(57)【要約】  本発明は、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）に非共有結合させた核酸ポリメラーゼを第１のヌクレオチドまたは第１のヌクレオチド類似体及び鋳型と接触させること、ならびに核酸ポリメラーゼと、立体構造が変化した核酸ポリメラーゼとの間のＳＷＮＴの第１の電気コンダクタンス変化を測定することによって、立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを検出することを含む、核酸ポリメラーゼ立体構造の変化を検出するための方法及び組成物を提供する。本方法は、ポリヌクレオチドの配列決定に有用である。
2018500905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）に非共有的に付着させた核酸ポリメラーゼを第１のヌクレオチドまたは第１のヌクレオチド類似体及び鋳型核酸配列と接触させ、それにより、前記第１のヌクレオチドまた前記第１のヌクレオチド類似体及び前記鋳型核酸配列と結合した、立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを形成すること、
（ｉｉ）前記核酸ポリメラーゼと、前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼとの間の前記ＳＷＮＴの第１の電気コンダクタンス変化を測定することによって前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを検出すること
を含む、核酸ポリメラーゼ立体構造の変化を検出する方法。
【請求項２】
前記核酸ポリメラーゼは、第１のヌクレオチド類似体と接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉｉｉ）前記第１の電気コンダクタンス変化によって生成された第１の信号に基づいて前記第１のヌクレオチドまたは第１のヌクレオチド類似体を特定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉｖ）前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼに前記第１のヌクレオチドまたは第１のヌクレオチド類似体を放出させ、それにより、前記核酸ポリメラーゼを再形成することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｖ）単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）に非共有的に付着させた核酸ポリメラーゼを第２のヌクレオチドまたは第２のヌクレオチド類似体及び前記鋳型核酸配列と接触させることにより、前記第２のヌクレオチドまたは前記第２のヌクレオチド類似体及び前記鋳型核酸配列と結合した立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを形成すること、及び
（ｖｉ）前記核酸ポリメラーゼと、前記第２のヌクレオチドまたは前記第２のヌクレオチド類似体及び前記鋳型核酸配列と結合した前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼとの間の前記ＳＷＮＴの電気コンダクタンス変化を測定することによって前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを検出することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸ポリメラーゼは、第２のヌクレオチド類似体と接触させられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｖｉｉ）前記第２の電気コンダクタンス変化によって生成された第２の信号に基づいて前記第２のヌクレオチドまたは第２のヌクレオチド類似体を特定すること、及び前記鋳型核酸内の配列を特定することをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、非ワトソン・クリック塩基対合により前記鋳型核酸配列とハイブリダイズする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、２−チオｄＣＴＰ、２−チオｄＴＴＰまたは６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ、６−アザ−ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰまたはα−チオ−ｄＴＴＰである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、三リン酸部分において修飾される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記三リン酸部分は、α−チオ置換を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＣＴＰまたはα−チオ−ｄＴＴＰである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、ヌクレオベースに置換をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、α−チオ−２−チオ−ｄＴＴＰ、α−チオ−２−チオ−ｄＣＴＰ、α−チオ−６−Ｃｌ−２０ＡＰＴＰまたは６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月１８日に出願された米国特許仮出願第６２／０９３，６７１号の利益を主張するものであり、その内容の全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の助成による研究開発において行われた発明に対する権利に関する陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金第１  ＲＯｌ  ＣＡ１３３５９２−０１号、及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって付与された助成金第ＥＣＣＳ−１２３１９１０号による政府の助成のもとで行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
ＡＳＣＩＩファイルとして提出される「配列表」、表またはコンピュータプログラムリスト付属書類の参照
２０１５年１２月１３日に作成された、２，８２８バイト、マシンフォーマットＩＢＭ−ＰＣ、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムのファイル４８５３８−５２６００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ＴＸＴに記載された配列表がその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡ配列決定の産業において、合成（非天然）分子の使用は、ＤＮＡを構成する４つのヌクレオチド塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ及びＧ）を区別するための主要な方法である。この方法は、尊ぶべきサンガーの配列決定法にうまく適用され、最初のヒトゲノム活動のために使用された。
【０００５】
ＤＮＡの配列を決定するための技術は存在するが、速度を増加させ、誤差率を低下させ、複雑さ、コスト及び試薬の必要量を低減させることができる新規の技術に対して商業上の需要がある。固体電子工学は、速度、コスト及び複雑さに多くの利益を提供することができるため、電子回路を使用してＤＮＡの配列を決定することができる技術にかなりの関心が集まっている。
【０００６】
近年、ＤＮＡをナノ細孔に通過させ、同じ細孔を通るイオン電流を観察することによって、またはＤＮＡをナノ細孔に通過させるが、隣接電気的トンネル接合を使用して通過を変換することによって動作する電子的構成が形成された。両プラットフォームもナノ細孔のＤＮＡの通過に依存するため、不安定性、脆弱さ及び高精度の流体取り扱い要件などのナノ細孔を扱う固有の難題を共有する。さらに、ＤＮＡのナノ細孔の通過は、信号対ノイズが限定され、その結果、実際には、いずれの配列決定情報も蛍光法を使用して独立して確認されなければならない。さらに、ナノ細孔による高い誤差率及び「ずれ」により、ヒトの特定用途に必要とされる短いタンデム反復の高頻度反復配列の配列決定に対してなど用途が制限される。
【０００７】
バイオセンサーは、変換素子と直接空間的に接触した生物学的識別素子を組み込む分析デバイスである。その組込みにより、確実に生物学的現象を検出可能な信号へ高速で簡便に変換する。種々の電気的バイオセンシング構成のうち、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）に基づくデバイスが、標的分子（例えば、生体分子）とトランジスタ表面との間の相互作用を読取り可能な電気信号に直接変えることができるバイオセンサーのタイプであるため大きな注目を集めてきた。標準的な電界効果トランジスタにおいて、電流は、２つの電極（ソース及びドレイン）に接続された導電路（チャネル）に沿って流れる。ソースとドレインの間のチャネルコンダクタンスは、薄い誘電層を介して容量的に結合された第３の（ゲート）電極によってオン及びオフにされる。電界効果トランジスタは、例えば、産業的プロセス制御、漏出検出、排水監視及び医療診断を含む広い範囲の商業的用途用のために標的化学物質を検出し、化学物質濃度を測定する。
【０００８】
例えば、単一分子レベルで検出するのに十分な感度の電子デバイスが米国特許出願公開第１３／６２６，７６０号に開示されている。この発明の態様は、上に１つの高感度化分子を結合させた導電性チャネルを使用して達成される。したがって、そこで開示されているデバイスは、１つの分子反応の動態をモニターし、単一分子配列決定反応における検出器など重要な単一分子生化学的アッセイに使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第１３／６２６，７６０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、当該技術分野において現存の技術よりも効率的でより有益な次世代のＤＮＡ配列決定技術が必要とされている。ここに、当該技術分野におけるこれら及びその他の課題に対する解決法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書において、とりわけ、天然及び非天然ヌクレオチド塩基の混合物を用いた、ＤＮＡサンプルの遺伝子配列を決定するための回路が提供される。具体的な技術及びＤＮＡ鎖の遺伝子コードを決定するための回路の使用の実施化について記載される。
【００１２】
本回路は、ＤＮＡの配列決定、ひいては、ＲＮＡ及び炭水化物の配列決定を可能にする。本発明は、より従来の配列決定方法に首尾よく匹敵するであろう低コストで、高速で、忠実性が高いＤＮＡ配列決定の方法を提供する。
【００１３】
本明細書において提供される方法及び組成物は、酵素処理中の１つの分子の活性を追跡することができる。ＤＮＡ鎖からの固有の識別可能な信号を生成するために、合成の基質、ヌクレオチド及びフルオロフォアが使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃ。化学修飾ｄＮＴＰを用いたＫＦ活性の電気的モニタリング。図１Ａ：ＫＦによる組み込みに関して試験した単一ＫＦナノ回路及び化学修飾ｄＮＴＰ。（ａ）「フィンガー」サブドメインに挿入された１つのシステインによりＤＮＡポリメラーゼＩ（ＫＦ）の１つの分子と非共有結合的に生体共役反応した単層カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴ）の概略図。π−πスタッキングによりＳＷＣＮＴ−ＦＥＴに結合し、ＫＦを固定するための１つのシステインと共有結合したピレン−マレイミドリンカー（黄色）。ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴがＳｉＯ２上に成長させられ、ソース及びドレイン金属電極に接続され、ポリマー（ＰＭＭＡ、レッド）で不動態化される。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃ。化学修飾ｄＮＴＰを用いたＫＦ活性の電気的モニタリング。図１Ｂ：原子間力顕微鏡は、１つのＫＦが結合した１〜２ｎｍ直径のＳＷＮＴ  ＦＥＴを示す（７ｎｍ、矢印）。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃ。化学修飾ｄＮＴＰを用いたＫＦ活性の電気的モニタリング。図１Ｃ：本明細書中で開示される類似体ｄＮＴＰの化学構造。未変性ｄＮＴＰからの化学的修飾が強調されている。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｆ。未変性及び類似体ｄＮＴＰ組み込み中の電流の変化。図２Ａ：ポリ（ｄＣ）４２鋳型及びその相補的な未変性ｄＧＴＰの存在下におけるこの電流測定において、ΔＩ（ｔ）振幅は、各塩基の組み込みの間に生じる。高い及び低い電流状態は、それぞれ酵素の開いた立体構造及び閉じた立体構造に対応する。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｆ。未変性及び類似体ｄＮＴＰ組み込み中の電流の変化。図２Ｂ〜２Ｆ：図２Ａに対応するデータの時間倍率（時間窓１．５から２．５ｓ）は、ｄＧＴＰ（図２Ｂ）、α−チオ−ｄＧＴＰ（図２Ｃ）、６−クロロ−２ＡＰＴＰ（図２Ｄ）及び２−チオ−ｄＣＴＰ（図２Ｅ〜２Ｆ）の塩基組み込みに対応するスイッチング現象の減少を説明する。図２Ｂ〜２Ｆのそれぞれの右側の拡大図は、単一塩基分解能を強調する、それぞれ示した塩基に対する１つのΔＩ（ｔ）振幅を示し、棒は１ｍｓの時間間隔を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｆ。未変性及び類似体ｄＮＴＰ組み込み中の電流の変化。図２Ｂ〜２Ｆ：図２Ａに対応するデータの時間倍率（時間窓１．５から２．５ｓ）は、ｄＧＴＰ（図２Ｂ）、α−チオ−ｄＧＴＰ（図２Ｃ）、６−クロロ−２ＡＰＴＰ（図２Ｄ）及び２−チオ−ｄＣＴＰ（図２Ｅ〜２Ｆ）の塩基組み込みに対応するスイッチング現象の減少を説明する。図２Ｂ〜２Ｆのそれぞれの右側の拡大図は、単一塩基分解能を強調する、それぞれ示した塩基に対する１つのΔＩ（ｔ）振幅を示し、棒は１ｍｓの時間間隔を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｆ。未変性及び類似体ｄＮＴＰ組み込み中の電流の変化。図２Ｂ〜２Ｆ：図２Ａに対応するデータの時間倍率（時間窓１．５から２．５ｓ）は、ｄＧＴＰ（図２Ｂ）、α−チオ−ｄＧＴＰ（図２Ｃ）、６−クロロ−２ＡＰＴＰ（図２Ｄ）及び２−チオ−ｄＣＴＰ（図２Ｅ〜２Ｆ）の塩基組み込みに対応するスイッチング現象の減少を説明する。図２Ｂ〜２Ｆのそれぞれの右側の拡大図は、単一塩基分解能を強調する、それぞれ示した塩基に対する１つのΔＩ（ｔ）振幅を示し、棒は１ｍｓの時間間隔を示す。
【図２Ｅ】図２Ａ〜２Ｆ。未変性及び類似体ｄＮＴＰ組み込み中の電流の変化。図２Ｂ〜２Ｆ：図２Ａに対応するデータの時間倍率（時間窓１．５から２．５ｓ）は、ｄＧＴＰ（図２Ｂ）、α−チオ−ｄＧＴＰ（図２Ｃ）、６−クロロ−２ＡＰＴＰ（図２Ｄ）及び２−チオ−ｄＣＴＰ（図２Ｅ〜２Ｆ）の塩基組み込みに対応するスイッチング現象の減少を説明する。図２Ｂ〜２Ｆのそれぞれの右側の拡大図は、単一塩基分解能を強調する、それぞれ示した塩基に対する１つのΔＩ（ｔ）振幅を示し、棒は１ｍｓの時間間隔を示す。
【図２Ｆ】図２Ａ〜２Ｆ。未変性及び類似体ｄＮＴＰ組み込み中の電流の変化。図２Ｂ〜２Ｆ：図２Ａに対応するデータの時間倍率（時間窓１．５から２．５ｓ）は、ｄＧＴＰ（図２Ｂ）、α−チオ−ｄＧＴＰ（図２Ｃ）、６−クロロ−２ＡＰＴＰ（図２Ｄ）及び２−チオ−ｄＣＴＰ（図２Ｅ〜２Ｆ）の塩基組み込みに対応するスイッチング現象の減少を説明する。図２Ｂ〜２Ｆのそれぞれの右側の拡大図は、単一塩基分解能を強調する、それぞれ示した塩基に対する１つのΔＩ（ｔ）振幅を示し、棒は１ｍｓの時間間隔を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｂ。５０を超えるデータセットから得た示したｄＮＴＰの組み込みの間の開いた状態τｏｐｅｎ及び閉じた状態τｃｌｏｓｅｄの継続時間の確率分布の直接的な比較。Ｙ軸は、対数確率％としてプロットされた。τｃｌｏｓｅｄ（図３Ａ）及びτｏｐｅｎ（図３Ｂ）両方に関して、ホモポリマー型ポリ（ｄＣ）４２が鋳型を提供した。図３Ａ〜３Ｂでは、各ヌクレオチドに対する単一指数関数フィットが実線として示されている。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｂ。５０を超えるデータセットから得た示したｄＮＴＰの組み込みの間の開いた状態τｏｐｅｎ及び閉じた状態τｃｌｏｓｅｄの継続時間の確率分布の直接的な比較。Ｙ軸は、対数確率％としてプロットされた。τｃｌｏｓｅｄ（図３Ａ）及びτｏｐｅｎ（図３Ｂ）両方に関して、ホモポリマー型ポリ（ｄＣ）４２が鋳型を提供した。図３Ａ〜３Ｂでは、各ヌクレオチドに対する単一指数関数フィットが実線として示されている。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂ。ポリ（ｄＡ）４２の処理において生成された電子信号。図４Ａ：ＫＦがポリ（ｄＡ）４２を天然ヌクレオチド、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の存在下において処理する場合、各塩基対の組み込みは負の電流スパイクΔＩ＜０を生成する
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂ。ポリ（ｄＡ）４２の処理において生成された電子信号。図４Ｂ：ｄＴＴＰが非天然ヌクレオチド、２−チオ−２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸（２−チオ−ｄＴＴＰ）で置き換えられた場合、塩基組み込みは正の電流スパイクΔＩ＞０を生成する。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃ。不均質な基質の処理において生成される電子信号。図５Ａ：ＫＦが４種すべての天然ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が存在する不均質な基質を処理する場合、各塩基対の組み込みは負の電流スパイクΔＩ＜Ｏを生成する。個々のスパイクを、示されるとおりに数え上げることができるが、一般にそれらは１種類の塩基を別の種類の塩基と区別することはない。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃ。不均質な基質の処理において生成される電子信号。図５Ｂ：図５Ｂは、２−チオ−ｄＴＴＰで置き換えたｄＴＴＰを用いた同じデータセットのシミュレーションを示す。チオール化デオキシチミジンを用いると、正のスパイクは、ここで（番号２、６、７）Ｔヌクレオチドが組み込まれた場所を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃ。不均質な基質の処理において生成される電子信号。図５Ｃは、ＫＦが特定の類似体と混合された天然ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が存在する不均質な基質を処理する場合、結果として生じるパターンは、選択した塩基を特定するために使用することができる正及び負の電流スパイクを含むことを示す。この例は、Ｇ組み込みのための類似体としての６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰと混合された３種の未変性ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）を使用して得られたデータを示す。この情報は、オリゴヌクレオチドのナノチューブ配列決定のための方法に使用される。
