(57)【要約】  本発明は、少なくとも１種類の治療剤の輸送、ベクター化、細胞送達、細胞ターゲッティング又は細胞局在化のための剤として有用である、金属ナノ粒子及び少なくとも１種類の治療剤を装填した、非高分子脂質ベースのナノ担体組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
ａ）少なくとも１種類の式（Ｉ）の化合物、
【化１】
2018513195.tif 000007
［式中、
−  Ｘは、酸素原子、硫黄原子又はメチレン基であり、
−  Ｂは、プリン塩基若しくはピリミジン塩基であるか、又はその各環が４〜７員を含み、任意に置換された、非天然の単環若しくは二環の複素環式塩基であり、
−  Ｌ1及びＬ2は、同一であるか又は異なって、水素、オキシカルボニル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基、チオカルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−基、カルボネート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−基、カルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−基、酸素原子、リン酸基、ホスホネート基、或いは非置換であるか、又は直鎖若しくは分岐鎖の、飽和若しくは不飽和のＣ2−Ｃ30炭化水素鎖によって置換された、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表すか、又は、
−  Ｌ1とＬ2は一緒に、以下の式：
【化２】
2018513195.tif 000008
のケタール基を形成するか、又は
−  Ｌ1又はＬ2は、水素を表し、且つ、もう片方は、ヒドロキシ基、或いは非置換であるか、又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル鎖により置換された、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、
−  Ｒ1及びＲ2は、同一であるか又は異なって、以下の：
−  飽和又は部分的不飽和の、直鎖又は分岐鎖のＣ2−Ｃ30炭化水素鎖、
−  Ｃ2−Ｃ30アシル鎖、
−  各アシル鎖がＣ2−Ｃ30であるジアシル鎖、
−  各アシル鎖がＣ2−Ｃ30であるジアシルグリセロール、又は
−  各アシル鎖がＣ2−Ｃ30であるスフィンゴシン又はセラミド基、
を表すか、又は
−  Ｌ1又はＬ2が水素を表し、且つ、もう片方がヒドロキシ基若しくは１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表すとき、Ｒ1及びＲ2は、存在せず；
−  Ｒ3は、以下の：
−  ヒドロキシ、アミノ、ホスフェート、ホスホネート、ホスファチジルコリン、Ｏ−アルキルホスファチジルコリン、チオホスフェート、ホスホニウム、ＮＨ2−Ｒ4、ＮＨＲ4Ｒ5又はＮＲ4Ｒ5Ｒ6基（式中、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、同一であるか又は異なって、水素原子、又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ1−Ｃ6アルキル鎖、又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ1−Ｃ6ヒドロキシアルキルを表す）、又は
−  ヒドロキシ基によって任意に置換された直鎖若しくは分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル鎖、又は
−  非置換であるか、或いはヒドロキシ基によって任意に置換されたＣ2−Ｃ30アルキルによって；又は（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（式中、ｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜２０であり、及びＲ9は、水素を表すか、或いは非置換であるか、又は少なくとも１種類の直鎖若しくは分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル、又はステロールラジカルによって置換された５〜７個の炭素原子を含む環状ケタール基を表す）によって置換された１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基、又は
−  −Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）q−Ｃ（Ｏ）−Ｏ［（ＣＨ2）2−Ｏ］r−Ｈ基（式中、ｑは２〜６の整数であり、及びｒは４〜３０、好ましくは１０〜２０の整数である）、
を表すか、或いは、
−  Ｒ3は、二量体の形態で式（Ｉ）の化合物を形成するために、同一であるか又は異なる式（Ｉ）の別の化合物の、同一であるか又は異なる別の置換基Ｒ3との共有結合による結合である］、
ｂ）少なくとも１種類の金属ナノ粒子、及び
ｃ）少なくとも１種類の治療剤、
を含む、脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項２】
以下の：
ａ）少なくとも１種類の式（Ｉ）の化合物、
【化３】
2018513195.tif 000009
［式中、
−  Ｘは、酸素原子、硫黄原子又はメチレン基であり、
−  Ｂは、プリン塩基若しくはピリミジン塩基であるか、又はその各環が４〜７員を含み、任意に置換された、非天然の単環若しくは二環の複素環式塩基であり、
−  Ｌ1及びＬ2は、同一であるか又は異なって、水素、オキシカルボニル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基、チオカルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−基、カルボネート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−基、カルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−基、酸素原子、リン酸基、ホスホネート基、或いは非置換であるか、又は直鎖若しくは分岐鎖の、飽和若しくは不飽和のＣ8−Ｃ30炭化水素鎖によって置換された、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、ここで、Ｌ1とＬ2は、同時に水素であることはなく、又は、
−  Ｌ1とＬ2は一緒に、以下の式：
【化４】
2018513195.tif 000010
のケタール基を形成するか、又は
−  Ｌ1又はＬ2は、水素を表し、且つ、もう片方は、ヒドロキシ基、或いは非置換であるか、又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ8−Ｃ30アルキル鎖により置換された、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、
−  Ｒ1及びＲ2は、同一であるか又は異なって、以下の：
−  飽和又は部分的不飽和の、直鎖又は分岐鎖のＣ8−Ｃ30炭化水素鎖、
−  Ｃ8−Ｃ30アシル鎖、
−  各アシル鎖がＣ8−Ｃ30であるジアシル鎖、
−  各アシル鎖がＣ8−Ｃ30であるジアシルグリセロール、又は
−  各アシル鎖がＣ8−Ｃ30であるスフィンゴシン又はセラミド基、
を表すか、又は
−  Ｌ1又はＬ2が水素を表し、且つ、もう片方がヒドロキシ基若しくは１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表すとき、Ｒ1及びＲ2は、存在せず；
−  Ｒ3は、以下の：
−  ヒドロキシ、アミノ、ホスフェート、ホスホネート、ホスファチジルコリン、Ｏ−アルキルホスファチジルコリン、チオホスフェート、ホスホニウム、ＮＨ2−Ｒ4、ＮＨＲ4Ｒ5又はＮＲ4Ｒ5Ｒ6基（式中、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、同一であるか又は異なって、水素原子、或いは直鎖若しくは分岐鎖のＣ1−Ｃ6アルキル鎖、又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ1−Ｃ6ヒドロキシアルキルを表す）、又は
