(57)【要約】本発明は、脈絡膜血管新生の処置のための方法及び医薬組成物に関する。詳しくは、本発明は、脈絡膜血管新生の処置を必要とする被験体における脈絡膜血管新生の処置方法であって、治療有効量のミネラルコルチコイド受容体拮抗薬を被験体に投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脈絡膜血管新生の処置を必要とする被験体における脈絡膜血管新生の処置方法であって、治療有効量のミネラルコルチコイド受容体拮抗薬を被験体に投与することを含む方法。
【請求項２】
被験体が、加齢黄斑変性症、近視性脈絡膜血管新生、特発性脈絡膜血管新生、中心性漿液性脈絡網膜症を伴うか又は伴わないポリープ状脈絡網膜症、並びに後部ブドウ膜炎、外傷性脈絡膜破裂、網膜色素線条症、及び眼ヒストプラズマ症候群のような、ある種の炎症症状からなる群より選択される疾患に罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
脈絡膜血管新生が、加齢黄斑変性症に続発する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
脈絡膜血管新生が、病的近視に続発する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
脈絡膜血管新生が、特発性脈絡膜血管新生である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
被験体が、ポリープ状脈絡膜血管症に罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＭＲ拮抗薬が、エポキシ−ステロイド系ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬又は非エポキシ−ステロイド系ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＭＲ拮抗薬が、抗ＶＥＧＦ剤と併用して被験体に投与される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
被験体が、抗ＶＥＧＦ処置に難治性である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ＭＲ拮抗薬が、硝子体内、又は結膜下、テノン嚢下、眼球周囲、眼球後、強膜内、脈絡膜上などの眼周囲の腔のいずれかに直接に注入される、眼内又は眼周囲投与によって被験体に投与される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ＭＲ拮抗薬が、結膜下腔内又は硝子体内に注入されるミクロスフェアの形態で被験体に投与される、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脈絡膜血管新生の処置のための方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、網膜内液若しくは網膜下液の滲出、出血、又は黄斑の線維症に起因する視力低下を引き起こし得る。ＣＮＶの最も重要な原因は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）及び病的近視（ＰＭ）である。炎症、ポリープ状脈絡膜症、又は中心性漿液性脈絡網膜症のような他の原因が認められている。例えば、ＡＭＤは、全高所得諸国において高齢者に影響を及ぼす失明及び重度の視力障害の主要な原因である。この疾患の有病率は、５０歳以降１０年毎に指数関数的に増加する。ＰＭは、一般人口の約２％でよく見られる。近視性ＣＮＶは、ＰＭの眼における重度の視力低下及び失明の主要な原因であり、これらは罹患した眼の４〜１１％で発症する。これは、アジア人の５０歳未満の人々には特に多い。ＣＮＶは、視力を脅かす最重要因子であり、一般にＡＭＤ及びＰＭに続発する。網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に対する酸化ストレスは、細胞外デブリの蓄積を引き起こし、その結果ドルーゼンが生じて、栄養に対するブルッフ（Bruch）膜の浸透性に影響することによってＲＰＥ細胞の機能障害をもたらすと考えられている。ＶＥＧＦは、ＲＰＥ及び網膜光受容器によって通常産生される重要な血管新生促進因子である。ＣＮＶでは、ＲＰＥは非定型血管新生を促進し、そしてＶＥＧＦは新血管の発生及び進展を担う主要な成長因子である。抗ＶＥＧＦ薬によりＶＥＧＦの活性を阻害するという考えは、眼の新生血管障害の対応において、特に、その結果の処置、即ち、網膜下液及び／又は網膜内液の処置のために研究されている。現在の抗ＶＥＧＦ処置はＣＮＶの完全な退縮を誘導せず、視力維持のために反復注射を必要としている。更には、抗ＶＥＧＦ療法耐性に関する証拠が、ＣＮＶの処置のための代替医薬品の必要性を示唆している。
【０００３】
発明の要約
本発明は、脈絡膜血管新生の処置のための方法及び医薬組成物に関する。詳しくは、本発明は請求の範囲により定義される。
【０００４】
発明の詳細な説明
本発明は、脈絡膜血管新生の処置を必要とする被験体における脈絡膜血管新生の処置方法であって、治療有効量のミネラルコルチコイド受容体拮抗薬を被験体に投与することを含む方法に関する。
【０００５】
本明細書に使用されるとき、「脈絡膜血管新生」又は「ＣＮＶ」という用語は、当該分野におけるその一般的な意味を有しており、網膜色素上皮下で、若しくは網膜下腔へと広がるか、又は両方の組合せの脈絡膜からの新生血管の成長のことをいう。
【０００６】
本明細書で使用されるとき、「処置」又は「処置する」という用語は、疾患に罹患する危険性がある被験体又は疾患に罹患した疑いのある被験体の、更には病気であるか又は疾患若しくは病状に罹患していると診断されている被験体の処置を含む、予防又は防止処置、並びに治癒的又は病態修飾処置の両方のことをいい、そして臨床的再発の抑制を含む。処置は、医学的障害を有する被験体又は最終的にはその障害が起こり得る被験体に対して、障害又は再発性障害１つ以上の症状を予防し、治癒し、発症を遅延し、重症度を軽減するか、又は改善するために、あるいはそのような処置の非存在下で予想される以上に被験体の生存期間を延長させるために実施することができる。「治療レジメン」とは、病気の処置パターン、例えば、治療中に使用される投薬パターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含むことができる。「導入レジメン」又は「導入期間」という語句は、疾患の初期処置に使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）のことをいう。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間中に高レベルの薬物を被験体に提供することである。導入レジメンは、医師が維持レジメンの間に使用するであろうよりも多量の薬物を投与すること、医師が維持レジメンの間に薬物を投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含むことができる、「負荷レジメン」を（部分的又は全体的に）採用することができる。「維持レジメン」又は「維持期間」という語句は、病気の処置中に被験体の維持のために、例えば、被験体を長期間（数カ月又は数年）寛解期に保つために、使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）のことをいう。維持レジメンは、持続的療法（例えば、毎週、毎月、毎年などの定期的な間隔で薬物を投与する）又は間欠的療法（例えば、処置中断、間欠的処置、再発時の処置、又は特定の予め定められた基準［例えば、疼痛、疾患の発現など］の達成時の処置）を採用することができる。
【０００７】
ＣＮＶを伴う代表的な疾患は、加齢黄斑変性症、近視性脈絡膜血管新生、特発性脈絡膜血管新生、中心性漿液性脈絡網膜症を伴うか又は伴わないポリープ状脈絡網膜症を含み、そしてある種の炎症症状もまたこの病状を誘導しうる。本発明において、ＣＮＶを伴う疾患は、上記の疾患に限定されず、ブルッフ膜及び網膜色素上皮のレベルでの損傷と、それに続く炎症性脈絡膜血管新生を生じさせる他の疾患（後部ブドウ膜炎、外傷性脈絡膜破裂、網膜色素線条症、及び眼ヒストプラズマ症候群など）に起因するＣＮＶを伴う疾患も含む。
【０００８】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）（加齢黄斑症とも呼ばれる）に続発するＣＮＶの処置に特に適している。ＡＭＤは、眼の進行性疾患であり、脈絡膜血管新生に関連している。ＡＭＤは、網膜の中心で最重要領域である黄斑に進行性の損傷を引き起こし、結果として中心視力が徐々に低下する。これは、高齢者の中心視力の不可逆的な低下の最大の一般的な原因である。これは、男性と女性の間で一般的に同程度に起こる。ＡＭＤには、ドライ（萎縮性）及びウェット（新血管性又は滲出性）ＡＭＤの２つの形態がある。黄斑変性症の患者の９０％がドライ型である。しかし、黄斑変性症に起因する失明の９０％は、その１０％のウェット型の人に発生する。
【０００９】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、病的近視に続発するＣＮＶの処置に特に適している。近視性脈絡膜血管新生は実に、病的近視を有する人に視力障害を引き起こす最も一般的な疾患である。黄斑部に血管が新たに生成すると、視力中心に暗点を生じさせる色素性線維瘢痕がしばしば形成される。日本人によく見られる過度の近視は、眼の前後長（眼軸）の異常な伸長によって引き起こされる。結果として、ＣＮＶのような種々の近視に特異的な眼底病変が、眼底の後極に発生し、これが視力障害を引き起こす可能性がある。