【図６】過剰発現及び精製後のＫＦの典型的な１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ＫＦは９５％を超える均質性に精製され、約６８ｋＤａのその予想された質量で移動した。
【図７】定常状態条件におけるＫＦ（Ｌ７９０Ｃ）（黒丸）及び野生型ＫＦ（灰色の丸）の活性を示す蛍光に基づく活性アッセイを示す。ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの存在下においてプライマー伸長反応が起こる。未処理データは、ｄＮＴＰの不在下において活性を測定したバックグラウンドから差し引かれた。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂ。本明細書に記載されている鋳型を用いたｄＮＴＰ類似体の組み込みを示すアンサンブルアッセイを示す。ｄＮＴＰ類似体と、Ａ／Ｔ組み込み鋳型（図８Ａ）またはＧ／Ｃ組み込み鋳型（図８Ｂ）を用いた重合産物は、５％高分解能アガロースゲルで電気泳動された。ｄＴＴＰ（１）、ｄＡＴＰ（２）、ｄＣＴＰ（８）及びｄＧＴＰ（９）を省いた３種のｄＮＴＰだけを用いた陰性対照反応には、ｄｓＤＮＡが含まれなかった。４種すべてのｄＮＴＰを用いた陽性対照反応は、Ａ／Ｔ組み込み鋳型（３）及びＧ／Ｃ組み込み鋳型（１０）ともにｄｓＤＮＡへの変換を示した。ｄＮＴＰ類似体を用いた反応（４〜７及び１１〜１４）は、その未変性ｄＮＴＰ対応物が省かれ、残りの３種の未変性ｄＮＴＰが含まれた。Ａ／Ｔ組み込み鋳型の向かい側には、鋳型塩基Ａの向かい側にα−チオ−ｄＴＴＰ（４）及び２−チオ−ｄＴＴＰ（５）が組み込まれ、鋳型塩基Ｔの向かい側にα−チオ−ｄＡＴＰ（６）及び６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰ（７）が組み込まれた。Ｇ／Ｃ組み込み鋳型の向かい側には、鋳型塩基Ｇの向かい側にα−チオ−ｄＣＴＰ（１１）及び２−チオ−ｄＣＴＰ（１２）が組み込まれ、鋳型塩基Ｃの向かい側にα−チオ−ｄＧＴＰ（１３）及び６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰ（１４）が組み込まれた。視覚化後に、画像の色を反転させた後、白黒に変えた。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂ。本明細書に記載されている鋳型を用いたｄＮＴＰ類似体の組み込みを示すアンサンブルアッセイを示す。ｄＮＴＰ類似体と、Ａ／Ｔ組み込み鋳型（図８Ａ）またはＧ／Ｃ組み込み鋳型（図８Ｂ）を用いた重合産物は、５％高分解能アガロースゲルで電気泳動された。ｄＴＴＰ（１）、ｄＡＴＰ（２）、ｄＣＴＰ（８）及びｄＧＴＰ（９）を省いた３種のｄＮＴＰだけを用いた陰性対照反応には、ｄｓＤＮＡが含まれなかった。４種すべてのｄＮＴＰを用いた陽性対照反応は、Ａ／Ｔ組み込み鋳型（３）及びＧ／Ｃ組み込み鋳型（１０）ともにｄｓＤＮＡへの変換を示した。ｄＮＴＰ類似体を用いた反応（４〜７及び１１〜１４）は、その未変性ｄＮＴＰ対応物が省かれ、残りの３種の未変性ｄＮＴＰが含まれた。Ａ／Ｔ組み込み鋳型の向かい側には、鋳型塩基Ａの向かい側にα−チオ−ｄＴＴＰ（４）及び２−チオ−ｄＴＴＰ（５）が組み込まれ、鋳型塩基Ｔの向かい側にα−チオ−ｄＡＴＰ（６）及び６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰ（７）が組み込まれた。Ｇ／Ｃ組み込み鋳型の向かい側には、鋳型塩基Ｇの向かい側にα−チオ−ｄＣＴＰ（１１）及び２−チオ−ｄＣＴＰ（１２）が組み込まれ、鋳型塩基Ｃの向かい側にα−チオ−ｄＧＴＰ（１３）及び６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰ（１４）が組み込まれた。視覚化後に、画像の色を反転させた後、白黒に変えた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、とりわけ、核酸ポリメラーゼ確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）の変化を検出する方法であって、核酸ポリメラーゼの立体構造変化が検出される核酸ポリメラーゼの配列を決定する方法が提供される。複数の実施形態において、本方法は、核酸類似体を用いて核酸ポリメラーゼの立体構造変化を検出することを含む。
【００１６】
定義
以下の定義は、本主題を理解するため及び添付の特許請求の範囲を構築するために含まれる。本明細書中で使用される略語は、化学的及び生物学的技術内におけるそれの従来の意味を有する。
【００１７】
別に定義されない限り、本明細書中で使用される技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  １９９４）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９）を参照。本明細書中で示されるものと同様もしくは同等の任意の方法、デバイス及び材料を、本開示の実務に使用することができる。以下の定義は、本明細書において頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供されるものであり、本開示の範囲を限定する意図はない。
【００１８】
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及び単鎖、二重鎖もしくは多重鎖のいずれかの形態のそれらの重合体またはその相補体を指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの直線的な配列を指す。「ヌクレオチド」という用語は、一般にポリヌクレオチドの１つの単位、すなわち、単量体を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの修飾型であってもよい。本明細書において意図されるポリヌクレオチドの例としては、単鎖及び二重鎖ＤＮＡ、単鎖及び二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、ならびに単鎖及び二重鎖のＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。核酸は、直鎖または分岐であってもよい。例えば、核酸は、ヌクレオチドの直鎖であってもよく、または核酸は、例えば、核酸がヌクレオチドの１つ以上のアームまたは分岐部を含むように分岐であってもよい。任意に、分岐型核酸は、繰り返し分岐して、デンドリマー及び同種のものなどの高次構造を形成する。
【００１９】
ホスホチオアート骨格を有する核酸を含む核酸は、１つ以上の反応部分を含んでもよい。本明細書中で使用される場合、反応部分という用語は、共有結合性、非共有結合性またはその他の相互作用により別の分子、例えば、核酸またはポリペプチドと反応することができるあらゆる基を含む。例として、核酸は、共有結合性、非共有結合性またはその他の相互作用によりタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸と反応するアミノ酸反応部分を含んでもよい。
【００２０】
この用語は、既知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基もしくは結合を含有する核酸も包含し、これは、合成物、天然に生じる及び天然に生じないものであり、基準核酸として類似の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。そのような類似体の例としては、以下に限定されない、例えば、ホスホルアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホロチオアート（ホスホチオアートとしても知られている）、ホスホロジチオアート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシラート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、メチルホスホナート、ホスホン酸ホウ素またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合を含むホスホジエステル誘導体（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、ならびにペプチド核酸骨格及び結合が挙げられる。その他の類似体核酸としては、陽性骨格；非イオン性骨格、修飾糖及び非リボース骨格（例えば、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴまたはロックド核酸（ＬＮＡ））を有するものが挙げられ、米国特許第５，２３５，０３３号ならびに同第５，０３４，５０６号、及びＣｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎｇｈｕｉ  ＆  Ｃｏｏｋ，ｅｄｓに記載されているものが含まれる。１つ以上の炭素環式糖を含む核酸も核酸の一定義内に含まれる。リボース−リン酸骨格の修飾は、さまざまな理由のため、例えば、生理環境におけるそのような分子またはバイオチップ上のプローブとしての安定性及び半減期を増加させるために行われてもよい。天然に生じる核酸及び類似体の混合物が生成されてもよく、あるいは、異なる核酸類似体の混合物ならびに天然に生じる核酸及び類似体の混合物が生成されてもよい。複数の実施形態において、ＤＮＡのヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体または両方の組み合わせである。
【００２１】
「相補的な」または「相補性」という単語は、第２のポリヌクレオチドの別の核酸と塩基対を形成するポリヌクレオチドの核酸の能力を指す。例えば、配列Ａ−Ｇ−Ｔは、配列Ｔ−Ｃ−Ａと相補的である。相補性は、部分的であってもよく、その場合、一部の核酸のみが塩基対合により対をなし、または完全であってもよく、その場合、すべての核酸が塩基対合により対をなす。
【００２２】
「ハイブリダイゼーション」及び同種の用語は、通常の従来の意味で、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む二重鎖の（すなわち、二本鎖の）核酸の形成を指す。当然のことながら二本鎖の核酸の形成は、ワトソン・クリック塩基対合によるものでもよい。「と選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、例えば、よりストリンジェントな条件下において、その他のヌクレオチド配列に対してよりも高い親和性で核酸が特定のヌクレオチド配列と結合すること、二本鎖化することまたはハイブリダイズすることを指す（例えば、細胞内のすべてのＤＮＡもしくはＲＮＡまたはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡ）。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、核酸ポリメラーゼの立体構造変化は、単層カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴ）を使用して検出される。例えば、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＫＦ）ナノ回路は、「フィンガー」サブドメインに挿入された１つのシステインを介してＤＮＡポリメラーゼＩ（ＫＦ）の１つの分子と非共有結合的に生体共役反応したＳＷＣＮＴ−ＦＥＴを含む。立体構造変化は、ＫＦナノ回路によって生成されるΔＩ（ｔ）信号により判定される。本デバイスは、連続して起こる負のΔＩ（ｔ）振幅を生成し、それぞれが一塩基対の形成を示し、逆の振幅は異なるＫＦ立体構造を反映する（図２Ｃ、図２Ｆ）。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、複数の実施形態において、第１のヌクレオチドまたは第１のヌクレオチド類似体は、それぞれ第２のヌクレオチドまたは第２のヌクレオチド類似体と同じであってもよい。複数の実施形態において、第１のヌクレオチドまたは第１のヌクレオチド類似体は、それぞれ第２のヌクレオチドまたは第２のヌクレオチド類似体と異なってもよい。
【００２５】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸が、一般に、核酸の複合混合物中の標的配列とハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況では異なる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、規定されたイオン強度ｐＨでの特異的な配列の熱的融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるよう選択される。Ｔｍは、標的と相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズして平衡状態になる温度（規定されたイオン強度ｐＨ及び核酸濃度における）である（標的配列は過剰に存在するため、Ｔｍにおいて５０％のプローブが占有されて平衡状態になる）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により実現されてもよい。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのために、陽性信号は、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例となるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりであってもよい：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、さらに６５℃で０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で洗浄。例となる「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、３７℃における４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳのバッファー中でのハイブリダイゼーション及び４５℃の１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。類似のストリンジェンシーの条件をもたらすために別のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用することができることを当業者は容易に認識するであろう。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するためのさらなるガイドラインが、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓなどの数々の文献において提供されている。
【００２６】
複数の実施形態において、単一分子検知デバイス１０は、トランジスタ、すなわち、電気回路に対する「ゲート」として働く生体分子を結合させ電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）の形態をとることができる。この実施形態において、１つの高感度化分子は、このデバイスの単一分子ゲートの役割を果たす。本トランジスタ実施形態は、２端子または３端子トランジスタを含んでもよい。伝導チャネルはまた、金属、金属酸化物、半導体またはナノワイヤー、グラフェンもしくは単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）などのナノメートルスケールの導体から形成されてもよい。一実施形態において、伝導チャネルは、１つのＳＷＮＴである。
【００２７】
方法
ここで、核酸ポリメラーゼ立体構造の変化を検出する方法が提供される。本方法は、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）に非共有結合させた核酸ポリメラーゼをヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体（例えば、第１のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）及び鋳型核酸配列（例えば、センス鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）と接触させることにより、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及び鋳型核酸配列と結合した立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを形成することを含む。核酸ポリメラーゼと、立体構造が変化した核酸ポリメラーゼとの間のＳＷＮＴの電気コンダクタンスの変化を測定することによって、立体構造が変化した核酸ポリメラーゼが検出される。「接触させること」という用語及び同種のものは、通常の従来の意味で、２つ以上化学種を化学種間で相互作用、例えば、結合、化学反応または同種のものが生じ得るだけ十分に近接して接触させることを指す。「電気コンダクタンス変化」という用語及び同種のものは、通常の従来の意味で、当該技術分野において既知の方法及び本明細書中で開示される方法によって測定することができる電気コンダクタンスの変化を指す。「立体構造が変化した核酸ポリメラーゼ」という用語及び同種のものは、通常の従来の意味で、当該技術分野において知られているとおり、二次、三次及び／または四次構造あるいは核酸の変化を指す。
【００２８】
本明細書中で開示されるとおり、コンダクタンスの変化は、核酸ポリメラーゼと立体構造が変化した核酸ポリメラーゼに対して核酸ポリメラーゼの一部を形成する高感度化分子（例えば、アミノ酸）の位置が変化した結果である場合もある。電流変動は、縁が四角いパターンの単純な増加及び減少から成ってもよい。あるいは、この変動は、三角形、正弦波の形状を含むか、または任意の数のフーリエ成分を有する任意の小波を含む場合もある。これらの小波の振幅、継続時間及び形状はすべて標的に特異的な構成要素の活性を符号化し、それゆえに、結合の反応速度ならびにその他の機械的及び電子的自由度を明らかするためにコンピュータを使用して解析されてもよい。これらのパラメータの統計分析は、標的結合及び解離プロセスの反応速度の変動性、遷移及び中間の化学状態に関する洞察を与える。電流信号の自由度は、すべて同じ部位に結合する複数の類似標的分子間、例えば、その結合部位の標的分子と阻害分子との間の違いを識別する。これらの自由度は、真の結合の前に起こる分子認識などの弱い相互作用も識別することができる。
