(57)【要約】  本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作され得る免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を製造する方法およびそれを含む組成物および反応混合物を提供する。
2018500944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ調節性細胞が枯渇し、ＣＡＲを発現するように操作され得る免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の集団の製造法であって、
免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の集団を提供し、
Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を集団から除去し、それにより、ＣＡＲ発現に適するＴ調節性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団を提供する
ことを含む、方法。
【請求項２】
Ｔ調節性枯渇細胞の集団が３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％より少ないＣＤ２５＋細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫エフェクター細胞の集団が癌を有する対象、例えば、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)のような、例えば、ＣＤ２５発現性癌を有する対象の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｔ調節性枯渇細胞の集団が５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントを使用して集団から除去されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントが基質、例えば、ビーズにコンジュゲートされている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
免疫エフェクター細胞の集団が、血液癌、例えば、白血病、例えば、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)またはリンパ腫、例えば、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)を有する対象から得られている、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
、Ｔ調節性枯渇細胞の集団が３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の白血病細胞、例えば、ＣＬＬ細胞、ＡＬＬ細胞またはリンパ腫細胞、例えば、ＭＣＬ細胞、ＨＬ細胞を含み、例えば、ここで、Ｔ調節性枯渇細胞の集団が１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含み、例えば、ここで、Ｔ調節性枯渇細胞の集団が１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する集団から細胞を除去し、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ調節性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
チェックポイント阻害物質、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害物質を発現する集団、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１以上から細胞を除去し、それによりＴ調節性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害物質枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
提供される免疫エフェクター細胞の集団が、１以上のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現に基づき選択されている、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の提供される集団がＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、例えば、ここに記載する方法によりＴ調節性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団を活性化することおよび／またはＴ調節性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団からの細胞をＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターで形質導入することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
さらに、例えば、ＣＡＲ、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現するように、例えば、ここに記載する方法により、操作されたＴ調節性枯渇細胞の集団を拡張することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞の集団が８日以下、例えば、７日、６日、５日、４日または３日の期間拡張されまたは細胞の集団が５日培養で拡張され、得られた細胞が、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞よりも強力である、例えば、５日拡張させた細胞が、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示すまたは細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞が、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞の集団が、例えば、ここに記載するような、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する物質および細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドの存在下に細胞を培養することにより拡張される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞の集団が、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日拡張期間にわたり細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)をもたらす１以上のインターロイキンを含む適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で拡張される、例えば、ここで、細胞の集団がＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)の存在下で拡張される、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
細胞の集団が適切な拡張期間後凍結保存される、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることをさらに含み、核酸が、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞の集団を含む反応混合物。
【請求項２０】
５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞の集団および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む反応混合物。
【請求項２１】
細胞の集団が１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む、または細胞の集団が１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む、請求項２０に記載の反応混合物。
【請求項２２】
反応混合物が５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のチェックポイント阻害物質発現細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞またはＴＩＭ３＋細胞の集団を含む、請求項２０または２１に記載の反応混合物。
【請求項２３】
反応混合物が集団の細胞を活性化および／または拡張する物質、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する物質および／または細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドをさらに含み、例えば、物質が抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズである、請求項１９〜２２のいずれかに記載の反応混合物。
【請求項２４】
さらに血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは細胞増殖用の何らかの他の添加物、例えば、ここで、反応混合物は、さらにＩＬ−１５および／またはＩＬ−７を含む、増殖および／または生存能のための１以上の因子を含む、請求項１９〜２３のいずれかに記載の反応混合物。
【請求項２５】
反応混合物における複数の細胞の集団が、例えば、ここに記載するような、ＣＡＲコード化配列、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲコード化配列を含む、核酸分子、例えば、ここに記載する核酸分子を含み、例えば、反応混合物における複数の細胞の集団が、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含み、例えば、ここで、ベクターが、ここに記載するベクター、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである、請求項１９〜２４のいずれかに記載の反応混合物。
【請求項２６】
さらに、例えば、サッカライド、オリゴサッカライド、多糖およびポリオール(例えば、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、グルコースおよびデキストラン)、塩およびクラウンエーテルのような凍結保護物質または安定剤を含む、請求項１９〜２４に記載の反応混合物。
【請求項２７】
ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法であって、
免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の集団であって、複数の免疫エフェクター細胞がＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸を含むものを提供し、
細胞の集団を、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日拡張期間にわたり細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)をもたらす１以上のインターロイキン存在下で拡張させることを含む、
方法。
【請求項２８】
細胞の集団がＩＬ−１５および／またはＩＬ−７、例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７存在下で拡張される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞の集団が８日未満、例えば、７日、６日、５日、４日または３日の期間拡張される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞が、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞よりも強力である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３１】
５日拡張させた細胞が、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示すまたは細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞が、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞の集団が、細胞を、例えば、ここに記載するような、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する物質および細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンド存在下での培養することにより拡張され、例えば、物質が抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズである、請求項２７〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
提供される免疫エフェクター細胞の集団が５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞の集団であるまたは提供される免疫エフェクター細胞の集団が５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞の集団である、請求項２７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
提供される細胞の集団が、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含むまたは提供される細胞の集団が１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
提供される免疫エフェクター細胞の集団がまた５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のチェックポイント阻害物質発現細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞またはＴＩＭ３＋細胞を含む、請求項５０〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
さらに免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸をさらに接触させ、核酸が、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
免疫エフェクター細胞の集団を含む反応混合物であって、その中の複数の細胞の集団が、例えば、ここに記載するような、ＣＡＲコード化配列、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲコード化配列を含む、核酸分子、例えば、ここに記載する核酸分子およびＩＬ−７および／またはＩＬ−１５を含む、反応混合物。
【請求項３８】
免疫エフェクター細胞の集団を含む反応混合物であって、その中の複数の細胞の集団が、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸配列およびＩＬ−７および／またはＩＬ−１５を含むベクターを含み、所望によりベクターが、ここに記載するベクター、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである、反応混合物。
【請求項３９】
さらに集団の細胞を活性化および／または拡張する物質、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する物質および／または細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドを含み、例えば、物質が抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズである、請求項３７または３８に記載の反応混合物。
【請求項４０】
免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法であって、
免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の集団を提供し、
免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードするＲＮＡを、ＣＡＲおよびテロメラーゼサブユニットの発現に適する条件下で接触させることを含む、
方法。
【請求項４１】
ＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡが同じ核酸分子の一部であるまたはＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡが別々の核酸分子の一部である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを実質的に同時に接触させるか、または免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸とを免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを接触させる前に接触させるか、または免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸とを免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを接触させた後に接触させることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡがｍＲＮＡであるまたはテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡがポリ(Ａ)テイルまたは５’キャップ構造を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
免疫エフェクター細胞に、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを遺伝子導入、形質導入または電気穿孔することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
ＣＡＲをコードする核酸および
外来テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴコード化ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)
を含む、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)。
【請求項４６】
ＣＡＲおよび
外来テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴ
を含むが、外来テロメラーゼサブユニットコード化ＤＮＡを含まない、
免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国出願６２／０９７,３７５号(２０１４年１２月２９日出願)および米国出願６２／１３３,１３７号(２０１５年３月１３日出願)に基づく優先権を主張し、それらの内容を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出した配列表を含み、その全体を引用により本明細書に包含させる。該ASCIIコピーは、２０１５年１２月１８日に作成し、N2067-7067WO_SL.txtなるファイル名であり、２４６,１４７バイトサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般にキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法およびそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
自己Ｔ細胞、特にキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を形質導入したＴ細胞での養子細胞移入(ＡＣＴ)治療は、いくつかの血液癌治験で有望であることが示されている。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ＣＡＲを発現するように操作できる免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法およびそれを含む組成物に関する。
【０００６】
したがって、ある面において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作できる免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法であって、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の集団を提供し、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を集団から除去し、それにより、ＣＡＲ発現に適するＴ調節性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団を提供することを含む、方法に関する。
【０００７】
ある態様において、Ｔ調節性枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％より少ないＣＤ２５＋細胞を含む。
【０００８】
ある態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、癌を有する対象、例えば、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)のような、例えば、ＣＤ２５発現性癌を有する対象の細胞である。ある態様において、Ｔ調節性枯渇細胞の集団は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞を含む。
【０００９】
ある態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、処置のために細胞を投与される対象に自己である。ある態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、処置のために細胞を投与される対象に同種異系である。
【００１０】
ある態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、例えばＩＬ−２を使用して集団から除去する。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドは基質、例えば、ビーズにコンジュゲートするかまたは基質、例えば、ビーズ上に他にコーティングされる。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントは、ここに記載する基質にコンジュゲートする。ある態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体分子またはそのフラグメントを使用して集団から除かれる。
【００１１】
ある態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ミルテニーＴＭからのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除かれる。ある態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤比は、１ｅ７細胞対２０μLまたは１ｅ７細胞対１５μLまたは１ｅ７細胞対１０μLまたは１ｅ７細胞対５μLまたは１ｅ７細胞対２.５μLまたは１ｅ７細胞対１.２５μLである。
【００１２】
ある態様において、Ｔ調節性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団は、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲの発現に適する。ある態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、血液癌、例えば、白血病、例えば、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)またはリンパ腫、例えば、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)またはホジキンリンパ腫(ＨＬ)を有する対象から得る。ある態様において、Ｔ調節性枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の白血病細胞、例えば、ＣＬＬ細胞、ＡＬＬ細胞またはリンパ腫細胞、例えば、ＭＣＬ細胞またはＨＬ細胞を含む。ある態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＬＬを有し、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の白血病細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含むＴ調節性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団を有する対象から得て、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲの発現に適する。ある態様において、Ｔ調節性枯渇細胞の集団は、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。ある態様において、Ｔ調節性枯渇細胞の集団は、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。
【００１３】
ある態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、末梢血リンパ球から単離されたＴ細胞である。ある態様において、Ｔ細胞の集団は、赤血球溶解および／または単球枯渇により得る。ある態様において、Ｔ細胞の集団は、末梢リンパ球から、例えば、ここに記載する方法を使用して単離する。
【００１４】
ある態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、例えば、アフェレーシスにより得た、対象からの血液サンプルから得ることができる。ある態様において、アフェレーシスにより回収した細胞を洗浄して血漿フラクションを除去し、所望により、細胞を、その後の処理工程のための適切な緩衝液または媒体に入れる。ある態様において、細胞を、例えば、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)のような緩衝液で洗浄する。ある態様において、細胞を、カルシウムおよびマグネシウムのような１以上の二価カチオンを欠く、例えば、カルシウムおよびマグネシウムの両者を欠く、洗浄溶液で洗浄する。ある態様において、細胞を、実質的に二価カチオンを含まない緩衝液で洗浄する。
【００１５】
ある態様において、方法は、さらに、細胞を腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する集団から除去することを含み、それにより、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ調節性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供する。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞を、Ｔ調節性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去する。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを、細胞の除去に使用できる同じ基質、例えば、ビーズに結合でき、または抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラグメントまたは抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを、混合物が細胞の除去に使用できる別々のビーズに結合できる。他の態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも起こり得る。
【００１６】
ある態様において、方法は、さらに、細胞をチェックポイント阻害物質、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害物質を発現する集団、例えば、１以上の(例えば、２または３の)ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞から除去することをさらに含み、それによりＴ調節性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害物質枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する。ある態様において、ＰＤ１＋細胞およびＬＡＧ３＋細胞を除去する；ＰＤ１＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞を除去する；またはＬＡＧ３＋およびＴＩＭ３＋細胞を除去する。ある態様において、チェックポイント阻害物質発現細胞を、Ｔ調節性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去する。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害物質抗体またはそのフラグメントを、細胞の除去に使用できる同じビーズに結合でき、または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントと抗チェックポイント阻害物質抗体またはそのフラグメントを混合物が細胞の除去に使用できる別々のビーズに結合できる。他の態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害物質発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも起こり得る。
【００１７】
ある態様において、除去する細胞の集団は、調節性Ｔ細胞でも腫瘍細胞でもないが、ＣＡＲＴ細胞の発現および／または機能に他に負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。ある態様において、このような細胞は、調節性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後にまたは他の順番で除去することが企図される。
【００１８】
ある態様において、方法は、さらにＣＤ１４を発現する集団から細胞を除去することを含み、それにより、Ｔ調節性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびＣＤ１４＋枯渇細胞の集団を提供する。ある態様において、ＣＤ１４＋細胞を、Ｔ調節性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去する。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗ＣＤ１４抗体またはそのフラグメントを、細胞の除去に使用できるのと同じビーズに結合でき；または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗ＣＤ１４抗体またはそのフラグメントを、混合物が細胞の除去に使用できる別々のビーズに結合できる。他の態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびＣＤ１４＋細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも起こり得る。ある態様において、ＣＤ１４＋細胞をＣＤ１４抗体分子またはそのフラグメントを使用して除去する。
【００１９】
ある態様において、提供される免疫エフェクター細胞の集団は、１以上のマーカー(例えば、２、３、４、５、６、７以上のマーカー)、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現に基づき選択されており、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の提供される集団はＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である。
【００２０】
ある態様において、方法は、さらに、１以上のマーカー(例えば、２、３、４、５、６、７以上のマーカー)、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現について富化された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を得ることを含む。ある態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋細胞について富化される。例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コンジュゲートビーズとのインキュベーションにより単離したＴ細胞を得る。ある態様において、方法は、さらに、細胞を、１以上のマーカー(例えば、２、３、４、５以上のマーカー)、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯを発現するＴ調節性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団から選択することを含む。
【００２１】
ある態様において方法は、例えば、ここに記載する方法により、Ｔ調節性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団を活性化することを含む。
【００２２】
ある態様において方法は、さらに、Ｔ調節性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団からの細胞を、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターで形質導入することを含む。ある態様において、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。ある態様において、Ｔ調節性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団からの細胞を、ベクターで一度に、例えば、免疫エフェクター細胞の集団を、例えば、アフェレーシスにより得た、対象からの血液サンプルから得た後１日以内に形質導入する。
【００２３】
ある態様において、方法は、さらに、Ｔ調節性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団から、一過性に外来ＲＮＡを発現するＲＮＡ操作細胞の集団を産生することを含む。方法は、インビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを集団からの細胞に導入することを含み、ここで、ＲＮＡは、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸を含む。
【００２４】
ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸で形質導入された細胞を、例えば、ここに記載する方法により拡張させる。ある態様において、細胞を、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約１４日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日)の期間の培養により拡張させる。ある態様において、細胞を３〜９日の期間拡張させる。ある態様において、細胞を４〜９日の期間拡張させる。ある態様において、細胞を、８日またはそれ未満、例えば、７日、６日、５日、４日または３日拡張させる。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞を、３日または４日の培養により拡張させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞よりも強力である。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死滅、サイトカイン産生、活性化、遊走またはこれらの組み合わせにより定義され得る。ある態様において、３日または４日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある態様において、５日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を、３日または４日の培養により拡張させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある態様において、３日または４日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、pg／mlでの炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上の増加を示す。ある態様において、５日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、pg／mlでの炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルの少なくとも１倍、２倍、３���、４倍、５倍、１０倍以上の増加を示す。ある態様において、３日、４日または５日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、少なくとも同程度のpg／mlでのサイトカイン産生、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８またはＩＬ１０レベルのまたは少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上の増加を示す。
【００２５】
ある態様において、ビーズ(例えば、ＣＤ３／２８刺激性ビーズ)を機械的破砕により細胞から除去する。ある態様において、機械的破砕は、細胞をピペットチップ、例えば、狭口径ピペットチップを通過(例えば、反復通過)させることを含む。ある態様において、細胞を、１以上(例えば、２、３、４または５以上)チューブ、例えば、狭口径チューブを通す。ある態様において、チューブは、閉細胞培養系の一部である。ある態様において、ピペットチップまたはチューブの内径は約１mm、０.９mm、０.８mm、０.７mm、０.５mm、０.４mm、０.３mmまたは０.２mm未満であり、所望により直径は０.１mm、０.２mm、０.３mmまたは０.４mmより大きい。
【００２６】
ある態様において、３日、４日または５日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、Ｔｅｍ細胞、Ｔｃｍ細胞またはＴｅｍ細胞とＴｃｍ細胞の両者の比率が増加している。ある態様において、３日、４日または５日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、Ｔｅｍ細胞、Ｔｅｆｆ細胞またはＴｅｍ細胞とＴｅｆｆ細胞の両者の比率が増加している。ある態様において、３日、４日または５日拡張させた細胞、例えば、ＣＤ１９ここに記載するＣＡＲ細胞の集団は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％、所望により最大約４０％または５０％のＴナイーブ様細胞(Ｔナイーブ様、ＴｅｆｆおよびＴｃｍ細胞中)のパーセンテージを有する。ある態様において、３日、４日または５日拡張させた細胞、例えば、ＣＤ１９ここに記載するＣＡＲ細胞の集団は、少なくとも約１０％、１５％または２０％および所望により最大約１５％または２０％のＴｅｍ細胞(Ｔナイーブ様、ＴｅｆｆおよびＴｃｍ細胞中)のパーセンテージを有する。ある態様において、３日、４日または５日拡張させた細胞、例えば、ＣＤ１９ここに記載するＣＡＲ細胞の集団は、(Ｔナイーブ様＋Ｔｅｍ)細胞(Ｔナイーブ様、ＴｅｆｆおよびＴｃｍ細胞中)は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％および所望により最大約５０％または７０％のパーセンテージを有する。
【００２７】
ある態様において、３日、４日または５日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、０.５×１０６細胞の用量で投与したとき、図３１ＡのＮＡＬＭ６アッセイにおいて同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞の、１×１０６、１.５×１０６、２×１０６、２.５×１０６、３×１０６、４×１０６または５×１０６の用量より大きいまたは同等な活性を有する。ある態様において、活性を１週目、２週目、３週目、４週目、５週目または６週目に測定する。
【００２８】
ある態様において、細胞を、例えば、ここに記載するような、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する物質および細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドの存在下の細胞培養により拡張させる。ある態様において、物質は抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズである。
【００２９】
ある態様において、細胞を、所望により、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは細胞増殖用の任意の他の添加物を含む、増殖および／または生存能のための１以上(例えば、２、３、４または５以上)の因子を含む、適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で拡張させる。
【００３０】
ある態様において、細胞を、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日拡張期間にわたり細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)の増加をもたらす、１以上(例えば、２、３、４または５以上)のインターロイキンを含む適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で拡張させる。ある態様において、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)存在下で拡張させる。
【００３１】
ある態様において、細胞を、適切な拡張期間後凍結保存する。ある態様において、細胞を、ここに記載する方法に従い凍結保存する。ある態様において、拡張した細胞を、例えば、ここに記載するような、適切な培地、例えば、不溶解性培地で凍結保存する。
【００３２】
ある態様において、方法は、さらに、免疫エフェクター細胞の集団と、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む。ある態様において、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００３３】
他の面において、本発明は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞の集団を含む反応混合物に関する。ある態様において、反応混合物は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞の集団および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。ある態様において、細胞の集団は、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。ある態様において、細胞の集団は、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。
【００３４】
ある態様において、反応混合物は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のチェックポイント阻害物質発現細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞またはＴＩＭ３＋細胞の集団を含む。反応混合物は、緩衝液または他の試薬、例えば、ＰＢＳ含有溶液をさらに含み得る。
【００３５】
ある態様において、反応混合物は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞の集団および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ１４＋細胞を含む。反応混合物は、緩衝液または他の試薬、例えば、ＰＢＳ含有溶液をさらに含み得る。
【００３６】
ある態様において、反応混合物は、さらに、例えば、ここに記載するような、集団の細胞を活性化するおよび／または拡張する物質、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する物質および／または細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドを含み得る。ある態様において、物質は抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズである。
【００３７】
ある態様において、反応混合物は、さらに、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは細胞増殖用の任意の他の添加物を含む、増殖および／または生存能のための１以上(例えば、２、３、４または５)の因子を含む。ある態様において、反応混合物は、さらにＩＬ−１５および／またはＩＬ−７を含む。
【００３８】
ある態様において、反応混合物における複数の細胞の集団は、例えば、ここに記載するような、ＣＡＲコード化配列、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲコード化配列を含む、核酸分子、例えば、ここに記載する核酸分子を含む。
【００３９】
ある態様において、反応混合物における複数の細胞の集団は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む。ある態様において、ベクターは、ここに記載するベクター、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。
【００４０】
ある態様において、反応混合物は、さらに、例えば、サッカライド、オリゴサッカライド、多糖およびポリオール(例えば、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、グルコースおよびデキストラン)、塩およびクラウンエーテルのような凍結保護物質または安定剤を含む。ある態様において、凍結保護物質はデキストランである。
【００４１】
他の面において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法であって、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の集団であって、複数の免疫エフェクター細胞がＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸を含むものを提供し、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日拡張期間にわたり細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)増加をもたらす、１以上(例えば、２、３、４または５)のインターロイキン存在下、細胞の集団を拡張させることを含む、方法に関する。ある態様において、細胞の集団を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７、例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下に拡張させる。
【００４２】
ある態様において、細胞を、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約１４日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日)の期間の培養により拡張させる。ある態様において、細胞を４〜９日の期間拡張させる。ある態様において、細胞を、８日またはそれ未満、例えば、７日、６日または５日拡張させる。ある態様において、細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死滅、サイトカイン産生、活性化、遊走またはこれらの組み合わせにより定義され得る。ある態様において、５日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある態様において、５日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、pg／mlでの炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上の増加を示す。
【００４３】
ある態様において、細胞を、例えば、ここに記載するような、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する物質および細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドの存在下の細胞培養により拡張させる。ある態様において、物質は抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズ。
【００４４】
ある態様において、提供される免疫エフェクター細胞の集団は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞の集団である。ある態様において、提供される免疫エフェクター細胞の集団は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞の集団および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞である。ある態様において、提供される細胞の集団は、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。ある態様において、提供される細胞の集団は、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。
【００４５】
ある態様において、提供される免疫エフェクター細胞の集団は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のチェックポイント阻害物質発現細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞またはＴＩＭ３＋細胞の集団である。
【００４６】
ある態様において、提供される免疫エフェクター細胞の集団は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含むＴ調節性枯渇細胞および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ１４＋細胞の集団である。
【００４７】
ある態様において、方法は、さらに、拡張前に、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を集団から除去し、それにより、拡張するＴ調節性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞を提供することを含む。ある態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞をここに記載する方法により除去する。
【００４８】
ある態様において、方法は、さらに、拡張前に、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ１４＋細胞を集団から除去し、それにより、拡張するＣＤ１４＋枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ１４＋細胞をここに記載する方法により除去する。
【００４９】
ある態様において、方法は、さらに、免疫エフェクター細胞の集団と、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む。ある態様において、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００５０】
他の面において、本発明は、免疫エフェクター細胞の集団を含む反応混合物に関し、ここで、反応混合物における複数の細胞の集団は、例えば、ここに記載するような、ＣＡＲコード化配列、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲコード化配列を含む、核酸分子、例えば、ここに記載する核酸分子およびＩＬ−７および／またはＩＬ−１５を含む。
【００５１】
ある態様において、反応混合物における複数の細胞の集団は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む。ある態様において、ベクターは、ここに記載するベクター、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。
