(57)【要約】本発明は、コレステロールの蓄積に関連する疾患の診断用マーカー組成物及びこれを検出して、関連疾患の診断に有用な情報を提供する方法を提供する。より具体的には、ハイポキサンチンは直接的又は間接的に細胞内のコレステロールの蓄積を増加させ、酸化的ストレスを誘発するという点で、コレステロールの蓄積と関連疾患、より好ましくは、冠状動脈疾患の診断用マーカーとして有用に使用することができる。また、本発明の診断用マーカーを使用してコレステロールの蓄積と関連疾患の発見や予後予測に重要な情報を提供することができ、関連疾患の治療薬のスクリーニングに利用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a)生物学的試料に存在するハイポキサンチン（hypoxanthine）の量を測定する段階;及び
（b)前記（a)段階での測定結果を正常対照群試料のハイポキサンチン量と比較する段階を含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の診断又は予後に有用な情報を提供する方法。
【請求項２】
前記コレステロールの蓄積に関連する疾患は、高脂血症、脂肪肝臓、冠状動脈疾患及び心血管疾患からなる群より選ばれるいずれか一つであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記冠状動脈疾患は、心筋梗塞、狭心症、粥状動脈硬化症、急性冠状動脈症候群又は脳血管発作であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ハイポキサンチンの量はミセル液体クロマトグラフィー（micellar  liquid  chromatography）、ミセル動電毛細管法（micellar  electrokinetic  capillary)、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）及び気体クロマトグラフィー/質量分析（GC/MS)からなる群より選ばれるいずれか一つの方法で測定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料は、組織、細胞、血液、血清、血漿、唾液及び尿からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
ハイポキサンチンを含むコレステロールの蓄積に関連する疾患の診断用マーカー組成物。
【請求項７】
任意の物質をヒト以外の動物に投与した後、血清ハイポキサンチンの濃度を測定することを含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
ハイポキサンチンを含むコレステロールの蓄積に関連する疾患の診断用マーカーを製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロールの蓄積による疾患診断用マーカーとして、ハイポキサンチン（hypoxanthine）の利用と、これを利用して病気の診断に有用な情報を提供する方法に関する発明であって、さらに詳細には、生体試料からハイポキサンチンの量を測定して、コレステロールの蓄積による疾患を診断及び予測する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、2015年4月10日に出願された大韓民国特許出願第10-2015-0051122号に基づく優先権を主張し、前記明細書全体は参照により本出願に援用する。
【０００３】
動脈硬化は、長期間に渡って血管の壁に脂肪が蓄積され、また、血管壁が厚くなる疾患である。主に高脂血症、特に高コレステロール血症が主な危険因子であり、また、高血圧及び糖尿病なども危険因子として知られている。最近の西欧化された食事及び人口の高齢化に伴い、動脈硬化の発症及びこれと関連する脳心血管系疾患が大幅に増加している。動脈硬化の進行過程を見ると、酸化脂質、高血圧と速い血流などにより、血管内面を構成している血管内皮細胞の損傷が先に生じ、徐々に血管壁に脂肪が蓄積され、大食細胞及びＴ細胞などの浸潤と炎症反応が進行し、血管平滑筋細胞の増殖により、血管の壁が厚くなる。その結果、血管が狭くなり、血液の流れが円滑でなくなる。心臓の冠状動脈が狭くなった場合、無理な運動などにより、心臓への血液供給が不足して痛みを感じるようになる狭心症の症状を呈するようになる。一方、厚くなった血管壁（この部分を動脈硬化プラークと称す）内の大食細胞により生成されるタンパク質分解酵素の活性が旺盛な場合、プラークを覆っている組織の一部が裂けるようになる。このとき、プラーク内にあった脂肪及び周辺タンパク質などが血管内に流れ出て血栓を形成し、心臓の冠状動脈又は脳の血管などを塞いでしまい、心筋梗塞又は脳卒中を引き起こすことになる。
【０００４】
従来の動脈硬化の診断は、超音波及び血管造影術を利用して、血管の壁が狭くなったことや石灰化などの観察を通じてなされる。しかし、従来の診断は、動脈硬化がかなり進行して、目視で区別が可能なほどに血管が狭くなったとき可能である。さらに、血管が狭くなった所見だけでは、病変が安定したプラーク(stable  plaque)であるか、近い将来に裂かれる可能性が大きい不安定なプラーク（vulnerable  plaque又はrupturable  plaque）であるかの判断には全く役に立たない。したがって、これらの従来の動脈硬化プラーク診断の短所を補完して、血管が顕著に狭くなる前の動脈硬化を早期に発見して、診断に役立つ新たな診断用マーカー及びこれに使用できる診断用組成物の開発が必要な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の発明者らは、プリン代謝過程の最終生成物であるハイポキサンチンが（hypoxanthine）が、細胞内のコレステロールの蓄積及び酸化的ストレスを増加させることを発見し、この結果に基づいて、ハイポキサンチンがコレステロールの蓄積による疾患、特に冠状動脈疾患の診断に極めて有用なマーカーとして使用できることに着目して本発明を完成した。
【０００６】
