(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病及び関連障害の治療及び管理に使用するための抗体分子及びペプチド送達系に関する。詳細には、抗体分子は、単一ドメイン形式で、ベータアミロイドペプチドのオリゴマー形態に優先的に結合し、ペプチド送達系は、血液脳関門を超えるそのような抗体分子の特異的輸送はもちろん、他のカーゴ分子のそのような特異的輸送も促進する。本発明は、抗体分子及び送達ペプチドのコンストラクト、並びに有効量の抗体分子、送達ペプチド及び／又はそれらのコンストラクト（ヒト化バージョンの抗体分子及びコンストラクトを含む）を含む医薬組成物にも関する。本発明は、これらの生成物及びそれらの医薬組成物を製造する方法、並びにアルツハイマー病及び関連障害、例えば、脳内で凝集するベータアミロイドペプチド若しくは他のペプチドの蓄積を含むものの治療又は防止に医薬組成物を使用する方法、並びにこれらの障害を診断するための方法及びキットに、さらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータアミロイドペプチド４２（ＢＡＰ４２）の少なくとも１つのオリゴマー形態に対して、及び／又はモノマーＢＡＰ４２に対して免疫特異性を有する抗体分子であって、
好ましくは、フィブリルＢＡＰ４２に対して免疫特異性を有さない、前記抗体分子。
【請求項２】
血液脳関門を通過する、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗体分子であって、
前記分子が、Ｆｃドメイン若しくはｓｃＦｖ分子、又は配列番号１２７からなるポリペプチドのドメインに融合体として、好ましくはペプチドリンカーによって結合されており、
より好ましくは、前記ＦｃドメインがヒトＦｃドメインであり、及び
最も好ましくは、前記分子が、前記ヒトＦｃドメインのＮ末端に結合されている、前記抗体分子。
【請求項４】
第二の抗体分子をさらに含む、請求項３に記載の抗体分子であって、
第一及び前記第二の抗体分子の各々が、第一及び第二のＦｃドメインの各々のＮ末端に融合されており、
好ましくは、結合の各々がペプチドリンカーを介したものであり、
好ましくは、前記２つのＦｃドメインが、完全Ｆｃ領域を、最も好ましくはヒト完全Ｆｃ領域を構成している、
前記抗体分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体分子であって、
前記分子が、一価又は二価であり、
好ましくは、前記分子が、一価であり、
より好ましくは、前記一価の分子が、単一ドメイン抗体である、
前記抗体分子。
【請求項６】
単一ドメインが、ウサギ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又はそのＢＡＰ４２結合断片である、請求項５に記載の抗体分子であって、
好ましくは、前記分子がヒト化されており、
より好ましくは、前記ヒト化分子が、前記抗体分子の１つ又は２つ以上のＣＤＲ、及びヒト抗体ドメインの１つ又は２つ以上のフレームワーク領域を含む、
前記抗体分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体分子であって、
前記分子が安定しており、
前記安定性が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼと融合している前記抗体分子をコードする１コロニー形成単位のベクターによる形質転換と、前記形質転換された大腸菌による前記融合体の発現とを介して、２４時間以内に、３７℃及び２．４８ｍＭクロラムフェニコールの存在下で前記形質転換された大腸菌の４００〜６００コロニーの増殖を可能ならしめることとして定義される、
前記抗体分子。
【請求項８】
ＢＡＰ４２のフィブリル化をインビトロで少なくとも５０％妨げる、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項９】
ウサギ単一ドメイン抗体が、配列番号１〜２１からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、又はそのＢＡＰ４２結合断片を含む、請求項６に記載の抗体分子であって、
好ましくは、前記ウサギ単一ドメイン抗体が、配列番号１〜２１からなる群から選択される１つのアミノ酸配列、又はそのＢＡＰ４２結合断片からなる、
前記抗体分子。
【請求項１０】
抗体分子に融合しているペプチドをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体分子であって、前記ペプチドが、配列番号１２７からなるポリペプチドの疎水性断片を含み、前記ペプチドと融合していない前記抗体分子より大きい血液脳関門通過能力を示す抗体−ペプチドコンストラクトをもたらす、前記抗体分子。
【請求項１１】
抗体−ペプチドコンストラクトが、ペプチドと融合していない抗体分子より少なくとも３倍の血液脳関門通過能力を示す、請求項１０に記載の抗体分子。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の抗体分子であって、ペプチドが、リンカー、好ましくはペプチドリンカーによって、前記抗体分子に融合されている、前記抗体分子。
【請求項１３】
ペプチドが、抗体分子のＣ末端の下流に融合されている、請求項１０〜１２のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項１４】
ペプチドが血液脳関門の内皮細胞に対する毒性を欠如しており、
前記毒性の欠如が、１００μＭ以下の非融合ペプチドとの２４時間のインキュベーション後に前記内皮細胞の生存率の、２０％を超える減少を生じさせないことと定義される、
請求項１０〜１３のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項１５】
ペプチドの少なくとも３０％が、０．１〜１ｍＭの非融合ペプチドをマウスに注射して２分以内に前記マウスの脳に到達する、請求項１０〜１４のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項１６】
マウスの脳に到達したペプチドの少なくとも９０％が、０．１〜１ｍＭの非融合ペプチドを前記マウスに注射して６０分以内に前記脳から排除される、請求項１５に記載の抗体分子。
【請求項１７】
ペプチドが、配列番号２２〜２５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ペプチドが、配列番号２２〜２５からなる群から選択される１つのアミノ酸配列からなる、
請求項１０に記載の抗体分子。
【請求項１８】
抗体−ペプチドコンストラクトが、配列番号２８〜１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
好ましくは、前記抗体−ペプチドコンストラクトが、配列番号２８〜１１１からなる群から選択される１つのアミノ酸配列からなる、
請求項１０に記載の抗体分子。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２０】
メマンチン、ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン、及びタクリンからなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１９に記載の医薬組成物を製造する方法であって、
請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体分子を用意するステップ、及び
薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含み、好ましくは前記抗体分子がヒト化されている、前記方法。
【請求項２２】
医薬組成物が、静脈内注射、髄腔内注射、又は鼻腔内投与用に製剤化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
それを必要とする対象のアルツハイマー病、関連障害、又はその症状の、治療、遅延、緩徐化、防止、又は発生率低下のための医薬を調製するための、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物の有効量の使用。
【請求項２４】
症状が、短期記憶喪失、見当識障害、認知症、認知障害、軽度認知障害、気分変動、無気力、セルフケア欠如、会話困難、及び問題解決困難からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
関連障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、海綿状脳症、及びＣＮＳ障害からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２３又は２４に記載の使用。
【請求項２６】
対象が、アルツハイマー病の早期、又は軽度認知障害を伴う病期にある、請求項２３又は２４に記載の使用。
【請求項２７】
対象において凝集しやすいペプチドを検出する方法であって、
請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体分子と、前記対象からの被検試料、好ましくは脳脊髄液又は血清を含む前記試料とを、免疫特異的結合を可能ならしめる条件下で接触させるステップ、及び
前記免疫特異的結合を検出するステップ
を含み、
好ましくは、前記凝集しやすいペプチドが、ＢＡＰ４２、α−シヌクレインのペプチド、膵島アミロイドポリペプチドのペプチド、ハンチントンペプチド、及びプリオンタンパク質のペプチドからなる群から選択され、
より好ましくは、前記凝集しやすいペプチドがＢＡＰ４２である、前記方法。
【請求項２８】
免疫特異的結合が、アルツハイマー病又は関連障害を有さず、その素因もない対象からの対照試料を使用して得られる免疫特異的結合より大きい場合、アルツハイマー病又は関連障害の診断を下すステップをさらに含み、
好ましくは、前記免疫特異的結合が検出されると、アルツハイマー病の早期、又は軽度認知障害を伴う病期が示される、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
診断された対象に、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体分子を含む医薬組成物の有効量の投与を受けさせるステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法であって、
好ましくは、前記抗体分子が、接触ステップで使用したものと同じである、
前記方法。
【請求項３０】
被検試料と接触させるとき、抗体分子が固定化されている、好ましくはチップに固定化されている、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３１】
対象から異なる時点で得られた第二の被検試料を用いて接触及び検出ステップを反復するステップ、及び
前記異なる時点での免疫特異的結合量を比較するステップ
をさらに含み、それによって前記対象における凝集しやすいペプチドをモニターする、請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜１８のいずれかに記載の複数の抗体分子を含むキットであって、
前記複数が、アルツハイマー病又は関連障害を有する第一の対象からの試料と接触させたときに免疫特異的結合を検出するのに十分な量の前記抗体分子を提供し、
好ましくは、前記試料が脳脊髄液を含む、前記キット。
【請求項３３】
複数の抗体分子が、固定化されている、好ましくはチップに固定化されている、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
免疫特異的結合が検出されると、アルツハイマー病の早期、又は軽度認知障害を伴う病期が示される、請求項３２又は３３に記載のキット。
【請求項３５】
請求項１〜１８のいずれかに記載の少なくとも第二の複数の第二の抗体分子をさらに含む、請求項３１〜３３のいずれかに記載のキットであって、
前記第二の抗体分子が、第二の対象からの試料と接触させたとき免疫特異的結合を示し、前記第二の対象が、第一の対象と比較して、疾患又は障害の異なる病期にあり、
好ましくは、前記第一の対象がアルツハイマー病の早期にあり、前記第二の対象がアルツハイマー病のより後期にある、
前記キット。
【請求項３６】
対象の脳内の凝集しやすいペプチドを画像化する方法であって、
標識と会合している、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体分子を前記対象に投与するステップ、及び
前記凝集しやすいペプチドを示す、前記対象の脳の画像を得るステップ
を含み、
好ましくは、前記凝集しやすいペプチドが、ＢＡＰ４２、α−シヌクレインのペプチド、膵島アミロイドポリペプチドのペプチド、ハンチントンペプチド、及びプリオンタンパク質のペプチドからなる群から選択され、
好ましくは、前記凝集しやすいペプチドがＢＡＰ４２であり、
好ましくは、前記抗体分子がヒト化されており、
より好ましくは、前記ヒト化された抗体分子が、前記抗体分子の１つ又は２つ以上のＣＤＲ、及びヒト抗体ドメインの１つ又は２つ以上のフレームワーク領域を含む、前記方法。
【請求項３７】
抗体分子が、インビトロでＢＡＰ４２に免疫特異的に結合し、インビトロ血液脳関門モデルを移行し、前記ＢＡＰ４２のプラークを解凝集しない抗体分子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
画像が、アルツハイマー病又は関連障害を有さず、その素因もない対象に存在するものより多くの凝集しやすいペプチドを示す場合、アルツハイマー病又は関連障害の診断を下すステップをさらに含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
診断された対象に、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体分子を含む医薬組成物の有効量の投与を受けさせるステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法であって、
好ましくは、前記抗体分子が、画像化ステップで使用したものと同じである、
前記方法。
【請求項４０】
標識が、放射性部分構造、蛍光部分構造、蛍光消光部分構造、常磁性部分構造、検出可能なタンパク質、検出可能なタンパク質をコードする遺伝子、及び色素からなる群から選択される、請求項３６〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
対象において投与及び画像化ステップを異なる時点で反復するステップ、及び
前記異なる時点での免疫特異的結合量を比較するステップ
をさらに含み、それによって前記対象における凝集しやすいペプチドをモニターする、請求項３６〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
標識と会合している、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体分子を含むキットであって、
好ましくは、前記標識が、放射性部分構造、蛍光部分構造、蛍光消光部分構造、常磁性部分構造、検出可能なタンパク質、検出可能なタンパク質をコードする遺伝子、及び色素からなる群から選択され、
より好ましくは、前記標識が、前記抗体分子に共有結合されている、前記キット。
【請求項４３】
抗体分子が、対象に投与されたときに前記対象の脳内の凝集しやすいペプチドを示す画像をもたらすのに十分な量で存在し、
好ましくは、前記凝集しやすいペプチドが、ＢＡＰ４２、α−シヌクレインのペプチド、膵島アミロイドポリペプチドのペプチド、ハンチントンペプチド、及びプリオンタンパク質のペプチドからなる群から選択され、
好ましくは、前記凝集しやすいペプチドがＢＡＰ４２である、
請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
抗体分子が、アルツハイマー病の早期又は軽度認知障害を伴う病期に特有のＢＡＰ４２オリゴマーに免疫特異的に結合する、請求項４２又は４３に記載のキット。
【請求項４５】
第二の標識と会合している、請求項１〜１８のいずれかに記載の少なくとも第二の抗体分子をさらに含む、請求項４２〜４４のいずれかに記載のキットであって、
前記第二の抗体が、軽度認知障害を伴う病期と比較してアルツハイマー病のより後期に特有のＢＡＰ４２オリゴマーに免疫特異的に結合する、
前記キット。
【請求項４６】
配列番号１２７からなるポリペプチドの断片を含むペプチドであって、
非脳内皮細胞層より多く脳内皮細胞を含む内皮細胞層を通過し、
好ましくは、疎水性ペプチドである、前記ペプチド。
【請求項４７】
血液脳関門の内皮細胞に対する毒性が欠如している、請求項４６に記載のペプチドであって、
前記毒性の欠如が、１００μＭ以下のペプチドとの２４時間のインキュベーション後に前記内皮細胞の生存率の、２０％を超える減少を生じさせないことと定義される、
前記ペプチド。
【請求項４８】
０．１〜１ｍＭのペプチドをマウスに注射して２分以内に前記マウスの脳に到達する、請求項４６又は４７に記載のペプチド。
【請求項４９】
マウスの脳に到達したペプチドの少なくとも９０％が、０．１〜１ｍＭのペプチドを前記マウスに注射して６０分以内に前記脳から排除される、請求項４８に記載のペプチド。
【請求項５０】
配列番号２２〜２５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、
好ましくは、配列番号２４からなるアミノ酸配列（ｐｅｐＨ３）
を含む、請求項４６に記載のペプチド。
【請求項５１】
配列番号２２〜２５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる、請求項５０に記載のペプチド。
【請求項５２】
ペプチドと会合しているカーゴ分子をさらに含む、請求項４６〜５１のいずれかに記載のペプチドであって、
好ましくは、前記カーゴ分子が、前記ペプチドに共有結合している、
前記ペプチド。
【請求項５３】
カーゴ分子が、核酸、ポリペプチド、抗体分子、脂質、リポソーム、多糖類、合成ポリマー、ウイルス、小分子化合物、金属、ナノ粒子、毒素、及び標識からなる群から選択される、請求項５２に記載のペプチド。
【請求項５４】
カーゴ分子が、ペプチドに共有結合している抗体分子である、請求項５３に記載のペプチド。
【請求項５５】
抗体分子が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ウサギ抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ダイアボディ、ミニボディ、イントラボディ、ナノボディ、Ｆａｂ断片、及びＦ（ａｂ’）断片からなる群から選択される、請求項５４に記載のペプチド。
【請求項５６】
血液脳関門を越えるカーゴ分子の特異的送達における、請求項５２〜５５のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項５７】
請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体分子又は請求項４６〜５５のいずれかに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５８】
請求項５７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５９】
請求項５８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体分子又は請求項４６〜５５のいずれかに記載のペプチドを製造する方法であって、
（ｉ）前記抗体分子又は前記ペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を用意するステップ、
（ii）前記抗体分子又は前記ペプチドの発現を可能ならしめる条件下で前記細胞を培養するステップ、及び
（iii）前記抗体分子又は前記ペプチドを前記培養から回収するステップ
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病及び関連障害（related disorders）の治療及び管理に使用するための抗体分子及びペプチド送達システムに関する。詳細には、抗体分子は、単一ドメイン形式で、ベータアミロイドペプチドのオリゴマー形態に優先的に結合し、ペプチド送達システムは、血液脳関門を越える、そのような抗体分子の特異的輸送はもちろん、他のカーゴ分子のそのような特異的輸送も促進する。本発明は、抗体分子及び送達ペプチドのコンストラクト、並びに有効量の抗体分子、送達ペプチド及び／又はそれらのコンストラクト（ヒト化バージョンの抗体分子及びコンストラクトを含む）を含む医薬組成物にも関する。本発明は、これらの生成物及びそれらの医薬組成物を作製する方法、並びにアルツハイマー病及び関連障害、例えば、脳内で凝集するベータアミロイドペプチド若しくは他のペプチドの蓄積を含むものの治療又は防止に医薬組成物を使用する方法、並びにこれらの障害を診断するための方法及びキットに、さらに関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１月２９日に出願したポルトガル特許出願第１０８１８２Ｄ号及び２０１５年１月２９日に出願したポルトガル特許出願第１０８１８１Ｃ号の外国優先権を主張するものであり、これらの特許出願各々の開示全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出した配列表を含み、該配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。２０１６年１月２８日に作成した前記ASCIIコピーは、１４１１６−１０５０１５ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔという名であり、サイズは１６８，６３２バイトである。
【背景技術】
【０００４】
アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン病などの神経変性疾患は、人口の高齢化に起因して益々一般的になっている。これらの疾患は、タンパク質凝集物の細胞外及び細胞内蓄積につながる、特異的タンパク質の機能不全を特徴とするので、「タンパク質症」として知られている。
【０００５】
アルツハイマー病（ＡＤ，Alzheimer’s disease）は、世界中で最も一般的な型の認知症である。最近のデータは、アルツハイマー病患者の症例数の指数関数的増加を示しており、このため、有効な治療を開発する必要性が強調される。今日、この疾患に罹患している人が全世界に約３５６０万名生存しており、２０５０年までにその数は１億１５００万近くに達すると予想されている。実際、医薬品産業において成長する可能性が最も高い部門は、神経疾患用の薬物の開発に関係する。
【０００６】
ＡＤは、神経病理学的には、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ，amyloid precursor protein）のプロセシングの結果として生ずるベータアミロイドペプチド（ＢＡＰ，beta-amyloid peptide）の蓄積を特徴とする。ＢＡＰは、ＡＤ病理発生の出発点である老人斑の主成分を形成する。
【０００７】
近年、脳病理の理解及び治療は進歩してきてはいるが、ＡＤを含む中枢神経系（ＣＮＳ，central nervous system）の多くの障害は甚大な被害をもたらし続けており、依然として十分に治療できないままである。これらの障害を治療する上での１つの問題は、多くの薬物が、血液脳関門（ＢＢＢ，blood-brain barrier）を通過してＣＮＳに到達することができないことであり、これは、特に大分子薬に見られる問題である。ＢＢＢは、脳に供給する毛細血管を裏打ちする、特殊化した内皮細胞（脳内皮細胞）によって形成され、血液からＣＮＳへの物質の通過を防止する、又は妨げる。
【０００８】
この難題を克服するために様々なアプローチが試みられてきた。例えば、放出制御システム（controlled release systems）が使用されたが、これらのシステムは、ＢＢＢの働きに干渉することもある。別のアプローチは、親油性薬物の開発を含むが、これらにはすぐに血流に排出されてしまう欠点がある。このバリアを一時的に解放するための外科手術手技、例えば、細胞サイズを減少させ、細胞間に空隙を残すためのマンニトール注射の使用も試験されたが、そのような手技は危険であり、腫脹、痙攣、及び感染症への感受性増加の原因になる可能性を秘めている。ＢＢＢを越えて薬物を送達するためのさらに別のアプローチは、インスリン、レプチン又はトランスフェリン受容体などの、ＢＢＢ上の受容体に特異的な抗体への薬物の結合、及び受容体媒介サイトーシスを用いた、ＢＢＢを越える既存の「進入路」の活用を含む。とはいえ、このアプローチを使用する送達は、受容体飽和、及び血管外組織への透過不良によって制限される。さらに、これらの受容体は、他の組織で発現し、代謝に肝要な細胞機能に関与するので、安全性リスクを生じさせる。
【０００９】
代替アプローチは、移行能力がある細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ，cell-penetrating peptide）の使用を含む。アンテナペディアホメオドメインの第３ヘリックスが生体膜を通過するという発見後、研究者は、低分子量薬物、リポソーム、プラスミド、抗体及びナノ粒子を含む、様々な担持カーゴ物質を細胞内に運ぶことができる種々のＣＰＰを研究してきた。それでもやはり、送達システムとしてのＣＰＰの使用は、ＣＰＰ媒介カーゴ送達の細胞特異性不足によって制限される。
【００１０】
さらに、ＢＢＢを通過したら、治療剤は、その治療効果を発揮した後、脳及びＣＮＳから効率的に排除されて、患者の身体からの除去のために全身循環に戻されるのが有利である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、ＡＤ及び関連障害を治療及び管理するための治療剤に対する要求、詳細には、特異的にＢＢＢを通過すること及びその後そこから効率的に排除されることが可能な治療剤、並びにこのバリアを越えてＣＮＳに治療剤を安全に送達する送達システムに対する要求が、当技術分野に依然として存在する。ＡＤの初期及び後期の有効な診断に対する要求も依然として存在する。本発明は、これら及び他の要求に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの態様は、ベータアミロイドペプチドの非フィブリル形態、例えばモノマー及びオリゴマー形態を、ペプチドのフィブリル形態より選択的に標的とする抗体分子に関する。特定の実施形態において、抗体分子は、ベータアミロイドペプチド４２として公知のベータアミロイドペプチドのオリゴマーに対して免疫特異性を有する単一ドメイン抗体、例えば、配列番号１〜２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単一ドメイン抗体、並びにその二量体形態、及び配列の１つ又は２つ以上のＣＤＲが対応するヒト抗体ドメインのフレームワーク領域と組み合わさっている、そのヒト化形態である。特定の実施形態において、抗体分子は、血液脳関門の通過を促進するための送達システムと併用される。
【００１３】
本発明の別の態様は、血液脳関門を通過するペプチド、詳細には、このバリアを特異的に通過する配列番号１２７に対応するアミノ酸配列の断片に関する。ペプチドは、脳及び中枢神経系への送達のための血液脳関門を越えるカーゴ分子の移送を促進する送達システムを提供する。特定の実施形態では、本発明の抗体分子を送達ペプチドに結合させて、ペプチドに結合していない抗体分子より高い血液脳関門通過能力及びより特異的なそのような通過能力を有する抗体−ペプチドコンストラクトを形成する。特定の実施形態では、その後、抗体−ペプチドコンストラクトは、ペプチドに結合していない抗体分子より効率的に脳から排除される。
【００１４】
本発明の別の態様は、上に記載した抗体分子、送達ペプチド及び抗体−ペプチドコンストラクトを作製する方法に関する。本発明は、本明細書に記載する抗体分子、送達ペプチド及び／又は抗体−ペプチドコンストラクトを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらを含有するベクター及び宿主細胞、特に、ポリペプチドの発現を可能ならしめる発現ベクター及び宿主細胞も提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、上に記載した抗体分子、送達ペプチド及び／又は抗体−ペプチドコンストラクトの有効量を含む医薬組成物、並びに医薬組成物を作製する、例えば、薬学的に許容される担体と混合する方法に関する。特定の実施形態において、医薬組成物は、非経口投与用に製剤化される。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、神経障害、例えば、アルツハイマー病、関連障害、又はその症状を治療又は防止するための医薬組成物の使用に関する。特定の実施形態では、送達ペプチドに結合している又はしていない抗体分子の有効量を含む本発明の医薬組成物がアルツハイマー病の患者に投与されて、血液脳関門を通過し、ベータアミロイドペプチド４２のオリゴマー及び／又はモノマー形態に特異的に結合するが、好ましくはフィブリル形態に結合せず、そのようにしてプラーク形成を防止又は減少させることによって、脳内のプラーク形成を防止又は減少させる。特定の実施形態では、送達ペプチドに結合している又はしていない抗体分子は、その後、脳から排除されて、排出のために迅速に及び効率的に循環に戻る。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、抗体分子、送達ペプチド、及び抗体−ペプチドコンストラクトの診断上の使用、例えば、アルツハイマー病又は関連障害を診断する際の使用に関する。本発明は、本発明の抗体分子、送達ペプチド及び／又は抗体−ペプチドコンストラクトを含むキット、例えば、アルツハイマー病又は関連障害を診断する際に使用するためのキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ペプチドのモノマーからダイマー、オリゴマー、そしてその後、プラークを形成しうるフィブリルに進行する、ＢＡＰ４２凝集スキームを示す図である。
【図２】ＢＡＰ４２のモル吸収係数の決定であって、該ペプチドの既知濃度の様々な溶液を使用して吸光度を測定し、それを相関させて、係数を算出することによる決定、ε２８０ｎｍ＝０．３２６５±０．００４３（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１又は±１４７４．０４１  ε２８０ｎｍ＝１９，２８７Ｍ−１ｃｍ−１を示す図である。
【図３Ａ−３Ｂ】オリゴマー（図３Ａ）又はフィブリル（図３Ｂ）を得るための、ＢＡＰ４２の様々な分子種の調製についての代表的スキームを示す図である。
【図４】チオフラビンＴアッセイを使用する、最適化された方法で単離されたＢＡＰ４２種の特性解析を示す図である。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離された、ＢＡＰ４２種の混合物のウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図６Ａ−Ｂ】異なる粒子のシグナル強度パーセントを該粒子の直径の関数として表した、単離されたＢＡＰ４２種の動的光散乱分析を示す図である。図６Ａは、モノマー（灰色）、オリゴマー（赤色）及び繊維（緑色）試料中に存在する個々の粒子のサイズ分布のプロファイルを示し、図６Ｂは、クラスサイズ分布のプロファイル、すなわち、サイズが異なる粒子の範囲に関する粒径の関数としてのシグナル強度のパーセンテージの分布プロファイルを示す。
【図７】モノマーＢＡＰ４２種とオリゴマーＢＡＰ４２種を分離するための代表的クロマトグラムを示す図である。
【図８Ａ−８Ｂ】ＢＡＰ４２モノマー（図８Ａ）又はＢＡＰ４２オリゴマー（図８Ｂ）で免疫したウサギの、免疫後２６日目におけるＥＬＩＳＡによる免疫応答を示す図である。
【図９Ａ−９Ｂ】ＢＡＰ４２モノマー（図９Ａ）又はＢＡＰ４２オリゴマー（図９Ｂ）で免疫したウサギの、免疫後７４日目（最終採血）におけるＥＬＩＳＡによる免疫応答を示す図である。
【図１０】膜ファージディスプレイ（ウェスタンパニング）を使用する１ラウンドのバイオパニングにおけるＢＡＰ４２オリゴマーに特異的なｓｄＡｂの選択についての概略図を示す図である。
【図１１】ＢＡＰ４２のオリゴマー形態についてＥＬＩＳＡによって分析した９４クローンの結合プロファイル及びライゲーション値を示す図（Ｍ−モノマー、Ｏ−オリゴマー、Ｆ−繊維；Ｘ−ＢＳＡ  ３％）である。
【図１２】ＢＡＰ４２のモノマー形態についてＥＬＩＳＡによって分析した９４クローンの結合プロファイル及びライゲーション値をそれぞれ示す図（Ｍ−モノマー、Ｏ−オリゴマー、Ｆ−繊維；Ｘ−ＢＳＡ  ３％）である。
【図１３】本発明の例示的な抗体分子のウェスタンブロットでの検出を示す図である。
【図１４】ＰＶＤＦ膜における異なるＢＡＰ４２アイソフォームのウェスタンブロット分析での主にモノマー及びオリゴマーの認識を示す図である。
【図１５】例示的な抗体分子のＢＩＡｃｏｒｅ分析及びＢＡＰ４２のオリゴマー形態への結合プロファイルを示す図である。
【図１６Ａ−１６Ｄ】「ＶＬ＃２６」（図１６Ａ）、「ＶＬ＃２０」（図１６Ｂ）、「ＶＬ＃６」（図１６Ｃ）及び「ＶＬ＃２」（図１６Ｄ）と呼ぶ４つの例示的な抗体分子（候補抗ＢＡＰ４２オリゴマー抗体）のＢＩＡｃｏｒｅ動態研究を示す図である。
【図１７】ヘルパーファージ、ＤＥＮ−ファージ、及びＢＢＢを通過する陽性対象（＋ファージ）の試料について、インビトロＢＢＢモデルの両側の頂部及び基底部におけるファージ力価の比較に基づいて、ペプチドと融合しているファージ（ＤＥＮ−ファージ）の移動を総初期ファージ（ストック）と比較して示す図である。
【図１８】無細胞対象（ブランク）を使用して、ｂＥｎｄ３細胞を伴うＢＢＢモデル（細胞）を使用して、及びファージとのインキュベーション後のＢＢＢモデル（ファージ）を使用して、４０ｋＤａデキストラン蛍光分子（ＦＤ４０）を用いて試験したときの、インビトロＢＢＢモデルの内皮バリア完全性を示す図である。
【図１９Ａ−１９Ｆ】異なるＤＥＮ２ＣペプチドについてのＨＰＬＣ結果を示す図である。
【図２０Ａ−２０Ｆ】異なるＤＥＮ２ＣペプチドについてのＭＳ結果を示す図である。
【図２１Ａ−２１Ｆ】ｂＥｎｄ３細胞（ＢＢＢモデル）の組織培養インサート及び細胞が入っていない（対照）組織培養インサートを用いて５時間インキュベートした後の異なるＤＥＮ２ペプチドの移動を示す、トランズウェルシステムの頂部及び基底部で回収された％９９ｍＴｃ−放射性ペプチドを示す図である。
【図２２Ａ−２２Ｆ】組織培養インサートにおけるｂＥｎｄ３細胞（ＢＢＢ）との１５分、５時間及び２４時間のインキュベーション後の異なるＤＥＮ２Ｃペプチドの移動を示す、トランズウェルシステムの頂部及び基底部で回収された％９９ｍＴｃ−放射性ペプチドを示す図である。
【図２３Ａ−２３Ｅ】１５分、５時間及び２４時間のインキュベーション後の、ＢＢＢ細胞への異なるＤＥＮ２Ｃペプチドの内在化能力を示す図である。
【図２４Ａ−２４Ｅ】異なる濃度の選択ＤＥＮ２ＣペプチドのＢＢＢ細胞に対する毒性の欠如を示す図である。
【図２５Ａ−２５Ｃ】ＢＢＢ細胞を有さないフィルター（フィルター）を越える、ｂＥｎｄ３バリア（ＢＢＢ）を越える、及び異なるペプチドとプレインキュベートしたｂＥｎｄ３バリアを越える、蛍光分子（ストック）の移動能力を示す図である。
【図２６Ａ−２６Ｃ】ジ−８−ＡＮＥＰＰＳで標識された次の脂質組成の膜モデル（ＬＵＶ）：ＰＯＰＣ；ＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ（４：１）；ＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ（３：２）；ＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ（１：４）；ＰＯＰＣ：ＰＯＰＧ（４：１）；及びＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ（２：１）と選択ＤＥＮ２Ｃペプチドの相互作用、及び両極性電位の乱れを示す図である。
【図２７】ｔｒｐの固有蛍光によるＤＥＮ２ＣペプチドｐｅｐＨ３のＫｐ定数の決定を示す図である。
【図２８Ａ−２８Ｄ】ＨＰＬＣ分析を使用して、マウスへの注射前並びに５及び６０分後の血液（図２８Ａ）及び尿（図２８Ｂ）中でのｐｅｐＨ１の安定性並びに血液（図２８Ｃ）及び尿（図２８Ｄ）中でのｐｅｐＨ３安定性を示す図である。
【図２９Ａ−２９Ｂ】本発明の抗体分子を使用したときの、並びに２つの比率：１：５（ＢＡＰ４２分子５個ごとに１個のｓｄＡｂ分子）（図２９Ａ）及び１：２０（ＢＡＰ４２分子２０個ごとに１個のｓｄＡｂ分子）（図２９Ｂ）の本発明の抗体−ペプチドコンストラクトを使用したときの、ＢＡＰ４２凝集の阻害を示す図である。
【図３０Ａ−３０Ｂ】本発明の例示的な抗体分子「Ａ」若しくは例示的な抗体−ペプチドコンストラクト「Ｂ」で又は対照「Ｃ」で治療した５ｘＦＡＤトランスジェニックマウスの海馬（図３０Ａ）又は皮質（図３０Ｂ）におけるチアジンレッド染色の結果を示す図である。
【図３１Ａ−３１Ｄ】本発明の例示的な抗体分子「Ａ」若しくは例示的な抗体−ペプチドコンストラクト「Ｂ」で又は対照「Ｃ」で治療した５ｘＦＡＤトランスジェニックマウスの、海馬における正規化されたプラーク負荷量／ｍｍ（図３１Ａ）及びプラーク数／ｍｍ（図３１Ｂ）並びに皮質における正規化されたプラーク負荷量／ｍｍ（図３１Ｃ）及びプラーク数／ｍｍ（図３１Ｄ）を示す、チアジンレッド染色の結果を示す図である。
【図３２Ａ−３２Ｂ】注射後２及び６０分の時点でのマウスにおける９９Ｔｃ標識ｓｄＡｂ−ｐｅｐコンストラクトのＳＰＥＣＴ画像をそれぞれ示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．定義
「神経疾患又は障害」は、これらに限定されるものではないが、てんかん、全及び局所虚血性及び出血性脳卒中、頭部外傷、脊髄損傷、心停止及び新生児仮死におけるような低酸素誘導神経細胞障害、並びにがんに関連する神経学的疾患、並びに神経変性疾患を含む、神経系の疾患又は障害を意味する。
【００２０】
「神経変性疾患」は、これらに限定されるものではないがアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ，amyotrophic lateral sclerosis）を含む、疾患を意味する。アルツハイマー病（ＡＤ）は、アルツハイマー病（Alzheimer disease）又は単にアルツハイマーとも呼ばれ、日常業務を果すことができなくなり、最終的には認知症に至る、進行する記憶喪失はもちろん言語、判断、及び問題解決に関する問題も伴う進行性認知衰退を特徴とする、慢性神経変性障害である。
【００２１】
「ベータアミロイドペプチド」（ＢＡＰ）は、ＡＤの疾患過程において重大な役割を果す、脳内で形成されるペプチドを指す。この疾患過程は、より大きいアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の断片である、長さ３７〜４２アミノ酸の範囲の異常に折り畳まれたベータアミロイドペプチド（ＢＡＰ）の蓄積に起因する、プラーク形成に関連する。ＡＰＰは、ニューロン膜を透過し、ニューロン成長、生存及び修復に関与する、膜貫通タンパク質である。あるＢＡＰ、詳細には、ＡＰＰの最初の４２アミノ酸で構成されているＣ末端断片を、本明細書では、「ＢＡＰ４２」、「Ａβ４２」、「βＡ４２」、「ベータアミロイドペプチド４２」、又は「ベータアミロイドペプチド１−４２」と呼ぶ。この断片は、ニューロンの外側で沈着物にともに凝集塊となるフィブリルの一因となる高凝集傾向を有し、したがって、ＡＤに特有の「老人斑」の形成に重要な役割を果す。