【００５２】
ある態様において、反応混合物は、さらに、例えば、ここに記載するような、集団の細胞を活性化するおよび／または拡張する物質、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する物質および／または細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドを含み得る。ある態様において、物質は抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズである。
【００５３】
他の面において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法であって、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の集団であって、複数の免疫エフェクター細胞がＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸を含むものを提供し、細胞の集団を５日の培養で拡張することを含み、ここで、得られた細胞が、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞増殖レベルで測定して、より強力である、方法に関する。
【００５４】
ある態様において、５日拡張させた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある態様において、５日拡張させた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、pg／mlでの炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上の増加を示す。
【００５５】
他の面において、本発明は、対象に、ここに記載する方法により製造し、ＣＡＲ、例えばここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む、方法に関する。
【００５６】
ある態様において、方法は、癌、例えば、ＣＬＬのような、例えば、血液癌を有する対象における抗腫瘍免疫を提供する。ある態様において、方法は、癌、例えば、白血病(例えば、ＣＬＬ、ＡＬＬ)またはリンパ腫(例えば、ＭＣＬ、ＨＬ)のような、例えば、ここに記載する血液癌を有する対象を処置する方法である。ある態様において、細胞の集団は、集団を投与する対象に自己である。ある態様において、細胞の集団は、集団を投与する対象に同種異系である。ある態様において、対象はヒトである。
【００５７】
ある態様において、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９と関係する疾患は、癌または悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患から選択されるかまたはここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する非癌関連徴候である。ある態様において、疾患は、ここに記載する癌、例えば、ここに記載する標的と関係するとしてここに記載する癌である。ある態様において、血液癌は白血病である。ある態様において、癌は、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(“ＢＡＬＬ”)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(“ＴＡＬＬ”)、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の急性白血病；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病；Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、血漿芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症および骨髄血液細胞の無効な産生(または異形成)によりまとめられる種々の血液学的状態の集まりである“前白血病状態”およびここに記載する腫瘍抗原を発現する非典型的および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されないここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患を含むが、これらに限定されないさらなる血液癌または血液学的状態；およびこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される。他の態様において、ここに記載する腫瘍抗原と関係する疾患は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸部、胃、卵巣、頭部または肺の癌である。
【００５８】
ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸を形質導入した免疫エフェクター細胞の集団を、例えば、ここに記載する方法により拡張させる。ある態様において、細胞を、８日またはそれ未満、例えば、７日、６日、５日、４日または３日拡張させる。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞よりも強力である。ある態様において、対象の体重kgあたり、１０４〜１０６免疫エフェクター細胞を対象に投与する。ある態様において、対象は、免疫エフェクター細胞の集団の最初の投与(例えば、対象の体重kgあたり１０４〜１０６免疫エフェクター細胞、例えば、対象の体重kgあたり１０４〜１０５免疫エフェクター細胞の最初の投与)を受け、その複数がＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸を含み、その後、１以上(例えば、２、３、４または５)の免疫エフェクター細胞の集団(例えば、１以上の対象の体重kgあたり１０４〜１０６免疫エフェクター細胞、例えば、対象の体重kgあたり１０４〜１０５免疫エフェクター細胞のその後の投与)を受け、その複数がＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸を含む。ある態様において、１以上のその後の投与を、先の投与後１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内、例えば、先の投与後４日、３日、２日以内に投与する。ある態様において、対象は、免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも３投与のコースにわたり対象の体重kgあたり計約１０６免疫エフェクター細胞を受け、例えば、対象は、１×１０５免疫エフェクター細胞の最初の用量、３×１０５免疫エフェクター細胞の第二の投与および６×１０５免疫エフェクター細胞の第三の投与を受け、例えば、各投与を先の投与後４日、３日、２日以内に投与する。
【００５９】
ある面において、本発明は、自己免疫エフェクター細胞の集団に関し、その複数は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターで遺伝子導入または形質導入され、ここで、細胞の集団は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。ある態様において、細胞の集団は、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。ある態様において、細胞の集団は、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。
【００６０】
他の面において、本発明は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法に関する。ある態様において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能にする条件下で接触させることを含む。
【００６１】
ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＲＮＡである。他の態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡである。ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動できるプロモーターを含む。
【００６２】
関連する面において、本発明は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法であって、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の集団を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードするＲＮＡを、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能にする条件下で接触させることを含む、方法に関する。
【００６３】
ある態様において、ＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは同じ核酸分子の一部である。ある態様において、ＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは、別々の核酸分子の一部である。
【００６４】
ある態様において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを、実質的に同時に接触させることを含む。ある態様において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを接触させる前に接触させることを含む。ある態様において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを接触させた後に接触させることを含む。
【００６５】
ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡはｍＲＮＡである。ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは、ポリ(Ａ)テイルを含む。ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。
【００６６】
ある態様において、方法は、免疫エフェクター細胞にテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを遺伝子導入することを含む。ある態様において、方法は、免疫エフェクター細胞にテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを形質導入することを含む。ある態様において、方法は、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能にする条件下、免疫エフェクター細胞を、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡで電気穿孔することを含む。
【００６７】
他の面において、本発明は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法であって、ＣＡＲを発現するおよび／またはＣＡＲをコードする核酸を含む免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し；免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を、ｈＴＥＲＴ発現を可能にする条件下で接触させることを含む、方法に関する。
【００６８】
他の面において、本発明は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造法であって、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を発現する免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を、ＣＡＲ発現を可能にする条件下で接触させることを含む、方法に関する。
【００６９】
ある面において、本発明は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸；および外来テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を含む、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供する。ある態様において、外来テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである。
【００７０】
ある面において、本発明は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ；および外来テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴを含む免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供する。ある態様において、細胞は、外来テロメラーゼサブユニットをコードするＤＮＡ、例えば、外来ＤＮＡ、例えば、ベクターを含まない。例えば、細胞を、外来テロメラーゼサブユニットをコードするｍＲＮＡと接触させ得る。
【００７１】
ここに記載するものに類するまたは匹敵する方法および材料を、本発明の実施または試験に際して使用できるが、適当な方法および材料を下に記載する。ここに記載する全ての刊行物、特許出願、特許および他の引用(例えば、配列データベース参照番号)は、その全体を引用により本明細書に包含させる。例えば、ここに、例えば、ここでのいずれかの表に記載する全てのＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉｇｅｎｅおよびＥｎｔｒｅｚ配列を、引用により本明細書に包含させる。特に断らない限り、ここでのいずれかの表を含む、ここに特定する配列アクセッション番号は、２０１４年１２月２９日現在のデータベースエントリーを参照する。１遺伝子またはタンパク質が、複数の配列アクセッション番号を引用しているとき、全ての配列バリアントが包含される。
【００７２】
さらに、材料、方法および例は単なる説明であり、限定を意図しない。表題、副題または番号または文字を付された要素、例えば、(ａ)、(ｂ)、(ｉ)などは、単に読みやすさのために提供する。本明細書における表題または番号または文字を付された要素の使用は、工程または要素を、アルファベット順に行うことを必須とするものではなくまたは工程または要素が必ずしも互いに区別できることを必要としない。本発明の他の特性、目的および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ−１Ｈ】ＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積に対するγｃサイトカインおよびＩＬ−１８の差次的効果を示す。図１Ａは、Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲベクターの模式図である。図１Ｂは、レンチウイルス形質導入４８時間後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現の２つの代表的ＦＡＣＳヒストグラムプロットである。図１Ｃは、種々のサイトカイン曝露に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の全体的蓄積を示すグラフである。Ｔ細胞を形質導入し、翌日(０日目)から最終濃度１０ng／mLで種々の外来サイトカインに曝した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の数を、Ｔ細胞数およびＣＡＲ発現パーセンテージに基づき計算した。曲線は、６ドナーの代表例である。＊Ｐ＜０.０５、＊＊＊Ｐ＜０.００１。ＮＣ、サイトカイン無し。図１Ｄは、レンチウイルス形質導入１５日後のＴ細胞によるＣＡＲ発現を示すグラフである。棒グラフは、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＣＡＲ発現レベル(±ＳＥＭ、ｎ＝６)を示し、ＮＣ群におけるＣＡＲ発現を１として正規化した。＊Ｐ＜０.０５対ＩＬ−２群；Ｎ.Ｓ.、統計的差異無し。図１Ｅは、種々のサイトカインに対する応答におけるＴ細胞の増殖を示すヒストグラムである。レンチウイルス形質導入後７日目、ＮＣ群のＴ細胞をＣＦＳＥ(２.５μＭ)で標識し、種々のサイトカインに曝した。７日後、Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ希釈について分析した。図１Ｆは、レンチウイルス形質導入１５日後のＴ細胞の生存能を示すグラフである。種々のサイトカイン群からのＴ細胞をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖおよび７−ＡＡＤで染色し、生存可能細胞の比を分析する(Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖおよび７−ＡＡＤ両者に陰性)。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１対ＩＬ−２群(ｎ＝６)。図１Ｇおよび１Ｈは、ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＢｃｌ−ｘＬ発現を示す。レンチウイルス形質導入後１５日目、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによりＢｃｌ−２タンパク質の発現について評価する。図１Ｇは、種々のサイトカイン群におけるＢｃｌ−ｘＬ発現の代表的ＦＡＣＳヒストグラムプロットである。図１Ｈは、６ドナーのＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＢｃｌ−ｘＬ発現(±ＳＥＭ)を記載するグラフである。＊Ｐ＜０.０１対ＩＬ−２群。
【００７４】
【図２Ａ−２Ｉ】ＣＡＲ−Ｔ細胞の記憶Ｔ細胞サブセットを示す。図２Ａは、Ｔ細胞サブセット分析のゲーティング戦略を示す代表的ＦＡＣＳプロットである。Ｔ細胞をＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき４サブセットに分け、次いでＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＤ９５の発現を全サブセットでさらに評価する。ＣＤ９５発現は、レンチウイルス形質導入により顕著に上方制御される。図２Ｂは、形質導入前のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ｓｕｂＴ細胞の集団および形質導入１５日後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＤ９５発現を示す。図２Ｃおよび２Ｄは、レンチウイルス形質導入後のＣＤ４＋(図２Ｃ)およびＣＤ８＋Ｔ細胞(図２Ｄ)における記憶幹Ｔ細胞(Ｔｓｃｍ)比率増加を示すグラフである。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞サブセットとして定義する。図２Ｅは、Ｔ細胞形質導入前のナイーブＴ(Ｔｎ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−集団として定義)の量と形質導入後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍの比率の相関を示すグラフである(ｎ＝６)。左棒は、形質導入前のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴｎのパーセンテージを表し、右棒は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍのパーセンテージを表す。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１。図２Ｆ、２Ｇおよび２Ｈは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のサブセットの分布を示すグラフである。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴサブセットは、ＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき規定する。Ｔｓｃｍの割合は種々のサイトカイン群、＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１、対ＩＬ−２群(ｎ＝６)で同等である。(Ｆ)ＣＡＲ−Ｔ細胞の種々のサブセットの自己複製および分化。ＦＡＣＳソートＣＡＲ＋Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ細胞を、３日ＩＬ−２(１０ng／mL)に曝して培養し、次いでＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき表現型を分析する(ｎ＝３)。図２Ｉは、ＩＬ−２に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の種々のサブセットの増殖を示すヒストグラムプロットである。ＦＡＣＳソートＣＡＲ＋Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ細胞をＣＦＳＥ(２.５μＭ)出標識し、次いで３日ＩＬ−２(１０ng／mL)に曝して培養した。３日後、Ｔ細胞をＣＦＳＥ希釈について分析した。
【００７５】
【図３Ａ−３Ｂ】ＣＤ４５  ＲＡ発現およびＣＦＳＥ強度間の相関性を示す。図３Ａは、ＣＤ４５ＲＡ発現がＣＦＳＥ強度と逆相関することを示す。図３Ｂは、全サイトカイン群(ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１)に関して、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ  ｄｉｍおよび陰性Ｔ細胞より遙かに低いＣＦＳＥレベルを示し、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞より強い増殖活性を有したことを示す。
【００７６】
【図４Ａ−４Ｂ】種々のサイトカインへの曝露により得られたＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型を示す。図４Ａは、レンチウイルス形質導入後１４日ＩＬ−２に曝したＣＡＲ−およびＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８の発現を示す代表的ＦＡＣＳドットプロットである。図４Ｂは、記載したサイトカイン群におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の表面のＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＩＬ−７Ｒα発現の定量化を示す一連のグラフである。ヒストグラムは、６独立ドナーからの発現レベルの平均値±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１対ＩＬ−２群。
【００７７】
【図５Ａ−５Ｉ】種々のサイトカインに曝したＣＡＲ−Ｔ細胞の機能的分析を示す。図５Ａは、ＣＡＲ−Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の染色を示す代表的ＦＡＣＳプロットである。図５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、ＩＦＮ−γ(図５Ｂ)、ＴＮＦ−α(図５Ｃ)およびＩＬ−２(図５Ｄ)の産生に関する、種々のサイトカイン群(ｎ＝６)におけるサイトカイン産生ＣＡＲ−Ｔ細胞のパーセンテージを示す定量的プロットである。レンチウイルス形質導入Ｔ細胞を、記載するサイトカインに１４日曝し、次いでＳＫＯＶ３細胞と５時間共培養して、フローサイトメトリー分析のために回収する。図５Ｅは、ＳＫＯＶ３刺激後の種々の数のサイトカイン(ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２)を産生する細胞の比率を描く一連の円グラフである。＊Ｐ＜０.０５。図５Ｆは、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムＢ(ＧｒａｎｚＢ)の発現を示す代表的ＦＡＣＳプロットである。図５Ｇおよび５Ｈは、種々のサイトカイン群(ｎ＝６)のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるパーフォリン(図５Ｇ)およびグランザイムＢ発現(図５Ｈ)のパーセンテージを示す定量的プロットである。レンチウイルス形質導入Ｔ細胞を、記載するサイトカインに１４日曝し、次いでＳＫＯＶ３細胞と５時間共培養して、フローサイトメトリー分析のために回収する。図５Ｉは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原特異的細胞毒性活性を示すグラフである。記載したサイトカイン曝露１４日後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、記載するＥ／Ｔ比でＳＫＯＶ３と１８時間共培養後、ルシフェラーゼベースのアッセイの使用により細胞溶解能を評価した。非形質導入Ｔ細胞(ＵＮＴ)は、負のエフェクター対照として役立った。示すデータは６独立細胞溶解アッセイの平均値±ＳＥＭである。
【００７８】
【図６Ａ−６Ｃ】図５Ａ−５Ｉに上記するＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型および機能を示す。図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ６２Ｌ−ＣＡＲ−Ｔ細胞(ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ)と比較したとき、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＡＲ−Ｔ細胞(ＴｓｃｍおよびＴｃｍ)は、低いサイトカイン産生活性(図６Ａおよび６Ｂ)および弱い細胞溶解能(図６Ｃ)を示した。
【００７９】
【図７Ａ−７Ｅ】抗原負荷に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞の発現および表現型を示す。図７Ａは、抗原および記載するサイトカインへの曝露におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の全体的蓄積および生存能を示す２グラフである。ＩＬ−２に曝したＴ細胞を１５日目に回収し、次いでＳＫＯＶ３と５：１のＥ／Ｔ比で、かつ記載するサイトカイン(１０ng／mL)と７日共培養し、ＳＫＯＶ３細胞を１日目および１４日目に補充する(図７Ｃ、７Ｄおよび７Ｅと同じプロトコール)。発現倍率は平均値±ＳＥＭである。Ｔ細胞をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖおよび７−ＡＡＤで染色し、次いで同日に生存可能細胞の比率について分析する。＊Ｐ＜０.０５対ＩＬ−２群。図７Ｂは、抗原負荷により予め記載するサイトカインに曝したＣＡＲ−Ｔの全体的蓄積および生存能を示す２グラフを示す。記載するサイトカインに曝したＴ細胞を１５日目に回収し、次いでＳＫＯＶ３と５：１のＥ／Ｔ比で共培養する。ＣＡＲ−Ｔ細胞の発現を計算し、Ｔ細胞の生存能を７日目に評価する。図７Ｃは、ＳＫＯＶ３および記載するサイトカインと７日共培養後のＴ細胞によるＣＡＲ発現を示すグラフである。＊Ｐ＜０.０５対ＩＬ−２。図７Ｄは、ＳＫＯＶ３および記載するサイトカインと７日共培養後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＤ２７およびＣＤ２８発現の定量化を示す２グラフである。＊Ｐ＜０.０５対ＩＬ−２。図７Ｅは、種々のサイトカイン群におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の記憶Ｔサブセットの分布を示す２グラフである。Ｎ.Ｓ.、統計的差異無し。
【００８０】
【図８Ａ−８Ｇ】先にサイトカイン曝露した種々のＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。図８Ａは、インビボ実験スキームである。図８Ｂ：種々のサイトカイン曝露Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗ＣＤ１９−２７ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍成長曲線。データを平均値±ＳＥＭで示す。矢印は、Ｔ細胞注入の時点を示す。図８Ｃは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の最初の静脈内注射直前(３８日目)、２週間後(５３日目)および５週間後(７４日目)のＮＳＧマウスにおけるｆＬｕｃ＋ＳＫＯＶ３腫瘍を示すバイオルミネセンス画像である。図８Ｄは、ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の最初の投与の１５日後のマウス末梢血における循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数の定量化を示すグラフである。図８Ｅは、マウス血中の循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現の定量化を示すグラフである。図８Ｆは、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ染色に基づくマウス血液における循環ヒトＴ細胞のＴ細胞サブセットの分布を示すグラフである。図８Ｇは、マウス血液における循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２７およびＣＤ２８発現の定量化を示すグラフである。
【００８１】
【図９Ａ−９Ｂ】ＦＡＣプロットを示す。図９Ａは、ＣＬＬ患者のアフェレーシスからの細胞におけるＣＤ４５、ＣＤ３およびＣＤ２５発現の分布を示す一連のＦＡＣｓプロットである。図９Ｂは、ＣＤ３およびＣＤ１９集団を示す一連のＦＡＣＳプロット(上部)およびアフェレーシスからの細胞、抗ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて選択した細胞、ＣＤ２５枯渇細胞およびＣＤ２５富化細胞のＣＤ１４発現を示すヒストグラム(下部)である。
【００８２】
【図１０】ＣＤ３／ＣＤ２８選択またはＣＤ２５枯渇後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布を比較する２ＦＡＣｓプロットである。
【００８３】
【図１１Ａ−１１Ｃ】ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞とＣＤ２５枯渇細胞間の増殖能の比較を示す。図１１Ａは、記載した培養日の総細胞数を示すグラフである。図１１Ｂは、示す各培養日の定量化集団倍加を示すグラフである。図１１Ｃは、記載した培養日の生存可能細胞のパーセンテージを示す。
【００８４】
【図１２Ａ−１２Ｂ】ＣＡＲ１９のレンチウイルス形質導入に対するＣＤ２５枯渇の効果を示す。図１２Ａは、ＣＤ２５枯渇の効率を示す一連のＦＡＣＳプロットである。図１２Ｂは、非形質導入細胞、ＣＤ３選択細胞およびＣＤ２５枯渇細胞のＣＡＲ１９発現を示す一連のＦＡＣＳプロットである。
【００８５】
【図１３】ＣＤ２５枯渇またはサイトカイン補充した培養前の患者からのＰＢＭＣからの細胞におけるＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ２５発現の分布を示す一連のＦＡＣＳプロットである。
【００８６】
【図１４】記載するサイトカイン補充、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−７およびＩＬ−１５と共に培養後の未操作ＰＢＭＣおよびＣＤ２５枯渇ＰＢＭＣにおけるＣＤ３およびＣＤ１９の分布を示す一連のＦＡＣｓプロットである。
【００８７】
【図１５】記載するサイトカイン補充した１０日培養後の細胞総数を示すグラフである。
【００８８】
【図１６】細胞をアフェレーシスにより得た日(０日目)および１日後(１日目)の、２日遺伝子導入した日(０＋１日目)の；ドナー細胞を、アフェレーシスにより細胞を得た日に１回遺伝子導入した日(０日目)の；ドナー細胞を、細胞をアフェレーシスにより得た翌日に１回遺伝子導入した日(１日目)の；ドナー細胞を、細胞をアフェレーシスにより得た２日後に１回遺伝子導入した日(２日目)の；そしてドナー細胞を、細胞をアフェレーシスにより得た翌日に１回遺伝子導入した日(３日目)のドナー細胞のレンチウイルス遺伝子導入レベルの指標としての緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)シグナル伝達のパーセンテージを示すグラフである。
【００８９】
【図１７】抗ＣＤ３およびＣＤ２８ビーズで刺激し、未操作のままにするか(ＵＴＤ)またはＣＤ１９  ＣＡＲ(ＣＤ１９.ＢＢｚ)で形質導入することにより刺激しており、脱ビーズ化し、次いで５日目および９日目に回収した、ＰＢＭＣの集団倍加(図１７Ａ)および平均サイズ(ｆＬ)(図１７Ｂ)における拡張プロファイルを示すグラフを含む。
【００９０】
【図１８】抗ＣＤ３およびＣＤ２８ビーズで刺激し、未操作のままにするか(ＵＴＤ)またはＣＤ１９  ＣＡＲ(ＣＤ１９.ＢＢｚ)で形質導入することにより刺激しており、脱ビーズ化し、次いで５日目および９日目に回収した、ＰＭＢＣで処理したＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞の溶解パーセントとしての細胞毒性を示すグラフを含む。
【００９１】
【図１９】抗ＣＤ３およびＣＤ２８ビーズ(３ｘ２８ビーズ)、野生型Ｋ５６２細胞、ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞、ＡＬＬ細胞(Ｎａｌｍ６)またはＣＬＬ細胞(ＰＩ１４)で刺激したＰＢＭＣの増殖を示すグラフを含む。ＰＢＭＣは、未操作のままにするか(ＵＴＤ)またはＣＤ１９  ＣＡＲ(ＣＤ１９.ＢＢｚ)で形質導入することにより刺激しており、脱ビーズ化し、次いで５日目および９日目に回収した。
【００９２】
【図２０】例示的操作スキームの模式図である。
【００９３】
【図２１】例示的操作スキームの模式図である。
【００９４】
【図２２】０〜９日にわたり拡張させたＣＴＬ０１９  ＣＡＲを遺伝子導入したドナー細胞の二つの異なる操作バッチ、患者１５(左パネル)および患者２１(右パネル)、の細胞増殖レベルを示すグラフを含む。
【００９５】
【図２３】ＣＴＬ０１９  ＣＡＲ、すなわち患者１５細胞またはｓｓ１−ｍｅｓｏＣＡＲ、すなわち患者２１細胞のいずれかで遺伝子導入し、アフェレーシス後０〜９日にわたり拡張させたドナー細胞の二つの異なる製造バッチの炎症誘発性サイトカイン、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−４の産生を示すグラフを含む。
【００９６】
【図２４】抗ＣＡＲ１９−イディオタイプ抗体ビーズまたは対照ビーズで刺激し、ＣＴＬ０１９  ＣＡＲを遺伝子導入し、５〜９日拡張させたドナー細胞におけるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４産生レベルを示すグラフを含む。無サイトカインまたは低サイトカインレベル(＜２００pg／ml)を対照ビーズで検出した。
【００９７】
【図２５】未操作のままにするか(ＵＴＤ)またはＣＤ１９  ＣＡＲ(ＣＡＲＴ１９)を形質導入し、脱ビーズ化し、次いで５日目および９日目に回収したＰＢＭＣのＮａｌｍ６(ＡＬＬ)細胞のルシフェラーゼアッセイを使用する総ライセートに基づく細胞死滅を示すグラフを含む。ＰＭＢＣ対Ｎａｌｍ６細胞(エフェクター(Ｅ)：標的(Ｔ))を種々の比で培養した。示されるように、５日目に回収したＣＡＲＴ１９細胞は、良好な死滅能を有する。
【００９８】
【図２６】未操作のままにするか(ＵＴＤ)またはＣＤ１９  ＣＡＲ(ＣＡＲＴ１９)を形質導入し、脱ビーズ化し、次いで５日目および９日目に回収したＰＢＭＣの長期インビボ死滅能を示すグラフである。ＰＢＭＣを、Ｎａｌｍ６細胞を接種した非肥満糖尿病性／重症複合型免疫不全マウスに導入した。
【００９９】
【図２７Ａ−２７Ｄ】早い時点でのビーズ除去は、細胞喪失を誘導しないことを示す。図２７Ａは、３日目に磁石によりαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズを除去する前後の平均Ｔ細胞容積および濃度を示すコールター分析である。細胞を、次いで、ビーズ除去後凍結させた。図２７Ｂは、細胞数を磁気ビーズ除去前後で評価した。濃度は類似した。図２７Ｃは、融解前後の同一細胞の平均細胞容積を示す重層である。細胞は、凍結融解工程中その容積を保持する。結果は、少なくとも１５の異なる実験の代表である。図２７Ｄは、αＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズ除去前後のＴ細胞産物の代表的コールター分析を示し、工程の効率を示す。
【０１００】
【図２８Ａ−２８Ｂ】活性化され、ＣＤ１９特定のＣＡＲ担持ＢＢｚシグナル伝達を形質導入され、活性化から３日目という早期にＴ細胞培養から回収されたＴ細胞が、インビトロで強力な、抗原特異的細胞毒性活性を有することを示す。図２８Ａ、上部パネル、Ｋ５６２−ＷＴ細胞を使用する４時間死滅アッセイ。図２８Ｂ、下部パネル、Ｋ５６２−１９細胞を使用する４時間死滅アッセイ。図２８Ｂ、上部パネル、ＩＬ−７／ＩＬ−１５(左)またはＩＬ−２(右)を使用する形質導入効率。図２８Ｂ、中央パネル、ＩＬ−２と比較したＩＬ−７／ＩＬ−１５を使用する集団倍加。図２８Ｂ、下部パネル、ＩＬ−２と比較したＩＬ−７／ＩＬ−１５を使用する容積。
【０１０１】
【図２９Ａ−２９Ｃ】３日目および９日目４−１ＢＢζ  ＣＡＲＴ細胞は、Ｋ５６２−ＣＤ１９に応答してサイトカインの類似パターンを産生することを示す。ＩＬ−２またはＩＬ−７／１５含有培地で予め培養された、３日目および９日目ＣＡＲＴ  １９細胞を、Ｋ５６２−ＣＤ１９(図２９Ａおよび２９Ｂ)、培地単独(図２９Ｃ)と２４時間インキュベートした。図２９Ａおよび図２９Ｂにおける“無抗原”は、細胞がＣＤ１９不在野生型Ｋ５６２細胞で刺激されたことを示す。サイトカインを、培養上清においてサイトカインビーズアレイ(Luminex)により測定した。図２９Ｃは、融解２４時間後のＣＡＲＴ  １９  Ｔ細胞における代表的サイトカイン産生を示す。サイトカインレベルは最少である。
【０１０２】
【図３０Ａ−３０Ｂ】漸進的移行が、ＴｅｍおよびＴｃｍ細胞の比率の増加を伴いながら、より分化型の表現型に向かうことを示す。
【０１０３】
【図３１Ａ−３１Ｄ】図３１Ａは、種々の条件下で産生したＣＡＲＴ細胞の効力を試験するための実験構成を示す。図３１Ｂは、マウスのＮａｌｍ６腫瘍成長減速におけるＩＬ−２処理ＣＡＲＴ細胞の効力を示す。Ｄ３、Ｄ５およびＤ９は、３日目、５日目または９日目に回収されたＣＡＲＴ細胞を示す。３ｅ６および０.５ｅ６は、投与したＣＡＲ＋細胞数を示す。ＣＡＲ＋細胞の割合は図３１Ｃに示す。図３１Ｄは、マウスのＮａｌｍ６腫瘍成長減速におけるＩＬ−２処理およびＩＬ−７／ＩＬ−１５処理ＣＡＲＴ細胞の効力を比較する。
【０１０４】
【図３２】抗原刺激後、ＩＬ−２およびＩＬ−７／１５含有培地でのＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビトロ拡張。左パネル、健常ヒトドナーからのＰＢＭＣをαＣＤ３／αＣＤ２８被覆Dynalビーズで０日目に刺激し、１日目に１９−ＢＢζをレンチウイルスで形質導入した。これらの細胞を、ＩＬ−２またはＩＬ−７／１５添加培地で９日拡張させた。Ｔ細胞を、隔日で、ビーズベース計数を使用してフローサイトメトリーにより計数した。右パネル、拡張の間の平均Ｔ細胞容積(ｆｌ)をモニターした。データは、少なくとも６独立ドナーの代表である。
【０１０５】
【図３３】ＩＬ−２またはＩＬ−７／１５含有培地で培養した３日目および９日目ＣＡＲＴ１９細胞はＫ５６２−ＣＤ１９に応答して増殖し、Ｋ５６２−ＷＴまたは培地単独ではしない。Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、Ｋ５６２−ＣＤ１９、野生型Ｋ５６２または陰性対照としての培地単独で１２０時間共培養した。増殖Ｔ細胞数は、野生型Ｋ５６２または培地単独と比較してＫ５６２−ＣＤ１９に応答して有意に高く、ＩＬ−７／１５およびＩＬ−２群で同等であった。結果は、２の異なるドナーの代表である。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
詳細な記載
定義
他に定義しない限り、ここに使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術の当業者により共通して理解されているのと同じ意味を有する。
【０１０７】
単数表現は、対象とする物品が１または１を超える(すなわち、少なくとも１)ことを意味する。例として、“成分”は、１成分または１を超える成分を意味する。
【０１０８】
用語“約”は、量、時間的持続などのような測定可能値をいうとき、そのような変動が開示された方法の実施に適する限り、特定された値からの±２０％またはある例において±１０％またはある例において±５％またはある例において±１％またはある例において±０.１％の変動を包含することを意味する。
【０１０９】
用語“キメラ抗原受容体”または代替的に“ＣＡＲ”は、免疫エフェクター細胞において、細胞に標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および細胞内シグナル形成をもたらす、一般的に最も単純な態様において、２個のポリペプチドのセットをいう。ある態様において、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび下に定義する刺激性分子および／または共刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”と称する)を含む。ある態様において、ポリペプチドのセットは、同じポリペプチド鎖にある(例えば、キメラ融合タンパク質を含む)。ある態様において、ポリペプチドのセットは互いに隣接していない、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。ある態様において、ポリペプチドのセットは、二量体化分子存在下、一方のポリペプチドを他方と連結できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインと連結できる、二量体化スイッチを含む。ある態様において、ＣＡＲの刺激性分子は、Ｔ細胞受容体複合体と結合するゼータ鎖である。ある面において、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、下に定義する少なくとも１共刺激性分子の１以上の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、共刺激性分子は、ここに記載する共刺激性分子、例えば、４−１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよび／またはＣＤ２８である。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激性分子の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質である。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激性分子の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激性分子の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび１以上の共刺激性分子の２機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激性分子の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび１以上の共刺激性分子の少なくとも２機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激性分子の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ末端)に任意のリーダー配列を含む。ある態様において、ＣＡＲはさらに細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は、所望により細胞プロセスおよびＣＡＲの細胞膜への局在化中に抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)から開裂される。
【０１１０】
ここに記載するもののような特異的腫瘍抗原Ｘを標的とする抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖまたはＴＣＲ)を含むＣＡＲはＸＣＡＲとも称する。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲはＣＤ１９ＣＡＲと称する。
【０１１１】
用語“シグナル伝達ドメイン”は、第二メッセンジャーの産生によりまたはこのようなメッセンジャーに応答するエフェクターとして機能することにより、規定されたシグナル伝達経路を経て細胞活性を制御するために細胞内で情報を伝達することにより作用するタンパク質の機能的部分をいう。
【０１１２】
ここで使用する用語“抗体”は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列をいう。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでも、多鎖でも単鎖でもまたはインタクト免疫グロブリンでもよく、天然源に由来しても組み換え源に由来してもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
【０１１３】
用語“抗体フラグメント”は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する(例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間的分布による)能力を保持する、抗体の少なくとも一部分をいう。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド架橋Ｆｖｓ(ｓｄＦｖ)、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、直線状抗体、ｓｄＡｂのような単一ドメイン抗体(ＶＬまたはＶＨいずれか)、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成される多特異的抗体および単離ＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに取り込まれてもよい(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗原結合フラグメントを、フィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づくスキャフォールドに移植もできる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許６,７０３,１９９号参照)。
【０１１４】
用語“ｓｃＦｖ”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントを含む融合タンパク質をいい、ここで、軽鎖および重鎖可変領域は、合成リンカー、例えば、短可動性ポリペプチドリンカーを経て連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現されることができ、ここで、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクト抗体の特異性を保持する。特記しない限り、ここで使用するｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、ＶＬおよびＶＨ可変領域をいずれかの順序で含んでよく、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでも、ＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。
【０１１５】
抗体またはその抗体フラグメントを含むＣＡＲの部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)およびヒト化抗体を含む、抗原結合ドメインが連続的ポリペプチド鎖の一部として発現される多様な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【０１１６】
ここで使用する用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、少なくとも１免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントをいう。用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある態様において、抗体分子は多特異的抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、該複数の中の第一免疫グロブリン可変ドメイン配列は第一エピトープに結合特異性を有し、該複数の中の第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は第二エピトープに結合特異性を有する。ある態様において、多特異的抗体分子は二特異的抗体分子である。二特異的抗体は、２を超えない抗原に特異性を有する。二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
【０１１７】
本発明のＣＡＲの抗体またはその抗体フラグメントを含む部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、ヒト化抗体または二特異的抗体を含む、抗原結合ドメインが連続的ポリペプチド鎖の一部として発現される多様な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは抗体フラグメントを含む。さらなる面において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【０１１８】
用語“抗体重鎖”は、天然に存在する構造において抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の大きい方をいい、通常抗体が属するクラスを決定する。
【０１１９】
用語“抗体軽鎖”は、天然に存在する構造において抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の小さい方をいう。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
【０１２０】
ここで使用する用語“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”は、抗原特異性および結合親和性を与える、抗体可変領域内のアミノ酸の配列をいう。例えば、一般に、各重鎖可変領域に３ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３)および各軽鎖可変領域に３ＣＤＲ(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３)がある。あるＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat”ナンバリングスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (“Chothia”ナンバリングスキーム)に記載のものまたはこれらの組み合わせを含む、多数の周知スキームのいずれかを使用して決定できる。Kabatナンバリングスキーム下、ある態様において、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)におけるＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号づけられ、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)におけるＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)と番号づけられる。Chothiaナンバリングスキーム下、ある態様において、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸は２６〜３２(ＨＣＤＲ１)、５２〜５６(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号づけられ、ＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基は２６〜３２(ＬＣＤＲ１)、５０〜５２(ＬＣＤＲ２)および９１〜９６(ＬＣＤＲ３)と番号づけられる。KabatおよびChothiaナンバリングスキームの組み合わせにおいて、ある態様において、ＣＤＲは、Kabat  ＣＤＲ、Chothia  ＣＤＲまたは両者の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えば、ある態様において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば、哺乳動物ＶＨ、例えば、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基２６〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)；およびＶＬ、例えば、哺乳動物ＶＬ、例えば、ヒトＶＬにおけるアミノ酸残基２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)に対応する。
