(57)【要約】  本発明は、癌、特に乳癌の診断法及び処置法に関する。特に、本発明は、ｉ）被験者から得られた腫瘍試料中のｈＧＳＴＡ１の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）ｈＧＳＴＡ１の発現レベルがその予め決定された基準値よりも低い場合には、被験者は癌を患っていると結論付ける工程を含む、被験者における癌を診断する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）被験者から得られた腫瘍試料中のｈＧＳＴＡ１の発現レベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較すること、及びｉｉｉ）ｈＧＳＴＡ１の発現レベルがその予め決定された基準値よりも低い場合には、被験者は癌を患っていると結論付けることの工程を含む、被験者における癌を診断する方法。
【請求項２】
ｉ）被験者から得られた腫瘍試料中のｈＧＳＴＡ１の発現レベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較すること、及びｉｉｉ）ｈＧＳＴＡ１の発現レベルがその予め決定された基準値よりも高い場合には、被験者は長い生存時間を有するであろうと結論付けるか、又は、ｈＧＳＴＡ１の発現レベルがその予め決定された基準値よりも低い場合には、被験者は短い生存時間を有するであろうと結論付けることの工程を含む、癌を患っている被験者の生存時間を決定するための方法。
【請求項３】
ｉ）被験者から得られた腫瘍試料中のｈＧＳＴＡ１の発現レベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較すること、及びｉｉｉ）ｈＧＳＴＡ１の発現レベルがその予め決定された基準値よりも低い場合には、被験者はデンドロゲニンＡに応答するであろうと結論付ける、癌を患っている被験者がデンドロゲニンＡに応答するかどうかを決定するための方法。
【請求項４】
癌が、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系の癌、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、食道癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭癌及び下咽頭癌、肝臓癌、肺癌、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔癌及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌及び中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、膣癌、外陰部癌、及び子宮癌からなる群より選択される、請求項１、２又は３の方法。
【請求項５】
癌が乳癌である、請求項４の方法。
【請求項６】
被験者が癌を患っていると決定された場合、被験者は、ｈＧＳＴＡ１をコードしている核酸、化学療法剤、放射線療法剤、又は免疫療法剤を投与される、請求項１の方法。
【請求項７】
被験者がデンドロゲニンＡに応答するであろうと決定された場合、被験者は該薬物を投与される、請求項３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、癌、特に乳癌の診断法及び処置法に関する。
【０００２】
発明の背景：
いくつかの近年の研究は、コレステロールの代謝が癌と動力学的に関連していることを示した。さらに、腫瘍促進（ＴＰ）特性を有するコレステロール代謝物、例えば２７−ヒドロキシコレステロール１、２、コレステリル脂肪酸エステル３〜５、及びコレスタン−３β，５α，６β−トリオールの代謝物６、７が記載され、癌発生におけるコレステロールの役割を支持する。重要なことには、腫瘍のプロモーションにおけるコレステロールの独特で積極的な関与を支持する分子レベルでの議論は、腫瘍サプレッサー（ＴＳ）特性を有するコレステロール代謝物であるデンドロゲニンＡ（ＤＤＡ）の発見によって相殺された８〜１０。一方で、細胞へのコレステロール又はそのＴＰ代謝物の過剰添加は腫瘍の発生に有利に働き得、抗コレステロール薬の使用は癌から防御し得ることを示唆するだろう。他方で、コレステロールの新規生合成が抗コレステロール薬によって遮断されるならば、ＴＳの存在は、癌発生のリスク因子の導入を示唆するだろう。
【０００３】
ＤＤＡは、インビトロ及びインビボでnMの用量で腫瘍細胞の再分化を制御し１０、１１、かつμMの濃度で黒色腫８、９及び急性骨髄性白血病細胞においてオートファジー性細胞死を誘発する、ＬＸＲの新規な内因性モジュレーターである。ＤＤＡは、nM濃度で神経を起源とする多能性の正常な前駆細胞の分化を誘発し、このことは細胞運命におけるこの分子の活発な役割を示唆する１２。逆の特性を有するコレステロール代謝物の同定は、これらのＴＰレベルとＴＳレベルとの間の可能な比を示唆し、ＴＰに傾くようにこの比を改変することにより癌は促進され得るか、又は代替的にはＴＳに傾くように比を増加させれば癌から防御され得る。したがって、ＤＤＡが合成される機序を同定することが重要である。ＤＤＡ（５α−ヒドロキシ−６β−［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチルアミン］−コレスタン−３β−オール）は、哺乳動物において現在までに発見された最初のステロイド系アルカロイドである。ＤＤＡは、５，６α−エポキシ−コレステロール（５，６α−ＥＣ）とヒスタミン（ＨＡ）のコンジュゲーションから得られた。化学合成及び生化学合成は触媒又は酵素を必要としたことが示された。さらに、大半のエポキシドを有する化学物質とは対照的に、５，６α−ＥＣは、アミンなどの求核性官能基と自発的に反応しなかった１１、１３。哺乳動物組織ホモジネートは５，６α−ＥＣ及びＨＡからＤＤＡを産生したが、ホモジネートを熱又はプロテアーゼによって変性させた場合にはこの転換は失われたことが示された：これはＤＤＡ生合成に対してタンパク質性酵素が必要とされる証拠である。したがって、ＤＤＡシンターゼ（ＤＤＡＳ）の同定は重要である。なぜなら、１）それは５，６α−ＥＣの新型のヒスタミン化酵素反応を触媒するからである；２）乳癌におけるＤＤＡ含量の欠乏がＤＤＡＳの欠乏に起因するかそうではないかを解明することを助けるだろうからである；３）乳房内のＤＤＡ産生細胞の同定を可能とするであろうからである。
【０００４】
発明の要約：
本発明は、癌、特に乳癌の診断法及び処置法に関する。特に、本発明は特許請求の範囲によって定義される。
【０００５】
発明の詳細な説明：
デンドロゲニンＡ（ＤＤＡ）は、腫瘍抑制特性を有する新規な哺乳動物の内因性コレステロール代謝物である。ＤＤＡは、５，６α−エポキシ−コレステロール（５，６α−ＥＣ）のヒスタミン化を触媒する依然として不明な酵素によって生成される。本発明者らはここで、ＤＤＡシンターゼ（ＤＤＡＳ）がヒトグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＡ１（ｈＧＳＴＡ１）であることを報告する。ｈＧＳＴＡ１の触媒効率は、その生体異物の基質のグルタチオンに対するよりも、５，６α−ＥＣ及びヒスタミン化に対する方がより高く、このことは、その主な機能がＤＤＡＳ活性であることを示唆する。乳房において、ＤＤＡＳは、乳管及び小葉由来の上皮細胞の細胞質において選択的に発現されている。ＤＤＡＳは、管腔細胞型乳癌の起始部の細胞に専ら見られた。これとは対照的に、乳腺腫瘍株及び乳癌細胞株では、ＤＤＡＳの発現及びＤＤＡの産生は劇的に減少していた。この研究はｈＧＳＴＡ１としてのＤＤＡＳの同定を確立し、その発現の欠如は、管腔細胞型乳癌に至る発癌過程に関連していた。
【０００６】
本発明の診断法：
したがって、本発明の目的は、ｉ）被験者から得られた腫瘍試料中のｈＧＳＴＡ１の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）ｈＧＳＴＡ１の発現レベルがその予め決定された基準値よりも低い場合には、被験者は癌を患っていると結論付ける工程を含む、被験者における癌の診断法に関する。
【０００７】
典型的には、癌は、胆管癌（例えば、末梢癌、遠位胆管癌、肝内胆管癌）、膀胱癌、骨癌（例えば、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳及び中枢神経系の癌（例えば、髄膜腫、星細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば、乳管内上皮内癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、血管小胞性リンパ節過形成症）、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮体癌（例えば、子宮内膜腺癌、腺類癌、乳頭漿液性腺癌、明細胞）、食道癌、胆嚢癌（粘液性腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛癌、破壊性絨毛腺癌）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、咽頭癌及び下咽頭癌、肝臓癌（例えば、血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔癌及び副鼻腔癌（例えば、感覚神経芽腫、正中肉芽腫）、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌及び中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫、非黒色腫皮膚癌）、胃癌、精巣癌（例えばセミノーマ、非セミノーマ胚細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例えば、濾胞性癌、未分化癌、低分化癌、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫）、膣癌、外陰部癌、及び子宮癌（例えば、子宮平滑筋肉腫）からなる群より選択され得る。いくつかの実施態様では、癌は乳癌である。
【０００８】
「腫瘍試料」という用語は、被験者から得られた任意の組織腫瘍試料を意味する。該組織試料は、インビトロでの評価の目的のために得られる。試料は、新鮮、凍結、固定（例えばホルマリンで固定）、又は包埋（例えばパラフィンに包埋）であり得る。いくつかの実施態様では、腫瘍試料は、被験者から切除された腫瘍から得ることができる。いくつかの実施態様では、腫瘍試料は、被験者の原発性腫瘍で実施されるか、又は被験者の原発性腫瘍から遠い転移性試料で実施された生検材料から得ることができる。例えば、結腸直腸癌に冒された被験者の腸で実施された内視鏡生検材料。
【０００９】
本明細書において使用する「ｈＧＳＴＡ１」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトグルタチオンＳ−トランスフェラーゼα１を指す。ｈＧＳＴＡ１に対する例示的なアミノ酸配列は配列番号１である。ｈＧＳＴＡ１に対する例示的な核酸配列は配列番号２である。該用語はまた、ｈＧＳＴＡ１変異体、例えば天然のｈＧＳＴＡ１に対して実質的に相同なタンパク質、すなわち、１つ以上の天然又は非天然のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換を有するタンパク質（例えばｈＧＳＴＡ１誘導体、相同体、及び断片）を含む。ｈＧＳＴＡ１変異体のアミノ酸配列は、天然のｈＧＳＴＡ１に対して少なくとも約８０％同一であるか、又は配列番号１に対して少なくとも約９０％同一であるか、又は少なくとも約９５％同一であり得る。
【００１０】
配列番号１：ｈＧＳＴＡ１のホモサピエンスのアミノ酸配列
【化１】
2018503064.tif 000002
【００１１】
配列番号２：ｈＧＳＴＡ１のホモサピエンスの核酸配列
【化２】
2018503064.tif 000003
【００１２】
本発明のさらなる目的は、ｉ）被験体から得られた腫瘍試料中のｈＧＳＴＡ１の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）ｈＧＳＴＡ１の発現レベルがその予め決定された基準値よりも高い場合には、被験者は長い生存時間を有するであろうと結論付けるか、又は、ｈＧＳＴＡ１の発現レベルがその予め決定された基準値よりも低い場合には、被験者は短い生存時間を有するであろうと結論付ける工程を含む、癌を患っている被験者の生存時間を決定するための方法に関する。
【００１３】
前記方法は、癌被験者の全生存期間（ＯＳ）、無憎悪生存期間（ＰＦＳ）、及び／又は無病生存期間（ＤＦＳ）を予測するのに特に適している。当業者は、ＯＳ生存期間は一般的に、特定の種類の癌から特定の時間生き延びた人々の比率に基づきかつ該比率として表現されることを認識しているだろう。癌の統計は５年生存率を使用することが多い。一般的に、全生存率は、癌生存者が５年目に依然として処置を受けているかどうか又は癌がなくなったか（寛解を達成したか）どうかを特定しない。ＤＦＳはより具体的な情報を与え、寛解を達成した特定の癌を有する人々の数である。また、無憎悪生存（ＰＦＳ）率（依然として癌を有するが、その疾患は進行していない人々の数）は、処置を用いて幾分の成功を収めた可能性があるが、癌は完全に消失していない人々を含む。本明細書において使用する「短い生存時間」という表現は、被験者が、該癌を患っている被験者の一般集団において観察された中央値（又は平均値）よりも短い生存時間を有するであろうことを示す。被験者が短い生存時間を有するであろう場合、被験者は「悪い予後」を有するであろうことを意味する。逆に、「長い生存時間」という表現は、被験者が、該癌を患っている被験者の一般集団において観察された中央値（又は平均値）よりも長い生存時間を有するであろうことを示す。被験者が長い生存時間を有するであろう場合、被験者は「良好な予後」を有するであろうことを意味する。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、ｉ）被験者から得られた腫瘍試料中のｈＧＳＴＡ１の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）ｈＧＳＴＡ１の発現レベルがその予め決定された基準値よりも低い場合には、被験者はデンドロゲニンＡに応答するであろうと結論付ける工程の、癌を患っている被験者がデンドロゲニンＡに応答するであろうかどうかを決定するための方法に関する。
【００１５】
本明細書において使用する「デンドロゲニンＡ」という用語は、薬学的に活性な化合物の５−ヒドロキシ−６−[２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチルアミノ]コレスタン−３−オールを指す。デンドロゲニンＡは、国際公開公報第０３／８９４４９号及びde Medina et al（J. Med. Chem. , 2009）に遊離塩基として開示されている。その構造式は以下：
【化３】
2018503064.tif 000004
である。
【００１６】
遺伝子（すなわちｈＧＳＴＡ１）の発現レベルの測定は、当技術分野において周知である様々な技術によって実施され得る。
【００１７】
いくつかの実施態様では、発現レベルは、核酸レベルで決定される。典型的には、遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定され得る。ｍＲＮＡの量を決定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、試料（例えば被験者から調製された細胞又は組織）中に含有される核酸をまず標準的な方法に従って、例えば溶解酵素若しくは化学溶液を使用して抽出するか、又は、製造業者の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出する。次いで、抽出されたｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えばノザンブロット分析、インサイツハイブリダイゼーション）及び／又は増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。他の増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００１８】
少なくとも１０個のヌクレオチドを有しかつ本明細書の関心対象のｍＲＮＡに対して配列相補性又は相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとしての有用性を見出す。このような核酸は同一である必要はないが、典型的には同等なサイズの相同領域に対して少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、さらにより好ましくは９０〜９５％同一であると理解される。特定の実施態様では、ハイブリダイゼーションの検出のために、適切な手段、例えば検出可能な標識と組み合わせて核酸を使用することが有利であろう。
