(57)【要約】  皮膚修復および安定化の方法であって、オレアノール酸のペンタペプチドコンジュゲートと皮膚細胞とを接触させるステップを含み、その結果、皮膚細胞において修復および安定化を可能にする遺伝子およびタンパク質の発現を生じさせる、分子レベルでの細胞情報伝達増加の効果が実現される方法が開示される。本発明は、皮膚におけるトランスフォーミング成長因子−βおよび線維芽細胞成長因子の遺伝子の発現を増加させることにおける、オレアノール酸のペンタペプチドコンジュゲートの効果を実証する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト線維芽細胞におけるトランスフォーミング成長因子−βの発現を増加させる方法であって、ヒト線維芽細胞と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、細胞外マトリックスタンパク質、特にコラーゲン合成の調節を生じさせるステップを含む、方法。
【化１】
2018505890.tif 000006
(STR#1)
【請求項２】
ヒト線維芽細胞における線維芽細胞成長因子の発現を増加させる方法であって、ヒト線維芽細胞と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、皮膚瘢痕減少の効果を生じさせるステップを含む、方法。
【化２】
2018505890.tif 000007
(STR#1)
【請求項３】
ヒト皮膚におけるＨＳＰ９０遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、コラーゲンを修復および再構築する効果を生じさせるステップを含む、方法。
【化３】
2018505890.tif 000008
(STR#1)
【請求項４】
ヒト皮膚におけるＨＳＰ  ４７遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、プロコラーゲン合成をプロセシングする効果を生じさせるステップを含む、方法。
【化４】
2018505890.tif 000009
(STR#1)
【請求項５】
ヒト皮膚におけるＬＯＸ（リシルオキシダーゼ）遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、細胞外マトリックスリモデリングの効果を生じさせるステップを含む、方法。
【化５】
2018505890.tif 000010
(STR#1)
【請求項６】
ヒト皮膚におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）遺伝子の組織阻害剤の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、マトリックスメタロプロテイナーゼ様コラゲナーゼおよびエラスターゼの阻害を生じさせるステップを含む、方法。
【化６】
2018505890.tif 000011
(STR#1)
【請求項７】
コルネオデスモシン（ＣＤＳＮ）、クラウジン７（ＣＬＤＮ７）、フィラグリン（ＦＬＧ）、最近角質化したエンベロープ３Ｄ（ＬＣＥ３Ｄ）、ロリクリン（ＬＯＲ）およびインテグリンベータ４（ＩＴＧＢ４）からなる群から選択される皮膚のバリア機能を改善する遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む、方法。
【化７】
2018505890.tif 000012
(STR#1)
【請求項８】
ロリクリン（ＬＯＲ）およびカルモジュリン様５（ＣＡＬＭＬ５）からなる群から選択される、ヒト皮膚における角化細胞の分化を増加させる遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む、方法。
【化８】
2018505890.tif 000013
(STR#1)
【請求項９】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲＤ）、腫瘍タンパク質ｐ６３（ＴＰ６３）およびＫｉ−６７抗体により同定された抗原（ＭＫＩ６７）からなる群から選択される、皮膚における細胞周期および細胞増殖を改善する遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む、方法。
【化９】
2018505890.tif 000014
(STR#1)
【請求項１０】
皮膚におけるアクアポリン５遺伝子（ＡＱＰ５）の発現を増加させることにより皮膚の水和を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む、方法。
【化１０】
2018505890.tif 000015
(STR#1)
【請求項１１】
皮膚における関連するトランスフォーミング成長因子−ベータ１（ＴＧＦＢ１）遺伝子の発現を増加させることにより、皮膚におけるコラーゲン合成を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む、方法。
【化１１】
2018505890.tif 000016
(STR#1)
【請求項１２】
皮膚における関連する骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）遺伝子の発現を増加させることにより、皮膚におけるメラニン形成を誘発する方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む、方法。
【化１２】
2018505890.tif 000017
(STR#1)
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
【０００２】