【００２９】
核酸ポリメラーゼ立体構造の変化を検出する方法は、核酸の配列決定（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の方法の一部として使用されてもよい。このように、一部の実施形態では、本方法は、第１のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と結合した立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを検出した後に、前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼに第１のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を放出させることにより、核酸ポリメラーゼを再形成することによって前記核酸ポリメラーゼの立体構造の第２の変化を検出することをさらに含む。本方法は、その結果、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）に非共有結合させた核酸ポリメラーゼを第２のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と接触させることにより、第２のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と結合した立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを形成することを含む。第２のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と結合した立体構造が変化した核酸ポリメラーゼは、核酸ポリメラーゼと、立体構造が変化した核酸ポリメラーゼとの間のＳＷＮＴの電気コンダクタンスの変化を測定することによって検出される。
【００３０】
複数の実施形態において、第１及び／または第２のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、検出される固有のコンダクタンス信号を生成する。固有のコンダクタンス信号は、前記第１及び／または第２のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を特定することにより鋳型核酸の配列を特定するために使用される。「コンダクタンス信号」、「第１のコンダクタンス信号」、「固有のコンダクタンス信号」という用語及び同種のものは、通常の従来の意味で、本明細書中で開示される方法を含む当該技術分野において既知の方法によって測定される化学種のコンダクタンスを指す。
【００３１】
従来の配列決定技術よりも速く、低コストで、場合によってははるかに低下した誤差率で操作可能なカーボンナノチューブ回路は、本明細書において提供される方法に有用である。本明細書において提供される組成物及び方法は、両方のナノ細孔ベースの電子的構成を上回る大幅な改善をもたらす。第１に、カーボンナノチューブ回路は、独立した確認を必要としない優れたノイズ特性を有する電子信号を形成する。第２に、ナノチューブ回路は広い範囲の環境及び手荒い取り扱いに耐え、その結果、流体の取り扱いに対する規定及び全体的なシステムの複雑さがナノ細孔構成と比較して著しく緩和される場合がある。第３に、ナノチューブ回路は、概念的に端的で、種々の異なる様式で操作するために容易に適合される。第４に、このアプローチは、高忠実性酵素を利用して塩基対の識別を提供することができ、推定誤差率は、１８×１０−６の酵素の理論上の最高値と同じだけ低いであろう。そのような低い誤差率は、現在利用可能な市販の器具よりおよそ１０，０００倍の向上に相当するであろう。それにより、本明細書において、コスト、複雑さ、誤差率及び広範囲な再配列決定の付加的な負担を著しく低減する方法及び組成物が提供される。ナノチューブ回路の全般的な説明は、付属書類Ａ及び米国特許出願第１３／６２６，７６０号に提供される。
【００３２】
本発明は、概して単一分子レベルで検出するのに十分な感度の電子デバイスを提供する。本発明の態様は、１つの高感度化分子を結合させた導電性チャネルを使用して達成される。したがって、本発明のデバイスは、１つの分子反応の動態をモニターし、単一分子配列決定反応における検出器など重要な単一分子生化学的アッセイに使用することができる。
【００３３】
一般に電界効果トランジスタに見られるあらゆるタイプの伝導チャネルを本発明とともに使用することができる。例となる伝導チャネルは、金属、金属酸化物、半導体またはナノワイヤー、グラフェンもしくは単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）などのナノメートルスケールの導体から形成される。複数の実施形態において、伝導チャネルは、１つのＳＷＮＴである。
【００３４】
材料のクラスとして、ＳＷＮＴは、１電子ボルトから効果的に０に変化することができる電子バンドギャップを有する半導体である。この変動が金属性または半金属性としてのカーボンＳＷＮＴ及び半導性としてのその他に分類につながる。電極、静電ゲート及びその他の制御回路の接続を用いて、半導性ＳＷＮＴは、センサーＦＥＴとして、ＲＦ増幅器として、または低温単電子トランジスタとして構成されてもよい。本デバイス及び方法はそのような追加を妨げない。それは、複数の実施形態では、本デバイスが、ＳＷＮＴ導体の２端子のみから構成されるためである。ＳＷＮＴが伝導チャネルであり、その場合、単一分子検知デバイスは、ゲート電極を伴うか、または伴わず、ガラス、プラスチックまたはケイ素基板上に任意のタイプのＳＷＮＴワイヤーから作製されてもよい。本明細書中に記載される単一分子検知デバイスは、ＦＥＴまたは任意の数のさらに複雑な電子もしくは光電子デバイス及び回路内の一構成要素であってもよい。
【００３５】
本開示の一態様は、各デバイスに確実に１つのみの活性高感度化分子を実現することである。一般に、高感度化分子は、調製に使用される濃度及びインキュベーション時間によって決定される平均間隔でＳＷＮＴを被覆することになる。その平均間隔が特定のセットの条件に対して経験的に決定されたら、等しい長さを有するよう、リソグラフィーによってＳＷＮＴ導体の形が定められてもよい。実際には、高感度化分子がＳＷＮＴ導体に直接結合する場合、この長さは一般に光リソグラフィーを使用して制御するのが難しい範囲である１から１００ｎｍである。
【００３６】
複数の実施形態において、リンカー分子は、高感度化分子の平均離隔に対する制御を向上させる結合手段として働く。１つの高感度化分子を導体に結合するために当該技術分野において既知の任意の方法が使用されてもよい。複数の実施形態において、１つの高感度化分子を結合させるためにリンカー分子が使用される。複数の実施形態において、リンカー分子は、少なくとも第１及び第２の官能基を含む。一般に、第１の官能基は伝導チャネル（例えば、単層カーボンナノチューブ）と相互作用し、第２の官能基は高感度化分子と相互作用する。例となる第１の官能基としては、ピレン、ベンゼン、シクロヘキサン及び２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンが挙げられる。例となる第２の官能基は、マレイミドである。伝導チャネルがＳＷＮＴである特定の実施形態において、リンカー分子は、パイ−パイスタッキングによりＳＷＮＴの側壁と相互作用する。
【００３７】
リンカーを使用すると、高感度化分子間距離を１マイクロメートル以上にまで劇的に増加させることができる。１マイクロメートル離れて間隔をあけた高感度化分子を用いると、標準的なリソグラフィーマスキング技術を使用して、それぞれ、およそ１マイクロメートルの長さの導体でいっぱいのウェーハの形を定めることが可能である。あるいは、マスクデザインによって定められるとおり所望のデバイスピッチが与えられたら、１デバイス当たり１分子の同じ結果を実現するために、高感度化分子の濃度及びインキュベーションの継続時間が変えられてもよい。１０回の作製の試みのうち少なくとも８回において、すべてＳＷＮＴ導体のｓｐ２特性を乱すことなく単一分子検知デバイスを作り出すことができる。
【００３８】
当該技術分野において既知の任意の高感度化分子を本発明のデバイスとともに使用することができ、選ばれた高感度化分子は、検出対象の分子またはモニター対象の反応により決まることになる。例となる高感度化分子としては、酵素、タンパク質、核酸、リボザイム、アプタマー及び多糖が挙げられる。特定の実施形態において、酵素は、リゾチーム、プロテインキナーゼＡまたはＤＮＡポリメラーゼＩである。
【００３９】
他の態様において、単一分子動態検知を実現するために、各デバイスに２つ以上の高感度化分子が必要な場合もある。例えば、所望の操作温度またはｐＨにおいて、特定のタイプの高感度化分子が２５％の確率でしか化学的に活性でない場合もあろう。これらの条件下では、そのうちの１つが活性である可能性があるデバイスを製造するために、各導体に追加の高感度化分子（例えば、４つ）を結合させることが適切である。このより密度の高い結合は、デバイスの長さを分子間の平均離隔距離の適切な倍数に増加させることによって、あるいは結合条件を変更することにより同じ離隔を縮小することによってのいずれかで上記のスキームを使用して容易に実現される。
【００４０】
複数の実施形態において、単一分子検知デバイスは、並列接続した複数の導体を含む（例えば、ＳＷＮＴ導体）。１つの活性高感度化分子は導体のうちの１つに結合し、それは、無修飾の導体の並列だが静的コンダクタンスから分離可能な動的電子信号を引き起こす。この実施形態は、導体合成または配置の設計の際に、及び結合の確率が非常に低い高感度化分子を使用した単一分子検知デバイスをうまく作製する際にさらなる柔軟性を提供する。
【００４１】
複数の実施形態において、１デバイス当たり１つの高感度化分子が結合した複数の単一分子検知デバイスが、同じタイプの高感度化分子を使用して同時に作製される。別の実施形態では、異なる標的に対して高感度化された複数の単一分子検知デバイスを実現するために、複数の導体を作製した後、異なる高感度化分子に曝露される。別の実施形態では、単一分子検知デバイスは、高感度化分子により特異性の範囲で複数の標的に反応する。
【００４２】
複数の実施形態において、単一分子検知デバイスは、第１の電極及び第２の電極を含む。単層カーボンナノチューブは、それぞれ第１の電極及び第２の電極と接続される。デバイスは、第１及び第２の官能基を有する少なくとも１つのリンカー分子を含み、少なくとも１つのリンカー分子は、単層カーボンナノチューブの側壁により非共有結合的に官能化される第１の官能基を有する。少なくとも１つの官能基を有する１つの高感度化分子、１つの高感度化分子の前記少なくとも１つの官能基は、少なくとも１つのリンカー分子の第２の官能基により官能化される。
【００４３】
複数の実施形態において、単一分子検知デバイスを作製するための方法は、第１の電極及び第２の電極と接続された基板上に少なくとも１つの単層カーボンナノチューブを形成すること、デバイスの単層カーボンナノチューブ側壁を複数の官能基を含む少なくとも１つのリンカー分子の少なくとも１つの官能基により非共有結合的に官能化すること、及び少なくとも１つのリンカー分子の官能基のうちの少なくとも１つを１つの高感度化分子の１つ以上の官能基により官能化することを含む。
【００４４】
複数の実施形態において、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）を有する単一分子検知デバイスを使用する方法が開示される。ＳＷＮＴは、基板上に配置され、第１の電極及び第２の電極と接続され、検知デバイスは、ＳＷＮＴにより非共有結合的に官能化されたリンカー分子を使用してＳＷＮＴに固定された１つの高感度化分子を有する。ＳＷＮＴに電圧が印加される。高感度化分子が化学環境に曝露される。ＳＷＮＴを通って流れる電流の変動がモニターされる。
【００４５】
複数の実施形態において、単一分子検知デバイスを使用して核酸の配列を決定するための方法が開示される。本検知デバイスは、導電性チャネルを含む。導電性チャネルとしては、第１の電極及び第２の電極と接続された基板上の単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）を挙げることができる。検知デバイスは、チャネル（例えば、ＳＷＮＴ）により非共有結合的に官能化されたリンカー分子を使用してチャネルに固定された１つの高感度化酵素を有する。本方法は、デバイスを少なくとも１種類のヌクレオチドに曝露すること、チャネルに電位を印加すること、ＳＷＮＴを通って流れる電流の変動をモニターすること、及び電流のモニターされた変動に少なくとも部分的に基づいて酵素によって核酸鋳型に組み込まれているヌクレオチドを特定することを含む。酵素は、ポリメラーゼまたは逆転写酵素であってもよい。ヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体であってもよい。特定の実施形態において、本デバイスは、１回に２種類以上のヌクレオチドに曝露される。
【００４６】
本検知デバイスはまた、タンパク質、すなわち酵素の処理反応速度を判定するために使用されてもよい。本検知デバイスのさらに別の用途は、遺伝子突然変異の影響を判定することである。遺伝子突然変異を有する高感度化分子または標的を使用したデバイスを、突然変異のない高感度化分子または標的を用いた類似のデバイスから得られる性能と比較してもよい。さらに別の用途において、本検知デバイスは、タンパク質を活性または不活性にするためのタンパク質上の薬物またはその他の小分子の効果を判定するために使用することができる。
【００４７】
本発明のデバイスを作製する方法は、生化学的共役プロトコルに続いて制御されたすすぎを含んでもよい。そのようなプロセスは、１つの高感度化分子を有し、妨害分子の非特異的な結合がない本発明のデバイスをもたらす。特定の実施形態において、高感度化分子は、非共有結合性相互作用により導体に直接結合される。他の実施形態において、高感度化分子は、一方が非共有結合のため、もう一方が高感度化分子との用途の広い生体共役反応のための、少なくとも２つの官能基を有する中間のリンカー分子に結合される。中間のリンカーを使用する一スキームは、広範なクラスの高感度化分子から本発明のデバイスを構築するための化学的用途の広いプラットフォームを提供する。
【００４８】
複数の実施形態において、単一分子検知デバイスを作製するための方法は、第１の電極及び第２の電極と接続された基板上に少なくとも１つの単層カーボンナノチューブを形成すること、デバイスの単層カーボンナノチューブ側壁を複数の官能基を含む少なくとも１つのリンカー分子の少なくとも１つの官能基で非共有結合的に官能化すること、及び少なくとも１つのリンカー分子の官能基のうちの少なくとも１つを１つの高感度化分子の１つ以上の官能基により官能化することを含む。
【００４９】
複数の実施形態において、単一分子検知デバイスは、トランジスタ、すなわち、電気回路に対する「ゲート」として働く生体分子が結合された電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）の形態をとってもよい。この実施形態において、１つの高感度化分子は、このデバイスの単一分子ゲートの役割を果たす。本トランジスタ実施形態は、２端子または３端子トランジスタを含むことができる。伝導チャネルはまた、金属、金属酸化物、半導体またはナノワイヤー、グラフェンもしくは単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）などのナノメートルスケールの導体から形成されてもよい。一実施形態では、伝導チャネルは、１つのＳＷＮＴである。
【００５０】
一般に、ＳＷＮＴの長さは、約０．１から約１０マイクロメートルまで変えることができる。ＳＷＮＴの具体的な長さは、統計学的に、製造されるデバイス１０の大部分がＳＷＮＴと結合した高感度化分子を１つだけ有するように選択される。さらにより好ましくは、外部の化学環境に曝露されるＳＷＮＴの長さは、製造されるデバイスの７５％超がＳＷＮＴと結合した高感度化分子を１つだけ含むように選ばれる。ある場合には、この距離は、第１の電極と第２の電極の間の距離である。
【００５１】
第１の電極及び第２の電極は、任意にカバーで覆われていてもよい。カバーは、外部環境からＳＷＮＴへの入り口を提供する窓、凹部、細長い穴またはその他の開口部を含んでもよい。この関連で、ＳＷＮＴは、化学環境に曝露されもよい。例えば、露出した窓は、製造工程においてカバーに形が定められてもよい。保護被覆がその環境から確実に第１及び第２の電極を含む表面の大部分を保護する。さらに、好適な実施形態において、窓の長さは、正確なデバイスの長さを実現するために調整される。窓の長さは、ＳＷＮＴにおける所望の活性領域を実現するために変えてもよい。例えば、第１及び第２の電極は、ＳＷＮＴに接続され、２μｍの距離だけ離されてもよい。ただし、窓は、電極間の距離よりも小さく作製されてもよい。保護被覆内の露出した窓は、ＳＷＮＴ及び結合した高感度化分子を化学環境にさらす。保護カバーは、１つ以上の層で構成された任意の電気絶縁膜であってもよい。膜材料としては、ポリマー、酸化アルミニウム、酸化ハフニウム（ｈａｌｆｎｉｕｍ）、二酸化ケイ素または窒化ケイ素が挙げられる。リソグラフィー技術を使用して保護被覆内に窓の形が定められる。リソグラフィー技術は、当該技術分野において周知であり、露光、電子ビーム法及びポジ型またはネガ型レジストの任意の許容される組み合わせを使用することを含む。
【００５２】
複数の実施形態において、デバイス作製は、ポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）などの陽電子ビームレジストの保護被覆でデバイスをコーティングすること、電子ビームを用いてリソグラフィーのパターンを描画すること、及びその後、描画した領域を現像して、長さが０．５から１．０μｍの有効なＳＷＮＴチャネルを露出させることを含む。別の実施形態では、デバイス作製は、酸化アルミニウムの保護被覆でデバイスをコーティングすること、光フォトレジストの膜でデバイスさらにコーティングすること、所望の窓を光に曝露すること、描画した領域を現像して、酸化アルミニウムの狭い窓を露出させること、酸化アルミニウムをエッチングして、下にある長さが０．５から１．０μｍのＳＷＮＴチャネルをさらに露出させることを含む。保護コーティングの材料の２つ以上の層の組み合わせは、異なる化学特性を有するコーティングをもたらす。
【００５３】
本デバイスは、電子回路に結合される。電子回路は、ともに第１の電極と第２の電極の間に電圧バイアス（例えば、５０〜１００ｍＶ）をかけるために使用され、またＳＷＮＴの端から端までの電流の流れを時間の関数として測定するように構成される。電子回路は、デバイスによる電圧及び電流の印加を制御するため、ならびにデバイスによって生成されたデータを取得し、記憶し、分析するために使用される１つ以上のプロセッサを中に有するコンピュータ２４と結合されてもよい。デバイスの操作中、電圧（例えば、ＤＣ定電圧またはＡＣ及びＤＣ電圧の組み合わせ）が、第１の電極と第２の電極の間に印加される。その後、ＳＷＮＴを通過する電流が電子回路を使用して測定され、これは、１つ以上の増幅器を備えた電流計を含んでもよい。
【００５４】
