(57)【要約】  本発明は、液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱する方法に関する。本発明によれば、５．０ｋＶ／ｃｍ未満の電界強度を長期間印加することで、したがって、比較的低い電界強度及び比較的延長されたパルス持続時間を選択することによって、十分かつ効果的な微生物不活性化が達成される。本発明の方法は、中性ｐＨ及び７未満のｐＨで効率的である。さらに、本発明の方法は、広範囲の関連する微生物を不活性化するのに効率的である。本発明は、さらに、液体生成物をその方法に供する前に液体生成物が予熱される方法に関する。本発明は、本発明による方法によって得られる液体生成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱して、加熱された液体生成物を得るための方法であって、
（ａ）液体生成物を提供する工程；
（ｂ）液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための装置を提供する工程；
（ｃ）前記液体生成物を前記装置の入口に供給し、前記装置を通して前記液体生成物を流す工程；
（ｄ）前記装置中に流れている前記液体生成物に電流を連続的に発生させる工程であって、最小の１つのパルスが通過中に各流体エレメントに少なくとも１０マイクロ秒のパルス持続時間で印加され、電界強度が０．１〜５ｋＶ／ｃｍである、当該工程；
を含み、
前記液体生成物の最高温度が前記抵抗加熱中に自律的に９２℃未満のままである、
上記方法。
【請求項２】
前記液体生成物のｐＨが、ｐＨ１．５〜９．０、好ましくは４．６を超え、好ましくは４．８〜９．０、より好ましくは５．５〜８．０、より好ましくは６．０〜７．５である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記液体生成物が、２０℃で測定して０．０１〜１０Ｓ／ｍ、好ましくは２０℃で測定して０．１〜３Ｓ／ｍ、より好ましくは２０℃で測定して０．２Ｓ／ｍ〜０．８Ｓ／ｍの電気伝導率を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記液体生成物が、液体食品生成物又は液体飼料生成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記液体生成物が、成分、半完成生成物、又は、果物ジュース、野菜ジュース若しくはスムージー、ジャム、スプレッド、アルコール若しくは非アルコール飲料、乳製品、植物性ミルク生成物、液状卵、スープ、若しくはソースのような最終液体生成物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記乳製品が、ミルク、ミルク生成物、又はミルク構成成分若しくはミルク画分を含む液体組成物から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記液体生成物の温度が、前記抵抗加熱中に自律的に８５℃未満、好ましくは７５℃未満、より好ましくは６０℃未満のままである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記電界強度が、０．５〜５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは２．５〜４ｋＶ／ｃｍである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記パルス持続時間が、少なくとも１０マイクロ秒、好ましくは１０〜２０００マイクロ秒、より好ましくは５０〜５００マイクロ秒、最も好ましくは５０〜１００マイクロ秒である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
バイポーラパルスが印加される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記液体生成物中の微生物の不活性化のための方法である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記加熱された液体生成物が、前記装置を通って流れた直後に冷却される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記液体生成物が、前記装置に供給される前に、２０℃〜７０℃、好ましくは３５℃〜６５℃、より好ましくは４０℃〜６０℃の範囲の温度まで予熱される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記液体生成物中の微生物数（ｃｆｕ）が、少なくとも２ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは少なくとも５ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ、最も好ましくは６ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ以上減少する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって得られる液体生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための方法に関する。本発明は、さらに、液体生成物をその方法に供する前に液体生成物が予熱される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パルス電界（ＰＥＦ）は、高強度の外部電界による短時間のパルスの印加によって細胞膜のエレクトロポレーションを誘導する技術として使用される。この現象に関する最も広く受け入れられている理論は、生体膜に外部電界を印加することにより、脂質二重層における局所的不安定性が誘発され、最終的に細孔形成につながるということである。細孔の形成（エレクトロポレーション）は、膜を通過する透過性（電気透過性）を高め、印加電界の強度に依存して、可逆的プロセスであるか、又は高電圧で印加された場合には不可逆的であり、細胞死をもたらす。
【０００３】
連続流ＰＥＦ処理システムでは、パルスの持続時間、２つのパルスの間の時間（休止時間）、高電界領域における流体エレメントの滞留時間及び通過時間、冷却セクションに入る前に高電界領域を離れる時間を含めた種々の臨界時間が考慮されなければならない（Ｍａｓｔｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。総（有効）処理時間は、パルスの数と、処理装置を通してポンプで送られた場合に高電界条件で流体エレメントによって受け取られるパルス当たりの時間との積として定義される。現在、総処理時間及び電界強度は、不可逆的エレクトロポレーションの効率を決定する重要な要因として知られている（Ｓａｕｌｉｓ  ａｎｄ  Ｗｏｕｔｅｒｓ，２００７）。不可逆的エレクトロポレーションは、２マイクロ秒の持続時間のパルスを１００〜４００マイクロ秒の総処理時間に関して使用する場合、１０〜２０ｋＶ／ｃｍの範囲の電界強度で栄養微生物に効果的である（図１）。Ｒｅｙｎａｒｄ及び共同研究者ら（１９９８）は、遺伝子導入のための単一パルスのパルス持続時間に対する臨界効果を調査した。彼らは、約１ミリ秒の最低のパルス時間が配向に必要であることを見出し、１〜２．７ｋＶ／ｃｍの電界強度で２４ミリ秒持続時間のパルスを使用して３〜５ミリ秒の透過処理のための臨界応答時間を示した。
【０００４】
直流（ＤＣ）パルスとは対照的に、交流（ＡＣ）電流は、液体中で高電界条件を引き起こすために使用される。固定周波数（ｆ）を有するＡＣ電流は、１／ｆの持続時間を有するパルスとして見ることができるが、ここで考慮される特徴的なパルス形状は、長方形であり、これは、パルスの繰返し周波数が帯域幅（１／パルス持続時間）よりも小さいことを意味する。米国特許第２０１０／０２９７３１３号明細書では、１ＭＨｚを超える周波数（又は１マイクロ秒未満のパルス持続時間）のＡＣ電流が検討されている。
【０００５】
特定の処理条件に関する選択は、エレクトロポレーションの種々の適用及び目的に関連している。可逆的エレクトロポレーションは、小さい又は大きい分子、例えば、薬物、オリゴヌクレオチド、抗体、及びプラスミドを細胞中に導入するために分子生物学及び臨床バイオテクノロジーにおいて頻繁に使用される手順であり、細胞が生きた状態に保つことを目標とする。不可逆的エレクトロポレーションは、細胞から分子を抽出する又は細胞を不活性化するために使用され得る。本発明では、我々は、非熱保存法としての不可逆的エレクトロポレーションを目標とし、ここでは、ＰＥＦプロセシングによって得られる最高温度及び保持時間が従来の加熱低温殺菌よりも低い。このことは、例えば、生成物の新鮮な味及び栄養価のより良好な保存における他の有益な側面をもたらす。
【０００６】
微生物不活性化を目標とする場合、パルス電気処理のために選択されるプロセシング条件は、いくつかの要因に依存するが、プロセシングパラメータ、微生物特性、及び処理媒体特性の３つのグループに分類することができる。
【０００７】
電界強度及び処理時間に加えて、温度が、ＰＥＦによる微生物不活性化の有効性にとって重要であると考えられている（Ｒａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。電界強度及び処理時間の増加は、ＰＥＦ致死性の増加につながる。これらの条件の結果として、質量単位あたりより多くのエネルギーが適用されることになり、生成物の発熱がより大きくなる。不可逆的エレクトロポレーションに使用される典型的なプロセス条件は、高電圧（５〜８０ｋＶ／ｃｍ）でのマイクロ秒の短いパルスの範囲内にある。
【０００８】
ＰＥＦによる微生物不活性化の程度は、微生物にとって致命的ではない温度範囲であっても、ＰＥＦ処理の前に、培地（例えば、液体食品生成物）の温度を上昇させることによって増強される。理論に束縛されることを望むものではないが、この予熱効果は、細胞膜のリン脂質二重層構造に影響を及ぼし、細胞をＰＥＦプロセスに対してより脆弱にする（Ｗｏｕｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０００９】
微生物の特性は、ＰＥＦによる微生物不活性化の有効性に影響を与える。一般に、比較的大きな微生物は、より小さい微生物よりもＰＥＦに対してより感受性であり、グラム陰性菌は、グラム陽性菌よりもＰＥＦに対してより感受性であることが報告されている。
【００１０】
ＰＥＦ処理の有効性は、微生物で懸濁した液体培地において研究されることが多い。この処理培地の特性が調査されており、ｐＨが処理の有効性にとって非常に重要であると報告されている。すなわち、ＰＥＦは、中性ｐＨの培地におけるよりも低ｐＨの培地においてはるかに効果的である。
【００１１】
不可逆的ＰＥＦプロセシングの商業的適用は、処理装置を一回通過させることによる、連続流中の微生物の不活性化を目標としている。米国特許第２０１２／０１０３８３１号明細書に記載されているように、処理された生成物を未処理生成物と混合することによって処理装置を通る複数回の通過を提供する循環ループは、プロセスの複雑さのために回避される。
【００１２】
前述のように、生成物への外部パルスの印加により、生成物にエネルギーが導入され、生成物の温度上昇をもたらす。この温度上昇は、選択されたプロセス条件及び生成物の特性に依存する（Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。生成物の過剰な加熱を避けるために、いくつかの適用において２つの処理チャンバ間に冷却セクションが配置された（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかし、このアプローチでは、より多くの電気エネルギーと冷却のためのエネルギーが必要である。あまりに多くの加熱を避けるために、記載された別の可能性は、パルスの印加後又はパルス列後に休止を導入することである（Ｅｌ  Ｚａｋｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかし、インライン熱低温処理に関する典型的な時間が数秒から数分の範囲にあるのに対して、この研究（Ｅｌ  Ｚａｋｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）では総処理時間が５２００秒〜７８００秒に増加したため、これは、商業的適用において可能ではない。少なくとも１分のパルス間又は一連のパルス間の休止は、カナダ特許第２７５８６７８号明細書に記載されているバッチシステムでも適用されている。
