(57)【要約】【課題】一種類のポリ乳酸単量体産生菌及びその構築方法と乳酸製造方法を提供する。【解決手段】本発明は非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸の発酵生産に用いる発酵生産菌、及びその構築方法と該菌株で非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸の製造方法を提供する。前記D-乳酸発酵生産用菌株の本尊番号はCGMCC  No.１１０５９であって、L-乳酸発酵生産菌株の保存番号はCGMCC  No.１１０６０である。本発明に提供する方法によって、菌株の代謝増殖及び酸生成の時の特性と工業化規模生産の特性を結合し低コストかつ容易に実施できる非常に高い光学純度の乳酸単量体製造方法を実現することができる。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生産に用いるポリ乳酸単量体産生菌であって、
菌株保存号番号はCGMCC  No.１１０５９であることを特徴とするポリ乳酸単量体産生菌。
【請求項２】
非常に高い光学純度のL-乳酸の発酵生産に用いるポリ乳酸単量体産生菌であって、
菌株保存号番号はCGMCC  No.１１０６０であることを特徴とするポリ乳酸単量体産生菌。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のポリ乳酸単量体産生菌の構築方法であって、
単一または複数の遺伝子を除去し菌株を初期構築し、これらの遺伝子には、ldhA、thiE、dld、ackA、pta、pps、pflB、poxB、frdA、adhE、lldDが含まれる単一または複数の遺伝子があり、これらの遺伝子にはkan-cIts８５７-pR-pL-ldhA、ldhBcoa、ldhLca、ldhStrbが含まれ、温度誘導遺伝子転写方法を使用し細胞増殖プロセスおよび乳酸生成プロセスを制御、調節し、株が最初に構築された後、株を２５〜５０℃で段階的に細胞の発酵培養-誘導-酸生成を完了し、単一の発酵因子で細胞増殖プロセスにおける細胞の蓄積を定量的に制御することができ、この単一の発酵因子は、細胞の中心代謝経路における鍵酵素の転写過程の調節因子、鍵酵素の翻訳過程における調節因子、鍵酵素の分泌過程の調節因子、または鍵酵素発現後触媒過程の調節因子であることを特徴とするポリ乳酸単量体産生菌の構築方法。
【請求項４】
請求項３に記載のポリ乳酸単量体産生菌の構築方法であって、
前記菌株の初期構築後の菌株成長プロセスは、単一の発酵因子の調節に関連しており、この単一の発酵因子は、グルコース、グリセロールなどの炭素源、または酵母エキス、ペプトン、硫酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウムなどの単位、または鉄イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオンなどの金属イオン、また VB１、VB6、VB１２、ビオチン、塩酸チアミン、ピロリン酸チアミンなどの一種や多種の栄養成分であり、
前記一種の単一の発酵因子は、細胞の蓄積を定量的に制御し、細胞の迅速な蓄積および高い活性を保障することができ、乳酸の合成は、スイッチ制御の方式で乳酸の合成を開始または停止することができ、このプロセスは対応する発酵因子を予め定量添加することによって前記の調節プロセスを達成することができることを特徴とする構築方法。
【請求項５】
一種の乳酸製造方法であって、
具体的には、請求項１または請求項２に記載のポリ乳酸単量体産生菌を用いて、菌株の宿主細胞は全合成無機塩培地で急速に増殖し、全合成無機塩培地はチアミン含有培地であって、宿主細胞は全合成培地で急速に増殖し、その中、７L発酵系に８-１0時間で細胞塊が１１.５g / Lの細胞乾燥重量までに蓄積し、単一の発酵因子を定量的に添加することで、細胞乾燥重量をさらに高く蓄積し、
乳酸の微量な形成が細胞増殖に影響しない程度に、宿主細胞培養プロセスでは大量の乳酸を形成せず、宿主細胞は増殖した後に急速に乳酸を蓄積することを特徴とする乳酸菌製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の乳酸製造方法であって、
D-乳酸およびL-乳酸の蓄積プロセスが適切なポリ乳酸単量体産生菌を換えることによって同じ生産システムで切り替えて行われ、
前記発酵酸生成プロセスは、設定可能な自動的開始の特徴を有し、培養培地成分と菌株自身の増殖特性との組み合わせにより、細胞は特定の段階まで増殖する時、培地中の対応する調節因子成分の含有量の変化によって、酸生成プロセスを自動的に開始することを特徴とする乳酸菌製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載の乳酸製造方法であって、
前記乳酸製造方法は、全合成無機塩培地は主要の成分：
D-乳酸発酵生産用発酵培地（g / L）：リン酸水素二アンモニウム０-２５、リン酸二水素カリウム０-５、リン酸水素二ナトリウム ０-２５、塩化ナトリウム０-５、MgSO４ ０-０.５、FeSO４ ０-１、FeCl３ ０-１、CoCl２ ０-１、CuCl２ ０-１、Na２MoO４ ０-１、H３BO３ ０-１、MnCl２ ０ -１、クエン酸０-２５、チアミン０-１、キシロース０-５０、グリセロール０-５０、グルコース０-５０、硫酸０-５、pH6.０~７.５、
L-乳酸発酵生産用発酵培地（g / L）：リン酸水素二アンモニウム０-２５、リン酸二水素カリウム０-５、リン酸水素二ナトリウム ０-２５、塩化ナトリウム０-５、MgSO４ ０-０.５、FeSO４ ０-１、FeCl３ ０-１、CoCl２ ０-１、CuCl２ ０-１、ZnCl２ ０-１、Na２MoO４ ０-１、H３BO３ ０-１、MnCl２ ０-１、クエン酸０-２５ チアミン０-１、キシロース０-５０、グリセロール０-５０、グルコース０-５０、硫酸０-５、pH6.０-７.５であることを特徴とする乳酸製造方法。
【請求項８】
請求項５に記載の乳酸製造方法であって、
菌株の生育過程及び乳酸生成過程がいずれも発酵温度に関係していて、発酵酸生成プロセスは非固定温度で行われ、酸生成菌株の特性に応じて、発酵温度は徐々に上昇するが、特定の組合せ様式では、温度は酸生成プロセスに最も重要な影響を与え、酸生成効率が最も高い、例えば、発酵温度が上昇すると増殖は遅くなって、発酵温度が低下すると増殖はとても速くなって、 高い活性の細胞を蓄積する特性もあって、発酵温度が上昇すると乳酸を急速に形成するが、発酵温度が低下すると乳酸をゆっくりと形成し、または形成しない場合もあり、乳酸を効率的に蓄積する特徴を持つことを特徴とする乳酸製造方法。
【請求項９】
請求項５に記載の乳酸製造方法であって、
前記細菌がまず２５〜３６℃でグルコースで急速に増殖して菌株を形成し、次いで３７〜５０℃でグルコースで乳酸を迅速に蓄積することを特徴とする乳酸製造方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の乳酸製造方法であって、
（１）遺伝子工学技術によりD-乳酸とL-乳酸多産組換え菌の染色体の乳酸デヒドロゲナーゼコーディング遺伝子発見を単純な条件下で動的に調節して、酸生成菌株を得て、
（２）菌株を２５〜３６℃、２００ r/minで6-１０時間好気増殖させ、３７〜４５℃で静止培養で乳酸を発酵し、スターター菌株B００１３-０７０を対照菌株として、細胞密度、糖消耗、乳酸生産率、主要な代謝中間体などの有機酸生成物を分析し、乳酸合成の誘導のタイミングを確定する。菌株をそれぞれ０.０6〜１００μg/ Lのチアミン、２００ r/minで振盪培養を行い、
（３）非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生成時、限酸素段階：０-３h の発酵温度３３-３９℃、３-6hの発酵温度３７-４２℃、6-１０hの発酵温度３８-４５℃、１０-１6hの発酵温度４０-４８℃、 １6〜２４hの発酵温度４５〜５０℃、
（３’）非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生成時、限酸素段階の発酵温度は３７-５０℃で、他はステップ３と同じであることを特徴とする乳酸製造方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の乳酸製造方法であって、
発酵終了後の乳酸の抽出方法も含み、生産菌の遺伝的に改変された特性と組み合わせ、発酵液中のD-乳酸とL-乳酸がいずれも非常に高い光学純度と化学的純度の形態で存在し、全合成培地の使用は簡潔なの抽出プロセスを確保し、その最終製品の抽出方法は、酸性化、プレートフレームで細菌の除去、限外濾過で色素やハイブリッドタンパク質の除去、イオン交換で陰イオンとカチオンの干渉の除去、適切な濃度の製品の濃縮、ナノ濾過で製品の精製の工程を含むことを特徴とする乳酸製造方法。
【請求項１２】
請求項５に記載の乳酸製造方法であって、
乳酸生成過程終了後に、低温酸性化によってD-乳酸およびL-乳酸が遊離され、
前記乳酸遊離過程は発酵液中の他の残渣の影響を受けず、酸性化に利用される酸は硫酸、塩酸またはシュウ酸であることを特徴とする乳酸製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の応用分野に関し、特に一種類のポリ乳酸単体産生菌及びその構築方法と乳酸製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性材料とは、使用済みの廃棄物を環境（微）生物によって分解して利用することができる一種の新しい材料を指す。新世代の生分解性材料はポリ乳酸を代表として、ポリL--乳酸とポリ-D-乳酸に分け、単量体L-乳酸またはD-乳酸を重合して得るものである。 ポリ乳酸は世界的な需要が2020年までに年間1,500万トンに達すると推定されており、そして年間需要量が5,000万トンであるポリエチレンテレフタレート(Polyethylene terephthalate, PET）とポリスチレン(Polystyrene, PS) の最も可能性の高い代替品である。
【０００３】
ポリD-乳酸材料は高品質のD-乳酸によって重合したもので、通常の化学物によって重合した繊維、プラスチックおよび他の製品の良い代替物となり得る。特にハイエンド消費者製品の分野では、例えば、おむつ、タバコフィルターなどの材料の加工や重合の分野では、その独特なバイオマス材料特性、生体適合性および無毒無害特性は関連製品の品質を大幅に向上させ、 市場空間は大きいである。ポリD-乳酸を原材料として3D印刷技術で生産した新製品は環境保護特性、良好な機械的性質、安全性など多くの利点があり、自動車、使い捨て製品、電子機器、医療などの分野で広く使用されている。より注意を要するのは、非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸によって重合された高品質のポリ乳酸（PLA）と同じ生分解性あるブチレンスクシネート - ブチレンアジペート共重合体（PBSA）を混紡し、生分解性材料の強度および靭性を大幅に増加させ、関連製品の適用範囲を拡大することができる。現在、BASFなどの企業は、PLAとPBSAの混紡製品の試作を完了し、優れた特性ある一連の新しい生分解性材料を成功に発売し始め、非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸の市場ニーズを大幅に増加させた。
【０００４】
リゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）やラクトバチルス・サーモフィルス（Lactobacillus thermophilus）のような伝統的な乳酸生産菌株は、それ自体の特性と培地の複雑さで、生産した乳酸の光学純度は重合度の要求を満たすことができないため、非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸の大規模生産に使えない。組換え酵母と大腸菌は非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸を合成する能力を持ち、そして栄養要求性が低く、高密度での培養が容易で、工業的な規模で広めやすい。非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸生産菌株を研究する焦点になる。組換え酵母と複数の遺伝子で修飾された大腸菌は、光学純度と化学純度の非常に高い乳酸を合成することができ、そして大腸菌の培養温度が酵母より高いため、組換え大腸菌は乳酸の発酵生産に必要な周期が組換え酵母より大幅に減少する。したがって、組換え大腸菌は工業的規模で非常に高い光学純度のD-乳酸およびL-乳酸を生産するための最も理想的な株であると考えられている。
特に近年以来、大腸菌はD-乳酸産生菌株として広く承認されている。 大腸菌は光学純度の高いL-乳酸の発酵生産に使用することができれば、D-乳酸とL-乳酸が同一生産ラインで交互に生産されることに非常に重要である。また、高品質の乳酸単量体とポリ乳酸製造業の迅速な発展にも役に立つ。
組換え大腸菌が生産菌株として非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生産に使用されることについて、多くの効果的な研究を行った。（Zhou L. et al., Current Microbiology, 2011,62: 981-989；Zhu Y. et al., Applied Environmental Microbiology, 2007,73: 456-464; Zhou S. et al., Applied Environmental Microbiology, 2003,69: 399-407; Zhu J. et al., Applied Microbiology and Biotechnology,2004, 64: 367-375; Zhu J. et al., Metabolic Engineering, 2005, 7:104-115; Bunch P.K. et al., Microbiology, 1997, 143: 187-195）。例えば、１）厳密な嫌気性発酵により酸生成効率を向上させる（Li et al、Applied Microbiology and Biotechnology、2002,60：101-106）; 2）エアレーションでの酸素が制限された発酵を停止し、酸生成効率を向上させる（(Zhou L. et al., Current Microbiology, 2011, 62:981-989）; 3）微好気性発酵の条件を維持し酸生成効率を向上させる（Tian K et al.,2012African Journal of Biotechnology、11（21）：4860-4867; Zhou L et al., Biotechnology letters 2012, 34:1123-1130)；４）適切な培養温度で微生物を成長させて適度な生育温度で微生物の成長を制限することにより、発酵酸生成効率を向上させる（(Niu D et al.,Microbial Cell Factories 2014, 13:78-88; Zhou L et al., Metabolic Engineering, 2012, 14: 560-568)；5）微生物の成長と発酵に異なる炭素源を使用することによって発酵時の酸生成効率を向上させる（Zhu L et al.,Applied Environmental Microbiology、2007,73：456-464）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者が早期に得た特許（中国特許、特許番号：ZL201210102731.8）は、遺伝子転写レベルに温度制御ユニットを導入し、発酵温度の制御と結合しD-乳酸の合成効率を大幅に改善する。これに基づいて、本発明は、微生物増殖の定量的制御メカニズムを導入することにより、細胞増殖プロセスとD-乳酸合成プロセスの二重スイッチメカニズムを形成し、D-乳酸の合成効率をさらに向上させる。
