(57)【要約】細胞培養培地としての使用に適する粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物は、供与源血小板の溶解から放出された増殖因子、サイトカインおよびケモカインを含むことができ、供与源血小板からの細胞片が濾過によって（部分的または完全に）取り除かれる。増殖因子、サイトカインおよびケモカインは、凍結乾燥されて、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を形成する。１つの具体例では、細胞または組織を培養する方法は、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を再溶解して細胞培養培地を形成すること、および細胞または組織を細胞培養培地と接触させて、培養物中の細胞または組織を形成することを含むことができる。
2018517771.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
供与源血小板の溶解から放出された増殖因子、サイトカインおよびケモカインを含む、細胞培養培地としての使用に適する粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物であって、前記供与源血小板からの細胞片が濾過によって少なくとも部分的に取り除かれ、前記増殖因子、サイトカインおよびケモカインが凍結乾燥されて、前記粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を形成する、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項２】
前記増殖因子、サイトカインおよびケモカインが、前記組成物中の前記供与源血小板のうちの少なくとも３０％からの溶解によって放出される、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項３】
前記増殖因子、サイトカインおよびケモカインが、前記組成物中の前記供与源血小板のうちの少なくとも５０％からの溶解によって放出される、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項４】
前記増殖因子、サイトカインおよびケモカインが、前記組成物中の前記供与源血小板のうちの少なくとも７０％からの溶解によって放出される、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項５】
前記増殖因子、サイトカインおよびケモカインが、前記組成物中の前記供与源血小板のうちの少なくとも９０％からの溶解によって放出される、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項６】
−８０℃で少なくとも５年間保存したとき、その粒状の形態で安定している、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項７】
４℃で少なくとも１年間保存したとき、その粒状の形態で安定している、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項８】
室温で少なくとも１年間保存したとき、その粒状の形態で安定している、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用のために製剤化される、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のために製剤化される、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項１１】
前記供与源血小板が、ヒト以外の哺乳動物の血小板供与源に由来する、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項１２】
前記供与源血小板が、ヒトの血小板供与源に由来する、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項１３】
液体培地で再溶解して細胞培養培地を形成する、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項１４】
複数のインタクトな血小板を保持する、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項１５】
前記粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を室温で少なくとも１２カ月間保存することが、初期に調製された粒状の凍結乾燥血小板溶解物と比較したとき、および前記粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物が細胞培養培地として再溶解されるとき、幹細胞の増殖または分化に実質的に影響しない、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項１６】
前記溶解された血小板からの細胞片を含む、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項１７】
血小板溶解によって生成された細胞片が、凍結乾燥の前に前記組成物から少なくとも部分的に濾過されて、前記凍結乾燥血小板溶解物組成物の粒状形態が形成される、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項１８】
血小板溶解によって生成した細胞片が、凍結乾燥の前に濾過によって実質的に取り除かれるかまたは完全に取り除かれて、前記凍結乾燥血小板溶解物組成物の粒状形態が形成される、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項１９】
３重量％未満の水を有する、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項２０】
少なくとも５０重量％の増殖因子、ケモカイン、サイトカインまたはそれらの組合せを含み、前記増殖因子、ケモカイン、サイトカインまたはそれらの組合せは血小板溶解中に血小板から放出される、請求項１に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物。
【請求項２１】
培養中に細胞または組織の凝固活性を示さない濃度で製剤化されている、液体培地で再溶解された粒状の凍結乾燥血小板溶解物を含む細胞培養培地。
【請求項２２】
前記粒状の凍結乾燥血小板溶解物が、約２０重量％から約７０重量％の量で存在する、請求項２１に記載の細胞培養培地。
【請求項２３】
細胞培養混合培地を形成するための、前記細胞培養培地と混合される追加の培養培地をさらに含む、請求項２１に記載の細胞培養培地。
【請求項２４】
前記追加の培養培地が、１０重量％から９０重量％の前記細胞培養混合培地を含む、請求項２３に記載の細胞培養培地。
【請求項２５】
前記細胞培養培地が−８０℃、４℃または室温で少なくとも１年間保存された後２４時間以内に、前記細胞培養混合培地が、平板培養細胞の量を２倍にする能力を保持する、請求項２３に記載の細胞培養培地。
【請求項２６】
初期に加えて室温で１年間保存された後も、継続した多分化能を示す、請求項２１に記載の細胞培養培地。
【請求項２７】