【００２２】
ＢＡＰ４２の「非フィブリル形態」は、プラークを形成するほど密にともに凝集塊とならない、該ペプチド分子のモノマー、ダイマー、トリマー及び低級オリゴマーを指す。「オリゴマー形態」又は「ＢＡＰ４２オリゴマー」は、２個の会合した（associated）モノマーのダイマー、又は２個より多くのモノマー、例えば３、４、６、８若しくは１０個のモノマーの会合体、並びにＢＡＰ４２の１５、２０、２５、３０、３５及び４０個のモノマーの会合体に対応する、１０〜２００ｋＤａの範囲の分子量を有するペプチドのオリゴマーを指す。
【００２３】
ＢＡＰ４２の「フィブリル形態」又は「ＢＡＰ４２フィブリル」は、ＡＤに特有の老人斑を構成する、ＢＡＰ４２分子のより高次の凝集塊を指す。試料中の「粒子」又は「分子種」は、試料中の個々のモノマー、ダイマー、オリゴマーなど、複合体を指す。試料中の個々の分子種のパーセンテージを与えることによって、その試料中に存在する様々な分子種の配分を記述することができる。
【００２４】
「抗体分子」は、免疫グロブリンの少なくとも１つのドメイン、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの重鎖ドメイン若しくは軽鎖ドメイン又は合成（例えば組換え）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体など）の対応するドメインを含有する、免疫特異性ポリペプチド又はその結合断片を意味する。天然に存在する免疫グロブリンの基本構造単位（例えば、ＩｇＧ）は、約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として通常は表現される、２本の軽鎖（Ｌ）と２本の重鎖（Ｈ）を有する四量体である。各軽鎖は、一般に、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）で構成され、その一方で各重鎖は、一般に、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）、並びにヒンジ領域（Ｈ）を含む。抗体又は抗体断片の可変領域は、抗原と接触している残基を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ，complementarity determining region）と、（ある一定のフレームワーク残基は抗原に接触することもあるが）一般に、ＣＤＲループの構造を維持し、配置を決定する、フレームワークセグメント又はフレームワーク領域（ＦＲ若しくはＦｗＲ，framework region）と呼ばれる、非ＣＤＲセグメントとを含む。
【００２５】
抗体断片は、インタクトな通常のＩｇＧから生成することができ、抗原結合断片、Ｆｃドメイン、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ））、Ｆ（ａｂ’）断片、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ，single-chain Fv）、ＶＨ−ＶＬ二量体、重鎖ドメインのみ、軽鎖ドメインのみ、並びに個々の（単一）ドメイン、例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２メイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメインなどを含む。
【００２６】
用語「抗体単一ドメイン」、「単一ドメイン抗体」、「小ドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のみを有する、抗体の単一の単量体型断片を含む、又はそのような断片からなる、抗体断片を指す。インタクトな抗体同様、単一ドメイン抗体は、特異的抗原に免疫特異的に結合することができる。しかし、全抗体とは異なり、単一ドメイン抗体は、Ｆｃ領域がないので補体系誘発細胞毒性を示さない。２つ又は３つ以上の単一ドメイン抗体が組み合わさって、それらの二量体及びより高次の構造を生ずることもある。
【００２７】
本明細書において用いる用語「ヒト化抗体分子」は、ヒトフレームワーク領域を含む少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域と本発明の抗体分子の１つ又は２つ以上のＣＤＲとを含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、本発明の抗体分子は、全免疫グロブリンを含まず、例えば、単一免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、ＶＨ又はＶＬドメイン）を含むが、他の一切の免疫グロブリンドメイン及び領域を含まない（例えば、Ｆｃ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬなどを含まない）。ＣＤＲを提供する抗体分子（例えば、ＶＬドメイン）は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリン又はその断片（例えば、ヒト可変ドメイン）は、「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合、好ましくは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％又は９６％以上同一である。それ故、本発明の抗体分子がヒト化される実施形態に従って、抗体分子の、おそらくＣＤＲを除いて、すべての部分は、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。結果として生ずるヒト化分子が、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原と結合すると予想される場合、ドナー分子は「ヒト化」されたと言われる。一般に、ヒト化免疫特異性分子は、超可変領域残基が、望ましい特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種からの超可変領域残基（例えば、ウサギＶＬドメインからのドナーＣＤＲ）によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（又はそれらの可変ドメイン及び／又は断片）である。
【００２８】
さらに、ヒト化分子は、レシピエント抗体においてもドナー抗体においても見つけられない残基を含むことがある。これらの修飾は、機能性、例えば免疫特異性をさらに洗練させるために、又は免疫原性を低下させるために行われる。一般に、ヒト化抗体分子は、超可変領域のすべて又は実質的にすべてがウサギ可変ドメインのものに対応する、少なくとも１つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、ＦＲのすべて又は実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列のものである。一部の実施形態において、本発明のヒト化抗体分子は、バリアントである。そのようなヒト化分子は、非ヒト、例えばウサギＣＤＲの１つ又は２つ以上にアミノ酸残基置換、欠失又は付加を含むことがある。ヒト化分子のバリアントは、親ヒト化抗体分子と比較したとき、実質的に同じ結合を有することもあり、より良好な結合を有することもあり、又はより不良な結合を有することもある。
【００２９】
本明細書において用いる用語「免疫特異性」は、生理条件下で抗原（例えば、エピトープ又は免疫複合体）と特異的に結合するが別の分子とは特異的に結合しない分子の能力を指す。他の部分構造よりその標的抗原と優先的に結合する抗体分子は、その標的抗原に「免疫特異的に結合する」又はその標的抗原を「免疫特異的に認識する」と言うことができる。所与の抗原への免疫特異性を有する分子を、その特定の抗原に対して「抗原結合性」又は「抗原特異的」と記述することもある。抗原に免疫特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は当業者に公知の他の技術によって同定することができる。免疫特異的結合を、最小結合パラメータ、例えば、約０．００１ｎＭ〜約１，０００ｐＭによって、定量的に定義することもできる。抗原に免疫特異的に結合する分子は、他の部分構造に結合（又は、と「交差反応」）することがあるが、例えばイムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ又は当技術分野において公知の他のアッセイによって判定して、より低い親和性、好ましくは、はるかに低い親和性で結合（又は「交差反応」）する。
【００３０】
「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」は、ＣＮＳ内の循環血と脳細胞外液とを分離するバリアを指す。ＢＢＢは、高い選択的透過性を有し、大脳毛細血管レベルでタイトジャンクションによって接続された脳内皮細胞（「ＢＥＣ，brain endothelial cell」又は「ｂＥｎｄ３細胞」）により形成される。ＢＢＢは、体内の他の箇所の毛細血管の内皮細胞よりはるかに厳しい程度で、血流からの物質の通過を制限する。例えば、ＢＢＢは、小さい疎水性の分子、例えば酸素、二酸化炭素及びある特定のホルモンの拡散のみを許すことによって、微視的細菌及び大きい又は親水性の分子の拡散を制限する。ＢＢＢの細胞はまた、特異的タンパク質を利用して、このバリアを越えて代謝産物、例えばグルコース及びアミノ酸を能動輸送する。逆に、「非脳内皮細胞層」は、脳内皮細胞以外の細胞で構成された内皮細胞層、例えば、血液脳関門以外の内皮細胞層を指す。
【００３１】
「ペプチド送達システム」は、本明細書では「トランスポゾンペプチド」又は「細胞膜透過性ペプチド」（ＣＰＰ）とも呼ぶ「送達ペプチド」を使用して、カーゴ分子を送達するアプローチを意味する。ＣＰＰは、細胞膜を通過する能力がある短いペプチドであり、したがって、細胞の内部に様々な担持カーゴ物質を移行させることができ、これは、低分子量薬物、リポソーム、プラスミド、抗体及びナノ粒子を移行させることを含む。カーゴ分子は、共有結合性相互作用又は非共有結合性相互作用のどちらかによって、ペプチドと会合（associate）する。ＣＰＰは、一般に、それらのカーゴ分子を、エンドサイトーシス、特に吸着媒介トランスサイトーシスの過程を通して細胞内に送達する。
【００３２】
典型的に、ＣＰＰは、リシン若しくはアルギニン残基などの正荷電アミノ酸を多く含有するアミノ酸組成を有するか、極性／荷電アミノ酸と非極性／疎水性アミノ酸の交互パターンを示す。ＣＰＰのこれら２つのタイプは、それぞれ、ポリカチオン性及び両親媒性と呼ばれる。ＣＰＰの第三のタイプは、非極性残基を多く含有し正味電荷が低い、疎水性ペプチド、又は細胞内取り込みを促進する疎水性アミノ酸基を多く含有する、疎水性ペプチドである。ＣＰＰの様々な例としては、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１，human immunodeficiency virus 1）からのトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）；アンテナペディアホメオドメインの第３ヘリックス、ｐＡｎｔｐ（４３５８）；及び２型デング熱ウイルス（「ＤＥＮ２Ｃ」）のカプシドタンパク質が挙げられる。ＤＥＮ２Ｃは、ＲＮＡと相互作用するための塩基性残基と、膜と相互作用するための非極性領域とを有する対称ダイマーを形成する、１２ｋＤａタンパク質である。タンパク質は、４つのドメイン：α１、α２、α３及びα４から形成される（Ma, et al., Proc Natl Acad Sci USA (2004) 101(10): 3414-3419）。
【００３３】
「血液脳関門特異的」又は「ＢＢＢ特異的」は、体内の他の膜又はバリアを通過するより高い度合いで血液脳関門を通過し、そのようにして脳を透過してカーゴ分子をＣＮＳに送達する、送達ペプチドの能力を指す。
【００３４】
ポリペプチドとの関連で本明細書において用いる用語「誘導体」又は「バリアント」は、アミノ酸残基置換、欠失又は付加の導入によって変更されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。用語「誘導体」又は「バリアント」は、修飾されたポリペプチド、すなわち、該ポリペプチドへの任意のタイプの分子の共有結合によって修飾されたポリペプチドも指す。例えば、限定としてではないが、ポリペプチドは、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への結合などによって修飾されることがある。誘導体ポリペプチドは、これらに限定されるものではないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、当業者に公知の技術を使用する化学修飾によって生成されることもある。さらに、誘導体ポリペプチドは、１つ又は２つ以上の非古典的アミノ酸を含有することもある。ポリペプチド誘導体又はバリアントは、それが由来したポリペプチドと同様の又は同一の機能を有する。生物に「由来する」ポリペプチドに関して用いる用語「由来する」は、前記生物（例えば、細菌細胞又はファージ）から直接ポリペプチドを単離することも指すことがある。
【００３５】
用語「対象」、「宿主」及び「患者」は、互換的に用いられる。本明細書で用いる対象は、好ましくは哺乳動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えば、サル及びヒト）、最も好ましくはヒトである。
【００３６】
本明細書において用いる用語「治療剤」は、アルツハイマー病又は関連障害（脳内の、フィブリルを形成するオリゴマーベータアミロイドペプチドの蓄積若しくは他の凝集しやすいペプチドの蓄積に関連する状態を含む）に関連する症状の治療、管理又は改善に使用することができるあらゆる薬剤を指す。本明細書において用いる「治療有効量」は、標的疾患又は障害の治療又は管理に際して、そのような疾患又は障害に罹患している対象に投与したとき、少なくとも１つの治療的恩恵をもたらす薬剤の量（例えば、本発明の医薬組成物中の、単一ドメイン抗体の量、又は該抗体と送達ペプチドのコンストラクトの量）を指す。さらに、本発明の薬剤に関する治療有効量は、疾患又は障害の治療又は管理に際して少なくとも１つの治療的恩恵をもたらす、単独での、又は他の治療と併用での、薬剤の量を意味する。
【００３７】
アルツハイマー病の場合、抗体分子又はそのコンストラクトの治療有効量は、この疾患の１つ又は２つ以上の認知又は情動症状を軽減すること、例えば、短期記憶喪失を軽減すること、見当識障害、気分変動、又は意欲低下を軽減すること、及びこの疾患のより後期に特有の他の方法で介護者からの自立を増すことができるだろう。
【００３８】
本明細書において用いる用語「予防剤」は、アルツハイマー病若しくは関連障害又はその症状の防止、遅延、又は進行の緩徐化に使用することができる、あらゆる薬剤を指す。本明細書において用いる「予防有効量」は、標的疾患又は症状の防止又は遅延に際して、そのような疾患又は障害の素因がある対象に投与したとき、少なくとも１つの予防的恩恵をもたらす予防剤の量（例えば、本発明の医薬組成物中の、単一ドメイン抗体の量、又は該抗体と送達ペプチドのコンストラクトの量）を指す。予防有効量は、標的疾患若しくは障害を防止する、遅延させる、若しくはその発生率を低下させる、又は標的疾患若しくは障害の進行を緩徐化する、又は標的疾患若しくは障害の発症を遅延させる若しくは最小化する、又は標的疾患若しくは障害の再発若しくは再燃を防止する若しくは遅延させるのに十分な、薬剤の量を指すこともある。予防有効量は、標的疾患又は障害の症状の増悪を防止する又は遅延させるのに十分な薬剤の量を指すこともある。さらに、予防有効量は、疾患又は障害の防止又は遅延に際して少なくとも１つの予防的恩恵をもたらす、単独での、又は他の薬剤と併用時の、予防剤の量を指す。
【００３９】
本発明の予防剤は、標的疾患又は障害の「素因がある」、すなわち、アルツハイマー病又は関連障害（非フィブリルルベータアミロイドペプチド若しくは他の凝集しやすいオリゴマーの蓄積に関連する状態を含む）の素因がある、対象に投与することができる。疾患又は障害の「素因がある」対象は、その疾患若しくは障害の発症に関連する症状を示す対象、又は体質、環境曝露、若しくはそのような疾患若しくは障害の他のリスク因子を有するが、症状がまだその疾患若しくは障害と診断されるレベルでない対象である。例えば、アルツハイマー病の家族歴を有する患者は、その素因がある者とみなされることがある。
【００４０】
本明細書において用いる用語「併用で」は、１以上の予防及び／若しくは治療剤又は活性薬剤の使用を指す。用語「併用で」の使用は、予防及び／又は治療剤を対象に投与する順序を限定しない。第一の予防又は治療剤を、（第一の予防又は治療剤とは異なる）第二の予防又は治療剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間若しくは１２週間前）に、投与と同時に、又は投与の後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間若しくは１２週間後）に、それを必要とする対象に投与することができる。
【００４１】
２．ベータアミロイドペプチドの非フィブリル形態を標的とする抗体分子
本発明の１つの態様は、ベータアミロイドペプチド４２（ＢＡＰ４２）の非フィブリル形態、例えばモノマー及びオリゴマー形態に、ペプチドのフィブリル形態より優先的に結合する抗体分子に関する。例えば、抗体分子は、ペプチドのフィブリル形態と比較してオリゴマー形態に少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１，０００、少なくとも約２，０００、少なくとも約４，０００、少なくとも約６，０００、少なくとも約８，０００、又は少なくとも約１０，０００倍高度な結合を示すことができる。詳細には、ＢＡＰ４２の１つ又は２つ以上のオリゴマー形態に対して免疫特異性を有するが、ＢＡＰ４２フィブリルへの免疫特異性を示さない（又はフィブリルへの非常に低い免疫特異性を示す）、抗体分子を提供する。
【００４２】
一部の実施形態において、抗体分子は、ウサギ免疫グロブリンに由来する及び／又はウサギ免疫グロブリンにおいて同定された可変ドメイン又はアミノ酸配列若しくは残基を含み、該分子は、ＢＡＰ４２モノマー及び／若しくはオリゴマー又はどちらかのエピトープに免疫特異的に結合する。免疫特異的結合は、抗原／タンパク質結合特異性を評定するための当技術分野において公知のいずれの標準的方法によって判定してもよい。抗体又はその抗原結合断片の抗原又はエピトープに対する結合特異性を判定するためのアッセイは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）、及びラジオイムノアッセイを含むが、これらに限定されない。結合特異性を評定するための当技術分野において公知のいずれの方法を使用して本発明の抗体分子を同定してもよい。好ましい実施形態において、本発明の単離された単一ドメイン抗体分子は、０．００１ｎＭより大きい、０．００５ｎＭより大きい、０．０１ｎＭより大きい、０．０５ｎＭより大きい、０．１ｎＭより大きい、０．５ｎＭより大きい、１ｎＭより大きい、２ｎＭより大きい、しかし５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、９０ｎＭ以下又は１００ｎＭ以下のＫｄを示す。ある特定の実施形態において、本発明の単離された単一ドメイン抗体分子は、おおよそ１０ｎＭ、おおよそ１５ｎＭ、おおよそ２０ｎＭ、おおよそ２５ｎＭ、おおよそ３０ｎＭ、おおよそ３５ｎＭ、おおよそ４０ｎＭ、おおよそ４５ｎＭ、おおよそ５０ｎＭ、おおよそ５５ｎＭ、おおよそ６０ｎＭ、おおよそ６５ｎＭ、おおよそ７０ｎＭ、おおよそ７５ｎＭ、おおよそ８０ｎＭ、おおよそ８５ｎＭ、又はおおよそ９０ｎＭのＫｄを示す。図１６Ａ〜１６Ｄも参照されたい。
【００４３】
好ましい実施形態において、抗体分子は、ＢＡＰ４２のオリゴマー形態にＢＡＰ４２のフィブリル形態より優先的に結合する。例えば、抗体分子は、ＢＡＰ４２オリゴマーにフィブリルより強く、例えば、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍又は少なくとも約５０倍といった倍率で、結合することができる。一部の実施形態において、抗体分子は、ＢＡＰ４２フィブリルに対する免疫特異的結合を示さず、又は実質的に示さず、例えば、抗体特異性を評定するための当技術分野において公知の標準的方法によって検出することができない結合を示す。
【００４４】
本発明の抗体分子は、多価であることもあり、又は一価であることもある。多価抗体分子は、二価のもの（例えば、本発明の単一ドメイン抗体分子の二量体）、三価のもの、及びより高次の結合価のもの、例えば、同じエピトープを各々が認識する２つの抗原結合部位を有する二価ＩｇＧ複合体を含む。好ましい実施形態において、抗体分子は一価であり、したがって分子１つ当たり１つだけの抗原結合部位を提示する。特定の実施形態において、抗体分子は、単一ドメイン抗体、又はその抗原結合断片、例えば、単一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又は単一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、さらにいっそう好ましくは、ウサギのＶＬ若しくはＶＨ、又はそのＶＨ若しくはＶＬの抗原結合ドメインである。
【００４５】
免疫グロブリンＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列は、無感作ウサギから得てもよく、又は抗原で、例えばＢＡＰ４２モノマー又はオリゴマーで、以前に免疫されたウサギから得てもよい。ウサギを免疫すること、及びウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ）の単離は、当技術分野において公知の又は本明細書に記載するいずれの方法によって行ってもよい。ある特定の実施形態では、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を無感作ウサギ又は免疫されたウサギのいかなる組織から得てもよいが、形質細胞、例えばＢ細胞を多く含む組織源から得ることが好ましい。ある特定の実施形態において、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含むウサギ組織は、骨髄である。他の実施形態において、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含むウサギ組織は、虫垂組織及び／又はリンパ系組織、例えば脾臓若しくはリンパ節組織である（例えば、その全体が参照により組み込まれている、Goncalves et alの国際公開第２００８／１３６６９４号パンフレットを参照されたい）。
【００４６】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体分子は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＶＨ−ＶＬ二量体、一本鎖抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ，anti-Id）抗体（例えば、本発明の抗体の抗Ｉｄ及び抗・抗Ｉｄ抗体を含む）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、又は上記のもののいずれかの抗原結合断片（Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ，bispecific Fv）を含むがこれらに限定されない）、及びイントラボディである。
【００４７】
本発明の抗体分子は、二重又は多重特異性であることがあり、例えば、異なる抗原又は異なるエピトープに対して親和性を示す２つの抗原結合部位を有する二重特異性分子であってもよい。本発明の二重又は多重特異性分子は、当技術分野において周知の方法、例えば、本発明の１つ又は２つ以上の単一ドメイン抗体分子同士の及び／又は異なるエピトープ結合ポリペプチドとの化学的コンジュゲーションを用いて、形成することができる。例えば、本発明の抗体分子は、第一及び第二のＶＬドメイン、又は第一及び第二のＶＨドメインであって、異なる結合特異性を有する（すなわち、異なる抗原に結合する）第一及び第二のドメインを含むこともある。
【００４８】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体分子又はそれらの抗原結合断片は、ＣＨ１ドメインを含まない。他の実施形態において、本発明の抗体分子又はそれらの抗原結合断片は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＬドメイン、ＣＨ３ドメイン若しくはＨドメインのうちのいずれかの１つ若しくは２つ以上を含まず、又はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＬドメイン、ＣＨ３ドメイン又はＨドメインのいずれも含まない。さらに他の実施形態において、本発明の抗体分子又はそれらの抗原結合断片は、ＣＨ１ドメイン、Ｈドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＬドメイン又はＣＨ３ドメインのうちの１つを含み、免疫グロブリンに由来する他のいずれの定常ドメインもヒンジ領域も含まない。
【００４９】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体分子は、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン及び／又はＶＬ  ＣＤＲ３ドメインのうちの１つ又は２つ以上を含む。ある特定の実施形態において、抗体分子は、ＶＨ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ２ドメイン及びＶＨ  ＣＤＲ３ドメインの各々、又はＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインの各々を含む。好ましい実施形態において、抗体分子は、ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインの各々を含む。
【００５０】
本発明の抗体分子は、いかなる種（例えば、ウサギ、マウス、ラット）に由来する免疫グロブリン分子を含んでもよいが、ヒト又はヒト化免疫グロブリン分子であることが好ましく、該免疫グロブリン分子は、いかなるタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）又はクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであってもよい。本発明の抗体分子又はそれらの抗原結合断片は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、化学合成又は組換え技術によって産生することができる。
【００５１】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体分子は、脱免疫化されている。すなわち、抗体分子を、その免疫原性を低下させるように修飾してもよく、例えば、その場合、少なくとも１つのＴＨエピトープを除去及び／又は減少させる。一部の実施形態では、免疫原性低下はもちろん（免疫原性低下とは別に）、溶解度及び／又は免疫特異性向上も得られるように、抗体分子を変異させる。免疫原性を低下させた抗体分子を「脱免疫化」抗体分子と呼ぶ。一般に、抗体分子は、１つ又は２つ以上のＨＬＡクラスII受容体に結合するエピトープを減少又は除去するような１つ又は２つ以上のアミノ酸位置での置換を含む。本発明の脱免疫化抗体分子によって、所期の宿主での、例えば、ヒト患者での免疫原性低下が得られる。
【００５２】
脱免疫化は、当技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載するいずれの方法によって果してもよい。１つのアプローチでは、抗体分子の３Ｄ構造のモデルを構築する。次いで、ＴＨエピトープ数を最小にするように一連の置換を計画して、好ましくは、抗体分子の安定性、又は標的、例えばＢＡＰ４２オリゴマーへのその結合親和性に影響を与えることなく最も重要なエピトープを除去する。一部の実施形態において、脱免疫化抗体分子は、少なくとも約１０個のＴＨエピトープ、少なくとも約１５個のＴＨエピトープ、少なくとも約２０個のＴＨエピトープ、少なくとも約２５個のＴＨエピトープ、少なくとも約３０個のＴＨエピトープ、少なくとも約４０個のＴＨエピトープ、又は少なくとも約５０個のＴＨエピトープを除去する置換を含む。好ましい実施形態において、置換は、脱免疫化前の抗体分子と比較して、抗体分子の免疫特異的結合に影響を与えない、又は少なくとも実質的に影響を与えない。
【００５３】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体分子は、例えば該抗体分子の半減期を延長するように、Ｆｃドメイン、好ましくはヒトＦｃドメインと会合している。抗体分子は、Ｆｃドメインに直接結合されることもあり、又はペプチドリンカーを含む若しくはペプチドリンカーからなる介在アミノ酸配列などのリンカーを介して間接的に結合されることもある。好ましい実施形態では、抗体分子は、二価コンストラクトを得るために、融合生成物としてヒトＦｃドメインのＮ末端に結合される（Farrington et alの国際公開第２０１３／１０６５７７号パンフレット（Biogen社）も参照されたい）。一部の実施形態において、本発明の２つの抗体分子各々は、完全Ｆｃ領域の２つのＦｃドメインの各々のＮ末端に、好ましくはペプチドリンカーを介して、結合され、２つの抗体分子は、同じであってもよく、又は異なってもよい。一部の実施形態において、抗体分子は、ｓｃＦｖ分子のＮ末端に結合される。
【００５４】
理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明の抗体分子は、脳内のＢＡＰ４２又は他の凝集しやすいペプチドの凝集に干渉することによって作用して、アルツハイマー又は関連障害において有益な治療／予防効果を生じさせることができる。ＢＡＰ４２は、アルツハイマー患者の脳内に様々な会合形態で存在する。ＢＡＰ４２は、高いオリゴマー化能力と繊維を形成する能力がある一連の分子の１つであり、様々な成熟段階を経るこのペプチドに関わる過程を図１に模式的に示す。
【００５５】
図１が示すように、ＢＡＰ４２は、ペプチドのモノマーから、プラークを形成することができる繊維へと進行する、凝集スキームに従って凝集する。ペプチドは、高いオリゴマー化能力を有し、自己会合によって開始して小さいオリゴマーを生じさせ、その後、それらのオリゴマーがこのペプチドの他の分子と会合する。ペプチドの構造は、繊維の特徴である、ベータシートを多く含む二次構造をもたらすように変化する。ＢＡＰ４２及び他のアミロイド形成タンパク質の毒性は、蓄積する不溶性繊維中にではなく、むしろ可溶性オリゴマー中間体中に存在しうる（Rakez et al (2003) Science 300: 486-489；Selkoe (1991) Neuron 6: 487-498；及びHardy (1992) Science 256: 184-185）。この仮説によると、脳内におけるＢＡＰ４２の産生と排除又は分解との不均衡は、アルツハイマーの開始事象であり、最終的にシナプス及び神経の機能障害及び変性に至り、その後、認知の障害となる。
【００５６】
非フィブリルＢＡＰ４２を優先的に標的とする抗体分子は、本明細書に開示する配列情報を用いて開始して組換え手段によって得てもよく、又は本明細書に開示する手順に従って、免疫グロブリンを産生させ、単離してＢＡＰ４２形態を選択することによって生じさせてもよい。実施例１は、そのような手順を例示する。簡単に述べると、異なるＢＡＰ４２形態を調製して特性解析し、次いでモノマー又はオリゴマー形態を使用してウサギを免疫した。単離したウサギ抗体を使用して、ＶＬ抗体ライブラリーを構築し、ファージディスプレイによって抗ＢＡＰ４２抗体を選択した。
【００５７】
特定の実施形態では、「ファージディスプレイ膜」を使用してファージディスプレイプロセスを最適化し、この最適化は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis）によって分離してポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ，polyvinylidene fluoride）膜にエレクトロブロットしたタンパク質に対するファージディスプレイ抗体レパートリーのパニングを含む。これらの膜には、他の膜より有意に低いバックグラウンドファージ結合レベルという利点がある（Marks et al. (2001) “Towards Proteome-wide Production of Monoclonal Antibody by Phage Display” J. Mol. Biol.  315:1063-1073）。それ故、モノマー及びオリゴマーＢＡＰ４２形態をＰＶＤＦ膜に固定化して、これらの形態に特異的な単一ドメイン抗体分子についてパニングする。本発明の別の態様は、抗体ライブラリーのパニングに使用するための、異なるＢＡＰ４２形態の膜接合体に関する。
【００５８】
本発明の抗体分子は、以前のアプローチと比較して有利である、アルツハイマー病及び関連障害に関する治療及び予防アプローチを一般に提供する。例えば、単一ドメイン形式の抗体分子は、非フィブリルＢＡＰ４２形態に対する高い免疫特異性と小さいサイズ及び安定性を兼ね備えており、したがって、アルツハイマーの免疫治療での使用に有利な薬剤をもたらす。
【００５９】
一部の実施形態において、抗体分子は、サイズが小さく、例えば、約３０ｋＤａ未満、約２０ｋＤａ未満、約１５ｋＤａ未満若しくは１０ｋＤａ未満であり、及び／又は約５ｋＤａより大きい、約１０ｋＤａより大きい、又は約１５ｋＤａより大きい。特に好ましい実施形態において、抗体分子は、サイズが約１２〜１５ｋＤａの単一ドメイン抗体である。この小さいサイズは、ＩｇＧ１分子のサイズ（約１５０ｋＤａ）より約１桁小さい。小さいサイズは、組織への透過を増すことができ、フルサイズの抗体には接近できないこともあるタンパク質標的の空洞又は活性部位内に結合することができる。小さいサイズは、生成物１グラム当たりのモル当量をより高くさせることもあり、その結果、１用量当たりの力価が増され、全製造コストが低下される。小さいサイズは、下でより詳細に説明するように、単独での、又は送達ペプチドに融合した状態での、ＢＢＢの通過も促進する。
【００６０】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体分子は、ＶＬドメインを含み、ＶＨドメインを含まない。特定の実施形態において、抗体分子は、単一ドメイン抗体、好ましくは、ウサギＶＬドメイン又はそれに由来するヒト化ＶＬドメインからなる。単一ドメイン抗体は、一般に、長さ約１００アミノ酸、例えば、長さ約９０、約１００、約１１０又は約１１５アミノ酸である。
【００６１】
一部の実施形態において、抗体分子は、モノマーであり、可溶性であり、したがって、好ましくは、凝集物を形成しない、又は有意な程度には凝集物を形成しない（又は凝集を減少させるように抗体分子を改変することができる）。本発明の単一ドメイン抗体分子は、例えば、細菌、酵母及び／又は哺乳動物細胞系において一般によく発現するので、産生する上でさらに有利である。一部の実施形態において、抗体分子は安定しており、例えば、単一ドメイン抗体は、一般に、循環内でフルサイズの抗体より安定しているが、それらの安定性をさらに増すように改変することもできる。一部の実施形態において、抗体分子の血清半減期は、例えば、半減期を延長するためのアプローチ、例えば、これらに限定されるものではないが、ＰＥＧ化、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ，human serum albumin）への融合、及びＨＡＳ結合ペプチドへの融合を用いて、数分又は数時間から数週間に増される（例えば、その全体が参照により組み込まれているda Silva, et al.の国際公開第２０１３／０４３０７１号パンフレットに記載されているアプローチも参照されたい）。安定性が増した本発明の抗体分子は、経口投与又は肺経路による送達の選択肢を与えることもあり、及び／又はＢＢＢに透過できることもある。安定性が増した抗体分子は、例えば精製、保管及び／又は輸送中に、活性をよりよく保持できることもある。例えば、一部の実施形態において、抗体分子は、凍結乾燥又は熱変性などの厳しい条件に付された後、活性を保持する。
【００６２】
特定の実施形態では、改良型ＣＡＴ融合アッセイ（例えば、その全体が参照により組み込まれているGoncalves et alの国際公開第２００８／１３６６９４号パンフレットを参照されたい）を用いて、抗体分子を安定性について選択する。ＣＡＴ融合アッセイを用いる安定したｓｄＡｂライブラリーの選択を説明する、下に提供する実施例１、パート（ｃ）、サブパート（iv）も参照されたい。簡単に述べると、安定したドメインを含有する融合体を発現する細菌がクロラムフェニコールに対してより耐性である場合、推定ドメインのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼへの融合によって、安定したドメインを選択することができる。安定性をこのアッセイによって定義することができ、例えば、本発明の安定した抗体分子は、ＣＡＴに融合されて所与の細菌において発現したときに、定められた量のクロラムフェニコールの存在下で、ある特定の時間内に、その細菌のある特定の数のコロニーの増殖を可能ならしめるものとして定義することができる。
【００６３】
ある特定の実施形態において、抗体分子の安定性は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼと融合している前記抗体分子をコードする１コロニー形成単位のベクターによる形質転換、及び形質転換された大腸菌（E. Coli）による融合体の発現を介して、２４時間以内に、３７℃及び１．８６ｍＭクロラムフェニコールの存在下で形質転換された大腸菌の４００〜６００コロニーの増殖を可能ならしめることとして定義される。下の実施例１、表６を参照されたい。安定性を、他のパラメータ、例えば、表６及び附属の文章の中で提供するパラメータによって定義することもできる。
【００６４】
好ましい実施形態において、抗体分子は、ＢＡＰ４２のモノマー又はオリゴマー種の凝集に干渉し、その結果、脳内でフィブリルを形成するオリゴマーのフィブリル化及び／若しくは凝集を減少、逆行、防止、緩徐化若しくは遅延させる、又は脳内でプラークの解凝集を起こさせる。特定の実施形態において、抗体分子は、脳内でのＢＡＰ４２のフィブリル化を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％妨げる。フィブリル化を妨げる程度は、例えば、候補抗オリゴマーＢＡＰ４２抗体分子を使用するインビトロアッセイによって評定することができる。そのようなインビトロアッセイの例については、実施例１、パート（ｃ）、サブパート（ｖ）を参照されたい。
