(57)【要約】ペット治療用の組成物及び方法が提供される。エリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする配列を含む核酸分子を含むアデノ随伴ウイルスベクターが、提供される。望ましい実施形態において、対象は、ネコまたはイヌである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターゲノムを中にパッケージングして有するＡＡＶカプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列、末端逆位反復配列、及び宿主細胞での前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列を含む、
前記組換えアデノ随伴ウイルス。
【請求項２】
ベクターゲノムを中にパッケージングして有するＡＡＶカプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムは、イヌエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列、末端逆位反復配列、及び宿主細胞での前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列を含む、
前記組換えアデノ随伴ウイルス。
【請求項３】
前記ＥＰＯ配列は、全長ＥＰＯタンパク質をコードする、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項４】
前記ＥＰＯ配列は、異種リーダー配列と組み合わせて、成熟ＥＰＯタンパク質をコードする、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項５】
前記ＥＰＯ配列は、配列番号４のタンパク質配列をコードする、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項６】
前記ＥＰＯ配列は、配列番号３のタンパク質配列をコードする、請求項２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項７】
前記ＥＰＯ配列は、配列番号６の核酸配列またはその変異体を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項８】
前記変異体は、配列番号６のコドン最適化変異体である、請求項７に記載のｒＡＡＶ。
【請求項９】
コドン最適化変異体は、配列番号８である、請求項８に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１０】
前記ＥＰＯ配列は、配列番号５の核酸配列またはその変異体を含む、請求項２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１１】
前記変異体は、配列番号５のコドン最適化変異体である、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１２】
コドン最適化変異体は、配列番号７である、請求項１１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１３】
前記発現制御配列は、プロモーターを含む、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１４】
前記プロモーターは、ＣＢ７プロモーターである、請求項１３に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１５】
前記プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである、請求項１３に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１６】
前記発現制御配列は、組織特異的プロモーターを含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１７】
前記組織特異的プロモーターは、腎臓特異的プロモーターである、請求項１６に記載の
ｒＡＡＶ。
【請求項１８】
前記組織特異的プロモーターは、Ｎｋｃｃ２プロモーター、ウロモジュリンプロモーター、Ｋｓｐ−カドヘリンプロモーター、及びＴＨＰ遺伝子プロモーターから選択される、請求項１６に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１９】
さらに、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ、及び転写後調節エレメントのうち１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項２１】
前記ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８、ｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ．３７、またはｒｈ１０、及びそれらの変異体から選択される、請求項１または２に記載の組換えベクター。
【請求項２２】
前記カプシドは、ＡＡＶ８カプシドである、請求項１または２に記載のウイルスベクター。
【請求項２３】
さらに、ＡＡＶ末端逆位反復配列を含む、請求項１または２に記載のウイルスベクター。
【請求項２４】
ベクターゲノムを中にパッケージングして有するＡＡＶ８カプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列、末端逆位反復配列、及び宿主細胞でのＥＰＯの発現を指示する発現制御配列を含む、
前記組換えアデノ随伴ウイルス。
【請求項２５】
薬学上許容される担体、及び請求項１から２４のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
慢性腎臓疾患の治療方法であって、薬学上許容される担体、及び請求項１または請求項２に記載のウイルスベクターを含む医薬組成物を投与することを含む、
前記方法。
【請求項２７】
前記組成物は、静脈内投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象は、ネコまたはイヌである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象は、ネコであり、かつ前記ＥＰＯは、ネコ配列である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物は、別の治療法と併用して投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物は、約３×１０10ＧＣ／ｋｇの投与量で投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物は、１回より多く投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
慢性腎臓疾患の治療の使用における、請求項１から２４のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶの使用。
【請求項３４】
慢性腎臓疾患の治療に使用するのに適している、請求項１から２４のいずれか１項に記
載の組換えｒＡＡＶ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子形式で提出されたデータの参照による援用
本出願人は、本明細書とともに電子形式で出願された配列表データを、本明細書により参照することにより援用する。このファイルは、「１５−７４７２ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と名前が付いている。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、大部分が腎臓の尿細管周囲細胞内で作られるホルモンである。このホルモンは、骨髄に作用して、赤血球生成を刺激する。エリスロポエチンはまた、成熟赤血球のアポトーシス（プログラム細胞死）を制御する。腎疾患は、エリスロポエチン産生を減少させる。ヒトでは、組換えヒトエリスロポエチン（エポエチン）の開発により、慢性腎臓疾患における貧血の管理に大変革がもたらされた。慢性腎臓疾患に原因があるとされてきた症状の多く、例えば、疲労、嗜眠、傾眠、及び息切れなどは、全て生活の質に望ましくない影響を及ぼすが、これらが、貧血を治すことで解消され、または大幅に改善された。
【０００３】
慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を罹患しているネコは２００万匹、イヌは３５０，０００匹を超える。ＣＫＤ関連腎不全のペットも、同様に苦しんでいる。そのようなペットは、十分なＥＰＯを有しておらず、その結果、重度の貧血になる。これまで、獣医師は、動物が、輸液されたＥＰＯに対し免疫応答を生じるようになるまで、ヒト組換えＥＰＯを投与してきた。実質上、これにより、十分によく理解された生理プロセスの、臨床上明らかに必要とされる長期治療法が市場にないこととなる。
【０００４】
したがって、対象、特にペットでＥＰＯを発現させるのに有用な組成物が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