従って、本発明の目的は、（a)生物学的試料に存在するハイポキサンチンの量を測定する段階；及び（b)上記（a)段階での測定結果を正常対照群試料のハイポキサンチンの量と比べる段階を含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の診断又は予後に有用な情報を提供する方法を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、ハイポキサンチンを含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の診断用マーカー組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、任意の物質をヒト以外の動物に投与した後、血清ハイポキサンチンの濃度を測定することを含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、ハイポキサンチンを含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の診断用マーカーを製造するための使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［技術的解決方法］
前記目的を達成するために、（a)生物学的試料に存在するハイポキサンチンの量を測定する段階；及び（b)前記（a)段階での測定結果を正常対照群試料のハイポキサンチンの量と比べる段階を含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の診断又は予後に有用な情報を提供する方法を提供する。
【００１１】
本発明の他の目的を達成するために、本発明はハイポキサンチンを含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の診断用マーカー組成物を提供する。
【００１２】
本発明の他の目的を達成するために、任意の物質をヒト以外の動物に投与した後の血清ハイポキサンチンの濃度を測定することを含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、（a)生物学的試料に存在するハイポキサンチンの量を測定する段階；及び(b)前記（a)段階での測定結果を正常対照群試料のハイポキサンチンの量と比べる段階を含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の診断又は予後に有用な情報を提供する方法を提供する。
【００１５】
ハイポキサンチンは、下記化学式1で表現される化合物であって、尿酸合成の中間産物であり、アデニル酸から生成され、キサンチンの前駆物質である。ハイポキサンチン、キサンチン及び尿酸は、プリンの代謝経路の最終産物に相当する。非正常的なプリン代謝過程及びプリン過生成はレシニハン症候群（Lesch-Nyhan  syndrome）と関連があり、この症候群は、HGPRT(purine  salvage  enzyme-guanine  phosphoribosyltransferase)の欠乏により発生される。
【化１】
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【００１６】
一方、ハイポキサンチンは、キサンチン酸化酵素（xanthine  oxidase）の基質として作用し、この過程でROS（reactive  oxigen  species)の生成を増加させることになる。ROSは、血管の機能喪失及び／又は動脈硬化症の発症と密接に関連しており、飲酒又は喫煙は、HGPRTの活性を下げるようになり、結果的に血中ハイポキサンチンの濃度を増加させて、冠状動脈疾患の発症の可能性を高めることになる。
【００１７】
そこで、本発明の発明者らは、ハイポキサンチンと、高脂血症、心血管系疾患などのコレステロールの蓄積及び／又は酸化的ストレスと関連している疾患との相関性を明らかにするための研究を進めており、ハイポキサンチンが一連のメカニズムを介して細胞内のコレステロールの蓄積を増加させ、酸化的ストレスを誘発して心血管系疾患の発症可能性を高めるという事実に基づいて本発明を完成した。
【００１８】
本発明の一実施例によれば、ApoEが欠損（knock-out)されているマウスにハイポキサンチンを８週間投与した結果、動物の体重には影響を与えず、血中コレステロール値を大幅に増加させ、ハイポキサンチンを投与された動物は、動脈硬化性プラークの形成が対照群と比べて著しく増加することを確認した（実施例１）。また、本発明の他の実施例によれば、ハイポキサンチンを24時間処理したHepG2細胞は、対照群の細胞と比べてROSの生成量及びコレステロールの蓄積量が顕著に増加していた（実施例2-1）。
【００１９】
前記結果を基に、血中ハイポキサンチンの濃度が高ければ、高脂血症、動脈硬化症などのような、コレステロールの蓄積による疾患が誘発されることが確認できた。
【００２０】
一方、本発明の発明者らは、ハイポキサンチンによりコレステロールの蓄積が誘発されるメカニズムを明らかにするために、一連の実験を行った。つまり、本発明の他の一実施例によれば、ハイポキサンチンの処理により、HepG2細胞においてコレステロールの細胞放出（efflux）を誘導するトランスポーターであるApoEとABCA1（ATP-binging  casette、sub-family  A、member  1）のmRNA発現及びタンパク質の量が、対照群と比べて著しく減少していた。一方、コレステロールの生成と関連しているHMG-CoA還元酵素（HMGCR)とLDLR（low  density  lipoprotein  receptor）タンパク質の量は、ハイポキサンチンの処理によって何らの変化も見られなかった（実施例2-2）。
【００２１】
また、本発明の他の一実施例では、本発明の発明者らは、ハイポキサンチンが代謝される過程で誘発される酸化的ストレスが、コレステロールの蓄積と関連性があるか否かを確認するための実験を行った。活性酸素の一種である過酸化水素(H2O2）をHepG2に24時間処理した結果、細胞内のコレステロール値が対照群と比べて著しく増加していることを確認することができた（実施例3-1）。また、過酸化水素の処理により、HepG2細胞において、対照群と比べてApoE及びABCA1のmRNA発現量及びタンパク質の量が著しく減少し、LDLRのタンパク質の量が増加していることを確認した（実施例3-2）。