本願は、２０１５年２月５日出願の米国特許出願第１４／６１４，５３８号のＰＣＴ出願であり、これは２０１０年１２月２８日出願の「ＯＬＥＡＮＯＹＬＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＡＮＤ  Ａ  ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＳＫＩＮ  ＡＧＩＮＧ」という表題の米国特許出願第１２／９７９，６６７号の一部継続であり、後者はさらに「ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＷＩＴＨ  ＴＲＩＴＥＲＰＥＮＯＩＤＳ  ＡＮＤ  ＳＭＡＬＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ：ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＩＮ  ＯＳＭＥＣＥＵＴＩＣＡＬＳ」という表題の２００７年８月７日出願の出願番号１１／８３５，１６５の一部継続であり、これによりこれら両者は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、オレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する組成物、ならびに関連する遺伝子発現の調節により皮膚を修復および安定化する方法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
皮膚の外見および状態は、天然に生じる環境要因（日光、風による擦傷、湿度など）もしくは人為的な環境要因（加熱、空調、汚染物質など）、病理学的過程、例えば、皮膚科の疾患または正常な老化過程の効果により劣化し得る。皮膚が曝露される種々の傷害の原因は、個々にまたは相乗的に作用し得る。年月の経過により起こり得る皮膚の質の劣化を改善または予防するために、消費者は、皮膚の手入れに関する、新しいまたは改善された化粧用組成物および化粧方法を益々求めてきた。そのような製品または方法は、老化過程の可視的徴候、例えば、皺、線の出現、皮膚の張りの喪失、皮膚の薄化、色素沈着過剰または斑点形成および老人斑などを予防、遅延または逆行させる。そのような製品または方法は、敏感な、乾燥したまたははげ落ちやすい皮膚の外見および状態を改善し、ならびに／または他の可能な刺激物の中でも化学物質、風もしくは日光への曝露により刺激された皮膚を癒す。
【０００４】
高齢化人口に伴い、人体および、より特に、ヒトの皮膚に関する老化の研究が増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）してきている。例えば、小じわ、皺等の存在により示される老化皮膚の処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、多大の注目を受けてきた。小じわ、皺、たるみ、および色素沈着過剰などの皮膚の（ｄｅｒｍａｌ）老化の徴候は、手術、レーザ処置および化粧品を含む多くの方策によって闘われてきた。化粧の処置は、皮膚の老化の効果を変更するための種々のクリーム剤およびローション剤の使用を含む。先行技術における文献の多くは、数種類の有害な老化の影響の１つを予防する単一の主成分の使用に焦点を合わせている。例えば、１つの方策は、他の成分なしで皮膚細胞の再成長を刺激するために１種または複数のヒドロキシ酸またはレチノイン酸を使用してきた。この手法は、複数の供給源から来る皮膚における複数の薬剤の有害な相互作用により老化が惹起されて、複数の同時の損傷経路により皮膚に対する損傷が惹起されることを認識していないため、問題がある。
【０００５】
消費者は、皮膚の皺寄り、縦溝および深い皺寄りを処置する「老化防止」製品を益々求めている。顔面の表情線（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｎｅ）を処置するための高価なおよび苦痛のある化粧用の注射の出現により、効果的なおよび非侵襲的な局所用の代替品を見出すことにおける関心が高まった。
表情線は、成人年齢の初期に顔面の皮膚に生じる独特なタイプの皺である。それらは眼窩周囲、眉間、額および口周囲の領域における顔面の表情筋に解剖学的に関係する。微笑する、横目で見る、唇をすぼめるおよび眉間に皺を寄せる行為中におけるこれらの筋肉の活動は、顔面の他の領域におけるよりも顔面上の皮膚に大きい物理的応力をかける。この理由で、表情線は、表皮などの皮膚の解剖学的構造の非収縮性の要素に焦点を合わせるこれらの局所的処置にあまり応答しない。最も効果的であるためには、表情線の処置は、真皮（ｄｅｒｍｉｓ）と結びついた顔面の表情筋および筋線維要素の阻害も必然的に伴うべきである。横紋筋線維を弛緩させる多様な物質は、化粧用の先行技術に記載されている。問題は、先行技術の筋弛緩剤は、作用するのが遅く十分強くないか、または阻害効果が累積的でないかのいずれかであることである。さらに、これらの筋弛緩剤のいずれも顔面の筋肉の活動を弱めない。真皮の変形を急速に阻害する新たに発見された植物抽出物は、それを修復して若返らせる物質がより効果的になることを可能にする。
【０００６】
表情線は、顔面の表情の筋肉が皮膚の下でそれ自体収縮するかまたは縮まり、次に弛緩してその休止している長さに戻るときに形成される。皮膚も縮まって元へ戻ることはできるが、筋肉と同様ではない。それ故、皮膚は、筋肉が収縮するときに、曲がって内側に折りたたまれる傾向がある。下にある筋肉の縮まりおよび戻りに抵抗する皮膚の能力は、上側の真皮の質および健康に関係する。増加する年齢とともに、真皮の厚さ、弾性、コラーゲン含量および修復能力は減少する。皮膚は、この作用からもはや戻ることができず、真皮の線維状の細胞間のマトリックスは、弱まって壊れる。この点で、皮膚は、永続性の皺を発生している。皮膚のこの領域が顔面の表情の絶え間のない応力を受けるにつれて、皺は深まり続ける。
