(57)【要約】  本発明は、重合組換えタンパク質、この重合組換えタンパク質をコードする組換え核酸、この組換え核酸を含む発現カセット、この発現カセットにより形質転換されている宿主細胞、および組換えタンパク質を多量体化する方法に関する。本発明の重合タンパク質は、医薬組成物または免疫原性組成物で使用され得る。具体的には、この組換えタンパク質は、抗原、抗体または足場であることができる。具体的には、この重合組換えタンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素であることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含む分子。
【請求項２】
組換えタンパク質である、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
配列番号１の２位、７位、１３位、１９位、２１位、２４位および２７位に対応する前記分子内の位置でシステイン残基を含む、請求項１または２に記載の分子。
【請求項４】
前記第１のアミノ酸配列が配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性または１００％の同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子。
【請求項５】
配列番号２を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子。
【請求項６】
ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体タンパク質ではない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子。
【請求項７】
ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モジュールを含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項８】
配列番号２９で定義される配列の群から選択される配列を含まない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分子。
【請求項９】
前記分子中におけるヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体に由来するアミノ酸配列のみが、配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の同一性を有する配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１０】
前記第１のアミノ酸配列と前記異種アミノ酸配列との間にリンカーが存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１１】
前記異種アミノ酸配列が抗原をコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１２】
前記抗原が、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、コクサッキーウイルス、単純ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の分子。
【請求項１３】
前記抗原がインフルエンザウイルス由来であり、かつ赤血球凝集素（ＨＡ）、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）およびＨＡＭ２融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１２に記載の分子。
【請求項１４】
前記抗原がインフルエンザ赤血球凝集素であり、好ましくはインフルエンザ赤血球凝集素の外部ドメインである、請求項１３に記載の分子。
【請求項１５】
前記抗原がシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）由来であり、かつＩｐａＤおよびＭｘｉＨからなる群から選択される、請求項１２に記載の分子。
【請求項１６】
前記異種アミノ酸配列が抗体または足場をコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１７】
前記抗体または足場が、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、コクサッキーウイルス、単純ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からなる群から選択される抗原に特異的である、請求項１６に記載の分子。
【請求項１８】
前記抗体が、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および二重特異性抗体（Ｄｂ）からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の分子。
【請求項１９】
前記異種アミノ酸配列が、二重特異性抗体、多重特異性抗体、二重特異性足場および多重特異性足場からなる群から選択される抗体または足場をコードする、請求項１６または１７に記載の分子。
【請求項２０】
配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１の核酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２の核酸配列とを含む組換え核酸。
【請求項２１】
前記第１の核酸配列がアミノ酸配列をコードし、前記アミノ酸配列が、配列番号１の２位、７位、１３位、１９位、２１位、２４位および２７位に対応する前記アミノ酸配列内の位置でシステイン残基を含む、請求項２０に記載の組換え核酸。
【請求項２２】
前記第１の核酸配列が配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性または１００％の同一性を有する、請求項２０または２１に記載の組換え核酸。
【請求項２３】
配列番号４を含む、請求項２０または２１に記載の組換え核酸。
【請求項２４】
ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体をコードしない、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項２５】
請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組換え核酸を含む発現カセットであって、前記組換え核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、発現カセット。
【請求項２６】
請求項２５に記載の発現カセットで形質転換されている宿主細胞。
【請求項２７】
原核生物であり、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）種、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からなる群から選択される原核生物宿主細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
真核生物であり、好ましくは、原生生物、昆虫細胞、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、微細藻類または真菌からなる群から選択される宿主細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
リーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）、ＣＨＯおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からなる群から選択される、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
安定な多量体タンパク質を形成することができる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の分子。
【請求項３１】
配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む安定なホモ多量体組換えタンパク質。
【請求項３２】
請求項１〜１９もしくは３０のいずれか一項に記載の分子または請求項３１に記載の組換えタンパク質と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項３３】
薬剤として使用するための、請求項１〜１９もしくは３０のいずれか一項に記載の分子または請求項３１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３４】
対象中での抗原に対する免疫応答の誘発で使用するための、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の分子または請求項３１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３５】
組換えタンパク質を多量体化する方法であって、
ａ）配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列に融合させることであって、但し前記組換えタンパク質がヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体タンパク質ではない、融合させること、
ｂ）前記組換えタンパク質の多量体化をもたらす条件下で、前記核酸配列によりコードされる融合タンパク質を発現させること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、多量体組換えタンパク質の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、（例えば免疫系における）分子認識、シグナル伝達経路（ホルモン）、代謝産物および栄養素の輸送ならびに生化学反応の触媒（酵素）等の細胞機能の大部分に関与している。
【０００３】
タンパク質の機能はこのタンパク質の三次元構造に起因しており、即ち、ポリペプチド鎖のアミノ酸が空間中で互いに対してどのように配置されているかに起因している。タンパク質がこのタンパク質の生物学的活性を発揮することができるのは、通常、このタンパク質の折り畳まれた状態（天然状態）のみである。
【０００４】
大部分のタンパク質は一次構造（アミノ酸構造）、二次構造（アルファ−ヘリクスおよびベータ−シート）ならびに三次構造（三次元）を有するが、タンパク質オリゴマーは、三次元構造の一部である四次構造と呼ばれる更なるレベルを有する。オリゴマーは、いくつかのポリペプチドの複合体である。このオリゴマーは、サブユニットと称される同一タンパク質のいくつかのコピーを含むことができ、ホモオリゴマーと称されるか、またはこのオリゴマーは複数種のタンパク質サブユニットからなり得、この場合、このオリゴマーはヘテロオリゴマーと称される。血液中の酸素担体であるヘモグロビンは、同一サブユニットを含むタンパク質の一例である。窒素ガスのアンモニアへの還元に関与している微生物酵素であるニトロゲナーゼは、同一ではないサブユニットを含むタンパク質の一例である。
【０００５】
興味深い多数の組換えタンパク質、例えば、抗体、多くの膜貫通タンパク質、例えば膜貫通受容体、ポリン、ウイルス表面抗原、熱ショックタンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、フェリチン、インスリン、多くの酵素、例えばグルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ、コラーゲンおよび多くのその他のものは、天然ではオリゴマーである。
【０００６】
例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）は、ウイルスと宿主細胞受容体との相互作用に関与しているウイルス表面上のホモ三量体糖タンパク質である。ＨＡの三次元構造は（非特許文献１）で詳細に説明されている。インフルエンザウイルスに対するワクチン接種により誘発される防御免疫応答は主にウイルスＨＡタンパク質を対象とする。従って、組換えＨＡタンパク質（ｒＨＡ）は、インフルエンザワクチンの開発にとって興味深い抗原である。
【０００７】
興味深い別のオリゴマー抗原はシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の侵入プラスミド抗原（Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ）Ｄ（ＩｐａＤ）タンパク質であり、このタンパク質は、この細菌の針先で五量体または（ＩｐａＢの存在下で）三量体のいずれかを形成することが発見されている（非特許文献２）。
【０００８】
興味深い更なるオリゴマー抗原は、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の針を作るサブユニットのらせん状集合体を形成することが発見されているシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）のＩｐａＨ（ＭｘｉＨ）タンパク質の膜発現である（非特許文献３）。
【０００９】
組換えタンパク質分野での課題の１つは、組換えタンパク質が常に天然タンパク質と同じ三次元立体構造を有するとは限らないことである。更に、タンパク質の機能は、このタンパク質の三次元構造に起因することが多い。
【００１０】
同様に、オリゴマーに関して、組換えタンパク質が天然タンパク質の四次構造を維持しない場合、この組換えタンパク質の機能が変更される可能性があるか、または抑制される可能性がある。
【００１１】
例えば、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｃ．Ｗｅｌｄｏｎらは、（非特許文献４）において、組換えインフルエンザ赤血球凝集素の不十分な三量体が低い免疫原性の一因となり得ることを示した。
【００１２】
従って、天然タンパク質のオリゴマー構造および所望の生物学的機能をより良好に保持する組換えタンパク質を製造する必要がある。
【００１３】
Ｃｈｉｈ−Ｊｅｎ  Ｗｅｉらは、（非特許文献５）において、Ｔ４ファージのフォルドン配列（ｆｏｌｄｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を使用するインフルエンザｒＨＡの三量体化を説明している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，２８９，３６６−３７３（１９８１）
【非特許文献２】Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，９５（１），３１−５０（２０１５）
【非特許文献３】Ｃｏｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７８（１９），１７１０３−１７１０７（２００３）
【非特許文献４】Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，５（９），ｅ１２４６６（２０１０）
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８２（１３），６２００−６２０８（２００８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、驚くべきことに、ヤツメウナギ可変リンパ球受容体Ｂ（ＶＬＲ−Ｂ）抗体の配列の断片を異種融合タンパク質の多量体化に使用し得ることを確認した。
【００１６】
ヤツメウナギは、ロイシンリッチリピート遺伝子セグメントのコンビナトリアル集合体（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）により作られた可変リンパ球受容体（ＶＬＲ）を発現するクローン的に多様なリンパ球で適応免疫系が構成されている無顎脊椎動物である。ＶＬＲ−Ｂが分泌され得、有顎脊椎動物中において抗体と同様に機能し得る。
【００１７】
驚くべきことに、本発明者らは、目的のタンパク質をコードする核酸配列と、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の最Ｃ末端（ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）（即ちＣ末端からＳｔａｌｋ領域）（国際公開第２００８／０１６，８５４号パンフレットの図１１Ｃにおいて「Ｃ−ＴＥＲＭ」と命名されたドメイン）で見出されるペプチドをコードする核酸配列との融合により、種々のオリゴマー化度でオリゴマー化し得る組換えタンパク質がコードされることを発見した。