【００１０】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、特発性脈絡膜血管新生の処置に特に適している。特発性脈絡膜血管新生は、若い女性の片眼でしばしば発生し、ブドウ膜炎、傷害、膠原病、感染などが否定できる場合に診断することができる。新たに生成した小さな血管組織、出血、及び浮腫のような滲出性変化が網膜下に見られる。抗炎症性ステロイドによる処置の数ヶ月後に緩和するため、この疾患において炎症の関与が示唆されている。
【００１１】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）の処置に特に適している。ＰＣＶは、脈絡膜血管新生の特定の形態として分類されるが、その遺伝的に好都合な因子が古典的ＡＭＤとは異なり、動脈瘤性拡張及び漏出分岐血管として現れ、古典的な抗ＶＥＧＦ処置に対してより重要な抵抗性を有する、脈絡膜血管症の一形態である。ＰＣＶは、中心性漿液性脈絡網膜症を伴うことがあってもなくともよい。
【００１２】
本明細書に使用されるとき、「ＭＲ拮抗薬」という用語は、当該分野におけるその一般的な意味を有する。化合物のＭＲ拮抗作用は、J, Souque A, Wurtz JM, Moras D, Rafestin-Oblin ME. MolEndocrinol. 2000 Aug;14(8):1210-21; Fagart J, Seguin C, Pinon GM, Rafestin-Oblin ME. MolPharmacol. 2005 May;67(5):1714-22 又は Hellal-Levy C, Fagart J, Souque A, Wurtz JM, Moras D, Rafestin-Oblin ME. MolEndocrinol. 2000 Aug;14(8):1210-21に記載されるような、種々の方法を用いて決定することができる。典型的には、ルシフェラーゼ発現レポーター遺伝子と一緒のＣＯＳ細胞へのヒトミネラルコルチコイド受容体のトランスフェクションにより、候補化合物の存在下でのそのトランス活性化活性を測定できる。本発明に照らして、ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬は典型的には、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、甲状腺ホルモン受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レチノイン酸受容体、ファルネソイドｘ受容体、プレグナンｘ受容体、肝臓Ｘ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイドｘ受容体及び構成的アンドロスタン受容体のような関連受容体と比較すると、ミネラルコルチコイド受容体に対して選択的である。「選択的」とは、ミネラルコルチコイド受容体に対する拮抗薬の親和性が、関連受容体に対する親和性よりも少なくとも１０倍、典型的には２５倍、更に典型的には１００倍、なお典型的には５００倍高いことを意味する。ＭＲ拮抗薬は、当業者には周知の薬理化合物の一分類を構成する。
【００１３】
例えば、本発明のミネラルコルチコイド受容体拮抗薬は一般に、スピロラクトン型ステロイド化合物である。「スピロラクトン型」という用語は、ステロイド核に、典型的にはステロイド「Ｄ」環で、スピロ結合構造を介して結合したラクトン部分を含む構造を特徴付けることが意図される。スピロラクトン型ミネラコルチコイド受容体拮抗薬化合物のサブクラスは、エプレレノンのような、エポキシ−ステロイド系ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬化合物からなる。スピロラクトン型拮抗薬化合物の別のサブクラスは、スピロノラクトンのような、非エポキシ−ステロイド系ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬化合物からなる。
【００１４】
本発明の方法において使用されるエポキシ−ステロイド系ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬化合物は一般に、エポキシ型部分で置換されたステロイド核を有する。「エポキシ型」部分という用語は、２個の炭素原子の間の架橋として酸素原子を有することを特徴とする任意の部分を包含することが意図される。
【００１５】
「エポキシ−ステロイド系」という語句に使用されるとき、「ステロイド系」という用語は、従来型の「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、及び「Ｄ」環を有する、シクロペンテノ−フェナントレン部分によって提供される核を意味する。エポキシ型部分は、シクロペンテノ−フェナントレン核に任意の結合可能又は置換可能な位置で結合、即ち、ステロイド核の環の１つに縮合していてもよいか、あるいはこの部分は、環系の環員上で置換されていてもよい。「エポキシステロイド系」という語句は、１つ又は複数のエポキシ型部分を結合させているステロイド核を包含することが意図される。
【００１６】
本発明の方法に使用するために適切なエポキシ−ステロイド系ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬は、ステロイド核の「Ｃ」環に縮合したエポキシ部分を有する化合物の一群を含む。例としては、以下のような、９α，１１α−置換エポキシ部分の存在を特徴とする２０−スピロキサン（spiroxane）化合物を含む：
−  プレグナ−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、メチルエステル、（７α、１１α、１７β）
−  プレグナ−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、ジメチルエステル、（７α、１１α、１７β）
−  ３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β、７β、１１α、１７β）
−  プレグナ−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−（１−メチルエチル）エステル、モノカリウム塩、（７α、１１α、１７β）
−  プレグナ−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−メチルエチル）エステル、モノカリウム塩、（７α、１１α、１７β）
−  ３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−１，４，６−トリエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン（６β、７β、１１α）
−  ３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、メチルエステル、（６β、７β、１１α、１７β）
−  ３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、モノカリウム塩、（６β、７β、１１α、１７β）
−  ３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−１，４，６−トリエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン（６β、７β、１１α、１７β）
−  プレグナ−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、エチルエステル、（７α、１１α、１７β）
−  プレグナ−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、１−メチルエチルエステル（７α、１１α、１７β）。
【００１７】
エプレレノンによって例示されるような、エポキシステロイド系ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬を用いることの特別な利点は、ミネラルコルチコイド受容体に対するこの群のミネラルコルチコイド受容体拮抗薬の高い選択性である。エプレレノンの優れた選択性は、アンドロゲン又はプロゲステロン受容体のような、関連受容体への非選択的結合を示すミネラルコルチコイド受容体拮抗薬によって引き起こされ得る副作用の減少をもたらす。
【００１８】
これらのエポキシステロイド類は、Grobらの米国特許第4,559,332号に記載の手順により調製することができる。９，１１−エポキシステロイド化合物及びこれらの塩の調製のための更に別の方法は、NgらのWO 97/21720及びNgらのWO 98/25948に開示されている。
【００１９】
特に関心の対象は、エポキシメクスレノン（epoxymexrenone）としても知られている、化合物エプレレノン（プレグナ−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、メチルエステル、（７α、１１α、１７β））（ＣＡＳ番号 107724-20-9）である。エプレレノンは、ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬であり、例えば、スピロノラクトンよりもミネラルコルチコイド受容体に対して高い選択性を有する。本発明の方法におけるミネラルコルチコイド受容体拮抗薬としてエプレレノンを選択することは、特異性の低いミネラルコルチコイド受容体拮抗薬の使用により起こる、女性化乳房のようなある種の副作用を減少させるのに有益であろう。
