(57)【要約】デンスブレストを有する女性における乳癌の存在を予測および診断するための、ならびに癌処置の治療的有効性を評価するための、ならびに対象が潜在的に癌を発達させているかどうかを判定するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、デンスブレスト組織を有する対象における乳癌を診断または予後予測するための方法であって、前記対象の乳房組織はデンスブレスト組織であると特徴付けられている、前記方法：
（a）対象由来のサンプル中における少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーおよび少なくとも1つの自己抗体のレベルを測定する段階であって、該少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーがVEGF、FasL、TNF-A、IL-8、IL-12、HGF、およびCEAより選択される、段階；ならびに
（b）腫瘍の存在を判定するために、前記対象の乳房組織の画像解析を行う段階。
【請求項２】
前記サンプルが、腹水、血清、血漿、糞便、リンパ液、脳脊髄液、乳頭吸引液、または尿などの体液である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーが、ERBB2、HGF、IFNG、IL6、OPN、VEGFC、VEGFD、ATF3、ATP6AP1、BDNF、CTBP1、DBT、EIF3E、FRS3、HOXD1、p53、PDCD6IP、RAC3、SELL、SF3A1、SOX2、TFCP2、TRIMP2、UBAP1、ZMYM6、IGF2PB2、MUC1、BAT4、BMX、C15orf48、CSNK1E、GPR157、MYOZ2、RAB5A、SERPINH1、SLC33A1、およびZNF510のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記自己抗体が、RAC3、IGF2BP2、MUC1、ErbB2、ATP6AP1、PDCD6IP、DBT、CSNK1E、FRS3、HOXD1、SF3A1、CTBP1、C15orf48、MYOZ2、EIF3E、BAT4、ATF3、BMX、RAB5A、UBAP1、SOX2、GPR157、BDNF、ZMYM6、SLC33A1、TRIM32、ALG10、TFCP2、SERPINH1、SELL、ZNF510、またはp53に特異的に結合する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記自己抗体がp53に特異的に結合し、かつ前記バイオマーカーが、VEGF、FasL、TNF-A、IL-8、IL-12、HGF、およびCEAのうちの少なくとも1つであるか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
生検組織の組織学的解析をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
画像解析をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーのレベルが、タンパク質アレイ解析によって決定される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が哺乳動物である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
治療薬または治療レジメンを前記対象に施す段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
治療レジメンを患者に処方する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
（b）が、前記少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーまたは前記少なくとも1つの自己抗体の発現産物を測定することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現産物が、タンパク質、マイクロRNA、またはmRNAである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍が良性である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍が癌性である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
デンスブレスト組織を有すると前記対象を特徴付ける段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
以下の段階を含む、デンスブレスト組織を有する対象における乳癌を検出するための方法であって、前記対象の乳房組織はデンスブレスト組織であると特徴付けられている、前記方法：
（a）対象由来のサンプル中における少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーおよび少なくとも1つの自己抗体のレベルを測定する段階であって、該少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーがVEGF、FasL、TNF-A、IL-8、IL-12、HGF、およびCEAより選択される、段階；ならびに
（b）腫瘍の存在を判定するために、前記対象の乳房組織の画像解析を行う段階。
【請求項１９】
前記サンプルが、腹水、血清、血漿、糞便、リンパ液、脳脊髄液、乳頭吸引液、または尿などの体液である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーが、ERBB2、HGF、IFNG、IL6、OPN、VEGFC、VEGFD、ATF3、ATP6AP1、BDNF、CTBP1、DBT、EIF3E、FRS3、HOXD1、p53、PDCD6IP、RAC3、SELL、SF3A1、SOX2、TFCP2、TRIMP2、UBAP1、ZMYM6、IGF2PB2、MUC1、BAT4、BMX、C15orf48、CSNK1E、GPR157、MYOZ2、RAB5A、SERPINH1、SLC33A1、およびZNF510のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
前記自己抗体が、RAC3、IGF2BP2、MUC1、ErbB2、ATP6AP1、PDCD6IP、DBT、CSNK1E、FRS3、HOXD1、SF3A1、CTBP1、C15orf48、MYOZ2、EIF3E、BAT4、ATF3、BMX、RAB5A、UBAP1、SOX2、GPR157、BDNF、ZMYM6、SLC33A1、TRIM32、ALG10、TFCP2、SERPINH1、SELL、ZNF510、またはp53に特異的に結合する、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
前記自己抗体がp53に特異的に結合し、かつ前記バイオマーカーが、VEGF、FasL、TNF-A、IL-8、IL-12、HGF、およびCEAのうちの少なくとも1つであるか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項18に記載の方法。
【請求項２３】
生検組織の組織学的解析をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２４】
画像解析をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーのレベルが、タンパク質アレイ解析によって決定される、請求項18に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が哺乳動物である、請求項18に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物がヒトである、請求項18に記載の方法。
【請求項２８】
治療薬を前記対象に投与する段階をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２９】
治療レジメンを患者に処方する段階をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項３０】
（b）が、前記少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーまたは前記少なくとも1つの自己抗体の発現産物を測定することを含む、請求項18に記載の方法。
【請求項３１】
前記発現産物が、タンパク質、マイクロRNA、またはmRNAである、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍が良性である、請求項18に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍が癌性である、請求項18に記載の方法。