【０００６】
本発明が解決しようとする技術的課題は、一種のポリ乳酸単量体産生菌を提供することである。
【０００７】
本発明が解決しようとする他の技術的課題は、前記ポリ乳酸単量体産生菌を構築する方法を提供することである。
【０００８】
本発明が解決しようとする他の技術的課題は、前記ポリ乳酸単量体産生菌を用いた乳酸製造方法を提供することであり、具体的には、菌株の代謝増殖及び酸生成の時の特性と工業化規模生産の特性を結合し低コストかつ容易に実施できる非常に高い光学純度の乳酸単量体製造方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策は：
非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生産に用いるポリ乳酸単量体産生菌で、菌株保存号番号はCGMCC  No.11059（実施例では株番号B0013-090B）である。
非常に高い光学純度のL-乳酸の発酵生産に用いるポリ乳酸単量体産生菌で、菌株保存号番号はCGMCC  No.11060（実施例では株番号 B0013-101J ）である。
前記非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生産のためのポリ乳酸単量体産生菌および非常に高い光学純度のL-乳酸の発酵生産のためのポリ乳酸単量体産生菌は、それぞれ非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸を形成する能力を持ち、光学純度は99.9％以上となり、D-乳酸とL-乳酸の光学純度特性はいずれも、高品質ポリ乳酸の重合プロセスにおける乳酸単量体の光学純度に対する最高の要件を満たす 。
【００１０】
前記非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生産のためのポリ乳酸単量体産生菌および非常に高い光学純度のL-乳酸の発酵生産のためのポリ乳酸単量体産生菌は、それぞれ非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸を形成する能力を持ち、化学純度は99％以上となり、D-乳酸およびL-乳酸の化学的純度特性は、簡単な後続処理または処理なしでさえも、高品質ポリ乳酸の重合プロセスにおける乳酸単量体の光学純度に対する最高の要件を満たす 。
【００１１】
前記非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生産のためのポリ乳酸単量体産生菌および非常に高い光学純度のL-乳酸の発酵生産のためのポリ乳酸単量体産生菌の構築方法：単一または複数の遺伝子を除去し菌株を初期構築し、 これらの遺伝子には、ldhA、thiE、dld、ackA、pta、pps、pflB、poxB、frdA、adhE、lldDが含まれ;単一または複数の遺伝子が発現され、これらの遺伝子にはkan-cIts857-pR-pL-ldhA、ldhBcoa、ldhLca、ldhStrbが含まれる。
【００１２】
温度誘導遺伝子転写方法を使用し細胞増殖プロセスおよび乳酸生成プロセスを制御、調節する：株が最初に構築された後、株を25〜50℃で段階的に細胞の発酵培養-誘導-酸生成を完了し、単一の発酵因子で細胞増殖プロセスにおける細胞の蓄積を定量的に制御することができ、この単一の発酵因子は細胞の中心代謝経路における鍵酵素の転写過程の調節因子で、鍵酵素の翻訳過程における調節因子で、鍵酵素の分泌過程の調節因子または鍵酵素発現後触媒過程の調節因子である。
【００１３】
好ましくは、前記ポリ乳酸単量体産生菌の構築方法は、菌株の蓄積量の定量制御が予めの計算によることができ、異なる発酵系で一定量の単一発酵因子を添加し生産工程の実際のニーズに応じて正確に制御する。
好ましくは、前記ポリ乳酸単量体産生菌の構築方法は、菌株の初期構築後の菌株成長プロセスは、単一の発酵因子の調節に関連しており、この単一の発酵因子は、グルコース、グリセロールなどの炭素源、または酵母エキス、ペプトン、硫酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウムなどの単位、または鉄イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオンなどの金属イオン、また VB1、VB6、VB12、ビオチン、塩酸チアミン、ピロリン酸チアミンなどの栄養成分である。特に、一種の単一の発酵因子は、細胞の蓄積を定量的に制御し、細胞の迅速な蓄積および高い活性を保障することができる。乳酸の合成は、スイッチ制御の方式で乳酸の合成を開始または停止することができ、そしてこのプロセスは対応する発酵因子を予めの定量添加によって前記の調節プロセスを達成することができる。
【００１４】
一種の乳酸製造方法、具体的な方法は：前記ポリ乳酸単量体産生菌を用いて、菌株の宿主細胞は全合成無機塩培地で急速に増殖し、全合成無機塩培地はチアミン含有培地であって、宿主細胞は全合成培地で急速に増殖し、その中、7L発酵系に8-10時間の期間内に細胞塊が11.5g / Lの細胞乾燥重量までに蓄積し、単一の発酵因子定量的に添加することで、細胞乾燥重量はもっと高い。宿主細胞培養プロセスは大量の乳酸を形成しない、すなわち、乳酸の量は細胞増殖に影響しなくて、宿主細胞は増殖した後に急速に乳酸を蓄積する。
【００１５】
好ましくは、前記乳酸製造方法は、D-乳酸およびL-乳酸の蓄積プロセスが適切なポリ乳酸単量体産生菌を換えることによって同じ生産システムで切り替えて行われる。
前記全合成培地中の有機物質の添加は、高密度細胞培養プロセスに影響を及ぼさないが、有機物質を添加しないことは、高密度細胞培養プロセスにより効果的である。
【００１６】
好ましくは、前記乳酸製造方法は、全合成無機塩培地は主要の成分：D-乳酸発酵生産用発酵培地（g / L）：リン酸水素二アンモニウム0-25、リン酸二水素カリウム0-5、リン酸水素二ナトリウム 0-25、塩化ナトリウム0-5、MgSO4 0-0.5、FeSO4 0-1、FeCl3 0-1、CoCl2 0-1、CuCl2 0-1、Na2MoO4 0-1、H3BO3 0-1、MnCl2 0 -1、クエン酸0-25、チアミン0-1、キシロース0-50、グリセロール0-50、グルコース0-50、硫酸0-5、pH6.0~7.5である。 L-乳酸発酵生産用発酵培地（g / L）：リン酸水素二アンモニウム0-25、リン酸二水素カリウム0-5、リン酸水素二ナトリウム 0-25、塩化ナトリウム0-5、MgSO4 0-0.5、FeSO4 0-1、FeCl3 0-1、CoCl2 0-1、CuCl2 0-1、ZnCl2 0-1、Na2MoO4 0-1、H3BO3 0-1、MnCl2 0-1、クエン酸0-25 チアミン0-1、キシロース0-50、グリセロール0-50、グルコース0-50、硫酸0-5、pH6.0-7.5。
【００１７】
前記発酵酸生成プロセスは、設定可能な自動的開始の特徴を有し、培養培地成分と菌株自身の増殖特性との組み合わせにより、細胞は特定の段階まで増殖する時、培地中の対応する調節因子成分の含有量の変化によって、酸生成プロセスを自動的に開始する。
【００１８】
好ましくは、前記乳酸製造方法は、菌株の生育過程及び乳酸生成過程がいずれも発酵温度に関係している。発酵酸生成プロセスは非固定温度で行われ、酸生成菌株の特性に応じて、発酵温度は徐々に上昇するが、特定の組合せ様式では、温度は酸生成プロセスに最も重要な影響を与え、酸生成効率が最も高い、例えば、発酵温度が上昇すると増殖は遅くなって、発酵温度が低下すると増殖はとても速くなって、 高い活性の細胞を蓄積する特性もある;発酵温度が上昇すると乳酸を急速に形成するが、発酵温度が低下すると乳酸をゆっくりと形成し、または形成しない場合もあり、乳酸を効率的に蓄積する特徴を持つ。
好ましくは、前記乳酸製造方法は、前記細菌がまず25〜36℃でグルコースで急速に増殖して菌株を形成し、次いで37〜50℃でグルコースで乳酸を迅速に蓄積する。
菌株は、より低い温度、例えば25〜36℃でD-乳酸とL-乳酸の合成における鍵酵素のコーディング遺伝子ldhAとBcoaLDHの転写が強く抑制されるが、より高い温度、例えば37-50℃でD-乳酸とL-乳酸の合成における鍵酵素のコーディング遺伝子ldhAとBcoaLDHの転写が強く始動される。ここで、株が増殖する温度と酸が形成される温度は、単一の温度での連続的過程または複数の温度勾配点の組み合わせであることが分かる。複数の温度勾配点の組み合わせを用いることがより好ましい。
【００１９】
好ましい前記乳酸製造方法は、具体的な手順は次のとおり：
（１）遺伝子工学技術によりD-乳酸とL-乳酸多産組換え菌の染色体の乳酸デヒドロゲナーゼコーディング遺伝子発見を単純な条件下で動的に調節し、酸生成菌株を得る。
（２）菌株を25〜36℃、２００ r/minで6-１０時間好気増殖させ、３７〜４５℃で静止培養で乳酸を発酵し、スターター菌株B００１３-０７０を対照菌株として、細胞密度、糖消耗、乳酸生産率、主要な代謝中間体などの有機酸生成物を分析し、乳酸合成の誘導のタイミングを確定する。菌株をそれぞれ０.０6〜１００μg/ Lのチアミン、２００ r/minで振盪培養を行う。
（３）非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生成時、限酸素段階：０-３h の発酵温度３３-３９℃、３-6hの発酵温度３７-４２℃、6-１０hの発酵温度３８-４５℃、１０-１6hの発酵温度４０-４８℃、 １6〜２４hの発酵温度４５〜５０℃。
（３’）非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生成時、限酸素段階の発酵温度は３７-５０℃、他はステップ３と同じである。
【００２０】
好ましくは、前記乳酸製造方法は、発酵終了後の乳酸の抽出方法も含み、生産菌の遺伝的に改変された特性と組み合わせ、発酵液中のD-乳酸とL-乳酸がいずれも非常に高い光学純度および化学純度の形態で存在し、全合成培地の使用は簡潔なの抽出プロセスを確保する。その最終製品の抽出方法は、酸性化、プレートフレームで細菌の除去、限外濾過で色素やハイブリッドタンパク質の除去、イオン交換で陰イオンとカチオンの干渉の除去、適切な濃度の製品の濃縮、ナノ濾過で製品の精製などの段階を含む。
【００２１】
好ましくは、前記乳酸製造方法は、乳酸生成過程終了後に、低温酸性化によってD-乳酸およびL-乳酸が遊離され、前記乳酸遊離過程は発酵液中の他の残渣の影響を受けず、酸性化が利用される酸は、硫酸、塩酸またはシュウ酸で、より好ましくは硫酸である。
【００２２】
前記記乳酸製造方法は、非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸の発酵生成過程は30-36時間を超えず、D-乳酸およびL-乳酸の生成レベルはそれぞれ150g / L、180g / Lまた以上で、D-乳酸とL-乳酸の光学純度はいずれも99.95以上で、化学純度は97％以上である。
前記乳酸製造方法にも類似の反応プロセスを有する他の化学物質も含まれ、例えば、クエン酸、ギ酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、α-ケトグルタル酸、コハク酸、アジピン酸、 ジアミン、ヘキサメチレンジアミン、メタクリル酸、イソプレン、イタコン酸などの各種有機酸と有機アミン;またはプロリン、アラニン、リジン、メチオニン、グルタミン酸、アルギニンなどのアミノ酸；チアミン、ビタミンB12などの各種微生物；エタノール、プロパノールなどの短鎖アルコール；イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖などの各種機能糖。
【発明の効果】
【００２３】
本出願はZL201210102731.8に記載されているように遺伝子転写レベルに温度調節エレメントを導入し、発酵温度制御ストラテジーと組み合わせてD-乳酸の合成効率を大幅に高めることに基づいて、菌体増殖の定量的制御の調節機構の導入によって D-乳酸合成効率をさらに向上させる;本発明は、非常に高い光学純度のL-乳酸が外来のL-乳酸脱水素酵素翻訳表現後の酵素学特性を充分に利用し、その触媒活性の温度調節機構を導入し、菌体増殖の定量的制御の調節機構と組み合わせ、細胞増殖とL-乳酸合成の二重スイッチ制御が完了する。
より顕著なのは、本発明においては、非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸の製造は菌株の単純な交換によって同じ生産系で2つの生成物を大量化生産することができる 。
【００２４】
具体的な効果は：
１、本発明により提供される組換え細菌は、非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸を効率的に合成する能力が明らかで、同時に非常に高い化学純度のD-乳酸とL-乳酸を効率的に合成する能力もある。 この菌株は25〜50℃で8〜10時間で急速に増殖し、発酵酸生成は16〜18時間、D-乳酸生成量は15％（w / v）また以上、L-乳酸生成量は18％（w / v）また以上；
2、本発明は、非常に高い光学純度の乳酸単量体を効率的に合成する遺伝子工程菌は、自培養中に全合成培養培地が使用され、培養液が清澄化され、その後の生成物の分離および抽出に有利である。
3、本発明は、非常に高い光学純度の乳酸単量体を効率的に合成する遺伝子工程菌は、細胞増殖および発酵酸生成プロセスが温度変化によって効果的に制御することができる。
4、本発明は、非常に高い光学純度の乳酸単量体を効率的に合成する遺伝子工程菌は、細胞増殖および発酵酸生産プロセスが、栄養素を加えることによって定量的に制御およびスイッチ制御することができる。
5、本発明は、非常に高い光学純度の乳酸単量体の効率的に合成過程は、細胞増殖温度が25〜36℃でグルコースで6〜12時間に急激に増殖し菌体を形成し、37〜50℃でグルコースを用いて非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸を迅速に合成する。 即ち、本発明の組換え細菌及びその非常に高い光学純度の乳酸単量体製造プロセスは、発酵温度制御パラメーターを変更して栄養素を添加するだけで、非常に高い光学純度のD-乳酸及びL-乳酸の効率的な製造を達成することができる 。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ミュータントボックスプラスミドpUC-1dhAp :: kan-cIts857-pR-pL物理図鑑;
【図２】ミュータントボックスプラスミドpUC-thiE':: difGmの物理図鑑;
【図３】ミュータントボックスプラスミドpUC-dld':: difGmの物理図鑑;
【図４】ミュータントボックスプラスミドpUC-ackA-pta ':: difGmの物理図鑑;
【図５】ミュータントボックスプラスミドpUC-pps':: difGmの物理図鑑;
【図６】ミュータントボックスプラスミドpSK-pflB':: difGmの物理図鑑;
【図７】ミュータントボックスプラスミドpUC-poxB':: difGmの物理図鑑;
【図８】ミュータントボックスプラスミドpSKsym-frdA':: difGmの物理図鑑;
【図９】ミュータントボックスプラスミドpUC-adhE':: difGmの物理図鑑;
【図１０】ミュータントボックスプラスミドpUC-ldhA':: difGmの物理図鑑;
【図１１】ミュータントボックスプラスミドpUC-lldD':: PldhA-ldhBcoa-difGmの物理図鑑;
【図１２】ミュータントボックスプラスミドpUC-1ldD':: PldhA-1dhLca-difGmの物理図鑑;
【図１３】ミュータントボックスプラスミドpUC-1ldD':: PldhA-1dhStrb-difGmの物理図鑑、