【００６５】
一部の実施形態において、抗体分子は、脳内皮細胞を含む内皮細胞層、例えば、ヒトのＢＢＢを通過する。抗体分子は、投与後、例えば、対象への非経口投与後、ＢＢＢを通過して脳及びＣＮＳに到達することができる。好ましい実施形態において、抗体分子は、送達ペプチドを使用しなくてもＢＢＢを通過する。より好ましい実施形態において、抗体分子は、脳内皮細胞を含まないバリアなどの他の内皮細胞層より高い度合いでＢＢＢを通過する。
【００６６】
好ましい実施形態において、抗体分子は、送達ペプチドに融合されていなくても、モデルＢＢＢを越える有効な移行を示す。例えば、本発明の抗体分子は、例えば標識された抗体分子の放射活性によって測定して、ＢＢＢモデルにおいて２４時間以内のインキュベーションで少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％の移行を好ましくは示す。特に好ましい実施形態では、ＢＢＢの細胞と相互作用することなく、又はＢＢＢの細胞と実質的に相互作用することなく、例えば、ＢＢＢ細胞内に内在化されて蓄積することなく、又は実質的にＢＢＢ細胞内に内在化されて蓄積することなく、移行が起こる。したがって、非常に好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、驚くべきことに、脳内皮細胞内に少ししか捕捉されないばかりでなく水性媒体への高い溶解度とＢＢＢを越える効率的移行も兼ね備えている。
【００６７】
好ましい実施形態において、抗体分子は、対象の脳に到達するのに及び／又はその後、脳から排除され、最終的に対象の身体から除去されるのに好適な生体内分布プロファイルを有する。生体内分布プロファイルを、当技術分野において公知の又は本明細書に記載する技術によって判定してもよい。例えば、抗体分子を１つ又は２つ以上の放射性同位元素で標識し、被験動物に注射してもよい。注射後、様々な時点で屠殺後、脳組織を含む様々な器官／組織を除去し、計量し、放射活性について試験する。ＢＢＢの通過又はＢＢＢを越える移行を当技術分野において公知の又は本明細書に記載する技術によってインビボで測定してもよい。例えば、健常又は５ｘＦＡＤトランスジェニックマウスを使用してもよく、その場合、送達ペプチドに融合している又はしていない抗体分子を動物に注射し、その後、脳を画像化して抗体分子の移行を判定する。実施例４は、本発明の例示的な抗体分子の投与後、チアジンレッドを使用して２光子顕微鏡法に従ってプラークを同定する、このアプローチに関するさらなる詳細を提供する。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号１〜２１からなる群から選択される１つのアミノ酸配列若しくは配列番号１〜２１のいずれか１つのＢＡＰ４２オリゴマー結合断片を含む、又はそのようなアミノ酸配列若しくは断片からなる単一ドメイン抗体の１つ若しくは２つ以上を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号１〜２１からなる群から選択される１つのアミノ酸配列若しくはそのＢＡＰ４２オリゴマー結合断片を含む、又はそのようなアミノ酸配列若しくは断片からなる単一ドメイン抗体である。ＢＡＰ４２オリゴマー結合断片は、親分子の免疫特異性を保持する、又は親の免疫特異性を実質的に保持する、同定された抗体分子の短縮形態を指す。例えば、断片は、ＢＡＰ４２オリゴマーに対する優先的免疫特異的結合を保持することができるが、ＢＡＰ４２の繊維とは免疫特異的に結合しないだろう。この活性を保持する断片は、本明細書に記載する及び下の実施例１で詳細に述べるように、所与のアミノ酸配列の様々な長さの断片を生成し、ＢＡＰ４２繊維と比較してＢＡＰ４２オリゴマーとの結合について試験することによって、選択することができる。
【００６９】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体分子は、ヒト化されている。例えば、本発明のヒト化抗体分子は、超可変領域残基が、ＢＡＰ４２オリゴマー及び／又はモノマーへの優先的及び免疫特異的結合を有するウサギＶＬドメインからの超可変領域残基によって置換されている、ヒト可変ドメイン及び／又はそれらの断片を含むことがある。好ましい実施形態において、ヒト化抗体分子は、超可変領域のすべて又は実質的にすべてがウサギＶＬドメインのものに対応するヒトＶＬドメインの実質的にすべてを含み、ＦＲのすべて又は実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。
【００７０】
一部の実施形態において、本発明のヒト化抗体分子は、バリアントである。そのようなヒト化分子は、非ヒト、例えばウサギ、ＣＤＲの１つ又は２つ以上にアミノ酸残基置換、欠失又は付加を含む。ヒト化抗体分子のバリアントは、例えば１つ若しくは２つ以上のＢＡＰ４２オリゴマー若しくはＢＡＰ４２モノマーに関して、親ヒト化抗体分子と比較して実質的に同じ結合若しくは良好な結合を有することがあり、及び／又はＢＡＰ４２フィブリルに関して、本発明の親ヒト化抗体分子と比較して実質的に同じ結合若しくは不良な結合を有することがある。一部の実施形態において、本発明のヒト化抗体分子は、当技術分野において公知の方法に基づいてヒトフレームワーク領域にグラフトされたウサギ単一ドメイン抗体からのＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ２ドメイン及びＶＬ  ＣＤＲ３ドメインのうちの１つ若しくは２つ以上を含む。さらなる実施形態では、当技術分野において公知の方法に基づいてフレームワーク領域をさらに変化させて、親と比較して結合をさらに修飾すること、例えば、１つ若しくは２つ以上のＢＡＰ４２オリゴマー若しくはＢＡＰ４２モノマーに対する免疫特異的結合を増すこと、及び／又はＢＡＰ４２フィブリルに対する結合を減少させることができる。
【００７１】
ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜２１のアミノ酸配列のヒト化バリアント又は誘導体であって、例えば配列番号１〜２１のいずれかからの１つ又は２つ以上のＣＤＲを含み、ＣＤＲがヒトフレームワーク領域にグラフトされている、ヒト化バリアント又は誘導体であり、親配列の少なくとも１つの活性を保持するヒト化バリアント又は誘導体を包含する。例えば、ヒト化バリアント又はその断片は、ＢＡＰ４２オリゴマー及び／又はモノマーに優先的に及び免疫特異的に結合することができる。この活性を保持するヒト化バリアント（及びそれらの断片）は、本明細書に記載する及び下の実施例１で詳細に述べるように、親配列の１つ又は２つ以上のＶＬ  ＣＤＲを保持して他の領域又はアミノ酸残基をヒト抗体ドメインの対応する領域又はアミノ酸残基で置換し、ＢＡＰ４２の繊維と比較してＢＡＰ４２オリゴマー又はモノマーとの結合について試験することによって、選択することができる。
【００７２】
ある特定の実施形態において、本発明は、親配列の少なくとも１つの活性を保持する、配列番号１〜２１のアミノ酸配列のバリアント若しくは誘導体、又は同じ親の少なくとも１つの活性も保持する、前記バリアント若しくは誘導体の断片を包含する。例えば、バリアント又は断片は、ＢＡＰ４２オリゴマー及び／又はモノマーに優先的に及び免疫特異的に結合することができる。この活性を保持するバリアント（及びそれらの断片）は、本明細書に記載する及び下の実施例１で詳細に述べるように、所与のアミノ酸配列のバリアントを生成し、ＢＡＰ４２の繊維と比較してＢＡＰ４２オリゴマー又はモノマーへの結合について試験することによって、選択することができる。
【００７３】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体分子は、同じ長さの（すなわち、同数の残基からなる）第二のアミノ酸配列（該第二のアミノ酸配列は配列番号１〜２１から選択される）と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、若しくはそのようなアミノ酸配列からなるバリアント、及び／又はその断片であり、バリアントは、それが由来した親配列の少なくとも１つの活性を示す（例えば、ＢＡＰ４２オリゴマー及び／又はモノマーに優先的に及び免疫特異的に結合する）。
【００７４】
本発明の抗体分子のアミノ酸配列バリアントは、候補配列に関して本明細書に提供する開示に基づいて、当技術分野において公知の技術によって生成することができる。一部の実施形態において、バリアントは、置換、挿入及び／又は欠失バリアントでありうる。欠失バリアントには親アミノ酸配列の１つ又は２つ以上の残基がなく、これらの残基は、通常、機能（例えばＢＡＰ４２オリゴマー結合）にとって不可欠なものでない。挿入変異体は、通常は、ポリペプチドの非末端位置における物質の付加を含む。
【００７５】
置換バリアントは、通常は、アミノ酸配列内の１つ又は２つ以上の部位におけるあるアミノ酸と別のアミノ酸の交換を含むものであるが、タンパク質切断に対する安定性などの抗体分子の１つ又は２つ以上の特性を、好ましくは他の機能又は特性の喪失（又は実質的喪失）なく、モジュレートするために設計されることもある。この種の置換は、保存的であることが好ましく、すなわち、あるアミノ酸を同様の形状及び電荷の別のアミノ酸で置換する。保存的置換は、当技術分野において周知であり、例えば、アラニンのセリンへの、アルギニンのリシンへの、アスパラギンのグルタミン又はヒスチジンへの、アスパルテートのグルタメートへの、システインのセリンへの、グルタミンのアスパラギンへの、グルタメートのアスパルテートへの、グリシンのプロリンへの、ヒスチジンのアスパラギン又はグルタミンへの、イソロイシンのロイシン又はバリンへの、ロイシンのバリン又はイソロイシンへの、リシンのアルギニンへの、メチオニンのロイシン又はイソロイシンへの、フェニルアラニンのチロシン、ロイシン又はメチオニンへの、セリンのトレオニンへの、トレオニンのセリンへの、トリプトファンのチロシンへの、チロシンのトリプトファン又はフェニルアラニンへの、及びバリンのイソロイシン又はロイシンへの変化を含む。
【００７６】
当業者は、例えば、単一アミノ酸変化を、好ましくは配列番号１〜２１の中の非保存位置で、発生させて、どのアミノ酸残基が免疫特異的結合に重要であるのかを非常に詳細に特定することができる。好ましくは、アミノ酸の変異は、等価の、又はさらには改善された、次世代抗体分子を生じさせる。例えば、ある特定のアミノ酸で他のアミノ酸を、機能（例えば、ＢＡＰ４２オリゴマーへの優先的結合）の検出可能な又は実質的な喪失なく、置換することができる。そのような変化を加える際、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することがある。免疫特異性を付与する際のヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野において一般に理解されている。アミノ酸の相対ヒドロパシー性は、結果として生ずるタンパク質の二次構造に寄与し、そしてまたこの二次構造が、そのタンパク質の他の分子との相互作用、例えば、フィブリルと比較してＢＡＰ４２オリゴマー又はモノマーへの免疫特異的結合を規定すると理解されている。各アミノ酸には、それらの疎水性及び電荷特性に基づいてヒドロパシー指数が割り当てられている。例えば、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン  ０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、及びアルギニン（−４．５）。同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて有効に行うことができることも、当技術分野では理解されている。疎水性同様、親水性の値が各アミノ酸に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０＋１）、グルタメート（＋３．０＋１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５＋１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。あるアミノ酸での別のアミノ酸の置換によって、それらのヒドロパシー指数及び／又はそれらの親水性指数が互いに＋２、好ましくは１、又は最も好ましくは＋５以内である場合、等価の分子を得ることができる。
【００７７】
ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０又は１１以上のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失など）を含む抗体分子を包含する。好ましい実施形態では、免疫特異性が保持される又は実質的に保持されるように変異を起こさせる。
【００７８】
３．血液脳関門を通過するペプチド
本発明の別の態様は、血液脳関門を通過するペプチド、特に、配列番号１２７のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片であって、ＢＢＢを特異的に通過する断片に関する。ペプチドは、脳及びＣＮＳへの送達のためにＢＢＢを越えてカーゴ分子、例えば治療及び予防剤を移送するのを促進する、送達システムを提供する。特定の実施形態において、送達ペプチドは、長さ約１０〜約３０アミノ酸の断片、好ましくは約１５〜約２５アミノ酸、又は約１０〜約２０アミノ酸の断片を含む。
【００７９】
本発明の送達ペプチドは、脳内皮細胞を含む内皮細胞層、例えば、哺乳動物のＢＢＢ、好ましくはヒトのＢＢＢを通過する能力を示す。ある特定の実施形態において、送達ペプチドは、血液脳関門以外の内皮層などの他の細胞を含む内皮細胞層より高い度合いで、脳内皮細胞層を通過する。特定の実施形態において、送達ペプチドは、ＢＢＢを選択的に又は優先的に通過し、したがって、ＢＢＢの方が一般には通過困難であるにもかかわらず、他の内皮層を通過するより高い度合いでこのバリアを通過する。
【００８０】
ＢＢＢへの選択的又は優先的送達を「ＢＢＢ特異的送達」と呼び、そのような送達を果すペプチドを「ＢＢＢ特異的送達ペプチド」又は「ＢＢＢ特異的ペプチド」と呼ぶ。例えば、送達ペプチドは、脳内皮細胞を含まない内皮細胞層より高い度合いで、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、又は少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、又は少なくとも約８０倍といった倍率で、ＢＢＢを通過することができる。一部の実施形態において、ペプチド分子は、ＢＢＢ以外の内皮細胞層を通過しない、又は実質的に通過しない。
【００８１】
血液脳関門の通過、又は血液脳関門を越える移行を、当技術分野において公知の又は本明細書に記載する技術によって測定してもよい。実施例２は、ＢＢＢ通過を測定するための幾つかの例示的なアプローチを提供する。例えば、トランズウェルシステムの組織培養インサートで増殖する脳内皮細胞（ＢＥＣ、例えばｂＥｎｄ３細胞）からなるインビトロＢＢＢモデルを使用することができる。ＢＥＣをミクロ多孔質膜上で増殖させて、システムの上の区画（頂部）と下の区画（基底部）の間にインビトロで内皮バリアを形成することができる。単離して標識した送達ペプチド、又はファージディスプレイ技術によって提示された送達ペプチド、いずれかを頂端に導入し、様々な期間にわたってインキュベートすることができる。所与のインキュベーション期間の後、標識又はファージを基底部において検出し、これらの測定値と頂部の標識又はファージの量と比較することによって、ペプチドがモデルＢＢＢを通過した程度を決定することになる。実施例２、パート（ａ）（図１７も参照されたい）も、実施例２、パート（ｃ）（図２２Ａ〜２２Ｆも参照されたい）も、このアプローチのさらなる詳細を提供する。
【００８２】
ある特定の実施形態において、送達ペプチドは、疎水性と親水性を兼ね備えており、正電荷に起因して負荷電膜と優先的に相互作用する。アミノ酸の疎水性及び親水性は、上に記載しており、所与のペプチドについてそのアミノ酸組成に基づいて算出することができる。様々な膜との相互作用をインビトロ及びインビボモデルで試験することができる。インビトロアッセイは、モデルＢＢＢの細胞による取り込みを測定してペプチドの内在化能力を判定することを含む。例えば、実施例２、パート（ｃ）は、このアプローチのさらなる詳細を提供する（図２３Ａ〜２３Ｅ及び表９も参照されたい）。
【００８３】
インビトロアッセイは、表面に異なる量の負電荷を有する様々な膜、例えば、異なる脂質組成を有するように設計された膜モデルについての膜電位、分配係数、又はそのような膜に対する送達ペプチドの親和定数の測定も含む。例えば、実施例２、パート（ｅ）は、このアプローチのさらなる詳細を提供する（図２６Ａ〜２６Ｃ、図２７及び表１０も参照されたい）。真核細胞の大多数はそれらの膜の内部に負荷電脂質を有するが、ＢＢＢからの内皮細胞は、他の内皮からの細胞と比較して高い負電荷をもつ表面を有する。この負電荷は、その負荷電脂質にばかりでなく、より高いグリコシル化レベルにも起因する。負荷電ＢＢＢを模倣する膜モデルによって、本発明の送達ペプチドとのそれらの静電相互作用の分析が可能になる。好ましい実施形態において、送達ペプチドは、負電荷を多く含む膜、例えば、負荷電リン脂質を多く含む膜、例えば、リン脂質の少なくとも約５０％が負に荷電している、リン脂質製のモデル膜、との相互作用しか示さない。より好ましい実施形態において、送達ペプチドは、リン脂質の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が負に荷電している膜としか相互作用を示さない。負荷電脂質としては、限定ではないが、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルセリン（ＰＯＰＳ，1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylserine）及び１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ，1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol）が挙げられる。
【００８４】
好ましい実施形態において、送達ペプチドは、モデルＢＢＢを越える有効な移行を示す。例えば、本発明の送達ペプチドは、例えば標識された送達ペプチドの放射活性によって測定して、ＢＢＢモデルにおいて２４時間以内のインキュベーションで少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％の移行又は移動を好ましくは示す。特に好ましい実施形態では、ＢＢＢの細胞と相互作用することなく、又はＢＢＢの細胞と実質的に相互作用することなく、例えば、ＢＢＢ細胞内に内在化されて蓄積することなく、又は実質的にＢＢＢ細胞内に内在化されて蓄積することなく、移行が起こる。したがって、非常に好ましい実施形態において、本発明の送達ペプチドは、脳内皮細胞内に少ししか捕捉されないばかりでなく、水性媒体への高い溶解度とＢＢＢを越える効率的移行も兼ね備えている。
【００８５】
本発明の送達ペプチドは、例えば、ＢＢＢの完全性を壊さないこと及び／又は内皮細胞に対する毒性を欠如していること、特に、脳内皮細胞に対する毒性を欠如していることを含む、ＢＢＢを越えてカーゴを送達する上での利点を提供する。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明の送達ペプチドは内皮細胞に対する毒性を欠如しており、特に、脳内皮細胞に対する毒性を欠如している。毒性を当技術分野において公知の又は本明細書に記載する技術によって測定してもよい。例えば、ＭＴＴアッセイなどの比色アッセイを使用して、様々な濃度の送達ペプチドの存在下でＢＢＢ細胞の毒性をインビトロで測定して細胞代謝を評定することができる。実施例２、パート（ｄ）は、このアプローチに関するさらなる詳細を提供する（図２４Ａ〜２４Ｅも参照されたい）。脳内皮細胞に対する毒性を欠如している送達ペプチドは、所与のインキュベーション期間にわたってある特定の濃度のペプチドとのインキュベーションによって、層内の細胞の生存率を低下させないものと定義することができる。例えば、血液脳関門の内皮細胞に対して毒性を欠如している送達ペプチドは、１００μＭのペプチドとの２４時間のインキュベーション後に内皮細胞の生存率の、２０％を超える減少を生じさせない、又は１０％を超える低下を生じさせないペプチドと定義することができる。毒性の欠如を、他のパラメータ、例えば、図２４Ａ〜２４Ｅ及び附属の文章の中で提供するパラメータによって定義することもできる。
【００８７】
好ましい実施形態において、送達ペプチドは、対象の脳に到達するのに及び／又はその後、脳から排除され、最終的に対象の身体から除去されるのに好適な生体内分布プロファイルを有する。生体内分布プロファイルを、当技術分野において公知の又は本明細書に記載する技術によって判定してもよい。例えば、送達ペプチドを１つ又は２つ以上の放射性同位元素で標識し、被験動物に注射してもよい。屠殺後、脳組織を含む、様々な器官／組織を除去し、計量し、放射活性について試験する。実施例２、パート（ｆ）は、迅速な脳への取り込みを示す送達ペプチドを同定する、このアプローチに関するさらなる詳細を提供する（表１１も参照されたい）。迅速な脳への取り込みを示す送達ペプチドは、ある特定の量のペプチドの注射後、ある特定の期間内に被験動物の脳に到達するものと定義することができる。例えば、１０４μｇのペプチドをマウスに注射して約２分以内にそのマウスの脳に到達する送達ペプチドは、迅速な脳への取り込みの点から望ましい生体内分布を示すものとして同定されうる。迅速な脳への取り込みを、他のパラメータ、例えば、表１１及び附属の文章の中で提供するパラメータによって定義することもできる。
【００８８】
生体内分布は、いかに迅速に送達ペプチドがＢＢＢを通過して脳に到達するのかのみならず、その後、いかに迅速に脳から排除されて排泄のために循環に戻るのかにも関係する。脳からの排除を「脳からの排出（brain washout）」と言うこともあり、その場合、望ましい送達ペプチドは、脳への迅速な透過、その後、迅速な脳からの排出を示すものである。脳からの排除を、当技術分野において公知の又は本明細書に記載する技術によって、例えば、放射標識した候補ペプチドの注射後に屠殺した動物の脳を放射活性について測定することによって、判定してもよい。実施例２、パート（ｆ）は、迅速な脳からの排除を示す送達ペプチドを同定する、このアプローチに関するさらなる詳細を提供する（表１１も参照されたい）。脳からの送達ペプチドの望ましい排除は、ある特定の量のペプチドの注射後、ある特定の期間内に被験動物の脳内に残存するペプチドのパーセンテージ、又は逆に、脳から排除されるパーセンテージによって定義することができる。例えば、好ましい実施形態において、マウスの脳に到達した送達ペプチドの少なくとも約９０％は、１０４μｇのペプチドをマウスに注射して６０分以内にマウスの脳から排除されうる。迅速な排除を、他のパラメータ、例えば、表１１及び附属の文章の中で提供するパラメータによって定義することもできる。
【００８９】
生体内分布は、送達ペプチドが、排出器官に加えて他の器官内に蓄積するかどうかにも関係する。上記の及び／又は当技術分野において公知の、生体内分布プロファイルを生成する方法を用いて、この特徴についてさらにアッセイしてもよい。この場合もやはり、例えば実施例２、パート（ｆ）、及び表１１を参照されたい。
【００９０】
従って、本発明の送達ペプチドは、疎水性と親水性を兼ね備えている配列番号１２７の断片であって、正荷電アミノ酸残基に起因して、ＢＢＢを模倣する負荷電膜としか又は実質的にそのような膜としか相互作用しない；好ましくは、ＢＥＣ内に蓄積しない、若しくは実質的に蓄積しない、及び／又はＢＢＢ膜を破壊しない、若しくは実質的に破壊しない、及び／又はＢＥＣ生存率を低下させない、若しくは実質的に低下させない；より好ましくは、動物モデルにおいて迅速な脳への取り込み及び／又は迅速な脳からの排除を示す、断片を含む。本アプローチは、ＢＢＢを優先的に及び効率的に通過し、驚くべきことに、文献（Muruganandam, et al. (2002) FASEB J, 16(2): 240-241、及びAbulrob, et al. (2005) J Neurochem 95(4):1201-1214）に記載されている他の分子より優れた又はそのような他の分子に匹敵する脳への送達を果すＢＢＢ特異的送達ペプチドを提供する。例えば、他の放射標識ペプチド、例えば、ＴＡＴ、ペネトラチン、ｓｙｎＢ１及びその他のものの脳への取り込み率は、組織１グラム当たりたった０．２〜０．９％ＩＤの範囲である（Sarko, et al., Mol Pharm (2010) 7(6):2224-2231）。
【００９１】
特定の実施形態において、本発明の送達ペプチドは、配列番号２２〜２５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、若しくは配列番号２２〜２５のいずれか１つのＢＢＢ特異的断片を含む、又はそのようなアミノ酸配列若しくはそのような断片からなる。特定の実施形態において、送達ペプチドは、配列番号２２〜２５からなる群から選択される１つのアミノ酸配列、若しくはそのＢＢＢ特異的断片を含む、又はそのようなアミノ酸配列若しくはそのような断片からなる。ＢＢＢ特異的断片は、親分子の能力を保持する、又はＢＢＢを選択的に通過する親の能力を実質的に保持する、同定された送達ペプチドの短縮形態を指す。例えば、断片は、非脳内皮細胞層より高い度合いで、ＢＢＢを通過する能力を保持しうる。この活性を保持する断片は、本明細書に記載する及び下の実施例２で詳細に述べるように、所与のアミノ酸配列の様々な長さの断片を生成し、優先的なＢＢＢ通過について試験することによって、選択することができる。
【００９２】
ある特定の実施形態において、本発明は、親配列の少なくとも１つの活性を保持する、配列番号２２〜２５のアミノ酸配列のバリアント若しくは誘導体、又は同じく親配列の少なくとも１つの活性を保持する、前記バリアント若しくは誘導体の断片を包含する。例えば、バリアント又はその断片は、ＢＢＢを優先的に通過しうる。この活性を保持するバリアント（及びそれらの断片）は、本明細書に記載する及び下の実施例２で詳細に述べるように、所与のアミノ酸配列のバリアントを生成し、優先的なＢＢＢ通過について試験することによって、選択することができる。
【００９３】
ある特定の実施形態において、本発明の送達ペプチドは、同じ長さの（すなわち、同数の残基からなる）第二のアミノ酸配列（該第二のアミノ酸配列は配列番号２２〜２５から選択される）と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、若しくはそのようなアミノ酸配列からなるバリアント、及び／又はその断片であり、バリアントは、それが由来した親配列の少なくとも１つの活性を示す（例えば、他の内皮細胞層より高い度合いで、ＢＢＢを通過する）。
【００９４】
本発明の送達ペプチドのアミノ酸配列バリアントは、候補配列に関して本明細書に提供する開示に基づいて、当技術分野において公知の技術によって生成することができる。一部の実施形態において、バリアントは、上記の保存的置換を含む、置換、挿入及び／又は欠失バリアントでありうる。そのような変化を加える際、アミノ酸のヒドロパシー指数を上記のように考慮することがあり、及び／又は同じく上記のように疎水性尺度を考慮することもある。例えば、送達ペプチドの疎水性スコアを変化させない、又はより強い全体的疎水性を有するバリアントを生じさせる、保存的置換を行うことによって、バリアントを生じさせてもよい。ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０又は１１以上のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失など）を含む送達ペプチドを包含する。好ましい実施形態では、親ペプチドのＢＢＢ特異的送達が保持される又は実質的に保持されるように、変異を起こさせる。
【００９５】
理論によって拘束されるものではないが、送達ペプチド、例えば、配列番号２４のペプチド（ｐｅｐＨ３）は、受容体非依存的様式で脳内皮細胞膜を通過する。受容体に頼らない通過は、輸送が受容体の発現によっても飽和によっても制限されないので、さらに有利である。
【００９６】
特定の実施形態において、送達ペプチドは、カーゴ分子と会合している。カーゴ分子と送達ペプチドの会合は、ＢＢＢなどの脳内皮細胞層を越えるカーゴ分子の移行を一般に増加させる。カーゴ分子は、例えば治療上の、予防上の若しくは診断上の使用のために、又は脳若しくはＣＮＳ内の構造とのカーゴ分子の相互作用の分析などの基礎研究を前進させるために、ＢＢＢを越える分子の輸送を増進することが望ましい場合、いかなる分子であってもよい。カーゴ分子は、例えば、核酸、ポリペプチド、抗体分子、多糖類、小分子化合物、ナノ粒子、合成ポリマー、ウイルス、プラスミド、金属、脂質、リポソーム、高分子、高分子複合体、毒素、又は標識を含みうる。
【００９７】
適するカーゴ分子でありうる核酸の例は、当業者に公知のあらゆる核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はこれらの誘導体を含み、誘導体には、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、一本鎖又は二本鎖標的に対するアンチセンス配列、リボソーム、及びアンチセンスＲＮＡが含まれる。アナログは、荷電及び非荷電骨格アナログ、例えば、リン酸エステル、メチルリン酸エステル、アミド亜リン酸エステル、例えばＮ−３’又はＮ−５’、チオリン酸エステル、非荷電モルホリノ系ポリマー、及びタンパク質核酸（ＰＮＡ，protein nucleic acid）を含む。核酸は、プラスミドも含みうる。プラスミドは、染色体ＤＮＡとは異なる染色体外遺伝物質であって、自律複製することができる、あらゆる染色体外遺伝物質を含みうる。例えば、プラスミドは、真核細胞において自律複製することができるＤＮＡ分子であって、所望のポリペプチド、例えば治療用タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含みうる。
【００９８】
適するカーゴ分子でありうるポリペプチドの例は、ある特定の酵素若しくはホルモンのような治療若しくは予防効果が分かっているタンパク質、又はＥＧＦＰ若しくはルシフェリンのような標識として役立つことができるタンパク質を含む、当業者に公知のあらゆるポリペプチドを含む。治療用ポリペプチドとしては、限定ではないが、腫瘍抑制タンパク質、転写因子、キナーゼ阻害剤、キナーゼ、サイトカイン、調節タンパク質、アポトーシスタンパク質、抗アポトーシスタンパク質、微生物抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原又は細胞性抗原、並びにある特定の抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗増殖剤、免疫抑制剤、ヒスタミン受容体アンタゴニスト、接着分子及び受容体分子を挙げることができる。ポリペプチドは、糖タンパク質も含む。
【００９９】
送達ペプチドとともに使用するためのホルモンの例としては、限定ではないが、プロスタグランジン、セロトニン、ヒスタミン、ブラジキニン、カリクレイン、及び胃腸ホルモン、放出ホルモン、下垂体ホルモン、インスリン、バソプレッシン（ＡＤＨ）、グルカゴン、及びエンセファリンが挙げられる。送達ペプチドとともに使用するための接着分子の例としては、限定ではないが、ＩｇＳＦ  ＣＡＭ、例えばＮＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｌ１、ＣＨＬ１、ＭＡＧ、インテグリン又はセレクチン、並びに細胞接着過程で細胞又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ，extracellular matrix）に結合することが公知の他の分子が挙げられる。送達ペプチドとともに使用するための受容体分子の例としては、限定ではないが、代謝調節型受容体、Ｇタンパク質結合受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、アンジオテンシン受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、グルカゴン受容体、代謝調節型グルタミン酸受容体、ヒスタミン受容体、嗅覚受容体、オピオイド受容体、ケモカイン受容体、カルシウム感知受容体、ソマトスタチン受容体、セロトニン受容体又はセクレチン受容体、及びリガンドと結合すること、例えばシグナルを伝達することが公知の、細胞膜上、細胞質中又は核内の、他のタンパク質が挙げられる。
【０１００】
送達ペプチドとともに使用するための適するカーゴ分子でありうる抗体分子の例は、当業者に公知のあらゆる抗体、又は本明細書に記載のあらゆる抗体を含む。抗体分子は、哺乳動物免疫系の活性を阻害、低下又は遅延させる抗体分子を含む免疫抑制剤を含みうる。公知の免疫抑制剤としては、限定ではないが、抗ＩＬ−２受容体抗体、抗ＯＫＴ３抗体、抗ＣＤ３抗体、及びＴＮＦ−アルファ結合抗体が挙げられる。
【０１０１】
適するカーゴ分子でありうる多糖類の例は、当業者に公知のあらゆる多糖類、又は本明細書に記載のあらゆる多糖類を含む。
【０１０２】
適するカーゴ分子でありうる小分子化合物の例は、あらゆる有機分子、例えば、治療活性を有する旧来の薬物分子、及びある特定の化学療法剤、ビタミン、鎮痛剤、抗炎症剤などを含む。小分子化合物は、ウイルス又は細菌種の増殖を阻害する化合物をそれぞれ含む、抗ウイルス剤及び抗菌剤も含みうる。小分子化合物は、真菌種の増殖を阻害する化合物を含む抗真菌剤も含みうる。
【０１０３】
送達ペプチドとともに使用するための抗真菌剤の例としては、限定ではないが、アンホテリシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ニスタチン、クロトリマゾール、フルコナゾール、シクロピロクス、エコナゾール、ナフチフィン、テルビナフィン、及びグリセオフルビンが挙げられる。送達ペプチドとともに使用するための抗ウイルス剤の例としては、限定ではないが、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、イドクスウリジン、ソリブジン、トリフルリジン（トリフルオロピリジン）、バラシクロビル、シドホビル、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン、リバビリン、及びリマンタジン（rimantatine）が挙げられる。送達ペプチドとともに使用するための抗菌剤の例としては、限定ではないが、ベータラクタム系抗生物質若しくはキノロン系抗生物質、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、セファロスポリン、セフォタキシム、セフトリアキソン、リファンピン、ミノサイクリン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、マクロライド、キノロン、β−ラクトン、Ｐ−ラクタマーゼ阻害剤、サリチルアミド、バンコマイシン、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルフィソキサゾール、スルファジアジン、ペニシリン、例えば、ペニシリンＧ及びＶ、メチシリン、オキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン並びにピペラシリン、セファロスポリン、例えば、セファロチン、セファキソリン、セファレキシン、セファドロキシル、セファマンドール、セフォキシチン、セファクロル、セフロキシン（cefuroxine）、ロラカルベフ、セフォニシド、セフォテタン、セフォラニド、セフォタキシム、セフポドキシム、プロキセチル（cefpodoxime, proxetil）、セフチゾキシム、セフォペラゾン、セフタジジム及びセフェピム、アミノグリコシド、例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシンなど、テトラサイクリン、例えば、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン及びミノサイクリン、並びにマクロライド、例えば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン及びアジスロマイシン、又はこれらのアナログが挙げられる。
【０１０４】
小分子化合物は、細胞増殖を阻害又は制限する化合物を含む、抗増殖剤も含みうる。送達ペプチドとともに使用するための抗増殖剤の例としては、限定ではないが、メトトレキサート、アザチオプリン、フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、６−チオグアニン、シクロホスファミド、メクロレタミン塩酸塩、カルムスチン、シクロスポリン、タキソール、タクロリムス、ビンブラスチン、ダプソン、ネドクロミル、クロモリン（クロモグリク酸）、及びスルファサラジンが挙げられる。小分子化合物は、腫瘍を阻害、減少又は遅延させる化合物を含む、抗悪性腫瘍剤も含みうる。送達ペプチドとともに使用するための抗悪性腫瘍剤の例としては、限定ではないが、ペントスタチン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、メトトレキサート、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル、シタラビン、フルダラビン、マイトマイシン、シスプラチン、プロカルバジン、ダカルバジン、パクリタキセル、コルヒチン、及びビンカアルカロイドが挙げられる。
【０１０５】
送達ペプチドとともに使用するための適するカーゴ分子でありうるナノ粒子の例は、４００ｎｍ未満の少なくとも１つの寸法又は当業者に公知の任意の他の適する形及びサイズを有するあらゆる小粒子、例えば、金粒子、量子ドット担持高分子ミセル、又はある特定のリポソームを含む。より好ましくは、ナノ粒子は、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約２０未満、約１０ｎｍ未満又は３ｎｍ未満の少なくとも１つの直径を有する。
【０１０６】
送達ペプチドとともに使用するための適するカーゴ分子でありうる合成ポリマーの例は、当業者に公知のあらゆる人工ポリマー、又は本明細書に記載のあらゆる人工ポリマーを含む。
【０１０７】
送達ペプチドとともに使用するための適するカーゴ分子でありうるウイルスの例は、当業者に公知のあらゆるタイプのウイルス又はウイルス粒子、例えば、限定ではないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、シンプレックスウイルス、レンチウイルス及びレトロウイルスを含む。ウイルスは、修飾されていてもよく、例えば、感染力を増加又は減少させるように変化させたウイルスであってもよい。ウイルス粒子は、ウイルスに由来する遺伝要素を含むウイルスベクターを含む。典型的に、ウイルスベクターの場合、ウイルス複製に必要なウイルスゲノムの一部が欠失されており、したがって、新たなビリオンの産生を可能ならしめるためにヘルパーウイルスを供給しなければならない。
【０１０８】
送達ペプチドとともに使用するための適するカーゴ分子でありうる金属の例は、当業者に公知のあらゆる金属、例えば、金、白金、ランタニド金属、アクチニド金属などはもちろん、放射性金属も含み、この場合のカーゴ分子は、検出及び／又は画像化を促進する。