【００２０】
本発明の方法における使用に適した非エポキシステロイド系ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬は、式（Ｉ）：
【００２１】
【化１】
2018535954.tif 000002
［式中、
【００２２】
【化２】
2018535954.tif 000003
であり、
−  Ｒは、最大５個の炭素原子の低級アルキルであり、そして
【００２３】
【化３】
2018535954.tif 000004
である］
で定義されるスピロラクトン型化合物の一群を含む。
【００２４】
低級アルキル残基は、分岐及び非分岐基、例えば、メチル、エチル及びｎ−プロピルを含む。
【００２５】
式（Ｉ）に含まれる対象となる特定化合物は、以下のものである：
−  ７α−アセチルチオ−３−オキソ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
−  ３−オキソ−７α−プロピオニルチオ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
−  ６β，７β−メチレン−３−オキソ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
−  １５α，１６α−メチレン−３−オキソ−４，７α−プロピオニルチオ−４−アンドロステン［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
−  ６β，７β，１５α，１６α−ジメチレン−３−オキソ−４−アンドロステン［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
−  ７α−アセチルチオ−１５β，１６β−メチレン−３−オキソ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
−  １５β，１６β−メチレン−３−オキソ−７β−プロピオニルチオ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；及び
−  ６β，７β，１５β，１６β−ジメチレン−３−オキソ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン。
【００２６】
式（Ｉ）の化合物の製造方法は、１９７８年１２月１２日に発行されたWiechartらの米国特許第4,129,564号に記載されている。
【００２７】
対象となる非エポキシステロイド系化合物の別の一群は、式（II）：
【００２８】
【化４】
2018535954.tif 000005
［式中、Ｒ１は、Ｃ１−３−アルキル又はＣ１−３−アシルであり、そしてＲ２は、Ｈ又はＣ１−３−アルキルである］で定義される。
【００２９】
式（II）に含まれる対象となる特定化合物は、以下のものである：
−  １α−アセチルチオ−１５β，１６β−メチレン−７α−メチルチオ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４−エン−２１，１７−カルボラクトン；及び
−  １５β，１６β−メチレン−１α，７α−ジメチルチオ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４−エン−２１，１７−カルボラクトン。
【００３０】
式（II）の化合物の製造方法は、１９８８年１２月６日に発行されたNickischらの米国特許第4,789,668号に記載されている。
【００３１】
対象となる非エポキシステロイド系化合物の更に別の一群は、式（III）：
【００３２】
【化５】
2018535954.tif 000006
［式中、Ｒは、低級アルキルであって、その例は、メチル、エチル、プロピル及びブチルの低級アルキル基を含む］の構造で定義される。対象となる特定化合物は、以下を含む：
−  ３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグナ−５，１５−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
−  ３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグナ−５，１５−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン ３−アセタート；
−  ３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグナ−５−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
−  ３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグナ−５−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン ３−アセタート；
−  ２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
−  ２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４，６−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
−  ２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−１，４−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
−  ７α−アシルチオ−２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；及び
−  ７α−アセチルチオ−２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン。
【００３３】
式（III）の化合物の製造方法は、１９６６年６月２１日に発行されたPatchettの米国特許第3,257,390号に記載されている。
【００３４】
対象となる非エポキシステロイド系化合物のなお別の一群は、式（IV）：
【００３５】
【化６】
2018535954.tif 000007
［式中、Ｅ’は、エチレン、ビニレン及び（低級アルカノイル）チオエチレン基からなる群より選択され、Ｅ”は、エチレン、ビニレン、（低級アルカノイル）チオエチレン及び（低級アルカノイル）チオプロピレン基からなる群より選択され；Ｒは、Ｅ’及びＥ”が、それぞれエチレン及び（低級アルカノイル）チオエチレン基である場合を除いてメチル基であり、Ｅ’及びＥ”がそのような場合には、Ｒは、水素及びメチル基からなる群より選択され；そしてＥ’及びＥ”の選択は、少なくとも１個の（低級アルカノイル）チオ基が存在するというものである］により表される。
【００３６】
式（IV）に含まれる非エポキシステロイド系化合物の一群は、式（Ｖ）：
【００３７】
【化７】
2018535954.tif 000008
により表される。
【００３８】
式（Ｖ）の別の化合物は、１−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３−オンラクトンである。
【００３９】
式（IV）に含まれる非エポキシステロイド系化合物の別の一群は、式（VI）：
【００４０】
【化８】
2018535954.tif 000009
により表される。
【００４１】
式（VI）に含まれる例示化合物は、以下を含む：
−  ７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３−オンラクトン；
−  ７β−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３−オンラクトン；
−  １α，７α−ジアセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４，６−ジエン−３−オンラクトン；
−  ７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−３−オンラクトン；
−  ７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−１９−ノルアンドロスタ−４−エン−３−オンラクトン；及び
−  ７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−６α−メチルアンドロスタ−４−エン−３−オンラクトン。
【００４２】
式（IV）〜（VI）において、「アルキル」という用語は、１〜約８個の炭素を含む直鎖及び分岐アルキル基を包含することが意図される。「（低級アルカノイル）チオ」という用語は、式：
【００４３】
【化９】
2018535954.tif 000010
で示される基を包含する。
【００４４】
特に関心の対象は、下記構造：
【００４５】
【化１０】
2018535954.tif 000011
を有する化合物スピロノラクトン（１７−ヒドロキシ−７α−メルカプト−３−オキソ−１７α−プレグナ−４−エン−２１カルボン酸γ−ラクトン アセタート）である。
【００４６】