【００１９】
典型的には、核酸プローブは、例えば、開示されたプローブを使用した標的核酸分子の検出を可能とするための、１つ以上の標識を含む。インサイツハイブリダイゼーション手順などの様々な適用において、核酸プローブは標識（例えば検出可能な標識）を含む。「検出可能な標識」は、試料中のプローブ（特に結合した又はハイブリダイズしたプローブ）の存在又は濃度を示す、検出可能なシグナルを発生させるために使用することのできる、分子又は材料である。したがって、標識された核酸分子は、試料中の標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）（これに、標識された独特な特異的な核酸分子が結合又はハイブリダイズしている）の存在又は濃度の指標を提供する。１つ以上の核酸分子（例えば開示された方法によって生成されたプローブ）に結合した標識は、直接的に又は間接的にのいずれかで検出され得る。標識は、光子（ラジオ波周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数、及び紫外線周波数の光子を含む）の吸収、放出及び／又は散乱をはじめとする任意の公知の機序又は依然として発見されていない機序によって検出することができる。検出可能な標識としては、着色した、蛍光の、リン光の、及び発光の分子及び材料、ある物質を別の物質へと変換して検出可能な差をもたらす触媒（例えば酵素）（例えば、無色物質を着色物質へと若しくはその逆へと変換することによって、又は沈降物を生成するか若しくは試料の濁度を増加させることによって）、抗体結合相互作用によって検出することのできるハプテン、並びに常磁性及び磁性の分子又は材料が挙げられる。
【００２０】
検出可能な標識の特定の例としては、蛍光分子（又は蛍光色素）が挙げられる。数多くの蛍光色素が当業者には公知であり、例えばライフ・テクノロジーズ社（以前はインビトロジェン社）から選択することができ、例えばThe Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesを参照されたい。核酸分子（例えば独特な特異的な結合領域）に付着（例えば化学的にコンジュゲート）することのできる特定のフルオロフォアの例が、Nazarenko et al.の米国特許第５，８６６，３６６号に提供され、例えば４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソチオシアネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−[３ビニルスルホニル]フェニル]ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’ジブロモピロガロール−スルホネフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（disulfor1ic acid）；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアネート；エリスロシン及び誘導体、例えばエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体、例えば５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びＱＦＩＴＣ Ｑ（ＲＩＴＣ）；２’，７’−ジフルオロフルオレセイン（オレゴングリーン（登録商標））；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート、及びスクシンイミジル１−ピレンブチレート；リアクティブレッド４（チバクロンブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミン及び誘導体、例えば６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンロ���ダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロソール酸及びテルビウムキレート誘導体である。他の適切なフルオロフォアとしては、約６１７nmで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート（Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999）、並びに、ＧＦＰ、リサミンＴＭ、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン、及びキサンテン（Lee et al.の米国特許第５，８００，９９６号に開示されているような）及びその誘導体が挙げられる。当業者に公知である他のフルオロフォア、例えば、ライフ・テクノロジーズ社（インビトロフェン社；モレキュラープローブ（ユージーン、オレゴン州)）から入手できるもの、例えばALEXA FLUOR（登録商標）シリーズの色素（例えば、米国特許第５，６９６，１５７号、第６，１３０，１０１号、及び第６，７１６，９７９号に記載）、BODIPYシリーズの色素（ジピロメテンボロンジフルオリド色素、例えば米国特許第４，７７４，３３９号、第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号、第５，２７４，１１３号、第５，３３８，８５４号、第５，４５１，６６３号、及び第５，４３３，８９６号に記載のような）、カスケードブルー（米国特許第５，１３２，４３２号に記載のスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）及びマリーナブルー（米国特許第５，８３０，９１２号）も使用することができる。
【００２１】
上記の蛍光色素に加えて、蛍光標識は、蛍光ナノ粒子、例えば半導体ナノ結晶、例えばQUANTUM DOTS（例えばライフ・テクノロジーズ社（QuantumDot社、インビトロジェン社のナノクリスタルテクノロジー、ユージーン、オレゴン州）から得られた；米国特許第６，８１５，０６４号；第６，６８２，５９６号；及び第６，６４９，１３８号も参照）であり得る。半導体ナノ結晶は、サイズ依存性の光学的及び／又は電気的特性を有する顕微粒子である。半導体ナノ結晶を第一のエネルギー源を用いて照射すると、半導体ナノ結晶に使用された半導体材料のハンドギャップに相当する周波数の第二のエネルギーの放出が起こる。この放出は、特定の波長の色光又は蛍光として検出することができる。様々なスペクトル特徴を有する半導体ナノ結晶が、例えば、米国特許第６，６０２，６７１号に記載されている。例えば、Bruchez et al., Science 281 :20132016, 1998; Chan et al., Science 281:2016-2018, 1998；及び米国特許第６，２７４，３２３号に記載の技術によって様々な生物学的分子（例えばｄＮＴＰ及び／又は核酸）又は基質に結合させることのできる半導体ナノ結晶。様々な組成の半導体ナノ結晶の形成が、例えば、米国特許第６，９２７，０６９号；第６，９１４，２５６号；第６，８５５，２０２号；第６，７０９，９２９号；第６，６８９，３３８号；第６，５００，６２２号；第６，３０６，７３６号；第６，２２５，１９８号；第６，２０７，３９２号；第６，１１４，０３８号；第６，０４８，６１６号；第５，９９０，４７９号；第５，６９０，８０７号；第５，５７１，０１８号；第５，５０５，９２８号；第５，２６２，３５７号、及び米国特許公開公報第２００３／０１６５９５１号並びにＰＣＴ公開公報第９９／２６２９９号（１９９９年５月２７日に公開）に開示されている。その異なるスペクトル特徴に基づいて同定可能である別の集団の半導体ナノ結晶を生成することができる。例えば、その組成、サイズ、又はサイズと組成に基づいて異なる色の光を放出する半導体ナノ結晶を生成することができる。例えば、本明細書に開示されたプローブにおける蛍光標識として適切である、サイズに基づいて異なる波長（５６５nm、６５５nm、７０５nm、又は８００nmの発光波長）で発光する量子ドットは、ライフ・テクノロジーズ社（カールスバッド、カリフォルニア州）から入手可能である。
【００２２】
追加の標識としては、例えば、放射性同位体（例えば３Ｈ）、金属キレート、例えばＧｄ３＋のような放射性又は常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレート、並びにリポソームが挙げられる。
【００２３】
核酸分子と共に使用することのできる検出可能な標識としては、酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、又はβ−ラクタマーゼも挙げられる。
【００２４】
あるいは、酵素を、金属組織検出スキームに使用することができる。例えば、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）手順は、ハイブリダイズしたゲノム標的核酸配列の同定及び場所決定のための金属組織検出スキームを含む。金属組織検出法は、アルカリホスファターゼなどの酵素を、水溶性金属イオン及び酸化還元不活性な酵素の基質と組み合わせて使用することを含む。基質は、酵素によって酸化還元活性な物質へと変換され、酸化還元活性物質は金属イオンを還元し、それが検出可能な沈降物を形成することを引き起こす（例えば、米国特許出願公開公報第２００５／０１００９７６号、ＰＣＴ公開公報第２００５／００３７７７号及び米国特許出願公開公報第２００４／０２６５９２２号を参照）。金属組織検出法はまた、酸化還元酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ）を、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共に使用して、ここでも検出可能な沈降物を形成することを含む。（例えば、米国特許第６，６７０，１１３号参照）。
【００２５】
開示された方法を使用して作製されたプローブを、核酸の検出のために、例えばＩＳＨ手順に（例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、及び銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ））使用することができる。
【００２６】
インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、中期又は間期染色体調製物の脈絡での標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）を含有している試料（例えばスライド上に積載されている細胞試料又は組織試料）を、標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）に特異的にハイブリダイズすることができるか又は特異的である標識プローブと接触させることを含む。スライドに場合により前処理をして、例えば、均一なハイブリダイゼーションを妨害する可能性のあるパラフィン又は他の材料を除去する。試料及びプローブは両方共に、二本鎖核酸を変性させるために、例えば加熱することによって処理される。プローブ（適切なハイブリダイゼーション緩衝液中で調合される）及び試料を、ハイブリダイゼーションが起こる（典型的には平衡に到達する）ことを許容する条件下及び十分な時間かけて合わせる。染色体調製物を洗浄して過剰なプローブを除去し、染色体標的の特異的標識の検出は、標準的な技術を使用して実施される。
【００２７】
例えば、ビオチン化プローブは、フルオレセインで標識されたアビジン又はアビジン−アルカリホスファターゼを使用して検出することができる。蛍光色素の検出のために、蛍光色素を直接検出しても、又は、試料を、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートさせたアビジンと共にインキュベートしてもよい。ＦＩＴＣシグナルの増幅は、必要であれば、ビオチンにコンジュゲートさせたヤギ抗アビジン抗体と共にインキュベーション、洗浄、ＦＩＴＣにコンジュゲートさせたアビジンと２回目のインキュベーションによって行なわれ得る。酵素活性による検出のために、試料を、例えば、ストレプトアビジンと共にインキュベートし、洗浄し、ビオチンにコンジュゲートさせたアルカリホスファターゼと共にインキュベートし、再度洗浄し、そして事前に平衡化（例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）緩衝液中で）させることができる。インサイツハイブリダイゼーション手順の一般的な説明については、例えば、米国特許第４，８８８，２７８号を参照されたい。
【００２８】
ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨのための数多くの手順が当技術分野において公知である。例えば、ＦＩＳＨを実施するための手順は、米国特許第５，４４７，８４１号；第５，４７２，８４２号；及び第５，４２７，９３２号；及び例えばPir1kel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986；Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988；及びLichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9664-9668, 1988に記載されている。ＣＩＳＨは、例えばTanner et al., Am. .1. Pathol. 157:1467-1472, 2000及び米国特許第６，９４２，９７０号に記載されている。追加の検出法は米国特許第６，２８０，９２９号に提供されている。
【００２９】
数多くの試薬及び検出スキームを、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨ手順と併せて使用して、感度、分解能、又は他の所望の特性を改善させることができる。上記に考察されているように、フルオロフォア（蛍光色素及びQUANTUM DOTS（登録商標）を含む）で標識されたプローブは、ＦＩＳＨを実施した場合、直接光学的に検出することができる。あるいは、プローブを、非蛍光分子、例えばハプテン（例えば以下の非制限的な例；ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ、及び様々なオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、クマリン、クマリンをベースとした化合物、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシンに基づいた化合物、及びその組合せ）、リガンド又は他の間接的に検出可能な部分を用いて標識することができる。次いで、このような非蛍光分子で標識されたプローブ（及びそれらが結合する標的核酸配列）を、試料（例えばプローブが結合する細胞試料又は組織試料）を、選択されたハプテン又はリガンドに対して特異的である標識された検出試薬、例えば抗体（又は受容体、又は他の特異的な結合対）と接触させることによって検出することができる。検出試薬は、フルオロフォア（例えばQUANTUM DOTS（登録商標））で又は別の間接的に検出可能な部分で標識しても、あるいは、フルオロフォアで標識されていてもよい１つ以上の追加の特異的な結合剤（例えば二次抗体又は特異的抗体）と接触させてもよい。
【００３０】
他の例では、プローブ又は特異的結合物質（例えば抗体、例えば一次抗体、受容体、又は他の結合物質）を、蛍光発生組成物又は発色性組成物を検出可能な蛍光シグナル、着色シグナル、又は別様に検出可能なシグナル（例えば、ＳＩＳＨにおいて検出可能な金属粒子の沈着におけるように）へと変換することができる酵素を用いて標識する。上記に示されているように、酵素を、リンカーを介して、関連したプローブ又は検出試薬へと直接的に又は間接的に付着させることができる。適切な試薬（例えば結合試薬）及び化学物質（例えばリンカー及び付着用化学物質）の例は、米国特許出願公開公報第２００６／０２４６５２４号；第２００６／０２４６５２３号及び第２００７／０１１７１５３号に記載されている。
【００３１】