【請求項３４】
デンスブレスト組織を有すると前記対象を特徴付ける段階をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項３５】
以下の段階を含む、乳癌を処置する治療レジメンに対する対象の感受性を判定するための、または、デンスブレスト組織を有する対象における乳癌の進行をモニタリングするための方法であって、前記対象の乳房組織はデンスブレスト組織であると特徴付けられている、前記方法：
（a）対象由来のサンプル中における少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーおよび少なくとも1つの自己抗体のレベルを測定する段階であって、該少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーがVEGF、FasL、TNF-A、IL-8、IL-12、HGF、およびCEAより選択される、段階；
（b）腫瘍の存在を判定するために、前記対象の乳房組織の画像解析を行う段階；ならびに
（c）治療レジメンまたは癌の進行を評価する段階。
【請求項３６】
前記治療レジメンが、化学療法剤の投与を含む、請求項36に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は米国特許法§119(e)の下において、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2015年9月25日に出願された米国特許出願第62/233,010号の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、癌の検出のための方法、より具体的には、デンスブレストを有する女性における乳癌の予測および診断のための方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報 
疾患を早期に検出できる、ならびに／または、疾患の進行および再発をモニタリングできるバイオマーカーの研究においては懸命な努力がなされている。分子標的治療の出現によって、癌の生物学的サブタイプに関連するバイオマーカーが、治療的介入に対する反応を予測するために有用となる可能性がある。
【０００４】
複雑なタンパク質混合物内における少量のタンパク質断片の同定が難しいこと、タンパク質の不安定性、そして患者集団内においてはタンパク質含量に自然に多様性が生ずることから、担癌患者の血清を健常な対照血清から識別する、タンパク質に基づくアプローチには課題があった。安定性があり、高度に特異的であり、血清から容易に精製でき、そして十分に有効性が認められた二次試薬を用いて容易に検出されるため、腫瘍抗原に対する自己抗体（AAb）には潜在的な癌バイオマーカーとしての利点がある。しかし対照血清から癌を識別する高い特異度を有する一方、ほとんどの腫瘍関連自己抗体（TAAb）は感度が低い。複数の抗原について並行して検査を行うことが、免疫診断として使用する腫瘍特異的抗体の予測値の上昇に役立つ可能性がある。
【０００５】
腫瘍抗原を用いて免疫応答についてスクリーニングを行うために利用できる、幾つかのプラットフォームがある。例えば、タンパク質マイクロアレイでは、免疫応答についてスクリーニングを行うために腫瘍抗原を提示するプラットフォームが提供される。タンパク質マイクロアレイでは、何百もの腫瘍抗原を同時に提示および評価することができる。各々のタンパク質の位置が事前に分かっており、表示の問題がないため、反応は迅速に特定される；全てのタンパク質が、稀有なものでさえも同等に表される（通常、二連で）。タンパク質は1つの顕微鏡スライド上に配置され、アッセイごとに必要とされる血清は数マイクロリットルにすぎない。公知の腫瘍抗原および予測される腫瘍の抗原を含めて、網羅的なタンパク質腫瘍抗原アレイを作製することができる。
【０００６】
癌の正確な診断において主に必要とされるのは、画像法や患者の検査のような既存の標準的治療を補う技術の使用である。腫瘍の検出における画像法の感度が低いデンスブレスト組織を有する患者においてこのことは特に重要である。従って、乳癌の検出においてプロテオミクスのアプローチと画像法アプローチとの組み合わせを利用して、既存の標準的治療の改善（偽陽性および偽陰性の減少）を企図することは有益である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、概して、癌のバイオマーカー、特に乳癌と関連するバイオマーカーに関する。それは、特定のバイオマーカーを測定することによって、癌、特に乳癌を予測、評価、診断およびモニタリングする方法を提供する。血清タンパク質バイオマーカー（SPB）を含むバイオマーカーとTAAbのセットによって、対象における乳癌の検出可能な分子シグニチャーが提供され、それは従来的な画像技術と組み合わせてデンスブレスト組織を有する女性における乳癌を検出するために特に有用である。
【０００８】
従って、ある態様において本発明はデンスブレストを有する対象における乳癌を検出、診断、または予後予測するための方法を提供する。本方法は、サンプル中の少なくとも1つの自己抗体および少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーのレベルを測定し、双方を健常な対象のサンプルと比較する段階；ここで、抗体およびバイオマーカーのレベルが健常者のサンプルにおいて認められるものより高い場合は、対象が乳癌であるまたは乳癌を有するリスクがあることが示される；ならびに、腫瘍の存在を判定するために、前記対象の乳房組織の画像解析を行う段階を含む。前記方法は、デンスブレスト組織を有する対象において行われる。
【０００９】
別の態様において本発明は、乳癌を処置する治療レジメンに対する対象の感受性を判定する、または、デンスブレスト組織を有する対象における乳癌の進行をモニタリングする方法を提供する。本方法は、対象由来のサンプル中における少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーおよび少なくとも1つの自己抗体のレベルを測定する段階であって、少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーがVEGF、FasL、TNF-A、IL-8、IL-12、HGF、およびCEAより選択される、段階；腫瘍の存在を判定するために、前記対象の乳房組織の画像解析を行う段階；ならびに治療レジメンの有効性または癌の進行を評価する段階を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（IFNG）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（IL6）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（IL8）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図４】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（TNFA）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図５】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（VEGFD）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図６】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（VEGFC）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図７】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（HGF）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図８】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（FASL）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図９】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（ERBB2）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図１０】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