【０１０９】
送達ペプチドとともに使用するための適するカーゴ分子でありうる毒素の例は、体組織との接触又は吸着時に細胞死を引き起こすことができるあらゆる分子を含む。例としては、限定ではないが、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、熱安定性及び熱不安定性大腸菌エンテロトキシン、コレラ毒素、志賀毒素、細胞致死性膨張性毒素、気管細胞毒素、ジフテリア毒素、クロストリジウム毒素、テトロドトキシン、バトラコトキシン、マウロトキシン、アジトキシン、カリブドトキシン、マルガトキシン、スロトキシン、シラトキシン、カルシセプチン、タイカトキシン、並びにカルシクルジンが挙げられる。
【０１１０】
送達ペプチドとともに使用するための適するカーゴ分子でありうる脂質の例には、脂肪酸（例えば、飽和の、不飽和の、４炭素超の鎖長の、プロスタノイド、ロイコトリエン、エコサノイドなど）、天然脂質（例えば、コレステロール及びそのエステル、トリグリセリド、ステロイド、スペルマセチ（パルミチン酸セチル）、蝋、脂肪アルコールなど）、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、エタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、血小板活性化因子、脂肪酸グリセロールエーテル、カルジオリピドなど）、及び複合脂質（例えば、スフィンゴ脂質、セラミド、糖脂質、ガングリオシド、スルホリピドなど）を限定ではないが含む、当業者に公知のあらゆる脂質が含まれる。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、カーゴ分子は、ＢＢＢを通過することによって治療的及び／又は予防的恩恵をもたらす、治療又は予防剤である。特定の実施形態において、送達ペプチドは、本明細書に記載のカーゴ分子に結合されているばかりでなく、さらに、例えばＣＮＳ／脳内の特異的構造又は受容体にカーゴ分子を指向させるための、標的化剤にも結合されている。そのような結合は、本明細書に記載のいずれの結合であってもよく、好ましくは、ペプチド結合である。標的化剤の例は、限定ではないが、細胞受容体のリガンド（例えば、ＮＧＦ、ＥＧＦ及びその他）、及び受容体に対する抗体を含む。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、カーゴは、送達ペプチドの位置及び同じくカーゴ分子と会合していることがある任意の分子の位置の画像化又は検出のために、標識を含む。本発明の文脈の中での「標識」は、巨視的又は微視的レベルでの分子及び／又は細胞プロセスの可視化を可能ならしめる、あらゆる画像診断剤又は造影剤を含む。標識の例としては、限定ではないが、ｍＴｃグルコヘプトン酸；磁気共鳴画像法（ＭＲＩ，magnetic resonance imaging）手順に使用される物質、例えば、ガドリニウムドープキレート剤、例えばＧｄ−ＤＴＰＡ；発現したときに検出可能なタンパク質、例えば、ベータガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，horse-radish peroxidase）、ルシフェラーゼ、又は細胞のマーキングに適している他の酵素をコードするマーカー遺伝子；重金属；ハロゲン；酵素；酵素基質；酵素補因子；酵素阻害剤；リガンド；及びハプテン；並びに蛍光部分構造、例えば蛍光体；蛍光消光部分構造、放射性部分構造、例えば放射性核種；放射線不透過性部分構造；常磁性部分構造；ナノ粒子；小胞；分子ビーコン；同位元素；マーカー、色素、放射線増感剤（例えば、放射線治療用のもの）、又は他の画像診断剤若しくは造影剤が挙げられる。
【０１１３】
例示的な蛍光標識としては、限定ではないが、蛍光色素、フルオレセイン、半導体量子ドット、ランタニド原子含有錯体、及び蛍光タンパク質が挙げられる。例示的な蛍光タンパク質としては、限定ではないが、天然に存在する緑色蛍光タンパク質と修飾された（すなわち変異体）緑色蛍光タンパク質の両方（Prasher et al., Gene 111:229-233 (1992)、ＰＣＴ出願国際公開第９５／０７４６３号パンフレット（これらの参考文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている））、天然に存在する青色蛍光タンパク質と修飾された青色蛍光タンパク質の両方（Karatani et al., Photochem. Photobiol. 55(2):293-299 (1992)、Lee et al., Methods Enzymol. (Biolumin. Chemilumin.) 57:226-234 (1978)、Gast et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80(1):14-21 (1978)（これらの参考文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている））、及びラン藻類及び真核性藻類に由来するタイプのフィコビリタンパク質（Apt et al., J. Mol. Biol. 238:79-96 (1995)、Glazer, Ann. Rev. Microbiol. 36:173-198 (1982)、Fairchild et al., J. Biol. Chem. 269:8686-8694 (1994)、Pilot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6983-6987 (1984)、Lui et al., Plant Physiol. 103:293-294 (1993)、Houmard et al., J. Bacteriol. 170:5512-5521 (1988)（これらの参考文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている））が挙げられ、これらのうちの幾つかは、ProZyme社（San Leandro、Calif.）から市販されている。
【０１１４】
送達ペプチドを標識するための適するカーゴ分子でありうる同位元素の例は、あらゆる放射性同位元素を含む。放射性同位元素の例としては、限定ではないが、Ｎ１５、Ｃ１３、Ｐ３１、Ｆ１９、又はＩ１３１が挙げられる。好ましい放射性同位元素としては、テクネチウム（例えば、９９ｍＴｃ）及びガリウム（例えば、ＧａＣｌ３）が挙げられる。実施例２、パート（ｂ）は、ＢＢＢモデルでのインビトロアッセイに使用するための本発明の送達ペプチドを標識するためのこれらの放射性同位元素の使用に関するさらなる詳細を提供し、実施例２、パート（ｆ）は、マウスにおけるインビボ生体内分布研究での使用についての詳細を提供する。
【０１１５】
送達ペプチドを標識するための適するカーゴ分子でありうる色素の例は、分子用のあらゆる有色物質を含む。例示的な色素としては、限定ではないが、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、テキサスレッド、カルセイン、ＦＩＴＣ、ＦｌｕｏｒＸ（商標）、Ａｌｅｘａ  ４０５、４３０、４８８、５４６、５５９、５９４、６３３、６６０、６７４、６８０、７００、ローダミン色素、カスケードブルー、パシフィックブルー、５−ＦＡＭ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）４８８、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、５６４／５７０、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）、フィコエリトリン、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）、ピロニンＹ、Ｃｙ３．５（商標）、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｒｉｍｓｏｎ（商標）、Ａｌｅｘａ（商標）５９４、ナイルレッド、Ｒ−フィコシアニン、Ｃ−フィコシアニン、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）、ＣｙＳ（商標）、チアジカルボシアニン、及びＣｙ５．５（商標）が挙げられる。例示的なランタニド原子としては、限定ではないが、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ及びＬｖが挙げられる。これらのうち、Ｎｄ、Ｅｒ及びＴｂは、画像化用途に一般に使用されているので、好ましい。
【０１１６】
送達ペプチドは、そのカーゴ分子と、共有結合性及び／又は非共有結合性相互作用によって、好ましくは、ＢＢＢを通過して送達するための安定したコンストラクト又は複合体を形成するように、会合していることがある。例えば、送達ペプチドとそのカーゴ分子は、静電相互作用、ファンデルワールス力、及び／又は水素結合によって非共有結合的に会合していることがある。好ましくは、会合は、共有結合性手段、例えば、送達ペプチド上の基とカーゴ分子上の基との化学結合の形成による。結合は、直接的であってもよく、又は例えばリンカーを使用して、間接的であってもよい。特定の実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカーである。カーゴ分子を送達ペプチドのＮ末端若しくはＣ末端のどちらかに結合させてもよく、又はそのアミノ酸配列内の部位に結合させてもよい。
【０１１７】
カーゴ分子がポリペプチドを含む一部の実施形態では、カーゴ分子は、送達ペプチドに融合体として結合されていることもある。例えば、カーゴ分子及び送達ペプチドを単一の核酸（又はポリヌクレオチド）から単一の連続領域として発現することもある。これらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらの核酸を含むベクター又は宿主細胞、並びにこれらの宿主細胞、ベクター及び／又はポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、本発明によって企図される。
【０１１８】
本明細書に記載する送達システムを１つ又は２つ以上の他の送達アプローチと併用してもよい（例えば、Neuwelt et al. “Strategies to advance translational research into brain barriers” Lancet Neurol. 2008 (7):84-96、Pardridge, Pharmaceutical research (2007) 24:1733-1744、Pardridge, Drug Discov Today (2007) 12(1-2): 54-61、Pardridge, Nat Rev Drug Discov (2002) 1(2):131-139、Strazielle, et al. Mol Pharm (2013) 10(5):1473-1491、Abbott, et al. Neurobiol Dis. (2010) 37:13-25、Patel, et al., CNS Drugs (2009) 23(1): 35-58、Neuwelt, et al. Nature reviews Neuroscience (2011) 12:169-182、Interlandi, Scientific American (2013) 308:52-57、Niewoehner, et al. Neuron. (2014) 81:49-60、Yu, et al. Science translational medicine (2014) 6:261ra154、Sharma, et al. Journal of pharmaceutical sciences (2012) 101:2468-2478、Derossi, et al. The Journal of biological chemistry (1994) 269:10444-10450、Zou, et al. Curr Neuropharmacol (2013) 11(2): 197-208、及びGupta, et al. Advanced drug delivery reviews (2005) 57:637-651において論じられているアプローチを参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により組み込まれている）。
【０１１９】
特定の実施形態において、カーゴ分子は、アルツハイマー又は関連障害を治療するための、当技術分野において使用されている又は試験中の、活性薬剤を含む。例えば、カーゴ分子は、オリゴマー形成の阻害剤であるＥＬＮ  ０００５；ＢＡＰのＮ末端Ｂ細胞エピトープに由来するＢＡＰ１−６ペプチドを提供するＣＡＤ  １０６（Novartis社）；ＢＡＰ１−６アミノ末端断片を提供するＡＣＣ−００１（Ａｆｆｉｔｏｐｅ  ＡＤ０２）；及びＩＳＣＯ−ＭＡＴＲＩＸにコンジュゲートされたアミノ末端ＢＡＰを提供するＶ９５０のうちの１つ又は２つ以上であってもよい。ＣＮＳ及び脳への送達を向上させるために、これらの活性薬剤のいずれかの１つ又は２つ以上を本発明の１つ又は２つ以上の送達ペプチドと、例えば融合体として、会合させてもよい。
【０１２０】
特定の実施形態において、カーゴ分子は、アルツハイマー又は関連障害を治療するための、当技術分野において使用されている又は試験中の、抗体を含む。好ましい実施形態において、カーゴ分子は、例えば、本明細書に記載の又は当技術分野において公知の、ＢＡＰ又はその断片に免疫特異的に結合する抗体分子を含む。当技術分野における抗ＢＡＰ抗体の例としては、ＢＡＰの可溶性形態とフィブリル形態の両方と結合するヒト化モノクローナル抗ＢＡＰ抗体バピネオズマブ（Wyeth社及びElan社）（その全体が本明細書に組み込まれている、Bard et al. (2000) Nature Medicine 6: 916-919）；プロトフィブリルを標的とするヒト化モノクローナル抗体であるＢＡＮ２４０１；ＢＡＰ１−４０及びＢＡＰ４２に対するヒト化抗体であるクレネズマブ；ＢＡＰ１−１１に対するヒト化モノクローナル抗体であるガンテネルマブ；ＢＡＰのＮ末端に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＧＳＫ９３３７７６；及び可溶性ＢＡＰに優先的に結合するＢＡＰ１６−２４に対するヒト化モノクローナル抗体であるソラネズマブ（Eli Lilly社）（その全体が本明細書に組み込まれている、Teich (2012) Biochem.J. 446: 165-177）；並びにSumbria, et al. “Disaggregation of amyloid plaque in brain of Alzheimer's disease transgenic mice with daily subcutaneous administration of a tetravalent bispecific antibody that targets the transferrin receptor and the beta amyloid peptide” Molecular pharmaceutics (2013) 10: 3507-3513（その全体が本明細書に組み込まれている）に記載されている抗体が挙げられる。ＣＮＳ及び脳への送達を向上させるために、これらの抗体のいずれかの１つ又は２つ以上を本発明の１つ又は２つ以上の送達ペプチドと、例えば融合体として、会合させてもよい。
【０１２１】
より好ましい実施形態において、カーゴ分子は、例えば本発明の送達ペプチドに融合している、本発明の抗体分子、例えば、下でより詳細に説明するものを含む。
【０１２２】
４．抗体−ペプチドコンストラクト
特定の実施形態では、本発明の抗体分子を本発明の送達ペプチドに結合させて抗体−ペプチドコンストラクトを形成する。一般に、抗体−ペプチドコンストラクトが示す、血液脳関門を通過する及び特異的に通過する能力は、ペプチドが結合していない抗体分子より高い。抗体分子の送達は、アルツハイマー又はその関連障害（脳内の凝集しやすいペプチドの蓄積に関連する状態を含む）に治療的及び／又は予防的恩恵をもたらすことができる。上で述べたように、送達ペプチドは、例えば、好ましい実施形態では、非毒性化合物に分解すること、及び／又はインビボで薬物間相互作用をもたらす可能性が低いことなどの、治療上及び予防上の使用にとっての利点を提供する。それらは、一般に、大きいタンパク質と比較して免疫反応を引き起こす確率も低く、したがって、担体分子としてもたらす免疫原性が低い。
【０１２３】
血液脳関門通過の増加は、本発明の抗体分子の、該抗体分子が脳内のＢＡＰ４２オリゴマーのフィブリル化を減少、防止、緩徐化、遅延又は逆行させるように作用する、脳への送達を促進する。好ましい実施形態において、抗体−ペプチドコンストラクトは、ＢＢＢ通過を、ペプチドが結合していない抗体分子と比較して少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、又は少なくとも約６倍といった倍率で増加させる。
【０１２４】
特定の好ましい実施形態において、抗体−ペプチドコンストラクトは、ＢＢＢを優先的に通過し、したがって、ＢＢＢの方が一般には通過困難であるにもかかわらず、他の内皮層を通過するより高い度合いでこのバリアを通過する。例えば、抗体−ペプチドコンストラクトは、脳内皮細胞を含まない内皮細胞層より高い度合いで、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、又は少なくとも約８０倍といった倍率で、ＢＢＢを通過しうる。一部の実施形態において、抗体−ペプチドコンストラクトは、血液脳関門以外の内皮細胞層を通過しない、又は実質的に通過しない。
【０１２５】
特定の実施形態では、抗体分子を共有結合で、好ましくは融合体として、送達ペプチドに結合させる。抗体分子及び送達ペプチドを互いに対していかなる順序で配置してもよく、例えば、送達ペプチドを抗体分子のＮ末端の上流に融合させてもよく、又は送達ペプチドを抗体分子のＣ末端の下流に融合させてもよい。一部の実施形態では、抗体分子をリンカー、好ましくはペプチドリカーによって送達ペプチドに結合させる。例えば、リンカーを抗体分子のＮ末端の上流又は抗体分子のＣ末端の下流に結合させ、そのリンカーの遊離末端に送達ペプチドを結合させてもよい。
【０１２６】
一部の実施形態では、１以上の抗体分子を所与の送達ペプチドと結合させてもよく、それらの複数の抗体分子は、同じ抗体分子であってもよく、又は異なる抗体分子であってもよい。例えば、下でより詳細に論じるように、２つのＶＬ抗体分子を結合させて二量体を得てもよく、その二量体自体を１つの送達ペプチドに、又は２つ若しくは３つ以上の送達ペプチドに結合させる。
【０１２７】
すなわち、一部の実施形態では、１以上の送達ペプチドを所与の抗体分子に結合させてもよく、それらの複数の送達ペプチドは、同じ送達ペプチドであってもよく、又は異なる送達ペプチドであってもよい。特定の実施形態では、２つ又は３つ又は４つの送達ペプチドを所与の抗体分子に、例えば、抗体分子のＣ末端若しくはＮ末端に連続して結合させるか、又は１つを抗体分子のＣ末端に及び２つを連続してＮ末端に結合させてもよく、又は２つを連続して抗体分子のＣ末端に及び１つをＮ末端に結合させてもよい。所与のコンストラクトに使用される複数の送達ペプチドは、各々が同じであってもよく、又は２つ若しくは３つ若しくは４つ以上の異なる送達ペプチドを使用してもよい。抗体分子１つ当たり１以上の送達ペプチドの使用は、結合力を増し、好ましくは、ＢＢＢを通過するコンストラクトの能力を増す。
【０１２８】
抗体−ペプチドコンストラクトは、上で論じたような、本発明の抗体分子の１つ若しくは２つ以上の好ましい特性、及び／又は同じく上で論じたような、本発明の送達ペプチドの１つ若しくは２つ以上の好ましい特性を兼ね備えていることが好ましい。
【０１２９】
さらに、抗体−ペプチドコンストラクトは、安定性、可溶性、及び／又は宿主細胞における高度な発現といった特性を示すことが好ましい。これらの特性を有するコンストラクトを得るために抗体分子、例えば単一ドメイン抗体分子に結合する、適する送達ペプチドは、被検単一ドメイン抗体を用いてクローニングし、それらの安定性、可溶性及び／発現の判定によって、選択することができる。実施例３、パート（ａ）〜（ｂ）は、送達ペプチドの例示的な実施形態のテストクローニング、及び被検抗体−ペプチドコンストラクトの発現の測定についての詳細を提供する。例えば、適する条件下で所与の宿主細胞において所与の発現ベクターからよく発現することが公知の被検抗体と少なくとも同様の高さの発現を有するような被検コンストラクトを選択することができる。適する条件下で所与の宿主細胞において所与の発現ベクターから安定的に及び可溶性形態で発現することが公知の被検抗体と少なくとも同様の高さの安定性及び／又は少なくとも同様の高さの溶解度を有する被検コンストラクトを選択することもできる。例えば、高い発現レベルを示す対照ｐＴ７−ｓｄＡｂと結果を比較する、実施例３、パート（ｂ）を参照されたい。
【０１３０】
本発明の好ましい抗体−ペプチドコンストラクトは、一般に、ＢＡＰ４２のオリゴマー種の凝集に干渉して、脳内でのオリゴマーのフィブリル化を減少、逆行、防止、緩徐化又は遅延させる。好ましい実施形態において、コンストラクトは、送達ペプチドが結合されていない抗体分子と同程度に、又は実質的に同程度に、脳内でのオリゴマーのフィブリル化を減少、逆行、防止、緩徐化又は遅延させる。例えば、抗体−ペプチドコンストラクトは、候補抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトの非存在下でのフィブリル化と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、フィブリル化を妨げることができる。インビトロアッセイでフィブリル化が妨げられる程度は、本発明の所与の抗体−ペプチドコンストラクトによって脳内でのフィブリル化が妨げられる程度を示すことができる。実施例３、パート（ｃ）は、ＢＡＰ４２凝集を妨げる本発明の例示的なコンストラクトの能力についての試験の詳細を提供する（図２９Ａ〜２９Ｂも参照されたい）。
【０１３１】
本発明の好ましい抗体−ペプチドコンストラクトは、対象の脳に到達するのに及び／又はその後、脳から排除され、最終的に対象の身体から除去されるのに好適な生体内分布プロファイルを一般に有する。生体内分布プロファイルを、当技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載する技術によって判定してもよい。例えば、上で説明したように、抗体−ペプチドコンストラクトを１つ又は２つ以上の放射性同位元素で標識し、被験動物に注射し、その後、屠殺した動物の脳を放射活性について所与の時間間隔後に測定してもよい。実施例３、パート（ｅ）は、迅速な脳への取り込み及び／又は迅速な脳からの排出を示す抗体−送達コンストラクトを同定する、このアプローチに関するさらなる詳細を提供する（表１４〜１６も参照されたい）。迅速な脳への取り込みを示す抗体−ペプチドコンストラクトは、ある特定の量のペプチドの注射後、ある特定の期間内に被験動物の脳に到達するものと定義することができる。例えば、約０．１ｍＭ〜約０．２ｍＭ抗体−ペプチドコンストラクトをマウスに注射して約２分以内にそのマウスの脳に到達する抗体−ペプチドコンストラクトは、迅速な脳への取り込みの点から望ましい生体内分布を示すものとして同定されうる。脳からの抗体−ペプチドコンストラクトの望ましい排除は、ある特定の量の抗体−ペプチドコンストラクトの注射後、ある特定の期間内に被験動物の脳内に残存するペプチドのパーセンテージ、又は逆に、脳から排除されるパーセンテージによって定義することができる。例えば、好ましい実施形態において、マウスの脳に到達した抗体−ペプチドコンストラクトの少なくとも約９０％は、約０．１ｍＭ〜約０．２ｍＭ抗体−ペプチドコンストラクトをマウスに注射して６０分以内にマウスの脳から排除されうる。（０．１ｍＭ〜約０．２ｍＭは、約１５０μｇ〜約２５０μｇの抗体又は抗体−ペプチドコンストラクトと等価である）。迅速な脳への取り込み及び迅速な脳からの排除を含む、望ましい生体内分布を、他のパラメータ、例えば、表１４〜１６及び附属の文章の中で提供するパラメータによって定義することもできる。
【０１３２】
好ましい実施形態において、コンストラクトは、送達ペプチドに結合していない対応する抗体分子と比較して驚くほど向上した生体内分布プロファイルを示す。例えば、未結合抗体分子と比較して、抗体−ペプチドコンストラクトは、脳への取り込みの少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍増加を示すことができる。未結合抗体分子と比較して、抗体−ペプチドコンストラクトは、脳からの排出の増加を示すこともあり、又は脳への取り込みの向上より少ない程度に脳からの排出の減少を示すこともある。表１４は、例えば、驚くべきことに、「＃２」ｓｄＡｂの送達ペプチド「ｐｅｐＨ３」への結合が、２分以内に脳内のその存在を約３倍に増加させ、１時間後、脳からの排出における約２倍の遅延しか示さなかったことを示す。すなわち、約３倍の抗体が２分で脳に到達したが、１時間後に残存した（すなわち、洗い出されなかった）抗体は約２倍に過ぎなかった。さらにいっそう驚くべきことに、表１６は、「＃２７ｉｎ」ｓｄＡｂの送達ペプチド「ｐｅｐＨ３」への結合が、２分以内に脳内のその存在を約６倍に増加させ、１時間後に脳からの排出における約２倍の遅延しか示さなかったことを示す。すなわち、約６倍の抗体が２分で脳に到達したが、１時間後に残存した抗体は約２倍に過ぎなかった。
【０１３３】
本発明の好ましい抗体−ペプチドコンストラクトは、一般に、インビボで、例えば動物モデルにおいて、有効性を示す。アルツハイマー又は関連障害の適する動物モデルは、当技術分野において公知のもの又は本明細書に記載するものを含む。例えば、動物に抗体分子又はそれらのペプチドコンストラクトを注射し、その後、画像化して、動物の脳内のベータアミロイドプラークの存在及び程度を判定する場合に、５ｘＦＡＤトランスジェニックマウスを使用してもよい（Jawhar, et al. (2012) Neurobiology of Aging 33(1): 96.e29-196.e40）。実施例４は、本発明の例示的な抗体−ペプチドコンストラクトの投与後、チアジンレッドを使用して２光子顕微鏡法に従ってプラークを同定する、このアプローチに関するさらなる詳細を提供する。
【０１３４】
特定の実施形態において、本発明の抗体−ペプチドコンストラクトは、配列番号２８〜１１１からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、若しくは配列番号２８〜１１１のいずれか１つの断片を含み、又はそのようなアミノ酸配列若しくはそのような断片からなり、断片は、親配列のＢＡＰ４２オリゴマー免疫特異性及び／若しくはＢＢＢ特異性を保持する、又は親のＢＡＰ４２オリゴマー免疫特異性及び／若しくはＢＢＢ特異性を実質的に保持するものである。特定の実施形態において、抗体−ペプチドコンストラクトは、配列番号２８〜１１１からなる群から選択される１つのアミノ酸配列、若しくはそのＢＡＰ４２オリゴマー免疫特異性、ＢＢＢ特異的断片を含む、又はそのようなアミノ酸配列若しくはそのような断片からなる。これらの活性を保持する断片は、本明細書に記載するように、所与のアミノ酸配列の様々な長さの断片を生成し、ＢＡＰ４２オリゴマーへの優先結合及びＢＢＢの優先的通過について試験することによって、選択することができる。
【０１３５】
ある特定の実施形態において、本発明は、親配列の少なくとも１つの活性を保持する、配列番号２８〜１１１のアミノ酸配列のバリアント若しくは誘導体、又は同じく親の少なくとも１つの活性を保持する、前記バリアント若しくは誘導体の断片を包含する。例えば、バリアント又はその断片は、ＢＢＢを優先的に通過し、ＢＡＰ４２オリゴマー及び／又はモノマーに免疫特異的に及び優先的に結合することができる。これらの活性を保持するバリアント（及びそれらの断片）は、本明細書に記載するように、所与のアミノ酸配列のバリアントを生成し、ＢＡＰ４２オリゴマー及び／又はモノマーとの免疫特異的結合、並びに優先的ＢＢＢ通過について試験することによって、選択することができる。
【０１３６】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体−ペプチドコンストラクトは、同じ長さの（すなわち、同数の残基からなる）第二のアミノ酸配列（該第二のアミノ酸配列は配列番号２６〜１０９から選択される）と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、若しくはそのようなアミノ酸配列からなるバリアント、及び／又はその断片であり、バリアントは、それが由来した親配列の少なくとも１つの活性を示す（例えば、ＢＡＰ４２オリゴマーに優先的に及び免疫特異的に結合する、並びに／又は他の内皮細胞層より高い度合いでＢＢＢを通過する）。
【０１３７】
本発明の抗体−ペプチドコンストラクトのアミノ酸配列バリアントは、候補配列に関して本明細書に提供する開示に基づいて、当技術分野において公知の技術によって生成することができる。一部の実施形態において、バリアントは、上記の保存的置換を含む、置換、挿入及び／又は欠失バリアントでありうる。そのような変化を加える際、アミノ酸のヒドロパシー指数を上記のように考慮することがあり、及び／又は同じく上記のように疎水性尺度を考慮することもある。
【０１３８】
ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０又は１１以上のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失など）を含む抗体−ペプチドコンストラクトを包含する。好ましい実施形態では、ＢＡＰ４２オリゴマー結合及びＢＢＢ特異的送達が保持される又は実質的に保持されるように、変異を起こさせる。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体−ペプチドコンストラクトは、脱免疫化されている。すなわち、抗体−ペプチドコンストラクトを、その免疫原性を低下させるように修飾してもよく、例えば、その場合、少なくとも１つのＴＨエピトープを除去及び／又は減少させる。具体的には、送達ペプチドに融合している又はしていない抗体分子を修飾することができ、この場合の修飾は免疫原性を低下させる。一部の実施形態では、融合体の送達ペプチドを、別途、脱免疫化することもある。詳細には、本発明は、１つ又は２つ以上の送達ペプチドに融合している１つ又は２つ以上の抗体単一ドメインを含む抗体分子であって、ペプチド又はドメインのどちらか又は両方が、当技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載する任意の方法によって抗体−ペプチドコンストラクトの免疫原性を低下させるように修飾されている、抗体分子を包含する。
【０１４０】
脱免疫化は、上で述べたように、当技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載するいずれの方法によって果してもよい。したがって、一部の実施形態では、脱免疫化されている抗体分子、及び送達ペプチドとその融合体を提供する。この「脱免疫化」ポリペプチドは、ＴＨエピトープ含有量を減少させるように変異されたものであり、免疫原性を低下させる１つ又は２つ以上の置換を含む。一般に、抗体−ペプチドコンストラクトは、１つ又は２つ以上のＨＬＡクラスII受容体に結合するエピトープを減少又は除去するような１つ又は２つ以上のアミノ酸位置での置換を含む。
【０１４１】
置換は、例えば、抗体単一ドメインに、例えば軽鎖可変ドメインに起こることもあり、及び／又は融合された送達ペプチド内に起こることもある。一部の実施形態において、脱免疫化抗体分子は、少なくとも１０個のＴＨエピトープ、少なくとも１５個のＴＨエピトープ、少なくとも２０個のＴＨエピトープ、少なくとも２５個のＴＨエピトープ、少なくとも３０個のＴＨエピトープ、少なくとも４０個のＴＨエピトープ、又は少なくとも５０個のＴＨエピトープを除去する置換を含む。好ましい実施形態において、置換は、脱免疫化前の抗体分子及び／又は送達ペプチドと比較して、抗体分子の免疫特異的結合に影響を与えず、若しくは少なくとも実質的に影響を与えず、及び／又は送達ペプチドのＢＢＢ特異性に影響を与えず、若しくは少なくとも実質的に影響を与えない。
【０１４２】
本発明の抗体−ペプチドコンストラクトは、アルツハイマー及び関連障害を治療又は防止するための方法及び医薬組成物に使用はもちろん、下でより詳細に論じるような、これらの障害を診断するための方法及びキットへの使用も見出す。
【０１４３】
５．医薬組成物及びそれらの作製方法
本発明の別の態様は、本発明の医薬組成物及び該医薬組成物の作製方法を含む。医薬組成物は、本発明の少なくとも１つの抗体分子、送達ペプチド又は抗体−ペプチドコンストラクトを使用し、薬学的に許容される担体と混合することによって、製剤化することができる。抗体分子、送達ペプチド、及び抗体−ペプチドコンストラクトは、本発明の「活性薬剤」と考えられ、治療又は予防活性薬剤（「治療又は予防剤」とも呼ばれる）でありうる。医薬組成物を、ＣＮＳ又は脳に対するそれらの作用から「神経医薬品」と呼ぶこともある。一部の実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象への投与後の発現のために、薬学的に許容される担体と配合された、本発明の少なくとも１つの抗体分子、送達ペプチド又は抗体−ペプチドコンストラクトをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１４４】
薬学的に許容される担体は、一般に、所期の投与方法、及び送達すべき活性薬剤に基づいて選択される。特定の実施形態において、用語「薬学的に許容される」は、動物での使用、さらに特にヒトでの使用が、連邦若しくは州政府の監督官庁によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認知されている薬局方に記載されているという意味である。この用語は、例えば本明細書の実施例において、活性薬剤とともに使用される製剤も指すことがある。
【０１４５】
用語「担体」は、薬剤を投与するために用いられる希釈剤、アジュバント（例えば、フロイント完全及び不完全アジュバント）、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、水及び油などの滅菌液であることができ、油には、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む、石油、動物、植物又は合成起源のものが含まれる。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の一般的な担体である。食塩溶液、並びにデキストロース及びグリセロール水溶液も、特に注射用溶液に、液体担体として用いることができる。適する医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール（propylene, glycol）、水、エタノールなどが挙げられる。薬学的に許容される担体、賦形剤及び安定剤のさらなる例としては、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸及び他の有機酸；アスコルビン酸をはじめとする、酸化防止剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン及びゼラチン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンをはじめとする、単糖類、二糖類及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトール若しくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；並びに／又は当技術分野において公知の非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ，polyethylene glycol）及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、徐放性製剤などの形態をとることができる。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、本発明の方法に従って使用するための医薬組成物であって、本発明の活性薬剤の治療及び／又は予防有効量を薬学的に許容される担体とともに含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物を、当技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載するいずれの技術によって作製してもよい。
【０１４７】
一部の実施形態において、医薬組成物は、非経口投与のための本発明の１つ若しくは２つ以上の抗体分子、１つ若しくは２つ以上の送達ペプチド及び／又は１つ若しくは２つ以上の抗体−ペプチドコンストラクトを含む。非経口投与は、例えば、静脈内、皮内、皮下、腹腔内及び筋肉内投与を含む。活性薬剤を送達するための他の投与経路としては、例えば、経口、吸入、経皮（局所）及び経粘膜投与はもちろん、鼻腔内及び髄腔内投与も挙げられる。
【０１４８】
非経口投与に使用される液剤又は懸濁剤は、次の成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩；等張性を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロース、抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸。非経口製剤を、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は複数回投与用バイアルに封入することができる。
【０１４９】
注射剤用に適する医薬組成物としては、滅菌水溶液又は水性分散液、及び無菌注射用液剤又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。静脈内投与に適する担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ．（BASF社、Parsippany、N.J.）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，phosphate buffered saline）が挙げられる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの適する混合物を含有する、溶媒又は分散媒であることができる。例えば界面活性剤を使用して、適する流動度を維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって果すことができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に組み入れることによってもたらすことができる。
【０１５０】
無菌注射用液剤は、上に列挙した成分の１つ又は２つ以上とともに必要量の抗体分子、送達ペプチド又は抗体−ペプチドコンストラクトを適切な溶媒に添合し、その後、滅菌濾過することによって、調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒を含有する滅菌ビヒクルを使用することによって調製される。無菌注射用液剤の調製のための無菌粉末の場合、真空乾燥又は凍結乾燥が使用されうる。