【０１２１】
用語“組み換え抗体”は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系により発現された抗体のような、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生される抗体をいう。本用語はまた抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により産生され、該ＤＮＡ分子が抗体タンパク質または抗体を特定化するアミノ酸配列を発現する抗体を意味するとも解釈されるべきであり、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当分野で利用可能であり、周知である組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列テクノロジーを使用して得られている。
【０１２２】
用語“抗原”または“Ａｇ”は、免疫応答を引き起こす分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特異的免疫適格細胞活性化または両者を含み得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含むあらゆる巨大分子が、抗原として働き得ることを理解する。さらに、抗原は組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を引き起こすタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、それゆえに、本明細書で使用される用語としての“抗原”をコードすると理解する。さらに、当業者は、抗原が必ずしも遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解する。本発明は、１を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を引き起こすポリペプチドをコードするための種々の組み合わせで配置されることを含むが、これらに限定されないことは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が全く“遺伝子”によりコードされる必要がないことを理解する。抗原は合成により産生できまたは生物学的サンプルから由来できまたはポリペプチド以外の巨大分子であり得る。このような生物学的サンプルは、他の生物学的成分を伴う組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または流体を含み得るが、これらに限定されない。
【０１２３】
用語“自己”は、後に再導入される個体と同じ個体由来のあらゆる物質をいう。
【０１２４】
用語“同種異系”は、後に物質が導入される個体と同じ種の異なる動物由来のあらゆる物質をいう。２以上の個体は、１以上の座位の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系といえる。ある面において、同じ種の個体からの同種異系物質は、抗原性に相互作用するために遺伝的に十分類似していない可能性がある。
【０１２５】
用語“異種”は、異なる種の動物由来のあらゆる物質をいう。
【０１２６】
用語“癌”は、異常細胞の未制御の成長により特徴付けられる疾患をいう。癌細胞は、局所性にまたは血流およびリンパ系を通って体の他の部分に拡散できる。種々の癌の例をここに記載し、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。用語“腫瘍”および“癌”はここでは相互交換可能に使用し、例えば、両用語は、固形および液性、例えば、汎発性または循環性、腫瘍を含む。ここで使用する用語“癌”または“腫瘍”は、前悪性ならびに悪性癌および腫瘍を含む。
【０１２７】
ここで使用される用語“由来する”は、第一および第二分子の関係を示す。一般に第一分子と第二分子の構造的類似性をいい、第二分子に由来する第一分子に対する処理または源の制限を暗示も含意もしない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを産生する能力を有するように、十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。細胞内シグナル伝達ドメインを製造する特定の方法に対する制限を暗示または包含せず、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から出発し、望まない配列を除去するか変異を付して、該細胞内シグナル伝達ドメインに到達しなければならないことは意味しない。
【０１２８】
用語“ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患”は、例えば、癌または悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患；またはここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含む、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患またはここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞と関係する状態を含むが、これらに限定されない。ある態様において、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する癌は血液癌である。ある態様において、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する癌は固形癌である。さらにここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患は、例えば、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する非典型的および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患、(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するかまたはいずれかの時点で発現していた。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは減少したレベルで発現され得る。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で検出可能レベルの腫瘍抗原タンパク質を発現し、その後実質的に検出可能腫瘍抗原タンパク質を産生しない。
【０１２９】
用語“ＣＤ１９の発現と関係する疾患”は、例えば、癌または悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患；またはＣＤ１９を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含む、ＣＤ１９の発現と関係する疾患またはＣＤ１９を発現する細胞と関係する状態を含むが、これらに限定されない。ある面において、ＣＤ１９の発現と関係する癌は血液癌である。ある面において、血液癌は白血病またはリンパ腫である。ある面において、ＣＤ１９の発現と関係する癌は、例えば、急性骨髄白血病(ＡＭＬ)、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(ＢＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(ＴＡＬＬ)、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない、例えば、１以上の急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病を含むが、これらに限定されない、癌および悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。ＣＤ１９の発現と関係するさらなる癌または血液学的状態は、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、血漿芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄増殖性新生物；組織球性障害(例えば、肥満細胞障害または芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物)；肥満細胞障害、例えば、全身性肥満細胞症または肥満細胞白血病；Ｂ細胞前リンパ球性白血病、形質細胞骨髄腫および骨髄血液細胞の無効な産生(または異形成)によりまとめられる種々の血液学的状態の集まりである“前白血病状態”などを含むが、これらに限定されない。さらにＣＤ１９の発現と関係する疾患は、例えば、非典型的および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性ＣＤ１９の発現と関係する疾患を含むが、これらに限定されない。ＣＤ１９の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患、(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞ｅｘｐｒｅｓｓまたはいずれかの時点で発現していた、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡ。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは減少したレベルで存在し得る。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、検出可能レベルの腫瘍抗原タンパク質をある時点で産生し、その後実質的に検出可能腫瘍抗原タンパク質を産生しない。他の態様において、疾患は、ＣＤ１９陰性癌、例えば、ＣＤ１９陰性再発癌である。ある態様において、腫瘍抗原(例えば、ＣＤ１９)発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するまたはいずれかの時点で発現していた。ある態様において、腫瘍抗原(例えば、ＣＤ１９)発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは減少したレベルで存在し得る。ある態様において、腫瘍抗原(例えば、ＣＤ１９)発現細胞は、検出可能レベルの腫瘍抗原タンパク質をある時点で産生し、その後実質的に検出可能腫瘍抗原タンパク質を産生しない。
【０１３０】
用語“Ｂ細胞抗原の発現と関係する疾患”は、例えば、癌または悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患；またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含む、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上の発現と関係する疾患またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上を発現するまたはいずれかの時点で発現していた細胞と関係する状態を含むがこれらに限定されない。誤解がないように付言すれば、Ｂ細胞抗原の発現と関係する疾患は、例えば、抗原発現が、例えば、Ｂ細胞抗原を標的とする分子、例えば、Ｂ細胞標的化ＣＡＲで処置されているために、下方制御されており、現時点ではＢ細胞抗原を発現しない細胞と関係する状態を含む。用語“Ｂ細胞抗原の発現と関係する疾患”は、ここに記載するＣＤ１９の発現と関係する疾患を含む。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、Ｂ細胞抗原と関係する疾患の処置に使用される。ある態様において、ここでの方法により産生されたＣＡＲは、Ｂ細胞抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
【０１３１】
ここで使用する用語“再発”は、最初の応答性の期間後、例えば、治療剤、例えば、癌治療剤での最初の処置(例えば、完全応答または部分的応答)後の疾患(例えば、癌)の再出現をいう。最初の応答性の期間は、ある閾値、例えば、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満への癌細胞レベルの低下を含み得る。再出現は、ある閾値、例えば、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％を超える、癌細胞レベルの増加を含み得る。例えば、Ｂ−ＡＬＬの状況において、例えば、再出現は、例えば、完全応答後の、血液、骨髄(＞５％)またはいずれかの髄外部位における芽細胞の再出現を含み得る。この状況において、完全応答は、＜５％ＢＭ芽細胞を含み得る。より一般に、ある態様において、応答(例えば、完全応答または部分的応答)は、検出可能ＭＲＤ(最小残存疾患)の不在を含み得る。ある態様において、最初の応答性の期間は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日または６日；少なくとも１週、２週、３週または４週；少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１０ヶ月または１２ヶ月；または少なくとも１年、２年、３年、４年または５年続く。
【０１３２】
ここで使用する“難治性”は、処置に応答しない疾患、例えば、癌をいう。ある態様において、難治性癌は、処置開始前または処置開示時に処置に抵抗性であり得る。他の態様において、難治性癌は処置中に抵抗性となり得る。難治性癌は抵抗性癌とも呼ばれる。
【０１３３】
用語“保存的配列修飾”は、アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特徴に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準法により、本発明の抗体または抗体フラグメントに導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それゆえに、ここに記載するＣＡＲ内の１以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えてよく、改変されたＣＡＲを、ここに記載する機能的アッセイを使用して試験できる。
【０１３４】
用語“刺激”は、刺激性分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ)とその同族リガンド(またはＣＡＲの場合腫瘍抗原)の結合により誘発され、それにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を経るシグナル伝達または適切なＮＫ受容体またはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを経るシグナル伝達を含むが、これらに限定されないシグナル伝達事象に介在する、一次応答をいう。刺激は、ある分子の発現を変え得る。
【０１３５】
用語“刺激性分子”は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともある面について、刺激性の方法で免疫細胞の活性化を制御する、細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞)により発現される分子をいう。ある面において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを搭載しているＭＨＣ分子の結合により開始され、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の介在に至る、一次シグナルである。刺激性の方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも称する)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明で特に有用であるＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２に由来するものを含むが、これらに限定されない。本発明の特定のＣＡＲにおいて、本発明の任意の１以上のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号９として提供される配列(変異体ＣＤ３ゼータ)または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１０において提供される配列(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。
【０１３６】
用語“抗原提示細胞”または“ＡＰＣ”は、表面に主要組織適合複合体(ＭＨＣ)と複合体化した外来抗原を示す、アクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、これらの複合体を、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用して認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それをＴ細胞に提示させる。
【０１３７】
ここで使用する用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを産生できる。例えば、ＣＡＲＴ細胞における、免疫エフェクター機能の例は、サイトカイン分泌を含む、細胞溶解活性およびヘルパー活性を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化機能の実施を指示するタンパク質の部分である。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合全鎖を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分を使用する限り、そしてこのような切断された部分を、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用し得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、ゆえに、エフェクター機能シグナル伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された部分を含むことを意図する。
【０１３８】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、一次刺激または抗原依存的刺激を担う分子由来のものを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激性細胞内ドメインを含み得る。共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインの例は、共刺激性シグナルまたは抗原非依存的刺激を担う分子由来のものを含む。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含んでよく、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは共受容体または共刺激性分子からの細胞質配列を含んでよい。
【０１３９】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”)、ＦｃεＲＩおよびＣＤ６６ｄ、ＣＤ３２、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。
【０１４０】
用語“ゼータ”または代替的に“ゼータ鎖”、“ＣＤ３ゼータ”または“ＴＣＲゼータ”は、GenBank Acc. No. BAG36664.1として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基として定義され、“ゼータ刺激性ドメイン”または代替的に“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン”または“ＴＣＲゼータ刺激性ドメイン”は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルの機能的伝達に十分なゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。ある面において、ゼータの細胞質ドメインは、GenBank Acc. No. BAG36664.1またはその機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基の残基５２〜１６４を含む。ある面において、“ゼータ刺激性ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン”は、配列番号９として提供される配列である。ある面において、“ゼータ刺激性ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン”は、配列番号１０として提供される配列である。
【０１４１】
用語“共刺激性分子”は、共刺激性リガンドと特異的に結合し、それにより、増殖のような、しかし、これに限定されないＴ細胞による共刺激性応答に介在する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーをいう。共刺激性分子は、効率的免疫応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激性分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Tactile)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、由来する分子の細胞内部分全体または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体またはその機能的フラグメントを含み得る。
【０１４３】
細胞内シグナル伝達ドメインは、由来する分子の細胞内部分全体または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体またはその機能的フラグメントを含み得る。
【０１４４】
用語“４−１ＢＢ”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーまたは非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基をいい、“４−１ＢＢ共刺激性ドメイン”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基のアミノ酸残基２１４〜２５５として定義される。ある面において、“４−１ＢＢ共刺激性ドメイン”は、配列番号７として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。
【０１４５】
本明細書で使用する“免疫エフェクター細胞”は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞および骨髄由来貪食細胞を含む。
【０１４６】
ここで使用する用語“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅または成長もしくは増殖の阻害を促進するＴまたはＮＫ細胞の性質をいう。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は免疫エフェクター機能または応答の例である。
【０１４７】
用語“エフェクター機能”は、細胞の特殊化機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカイン分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。
【０１４８】
用語“コード化”は、ヌクレオチドの定義された配列(例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)またはアミノ酸の定義された配列を有する、生物学的過程における他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として働く遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特異的配列の固有の性質およびそれに由来する生物学的性質をいう。それゆえに、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両者を、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称することができる。
【０１４９】
特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。用語タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はまたタンパク質をコードするヌクレオチド配列があるバージョンにおいてイントロンを含むのであれば、イントロンも含み得る。
【０１５０】
用語“内因性”は、生物、細胞、組織または系由来またはその中で産生されるあらゆる物質をいう。
【０１５１】
用語“外来性”は、生物、細胞、組織または系に外から導入されたまたは外で産生されたあらゆる物質をいう。
【０１５２】
用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をいう。
【０１５３】
用語“導入ベクター”は、単離核酸を含み、単離核酸を細胞の内部に伝達するのに使用できる組成物をいう。直線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない多数のベクターが当分野で知られる。それゆえに、用語“導入ベクター”は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。本用語は、さらに、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への導入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むとも解釈すべきである。ウイルス導入ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
【０１５４】
用語“発現ベクター”は、発現するヌクレオチド配列に操作可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性成分を含み；発現のための他の成分は、宿主細胞により提供されるかまたはインビトロ発現系にあり得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを取り込むコスミド、プラスミド(例えば、剥き出しまたはリポソーム内に包含)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含む全ての既知のものを含む。
【０１５５】
用語“レンチウイルス”は、レトロウイルス科ファミリーに属する属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できる点でレトロウイルスの中で独特であり、相当量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに伝達でき、それゆえに、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
【０１５６】
用語“レンチウイルスベクター”は、特にMilone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009).により提供される自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターをいう。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例は、例えば、Oxford BioMedicaからのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、LentigenからのLENTIMAXTMベクター系などを含むが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られる。
【０１５７】
用語“相同”または“同一性”は、２重合分子間、例えば、２ＤＮＡ分子または２ＲＮＡ分子のような、２核酸分子間または２ポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性をいう。２分子の両者におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットで占拠されているとき、例えば、２ＤＮＡ分子のある位置がアデニンで占拠されているならば、それらはその位置で相同または同一である。２配列間の相同性は、整合または相同位置の数の直接関数であり、例えば、２配列の位置の半分(例えば、１０サブユニット長ポリマーにおける５位置)が相同であるならば、２配列は５０％相同であり、位置の９０％(例えば、１０中９)が整合または相同であるならば、２配列は９０％相同である。
【０１５８】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列)である。大部分について、ヒト化抗体およびその抗体フラグメントは、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲ由来の残基で置き換えられる、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)である。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基に置き換わる。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾を、さらに洗練し、抗体または抗体フラグメント性能を最適化し得る。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、少なくとも１および一般に２、可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンに対応し、ＦＲ領域の全てまたは相当部分は、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた、一般にヒト免疫グロブリンである、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部も含み得る。さらなる詳細について、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992参照。
【０１５９】
“完全ヒト”は、分子全体がヒト起源であるまたはヒト形態の抗体または免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントのような免疫グロブリンをいう。
【０１６０】
用語“単離”は、天然状態から変えられたまたは除かれたことを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、天然状態での共存物質から一部または完全に分離されている同じ核酸またはペプチドは“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在できまたは、例えば、宿主細胞のような、非天然環境で存在できる。
【０１６１】
本発明の状況において、一般に生じる核酸塩基について次の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンを指し、“Ｃ”はシトシンを指し、“Ｇ”はグアノシンを指し、“Ｔ”はチミジンを指し、“Ｕ”はウリジンを指す。
【０１６２】
用語“操作可能に連結”または“転写制御”は、調節性配列および異種核酸配列の、後者の発現を生じる機能的結合をいう。例えば、第一核酸配列は、第一核酸配列が第二核酸配列と機能的関係にあるとき、第二核酸配列と操作可能に連結される。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響するならば、コード配列に操作可能に連結される。操作可能に連結されたＤＮＡ配列は、互いに連続的であってよく、例えば、２タンパク質コード領域を連結する必要があるとき、同じリーディングフレーム内にある。
【０１６３】
免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)、胸骨内または腫瘍内注射または点滴技術をいう。
【０１６４】
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)またはＤＮＡまたはＲＮＡとポリマーの組み合わせをいう。用語“核酸”は遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む。ある態様において、核酸分子は、合成(例えば、化学合成)されているかまたは組み換えである。特に限定しない限り、本用語は、対照核酸と類似の結合性質を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似する態様で代謝される、天然ヌクレオチドの類似体または誘導体を含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾バリアント(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列ならびに明示的に示す配列を暗黙のうちに包含する。特に、縮重コドン置換は、１以上の選択(または全)コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列の産生により達成できる(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
【０１６５】
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は相互交換可能に使用し、ペプチド結合により共有結合的に連結したアミノ酸残基からなる化合物をいう。タンパク質またはペプチドは少なくとも２アミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチド配列に含まれ得るアミノ酸の最大数に制限は課せられていない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに連結した２以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。ここで使用する用語は、一般に当分野で、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとしても称される短鎖および一般に当分野でタンパク質と呼ばれ、多くのタイプがある長鎖の両者を含む。“ポリペプチド”は、例えば、とりわけ、生物学的活性フラグメント、実質的に相同ポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
【０１６６】
用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写開始に必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列をいう。
【０１６７】
用語“プロモーター／制御配列”は、プロモーター／制御配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列をいう。ある例において、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例においては、この配列は、エンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要な他の調節性成分も含んでよい。プロモーター／制御配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的方法で発現させるものである。
【０１６８】
用語“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定化するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、細胞の大部分または全ての生理学的条件下、細胞で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列をいう。
【０１６９】
用語“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定化するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的にプロモーターに対応するインデューサーが細胞に存在するときのみ、細胞に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列をいう。
【０１７０】
用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定化するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときのみ、細胞に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列をいう。
【０１７１】
用語“癌関連抗原”または“腫瘍抗原”は、相互交換可能に、正常細胞と比較して、優先的に癌細胞の表面上に全体的にまたはフラグメント(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)として発現され、物質の癌細胞への優先的標的化に有用である、分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)をいう。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞および癌細胞の両者により発現されるマーカー、例えば、細胞系譜マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。ある面において、本発明の腫瘍抗原は、原発または転移黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌のような腺癌などを含むが、これらに限定されない癌に由来する。ある態様において、癌関連抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過発現している、例えば、正常細胞と比較して、１倍過発現、２倍過発現、３倍またはそれ以上過発現している細胞表面分子である。ある態様において、癌関連抗原は、癌細胞での合成が不適切である細胞表面分子、例えば、正常細胞で発現される分子と比較して、欠失、付加または変異を含む分子である。ある態様において、癌関連抗原は、排他的に癌細胞の細胞表面上に全体的にまたはフラグメント(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)として発現され、正常細胞の表面では合成または発現されない。ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドと結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＣＡＲを含む。通常、内因性タンパク質由来ペプチドは、主要組織適合複合体(ＭＨＣ)クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋Ｔリンパ球のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)により認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全有核細胞により構成的に発現される。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫治療のための細胞表面標的の独特なクラスを表す。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況におけるウイルスまたは腫瘍抗原由来ペプチドを標的過するＴＣＲ様抗体が記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100参照)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｃＦｖファージディスプレイライブラリーのようなライブラリーのスクリーニングから同定できる。
【０１７２】
ｓｃＦｖの文脈において使用される用語“可動性ポリペプチドリンカー”または“リンカー”は、可変重鎖と可変軽鎖領域を連結させるために、単独でまたは組み合わせて使用する、グリシンおよび／またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーをいう。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(配列番号１５)を含み、ここで、ｎは１以上の正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)を含むが、これらに限定されない。他の態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)(配列番号２９)の複数反復を含む。また本願発明の範囲に包含されるのは、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１２／１３８４７５号に記載のリンカーである。
【０１７３】
ここで使用する５’キャップ(ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ  ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも称する)は、転写開始の直後に、真核メッセンジャーＲＮＡの“前面”または５’末端に付加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第一転写ヌクレオチドに連結する末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は転写と連結され、各々が影響し合うように共転写的に起こる。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端を、ＲＮＡポリメラーゼと結合したキャップ合成複合体により結合させる。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多工程生化学反応として進む。キャッピング部分を、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能性を調節するために修飾できる。
【０１７４】
ここで使用する“インビトロ転写ＲＮＡ”は、インビトロで合成されているＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡをいう。一般に、インビトロ転写ＲＮＡはインビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの産生に使用される鋳型を含む。
【０１７５】
ここで使用する“ポリ(Ａ)”は、ｍＲＮＡにポリアデニル化により結合した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物のある態様において、ポリＡは５０〜５０００(配列番号３０)であり、例えば、６４を超える、例えば、１００を超える、例えば、３００または４００を超えるポリ(Ａ)配列を、局在化、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡ機能性を調節するために化学的または酵素的に修飾できる。
【０１７６】
ここで使用する“ポリアデニル化”は、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニリル基またはその修飾バリアントの共有結合をいう。真核生物において、大部分のメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は、３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素、ポリアデニレートポリメラーゼの作用によりプレｍＲＮＡに添加されるアデニンヌクレオチドの長配列(しばしば数百)である。高級真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含むトランスクリプト上に付加される。ポリ(Ａ)テイルおよびそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護することを助ける。ポリアデニル化はまた転写終結、ｍＲＮＡの核からの排出および翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写直後に核で生じるが、さらに細胞質で後にも起こり得る。転写が終結された後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により開裂される。開裂部位は、通常開裂部位近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在により特徴付けられる。ｍＲＮＡが開裂されたら、アデノシン残基を開裂部位の遊離３’末端に添加する。
【０１７７】
ここで使用する“一過性”は、非統合導入遺伝子の数時間、数日または数週の期間の発現をいい、ここで、発現の期間は、ゲノムに統合されているまたは宿主細胞における安定なプラスミドレプリコン内に含まれるときの遺伝子の発現期間より短い。
【０１７８】
アフェレーシスは、全血を個体から除き、選択成分に分け、残りを循環に戻す方法である。一般に、血液成分の分離のために、遠心性および非遠心性の方法がある。白血球アフェレーシスは、患者の白血球の能動的選択および除去をもたらす。
【０１７９】
ここで使用する用語“処置”および“処置する”は、１以上の治療(例えば、本発明のＣＡＲのような１以上の治療剤)の投与に起因する、増殖性障害の進行、重症度および／または期間の低減または改善または増殖性障害の１以上の症状(例えば、１以上の認識できる症状)の改善をいう。具体的態様において、用語“処置”および“処置する”は、必ずしも患者により認識され得るものではない、腫瘍の成長のような増殖性障害の少なくとも１の測定可能な身体パラメータの改善をいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、例えば、認識できる症状の安定化により、身体的に、例えば、身体パラメータの安定化により、生理学的に、または両者により、増殖性障害の進行を阻止することをいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、腫瘍サイズまたは癌性細胞数の低減または安定化をいう。
【０１８０】
用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナル伝達に役割を有する多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。用語“細胞表面受容体”は、細胞の膜を超えてシグナルを受け取るおよびシグナルを伝達することができる分子および分子の複合体をいう。
【０１８１】
用語“対象”は、免疫応答が惹起され得る生存生物(例えば、哺乳動物、ヒト)を含むことを意図する。
【０１８２】
用語“実質的に精製された”細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞をいう。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態では通常関連している他の細胞型から離されている細胞もいう。ある例において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の同種集団をいう。他の例において、本用語は、天然状態では自然に関連している細胞から離されている細胞を単にいう。ある面において、細胞は、インビトロで培養される。他の面において、細胞はインビトロで培養されない。
【０１８３】
本発明の状況において、“腫瘍抗原”または“過増殖性障害抗原”または“過増殖性障害と関係する抗原”は、特定の過増殖性障害に共通する抗原をいう。ある態様において、腫瘍抗原は、原発または転移黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌のような腺癌などを含むが、これらに限定されない癌に由来する。
【０１８４】
用語“遺伝子導入”または“形質転換”または“形質導入”は、外来核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。“遺伝子導入”または“形質転換”または“形質導入”細胞は、外来核酸が遺伝子導入、形質転換または形質導入されているものである。細胞は、一次対象細胞およびその子孫を含む。
【０１８５】
用語“特異的に結合”は、サンプルに存在する同族結合パートナータンパク質により認識および結合される抗体またはリガンドをいうが、該抗体またはリガンドは、サンプルにおける他の分子を実質的に認識または結合しない。
【０１８６】
範囲：本明細書をとおして、本発明の種々の面は、範囲の形態で提示され得る。範囲の形態の記載は、単に簡便さかつ簡潔さのためであって、本発明の範囲における確固たる制限として解釈してはならないことは理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能性のある部分範囲ならびに個々の数値が具体的に開示されていると解釈すべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような部分範囲ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６の具体的開示と解釈すべきである。他の例として、９５〜９９％同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するものおよび９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性のような部分範囲を含む。範囲の広さに関係なく、このことは適用される。
【０１８７】
記載
ここに提供されるのは、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲで操作できる免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を製造する方法およびそのような細胞を含む反応混合物および組成物である。
【０１８８】
ある面において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)に関し、ここで、操作された免疫エフェクター細胞は、抗腫瘍性を示す。例示的抗原は、ここに記載する癌関連抗原(すなわち、腫瘍抗原)である。ある面において、細胞をＣＡＲで形質転換し、ＣＡＲは細胞表面に発現される。ある態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入する。ある態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。あるこのような態様において、細胞はＣＡＲを安定に発現し得る。他の態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡで遺伝子導入する。あるこのような態様において、細胞は、ＣＡＲを一過性に発現し得る。
【０１８９】
さらに、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ組成物および医薬におけるそれらの使用または数ある疾患の中で、癌またはここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞または組織が関与するあらゆる悪性腫瘍または自己免疫性疾患を処置する方法を提供する。
【０１９０】
ある面において、本発明のＣＡＲを、ここに記載する腫瘍抗原を発現する正常細胞の根絶に四湯でき、それにより細胞移植前の細胞コンディショニング治療としての使用に適用可能である。
【０１９１】
免疫エフェクター細胞の源
ある態様において、拡張および遺伝子修飾または他の修飾前に、細胞、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の源を対象から得ることができる。対象の例は、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む多数の源から得ることができる。
【０１９２】
本発明のある面において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ＦｉｃｏｌｌTM分離のような当業者に知られる任意の数の技術を使用して、対象から採取した血液から得ることができる。ある面において、個体の循環血からの細胞は、アフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、一般に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球および血小板を含む。ある面において、アフェレーシスにより採取した細胞を、洗浄して血漿フラクションを除いてよく、所望により、細胞を続く処理工程のための適切な緩衝液または培地に加える。ある態様において、細胞をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄する。別の態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよくまたは全てではないにしても大部分の二価カチオンを欠いていてよい。
【０１９３】