【００１８】
より驚くべきことに、本発明者らは、得られた多量体組換えタンパク質が安定であることを発見した。
【００１９】
更により驚くべきことに、本発明者らは、得られた安定な多量体組換えタンパク質が、このタンパク質の天然型の生物学的活性を保持しつつ種々のオリゴマー化度を有することを発見した。
【００２０】
一実施形態によれば、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含む分子が得られる。
【００２１】
別の実施形態によれば、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含む組換えタンパク質が得られる。
【００２２】
別の実施形態によれば、配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１の核酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２の核酸配列とを含む組換え核酸が構築されている。
【００２３】
別の態様は、上記で説明した組換え核酸を含む発現カセットであって、この組換え核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、発現カセットを対象とする。
【００２４】
別の態様は、この発現カセットで形質転換されている宿主細胞を対象とする。
【００２５】
本発明はまた、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む安定なホモ多量体組換えタンパク質も対象とする。
【００２６】
別の実施形態は、本発明の分子または組換えタンパク質と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を対象とする。
【００２７】
別の態様では、本発明は、本発明の分子または組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明の分子または組換えタンパク質を薬剤として使用する。
【００２９】
本発明の更なる態様では、本発明の分子または組換えタンパク質を、対象中での抗原に対する免疫応答の誘発で使用する。
【００３０】
本発明はまた、組換えタンパク質を多量体化する方法であって、
ａ）配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列に融合させることであって、但し前記組換えタンパク質がヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体タンパク質ではない、融合させること、
ｂ）前記組換えタンパク質の多量体化をもたらす条件下で、前記核酸配列によりコードされる融合タンパク質を発現させること
を含む方法も対象とする。
【００３１】
定義
本発明に関連して、タンパク質「オリゴマー」または「ポリマー」または「多量体」は同じ意味（即ち四次構造を有するタンパク質）を有しており、少なくとも２個のポリペプチドの複合体であり、前記ポリペプチドは同一でもよく、または異なってもよい。従って、本発明に関連して、「多量体化」、「オリゴマー化」および「重合」は、「多量体化される」、「オリゴマー化される」および「重合される」、または「多量体化する」、「オリゴマー化する」および「重合させる」と同じ意味を有する。
【００３２】
「組換えタンパク質」とは、組換え核酸によりコードされるタンパク質のことである。この組換えタンパク質は、宿主細胞中で組換え核酸から発現される。本明細書において、「組換え核酸」を、この組換え核酸の起源または操作により、天然では関連しているポリヌクレオチドの全てもしくは一部と関連していないおよび／または天然では連結されているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されている核酸分子を説明するために使用する。本発明の組換えタンパク質は、ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体由来のタンパク質断片と、このヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体由来のタンパク質断片に対して異種である目的のタンパク質とを含む。本明細書で説明する場合、本発明の組換えタンパク質は、ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体の最Ｃ末端由来のタンパク質断片を含む。
【００３３】
本発明に関連して、「分子」とは、ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体由来のタンパク質断片と、このヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体由来のタンパク質断片に対して異種である目的のタンパク質との間の任意の手段による接合のことである。例えば、共有結合によりＶＬＲ−Ｂタンパク質と目的の異種タンパク質とを接合させることにより、本発明の分子を作ることができる。そのような共有結合の例として、ペプチド結合、エステル結合、アミド結合およびジスルフィド結合が挙げられる。本明細書で説明する場合、ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体由来のタンパク質断片は、ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体の最Ｃ末端に由来する。
【００３４】
本発明の分子または組換えタンパク質の説明における「第１のアミノ酸配列」および「第２のアミノ酸配列」は、これらの配列の特定の順序が意図されることを意味するものではない。本発明の分子または組換えタンパク質に含まれる２種の配列をより明確に区別することは、実施形態を明瞭にするためにすぎない。
【００３５】
本発明の組換え核酸の説明における「第１の核酸配列」および「第２の核酸配列」は、これらの配列の特定の順序が意図されることを意味するものではない。本発明の組換え核酸に含まれる２種の配列をより明確に区別することは、実施形態を明瞭にするためにすぎない。
【００３６】
本発明に関連して、第１の配列（アミノ酸配列または核酸配列のいずれか）は、ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体のＣ末端に由来するアミノ酸配列または核酸配列をそれぞれ示す。本発明によれば、第１のポリペプチド配列のサイズは概して２４〜４３個のアミノ酸長であり、具体的には３０〜４３個のアミノ酸長であり、境界が含まれる。従って、第１のポリペプチド配列のサイズは、好ましくは約３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個または４３個のアミノ酸長であることができる。本発明によれば、第１の核酸配列のサイズは概して７２〜１２９個の塩基対長であり、具体的には９０〜１２９個の塩基対長であり、境界が含まれる。従って、第１の核酸配列のサイズは、好ましくは約９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個または１２９個の塩基対長であることができる。
【００３７】
本発明に関連して、第２の配列（アミノ酸配列または核酸配列のいずれか）は、目的のタンパク質のアミノ酸配列もしくはこの断片または目的のタンパク質をコードする核酸配列もしくはこの断片をそれぞれ示す。本発明に関連して、本明細書で言及するタンパク質の「断片」は、この断片が由来する完全長タンパク質の生物学的機能を保持する。そのため、本発明に係る断片は、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個または少なくとも１５０個のアミノ酸長であることができる。
【００３８】
単一の組換え分子に含まれる２種の配列は、これらの配列が天然では通常互いに関連していない場合、互いに対して「異種」である。本発明に関連して、第１の配列（アミノ酸配列または核酸配列のいずれか）に対して異種である第２の配列は、この第２の異種配列が、ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体由来の配列ではないか、またはこの配列を含まないことを意味する。本発明に関連して、この異種配列は、ポリヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ−タグ）のアミノ酸配列またはＨｉｓ−タグをコードする核酸配列ではない。更に、本発明に係る異種核酸が少なくとも５個、少なくとも１０個または少なくとも１５個のアミノ酸長である（またはそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である）ことが好ましい。
【００３９】
「融合タンパク質」とは、元々は別々のタンパク質をコードする２種以上の遺伝子の連結により作られるタンパク質のことである。これは、概して、第１のタンパク質をコードするＤＮＡ配列から終止コドンを除去すること、次いでライゲーションまたは重複伸長ＰＣＲによりフレーム中で第２のタンパク質のＤＮＡ配列を付加することを含む。３種以上の遺伝子を融合させる場合、その他の遺伝子を同様にフレーム中で付加する。次いで、結果として生じるＤＮＡ配列を単一タンパク質として細胞により発現させることができる。本発明の融合タンパク質は、目的のタンパク質のいずれかもしくは全てまたはこの断片をコードする核酸に融合している、ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体由来のタンパク質断片をコードする核酸から得られる。本発明に関連して、このタンパク質を、目的のタンパク質の完全配列または目的のタンパク質の一部のみを含むように操作することができる。２種以上の遺伝子の連結を任意の順序で行なうことができ、即ち、目的のタンパク質をコードする配列またはこの断片は、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の断片をコードする配列から３’または５’のいずれかに位置する。好ましくは、目的のタンパク質をコードする配列またはこの断片は、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の断片をコードする配列から５’に位置する。本明細書の別の箇所で説明するように、本発明に関連して、ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体由来のタンパク質断片はヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の最Ｃ末端に由来する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、第２の配列に対して少なくともｘ％の同一性を有する第１の配列は、第２のアミノ酸配列の完全長に対する、グローバルアラインメントにより両方の配列を最適にアラインさせた場合に第２の配列のアミノ酸とマッチした第１の配列のアミノ酸と同一である第１の配列中のアミノ酸の数をｘ％が表すことを意味する。両方の配列は、ｘが最大である場合に最適にアラインされる。グローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、例えばポリペプチド配列比較用の下記のパラメータ：比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８９，１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップペナルティ：８およびギャップ長ペナルティ：２ならびにポリヌクレオチド配列比較用の下記のパラメータ：比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０、ギャップペナルティ：５０およびギャップ長ペナルティ：３による、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，４８，４４３−４５３（１９７０）で説明されているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、アラインメントおよび同一性の割合の決定を手動でまたは自動で実行することができる。
【００４１】
上記パラメータと共に使用することができるプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩから「ギャップ」プログラムとして公的に利用可能である。上述したパラメータは、ペプチド比較（エンドキャップに対するペナルティはない）および核酸比較のそれぞれのためのデフォルトパラメータである。
【００４２】
「抗原」は、個体中で免疫応答を誘発することができるあらゆる因子（好ましくは巨大分子）を意味する。この用語を、個々の巨大分子または抗原巨大分子の同種集団もしくは異種集団を意味するために使用することができる。本明細書で使用する場合、好ましくは、１種または複数種のエピトープを含むタンパク質分子またはこの一部を意味するために「抗原」を使用する。エピトープは、抗原中において抗体またはＴ細胞受容体により認識される部分である。一部のエピトープは、非連続的なコンフォメーションエピトープ（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）と称される。この非連続的なコンフォメーションエピトープは、このエピトープを含むアミノ酸が、タンパク質の三次元構造中では互いに近位であるが、一次元の直鎖状アミノ酸配列で厳密に見ると互いに遠位に見えることを意味する。従って、免疫系が実際には何を認識するかという観点から、タンパク質の三次元構造が極めて重要であることは明らかである。
【００４３】
「外部ドメイン」とは、膜貫通アンカー型タンパク質中において膜を超えて細胞外空間へと伸びる部分のことである。
【００４４】
「足場」とは、適切な露出表面残基の選択的ランダム変異誘発、続いて所望の結合活性を有する多様体の選択により、選択されたタンパク質足場のコンビナトリアルライブラリから通常作成される特異的リガンド結合人工構造物のことである。Ｋａｓｐａｒ  Ｂｉｎｚらは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８６（１０），１２５７−１２６８（２００５）において、多数の代替タンパク質足場、これら代替タンパク質足場からコンビナトリアルライブラリを設計するための十分に確立された技術、適切な多様体を選択するための十分に確立された技術（ほとんどがファージディスプレイ）ならびに関連する方法を概説している。
【００４５】
下記の実施形態の詳細な説明および添付図面を参照して、実施形態の様々な特徴をより詳細に認識することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】組換えインフルエンザＨＡ外部ドメインタンパク質を製造するために使用する発現カセットを示す。（ａ）ｐＬｅｘｓｙ−Ｉ−ｂｌｅｏ２発現カセット。（ｂ）配列１は配列番号７と一致し、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）のＨＡタンパク質の外部ドメインをコードする核酸配列に融合した核酸配列（第１の試験配列をコードする）である。（ｃ）配列２は配列番号８と一致し、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）のＨＡタンパク質の外部ドメインをコードする核酸配列に融合した核酸配列（第２の試験配列をコードする）である。（ｄ）配列３は配列番号９と一致し、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）のＨＡタンパク質の外部ドメインをコードする核酸配列に融合した核酸配列（第３の試験配列をコードする）である。
【図２】様々な組換えＨＡ外部ドメインタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを示す写真である。・レーン１：分子量サイズマーカー・レーン２：陰性コントロール  −  プロモーターの導入なし、加熱処理あり・レーン３：陰性コントロール  −  プロモーターの導入なし・レーン４：陰性コントロール  −  不適切な抗原（インフルエンザ抗体）、加熱処理あり・レーン５：陽性コントロール  −  ｒＨＡ外部ドメイン、重合配列なし、加熱処理あり・レーン６：陽性コントロール  −  ｒＨＡ外部ドメイン、重合配列なし・レーン７：一実施形態に係る配列番号１の重合配列に融合したｒＨＡ外部ドメイン、加熱処理あり・レーン８：一実施形態に係る配列番号１の重合配列に融合したｒＨＡ外部ドメイン・レーン９：一実施形態に係る配列番号２の重合配列に融合したｒＨＡ外部ドメイン、加熱処理あり・レーン１０：一実施形態に係る配列番号２の重合配列に融合したｒＨＡ外部ドメイン・レーン１１：配列番号５の重合配列に融合したｒＨＡ外部ドメイン、加熱処理あり・レーン１２：配列番号５の重合配列に融合したｒＨＡ外部ドメイン