式（IV）〜（VI）の化合物の製造方法は、１９６１年１２月１２日に発行された、Cellaらの米国特許第3,013,012号に記載されている。スピロノラクトンは、G. D. Searle & Co., Skokie, Ill.により、「アルダクトン（ALDACTONE）」という商標の下、１錠当たり２５mg、５０mg及び１００mgの用量で錠剤の投与剤形で販売されている。
【００４７】
ステロイド系ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬の別の一群は、ドロスピレノン（drospirenone）、（６Ｒ−（６α，７α，８β，９α，１０β，１３β，１４α，１５α，１６α，１７β））−１，３’，４’，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，２０，２１−ヘキサデカヒドロ−１０，１３−ジメチルスピロ［１７Ｈ−ジシクロプロパ（６，７：１５，１６）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−１７，２’（５’Ｈ）−フラン］−３，５’（２Ｈ）−ジオン、ＣＡＳ登録番号 67392-87-4を例とする。ドロスピレノンの製造方法及び使用方法は、特許GB 1550568 1979（優先権 DE 2652761 1976）に記載されている。
【００４８】
ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬であるエプレレノンについては、取り扱いが容易で、形態が再現可能で、容易に調製され、安定であり、そして非吸湿性である結晶形が同定されている。これらは、結晶形Ｈ、結晶形Ｌ、種々の結晶性溶媒和物及び無定形エプレレノンを含む。これらの結晶形、これらの結晶形の製造方法、並びに組成物及び薬剤の調製におけるこれらの結晶形の使用は、BartonらのWO 01/41535及びBartonらのWO 01/42272に開示されており、両者ともその全体が本明細書に取り込まれる。
【００４９】
本発明のミネラルコルチコイド受容体拮抗薬はまた、非ステロイド系であってもよい。例えば、非ステロイド系ＭＲ拮抗薬の分類は、ここ数年の間に出現し始めたばかりである（Meyers, Marvin J1; Hu Xiao Experts Opinion on Therapeutic Patents, Volume 17, Number 1, January 2007, pp. 17-23(7) 及び Piotrowski DW. Mineralocorticoid Receptor Antagonists for the Treatment of Hypertension and Diabetic Nephropathy J. Med. Chem. 2012, 55, 7957-7966）。例えば、ジヒドロピリミジン類は、ＭＲ拮抗作用を示すことが明らかになっている（Activation of Mineralocorticoid Receptors by Exogenous Glucocorticoids and the Development of Cardiovascular Inflammatory Responses in Adrenalectomized Rats. Young MJ, Morgan J, Brolin K, Fuller PJ, Funder JW. Endocrinology. 2010 Apr 21）。更には、Arhancetらは、非ステロイド系ＭＲ拮抗薬の他の分類を開示している（Arhancet GB, Woodard SS, Dietz JD, Garland DJ, Wagner GM, Iyanar K, Collins JT, Blinn JR, Numann RE, Hu X, Huang HC. Stereochemical Requirements for the Mineralocorticoid Receptor Antagonist Activity of Dihydropyridines. J Med Chem. 2010 Apr 21）。他の例示的な非ステロイド系ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬は、US 20090163472、WO 2004052847、WO 2008053300、WO 2008104306、WO 2007025604、WO 201264631、WO 2008126831、WO 2012008435、WO 2010104721、WO 200985584、WO 200978934、WO 2008118319、WO 200917190、WO 200789034、WO 2012022121、WO 2012022120、WO 2011141848及びWO 200777961（引用例として本開示に取り込まれる）に記載されているものを含むがこれらに限定されない。
【００５０】
幾つかの実施態様において、ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬は、以下：
【００５１】
【化１１】
2018535954.tif 000012
2018535954.tif 000013
からなる群より選択される。
【００５２】
「治療有効量」とは、任意の医学的処置に適用可能な妥当な便益／リスク比でのＣＮＶの処置のために充分なＭＲ拮抗薬の量を意味する。当然のことながら、本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されよう。任意の特定の被験体に対する具体的な治療有効量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成物；被験体の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食生活；投与時間、投与経路、及び使用される具体的な化合物の排出速度；処置の継続期間；使用される具体的なポリペプチドと併用して又は同時に使用される薬物；並びに医学分野で周知の同様の要因を含む種々の要因に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルより低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、充分に当業者の守備範囲内である。しかしながら、本製品の１日投与量は、１日当たり成人１人当たり０．０１〜１，０００mgの広い範囲にわたって変化させることができる。好ましくは、組成物は、処置される被験体への投与量の対症的調整のためにＭＲ拮抗薬０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgを含有する。医薬品は、典型的にはＭＲ拮抗薬約０．０１mg〜約５００mg、好ましくはＭＲ拮抗薬１mg〜約１００mgを含有する。薬物の有効量は、通常は０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重/日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重/日の投与量レベルで供給される。
【００５３】
幾つかの実施態様において、本発明のＭＲ拮抗薬は、抗ＶＥＧＦ剤と併用して被験体に投与される。
【００５４】
本明細書に使用されるとき「抗ＶＥＧＦ剤」とは、ＶＥＧＦが介在する血管形成を阻害する分子のことをいう。例えば、抗ＶＥＧＦ治療剤は、ＶＥＧＦに対する抗体か又は他の拮抗薬であるかもしれない。「抗ＶＥＧＦ抗体」は、本発明の方法において有用であるために充分な親和性及び特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常はＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃのような他のＶＥＧＦホモログ、あるいはＰ１ＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦのような他の成長因子には結合しないであろう。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ（登録商標）HB 10709によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体A4.6.1と同じエピトープに結合し、かつ高親和性抗ＶＥＧＦ抗体である、モノクローナル抗体である。「高親和性抗ＶＥＧＦ抗体」は、モノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体A4.6.1よりもＶＥＧＦに対して少なくとも１０倍高い親和性を有する。好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、WO98/45331により作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体断片であって、Y0317のＣＤＲ又は可変領域を含む抗体を含む。更に好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、ラニビズマブ（LUCENTIS（登録商標））として知られる抗体断片である。抗ＶＥＧＦ抗体のラニビズマブは、ヒト化親和性成熟抗ヒトＶＥＧＦ Ｆａｂ断片である。ラニビズマブは、大腸菌（E. coli）発現ベクターにおける標準的な組換え手法及び細菌発酵によって産生される。ラニビズマブは、グリコシル化されておらず、≒４８，０００ダルトンの分子量を有する。WO 98/45331及びUS 2003/0190317を参照のこと。抗ＶＥＧＦ剤は、ベバシズマブ（ｒｈｕＭａｂ ＶＥＧＦ、Avastin（登録商標）、Genentech, South San Francisco Calif.）、ラニビズマブ（ｒｈｕＦＡｂ Ｖ２、Lucentis（登録商標）、Genentech）、ペガプタニブ（Macugen（登録商標）、Eyetech Pharmaceuticals, New York N.Y.）、マレイン酸スニチニブ（Sutent（登録商標）、Pfizer, Groton Conn.）を含むがこれらに限定されない。幾つかの実施態様において、抗ＶＥＧＦ剤は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したヒトＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２受容体細胞外ドメインの主要リガンド結合部分からなる２つの受容体−Ｆｃ融合タンパク質から構成される、高親和性でＶＥＧＦに結合することができる二量体融合タンパク質である（「ＶＥＧＦトラップ」、アフリベルセプトと呼ばれる）。具体的には、ＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦＲ１由来のＩｇドメイン２からなり、これがＶＥＧＦＲ２由来のＩｇドメイン３に融合され、次にこれがＩｇＧ１のＦｃドメインに融合されている。