標識プローブ−特異的結合物質の対を適切に選択することによって、１回のアッセイ（例えば１つの細胞試料若しくは組織試料上での、又は、１つを超える細胞試料若しくは組織試料上での）で複数の標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）の検出を容易にする多重検出スキームを作成することができることが当業者によって理解されるだろう。例えば、第一標的配列に対応する第一プローブを、ビオチンなどの第一のハプテンで標識し、一方で、第二標的配列に対応する第二のプローブをＤＮＰなどの第二のハプテンで標識してもよい。プローブに試料を曝露した後、試料を、第一の特異的な結合物質（この場合、第一のフルオロフォアで標識されたアビジン、例えば５８５nmで発光する、例えば第一のスペクトル的に明確に異なるQUANTUM DOTS（登録商標））及び第二の特異的な結合物質（この場合、第二のフルオロフォア（例えば、７０５nmで発光する、例えば第二のスペクトル的に明確に異なるQUANTUM DOTS（登録商標））で標識された抗ＤＮＰ抗体、又は抗体断片）と接触させることによって、結合したプローブを検出することができる。追加のプローブ／結合物質の対を、他のスペクトル的に明確に異なるフルオロフォアを使用して多重検出スキームに加えることができる。直接的及び間接的（１工程、２工程、又はそれ以上）な数多くの変法を想定することができ、その中の全てが開示されたプローブ及びアッセイの脈絡において適切である。
【００３２】
プローブは典型的には、１０〜１０００、例えば１０〜８００、より好ましくは１５〜７００、典型的には２０〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは典型的には、増幅しようとする関心対象の核酸と完全に又はほぼ完全に一致するように設計された、１０〜２５ヌクレオチド長のより短い一本鎖核酸である。プローブ及びプライマーは、それらがハイブリダイズする核酸に対して「特異的」であり、すなわち、それらは好ましくは高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする（最も高い融解温度Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣに相当する。ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M Ｎａ−クエン塩である）。
【００３３】
上記の増幅法及び検出法に使用された核酸プライマー又はプローブは、キットとして構築され得る。このようなキットは、共通プライマー及び分子プローブを含む。好ましいキットはまた、増幅が起こったかどうかを決定するのに必要とされる成分を含む。キットはまた、例えば、ＰＣＲ緩衝液及び酵素；正の制御配列、反応制御プライマー；並びに、特異的な配列を増幅及び検出するための説明書も含み得る。
【００３４】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、卵丘細胞から抽出された全ＲＮＡを準備する工程、及び、より特定すると定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡを増幅及び特異的なプローブに対するハイブリダイゼーションにかける工程を含む。
【００３５】
いくつかの実施態様では、発現レベルは、ＤＮＡチップ分析によって決定される。このようなＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、スライドガラス、又はマイクロスフィアのサイズのビーズであり得る、基材に化学的に付着させた様々な核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカ、又はシリカをベースとした材料、炭素、金属、無機ガラス、又はニトロセルロースから構成され得る。プローブは、核酸、例えばｃＤＮＡ又は約１０〜約６０塩基対であり得るオリゴヌクレオチドを含む。発現レベルを決定するために、場合によりまず逆転写にかけた試験被験者の試料を、標識し、そして、マイクロアレイ表面に付着させたプローブ配列に対して相補的である標的核酸との間で複合体を形成するに至るハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させる。次いで、標識されたハイブリダイズした複合体を検出し、定量又は半定量することができる。標識は、様々な方法によって、例えば放射能標識又は蛍光標識を使用することによって成し遂げることができる。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変法が、当業者には利用可能である（例えば、Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210による総説を参照）。
【００３６】
いくつかの実施態様では、nCounter（登録商標）分析システムを使用して、内在性遺伝子発現を検出する。nCounter（登録商標）分析システムの基本は、アッセイしようとする各々の核酸標的に割り当てられた独特なコードである（国際特許出願公開公報第０８／１２４８４７号、米国特許第８，４１５，１０２号及びGeiss et al. Nature Biotechnology. 2008. 26(3): 317-325；その内容は各々その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。コードは、アッセイしようとする各標的に対する独特なバーコードを作成する規則正しい一連の有色蛍光スポットから構成される。各々のＤＮＡ標的又はＲＮＡ標的のための１対のプローブ、すなわちビオチン化捕捉プローブと蛍光バーコードを有するレポータープローブとを設計する。このシステムは本明細書においてナノレポーターコードシステムとも称される。各標的に対して特異的なレポーター及び捕捉プローブを合成する。レポータープローブは、第一シグナルを構成している光を放出する１つ以上の標識モノマーが付着する少なくとも１つの第一標識付着領域；第二のシグナルを構成している光を放出する１つ以上の標識モノマーが付着する、第一の標識付着領域と重複していない、少なくとも１つの第二の標識付着領域；及び、第一の標的特異的配列を含み得る。好ましくは、各々の配列特異的レポータープローブは、１つ以下の遺伝子にハイブリダイズすることができる標的特異的配列を含み、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの標識付着領域を場合により含み、該付着領域は、それぞれ少なくとも１つの第三のシグナル又は少なくとも１つの第四のシグナルを構成している光を放出する１つ以上の標識モノマーを含む。捕捉プローブは、第二の標的特異的配列；及び第一の親和性タグを含み得る。いくつかの実施態様では、捕捉プローブはまた、１つ以上の標識付着領域を含み得る。好ましくは、レポータープローブの第一の標的特異的配列及び捕捉プローブの第二の標的特異的配列は、検出しようとする同じ遺伝子の異なる領域にハイブリダイズする。レポータープローブ及び捕捉プローブは全て、１つのハイブリダイゼーション混合物、すなわち「プローブライブラリー」にプールされる。１回の多重ハイブリダイゼーション反応における各標的の相対量を測定する。該方法は、腫瘍試料をプローブライブラリーと接触させる工程を含み、よって、試料中の標的の存在は、プローブ対−標的の複合体を作る。次いで、複合体を精製する。より具体的には、試料をプローブライブラリーと合わせ、溶液中でハイブリダイゼーションが起こる。ハイブリダイゼーション後、三者間のハイブリダイズした複合体（プローブ対及び標的）を、捕捉プローブ及びレポータープローブ上に存在するユニバーサル配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドに連結させた磁気ビーズを使用して２工程手順で精製する。この二重精製過程は、大過剰の標的特異的プローブを用いてハイブリダイゼーション反応を完了に導くことが可能である。なぜなら、それらは最終的に除去され、したがって、試料の結合及びイメージングに干渉しないからである。全てのハイブリダイゼーション後工程は、カスタムリキッドハンドリングロボット（プレップステーション、ナノストリング・テクノロジー社）でロボ���ト操作する。精製された反応液は典型的には、捕捉プローブを介してストレプトアビジンでコーティングされた表面に結合した、試料カートリッジの個々のフローセルにプレップステーションによって蓄積され、電気泳動にかけてレポータープローブを伸長し、そして固定する。加工後、試料カートリッジを、完全自動化イメージング装置及びデータ収集装置（デジタルアナライザ、ナノストリング・テクノロジー社）に移す。各試料をイメージングし、その標的に対するコードが検出された回数を計数することによって標的の発現レベルを測定する。各試料について、約１０mm2の結合表面を表現する典型的には６００個の視野（ＦＯＶ）が画像撮影される（１３７６×１０２４ピクセル）。典型的な画像密度は、多重化度、試料投入量、及び標的の総量に依存して、１視野あたり１００〜１２００個の計数されたレポーターである。データは、１つの標的あたり、１つの試料あたりの計数を列挙した簡単なスプレッドシート形式に出力する。このシステムをナノレポーターと共に使用することができる。ナノレポーターに関する追加の開示は、国際公開公報第ＷＯ０７／０７６１２９号及び第ＷＯ０７／０７６１３２号、及び米国特許公開公報第２０１０／００１５６０７号及び第２０１０／０２６１０２６号に見出すことができ、その内容はその全体が本明細書に組み入れられる。さらに、核酸プローブ及びナノレポーターという用語は、その全体が参照により本明細書に組み入れられた国際公開公報第ＷＯ２０１０／０１９８２６号及び米国特許公報第２０１０／００４７９２４号に記載の合理的に設計された（例えば合成配列）を含み得る。
【００３７】
遺伝子の発現レベルは、絶対発現レベル又は標準化発現レベルとして表現され得る。典型的には、発現レベルは、その発現を、被験者の癌段階を決定するのに関連のない遺伝子、例えば構成的に発現されているハウスキーピング遺伝子の発現と比較することによって、遺伝子の絶対発現レベルを修正することによって標準化される。標準化のための適切な遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子、例えばアクチン遺伝子ＡＣＴＢ、リボソーム１８Ｓ遺伝子、ＧＵＳＢ、ＰＧＫ１及びＴＦＲＣが挙げられる。この標準化により、１つの試料中の発現レベルの比較、例えば、被験者の試料と別の試料、又は異なる入手源に由来する試料間の比較が可能となる。
【００３８】
いくつかの実施態様では、ｈＧＳＴＡ１の発現レベルは、当技術分野における任意の周知の方法によってタンパク質レベルで決定される。典型的には、このような方法は、腫瘍組織試料を、ｈＧＳＴＡ１と選択的に相互作用することができる少なくとも１つの選択的結合物質と接触させる工程を含む。選択的結合物質は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗体断片、合成抗体、又は他のタンパク質特異的物質、例えば核酸又はペプチドアプタマーであり得る。いくつかの抗体が先行技術において記載され、実施例に記載のような多くの抗体がまた市販されている。顕微鏡又は自動分析システムによってｈＧＳＴＡ１の存在を検出可能とする抗体の検出のために、抗体を、検出可能な標識、例えば酵素、色素原、又は蛍光プローブを用いて直接タグ化しても、あるいは検出可能な標識とコンジュゲートさせた二次抗体を用いて間接的に検出してもよい。本発明による好ましい方法は、免疫組織化学的方法である。免疫組織化学的方法は典型的には、以下の工程を含む：
−該腫瘍試料をホルマリンで固定する、
−該腫瘍試料をパラフィンに包埋する、
−該腫瘍試料を染色のために切片へと切断する、
−該切片を、特異的な結合対と共にインキュベートする、
−該切片を濯ぐ、
−該切片をビオチン化二次抗体と共にインキュベートする、
−抗原−抗体複合体を、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて顕現させる。
【００３９】
したがって、組織腫瘍試料をまず、結合対と共にインキュベートする。洗浄後、関心対象のマーカーに結合させた標識抗体を、例えば放射性標識、蛍光標識、又は酵素標識などの標識された抗体によって生じる標識の種類に応じて、適切な技術によって顕現させる。多数の標識を同時に行なうことができる。あるいは、本発明の方法は、増幅システム（染色シグナルを増強するために）と酵素分子に結合させた二次抗体を使用してもよい。このような結合させた二次抗体は市販されており、例えばダコ社のEnVisionシステムである。対比染色、例えばヘマトキシリン及びエオシン、ＤＡＰＩ、ヘキストを使用し得る。他の染色法は、自動化、半自動化、又は手動システムをはじめとする当業者には明らかであろう任意の適切な方法又はシステムを使用して成し遂げられ得る。
【００４０】
典型的には、予め決定された基準値は、閾値又はカットオフ値である。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的に、経験的に、又は理論的に決定され得る。閾値はまた、当業者によって認識されているように、既存の実験及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択され得る。例えば、適切に預けられた歴史的被験者試料中のｈＧＳＴＡ１の発現レベルの後向き測定を、予め決定された基準値の確立のために使用し得る。閾値は、試験の機能及び利益／リスクのバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に従って最適な感度及び特異性を得るように決定されなければならない。典型的には、最適な感度及び特異性（及び閾値も）は、実験データに基づいた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定することができる。例えば、基準の群におけるｈＧＳＴＡ１の発現レベルの決定後、試験しようとする試料中のｈＧＳＴＡ１の測定された発現レベルの統計処理のためにアルゴリズム分析を使用することができ、したがって、試料分類について有意性を有する分類標準を得ることができる。ＲＯＣ曲線のフルネームは受信者動作特性曲線であり、これは受信者操作特性曲線としても知られる。それは主に臨床生化学的診断試験のために使用される。ＲＯＣ曲線は、真陽性率（感度）及び偽陽性率（１−特異性）の連続変数を反映する総合的指標である。それは、画像合成法を用いての感度と特異性との間の関係を明らかとする。一連の異なるカットオフ値（閾値又は臨界値、診断検査の正常な結果と異常な結果との間の境界値）が、一連の感度及び特異性の数値を計算するための連続変数として設定される。次いで、感度は、曲線を描くための垂直座標として使用され、特異性は水平座標として使用される。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きくなればなるほど、診断の正確度は高くなる。ＲＯＣ曲線上で、座標図のはるか左上に最も近い点は、高い感度と高い特異性の数値の両方を有する臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は１．０〜０．５である。ＡＵＣが０．５を上回る場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて、診断結果はより良好となる。ＡＵＣが０．５から０．７である場合、正確度は低い。ＡＵＣが０．７から０．９である場合、正確度は中程度である。ＡＵＣが０．９より高い場合、正確度は極めて高い。このアルゴリズム法は好ましくはコンピューターを用いて行なわれる。当技術分野における既存のソフトウェア又はシステム、例えば、MedCalc 9.2.0.1医学統計ソフトウェア、SPSS 9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER POWER.SAS、CREATE-ROC.SAS、GB STAT VI0.0（ダイナミック・マイクロシステム社、シルバースプリング、ミズーリ州、米国）などを、ＲＯＣ曲線の描写のために使用し得る。
【００４１】
予め決定された基準値は、同じ又は類似した年齢範囲の被験者、同じ又は類似した民族群の被験者、及び同じ深刻度の癌を有する被験者を含むがこれらに限定されない、集団研究から導かれた数字又は数値と比較してであり得る。このような予め決定された基準値は、数学的アルゴリズム及びコンピューター指数から得られた集団の統計分析及び／又はリスク予測データから導かれ得る。いくつかの実施態様では、予め決定された基準値は、癌を患っていない１人以上の被験者から得られた対照試料中のｈＧＳＴＡ１の発現レベルから導かれる。さらに、適切に預けられた歴史的被験者試料中のｈＧＳＴＡ１の発現レベルの後向き測定を、これらの予め決定された基準値の確立のために使用し得る。
【００４２】
いくつかの実施態様では、予め決定された基準値は、隣接する非腫瘍組織において決定されたｈＧＳＴＡ１の発現レベルである。