カルシウム不在下の最初の活性化工程は、活性化の増強を生じ得る。当業者には容易に認識されるとおり、洗浄工程は、製造業者の指示に従い半自動化“フロースルー”遠心分離(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)を使用することによるような、当分野で知られる方法により達成できる。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、PlasmaLyte Aのような多様な生体適合性緩衝液または緩衝剤を用いるまたは用いない他の食塩水溶液に再懸濁できる。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
【０１９４】
ある面において、Ｔ細胞を、赤血球を溶解し、単球を、例えば、PERCOLLＴＭ勾配または向流遠心性水簸により枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。
【０１９５】
ここに記載する方法は、例えば、ここに記載する、例えば、陰性選択技術を使用する、Ｔ調節性細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である、例えば、特異的免疫エフェクター細胞の亜集団、例えば、Ｔ細胞の選択を含み得る。ある態様において、Ｔ調節性枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％より少ないＣＤ２５＋細胞を含む。
【０１９６】
ある態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、例えばＩＬ−２を使用して集団から除去する。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドは基質、例えば、ビーズにコンジュゲートするかまたは基質、例えば、ビーズ上に他にコーティングされる。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントは、ここに記載する基質にコンジュゲートする。
【０１９７】
ある態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞をミルテニーＴＭからのＣＤ２５枯渇剤を使用して、集団から除去する。ある態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤比は、１ｅ７細胞対２０μLまたは１ｅ７細胞対１５μLまたは１ｅ７細胞対１０μLまたは１ｅ７細胞対５μLまたは１ｅ７細胞対２.５μLまたは１ｅ７細胞対１.２５μLである。ある態様において、例えば、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇について、５億細胞／mlを超えて使用する。さらなる面において、６億、７億、８億または９億細胞／mlの細胞濃度を使用する。
【０１９８】
ある態様において、枯渇する免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９  ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。他の面において、枯渇する免疫エフェクター細胞の集団は約１×１０９〜１×１０１０  ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびその間の任意の整数値を含む。ある態様において、得られた集団Ｔ調節性枯渇細胞は、２×１０９以下のＴ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞(例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７以下のＣＤ２５＋細胞)を有する。
【０１９９】
ある態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞を、例えば、チューブ１６２−０１のような、枯渇チューブセットを備えたCliniMACシステムを使用して集団から除去する。ある態様において、CliniMACシステムを、例えば、DEPLETION2.1のような枯渇設定で作動させる。
【０２００】
特定の理論に縛られることを望まないが、対象におけるアフェレーシス前またはＣＡＲ発現細胞産物の製造中の免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの低減(例えば、望まない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数の減少)は、対象再発のリスクを顕著に低減させる。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇する方法が当分野で知られる。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体(ここに記載の抗ＧＩＴＲ抗体)、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害物質およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０２０１】
ある態様において、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞数減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造方法は、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)を接触させ、例えば、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。
【０２０２】
特定の理論に縛られることを望まないが、対象におけるアフェレーシス前またはＣＡＲ発現細胞産物の製造中の、免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの低減(例えば、望まない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞数の減少)は、対象の再発のリスクを低減させ得る。ある態様において、対象を、ＣＡＲ発現細胞産物製造用の細胞採取前にＴＲＥＧ細胞を減少させる１以上の治療で前処置し、それによりＣＡＲ発現細胞処置に対する対象再発のリスクを軽減する。ある態様において、ＴＲＥＧ細胞を減少する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。ある態様において、ＴＲＥＧ細胞を減少する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害物質またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物の点滴前、中または後に行い得る。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害物質またはこれらの組み合わせの１以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物の点滴前、中または後に行い得る。
【０２０３】
ある態様において、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞の数の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造方法は、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと、抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)を接触させ、例えば、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。
【０２０４】
ある態様において、対象を、ＣＡＲ発現細胞産物製造用の細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置し、それによりＣＡＲ発現細胞処置に対する対象再発のリスクを軽減する(例えば、ＣＴＬ０１９処置)。ある態様において、対象をＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)産物製造用の細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置し、それによりＣＡＲ発現細胞処置に対する対象再発のリスクを軽減する。
【０２０５】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)製造法は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物(例えば、ＣＴＬ０１９産物)の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させるように修飾される。ある態様において、ＣＤ２５枯渇を使用して、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物(例えば、ＣＴＬ０１９産物)の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させる。
【０２０６】
ある態様において、除去する細胞の集団は、調節性Ｔ細胞でも腫瘍細胞でもないが、ＣＡＲＴ細胞の増殖および／または機能に他の態様で負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。ある態様において、このような細胞は、調節性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたはそれらの枯渇後にまたは他の順番で除去することが企図される。
【０２０７】
ここに記載する方法は、１を超える選択工程、例えば、１を超える枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体と組み合わせて、達成できる。一つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含み得る。
【０２０８】
ここに記載する方法は、さらに腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する集団から細胞を除去し、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ調節性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することを含み得る。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞を、Ｔ調節性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去する。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを、細胞または抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラグメントの除去に使用できる同じ基質、例えば、ビーズに結合でき、または抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを、混合物が細胞の除去に使用できる別々のビーズに結合できる。他の態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも起こり得る。
【０２０９】
チェックポイント阻害物質、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害物質を発現する集団、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１以上から細胞を除去し、それによりＴ調節性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害物質枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する方法も提供される。例示的チェックポイント阻害物質は、例えば、ここに記載するような、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲ(例えば、ＴＧＦＲベータ)を含む。ある態様において、チェックポイント阻害物質発現細胞を、Ｔ調節性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去する。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害物質抗体またはそのフラグメントを、細胞の除去に使用できるのと同じビーズに結合できまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害物質抗体またはそのフラグメントを、混合物が細胞の除去に使用できる別々のビーズに結合できる。他の態様において、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害物質発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも起こり得る。
【０２１０】
ここに記載する方法は、陽性選択工程を含み得る。例えば、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３ｘ２８)コンジュゲートビーズとのインキュベーションにより単離できる。ある態様において、時間は約３０分である。さらなる態様において、時間は、３０分〜３６時間またはそれより長い範囲およびその間の全ての整数値である。さらなる態様において、時間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに他の態様において、時間は１０〜２４時間、例えば、２４時間である。長いインキュベーション時間を使用して、腫瘍組織または免疫不全個体からの腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)の単離のような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ない、あらゆる状況においてＴ細胞を単離し得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を上げ得る。それゆえに、単にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を長くしたり短くしたりするおよび／またはビーズ対Ｔ細胞比を増加させたり減らしたりするだけで(さらにここに記載するように)、Ｔ細胞の亜集団は、開始時または工程中の他の時点で優先的に選択され得る。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加させたり減らしたりすることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時または他の所望の時点で優先的に選択できる。
【０２１１】
ある態様において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンの１以上または他の適切な分子、例えば、他のサイトカインを発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現をスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法により決定できる。
【０２１２】
陽性または陰性選択による所望の細胞の集団の単離のために、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度は変わり得る。ある面において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を共に混合する容積を顕著に減少させることが望ましいことがある(例えば、細胞の濃度の増加)。例えば、ある面において、１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／mlまたは５０億／mlの濃度を使用する。ある面において、１０億細胞／mlの濃度を使用する。さらにある面において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞の濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。
【０２１３】
高濃度の使用は、細胞収量、細胞活性化および細胞拡張を増加させ得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱くしか発現し得ない細胞のまたは多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病血液、腫瘍組織など)からのより効率的捕捉を可能にする。このような細胞の集団は治療価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０２１４】
関連する面において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を大幅に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量発現する細胞について選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度においてＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。ある面において、使用する細胞の濃度は５×１０６／mlである。他の面において、使用する濃度は、約１×１０５／ml〜１×１０６／mlおよびその間の任意の整数値であり得る。
【０２１５】
他の面において、細胞を、２〜１０℃または室温で、種々の長さの時間、種々の速度で回転振盪機上でインキュベートし得る。
【０２１６】
ある態様において、複数の免疫エフェクター細胞の集団はジアグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)を発現せず、例えば、ＤＧＫ欠損である。ある態様において、複数の免疫エフェクター細胞の集団はイカロスを発現せず、例えば、イカロス欠損である。ある態様において、複数の免疫エフェクター細胞の集団はＤＧＫおよびイカロスを発現せず、例えば、ＤＧＫおよびイカロス両者の欠損である。
【０２１７】
刺激のためのＴ細胞も洗浄工程後凍結できる。理論に縛られることを望まないが、凍結およびその後の融解工程は、細胞集団における顆粒球およびある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結用溶液に懸濁させ得る。多くの凍結用溶液およびパラメータが当分野で知られ、この目的に有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳまたは１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯまたは３１.２５％PlasmaLyte A、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯ含有培養培地または他の適当な例えば、ＨｅｓｐａｎおよびPlasmaLyte Aを含む細胞凍結培地の使用を含み、これを、１°／分の速度で−８０℃まで冷却凍結させ、液体窒素保存タンクの蒸気相で保存する。制御凍結の他の方法および即座に−２０℃または液体窒素中での非制御凍結も使用し得る。
【０２１８】
ある面において、凍結保存細胞をここに記載のように融解し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化前に、１時間室温で休息させる。
【０２１９】
本発明の状況においてまた企図されるのは、ここに記載する拡張した細胞が必要である場合の一定の時間前での、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシス産物の採取である。そのために、拡張する細胞の源を必要な任意の時点で採取し、Ｔ細胞のような所望の細胞を、ここに記載するもののような、免疫エフェクター細胞治療により利益を受けるあらゆる数の疾患または状態のための免疫エフェクター細胞治療における後の使用のために単離し、凍結し得る。ある面において血液サンプルまたはアフェレーシス産物を一般に健常対象から採る。ある面において、血液サンプルまたはアフェレーシス産物を、疾患を発症するリスクがあるがまだ疾患を発症していない一般に健常対象から採り、目的の細胞を後の使用のために単離および凍結する。ある面において、Ｔ細胞を後の時点で、拡張させ、凍結し、使用し得る。ある面において、サンプルを、ここに記載する特定の疾患の診断直後であって処置前に患者から採取する。さらなる面において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および放射線のような他の免疫除去剤のような因子での処置を含むが、これらに限定されない、任意の数の適切な処置モダリティの前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシス産物から単離する。
【０２２０】
本発明のさらなる面において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後直接患者から得る。この点に関し、ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、患者が通常該処置から回復するであろう期間の間の処置直後、得られるＴ細胞の品質が最適であるかまたはエクスビボで拡張する能力が改善している可能性が観察されている。同様に、ここに記載する方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着およびインビボ拡張増強に好ましい状態であり得る。それゆえに、本発明の状況においては、この回復期間中に造血細胞系譜のＴ細胞、樹状細胞または他の細胞を含む血液細胞を採取することが企図される。さらに、ある面において、可動化(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動か)およびコンディショニングレジメンを使用して、特に治療後の一定の時間枠内で、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または拡張が好ましい対象における状態の創出のために使用できる。細胞型の例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞を含む。
【０２２１】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害物質を受けている対象から得る。ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作される、免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ細胞を、対象におけるまたは対象から採取されている、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過性に増加するように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害物質の十分な時間または十分な用量の投与後に採取する。
【０２２２】
他の態様においてＣＡＲを発現するように操作されているまたは操作される免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ細胞を、エクスビボで、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増加させるまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増加させる量のｍＴＯＲ阻害物質のとの接触により処理できる。
【０２２３】
本発明の方法は、５％以下、例えば２％の、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を使用し、既知培養培地条件および組成物、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31に記載のものを用いることができることは認識される。
【０２２４】
ある態様において、本発明の方法は、無血清培地を含む培養培地条件を利用できる。ある態様において、無血清培地は、OpTmizer CTS(LifeTech)、Immunocult XF(Stemcell technologies)、CellGro(CellGenix)、TexMacs(Miltenyi)、Stemline(Sigma)、Xvivo15(Lonza)、PrimeXV(Irvine Scientific)またはStemXVivo(RandD systems)である。無血清培地に、LifeTechからのＩＣＳＲ(免疫細胞血清置換)のような血清代替で補い得る。血清代替(例えば、ＩＣＳＲ)のレベルは、例えば、最大５％、例えば、約１％、２％、３％、４％または５％であり得る。
【０２２５】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ジアグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ  ＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないまたはＤＧＫ活性が低減または阻止されている細胞を含む。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減または阻止するための遺伝的アプローチ、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞を、ここに記載するＤＧＫ阻害物質での処置により産生できる。
【０２２６】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロス  ＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないまたはイカロス活性が低減または阻止されている細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減または阻止するための遺伝的アプローチ、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害物質、例えば、レナリドマイドでの処置により産生できる。
【０２２７】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損およびイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびイカロスを発現しないまたはＤＧＫおよびイカロス活性が低減または沿いされている。このようなＤＧＫおよびイカロス欠損細胞を、ここに記載する任意の方法により産生できる。
【０２２８】
ある態様において、ＮＫ細胞を対象から得る。他の態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株(Conkwest)である。
【０２２９】
同種異系ＣＡＲ
ここに記載する態様において、免疫エフェクター細胞は同種異系免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種異系Ｔ細胞、例えば機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現を欠く同種異系Ｔ細胞、であり得る。
【０２３０】
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、表面にいかなる機能的ＴＣＲも発現しないように操作され、機能的ＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように操作され(例えば、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロンおよび／またはＴＣＲゼータを発現しない(または発現が低減する)ように操作される)または表面にごくわずかな機能的ＴＣＲを生じるように操作されることができる。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１以上の変異または切断形態の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現し得る。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが宿主における有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。
【０２３１】
ここに記載するＴ細胞は、例えば、表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作され得る。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１および／またはＨＬＡクラスIIが下方制御されるように操作され得る。ある態様において、ＨＬＡの下方制御は、ベータ−２ミクログロブリン(Ｂ２Ｍ)発現の低減または除去により達成され得る。
【０２３２】
ある態様において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠くことができる。
【０２３３】
機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞を、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、何らかの適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用するＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。
【０２３４】
ある態様において、同種異系細胞は、例えばここに記載するいずれかの方法により、阻害性分子を発現しないまたは低レベルでしか発現しない細胞であり得る。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を搭載する能力を低減できる、阻害性分子を発現しないまたは低レベルでしか発現しない細胞であり得る。阻害性分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲ(例えば、ＴＧＦＲベータ)を含む。阻害性分子の、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、例えば、ここに記載するような、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用できる。
【０２３５】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現は、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡおよび／またはここに記載する阻害性分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して阻害できる。
【０２３６】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡのための発現系および例示的ｓｈＲＮＡは、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６４９および６５０に記載される。
【０２３７】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ”は、一連のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートまたはこのような一連の反復を含む系をいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”系は、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＴＣＲおよび／またはＨＬ遺伝子および／またはここに記載する阻害性分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の発現抑制または変異に使用できる、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓに由来する系をいう。
【０２３８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびその使用は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６５１〜６５８に記載されている。
【０２３９】
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
“ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ”は、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害性分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
【０２４０】
ＴＡＬＥＮおよびその使用は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６５９〜６６５に記載される。
【０２４１】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ”は、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害性分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをいう。
【０２４２】
ＺＦＮおよびその使用は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６６６〜６７１に記載される。
【０２４３】
テロメラーゼ発現
テロメアは、体細胞残留性に重要な役割を有し、その長さはテロメラーゼ(ＴＥＲＴ)により維持される。ＣＬＬ細胞のテロメア長は極めて短い可能性があり(Roth et al., “Significantly shorter telomeres in T-cells of patients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia” British Journal of Haematology, 143, 383-386., August 28 2008)、製作ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ１９細胞ではさらに短い可能性があり、養子移入後の患者における拡張の可能性を制限する。テロメラーゼ発現は、ＣＡＲ発現細胞を複製疲弊から救出できる。
【０２４４】
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ある態様において、治療的Ｔ細胞は、Ｔ細胞の短いテロメアにより、患者において短期残留性を有し、したがって、テロメラーゼ遺伝子を伴う遺伝子導入は、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善できる。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それゆえに、ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを異所性に発現する。ある面において、本発明は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、ＣＡＲをコードする構築物との接触前に、同時にまたは後に該核酸と接触させ得る。
【０２４５】
テロメラーゼ発現は、安定(例えば、核酸は細胞のゲノムに統合され得る)でも、一過性(例えば、核酸は統合されず、発現は一定期間、例えば、数日後に減弱する)でもよい。安定な発現は、細胞にテロメラーゼサブユニットおよび選択可能マーカーをコードするＤＮＡを遺伝子導入または形質導入し、安定な組み込み体を選択することにより達成できる。それとは別にまたは組み合わせて、安定な発現は、例えば、Ｃｒｅ／ＬｏｘまたはＦＬＰ／ＦＲＴ系を使用する、部位特異的組換えにより達成し得る。
【０２４６】
一過性発現は、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＭＲＮＡのようなＲＮＡでの遺伝子導入または形質導入を含み得る。ある態様において、一過性ｍＲＮＡ遺伝子導入は、ＴＥＲＴでの安定な遺伝子導入に時々関係する遺伝的不安定性を避ける。外来テロメラーゼ活性の一過性発現は、例えば、全体を引用により本明細書に包含する国際出願ＷＯ２０１４／１３０９０９号に記載させる。ある態様において、テロメラーゼサブユニットのｍＲＮＡベースの遺伝子導入は、Moderna Therapeuticsにより市販のメッセンジャーRNA TherapeuticsTMプラットフォームにより実施する。例えば、方法は、米国特許８７１０２００号、８８２２６６３号、８６８００６９号、８７５４０６２号、８６６４１９４号または８６８００６９号に記載された方法であり得る。
【０２４７】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Protein ID AAC51724.1のアミノ酸配列を有する(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)：
【化１】
2018500944.tif 000003
(配列番号１０８)
【０２４８】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１０８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１０８の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両端に欠失(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両端にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。
【０２４９】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Accession No. AF018167の核酸配列によりコードされる(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)：
【化２】
2018500944.tif 000004
(配列番号２３)
【０２５０】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する核酸によりコードされる。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２３の配列によりコードされる。
【０２５１】
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)
本発明は、免疫エフェクター細胞を癌に指向させる１以上のＣＡＲを含むように操作された、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供する。これは、癌関連抗原に特異的であるＣＡＲ上の抗原結合ドメインを介して達成される。ここに記載するＣＡＲにより標的となり得る２クラスの癌関連抗原(腫瘍抗原)がある：(１)癌細胞の表面に発現される癌関連抗原；および(２)それ自体は細胞内であるが、フラグメント(ペプチド)がＭＨＣ(主要組織適合複合体)により癌細胞の表面に提示される癌関連抗原。
【０２５２】
したがって、例えば、ここに記載する方法により得る免疫エフェクター細胞は、次の癌関連抗原(腫瘍抗原)の１つを標的とするＣＡＲを包含するように操作できる：ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、キット、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソセリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Prostase、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡIX、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼおよびｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２。
【０２５３】
二特異的ＣＡＲ
ある態様において、多特異的抗体分子は二特異的抗体分子である。二特異的抗体は、２を超えない抗原に特異性を有する。二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列、第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある態様において、第一および第二エピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)にある。ある態様において、第一および第二エピトープは重複する。ある態様において、第一および第二エピトープは重複しない。ある態様において、第一および第二エピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。ある態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列ならびに第二エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントを含む。
【０２５４】
ある態様において、抗体分子は、多特異的(例えば、二特異的または三特異的)抗体分子である。二特異的またはヘテロ二量体抗体分子の製造のためのプロトコールおよび二特異的抗体分子の種々の配置は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願のＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ４５５〜４５８に記載される。
【０２５５】
ある面において、二特異的抗体分子は、ＣＤ１９に結合特異性を有する、例えば、ここに記載するｓｃＦｖを含むまたはここに記載するｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲを含む第一免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば、ｓｃＦｖおよび異なる抗原上の第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
【０２５６】
キメラＴＣＲ
ある面において、本発明の抗体および抗体フラグメント(例えば、ＣＤ１９抗体およびフラグメント)を、Ｔ細胞受容体(“ＴＣＲ”)鎖、例えば、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ鎖の１以上の定常ドメインに移植し、キメラＴＣＲを創成できる。理論に縛られないが、キメラＴＣＲは、抗原結合によりＴＣＲ複合体を経てシグナル伝達すると考えられる。例えば、ここに開示するｓｃＦｖを、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の定常ドメイン、例えば、細胞外定常ドメインの少なくとも一部、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに移植できる。他の例として、抗体フラグメント、例えばここに記載するＶＬドメインを、ＴＣＲアルファ鎖の定常ドメインに移植でき、抗体フラグメント、例えばここに記載するＶＨドメインを、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに移植できる(または別法として、ＶＬドメインをＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに移植してよく、ＶＨドメインをＴＣＲアルファ鎖に移植してよい)。他の例として、抗体または抗体フラグメントのＣＤＲを、ＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖に移植して、キメラＴＣＲを創成する。例えば、ここに開示するＬＣＤＲをＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインに移植してよく、ここに開示するＨＣＤＲをＴＣＲベータ鎖の可変ドメインに移植してよく、または逆も可能である。このようなキメラＴＣＲを、例えば、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74)。
【０２５７】
非抗体スキャフォールド
ある態様において、抗原結合ドメインは非抗体スキャフォールド、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小型モジュール免疫薬、マキシボディ、タンパク質Ａまたはアフィリンを含む。非抗体スキャフォールドは、細胞上の標的抗原に結合する能力を有する。ある態様において、抗原結合ドメインは、細胞に発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチドまたはそのフラグメントである。ある態様において、抗原結合ドメインは非抗体スキャフォールドを含む。多種多様な非抗体スキャフォールドを、得られたポリペプチドが、標的細胞上の標的抗原に特異的に結合する少なくとも１結合領域を含む限り、用いることができる。
【０２５８】
非抗体スキャフォールドは、フィブロネクチン(Novartis, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd., Cambridge, MAおよびAblynx nv, Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小型モジュール免疫薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(Avidia, Inc., Mountain View, CA)、タンパク質Ａ(Affibody AG, Sweden)およびアフィリン(ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含む。
【０２５９】
ある態様において、抗原結合ドメインは、標的細胞の表面のカウンターリガンドに結合する分子の細胞外ドメインまたはそのカウンターリガンド結合フラグメントを含む。
【０２６０】
免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする配列を含む組み換えＤＮＡ構築物を含むことができ、ここで、ＣＡＲは、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含み得る。他の場所に記載するとおり、ここに記載する方法は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸での、例えば、Ｔ調節性枯渇細胞の集団からの細胞の形質導入を含み得る。
【０２６１】
具体的な面において、ＣＡＲはｓｃＦｖドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖの前に、配列番号１に提供するような任意のリーダー配列があり、後に配列番号２または配列番号３６または配列番号３８に提供するような任意のヒンジ配列、配列番号６に提供するような膜貫通領域、配列番号７または配列番号１６を含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号９または配列番号１０を含むＣＤ３ゼータ配列があってよく、例えば、ここで、ドメインは連続的であり、同じリーディングフレーム内にあり、単一融合タンパク質を形成する。
【０２６２】
ある面において、例示的ＣＡＲ構築物は、任意のリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および細胞内刺激性ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内刺激性ドメイン)を含む。ある面において、例示的ＣＡＲ構築物は、任意のリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)、細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメイン)および／または細胞内一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン)を含む。
【０２６３】
例示的リーダー配列を配列番号１として提供する。例示的ヒンジ／スペーサー配列を、配列番号２または配列番号３６または配列番号３８として提供する。例示的膜貫通ドメイン配列を、配列番号６として提供する。例示的４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの配列を、配列番号７として提供する。例示的ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの配列を、配列番号１６として提供する。例示的ＣＤ３ゼータドメイン配列を、配列番号９または配列番号１０として提供する。
【０２６４】
ある面において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を含み、ここで、核酸分子は、抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、ここで、該配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続的であり、同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲにおいて使用できる細胞内シグナル伝達ドメインの例は、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢなどの、細胞内シグナル伝達ドメインの１以上を含むが、これらに限定されない。ある例において、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。
【０２６５】
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用する、例えば核酸分子を発現する細胞のライブラリーのスクリーニングによる、それを含むことが知られるベクターから核酸分子を誘導することによるまたはそれを含む細胞および組織から直接単離することによるなどのような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の核酸を、クローン化ではなく、合成的に産生する。
【０２６６】
ＣＡＲをコードする核酸を、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター構築物を使用して、免疫エフェクター細胞に導入できる。
【０２６７】
ＣＡＲをコードする核酸はまた、例えば、、細胞に直接的に遺伝子導入され得るＲＮＡ構築物を使用しても、免疫エフェクター細胞に導入できる。遺伝子導入に使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、特別に操作されたプライマーを伴う鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、一般に５０〜２０００塩基長(例えば、実施例に記載、例えば、配列番号３５)の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)(例えば、ここに記載する３’および／または５’ＵＴＲ)、５’キャップ(例えば、ここに記載する５’キャップ)および／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)(例えば、ここに記載するＩＲＥＳ)、発現させる核酸およびポリＡテイルを含む構築物を産生する。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞に効率的に遺伝子導入できる。ある態様において、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。ある態様において、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターを、エレクトロポレーションにより、細胞、例えば、Ｔ細胞に形質導入する。
【０２６８】
抗原結合ドメイン
ある面において、複数の免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ調節性枯渇細胞の集団は、抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合成分を含むＣＡＲをコードする核酸を含む。結合成分の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関係する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択し得る。それゆえに、ここに記載するＣＡＲにおける抗原結合ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス、細菌および寄生虫感染症、自己免疫性疾患および癌細胞と関係するものを含む。
【０２６９】
ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインを含む部分は、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
【０２７０】
抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)およびラクダ類由来ナノボディの可変ドメイン(ＶＨＨ)のような単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびその機能的フラグメントを含むが、これらに限定されない抗原に結合するあらゆるドメインおよび組み換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲなどのような、抗原結合ドメインとして機能することが当分野で知られる代替的スキャフォールドであり得る。ある例において、抗原結合ドメインが、ＣＡＲを最終的に使用するのと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトでの使用のために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を含むことが有益である。