新規改変エリスロポエチン（ＥＰＯ）構築物が、本明細書中提供される。これらの構築物は、複数の経路を介して、特に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターなどの組換えベクターが介在するｉｎ  ｖｉｖｏ発現により、それらを必要とする対象に送達することができる。
【０００６】
いくつかの実施形態において、ＥＰＯは、内在性配列によりコードされる。すなわち、ＥＰＯ配列は、最終的に投与が意図される対象と同一種に由来する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、薬学上許容される担体及び本明細書中記載されるとおりの組換えベクターを含む医薬組成物が提供される。同じく提供されるのは、治療の必要がある対象に、発現カセットを有する本明細書中記載される組換えベクターを投与することによる、慢性腎臓疾患の治療方法であり、この発現カセットは、さらに、対象でのＥＰＯ構築物の発現を指示する調節性制御配列を含む。いくつかの実施形態において、治療される対象は、ペットである。１つの実施形態において、対象は、ネコである。別の実施形態において、対象は、イヌである。本明細書中使用される場合、「患者」及び「対象」という用語は、同義で使用され、ヒトまたは獣医学対象を示すことができる。
【０００８】
さらに別の実施形態では、ＥＰＯをコードする発現カセットを有する本明細書中記載される組換えベクターを提供することを含む、対象の循環ＥＰＯの量を増加させる方法である。
【０００９】
上に記載される組換えベクターは、循環赤血球の量の減少を特徴とする、慢性腎臓疾患及び他の症状の治療レジメンに使用することができる。
【００１０】
本発明の他の態様及び利点は、以下の本発明の詳細な説明から容易に明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ネコエリスロポエチンを発現するＡＡＶ８で処置したネコのヘマトクリットを示すグラフである。点線は、正常範囲を示す。
【図２】イヌエリスロポエチンを発現するＡＡＶ８で処置したイヌのヘマトクリットを示すグラフである。点線は、正常範囲を示す。
【図３Ａ】イヌＥＰＯプロペプチド配列を示し、リーダー配列には下線を付してある。
【図３Ｂ】ネコＥＰＯプロペプチド配列を示し、リーダー配列には下線を付してある。
【図４】ネコエリスロポエチンを発現するＡＡＶ８で処置したネコのヘマトクリットを示すグラフである。ネコは、３．０×１０7ＧＣ、３．０×１０8ＧＣ、３．０×１０9ＧＣ、または３．０×１０10ＧＣのＡＡＶ８ｆ．ＥＰＯで処置した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ペット（例えば、ネコ及びイヌ）を含む対象で使用するためのＥＰＯ発現構築物を保有するアデノ随伴ウイルスベクターが開発された。イヌまたはネコに特異的な組換えＥＰＯタンパク質治療薬は、有効性が期待できるものの、罹患動物にＥＰＯを送達するためのウイルスベクター介在系よりも開発及び製造費用が高くなると思われる。ウイルスベクター治療薬を用いると、組換えＥＰＯの頻繁な注射とは対照的に、動物を１回で治療できるという簡便さもある。ＥＰＯの安定発現は、貧血を補正し、動物に改善された生活の質をもたらすであろう。本明細書中記載されるＥＰＯ構築物は、対象にとって内在性であり、対象が外来タンパク質に対する免疫応答を生じるリスクを低下させるＥＰＯ配列を提供することも特長とする。
【００１３】
同じく提供されるのは、本明細書中記載される構築物の使用である。これら構築物を、複数の経路を介して、必要としている対象に送達すること、及び特にｒＡＡＶベクターなどの組換えベクターを介して行われるｉｎ  ｖｉｖｏで発現するように送達することが、記載される。１つの実施形態において、慢性腎臓疾患の治療を必要とする対象でその治療レジメンにおいて構築物を使用する方法及び対象のＥＰＯを増加させる方法が提供される。１つの実施形態において、貧血の治療を必要とする対象でその治療レジメンにおいて構築物を使用する方法が提供される。別の実施形態において、対象の貧血は、他の医薬の使用と関連するものである。貧血の一因となる可能性がある医薬として、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療（ＡＺＴを含む）及び化学療法をはじめとする癌治療が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、対象の貧血は、病状と関連するものである。貧血の一因となる可能性がある病状として、癌、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、リウマチ様関節炎、クローン病及び他の慢性炎症性疾患及び機能障害性骨髄（例えば、再生不良性貧血、白血病、脊髄形成異常症、または骨髄線維症）、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患及びリンパ腫、溶血性貧血、鎌状赤血球貧血、ならびにサラセミアが挙げられるが、これらに限定されない。また、対象のＥＰＯ活性を向上させる方法も提供される。
【００１４】
ＥＰＯは、ｉｎ  ｖｉｖｏでプロペプチドとして発現し、リーダー配列は、種にまたがって、ある相同性を共有している。配列番号３は、イヌＥＰＯプロペプチドの配列を示し、成熟タンパク質は、４１位アミノ酸から始まる。図３ａ中、リーダー配列に下線を付し
てある。配列番号４は、ネコＥＰＯプロペプチドの配列を示し、成熟タンパク質は２７位アミノ酸から始まる。図３Ｂ中、リーダー配列に下線を付してある。
【００１５】
１つの実施形態において、ＥＰＯの機能的変異体として、本明細書中記載されるまたは当該分野で既知のＥＰＯ核酸またはアミノ酸配列から最高約１０％の変異を含む可能性があるが、野生型配列の機能を保持する変異体が挙げられる。ＥＰＯ変異体の基礎となる配列は、いくつかの実施形態において、プロペプチドリーダー配列を含む（例えば、配列番号３及び配列番号４に示されるとおり）。別の実施形態において、本明細書中記載されるＥＰＯ変異体は、成熟ペプチド（例えば、配列番号３のアミノ酸４１〜２０６位、または配列番号４アミノ酸２７〜１９２位）のみを示す。本明細書中使用される場合、「機能を保持する」により、核酸またはアミノ酸が、野生型配列と同じように機能することを意味するが、その発現または活性は必ずしも同じレベルとは限らない。例えば、１つの実施形態において、機能的変異体は、野生型配列と比較して、発現または活性が上昇している。別の実施形態において、機能的変異体は、野生型配列と比較して、発現または活性が低下している。１つの実施形態において、機能的変異体は、野生型配列と比較して、発現または活性が、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上に上昇または低下している。イヌＥＰＯのアミノ酸配列は、本明細書中、配列番号３として提示される。ネコＥＰＯのアミノ酸配列は、本明細書中、配列番号４として提示される。
【００１６】
別の実施形態において、ＥＰＯの機能的変異体として、本明細書中記載されるまたは当該分野で既知のＥＰＯ核酸またはアミノ酸配列から最高約２０％の変異を含む可能性があるが、野生型配列の機能を保持する変異体が挙げられる。１つの実施形態において、ＥＰＯの機能的変異体として、本明細書中記載されるまたは当該分野で既知のＥＰＯ核酸またはアミノ酸配列から最高約３０％の変異を含む可能性があるが、野生型配列の機能を保持する変異体が挙げられる。以下の配列比較は、上段にイヌ配列、下段にネコ配列を示し、共通配列は中段にある。
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【００１７】
１つの実施形態において、ＥＰＯという用語は、野生型配列（リーダーペプチドを持つまたは持たない配列いずれかである、配列番号３または配列番号４）と比較して、１つまたは複数のアミノ酸置換が行われた活性ＥＰＯを示す。１つの実施形態において、１つま
たは複数のアミノ酸置換は、変異が、上記の配列比較で示すように種にまたがって示されるある残基でなされている。別の実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換は、保存が種にまたがって示されるある残基でなされている。ＥＰＯは種にまたがって高い度合いの同一性を共有するものの、１つの実施形態において、最終的にベクターの投与が意図される対象の種に基づいてＥＰＯ配列を選択することが望ましい。１つの例において、対象は、哺乳類である。例えば、１つの実施形態において、対象がネコである場合、ＥＰＯ配列は、ネコタンパク質に由来する。別の実施形態において、ＥＰＯ配列は、イヌタンパク質に由来する。別の実施形態において、ＥＰＯ配列は、非ヒト霊長類タンパク質に由来する。別の実施形態において、ＥＰＯは、ウシ、ヒツジ、またはブタタンパク質に由来する。別の実施形態において、ＥＰＯ配列は、配列番号３のものである。別の実施形態において、ＥＰＯ配列は、配列番号４のものである。
【００１８】