【００４３】
いくつかの実施態様では、予め決定された基準値は、生存時間（例えば無病生存期間（ＤＦＳ）及び／又は全生存期間（ＯＳ））に相関している。したがって、予め決定された基準値は、典型的には、
ａ）同じ癌を患っている被験者の腫瘍試料の集合を準備する工程；
ｂ）工程ａ）で準備された各腫瘍試料について、対応する被験者についての実際の臨床転帰に関する情報（すなわち、無病生存期間（ＤＦＳ）及び／又は全生存期間（ＯＳ））を準備する工程；
ｃ）一連の任意の定量化値を準備する工程；
ｄ）工程ａ）で準備された集合に含有される各腫瘍試料についてのｈＧＳＴＡ１のレベルを決定する工程；
ｅ）該腫瘍試料を、工程ｃ）で準備された１つの特定の任意の定量化値に対して２つの群にそれぞれ分類する工程：（ｉ）一連の該定量化値に含有される任意の該定量化値よりも低いレベルの定量化値を示す腫瘍試料を含む第一の群；（ｉｉ）一連の該定量化値に含有される任意の該定量化値よりも高いレベルの定量化値を示す腫瘍試料を含む第二の群；これにより特定の該定量化値についての２つの群の腫瘍試料が得られ、ここで各群の腫瘍試料は別々に列挙される；
ｆ）（ｉ）工程ｅ）で得られた定量化値と、工程ｆ）で定義された第一群及び第二群に含有される腫瘍試料が得られた被験者の実際の臨床転帰との間の統計学的有意性を計算する工程；
ｇ）工程ｄ）で提供されたあらゆる任意の定量化値が試験されるまで工程ｆ）及びｇ）を反復する工程；
ｈ）前記の予め決定された基準値を任意の定量化値（最も高い統計学的有意性（最も有意）は工程ｇ）で計算されている）からなると設定する工程
を含む方法を実施することによって決定され得る。
【００４４】
例えば、１００人の被験者の１００個の腫瘍試料についてのｈＧＳＴＡ１の発現レベルを評価した。１００個の試料を、ｈＧＳＴＡ１の発現レベルに従って順位付けする。試料１は最も高いレベルを有し、試料１００は最も低いレベルを有する。最初のグループ分けは２つの部分集合を与える：片方の側には試料番号１、他方の側には９９個の他の試料。次のグループ分けは片方の側に試料１及び２、他方の側に９８個の残りの試料を与えるなど、最後のグループ分けまで続く：片方の側には試料１〜９９、他方の側では試料番号１００である。対応する癌被験者についての実際の臨床転帰に関する情報に従って、２つの部分集合の９９個の群の各々についてのカプランマイヤー曲線を作成する。また、９９個の群の各々について、両方の部分集合間のｐ値を計算した。次いで、最小ｐ値の基準に基づいた識別が最強となるように予め決定された基準値を選択する。換言すれば、ｐ値が最小である両方の部分集合間の境界に対応するｈＧＳＴＡ１の発現レベルは、予め決定された基準値と考えられる。予め決定された基準値は、ｈＧＳＴＡ１のレベルの中央値では必ずしもないことを注記すべきである。
【００４５】
したがって、いくつかの実施態様では、予め決定された基準値は、よって、被験者についてのＤＦＳ及びＯＳに関して不良な予後と良好な予後の間の識別を可能とする。実践的には、高い統計学的有意性を有する値（例えば低いＰ値）は一般的に、一連の連続的な任意の定量化値に対して得られるのであって、１つの任意の定量化値だけに対して得られるのではない。したがって、本発明の１つの代替的な実施態様では、限定的な予め決定された基準値を使用する代わりに、一連の数値が提供される。それ故、最小の統計学的有意性を有する値（最小の有意性の閾値、例えば最大閾値Ｐ値）は任意に設定され、工程ｇ）で計算された統計学的に有意な数値がより高い（より有意である、例えばより低いＰ値）一連の複数の任意の定量化値が保持され、よって、一連の定量化値が提供される。この範囲の定量化値は、上記のような「カットオフ」値を含む。
【００４６】
例えば、「カットオフ」値のこの特定の実施態様によると、転帰は、ｈＧＳＴＡ１の発現レベルを、同定された数値の範囲と比較することによって決定され得る。特定の実施態様では、したがって、カットオフ値は、例えば、最も高い統計学的に有意な値が見られる（例えば一般的に見られるのは最小ｐ値）定量化値に中心を置いた、一連の定量化値からなる。例えば、１から１０の仮定上の尺度では、理想的なカットオフ値（最も高い統計学的有意性を有する値）が５である場合、適切な（例示的な）範囲は４〜６であり得る。例えば、被験者は、ｈＧＳＴＡ１の発現レベルを測定することによって得られた数値を比較することによって評価され得、ここで５を超える数値により良好な予後が明らかとなり、５未満の数値により不良な予後が明らかとなる。別の実施態様では、被験者は、ｈＧＳＴＡ１の発現レベルを測定することによって得られた数値を比較し、尺度で該数値を比較することによって評価され得、ここで４〜６の範囲を超える数値は良好な予後を示し、４〜６の範囲を下回る数値は不良な予後を示し、４〜６の範囲内に該当する数値は中間の出来事（すなわち予後）を示す。
【００４７】
本発明の治療法
被験者が一旦癌を患っていると診断されると、医師は、被験者に最も的確な処置を投与する選択肢を採用することができる。典型的には、処置としては、化学療法、放射線療法、及び免疫療法が挙げられる。
【００４８】
いくつかの実施態様では、本発明の方法によって一旦癌を患っていると診断された被験者は、化学療法剤を投与される。「化学療法剤」という用語は、腫瘍の増殖を抑制するのに有効である化合物を指す。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン系、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ；エチレンイミン類及びメチルメラミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミン；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン類（合成類似体のトポテカンなど）；ブリオスタチン類；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えば、そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩなど）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノボエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシン（１１及びカリケアマイシン２１１、例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186（1994）参照）；ダイネミシン、例えばダイネミシンＡ；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連したクロモプロテイン系エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（例えばモルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６��アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充物質、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲンナニウム（spirogennanium）；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベルカリンＡ、ロリジンＡ、及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology、プリンストン、N.J.州）及びドセタキセル（タキソテア（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer、アントニー、フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸塩；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；並びに、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。またこの定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン拮抗剤、例えばエストロゲン拮抗薬、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（フェアストン）；及びアンドロゲン拮抗薬、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体も含まれる。
【００４９】
いくつかの実施態様では、一旦癌を患っていると診断された被験者は、標的化癌療法を投与される。標的化癌療法は、癌の増殖、進行、及び拡大に関与する特定の分子（「分子標的」）に干渉することによって、癌の増殖及び拡大を遮断する薬物又は他の物質である。標的化癌療法は、時々、「分子標的化薬」、「分子標的化療法」、「精密医療」又は類似の名称で呼ばれる。いくつかの実施態様では、標的化療法は、被験者にチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程からなる。「チロシンキナーゼ阻害剤」という用語は、受容体型及び／又は非受容体型チロシンキナーゼの選択的又は非選択的阻害剤として作用する様々な治療剤又は薬物のいずれかを指す。チロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は当技術分野において周知であり、米国特許公開公報第２００７／０２５４２９５号に記載され、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。チロシンキナーゼ阻害剤に関連した化合物は、チロシンキナーゼ阻害剤の効果を再現するだろう、例えば関連化合物は、異なるメンバーのチロシンキナーゼシグナル伝達経路に作用して、そのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ阻害剤と同じ作用を生じることが当業者によって理解されるだろう。本発明の実施態様の方法に使用するのに適したチロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物の例
としては、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＰＰ２、ＢＥＺ２３５、サラカチニブ、ゲフィチニブ（イレッサ）、スニチニブ（スーテント；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（タルセバ；ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、イマチニブ（グリベック：ＳＴＩ５７１）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクチマ；ＺＤ６４７４）、ＭＫ−２２０６（８−［４−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン塩酸塩）、その誘導体、類似体、及び組合せが挙げられるがこれらに限定されない。本発明に使用するに適した追加のチロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は、例えば、米国特許公開公報第２００７／０２５４２９５号、米国特許第５，６１８，８２９号、第５，６３９，７５７号、第５，７２８，８６８号、第５，８０４，３９６号、第６，１００，２５４号、第６，１２７，３７４号、第６，２４５，７５９号、第６，３０６，８７４号、第６，３１３，１３８号、第６，３１６，４４４号、第６，３２９，３８０号、第６，３４４，４５９号、第６，４２０，３８２号、第６，４７９，５１２号、第６，４９８，１６５号、第６，５４４，９８８号、第６，５６２，８１８号、第６，５８６，４２３号、第６，５８６，４２４号、第６，７４０，６６５号、第６，７９４，３９３号、第６，８７５，７６７号、第６，９２７，２９３号、及び第６，９５８，３４０号に記載され、これら全てのその全体が参照により本明細書に組み入れられる。特定の実施態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、経口投与され、少なくとも１回の第Ｉ相臨床試験、より好ましくは少なくとも１回の第ＩＩ相臨床試験、さらにより好ましくは少なくとも１回の第ＩＩＩ相臨床試験の、最も好ましくは少なくとも１つの血液学的又は腫瘍学的適応症についてＦＤＡによって承認されている対象である、低分子キナーゼ阻害剤である。このような阻害剤の例としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ−４８０）、ネラチニブ、ＫＲＮ−６３３、ＣＥＰ−１１９８１、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ＡＺＭ−４７５２７１、ＣＰ−７２４７１４、ＴＡＫ−１６５、スニチニブ、バタラニブ、ＣＰ−５４７６３２、バンデタニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、タンデュチニブ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、ＡＥＥ−７８８、パゾパニブ、アキシチニブ、モテサニブ、ＯＳＩ−９３０、セジラニブ、ＫＲＮ−９５１、ドビチニブ、セリシクリブ、ＳＮＳ−０３２、ＰＤ−０３３２９９１、ＭＫＣ−１（Ｒｏ−３１７４５３；Ｒ−４４０）、ソラフェニブ、ＡＢＴ−８６９、ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４）、ＳＵ−１４８１３、テラチニブ、ＳＵ−６６６８、（ＴＳＵ−６８）、Ｌ−２１６４９、ＭＬＮ−８０５４、ＡＥＷ−５４１、及びＰＤ−０３２５９０１が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５０】
いくつかの実施態様では、一旦癌を患っていると診断された被験者は、免疫療法剤を投与される。本明細書において使用する「免疫療法剤」という用語は、癌細胞に対する生体の免疫応答を間接的に若しくは直接的に増強、刺激、若しくは増大させ、及び／又は、他の抗癌療法の副作用を低減する化合物、組成物、又は処置を指す。したがって、免疫療法は、癌細胞に対する免疫系の応答を直接的に若しくは間接的に刺激若しくは増強させ、及び／又は、他の抗癌剤によって引き起こされ得る副作用を和らげる療法である。免疫療法はまた、当技術分野において免疫学的療法、生物学的療法、生体応答調節剤療法、及び生物療法とも呼ばれる。当技術分野において公知である一般的な免疫療法剤の例としては、サイトカイン、癌ワクチン、モノクローナル抗体、及び非サイトカインアジュバントが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、免疫療法処置は、ある量の免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞など）を被験者に投与することからなり得る。
【００５１】
免疫療法剤は非特異的であってもよく、すなわち、免疫系を全般的にブーストし、よってヒト生体が癌細胞の増殖及び／又は蔓延に対して戦うのにより効果的となるか、あるいは、それらは特異的であってもよく、すなわち、癌細胞それ自体に標的化されてもよく、免疫療法計画は、非特異的な免疫療法剤と特異的な免疫療法剤を併用してもよい。
【００５２】
非特異的免疫療法剤は、免疫系を刺激するか又は間接的に増大させる物質である。非特異的免疫療法剤は、癌の処置のための主要な療法として単独で使用されているだけでなく、主要な療法に付加して使用され、この場合には、非特異的免疫療法剤は、他の療法（例えば癌ワクチン）の効力を増強させるアジュバントとして機能する。非特異的免疫療法剤はまた、この後者の状況において、他の療法の副作用、例えば特定の化学療法剤によって誘発された骨髄抑制などを低減させるように機能することができる。非特異的免疫療法剤は、重要な免疫系の細胞に対して作用することができ、そして二次応答、例えばサイトカイン及び免疫グロブリンの増加した産生を引き起こすことができる。あるいは、該薬剤は、それ自体、サイトカインを含んでいてもよい。非特異的免疫療法剤は、一般的に、サイトカイン又は非サイトカインアジュバントとして分類される。
【００５３】