【０２７１】
ある態様において、抗原結合ドメインは抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合ドメインは、表１に挙げる可変重鎖および可変軽鎖を含む。可変重鎖および可変軽鎖を連結するリンカー配列は、例えば、ここに記載するリンカー配列のいずれか、あるいは、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号１０４)であり得る。
【０２７２】
【表１】
2018500944.tif 000005
【表２】
2018500944.tif 000006
【０２７３】
【表３】
2018500944.tif 000007
【０２７４】
あらゆるＣＤ１９  ＣＡＲ、例えば、あらゆる既知ＣＤ１９  ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合ドメインを、本発明に従い使用できる。例えば、ＬＧ−７４０；米国特許８,３９９,６４５号；米国特許７,４４６,１９０号；Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013);および16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ。
【０２７５】
ＣＡＲ発現細胞を使用して標的かできる例示的標的抗原は、とりわけ、例えば、ＷＯ２０１４／１３０６３５号、ＷＯ２０１４／１３０６５７号およびＷＯ２０１５／０９０２３０号(これらの各々をその全体を引用により本明細書に包含させる)に記載の、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖIII、メソセリンを含むが、これらに限定されない。
【０２７６】
ある態様において、ＣＤ１９に特異的に結合するＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＵＳＡＮ指定TISAGENLECLEUCEL-Tを有する。ＣＴＬ０１９は、ＥＦ−１アルファプロモーター制御下、ＣＴＬ０１９導入遺伝子を含む自己不活性化、複製欠損レンチウイルス(ＬＶ)ベクターでの形質導入による安定な挿入が介在するＴ細胞の遺伝子修飾により産生される。ＣＴＬ０１９は、導入遺伝子陽性Ｔ細胞パーセントに基づき対象に送達された導入遺伝子陽性および陰性Ｔ細胞の混合物であり得る。
【０２７７】
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ヒトＣＤ１９に特異的に結合でき、例えば、引用によりここに包含するＷＯ２０１４／１５３２７０の号表３に従うＣＡＲ分子または抗原結合ドメイン(例えば、ヒト化抗原結合ドメイン)を含み得る。
【０２７８】
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３に特異的に結合でき、例えば、引用により本明細書に包含するＷＯ２０１４／１３０６３号５の表１〜２に従うＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ１〜ＣＡＲ８のいずれか)または抗原結合ドメインを含み得る。
【０２７９】
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＥＧＦＲｖIIIに特異的に結合でき、例えば、引用により本明細書に包含するＷＯ２０１４／１３０６５７号の表２または配列番号１１に従うＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを含み得る。
【０２８０】
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、メソセリンに特異的に結合でき、例えば、引用により本明細書に包含するＷＯ２０１５／０９０２３０号の表２〜３に従うＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを含み得る。
【０２８１】
ある態様において、抗原結合ドメインは、上に挙げた抗体からの１、２、３(例えば、全３)重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３および／または上に挙げた抗体からの１、２、３(例えば、全３)軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、上に挙げたまたは記載した抗体の重鎖可変領域および／または可変軽鎖領域を含む。
【０２８２】
ある態様において、腫瘍抗原は、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号に記載する腫瘍抗原である。ある態様において、腫瘍抗原は、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１(別名ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９および１９Ａ２４)；Ｃ型レクチン様分子−１(ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１)；ＣＤ３３；上皮細胞増殖因子受容体バリアントIII(ＥＧＦＲｖIII)；ガングリオシドＧ２(ＧＤ２)；ガングリオシドＧＤ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−８)ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟(ＢＣＭＡ)；Ｔｎ抗原((Ｔｎ  Ａｇ)または(ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ))；前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１(ＲＯＲ１)；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ＦＬＴ３)；腫瘍関連糖タンパク質７２(ＴＡＧ７２)；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原(ＣＥＡ)；上皮性細胞接着分子(ＥＰＣＡＭ)；Ｂ７Ｈ３(ＣＤ２７６)；キット(ＣＤ１１７)；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２(ＩＬ−１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２)；メソセリン；インターロイキン１１受容体アルファ(ＩＬ−１１Ｒａ)；前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)；プロテアーゼセリン２１(TestisinまたはＰＲＳＳ２１)；血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)；ルイス(Ｙ)抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲ−ベータ)；ステージ特異的胚性抗原−４(ＳＳＥＡ−４)；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン−タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)；ムチン１、細胞表面関連(ＭＵＣ１)；上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)；神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)；Prostase；前立腺酸ホスファターゼ(ＰＡＰ)；伸長因子２変異(ＥＬＦ２Ｍ)；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(ＦＡＰ)；インシュリン様増殖因子１受容体(ＩＧＦ−Ｉ受容体)、炭酸脱水酵素IX(ＣＡIX)；プロテアソーム(Prosome、Macropain)サブユニット、ベータ型、９(ＬＭＰ２)；糖タンパク質１００(ｇｐ１００)；切断点クラスター領域(ＢＣＲ)およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１(Ａｂｌ)からなる癌遺伝子融合タンパク質(ｂｃｒ−ａｂｌ)；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２(ＥｐｈＡ２)；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子(ｓＬｅ)；ガングリオシドＧＭ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)；トランスグルタミナーゼ５(ＴＧＳ５)；高分子量黒色腫関連抗原(ＨＭＷＭＡＡ)；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド(ＯＡｃＧＤ２)；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１(ＴＥＭ１／ＣＤ２４８)；腫瘍内皮マーカー７関連(ＴＥＭ７Ｒ)；クローディン６(ＣＬＤＮ６)；甲状腺刺激ホルモン受容体(ＴＳＨＲ)；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣ群５、メンバーＤ(ＧＰＲＣ５Ｄ)；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１(ＣＸＯＲＦ６１)；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)；ポリシアル酸；胎盤特異的１(ＰＬＡＣ１)；ｇｌｏｂｏＨ糖セラミドのヘキササッカライド部分(ＧｌｏｂｏＨ)；乳腺分化抗原(ＮＹ−ＢＲ−１)；ウロプラキン２(ＵＰＫ２)；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１(ＨＡＶＣＲ１)；アドレナリン受容体ベータ３(ＡＤＲＢ３)；パネキシン３(ＰＡＮＸ３)；Ｇタンパク質共役受容体２０(ＧＰＲ２０)；リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ９(ＬＹ６Ｋ)；嗅覚受容体５１Ｅ２(ＯＲ５１Ｅ２)；ＴＣＲガンマ交互リーディングフレームタンパク質(ＴＡＲＰ)；ウィルムス腫瘍タンパク質(ＷＴ１)；癌／精巣抗原１(ＮＹ−ＥＳＯ−１)；癌／精巣抗原２(ＬＡＧＥ−１ａ)；黒色腫関連抗原１(ＭＡＧＥ−Ａ１)；ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、染色体１２ｐに位置(ＥＴＶ６−ＡＭＬ)；精子タンパク質１７(ＳＰＡ１７)；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ(ＸＡＧＥ１)；アンギオポエチン−結合細胞表面受容体２(Ｔｉｅ  ２)；黒色腫癌精巣抗原−１(ＭＡＤ−ＣＴ−１)；黒色腫癌精巣抗原−２(ＭＡＤ−ＣＴ−２)；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３(ｐ５３)；ｐ５３変異体；プロステイン；ｓｕｒｖｉｖｉng；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１(ＰＣＴＡ−１またはガレクチン８)、Ｔ細胞１により認識される黒色腫抗原(ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１)；ラット肉腫(Ｒａｓ)変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(ｈＴＥＲＴ)；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害物質(ＭＬ−ＩＡＰ)；ＥＲＧ(膜貫通プロテアーゼ、セリン２(ＴＭＰＲＳＳ２)ＥＴＳ融合遺伝子)；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ(ＮＡ１７)；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３(ＰＡＸ３)；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄サイトマトーシスウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ(ＭＹＣＮ)；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ(ＲｈｏＣ)；チロシナーゼ関連タンパク質２(ＴＲＰ−２)；チトクロムＰ４５０１Ｂ１(ＣＹＰ１Ｂ１)；ＣＣＣＴＣ−結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(ＢＯＲＩＳまたはBrother of the regulator of imprinted sites)、Ｔ細胞により認識される扁平上皮細胞癌抗原３(ＳＡＲＴ３)；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５(ＰＡＸ５)；プロアクロシン結合タンパク質ｐ３２(ＯＹ−ＴＥＳ１)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(ＬＣＫ)；Ａキナーゼアンカータンパク質４(ＡＫＡＰ−４)；滑膜肉腫、Ｘ限界点２(ＳＳＸ２)；終末糖化産物の受容体(ＲＡＧＥ−１)；腎臓ユビキタス１(ＲＵ１)；腎臓ユビキタス２(ＲＵ２)；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスＥ６(ＨＰＶＥ６)；ヒト乳頭腫ウイルスＥ７(ＨＰＶ  Ｅ７)；腸カルボキシルエステラーゼ；ヒートショックタンパク質７０−２変異(ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２)；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１(ＬＡＩＲ１)；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント(ＦＣＡＲまたはＣＤ８９)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２(ＬＩＬＲＡ２)；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ(ＣＤ３００ＬＦ)；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ(ＣＬＥＣ１２Ａ)；骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２(ＥＭＲ２)；リンパ球抗原７５(ＬＹ７５)；グリピカン−３(ＧＰＣ３)；Ｆｃ受容体様５(ＦＣＲＬ５)；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１(ＩＧＬＬ１)の１以上から選択される。
【０２８３】
ある態様において、抗原結合ドメインは、上に挙げた抗体からの１、２、３(例えば、全３)重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３および／または上に挙げた抗体からの１、２、３(例えば、全３)軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、上に挙げたまたは記載した抗体の重鎖可変領域および／または可変軽鎖領域を含む。
【０２８４】
ある面において、抗腫瘍抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある面において、ここに記載する抗癌関連抗原結合ドメインはＦｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２または二機能的(例えば二特異的)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))。ある面において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、ここに記載する癌関連抗原タンパク質と野生型のまたは増強された親和性で結合する。
【０２８５】
ある例において、ｓｃＦｖｓを、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。ＳｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用してＶＨとＶＬ領域を相互に連結することにより産生できる。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに影響する。実際、短ポリペプチドリンカーを用いたならば(例えば、５〜１０アミノ酸)鎖内折り畳みは阻止される。鎖内折り畳みはまた機能的エピトープ結合部位を形成するために、２可変領域を一緒にするのに必要である。リンカー配向およびサイズの例として、例えば、引用により本明細書に包含させる、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号を参照のこと。
【０２８６】
ｓｃＦｖは、ＶＬ領域とＶＨ領域の間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある態様において、リンカー配列はアミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎのような一連のグリシンおよびセリン反復を含み、ここで、ｎは１以上の正の整数である(配列番号２５)。ある態様において、リンカーは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)であり得る。リンカー長の変動は、活性を保持または増強し得て、活性試験における優れた有効性を生じる。
【０２８７】
他の面において、抗原結合ドメインはＴ細胞受容体(“ＴＣＲ”)またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲ(ｓｃＴＣＲ)である。このようなＴＣＲを製造する方法が当分野で知られる。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)参照(引用文献は、その全体をここに包含させる)。例えば、ｓｃＴＣＲを、リンカー(例えば、可動性ペプチド)により連結したＴ細胞クローンからのＶαおよびＶβ遺伝子を含むように操作できる。この試みは、それ自体は細胞内であるが、そのような抗原(ペプチド)のフラグメントがＭＨＣにより癌細胞表面に提示される癌関連標的に極めて有用である。
【０２８８】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の態様において、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合した膜貫通ドメインを含むＣＡＲを操作できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１以上のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通ドメインが由来するタンパク質の細胞外領域と関係する１以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関係する１以上のさらなるアミノ酸(例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)を含み得る。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの１個と関係するものである。ある例において、膜貫通ドメインを、このようなドメインの同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合、を避けるために、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために選択またはアミノ酸置換による修飾ができる。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の他のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる面において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列を、同じＣＡＲＴに存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように修飾または改変し得る。
【０２８９】
膜貫通ドメインは、天然由来でも組み換え由来でもよい。起源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合しているときは細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Tactile)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＣまたはＣＤ１９の、少なくとも膜貫通領域を含み得る。
【０２９０】
ある例において、膜貫通ドメインを、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合できる。例えば、ある態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む(例えば、からなる)。ある面において、膜貫通ドメインは、配列番号６の膜貫通ドメインを含む(例えば、からなる)。
【０２９１】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーはＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(配列番号３６)のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(配列番号３７)のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
【０２９２】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(配列番号３８)のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(配列番号１０３)のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
【０２９３】
ある面において、膜貫通ドメインは組み換えであってよく、この場合、優勢にロイシンおよびバリンのような疎水性残基を含む。ある面においてフェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットを、組み換え膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。
【０２９４】
所望により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴ−またはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域の間の結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは特に適当なリンカーを提供する。例えば、ある面において、リンカーは、GGGGSGGGGS(配列番号５)のアミノ酸配列を含む。ある態様において、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(配列番号８)のヌクレオチド配列によりコードされる。
【０２９５】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーはＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０２９６】
細胞質ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つの活性化を一般に担う。
【０２９７】
ここに記載するＣＡＲで使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体結合後のシグナル伝達に協調して働くＴ細胞受容体(ＴＣＲ)および共受容体の細胞質配列ならびに同じ機能的能力を有するこれらの配列のあらゆる誘導体またはバリアントおよびあらゆる組み換え配列を含む。
【０２９８】
ＴＣＲ単独により産生されたシグナルは、Ｔ細胞の完全活性化に不十分であり、二次性および／または共刺激性シグナルも必要であることが知られている。それゆえに、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在するということができる：ＴＣＲにより抗原依存性一次活性化を開始するもの(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)および二次性または共刺激性シグナルを提供するために抗原非依存的方法で作用するもの(二次性細胞質ドメイン、例えば、共刺激性ドメイン)。
【０２９９】
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性方向または阻害性方向で制御する。刺激性方法で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０３００】
本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても既知)、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄのものを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータ配列を含む。
【０３０１】
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば、天然ＩＴＡＭドメインと比較して改変(例えば、増加または低減)された活性を有する変異ＩＴＡＭドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または切断ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
【０３０２】
共刺激性シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン単独を含んでよく、または本発明のＣＡＲの状況で有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてよい。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激性シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分をいう。ある態様において、細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように操作する。ある面において、細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように操作する。
【０３０３】
共刺激性分子は、リンパ球の抗原への効率的応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の拡張、エフェクター機能および生存を増強し、インビボでヒトＴ細胞残留性および抗腫瘍活性を増強することが示されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。このような共刺激性分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Tactile)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＣおよびＰＡＧ／Ｃｂｐを含む。
【０３０４】
ＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、無作為のまたは特定の順序で互いに連結させ得る。所望により、短オリゴ−またはポリペプチドリンカー、例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長は、細胞内シグナル伝達配列間の結合を形成し得る。ある態様において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。ある態様において、単一アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
【０３０５】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２以上、例えば、２、３、４、５以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含むように操作する。ある態様において、２以上、例えば、２、３、４、５以上の共刺激性シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により離れる。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある態様において、リンカーはアラニン残基である。
【０３０６】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように操作する。ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように操作する。ある面において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のシグナル伝達ドメインである。ある面において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９のシグナル伝達ドメインである。
【０３０７】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように操作する。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(配列番号１６)のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(配列番号１４)の核酸配列によりコードされる。
【０３０８】
ある面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに第二ＣＡＲ、例えば、同一標的または異なる標的(例えば、ここに記載する癌関連抗原以外の標的またはここに記載する別の癌関連抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に対する異なる抗原結合ドメインを含む、例えば、第二ＣＡＲを含み得る。ある態様において、第二ＣＡＲは、癌関連抗原と同じ癌細胞型に発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、第一抗原を標的とし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第二の、異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。理論に縛られることを望まないが、共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７またはＯＸ−４０の第一ＣＡＲへの配置および一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの第二ＣＡＲへの配置は、ＣＡＲ活性を両標的が発現される細胞に限定できる。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載する標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激性ドメインを含む第一癌関連抗原ＣＡＲおよび異なる標的抗原(例えば、第一標的抗原と同じ癌細胞型に発現される抗原)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載する標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第一標的抗原以外の抗原(例えば、第一標的抗原と同じ癌細胞型に発現される抗原)を標的とし、該抗原への抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
【０３０９】
他の面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の集団に関する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。
【０３１０】
例えば、ある態様において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞および異なる抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する異なる癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるＣＡＲの抗原結合ドメインにより結合される癌関連抗原と異なるここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
【０３１１】
他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびここに記載する癌関連抗原以外の標的に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次性シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
【０３１２】
他の面において、本発明は、細胞の集団に関し、ここで、集団における少なくとも１細胞が、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞が他の物質、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する物質を発現する。例えば、ある態様において、物質は、阻害性分子を阻害する物質であり得る。阻害性分子、例えば、ＰＤ−１は、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を搭載する能力を低減できる。阻害性分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲ(例えば、ＴＧＦＲベータ)を含む。ある態様において、阻害性分子を阻害する物質は、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した第一ポリペプチド、例えば、阻害性分子である。ある態様において、物質は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメントのような阻害性分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激性ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、物質は、ＰＤ−１またはそのフラグメントの第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
【０３１３】
抗ＣＤ１９結合ドメインの配列を、ここに表１に提供する。完全ＣＡＲ構築物を、表１に記載する抗原結合ドメインのいずれかと、下に提供する１以上のさらなるＣＡＲ成分の使用により産生できる。
【０３１４】
・  リーダー(アミノ酸配列)(配列番号１)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
・  リーダー(核酸配列)(配列番号１２)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
【０３１５】
・  ＣＤ８ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号２)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
・  ＣＤ８ヒンジ(核酸配列)(配列番号１３)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
【０３１６】
・  ＣＤ８膜貫通(アミノ酸配列)(配列番号６)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
・  膜貫通(核酸配列)(配列番号１７)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
【０３１７】
・  ４−１ＢＢ細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号７)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
・  ４−１ＢＢ細胞内ドメイン(核酸配列)(配列番号１８)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
【０３１８】
・  ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列)(配列番号９)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
・  ＣＤ３ゼータ(核酸配列)(配列番号２０)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
【０３１９】
・  ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列；NCBI Reference Sequence NM_000734.3)(配列番号１０)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
・  ＣＤ３ゼータ(核酸配列；NCBI Reference Sequence NM_000734.3)；(配列番号２１)
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
【０３２０】
ＩｇＧ４ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号３６)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
ＩｇＧ４ヒンジ(ヌクレオチド配列)(配列番号３７)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
【０３２１】
ＥＦ１アルファプロモーター
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(配列番号１１)。
【０３２２】
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２５)
GGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２６)：この配列は、１〜６“Gly Gly Gly Gly Ser”反復単位を含み得る
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２７)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２８)
GGGGSGGGGS GGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２９)
GGGS
【０３２３】
ポリＡ(配列番号３０)：Ａ５０００
ポリＡ(配列番号３１)：Ａ１００
ポリＴ(配列番号３２)：Ｔ５０００
ポリＡ(配列番号３３)：Ａ５０００
ポリＡ(配列番号３４)：Ａ４００
ポリＡ(配列番号３５)：Ａ２０００
【０３２４】
・  Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号１５)：この配列は１〜１０“Gly Gly Gly Ser”反復単位を含み得る
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
【０３２５】
ここに記載する方法において使用できる例示的ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物を表３に示す。
【表４】
2018500944.tif 000008
【表５】
2018500944.tif 000009
【０３２６】
【表６】
2018500944.tif 000010
【表７】
2018500944.tif 000011
【０３２７】
【表８】
2018500944.tif 000012
【表９】
2018500944.tif 000013
【０３２８】
【表１０】
2018500944.tif 000014
【表１１】
2018500944.tif 000015
【０３２９】
【表１２】
2018500944.tif 000016
【表１３】
2018500944.tif 000017
【０３３０】
【表１４】
2018500944.tif 000018
【表１５】
2018500944.tif 000019
【０３３１】
【表１６】
2018500944.tif 000020
【表１７】
2018500944.tif 000021
【０３３２】
【表１８】
2018500944.tif 000022
【表１９】
2018500944.tif 000023
【０３３３】
【表２０】
2018500944.tif 000024
【表２１】
2018500944.tif 000025
【０３３４】
【表２２】
2018500944.tif 000026
【表２３】
2018500944.tif 000027
【０３３５】
【表２４】
2018500944.tif 000028
【表２５】
2018500944.tif 000029
【０３３６】
ＣＡＲと他の分子または物質との共発現
第二ＣＡＲの共発現
ある面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに第二ＣＡＲ、例えば、同じ標的(例えば、ＣＤ１９)または異なる標的(例えば、ＣＤ１９と異なる標的、例えば、ここに記載する標的)に対する異なる抗原結合ドメインを含む、例えば、第二ＣＡＲを含み得る。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、第一抗原を標的とし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第二の、異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０またはＩＣＯＳの第一ＣＡＲへの配置および一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの第二ＣＡＲへの配置は、ＣＡＲ活性を両標的が発現される細胞に限定できる。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激性ドメインを含む第一ＣＡＲおよび他の抗原を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび他の抗原を標的とし、該抗原への抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
【０３３７】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載するＸＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞に見られるが、癌細胞に見られず、例えば、Ｘも発現する抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、阻害性分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲ(例えば、ＴＧＦＲベータ)の細胞内ドメインであり得る。
【０３３８】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が２以上の異なるＣＡＲを含むとき、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、これら抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものである。例えば、第一および第二ＣＡＲを発現する細胞は、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインを、例えば、フラグメント、例えば、ｓｃＦｖとして有することができ、これは、第二ＣＡＲの抗原結合ドメインと結合を形成せず、例えば、第二ＣＡＲの抗原結合ドメインはＶＨＨである。
【０３３９】
ある態様において、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子を含み、これは、相補的決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む。その例は、重鎖可変ドメイン、天然に軽鎖を欠く結合分子、単一ドメイン由来する慣用の４鎖抗体、操作されたドメインおよび抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当分野で知られるまたは将来的に知られるであろうあらゆる単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されない任意の種に由来し得る。本用語はまたラクダ科およびサメ以外の種からの天然に存在する単一ドメイン抗体分子を含み得る。
【０３４０】
ある面において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメ血清において発見された新規抗原受容体(ＮＡＲ)として知られる免疫グロブリンアイソタイプに由来するもののような、魚で見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲ可変領域由来単一ドメイン分子(“ＩｇＮＡＲ”)を製造する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載されている。
【０３４１】
他の側面では、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に開示されている。明確化のために、この天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの通常のＶＨと区別するように、この分野では、ＶＨＨまたはナノボディとして知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコ由来であり得る。ラクダ科以外の種は天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生し得、このようなＶＨＨは本発明の範囲内である。
【０３４２】
ＳＤＡＢ分子は、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化および／またはインビトロ産生(例えば、ファージディスプレイにより選択)であり得る。
【０３４３】
抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞において、例えば、１以上の抗原結合ドメインがその同族抗原に結合する能力を阻害するため、受容体の抗原結合ドメイン間の相互作用が望ましくないものであり得ることも判明した。したがって、ここに開示されるのは、このような相互作用が最小化された抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞である。またここに開示されるのは、このような相互作用が最小化された抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸ならびにこのような細胞および核酸を製造および使用する方法である。ある態様において、第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインの一方はｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。
【０３４４】
ある態様において、ここでの組成物は第一および第二ＣＡＲを含み、ここで、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインを含まない。ある態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはナノボディを含む。ある態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【０３４５】
ある態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【０３４６】
ある態様において、細胞の表面に存在するとき、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第二ＣＡＲの存在により実質的に減少しない。ある態様において、  第二ＣＡＲ存在下の第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第二ＣＡＲ非存在下の第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【０３４７】
ある態様において、細胞の表面に存在するとき、第一および第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインにある場合より少なく互いに結合する。ある態様において、第一および第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインにあるときより他の少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より少なく、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少なく互いに結合する。
【０３４８】
ＣＡＲ活性を増強する物質の共発現
他の面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに他の物質、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性または適合性を増強する物質を発現できる。
【０３４９】
例えば、ある態様において、物質は、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば、阻害する分子を阻害する物質であり得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御する分子は阻害性分子である。阻害性分子、例えば、ＰＤ１は、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を搭載する能力を低減させ得る。阻害性分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦＲベータを含む。
【０３５０】
ある態様において、例えば、ここに記載するような、物質、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ；または例えば、阻害性タンパク質または系、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＣＡＲ発現細胞におけるＴ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害できる。ある態様において、物質はｓｈＲＮＡ、例えば、ここに記載するｓｈＲＮＡである。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する因子は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。例えば、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲの成分、例えば、成分の全てをコードする核酸と連結させる。
【０３５１】
ある態様において、阻害性分子を阻害する物質は、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した第一ポリペプチド、例えば、阻害性分子を含む。ある態様において、物質は、第一ポリペプチド、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの少なくとも細胞外ドメイン部分)のような阻害性分子およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激性ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、物質は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメイン部分)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 is abundant in human cancers (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所阻害の阻害により回復され得る。
【０３５２】