【００１３】
商業的に適用される処理条件は、ＰＥＦが１０〜３０ｋＶ／ｃｍの電界強度で伝えられる条件である。これは、より高い電界強度の印加には技術的限界があり、食品材料の絶縁破壊を引き起こす可能性があるからである。
【００１４】
適用されるプロセス条件は、低ｐＨを有する液体食品生成物、すなわち、約４．６未満のｐＨを有する高酸性フルーツジュースに適している。これらのプロセス条件は、いくつかの適用において、液体食品生成物中のより大きいサイズの微生物を不活性化するのに適しているように思われる。さらに、グラム陰性菌はグラム陽性菌よりもより効果的に不活性化され得る。特に、小さいサイズのグラム陽性菌を不活性化することは、ほとんどの場合、現在知られているＰＥＦプロセス条件では厄介である。さらに、現在の低ｐＨプロセス条件は、約４．６より高いｐＨを有する食品に有効な方法では適用できない。
【００１５】
液体食品生成物に関する現在のＰＥＦプロセスは、比較的高い、すなわち５ｋＶ／ｃｍ以上、典型的に１０〜３０ｋＶ／ｃｍである電界強度を包含する。これらの比較的高い電界強度は、ピーク電力の要件及び最大蓄積パルスエネルギーによる単一のパルスの持続時間における制限により、大容量までのＰＥＦプロセシングのアップスケーリングを一般に妨げる。これらの技術的境界は、低導電性酸性フルーツジュースの保存のための単一ラインの最大処理量を５０００Ｌ／ｈに制限する。
【００１６】
したがって、以下のようなＰＥＦプロセシング条件が必要である。
−  好ましくはグラム陰性菌を不活性化すること及び／又は比較的大きいサイズの微生物を不活性化することに関する効率を失うことなく、グラム陽性菌及び／又は比較的小さいサイズの微生物を不活性化することに効率的であり、かつ／又は
−  約４．６より高いｐＨ及び４．６より低いｐＨを有する液体食品生成物中の微生物及び／又は胞子を不活性化し、かつ／又は
−  既存の不活性化技術よりも経済的に収益性が高く、かつ／又は
−  適用可能であり、単一ラインを使用して、使用されている現在の最先端の条件よりもより大きい処理量体積にスケールアップする可能性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第２０１０／０２９７３１３号明細書
【特許文献２】米国特許第２０１２／０１０３８３１号明細書
【特許文献３】カナダ特許第２７５８６７８号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｍａｓｔｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
【非特許文献２】Ｓａｕｌｉｓ  ａｎｄ  Ｗｏｕｔｅｒｓ，２００７
【非特許文献３】Ｒｅｙｎａｒｄ及び共同研究者ら（１９９８）
【非特許文献４】Ｒａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献５】Ｗｏｕｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９
【非特許文献６】Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２
【非特許文献７】Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献８】Ｅｌ  Ｚａｋｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６
【非特許文献９】Ｅｌ  Ｚａｋｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱して、加熱された液体生成物を得るための方法であって、
（ａ）液体生成物を提供する工程；
（ｂ）液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための装置を提供する工程；
（ｃ）前記液体生成物を前記装置の入口に供給し、前記装置を通して前記液体生成物を流す工程；
（ｄ）前記装置中に流れている前記液体生成物に電流を連続的に発生させる工程であって、最小の１つのパルスが通過中に各流体エレメントに少なくとも１０マイクロ秒のパルス持続時間で印加され、電界強度が０．１〜５ｋＶ／ｃｍである工程；
を含み、
前記液体生成物の最高温度が前記抵抗加熱中に自律的に９２℃未満のままである、方法に関する。
【００２０】
単一パルスのパルス持続時間が総有効処理時間よりもむしろ重要な要因であることは、本発明の一部である。本発明者らは、Ｅ２・τとして計算される総有効処理時間が従来のＰＥＦ処理が用いられる２０ｋＶ／ｃｍでのものよりも４倍高かったにもかかわらず、２マイクロ秒（τ）のパルス持続時間及び１０ｋＶ／ｃｍの電界強度（Ｅ）で、不活性化が効率的ではなかったことを見出した。０．１〜５ｋＶ／ｃｍの条件では、不活性化が、１０マイクロ秒を超える（例えば、１００〜１０００マイクロ秒）のパルス持続時間に対してのみ有効であることが見出された。
【００２１】
本発明の方法は、液体食品生成物及び液体飼料生成物に適用可能であり、本発明のＰＥＦプロセシング条件は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌を不活性化するのに同等に有効である。ＰＥＦプロセシング条件は、液体食品生成物及び液体飼料生成物に適用可能であり、この条件は、比較的大きな微生物を不活性化することと、比較的小さな微生物を不活性化することの両方に効果的である。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、ＰＥＦプロセシング条件が、比較的低いｐＨの現在適用されている条件及びより高いｐＨでの条件下で、適用可能であることを見出した。最後に、本発明者らは、当技術分野で知られている抵抗加熱によって液体生成物を所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための方法を用いて以前可能であった処理量よりも、液体食品生成物又は液体飼料生成物のより高い処理量に適用可能な、プロセシング条件を見出した。
【００２２】
本発明の第２の態様は、本発明による方法によって得られる液体生成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】種々のＰＥＦ処理条件後にｐＨ３．８のオレンジジュースにおける大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、サルモネラ・センフテンベルグ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の生きている数の減少を示す図である。左のパネルは現在使用されているＰＥＦ条件を表し、右のパネルは本発明のＰＥＦ条件を示す。各パネルに関連する様々なＰＥＦ処理条件は、図１Ｂのパネルの下に言及されている。中空でない三角形は、１０ｋＶ／ｃｍ、２マイクロ秒であり、中空でないグレーのダイヤモンド形は、１５ｋＶ／ｃｍ、２マイクロ秒であり、中空の白い円は、２０ｋＶ／ｃｍ、２マイクロ秒であり、中空でないグレーの円は、０．９ｋＶ／ｃｍ、１０００マイクロ秒であり、黒い菱形は、２．７ｋＶ／ｃｍ、１０００マイクロ秒であり、中空の白いダイヤモンド形は、２．７ｋＶ／ｃｍ、１００マイクロ秒であり、破線は、検出限界である。
【図１Ｂ】種々のＰＥＦ処理条件後にｐＨ３．８のオレンジジュースにおける大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、サルモネラ・センフテンベルグ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の生きている数の減少を示す図である。左のパネルは現在使用されているＰＥＦ条件を表し、右のパネルは本発明のＰＥＦ条件を示す。各パネルに関連する様々なＰＥＦ処理条件は、図１Ｂのパネルの下に言及されている。中空でない三角形は、１０ｋＶ／ｃｍ、２マイクロ秒であり、中空でないグレーのダイヤモンド形は、１５ｋＶ／ｃｍ、２マイクロ秒であり、中空の白い円は、２０ｋＶ／ｃｍ、２マイクロ秒であり、中空でないグレーの円は、０．９ｋＶ／ｃｍ、１０００マイクロ秒であり、黒い菱形は、２．７ｋＶ／ｃｍ、１０００マイクロ秒であり、中空の白いダイヤモンド形は、２．７ｋＶ／ｃｍ、１００マイクロ秒であり、破線は、検出限界である。
【図２】オレンジジュース（ｐＨ３．８）、ココナッツ水（ｐＨ５．０）、スイカジュース（ｐＨ６．０）の温度伝導率プロファイルである。
【図３】２．７ｋＶ／ｃｍ、１０００マイクロ秒でのＰＥＦ処理後のオレンジジュース、ココナッツ水及びスイカジュースにおける大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の生きている数の減少を示す図である。
【図４】未処理及びＰＥＦ処理オレンジジュースの微生物分析（ｎ＝６）を示す図であり、一部の分析が定性的であり（図４Ｂ）、他が定量的であった（図４Ａ）。
【図５】示された期間にわたって７℃及び周囲温度で保管されたオレンジジュース試料の知覚による評価を示す図であり、搾りたてのオレンジジュースに匹敵する場合、試料は「良好」と示され、搾りたてのオレンジジュースに匹敵しない場合、「非良好」と示された。
【図６】７℃及び周囲温度での３ヶ月間の貯蔵中のＰＥＦ処理前及びＰＥＦ処理後のオレンジジュースにおける可溶性固形物（°ブリックス）の量を示す図である。
【図７】７℃及び周囲温度での３ヶ月間の貯蔵中のＰＥＦ処理前及びＰＥＦ処理後のオレンジジュースの酸度を示す図である。
【図８】７℃及び周囲温度での３ヶ月間の貯蔵中のＰＥＦ処理前及びＰＥＦ処理後のオレンジジュースのｐＨを示す図である。
【図９】７℃及び周囲温度での３ヶ月間の貯蔵中のＰＥＦ処理前及びＰＥＦ処理後のオレンジジュースの油含有量を示す図である。
【図１０】７℃及び周囲温度での３ヶ月間の貯蔵中のＰＥＦ処理前及びＰＥＦ処理後のオレンジジュースのビタミンＣ含有量を示す図である。
【図１１】７℃及び周囲温度での３ヶ月間の貯蔵中のＰＥＦ処理前及びＰＥＦ処理後のペクチンエステラーゼ活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者らは、液体食品生成物及び液体飼料生成物に適用可能なＰＥＦプロセシング条件を見出し、この条件が、グラム陰性菌及びグラム陽性菌を不活性化するのに同等に有効であることを見出した。本発明者らはまた、液体食品生成物及び液体飼料生成物に適用可能なＰＥＦプロセシング条件を見出し、この条件が、比較的大きな微生物を不活性化することと、比較的小さな微生物を不活性化することの両方に効果的であることを見出した。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、ＰＥＦプロセシング条件が、比較的低いｐＨの条件、及びより高いｐＨでの条件下で、適用可能であることを見出した。最後に、本発明者らは、現在利用可能な方法で以前可能であった処理量よりも、液体食品生成物及び液体飼料生成物のより大きな処理量に適用可能な、ＰＥＦプロセシング条件を見出した。
【００２５】
これによって、本発明者らは、微生物負荷が減少した液体生成物を得るために液体生成物を加熱するための現在知られている方法に関連する欠点の多くに対処する方法を提供する。
【００２６】
本発明は、液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱して、加熱された液体生成物を得るための方法であって、
（ａ）液体生成物を提供する工程；