【図３】一実施形態に係る多量体ｒＨＡで免疫付与したマウスでの赤血球凝集平均抗体力価の抑制を示すグラフである。
【図４】ＣＨＯ細胞中で組換えインフルエンザＨＡ外部ドメインタンパク質を産生するために使用したｐＥＥ１４．４発現カセットを示す。
【図５】ＣＨＯ細胞中で発現した様々な組換えＨＡ外部ドメインタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを示す写真である。
【図６】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で組換えシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＩｐａＤタンパク質を産生するために使用したｐＭ１８００発現カセットを示す。
【図７】様々な組換えシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＩｐａＤタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを示す写真である。
【図８】Ｈｉｓ−タグを有する様々な組換えシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＩｐａＤタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを示す写真である。
【図９】加熱処理した様々な組換えシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＩｐａＤタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを示す写真である。
【図１０】様々な組換えシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＭｘｉＨタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを示す写真である。「ＩＳ」は不溶性（ペレット試料）を意味し、「Ｓ」は可溶性（上清試料）を意味する。
【図１１】Ｈｉｓ−タグを有する様々な組換えシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＭｘｉＨタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを示す写真である。「ＩＳ」は不溶性（ペレット試料）を意味し、「Ｓ」は可溶性（上清試料）を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
一実施形態によれば、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含む分子が得られる。具体的には、本発明に係る分子は、配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する第１のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
一実施形態によれば、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含む分子が得られる。具体的には、本発明に係る分子は、配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する第１のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、配列番号１の２位、７位、１３位、１９位、２１位、２４位および２７位に対応する７個のシステインが第１のアミノ酸配列で保存されている。本発明の分子はヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体タンパク質を含まない。
【００５０】
好ましい実施形態では、配列番号２の２位、１５位、２０位、２６位、３２位、３４位、３７位および４０位に対応する８個のシステインが第１のアミノ酸配列で保存されている。本発明の分子はヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体タンパク質を含まない。
【００５１】
一実施形態によれば、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含む組換えタンパク質が得られる。具体的には、本発明に係る組換えタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する第１のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
一実施形態によれば、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含む組換えタンパク質が得られる。具体的には、本発明に係る分子は、配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する第１のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
好ましい実施形態では、配列番号１の２位、７位、１３位、１９位、２１位、２４位および２７位に対応する７個のシステインが第１のアミノ酸配列で保存されている。本発明の組換えタンパク質はヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体タンパク質を含まない。
【００５４】
好ましくは、本発明の分子または組換えタンパク質は、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モジュールを含まない。ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のＬＲＲモジュールのコンセンサス配列はＬＸＸＬＸＸＬＸＬＸＸＮＸＬＸＸＸＰＸＧＸＦＤＸであり、このコンセンサス配列においてＸはあらゆるアミノ酸であることができる（配列番号２９）。好ましくは、本発明の分子または組換えタンパク質は、配列番号２９で定義される配列の群の範囲に含まれる配列を含まず、即ち本発明の分子または組換えタンパク質は配列番号２９を含まない。ＬＲＲモジュール（国際公開第２００８／０１６８５４号パンフレットの図１１Ｃを参照されたい）の具体例として、Ｎ末端キャップＬＲＲ（ＬＲＲＮＴと称される）、ＬＲＲ１、可変ＬＲＲモジュール（ＬＲＲＶと称される）および末端ＬＲＲＶ（ｅｎｄ  ＬＲＲＶ）（ＬＲＲＶｅとして既知である）およびＣ末端キャップＬＲＲ（ＬＲＲＣＴと称される）が挙げられる。好ましくは、本発明の分子または組換えタンパク質は、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のＬＲＲＮＴ、ＬＲＲ１、ＬＲＲＶおよびＬＲＲＣＴモジュールのうちの１種または複数種を含まない。ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体はまた、ＬＲＲモジュールに加えて連結ペプチド（ＣＰ）およびＳｔａｌｋ領域も含む。好ましくは、本発明の分子または組換えタンパク質は、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のＣＰまたはＳｔａｌｋ領域を含まない。好ましくは、本発明の分子または組換えタンパク質は、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のＬＲＲモジュール、ＣＰまたはＳｔａｌｋ領域を含まない。好ましくは、本発明の分子中においてまたは組換えタンパク質中においてヤツメウナギ由来のアミノ酸配列のみが、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の最Ｃ末端（即ちタンパク質のＣ末端からＳｔａｌｋ領域の部分、国際公開第２００８／０１６８５４号パンフレットの図１１Ｃを参照されたい）に由来する。好ましくは、本発明の分子中においてまたは組換えタンパク質中においてヤツメウナギ由来のアミノ酸配列のみが、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列であり、例えば、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する配列である。
【００５５】
別の実施形態は、配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１の核酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２の核酸配列とを含む組換え核酸を対象とする。具体的には、本発明に係る組換え核酸は、配列番号３に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する第１の核酸配列を含む。
【００５６】
別の実施形態は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１の核酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２の核酸配列とを含む組換え核酸を対象とする。具体的には、本発明に係る組換え核酸は、配列番号４に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する第１の核酸配列を含む。
【００５７】
好ましい実施形態では、第１の核酸配列は下記のようなアミノ酸配列をコードし、このアミノ酸配列は、配列番号１の２位、７位、１３位、１９位、２１位、２４位および２７位に対応する前記アミノ酸配列内の位置でシステイン残基を含む。本発明の組換え核酸はヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体をコードしない。好ましい実施形態では、第１の核酸配列は下記のようなアミノ酸配列をコードし、このアミノ酸配列は、配列番号２の２位、１５位、２０位、２６位、３２位、３４位、３７位および４０位に対応する前記アミノ酸配列内の位置でシステイン残基を含む。
【００５８】
好ましくは、本発明の組換え核酸は、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モジュールをコードしない。具体的には、本明細書で説明する組換え核酸は、配列番号２９の配列を有するアミノ酸配列をコードしない。好ましくは、本発明の組換え核酸は、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のＬＲＲＮＴモジュール、ＬＲＲ１モジュール、ＬＲＲＶモジュール、ＬＲＲＣＴモジュール、ＣＰおよびＳｔａｌｋ領域のうちの１種または複数種をコードしない。好ましくは、本発明の組換え核酸によりコードされるヤツメウナギ由来のアミノ酸配列のみが、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の最Ｃ末端（即ちタンパク質のＣ末端からＳｔａｌｋ領域の部分、国際公開第２００８／０１６８５４号パンフレットの図１１Ｃを参照されたい）に由来する。好ましくは、本発明の組換え核酸中においてヤツメウナギ由来の核酸配列のみが、配列番号３または配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列であり、例えば、配列番号３または配列番号４に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する配列である。
【００５９】
第１のアミノ酸配列と第２の異種アミノ酸配列との間にリンカーを挿入することができる。リンカーは、タンパク質ドメイン間の短ペプチド配列または別の適切な共有結合的連結であることができる。好ましくは、リンカーは短ペプチド配列である。好ましくは、前記ペプチドリンカーは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）のような可能性残基から構成されており、そのため、隣接するタンパク質ドメインは互いに対して自由に動く。好ましくは、前記リンカーは、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または少なくとも１５個のアミノ酸残基長である。当業者に既知のあらゆる可能なリンカーを本発明の目的に使用することができる。例えば、リンカーは、Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，５（９），ｅ１２４６６（２０１０）でＷｉｌｌｉａｍ  Ｃ．Ｗｅｌｄｏｎらにより使用されているＧ６Ｓ９（６個のグリシンに続いて９個のセリンを意味する）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８６，２５４３−２５５２（２００５）でＬｕｄｍｉｌｌａ  Ｓｉｓｓｏｅｆｆらにより使用されているＧ８、またはＧ４Ｓ３であることができる。
【００６０】
第１の核酸配列と第２の異種核酸配列との間に、上記で説明したペプチドリンカーをコードするスペーサー核酸配列を挿入することができる。
【００６１】
好ましい実施形態では、目的の異種タンパク質は抗原またはこの断片である。この実施形態では、異種アミノ酸配列は抗原アミノ酸配列由来であるか、または異種核酸配列は抗原核酸配列由来である。本発明では、抗原をあらゆる適切な供給源から得ることができるか、またはこの抗原はあらゆる適切な供給源に由来し得る。好ましくは、抗原の供給源は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、コクサッキーウイルス、単純ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からなる群から選択される。好ましくは、この抗原は分子量が１５０ｋＤａ未満であるか、１２５ｋＤａ未満であるか、または１００ｋＤａ未満である。最も好ましくは、この抗原は分子量が１００ｋＤａ未満である。
【００６２】
好ましくは、抗原の供給源は、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択される。好ましくは、抗原の供給源はインフルエンザウイルスおよびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）から選択される。
【００６３】
一部の実施形態では、本発明の分子または組換えタンパク質は、本明細書で説明するヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ配列に対して異種である複数種の抗原を含むことができる。本分子または本組換えタンパク質が数種の抗原を含む場合、これらの抗原は独立して、目的の完全タンパク質または目的のタンパク質の断片であり、同一の生物に由来してもよく、または異なる生物に由来してもよい。この抗原は、同一の生物由来のまたは異なる生物由来の異なるタンパク質の融合抗原またはこの断片であることができる。
【００６４】
好ましくは、本発明の分子または組換えタンパク質で使用する抗原は、インフルエンザウイルス由来である。インフルエンザウイルスは、季節性インフルエンザウイルスでもよく、または汎発性インフルエンザウイルスでもよい。インフルエンザウイルスは、Ａ株、Ｂ株またはＣ株のあらゆる亜型であることができる。具体的には、インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１Ｎ１ウイルス、Ｈ２Ｎ２ウイルス、Ｈ３Ｎ１ウイルス、Ｈ３Ｎ２ウイルス、Ｈ３Ｎ８ウイルス、Ｈ５Ｎ１ウイルス、Ｈ７Ｎ１ウイルス、Ｈ７Ｎ７ウイルス、Ｈ１Ｎ２ウイルス、Ｈ９Ｎ２ウイルス、Ｈ７Ｎ２ウイルス、Ｈ７Ｎ３ウイルスおよびＨ１０Ｎ７ウイルスからなる群から選択される。
【００６５】
好ましくは、インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素（ＨＡ）またはこの断片、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）（Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８３，３２−４３（１９９１））またはこの断片およびＨＡＭ２融合タンパク質から選択される。ＨＡＭ２融合タンパク質では、ＨＡおよびＭ２は独立して、完全タンパク質またはこのタンパク質の断片である。より好ましい実施形態では、抗原はインフルエンザ赤血球凝集素またはこの断片である。
【００６６】
更に、本発明では、改変（例えば、天然配列に対する欠失、付加および置換）を有するタンパク質が十分な免疫原性を維持する限り、抗原はこのタンパク質を含む。この改変は、例えば部位特異的変異誘発による故意であってもよく、または宿主細胞中での抗原の発現中に起こる変異等の偶発的であってもよい。この抗原はまた、コンセンサス配列によりコードされるタンパク質またはこの断片であることもできる。
