(57)【要約】本発明は、テストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏ（固形腫瘍に対して治療効果を有するインターフェロン）に対する相対効力を確定又は比較する新規な方法、テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏとの間の実質的同等性を構築する方法、及びテストインターフェロンの効力を確定する方法、これら方法による同定キット、及び前記活性を有するインターフェロン若しくはインターフェロン代用物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
テストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する相対効力を確定又は比較する方法において、
（１）前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供することと、
（２）同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、それぞれ以下の（ａ）〜（ｋ）から選ばれるいずれか１種又は多種の活性を測定することとを含み、
前記テストインターフェロンが、統計学的に有意であるように、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうち所定のいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は６種の活性を有し、及び／又は前記テストインターフェロンが、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）のうち所定のいずれか１種又は多種の活性を有するのは、前記テストインターフェロンがｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物と実質的に同じ効力を有することを示す、方法：
（ａ）いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；
（ｂ）癌細胞生存率の減少；
（ｃ）癌細胞転移に対する阻害；
（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；
（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；
（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；
（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する阻害；
（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；
（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；
（ｊ）ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；
（ｋ）癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性。
【請求項２】
テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との間の実質的同等性を構築する方法において、
（１）前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供することと、
（２）同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、それぞれ以下の（ａ）〜（ｋ）から選ばれるいずれか１種又は多種の活性を測定することとを含み、
前記テストインターフェロンが、統計学的に有意であるように、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうち所定のいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は６種の活性を有し、及び／又は前記テストインターフェロンが、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）のうち所定のいずれか１種又は多種の活性を有するのは、前記テストインターフェロンがｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物と実質的同等であることを示す、方法：
（ａ）いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；
（ｂ）癌細胞生存率の減少；
（ｃ）癌細胞転移に対する阻害；
（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；
（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；
（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；
（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する阻害；
（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；
（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；
（ｊ）ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；
（ｋ）癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性。
【請求項３】
前記１種又は多種の活性を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、子宮頚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞及び前立腺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記１種又は多種の活性を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＳＷ６２０細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
活性（ａ）である体内癌細胞生長に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肝臓癌細胞、子宮頚癌細胞、結腸癌細胞及び肺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
活性（ａ）を測定するために用いられる癌細胞は、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＨＴ−２９細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞及びＡ５４９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、ＨＴ−２９細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞及びＡ５４９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、さらに好ましくは、Ａ５４９細胞を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
活性（ａ）の阻害作用の測定において、生理食塩水若しくはＰＢＳはコントロールとして用いられる請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇの量で投与される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は一日おきに投与される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約２週間〜約６週間、好ましくは、約３週間〜約４週間継続して投与される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
活性（ｂ）である癌細胞生存率の減少の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲で、それぞれ癌細胞生存率を約５０％減少させる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、少なくとも約２５ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも約５０ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも約７５ｍｃｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、少なくとも約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で、それぞれ癌細胞生存率を実質的に検出できない程度まで減少させる請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の濃度は約０．２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲に入る請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、癌細胞を少なくとも約１日間、好ましくは、少なくとも約２日間処理する請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、子宮頚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞及び前立腺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、肺癌細胞、結腸癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞及び前立腺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞及びＰＡＮＣ−１細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞及びＰＡＮＣ−１細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、約１日間〜約１０日間、好ましくは、約１日間〜約６日間処理される請求項１〜１０と１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
活性（ｃ）である癌細胞転移に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
トランスウェル法を利用して活性（ｃ）である癌細胞転移に対する阻害を測定する請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
活性（ｄ）である癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞、ＨＴ−２９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
β−カテニン／ＴＣＦの転写活性はレポーターシステムを用いて測定される請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記レポーターシステムはＴＯＰＦｌａｓｈを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記レポーターシステムはｐＳＶ４０−ＲＬプラスミドを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
活性（ｅ）である癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーションを測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＳＷ６２０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、さらに好ましくは、ＨＴ−２９細胞を含む請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
活性（ｅ）の測定において、ＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６のｍＲＮＡレベルを測定することによりＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現を確定する請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
活性（ｆ）であるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は肺癌細胞を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞を含む請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｆ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｆ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
活性（ｆ）の測定において、Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及び／又はＩＤ２のｍＲＮＡレベルを測定することによりそれに対応する発現を確定する請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
活性（ｆ）の測定において、コントロールに比べて、テストインターフェロンが癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種のうち少なくとも約３０％、好ましくは、少なくとも約４０％、より好ましくは、少なくとも約５０％、さらに好ましくは、少なくとも約６０％の発現を減少する場合、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する又は実質的同等であるとみなされる請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
活性（ｇ）である癌細胞における偽足形成に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は肺癌細胞を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞を含む請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約４日間、好ましくは、少なくとも約８日間処理する請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
活性（ｈ）である癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞及びＳＷ４８０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
活性（ｈ）の測定において、ウエスタンブロットを利用してβ−カテニン発現に対する阻害を測定する請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約４８時間、好ましくは、少なくとも約７２時間処理する請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
活性（ｉ）である癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーションを測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＳＷ６２０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間処理し、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
活性（ｉ）の測定において、ＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及び／又はＢＡＴＦ２のｍＲＮＡレベルを測定することによりそれに対応する発現を確定する請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
活性（ｊ）の測定において、ＩＦＮα−２ｂに比べて、テストインターフェロンが少なくとも約２倍、好ましくは、少なくとも約３倍、より好ましくは、少なくとも約４倍、さらに好ましくは、少なくとも約４．５倍とより高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性を有する場合、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する又は実質的同等であるとみなされる請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
活性（ｊ）の測定において、ＩＦＮα−２ｂに比べて、テストインターフェロンが少なくとも約５倍、好ましくは、少なくとも約７倍、より好ましくは、少なくとも約９倍、さらに好ましくは、少なくとも約１１倍とより低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性を有する場合、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する又は実質的同等であるとみなされる請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
活性（ｊ）の測定において、解離定数（ＫＤ）を測定することで、ＩＦＮα−２ｂ、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物のＩＦＮＡＲ１及び／又はＩＦＮＡＲ２への結合親和性を確定する請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
活性（ｋ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞及びＨｅｌａ細胞のうちいずれか１種又は多種を含む請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
活性（ｋ）の測定において、癌細胞に接触する前に、ＩＦＮα−２ｂ、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を約５ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌのＢ１８Ｒとともにインキュベートする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
活性（ｋ）の測定において、ＩＦＮα−２ｂに比べて、癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおけるテストインターフェロンが、より低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性を有する場合、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する又は実質的同等であるとみなされる請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項６２】
活性（ｋ）の測定において、ウエスタンブロットを利用してｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションを測定する請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
統計学的に有意であるとは、コントロールに比べて、ｐ値≦０．０５、又は≦０．０１、又は≦０．００５、又は≦０．００１、又は≦０．０００５、又は≦０．０００１である請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記コントロールは、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で処理されず、生理食塩水若しくはＰＢＳで処理され、又はＩＦＮα−２ｂで処理され、又は未処理のコントロール（Ｍｏｃｋ）である請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも１種、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１種の下記の（ａ）〜（ｋ）の活性において、テスト化合物とｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との間の実質的同等性を構築する方法において、下記の（ａ）〜（ｋ）の活性を比較して実質的に同じ反応を示すことを含む方法：
（ａ）いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；
（ｂ）癌細胞生存率の減少；
（ｃ）癌細胞転移に対する阻害；
（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；
（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；
（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；
（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する阻害；
（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；
（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；
（ｊ）ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；
（ｋ）癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性。
【請求項６６】
（ａ）一定量の特定な活性を有するｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物と、（ｂ）検出を行うための取り扱い説明書及び検出を行うための試薬のうち少なくとも１種と、を含むテストインターフェロンの効力を評価するキット。
【請求項６７】
前記テストインターフェロンのアミノ酸配列とｒＳＩＦＮ−ｃｏのアミノ酸配列（配列番号１）は少なくとも９０％の同一性を有し、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する請求項１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記テストインターフェロンをコードするヌクレオチド配列とｒＳＩＦＮ−ｃｏをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）は少なくとも９０％の同一性を有し、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する請求項１〜６５及び６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏは同じアミノ酸配列（配列番号１）を有し、且つ同じヌクレオチド配列（配列番号２）にコードされている請求項１〜６５及び６７〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏは実質的に同じ比活性を有する請求項１〜６５及び６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記比活性は約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約１×１０９ＩＵ／ｍｇの範囲内にある請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；癌細胞生存率の減少；癌細胞転移に対する阻害；癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；癌細胞における偽足形成に対する阻害；癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；及び、癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性から選ばれる１種又は多種の活性、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１種の活性を含むインターフェロン若しくはインターフェロン代用物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏに対する相対効力を確定又は比較する新規な方法、テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏとの間の実質的同等性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）を構築する方法、癌細胞転移、偽足（ｐｓｅｕｄｏｐｏｄ）形成、β−カテニン／ＴＣＦ−媒介の転写活性及びβ−カテニンの蛋白レベルを阻害する方法、Ｗｎｔ関連受容体若しくは共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現をダウンレギュレーションする方法、Ｗｎｔシグナル伝達経路の標的遺伝子の発現を阻害する方法、腫瘍阻害遺伝子をアップレギュレーションする方法、ならびにいずれ及びあらゆる前記方法を行うための測定キットに関する。本発明はさらに前記活性を有するインターフェロン若しくはインターフェロン代用物に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーインターフェロン（以下、「ｒＳＩＦＮ−ｃｏ」又は「ｓＩＦＮ−Ｉ」と呼ばれ、固形腫瘍に対して治療作用を有するインターフェロンである）は既に特許文献１（組換え高効複合インターフェロン）と特許文献２（組換えインターフェロンをコードする核酸）に記載されている。ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｆａｃｏｎ−１）（特許文献３に開示された複合インターフェロンα）と同じアミノ酸配列をコードする工程化された遺伝子構築物より発現される。しかし、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）をコードする核酸配列と異なる新しい核酸配列にコードされている。ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ蛋白は新しい三次構造と改善された生物学特性を有する。
【０００３】
特許文献４、特許文献５と特許文献６に記載されているように、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、固形腫瘍に対する直接阻害作用及び抗ウイルス活性を含むより広域スペクトルの生物活性も有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７，３６４，７２４号
【特許文献２】米国特許第７，５８５，６４７号
【特許文献３】米国特許第４，６９５，６２３号
【特許文献４】米国特許第８，１１４，３９５号
【特許文献５】米国特許第８，２８７，８５２号