ある態様において、阻害性分子、例えば、プログラム死１(ＰＤ１)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含む物質を、膜貫通ドメインおよび４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような細胞内シグナル伝達ドメインと融合させ得る(ここではＰＤ１  ＣＡＲとも称する)。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、ここに記載するＸＣＡＲと組み合わせて使用したとき、Ｔ細胞の残留性を改善する。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号１０５の下線で示すＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＣＡＲである。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
【化３】
2018500944.tif 000030
【０３５３】
ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、下に示すアミノ酸配列(配列番号１０６)を含む。
【化４】
2018500944.tif 000031
【０３５４】
ある態様において、物質は、ＰＤ１  ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲの核酸配列を下に示し、ＰＤ１  ＥＣＤを下において配列番号１０７で下線を付す。
【化５】
2018500944.tif 000032
【０３５５】
他の例において、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する物質は共刺激性分子または共刺激性分子リガンドであり得る。共刺激性分子の例は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)を含むう。このような共刺激性分子のさらなる例は、例えば、ここに記載するような、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Tactile)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む。共刺激性分子リガンドの例は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬおよびＬＩＧＨＴを含む。ある態様において、共刺激性分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激性分子ドメインと異なる共刺激性分子のリガンドである。ある態様において、共刺激性分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激性分子ドメインと同じ共刺激性分子のリガンドである。ある態様において、共刺激性分子リガンドは４−１ＢＢＬである。ある態様において、共刺激性リガンドはＣＤ８０またはＣＤ８６である。ある態様において、共刺激性分子リガンドはＣＤ７０である。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を、１以上のさらなる共刺激性分子または共刺激性分子リガンドを発現するようにさらに操作できる
【０３５６】
ＣＡＲとケモカイン受容体の共発現
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞は、さらにケモカイン受容体分子を含む。Ｔ細胞におけるケモカイン受容体ＣＣＲ２ｂまたはＣＸＣＲ２のトランスジェニック発現は、黒色腫および神経芽腫を含むＣＣＬ２−またはＣＸＣＬ１分泌固形腫瘍への輸送を増強する(Craddock et al., J Immunother. 2010 Oct; 33(8):780-8およびKershaw et al., Hum Gene Ther. 2002 Nov 1; 13(16):1971-80)。それゆえに、理論に縛られることを望まないが、腫瘍、例えば、固形腫瘍により分泌されるケモカインを認識するＣＡＲ発現細胞において発現されるケモカイン受容体は、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍へのホーミングを改善し、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍への浸潤を促進し、そしてＣＡＲ発現細胞の抗腫瘍有効性を増強すると考えられる。ケモカイン受容体分子は、天然に存在するまたは組み換えケモカイン受容体またはそのケモカイン結合フラグメントを含み得る。ここに記載するＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ−Ｔｘ)における発現に適するケモカイン受容体分子は、ＣＸＣケモカイン受容体(例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６またはＣＸＣＲ７)、ＣＣケモカイン受容体(例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０またはＣＣＲ１１)、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体(例えば、ＣＸ３ＣＲ１)、ＸＣケモカイン受容体(例えば、ＸＣＲ１)またはそのケモカイン結合フラグメントを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲと共に発現させるケモカイン受容体分子は、腫瘍により発現されるケモカインに基づき選択する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらにＣＣＲ２ｂ受容体またはＣＸＣＲ２受容体を含む、例えば、発現する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は、同じベクターにあるかまたは２つの異なるベクターにある。ここに記載するＣＡＲおよびケモカイン受容体分子が同じベクターにある態様において、ＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は、各々２つの異なるプロモーターの制御下にあるかまたは同じプロモーターの制御下にある。
【０３５７】
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明はまた、ここに記載する１以上のＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を含む、例えば、ここに記載する方法により製造された、免疫エフェクター細胞も提供する。ある面において、核酸分子はメッセンジャーＲＮＡトランスクリプトとして提供される。ある面において、核酸分子はＤＮＡ構築物として提供される。
【０３５８】
ここに記載する核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子またはこれらの組み合わせであり得る。ある態様において、核酸分子は、ここに記載するＣＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。他の態様において、核酸分子は、前記核酸分子のいずれかを含むベクターである。
【０３５９】
ある面において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている核酸分子によりコードされる。ある面において、本発明のＣＡＲ構築物全体は、配列全体が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている核酸分子によりコードされる。コドン最適化は、コードＤＮＡにおける同義コドン(すなわち、同一アミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が、種毎に偏っているとの発見をいう。このようなコドン縮重は、同一ポリペプチドが多様なヌクレオチド配列によりコードされることを可能にする。多様なコドン最適化方法が当分野で知られ、例えば、少なくとも米国特許５,７８６,４６４号および６,１１４,１４８号に開示された方法を含む。
【０３６０】
したがって、ある面において、例えば、ここに記載する方法により製造された、免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする核酸分子を含み、ここで、ＣＡＲは、ここに記載する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および刺激性ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメイン)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載するゼータ鎖)を含む細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。
【０３６１】
本発明はまた、ＣＡＲをコードする核酸分子、例えば、ここに記載する核酸分子が挿入されたベクターも提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期にわたる、安定な組込みおよび娘細胞へのその遺伝を可能にするため、長期遺伝子導入の達成に適当なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖性細胞に形質導入できるため、マウス白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルスに由来するベクターを超える利点を有する。低免疫原性であるとのさらなる利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターでもあり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(ＰＢＳ)、１以上(例えば、２)の末端反復配列(ＬＴＲ)および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのようなウイルス構造遺伝子を欠き得る。例示的ガンマレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)およびこれら由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載されている。
【０３６２】
他の態様において、所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターはアデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。他の態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、sleeping beauty、crisper、ＣＡＳ９および亜鉛フィンガーヌクレアーゼのようなトランスポゾンの使用により達成できる。引用により本明細書に包含させるJune et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716参照。
【０３６３】
簡潔に概要を述べると、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、一般にＣＡＲポリペプチドをコードする核酸またはその部分をプロモーターと操作可能に連結させ、該構築物を発現ベクターに取り込ませることにより達成される。ベクターは、真核生物での複製および組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
【０３６４】
核酸を、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよびシーケンシングベクターを含む。
【０３６５】
さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形で細胞に提供できる。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許６,３２６,１９３号)。
【０３６６】
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。当分野で知られる技術を使用して、選択遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。組み換えウイルスを、次いでインビボまたはエクスビボで単離し、対象の細胞に送達できる。多数のレトロウイルス系が当分野で知られる。ある態様において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。ある態様において、レンチウイルスベクターが使用される。
【０３６７】
さらなるプロモーター成分、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。一般に、これらは、開始部位の３０〜１１０bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位の下流に同様に機能的成分を含むことが示されている。プロモーター成分間のスペーシングは、プロモーター機能が、これら成分が互いに逆になったときまたは移動したときに保持されるように、しばしば可動性である。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーター成分間のスペーシングは、活性が低減し始める前に５０bp離れるまで増加し得る。プロモーターにより、個々の成分が、転写活性化のために協調的にまたは個々に機能できるように見える。例示的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。
【０３６８】
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲコード化核酸分子を発現できるプロモーターの例は、ＥＦ１プロモーターである。天然ＥＦ１プロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素的送達を担う伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１プロモーターは、哺乳動物発現プラスミドにおいて広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された核酸分子からのＣＡＲ発現の駆動に有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)参照。ある面において、ＥＦ１プロモーターは、実施例に提供する配列を含む。
【０３６９】
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０(ＳＶ４０)早期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターのようなしかしこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーター配列も使用してよい。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望ましいときにオンにするまたは発現が望ましくないときに発現をオフにすることができる分子スイッチを提供できる。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０３７０】
プロモーターの他の例は、ホスホグリセラートキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターである。ある態様において、切断ＰＧＫプロモーター(例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較したとき、１以上、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００または４００ヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター)が所望され得る。
【０３７１】
例示的ＰＧＫプロモーターのヌクレオチド配列を下に提供する。
ＷＴ  ＰＧＫプロモーター：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(配列番号１０９)
【０３７２】
例示的切断ＰＧＫプロモーター：
ＰＧＫ１００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(配列番号１１０)
【０３７３】
ＰＧＫ２００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(配列番号１１１)
【０３７４】
ＰＧＫ３００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(配列番号１１２)
【０３７５】
ＰＧＫ４００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(配列番号１１３)
【０３７６】
ベクターは、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子から)、原核生物におけるエピソーム複製および複製を可能にする成分(例えばＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当分野で知られるその他)および／または選択を可能にする成分(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー)も含み得る。
【０３７７】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを介する遺伝子導入または感染が探索される細胞集団から、発現細胞の特定および選択を容易にするために選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両者も含み得る。他の面において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの異なる切片により運搬されてよく、共遺伝子導入法により使用される。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の両者は、宿主細胞における発現を可能とするために、適切な調節性配列に隣接させ得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどのような抗生物質耐性遺伝子を含む。
【０３７８】
レポーター遺伝子を、潜在的遺伝子導入細胞の同定および調節性配列の機能性の評価に使用する。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在せずまたはそれらにより発現されず、その発現がある容易に検出可能な性質、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後適当な時間にアッセイされる。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技術により製造しても、商業的に得てもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動転写を調節する能力について物質を評価するのに使用され得る。
【０３７９】
ある態様において、ベクターは、２以上の核酸ＣＡＲをコードする配列、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲおよび第二ＣＡＲ、例えば、阻害性ＣＡＲまたはＣＤ１９以外の抗原に特異的に結合するＣＡＲを含み得る。このような態様において、ＣＡＲをコードする２以上の核酸配列は、同じフレーム内の単一核分子により、単一ポリペプチド鎖としてコードされる。この面において、２以上のＣＡＲは、例えば、１以上のペプチド開裂部位により分離され得る(例えば、自己開裂部位または細胞内プロテアーゼ用基質)。ペプチド開裂部位の例は、Ｔ２Ａ部位、Ｐ２Ａ部位、Ｅ２Ａ部位またはＦ２Ａ部位を含む。
【０３８０】
遺伝子を細胞に導入に、発現させる方法が当分野で知られる。発現ベクターの状況において、ベクターを、あらゆる方法、例えば、当分野で知られるものにより、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に容易に導入できる。例えば、発現ベクターを、物理的、化学的または生物学的手段により宿主細胞に導入できる。
【０３８１】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を産生する方法は当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY参照。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入のための適当な方法は、リン酸カルシウム遺伝子導入である。
【０３８２】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子の哺乳動物、例えば、ヒト細胞への挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号参照。
【０３８３】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系のようなコロイド分散体系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用する例示的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なミクロン未満のサイズの送達系でのポリヌクレオチドの送達のような他の最先端核酸標的化送達法が利用可能である。
【０３８４】
非ウイルス送達系を利用する場合、例示的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用が、宿主細胞への核酸の導入に企図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の面において、核酸を脂質と結合させ得る。脂質と結合した核酸をリポソームの水性内側に封入し、リポソームの脂質二重層内に分散させ、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両者と結合する結合分子を経てリポソームに結合させ、リポソームに封入し、リポソームと複合体化させ、脂質含有溶液に分散させ、脂質と混合し、脂質と組み合わせ、脂質中の懸濁液として包含させ、ミセルに包含させまたは複合体化させまたは他に脂質と結合させてよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液で何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは二重層構造、ミセルまたは“崩壊”構造で存在し得る。それらは単に溶液に分散していてもよく、おそらく、大きさまたは形が均一ではない凝集体を形成する。脂質は、天然に存在するまたは合成である脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に存在する脂肪滴ならびに長鎖脂肪族炭化水素および脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのようなその誘導体を含む一群の化合物を含む。
【０３８５】
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ、ジセチルホスフェート(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories (Plainview, NY)から得ることができ、コレステロール(“Ｃｈｏｉ”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液を約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用する。“リポソーム”は、封入脂質二重層または凝集体の生成により形成される多様な単および多重膜脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重膜および内部水性媒体を伴う小胞構造を有するとして特徴付けられ得る。多重膜リポソームは、水性媒体により分離された複数の脂質層を含む。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質成分は自己再構成され、その後閉構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層内に封入する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、溶液で通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造であるかまたは単に脂質分子の不均一な凝集体とみなし得る。またリポフェクタミン−核酸複合体も企図される。
【０３８６】
外来核酸を宿主細胞に導入するまたは他に細胞を本発明の阻害物質に曝す方法と無関係に、宿主細胞における組み換え核酸配列の存在を確認するために、多様なアッセイを実施し得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ；例えば、免疫学的手段(ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット)により、特定のペプチドの存在または不在を検出するまたは本発明の範囲内に入る物質を特定するためのここに記載するアッセイによるような、“生化学的”アッセイを含む。
【０３８７】
ナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)ＣＡＲ
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ分子は、ナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)の１以上の成分を含み、それによりＮＫＲ−ＣＡＲを形成する。ＮＫＲ成分は、次のナチュラルキラー細胞受容体のいずれかからの膜貫通ドメイン、ヒンジドメインまたは細胞質ドメインであり得る：キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞毒性受容体(ＮＣＲ)、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭ)ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)、例えば、ＣＤ１６およびＣＤ６４；およびＬｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃ。ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ分子は、アダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用し得る。ＮＫＲ成分を含むＣＡＲ分子の例示的配置および配列は、内容を引用により本明細書に包含させる国際公開ＷＯ２０１４／１４５２５２号に記載されている。
【０３８８】
スプリットＣＡＲ
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞はスプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、公報ＷＯ２０１４／０５５４４２号およびＷＯ２０１４／０５５６５７号により詳細に記載される。簡潔にいうと、スプリットＣＡＲ系は、第一抗原結合ドメインおよび共刺激性ドメイン(例えば、４１ＢＢ)を有する第一ＣＡＲを発現する細胞を含み、該細胞はまた第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を有する第二ＣＡＲも発現する。細胞が第一抗原に遭遇したとき、共刺激性ドメインは活性化され、細胞が増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインは活性化され、細胞−死滅活性が開始される。それゆえに、ＣＡＲ発現細胞は、両抗原の存在下でのみ完全活性化される。
【０３８９】
キメラ抗原受容体制御のための戦略
ある態様において、ＣＡＲ活性が制御できる制御可能ＣＡＲ(ＲＣＡＲ)が、ＣＡＲ治療の安全性および有効性を最適化するために望ましい。ＣＡＲ活性が制御され得る多くの方法がある。例えば、二量体化ドメインに融合したカスパーゼ(例えば、Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683参照)を使用する、例えば、誘導性アポトーシスを、本発明のＣＡＲ治療における安全性スイッチとして使用できる。ある態様において、本発明のＣＡＲを発現する細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)はさらに誘導性アポトーシススイッチを含み、ここで、ヒトカスパーゼ(例えば、カスパーゼ９)または修飾バージョンが、条件的二量体化を可能にするヒトＦＫＢタンパク質の修飾に融合する。ラパログ(例えば、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７)のような小分子存在下、誘導性カスパーゼ(例えば、カスパーゼ９)が活性化され、本発明のＣＡＲを発現する細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の迅速なアポトーシスおよび死を生じる。カスパーゼベースの誘導性アポトーシススイッチ(またはこのようなスイッチ１以上の局面)の例は、例えば、ＵＳ２００４０４００４７号；ＵＳ２０１１０２８６９８０号；ＵＳ２０１４０２５５３６０号；ＷＯ１９９７０３１８９９号；ＷＯ２０１４１５１９６０号；ＷＯ２０１４１６４３４８号；ＷＯ２０１４１９７６３８号；ＷＯ２０１４１９７６３８号に記載されており；これら全てを引用により本明細書に包含させる。
【０３９０】
他の例において、ＣＡＲ発現細胞はまた誘導性カスパーゼ−９(ｉカスパーゼ−９)分子も発現でき、これは、二量体化剤(例えば、rimiducid(別名AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)またはAP20187(Ariad))の投与により、細胞のカスパーゼ−９およびアポトーシスの活性化に至る。ｉカスパーゼ−９分子は、二量体化(ＣＩＤ)存在下二量体化に介在する、ＣＩＤ結合ドメインの化学的インデューサーを含む。これは、ＣＡＲ発現細胞の誘導的および選択的枯渇をもたらす。ある場合、ｉカスパーゼ−９分子は、ＣＡＲコード化ベクターと離れた核酸分子によりコードされる。ある場合、ｉカスパーゼ−９分子は、ＣＡＲコード化ベクターと同じ核酸分子によりコードされる。ｉカスパーゼ−９は、ＣＡＲ発現細胞の何らかの毒性を避けるための安全性スイッチを提供できる。例えば、Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. No. NCT02107963;およびDi Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83参照。
【０３９１】
本発明のＣＡＲ治療を制御するための代替的ストラテジーは、例えば、抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)の誘発による、例えば、ＣＡＲ発現細胞の削除により、ＣＡＲ活性を不活性化またはオフにする小分子または抗体を含む。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、細胞死、例えば、ＡＤＣＣまたは補体誘発細胞死を誘発できる分子により認識される抗原も発現し得る。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、抗体または抗体フラグメントにより標的化され得る受容体も発現し得る。このような受容体の例は、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン(例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ3/4β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν)、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー(例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２)、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７およびＥＧＦＲおよびこれらの切断バージョン(例えば、１以上細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の１以上の領域を欠くバージョン)を含む。
【０３９２】
例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、シグナル伝達能を欠くが、ＡＤＣＣを誘発することができる分子、例えば、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))により認識されるエピトープを保持する切断上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)を、セツキシマブ投与がＡＤＣＣおよびＣＡＲ発現細胞のその後の枯渇も誘発するように、発現し得る(例えば、ＷＯ２０１１／０５６８９４号およびJonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860参照)。他のストラテジーは、例えば、ＡＤＣＣによる、ＣＡＲ発現細胞の選択的枯渇をもたらす、リツキシマブと結合する、ここに記載するＣＡＲ発現細胞においてＣＤ３２およびＣＤ２０抗原両者由来の標的エピトープを合わせる高度にコンパクトなマーカー／自殺遺伝子の発現を含む(例えば、Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287参照)。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を枯渇させる他の方法は、例えば、ＡＤＣＣによる、破壊のために、成熟リンパ球、例えば、ＣＡＲ発現細胞と選択的に結合し、標的とする、モノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるキャンパスの投与を含む。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化され得る。ある態様において、抗イディオタイプ抗体はエフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らし得る。他の態様において、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体を細胞死滅を誘発する物質、例えば、トキシンと連結し、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らし得る。あるいは、ＣＡＲ分子それ自体が、下記のとおり、活性が制御され得るように、例えば、オンおよびオフとなるように操作できる。
【０３９３】
他の態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、Ｔ細胞枯渇剤により認識される標的タンパク質も発現し得る。ある態様において、標的タンパク質はＣＤ２０であり、Ｔ細胞枯渇剤は抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブである。このような態様において、Ｔ細胞枯渇剤を、例えば、ＣＡＲ誘発毒性を軽減するために、ＣＡＲ発現細胞を減少または排除することが望ましいときに投与する。他の態様において、Ｔ細胞枯渇剤は、ここでの実施例に記載のような、抗ＣＤ５２抗体、例えば、アレムツズマブである。
【０３９４】
他の態様において、ＲＣＡＲは、ここに記載する標準的ＣＡＲの成分、例えば、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが、別々のポリペプチドまたはメンバーに分割される、一般に最も単純な態様においては２の、ポリペプチドのセットを含む。ある態様において、ポリペプチドのセットは、二量体化分子存在下、一方のポリペプチドを他方と連結できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインと連結できる、二量体化スイッチを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲは、例えば、引用により本明細書に包含させる、ＷＯ２０１４１２７２６１号に記載のもののような二量体化スイッチを利用する。このような制御可能ＣＡＲのさらなる記載および例示的配置は、ここに、および、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際公開ＷＯ２０１５／０９０２２９号のパラグラフ５２７〜５５１に提供される。ある態様において、ＲＣＡＲは、スイッチドメイン、例えば、配列番号１１４に示すＦＫＢＰスイッチドメインを含むかまたは例えば、配列番号１１５に示すようなＦＲＢと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメントを含む。ある態様において、ＲＣＡＲは、例えば、配列番号１１６に示すＦＲＢ配列、または、例えば、配列番号１１７〜１２２に示す変異体ＦＲＢ配列を含むスイッチドメインを含む。
【０３９５】
DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY(配列番号１１４)
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETＳ(配列番号１１５)
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK(配列番号１１６)
【０３９６】
【表２６】
2018500944.tif 000033
【０３９７】
ＲＮＡ遺伝子導入
ここに開示されるのは、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲを製造する方法である。ＲＮＡ  ＣＡＲおよびそれを使用する方法は、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ５５３〜５７０に記載される。
【０３９８】
免疫エフェクター細胞は、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされるＣＡＲを含み得る。ある面において、ここに記載するＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＣＡＲ発現細胞の産生のために、例えば、ここに記載する方法により製造された、免疫エフェクター細胞に導入され得る。
【０３９９】
ある態様において、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲは、一過性遺伝子導入の形で細胞に導入され得る。ＲＮＡは、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)産生鋳型を使用するインビトロ転写を使用して産生する。何らかの源からの目的のＤＮＡを、ＰＣＲにより、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接変換できる。ＤＮＡの源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列または何らかの他の適切なＤＮＡの源であり得る。インビトロ転写のための所望の鋳型はここに記載するＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲのための鋳型は、ここに記載する腫瘍関連抗原に対する抗体の一本鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメインのような、ここに記載する膜貫通ドメイン)；および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインを含む、例えば、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む、細胞質領域を含む。
【０４００】
ある態様において、ＰＣＲで使用するＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であり得る。ある態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)の一部または全てを含み得る。核酸は、エキソンおよびイントロンを含み得る。ある態様において、ＰＣＲで使用するＤＮＡはヒト核酸配列である。他の態様において、ＰＣＲで使用するＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、あるいは天然に存在する生物で通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。例示的人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように、一緒にライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。一緒にライゲートされるＤＮＡの部分は、単一生物由来でも１を超える生物由来でもよい。
【０４０１】
ＰＣＲを、遺伝子導入に使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型の産生に使用する。ＰＣＲを実施する方法は、当分野で周知である。ＰＣＲで使用するプライマーは、ＰＣＲの鋳型として使用するＤＮＡの領域に実質的に相補的である領域を含むように操作される。ここで使用する“実質的に相補的”は、プライマー配列の塩基の大部分または全てが相補的であるかまたは１以上の塩基が非相補的または不適正である、ヌクレオチドの配列をいう。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下で、意図するＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の何らかの部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、５’および３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される核酸部分(オープンリーディングフレーム)を増幅するように操作できる。プライマーはまた特定の目的のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも操作できる。ある態様において、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように操作できる。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野で周知である合成方法により産生できる。“順方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の上流であるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“上流”は、ここでは、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配列の５’の位置をいうために使用する。“逆方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の下流である二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“下流”は、ここでは、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配列の３’の位置をいうために使用する。
【０４０２】
ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼを、ここに開示する方法で使用できる。試薬およびポリメラーゼは、多数の業者から商業的に入手可能である。
【０４０３】
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学的構造も使用し得る。ある態様におけるＲＮＡは、５’および３’ＵＴＲを有する。ある態様において、５’ＵＴＲは、１〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加する５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの種々の領域とアニールするＰＣＲ用プライマーの操作を含むが、これらに限定されない、種々の方法により改変され得る。この試みを使用して、当業者は、転写ＲＮＡの遺伝子導入後最適翻訳効率の達成に必要な５’および３’ＵＴＲ長を修飾できる。
【０４０４】
５’および３’ＵＴＲは、目的の核酸のための、天然に存在する、内因性５’および３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の核酸に内因性ではないＵＴＲ配列を、ＵＴＲ配列を順方向および逆方向プライマーに取り込ませることによりまたは鋳型の何らかの他の修飾により添加できる。目的の核酸に内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率の修飾に有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列におけるＡＵ富成分が、ｍＲＮＡの安定性を低減し得ることが知られる。それゆえに、３’ＵＴＲを、当分野で周知である、ＵＴＲの性質に基づき、転写ＲＮＡの安定性を増加するように選択または操作できる。
【０４０５】
ある態様において、５’ＵＴＲは、内因性核酸のコザック配列を含み得る。あるいは、目的の核酸に内因性ではない５’ＵＴＲを上記のようにＰＣＲで付加するとき、コンセンサスコザック配列を、５’ＵＴＲ配列の付加により再操作できる。コザック配列は、あるＲＮＡトランスクリプトの翻訳効率を高め得るが、効率的翻訳を可能にするために全ＲＮＡで必要であるようには見えない。多くのｍＲＮＡについてのコザック配列の必要性は、当分野で知られる。他の態様において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲである。他の態様において、種々のヌクレオチド類似体を、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために３’または５’ＵＴＲにおいて使用できる。
【０４０６】
遺伝子クローニングの必要なくＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするために、転写のプロモーターを、転写する配列の上流のＤＮＡ鋳型に付着させるべきである。ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの５’末端に付加するとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写するオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に取り込まれるようになる。ある態様において、プロモーターは、ここでの他の場所に記載するとおり、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのためのコンセンサスヌクレオチド配列が当分野で知られる。
【０４０７】
ある態様において、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳の開始および細胞におけるｍＲＮＡ安定性を決定する、５’末端および３’ポリ(Ａ)テイルの両者上にキャップを有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、長い鎖状体産物を産生し、これは、真核細胞における発現に適さない。３’ＵＴＲの末端で直線化したプラスミドＤＮＡの転写は、転写後ポリアデニル化されても、真核遺伝子導入に有効ではない、通常サイズのｍＲＮＡをもたらす。
【０４０８】
直線状ＤＮＡ鋳型において、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、トランスクリプトの３’末端を鋳型の最後の塩基を超えて伸長できる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。
【０４０９】
ＤＮＡ鋳型へのポリＡ／Ｔストレッチ組込みの慣用法は分子クローニングである。しかしながらプラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミド不安定性を起し得て、これが、細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型がなぜしばしば欠失および他の異常で高度に汚染されているかの理由である。これにより、クローニング法が骨が折れ、時間がかかるだけでなく、しばしば信頼性がないものとなる。これが、クローニングを用いないポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築が高度に望まれる理由である。
【０４１０】
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００Ｔテイル(配列番号３１)のようなポリＴテイル(サイズは５０〜５０００Ｔ(配列番号３２)であり得る)を含む逆方向プライマーの使用によりＰＣＲ中またはＰＣＲ後、ＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない他の方法により、産生できる。ポリ(Ａ)テイルはまたＲＮＡに安定性を提供し、その分解を低減させる。一般に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写ＲＮＡの安定性と正に相関する。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルは、１００〜５０００アデノシン(例えば、配列番号３３)である。
【０４１１】
ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)のようなポリ(Ａ)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後さらに伸長できる。ある態様において、ポリ(Ａ)テイル長の１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチド(配列番号３４)への増加は、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加をもたらす。さらに、種々の化学基の３’末端への結合は、ｍＲＮＡ安定性を増加させ得る。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログを、ポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用してポリ(Ａ)テイルに取り込み得る。ＡＴＰアナログは、ＲＮＡの安定性をさらに増加させ得る。
【０４１２】
５’キャップもまたＲＮＡ分子に安定性を提供する。ある態様において、ここに開示する方法により産生したＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、当分野で知られ、ここに記載する技術を使用して提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
【０４１３】
ここに開示する方法により産生したＲＮＡはまた配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳開始を促進する、あらゆるウイルス、染色体または人工操作配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤のような細胞透過性および生存能を促進する因子を含み得る、細胞エレクトロポレーションに適するあらゆる溶質が包含され得る。
【０４１４】
ＲＮＡは、多数の異なる方法、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在遺伝子導入、ポリマー封入、ペプチド介在遺伝子導入または“遺伝子銃”のような微粒子銃送達系(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)を含むが、これらに限定されない、商業的に利用可能な方法のいずれかを使用して、標的細胞に導入され得る。
【０４１５】
非ウイルス送達方法
ある面において、非ウイルス方法を使用して、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を細胞または組織または対象に送達できる。
【０４１６】
ある態様において、非ウイルス方法は、トランスポゾン(転位性成分とも呼ばれる)の使用を含む。ある態様において、トランスポゾンは、それ自体、ゲノムにおけるある位置に挿入され得るＤＮＡ片、例えば、自己複製し、そのコピーをゲノムに挿入できるＤＮＡ片または長い核酸から巣プライスされ、ゲノムの他の位置に挿入され得るＤＮＡ片である。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆反復フランキング遺伝子からなるＤＮＡ配列を含む。
【０４１７】
トランスポゾンを使用する核酸送達の例示的方法は、Sleeping beautyトランスポゾン系(ＳＢＴＳ)およびpiggyBac(ＰＢ)トランスポゾン系を含む。例えば、全て引用により本明細書に包含させるAronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65;およびDing et al. Cell. 122.3(2005):473-83参照。
【０４１８】
ＳＢＴＳは、２成分含む：１)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび２)トランスポザーゼ酵素の源。トランスポザーゼは、担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)からのトランスポゾンを、宿主細胞染色体／ゲノムのような標的ＤＮＡに転置できる。例えば、トランスポザーゼは担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子を含む)をプラスミドから切り出し、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えば、Aronovich et al. supra.参照。