初期に加えて室温で１年間保存された後も、幹細胞を脂肪生成的、軟骨形成的および骨形成的に分化させる能力を示す、請求項２１に記載の細胞培養培地。
【請求項２８】
間葉性幹細胞を増殖させる能力を有する、請求項２１に記載の細胞培養培地。
【請求項２９】
前記細胞培養培地上で増殖させられる前記間葉性幹細胞が、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ７１およびＣＤ９０のうちの少なくとも１つを含む、請求項２８に記載の細胞培養培地。
【請求項３０】
抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗生物質および増殖因子からなる群から選択される少なくとも１つの活性剤をさらに含む、請求項２１に記載の細胞培養培地。
【請求項３１】
粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を調製するための方法であって、
血小板および流体担体を含む血小板供与源を得るステップ；
前記血小板を溶解して複数の溶解物を形成するステップ；
溶解後に前記複数の溶解物を濾過して細胞片を取り除くステップ；および
前記複数の溶解物を凍結乾燥させて、放出された濃度の利用可能な増殖因子、サイトカインおよびケモカインを有する粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を形成するステップ
を含む方法。
【請求項３２】
生細胞または組織培養において凝固活性を引き起こさない濃度で、前記粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を液体培地で再溶解するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記濃度が、約２０重量％から約７０重量％である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記血小板供与源を得るステップが、血小板含有流体から血小板を濃縮して血小板豊富な部分を形成することを含み、前記血小板を溶解させるステップが、前記血小板豊富な部分からである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記濃縮するステップが遠心分離による、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記血小板供与源が、全血である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記血小板供与源が、血小板多血漿である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記血小板供与源が、ヒトからである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記溶解ステップが、前記血小板供与源における凍結融解サイクルを使用することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
単回の凍結融解サイクルが、前記血小板供与源中の血小板のうちの少なくとも３５％を溶解させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記凍結融解サイクルのための凍結が、少なくとも４８時間の間実行される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
予め決められた程度の細胞崩壊が起こるまで、前記凍結融解サイクルが繰り返される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記凍結融解サイクルの各々のための凍結が、少なくとも２４時間実行される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記予め決められた程度の細胞崩壊が、血小板数で少なくとも３０％の細胞崩壊である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１回の凍結融解サイクルの後、前記複数の溶解物を濾過して細胞膜および細胞片を取り除くことが行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
濾過することが、ポリビニリジンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、親水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、再生セルロース（ＲＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリカーボネートトラックエッチド（ＰＣＴＥ）、ポリエステルトラックエッチド（ＰＥＴＥ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、非対称ＰＥＳ、酢酸セルロース（ＣＡ）およびそれらの組合せからなる群から選択される濾過膜を使用して実行される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記濾過膜が、約０．１ミクロンから０．３ミクロンの孔径を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
濾過することが、前記濾過膜に加えて前置フィルターを使用することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記溶解ステップが、前記血小板供与源における超音波処理を使用することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５０】
前記溶解ステップが、前記血小板供与源における濾過を使用することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５１】
細胞または組織を培養する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を再溶解して細胞培養培地を形成するステップ；および
細胞または組織を前記細胞培養培地と接触させて、培養物中の細胞または組織を形成するステップ
を含む方法。
【請求項５２】
培養物中の前記細胞または組織が、間葉性幹細胞、ヒト胚性幹細胞、ケラチノサイトまたは心筋細胞由来である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
培養物中の前記細胞または組織が、間葉性幹細胞由来であり、前記間葉性幹細胞が臍帯由来である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
細胞または組織を培養する方法であって、細胞または組織を前記細胞培養培地と接触させて、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の培養物中の細胞または組織を形成するステップを含む方法。
【請求項５５】
培養物中の前記細胞または組織が、間葉性幹細胞、ヒト胚性幹細胞、ケラチノサイトまたは心筋細胞由来である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