【特許文献６】米国特許第８，４２５，８９６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ｒＳＩＦＮ−ｃｏが他の従来の市販インターフェロンよりも独特な生物学活性、及び人類への応用可能性を有することに鑑みて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏと他のテストインターフェロンの生物学活性及び／又は効力を評価する方法を提供することが望まれ、例えば、製造過程中或いは他の面における品質制御を目的として、最終製品が所望の活性を保有又は有し、且つ従来の市販のインターフェロンと異なっていることを保証する。さらに、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの他の用途、及び所望の活性を有するインターフェロン若しくはインターフェロン代用物を提供することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一つの形態では、本発明は、テストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する相対効力を確定又は比較する方法において、（１）前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供することと、（２）同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、それぞれ以下の（ａ）〜（ｋ）から選ばれるいずれか１種又は多種の活性を測定することとを含み、前記テストインターフェロンが、統計学的に有意であるように、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうち所定のいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は６種の活性を有し、及び／又は前記テストインターフェロンが、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）のうち所定のいずれか１種、又は例えば２種、又は３種、又は４種、又は５種のような多種の活性を有するのは、前記テストインターフェロンがｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物と実質的に同じ効力を有し、即ち、実質的に同じ有効性を有し又は実質的に同じ結果を生じることを示す、方法を提供する。（ａ）いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；（ｂ）癌細胞生存率の減少；（ｃ）癌細胞転移に対する阻害；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する阻害；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；（ｉ）癌細胞、例えばＡ５４９細胞又はＳＷ６２０細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；（ｊ）ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；（ｋ）癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性。ここで、「実質的に同じ」とは、少なくとも約７０％が同じであり、好ましくは、少なくとも約８０％が同じであり、より好ましくは、少なくとも約９０％が同じであり、さらに好ましくは、少なくとも約９５％が同じである。
【０００７】
他の形態では、本発明は、テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との間の実質的同等性を構築する方法において、（１）前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供することと、（２）同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、それぞれ以下の（ａ）〜（ｋ）から選ばれるいずれか１種又は多種の活性を測定することとを含み、前記テストインターフェロンが、統計学的に有意であるように、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうち所定のいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は６種の活性を有し、及び／又は前記テストインターフェロンが、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）のうち所定のいずれか１種又は多種の活性、例えば２種、又は３種、又は４種、又は５種の活性を有するのは、前記テストインターフェロンがｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物と実質的同等であることを示す、方法を提供する。（ａ）いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；（ｂ）癌細胞生存率の減少；（ｃ）癌細胞転移に対する阻害；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する阻害；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；（ｉ）癌細胞、例えばＡ５４９細胞又はＳＷ６２０細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；（ｊ）ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；（ｋ）癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性。
【０００８】
幾つかの実施形態では、前記１種又は多種の活性を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、子宮頚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞及び前立腺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、前記１種又は多種の活性を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＳＷ６２０細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。
【０００９】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）である体内癌細胞生長に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肝臓癌細胞、子宮頚癌細胞、結腸癌細胞及び肺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ａ）を測定するために用いられる癌細胞は、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＨＴ−２９細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞及びＡ５４９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、ＨＴ−２９細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞及びＡ５４９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、さらに好ましくは、Ａ５４９細胞を含む。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の阻害作用の測定において、生理食塩水若しくはＰＢＳはコントロールとして用いられる。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇの量で投与される。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は一日おきに投与される。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約２週間〜約６週間、好ましくは、約３週間〜約４週間継続して投与される。
【００１０】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）である癌細胞生存率の減少の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲で、それぞれ癌細胞生存率を約５０％減少させる。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、少なくとも約２５ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも約５０ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも約７５ｍｃｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、少なくとも約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で、それぞれ癌細胞生存率を実質的に検出できない程度まで減少させる。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の濃度は約０．２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲に入る。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、癌細胞を少なくとも約１日間、好ましくは、少なくとも約２日間処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、子宮頚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞及び前立腺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、肺癌細胞、結腸癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞及び前立腺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞及びＰＡＮＣ−１細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞及びＰＡＮＣ−１細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、約１日間〜約１０日間、好ましくは、約１日間〜約６日間処理される。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、活性（ｃ）である癌細胞転移に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、トランスウェル法を利用して活性（ｃ）である癌細胞転移に対する阻害を測定する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。
【００１３】
幾つかの実施形態では、活性（ｄ）である癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞、ＨＴ−２９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、β−カテニン／ＴＣＦの転写活性はレポーターシステムを用いて測定される。幾つかの実施形態では、前記レポーターシステムはＴＯＰＦｌａｓｈ又はｐＳＶ４０−ＲＬプラスミドを含む。
【００１４】
幾つかの実施形態では、活性（ｅ）である癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーションを測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＳＷ６２０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、さらに好ましくは、ＨＴ−２９細胞を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｅ）の測定において、ＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６のｍＲＮＡレベルを測定することによりＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現を確定する。
【００１５】
幾つかの実施形態では、活性（ｆ）であるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は肺癌細胞を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｆ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｆ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｆ）の測定において、Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及び／又はＩＤ２のｍＲＮＡレベルを測定することによりそれに対応する発現を確定する。幾つかの実施形態では、活性（ｆ）の測定において、コントロールに比べて、テストインターフェロンが癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種のうち少なくとも約３０％、好ましくは、少なくとも約４０％、より好ましくは、少なくとも約５０％、さらに好ましくは、少なくとも約６０％の発現を減少する場合、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する又は実質的同等であるとみなされる。
【００１６】
幾つかの実施形態では、活性（ｇ）である癌細胞における偽足形成に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は肺癌細胞を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約４日間、好ましくは、少なくとも約８日間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。
【００１７】
幾つかの実施形態では、活性（ｈ）である癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞及びＳＷ４８０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｈ）の測定において、ウエスタンブロットを利用してβ−カテニン発現に対する阻害を測定する。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約４８時間、好ましくは、少なくとも約７２時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。
【００１８】
幾つかの実施形態では、活性（ｉ）である癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーションを測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＳＷ６２０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間処理し、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｉ）の測定において、ＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及び／又はＢＡＴＦ２のｍＲＮＡレベルを測定することによりそれに対応する発現を確定する。
【００１９】
幾つかの実施形態では、活性（ｊ）の測定において、ＩＦＮα−２ｂに比べて、テストインターフェロンが少なくとも約２倍、好ましくは、少なくとも約３倍、より好ましくは、少なくとも約４倍、さらに好ましくは、少なくとも約４．５倍、例えば４．７２倍とより高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性を有する場合、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する又は実質的同等であるとみなされる。幾つかの実施形態では、活性（ｊ）の測定において、ＩＦＮα−２ｂに比べて、テストインターフェロンが少なくとも約５倍、好ましくは、少なくとも約７倍、より好ましくは、少なくとも約９倍、さらに好ましくは、少なくとも約１１倍、例えば１１．９倍とより低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性を有する場合、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する又は実質的同等であるとみなされる。幾つかの実施形態では、活性（ｊ）の測定において、解離定数（ＫＤ）を測定することで、ＩＦＮα−２ｂ、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物のＩＦＮＡＲ１及び／又はＩＦＮＡＲ２への結合親和性を確定する。
【００２０】
幾つかの実施形態では、活性（ｋ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞及びＨｅｌａ細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｋ）の測定において、癌細胞に接触する前に、ＩＦＮα−２ｂ、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を約５ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌのＢ１８Ｒとともにインキュベートする。幾つかの実施形態では、活性（ｋ）の測定において、ＩＦＮα−２ｂに比べて、癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおけるテストインターフェロンが、より低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性を有する場合、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する又は実質的同等であるとみなされる。幾つかの実施形態では、活性（ｋ）の測定において、ウエスタンブロットを利用してｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションを測定する。
【００２１】
幾つかの実施形態では、統計学的に有意であるとは、コントロールに比べて、ｐ値≦０．０５、又は≦０．０１、又は≦０．００５、又は≦０．００１、又は≦０．０００５、又は≦０．０００１である。
【００２２】
幾つかの実施形態では、前記コントロールは、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で処理されず、生理食塩水若しくはＰＢＳで処理され、又はＩＦＮα−２ｂで処理され、又は未処理のコントロール（Ｍｏｃｋ）である。
【００２３】
他の形態では、本発明は、（ａ）複数濃度のテストインターフェロンを提供すること、（ｂ）該複数濃度のテストインターフェロンを用いて、特定な条件で、第一群の癌細胞の生存率に対するテストインターフェロンの第一投与量反応を確定すること、（ｃ）複数濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供すること、（ｄ）該複数濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を用いて、同じ特定な条件で、第二群の癌細胞の生存率に対するｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の第二投与量反応を確定すること、及び、（ｅ）第一投与量反応と第二投与量反応とを比較することを含む、化合物（例えば、テストインターフェロン）の効力を確定又は比較する方法を提供する。このように、化合物、例えばテストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する相対効力を確定する。
【００２４】
幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは特定な比活性を有し、且つ比活性が約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約１×１０９ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、比活性が約４．４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約９×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、比活性が約５×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約８×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、比活性が約６×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約７．５×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。好ましくは、比活性が約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約５×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。
【００２５】
幾つかの実施形態では、化合物の効力を確定又は比較する方法において、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏの濃度が約０．２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にある。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏの濃度は、０．２ｍｃｇ／ｍｌ、０．３９ｍｃｇ／ｍｌ、０．７８ｍｃｇ／ｍｌ、１．５６ｍｃｇ／ｍｌ、３．１３ｍｃｇ／ｍｌ、６．２５ｍｃｇ／ｍｌ、１２．５ｍｃｇ／ｍｌ、２５ｍｃｇ／ｍｌ、５０ｍｃｇ／ｍｌ及び１００ｍｃｇ／ｍｌのうち少なくとも２種以上の濃度である。
【００２６】
幾つかの実施形態では、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは少なくとも約２４時間、より好ましくは少なくとも約４８時間、さらに好ましくは少なくとも約７２時間処理する。
【００２７】
幾つかの実施形態では、本発明は本文に記載したような方法を提供し、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲（癌細胞のタイプに依存する。）で癌細胞生存率を５０％減少できる効力を有する。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜１２．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内で、癌細胞生存率を５０％減少させることができる。他の実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、約１２．５ｍｃｇ／ｍｌ〜２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内で、癌細胞生存率を５０％減少させることができる。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏのＩＣ５０は約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にあり、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１５ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にある。
【００２８】
他の形態では、本発明は、（ａ）複数の癌細胞を提供すること、（ｂ）特定な条件で、ある量のテストインターフェロンで第一群の癌細胞をテストし、第一群の生存率データを生成すること、（ｃ）同じ特定な条件で、有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で第二群の癌細胞を処理し、第二群の生存率データを生成すること、及び、（ｄ）第一群の生存率データと第二群の生存率データとを比較し、テストインターフェロンの効力を確定することを含む、化合物（例えば、テストインターフェロン）のｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する癌細胞生存率への相対効力を確定又は比較する方法を提供する。
【００２９】
幾つかの実施形態では、約１日間〜約６日間の範囲内で癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約５０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは約７ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは約８ｍｃｇ／ｍｌ〜約１２．５ｍｃｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０ｍｃｇ／ｍｌの範囲内の濃度でｒＳＩＦＮ−ｃｏを使用する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌの範囲内の濃度でｒＳＩＦＮ−ｃｏを使用する。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは特定な比活性を含む。
【００３０】
幾つかの実施形態では、本文に用いられる癌細胞はヒト腫瘍細胞と動物腫瘍細胞から選ばれる。幾つかの実施形態では、腫瘍細胞は肺腫瘍細胞、又は子宮頚腫瘍細胞、又は肝臓腫瘍細胞、又は結腸直腸腫瘍細胞、又は乳腺腫瘍細胞、又はすい臓腺腫瘍細胞、又は前立腺腫瘍細胞、又はウイルス誘発した腫瘍細胞又はウイルス転化した細胞である。幾つかの実施形態では、癌細胞はＡ５４９細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈ４６０細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＨＴ２９細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、ＳＷ４８０細胞及びＳＷ６２０細胞のうちから選ばれる少なくとも１種である。
【００３１】
幾つかの実施形態では、テストインターフェロンもインターフェロンであり、ｒＳＩＦＮ−ｃｏと異なる製造ロットから得られるインターフェロンを含む。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンのアミノ酸配列とｒＳＩＦＮ−ｃｏのアミノ酸配列（配列番号１）は少なくとも９０％の同一性を有し、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンをコードするヌクレオチド配列とｒＳＩＦＮ−ｃｏをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）は少なくとも９０％の同一性を有し、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏは同じアミノ酸配列（配列番号１）を有し、且つ同じヌクレオチド配列（配列番号２）にコードされている。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏは実質的に同じ比活性を有する。幾つかの実施形態では、前記比活性は約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約１×１０９ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンは、配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入することを含む方法により得られる。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンは大腸菌宿主の中でポリヌクレオチド（配列番号２）を発現することにより作られ、好ましくは、大腸菌宿主の中でＰＢＡＤプロモーターの制御で発現される。
【００３２】
他の形態では、本発明は、（例えば、腫瘍転移中に発生する）細胞転移を阻害する方法を提供し、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらし、細胞転移を阻害することを含む。
【００３３】
幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの有効量は、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは約８ｍｃｇ／ｍｌ〜約５０ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌを含む。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの有効量は、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌを含む。