（ｂ）液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための装置を提供する工程；
（ｃ）前記液体生成物を前記装置の入口に供給し、前記装置を通して前記液体生成物を流す工程；
（ｄ）前記装置中に流れている前記液体生成物に電流を連続的に発生させる工程であって、最小の１つのパルスが通過中に各流体エレメントに少なくとも１０マイクロ秒のパルス持続時間で印加され、電界強度が０．１〜５ｋＶ／ｃｍである工程；
を含み、
前記液体生成物の最高温度が前記抵抗加熱中に自律的に９２℃未満のままである、方法に関する。
【００２７】
本発明によれば、液体生成物を抵抗加熱によって加熱温度まで急速かつ均一に加熱する方法は、微生物負荷が減少した加熱された液体生成物を提供する。
【００２８】
液体生成物をある最高温度を超える温度、例えば、所定の最高温度まで加熱することは、新鮮な（未処理の）生成物中に存在する新鮮な風味、ビタミン及び栄養素の望まれない減少及びタンパク質の変性を引き起こし得る。構成成分の減少及び変性の程度は、生成物が処理に暴露される温度及び時間に関連する。様々な液体生成物が、酵素及び微生物不活性化の所望の程度を得るために様々な温度−時間の組合せに曝される。したがって、生成物への温度及び／又は時間の暴露が低減された代替の（非）熱プロセスが多くの関心を集めているが、これは、生成物の新鮮な特徴をよりよく保持することができるからである。温度又は暴露時間のいずれかを低下（短縮）できる場合、より良い生成物品質が期待できる。本発明の方法では、熱に対する暴露時間が大幅に短縮され、選択されたプロセス条件により、液体生成物の最高温度は、抵抗加熱中に自律的に約９２℃未満のままである。好ましくは、液体生成物の最高温度は、本発明の方法による抵抗加熱中に自律的に臨界温度未満にとどまり、生成物中に存在する場合、液体生成物のこの温度では、感熱性構成成分の減少もタンパク質の変性も被らないが、同時に、液体生成物中の微生物負荷は、目的とされた許容レベルまで減少される。ここで、本発明の方法により、液体生成物の微生物負荷をなお効果的かつ効率的に低下させながら、液体生成物の過熱を防ぐプロセシング条件が適用可能となった。
【００２９】
本発明による方法では、単一パルスのパルス持続時間が総有効処理時間よりもむしろ重要な要因である。２マイクロ秒のパルス持続時間及び１０ｋＶ／ｃｍの電界強度を適用した場合、総有効処理時間が従来のＰＥＦ処理が用いられる電界強度である２０ｋＶ／ｃｍでの４倍であったにもかかわらず、微生物の不活性化が効率的ではなかったことが決定された。理論に束縛されることを望むものではないが、その説明は、１０ｋＶ／ｃｍの減少した電界強度で、エレクトロポレーション効果が損なわれるというものである。
【００３０】
本発明者らは、驚くべきことに、１００〜１０００マイクロ秒の延長されたパルス持続時間と組み合わせた０．１〜５ｋＶ／ｃｍの低い電界強度の条件で、微生物不活性化が従来の熱低温殺菌又は１０ｋＶ／ｃｍでのＰＥＦ処理によって要求されるよりも集中的でない温度−時間組合せでの不活性化を達成するのに効果的であったことを見出した。理論に束縛されることを望むものではないが、これらの知見は、パルス持続時間が本発明による方法において重要な要因となったことを示している。
【００３１】
理論に束縛されることを望むものではないが、生成物に印加される外部電界は、生成物に存在する微生物の細胞膜中のタンパク質チャネル及び／又は細胞膜の脂質ドメインに対する影響を有し、これは、チャネル及び／又はドメインにおける立体構造変化をもたらす。膜タンパク質チャネルは、脂質二重層における細孔形成に必要な１５０〜４００ｍＶよりもかなり低い５０ｍＶの膜電位で開く（Ｔｓｏｎｇ，１９９２）。
【００３２】
多くのタンパク質チャネルの開閉は膜電位差に依存するので、電気処理が適用される場合、電位感受性タンパク質チャネルが開かれることになると仮定される。いったんこれらのチャネルが開かれると、これらのチャネルは、これらのチャネルが設計されている電流よりも高い電流を伝える。その結果、これらのチャネルは、ジュール加熱によって不可逆的に変性され得るかつ／又はそれらの官能基の電気的改変が生じる（Ｔｓｏｎｇ，１９９２）。タンパク質チャネルの開閉は、サブマイクロ秒の時間範囲で起こる一方、タンパク質の変性は数ミリ秒から数秒かかる（Ｔｓｏｎｇ，１９９２）。
【００３３】
これは、脂質二重層が影響を受ける電界強度よりも３〜８倍小さい電界強度、すなわち、脂質二重層のエレクトロポレーションによる不可逆的損傷に必要な２０ｋＶ／ｃｍ（すなわち、従来のＰＥＦ条件）と比較して、タンパク質チャネルの不活性化のための２．５ｋＶ／ｃｍ〜７ｋＶ／ｃｍの電界強度でタンパク質チャネルが影響され得ることを示唆している。本発明によれば、１０〜１０００マイクロ秒のパルス持続時間と組み合わされた０．１ｋＶ／ｃｍ〜５ｋＶ／ｃｍの電界強度が、液体生成物中の微生物の効率的な不活性化を確立することに関して十分かつ有効である。例えば、本発明の方法は、１Ｌ／ｈ  ＰＥＦ装置（「ＰＥＦシステム」）中の液体生成物に適用可能である。例示的液体生成物に関して、パルス持続時間を１００マイクロ秒又は１０００マイクロ秒のいずれかに設定し、選択された電界強度又は「電界強度」は、０．９ｋＶ／ｃｍ又は２．７ｋＶ／ｃｍのいずれかであった。液体生成物に印加されるパルス数は、０〜３５の間で変動し、２つの連続するパルス間の時間差は、０．６ミリ秒〜１９９ミリ秒の間で変動し、その結果、得られた最高温度は、３６℃〜９２℃の間で変動した。以下の本発明の方法の効率を実証するより詳細な概要、実施例１を参照されたい。
【００３４】
本発明者らは、微生物不活性化が栄養細胞に特に効率的であることを見出した。おそらく、本発明の方法のこの効果に基づいて、本発明による方法は、胞子を不活性化する効率的なメカニズムも提供する。胞子は、外部電気刺激の標的である、内膜における及び胞子皮層における発芽のための必須タンパク質を含有する。
【００３５】
本発明の方法の適用のさらなる例として、例えば、液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための１２００Ｌ／ｈ  ＰＥＦ装置を適用し、液体生成物のバッチが本発明の方法でプロセシングされる。パルス持続時間は１０００マイクロ秒であり、電界強度は２．０ｋＶ／ｃｍである。液体生成物に印加されるパルスの数は、約５パルスであり、２つの連続するパルス間の時間差は、３．８ミリ秒である。本発明の詳細な実施形態に関して、以下の実施例３も参照されたい。
【００３６】
本発明の一実施形態は、本発明の方法であって、液体生成物のｐＨが、ｐＨ１．５〜９．０、好ましくは４．６を超え、好ましくは４．８〜９．０、より好ましくは５．５〜８．０、より好ましくは６．０〜７．５である。本発明の一実施形態は、本発明の方法であって、ｐＨが約５．０を超え、好ましくは約６．０である。
【００３７】
さらに、一実施形態では、本発明は、液体生成物のｐＨが、４．６未満、好ましくは１．５〜４．６、より好ましくは約１．５〜約３．８である、本発明による方法に関する。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態では、本発明の方法において、液体生成物のｐＨが、４．６より高く、好ましくは４．６〜９．０である。本発明の一実施形態は、本発明の方法であって、液体生成物のｐＨが、５．０〜９．０、好ましくは６．０〜９．０である。
【００３９】
本発明の方法の適用可能性により、広範囲のｐＨを有する液体生成物が、本発明による１つの同じ方法でプロセシングされる。本発明の方法は、このように多種多様なｐＨを有する液体生成物をプロセシングすることに適用可能であるので、ＰＥＦプロセシングが望ましく、本発明の方法でのプロセシングに選択可能な液体生成物の多様性は非常に大きい。実質的に、例えば、食品プロセシングに適用される任意の液体生成物、成分、又は半完成生成物は、本発明の方法による急速かつ均一な加熱に適している。そのＰＥＦプロセスがこのような広いｐＨ範囲において効果的かつ効率的であるという本発明者らの驚くべき発見により、本発明によるＰＥＦを組み込んだ方法で食品をプロセシングすることは、今や以前よりも広く利用可能となっている。
【００４０】
さらに、本発明の一実施形態は、２０℃で測定して０．０１〜１０Ｓ／ｍ、より好ましくは２０℃で測定して０．１〜３Ｓ／ｍ、最も好ましくは２０℃で測定して０．２Ｓ／ｍ〜０．８Ｓ／ｍの電気伝導率を有する、本発明による液体生成物である。
【００４１】
そのような電気伝導率は、本発明の方法による液体生成物の急速かつ均一な加熱を助けるので、これらの示された境界内の電気伝導性が典型的に好ましい。大部分の液体食品生成物は、液体食品生成物での本発明の方法の適用に適用可能な境界内の電気伝導率を有するので、本発明の方法は、微生物負荷を下げることが望ましい多数の液体食品生成物を処理するのに適用可能である。例えば、２０℃での電気伝導率が、数バッチの液体食品生成物について測定され、例えば、クランベリージュースに関しては０．１Ｓ／ｍ、ビールに関しては０．１５Ｓ／ｍ、リンゴジュースに関しては０．２Ｓ／ｍ、チョコレートミルクに関しては０．４Ｓ／ｍ、全乳に関しては０．４５Ｓ／ｍ、豆乳に関しては０．４Ｓ／ｍ、アーモンドミルクに関しては０．２５Ｓ／ｍ、ニンジンジュースに関しては１．０Ｓ／ｍ、トマトソースに関しては１．８Ｓ／ｍであった。したがって、本発明の方法は、幅広い多種多様な液体食品生成物に適用可能である。
【００４２】
理論に束縛されることを望むものではないが、本発明のＰＥＦプロセシング条件は、微生物不活性化のための新しいメカニズムへの道を開くように思われる。
【００４３】
本発明者らは、本発明のＰＥＦプロセシング条件を適用した場合、液体食品生成物が効果的に低温殺菌される（すなわち、微生物が効果的かつ効率的に不活性化される）ことを見出した。その条件は、４０℃〜９２℃、好ましくは５０℃〜９２℃、より好ましくは約６０℃〜８５℃の液体食品生成物の最高温度で、１０〜１０００マイクロ秒、好ましくは約１０００マイクロ秒、より好ましくは約１００マイクロ秒のパルス持続時間と組み合わせて、０．１〜５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは４ｋＶ／ｃｍ以下、より好ましくは３ｋＶ／ｃｍ以下の驚くほど低い電界強度を含む。
【００４４】
本発明によれば、本発明の方法を適用する際の低温殺菌は、処理ゾーン内の通過中に連続的に流れる液体生成物に印加されるパルスの数が、各流体エレメントについて少なくとも１、好ましくは１〜１００、より好ましくは５〜５０である場合、特に効率的かつ効果的である。
【００４５】
パルスの数は、等式１によって与えられ、ｎは、パルスの数であり、Ｖは、処理チャンバの容積（Ｌ）であり、ｆは、使用されるパルス周波数（Ｈｚ）であり、φは、流速（Ｌ／ｈ）である。
【数１】
2018536435.tif 000002
【００４６】
パルスの数は、本発明により、少なくとも１つのパルスが、液体生成物を急速かつ均一に加熱するための装置の処理チャンバを通って流れる全ての流体エレメントに印加される限り、プロセスを設計する上で重要なステップではない。少なくとも１つのパルスが全ての流体エレメントに印加されることを保証するために、システムは、処理チャンバにおける滞留時間が１／ｆより大きいという目的で設計されなければならない。印加されるパルスの数は、液体生成物の所望の処理量（φ、Ｌ／ｈ）、液体生成物の伝導率（σ、Ｓ／ｍ）、生成物の比熱容量（ｃｐ、ｋＪ／ｋｇ・Ｋ）、生成物の密度（ρ、ｋｇ／ｍ３）、印加された電界強度（Ｅ、Ｖ／ｍ）、パルス持続時間（τ−ｐｕｌｓｅ、ｓ）、及びプロセスで得られる温度勾配（ΔＴ、℃）（液体生成物の入口温度と出口温度との間の差）に基づいたプロセス設計の結果となる。これらのパラメータ間の関係は、等式２で与えられる。
【数２】
2018536435.tif 000003
【００４７】
先に述べたように、そして以下の実施例１にさらに例示されるように、パルス持続時間は、本発明の方法によるＰＥＦ処理の有効性に重要である。したがって、１つの比較的長いパルスの印加は、同様の総有効処理時間を有するより短いパルスの印加よりも効果的であり得る。
【００４８】