【００２２】
また、本発明の他の一実施例では、ハイポキサンチン及び過酸化水素を処理したHepG2細胞にNAC（N-acetylcystein）を処理した結果、細胞内のコレステロール値が減少し、活性酸素の一種である過酸化水素の量が減少することが分かった。さらに、ハイポキサンチンと過酸化水素により減少したApoE及びABCA1発現量が増加することを確認した（実施例4）。
【００２３】
また、本発明の他の一実施例では、ハイポキサンチンを処理したHepG2細胞にアロプリノール（allopurinol)を処理した結果、細胞内でハイポキサンチンにより増加したROSの生成量とコレステロール蓄積の減少が示され、ハイポキサンチンにより減少したABCA1及びLXR-αの発現量が増加することを確認した（実施例5）。
【００２４】
また、本発明の他の一実施例では、ApoEが欠損したHepG2細胞にハイポキサンチンを処理した結果、細胞内のコレステロールの量が増加し、ApoE及びABCA1の発現量が減少することが示され、細胞にApoEを形質転換させてハイポキサンチンを処理した結果、相乗作用によりコレステロールの量が増加する一方、ApoE及びABCA1のmRNAとタンパク質発現量が減少することを確認した（実施例6）。
【００２５】
つまり、ハイポキサンチンは直接的に細胞に作用して、コレステロールの排出と関係したApoE及びABCA1の発現を減少させ、細胞内にコレステロールの蓄積を誘発することが分かり、ハイポキサンチンにより誘発される酸化的ストレスは、ApoE及びABCA1の発現を減少させるだけでなく、コレステロールの生成と密接な関連があるLDLRの発現を増加させ、細胞内のコレステロールの蓄積をさらに増加させ、細胞に酸化的ストレスを誘発し、心血管系に否定的な影響を与える可能性があることが分かった。
【００２６】
本発明の他の一実施例によれば、臨床患者の血液サンプルについて血中コレステロール濃度とハイポキサンチン濃度との相関性を分析した結果、正常対照群と比べて、高コレステロール群において血中ハイポキサンチンの濃度が統計的に有意に高く示されることを確認して、ハイポキサンチンがコレステロールの蓄積による疾患に対するバイオマーカーとして有用に使用できることを改めて確認した（実施例7）。
【００２７】
前記の通り、ハイポキサンチンは、コレステロールの蓄積により誘発される疾患の診断用バイオマーカー又は心血管系疾患の酸化的ストレスを予測するバイオマーカーとして有用に使用することができ、本発明に係るコレステロール蓄積関連疾患を、診断用マーカー組成物を用いて、その疾患に疑われる患者群の生体試料からハイポキサンチンの量を測定することで、疾患の効果的な予測及び診断のための情報として提供することができる。
【００２８】
より具体的には、コレステロールの蓄積に関連する疾患が疑われる患者の生物学的試料からハイポキサンチンの量を検出し、これを正常対照群の数値と比較することにより、コレステロールの蓄積に関連する疾患を診断又は予後を予測することができる。つまり、生物学的試料内のハイポキサンチンの量について、正常対照群のものより、疑わしい患者の方が高い場合は、その患者を、コレステロール蓄積関連疾患を発症する可能性のある患者と予測することができて、時間経過によって同じ患者の生物学的試料からハイポキサンチンの検出量を比較することにより、疾病の予後を予測できる。
【００２９】
前記（a)段階で、ハイポキサンチンの量はミセル液体クロマトグラフィー（micellar  liquid  chromatography）、ミセル動電毛細管法（micellar  electrokinetic  capillary)、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、液体クロマトグラフィー質量分析（LC/MS）、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC/MS)及び商業的に利用可能な検出用キットからなる群から選ばれるいずれか一つの方法で測定できるものの、これに限定されるものではない。
【００３０】
本発明では、前記コレステロールの蓄積に関連する疾患は、高脂血症、脂肪肝臓、冠状動脈疾患及び心血管疾患からなる群より選ばれるいずれか一つであることを特徴とする組成物を提供する。
【００３１】
本発明では、前記冠状動脈疾患は、心筋梗塞、狭心症、粥状動脈硬化症、急性冠状動脈症候群又は脳血管発作であることを特徴とする組成物を提供する。
【００３２】
冠状動脈心疾患とも呼ばれる冠状動脈疾患は、心臓に酸素が豊富な血液を供給する心臓冠状動脈の内部に、血栓が蓄積される疾患を意味する。血栓は、脂肪、コレステロール、カルシウム及びその他の血液から発見される物質で構成されており、血栓が動脈に蓄積される疾患を動脈硬化症と定義する。血栓は、動脈を狭窄させ、心臓に流れる血流量を減らして、動脈内で血液凝固が発生する可能性を高めることになる。血液凝固により、血流が一部遮断される又は完全に遮断されることもあって、このように動脈が詰まると血液が心臓に到達できず、狭心症（胸痛）や心臓麻痺が発生することがある。
【００３３】
冠状動脈疾患を誘発する因子は多様であるが、その中で最も危険な因子としては、高血中コレステロール数値を挙げることができ、ハイポキサンチンの血中値が高い場合、高脂血症、冠状動脈疾患などが発生する可能性が増加する点で、ハイポキサンチンの血中濃度を評価して、冠状動脈疾患などの、コレステロールの蓄積と関連した疾患の発症可能性、予後などの予測ができる。
【００３４】
前記生物学的試料は、組織、細胞、血液、血清、血漿、唾液、及び尿からなる群より選
ばれるが、これらに限定されるものではなく、好ましくは血清又は尿でもある。
【００３５】
本発明は、ハイポキサンチンを含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の診断用マーカー組成物を提供する。
【００３６】
本発明は、任意の物質をヒト以外の動物に投与した後、血清ハイポキサンチンの濃度を測定することを含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３７】