【０００７】
表情線の解剖学的構造
表情線と関係する皮膚は、顔面の他の場所で見出されるものと組織学的に異なる。皮下の結合組織の小葉間の隔膜は、横紋筋組織の線維（皮筋層）を含有する。これらの線維は、下にある顔面の筋肉群から生じる。それらは、下側の（網状の）真皮のコラーゲンのネットワーク内に統合されている。上部の（乳頭）真皮中の「筋肉−線維芽細胞」として知られる真皮の線維芽細胞の下位集団は、横紋筋組織と同様な固有の収縮特性を有する。これらの真皮の線維芽細胞内の収縮は、横紋筋の線維要素と同じ神経伝達物質、すなわち、アセチルコリンによって媒介される。
【０００８】
顔面の皮膚内の筋線維は、その表面の平滑性に直接影響を有し、これらの筋線維への運動神経の流入を変調することは、皺の減少を引き起こす。例えば、顔面神経のベル麻痺を患う患者は、顔面の麻痺していない側よりも麻痺した側でより平滑な皮膚を有する。Ｂｏｔｏｘ（商標）の化粧用の注射も、額および眉の上部の筋肉を不動化するだけでなく、これらの筋肉の外の皮膚も平滑にする。Ｂｏｔｏｘ（商標）は、筋線維の球心性の運動神経のシナプシスの接合部内におけるアセチルコリンの取り込みに干渉して、それにより皺および深い皺と関連する筋組織の収縮を予防する。Ｂｏｔｏｘ（商標）処置は、大きい需要があり、したがって、局所で同等のもの（ｔｏｐｉｃａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｙ）を開発することは化粧用の科学者の目標である（A. Blitzer et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 119, pages 1018 to 1022 (1993)を参照されたい）（J. D. Carruthers et al., J. Dermatol. Surg. Oncol., 18, pages 17 to 21 (1992)を参照されたい）。
【０００９】
消費者の要求に応えるために、多くの化粧用組成物および化粧用方法が皮膚の手入れおよび処置のために開発されてきた。しかしながら、大部分ではないとしても、これまでに記載された多くの製品または処置方法は、不適切な結果をもたらす、または望ましくない副作用により傷つけられている。これらは、皮膚または隣接する粘膜の刺激、皮膚の過剰な脂っこさもしくは油っぽさまたは皮膚の変色を含み得る。
皮膚の修復：真皮の再生能力は、慢性の筋収縮および表情筋の弛緩に抵抗するその能力に決定的な影響を有する。老化または日光で傷ついた皮膚の帰結として、下側の真皮を若返らせるために必要な線維芽細胞および血管が減少する。上部の真皮の「基底層」中の線維芽細胞が複製されて新しい細胞になるのが遅くなり、コラーゲンを産生するそれらの能力が衰えて、コラーゲン線維ネットワークを組織化して保存する能力が弱まる。皮膚のマトリックスは、コラーゲンおよび主要な水を保持する分子、すなわち、グリコアミノグリカンおよびヒアルロン酸の供給源であるから、それを保存することは表皮の健康にとって必須である。前駆体タンパク質の連続的補給がなくては、コラーゲン線維のネットワークおよび細胞外のマトリックスの解体および溶解が起こる。この過程の結果は、真皮と表皮の接合部の平坦化および上部の真皮の機械的抵抗力の弱化である。したがって、老化が進む皮膚は、顔面に表情を表す間に起こる一時的変形の永続性になりやすさが非常に大きい。（Oikarinen, "The Aging of Skin: Chronoaging Versus Photoaging," Photodermatol. Photoimmunol. Formation, Photomed., vol. 7, pp. 3-4, 1990を参照されたい）。（Thalmann et al. "A Computational Skin Model: Fold and Wrinkle Formation" pp. 1-5を参照されたい）。
【００１０】
当技術分野においては、皮膚の弾性を増強するためのまたは真皮を強化するための特異な分子またはそれらの組成物を論じた数件の教示（米国特許第６，７９４，３６２号）（米国特許第６，７７７，３８９号）がある。それらは、エラスチンの分子組成を模倣するまたはそれに付加するペプチドまたはペプチド様化合物から製剤化される。Ｍｉｔｔｓら（米国特許第６，８０９，０７５号）は、ペプチド／レチノイド組成物が、真皮のエラスチン成分内でまとまることができて、それにより皮膚の変形から戻る能力を増進させると仮定している。よりしばしば、先行技術は、天然または合成ペプチド製剤が、コラーゲン線維ネットワークまたは皮膚のマトリックスの細胞外基質を増強し得ることを教示する。それ故、新規な統合である（Lowe, N. et al., "Pharmacology of Retinols In Skin", Vol. 3 (1989), pp. 240-248）。しかしながら、レチノイドが原因の不安定性および刺激は問題である。Ｄｉｏｇｕａｒｄｉにより提唱された手法（米国特許第５，１９８，４６５号）は、一般的に、合成された前駆体コラーゲン分子およびコラーゲン代謝性経路の補酵素の局所適用により、皮膚中におけるコラーゲン含量を増加させることである。仮定は、前駆体分子の拡散および吸着による直接置き換えが、不完全な皮膚を強化するということである。Ｋｌｕｄａｓ（米国特許第５，０５５，２９８）により教示された同様な概念は、実質的に天然の組成物は、真皮と表皮の接合部において補修およびリモデリング効果を有し得るというものである。最近の技術も（米国特許第６，９０６，０３６号、米国特許第６，８８４，４２５号）、マトリックスプロテイナーゼの阻害剤は、真皮の崩壊を予防して、それを治癒し、正常で健常な皮膚への復帰を助長することができることを教示している。上記の特許のいずれも、線維芽活性およびコラーゲン前駆体の合成を刺激する能力は教示せず；それらは皮膚の厚さおよびコラーゲン線維ネットワークを復活させることも明言していない。