【００６７】
好ましくは、抗原は膜貫通アンカー型タンパク質の外部ドメインである。この外部ドメインは下記のような天然タンパク質に対応しており、この天然タンパク質では、抗原を産生する宿主中でのこの天然タンパク質の分泌およびこの天然タンパク質の容易な下流精製を可能にするために、存在する場合には膜貫通ドメインおよび細胞質側末端が欠失されている。
【００６８】
好ましくは、抗原はインフルエンザウイルスＨＡの外部ドメインである。
【００６９】
別の好ましい実施形態では、目的のタンパク質（即ち本発明の抗原または組換えタンパク質で使用する抗原）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）（Ｓｃｈｅｆｆｃｚｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５０６，１１３−１１６（２００１））もしくはこの断片、サイトメガロウイルスＵＬ１３０タンパク質（Ｐａｔｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１３），８３６１−８３７３（２００５））もしくはこの断片またはｇＢ−ＵＬ１３０融合タンパク質、およびＨＩＶ糖タンパク質４１（Ｇｐ４１）（Ｐａｎｃｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１４（７５２３），４５５−４６１（２０１４））もしくはこの断片から選択される。このｇＢ−ＵＬ１３０融合タンパク質では、ｇＢおよびＵＬ１３０は独立して完全タンパク質またはこの断片である。
【００７０】
より好ましい実施形態では、抗原はＣＭＶ  ｇＢタンパク質またはＨＩＶ  Ｇｐ４１タンパク質の外部ドメインである。ｇＢ−ＵＬ１３０融合タンパク質では、ｇＢは完全タンパク質またはｇＢタンパク質の外部ドメインである。別の好ましい実施形態では、抗原は、ＨＩＶ  Ｇｐ４１タンパク質およびサイトメガロウイルスＵＬ１３０タンパク質からなる群から選択される。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、抗原は細菌タンパク質であり、例えばシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種由来のタンパク質である。好ましくは、抗原は、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）またはシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）に由来する。好ましくは、抗原はシゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）またはシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）に由来するＩｐａＤまたはＭｘｉＨである。特定の実施形態では、抗原は、好ましくはＣＭＶ  ｇＢタンパク質またはＣＭＶ  ｇＢタンパク質の外部ドメインではない。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、目的のタンパク質は抗体または足場である。この実施形態では、異種アミノ酸配列は抗体もしくは足場のアミノ酸配列に由来するか、または異種核酸配列は抗体もしくは足場の核酸配列に由来する。
【００７３】
好ましい実施形態では、抗体または足場は抗原に特異的であり、即ち抗原に特異的に結合する。本発明では、抗体または足場が特異的である抗原をあらゆる適切な供給源から得ることができるか、またはこの抗原はあらゆる適切な供給源に由来し得る。好ましくは、抗原の供給源は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、コクサッキーウイルス、単純ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からなる群から選択される。
【００７４】
好ましくは、抗原の供給源は、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択される。
【００７５】
好ましい実施形態では、抗体は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１２（２），１７６−１８３（２０１０）でＲｏｌａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎにより説明されている代替型のうちの１つである。具外的には、抗体は、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および二重特異性抗体（Ｄｂ）からなる群から選択される。この実施形態では、異種アミノ酸配列または異種核酸配列は、それぞれモノクローナル抗体、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＤｂのアミノ酸配列に由来するか、またはモノクローナル抗体、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＤｂの核酸配列に由来する。
【００７６】
Ｒｏｌａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎはまた、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１２（２），１７６−１８３（２０１０）において二重特異性抗体型も説明している。一部の実施形態では、本発明の分子（例えば組換えタンパク質）は二重特異性抗体もしくは二重特異性足場であり、即ち２種の異なる抗原に特異的な抗体もしくは足場であるか、または多重特異性抗体もしくは多重特異性足場であり、即ち３種以上の異なる抗原に特異的な抗体もしくは足場である。この実施形態では、異種アミノ酸配列は、少なくとも２種の異なる抗体、モノクローナル抗体、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｄｂもしくは足場のアミノ酸配列を含むか、または異種核酸配列は、少なくとも２種の異なる抗体、モノクローナル抗体、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｄｂもしくは足場の核酸配列を含む。２種以上の遺伝子は任意の順序で連結され得、即ち、目的の２種以上のタンパク質をコードする配列もしくはこの断片は、本発明に係るヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の断片をコードする配列の３’もしくは５’のいずれかに位置するか、または目的のタンパク質をコードする配列のうちの１種もしくはこの断片は、本発明に係るヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の断片をコードする配列の５’に位置し、目的のタンパク質をコードするその他の配列もしくはこの断片は３’に位置する。好ましくは、目的の２種以上のタンパク質をコードする配列またはこれらの断片は、本発明に係るヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の断片をコードする配列から５’に位置する。
【００７７】
本発明の分子または組換えタンパク質を、当業者に公知の任意の方法により合成することができる。そのような方法として、固相中での（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５（１４），２１４９−２１５４（１９６３））または液相中での従来の化学合成、構成的アミノ酸またはこの誘導体からの酵素合成（Ｋ．Ｍｏｒｉｈａｒａ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５（６），１６４−１７０（１９８７））、無細胞タンパク質合成（Ｋａｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３（３），１５０−１５６（２００５））、および組換え技術による生物学的産生方法が挙げられる。
【００７８】
当業者に既知の任意の方法を、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の化学的コンジュゲーションに使用することができる。そのような方法として、任意選択でペプチドリンカーとのペプチド結合（例えば、組換え核酸からの融合タンパク質としての第１のおよび第２のアミノ酸配列の発現）による従来の化学的コンジュゲーション、または任意の共有結合的連結（例えばペプチド結合、エステル結合、アミド結合もしくはジスルフィド結合）によるコンジュゲーションが挙げられる。好ましくは、第１のおよび第２のアミノ酸配列を融合タンパク質として一緒に発現させる。
【００７９】
本発明の分子または組換えタンパク質の化学合成は特に有利であり得、なぜなら、この化学合成により、高純度、望ましくない副生成物の不存在および容易な製造が可能になるからである。
【００８０】
次いで、そのような方法により得られた本発明の分子またはタンパク質を、当業者に既知の任意の方法を使用して任意選択で精製することができる。
【００８１】
好ましくは、組換え宿主細胞による生物学的製造プロセスを使用して、本発明の組換えタンパク質を得る。そのようなプロセスでは、発現カセット（本発明のタンパク質または融合タンパク質をコードする核酸を含む）を宿主細胞中に導入し、この宿主細胞を、対応するタンパク質または融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する。次いで、これにより産生されるタンパク質または融合タンパク質を回収して精製することができる。
【００８２】
本発明はまた、本発明の組換え核酸を含む発現カセットであって、この組換え核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、発現カセットも対象とする。多数の発現カセットが当技術分野で説明されており、これらの発現カセットは、それぞれ、宿主細胞内でＤＮＡまたはＤＮＡ断片のｍＲＮＡへの転写およびこのｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を可能にする要素の全てを概して含む。典型的には、宿主細胞中での核酸の発現に必要な要素として、選択された宿主細胞中で機能し、構成的または誘導性であり得るプロモーター；リボソーム結合部位；開始コドン（ＡＴＧ）；分泌される組換えタンパク質に必要なシグナルペプチドをコードする領域；終止コドン；ならびに３’末端領域（翻訳ターミネーターおよび／または転写ターミネーター）が挙げられる。その他の転写制御要素（例えばエンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー）もポリヌクレオチドに作動可能に関連付けて、細胞内での転写および／または翻訳を指示することもできる。シグナルペプチドコード領域は、好ましくは、本発明の組換えタンパク質をコードする核酸に隣接しており、適切なリーディングフレーム中に位置している。シグナルペプチドコード領域は、目的のタンパク質または本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子に対して相同または非相同であることができ、発現に使用する宿主の分泌装置に特異的であることができる。
【００８３】
本発明の組換え核酸により構成されているオープンリーディングフレームは単独でまたはシグナルペプチドと一緒にプロモーターの制御下に置かれており、そのため、転写および翻訳が宿主細胞中で起こる。宿主細胞中での核酸の発現に必要なプロモーターおよびその他の要素が広く知られており、当業者に利用可能である。
【００８４】
最後に、本発明のタンパク質および／もしくは融合タンパク質をコードするＤＮＡの転写が増強されるように、ならびに／またはこのタンパク質および／もしくは融合タンパクをコードするｍＲＮＡの翻訳が促進されるように、本発明の核酸配列をコドン最適化してもよい。
【００８５】
「コドン最適化ＤＮＡまたはコドン最適化ｍＲＮＡ配列」は、コドン最適化ＤＮＡ配列の場合、宿主細胞中へのより良好な発現に最適化されている核酸配列であって、米国特許出願公開第２００４／０２０９２４１号明細書で説明されているように、１個または複数個のコドンを前記宿主細胞の遺伝子でより頻繁に使用される１個または複数個のコドンで置き換えることにより最適化されている核酸配列を意味しており、コドン最適化ｍＲＮＡ配列の場合、米国特許出願公開第２０１１／０２６９９５０号明細書で説明されているように、使用する宿主細胞に係るｍＲＮＡ配列のＧ／Ｃ含有量を最大化するように最適化されている核酸配列を意味する。核酸配列のコドン最適化は、宿主細部中で発現されるタンパク質および／または融合タンパク質のアミノ酸配列を変更しないように適切に管理される。
【００８６】
別の実施形態では、宿主細胞を本発明の発現カセットで形質転換させる。宿主細胞は、発現カセットが挿入され得るあらゆる細胞（即ち、あらゆる真核細胞または原核細胞）であることができる。本発明によれば、好ましい宿主細胞は真核細胞または原核細胞であり、これらの細胞として、動物細胞（例えば哺乳動物、トリ、昆虫および魚の宿主細胞）、植物細胞（例えば真核藻類細胞）、真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞および原生生物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。本発明で有用な好ましい原核生物宿主細胞として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）が挙げられる。本発明での使用に特に好ましい原核生物宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。本発明で有用な好ましい真核生物宿主細胞として、リーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ウィラーティア・マグナ（Ｗｉｌｌａｅｒｔｉａ  ｍａｇｎａ）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＳＦ９細胞、Ｓ２細胞、ＥＢ６６アヒル細胞、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）細胞、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）細胞、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）細胞、オリザ・グラベリマ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）細胞、メディカゴ・トランカツラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）細胞、ゼア・マイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）細胞、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）およびマイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）が挙げられる。本発明での使用に特に好ましい真核生物宿主細胞は、リーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）またはＣＨＯである。
【００８７】
真核生物細胞中でのグリコシル化は原核生物細胞中でのグリコシル化と異なり、かつこのグリコシル化と比べて複雑であることから、真核生物細胞中で天然に発現される目的のタンパク質は、真核生物宿主細胞中において、本発明に係るヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の断片との融合タンパク質として好ましくは発現される。同様に、原核生物細胞中で天然に発現される目的のタンパク質は、原核生物宿主細胞中において、本発明に係るヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の断片との融合タンパク質として好ましくは発現される。
【００８８】