−  ヒドロキシ基によって任意に置換された直鎖若しくは分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル鎖、又は
−  非置換であるか、或いはヒドロキシ基によって任意に置換されたＣ2−Ｃ30アルキルによって；又は（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（式中、ｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜２０であり、及びＲ9は、水素を表すか、或いは非置換であるか、又は少なくとも１種類の直鎖若しくは分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル、又はステロールラジカルによって置換された５〜７個の炭素原子を含む環状ケタール基を表す）によって置換された１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基、又は
−  −Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）q−Ｃ（Ｏ）−Ｏ［（ＣＨ2）2−Ｏ］r−Ｈ基（式中、ｑは２〜６の整数であり、及びｒは４〜３０、好ましくは１０〜２０の整数である）、
を表すか、或いは、
−  Ｒ3は、二量体の形態で式（Ｉ）の化合物を形成するために、同一であるか又は異なって式（Ｉ）の別の化合物の、同一であるか又は異なって別の置換基Ｒ3との共有結合による結合である］、
ｂ）少なくとも１種類の金属ナノ粒子、及び
ｃ）少なくとも１種類の治療剤、
を含む、請求項１に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項３】
以下の：
−  Ｘが、酸素原子である；
−  Ｂが、チミン又はウラシルである；
−  Ｌ1及びＬ2が、飽和若しくは部分的不飽和の、直鎖又は分岐鎖のＣ2−Ｃ30、好ましくはＣ8−Ｃ30炭化水素鎖によって置換されたオキシカルボニル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基であるか； 
−  Ｌ1が、各アシル基がＣ2−Ｃ30、好ましくはＣ8−Ｃ30であるジアシルグリセロールによって置換されたリン酸基であり、且つ、Ｌ2が、水素である；
−  Ｒ3が、ヒドロキシ、ＮＲ4Ｒ5Ｒ6基（式中、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、水素原子又は−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）q−Ｃ（Ｏ）−Ｏ［（ＣＨ2）2−Ｏ］r−Ｈ基（式中、ｑは、２〜６の整数であり、及びｒは、４〜３０、好ましくは１０〜２０の整数である）を表す）である、
のうちの少なくとも１つの条件を満たしている少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を含む、請求項１又は２に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項４】
前記式（Ｉ）におけるＬ1、Ｌ2、Ｒ1、Ｒ2又はＲ3の定義において、直鎖又は分岐鎖のアルキル鎖が、Ｃ8−Ｃ26、好ましくはＣ16−Ｃ20であり；及び／又は直鎖又は分岐鎖のＣ2−Ｃ30炭化水素鎖が、Ｃ8−Ｃ26、好ましくはＣ16−Ｃ20であり；及び／又はＣ2−Ｃ30アシル鎖が、Ｃ8−Ｃ26、好ましくはＣ16−Ｃ20である、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項５】
以下の：
−  Ｎ−［５’−（２’，３’−ジオレオイル）ウリジン］−Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアンモニウム、
−  チミジン３’−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート）、及び
−  ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）、α−ヒドロ−ω−メトキシ−のウリジン５’−（水素ブタンジオアート）２’，３’−ジ−（９Ｚ）−９−オクタデセノアートとのエステル、
から選択される少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項６】
少なくとも２つの異なった式（Ｉ）の化合物を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項７】
複数の金属ナノ粒子を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項８】
前記金属ナノ粒子が、金属酸化物、金属、金属合金又は金属カルコゲニドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項９】
前記金属ナノ粒子が酸化鉄を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項１０】
前記金属ナノ粒子が、２ｎｍ〜２０ｎｍの外形寸法を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項１１】
前記金属ナノ粒子の（単数若しくは複数の）集団が、単分散であるか、単分散及び／又は多分散であるか、或いは、多分散のいずれかである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項１２】
前記治療剤が、抗腫瘍剤、抗生物質製剤、抗微生物剤、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、気管支拡張剤、中枢神経系に対して活性である剤、抗高血圧剤、心血管系に対して活性である剤、抗アテローム性動脈硬化症剤、核酸及びその断片；ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、抗原、抗体又は幹細胞から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項１３】
前記治療剤が、抗腫瘍剤及び抗アテローム性動脈硬化症剤から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項１４】
以下のステップ：
−  有機溶媒中に少なくとも１種類の式（Ｉ）の化合物、少なくとも１種類の金属ナノ粒子及び少なくとも１種類の治療剤を含む溶液を調製し、
−  この溶液を、撹拌しながら水性媒質に加え、
−  得られた水溶液を超音波処理し、有機溶媒を蒸発させ、そして
−  こうして得られた脂質ベースのナノ担体組成物を回収すること、
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の金属ナノ粒子を含む脂質ベースのナノ担体組成物を調製する方法。
【請求項１５】
少なくとも１種類の治療剤の輸送、ベクター化、細胞送達、細胞ターゲッティング又は細胞局在化のための剤として使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の脂質ベースのナノ担体組成物、及び医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属ナノ粒子及び少なくとも１種類の治療剤を装填した、非高分子脂質ベースのナノ担体組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子技術は、疾患、検出、治療法、及び処置観察向けの新たな多機能ナノ粒子の提供を可能にした。
【０００３】
それらの多数の利点としては、必要とされる薬剤の量を最小化すること、特に疎水性薬剤に関して、生物学的利用能を増強すること、及び薬剤の毒性を低減することが挙げられる。
【０００４】
磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、世界中で使用されている非侵襲性の造影及び診断技術であり、そしてそれは、軟組織を造影するのに非常に効果的であり、身体の詳細な解剖学的画像を提供する。超微細の超常磁性酸化鉄ナノ粒子が現在、磁気共鳴映像法において造影剤として使用されている。
【０００５】
