた（図３Ｃ）。Ｅｎ２によるニューロンレスキューは、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、ヌクレオリン、およびγ−Ｈ２ＡＸの正常な染色パターンの再現と関連する（図４Ｄ）。「野生型」核小体周囲がＨ３Ｋ２７ｍｅ３で染色されたＴＨ＋細胞のパーセンテージは、６時間後に２０％から３７％に増大し、そして２４時間後および７日後にそれぞれ６０％および８０％に達した。野生型ヌクレオリンパターンは、回復が２４時間目にのみ観察され、２４時間から１週間、ほとんど変化が見られなかったので、再現にはより長い時間を要した。最後に、γ−Ｈ２ＡＸ病巣数の減少はより遅く、７日目にのみ完全に回復した。
【００９５】
レスキューは、Ｅｎ２注射の早くも６時間後に、ＴＨ  ｍＲＮＡ発現の有意な増大、およびｐｒｅ−４５Ｓ  ｒＲＮＡ発現の減少と相関した（図３Ｅ）。Ｅｎ１＋／−マウスにおいて上方制御された、または６−ＯＨＤＡの注射直後の、細胞周期およびアポトーシスに関連する、選択された遺伝子の発現は、６−ＯＨＤＡ／Ｅｎ２マウスのＳＮｐｃにおいて、抑制された（図３Ｅ）。偽注射、そしてＥｎ２注射した動物が、類似した数のｍＤＡニューロンを依然として有する６時間後に、分析を行った（図３Ｂ）。
【００９６】
Ｅｎｇｒａｉｌｅｄを発現するが、ドーパミン作動性であるのはわずか１〜２％であるＥ１４．５中脳ニューロンを、Ｅｎ２の有無に拘らず、Ｈ２Ｏ２に曝した。図Ｓ４Ｅは、ＤＮＡ損傷の徴候を示すコメットテールの形成の減少と並行して、Ｅｎ２が、Ｈ２Ｏ２によって誘導されるＤＳＢ数を減少させることを示す。
【００９７】
実施例６：Ｅｎｇｒａｉｌｅｄは、短期生存経路および長期生存経路を活性化する
Ｅｎ２による保護は、２４時間前の注射を必要とする（図Ｓ３Ｆ）。この早期生存経路における遺伝子を同定するために、６−ＯＨＤＡ／偽マウスまたは６−ＯＨＤＡ／Ｅｎ２マウス（６時間）由来のＳＮｐｃ  ＲＮＡを配列決定して、クロマチンリモデリング、ＤＮＡ損傷、アポトーシス、および細胞周期の経路における遺伝子を、Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｓｔｕｄｉｏに従って分析した。図４Ａ、図４Ｂは、読取り数の最も大きい差により、大きさの順によって、遺伝子をランク付けしており、図４Ｃは、分析した４つの経路における代表的な上位の遺伝子についての発現の増強の、ｑＲＴ−ＰＣＲによる確認を示す。アポトーシス経路における遺伝子が、Ｅｎ１＋／−マウスにおけるよりも多く表されている（図１）。これは、Ｅｎ２注射自体に起因するものではなく（図Ｓ４Ｆ）、このことは、Ｅｎ２による抗アポトーシス経路の急速な上方制御が、急性酸化ストレス後に特異的に起こることを示唆している。
【００９８】
８週齢のＥｎ１＋／−マウスにおけるＧａｄｄ４５ｂ発現の減少と並行して、レスキュー実験においてシクロヘキシミドを加えることで、Ｇａｄｄ４５ｂは、対照についてのＰｍｌとは対照的に、介在タンパク質の翻訳を必要としないので、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄの直接のターゲットであることが実証される（図４Ｄ）。Ｇａｄｄ４５ｂ／ｇおよびＮＦ−ｋＢの高誘導は、ＰＤが挙げられるいくつかの神経変性疾患に包含される経路、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達の役割を示唆した（Ｃｏｆｆｅｙ，２０１４，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １５，２８５−２９９）。図４Ｅ、図４Ｆは、６−ＯＨＤＡの６時間後のｐ−ＪＮＫ染色の強い増大が、Ｅｎ２によって拮抗されることを確認する（図４Ｆ）。
【００９９】
実施例７：Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、ならびに２つの他のホメオタンパク質、Ｇｂｘ２およびＬｈｘ９が、Ｈ２Ｏ２によって誘導されるＤＳＢの数を減少させる
ホメオタンパク質の高い構造的保存および機能的保存を考慮して、本発明者らは、他のホメオタンパク質が、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄと同様の作用を有するであろうと予想した。ゆえに、本発明者らは、２つの他のホメオタンパク質、Ｇｂｘ２（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３，３３５−３４２）およびＬｈｘ９（Ｒｅｔａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９（２），７８３−７９３）の、Ｈ２Ｏ２によって誘導されるＤＮＡ損傷に及ぼす作用を比較して、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄと比較した。
【０１００】