（CEA）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図１１】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（OPN）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図１２】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（BDNF）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図１３】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（FRS3）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図１４】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（GPR157）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図１５】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（HOXD1）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図１６】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（p53）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図１７】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（PDCD6IP）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図１８】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（SELL）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図１９】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（SERPINH1）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２０】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（SF3A1）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２１】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（TFCP2）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２２】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（TRIM32）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２３】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（UBAP1）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２４】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（ATF3）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２５】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（ATP6AP1）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２６】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（CTBP1）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２７】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（DBT）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２８】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（EIF3E）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図２９】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（MYOZ2）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３０】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（RAB5A）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３１】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（RAC3）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３２】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（SLC33A1）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３３】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（SOX2）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３４】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（ZMYM6）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３５】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（ZNF510）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３６】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（BAT4）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３７】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（BMX）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３８】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（C15of48）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【図３９】実験データを示すグラフ表示である。本図は、本明細書の実施例1において説明される調査での、デンスブレストを有する患者および非デンスブレストを有する患者における、選択されたバイオマーカー（CSNK1E）についてのSPB濃度を表す箱ひげ図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、乳癌に関連するバイオマーカーに関する。それは、特定のバイオマーカーを測定することによって癌、特に乳癌を予測、評価、診断、およびモニタリングする方法を提供する。血清タンパク質バイオマーカーを含むバイオマーカーとTAAbのセットによって、対象における乳癌の検出可能な分子シグニチャーが提供される。さらに、本出願はAAbとSPBを組み合わせることによって、いずれかのバイオマーカー単独の場合と比べて、良性のものと乳癌とを区別するより高い感度および特異度が提供されるという概念の証拠を明らかにするものである。
【００１２】
乳癌の検出における最も大きな課題の1つは、乳房組織の密度である。通常の乳腺密度を有する女性と比較して、乳腺密度の高い女性は乳癌と診断される可能性が4〜5倍高いが、それは現行の放射線学的スクリーニング法の公知の限界によるところが大きい。その結果、画像法の感度および特異度が低いことによって、患者や医療制度にとって不必要な負担となる偽陽性の結果の増加が導かれる。従って、IBC/DCISのような、臨床的に重要な疾患を確実に検出する、乳腺密度や病変サイズに非依存的な技術が非常に必要とされている。