ＥＰＯペプチドまたは核酸コード配列は、ＥＰＯ成熟タンパク質配列と併せて異種リーダー配列を含む場合がある。「異種」という用語は、タンパク質または核酸に関して使用される場合、タンパク質または核酸が、２つ以上の配列またはサブ配列を、自然ではそれらが互いに取ることの見られない関連性で含んでいることを示す。例えば、発現カセットは、典型的には、組換えにより製造され、新たな機能的核酸を作るように配置された無関係の遺伝子由来の配列を２つ以上有する。例えば、１つの実施形態において、リーダー配列は、ＥＰＯとは異なる遺伝子由来の場合がある。したがって、ＥＰＯコード配列に関して、リーダーは、異種である。１つの実施形態において、リーダー配列は、ＥＰＯ配列とは異なる種に由来する。
【００１９】
１つの実施形態において、配列は、ＥＰＯ成熟ポリペプチドの上流に融合したＩＬ−２リーダーペプチドをコードする。１つの実施形態において、リーダー配列は、配列番号９：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳである。しかしながら、別の異種リーダー配列を、ＩＬ−２シグナル／リーダーペプチドと置き換えてもよい。リーダーは、とりわけ、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ１８など）、免疫グロブリン、インスリン、アルブミン、β−グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼまたはフィブロネクチン分泌シグナルペプチド、あるいは組織特異的に分泌されるタンパク質由来の配列で自然に見つかるシグナル配列が可能である。１つの実施形態において、リーダー配列は、ＥＰＯプロペプチド由来の内在性リーダー配列である。
【００２０】
本明細書中使用される場合、「派生」または「に由来する」という用語は、配列またはタンパク質が、特定の対象種を起源とするか、あるいは特定の対象種を起源とするタンパク質または配列と同じ配列を共有することを意味する。例えば、イヌ「に由来する」プロペプチド配列は、イヌで発現するものと同じプロペプチド配列と同じ配列（または、本明細書中定義されるとおりのその変異体）を共有する。しかしながら、指定される核酸またはアミノ酸は、実際にイヌを起源とする必要はない。所望の配列を製造することを可能にする様々な技法が当該分野で既知であり、そのような技法として、同様なタンパク質（例えば、相同体）の変異誘発または核酸もしくはアミノ酸配列の人為的製造が挙げられる。「派生」核酸またはアミノ酸は、派生配列の実際の起源にかかわらず、その「派生」元の種の同一核酸またはアミノ酸の機能を保持する。
【００２１】
本明細書中使用される場合、「ＥＰＯ構築物」、「ＥＰＯ発現構築物」という用語、及びそれらの同義語は、本明細書中記載されるとおりのＥＰＯ配列を含む。「ＥＰＯ構築物」、「ＥＰＯ発現構築物」という用語、及びそれらの同義語は、ＥＰＯ（内在性もしくは異種リーダーを持つＥＰＯ成熟タンパク質またはプロペプチドを含む）をコードする核酸配列またはその発現産物を示すのに使用することができる。
【００２２】
「アミノ酸置換」という用語及びその同義語は、アミノ酸を、別の置換用アミノ酸で置
き換えることによる、アミノ酸配列の修飾を包含することが意図される。置換は、保存的置換の場合がある。置換は、非保存的置換の場合もある。保存的という用語は、２つのアミノ酸に言及する際、それらのアミノ酸が当業者に認識される共通の性質を共有することを意味することが意図される。例えば、疎水性非酸性側鎖を有するアミノ酸、疎水性酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性非酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性酸性側鎖を有するアミノ酸、及び親水性塩基性側鎖を有するアミノ酸である。共通の性質は、疎水性側鎖を有するアミノ酸、脂肪族疎水性側鎖を有するアミノ酸、芳香族疎水性側鎖を有するアミノ酸、極性中性側鎖を持つアミノ酸、電荷を帯びた側鎖を持つアミノ酸、電荷を帯びた酸性側鎖を持つアミノ酸、及び電荷を帯びた塩基性側鎖を持つアミノ酸の場合もある。天然及び非天然両方のアミノ酸が当該分野で既知であり、実施形態において、置換用アミノ酸として使用することができる。アミノ酸を置き換える方法は、当業者に周知であり、そのような方法として、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の突然変異が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中「１つまたは複数の」と言及する場合、個々の実施形態、例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上についての実施形態を包含することが意図される。
【００２３】
同じく提供されるのは、本明細書中記載される組み立てられたＥＰＯタンパク質である。１つの実施形態において、ＥＰＯタンパク質は、記載されるＡＡＶ構築物により産生される。１つの実施形態において、ＥＰＯタンパク質は、異種リーダーを、成熟ＥＰＯタンパク質と組み合わせて含む。１つの実施形態において、異種リーダーは、ＩＬ−２由来である。組み立てられたＥＰＯタンパク質は、診断アッセイをはじめとする多くの用途を有する。すなわち、１つの実施形態において、ＥＰＯタンパク質は、標識化される。本明細書中使用される場合、「標識」は、ＥＰＯタンパク質を標識化するのに有用な化学的または生化学的部分である。「標識」として、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、消光剤、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、阻害剤、放射性同位元素、磁性粒子、及び当該分野で既知の他の部分が挙げられる。「標識」または「レポーター分子」は、測定可能なシグナルを生成することができ、共有結合または非共有結合で、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド（例えば、非天然ヌクレオチド）またはリガンドと結合することができる。最も望ましくは、標識は、視覚的に、例えば比色測定で検出可能である。そのような標識は、当該分野で多数知られており、そのような標識として、制限なく、蛍光性の検出可能な蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、コリホスフィン−Ｏ（ＣＰＯ）、またはタンデム型色素、ＰＥ−シアニン−５（ＰＣ５）、及びＰＥ−テキサスレッド（ＥＣＤ）を挙げることができる。一般的に使用される蛍光色素として、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）が挙げられ、同じくタンデム型色素、ＰＥ−シアニン−５（ＰＣ５）、ＰＥ−シアニン−７（ＰＣ７）、ＰＥ−シアニン−５．５、ＰＥ−テキサスレッド（ＥＣＤ）、ローダミン、ＰｅｒＣＰ、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、及びアレクサダイが挙げられる。そのような標識の併用、例えば、とりわけ、テキサスレッドとローダミン、ＦＩＴＣ＋ＰＥ、ＦＩＴＣ＋ＰＥＣｙ５、及びＰＥ＋ＰＥＣｙ７は、アッセイ方法に応じて使用され得る。他の望ましい標識またはタグとして、タンパク質の基質上で物理的分離または固定を可能にするものが挙げられる。そのような標識として、ビオチンが挙げられる。他の適切な標識またはタグは、例えば、ＵＳ２０１１−０１７７９６７  Ａ１に記載されており、これは、本明細書中、参照により援用される。
【００２４】
別の実施形態において、ＥＰＯペプチドは、ＥＰＯ配列から最高約１０％の変異を含む可能性がある変異体を含む。すなわち、ＥＰＯペプチドは、本明細書中提供される及び／または当該分野で既知のＥＰＯ配列と、約９０％同一性〜約９９．９％同一性、約９５％〜約９９％同一性、または約９７％〜約９８％同一性を共有する。
【００２５】
本明細書中提供されるＥＰＯペプチドに加えて、これらのペプチドをコードする核酸配列が、提供される。１つの実施形態において、本明細書中記載されるＥＰＯペプチドをコードする核酸配列が、提供される。別の実施形態において、これには、配列番号３のイヌＥＰＯタンパク質または配列番号３と少なくとも９０％同一性を共有する配列をコードする任意の核酸配列が含まれる。別の実施形態において、これには、配列番号４のネコＥＰＯタンパク質または配列番号４と少なくとも９０％同一性を共有する配列をコードする任意の核酸配列が含まれる。
【００２６】
１つの実施形態において、イヌＥＰＯをコードする核酸配列は、配列番号５のものである。１つの実施形態において、ネコＥＰＯをコードする核酸配列は、配列番号６のものである。さらに別の実施形態において、ＥＰＯ核酸は、本明細書中記載されるまたは当該分野で既知のＥＰＯ配列から最高約１０％の変異を含む可能性がある変異体を含む。さらに別の実施形態において、ＥＰＯ核酸は、本明細書中記載されるまたは当該分野で既知のＥＰＯ配列から最高約２０％の変異を含む可能性がある変異体を含む。さらに別の実施形態において、ＥＰＯ核酸は、本明細書中記載されるまたは当該分野で既知のＥＰＯ配列から最高約３０％の変異を含む可能性がある変異体を含む。別の実施形態において、ＥＰＯ核酸は、本明細書中記載されるまたは当該分野で既知のＥＰＯ配列から最高約４０％の変異を含む可能性がある変異体を含む。
【００２７】