【図１４】ミュータントボックスプラスミドpUC-ldhA':: PldhA-ldhLca-difGmの物理図鑑;
【図１５】ミュータントボックスプラスミドpUC-1dhA':: PldhA-ldhStrb-difGmの物理図鑑;
【図１６】ミュータントボックスプラスミドpUC-thiE':: PldhA-ldhLca-difGmの物理図鑑;
【図１７】ミュータントボックスプラスミドpUC-thiE':: PldhA-ldhStrb-difGmの物理図鑑。
【図１８】ミュータントボックスプラスミドpUC-thiE’:: PldhA-ldhBcoa-difGmの物理図鑑。
【図１９】非常に高い光学純度のD-乳酸産生株のスクリーニング結果；
【図２０】非常に高い光学純度のL-乳酸産生株のスクリーニング結果；
【図２１】非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵プロセス；
【図２２】D-乳酸の光学純度のテスト図鑑;
【図２３】非常に高い光学純度のL-乳酸の発酵プロセス；
【図２４】L-乳酸の光学純度のテスト図鑑。［保存情報］カテゴリ名：エシェリヒア・コリEscherichia coli寄託部門名：中国微生物保存管理委員会普通微生物センター寄託部門所在地：北京朝陽区北辰西路1号院3号寄託日：2015年7月7日保存番号：CGMCC No.11059参照のバイオマテリアル：B0013-090Bカテゴリ名：エシェリヒア・コリEscherichia coli寄託部門名：中国微生物保存管理委員会普通微生物センター寄託部門所在地：北京朝陽区北辰西路1号院3 号寄託日：2015年7月7日保存番号：CGMCC No.11060参照のバイオマテリアル：B0013-101J
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下本発明の技術的解決策は、特定の実施形態を参照して以下にさらに説明される。
本発明は、非常に高い光学純度のD-乳酸およびL-乳酸の高収率の菌株と構築方法及び非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸効率の製造方法を提供する。 菌株は25〜36℃でグルコースを用いて急速に増殖し、高活性な細胞を形成し、次いで37〜50℃で非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸を効率的に蓄積して、蓄積された乳酸の化学純度が非常に高い。このプロセスの特徴は、25〜50℃の条件下で、菌体の発酵培養、温度変化で効率的な酸生産の後で、生産したD-乳酸は濃度15％（w / v）またそれ以上、光学純度は99.9％以上、化学純度が97％以上である。生産したL-乳酸は濃度18％（w / v）またそれ以上、光学純度は99.9％以上、化学純度は98％以上である。
【００２７】
本発明に含まれる具体的な方法は：
染色体遺伝子組み換え技術：PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を使用して大腸菌のゲノムから染色体標的組み込み部位の上流および下流のそれぞれ50-700bpの遺伝子配列を得る。 標的組み込み遺伝子を耐性遺伝子と連結し、得られた部分のクローニングを標的組み込み部位の上流および下流の遺伝子配列の間に入れ、標的遺伝子組み込み配列を形成させ、例えば、ldhA :: kan-cIts857 -pR -pL, thiE’:: difGm, dld’:: difGm, ackA-pta’:: difGm, pps ’:: difGm, pflB’:: difGm , poxB’ :: difGm , frdA’:: difGm , adhE’:: difGm, ldhA’::difGm, lldD’::PldhA-ldhBcoa-difGm, lldD’::PldhA-ldhLca-difGm, lldD’::PldhA-ldhStrb-difGm, ldhA’::PldhA-ldhLca-difGm, ldhA’::PldhA-ldhStrb-dif Gm, thiE::PldhA-ldhLca-dif Gm，thiE’::PldhA-ldhStrb-difGm， thiE’::PldhA-ldhBcoa-difGmである。前記の遺伝子組み込み配列の一つまた二つや二つ以上を組み合わせて転化し大腸菌に入れる。選択培地上で形質転換体を選択して培養する。形質転換体染色体DNAを抽出し、形質転換体の標的遺伝子変異をPCRにより検証する。発酵実験でB0013-090Bのような非常に高い光学純度のD-乳酸多産細菌およびB0013-101Jのような非常に高い光学純度のL-乳酸多産細菌をスクリーニングする。
【００２８】
前記組換え法を用いて、以下のプロセスに従って動態調節可能のD-乳酸組換え細菌の構築を完了する。
１、研究株：大腸菌B0013（（Zhou L. et al., Curr Microbiol，2011,62：981-989）。
２、遺伝子組換え技術を用いて、ステップ1で得られたスターター株の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターldhApをpR-pLプロモーターに置換した（Love  C.A. et al., Gene，1996,176：49-53） 組換え大腸菌1を得る。
３、遺伝子組換え技術を用いて、チアミンリン酸合成酵素（thiE）コーディング遺伝子欠失用変異体ボックスthiE’::difGmを構築し、ステップ2で得られた組換え株のthiE遺伝子を欠失させて、組換え大腸菌2を得る。
４、遺伝子組換え技術を用いて、FAD依存性D-乳酸デヒドロゲナーゼ（dld）コーディング遺伝子欠失用変異体ボックスdld’::difGmを構築し、ステップ３で得られた組換え株のdld遺伝子を欠失させて、組換え大腸菌３を得る。
５、遺伝子組換え技術を用いて、アセテートキナーゼ（ackA）とホスホトランスアセチラーゼ（pta）コーディング遺伝子欠失用変異体ボックスackA-pta’::difGmを構築し、ステップ4で得られた組換え細菌のackA-pta遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌４を得る。
６、遺伝子組換え技術を用いて、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（pps）コーディング遺伝子欠失用変異体ボックスpps ':: difGmを構築し、ステップ4および5で得られた組換え細菌のpps遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌5および6を得る 。
７、遺伝子組換え技術を用いて、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）遺伝子欠失用変異体ボックスpflB ':: difGmを構築し、ステップ4、ステップ5およびステップ6で得られた組換え細菌のpps遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌7- 10を得る。
８、遺伝子組換え技術を用いて、ピルビン酸オキシダーゼ（poxB）遺伝子欠失用変異体ボックスpoxB ':: difGmを構築し、ステップ4、ステップ5、ステップ6およびステップ7で得られた組換え細菌のpflB遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌11-18を得る。
９、遺伝子組換え技術を用いて、フマル酸レダクターゼ（frdA）遺伝子欠失用変異体ボックスfrdA’:: difGmを構築し、ステップ4、ステップ5、ステップ6、ステップ7およびステップ8で得られた組換え細菌のfrdA 遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌19-34を得る。
１０、遺伝子組換え技術を用いて、アルコールデヒドロゲナーゼ（adhE）遺伝子欠失用変異体ボックスadhE’:: difGmを構築し、ステップ4、ステップ5、ステップ6、ステップ7、ステップ８およびステップ９で得られた組換え細菌のadhE遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌35-66を得る。
１１、遺伝子組換え技術を用いて、D-乳酸デヒドロゲナーゼ（ldhA）遺伝子欠失用変異体ボックスldhA’:: difGm、を構築し、組換え細菌B0013-070 のldhA遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌67を得る。
１２、遺伝子組換え技術を用いて、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldhA）遺伝子欠失用変異体ボックスldhA’::PldhA-ldhLca-difGmを構築し、組換え細菌B0013-070 のldhA遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌6８を得る。
１３、遺伝子組換え技術を用いて、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldhA）遺伝子欠失用変異体ボックスldhA’::PldhA-ldhStrb-difGmを構築し、組換え細菌B0013-070 のldhA遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌6９を得る。
１４、遺伝子組換え技術を用いて、FMNを補体としてのL-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（lldD）遺伝子欠失用変異体ボックスlldD’:: PldhA-ldhBcoa-difGmを構築し、組換え菌B0013-070とステップ11、ステップ12およびステップ13で得られた組換え細菌のLldD遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌70-73を得る。
１５、遺伝子組換え技術を用いて、FMNを補体としてのL-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（lldD）遺伝子欠失用変異体ボックスlldD’::PldhA-ldhLca-difGmを構築し、組換え菌B0013-070とステップ11、ステップ12およびステップ13で得られた組換え細菌のLldD遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌74-77を得る。
１６、遺伝子組換え技術を用いて、FMNを補体としてのL-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（lldD）遺伝子欠失用変異体ボックスlldD’::PldhA-ldhLca-difGmを構築し、組換え菌B0013-070とステップ11、ステップ12およびステップ13で得られた組換え細菌のLldD遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌78-81を得る。
１７、遺伝子組換え技術を用いて、チアミンリン酸シンターゼ（thiE）遺伝子欠失用変異体ボックスthiE’::difGmを構築し、ステップ11、ステップ12、ステップ13、ステップ14、ステップ15およびステップ16で得られた組換え細菌のthiE 遺伝子を欠失させ、組換え菌株82-96を得る。
１８、遺伝子組換え技術を用いて、チアミンリン酸シンターゼ（thiE）遺伝子欠失用変異体ボックスthiE’::PldhA-ldhLca-difGmを構築し、ステップ11、ステップ12、ステップ13、ステップ14、ステップ15およびステップ16で得られた組換え細菌のthiE 遺伝子を欠失させ、組換え菌株97-111を得る。
１９、遺伝子組換え技術を用いて、チアミンリン酸シンターゼ（thiE）遺伝子欠失用変異体ボックスthiE’::PldhA-ldhStrb-difGmを構築し、ステップ11、ステップ12、ステップ13、ステップ14、ステップ15およびステップ16で得られた組換え細菌のthiE 遺伝子を欠失させ、組換え菌株112-126を得る。
２０、遺伝子組換え技術を用いて、チアミンリン酸シンターゼ（thiE）遺伝子欠失用変異体ボックスthiE’::PldhA-ldhBcoa-difGmを構築し、ステップ11、ステップ12、ステップ13、ステップ14、ステップ15およびステップ16で得られた組換え細菌のthiE 遺伝子を欠失させ、組換え菌株127-156を得る。
２１、ステップ4、ステップ5、ステップ6、ステップ7、ステップ8、ステップ9、ステップ10、ステップ11、ステップ12、ステップ13、ステップ14、ステップ15、ステップ16、ステップ17、ステップ18、ステップ19およびステップ２０で 得られた組換え株を30℃、45℃で200r / minの振盪培養をし、スターター菌株B0013-070を対照株とし、リジンデヒドロゲナーゼの比活性を解析し、プロモーターpR-pLとthiEの機能を判定し、最も優れた菌株を選別する。
２２、ステップ２１で 得られた最も優れた菌株をそれぞれ25-36℃、200r / minで振盪培養し、スターター菌株B0013-070を対照株とし、細胞密度、乳酸、主な代謝中間生成物などの有機酸生成物を分析し、細胞増殖の培養温度を確定する。
２３、ステップ21で得られた最適株を25〜36℃、200 r/minで10時間好気増殖させ、37〜45℃で乳酸を静止培養で発酵し、スターター菌株B0013-070を対照菌株として、細胞密度、糖消耗、乳酸生産率、主要な代謝中間体などの有機酸生成物を分析し、乳酸合成の誘導のタイミングを確定する。
２４、ステップ21で得られた最適株をそれぞれ0.06〜100μg/ Lのチアミン、200 r/minで振盪培養し、スターター菌株B0013-070を対照菌株として、細胞密度、乳酸生産率、主要な代謝中間体などの有機酸生成物を分析し、細胞増殖に添加されるチアミンの量を確定する。
２５、ステップ20で得られた最適株を7L〜30,000Lの発酵槽で乳酸発酵試験を行う。 発酵中に、定刻にサンプリングし、細胞密度、糖消耗、乳酸生産率、主な代謝中間体などの有機酸生成物を分析する。
【００２９】
以下具体例を用いて、本発明の技術案をさらに詳細に説明する。
【００３０】
［実施例１］
変異体ボックスldhA :: kan-cIts857-pR-pLの構築
染色体B0013のldhAの遺伝子断片ldhA’をプライマーldhA1とldhA2によりPCR増幅し、ベクターpUC18にクローニングして組換えプラスミドpUC-ldhA 'を得た。 プラスミドpPL451をプライマーPPL1とPPL2で逆方向PCR増幅し、そしてカナマイシン耐性遺伝子断片（プラスミドpSKsymKmをSmaIで消化し、966bpの断片をゲルで回収した）と組合わせて組換えプラスミドpPL-Kanを得る。プラスミドpPL-KanをプライマーPPL3とPPL4でPCR増幅し、生成物をEcoRIとEcoRVで二重消化し、pUC-1dhA 'をモデルとしてプライマーEc-R1A1とEc-R1A2で逆方向PCR増幅し、EcoRIで消化した生成物と組合わせて組換えプラスミドpUC-ldhAp :: kan-cIts857-pR-pLを得た。得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図1に示すようである。組換えプラスミドpUC-1dhAp :: kan-cIts857-pR-pLをKpnIで消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーldhA1とldhA2でPCR増幅し、ldhAp :: kan-cIts857-pR-pL遺伝子断片を得た 。