【００３４】
他の形態では、本発明は、癌細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことにより、偽足形成を阻害することを含む、癌細胞における偽足形成を阻害する方法を提供する。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの有効量は、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌを含む。
【００３５】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことを含む、細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦ−媒介の転写活性を阻害する方法を提供する。幾つかの実施形態では、レポーターシステムにより、好ましくは、ルシフェラーゼレポーターシステムにより、β−カテニン／ＴＣＦ−媒介の転写活性を確定する。幾つかの実施形態では、レポーターシステムはＴＯＰＦｌａｓｈレポーターシステムである。幾つかの実施形態では、プラスミドｐＳＶ４０−ＲＬを使用する。
【００３６】
他の形態では、本発明はさらに、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことを含む、細胞におけるβ−カテニンの蛋白レベルを減少する方法を提供する。幾つかの実施形態では、β−カテニンの特異性抗体を使用し、ウエスタンブロットを介してβ−カテニンの蛋白レベルを検出する。幾つかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコントロールとして用いる。
【００３７】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことにより、Ｗｎｔ関連受容体若しくは共受容体をダウンレギュレーションすることを含む、細胞におけるＷｎｔ関連受容体若しくは共受容体の発現をダウンレギュレーションする方法を提供する。幾つかの実施形態では、Ｗｎｔ関連受容体若しくは共受容体はＬＲＰ蛋白、例えばＬＲＰ６を含む。幾つかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の受容体若しくは共受容体はＦＺＤ蛋白、例えばＦＺＤ６を含む。幾つかの実施形態では、Ｗｎｔ関連受容体若しくは共受容体の発現の確定は、これら受容体若しくは共受容体のｍＲＮＡレベルの確定を含む。幾つかの実施形態では、これらｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを調製することにより、これらｍＲＮＡレベルを確定する。
【００３８】
他の形態では、本発明は、細胞におけるある遺伝子（Ｗｎｔシグナル伝達経路のうち少なくとも１個の標的遺伝子を含む）の発現を阻害する方法、例えば標的遺伝子過度活発（ｏｖｅｒ−ａｃｔｉｖｅ）の疾病又は症状を治療する方法を提供する。これらダウンレギュレーション遺伝子はＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、及び／又はＩＤ２を含む。該方法は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことにより、標的遺伝子の発現を阻害することを含む。
【００３９】
本発明の幾つかの実施形態では、細胞がｒＳＩＦＮ−ｃｏにさらされる所定時間は少なくとも約１２時間、好ましくは、少なくとも約２０時間、より好ましくは、少なくとも約２４時間、さらに好ましくは、少なくとも約３６時間、さらに好ましくは、少なくとも約４８時間、さらに好ましくは、少なくとも約７２時間である。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理した細胞が癌細胞である。
【００４０】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことにより、少なくとも１種の腫瘍阻害遺伝子の発現に対するアップレギュレーションを実現することを含む、細胞におけるある遺伝子（少なくとも１種の腫瘍阻害遺伝子を含む）の発現をアップレギュレーションする方法を提供する。幾つかの実施形態では、アップレギュレーションされる遺伝子は、ＤＫＫ３、ＫＬＦ４及びＢＡＴＦ２のうち少なくとも１種を含む。幾つかの実施形態では、これらｍＲＮＡレベルを測定することでアップレギュレーションされた遺伝子の発現を確定する。幾つかの実施形態では、ｃＤＮＡはこれらｍＲＮＡにより合成され、測定目的に合わせて任意に増幅される。
【００４１】
他の形態では、本発明は、少なくとも１種、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１種の下記の（ａ）〜（ｋ）の活性において、テスト化合物とｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との間の実質的同等性を構築する方法において、下記の（ａ）〜（ｋ）の活性を比較して実質的に同じ反応を示すことを含む方法を提供する。（ａ）いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；（ｂ）癌細胞生存率の減少；（ｃ）癌細胞転移に対する阻害；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する阻害；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；（ｊ）ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；（ｋ）癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性。幾つかの実施形態では、本発明は、少なくとも２種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供し、好ましくは、本発明は、少なくとも３種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供し、より好ましくは、少なくとも４種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、少なくとも５種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、少なくとも６種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、少なくとも７種、又は８種、又は９種、又は１０種、又は１１種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供する。
【００４２】
他の形態では、本発明は、テストインターフェロン効力を確定する、少なくとも１種のＷｎｔ−関連標的遺伝子の発現を阻害する、腫瘍阻害遺伝子をアップレギュレーションする、及び／又は、ＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６発現をダウンレギュレーションするための、（ａ）ｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物と、（ｂ）本文に述べた一つ以上の方法を行うための取り扱い説明書及びこれら方法を行うための試薬のうち少なくとも１種と、を含む測定キットを提供する。これら試薬はリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）又は緩衝剤を含んでもよい。幾つかの実施形態では、測定キットにおけるｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は特定な比活性を有する。
【００４３】
他の形態では、本発明は、いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；癌細胞生存率の減少；癌細胞転移に対する阻害；癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；癌細胞における偽足形成に対する阻害；癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；及び、癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性から選ばれる少なくとも１種、好ましくは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１種の活性を含むインターフェロン若しくはインターフェロン代用物を提供し、前記インターフェロン若しくはインターフェロン代用物はｒＳＩＦＮ−ｃｏではない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、実施例１に記載の処理を開始してから２１日間の間、ヒト肝臓癌腫瘍ＳＭＭＣ−７７２１のヌードマウスにおける生長曲線を示し、平均相対腫瘍体積（ＲＴＶ）で表し、各群に対して、ＭＭＣ（５ｍｇ／ｋｇ）、若しくは０．１５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．１０ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．０５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理し、又はビヒクルの生理食塩水（ＮＳ）（０．１５ｍｌ／マウス）で注射した。
【図２】図２は、実施例２に記載の２８日間処理期間でのヒト子宮頚腫瘍のヌードマウスにおける生長曲線を示し、ＲＴＶで表し、各群に対して、ＭＭＣ（５ｍｇ／ｋｇ）、若しくは０．１５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．１０ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．０５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理し、又はビヒクルの生理食塩水（０．１５ｍｌ／マウス）で注射した。
【図３】図３は、実施例３に記載の２８日間処理期間でのヒト結腸腫瘍ＨＴ−２９のヌードマウスにおける生長曲線を示し、ＲＴＶで表し、各群に対して、ＭＭＣ（５ｍｇ／ｋｇ）、若しくは０．１５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．１０ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．０５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．１５ｍｇ／マウスのＩＦＮα−２ｂで処理し、又はビヒクルの生理食塩水（０．１５ｍｌ／マウス）で注射した。
【図４】図４は、実施例４に記載の２１日間処理期間でのヒト肺腫瘍ＳＰＣ−Ａ４のヌードマウスにおける生長曲線を示し、ＲＴＶで表し、各群に対して、ＭＭＣ（５ｍｇ／ｋｇ）、若しくは０．１５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．１０ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．０５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．１５ｍｇ／マウスのＩＦＮα−２ｂで処理し、又はビヒクルの生理食塩水（０．１５ｍｌ／マウス）で注射した。
【図５】図５は、濃度が０、０．２、０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５０、２５、５０及び１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで４８時間処理した後、異なる腫瘍細胞の生存率に関する投与量反応曲線を示す。テストする細胞は、Ａ５４９肺腫瘍細胞（図５Ａ）、Ｈｅｌａ子宮頚腫瘍細胞（図５Ｂ）、ＣＬ−１肝臓腫瘍細胞（図５Ｃ）、Ｈｕｈ−７肝臓腫瘍細胞（図５Ｄ）、ＳＷ４８０結腸腫瘍細胞（図５Ｅ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺腫瘍細胞（図５Ｆ）、Ｃａｌｕ−１肺腫瘍細胞（図５Ｇ）、ＳＭＭＣ−７７２１肝臓腫瘍細胞（図５Ｈ）、及びＰＡＮＣ−１前立腺腫瘍細胞（図５Ｉ）である。結果は、コントロール細胞に対する細胞生存の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。
【図６】図６は、１、２、３、４、５及び６日間の所定日数で処理した後、１０ｍｃｇ／ｍｌでのＩＦＮα−２ｂ処理とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理の、Ａ５４９細胞（図６Ａ）とＳＷ６２０細胞（図６Ｂ）の生存率に対する作用をそれぞれ示す生存率曲線である。細胞生存率はＭＴＴ法により評価される。結果はコントロール細胞に対する細胞生存の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。（＊＊ｐ＜０．０１）
【図７】図７は、Ｍｏｃｋコントロール（図７，Ａ列）に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理（図７，Ｃ列）とＩＦＮα−２ｂ処理（図７，Ｂ列）の、肺癌細胞Ａ５４９の３Ｄ培養における４日後のコロニー形成（１行目）（１００倍拡大）、及び８日後の偽足形成（２行目と３行目）（４００倍拡大）に対する作用をそれぞれ示すミクロ写真である。Ａ列とＢ列における黒い矢印は癌細胞から突出する偽足を示す。Ｃ列における星印付きの矢印が偽足のない細胞を示す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｅは、ｍｏｃｋコントロールに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理とＩＦＮα−２ｂ処理の、異なる肺癌細胞Ａ５４９（図８Ａ）、Ｈ１２９９（図８Ｂ）及びＨ４６０（図８Ｃ）、並びに異なる結腸癌細胞ＨＴ−２９（図８Ｄ）及びＳＷ６２０（図８Ｅ）のβ−カテニン／ＴＣＦ−媒介の転写活性に対する作用をそれぞれ示す棒グラフである。数値は３回の試験の平均値である。（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）
【図９】図９Ａと図９Ｂは、ｍｏｃｋコントロールに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理とＩＦＮα−２ｂ処理の、異なる癌細胞Ａ５４９、Ｈ４６０、ＳＷ６２０及びＨＴ−２９におけるＷｎｔ関連受容体若しくは共受容体ＬＲＰ６（図９Ａ）とＦＺＤ６（図９Ｂ）の発現に対する作用をそれぞれ示す棒グラフ（ＧＡＰＤＨ発現に対するｍＲＮＡレベルにより測定される）である。３群で並行して実験を行い、結果をｍｏｃｋコントロール群で正規化する。
【図１０】図１０Ａと図１０Ｂはウエスタンブロットであり、それぞれ２４、４８及び７２時間処理した後、ｍｏｃｋコントロールに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理とＩＦＮα−２ｂ処理の、癌細胞Ａ５４９（図１０Ａ）とＳＷ４８０（図１０Ｂ）におけるβ−カテニンの蛋白レベルに対する作用をそれぞれ示す。ＧＡＰＤＨ発現はコントロールとして用いられる。３群で並行して実験を行う。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｄは、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂでＡ５４９肺癌細胞を２４時間処理した後、ｍｏｃｋコントロールに比べて、Ｗｎｔシグナル伝達経路の下流であるＡｘｉｎ２（図１１Ａ）、ＣＤ２４（図１１Ｂ）、サバイビン（図１１Ｃ）及びＩＤ２（図１１Ｄ）という４種の遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。３群で並行して実験を行い、ｍｏｃｋコントロール群で正規化する。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで処理した後、ｍｏｃｋコントロールに比べて、異なる腫瘍細胞Ａ５４９、Ｈ４６０、ＳＷ６２０及びＨＴ−２９における３種の腫瘍阻害遺伝子ＤＫＫ−３（図１２Ａ）、ＢＡＴＦ２（図１２Ｂ）及びＫＬＦ４（図１２Ｃ）の相対ｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。３群で並行して実験を行い、ｍｏｃｋコントロール群で正規化する。
【図１３】図１３Ａと図１３Ｂは、ｍｏｃｋコントロールに比べて、ＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理した後、Ａ５４９細胞（図１３Ａ）とＳＷ６２０細胞（図１３Ｂ）の腫瘍細胞転移を示す棒グラフである。結果はこの処理後の単位領域中の転移細胞平均数±ＳＤとして表される。（＊＊ｐ＜０．０１）
【図１４】図１４は、Ｍｏｃｋコントロール及び５ＦＵ処理した細胞に比べて、Ａ５４９細胞（図１４Ａ）とＳＷ６２０細胞（図１４Ｂ）をＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで２４時間又は４８時間処理した後、それぞれ針でプロカスパーゼ−３（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３）、切断したカスパーゼ−３（ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３）、プロカスパーゼ−８（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−８）、切断したカスパーゼ−８（ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−８）、ＰＡＲＰ及びβ−チューブリン（β−ｔｕｂｕｌｉｎ）の特異性抗体を染色して得られるウエスタンブロットである。
【図１５】図１５は、Ａ５４９細胞を１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ（図１５Ａ）、又は１０ｍｃｇ／ｍｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏ（図１５Ｂ）で処理した後、又はＨｅｌａ細胞を１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ（図１５Ｃ）、又は１０ｍｃｇ／ｍｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏ（図１５Ｄ）で処理した後、Ｐ−ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ１、Ｐ−ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ２、Ｐ−ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３及びＧＡＰＤＨの特異性抗体により染色して得られるウエスタンブロットである。
【図１６】図１６は、ＰＢＳ処理したコントロールに比べて、処理を開始してからの２７日間で、ＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理した後、腫瘍生長に対する阻害を示す腫瘍生長曲線である。データは平均腫瘍体積（ｍｍ３）±ＳＤ（ｎ＝８）として表される。
【図１７】図１７Ａは、定常解析（ｓｔｅａｄｙ−ａｎａｌｙｓｉｓ）モデルにより解析して得られるＩＦＮＡＲ１インターフェロン受容体の親和定数のＫＤ（ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ／ＩＦＮα−２ｂ）：２．８３５×１０−６ｍｏｌ／Ｌ（黒いダイヤモンド形）とＫＤ（ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ／ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）：６．００３×１０−７ｍｏｌ／Ｌ（黒い円形）を示す。図１７Ｂは、動的解析モデルにより解析して得られるＩＦＮＡＲ２インターフェロン受容体の親和定数のＫＤ（ＩＦＮＡＲ２−ＥＣ／ＩＦＮα−２ｂ）１．８４３×１０−９ｍｏｌ／ＬとＫＤ（ＩＦＮＡＲ２−ＥＣ／ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）：２．１９２×１０−８ｍｏｌ／Ｌを示す。図１７Ｃは、ＩＦＮα−２ｂとｒＳＩＦＮ−ｃｏのそれぞれの、ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ又はＩＦＮＡＲ２−ＥＣへの受容体結合親和性の比較結果を示す棒グラフであり、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ／ＩＦＮＡＲ１がＩＦＮα−２ｂ／ＩＦＮＡＲ１よりも約４．７２倍と強い結合親和性を示すこと、及び、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ／ＩＦＮＡＲ２がＩＦＮα−２ｂ／ＩＦＮＡＲ２よりも約１１．９倍と弱い結合親和性を示すことを表明する。
【図１８】図１８は、癌細胞を１ｎｇ／ｍｌ（最終の測定濃度）のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで処理した後、Ｐ−ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ１、Ｐ−ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ２、Ｐ−ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３、アクチン及びＧＡＰＤＨの特異性抗体により染色して得られるウエスタンブロットであり、処理前に、この癌細胞をそれぞれ１、１０又は１００ｎｇ／ｍｌのＢ１８Ｒ組換え蛋白とともにインキュベートし、前記癌細胞はＡ５４９細胞（図１８Ａ）又はＨｅｌａ細胞（図１８Ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
定義
特に断りのない限り、本文に用いられる科学・技術用語は、当業者がそれらに与える意味又は当業者が通常に理解する意味を有する。
【００４６】
また、特に断りのない限り、単数形は複数を含み、複数形は単数を含む。
【００４７】
また、特に断りのない限り、本文に用いられる用語「又は（ｏｒ）」は「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。
【００４８】
本文に用いられる用語「化合物」とは、あらゆる蛋白（あらゆる抗体、あらゆる活性抗体断片、とあらゆる二量体蛋白又は多量体蛋白を含む）、ポリペプチド、小分子、及び１種又は多種の生物学活性を有する他の分子を指す。
【００４９】
本文に用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は広義的に解読されて制限されず、「である（ｉｓ又はａｒｅ）」という意味を含む。
【００５０】
本文に用いられる用語「症状」と「疾病」は互換して使用しても併用しても良く、被験者の疾病、感染、炎症、癌症、治療による副作用、又は悪い健康状況の他の成因を示す。
【００５１】
本文に用いられる用語「有効量」は、所望の効果を奏する、例えば細胞生存率を減少させる、蛋白の発現若しくは活性をダウンレギュレーション若しくはアップレギュレーションする、又は疾病若しくは病症を治療する量を意味する。
【００５２】
本文に用いられる用語「実質的同等性を構築する」とは、ある又は幾つかのテストを行うことで実質的に同じレベルの反応、活性、有効性又は結果を示し、実験誤差の制限内（例えば、±標準差（ＳＤ））にある。
【００５３】
本文に用いられる用語「実質的に同じ」とは、少なくとも約７０％が同じ、好ましくは、少なくとも約８０％が同じ、より好ましくは、少なくとも約９０％が同じ、さらに好ましくは、少なくとも約９５％が同じであることを意味する。
【００５４】
本文に用いられる用語「約・・・の範囲」又は「約・・・の間の範囲」は、該範囲内の数、及びこの特定な範囲内のすべての一位と小数点を意味する。例えば、「約４×１０８ＩＵ／ｍｇと約５×１０８ＩＵ／ｍｇとの間の範囲」は４×１０８ＩＵ／ｍｇ、４．１×１０８ＩＵ／ｍｇ、４．２×１０８ＩＵ／ｍｇ、４．３×１０８ＩＵ／ｍｇ、４．４×１０８ＩＵ／ｍｇ等を含み、且つ「８ｍｃｇ／ｍｌ〜２０ｍｃｇ／ｍｌ」は９ｍｃｇ／ｍｌ、１０ｍｃｇ／ｍｌ等を含む。
【００５５】
本文に用いられる用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ又はｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は非限定的に理解すべきであり、且つ指定の元素及び非指定の元素も含む。
【００５６】
本文に用いられる用語「インターフェロン」又は「ＩＦＮ」はあらゆる自然的にある又は人為的に発生させるインターフェロンを意味し、題名が「複合ヒト白血球インターフェロン」のアメリカ特許４，６９５，６２３に記載の複合インターフェロンα、及びｒＳＩＦＮ−ｃｏを含む。
【００５７】
本文に用いられる用語「インターフェロン活性」は、自然的にあるインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏの特徴としての１種又は多種の生物学活性、例えば抗腫瘍活性及び／又は抗ウイルス活性を意味する。
【００５８】
本文に用いられる用語「ｒＳＩＦＮ−ｃｏ」はコンテキストに応じて、アメリカ特許第７，３６４，７２４号とアメリカ特許第７，５８５，６４７号に記載したようなポリヌクレオチド配列とアミノ酸配列、又はその活性断片を有する蛋白又は核酸分子を意味する。前記アメリカ特許第７，３６４，７２４号とアメリカ特許第７，５８５，６４７号に記載のポリヌクレオチド配列とアミノ酸配列は以下の通りである。
【００５９】
【化１】
2018517406.tif 000002
【００６０】
本文に用いられる用語「ｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物」とは、ｒＳＩＦＮ−ｃｏに対して効力を測定した又は測定しようとする、テスト化合物の効力又は活性の確定において比較の目的でｒＳＩＦＮ−ｃｏの代わりに使用できる任意の化合物を意味する。ｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物はインターフェロン又はインターフェロン特性を有する化合物であっても良い。
【００６１】
本文に用いられる比活性は生物学活性と蛋白質含有量との比である。該生物学活性は、任意の本分野で慣用する相関生物学活性、例えば、中華人民共和国薬典２０１０版三部付録ＸＣに公布している細胞病変阻害法により測定した生物学活性であっても良い。蛋白質含有量は本分野で慣用する任意の方法、例えば、中華人民共和国薬典２０１０版三部付録ＶＩ  Ｂに公布しているＬｏｗｒｙ法により測定できる。
【００６２】
本文に用いられる用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾病を完全又は一部治癒する、疾病の不進展を引き起こす又は誘発する、疾病又は病症の厳重さを改善又は減少させる、疾病再発を防止する、疾病再発の頻度を減少させる、疾病の副作用を減少する、疾病を緩和させる、健康状況を改善する全体感覚等を含む。
【００６３】
用語「Ｗｎｔ関連受容体若しくは共受容体」は、単独又は共同的にＷｎｔファミリー蛋白に結合し、細胞中の標準Ｗｎｔシグナル伝達経路又は非標準Ｗｎｔシグナル伝達経路におけるシグナル伝達を誘発する１種又は多種の分子を含む。該用語は、例えば、Ｗｎｔ共受容体であって、ＤＫＫ１と相互作用する低密度リポ蛋白受容体相関蛋白６であるＬＲＰ６、及びＷｎｔ−４リガンドの受容体とされる、Ｗｎｔシグナル伝達の受容体であるＦＺＤ６を含む。
【００６４】
本文に用いられる用語「Ｗｎｔシグナル伝達活性」とは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）ファミリー受容体及びＬＲＰ５／ＬＲＰ６共受容体に結合することにより伝達するＷｎｔシグナル伝達カスケードであり、β−カテニンの放出及びその細胞核への転移を引き起こし、細胞活性化する。
【００６５】
本文に用いられる用語「ＩＦＮＡＲ１」とは、Ｕｚｅら，Ｃｅｌｌ，６０：２２５−２３４（１９９０）によりクローンされた５５７個のアミノ酸の受容体蛋白質であり、Ｕｚｅらの２２９頁図５に示すように、４０９個の残基の細胞外ドメイン、２１個の残基の膜貫通ドメイン、及び１００個の残基の細胞内ドメインを含む。幾つかの実施形態では、前記用語は、ＩＦＮＡＲ１の断片を含み、ＩＦＮＡＲ１の細胞外ドメイン（ＥＣ又はＥＣＤ）（或いはＥＣ又はＥＣＤの断片）を含む。