１つの実施形態において、ＥＰＯをコードする核酸配列は、記載された配列と少なくとも９０％同一性を共有する配列を含む、本明細書中記載されるＥＰＯペプチドのいずれかをコードする配列がコドン最適化されたものである。１つの実施形態において、核酸配列は、投与が望まれる対象における発現について、コドン最適化されている。１つの実施形態において、イヌＥＰＯをコードする核酸配列は、配列番号７のものである。１つの実施形態において、ネコＥＰＯをコードする核酸配列は、配列番号８のものである。
【００２８】
ＥＰＯペプチドの変異体が望ましい場合、これらペプチドのコード配列は、野生型核酸配列の部位特異的変異誘発を用いて生成させることができる。インターネット上のまたは市販されているコンピュータープログラム、ならびにサービス提供企業を利用して、ＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡの両方を含めて、アミノ酸配列から核酸コード配列への逆翻訳が可能である。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／；Ｇｅｎｅ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ−／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）；ＥｘＰａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照。１つの実施形態において、ＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡコード配列は、本明細書中説明されるとおり、最終的に投与が意図される対象種で最適に発現するように設計される。すなわち、１つの実施形態において、コード配列はネコで最適に発現するように設計される。別の実施形態において、コード配列は、イヌで最適に発現するように設計される。さらに別の実施形態において、コード配列は、霊長類で最適に発現するように設計される。
【００２９】
コード配列は、コドン最適化を用いて、最適に発現するように設計することができる。コドン最適化された翻訳領域は、様々な異なる方法で設計することができる。この最適化は、オンラインで入手可能な公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する企業による方法を用いて行うことができる。コドン最適化方法の１つは、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記載されており、これは本明細書中に参照により援用される。簡単に述べると、産物をコードする核酸配列を、同義コドン配列で修飾する。適切には、産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を修飾する。しかしながら、いくつかの実施形態において、ＯＲＦの断片のみを改変する場合がある。これらの方法の１つを用いることにより、いかなるポリペプチド配列にもその出現頻度を与える
ことができ、ポリペプチドをコードするコドン最適化された翻訳領域の核酸断片を製造することができる。
【００３０】
核酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、または「同一なパーセント」という用語は、対応について整列させた場合に同一である、２つの配列中の塩基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノム全長、遺伝子コード配列の全長、または少なくとも約１００〜１５０ヌクレオチドの断片、あるいは望み通りの長さにわたる場合がある。しかしながら、それより小さな断片、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０〜２４ヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２ヌクレオチド、少なくとも約３６以上のヌクレオチドの断片内での同一性が望ましい場合もある。複数の配列整列プログラムが、核酸配列についても入手可能である。そのようなプログラムの例として、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」、「ＣＡＰ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられ、これらは、インターネット上のウエブサーバーでアクセスできる。そのようなプログラムの他の提供元も、当業者に既知である。あるいは、ベクターＮＴＩユーティリティーも使用される。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに使用可能なアルゴリズムも同じく当該分野で複数知られており、上記のプログラムに含まれているものが挙げられる。別の例として、ポリヌクレオチド配列を、ＧＣＧバージョン６．１に含まれるプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、クエリ配列とサーチ配列の間で最もオーバーラップする領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、Ｆａｓｔａ（商標）をＧＣＧバージョン６．１で提供されるとおりのそのデフォルトパラメーター（語長６及びスコア計算マトリクス用のＮＯＰＡＭファクター）で用いて求めることができ、これは本明細書中参照により援用される。
【００３１】
アミノ酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、または「同一なパーセント」という用語は、対応について整列させた場合に同一である、２つの配列中の塩基の多さを示す。同一性パーセントは、タンパク質の全長、ポリペプチド、約７０アミノ酸〜約１００アミノ酸、またはそれらのペプチド断片もしくは対応する核酸配列コード配列にわたるアミノ酸配列について容易に決定することができる。適切なアミノ酸断片は、長さが少なくとも約８アミノ酸の場合があり、最長約１５０アミノ酸の場合がある。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」について言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列した」配列を参照して決定される。「整列した」配列または「整列」は、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を示し、これらは、参照配列と比較した場合に欠けているまたは追加されている塩基もしくはアミノ酸の補正を含むことが多い。整列は、公開されているまたは市販されている様々な複数配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。アミノ酸配列用の配列整列プログラムが入手可能であり、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」などのプログラムがある。一般に、これらのプログラムのどれでも、初期設定で使用されるが、当業者なら、それらの設定を必要に応じて変更できる。あるいは、当業者なら、上記のアルゴリズム及びプログラムが提供するものと少なくとも同レベルの同一性または整列を提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用できる。例えば、Ｊ．  Ｄ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，“Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照。
【００３２】
１つの実施形態において、本明細書中記載されるＥＰＯ構築物をコードする核酸配列は、操作されて、任意の適した遺伝要素、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ファージ、トランス
ポゾン、コスミド、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、エピソームなどに導入され、この遺伝要素は、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡを保有するナノ粒子、パッケージング宿主細胞に入ったウイルスベクターを生成するため、及び／または対象の宿主細胞に送達するために、それらが保有するＥＰＯ配列を宿主細胞へと移送する。１つの実施形態において、遺伝要素は、プラスミドである。選択された遺伝要素は、任意の適切な方法で送達することができ、そのような方法として、形質移入、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合法、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合が挙げられる。そのような構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作の当業者に既知であり、そのような方法として、遺伝子操作、組換え操作、及び合成技法が挙げられる。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照。
【００３３】