【００１１】
最近の特許で、Ｖａｒａｎｉらは（米国特許第６，９１９，０７２）、コラーゲンの分解を阻害して、プロコラーゲン合成を増加させることによりコラーゲン含量を増進し、ケラチン生成細胞および線維芽の増殖を増加させるレチノイドおよびマトリックスのメタロプロテアーゼ阻害剤の組成物を同定している。本発明は、年代順に老化した皮膚における表皮と真皮の界面の厚さを回復させて、上部の真皮内のコラーゲン含量を正常レベルに回復させる。環境のおよび物理的なストレスに耐える強度を皮膚に与える性質はその中にある。他のレチノイドと同様に、Ｌｏｗｅのレチノイドは、長期の適用を必要として、真皮の修復は、本願の好ましい実施形態よりはるかに遅い。
【００１２】
ペプチドの有意性
初期の技術の焦点は、新しいコラーゲンを構築する分子を物理的に補充すると考えられる物質を明らかにすることまたは基底層を刺激するかもしくは攪乱してその再生および健常な再構成をもたらす物質を添加することにあった。より最近の技術は、上部の真皮を刺激して細胞の再成長によってそれ自体を一新することにおける局所的ペプチド処置の利益を教示する。このことは、身体は、皮膚に対する創傷に続く治癒過程を刺激することの助けになる天然に生じるペプチドを有するという知識により支持される。Ｒｏｂｉｎｓｏｎは（米国特許第６，４９２，３２６号）、パルミトイルペンタペプチド−３、ペンタペプチドの誘導体およびそれらの混合物の組合せを含有する種々の製剤を教示する。Ｌｉｎｔｎｅｒは（米国特許第６，６２０，４１９号）、コラーゲンおよびグリコアミノグリカンの合成を増加させる一般配列パルミトイル−リシル−トレオニル−トレオニル−リシル−セリン（パルミトイル基が配列番号１に結合している）のペプチドの製法を開示している。それらは、以前の製剤よりもはるかに効果的に老化した皮膚の皺および他の形態を、相乗的に治癒するように作用する。Ｌｉｎｔｎｅｒの教示のＲｏｂｉｎｓｏｎのそれに対する重要な差は、この親油性の修飾ペプチドを、表皮に浸入することに非常に効率的なしたがって真皮の形成層に達するためにより効果的にするペンタペプチドの末端における脂肪酸鎖の添加である。正味の結果は、上部の真皮の修復能力を回復させることにより皮膚の厚さを増加させることである。その結果として、皮膚は、表情筋の活発な収縮および弛緩ならびに皮膚自体内における微小な収縮により課せられた変形に、より良く耐えることができる。
【００１３】
より包括的な研究により、ストレス、太陽への曝露および食品、水および空気中の不純物などの環境要因も、皮膚の上皮性のおよび真皮の層の成分に有害に作用して、それが、順送りで、皮膚の外見に影響して変化させ、早発の老化の外見をもたらすことが見出された。例えば、フリーラジカル、反応性窒素種（「ＲＮＳ」）、反応性酸素種（「ＲＯＳ」）および他の酸化性の種（「ＯＯＳ」）などの要因は、皮膚を含む人体に有害に影響し得る。皮膚の外見に影響して有害に影響することが見出された上記群の中の特定の要因には、酸化窒素、スーパーオキシドラジカル、過酸化水素およびヒドロキシフリーラジカルが含まれる。これらの要因は、皮膚の光線性損傷、一般的老化、接触皮膚炎、皺寄り、脂質過酸化、コラーゲンおよび／またはエラスチンの酵素分解、還元および分解、ＤＮＡの分解および阻害された複製、皮膚組織における炎症および一般的損傷を含む多くの皮膚状態にいろいろと関わる。
【００１４】
酸化防止剤の活性は、身体中における反応性酸素種の産生を減少させて、同時に、細胞に対して回復しがたい損傷を引き起こす酸化を予防する活性である。基底状態、すなわち三重項の酸素は、環境への曝露または酵素、還元代謝、化学的化合物、汚染物質および光化学反応などの生化学的要因の結果として活性化されて、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシラジカルおよび過酸化水素などの高い反応性を有する反応性酸素種（ＲＯＳ）に変換され得る。したがって、それは結果として、細胞の構成要素を非可逆的に攪乱する。そのような反応性酸素種の作用は、全て身体の防御系を形成する、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼおよびペルオキシダーゼなどの酸化防止性酵素およびビタミンＣ、ビタミンＥおよびグルタチオンなどの酸化防止物質によって低減させることができる。しかしながら、身体におけるそのような防御機構の障害または過剰な反応性酸素種への曝露が生じた場合には、反応性酸素種は、脂質、タンパク質およびＤＮＡを非可逆的に攪乱し得る。老化、癌、複数の動脈硬化症、関節炎およびパーキンソン病を含む種々の疾患がその結果である。
【００１５】
ＢＨＡ（ブチル化されたヒドロキシアニソール）、ＢＨＴ（ブチル化されたヒドロキシトルエン）およびＮＤＧＡ（ノルジヒドロ−グアイアレチン酸）などの合成抗酸化剤がこれまでに開発された。天然抗酸化剤の例として、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼなどの酸化防止酵素；およびトコフェロール（ビタミンＥ）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カロテノイドおよびグルタチオンなどの非酵素酸化防止剤物質がある。