宿主細胞中へ発現カセットを挿入するための様々な手段およびプロトコルが存在しており、これらの例として、形質転換、遺伝子導入、細胞またはプロトプラストの融合、化学的処理（例えば、プロトプラストのポリエチレングリコール処理、カルシウム処理、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）遺伝子導入試薬等の遺伝子導入剤）の使用、様々なタイプのリポソームの使用、機械的デバイス（例えば核酸コーティング微粒子）の使用、電荷（例えばエレクトロポレーション）の使用ならびにこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で説明する特定のベクター分子を所望の宿主細胞中へと挿入するために使用する特定のプロトコルおよび／または手段を決定することは、当業者の技能の範囲内である。
【００８９】
組換え宿主細胞を、この細胞の要求によって決定される様々な所定の条件下で増殖させることができる。例えば、宿主細胞は、特定の栄養要求または物理的条件（例えば温度）および／もしくは化学的条件（例えば抗生物質）に対する特定の耐性もしくは感受性を有する場合がある。加えて、所望の遺伝子の発現を調節するために特定の培養条件が必要な場合がある（例えば、誘導性プロモーターの使用）。これらの様々な条件およびそのような条件を満たすための要件は、当業者に理解および認識される。
【００９０】
タンパク質の精製方法は当業者に公知である。例えば分画、クロマトグラフィー法、特定のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用するイムノアフィニティー法等を単独でまたは組み合わせて使用する方法により、得られた組換えタンパク質または融合タンパク質を、溶解物および細胞抽出物から、培養培地上清から精製することができる。好ましくは、得られた組換えタンパク質または融合タンパク質を培養培地上清から精製する。
【００９１】
別の実施形態は、安定な多量体を形成することができる本発明の分子または組換えタンパク質を対象とする。好ましい実施形態では、本発明の安定な多量体は、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む安定なホモ多量体組換えタンパク質である。具体的には、この安定なホモ多量体組換えタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましくは、このタンパク質はインフルエンザＨＡタンパク質である。
【００９２】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の安定な多量体は、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む安定なホモ多量体組換えタンパク質である。具体的には、この安定なホモ多量体組換えタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましくは、このタンパク質はインフルエンザＨＡタンパク質である。
【００９３】
本発明のこれらの実施形態（即ち安定な多量体）の好ましい態様では、配列番号１の２位、７位、１３位、１９位、２１位、２４位および２７位に対応する７個のシステイン（または配列番号２の２位、１５位、２０位、２６位、３２位、３４位、３７位および４０位に対応する８個のシステイン）は、ヤツメウナギＶＬＲ−ＢのＣ末端に由来するならびにインフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質に融合したタンパク質のアミノ酸配列で保存されている。一部の実施形態では、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列と融合アミノ酸配列との間にリンカーを挿入することができる。
【００９４】
好ましくは、本発明の安定な多量体は、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モジュールを含まない。具体的には、本明細書で説明する安定な多量体は、配列番号２９の配列を有するアミノ酸配列を含まない。好ましくは、本発明の安定な多量体は、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のＬＲＲＮＴモジュール、ＬＲＲ１モジュール、ＬＲＲＶモジュール、ＬＲＲＣＴモジュール、ＣＰおよびＳｔａｌｋ領域のうちの１種または複数種を含まない。好ましくは、本発明の安定な多量体中に存在するヤツメウナギ由来のアミノ酸配列のみが、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の最Ｃ末端（即ちタンパク質のＣ末端からＳｔａｌｋ領域の部分、国際公開第２００８／０１６８５４号パンフレットの図１１Ｃを参照されたい）に由来する。好ましくは、本発明の安定な多量体中に存在するヤツメウナギ由来のアミノ酸配列のみが、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列であり、例えば、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する配列である。
【００９５】
本発明はまた、配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子から発現系により産生された安定なホモ多量体組換えタンパク質も提供する。具体的には、この安定なホモ多量体組換えタンパク質は、配列番号３に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する核酸配列に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子から発現系により産生される。好ましくは、この核酸配列はインフルエンザＨＡタンパク質をコードする。
【００９６】
一部の実施形態では、この安定なホモ多量体組換えタンパク質は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子から発現系により産生される。具体的には、この安定なホモ多量体組換えタンパク質は、配列番号４に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有する核酸配列に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子から発現系により産生される。好ましくは、この核酸配列はインフルエンザＨＡタンパク質をコードする。
【００９７】
本発明のこれらの実施形態の好ましい態様では、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体のＣ末端に由来するアミノ酸配列をコードする（ならびにインフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列に融合している）核酸配列は下記のようなアミノ酸配列をコードし、このアミノ酸配列は、配列番号１の２位、７位、１３位、１９位、２１位、２４位および２７位に対応する前記アミノ酸配列内の位置でシステイン残基を含む（または配列番号２の２位、１５位、２０位、２６位、３２位、３４位、３７位および４０位に対応する前記アミノ酸配列内の位置でシステイン残基を含む）。一部の実施形態では、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列と融合核酸配列との間に、ペプチドリンカーをコードするスペーサー核酸配列を挿入することができる。
【００９８】
本発明はまた、本発明の分子または組換えタンパク質と薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物も提供する。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は本発明の分子または組換えタンパク質を含む。本発明の分子または組換えタンパク質を薬剤として使用することもできる。好ましい実施形態では、本発明の分子または組換えタンパク質を、対象中での抗原に対する免疫応答の誘発で使用する。別の好ましい実施形態では、本発明に係るインフルエンザ抗原を含む分子または組換えタンパク質を、インフルエンザウイルスに対する免疫応答の誘発で使用する。より好ましい実施形態では、本発明に係る組換えインフルエンザＨＡタンパク質を、インフルエンザウイルスに対する免疫応答の誘発で使用する。別の好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物はワクチン組成物である。
【００９９】
本発明の医薬組成物および免疫原性組成物は、従来の医薬製剤またはワクチン製剤として製剤化され得る。これは、標準的な医薬製剤またはワクチン製剤の化学および方法を使用して行なうことができ、これらの化学および方法を当業者は入手可能である。特にヒトで二次反応（例えばアレルギー反応）を全く生じない、活性剤の安定性、無菌性、効力または送達性を増強するために医薬品およびワクチンの製剤化で一般に使用されるあらゆる溶媒、分散媒、電荷（ｃｈａｒｇｅ）、アジュバント等を使用することができる。この添加剤は、選択される医薬形態またはワクチン形態、投与の方法および経路に基づいて選択される。適切な添加剤および医薬製剤に関する要件は、当技術分野での参考文献である“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５））で説明されている。薬学的に許容される添加剤の例は、水、リン酸緩衝生理食塩溶液および０．３％グリシン溶液である。
【０１００】
医薬組成物および免疫原性組成物は、従来の無菌技術により無菌化してもよく、または無菌ろ過してもよい。結果として生じる水溶液を包装して液体形態で保存してもよく、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥製剤を投与前に無菌水性担体で再構成する。好ましい実施形態では、医薬組成物および免疫原性組成物を包装し、国際公開第２００９１０９５５０号パンフレットで説明されている小球化プロセスによりマイクロペレットとして保存する。この製剤のｐＨは概して３〜１１であることができ、例えば５〜９、６〜８または７〜８であることができ、例えば７〜７．５であることができる。
【０１０１】
製剤化または再構成されると、医薬組成物および免疫原性組成物は、様々な既知の経路および技術を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで対象に送達され得る。例えば、液体製剤を注射可能な溶液、懸濁液または乳濁液として準備し、従来の針およびシリンジを使用するまたは液体ジェット注射システムを使用する非経口注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射により投与することができる。液体製剤を皮膚もしくは粘膜組織に局所的に投与することもでき、または呼吸もしくは経肺投与に適した微細化噴霧として準備することもできる。その他の投与様式として、経口投与、坐薬および能動的なまたは受動的な経皮的送達技術が挙げられる。
【０１０２】
経口投与の場合、医薬組成物および免疫原性組成物は、例えばカプセル、錠剤、懸濁液または液剤として製剤化することができる。
【０１０３】
医薬組成物および免疫原性組成物を固体形態（例えば顆粒、マイクロペレット、粉末または坐薬）で調製することもできる。
【０１０４】
別の実施形態は、患者を処置する方法であって、本発明の医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法を対象とする。好ましい実施形態は、患者中で抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物を前記患者に投与することを含む方法を意図する。
【０１０５】
別の実施形態は、組換えタンパク質を多量体化する方法であって、
ａ）配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列に融合させることであって、但し前記組換えタンパク質がヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体タンパク質ではない、融合させること、
ｂ）前記組換えタンパク質の多量体化がもたらされる条件下で、前記核酸配列によりコードされる融合タンパク質を発現させること
を含む方法を対象とする。この条件は当業者に既知であり、極端な条件（例えば、高濃度の溶質、極端なｐＨ、機械的力および化学的変性剤の存在）を避けることから本質的になる。
【０１０６】
別の実施形態は、組換えタンパク質を多量体化する方法であって、
ａ）配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列に融合させることであって、但し前記組換えタンパク質がヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体タンパク質ではない、融合させること、
ｂ）前記組換えタンパク質の多量体化がもたらされる条件下で、前記核酸配列によりコードされる融合タンパク質を発現させること
を含む方法を対象とする。
【０１０７】
好ましい実施形態では、この方法は、抗原、抗体または足場の多量体化用である。最も好ましい実施形態では、この方法は、組換えインフルエンザＨＡまたはＨＡ外部ドメインのタンパク質の多量体化用である。
【実施例】
【０１０８】
実施例１：組換えインフルエンザＨＡ外部ドメインタンパク質の重合
ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体のＣ末端に由来する２種の配列を、ＨＡタンパク質のＣ末端への融合により評価した。第１の試験配列は配列番号１であり、第２の試験配列は配列番号２であった。配列番号１は配列番号２の短縮バージョンである。配列番号１はヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体の最Ｃ末端での３０個のアミノ酸と一致し、配列番号２はヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体の最Ｃ末端での４３個のアミノ酸と一致する（国際公開第２００８／０１６，８５４号パンフレットの図１１Ｃを参照されたい）。最Ｃ末端は、ＶＬＲ−ＢのＣ末端からＳｔａｌｋ領域の部分を意味する。
【０１０９】
試験する第３の配列はＴ４ファージのフォルドン配列（配列番号５）であった。
【０１１０】
インフルエンザ株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）由来のＨＡ外部ドメイン（独自のシグナル配列を含むが、ＨＡの膜貫通領域および細胞質側末端領域の配列を含まない）をコードする核酸配列を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりリーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）中でのコドン使用に最適化した。本明細書では、この配列を配列番号１０と称する。
【０１１１】
試験する３種の多量体化配列（即ち、ＶＬＲ−Ｂ抗体のＣ末端に由来する２種の配列およびＴ４ファージフォルドン配列）をコードする核酸配列を個々に、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、配列番号１０の核酸配列（インフルエンザ株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９由来のＨＡタンパク質の外部ドメインをコードする）に融合させた。従って、配列７は、配列番号１０の核酸配列に融合した配列番号３の核酸配列（配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明に係るヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の短縮断片）をコードする核酸配列である）である。配列８は、配列番号１０の核酸配列に融合した配列番号４の核酸配列（配列番号２のアミノ酸配列（即ち本発明に係るヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の「長」（短縮されていない）断片）をコードする核酸配列である）であり、配列９は、配列番号１０の核酸配列に融合した配列番号６の核酸配列（配列番号５のアミノ酸配列（即ち、Ｔ４ファージのフォルドン配列）をコードする核酸配列である）である。
【０１１２】
配列番号７、配列番号８および配列番号９をそれぞれ別々に、図１に示すｐＬｅｘｓｙ−Ｉ−ｂｌｅｏ２発現カセットのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限部位に挿入した。配列番号１０を、ｐＬｅｘｓｙ−Ｉ−ｂｌｅｏ２発現カセットのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限部位に挿入した。この発現カセットは、宿主のＲＮＡポリメラーゼＩの制御下でバクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴＥＴリプレッサーを構成的に発現するリーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）Ｔ７−ＴＲ受容株（Ｋｕｓｈｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，４２（１），３７−４６（２００５））の染色体のオルニチンデカルボキシラーゼ（ｏｄｃ）遺伝子座への目的の遺伝子の組込みを可能にする。目的のタンパク質の発現の誘発を、テトラサイクリン添加により誘発可能なＴ７プロモーターにより実行する（ユーザーズガイドＥＧＥ−１４００、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１１３】