培養物中の前記細胞または組織が、間葉性幹細胞由来であり、前記間葉性幹細胞が臍帯由来である、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
主流の医学において、細胞療法および細胞研究が増加しつつある。増加の結果、様々な培養培地が作製された。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をベースとした培養培地は、より一般的なタイプの１つであり、大規模で製造することができ、ロット間の変動を低減することができ、ヒト細胞を培養する場合に使用することができる。しかし、ＦＢＳをベースとした培養培地上で作製される細胞培養物は、免疫原性の残留したウシタンパク質に曝露されることがあり、純度の懸念をもたらす。１つの代替の培養培地を、ヒト血小板溶解物から作製することができる。ヒト血小板溶解物をベースにした培養培地は優れた性能を示すことができ、ＦＢＳをベースとした培養培地上で平板培養された（ｐｌａｔｅ）細胞培養物と関連した曝露の懸念を排除することができる。しかし、これらの培地は、ストリンジェントな保存条件を有する。したがって、ＦＢＳをベースとした培養培地と関連した曝露の懸念を排除し、容易に保存できる細胞培養培地の需要がある。
【０００２】
本技術の特徴および利点は、本技術の特徴を例示するための以下に記載の詳細な説明を添付の図面と共に検討することにより明らかになるだろう。これらの図面は例示的な実施形態を単に表したものであり、したがって範囲を限定するものと考えるべきでないと理解される。さらに、本明細書および他の場所で一般的に記載され、図面に例示される要素は、多種多様の異なる方法で製剤化および／または設計することができることが、容易に認められる。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】図１は、様々な温度および時間で保存した後の、ヒト血小板溶解物培養培地中の冷凍保存された第３継代の臍帯由来の間葉性幹細胞の増殖曲線結果を図式的に示す。
【０００４】
【図２】図２は、様々な温度で１２カ月の間保存した対照培地および実験培地を含む、ヒト血小板溶解物培養培地に平板培養された、冷凍保存された第３継代の臍帯由来の間葉性幹細胞の細胞分化の白黒画像を図式的に示す。
【０００５】
【図３】図３は、１つの群の試料について凍結融解溶解方法の１回の凍結融解サイクルあたりの溶解した血小板の百分率を図式的に示す。
【０００６】
【図４】図４は、特定数の凍結融解サイクルにわたって血小板が溶解した後に得られた特異的増殖因子量の一例を図式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
これらの図面は、技術の様々な態様を例示するために提供され、特許請求の範囲による別段の限定がない限り、結果または要素に関して限定することを意図しない。
【０００８】
例示的な実施形態に言及され、それを記載するために本明細書で特異的言語が使用される。それにもかかわらず、それによって本発明の範囲の限定を意図するものでないことが理解される。当業者およびこの開示の所有者に思いつくであろう、本明細書に例示される発明の特徴の変更およびさらなる改変、ならびに本明細書に例示される本開示の原理の追加の応用は、本発明の範囲内であると考慮されるべきである。それらはある程度異なることがあるので、この開示が、本明細書に開示される特定の構成、プロセスステップおよび材料に限定されないことも理解すべきである。さらに、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することだけのために使用され、本開示の範囲として限定するものではないことを理解すべきである。
【０００９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には複数形が含まれる点に留意されたい。
【００１０】
本明細書で使用される場合、用語「血小板含有流体」は、血小板を含有する、生体のまたは人工的なあらゆる流体を指す。そのような流体の非限定的な例には、ヒトおよび非ヒト供与源由来の、全血、血漿、血小板多血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ）、任意の媒体中の濃縮された血小板などの様々な形態が含まれる。
【００１１】
本明細書で使用される場合、用語「濃縮する」または「濃縮すること」は、血漿、全血または血小板が存在する他の流体の大部分から血小板を分離することを指す。例えば、遠心分離、分光測定、濾過、デカント法、重力沈澱、または血小板含有流体から血小板を濃縮する他の方法を使用することができる。血小板を濃縮するとき、血液、血漿または他の流体の他の要素から血小板を分離する間の凝固を予防するために、血小板の供与源とともに抗凝固剤（特に遠心分離または重力沈澱の場合）を使用するのが望ましいことがある。
【００１２】
用語「抗凝固剤」は、本開示の例に従って使用するための血小板を濃縮または収集するときに凝固を阻害する組成物を指す。抗凝固剤は、凝固因子合成の阻害剤、トロンビンの阻害剤または抗血小板薬として一般的に利用可能である。肝臓である特定の凝固因子の生成を阻害する凝固因子合成の阻害剤には、ワルファリン（Ｃｏｕｍａｄｉｎ）などの組成物が含まれる。トロンビンの阻害剤は、トロンビンの活性をブロックすることによって血液凝固を妨害し、ヘパリンおよびレピルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ）などの組成物を含む。抗血小板薬は血小板それ自体と相互作用し、アスピリン、チクロピジン（Ｔｉｃｌｉｄ）、クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ）、チロフィバン（Ａｇｇｒａｓｔａｔ）、エプチフィバチド（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ）などの薬物を含む。
【００１３】
用語「凍結乾燥」、「凍結乾燥する」などは、血小板を保存するためにしばしば使用されるが、本開示の実施形態に従って若干異なって使用される、フリーズドライまたは脱水プロセスを指す。具体的には、凍結乾燥は主に保存プロセスとして使用されるだけでなく、最初の凍結融解または他の溶解技術が実行された後に血小板をさらに溶解するためにさらに使用することができる。言い換えると、本開示の例に従って、本明細書に記載されるように溶解物が形成された後、凍結乾燥は、最初は血小板の中に封入されるかまたはその表面に結合しているが、本明細書に記載されるように血小板が溶解するとき、例えば凍結融解溶解するときに放出された、増殖因子、サイトカイン、ケモカインおよび他の含有物を保存する追加の利点を提供する。このプロセスは、材料を凍結させ、周囲の圧を低減して材料中の凍結水が固相から気相に直接的に昇華することを可能にすることによって典型的に働く。凍結乾燥は、超音波処理および／もしくは濾過を含む、凍結融解サイクリング以外の技術、またはこれらの溶解技術の任意の組合せを使用して細胞を溶解させた後に、同様に実行することができる。
【００１４】
用語「組織」には、小組織部位から完全器官の全範囲が含まれる。
【００１５】