【００６６】
本文に用いられる用語「ＩＦＮＡＲ２」とは、Ｄｏｍａｎｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７：２１６０６−２１６１１（１９９５）によりクローンされた５１５個のアミノ酸の受容体蛋白質であり、Ｄｏｍａｎｓｋｉらの２１６０８頁図１に示すように、２１７個の残基の細胞外ドメイン、２１個の残基の膜貫通ドメイン、及び２５０個の残基の細胞内ドメインを含む。幾つかの実施形態では、前記用語は、ＩＦＮＡＲ２の断片を含み、ＩＦＮＡＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣ又はＥＣＤ）（或いはＥＣ又はＥＣＤの断片）を含む。
【００６７】
本発明の発明者は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの投与又は治療による生物学作用を見出し、特に、製造過程で効力の一致性を必要とする場合、或いは薬物開発過程で効力を改善しようとする場合、これら生物学作用はｒＳＩＦＮ−ｃｏ及び他の類似する特性を有するような化合物の効力の評価に用いられることを見出した。本発明の発明者はさらに、今まで未知の、ｒＳＩＦＮ−ｃｏを用いて治療する生物学作用を見出し、且つこれら生物学作用は、特定な遺伝子をアップレギュレーション又はダウンレギュレーションする必要がある他の症状又は疾病の治療を含むｒＳＩＦＮ−ｃｏの他の用途に用いられる。
【００６８】
一つの形態では、本発明は、テストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する相対効力を確定又は比較する方法において、（１）前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供することと、（２）同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、それぞれ以下の（ａ）〜（ｋ）から選ばれるいずれか１種又は多種の活性を測定することとを含み、前記テストインターフェロンが、統計学的に有意であるように、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうち所定のいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は６種の活性を有し、及び／又は前記テストインターフェロンが、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）のうち所定のいずれか１種又は多種の活性、例えば２種、又は３種、又は４種、又は５種の活性を有するのは、前記テストインターフェロンがｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物と実質的に同じ効力を有することを示す、方法を提供する。（ａ）いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；（ｂ）癌細胞生存率の減少；（ｃ）癌細胞転移に対する阻害；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する阻害；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；（ｉ）癌細胞、例えばＡ５４９細胞又はＳＷ６２０細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；（ｊ）ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；（ｋ）癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性。
【００６９】
他の形態では、本発明は、テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との間の実質的同等性を構築する方法において、（１）前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供することと、（２）同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、それぞれ以下の（ａ）〜（ｋ）から選ばれるいずれか１種又は多種の活性を測定することとを含み、前記テストインターフェロンが、統計学的に有意であるように、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のうち所定のいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は６種の活性を有し、及び／又は前記テストインターフェロンが、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）のうち所定のいずれか１種又は多種の活性、例えば２種、又は３種、又は４種、又は５種の活性を有するのは、前記テストインターフェロンがｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物と実質的同等であることを示す、方法を提供する。（ａ）いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；（ｂ）癌細胞生存率の減少；（ｃ）癌細胞転移に対する阻害；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する阻害；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；（ｉ）癌細胞、例えばＡ５４９細胞又はＳＷ６２０細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；（ｊ）ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；（ｋ）癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性。好ましくは、テストインターフェロンで処理又は投与する場合、例えばＡ５４９細胞及び／又はＳＷ６２０細胞におけるインビトロ癌細胞生存率の減少の存在、及び例えばＡ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害の存在は、統計学的に有意である。そして好ましくは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達の付加的存在は、テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏとの間が実質的同等であることを示す。また好ましくは、例えば、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロンで適当な細胞を約１日間〜約６日間処理する場合、細胞生存率の測定を行っても良い。好ましくは、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種の癌細胞において、β−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害を測定し、例えば、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロンでこれら細胞を約２４時間処理する。好ましくは、ＳＴＡＴ蛋白、例えばＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２及び／又はＳＴＡＴ３の���ン酸化の存在を測定することで、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を測定し、例えば約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロンでＡ５４９細胞又はＨｅｌａ細胞を異なる時間、例えば約５、１５、３０、６０、１２０及び／又は２４０分間処理する。
【００７０】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも２種の上記の活性、例えば、（ａ）と（ｂ）；（ａ）と（ｃ）；（ａ）と（ｄ）；（ａ）と（ｅ）；（ａ）と（ｆ）；（ａ）と（ｇ）；（ａ）と（ｈ）；（ａ）と（ｉ）；（ａ）と（ｊ）；（ａ）と（ｋ）；（ｂ）と（ｃ）；（ｂ）と（ｄ）；（ｂ）と（ｅ）；（ｂ）と（ｆ）；（ｂ）と（ｇ）；（ｂ）と（ｈ）；（ｂ）と（ｉ）；（ｂ）と（ｊ）；（ｂ）と（ｋ）；（ｃ）と（ｄ）；（ｃ）と（ｅ）；（ｃ）と（ｆ）；（ｃ）と（ｇ）；（ｃ）と（ｈ）；（ｃ）と（ｉ）；（ｃ）と（ｊ）；（ｃ）と（ｋ）；（ｄ）と（ｅ）；（ｄ）と（ｆ）；（ｄ）と（ｇ）；（ｄ）と（ｈ）；（ｄ）と（ｉ）；（ｄ）と（ｊ）；（ｄ）と（ｋ）；（ｅ）と（ｆ）；（ｅ）と（ｇ）；（ｅ）と（ｈ）；（ｅ）と（ｉ）；（ｅ）と（ｊ）；（ｅ）と（ｋ）；（ｆ）と（ｇ）；（ｆ）と（ｈ）；（ｆ）と（ｉ）；（ｆ）と（ｊ）；（ｆ）と（ｋ）；（ｇ）と（ｈ）；（ｇ）と（ｉ）；（ｇ）と（ｊ）；（ｇ）と（ｋ）；（ｈ）と（ｉ）；（ｈ）と（ｊ）；（ｈ）と（ｋ）；（ｉ）と（ｊ）；（ｉ）と（ｋ）；（ｊ）と（ｋ）、を測定する。
【００７１】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも３種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｄ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｅ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｅ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｅ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｆ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｇ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｈ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）、を測定する。
【００７２】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも４種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）、を測定する。
【００７３】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも５種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）、を測定する。
【００７４】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも６種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）、を測定する。
【００７５】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも７種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）を測定する。
【００７６】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも８種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）、を測定する。
【００７７】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも９種、１０種、又はあらゆる１１種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）、を測定する。
【００７８】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において、コントロールに比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．０５、好ましくは、ｐ＜０．０１、より好ましくは、ｐ＜０．００５、さらに好ましくは、ｐ＜０．００１、また好ましくは、ｐ＜０．０００５、またさらに好ましくは、ｐ＜０．０００１）、（ａ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。
【００７９】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定で使用される担癌動物モデルは、マウス、好ましくは、ヌードマウス、より好ましくは、ＢＡＬＢ／ｃＡ  ｎｕ／ｎｕマウスを含む。幾つかの実施形態では、前記マウス、例えば、ＢＡＬＢ／ｃＡ  ｎｕ／ｎｕマウスは、約３〜約７週齢、好ましくは、約４〜約６週齢のマウスを含む。幾つかの実施形態では、前記マウス、例えば、ＢＡＬＢ／ｃＡ  ｎｕ／ｎｕマウスは、体重が約１５±２ｇ〜約３０±２ｇであり、好ましくは、約１９±２ｇ〜約２３±２ｇの範囲内にある。
【００８０】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）である体内癌細胞生長に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肝臓癌細胞、子宮頚癌細胞、結腸癌細胞及び肺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ａ）を測定するために用いられる癌細胞は、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＨＴ−２９細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞及びＡ５４９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、ＨＴ−２９細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞及びＡ５４９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、より好ましくは、Ａ５４９細胞を含む。
【００８１】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の阻害作用の測定において、生理食塩水又はＰＢＳ、好ましくは、生理食塩水はコントロールとして用いられる。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、より好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で投与される。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は一日おきに投与される。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約２週間〜約６週間、好ましくは、約３週間〜約４週間継続して投与される。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるコントロールが、約０．０５ｍｌ〜約０．３０ｍｌ、好ましくは、約０．１０ｍｌ〜約０．２０ｍｌの量で投与される。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるコントロールは一日おきに投与される。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるコントロールは約２週間〜約６週間、好ましくは、約３週間〜約４週間継続して投与される。幾つかの実施形態では、腫瘍内にテストインターフェロン及び／又はコントロールを投与する。
【００８２】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定でＳＭＭＣ−７７２１細胞を使用する場合、コントロール（例えば、生理食塩水）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えば約０．０５ｍｇと約０．１０ｍｇに対して、ｐ＜０．０５、好ましくは、約０．１５ｍｇに対して、ｐ＜０．０１）、（ａ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、より好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で一日おきに投与され、約３週間継続して投与される。
【００８３】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定でＨｅｌａ細胞を使用する場合、コントロール（例えば、生理食塩水）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えば、約０．１５ｍｇに対して、ｐ＜０．０５、好ましくは、約０．０５ｍｇと約０．１０ｍｇに対して、ｐ＜０．０１）、（ａ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、より好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で一日おきに投与され、約４週間継続して投与される。
【００８４】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定でＨＴ−２９細胞を使用する場合、コントロール（例えば、生理食塩水）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように、（例えば約０．１０ｍｇと約０．１５ｍｇに対して、ｐ＜０．０１、好ましくは、約０．０５ｍｇに対して、ｐ＜０．００１）、（ａ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、より好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で一日おきに投与され、約４週間継続して投与される。
【００８５】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定でＳＰＣ−Ａ４細胞を使用する場合、コントロール（例えば、生理食塩水）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えば約０．０５ｍｇ、約０．１０ｍｇと約０．１５ｍｇに対して、ｐ＜０．０１）、（ａ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、より好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で一日おきに投与され、約３週間継続して投与される。
【００８６】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定でＡ５４９細胞を使用する場合、コントロール（例えば、ＰＢＳ）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．０００１）、（ａ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、より好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で一日おきに投与され、約３週間継続して投与される。
【００８７】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）である癌細胞生存率の減少の測定において、テストインターフェロンが約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にある場合、癌細胞生存率を約５０％減少させると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロンが少なくとも約２５ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも約５０ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも約７５ｍｃｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、少なくとも約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で、癌細胞生存率を実質的に検出できない程度まで減少させると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。
【００８８】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の濃度は約０．２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲に入る。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の濃度は、０．２ｍｃｇ／ｍｌ、０．３９ｍｃｇ／ｍｌ、０．７８ｍｃｇ／ｍｌ、１．５６ｍｃｇ／ｍｌ、３．１３ｍｃｇ／ｍｌ、６．２５ｍｃｇ／ｍｌ、１２．５ｍｃｇ／ｍｌ、２５ｍｃｇ／ｍｌ、５０ｍｃｇ／ｍｌ及び１００ｍｃｇ／ｍｌのうち少なくとも２種以上の濃度を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、癌細胞を少なくとも約１日間、好ましくは、少なくとも約２日間処理する。
【００８９】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、子宮頚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞及び前立腺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、肺癌細胞、結腸癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞及び前立腺癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞及びＰＡＮＣ−１細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞及びＰＡＮＣ−１細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。
【００９０】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、前記テストインターフェロンが約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約１２．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲で処理した後、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＰＡＮＣ−１細胞のうちいずれか１種又は多種の生存率を約５０％減少させると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。
【００９１】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、前記テストインターフェロンが約１２．５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲で処理した後、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、Ｃａｌｕ−１細胞及びＳＭＭＣ−７７２１細胞のうちいずれか１種又は多種の生存率を約５０％減少させると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。
【００９２】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、Ａ５４９細胞及び／又はＳＷ６２０細胞を使用する場合、コントロール（例えば、ＩＦＮα−２ｂ）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．０１）、（ｂ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は約１日間〜約１０日間、好ましくは、約１日間〜約６日間処理される。
【００９３】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、Ａｍ−Ｂｌｕｅ法又はＭＴＴ法により癌細胞生存率を測定する。
【００９４】
幾つかの実施形態では、活性（ｃ）の測定において、コントロールに比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．０１）、（ｃ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、前記コントロールは未処理のコントロール（Ｍｏｃｋ）である。
【００９５】
幾つかの実施形態では、活性（ｃ）である癌細胞転移に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞はＡ５４９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、トランスウェル法を利用して活性（ｃ）である癌細胞転移に対する阻害を測定する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。
【００９６】
幾つかの実施形態では、活性（ｄ）の測定において、コントロールに比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．０５，好ましくは、ｐ＜０．０１）、（ｄ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、前記コントロールは未処理のコントロール（Ｍｏｃｋ）である。
【００９７】
幾つかの実施形態では、活性（ｄ）である癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞、ＨＴ−２９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、β−カテニン／ＴＣＦの転写活性はレポーターシステムを用いて測定される。幾つかの実施形態では、前記レポーターシステムはＴＯＰＦｌａｓｈ又はｐＳＶ４０−ＲＬプラスミドを含む。
【００９８】
幾つかの実施形態では、活性（ｅ）の測定において、コントロールに比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．００５、好ましくは、ｐ＜０．００１、より好ましくは、ｐ＜０．０００５）、（ｅ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、前記コントロールは未処理のコントロール（Ｍｏｃｋ）である。
【００９９】
幾つかの実施形態では、活性（ｅ）である癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーションを測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＳＷ６２０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、より好ましくは、ＨＴ−２９細胞を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｅ）の測定において、ＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６のｍＲＮＡレベルを測定することによりＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現を確定する。幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡレベルを測定する時、ＧＡＰＤＨをコントロールとして用いる。
【０１００】