Ｅ１４．５中脳細胞を、トリプシンによって解離させて、ポリ−Ｄ−リシン／ラミニンガラスカバースリップ上の、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、および抗生物質／抗真菌混合物を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で６日間、培養した。次に、細胞を、示した濃度のホメオタンパク質で２４時間処理してから、１００μＭ  Ｈ２Ｏ２で１時間誘発（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）して、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。ＤＮＡ切断を、τ２ＨＡＸ免疫蛍光法により可視化した。グラフ中の各データ点は、細胞の核中の、中程度から大きな病巣の数を表す。１条件につき４つのカバースリップが、そしてカバースリップあたり５〜１０個の細胞が存在した。病巣のない細胞は含めなかった。
【０１０１】
群間の差を、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定に続いて、Ｄｕｎｎの多重比較検定を用いて評価した。
【０１０２】
７．１．Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ  １の用量反応（図５．１）
１００μＭＨ  Ｈ２Ｏ２で処理すると、病巣の数は、１．９から８．３個／細胞に有意に増大した（ｐ＜０．０１）。Ｅｎ１による前処理は、病巣の数を用量依存的に減少させた。１ｎｇ／ｍｌ（０．２５ｎＭ）では、Ｈ２Ｏ２によって引き起こされる病巣の数は部分的に、しかし有意に減少した（ｐ＜０．０１）。５ｎｇ／ｍｌ（１．２５ｎＭ）および２０ｎｇ／ｍｌ（０．５ｎＭ）では、病巣の数はさらに減少したが（ｐ＜０．０１）、ビヒクル処理対照条件よりもずっと多かった（ｐ＜０．０１）。１００ｎｇ／ｍｌ（２．５ｎＭ）では、対照処理細胞と区別できなかったので、Ｈ２Ｏ２によって生じるＤＮＡ切断を完全に防止した。
【０１０３】
７．２．Ｇｂｘ２の用量反応（図５．２）
Ｈ２Ｏ２で処理すると、ビヒクル処理対照と比較して、τ２ＨＡＸ病巣の数が有意に倍増した（ｐ＜０．０１）。１ｎｇ／ｍｌ（０．０２７ｎＭ）では、病巣の数は部分的に、しかし有意に減少した（ｐ＜０．０１）。２０ｎｇ／ｍｌ（０．５４ｎＭ）では、病巣の数がさらにいくらか減少し、１００ｎｇ／ｍｌ（２．６８ｎＭ）では、Ｈ２Ｏ２の作用を阻止した。
【０１０４】
７．３．Ｌｈｘ９の用量反応（図５．３）
Ｈ２Ｏ２で処理すると、ビヒクル処理対照と比較して、τ２ＨΑＸ病巣の数が有意に倍増した（ｐ＜０．０１）。５ｎｇ／ｍｌ（０．０２２ｎＭ）では、病巣の数が有意に減少し、この減少は、２０ｎｇ／ｍｌ（０．５４ｎＭ）ではさらに大きかったが、完全ではなかった。１００ｎｇ／ｍｌ（２．６８ｎＭ）では、Ｈ２Ｏ２の作用を完全に阻止した。
【０１０５】
結論
Ｅｎｇｒａｉｌｅｄホメオタンパク質は、黒質の成体ドーパミン作動性ニューロン中で発現される。Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ１ヘテロ接合マウスでは、当該ニューロンは、６週目に死に始め、酸化ストレスに対して感受性がより高く、かつ、野生型ニューロンに屈折した（ｉｎｆｌｅｃｔｅｄ  ｔｏ）急性かつ強力な酸化ストレス後に観察される特性に類似した特性を次第に発揮する。これらの変化として、ＤＮＡ鎖切断、ならびに核および核小体のいくつかのヘテロクロマチンマークの修飾（強度および分布）が挙げられる。Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ１およびＥｎｇｒａｉｌｅｄ２は、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ１ヘテロ接合マウスおよびパーキンソン病のマウスモデルにおいて、ドーパミン作動性ニューロン死に拮抗させるために以前に用いられた、生化学的に等価な形質導入タンパク質である。
【０１０６】
したがって、本発明者らは、急性酸化ストレス後に、単回のＥｎｇｒａｉｌｅｄ２注射が、核および核小体の全ヘテロクロマチンマークを回復し、ＤＮＡ鎖の切断数を減少させ、かつドーパミン作動性ニューロンをアポトーシスから保護することを示す。これらの結果は、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄが、黒質のドーパミン作動性ニューロンに存在するドーパミン作動性ニューロンの損傷を予防するだけでなく、当該ニューロンを、酸化ストレスによって損傷した場合に救済することができるという事実を支持している。
【０１０７】