本開示により、「溶解物」は、血小板がそれらの細胞膜を崩壊させることによって破壊され、調製された組成物である。これは化学的に、機械的に、液体ホモジナイゼーション、濾過および／または超音波処理によって実行することができるが、本明細書に記載されるある特定の実施形態により、細胞崩壊は、凍結融解サイクルを使用して、およびより少ない程度で、最終凍結乾燥プロセスの一部として実行することができる。凍結融解溶解物は、血小板懸濁液を凍結させ、次に材料を室温より高い温度に、例えば３０℃から４５℃に融解させることによって形成することができるが、それらが血小板の細胞崩壊につながるならば、他の凍結融解レジメンも本開示の範囲内に含まれる。凍結融解技術により、この方法は細胞を膨潤させ、氷晶が形成するときに破壊させ、続いて融解時に収縮させる。したがって、サイクルの（ｃｙｃｌｉｃａｌ）膨潤および収縮は、最終的に血小板を崩壊させる。より完全な溶解のために複数回のサイクルが典型的に使用されるが、「より完全な」溶解は本開示の例により必ずしも必要であるとは限らない。様々な程度の血小板細胞崩壊、例えば、血小板数で少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％または最高１００％の細胞崩壊が起こることがある。血小板を溶解させるとき、２回またはそれを超える凍結融解サイクル、３回またはそれを超えるサイクル等を使用することができる。あるいは、１回の凍結融解サイクルを使用し、続いて凍結乾燥ステップを使用することができる。したがって、技術に関係なく、１つまたはそれを超える溶解ステップ（例えば、凍結融解、超音波処理、濾過、液体ホモジナイゼーション、機械的溶解、化学的溶解等）が実行され、続いて凍結乾燥ステップ（例えば、フリーズドライまたは脱水）が実行される。凍結乾燥ステップは、１つまたはそれを超える溶解ステップに加えて追加の溶解を引き起こすことができる。
【００１６】
用語「凍結乾燥血小板溶解物」または「ＬＰＬ」は、本明細書に記載されるように調製される。しかし、凍結乾燥血小板溶解物という用語は、具体的なタイプの凍結乾燥血小板溶解物として、「凍結乾燥血小板多血漿溶解物」または「ＬＰＲＲＬ」も含むことに留意されたい。したがって、１つの差は血小板多血漿が方法または組成物の一部として使用または形成されることであるという理解の下で、凍結乾燥血小板溶解物（ＬＰＬ）の任意の議論は、凍結乾燥血小板多血漿溶解物（ＬＰＲＲＬ）も含む。しかし、いずれの組成物でも、両方とも凍結乾燥血小板溶解物を含む。
【００１７】
「凝固活性を示さない」細胞培養培地として製剤化された再溶解した粒状凍結乾燥血小板組成物と述べられる場合、それは、凝固活性がないか、または培養培地中の細胞または組織試料の増殖に干渉しないわずかな凝固活性だけがあってよいものと理解される。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、所与の値がエンドポイントの「少し上」または「少し下」であり得ると提供することによって、数値範囲エンドポイントに柔軟性を提供するために使用される。この用語の柔軟性の程度は、特定の可変値によって規定される可能性があり、経験および本明細書での関連記述に基づいて判定する当業者の知識の範囲内である。
【００１９】
本明細書で使用される場合、複数の要素が、便宜上共通のリストに提示される場合がある。しかし、これらのリストは、リストの各メンバーが別個の固有なメンバーとして個々に識別されるのと同様に解釈されるべきである。したがって、そのようなリストの個々のメンバーは、そうではないことが示されない限り、単に共通の群におけるそれらの提示に基づいて、同じリストの他のいかなるメンバーの事実上の同等物であると解釈されるべきではない。
【００２０】
濃度、量および他の数値データは、本明細書において範囲の形式で表すかまたは提示することができる。そのような範囲の形式は、単に便宜上および簡潔さのために使用され、したがって、範囲の限界として明示的に記載された数値だけを含むのではなく、各数値および部分範囲が明示的に記載されたのと同様にその範囲内に包含される全ての個々の数値または部分範囲も含むものと柔軟に解釈されるものと理解すべきである。例示として、「約０．０１から２．０」という数値範囲は、約０．０１から約２．０の明示的に記載された値だけを含むのではなく、示される範囲内の個々の値および部分範囲も含むものと解釈すべきである。したがって、この数値範囲には、０．５、０．７および１．５などの個々の値、ならびに０．５から１．７、０．７から１．５、および１．０から１．５などの部分範囲が含まれる。この同じ原理は、１つの数値だけを挙げている範囲にも適用される。さらに、そのような解釈は、範囲の幅または記載されている特性に関係なく適用されるべきである。
【００２１】
これらの定義を念頭に、細胞培養培地としての使用に適する粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物は、供与源血小板の溶解から放出された増殖因子、サイトカインおよびケモカインを含むことができ、ここで、供与源血小板からの細胞片は濾過によって取り除かれ、増殖因子、サイトカインおよびケモカインは凍結乾燥されて、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を形成する。１つの具体例では、細胞または組織を培養する方法は、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を再溶解して細胞培養培地を形成すること、および細胞または組織を細胞培養培地と接触させて、培養物中の細胞または組織を形成することを含むことができる。培地は、間葉性幹細胞、ヒト胚性幹細胞、ケラチノサイトまたは心筋細胞由来の細胞培養のために使用することができる。一部の実施形態では、間葉性幹細胞は、臍帯由来でもよい。他の細胞型を、同様に使用することができる。
【００２２】
別の例では、細胞培養培地は、液体培地で再溶解した粒状の凍結乾燥血小板溶解物を含むことができ、ここで、細胞培養培地は、培養物中の細胞または組織において凝固活性を示さない濃度で製剤化される。１つの具体例では、細胞または組織を培養する方法は、細胞または組織を細胞培養培地と接触させて、培養物中の細胞または組織を形成することを含むことができる。同じく、培地は、間葉性幹細胞、ヒト胚性幹細胞、ケラチノサイトまたは心筋細胞由来の細胞培養のために使用することができる。一部の実施形態では、間葉性幹細胞は、臍帯由来でもよい。他の細胞型を、同様に使用することができる。
【００２３】
別の例では、凍結乾燥血小板溶解物組成物を調製するための方法は、血小板および流体担体を含む血小板供与源を得るステップ；血小板を溶解して複数の溶解物を形成するステップ；および溶解後に複数の溶解物を濾過して細胞片を取り除くステップを含むことができる。この例では、追加のステップは、複数の溶解物を凍結乾燥させて、放出された濃度の利用可能な増殖因子、サイトカインおよびケモカインを有する粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を形成することを含むことができる。１つの具体例では、細胞培養培地として再溶解したとき、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物は生細胞または組織培養において凝固活性を引き起こさない。
【００２４】