幾つかの実施形態では、活性（ｆ）の測定において、コントロールに比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えば、ｐ＜０．０００５、好ましくは、ｐ＜０．０００１）、（ｆ）における所定の活性を有すると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。幾つかの実施形態では、前記コントロールは未処理のコントロール（Ｍｏｃｋ）である。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、活性（ｆ）であるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は肺癌細胞を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｆ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｆ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｆ）の測定において、Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及び／又はＩＤ２のｍＲＮＡレベルを測定することによりそれに対応する発現を確定する。幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡレベルを測定する時、ＧＡＰＤＨをコントロールとして用いる。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、活性（ｆ）の測定において、コントロールに比べて、テストインターフェロンが癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種のうち少なくとも約３０％、好ましくは、少なくとも約４０％、より好ましくは、少なくとも約５０％、さらに好ましくは、少なくとも約６０％の発現を減少する場合、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力有する又は実質的同等であるとみなされる。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、活性（ｇ）の測定において、前記テストインターフェロンが実質的に癌細胞における偽足形成を阻害した場合、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。ここで、「実質的に阻害」とは、少なくとも約６０％阻害し、好ましくは、少なくとも約７０％阻害し、より好ましくは、少なくとも約８０％阻害し、さらに好ましくは、少なくとも約９０％阻害し、またさらに好ましくは、少なくとも約９５％阻害する。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、活性（ｇ）である癌細胞における偽足形成に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は肺癌細胞を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約４日間、好ましくは、少なくとも約８日間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、Ｍａｔｒｉｇｅｌで活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を培養する。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、活性（ｈ）の測定において、前記テストインターフェロンが癌細胞におけるβ−カテニンレベルを顕著に減少させた場合、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。ここで、例えばウエスタンブロットにおいて処理前に比べて蛋白質を示すバンドが薄くなる又はなくなれば、処理後に癌細胞におけるβ−カテニンレベルが顕著に減少する。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、活性（ｈ）である癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞及びＳＷ４８０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｈ）の測定において、ウエスタンブロット法を利用してβ−カテニン発現に対する阻害を測定する。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約４８時間、好ましくは、少なくとも約７２時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、活性（ｉ）の測定において、ＩＦＮα−２ｂに比べて、前記テストインターフェロンが癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現をより効果的にアップレギュレーションできると、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的同等であることを示す。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、活性（ｉ）である癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーションを測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞及び結腸癌細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＳＷ６２０細胞及びＨＴ−２９細胞のうちいずれか１種又は多種を含み、好ましくは、Ａ５４９細胞及びＳＷ６２０細胞のうちいずれか１種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間処理し、好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｉ）の測定において、ＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及び／又はＢＡＴＦ２のｍＲＮＡレベルを測定することによりそれに対応する発現を確定する。幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡレベルを測定する時、ＧＡＰＤＨをコントロールとして用いる。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、統計学的に有意であるとは、コントロールに比べて、ｐ値≦０．０５、又は≦０．０１、又は≦０．００５、又は≦０．００１、又は≦０．０００５、又は≦０．０００１である。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、前記コントロールは、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で処理されず、又は生理食塩水若しくはＰＢＳで処理され、又はＩＦＮα−２ｂで処理され、又は前記コントロールが未処理コントロール（Ｍｏｃｋ）である。
【０１１１】
一つの形態では、本発明は、（ａ）複数濃度のテストインターフェロンを提供すること、（ｂ）該複数濃度のテストインターフェロンを用いて、特定な条件で、第一群の癌細胞生存率に対するテストインターフェロンの第一投与量反応を確定すること、（ｃ）複数濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏの代用物（以下、「ｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物」と呼ばれる）を提供すること、（ｄ）該複数濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を用いて、同じ特定な条件で、第二群の癌細胞生存率に対するｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の第二投与量反応を確定すること、及び、（ｅ）第一投与量反応と第二投与量反応とを比較することを含む、化合物（例えば、テストインターフェロン）の効力を確定又は比較する方法を提供する。このように、化合物、例えばテストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する相対効力を確定する。
【０１１２】
本発明の幾つかの実施形態では、大腸菌宿主において、好ましくは大腸菌宿主においてプロモーターＰＢＡＤの制御で新しいポリヌクレオチド（配列番号２）を発現して、アメリカ特許７，３６４，７２４（組換え高効複合インターフェロン）に記載したようなｒＳＩＦＮ−ｃｏ（配列番号１）を調製する。本発明の幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列を大腸菌に導入することを含む方法により得られる。本発明の幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが配列番号１のアミノ酸配列を有し、配列番号２のヌクレオチド配列でコードされ、配列番号２のヌクレオチド配列にコードされないインターフェロン、例えばインターフェロンａｌｆａｃｏｎ−１（ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標））に比べて、前記インターフェロンはＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨｂｓＡｇ）とＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨｂｅＡｇ）の発現に対して増加した阻害活性を有する。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、本文方法に用いられるｒＳＩＦＮ−ｃｏは特定な比活性を有する。該比活性は、例えば、約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約１×１０９ＩＵ／ｍｇの範囲内であってもよい。幾つかの実施形態では、比活性が約４．４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約９×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、比活性が約５×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約８×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、比活性が約６×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約７．５×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。好ましくは、比活性が約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約５×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、化合物の効力を確定又は比較する方法において、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏの濃度が約０．２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にある。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏの濃度は、０．２ｍｃｇ／ｍｌ、０．３９ｍｃｇ／ｍｌ、０．７８ｍｃｇ／ｍｌ、１．５６ｍｃｇ／ｍｌ、３．１３ｍｃｇ／ｍｌ、６．２５ｍｃｇ／ｍｌ、１２．５ｍｃｇ／ｍｌ、２５ｍｃｇ／ｍｌ、５０ｍｃｇ／ｍｌ及び１００ｍｃｇ／ｍｌのうち少なくとも２種以上の濃度を含む。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、本文に用いられるｒＳＩＦＮ−ｃｏ効果を確定する方法における細胞は癌細胞であり、ヒト細胞又は動物細胞である。テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで細胞を少なくとも約２４時間、好ましくは、少なくとも約４８時間、より好ましくは、少なくとも約７２時間処理し、特に断りのない限り、標準培養条件で、完全培地において、３７℃で、５％ＣＯ２雰囲気中で処理する。培地は、腫瘍細胞の培養に適するあらゆる標準完全培地であってもよく、例えば、１０％胎児牛血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、４ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されているＳｈａｎｇｈａｉ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（中国上海）の培地から入手できる。ＩＦＮα−２ｂは上海華新生物高技術有限公司（中国上海）から入手でき、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは四川輝陽生命工程股分有限公司（中国成都）から入手できる。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、本発明は、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内で（癌細胞のタイプに依存）、癌細胞生存率を５０％減少させる能力を有するｒＳＩＦＮ−ｃｏを提供する。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜１２．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内で細胞の生存率を５０％減少できる。他の実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは約１２．５ｍｃｇ／ｍｌ〜２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内で細胞生存率を５０％減少できる。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏのＩＣ５０が約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にある。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、テストインターフェロンもインターフェロンであるが、比較で使用するｒＳＩＦＮ−ｃｏと異なる製造ロットより得られる。
【０１１８】
したがって、例えば、テストインターフェロンなどの化合物の効力を確定する時、テストインターフェロンが多種の濃度に希釈され、使用される容器に適する一定数の調製細胞（例えば、１００μｌ完全培地における５×１０３細胞）をこれら多種の濃度のテストインターフェロンと共に一定時間、例えば４８時間インキュベートする。インキュベートした後、細胞の生存率を確定し、同様にテストインターフェロンではなく、ｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理した細胞生存率と比較する。結果より、それぞれのテストインターフェロンで処理した細胞及びｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理した細胞の投与量反応曲線が作られ比較できる。このように、５０％有効投与量又はＩＣ５０の面で、テストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏに対する相対効力を確定できる。
【０１１９】
他の形態では、本発明は、（ａ）複数の癌細胞を提供すること、（ｂ）特定な条件で、一定量のテストインターフェロンで第一群の癌細胞を測定し、第一群の生存率データを生成すること、（ｃ）同じ特定な条件で、有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で第二群の癌細胞を処理し、第二群の生存率データを生成すること、及び、（ｄ）第一群の生存率データと第二群の生存率データとを比較することにより、テストインターフェロンの効力を確定することを含む、化合物（例えば、テストインターフェロン）のｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する癌細胞生存率への相対効力を確定又は比較する方法を提供する。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、約１日間〜約６日間の範囲内で癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約５０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは約７ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは約８ｍｃｇ／ｍｌ〜約１２．５ｍｃｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０ｍｃｇ／ｍｌの範囲内の濃度でｒＳＩＦＮ−ｃｏを使用する。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは特定な比活性を含む。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、本文に用いられる癌細胞はヒト腫瘍細胞と動物腫瘍細胞から選ばれる。幾つかの実施形態では、腫瘍細胞は肺腫瘍細胞、又は子宮頚腫瘍細胞、又は肝臓腫瘍細胞、又は結腸腫瘍細胞、又は乳腺腫瘍細胞、又はすい臓腺腫瘍細胞、又は前立腺腫瘍細胞、又はウイルス誘発した腫瘍細胞又はウイルス転化した細胞である。幾つかの実施形態では、癌細胞はＡ５４９細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈ４６０細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＨＴ２９細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、ＳＷ４８０細胞及びＳＷ６２０細胞のうちから選ばれる少なくとも１種である。
【０１２２】
したがって、例えば、テスト容器に適する適当な体積における一定数の癌細胞、例えば、１００μｌ完全培地における２×１０３細胞を、９６ウェルプレートに置き、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで１、２、３、４、５又は６日間継続して処理し、又は処理せずにコントロールとしてもよく、未処理コントロール群の生存率に対する処理した細胞の生存率を毎日確定する。実験終了時、未処理コントロール群の生存率に対する処理細胞の生存率は、インターフェロン処理の日数に対してプロットできる。このように、テスト化合物が癌細胞生存率を減少させる能力を比較でき、ｒＳＩＦＮ−ｃｏに対する相対効力を確定できる。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことにより、細胞転移を阻害することを含む、（例えば腫瘍転移中で発生した）細胞転移を阻害する方法を提供する。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、本文に言及した腫瘍細胞のような細胞をｒＳＩＦＮ−ｃｏにさらすことは、インビトロ又はインビボで、有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏが存在したままで細胞を３７℃で一定時間（例えば２４時間）インキュベートすることにより、又は動物或いは被験者に有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏを投与することで一定濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏを所望の効果を得るために十分な時間保持することにより、実施できる。上述した所望の効果は、例えば転移中の腫瘍細胞転移に対する阻害、又は偽足生成に対する阻害、β−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害、β−カテニンの発現に対する阻害、Ｗｎｔ関連受容体及び／又は共受容体に対するダウンレギュレーション、Ｗｎｔシグナル伝達下流標的遺伝子に対するダウンレギュレーション、腫瘍阻害遺伝子に対するアップレギュレーション、及び本文に記載している他の状況である。
【０１２５】
任意の適当な市販のキットを用いて細胞転移検出を行ってもよい。例えば、ここで、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）の２４ウェルプレートにセットされている微孔膜を含む８μｍインサート式セル（ｉｎｓｅｒｔ）を使用できる。この検出について、３７℃のＦＢＳを含有しない温熱炭酸水素塩類培地をインサート式セルの内部及びウェルの底部に添加し、加湿された組織培養インキュベーターにおいて３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気で約２時間復水した。復水した後、注意深く培地を除去し、約０．５×１０４細胞／インサート式セルの密度で、約５００μｌのＦＢＳを含有しない培地に混合懸濁し調製される細胞（例えば３７℃でｒＳＩＦＮ−ｃｏで２４時間予め処理した細胞）をインサート式セルフィルターの上側に接種する。その後、２４ウェルプレートの下室に５００μｌの１０％ＦＢＳを含有する完全培地を添加しても良い。そして、３７℃で細胞／インサート式セル／プレートを約２４時間インキュベートし、例えば綿棒で室膜の上側にある非転移細胞を除去できる。転移細胞を含有するインサート式培養セルの下表面は例えば４％のパラホルムアルデヒドで固定し、２％クリスタルバイオレットで染色することができる。室膜と反対側にある転移細胞の数量をカウントし、単位領域の平均転移細胞数を確定できる。このように、テストインターフェロンの腫瘍細胞転移を阻害する能力を示すことができる。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの有効量は、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは約８ｍｃｇ／ｍｌ〜約５０ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌを含む。
【０１２７】
他の形態では、本発明は、癌細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことにより、偽足形成を阻害することを含む、癌細胞における偽足形成を阻害する方法を提供する。
【０１２８】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことを含む、細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦ−媒介の転写活性を阻害する方法を提供する。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いてβ−カテニン／ＴＣＦ−媒介の転写活性を確定できる。幾つかの実施形態では、レポーターシステムはＴＯＰＦｌａｓｈレポーターシステムである。幾つかの実施形態では、プラスミドｐＳＶ４０−ＲＬを使用する。したがって、例えば、テストしようとする細胞を９６ウェルプレート上に敷き、例えばウェル毎に約１×１０４細胞、３７℃で約１２時間インキュベートし、そして、約１００ｎｇのＴＯＰＦｌａｓｈ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で瞬時トランスフェクションする。トランスフェクションの効率を標準化するために、さらに１ｎｇのＳＶ４０プロモーターにより駆動される内部コントロールレポーターウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａｒ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ（ｐＲＬ−ＳＶ４０，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で細胞をコトランスフェクションする。６時間トランスフェクションした後、インビトロ分析に用いる細胞をｒＳＩＦＮ−ｃｏで約２４時間処理しても良い。インビトロ分析のためのｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理の後又はインビボ分析のためのトランスフェクションの後、デュアルルシフェラーゼエッセイシステムキットを用いてメーカーのマニュアル（Ｃａｔ＃：Ｅ１９６０，Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼ検出を行うことができる。相対ルシフェラーゼ活性はホタルルシフェラーゼ／ウミシイタケルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ／ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性の比率として確定できる。
【０１３０】
他の形態では、本発明はさらに、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことを含む、細胞におけるβ−カテニンの蛋白レベルを減少させる方法を提供する。幾つかの実施形態では、その特異性抗体を用いてウエスタンブロットによりβ−カテニンの蛋白レベルを測定する。幾つかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコントロールとして用いる。
【０１３１】
細胞（細胞はインビトロ培養又はインビボ腫瘍サンプルに由来する）におけるβ−カテニンレベルを確定するウエスタンブロット分析について、標準ステップが用いられる。例えば、全細胞蛋白は抽出試薬（Ｃａｔ＃：Ｐ００１３）を利用してメーカーのマニュアル（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｃｈｉｎａ）に従って抽出できる。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌｏｗｒｙ蛋白検出システムにより蛋白濃度を確定できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１０％〜１２％ゲルで全蛋白を分離し、そして０．４５μｍの硝酸セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に転移することができる。該膜はブロッキング緩衝液（５％牛血清白蛋白、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて４℃で徹夜ブロックでき、そして一次抗体（１：１０００に希釈）とともにインキュベートし、そしてＨＲＰ結合の二次抗体とインキュベートする。抗体はどの販売会社から購入してもよく、例えばマウスモノクローナルβ−カテニン抗体（１：１０００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、マウスモノクロールＧＡＰＤＨ抗体（１：２０００，Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ）及び抗マウスＨＲＰ結合の二次抗体（１：２０００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等の抗体を用いることができる。冷光／蛍光イメージングＬＡＳ４０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）及びｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ化学発光基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いてブロットを可視化することができる。