多くのサイトカインが、免疫系をブーストさせるように設計された一般的な非特異的免疫療法剤として、又は、他の療法と共に施されるアジュバントとしてのいずれかとして癌の処置に適用を見出す。適切なサイトカインとしては、インターフェロン、インターロイキン、及びコロニー刺激因子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本発明によって考えられるインターフェロン（ＩＦＮ）としては、一般的な種類のＩＦＮ、ＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）、及びＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）が挙げられる。ＩＦＮは、例えば、癌細胞の増殖を減速させることによって、癌細胞からより正常な行動を有する細胞への発達を促進することによって、及び／又は、癌細胞による抗原の産生を増加させて免疫系が癌細胞をより容易に認識し破壊できるようにすることによって、癌細胞に対して直接的に作用することができる。ＩＦＮはまた、例えば、血管新生を減速させることによって、免疫系をブーストすることによって、並びに／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞及びマクロファージを刺激することによって、癌細胞に対して間接的に作用することもできる。組換え型ＩＦＮ−αは、ロフェロン（ロシュ製薬）及びイントロンＡ（シェリング社）として市販されている。
【００５５】
本発明によって考えられるインターロイキンとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１１及びＩＬ−１２が挙げられる。市販されている組換え型インターロイキンの例としては、プロロイキン（登録商標）（ＩＬ−２；カイロン社）及びニューメガ（登録商標）（ＩＬ−１２；ワイス製薬）が挙げられる。ザイモジェネティクス社（シアトル、ワシントン州）は、組換え型ＩＬ−２１を現在試験中であり、これもまた本発明の合剤への使用に考えられる。
【００５６】
本発明によって考えられるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）としては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ又はフィルグラスチム）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ又はサルグラモスチム）及びエリスロポエチン（エポエチンアルファ、ダルベポエチン）が挙げられる。１つ以上の増殖因子を用いての処置は、従来の化学療法を受けている被験者において新たな血球の生成を刺激するのに役立ち得る。したがって、ＣＳＦを用いての処置は、化学療法に伴う副作用を低減させるのに役立ち得、またより高用量の化学療法剤の使用を可能とし得る。様々な組換え型コロニー刺激因子、例えば、ニューポジェン（登録商標）（Ｇ−ＣＳＦ；アムジェン社）、ニューラスタ（ペグフィルグラスチム；アムジェン社）、ロイキン（ＧＭ−ＣＳＦ；バーレックス社）、プロクリット（エリスロポエチン；オーソバイオテック社）、エポジェン（エリスロポエチン；アムジェン社）、アラネスプ（エリスロポエチン）が市販されている。
【００５７】
特異的又は非特異的標的を有することに加えて、免疫療法剤は能動的であってもよく、すなわち生体自身の免疫応答を刺激することができてもよく、又は、それらは受動的であってもよく、すなわち、生体の外部で生成される免疫系の成分を含んでいてもよい。
【００５８】
受動的で特異的な免疫療法は、典型的には、癌細胞の表面上に見られる特定の抗原に対して特異的であるか、又は特定の細胞増殖因子に対して特異的である、１つ以上のモノクローナル抗体の使用を含む。モノクローナル抗体は、癌の処置における多くの方法に使用されて、例えば特定の種類の癌に対する被験者の免疫応答を増強させ得るか、血管新生に関与する細胞増殖因子などの特定の細胞増殖因子を標的化することによって、又は化学療法剤、放射性粒子若しくは毒素などの薬剤と連結若しくはコンジュゲートさせた場合に癌細胞への他の抗癌剤の送達を増強させることによって、癌細胞の増殖を妨害し得る。
【００５９】
本発明の合剤への封入に適した、癌免疫療法剤として現在使用されているモノクローナル抗体としては、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ゼヴァリン（登録商標））、トシツモマブ（ベキサール（登録商標））、セツキシマブ（Ｃ−２２５、アービタックス（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ（登録商標））、アレムツズマブ（キャンパス（登録商標））、及びＢＬ２２が挙げられるがこれらに限定されない。他の例としては、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えばイピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＴＩＭＰ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、又は抗Ｂ７Ｈ６抗体が挙げられる。いくつかの実施態様では、抗体としては、Ｂ細胞枯渇抗体が挙げられる。典型的なＢ細胞枯渇抗体としては、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体［例えばリツキシマブ（ロシュ社）、イブリツモマブチウキセタン（バイエルシェーリング社）、トシツモマブ（グラクソスミスクライン社）、ＡＭＥ−１３３ｖ（アプライドモレキュラーエボリューション社）、オクレリズマブ（ロシュ社）、オファツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ジェンマブ社）、ＴＲＵ−０１５（トルビオン）、及びＩＭＭＵ−１０６（イムノメディクス社）］、抗ＣＤ２２抗体［例えば、エプラツズマブ、Leonard et al., Clinical Cancer Research (Z004) 10: 53Z7-5334］、抗ＣＤ７９ａ抗体、抗ＣＤ２７抗体、又は抗ＣＤ１９抗体（例えば米国特許第７，１０９，３０４号）、抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体（例えば、ベリムマブ、グラクソスミスクライン社）、抗ＡＰＲＩＬ抗体（例えば抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体、プロサイ社）、及び抗ＩＬ−６抗体［例えば、De Benedetti et al., J Immunol (2001) 166: 4334-4340及びSuzuki et al., Europ J of Immunol (1992) 22 (8) 1989-1993によって以前に記載されている、これらは完全に参照により本明細書に組み入れられる］が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
免疫療法剤による処置は、特に造血幹細胞ＨＳＣを用いて同種移植片を同種移植することからなり得る。免疫療法剤による処置はまた、Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley and Steven A. Rosenberg “Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012によって記載のような養子免疫療法からなり得る。養子免疫療法では、被験者の循環中のリンパ球のＮＫ細胞をインビトロで単離し増幅させ、被験者に再投与する。活性化されたリンパ球又はＮＫ細胞は最も好ましくは、血液又は腫瘍試料から事前に単離されインビトロで活性化（又は「増殖」）させた被験者自身の細胞である。
【００６１】
いくつかの実施態様では、一旦癌を患っていると診断された被験者は、放射線療法剤を投与される。本明細書において使用する「放射線療法剤」という用語は、癌（これに限定されない）を処置又は寛解するのに有効であることが当業者には公知である任意の放射線療法剤を指すことを意図する。例えば、放射線療法剤は、小線源療法又は放射性核種療法に投与される薬剤などの薬剤であり得る。このような方法は場合によりさらに、化学療法及び／又は別の放射線療法などであるがこれらに限定されない、１つ以上の追加の癌療法の投与を含み得る。
【００６２】
いくつかの実施態様では、被験者がデンドロゲニンＡに応答するであろうことが決定された場合、次いで、被験者は該薬物を投与される。
【００６３】
いくつかの実施態様では、一旦癌を患っていると診断された被験者は、ｈＧＳＴＡ１をコードしている核酸を投与される。典型的には、ｈＧＳＴＡ１をコードしている核酸はベクターと共に送達される。
【００６４】
その最も広義な意味において、「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸の細胞への導入を促進することのできる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で生じるであろう分解の程度と比較して低減された分解度で細胞に核酸を輸送する。一般的に、本発明において有用なベクターとしては、関心対象の核酸配列の挿入又は組込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源又は細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられるがこれらに限定されない。ウイルスベクターは好ましい種類のベクターであり、これは以下のウイルス由来の核酸配列を含むがこれらに限定されない：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプシュタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス。命名されていないが当技術分野において知られている他のベクターも容易に使用することができる。
【００６５】
好ましいウイルスベクターは、非細胞壊死性真核生物ウイルスに基づき、このウイルスにおいては必須ではない遺伝子は関心対象の遺伝子で置換されている。非細胞壊死性ウイルスとしては、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写と、その後の宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験に対して承認されている。最も有用なのは、複製欠損であるレトロウイルスである（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することはできるが、感染性粒子を製造することはできない）。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率の形質導入に対する全般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを生成するための標準的なプロトコール（外因性遺伝子材料をプラスミドに組み込み、パッケージング細胞株をプラスミドでトランスフェクションし、パッケージング細胞株により組換えレトロウイルスを産生し、組織培養培地からウイルス粒子を回収し、そして標的細胞をウイルス粒子で感染させる工程を含む）は、KRIEGLER（A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York, 1990）及びMURRY（"Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991）において提供される。
【００６６】
特定の適用のために好ましいウイルスは、ヒトにおける遺伝子療法の使用にすでに承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは複製欠損であるように工学操作することができ、そして多種多様の細胞型及び細胞種に感染することができる。それはさらに、熱及び脂質溶媒に対する安定性；造血細胞をはじめとする多様な系統の細胞における高い形質導入頻度；及び重複感染阻害がなく、よって複数回の形質導入が可能であるなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込み、これによりレトロウイルス感染に特徴的な挿入突然変異誘発及び挿入遺伝子発現の変異の可能性は最小限となる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択的な圧力の非存在下では組織培養液中で１００回を超える継代におよび続き、このことは、アデノ随伴ウイルスゲノム組込みは比較的安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能することができる。
【００６７】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは当技術分野において十分に記載され、当業者には周知である。例えば、SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。過去数年間、プラスミドベクターは、インビボで抗原をコードする遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。それらはこのために特に有利である。なぜなら、それらは多くのウイルスベクターと同じ安全性の懸念を有さないからである。しかしながら、宿主細胞と適合性であるプロモーターを有するこれらのプラスミドは、該プラスミド内に操作によりコードされた遺伝子からのペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びpBlueScriptが挙げられる。他のプラスミドは当業者には周知である。さらに、プラスミドは、ＤＮＡの特定の断片を除去及び付加するための制限酵素及びライゲーション反応を使用してカスタム設計され得る。プラスミドは、様々な非経口、粘膜、及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路によって注射され得る。それはまた、鼻腔内スプレー又は液滴、直腸坐剤によって、及び経口的に投与されてもよい。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面に投与されてもよい。プラスミドは、水溶液中に与えられ得るか、金粒子上に乾燥させ得るか、又はリポソーム、デンドリマー、コクリエート（cochleate）及びマイクロカプセル化を含むがこれらに限定されない別のＤＮＡ送達システムと結合させ得る。
【００６８】
典型的には、上記のような活性成分は、治療有効量で被験者に投与される。
【００６９】
上記のような活性成分の「治療有効量」によって、化合物の十分量を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されるだろうことが理解されるだろう。任意の特定の被験者に対する具体的な治療有効投与量レベルは、処置される障害及び障害の重度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成、被験者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに、医学分野において周知である同様な要因をはじめとする、様々な要因に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで次第に用量を増加させることは十分に当分野の技能範囲内である。しかしながら、製品の１日量は、１日あたり成人１人あたり０．０１〜１，０００mgまでの幅広い範囲にわたって変動し得る。典型的には、該組成物は、処置される被験者への症候による用量の調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの活性成分を含有している。医薬品は典型的には、約０．０１〜約５００mgの活性成分、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含有している。有効量の薬物は、通常、１日あたり体重１kgあたり０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg、特に１日あたり体重１kgあたり約０．００１mg/kg〜７mg/kgの用量レベルで供給される。
【００７０】
本発明によると、活性成分は、医薬組成物の剤形で被験者に投与される。典型的には、活性成分は、薬学的に許容される賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、医薬組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の都合の悪い反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意のタイプの製剤化補助剤を指す。