上の例で記したように、本開示の組成物の１つの利点は、これらの組成物は、それらが細胞または組織培養で凝固を示さないかまたは促進しないように、すなわち、細胞または組織培養に負の影響を実質的に与えないわずかな凝固以下であるように調製することができるということである。一部の例では、細胞培養培地中の少なくとも５０重量％、または約１０重量％、２０重量％もしくは３０重量％から約５０重量％、６０重量％もしくは７０重量％の量の凍結乾燥血小板溶解物は、凝固を示さないかまたは促進しない。ＬＰＬの阻害された凝固活性は、溶解の程度に起因すると考えられている。様々な程度の血小板溶解が起こり得る。一実施形態では、血小板数で、組成物中に残る供与源血小板の少なくとも１５％は、溶解されて凍結乾燥血小板溶解物を形成する。別の実施形態では、血小板数で、組成物中に残る供与源血小板の少なくとも３０％は、溶解されて凍結乾燥血小板溶解物を形成する。さらに別の実施形態では、血小板数で、組成物中に残る供与源血小板の少なくとも約５０％は、溶解されて凍結乾燥血小板溶解物を形成する。一例では、血小板数で、組成物中に残る供与源血小板の少なくとも７０％は、溶解されて凍結乾燥血小板溶解物を形成する。別の例では、血小板数で、組成物中に残る供与源血小板の少なくとも９０％は、溶解されて凍結乾燥血小板溶解物を形成する。さらに別の例では、血小板数で、組成物中に残る供与源血小板の少なくとも９９％は、溶解されて凍結乾燥血小板溶解物を形成する。
【００２５】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、細胞または組織培養培地としての使用のために再溶解されるときにＬＰＬ粒状組成物を溶解または分散させる溶媒以外に、いかなる追加の要素も含有しない。粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物は、細胞培養培地の意図された目的に適当な任意の液体培地を使用して再溶解することができる。一部の実施形態では、ＬＰＬは、意図された適用のために適当な濃度で液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、食塩水、血漿、ＤＭＳＯ、ＭＥＭアルファ、ＲＰＭＩ、Ｂ−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミンなど、またはそれらの組合せ）で再溶解することができる。一部の例では、ＬＰＬ粒状組成物は、容量で０．０１％から１００％、１％から９０％、１０％から８０％、または２０％から７０％の範囲の異なる濃度で再水和し、その疎水性膜の中のリポソーム溶液と混合することができる。他の実施形態では、細胞培養培地は、溶媒以外の追加の要素と混合することができる。一実施形態では、細胞培養培地は、当技術分野で公知である他の培養培地製品（複数可）と混合される。さらに別の実施形態では、細胞培養培地は、活性剤または生物学的薬剤をさらに含むことができる。活性剤または生物学的薬剤は、培地の使用目的に特異的な、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗生物質、増殖因子および／または他の化学物質の少なくとも１つを含むことができる。活性剤または生物学的薬剤の量は、培地の使用目的の必要を満たす任意の濃度であってよい。任意の追加の要素と組み合わせたとき、培地中の組み合わせたＬＰＬならびにフリーズドライされた増殖因子、サイトカインおよびケモカインの量は、重量で約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％または４０％から約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％で存在することができる。１つの具体例では、組み合わせたＬＰＬならびにフリーズドライされた増殖因子、サイトカインおよびケモカインの量は、約２０重量％から約９０重量％、または約３０重量％から約８０重量％、または約４０重量％から約７０重量％であってよい。細胞培養培地はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のために製剤化することができる。
【００２６】
粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物の活性は、長期間安定であり得る。一実施形態では、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物は、−８０℃で保存したとき少なくとも５年間安定であり得る。別の実施形態では、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物は、４℃で保存したとき、少なくとも１年間またはもっと長く、例えば、少なくとも２年間、少なくとも３年間等、安定であり得る。さらに別の実施形態では、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物は、室温で保存したとき、少なくとも１年間安定であり得る。一部の実施形態では、粒状の凍結乾燥血小板組成物を−８０℃、４℃または室温で少なくとも１２カ月間保存すると、組成物は液体培地で容易に再溶解することができ、その特性、例えば幹細胞培養特性および機能を実質的にまたは完全に保持することができ、幹細胞増殖または分化に関して実質的に影響を受けない細胞培養を支持することができる。他の実施形態では、粒状の凍結乾燥血小板組成物は、上で概説されるように長期間保存されたときでも、２４時間以内に平板培養細胞の量を２倍にする能力を保持する。
【００２７】
粒状の凍結乾燥血小板組成物は、１年間の保存とそれに続く再溶解の後も、継続的な多分化能に関する能力を実証することができる。一部の実施形態では、細胞培養培地は、脂肪生成的、軟骨形成的および／または骨形成的に分化する幹細胞を増殖させるために使用することができる。細胞を分化させる培養培地の能力は、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物（再溶解前）が−８０℃で少なくとも１年間、４℃で少なくとも１年間、または室温で少なくとも１年間保存した後に存在することができる。一部の実施形態では、間葉性幹細胞が細胞培養培地上で増殖されるとき、間葉性幹細胞は、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ７１およびＣＤ９０の少なくとも１つを表現型的に含むことができる。一部の実施形態では、表現型分析は、上記タンパク質の少なくとも９０％の検出をもたらすことができる。
【００２８】
一部の実施形態では、血小板を得るとき、全血由来の血小板を含む任意の血小板供与源を使用することができる。一実施形態では、血小板供与源は、血小板多血漿であってよい。一実施形態では、血小板は、哺乳動物の血小板供与源由来でもよい。さらに別の実施形態では、血小板は、ヒト以外の動物供与源由来でもよい。さらなる実施形態では、血小板は、ヒト供与源由来でもよい。供与源に関係なく、血小板は、それらがいかなる感染因子も含まないことを確実にするために検査することができる。
【００２９】
血小板は、所望により、当技術分野で公知の任意の方法を使用して濃縮することができる。例えば、血小板を血小板含有流体から濃縮して、血小板豊富な部分を形成することができる。濃縮方法の非限定的な例には、遠心分離または市販の血小板精製装置を含めることができる。
【００３０】