具体的には、コレステロールの蓄積に関連する疾患に効果を示すことが期待される任意の物質をヒト以外の動物に投与した後、動物から得られた生物学的試料から前記マーカー組成物の量を測定して、任意の物質を処理していない対照群と比べてハイポキサンチンの量が減少した物質を、コレステロールの蓄積に関連する疾患の治療剤として選別することができる。
【００３８】
本発明は、ハイポキサンチンを含む、コレステロールの蓄積に関連する疾患の診断用マーカーを製造するための使用を提供する。
【００３９】
本発明で“診断”とは、疾病発生の予測及び疾病の発生危険度を決定する又は導出するために使用される全てのタイプの分析を含む。本発明に係る診断用マーカーはコレステロールの蓄積に因る高脂血症、脂肪肝、冠状動脈疾患及び心血管疾患などを特異的に診断することができる。
【発明の効果】
【００４０】
前記の通り、ハイポキサンチンは、直接又は間接的に細胞内のコレステロールの蓄積を増加させ、酸化的ストレスを誘発する点で、コレステロールの蓄積に関連する疾患、より好ましくは冠状動脈疾患の診断用マーカーとして有用に使用できる。さらに、本発明の診断用マーカーを介して、コレステロールの蓄積と関連した疾患の発見及び予後予測に重要な情報を提供することができ、関連疾患の治療薬剤のスクリーニングに活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、C57BL/6マウス（WT）とApoE欠損（knock-out)マウスにハイポキサンチンを投与した後、撮影した大動脈溝写真（A)と、マウスの動脈硬化症の発症領域を測定した結果（B)を示したものである。データは、平均±標準偏差（mean±SEM）で示した(-：ハイポキサンチン未処理群、+：ハイポキサンチン処理群、***P<0.001  対WT、＃P <0.05  対ApoE KO、Hx：ハイポキサンチン）
【図２】図２は、HepG2細胞においてハイポキサンチンがROS生成とコレステロールの蓄積を誘導することを示したもので、HepG2細胞にハイポキサンチン（1、2.5mM）を処理した後、ROS生成量を蛍光顕微鏡で観察した結果（A)、Amplex  red分析法で過酸化水素の量を測定した結果（B)、HepG2細胞に異なる濃度のハイポキサンチンを処理した後、細胞溶解物中のコレステロールとコレステリルエステルのレベルを測定した結果（C)、及びRT-PCRでAPOE、ABCA1、HMGCR、LDLRのmRNAレベルを測定した結果（D)、ウェスタンブロットでAPOE、ABCA1、HMGCR、LDLRのタンパク質量を測定した結果（E)及びタンパク質濃度をグラフで表したもの（F)である。データは、平均±標準偏差で示した（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001  対コントロール（Ctrl）、AU：任意単位)。
【図３】図３は、HepG2細胞において、過酸化水素がコレステロールの蓄積及び脂肪形成に関連した遺伝子に及ぼす影響を示したもので、HepG2細胞に過酸化水素を濃度別に処理したとき、細胞毒性を発光顕微鏡（倍率：40X）で観察した結果（A)、細胞毒性をMTT  assayを用いて測定した結果（B)、Amplex  red  assayで過酸化水素レベルを測定した結果（C)、細胞溶解物中の細胞内総コレステロールとコレステリルエステルの量を測定した結果（D)、RT-PCRでAPOE、ABCA1、HMGCR、LDLRのmRNAレベルを測定した結果（E)、ウェスタンブロットでAPOE、ABCA1、HMGCR、LDLRのタンパク質量を測定した結果（F)タンパク質濃度をグラフで表したもの（G)である。データは、平均±標準偏差で示した（*P<0.05,**P<0.01  対コントロール、***P<0.001  対コントロール（Ctrl）AU：任意単位)。
【図４】図４は、ハイポキサンチン又は過酸化水素が処理されたHepG2細胞において、NACがコレステロールレベル及び脂肪形成に関連した遺伝子に及ぼす影響を示したもので、Amplex  red  assayで過酸化水素レベルを測定し、細胞溶解物中のコレステロールとコレステリルエステルの量を分析した結果（A)、5mM  NACを2時間処理した後、24時間、1mMハイポキサンチンを処理した細胞においてRT-PCRでAPOE、ABCA1、HMGCR、LDLRのmRNAレベルを測定した結果（B)、ウェスタンブロットでAPOE、ABCA1、HMGCR、LDLRのタンパク質量を測定した結果（C)、5mM  NACを2時間処理した後、24時間500μM過酸化水素を処理した細胞においてRT-PCRでAPOE、ABCA1、HMGCR、LDLRのmRNAレベルを測定した結果（D)、ウェスタンブロットでAPOE、ABCA1、HMGCR、LDLRのタンパク質量を測定したものとグラフで表した結果（E)を示したものである。データは、平均±標準偏差で示した（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001  対コントロール（Ctrl）。#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001  対Hx：ハイポキサンチン、AU：任意単位)。
【図５】図５は、ハイポキサンチンが処理されたHepG2細胞において、アロプリノール（allupurinol)がコレステロールレベル及び脂肪形成に関連した遺伝子に及ぼす影響を示したもので、細胞に1mMハイポキサンチンと100μMアロプリノールを処理した後、Amplex  red  assayで過酸化水素を測定した結果（A)、細胞溶解物中のコレステロールとコレステリルエステルの量を測定した結果（B)、RT-PCR法でABCA1  mRNA（C)とLXR-α（D)の発現量を測定した結果を示したものである。データは、平均±標準偏差で示した（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001  対コントロール（Ctrl）。#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001  対Hx:ハイポキサンチン A：アロプリノール;AU：任意単位)。
