(57)【要約】  本発明は、培養細胞の細胞間分離方法に関し、培養状態で培養された細胞を分離する方法において、第１収容空間と、第１収容空間の液体内で複数の細胞が互いに連結された状態で存在する細胞浮遊液と、前記第１収容空間と密閉されて連結され、平均直径５μｍ〜３００μｍの貫通孔を１以上有する細胞分割部材が取り付けられたフィルタ容器と、前記フィルタ容器と密閉されて連結される第２収容空間において、前記細胞浮遊液を第１収容空間からフィルタを経て第２収容空間に移動させることで、フィルタの固定された抵抗部と当たりながら細胞間の連結が受動的、機械的に分離されるようにすることを特徴とする培養細胞の細胞間分離方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養状態で培養された細胞を分離する方法において、
第１収容空間と、
第１収容空間の液体内で複数の細胞が互いに連結された状態で存在する細胞浮遊液と、
前記第１収容空間と密閉されて連結され、平均直径５μｍ〜３００μｍの貫通孔を１以上有する細胞分割部材が取り付けられたフィルタ容器と、
前記フィルタ容器と密閉されて連結される第２収容空間において、
前記細胞浮遊液を第１収容空間からフィルタを経て第２収容空間に移動させることで、フィルタの固定された抵抗部と当たりながら細胞間の連結が受動的、機械的に分離されるようにすることを特徴とする、培養細胞の細胞間分離方法。
【請求項２】
前記細胞分割部材通過を複数にするために第２収容空間からまた第１収容空間に移動させる過程を１回以上含む、請求項１に記載の培養細胞の細胞間分離方法。
【請求項３】
前記細胞分割部材通過を複数にするために前記フィルタ容器内に複数の細胞分割部材が形成されたことを特徴とする、請求項１に記載の培養細胞の細胞間分離方法。
【請求項４】
前記細胞分割部材通過を複数にするために第２フィルタ容器を追加し、前記第２フィルタ容器に密閉連結される第３収容空間が形成されることを特徴とする、請求項１に記載の培養細胞の細胞間分離方法。
【請求項５】
前記細胞分割部材は、製織されたメッシュ型、穴あき板型、多重ブレード（ラジエータ、えら）型のうち一つ以上を使用することを特徴とする、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の培養細胞の細胞間分離方法。
【請求項６】
前記フィルタ容器は、容量を調節できる密閉された容器であることを特徴とする、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の培養細胞の細胞間分離方法。
【請求項７】
前記フィルタ容器は、加圧を通して移動できる管を含むことを特徴とする、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の培養細胞の細胞間分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養された細胞の細胞間分離方法に関し、さらに詳細には、培養で得た細胞に対し、水流を利用して細胞間分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞は、培養の際、デスモソームのような細胞間の結合で互いに強く結合する場合がある。細胞間の結合は、細胞質で仮足のような突起が育って相手細胞の突起と結合する方式から始まり、結合強度が徐々に増加することとなる。
【０００３】
このように互いに結合されている細胞を分離するための既存の方法を検討すると、次のとおりである。
【０００４】
先ず、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）のようなタンパク質溶解剤を使用して前記細胞質突起を除去する方法がある。しかし、これは細胞毒性が多く、細胞の表面特性まで除去する短所がある。
【０００５】
第２に、水の乱流中に位置させ、水のせん断力を利用して分離する方法がある。しかし、この方法は、純粋な水のせん断力で１０μｍ程度の細胞が互いに異なる方向の慣性質量を同様にするまで水の乱流に極大化された多様性を付与するか、または流速が激しい状態で摩擦を誘発させなければならない。また、層化された水流の境界が１０μｍ単位のｍｉｃｒｏ  ｆｌｕｉｄで構成されなければならないので、具現が難しいだけでなく、流速差が大きくない場合、数回繰り返さなければならない問題がある。これによって、細胞が破壊される確率が高くなると同時に分離率が極めて低い問題点がある。
【０００６】
また、細胞を分離するために水流を利用する方法もあった。
【０００７】