しかしながら、合成抗酸化剤は、アレルギー性反応、および身体におけるそれらの強い毒性に基づく腫瘍形成を惹起することがあり、かつ温度に敏感なために熱により容易に破壊される。他方、天然抗酸化剤は、身体において合成抗酸化剤よりも安全であるが、しかし効果がより弱いことが問題である。それ故、使用において安全性について問題がなく、優れた酸化防止活性も有する新しい天然酸化防止剤の開発が要求される。局所的に適用される抗酸化剤は、全てのタイプの皮膚について皮膚を健常に保ち、太陽による損傷を予防することを助けて、細胞機能を改善するメリットを有する。
【００１６】
抗酸化剤は、皮膚刺激および炎症を低減させることに積極的な効果を発揮することが結論的に示され、その効果は、健常な、生気にあふれる皮膚を創りまたは維持して、それ故、可能性として皺を減少させることにおける非常に重要なステップである。（International Journal of Experimental Pathology, 2000:257-263; Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology, 2000: 143-149）
ポリフェノール（ポリヒドロキシフェノール）構造（すなわち、芳香族環上に数個のヒドロキシル基）を有する数百種の分子が、可食植物中で同定された。これらの分子は、植物の二次代謝物であり、紫外線照射または病原体による攻撃に対する防御に一般的に関与する。ポリフェノールは、果実、野菜、穀物、乾燥したマメ科植物、チョコレート、および茶、コーヒーまたはワインなどの飲料の広範な構成要素である。
【００１７】
これらの化合物は、それらが含有するフェノール環およびこれらの環を互いに結合する構造的要素の数の関数として異なる群に分類することができる。ポリフェノールのクラスは、フェノール性の酸、フラボノイド、スチルベンおよびリグナンを含む。フェノール性酸には２つのクラス：安息香酸の誘導体およびケイ皮酸の誘導体がある。
ｉｎ  ｖｉｖｏで抗酸化剤の各々および全部を測定することは実際には役立たない。酸化的ストレスを及ぼす主要な要因は、系の全体的な抗酸化状態であり、それが、フリーラジカルおよびＲＯＳを排除することにより疾患を予防すると今も広く想定されている。それ故、細胞外の抗酸化状態を集合的に測定することができる方法を有することが必須である。標的指示分子に達する発生したフリーラジカルの抗酸化剤による阻害に基づく抗酸化の状態を測定するための方法がある。阻害アッセイの共通の特徴は、フリーラジカルを発生させて標的分子と反応させ、それにより観察され得る終点を生じさせて定量化することである。抗酸化剤の添加は、この終点の発生を阻害する。この指示分子のよい例は、フリーラジカルを捕捉するＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ヒドラジル）の活性である。
【００１８】
結合組織の弾性線維中において最高の濃度で見出されるエラスチンは、皮膚のきめおよび張りの原因となる。エラスターゼ、セリンプロテアーゼ酵素は、広範囲の細胞間の線維ネットワークを含有する組織を分離する役割を有する。過剰のエラスターゼ産生は、皮膚の皺寄り／早発の老化を生じさせる。
重要なタンパク質であるコラーゲンは、皮膚の張りおよび構造を維持する。コラゲナーゼは、セリンプロテアーゼ酵素であり、それは、創傷をいかなる死んだ組織からも浄化して、創傷床を治癒の準備ができた状態にして残す。炎症中に猛烈に産生されたコラゲナーゼは、皮膚の張りおよび構造を維持する重要なタンパク質コラーゲンを消化することにより、皮膚の皺寄りにおいて役割を有することが知られている。
【００１９】
老化防止のための別の機構は、皮膚におけるコラーゲンの増強である。新しいコラーゲンを構築する分子を物理的に補充することができるまたは基底層を刺激するかもしくは撹乱してその再生および健常な再構成をもたらす物質を添加する活性物質は、老化防止組成物として優れている。より最近の技術は、上部の真皮を刺激して細胞の再成長によりそれ自体を一新することにおける局所ペプチド処置の利益を教示する。これは、皮膚に対する創傷に続く治癒過程を刺激する助けになる天然に生じるペプチドを身体が有するという知識により支持される。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（米国特許第６，４９２，３２６号）は、パルミトイルペンタペプチド−３、ペンタペプチドの誘導体、およびそれらの混合物を含有する種々の製剤を教示している。Ｌｉｎｔｎｅｒ（米国特許第６，６２０，４１９）は、コラーゲンおよびグリコアミノグリカンの合成を増加させる一般配列パルミトイル−リシル−トレオニル−リシル−セリン（パルミトイル基が配列番号１に結合している）のペプチドの製法を開示している。それらは、相乗的に作用して、皺および皮膚老化の他の形態を、以前の製剤よりもより効果的に治癒する。
【００２０】
本発明は、オレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する組成物および皮膚修復の方法におけるその効果的な使用ならびに関連する遺伝子発現の調節による安定化を開示する。
したがって、皮膚の修復および安定化の方法であって、オレアノール酸のペンタペプチドコンジュゲートと皮膚細胞とを接触させるステップを含み、その結果、皮膚細胞において修復および安定化を可能にする遺伝子およびタンパク質の発現を生じさせる、分子レベルでの細胞情報伝達増加の効果が実現される方法を開示することが本発明の主な目的である。
本発明は、上記の目的を満たし、さらに関係する利点を提供する。
【発明の概要】
【００２１】
皮膚修復および安定化の方法であって、オレアノール酸のペンタペプチドコンジュゲートと皮膚細胞とを接触させるステップを含み、その結果、皮膚細胞において修復および安定化を可能にする遺伝子およびタンパク質発現を生じさせる、分子レベルでの細胞情報伝達増加の効果が実現される方法が開示される。本発明は、皮膚におけるトランスフォーミング成長因子−βおよび線維芽細胞成長因子の遺伝子の発現を増加させることにおける、オレアノール酸のペンタペプチドコンジュゲートの効果を実証する。