本明細書中使用される場合、「発現カセット」は、ＥＰＯペプチドのコード配列、プロモーターを含み、さらにそれらのための他の制御配列を含む場合がある核酸分子を示し、カセットは、操作されて遺伝要素に導入される、及び／またはウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）にパッケージングされる場合がある。典型的には、ウイルスベクターを生成するためのそのような発現カセットは、隣にウイルスゲノムのパッケージングシグナル及び他の発現制御配列、例えば本明細書中記載されるものなどを配置した本明細書中記載されるＥＰＯ構築物配列を、含む。発現制御配列はどれでも、当該分野で既知の技法を用いて特定種に合わせて最適化することができ、そのような技法として、例えば、本明細書中記載されるとおりのコドン最適化が挙げられる。
【００３４】
発現カセットは、典型的には、発現制御配列の一部分としてプロモーター配列を含む。１つの実施形態において、ＣＢ７プロモーターが使用される。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを持つトリβ−アクチンプロモーターである。あるいは、他の肝臓特異的プロモーターを使用することができる［例えば、Ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ，ａｌｐｈａ  １  ａｎｔｉ−ｔｒｙｐｓｉｎ（Ａ１ＡＴ）；  ｈｕｍａｎ  ａｌｂｕｍｉｎ  Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４  ３２（１９９７），ｈｕｍＡｌｂ；及びｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２  ９（１９９６）を参照］。ＴＴＲ微小エンハンサー／プロモーター、アルファ−抗トリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）２５（無イントロンｓｃＡＡＶを必要とする）。１つの実施形態において、肝臓特異的プロモーターのチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が使用される。他のプロモーター、例えば、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節型プロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照］、または生理学的合図に反応するプロモーターを、本明細書中記載されるベクターに使用することができる。
【００３５】
プロモーターの他にも、発現カセット及び／またはベクターは、他の適切な転写開始配列、終止配列、エンハンサー配列、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングシグナル及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；ＴＡＴＡ配列；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、Ｋｏｚａｋ共通配列）；イントロン；タンパク質安定性を向上させる配列；ならびに、望まれる場合に、コードされた産物の分泌を向上させる配列を含むことができる。発現カセットまたはベクターは、本明細書中記載される要素を全く含まないか、またはそれらのいずれか１つまたは複数を含むことができる。適切なポリＡ配列の例として、例えば、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、及びＴＫポリＡが挙げられる。適切なエンハンサーの例として、とりわけ、例
えば、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、アルファ胎児タンパク質エンハンサー、ＴＴＲ微小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／アルファ１−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が挙げられる。
【００３６】
１つの実施形態において、ウイルスベクターは、核酸発現カセットを含み、この核酸発現カセットは、５’ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、任意選択のエンハンサーを持つプロモーター、ＥＰＯ配列、ポリＡ配列、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲを含んでおり、この発現カセットは、宿主細胞で機能的ＥＰＯを発現する。
【００３７】
これらの制御配列は、ＥＰＯ構築物配列と「作動可能に連結されている」。本明細書中使用される場合、「作動可能に連結されている」という用語は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、及びトランスまたはある距離にあって目的の遺伝子を制御するように作用する発現制御配列の両方を示す。
【００３８】
発現カセットは、操作されて、ウイルスベクターの製造に使用されるプラスミド上に導入され得る。発現カセットをＡＡＶウイルス粒子にパッケージングするために必要な最小配列は、ＡＡＶの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲであり、これらは、カプシドと同一ＡＡＶ起源のものである場合もあるし、異なるＡＡＶ起源のものである場合もある（ＡＡＶ偽型を製造するため）。１つの実施形態において、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、またはその欠失型（ΔＩＴＲ）が、利便性から、及び規制当局の承認を早めるために使用される。しかしながら、他のＡＡＶ源由来のＩＴＲが選択される場合もある。ＩＴＲ源がＡＡＶ２であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ源由来である場合、得られるベクターは、偽型と呼ばれる。典型的には、ＡＡＶベクター用発現カセットは、ＡＡＶの５’ＩＴＲ、プロペプチド−ＥＰＯ活性ペプチドコード配列及び任意の制御配列、ならびにＡＡＶの３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらの要素の他の構成が適切な場合もある。ΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮型が報告されてきているが、これはＤ−配列及び末端分割部位（ｔｒｓ）が欠失されている。他の実施形態において、全長ＡＡＶ  ５’及び３’ＩＴＲが使用される。
【００３９】
例示のプラスミドを、配列表に提示する。配列番号１は、イヌＥＰＯ構築物をコードするプラスミドの配列を提示し、これはｐｎ１０４４．ＣＢ７．ｃａＥＰＯと名付けられている。１つの実施形態において、発現カセットは、操作されて配列番号１のプラスミドに導入されている。配列番号２は、ネコＥＰＯ構築物をコードするプラスミドの配列を提示し、これはｐｎ１０４４．ＣＢ７．ｆｅＥＰＯと名付けられている。１つの実施形態において、発現カセットは、操作されて配列番号２のプラスミドに導入されている。プラスミド、例えば配列番号１及び配列番号２に示されるものなどは、本明細書中記載される構成要素を１つまたは複数追加で含むように修飾される場合もあるし、必要に応じて構成要素を除去または交換する場合もある。１つの実施形態において、プラスミドは、配列番号１の配列またはそれと少なくとも８０％同一性を共有する配列を有する。別の実施形態において、プラスミドは、配列番号２の配列またはそれと少なくとも８０％同一性を共有する配列を有する。
【００４０】
「ｓｃ」という略号は、自己相補的であることを示す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が保有する翻訳領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている発現カセットを有する、プラスミドまたはベクターを示す。感染の際、第二鎖の細胞仲介型合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的半身が会合して、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになり、この単位は直ちに複製及び転写を行うことができる。例えば、Ｄ  Ｍ  ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，“Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎ
ｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２００１），Ｖｏｌ  ８，Ｎｕｍｂｅｒ
１６，Ｐａｇｅｓ  １２４８−１２５４を参照。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中に参照により援用される。