【図６】図６は、ApoE欠乏HepG2細胞においてハイポキサンチンがコレステロールレベルと脂肪形成と関連した遺伝子に及ぼす影響を示したもので、HepG2細胞にAPOE-siRNA（siAPOE）又はnon-target-siRNA（siN)を形質転換した後、ハイポキサンチンを処理して細胞溶解物中のコレステロールとコレステリルエステルの量を測定した結果（A)、RT-PCRでAPOE、ABCA1、HMGCR、LDLR mRNAの発現量を測定した結果（B)、ウェスタンブロットでAPOE、ABCA1、HMGCR、LDLRタンパク質の量を測定した結果（C)及びタンパク質の量をグラフで表したもの（D)である。データは、平均±標準偏差で示した（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001  対コントロール（Ctrl）、#P<0.05、###P<0.001  対Hx：ハイポキサンチン）
【図７】図７は、臨床患者の血液サンプルから血中コレステロール値を測定した結果（A)と、臨床患者の血液サンプルから血中ハイポキサンチン値を測定した結果（B)を示したものである（control:正常対照群、Hypercholesterol：高コレステロール群）。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４３】
但し、下記の実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
<実験方法>
１．動物管理、食餌及びハイポキサンチン投与
７週齢の雄ApoE欠損（knock-out)マウス及びC57BL/6マウスに高コレステロールの食餌を12週間投与し、高コレステロール食餌には16％の脂肪、1.25％のコレステロール及
び0.5％のコール酸ナトリウムが含まれていた。14匹の野生型マウスを、ハイポキサンチンを投与していないグループ（WT、n=6)とハイポキサンチンを投与したグループ（WT-Hx、n=8)に分類して、14匹のApoeE欠損マウスを、ハイポキサンチンを投与していないグループ（ApoE  KO、n=6)とハイポキサンチンを投与したグループ（ApoE  KO-Hx、n=8)に分類した。４週間の高コレステロール食餌を終えた後、ハイポキサンチンを200mg/kg/dayで8週間腹腔投与し、12週間のin  vivo実験終了後、マウスを犠牲にして大動脈を抽出して組織学的に分析して血清化学検査のために血液を収得した。
【００４５】
２．血清化学検査
全ての投与が終了した後、それぞれのマウスの心臓から血液サンプルを収得した。血液サンプルは、マウスの心臓から獲得して、凝固を防止するためにEDTAがない瓶に準備した。血清から総コレステロール脂質とトリグリセリドのレベルを分析した。
【００４６】
３．大動脈の動脈硬化性プラーク確認
冷PBSで灌流した後、冷ホルマリン緩衝液で灌流した後、大動脈を胸腔及び心臓から抽出した。大動脈を長く広げてワックスボードに平面にマウントして0.5％ズダンIV溶液で染色した。表面の（en  face）物質をデジタルで撮影した後、Image  J（NIH、USA)を使用して定量してプラーク範囲の割合（％）を測定した。
【００４７】
４．細胞培養及びハイポキサンチン処理
ヒトの肝臓癌細胞株であるHepG2細胞をATCCから購入して、37℃、5%CO2で10％FBS（Gibco-BRL)、100μg/mLペニシリン、10μg/mLストレプトマイシン（Gibco-BRL)が添加されたダルベッコ変形イーグル培地（DMEM）（Gibco-BRL、Gaithersburg、MD、USA)で細胞を培養した。HepG2細胞は12ウェル又は6ウェルプレートに分株して培養し、3〜4日ごとに培地を交換した。1mMと2.5mMのハイポキサンチン、0、100、250、500、及び1000μMのH2O2、5mMのN-アセチルシステイン（NAC、Sigma-Aldrich)、及び100μMのアロプリノール（allopurinol、Sigma-Aldrich)の存在下及び非存在下で、10％DMEMでHepG2細胞を24時間37℃で培養した。
【００４８】
５．総コレステロール及びコレステリルエステルの測定
HepG2細胞は、37℃で24時間ハイポキサンチン（1又は2mMの濃度）又は過酸化水素が添加された又は添加されないDMEM培地で培養した。細胞を氷冷生理食塩水（ice-cold  saline)で洗浄した。細胞内構成物であるコレステロールとコレステリルエステルを、クロロホルム：イソプロパノール：NP-40の割合が7：11：0.1の溶液で抽出した後、製造社の指示に従い、コレステロール分析バッファ（ab65359;Abcam、UK）を用いて測定した。すべてのサンプルは37℃で60分間、コレステロール分析反応バッファーで培養し、590nmで測定した。
【００４９】
６．細胞内ROS測定
細胞内ROSの量を測定するために 2’,7’-ジクロロフルオレッシンジアセテート（DCFH-DA)を用いた。HepG2細胞を、96ウェルプレートに1×104細胞／ウェルで分株した。DCFH-DAは細胞内で、エステラーゼ(esterase)によって、ジクロロフルオレッシン(DCFH)へと加水分解される。この非蛍光分子は、細胞内酸化剤の活性により、蛍光ジクロロフルオレッセイン(DCF)に酸化された。NAC処理群には5mM  NACが含まれた培地を添加し、先に２時間に培養した後、PBSで２回洗浄して、50μMのDCFH-DA溶液を入れて細胞を30分間培養した。その後、細胞をPBSで洗浄した後、各濃度のハイポキサンチン又は過酸化水素を細胞に処理して２時間培養した。その後、482nmの励起及び520nmの発光の条件で蛍光顕微鏡を用いて細胞内ROSレベルを測定した。
【００５０】
７．過酸化水素の測定
96ウェルプレートにHepG2細胞を培養した後、製造社の指示に従いAmplex  Red  Hydrogen  Peroxide  Assay  Kit（Molecular  Probes、Invitrogen社、USA)を使用して過酸化水素のレベルを測定した。蛍光は545nm励起と590nm発光の条件でマイクロプレートリーダー（FLUOstar、BMG  Labtechnologies、USA)を使用して測定した。
【００５１】
８．細胞生存能測定