基板の上に第１の電極、第２の電極及びＳＷＮＴが配置されてもよい。基板は、任意の数のガラス、プラスチックまたはケイ素などの基板材料を含んでもよい。本発明の代替的な一実施形態は、ガラスまたは石英などの光学的に透明な基板上でのデバイスの作製を含む。センサーＦＥＴ及び多くの検知に関する先行技術と違って、本デバイスは、ゲート電極または導電性支持基板を必要としない。それゆえに、本デバイスは、透明なものを含む広い範囲の表面上に作製することができる。石英は、高温に適合するため上記のＣＶＤ作製工程に好適である。ＳＷＮＴが合成され、溶液からのスピンコーティングなどの他の手段によって基板上に堆積される場合、またはデバイスがウェーハ上に作製された後、支持のためのガラスに移される場合、ガラスウェーハも使用することができる。いかなる場合も、石英、ガラス、サファイアまたはその他の透明基板の使用もデバイスの光学的なモニタリングを可能にする。連結された分子からの蛍光信号をモニターすることは、当該技術分野において周知であり、透明な基板により最適に成し遂げられる。石英基板上に形成されたデバイス１０は、本明細書に記載されている電気技術を使用し、単一分子蛍光及びｓｍＦＲＥＴを含む光学技術によって分子動態の独立したモニタリングを可能にする。
【００５５】
複数の実施形態において、同じ単一分子からの電気信号及び光信号が、異なる時点で、または同時に得られる。透明な基板（例えば、石英）に配置された単一分子検知デバイスは、独立した単一分子技術でｓｍＦＲＥＴを補完するための先行技術では見られない類のない機会を提供する。この実施形態において、ＳＷＮＴは、照明光源を使用して透明な基板を通して照らされる。発せられた蛍光は、透明な基板に接触させるために油または水を使用した対物レンズを使用して集めることができる。蛍光は、例えば、ビームスプリッターを使用して光子カウンターに向けることができる。
【００５６】
そのようなデュアルモードモニタリングは、アンサンブルレベルで行われた蛍光のターンオーバー測定による電子モニタリングなどの一アプローチによって行われた測定を較正することがきる。２つの独立した手段によって１つの分子を同時に調べることは、同じ分子の異なる２つの部分を調査するため、例えば、動く部分、電荷の移動を受入れる部分、触媒部位を含む部分または光子を吸収もしくは発する部分を比較するための格好の条件を提供する。そのような２つの部分の同時のモニタリングは、調節部位の立体構造変化と相互に関連した活性部位の動きなどの２つの現象の相対的なタイミング及び因果関係を確認することができる。さらに、透明な基板は、結果として生じた立体構造変化の調査のための触媒部位の機能の光誘発性活性化または光駆動の電荷移動を可能にする。ＳＷＮＴは、一実施形態においては、流体が測定のためにＳＷＮＴ上を流れることができるようにフローセルまたな同種のものの中に組み込まれてもよい。あるいは、流体が、デバイスの上に選択的に置かれてもよい。
【００５７】
本デバイスは、ＳＷＮＴの外側の側壁に非共有結合した１つ以上の官能基を含む１つのリンカー分子を含んでもよい。官能基としては、ピレン、ベンゼン、シクロヘキサン及び２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンを挙げることができる。ＳＷＮＴの外側の側壁に非共有結合した官能基は、当該技術分野において周知であり、この官能基のための特定の設計は、本発明における使用に適したあらゆる設計を含んでもよい。さらに、リンカー分子（複数可）は、高感度化分子の機能の一部またはすべてを保持するような方法で高感度化分子に結合しているか、または結合していた別の官能基により官能化された１つ以上の官能基を含む。官能基のペアとしては、アジドとアルキン、ＮＨＳエステルとアミン、チオールとアルキン及びチオールとマレイミドを挙げることができる。他の官能基により官能化された官能基は、当該技術分野において周知であり、この官能基のための特定の設計は、本発明における使用に適したあらゆる設計を含んでよい。
【００５８】
本デバイスは、高感度化分子の機能を保持するような方法で１つのリンカー分子の１つ以上の官能基により官能化された１つ以上の官能基を含む１つの高感度化分子を含んでもよい。本発明の高感度化分子としては、あらゆる分子が挙げられる。好ましい高感度化分子としては、他の分子との相互作用が化学的に特異的である分子が挙げられる。より好ましくは、高感度化分子としては、ポリマー、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム及び／またはアプタマー、多糖あるいはその他の生体分子を挙げることができる。高感度化分子３０は、当該技術分野において周知であり、本発明における使用に適したあらゆる高感度化分子を含んでよい。
【００５９】
複数の実施形態において、リンカー分子は、ＳＷＮＴの壁に非共有結合する第１の官能基及び高感度化分子に結合するよう設計された第２の官能基を含んでもよい。リンカー分子の使用が、高感度化分子とＳＷＮＴの間の効果的で直接的な結合の設計の問題を回避する。この実施形態において、リンカー分子及び高感度化分子は、事実上１つの要素である。実際には、所望の表面密度の実現及び制御には、リンカー分子（複数可）と高感度化分子が２つの別々の溶液として調製される必要がある場合が多く、それら分子間の最後の結合はＳＷＮＴの所定の位置で実施される。高感度化分子は、第１の官能基及び第２の官能基を含んでもよく、これは、標的に選択的な官能基を含んでもよい。高感度化分子の第１の官能基は、リンカー分子の第２の官能基と結合する。結合は、当該技術分野において既知の任意の化学的相互作用、例えば、共有結合または非共有結合であってもよい。複数の実施形態において、結合は、共有結合による。第２の官能基は、標的分子または複数の標的分子と任意の結合相互作用により結合するよう設計される。高感度化分子はまた、理想的にはＳＷＮＴ結合の部位の近くにある伝導性調節構成要素を含む。伝導性調節構成要素は、第２の官能基と近接近している必要はないが、この２つは、機械的手段、アロステリックな手段または電子的手段を介して通じていなければならず、高感度化分子の化学的標的との相互作用が、同じ高感度化分子の伝導性調節構成要素に動的な変化を引き起こして、ＳＷＮＴの電子的変化に影響を及ぼす。
【００６０】
複数の実施形態において、ピレン官能基は、パイ−パイスタッキングを介してＳＷＮＴ表面に非共有結合してもよい。１つの高感度化分子がＳＷＮＴと結合してもよい。完成したデバイスの一般的な電気的特性は、半導性ＳＷＮＴの側壁と直接接触した水性電解質により測定されてもよい。
【００６１】
複数の実施形態において、３つすべての構成要素が１つの高感度化分子において組み合わされる。例えば、タンパク質の１つのアミノ酸がＳＷＮＴとの結合に有効な部位かもしれず、別のアミノ酸がＳＷＮＴの伝導性を調節することができる正味の表面電荷を有するかもしれず、第３のアミノ酸は検出対象の標的分子であるタンパク質の結合パートナーに対する認識または結合部位として働くかもしれない。あるいは、３つすべての構成要素を１つの高感度化因子として一緒にするために共有結合性または非共有結合性複合体が設計され、合成されてもよい。
【００６２】
複数の実施形態において、高感度化分子の異なる機能的構成要素は、２つ以上の分子間で分離され、そのすべてがＳＷＮＴ導体上で共有結合的または非共有結合的に組み立てられる。この代替的実施形態において、伝導性調節構成要素は、リンカー分子の一方の官能基に結合した分子であってもよく、標的に選択的な化学的構成要素は、同じリンカーの異なる官能基に結合した第２の分子であってもよい。あるいは、標的に選択的な化学的構成要素は、伝導性調節構成要素を含む分子と直接結合した官能基を有してもよい。この結合は、多くの生体分子に一般的な共有結合または非共有結合性認識もしくはドッキングによるものであってもよい。どの場合においても、構成要素間でなんらかの形の機械的、立体的または電気的伝達が実現されることになり、その結果、標的に特異的な化学的構成要素の動態が高感度化複合体全体の伝導性調節構成要素に変化をもたらす。
【００６３】
実施形態、単一分子検知デバイスは、１つ以上のＳＷＮＴを有する導体と、２つ以上官能基を含み、そのうちの１つ以上がＳＷＮＴの表面に非共有結合している１つ以上のリンカー分子と、リンカー分子の少なくとも１つの官能基により官能化された少なくとも１つの官能基を含む１つの高感度化分子とを含んでもよい。
【００６４】
複数の実施形態において、単一分子検知デバイスは、カルボキシラート基を含むリンカー分子及びアミンを含む高感度化分子を含む。リンカー分子のカルボキシラート官能基は、反応性エステルとして活性化され、当該技術分野において周知の技術を使用してアミド化されてもよい。反応性エステルは、その後、高感度化分子のアミン基と共有結合して、当該技術分野において周知の方法で安定したアミド結合を形成してもよい。
【００６５】
複数の実施形態において、単一分子検知デバイスは、ピレンマレイミドであるリンカー分子及び反応性チオール基を含む高感度化分子を含む。リンカー分子のマレイミド官能基は、高感度化分子のチオール基と共有結合して、当該技術分野において周知の方法で安定したチオエステル結合を形成してもよい。
【００６６】
複数の実施形態において、非共有結合性の単一分子検知デバイスは、ピレンマレイミドであるリンカー分子及びタンパク質である高感度化分子を含む。別の実施形態は、タンパク質が酵素であるものを含む。複数の実施形態において、酵素は、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素である。これらの酵素のそれぞれを利用した単一分子検知デバイスの類似の収率が、酵素の結合時に使用される溶液ｐＨ、浸漬時間及びすすぎ条件を調整することによって達成された。
【００６７】
複数の実施形態において、高感度化分子は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、リボザイム、アプタマー、多糖またはその他の生体分子である。基質もしくはリガンドの結合またはそれに対する作用時に立体構造の動態に変化が起こる任意の高感度化分子が本発明への使用に適している。複数の実施形態において、リンカー分子は、ＳＷＮＴの表面に非共有結合的に官能性をもたせることが当該技術分野において既知の少なくとも１つの官能基及び別の官能基と結合を形成することが当該技術分野において既知の官能基である少なくとも１つの官能基を含むリンカー分子を含む。
【００６８】
一実施形態は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ分子の非光学的な配列決定を可能にするための、ＳＷＮＴに非共有結合した１つの高感度化分子としてのＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の使用である。ｄＮＴＰの鋳型依存的な組み込みを触媒する酵素は、本明細書に記載の方法及びデバイスにより、天然または類似体ｄＮＴＰまたはＮＴＰのヌクレオチドに特異的な組み込みをモニターするために使用することができるよく特徴づけられた立体構造変化が起こることが知られており、それにより鋳型分子の配列を提供する。本発明は、配列決定のために連続した周期的な様式で個々のｄＮＴＰもしくは類似体ｄＮＴＰまたはＮＴＰを流す実務に適合しているが、４種の天然または類似体ｄＮＴＰまたはＮＴＰの均質な混合物からのヌクレオチドに特異的な組み込み現象の識別を可能にする限り、この無標識の配列決定方法は現在実施されている非光学的な配列決定方法を上回る利点を有する。非共有結合した高感度化分子３０としての逆転写酵素の使用は、中間体ｃＤＮＡの変換工程を必要としないＲＮＡ分子の直接的な配列決定を可能にする。
【００６９】
正確なヌクレオチド組み込みの精度はＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの配列決定に同等に重要であるため、正確なｄＮＴＰまたはＮＴＰの特異的な組み込みの検出を向上させるための代替的な方法は、正確なヌクレオチドの組み込みの立体構造の動態を激化させる類似体ｄＮＴＰまたはＮＴＰを使用することであり、それにより確実に正確な配列決定にする。正確なヌクレオチドの組み込みの反応速度または動態の識別を向上させるために使用することができる非標識化類似体ｄＮＴＰまたはＮＴＰは当業者に周知であり、そのようなものとしては、プリン及びピリミジン塩基の修飾（すなわち、Ｃ−４及びＣ−７位）、ヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボース部分及び付加的なリン酸修飾を有するか、もしくは有さないテトラもしくはペンタ−リン酸の使用を含むｄＮＴＰまたはＮＴＰのアルファ、ベータ及びガンマ−リン酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
以下に限定されるものではないが同じ鋳型分子を複数回の読むことを含む本発明に適合した当業者に既知の配列精度の向上のその他の方法が使用されてもよい。その他の可能な手段は、２度読み方式の使用を含み、この場合、２度目に同じ鋳型分子を読むために加ピロリン酸分解が使用される。
【００７１】
複数の実施形態において、単一分子検知デバイスの動態及び反応速度を検出するための方法が提供される。単一分子検知デバイスをモニターするために、ＳＷＮＴの電気伝導度の変化を測定するための任意の方法が使用されてもよい。複数の実施形態において、回路を使用して１００ｍＶのバイアス差がＳＷＮＴに印加され、導体を通って流れる電流が時間の関数として測定される。高感度化分子の標的に特異的な構成要素における化学結合または認識は、高感度化分子の伝導性調節構成要素に変化をもたらし、測定される電流の増加及び低下を引き起こす。平均したときに、標的に特異的な構成要素の化学反応速度を含む複数の結合及び解離現象が、当該技術分野において既知の信号処理技術を使用して時間が記録され、計数され、識別され、分析され、または記憶され得る複数の電流変動をもたらす。電流変動は、縁が四角いパターンの単純な増加及び減少から成る場合がある。あるいは、この変動は、三角形、正弦波の形状を含むか、または任意の数のフーリエ成分を有するいずれかの小波を含む場合もある。これらの小波の振幅、継続時間及び形状はすべて、標的に特異的な構成要素の活性を符号化し、その結果、結合の反応速度ならびにその他の機械的及び電子的自由度を明らかするためにコンピュータ２４を使用して分析することができる。これらのパラメータの統計分析は、標的結合及び解離プロセスの反応速度の変動性、遷移及び中間の化学状態に関する洞察を与える。電流信号の自由度は、すべて同じ部位に結合する複数の類似標的分子間、例えば、その結合部位の標的分子と阻害分子との間で違いを識別する。これらの自由度は、真の結合の前に起こる分子認識などの弱い相互作用も識別することができる。
【００７２】
複数の実施形態において、阻害分子の共有結合または非共有結合のいずれかを識別し、モニターする機能も提供される。タンパク質機能の阻害物質は、抗ウイルス、抗がん及び抗細菌治療薬を含む医薬品として商業的に重要である。有効な阻害物質の試験は、時間がかかり、高価なプロセスである。本デバイスは、１分子分解能でタンパク質機能を直接モニターする一方で、同時にタンパク質を任意の数の異なる候補阻害物質とともに精査することを提供する。フローセルなどの当該技術分野で周知の自動流体送達システムを使用して、候補阻害物質溶液を本デバイスに１つずつ送達して、所望の反応速度特性を有する阻害物質を特定することができる。あるいは、候補分子の全バッチを急速にアッセイするために、候補阻害物質は合成されたままの混合物、あるいは化学構造もしくは機能または任意のその他の特徴によって意図的に分類された混合物であってもよい。
【００７３】
したがって、本開示の方法は、１つの高感度化分子の動態及び反応速度を検出できることがわかるであろう。高感度化分子が酵素である場合、反応速度及び動態は、酵素の回転率または立体構造の動きの速度を含む。本発明の技術的な利点は、１つの高感度化分子の動態及び反応速度を検出して、ＳＷＮＴ上に複数の高感度化分子が存在する場合に生じるアンサンブル測定の問題を克服することができることである。さらに、本開示の方法は、後で、１つの高感度化分子により官能化されるＳＷＮＴに欠陥部位を作り出す、単一分子デバイスを作製する以前の方法に関連する問題を克服する。
【００７４】
実施形態は、単一分子検知デバイスを作製する方法を含む。本方法は、それぞれ、第１の電極及び第２の電極に接続された第１及び第２の端部を有する基板２６上に少なくとも１つの単層カーボンナノチューブを形成することを含む。本デバイスの単層カーボンナノチューブ側壁は、その後、複数の官能基を含む少なくとも１つのリンカー分子の少なくとも１つの官能基により非共有結合的に官能化される。１つの高感度化分子は、少なくとも１つのリンカー分子の少なくとも１つの官能基により官能化される（例えば、ＳＷＮＴにより非共有結合的に官能化されていない官能基）。
【００７５】
複数の実施形態において、ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴが作製され、エキソヌクレアーゼ欠損ＫＦの単一システインバリアント（Ｄ３５５Ａ／Ｅ３５７Ａ／Ｌ７９０Ｃ／Ｃ９０７Ｓ）により官能化される。その均一性により９５％超までのＫＦの精製が確保にされる（図６）。蛍光に基づくアッセイにより結合前のバルク酵素の活性を確認する（図７）。ＫＦのＳＷＣＮＴ−ＦＥＴとの結合は、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミド（１ｍＭ、エタノール中、３０分）の溶液にデバイスを浸漬した後に、ＫＦ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ８．０の標準的なＫＦ活性バッファー中の３００ｎＭ  ＫＦ）とともにインキュベーションすることによって達成される。データ収集後に原子間力顕微鏡により１つのＫＦ分子の各デバイスとの結合を確認する（図１Ｂ）。そのようなデバイスは、単にＫＦナノ回路と呼ばれる。
【００７６】
複数の実施形態において、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの立体構造変化を検出するために、相補的なｄＮＴＰ類似体と混合されたホモポリマー型の鋳型ポリ（ｄＡ）４２、ポリ（ｄＴ）４２、ポリ（ｄＧ）４２またはポリ（ｄＣ）４２が使用される。複数の実施形態において、それぞれの鋳型がＭ１３プライミング部位に融合され、１：１の理論混合比でＭ１３フォワードプライマーと混合され、ハイブリダイゼーションのために、その混合物は、サーマルサイクラーにおいて９５℃に５から１０分間加熱され、続いて６５℃に冷却された後、５分毎に５℃のグラジエントで室温になるまでさらに冷却される。複数の実施形態において、ＫＦナノ回路は、アニーリングされた鋳型−プライマーを１００ｎＭの濃度で含む活性バッファーに浸漬される。未変性または類似体ｄＮＴＰが過剰にそのバッファーに添加され、ＫＦ触媒反応に対するＶｍａｘ条件を確保する。場合によってｄＮＴＰ類似体の低下した親和性を補うために、実験は、未変性ｄＮＴＰ（例えば、１０μＭ）よりも高い類似体の濃度（図１Ｃ、例えば、１００μＭ）を適用する。
【００７７】