例えば、本発明の方法による１Ｌ／ｈｒの連続流１Ｌ／ｈ  ＰＥＦ装置でプロセシングされた液体生成物に関して、典型的に、パルス持続時間は、約１００〜１０００マイクロ秒であり、電界強度は、約２．７ｋＶ／ｃｍである。そのとき、典型的に、パルスの数は、約１〜２５であり、処理チャンバにわたる所望の温度増加に依存して、約０．６〜３９ミリ秒であり、これは、２つの連続パルス間の時間差は、入口温度と最高温度との差である。
【００４９】
例えば、本発明の方法による１２００Ｌ／ｈ  ＰＥＦ装置においてプロセシングされた液体生成物バッチに関して、典型的に、パルス持続時間は、本発明による方法において、１０００マイクロ秒であり、電界強度は約２．０ｋＶ／ｃｍである。そのとき、典型的に、パルスの数は、約５であり、２つの連続パルス間の時間差は、約３．８ミリ秒である。
【００５０】
典型的に、本発明の方法は、本発明に従って、３０Ｌ／ｈ〜２００Ｌ／ｈの処理量を有するＰＥＦ装置における液体生成物をプロセシングすることに適用可能である。
【００５１】
典型的に、本発明の方法は、本発明に従って、約３０，０００Ｌ／ｈの処理量を有するＰＥＦ装置における液体生成物をプロセシングすることに適用可能である。
【００５２】
本発明の一実施形態は、本発明の方法であって、液体生成物を所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための装置が、約１Ｌ／ｈ〜約３０，０００Ｌ／ｈ、好ましくは約１Ｌ／ｈ若しくは約３０Ｌ／ｈ、又は約２００Ｌ／ｈ、若しくは約１２００Ｌ／ｈ、又は約３０，０００Ｌ／ｈの処理量を有する。
【００５３】
ここでも、理論に束縛されることを望むものではないが、本発明のこれらのＰＥＦプロセシング条件は、細胞の膜のタンパク質チャネルを不活性化する理論的メカニズムに従って微生物の不活性化をもたらす。本発明のこれらの新しいＰＥＦプロセシング条件は、ＰＥＦに関する現在使用されている処理条件と比較して、微生物不活性化における新たな機会を提供する。本発明のこれらの新たな条件では、比較的小さな微生物及び／又はグラム陽性菌と比較して、比較的大きな微生物及び／又はグラム陰性菌に関する不活性化を優先することなく、全ての栄養微生物が不活性化される。
【００５４】
したがって、本発明の方法で、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、他の腸内細菌科及び酢酸菌などのグラム陰性菌が液体生成物中で不活性化される。さらに、本発明の方法では、例えばリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）株及びストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種などのグラム陽性菌も液体生成物中で不活性化される。予想される理論的メカニズムに基づいて、胞子形成細菌の細胞膜も、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌及びクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）細菌のように、電位依存性チャネルを含有するため、胞子形成細菌も不活性化され得ることが予想される。さらに、胞子自体が、外部印加パルスによって標的とされ得る、内膜及び胞子皮層における発芽に必須のタンパク質を含有する。
【００５５】
さらに、本発明の方法は、例えば、酵母及びカビなどの比較的大きな微生物の液体生成物における不活性化に適している。本発明の方法は、例えば、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）などの比較的小さな微生物、液体生成物における不活性化にも適している。当然、本発明の方法は、実施例１に示された、これらの例証された微生物のサイズを有する微生物の液体生成物における不活性化に同等に適している。
【００５６】
次に、本発明のＰＥＦプロセシング条件は、比較的低いｐＨを有する液体食品生成物中及び比較的高いｐＨを有する液体食品生成物中の微生物を不活性化することにおいて同等に効果的であるので、本発明のこれらの新たな条件では、全ての型の（液体食品）生成物中の微生物の不活性化が可能である。
【００５７】
最後に、現在適用されているＰＥＦ条件と比較して、本発明のＰＥＦプロセシング条件において使用されるより低い電界強度により、本発明においてより低いピーク電圧が使用されるので、本発明のこれらの条件は、容易にスケールアップされ、本発明のＰＥＦプロセシング条件は、より大きい体積及び処理量で産業における実施に適用可能になる。本発明の方法は、高電界領域における流体の滞留時間が約１７ミリ秒〜２秒である場合、液体生成物を抵抗加熱によって加熱温度まで急速かつ均一に加熱するための装置における本発明の方法に供される液体食品生成物に特に適している。パルスの周波数は、電極の金属放出を避けるために、１ｋＨｚ〜５０ｋＨｚに制限される（Ｍａｓｔｗｉｊｋ、２００６）。典型的に、本発明によれば、本発明の方法において、液体生成物の流速は、この場合、約１Ｌ／ｈ〜５０００Ｌ／ｈ、好ましくは約１０００Ｌ／ｈ〜３０，０００Ｌ／ｈである。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態は、液体生成物が液体食品生成物又は液体飼料生成物である、本発明の前の実施形態のいずれかによる方法である。
【００５９】
さらに、本発明の一実施形態は、本発明による方法であって、液体生成物が、成分、半完成生成物、又は、果物ジュース、野菜ジュース、幼児食品、ジャム、スプレッド若しくはスムージー、アルコール若しくは非アルコール飲料、乳製品、植物性ミルク生成物、液状卵、スープ、若しくはソースのような最終液体生成物である。
【００６０】
本発明の一実施形態は、乳製品が、ミルク、ミルク生成物、又はミルク構成成分若しくはミルク画分を含む液体組成物から選択される、液体生成物を本発明による抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための方法である。
【００６１】
さらに、本発明の実施形態は、本発明による方法であって、液体生成物が、ミルク、ミルク生成物、ミルク構成成分又はミルク画分を含む乳製品である。
【００６２】
本発明の重要な態様は、本発明によれば、ＰＥＦプロセシング中に、液体生成物の温度を約９２℃未満、又は約８５℃未満、又は約７０℃未満、又は約６０℃未満に保つために、本発明による方法において適用される装置の処理チャンバ間に冷却セクションが必要でないという知見である。
【００６３】
先に述べたように、現在の最先端技術の方法では、液体生成物の過熱を避けるために、冷却セクションが処理チャンバの間に追加されている。上述したように、臨界温度での加熱が非常に速く（処理チャンバにおける滞留時間であり、１秒未満である）、最高温度までの暴露時間が非常に短いので、本発明の方法に冷却が必要でないことは、本発明内で重要な知見である。
【００６４】
効率的な方法を有するために、本発明に記載されたように、臨界温度（生成物品質が影響を受けることになる温度である）への暴露のみが電気エネルギーで得られる。非臨界温度ドメインは、従来の加熱での予熱とすることができる。したがって、好ましくは本発明の方法において、液体生成物は、装置に供給する前に２０℃〜７０℃、好ましくは３５℃〜６５℃、より好ましくは４０℃〜６０℃の範囲の温度まで予熱される。本発明の一実施形態は、本発明による方法であって、液体生成物が、装置に供給される前に２０℃〜７０℃、好ましくは３５℃〜６５℃、より好ましくは４０℃〜６０℃の範囲の温度まで予熱される。
【００６５】
実際の目的のために、本発明による方法に供された液体食品生成物などの液体生成物は、周囲温度以下に直ちに冷却される、例えば、２〜８℃に冷却される。保持時間が必要ないので、液体生成物の冷却は、液体生成物が高電界領域を離れた直後（好ましくは３秒以内）に進行する。本発明の現在のプロセス設計では、冷却管が高電界領域から０．５ｍ下流に設置され得る。３インチ配管径を有する３０，０００Ｌ／ｈ（＝８．３Ｌ／ｓ）システムに関して、これは、第１の冷却セクションに入る前の２．２Ｌ体積又は０．２７秒及び最高温度からの最初の１０℃の臨界温度下落前の約１〜５秒（粘度に依存する）が確立され、通常は４〜７℃の範囲内の所望の出口温度に向けて（従来の）冷却がそれに続くことを意味する。
【００６６】
「自律的」という用語は、その通常の意味を有し、ここでは、処理中に外部冷却（又は加熱）による助けなしに本発明の方法においてある値に達する液体生成物の温度を指す。
【００６７】
例えば、オレンジジュース、乳製品、ココナッツ水、スイカジュースから選択される液体食品生成物などの液体生成物は、例えば、約４０℃、約５０℃又は約６０℃に予熱される。例えば、本発明の方法の適用時に液体生成物中の微生物を効率的かつ効果的に不活性化するために、液体生成物は、約３０℃〜６５℃、好ましくは３６℃〜５９℃に予熱される。
【００６８】
好ましくは、液体生成物の最高温度は、本発明によれば、抵抗加熱中に自律的に約８５℃未満、より好ましくは約７０℃未満、約６３℃未満、又は約６０℃未満のままである。本発明の方法のプロセスパラメータが液体生成物の最高温度が自律的に選択された温度未満のままであるように選択されることは、本発明の一部である。本発明の方法を適用する場合、選択された温度以下で、液体生成物中に存在する微生物の効率的かつ効果的な死滅が保証される一方、新鮮な（未処理の）液体生成物中に存在する新鮮な風味、ビタミン、及び栄養素の望ましくない低下及びタンパク質の変性が防止されるか、少なくとも大部分は防止される。
【００６９】
本発明によるパルス持続時間で本発明による電界強度を適用することによって、本発明者らは、驚くべきことに、本発明によれば、液体生成物の温度が約９２℃、又は約８５°、又は約７０℃、又は約６０℃の最高温度未満のままであり、これにより本発明の方法が大規模な設定、例えば、商業的設定での実施に特に適したものになることを見出した。
本発明の方法の商業的適用の例は、液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための装置における液体食品生成物のプロセシングであり、本発明によれば、装置を通る液体食品生成物の流れは、約５００Ｌ／ｈ〜３０，０００Ｌ／ｈ、例えば、約１２００Ｌ／ｈである。
【００７０】
したがって、本発明の一実施形態は、本発明の方法であって、液体生成物の温度が、抵抗加熱の間に自律的に８５℃未満、好ましくは７５℃未満、より好ましくは６０℃未満のままである。
【００７１】
一実施形態では、本発明は、電界強度が約５ｋＶ／ｃｍ未満である、本発明による方法に関する。
【００７２】
本発明の一実施形態は、本発明による方法であって、電界強度が、０．５〜５ｋＶ／ｃｍ、より好ましくは２．５〜４ｋＶ／ｃｍである。一実施形態では、本発明は、電界強度が約３ｋＶ／ｃｍ未満、好ましくは約２．７ｋＶ／ｃｍ以下、より好ましくは約０．９〜約２．５ｋＶ／ｃｍである本発明の方法に関する。
【００７３】
本発明の一実施形態は、本発明による方法であって、パルス持続時間が、少なくとも１０マイクロ秒、より好ましくは１０〜２０００マイクロ秒、さらにより好ましくは５０〜５００マイクロ秒、最も好ましくは５０〜１００マイクロ秒である。一実施形態では、本発明は、パルス持続時間が約１００マイクロ秒〜約１０００マイクロ秒である、本発明による方法に関する。さらなる実施形態では、本発明は、パルス持続時間が１０００マイクロ秒以下、好ましくは約１００マイクロ秒である、本発明による方法に関する。
【００７４】
本発明の一実施形態は、本発明による方法であって、印加パルスがバイポーラパルスである。したがって、本発明の一実施形態は、本発明による方法であって、液体生成物に印加される最小の１パルスが、バイポーラパルス形で印加されるパルスである。電極損傷を回避するために、液体生成物にバイポーラパルスを印加することが有利である（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ、１９９６）。当然、他の種類のパルスも本発明の方法に同等に適用可能であることは本発明の一部である。