【００４１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターとは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ  ＤＮＡアーゼ耐性粒子であり、その中に標的細胞に送達するための核酸配列がパッケージングされている。ＡＡＶカプシドは、６０のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成されており、これらは選択したＡＡＶに応じて約１：１：１０〜１：１：２０の比で、２０面体対称に配列されている。ＡＡＶ血清型を、ＡＡＶウイルスベクター（ＤＮＡアーゼ耐性ウイルス粒子）のカプシド源として選択することができ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８、ｒｈ．１０、既知もしくは記載済みのＡＡＶまたはまだ発見されていないＡＡＶのいずれかの変異体が挙げられる。１つの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ８カプシドであるか、またはその変異体である。例えば、米国特許出願公開第２００７−００３６７６０−Ａ１号；米国特許出願公開第２００９−０１９７３３８−Ａ１号；ＥＰ１３１０５７１を参照。同じく、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１、及び米国特許第７，９０６，１１１号（ＡＡＶ９）、ならびにＷＯ２００６／１１０６８９、ならびにＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）を参照。あるいは、上記のＡＡＶのいずれかに基づく組換えＡＡＶが、ＡＡＶカプシド源として使用され得る。これらの文献は、ＡＡＶ生成用に選択され得る他のＡＡＶも記載しており、参照により援用される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターに使用するためのＡＡＶｃａｐは、上記ＡＡＶＣａｐのうち１つまたはそれをコードする核酸の変異誘発により（すなわち、挿入、削除、または置換により）生成させることができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、上記ＡＡＶカプシドタンパク質の２種、３種、４種、またはそれ以上に由来するドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、２種または３種の異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶ由来のＶｐ１、Ｖｐ２、及びＶｐ３単量体のモザイクである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、上記Ｃａｐを１種より多く含む。別の実施形態において、ＡＡＶカプシドは、上記のまたは既知のＡＡＶカプシド配列いずれかから最高約１０％の変異を含み得る変異体を含む。すなわち、ＡＡＶカプシドは、本明細書中提供される及び／または当該分野で既知のＡＡＶカプシドと、約９０％同一性〜約９９．９％同一性、約９５％〜約９９％同一性、または約９７％〜約９８％同一性を共有する。１つの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドと少なくとも９５％同一性を共有する。ＡＡＶカプシドの同一性を決定する場合、比較は、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のいずれかにわたり行われ得る。１つの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８ｖｐ３と少なくとも９５％同一性を共有する。別の実施形態において、自己���補的ＡＡＶが使用される。
【００４２】
発現カセットをビリオンに封入する場合、ＩＴＲは、同一構築物内で遺伝子としてシスで必要とされる唯一のＡＡＶ構成要素である。１つの実施形態において、ＡＡＶベクターを生成する目的で、複製（ｒｅｐ）及び／またはカプシド（ｃａｐ）用のコード配列を、ＡＡＶゲノムから取り出し、トランスでまたはパッケージング細胞株により供給する。例えば、上記のとおり、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶカプシド源とは異なる提供源由来のＩＴＲを含有し得る。これに加えてまたはこれとは別に、キメラＡＡＶカプシドが利用され得る。さらに他のＡＡＶ構成要素が選択され得る。そのようなＡＡＶ配列の提供源は、本明細書中記載されるものであり、教育関係、企業、または公的提供元（例えば、アメリカ培養細
胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から単離または得られる場合もある。あるいは、ＡＡＶ配列は、合成または他の適切な手段を通じて、公開されている配列、例えば文献またはデータベースなど（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）など）で入手可能なものを参照することにより得られる場合もある。
【００４３】
対象に送達するのに適したＡＡＶウイルスベクターを生成及び単離する方法は、当該分野で既知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、ＷＯ  ２００３／０４２３９７、ＷＯ  ２００５／０３３３２１、ＷＯ  ２００６／１１０６８９、及びＵＳ  ７５８８７７２  Ｂ２を参照］。１つの系において、プロデューサー細胞株を、ＩＴＲならびにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）が隣に配置された導入遺伝子をコードする構築物で一時的に形質移入する。第二の系では、ｒｅｐ及びｃａｐを安定供給するパッケージング細胞株を、ＩＴＲが隣に配置された導入遺伝子をコードする構築物で一時的に形質移入する。これらの系それぞれにおいて、ＡＡＶビリオンが、ｒＡＡＶを混入ウイルスから分離するのに必要なヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に反応して産生される。さらに最近、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスの感染を必要としない系が開発された。必要なヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、系により、トランスで供給される。これらのより新しい系では、ヘルパー機能は、必要なヘルパー機能をコードする構築物で細胞を一時的に形質移入することにより供給することができ、または細胞を、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含有しているように操作することができ、その遺伝子の発現は、転写レベルまたは転写後レベルで制御することができる。さらに別の系では、ＩＴＲ及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子が隣に配置された導入遺伝子を、バキュロウイルス系ベクターで感染させることにより、昆虫細胞に導入する。これらの製造系の総説については、全般的には、例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ
２０：９２２−９２９を参照、これらそれぞれの内容は、その全体が本明細書中に参照により援用される。これら及び他のＡＡＶ製造系の作製法及び使用法は、以下の米国特許にも記載されており、これらそれぞれの内容は、その全体が本明細書中に参照により援用される：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５。全般的には、例えば，Ｇｒｉｅｇｅｒ  ＆  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒ：  Ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９９：  １１９−１４５、Ｂｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ
ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  １０：７１７−７３３、及び以下に記載される参考文献を参照、これらは、それぞれが、その全体が本明細書中に参照により援用される。本発明のいずれかの実施形態を構築するのに使用される方法は、核酸操作の当業者に既知であり、そのような方法として、遺伝子操作、組換え操作、及び合成技法が挙げられる。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法も周知であり、適切な方法の選択は、本発明に制限をかけるものではない。例えば、Ｋ．  Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９
３）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照。
【００４４】