複数の実施形態において、測定は、結合したＫＦ分子がその周辺の環境と相互作用した間にＳＷＣＮＴ−ＦＥＴを通るソース−ドレイン電流Ｉ（ｔ）をモニターすることから成る。複数の実施形態において、ドレイン電極は、１００ｍＶでバイアスがかけられ、ゲート電極として働く電解質は０Ｖまたはその付近に保持される。デバイスの任意の鋳型−プライマー及びその相補的なｄＮＴＰとのインキュベーションは、変動ΔＩ（ｔ）を伝達するのに対し、こうした変動は、非相補的なｄＮＴＰを用いた場合、または鋳型−プライマーもしくはＫＦ結合が存在しない対照測定においてはない場合もある。複数の実施形態において、Ｉ（ｔ）変動が増幅され、１００ｋＨｚでデジタル化され、連続の６００ｓとして記憶される。測定間で、別のヌクレオチド及び鋳型−プライマーを導入する前に、ＫＦナノ回路を活性バッファーで２回すすぎ、バッファー中で５分間インキュベートし、その後、バッファーで２回すすいでもよい。各ＫＦ分子は、直接比較できるデータセットを収集し、典型的なＫＦ活性を確認し、ΔＩ（ｔ）振幅を生成するために、複数の類似体、その対応する未変性ｄＮＴＰ及びヌクレオチドを含まないバッファーとともにモニターされてもよい。
【００７８】
図２Ａ及び２Ｂは、ｄＧＴＰの存在下においてポリ（ｄＣ）４２鋳型を処理するＫＦナノ回路によって生成された典型的なΔＩ（ｔ）信号を示す。複数の実施形態において、本デバイスは、連続して起こる負のΔＩ（ｔ）振幅を生成し、それを３つの異なる倍率で示した。それぞれのΔＩ（ｔ）振幅は、１つの塩基対の生成を示し、ΔＩ（ｔ）データセットから得られた反応速度パラメータは、既知のＫＦの動きの単一分子解析及びアンサンブルＫＦの組み込み速度と一致した。複数の実施形態において、Ｇ●ＣまたはＣ●Ｇ塩基対の形成は互いに一致する場合もあり、Ａ●Ｔ／Ｔ●Ａ塩基対の形成も互いに比較して極めて類似した重合反応速度、動態及びΔＩ（ｔ）値をもたらす場合もある。未変性ｄＮＴＰを用いた測定は、ｄＮＴＰ類似体との比較のための基準値を提供することができる。
【００７９】
複数の実施形態において、アンサンブル及び単一分子アッセイの両方において、商業
的に入手可能なｄＮＴＰ類似体がＫＦ重合によりＤＮＡに組み込まれる（図８Ａ〜８Ｂ）。複数の実施形態において、α−チオ−ｄＮＴＰ、すなわちｄＮＴＰαＳ類似体が生成したΔＩ（ｔ）データセットを含む測定値は、未変性ｄＮＴＰと類似しているように見え得るが、組み込み速度が異なる（図２Ｃ）。複数の実施形態において、ＫＦナノ回路を用いて測定される場合、ポリ（ｄＣ）４２及びポリ（ｄＴ）４２鋳型の両方の向かい側への６−クロロ−２−アミノプリン−ｄｒＴＰ、すなわち６−Ｃｌ−２−ＡＰＴＰの組み込みは、異なるＫＦ立体構造を反映する逆の振幅を有するΔＩ（ｔ）信号をもたらす（図２Ｄ）。この類似体は、よりゆっくりと合体し、例えば、ポリ（ｄＣ）４２の向かい側で６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰは、ｄＧＴＰの速度の８０％のΔＩ（ｔ）振幅を生成した。２−チオ−ｄＮＴＰ類似体を用いたΔＩ（ｔ）の記録は、混合した挙動をもたらし、この場合、ＫＦ活性は、１つの鋳型鎖に沿ってある瞬間において負のΔＩ（ｔ）振幅を、別の瞬間において正のΔＩ（ｔ）振幅を、さらにまれに、両方挙動の混ざったものを生成した（図２Ｅ〜２Ｆ）。
【００８０】
未変性ｄＮＴＰに関する、実験的基準電流に対する時間定数、τｏｐｅｎは、τｈｉとも呼ばれる。未変性ｄＮＴＰの組み込み現象を示す時間定数はより低い電流で生じることもあり、τｌｏと呼ばれる。ここでは正、負または正及び負の両方の混ざったΔＩ（ｔ）振幅が開示されており、振幅のいずれかの方向に関する時間定数はτｃｌｏｓｅｄと呼ばれる。τｏｐｅｎ及びτｃｌｏｓｅｄの分布は、重合データのそれぞれの記録から導き出される。
【００８１】
図３Ａ〜３Ｂは、ポリ（ｄＣ）４２鋳型へのｄＧＴＰ基質の組み込みに関する例の分布を示す。未変性及び類似体ｄＧＴＰのτｃｌｏｓｅｄ現象の分布は、本発明者らが最低の統計値を有する末端のまれな現象を除いてほとんど見分けがつかなかった（図３Ａ）。未変性ｄＮＴＰと類似体ｄＮＴＰとの間の比較を得るために、本発明者らは、これらの分布の主要なポアソン成分の平均時間定数＜τ＞に焦点を当てた。＜τｃｌｏｓｅｄ＞に関する平均値のすべてがほぼ０．３±０．１ｍｓ前後に一致した。比較して、＜τｏｐｅｎ＞の分布及び平均値は明らかに異なっていた。例えば、α−チオ−ｄＧＴＰを処理するとき、ＫＦは６３．６±２．８ｍｓ開いた立体構造でおり、これは、未変性ｄＧＴＰに対して観察された４０．８±０．６ｍｓよりも５６％長い（図３Ｂ）。
【００８２】
反応速度パラメータ＜τｃｌｏｓｅｄ＞、＜τｏｐｅｎ＞及び組み込みの平均速度ｋを、未変性及び類似体ｄＮＴＰを用いて４種のホモポリマー型の鋳型に関して分析した（表１）。上記の場合と同様に、すべての組み合わせが同一のτｃｌｏｓｅｄ分布を生成し、＜τｃｌｏｓｅｄ＞値は０．３±０．１ｍｓの範囲にあった。４種の未変性ｄＮＴＰに対して類似の結果が予め観察されたが、３３異なるヌクレオベースサイズ、電子的特性、水素結合またはα−ホスホジエステルに置換を有するｄＮＴＰ類似体にまでのこの結果が及ぶことは予想外であった。
【００８３】
一方、τｏｐｅｎの方がｄＮＴＰの素性に対してより敏感である。＜τｏｐｅｎ＞の平均継続時間は、未変性ｄＣＴＰの２３ｍｓからα−チオ−ｄＡＴＰの１４５ｍｓに及んだ。４種の未変性ｄＮＴＰ間で、＜τｏｐｅｎ＞は、ｄＧＴＰまたはｄＣＴＰの組み込みに関してよりもｄＴＴＰまたはｄＡＴＰの組み込みに関して長い。この階層は、全４種のα−チオ−ｄＮＴＰに対して測定された長い＜τｏｐｅｎ＞継続時間に維持された。α−チオ置換は、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの場合、＜τｏｐｅｎ＞を５０％増加させたのに対し、ｄＴＴＰ及びｄＡＴＰに関する増加は、１００％を超えた。
【００８４】
ｄＮＴＰ組み込みに対するＫＦ平均処理速度は、ｋ＝（＜τｏｐｅｎ＞＋＜τｃｌｏｓｅｄ＞）−１として算出された。τｏｐｅｎはτｃｌｏｓｅｄよりも少なくとも６０倍長いため、τｏｐｅｎがｋをおおかた決める。その最速では、ＫＦは、３０ｓ−１超で２−チオ−ｄＣＴＰを組み込んだ。α−チオ−ｄＮＴＰに対する上記のτｏｐｅｎの増加は、α−チオ−ｄＣＴＰ及びα−チオ−ｄＧＴＰに関しては１５ｓ−１にならびにα−チオ−ｄＡＴＰ及びα−チオ−ｄＴＴＰに関しては７ｓ−１にｋを低下させた。６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰの組み込み速度は、未変性ｄＧＴＰの組み込みに対して観察された最低速度と比べてひけを取らなかった。反対に、２−チオ−ｄＴＴＰ及び２−チオ−ｄＣＴＰの組み込みは、それらの未変性の同等物の組み込みよりもやや速いようであった。
【００８５】
１２種のさまざまなＫＦ分子を使用して同様の結果が再現された。各ＫＦを、異なるＳＷＣＮＴ−ＦＥＴに結合させ、独立して測定した。比較のために、ｄＮＴＰ類似体を用いて測定された非ホモポリマー型の鋳型は類似の反応速度をもたらした（データは示していない）。上記のとおり、本発明者らの実験は、確実に定常状態条件にするために１００μＭのｄＮＴＰ類似体を利用し、比較のために、ポリ（ｄＴ）４２鋳型を用いた１０μＭのα−チオ−ｄＡＴＰはＤＮＡ重合に影響を及ぼさなかった。静的な無秩序性により、一部のＫＦ分子は、アンサンブル平均よりも速くまたはゆっくり処理したが、未変性ｄＮＴＰに対する類似体の相対的比較にはいかなる有意な変化もなかった。
【００８６】
この研究において行われた単一分子実験は、ＫＦのようなＤＮＡポリメラーゼの十分に認識された柔軟性を説明し、新たに解明する。このクラスの酵素は、入ってくる非常に大幅に修飾されたｄＮＴＰでも適応することができる。しかしながら、本発明者らは、特定の改変がされたｄＮＴＰに直面したときに忠実性を保持するために、酵素が必要とする立体構造の動きを直接観察する。そのような適応に対する制限を反映して、ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰのサイズ及び形状の軽微な変化に高い感受性を示すことが知られている。本発明者らの分析は、多数の進行する組み込み現象中の未変性ｄＮＴＰと類似体ｄＮＴＰを用いた単一分子データの比較から利益を得る。この分析は、触媒反応の間に観察される２つの酵素立体構造の反応速度から始め、これらはτｏｐｅｎ及びτｃｌｏｓｅｄによって捕らえられた。
【００８７】
τｏｐｅｎの間に起こる現象は、ｄＮＴＰ認識の律速段階を含み、これは、ヌクレオベース修飾及び骨格修飾の両方に対して敏感である。適切なヌクレオチドの正常な認識及び結合は、ＫＦの活性化及び閉鎖を引き起こす。関連するＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを用いた以前のＦＲＥＴに基づく実験は、不適正塩基対の認識の結果として生じる「完全に開いた」立体構造状態を確認した。しかしながら、Ｌ７９０Ｃ結合部位を使用したＳＷＣＮＴ−ＦＥＴは、不適正なｄＮＴＰの存在下ではＫＦの動きがないこと、信号がないことを記録している。中間の状態または不適正塩基対に関連した動きがないことは、本発明者らの結合部位がこの最初の忠実性のチェックポイントに反応しないことを示唆する。よって、ΔＩ（ｔ）振幅は、触媒と関係した立体構造に起因し、単純に酵素の開閉の全般的な動きに制限されるものではない。
【００８８】
ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ鋳型に組み込まれるその能力ならびにサイズ、構造及び反応性のバリエーションに関してｄＮＴＰ類似体を選んだ。本発明者らは、α−リン酸またはヌクレオベースのいずれかの置換を調べた。新規の立体中心を導入し、この非常に重要な部位の反応性を変えるために非橋架α−ホスホリル酸素原子が硫黄で置換された第１のタイプの類似体、例えば、α−チオ−ｄＮＴＰ。ｄＮＴＰ類似体の第２のカテゴリー、ヌクレオベースにおける置換、例えば、ハロゲンまたは硫黄置換は、塩基対のサイズ及び電子構造を変え、一部の類似体は、塩基対合に利用可能な水素結合も変わる。例えば、６−Ｃｌ−２−ＡＰＴＰ（図１Ｃ）は、２つの水素結合特性を有し、そのことが、Ｔ及びＣ塩基の向かい側にそれを組み込むことを可能にする。ｄＡＴＰと比較して、６−Ｃｌ−２−ＡＰＴＰは、６−アミノ基を塩素で置換するが２−アミノ官能基を組み込み、この構成が最終的にｄＡＴＰと同じ数のＴに相補的なワトソン・クリック水素結合をもたらす。ｄＧＴＰ類似体として使用されるとき、６−Ｃｌ−２−ＡＰＴＰは、異なる互変異性化を有し、これは、Ｎ−１を水素結合ドナーからアクセプターに変える。この場合、塩素による酸素の置換が、劇的に水素結合の強さを低下させる。４１６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰのように、硫黄置換類似体２−チオ−ｄＴＴＰ及び２−チオ−ｄＣＴＰも、チオカルボニルの結合距離の増加のため大きな塩基対を形成する。
【００８９】
複数の実施形態において、ｄＮＴＰまたはＮＴＰ類似体は、三リン酸部分に化学修飾を含む。複数の実施形態において、三リン酸部分の化学修飾は、α−位のＯのＳによる置換である。複数の実施形態において、任意のｄＮＴＰまたはＮＴＰ類似体の三リン酸部分は、式（Ｉ）、
【００９０】
【化１】
2018500905.tif 000003
の構造を有し、式中、Ｘ１はＳまたはＯである。複数の実施形態において、ｄＮＴＰ類似体は、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＣＴＰまたはα−チオ−ｄＴＴＰである。複数の実施形態において、ＮＴＰ類似体は、α−チオ−ＡＴＰ、α−チオ−ＧＴＰ、α−チオ−ＣＴＰまたはα−チオ−ＴＴＰである。複数の実施形態において、ｄＮＴＰまたはＮＴＰ類似体は、三リン酸部分のα−位に式（Ｉ）に記載されるとおりの置換ならびにヌクレオベースに１つ以上の本明細書中で開示されるとおりの、当該技術分野において既知の置換を含む。
【００９１】
複数の実施形態において、ｄＮＴＰまたはＮＴＰ類似体は、ヌクレオベースにおいて置換されている。複数の実施形態において、プリンは、式（ＩＩａ）
【００９２】
【化２】
2018500905.tif 000004
に示されるとおりに置換され、式中、Ｘ１は水素、ハロゲンまたは−ＮＨ２であり、Ｘ２は水素または−ＮＨ２である。複数の実施形態において、Ｘ１は−ＮＨ２であり、Ｘ２は水素であり、ｄＡＴＰまたはＡＴＰをもたらす。複数の実施形態において、Ｘ１は−ＮＨ２ではなく、Ｘ２は−ＮＨ２であり、６−置換２−ＡＰＴＰまたはその置換類似体をもたらす。複数の実施形態において、類似体は、６−Ｃｌ−ｄＧＴＰとしても知られている６−Ｃｌ−２−ＡＰＴＰである。
【００９３】
複数の実施形態において、ｄＮＴＰまたはＮＴＰ類似体としては、８−オキソグアニン、２，６−ジアミノ−４−オキソ−５−ホルムアミドピリミジン、Ｎ６−メチル−アデノシン、Ｏ６−メチルグアノシン、Ｎ２−メチル−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、インドリル、５−メチルインドリル、５−アルキル−インドリル（例えば、５−エチル−インドリル）、５−エチレン−インドリル、５−ニトロ−インドリル、４−ニトロ−インドリル、５−フェニル−インドリル、５−ハロ−インドリル（例えば、５−Ｆ−インドリル）、５−アミノ−インドリル、または６−ニトロ−インドリルであるヌクレオベースが挙げられる。
【００９４】
複数の実施形態において、ｄＮＴＰまたはＮＴＰは、式（ＩＩｂ）
【００９５】
【化３】
2018500905.tif 000005
の構造を有するヌクレオベースを含み、式中、Ｘ３はＯまたはＳである。複数の実施形態において、Ｘ３はＯであり、シトシンヌクレオベースをもたらす。複数の実施形態において、Ｘ３はＳであり、２−チオヌクレオベースをもたらす。複数の実施形態において、ヌクレオベースは、２−チオ−ｄＣＴＰまたは２−チオ−ＣＴＰである。
【００９６】
複数の実施形態において、ｄＮＴＰまたはＮＴＰは、式（ＩＩｃ）
【００９７】
【化４】
2018500905.tif 000006
の構造を有するヌクレオベースを含み、式中、Ｘ４はＯまたはＳである。複数の実施形態において、Ｘ４はＯであり、チミンヌクレオベースをもたらす。複数の実施形態において、Ｘ４はＳであり、２−チオヌクレオベースをもたらす。複数の実施形態において、ヌクレオベースは、２−チオ−ｄＴＴＰまたは２−チオ−ＴＴＰである。
【００９８】
複数の実施形態において、ｄＮＴＰまたはＮＴＰは、式（ＩＩｄ）
【００９９】
【化５】
2018500905.tif 000007
の構造を有するヌクレオベースを含み、式中、Ｘ５はＯまたはＳである。複数の実施形態において、Ｘ５はＯであり、６−アザ−チミンヌクレオベースをもたらす。複数の実施形態において、Ｘ５はＳであり、６−アザ−２−チオヌクレオベースをもたらす。複数の実施形態において、ヌクレオベースは、６−アザ−２−チオ−ｄＴＴＰまたは６−アザ−２−チオ−ＴＴＰである。
【０１００】
複数の実施形態において、類似体は、アルファ−チオｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、２−チオｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、２−アミノ−６−Ｃｌ−プリン−２’−デオキシリボシド−三リン酸（６−Ｃｌ  ｄＧＴＰまたは６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰと呼ばれる）、４−チオｄＴＴＰ、２−アザｄＴＴＰ、５−フルオロｄＴＴＰ、またはガンマ−ＡＮＳ  ｄＴＴＰである。
【０１０１】
複数の実施形態において、τｏｐｅｎにおいて観察される差は、大抵、非天然ｄＮＴＰを認識し、結合するためのメカニズムを示す。未変性ｄＧＴＰと比較してα−チオ−ｄＧＴＰ及び６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰに関する分布の長い末端が、＜τｏｐｅｎ＞の増加の原因である可能性がある（図３Ｂ）。この末端は、時間定数が２００ｍｓで第２の指数関数にフィットさせることができ、未変性ｄＧＴＰの＜τｏｐｅｎ＞よりも約５倍長い。類似した長い末端が本明細書中で開示されるすべてのｄＮＴＰ類似体で観察される可能性もあり、そのことは、非天然基質を組み込むときに酵素が直面する問題を示す。ここで報告されるτｏｐｅｎの間に認識以外の段階が起こる可能性があり、共有結合形成が可能性のある一例であり、これは、α−チオ−ｄＮＴＰのゆっくりした反応性でも、起こるのが速過ぎて律速として検出できない。２−チオ類似体で観察される組み込みのより速い速度は、より安定した塩基対形成に起因し、効果的に＜τｏｐｅｎ＞値を短縮することができる。鋳型Ｇ塩基との水素結合界面にあるより大きなサイズの２−チオ−ｄＣＴＰの硫黄原子は、効率的に塩基対になる２−チオ−ｄＣＴＰの能力には影響を及ぼさないようである。複数の実施形態において、核酸ポリメラーゼ立体構造を検出する方法は、ｄＴＴＰ組み込みと比較して２−チオ−ｄＴＴＰ及び４−チオ−ｄＴＴＰとの重合効率の増加を検出している。
【０１０２】
ｄＧＴＰと比較して、はるかに弱い水素結合のために起こる不完全な塩基対合を有する６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰ類似体は、ＫＦ触媒ＤＮＡ重合の間の塩基対合認識の問題を実証する。ポリ（ｄＣ）４２鋳型の向かい側へのｄＧＴＰ組み込みに対してよりも長い６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰの＜τｏｐｅｎ＞値は、部分的に認識に当てられる時間を延長することにより非天然ｄＮＴＰを受入れようとするＤＮＡポリメラーゼの意向を示す。ポリ（ｄＣ）の向かい側での６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰの重合の間に観察される＜τｏｐｅｎ＞値、よって組み込みの速度は、相補的なホモポリマー型の鋳型の向かい側への未変性ｄＧＴＰ及びｄＡＴＰ組み込みに対して測定された値の間にあった。したがって、その改変された互変異性化のために起こる、ｄＧＴＰと比較して少なくとも１つの塩基対合水素結合の喪失にもかかわらず、６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰは依然として未変性ｄＡＴＰよりも急速に組み込まれることが可能である。複数の実施形態において、核酸ポリメラーゼ立体構造を検出する方法は、６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰがｄＧＴＰ類似体と見なされる場合、副溝にある塩基対合の水素結合は依然として変わらないままであり、ポリ（ｄＣ）鋳型の向かい側のｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰに対して観察される比較的速い速度に影響を与えるであろうことを検出している。
【０１０３】
複数の実施形態において、例えば、図５Ａを参照、ＫＦは、４種すべての天然ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が存在する不均質な基質を処理し、各塩基対の組み込みは負の電流スパイクΔＩ＜Ｏを生成する。個々のスパイクを図５Ａに示されるとおりに数え上げることができるが、一般にそれらは１種類の塩基を別の種類の塩基と区別しない。
【０１０４】
複数の実施形態において、例えば、図５Ｂを参照、２−チオ−ｄＴＴＰ類似体が使用される。チオール化デオキシチミジンを用いた場合、正のスパイクは、Ｔヌクレオチドが組み込まれた場所を示す（番号２、６、７）。この観察結果は、ＲＮＡポリメラーゼでＫＦを置き換えることによってＲＮＡ配列決定まで拡張することができる。図５Ｂに示される処理は、特定のＤＮＡ基質中のすべてのＴヌクレオチド組み込みを特定する。この処理は、４種の異なるチオール化ヌクレオチドのそれぞれを含む基質を測定することによって４種すべての塩基に拡張することができる。