【０１５１】
一部の実施形態において、医薬組成物は、例えば画像化及び／又は診断のための標識と会合している、本発明の抗体分子、送達ペプチド又は抗体−ペプチドコンストラクトを含む。標識は、当技術分野において公知の又は本明細書に記載するいずれの標識であってもよい。好ましい実施形態において、標識は、投与後の患者の脳又はＣＳＦの画像化を促進する。特定の標識は、限定ではないが、放射標識、例えば、テクネチウム又はガリウムのような放射性同位元素；蛍光標識；あるいはＳＰＥＣＴ若しくはＰＥＴ画像化又はＣＴ若しくはＭＲＩスキャンに適しているあらゆる標識を含む。好ましい実施形態において、使用される標識は、患者にとって有害でない。実施例２、パート（ｂ）は、テクネチウム又はガリウムで本発明の薬剤を標識することに関する詳細を提供し、実施例５、パート（ｂ）は、画像化における本発明の放射標識された薬剤の使用に関する詳細を提供する。
【０１５２】
本発明の組成物は、医薬組成物（すなわち、対象又は患者への投与に適している組成物）ばかりでなく、医薬組成物の製造に有用なバルク薬組成物（例えば、不純又は非滅菌組成物）も含む。バルク薬組成物は、例えば、本明細書に開示する活性薬剤又はそれらの薬剤の組合せの予防又は治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む、単位剤形の調製において使用することができる。好ましい実施形態において、本発明の抗体分子、送達ペプチド、又は抗体−ペプチドコンストラクトは、実質的に精製されている（すなわち、その効果を制限する又は望ましくない副作用を生じさせる物質が実質的にない）。
【０１５３】
本発明は、開示する方法で使用することができるキットをさらに提供する。一実施形態において、キットは、例えば１つ又は２つ以上の容器内の、本発明の１つ又は２つ以上の薬剤を含む。別の実施形態において、キットは、１つ又は２つ以上の容器内の、アルツハイマー病又はその関連障害に有用な１つ又は２つ以上の他の予防又は治療剤をさらに含む。例えば、一部の実施形態において、本発明は、本発明の医薬組成物の活性薬剤の１つ又は２つ以上を充填した１つ又は２つ以上の容器を含む医薬品パック又はキットを提供する。医薬品若しくは生物学的製剤の製造、使用若しくは販売を監督する政府機関によって指示された形式での注意書きであって、ヒトへの投与のための製造、使用若しくは販売についての機関による承認を表す注意書き；及び／又は使用説明書を、場合によってはそのような容器に付随させることができる。
【０１５４】
一般に、本発明の医薬組成物の成分は、別々に、又は単位剤形にともに混合された状態で、例えば、活性薬剤の量を示すアンプル又は小袋などの密封容器内の乾燥粉末又は無水濃縮製剤として、供給される。組成物が経口投与されることになる場合、例えば投与のための１つ又は２つ以上の活性薬剤各々の単位用量を提供する、１つ又は２つ以上の錠剤又はカプセルで、組成物を提供することができる。あるいは、組成物が経口投与される場合、水又は他の飲料に添加して飲用の液剤を調製するための粉末として、組成物を提供してもよい。組成物が吸入によって投与されることになる場合、医薬品グレードの滅菌水又は食塩水が入っている吸入ボトルで組成物を投薬することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に活性薬剤と他の成分を混合することができるように無菌注射用水又は食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１５５】
本発明の抗体分子若しくは抗体−ペプチドコンストラクト、又は本発明の送達ペプチドとアルツハイマー若しくは関連障害を治療するために当技術分野において使用される異なる活性薬剤を含むコンストラクトを含む医薬組成物で、本抗体分子又はコンストラクトを唯一の活性成分として提供してもよい。あるいは、抗体分子、抗体−ペプチドコンストラクト、又は本発明の送達ペプチドとアルツハイマー若しくは関連障害を治療するために当技術分野において使用される抗体を含むコンストラクトを、アルツハイマー病又は関連障害に使用するための１つ又は２つ以上の他の治療若しくは予防剤又は治療若しくは予防アプローチとの組合せで提供してもよい。例えば、本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを含む医薬組成物は、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ，Food and Drug Administration）によってアルツハイマーの治療に承認されている５つの薬物、すなわち、非競合的ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、メマンチン、並びにコリンエステラーゼ阻害剤、ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン及びタクリンのうちの１つ又は２つ以上をさらに含むこともある。
【０１５６】
本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを含む医薬組成物を、アルツハイマーを治療するための以下のアプローチの１つ又は２つ以上と併用してもよい：タウベースの治療（例えば、タウリン酸化阻害、微小管安定化、タウオリゴマー化の阻止、タウ分解の増進、及びタウベースの免疫治療）；他のアミロイドベースの戦略（例えば、セクレターゼ酵素調節、アミロイド輸送、アミロイド凝集防止、及びアミロイド排除促進）；細胞内シグナル伝達カスケードのモジュレーション；酸化ストレス低減（例えば、外因性抗酸化物質補充及び内因性防御増強）；ミトコンドリア標的治療；細胞カルシウム恒常性のモジュレーション、及び抗炎症治療、並びに性腺刺激ホルモン補充、脂質修飾因子、例えばスタチン、成長因子補充、金属キレート化、エピジェネティック修飾因子、カスパーゼ阻害剤、一酸化窒素合成酵素調節、核酸薬、及び複数標的指向性リガンド。
【０１５７】
本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを含む医薬組成物は、アルツハイマー又は関連障害を治療するための１つ又は２つ以上の活性薬剤をさらに含むこともある。例えば、本発明の医薬組成物を、オリゴマー形成の阻害剤である、ＥＬＮ  ０００５；バクテリオファージＱβコートタンパク質の１８０コピーを含有する担体にそれ自体がカップリングしている、ＢＡＰのＮ末端Ｂ細胞エピトープに由来するＢＡＰ１−６ペプチドの複数のコピーを提供するワクチンである、ＣＡＤ  １０６（Novartis社）；ＢＡＰ１−６アミノ末端断片を提供する別のワクチンである、ＡＣＣ−００１（Ａｆｆｉｔｏｐｅ  ＡＤ０２）；及びＩＳＣＯ−ＭＡＴＲＩＸにコンジュゲートされたアミノ末端ＢＡＰを含むＶ９５０のうちの１つ又は２つ以上と併用してもよい。例えば、本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを含む医薬組成物にこれらの活性薬剤のいずれかの１つ又は２つ以上を兼備させてもよい。さらに、ＣＮＳ及び脳への送達を向上させるためにこれらの活性薬剤のいずれかの１つ又は２つ以上を本発明の１つ又は２つ以上の送達ペプチドと例えば融合体として会合させ、本発明の医薬組成物に備えさせてもよい。
【０１５８】
本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを含む医薬組成物は、アルツハイマー又は関連障害を治療するための１つ又は２つ以上の他の抗体をさらに含むことがある。例えば、本発明の医薬組成物を、Ohshima-Hosoyama, S., et al., PLoS One (2012) 7(6):e39036、及びCouch, et al., Sci Transl Med (2013) 5(183): 183ra57, 1-12に開示されている抗体の１つ又は２つ以上と併用してもよい。本発明の抗体分子を、例えば抗炎症性Ｔ細胞反応を回避するために、１つ又は２つ以上の他の抗ＢＡＰ抗体の受動免疫と併用してもよい。他の抗ＢＡＰ抗体の例としては、ＢＡＰの可溶性形態とフィブリル形態の両方と結合するヒト化モノクローナル抗ＢＡＰ抗体バピネオズマブ（Wyeth社及びElan社）；プロトフィブリルを標的とするヒト化モノクローナル抗体であるＢＡＮ２４０１；ＢＡＰ１−４０及びＢＡＰ４２に対するヒト化抗体であるクレネズマブ；ＢＡＰ１−１１に対するヒト化モノクローナル抗体であるガンテネルマブ；ＢＡＰのＮ末端に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＧＳＫ９３３７７６；並びに可溶性ＢＡＰに優先的に結合するＢＡＰ１６−２４に対するヒト化モノクローナル抗体であるソラネズマブ（Eli Lilly社）（しかし、ソラネズマブそれだけでは、有意な機能向上も脳へのアミロイド蓄積の変化も実証することができなかった（参照により組み込まれている、Williams (2013) Pharmacology 85: 289-305））が挙げられる。例えば、これらの他の抗ＢＡＰ抗体のいずれか１つ又は２つ以上を、本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを含む医薬組成物に兼備させてもよい。さらに、ＣＮＳ及び脳への送達を向上させるためにこれらの抗ＢＡＰ抗体のいずれかの１つ又は２つ以上を本発明の１つ又は２つ以上の送達ペプチドと例えば融合体として会合させ、本発明の医薬組成物に備えさせてもよい。
【０１５９】
本発明の医薬組成物は、下でより詳細に説明するように、アルツハイマー病又は関連障害に対する治療及び／又は予防戦略への使用を見出す。
【０１６０】
６．治療上の及び予防上の使用
本発明の別の態様は、神経疾患若しくは障害の、遅延、緩徐化、防止、治療、好転、発生率低下、及び／若しくは管理、並びに／又は神経疾患若しくは障害に関連する１つ若しくは２つ以上の症状の改善のための戦略であって、それを必要とする対象に本発明による医薬組成物を投与することを含む戦略に関する。それを必要とする対象は、疾患若しくは障害に罹患している対象、又はその素因がある対象、例えば、疾患若しくは障害を発症若しくは再発するリスクがある対象を含む。
【０１６１】
神経障害には、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、ハンチントン病及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含むがこれらに限定されない、神経変性疾患が含まれる。神経障害には、脳内の他の凝集しやすいオリゴマーペプチドの蓄積に関連する状態も含まれる。
【０１６２】
病理組織学的レベルでは、アルツハイマーは、逐次的に相互作用する病理学的カスケードが炎症及び酸化ストレスなどの下流のプロセスと組み合わさった（これらのすべてが、シナプス完全性、有効な神経回路網の結合性の喪失、及び進行性の局所的神経変性の一因となる）複雑な進行性状態である。アルツハイマーの２つの主な神経病理学的特徴は、細胞外ベータアミロイドプラーク、及びタウ（τ）タンパク質過剰リン酸化に由来する細胞内神経原線維変化である。アルツハイマー脳は、老人斑でのベータアミロイドタンパク質の沈着を示す。このタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の分解によって産生され、ＡＰＰは、細胞分化において重要な発生学的機能を果し、酵素ベータセクレターゼ及びガンマセクレターゼによるシナプスの確立において重要な発生学的機能を果す可能性がある。
【０１６３】
アルツハイマーの発症過程でのベータアミロイド蓄積に加えて、タウタンパク質は、神経原線維変化でも蓄積する。このタンパク質は、細胞体から軸索末端及び後方に栄養素、小胞、ミトコンドリア及び染色体を輸送する内部支持構造である微小管の不可欠成分である。アルツハイマーでは、タウタンパク質が過剰リン酸化される。このリン酸化に起因して、タンパク質が互いに結合してもつれた糸を形成し、このもつれた糸は輸送の乱れをもたらし、最終的にはニューロン死の一因となる。
【０１６４】
タウ及びベータアミロイドは、内側側頭葉（海馬及び海馬傍回）の嗅内皮質及び海馬の小領域の神経連絡を必要とするエピソード記憶の形成をもたらすと考えられる。見ること、聞くこと及び感じることによって獲得される膨大な量の情報は、新皮質で処理され、ほぼすべての新皮質野から投射によって嗅内野に収束される。タウ及びベータアミロイドの異常、例えば上で説明したような異常は、これらのプロセスに干渉し、その結果、アルツハイマーの臨床症状に至ると考えられる。
【０１６５】
本発明は、それを必要とする対象におけるアルツハイマー若しくは関連障害の遅延、緩徐化、防止、発生率低下、治療、好転及び／若しくは管理、又はアルツハイマー若しくは関連障害の１つ若しくは２つ以上の症状の改善のための方法を提供する。方法は、一般に、本発明の医薬組成物、例えば、本発明の抗体分子若しくは抗体−ペプチドコンストラクトを含む組成物又は本発明の送達ペプチドと別の活性薬剤を含むコンストラクトを含む組成物の治療又は予防有効量の前記対象への投与を含む。特定の実施形態において、本発明は、アルツハイマー又は関連障害のリスクがある対象における該疾患それ自体の進行の緩徐化又は遅延はもちろん、該疾患の発症の防止又は遅延ももたらす。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、アルツハイマー及び／又は関連障害に関する治療的及び／又は予防的恩恵をもたらす。関連障害は、ＣＮＳに関連する他の状態、例えば、オリゴマー形態又はより高次の形態のＢＡＰ、特にＢＡＰ４２の蓄積を伴う他の神経学的状態はもちろん、他の認知症も含む。関連障害は、同じく本発明の抗体分子が標的としうる別の凝集しやすいオリゴマー、すなわち、他の神経変性疾患又はプリオン障害を特徴付ける他の凝集しやすいペプチドが関与する状態も含む。他の凝集しやすいペプチドの例としては、例えば、次の組換え疾患タンパク質に由来する可溶性オリゴマーが挙げられる：α−シヌクレイン（パーキンソン病に関与する）、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ，islet amyloid polypeptide；II型糖尿病に関与する）、伸長したポリグルタミンストレッチを伴うハンチントン（ハンチントン病に関与する）、及びプリオンタンパク質（ＰｒＰ，the prion protein；伝達性及び遺伝性海綿状脳症に関与する）。
【０１６７】
理論によって拘束されることを望むものではないが、これらの異なる凝集しやすいオリゴマーは、全く異なる配列の可溶性ペプチドが折り重なって、１つ又は２つ以上の共有立体構造エピトープを含有するベータシートを多く含む構造になることができるような、多少共通の構造的特徴を有しうる。したがって、異なる病原性タンパク質によって産生されるコンストラクトには類似の細胞毒性メカニズムを開始させる可能性があり、さらに、治療的及び／又は予防的介入のために本発明の抗体分子を使用してコンストラクトをそれらの共通の構造によって標的化することができるだろうということになる。
【０１６８】
アルツハイマー及びそれに関連する一部の疾患の症状は、例えば、記憶喪失、見当識障害、認知症、認知障害、軽度認知障害、並びに言語、判断、及び問題解決に関する問題を含む。これらの問題は、一般に、日常業務の遂行不能につながり、そして最終的には認知症に至る。最も一般的な初期症状は、最近の出来事を思い出すことが難しいこと（短期記憶喪失）であり、続いて、会話の問題、忘れやすくなる問題、気分変動の問題、意欲低下の問題、及びセルフケアの管理ができない問題が起こることが多い。アルツハイマーは、次の４つの病期に分けられる：記憶喪失に対する加齢の影響に似ている、前認知症；物忘れの増加及び不慣れな状況での混乱を伴う、早期；最近知った情報を思い出すことが難しいこと、及び自立性の喪失を伴う、中期；並びに介護者への完全依存、失語症の可能性、及び寝たきりになることを特徴とする後期。徐々に、身体機能さえも喪失し、最終的には死に至る。
【０１６９】
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子若しくは抗体−ペプチドコンストラクトを含む医薬組成物、又は本発明の送達ペプチドと異なる活性薬剤を含むコンストラクトを含む医薬組成物は、アルツハイマーの早期、より好ましくは前認知症の間に投与されるか、又は前認知症の徴候をまだ示していない、アルツハイマーの素因がある患者に投与される。アルツハイマーの素因がある又はリスクがある対象は、この疾患のバイオマーカー、例えば、当技術分野において公知の及び／又は本明細書において開示するバイオマーカーによって同定することができる。アルツハイマーの素因がある又はリスクがある対象は、家族歴によって又は家族歴とバイオマーカー情報の組合せによって同定することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、早期若しくは前認知症期での、又はさらにはこれらの病期の前の介入によって、老人斑の形成を、それらが集積する前に、又はそれらが有意な量に集積する前に防止して、正常な脳の構造及び機能を保つことができる。
【０１７０】
本発明の医薬組成物は、一般に、所望の治療的及び／又は予防的恩恵を得るのに有効な時間にわたって、そのような恩恵を得るのに有効な量で投与されることになる。好ましい実施形態において、処方される及び／又は投与される有効量は、慢性使用でも実質的な毒性をもたらさない。細胞培養アッセイ及び動物研究から得たデータを、ヒトにおいて使用するための本発明の活性薬剤の投薬範囲及び／又は投薬スケジュールの策定に使用することができる。治療及び／又は予防有効用量をもたらすための本発明の活性薬剤の量は、本明細書において提示する開示に鑑みて、臨床的手法によって決定することができる。例えば、本発明の例示的な抗体分子及び抗体−ペプチドコンストラクトの適切な投薬量及び投与経路に関する情報を提供する、ＣＤ１マウスでの生体内分布研究（例えば、実施例３、パート（ｅ）を参照されたい）及び５ｘＦＡＤマウスでの有効性研究（実施例４を参照されたい）から、有効用量を推定してもよい。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１７１】
投薬量及び頻度は、投与される特定の治療又は予防剤、疾患の重症度及びタイプ、投与経路、並びに患者の年齢、体重、応答及び過去の病歴に依存する、各患者に特異的な因子によって変わることがあり、一部の実施形態では、施術者の判断及び各患者の事情によって決定される。当業者は、そのような因子を考慮することによって、並びに例えば文献に報告されている及びPhysician 's Desk Reference (56th ed., 2002)において推奨されている投薬量に従うことによって、適する用量及び投与計画を選択することができる。治療又は予防剤を反復投与することができる。その手順の幾つかの態様、例えば、治療又は予防剤を投与するための経時的投与計画、及びそのような薬剤を別々に投与するのか、又は他の薬剤と併用で投与するのかは、変わることがある。
【０１７２】
予防及び／又は治療剤、並びにそれらの組合せを、ヒトにおいて使用する前に適する動物モデル系で試験することができる。そのような動物モデル系としては、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野において周知のいずれの動物系を使用してもよい。そのようなモデル系、例えば５ｘＦＡＤマウスモデルは、広く使用されており、当業者に周知である。一部の好ましい実施形態では、ラット、マウス又は他の小さい哺乳動物に基づく、アルツハイマー又は関連障害のための動物モデル系を使用する。例えば、特定の実施形態では、ＢＢＢ特異的、ＢＡＰ４２オリゴマー免疫特異性抗体−ペプチドコンストラクトの推定される予防用及び／治療用組成物を５ｘＦＡＤマウスモデルで試験する。
【０１７３】
本発明の予防及び／又は治療剤を動物モデルで試験したら、それらを臨床試験で試験して有効性を確証することができる。確証する臨床試験は、当業者に公知の一般的方法論、並びに最適な投薬量及び投与経路に従って行われることになり、本発明の薬剤の毒性プロファイルを確証することができる。例えば、配列番号１〜２１から選択されるアミノ酸配列の１つ又は２つ以上のＣＤＲを含むヒト化抗体−ペプチドコンストラクトを含む医薬組成物を、アルツハイマー病を有するヒト患者において有効性及び毒性について試験するように臨床試験を設計することができる。一部の実施形態では、ヒト化抗体−ペプチドコンストラクトを約０．１ｎｇ〜約１ｇの用量で投与して、アルツハイマーを治療する。この約０．１ｎｇ〜約１ｇの用量を単一用量として投与してもよく、又は治療過程にわたって複数の用量として投与してもよい。
【０１７４】
本発明の予防及び／又は治療剤の毒性及び有効性は、細胞培養物又は実験動物で、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、標準的な薬学的手順によって、判定することができる。毒性効果対治療効果の用量比が治療指数であり、例えば比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される。大きい治療指数を示す予防及び／又は治療剤が好ましい。さらに、本発明の薬剤の特異性、例えば、ＢＡＰ４２オリゴマーへの免疫特異的結合及びＢＢＢを越える優先的移行を示す好ましい実施形態における特異性は、十分に毒性範囲外の有効性の達成を促進する。
【０１７５】
さらに、当業者は、アルツハイマー又は関連障害の関連でのＢＡＰ４２オリゴマー免疫特異的及びＢＢＢ特異的薬剤の様々な特性に関する本開示を考慮して、有効用量及び投与計画を選択することができる。例えば、好ましい実施形態では、上で論じたように、本発明の抗体分子、又はコンストラクトの抗体分子成分は、ＢＡＰ４２フィブリルと比較してＢＡＰ４２オリゴマー及び／又はモノマーに対する高い免疫特異性をもたらす。好ましい実施形態では、上で論じたように、本発明の抗体分子、又はコンストラクトの抗体分子成分は、小さく、一価であり、及び／又は安定している。好ましい実施形態では、上で論じたように、本発明の送達ペプチド、又はコンストラクトの送達ペプチド成分は、優先的なＢＢＢ移行、脳内皮細胞に対する低い毒性、迅速な脳への取り込み、及び／又は迅速な脳からの排除をもたらす。好ましい実施形態では、上で論じたように、本発明の抗体−ペプチドコンストラクトは、上記特性を兼ね備えており、より好ましくは、安定した及び／又は可溶性形態での高度な発現をさらに示す。
【０１７６】
本発明の活性薬剤を単独で投与してもよく、あるいは本発明の異なる活性薬剤又はさらに他の予防及び／若しくは治療剤と併用で投与してもよい。各予防又は治療剤を、同じ若しくは別の製剤で同時に投与してもよく、又は別個の製剤で、任意の順序で異なる時点で逐次的に投与してもよいが、同時に投与しない場合、あらゆる相乗効果を含む所望の治療又は予防効果をもたらすのに十分な時間的な近さでそれらを投与すべきである。各治療／予防剤を別々に、任意の適切な形態で、及び任意の適する経路によって投与することができる。
【０１７７】
様々な実施形態では、異なる予防及び／又は治療剤を、１時間以上離さずに、約１時間離して、約１〜約２時間離して、約２時間〜約３時間離して、約３時間〜約４時間離して、約４時間〜約５時間離して、約５時間〜約６時間離して、約６時間〜約７時間離して、約７時間〜約８時間離して、約８時間〜約９時間離して、約９時間〜約１０時間離して、約１０時間〜約１１時間離して、約１１時間〜約１２時間離して、２４時間より長くは離さずに、又は４８時間より長くは離さずに投与する。
【０１７８】
本発明の活性薬剤の治療又は予防有効量での対象の治療は、単回投与を含むことができ、又は治療過程にわたっての一連の投与を含むことができる。例えば、ＢＡＰ４２オリゴマーに特異的な本発明の抗体分子を含む医薬組成物を１日１回、１日２回、又は１日３回投与してもよい。一部の実施形態では、活性薬剤を１日１回、１日おきに、週１回、週２回、２週間に１回、月１回、１ヶ月おきに、６週間に１回、年２回、又は１年に１回投与してもよい。好ましい実施形態では、週１回用量を用い、より好ましくは、疾患の経過にわたって継続する。ある特定の活性薬剤の有効投薬量が、治療の過程で、例えば治療の過程での対象の改善に依存して、増加又は減少することがあることも理解されるであろう。
【０１７９】
一部の実施形態では、継続的治療が、例えば、長期的に、例えば、アルツハイマーのような慢性疾患の継続的治療及び／又は管理の際に、指示される。例えば、特定の実施形態では、本発明の活性薬剤をある期間にわたって、例えば、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年間、又はそれを必要とする対象の残りの生涯にわたって投与する。
【０１８０】
様々な送達システムが公知であり、それらを使用して本発明の活性薬剤を投与することができる。本発明の活性薬剤を投与する方法としては、非経口投与（例えば、注入又はボーラス注射を含む、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下投与）、硬膜外投与、経口投与（例えば、カプセル、錠剤、又は摂取用液剤での投与）、髄腔内投与、及び上皮又は皮膚粘膜若しくは粘膜内層（例えば、鼻腔内、口腔粘膜、直腸、及び腸粘膜など）経由の吸収による投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
鼻腔内又は吸入による投与のための本発明の活性薬剤は、乾燥粉末吸入器の形態で又はエアロゾルスプレーの体裁で送達することができる。エアロゾルは、加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーから、好ましくは、適する噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ（商標））若しくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ（商標））、二酸化炭素又は他の適するガスを使用して、送達することができる。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するための弁を設けることによって投薬量単位を判定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーは、活性薬剤の溶液又は懸濁液であって、例えば、溶媒としてエタノールと噴射剤の混合物を使用し、滑沢剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンをさらに含有することもある、溶液又は懸濁液を収容することができる。吸入器又は注入器で使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチン製のもの）を、例えば、抗体分子とラクトース又はデンプンなどの適する粉末基剤との粉末混合物を含有するように処方することもできる。
【０１８２】
別の特定の実施形態では、本発明の活性薬剤を髄腔内（ＩＴ，intrathecal）注射、すなわち、脳脊髄液（ＣＳＦ，cerebrospinal fluid）へのタンパク質の投与によって送達することができる。ＣＳＦが脳及び髄膜への優れた到達をもたらすことから、髄腔内注射は他の標準的投与経路より有利である。ＣＳＦは、脳を覆っており、表面より６ｍｍ下までの皮質ニューロンとの大きな表面積の接触を提供し、それによって、本発明の抗体分子若しくは抗体−ペプチドコンストラクト、又は本発明の送達ペプチドと異なる活性薬剤を含むコンストラクトの、脳組織へのより十分な透過が可能になる。
【０１８３】
別の特定の実施形態では、本発明の活性薬剤を徐放性製剤で送達することができ、例えば、この場合、製剤は、投与された薬剤の持続放出及びしたがって半減期延長をもたらす。一般的な貯留デバイスとしては、例えば、膜、カプセル、フィルムコートカプセル、マイクロカプセル、リポソーム及び中空繊維が挙げられる。モノリシック（マトリックス）デバイスは、医薬組成物を律速マトリックス（例えば、ポリマーマトリックス）に分散又は溶解させる、第二のタイプの拡散制御システムである。本発明の活性薬剤を律速マトリックス全体にわたって均一に分散させることができるので、該マトリックス経由の拡散によって放出速度が制御される。モノリシックマトリックスデバイスでの使用に適するポリマーは、天然に存在するポリマー、合成ポリマー、及び合成的に修飾された天然ポリマーはもちろん、ポリマー誘導体も含む。
【０１８４】
７．診断上の使用
本発明の抗体分子若しくは抗体−ペプチドコンストラクト、又は本発明の送達ペプチドと異なる活性薬剤を含むコンストラクトは、アルツハイマー及び関連障害のバイオマーカー、好ましくは、診断応用に有用な抗原認識パターンを提供するバイオマーカーを同定することができる。特定の実施形態において、本明細書において開示する抗体分子及び抗体−ペプチドコンストラクトは、脳内のＢＡＰ４２又は他の凝集しやすいペプチドの異常を伴う脳／神経疾患の診断のための組成物、キット及び方法を提供する。特定の実施形態において、組成物、キット及び方法は、アルツハイマーの前認知症期若しくは早期の早期臨床診断を促進し、又はアルツハイマーを発症する患者のリスクを予測する。より好ましい実施形態において、本発明は、アルツハイマー患者における軽度認知障害（ＭＣＩ，mild cognitive impairment）の進行の診断を促進する。
【０１８５】
アルツハイマーは、一般に、他の型の認知症の除外に基づいて臨床的に診断される。その診断を特定の脳領域における大量の老人斑（neuritic / senile plaques）及び神経原線維変化（ＮＦＴ，neurofibrillary tangles）の立証によって神経病理学的に確認することができる。
【０１８６】
本発明の抗体分子及び抗体−ペプチドコンストラクトは、アルツハイマー若しくは関連障害を有する患者又はその素因がある患者の脳内、ＣＳＦ中又は血液（血清）中に変化したレベルで存在する、ＢＡＰ４２モノマー及びオリゴマー並びに／又は他の凝集しやすいペプチドに免疫特異的に結合し、変化したレベルはフィブリル化増加と相関する。すなわち、アルツハイマー若しくは関連障害を有する患者又はアルツハイマー若しくは関連障害のリスクがある患者については、ＢＡＰ４２モノマー及びオリゴマー並びに／又は他の凝集しやすいペプチドのレベルが、一般に、健常な対照対象についての正常範囲外になる。免疫複合体を形成するような免疫特異的結合の検出によって、インビトロ状況で又はインビボ画像化により診断を得ることができることはもちろん、疾患若しくは障害の進行をモニターするための、又は治療過程にわたって治療若しくは予防剤の有効性を判定するための、他の情報を得ることもできる。
【０１８７】
特定の実施形態では、被検試料を対象から得て、例えばインビトロでの診断を行う。被検試料は、血清、脳組織、又はＣＳＦの試料でありうる。好ましい実施形態において、被検試料はＣＳＦを含む。ＣＳＦ試料を、腰椎穿刺又は脊椎穿刺などの当技術分野において公知の方法によって得てもよい。一般に、患者が膝を胸の方に引いて横向きに寝て、医療提供者がその下部脊椎に局所麻酔薬（麻酔剤）を注射し、その後、くも膜下穿刺針を通常はその腰部に挿入して、被検試料を収集する。場合によっては、蛍光透視法を用いて針の誘導を助ける。代替アプローチとしては、後頭骨（頭蓋骨の後部）の下に配置された針を使用する大槽穿刺、及び頭蓋骨にドリルで穴をあけて脳室の１つに針を直接挿入することを含む脳室穿刺が挙げられる。
【０１８８】
患者又は対象は、アルツハイマー若しくは関連障害のあらゆる病期を有することがあり、又は例えば家族歴及び／若しくは他の早期マーカーに基づいて、アルツハイマー若しくは関連障害のリスクがあると疑われることもある。好ましい実施形態において、患者は、軽度認知障害（ＭＣＩ）を特徴とする早期にある。例えば、認知愁訴、記憶の問題、及び／若しくは同定された認知症を有する患者、又は脳画像化（ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ）によってアルツハイマーの早期にあると同定された患者から、被検試料を得ることができる。
【０１８９】
例えば、アルツハイマー病もいかなる関連障害も有さない対象、及び／又はアルツハイマー病のリスクもいかなる関連障害のリスクもない対象から、対照試料を収集することもできる。対照試料は、アルツハイマー及び関連障害に関連する凝集しやすいオリゴマーペプチド（本発明に関しては「関連脳ペプチド」と呼ぶ）の正常な量を有すると予想される。例えば、対照試料は、一般に、ＢＡＰ４２オリゴマー、α−シヌクレインのペプチド（パーキンソン病で指示される）、膵島アミロイドポリペプチドのペプチド（II型糖尿病で指示される）、ハンチントンのペプチド（ハンチントン病で指示される）、及び／又はプリオンタンパク質のペプチド（海綿状脳症で指示される）について健常範囲内の量を有する。一部の実施形態において、対照試料は、例えば、正常な健常対象における関連脳ペプチドの量、例えば、アルツハイマーも関連障害を有さない又はアルツハイマーのリスクも関連障害のリスクもない対象のＣＳＦ、脳又は血清中の関連脳ペプチドの濃度に関する情報が既に利用可能である場合、収集されない。
【０１９０】
本発明の抗体分子を、アルツハイマー若しくは関連障害を有する又はアルツハイマー若しくは関連障害の素因がある対象からの被検試料と接触させると、一般に、対照試料との接触時に得られるものの範囲外のレベルの免疫特異的結合が得られる。具体的には、被検試料中のＢＡＰ４２オリゴマー又は他の関連脳ペプチドの量を判定するために、被検試料を本発明の１つ若しくは２つ以上の抗体分子、又はそれらのペプチドコンストラクトと接触させて、免疫特異的に結合させる。抗体分子及び／又は抗体−ペプチドコンストラクトを、該抗体分子、又は該コンストラクトの抗体成分と、それが免疫特異的に認識し結合する抗原との免疫複合体の形成を可能ならしめる条件下で、被検試料と接触させる。特定の実施形態において、抗体分子又はコンストラクトは、アルツハイマーの早期の患者のＣＳＦと接触させると免疫特異的結合の中等度の上昇、又は統計的に有意な上昇を示す。
【０１９１】
一部の実施形態では、被検試料と接触させるとき、抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは固定化されている。例えば、複数の抗体分子又はコンストラクトを適する支持体上に固定化することができる。支持体は、樹脂、チップ（例えば、マイクロ流体チップ）、マイクロアレイ、ビーズ、ガラス、バイアル、クロマトグラフィーカラム、プレート、セラミック、エンジニアリング熱可塑性プラスチック、クレー、ポリエステル繊維、テフロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、生体膜若しくは人工膜などの、又は当業者に公知のいかなる免疫アッセイ形式による、いかなる固体又は半固体物質であってもよい。
【０１９２】
固定化は、抗体分子又はそれらのコンストラクトを、本明細書に記載の又は当技術分野において公知の共有結合性又は非共有結合性相互作用により支持体に結合させることによって、果すことができる。非共有結合性相互作用は、静電引力、ファンデルワールス力、及び／又は水素結合を含む。好ましくは、固定化は、共有結合性相互作用、例えば、抗体分子又はそのコンストラクト上の基と支持体上の基との化学結合の形成による。固定化は、支持体に直接行われることもあり、又は間接的に、例えば、リンカー若しくは結合抗体を介して行われることもあり、結合抗体は、それ自体が本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを認識し、本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトに結合するものである。さらに、固定化が、抗体分子、又はそのコンストラクトの抗体成分の機能性を保持するように、例えば、ＢＡＰ４２オリゴマー又は他の関連脳ペプチドへの優先的及び免疫特異的結合を保持又は実質的に保持するように行われることは、当業者に認識されるであろう。
【０１９３】
固定化された抗体分子又は、抗体−ペプチドコンストラクトとの接触前に、試料を１又は２以上のステップに付すこともある。例えば、試料中のＢＡＰ４２オリゴマー又は他の関連脳ペプチドを濃縮してもよく、又はある特定の不純物、例えば、本発明の抗体分子との免疫特異的結合に干渉しうる物質を除去することによって部分的に精製してもよい。あるいは、試料中の関連脳ペプチドを、本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトと接触させる前に、例えば上記の適する支持体上に、固定化してもよい。
【０１９４】
被検試料中の関連脳ペプチド、例えばＢＡＰ４２オリゴマーへの免疫特異的結合を検出することができる。検出は、抗体分子とその標的抗原の免疫複合体の形成を検出、測定又は定量するための、すなわち、イムノアッセイを使用して免疫特異的結合を検出するための、当技術分野において公知のいずれの手段によって行ってもよい。使用することができるイムノアッセイは、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme linked immunosorbent assay）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する、競合及び非競合アッセイシステムはもちろん、ＢＩＡｃｏｒｅ分析も含むが、これらに限定されない。そのようなアッセイは、当技術分野において説明されている（例えば、その全体が参照により組み込まれている、Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい）。免疫特異的結合は、例えば、フローサイトメトリー又はシンチレーションアッセイを使用して、検出、測定又は定量することもできる。例えば、本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、例えば、放射標識（例えば、９９Ｔｃ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、３２Ｐ、３５Ｓ及び１２５Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレスカミン）、又は免疫特異的結合の検出を可能ならしめるための本明細書に記載する若しくは当技術分野において公知の標識を使用して、標識することができる。
【０１９５】
免疫特異的結合の検出は、試料中に存在する関連脳ペプチドの量を示すことになり、この量は、正常量に相当することもあり、又は正常量より多い若しくは少ない量に相当することもあり、この場合の正常量は、アルツハイマーも関連障害を有さず、アルツハイマーの素因も関連障害の素因もない対象から得た対照試料中で検出されるものに相当する。
【０１９６】
対照試料で得られる範囲外の、又はその範囲の下限若しくは上限に近い免疫特異的結合は、アルツハイマー又は関連障害の診断をもたらすことができる。例えば、ＢＡＰ４２オリゴマーに免疫特異的に結合する本発明の抗体分子は、対象からのＣＳＦ試料中のＢＡＰ４２オリゴマー量の中等度の上昇（統計的に有意な上昇）を示すことによって、特に他の診断法と併用したとき、前記対象をアルツハイマーと診断することができる。免疫特異的結合の程度は、アルツハイマーの異なる病期を示すことができ、例えば、わずかに正常範囲外のＢＡＰ４２オリゴマーの量は、前認知症期又は早期アルツハイマーを示し、変化が顕著であるほど、進行した病期を示す。実施例５、パート（ａ）は、本発明の例示的な抗体分子及び抗体−ペプチドコンストラクトを使用するインビトロでの診断のさらなる詳細を提供する。