血小板濃縮の後、血小板を溶解することができる。溶解は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して起こすことができる。一部の実施形態では、溶解は、超音波処理、溶解を引き起こす方法で実行される濾過および／または凍結融解の結果であってよい。
【００３１】
溶解が凍結融解プロセスを通して起こるとき、その結果としての濃縮された血小板材料、例えば、一部の例では、濃縮された血小板豊富な部分は、約−１９０℃の液体窒素などで、あるいはドライアイスおよびエタノール、アセトンなど、または他の凍結を助ける組成物、器械（例えば、−８０℃フリーザー、または他の適する器械）、もしくはそれらの組合せを使用して、少なくとも約−８０℃まで凍結させることができる。
【００３２】
上記のものに加えて、いくつかの凍結温度を使用することができる。しかし、一部の実施形態では、凍結温度は約−８０℃またはそれより下であってよい。−８０℃またはそれより下などの低い温度は、多数の血小板が数分以内に凍結するように、試料または試料のかなりの割合を急速に凍結させるのに効果的である可能性がある。一部の例では、急速な凍結は、細胞内成分に損傷を与えることがある大きな氷晶の形成を予防することができ、細胞内増殖因子、サイトカインおよびケモカインの完全性をより効果的に保存することができる。したがって、一部の例では、試料または試料の少なくとも一部をできるだけ速やかに、例えば５分、１０分、２０分、３０分または６０分以内に凍結させるのに十分に低い温度に血小板を曝露させることが有利である可能性がある。しかし、一部の例では、完全な凍結には、数時間、例えば約１２時間から約３６時間、約２４時間から約４８時間、または少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、または他の適する時間、かかることがある。融解前の試料の完全な凍結は、単回の凍結融解サイクルの間に溶解する血小板の量を効果的に増加させることができる。さらに、１サイクルあたりのより完全な凍結は、血小板の十分な溶解を達成するのに実行される必要がある凍結融解サイクルの数を低減することができる。所望の細胞内成分の十分な量を達成するための凍結融解サイクルの回数を低減することは、それらの成分に加えられる熱ストレスを低減することができる。試料の容量は、試料の完全な凍結を達成するために必要な時間に影響し得ることに留意されたい。例えば、より大きな用量は、試料の完全な凍結を達成するためにより長い時間を必要とする可能性がある。
【００３３】
例えば、１つの例では、試料の完全な凍結を達成するための時間凍結した後に、濃縮された血小板材料は、次に室温より上に、例えば３０℃から４５℃、３４℃から４０℃、３０℃から３５℃、３９℃から４５℃に、または１つの例では約３７℃で、速やかに融解させることができる。次にこの凍結融解サイクルを繰り返して、血小板溶解物の濃度を増加させることができる。一部の例では、血小板の単回の凍結融解サイクルは、−８０℃またはそれより下の温度で、少なくとも４８時間の間実行することができる。一部の例では、追加の凍結融解サイクルが実行される場合、各追加のサイクルは約２４時間から約４８時間の間実行することができる。
【００３４】
一般的に、より多くのサイクルを実行するほど、より多くの血小板が溶解する。さらなる溶解が起こるとき、増殖因子、サイトカインおよびケモカインの増加した量がその結果としての材料中に存在する。予め決められた程度の溶解が起こるまで、凍結融解サイクルの量を繰り返すことができる。予め決められた程度の溶解は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％または少なくとも９０％の細胞崩壊であってよい。一部の例では、少なくとも４８時間の凍結期間を有する単一のまたは第１の凍結融解サイクルは、血小板供与源中の血小板の少なくとも３５％、または約３５％から約４５％を溶解させることができ、溶解物１ｍｌにつき少なくとも６０ｎｇの放出された増殖因子および他の細胞成分、例えばサイトカインおよびケモカインを提供することができる。一部の例では、２回の凍結融解サイクル（追加のサイクルの凍結期間が２４時間から４８時間である）は、血小板供与源中の血小板の少なくとも５５％、または約５５％から約６５％を溶解させることができ、溶解物１ｍｌにつき少なくとも９０ｎｇの放出された増殖因子および他の細胞成分、例えばサイトカインおよびケモカインを提供することができる。一部の例では、３回の凍結融解サイクル（追加のサイクルの凍結期間が２４時間から４８時間である）は、血小板供与源中の血小板の少なくとも６５％、または約６５％から約７５％を溶解させることができ、溶解物１ｍｌにつき少なくとも１４０ｎｇの放出された増殖因子および他の細胞成分、例えばサイトカインおよびケモカインを提供することができる。一部の例では、４回の凍結融解サイクル（追加のサイクルの凍結期間が２４時間から４８時間である）は、血小板供与源中の血小板の少なくとも７５％、または約７５％から約８５％を溶解させることができ、溶解物１ｍｌにつき少なくとも１９０ｎｇの放出された増殖因子および他の細胞成分、例えばサイトカインおよびケモカインを提供することができる。一部の例では、５回の凍結融解サイクル（追加のサイクルの凍結期間が２４時間から４８時間である）は、血小板供与源中の血小板の少なくとも９０％、または約９０％から約１００％を溶解させることができ、溶解物１ｍｌにつき少なくとも２３０ｎｇの放出された増殖因子および他の細胞成分、例えばサイトカインおよびケモカインを提供することができる。
【００３５】
一部の実施形態では、凍結融解サイクルの１つから全ての後に、濾過が続いてよい。一部の例では、濾過は、凍結融解溶解の前またはそれと別々に使用することができる。複数の溶解物を濾過することまたは少なくとも部分的に濾過することは、細胞片、例えば溶解した膜および他の大きな粒子、ならびにインタクトな血小板を、部分的、実質的または完全に取り除くことができ、それによってクリーンで濃縮された血小板溶解物組成物を提供する。したがって、結果として生じる溶解物は、溶解中に血小板から放出された、少なくとも５０重量％、少なくとも７０重量％、または少なくとも９０重量％の増殖因子、サイトカイン、ケモカインまたはそれらの組合せの固形分を含むことができる。さらに、濾過は、所与の試料で達成される血小板溶解の量を、約５％から約１５％、または１５％を超えて増加させることができる。例えば、単回の凍結融解サイクルが試料中の血小板の約４０％の血小板溶解を達成した場合、試料の以降の濾過は、一部の例では、血小板溶解を約４２％から約４６％、またはそれを超えて増加させることができる。濾過は、血小板溶解物中の潜在的細菌汚染の量を減少させることもできる。
【００３６】