【０４１９】
例示的トランスポゾンは、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、全て引用により本明細書に包含させるGrabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47;およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971参照。例示的トランスポザーゼは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポザーゼまたはＳＢ１１トランスポザーゼ(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現され得る機能亢進トランスポザーゼ)を含む。例えば、全て引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al.; Kebriaei et al.;およびGrabundzija et al.参照。
【０４２０】
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能とする。ここに提供されるのは、例えば、ＳＢＴＳのようなトランスポゾン系を使用する、ここに記載するＣＡＲを安定に発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を産生する方法である。
【０４２１】
ここに記載する方法によって、ある態様において、ＳＢＴＳ成分を含む１以上の核酸、例えば、プラスミドが、細胞(例えば、ＴまたはＮＫ細胞)に送達される。例えば、核酸は、標準的核酸(例えば、プラスミドＤＮＡ)送達法、例えば、ここに記載する方法、例えば、エレクトロポレーション、遺伝子導入またはリポフェクションにより送達される。ある態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。ある態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸)ならびにトランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む。他の態様において、２核酸を有する系、例えば、第一プラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第二プラスミドがトランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、例えば、デュアルプラスミド系が提供される。例えば、第一および第二核酸は宿主細胞に共送達される。
【０４２２】
ある態様において、ＳＢＴＳを使用する遺伝子挿入とヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または操作されたメガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用する遺伝子編集の組み合わせの使用により、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞が産生される。
【０４２３】
ある態様において、非ウイルス送達方法の使用は、細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞の再プログラムおよび細胞の対象への直接注入を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、容易かつ比較的安価な患者集団の要求に見合う十分量の産生、貯蔵中の安定性および免疫原性の欠如を含むが、これらに限定されない。
【０４２４】
製造／産生の方法
ある態様において、ここに開示する方法は、さらに細胞(例えば、ここに記載する免疫エフェクター細胞)での処置後のＴ細胞枯渇剤を含み、それによりＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞)を減少(例えば、枯渇)させる。このようなＴ細胞枯渇剤は、毒性軽減のために、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞)を効率的に枯渇させるために使用できる。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここでの方法により製作され、例えば、ここでの方法によりアッセイされた(例えば、遺伝子導入または形質導入前後)。
【０４２５】
ある態様において、Ｔ細胞枯渇剤を、ここに記載する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団の投与１週間、２週間、３週間、４週間または５週間後に投与する。
【０４２６】
ある態様において、Ｔ細胞枯渇剤は、例えば、抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)および／または補体誘発細胞死により、ＣＡＲ発現細胞を枯渇させる物質である。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、細胞死、例えば、ＡＤＣＣまたは補体誘発細胞死を誘発できる分子により認識される抗原(例えば、標的抗原)も発現し得る。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、抗体または抗体フラグメントにより標的化され得る標的タンパク質(例えば、受容体)も発現し得る。このような標的タンパク質の例は、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン(例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν)、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー(例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２)、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７およびＥＧＦＲおよびその切断バージョン(例えば、１以上細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の１以上の領域を欠くバージョン)を含むが、これらに限定されない。
【０４２７】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲおよび標的タンパク質を共発現し、例えば、標的タンパク質を天然に発現するかまたは標的タンパク質を発現しように操作される。例えば、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＡＲ核酸(例えば、ここに記載するＣＡＲ核酸)および標的タンパク質をコードする核酸を含む核酸(例えば、ベクター)を含み得る。
【０４２８】
ある態様において、Ｔ細胞枯渇剤はＣＤ５２阻害物質、例えば、抗ＣＤ５２抗体分子、例えば、アレムツズマブである。
【０４２９】
他の態様において、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、ここに記載するＣＡＲ分子(例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ)およびＴ細胞枯渇剤により認識される標的タンパク質を発現する。ある態様において、標的タンパク質はＣＤ２０である。標的タンパク質がＣＤ２０である態様において、Ｔ細胞枯渇剤は抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブである。
【０４３０】
前記方法のいずれかのさらなる態様において、方法は、さらに細胞、例えば、造血幹細胞または骨髄を哺乳動物に移植することを含む。
【０４３１】
他の面において、本発明は、細胞移植前に哺乳動物をコンディショニングする方法に関する。方法は、哺乳動物に、有効量のＣＡＲ核酸またはポリペプチド、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ核酸またはポリペプチドを含む細胞を投与することを含む。ある態様において、細胞移植は、幹細胞移植、例えば、造血幹細胞移植または骨髄移植である。他の態様において、細胞移植前の対象のコンディショニングは、対象における標的発現細胞、例えば、ＣＤ１９発現正常細胞またはＣＤ１９発現癌細胞の数を減らすことを含む。
【０４３２】
免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の活性化および拡張
Ｔ細胞のような免疫エフェクター細胞は、一般に、例えば、米国特許６,３５２,６９４号；６,５３４,０５５号；６,９０５,６８０号；６,６９２,９６４号；５,８５８,３５８号；６,８８７,４６６号；６,９０５,６８１号；７,１４４,５７５号；７,０６７,３１８号；７,１７２,８６９号；７,２３２,５６６号；７,１７５,８４３号；５,８８３,２２３号；６,９０５,８７４号；６,７９７,５１４号；６,８６７,０４１号；および米国特許出願公開２００６０１２１００５号に記載の方法を使用して、活性化および拡張され得る。
【０４３３】
一般に、免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ調節性細胞枯渇細胞は、それが結合した表面と、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する物質およびＴ細胞の表面の共刺激性分子を刺激するリガンドを接触させることにより拡張させ得る。特に、Ｔ細胞集団は、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体または抗原結合そのフラグメントまたは抗ＣＤ２抗体との接触またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触によるような、ここに記載するように刺激させ得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激に関して、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の刺激増殖に適する条件下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用できる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９.３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８(Diaclone, Besancon, France)を含み、一般的に当分野で知られる他の方法で可能であるように使用できる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
【０４３４】
ある面において、Ｔ細胞のための一次刺激性シグナルおよび共刺激性シグナルは、異なるプロトコールにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する物質は溶液にあっても、表面に連結させてもよい。表面に連結させるとき、物質は、同じ表面(すなわち、“ｃｉｓ”形態)または別の表面(すなわち、“ｔｒａｎｓ”形態)に連結させ得る。あるいは、１剤は表面に連結させ、他剤が溶液中であり得る。ある面において、共刺激性シグナルを提供する物質を細胞表面に結合させ、一次活性化シグナルを提供する物質は溶液中または表面に連結される。ある面において、両剤は溶液にあり得る。ある面において、物質は不溶性形態であり、次いでＦｃ受容体または抗体または該物質と結合する他の結合剤を発現する細胞のような表面に架橋させ得る。この点に関し、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化および拡張における使用が企図される人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)に関する米国特許出願公開２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号参照。
【０４３５】
ある面において、２剤をビーズ上に、同一ビーズに、すなわち、“ｃｉｓ”でまたは別々のビーズに、すなわち、“ｔｒａｎｓ”で固定化する。例として、一次活性化シグナルを提供する物質は抗ＣＤ３抗体または抗原結合そのフラグメントであり、共刺激性シグナルを提供する物質は抗ＣＤ２８抗体または抗原結合そのフラグメントであり、両剤を等分子量で同一ビーズに共固定化する。ある面において、ＣＤ４＋Ｔ細胞拡張およびＴ細胞成長のためのビーズに結合した各抗体の１：１比を使用する。本発明のある面において、１：１比を使用して観察される発現と比較して、Ｔ細胞拡張増加が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体比を使用する。ある特定の面において、１：１の比を使用して観察される発現と比較して約１〜約３倍の増加が観察される。ある面において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００の範囲およびその間の全ての整数値である。ある面において、抗ＣＤ３抗体より多い抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合し、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は１未満である。ある面において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は２：１より大きい。ある特定の面において、ビーズに結合した抗体の１：１００  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。ある面において、ビーズに結合した抗体の１：７５  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。さらなる面において、ビーズに結合した抗体の１：５０  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。ある面において、ビーズに結合した抗体の１：３０  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。ある面において、ビーズに結合した抗体の１：１０  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。ある面において、ビーズに結合した抗体の１：３  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。さらにある面において、ビーズに結合した抗体の３：１  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。
【０４３６】
１：５００〜５００：１およびその間のあらゆる整数値の粒子対細胞の比を、Ｔ細胞または他の標的細胞の刺激に使用し得る。当業者には容易に認識され得るとおり、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径により得る。例えば、小型ビーズは少ない数の細胞しか結合できず、一方大型ビーズは多数結合できる。ある面において細胞対粒子比は、１：１００〜１００：１の範囲およびその間のあらゆる整数値であり、さらなる面において比は１：９〜９：１およびその間のあらゆる整数値を含み、これらはまたＴ細胞の刺激に使用できる。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は上記のように変わり得るが、しかしながらある適当な値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、一つの適当な比は、少なくとも１：１  粒子：Ｔ細胞である。ある面において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。ある特定の面において、適当な粒子：細胞比は１：５である。さらなる面において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、ある面において、粒子対細胞比は、第一日目は１：１〜１０：１であり、さらなる粒子をその後最大１０日まで連日または隔日で細胞に添加し、最終比１：１〜１：１０(添加した日の細胞数に基づく)である。ある特定の面において、粒子対細胞比は、刺激第一日目１：１であり、刺激３日目および５日目に１：５に調節する。ある面において、第一日目の１：１および刺激３日目および５日目の１：５の最終比に基づき、粒子を連日または隔日で添加する。ある面において、粒子対細胞比は刺激第一日目２：１であり、刺激３日目および５日目に１：１０に調節する。ある面において、第一日目の１：１および刺激３日目および５日目の１：１０の最終比に基づき、粒子を連日または隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が、本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径ならびに細胞のサイズおよびタイプにより変わる。ある面において、使用のための最も典型的な比は、第一日目に１：１、２：１および３：１付近である。
【０４３７】
さらなる面において、Ｔ細胞のような細胞を、物質被覆ビーズと組み合わせ、ビーズおよび細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。代替的面において、培養前に、物質被覆ビーズおよび細胞を分離せず、一緒に培養する。さらなる面において、ビーズおよび細胞をまず磁気力のような力の適用により濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘発する。
【０４３８】
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合している常磁性ビーズ(３ｘ２８ビーズ)をＴ細胞と接触させることによりライゲートさせ得る。ある面において細胞(例えば、１０４〜１０９  Ｔ細胞)およびビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズを１：１比)を、緩衝液、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオン不含)中で合わせる。再度、当業者は、あらゆる細胞濃度を使用し得ることを容易に認識できる。例えば、標的細胞はサンプル中に稀であり、サンプル中に０.０１％しか含まれないかまたはサンプル全体(すなわち、１００％)が目的の標的細胞を含むかもしれない。したがって、あらゆる細胞数が、本発明の状況において範囲内である。ある面において、細胞と粒子の最大接触を隔日にするために、粒子と細胞を一緒に混合する容積を顕著に減少させる(すなわち、細胞の濃度の増加)ことが望ましいかもしれない。例えば、ある面において、約１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／ml、５０億／mlまたは２０億細胞／mlの濃度を使用する。ある面において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる面において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらにある面において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞の濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。高濃度の使用は、細胞収量、細胞活性化および細胞拡張を増加させ得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱くしか発現し得ない細胞のより効率的な捕捉を可能とする。このような細胞の集団は治療価値を有し得て、得ることが望まれるある面において。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０４３９】
ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸で形質導入された細胞を、例えば、ここに記載する方法により拡張させる。ある態様において、細胞を、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約１４日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日)の期間の培養により拡張させる。ある態様において、細胞を４〜９日の期間拡張させる。ある態様において、細胞を、８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間拡張させる。ある態様において、細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死滅、サイトカイン産生、活性化、遊走またはこれらの組み合わせにより定義され得る。ある態様において、５日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を５日の培養により拡張させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある態様において、５日拡張させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日の培養により拡張させた同じ細胞と比較して、pg／mlでの炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上の増加を示す。
【０４４０】
Ｔ細胞の培養時間が６０日以上であり得るように数サイクルの刺激が望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞増殖用の任意の他の添加物を含む、増殖および生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  １５(Ｌｏｎｚａ))を含む。細胞成長のための他の添加物は、界面活性剤、プラスマネートおよびＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含む。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンを含む、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得て、無血清培地であるかまたは適切な量の血清(または血漿)または定義された一連のホルモンおよび／またはＴ細胞成長および拡張に十分な量のサイトカインが添加される。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養にのみ添加され、対象に注入する細胞の培養には添加されない。標的細胞を、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)で維持する。
【０４４１】
ある態様において、細胞を、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日拡張期間にわたり細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)増加をもたらす１以上のインターロイキンを含む適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で拡張させる。ある態様において、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)存在下拡張させる。
【０４４２】
ある態様において、ここに記載する方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞製造方法は、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して、細胞集団から除去する方法を含む。Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を細胞集団から除去する方法はここに記載される。ある態様において、方法、例えば、製造方法は、さらに細胞集団(例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のようなＴ調節性細胞が枯渇している細胞集団；または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと予め接触させた細胞集団)とＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の接触を含む。例えば、細胞集団(例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと予め接触させた)を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７存在下拡張させる。
【０４４３】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者の組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と、ＣＡＲ発現細胞製造中、例えば、エクスビボで接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者の組み合わせを含む組成物と、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで接触させる。
【０４４４】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と、エクスビボ拡張中接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と、エクスビボ拡張中接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者を含む組成物と、エクスビボ拡張中接触させる。ある態様において、接触は、リンパ球集団、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および増殖を起こす。
【０４４５】
様々な刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的血液またはアフェレーシス処理末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より大きいヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体刺激によるＴ細胞のエクスビボ拡張は、約８〜９日前、優勢にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８〜９日後、Ｔ細胞の集団は、ＴＣ細胞の徐々に拡大する集団を含む。したがって、処置の目的によって、優勢にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団の対象への注入が有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されていたら、大いにこのサブセットを拡張することが有利であり得る。
【０４４６】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞拡張過程の間、相当に、しかし、大部分、再現性よく変わる。それゆえに、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物をあつらえる能力を可能とする。
【０４４７】
ここに記載するＣＡＲが構築されたら、種々のアッセイを使用して、適切なインビトロおよび動物モデルにおいて、抗原刺激後Ｔ細胞を拡張する能力、再刺激非存在下でのＴ細胞拡張の維持および抗癌活性を含むが、これらに限定されない分子の活性を評価できる。本発明のＣＡＲの効果を評価するアッセイは、下にさらに詳述する。
【０４４８】
一次Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を使用して、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６９５に記載のように、単量体および二量体の存在を検出できる。
【０４４９】
抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビトロ拡張は、フローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８  ａＡＰＣで刺激し、続いて、分析するプロモーターの制御下、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。例示的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおける培養６日目に評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。あるいは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボゾームスキッピング配列を使用するｅＧＦＰと共にＣＡＲを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を、ここに記載するような癌関連抗原＋Ｋ５６２細胞(ここに記載する癌関連抗原を発現するＫ５６２)、野生型Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２野生型)またはＨＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体(Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８)存在下再刺激し、続いて洗浄する。外来ＩＬ−２を、１００ＩＵ／mlで隔日添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞を、ビーズベース計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。
【０４５０】
再刺激非存在下での持続的ＣＡＲ＋Ｔ細胞拡張も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔にいうと、平均Ｔ細胞容積(ｆｌ)を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激および１日目の記載するＣＡＲでの形質導入後、培養８日目にCoulter Multisizer III粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して測定する。
【０４５１】
動物モデルを、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６９８に記載のように、ＣＡＲ発現細胞活性の測定にも使用できる。
【０４５２】
用量依存的ＣＡＲ処置応答を、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６９９に記載のように、アッセイできる。
【０４５３】
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ７００のように先に記載されている。
【０４５４】
細胞毒性は、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ７０１に記載のように、標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。
【０４５５】
細胞毒性をまた、例えば、xCELLigenceリアルタイム細胞分析器(ＲＴＣＡ)を使用する、付着細胞の電気インピーダンスの変化の測定によっても評価できる。ある態様において、細胞毒性を複数時点で測定する。
【０４５６】
造影技術を使用して、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ７０２に記載のように、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送および増殖を評価できる。
【０４５７】
ここでの実施例部分に記載するならびに当分野で知られるものを含む他のアッセイもここに記載するＣＡＲの評価に使用できる。
【０４５８】
ここに開示する方法とは別にまたは組み合わせて、ＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量化(例えば、インビトロまたはインビボ(例えば、臨床的モニタリング))；免疫細胞拡張および／または活性化；および／またはＣＡＲリガンドの使用を含むＣＡＲ特異的選択の１以上のための方法および組成物が開示される。ある例示的態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体(例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体；または細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体)である。他の態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子(例えば、ここに記載するＣＡＲ抗原分子)である。
【０４５９】
ある面において、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量する方法が開示される。例えば、ＣＡＲリガンドを使用して、インビトロまたはインビボでのＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量に使用できる(例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞の臨床的モニタリングまたは患者への投与)。方法は
ＣＡＲリガンド(所望により、標識ＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射性または蛍光標識を含むＣＡＲリガンド)を提供し；
ＣＡＲ発現細胞を獲得し(例えば、製造サンプルまたは臨床的サンプルのようなＣＡＲ発現細胞含有サンプルを獲得し)；
結合が生じる条件下でＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドを接触させ、それにより存在するＣＡＲ発現細胞のレベル(例えば、量)を検出する
ことを含む。ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどのような標準技術を使用して検出できる。
【０４６０】
他の面において、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)を拡張および／または活性化する方法が開示される。方法は、
ＣＡＲ発現細胞(例えば、第一ＣＡＲ発現細胞または一過性に発現するＣＡＲ細胞)を提供し；
該ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンド(例えば、ここに記載するＣＡＲリガンド)を、免疫細胞拡張および／または増殖が生じる条件下で接触させ、それにより活性化および／または拡張した細胞集団を産生する
ことを含む。
【０４６１】
ある態様において、ＣＡＲリガンドは基質上に存在する(例えば、基質、例えば、天然に存在しない基質に固定化または結合している)。ある態様において、基質は非細胞基質である。非細胞基質は、例えば、プレート(例えば、マイクロタイタープレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜)、マトリクス、チップまたはビーズから選択される、固体支持体であり得る。ある態様において、ＣＡＲリガンドは基質に存在する(例えば、基質表面上)。ＣＡＲリガンドは、基質に共有結合または非共有結合(例えば、架橋)により固定化、結合または関係している。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、ビーズに結合(例えば、共有結合)している。前記態様において、免疫細胞集団をインビトロまたはエクスビボで拡張させ得る。方法は、さらに、例えば、ここに記載する方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ分子のリガンドの存在下、免疫細胞の集団を培養することを含む。
【０４６２】
他の態様において、細胞を拡張および／または活性化する方法は、さらに第二刺激性分子、例えば、ＣＤ２８の添加を含む。例えば、ＣＡＲリガンドおよび第二刺激性分子を基質、例えば、１以上のビーズに固定化し、それにより細胞拡張および／または活性化を増加させ得る。
【０４６３】
さらに他の面において、ＣＡＲ発現細胞を選択または富化する方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞とここに記載するＣＡＲリガンドを接触させ、細胞をＣＡＲリガンドの結合に基づき選択することを含む。
【０４６４】
さらに他の態様において、ＣＡＲ発現細胞を枯渇、低減および／または死滅させる方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞とここに記載するＣＡＲリガンドを接触させ、ＣＡＲリガンドの結合に基づき細胞を標的化し、それにより、ＣＡＲ発現細胞の数を減らすおよび／または死滅させることを含む。ある態様において、ＣＡＲリガンドを毒性剤(例えば、トキシンまたは細胞除去剤)と連結させる。他の態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし得る。
【０４６５】
ここに開示方法において使用できる例示的抗ＣＡＲ抗体は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３号およびJena et al., “Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”, PLOS March 2013 8:3 e57838に記載され、これらの内容を引用により本明細書に包含させる。
【０４６６】
ある面および態様において、ここでの組成物および方法は、例えば、内容をその全体を頻用により本明細書に包含させる、２０１５年７月３１日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４３２１９号に記載のような、Ｔ細胞の特異的サブセットのために最適化される。ある態様において、Ｔ細胞の最適化サブセットは、同じ構築物を発現する対照Ｔ細胞、例えば、異なるタイプのＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋)と比較して、残留性の増強を示す。
【０４６７】
ある態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞はここに記載するＣＡＲを含み、該ＣＡＲは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のための適当な(例えば、最適化された、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインを含む。ある態様において、ＣＤ８＋Ｔ細胞はここに記載するＣＡＲを含み、該ＣＡＲは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のための適当な(例えば、最適化された、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の他の共刺激性ドメインを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲは、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む。
【０４６８】
ある面において、対象、例えば、癌を有する対象の処置方法をここに記載する。方法は、該対象に、有効量の：
１)抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第一共刺激性ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインを含む
ＣＡＲを含むＣＤ４＋Ｔ細胞(ＣＡＲＣＤ４＋)；および
２)抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第二共刺激性ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の他の共刺激性ドメインを含む
ＣＡＲを含むＣＤ８＋Ｔ細胞(ＣＡＲＣＤ８＋)；
を投与することを含み、ここで、ＣＡＲＣＤ４＋およびＣＡＲＣＤ８＋は、互いに異なる。
【０４６９】
所望により、方法は、さらに、
３)抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメインを含む
ＣＡＲを含む第二ＣＤ８＋Ｔ細胞(第二ＣＡＲＣＤ８＋)の投与を含み、ここで、第二ＣＡＲＣＤ８＋は、ＣＡＲＣＤ８＋に存在しない細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、所望により、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインを含まない。
【０４７０】
バイオポリマー送達方法
ある態様において、１以上のここに開示するＣＡＲ発現細胞を、バイオポリマースキャフォールド、例えば、バイオポリマーインプラントを経て対象に投与または送達できる。バイオポリマースキャフォールドは、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の送達、拡張および／または分散を支持または増強できる。バイオポリマースキャフォールドは、天然に存在するまたは合成であり得る生体適合性(例えば、実質的に炎症性または免疫応答を誘発しない)および／または生分解性ポリマーを含む。例示的バイオポリマーは、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ１００４〜１００６に記載される。
【０４７１】
医薬組成物および処置
ある面において、本発明は、ここに記載するように産生したＣＡＲ発現細胞を、所望により１以上の他の治療と組み合わせて投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。ある面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望により１以上の他の治療と組み合わせて含む反応混合物を投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。ある面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を含む反応混合物を輸送または受容する方法を提供する。ある面において、本発明は、ここに記載するように産生したＣＡＲ発現細胞を受容し、さらに該ＣＡＲ発現細胞を、患者に、所望により１以上の他の治療と組み合わせて投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。ある面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を産生し、さらに該ＣＡＲ発現細胞を、患者に、所望により１以上の他の治療と組み合わせて投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。他の治療は、例えば、化学療法のような癌治療であり得る。
【０４７２】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象にＴＲＥＧ細胞集団を低減する分子と組み合わせて投与する。ＴＲＥＧ細胞の数を減少させる(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与、ＧＩＴＲ機能調節を含む。理論に縛られることを望まないが、アフェレーシス前またはここに記載するＣＡＲ発現細胞投与前の対象におけるＴＲＥＧ細胞の数の減少は、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞(例えば、Ｔｒｅｇ)の数を減少させ、対象の再発のリスクを低減すると考えられる。
【０４７３】
ある態様において、ここに記載する治療、例えば、ＣＡＲ発現細胞を、対象に、調節性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体のようなＧＩＴＲを標的化するおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象にシクロホスファミドと組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子(例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体)を、ＣＡＲ発現細胞前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレーシス前に投与してよい。ある態様において、シクロホスファミドを、対象にＣＡＲ発現細胞投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある態様において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を、対象に、ＣＡＲ発現細胞投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある態様において、対象は、癌(例えば、固形癌またはＡＬＬまたはＣＬＬのような血液癌)を有する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象はＡＬＬを有する。ある態様において、対象は、固形癌、例えば、ここに記載する固形癌を有する。例示的ＧＩＴＲアゴニストは、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１号８および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または号、例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のような、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含む。
【０４７４】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ここに記載するＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、ＣＡＲ発現細胞前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレーシス前に投与してよい。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。
【０４７５】
ここに記載する方法は、さらにＣＡＲ発現細胞の医薬組成物への製剤を含む。医薬組成物は、ここに記載するように、ＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と共に含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。組成物は、例えば、静脈内投与用に製剤できる。
【０４７６】
ある態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製コンピテントレンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残存抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯蔵ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される汚染物を、実質的に含まない、例えば、検出可能レベルで存在しない。ある態様において、細菌は、アルカリゲネス・フェーカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザ、ナイセリア・メニンジタイディス、シュードモナス・アエルギノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ニューモニアエおよびスタフィロコッカス・ピオゲネシスＡ群からなる群から選択される、少なくとも１つである。
【０４７７】
“免疫学的有効量”、“抗癌有効量”、“癌阻害有効量”または“治療的量”を記載するとき、組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度および患者(対象)の状態の個々の差を考慮して医師が決定できる。一般に、ここに記載する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を含む医薬組成物は、これらの範囲内の全ての整数値を含む、１０４〜１０９細胞／kg体重、ある例において１０５〜１０６細胞／kg体重の用量で投与し得る。Ｔ細胞組成物はまたこれらの用量で複数回投与してよい。細胞は、免疫治療で一般的に知られる注入技術を使用して投与し得る(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。
【０４７８】
ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞)の用量は、約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８細胞／kgを含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞)の用量は、少なくとも約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８細胞／kgを含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞)の用量は、最大約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８細胞／kgを含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞)の用量は、約１.１×１０６  −  １.８×１０７細胞／kgを含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞)の用量は、約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞を含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞)の用量は、少なくとも約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞を含む。ある態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞)の用量は、最大約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞を含む。
【０４７９】
ある面において、活性化免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を対象に投与し、次いでその後再び採血し(またはアフェレーシスを実施し)、そこからの免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を活性化し、患者にこれらの活性化および拡張免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を再点滴することが望ましいかもしれない。この工程を、数週毎に複数回実施し得る。ある面において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、１０cc〜４００ccの採血した血液化から活性化する。ある面において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、２０cc、３０cc、４０cc、５０cc、６０cc、７０cc、８０cc、９０ccまたは１００ccの採血した血液化から活性化する。
【０４８０】
対象への組成物の投与は、任意の簡便な方法で実施できる。ここに記載する組成物を、患者に経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、節内、脊髄内、筋肉内に、静脈内(ｉ.ｖ.)注射によりまたは腹腔内に、例えば、皮内または皮下注射により投与できる。免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の組成物を、腫瘍、リンパ節または感染の部位に直接注射し得る。
【実施例】
【０４８１】
本発明を、さらに次の実験的実施例を参照して詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみの目的で提供し、特に断らない限り限定を意図するものではない。それゆえに、本発明は、如何なる態様においても次の実施例に限定されると解釈されてはならず、むしろ、ここに提供する教示の結果として明らかとなる任意かつ全てのバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
【０４８２】
実施例１：外来サイトカインでのＣＡＲＴ産生の最適化