同じく提供されるのは、本明細書中記載されるウイルスベクター構築物を含む組成物である。本明細書中記載される医薬組成物は、それを必要とする対象に、任意の適切な経路でまたは異なる経路の組み合わせで送達されるように設計される。肝臓への直接送達（任意選択で、静脈内を介して、肝動脈を介して、または移植により）、経口、吸入、経鼻、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与経路。本明細書中記載されるウイルスベクターは、１つの組成物としてまたは複数の組成物として送達され得る。任意選択で、２種以上の異なるＡＡＶ、または複数のウイルスが、送達され得る［例えば、ＷＯ  ２０１１／１２６８０８及びＷＯ  ２０１３／０４９４９３を参照］。別の実施形態において、複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶ及びアデノウイルス）を含有し得る。
【００４５】
複製欠損ウイルスは、遺伝子導入及び遺伝子治療用途で使用するために、生理学的に許容される担体とともに配合することができる。ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量を、配合物または懸濁液に含まれる用量の尺度として使用することができる。当該分野で既知の任意の方法を用いて、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を求めることができる。ＡＡＶのＧＣ数測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を行う１つの方法は、以下の通りである。精製ＡＡＶベクター試料を、最初にＤＮＡアーゼで処理して、カプセル化されていないＡＡＶゲノムＤＮＡまたは混入プラスミドＤＮＡを、製造プロセスから排除する。次いで、ＤＮＡアーゼ耐性粒子を、熱処理に供して、ゲノムをカプシドから放出させる。次いで、放出されたゲノムを、リアルタイムＰＣＲで、ウイルスゲノムの特定領域（通常は、ポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを用いて、定量する。
【００４６】
同じく、複製欠損ウイルス組成物は、約１．０×１０9ＧＣ〜約１．０×１０15ＧＣ範囲の量である複製欠損ウイルスを含有するように、投薬単位に配合することができる。別の実施形態において、この量のウイルスゲノムは、分割した用量で送達される場合がある。１つの実施形態において、投与量は、約５ｋｇの平均的なネコまたは小型のイヌ対象について約１．０×１０10ＧＣ〜約１．０×１０12ＧＣである。１つの実施形態において、投与量は、約２０ｋｇの平均的な中型のイヌ対象について約１．０×１０11ＧＣ〜約１．０×１０13ＧＣである。平均的なイヌは、体重が約５〜約５０ｋｇの範囲にある。１つの実施形態において、投与量は、対象について約１．０×１０11ＧＣ〜１．０×１０13ＧＣである。別の実施形態において、用量は約３×１０12ＧＣである。例えば、ＡＡＶウイルスの用量は、約１×１０11ＧＣ、約５×１０11ＧＣ、約１×１０12ＧＣ、約５×１０12ＧＣ、または約１×１０13ＧＣの場合がある。１つの実施形態において、投与量は、約３×１０10ＧＣ／ｋｇである。別の例において、構築物は、１ｍＬあたり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの量で送達され得る。１つの実施形態において、構築物は、獣医学的対象について、１μＬ〜約１００ｍＬの体積で送達され得る。例えば、種々の獣医学的動物に対する物質の投与を良好に実施するための説明について、Ｄｉｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２１：１５−２３（２００１）を参照。この文献は、本明細書中参照により援用される。本明細書中使用される場合、「投与量」という用語は、治療課程にある対象に送達される合計投与量、または（複数回のうち）１回の投与で送達される量を示すことができる。
【００４７】
上記の組換えベクターは、公開された方法に従って、宿主細胞に送達することができる。ｒＡＡＶを、好ましくは生理学的に適合性のある担体、希釈剤、賦形剤、及び／またはアジュバントに懸濁させて、望まれる対象に投与することができ、そのような対象として、制限なく、ネコ、イヌ、または他の非ヒト哺乳類対象が挙げられる。適切な担体は、移
送ウイルスを仕向ける適応症を考慮して、当業が容易に選択することができる。例えば、適切な担体の１つとして、生理食塩水が挙げられ、これは、様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）とともに配合することができる。担体の他の例として、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。キャリアの選択は、本発明を制限するものではない。
【００４８】
任意選択で、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び／または変異体及び担体（複数可）に加えて、他の従来の医薬成分、例えば、保存料、または化学的安定剤を含むことができる。保存料の適切な例として、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学的安定剤として、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
【００４９】
本明細書中記載されるウイルスベクター及び他の構築物は、必要としている対象にＥＰＯ構築物を送達するための、及び／または対象の慢性腎臓疾患を治療するための医薬を製造するのに、使用することができる。したがって、別の態様において、慢性腎臓疾患の治療方法が提供される。本方法は、その必要がある対象に、本明細書中記載されるとおりの組成物を投与することを含む。１つの実施形態において、組成物は、本明細書中記載されるとおり、ＥＰＯ発現カセットを含むウイルスベクターを含む。１つの実施形態において、対象は、哺乳類である。別の実施形態において、対象は、ネコまたはイヌである。さらに別の態様において、貧血の治療方法が提供される。本方法は、その必要がある対象に、本明細書中記載されるとおりの組成物を投与することを含む。１つの実施形態において、組成物は、本明細書中記載されるとおり、ＥＰＯ発現カセットを含むウイルスベクターを含む。１つの実施形態において、対象は、哺乳類である。別の実施形態において、対象は、ネコまたはイヌである。
【００５０】
別の実施形態において、ネコの慢性腎臓疾患の治療方法が提供される。本方法は、ネコＥＰＯをコードする配列を含む核酸分子を含むＡＡＶウイルスベクターを投与することを含む。別の実施形態において、イヌの慢性腎臓疾患の治療方法が提供される。本方法は、イヌＥＰＯをコードする配列を含む核酸分子を含むＡＡＶウイルスベクターを投与することを含む。
【００５１】
治療課程は、任意選択で、同一ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ８ベクター）または異なるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ８及びＡＡＶｒｈ１０）の繰り返し投与を含むことができる。本明細書中記載されるウイルスベクターを用いてさらに他の組み合わせを選択することができる。任意選択で、本明細書中記載される組成物は、例えば、組換えＥＰＯをはじめとする他の薬物またはタンパク質系療法が関与するレジメンに組み合わせることができる。任意選択で、本明細書中記載される組成物は、食事及び運動レジメンをはじめとする生活様式の変更が関与するレジメンに組み合わせることができる。
【００５２】
なお、「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つまたは複数を示す。そのため、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、及び「少なくとも１つの」という用語は、本明細書中、同義で使用される。
【００５３】
「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」という語は、排他的ではなく包括的であることを意図するものである。「ｃｏｎｓｉｓｔ（からなる）」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ（からなっている）」という語、及びそれらの活用形は、排他的であり、包括的ではないことを意図するものである。明細書中、様々な実施形態が「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」という
表現を用いて提示されるが、他の状況下では、関連実施形態も、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ
ｏｆ（からなる）」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的にからなる）」という表現で解釈され、その表現で記載されることが意図される。
【００５４】
本明細書中使用される場合、「約」という用語は、特に記載がない限り、与えられた参照値から１０％の変動可能性を意味する。
【００５５】
「調節」という用語またはその変形語は、本明細書中使用される場合、組成物が持つ、生体経路の１つまたは複数の成分を阻害する能力を指す。
【００５６】