いくつかの適するフィルター膜を使用することができる。典型的には、フィルター膜は低いタンパク質結合親和性を有することができ、および／または、生体試料での使用に適する可能性がある。一部の例では、フィルター膜は、ポリビニリジンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、親水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、再生セルロース（ＲＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリカーボネートトラックエッチド（ＰＣＴＥ）、ポリエステルトラックエッチド（ＰＥＴＥ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、非対称ＰＥＳ、酢酸セルロース（ＣＡ）およびそれらの組合せからなる群から選択される材料で作製することができる。一部の例では、フィルター膜は、約０．１ミクロンから０．３ミクロン、例えば、約０．２２ミクロン、約０．２ミクロンまたは約０．１ミクロンの孔径を有することができる。一部の例では、フィルター膜は、ガラスマイクロファイバー、非対称ポリエーテルスルホンまたは他の適する前置フィルターなどの前濾過膜または層を有することができる。一部の例では、血小板溶解物試料は、重量圧によりフィルターを通過させることができる。他の例では、試料のフィルター通過を促進するために、真空または正の圧を血小板溶解物試料に加えることができる。一般的に、正または負の圧の下の濾過は、血小板溶解物試料で血小板溶解の量を増加させることができる。導入される正または負の圧が高いほど、血小板溶解の増加が大きい。
【００３７】
血小板溶解物を濾過した後、それらは、標準の凍結乾燥技術を使用して凍結乾燥またはフリーズドライすることができる。例えば、濾過された血小板溶解物は、液体窒素中で凍結させることができ、またはドライアイスおよびエタノールもしくはアセトン溶液中で凍結させることができる。凍結の後、試料はフリーズドライヤーに流れるように連結し、所定の乾燥まで標準の凍結乾燥パラメータの下で乾燥させることができる。例えば、試料は、１５重量％未満の含水量、１０重量％未満の含水量、７重量％未満の含水量、５重量％未満の含水量、３重量％未満の含水量、または１重量％未満の含水量を有するように乾燥させることができる。長期保存のために、３重量％未満または１重量％未満の含水量を有するまで、試料をフリーズドライすることが望ましいことがある。血小板溶解物が凍結乾燥されると、それは粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を形成することができる。乾燥すると、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物は、血小板の溶解中に血小板から放出された、少なくとも５０重量％、少なくとも７０重量％、または少なくとも９０重量％の増殖因子、サイトカイン、ケモカインまたはそれらの組合せを含むことができる。組成物中の溶解物の濃度または効力を増加させるために、上記のように、細胞片およびインタクトな血小板を濾過ステップの間にほとんど取り除くことができる。
【００３８】
指摘したように、粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物は、細胞培養培地の意図された目的に適当な任意の液体培地を使用して再溶解することができる。ＬＰＬを濃縮したこのタイプの培地は、哺乳動物の細胞、特に、ヒト血小板が研究または治療用途のために使用されるときにヒト細胞を培養するために使用することができる。本開示に従って調製される凍結乾燥血小板溶解物は、細胞および組織の増殖を可能にするだけでなく、器官およびそれらの機能等を維持する、増殖因子、サイトカインおよびケモカインを含有するので、ＬＰＬは、様々な組織からの間葉性幹細胞、ヒト胚性幹細胞、ケラチノサイト、心筋細胞およびヒト体内の多くの他の細胞型を含むがこれらに限定されない、各種の細胞または組織を増殖させるかまたは誘導するのに有用であることに留意されるべきである。
【００３９】
一部の例では、培養培地は、異なるＬＰＬ試料で作製することができる。例えば、培養培地は、一部、少数の凍結融解サイクルを使用して得られたＬＰＬ試料で、および一部、多数の凍結融解サイクルを使用して得られたＬＰＬ試料で作製することができる。一部の例では、凍結融解サイクルの回数は異なる細胞成分に異なる影響を及ぼすことができるので、これは有利であり得る。例えば、一部の細胞成分は、より低い程度の細胞崩壊を誘導する条件下でより優勢になることができるが、他の細胞成分は、より高度の細胞崩壊を誘導する条件下でより優勢になり、その逆もまた同じである。
【００４０】
一部の例では、追加の培養培地をＬＰＬ培養培地と混合して、細胞培養混合培地を形成することができる。一部の例では、追加の培養培地は、約１０重量％から約９０重量％、約２０重量％から約８０重量％または約３０重量％から約７０重量％の細胞培養混合培地を含むことができる。一部の例では、細胞培養培地を−８０℃、４℃または室温で少なくとも１年間保存してから２４時間以内に、細胞培養混合培地は、平板培養細胞の量を２倍にする細胞培養培地の能力を保持することができる。
【００４１】
細胞培養培地は、大きなバッチで調製することができる。一実施形態では、細胞培養培地は、約０．５Ｌから約１０００Ｌ、１Ｌから５００Ｌ、１０Ｌから１０００Ｌ等のバッチサイズで調製される。より具体的には、バッチサイズは、各々約０．５Ｌ、１Ｌ、１０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌまたは７５０Ｌであってよい。大きなバッチサイズを作製する能力は、ロット間変動性の低減された培養培地をもたらすことができる。
【００４２】
開示される技術実施形態の精神から逸脱することなく、明らかな性質の様々な変更および改変を加えることができることは、当業者にとって容易に明らかになり、全てのそのような変更および改変は、添付の特許請求の範囲を含めて本明細書に列挙される技術の範囲内にあると考えられる。そのような変更および改変の１つの例は、これらに限定されないが、培養培地に追加の要素を組み込むことおよび／または本明細書に明記されたそれらの中間の保存温度を使用することを含むことができるかもしれない。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例は、現在最もよく知られている本開示の実施形態を例示する。しかし、以下のものは本開示の原理の適用を単に例示または解説するものにすぎないことを理解すべきである。本開示の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は多数の改変および代替組成物、方法および系を考案することができる。添付の特許請求の範囲は、そのような改変およびアレンジを包含するものである。したがって、本開示は上で詳細に記載されているが、以下の実施例は、現在最も実際的な実施形態であると考えられるものに関連したさらなる詳細を提供する。
（実施例１）
粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物の調製および再溶解された細胞培養培地
【００４４】