サイトカインは、Ｔ細胞拡張、分化、生存およびホメオスタシスに関する重要な機能を有する。臨床使用のための最も重要なサイトカインファミリーの一つは、共通γ鎖(γｃ)ファミリーサイトカインであり、これは、インターロイキン(ＩＬ)−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含む(Liao et al., 2013, Immunity, 38:13-25)。ＩＬ−２は、癌の免疫治療剤として広く研究されている。ＩＬ−２の補充は、臨床試験における抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍能を増強する(Xu et al., 2013, Lymphoma, 54:255-60)。しかしながら、ＩＬ−２の投与は、副作用および調節性Ｔ細胞を拡張する傾向および誘発細胞死(ＡＩＣＤ)の活性化効果により制限される(Malek et al., 2010, Immunity, 33:153-65;およびLenardo et al., 1999, Annu Rev Immunol, 17:221-53)。ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１は、各々、養子免疫治療の有効性を増強でき、ＩＬ−２と比較して、毒性が低いようである(Alves et al., 2007, Immunol Lett, 108:113-20)。上記サイトカインの役割に関する広範な前臨床および臨床研究にもかかわらず、ＣＡＲ−Ｔ細胞養子治療に対する種々の外来γｃサイトカインの役割の多数値比較研究はない。
【０４８３】
γ鎖サイトカインに加えて、ＩＬ−１８は、免疫応答を制御する他の免疫刺激性サイトカインであり、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生を増強し、ＣＴＬの細胞溶解活性を増強する(Srivastava et al., 2010, Curr Med Chem, 17:3353-7)。ＩＬ−１８の投与は、用量が１０００μg／kg程度に高くても、安全であり、良好に耐容性である(Robertson et al., 2006, Clin Cancer Res, 12:4265-73)。それゆえに、ＩＬ−１８は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍の押し上げに使用する他の候補であり得る。
【０４８４】
本実施例において、種々の外来サイトカインの投与の効果を、Ｔ細胞および葉酸受容体アルファ(ＦＲα)ＣＡＲＴ細胞の拡張、表現型、インビトロエフェクター機能およびインビボ抗腫瘍有効性について試験した。
次の物質および方法を、本実施例に記載する実験で使用した。
【０４８５】
ＣＡＲ構築およびレンチウイルス調製
ｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲベクターを、先に記載のように構築した(原稿審査中)。要約すれば、tggtggagtctgggggaggc-3’(配列番号１９)および5’-atagctagcacctaggacggtcagcttggtccc-3’(配列番号２４)(ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩを下線で示す)をプライマーとするＣ４フラグメントのＰＣＲ増幅用鋳型として、抗ＦＲαＣ４／scＦｖを含むｐＨＥＮ２プラスミドを使用した。ＰＣＲ産物および第三世代自己不活性化レンチウイルス発現ベクターｐＥＬＮＳをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化した。消化ＰＣＲ産物を、次いで導入遺伝子発現が伸長因子１α(ＥＦ−１α)プロモーターにより駆動される、ＣＤ２７−ＣＤ３ｚ  Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン含有ｐＥＬＮＳベクターに挿入した。
【０４８６】
高力価複製欠損レンチウイルスを、先に記載のようなExpress In(Open Biosystems)の使用により、４プラスミド(ｐＶＳＶ−Ｇ、ｐＲＳＶ.ＲＥＶ、ｐＭＤＬｇ／ｐ.ＲＲＥおよびｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲ)を伴うヒト胚性腎臓細胞株２９３Ｔ(２９３Ｔ)細胞の遺伝子導入により産生した。上清を遺伝子導入２４時間および４８時間後に採取し、超遠心分離により濃縮した。ウイルス力価を、限外希釈方法の使用により、レンチウイルスのＳｕｐＴ１細胞への形質導入効率に基づき決定した。
【０４８７】
Ｔ細胞および細胞株
末梢血リンパ球を、インフォームドコンセント後University Institutional Review Board at the University of Pennsylvaniaにより承認されたプロトコール下、健常ドナーから得た。一次Ｔ細胞を、陰性選択後、Human Immunology Coreから購入した。Ｔ細胞を完全培地(１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／mL  ペニシリン、１００μg／mL硫酸ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ  １６４０)培養し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂｓ被覆ビーズ(Invitrogen)で、指示に従い１：１比で刺激した。活性化２４時間後、細胞を、レンチウイルスで５のＭＯＩで形質導入した。記載するサイトカインを、１０ng／mLの最終濃度で翌日から形質導入Ｔ細胞に添加した。サイトカインを３日毎に取り替えた。
【０４８８】
レンチウイルスパッケージングに使用した２９３Ｔ細胞およびレンチウイルス力価測定に使用したＳｕｐＴ１細胞をＡＴＣＣから得た。確立された卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３(ＦＲα＋)およびＣ３０(ＦＲα−)を、サイトカイン分泌および細胞毒性アッセイのための標的細胞として使用した。生物発光アッセイのために、ＳＫＯＶ３を、ホタルルシフェラーゼ(ｆＬｕｃ)を発現するようにレンチウイルスで形質導入した。
【０４８９】
フローサイトメトリー分析および細胞選別
フローサイトメトリーを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏで実施した。抗ヒトＣＤ４５(ＨＩ３０)、ＣＤ３(ＨＩＴ３ａ)、ＣＤ８(ＨＩＴ８ａ)、ＣＤ４５ＲＡ(ＨＩ１００)、ＣＤ６２Ｌ(ＤＲＥＧ−５６)、ＣＣＲ７(Ｇ０４３Ｈ７)、ＩＬ−７Ｒα(Ａ０１９Ｄ５)、ＣＤ２７(Ｍ−Ｔ２７１)、ＣＤ２８(ＣＤ２８.２)、ＣＤ９５(ＤＸ２)、ＴＮＦ−α(ＭＡｂ１１)、ＩＦＮ−γ(４Ｓ.Ｂ３)、ＩＬ−２(ＭＱ１−１７Ｈ１２)、パーフォリン(Ｂ−Ｄ４８)、グランザイム−Ｂ(ＧＢ１１)をBiolegendから得た。ビオチン−ＳＰコンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)をJackson Immunoresearchから購入し、ＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジンをBiolegandから購入した。抗ヒトＢｃｌ−ｘｌ(７Ｂ２.５)をSouhernBiotechから購入した。アポトーシスキットおよびTruCountチューブをBD Bioscienceから購入した。末梢血Ｔ細胞計数のために、血液を後眼窩採血により得て、ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の存在について染色した。ヒトＣＤ４５＋ゲート化、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットを、製造業者の指示に従いTruCountチューブで定量した。
【０４９０】
養子細胞治療のインビボ研究
雌非肥満糖尿病性／重症複合型免疫不全／γ鎖−／−(ＮＳＧ)マウス８〜１２週齢を、Stem Cell and Xenograft Core of the Abramson Cancer Center, University of Pennsylvaniaから得た。マウスに、３×１０６  ｆＬｕｃ＋ＳＫＯＶ３細胞を脇腹に０日目に皮下接種した。群あたり４匹または５匹のマウスを無作為化し、処置した。腫瘍が触診可能となったとき、ヒト一次Ｔ細胞を、先に記載のように活性化および形質導入した。Ｔ細胞を、約２週間、ＩＬ−２(５ng／mL)の存在下拡張させた。腫瘍負荷が約２５０〜３００mm３となったとき、マウスに５×１０６  ＣＡＲ−Ｔ細胞または１００μl食塩水を静脈内注射し、次いで連日７日間ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１またはリン酸緩衝液(ＰＢＳ)５μgの腹腔内注射を受けた。腫瘍寸法をカリパスで測定し、腫瘍容積を次の式により計算した：腫瘍容積＝(長さ×幅２)／２。レシピエントマウス血液における導入Ｔ細胞の数および表現型を、後眼窩採血後フローサイトメトリーで決定した。腫瘍容積が２０００mm３を超えたときマウスを屠殺し、腫瘍をさらなる分析のためにすぐに摘出した。
【０４９１】
統計的分析
統計的分析をPrism 5(GraphPad software)およびIBM SPSS Statistics 20.0 softwareで実施した。データを、明記しない限り平均±ＳＥＭで示した。対応サンプルｔ検定またはノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定を２群の比較に使用し、反復測定ＡＮＯＶＡまたはフリードマン検定を、３以上の群の統計的有意差の検定に試験した。Ｐ値が０.０５未満であるとき、測定値を統計的有意とした。
【０４９２】
結果
１. 抗ＦＲαＣ４  ＣＡＲの構築および発現
ｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通領域に連結した抗ＦＲαＣ４、続くＣＤ３ζシグナル伝達部分をＣＤ２７細胞内シグナル伝達モチーフとタンデムで含んだ(図１Ａ)。一次ヒトＴ細胞は、形質導入４８時間後検出したとき、４３％〜６５％の形質導入効率で、Ｃ４  ＣＡＲレンチウイルスベクターで効率的に形質導入された(図１Ｂ)。ＣＡＲ発現レベルはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞で同等であった(５２.６±１０.２％対４９.５±１７.１％、Ｐ＝０.７１３)。
【０４９３】
２. ＣＡＲ  形質導入Ｔ(ＣＡＲ−Ｔ)細胞の拡張に対するサイトカインの効果
種々のγｃサイトカインおよびＩＬ−１８存在下のＣＡＲ−Ｔ細胞の発現および蓄積を試験した。培養で種々のサイトカイン曝露３週後、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−５存在下で培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、１０００〜２０００倍拡張した。ＩＬ−１８、ＩＬ−２１存在下またはＮＣ(対照、無サイトカイン)で培養したＣＡＲ−Ｔ細胞は、２００倍未満の拡張を示した(図１Ｃ)。
【０４９４】
ＣＡＲ発現レベルを、種々のＴ細胞集団で形質導入１５日後比較した：ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞。種々のサイトカイン存在下で増殖させたＣＡＲ−Ｔ細胞の各群のＣＡＲ発現レベルは、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団で類似した。ＩＬ−２１存在下培養したＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ３＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、他のサイトカイン(ＩＬ−２を含む)に暴露したＣＡＲ−Ｔ細胞およびサイトカイン存在下で培養していない(ＮＣ)対照細胞より高レベルのＣＡＲ発現を示した(図１Ｄ)。
【０４９５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の高い蓄積に寄与する理由を分析し、特に、Ｔ細胞の増殖およびアポトーシスを評価した。増殖性応答を、７日培養したＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の細胞分裂のモニタリングにより測定した。図１Ｅに示すように、ＩＬ−２およびＩＬ−１５と培養したＴ細胞が最高増殖性能を示し、続いてＩＬ−７であった；一方ＩＬ−２１およびＩＬ−１８は、あまり強力ではない分裂促進的刺激剤であった。種々のサイトカイン中で培養したＴ細胞のアポトーシスを、Annexin-V染色を使用して試験した。結果は、ＮＣ、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１群と比較して、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５中で培養したＴ細胞の受けたアポトーシスが少ないことを示した(図１Ｆ)。次に、リンパ球アポトーシスの重要な負のレギュレーターであるＢｃｌ−ｘＬの発現をＦＡＣｓ分析で試験した。図１Ｆにおけるアポトーシス結果に一致して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両者でＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５曝露がＢｃｌ−ｘＬ発現を上方制御する傾向があり、一方ＩＬ−２１はＢｃｌ−ｘＬ発現を増加させなかった(図１Ｇおよび１Ｈ)。これらの結果は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５存在下拡張されたＴ細胞の蓄積増加は、Ｂｃｌ−ｘｌ抗アポトーシス経路の活性化による増殖増加およびアポトーシス減少の両者により引き起こされ得る。
【０４９６】
３. ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型に対するサイトカインの影響
次に、外来サイトカイン存在下拡張させたＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型を試験した。健常ドナーからの新鮮Ｔ細胞を、一般にＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき４サブセットに分けた：１)ナイーブＴ細胞(ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、Ｔｎと称する)、２)中枢記憶Ｔ細胞(ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋、Ｔｃｍと称する)、３)エフェクター記憶Ｔ細胞(ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−、Ｔｅｍと称する)および４)ＣＤ４５Ｒ陽性エフェクターＴ細胞(ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−、Ｔｅｍｒａと称する)。次いでＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＤ９５の発現を、さらに各サブセットで評価した(図２Ａ)。後３者のＴ細胞サブセットはＣＤ９５に陽性であったが、Ｔｎはわずかな部分しかＣＤ９５を発現しなかった(ＣＤ４＋において３.６±１.４％およびＣＤ８＋Ｔ細胞において３.７±１.３％)。この小集団はまたＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＣＲ７を共発現し、記憶幹Ｔ細胞(Ｔｓｃｍ)と考えられた。しかしながら、ＣＡＲを有するレンチウイルス形質導入前後の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの刺激後、ＣＤ９５はこの集団で１００％近くまで大きく上方制御された(図２Ｂ)。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋Ｔ細胞のパーセンテージは、新鮮Ｔ細胞と比較したとき、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴおよびＣＡＲ−Ｔ細胞の両者で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激後大きく増加した(図２Ｃおよび２Ｄ)。この集団は、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＣＲ７を同時に高度に発現し(図２Ａ)、Ｔｓｃｍとして定義され得ることを示した。さらに、ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞は、最初のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴｎの高い比率と関係し得るであろう、Ｔｓｃｍ細胞の高いパーセンテージを有した(図２Ｆおよび２Ｇ)。
【０４９７】
種々のサイトカインと共培養１４日後、ＣＡＲ−Ｔ細胞のＴ細胞サブセットの割合を、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ９５の発現の測定により試験した。図２Ｅに示すように、ＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞で、ＩＬ−２群と比較して有意に高いパーセンテージのＴｓｃｍ細胞がＩＬ−７群に存在し、一方ＮＣおよびＩＬ−１８群はＴｓｃｍで低いパーセンテージをシメたが、Ｔｃｍで高いパーセンテージであった。ＩＬ−１５群におけるＴ細胞サブセットの分布はＩＬ−２群と類似したが、ＩＬ−２１群は、Ｔｃｍの高いパーセンテージを提供し、一方ＴｓｃｍはＩＬ−２群と同等であった。ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞は、各サイトカイン投与群について４Ｔ細胞サブセットの分化および分布に対してＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞と同等な傾向を示し、ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の対応する群におけるＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、Ｔｓｃｍが高い比率であった。
【０４９８】
種々のＣＡＲ−Ｔ細胞亜集団が自己複製し、他の細胞型に分化する能力を、さらに試験した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の４サブセットをＣＡＲ、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づきソートし、ＩＬ−２含有培地で３日間別々に培養した。図２Ｈに示すように、Ｔｓｃｍサブセットは他の全３サブセットに分化でき、ＴｃｍおよびＴｅｍｒａサブセットはＴｅｍに分化できた。これらの結果は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞が、それぞれＣＤ６２Ｌ−およびＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞に分化できることを示す。４サブセットの増殖能をＣＦＳＥ希釈により評価し、次いで比較した。結果は、Ｔｓｃｍが、他のサブセットより強い増殖能を提供することを示した(図２Ｉ)。さらに、ＣＤ４５ＲＡ発現はＣＦＳＥ強度と逆相関するが、一方ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７発現は増殖と直接相関した。全サイトカイン群において、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ  ｄｉｍおよび陰性Ｔ細胞よりはるかに低いＣＦＳＥレベルを示し(図３)、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞より強い増殖活性を有することを示した。それゆえに、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５存在下増殖させたＴ細胞の蓄積増加は、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞(増加した増殖能を有する)の割合の増加と関係し得る(図４Ｂ)。
【０４９９】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型に関して、Ｔ細胞表面上に、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８の低い発現を示すが、ＣＣＲ７の発現は高かった(図４Ａ)。ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型に対するサイトカインの影響を、さらに次の表面マーカーの発現に基づき評価した：ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７およびＩＬ−７Ｒα。ＩＬ−１８存在下増殖させたＣＡＲ−Ｔ細胞は、サイトカイン添加なしで増殖する、極めて類似した発現パターンを示した。ＩＬ−２は、ＮＣ対照と比較したとき、ＣＤ２７、ＣＤ２８  ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７およびＩＬＲ７αの発現を劇的に下方制御した。他のγｃサイトカインで、ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−７曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞が高いＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８発現を示したが、ＣＣＲ７発現は顕著に減少した；ＩＬ−１５群ＣＡＲ−Ｔ細胞は高いＣＤ２７およびＣＤ２８発現を示した；そしてＩＬ−２１曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は高いＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８発現を示し、Ｔ細胞のサブセットのＩＬ−２曝露が、全ての他の群よりはるかに成熟Ｔ細胞表現型を伴う発現を誘発したことを示した(図４Ｂ)。
【０５００】
４. ＣＡＲ−Ｔ細胞のエフェクター機能に対するサイトカインの影響
ＣＡＲ−Ｔ細胞エフェクター機能に対するサイトカインの影響を試験するために、ＦＲα発現ＳＫＯＶ３細胞で刺激後のＣＡＲ−Ｔ細胞のサイトカイン産生能を評価した。５時間刺激後、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２はＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞質で検出可能であり、ＣＡＲ−Ｔ細胞の４１.５〜５４.０％がＴＮＦ−αを産生し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の１２.４〜１５.３％がＩＦＮ−γを産生し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の４.３〜６.５％がＩＬ−２を産生した(図５Ａ＆Ｂ)。拡張中のＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５曝露は、ＣＡＲ−Ｔ細胞のＴＮＦ−α産生を促進したが、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生ＣＡＲ−Ｔ細胞数は、全サイトカイン群で同等であった(図５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄ)。次に、応答性ＣＡＲ−Ｔ細胞の画分およびその多機能性を比較した(図５Ｅ)。拡張中のＩＬ−２への曝露と比較して、拡張中のＩＬ−１８、ＩＬ−２１への暴露または無サイトカイン曝露は、標的細胞で刺激したとき、誘発されたサイトカイン産生ＣＡＲ−Ｔ細胞が少なく、多サイトカインを産生する能力を有するＣＡＲ−Ｔ細胞が少なかった。これらの結果は、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１およびＮＣ群におけるＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＩＬ−２暴露群より低分化型である表現型と一致する。
【０５０１】
次いで、抗原刺激後の細胞溶解分子パーフォリンおよびグランザイムＢの発現に対する拡張中のサイトカイン曝露の効果を決定した(図５Ｉ)。ＴＮＦ−α産生に類似して、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＮＣ、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１に曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、パーフォリン発現の増加を示した。しかしながら、ＩＬ−２１に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞はＴＮＦ−αおよびパーフォリンの産生が少なく、最高レベルのグランザイムＢを産生した。次に最高レベルのグランザイムＢ産生が拡張中ＣＡＲ−ＩＬ−２およびＩＬ−１５に曝したＴ細胞で観察された。ＩＬ−１８群のＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原刺激後のパーフォリンおよびグランザイムＢ発現の両者で最低量を示した(図５Ｇおよび５Ｈ)。
【０５０２】
最後に、拡張中の種々のサイトカインへのＣＡＲ−Ｔ細胞曝露による腫瘍溶解活性をルシフェラーゼアッセイにより数値化した。図５Ｆに示すとおり、ＩＬ−２およびＩＬ−１５と共培養したＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＮＣおよびＩＬ−１８よりも効率的にＳＫＯＶ３を溶解した(両者ともＰ＜０.０５)。
【０５０３】
ＣＡＲ−Ｔ細胞とその機能の関係をさらに確認した。Ｔ細胞１４日を、レンチウイルス形質導入後ＣＡＲおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づきソートした。ＣＤ６２Ｌ＋ＣＡＲ−Ｔ細胞(ＴｓｃｍおよびＴｃｍ)は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＡＲ−Ｔ細胞(ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ)と比較して、低サイトカイン産生活性および弱細胞溶解能を示した(図６)。この観点において、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞は、多くのサイトカインを産生し、強い腫瘍溶解活性を示し、これは、一部、これらの群におけるＴｅｍおよびＴｅｍｒａの高い比率に起因するものである。
【０５０４】
５. 抗原負荷後のＣＡＲ−Ｔ細胞の拡張および表現型
特異的抗原負荷下のＣＡＲ−Ｔ細胞拡張に対するサイトカインの影響を調べるために、２週間ＩＬ−２に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞をＳＫＯＶ３(ＦＲα＋)またはＣ３０(ＦＲα−)細胞と、記載するサイトカイン存在下、７日共培養した。無抗原状況に類似して、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞提示は、他のサイトカインに曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞より高倍率の拡張を示した。拡張中にＩＬ−２１に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞は、アポトーシスをより受けやすい可能性がある(図７Ａ)。しかしながら、２週間記載するサイトカインに曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞を、さらにサイトカイン補充することなく７日ＳＫＯＶ３またはＣ３０細胞と共培養したとき、ＣＡＲ−Ｔ細胞の蓄積は全群で同等であり、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８に曝露したものが、最小量のアポトーシスを受けた(図７Ｂ)。最高ＣＡＲ発現を有するＴ細胞は、拡張中ＩＬ−２１に曝露した群であった(図７Ｃ)。ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型もまた分析した。ＣＤ２７およびＣＤ２８は、全サイトカイン群で、それぞれＣＤ８＋およびＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞で高度に発現された。無抗原拡張に類似して、ＩＬ−２１曝露は、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＤ２７およびＣＤ２８の発現を増加させた(図７Ｄ)。記憶Ｔ細胞の４サブセットに関して、結果は無抗原試験と異なった：Ｔｓｃｍは稀であり、Ｔｅｍは無サイトカイン、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１全群で５０％を超えた。サイトカインは記憶Ｔサブセットの組成に顕著な影響を有さず、ＩＬ−７曝露はＴｓｃｍの増加を支えなかった(図７Ｅ)。
【０５０５】
６. 動物モデルにおける種々のサイトカインの抗腫瘍有効性
インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性に対するＣＡＲ−Ｔ細胞のエクスビボ拡張中の種々のサイトカインの効果を評価するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞の残留性および成果を、卵巣癌のＮＳＧマウス異種移植モデルを使用して試験した。皮下ＳＫＯＶ３腫瘍担持マウスに、エクスビボで予め記載するサイトカインに２週されている２用量の５×１０６  Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を静脈内注射した(図８Ａ)。Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞注入を受けた全マウスは、非形質導入Ｔ細胞および抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞を注射されたものと比較して、腫瘍負荷が低かった(図８Ｂ＆８Ｃ)。種々のサイトカイン群で、先のＩＬ−２曝露と共にＣＡＲ−Ｔ細胞を注射されたマウスが、最高腫瘍負荷を示し、これらのマウスにおける循環ヒトＴ細胞の最小量と矛盾しなかった。ＮＣ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１群の腫瘍は、全て顕著に抑制され、または消失しており、腫瘍サイズの統計的差異はいずれもなかった。末梢血における導入Ｔ細胞の残留性を、養子移入１５日および３２日後に決定した。ＩＬ−７およびＩＬ−２１処理ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けたマウスは、＋１５日目に末梢血において他の群より高量のヒトＴ細胞を揺するように見えたが、ＩＬ−２処理ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けたマウスは、ヒトＴ細胞が最小数であった(図８Ｄ)。種々のＣＡＲ−Ｔ細胞集団のパーセンテージに関して、ＮＣ、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１暴露群は全てＩＬ−２群と比較したとき高いＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を示し、一方ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のパーセンテージは全群で同等であった(図８Ｅ)。Ｔ細胞表現型で、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８は、Ｔ細胞の約５〜１０％にしか発現されず、ＩＬ−２およびＮＣ群より高いＣＤ２８を発現したＩＬ−２１群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を除いて、全群で同等であった(両方Ｐ＜０.０５)(図８Ｆ＆８Ｇ)。興味深いことに、ＮＣおよびＩＬ−１８は、血液に遥かに高量のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞を有しており、インビトロ実験で得た結果と逆であった(図８Ｆ、２Ｅ＆２Ｆ)。＋３２日目に、全ＣＡＲ−Ｔ細胞群における循環ヒトＴ細胞は、ＩＬ−２群以外顕著に拡張され、平均Ｔ細胞数１４９０７／μl〜１９６５１／μlであった(そして、ＩＬ−２群はわずか２４２／μl)。２匹のマウスが死亡したが、腫瘍は退行していた。
【０５０６】
考察
ＩＬ−２は、養子免疫治療用リンパ球産生に最もしばしば使用されるサイトカインである。これはＴ細胞生存および拡張を促進し、Ｔ細胞の腫瘍死滅能を増強する。しかしながら、ＩＬ−２の作用は、Ｔ細胞の活性化誘発細胞死(ＡＩＣＤ)および調節性Ｔ細胞発達をもたらすため、限定されている(Malek et al., Immunity, 2010, 33:153-65;およびLenardo et al., Annu Rev Immunol, 1999, 17:221-53)。本実施例において、ＩＬ−２はＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積およびその細胞毒性能を顕著に増加させたが、ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は養子移入後インビボで優れた抗腫瘍免疫を示した。この発見は、インビトロ腫瘍溶解とインビボ腫瘍根絶の逆の関係を示す。ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８の発現が低く、比較的成熟表現型を示し、インビボで永続性が低い(Yang et al., Cancer Immunol Immunother, 2013, 62:727-36)。最近の研究は、あまり分化されていないＴ細胞の養子移入は優れた腫瘍後退と相関し、これは、ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞が他の群より有効ではないとの発見を支持する(Gattinoni et al., Nat Med, 2011, 17:1290-7;およびMarkley et al., Blood, 2010, 115:3508-19)。
【０５０７】
ＩＬ−１５は、ＩＬ−２と同程度の刺激ＣＡＲ−Ｔ細胞拡張および腫瘍溶解機能を示すが、あまり分化されていない表現型を誘発した(ＣＤ２７およびＣＤ２８の高発現)。それゆえに、ＩＬ−１５はインビボでＣＡＲ−Ｔ細胞の残留性を支持し、動物モデルで良好な抗腫瘍免疫を示す。
【０５０８】
ＩＬ−２およびＩＬ−１５と比較して、ＩＬ−７は、ＣＡＲ−Ｔ細胞拡張を促進する能力は同等であるが、高レベルのＣＤ６２Ｌ発現を誘発し、無抗原状況でＣＡＲ−Ｔｓｃｍ細胞の最高の割合を示す。それゆえに、ＩＬ−２に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、抗原負荷を伴わないＩＬ−７のエクスビボ曝露は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を増強した。ＩＬ−７曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原負荷下のＣＡＲ−Ｔ細胞の低拡張により、ＩＬ−２より良好なインビボ抗腫瘍有効性をもたらさず、有効性はＩＬ−１５より劣った。
【０５０９】
ＩＬ−２１は、例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ発現により、抗アポトーシス能を増強できなかったような、ＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積に対してほとんど効果を発揮しなかった。しかしながら、ＩＬ−２１は、あまり分化されていないＣＡＲ−Ｔ細胞の発現を誘発し、抗原負荷の状況下での、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８の高発現の表現型を有した。それゆえに、ＩＬ−２１曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は、インビボで動物モデルおよびＩＬ−２１注射において最良の残留性を示し、ＩＬ−１５以外の他のサイトカイン群より腫瘍根絶促進の良好な有効性を提供した。これらの結果は、あまり分化されていないＣＡＲ−Ｔ細胞が優れた腫瘍後退と相関するという先の発見と一致する。
【０５１０】
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１ファミリーに属する炎症誘発性サイトカインであり、インビボでの活性化単球、ＮＫ細胞およびＴ細胞およびＩＦＮ−γ産生ならびに他のサイトカインによる自然および獲得免疫応答両者を制御する(Srivastava et al., Curr Med Chem, 2010, 17:3353-7)。ここに提供する結果は、ＩＬ−１８が、ＩＬ−１８群での結果のほとんどがＮＣ群と類似するか同等であるため、エクスビボ実験でＣＡＲ−Ｔ細胞拡張、表現型および機能にほとんど影響しないことを示す。ＩＬ−１８は、対照(ＮＣ)群と比較して、抗原負荷下、Ｔ細胞の増殖をほとんど促進せず、多くのＴ細胞生存を維持した。インビボ試験は、サイトカイン補充なしのマウスと比較したとき、ＩＬ−１８はＣＡＲ−Ｔ細胞有効性に顕著な影響を有しないことを示す。
【０５１１】
要約すると、これらの実験からの知見は、ＣＡＲ−Ｔ細胞拡張のためのエクスビボでのＩＬ−２補充は、広く使用されているものの、最適のストラテジーではないことを示す。ＩＬ−１８、ＩＬ−２１または無サイトカイン補充について、比較的有効なＣＡＲ−Ｔ細胞を誘発し得るが、十分なＣＡＲ−Ｔ細胞が限定された拡張時間で臨床使用用に製造できるほど、ＣＡＲ−Ｔ細胞拡張を十分効率的に誘発しない。それゆえに、ＩＬ−１５およびＩＬ−７は、ＣＡＲ−Ｔ細胞拡張に対して良好であり得る。さらに、ＩＬ−７とＩＬ−１５補充の組み合わせは、Ｔｓｃｍの生成を指示し、これは、より“若い”ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生に有利である。インビボサイトカイン注射に関して、全γｃサイトカイン補充は、これらの多くがＣＡＲ−Ｔ細胞発現を指示したため、抗腫瘍有効性を増強し、ＩＬ−１５が最良の効果を示した。注射によりＩＬ−１５曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けたマウスは、一部、腫瘍処置中のＣＡＲ−Ｔ細胞の拡張能増加および残留性増加により、有効性が増加した。それゆえに、これらの実験の結果は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５が、ＣＡＲ−Ｔ細胞拡張の促進および治療的処置に最も有効であるＴ細胞表現型の誘発に有効である有望性を示す。
【０５１２】
実施例２：細胞成長および形質導入効率に対するＣＤ２５枯渇の効果
ＣＤ２５としても知られるインターロイキン−２ａ鎖は、調節性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)により発現されるが、慢性Ｂ細胞白血病(ＣＬＬ)細胞でも見られる(８５％を超えるＣＬＬ患者で)。Ｔｒｅｇは、免疫抑制性機能を有し、例えば、Ｔ細胞増殖阻害により、免疫治療の有効性を妨害し得る。アフェレーシスによるＣＬＬ患者からのＴ細胞の現在の単離または富化は、通常、顕著に増加した割合でＴｒｅｇならびにＣＬＬ細胞を含む。ＣＤ２５枯渇方法による出発物質におけるＴｒｅｇおよびＣＬＬ細胞の枯渇が、エフェクターＴ細胞の純度を顕著に改善し、それによりＣＡＲ１９発現Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲＴ１９細胞の効力を増加させる。
【０５１３】
図９Ａは、ＣＬＬ患者のアフェレーシスからの細胞のフローサイトメトリー分析プロットを示す。細胞を、まず、ＣＤ４５発現についてソートし、ＣＤ４５発現(ＣＤ４５＋)サブセットを次いでさらにＣＤ２５およびＣＤ３発現について分析した。図９Ａの右パネルに示すように、ＣＬＬ患者は、ＣＤ２５発現細胞の高いパーセンテージを示す。
【０５１４】
ＣＤ２５枯渇最適化
検証実験を実施して、CliniMACS SystemにおけるミルテニーからのCD25 Reagentを使用して、２患者のアフェレーシスからのＣＤ２５枯渇について最適条件を同定した。ＣＤ２５枯渇剤を、同じ枯渇効率が少ない試薬の使用で得られるか否かを毒亭するために、製造業者の推奨量の１００％、７０％および３０％で使用した。Miltenyiからの異なる２つのチューブセットも試験した。枯渇を製造業者の指示に従い実施した。実験結果を下表に示す。対照として、抗ＣＤ３／ＣＤ２８免疫磁気ビーズを使用する選択を実施した。
【０５１５】
【表２７】
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【０５１６】
予測ＣＤ２５−(ＣＤ２５陰性)Ｔ細胞収量は、各操作における１００％効率を仮定して計算した計算ＣＤ２５−Ｔ細胞収量を表す。ＣＤ２５−Ｔ細胞の観察収量は、各操作後のＣＤ２５−Ｔ細胞数を表す。表５に示すとおり、製造業者の推奨より少ない量の試薬の使用は、ＣＤ２５枯渇の同じ効率をもたらさなかった。異なるチューブを使用して、Ｔ細胞富化の１ログの増加をもたらした。
【０５１７】
図９Ｂは、アフェレーシス(図９Ｂの上部左パネル)、対照ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞(図９Ｂの上部中央左パネル)、ＣＤ２５枯渇細胞(図９Ｂの上部中央右パネル)およびＣＤ２５富化細胞(図９Ｂの上部右パネル)からの総細胞と比較した、ＣＤ２５枯渇の効率を示す代表的フローサイトメトリー分析プロット(上部パネル)を示す。ヒストグラム(下部パネル)は、ＣＤ３−ＣＤ１９−サブセットのＣＤ１４発現により決定した、細胞集団の単球含量を示す。これらの結果は、効率的ＣＤ２５枯渇およびＣＤ２５枯渇はまた顕著な単球含量をもたらすことも示す(アフェレーシス、対照およびＣＤ２５富化細胞からの総細胞における２％未満と比較して６１.１％ＣＤ１４発現細胞)。
【０５１８】
Ｔ細胞集団および増殖に対するＣＤ２５枯渇の効果
次に、ＣＤ２５枯渇後のＴ細胞産物の品質を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合および増殖能の決定により評価した。
特異的Ｔ細胞集団の割合を決定するために、細胞を、上記のとおり抗ＣＤ３／ＣＤ２８またはＣＤ２５枯渇による選択後９日にフローサイトメトリーにより分析した。結果は、ＣＤ３／ＣＤ２８−選択Ｔ細胞が、ＣＤ２５枯渇細胞と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞で大きな割合を有することを示す(８４.６％対４６.８％ＣＤ４＋Ｔ細胞、図１０の上部左のパネルに箱で囲む)。逆に、ＣＤ２５枯渇細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８−選択細胞と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きな割合を有した(４７.２％対１１.５％ＣＤ８＋Ｔ細胞；図１０における下部右のパネルに箱で囲む)。それゆえに、ＣＤ２５枯渇は、ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞の割合が大きいＴ細胞をもたらす。
【０５１９】
増殖能および細胞生存能を、対照(ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞)およびＣＤ２５枯渇細胞でも評価した。対照およびＣＤ２５枯渇細胞からの１.６×１０７細胞を播種し、細胞数および生存能を１０〜１３日にわたり測定した。図１１Ａは、経時的総細胞数を示し、図１１Ｂは、計算集団倍加を示す(細胞総数から計算)。結果は、ＣＤ２５枯渇細胞が、対照細胞と類似の成長特徴を示すことを示す。図１１Ｃは、生存可能細胞のパーセンテージを示し、結果は、生存能も対照とＣＤ２５枯渇細胞で類似することを示す。
【０５２０】
レンチウイルス形質導入効率に対するＣＤ２５枯渇の効果
レンチウイルス形質導入効率に対するＣＤ２５枯渇の効果を、形質導入後ＣＡＲの発現の決定により評価した。患者アフェレーシスは、上記のとおりＣＤ２５細胞が枯渇した。ＣＤ２５枯渇の効率を、ＣＤ２５枯渇前(アフェレーシスサンプル)および後(ＣＤ２５枯渇フラクション)のＣＤ２５発現集団を比較するフローサイトメトリー分析プロットで示す(図１２Ａ)。ＣＤ２５枯渇後、ＣＤ２５枯渇フラクションは約５９.２％のＣＤ２５陰性細胞およびわずか１０.３％ＣＤ２５陽性細胞を含んだ。
【０５２１】
ＣＤ２５枯渇フラクションをレンチウイルス構築物コード化ＣＡＲ１９で形質導入した。１１日の培養後、ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーで評価した。形質導入していない細胞および形質導入ＣＤ３選択細胞を対照として使用した。図１２Ｂに示すとおり、ＣＡＲ１９発現は、ＣＤ３選択細胞と比較して、ＣＤ２５枯渇細胞が有意に高かった(５１.４％対１２.８％)。この結果は、ＣＤ２５枯渇細胞のレンチウイルス形質導入効率が改善されていることを示し、これは、ＣＡＲＴ治療の治療効果改善に重要であり得る。
【０５２２】
実施例３：サイトカインとＣＤ２５枯渇細胞の使用
本実施例において、拡張培養においてサイトカイン補充するＣＤ２５枯渇の効果を試験した。末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を患者から単離し、未操作のままであるか、または実施例２に記載のようにＣＤ２５発現細胞を枯渇した。Ｔ細胞富化を、抗ＣＤ３およびＣＤ２８被覆ビーズでの刺激により達成した。Ｔ細胞を、１０ng／ml  ＩＬ−７、１０ng／ml  ＩＬ−１５または１０ng／ml  ＩＬ−７と１０ng／ml  ＩＬ−１５の組み合わせを補充した培地ですぐに培養した。３日目、培地を同じサイトカインを添加して交換した。５日目、１００ＩＵ  ＩＬ−２／ml含有培地を添加し、細胞を計１０日増殖させた。
【０５２３】
フローサイトメトリー分析は、未操作のＰＢＭＣ(標準ＣＤ３／ＣＤ２８選択)と比較して、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−７およびＩＬ−１５存在下での培養後のＣＤ２５枯渇細胞におけるＣＤ３およびＣＤ１９細胞の分布の変化を示した。出発集団(例えば、ＣＤ２５枯渇前およびサイトカイン補充培養前)におけるＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ２５発現細胞の分布を図１３に示す。出発集団は、ＣＤ３−ＣＤ１９＋細胞の割合が高く(上部パネル、図１１)、ＣＤ２５発現細胞の割合が高かった(下部パネル、図１３)。操作(ＣＤ２５枯渇)およびサイトカインと培養後、分布は図１４に示すように変化した。ＣＤ２５枯渇細胞は、全体的に未操作細胞と比較して、ＣＤ１９発現細胞の大きな減少を示した。
【０５２４】
増殖能も、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズで刺激１０日後に、培養における細胞総数決定により同じ細胞サンプルで評価した。各細胞サンプルの細胞数を下におよび図１５に示す。
【表２８】
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【０５２５】
これらの結果は、ＣＤ２５枯渇Ｔ細胞培養中のＩＬ−１５補充は、未操作細胞と比較して、拡張を増加させる。培養中の培地へのＩＬ−７およびＩＬ−１５添加は、未操作細胞およびサイトカインＩＬ−７またはＩＬ−１５個々の添加と比較して、拡張を増加させる。それゆえに、ＩＬ−７とＩＬ−１５の組み合わせの補充は、最も増殖能が増加したＴ細胞をもたらした。
【０５２６】
実施例４：３日製造法
遺伝子導入技術の使用により、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に主要組織適合複合体(ＭＨＣ)により課せられる束縛と無関係な特異性を与える、表面上の抗体結合ドメインを安定に発現するように、遺伝的に修飾できる。ＣＡＲ治療は、抗体の抗原認識フラグメント(ｓｃＦｖまたは単一鎖可変領域フラグメント)とＣＤ３ゼータ鎖の細胞内ドメインを融合させる、Ｔ細胞上に発現される合成タンパク質を利用できる。ｓｃＦｖの同族抗原を発現する標的細胞との相互作用により、Ｔ細胞に発現されるＣＡＲはＴ細胞活性化を惹起し、標的細胞死滅(標的細胞溶解とも称する)を生じさせる。ＣＤ１３７またはＣＤ２８の細胞質ドメインのようなさらなる共刺激性シグナルと組み合わせて、これらの受容体はまたインビボでＴ細胞増殖を刺激し、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞(ＣＡＲＴ)残留性を増加させる。
【０５２７】
ＣＡＲＴ残留性の根底にある機構は探索中である。ＣＡＲにおけるシグナル伝達ドメインは、残留性決定の重要な因子であると考えられる；しかしながら、多数のマウスおよび非ヒト霊長類の公開された試験(Klebanoff, C. A., et al. (2005). “Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.” Proc Natl Acad Sci U S A 102(27): 9571-9576, Berger, C., et al. (2008). “Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.” J Clin Invest 118(1): 294-305, Hinrichs, C. S., et al. (2009). “Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.” Proc Natl Acad Sci USA 106(41): 17469-17474, Wang, X., et al. (2011). “Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.” Blood 117(6): 1888-1898)およびヒト臨床試験相関的試験からのデータは、養子導入産物におけるＴ細胞の表現型も養子移入後のＴ細胞残留性の重要な決定因子である(Xu, Y., et al. (2014). “Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.” Blood 123(24): 3750-3759)。理論に縛られることを望まないが、エクスビボ培養中外来ＩＬ−２と組み合わせた一般的に使用される抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８アゴニスト抗体の系下で拡張されたＴ細胞は、拡張Ｔ細胞を、残留性が低減されたより分化された細胞に偏らせると仮説立てられる。ＩＬ−２のＩＬ−７およびＩＬ−１５への置き換えは、エクスビボ培養を、経時的により最適なＴｓｃｍ／ｃｍ表現型を有する細胞に偏らせると仮説立てられる。低エクスビボ培養の産物が、養子移入後生着および残留性の最適表現型を有する細胞の大きな割合を有することも仮説立てられる。
【０５２８】
本実施例は、細胞の経時的な表現型を特徴付け、活性化および形質導入後の種々の時点での細胞の機能性を評価する。
【０５２９】
ＣＤ３／２８刺激性ビーズで活性化後のＴ細胞からのビーズ除去は、図２７Ａ〜２７Ｄに示すとおり、機械的破砕により高い効率で達成され得る。ビーズ脱離は狭口径ピペットチップに細胞懸濁液を繰り返し通す(押し出し)ことにより、これらの前臨床試験で達成された。閉培養系において、穏やかな剪断を創成するための押し出しは、ビーズ除去前に閉系に一連の狭口径チューブを取り込む閉系を使用して実施できた。
【０５３０】
図２８に示すように、活性化され、ＣＤ１９特定のＣＡＲ担持ＢＢｚシグナル伝達を形質導入され、活性化から３日目という早期にＴ細胞培養から回収されたＴ細胞は、インビトロで強力な抗原特異的細胞毒性活性を有する。これらの早期に回収された細胞はまた、エクスビボで５日または９日の長期間培養したものと類似のパターンおよび品質でサイトカインを産生でき(図２９Ａ)、規程分泌も類似である(図２９Ｂ)。
【０５３１】
エクスビボ培養中、Ｔ細胞の集団は、図３０Ａに示すとおり、より分化された表現型に向けて、Ｔエフェクター記憶(Ｔｅｍ)およびＴｃｍ細胞の割合を増加させながら、漸進的移行する。ＴｅｍおよびＴｃｍ細胞の割合のこの増加は、ナイーブ様／Ｔｓｃｍ細胞の最小の拡張および／または減少を伴う、より分化されたＴ細胞サブセットの増加に起因する(図３０Ｂ)。
【０５３２】
図３１Ａは、種々の条件下で産生したＣＡＲＴ細胞の効力を試験する実験構成を示す。図３１Ｂは、マウスにおけるＮａｌｍ６腫瘍成長減速におけるＩＬ−２処理ＣＡＲＴ細胞の効力を示す。３日目細胞は、全用量での効力増加を示す。活性化され、４−１ＢＢｚシグナル伝達ドメイン担持ＣＤ１９特異的ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞は、早期時点で回収したとき、インビボで強力な抗白血病活性を示す。この増加した効力は、５日目または９日目回収細胞と比較して、３日目回収ＣＡＲＴ１９細胞が白血病を根絶するのに必要なＴ細胞の用量が少ないことにより示される。ＣＡＲ＋細胞の割合は図３１Ｃに示す。
【０５３３】
ＩＬ−２およびＩＬ−７／１５で処理した細胞を、異なる日(３、９)に２回回収した。比較的低用量の０.７ｅ６  ＣＡＲ＋細胞を使用した。活性化し、４−１ＢＢｚシグナル伝達ドメイン担持ＣＤ１９特異的ＣＡＲを形質導入し、ＩＬ−７／ＩＬ−１５中で培養したＴ細胞は、早期(３日目)および後期(９日目)時点で、限定的用量で、ＩＬ−２中で拡張させ、た細胞より、強力な活性を示した(図３１Ｄ)。ＩＬ−７／１５で処理した３日目細胞は、早期時点で効力増強を示した。
【０５３４】
均等物
ここに引用する各々のおよび全ての特許、特許出願および刊行物の発明は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明は具体的面を参照して開示しているが、本発明の他の面および改変が、本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく、当業者により考案され得る。添付する特許請求の範囲は、このような面および等価な改変物を含むことを意図する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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