【００３１】
［実施例２］
変異体ボックスthiE::difGm の構築
E. coli B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーThiE1pとThiE2pで増幅し0.6kbの長さのthiE遺伝子の部分配列を得た。 これをpUC18にクローニングして、組換えプラスミドpUC-thiEを得た。1.2kb の長さの difGm断片をthiEの中央のStuI部位にクローニングして、組換えプラスミドpUC-thiE :: difGmを得た。 得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図２に示すようである。 組換えプラスミドpUC-thiE :: difGmをApaLIで消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーThiE1pとThiE2pでPCR増幅してthiE :: difGm遺伝子断片を得た。
【００３２】
［実施例３］
変異体ボックスdld::difGm の構築
菌株B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーDld1 とDld2 で遺伝子断片dld’(0.9 kb)をPCR 増幅し、PCR産物をベクターpUC18 SmaI部位にクローニングし、組換えプラスミドpUC-dld’を得た。この組換えプラスミドをEcoRVで消化してdld '遺伝子の中間部分の0.4kbの遺伝子断片を除去し、dif-Gm-dif断片にクローニングして組換えプラスミドpUCdld' :: difGmを得た。 得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図３に示すようである。 組換えプラスミドpUC-dld’::difGm をEcoRI で消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーDld1 と Dld2 でPCR増幅してdld’::difGm遺伝子断片を得た。
【００３３】
［実施例４］
変異体ボックスackA- pta::difGmの構築
菌株B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーAckA-Pta1 とAckA-Pta2でackA-pta’遺伝子断片(2.8 kb)をPCR 増幅し、PCR産物をベクターpUC18 にクローニングし、組換えプラスミドpUC-ackA-pta’を得た。この組換えプラスミドをEcoRVで消化してackA-pta’遺伝子の中間部分の2.6 kb の遺伝子断片を除去し、dif-Gm-dif断片にクローニングして組換えプラスミドpUC-ackA-pta’::difGmを得た。 得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図４に示すようである。 組換えプラスミドpUC-ackA-pta’::difGm  をKpnI で消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーAckA-Pta1  とAckA-Pta2 でPCR増幅してackA-pta’::difGm 遺伝子断片を得た。
【００３４】
［実施例５］
変異体ボックスpps::difGm の構築
菌株B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーPps1  とPps2でpps 遺伝子断片(2.3 kb)をPCR 増幅し、PCR産物をベクターpUC18 にクローニングし、組換えプラスミドpUC-pps’を得た。プラスミドpUC-pps’をモデルとしてプライマーRPps1とRPps2で逆方向PCR増幅しRPps1遺伝子の中間部分の2.1 kb  の遺伝子断片を除去し、dif-Gm-dif断片にクローニングして組換えプラスミドpUC-pps’::difGmを得た。 得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図５に示すようである。 組換えプラスミドpUC-pps’::difGmをApaLIで消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーPps1 とPps2 でPCR増幅してpps’::difGm 遺伝子断片を得た。
【００３５】
［実施例６］
変異体ボックスpflB::difGm の構築
大腸菌B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーPflB1とPflB2でPCR増幅し、増幅産物PflB 'をベクターpSKのEcoRVとSmaI部位にクローニングし（この過程で、PstIとEcoRIは消失した）、組換えプラスミドpSK-pflB'を得た。組換えプラスミドpSK-pflB 'をPstIで消化し、平滑末端化しpSK-EcdifGm中のdifGmと連結して、組換えプラスミドpSK-pflB' :: difGmを得た。得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図６に示すようである。 組換えプラスミドpSK-pflB’::difGmをApaLIで消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーPflB1  とPflB1 でPCR増幅してpflB’::difGm 遺伝子断片を得た。
【００３６】
［実施例７］
変異体ボックスpoxB::difGm の構築
プライマーPoxB1とPoxB2で大腸菌のpoxB遺伝子断片を増幅し、PCR産物をプラスミドpUC18のSmaI制限部位にクローニングして組換えプラスミドpUC-poxB 'を得た。この組換えプラスミドをEcoRVで消化して、dif-Gm断片にクローニングして組換えプラスミドpUC-poxB’::difGmを得た。 得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図７に示すようである。 組換えプラスミドpUC- poxB’::difGm をApaLIで消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーPoxB1 とPoxB2 でPCR増幅してpoxB’::difGm遺伝子断片を得た。
【００３７】
［実施例８］
変異体ボックスfrdA::difGm の構築
菌株B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーFrdA1 とFrdA2でfrdA’遺伝子断片(1.6 kb)を増幅し、PCR産物をベクターpSKsym SmaI部位にクローニングして組換えプラスミドpSKsym-frdA’を得た。この組換えプラスミドをPstI で消化して、遺伝子frdA 'の中央の1.3kbの遺伝子断片を除去し、PstIの付着末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑化し、dif-Gm-dif断片にクローニングして組換えプラスミドpSKsym-frdA’::difGm を得た。 得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図８に示すようである。 組換えプラスミドpSKsym-frdA’::difGm  をApaLIで消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーFrdA1 とFrdA2 でPCR増幅してfrdA’::difGm遺伝子断片を得た。
【００３８】
［実施例９］
変異体ボックスadhE::difGmの構築
菌株B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーAdhE1 とAdhE1 でadhE’遺伝子断片(1.4 kb)を増幅し、PCR産物をベクターpUC19 SmaI部位にクローニングして組換えプラスミドpUC-adhE’を得た。この組換えプラスミドをEcoRV で消化して、遺伝子adhE’の中央の1 kbの遺伝子断片を除去し、、dif-Gm-dif断片にクローニングして組換えプラスミドpUC-adhE’::difGmを得た。 得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図９に示すようである。 組換えプラスミドpUC-adhE’::difGm  をEcoRI とPstIで二重消化し、遺伝子断片adhE1-dif-Gm-dif-adhE2 をゲルで回収する。
【００３９】
［実施例１０］
変異体ボックスldhA::difGm の構築
大腸菌B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーldhA3とldhA４でPCR増幅し乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldhA）を得て、このPCR産物をpUC18 のEcoRI 部位にクローニングして組換えプラスミドpUC-ldhAを得た。その中の400bpの断片をPstIで消化除去し、付着末端をT4 DNA ポリメラーゼで平滑化し、difGm断片に連結し、組換えプラスミドpUC-ldhA::Gmdifを得た。 得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図１０に示すようである。この組換えプラスミドをEcoRIで消化し、乳酸デヒドロゲナーゼldhA'-dif-Gm-dif-ldhAの遺伝子欠失配列、すなわちldhA :: Gmdifを得た。
【００４０】
［実施例１１］
変異体ボックスlldD::PldhA-ldhBcoa-difGm の構築
E. coli CICIM  B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーldhA５とldhA６で増幅しldhA遺伝子の全部のプロモーターと一部の構造断片を得て、断片ldhA 'をサブクローニングベクターpUC18にクローニングして、組換えプラスミドpUC-ldhA'を得た。pUC-ldhA’をモデルとし、プライマーRldhA1とRldhA12 で逆方向PCR増幅して生成物を自動的に組み合わせ、組換えプラスミドpUC-PldhAを得た。Bacillus coagulans CICIM B1821 染色体DNAをモデルとし、プライマーBcoaLDH1 とBcoaLDH4 でPCR増幅し、遺伝子断片ldhBcoaを得てBamHIとEcoRIで消化した後、プラスミドpUC-PldhA 'のBglIIとEcoRIにクローニングし、組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhBcoaを得た。次いで、difGm断片を組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhBcoaのEcoRV部位にクローニングし、組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhBcoa-difGmを得た。
プライマーlldD1 とlldD２ でPCR増幅し遺伝子断片lldDを得て、この断片をサブクローニングベクターpUC18にクローニングして、組換えプラスミドpUC-lldDを得た。組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhBcoa-difGmをBamHIで消化して断片遺伝子断片PldhA-ldhBcoa-difGmを得、組換えプラスミドpUC-1ldDのBamHI部位にクローニングし、組換えプラスミドppUC-lldD::PldhA-ldhBcoa-difGmを得た。得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図１１に示すようである。 組換えプラスミドpUC-lldD::PldhA-ldhBcoa-difGm をSmaIで消化し、ゲルで回収し遺伝子断片ldD::PldhA-ldhBcoa-difGmを得た。
【００４１】
［実施例１２］
変異体ボックスlldD::PldhA-ldhLca-difGm の構築
E. coli CICIM  B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーldhA５とldhA６で増幅し、ldhA遺伝子の全部のプロモーターと一部の構造断片を得て、断片ldhA 'をサブクローニングベクターpUC18にクローニングして、組換えプラスミドpUC-ldhA'を得た。pUC-ldhA’をモデルとし、プライマーRldhA1とRldhA12 で逆方向PCR増幅して生成物を自動的に組み合わせ、組換えプラスミドpUC-PldhAを得た。Lactobacillus casei B1192 染色体DNAをモデルとし、プライマーLcaLDH1  とLcaLDH14 でPCR増幅し、遺伝子断片ldhLcaを得てBamHIとEcoRIで消化した後、プラスミドpUC-PldhA 'のBglIIとPstIにクローニングし、組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhLcaを得た。次いで、difGm断片を組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhLcaのEcoRV部位にクローニングし、組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhLca-difGmを得た。
プライマーlldD1 とlldD２ でPCR増幅し遺伝子断片lldDを得て、この断片をサブクローニングベクターpUC18にクローニングして、組換えプラスミドpUC-lldDを得た。組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhLca-difGmをBamHIで消化して断片PldhA-ldhLca-difGm を得て、組換えプラスミドpUC-1ldDのBamHI部位にクローニングし、組換えプラスミドpUC-lldD::PldhA-ldhLca-difGmを得た。得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図１２に示すようである。 組換えプラスミドpUC-lldD::PldhA-ldhLca-difGm をSmaIで消化し、ゲルで回収し遺伝子断片lldD::PldhA-ldhLca-difGmを得た。
【００４２】
［実施例１３］
変異体ボックスlldD::PldhA-ldhStrb-difGmの構築
E. coli CICIM  B0013 染色体DNAをモデルとし、プライマーldhA５とldhA で増幅しldhA遺伝子の全部のプロモーターと一部の構造断片を得て、断片ldhA 'をサブクローニングベクターpUC18にクローニングして、組換えプラスミドpUC-ldhA'を得た。pUC-ldhA’をモデルとし、プライマーRldhA1とRldhA12 で逆方向PCR増幅して生成物を自動的に組み合わせ、組換えプラスミドpUC-PldhAを得た。Steptococcus. bovis 1.1624染色体DNAをモデルとし、プライマーStrbLDH1 とStrbLDH２でPCR増幅し、遺伝子断片ldhStrbを得てBamHIとEcoRIで消化した後、プラスミドpUC-PldhA 'のBglIIとEcoRIにクローニングし、組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhStrbを得た。次いで、difGm断片を組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhStrbのEcoRV部位にクローニングし、組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhBcoa-difGmを得た。