図２および図３は、従来の水流利用法を利用して細胞分離する概略図を示したものである。
【０００８】
従来の水流利用法の第１は、中心高速移動区間で細胞がかたまって移動し、抵抗面では速度差による同一方向分離が起こる（図２参照）。
【０００９】
強い流速で通過する他の方式では、水流を微細に分けるための部材が存在せず、単に通過する管の内壁で誘発される抵抗にのみ依存したので、流速が速い中心灌流では何らの細胞分離現象が生じない問題があるにもかかわらず、単に数回繰り返してこれを克服しようとした場合であり、細胞群が通過するとき、細胞間に置かれた抵抗体が細胞間の連結を効果的に切断するのに細胞群外部での互いに異なる抵抗を利用したという点で非効率的であった。
【００１０】
従来の水流利用法の第２は、水槽のような円筒状の容器で乱流を作る方法である（図３参照）。
【００１１】
水槽の壁側は、安定した層流が形成され、細胞が回転するだけで細胞間の速度差を大きく与えることができず、非効率的な問題点があった。乱流側から分離される細胞は、不要な力を受けるか、または均等な確率で細胞を接するようにするのに困難があった。また、乱流適用回数の偏差が大きい問題点があった。回転水流で様々な種類の抵抗体が回転する場合、意図した抵抗誘発という側面でより効率的であるが、試料の処理確率を均一に適用する単方向水流ではないという点で１細胞当たりの処理確率を均一化しにくい問題点がある。
【００１２】
液状試料を適切に粉砕または混合するためには、ｌｉｎｅ  ｍｉｘｅｒ、ｈｏｍｏ  ｍｉｘｅｒなどのように試料の一部だけを通過させながら処理し、一度処理された試料は、処理装置の他方に集まるよう前処理試料と処理後の試料が区分された空間に位置するようにしなければならない。
【００１３】
上記において検討したように、培養された細胞を培養された細胞を分離するにあたって外部抵抗を最小限に受けるようにし、細胞損傷を最小限にする必要性があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
前記問題点を解決するために、本発明の目的は、細胞の損傷を最小限にしながら培養された細胞を分離する方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、幹細胞を分離するにあたって、簡単でありながらも外部からの衝撃による細胞の損傷を最小限に減らしながら細胞を分離できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明は、培養状態で培養された細胞を分離する方法において、第１収容空間と、第１収容空間の液体内で複数の細胞が互いに連結された状態で存在する細胞浮遊液と、前記第１収容空間と密閉されて連結され、平均直径５μｍ〜３００μｍの貫通孔を１以上有する細胞分割部材が取り付けられたフィルタ容器と、前記フィルタ容器と密閉されて連結される第２収容空間において、前記細胞浮遊液を第１収容空間からフィルタを経て第２収容空間に移動させることで、フィルタの固定された抵抗部と当たりながら細胞間の連結が受動的、機械的に分離されるようにすることを特徴とする培養細胞の細胞間分離方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記細胞分割部材通過を複数にするために第２収容空間からまた第１収容空間に移動させる過程を１回以上含む培養細胞の細胞間分離方法を提供する。
【００１８】
本発明は、前記細胞分割部材通過を複数にするために前記フィルタ容器内に複数の細胞分割部材が形成されたことを特徴とする培養細胞の細胞間分離方法を提供する。
【００１９】
本発明は、前記細胞分割部材通過を複数にするために第２フィルタ容器を追加し、前記第２フィルタ容器に密閉連結される第３収容空間が形成されることを特徴とする培養細胞の細胞間分離方法を提供する。
【００２０】
本発明の前記細胞分割部材は、製織されたメッシュ型、穴あき板型、多重ブレード（ラジエータ、えら）型のうち一つ以上を使用することを特徴とする培養細胞の細胞間分離方法を提供する。
【００２１】
本発明の前記フィルタ容器は、容量を調節できる密閉された容器であることを特徴とする培養細胞の細胞間分離方法。
【００２２】
本発明の前記フィルタ容器は、加圧を通して移動できる管を含むことを特徴とする培養細胞の細胞間分離方法を提供する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る細胞間分離方法は、細胞の損傷を最小限にしながら培養された細胞を分離する効果がある。
【００２４】