【０１９７】
本発明の異なる抗体分子は、アルツハイマーの異なる病期を示すことができ、例えば、第一の抗体分子による異常な免疫特異的結合レベルは、より早期を示し、第二の抗体分子による異常な免疫特異的結合レベルは、より後期を示す。したがって、本発明は、アルツハイマーの特定の病期、特に、早期及びＭＣＩを伴う病期のバイオマーカーを同定する。
【０１９８】
本発明は、インビボでの診断又は画像化方法も提供する。具体的には、本発明の抗体分子及び抗体−ペプチドコンストラクトは、健常な対照対象と比較して、アルツハイマー若しくは関連障害を有する患者又はその素因がある患者の脳内又はＣＳＦ中に変化した量及び／又は変化した分布パターンで存在する、ＢＡＰ４２モノマー及びオリゴマー並びに／又は他の凝集しやすいペプチドに免疫特異的に結合する。インビボ画像化による免疫特異的結合の検出によって疾患又は障害の診断を得ることができる。
【０１９９】
特定の実施形態において、本発明は、患者の体内の凝集しやすいペプチドを画像化する方法を提供する。例えば、本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを標識と会合させ、患者に投与してもよい。標識は、当技術分野において公知の又は本明細書に記載するいずれの標識であってもよい。好ましい実施形態において、標識は、投与後の患者の脳又はＣＳＦの画像化を促進する。特定の標識としては、限定ではないが、放射標識又は蛍光標識が挙げられる。好ましい実施形態において、使用する標識は、患者にとって有害でない。
【０２００】
投与は、一般に、非経口投与、好ましくは、対象のＢＢＢを越えて脳又はＣＮＳへの抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトの送達を促進する様式での非経口投与を含む。好ましい実施形態において、インビボ画像化に使用する抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、ヒト化されており、本明細書に記載するようにＢＢＢ特異的移行及び／又はＢＡＰ４２オリゴマー免疫特異的結合を示す。より好ましい実施形態において、使用する抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、この場合もやはり本明細書に記載するように、患者におけるＢＢＢの破壊の原因にならない。
【０２０１】
凝集しやすいペプチドは、本明細書に記載するような、ＢＡＰ４２オリゴマー又は他の関連脳ペプチドでありうる。免疫特異的結合の検出は、患者の脳内に存在する関連脳ペプチドの量を示すことになり、この量は、正常量に相当することもあり、又は正常量より多い若しくは少ない量に相当することもあり、この場合の正常量は、アルツハイマーも関連障害も有さず、アルツハイマーの素因も関連障害の素因もない対象において検出されるものに相当する。
【０２０２】
特定の実施形態では、ＢＡＰ４２オリゴマーの免疫特異的結合の中等度の上昇（統計的に有意な上昇）を示す画像によってアルツハイマーの診断が得られる。さらに、免疫特異的結合の程度及び／又はパターンは、本明細書に記載するような、アルツハイマーの異なる病期を示すことができる。実施例５、パート（ｂ）は、本発明の例示的な抗体分子及びそれらのコンストラクトを使用するインビトロでの画像化及び診断のさらなる詳細を提供する。
【０２０３】
本発明の異なる抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、アルツハイマーの異なる病期を示すこともでき、例えば、第一の抗体分子は、より早期を示し、第二の抗体分子は、より後期を示す。したがって、本発明は、アルツハイマーの特定の病期、特に、早期及びＭＣＩを伴う病期のバイオマーカー及び結合パターンを同定する。
【０２０４】
本明細書に記載する診断方法を単独で使用してもよく、又は互いに併用してもよく、又はアルツハイマーを診断するための１つ若しくは２つ以上の他の手段と併用してもよい。一部の実施形態では、タウタンパク質（Ｔ−ｔａｕ）及びリン酸化タウタンパク質（Ｐ−ｔａｕ１８１）の総量についてのアッセイを本発明によるアプローチと併用することがある。特定の例では、ＢＡＰ４２オリゴマー測定と組み合わせたＴ−ｔａｕの分析によって、アルツハイマーの際の軽微な認知機能障害の進行に対する８３％特異性及び９５％感受性が得られる。別の特定の実施形態では、ＢＡＰ４２オリゴマー／Ｐ−ｔａｕ比と組み合わせたＴ−ｔａｕの分析によって、９５％感受性及び８７％特異性が得られる。ＣＳＦ中のこれらのタンパク質の組合せは、アルツハイマーの際の軽微な認知障害の進行の予測バイオマーカーの構成要素であり、この組合せをアルツハイマーの診断基準に組み入れることができる。
【０２０５】
本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを使用する診断によって患者の神経化学的異常に関する情報を得ることができ、それによって、新たな神経保護治療に関する臨床試験のための特定の治療的介入及び／又は可能性のある患者の選択が可能になる。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のインビトロ又はインビボでの診断後、治療的介入、例えば、診断された患者への本明細書に記載する医薬組成物の有効量の投与、並びに／又は当技術分野において公知の及び／若しくは本明細書に記載する任意の他のアルツハイマー治療の投与が行われる。特定の実施形態において、患者に投与する本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、インビトロ若しくはインビボで診断を得るために使用したのと同じ抗体分子若しくは抗体−ペプチドコンストラクト、又はそれらのヒト化バージョンである。
【０２０６】
抗体分子又はコンストラクトは、特定の患者に異常な量で又は異常なパターンで存在すると同定された脳ペプチドに対する免疫特異性を示すので、同抗体分子又はそのコンストラクトの投与は、その特定の患者の治療に適切な脳ペプチドを中和するための有望な治療剤を与えることになるということは、当業者には分かるであろう。特定の実施形態において、患者を治療するステップは、適する治療剤、例えば、本発明の抗体分子を含む医薬組成物を投与するステップを含む。特定の実施形態において、患者を治療するステップは、その後治療を施す医療提供者が診断に関する情報を入手できるようにするステップを含む。
【０２０７】
本アプローチを使用して、所与の対象又は対象集団についてのインビボでの画像化及び／又はインビトロでのアッセイを繰り返すことにより、アルツハイマー病又は関連障害を経時的にモニターすることもできる。対象が、ある治療コースでの治療を、例えば臨床又は研究設定で、受けているときに反復試験を使用して、その治療コース全体を通して有効性を評定することができる。例えば、治療を始める前に、例えば本発明の抗体分子の投与前に、患者を試験し、その後、活性薬剤の何回かの投与後に又は投与ごとに再び試験してもよい。例えばＣＦＳ試料中の又は脳画像中の、ＢＡＰ４２オリゴマー又は他の凝集しやすいペプチドの量の変化を経時的に判定することによって、投与している薬剤の有効性に関する情報を得ることができる。
【０２０８】
具体的には、第二の被検試料をより後の時点で同じ患者から得てもよい。その第二の被検試料を本発明の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトと接触させた後、免疫特異的結合の検出を行うことができる。異なる時点での免疫特異的結合量の比較によって、対象における凝集しやすいペプチドの量のモニターが可能になる。例えば、対象からのＣＳＦ試料中のＢＡＰ４２オリゴマーレベルの増加／減少は、アルツハイマーの改善を経時的に示すことができ、そのレベルが正常範囲に近づく場合、それによって、投与している治療の有効性が立証される。同様に、患者の脳のインビボでの画像化を経時的に反復することによって、凝集しやすいペプチドの量及び／又はパターンの変化、例えばアルツハイマー患者におけるＢＡＰ４２オリゴマーの変化を示す一連の画像を得ることができる。患者の脳内のＢＡＰ４２オリゴマーの正常量及び／又は正常パターンに向かう傾向を示す画像は、経時的なアルツハイマーの改善を示すことができ、それによって投与している治療の有効性が立証される。
【０２０９】
８．診断キット
本発明の別の態様は、本発明の抗体分子、送達ペプチド及び／又は抗体−ペプチドコンストラクトを含むキット、例えば、アルツハイマー病又は関連障害の診断に使用するためのキットに関する。本発明は、上で説明したインビトロ又はインビボでの診断方法を使用するためのキットを提供する。
【０２１０】
一部の実施形態において、本発明は、本発明の複数の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを含むキットを提供する。複数の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、一緒に使用するための集合体として提供される、同じタイプの抗体又はそのコンストラクトの１以上の分子を指す。特定の実施形態において、複数の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、ＣＳＦ試料中のＢＡＰ４２オリゴマーへの結合などの、インビトロでの標的抗原への免疫特異的結合の検出を可能ならしめるのに十分な量の分子を提供する。特定の実施形態において、複数の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、患者の脳内でＢＡＰ４２オリゴマーとともに形成された免疫複合体の画像を提供することなどの、インビボでの標的抗原への免疫特異的結合の検出を可能ならしめるのに十分な量の分子を提供する。必要とされる量が、免疫特異的結合を判定、測定又は定量するために使用される検出アプローチ又はイムノアッセイに依存することになることは、当業者に認識されるであろう。
【０２１１】
一部の実施形態において、キットは、例えば、薬剤が（例えば、インビボでの画像化又は診断方法で）患者に投与することを目的としたものである場合、抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトのヒト化バージョンを含む。一部の実施形態において、キットは、免疫特異的結合の検出を促進するための標識も含む。標識は、キットの別の区画に含まれていることもあり、又は抗体分子若しくは抗体−ペプチドコンストラクトと会合していることもある。適する標識は、イムノアッセイでの使用のための、本明細書において開示する及び／又は当技術分野において公知のあらゆる標識を含む。
【０２１２】
特に好ましい実施形態において、複数の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、適する支持体上に固定化されている。支持体は、上で開示したような、いかなる固体又は半固体物質であってもよく、固定化は、この場合もやはり上で述べたように、いかなる共有結合性又は非共有結合性相互作用によって果してもよい。
【０２１３】
一部の実施形態において、キットは、本発明の１つのタイプの抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを含む。一部の実施形態において、キットは、２つ又は３つ以上の異なる抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを含む。上で論じたように、本発明の異なる抗体分子は、異なる免疫特異的結合パターンを示すことができ、それによって、アルツハイマー及び／又は関連障害の異なる病期の診断が可能になる。したがって、一部の実施形態において、キットは、本発明の第一の複数の第一の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクト、及び本発明の第二の複数の第二の抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトを提供する。
【０２１４】
インビトロでの検出に関する特定の実施形態において、第一の抗体分子又はコンストラクトは、アルツハイマーの早期の患者からの被検試料と接触させたとき、異常な免疫特異的結合レベルを示し、第二の抗体分子又はコンストラクトは、アルツハイマーのより後期の患者からの被検試料と接触させたとき、異常な免疫特異的結合レベルを示す。インビボでの画像化に関する特定の実施形態において、第一の抗体分子又はコンストラクトは、アルツハイマーの早期の患者の脳において免疫特異的結合の中等度の上昇（統計的に有意な上昇）を示し、第二の抗体分子又はコンストラクトは、アルツハイマーのより後期の患者の脳において免疫特異的結合の中等度の上昇（統計的に有意な上昇）を示す。対象の疾患の異なる病期の診断を促進するために、アルツハイマーの異なる病期に対する複数の異なる抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトをキットに備えさせることができることは、当業者には理解されるであろう。
【０２１５】
インビトロでの診断に関する特に好ましい実施形態において、異なる複数の異なる抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、キット内の、適する支持体上の又は異なる支持体上の又は異なる区画内の、区別可能な位置に固定化されている。区別可能な位置は、２つの複数のもの各々についての免疫特異的結合の検出中に第一の部位と識別することができる、キット内の別の部位を指す。一部の実施形態において、異なる複数の異なる抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは区別可能に標識されており、したがって、例えば、抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトが重複位置に固定化されている場合でも、又はそれらが固定化されていない場合でも、２つの複数のものの各々についての免疫特異的結合を識別することができる。
【０２１６】
９．抗体分子、送達ペプチド、及びそれらのコンストラクトを作製する方法
本発明の別の態様は、本発明の抗体分子、送達ペプチド、及び抗体−ペプチドコンストラクト、並びにそれらのＢＢＢ特異的及び／又はＢＡＰ４２オリゴマー結合断片又は誘導体（脱免疫化及び／又はヒト化バリアントを含む）の作製する方法を含む。一部の実施形態において、抗体分子、送達ペプチド、抗体−ペプチドコンストラクト、並びにそれらの断片及びバリアントは、組換えＤＮＡ技術によって、又は他のタンパク質合成技術、例えばペプチド合成装置の使用によって、産生される。
【０２１７】
一部の実施形態において、抗体分子又はその抗体−ペプチドコンストラクトは、結合されている、例えば、二量体、三量体、四量体、例えばＶＬ−ＶＬ二量体を形成するように結合されている、１以上の抗体単一ドメインを含む。二量体ポリペプチド、及びより高次のポリペプチドコンストラクトを産生する方法は、当技術分野において公知である。例えば、第一の抗体単一ドメインをコードする核酸を、第二の抗体単一ドメインを含有する発現ベクターにクローニングすることができ、したがって、これら２つのドメインは、リンカーが介在して及び介在せずに、インフレームで結合される。例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202、Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214、Gillies et al., 1989, J. Immunol.Methods 125:191-202、及び米国特許第６，３１１，４１５号明細書、同第５，８０７，７１５号明細書、同第４，８１６，５６７号明細書及び同第４，８１６，３９７号明細書を参照されたく、これらの参考文献は、それら全体が参照により組み込まれている。
【０２１８】
一部の実施形態において、本発明の抗体分子は、送達ペプチドに融合されている。融合タンパク質も標準的な組換えＤＮＡ技術によって、又はタンパク質合成技術によって、例えばペプチド合成装置の使用によって、又はＰＣＲ増幅によって生成することができる。組換え融合に加えて、送達ペプチドへの結合は、例えば、共有結合性のコンジュゲーションと非共有結合性のコンジュゲーションの両方を含む化学的コンジュゲーションを含みうる。
【０２１９】
結合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列によって行われることもあり、又は化学的コンジュゲーションによって行われることもある。所望の抗体分子と送達ペプチド間のタンパク質リンカーは、可撓性及び適正な折り畳みを維持するように、好ましくは、結合された生成物が、ＢＢＢ特異性及びＢＡＰ４２オリゴマー免疫特異性を示すように、選択することができる。例えば、ＢＡＰ４２オリゴマーへの良好な同時結合及びＢＢＢの選択的通過を可能ならしめる、リンカーを選択することができる。そのような結合を、当業者に公知の及び／又は本明細書に記載する技術によってアッセイすることができる。
【０２２０】
本発明のポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、本発明の抗体分子の発現のためのベクターも包含する。本発明による抗ＢＡＰ４２オリゴマー抗体のコード配列とともに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを、当業者に周知の方法を使用して構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えを含む。（例えば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.及びAusubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載されている技術を参照されたい）。
【０２２１】
本発明の抗体分子の核酸配列を含む発現ベクター、例えば、本明細書に記載の送達ペプチドとの融合体タンパク質を、従来技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、及びリン酸カルシウム沈降法）によって宿主細胞に移入し、その後、それらのトランスフェクト細胞を従来技術によって培養して、本発明のコンストラクトを産生することができる。特定の実施形態において、抗体分子又は抗体−ペプチド融合体の発現は、構成的プロモーターによって調節される。別の実施形態において、発現は、誘導性プロモーターによって調節される。これらの実施形態に従って、プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。
【０２２２】
特定の実施形態では、タンパク質をコードする核酸に作動可能に結合されたプロモーターと、１つ又は２つ以上の複製起点と、場合により１つ又は２つ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）とを含む、ベクターを使用する。様々な宿主発現ベクター系を用いて、本発明の抗体分子及び送達ペプチド並びに／又はそれらの融合体を発現させることができる。組換え抗体分子、送達ペプチド又はそれらの融合体を発現させるために使用する宿主細胞は、例えば、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌細胞であってもよく、又は真核細胞であってもよい。適する細菌細胞の例としては、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌大腸菌又は枯草菌（B. subtilis）が挙げられる。
【０２２３】
特定の実施形態では、大腸菌Tuner（商標）（ＤＥ３）細胞を本発明の抗体分子、送達ペプチド及び抗体−ペプチドコンストラクトの大規模発現に使用する。「Tuner（商標）株」は、細胞培養でのタンパク質発現レベルの制御調整を促進する大腸菌ＢＬ２１のｌａｃＺＹ欠失変異体である。発現レベルは、ｌａｃパーミアーゼ（ｌａｃＹ）変異によって制御され、この変異は、集団内の細胞へのＩＰＴＧの均一な侵入を可能ならしめ、その結果、様々なＩＰＴＧ濃度に応じた濃度依存性の均一な導入が生ずる。「ＤＥ３」は、宿主が、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有するλυＥ３の溶原菌であることを示す。
【０２２４】
本発明の抗体分子、送達ペプチド又は抗体−ペプチドコンストラクトの発現レベルを、例えば、ベクター増幅によって増加させることができる（総説については、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)を参照されたい）。本明細書に記載するポリペプチドを発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、培養培地の変化がマーカー遺伝子のコピー数を増加しうる。増幅領域は、本発明の抗体分子、送達ペプチド又は抗体−ペプチドコンストラクトをコードするヌクレオチド配列を伴うことができるので、薬剤の産生も増加しうる（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
【０２２５】
組換えタンパク質の長期、高収率産生のために、安定した発現が好ましい。例えば、本発明の抗体分子、送達ペプチド又は抗体−ペプチドコンストラクトを安定的に発現する細胞株を改変してもよい。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択マーカーによって制御されたＤＮＡで宿主細胞を形質転換させることができる。異種ＤＮＡの導入後、改変細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、そしてその後、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性をもたらし、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定的に組み込むこと及び増殖してフォーカスを形成することを可能ならしめ、そしてまたそれらのフォーカスをクローニングし、増殖させて細胞株にすることができる。有利には、この方法を使用して、長期、高収率産生のために本発明の抗体分子、送達ペプチド又は抗体−ペプチドコンストラクトを発現する細胞株を改変することができる。そのような改変細胞株は、抗体分子、送達ペプチド及び／又はそれらの融合体と直接又は間接的に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価にも、特に有用でありうる。
【０２２６】
本発明の抗体分子、送達ペプチド、又は抗体−ペプチドコンストラクトを組換え発現させたら、それを、薬剤の精製のための当技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に、プロテインＡクロマトグラフィー後の特異的抗原に対するアフィニティークロマトグラフィー、及びサイズ選別カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、較差溶解度によって精製してもよく、又はタンパク質の精製のための他の任意の標準的技術によって精製してもよい。本発明のポリペプチドをペプチドなどのマーカー配列に融合させて、精製を促進することができる。一部の実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、数ある中でもｐＱＥベクター（QIAGEN社、9259 Eton Avenue、Chatsworth、Calif, 91311）に備えられているタグなどの、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それらの多くが市販されている。例えば、Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821 824, 1989（その全体が参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているように、ヘキサ−ヒスチジンタグによって、抗体分子、送達ペプチド又はそれらの融合体の適便な精製が実現される。精製に有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ，hemagglutinin」タグ（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wilson et al., Cell, 37:767 1984）、及び「ｆｌａｇ」タグ（Knappik et al., Biotechniques, 17(4):754-761, 1994）が挙げられるが、これらに限定されず、参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。別の技術は、大腸菌における発現後、エンドトキシン除去のためのニッケルアフィニティークロマトグラフィーを含む。
【０２２７】
本発明の脱免疫化抗体分子、送達ペプチド又は抗体−ペプチドコンストラクトは、詳細に上で説明したように、ポリペプチド中の１つ又は２つ以上のＴＨエピトープを減少又は除去するための技術を使用して生成することができる。アミノ酸レベルでの置換は、同じくより詳細に下で説明するように、それをコードする対応する核酸の構築の情報を与える。
【０２２８】
本発明のヒト化抗体分子又は抗体−ペプチドコンストラクトは、上で詳細に説明したように、非ヒト抗体の領域又はアミノ酸残基をヒト抗体からの対応する領域又はアミノ酸残基で置換する技術を使用して生成することができる。一般に、ヒト化抗体分子は、超可変領域残基が、望ましい免疫特異性を有する非ヒト種からの超可変領域残基（例えば、ウサギＶＬドメインからのドナーＣＤＲ）によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（又はそれらの可変ドメイン及び／又は断片）である。
【０２２９】
１０．本発明の薬剤をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明のポリペプチド、例えば抗体分子、送達ペプチド、抗体−ペプチドコンストラクト、又はそれらの断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において開示する抗体分子、例えば、配列番号１〜２１の１つ若しくは２つ以上、又はそれらのＢＡＰ４２オリゴマー結合断片、又はそれらのヒト化バリアント、例えば、ヒト抗体ドメインのフレームワーク領域にグラフトされた配位列番号１〜２１の１つ若しくは２つ以上のＣＤＲを含むものをコードする核酸を含む、又はそのような核酸からなる。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において開示する送達ペプチド、例えば、配列番号２２〜２５の１つ又は２つ以上をコードする核酸を含む、又はそのような核酸からなる。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において開示する抗体−ペプチドコンストラクト、例えば、配列番号２８〜１１１の１つ若しくは２つ以上、又はそれらのＢＡＰ４２オリゴマー結合及び／若しくはＢＢＢ特異的断片、又はそれらのヒト化バージョンをコードする核酸を含む、又はそのような核酸からなる。本発明は、上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに高ストリンジェンシー、中又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドも包含する。
【０２３０】
当技術分野において公知のいずれの方法によって、ポリヌクレオチドを得てもよく、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい。例えば、本発明の薬剤をコードするポリヌクレオチドを、適する源（例えば、ＢＡＰ４２オリゴマーで免疫したウサギ）からの核酸から生成してもよい。特定のポリペプチドをコードする核酸を含有する源を入手できないが、本発明の薬剤のアミノ酸配列が分かっている場合、その薬剤をコードする核酸を化学的に合成し、当技術分野において周知の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングしてもよい。
【０２３１】
本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定したら、当技術分野において周知のヌクレオチド配列操作方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、the techniques described in Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY及びAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載されている技術を参照されたく、これらの参考文献は、それら全体が参照により組み込まれている）を使用して、異なるアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドを生成するように、例えば、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を生じさせるように、そのヌクレオチド配列を操作してもよい。上で説明したように、そのような変異配列によって、薬学的特性が向上された、例えば、免疫特異性が改善された、ＢＢＢ特異性が改善された、及び／又は免疫原性が減少された、本発明の薬剤を得ることができる。
【０２３２】
当技術分野において周知であり、常例的に実施されているような組換え技術によって、融合生成物をコードするポリヌクレオチドを得てもよい。そのようなポリヌクレオチドを「キメラポリヌクレオチド」と呼ぶこともある。組換えキメラポリヌクレオチドは、元々別のタンパク質をコードしていた２つ若しくは３つ以上の遺伝子、又はそれらの一部を連結させることによって、通常は創製される。個々の配列は、通常は、それぞれのタンパク質各々の機能性ドメインのコード配列に対応し、したがって、融合ポリペプチドは、二重機能性を有する（例えば、ＢＡＰ４２オリゴマーと結合し、及びＢＢＢを特異的に通過する）融合タンパク質をコードする。例えば、第一のコード配列又はその一部を第二のコード配列又はその一部にインフレームで連結させてもよく、この連結は、通常は、ライゲーション又はオーバーラップ伸長ＰＣＲによって果される。ライゲーションは、「カセット変異誘発法」と呼ばれる、従来のキメラ遺伝子創製方法と併用される。この方法では、制限エンドヌクレアーゼ認識部位に作用する制限エンドヌクレアーゼによってＤＮＡを特異的断片に切断することができ、その後、それらの特異的断片をライゲーションすることができる。特定の断片を、適合性末端を有する異種のもので置換して、それを親ＤＮＡにライゲーションすることができる。例えば、その全体が参照により組み込まれている、Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)を参照されたい。
【０２３３】
あるいは、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法などの、ＰＣＲを含む様々なアプローチを使用してもよい。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ho, S.N., et al (1989). Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77:51-59を参照されたい。このＰＣＲアプローチの幾つかの変形形態は公知であり、融合生成物を生成するために使用されている。１つのそのようなアプローチは、例えば、制限酵素の非存在下でキメラ遺伝子を生じさせるための次の３ステップでの改良型オーバーラップ伸長ＰＣＲを含む：（ｉ）融合すべき隣接断片に５’末端が部分的に相補的なプライマーを使用してキメラ分子を生じさせる、従来のＰＣＲステップ；（ii）プライマーの相補的末端を使用して、第一のステップで生成されたＰＣＲ断片を融合させる、第二のＰＣＲステップ；及び（iii）その融合生成物のＰＣＲ増幅を含む第三のステップ。最終ＰＣＲ生成物は、異なる増幅ＰＣＲ断片で構成されているキメラ遺伝子である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wurch, T. et al (1998) A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnology Techniques. 12(9):653-657を参照されたい。いかなるライゲーション及び／又はＰＣＲベースの組換えアプローチを使用して、本発明のキメラ（融合）ポリヌクレオチドを生じさせてもよい。
【０２３４】
あるいは、融合生成物をコードする核酸を化学合成してもよい。例えば、本発明の抗体−ペプチドコンストラクトの所望のアミノ酸配列を使用して、例えば当技術分野において周知の方法を使用して、対応するヌクレオチド配列を考案し、化学的に合成し、複製可能なクローニングベクターにクローニングしてもよい。
【０２３５】
本発明は、本発明の薬剤をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供する。一部の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。本発明は、本発明の１つ又は２つ以上のベクターを含む宿主細胞、例えば、コードされたポリペプチドの発現を可能ならしめる宿主細胞を、さらに提供する。ベクター、発現ベクター及び宿主細胞は、上で論じたポリヌクレオチドをどれでも含むことができる。
【０２３６】
［実施例］
以下の実施例は、ベータアミロイドペプチドの非フィブリル形態を特異的に標的とする、単一ドメイン形式の抗体分子の開発、及び血液脳関門を特異的に通過するペプチドの開発、並びにペプチド及び単一ドメイン抗体のコンストラクトを証明するものである。以下の実施例は、抗体分子及びコンストラクトが、アルツハイマーの動物モデルにおいて老人斑の形成を有効に減少させ、防止するという予想外の結果をさらに証明することはもちろん、疾患の早期を同定するためのインビトロでの診断及びインビボでの画像化のためのバイオマーカーも提供する。
【実施例１】
【０２３７】
非フィブリルＢＡＰ４２を標的とするｓｄＡｂの産生
ＢＡＰ４２のモノマー及びオリゴマー形態を特異的に認識するが、フィブリル形態を認識しない、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ，single domain antibody）を開発した。ｓｄＡｂの開発は、下に（ａ）〜（ｃ）として概要を示す３パートプロセスを含む。簡単に述べると、（ａ）異なるＢＡＰ４２形態を調製し、（ｂ）特性解析し、そしてその後、（ｃ）モノマー又はオリゴマー形態でウサギを免疫し、ウサギ抗体を使用して、これら２つの形態の各々に対する、ＶＬドメインの、単一ドメイン抗体ライブラリーを構築することによって、非フィブリル形態を特異的に標的とするｓｄＡｂを開発した。固定化された異なる形態の抗原を有する「ファージディスプレイ膜」を使用してこの選択プロセスを最適化して、ＢＡＰ４２モノマー及びオリゴマー形態に特異的なｓｄＡｂのパネルを得た。
【０２３８】
ａ．ＢＡＰ４２の異なる形態の生成
上で述べたように、ＢＡＰ４２は、アルツハイマー患者の脳内に様々な会合形態で存在する。ＢＡＰ４２には、高いオリゴマー化能力及び繊維を形成する能力があり、様々な成熟段階を経るこのペプチドに関わると考えられるプロセスを図１に模式的に示す。
【０２３９】
図１が示すように、ＢＡＰ４２は、ペプチドのモノマーから、プラークを形成することができる繊維へと進行する凝集スキームに従って凝集する。ペプチドは、高いオリゴマー化能力を有し、自己会合によって開始して小さいオリゴマーを生じさせ、その後、それらのオリゴマーがこのペプチドの他の分子と会合する。ペプチドの構造は、繊維の特徴である、ベータシートを多く含む二次構造をもたらすように変化する。
【０２４０】
したがって、第一のステップとして、ＢＡＰ４２の様々な分子種（モノマー、オリゴマー、フィブリル）を生成するためのペプチド再構成プロトコルを確立した。使用した出発物質は、凍結乾燥された合成ＢＡＰ４２であり、それをＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁させて、最終濃度１０ｍｇ／ｍＬにした。この濃度及びｐＨで、ペプチドは可溶性でなかった。可溶化ｐＨをアンモニアでの滴定によって最適化した。ｐＨ１０で、ペプチドは可溶性になった。その後、ペプチドをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬの作業濃度に希釈し、ｐＨを７．４に戻した。ペプチド濃度を分光測定で定量するために、図２に示すようにλ＝２８０ｎｍでのモル吸光係数を決定した。
【０２４１】
図２は、ＢＡＰ４２のモル吸光係数の決定を示す。簡単に述べると、濃度が分かっているペプチドの様々な溶液を使用して吸光度を測定し、相関させて、係数を算出した。ε２８０ｎｍ＝０．３２６５±０．００４３（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１又は±１４７４．０４１  ε２８０ｎｍ＝１９，２８７Ｍ−１ｃｍ−１。
【０２４２】
ＢＡＰ４２の様々な分子種を得るために、タンパク質再構成後、５ｋＤａの細孔を有するフィルターに通してタンパク質を濾過した。このフィルターは、ペプチドのオリゴマー／フィブリル種の可能性のあるものを保持するが、すぐに使用するためのより低い分子量を有するモノマー種を溶出した。オリゴマー又は繊維を得るために最適化した、ＢＡＰ４２の様々な分子種を調製するための代表的方法は、図３Ａ〜３Ｂに示す通り。
【０２４３】
図３Ａに示すように、及び上で述べたように、第一のステップは、ｐＨを上昇させ、その後７．４に戻すことによる、凍結乾燥された合成ＢＡＰ４２の可溶化、続いて、可溶化されたＢＡＰ４２を使用するCentricon遠心分離、そしてモノマーを得るためのフロースルーの収集を含む。モノマー種を使用して、１６時間にわたる３７℃での１ｍｇ／ｍＬ  ＢＡＰ４２のオリゴマー化反応でオリゴマーを生成し、このオリゴマー化反応を一定したかき混ぜ（撹拌）によって促進した。この期間の後、得られた繊維を超遠心分離によって分離し、上で説明したように上清を遠心分離することによってモノマーを分離した。フィルターに保持された画分は、オリゴマーＢＡＰ４２画分に相当し、前に算出した係数を使用して分光測定でその画分をアッセイした。オリゴマー濃度は１ｍｇ／ｍＬであると決定された。
【０２４４】
図３Ｂに示すように、別の反応でモノマー種を使用して、４０時間にわたる３７℃での１ｍｇ／ｍＬ  ＢＡＰ４２の一定したかき混ぜに基づいて、フィブリルを生成した。得られたフィブリルを再び超遠心分離によって分離し、沈降物を収集した。試料中に存在するモノマーの初期量と、モノマー及びオリゴマーを含有する超遠心分離からの上清中に存在する最終量との差を算出することによって、フィブリルの量を決定した。
【０２４５】
ｂ．ＢＡＰ４２の異なる形態の特性解析
上で説明したようにＢＡＰ４２の異なる形態を単離した後、それらを次の３つの方法によって特性解析した：（ｉ）チオフラビンＴ結合、（ii）動的光散乱（ＤＬＳ，Dynamic Light Scattering）、及び（iii）分子排除クロマトグラフィー。
【０２４６】
ｉ．チオフラビンＴ結合による特性解析