次いで、重合配列のうちの１つを有するまたは有しないＨＡ配列を含む発現カセットをＳｗａＩで消化し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ装置（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するおよびＢａｓｉｃ  Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ  １（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｌｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の指示に従うヌクレオポレーション（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により、精製した各直鎖状ＳｗａＩ断片１μｇを別々の実験でＬ．タレントラエ（Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）Ｔ７−ＴＲ宿主株中に遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を、５μｇ／ｍｌのヘミン、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（細菌汚染を避けるためのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、１００μｇ／ｍｌのノウルセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）（ＮＴＣ）および１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（ＮＴＣ／ハイグロ：Ｔ７−ＴＲ宿主中でＴ７ポリメラーゼ遺伝子およびＴＥＴリプレッサー遺伝子をそれぞれ維持するため）を含むＢＨＩ（ブレイン−ハートインフュージョン）培地（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１０ｍｌ中に移し、暗所において２６℃で一晩インキュベートした。遺伝子導入から２４時間後に懸濁液の２ｍｌアリコートを２０００ｇで５分にわたり遠心分離し、ペレットをＢＨＩ培地５０〜１００μｌに再懸濁させ、細胞を、抗生物質および組換え寄生生物の選択用の１００μｇ／ｍｌのブレオマイシンを含む新鮮なＢＨＩ寒天プレート（選択的増殖培地）上に静かに播種した。播種から約７〜９日後に小さいコロニーを視認し、選択的増殖培地０．２ｍｌに移した。寄生生物の各組換えクローンを、２６℃において振とうフラスコ中で選択培地１０ｍｌに広げた。
【０１１４】
ＨＡ配列を含む発現カセットのゲノムへの組込みの確認を、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの推奨に従う診断ＰＣＲにより実施した。
【０１１５】
確認した組換え寄生生物を、ヘミンおよび抗生物質を上記で説明したように補充したＢＨＩ培地１００ｍｌ中で２６℃において培養し、暗所において１００ｒｐｍで撹拌した。ｒＨＡタンパク質の産生を誘発するために、寄生生物の接種時に補充培地に１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを添加することにより、Ｔ７により駆動される転写を誘発した。
【０１１６】
発酵用に、１リットルのＢｉｏｓｔａｔ  Ｑｐｌｕｓ  １２発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。簡潔に言うと、補充ＢＨＩ培地７００ｍｌに、指数関数的増殖（０．４ＯＤ６００）で組換え寄生生物スターター培養物の１／１０を接種し、２６℃、１００ｒｐｍ、４０％ｐＯ２、ｐＨ７．４±０．１において暗所で培養した。ＭＦＣＳ／ＷＩＮソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ）を使用して培養パラメータを記録した。１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを使用する誘発を（振とうフラスコ培養物に関して行なったように）組換え寄生生物の接種と並行して実施した。誘発から４３時間後にＨＣｌ  １Ｎ／ＮａＯＨ  １ＮによるｐＨの調節および１．５ｍｌ／時間での１００ｇ／Ｌのグルコース溶液の注入を開始し、Ｐ１８６０抗プロテアーゼカクテル（１／８００、Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）を同時に添加した。
【０１１７】
培養物の試料を毎日採取して、この培養物の光学密度（ＯＤ６００）（１ＯＤ６００は約１．５×１０７個の寄生生物／ｍｌに相当する）を測定し、様々な代謝産物（Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕｃ、Ｌａｃ、ＮＨ４＋）の濃度および細胞移動度を顕微鏡で測定した。
【０１１８】
４８時間後、形質転換リーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）培養物の上清を回収し、０．２μｍフィルタでろ過した。５９５ｎｍでの光学密度測定により試料中のタンパク質を定量化し、試料を正規化した。
【０１１９】
各試料２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ  ４〜１２％、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）にロードして泳動した。転写誘発体テトラサイクリンの非存在下で４８時間を超えて培養した形質転換リーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）培養物からの上清は、陰性コントロールの役割を果たした。
【０１２０】
様々な発現プラスミドを使用して得た様々な組換えＨＡタンパク質の熱安定性を試験するために、３種の試験試料および陰性コントロール試料を２つに分け、各試料の半分を、加熱ブロックを使用して１５分にわたり９９℃に加熱した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、残り半分を加熱することなくＳＤＡ−ＰＡＧＥゲル上で泳動した。ゲルでの更なるコントロール試料は、別のタンパク質（即ち、インフルエンザに対する抗体）を発現するプラスミドで形質転換したリーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）の加熱培養上清（９９℃の温度で１５分）を含んだ。
【０１２１】
ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを作成し、続いてＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％および乳５％（ＤＩＦＣＯ−ＢＤ、Ｓｐａｒｋｓ，ＵＳＡ）で処理して非特異的定着部位をブロックした。
【０１２２】
８０００の力価（赤血球凝集の抑制）および３２０００の力価（血清中和）の、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９  ＨＡに対するウサギポリクローナル抗体を使用し、続いて抗ウサギＩＲＤｄｙｅ８００ＣＷ抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＳＡ）およびＯＰＴＩ−４ＣＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）基質を使用してブロットをプローブした。このウェスタンブロットをＯＤＹＳＳＥＹ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）撮像システムで分析した。
【０１２３】
このウェスタンブロットの結果を図２に示す。この結果は非常に顕著であった。初めに、Ｔ４フォルドン配列（配列番号５、レーン１１〜１２）に融合したＨＡタンパク質は三量体型のみであったが、配列番号１のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインに融合したＨＡタンパク質（レーン７〜８）または配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインに融合したＨＡタンパク質（レーン９〜１０）は、三量体としてだけでなく、四量体、五量体およびその他のより高次な重合型としても産生された。加えて、ＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端配列に融合したＨＡタンパク質は大部分が培養上清中に分泌されており、細胞内ではＨＡをほとんどまたは全く検出せず、溶解も観測しなかった（結果を示さない）。培養上清中への組換えタンパク質の分泌は、宿主細胞内に残存する組換えタンパク質の精製と比較した場合、下流精製にとって非常に有利である。更に、試験したヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインのいずれか１つに融合したＨＡタンパク質から得られたポリマーは加熱処理後に安定であった（レーン７および９）が、Ｔ４フォルドン配列に融合したＨＡタンパク質は加熱処理後にその三量体型を失った（レーン１１）ことが分かる。試験したヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインのうちの１つに融合したＨＡタンパク質から得られたポリマーの熱安定性は重要であり、なぜなら、安定性の増加により、そのような抗原を含む免疫原性組成物の保存可能期間が延びるはずだからである。更に、熱安定性の組換えタンパク質抗原は、患者に注入された場合により長いｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を有することも期待される。
【０１２４】
実施例２：ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインへの融合により重合した組換えインフルエンザＨＡタンパク質の免疫原性研究
配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインへの融合により重合した組換えＨＡ外部ドメインタンパク質（ｒＨＡポリ）を実施例１で説明したように製造した。
【０１２５】
Ｌ．タレントラエ（Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）培養培地中でのテトラサイクリンによる誘発の７２時間後、振とうフラスコ回収を実施して５，０００ｇで３０分にわたり遠心分離した。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓａｒｔｏｃｏｎ  ｓｌｉｃｅ  ２００カセットによる濃縮および透析ろ過後、上清を１ｍｌのＣｏｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム上に置いた。ＰＢＳ−ＭＭ緩衝液中の０．５Ｍのアルファ−Ｄ−メチルマンノシドを使用して、組換えＨＡを溶出させた。溶出液をＰＢＳ／ｔｗｅｅｎに対して透析し、Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ  １０Ｋで濃縮し、０．２２μｍフィルタでろ過した。組換えＨＡをマイクロブラッドフォールド（ｍｉｃｒｏｂｒａｄｆｏｒｄ）技術で滴定した。各試料をＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．００５％に再懸濁させた。
【０１２６】
１０匹の雌の８週齢Ｂａｌｂ／Ｃ  ＢｙＪマウスからなる２つの群に、配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインへの融合により重合したインフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  ｒＨＡ外部ドメインタンパク質（ｒＨＡポリ）１０μｇ（実施例１で説明したように製造した）またはｒＨＡ外部ドメインのみ（即ち重合配列に融合していないｒＨＡ外部ドメイン）（配列番号１１）を発現するプラスミドで形質転換させたリーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）中で産生されたインフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  ｒＨＡ外部ドメインモノマータンパク質（ｈｒＨＡモノ）１０μｇのいずれかによる、筋肉内（ＩＭ）経路を介した２回の免疫付与（１回は０日目および１回は２８日目）を施した。ｒＨＡタンパク質１０μｇを緩衝液（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．００５％）に再懸濁させ、注入体積は２×５０μｌ（合計で１００μｌ）であった。
【０１２７】
最後に、５匹の雌の８週齢Ｂａｌｂ／Ｃ  ＢｙＪマウスに緩衝液１００μｌ（２×５０μｌ）を投与した。
【０１２８】
このブースター注射の３週間後、全ての動物からＤ４９での麻酔下で血液サンプルを採取した。この麻酔を、腹腔内経路を介して２００μｌの体積で投与したＩｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）（ケタミン１．６ｍｇ）およびＲｏｍｐｕｎ（キシラジン０．３２ｍｇ）により実施した。血液１ｍｌを、凝血活性化剤および血清分離剤を含むバイアル（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ  ｒｅｆ  ３６７７８３）に回収した。＋４℃で一晩または３７℃で１時間後、この血液を５分にわたり１０，０００ｒｐｍまたは２０分にわたり３，０００ｒｐｍで遠心分離し、分析するまで血清を−２０℃で保存した。
【０１２９】
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）株に対する赤血球凝集抑制抗体の存在を、ニワトリの赤血球（ｃＲＢＣ）を使用して評価した。Ｋｅｎｄａｌらにより、Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｎ−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ，１９８２，ｐｐ．Ｂ１７−Ｂ３５．９で説明されているように、受容体破壊酵素（ＲＤＥ）処理した血清サンプルそれぞれにアッセイを実施して、力価を、赤血球凝集を示さない最高希釈度の逆数として表した。
【０１３０】
赤血球凝集アッセイの抑制の結果を図３に示す。ポリマーｒＨＡ外部ドメインによるマウスへの免疫付与によって得られる赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）力価は、モノマーｒＨＡ外部ドメインによるマウスへの免疫付与によって得られるＨＡＩ力価と比べて有意に高い。表Ｉは、配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインへのインフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９ｒＨＡ外部ドメインタンパク質の融合により得られるポリマーｒＨＡ外部ドメインは、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９モノマーｒＨＡ外部ドメインと比べて免疫原性が４倍高いことを示す。
【０１３１】
【表１】
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【０１３２】
実施例３：ＣＨＯ細胞中で発現された組換えインフルエンザＨＡ外部ドメインタンパク質の重合
ヤツメウナギ配列との融合による組換えインフルエンザＨＡ外部ドメインタンパク質の重合を別の宿主細胞でも試験した。
【０１３３】