【００５５】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、抗ＶＥＧＦ処置に難治性の被験体の処置に特に適している。
【００５６】
本明細書に使用されるとき、「抗ＶＥＧＦ処置に難治性の被験体」という表現は、抗ＶＥＧＦ剤での処置に対してノンレスポンダーであるか又は不十分なレスポンダーである被験体に適用される。「ノンレスポンダー」とは、被験体が抗ＶＥＧＦ剤でその症状を回復、改善、又は安定化しないことを意味する。例えば、抗ＶＥＧＦ処置に難治性の被験体は、抗ＶＥＧＦ剤での処置が失敗に終わった被験体か、又は抗ＶＥＧＦ剤に基づく処置にうまく反応できないことが知られている被験体である。
【００５７】
ＭＲ拮抗薬は、典型的には、医薬組成物を形成するために、薬学的に許容し得る賦形剤、及び場合により徐放性マトリックス（生分解性ポリマーなど）と組合せられる。「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」という用語は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応又は他の不都合な反応を生じさせない分子実体及び組成物のことをいう。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤とは、任意のタイプの非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤補助剤のことをいう。
【００５８】
幾つかの実施態様において、本発明のＭＲ拮抗薬は、硝子体内又は眼周囲の腔（結膜下、テノン嚢下、眼球周囲、眼球後、強膜内、脈絡膜上など）のいずれかに直接に注入される、眼内又は眼周囲投与によって被験体に投与される。
【００５９】
幾つかの実施態様において、本発明のＭＲ拮抗薬は、種々の期間にわたって薬物負荷を放出し得る、ポリマーインプラント及びミクロスフェアの形態で被験体に投与される。これらのインプラント又はミクロスフェアは、眼の結膜下（テノン嚢下など）腔又は硝子体内に挿入されると、長期間（例えば、約１週間以上）治療レベルのＭＲ拮抗薬を提供する。
【００６０】
本明細書に使用されるとき、「ミクロスフェア」という用語は、当該分野において一般的な意味を有しており、そして結膜下（即ち、テノン嚢下）又は硝子体内に投与されるように構築されるか、サイズ化されるか、そうでなければ構成される、小径又は低寸法のデバイス又は要素のことをいう。ミクロスフェア又は微粒子は、治療剤を封入するか又は取り込む生体適合性マトリックスを含む、粒子、ミクロ又はナノスフェア、小断片、微粒子、ナノ粒子、微粉末などを含む。ミクロスフェアは、一般に、眼の生理的状態と生体適合性があり、著しい有害な副作用を引き起こさない。眼内投与されたミクロスフェアは、眼の視覚を乱すことなく安全に使用することができる。ミクロスフェアは、直径又は長さなどの最大寸法が１mm未満である。例えば、微粒子は、約５００μm未満の最大寸法を有することができる。ミクロスフェアはまた、約２００μm以下の最大寸法を有することができるか、又はとりわけ約３０μm〜約５０μmの最大寸法を有してもよい。「インプラント」は、ミクロスフェアよりもかなり大きい薬物送達デバイスであり、眼球の症状（緑内障など）を処置するためには多数（即ち、数百又は数千）のミクロスフェアが投与されるのに対して、同じ目的に通常わずか１個から多くとも６個までのインプラントが投与される。
【００６１】
典型的には、本発明のＭＲ拮抗薬は、好ましくは、インプラント又はミクロスフェアの約１重量％〜９０重量％である。更に好ましくは、ＭＲ拮抗薬は、インプラント又はミクロスフェアの約５重量％〜約３０重量％である。好ましい実施態様において、ＭＲ拮抗薬は、ミクロスフェアの約１０重量％（例えば、５％〜１５％）を占める。幾つかの実施態様において、ＭＲ拮抗薬は、ミクロスフェアの約４０重量％を占める。
【００６２】
インプラント又はミクロスフェアに使用するのに適したポリマー材料又は組成物は、眼の機能性又は生理に実質的な干渉を引き起こさないように、眼との適合性、即ち、生体適合性のある材料を含む。このような材料は、好ましくは、少なくとも部分的に、そして更に好ましくは実質的に完全に生分解性である。「生分解性ポリマー」は、インビボで分解するポリマー（単数又は複数）であって、このポリマー（単数又は複数）の経時的な侵食が治療剤の放出と同時に又は放出後に起こるポリマーである。「生分解性」及び「生体内侵食性」という用語は同等であり、本明細書では互換的に使用される。生分解性ポリマーは、ホモポリマー、コポリマー、又は３種以上の異なるポリマー単位を含むポリマーであってもよい。有用なポリマー材料の例としては、分解されると生理学的に許容し得る分解産物（モノマーを含む）を生じる、有機エステル類及び有機エーテル類から誘導される材料、及び／又はこれら有機エステル類及び有機エーテル類を含む材料が挙げられるがこれらに限定されない。また、単独で又は他のモノマーと組合せられて、無水物、アミド、オルトエステルなどから誘導されるポリマー材料、及び／又はこれら無水物、アミド、オルトエステルなどを含むポリマー材料も、用いることができる。ポリマー材料は、付加又は縮合ポリマーであってもよく、有利には縮合ポリマーである。ポリマー材料は架橋されていても架橋されていなくともよく、例えば、ポリマー材料の約５％未満、又は約１％未満が架橋されているというように、せいぜい軽度に架橋されていてもよい。大部分、炭素及び水素の他に、ポリマーは、酸素及び窒素の少なくとも一方を、有利には酸素を含む。酸素は、オキシ、例えば、ヒドロキシ又はエーテルとして、カルボニル、例えば、カルボン酸エステルのような非オキソ−カルボニルなどとして存在してもよい。窒素は、アミド、シアノ及びアミノとして存在してよい。制御薬物送達のための封入を記載している、Heller, Biodegradable Polymers in Controlled Drug Delivery, In: CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Vol. 1, CRC Press, Boca Raton, Fla. 1987, pp 39-90に明記されるポリマーは、本発明のミクロスフェアに用いることができる。特に関心の対象は、ホモポリマー又はコポリマーのいずれかのヒドロキシ脂肪族カルボン酸のポリマー、及び多糖類である。対象となるポリエステルには、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、ラセミ乳酸、グリコール酸、カプロラクトン、及びこれらの組合せのホモポリマー又はコポリマーが含まれる。グリコール酸と乳酸のコポリマーは、特に興味深く、ここでは生分解速度が、グリコール酸対乳酸の比によって制御される。ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）コポリマー中の各モノマーの割合は、０〜１００％、約１５〜８５％、約２５〜７５％、又は約３５〜６５％であってよい。幾つかの実施態様において、２５／７５ ＰＬＧＡ及び／又は５０／５０ ＰＬＧＡコポリマーが使用される。生分解性眼内インプラントはまた、ＭＲ拮抗薬の放出を加速又は遅延させる追加の親水性又は疎水性化合物を含んでもよい。よって、中心が１つの材料からなり、そして表面が同一又は異なる組成の１層以上の層を有してもよいインプラント又はミクロスフェアを調製することができ、ここで層は架橋されていてもよいか、又は異なる分子量、異なる密度若しくは空隙率などのものであってもよい。例えば、初期ボーラス投与の薬物を迅速に放出することが望ましい場合、初期分解速度が向上するように、ミクロスフェアの中心は、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマーで被覆されたポリ乳酸であってもよい。あるいは、外側ポリ乳酸の分解により、中心が溶解して眼から急速に洗い流されるように、中心は、ポリ乳酸で被覆されたポリビニルアルコールであってもよい。
【００６３】
インプラント又はミクロスフェアは、マイクロ及びナノスフェア、マイクロ及びナノ粒子、球、粉末、断片などを含む、任意の粒状の幾何形状であってよい。ミクロスフェアのサイズの上限は、インプラントに対する耐性、挿入時のサイズ制限、所望の放出速度、取り扱いの容易さなどのような因子によって決定される。球は、直径約０．５μm〜４mmの範囲であり得、他の形状の粒子ではこれに匹敵する体積を有し得る。