セラノスティックアプローチとは、診断的及び治療的機能性の両方を組み込んだ、分子又は巨大分子ターゲッティングベクター及びナノプラットフォーム技術を指す。これらの実体は、同時の標的化薬物の送達及び放出、並びに診断に使用されることができ、それは、疾患の進行及び治療に対する応答を観察することが含まれる。
【０００６】
加えて、このアプローチは、治療剤の安全且つ効果的な用量を選択するため、治療法の初期における有害影響を認識するため、並びに治療法をリアルタイムに観察するために使用でき、そして、それらの治療応答における個体間の多様性の作用に従って個々の患者に処置を適合させることを可能にする。
【０００７】
量子ドット脂質オリゴヌクレオチドバイオコンジュゲートは、A. Aime et al., Bioconjugate Chem., 2013, 24, 1345-1355において試験されている。これらのバイオコンジュゲートは、認識及び検出特性を有する機能性量子ドットを提供する目的で、核脂質及び脂質オリゴヌクレオチドコンジュゲートによってカプセル化された、量子ドットと名付けられた蛍光半導体ナノ結晶から成る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ナノ粒子及び治療剤を装填した、非高分子系である脂質ベースのセラノスティックシステムが、特に癌療法における毒性有効成分の使用に関連する副作用を回避しながら、特に、薬物ターゲッティング、薬物送達、及び処置の観察に使用できる可能性があることが、この度わかった。
【０００９】
有利なことには、これらのシステムにおけるヌクレオシド脂質（核脂質とも呼ばれる）の使用は、安定した超分子構築物の形成を可能にする。
【００１０】
いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、金属ナノ粒子が、核脂質との親水性／疎水性相互作用によりクラスタとして互いに結び付いているのに対して、核脂質の代わりに脂質を使用したときには、斯かるクラスタは形成されないと仮定され得る。前記核脂質はまた、親水性／疎水性相互作用によって（単数若しくは複数の）治療剤を封じ込めるのにも役立つので、外側の水性媒質と共に境界面に存在する。
【００１１】
また、有利なことには、本発明による脂質ベースのナノ担体組成物は、有効成分の点での高含有率、及び造影目的に使用できるナノ粒子の形成を可能にすることもわかった。
【００１２】
これらのナノ粒子は、金属ナノ粒子及び治療剤を充填され、且つ、核脂質によって安定化された固形脂質ナノ粒子である。
【００１３】
実際には、金属ナノ粒子に関連した脂質、例えば、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）の使用は、所望のコロイド安定性を有する製剤をもたらさないのに対して、驚いたことに、発明者らは、そうした安定性が、以下の式（Ｉ）の核脂質によって提供される得ることを見出した。
【００１４】
加えて、金属ナノ粒子のクラスタ形成は、より大きな疎水性リザーバを作り出し、そしてそれが、有利なことに、より多量の治療剤の封じ込めを可能にする。
【００１５】
その一方、脂質ベースのナノ担体組成物の磁気感受性は、これらの安定した超分子構築によって高められ、その結果、磁気共鳴シグナルもまた増強されるので、これにより、本発明の脂質ベースのナノ担体組成物の検出も増強され、そしてそれが、セラノスティックアプローチにおいて決定的な役割を果たす。
【００１６】
よって、本発明は、以下の：
ａ）少なくとも１種類の式（Ｉ）の化合物、
【００１７】
【化１】
2018513195.tif 000002
【００１８】
［式中、
−  Ｘは、酸素原子、硫黄原子又はメチレン基であり、
−  Ｂは、プリン塩基若しくはピリミジン塩基であるか、又はその各環が４〜７員を含み、任意に置換された、非天然の単環若しくは二環の複素環式塩基であり、
−  Ｌ1及びＬ2は、同一であるか又は異なって、水素、オキシカルボニル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基、チオカルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−基、カルボネート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−基、カルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−基、酸素原子、リン酸基、ホスホネート基、或いは非置換であるか、又は直鎖若しくは分岐鎖の、飽和若しくは不飽和のＣ2−Ｃ30炭化水素鎖によって置換された、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表すか、又は、
−  Ｌ1とＬ2は一緒に、以下の式：
【００１９】
【化２】
2018513195.tif 000003
【００２０】
のケタール基を形成するか、又は
−  Ｌ1又はＬ2は、水素を表し、且つ、もう片方は、ヒドロキシ基、或いは非置換であるか、又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル鎖により置換された、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、
−  Ｒ1及びＲ2は、同一であるか又は異なって、以下の：
−  飽和又は部分的不飽和の、直鎖又は分岐鎖のＣ2−Ｃ30炭化水素鎖、
−  Ｃ2−Ｃ30アシル鎖、
−  各アシル鎖がＣ2−Ｃ30であるジアシル鎖、
−  各アシル鎖がＣ2−Ｃ30であるジアシルグリセロール、又は
−  各アシル鎖がＣ2−Ｃ30であるスフィンゴシン又はセラミド基、
を表すか、又は
−  Ｌ1又はＬ2が水素を表し、且つ、もう片方がヒドロキシ基若しくは１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表すとき、Ｒ1及びＲ2は、存在せず；
【００２１】
−  Ｒ3は、以下の：
−  ヒドロキシ、アミノ、ホスフェート、ホスホネート、ホスファチジルコリン、Ｏ−アルキルホスファチジルコリン、チオホスフェート、ホスホニウム、ＮＨ2−Ｒ4、ＮＨＲ4Ｒ5又はＮＲ4Ｒ5Ｒ6基（式中、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、同一であるか又は異なって、水素原子、或いは直鎖若しくは分岐鎖のＣ1−Ｃ6アルキル鎖、又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ1−Ｃ6ヒドロキシアルキルを表す）、又は
−  ヒドロキシ基によって任意に置換された直鎖若しくは分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル鎖、又は
【００２２】
−  非置換であるか、或いはヒドロキシ基によって任意に置換されたＣ2−Ｃ30アルキルによって；又は（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（式中、ｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜２０であり、及びＲ9は、水素を表すか、或いは非置換であるか、又は少なくとも１種類の直鎖若しくは分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル、又はステロールラジカルによって置換された５〜７個の炭素原子を含む環状ケタール基を表す）によって置換された１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基、又は
−  −Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）q−Ｃ（Ｏ）−Ｏ［（ＣＨ2）2−Ｏ］r−Ｈ基（式中、ｑは２〜６の整数であり、及びｒは４〜３０、好ましくは１０〜２０の整数である）、
を表すか、或いは、
−  Ｒ3は、二量体の形態で式（Ｉ）の化合物を形成するために、同一であるか又は異なる式（Ｉ）の別の化合物の、同一であるか又は異なる別の置換基Ｒ3との共有結合による結合である］、
【００２３】
ｂ）少なくとも１種類の金属ナノ粒子、及び
ｃ）少なくとも１種類の治療剤、
を含む、脂質ベースのナノ担体組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１ａ】図１は、ＤＯＴＡＵナノ粒子（対照）の動的光散乱法（ＤＬＳ）（図１Ａ）及びゼータ電位分布（図１Ｂ）によって計測される強度によるサイズ分布を示す。