本発明に係る細胞間分離方法は、培養された細胞を分離するにあたって、簡単でありながらも外部からの衝撃を最小限に減らしながら細胞を分離できる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】培養状態で細胞間結合を示した図である。
【図２】従来の水流利用法を利用して細胞分離する概略図を示したものである。
【図３】従来の水流利用法を利用して細胞分離する概略図を示したものである。
【図４】本発明の一実施例に係る細胞分離の概略図を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明に添付の図面を参照して、本発明を詳細に説明する。先ず、図面中、同じ構成要素または部品は、できる限り同じ参照符号を示していることに留意すべきである。本発明を説明するにあたって、関連した公知の機能または構成についての具体的な説明は、本発明の要旨を曖昧にしないようにするために省略する。
【００２７】
本明細書において用いられる程度の用語、「約」、「実質的に」等は、言及された意味に固有な製造および物質許容誤差が提示されるとき、その数値で、またはその数値に近接した意味で用いられ、本発明の理解を助けるために正確または絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不当に利用することを防止するために用いられる。
【００２８】
本明細書において表現された「水流」は、細胞培養液を含む液体が収容空間内で移動する状態を示したものである。
【００２９】
本発明は、培養状態で培養された細胞を分離する方法において、第１収容空間と、第１収容空間の液体内で複数の細胞が互いに連結された状態で存在する細胞浮遊液と、前記第１収容空間と密閉されて連結され、平均直径５μｍ〜３００μｍの貫通孔を１以上有する細胞分割部材が取り付けられたフィルタ容器と、前記フィルタ容器と密閉されて連結される第２収容空間において、前記細胞浮遊液を第１収容空間からフィルタを経て第２収容空間に移動させることで、フィルタの固定された抵抗部と当たりながら細胞間の連結が受動的、機械的に分離されるようにすることを特徴とする。
【００３０】
図４は、本発明の一実施例に係る細胞分離の概略図を示したものである。
【００３１】
本発明は、培養状態で培養された細胞を分離する方法であって、さらに詳細には、同一の方向の水流に含まれ、互いに連結された培養細胞１０を含む細胞浮遊液が水流方向に直角に位置した固定された固体の細胞分割部材１２１を通過しながら細胞間に互いに離れる方向の摩擦抵抗を誘発するように構成した。
【００３２】
即ち、受動的に作用する抵抗刃である細胞分割部材１２１を多数配置した空間での水流は、自然に水流が微細に分割される効果を奏するが、基本的に水流が移動する方向は同一であるので、単に細胞の間を離れるようにするのに必要な最小限の摩擦だけを誘発するように構成されるという点で水流を利用し、最小限の細胞損傷で細胞分離ができるように構成したものである。
【００３３】
本発明に係る培養細胞の細胞間分離方法は、培養された細胞を含む細胞培養液を一定の収容空間内で大きな摩擦や乱流をほとんど発生させずに細胞間に結合された結合部位を除去する方法を示したものである。培養細胞１０間の結合は、細胞質で仮足のような突起が育って他の細胞の突起と結合する方式で結合することとなる。これによって、若干の外部衝撃で結合していた突起を離脱させると、細胞間分離が生じることとなる。
【００３４】
培養細胞１０の細胞間分離のために、細胞が含まれた細胞培養液を収容空間内で流れを起こし、中間に抵抗を起こすことができる流れ方向と直角に細胞分割部材１２１を形成して、細胞結合間に分離を自然に誘導することができる。
【００３５】
本発明の一実施例に係る培養細胞の分離方法は、第１収容空間１１０と、第１収容空間１１０の液体内で複数の細胞が互いに連結された状態で存在する細胞浮遊液と、前記第１収容空間１１０と密閉されて連結され、５μｍ〜３００μｍの複数の貫通孔を有する細胞分割部材１２１が取り付けられたフィルタ容器１２０と、前記フィルタ容器１２０と密閉されて連結される第２収容空間１３０において、前記細胞浮遊液を第１収容空間１１０から細胞分割部材１２１を経て第２収容空間１３０に移動させることで、細胞分割部材１２１と当たりながら細胞間の連結が受動的、機械的に分離されるようにすることができる。
【００３６】
本発明の培養細胞分離のために、第１収容空間１１０、前記第１収容空間１１０と密閉されて連結され、複数の貫通孔を有する分割部材が取り付けられたフィルタ容器１２０があり、前記フィルタ容器１２０と密閉されて連結される第２収容空間１３０で構成され得る。