【００６４】
治療剤に加えて、本明細書に開示されるインプラント及びミクロスフェアは、有効量の緩衝剤、保存料などを含む薬物送達系を含み得るか又はこのような系で提供され得る。適切な水溶性緩衝剤は、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなどのような、アルカリ及びアルカリ土類の炭酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩などを含むがこれらに限定されない。これらの薬剤は、系のｐＨを約２〜約９、更に好ましくは約４〜約８の間に維持するのに充分な量で存在するのが有利である。緩衝剤自体は、インプラント全体の約５重量％程度であり得る。適切な水溶性保存料は、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸塩、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、パラベン類、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、ベンジルアルコール、フェニルエタノールなど、及びこれらの混合物を含む。これらの薬剤は、約０．００１重量％〜約５重量％、好ましくは約０．０１重量％〜約２重量％の量で存在することができる。本発明のミクロスフェアの少なくとも１つにおいて、塩化ベンザルコニウム保存料がインプラント中に提供される。本明細書に開示されるインプラント及びミクロスフェアに含まれるＭＲ拮抗薬に加えて、ミクロスフェアはまた、１種以上の追加の眼科的に許容し得る治療剤を含むことができる。例えば、ミクロスフェアは、１種以上の抗ヒスタミン剤、１種以上の抗生物質、１種以上のβ遮断薬、１種以上のステロイド、１種以上の抗悪性腫瘍剤、１種以上の免疫抑制剤、１種以上の抗ウイルス剤、１種以上の酸化防止剤、及びこれらの混合物を含むことができる。あるいは、インプラント又はミクロスフェアの単回注射は、それぞれ異なる治療剤（単数又は複数）を含む、２種以上のミクロスフェアのバッチを含むことができる。異なるインプラント及びミクロスフェアのこのような混合物が本発明に含まれる。更には、米国特許第5,869,079号に記載されるような放出モジュレーターをインプラント又はミクロスフェアに含めることができる。使用される放出モジュレーターの量は、所望の放出プロフィール、モジュレーターの活性、及びモジュレーターの非存在下でのＭＲ拮抗薬の放出プロフィールに依存する。塩化ナトリウム及び塩化カリウムのような電解質もミクロスフェアに含められ得る。緩衝剤又はエンハンサーが親水性である場合、これは放出促進剤としても作用し得る。親水性添加剤は、ミクロスフェア中の薬物を包囲する材料を速く溶解して放出速度を増加させるように作用し、これにより、暴露される薬物の表面積が増加し、そのため薬物の生体内侵食速度が増加する。同様に、疎水性の緩衝剤又はエンハンサーは、より緩やかに溶解し、薬物の暴露を遅延させ、そのため薬物の生体内侵食速度を遅延させる。
【００６５】
典型的には、本発明のミクロスフェアは、ミクロスフェアを含む眼科的に許容し得る組成物を被験体に投与することにより、被験体に投与することができる。例えば、ミクロスフェアは、液体組成物、懸濁液、エマルジョンなどにして提供され得、眼の結膜下腔内への注入又は移植によって投与することができる。適切なサイズの針、例えば、２２ゲージ針、２７ゲージ針又は３０ゲージ針を含む注射器装置を効果的に使用して、ミクロスフェアを結膜下腔内又は硝子体内に注入することができる。
【００６６】
本発明は、以下の図面及び実施例によって更に説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、なんら本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】スピロノラクトンの皮下投与は、ラット眼におけるレーザーにより誘発された脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を制限する。ＣＮＶのピーク（即ち、レーザー誘発後１４日目）で実施された代表的な早期（Ａ〜Ｃ）及び後期（Ｄ〜Ｆ）のフルオレセイン血管造影（ＦＡ）により、レーザー対照群と比較して、スピロノラクトン処置群（ｓｐｉ）における血管漏出低下が強調される。硝子体内抗ＶＥＧＦ処置を陽性対照とする。ＦＡ（Ｇ）における血管漏出の等級付けにより、抗ＶＥＧＦ群（−３７％）に匹敵するスピロノラクトン処置（−４５％）での血管造影スコアの有意な減少が明らかになる。結果は、平均血管造影スコア／熱傷／ラット±ＳＥＭとして表される。両眼のそれぞれに６個のレーザー熱傷を作り、ラットｎ＝１１を対照群、６匹をスピロノラクトン群、及び５匹を抗ＶＥＧＦ群とした。クラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）検定を用いて、次にダン（Dunn）法により比較した。＊、Ｐ＜０．０５。硝子体内抗ＶＥＧＦ＋皮下スピロノラクトンの併用処置は、対照と比較して−８４％の漏出という有意な相加効果を示す（図示せず）。網膜色素上皮／脈絡膜フラットマウントにおけるＣＮＶをＦＩＴＣ−ＧＳＬ Ｉ−イソレクチンＢ４で標識した。スピロノラクトン処置群（Ｉ）は、レーザー対照（Ｈ）と比較してＣＮＶサイズの減少を示す。抗ＶＥＧＦ処置（Ｊ）は陽性対照群である。ＣＮＶ（Ｋ）のサイズの定量により、スピロノラクトン及び抗ＶＥＧＦ群のＣＮＶ体積のレーザー対照と比較した有意な減少が明らかになる。結果は、平均ＣＮＶ体積／熱傷／ラット±ＳＥＭとして表される。ラットの片眼当たり６個のレーザー熱傷、ラットｎ＝１１を対照群、６匹をスピロノラクトン群、及び７匹を抗ＶＥＧＦ群とした。クラスカル・ワリス検定を用いて、次にダンの多重比較を用いた。＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図２】レーザー誘発後の異なる時点におけるラット網膜組織におけるＭＲ発現。レーザー後３日目（マクロファージ浸潤のピーク）に、対照正常ラット眼（Ｃｔｒｌ、レーザー処置なし）と比較して、網膜色素上皮（ＲＰＥ）−脈絡膜複合体（左）及び神経網膜（右）の両方でＭＲは上方調節される。血管新生のピークである１６日目に、ＲＰＥ−脈絡膜（左）及び神経網膜（右）におけるＭＲ発現は、対照と同レベルまで低下することが判明した。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。ラットｎ＝６を対照、ラット５匹をＤ３、及びラット４匹をＤ１６とした。クラスカル・ワリス検定を用いて、次にダン法により比較した。＊、Ｐ＜０．０５。
【図３Ａ−Ｄ】スピロノラクトンは、レーザー３日後ラット網膜においてマクロファージ／ミクログリアの動員を阻害し、炎症促進遺伝子発現を下方調節する。マクロファージ／ミクログリアの浸潤／活性化のピークは、レーザー後３日目に存在する。網膜色素上皮（ＲＰＥ）−脈絡膜フラットマウント上で、これらの細胞をＩＢＡ１で標識した。円形の活性化ＩＢＡ１陽性細胞を、レーザー熱傷を有する領域で計数した。スピロノラクトン（Ｓｐｉ）は、無処置の眼（Ａ）と比較して、熱傷におけるＩＢＡ１陽性細胞を減少させる（Ｂ）。細胞の定量により、スピロノラクトン処置眼で観測された活性化マクロファージ／ミクログリアは、レーザー対照群よりも有意に少ないことが明らかになる（Ｃ）。Ａ及びＢのバー：１００μm。結果は、平均ＩＢＡ１陽性細胞／熱傷／ラット±ＳＥＭとして表される。ラットの片眼当たり６個のレーザー熱傷、ラットｎ＝７をレーザー群、及びラット４匹をレーザー＋Ｓｐｉ群とした。マンホイットニー（Mann Whitney）Ｕ検定を用いた、＊Ｐ＜０．０５。３日目の定量的ＰＣＲにより、スピロノラクトンが、ＲＰＥ−脈絡膜複合体におけるＭＣＰ１、ＩＬ１β、ＩＬ６及びＴＮＦαのレーザー誘発遺伝子発現を下方調節し（Ｄ）、そして神経網膜におけるＭＣＰ１、ＩＬ１β及びＴＮＦαのレーザー誘発遺伝子発現を下方調節する（Ｅ）ことが明らかになる。しかし、血管新生促進因子のＶＥＧＦ−Ａ及びＰｌＧＦの発現は、ＲＮＡレベルでは調節されず（Ｄ及びＥ）、このことは、スピロノラクトン効果がＶＥＧＦ及びＰｌＧＦとは無関係であることを示している。結果は、平均±ＳＥＭとして表され、ラットｎ＝５をレーザー群、及びラット６匹をスピロノラクトン群とした。マンホイットニーＵ検定を用いた。＊Ｐ＜０．０５。
【図３Ｄ（２）】スピロノラクトンは、レーザー３日後ラット網膜においてマクロファージ／ミクログリアの動員を阻害し、炎症促進遺伝子発現を下方調節する。マクロファージ／ミクログリアの浸潤／活性化のピークは、レーザー後３日目に存在する。網膜色素上皮（ＲＰＥ）−脈絡膜フラットマウント上で、これらの細胞をＩＢＡ１で標識した。円形の活性化ＩＢＡ１陽性細胞を、レーザー熱傷を有する領域で計数した。スピロノラクトン（Ｓｐｉ）は、無処置の眼（Ａ）と比較して、熱傷におけるＩＢＡ１陽性細胞を減少させる（Ｂ）。細胞の定量により、スピロノラクトン処置眼で観測された活性化マクロファージ／ミクログリアは、レーザー対照群よりも有意に少ないことが明らかになる（Ｃ）。Ａ及びＢのバー：１００μm。結果は、平均ＩＢＡ１陽性細胞／熱傷／ラット±ＳＥＭとして表される。ラットの片眼当たり６個のレーザー熱傷、ラットｎ＝７をレーザー群、及びラット４匹をレーザー＋Ｓｐｉ群とした。マンホイットニー（Mann Whitney）Ｕ検定を用いた、＊Ｐ＜０．０５。３日目の定量的ＰＣＲにより、スピロノラクトンが、ＲＰＥ−脈絡膜複合体におけるＭＣＰ１、ＩＬ１β、ＩＬ６及びＴＮＦαのレーザー誘発遺伝子発現を下方調節し（Ｄ）、そして神経網膜におけるＭＣＰ１、ＩＬ１β及びＴＮＦαのレーザー誘発遺伝子発現を下方調節する（Ｅ）ことが明らかになる。しかし、血管新生促進因子のＶＥＧＦ−Ａ及びＰｌＧＦの発現は、ＲＮＡレベルでは調節されず（Ｄ及びＥ）、このことは、スピロノラクトン効果がＶＥＧＦ及びＰｌＧＦとは無関係であることを示している。結果は、平均±ＳＥＭとして表され、ラットｎ＝５をレーザー群、及びラット６匹をスピロノラクトン群とした。マンホイットニーＵ検定を用いた。＊Ｐ＜０．０５。