【図１ｂ】図１は、ＤＯＴＡＵナノ粒子（対照）の動的光散乱法（ＤＬＳ）（図１Ａ）及びゼータ電位分布（図１Ｂ）によって計測される強度によるサイズ分布を示す。
【図２ａ】図２は、ｄｉＣ１６ｄＴのナノ粒子（対照）の動的光散乱法（ＤＬＳ）（図２Ａ）及びゼータ電位分布（図２Ｂ）によって計測される強度によるサイズ分布を示す。
【図２ｂ】図２は、ｄｉＣ１６ｄＴのナノ粒子（対照）の動的光散乱法（ＤＬＳ）（図２Ａ）及びゼータ電位分布（図２Ｂ）によって計測される強度によるサイズ分布を示す。
【図３ａ】図３は、α−トコフェロールを含む脂質ベース（ＤＯＴＡＵ）のナノ担体組成物の動的光散乱法（ＤＬＳ）（図３Ａ）及びゼータ電位分布（図３Ｂ）によって計測される強度によるサイズ分布を示す。
【図３ｂ】図３は、α−トコフェロールを含む脂質ベース（ＤＯＴＡＵ）のナノ担体組成物の動的光散乱法（ＤＬＳ）（図３Ａ）及びゼータ電位分布（図３Ｂ）によって計測される強度によるサイズ分布を示す。
【図４ａ】図４は、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２．Ｎａ）を含む脂質ベース（ｄｉＣ１６ｄＴ、ＤＯＰＣ（共脂質）及びＤＯＵ−ＰＥＧ２０００）のナノ担体組成物の動的光散乱法（ＤＬＳ）（図４Ａ）及びゼータ電位分布（図４Ｂ）によって計測される強度によるサイズ分布を示す。
【図４ｂ】図４は、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２．Ｎａ）を含む脂質ベース（ｄｉＣ１６ｄＴ、ＤＯＰＣ（共脂質）及びＤＯＵ−ＰＥＧ２０００）のナノ担体組成物の動的光散乱法（ＤＬＳ）（図４Ａ）及びゼータ電位分布（図４Ｂ）によって計測される強度によるサイズ分布を示す。
【図５】図５は、アポリポプロテイン−Ａ１（ＡＰＯＡ１）を含む脂質ベース（ＤＯＴＡＵ）のナノ担体組成物のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル実験を示す。
【図６ａ】図６は、アポリポプロテイン−Ａ１（ＡＰＯＡ１）を含む脂質ベース（ＤＯＴＡＵ）のナノ担体組成物の動的光散乱法（ＤＬＳ）（図６Ａ）及びゼータ電位分布（図６Ｂ）によって計測される強度によるサイズ分布を示す。
【図６ｂ】図６は、アポリポプロテイン−Ａ１（ＡＰＯＡ１）を含む脂質ベース（ＤＯＴＡＵ）のナノ担体組成物の動的光散乱法（ＤＬＳ）（図６Ａ）及びゼータ電位分布（図６Ｂ）によって計測される強度によるサイズ分布を示す。
【図７】図７は、Zetasizer 3000 HAS MALVERNを用いて決定した、ＤＯＴＡＵ又はｄｉＣ１６ｄＴによってカプセル化した酸化鉄ナノ粒子クラスタ（調製物１及び２）、或いは、酸化鉄ナノ粒子及びα−トコフェロールを含むＤＯＴＡＵベースのナノ担体組成物（実施例１）の粒径を示す。
【図８ａ】図８は、ＤＯＴＡＵ（図８Ａ）及びα−トコフェロール（図８Ｂ）のための検出用検量線を示す。
【図８ｂ】図８は、ＤＯＴＡＵ（図８Ａ）及びα−トコフェロール（図８Ｂ）のための検出用検量線を示す。
【図９ａ】図９は、調製物１で調製したＤＯＴＡＵによってカプセル化された酸化鉄ナノ粒子クラスタ、並びに実施例１で調製した酸化鉄ナノ粒子及びα−トコフェロールを含むＤＯＴＡＵベースのナノ担体組成物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図９ｂ】図９は、調製物１で調製したＤＯＴＡＵによってカプセル化された酸化鉄ナノ粒子クラスタ、並びに実施例１で調製した酸化鉄ナノ粒子及びα−トコフェロールを含むＤＯＴＡＵベースのナノ担体組成物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図１０】図１０は、脂質（ＤＯＰＣ）又は核脂質（ＤＯＴＡＵ）によってカプセル化された酸化鉄ナノ粒子クラスタの安定性比較を示す。
【図１１】図１１は、陽イオン性又は陰イオン性金属ナノ粒子の調製物の磁気共鳴緩和時間測定試験を示す。
【図１２】図１２は、実施例２のナノ担体組成物の血小板抗凝集活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
「ナノ担体」とは、本発明のセラノスティックシステムが、約２０〜３００ｎｍの外形寸法（平均直経）を有することを意味する。
Ｘは、酸素原子を表すのが好ましい。
【００２６】
「直鎖又は分岐鎖のＣ1−Ｃ6アルキル」とは、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、好ましくはメチル又はエチルと理解される。
【００２７】
好ましいＣ2−Ｃ30炭化水素鎖は、Ｃ8−Ｃ30、好ましくはＣ8−Ｃ26、より好ましくはＣ16−Ｃ20炭化水素鎖である。
【００２８】
好ましい直鎖又は分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル鎖は、Ｃ8−Ｃ30、好ましくはＣ8−Ｃ26、より好ましくはＣ16−Ｃ20直鎖又は分岐鎖のアルキル鎖である。
【００２９】
好ましいＣ2−Ｃ30アシル鎖は、Ｃ8−Ｃ30、好ましくはＣ8−Ｃ26、より好ましくはＣ16−Ｃ20アシル鎖である。
【００３０】
Ｌ1、Ｌ2、Ｒ1又はＲ2の定義において、アルキル、アシル又は炭化水素鎖は、好ましくはＣ8−Ｃ30アルキル、アシル又は炭化水素鎖である。
【００３１】
好ましくは、Ｌ1とＬ2は、同時に水素であることはない。
【００３２】
具体的には、本発明は、以下の：
ａ）少なくとも１種類の式（Ｉ）の化合物、
【００３３】
【化３】
2018513195.tif 000004
【００３４】
［式中、
−  Ｘは、酸素原子、硫黄原子又はメチレン基であり、
−  Ｂは、プリン塩基若しくはピリミジン塩基であるか、又はその各環が４〜７員を含み、任意に置換された、非天然の単環若しくは二環の複素環式塩基であり、
−  Ｌ1及びＬ2は、同一であるか又は異なって、水素、オキシカルボニル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基、チオカルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−基、カルボネート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−基、カルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−基、酸素原子、リン酸基、ホスホネート基、或いは非置換であるか、又は直鎖若しくは分岐鎖の、飽和若しくは不飽和のＣ8−Ｃ30炭化水素鎖によって置換された、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、ここで、Ｌ1とＬ2は、同時に水素であることはなく、又は、
−  Ｌ1とＬ2は一緒に、以下の式：
【００３５】
【化４】
2018513195.tif 000005
【００３６】
のケタール基を形成するか、又は
−  Ｌ1又はＬ2は、水素を表し、且つ、もう片方は、ヒドロキシ基、或いは非置換であるか、又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ8−Ｃ30アルキル鎖により置換された、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、
−  Ｒ1及びＲ2は、同一であるか又は異なって、以下の：
−  飽和又は部分的不飽和の、直鎖又は分岐鎖のＣ8−Ｃ30炭化水素鎖、
−  Ｃ8−Ｃ30アシル鎖、
−  各アシル鎖がＣ8−Ｃ30であるジアシル鎖、
−  各アシル鎖がＣ8−Ｃ30であるジアシルグリセロール、又は
−  各アシル鎖がＣ8−Ｃ30であるスフィンゴシン又はセラミド基、
を表すか、又は
−  Ｌ1又はＬ2が水素を表し、且つ、もう片方がヒドロキシ基若しくは１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表すとき、Ｒ1及びＲ2は、存在せず；
【００３７】
−  Ｒ3は、以下の：
−  ヒドロキシ、アミノ、ホスフェート、ホスホネート、ホスファチジルコリン、Ｏ−アルキルホスファチジルコリン、チオホスフェート、ホスホニウム、ＮＨ2−Ｒ4、ＮＨＲ4Ｒ5又はＮＲ4Ｒ5Ｒ6基（式中、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、同一であるか又は異なって、水素原子、或いは直鎖若しくは分岐鎖のＣ1−Ｃ6アルキル鎖、又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ1−Ｃ6ヒドロキシアルキルを表す）、又は