【００１３】
過去には、2つの前向き無作為化多施設共同臨床試験（Provista-001治験、n=351およびProvista-002治験の第1コホート、n=501）からのデータにより、Videssa（商標）Breastには、画像法の単独使用と比べて偽陽性の結果を減らし、生検を行うべきか、または6ヶ月の追跡画像診断を続けるべきかの決断への情報を与える能力があることが示された。ここでは、デンスブレストを有する女性における乳癌の検出についてのVidessa（商標）Breast（組み合わせタンパク質バイオマーカーアッセイ（Combinatorial Protein Biomarker Assay））の有用性を判定するための、848例の前向き収集された患者サンプルの後向き解析について報告される。付加的に、本解析は本発明者らの組み合わせタンパク質バイオマーカーアッセイの実用性を改善するために年齢層別化を使用することを支持するものである。近年、Provista-002治験の第1コホート（n=501）からのデータの解析が完了した。本データから、デンスブレストを有する女性における乳癌の検出について強力な、および著しく感度の高いバイオマーカーアッセイの結果が確認された。
【００１４】
本組成物および方法がさらに説明される前に、本発明は説明される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されるものではなく、そのような組成物、方法、および条件は変化し得ることを理解されるべきである。本明細書において使用される用語は特定の態様を説明する目的でのみ使用され、限定することは意図されず、従って本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定されることも理解されるべきである。
【００１５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、文脈によって特に明らかに指示されない限り、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、複数の言及をも含む。従って、例えば「方法」という言及は、本開示等を読むことで当業者には明らかとなる、本明細書において説明されるタイプの1つまたは複数の方法および／または段階を含む。
【００１６】
本明細書において使用されるように、「約」という語は、そのような値が誤差の範囲内で変化し得ることを意味し、それが修飾する数値に係ることを意図する。データのグラフまたは表において与えられる平均値に対する標準偏差のような特定の誤差の範囲が列挙されていない場合、「約」という語は、有効数字を考慮に入れて、該範囲が列挙される値および四捨五入することによってその数字に含まれる範囲をも包含することを意味すると理解されるべきである。
【００１７】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的な語は本発明が属する技術分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験においては、本明細書において説明するものと同様または同等の任意の方法および材料を使用できるが、ここでは好ましい方法および材料を説明する。
【００１８】
従って、ある態様において本発明は、デンスブレストを有する対象が乳癌であるのかどうか、または乳癌のリスクがあるのかどうかを判定するための方法を提供する。本方法は、対象から生物学的サンプルを得る段階；サンプル中の少なくとも1つの自己抗体および少なくとも1つのタンパク質バイオマーカーのレベルを測定し、双方を健常な対象のサンプルと比較する段階；ここで、抗体およびバイオマーカーのレベルが健常サンプルにおいて認められるものより高い場合は、対象が乳癌であるまたは乳癌のリスクがあることが示される；ならびに、腫瘍の存在を判定するために、前記対象の乳房組織の画像解析を行う段階を含む。乳房組織は、実施例1において論じられるように非デンスブレストまたはデンスブレストであると特徴付けられ、本方法はデンスブレスト組織を有する対象において行われる。
【００１９】
本明細書において開示される本発明は、デンスブレスト組織を有する患者における乳癌の検出、望ましくは早期検出に有用な、TAAbと組み合わせたタンパク質、具体的には血清タンパク質を含む、バイオマーカーパネルを提供する。本明細書において提供されるバイオマーカーパネルは、他のスクリーニング法単独による腫瘍の早期検出についての、ある種の限界に取り組むものである。
【００２０】
幾つかのタンパク質について評価を行った。様々な態様において、前記パネルは1つまたは複数の以下のタンパク質およびその断片を含む：FasL、TNFA、IL8、CEA、ERBB2、HGF、IFNG、IL6、OPN、VEGFC、VEGFD、ATF3、ATP6AP1、BDNF、CTBP1、DBT、EIF3E、FRS3、HOXD1、p53、PDCD6IP、RAC3、SELL、SF3A1、SOX2、TFCP2、TRIMP2、UBAP1、ZMYM6、IGF2PB2、MUC1、BAT4、BMX、Cl5orf48、CSNK1E、GPR157、MYOZ2、RAB5A、SERPINH1、SLC33A1、およびZNF510。
【００２１】
タンパク質検出と組み合わせて、本明細書において開示される方法は、TAAbの検出、例えば、各TAAbがRAC3、IGF2BP2、MUC1、ErbB2、ATP6AP1、PDCD6IP、DBT、CSNK1E、FRS3、HOXD1、SF3A1、CTBP1、C15orf48、MYOZ2、EIF3E、BAT4、ATF3、BMX、RAB5A、UBAP1、SOX2、GPR157、BDNF、ZMYM6、SLC33A1、TRIM32、ALG10、TFCP2、SERPINH1、SELL、ZNF510、またはp53に対して特異的である、1つまたは複数のTAAbの検出を利用する。付加的に、複数のTAAbを利用することができ、ここで複数のTAAbの各々はRAC3、IGF2BP2、MUC1、ErbB2、ATP6AP1、PDCD6IP、DBT、CSNK1E、FRS3、HOXD1、SF3A1、CTBP1、C15orf48、MYOZ2、EIF3E、BAT4、ATF3、BMX、RAB5A、UBAP1、SOX2、GPR157、BDNF、ZMYM6、SLC33A1、TRIM32、ALG10、TFCP2、SERPINH1、SELL、ZNF510、またはp53のうちのただ1つに対して特異的である。ある態様においては、複数のp53 TAAbを利用することができ、例えば、12種またはそれ以上のp53 TAAbを利用することができる。
【００２２】
様々な態様においてTAAbの検出は、その野生型、突然変異体およびタンパク質断片を含む、RAC3、IGF2BP2、MUC1、ErbB2、ATP6AP1、PDCD6IP、DBT、CSNK1E、FRS3、HOXD1、SF3A1、CTBP1、C15orf48、MYOZ2、EIF3E、BAT4、ATF3、BMX、RAB5A、UBAP1、SOX2、GPR157、BDNF、ZMYM6、SLC33A1、TRIM32、ALG10、TFCP2、SERPINH1、SELL、ZNF510、またはp53の任意のアイソフォームまたは変異体を用いて行うことができる。
【００２３】
本明細書において開示されるバイオマーカーは、組み合わせにおいて、乳癌の早期検出についての有意な臨床的有用性を提供する。従って、ある態様においては、乳癌の可能性が高いまたは低い群に対象を振り分けるための方法が提供される。ある態様において本方法は、患者由来のサンプル中におけるバイオマーカーパネルの各々のレベルを決定する段階であって、前記パネルが、FasL、TNFA、IL8、およびCEAのうちの少なくとも1つと、少なくとも1つのTAAb、例えば少なくとも1つのp53 TAAbとを含む、段階、ならびに、前記パネル中の各バイオマーカーの決定量に基づいて、乳癌の可能性が高いまたは低い群に患者を振り分ける段階を含む。
【００２４】
ある態様においては、乳癌についての高リスク群に対象を振り分けるための方法が提供される。
【００２５】
ある態様においては、潜在的な乳癌を有する対象の処置を管理するための方法が提供される。
【００２６】
様々な態様において本発明の方法は、SPBまたはTAAbを単独で使用するよりも高い感度／特異度を提供する。例えば、本発明の方法は、SPBをAAbと組み合わせて利用して、約85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99％より高い検出の感度／特異度を提供する。
【００２７】