【０１０５】
複数の実施形態において、例えば、図５Ｃを参照、特定の類似体と混合された天然ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が存在する不均質な基質をＫＦが処理する場合、結果として生じるパターンは、選択した塩基を特定するために使用することができる正及び負の電流スパイクを含む。複数の実施形態において、Ｇ組み込みのための類似体としての６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰと混合された３種の未変性ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）が使用される。この実施形態における電流スパイクには、１５の塩基組み込み現象を数え上げるために番号が付けられている。大半の現象（番号１、４、７、９、１０、１３、１４、１５）は１つの負の電流スパイクから成ることもあり、これは、未変性ヌクレオチドの組み込みを特定する。複数の実施形態において、これらの現象のうちの５つ（例えば、図５Ｃに矢印で強調した番号２、３、６、８、１１）は正の電流スパイクであり、これは、６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰヌクレオチド組み込みを特定する。複数の実施形態において、未変性ｄＧＴＰヌクレオチドの類似体として６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰが使用される場合、これらの現象（例えば、図５Ｃに矢印で強調した番号２、３、６、８、１１）は、ＤＮＡ配列中のＧヌクレオチドを特定する。
【０１０６】
複数の実施形態において、図５Ｃに示されるこれらの現象のうちの２つ（番号５、１２）は、１組の密集した電流スパイクを含む。これらの組は、急速な連続した１つの未変性ヌクレオチドと１つの６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰヌクレオチドの組み込みを示す可能性がある。あるいは、１組のスパイクは、ｄＡＴＰの擬似類似体としてとして働く６−Ｃｌ−ｄＡＰＴＰに由来する固有の信号であろう。
【０１０７】
複数の実施形態において、ポリメラーゼの立体構造変化を検出する方法は、オリゴヌクレオチドの配列を決定するために使用される。ポリメラーゼはその基質に沿って移動するため、スパイクが、どのヌクレオチドまたは類似体が組み込まれているかを示すので、得られた情報（例えば、図５Ａ〜５Ｃ）はオリゴヌクレオチドの配列を知らせる。
【０１０８】
認識及び結合に加えて、α−チオ−ｄＮＴＰ組み込みの延長された＜τｏｐｅｎ＞値は、新たに合成されたＤＮＡの安定性が低下したことによるものであろう。ホモポリマー型の鋳型のＫＦ触媒処理は、変形したｄｓＤＮＡをもたらす可能性がある。さらに、α−チオ−ｄＮＴＰは、特に好ましくないＤＮＡ骨格の相互作用により安定性が劣る１対の複合体を形成する傾向があり、これがＫＦの触媒率を段々低下させる。それぞれの未変性ｄＮＴＰを用いた実験と比較して、この段階へのさらに際立った影響がα−チオ−ｄＡＴＰ／α−チオ−ｄＴＴＰ対α−チオ−ｄＧＴＰ／α−チオ−ｄＣＴＰの組み込みの間に観察された。複数の実施形態において、核酸ポリメラーゼ立体構造を検出する方法は、配列依存性のＤＮＡ不安定性を指摘し、これは、ホモポリマー型の鋳型が使用される場合の注意を強調する。あるいは、この差は、α−チオ置換が未変性Ａ●Ｔ／Ｔ●Ａ塩基対の＜τｏｐｅｎ＞を長くするメカニズムをさらに妨げることを示唆するであろう。α−チオ−ｄＮＴＰ組み込みと関連するτｏｐｅｎの変化の一部は、この類似体の市販の合成物におよそ１：１の比率でＳｐ立体異性体とともに存在する弱い阻害性のＲｐ立体異性体（Ｋｉ≒３０μＭ）によるものであろう。この阻害は、未変性ｄＮＴＰのＫｍよりおよそ１桁弱く、１０それにより、＜τｏｐｅｎ＞値にわずかに影響を及ぼすことが予想できる。
【０１０９】
τｃｌｏｓｅｄの間、ＫＦは、入ってくるヌクレオチドと新生のｄｓＤＮＡの間に１つのホスホジエステル結合が形成されるのに対応した異なる立体構造変化を受ける。基質制限実験において、ΔＩ（ｔ）振幅の数が突出している鋳型塩基の数と一致した。これにより、τｃｌｏｓｅｄの間の立体構造変化は、それぞれのうまく前進するヌクレオチド組み込みに対して生じるものにちがいない。これまでの、未変性ｄＮＴＰに対する＜τｃｌｏｓｅｄ＞の短い及び等しい継続時間は、τｃｌｏｓｅｄが共有結合形成段階自体に起因するモデルを裏づけた。３３複数の実施形態において、核酸ポリメラーゼ立体構造を検出する方法は、ｄＮＴＰ類似体に関する３つの観察結果を使用する。第１に、ΔＩ（ｔ）振幅の方向は、一部のｄＮＴＰ類似体に関して逆である。第２に、２−チオ−ｄＮＴＰ類似体の組み込みは、正及び負の両方の混ざったΔＩ（ｔ）振幅を生成する。第３に、表１に示されるとおり、求電子性のα−リン酸における置換またはヌクレオベースに置換を適応させるために必要とされる適当な別の立体構造にもかかわらず、＜τｃｌｏｓｅｄ＞の不変性は試験されたすべての類似体に及んだ。
【０１１０】
この電子技術において、基礎をなすＳＷＣＮＴ−ＦＥＴは、１ｎｍの結合部位内のタンパク質の荷電表面残基による静電ゲーティングに対して極めて高感度である。同じ酵素の異なるバリアントは、ＳＷＣＮＴの近傍の残基の電荷及びその動きの方向に応じて正または負のいずれかのΔＩ（ｔ）振幅を示すことができる。複数の実施形態において、核酸ポリメラーゼ立体構造を検出する方法の間に、ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴを静電的にゲート制御するＫＦ及びその荷電残基は、不変のままである可能性もある。変動するΔＩ（ｔ）振幅は、ＫＦ結合部位に隣接する残基が、触媒が十分なサイクルの間に特定のｄＮＴＰ類似体に反応して異なる動きをとっていることを示す可能性もある。そのような動きは、アロステリック効果によりＫＦ活性部位から伝達される可能性もあるが、それは共有結合形成の動きではない可能性もある。複数の実施形態において、共有結合段階は、同じメカニズムによって進行していない可能性もあり、同じ＜τｃｌｏｓｅｄ＞継続時間であるが、２つの相反する動きを伴う。むしろ、τｃｌｏｓｅｄに関与する関連した残基の動きは、最初の分子認識及びＫＦ触媒反応の化学的段階の両方と無関係である可能性もある。
【０１１１】
複数の実施形態において、核酸ポリメラーゼ立体構造を検出する方法では、ＫＦは、「フィンガー」サブドメインにあるタンパク質のＬ７９０Ｃ側鎖によりＳＷＣＮＴ−ＦＥＴに結合し、τｃｌｏｓｅｄの間の関連した荷電残基の静電ゲーティングの動きを触媒に関係した動きと関連づける。それぞれのτｃｌｏｓｅｄ現象は、活性部位Ｏ−ヘリックス自体またはうまくいっているヌクレオチド組み込みの観察段階の間の２つの可能な方向への特定のＯ−ヘリックス残基のねじれによりもたらされる可能性もある。この提示したねじれは、ヌクレオチド組み込みの既知の段階の間に起こる活性部位残基の動きと、荷電残基のＳＷＣＮＴ−ＦＥＴとの理論上の近接に対するそれらの影響とを考慮することによって推測される。例えば、ＫＦを用いたｓｍＦＲＥＴ実験は、開いた状態と閉じた状態の間の活性部位Ｏ−ヘリックスの中間の立体構造を明らかにし、場合によっては、類似の「少し開いた」立体構造がＫＦ同族体Ｂｓｔ  Ｐｏｌ  Ｉの結晶構造で観察される。Ｂｓｔ  Ｐｏｌ  ＩのＯ−ヘリックスのＣ末端は、ＫＦ  Ｙ７６６同等物の大きな移動にＫＦ  Ｆ７６２同等物の微細な回転が伴うように、閉鎖への経路上でよじれる。ＫＦ  Ｆ７６２等価物の回転は、酵素の閉鎖まで継続する。
【０１１２】
ＫＦ及びＢｓｔ  Ｐｏｌ  Ｉの結晶構造を比較することによって、ＫＦ活性部位のＹ７６６及びＦ７６２による回転に応じて動くであろう、ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴに隣接する荷電残基が特定される。複数の実施形態において、核酸ポリメラーゼ立体構造を検出する方法では、ΔＩ（ｔ）振幅の原因は、酵素の閉鎖及び塩基組み込み後に、ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴに近い荷電残基に伝わり続けるＹ７６６及び／またはＦ７６２の付加的な動きである。新生の塩基対がＫＦの挿入後位置に移動するときの付加的なＫＦ立体構造変化が、うまくいったヌクレオチド組み込み後にｓｍＦＲＥＴによって確認され、ことによると、τｃｌｏｓｅｄによって判定される動きである可能性がある。芳香族活性部位残基によって与えられる著しい相互作用は、新たに形成された塩基対とのπ−πスタッキングを含むであろう。そのような動きは、塩基対の電子配置を評価し、ｄＮＴＰ類似体の置換によって変えられる親水性相互作用を必要としない結合形成段階の忠実性を調べるであろう。
【０１１３】
開示されているものを含むＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定用途を含むそれらの特性を調整するための突然変異誘発を極めて受入れやすい。複数の実施形態において、本開示の方法は、カーボンナノチューブとの酵素の生体共役反応のためにＤＮＡポリメラーゼに導入される突然変異を含む。複数の実施形態において、そのような突然変異は、非天然塩基のさらに効率的な組み込みのため、及び酵素の処理能力を変えるためにＤＮＡポリメラーゼの特性を変える。複数の実施形態において、そのような突然変異誘発は、電気的読取り及び酵素の特性を向上させるために使用される。例えば、複数の実施形態において、突然変異は、酵素活性部位に生じさせる突然変異と相補的な形状または官能性を有する特定のｄＮＴＰ類似体に適応するように酵素活性部位に導入される。複数の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、突然変異をしてＤＮＡ重合中に組み込まれるそれぞれ塩基から得られる電気的応答を向上させ、例えば、酵素の荷電残基をカーボンナノチューブに近づける置換は、酵素の動きの間、合理化可能な応答をもたらした。
【０１１４】
ＫＦナノ回路は、塩基対のＧ●Ｃ／Ｃ●Ｇセットに対してよりもＡ●Ｔ／Ｔ●Ａセットに対してより大きなΔＩ（ｔ）振幅を示す。構造的結果は、Ａ及びＴ鋳型塩基が、ＤＮＡポリメラーゼ活性部位に最も深く沈められ、そのため、Ｏ−ヘリックスの旋回が最大化されるであろうことを示した。ＫＦ  Ｅ７１０及びＹ７６６ならびにその他の相応する活性部位グルタミン酸及びチロシン残基が、Ｇ●Ｃ／Ｃ●Ｇ塩基対を上回るＡ●Ｔ／Ｔ●Ａ塩基対の安定化に対するメカニズムに結びつけられた。複数の実施形態において、ヌクレオチド組み込みに先立つＫＦ  Ｅ７１０とＫＦ  Ｙ７６６の間の水素結合相互作用は、活性部位のサイズ及び形状に影響を与えるであろうし、ｄＮＴＰ類似体認識のτｃｌｏｓｅｄ段階に重要な役割を果たしている可能性もある。
【０１１５】
複数の実施形態において、２−チオ−ｄＴＴＰ及び２−チオ−ｄＣＴＰの組み込み中の類似した結果は、塩基対の電子構造に対するＫＦの選択的認識が観察されることを説明する。硫黄置換は２−チオ−ｄＣＴＰ類似体のワトソン・クリック水素結合アクセプターにのみ影響を及ぼすが、両２−チオ−ｄＮＴＰ類似体は、正及び負の混ざったΔＩ（ｔ）振幅をもたらすため、ともに組み込みの間に同様のＫＦの動きを引き起こす。２−チオ−ｄＮＴＰ類似体に関する硫黄置換は、６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰに導入されたさらに大幅な電子的変化と比較して軽微なものであるが、酵素は非排他的であるが同様の様式で反応する。観察された負及び正の両方が混ざったΔＩ（ｔ）振幅は、ＫＦが、２−チオ−置換ｄＮＴＰの組み込みの間にそれぞれ自然状態の動きと別の動きの両方を利用できることを示唆する。識別できるメモリー効果は酵素を一方の動きまたは他方の動きに何秒間か固定し、結果として２−チオ−ｄＮＴＰの特別な場合のエネルギー的に双安定な付加的な立体構造変化に影響を与える。
【０１１６】
複数の実施形態において、核酸ポリメラーゼ立体構造を検出する方法は、正のΔＩ（ｔ）振幅のあり得る原因として新生のＤＮＡの不活性エキソヌクレアーゼ（エキソ）ドメインへの往復を含む。不完全な塩基対合ための不安定なプライマー末端の融解時に、ＤＮＡは不活性エキソドメインを往復し、ＫＦは異なる立体構造変化を受ける。しかしながら、そのような遷移は、結合部位から離れて起こり、ここで観察される正のΔＩ（ｔ）振幅は＜τｃｌｏｓｅｄ＞の継続時間を変化させない。したがって、エキソドメインへの往復は、正のΔＩ（ｔ）振幅の観察と一致しないようである。不適正なｄＮＴＰ認識の間に生じる既知の立体構造段階と同様に、エキソドメインへの往復はτｏｐｅｎの間に起こっているにちがいない。本開示のΔＩ（ｔ）振幅は関係した触媒サイクルの間に生じる可能性もあり、新たに形成されたＤＮＡ塩基対の電子的完全性を試験する旋回するＯ−ヘリックスと一致した適合性のあるＫＦの動きを表すことができる。
【０１１７】
複数の実施形態において、核酸ポリメラーゼ立体構造を検出する方法、ｄＮＴＰ類似体は、求電子性のリン酸の立体化学、入ってくる塩基の水素結合能力及び忠実性チェックのメカニズムを含むＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド組み込みの制限に挑む。大半のｄＮＴＰ類似体は、平均＜τｏｐｅｎ＞及びその反応速度分布の広さを増加させるため、速度を決定するｄＮＴＰ認識工程は基質構造の軽微な変化に対してでも極めて高感度であるようだ。しかしながら、結合形成の反応性部位における大幅な置換は、＜τｃｌｏｓｅｄ＞の継続時間に影響を与えない。他方で、ΔＩ（ｔ）振幅の方向は、塩基が修飾されたｄＮＴＰ類似体を用いると正または負及び正の両方が混ざった信号に変わる。これらのｄＮＴＰ類似体は、未変性基質と同一の結合形成の中心に官能性を有し、ΔＩ（ｔ）の方向の著しい変化は次の基質を処理するための開口の前のＫＦによる忠実性チェックに起因する可能性もある。そのような現象は未変性ｄＮＴＰ組み込み現象と容易に区別することができ、その動的なエラーチェックの方向を逆転させることによって非天然ｄＮＴＰに適応する酵素の直接観察をもたらす。
【実施例】
【０１１８】
実施例１．単一分子ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ）ナノ回路によるデオキシヌクレオシド三リン酸類似体の組み込み。
【０１１９】
緒言．既知の全生物の生存を確実にするために、ＤＮＡポリメラーゼは、入ってくるデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）基質を適切に認識し、ＤＮＡの新しい鎖へのそれらの組み込みをうまく触媒しなければならない。すべてのＤＮＡポリメラーゼに必要とされる忠実性は、部分的に一本鎖ＤＮＡ鋳型とハイブリダイズする入ってくるｄＮＴＰのワトソン・クリック塩基対相補性に依存する。［１、２］しかしながら、未変性の相補的な塩基と水素結合することができない非天然ｄＮＴＰもＤＮＡポリメラーゼによって首尾よく組み込まれた。そのような類似体は、標準的なＡ●Ｔ及びＧ●Ｃ塩基対と類似した形状を有する安定した塩基対を形成することができる。［３〜５］ｄＮＴＰ類似体を用いた研究は、ヌクレオチド組み込み中の立体化学、形状、電子的効果及び疎水性相互作用に対する要件を示した。［６〜９］
【０１２０】
ｄＮＴＰ類似体組み込み実験の結果は、さらなる鎖伸長及び効率的な触媒反応に対する要件を含むＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの選択基準を明らかにする。例えば、ホスホロチオアート類似体を用いた重合の触媒率は、ｄＮＴＰの求電子性α−リン酸に対するプライミング３’−ＯＨによる求核攻撃に関する立体化学的選択性を確認した。［６］水素結合位置におけるチオ及びハロ置換を含むヌクレオベースの小さな修飾は組み込み速度を変え、ＤＮＡポリメラーゼ活性部位に密に立体的にはまるための要件を明らかにする。［８、１０］］非天然塩基を組み込むために必要とされるワトソン・クリック様の形状は、ポリメラーゼ活性部位とできつつある塩基対との間のいくつかの相互作用によってもたらされる。［５］
【０１２１】
１つの塩基対を超えた非天然ｄＮＴＰ重合の詳細な評価は、この変性ポリメラーゼ活性についての正確な反応速度情報を提供するであろう。さらに、塩基認識過程における関連した小さな立体構造変化を確かな測定値へ変換することにより、ＤＮＡ重合に立体効果及び電子が果たす役割の新しい側面が明らかになるであろう。ここで報告されるとおり、そのような情報は、単一分子技術によって解明することができる。
【０１２２】
酵素のバルクまたはアンサンブル集団の従来の研究では、反応メカニズムの中間段階及び遷移状態を観察することができない。しかしながら、個々の分子を用いた実験は、そうでなければ、アンサンブル集団として平均されることにるであろうそのような状態の観察を可能にする。［１１〜１３］単一分子Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー転移（ｓｍＦＲＥＴ）を使用したＤＮＡ重合実験は、立体構造の柔軟性及び以降ＫＦとするＤＮＡポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔの忠実性メカニズムに対する洞察を示した。［１４〜１６］酵素の動態についての新しい情報を捕らえるその力にもかかわらず、ｓｍＦＲＥＴは、蛍光標識化タンパク質及び／または基質を必要とする。フルオロフォア間のフォトブリーチング及び光子束は、それぞれ、ｓｍＦＲＥＴ実験の継続時間及び時間分解能の両方を制限する。
【０１２３】
最近、本発明者らは、単一分子酵素学に対する新しいアプローチを示し、それを３つの酵素に適用した。この技術では、個々のタンパク質を単層カーボンナノチューブ電界効果トランジスタと生体共役反応させる（ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴ、図１Ａ）。このアプローチは、段階の数、反応速度パラメータ及び１００年以上研究されてきた酵素であるＴ４リゾチームの処理能力に対する新しい洞察を示した。［１７、１８］ポリヌクレオチドキナーゼＡ（ＰＫＡ）の非常に大きな動的速度は、高度に調節可能な分子スイッチとしての酵素の役割を明らかにした。［１９］ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴと共役したＫＦを調べる際、Ａ●Ｔ／Ｔ●ＡとＧ●Ｃ／Ｃ●Ｇの塩基対合の間の顕著な差は、酵素の閉じた立体構造が入ってくるｄＮＴＰの素性に依存することを示した。［２０］ワトソン・クリック塩基対が類似のサイズを有するため、この差に対する感度は意外であり、それは、ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴ技術がｄＮＴＰ類似体と関連する固有の反応速度及び立体構造にも反応するかもしれないことを示した。
【０１２４】
ここで、ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴ技術を、ＫＦによる組み込み中の未変性ｄＮＴＰとｄＮＴＰ類似体の間の差を識別するために使用した。チオ及びハロ置換ｄＮＴＰ類似体を使用したＤＮＡ重合をモニターした後、統計分析して、すべてではなく一部のｄＮＴＰ類似体に関する組み込み反応速度の差を明らかにした。さらに、それぞれ類似体が酵素の開いた立体構造及び閉じた立体構造に費やす時間が、律速段階に必要とされる時間の変化を明らかにする。その結果は、触媒反応の間の分子認識における問題に取り組む酵素のポートレートをもたらす。