【００３７】
前記第１収容空間１１０は、培養した細胞を収容できる空間であり、細胞培養液を入れて水流を起こすようにすることができる。前記第１収容空間１１０で細胞培養液を収容させ、外力による培養細胞液に水流を起こして移動するようにすることができる。
【００３８】
細胞培養液を一定方向に流れるようにする水流は、速度が全体空間で一定であるようにして、流れがある間、乱流などが発生しないようにする。このためには、第１収容空間１１０、フィルタ容器１２０、第２収容空間１３０の断面積が一定であることが好ましい。
【００３９】
また、第１収容空間１１０は、特に制限されるものではないが、水流が一定であるように断面積が一定であることが好ましい。
【００４０】
前記細胞分割部材１２１は、第１収容空間１１０で流れる細胞培養液の培養細胞１０を分離するための用途で受動的に作用する分割部材が多数配置された空間に移動時に摩擦抵抗を起こすようにして自然的に分割される効果を有するようにする。
【００４１】
前記細胞分割部材１２１は、５〜３００μｍの貫通孔で形成され、培養細胞１０が移動時、第１収容空間１１０から第２収容空間１３０に移動時に貫通孔を通して細胞が分割され得るようにするためである。
【００４２】
本発明の長所の一つは、乱流がほとんど発生しないという点である。第１収容空間１１０、フィルタ容器１２０および第２収容空間１３０で細胞培養液が移動するとき、断面積が同一で乱流を最小限に発生させるため、外部衝撃による細胞損傷を最小限にすることができる。
【００４３】
また、前記細胞分割部材１２１は、メッシュ型に形成され、かなり多くの数の貫通孔を形成することもできる。前記細胞分割部材１２１は、前記メッシュ型だけでなく、穴あき板型、多重ブレード型等からなる群で一つ以上の形態に形成され得る。
【００４４】
一方、前記細胞分割部材１２１の通過を数回繰り返すようにすることができる。このために、第２収容空間１３０に移動した細胞培養液をまた第１収容空間１１０に移動させ、細胞分割部材１２１を通過するようにして複数回繰り返すことができる。
【００４５】
または、細胞分割部材１２１を第２収容空間１３０の末端部に形成して細胞分割部材１２１が取り付けられたフィルタ容器１２０がさらに形成され、第３収容空間が形成されてもよい。第２収容空間１３０と第３収容空間との間に細胞分割部材１２１が形成されることで、細胞分離をさらに容易にすることができる。
【００４６】
または、選択的にフィルタ容器１２０内に細胞分割部材１２１が２つ以上形成され、細胞分離が複数回なされるようにすることもできる。
【００４７】
また、前記フィルタ容器１２０は、容量を調節できる密閉された容器であってよい。前記密閉された容器の例としては、医療用注射器であってよい。前記医療用注射器は、外部と密閉された容器であり、注射針を通して細胞が移動し、注射針の注入部は、細胞分割部材１２１の役割をすることができる。
【００４８】
また、前記フィルタ容器１２０は、加圧を通して移動できる管であってよい。前記加圧を通して移動できる管は、ポンプであってよい。ポンプのような機構を利用して外部から圧力を加えて培養細胞１０を強制的に移動させ、管内では細胞分割部材１２１を形成し、ポンプの作動により培養細胞１０が移動時に管を通して細胞間分離がなされるようにすることができる。
【００４９】
一方、本発明に使用される培養細胞は、培養器の内部表面で成長し、これを収集するためには、成長した培養細胞１０を外部的な力を加えて掻き出さなければならない。即ち、機械的に掻き出してかたまった状態である培養細胞１０を利用することができる。これを細胞分割部材１２１を利用して培養細胞１０を分離するのである。
【００５０】
以上において説明した本発明は、前述した実施例および添付の図面により限定されるものではなく、本発明の技術的思想を外れない範囲内で様々な置換、変形および変更が可能であることは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって明らかであるだろう。
【符号の説明】
【００５１】
１０：培養細胞                         １１０：第１収容空間  
１２０：フィルタ容器                   １２１：細胞分割部材  
１３０：第２収容空間  
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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