−  ヒドロキシ基によって任意に置換された直鎖若しくは分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル鎖、又は
【００３８】
−  非置換であるか、或いはヒドロキシ基によって任意に置換されたＣ2−Ｃ30アルキルによって；又は（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（式中、ｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜２０であり、及びＲ9は、水素を表すか、或いは非置換であるか、又は少なくとも１種類の直鎖若しくは分岐鎖のＣ2−Ｃ30アルキル、又はステロールラジカルによって置換された５〜７個の炭素原子を含む環状ケタール基を表す）によって置換された１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基、又は
−  −Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）q−Ｃ（Ｏ）−Ｏ［（ＣＨ2）2−Ｏ］r−Ｈ基（式中、ｑは２〜６の整数であり、及びｒは４〜３０、好ましくは１０〜２０の整数である）、
を表すか、或いは、
−  Ｒ3は、二量体の形態で式（Ｉ）の化合物を形成するために、同一であるか又は異なって式（Ｉ）の別の化合物の、同一であるか又は異なって別の置換基Ｒ3との共有結合による結合である］、
【００３９】
ｂ）少なくとも１種類の金属ナノ粒子、及び
ｃ）少なくとも１種類の治療剤、
を含む、脂質ベースのナノ担体組成物に関する。
【００４０】
プリン又はピリミジン塩基は、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、尿酸、カフェイン、テオブロミン、ウラシル、チミン、ジヒドロウリジン、及びその誘導体から選択され得る。
【００４１】
チミンとウラシルが好ましい。
【００４２】
また、先の式（Ｉ）において、プリン又はピリミジン塩基は、例えば、ハロゲン、アミノ基、カルボキシ基、カルボニル基、カルボニルアミノ基、ヒドロキシ、アジド、シアノ、チオール、直鎖の又は分岐鎖のＣ1−Ｃ6アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルオキシ（例えば、メトキシ）、オキシカルボニル、ビニル、エチニル、プロピニル、アシル基などから選択される少なくとも１つの置換基によって置換され得る。
【００４３】
「プリン又はピリミジン塩基の誘導体」とは、例えば、プリン又はピリミジン塩基について先に述べたように任意に置換された、各環が４〜７員を有する非天然の単環又は二環の複素環式塩基を意味する。
【００４４】
「非天然の複素環式塩基」とは、天然には存在しない、例えば、３−ニトロピロール、４−ニトロイミダゾール又は５−ニトロインドールなどの全般的な塩基を意味する。
【００４５】
「１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール」とは、１〜４個の窒素原子によって隔てられた、合計で５〜１２個の原子を含む芳香族の、若しくは部分的に不飽和の単環又は二環の炭素環式基を意味し、そしてそれは、例えば、フラン、ピロール、オキサゾール、オキサジアゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、トリアゾール、テトラゾール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、ベンゾフラン、インドール、キノレイン、イソキノレイン、クロマン、ナフチリジン、及びベンゾジアジン基から選択され得るものであり、そして、トリアゾールが好ましい。
【００４６】
少なくとも１つの条件を満たしている、以下の式（Ｉ）の化合物が好まれる：
−  Ｘが、酸素原子である；
−  Ｂが、チミン又はウラシルである；
−  Ｌ1及びＬ2が、飽和若しくは部分的不飽和の、直鎖又は分岐鎖のＣ2−Ｃ30、好ましくはＣ8−Ｃ30炭化水素鎖、好ましくはＣ8−Ｃ26、より好ましくはＣ16−Ｃ20によって置換されたオキシカルボニル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基であるか；又は
−  Ｌ1が、各アシル基がＣ2−Ｃ30、好ましくはＣ8−Ｃ30、より好ましくはＣ8−Ｃ26、より一層好ましくはＣ16−Ｃ20であるジアシルグリセロールによって置換されたリン酸基であり、且つ、Ｌ2が、水素である；
−  Ｒ3が、ヒドロキシ、ＮＲ4Ｒ5Ｒ6基（式中、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、水素原子又は−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）q−Ｃ（Ｏ）−Ｏ［（ＣＨ2）2−Ｏ］r−Ｈ基（式中、ｑは２〜６の整数であり、及び、ｒは４〜３０、好ましくは１０〜２０の整数である）を表す）である。
【００４７】
特に好ましい式（Ｉ）の化合物は、以下の：
−  Ｎ−［５’−（２’，３’−ジオレオイル）ウリジン］−Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＵ）（ＣＡＳ登録番号：８６８２２６−０６−６）、
−  チミジン３’−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート）、別名ｄｉＣ１６ｄＴ（ＣＡＳ登録番号：１１６０００２−７０−９）、及び
−  ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）、α−ヒドロ−ω−メトキシ−のウリジン５’−（水素ブタンジオアート）２’，３’−ジ−（９Ｚ）−９−オクタデセノアートとのエステル（ＤＯＵ−ＰＥＧ）（ＣＡＳ登録番号：１３５３５７０−７５−８）、
から選択される。
【００４８】
好ましい実施形態において、本発明による脂質ベースのナノ担体組成物は、少なくとも２つの異なった式（Ｉ）の化合物を含む。
【００４９】
特に、脂質ベースのナノ担体組成物は、式（Ｉ）の化合物に加えて少なくとも１種類の共脂質を含み得る。
【００５０】
「共脂質」とは、式（Ｉ）の化合物と組み合わせて使用される化合物を意味し、それは、脂質ベースのナノ担体組成物の構造の生成に貢献する。
【００５１】
好ましくは、双性イオン共脂質が使用される。
【００５２】
前述の共脂質は、例えば、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレイルホスファチジルウリジンホスファチジルコリン（ＤＯＵＰＣ）又はジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から選択され得る。
【００５３】
これらの化合物は、それらが式（Ｉ）の化合物との混合物中で使用されるとき、共脂質の役割を果たすことができる。或いは、それらは、例えば、ジオレイルホスファチジルウリジンホスファチジルコリン（ＤＯＵＰＣ）などの式（Ｉ）に含まれ得る。この場合、それらは、式（Ｉ）の化合物の役割を果たすか、又は別の式（Ｉ）の化合物と組み合わせられた状態で、共脂質の役割を果たす。
【００５４】
式（Ｉ）の化合物の調製に関して、このタイプの化合物への異なる到達経路を記載しているＷＯ２００５／１１６０４３（特に８〜１７ページ及び実施例を参照のこと）、並びにＷＯ２００９／０９８４０４又はＷＯ２０１０／１３６６７６を参照することができる。
【００５５】
好ましくは、本発明による脂質ベースのナノ担体組成物は、多くの金属ナノ粒子、具体的には、１０〜９０％（ｗ／ｗ）、好ましくは５０〜８０％の金属ナノ粒子を含んでいる。
【００５６】
金属ナノ粒子は、好ましくは、例えば、その磁的特性で知られている酸化鉄（磁鉄鋼Ｆｅ3Ｏ4、マグヘマイトγ−Ｆｅ2Ｏ3、又は他のＣｏフェライト又はＮｉフェライト）から選択され得る金属酸化物を含む一方で、金属（Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｆｅ、Ｃｏなど）、合金（ＦｅＣｏ、ＦｅＰｔ、ＣｏＰｔ、ＦｅＢｉなど）及び金属カルコゲニド（ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ...など）は、生体イメージング、タッキング又はセンシングのための造影剤又は標識化ツールの開発の目的において興味深いそれらのプラズモン特性、ルミネセンス特性又は磁的特性のために使用され得る。