プライマーlldD1 とlldD２でPCR増幅し遺伝子断片lldDを得て、この断片をサブクローニングベクターpUC18にクローニングして、組換えプラスミドpUC-lldDを得た。組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhBcoa-difGmをBamHIで消化して断片PldhA-ldhStrb-difGmを得て組換えプラスミドpUC-1ldDのBamHI部位にクローニングする。得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図１３に示すようである。 組換えプラスミドpUC-lldD::PldhA-ldhStrb-difGm をSmaIで消化し、ゲルで回収し遺伝子断片lldD::PldhA-ldhStrb-difGmを得た。
【００４３】
［実施例１４］
変異体ボックスldhA::PldhA-ldhLca-difGm Lの構築
実施例10の組換えプラスミドpUC-1dhAは400bpの断片をPstIで消化して付着末端をpfu ポリメラーゼで平滑化し、実施例12の組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhLca-difGmをBamHI で消化して付着末端をpfu  ポリメラーゼで平滑化した断片PldhA-ldhLca-difGm と連結し、組換えプラスミドpUC-ldhA::PldhA-ldhLca-difGmを得た。得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図１４に示すようである。 組換えプラスミド pUCldhA ::PldhA ldh Lcadif GmをApaLI で消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーldhA3 とldhA４でPCR増幅してldhA::PldhA-ldhLca-difGm 遺伝子断片を得た。
【００４４】
［実施例１５］
変異体ボックスldhA::PldhA-ldhStrb-difGm の構築
実施例10の組換えプラスミドpUC-1dhAは400bpの断片をPstIで消化して付着末端をpfu ポリメラーゼで平滑化し、実施例1３の組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhStrb-difGmをBamHI で消化して付着末端をpfu  ポリメラーゼで平滑化した断片PldhA-ldhStrb-difGm  と連結し、組換えプラスミドpUC-ldhA::PldhA-ldhStrb-difGmを得た。得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図１５に示すようである。組換えプラスミドpUC-ldhA::PldhA-ldhStrb-difGmをApaLI で消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーldhA3 とldhA４でPCR増幅してldhA::PldhA-ldhStrb-difGm  遺伝子断片を得た。
【００４５】
［実施例１６］
変異体ボックスthiE::PldhA-ldhLca-difGm の構築
実施例12の組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhLca-difGmをBamHIで消化し断片PldhA-ldhLca-difGmを得て、断片PldhA-ldhLca-difGmをDNAポリメラーゼpfuで平滑化し、実施例2の組換えプラスミドpUC-thiEのStuI部位にクローニングし、組換えプラスミドpUC-thiE::PldhA-ldhLca-difGmを得た。得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図１６に示すようである。 組換えプラスミドpUC-thiE::PldhA-ldhLca-difGm をApaLI で消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーThiE1pとThiE２pでPCR増幅して遺伝子断片lthiE::PldhA-ldhLca-difGm を得た。
【００４６】
［実施例１７］
変異体ボックスthiE::PldhA-ldhStrb-difGm の構築
実施例1３の組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhStrb-difGm をBamHIで消化し断片PldhA-ldhStrb-difGm を得て、断片ldhA-ldhStrb-difGmをDNAポリメラーゼpfuで平滑化し、実施例2の組換えプラスミドpUC-thiEのStuI部位にクローニングし、組換えプラスミドpUC-thiE::PldhA-ldhStrb-difGmを得た。得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図１７に示すようである。 組換えプラスミドpUC-thiE::PldhA-ldhStrb-difGm をApaLI で消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーThiE1pとThiE２pでPCR増幅して遺伝子断片thiE::PldhA-ldhStrb-difGmを得た。
【００４７】
［実施例１８］
変異体ボックスthiE::PldhA-ldhBcoa-difGm の構築
実施例1１の組換えプラスミドpUC-PldhA-ldhBcoa-difGmをBamHIで消化し断片PldhA-ldhBcoa-difGmを得て、.断片PldhA-ldhBcoa-difGmをDNAポリメラーゼpfuで平滑化し、実施例2の組換えプラスミドpUC-thiEのStuI部位にクローニングし、組換えプラスミpUC-thiE::PldhA-ldhBcoa-difGmを得た。得られた組換えプラスミドの物理的図鑑は図１７に示すようである。 組換えプラスミドpUC-thiE::PldhA-ldhBcoa-difGm  をApaLI で消化し、線状化したプラスミドをゲルで回収し、プライマーThiE1pとThiE２pでPCR増幅して遺伝子断片thiE::PldhA-ldhBcoa-difGm を得た。
【００４８】
［実施例１９］
温度制御型の非常に高い光学純度のD-乳酸生成株の構築
遺伝子組み換え技術を用いて、スターター菌株B0013の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターldhApをpR-pLプロモーター（Love C.A. et al., Gene, 1996, 176: 49-53）に変え、組換え株大腸菌B0013-010B（B0013 ldhA :: kan-cIts857-pR-pL）を得た。
【００４９】
［実施例２０］
増殖定量調節可能型の非常に高い光学純度のD-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、チアミンリン酸シンターゼ（thiE）遺伝子欠失用変異体ボックスthiE’::difGmを構築し、ステップ２で得られた組換え細菌のthiE 遺伝子を欠失させ、組換え菌株大腸菌B0013-020B（B0013-010B thiE::dif）を得た。
【００５０】
［実施例２１］
D-乳酸代謝の利用経路遮断型の非常に高い光学純度のD-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、FAD依存性D-乳酸デヒドロゲナーゼ（dld）コーディング遺伝子欠失用変異体ボックスdld’::difGmを構築し、ステップ３で得られた組換え株のdld遺伝子を欠失させて、組換え大腸菌B0013-030B（B0013-020B dld::dif）を得た。
【００５１】
［実施例２２］
嫌気性酢酸合成経路経路遮断型の非常に高い光学純度のD-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、アセテートキナーゼ（ackA）とホスホトランスアセチラーゼ（pta）コーディング遺伝子欠失用変異体ボックスackA-pta’::difGmを構築し、ステップ4で得られた組換え細菌のackA-pta遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-040B（B0013-030B ackA-pta::dif）を得た。
【００５２】
［実施例２３］
ピルビン酸逆流経路遮断型の非常に高い光学純度のD-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（pps）コーディング遺伝子欠失用変異体ボックスpps ':: difGmを構築し、ステップ4および5で得られた組換え細菌のpps遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-040C（B0013-030B pps::dif）およびB0013-050B（B0013-040Bpps::dif）を得た 。
【００５３】
［実施例２４］
ギ酸嫌気性合成経路遮断型の非常に高い光学純度のD-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflB）遺伝子欠失用変異体ボックスpflB ':: difGmを構築し、ステップ4、ステップ5およびステップ6で得られた組換え細菌のpps遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-040D（B0013-030B pflB::dif）、B0013-050C（B0013-040B pflB::dif）、B0013-050D（B0013-040C pflB::dif）とB0013-060B（B0013-050B pflB::dif）を得た。
【００５４】
［実施例２５］
酢酸好気性合成経路遮断型の非常に高い光学純度のD-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、ピルビン酸オキシダーゼ（poxB）遺伝子欠失用変異体ボックスpoxB ':: difGmを構築し、ステップ4、ステップ5、ステップ6およびステップ7で得られた組換え細菌のpflB遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-040E（B0013-030B poxB :: dif）、B0013-050E（B0013-040BpoxB :: dif）、B0013-050F（B0013-040CpoxB :: dif）、B0013-060C（B0013-050BpoxB :: dif）、B0013-050G（B0013-040DpoxB :: dif）、B0013-060（B0013-050C poxB :: dif）、B0013-060F（B0013-050D poxB :: dif）とB0013-070B（B0013-060B poxB :: dif）を得た。
【００５５】
［実施例２６］
ブタン二酸合成経路遮断型の非常に高い光学純度のD-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、フマル酸レダクターゼ（frdA）遺伝子欠失用変異体ボックスfrdA’:: difGmを構築し、ステップ4、ステップ5、ステップ6、ステップ7およびステップ8で得られた組換え細菌のfrdA 遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-050B（B0013-040B frdA :: dif）、B0013-050I（B0013-040C frdA :: dif）、B0013-060G（B0013-050B frdA :: dif） ）、B0013-050I（B0013-050D frdA :: dif）、B0013-060H（B0013-050C frdA :: dif）、B0013-060I（B0013-050D frdA :: dif）、B0013-070C（B0013-060B frdA：（B0013-050F frdA :: dif）、B0013-060J（B0013-050E frdA :: dif）、B0013-060K（B0013-050F frdA :: dif）、B0013-070D（B0013-060D B0013-060F（B0013-060F frdA :: dif）、B0013-070E（B0013-060D frdA :: dif）、B0013-070F（B0013-060F frdA :: dif）とB0013-080B -070B frdA :: dif）を得た。
【００５６】
［実施例２７］
エタノール合成経路遮断型の非常に高い光学純度のD-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、アルコールデヒドロゲナーゼ（adhE）遺伝子欠失用変異体ボックスadhE’:: difGmを構築し、ステップ4、ステップ5、ステップ6、ステップ7、ステップ８およびステップ９で得られた組換え細菌のadhE遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-040G（B0013-030BadhE :: dif）、B0013-050L（B0013-040B adhE :: dif）、B0013-050M（B0013-040CadhE :: dif）、B0013-060M（B0013-050B adhE :: dif）、B0013-050N（B0013-040DadhE :: dif）、B0013-060N（B0013-050C adhE :: dif）、B0013-060O（B0013-050DadhE :: dif）、B0013-070G（B0013-060B adhE :: dif）、B0013-050O（B0013-040EadhE :: dif）、B0013-060P（B0013-050E adhE :: dif）、B0013-060Q（B0013-050FadhE :: dif）、B0013-070H（B0013-060C adhE :: dif）、B0013-060R（B0013-050GadhE :: dif）、B0013-070I（B0013-060D adhE :: dif）、B0013-070J（B0013-060FadhE :: dif）、B0013-080C（B0013-070B adhE :: dif）。 B0013-050F（B0013-040FadhE :: dif）、B0013-060S（B0013-050H adhE :: dif）、B0013-060T（B0013-050IadhE :: dif）、B0013-070K（B0013-060G adhE :: dif）、B0013-060U（B0013-050JadhE :: dif）、B0013-070L（B0013-060H adhE :: dif）、B0013-070M（B0013-060IadhE :: dif）、B0013-080D（B0013-070C adhE :: dif）、B0013-060V（B0013-050KadhE :: dif）、B0013-070N（B0013-060J adhE :: dif）、B0013-070O（B0013-060KfrdA :: dif）、B0013-080E（B0013-070D adhE :: dif）、B0013-070P（B0013-060LadhE :: dif）、B0013-080F（B0013-070E adhE :: dif）、B0013-080G（B0013-070FadhE :: dif）およびB0013-090B（B0013-080B adhE :: dif）を得た。
【００５７】
［実施例２８］