【００７５】
本発明の方法は、ジュース、ソース、乳製品などの液体食品生成物中の微生物の不活性化に特に適している。すなわち、そのような液体食品生成物の例は、成分、半完成生成物、又は、果物ジュース、野菜ジュース、幼児食品、ジャム、スプレッド若しくはスムージー、アルコール若しくは非アルコール飲料、乳製品、植物ミルク生成物、液状卵、スープ若しくはソースのような最終液体生成物である。
【００７６】
本発明の一実施形態は、本発明による方法であって、液体生成物中の微生物の不活性化のための方法である。上述したように、本発明の方法は、抵抗加熱によって液体生成物を加熱するための現在の方法よりも多くの利点を有する。本発明の方法で達成可能な主な利点の１つは、液体生成物、例えば、液体食品生成物の低温殺菌であり、ここで、微生物が小さいか又は大きく、微生物がグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。
【００７７】
実際の目的のために、本発明による方法に供される、例えば、液体食品生成物などの液体生成物は、本発明の方法が液体生成物に適用された直後に周囲温度以下、例えば、２〜８℃に冷却される。
【００７８】
したがって、本発明の一実施形態は、加熱された液体生成物が、液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための装置を通って流れた直後に冷却される方法である。当然、実際の目的のために、冷却は、液体生成物が装置を通って流された瞬間からすぐに、例えば、可能な限り速く、好ましくは３秒以内に適切に適用される。したがって、本発明の実施形態は、加熱された液体生成物が、液体生成物を抵抗加熱によって加熱温度まで急速かつ均一に加熱するための装置を通って移された後に冷却される方法でもある。本発明による方法が液体生成物を抵抗加熱によって加熱温度まで急速かつ均一に加熱するための装置を用いた適用に適しており、この装置が約０．５Ｌ／ｈ〜約２０００Ｌ／ｈ、好ましくは約０．５Ｌ／ｈ〜約２Ｌ／ｈ、より好ましくは約１Ｌ／ｈ、又は同等に好ましくは約１００Ｌ／ｈ〜約２０００Ｌ／ｈ、好ましくは約１０００〜１５００Ｌ／ｈ、より好ましくは約１２００Ｌ／ｈでの液体生成物の流速で作動されることは、本発明の一部である。好ましくは、流速は、約３０，０００Ｌ／ｈである。
【００７９】
前に述べたように、液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱するための方法に液体生成物を供する前に液体生成物を予熱することにより、プロセス中の不活性化効率が改善されることは、以前に確立されていた。しかしながら、当該技術分野において知られているＰＥＦ条件の適用時に、液体生成物が容認できない値まで加熱されたので、プロセスの過程中に液体生成物を冷却することが前提条件であった。上述したように、ここで、液体生成物の温度が容認できない閾値を超えないので、本発明のプロセス中の冷却が必要ではないことが、本発明内で重要な知見である。したがって、本発明の方法では、液体生成物は、プロセス中に冷却する必要はなく、液体生成物を抵抗加熱によって所定の温度まで急速かつ均一に加熱するプロセスに供する前に、十分に予熱される。
【００８０】
したがって、好ましくは、本発明の方法において、液体生成物は、装置に供給される前に２０℃〜７０℃、好ましくは３５℃〜６５℃、より好ましくは４０℃〜６０℃の範囲の温度まで予熱される。
【００８１】
本発明による方法は、本発明による抵抗加熱によって液体生成物を所定の温度まで急速かつ均一に加熱する方法に供される液体生成物中に存在する微生物を不活性化するのに非常に効果的かつ効率的である。本発明の方法を、微生物を含む液体生成物に適用すると、微生物数は、少なくとも２ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ、最も好ましくは６ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ以上減少する。
【００８２】
したがって、好ましくは、本発明は、液体生成物中の微生物数（コロニー形成単位ｃｆｕ）が、少なくとも２ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは少なくとも５ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ、最も好ましくは６ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ以上減少する方法である。本発明の一実施形態は、液体生成物中の微生物数が少なくとも４ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは少なくとも７ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ減少する本発明による方法である。
【００８３】
本発明者らは、液体食品生成物中の微生物数のこのような減少が、生成物の品質尺度の保存に大きく貢献することを確立した。例えば、未処理の液体食品生成物と比較して、本発明の方法に供された液体食品生成物の味、匂い、色、及び外観はより長い期間保存される。例えば、本発明の方法で、液体食品生成物オレンジジュースの味及び匂いは、ジュースが約７℃で保管された場合、本発明の方法をオレンジジュースに適用すると約６０日間以上保存される。オレンジジュースが本発明の方法に供された後、周囲温度で保たれた場合、約２３日間のオレンジジュースの品質の強化が同様に有益である。
【００８４】
本発明の方法は、液体生成物中のグラム陽性菌を不活性化すること、及び液体生成物中のグラム陰性菌を不活性化することに同等に適用可能であることが分かる。さらに、微生物の大きさは限定的な役割を果たさず、これは、より小さいサイズ又はより大きいサイズの微生物が本発明による方法によって不活性化されることを意味する。したがって、本発明まで、小さいグラム陽性菌は、液体生成物を抵抗加熱によって加熱温度まで急速かつ均一に加熱するための既知の方法で効率的に不活性化することができなかったので、本発明の様々な態様及び実施形態が当技術分野への重要な貢献である。
【００８５】
したがって、本発明の一実施形態は、本発明の方法であって、微生物がグラム陽性菌を任意選択で含む。
【００８６】
本発明の方法を液体生成物で適用する場合、液体生成物のｐＨは、仮に変化したとしても、プロセスの過程中に最小限に改変される。これは、本発明による方法のさらなる有益な特色である。
【００８７】
したがって、一実施形態では、本発明は、プロセスの終わりでの液体生成物のｐＨが、プロセスの開始時のｐＨから０．５ｐＨ単位以内、好ましくは０．２ｐＨ単位以内、より好ましくは０．１ｐＨ単位以内、最も好ましくは０．０５ｐＨ単位以内である、方法に関する。
【００８８】
本発明による方法は、液体生成物、特に液体食品生成物に適している。
【００８９】
本発明の第２の態様は、上記の本発明による方法によって得られる液体生成物に関する。
【００９０】
本発明は、以下に提供される以下の非限定的な例によってさらに説明される。
【実施例】
【００９１】
［実施例１］
＜オレンジジュースにおけるｐＨ＝３．６での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、サルモネラ・センフテンベルグ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の微生物不活性化（１Ｌ／ｈスケール）＞
病原性及び腐敗性の微生物を、それらの形態並びに果実ジュースとのそれらの関連及び蔓延に基づいて選択した。さらに、株の耐熱性又はＰＥＦ耐性を株の選択の基準として使用した。選択された微生物を表１に列挙する。
【００９２】
表１．本実施例で使用された細菌株及び酵母株
【表１】
2018536435.tif 000004
【００９３】
表１に列挙された、５種全ての微生物の新鮮な培養物を、凍結ストックから培地への播種及び終夜の培養によって調製した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びサルモネラ・エンテシア亜種エンテリカ血清型センフテンベルグ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ）の培養は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４に記載されていた。ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の新鮮な培養物を、凍結ストックから５２．２ｇのＭＲＳ（Ｄｅ  Ｍａｎ、Ｒｏｓｏｇａ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ｂｒｏｔｈ、Ｍｅｒｃｋ）及び１Ｌの蒸留水当たり１２ｇの寒天を含有するＭＲＳ培地への播種によって同様に調製した。プレートを３０℃で終夜インキュベートした。単一のコロニーを使用して、１０ｍＬのＭＲＳブロスを有する１００ｍＬのフラスコに接種し、振とう培養器（１８０ｒｐｍ）において２０℃で２４時間培養した。この培養物から、２００マイクロリットルを使用して、新鮮な１９．８ｍＬのＭＲＳブロスに接種し、１％グルコース（１００ｍＬフラスコ）を補充し、２０℃及び１８０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
【００９４】
培養後、細胞を洗浄し、選択された微生物の懸濁液を約１．０Ｅ＋８−１．０Ｅ＋９ｃｆｕ／ｍＬの最終濃度までオレンジジュース（Ｍｉｎｕｔｅ  Ｍａｉｄ（登録商標））に添加した。
【００９５】
接種された懸濁液を、１３．０±０．５ｍＬ／分の流速で１Ｌ／ｈ  ＰＥＦシステムにポンプで通し、電気処理の前に３６℃に予熱した。次に、懸濁液は、垂直に配置された２つの共直線処理チャンバに入り、ここで電気的処理が行われた。処理条件（電界強度、パルス持続時間、及び印加パルスの数）の強度の多様性のために、ジュースは自律的に可変の最高温度まで加熱された（表２は、使用された条件を例示する）。保持セクションを加えなかったので、処理チャンバを離れた直後（３秒以内）に、ジュースをウォーターバスに浸された加熱スパイラルを介して冷却した。出口では、試料を無菌的に収集した。選択された周波数の多様性のために、印加されるパルスの数及び結果として起こる最高温度につながる温度上昇が変動した（表２）。試料を種々の最高温度で収集し、固定電界強度及びパルス持続時間に関する動態を決定した。
【００９６】
生存可能な微生物細胞の数を、１００μＬの連続希釈ＰＥＦ処理ジュースを、０．１％ピルビン酸ナトリウムを補充した適切な寒天プレート上の滅菌ペプトン生理的食塩希釈液（ＰＳＤＦ）に播種して、亜致死的に損傷された細胞の増殖を強化することによって、決定した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。２５℃（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、３０℃（Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ））、又は３７℃（Ｓ．センフテンベルグ（Ｓ．Ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））での５日間のインキュベーション後に生存細胞を計数した。
【００９７】
処理チャンバの前及び直後の温度を、ＨＹＰ−Ｏ  Ｔ型熱電対（オメガ）を使用して測定した。さらに、最高温度を、ＮＴＣ抵抗器を使用して間接的に測定し、最高温度をモニターした。処理チャンバ内の方形波バイポーラパルス、電圧、及び電流をデジタルオシロスコープ（Ｒｉｇｏｌ  ＤＳ１１０２Ｅ）で記録した。電気エネルギーを、（Ｍａｓｔｗｉｊｋ、２００６）及び（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）に従って、電圧及び電流トレースの数値積分によって得、これは、実験誤差（１０％）内のカロリー電力に等しい。
【００９８】