本明細書において開示されるバイオマーカーパネルの各バイオマーカーのレベルは、様々な動物組織において決定することができる。ある態様においてバイオマーカーは、非限定的に血清、血液、血漿、尿、痰、精液、脳脊髄液、腹水、糞便、リンパ液または乳頭吸引液、乳房組織等のような体液を含む対象由来のサンプルにおいて検出され得る。
【００２８】
ある態様において、本明細書において開示される方法は、各バイオマーカー量を統計解析する段階を含み得る。統計解析は、予め決定されたアルゴリズムをバイオマーカー量に適用する段階を含み得る。アルゴリズムの結果は、乳癌の可能性が高いまたは低い群に対象を振り分けるために使用できる。
【００２９】
本発明の文脈における「バイオマーカー」は、疾患の進行または処置の効果を測るために使用できる生化学的特徴または様相といった特定の生物学的特性の分子指標である。「バイオマーカー」は、非限定的に、その多型、突然変異体、変異体、改変体、サブユニット、断片、複合体、特異的エピトープ、および分解産物を含む、血清タンパク質およびTAAbを包含する。
【００３０】
「ポリペプチド」という語は、タンパク質およびペプトイドを含むサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチドミメティックのポリマーに言及するように、その最も広い意味で使用される。ポリペプチドは天然に存在する全長タンパク質またはその断片、天然に存在するポリペプチドが（酵素切断などによって）プロセシングされた形態、化学的に合成されたポリペプチド、または組換えによって発現されたポリペプチドであることが可能である。ポリペプチドは、D-アミノ酸および／またはL-アミノ酸、ならびに任意の他の合成アミノ酸サブユニットを含み得、非限定的にペプチドミメティック結合および還元ペプチド結合を含む、任意の他のタイプの好適な改変を包含し得る。
【００３１】
ある態様においては、開示される方法は1種もしくは複数種のRAC3 TAAb、1種もしくは複数種のIGF2BP2 TAAb、1種もしくは複数種のMUC1 TAAb、1種もしくは複数種のErbB2 TAAb、ATP6AP1 TAAb、1種もしくは複数種のPDCD6IP TAAb、1種もしくは複数種のDBT TAAb、1種もしくは複数種のCSNK1E TAAb、1種もしくは複数種のFRS3 TAAb、1種もしくは複数種のHOXD1 TAAb、1種もしくは複数種のSF3A1 TAAb、1種もしくは複数種のCTBP1 TAAb、1種もしくは複数種のC15orf48 TAAb、1種もしくは複数種のMYOZ2 TAAb、1種もしくは複数種のEIF3E TAAb、1種もしくは複数種のBAT4 TAAb、1種もしくは複数種のATF3 TAAb、1種もしくは複数種のBMX TAAb、1種もしくは複数種のRAB5A TAAb、1種もしくは複数種のUBAP1 TAAb、1種もしくは複数種のSOX2 TAAb、1種もしくは複数種のGPR157 TAAb、1種もしくは複数種のBDNF TAAb、1種もしくは複数種のZMYM6 TAAb、1種もしくは複数種のSLC33A1 TAAb、1種もしくは複数種のTRIM32 TAAb、1種もしくは複数種のALG10 TAAb、1種もしくは複数種のTFCP2 TAAb、1種もしくは複数種のSERPINH1 TAAb、1種もしくは複数種のSELL TAAb、1種もしくは複数種のZNF510 TAAb、または1種もしくは複数種のp53 TAAbの検出を利用する。そのようにして本方法はRAC3、IGF2BP2、MUC1、ErbB2、ATP6AP1、PDCD6IP、DBT、CSNK1E、FRS3、HOXD1、SF3A1、CTBP1、C15orf48、MYOZ2、EIF3E、BAT4、ATF3、BMX、RAB5A、UBAP1、SOX2、GPR157、BDNF、ZMYM6、SLC33A1、TRIM32、ALG10、TFCP2、SERPINH1、SELL、ZNF510もしくはp53の異なる「抗原性断片」に、またはRAC3、IGF2BP2、MUC1、ErbB2、ATP6AP1、PDCD6IP、DBT、CSNK1E、FRS3、HOXD1、SF3A1、CTBP1、C15orf48、MYOZ2、EIF3E、BAT4、ATF3、BMX、RAB5A、UBAP1、SOX2、GPR157、BDNF、ZMYM6、SLC33A1、TRIM32、ALG10、TFCP2、SERPINH1、SELL、ZNF510もしくはp53の変異体もしくは突然変異体に結合する様々な抗体の検出を利用することができる。本明細書において使用されるように、「抗原性断片」は、免疫応答を誘発することのできる少なくとも4個のアミノ酸からなるポリペプチドの任意の部分である。様々な態様において、抗原性断片は所定のポリペプチドの少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、151、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300個、または全長のアミノ酸配列である。
【００３２】
本明細書において開示される方法においては、様々なアルゴリズムを使用できる。使用されるアルゴリズムは本明細書において説明されるものに限定されず、むしろ本開示を検討すれば当業者には明らかとなるようなアルゴリズムを含む。
【００３３】
バイオマーカーパネルの各バイオマーカーのレベルは、本明細書において開示される方法において決定することができる。ある態様においてバイオマーカーパネルは、1つまたは複数の血清タンパク質、および少なくとも1つまたは複数のTAAbを含み得る。しかし、本明細書において開示される本発明は上記に説明されるバイオマーカーパネルには限定されない。乳癌または乳癌の進行と相関する任意のマーカーが、本明細書において提供されるバイオマーカーパネルに含まれることができ、本明細書において開示される本発明の範囲内にある。本明細書において開示される方法での使用に好適である、付加的な乳癌バイオマーカーを特定するために、任意の好適な方法を利用できる。例えば、当業者に公知の方法を用いて乳癌においてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされることが公知であるまたは確認されているバイオマーカーを使用することができる。付加的なバイオマーカーは、ポリペプチド、小分子の代謝産物、脂質およびヌクレオチド配列のうちの1つまたは複数を含み得る。パネルに含めるマーカーは、非限定的に、説明されるものを含む任意の好適な方法を用いてその予測値についてスクリーニングすることによって選択できる。
【００３４】
前述の態様から明らかであるように、本明細書において開示される方法は、乳癌について、乳癌の早期検出について、および潜在的な乳癌を有する患者または乳癌を有することが分かっている患者の処置の管理について、患者をスクリーニングするために有用である。例えばある態様において、バイオマーカーパネルは乳腺腫瘍を検出するための画像法または他の公知の方法以前に患者をスクリーニングし、乳癌のリスクの高い患者、またはより高いリスクのある患者を明確にするために有用であり得る。さらに、本明細書において開示される方法は、画像法または組織学的解析のような他のスクリーニング法と組み合わせて利用できる。
【００３５】
ある態様においては、乳癌のリスクのある対象由来のサンプル中における任意の量のバイオマーカーの存在が、該対象の乳癌の可能性を示し得る。別の態様においては、乳癌のリスクのある対象由来のサンプル中のバイオマーカーが対照サンプル（乳癌ではない対象由来のサンプル）のものより高いレベルで存在する場合、乳癌のリスクのある該対象は乳癌の可能性がある。乳癌の可能性がある対象はその後、生検、組織学的解析または画像法、例えばMRIを含む当業者には公知の標準的な診断技術を用いて、乳癌の実際の存在について検査することができる。様々な態様において、本方法は、結果的に少なくとも70％の症例において；より好ましくは少なくとも75％、80％、85％、90％またはそれ以上の症例において正確な診断をもたらす。
【００３６】
本開示を検討すれば当業者には明らかとなるように、パネルの各バイオマーカーのレベルを決定するために任意の好適な方法を使用できる。例えば、TAAbを検出するための方法は、固体の支持体または基板上に固定化した生体分子の使用を含み得る。ある態様においては、核酸プログラマブルタンパク質アレイ（NAPPA）技術を使用できる。NAPPAアレイは標的タンパク質をコードする全長cDNAを各特徴のアレイにプリンティングすることによって作製される。タンパク質をその後、無細胞系によって転写および翻訳し、該タンパク質に融合させたエピトープタグを用いてインサイチューで固定化する。他の好適な固定化法は非限定的に、ルシフェラーゼ免疫沈降システム（LIPS）、Luminex（商標）ビーズ、質量分光光度計、標準免疫ディップスティック検定法、標準のプレートベースELISAアッセイ、マイクロビーズベースELISAアッセイを含む。
【００３７】