96ウェルプレートにおいて1.0X104細胞／ウェルの濃度で分株し、DMEMで培養したHepG2細胞に過酸化水素（0、100、250、500、及び1000μM)を２時間又は24時間処理した。培地を交換した後、HepG2細胞を24時間培養し、500μg/mlのMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物)を4時間処理した。200μl  DMSO(Amresco、USA)を添加してホルマザン（formazan）を溶解した後、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad、USA)を使用して570nmで吸光度を測定した。
【００５２】
９．形質転換
ヒトのApoE  siRNA、非標的siRNA及び陰性対照群をDharmacon（USA)から購入して20nMを使用し、Opti-MEM（登録商標）（Invitrogen）の形質転換培地とLipofectamine（登録商標）（invitrogen）を使用した。HepG2細胞を形質転換１日前に接種し、翌日40〜50％になるように培養した。形質感染複合体を形成するために、ApoEに対するRNAi二重鎖をLipofectamineと混合して培養された細胞に添加し、4時間培養した後、培地をDMEMに交換して24時間培養した。
【００５３】
１０．ウエスタンブロット（Western  blotting）
ウェスタンブロットは当業界で通常的に行われる方法により進行して、各タンパク質に対する１次抗体は、それぞれApoE(1：2000、Abcam、UK）、ABCA1(1：2000、Abcam)、HMGCR(1：5000、Abcam)、LDLR(1：2000、Abcam)、及びβ-actin(1：10,000、Sigma-Aldrich、St.Louis MO、USA)を利用した。２次抗体には、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体又はヤギ抗マウス抗体（Dako、Glostrup、Denmark)を利用した。陽性免疫バンドはβ-actinと比較してデンシトメトリーで定量化した。
【００５４】
１１．RNA抽出及びRT-PCR解析
HepG2細胞をハイポキサンチンが添加（1又は2mMの濃度）又は添加されていない10％DMEMで24時間培養した。細胞を培養した後、PBSで洗浄してトータルRNAをTRIreagent（MolecularResearch  Center  Inc.、USA)を用いて抽出した。1μgのトータルRNAをcDNA合成キット（宝酒造、日本)を用いて転写した後、製造社の指示に従い、PRISM7000  Sequence  Detection  SystemでSYBR  green  PCR  Master  Mix（Applied  Biosistems、USA)を使用して、RT-PCR（real-time  PCR)を実施した。すべてのサンプルは、遺伝子発現の相対的な定量のためにCt法を使用して定量し、β-actinで標準化し、遺伝子増幅に使用されたプライマーセットの塩基配列は下記表１に開示した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
１２．統計的分析
データは平均±標準偏差で表示した。すべての実験は少なくとも３回の独立的な実験で実施し、すべてのデータはShapiro-Wilks標準化検査を使用して正常試験をした。グループ間の差の重要性をDunett's  post-hoc検査又はBonferroni  post-hoc検査により一元変量分析（ANOVA)で分析した。非一般的に分散されたデータは、KruskalWallis検査で分析し、0.05以下のP値は統計的に有意なものと見做された。統計分析は、GraphPad  Prism  5（GraphPad、CA）で実施した。
【００５７】
＜実施例１＞
ハイポキサンチン投与による血中脂質含量の変化及び動脈硬化性プラーク形成
【００５８】
ハイポキサンチン動脈硬化症などのコレステロールの蓄積に関連する疾患の相関性を判断するために、ハイポキサンチンの投与が脂質プロファイルを変化させるか否か、及びプラーク形成を誘発するか否かを評価した。
【００５９】
７週齢の雄ApoE欠損マウスと野生型マウスに12週間高脂肪、高コレステロールの食餌を提供し、高脂肪の食餌摂取して4週間後から8週間、ハイポキサンチンを投与した。
【００６０】
高コレステロールの食餌摂取期間及びハイポキサンチン投与期間を含む計12週間経過後、ハイポキサンチンは動物の体重には何らの影響も示さなかった。興味深いことに、ApoE欠損マウスはハイポキサンチン投与により血中総コレステロール値が著しく増加した（表２参照）。
【００６１】
その結果、図１に示した通り、ApoE欠損マウスではハイポキサンチン投与により動脈硬化性プラークの形成が顕著に増加した。一方、野生型マウスではハイポキサンチン投与による差がないと示され、表面の（en face）大動脈の分析は、ハイポキサンチンを投与していないApoE欠損マウスと比べて。ハイポキサンチンを投与したApoE欠損マウスにおいて顕著に動脈硬化性プラークが形成されることを確認できた。
【００６２】
【表２】
2018513986.tif 000005
【００６３】
＜実施例２＞
ハイポキサンチンがHepG2細胞株でROSの生成量及びコレステロールに及ぼす影響
【００６４】
＜実施例２−１＞
HepG2細胞においてハイポキサンチンがROS生成及びコレステロールの蓄積に及ぼす影響
【００６５】
in  vitroでハイポキサンチンがHepG2細胞においてコレステロールの上向調節と関連したメカニズムを調査するために、次のように実験を実施した。
【００６６】
前記記載された実験方法によりHepG2細胞に24時間ハイポキサンチンを処理して細胞を収得し、細胞溶解物中のROS生成量、総コレステロール及びコレステリルエステルのレベルを測定した。ROSの生成量を蛍光顕微鏡で観察し、Amplex  red  assay法で測定した。また、細胞溶解物中のコレステロール及びコレステリルエステルのタンパク質の量を測定した。
【００６７】