全ての実験を二連で行った。
【００９９】
表２：本研究で使用されたＰＥＦ条件
【表２】
2018536435.tif 000005
【０１００】
試験した条件を表２に提供する。処理チャンバの寸法は、可変の電界強度を得るために変動した。この可変寸法の結果として、処理チャンバ内の滞留時間は、試験された各条件に関して同じではなかった。所望の最高温度を得るために、周波数を調節した。最後に、パルスの数を、使用された滞留時間及び周波数の積を取ることによって計算した。２つのパルスの間の時間は、滞留時間をパルス数で除し、パルス持続時間を引くことによって計算した。
【０１０１】
不活性化は、微生物の開始濃度で除された、試験された条件での生存微生物の数の対数Ｎとして示し、Ｎ０はｌｏｇ−１０（Ｎ／Ｎ０）である。図１において、不活性化は、試験された微生物に関する処理チャンバの出口での最高温度の関数として示されている。左パネルでは、短パルス（２マイクロ秒）に関する様々な電界強度での不活性化を示し、これは、現在の最先端技術を示し、右パネルでは、長パルス（すなわち１００又は１０００マイクロ秒）に関する様々な電界強度での不活性化を示し、これは、本出願に記載された発明を実証している。
【０１０２】
電界強度及び変動するパルス持続時間の関数としてのオレンジジュース中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の不活性化を図１に示す。
【０１０３】
図１の左のパネル（電界強度は、１０ｋＶ／ｃｍ、１５ｋＶ／ｃｍ又は２０ｋＶ／ｃｍであり、パルス持続時間は、２マイクロ秒である）及び図１の右のパネル（電界強度は、０．９ｋＶ／ｃｍ又は２．７ｋＶ／ｃｍであり、パルス持続時間は、１０００マイクロ秒である）の両方から図１において見ることができるように、一定のパルス持続時間での電界強度の増加は、選択された最高温度でのより多くの不活性化をもたらした。
【０１０４】
この増加した電界強度の効果は、図１に示された他の微生物でも観察され、より高い電界強度でのより多くの不活性化を示した。
【０１０５】
５ｋＶ／ｃｍまでの本発明において記載された条件の電界強度のさらなる増加は、所望の数の微生物を依然として不活性化しながら最高温度をさらに低下させることが予想される。
【０１０６】
理論に束縛されることを望むものではないが、これは、膜の臨界電界強度（Ｅ−ｃ）に対する外部印加電界（Ｅ）の超過によって説明され、より多くの損傷及び不活性化をもたらす（Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。Ｅ−ｃは種々の微生物によって異なり、微生物不活性化には５ｋＶ／ｃｍを超える電界強度が必要であるという技術分野における合意がある（Ｒａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかしながら、ここで、本発明者らは、本発明によれば、５ｋＶ／ｃｍ未満、例えば、２．７ｋＶ／ｃｍ未満の電界強度が不活性化された微生物を１．０Ｅ−７（Ｎ／Ｎ０）以下の十分なレベルで達成するのに有効であることも初めて示す。図１の左のパネルと右のパネルとを比較すると、１００マイクロ秒又は１０００マイクロ秒のパルス持続時間での２．７ｋＶ／ｃｍの電界強度が、当技術分野において通常適用されるより高い電界強度及びより短いパルス持続時間と比較して、より高い程度の微生物の不活性化をもたらすことが分かる。
【０１０７】
理論に束縛されることを望むものではないが、パルス持続時間が微生物を不活性化することにおいて重要な役割を果たすことが提案され、本発明において記載された条件に関する今日使用されているものとは別のメカニズムを暗示している。パルス持続時間が十分に長い場合、電圧感受性タンパク質チャネルが開かれ、それらが設計されているよりも高い電流を伝えることになると仮定されている。結果として、チャネルは不可逆的に変性し、細胞は生存能を失うことになる。
【０１０８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の不活性化データは、１００又は１０００マイクロ秒のパルスが使用される場合、２．７ｋＶ／ｃｍでの不活性化の程度に差違を示さず、これは、パルスの臨界持続時間が１００マイクロ秒未満であることを暗示している。
【０１０９】
さらに、この新しいＰＥＦ条件を使用して、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方が１．０Ｅ−７（Ｎ／Ｎ０）まで不活性化され得ることが分かり得る。また、微生物のサイズは、現在の最先端の条件（左パネル）で果たすような、不活性化の程度（右パネル）における顕著な役割を果たさない。酵母は、２．７ｋＶ／ｃｍでＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びＳ．センフテンベルグ（Ｓ．Ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ）よりも低い最高温度で不活性化され得るが、新しいＰＥＦ条件では大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）間に大きな差違は見出されない。一方、現在使用されているＰＥＦ条件ではより大きな差違が見出された（左パネル）。
［実施例２］
＜可変特性を有する生成物中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の微生物不活性化（１Ｌ／ｈスケール）＞
【０１１０】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ３５２１８）及びリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＮＶ８を、（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に記載の方法に従って、凍結ストックから調製し、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））又はＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））中で培養した。
【０１１１】
培養後、細胞を洗浄し、それぞれ異なるｐＨ及び伝導率を有する（図２を参照）、オレンジジュース（Ｍｉｎｕｔｅ  Ｍａｉｄ（登録商標））、ココナッツ水（Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｐｅｏｐｌｅ）、又はスイカジュース（搾りたて）のいずれかに、約１．０Ｅ＋８ｃｆｕ／ｍＬの濃度に達するように懸濁した。実施例１に記載したのと同じＰＥＦ装置システム及びセットアップを使用し、流速は、１３．５±０．５ｍＬ／分であった。しかしながら、２．７ｋＶ／ｃｍの電界強度及び１０００マイクロ秒のパルス持続時間である１つのプロセス条件のみを使用した。３つの生成物（図２）の間で伝導率が異なるため、異なる周波数設定が必要であり、各生成物の同様の最高温度に達するために処理中に与えられるパルスの数が異なった。表３において、３つの試験されたジュースに関する試験された周波数の範囲、パルスの数、及び処理後の最高温度を示す。
【０１１２】
不活性化は、微生物の開始濃度で除された、試験された条件での生存微生物の数の対数Ｎとして示し、Ｎ０はｌｏｇ−１０（Ｎ／Ｎ０）である。
【０１１３】
表３：本研究で使用されたＰＥＦ条件
【表３】
2018536435.tif 000006
【０１１４】
様々なジュース中の様々な最高温度での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の不活性化を図３に示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（図３Ａ）及びＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（図３Ｂ）の不活性化曲線を様々な液体培地、すなわち液体生成物オレンジジュース、ココナッツ水、及びスイカジュースについて比較すると、不活性化が始まる温度に関する差違が観察されないことが分かる。さらに、不活性化の程度は、オレンジジュース、ココナッツ水、及びスイカジュースに関して類似している。これは、生成物マトリックス、すなわち液体生成物オレンジジュース、ココナッツ水及びスイカジュースの様々なｐＨ、及び様々な電気伝導率が、不活性化の程度に対する効果を有さないことを示している。さらに、類似した温度での不活性化を示す比較可能な不活性化曲線が、グラム陰性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（約０．７〜１．５マイクロメートル×２〜５マイクロメートルの細菌細胞のサイズを有する）及びグラム陽性Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（約０．４〜０．５マイクロメートル×０．５〜２マイクロメートルの細胞の大きさを有する）に関して見出され、これは、使用される微生物に関する差違がないことを示している。
【０１１５】
これは、オレンジジュース、ココナッツ水、及びスイカジュースに適用された本発明の方法が、種々の異なる液体培地、すなわち異なる液体食品生成物中のグラム陽性菌及びグラム陰性菌の不活性化に関して同様に効果的かつ効率的であることを示している。
［実施例３］
＜１２００Ｌ／ｈスケールでの微生物検証＞
【０１１６】
１バッチのオレンジ（品種：Ｎａｔａｌ  ｆｏｌｈａ  ｍｕｒｃｈａ）を商業的に圧縮して４．０００Ｌのオレンジジュースを得た。オレンジジュースに微生物を接種しなかったので、オレンジジュースに自然に存在する微生物集団を研究して、大規模（１．２００Ｌ／ｈ）で１Ｌ／ｈで以前決定されたプロセス条件を検証した。
【０１１７】
オレンジジュースを１．２００±１００Ｌ／ｈの流れで、ポンプで送り、５９℃に予熱した。パルスを３つの垂直に配置された処理チャンバに加えて、７０℃の最高温度に達した。中央処理チャンバ内の処理ゾーンの体積は、第１及び第３の（外側）処理チャンバの処理ゾーン（寸法長さ１４ｍｍ、直径１２ｍｍ）よりも小さかった（寸法長さ１４ｍｍ、直径８ｍｍ）。電源の接続により、これは、外側の処理チャンバと比較して、中央処理チャンバにおける２倍の電界強度をもたらし、中央では１．９ｋＶ／ｃｍであり、外側の処理チャンバでは１．０ｋＶ／ｃｍであった。パルスは、１０００マイクロ秒の固定持続時間を有した。中央処理チャンバの滞留時間は、５．４±０．５ミリ秒であり、外側処理チャンバでは、９．５±０．９ミリ秒であり、処理中に加えられたパルスの総数は、２０７±１８Ｈｚの繰返し率で５．１±０．０１であった。
【０１１８】
ジュースを処理チャンバから離れた直後に３秒以内に冷却したため、保持時間が最小化されて、生成物の熱負荷を減少させた。冷却後、ジュースを包装し、無菌的にかつ保存した。
【０１１９】
未処理及びＰＥＦ処理ジュースの微生物試料を３つの異なる実験室で、二連で分析し、合計６つの未処理及びＰＥＦ試料を有した。Ｄｏｗｅｓ  ａｎｄ  ＩＴＯ（２００１）によって記載された方法に従って、全中温性プレート数、全大腸菌群、並びに酵母及びカビの数を分析した。好酸好熱性胞子形成細菌（ＡＴＳＢ）をＥｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）の方法に従って分析し、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）をＡＯＡＣ（２０００）の方法に従って分析し、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）をＩＳＯ１１２９０−１（１９９６）の方法に従って分析し、乳酸菌をＳｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）の方法に従って分析した。
【０１２０】