高レベルの活性酸素種（ＲＯＳ）は、特にＤＤＲを直接誘導するＤＮＡレベルにて、毒性である。結果として、多量のＡＴＰおよびＲＯＳを産生する、代謝活性が高いニューロン、例えばＳＮｐｃ  ｍＤＡニューロンは、変性するリスクがある。ＤＮＡ損傷が、クロマチン変化（それ自体、ＤＮＡ修復機構を利用するのに必須である）を誘導するので、クロマチンリモデリング経路およびＤＤＲ経路が、相互に関連している。本研究は、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ遺伝子を、ｍＤＡニューロンにおける慢性形態および急性形態の酸化ストレスに付随するＤＮＡ損傷およびクロマチン変化の重要なレギュレータとして位置付ける。
【０１０８】
ｍＤＡニューロンが、進行性であるがＷＴマウスよりも速い死を示す、酸化ストレスのＥｎ＋／−慢性モデルは、成体網膜へのＯｔｘ２投薬量と同様に、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ投薬量が、成体ＳＮｐｃに重要であることを示している。実際、Ｅｎ１とＥｎ２が生化学的に同等であることを考えると、４つのうち１つの対立遺伝子のみが喪失しても、細胞死を加速するのに十分である。老化および神経学的疾患の関連で、このことは、Ｅｎ１＋／−マウスにおけるｍＤＡニューロンが、ＰＤの動物モデルに用いた毒素である６−ＯＨＤＡに対してより速く、かつ感受性がより高いことを示唆している。
【０１０９】
ＰＤは、たとえそのファミリ形態であっても、生涯でかなり遅くに現れ、年齢に関連したリスクであることを明白に示している。ＥｎｇｒａｉｌｅｄがＰＤ遺伝子でないとしても、その老化防止特性は、ＥＮ１多型の関連性およびＰＤを発症するリスクを説明するかもしれない。これに関連して、Ｅｎ１＋／−マウスまたは急性６−ＯＨＤＡモデルのいずれかにおいて観察されるいくつかの表現型が、ＰＤ患者またはＰＤモデルにおいてなされた観察を連想させることは、注目に値する。例えば、ＳＮｐｃ  ｍＤＡニューロンにおけるＭｅＣＰ２の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性経路を損なう；ＪＮＫ経路およびサイクリン経路は、ＰＤに包含され、そしてヌクレオリン拡散は、ＰＤ患者において報告されている。
【０１１０】
以前の研究では、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄが、ＰＤの３つのマウスモデルにおいて、ｍＤＡニューロンを保護することが示された（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。本研究は、６−ＯＨＤＡが、ＳＮｐｃ中に直接注射されるのではなく、線条体中に注射される（長期の二次効果を妨げる急性かつ厳しい方法である）という意味で、非常に異なっていた。より重要なことに、以前の研究では、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄは、６−ＯＨＤＡ注射の３０分後に注射されずに、線条体傷害の３週前にＳＮｐｃ中に注入された。最後に、以前の研究に反して、本研究は、転写レギュレータおよびエピジェネティックレギュレータとしてのＥｎｇｒａｉｌｅｄの役割を確立するが、これは、たとえ２つの作用モードが協働して細胞を救い得るとしても、タンパク質翻訳レベルにおいてだけではない。この転写活性およびエピジェネティック活性は、ＥｎｇｒａｉｌｅｄがｍＤＡニューロンの生存に及ぶ、長期間持続する作用を有し得ることを示唆しているため、非常に重要である。さらに、本研究は、以前の研究に反して、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄが酸化ストレス誘導損傷を予防するだけでなく、ドーパミン作動性を救助するのに有用であり得ることを示している。
【０１１１】
ゆえに、短期的作用および長期的作用に基づく機構を提案することができる。短期的作用として、ミトコンドリアタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１：Ｓｔｅｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、そして特に、以下のものだけではないが、抗アポトーシス遺伝子の転写（本研究）、および既に提案されているアポトーシスの抑制（Ａｌｂｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｂｅｌｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）が挙げられ、外観上、ＧＡＤＤ４５ｂ／ｇ、ＮＦ−ｋＢ、およびＪＮＫの経路で優勢である。本発明者らは、持続的な作用が、ＷＴおよびＥｎ１＋／−のＳＮｐｃのトランスクリプトームを比較する本発明者らの初期のＲＮＡ−ｓｅｑ研究において強調した遺伝子の調節に基づいて、２つの高度に相互関連する経路であるクロマチン再構築およびＤＮＡ修復の双方を可能にする転写機構およびエピジェネティック機構に関連することを提唱する。
【０１１２】
結論として、ＰＤモデルにおけるＥｎｇｒａｉｌｅｄの保護作用（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）は、本データと共に、ｍＲＮＡ翻訳、および直接的または間接的な遺伝子転写の双方のレベルにて作用する治療用タンパク質としてＥｎｇｒａｉｌｅｄを用いる発想を、正当に評価している。