その結果、図2A及び図2Bに示した通り、1mMと2.5mMのハイポキサンチンに２時間処理した後、ROSを示すDCF緑色蛍光の頻度数が増加し、過酸化水素の量が増加することが分かった。また、図2Cに示した通り、細胞に1mMと2.5mMのハイポキサンチンを24時間処理した場合が、対照群に比べて総コレステロール量とコレステリルエステルの量がかなり増加することが分かった。これにより、ハイポキサンチンがROSの生成を誘発して細胞に酸化的ストレスを誘発することが確認できた。
【００６８】
＜実施例２−２＞
ハイポキサンチンが脂肪形成に関連する遺伝子及びタンパク質発現に及ぼす影響
【００６９】
細胞内でハイポキサンチンにより誘導されたコレステロールが蓄積されるメカニズムを明らかにするために、脂肪生成と関連した遺伝子の発現量をRT-PCR法で確認し、タンパク質のレベルでも同じように示されるか否かを確認するためにウエスタンブロットを実施した。
前記記載された実験方法によりHepG2細胞をハイポキサンチンが添加されたDMEM培地で培養した。培養した細胞からRNAを抽出してcDNAを合成し、当業界で通常的に使用される条件によりRT-PCRを実施した。また、培養した細胞を収得して前記実験方法によりウェスタンブロットを実施した。
【００７０】
その結果を図2D〜図2Fに示した。
【００７１】
ApoEとABCA1はすべて細胞内のコレステロールを細胞外に排出（efflux）させる役割を担う細胞膜タンパク質であり、前記タンパク質の発現が減少すると細胞内のコレステロールの排出が削減され、コレステロールの蓄積が増加するようになる。図2D及び図2Fに示した通り、ハイポキサンチンをHepG2細胞に24時間処理した結果、ApoEとABCA1遺伝子の発現が減少することが示されたのに対し、細胞内のコレステロールの合成に関連したHMGCR及びLDLRのmRNAはハイポキサンチンの処理により何の変化もないことが示された。また、図2Eに示した通り、ApoEとABCA1タンパク質の発現量が減少するものと示されたのに対し、細胞内のコレステロールの合成に関連したHMGCR及びLDLRタンパク質はハイポキサンチンの処理により増加する傾向を示したが、統計的に有意性は示されなかった。
【００７２】
これにより、ハイポキサンチンの処理で細胞膜に存在するコレステロール排出輸送体であるApoE及びABCA1のmRNAの発現及びタンパク質発現が減少し、細胞内のコレステロールの合成と関連したHMGCR及びLDLRのmRNAの発現及びタンパク質発現はなんらの影響もなかったので、細胞内で生成されたコレステロールが細胞外に排出されず、コレステロールの蓄積が誘発されることが分かった。
【００７３】
＜実施例３＞
過酸化水素がHepG2細胞株でROSの生成量及びコレステロールに及ぼす影響
【００７４】
＜実施例３−１＞
HepG2細胞で過酸化水素がコレステロールの蓄積に及ぼす影響
【００７５】
ハイポキサンチンの代謝過程で活性酸素が生成される事実は公知されており、これらの活性酸素が、コレステロールの蓄積に関連した疾患とどのような関連性があるか否かを判断するため、次のような実験を行った。
【００７６】
HepG2細胞に100、500及び1000μMの過酸化水素を2時間及び24時間処理して、前記記載された実験方法によりMTT法と光学顕微鏡で細胞生存率を確認し、ROSレベルと総コレステロールレベルを分析した。
【００７７】
その結果、図3A及び図3Bに示した通り、細胞に500μMと1000μMの過酸化水素を処理した場合、細胞の形態が変形され、細胞の生存能力が大幅に減少することが分かった。また、図3Cに示した通り、過酸化水素をHepG2細胞に2時間処理した結果、過酸化水素の濃度が対照群に比べて増加することが示され、図3Dに示した通り、過酸化水素をHepG2細胞に24時間処理した結果、コレステロールレベルとコレステリルエステルのレベルが対照群に比べて増加することが示された。ただ、過酸化水素1000μMでは細胞の生存率が低いため、コレステロールレベルが低く測定されたものと判断される。
【００７８】
＜実施例３−２＞
過酸化水素が脂肪形成と関連する遺伝子及びタンパク質の発現に及ぼす影響
【００７９】
前記実施例3-1で示した通り、過酸化水素処理により細胞内のコレステロールが蓄積されるメカニズムを明らかにするため、脂肪生成と関連した遺伝子の発現量をRT-PCR法で確認し、タンパク質レベルでも同じく示されるかを確認するためにウエスタンブロットを実施した。
【００８０】
その結果、図3E〜図3Gで示した通り、過酸化水素を処理した場合に、ApoEとABCA1遺伝子とタンパク質の発現量が著しく減少することが示された。一方、500μM過酸化水素を処理した場合に、LDLR遺伝子とタンパク質発現量が増加することが示された。また、過酸化水素の濃度依存的にHMGCR遺伝子の発現量は減少したのに対し、タンパク質の発現量は対照群と比べて有意性が示されなかった。一方、過酸化水素1000μMでは細胞の生存率が低く、β-actinのバンドが減少するものと判断される。
【００８１】
これにより、500μMの過酸化水素を使用して、HepG2細胞において過酸化水素で誘導された酸化的効果を確認できた。
【００８２】
＜実施例４＞
NACがHepG2細胞株においてROSの生成量及びコレステロールに及ぼす影響
【００８３】
＜実施例４−１＞
HepG2細胞においてNACがコレステロールの蓄積に及ぼす影響
【００８４】
in  vitroでハイポキサンチン及び過酸化水素により誘導されたコレステロールの蓄積に抗酸化剤が及ぼす影響を確認するために次のように実験を行った。
【００８５】
HepG2細胞にハイポキサンチン（1mM）又は過酸化水素（500μM）を処理する前に、5mMのNAC(N-acetylcystein)を2時間処理した。前記記載された実験方法により細胞を収得して過酸化水素の生成量及び総コレステロールのレベルを測定した。
【００８６】
その結果、図4Aに示した通り、5mM  NACを処理した場合に、過酸化水素の量が減少することを示し、対照群と類似した量であることが示された。さらに、HepG2細胞にハイポキサンチンと過酸化水素を処理したとき、総コレステロールレベルが増加した反面、NACがコレステロールの蓄積を改善させることが示された。
【００８７】
これにより、ROSを除去するNACは、ROSで誘導されたコレステロールの蓄積を抑制することを確認できた。
【００８８】
＜実施例４−２＞
NACが脂肪形成と関連した遺伝子及びタンパク質発現に及ぼす影響
【００８９】