未処理オレンジジュース及びＰＥＦ処理オレンジジュースにおける微生物不活性化の結果を図４Ａ及びＢに示す。未処理オレンジジュース中の最初の微生物負荷は、比較的高く、未処理オレンジジュース中に約１，０Ｅ＋５ｃｆｕ／ｍＬが存在していた（図４Ａ）。オレンジジュースのＰＥＦ処理後、プレート上に微生物は検出されず（全プレート数）、さらに、カビも酵母も大腸菌群もプレート上に検出されなかった（全てのプレートは、＜１ｃｆｕ／ｍＬを示す。図４Ａ参照）。図４Ｂにおいて、定性的データから、未処理のオレンジジュース中に存在した全ての乳酸菌及び好酸好熱性胞子形成細菌（ＡＴＳＢ）もオレンジジュースのＰＥＦ処理中に不活性化されたことが分かる。
［実施例４］
＜品質態様及び微生物貯蔵寿命に対する本発明のＰＥＦ条件の影響＞
【０１２１】
実施例３で作製され記載されたＰＥＦ処理オレンジジュース試料を、３ヶ月間続く貯蔵寿命試験の間毎週分析した。この期間中、品質態様及び微生物数を分析した。微生物分析は、実施例３に記載されたプロセスと同様であった。品質分析に関して、当技術分野で一般に知られている方法に従って、可溶性固形物の量（ＪＢＴ  ＦｏｏｄＴｅｃｈ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２０１１−１）、酸性度（ＪＢＴ  ＦｏｏｄＴｅｃｈ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２０１１−２）、ｐＨ（ＪＢＴ  ＦｏｏｄＴｅｃｈ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２０１１−３）、油含有量（ＪＢＴ  ＦｏｏｄＴｅｃｈ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２０１１−４）、ビタミンＣ含有量（ＪＢＴ  ＦｏｏｄＴｅｃｈ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２０１１−５）、及びペクチンエステラーゼ活性（Ｒｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ、１９５５）を示された時間で測定した（表２）。試料を７℃及び室温（周囲温度２０〜２５℃）の両方で保管して、加速貯蔵寿命試験を促進した。
【０１２２】
試料の微生物評価を行い、その結果を表２に示す。ＰＥＦ処理試料の微生物数は、オレンジジュースが７℃で保存された場合とオレンジジュースが周囲温度保存された場合の両方で、１０４日間続く貯蔵寿命研究全体中に１ｃｆｕ／ｍＬの検出限界未満であることを示した。
【０１２３】
表４．７℃又は周囲温度のいずれかで保存された、貯蔵期間中のＰＥＦ処理オレンジジュースの微生物分析の結果。
【表４】
2018536435.tif 000007
【０１２４】
知覚による評価は、訓練されたパネルによって行われた。試料を全体的な外観、色、匂い、及び味について評価した。搾りたてのオレンジジュースと特性が類似している場合、試料を「良好」と評価し、もはや搾りたてのジュースの高品質ではない場合、試料を「非不良」と評価した。
【０１２５】
貯蔵寿命中の知覚による分析の結果を図５に示す。７℃で保存された試料は、６４日の貯蔵寿命まで絞りたてのオレンジジュースに類似していることが示された。この貯蔵時間の後、新鮮な匂い及び味は減少するが、ジュースの外観及び色は、７℃での９０日の貯蔵まで「良好」とみなされた（図５Ａ）。周囲温度で保存されたＰＥＦ処理ジュースは、２７日の貯蔵までのみ許容された（図５Ｂ）。この時間の後、もはや新鮮なジュースとはみなされなかった。
【０１２６】
オレンジジュースの品質態様も同様にモニターした。これらの態様に関して、未処理のジュースをＰＥＦ処理の前に同様に評価して、これらの態様に対するプロセスの影響を評価した。
【０１２７】
全可溶性固形物の量（°Ｂｒｉｘ）（図６。周囲温度及び７℃で実施された実験の曲線は、グラフの６日目以降に一致する）、酸性度（図７）、ｐＨ（図８）、油含有量（図９）及びビタミンＣ含量（図１０）は、ＰＥＦ処理及び７℃での保存及び周囲温度での保存によって変化しなかった。
【０１２８】
差違がＰＥＦ処理の前及び後にペクチンメチルエステラーゼ（ＰＭＥ）活性において見出される（図１１）。ＰＥＦプロセス中に発生された温度のために、ＰＭＥ酵素の一部が不活性化され、酵素活性の低下につながる。すなわち、本発明によるプロセス中に発生した熱は、ジュースの温度を７０℃に上昇させた。本発明のＰＥＦプロセスに供されたジュースを、連続流下でＰＥＦ装置に導入する前に５９℃に予熱した。この酵素の不活性化は、酵素の残存活性が貯蔵中の柑橘類ジュースの濁り消失及びゲル化につながり得るので、低温殺菌の目的の１つである。この酵素の活性は、ｐＨ７．８及び２０℃での時間の関数としてのペクチン加水分解中のｍＬ当たりの酸の放出（１．０Ｅ＋４を掛けた）として表される。一般に、ほとんどのジュース殺菌装置は、１．０Ｅ−６〜１．０Ｅ−４の値を有するペクチンエステラーゼ単位（ＰＥＵ）で表されるペクチンエステラーゼ活性を有するジュースを提供する。
＜参考文献＞
【０１２９】
−ＡＯＡＣ（２０００）．ＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９８９．１３−１９９８．Ｍｏｔｉｌｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｉｎ  ａｌｌ  ｆｏｏｄｓ．ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．
−Ａｌｖａｒｅｚ，Ｉ．，Ｃｏｎｄｏｎ，Ｓ．，Ｒａｓｏ，Ｊ．，（２００６）．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｉｎ：Ｒａｓｏ，Ｊ．，Ｈｅｉｎｚ，Ｖ．（Ｅｄｓ）．Ｐｕｌｓｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
−Ｂｅｒｇｅｙ，１９８６．Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
−Ｃａｍｐｏｓ，Ｆ．Ｐ．，Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ，Ｍ．（２００７）Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ｉｎ  ｏｒａｎｇｅ  ｊｕｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｕｌｔｒａ  ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｐａｓｔｅｕｒｉｓａｔｉｏｎ．Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，８，２２６−２２９
−Ｄｏｙｌｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｍａｚｏｔｔａ，Ａ．Ｓ．（２０００）Ｒｅｖｉｅｗ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，６３，７７９−７９５
−Ｄｏｗｅｓ，Ｆ．Ｐ．，Ｉｔｏ，Ｋ．，（２００１）．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｏｄｓ．４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
−Ｅｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｙ．，Ｍａｎｆｉｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｐｉｎｈａｔｔｉ，Ｍ．Ｅ．，Ａｚｕｍａ，Ｅ．，Ｖａｒｉａｎｅ，Ｓ．Ｆ．（１９９９）．Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｓｐｏｒｅｆｏｒｍｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ（ＡＴＳＢ）ｉｎ  ｏｒａｎｇｅ  ｊｕｉｃｅｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｃｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｕｉｔ  ｊｕｉｃｅｓ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｊｅｃｔ  ＡＢＥ  Ｃｉｔｒｕｓ，Ｃａｍｐｉｎａｓ（ＳＰ），Ｂｒａｓｉｌ．
−Ｅｌ  Ｚａｋｈｅｍ，Ｈ．，Ｌａｎｏｉｓｅｌｌｅ，Ｊ−Ｌ．，Ｌｅｂｏｖｋａ，Ｎ．Ｉ．，Ｎｏｎｕｓ，Ｍ．，Ｖｏｒｏｂｉｅｖ，Ｅ．（２００６）Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００，５５３−５６３
−Ｅｌ  Ｚａｋｈｅｍ，Ｈ．，Ｌａｎｏｉｓｅｌｌｅ，Ｊ−Ｌ．，Ｌｅｂｏｖｋａ，Ｎ．Ｉ．，Ｎｏｎｕｓ，Ｍ．，Ｖｏｒｏｂｉｅｖ，Ｅ．（２００７）Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｏｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２０，２５９−２６５
−Ｅｙｎａｒｄ，Ｎ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｆ．，Ｔｒｏｔａｒｄ，Ｊ．，Ｔｅｉｓｓｉｅ，Ｊ．（１９９８）Ｅｌｅｃｔｒｏｏｐｔｉｃｓ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｕｌｓａｔｉｏｎ：ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ，ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，７５，２５８７−２５９６
−Ｇｕｒｔｌｅｒ，Ｊ．Ｂ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｒ．Ｂ．，Ｇｅｖｅｋｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｑ．（２０１１）Ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  ｊｕｉｃｅ  ａｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｅｎｚｏａｔｅ，ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓｏｒｂａｔｅ，ａｎｄ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ．Ｆｏｏｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，２２，１６８９−１６９４
−Ｈｅｉｎｚ，Ｖ．，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｉ．，Ａｎｇｅｒｓｂａｃｈ，Ａ．，Ｋｎｏｒｒ，Ｄ．（２００２）．Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ  ｆｏｏｄｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ−ｂａｓｉｃ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，１０３−１１１
−ＩＳＯ１１２９０−１（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｕｆｆｓ．Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ−Ｐａｒｔ  １：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．