本明細書において使用されるように、アレイはポリペプチドの任意の配列または配置であってよい。ある態様においては、ポリペプチドはアレイ上の特定の、および識別可能な位置にある。アレイ上での、そのような多くのポリペプチドの並べ替えが可能であることが当業者には認識される。別の非限定的な態様においては、アレイ上の別個の位置の各々が別個のポリペプチドを含む。
【００３８】
任意の好適な支持体または表面を使用できる。そのような支持体の例は非限定的に、マイクロアレイ、ビーズ、カラム、光ファイバー、ワイプ、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、ジアゾ化メンブレン（ペーパーまたはナイロン）、シリコン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、半金属、半導体材料、被覆ビーズ、磁気粒子；ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリスチレンのようなプラスチック；ならびにタンパク質（例えばゼラチン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロース、ポリアクリルアミド、メチルメタクリル酸ポリマーのようなゲル形成物質；ゾルゲル；多孔質ポリマーハイドロゲル；ナノ構造表面；（カーボンナノチューブのような）ナノチューブ、ならびに（金ナノ粒子または量子ドットのような）ナノ粒子を含む。
【００３９】
ある態様においては、支持体は固体の支持体である。非限定的にデキストラン、ハイドロゲル、シリコン、石英、ランガサイトのような他の圧電性物質、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ジアゾ化メンブレン（ペーパーまたはナイロン）、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、半金属、半導体材料、被覆ビーズ、磁気粒子；ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリスチレンのようなプラスチック；ならびにタンパク質（例えばゼラチン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドのようなゲル形成物質を含む、ポリペプチドを付着できる任意の好適な「固体の支持体」を使用できる。
【００４０】
血清タンパク質を検出するために、様々な検出技術も好適である。例えば、タンパク質を検出する方法は、ガスクロマトグラフィー（GC）、液体クロマトグラフィー／質量分析法（LC-MS）、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（GC-MS）、核磁気共鳴法（NMR）、磁気共鳴画像法（MRI）、フーリエ変換赤外分光法（FT-IR）、および誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）を含み得る。質量分析技術は非限定的に、磁場型質量分析計および二重収束型質量分析計、四重極型質量分析計、四重極イオントラップ型質量分析計、飛行時間型質量分析装置（TOF）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析装置（FT-MS）、およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）の使用を含むことがさらに理解される。
【００４１】
ある態様においては、タンパク質バイオマーカーはゲル電気泳動、免疫組織化学法、および抗体結合のような、当業者に周知の技術を用いて検出することができる。関心対象のポリペプチドに対する抗体を作製する方法は当業者には周知である。本明細書において開示される本発明のタンパク質バイオマーカーに対する抗体は、それがタンパク質バイオマーカーを適切に認識する限り、任意のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。ある態様においては、抗体は任意の従来的な抗体または抗血清の調製工程に従って、免疫原としてタンパク質バイオマーカーを用いて作製される。本明細書において開示される本発明は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の双方の使用を提供する。加えて、本明細書において免疫原として使用されるタンパク質は、いかなる特定のタイプの免疫原にも限定されない。例えば、本明細書において開示される本発明のタンパク質バイオマーカーの断片を免疫原として使用できる。該断片は非限定的に、該タンパク質をコードする遺伝子の断片の発現、該タンパク質の酵素によるプロセシング、化学合成等を含む、任意の方法によって得られる。
【００４２】
本明細書において開示される本発明の抗体は、タンパク質バイオマーカーを検出するために有用となり得る。例えば、当技術分野においては公知の技術（例えば放射免疫測定法、ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、インサイチュー免疫測定法（例えばコロイド金、酵素または放射性同位元素標識を使用して）、ウエスタンブロット法、沈降反応、凝集法（例えばゲル凝集法、血球凝集試験等）、補体結合試験、免疫蛍光検査法、プロテインA検査法、および免疫電気泳動法等）によって抗体結合が検出される。本開示を検討すれば、本明細書において開示される本発明の方法を実行するのに有用となり得る数多の特異的免疫測定法の型およびその変形は当業者によく知られたものであるとわかる。
【００４３】
本発明の任意の態様において、検出法では、検出可能な部分のような検出可能なタグを利用することができる。タグは非限定的に、ジスルフィド結合を含む共有結合、水素結合、静電結合、組換え融合および立体構造変化による結合によってポリペプチドに連結することができる。または、1つもしくは複数の連結化合物によってタグをポリペプチドに連結することができる。ポリペプチドにタグを結合させるための技術は当業者には周知である。検出可能なタグは例えばサンプル中の抗体の存在、もしくはあるタンパク質に対する抗体の存在を評価するために；そしてそれにより乳癌の存在を検出するために、または乳癌の発達もしくは進行をモニタリングするために、臨床検査過程の一部として診断的に使用できる。非限定的に酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含む、任意の好適な検出タグを使用することができる。使用されるタグは、（組織）サンプルの免疫組織化学染色、フローサイトメトリー検出法、走査レーザーサイトメトリー検出法、蛍光免疫測定法、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）、生物学的検定法（例えば中和抗体法）、ウエスタンブロット法等のような、使用される特定の検出／解析／診断技術および／または方法による。組織サンプルの免疫組織化学染色については、好ましいタグは検出可能な産物の産生および局所堆積を触媒する酵素である。免疫組織化学的な視覚化を可能にするため典型的にポリペプチドに結合される酵素は周知であり、非限定的に、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコース酸化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびウレアーゼを含む。視覚的に検出可能な産物を産生および堆積させるための典型的な基質も当業者には周知である。ポリペプチドはコロイド金を用いて標識することができる、または、放射性同位元素を用いて標識することができる。
【００４４】
開示される方法においては、当技術分野において公知の任意の技術を用いて遺伝子発現レベルを決定することができる。典型的な技術は例えば、ポリヌクレオチド（例えばゲノム核酸配列および／または転写産物(例えばmRNA)）のハイブリダイゼーション解析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、タンパク質の検出に基づく方法（例えば、免疫組織化学法およびプロテオミクスに基づく方法）を含む。
【００４５】
本明細書において説明されるアッセイは、検査室を使用せずに一般の使用者によって行われるように適応させることができる。使用者はポイントオブケア検査を行う施設における医療従事者、または現場の条件における一般の消費者であることが可能である。装置は、単回使用装置、簡単で再利用可能な装置およびコンピューター制御生体モニターを含む、複数の態様を有することが可能である。妊娠についての市販のラテラルフローアッセイと同様に、単回使用装置は主観的なマルチバイオマーカーアッセイを実施することを可能にする。簡単で再利用可能な装置では、固形癌の腫瘤の微細なおよび強調された表示が提供される客観的なバイオマーカーアッセイも可能であり、遠隔データ処理も可能になり得る。