【０１３２】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことにより、Ｗｎｔ関連受容体若しくは共受容体をダウンレギュレーションすることを含む、細胞におけるＷｎｔ関連受容体若しくは共受容体の発現をダウンレギュレーションする方法を提供する。幾つかの実施形態では、Ｗｎｔ関連受容体若しくは共受容体はＬＲＰ蛋白、例えばＬＲＰ６を含む。幾つかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達受容体又は共受容体はＦＺＤ蛋白、例えばＦＺＤ６を含む。上述した通り、細胞をｒＳＩＦＮ−ｃｏにさらす方法はインビトロ方法又はインビボ方法であっても良い。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、Ｗｎｔ関連受容体若しくは共受容体の発現を確定することはこれら受容体又は共受容体のｍＲＮＡレベルを確定することを含む。任意の標準方法によりこれらｍＲＮＡレベルを確定できる。幾つかの実施形態では、これらｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを調製してこれらｍＲＮＡレベルを確定する。例えば、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、メーカーの取り扱い説明書に従って全ｍＲＮＡを分離することができる。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＲＴ−ＰＣＴキット（Ｃａｔ＃：ＦＳＱ−１０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いてメーカーの取り扱い説明書に従って合成され、そしてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｃａｔ＃：ＱＰＫ−２０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行ってもよい。適当なプライマーを使用でき、例えば、ＬＲＰ６に用いられるプライマーは、センスプライマー：５’−ＴＧＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号４）、アンチセンスプライマー：５’−ＣＡＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号５）であってもよく、且つＦＺＤ６に用いられるプライマーは、センスプライマー：５’−ＧＣＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＴＴＡＧＴＣ−３’（配列番号６）、アンチセンスプライマー：５’−ＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＣ−３’（配列番号７）であっても良い。増幅プロトコールは、９５℃で１分間インキュベートし、４０サイクル（９５℃で、１５秒；６０℃で、１５秒；及び７２℃で、３０秒）であっても良い。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染料をＰＣＲ産物に結合することはＢｉｏ−Ｒａｄ検出システムでリアルタイムでモニターされ、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  ｍａｎａｇｅｒ  ２．１ソフトウェアで分析してもよい。各条件についてサンプルを揃え、並行して行ってもよい。２−△△Ｃｔ法により、インターフェロン処理したサンプルとＭｏｃｋ未処理のサンプルとを比較し、倍率変化に対してプロットすることができる。ＧＡＰＤＨを標準化コントロールとして用いられる。該２−△△Ｃｔ法は、通常、リアルタイム定量ＰＣＲ実験からの遺伝子発現の相対変化を分析することに利用される。
【０１３４】
他の形態では、本発明は、細胞におけるある遺伝子（Ｗｎｔシグナル伝達経路のうち少なくとも１つの標的遺伝子を含む）の発現をダウンレギュレーションする方法、例えば標的遺伝子突然変異又は過度活発の疾病又は症状を治療する方法を提供する。これらダウンレギュレーション遺伝子は例えばＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及び／又はＩＤ２を含む。該方法は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことにより、標的遺伝子の発現を阻害することを含む。ダウンレギュレーションの度合は標準技術、例えば前述したｑＰＣＲにより確定できる。例えば、これらｑＰＣＲについて、Ａｘｉｎ２に対して、センスプライマー：５’−ＣＧＴＧＧＡＴＡＣＣＴＴＡＧＡＣＴＴ−３’（配列番号８）とアンチセンスプライマー：５’−ＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＴＧＴＡ−３’（配列番号９）を用いることができ、ＣＤ２４に対して、センスプライマー５’−ＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１０）とアンチセンスプライマー５’−ＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡ−３’（配列番号１１）を用いることができ、サバイビンに対して、センスプライマー：５’−ＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＴＴＣＡＡＧ−３’（配列番号１２）とアンチセンスプライマー５’−ＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号１３）を用いることができ、ＩＤ２に対して、センスプライマー５’−ＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１４）とアンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号１５）を用いることができる。
【０１３５】
本発明の幾つかの実施形態では、細胞がｒＳＩＦＮ−ｃｏにさらされる所定時間は少なくとも約１２時間、好ましくは、少なくとも約２０時間、より好ましくは、少なくとも約２４時間、さらに好ましくは、少なくとも約３６時間、さらに好ましくは、少なくとも約４８時間、さらに好ましくは、少なくとも約７２時間である。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理した細胞は癌細胞である。
【０１３６】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに所定時間さらすことにより、少なくとも１種の腫瘍阻害遺伝子の発現に対するアップレギュレーションを実現することを含む、細胞におけるある遺伝子（少なくとも１種の腫瘍阻害遺伝子を含む）の発現をアップレギュレーションする方法を提供する。幾つかの実施形態では、アップレギュレーションする遺伝子はＤＫＫ３、ＫＬＦ４及びＢＡＴＦ２のうち少なくとも１種を含む。標準技術により、これら遺伝子のアップレギュレーション程度を確定できる。幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡレベルを測定することにより、アップレギュレーション遺伝子の発現を確定できる。幾つかの実施形態では、これらｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成して任意に増幅させてこの測定目的に用いる。一つの実例として、増幅目的で、ＢＡＴＦ２に対して、センスプライマー５’−ＣＡＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１６）とアンチセンスプライマー５’−ＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１７）、ＤＫＫ３に対して、センスプライマー５’−ＧＧＡＧＣＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１８）とアンチセンスプライマー５’−ＡＣＧＣＣＴＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１９）、ＫＬＦ４に対して、センスプライマー５’−ＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号２０）とアンチセンスプライマー５’−ＧＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＧ−３’（配列番号２１）というプライマーを使用できる。
【０１３７】
他の形態では、本発明は、少なくとも１種、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１種の下記の（ａ）〜（ｋ）の活性において、テスト化合物とｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との間の実質的同等性を構築する方法において、下記の（ａ）〜（ｋ）の活性を比較して実質的に同じ反応を示すことを含む方法を提供する。（ａ）いずれか１種又は多種の担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する阻害；（ｂ）癌細胞生存率の減少；（ｃ）癌細胞転移に対する阻害；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対する阻害；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する阻害；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する阻害；（ｉ）癌細胞、例えばＡ５４９細胞又はＳＷ６２０細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及びＢＡＴＦ２のうちいずれか１種又は多種の発現に対するアップレギュレーション；（ｊ）ＩＦＮα−２ｂよりも高いＩＦＮＡＲ１への結合親和性、及び／又はＩＦＮα−２ｂよりも低いＩＦＮＡＲ２への結合親和性；（ｋ）癌細胞ｐ−ＳＴＡＴ発現に対するアップレギュレーションにおける、ＩＦＮα−２ｂよりも低いＢ１８Ｒ阻害に対する感受性。幾つかの実施形態では、本発明は、少なくとも２種の上記の活性、例えば、（ａ）と（ｂ）；（ａ）と（ｃ）；（ａ）と（ｄ）；（ａ）と（ｅ）；（ａ）と（ｆ）；（ａ）と（ｇ）；（ａ）と（ｈ）；（ａ）と（ｉ）；（ａ）と（ｊ）；（ａ）と（ｋ）；（ｂ）と（ｃ）；（ｂ）と（ｄ）；（ｂ）と（ｅ）；（ｂ）と（ｆ）；（ｂ）と（ｇ）；（ｂ）と（ｈ）；（ｂ）と（ｉ）；（ｂ）と（ｊ）；（ｂ）と（ｋ）；（ｃ）と（ｄ）；（ｃ）と（ｅ）；（ｃ）と（ｆ）；（ｃ）と（ｇ）；（ｃ）と（ｈ）；（ｃ）と（ｉ）；（ｃ）と（ｊ）；（ｃ）と（ｋ）；（ｄ）と（ｅ）；（ｄ）と（ｆ）；（ｄ）と（ｇ）；（ｄ）と（ｈ）；（ｄ）と（ｉ）；（ｄ）と（ｊ）；（ｄ）と（ｋ）；（ｅ）と（ｆ）；（ｅ）と（ｇ）；（ｅ）と（ｈ）；（ｅ）と（ｉ）；（ｅ）と（ｊ）；（ｅ）と（ｋ）；（ｆ）と（ｇ）；（ｆ）と（ｈ）；（ｆ）と（ｉ）；（ｆ）と（ｊ）；（ｆ）と（ｋ）；（ｇ）と（ｈ）；（ｇ）と（ｉ）；（ｇ）と（ｊ）；（ｇ）と（ｋ）；（ｈ）と（ｉ）；（ｈ）と（ｊ）；（ｈ）と（ｋ）；（ｉ）と（ｊ）；（ｉ）と（ｋ）；（ｊ）と（ｋ）、において実質的同等性を構築することを提供し、好ましくは、本発明は、少なくとも３種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、��ｄ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｄ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｄ）、��ｇ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｅ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｅ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｅ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｆ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｇ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｈ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）、において実質的同等性を構築することを提供し、より好ましくは、本発明は、少なくとも４種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｂ）、（��）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｆ）、（
ｇ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｅ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｅ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）；（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）、において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、本発明は、少なくとも５種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｋ）；（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）、において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、本発明は、少なくとも６種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）、において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、本発明は、少なくとも７種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）、において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、本発明は、少なくとも８種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）及び（ｋ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｊ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｋ）、において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、本発明は、少なくとも９種、１０種、又はあらゆる１１種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）、において実質的同等性を構築することを提供する。
【０１３８】
他の形態では、本発明は、（ａ）ｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物と、（ｂ）本文に述べた一つ以上の方法を行うための取り扱い説明書及びこれら方法を行うための試薬のうち少なくとも１種と、を含む測定キットを提供する。これら試薬はリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）又は緩衝剤を含んでもよい。幾つかの実施形態では、測定キットにおけるｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は特定な比活性を有する。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンはさらに癌細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路によりシグナルを伝達する及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏと共通ＩＦＮＡＲ１／２受容体をシェアすることにより、ｒＳＩＦＮ−ｃｏと実質的に等価である又はｒＳＩＦＮ−ｃｏと実質的に同じ効力を有する。幾つかの実施形態では、ＳＴＡＴファミリー、例えばＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２及び／又はＳＴＡＴ３に由来するリン酸化蛋白の存在を検出することで、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介するシグナル伝達を検出する。幾つかの実施形態では、ウエスタンブロットによりこのような検出を行う。幾つかの実施形態では、癌細胞Ａ５４９及び／又はＨｅｌａ細胞はこのような検出を行うために用いられる。幾つかの実施形態では、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで前記癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで癌細胞を約５、１５、３０、６０、１２０及び／又は２４０分間処理する。幾つかの実施形態では、インターフェロンで処理した後、細胞蛋白を収集してウエスタンブロット分析に用いる。幾つかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコントロールとして用いる。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくはｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との同等性、又は相対効力を構築するために行われるテスト又は活動は、任意の慣例的な方法を用いてもよく、ここで挙げた方法に制限されることはない。
【実施例】
【０１４１】
ここで、以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これら実施例は本発明の範囲を制限するものではない。本発明は、具体的に言及されていないが当業者にとって有用な任意の元素や制限が存在する又は存在しないままで行うことができる。さらに、ここで、本発明の説明は制限の意図がなく、特に断りのない限り、当業者に理解できる範囲で、記載された特徴、元素、又は制限の同等や変更、又はその一部の等同物若しくは変更を含むことは言うまでもない。本文に記載した概要を鑑みて、種々の他の実施形態を実施することができることは当然である。図面を組み合わせて、上述した内容より、具体的な説明と実施例及び添付の請求項に基づいて、本発明の他の目的、特徴、及び利点は、当業者にとって明白となる。
【０１４２】
すべてのデータは平均値±標準差（ＳＤ）として表される。ｔテスト（及びノンパラメトリックテスト）を用いて、異なる変化量の間の関係を分析する。ｐ＜０．０５である時、統計学的に有意である。
【０１４３】
実施例１．ｒＳＩＦＮ−ｃｏのヒト肝臓癌に対する活性
ヒト肝臓癌ＳＭＭＣ−７７２１をモデルとして本研究を行い、インビボシステムでヒト肝臓癌に対するｒＳＩＦＮ−ｃｏの活性と効力を実証した。テスト物であるｒＳＩＦＮ−ｃｏの活性を、マイトマイシンＣ（「ＭＭＣ」）の活性と比較した。ｒＳＩＦＮ−ｃｏは無色の液体であり、濃度が１ｍｇ／ｍｌであり、四川輝陽生命工程股分有限公司（中国成都）より提供された。テスト物を希釈せずに用いた。解凍して注射に用いるまで４℃で貯蔵した。マイトマイシンＣ（「ＭＭＣ」）、ロット５０５  ＡＧＢ、濃度２ｍｇ／バイアルはＫｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（日本）より提供された。ＭＭＣを注射時に生理食塩水で希釈した。
【０１４４】
アメリカ国立衛生研究院（ＮＩＨ）実験動物の管理と使用ガイドにより、動物実験を行った。
【０１４５】
用いられた動物は４〜６週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃＡ  ｎｕ／ｎｕマウスであり、重さが約２３±２ｇであり、上海薬物研究所（中国上海）より得られた。研究方案は上海薬物研究所の動物使用と管理委員会に審査され、基準制度を満たしており、研究を開始する前に委員会に批准された。研究に用いられるプロセスは、動物の不快感、苦痛や痛みを極力避ける又は最小化するように設計した。規定に基づき、厳重な又は慢性的で緩和できない痛み又は苦痛を経験する動物を無痛で安楽死させる。６匹の動物を一つの籠に入れた。これら動物の耳に穴を開ける識別法で耳標を付けた。室温を２５℃±１℃に維持した。光照射は、１２時間オンで１２時間オフとした。食物は不断給餌された。水ボトルで動物に、５μｍのフィルターでろ過した都市水道水を自由に飲めるように供給した。研究者と輝陽生命工程股分有限公司はいずれも、何らの本発明の意向や目的を干渉又は影響する食品汚染又は水汚染がないと考える。
【０１４６】
テスト物（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）とビヒクルコントロールをそれぞれ腫瘍内（ｉ．ｔ．）に投与した。動物の群によって、処理毎にマウス１匹毎に０．０５ｍｌ〜０．１５ｍｌの体積でテスト物を投与した。ＭＭＣを１０マイクロリットル（μｌ）／ｇで静脈（ｉ．ｖ．）投与した。マウス１匹毎に０．１５ｍｌの体積で生理食塩水を注射し、ビヒクルコントロールとした。
【０１４７】
動物をランダムに処理群に分けた。最初に、すべての動物は一つの大きな動物籠に入れた。群を分けて研究するために、それらは後に分けられ、各処理群を各籠に６匹の動物を入れた。各群の投与量や投与方案を表１に記載する。群１と群２はコントロール群であり、一回目処理後に一日おきに各動物にビヒクルを投与した。群３の動物は処理開始後の１日目と６日目に５ｍｇ／ｋｇの投与量でＭＭＣを投与した。群４、群５及び群６の動物は一回目処理後にそれぞれ０．１５ｍｇ／マウス（群４）、又は０．１０ｍｇ／マウス（群５）又は０．０５ｍｇ／マウス（群６）に一日おきにｒＳＩＦＮ−ｃｏを投与した。研究の過程において、週に２回各腫瘍の長さと幅を測定することで、腫瘍生長をモニターした。研究の過程において、各動物を週に２回秤量した。
【０１４８】
各マウスに５×１０６個の細胞を皮膚下（ｓ．ｃ．）接種することにより、各動物に腫瘍であるヒト肝臓癌ＳＭＭＣ−７７２１異種移植物を移入した。研究を開始する前に、異種移植物をヌードマウス中で２回継代した。無菌条件で、生長良好な腫瘍を１．５ｍｍ３の断片に切断し、トロカール針で一つのこのような断片を各匹の研究動物の右側腹部に注射した。腫瘍が１００ｍｍ３〜２００ｍｍ３の体積に達する時、マウスをランダムにコントロール群又は処理群に分け、各群を表１に記載した投与量と日程に従って、ビヒクル（群１と群２）、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ（群４、群５及び群６）又はＭＭＣ（群３）を受けさせ、３週間続けた。マイクロキャリパーで各腫瘍のサイズ（長さと幅）を週に２回測定した。式Ｖ＝（長さ×幅２）／２により腫瘍体積（Ｖ）を算出する。各相対腫瘍体積（ＲＴＶ）は公式ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０により算出され、Ｖｔは測定当日の腫瘍体積であり、Ｖ０は一回目処理当日の腫瘍体積であった。テスト物又はコントロール対象の治療効果をＴ／Ｃ（％）と阻害％で示し、Ｔ／Ｃ（％）は、公式：Ｔ／Ｃ（％）＝（処理群の平均ＲＴＶ／コントロール群の平均ＲＴＶ）×１００％を用い、阻害％は、公式：阻害％＝１００％−Ｔ／Ｃ％を用いた。
【０１４９】
【表１】
2018517406.tif 000003
【０１５０】
結果を表２と図１に示す。表２は、各処理群の０日目の初期腫瘍サイズ、２１日目の最終腫瘍サイズ並びに算出された平均ＲＴＶ、Ｔ／Ｃ％及び阻害％を示す。
【０１５１】
【表２】
2018517406.tif 000004
【０１５２】
表２は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏがすべての３つのテスト投与量で活性を有し、且つヒト肝臓癌細胞の生長を効果的に阻害したことを示す。２１日目（Ｄ２１）の平均ＲＴＶは、ビヒクルコントロール群が９．３６±３．９であり、ＭＭＣ処理群が５．０５±２．１であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４．１３±１．９であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４．５７±２．３であり、且つ０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４．９７±１．７であった。２１日目（Ｄ２１）の阻害％は、ＭＭＣ処理群が４７．１８％であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が５６．８０％であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が５２．２０％であり、且つ０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４８．０１であった。各処理群とビヒクルコントロール群との間のＲＴＶ差異は統計学的に有意であると確定された。
【０１５３】
図１は、各処理群に対する２１日間の研究期間で、ヌードマウスにおけるヒト肝臓癌ＳＭＭＣ−７７２１の生長進展（ＲＴＶより表される）を示し、処理を開始してから３、７、１０、１４、１７及び２１日目の腫瘍測定結果を示す。結果は、７日目の前に各ＭＭＣ処理群とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群における腫瘍生長の遅延を示し、２１日目まで維持された。結果はさらに、より高いｒＳＩＦＮ−ｃｏ投与量でより大きな阻害傾向を有することを示す。
【０１５４】
テスト物で処理した動物はいずれもテスト投与量に良く耐えられ、毒性又は体重軽減することはなかった。ビヒクル群、ＭＭＣ処理群、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群及び０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群の動物の平均体重（グラムで）は０日目（と２１日目）でそれぞれ、２２．７（２４．８）、２３．９（２５．４）、２３．７（２５．３）、２４．３（２６．２）、及び２２．６（２４．４）であった。
【０１５５】
実施例２．ｒＳＩＦＮ−ｃｏのヒト子宮頚癌に対する活性
Ｈｅｌａ細胞をモデルとして本研究を行い、ｒＳＩＦＮ−ｃｏのヒト子宮頚腫瘍治療に対する活性と効力を実証した。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが活性を有し、ヒト子宮頚癌細胞の生長を効果的に阻害したことを示す。特に説明したこと以外、実施例１のように該研究を行った。まず、実施例１と類似する方法で、ヌードマウスに５×１０６個のＨｅｌａ細胞を皮膚下接種して、生長良好な異種移植物をヌードマウス中で２回継代し、ヒト子宮頚癌異種移植物を構築して調製した。その後、１．５ｍｍ３の断片を作って、ｓ．ｃ．方式でテスト動物に移植した。動物の体重は投与初期の時、平均が１９±２ｇであった。実施例１に比べて、用いられる動物がいずれも雌性であった。各処理群の投与量や投与方案は実施例１と類似し、相違点は０日目で処理を開始してからの１と１３日目にＭＭＣを注射し、且つ研究を処理開始後に２８日間続けた。
【０１５６】
結果は表３と図２に示される。表３は、算出された０日目と２８日目の平均ＴＶ、並びに算出された平均ＲＴＶ、Ｔ／Ｃ（％）及び阻害％を示す。２８日目（Ｄ２８）のＲＴＶは、ビヒクルコントロール群が１２．４５±４．４６であり、ＭＭＣ処理群が４．９７±１．８５であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が７．４２±１．９１であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が６．６４±２．０４であり、０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が６．６４±１．６０であった。２８日目の阻害％は、ＭＭＣ処理群が６０．０８％であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４０．４０％であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４６．６７％であり、０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４６．６７％であった。ＭＭＣ処理群、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群及び０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群に対応するＴ／Ｃ（％）はそれぞれ３９．９２％、５９．６０％、５３．３３％及び５３．３３％である。各処理群とビヒクルコントロール群との間のＲＴＶ差異は統計学的に有意であると確定された。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはテスト動物におけるヒト子宮頚癌の生長を効果的に阻害したことを示す。
【０１５７】
【表３】
2018517406.tif 000005
【０１５８】
図２は、２８日間の研究期間での各処理群のＲＴＶ進展を示し、処理を開始してから４、７、１１、１４、１８、２１、２５及び２８日目に行われた腫瘍測定を反映する。結果より、７日目の前に各ＭＭＣ処理群とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群におけるヒト子宮頚腫瘍生長の遅延を示し、２８日目まで維持された。
【０１５９】
研究中のすべての動物はいずれもｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理に耐えられ、毒性現象がない。２８日間の処理期間で極小の平均体重変化が観察された。