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
配列番号：  １
<223>    合成ポリペプチド
配列番号：  ５から５０
<223>    合成オリゴヌクレオチド
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５．１】
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【図５．２】
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【図５．３】
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【図Ｓ１Ａ】
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【図Ｓ１Ｂ】
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【図Ｓ１Ｃ】
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【図Ｓ１Ｄ】
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【図Ｓ１Ｅ】
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【図Ｓ１Ｆ】
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【図Ｓ１Ｇ】
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【図Ｓ１Ｈ】
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【図Ｓ２Ａ】
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【図Ｓ２Ｂ】
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【図Ｓ２Ｃ】
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【図Ｓ２Ｄ】
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【図Ｓ２Ｅ】
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【図Ｓ２Ｆ】
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【図Ｓ２Ｇ】
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【図Ｓ２Ｈ】
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【図Ｓ２Ｉ】
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【図Ｓ３Ａ】
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【図Ｓ３Ｂ】
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【図Ｓ３Ｃ】
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【図Ｓ３Ｄ】
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【図Ｓ３Ｅ】
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【図Ｓ３Ｆ】
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【図Ｓ４Ａ】
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【図Ｓ４Ｂ】
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【図Ｓ４Ｃ】
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【図Ｓ４Ｄ】
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【図Ｓ４Ｅ】
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【図Ｓ４Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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