【図３Ｅ】スピロノラクトンは、レーザー３日後ラット網膜においてマクロファージ／ミクログリアの動員を阻害し、炎症促進遺伝子発現を下方調節する。マクロファージ／ミクログリアの浸潤／活性化のピークは、レーザー後３日目に存在する。網膜色素上皮（ＲＰＥ）−脈絡膜フラットマウント上で、これらの細胞をＩＢＡ１で標識した。円形の活性化ＩＢＡ１陽性細胞を、レーザー熱傷を有する領域で計数した。スピロノラクトン（Ｓｐｉ）は、無処置の眼（Ａ）と比較して、熱傷におけるＩＢＡ１陽性細胞を減少させる（Ｂ）。細胞の定量により、スピロノラクトン処置眼で観測された活性化マクロファージ／ミクログリアは、レーザー対照群よりも有意に少ないことが明らかになる（Ｃ）。Ａ及びＢのバー：１００μm。結果は、平均ＩＢＡ１陽性細胞／熱傷／ラット±ＳＥＭとして表される。ラットの片眼当たり６個のレーザー熱傷、ラットｎ＝７をレーザー群、及びラット４匹をレーザー＋Ｓｐｉ群とした。マンホイットニー（Mann Whitney）Ｕ検定を用いた、＊Ｐ＜０．０５。３日目の定量的ＰＣＲにより、スピロノラクトンが、ＲＰＥ−脈絡膜複合体におけるＭＣＰ１、ＩＬ１β、ＩＬ６及びＴＮＦαのレーザー誘発遺伝子発現を下方調節し（Ｄ）、そして神経網膜におけるＭＣＰ１、ＩＬ１β及びＴＮＦαのレーザー誘発遺伝子発現を下方調節する（Ｅ）ことが明らかになる。しかし、血管新生促進因子のＶＥＧＦ−Ａ及びＰｌＧＦの発現は、ＲＮＡレベルでは調節されず（Ｄ及びＥ）、このことは、スピロノラクトン効果がＶＥＧＦ及びＰｌＧＦとは無関係であることを示している。結果は、平均±ＳＥＭとして表され、ラットｎ＝５をレーザー群、及びラット６匹をスピロノラクトン群とした。マンホイットニーＵ検定を用いた。＊Ｐ＜０．０５。
【図４】スピロノラクトンを放出する硝子体内のポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ミクロスフェアは、ラット眼におけるレーザー誘発ＣＮＶを制限する。レーザー照射後１４日目に行われたフルオレセイン血管造影により、無負荷ミクロスフェアを注入した眼（ＮＬ−ＭＰ、Ａ）と比較して、スピロノラクトン負荷ミクロスフェアを注入した眼（Ｓｐｉ−ＭＰ、Ｂ）におけるフルオレセイン強度の低下が明らかになる。Ｓｐｉ−ＭＰ群では、ＮＬ−ＭＰ群と比較して血管造影スコアが減少する傾向が観察された（Ｃ）が、その差は有意ではない。結果は、平均血管造影スコア／熱傷／ラット±ＳＥＭとして表される。両眼のそれぞれに、６個のレーザー熱傷を作り、ラットｎ＝５をＮＬ−ＭＰ群、及びラット７匹をＳｐｉ−ＭＰ群とした。統計解析にはマンホイットニーＵ検定を用いた。網膜色素上皮／脈絡膜フラットマウントのＣＮＶをＦＩＴＣ−ＧＳＬ Ｉ−イソレクチンＢ４で標識した。ＮＬ−ＭＰ群（Ｄ）と比較して、Ｓｐｉ−ＭＰ群（Ｅ）におけるＣＮＶ染色の減少を観察した。ｚスタック共焦点画像上のＣＮＶの定量により、ＮＬ−ＭＰを注入した眼と比較して、Ｓｐｉ−ＭＰを注入した眼でＣＮＶ体積が有意に低下することが明らかになる。結果は、平均ＣＮＶ体積／熱傷／ラット±ＳＥＭとして表される。ラット片眼当たり６個のレーザー熱傷、各群ラットｎ＝８。マンホイットニーＵ検定を用いた、＊Ｐ＜０．０５。
【図５】血管内皮特異的ＭＲノックアウトマウス（ＥＣ−ＭＲ−ＫＯ）及び単球特異的ＭＲノックアウトマウス（ＭＣ−ＭＲ−ＫＯ）におけるレーザー誘発ＣＮＶ。マウスのＣＮＶ発生のピークに対応するレーザー後１０日目にフルオレセイン血管造影法（ＦＡ）を行った（Ａ〜Ｄ）。１２日目に、ＦＩＴＣ−デキストランによる静脈内灌流後、眼球を摘出した。灌流ＣＮＶは、網膜色素上皮−脈絡膜フラットマウントで観察された（Ｅ〜Ｈ）。ＦＡにより、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）（ＷＴ、Ａ）と比較した、組織特異的ＭＲノックアウトマウス（Ｂ及びＣ）両方の眼におけるフルオレセイン漏出の減少が明らかになるが、これは、血管造影スコアリング（Ｄ）によって確認される。結果は、平均スコア／レーザー熱傷±ＳＥＭとして表される。片眼当たり４個のレーザー熱傷、熱傷ｎ＝６８をＷＴ、６０個をＥＣ−ＭＲ−ＫＯ、及び１６個をＭＣ−ＭＲ−ＫＯマウスとした。クラスカル・ワリス検定を用いて、次にダンの多重比較を用いた、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＦＩＴＣ−ＧＳＬ Ｉ−イソレクチンＢ４標識により、ＷＴマウス（Ｅ）よりもＥＣ−ＭＲ−ＫＯ（Ｆ）及びＭＣ−ＭＲ−ＫＯマウス（Ｇ）の眼により小さなＣＮＶが発生することが明らかになる。ｚスタック共焦点画像上のＣＮＶの定量により、ＷＴ（Ｈ）と比較して両方のＭＲノックアウトマウスではＣＮＶサイズが減少することが判明した。結果は、平均ＣＮＶ体積／レーザー熱傷±ＳＥＭとして表される。片眼当たり４個の熱傷、熱傷ｎ＝８０をＷＴ、６８個をＥＣ−ＭＲ−ＫＯ、及び２４個をＭＣ−ＭＲ−ＫＯマウスとした。クラスカル・ワリス検定を用いて、次にダンの多重比較を用いた、＊Ｐ＜０．０５。
【図６】レーザー誘発ＣＮＶのラット（Ａ）及びマウス（Ｂ）モデルの実験計画
【実施例】
【００６８】
材料及び方法
動物
全ての実験は、欧州理事会指令（European Communities Council Directive）８６／６０９／ＥＥＣに従って実施され、地方倫理委員会（Ｃｅ５／２０１２／１１３）の承認を得た。Janvier breeding Center（Le Genest-Saint-Isle, France）からの６〜８週齢オスBrown Norwayラットを用いて、ＣＮＶのラットモデルを作製した。血管内皮細胞特異的ＭＲノックアウトマウス（ＥＣ−ＭＲ−ＫＯ）及び単球／マクロファージ特異的ＭＲノックアウトマウス（ＭＣ−ＭＲ−ＫＯ）はＣ５７ＢＬ／６遺伝的背景マウスにおいて作製され、F. Jaisser博士（UMRS 1138、チーム１）のチームから得られた。内皮細胞でＣｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスをＭＲフロックス対立遺伝子（MR-floxed alleles）を有するマウスと交配させることにより、ＥＣ−ＭＲ−ＫＯマウスを作製した（Berger S et al. Loss of limbic mineralocorticoid receptor impairs behavioural plasticity. PNAS USA 2006）。ＭＣ−ＭＲ−ＫＯマウスは、単球／マクロファージでＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウス（Clausen BE et al. Conditional gene targeting in macrophages and granulocytes using LysMcre mice. Trangenic Research 1999）をＭＲフロックス対立遺伝子を有するマウスと交配させることによって得られた。動物は、食物、水及び寝わらを有する無菌状態で維持され、１２時間／１２時間の明暗サイクルで収容された。麻酔は、筋肉内ケタミン（ラットで４０mg/kg、マウスで５０mg/kg）及びキシラジン（ラットで４mg/kg、マウスで１０mg/kg）によって導入された。二酸化炭素の吸入又は頸部脱臼により動物を殺処分にした。
【００６９】
実験計画
レーザー誘発ＣＮＶのラット及びマウスモデルの実験計画は、図６に詳述される。ラットＣＮＶモデルに与えられた処置は予防と考えられた。
【００７０】
レーザー凝固
麻酔及び瞳孔拡張後、カバースリップをコンタクトレンズとして角膜上に配置した。ラットでは、スリットランプに取り付けたにアルゴンレーザー（５３２nm）で、視神経乳頭から乳頭直径の２〜３倍離して６〜８個の熱傷を達成した（１７０mW、０．１秒及び５０μm）。マウスでは、視神経乳頭周囲の３、６、９、１２時の位置に４個のレーザー熱傷を誘発した（２５０mW、０．０５秒及び５０μm）。泡の存在はブルッフ膜の破裂を証明し、レーザー衝撃の成功を裏付けた。
【００７１】
処置
処置はＣＮＶのラットモデルにのみ導入された。レーザー光凝固後、ラットを６群に分けた：１）無処置；２）オリーブ油及びＤＭＳＯで希釈したスピロノラクトン（２５mg/kg/日）の殺処分までの連日皮下注射；３）ビヒクル（オリーブ油及びＤＭＳＯ）の殺処分までの連日皮下注射；４）０日目のみに抗ラットＶＥＧＦの硝子体内注入（ＩＶＴ）（１．５μg/μl、５μl、RnD system, Lille, France）（Couturier A et al. Anti-vascular endothelial growth factor acts on retinal microglia/macrophage activation in a rat model of ocular inflammation. Mol Vis 2014;20:908-20）；５）０日目にのみにスピロノラクトン負荷ＰＬＧＡ ＭＰのＩＶＴ（２．２μg/μl、５μl、Complutense University of MadridのPr R. Herrero-Vanrellのチームから得られた）。Ｓｐｉ−ＭＰのエクスビボの放出プロフィールを考慮すると、硝子体内に放出されるスピロノラクトンの１日量は１８μMであると推定される；６）０日目のみにブランクＰＬＧＡ ＭＰ（５μl）のＩＶＴ。