単離されたＢＡＰ４２種を、先ず、チオフラビンＴ蛍光を使用して特性解析した。チオフラビンＴ化合物は、ベータシート二次構造を多く含むタンパク質混合物と特異的に会合し、すると、蛍光収量の増加を伴うより高い波長を放出する、蛍光プローブである。したがって、この技術によって、蛍光シグナル強度をタンパク質試料中に存在する繊維の濃度と関係付けられる。具体的には、モノマーは、チオフラビンＴとの反応性を示さず、オリゴマー画分は、低レベルの反応性を示すが、フィブリル画分は、高レベルの反応性を示す。図４は、上で説明した最適化プロセスで単離されたＢＡＰ４２種を特性解析するためのチオフラビンＴアッセイの結果を示す。
【０２４７】
ペプチド種をそれらの分子量に従って分散させるための、変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用したウェスタンブロットによって、モノマー、オリゴマー及び繊維試料をさらに分析した。ウェスタンブロット検出は、ウサギに行った様々な免疫に関して、下でより詳細に説明するようなウサギ由来のポリクローナル血清を使用して行った。図５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離された、ＢＡＰ４２種の混合物のウェスタンブロッティングの結果を示す。
【０２４８】
図５を参照すると、ＢＡＰ４２モノマーは、約５ｋＤａの質量を有し（１０ｋＤａ未満の分子質量を分散させる膜領域で見出される）、オリゴマーは、１０〜２００ｋＤａの間で分散され（この集団が、様々な数のモノマー単位を有する異なるオリゴマーの組合せで不均一であることを示す）、フィブリル種は、ゲルの染色部に保持された（それらが３００ｋＤａより高い分子量を有することを示す）。試料の形態も原子間力顕微鏡によって評価して、これらの様々な分子種の特性解析を完了した。
【０２４９】
ii．動的光散乱（ＤＬＳ）による特性解析
単離されたＢＡＰ４２種を動的光散乱（ＤＬＳ）によっても特性解析した。この技術は、懸濁プロファイルとして粒径分布を決定する。
【０２５０】
単離されたＢＡＰ４２の異なる形態を０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、Zetasizer Nano ZS（Malvern社、UK）を使用する独立した実験各々について８つの測定値を得た。異なる粒子のシグナル強度パーセントを粒子の直径の関数として表して、モノマー、オリゴマー及び繊維の試料中に存在する個々の粒子のサイズ分布のプロファイルを得たことはもちろん、ある範囲の直径を有する粒子を各々が有するクラスサイズ分布のプロファイルも得た。すべての分析を独立した単離からの試料で三連で行った。結果を図６Ａ〜６Ｂに示す。
【０２５１】
図６Ａは、モノマー（灰色）、オリゴマー（赤色）及び繊維（緑色）試料のサイズ分布のプロファイルを示す。モノマー種は、最大ピーク強度が直径１２２ｎｍに対応するサイズ分布、及び２，５００ｎｍより大きい強度を有する小集団を示した。オリゴマー種は、直径１６４ｎｍに対応する最大強度を有する集団内では同一のプロファイルを示したが、この外に、直径が２，５００ｎｍより大きい粒子のより有意な集団を示した。フィブリル種は、最大強度が直径１４２ｎｍサイズ、５３１ｎｍサイズ、及び２，５００ｎｍより大きいサイズに対応する、３つの別個の集団を示した。
【０２５２】
図６Ｂは、クラスサイズ分布のプロファイルを示し、すなわち、シグナル強度のパーセンテージの分布プロファイルを異なるサイズの粒子の範囲について流体力学的粒子径の関数として分析した。モノマー試料と比較して、オリゴマー試料は、より大きい直径への予想されたシフトを示した。オリゴマー試料については、１００ｎｍ未満の分子種に起因するシグナル強度の割合は３６．７％であり、その一方で１００〜２５０ｎｍの直径を有する分子種に起因するシグナル強度の割合は２９．１％であり、したがって、（直径が１００ｎｍ未満の分子種について３９．９％の強度、及び直径が１００〜２５０ｎｍの分子種について３５．２％の強度を示した）同様のサイズのモノマーと比較して、それぞれ、８％及び１７％の減少を示した。とはいえ、２５１〜５００ｎｍの範囲の分子種のパーセンテージは同一であった。直径範囲５０１〜１，０００ｎｍの分子種及び直径範囲が１ｍｍを超える分子種について、モノマー試料は、それぞれ、４．９％及び３．６％のシグナル強度パーセントを示し、同じ範囲又はクラスについて、オリゴマー試料は、それぞれ、５．８％及び１２．１％の強度を示した。これらの範囲では、オリゴマー試料は、モノマー試料と比較して高い強度パーセントを明確に示し、オリゴマー試料は、直径範囲５０１〜１，０００ｎｍの粒子についてはモノマー試料に対して２０％増加、及び直径範囲が１ｍｍを超える粒子については２３４％増加を示した。
【０２５３】
繊維試料に関しては、モノマーとの差がさらに強調された。繊維試料では、粒子が大きいほど、強度パーセントの増加が大きく、強度パーセントが直径範囲２５１〜５００ｎｍ、直径範囲５０１〜１，０００ｎｍ、及び直径範囲１ｍｍ超えの粒子について、それぞれ、２３．３％、２０．９％及び１６．６％であった。したがって、繊維とモノマーを比較すると、直径範囲２５１〜５００ｎｍの分子種については４２％の増加、直径範囲５０１〜１，０００ｎｍの分子種については３３０％の増加、及び１，０００ｎｍを超える直径範囲の分子種については３６１％の増加があった。
【０２５４】
結論として、ＢＡＰ４２のモノマー形態の試料は、モノマー種の集団に対応する小サイズの集団を実際に主に有した。オリゴマー形態の試料は、モノマー試料と同様の集団に加えて、オリゴマーＢＡＰ４２にまさに対応する、直径が１，０００ｎｍより大きい、より大きい分子種の集団を有した。繊維の試料は、小さい直径の集団に加えて、直径が５０１〜１，０００ｎｍのサイズの範囲の分子種のより大きい集団と、直径が１，０００ｎｍを超えるサイズを有する分子種の別の集団を有し、より後期のオリゴマー化及びフィブリル化段階を確かに示した。
【０２５５】
iii．サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ，Size Exclusion Chromatography）による特性解析
オリゴマー化混合物中のＢＡＰ４２種の形成を分子サイズ排除クロマトグラフィーによって評定した。この技術は、各粒子の分子質量及び流体力学的半径に従って分子種を分離する。（より高い分子量を有する）より高度な会合体は、カラムの固体マトリックスと相互作用せず、最初に溶出し、その一方で（より低い分子量を有する）モノマー種は、固体マトリックスと相互作用し、より長い滞留時間後に溶出する。
【０２５６】
上で説明したように、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＡＰ４２調製物を１６時間にわたる３７℃での一定した撹拌に付した。この期間の後、得られた繊維を超遠心分離によって分離し、収集した上清をサイズ排除カラムにかけた。結果を図７に示す。
【０２５７】
図７を参照すると、ＢＡＰ４２のモノマーとオリゴマー種の両方がこの混合物中に存在した。モノマー及びオリゴマーＢＡＰ４２種の分離についての代表的クロマトグラムは、モノマー画分（青色曲線）がペプチドモノマーのみに対応する滞留時間で溶出したことを示す。１６時間、３７℃での一定した撹拌の結果として得た混合物のクロマトグラフィー装置への注入（緑色曲線）は、モノマーばかりでなく、オリゴマー種もより短い滞留時間で溶出することを示した。
【０２５８】
ｃ．非フィブリルＢＡＰ４２を標的とするｓｄＡｂの開発
非フィブリル形態を特異的に標的とするｓｄＡｂを開発するために、５段階プロセスに従った。簡単に述べると、（ｉ）ウサギをモノマー又はオリゴマー形態で免疫し、その後、（ii）ウサギ抗体を得て、使用して、これら２つの形態各々に対する単一ドメイン抗体ライブラリー（ＶＬ）を構築し、（iii）モノマー及びオリゴマーＢＡＰ４２形態を特異的に標的とする単一ドメイン抗体を、膜ファージディスプレイを使用して選択し、（iv）ＥＬＩＳＡでそれらの結合及び発現によってさらに選択し、その後、選択されたクローンを、ＣＡＴ融合アッセイを使用して安定性についてなおさらに選択し、（ｖ）最後に最上位の候補をシークエンシングし、分析した。
【０２５９】
ｉ．異なるＢＡＰ４２形態によるウサギの免疫
２匹のニュージーランド白ウサギの各々を、ＢＡＰ４２の異なる形態の生成に関するセクションにおいて上で説明したようにＢＡＰ４２のモノマー及びオリゴマー形態で免疫した。免疫は、製造業者（Ribi Immunochem Research社、Hamilton, Mont.）の指示書に従って１ｍＬアジュバント中、２〜３週間間隔で４回の皮下注射をウサギに投与するプロトコルに従って、約１００〜１５０μｇの各精製抗原、モノマー又はオリゴマーで、７４日間継続した。免疫付与プロセスを通して、血清を収集し、試料をＥＬＩＳＡによって評価して、各抗原に対する免疫応答の進展を判定した。結果を図８Ａ〜８Ｂ及び図９Ａ〜９Ｂに示す。
【０２６０】
図８Ａ〜８Ｂ及び図９Ａ〜９Ｂに示すように、血清力価は免疫付与の間全体にわたって増加した。これは、モノマー及びオリゴマー形態の各々についての富化及び特異性を明らかに示す。さらに、両方のウサギからの血清は、フィブリルＢＡＰ４２に対する抗体のより低い力価を明らかに示した。血清力価及び抗体特異性を２６日目（図８Ａ〜８Ｂ）及び７４日目（最終採血）（図９Ａ〜９Ｂ）に評価した。
【０２６１】
具体的には、図８Ａ〜８Ｂは、ＢＡＰ４２モノマーで免疫したウサギ（図８Ａ）又はＢＡＰ４２オリゴマーで免疫したウサギ（図８Ｂ）のＥＬＩＳＡによる免疫応答を示す。結果は、２回目の採血（２６日目）に対応する血清抗体の力価測定に対応し、この場合、免疫した動物からの抗血清を、二次抗体としてＨＲＰコンジュゲートされたヤギ抗ウサギＦｃポリクローナル抗体（ＰＩＥＲＣＥ）を使用してＥＬＩＳＡによりＢＡＰ４２のモノマー、オリゴマー及びフィブリル２００ｎｇへの結合について分析した。
【０２６２】
図９Ａ〜９Ｂは、血清力価及び抗体特異性を上で説明したように７４日目（最終採血）に評価したときの、ＢＡＰ４２モノマーで免疫したウサギ（図９Ａ）又はＢＡＰ４２オリゴマーで免疫したウサギ（図９Ｂ）のＥＬＩＳＡによる、より後の免疫応答を示す。得られた結果は非常に有望であり、この免疫付与プロトコルが、ＢＡＰ４２のモノマー及びオリゴマー形態各々に対して特異的なより多くの抗体を産生したことを示した。
【０２６３】
ii．ｓｄＡｂライブラリーの構築
動物を７４日目に屠殺し、その後、一次抗体産生及び成熟のための器官、すなわち骨髄及び脾臓を取り出した。その後、ＲＮＡを器官から抽出し、ｃＤＮＡを合成して単一ドメイン抗体のライブラリーを構築した（ＰＣＲ生成物の増幅及びファージミドでのクローニング）。
【０２６４】
具体的には、組織試料を採取し、TRI試薬（Molecular Research Centre社）をその製造業者のプロトコルに従って使用して全ＲＮＡ単離用に調製した。単離した全ＲＮＡを５００μｌのリボヌクレアーゼ不含水に溶解し、濃度及び純度を分光光度測定によって判定した。製造業者のプロトコルを用いてオリゴ（ｄＴ）プライマー及び逆転写酵素（Superscript、Invitrogen社）を使用して、第一鎖ｃＤＮＡを全ＲＮＡから合成した。
【０２６５】
表１に提示するセンスプライマー（可変領域の５’部分）及び表２に提示するアンチセンスプライマー（軽鎖の定常領域の３’部分）を使用して、軽鎖の可変領域をコードする遺伝子の一次増幅を行った。
【０２６６】
【表１】
2018513670.tif 000002
【０２６７】
【表２】
2018513670.tif 000003
【０２６８】
２５ｐｍｏｌの各プライマーを使用して反応容積５０μｌで一次ＰＣＲを行った。２．５μｌのランダムプライミングした又はオリゴ−ｄＴ  ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ  ５μｇと等価）をテンプレートとして使用した。一次ＰＣＲの反応条件は、９４℃で１１分、続いて、３０サイクルにわたって５４／５５／７２℃で３０／６０／１２０秒、そして７２℃で５分であった。すべての反応は、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＮＴＰ（Roche Diagnostics社、Brussels、Belgium）及び１．２５Ｕ  AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（Roche社）で行った。したがって、各ウサギからのｃＤＮＡを、ウサギＶＬ  ｓｄＡｂ（９×Ｖκ及び１×Ｖλ）コード配列の増幅のための、別個の３０サイクルポリメラーゼ連鎖反応と１０個の特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組合せに付した。
【０２６９】
ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲルで分離し、QIAquickゲル抽出キット又はQIAEXII（Qiagen社）を使用してＤＮＡを溶離した。ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成後、純度及び濃度を判定した。
【０２７０】
すべてのプライマーは、SfiI部位を有した。最終ＰＣＲ生成物をSfiI切断し、精製し、適切に切断されたファージミドベクターにクローニングした。ファージミドは、サプレッサー終止コドンと、精製用のペプチドタグ（Ｈｉｓ６）及び検出用のペプチドタグ（ＨＡ）をコードする配列とを含有した。
【０２７１】
ベクターを使用してライブラリーを形成し、大腸菌を形質転換させた。具体的には、（既知量に対するゲル電気泳動によって判定して）約１．４μｇの直線化ベクターＤＮＡをおおよそ１〜３倍過剰のインサートと、付着末端ライゲーションについてのライゲーションのために、１Ｘリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ジチオエリトリトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ７．５）及び１Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Roche社）を含有する２０μＬ反応物中でライゲーションした。ライゲーション物を１６〜１８時間、１２〜１４℃でインキュベートした。
【０２７２】
ライゲーションの結果及び対応する数のキュベットを氷上で１０分間インキュベートした。同時に、エレクトロコンピテント大腸菌を氷上で解凍した。２μＬの各ライゲーション反応物をそのエレクトロコンピテント細菌に添加し、キュベットに移し、１分間、氷上で保管した。エレクトロポレーションを２．５ｋＶ、２５μＦ、及び２００Ωで行った。室温で１ｍｌのＳＯＣ培地で直ちにキュベットをフラッシュし、培養物を２５０ｒｐｍで１時間、３７℃又は３０℃で震盪した。次いで、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンと１０μｇ／ｍＬ  テトラサイクリンとを含有するＬＢ寒天プレートに培養物を塗り広げ、一晩、３７℃又は３０℃でインキュベートした。
【０２７３】
ファージミドベクターを単離し、製造業者のプロトコルに従って宿主細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、５ｍＬのＳＯＣを添加し、培養物を１時間、３７℃で震盪した。その後、１０ｍＬのＳＢ培地を３７℃で１時間にわたって添加した。次に、４．５μＬの１００ｍｇ／ｍＬ  カルベニシリンを添加し、培養物をさらに１時間、３７℃で震盪した後、１ｍＬのＶＳＣＭ１３（ヘルパーファージ、１０１３ｐｆｕ／ｍＬ）を１５ｍＬ培養物各々に添加した。合計１７０ｍＬのＳＢ培地／ｃａｒｂを培養物に添加し、それらを２時間、３７℃でインキュベートした。２８０μＬの５０ｍｇ／ｍＬ  カナマイシンを添加し、それらの培養物を一晩、３７℃で震盪し続けた。翌朝、培養物を遠心分離し、２５ｍＬのＰＥＧ−８０００（ポリエチレングリコール）／ＮａＣｌを添加することによってファージ上清を沈降させ、氷上で３０分間、インキュベートした。ファージを上清から遠心分離し、ペレットを２ｍＬのＴＢＳ／ＢＳＡ  １％に再懸濁させ、回転沈降させ、０．２μｍのフィルターに通して滅菌チューブへと濾過した。
【０２７４】
異なるライブラリーの構築後、所望のｓｄＡｂを、下で説明するように選択した。
【０２７５】
iii．非フィブリルＢＡＰ４２に対するｓｄＡｂの選択  −  膜ファージディスプレイ
９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート内に固定化された抗原での旧来のファージディスプレイ（Barbas, et al. (1991). Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: The gene III site. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7978-7982を参照されたい）の代わりに、膜によるファージディスプレイを行った。それを図１０に模式的に示す。ＢＡＰ４２の異なる形態に対する抗体を選択するための選択技術としてこの方法を開発して、それらの形態が所望の形状に合い、凝集を被らないことを確認した。この方法論は、ＢＡＰ４２の異なる形態をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いでウェスタンブロッティングによってＰＶＤＦ膜に移送するステップを含み、そのときすべての選択ラウンドを標的抗原の固定化に役立つ膜で行った。このプロセスは「ウェスタンパニング」としても公知である（Ravn et al. (2000) “Identification of phage antibodies toward the Werner protein by selection on Western blots” Electrophoresis 21:509-516）。
【０２７６】
ブロットされた膜でのファージディスプレイの条件を最適化するために、幾つかの試験を行って、ＢＡＰ４２のモノマー又はオリゴマーに対する小ドメインの抗体の選択で使用するためのプロトコルを設計した。これらの試験は、ブロッキング条件、洗浄条件及び溶離を含んだ。これらの条件を同じプロトコルに従って別々に試験して、最適条件を特定した。ブロットされた抗原を用いずに、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ及びＰＶＤＦ膜（BioRad社）を使用してこれらのプロトコルを実行して、バックグラウンド、すなわち、膜に対する非特異的結合、及び使用した溶液に対する非特異的結合を分析した。各試験の前に、第一のステップは、膜の非特異的ファージ結合に対する耐性をより大きくするメタノール（Applichem社）処理での、膜の活性化であった。
【０２７７】
最適化は、標準プロトコルで開始した：メタノールでの活性化後の膜をＰＢＳＴ中５％ミルクで１時間３０分にわたってブロックし、ＰＢＳＴ  ０．２％で３回洗浄した。次いで、ＰＢＳＴ  ０．２％中１％ミルク中の１．０×１０１１ＣＦＵ／ｍＬのヘルパーファージを１時間にわたって室温で添加し、ＰＢＳＴ  ０．２で５回洗浄した。次いで、グリシン  ｐＨ３．０及びＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ１０．５でファージを溶離し、結合ファージの力価をｌｏｇファージ大腸菌、具体的にはＥＲ２７３８又はＳＳ３２０エレクトロコンピテントセルの感染によって決定した。
【０２７８】
評価した第一の条件はブロッキング溶液であった。次の６つのブロッキング溶液を評価した：ＰＢＳＴ  ０．２％中のミルク５％；ＰＢＳＴ  ０．２％中のＢＳＡ  ３％；Ｐｉｅｒｃｅブロッキング溶液（Blocking Pierce）；ＰＢＳＴ  ０．２％中のゼラチン５％；ＰＢＳＴ  ０．２％中のカゼイン０．５％；及びブロッキング溶液としてのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ。それらのすべてを４℃で一晩、評価した。洗浄条件の評価のために、次の３つの異なる溶液を試験した：ＰＢＳＴ  ０．５％；ＰＢＳＴ  ０．２％中の１Ｍ  ＮａＣｌ；及びＰＢＳＴ  ０．２％中の０．５Ｍ  ＮａＣｌ。これらの試験も、洗浄ステップを除いて、同じ標準プロトコルに従った。
【０２７９】
溶離ステップを評価するために、前に選択した条件を用いて、２つの異なるタイプの溶離（グリシンでの溶離及びトリプシンでの溶離）各々について試験を行った。ｌｏｇファージ大腸菌、具体的にはＥＲ２７３８エレクトロコンピテントセルの感染によって決定した結合ファージの力価によって、結果を比較した。
【０２８０】
膜パニングは、次のように進行した：１μｇ／ウェルでＢＡＰをブロットしたＰＶＤＦ膜をメタノール１００％で活性化し、次いでＰｉｅｒｃｅブロッキング溶液（Pierce blocking）又はＢＳＡ  ３％で一晩、４℃でブロックした。その一方で、１μｇのフィブリルをＥＬＩＳＡプレートの４つのウェル内に固定化し、そのプレートを一晩、４℃でインキュベートした。このステップは、繊維に対する特異性がより高いファージ／抗体を除去するために行った。翌日、膜及びウェルをＰＢＳで１回洗浄し、ブロックした。そのＥＬＩＳＡプレートを、膜に使用したのと同じブロッキング溶液で、１時間、３７℃でブロックした。ブロッキング後、１％結合溶液、例えばＰＢＳ−Ｐｉｅｒｃｅ、中の調製したてのファージ  １．１ｍＬをフィブリルＥＬＩＳＡプレートに１５分間にわたって室温（ＲＴ，room temperature）で添加した。膜をヘルパーファージ（１×１０１２ファージ／ｍＬ）とともに３０分間、室温でインキュベートし、その後、ＰＢＳで１回洗浄した。
【０２８１】
洗浄後、フィブリルＥＬＩＳＡプレートから得た調製したてのファージとともに膜を２時間、２０〜２５℃で、穏やかに揺動しながらインキュベートした。その後、ファージ溶液を廃棄し、揺動プラットフォームにおいて膜をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０．２％又は０．５％で５回洗浄して、抗原に対して特異的でないファージを除去した。膜のモノマー、オリゴマー及びフィブリルに対応する領域をハサミで切断し、１０ｍｇ／ｍＬの調製したてのトリプシン  １ｍＬを３０分にわたって３７℃で添加して、膜内の抗原に特異的である抗体を回収した。
【０２８２】
ファージ溶離後、大腸菌ＳＳ３２０培養物（おおよそ０．６であるＯ．Ｄ．）を３０分間、３７℃で所望の抗原に対応するファージ溶離物に感染させることによってファージ再増幅を果した。インキュベーション後、３μＬの１００ｍｇ／ｍＬ  アンピシリンを培養物に添加し、１時間、３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。その後、４．５μＬの１００ｍｇ／ｍＬ  アンピシリンを添加し、さらに１時間、２５０ｒｐｍ、３７℃で震盪した。最後に、４６μＬの１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンと１８４μＬの５ｍｇ／ｍＬ  テトラサイクリンとを含有する８５ｍＬの予温ＳＢ培地を添加した。その培養物を一晩、２１０ｒｐｍで、３７℃でインキュベートした。翌日、１００ｍｇ／ｍＬ  アンピシリンと１０ｍｇ／ｍＬ  テトラサイクリンとを含有する５〜９５ｍＬのＳＢ培地を、Ｏ．Ｄ．が約０．６に達するまで、添加することによって、培養物を希釈した。その後、培養物を１ｍＬのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに感染させ、２時間、２１０ｒｐｍ、３７℃でインキュベートした。１４０μＬの５０ｍｇ／ｍＬ  カナマイシンを添加し、一晩、３７℃、２１０ｒｐｍで震盪し続けた。産生されたファージを前に説明したようにＰＥＧ  ８０００及びＮａＣｌでの沈降によって回収し、新たな選択ラウンドを行った。
【０２８３】
膜ファージディスプレイを使用する第４回膜パニング（選択ラウンド）後、次のものを得た：ＢＡＰ４２のオリゴマー形態に特異的な７．５×１０５ファージ／ｍＬ、及びＢＡＰ４２のモノマー形態に特異的な１．８×１０５ファージ／ｍＬ。表３は、ＥＬＩＳＡウェル内に固定化されたオリゴマー形態を用い、標準ファージディスプレイプロトコルを使用して第４回パニング（選択ラウンド）後に得た結果を示す。膜ファージディスプレイを使用した結果を、各ラウンドに使用した条件とともに下の表４〜５に示す。
【０２８４】
【表３】
2018513670.tif 000004
【０２８５】
【表４】
2018513670.tif 000005
【０２８６】
【表５】
2018513670.tif 000006
【０２８７】
iv．ＣＡＴ融合アッセイを使用する安定した単一ドメイン抗体ライブラリーの選択
標的分子種、モノマー及びオリゴマーに特異的な安定した抗体をプールした後、次の目標は、対応する抗原に対して高い免疫特異性を示す候補を選択することであった。したがって、スクリーニングを行い、その後、抗オリゴマー及び抗モノマー活性についてＥＬＩＳＡによって評価して、それぞれの抗原に対する結合プロファイルを決定した。結果を図１１〜１２に示す。
【０２８８】
具体的には、図１１は、ＢＡＰ４２のオリゴマー形態を用いてＥＬＩＳＡによって分析した、膜ファージディスプレイから得た９４クローンの結合プロファイル及びライゲーション値を示し（Ｍ−モノマー、Ｏ−オリゴマー、Ｆ−繊維；Ｘ−ＢＳＡ  ３％）、図１２は、ＢＡＰ４２のモノマー形態を用いてＥＬＩＳＡによって分析した及び膜ファージディスプレイから得た９４クローンの結合プロファイルライゲーション値を示す（Ｍ−モノマー、Ｏ−オリゴマー、Ｆ−繊維；Ｘ−ＢＳＡ  ３％）。
【０２８９】
以前に記載されたような改良型ＣＡＴ融合アッセイ（例えば、Goncalves et alのＷＯ２００８／１３６６９４号パンフレットを参照されたい）を使用して、クローンを安定性についてさらに選択した。具体的には、ＣＡＴ遺伝子をＰＣＲによってｐＣＡＴ（Stratagene社）から増幅し、EcoRI及びSphI制限部位を使用してｐＥＴ由来プラスミドに挿入してｐＥ−ＣＡＴを生成した。可変ドメインをクローニングするために最初に使用した５’ＰＣＲプライマーも、２つの逐次的な異なるSfiIクローニング部位と、ＣＡＴ遺伝子の開始直前にアンバーコドン（ＴＡＧ）とを含有するように、設計した。
【０２９０】
ＣＡＴ遺伝子に融合した単一ドメイン抗体ライブラリーをクローニングするために、パニングによって選択されたファージミドベクターからＰＣＲによってＳＤＶＬ断片を生成した。得られたＳＤＶＬ  ＰＣＲ断片をゲル精製し、制限エンドヌクレアーゼSfiIで消化し、適切なSfiI切断ベクターｐＥ−ＣＡＴに独立してクローニングした。ｐＳＤＶＬ−ＣＡＴコンストラクトは、Ｎ末端Ｈｉｓ６アフィニティータグ及びアンピシリン耐性遺伝子も含む、強力なＬａｃプロモーターの制御下にあった。あるいは、クローニングされた配列をＣＡＴとの融合タンパク質として発現するように設計された容易に入手できるベクター、例えばＰＣＦＮ１ベクター（その全体が参照により組み込まれている、Maxwell, et al (1999) J Prot Sci 8:1908-1911を参照されたい）に、ＳＤＶＬ断片をクローニングしてもよい。
【０２９１】
ＥＲ２７８３細胞（New England Biolabs社）を各単一ドメインＣＡＴ融合ライブラリーで形質転換させることによって、クロラムフェニコール耐性アッセイを行った。形質転換混合物を５ｍＬのＳＯＣに接種し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、３μＬの１００ｍｇ／ｍｌ  アンピシリンを有する１０ｍＬのＳＢ培地を各ライブラリーに添加した。合計１５ｍＬの各培養物を１時間、３７℃で震盪した。その後、４．５μＬの１００ｍｇ／ｍｌ  アンピシリンを添加し、培養物を１時間、３７℃で震盪した。次いで、８５μＬの１００ｍｇ／ｍｌ  アンピシリンを有する８５ｍＬのＳＢ培地を添加し、培養物を一晩、３７℃で増殖させた。翌日、６００μＬの各培養物を使用して、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含有する２０ｍＬのＳＢ培地に接種した。
【０２９２】
培養物の光学密度が（６００ｎＭで）０．９に達したら、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によってＣＡＴ融合単一ドメインタンパク質の発現を誘導した。３７℃で２時間のインキュベーション後、各ライブラリーの１００μＬアリコートをＩＰＴＧ（２００μｇ／ｍＬ）及び様々な濃度のクロラムフェニコールとともに寒天プレートに蒔いた。プレートを３７℃で１６〜２０時間インキュベートした。３７℃インキュベーション期間後にコロニーが出現した時点での最高クロラムフェニコールレベルとして耐性レベルを定量した。１．８６ｍＭ又はそれより高いクロラムフェニコール濃度で検出されたコロニーを、安定しているとして選択した。結果を下の表６に示す。表中、＋＋＋は、検出された６００を超えるコロニーを示し、＋＋は、検出された４００〜６００コロニーを示し、＋は、検出された１〜３９９コロニーを示し、−は、対応するクロラムフェニコール濃度で検出されたコロニーがなかったことを示す。「ｓｄＡｂ２」、「ｓｄＡｂ６」「ｓｄＡｂ２０」及び「ｓｄＡｂ２６」は、ＢＡＰ４２オリゴマーに結合するｓｄＡｂ候補である。
【０２９３】
【表６】
2018513670.tif 000007
【０２９４】
ｖ．非フィブリルＢＡＰ４２に対する選択ｓｄＡｂの分析
ＥＬＩＳＡによって分析したクローンから、モノマー及びオリゴマーに対して高い特異性を有するがフィブリルＢＡＰ４２を認識しない、ある特定のクローンを、シークエンシングした。配列情報を配列番号１〜２１として配列表に提供する。シークエンシング後、候補間の相同性を評価し、相同性アラインメントを行い、ホモロジーツリーを構築した。
【０２９５】
１０の抗体を選択して、ウェスタンブロットによって異なるＢＡＰ４２形態についてのそれらの認識を評価した。結果を図１３及び図１４に示す。
【０２９６】
具体的には、図１３は、オリゴマーＢＡＰ４２に対するＥＬＩＳＡによる１０クローンの精製及び分析後、ウェスタンブロットによって精製及び検出した、１０クローンの検出を示す。図１４は、ＰＶＤＦ膜中の異なるＢＡＰ４２アイソフォームのウェスタンブロット分析での主にモノマー及びオリゴマーの認識を示す。他の選択抗オリゴマーｓｄＡｂは、ＢＡＰ４２オリゴマー形態の認識に関して同様のプロファイルを示す。
【０２９７】
精製し、ＢＡＰ４２オリゴマーの認識に関して検証したら、精製された抗オリゴマー抗体を、ペプチドのフィブリル形態への凝集を阻害するそれらの能力について試験した。このアッセイは、チオフラビンＴ（ＴｈＴ，thioflavin T）を使用して行った。チオフラビンＴは、上で論じたように、「ベータシート」を多く含む二次構造（フィブリルＢＡＰ４２にまさに特有の構造）を認識するプローブである。したがって、候補抗オリゴマーｓｄＡｂによる凝集阻害が大きいほど、形成されるフィブリルは少なく、それ故、アッセイ中にＴｈＴによって放出されるシグナルは小さい。他の選択抗オリゴマーｓｄＡｂは、同様の凝集阻害を示す。
【０２９８】
抗オリゴマーｓｄＡｂを、ＢＩＡｃｏｒｅによってＢＡＰ４２オリゴマーに対するそれらの相対結合プロファイルに関してさらに特性解析した。結果を図１５に示す。
【０２９９】
最後に、ＢＩＡｃｏｒｅによって解析した抗体から、ＢＡＰ４２のオリゴマー形態への最高結合プロファイルを示す候補（すなわち、「ＶＬ＃２６」、「ＶＬ＃２０」、「ＶＬ＃６」及び「ＶＬ＃２」）を、ＢＩＡｃｏｒｅでのさらなる動態研究及び生体内分布研究のために選択した。結果を、図１６Ａ〜１６Ｄ（動態研究）にそれぞれ、及び下に提示する表１４〜１６（生体内分布研究）にそれぞれ示すことにする。
【実施例２】
【０３００】
ウイルスカプシドタンパク質からのＢＢＢ特異的送達ペプチドの開発
送達ペプチドをカプシドタンパク質（ＤＥＮ２Ｃ）に基づいて調製した。ＤＥＮ２Ｃのセグメントは、ＤＮＡカーゴの細胞内在化を果す能力と、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，Green fluorescent protein）の発現を示した（Freire, et al. FEBS (2014) 281(1):191-215）。ＤＥＮ２Ｃタンパク質をこの実施例で使用して、６段階プロセスで血液脳関門（ＢＢＢ）に特異的なペプチドライブラリーを構築した。簡単に述べると、（ａ）全ＤＥＮ２Ｃタンパク質の移行能力を判定し、（ｂ）ＤＥＮ２Ｃペプチドを産生し、放射標識し、その後（ｃ）ＢＢＢ特異的移行及びＢＢＢ細胞内在化についてインビトロで試験し、及び（ｄ）ＢＢＢ細胞に対する毒性について試験し、（ｅ）それらの膜電位効果及び分配係数に関して研究し、そして最後に（ｆ）生体内分布及び安定性についてインビボで試験した。
【０３０１】
ａ．インビトロＢＢＢモデルにおけるＤＥＮ２Ｃ移行能力の判定
先ず、ＤＥＮ２Ｃ遺伝子によってコードされた全タンパク質配列をファージの表面に露出させ、それを使用してＢＢＢモデルとの相互作用を試験した。
【０３０２】
所望の遺伝子を含有するファージミドＤＮＡ（ＤＥＮ２Ｃ−ｐIII融合ファージミド）を大腸菌ＳＳ３２０細胞に導入し、ペプチドをコードする遺伝子を細胞の周辺質において発現させた。Ｍ１３ファージの形成に重要なエンベロープタンパク質及び遺伝子を、パッケージングシグナルが欠失しているヘルパーファージによって供給した。宿主細菌のファージミド及びヘルパーファージでの同時感染によって、ｐIII−ＤＥＮ２融合体を露出する、ハイブリッドビリオン（ファージ−ＤＥＮ２又はＤＥＮ−ファージ）を産生した。
【０３０３】
トランズウェルシステムにおいて増殖するＢＥＣを使用して、インビトロＢＢＢモデルを調製した。具体的には、トランズウェルシステムは、「組織培養インサート」の上の区画（頂部）と下の区画（基底部）の間にインビトロで内皮バリアを形成する、ミクロ多孔質膜上のｂＥｎｄ３細胞で構成されていた。次いで、ファージ−ＤＥＮ２をｂＥｎｄ３細胞とともにインキュベートした。すなわち、調製したファージを上の区画（頂部）に添加し、３０分間インキュベートした。ヘルパーファージ、カプシドタンパク質に融合したファージ（ＤＥＮ−ファージ）、及びＢＢＢを通過する陽性対照（＋ファージ）の試料を使用して、この実験を反復した。ヘルパーファージ、ＤＥＮ−ファージ及び陽性対象の試料についての、総初期ファージ（ストック）に対する、ＢＢＢモデルの両側の頂部及び基底部におけるファージ力価の比較に基づいて、ＤＥＮ−ファージの移動能力を判定した。結果を図１７に示す。
【０３０４】
図１７が立証するように、ＤＥＮ２Ｃ遺伝子は、陽性対照と比較してファージの移行能力を強化する。結果は、頂部と基底部の両方が１０１２という同じファージ力価を有する場合、モデルＢＢＢを介して頂部と基底部の間で平衡が達成されたことを示した。これらの結果は、驚くべきことに、ＤＥＮ−ファージが内皮バリアを通って自由に移動したことを立証する。バリアを移行する能力を有するファージを基底部から収集し、再増幅した。
【０３０５】
モデルバリアの完全性を保証するための試験を行った。バリアの完全性は、様々な方法で、例えば、異なる分子質量の蛍光分子を使用して、試験することができる。具体的には、使用したインビトロＢＢＢシステムにおいて蛍光分子と４０ｋＤａデキストラン（ＦＤ４０）を使用して内皮バリア完全性を試験した。ＦＤ４０を頂部に適用した後、細胞不含対照（ブランク）、ｂＥｎｄ３細胞を有するＢＢＢモデル（細胞）、及びファージとのインキュベーション後のＢＢＢモデル（ファージ）のいずれかを使用して、基底部における蛍光をアッセイした。結果を図１８に示す。
【０３０６】
図１８が示すように、細胞バリアでの分子の滞留（ＦＤ４０による通過２％未満）は、バリアがない場合（基底部では約８％ＦＤ４０）と比較して大きかった。さらに、バリアの完全性は、ファージとのインキュベーションによる影響を受けるようには見えなかった（ファージが存在するＦＤ４０の通過は依然として約２％）。
【０３０７】
ｂ．ＤＥＮ２Ｃペプチドの産生及び放射標識
約５〜約２５個のアミノ酸を有する、タンパク質のＤＥＮ２Ｃドメインに由来する小ペプチドを、カップリング−洗浄、洗浄そして脱保護の反復サイクルからなる固相でのＦｍｏｃ化学に基づいて合成した。
【０３０８】
次いで、これらのペプチド（配列番号２２〜２７及び１２７によるもの）をキレートとコンジュゲートさせた、又は放射性同位元素、テクネチウム又はガリウムでマーキングした。次いで、ＢＢＢインビトロモデルにおけるペプチドの移行能力と細胞内在化についてのそれらの能力の両方を分析するために、化合物をｂＥｎｄ３細胞と相互作用させた。結果を確認できるようにするために、２つの異なるタグをこれらの分析に使用した。
【０３０９】
より具体的には、コンジュゲーションは次のステップを含んだ：樹脂を膨潤させるステップ、末端アミノ酸の脱保護ステップ、活性化剤と塩基を使用するコンジュゲーション反応ステップ、及び切断終了時にペプチド−キレート生成物を得るステップ。使用したキレートは、ピラゾール誘導体、例えば、テクネチウムでの標識を促進するｔ−ＢｕＰｚ４（Morais, et al. J Med Chem (2013) 56(5):1961-73）、及びガリウムでのマーキングを促進するNODA-GA(tBu)3（４−（４，７−ビス（２−ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１−イル）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）５−オキソペンタン酸）であった。
【０３１０】
ＨＰＬＣ（High-performance liquid chromatography、高速液体クロマトグラフィー）を行って、ペプチド−キレートを精製し、精製を質量分光測定（ＭＳ，mass spectroscopy）によって確認した。結果を図１９Ａ〜１９Ｆ（異なるペプチドについて得たＨＰＬＣ結果）及び図２０Ａ〜２０Ｆ（ｔ−ＢｕＰｚ４のＭＷが３２６．６ｇｍｏｌ−１の場合の異なるペプチドについてのＭＳ結果）を示す。ＨＰＬＣ結果は、ペプチド単独（より短い滞留時間）及びキレートとコンジュゲーションしているペプチド（より長い滞留時間）に対応する、２つの主要な分子種を示した。ＭＳ結果は、（ペプチド単独より高いＭＷを有する）ペプチド−キレート種の精製を確証した。同様に、NODA-GA(tBu)3とのコンジュゲートを分析した（データを示さない）。最後に、ペプチドに８×１０−５Ｍの最終濃度で放射標識した。
【０３１１】
元のペプチド及びコンジュゲートしたペプチドの特徴を下の表７に要約する。表７は、各ペプチドの名称、等電点（ＰＩ，isoelectric point）、電荷（正の残基の数）、計算質量（Ｄａで）、及び実測されたイオン、並びに対応するコンジュゲートについての名称、計算質量及び実測イオン、並びにまたＨＰＬＣでの滞留時間、及び分配係数（ｌｏｇ  Ｐｏ／ｗ）を収載するものである。これらの値によってペプチドの親水性の性質を判定することが可能であり、ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ４を、最も親水性が高いペプチドと同定した。
【０３１２】
【表７】
2018513670.tif 000008
2018513670.tif 000009
【０３１３】
ｃ．ＤＥＮ２ＣペプチドのＢＢＢ特異的移行及び細胞内在化のインビトロ試験