【０１２５】
実験．ＳＷＣＮＴ  ＦＥＴを作製し［１７］、エキソヌクレアーゼ欠損ＫＦの１つのシステインバリアントにより官能化した。９５％超までのＫＦの精製がその均一性を確実にした。蛍光に基づくアッセイにより、結合前にバルク酵素の活性を確認した。［２０、２１］各デバイスからのデータ収集後に原子間力顕微鏡により個々のＫＦ分子の結合を確認した（図１Ｂ）。
【０１２６】
それぞれの測定に対して、ホモポリマー型の鋳型ポリ（ｄＡ）４２、ポリ（ｄＴ）４２、ポリ（ｄＧ）４２及びポリ（ｄＣ）４２を補完するためのｄＮＴＰを選択した。それぞれの鋳型をＭ１３プライミング部位と融合させ、１：１の理論混合比でＭ１３フォワードプライマーと混合し、ハイブリダイゼーションのために、その混合物を９５℃まで５から１０分間加熱し、続いて、室温まで冷却した。ＳＷＣＮＴ  ＦＥＴを、１００ｎＭの濃度で鋳型−プライマーハイブリッドを含む標準的なＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ活性バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ８．０）に浸漬した。未変性または類似体ｄＮＴＰを過剰にバッファーに添加して、ＫＦのＶｍａｘ条件を確保した。ｄＮＴＰ類似体のゆっくりとした組み込を補うために、実験には、未変性ｄＮＴＰ（１０μＭ、Ｆｉｓｈｅｒ）より高い濃度の類似体（図１Ｃ、１００μＭ、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用した。
【０１２７】
測定は、結合したＫＦ分子がその周辺の環境と相互作用する間のＳＷＣＮＴ  ＦＥＴのソース−ドレイン電流Ｉ（ｔ）をモニターすることから成るものとした。ＦＥＴに１００ｍＶでバイアスをかけ、ゲート電極として働く電解質は０Ｖに保持した。任意のヌクレオチド及びその相補的な鋳型−プライマーとのデバイスのインキュベーションは、電流プリアンプ（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ  ４２８）により測定され、１００ｋＨｚでデジタル化され、後の分析のために記憶される変動ΔＩ（ｔ）を伝達した。測定間で、別のヌクレオチドを導入する前にＫＦナノ回路をアッセイバッファーで２回すすぎ、バッファー中で５分間インキュベートした後、再び２回バッファーですすいだ。直接比較できるデータセットを収集し、典型的なＫＦの活動を確認し、以前に報告されたΔＩ（ｔ）の型を再現するために各ＫＦ分子を複数の類似体、対応する天然ｄＮＴＰ及びヌクレオチドを含まないバッファーとともにモニターした。［２０］
【０１２８】
結果．未変性ｄＮＴＰ及びその相補的な鋳型−プライマーを用いたナノ回路のインキュベーションは、電流に負の変化ΔＩ（ｔ）を引き起こした（図２Ａ）。前に報告したとおり、高速な電流変動は、ＫＦ、ｄＮＴＰ及び鋳型−プライマーの存在下においてのみ生じた。それぞれのΔＩ（ｔ）振幅は、ＫＦ酵素の閉鎖と相関関係にある。このように、未変性ｄＮＴＰを用いたそのような電流振幅の測定から導き出した反応速度パラメータは、酵素の動きの以前の分析と一致した（例えば、図２Ａ）。［２０］これらの測定は、ｄＮＴＰ類似体と比較するための基準値をもたらした（表１）。
【０１２９】
【表１】
2018500905.tif 000008
【０１３０】
ｄＮＴＰ類似体は、α−リン酸における置換またはヌクレオベースに対する変更のいずれかを調べた。第１のカテゴリーにおいて、硫黄によるホスホリル酸素原子の置換は、新しい立体中心をｄＮＴＰに導入して、ｄＮＴＰαＳとしても知られているα−チオ−ｄＮＴＰを作り出す。立体化学に対する制御なく商業的に合成された、このα−リンを中心としたジアステレオマー比はおそらく１：１であった。ｄＮＴＰ類似体の第２のカテゴリーにおいて、ヌクレオベース上のハロゲンまたは硫黄置換は、改変された互変異性化、それゆえに異なる水素結合を有するより大きな塩基を導入することができた。例えば、類似体６−クロロ−ｄＧＴＰ（６−Ｃｌ−２−ＡＰＴＰとしても知られている）は、ｄＧＴＰとは異なる互変異性化を有し、これがＮ−１を水素結合ドナーからアクセプター変化させる。また、塩化物による酸素の置換は水素結合の強さを低下させる。修飾されたヌクレオベースのその他の例、２−チオ−ｄＴＴＰ及び２−チオ−ｄＣＴＰは、酸素を硫黄で置き換えて、これらの塩基のサイズを増加させる。これらの類似体の組み込みから得られる変化した反応速度は、特有の電子信号をもたらすことが予想され、おそらく入ってくるｄＮＴＰの酵素認識を遅くする。
【０１３１】
ホスホロチオアート類似体（α−チオ−ｄＮＴＰ）、６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ、２−チオ−ｄＴＴＰ及び２−チオ−ｄＣＴＰを相補的な鋳型−プライマーとともにインキュベートした。未変性ｄＮＴＰで観察されたとおり、α−チオ−ｄＮＴＰ組み込みの間に負の電流変動が生じた（図２Ｂ）。反対に、６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ組み込みは、正の電流変動をもたらした（図２Ｃ）。２−チオ置換を含む類似体は、負及び正の両方が混ざった電流変動をもたらした。α−チオ−ｄＧＴＰ及び６−Ｃｌ−ｄＧＴＰの両類似体は、ｄＧＴＰよりも２から３倍低い頻度でΔＩ（ｔ）振幅を生成した。
【０１３２】
τｏｐｅｎ及びτｃｌｏｓｅｄの分布は、ｄＧＴＰ及びその２種の類似体の５０を超える重合データから得た（図３Ａ〜３Ｂ）。このデータは、１つの＜τ＞時間定数を有する単純なポアソン分布にフィットした。未変性及び類似体ｄＧＴＰのτｃｌｏｓｅｄ現象に関する分布のフィットのみ、とりわけ末端でわずかに互いからはずれる。大半の現象は、高い確率で重なった（約５０％）。ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰまたは６−Ｃｌ−ｄＧＴＰの存在下における閉じた複合体の平均継続時間はかなり一致していた（０．２から０．４ｍｓ）。未変性ｄＧＴＰに関するデータに対する単一指数関数フィットは、τｏｐｅｎ現象の９０％超を含んだ。しかしながら、α−チオ−ｄＧＴＰまたは６−ＣｌｄＧＴＰデータに対する類似のフィットは、τｏｐｅｎ現象の≒７５％しか含むことができなかった。ＫＦの開いた立体構造において、類似体の現象のわずか２０から３０％が、未変性ｄＧＴＰに必要とされるまさにその時間定数と重なった。ｄＧＴＰ類似体を用いた組み込みの反応速度は、未変性のものから大幅にはずれ、その平均時間定数は容易に区別することができた。
【０１３３】
反応速度パラメータτｃｌｏｓｅｄ、τｏｐｅｎ及び組み込みの速度（ｋ）のこの分析は、その他の未変性基質及び類似体基質にまで及んだ（表１）。α−チオ−ｄＧＴＰ及び６−Ｃｌ−ｄＧＴＰに関して記載されているとおり、τｃｌｏｓｅｄによって定量されたＫＦ閉鎖の間のホスホジエステル結合の形成は、未変性及び類似体を含む調べたすべてのｄＮＴＰに関して０．２から０．４ｍｓの間持続する。すべてのα−チオｄＮＴＰに関するＫＦの開いた立体構造の平均継続時間τｏｐｅｎは、その未変性ｄＮＴＰに関してよりも２から３倍長かった。例えば、ＫＦは、α−チオ−ｄＧＴＰを処理するとき（６３±３ｍｓ）、未変性ｄＧＴＰ（２４±１ｍｓ）を用いるよりもおよそ２．５倍長く開いた立体構造τｏｐｅｎにある。未変性ｄＮＴＰに対して報告されたとおり、［２０］α−チオ−ｄＣＴＰ及びα−チオ−ｄＧＴＰは、新生の鎖にα−チオ−ｄＡＴＰ及びα−チオ−ｄＴＴＰよりも速く組み込まれた。Ａ●Ｔ／Ｔ●Ａの塩基対形成を特徴づけるτｏｐｅｎは、Ｇ●Ｃ／Ｃ●Ｇ塩基対のτｏｐｅｎよりも２から３倍長い。
【０１３４】
τｏｐｅｎ及びτｃｌｏｓｅｄ値は、ｄＮＴＰ組み込みの全サイクルに必要とされる時間を明らかにする。ＫＦ平均処理速度は、ｋ＝１／（＜τｏｐｅｎ＞＋＜τｃｌｏｓｅｄ＞）として算出される。はるかに長い時間が開いた立体構造に費やされる（＞９８％）こと考慮すれば、τｏｐｅｎの継続時間が一般に酵素触媒反応の速度を決める。α−チオ−ｄＮＴＰ及び６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ類似体のＫＦ平均処理速度は、τｏｐｅｎが２から３倍長いため２から３倍低下した。例えば、６−Ｃｌ−ｄＧＴＰを処理するときにＫＦの開いた立体構造で費やされる時間（＜τｏｐｅｎ＞＝５０±１ｍｓ）は、ｄＧＴＰの処理（＜τｏｐｅｎ＞＝２４±１ｍｓ）より約２倍長く、それぞれ比較して２０ｓ−１と４１ｓ−１の速度になる。２−チオ−ｄＴＴＰ（＜ｋ＞＝１６ｓ−１）及び２−チオ−ｄＣＴＰ（＜ｋ＞＝３６ｓ−１）の速度は、およそそれらの未変性の同等物と同じであった。
【０１３５】
考察．ホスホジエステル結合形成は、α−リン酸が修飾されても類似体置換と無関係なようである。α−チオ−ｄＮＴＰの硫黄は、重要な求電子性官能基の非橋架酸素原子に取って代わる。リン酸の求電子性が弱まり、結果としてホスホジエステルに対してチオホスホジエステルの反応性が低下するにもかかわらず、結合交換段階は依然として高速で、律速ではない。［２２、２３］
【０１３６】
α−チオ−ｄＧＴＰ及び６−Ｃｌ−ｄＧＴＰのτｏｐｅｎ現象のおよそ２５パーセントがデータに対する単一指数関数フィットからはずれ、これは、非天然ｄＮＴＰをなんとか取り囲もうとするために起こる大きなはずれ現象と一致する。τｏｐｅｎに関するより遅い時間定数は、修飾塩基に固有の入ってくるｄＮＴＰ認識の律速段階に必要とされる時間がより長いことを裏づける。しかしながら、未変性と類似体ｄＧＴＰの分布間で実質的に重なる部分が、それぞれの現象にＫＦ立体構造を即時に割り当てるのを妨げる。
【０１３７】
以前の研究は、α−チオｄＮＴＰのＳｐジアステレオマーをＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉの組み込みに対して単に好ましい基質であると確認した。６  α−チオ−ｄＮＴＰの処理に関して観察された速度は、ＲｐジアステレオマーによるＤＮＡポリメラーゼの擬似基質阻害から生じたのであろう。α−チオ−ｄＴＴＰのＲＰジアステレオマーは、ＫＦ活性部位と弱く結合し、その触媒反応をＫｉ≒３０μＭで阻害する。この阻害定数は、未変性ｄＮＴＰに関するＫｍよりもおよそ１桁弱い。６立体化学的に制御されていないα−チオ−置換は利用可能な基質の半分を事実上除去するが、大過剰のα−チオ−ｄＧＴＰにより、そのような影響が酵素の開いた立体構造に費やされる時間を著しく長くする原因ではなさそうであることが確実になった。さらに、α−チオ−ｄＮＴＰのジアステレオマー混合物はまた、合成された鎖のＤＮＡ骨格の安定性にも影響を及ぼすであろう。［２４、２５］しかしながら、酵素の閉じた立体構造の間に起こるホスホジエステル骨格の形成がτｃｌｏｓｅｄによって定量され、変わらないままである。ゆえに、α−チオ−ｄＮＴＰの反応速度を遅らせる問題の最も可能性が高い原因は、入ってくる塩基認識段階におけるＲＰ立体異性体による阻害である。このように、ＫＦは、正しい立体化学的配置を有するｄＮＴＰを見つけ、酵素との結合及び阻害に競合する不適切な基質を拒絶する。
【０１３８】
以前の研究は、ポリ（ｄＣ）鋳型との塩基対合に６−Ｃｌ−ｄＧＴＰを組み込むためのＤＮＡポリメラーゼによる効率的な触媒反応を示した。［２６］］６−Ｃｌ−ｄＧＴＰは、塩基Ｔの向かい側にＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれ得るが［２７、２８］、この能力は今までＫＦ官能化ナノ回路においては調査されてこなかった。ここに記載される６−Ｃｌ−ｄＧＴＰを用いた実験は、不適切なワトソン・クリック塩基対合を有する非天然ｄＮＴＰを受入れようとするＤＮＡポリメラーゼの意向を示す。これらの変性塩基をうまく組み込むために、ＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチド選択のための従来の水素結合認識基準とは別のものを適用しなければならない。反応速度の結果は、ｄＮＴＰ認識中の水素結合に関連する律速段階の適合と一致している。
【０１３９】
大きなサイズの塩基６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ、２−チオ−ｄＴＴＰ及び２−チオ−ｄＣＴＰの識別に続く立体構造変化が高感度ＳＷＣＮＴ−ＦＥＴにおいて電荷ゲーティングの差を引き起こすのであろうという仮説が立てられた。うれしいことに、ＫＦナノ回路を６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ及びポリ（ｄＣ）４２とともにインキュベートした場合、固有の信号が観察された。正のΔＩ（ｔ）振幅、すなわち「アップスイッチ」は、異なる様式の酵素の閉鎖を表す可能性が高い（図２Ｄ）。これらの信号は、未変性ｄＧＴＰの組み込みの結果とは反対である。２０  Ｔ４リゾチームの電荷変異体を用いた実験において示されるとおり、２９  ６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ組み込みの間、マイナスに帯電したアミノ酸官能基は、ナノチューブにさらに近づくはずであり、またはプラスに帯電した官能基はさらに遠ざかるはずである。２−チオ置換ｄＮＴＰに関して、アップ及びダウンスイッチング現象の複雑に混ざったものが観察された。ＫＦの閉鎖に関連するアップ及びダウンスイッチングのランダムな分布は、酵素が効率的な触媒反応を維持するために２つ以上の立体構造を利用することを示唆する。
【０１４０】
未変性及び類似体ｄＧＴＰの組み込みに関する反応速度の大きな重なりにもかかわらず、２−チオｄＣＴＰ、２−チオｄＴＴＰ及び６−Ｃｌ−ｄＧＴＰとの触媒反応の間、ＫＦは異なる立体構造を利用する。ＫＦは完全ではない相補的な塩基の組み込みを認識するため、これらの固有のアップスイッチング信号は、エキソヌクレアーゼドメインへの分割またはそれからの分割の間にＫＦのＪ−ヘリックスによって制御される立体構造変化によって引き起こされるであろう。［１４、３０〜３２］しかしながら、未変性ｄＮＴＰと比較して６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ、２−チオ−ｄＴＴＰ及び２−チオ−ｄＣＴＰの酵素の閉鎖時間τｃｌｏｓｅｄの差が観察されなかったため、そのような往復は非常に速い速度で生じる必要があるのであろう。入ってくるｄＮＴＰの識別を可能にするこれらの異なる信号の可能性は、ＤＮＡ配列決定における予想される用途のためにさらに研究するに値する。
【０１４１】
結論．要約すると、ｄＮＴＰ類似体は、求電子性リン酸の立体化学、入ってくる塩基の水素結合能力及び酵素の閉鎖の程度を含むＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド組み込みの制限に挑む。調べた大半の類似体はτｏｐｅｎを短縮し、それゆえに酵素の速度を低下させるため、速度を決定するｄＮＴＰ認識段階は基質構造の軽微な変化に対して極めて高感度なようである。反対に、結合形成の反応性部位のたとえ大幅な置換であってもＫＦの閉鎖時間に影響を与えない。ここに記載されている結果は、ＫＦナノ回路を使用したｄＮＴＰ類似体の組み込みの各段階におけるＫＦ立体構造の割り当てを目的とした２つの可能な方法を提示する。第１に、修飾は、ｄＮＴＰ認識及び活性化中の開いたＫＦの立体構造を標的とすることができる。しかしながら、今まで、６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ及びα−チオ−ｄＮＴＰを含む修飾ｄＮＴＰは、酵素の平均速度を遅らせることしかできない。さらなる研究に値する別の方策は、ＫＦの閉じた立体構造に影響を及ぼす。６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ、２−チオｄＣＴＰ及び２−チオ−ｄＴＴＰなどの修飾塩基は、組み込みの間の酵素の立体構造を変えることができ、ＳＷＣＮＴを通過する電流の増加として観察される電子信号に劇的な影響を及ぼす。そのようなアップスイッチングは、未変性ｄＮＴＰの組み込みと容易に区別することができ、非天然ｄＮＴＰに容易に適応する酵素の直接観察をもたらす。結論として、立体構造的に高感度の電子的測定は、十分に研究された酵素であっても、酵素の動き及び動態の予想外の新しい側面を明らかにすることができる。
【０１４２】
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【０１４３】
実施例２．単一分子ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ）ナノ回路によるデオキシヌクレオシド三リン酸類似体の組み込み−２。
【０１４４】
説明．ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＫＦ）の１コピーを単層カーボンナノチューブデバイスに結合させ、異なる化学的補因子の存在下において電気的に測定した。作製のすべての態様は、Ｏｌｓｅｎらによって記載されたプロトコルに従った。
【０１４５】
結果．図４Ａ〜４Ｂは、ＫＦがポリ（ｄＡ）４２を天然ヌクレオチド、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰの存在下において処理する場合、各塩基対の組み込みは負の電流スパイクΔＩ＜０を生成することを示す。ｄＴＴＰが非天然ヌクレオチド、２−チオ−２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸（２−チオ−ｄＴＴＰ）で置き換えられた場合、塩基組み込みは正の電流スパイクΔＩ＞０を生成する。
【０１４６】
図５Ａは、ＫＦが４種すべての天然ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が存在する不均質な基質を処理する場合、各塩基対の組み込みは負の電流スパイクΔＩ＜Ｏを生成することを示す。個々のスパイクを、示されるとおりに数え上げることができるが、一般にそれらは１種類の塩基を別の種類の塩基と区別しない。
【０１４７】
図５Ｂに示されるとおり、ｄＴＴＰを２−チオ−ｄＴＴＰで置き換えた同じデータセットのシミュレーション。チオール化デオキシチミジンを用いると、正のスパイクは、ここで（番号２、６、７）Ｔヌクレオチドが組み込まれた場所を示す。この観察結果は、ＲＮＡポリメラーゼによりＫＦを置き換えることによってＲＮＡ配列決定まで拡張することができる。図５Ｂに示される処理は、特定のＤＮＡ基質中におけるすべてのＴヌクレオチド組み込みを特定する。この処理は、４種の異なるチオール化ヌクレオチドのそれぞれを含む基質を測定することによって４種すべての塩基に拡張することができる。
【０１４８】