D-乳酸合成経路遮断型株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、D-乳酸デヒドロゲナーゼ（ldhA）遺伝子欠失用変異体ボックスldhA’:: difGm、を構築し、組換え細菌B0013-070 のldhA遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-080H（B0013-070 ldhA::dif）を得た。
【００５８】
［実施例２９］
D-乳酸合成経路遮断型の非常に高い光学純度のL-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldhA）遺伝子欠失用変異体ボックスldhA’::PldhA-ldhLca-difGmを構築し、組換え細菌B0013-070 のldhA遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-080I（B0013-070 ldhA::PldhA-ldhLca-dif）を得た。
【００５９】
［実施例３０］
D-乳酸合成経路遮断型の非常に高い光学純度のL-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldhA）遺伝子欠失用変異体ボックスldhA’::PldhA-ldhStrb-difGmを構築し、組換え細菌B0013-070 のldhA遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-080J（B0013-070 ldhA::PldhA-ldhStrb-dif）を得た。
【００６０】
［実施例３１］
L-乳酸代謝利用経路遮断型の非常に高い光学純度のL-乳酸生成株の構築 
遺伝子組換え技術を用いて、FMNを補体としてのL-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（lldD）遺伝子欠失用変異体ボックスLdD :: PldhA-ldhBcoa-difGmを構築し、組換え菌B0013-070、B0013-080H、B0013-080I とB0013-080J のLldD遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-080K（B0013-070 lldD::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-090C（B0013-080H lldD::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-090D（B0013-080I lldD::PldhA-ldhBcoa-dif）とB0013-090E（B0013-080J lldD::PldhA-ldhBcoa-dif）を得た。
【００６１】
［実施例３２］
L-乳酸代謝利用経路遮断型の非常に高い光学純度のL-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、FMNを補体としてのL-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（lldD）遺伝子欠失用変異体ボックスlldD’::PldhA-ldhLca-difGmを構築し、組換え菌B0013-070、B0013-080H、B0013-080I とB0013-080JのLldD遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-080L（B0013-070 lldD:: PldhA-ldhLca-dif）、B0013-090F（B0013-080HlldD:: PldhA-ldhLca-dif）、B0013-090G（B0013-080I lldD:: PldhA-ldhLca-dif）とB0013-090H（B0013-080J lldD:: PldhA-ldhLca-dif）を得た。
【００６２】
［実施例３３］
L-乳酸代謝利用経路遮断型の非常に高い光学純度のL-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、FMNを補体としてのL-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（lldD）遺伝子欠失用変異体ボックスllldD’::PldhA-ldhLca-difGmを構築し、組換え菌BB0013-070、B0013-080H、B0013-080I 和B0013-080のLldD遺伝子を欠失させ、組換え大腸菌B0013-080M（B0013-070 lldD:: PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-090I（B0013-080HlldD:: PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-090J（B0013-080I lldD:: PldhA-ldhStrb-dif）とB0013-090K（B0013-080J lldD:: PldhA-ldhStrb-dif）を得た。
【００６３】
［実施例３４］
増殖定量調節可能型の非常に高い光学純度のL-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、チアミンリン酸シンターゼ（thiE）遺伝子欠失用変異体ボックスthiE’::difGmを構築し、ステップ11、ステップ12、ステップ13、ステップ14、ステップ15およびステップ16で得られた組換え細菌のthiE 遺伝子を欠失させ、組換え菌株B0013-090L（B0013-080HthiE::dif）、B0013-090M（B0013-080I thiE::dif）、B0013-090N（B0013-080JthiE::dif）、B0013-090O（B0013-080K thiE::dif）、B0013-100B（B0013-090CthiE::dif）、B0013-100C（B0013-090D thiE::dif）、B0013-100D（B0013-090EthiE::dif）、B0013-090E（B0013-080L thiE::dif）、B0013-100E（B0013-090FthiE::dif）、B0013-100F（B0013-090G thiE::dif）、B0013-100G（B0013-090HthiE::dif）、B0013-080N（B0013-070 thiE::dif）、B0013-100H（B0013-090IthiE::dif）、B0013-100I（B0013-090J thiE::dif）とB0013-100J（B0013-090KthiE::dif）を得た。
【００６４】
［実施例３５］
増殖定量調節可能型の非常に高い光学純度のL-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、チアミンリン酸シンターゼ（thiE）遺伝子欠失用変異体ボックスthiE’::PldhA-ldhLca-difGmを構築し、ステップ11、ステップ12、ステップ13、ステップ14、ステップ15およびステップ16で得られた組換え細菌のthiE 遺伝子を欠失させ、組換え菌株B0013-090R（B0013-080HthiE :: PldhA-1dhLca-dif）、B0013-090Q（B0013-080I thiE :: PldhA-1dhLca-dif）、B0013-090R（B0013-080JthiE :: PldhA-1dhLca-dif） B0013-090KthiE :: PldhA-1dhLca-dif、B0013-100K（B0013-090C thiE :: PldhA-1dhLca-dif）、B0013-100L（B0013-090D thiE :: PldhA-1dhLca-dif） （B0013-090EthiE :: PldhA-1dhLca-dif）、B0013-090T（B0013-080L thiE :: PldhA-1dhLca-dif）、B0013-100N（B0013-090F thiE :: PldhA-1dhLca-dif） （B0013-090GthiE :: PldhA-1dhLca-dif）、B0013-100P（B0013-090H thiE :: PldhA-1dhLca-dif）、B0013-080O（B0013-070thiE :: PldhA-1dhLca-dif） B0013-100R（B0013-090I thiE :: PldhA-1dhLca-dif）とB0013-100S（B0013-090K thiE :: PldhA-1dhLca-dif）を得た。
【００６５】
［実施例３６］
増殖定量調節可能型の非常に高い光学純度のL-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、チアミンリン酸シンターゼ（thiE）遺伝子欠失用変異体ボックスthiE’::PldhA-ldhStrb-difGmを構築し、ステップ11、ステップ12、ステップ13、ステップ14、ステップ15およびステップ16で得られた組換え細菌のthiE 遺伝子を欠失させ、組換え菌株B0013-090U（B0013-080HthiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-090V（B0013-080I thiE::PldhA-ldhStrb-dif），B0013-090W（B0013-080J thiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-090X（B0013-080KthiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-100T（B0013-090C thiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-100U（B0013-090D thiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-100V（B0013-090EthiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-090Y（B0013-080L thiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-100W（B0013-090F thiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-100X（B0013-090GthiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-100Y（B0013-090H thiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-080P（B0013-070 thiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-100Z（B0013-090IthiE::PldhA-ldhStrb-dif）、B0013-100BB（B0013-090J thiE::PldhA-ldhStrb-dif）とB0013-100BC（B0013-090K thiE::PldhA-ldhStrb-dif）を得た。
【００６６】
［実施例３７］
増殖定量調節可能型の非常に高い光学純度のL-乳酸生成株の構築
遺伝子組換え技術を用いて、チアミンリン酸シンターゼ（thiE）遺伝子欠失用変異体ボックスthiE’::PldhA-ldhBcoa-difGmを構築し、ステップ11、ステップ12、ステップ13、ステップ14、ステップ15およびステップ16で得られた組換え細菌のthiE 遺伝子を欠失させ、組換え菌株B0013-090Z（B0013-080HthiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-090BB（B0013-080I thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-090BC（B0013-080J thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-090BD（B0013-080KthiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BD（B0013-090C thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BE（B0013-090D thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BF（B0013-090EthiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-090BE（B0013-080L thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BG（B0013-090F thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BH（B0013-090GthiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BI（B0013-090H thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-080Q（B0013-070 thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BJ（B0013-090IthiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BK（B0013-090J thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BL（B0013-090K thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BM（B0013-090UthiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BN（B0013-090V thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BO（B0013-090W thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BP（B0013-090XthiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-101B（B0013-100T thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-101C（B0013-100U thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-101D（B0013-100VthiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-100BQ（B0013-090Y thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-101E（B0013-100W thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-101F（B0013-100XthiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-101G（B0013-100Y thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-090BF（B0013-080P thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-101H（B0013-100ZthiE:: thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）、B0013-101I（B0013-100BBhiE::PldhA-ldhBcoa-dif）とB0013-101J（B0013-100BC thiE::PldhA-ldhBcoa-dif）を得た。