−ＪＢＴ  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２０１１−１）．Ｔｏｔａｌ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｏｌｉｄｓ  ｂｙ  ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌａｋｅｌａｎｄ．
−ＪＢＴ  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２０１１−２）．Ｔｏｔａｌ  ｔｉｔｒａｔａｂｌｅ  ａｃｉｄｉｔｙ（ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌａｋｅｌａｎｄ．
−ＪＢＴ  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２０１１−３）．ｐＨ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌａｋｅｌａｎｄ．
−ＪＢＴ  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２０１１−４）．Ｒｅｃｏｖｅｒａｂｌｅ  ｏｉｌ（Ｓｃｏｔｔ  ｍｅｔｈｏｄ）．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌａｋｅｌａｎｄ．
−ＪＢＴ  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２０１１−５）．Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  Ｉｏｄｉｎｅ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌａｋｅｌａｎｄ．
−Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．（２００６）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｉｎ：Ｈｅｉｎｚ，Ｖ．，Ｒａｓｏ，Ｊ．（Ｅｄｓ．）Ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｏｏｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ  −ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
−Ｍａｓｔｗｉｊｋ，Ｈ．Ｃ．（２００６）Ｐｕｌｓｅｄ  Ｐｏｗｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｏｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｉｎ：Ｈｅｉｎｚ，Ｖ．，Ｒａｓｏ，Ｊ．（Ｅｄｓ．）Ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｏｏｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ−ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
−Ｍａｓｔｗｉｊｋ，Ｈ．Ｃ．，Ｇｕｌｆｏ−ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｋｏｍ，Ｋ．，Ｐｏｌ−Ｈｏｆｓｔａｄ，Ｉ．Ｅ．，Ｓｃｈｕｔｅｎ，Ｈ．，Ｂｏｏｎｍａｎ，Ｍ，Ｂａｒｔｅｌｓ，Ｐ．Ｖ．（２００７）．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｏｎ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｉｎ：Ｌｅｌｉｅｖｅｌｄ，Ｈ．Ｌ．Ｍ．，Ｎｏｔｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，ｄｅ  Ｈａａｎ，Ｓ．Ｗ．Ｈ．（Ｅｄｓ．）．Ｆｏｏｄ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｆｒｏｍ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｗｏｏｄｈｅａｄ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．
−Ｒａｓｏ，Ｊ．，Ｃｏｎｄｏｎ，Ｓ．，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｉ．，（２０１４）．Ｎｏｎ−ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｐｕｌｓｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｉｅｌｄ．Ｉｎ：Ｂａｔｔ，Ｃ．Ａ．（Ｅｄ）．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．
−Ｐｕｔ，Ｈ．Ｍ．Ｃ．，Ｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｊ．，Ｓａｎｄ，Ｆ．Ｅ．Ｍ．Ｊ．，Ｖａｎ  Ｇｒｉｎｓｖｅｎ，Ａ．Ｍ．（１９７６）Ｈｅａｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｙｅａｓｔ  ｓｐｐ．ｃａｕｓｉｎｇ  ｓｐｏｉｌａｇｅ  ｉｎ  ｓｏｆｔ  ｄｒｉｎｋｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，４０，１３５−１５２
−Ｒｏｕｓｅ，Ａ．Ｈ．，ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ，Ｃ．Ｄ．（１９５５）Ｐｅｃｔｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｐｅｃｔｉｎ  ｉｎ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｃｉｔｒｕｓ  ｊｕｉｃｅｓ  ａｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｕｓｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｉｔｒｕｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  ｓｔａｔｉｏｎ．Ｆｌｏｒｉｄａ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎｓ，５７０，３−１９．
−Ｓａｕｌｉｓ，Ｇ．，Ｗｏｕｔｅｒｓ，Ｐ．Ｃ．（２００７）．Ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｉｎ：Ｌｅｌｉｅｖｅｌｄ，Ｈ．Ｌ．Ｍ．，Ｎｏｔｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，ｄｅ  Ｈａａｎ，Ｓ．Ｗ．Ｈ．（Ｅｄｓ．）．Ｆｏｏｄ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｆｒｏｍ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｗｏｏｄｈｅａｄ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．
−Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．，Ｂｒｅｍｅｒ，Ｐ．，Ｏｅｙ，Ｉ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｄ．Ｗ．（２０１４）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｍｉｌｋ  ｕｓｉｎｇ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３５，４９−５６
−Ｓｉｌｖａ，Ｎ．，Ｊｕｎｑｕｅｉｒａ，Ｖ．Ｃ．Ａ．，Ｓｉｌｖｅｉｒａ，Ｎ．Ｆ．Ａ．，Ｔａｎｉｗａｋｉ，Ｍ．Ｈ．，Ｓａｎｔｏｓ，Ｒ．Ｆ．Ｓ．，Ｇｏｍｅｓ，Ｒ．Ａ．Ｒ．，Ｏｋａｚａｋｉ，Ｍ．Ｍ．，（２００７）．Ｍａｎｕａｌ  ｄｅ  Ｍｅｔｏｄｏｓ  ｄｅ  ａｎａｌｉｓｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ  ｄｅ  ａｌｉｍｅｎｔｏｓ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ．
−Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ，Ｒ．Ａ．Ｈ．，Ｎｉｅｒｏｐ  Ｇｒｏｏｔ，Ｍ．Ｎ．，Ｎｅｄｅｒｈｏｆｆ，Ａ．Ｌ．，ｖａｎ  Ｂｏｅｋｅｌ，Ｍ．Ａ．Ｊ．Ｓ．，Ｍａｔｓｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｍａｓｔｗｉｊｋ，Ｈ．Ｃ．（２０１４）．Ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｒｕｉｔ  ｊｕｉｃｅｓ：Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｐＨ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｉｌａｇｅ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７３，１０５−１１１．
−Ｔｓｏｎｇ，Ｔ．Ｙ．（１９９２）Ｔｉｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｊ．Ａ．，Ｓｏｗｅｒｓ，Ａ．Ｅ．（Ｅｄｓ）．Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
−Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｅｎ，Ｓ．，Ｗａｇｅｎｄｏｒｐ，Ａ．，Ａｂｅｅ，Ｔ．，Ｗｅｌｌｓ−Ｂｅｎｎｉｎｋ，Ｍ．Ｈ．（２００９）．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｆｌｏｗ  ｈｅａｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，５，９９９−１００４
−Ｗｏｕｔｅｒｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｄｕｔｒｅｕｘ，Ｎ．，Ｓｍｅｌｔ，Ｊ．Ｐ．Ｐ．Ｍ．，Ｌｅｌｉｅｖｅｌｄ，Ｈ．Ｌ．Ｍ．（１９９９）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ  ｏｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６５，５３６４−５３７１
【図１Ａ】
2018536435.tif 000008
【図１Ｂ】
2018536435.tif 000009
【図２】
2018536435.tif 000010
【図３Ａ】
2018536435.tif 000011
【図３Ｂ】
2018536435.tif 000012
【図４Ａ】
2018536435.tif 000013
【図４Ｂ】
2018536435.tif 000014
【図５Ａ】
2018536435.tif 000015
【図５Ｂ】
2018536435.tif 000016
【図６】
2018536435.tif 000017
【図７】
2018536435.tif 000018
【図８】
2018536435.tif 000019
【図９】
2018536435.tif 000020
【図１０】
2018536435.tif 000021
【図１１】
2018536435.tif 000022
【国際調査報告】
2018536435.tif 000023
2018536435.tif 000024
2018536435.tif 000025