インフルエンザ株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＦＪ９６６０８２）由来のＨＡ外部ドメイン（独自のシグナル配列を含むが、ＨＡの膜貫通領域および細胞質側末端領域の配列を含まない）をコードする核酸配列を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＣＨＯ中でのコドン使用に最適化した。本明細書では、この配列を配列番号１２と称する。
【０１３４】
ＣＨＯ中でのコドン使用に最適化した、試験する３種の多量体化配列（即ちＶＬＲ−Ｂ抗体のＣ末端に由来する２種の配列およびＴ４ファージフォルドン配列）をコードする核酸配列を個々に、配列番号１２の核酸配列に融合させた。従って、配列番号１３は、配列番号１２の核酸配列に融合した配列番号３の核酸配列である。配列番号１４は、配列番号１２の核酸配列に融合した配列番号４の核酸配列であり、配列番号１５は、配列番号１２の核酸配列に融合した配列番号６の核酸配列である。配列番号２６は、配列番号１３によりコードされるタンパク質配列である。配列番号２７は、配列番号１４によりコードされるタンパク質配列である。配列番号２８は、配列番号１５によりコードされるタンパク質配列である。
【０１３５】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５をそれぞれ別々に、図４に示すｐＥＥ１４．４発現カセットのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した。組換えタンパク質が構成的に発現されることから、この発現カセットでは誘発の必要がない。
【０１３６】
重合配列のうちの１つを有するまたは有しないＨＡ配列を含む発現カセットを、ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯＫ１６９  ＡＴＣＣ番号ＣＢ−ＣＣＬ−６１ｐＵｎＫ）中に遺伝子導入した。各プラスミド１０μｇを別々に、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ装置（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するヌクレオポレーションにより、１０×１０６個のＣＨＯ細胞中に導入した。次いで、ＣＨＯ細胞を、３７℃で、４ｍＭのＬ−グルタミンを含むＥＸ−Ｃｅｌｌ（登録商標）ＣＨＯ融合動物成分フリー培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２ｍｌ上に播種した。培養を２４時間にわたり５％ＣＯ２下で３７℃において静的に維持し、次いで４８時間にわたり撹拌しつつ（１００ｒｐｍ）維持した。
【０１３７】
ヌクレオポレーションの７２時間後、１０，０００ｒｐｍでの１０秒にわたる遠心分離により、形質転換ＣＨＯ培養物の上清を回収した。
【０１３８】
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（４ｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５μｌと混合した各試料１５μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ３〜８％Ｔｒｉｓ−酢酸塩、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）にロードして泳動した。あらゆる発現カセットの非存在下で電気穿孔したＣＨＯ培養物からの上清は、陰性コントロールの役割を果たした。ＨｉＭａｒｋ（商標）Ｐｒｅｓ染色Ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＬＣ５６９９  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｌｏｌｏｇｉｅｓ）２０μｌを分子量マーカーとして使用した。
【０１３９】
試料分離を、４０分にわたりＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液中で１５０Ｖにおいて実施した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１４０】
ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを作成し、続いてＰＢＳおよび乳５％（ＤＩＦＣＯ−ＢＤ、Ｓｐａｒｋｓ，ＵＳＡ）で一晩処理して非特異的定着部位をブロックした。
【０１４１】
室温で１時間にわたり、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＨＡに対するウサギポリクローナル抗体（ＰＢＳで１／１０００に希釈した）を使用してブロットをプローブした。次いで、このブロットをＰＢＳおよびＴｗｅｅｎ２０  ０．０５％で３回洗浄した後、ＰＢＳで１／５０００に希釈した抗ウサギＩＲＤｄｙｅ８００ヒツジ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｌｉｍｅｒｉｃｋ，ＵＳＡ）と共にインキュベートした。このウェスタンブロットをＯＤＹＳＳＥＹ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）撮像システムで分析した。
【０１４２】
このウェスタンブロットの結果を図５に示す。この結果も顕著であった。初めに、Ｔ４フォルドン配列に融合したＨＡタンパク質は二量体型または三量体型のみであったが、配列番号１のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメイン（短ヤツメウナギ配列）に融合したＨＡタンパク質または配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメイン（長ヤツメウナギ配列）に融合したＨＡタンパク質は、二量体または三量体としてだけでなく、四量体、五量体およびその他のより高次の重合型としても産生された。加えて、ＨＡタンパク質は培養上清中に分泌されており、なぜなら、ブロットを培養上清に対して行なったからである。培養上清中への組換えタンパク質の分泌は、宿主細胞内に残存する組換えタンパク質の精製と比較した場合、下流精製にとって非常に有利である。
【０１４３】
実施例４：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現された組換えシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＩｐａＤタンパク質の重合
シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）血清型２ａ株３０１（Ｑ．Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（２０），４４３２−４４４１（２００２）、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３８６５２６）由来のＩｐａＤタンパク質をコードする核酸配列を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのコドン使用に最適化した。本明細書では、この配列を配列番号１６と称する。
【０１４４】
配列番号１６を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にコドン最適化した配列番号４の核酸配列に融合させて、配列番号１７を生成した。対応するタンパク質配列は配列番号１８である。配列番号１６および配列番号１７を、ＧＧＳＬＥリンカーを介してポリヒスチジン−タグ（６×Ｈｉｓ）をコードする配列にも融合させ、配列番号１９（ＩｐａＤ−Ｈｉｓ、ＩｐａＤ配列とＨｉｓ−タグとの間にＧＧＳＬＥリンカー存在する）および配列番号２０（ＩｐａＤ−ヤツメウナギ−Ｈｉｓ、ＩｐａＤ−ヤツメウナギ配列とＨｉｓ−タグとの間にＧＧＳＬＥリンカーが存在する）をそれぞれ生成した。
【０１４５】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２０をそれぞれ別々に、図６に示すｐＭ１８００発現カセットのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ制限部位に挿入した。目的のタンパク質の発現の誘発をＩＰＴＧの添加により実行する。
【０１４６】
重合配列を有するまたは有しない、ならびにリンカー配列およびＨｉｓ−タグ配列を有するまたは有しないＩｐａＤ配列を含むプラスミド５μｇを水１０μｌに懸濁させた。重合配列を有するまたは有しない、ならびにリンカー配列およびＨｉｓ−タグ配列を有しないＩｐａＤ配列に対応する懸濁液０．５μｌを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ＤＥ３  Ｃ６０００−０３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｈｕｆｆｌｅ（Ｂ）ｒｅｆＣ３０２９Ｈ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、即ちタンパク質内でのジスルフィド結合の形成を促進するように操作されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））のいずれかの培養物に添加した。重合配列を有するまたは有しないがリンカー配列およびＨｉｓ−タグ配列を有するＩｐａＤ配列に対応する懸濁液０．５μｌを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｈｕｆｆｌｅ（Ｂ）に添加した。混合後、試料を１５分にわたり氷上に置いた。次いで、試料に３０秒にわたり４２℃で熱ショックを加えた。次いで、試料を２分にわたり氷上に置いた後、室温のＳ．Ｏ．Ｃ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）５００μｌで希釈した。次いで、試料を６０分にわたり３７℃でインキュベートした後、激しく振とうした（２５０ｒｐｍ）。
【０１４７】
各試料１００μｌを希釈し、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地プレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。無菌接種ループを使用して各形質転換プレートからコロニーを採取し、ＬＢブロス／カナマイシン２５μｇ／ｍｌ  ２ｍｌに添加した。次いで、培養物をＬＢ＋カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）培地２５ｍｌで希釈して、ＯＤ６００＝０．０５の播種を表す光学密度を得た。
【０１４８】
撹拌しつつ（２００ｒｐｍ）３７℃での増殖の２時間後、培養物が０．４〜０．８のＯＤ６００に達した場合にＩＰＴＧ  １ｍＭにより（即ち１Ｍ  ＩＰＴＧ  ２５μｌの添加により）組換えタンパク質の産生を誘発した。
【０１４９】
細菌を、撹拌しつつ約４時間にわたり３７℃で維持した。１ＯＤ６００単位を各Ｅｒｌｅｎフラスコから取り出して遠心分離した。上清の除去後、ペレットを−２０℃で保存した。
【０１５０】
このペレットを、ＴｒｉｓＥＤＴＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、Ｎｏｖａｇｅｎ）７５μｌ＋１／５０に希釈したＲｅａｄｙ  ｌｙｓｅ  ３５ＫＵ／μｌ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）１μｌ＋ベンゾナーゼ２５Ｕ／μｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ）１μｌに再懸濁させた。次いで、試料を３７℃で２０分にわたり撹拌した後、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（４Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５μｌを添加した。各試料２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）３〜８％Ｔｒｉｓ−酢酸塩、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）にロードして泳動した。ＨｉＭａｒｋ（商標）Ｐｒｅｓ染色Ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＬＣ５６９９  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｌｏｌｏｇｉｅｓ）１５μｌを分子量マーカーとして使用した。
【０１５１】
ＩｐａＤ配列を含まないｐＭ１８００（ＩＰＴＧにより誘発された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に挿入されている）は陰性コントロールの役割を果たした。試料分離を、１時間にわたりＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液中で１５０Ｖにおいて実施した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１５２】
ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを作成し、続いてＰＢＳおよび乳５％（ＤＩＦＣＯ−ＢＤ、Ｓｐａｒｋｓ，ＵＳＡ）で１時間にわたり処理した。
【０１５３】
ＩｐａＤに対するマウスモノクローナル抗体を使用し、続いてＰＢＳで１／５０００に希釈したＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  Ｇｏａｔ抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または抗マウスＩＲＤｙｅ８００抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を使用してブロットをプローブした。このウェスタンブロットをＯＤＹＳＳＥＹ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）撮像システムで分析した。
【０１５４】
これらのウェスタンブロットの結果を図７および８に示す。これらの結果は、上記の実施例１および３においてｒＨＡで観測した結果に類似している。実際には、図７は、ヤツメウナギ配列を有しないＩｐａＤタンパク質は二量体として発現される（ＩｐａＤ単量体は予想される分子量が３６．６ｋＤａである）が、配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインに融合したＩｐａＤタンパク質は、二量体としてだけでなく、三量体、四量体、五量体およびその他のより高次の重合型としても産生された（融合ＩｐａＤ−ヤツメウナギ単量体は予想される分子量が４１．２ｋＤａである）ことを示す。重合したＩｐａＤタンパク質は、Ｓｈｕｆｆｌｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中において最高量で産生された。
【０１５５】
図８の結果は、組換えタンパク質の下流精製に有用なＨｉｓ−タグの添加が、配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインによるＩｐａＤタンパク質の重合に悪影響を及ぼさないことを示す。
【０１５６】
得られた様々な組換えＩｐａＤタンパク質の熱安定性を試験するために、更なるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での泳動前に加熱ブロックを使用して試験試料および陰性コントロール試料を１０分にわたり９５℃に加熱した以外は上記で説明したように行なった。
【０１５７】
このウェスタンブロットの結果を図９に示す。配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインに融合したＩｐａＤタンパク質から得られたポリマーは、その後の加熱処理で安定であったことが分かる。配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインに融合したＩｐａＤタンパク質から得られたポリマーの熱安定性は重要であり、なぜなら、安定性の増加により、そのような抗原を含む免疫原性組成物の保存可能期間が延びるはずだからである。更に、熱安定性の組換えタンパク質抗原は、患者に注入された場合により長いｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を有することも期待される。
【０１５８】
実施例５：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された組換えシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＭｘｉＨタンパク質の重合
シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）血清型２ａ株３０１由来のＭｘｉＨタンパク質をコードする核酸配列を、Ｇｅｎｅａｒｔにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのコドン使用に最適化した。本明細書では、この配列を配列番号２１と称する。
【０１５９】
配列番号２１を、Ｇｅｎｅａｒｔにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にコドン最適化した配列番号４の核酸配列に融合させて、配列番号２２を生成した。対応するタンパク質配列は配列番号２３である。配列番号２１および配列番号２２を、ＧＧＳＬＥリンカーを介してポリヒスチジン−タグ（６×Ｈｉｓ）をコードする配列にも融合させ、配列番号２４（ＭｘｉＨ−Ｈｉｓ、ＭｘｉＨ配列とＨｉｓ−タグとの間にＧＧＳＬＥリンカー存在する）および配列番号２５（ＭｘｉＨ−ヤツメウナギ−Ｈｉｓ、ＭｘｉＨ−ヤツメウナギ配列とＨｉｓ−タグとの間にＧＧＳＬＥリンカーが存在する）をそれぞれ生成した。
【０１６０】
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２５をそれぞれ別々に、ｐＭ１８００発現カセットのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ制限部位中に挿入した。目的のタンパク質の発現の誘発をＩＰＴＧの添加により実行する。
【０１６１】
重合配列を有するまたは有しない、ならびにリンカー配列およびＨｉｓ−タグ配列を有するまたは有しないＭｘｉＨ配列を含むプラスミド５μｇを水１０μｌに懸濁させた。各懸濁液０．５μｌを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ＤＥ３  Ｃ６０００−０３または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｈｕｆｆｌｅ（Ｂ）ｒｅｆＣ３０２９Ｈのいずれかに添加し、この細菌に実施例４で説明したように熱ショックを加えた。
【０１６２】
次いで、実施例４で説明したように、試料をＬＢ培地上で培養し、ＩＰＴＧにより誘発し、遠心分離し、細胞ペレットを−２０℃で保存した。
【０１６３】
このペレットを、ＴｒｉｓＥＤＴＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、Ｎｏｖａｇｅｎ）６３μｌ＋１／２０に希釈したＲｅａｄｙ  ｌｙｓｅ  ２０ＫＵ／μｌ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）１μｌ＋ベンゾナーゼ２５Ｕ／μｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ）１μｌに再懸濁させた。次いで、試料を３７℃で１０分にわたり撹拌した後、１０分にわたり１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。
【０１６４】
上清６０μｌをＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（４ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μｌと混合し、ペレットをＴｒｉｓＥＤＴＡ６０μｌおよびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（４ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μｌに懸濁させた。
【０１６５】
各試料１５μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）にロードして泳動した。ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｌｏｌｏｇｉｅｓ）１５μｌを分子量マーカーとして使用した。
【０１６６】
ＩＰＴＧにより誘発された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に挿入された、ＭｘｉＨ配列を含まないｐＭ１８００は、陰性コントロールの役割を果たした。試料分離を、３０分にわたりＭＥＳ緩衝液中において２００Ｖで実施した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１６７】
実施例４で説明したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを作成した。
【０１６８】
ＭｘｉＨに対するマウスポリクローナル抗体（ＰＢＳで１／１０００に希釈した）を使用し、続いてＰＢＳで１／５０００に希釈したウサギ抗マウスＩＲＤｙｅ８００抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を使用して、ブロットをプローブした。Ｈｉｓに対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）（ＰＢＳで１／１０００に希釈した）を使用し、続いてＰＢＳで１／５０００に希釈したウサギ抗マウスＩＲＤｙｅ８００抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を使用して、別のウェスタンブロットをプローブした。これらのブロットをＯＤＹＳＳＥＹ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）撮像システムで分析した。
【０１６９】
これらのウェスタンブロットの結果を図１０および図１１に示す。ＭｘｉＨに対するマウスポリクローナル抗体でプローブしたブロットを示す図１０の結果は、上記の実施例１および３でのｒＨＡで観測した結果および実施例４でのＩｐａＤで観測した結果と類似する。実際に、図１０は、ＢＬ２１株中においておよびＳｈｕｆｆｌｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中において（Ｓｈｕｆｆｌｅで最も強い発現）、配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインに融合したＭｘｉＨタンパク質が、二量体、三量体、四量体、五量体およびその他のより高次の重合型として産生された（融合ＭｘｉＨ−ヤツメウナギ単量体は予想される分子量が１３．８６ｋＤａである）ことを示す。ＭｘｉＨをペレット（不溶性画分：図１０および図１１でのＩＳ）中で見出した。Ｈｉｓに対するマウスモノクローナル抗体でプローブしたブロットを示す図１１の結果は、Ｈｉｓ−タグの添加が、配列番号２のヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体Ｃ末端ドメインによるＭｘｉＨタンパク質の重合に有害な影響を及ぼさないことを示す。図１０および図１１ではＭｘｉＨが見られない。本発明者らは、ヤツメウナギ配列を有しないＭｘｉＨが、ブロット上で抗体により現れるには少なすぎる量で産生されると考える。
【図１−１】
2018505135.tif 000003
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018505135.tif 000009
【図７】
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【図８】
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【図９】
2018505135.tif 000012
【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年12月20日(2016.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含む分子であって、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モジュールを含まない分子。
【請求項２】
配列番号２９で定義される配列の群から選択される配列を含まない、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
前記分子中におけるヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体に由来するアミノ酸配列のみが、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列である、請求項１または２に記載の分子。
【請求項４】
組換えタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子。
【請求項５】
配列番号１の２位、７位、１３位、１９位、２１位、２４位および２７位に対応する前記分子内の位置でシステイン残基を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分子。
【請求項６】
前記第１のアミノ酸配列が配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性または１００％の同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子。
【請求項７】
配列番号２を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項８】
前記第１のアミノ酸配列と前記異種アミノ酸配列との間にリンカーが存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分子。
【請求項９】
前記異種アミノ酸配列が抗原をコードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１０】
前記抗原が、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、コクサッキーウイルス、単純ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からなる群から選択される、請求項９に記載の分子。
【請求項１１】
前記抗原がインフルエンザウイルス由来であり、かつ赤血球凝集素（ＨＡ）、マトリックス２タンパク質（Ｍ２）およびＨＡＭ２融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１０に記載の分子。
【請求項１２】
前記抗原がインフルエンザ赤血球凝集素であり、好ましくはインフルエンザ赤血球凝集素の外部ドメインである、請求項１１に記載の分子。
【請求項１３】
前記抗原がシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）由来であり、かつＩｐａＤおよびＭｘｉＨからなる群から選択される、請求項１０に記載の分子。
【請求項１４】
前記異種アミノ酸配列が抗体または足場をコードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１５】
前記抗体または足場が、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、コクサッキーウイルス、単純ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からなる群から選択される抗原に特異的である、請求項１４に記載の分子。
【請求項１６】
前記抗体が、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および二重特異性抗体（Ｄｂ）からなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の分子。
【請求項１７】
前記異種アミノ酸配列が、二重特異性抗体、多重特異性抗体、二重特異性足場および多重特異性足場からなる群から選択される抗体または足場をコードする、請求項１４または１５に記載の分子。
【請求項１８】
配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１の核酸配列と、前記第１の配列に対して異種である第２の核酸配列とを含む組換え核酸であって、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モジュールをコードしない組換え核酸。
【請求項１９】
前記第１の核酸配列がアミノ酸配列をコードし、前記アミノ酸配列が、配列番号１の２位、７位、１３位、１９位、２１位、２４位および２７位に対応する前記アミノ酸配列内の位置でシステイン残基を含む、請求項１８に記載の組換え核酸。
【請求項２０】
前記第１の核酸配列が配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性または１００％の同一性を有する、請求項１８または１９に記載の組換え核酸。
【請求項２１】
配列番号４を含む、請求項１８または１９に記載の組換え核酸。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組換え核酸を含む発現カセットであって、前記組換え核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、発現カセット。
【請求項２３】
請求項２２に記載の発現カセットで形質転換されている宿主細胞。
【請求項２４】
原核生物であり、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）種、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からなる群から選択される原核生物宿主細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
真核生物であり、好ましくは、原生生物、昆虫細胞、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、微細藻類または真菌からなる群から選択される宿主細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
リーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）、ＣＨＯおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からなる群から選択される、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
安定な多量体タンパク質を形成することができる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の分子。
【請求項２８】
配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に融合している、インフルエンザＨＡタンパク質の外部ドメイン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＩｐａＤタンパク質およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＭｘｉＨタンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む安定なホモ多量体組換えタンパク質。
【請求項２９】
請求項１〜１７もしくは２７のいずれか一項に記載の分子または請求項２８に記載の組換えタンパク質と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項３０】
薬剤として使用するための、請求項１〜１７もしくは２７のいずれか一項に記載の分子または請求項２８に記載の組換えタンパク質。
【請求項３１】
対象中での抗原に対する免疫応答の誘発で使用するための、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の分子または請求項２８に記載の組換えタンパク質。
【請求項３２】
組換えタンパク質を多量体化する方法であって、
ａ）配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列に融合させることであって、但し前記組換えタンパク質がヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体由来のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モジュールを含まない、融合させること、
ｂ）前記組換えタンパク質の多量体化をもたらす条件下で、前記核酸配列によりコードされる融合タンパク質を発現させること
を含む方法。
【国際調査報告】
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