「対象」は、哺乳類、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、または非ヒト霊長類、例えば、サル、チンパンジー、ヒヒ、またはゴリラなどである。本明細書中使用される場合、「対象」という用語は、「患者」と同義で使用される。
【００５７】
本明細書中使用される場合、「疾患」、「障害」、及び「症状」は、同義で使用され、対象の異常な状態を示す。
【００５８】
本明細書中特に記載がない限り、本明細書中使用される技術用語及び学術用語は、当該分野の当業者が一般的に認識するもの及び公開された文書を参照することにより認識されるものと同じ意味を有し、公開された文書は、当業者に、本明細書中使用される用語の多くに対して一般的な案内を提供するものである。
【００５９】
以下の実施例は、例示にすぎず、本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【００６０】
実施例１−ＥＰＯベクターの構築
イヌ及びネコのエリスロポエチンのアミノ酸配列を、Ｇｅｎｂａｎｋから入手した。アミノ酸配列を逆翻訳してコドン最適化を行い、続いてｋｏｚａｃ共通配列、終止コドン、及びクローニング部位を付加した。配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより製造され、これを、ＣＭＶエンハンサーを持つトリ−ベータアクチンプロモーターを含む発現ベクター（ｐ１０４４）にクローン導入した。発現構築物は、隣にＡＡＶ２  ＩＴＲが配置される。イヌ及びネコ構築物を、三重形質移入によりＡＡＶ血清型８カプシドにパッケージングし、イオジキサノール勾配精製を行い、Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲにより力価測定した。
【００６１】
実施例２−ネコにおけるネコエリスロポエチンのＡＡＶ介在型発現
３匹のネコに、体重１キログラムあたり３×１０10ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）のネコエリスロポエチン発現ＡＡＶ８を単回筋肉内注射して処置した（図１）。注射時及びその後周期的に、ヘマトクリット測定用に血液試料を採取した。ベクター注射後４２日目に、治療的瀉血を開始した。これまで、結果は、ＥＰＯ発現の持続が、１００日超でも見られたことを示している。
【００６２】
実施例３−イヌにおけるイヌエリスロポエチンのＡＡＶ介在型発現
３匹のイヌに、３×１０10ＧＣ／ｋｇのイヌエリスロポエチン発現ＡＡＶ８を単回筋肉内注射して処置した。注射時及びその後周期的に、ヘマトクリット測定用に血液試料を採取した（図２）。未処置の同腹仔から採取した血液試料が、対照として含まれた。ベクター注射後６０日目に、治療的瀉血を開始した。
【００６３】
実施例４−ネコにおけるネコエリスロポエチンのＡＡＶ介在型発現の投与量試験
ネコに、体重１キログラムあたり最高で３×１０7、３×１０8、３×１０9、または３
×１０10ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）のネコエリスロポエチン発現ＡＡＶ８を単回筋肉内注射して処置した。これらの３つのコホートは、１つの投与量あたり４匹のネコからなるものであった。ネコは全頭、正常／野生型であり、無作為に選択された。この試験の目的は、長期間の安全性及び有効性を示して、飼い主がいる動物での試験のための臨床薬候補として可能性があることを強調することであった。図４。
【００６４】
実施例５−ネコにおけるネコエリスロポエチンのＡＡＶ介在型発現
ネコに、体重１キログラムあたり最高３×１０9ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）のネコエリスロポエチン発現ＡＡＶ８を、左または右四頭筋に最高４００μＬの合計体積で単回筋肉内注射して処置する。注射時及びその後周期的に、ヘマトクリット測定用に血液試料を採取する。最初のベクター投与から２８日またはそれより後に、同一基準を用いて、ベクターを再投与する可能性がある。
【００６５】
この試験は、ステージＩＩＩの慢性腎臓疾患と関連した貧血のネコを最高９匹含む。ＣＫＤ関連貧血は、少なくとも１ヶ月間があいた２つの時点でヘマトクリットが２９％未満であり、かつ別の明白な貧血の原因がない、と定義される。登録された対象は、ネコエリスロポエチン導入遺伝子を保有するアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ８．ｆＥｐｏ）の単回筋肉内注射を受ける。対象は、試験施設で、ベクター投与時、ならびに投与の２、４、６、及び８週後に、評価される。来訪時ごとに、血液を採取して、エリスロポエチン濃度、ヘマトクリット、網状赤血球数、平均赤血球容積、平均赤血球血色素量、及び平均赤血球血色素濃度を評価する。患者は、ヘマトクリット測定のため、試験薬物投与から３ヶ月、６ヶ月、及び１２ヶ月後に、試験施設に戻ってくるか、またはそれらの主治医である獣医師により経過観察を受ける。試験薬物は、前に、４匹の正常なネコで、最高３Ｅ８ゲノムコピー／ｋｇの用量で安全であることが明らかになっている。この治験に登録された最初の３匹の対象は、１Ｅ８ゲノムコピー／ｋｇ用量のＡＡＶ８．ｆＥｐｏを投与される。安全性及びベクター活性の最初の評価は、最初の３匹の対象が、ベクター投与後８週に到達してから行われる。３匹の動物からなるこの臨床コホートでの８週目での分析結果に応じて、３匹の動物からなる第二コホートの投薬を、以下のスキームを用いて進める：
１．最初のコホートで何か重篤な有害事象が生じた場合、またはどれか１匹でも動物がヘマトクリット５５％に達した場合、用量を３倍減少させ、この減少した用量で、３匹の追加動物を登録する。（合計で６匹の対象が試験に登録される）
２．有害事象がなく、かつ全てのネコがヘマトクリットの上昇を少なくとも５％示し、またはヘマトクリットの正常範囲に到達した場合、開始用量で３匹の追加動物を登録する。（合計で６匹の対象が試験に登録される）
３．有害事象がなく、かつ全てのネコがヘマトクリットの少なくとも５％の上昇を示さないまたは正常範囲に到達しない場合、３匹の追加ネコを、３倍多い用量の３Ｅ８ゲノムコピー／ｋｇで処置する。このコホートの３匹の動物全てが、ベクター投与後６週に到達した後、再度、安全性及び活性の暫定評価を行う。有害事象がなく、かつ全てのネコがヘマトクリットの上昇を少なくとも５％示し、またはヘマトクリットの正常範囲に到達した場合、この用量で、３匹の追加ネコを、処置する。有害事象がなく、かつ全てのネコがヘマトクリットの少なくとも５％の上昇を示さないまたは正常範囲に到達しない場合、３匹の追加ネコを、６Ｅ８ゲノムコピー／ｋｇの用量で処置する。（合計で９匹の対象が試験に登録される）。したがって、この試験は、安全性の暫定評価ならびにヘマトクリットの変化についての結果に応じて、少なくとも６匹かつ最大で９匹の対象を登録する。主要評価項目には、安全性及びベクター発現の評価が含まれる。
副次評価項目には、動物の生活の質及びベクターの長期間持続した発現が含まれる。
組み入れ基準：
ステージＩＩＩの腎不全であるネコ（血清クレアチニンが２．９５ｍｇ／ｄＬ）
少なくとも１ヶ月間があいた２つの時点でヘマトクリットが２９％
飼い主が、試験薬物投与後、２週目、４週目、６週目、及び８週目に、試験施設に再来訪
すること、ならびに試験薬物投与から３ヶ月、６ヶ月、及び１２ヶ月後に、試験施設、またはそれらの主治医である獣医師のところに戻ってくることに同意している。
除外基準：
予想される平均余命が３ヶ月未満
腎臓移植
過去に、組換えエリスロポエチンを用いた治療を受けている（エポエチン、ダルベポエチン）
試験責任医師の見解で、試験薬物の安全性及び活性の評価から除外すべきであるその他の症状がある
ＡＡＶ８に対する中和抗体が先在する
適格なネコを最初の来訪中にスクリーニングする。これには、全病歴ならびに臨床検査、ＣＢＣ／化学検査、及びＡＡＶ８に対する先在抗体の有無、ならびに同意文書の全面公開が含まれる。
研究プロトコルの条件に同意した全ての適格なネコは、試験参加が認められてから少なくとも１週間後に、最高３Ｅ９ゲノムコピー／ｋｇのＡＡＶ８．ｆＥＰＯの単回筋肉内注射を受ける。
ベクター投与後、ネコは、８週間の期間にわたり、１週間おきに、評価される。これらの臨床検査には、ＣＢＣ網状赤血球数／化学検査、全体臨床評価、及び血清採取が含まれる。８週間後、これらの臨床評価は、３ヶ月ごとになり、ベクター投与後９０日目から開始する。３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、及び１年後の評価が行われる。
合併症の可能性
６５％ヘマトクリットという赤血球増加症を示した動物はいずれも、３週間ごとに最高１０％の血液体積の治療的瀉血を受ける。
【００６６】
本明細書中、ならびに仮出願番号第６２／２１２，１４４号及び同第６２／３３６，２１１号に引用される全ての文献は、本明細書中、参照により援用される。同様に、本明細書中参照される配列番号及び添付の配列表で見られる配列番号は、参照により援用される。本発明を特定の実施形態を参照して説明してきたものの、当然のことながら、本発明の精神から逸脱することなく改変を行うことができる。そのような改変は、添付の請求項の範囲に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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