【００５７】
好ましくは、金属ナノ粒子は、約２ｎｍ〜２０ｎｍ、好ましくは５〜１０ｎｍの外形寸法（平均直経）を有する。
【００５８】
本発明による脂質ベースのナノ担体組成物に含まれる金属ナノ粒子は、単分散（例えば、それらは約１０ｎｍを中心とした平均直径を有する集団から成る）であっても、又は単分散及び／又は多分散（例えば、約４ｎｍ及び１０ｎｍを中心とした平均直径を有する２つの集団など）であっても、そうでなければ、多分散（２ｎｍ〜２０ｎｍの範囲の異なった平均直径を有する異なった集団）であってもよい。
【００５９】
酸化鉄ナノ粒子が好まれる。
【００６０】
本発明による脂質ベースのナノ担体組成物に含まれる金属ナノ粒子は、例えば、アンカリング官能基（anchoring function）−主にカルボキシレート、金属酸化物及びアミンに使用するためのホスホネート基、金ナノ粒子などの金属ナノ粒子向けのチオール官能基若しくは他の強力な求核性官能基−、及び飽和若しくは不飽和の炭化水素鎖であっても又はペルフルオロ化炭素鎖であってもよい疎水性残基から成る、両親媒性若しくは脂肪性リガンドのグラフティングによって修飾された表面を有する、２ｎｍ〜２０ｎｍ、好ましくは５〜１０ｎｍで構成されるサイズを有する、表面官能化ナノ粒子、又は表面反応性基を提示するあらゆるタイプのナノ粒子であり得る。
【００６１】
例えば、共沈疎水性酸化鉄ナノ粒子は、脂肪酸としてステアリン酸を使用して、先に公開された（G.A. van Ewijk, G.J. Vroege, A.P. Philipse, Convenient preparation methods for magnetic colloids, J. Magn. Magn. Mater. 201 (1999) 31-33）のように調製した。
【００６２】
好ましい実施形態において、金属ナノ粒子は、それらに疎水特性を提供する表面官能化を有する。例えば、それらは、その表面上に脂肪酸残基を担持する。
【００６３】
「治療剤」とは、特に動物、特にヒトにおいて、又は分離細胞において、例えば、インビトロ又はインビボで、病的状態を予防するか又は処置する、或いは、生物学的機能を回復するために使用される天然又は合成の分子を意味する。
【００６４】
有利なことには、前記治療剤は、例えば、抗腫瘍剤、抗生物質製剤、抗微生物剤、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、気管支拡張剤、中枢神経系に対して活性である剤、抗高血圧剤、心血管系に対して活性である剤（特に血管拡張薬、抗アテローム性動脈硬化症剤、例えば、血小板抗凝集活性を有する剤など）、核酸及びそれらの断片；ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、抗原、抗体又は幹細胞などから選択され得る。
【００６５】
抗癌剤は、例えば、ソラフェニブ、スニチニブ、タキサン類（ドセタキセル、パクリタキセル、カバジタキセル...）、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノマイシン、メルファラン、ゲムシタビン、シスプラチン、ゲムシタビンの誘導体類、又はシスプラチン、イマチニブ（Gleevec（登録商標））、５−フルオロウラシル、９−アミノカンプトテシン、アミン修飾ゲルダナマイシン、Taxol（登録商標）、プロカルバジン若しくはヒドロキシウレアの誘導体などが特に着目される。
【００６６】
抗アテローム性動脈硬化症剤は、例えば、トコフェロール、レスベラトール、アントシアン、スクシノブコル、プロスタサイクリン、テルトロバン、ピコタミド、バレスプラジブ、ダラプラジブ、フマギリン、ケモカイン（ＣＸＣＲ３、ＩＬ１０）、アリスキレン、リシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、テルミサルタン、エプレルノン、アポリポプロテインＡ１（ＡＰＯＡ−１）又はグルタチオンなどもまた特に着目される。
【００６７】
本発明はまた、先に記載したように、金属ナノ粒子及び少なくとも１種類の治療剤を含む脂質ベースのナノ担体組成物を調製するプロセスに関し、そしてそれは、以下のステップを含む：
−  有機溶媒中に少なくとも１種類の式（Ｉ）の化合物、少なくとも１種類の金属ナノ粒子及び少なくとも１種類の治療剤を含む溶液を調製し、
−  この溶液を、撹拌しながら水性媒質に加え、
−  得られた水溶液を超音波処理し、有機溶媒を蒸発させ、そして
−  こうして得られた脂質ベースのナノ担体組成物を回収する。
【００６８】
好ましい反応条件は、以下のとおりである：
−  有機溶媒は、例えば、エーテル、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチル、ブタノール、プロパノール、エタノール、及びメタノールから選択される；
−  水性媒質は、水である；
−  有機溶媒の蒸発は、減圧下で実施される、すなわち、例えば、圧力は１ｂａｒから５ｍｂａｒへ減圧される；
−  脂質ベースのナノ担体組成物は、例えば、１５〜３０分間の１４０００ｒｐｍでの遠心分離によって回収される。
【００６９】
遠心分離後に、脂質ベースのナノ担体組成物を含むペレットは、水中に再懸濁されてもよい。
【００７０】
好ましくは、上記で定義した本発明の脂質ベースのナノ担体組成物中に含まれているとき、水相中において、治療剤は、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度にて、及び金属ナノ粒子は、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度にて存在する。
【００７１】
本発明はまた、特に造影誘導治療法における、少なくとも１種類の治療剤の輸送、ベクター化、細胞送達、細胞ターゲッティング又は細胞局在化のための剤としての脂質ベースのナノ担体組成物の使用にも関する。
【００７２】
例えば、本発明の脂質ベースのナノ担体組成物は、癌、アテローム性動脈硬化症、ウイルス及び非ウイルス性感染症、免疫性疾患、炎症などの疾患及び／又は障害に関連する様々な治療分野に使用されてもよい。
【００７３】
本発明はまた、先に記載した脂質ベースのナノ担体組成物、及び医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物にも関係がある。
【実施例】
【００７４】
本発明は、以下の実施例によって非限定的に例示される。
【００７５】
すべての市販の試薬及び溶媒（Fluka, Sigma-Aldrich, Alfa-Aesar）を、更なる精製なしで使用された。
【００７６】
カラムクロマトグラフィーを、フラッシュシリカゲル（０．０４〜０．０６３ｍｍ、Merck）又はＬＨ２０サイズ排除カラム（Sephadex LH-20）を用いて実施した。
【００７７】
以下の略称を使用する：
−  １，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）（ＣＡＳ登録番号：４２３５−９５−４）
【００７８】
−  Ｎ−［５’−（２’，３’−ジオレオイル）ウリジン］−Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＵ）（ＣＡＳ登録番号：８６８２２６−０６−６）
【００７９】
−  チミジン３’−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート）（別名ｄｉＣ１６ｄＴ）、ＣＡＳ登録番号：１１６０００２−７０−９、及び
【００８０】
−  ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）、α−ヒドロ−ω−メトキシ−のウリジン５’−（水素ブタンジオアート）２’，３’−ジ−（９Ｚ）−９−オクタデセノアートとのエステル（ＤＯＵ−ＰＥＧ）（ＣＡＳ登録番号：１３５３５７０−７５−８）。
【００８１】
調製物１：ＤＯＴＡＵ（対照）による酸化鉄ナノ粒子クラスタのカプセル化
【００８２】