細胞内でハイポキサンチンにより誘導されたコレステロールの増加が、ROSを介して媒介されたものか否かを確認するために、脂肪生成と関連する遺伝子の発現量に抗酸化剤が及ぼす効果をRT-PCR法で確認し、タンパク質のレベルでも同じく示されるか否かを確認するためにウエスタンブロットを実施した。
【００９０】
前記記載された実験方法によりHepG2細胞をハイポキサンチンが添加されたDMEM培地で培養した。培養した細胞からRNAを抽出し、cDNAを合成してRT-PCRを実施した。また、培養した細胞を収得して前記実験方法によりウェスタンブロットを実施した。
【００９１】
その結果、図4B〜図4Eに示した通り、NACを処理した場合にハイポキサンチンと過酸化水素により減少したApoE及びABCA1発現量が増加することが示された。それに対して、HMGCR及びLDLRのmRNA発現とタンパク質発現は、ハイポキサンチンとNAC処理により影響を受けないことと示された（図4B及び4C）。
【００９２】
また、過酸化水素を処理したときは、HMGCR転写量が大幅に減少したが、NACを処理したときは、HMGCR発現を抑制する過酸化水素の効果を抑制した。HMGCRタンパク質レベルは、対照群の細胞と比べて差が現れなかった。過酸化水素を処理したときは、LDLR  mRNA及びタンパク質のレベルが増加したが、NAC処理によりLDLR発現を増加させる過酸化水素の効果を抑制することと示された（図4D及び図4E）。
【００９３】
＜実施例５＞
アロプリノールがHepG2細胞株においてROSの生成量及びコレステロールに及ぼす影響
【００９４】
in  vitroでハイポキサンチンにより誘導されたコレステロールの蓄積に、特定のキサンチン酸化酵素が及ぼす効果を調べるために、アロプリノール（allopurinol)を使用して、次のように実験を実施した。
【００９５】
前記記載された実験方法により、HepG2細胞に2時間及び24時間、1mMのハイポキサンチンと100μMのアロプリノールを処理した後、ROSの生成量とコレステロールの量を測定した。また、HepG2細胞を収得してABCA1とLXR-α（liver  X  receptor  alpha）遺伝子発現量をRT-PCR法で測定した。
【００９６】
その結果、図5に示した通り、アロプリノールを処理したとき、ハイポキサンチンにより増加したROSの生成量とコレステロールの蓄積が減少することが示された（図5A、図5B）。また、アロプリノールを処理したグループからハイポキサンチンにより減少したABCA1の発現量が増加することが示され、ハイポキサンチンにより減少したLXR-αmRNAの発現量が増加することが示された。
【００９７】
＜実施例６＞
ApoE欠損状態でハイポキサンチンがコレステロール蓄積及び脂肪形成と関連する遺伝子に及ぼす影響
【００９８】
ApoEが欠損した細胞においてハイポキサンチンがコレステロールの蓄積に及ぼす影響を確認するために次のように実験を実施した。
【００９９】
前記記載された実験方法により、HepG2細胞をヒトのApoE-siRNA（siAPOE、20nM）又は非標的siRNA（siN、20nM）で形質転換させた。HepG2細胞に24時間siAPOE又はsiNで形質転換させた後、1mMハイポキサンチンを処理した細胞と処理していない細胞を24時間培養した。
【０１００】
その結果、図6に示した通り、ApoEの欠損はコレステロールを増加させ、ApoE及びABCA1の転写レベルを減少させる。細胞にsiAPOEを形質転換させ、ハイポキサンチンを処理した群では、相乗作用によりコレステロールの量が増加するものと示された（図6A)。また、siAPOEとハイポキサンチンは相乗作用してApoEとABCA1  mRNA発現量とタンパク質の発現量を減少させることに示されたのに対し、HMGCR及びLDLR  mRNA発現量及びタンパク質の発現量はsiAPOEとハイポキサンチンにより影響を受けないことを確認できた（図6B、図6C、図6D）。
【０１０１】
＜実施例７＞
高コレステロール患者の生体試料内ハイポキサンチン検出
【０１０２】
本発明で使用した臨床試料は、多様な疾患で慶北大学校病院を尋ねた患者から同意を得て-80℃で保管中の血清試料を使用した。
【０１０３】
臨床試料から、血中コレステロール濃度とハイポキサンチンの相関性を確認するために、総コレステロール200mg/dL以下の患者10人（対照群）と総コレステロール300-600 mg/dLの患者9人（高コレステロール群）を対象に、血中ハイポキサンチンの濃度を評価した。ハイポキサンチンの濃度は、Amplex  Red  Hypoxanthine  assay  kit(Molecular  Probe)を使用して患者の血清を対象に評価した。
【０１０４】
その結果を図７に示した。
【０１０５】
図７に示した通り、総コレステロールは、対照群で（control)平均150±4.1  mg/dLであり、高コレステロール群（Hypercholesterol）では376±31.5  mg/dLで測定された。血中ハイポキサンチンの濃度は、対照群では16±2.3μM、高コレステロール群では25±2.7μMで示され、統計学的に有意な結果を示した。つまり、血中コレステロール値とハイポキサンチンの数値が相関性を示すことを臨床試料から再び確認して、ハイポキサンチンがコレステロールの蓄積に因る疾患に対するバイオマーカーとして有用に使用できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
ハイポキサンチンは直接又は間接的に細胞内のコレステロールの蓄積を増加させ、酸化的ストレスを誘発するという点で、コレステロールの蓄積と関連した疾患、より好ましくは、冠状動脈疾患の診断用マーカーとして有用に使用することができる。また、本発明の診断用マーカーを介して、コレステロールの蓄積と関連した疾患の発見及び予後予測に重要な情報を提供することができ、関連疾患の治療薬剤のスクリーニングに活用することができる点で産業上の利用可能性が高い。
【図１】
2018513986.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018513986.tif 000014
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