【００６７】
［実施例３８］
非常に高い光学純度のD-乳酸多産菌株のスクリーニング
ステップ19〜27で得られた組換え菌株を0.06〜100μg/ Lのチアミン、25〜36℃および200 r/min の条件でそれぞれ10時間好気増殖させ、さらに37〜50℃で乳酸を静止培養で発酵し、スターター菌株B0013-070を対照株とし、D-乳酸合成量、生成したD-乳酸の光学純度および化学純度を分析し、最適な菌株をスクリーニングした。 スクリーニング結果を図19と表1に示す。
【００６８】
【表１】
2018515121.tif 000003
2018515121.tif 000004
2018515121.tif 000005
【００６９】
［実施例３９］非常に高い光学純度のD-乳酸多産菌株のスクリーニング
ステップ28-37で得られた組換え菌株を0.06〜100μg/ Lのチアミン、25〜36℃および200 r/min の条件でそれぞれ10時間好気増殖させ、さらに37〜50℃で乳酸を静止培養で発酵し、スターター菌株B0013-070を対照株とし、D-乳酸合成量、生成したD-乳酸の光学純度および化学純度を分析し、最適な菌株をスクリーニングする。 スクリーニング結果を図２０と表２に示す。
【００７０】
【表２】
2018515121.tif 000006
2018515121.tif 000007
2018515121.tif 000008
【００７１】
［実施例４０］
高光学純度のD-乳酸の発酵生産
実施例３８で得られた最適株を7L〜30,000Lの発酵槽で乳酸発酵試験を行った。 発酵中に、定刻にサンプリングし、細胞密度、糖消耗、乳酸生産率、主な代謝中間体などの有機酸生成物を分析した。25〜36℃で約15〜40のOD600値までの好気性培養を行い、発酵槽温度を37〜50℃に設定して好気性培養を0〜120min継続し、更に通気量を0〜0.2vvmに設定し限酸素発酵を行った。限酸素段階：0-3h の発酵温度33-39℃、3-6hの発酵温度37-42℃、6-10hの発酵温度38-45℃、10-16hの発酵温度40-48℃、 16〜24hの発酵温度45〜50℃。その 発酵培地（g / L）：リン酸二アンモニウム0-25、リン酸二水素カリウム0-5、リン酸水素二ナトリウム0-25、塩化ナトリウム0-5、MgSO4 0-0.5、 FeSO4 0-1、FeCl3 0-1、CoCl2 0-1、CuCl2 0-1、Na2MoO4 0-1、H3BO3 0-1、MnCl2 0-1、クエン酸0-25、チアミン0-1、キシロース0-50、グリセロール0-50、グルコース0-50、硫酸0-5、pH6.0-7.5。
詳細な発酵結果を図21および図22に示す。
【００７２】
［実施例４１］
非常に高い光学純度のD-乳酸の発酵生産
実施例３９で得られた最適株を7L〜30,000Lの発酵槽で乳酸発酵試験を行った。 発酵中に、定刻にサンプリングし、細胞密度、糖消耗、乳酸生産率、主な代謝中間体などの有機酸生成物を分析した。25〜36℃で約15〜40のOD600値までの好気性培養を行い、発酵槽温度を37〜50℃に設定して好気性培養を0〜120min継続し、更に通気量を0〜0.2vvmに設定し限酸素発酵を行い、限酸素発酵温度は37-50℃である。その 発酵培地（g / L）：リン酸二アンモニウム0-25、リン酸二水素カリウム0-5、リン酸水素二ナトリウム0-25、塩化ナトリウム0-5、MgSO4 0-0.5、 FeSO4 0-1、FeCl3 0-1、CoCl2 0-1、CuCl2 0-1、Na2MoO4 0-1、H3BO3 0-1、MnCl2 0-1、クエン酸0-25、チアミン0-1、キシロース0-50、グリセロール0-50、グルコース0-50、硫酸0-5、pH6.0-7.5。
詳細な発酵結果を図23および図24に示す。
【００７３】
［実施例４２］
菌株10トン発酵槽で非常に高い光学純度のD-乳酸の5バッチの発酵生産
実施例38で得られた非常に高い光学純度のD-乳酸の最適生産菌株を10トンの発酵槽中で5バッチの連続生産を行った。
【００７４】
（１）一級種子の拡張
低温グリセロールチューブ保存株1mlを取り、専用な液体培地（ZT1培地）1L / 5Lボトルに接種する。37℃、200 r/min 培養10-13h。
ZT1培地調合
成分1合計 12.6 g、700 mLの水に溶解して、121℃で滅菌20min。
成分2合計18g、150mLの水に溶解して単独に滅菌し、接種時に添加する。
成分3合計5g、150mLの水に溶解して単独に滅菌し、接種時に添加する。
ここで、ZT1培地の組成は（g / L）：リン酸二アンモニウム0〜25、リン酸二水素カリウム0〜5、リン酸水素二ナトリウム0-25、塩化ナトリウム0-5、MgSO4 0-0.5、FeSO4 0-1、FeCl3 0-1、CoCl20-1、CuCl2 0-1、ZnCl2 0-1、Na2MoO4 0-1、H3BO3 0-1、MnCl2 0-1、クエン酸0-25、チアミン0-1、キシロース0-50、グリセロール0-50、グルコース0-50、硫酸0-5、pH6.0-7.5。
【００７５】
(２)二級種子の拡張
前記種子液1Lを100L二級種子タンクに接種し、液量50L。33〜37℃低強度通気培養10〜13 h。
二級種子タンクZT2培地調合
成分1合計570g、30Lの水に溶解して、121℃で滅菌20min。
成分2合計810g、5Lの水に溶解して単独に滅菌し、接種時に添加する。
成分3合計1350g、5Lの水に5Lに溶解して単独に滅菌し、接種時に添加する。
ここで、ZT1培地の組成は（g / L）：リン酸二アンモニウム0〜25、リン酸二水素カリウム0〜5、リン酸水素二ナトリウム0-25、塩化ナトリウム0-5、MgSO4 0-0.5、FeSO4 0-1、FeCl3 0-1、CoCl20-1、CuCl2 0-1、ZnCl2 0-1、Na2MoO4 0-1、H3BO3 0-1、MnCl2 0-1、クエン酸0-25、チアミン0-1、キシロース0-50、グリセロール0-50、グルコース0-50、硫酸0-5、pH6.0-7.5。
【００７６】
（３）発酵
前記の二級種子拡張の種子液50Lを10m3の発酵槽に移す。初期作業容積は5m3であり、発酵培地の基礎はZT2培地である。 33-37℃低強度で通気培養8-9 h、初期換気比1：0.3（材料：風）、培養中、回転速度と通気量を増加させ溶存酸素を20％以上に制御する。Ca（OH）2を添加し pH7.0を維持する。 換気されていない発酵酸生成段階に移し、発酵温度は40-45℃、Ca（OH）2でpH7.0を維持する。 最初の発酵体積の計算によると、50g / Lの最終濃度まで追加のグルコースを4バッチで3 h間隔で加え、発酵20-22h、0.1％未満の残留グルコースを測定した後、ポットを入れることができる。発酵が完了すると前記のプロセスに従って 5バッチの発酵を繰り返す。 発酵は表3の結果となった。
【００７７】
【表３】
2018515121.tif 000009
【００７８】
［実施例４３］
菌株10トン発酵槽で非常に高い光学純度のD-乳酸の5バッチの発酵生産
実施例４２の発酵プロトコールに従って、生産菌株を実施例39で得られた最適生産菌株に替え、10トンの発酵槽中で5バッチの連続生産を行った。発酵は表４の結果となった。
【００７９】
【表４】
2018515121.tif 000010
【００８０】
［実施例４４］非常に高い光学純度のD-乳酸とL-乳酸の製品製造
発酵の終わりに、発酵液に濃度1％〜50％の硫酸をゆっくりと添加し酸性化する。 攪拌しながら徐々に硫酸を添加し、最初に1％-18％の量で添加し、 BaCl2とシュウ酸アンモニウム試薬でそれぞれ酸性を検出し、酸性の場合は、酸の添加を止め反応を6時間攪拌し、全過程に攪拌を行った。反応終点は BaCl2および シュウ酸アンモニウム試薬でそれぞれ検出される。
フレームフィルタ：酸溶液をフレームフィルタで加圧濾過する。 加圧濾過後、フィルターを85℃の温水で洗浄し、洗浄液中の乳酸濃度が0.1％未満になるまで洗浄する。洗浄後、 圧縮空気で乾燥させ、洗浄液を透明な液体に入れる。 細菌と固体カルシウム塩は、セメントまたはコンクリート成分として使用される。
限外濾過：超濾過で色素、タンパク質、アミノ酸および残留細菌などを除去する。 限外濾過効率を向上させるために、限外濾過前に濾過液を蒸発濃縮し、濃縮比4：1、濃縮液を限外濾過する。
イオン交換：限外濾過後に得られた濾液をイオン交換する。
カチオン交換：732 架橋を7％有するスチレン - ジビニルスチレンコポリマー上にスルホン酸基（-SO3H）のカチオン交換樹脂（-001×7（732）強酸性スチレンカチオン交換樹脂）を有する; 予備液体材料を室温まで冷却する。 5％W / V のHCl溶液を再生処理する。中間試験：Fe2 +は1ppm以下、交換流速300ml/mi（試験結果による）。
アニオン交換：330（701）弱アルカリ性アニオン交換樹脂（弱塩基性エポキシアニオン交換樹脂、主に水処理時のCl-、SO42-などのイオンを除去し、無機酸を除去し、有機酸を抽出し漂白を行い、 銅、銀イオンの回収ができる。）;再生処理：5％W / V NaOH溶液; 交換流速300ml /min（試験結果による）。中間検査：C1-は3ppm以下、 SO42-は5ppm以下。
製品濃縮：製品の要求される乳酸濃度に濃縮する。この製品はポリD-乳酸/ L-乳酸である。
【００８１】
要約すると、本発明は、D-乳酸およびL-乳酸多産組換え細菌の染色体上の乳酸デヒドロゲナーゼコーディング遺伝子の表し方を、単純な条件下で動的に調節し、組換え細菌がグルコースからD-乳酸とL-乳酸を単一で効率的に生産する簡潔な発酵工学技術を実現させる。
【００８２】
本発明の技術は、簡単な変更の後に、他の工業的に重要な微生物代謝産物にも適用することができ、例えば、クエン酸、ギ酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、α-ケトグルタル酸、コハク酸、アジピン酸、ペンタメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、メタクリル酸、イソプレン、イタコン酸酸などの有機酸および有機アミン；またはプロリン、アラニン、リジン、 メチオニン、グルタミン酸、アルギニン等のアミノ酸;チアミン、ビタミンB12等の各種微生物;またエタノール、プロパノール等の短鎖アルコール;イソマルトオリゴ糖、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖等の多機能糖の菌株構築、発酵生産と新工芸技術の確立と応用にも適用できる。
【００８３】
前記実施例において、ldhA1 のヌクレオチド配列は、<400>1 に示される配列であり、ldhA2 のヌクレオチド配列は、<400>2 に示される配列であり、PPL1 のヌクレオチド配列は、<400>3 に示される配列であり、PPL2 のヌクレオチド配列は、<400>4 に示される配列であり、PPL3 のヌクレオチド配列は、<400>5に示される配列であり、PPL4 のヌクレオチド配列は、<400>6 に示される配列であり、Ec-RlA1 のヌクレオチド配列は、<400>7 に示される配列であり、Ec-RlA2 のヌクレオチド配列は、<400>8 に示される配列であり、ThiE1p のヌクレオチド配列は、<400>9 に示される配列であり、ThiE2p のヌクレオチド配列は、<400>10 に示される配列であり、Dld1 のヌクレオチド配列は、<400>11 に示される配列であり、Dld2 のヌクレオチド配列は、<400>12 に示される配列であり、AckA-Pta1 のヌクレオチド配列は、<400>13に示される配列であり、AckA-Pta2 のヌクレオチド配列は、<400>14 に示される配列であり、Pps1 のヌクレオチド配列は、<400>15 に示される配列であり、Pps2 のヌクレオチド配列は、<400>16 に示される配列であり、RPps1 のヌクレオチド配列は、<400>17 に示される配列であり、RPps2 のヌクレオチド配列は、<400>18 に示される配列であり、PflB1 のヌクレオチド配列は、<400>19 に示される配列であり、PflB2 のヌクレオチド配列は、<400>20 に示される配列であり、PoxB1 のヌクレオチド配列は、<400>21 に示される配列であり、PoxB2 のヌクレオチド配列は、<400>22 に示される配列であり、FrdA1 のヌクレオチド配列〜序列表<400>23 に示される配列であり、FrdA2 のヌクレオチド配列は、<400>24 に示される配列であり、AdhE1のヌクレオチド配列は、<400>25 に示される配列であり、AdhE2 のヌクレオチド配列は、<400>26に示される配列であり、ldhA3 のヌクレオチド配列は、<400>27 に示される配列であり、ldhA4 のヌクレオチド配列は、<400>28 に示される配列であり、ldhA5 のヌクレオチド配列は、<400>29 に示される配列であり、ldhA6 のヌクレオチド配列は、<400>30 に示される配列であり、RldhA1 のヌクレオチド配列は、<400>31 に示される配列であり、RldhA2 のヌクレオチド配列は、<400>32 に示される配列であり、BcoaLDH1のヌクレオチド配列は、<400>33 に示される配列であり、BcoaLDH4 のヌクレオチド配列は、<400>34 に示される配列であり、LldD1 のヌクレオチド配列は、<400>35 に示される配列であり、LldD2 のヌクレオチド配列は、<400>36 に示される配列であり、LcaLDH1 のヌクレオチド配列は、<400>37に示される配列であり、LcaLDH4 のヌクレオチド配列は、<400>38 に示される配列であり、StrbLDH1 のヌクレオチド配列は、<400>39 に示される配列であり、StrbLDH2 のヌクレオチド配列は、<400>40 に示される配列である。
【００８４】
具体的な情報は以下の通り：
SEQ ID No.1 の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：27 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No. １
ldhA1：TCC GGTACC CAGCCCGAGCGTCATCAG； Kpn I
SEQ ID No.2の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：25 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.2
ldhA2：GTCAAGGTCGACGTTATTGAAACCG;
SEQ ID No.3の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：28 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.3
PPL1：AGCTTGGCTGCAGGTGATGATTATCAGC;
SEQ ID No.4の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：24 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.4