【００４６】
マイクロRNAまたは遺伝子転写産物（例えばmRNA）を定量することによって、遺伝子発現レベルを決定することもできる。当技術分野において公知の、サンプル中のmRNA発現の定量のために一般的に使用される方法は、非限定的に、ノーザンブロット法およびインサイチューハイブリダイゼーション；RNAseプロテクションアッセイ；ならびに逆転写PCR（RT-PCR）およびリアルタイム定量的PCR（qRT-PCRとも呼ばれる）のような、PCRに基づく方法を含む。または、DNA二本鎖、RNA二本鎖、およびDNA-RNAハイブリッド二本鎖、もしくはDNA-タンパク質二本鎖を含む特定の二本鎖を認識できる抗体を使用することもできる。配列決定に基づく遺伝子発現解析についての代表的な方法は、遺伝子発現の逐次分析法（SAGE）、および網羅的遺伝子発現解析法（MPSS）による遺伝子発現解析を含む。
【００４７】
mRNAレベルの決定に関わるある方法の態様においては、乳癌組織サンプルのような標的サンプルから単離したRNA（例えば全RNA）を利用する。RNA（例えば全RNA）の単離についての一般的な方法は当技術分野において周知であり、分子生物学の標準的な教科書において開示される。
【００４８】
マイクロアレイ技術を用いて差次的遺伝子発現を決定することもできる。これらの方法においては、関心対象のRNAに対して特異的なプローブ（cDNAもしくはオリゴヌクレオチドを含む）または関心対象のタンパク質に対して特異的な抗体のような、特異的な結合パートナーをマイクロチップ基板上にプレーティングまたは配置させる。マイクロアレイ上の特異的結合パートナーの1つまたは複数に対する1つまたは複数の標的（例えばマイクロRNA、mRNAまたはタンパク質）を含有するサンプルと、該マイクロアレイとを接触させる。配置された特異的結合パートナーは、関心対象のサンプル中のその同類の標的と特異的かつ検出可能な相互作用（例えばハイブリダイゼーションまたは特異的結合）を形成する。
【００４９】
ある例において差次的遺伝子発現は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）または発色インサイチューハイブリダイゼーション（CISH）のようなインサイチューハイブリダイゼーション技術を用いて決定される。これらの方法においては、標的cDNA、マイクロRNAまたはmRNA（例えばバイオマーカーcDNAもしくはmRNA分子もしくはマイクロRNA分子）に対して特異的な、フルオロフォアまたは色素原で標識したプローブのような特異的結合パートナーを、基板（例えばスライドガラス）上にマウントした乳癌サンプルのようなサンプルと接触させる。特異的結合パートナーはサンプル中のその同類の標的と特異的かつ検出可能な相互作用（例えばハイブリダイゼーション）を形成する。例えば、プローブと関連する標識を検出することなどによって、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出することができる。ある例においては、蛍光顕微鏡のような顕微鏡を使用する。
【００５０】
様々な態様において本発明の方法は、バイオマーカー検出の前、後、または同時に行うことができる、対象の乳房組織の画像解析を含む。本明細書において使用されるように、画像解析は例えばマンモグラフィー、視診、磁気共鳴画像法および臨床的乳房検査（CBE）のような、任意の数の従来的なスクリーニング法を含むことが意図される。
【００５１】
本発明の別の局面では、検査室ベースのバイオマーカー解析、および画像解析または目安とする指標がより簡便になり得るように、アッセイをキットにおいて提供できる。該キットは試薬、供給品、文書の指示書、および／またはソフトウェアを含む、複数の成分を含み得る。該キットは検査キットおよび郵送キットを含む複数の態様であることが可能である。該キットは二次試薬を含み得る。二次試薬は抗体、酵素、標識、または化学物質であることが可能であり、完全なバイオマーカーパネルアッセイを可能にし得る。
【００５２】
典型的なキットは、開示されるパネルの構成要素の1つまたは複数を検出するための少なくとも1つの手段（例えば少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つの検出手段）を含み得る。ある例においては、そのようなキットは1つまたは複数（例えば1つ〜3つ）のハウスキーピング遺伝子またはタンパク質を検出するための少なくとも1つの手段をさらに含み得る。検出手段は非限定的に、開示される遺伝子を含むゲノム配列に対して特異的な核酸プローブ、開示される遺伝子によってコードされる転写産物（例えばmRNA）に対して特異的な核酸プローブ、開示遺伝子（例えばゲノム配列またはそのような遺伝子のcDNA配列）の特異的な増幅のためのプライマーペア、開示される遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的な抗体または抗体断片を含み得る。
【００５３】
あるキットの態様においては、一次検出手段（例えば核酸プローブ、核酸プライマー、または抗体）は、例えばフルオロフォア、発色団、または（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、および当技術分野において一般的に公知の他のもののような）検出可能な産物を産生できる酵素によって直接的に標識することができる。他のキットの態様は、二次検出手段；例えば二次抗体（例えばヤギ抗ウサギ抗体、ウサギ抗マウス抗体、抗ハプテン抗体）または非抗体ハプテン結合分子（例えばアビジンまたはストレプトアビジン）を含む。そのようなある例における二次検出手段では、検出可能な部分によって直接的に標識がなされる。他の例においては、二次（またはそれ以上の次数の）抗体は、検出可能になるように標識された同類のハプテン結合分子（例えばストレプトアビジン(SA)西洋ワサビペルオキシダーゼ、SAアルカリホスファターゼ、および／またはSA QDot(商標））によって検出可能な（ビオチン、DNP、および／またはFITCのような）ハプテンに結合される。あるキットの態様は、発色試薬の展開のために酵素によって標識される、一次または二次（またはそれ以上の次数の）検出手段（例えば抗体）と連携して使用される、好適な容器内に入った発色試薬（例えばDAB、および／またはAEC）を含み得る。
【００５４】
ある態様においてキットは、特定のバイオマーカーを発現すること、またはしないことが知られている細胞株または組織のような、陽性対照または陰性対照サンプルを含む。
【００５５】
ある態様においてキットは、例えば開示される遺伝子もしくはその発現産物（例えばマイクロRNA、mRNAあるいはタンパク質）に特異的に結合するプローブもしくは抗体を使用する方法、または特定のプライマーもしくはプローブを使用する方法を開示する教材を含む。教材は、文書であること、電子的形態（例えばフロッピーディスクもしくはCD）であること、または視覚資料（例えば動画ファイル）であることが可能である。キットは、該キットが目的とする特定の適用を容易にする付加的な成分をも含み得る。従って、例えばキットは特定の開示される方法を実施するために日常的に使用される緩衝液および他の試薬を含み得る。そのようなキットおよび適切な内容物は当業者には周知である。
【００５６】
あるキットの態様は、箱、バッグ、小型かばん、プラスチック箱（例えば成型プラスチックもしくは他の透明な梱包）、包装体（例えば密封された、もしくは密封可能なプラスチック、紙、もしくは金属の包装体）、または他の容器のような運搬手段を含み得る。ある例においてキットの成分は、1つまたは複数のキットの成分を入れることのできる区画を有し得る、箱または他の容器のような1つの包装ユニットに封入される。他の例においては、キットは例えばバイアル、チューブ等のような、例えば検査される1つまたは複数の生物学的サンプルを保持できる1つまたは複数の容器を含む。
【００５７】
他のキットの態様は例えば、生物学的サンプルを処理、採取および／または加工するのに有用であり得るシリンジ、綿棒、またはゴム手袋を含む。キットはまた任意で、例えばスポイト、シリンジ等を含む、ある場所から別な場所へ生物学的サンプルを移動させるために有用な道具を含有し得る。なおも他のキットの態様は、使用済みの、またはもはや必要ではない品目（例えば対象サンプル）を廃棄するための処分手段を含み得る。そのような処分手段は、非限定的に、プラスチック、金属または他の不浸透性のバッグ、箱または容器のように、廃棄される材料からの漏出を阻止できる容器を含み得る。
【００５８】
キットはさらにソフトウェアを含み得る。ソフトウェアは、バイオマーカーアッセイのデモンストレーションを含む付加的なサポートを提供できるトレーニングビデオ、結果例、または本発明に従ってバイオマーカーアッセイを実施するための教材を含み得る。