【００７１】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性成分は単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与剤形、並びに直腸投与剤形を含む。
【００７２】
典型的には、医薬組成物は、注射され得る製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有している。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射液の復元を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。注射用途に適した医薬剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。本発明の化合物を遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中において並びに油中において調製され得る。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含有している。活性成分は、中性形又は塩の形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又はこのような有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄、及びこのような有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有している溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、該組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。無菌注射液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他のいくつかの成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体と上記に列挙された成分の中からの必要とされる他の成分とを含有している無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、典型的な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。直接注射のためのより濃縮された又は高度に濃縮された溶液の調製も考えられ、ここでの溶媒としてのＤＭＳＯの使用は極めて急速な浸透をもたらし、高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍領域に送達すると考えられる。製剤化時に、液剤は、投与製剤と適合性の様式で、かつ治療的に有効な量で投与されるだろう。製剤は、様々な剤形で、例えば上記のようなタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。水溶液での非経口投与のために、例えば、液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。用量の幾分の変更が、処置される被験者の容態に依存して必然的に行なわれるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験者に対する適切な用量を決定するだろう。
【００７３】
本発明はさらに、以下の図面及び実施例によって説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ａ）デンドロゲニンＡは、５，６α−エポキシ−コレステロール（５，６α−ＥＣ）とヒスタミン（ＨＡ）の酵素的コンジュゲーションの生成物である。反応は、ステロイド骨格のβ側を通してＣ６上へのヒスタミン（ＨＡ）の一級アミン（α）の攻撃から生じたＳＮ２反応であり、これにより６β置換生成物が生じる。ｂ）ラットグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＢ（ＧＳＴ−Ｂ）は、５，６α−ＥＣの立体選択的なグルタチオン付加を触媒し、これによりＣ６においてＤＤＡの正確な立体化学を有するコレステロール代謝物である５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−イル−Ｓ−グルタチオン（ＣＤＯ−ＳＧ）が得られる。
【図２ａ】ｈＧＳＴＡ１のグルタチオン付加活性の測定。ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、（ａ）漸増濃度のＣＤＮＢ及び単一濃度のＧＳＨ、又は（ｂ）漸増濃度のＧＳＨ及び単一濃度のＣＤＮＢの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を用いて行なわれた。ｃ）ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、１及び１０μMの５，６α−ＥＣ又はヒスタミン（ＨＡ）の存在下で行なわれた。５，６α−ＥＣのグルタチオン付加は、（ｄ）漸増濃度のｈＧＳＴＡ１、（ｅ）漸増濃度のＧＳＨ、又は（ｆ）漸増濃度の５，６α−ＥＣの存在下で行なわれた。ｈＧＳＴＡ１によるＣＤＯ−Ｓ−Ｇの生合成反応は、（ｇ）１及び１０mMのＣＤＮＢ、又は１及び１０μMのＨＡ、（ｈ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣの存在下で行なわれた。
【図２ｂ】ｈＧＳＴＡ１のグルタチオン付加活性の測定。ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、（ａ）漸増濃度のＣＤＮＢ及び単一濃度のＧＳＨ、又は（ｂ）漸増濃度のＧＳＨ及び単一濃度のＣＤＮＢの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を用いて行なわれた。ｃ）ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、１及び１０μMの５，６α−ＥＣ又はヒスタミン（ＨＡ）の存在下で行なわれた。５，６α−ＥＣのグルタチオン付加は、（ｄ）漸増濃度のｈＧＳＴＡ１、（ｅ）漸増濃度のＧＳＨ、又は（ｆ）漸増濃度の５，６α−ＥＣの存在下で行なわれた。ｈＧＳＴＡ１によるＣＤＯ−Ｓ−Ｇの生合成反応は、（ｇ）１及び１０mMのＣＤＮＢ、又は１及び１０μMのＨＡ、（ｈ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣの存在下で行なわれた。
【図２ｃ】ｈＧＳＴＡ１のグルタチオン付加活性の測定。ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、（ａ）漸増濃度のＣＤＮＢ及び単一濃度のＧＳＨ、又は（ｂ）漸増濃度のＧＳＨ及び単一濃度のＣＤＮＢの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を用いて行なわれた。ｃ）ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、１及び１０μMの５，６α−ＥＣ又はヒスタミン（ＨＡ）の存在下で行なわれた。５，６α−ＥＣのグルタチオン付加は、（ｄ）漸増濃度のｈＧＳＴＡ１、（ｅ）漸増濃度のＧＳＨ、又は（ｆ）漸増濃度の５，６α−ＥＣの存在下で行なわれた。ｈＧＳＴＡ１によるＣＤＯ−Ｓ−Ｇの生合成反応は、（ｇ）１及び１０mMのＣＤＮＢ、又は１及び１０μMのＨＡ、（ｈ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣの存在下で行なわれた。
【図２ｄ】ｈＧＳＴＡ１のグルタチオン付加活性の測定。ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、（ａ）漸増濃度のＣＤＮＢ及び単一濃度のＧＳＨ、又は（ｂ）漸増濃度のＧＳＨ及び単一濃度のＣＤＮＢの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を用いて行なわれた。ｃ）ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、１及び１０μMの５，６α−ＥＣ又はヒスタミン（ＨＡ）の存在下で行なわれた。５，６α−ＥＣのグルタチオン付加は、（ｄ）漸増濃度のｈＧＳＴＡ１、（ｅ）漸増濃度のＧＳＨ、又は（ｆ）漸増濃度の５，６α−ＥＣの存在下で行なわれた。ｈＧＳＴＡ１によるＣＤＯ−Ｓ−Ｇの生合成反応は、（ｇ）１及び１０mMのＣＤＮＢ、又は１及び１０μMのＨＡ、（ｈ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣの存在下で行なわれた。
【図２ｅ】ｈＧＳＴＡ１のグルタチオン付加活性の測定。ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、（ａ）漸増濃度のＣＤＮＢ及び単一濃度のＧＳＨ、又は（ｂ）漸増濃度のＧＳＨ及び単一濃度のＣＤＮＢの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を用いて行なわれた。ｃ）ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、１及び１０μMの５，６α−ＥＣ又はヒスタミン（ＨＡ）の存在下で行なわれた。５，６α−ＥＣのグルタチオン付加は、（ｄ）漸増濃度のｈＧＳＴＡ１、（ｅ）漸増濃度のＧＳＨ、又は（ｆ）漸増濃度の５，６α−ＥＣの存在下で行なわれた。ｈＧＳＴＡ１によるＣＤＯ−Ｓ−Ｇの生合成反応は、（ｇ）１及び１０mMのＣＤＮＢ、又は１及び１０μMのＨＡ、（ｈ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣの存在下で行なわれた。
【図２ｆ】ｈＧＳＴＡ１のグルタチオン付加活性の測定。ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、（ａ）漸増濃度のＣＤＮＢ及び単一濃度のＧＳＨ、又は（ｂ）漸増濃度のＧＳＨ及び単一濃度のＣＤＮＢの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を用いて行なわれた。ｃ）ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、１及び１０μMの５，６α−ＥＣ又はヒスタミン（ＨＡ）の存在下で行なわれた。５，６α−ＥＣのグルタチオン付加は、（ｄ）漸増濃度のｈＧＳＴＡ１、（ｅ）漸増濃度のＧＳＨ、又は（ｆ）漸増濃度の５，６α−ＥＣの存在下で行なわれた。ｈＧＳＴＡ１によるＣＤＯ−Ｓ−Ｇの生合成反応は、（ｇ）１及び１０mMのＣＤＮＢ、又は１及び１０μMのＨＡ、（ｈ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣの存在下で行なわれた。
【図２ｇ】ｈＧＳＴＡ１のグルタチオン付加活性の測定。ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、（ａ）漸増濃度のＣＤＮＢ及び単一濃度のＧＳＨ、又は（ｂ）漸増濃度のＧＳＨ及び単一濃度のＣＤＮＢの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を用いて行なわれた。ｃ）ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、１及び１０μMの５，６α−ＥＣ又はヒスタミン（ＨＡ）の存在下で行なわれた。５，６α−ＥＣのグルタチオン付加は、（ｄ）漸増濃度のｈＧＳＴＡ１、（ｅ）漸増濃度のＧＳＨ、又は（ｆ）漸増濃度の５，６α−ＥＣの存在下で行なわれた。ｈＧＳＴＡ１によるＣＤＯ−Ｓ−Ｇの生合成反応は、（ｇ）１及び１０mMのＣＤＮＢ、又は１及び１０μMのＨＡ、（ｈ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣの存在下で行なわれた。
【図２ｈ】ｈＧＳＴＡ１のグルタチオン付加活性の測定。ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、（ａ）漸増濃度のＣＤＮＢ及び単一濃度のＧＳＨ、又は（ｂ）漸増濃度のＧＳＨ及び単一濃度のＣＤＮＢの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を用いて行なわれた。ｃ）ＣＤＮＢのグルタチオン付加は、１及び１０μMの５，６α−ＥＣ又はヒスタミン（ＨＡ）の存在下で行なわれた。５，６α−ＥＣのグルタチオン付加は、（ｄ）漸増濃度のｈＧＳＴＡ１、（ｅ）漸増濃度のＧＳＨ、又は（ｆ）漸増濃度の５，６α−ＥＣの存在下で行なわれた。ｈＧＳＴＡ１によるＣＤＯ−Ｓ−Ｇの生合成反応は、（ｇ）１及び１０mMのＣＤＮＢ、又は１及び１０μMのＨＡ、（ｈ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣの存在下で行なわれた。
【図３ａ】ｈＧＳＴＡ１による５，６α−ＥＣのヒスタミン化の測定。５，６α−ＥＣのヒスタミン化は、（ａ）漸増濃度のＨＡ及び単一濃度の５，６α−ＥＣ、又は（ｂ）漸増濃度の５，６α−ＥＣ及び単一濃度のＨＡの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を使用して測定された。（ｃ）この反応生成物は質量分析によって特徴付けられ、予想された５１４．４３７１の質量を与え、ＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生成が確認された。（ｄ）ｈＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生合成反応は、１０mMのＣＤＮＢの存在下、１μMから１mMの範囲の漸増濃度のＧＳＨ、（ｅ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣを用いて行なわれた。
【図３ｂ】ｈＧＳＴＡ１による５，６α−ＥＣのヒスタミン化の測定。５，６α−ＥＣのヒスタミン化は、（ａ）漸増濃度のＨＡ及び単一濃度の５，６α−ＥＣ、又は（ｂ）漸増濃度の５，６α−ＥＣ及び単一濃度のＨＡの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を使用して測定された。（ｃ）この反応生成物は質量分析によって特徴付けられ、予想された５１４．４３７１の質量を与え、ＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生成が確認された。（ｄ）ｈＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生合成反応は、１０mMのＣＤＮＢの存在下、１μMから１mMの範囲の漸増濃度のＧＳＨ、（ｅ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣを用いて行なわれた。
【図３ｃ】ｈＧＳＴＡ１による５，６α−ＥＣのヒスタミン化の測定。５，６α−ＥＣのヒスタミン化は、（ａ）漸増濃度のＨＡ及び単一濃度の５，６α−ＥＣ、又は（ｂ）漸増濃度の５，６α−ＥＣ及び単一濃度のＨＡの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を使用して測定された。（ｃ）この反応生成物は質量分析によって特徴付けられ、予想された５１４．４３７１の質量を与え、ＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生成が確認された。（ｄ）ｈＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生合成反応は、１０mMのＣＤＮＢの存在下、１μMから１mMの範囲の漸増濃度のＧＳＨ、（ｅ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣを用いて行なわれた。
【図３ｄ】ｈＧＳＴＡ１による５，６α−ＥＣのヒスタミン化の測定。５，６α−ＥＣのヒスタミン化は、（ａ）漸増濃度のＨＡ及び単一濃度の５，６α−ＥＣ、又は（ｂ）漸増濃度の５，６α−ＥＣ及び単一濃度のＨＡの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を使用して測定された。（ｃ）この反応生成物は質量分析によって特徴付けられ、予想された５１４．４３７１の質量を与え、ＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生成が確認された。（ｄ）ｈＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生合成反応は、１０mMのＣＤＮＢの存在下、１μMから１mMの範囲の漸増濃度のＧＳＨ、（ｅ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣを用いて行なわれた。