PPL2：ATCGCCGGCAATTCGTAATCATGG; EcoRI
SEQ ID No.5の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：30 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.5
PPL3：TAAGATATCCCATGATTACGAATTGCCGGC; EcoRV
SEQ ID No.6の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：37 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.6
PPL4：TAAGAATTCAGTTAACCTCCTTAGGATCCCAATGCTT EcoRI
SEQ ID No.7の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：39 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.7
Ec-R1A1：TAAGAATTCATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAG; EcoRI
SEQ ID No.8の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：30 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.8
Ec-R1A2：AAGACTTTCTCCAGTGATGTTGAATCACAT;
SEQ ID No.9の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：29 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.9
ThiE1p：AGAGAATTCATTCATCGCCAACTCCTGCA
SEQ ID No.10の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：32 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.10
ThiE2p：AGAGAATTCGGTGGACAGCGTACAGTGGATCG;
SEQ ID No.11の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：26 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.11
Dld1：AGTACGTCTTGATACCTTCGAAGCGG;
SEQ ID No.12の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：23 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.12
Dld2：GGATTCATGCTGTTGGTCGGATC;
SEQ ID No.13の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：23 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.13
AckA-Pta1：TGAACATCATCACCTGCCACCTG;
SEQ ID No.14の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：19 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.14
AckA-Pta2：CAGCGCAAAGCTGCGGATG
SEQ ID No.15の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：25 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.15
Pps1：CGGCATGAATGATGTAGACAGGGTT
SEQ ID No.16の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：23 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.16
Pps2：TAACCAGGTTTGCACCACGGTGT
SEQ ID No.17の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：21 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.17
RPps1：TGTGGCGAAACCATTCGGAAC
SEQ ID No.18の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：22 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.18
RPps2：GTCCGACCACGAAGACTTTGCC
SEQ ID No.19の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：23 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.19
PflB1：TTCAGACTTCGGACCAACCTGCA
SEQ ID No.20の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：20 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.20
PflB2：CCGCGAACTGGATCCGATGA;
SEQ ID No.21の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：24 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.21
PoxB1：CAAACGGTTGCAGCTTATATCGCC
SEQ ID No.22の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：24 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.22
PoxB2：TGCGGTGGAATGGCTAACTCTTCT
SEQ ID No.23の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：23 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.23
FrdA1：CTTTCAAGCCGATCTTGCCATTG
SEQ ID No.24の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：24 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.24
FrdA2：ACTCTTTACGTGCCATTGCGGAGT
SEQ ID No.25の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：24 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.25
AdhE1：ATCTGATCGGCTGGATCGATCAAC
SEQ ID No.26の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：22 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.26
AdhE2：GAACCAGGTTGGCGTCGACAAT
SEQ ID No.27の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：35 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.27
ldhA3：TAAGAATTCTTATGAAACTCGCCGTTTATAGCACA EcoRI
SEQ ID No.28の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：38 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.28
ldhA4：CTTGAATTCAAGCTTGCTGCCGGAAATCATCATTTTTT EcoRI、HindIII
SEQ ID No.29の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：21 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.29
ldhA5：GGGCAGCCCGAGCGTCATCAG
SEQ ID No.30の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：23 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.30
ldhA6：GCTGCCGGAAATCATCATTTTTT
SEQ ID No.31の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：30 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.31
RldhA1：GGAAGATCTTCCGCGAGTTTCATAAGACTT BglII
SEQ ID No.32の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：24 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.32
RldhA2：CGGAATTCCGAACGAACTGGTTTA EcoRI
SEQ ID No.33の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：33 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.33
BcoaLDH1 CCGGATCCAATCAGGGTGTTGCAGAAGAGCTTG BamHI
SEQ ID No.34の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：34 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.34
BcoaLDH4 GCGGAATTCTTACAATACAGGTGCCATCGTTTCT EcoRI
SEQ ID No.35の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：28 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.35
LldD1GGCCCGGGCATGATTATTTCCGCAGCCA SmaI
SEQ ID No.36の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：30 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.36
LldD2：GGCCCGGGCAGGCAACTCTTTACCCAGCCC SmaI
SEQ ID No.37の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：30 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.37
LcaLDH1 CGCGGATCCAGTATTACGGATAAGGATCAC BamHI
SEQ ID No.38の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：25 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.38
LcaLDH4 CGCCTGCAGTCCTGTTCTTCGTTTG PstI
SEQ ID No.39の情報
（I）配列特徴：
（A）長さ：28 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.39
StrbLDH1 CGCGGATCCACTAAACAACACAAAAAAGBamHI
SEQ ID No.40の情報：
（I）配列特徴：
（A）長さ：28 bp
（B）タイプ：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）位相構造：リニアリティ
（Ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド
（Iii）配列の説明：SEQ ID No.40
StrbLDH2 CCGGAATTCTACAGGGATTGTTGCCGCA EcoRI
前記の実施例は乳酸の構築菌株及びその製造方法と応用について詳細に説明し、例示的であって制限的ではなく、定義された範囲に従っていくつかの例を挙げることができるので、 本発明の総体的な構想から離れなくて変更および修正し、本発明の保護範囲内に入るべきである。
【図１】
2018515121.tif 000011
【図２】
2018515121.tif 000012
【図３】
2018515121.tif 000013
【図４】
2018515121.tif 000014
【図５】
2018515121.tif 000015
【図６】
2018515121.tif 000016
【図７】
2018515121.tif 000017
【図８】
2018515121.tif 000018
【図９】
2018515121.tif 000019
【図１０】
2018515121.tif 000020
【図１１】
2018515121.tif 000021
【図１２】
2018515121.tif 000022
【図１３】
2018515121.tif 000023
【図１４】
2018515121.tif 000024
【図１５】
2018515121.tif 000025
【図１６】
2018515121.tif 000026
【図１７】
2018515121.tif 000027
【図１８】
2018515121.tif 000028
【図１９】
2018515121.tif 000029
【図２０】
2018515121.tif 000030
【図２１】
2018515121.tif 000031
【図２２】
2018515121.tif 000032
【図２３】
2018515121.tif 000033
【図２４】
2018515121.tif 000034
【配列表】
2018515121000001.app
【国際調査報告】
2018515121.tif 000035
2018515121.tif 000036
2018515121.tif 000037
2018515121.tif 000038
2018515121.tif 000039
2018515121.tif 000040
2018515121.tif 000041
2018515121.tif 000042