１００μＬの陽性荷電核脂質（ＤＯＴＡＵ）の原液（エーテル中に５０ｍｇ／ｍＬ）と、２０μＬの酸化鉄ナノ粒子の原液（エーテル中に１０ｍｇ／ｍＬ）を混合した。ＤＯＴＡＵを、P. Chabaud et al., Bioconjugate Chem., 2006, 17, 466-472に従って調製した。ボルテックスによって撹拌しながら、ガラス管に入れた水相（２ｍＬのMilli-Q水）に有機相を滴下して加えた。次に、その混合物をガラス製のフラスコに入れた。
【００８３】
エーテルを減圧下で除去し、得られた未精製の原料溶液を、３×１５分間の時間、超音波処理し、そして、ＬＳカラムによって精製して、純粋なナノ粒子の溶液を得た。
【００８４】
動的光散乱法（ＤＬＳ）によって計測した強度によるサイズ分布（ｄ＝８０ｎｍ）及びMalvernNanoZSデバイスを用いて計測したゼータ電位分布（ゼータ電位＝＋５５ｍＶ）を、図１Ａ及び１Ｂに示す。
【００８５】
調製物２：ｄｉＣ１６ｄＴ（対照）による酸化鉄ナノ粒子クラスタのカプセル化
【００８６】
７５μＬの陰性荷電核脂質（ｄｉＣ１６ｄＴ）の原液（クロロホルム中に５０ｍｇ／ｍＬ）と、２５μＬの１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）の原液（Avanti Polar lipids、クロロホルム中に５０ｍｇ／ｍＬ）と、３０μＬの中性核脂質（ＤＯＵ−ＰＥＧ２０００）の原液（クロロホルム中に１０ｍｇ／ｍＬ）と、２０μＬの酸化鉄ナノ粒子の原液（クロロホルム中に１０ｍｇ／ｍＬ）を混合した。ＤＩＣ１６ｄＴを、ＷＯ２０１０／１３６７６に開示されるとおり調製した。ＤＯＵ−ＰＥＧ２０００を、K. Oumzil et al., 2011, J. Control. Release, doi: 10. 1016/j. jconrel. 2011. 02. 008に従って調製した。
【００８７】
ボルテックスによって撹拌しながら、ガラス管に入れた水相（２ｍｌのMilli-Q水）に、有機相を滴下して加えた。次に、その混合物をガラス製のフラスコに入れた。
【００８８】
クロロホルムを減圧下で除去し、得られた未精製の原料溶液を、３×１５分間の時間、超音波処理し、そして、ＬＳカラムによって精製して、純粋なナノ粒子の溶液を得た。
【００８９】
動的光散乱法（ＤＬＳ）によって計測した強度によるサイズ分布（ｄ＝９２ｎｍ）及びMalvernNanoZSデバイスを用いて計測したゼータ電位分布（ゼータ電位＝−２３．６ｍＶ）を、図２Ａ及び２Ｂに示す。
【００９０】
実施例１：酸化鉄ナノ粒子及びα−トコフェロールを含む脂質ベース（ＤＯＴＡＵ）のナノ担体組成物の調製
【００９１】
１００μＬの陽性荷電核脂質（ＤＯＴＡＵ）の原液（エーテル中に５０ｍｇ／ｍＬ）と、１０μＬのα−トコフェロールの原液（Sigma Aldrich、エーテル中に５０ｍｇ／ｍＬ）と、２０μＬの酸化鉄ナノ粒子の原液（エーテル中に１０ｍｇ／ｍＬ）を混合した。ボルテックスによって撹拌しながら、ガラス管に入れた水相（２ｍＬのMilli-Q水）に有機相を滴下して加えた。次に、その混合物をガラス製のフラスコに入れた。
【００９２】
エーテルを減圧下で除去し、得られた未精製原料溶液を、３×１５分間、超音波処理し、そして、ＬＳカラムによって精製して、純粋なナノ粒子の溶液を得た。
【００９３】
動的光散乱法（ＤＬＳ）によって計測した強度によるサイズ分布（ｄ＝１０８ｎｍ）及びMalvernNanoZSデバイスを用いて計測したゼータ電位分布（ゼータ電位＝＋４９．２ｍＶ）を、図３Ａ及び３Ｂに示す。
【００９４】
実施例２：酸化鉄ナノ粒子及びプロスタサイクリン（ＰＧＩ２．Ｎａ）を含む脂質ベース（ｄｉＣ１６ｄＴ、ＤＯＰＣ、及びＤＯＵ−ＰＥＧ２０００）のナノ担体組成物の調製
【００９５】
７５μＬの陰性荷電核脂質（ｄｉＣ１６ｄＴ）の原液（クロロホルム＋２％のＥｔ3Ｎ中に５０ｍｇ／ｍＬ）と、２５μＬの共脂質としてのＤＯＰＣの原液（クロロホルム＋２％のＥｔ3Ｎ中に５０ｍｇ／ｍＬ）と、３０μＬの中性核脂質（ＤＯＵ−ＰＥＧ２０００）の原液（クロロホルム＋２％のＥｔ3Ｎ中に１０ｍｇ／ｍＬ）と、１ｍｇのＰＧＩ２．Ｎａ（Sigma Aldrich）と、２０μＬの酸化鉄ナノ粒子の原液（クロロホルム＋２％のＥｔ3Ｎ中に１０ｍｇ／ｍＬ）を混合した。ボルテックスによって撹拌しながら、ガラス管に入れた水相（２ｍｌの炭酸水素塩緩衝液、２５℃にてｐＨ９．６）に、有機相を滴下して加えた。次に、その混合物をガラス製のフラスコに入れた。
【００９６】
クロロホルムを減圧下で除去し、得られた未精製原料溶液を、３×１５分間の時間、超音波処理し、そして、ＬＳカラムによって精製して、純粋なナノ粒子の溶液を得た。
【００９７】
動的光散乱法（ＤＬＳ）によって計測した強度によるサイズ分布（ｄ＝１５４ｎｍ）及びMalvernNanoZSデバイスを用いて計測したゼータ電位分布（ゼータ電位＝−２２．６ｍＶ）を、図４Ａ及び４Ｂに示す。
【００９８】
実施例３：アポリポプロテイン−Ａ１（ＡＰＯＡ１）を含む脂質ベース（ＤＯＴＡＵ）のナノ担体組成物の調製
【００９９】
１００μＬの陽性荷電核脂質（ＤＯＴＡＵ）の原液（エーテル中に５０ｍｇ／ｍＬ）と、２０μＬの酸化鉄ナノ粒子の原液（エーテル中に１０ｍｇ／ｍＬ）を混合した。ボルテックスによって撹拌しながら、ガラス管に入れた水相（２ｍＬのMilli-Q水中に１００μｇのＡＰＯＡ１（Sigma Aldrich））に有機相を滴下して加えた。次に、その混合物をガラス製のフラスコに入れた。エーテルを減圧下で除去し、得られた未精製原料溶液を、３×１５分間、超音波処理し、そして、磁気ＬＳカラムによって精製して、純粋なナノ粒子の溶液を得た。ナノ粒子中のＡＰＯＡ１プロテインの存在を実証するために、ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル実験を実現した。そのゲルは、タンパク質がナノ粒子中に存在することを示している（２つの実験、図５）。
【０１００】
ＡＰＯＡ１（ｄ＝５．０１ｎｍ）の、及びＡＰＯＡ１（１０５ｄ＝ｎｍ）を含む脂質ベース（ＤＯＴＡＵ）のナノ担体組成物の、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって計測した、及びMalvernNanoZSデバイスを用いて計測した個数によるサイズ分布、並びに強度によって計測した個数によるサイズ分布を、図６Ａ及び６Ｂに示す。
【０１０１】
実施例４：安定性試験
ＤＯＴＡＵ又はｄｉＣ１６ｄＴによってカプセル化した酸化鉄ナノ粒子クラスタ（調製物１及び２）、並びに５００μＬのMilli-Ｑ水中に酸化鉄ナノ粒子及びα−トコフェロール（実施例１）を含むＤＯＴＡＵベースのナノ担体組成物を、５００ｒｐｍの撹拌下、３７℃にてインキュベートした。様々な時間（０、１、３、６、２４、４８ｈ）にわたって、粒径をZetasizer3000HAS MALVERNを使用して測定した。
【０１０２】
結果を図７に示す。
【０１０３】
結果は、全体的なサイズが、治療剤の不存在又は存在のいずれにおいても、陽性又は陰性のいずれに荷電していても、（２日間より長い）時間の結果として変化しないことを示し、そしてそれは、室温及び３７℃の両方におけるコロイドの安定性を示す。
【０１０４】
実施例５：ＨＰＬＣ分析法のためのサンプル調整、並びにＤＯＴＡＵ及びα−トコフェロールの投与量
【０１０５】
上清を取り除くために、調製物１及び実施例１で調製した陽イオン性ナノ粒子の純粋な懸濁液を、１４０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。（ペレットの形態の）陽イオン性ナノ粒子を、エタノール中に懸濁した。得られた溶液を、ＲＴにて１５分間混合し、そして、１４０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。次に、上清（エタノール）をＨＰＬＣによって分析した。
【０１０６】
酸化鉄ナノ粒子を含む脂質ベースのナノ担体組成物からの核脂質（ＤＯＴＡＵ）及びα−トコフェロールの定量化のために、逆相Ｕ−ＨＰＬＣ法を開発した。この方法は、５分以内のＤＯＴＡＵと脂質ベース（ＤＯＴＡＵ）のナノ担体組成物との分離を可能にする。
【０１０７】
分離を、ＭｅＯＨ＋０．１％のＨＣＯＯＨから構成された移動相を用いたカラムSyncronis C18、５０×２．１ｍｍ、１．７μｍにより実施した。流量は０．２ｍＬ／分に設定した。検出は、それぞれ、α−トコフェロール及びＤＯＴＡＵに関して２９３ｎｍ及び２６０ｎｍにておこなった。注入体積は１．０μＬであり、そしてそれが、それぞれ、５ｎｇ及び１５ｎｇの閾値にてＤＯＴＡＵ及びα−トコフェロールの検出を可能にする。