【０１６０】
実施例３．ｒＳＩＦＮ−ｃｏのヒト結腸癌に対する活性
ＨＴ−２９をモデルとして本研究を行い、ｒＳＩＦＮ−ｃｏのヒト結腸癌治療に対する活性と効力を実証した。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが活性を有し、ヒト結腸癌細胞の生長を効果的に阻害したことを示す。特に説明したこと以外、実施例１のように該研究を行った。まず、実施例１と類似する方法で、ヌードマウスに５×１０６個のＨＴ−２９細胞を皮膚下接種して、生長良好な異種移植物をヌードマウス中で２回継代し、ヒト結腸癌異種移植物を構築して調製した。その後、１．５ｍｍ３の断片を作って、ｓ．ｃ．方式でテスト動物に移植した。動物の体重は投与初期の時、平均が２０±２ｇであった。実施例１に比べて、この研究に用いられる動物がいずれも雌性であった。各処理群の投与量や投与方案は実施例１に記載した通りであり、相違点は１日目と１０日目に群３に対してＭＭＣを投与し、且つ別途に群７を増加したことにあり、群７において、各マウスを体積が０．１５ｍｌで投与量が０．１５ｍｇ／マウスのＩＦＮα−２ｂで処理し、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群と同様に１日おきに行い、処理を計４週間実施した。濃度が１．４１ｍｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂは輝陽生命工程股分有限公司により提供された。結果を表４と図３中に示す。
【０１６１】
【表４】
2018517406.tif 000006
【０１６２】
表４は、算出された０日目の初期平均ＴＶと２８日目の最終平均ＴＶ、並びに算出された平均ＲＴＶ、Ｔ／Ｃ（％）及び阻害％を示す。２８日目（Ｄ２８）のＲＴＶは、ビヒクルコントロール群が８．４１±２．８２であり、ＭＭＣ処理群が３．１２±１．１９であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４．５１±１．２５であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４．２２±０．８７であり、０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が３．２８±１．２５であり、ＩＦＮα−２ｂ処理群が６．２６±１．４３である。２８日目の阻害％は、ＭＭＣ処理群が６２．９％であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４６．３７％であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が４９．８２％であり、０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群が６１％であり、ＩＦＮα−２ｂ処理群が２５．５６％であった。ＭＭＣ処理群、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群、０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群及びＩＦＮα−２ｂ処理群に対応するＴ／Ｃ（％）はそれぞれ３７．１０％、５３．６３％、５０．１８％、３９．００％及び７４．４４％であった。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏがＩＦＮα−２ｂよりもヒト結腸癌細胞の生長を効果的に阻害したことを示す。各処理群とビヒクルコントロール群との間のＲＴＶ差異は統計学的に有意であると確定された。
【０１６３】
図３は２８日間の研究期間で各処理群のＲＴＶで表されるヒト結腸腫瘍生長に対する阻害を示し、処理を開始してからの３、７、１０、１４、１７、２１、２４及び２８日目に行った腫瘍測定を反映する。結果より、７日目の前に各ＭＭＣ処理群とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群におけるヒト結腸腫瘍生長の遅延を示し、２８日目まで維持された。３種の投与量のｒＳＩＦＮ−ｃｏはいずれもＩＦＮα−２ｂよりも強い腫瘍生長阻害を引き起こした。
【０１６４】
実施例１及び２と同様に、すべてのｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理した動物はいずれもテストの投与量に耐えられ、薬物毒性現象がなく、最小化の体重変化を示した。
【０１６５】
実施例４．ｒＳＩＦＮ−ｃｏのヒト肺癌に対する活性
ＳＰＣ−Ａ４をモデルとして本研究を行い、ｒＳＩＦＮ−ｃｏのヒト肺癌治療に対する活性と効力を実証した。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏがヒト肺腫瘍生長に対して顕著な阻害を示し、且つｒＳＩＦＮ−ｃｏがＩＦＮα−２ｂよりも遥かに効果的であった。特に説明したこと以外、実施例３のように該研究を行った。まず、実施例１と類似する方法で、テスト動物に注射するヒト異種移植物を構築して調製し、相違点はヌードマウスに２．５×１０６個のＳＰＣ−Ａ４細胞を皮膚下（ｓ．ｃ．）接種して、生長良好な腫瘍をヌードマウス中で２回継代することであった。その後、１．５ｍｍ３の断片を作って、ｓ．ｃ．方式でテスト動物に移植した。動物の体重は投与初期の時、平均が２２±２ｇであった。実施例３に比べて、該研究に用いられる動物がいずれも雌性であり、且つ該研究は２１日間の処理を行った。各処理群の投与量や投与方案は実施例３に記載した通りであり、相違点は１と６日目に群３に対してＭＭＣを投与することにある。結果を表５と図４に示す。
【０１６６】
【表５】
2018517406.tif 000007
【０１６７】
図４は、２１日間の研究期間における各処理群のＲＴＶで表されるヌードマウスにおけるヒト肺腫瘍の生長阻害を示し、処理を開始してから４、７、１１、１４、１８、と２１日目に行った腫瘍測定を反映する。結果は、７日目の前に各ＭＭＣ処理群とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群における腫瘍生長の遅延を示し、研究終了の２１日目まで維持された。１１日目になってはじめてＩＦＮα−２ｂ処理群中で腫瘍阻害が観察された。ＩＦＮα−２ｂによる腫瘍生長阻害はいずれのｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群における腫瘍生長阻害よりも低く且つ統計学的に有意ではない（ｐ＞０．０５）。したがって、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＩＦＮα−２ｂよりもヒト肺癌細胞の生長を効果的に阻害した。
【０１６８】
０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群における１匹のマウスが１７日目に原因不明で死亡した以外、実施例１〜３と同様に、すべての動物はいずれもテスト物のテスト投与量に耐えられ、毒性又は体重軽減の現象が観察されなかった。
【０１６９】
実施例５．ｒＳＩＦＮ−ｃｏは多種のヒト実体癌細胞生存率を減少した
細胞培養と試薬。ヒト肺癌細胞系（Ａ５４９、Ｈ１２９９、Ｈ４６０、Ｃａｌｕ−１）、ヒト肝臓癌細胞系（ＳＭＭＣ−７７２１、Ｈｕｈ−７、ＣＬ−１）、ヒト子宮頚癌細胞系（Ｈｅｌａ）、ヒト乳癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、ヒト前立腺癌細胞系（ＰＡＮＣ−１）及びヒト結腸癌細胞系（ＳＷ６２０、ＨＴ２９、ＳＷ４８０）はＳｈａｎｇｈａｉ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（中国上海）から購入された。以上の細胞系はいずれもＳｈａｎｇｈａｉ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎによる対応する完全生長培地で５％ＣＯ２と３７℃において培養され、該完全生長培地は１０％熱失活胎児牛血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有し、４ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充された。完全生長培地は、Ａ５４９に対してＦ−１２Ｋ（ロットＧＮＭ２１１２７；杭州吉諾生物医薬技術有限公司）、ＳＷ６２０とＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対してＬ−１５（ロット４１３００−０３９，ＧＩＢＣＯ）、ＳＭＭＣ−７７２１、Ｈｅｌａ、Ｈｕｈ−７、ＣＬ−１及びＰＡＮＣ−１に対してＤＭＥＭ（ロットＣ１１９９５，ＧＩＢＣＯ）、Ｈ４６０、Ｈ１２９９及びＳＷ４８０に対してＲＭＰＩ−１６４０（ロットＣ１１８７５，ＧＩＢＣＯ）、ＨＴ−２９に対してＭａｃｒｏ５ａ（ロットＭ４８９２，Ｓｉｇｍａ）、Ｃａｌｕ−１に対してＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳであった。
【０１７０】
９６ウェルプレートに対して１００μｌの完全培地中の約５×１０３個の細胞をウェル毎に入れ、徹夜インキュベートし、そしてそれぞれＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏを用いて１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、３．１３μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ、０．７８μｇ／ｍｌ、０．３９μｇ／ｍｌ及び０．２０μｇ／ｍｌの濃度で約４８時間処理し、そして細胞を収集して分析した。ＳｕｎＢｉｏ  Ａｍ−Ｂｌｕｅ測定キット（Ｃａｔ＃：ＳＢＡＢ８０２５，Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＢＯ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，中国上海）により細胞生存率を評価する。そのマニュアルに従って各ウェルに１０μｌのＡｍ−Ｂｌｕｅを添加した。その後、細胞を５％ＣＯ２と３７℃で４時間インキュベートする。９６ウェルプレートを３０秒振盪した後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏｎ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）により５７０ｎｍと５９５ｎｍ各ウェルの吸光率を読み取る。以下のように相対細胞生存率を算出する：細胞生存率＝（処理群（ＯＤ５７０−ＯＤ５９５）−空白（ＯＤ５７０−ＯＤ５９５））／（コントロール群（ＯＤ５７０−ＯＤ５９５）−空白（ＯＤ５７０−ＯＤ５９５））×１００％、但し、コントロール群が対応の未処理細胞である。結果を図５に示し、腫瘍細胞の生存率は未処理のコントロール細胞に対する百分率として表される。各データ点は少なくとも２個の独立実験の平均値を表す。
【０１７１】
図５は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂ処理して癌細胞生存率を減少させる各癌細胞系（Ａ）−（Ｉ）の投与量反応曲線を示す。（Ａ）Ａ５４９細胞；（Ｂ）Ｈｅｌａ細胞；（Ｃ）ＣＬ−１細胞；（Ｄ）Ｈｕｈ−７細胞；（Ｅ）ＳＷ４８０細胞；（Ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞；（Ｇ）Ｃａｌｕ−１細胞；（Ｈ）ＳＭＭＣ−７７２１細胞；（Ｉ）ＰＡＮＣ−１細胞。
【０１７２】
結果より、最高のテスト濃度（１００μｇ／ｍｌ）でも、ＩＦＮα−２ｂがＡ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＬ−１細胞、ＳＷ４８０細胞及びＳＭＭＣ−７７２１細胞の生存率減少に対して効果が無いかほとんど効果がないことを示した。１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）のＩＦＮα−２ｂでＨｕｈ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞及びＰＡＮＣ−１細胞を処理する時、５０％未満の生存率減少が観察された。それに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは遥かに低い投与量で、投与量に依存する形で腫瘍細胞生存率を減少でき、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＰＡＮＣ−１細胞に対して、６．２５μｇ／ｍｌ〜１２．５μｇ／ｍｌの濃度で５０％に近い細胞生存率減少に達成でき、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、Ｃａｌｕ−１細胞及びＳＭＭＣ−７７２１細胞に対して、１２．５μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌの濃度で５０％に近い細胞生存率減少に達成できた。通常、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが細胞生存率を減少するＩＣ５０は、異なる癌細胞に対して約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜１８ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にある。１００ｍｃｇ／ｍｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏで、いずれの癌細胞系に対しても細胞生存率が検測されなかった。したがって、各テスト濃度で、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはいずれもＩＦＮα−２ｂよりも腫瘍細胞生存率を効果的に減少した。
【０１７３】
実施例６Ａ．ｒＳＩＦＮ−ｃｏがＩＦＮα−２ｂよりも細胞生存率を効果的に減少させる
ｒＳＩＦＮ−ｃｏが細胞生存率を減少させる能力を実証するために、Ａ５４９とＳＷ６２０腫瘍細胞（１００μｌの完全培地中の２×１０３個の細胞をウェル毎に入れる）を９６ウェルプレートに入れ、それぞれ１０μｇ／ｍｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで１〜６日間処理した。標準ＭＴＴ法（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド検測，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により、細胞生存率を評価した。該検測について、各ウェルに約２０μｌのＭＴＴ（４ｍｇ／ｍｌ）を加える。細胞を３７℃で４時間インキュベートする。その後、丁寧に各ウェルの上澄み液を除去してから、各ウェルに同体積（１５０μｌ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えてクレードル上で徹底的に１５分間混合した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）を用いて５９５ｎｍにおいて９６ウェルプレートの吸光度を読み取る。相対細胞生存率は以下のように算出される：細胞生存率＝（処理群（ＯＤ５９５）−空白（ＯＤ５９５））／（コントロール群（ＯＤ５９５）−空白（ＯＤ５９５））×１００％。
【０１７４】
結果は未処理のコントロール細胞に対する百分率として表される。各データ点は少なくとも２個の独立実験の平均値を表す。図６に示されるように、ＩＦＮα−２ｂに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは時間に依存する形でＳＷ６２０細胞の細胞生存率を激しく減少させるが、ＩＦＮα−２ｂは有するとしても極弱い時間依存効果を有した。ｒＳＩＦＮ−ｃｏの時間依存性効果はＡ５４９細胞に対して、処理の約最初の３日間で顕著であった。各細胞系に対して、各時間点で、ｒＳＩＦＮ−ｃｏとＩＦＮα−２ｂとの間の効果差異が統計学的に有意であった（ｐ＜０．０１）。これらデータはｒＳＩＦＮ−ｃｏの時間依存性の強い抗腫瘍効果を示した。
【０１７５】
実施例６Ｂ．ｒＳＩＦＮ−ｃｏがインビボで腫瘍生長を阻害する
ＮＩＨ実験動物の管理と使用ガイドにより該実験を行った。４〜５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは上海実験動物センター（中国上海）より得られた。約５×１０６個のＡ５４９細胞を各マウスに皮膚下注射して異種移植腫瘍を移入した。動物をランダムに３群（各群８匹のマウス）に分け、ＰＢＳ（１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．２−７．４）、各マウス１００μｇ／１００μｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏ又は各マウス１００μｇ／１００μｌのＩＦＮα−２ｂで一日おきに腫瘍内処理を計１２回行った。３日間毎に一回腫瘍を測定し、腫瘍体積は以下のように算出される：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２。結果を図１６に示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝８）として表される。結果より、ＰＢＳ処理群に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは移入した腫瘍の生長をほとんど完全に阻害できることを実証した（ｐ＜０．０００１）。しかし、ＩＦＮα−２ｂは腫瘍生長に対する顕著な阻害を示さなかった。結果より、インビボで腫瘍生長を阻害する面では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＩＦＮα−２ｂよりも有効であることを実証した。
【０１７６】
実施例６Ｃ．ｒＳＩＦＮ−ｃｏは三次元培養体系における腫瘍細胞のコロニー形成と偽足形成を阻害する
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｔ＃：３５６２３４）を４℃冷蔵庫で氷の上で徹夜解凍し、２４ウェルプレートを−２０℃で徹夜冷凍した。その後、１５０μｌの１．０ｍｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌで冷凍した２４ウェルプレートの各ウェルを塗布した。その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌが塗布された２４ウェルプレートを３７℃で２０−３０分間インキュベートした。肺癌細胞Ａ５４９をトリプシン化してカウントする。Ｍａｔｒｉｇｅｌが塗布されたウェルに、２％Ｍａｔｒｉｇｅｌ及び１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏを含有する又はコントロールとしてのインターフェロンを含有しない馴化培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）における約５×１０３個の細胞を接種した。これら細胞を３７℃で少なくとも約８日間インキュベートする。３日間毎に一回約２００μｌの上記の馴化培地を添加し、培地が乾かすのを防止する。４日目又は８日目に、写真を撮ってコロニーのサイズと偽足形成を観察した。実験は３群並行して行った。
【０１７７】
結果を図７に示す。４日間後、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群（図７Ｃ）は未処理群（図７Ａ）よりも小さいコロニーを有することを発見した。８日後、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群は３群のうち最小のコロニーを有するだけではなく、細胞の周囲にはほとんど突出する偽足がないことも発見し（図７Ｃ、第２と３行）、未処理群（図７Ａ、第２と３行）とＩＦＮα−２ｂ処理群（図７Ｂ、第２と３行）の細胞において、偽足形成が顕著である。該実験は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが癌細胞コロニーの生長を阻害できるだけではなく、癌細胞における偽足形成（転移に必須な特徴）も阻害できることを証明した。
【０１７８】
実施例７．ｒＳＩＦＮ−ｃｏのβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する阻害
β−カテニン／ＴＣＦ転写レポーターシステムテスト。ｒＳＩＦＮ−ｃｏのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に対するインビトロ作用を測定した。癌細胞を９６ウェルプレートに入れ（ウェル毎に１×１０４個の細胞）、１２時間インキュベートし、そして１００ｎｇＴＯＰＦｌａｓｈ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で瞬時トランスフェクションを行った。トランスフェクション効率を標準化するために、細胞を１ｎｇのＳＶ４０プロモーターに駆動される内部コントロールレポーターウミシイタケルシフェラーゼｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）でコトランスフェクションし、そして１０ｍｃｇ／ｍｌインターフェロンｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで６時間処理する又はトランスフェクションした後に処理せずにコントロール（Ｍｏｃｋ）とする。インターフェロンで２４時間処理した後、メーカーのマニュアル（Ｃａｔ＃：Ｅ１９６０，Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、デュアルルシフェラーゼエッセイシステムキットでルシフェラーゼ検測を行った。相対ルシフェラーゼ活性はホタルルシフェラーゼ活性／ウミシイタケルシフェラーゼ活性の比率として表される。実験は３群並行して行った。
【０１７９】
図８に示されるように、結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはヒト実体癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦ媒介の転写活性を減少することを示した。２４時間処理した後、３種の肺癌細胞（Ａ５４９、Ｈ１２９９、Ｈ４６０）と２種類の結腸癌細胞（ＨＴ−２９、ＳＷ６２０）において、β−カテニン／ＴＣＦ媒介の転写活性は著しくｒＳＩＦＮ−ｃｏに阻害されていた（＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１）。しかし、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞及びＨＴ−２９細胞に対して、ＩＦＮα−２ｂは阻害作用を有せず、反って増強作用をもたらした。
【０１８０】
簡単に言えば、コントロール群、ＩＦＮα−２ｂ処理群及びｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群におけるホタルルシフェラーゼ活性／ウミシイタケルシフェラーゼ活性の比率はそれぞれ：（Ａ）Ａ５４９細胞に対して約３１０、約３５０及び約１００であった；（Ｂ）Ｈ１２９９細胞に対して約８００、約１０００及び約５００であった；（Ｃ）Ｈ４６０細胞に対して約４５０、約５００及び約２８０であった；（Ｄ）ＨＴ−２９細胞に対して約３００、約６００及び約２００であった；（Ｅ）ＳＷ６２０細胞に対して約１５００、約１２００及び約１００未満であった。該研究より、Ｗｎｔ／ＴＣＦシグナル伝達を阻害する面では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＩＦＮα−２ｂより優れているため、その抗腫瘍効果もより優れている。
【０１８１】
実施例８．ｒＳＩＦＮ−ｃｏが癌細胞におけるβ−カテニンの蛋白レベルを減少させる
癌細胞Ａ５４９とＳｗ４８０を約８５％の集密度まで培養して６ウェルプレートに入れた。細胞をそれぞれ１０ｍｃｇ／ｍｌ  ＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで２４時間、４８時間又は７２時間処理し、又は処理せずにコントロール（Ｍｏｃｋ）とした。処理後、細胞を収集してウエスタンブロットし、その特異性抗体でβ−カテニンの蛋白レベルを検測し、ＧＡＰＤＨを内因性ローディングコントロールとする。実験は３群並行して繰り返した。
【０１８２】
ウエスタンブロット分析。多種の蛋白の発現を確定するために、６ウェルプレートから細胞を収集し、メーカーのマニュアル（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｃｈｉｎａ）に従って抽出試薬（Ｃａｔ＃：Ｐ００１３）で細胞全蛋白を抽出した。Ｌｏｗｒｙ蛋白測定キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）により全蛋白濃度を測定する。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、１０％〜１２％のゲル上で全蛋白を分離し、それを０．２２又は０．４５μｍのＰＶＤＦ膜上（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に転移した。５％脱脂乳、牛血清白蛋白、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、４℃で膜を徹夜ブロッキングした。その後、ブロッキングされた膜と一次抗体（１：１０００に希釈）とをインキュベートし、そしてＨＲＰ結合の二次抗体とともにインキュベートした。冷光／蛍光イメージングＬＡＳ４０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）とｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ化学発光基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いてブロットを可視化した。
【０１８３】
本研究では、使用される一次抗体はマウスモノクローナルβ−カテニン抗体（１：１０００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）とマウスモノクローナルＧＡＰＤＨ抗体（１：２０００）（Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ）である。抗マウスＨＲＰ結合の二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を１：２０００の濃度で使用した。図１０に示される結果より、Ａ５４９細胞について、２日間（４８時間）処理した後、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはβ−カテニンの蛋白レベルを大幅に減少させたことを示した。これら細胞について、３日間（７２時間）処理した後、さらなる減少が観察された。ＳＷ４８０細胞におけるβ−カテニンの蛋白レベル減少は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏで７２時間処理した後に顕著となった。肺癌Ａ５４９細胞と結腸癌ＳＷ４８０細胞中において、β−カテニンのダウンレギュレーションは明らかに時間依存性であった。それに比べて、ＩＦＮα−２ｂは何らの顕著なβ−カテニンレベルの減少も引き起こさず、それがβ−カテニンのダウンレギュレーションには作用がないことを示した。
【０１８４】
実施例９．ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＷｎｔ経路媒介の標的遺伝子の転写ダウンレギュレーションを引き起こす
肺癌Ａ５４９細胞を６ウェルプレートに接種し、それぞれ１０μｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理し、又は処理せずにコントロール（Ｍｏｃｋ）とした。２４時間処理した後、ＴＲＩＺＯＬ試薬で細胞全ｍＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを合成し、４種のＷｎｔシグナル伝達下流遺伝子Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２の特異性プライマーでさらにｑＰＣＲを行った。実験は３群並行して行い、Ｍｏｃｋ群で標準化した。