【００７２】
フルオレセイン血管造影（ＦＡ）
ＦＡは、レーザー誘発後１４日目（ラット）又は１０日目（マウス）に行われた。瞳孔を拡張し、フルオレセイン（生理食塩水中の１０％フルオレセイン ０．２mL（ラット）又は０．１mL（マウス））を尾部に静脈内注射した。フルオレセイン注射後それぞれ１〜３分及び５〜７分の早期及び後期血管造影像を記録した。各レーザー誘発病変について、フルオレセイン漏出を、早期及び後期の間の色素のサイズ／強度の増加を評価することによって定性的に等級付けした。血管造影スコアは、以下の基準により２人の覆面観察者によって確立された：等級０は、過蛍光を示さない；等級１は、強度もサイズも増加しないわずかな過蛍光を示す；等級２は、強度は増加するがサイズは増加しない過蛍光を示す；等級３は、強度とサイズの両方で増加する過蛍光を示す。追加の等級４は、過蛍光のサイズ増加が最初のレーザー熱傷の直径の２倍を超える場合に与えられた。
【００７３】
ＲＰＥ−脈絡膜フラットマウント及びＣＮＶ定量
ＦＡ検査後２日目（フルオレセイン排出に必要な時間）、眼を摘出し、室温で１５分間４％パラホルムアルデヒド中に固定し、角膜縁で切開した；角膜及びレンズを廃棄した。網膜をＲＰＥ−脈絡膜複合体から分離した。ＲＰＥ−脈絡膜上に８本の放射状切開を行い、次にこれをフラットマウントし、−２０℃で１５分間アセトンで後固定した。ＰＢＳ中の０．１％ Triton x100で洗浄後、ＦＩＴＣ−ＧＳＬ Ｉ−イソレクチンＢ４（１：２００、Vector）を−４℃で一晩適用した。ＰＢＳで洗浄後、ＲＰＥ−脈絡膜をフラットマウントし、共焦点顕微鏡（Zeiss LSM710, Le Pecq, France）で観察した。ＣＮＶの画像は、コンピュータシステムに結合されたデジタルビデオカメラで捕捉された。ＣＮＶの表面から光学的水平断像（１μm間隔）を得た。病変につながる周囲の脈絡膜血管網が同定できた最も深い焦点面をＣＮＶ病変の床と判定した。ImageJソフトウェアを用いて、各水平断面上のＣＮＶ関連蛍光の面積を測定した。ＣＮＶの上端から下端までのｚスタック画像上の全蛍光領域の合計をＣＮＶ体積の指標として使用した。
眼球摘出前に、ＦＩＴＣ−デキストラン（分子量２，０００，０００、Sigma-Aldrich, St-Quentin Fallavier, France）でマウスを灌流した。ＲＰＥ−脈絡膜をフラットマウント化後、ＦＩＴＣ−デキストラン灌流ＣＮＶを検査して、前述のとおり分析した。
【００７４】
ＲＰＥ−脈絡膜フラットマウント上の免疫蛍光
レーザー誘発後３日目（マクロファージ浸潤のピーク）、ラットＲＰＥ−脈絡膜フラットマウントをまた免疫蛍光のために調製した。ウサギポリクローナル抗ＩＢＡ１（１：４００、Wako, Neuss, Germany）を−４℃で一晩適用した。０．１％ Triton x100／ＰＢＳで洗浄後、フラットマウントをAlexa Fluo（登録商標）594 ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００、Molecular Probes, Leiden, The Netherlands）と共にインキュベートし、核をＤＡＰＩで対比染色した。ＩＢＡ１陽性マクロファージ／ミクログリア細胞を、染色されたレーザー病変上で計数した。平均細胞数／衝撃／ラット眼を計算した。
【００７５】
定量的ＰＣＲ
レーザー誘発後３日目、ラットの神経網膜及びＲＰＥ−脈絡膜−強膜複合体を、摘出眼球から注意深く切断して、液体窒素中で急速冷凍し、使用するまで−８０℃で保存した。RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen, Courtaboeuf, France）を製造業者の取扱説明書に従い使用して、全ＲＮＡを組織から単離した。ランダムプライマー（Life Technologies, Cergy Pontoise, France）及びSuperScript II 逆転写酵素（Life Technologies）を用いて、全ｍＲＮＡから第１鎖の相補的ＤＮＡを合成した。SYBR Green又はTaqMan検出部のいずれかを持つ7500 Real-Time PCR System（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）で行われる定量的リアルタイムＰＣＲによって、ＭＲ、ＭＣＰ１、ＩＬ６、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ−Ａ及びＰｌＧＦの転写物レベルを分析した。
予備実験の結果、無処置レーザー群とビヒクル処置レーザー群の間のＣＮＶ体積及び血管造影スコアに差は認められなかったため、これら２群の結果を皮下スピロノラクトン処置レーザー群の対照としてプールした。
【００７６】
統計
結果は平均±ＳＥＭとして表される。統計解析は、GraphPad Prism 5 for Windows（GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA）を用いて行われた。ノンパラメトリックのクラスカル・ワリス検定とマンホイットニー検定を用いて、必要に応じて連続データを比較した。０．０５以下のＰ値を有意と見なした。
【００７７】
結果
我々の結果は、ＭＲ拮抗薬であるスピロノラクトンの全身投与が、ＣＮＶ発生を制限することを示しているが、これはラットの眼に硝子体内注入された抗ＶＥＧＦに匹敵する効果である（図１）。
ＭＲは、疾患の早期に上方調節され（図２）、ＭＲ拮抗作用は、レーザー熱傷領域における活性化マクロファージ／ミクログリア細胞の蓄積を阻害する（図３Ａ〜Ｃ）ため、ＭＲ過剰活性化は、マクロファージ／ミクログリア活性化を介してレーザーが誘発した早期炎症において役割を果たし、最終的にＣＮＶ発生に寄与することがある。３日目に、ＣＮＶ形成に関与することが知られている炎症性成分である、サイトカイン類（ＴＮＦα、Ｉｌ１β、ＩＬ６）及びケモカイン類（ＭＣＰ１）のレーザー誘発性発現（Lavalette Sophie et al. Il1β inhibition prevents CNV and does not exacerbate photoreceptor degeneration. Am J Pathol 2011; Raoul W, CCL2/CCR2 and CX3CL1/CX3CR1 chemokine axes and their possible involvement in age-related macular degeneration. J Neuroinflammation 2011; Kramer M et al. MCP1 in the aqueous humour of subjects with age-related macular degeneration. Clin Experiment Ophthalmol 2012; Miao H et al. Inflammatory cytokines in aqueous humor of subjects with CNV. Mol Vis 2012）は、スピロノラクトンによって無効になる（図３Ｄ及びＥ）が、血管新生促進因子（ＶＥＧＦ及びＰＧＦ）の発現は変更を受けず、このことは、ＭＲ拮抗薬が、ＶＥＧＦ以外の経路を介して作用してＣＮＶ発生を防止することを示唆している。
ＭＲ拮抗薬の長期使用に伴う最終的な全身性の副作用を制限するために、スピロノラクトンを制御放出するミクロスフェアを開発して、ラットの眼に硝子体内注入した。これらはまた、ＣＮＶを防止する有益な効果を示す（図４）。
マクロファージ／ミクログリア及び血管内皮細胞（ＥＣ）は、ＶＥＧＦ並びにサイトカイン類及びケモカイン類を発現し、次にこれらが単球及び内皮細胞動員を調節するため、ＣＮＶの病理発生には決定的に重要である（Grossniklaus et al. Macrophage and retinal pigment epithelium expression of angiogenic cytokines in CNV. Mol Vis 2002; Kvanta et al. Subfoveal fibrovascular membranes in AMD express VEGF. IOVS 1996）。マクロファージ及び脈絡膜ＥＣもまたＭＲを発現する。ＣＮＶ形成におけるマクロファージＭＲ及び内皮細胞ＭＲの役割を評価するために、我々はＥＣ特異的ＭＲノックアウトマウス及び単球／マクロファージ特異的ＭＲノックアウトマウスを用いてレーザー凝固を行った。両方のマウスは、ＣＮＶ形成の減少を示し（図５）、このことは、ＥＣ ＭＲ及びマクロファージＭＲがＣＮＶ発生に寄与することを示唆している。
【００７８】
参考文献：
この出願の至るところで、種々の参考文献は、本発明が関係する技術水準を記載している。これらの参考文献の開示は、引用例として本開示に取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｄ（２）】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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