【００５９】
上記の例に関連して本発明を説明したが、改変および変形が本発明の精神および範囲内に包含されることが理解される。本発明の例証的な例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるExhibit Aとして、本明細書において添付される。
【実施例】
【００６０】
実施例1 
デンスブレストを有する女性における乳癌の検出
年齢に関連する多様性：848例の前向き収集された患者サンプルの後向き解析により、デンスブレストを有する女性における乳癌の検出についての組み合わせタンパク質バイオマーカーアッセイ（Combinatorial Protein Biomarker Assay）の有用性を判定する。
【００６１】
概要
乳癌の正確な診断はしばしば、女性における良性乳房組織および高い乳腺密度の存在によって混乱させられる。しかし、乳癌に関連する生化学的（タンパク質）マーカーを検出する新しい技術の開発によって、検出の正確さが改善される可能性がある。解剖学的異常を特定する画像法とプロテオミクスのアプローチとを組み合わせることによって、強力な検出パラダイムの提供が約束される。さらに、プロテオミクスに基づくアプローチによって、逐年検診において乳癌を見落としてしまう主な原因であるデンスブレストを有する女性における乳癌を検出する強力なツールが提供される。乳癌の存在についてのタンパク質シグニチャーは理解しづらいままではあるが、ここで本発明者らは、血清タンパク質バイオマーカー（SPB）、腫瘍関連自己抗体（TAAb）を患者の臨床データと組み合わせる、組み合わせプロテオミクスバイオマーカーアッセイ（CPBA、Videssa(商標)Breast）の最適化について説明する。良性乳房疾患を浸潤性乳癌（IBC）／非浸潤性乳管癌（DCIS）と識別するためのVidessa（商標）Breastの臨床的妥当性を評価するために、2つの前向き無作為化多施設共同臨床試験が実施された。
【００６２】
序論
乳癌の検出における最も大きな課題の1つは、乳房組織の密度である。通常の乳腺密度を有する女性と比較して、乳腺密度の高い女性は乳癌と診断される可能性が4〜5倍高いが、それは現行の放射線学的スクリーニング法の公知の限界によるところが大きい。その結果、画像法の感度および特異度が低いことによって、患者や医療制度にとって不必要な負担となる偽陽性の結果の増加が導かれる。従って、IBC/DCISのような、臨床的に重要な疾患を確実に検出する、乳腺密度や病変サイズに非依存的な技術が非常に必要とされている。
【００６３】
過去には、2つの前向き無作為化多施設共同臨床試験（Provista-001治験、n=351、およびProvista-002治験の第1コホート、n=501）のデータにより、Videssa（商標）Breastには、画像法の単独使用と比べて偽陽性の結果を減らし、生検を行うべきか、または6ヶ月の追跡画像診断を続けるべきかの決断への情報を与える能力があることが示された。ここでは、デンスブレスト組織を有する女性における乳癌の検出についてのVidessa（商標）Breast（組み合わせタンパク質バイオマーカーアッセイ：Combinatorial Protein Biomarker Assay）の有用性を判定するための、848例の前向き収集された患者サンプルの後向き解析について報告される。付加的に、本解析は組み合わせタンパク質バイオマーカーアッセイの実用性を改善するために年齢層別化を使用することを支持するものである。近年、Provista-002治験の第1コホート（n=501）からのデータの解析が完了した。本データから、デンスブレストを有する女性における乳癌の検出について強力な、および著しく感度の高いバイオマーカーアッセイの結果が確認された。
【００６４】
Provista-001およびProvista-002治験では、米国中の15施設から852例の患者が登録され、患者を6ヶ月間追跡して癌の状態を確認した。採血前に4例の対象が調査から除外された。適格な患者は、画像診断によってACR BIRADS（登録商標）の3または4と同定された、癌の既往歴がない、または直近の6ヶ月間に事前の乳房の生検を行っていない、年齢25〜75歳の女性を含んだ（表1）。総計645例の対象が良性であると判定された一方、44例の対象が浸潤性乳癌（IBC）、33例の対象が非浸潤性乳管癌（DCIS）と診断され、生検または手術に伴う病理学法によって確認された。
【００６５】
結果  
【００６６】
（表１）登録された対象の人口統計、臨床的特徴および癌の状態
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【００６７】
生検以前に（その双方が参照により本明細書に組み入れられる、Hollingsworth and Reese, Oncology and Hematology Review, 10(2), Fall.2014;およびAnderson et al., J Proteome Res Jan 2011 10(1)85-96におけるもののような）事前に規定されたSPBとTAAbのセットについて測定を行った。SPBおよびTAAbの個々の濃度を患者の臨床データと組み合わせ、Logit Boost予測モデルを開発した。該モデルのパフォーマンスについては表3に示される。該モデルは全体的な感度が87.8％、特異度が83.7％、PPV（陽性予測値）が46.8％、NPV（陰性予測値）が97.7％、およびAUCが0.9018である。
【００６８】
Videssa（商標）Breastのパフォーマンスがデンスブレスト組織の存在によって影響されるかどうかを評価するために、本発明者らはデンスブレスト情報を集め、A、B（脂肪性〜乳腺散在−本明細書においては非デンスブレストと分類）またはC、D（不均一高濃度〜極めて高濃度−本明細書においてはデンスブレストと分類）のいずれかに分類した。
【００６９】
乳房の構成の4つの分類（a、b、cおよびd）は、（ACR BI-RADS(登録商標)ATLAS-MAMMOGRAPHY-ウェブサイトURL-acr.org/~/media/ACR/Documents/PDF/QualitySafety/Resources/BIRADS/01%20Mammography/02%20%20BIRADS%20Mammography%20Reporting.pdfにおいて利用可能；表2において定義付けられるように）視覚的に評価した、乳房中の線維腺密度の高い組織の含量によって定義付けた。
【００７０】
（表２）乳房組織・乳房の構成の分類
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【００７１】
総計256例の患者が非デンスブレスト、372例がデンスブレストと分類された。220例の患者についてはデンスブレスト情報が収集されなかった。しかし、非デンスブレスト（A、B）とデンスブレスト（C、D）との間の感度および特異度によって評価したところ、Videssa（商標）Breastのパフォーマンスに統計的差異は認められなかった（表3）。感度は83.8％〜92.5％の範囲に渡った一方、特異度は79.9％〜84.8％の範囲であった。これらの結果は、デンスブレストを有する女性に対して標準的治療の画像法と組み合わせてVidessa（商標）Breastを使用できることを強く示唆するものである。
【００７２】
（表３）様々な乳腺密度を有する女性におけるVidessa（商標）Breastのパフォーマンス
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【００７３】
結論
848例の患者の解析によって、25〜75歳の女性において高い感度およびNPVで良性乳房疾患を浸潤性乳癌（IBC）／DCISと区別する、（SPBとTAAbおよび患者データとを組み合わせた）組み合わせタンパク質バイオマーカーアッセイの能力が示される。
【００７４】
以前に認められたように、検出アルゴリズムについては50歳未満の女性と50歳以上の女性の間で明らかな差が認められた。
【００７５】
乳腺密度はVidessa（商標）Breastのパフォーマンスに影響を与えなかったことから、デンスブレストを有する女性における乳癌検出でのプロテオミクスパネルの重要な役割が示唆される。
【００７６】
標準的治療である画像法と組み合わせて使用した場合、これらの結果から、デンスブレストを有する女性における乳癌の早期検出についてのVidessa（商標）Breastの使用が支持される。      
【００７７】
上記の例に関して本発明を説明したが、改変および変形が本発明の精神および範囲内に包含されることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【国際調査報告】
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