【０１８５】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析。メーカーの取り扱い説明書に従ってＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて全ｍＲＮＡを分離した。メーカーの取り扱い説明書に従ってＲＴ−ＰＣＲキット（Ｃａｔ＃：ＦＳＱ−１０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｃａｔ＃：ＱＰＫ−２０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いてｑＰＣＲを行った。４種のＷｎｔ経路標的遺伝子のプライマーは、Ａｘｉｎ２センスプライマー：５’−ＣＧＴＧＧＡＴＡＣＣＴＴＡＧＡＣＴＴ−３’（配列番号８）とアンチセンスプライマー：５’−ＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＴＧＴＡ−３’（配列番号９）；ＣＤ２４センスプライマー：５’−ＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１０）とアンチセンスプライマー：５’−ＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡ−３’（配列番号１１）；サバイビンセンスプライマー：５’−ＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＴＴＣＡＡＧ−３’（配列番号１２）とアンチセンスプライマー：５’−ＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号１３）及びＩＤ２センスプライマー：５’−ＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１４）とアンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号１５）であった。
【０１８６】
増幅プロトコールは、９５℃で１分間インキュベートし、４０サイクル（９５℃１５秒，６０℃１５秒，７２℃３０秒）を含んだ。Ｂｉｏ−Ｒａｄ検測システムを用いて、リアルタイムでＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染料がＰＣＲ産物に結合する状況をモニターし、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  ｍａｎａｇｅｒ  ２．１ソフトウェアで分析した。各条件についてサンプルを集め、２群並行して行う。２−△△Ｃｔ法により処理したサンプルとＭｏｃｋを比較し、倍率変化でプロットした。ＧＡＰＤＨを標準化コントロールとして用いた。
【０１８７】
図１１に示す結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＷｎｔ経路媒介の標的遺伝子Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のダウンレギュレーションを引き起こす。ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理後に、これら遺伝子のｍＲＮＡレベルが顕著に減少するが、ＩＦＮα−２ｂ処理後に顕著に減少していない。
【０１８８】
簡単に言えば、Ｍｏｃｋコントロールの相対発現レベルを１とするとき、Ａｘｉｎ２遺伝子（図１１Ａ）は、ＩＦＮα−２ｂ処理によって１よりやや高いレベルが得られたが、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理によって約０．４のレベル（ｐ＜０．０００１、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理と未処理とを比較する）が得られた。Ｍｏｃｋ未処理細胞、ＩＦＮα−２ｂ処理細胞及びｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理細胞について、ＣＤ２４遺伝子の相応レベル（図１１Ｂ）はそれぞれ１、約０．９及び約０．４（ｐ＜０．０００１）であり、サバイビン遺伝子の相応レベル（図１１Ｃ）はそれぞれ１、約０．９及び約０．４（ｐ＜０．０００５）であり、ＩＤ２遺伝子の相応レベル（図１１Ｄ）はそれぞれ１、約１及び約０．４（ｐ＜０．０００１）であった。
【０１８９】
実施例１０．ｒＳＩＦＮ−ｃｏは異なる細胞におけるＷｎｔ関連受容体若しくは共受容体ＬＲＰ６／ＦＺＤ６のｍＲＮＡレベルをダウンレギュレーションできる
ｒＳＩＦＮ−ｃｏのＬＲＰ６／ＦＺＤ６に対する調節を研究した。実施例９に行われた通り、ｑＰＣＲにより本実施例を実施した。癌細胞Ａ５４９、Ｈ４６０、ＳＷ６２０及びＨＴ−２９を６ウェルプレートに接種し、１０μｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理する又は処理せずにコントロール（Ｍｏｃｋ）とした。２４時間処理した後、ＴＲＩＺＯＬ試薬で細胞全ｍＲＮＡを分離し、ＬＲＰ６とＦＺＤ６の特異性プライマーを用いてｃＤＮＡに対してｑＰＣＲを行う。使用されるプライマーは、ＬＲＰ６センスプライマー：５’−ＴＧＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号４）とアンチセンスプライマー：５’−ＣＡＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号５）、及びＦＺＤ６センスプライマー：５’−ＧＣＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＴＴＡＧＴＣ−３’（配列番号６）とアンチセンスプライマー：５’−ＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＣ−３’（配列番号７）である。実験は３群並行して行い、ｍｏｃｋコントロール群で正規化した。結果は、ＬＲＰ６又はＦＺＤ６のＧＡＰＤＨに対する相対ｍＲＮＡレベルとして記録された。
【０１９０】
図９に示される結果より、４種の癌細胞系において、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＬＲＰ６とＦＺＤ６を異なる程度でダウンレギュレーションさせたことを示した。図９Ａは、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理後にＡ５４９細胞（ｐ＜０．００５）、ＳＷ６２０細胞（ｐ＜０．００５）及びＨＴ−２９細胞（ｐ＜０．００５）におけるＬＲＰ６  ｍＲＮＡの相対発現は顕著に著減少したが、ＩＦＮα−２ｂ処理では顕著な減少が観察されなかったことを示した。図９Ｂは、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理後にすべての４個の細胞系Ａ５４９（ｐ＜０．００１）、Ｈ４６０（ｐ＜０．０００５）、ＳＷ６２０（ｐ＜０．００１）及びＨＴ−２９（ｐ＜０．０００５）においてＦＺＤ６  ｍＲＮＡの相対発現が顕著に減少したことを示した。他のインターフェロンＩＦＮα−２ｂは、ＨＴ−２９細胞におけるＦＺＤ６  ｍＲＮＡの発現を増強させる一方、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞及びＳＷ６２０細胞において、ｒＳＩＦＮ−ｃｏと同じ程度に達していないが、ＦＺＤ６  ｍＲＮＡの発現をある程度減少させた。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏによるＷｎｔシグナル伝達経路の阻害は、Ｗｎｔ関連の細胞表面受容体ＬＲＰ６とＦＺＤ６の発現が阻害されることにより引き起こされた可能性があることを示す。ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、テストされるヒト癌細胞（例えばヒト肺癌細胞とヒト結腸癌細胞）において、β−カテニン／ＴＣＦ媒介の転写活性とβ−カテニン蛋白レベル及びＷｎｔシグナル伝達経路関連受容体、共受容体並びに標的遺伝子に対するダウンレギュレーションを含むＷｎｔ経路を阻害する面では、インターフェロンＩＦＮα−２ｂより優れていた。
【０１９１】
実施例１１．ｒＳＩＦＮ−ｃｏが腫瘍阻害遺伝子の発現をアップレギュレーションする
本研究ではｒＳＩＦＮ−ｃｏの腫瘍阻害遺伝子に対するアップレギュレーション作用を実証した。癌細胞Ａ５４９、Ｈ４６０、ＳＷ６２０及びＨＴ−２９を６ウェルプレートに接種し、１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理する又は処理せずにＭｏｃｋコントロールとする。２４時間処理した後、ＴＲＩＺＯＬ試薬で細胞全ｍＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを合成し、ＤＫＫ３、ＫＬＦ４とＢＡＴＦ２の特異性プライマーを用いてさらにｑＰＣＲを行った。ＢＡＴＦ２に対して、センスプライマー５’−ＣＡＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１６）とアンチセンスプライマー５’−ＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１７）を使用し、ＤＫＫ３に対して、センスプライマー５’−ＧＧＡＧＣＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１８）とアンチセンスプライマー５’−ＡＣＧＣＣＴＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１９）を使用し、ＫＬＦ４に対して、センスプライマー５’−ＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号２０）とアンチセンスプライマー５’−ＧＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＧ−３’（配列番号２１）を使用した。
【０１９２】
実験は３群並行して行い、ｍｏｃｋコントロール群で正規化した。図１２に示される結果はＧＡＰＤＨと比較する相対ｍＲＮＡ発現レベルとして表された。Ａ５４９細胞に対して、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理はすべての３種の腫瘍阻害遺伝子ＤＫＫ−３（図１２Ａ）、ＢＡＴＦ２（図１２Ｂ）及びＫＬＦ４（図１２Ｃ）の発現を大幅に増大させ、ＩＦＮα−２ｂよりも遥かに有効であった。ＳＷ６２０細胞において、コントロールとＩＦＮα−２ｂ処理に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理後にＫＬＦ４発現のアップレギュレーションも大幅に増加した。ＩＦＮα−２ｂ処理はＨ４６０細胞におけるＤＫＫ−３の発現を顕著に増加した。
【０１９３】
実施例１２．ｒＳＩＦＮ−ｃｏが癌細胞転移を阻害する
ＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで２４時間処理（未処理のコントロール（Ｍｏｃｋ）に比べる）した後、肺癌Ａ５４９細胞と結腸癌ＳＷ６２０細胞が微孔膜を通して転移する能力を確定することで、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの腫瘍細胞転移を阻害する能力を実証した。２４ウェルプレートにおいて８μｍ細胞培養インサート式セル（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）で細胞転移テストを行う。ＦＢＳを含有しない温熱（３７℃）炭酸水素塩類培地をインサート式セルの内部及びウェルの底部に加え、加湿された組織培養インキュベーターにおいて３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気で約２時間復水した。復水した後、注意深く培地を除去した。その後、５００μｌのＦＢＳを含有しない培地に混合懸濁する調製細胞（１０μｇ／ｍｌ  ＩＦＮα−２ｂ又は１０μｇ／ｍｌ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理した後、又は完全に処理していない）を０．５×１０４細胞／インサート式セルの密度でインサート式セルのフィルターの上部に接種した。２４ウェルプレートの下室に５００μｌの１０％ＦＢＳ含有完全培地を入れた。通常な培養条件で３７℃において２４時間過ぎた後、室膜上部の非転移細胞を綿棒で除去した。培養セルの下部を４％パラホルムアルデヒドで固定して２％クリスタルバイオレットで染色する。３群の並行ウェルのそれぞれにおいて、細胞が入れている室膜の反対側における転移細胞数をカウントする。各実験を少なくとも２回繰り返し、毎回３群の並行ウェルを使用した。
【０１９４】
図１３に示される結果は、Ｍｏｃｋ、ＩＦＮα−２ｂ処理細胞及びｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理細胞のそれぞれの単位領域における転移細胞の平均数を示す。膜を通して転移したＡ５４９細胞について、未処理のＭｏｃｋ群では約３０個の細胞／領域が観察され、ＩＦＮα−２ｂ群では約１１０個の細胞が観察され、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理群では約１０個の細胞が観察された。ＩＦＮα−２ｂ処理による転移増強とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理による転移阻害が統計学的に有意であった（ｐ＜０．０１）。ＳＷ６２０細胞を用いる時にもｒＳＩＦＮ−ｃｏによる顕著な阻害が観察された。これに対して、ＩＦＮα−２ｂ処理はＳＷ６２０細胞における腫瘍細胞転移を増加させた。したがって、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは腫瘍細胞転移を効果的に阻害し、ＩＦＮα−２ｂよりも遥かに有効である。
【０１９５】
実施例１３．ｒＳＩＦＮ−ｃｏは細胞アポトーシス経路により作用を果たしたのではない
本研究は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは細胞アポトーシス経路以外の経路により腫瘍細胞生存率を減少させる作用を果たすことを示すために行われた。腫瘍細胞Ａ５４９とＳＷ６２０を６ウェルプレートに入れ、徹夜インキュベートしてから１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又は１０ｍｃｇ／ｍｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏ又は５ＦＵで２４時間又は４８時間処理する、又は処理しない（Ｍｏｃｋコントロールとする）。その後、ウエスタンブロットにより細胞アポトーシス関連の分子標記物をモニターする。使用される一次抗体は、マウスモノクローナルβ−チューブリン抗体（１：２０００，Ｃａｔ＃：ＣＷ００９８Ａ）とマウスモノクローナルＧＡＰＤＨ抗体（１：２０００，Ｃａｔ＃：ＣＷ０１００Ａ）（Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ）；マウスモノクローナルＰＡＲＰ抗体（１：１０００，Ｃａｔ＃：ｓｃ−２００７，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；ウサギモノクローナル−プロカスパーゼ−３抗体（１：１０００，Ｃａｔ＃：９６６５）とウサギポリクローナル切断したカスパーゼ−３抗体（１：１０００，Ｃａｔ＃：９６６１）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）；ヤギポリクローナルプロカスパーゼ−８抗体（１：１０００，Ｃａｔ＃：ｓｃ−６１３６，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；ウサギモノクローナル切断したカスパーゼ−８抗体（１：１０００，Ｃａｔ＃：９４９６）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）であった。
【０１９６】
Ａ５４９細胞の結果を図１４Ａに示し、ＳＷ６２０細胞の結果を図１４Ｂに示す。ウエスタンブロットは、５ＦＵ（既知の細胞アポトーシスを招く薬物）で処理した後、細胞のプロカスパーゼ−３、プロカスパーゼ−８及びＰＡＲＰレベルは顕著な減少を示すが、切断したカスパーゼ−３と切断したカスパーゼ−８はレベル増加を示した。それに対して、インターフェロンＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏはいずれも、プロカスパーゼ−３、プロカスパーゼ−８又はＰＡＲＰレベルを減少させず、切断したカスパーゼ−３又は切断したカスパーゼ−８レベルを増加させなかった。したがって、結果より、この２種類のインターフェロン、特にｒＳＩＦＮ−ｃｏは、細胞アポトーシス以外の異なるメカニズムにより腫瘍細胞生存率を減少させる可能性がある。
【０１９７】
実施例１４．ｒＳＩＦＮ−ｃｏがＳＴＡＴリン酸化を引き起こす
該実験は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＩＦＮα−２ｂと同様にＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を利用することを示すために行われた。本研究において、Ａ５４９細胞とＨｅｌａ細胞とをそれぞれ３．３ｃｍの皿に入れ、３７℃で徹夜インキュベートし、そしてそれぞれ１０μｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで０、５、１５、３０、６０、１２０及び２４０分間処理した。処理後、細胞を収集し、細胞蛋白を抽出してＳＤＳ−ＰＡＧＥアガロースにロッドし、ウエスタンブロット分析を行うことにより、ＳＴＡＴ１（Ｔｙｒ７０１）、ＳＴＡＴ２（Ｔｙｒ６９０）及びＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）のリン酸化を観察する。ＧＡＰＤＨをロッディングコントロールとした。
【０１９８】
使用される一次抗体は、ＳＴＡＴ１（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１７５Ｓ）、Ｔｙｒ７０１リン酸化−ＳＴＡＴ１（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１６７Ｓ）、ＳＴＡＴ２（１：５００，Ｃａｔ＃４５９４）、Ｔｙｒ６９０リン酸化−ＳＴＡＴ２（１：１０００，Ｃａｔ＃：４４１Ｓ）、ＳＴＡＴ３（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１３２）、Ｔｙｒ７０５リン酸化−ＳＴＡＴ３（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１４５Ｓ）である。抗マウス（Ｃａｔ＃：ｓｃ−２００５）又は抗ウサギ（Ｃａｔ＃：ｓｃ−２００４）又は抗ヤギ（Ｃａｔ＃：ｓｃ−２０２０）ＨＲＰ−結合の二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を１：２０００の濃度で使用した。冷光／蛍光イメージングＬＡＳ４０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）とｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ化学発光基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いてブロットを可視化した。
【０１９９】
図１５に示される結果より、この２種類のインターフェロン、即ち、ＩＦＮα−２ｂとｒＳＩＦＮ−ｃｏは、Ａ５４９細胞とＨｅｌａ細胞中でＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２とＳＴＡＴ３リン酸化パターンにおいて似たような挙動を示す。したがって、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ媒介のＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達レベルとＩＦＮα−２ｂ媒介のＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達レベルとは差異がなく、ｒＳＩＦＮ−ｃｏとＩＦＮα−２ｂは共通なＩＦＮＡＲ１／２受容体をシェアする可能性があることを示唆した。
【０２００】
実施例１５．ｒＳＩＦＮ−ｃｏのＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２への結合親和性
表面プラズモン共鳴技術に基づき、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００蛋白質相互作用アレイシステム（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｃｏ．）を使用してＩＦＮα−２ｂとｒＳＩＦＮ−ｃｏのＩＦＮＡＲ１−ＥＣ（Ｃａｔａ：１３２２２−Ｈ０８Ｈ，  Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ）又はＩＦＮＡＲ２−ＥＣ（Ｃａｔａ：  １０３５９−Ｈ０８Ｈ，  Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ）  への結合親和性を測定した。受容体サブユニットを固定するために、２０μｇ／ｍｌのＩＦＮＡＲ１−ＥＣサブユニット及び５０μｇ／ｍｌのＩＦＮＡＲ２−ＥＣサブユニットをそれぞれＣＭ５センサチップとともにインキュベートし、蛋白質中のアミノ基を介してチップのカルボキシル化デキストラン表面に結合させた。そして、２種のテストするインターフェロンを異なる濃度でリガンドに垂直注射し、ＩＦＮα−２ｂ／ＩＦＮＡＲ１結合は１００〜３，０００ｎＭの範囲にあり、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ／ＩＦＮＡＲ１結合は５０〜１，０００ｎＭの範囲にあり、ＩＦＮα−２ｂ／ＩＦＮＡＲ２結合及びｒＳＩＦＮ−ｃｏ／ＩＦＮＡＲ２結合は３．１２５〜８０ｎＭという別の範囲にあり、ＩＦＮｓ／ＩＦＮＡＲ２結合期間中、再生された２Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液を加えて５秒間の再活性化手順を継続させた。メーカーのマニュアルに従ってデータを分析した。式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ  （ｄ：解離；ａ：結合）に基づいてレート定数から解離定数ＫＤを確定した。
【０２０１】
図１７はｒＳＩＦＮ−ｃｏとＩＦＮα−２ｂの異なる受容体結合親和性を示した。この実験条件では、定常分析モデルにより分析してＩＦＮＡＲ１インターフェロン受容体の親和定数：ＫＤ（ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ／ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）：６．００３×１０−７ｍｏｌ／Ｌ；ＫＤ（ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ／ＩＦＮα−２ｂ）：２．８３５×１０−６ｍｏｌ／Ｌ（図１７Ａ）を得ることができ、動的分析モデルにより分析してＩＦＮＡＲ２インターフェロン受容体の親和定数：ＫＤ（ＩＦＮＡＲ２−ＥＣ／ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）：２．１９２×１０−８  ｍｏｌ／Ｌ；ＫＤ（ＩＦＮＡＲ２−ＥＣ／ＩＦＮα−２ｂ）：１．８４３×１０−９ｍｏｌ／Ｌ（図１７Ｂ）を得ることができ、それらの親和定数の比較結果について、ＩＦＮα−２ｂに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ／ＩＦＮＡＲ１はより強い結合親和性を示す（４．７２倍）（図１７Ｃ）が、ＩＦＮα−２ｂに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ／ＩＦＮＡＲ２は１１．９倍のより弱い結合親和性を示す（図１７Ｃ）。
【０２０２】
実施例１６．癌細胞において、Ｂ１８Ｒ予備処理後、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＩＦＮα−２ｂよりも高いｐ−ＳＴＡＴｓを引き起こす
本研究では、Ａ５４９とＨｅｌａ細胞を徹夜インキュベートした。培地において１０倍連続希釈した（１、１０及び１００ｎｇ／ｍｌ，最終の測定濃度）Ｂ１８Ｒ組換え蛋白（ワクシニアウイルスでコードされた中和Ｉ型インターフェロン受容体，Ｉ型インターフェロン阻害剤とも呼ばれる，Ｃａｔ＃：１４−８１８５，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ）を調製したとともに、室温で一定量（１ｎｇ／ｍｌ，最終の測定濃度）の各種ＩＦＮ蛋白（ＩＦＮα−２ｂとｒＳＩＦＮ−ｃｏ）を１時間混合した。Ｂ１８Ｒ／ＩＦＮ複合物で上記２種の細胞を処理して３０分間インキュベートした。そして、細胞溶解物を集め、ウエスタンブロットによってＳＴＡＴ１（Ｔｙｒ７０１）、ＳＴＡＴ２（Ｔｙｒ６９０）及びＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）のリン酸化を検出した。ＧＡＰＤＨ及びアクチンをロッディングコントロールとした。
【０２０３】
使用される一次抗体はＳＴＡＴ１（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１７５Ｓ）  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）、Ｔｙｒ７０１リン酸化−ＳＴＡＴ１（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１６７Ｓ）  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）、ＳＴＡＴ２（１：５００−１：１０００，Ｃａｔ＃４５９４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）、Ｔｙｒ６９０リン酸化−ＳＴＡＴ２（１：５００−１：１０００，Ｃａｔ＃：４４１Ｓ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）、ＳＴＡＴ３（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１３２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）、Ｔｙｒ７０５リン酸化−ＳＴＡＴ３（１：１０００，Ｃａｔ＃：  ９１４５Ｓ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）、ＧＡＰＤＨ（Ｃａｔ＃：ＣＷ０１００Ａ，Ｋａｎｇｗｅｉ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）、ｂ−アクチン（Ｃａｔ＃：ＣＷ００９６，Ｋａｎｇｗｅｉ  ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ）であった。
【０２０４】
図１８に示すように、Ａ５４９細胞（図１８Ａ）及びＨｅｌａ細胞（図１８Ｂ）において、１０ｎｇ／ｍｌの阻害剤Ｂ１８Ｒの存在下で、ＩＦＮα−２ｂ群に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＳＴＡＴ１／２／３リン酸化に対するより高い誘導を示す。
【産業上の利用可能性】
【０２０５】
本文に述べた方法と測定キットは、テスト化合物、例えばインターフェロンの効力の確定に用いられ、且つβ−カテニン又はＬＲＰ６、ＦＺＤ６、Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか１種又は多種の過度活発又は過度発現、又はＤＫＫ３、ＢＡＴＦ２、あるいはＫＬＦ４のダウンレギュレーションにより、不利な影響を受ける疾病又は病症の治療に用いられる。
【図１】
2018517406.tif 000008
【図２】
2018517406.tif 000009
【図３】
2018517406.tif 000010
【図４】
2018517406.tif 000011
【図５】
2018517406.tif 000012
【図６】
2018517406.tif 000013
【図７】
2018517406.tif 000014
【図８】
2018517406.tif 000015
【図９】
2018517406.tif 000016
【図１０】
2018517406.tif 000017
【図１１】
2018517406.tif 000018
【図１２】
2018517406.tif 000019
【図１３】
2018517406.tif 000020
【図１４】
2018517406.tif 000021
【図１５】
2018517406.tif 000022
【図１６】
2018517406.tif 000023
【図１７】
2018517406.tif 000024
【図１８】
2018517406.tif 000025
【配列表】
2018517406000001.app
【国際調査報告】
2018517406.tif 000026
2018517406.tif 000027
2018517406.tif 000028