上で説明したのと同じインビトロＢＢＢモデルを使用して、テクネチウム及びガリウムで標識したペプチドを、内皮バリアを通過する能力について試験した。各ペプチドについて、「組織培養インサート」で培養したｂＥｎｄ３細胞を、５μＣｉ・ｍＬ−１標識ペプチドとともに、異なるインキュベーション時間：１５分、５時間及び２４時間、インキュベートした。対照として、細胞を有さないモデル（無細胞対照）又は（フィルター）を使用し、細胞を有するモデル（ＢＢＢ）又は（細胞）と比較した。５時間インキュベーションについての結果を図２１Ａ〜２１Ｆに示す。
【０３１４】
図２１Ａ〜２１Ｆは、ＢＢＢモデル又は（対照として）無細胞を使用する、上記インビトロモデルとの５時間のインキュベーション後の頂部及び基底部における放射性同位元素テクネチウム標識ペプチドの活性パーセントを示すものであり、値は、２回の独立したアッセイから得た。放射性同位元素活性は、テクネチウム標識ペプチドを使用する５時間のインキュベーション後の移動が、バリアが存在する場合とそれがない場合とで異なったことを示した。これは、ペプチドの自由な通過に干渉するバリアを細胞が実際に形成したことをさらに確証する。さらに、結果は、有望な候補を示した。具体的には、ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３の各々について、細胞バリアの存在下でのわずか２０％と比較して、対照では５０％の過剰通過があった。ｐｅｐＨ２の移行は、対照においても、ＢＢＢモデルにおいても観察されなかった。ＰｅｐＲ’についての通過は、対照とＢＢＢモデルの両方において同様であった。
【０３１５】
１５分、５時間及び２４時間のインキュベーションについての結果を図２２Ａ〜２２Ｆに一緒に示す。すなわち、図２２Ａ〜２２Ｆは、ＢＢＢモデル又は（対照として）無細胞を使用する、上記インビトロモデルとの１５分、５時間及び２４時間のインキュベーション後の頂部及び基底部における放射性同位元素テクネチウム標識ペプチドの活性パーセントを示すものであり、値は、２回の独立したアッセイから得た。バリアの完全性を確証することはもちろんバリアを通過するペプチドを同定することになる差が、この場合もやはり観察された。具体的には、ｐｅｐＨ２は、２４時間後でさえ限られた移行を示し、バリアを通過したペプチドは９％に過ぎなかった。これは、上で述べたように、高い遮断能力を有するバリアが形成したことを確証する。とはいえ、ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３は、驚くべきことに、このバリアを越える有効な移行を示し、すなわち、２４時間後に基底部で約７０％放射活性を各々が示した。ｐｅｐＨ４及びｐｅｐＭも、良好な移行及び移動能力を示す（それぞれ、約６０％及び５０％を示す）。ｐｅｐＲ’は、バリアの通過に関してより大きく限定され、インサートの表面と強く相互作用し、回収困難であった。それ故、ｐｅｐＲ’をさらなる試験から除外した。
【０３１６】
ＢＢＢのモデルを試験することに加えて、取り込み試験を行って、候補ペプチドの内在化能力を判定した。ｂＥｎｄ３細胞を２４ウェルプレートで培養した。各時点で、細胞と相互作用していなかったペプチドを含有する培地を収集した。次のステップでは、細胞膜とより強く結合したペプチドを放出する酸性緩衝液で細胞を洗浄した（試料酸洗浄）。最後に、細胞を溶解して、内在化ペプチドを放出し、細胞内部の活性を定量した。結果を図２３Ａ〜２３Ｅに示すことにする。
【０３１７】
図２３Ａ〜２３Ｅは、ｂＥｎｄ３細胞との１５分、５時間及び２４時間のインキュベーション後の培地、洗浄用緩衝液（酸洗浄液）及び溶解物中の放射性同位元素テクネチウム標識ペプチドの活性パーセントを示すものであり、値は、２回の独立したアッセイから得た。結果は、ＢＢＢモデルを移行する良好な能力を有するペプチドが、細胞との低い相互作用も有することを示した。具体的には、ｐｅｐＨ１、ｐｅｐＨ３、ｐｅｐＨ４は、主としてインキュベーション培地中に残存した。ｐｅｐＨ２は、細胞と非常に相互作用して細胞に内在化することが観察され、溶解物中で４０％を超える放射活性を示した。ｐｅｐＭ’は、高い移動（約５０％）を示すばかりでなく、細胞内に内在化され、蓄積されるようにも見えた（溶解物中の放射活性約１３％）。
【０３１８】
これらの有望な結果は、驚くべきことに、ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３がＢＢＢ特異的送達ペプチドをもたらすことも立証する。表８は、次の通り、配列情報を提供するものである：
【０３１９】
【表８】
2018513670.tif 000010
【０３２０】
表９は、１５分、５時間及び２４時間のインキュベーション後の、テクネチウム及びガリウムで標識したペプチドについての、取り込み（内在化）及び細胞相互作用、並びにインビトロＢＢＢモデルを越える移行に関する結果を、放射性ペプチドの回収パーセントに基づいて要約するものである。この表は、ペプチドを収載するものであり、各ペプチドの名称、各々２５分、５時間及び２４時間のインキュベーション後の％ＢＢＢ移行、細胞相互作用％及び％内在化を提供する。
【０３２１】
【表９】
2018513670.tif 000011
【０３２２】
表９が示すように、移動の結果は、両方のタイプのマーキングに再現性があった。ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３は、両方とも、多い（約７０％）移動を示し、細胞との相互作用を殆ど示さなかったので、ＢＢＢ特異的送達ペプチドをもたらす。対照的に、ｐｅｐＨ２は、細胞と強く相互作用するようであり、少ない移動を示した一方で、ｐｅｐＨ４及びｐｅｐＭは、移動能力を有するばかりでなく、細胞と相互作用するようにも見えた。要約すると、このＢＢＢインビトロアッセイは、ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３の多い移行（２４時間で７０％を超える）及び少ない細胞相互作用／細胞への蓄積を立証した。しかし、ｐｅｐＨ２は、少ないＢＢＢ移行、並びに多い細胞相互作用及び細胞への内在化（４０％を超える）を提示した。さらに、これらの結果は、ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３が、ＢＥＣ内に少ししか捕捉されないばかりでなく、水性媒体への高い溶解度とＢＢＢを越える移行の向上も兼ね備えていることを立証した。
【０３２３】
ｄ．毒性：ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３の存在下での細胞生存率及びＢＢＢ完全性のアッセイ
選択ペプチドのＢＢＢ細胞に対する可能性のある毒性を試験するために、５×１０４個のｂＥｎｄ３細胞を９６ウェルプレートにおいて１００μＬ／ウェルで培養し、２４時間インキュベートした。その後、（０．１〜５０μＭの濃度で添加した）ｐｅｐＭ’を除いて、ペプチドを０．１〜１００μＭの濃度で添加した。生存率１００％を与える対照として、無血清培地を有するウェルを組み入れた。
【０３２４】
２４時間のインキュベーション後、細胞代謝活性を評定するための比色アッセイであるＭＴＴアッセイを行った。ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、２時間インキュベートした。この期間の後、溶液を除去し、ＤＭＳＯを添加して、形成された青紫色結晶を可溶化した。吸光度を５４０ｎｍで測定した。生存率パーセンテージ［（吸光度ペプチド処理細胞／吸光度未処理細胞）×１００］を計算し、ＩＣ５０値を３回の独立したアッセイから計算した。結果を図２４Ａ〜２４Ｅに示す。
【０３２５】
図２４Ａ〜２４Ｅが示すように、選択ペプチドは、細胞生存率に影響を与えず、具体的には、記載したアッセイを使用して観察可能な影響はなく、測定可能な影響もなかった。生存率の小さい減少がｐｅｐＨ２及びｐｅｐＭ’の各々で観察されたが、これは、実際には、ペプチドを希釈するために使用したＤＭＳＯ濃度に起因した（結果をＤＭＳＯ対照で得たものと比較することによって達した結論である）。
【０３２６】
細胞生存率及びペプチド毒性の判定に加えて、選択ペプチドの存在下でのバリア完全性を確認するためのアッセイを行った。ＢＢＢを通過しない（それぞれ、４ｋＤａ及び４０ｋＤａの分子量を有する）蛍光デキストランＦＤ４及びＦＤ４０を、上で説明したのと同様に使用した。３２６Ｄａの分子量を有する蛍光分子（ＦＩＴＣ）を対照として使用した（文献に基づいて、５００Ｄａ未満の分子量を有する分子は移動能力を有しうる）。
【０３２７】
ｂＥｎｄ３細胞を「組織培養インサート」において上で説明したように培養し、各々がおおよそ０．１μＭ及び１μＭの濃度の様々なペプチドとともに２４時間インキュベートした。すなわち、放射標識ペプチドを使用して、細胞を２４時間にわたって５μＣｉ・ｍＬ−１（おおよそ０．１μＭ）とともに、及びそれより１００倍高い濃度でインキュベートした。ｐｅｐＨ２及びｐｅｐＭ’は、可溶化にＤＭＳＯを必要とし、ペプチド／ＤＭＳＯ濃度が高いほど、結果として、誤差が大きく、細胞死が多かった。４０μＭ未満の濃度については、細胞死がなかった。値は、２回の独立したアッセイから得た。結果を図２５Ａ〜２５Ｃに示す。
【０３２８】
図２５Ａ−２５Ｃは、ＢＢＢ細胞を有さないフィルター（対照）を通過する、ｂＥｎｄ３バリアを通過する、及び異なるペプチドとプレインキュベートしたｂＥｎｄ３バリアを通過する、蛍光分子（ストック）の移動能力を示す。各々の蛍光分子は、細胞を使用する実験（ＢＢＢ）より対照（フィルター）実験での方が多い移行を示した。これにより、インビトロＢＢＢモデルアッセイが機能性であることが実証される。ＢＢＢ実験からの結果とＢＢＢ＋ペプチド実験からの結果の比較は、予想した通り、分子量が高いほど移動能力が低いことを示した。
【０３２９】
重要なこととして、異なるペプチドの存在下での頂端区画からの蛍光プローブ（ＦＩＴＣ、ＦＤ４及びＦＤ４０）の排除は、細胞バリアの開口部及び傍細胞への漏出が存在しないことを明らかに示す対照と同様であった。さらに、細胞生存率アッセイは、１００μＭのペプチドであっても、生細胞のパーセンテージが９０％より高いことを示した。したがって、生存率及びバリア完全性試験からの結果は、選択ペプチドが、驚くべきことに、毒性でないことを立証した。
【０３３０】
ｅ．ペプチドｐｅｐＨＩ及びｐｅｐＨ３の膜電位並びにｐｅｐＨ３のＫｐに対する効果
ペプチドｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３を膜モデルとの、具体的には１００ｎｍ単層小胞（「ＬＵＶ」）との、それらの相互作用について研究し、ｐｅｐＨ２を移動能力に関する陰性対照として組み入れた。異なる量の脂質膜成分、例えば、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＳ、ＰＯＰＧ及びコレステロール（ＣｈｏＩ）を有する、異なる脂質組成で、小胞を作製した。ＰＯＰＣは、生体膜において見出されるものと同様の流動特性を有する脂質である。ＰＯＰＣの存在下でコレステロールは流体膜に剛性を付与し、それによって真核生物の膜の二重層に存在することが公知の「脂質ラフト様プラットフォーム」の形成が可能になる。ＰＯＰＳ及びＰＯＰＧは、真核細胞及び細菌細胞にそれぞれ存在する負荷電脂質である。上で述べたように、大多数の真核細胞はそれらの膜の内部に負荷電脂質を有するが、ＢＢＢからの内皮細胞は、他の内皮からの細胞と比較して高い負電荷をもつ表面を有する。この負電荷は、その負荷電脂質にばかりでなく、より高いグリコシル化レベルにも起因する。いずれにせよ、ＰＯＰＳ及びＰＯＰＧの負電荷によって、負荷電ＢＢＢを模倣するモデルが得られ、それによって、選択ペプチドとそれらの静電相互作用の分析が可能になる。
【０３３１】
異なる脂質組成を試験した：ＰＯＰＣ，ＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ（４：１）、ＰＯＰＣ：ＰＯＰＧ（４：１）、ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ（２：１）、ＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ（３：２）、及びＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ（１：４）。結果を図２６Ａ〜２６Ｃに示す。
【０３３２】
図２６Ａ〜２６Ｃは、プローブ、ジ−８ＡＮＥＰＰＳを使用して膜の両極性電位の乱れを評価するアッセイで得た結果を示す。ｐｅｐＨ１は、微分スペクトルの変化を示さず、したがって、試験した様々な膜モデルにおいて相互作用を提示しなかった。ｐｅｐＨ３は、膜との、特に、ＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ（１：４）などの負荷電膜との、相互作用を示す、スペクトルの変化を示した。最後に、ｐｅｐＨ２は、試験した様々な膜モデルとの高い相互作用を示した。これらの結果は、ｐｅｐＨ２が高い内在化パーセンテージ並びにｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３と比較して高い細胞相互作用を示した、ＢＢＢモデルを使用した結果と、よく相関した。
【０３３３】
ｐｅｐＨ３については、このペプチドが元々トリプトファンを提示し、したがって、この脂質組成物をうまく投与することによってｐｅｐＨ３の親和定数を決定することができたので、「分配係数」又は「親和定数」も決定した。結果を図２７及び表１０に示す。
【０３３４】
図２７及び表１０が示すように、このアッセイは、ＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ（１：４）の親和定数が、研究した他の脂質組成についてのものより（例えば、Ｋｐ＝３２４を有するＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ（４：１）と比較して）５倍高い（Ｋｐ＝１，５５８）ので、ＰＯＰＳを多く含む膜モデルとｐｅｐＨ３のより高い相互作用を確証した。ｐｅｐＨ２及びｐｅｐＨ３は、疎水性（Ｐｏ／ｗ）が最も高いペプチドである。加えて、ｐｅｐＨ２は、膜モデルの様々な脂質組成物と相互作用するが、ｐｅｐＨ３は、ＰＳを多く含む膜（負荷電リン脂質）としか相互作用しない。得られた蛍光スペクトルによって、ｐｅｐＨ１は、研究した脂質膜と相互作用せず、様々な膜モデルの双極子ポテンシャルの変化を示さなかったが、その一方でｐｅｐＨ２は、すべての膜モデルとのより高い相互作用を示し、ｐｅｐＨ３は、ＰＳなどの負電荷を多く含む脂質モデルに対して、より高い相互作用を示すことが確認された。
【０３３５】
【表１０】
2018513670.tif 000012
【０３３６】
これらの研究、例えば、異なる細胞区画についての特異的マーカー又は細胞阻害剤も使用する研究は、これらのペプチドについての移動メカニズムの理解も促進した。
【０３３７】
ｆ．ペプチドｐｅｐＨＩ及びｐｅｐＨ３の生体内分布及び安定性についてのインビボ試験
ＢＢＢを通過する能力をインビボで評価するために、選択ペプチド、ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３をＣＤ１マウスにおいて生体内分布について分析した。これらのペプチドを８．５×１０−５Ｍの最終濃度のテクネチウムで標識し、ＰＢＳで希釈した。ＣＤ１マウスに注射した（ｉｖ注射、尾静脈）。インキュベーションの５及び６０分後に頸椎脱臼によってマウスを屠殺した。所望の組織を切断し、洗浄して過剰な血液を除去し、計量し、放射活性について測定した。異なるペプチドのテクネチウム放射活性を異なる器官について測定した。
【０３３８】
最初の結果を表１１に示す。表中の「％Ｉ．Ａ．」は、「％注射された活性」、すなわち、最初に注射した全放射活性量と比較した、所与の器官において測定された放射活性量を指す。
【０３３９】
【表１１】
2018513670.tif 000013
【０３４０】
表１１が示すように、マウスに１０μｇのｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３を注射したとき、脳における放射活性は、０．１１〜０．１５％であると判定された。腎臓及び肝臓などの排出器官への蓄積を考えれば、６０分後にはペプチドの大半が排出されたことが認められた。脳で収集されたパーセンテージは、試験した用量の約０．１５％であり、したがって、選択ペプチドの驚くほどよい移行パーセンテージが得られた（Rosler et al. Neuropharmacology (2011) 61:1413-1418、及びYu et al. Sci Transl Med (2011) 84(3):84ra44と比較されたい）。
【０３４１】
各ペプチドのより高い用量、具体的には１００倍増加を用いて、及び陰性対照としてｐｅｐＨ２を使用して、並びに２分及び６０分間インキュベーションして、生体内分布研究を反復した。組織／器官１グラム当たりの注射放射性ペプチド活性のパーセンテージで組織生体内分布プロファイルを測定した。結果を表１２に提示する。
【０３４２】
【表１２】
2018513670.tif 000014
【０３４３】
１４０μｇのペプチドは、次の通りのモル量に相当する：ｐｅｐＨ１について１４０μｇは１．１５ｍＭに等しく、ｐｅｐＨ２について１４０μｇは０．８４ｍＭに等しく、ｐｅｐＨ３について１４０μｇは１．６７ｍＭに等しく、及びｐｅｐＨ４について１４０μｇは０．５２４ｍＭに等しい。表１２が示すように、ペプチドｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３については１４０μｇに並びにｐｅｐＨ２については８０μｇに用量を増加させると、脳内のｐｅｐＨ３に起因する放射活性は倍増（０．３１％）したが、ｐｅｐＨ１に起因する％放射活性の増加はなかった。これらのペプチド（ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３）について、放射活性は、排出器官、例えば、腎臓及び肝臓に蓄積したが、６０分までにかなりの減少が観察された。これは、これらのペプチドの大部分がその時間までに排出されたことを示す。
【０３４４】
ｐｅｐＨ２は、６０分後に肝臓内の蓄積増加を示すばかりでなく、排出のための器官に加えて肺などの他の器官にも蓄積した。脳内の放射活性レベルに関して、ｐｅｐＨ２及びｐｅｐＨ３は、両方とも、０．３７％を示したが、ｐｅｐＨ２は６０分後に０．２％を示した。さらに、上で述べたように、ｐｅｐＨ２が非常に疎水性であることから予想された通り、６０分後に排出されたｐｅｐＨ２（１２．７％）は、ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３（それぞれ、３２．７％及び３６％）と比較して少なかった。
【０３４５】
要約すると、ｐｅｐＨ１、ｐｅｐＨ２及びｐｅｐＨ３は、迅速な脳への取り込み（２分後）を実証した。ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３については、脳への取り込み後、迅速に脳から洗い出され、相伴って殆どの器官から全放射活性が迅速に除去された。放射性ペプチドは、血液、肝臓、腎臓及びよく洗浄される器官から迅速に排除されて、腸に蓄積する。１時間の時点で、注射活性の重要な画分が排出された（３０％を超える）。特に、ｐｅｐＨ２は、脳によって取り込まれたが、脳からの排出は、より緩徐であった。肝臓、脾臓及び肺への蓄積も観察された。これらの結果は、ｐｅｐＨ２の高い疎水性と一致した。理論によって拘束されるものではないが、このデータは、ＢＢＢ移行のＡＭＴメカニズムと一致した。
【０３４６】
最後に、ペプチドの安定性を判定した。尿及び血液を死後の動物から取り出し、濾過し、ＲＴ−ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ分析を行って、投与５及び６０分後の血液及び尿中でのｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３ペプチドの安定性を、それぞれの元々の調製物と比較して評定した。結果を図２８Ａ〜２８Ｄに示す。
【０３４７】
図２８Ａ〜２８Ｄは、ｐｅｐＨ１及びｐｅｐＨ３についての動物への注射前のその元々の調製物中の、そしてその後、注射から５及び６０分後の、血液及び尿中の各々のプロファイルを示す。結果は、それらのペプチドが血液及び尿中で驚くほど安定しているが、より短い滞留時間を有する新たな分子種が６０分後に尿中に現れることを証明した。
【０３４８】
要約すると、インビトロ及びインビボでの結果は、選択ＤＥＮ２ＣペプチドがＢＢＢを効率的に通過することを示す。特に、上で述べたように、これらの結果は、驚くべきことに、ｐｅｐＨ３が脳に浸透し、血液循環に戻って排出されることを実証した。したがって、ｐｅｐＨ３を、文献（Muruganandam, et al. (2002) FASEB J, 16(2): 240-241、及びAbulrob, et al. (2005) J Neurochem 95(4):1201-1214）に記載されている他の分子より多い又はそのような分子に匹敵する脳への送達を示すとともに、脳に侵入でき、脳から退出できることはもちろん、排出器官に加えて他の臓器に蓄積もしないという驚くべき利点を示す、例示的な送達ペプチドであると同定した。実際、脳内のｐｅｐＨ３のパーセンテージは、非常に少数の公知の「高性能」ＢＢＢ移行ペプチドに匹敵した。例えば、他の放射標識ペプチド、例えば、ＴＡＴ、ペネトラチン、ｓｙｎＢ１及びその他のものの脳への取り込み率は、組織１グラム当たりたった０．２〜０．９％ＩＤの範囲である（Sarko, et al., Mol Pharm (2010) 7(6):2224-2231）。ｐｅｐＨ３を、上に記載した例示的な抗ＢＡＰ４２オリゴマーｓｄＡｂへの結合のために選択した。
【実施例３】
【０３４９】
抗非フィブリルＢＡＰ４２  ｓｄＡｂ及びＢＢＢ特異的送達ペプチドの構築
アルツハイマー及び関連障害を治療するための治療薬のバイオアベイラビリティを増加させるために、所望の送達ペプチドをＢＡＰ４２オリゴマーに特異的な選択ｓｄＡｂとコンジュゲートさせることによってコンストラクトを調製した。この方法は、次の５段階を含んだ：（ａ）被検ｓｄＡｂを有する送達ペプチドをテストクローニングする段階、及び（ｂ）それらの発現を判定する段階、続いて（ｃ）抗体−ペプチドコンストラクトを調製する段階、（ｄ）ＢＡＰ４２凝集を妨げるそれらの能力を判定する段階、そしてその後（ｅ）それらのインビボでの生体内分布及びＢＢＢ通過を分析する段階。
【０３５０】
ａ．被検ｓｄＡｂを有する選択送達ペプチドのテストクローニング
安定性（例えば、良好な発現レベル、及び発現したときの可溶性）及び良好な活性（例えば、低い毒性での有望なＢＢＢ特異的通過）の点で有望な融合コンストラクトを選択するためにテストクローニングを行った。具体的には、ｐｅｐＨ１、ｐｅｐＨ２、ｐｅｐＨ３及びｐｅｐＭ’のテストクローニングを行い、ここでは各ペプチドを、最終抗体−ペプチドコンストラクトを模倣するように無関係の抗体と融合させた。
【０３５１】
ｐｅｐＨ２を移動の陰性対照として使用した。使用した無関係の抗体は、非常に安定しているｓｄＡｂであって、最終抗体−ペプチド生成物を模倣するのに役立つｓｄＡｂである。Ｎ末端、Ｃ末端又は両方に送達ペプチドを有する二重特異性抗体のような形式を含む、様々な形式でコンジュゲーションを行った。ヒスチジンタグ、ＨＡ及びsfil部位を含む被検ｓｄＡｂのＮ又はＣ末端のどちらかに、リンカーを使用してｐｅｐＨ１、ｐｅｐＨ２、ｐｅｐＨ３又はｐｅｐＭ’（「ｐｅｐＤＥＮ」）を結合させた。
【０３５２】
ｂ．被検抗体−ペプチドコンストラクトの発現
抗体−ペプチドコンストラクトをＰＣＲによって増幅し、次いで精製し、その後、発現ベクター、すなわち発現ベクターＴ７及びｐＥＴ２１に挿入し、シークエンシングによってキメラを確認した。その後、それらのキメラを使用して、細菌細胞、具体的には細菌株ＢＬ２１を形質転換させた。ＢＬ２１の形質転換によって幾つかのコロニーが産生された。それらのコロニーをＰＣＲによって「スクリーニング」して、所望のクローンを同定した。同定された所望のクローンを、ＩＰＴＧ又は自動誘導培地を使用して発現させた。
【０３５３】
クマシーゲルの結果は、ｓｄＡｂ−ｐｅｐＨが、ｓｄＡｂのＣ末端にペプチドを有するコンストラクトからの特に高い発現を示すばかりでなく、他のペプチドコンストラクトと比較して高レベルで及び可溶性の高い生成物として発現することも立証した。
【０３５４】
これらの結果は、生体内分布及び安定性／発現分析からの結果とともに、送達ペプチドとしてのｐｅｐＨ３の、例えば抗オリゴマーＢＡＰ４２  ｓｄＡｂを脳に送達する際の使用に対する、有用性を確証する。次に、ｐｅｐＨ３を、下で説明するように本発明の抗オリゴマーＢＡＰ４２  ｓｄＡｂにコンジュゲートさせた。
【０３５５】
ｃ．抗体−ペプチドコンストラクトの調製
下の表１３に要約する通り、異なる抗体分子及び抗体−ペプチドコンストラクトをクローニングした。
【０３５６】
【表１３】
2018513670.tif 000015
【０３５７】
表１３が示すように、ＢＢＢ移動能力を示すｐｅｐＨ３とともにさらなるコンストラクトを使用した。ＢＢＢ移動の陽性対照としてＦＣ５抗体をクローニングし、ＢＡＰへの結合の陽性対照としてＢＡＰに対する抗体（「Ａｂｘ」）をクローニングし、陰性対照として無関係の抗体（「ＰＭＰ６Ａ６」）もクローニングした。ＦＣ５は、ヒト脳の内皮細胞に対するファージディスプレイによって開発されたものであり、ＢＢＢ上の受容体、特に、グリコシル化管腔ＢＥＣタンパク質（Ｃｄｃ５０Ａ）に結合することができる、文献に記載されているｓｄＡｂである（例えば、Muruganandam, et al. (2002) FASEB J, 16(2): 240-241、及びAbulrob, et al. (2005) J Neurochem 95(4):1201-1214を参照されたい）。Ａｂｘは、ＢＡＰポリペプチドに対するナノボディである（例えば、Lauwereys, et al.の米国特許第２００８／０１０７６０１号明細書を参照されたい）。ＰＭＰ６Ａ６もナノボディであって、血清アルブミンに結合するものである（例えば、Dombrecht, et al.の米国特許第２０１４／０２２８５４６号明細書を参照されたい）。
【０３５８】
抗体遺伝子に依存して、最終コンストラクトをｐＥＴ２１ａ、ｐＥＴ２８ａのどちらかに、又はｐＴ７ベクター内にクローニングした。クローニング後、これらのコンストラクトをシークエンシングし、さらなる特性解析のために発現させた。
【０３５９】
ｄ．ＢＡＰ４２凝集を妨げる点での抗体−ペプチドコンストラクトの効果
産生し、精製したら、コンストラクトの免疫特異性も測定し、ペプチドと融合していない対応するｓｄＡｂのものと同様であることを確認した。
【０３６０】
抗オリゴマーを、ＢＡＰ４２の凝集を阻害するそれらの能力についても試験した。このアッセイは、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）を使用して行った。チオフラビンＴは、上で説明したように、ＢＡＰ４２のフィブリル形態に特有の、ベータシートを多く含む構造を認識し、したがって、凝集を阻害するｓｄＡｂの能力を評定することができる。具体的には、阻害される凝集が多いほど、ＴｈＴによって放出されるシグナルは小さい。２つの比率、すなわち、１：５（ＢＡＰ４２分子５個ごとに１個のｓｄＡｂ分子）及び１：２０（ＢＡＰ４２分子２０個ごとに１個のｓｄＡｂ分子）を試験した。結果を図２９Ａ〜２９Ｂに示す。
【０３６１】
図２９Ａ〜２９Ｂは、ペプチドと融合している又はしていない本発明のｓｄＡｂが実際にフィブリル化を防止したのに対して、ＢＡＰ４２に特異的でない抗体（例えば、ＦＣ５並びに他の関連のない単一軽鎖可変ドメイン抗体、ＶＬ１８及びＶＬ２１８）がフィブリル化を阻害しない、又はフィブリル化を促進することさえあることを示す。
【０３６２】
ｅ．抗体−ペプチドコンストラクトの生体内分布及びＢＢＢ通過
異なる抗体−ペプチドコンストラクトを生体内分布アッセイに使用し、結果を、それぞれのＤＥＮ２Ｃペプチド（化学的に合成したｐｅｐＨ１、ｐｅｐＨ２、ｐｅｐＨ３及びｐｅｐＭ’）の生体内分布と比較した。選択抗体分子（ｓｄＡｂ）は、インビトロでＢＡＰオリゴマーの凝集を有効に阻害するばかりでなく、ＢＡＰ４２への強い結合も示すものであった。発現及び精製後、ｓｄＡｂ及びｓｄＡｂ−ペプチドコンストラクトを、前に説明したように、テクネチウム（９９Ｔｃ）とコンジュゲートさせて生体内分布アッセイを行った。結果を下の表１４〜１６に示す。
【０３６３】
表１４〜１６は、異なる抗ＢＡＰ４２  ｓｄＡｂ及び異なるペプチド（「ｐｅｐＨ３」）とそれらのコンストラクトの生体内分布を示す。表１４は、「＃２」及び「＃２−ｐｅｐＨ３」のキメラについての生体内分布結果を示し、表１５は、「＃２０」及び「＃２０−ｐｅｐＨ３」についての分布結果を示し、表１６は、「＃２７ｉｎ」及び「＃２７ｉｎ−ｐｅｐＨ３」についての分布結果を示す。
【０３６４】
【表１４】
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【０３６５】
【表１５】
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【０３６６】
【表１６】
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【０３６７】
これらの結果は、例示的なコンストラクトの生体内分布プロファイルの驚くべき向上を示す。表１４は、例えば、「＃２」ｓｄＡｂの送達ペプチドへの結合が、２分以内に脳内のその存在を約３倍増加させ、１時間後に脳からの排出における約２倍の遅延しか示さなかったことを示す。すなわち、約３倍の抗体が２分で脳に到達したが、１時間後に残存した抗体は約２倍に過ぎなかった。さらにいっそう驚くべきことに、表１６は、「＃２７ｉｎ」ｓｄＡｂの送達ペプチドへの結合は、２分以内に脳にその存在を約６倍増加させ、１時間後に脳からの排出における約２倍の遅延しか示さなかったことを示す。すなわち、約６倍が２分で脳に到達したが、１時間後に残存したのは約２倍に過ぎなかった。下の実施例で説明するような、アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルにおいてインビボで有効性を確認するための予備研究に、選択抗体を使用した。
【実施例４】
【０３６８】
候補化合物の前臨床有効性
選択ＢＢＢ特異的送達ペプチドにコンジュゲーションされている及びされていない選択抗ＢＡＰ４２  ｓｄＡｂを使用して、５ｘＦＡＤトランスジェニックマウスにおいてインビボで試験を行った。動物の脳内のベータアミロイドプラークに対する効果についてのインビボでの画像化及び観察を用いて、結果を評定した。具体的には、以下のように識別した、以下の３つの製剤を動物に注射した：
・「ｓｄＡｂ＃２」を含む製剤に対応する化合物「Ａ」、
・「ｓｄＡｂ＃２−ｐｅｐ」を含む製剤に対応する化合物「Ｂ」、及び
・活性薬剤を有さないビヒクルに対応する化合物「Ｃ」。
【０３６９】
投与１回当たり３７５μｇの活性薬剤を使用して、週３回、月曜、水曜及び金曜ごとに各化合物を被験動物にｉｐ注射した。動物の屠殺後、免疫組織化学的検査及び画像化を行った。具体的には、動物を屠殺し、脳の海馬及び皮質領域を切除し、プラークの存在を示す化合物であるチアジンレッドで染色した。結果を図３０Ａ〜３０Ｂ、表１７、及び図３１Ａ〜３１Ｄに示す。
【０３７０】
図３０Ａ〜３０Ｂは、上で識別した通りの候補「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｃ」で治療した５ｘＦＡＤトランスジェニックマウスからの、チアジンレッドでの海馬（図３０Ａ）及び皮質（図３０Ｂ）染色後の結果を示す。対照として使用した化合物Ｃ（１００％）に測定値を正規化した。化合物Ａ及びＢは、対照と比較してプラーク数を有効に示した。これは、抗体−ペプチドコンストラクト「ｓｄＡｂ＃２−ｐｅｐ」に対応する化合物Ｂについて特にそうである。表１７は、チアジンレッドによって同定されたプラークの絶対及び相対数を提供する。表３１Ａ〜３１Ｄは、これらの結果をさらに立証するものであり、海馬における正規化プラーク負荷量（図３１Ａ）及び１ｍｍ当たりのプラーク数（図３１Ｂ）、並びに皮質における正規化プラーク負荷量（図３１Ｃ）及び１ｍｍ当たりのプラーク数（図３１Ｄ）を示す。
【０３７１】
【表１７】
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【０３７２】
実施例で使用したさらなる抗体分子及び抗体−ペプチドコンストラクトを下の表１８、表１９及び表２０に要約する。
【０３７３】
【表１８】
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【０３７４】
【表１９】
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2018513670.tif 000023
【０３７５】
【表２０】
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【実施例５】
【０３７６】
ＡＤを予測するバイオマーカーとしての候補化合物の診断上の使用
以下の実施例は、ＢＢＢ特異的送達ペプチドにコンジュゲーションしている及びしていない、本発明の抗ＢＡＰ４２  ｓｄＡｂの、（ａ）インビトロ及び（ｂ）インビボでの診断における使用を実証する。
【０３７７】
ａ．ＡＤ患者の脳脊髄液を使用するＡＤのインビトロでの診断
ＡＤを診断するために、脳脊髄液の試料をアルツハイマー病の異なる病期の患者から、倫理的手順に従って収集した。具体的には、認知愁訴、記憶の問題、リスボンのHospital Santa Mariaで適切に同定された認知症を有する患者からＣＳＦ試料を得た。病歴を評価するための標準プロトコル、並びに神経学的検査、検査室検査及び脳画像化（ＣＴスキャン又はＭＲＩスキャン）、及びまたbattery of Lisbon for Evaluation of Dementia（ＢＬＡＤ）での神経生理学的検査に患者を付した。ＭＣＩ（軽度認知障害）群の患者の組み入れは、European Consortium on Alzheimer's disease（ＥＡＤＣ）及びAmerican Psychiatric Association（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ、２０００）の基準に基づいた。
【０３７８】
対照試料も収集した。試料収集は、Department of Neurology of the Hospital de Santa Mariaの標準手順に従って行った。この研究は、Ethics Committee of the Hospital de Santa Mariaによって承認され、患者は彼らのインフォームドコンセントに同意した。
【０３７９】
少なくとも８６名の患者からのＣＳＦ試料を収集し、これらの患者は、６２．２±９．０歳であり、４５名が男性であり、４３名が女性であり、４１名は、ＭＣＩを有すると診断され、４５名は、認知症と診断された（その大部分がアルツハイマー病に関連していた）。
【０３８０】
収集した試料を、本発明の抗ＢＡＰ４２  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ）に、又は本発明のｓｄＡｂとＢＢＢ特異的送達ペプチドのコンストラクト（ｓｄＡｂ−ｐｅｐ）、特に、上の表１３に提示したコンストラクトに曝露する。具体的には、ｓｄＡｂ及び／又はｓｄＡｂ−ｐｅｐをＣＭ５チップに固定化し、異なるＣＳＦ試料をそのチップに接触させ、ＢＩＡｃｏｒｅを使用して結合を検出する。接続すると、登録されたシグナルが、対応するｓｄＡｂ又はｓｄＡｂ−ｐｅｐをＡＤのバイオマーカーとして同定することはもちろん、存在するＢＡＰ４２オリゴマー／モノマーの量を定量もする。これらの異なるＣＳＦ試料中のＢＡＰ４２オリゴマーを認識し、該ＢＡＰ４２オリゴマーに免疫特異的に結合する、ある特定のｓｄＡｂ及びｓｄＡｂ−ｐｅｐは、認識とアルツハイマーの病期との相関関係も示し、したがって、ＡＤの特定の病期のためのバイオマーカー、特に、早期臨床診断においてアルツハイマーの早期及び／又は軽度認知障害を伴う病期を特定するバイオマーカーになる。
【０３８１】
ｂ．標識ｓｄＡｂ、及びＢＢＢ特異的ペプチドとそれらのコンストラクトを使用する、インビボでの画像化
選択ｓｄＡｂ及びｓｄＡｂ−ｐｅｐを画像化のために９９Ｔｃ／６７Ｇａでマーキングする。このために、インビトロでＢＡＰ４２を認識し、ＢＢＢを移行することができるが、形成されたベータアミロイドプラークの解凝集を明らかに示さない、ｓｄＡｂ／ｓｄＡｂ−ｐｅｐを選択する。画像化のために、必ずしも解凝集を生じさせる必要はないが、ＢＡＰ４２オリゴマーに結合して脳内のオリゴマーの存在を示す画像をもたらす、ｓｄＡｂを選択する。そのようなｓｄＡｂ／ｓｄＡｂ−ｐｅｐは、ＡＤに特有の「老人斑」の画像化によるインビボでの診断のためのバイオマーカーになる。
【０３８２】
具体的には、ｓｄＡｂ＃２−ｐｅｐを、上で説明したように９９Ｔｃで標識した。２匹の健常なマウスに標識コンストラクトを注射し、注射の２分又は６０分後に屠殺し、その動物に対して単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ，Single-Photon Emission Computed Tomography）を行った。結果を図３２Ａ〜３２Ｂに示す。
【０３８３】
図３２Ａが示すように、２分後、脳において、並びに膀胱及び腎臓のような器官において、シグナルが検出された。図３２Ｂが示すように、６０分後、脳からのシグナルはもはや観察されなかったが、腎臓でのシグナルは持続する。これらの結果は、ｓｄＡｂコンストラクトが動物の脳に実際に到達し、その後、脳から除去されたことを証明する。注射６０分後に対応する画像において尾で検出されたシグナルは正常であり、使用した老齢マウスにおける注射部位に相当した。
【０３８４】
本明細書に引用した特許出願及び出版物を含むすべての参考文献は、個々の出版物又は特許又は特許出願が具体的に及び個々に、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれていると示されている場合と同程度に、それら全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれている。当業者には明白であるであろうが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく本発明の多くの修飾形態及び変形形態を行うことができる。本明細書に記載する特定の実施形態は、例として提供するものに過ぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲の条項、及びそのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲によってのみ限定されるものとする。
【図１】
2018513670.tif 000025
【図２】
2018513670.tif 000026
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
2018513670.tif 000034
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018513670.tif 000043
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
2018513670.tif 000049
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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