【図３ｅ】ｈＧＳＴＡ１による５，６α−ＥＣのヒスタミン化の測定。５，６α−ＥＣのヒスタミン化は、（ａ）漸増濃度のＨＡ及び単一濃度の５，６α−ＥＣ、又は（ｂ）漸増濃度の５，６α−ＥＣ及び単一濃度のＨＡの存在下で組換えｈＧＳＴＡ１を使用して測定された。（ｃ）この反応生成物は質量分析によって特徴付けられ、予想された５１４．４３７１の質量を与え、ＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生成が確認された。（ｄ）ｈＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生合成反応は、１０mMのＣＤＮＢの存在下、１μMから１mMの範囲の漸増濃度のＧＳＨ、（ｅ）又は１μMの５，６β−ＥＣ又は１０μMのＣＴ、ＯＣＤＯ、２７−ＨＣ、又は２２（Ｒ）−ＨＣを用いて行なわれた。
【図４ａ】ＨＥＫ２９３におけるＧＳＴＡ１の発現は、ＤＤＡＳ活性を誘導した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｈＧＳＴＡ１（ｐ−ｈＧＳＴＡ１）をコードしているプラスミドを用いてトランスフェクションすることによるｈＧＳＴＡ１の発現は、ウェスタンブロット（ａ）及び免疫細胞化学法（ｂ）によって確認された。ｈＧＳＴＡ１の機能性は、ＤＣＮＢグルタチオン付加（ｃ）の測定によって確認された。（ｄ）トランスフェクトされた細胞は、ＤＤＡの生合成を活性化し、したがってＤＤＡＳ活性を活性化した。
【図４ｂ】ＨＥＫ２９３におけるＧＳＴＡ１の発現は、ＤＤＡＳ活性を誘導した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｈＧＳＴＡ１（ｐ−ｈＧＳＴＡ１）をコードしているプラスミドを用いてトランスフェクションすることによるｈＧＳＴＡ１の発現は、ウェスタンブロット（ａ）及び免疫細胞化学法（ｂ）によって確認された。ｈＧＳＴＡ１の機能性は、ＤＣＮＢグルタチオン付加（ｃ）の測定によって確認された。（ｄ）トランスフェクトされた細胞は、ＤＤＡの生合成を活性化し、したがってＤＤＡＳ活性を活性化した。
【図４ｃ】ＨＥＫ２９３におけるＧＳＴＡ１の発現は、ＤＤＡＳ活性を誘導した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｈＧＳＴＡ１（ｐ−ｈＧＳＴＡ１）をコードしているプラスミドを用いてトランスフェクションすることによるｈＧＳＴＡ１の発現は、ウェスタンブロット（ａ）及び免疫細胞化学法（ｂ）によって確認された。ｈＧＳＴＡ１の機能性は、ＤＣＮＢグルタチオン付加（ｃ）の測定によって確認された。（ｄ）トランスフェクトされた細胞は、ＤＤＡの生合成を活性化し、したがってＤＤＡＳ活性を活性化した。
【図４ｄ】ＨＥＫ２９３におけるＧＳＴＡ１の発現は、ＤＤＡＳ活性を誘導した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｈＧＳＴＡ１（ｐ−ｈＧＳＴＡ１）をコードしているプラスミドを用いてトランスフェクションすることによるｈＧＳＴＡ１の発現は、ウェスタンブロット（ａ）及び免疫細胞化学法（ｂ）によって確認された。ｈＧＳＴＡ１の機能性は、ＤＣＮＢグルタチオン付加（ｃ）の測定によって確認された。（ｄ）トランスフェクトされた細胞は、ＤＤＡの生合成を活性化し、したがってＤＤＡＳ活性を活性化した。
【図５ａ】ヒト乳腺腫瘍及び正常組織におけるＤＤＡＳの発現及び内因性ＤＤＡの定量化。患者の生検材料におけるＤＤＡＳ発現の免疫組織化学的染色の顕微鏡写真。染色液は、ヘマトキシリンを用いて対比染色されるジアミノベンジジンである。（ａ）ＤＤＡＳは、（１）授乳性乳管終末単位（ＬＴＤＵ）及び（３）授乳性乳管（ＬＤ）において特異的に発現されるが腫瘍細胞には発現されない（１、３）。ＤＤＡＳは、上皮細胞ＬＤ及びＬＤＴＵの細胞質に発現される（２、４）。（ｂ）免疫染色後の正常な乳房及び腫瘍におけるＤＤＡＳの発現の定量は、「方法」の章に記載されている通りに実施された（０は発現せず、３は高い発現である）。「方法」の章に記載されているように５０人の患者に由来する腫瘍及び隣接する正常組織におけるＤＤＡを定量した。（ｃ）各々の記号は、２回分析した各々の正常試料又は腫瘍試料におけるＤＤＡの平均濃度を示す。黒い線は、グループの試料の平均値±標準誤差を示す（＊Ｐ＜０．００１）。（ｄ）正常組織と対応する腫瘍との間のＤＤＡレベルの対比較（ｐ＝０．０２４、ｎ＝５０、対応のあるウィルコクソン符号順位検定）。
【図５ｂ】ヒト乳腺腫瘍及び正常組織におけるＤＤＡＳの発現及び内因性ＤＤＡの定量化。患者の生検材料におけるＤＤＡＳ発現の免疫組織化学的染色の顕微鏡写真。染色液は、ヘマトキシリンを用いて対比染色されるジアミノベンジジンである。（ａ）ＤＤＡＳは、（１）授乳性乳管終末単位（ＬＴＤＵ）及び（３）授乳性乳管（ＬＤ）において特異的に発現されるが腫瘍細胞には発現されない（１、３）。ＤＤＡＳは、上皮細胞ＬＤ及びＬＤＴＵの細胞質に発現される（２、４）。（ｂ）免疫染色後の正常な乳房及び腫瘍におけるＤＤＡＳの発現の定量は、「方法」の章に記載されている通りに実施された（０は発現せず、３は高い発現である）。「方法」の章に記載されているように５０人の患者に由来する腫瘍及び隣接する正常組織におけるＤＤＡを定量した。（ｃ）各々の記号は、２回分析した各々の正常試料又は腫瘍試料におけるＤＤＡの平均濃度を示す。黒い線は、グループの試料の平均値±標準誤差を示す（＊Ｐ＜０．００１）。（ｄ）正常組織と対応する腫瘍との間のＤＤＡレベルの対比較（ｐ＝０．０２４、ｎ＝５０、対応のあるウィルコクソン符号順位検定）。
【図５ｃ】ヒト乳腺腫瘍及び正常組織におけるＤＤＡＳの発現及び内因性ＤＤＡの定量化。患者の生検材料におけるＤＤＡＳ発現の免疫組織化学的染色の顕微鏡写真。染色液は、ヘマトキシリンを用いて対比染色されるジアミノベンジジンである。（ａ）ＤＤＡＳは、（１）授乳性乳管終末単位（ＬＴＤＵ）及び（３）授乳性乳管（ＬＤ）において特異的に発現されるが腫瘍細胞には発現されない（１、３）。ＤＤＡＳは、上皮細胞ＬＤ及びＬＤＴＵの細胞質に発現される（２、４）。（ｂ）免疫染色後の正常な乳房及び腫瘍におけるＤＤＡＳの発現の定量は、「方法」の章に記載されている通りに実施された（０は発現せず、３は高い発現である）。「方法」の章に記載されているように５０人の患者に由来する腫瘍及び隣接する正常組織におけるＤＤＡを定量した。（ｃ）各々の記号は、２回分析した各々の正常試料又は腫瘍試料におけるＤＤＡの平均濃度を示す。黒い線は、グループの試料の平均値±標準誤差を示す（＊Ｐ＜０．００１）。（ｄ）正常組織と対応する腫瘍との間のＤＤＡレベルの対比較（ｐ＝０．０２４、ｎ＝５０、対応のあるウィルコクソン符号順位検定）。
【図５ｄ】ヒト乳腺腫瘍及び正常組織におけるＤＤＡＳの発現及び内因性ＤＤＡの定量化。患者の生検材料におけるＤＤＡＳ発現の免疫組織化学的染色の顕微鏡写真。染色液は、ヘマトキシリンを用いて対比染色されるジアミノベンジジンである。（ａ）ＤＤＡＳは、（１）授乳性乳管終末単位（ＬＴＤＵ）及び（３）授乳性乳管（ＬＤ）において特異的に発現されるが腫瘍細胞には発現されない（１、３）。ＤＤＡＳは、上皮細胞ＬＤ及びＬＤＴＵの細胞質に発現される（２、４）。（ｂ）免疫染色後の正常な乳房及び腫瘍におけるＤＤＡＳの発現の定量は、「方法」の章に記載されている通りに実施された（０は発現せず、３は高い発現である）。「方法」の章に記載されているように５０人の患者に由来する腫瘍及び隣接する正常組織におけるＤＤＡを定量した。（ｃ）各々の記号は、２回分析した各々の正常試料又は腫瘍試料におけるＤＤＡの平均濃度を示す。黒い線は、グループの試料の平均値±標準誤差を示す（＊Ｐ＜０．００１）。（ｄ）正常組織と対応する腫瘍との間のＤＤＡレベルの対比較（ｐ＝０．０２４、ｎ＝５０、対応のあるウィルコクソン符号順位検定）。
【００７５】
実施例：
材料及び方法
化学物質。［１４Ｃ］コレステロール（５８mCi/mmol）及び［３Ｈ］コレステロール（５３Ci/mmol）はパーキンエルマー社から購入した。ステロール、オキシステロール及び薬物はSteraloids社又はシグマアルドリッチ社製であった。ＤＤＡ及び５，６α−ＥＣ及び５，６β−ＥＣは公開されている手順に従って本発明者らの研究室で合成された１０、２７。３β，５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−イル−Ｓ−グルタチオン（ＣＤＯ−ＳＧ）は以前に記載１４されている通りに合成され、ＴＬＣによって９９％純粋であった。溶媒はシグマ社、フィッシャー社、Scharlau社、又はＶＷＲ社製であった。ＴＬＣプレートはマッハライ・ナーゲル社製であった。Ｃ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｃｋカートリッジはウォーターズ社製であった。
【００７６】
ＧＳＴＡ１活性の測定。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ活性は、Habig et al２８の方法に従って測定された。簡潔に言えば、２μgのｈＧＳＴＡ１（ＮＢＰ１−３０３０７、ノーバス社）を、０．１Mリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中１mMグルタチオン及びエタノール中１００μM １−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ、シグマ社）（２．８５％vol/vol）の存在下でインキュベートした。混合物を３０℃で３０分間インキュベートし、反応をＭｅＯＨ ２００μlを用いて停止した。測定は、３４５nmで分光光度測定法で行なわれた（Ａｍ＝８．５mM−１．ｃｍ−１）。陰性対照は、ｈＧＳＴＡ１の非存在下で実施された同じ試験に対応する。
【００７７】
ＣＤＯ−ＳＧ及びＤＤＡの生合成の測定。０．１Mリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、２μgのｈＧＳＴＡ１（１μg/μl）を含む１００μlの最終アッセイ容量を、漸増濃度の［３Ｈ］５，６α−ＥＣ（５０nMから５００nM）、ＧＳＨ（１μMから１mM）又はＨＡ（０．１から１００μM）と共にインキュベートした。混合物を３０℃で３０分間インキュベートし、反応をＭｅＯＨ ２００μlの添加によって停止した。１８，０００ｇ（４℃）で１０分間遠心分離した後、上清をspeed vac遠心濃縮装置（Savant SP01010、サーモサイエンティフィック社）を使用して蒸発乾固し、残渣をＭｅＯＨ ２０μlに再懸濁した。試料をHPTLC NanoSilgur 10×10cmプレート（マッハライ・ナーゲル社、参照番号８１１０４２）上にスポットし、ＣＤＯ−ＳＧについては酢酸エチル／ブタノール／酢酸／水（６：２：３：２）、ＤＤＡについてはＣＨ２Ｃｌ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ８４：１５：１を使用して展開した。標準物質を試料と共に同じ場所にスポットした。プレートを硫酸への含浸及び加熱によって明らかとした。放射能を、標準の５，６α−ＥＣ、ＣＤＯ−ＳＧ又はＤＤＡ標準物質に対応する保持係数（Ｒｆ）でスクラップしたシリカのエタノール抽出物の液体シンチレーション計数によって定量した。
【００７８】
細胞培養。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣ製であった。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃で５％ＣＯ２を含む加湿化雰囲気中で、１．２mMグルタミン、５％ウシ胎児血清、ペニシリン、及びストレプトマイシン（５０単位／mL）の補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。
【００７９】
ＨＥＫ２９３ＴにおけるｈＧＳＴＡ１の発現。細胞を、インビトロジェン社（プログラム１３、５×１０６個の細胞）の説明書に従ってＮｅｏｎ（商標）トランスフェクションシステムを使用してトランスフェクトした。細胞を、偽プラスミド ４μg（ｐＣＭＶ６−ＡＣ、ＰＳ１０００２０、オリジーン社）又はｈＧＳＴＡ１をコードしているプラスミド（ｐＣＭＶ６−ｈＧＳＴＡ１、ＳＣ３２１９００、オリジーン社）を用いてトランスフェクトした。タンパク質を、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（NuPAGE Novex インビトロジェン社、４〜１２％ビス−トリスタンパク質ゲル、ＮＰ０３３５ＢＯＸ）上で分離し、ＰＶＤＦ膜上に電子転写し、ウサギ抗ＧＳＴＡ１抗体（ＰＡ５−２９８１１、サーモサイエンティフィック社）又は抗アクチン抗体（Ｃ４、ＭＡＢ１５０１、ミリポア社）と共に４℃で一晩インキュベートした。可視化は、ＥＣＬプラスキット（ピアス社）を使用して行なわれ、ChemiDoc（商標）MPイメージングシステム（バイオラッド社）を用いて明らかとした。免疫細胞化学法を、抗ｈＧＳＴＡ１抗体（ＰＡ５−２９８１１、サーモサイエンティフィック社、希釈率１／５００）を使用して以前に記載１０されている通りに行ない、ギムザ染色後に抗ＨＲＰ二次抗体（アブキャム社、抗ウサギＩｇＧ抗体、１／５００）を用いて明らかとした。
【００８０】
ｈＧＳＴＡ１を用いてトランスフェクトされた細胞におけるＤＤＡ生合成の測定。トランスフェクトされた細胞を、１ウェルあたり１０００００個の細胞で３つ組の６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、ＥｔＯＨ ０．１％中［１４Ｃ］−５，６αＥＣ（０．０７２μCi）と共にインキュベートした。４８時間後、細胞を１００μMのＨＡと共に９６時間インキュベートした。次いで、細胞を掻爬し、１，４００rpmで５分間の遠心分離によってペレット化し、次いで、抽出し、展開し、組換えｈＧＳＴＡ１と用いて記載の通りに分析した。
【００８１】
ＭＳ実験。質量分析実験を、ポジティブモードで作動しているＨＥＳｉ−ＩＩプローブエレクトロスプレーイオン化源を備えたExactive質量分析計（サーモサイエンティフィック社）で行なった。シリンジポンプ及び５００μLのシリンジ（サーモサイエンティフィック社）を使用して１０μL/分の流速で試料を導入した。ExactiveＭＳを１００fmol/μLのデンドロゲニンＡ溶液を使用して調整してパラメーターを最適化した。最適化されたパラメーターは以下の通りであった：スプレー電圧、３．８kV；加熱されたキャピラリー温度、１５０℃；キャピラリー電圧、８２．５０Ｖ；チューブレンズ電圧、１８５Ｖ；スキマー電圧、３４Ｖ、シースガス（窒素）流速、２０（任意単位）；補助ガス流速、１０（任意単位）。装置は１スペクトルあたり２回のマイクロスキャンを用いて５０ミリ秒の最大注入時間に設定された。データはThermo Exactive Tuneソフトウェアを介して取得した。
【００８２】
組織の調製。全てのヒト試料を、ピュルパン大学病院及びClaudius Regaud研究所の治験審査委員会の承認を得て回収した。手術による切除によって得られた正常組織及び腫瘍ヒト組織を−８０℃で凍結保存し、使用前に氷中で解凍した。患者の臨床特徴及び腫瘍病理特色は医学報告から得られ、本発明者らの施設で標準的な手順に従った。組織をポリトロンＢホモジナイザーを用いて緩衝液Ａ（５０mMトリス、０．５％ブチル化ヒドロキシトルエン（５mg/ml）、１５０mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）（５vol/gの組織）中で４℃でホモジナイズし、２，５００r.p.m.で５分間遠心分離した。ホモジネート及び血清を緩衝液Ａで希釈し、１mlあたり１０mgのタンパク質の試料を得た。腫瘍及び正常の匹敵する組織のＤＤＡの定量を以前に記載１０されている通りに正確に実施した。
【００８３】