本発明の他の特徴および利点は、例として本発明の原理を例示する添付図面とともに利用すれば、以下のさらに詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】オレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する組成物の変化する濃度に曝露された後の、ヒト真皮の線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞中におけるトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）発現の増加％のグラフ表示を示す。
【図２】オレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する組成物の変化する濃度に曝露された後の、ヒト真皮の線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞中における線維芽細胞成長因子発現の増加％のグラフ表示を示す。
【図３】オレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する組成物の変化する濃度に曝露された後の、皮膚中におけるＨＳＰ９０遺伝子の発現の増加％のグラフ表示を示す。
【図４】オレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する組成物の変化する濃度に曝露された後の、皮膚におけるＬＯＸ遺伝子の発現の増加％示す。
【図５】オレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する組成物の変化する濃度に曝露された後の、皮膚におけるＨＳＰ−４７遺伝子の発現の増加％示す。
【図６】オレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する組成物の変化する濃度に曝露された後の、皮膚におけるＴＩＭＰ遺伝子の発現の増加％示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（図１〜６）
【００２４】
最も好ましい実施形態において、本発明は、ヒト線維芽細胞におけるトランスフォーミング成長因子−βの発現を増加させる方法であって、ヒト線維芽細胞と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、細胞外マトリックスタンパク質、特にコラーゲン合成の調節を生じさせるステップを含む方法に関する。
別の最も好ましい実施形態において、本発明は、ヒト線維芽細胞における線維芽細胞成長因子の発現を増加させる方法であって、ヒト線維芽細胞と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、皮膚瘢痕減少の効果を生じさせるステップを含む方法に関する。
【００２５】
さらに他の最も好ましい実施形態において、本発明は、
Ａ．ヒト皮膚においてＨＳＰ９０遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、コラーゲン修復および再構築の効果を生じさせるステップを含む、方法；
Ｂ．ヒト皮膚におけるＨＳＰ４７遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、プロコラーゲン合成をプロセシングする(processing)効果を生じさせるステップを含む、方法；
【００２６】
Ｃ．ヒト皮膚におけるＬＯＸ（リシルオキシダーゼ）遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、細胞外マトリックスリモデリングの効果を生じさせるステップを含む、方法；
Ｄ．ヒト皮膚において、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｉｅｎａｓｅ）（ＴＩＭＰ）遺伝子の組織阻害剤の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させて、マトリックスメタロプロテイナーゼ様コラゲナーゼおよびエラスターゼの阻害を生じさせるステップを含む、方法；
にも関する。
【００２７】
さらなる例示的実施形態において、本発明は、
Ａ．コルネオデスモシン（ｃｏｒｎｏｄｅｓｍｏｓｉｎ）（ＣＤＳＮ）、クラウジン７（ＣＬＤＮ７）、フィラグリン（ＦＬＧ）、最近角質化したエンベロープ３Ｄ（ｌａｔｅ  ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ３Ｄ）（ＬＣＥ３Ｄ）、ロリクリン（ＬＯＲ）およびインテグリンベータ４（ＩＴＧＢ４）からなる群から選択される皮膚のバリア機能を改善する遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む、方法；
Ｂ．ロリクリン（ＬＯＲ）およびカルモジュリン様５（ＣＡＬＭＬ５）からなる群から選択される、ヒト皮膚において角化細胞を増加させる分化遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む，方法；
【００２８】
Ｃ．ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲＤ）、腫瘍タンパク質ｐ６３（ＴＰ６３）およびＫｉ−６７抗体により同定された抗原（ＭＫＩ６７）からなる群から選択される、皮膚における細胞周期および細胞増殖を改善する遺伝子の発現を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む，方法；