加工中に血液の凝固を防ぐために適当な量の抗凝固剤を用いて末梢血を収集する。この実施例では、３５ｍＬの血液を収集し、次に、ブレーキをオフモードに設定して４℃で２００×ｇ（１０００ｒｐｍ）により１０分間遠心分離する。遠心分離の後、血小板豊富な部分を取り出し、血小板豊富な部分のチューブを−１９０℃から−８０℃の凍結範囲に２４時間の間置く。２４時間後に、３７℃で速やかに融解させることによって血小板を溶解させる。融解後、チューブを次いで濾過し、同じ凍結範囲内の別の凍結サイクルに２４時間の間戻す。凍結融解サイクル（１回の凍結サイクルと続く１回の融解サイクル）を少なくともさらに１回繰り返し、より典型的には少なくとも２回で合計３サイクル、例えば３回から６回の凍結融解サイクルを繰り返す。１回またはそれを超える凍結融解サイクルの後、溶解した血小板を濾過して、細胞膜および細胞片を取り除いてもよい。血小板を溶解または収集するために、超音波処理、濾過なども、本明細書に記載される凍結融解サイクルの代わりにまたはそれに追加して使用することができることに注目されたい。最後の凍結融解サイクルの後、チューブを−８０℃で再凍結し、一晩保存する。翌日、−８４℃で、０．００８ミリバールの下でＦｒｅｅＺｏｎｅ２．５  Ｐｌｕｓ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）を使用してチューブを４８時間凍結乾燥する。凍結乾燥は、追加の血小板もさらに溶解させることができる。凍結乾燥される総量によって、時間は４８時間を超えて増加させることができる。同様に、一部の実施形態では、時間はある程度減少させることができる。粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物が形成される。次に組成物を、液体培地で再溶解し、撹拌し、加熱し、シャーレまたは試験管に注ぐことができる。
（実施例２）
間葉性幹細胞試験
【００４５】
実施例１に記載されるのと同様に調製された粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物を、各々−８０℃、４℃および室温で３、６、９および１２カ月間保存した。これらの保存期間の後の再溶解した凍結乾燥血小板溶解物組成物は、フローサイトメトリー、細胞形態、倍加速度、および臍帯由来の間葉性幹細胞での分化可能性に基づいて、市販の調製培地ＸｃｙｔｅＰＬＵＳ（商標）（ｉＢｉｏｌｏｇｉｃｓ（商標）、ＬＬＣ、Ａｒｉｚｏｎａから入手可能、−８０℃だけで保存された）と機能を比較した。ＸｃｙｔｅＰＬＵＳ（商標）は、４℃または室温で長期間保存することができないことに留意されたい。
フローサイトメトリー
【００４６】
全てのヒト血小板溶解物条件で増殖させた間葉性幹細胞の表現型分析を、フローサイトメトリーを使用して試験した。上記の様々な条件で保存した全ての培養培地で、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ７１およびＣＤ９０について９０％またはそれを超える陽性結果が識別された。ＣＤ１０６、ＨＬＡ−ＤＲ−ＤＰ−ＤＱ、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３３／２およびＳｔｒｏ１については、陽性結果はほとんどまたは全く示されなかった。
形態
【００４７】
全てのヒトタンパク質溶解物条件で増殖させた細胞のために間葉性幹細胞形態を評価するために、倒立光学顕微鏡法を利用した。記載された様々な条件で保存した培養培地の全ては、安定した形態をもたらした。
増殖曲線
【００４８】
冷凍保存された第３継代の臍帯由来の間葉性幹細胞を、１０％ヒト血小板溶解物を追加した培地に細胞数２１００／ｃｍ２で平板培養した。８０〜９０％の集密で細胞を収集し、さらなる２継代にわたって再平板培養した。各条件について増殖させた間葉性幹細胞の倍加時間を、統計学的に計算した。様々な条件および保存期間で保存した培養培地の全ては、２０〜２５時間の間の時間で倍加をもたらした。増殖曲線試験の結果は、図１に示す。
分化可能性
【００４９】
ヒト血小板条件で増殖させた間葉性幹細胞の多分化能を、脂肪生成、軟骨形成および骨形成分化について試験した。結果は、上記のように様々な条件および保存期間で保存した培養培地の全ては、細胞分化をもたらしたことを示す。図２は、分化キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから）を使用してとられた分化の画像を提示する。
（実施例３）
血小板溶解試験
【００５０】
血小板豊富な試料を、実施例１に記載されるのと同じ方法で得た。血小板豊富な試料を、−１９０℃から−８０℃の凍結範囲に４８時間の間置く。４８時間後に、３７℃で速やかに融解させることによって血小板を溶解させる。単回の凍結融解サイクルの後に溶解した細胞の量を判定するために、試料の第１のセットを分析した。上記のようにそれぞれ合計２、３、４および５サイクルにわたって、追加の試料を２４時間から４８時間の間再凍結させ、再融解させた。この試験の結果は、図３に表す。図３で分かるように、全ての血小板の完全な溶解が、５回の凍結融解サイクルで達成された。対照的に、単回の凍結融解サイクルは、約４０％の溶解だけを達成した。
【００５１】
さらに、用いた凍結融解サイクルの数と比較して得られた各それぞれの増殖因子の量を判定するために、試験試料の各々について３つの特異的増殖因子をモニタリングした。図４で分かるように、より多くの回数の凍結融解サイクルは、より多くの数の溶解細胞だけでなく、より多くの量の増殖因子を達成した。したがって、用いた凍結融解サイクルの数が多いほど、溶解した血小板の数は多く、また得ることができる増殖因子および他の細胞成分の量は多い。
（実施例４）
粒状の凍結乾燥血小板溶解物の特徴付け
【００５２】
試料は、上の実施例１に従って３つ調製した。標的細胞成分のどれが粒状の凍結乾燥血小板溶解物に存在し、どのくらいの量で存在していたかを判定するために、様々な増殖因子、サイトカインおよびケモカインをモニタリングした。結果は、下の表１に表す（全ての値は試料１ミリリットルあたりの細胞成分のピコグラム数（ｐｇ／ｍｌ）である：
【表１】
2018517771.tif 000003
【００５３】
表１から分かるように、粒状の凍結乾燥血小板溶解物は、細胞培養培地および他の用途で使用するのに有益である可能性のある様々な異なる細胞成分を含む。
（実施例５）
凝固試験
【００５４】
粒状の凍結乾燥血小板溶解物を、上の実施例１に従って調製した。粒状の凍結乾燥血小板溶解物を、５０重量％を超える量で水に再溶解した。組成物をシャーレに加え、組成物の凝固速度を判定するためにモニタリングした。しかし、試料で凝固は観察されなかった。
【００５５】
粒状の凍結乾燥血小板溶解物の凝固活性をさらに試験するために、試料を上記のように調製し、凝固速度を判定するためにトロンビンを組成物にさらに加えた。前と同じく、試料で凝固は観察されなかった。
（実施例６）
幹細胞回収試験
【００５６】
粒状の凍結乾燥血小板溶解物を、上の実施例１に記載の通りに調製した。試料を、１年間室温で保存した。１年の保存期間の後、少なくとも５０重量％の濃度で、試料を滅菌水で再溶解した。長期保存された溶解物とインキュベートされた間葉性幹細胞のパーセント回収率を判定する培養培地として、再溶解した粒状の凍結乾燥血小板溶解物を間葉性幹細胞培養と組み合わせた。３つの別個の試料で、室温で１年間の保存の後でも、幹細胞は、それぞれ９８％、９６％および９９％で回収された。
【００５７】
上記の実施例は本明細書で議論される原理および概念を例示するものであるが、発明の能力に影響を与えることなく、さらにそれらの原理および概念から逸脱することなく、形態、使用法および実行の詳細に多くの改変を加えることができることは当業者にとって明らかである。したがって、原理および概念は限定されず、下記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2018517771.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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