図５Ｃは、ＫＦが特定の類似体と混合された天然ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が存在する不均質な基質を処理する場合、結果として生じるパターンは、選択した塩基を特定するために使用することができる正及び負の電流スパイクを含むことを示す。この例は、Ｇ組み込みのための類似体としての６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰと混合された３種の未変性ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）を使用して得られたデータを示す。このデータセットの電流スパイクは、１５の塩基組み込み現象を数え上げるために数が付けられている。大半の現象（番号１、４、７、９、１０、１３、１４、１５）は、１つの負の電流スパイクから成り、これは未変性ヌクレオチドの組み込みを特定する。これらの現象のうちの５つ（番号２、３、６、８、１１）は、６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰヌクレオチド組み込みを特定する正の電流スパイクであるため、矢印で強調されている。ここでは未変性ｄＧＴＰヌクレオチドの類似体として６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰを使用したため、これらの５つの現象は、ＤＮＡ配列中のＧヌクレオチドを特定する。
【０１４９】
図５Ｃに示されるこれらの現象のうちの２つ（番号５、１２）は、１組の密集した電流スパイクを含む。これらの組は、短時間の急速な連続した１つの未変性のヌクレオチドと１つの６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰヌクレオチドの組み込みを示す可能性がある。あるいは、１組のスパイクは、ｄＡＴＰの擬似類似体として働く６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰ由来の固有の信号であろう。
【０１５０】
参考文献（実施例２及び背景）．［１］Ｔ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ，Ｙ．Ｃｈｏｉ，Ｐ．Ｃ．Ｓｉｍｓ，０．Ｔ．Ｇｕｌ，Ｂ．Ｌ．Ｃｏｒｓｏ，Ｃ．Ｄｏｎｇ，．．．Ｇ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  （Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ），Ｉ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５，７８５５（２０１３）；［２］Ｙ．Ｃｈｏｉ，１．．Ｍｏｏｄｙ，Ｐ．Ｃ．Ｓｉｍｓ，Ｓ．Ｒ．Ｈｕｎｔ，Ｂ．Ｌ．Ｃｏｒｓｏ，Ｇ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ，ｎｄ  Ｐ．  Ｇ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ  ｂｙ  ａｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｉｒｃｕｉｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５，３１９２０１２）；［３］，Ｙ．ｈｏｉ，１．５．Ｍｏｏｄｙ，Ｐ．Ｃ．Ｓｉｍｓ，Ｓ．Ｒ．Ｈｕｎｔ，Ｂ．Ｌ．Ｃｏｒｓｏ，Ｄ．Ｅ．Ｓｅｉｔｚ，．．．Ｇ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ，Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−  ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，．１．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４，２０３２２０１２）；  ［４］，Ｙ．Ｃｈｏｉ，Ｔ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ，Ｐ．Ｃ．Ｓｉｍｓ，１．Ｓ．Ｍｏｏｄｙ，Ｂ．Ｌ．Ｃｏｒｓｏ，Ｍ．Ｎ．ａｎｇ，．Ｐ．Ｇ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｕｂｅ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１３，６２５（２０１３）；［５］，Ｐ．Ｃ．Ｓｉｍｓ，Ｉ．Ｓ．Ｍｏｏｄｙ，Ｙ．Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｄｏｎｇ，Ｍ．Ｉｆｔｉｋｈａｒ，Ｂ．Ｌ．Ｃｏｒｓｏ，．．．Ｇ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ，  Ｉ  Ａｎｉ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５，７８６１（２０１３；［６］，Ｌ．  Ｔ．Ｃ．Ｆｒａｎｃａ，Ｅ．Ｃａｒｒｉｌｈｏ，  ａｎｄ  Ｔ．Ｂ．Ｌ．Ｋｉｓｔ，Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３５，  １６９  （２００２）；［７］，５．Ｅ．  Ｊａｃｕｔｉｎ，Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  （Ｔｅｘａｓ  Ａ  ＆  Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，  ＴＸ，  １９９７）．［８］，．  Ｄ．  Ｈａｒｒｉｓ，Ｐ．Ｒ．Ｂｕｚｂｙ，Ｈ．Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｅ．Ｂｅｅｒ，Ｊ．Ｂｏｗｅｒｓ，Ｉ．Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ，．Ｚ．Ｘｉｅ，Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０  １０６（２００８）；  ［９］，  Ｄ．  Ｓｔｏｄｄａｒｔ，  Ａ．  Ｊ．  Ｈｅｒｏｎ，Ｅ．  Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ，Ｇ．Ｍａｇｌｉａ，ａｎｄ  Ｈ．Ｂａｙ��ｅｙ，Ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｎａｎｏｐｏｒｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６，７７０２（２００９）；［１０］，Ｓ．Ｓｏｒｇｅｎｆｒｅｉ，Ｃ．−ｙ．Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｌ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｙ．−Ｊ．Ｙｕ，Ｐ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｎｕｃｋｏｌｌｓ，ａｎｄ  Ｋ．Ｌ．Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅ  ｆｉｅｌｄ−ｅｆｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ，Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．６，１２６（２０１１）；［１１］，Ｔ．Ｃ．Ｇｌｅｎｎ，Ｆｉｅｌｄ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｎｅｘｔ−  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  １１，７５９（２０１１）．
【０１５１】
実施例３：ＫＦの発現及び精製
【０１５２】
商業的に購入した試薬は、抗生物質（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎｉ−ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、細胞株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、デオキシヌクレオシド三リン酸（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、デオキシヌクレオシド三リン酸類似体（Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓまたはＦｅｒｍｅｎｔａｓ）、オリゴヌクレオチド（Ｆｉｓｈｅｒ）、高分解能アガロース（Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ）及び９６−ウェル蛍光プレート（Ｎｕｎｃ）を含む。その他のすべての化学薬品は、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ＥＭＤ、Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に購入した。すべての試薬は、受け取ったままの状態で使用した。
【０１５３】
以降ＫＦと呼ぶＫＦをコードする遺伝子（Ｄ３５５Ａ／Ｅ３５７Ａ／Ｃ９０７Ｓ／Ｌ７９０Ｃ）を含むｐＥＴ２８ｃプラスミド１、２を使用してＣａＣｌ２コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をヒートショックによって形質転換した。固体培地における一晩の増殖後に、１つのコロニーを使用して、振盪しながら液体培地中、３７℃で一晩増殖させるための、４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた２５ｍＬのＬＢ培地に接種した。４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えたＬＢ（１Ｌ）に１０ｍＬの一晩培養物を接種し、振盪しながら３７℃で数時間インキュベートした。細胞が対数ファージ（ｐｈａｇｅ）後期（ＯＤ６００＝０．９）に達したら、１ｍＭのＩＰＴＧの添加によりＫＦ発現を誘発した。振盪を伴う３７℃でのタンパク質発現の３〜４時間後に、遠心分離（６０００ｒｐｍ、２０分、４℃）により細胞を回収し、溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＢＭＥ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。超音波処理により細胞を溶解させ、細胞片を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４５分、４℃）によって回収した。０．４５μｍポアフィルターを通してろ過した後、ライセート上清をＮｉ−ＩＭＡＣ樹脂と４℃で一晩結合させた。ＫＦを、２５０ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液に溶出し、濃縮した後、ＴＥＶプロテアーゼにより４℃で２日間処理した。その混合物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗ  ＦＰＬＣによるＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００μＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ７．９）におけるサイズ排除クロマトグラフィーに先立って、遠心分離した後、０．４５μｍフィルターを通してろ過した。ＫＦ純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した（図６）。
【０１５４】
ＫＦのアンサンブル活性及びｄＮＴＰ類似体組み込み
活性を試験するために使用されたオリゴヌクレオチド
【０１５５】
表２は、ＫＦ活性、ｄＮＴＰ類似体組み込みを試験するため、及びナノ回路を用いた測定のために使用したオリゴヌクレオチドを列記する。受け取り次第、ＨＰＬＣ精製したオリゴヌクレオチドを水中で可溶化して１００μＭにした。太字の領域は、Ｍｌ３プライミング部位を示す。イタリック体の領域は、制限部位を示す。［２ＡｍＰｕｒ］は、２−アミノプリンを示す。
【０１５６】
【表２】
2018500905.tif 000009
【０１５７】
ＫＦ活性に関するアンサンブルアッセイ
野生型ＫＦに対するバリアントＫＦ（Ｌ７９０Ｃ）の活性を確認するために、先に記載したアッセイを次のとおり適合した。１、３２−アミノプリン（表Ｓ１の活性アッセイ鋳型）及びＭ１３プライミング部位（下線を引いた）の両方を含むランダム化されたＤＮＡ鋳型を、混合物を６５℃に加熱し、室温まで１時間ゆっくりと冷却することによって、Ｍ１３Ｆプライマーとアニーリングした。プライマー−鋳型混合物（２５μＭ）及びｄＮＴＰ（２５０μＭ）とともにインキュベーションすると、ＫＦ（Ｌ７９０Ｃ）及び野生型ＫＦ（ともに１μＭ）に対して同等の蛍光の減少が観察された。未処理の蛍光データは、ｄＮＴＰの不在下で測定したバックグラウンドを差し引くことによって補正した。この実験に利用した励起波長及び発光波長はそれぞれ３０５ｎｍ及び３６５ｎｍであった。
【０１５８】
ｄＮＴＰ類似体組み込みに関するアンサンブルアッセイ
ｄＮＴＰ類似体の組み込みを確認するために、ランダム化されたＤＮＡ鋳型（表Ｓ１）をＭ１３Ｆプライマーとのハイブリダイゼーション後にＫＦにより重合した。陽性対照反応は、１０ｍＭのトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．９中にＫＦ（１μＭ）、ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰ類似体（１００μＭ）及びＡ／ＴまたはＧ／Ｃ組み込み鋳型−プライマー（５μＭ）を含むものとした。ｄＮＴＰ類似体組み込みを試験するための反応は、未変性ｄＮＴＰの代わりに１００μＭのその類似体を含むものとし、陰性対照反応は、類似体またはその未変性ｄＮＴＰのいずれかを省いた。５％高分解能アガロースゲルにおける電気泳動前に、サーマルサイクラー中で反応を２５℃に２時間維持した（図８Ｂ）。
【０１５９】
本開示の実施形態：
（ｉ）単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）に非共有結合させた核酸ポリメラーゼを第１のヌクレオチドまたは第１のヌクレオチド類似体及び鋳型核酸配列と接触させることにより、前記第１のヌクレオチドまた前記第１のヌクレオチド類似体及び前記鋳型核酸配列と結合した、立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを形成すること、
（ｉｉ）前記核酸ポリメラーゼと、前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼとの間の前記ＳＷＮＴの第１の電気コンダクタンス変化を測定することによって前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを検出すること
を含む、核酸ポリメラーゼ立体構造の変化を検出する方法。
【０１６０】
前記核酸ポリメラーゼは、第１のヌクレオチド類似体と接触させられる、方法。
【０１６１】
（ｉｉｉ）前記第１の電気コンダクタンス変化によって生成された第１の信号に基づいて前記第１のヌクレオチドまたは第１のヌクレオチド類似体を特定することをさらに含む、方法。
【０１６２】
（ｉｖ）前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼに前記第１のヌクレオチドまたは第１のヌクレオチド類似体を放出させることにより、前記核酸ポリメラーゼを再形成することをさらに含む、方法。
【０１６３】
（ｖ）単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）に非共有結合させた核酸ポリメラーゼを第２のヌクレオチドまたは第２のヌクレオチド類似体及び前記鋳型核酸配列と接触させることにより、前記第２のヌクレオチドまたは前記第２のヌクレオチド類似体及び前記鋳型核酸配列と結合した立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを形成すること、及び
（ｖｉ）前記核酸ポリメラーゼと、前記第２のヌクレオチドまたは前記第２のヌクレオチド類似体及び前記鋳型核酸配列と結合した前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼとの間の前記ＳＷＮＴの電気コンダクタンス変化を測定することによって前記立体構造が変化した核酸ポリメラーゼを検出すること
をさらに含む、方法。
【０１６４】
前記核酸ポリメラーゼは、第２のヌクレオチド類似体と接触させられる、請求項５に記載の方法。
【０１６５】
（ｖｉｉ）前記第２の電気コンダクタンス変化によって生成された第２の信号に基づいて前記第２のヌクレオチドまたは第２のヌクレオチド類似体を特定すること、及び前記鋳型核酸内の配列を特定することをさらに含む、方法。
【０１６６】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、非ワトソン・クリック塩基対合により前記鋳型核酸配列とハイブリダイズする、方法。
【０１６７】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、２−チオｄＣＴＰ、２−チオｄＴＴＰまたは６−Ｃｌ−ｄＧＴＰ、６−アザ−ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰまたはα−チオ−ｄＴＴＰである、方法。
【０１６８】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は三リン酸部分において修飾される、方法。
【０１６９】
前記三リン酸部分は、α−チオ置換を含む、方法。
【０１７０】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＣＴＰまたはα−チオ−ｄＴＴＰである、方法。
【０１７１】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、ヌクレオベースに置換をさらに含む、方法。
【０１７２】
前記第１のヌクレオチド類似体または前記第２のヌクレオチド類似体は、α−チオ−２−チオ−ｄＴＴＰ、α−チオ−２−チオ−ｄＣＴＰ、α−チオ−６−Ｃｌ−２０ＡＰＴＰまたは６−Ｃｌ−２ＡＰＴＰである、方法。
【図１Ａ】
2018500905.tif 000010
【図１Ｂ】
2018500905.tif 000011
【図１Ｃ】
2018500905.tif 000012
【図２Ａ】
2018500905.tif 000013
【図２Ｂ】
2018500905.tif 000014
【図２Ｃ】
2018500905.tif 000015
【図２Ｄ】
2018500905.tif 000016
【図２Ｅ】
2018500905.tif 000017
【図２Ｆ】
2018500905.tif 000018
【図３Ａ】
2018500905.tif 000019
【図３Ｂ】
2018500905.tif 000020
【図４Ａ】
2018500905.tif 000021
【図４Ｂ】
2018500905.tif 000022
【図５Ａ】
2018500905.tif 000023
【図５Ｂ】
2018500905.tif 000024
【図５Ｃ】
2018500905.tif 000025
【図６】
2018500905.tif 000026
【図７】
2018500905.tif 000027
【図８Ａ】
2018500905.tif 000028
【図８Ｂ】
2018500905.tif 000029
【配列表】
2018500905000001.app
【国際調査報告】
2018500905.tif 000030
2018500905.tif 000031