Ｄ．皮膚におけるアクアポリン５遺伝子（ＡＱＰ５）の発現を増加させることにより、皮膚の水和を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む，方法；
Ｅ．皮膚における関連するトランスフォーミング成長因子−ベータ１（ＴＧＦＢ１）遺伝子の発現を増加させることにより皮膚におけるコラーゲン合成を増加させる方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む、方法；
Ｆ．皮膚における関連する骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）の遺伝子の発現を増加させることにより、皮膚におけるメラニン形成を誘発する方法であって、ヒト皮膚（処置するヒト皮膚）と、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する有効濃度の組成物とを接触させるステップを含む、方法；
にも関する。
【００２９】
【化１】
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(STR#1)
【００３０】
本発明の最も好ましい実施形態をさらに明らかにするために、これに添えて以下の説明のための実施例を含める。
【実施例】
【００３１】
（例１）
トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の評価：
ヒト真皮の線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞を、９６ウェルの組織培養プレート中の１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ媒体中で播種して試験のために培養した。播種の２４時間後に、ＨＤＦを、段階づけた濃度の試験試料（ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する組成物）により処理して、５％ＣＯ2のインキュベーター中３７℃で４８時間でインキュベートした。４８時間後に、上清を各ウェルから回収した。種々の処理をされたＨＤＦにより産生されたＴＧＦ−βおよびＦＧＦの量を、製造者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により提供されたキットのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ方法を使用して、および吸光度をＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａを使用して４５０ｎｍで測定して定量した。標準曲線は、適当なＴＧＦ−β／ＦＧＦ濃度に対する標準の吸光度の値をプロットすることにより発生させた。対照および試験試料のＴＧＦ−β／ＦＧＦ濃度を標準グラフの方程式から計算した。試験試料における発現の増加％を、未処理細胞に対して計算した。実験結果を図１および２にそれぞれ例示する。ウェル中の細胞外マトリックスの合成におけるＴＧＦ−β１の重要性は、
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で確立されている。
したがって、ヒト真皮の線維芽細胞におけるＴＧＦ−β発現の増加は、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する試験組成物のコラーゲン刺激／構築能力を明確に示す。
【００３２】
創傷治癒における線維芽細胞と筋線維芽細胞の類似性、能力は、Ian. A . Derby, "Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing", Clin Cosmet Investig Dermatol. 2014; 7: 301-311に文書で発表されている。筋線維芽細胞と協調して皮膚のホメオスタシスおよび瘢痕を含む生理学的組織修復を維持するための、線維芽細胞成長因子および皮膚組織の微環境におけるそのバイオアベイラビリティにおける重要性が、上記の引用文献で論じられている。したがって、ヒト真皮の線維芽細胞における線維芽細胞成長因子発現の増加は、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する試験組成物の生理学的組織修復能力を明確に示す。
【００３３】
（例２）
遺伝子発現の分析：
研究の目的は、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する試験組成物の適用が、皮膚における遺伝子発現にどのように影響するかを理解することであった。最近の研究は、全厚さのインビトロ皮膚培養モデル（ＥＦＴ−４００、ＭａｔＴｅｋ）を使用して実施された。１００μＬの試験材料を、各試験培養物の表面に適用して２４時間の期間インキュベートした。
培養物の処理および維持：ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する試験組成物の１００μＬを、各ＥＦＴ−４００培養の中心に適用した。滅菌ガラスのスプレッダーを、試験材料を分配するために使用した。均等な分布を確実にするために各培養物を目視で検査した。適用に続いて、培養物を３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーターに戻して２４時間置いた。２４時間後に、試験材料を各培養物の表面から滅菌ＰＢＳで洗浄した。試験材料の除去後、各培養物を４分の１に切ってＲＮＡ溶液に入れた。