免疫組織化学法。ヒト組織をｈＧＳＴＡ１発現について分析した。免疫組織化学的染色を、特異的な抗ヒトｈＧＳＴＡ１抗体（ＰＡ５−２９８１１、サーモサイエンティフィック社）を使用してパラフィンに包埋された組織切片に対して行なった。パラフィン切片の免疫染色の前に、１０mMクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中でマイクロ波オーブンを用いて２回、各回１０分間かけて加熱することによって抗原賦活技術を行なった。室温で１時間抗体と共にインキュベートした後、切片を、ビオチンにコンジュゲートさせたポリクローナル抗ウサギ免疫グロブリン抗体、その後、ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（Vectastain ABCキット、ベクターラボラトリーズ社、ＣＡ州）と共にインキュベートし、次いでヘマトキシリンを用いて対比染色した。陰性対照を、一次抗体を含まない緩衝化溶液中でインキュベートした。免疫組織化学法を、ポリリジンでコーティングされたスライド上に積載された、５０個の症例に由来する３μm厚の代表的な全組織切片に対して実施した。ｈＧＳＴＡ１抗体（ＰＡ５−２９８１１、サーモサイエンティフィック社）を１：１００で使用した。熱により誘導される抗原賦活を使用した：ｈＧＳＴＡ１抗体のための前処理モジュール（ラブビジョン社、フリーモント、ＣＡ州、米国）でｐＨ６．０の緩衝液中で３０分間。切片を、メタノール中１．５％Ｈ２Ｏ２を用いて１０分間かけて遮断し、室温で６０分間ｈＧＳＴＡ１抗体と共にインキュベートした。製造業者の推奨に従って、ベクターアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）システム（ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、ＣＡ州、米国）を用いて、３，３’−ジアミノベンジジン（ダコ社、グロストラップ、デンマーク）を発色基質として使用して検出を成し遂げた。スライドをヘマトキシリンを用いて軽度に対比染色した。陽性対照（正常な乳房切片）及び陰性対照（一次抗体の削除、及び一次抗体をＩｇＧの一致する対照により置換）を各実験に含めた。２つの抗体を用いて得られたｈＧＳＴＡ１免疫染色を、染色強度と染色細胞の比率を合わせたオールレッドスコアリングシステムを使用して５人の著者（ＭＶ、ＳＳＰ、ＭＰ、ＦＤ、及びＭＬＴ）によって独立して分析した（強度スコア０〜３＋％スコア０〜５）２９。各場合において、スコアを、細胞質、核、及び膜の反応性について別々に評価した。２を超えるオールレッドスコアは陽性と判断した。ｈＧＳＴＡ１クローンを用いての免疫組織化学的分析は、ＨＥＫ２３Ｔ−ｈＧＳＴＡ１クローンの分析結果に盲目である観察者により行なわれた。線維腫症との比較のために、本発明者らは、葉状腫瘍の間質細胞中及び異形成癌の最も豊富な成分中のβ−カテニンの発現パターン及び発現レベルを考えた。データ分析を、各抗体を用いて及びまた合わせた結果を用いて得られた結果を用いて行なった（すなわち、核／細胞質染色について、陽性とは、少なくとも１つの抗体について陽性として定義され；膜染色については最も高いオールレッドスコアが考慮された）。
【００８４】
統計分析。数値は、各々２回行なわれた３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。統計分析は、対応のない変数のためのスチューデントｔ検定を使用して行なわれた。図中の＊及び＊＊は、溶媒ビヒクルのみを受けた対照細胞と比較した、それぞれ０．００１未満及び０．０００１未満の統計的確率（Ｐ）を指す。患者の組織を、ウィルコクソン符号順位検定を用いて有意性及び対応性について分析した。図では、＊、＊＊、及び＊＊＊は、特記しない限り対照（ビヒクル）と比較して、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、及びＰ＜０．００１を指す。プリズムソフトウェアを全ての分析のために使用した。
【００８５】
結果
ｈＧＳＴＡ１はＤＤＡ生合成を触媒した。
市販されているｈＧＳＴＡ１は機能的に活性であることが判明し、生体異物である１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）とＧＳＨのコンジュゲーションを触媒して、ＣＤＮＢについてはＫｍＣＤＮＢ＝３２．２μM、ＶｍＣＤＮＢ＝２７４μmol/分/mgタンパク質、ＧＳＨについてはＫｍＧＳＨ＝３５．１μM、ＶｍＧＳＨ＝８．１２μmol/分/mgタンパク質でＳ−（２，４−ジニトロフェニル）−グルタチオン（ＣＤＮＢ−ＳＧ）を与えた（図２ａ〜ｂ及び表１）。５，６−ＥＣ及びＨＡは、ＣＤＮＢ−ＳＧ生合成の阻害剤ではなかった（図２ｃ）。それ故、本発明者らは、ｈＧＳＴＡ１が、ラットＧＳＴ Ｂで報告１４、１５されているように［１４Ｃ］−５，６−ＥＣ及びＧＳＨからＣＤＯ−ＳＧの形成を触媒することができるかどうかを試験した。本発明者らは、ｈＧＳＴＡ１が、Ｋｍ５，６ＥＣ＝０．４４μM及びＫｍＧＳＨ＝４７μMでＣＤＯ−ＳＧの生合成を触媒したが、酵素の非存在下では全く反応が起こらないことを示し、これによりそれはＣＤＯ−ＳＧ生合成には必須の必要条件であることが確立された（図２ｄ〜ｆ、及び表１）。本発明者らは、ｈＧＳＴＡ１が、ＣＤＮＢに対してよりも５，６−ＥＣに対して７３倍高い親和性を有することを見出し、一方、ＫｍＧＳＨは、両方の触媒活性について同じ範囲内であった。最大速度は、Ｖｍ５，６−ＥＣ＝１．３３pmol/分/mgタンパク質、ＶｍＧＳＨ＝１．５０pmol/分/mgタンパク質であり（表１）、このことは、ＣＤＮＢ−ＳＧを生成するよりもＣＤＯ−ＳＧを生成する能力の方が２４×１０６倍弱いことを示す。ＣＤＮＢはＣＤＯ−ＳＧ生合成を阻害しなかったが、ＨＡは反応の強力な阻害剤であり（図２ｇ）、このことは、ＨＡがｈＧＳＴＡ１の基質である可能性を示唆する。本発明者らは次に、Ｂ環オキシステロール、例えば５，６β−ＥＣ、ＣＴ及びＯＣＤＯがＣＤＯ−ＳＧ生合成の強力な阻害剤であり、側鎖オキシステロールは１０μMまで阻害剤ではないことを見出した（図２ｈ）。
【００８６】
本発明者らは次に、ｈＧＳＴＡ１が、Ｋｍ５，６ＥＣ＝０．２８μM及びＫｍＨＡ＝０．３５μMで、最大速度：Ｖｍ５，６ＥＣ＝０．８１pmol/分/mgタンパク質及びＶｍHA＝０．６６pmol/分/mgタンパク質で、［１４Ｃ］−５，６−ＥＣ及びＨＡからＤＤＡの生合成を触媒したことを示した（図３ａ〜ｂ、表１）。自然に生じた生体異物コンジュゲーションについて見られたものとは対照的に、酵素の非存在下では全く反応は起こらなかった。ｈＧＳＴＡ１はＣＤＮＢとＧＳＨのコンジュゲーション反応を容易にするか又は促進することが知られているが、本発明者らはここで、ＤＤＡＳがＤＤＡ生合成のために絶対に必要とされることを示した。ｈＧＳＴＡ１によるＤＤＡの生成は、ＤＤＡに特徴的である１０ＭＳ２において４９６の断片を与える質量５１４を有するＭＳ１親ピークを与える質量分析（図３ｃ）によって確認された。ｈＧＳＴＡ１は、その報告された内因性濃度の範囲内で、５，６α−ＥＣ及びＨＡに対して同等な親和性を示した（［５，６−ＥＣ］＝０．５μM６、［ＨＡ］＝１２μM１７）。次に本発明者らは、ＧＳＨがＤＤＡの生合成を用量依存的に阻害し、５２μMのＩＣ５０を与えたが、ＣＤＮＢはこの反応を阻害せず、そしてＢ環オキシステロールはＤＤＡＳの阻害剤であったが、側鎖のオキシステロールは阻害剤ではなかったことを示した（図３ｄ）。５，６β−ＥＣは、本発明者らが試験したオキシステロールシリーズの最も強力な阻害剤であることが判明した（図３ｅ）。ｈＧＳＴＡ１が細胞内でＤＤＡＳを触媒したかどうかを決定するために、ｈＧＳＴＡ１をコードしているプラスミドをＨＥＫ２９３細胞内で発現させた。酵素の発現はウェスタンブロットによって確認され（図４ａ）、免疫細胞化学法は、酵素が主に細胞質内及び核内であったことを示した（図４ｃ）。本発明者らは、ｈＧＳＴＡ１でトランスフェクトされた細胞が、ＣＤＮＢにグルタチオン付加し（図４Ａ）、重要なことには、ＤＤＡＳ活性を示し、ｈＧＳＴＡ１がＤＤＡ生合成をインタクトな細胞内で触媒したことを確立した（図４ｄ）。まとめると、これらのデータは、ｈＧＳＴＡ１がＤＤＡの生合成を触媒したことを確立した。
【００８７】
ＤＤＡＳは、授乳性乳管及び小葉終末単位の上皮細胞において選択的に発現されている。
本発明者らは以前、正常な乳房の全抽出物においてＤＤＡを見出したが１０、ＤＤＡを産生する細胞の性質は依然として確立されていなかった。次いで、本発明者らは、患者の正常な乳房組織においてＤＤＡＳを免疫組織化学的に分析した。最後に、正常な乳房組織試料は、ＤＤＡＳについて９７．９％陽性であることが判明し、これは、全ての試料に由来する授乳性乳管及び小葉終末単位の上皮細胞において選択的に発現されていた。ＤＤＡＳは脂肪細胞、血管に由来する内皮細胞、線維芽細胞、又は筋上皮細胞には見られなかった。上皮細胞内のＤＤＡＳの細胞内局在は主に細胞質内で（図５ａ）、試料の４％において核内にも見られた。これらのデータは、ＤＤＡＳが授乳性乳管及び小葉終末単位の上皮細胞において選択的に発現され、したがって、乳房内のＤＤＡ産生源を同定することを確立した。
【００８８】
ＤＤＡＳは、乳癌（ＢＣ）細胞及び腫瘍において発現されていない。
本発明者らは以前に、ＢＣ細胞株がＤＤＡを産生していなかったことを示し１０、一貫して本発明者らは、これらの細胞がＤＤＡＳを発現していないことを見出した（補足表１）。本発明者らは次に、ＩＨＣによって乳癌患者に由来する５０個の腫瘍を分析し、ＤＤＡＳ発現が、正常な匹敵する組織と比較して患者の腫瘍においてかなり減少していた（図５ｂ）ことを示した。腫瘍内のＤＤＡレベルの分析は、４２５±２８８から４９．９±１０．７ng/mg（組織）まで平均して８倍のＤＤＡの減少を示し（図３ｃ）、重要なことには、正常組織と匹敵する腫瘍組織間でＤＤＡにおいて測定された減少は対応していた（ウィルコクソン検定、ｐ＜０．００５）（図３ｃ）。これらのデータは、ＤＤＡＳがＢＣ細胞には発現されず、ＢＣ腫瘍ではかなり減少し、この減少は本発明者らが測定したＤＤＡの減少と平行していたことを確立した。
【００８９】
考察：
ＤＤＡは、５，６α−ＥＣとＨＡのα−アミノ基との酵素により触媒されたコンジュゲーションの生成物として、哺乳動物において近年発見されたステロイド系アルカロイドである１０。ＤＤＡの発見は重要であった。なぜなら、ＤＤＡはＴＳ特性を有し、これはコレステロール代謝物として今まで報告されたことはなかった。さらに、ＤＤＡは、哺乳動物における新規なクラスのステロイド及びμM以下の親和性を有する新規なクラスのＬＸＲ内因性リガンドを規定する８、９、現在までに発見された最初の哺乳動物ステロイド系アルカロイドである１０。
【００９０】
ＤＤＡは、ＢＣ細胞株には見い出されず、ＢＣ生検材料に少量見られ、このことは、ＢＣにおけるＤＤＡ代謝の脱調節を確立した。したがって、ＤＤＡシンターゼ（ＤＤＡＳ）の同定は、この脱調節を解明するための重要な挑戦であった。
【００９１】
本発明者らは、ｈＧＳＴＡ１がＤＤＡＳ活性のための可能性ある候補であったと仮定した。なぜなら、そのラットオルソログのＧＳＴ−Ｂは、５，６α−ＥＣ及び求核試薬としてのＧＳＨを使用して、類似の反応を触媒すると報告されたからであった。２つの異なるグループは、ＧＳＴ−Ｂが５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−イル−Ｓ−グルタチオン（ＣＤＯ−ＳＧ）の立体選択的な生合成を触媒し、これはＤＤＡと同じＣ５αＯＨ−Ｃ６β置換立体化学を示すことを示した１４、１５。本発明者らは、本研究において、そのヒトオルソログ（ｈＧＳＴＡ１）もまたＣＤＯ−ＳＧ生合成を触媒することを報告し、ヒト酵素がラット酵素と同じ反応を触媒し、内因性基質として５，６α−ＥＣ及びＧＳＨを使用したことを確立した。５，６α−ＥＣの転換について得られたＫｍは０．４４μMであり、これは、哺乳動物組織において測定された５，６α−ＥＣの０．５μMの内因性濃度と一致している６。ＧＳＨをＨＡによって置換すると、本発明者らは、ｈＧＳＴＡ１が、５，６α−ＥＣについては類似したＫｍ、及びＧＳＨよりもＨＡに対して１３５倍弱いＫｍで、５，６α−ＥＣからＤＤＡの生合成を触媒し、基質としてＧＳＨよりもＨＡに対するｈＧＳＴＡ１の選択性を確立した。ここでも、ＨＡの転換について得られたＫｍは０．３５μMであり、これはヒト乳房においてＨＡについて見られた内因性濃度と一致する１７。本発明者らは、ｈＧＳＴＡ１の異物性基質のＣＤＮＢはＣＤＯ−ＳＧ及びＤＤＡの生合成を阻害しなかったことを見い出し、このことは、ＣＤＮＢ及び５，６α−ＥＣに対する結合部位が異なっていたことを示唆する。ｈＧＳＴＡ１に以前に起因した生理機能は生体異物の解毒、ステロイド産生１８、及びＧＳＨとのコンジュゲーションによる５，６α−ＥＣの排除１４であった。ＧＳＴＡ１は、ＣＤＮＢと比較して５，６α−ＥＣを転換する６０倍高い触媒効率、及びＧＳＨと比較してＨＡを転換する６０倍高い触媒効率を有する。本発明者らは次に、細胞内のＧＳＴＡ１の発現がＤＤＡＳ活性を誘導したことを確立した。要するに、これらのデータは、ＧＳＴＡ１が、ＧＳＴＡ１の主な機能であり得るＤＤＡＳ活性を触媒したことを示した。
【００９２】
５，６α−ＥＣのジアステレオ異性体である５，６β−ＥＣがＤＤＡＳの強力な阻害剤であったという事実は興味深い。なぜなら、それはＤＤＡの生合成に潜在的に影響を及ぼす可能性があるからである。５，６β−ＥＣはＲＯＳにより活性化される脂質過酸化の主要な生成物であり６、１９、このことは、炎症が腫瘍サプレッサーであるＤＤＡの産生に対して有害である可能性があり、したがって、発癌性の原因となる可能性があることを示唆する。ここ７０年間で、ワタベのグループは、コレステロールからのＤＤＡの生合成に寄与する代謝物経路の存在を支援する、コレステロール５，６αエポキシダーゼの存在を報告している２０。彼らは、依然として同定されていないシトクロムＰ４５０が５，６α−ＥＣの立体選択的生合成を触媒したことを示した２０。このシトクロムＰ４５０を同定するためにさらなる研究が現在必要とされている。
【００９３】
正常な乳房は、様々な種類の細胞を含有している不均一な組織である。ＨＩＣ試験は、ＤＤＡＳが、乳房内のＤＤＡ産生の細胞性起源を与える乳管及び小葉に由来する上皮細胞の細胞質に選択的に発現されていることを明らかとした。ＢＣ腫瘍内にＤＤＡＳが存在しないことは、腫瘍内に見られるＤＤＡの含量の減少を説明する。ＤＤＡＳの発現欠如に起因するＢＣ組織内でのＤＤＡの不在は、それぞれ乳管癌及び乳房上皮過形成組織において測定されたＨＡ１７、２１及び５，６−ＥＣ２２の量の増加に一致する。スタチンは、心臓血管疾患の予防のために処方される広く使用されている抗コレステロール薬であるが２３、乳癌の化学療法による予防におけるその利点はまだ議論が交わされている２４。スタチンの長期使用は近年、侵襲性乳管癌及び侵襲性小葉癌の両方のリスクを高めると報告され２５、ここでは本発明者らはＤＤＡＳの発現が低減していることを見い出したので、乳房内でのＤＤＡ含量に対するスタチンの影響の重要な疑問を提起し、これはさらなる調査に値する。
【００９４】
本発明者らは、ＤＤＡＳの発現が、乳癌組織内のＤＤＡレベルを反映することを見い出した。ＢＣ腫瘍内のＬＣ／ＭＳによるＤＤＡレベルの定量の正確度は、正常組織の混入の可能性によって限定され；さらに、この方法は手間がかかり高価である。ＤＤＡＳの同定は、免疫組織化学法によるＢＣ内のその発現の測定を可能とした。このアプローチは、ＤＤＡの定量よりも安価でより正確であり、組織病理プラットフォームのために有用であろう。
【００９５】
ＤＤＡは、肺、脳、及び脾臓などの様々な哺乳動物器官に検出されているが、それらの対応する腫瘍細胞株には存在しないことが判明している１０。これがＤＤＡＳ活性の欠失と相関するかどうかを決定するにはさらなる研究が必要とされるであろう。
【００９６】
ＤＤＡは、測定可能な量のＤＤＡを含有せず８〜１１そしてＧＳＴＡ１を発現していないか又は弱くしか発現していない２６、様々な起源の腫瘍細胞株に対して活性であった。したがって、ＧＳＴＡ１の不在、及びＤＤＡの分子標的であるＬＸＲβの発現は、ＤＤＡに対する応答を予測し得る。
【００９７】
要約すると、本発明者らは、本研究において、腫瘍サプレッサーのデンドロゲニンＡの生合成を触媒する酵素であるＤＤＡＳの初めての同定及び分子同定を報告する。
【００９８】
【表１】
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ＣＤＮＢ：１，クロロ−２，４−ジニトロベンゼン；ＧＳＨ：グルタチオン；ＣＤＮＢ−Ｓ−Ｇ：Ｓ−（２，４−ジニトロフェニル）−グルタチオン；５，６α−ＥＣ：５，６α−エポキシ−コレステロール；５，６βＥＣ：５，６β−エポキシ−コレステロール；Ｈｉｓ：ヒスタミン：ＣＤＯ−ＳＧ：５α−ジヒドロキシコレスタン−６β−イル−Ｓ−グルタチオン；デンドロゲニンＡ（ＤＤＡ）：５α−ヒドロキシ−６β−［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチルアミン］コレスタン−３β−オール；５α−ヒドロキシ−６β−［Ｓ−グルタチオン］コレスタン−３β−オール，３β
【００９９】
【表２】
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【０１００】
参考文献
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０１】
【表３】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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