【０１０８】
図８Ａ及び８Ｂに示すとおり、ＤＯＴＡＵ及びα−トコフェロールの検量線を、濃度に対するシグナルの強度を測定することによって作成した。
【０１０９】
ＨＰＬＣ分析を、図９Ａ（２６０ｎｍ）及び９Ｂ（２９３ｎｍ）に示す。
【０１１０】
それに、ＤＯＴＡＵ及びα−トコフェロールの両方の定量化が可能であり、そしてそれは、カプセル化されたものの回収及び添加率の値の決定につながった。
【０１１１】
以下の表１に示したとおり、ＤＯＴＡＵ／α−トコフェロール（実施例１）の場合に得られた添加率は３８％であり、そして、カプセル化薬物の回収は約１０％であった。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
この方法には、分析に少量を使用すること及び短い分析時間といった利点があり、並びに、質量分析法との整合性があり、そしてそれは、生物学的解析のために有用であり得る。
【０１１４】
実施例６：核脂質（ＤＯＴＡＵ）と比較した、脂質（ＤＯＰＣ）（対照）によってカプセル化した酸化鉄ナノ粒子クラスタの懸濁液の安定性
【０１１５】
カプセル化金属ナノ粒子の安定化における式（Ｉ）の核脂質の役割を示すために、対照実験を、核脂質の不存在下において、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）のみを用いて実行した。
【０１１６】
７５μＬの（ＤＯＰＣ）（Avanti Polar lipids、クロロホルム中に５０ｍｇ／ｍＬ）の原液と、２０μＬの酸化鉄ナノ粒子（クロロホルム中に１０ｍｇ／ｍＬ）の原液を混合した。ボルテックスによって撹拌しながら、ガラス管に入れた水相（２ｍｌのMilli-Q水）に、有機相を滴下して加えた。次に、その混合物をガラス製のフラスコに入れた。クロロホルムを減圧下で除去し、得られた未精製の原料溶液を、３回（３×１５分間）超音波処理して、沈殿物を得た。
【０１１７】
ＤＯＰＣの代わりに核脂質Ｎ−［５’−（２’，３’−ジオレオイル）ウリジン］−Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＵ）を使用したことを除いて、同じプロトコールに従った。超音波処理によって沈殿物は得られなかった。
【０１１８】
図１０の写真は、核脂質ＤＯＴＡＵが安定したコロイド懸濁液（写真Ａ）の形成を可能にし、その一方で、脂質ＤＯＰＣを用いた類似の条件では、沈殿物が形成され、それは、ＤＯＰＣがこのコロイド安定性を提供しないことを証明していること（写真Ｂ）を示す。
【０１１９】
実施例７：磁気共鳴緩和時間試験
【０１２０】
ＤＯＴＡＵ又はｄｉＣ１６ｄＴ（調製物１及び２）によってカプセル化した、０〜０．５ｍＭの範囲にわたる総数８種類の異なった濃度のＦｅの酸化鉄ナノ粒子クラスタを、エッペンドルフPCRチューブ（０．５ｍＬ）内で調製した。
【０１２１】
８本のチューブを通過する横断画像を、３５ｍｍの内径の１Ｈホールボディーラジオ波（ＲＦ）ボリュームコイルを有する4.7T Bruker Biospin（Billerica, MA）磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）システムにより取得し、そして、Paravision6.0ソフトウェアを使用して、緩和率（Ｒｎ）マップを計算した。サンプルを、２５６×１９２マトリックス及び視野（ＦＯＶ）＝４０×３０ｍｍを用いて２１℃にてスキャンした。
【０１２２】
Relaxation Enhancement（ＲＡＲＥ）法（繰り返し時間（ＴＲ）＝５０００、３０００、１５００、８００、４００、２００ｍｓ；エコー時間（ＴＥ）＝６ｍｓ；ＲＡＲＥ係数＝２）を用いたBruker Ｔ1マップRapid Acquisitionを使用して、Ｒ1測定値を得た。
【０１２３】
マルチスピンエコー（ΔＴＥ＝８．４５；エコー数＝２０；ＴＲ＝２ｓ）及びグラジエントエコー（フリップ角＝６０°；エコー数＝８；ＴＥ初期＝３．５ｍｓ；ΔＴＥ＝５ｍｓ；ＴＲ＝８００ｍｓ；フライバック）シークエンスを用いて、それぞれ、Ｒ2マップ及びＲ2*マップを計算した。それぞれの希釈率の平均緩和率、Ｒｎを、各チューブを包含する関心領域（ＲＯＩｓ）から計算し、そして、それらの対応するＦｅ濃度に対してプロットした。
【０１２４】
線形回帰法を使用して、図１１に示すように、Ｆｅに関してｓ-1ｍＭ-1単位で得られた直線の傾きとして得られるそれぞれのサンプルの緩和能（ｒn）を得た。
【０１２５】
結果は、ＤＯＴＡＵ（×印を伴った直線によって表される）又はｄｉＣ１６ｄＴ（・印を伴った直線によって表される）によってカプセル化された酸化鉄ナノ粒子クラスタが、例えば、Feridex（登録商標）（点線）などの医療用分野で一般的に使用される造影剤と比較して、改良された磁的特性を有した。Feridex粒子（登録商標）は、D. Patel et al., Biomaterials, 2011, 32, 1167-1176に記載されている。
【０１２６】
従って、本発明の脂質ベースのナノ担体組成物の一部である、式（Ｉ）の陽イオン性又は陰イオン性核脂質によってカプセル化された酸化鉄ナノ粒子クラスタ（調製物１及び２）は、造影システムの感受性を増強することにより、改善されたＭＲＩ検出を可能にする。これらの結果を、K. Oumzil et al., Bioconjugate Chem., 2016, 27, 569-575で発表した。
【０１２７】
実施例８：カプセル化ＡＰＩの生理活性の分析
【０１２８】
血液を、試験前２週間、血小板機能に影響することが知られているいずれの薬剤も投与されていない健常ボランティアから、１／１０量の３．８％のクエン酸ナトリウム中に採血した。多血小板血漿（ＰＲＰ）を、１５０〜２００ｇにて１０〜１５分間、２０℃での遠心分離によって調製し、そして、室温にて保存した。
【０１２９】
乏血小板血漿（ＰＰＰ）を、２７００ｇにて１５分間、残った血漿を更に遠心分離することによって調製し、血小板凝集計の１００％の光透過を較正するために使用した。
【０１３０】
凝集率を、時間に対して追跡した。ＰＲＰ（２０７μＬ）を、３７℃にてキュベット内で撹拌し、作動薬アデノシン５’−ジホスフェート（ＡＤＰ）又はトロンビン受容体活性化ペプチド−６（ＴＲＡＰ−６）を、５秒の時に加えて、血小板凝集を促進し、そして、ＰＧＩ２活性を評価するために、実施例２の酸化鉄ナノ粒子及びプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）を含むＤＯＵ−ＰＥＧ２０００ベースのナノ担体組成物と共に、又は（陰性対照として使用された）調製物２のｄｉＣ１６ｄＴによってカプセル化された酸化鉄ナノ粒子クラスタと共に、或いは、（単数若しくは複数の）作動薬のみ（陰性対照）と共に、又は（単数若しくは複数の）作動薬及びＰＧＩ２（陽性対照）と共に、１５分間及び３時間インキュベートした。インビトロにおける血小板凝集を、四チャンネル透過血小板凝集計（APACT4004、ELITech, France）を使用して測定した。
【０１３１】
結果を図１２に示すが、ここで、１〜７に付番した曲線は、以下の実験条件を表す：
曲線番号１：ＰＲＰ＋ＴＲＡＰ−６
曲線番号２：ＰＲＰ＋ＡＤＰ＋調製物２
曲線番号３：ＰＲＰ＋ＡＤＰ
曲線番号４：ＰＲＰ＋ＴＲＡＰ−６＋実施例２（３時間のインキュベーション）
曲線番号５：ＰＲＰ＋ＴＲＡＰ−６＋ＰＧＩ２
曲線番号６：ＰＲＰ＋ＡＤＰ＋ＰＧＩ２
曲線番号７：ＰＲＰ＋ＡＤＰ＋実施例２（１５分間のインキュベーション）
【０１３２】
結果は、実施例２の酸化鉄ナノ粒子及びＰＧＩ２を含む、並びにＰＧＩ２を含まないＤＯＵ−ＰＥＧ２０００ベースのナノ担体組成物が、ＡＤＰ（１５分間のインキュベーション）及びＴＲＡＰ−６（３時間のインキュベーション）作動薬の両方によって誘発される血小板凝集を完全に阻害したことを示し、その一方で、陰性対照として使用される調製物２のｄｉＣ１６ｄＴによってカプセル化された酸化鉄ナノ粒子クラスタ（曲線番号２）は、完全なＡＤＰ凝集を示す。
【０１３３】
これらの結果を、K. Oumzil et al., Bioconjugate Chem., 2016, 27, 569-575で発表した。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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