【００３４】
ＲＮＡの単離：ＲＮＡを、組織からＭａｘｗｅｌｌ  １６ＬＥＶ  ＲＮＡ組織キットを使用して、製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示に従って単離して、ＯｐｅｎＡｒｒａｙプロセシングのために必要な２００ｎｇ／μＬ超まで真空濃縮した。ＲＮＡ濃度および純度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光光度計を使用して決定した。ｃＤＮＡ合成：ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して、製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の指示に従ってＯｐｅｎＡｒｒａｙプロセシングのために生成させた。
ｑＰＣＲプロセシング：ｑＰＣＲ反応を、検証されたＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを使用してＯｐｅｎＡｒｒａｙフォーマットで実行した。ＯｐｅｎＡｒｒａｙを、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘ機器で実行した。
【００３５】
データ分析：ｑＰＣＲデータを、相対定量（ＲＱ）法を使用して統計分析するためにＲｅａｌＴｉｍｅ  ＳｔａｔＭｉｎｅｒソフトウェアｖ４．２にインポートした。ＲＱ分析の第１のステップで、各試料について標的遺伝子のＣＴ値を内部対照遺伝子のＣＴ値に対して正規化してデルタＣＴ（ｄＣＴ）を得た。
図３、４、５および６は、ＳＴＲ＃１により表されるオレアノール酸と連結された配列番号１のペプチドを含有する試験組成物を適用した後の以下の遺伝子の皮膚発現における増加％を示す。皮膚の健康に対する遺伝子発現およびそれらの関連する利益を下で強調した。配列番号１のペプチドを含有する試験組成物を適用した後の皮膚におけるそれぞれの遺伝子発現の上方制御は、遺伝子発現が関連する皮膚の健康の利益を実現することを直接示す。
【００３６】
１．ＨＳＰ−９０（ＤＮＡ修復および細胞外マトリックスリモデリングに役立つ−Radovanac K et al, "Stabilization of integrin-linked kinase by the Hsp90-CHIP axis impacts cellular force generation, migration and the fibrotic response. ", EMBO J. 2013 May 15;32 (10): 1409-24)；
２．ＨＳＰ−４７（分子シャペロンとして作用して、プロコラーゲン分子の折りたたみおよびアセンブリーを助長し、折りたたまれていない分子をＥＲ内に保持して、正しく折りたたまれた分子のＥＲからゴルジ装置への輸送を助ける−Mohammed Tasab et al, "Hsp47: a molecular chaperone that interacts with and stabilizes correctly-folded procollagen", EMBO J. May 15, 2000; 19 (10): 2204-2211)
３．ＬＯＸ（細胞外マトリックスタンパク質が架橋されることを助ける−Rucker RB et al, "Copper, lysyl oxidase, and extracellular matrix protein cross-linking", Am J Clin Nutr. 1998 May; 67 (5 Suppl):996S-1002S)および
４．ＴＩＭＰ（マトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤は、マトリックスメタロプロテアーゼ活性を制御して、マトリックスの変性を最小化する−Dimitra Bourboulia et al, "Matrix MetalloProteinases (MMPs) and Tissue Inhibitors of MetalloProteinases (TIMPs): positive and negative regulators intumor cell adhesion", Semin Cancer Biol. Jun 2010; 20 (3): 161-168)
【００３７】
配列番号１のペプチドを含有する試験組成物による他の重要な遺伝子の上方制御を、表Ｉに示す。そのような上方制御は、配列番号１のペプチドを含有する試験組成物の能力を直接指し示して、種々の態様の皮膚の健康（ホメオスタシス、完全性および機能）を助長することにおける公知の遺伝子の機能を生じさせる。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
配列番号１のペプチドを含有する試験組成物による他の重要な遺伝子の下方制御を表ＩＩに示す。そのような下方制御は、配列番号１のペプチドを含有する試験組成物の公知の遺伝子機能の効果を低下させて、それにより最適の皮膚の健康を助長する能力を直接示す。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
本発明を、好ましい実施形態を参照して説明してきたが、本発明が、それらに限定されないことは、当業者により明確に理解されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に関連してのみ解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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