(57)【要約】本発明は、微小管阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤などの薬剤と、ＨＬＡ‐ＤＲまたはＴｒｏｐ‐２に対する抗体または免疫複合体との併用療法に関する。免疫複合体を使用する場合、それらにＳＮ‐３８またはプロ‐２ＰＤＯＸを組み込むのが好ましい。免疫複合体は、１ｍｇ／ｋｇ〜１８ｍｇ／ｋｇ、好ましくは４、６、８、９、１０、１２、１６または１８ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは８または１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与してもよい。併用療法は、固形腫瘍の大きさを縮小させ、転移を低減または除去し、また、放射線療法、化学療法または免疫療法などの標準的な療法に耐性を有する癌を治療するのに有効である。好ましくは、併用療法は、腫瘍増殖の阻害に対して相加的効果を有する。最も好ましくは、併用療法は、腫瘍増殖の阻害に対して相乗効果を有する。【選択図】図２Ａ
2018520140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する抗体または免疫複合体を、癌を有するヒト被験体に投与し；
ｂ）ＰＡＲＰ阻害剤、微小管阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの治療剤を被験体に投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項２】
前記抗体または免疫複合体と治療剤との併用が、腫瘍増殖の阻害において相乗効果を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が抗ＨＬＡ‐ＤＲ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がヒト化Ｌ２４３抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫複合体が、抗Ｔｒｏｐ‐２抗体に複合体化したＳＮ‐３８を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗Ｔｒｏｐ‐２抗体がｈＲＳ７である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＮ‐３８を、ＣＬ２Ａリンカーを介して抗Ｔｒｏｐ‐２抗体に複合体化する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫複合体が、ＳＮ‐３８、Ｐ２ＰＤｏｘ、オーリスタチン、カリチアマイシン、アントラサイクリン、カンプトテシン、タキサン、エポチロン、ＭＭＡＥ、パクリタキセル、バッカチンＩＩＩ、トポテカン、ドキソルビシン、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノ‐ドキソルビシン、２‐ピロリノドキシルビシン、エトポシド、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択される薬剤に複合体化した抗ＴＡＡ抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブ、タラゾパリブ（ＢＭＮ‐６７３）、ルカパリブ、ベリパリブ、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＢＧＢ‐２９０、ＡＢＴ‐８８８、ＡＧ０１４６９９、ＢＳＩ‐２０１、ＣＥＰ‐８９８３及び３‐アミノベンズアミドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＡＲＰ阻害剤がオラパリブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微小管阻害剤が、ビンカアルカロイド、タキサン、マイタンシノイド、オーリスタチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、メルタンシン、デメコルシン、ノコダゾール、エポチロン、ドセタキセル、ディスコデルモリド、コルヒチン、コンブレスタチン、ポドフィロトキシン、ＣＩ‐９８０、フェニラヒスチン、ステガナシン、クラシン、２‐メトキシエストラジオール、Ｅ７０１０、メトキシベンゼンスルホンアミド、ビノレルビン、ビンフルニン、ビンデシン、ドラスタチン、スポンジスタチン、リゾキシン、タシドチン、ハリコンドリン、ヘミアステリン、クリプトフィシン５２、ＭＭＡＥ及びエリブリンメシル酸塩からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記微小管阻害剤が、パクリタキセルまたはエリブリンメシル酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ブルトンキナーゼ阻害剤が、イブルチニブ（ＰＣＩ‐３２７６５）、ＰＣＩ‐４５２９２、ＣＣ‐２９２（ＡＶＬ‐２９２）、ＯＮＯ‐４０５９、ＧＤＣ‐０８３４、ＬＦＭ‐Ａ１３及びＲＮ４８６からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ブルトンキナーゼ阻害剤がイブルチニブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、イデラリシブ、ウォルトマニン、デメトキシビリジン、ペリホシン、ＰＸ‐８６６、ＩＰＩ‐１４５（デュベリシブ）、ＢＡＹ８０‐６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ１２０２、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＧＤＣ‐０９４１、ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００‐１１５、ＣＡＬ２６３、ＰＩ‐１０３、ＧＮＥ４７７、ＣＵＤＣ‐９０７、ＡＥＺＳ‐１３６及びＬＹ２９４００２からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がイデラリシブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が、Ｔｒｏｐ‐２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＨＬＡ‐ＤＲ、ＩＧＦ‐１Ｒ及び葉酸受容体からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、ｈＲＳ７、ｈＡ１９、ｈＡ２０、ｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＭＮ‐１４、ｈＬ２４３、ｈＰＡＭ４、ｈＩＭＭＵ３１、ｈＭｕ‐９、ｈＭＮ‐１５、ｈＭＮ‐３及びｈＲ１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＡＡが、炭酸脱水酵素ＩＸ、α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α‐アクチニン‐４、ＡＲＴ‐４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ‐１、ＣＡＳＰ‐８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ‐ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ‐４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ‐４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ‐１α、結腸特異抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ‐Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ‐１（Ｔｒｏｐ‐２）、ＥＧＰ‐２、ＥＬＦ２‐Ｍ、Ｅｐ‐ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ‐１、Ｆｌｔ‐３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ‐β、ＨＬＡ‐ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ‐１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ‐１）、ＨＳＰ７０‐２Ｍ、ＨＳＴ‐２、Ｉａ、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＦＮ‐γ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＦＮ‐λ、ＩＬ‐４Ｒ、ＩＬ‐６Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１５Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、ＩＬ‐１８Ｒ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２３、ＩＬ‐２５、インスリン様増殖因子‐１（ＩＧＦ‐１）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＫＳ１‐４、Ｌｅ‐Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ‐３、ＭＡＲＴ‐１、ＭＡＲＴ‐２、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１、ＴＲＡＧ‐３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣｌ６、ＭＵＭ‐１／２、ＭＵＭ‐３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓癌ムチン、ＰＤ‐１受容体、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ‐１Ｒ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン‐２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ‐７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ‐α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ‐Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン、ＷＴ‐１、１７‐１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ‐２、ｂｃｌ‐６、Ｋｒａｓ、癌遺伝子マーカーならびに腫瘍遺伝子産物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、アブシキシマブ（抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）、ラムブロリズマブ（抗ＰＤ‐１受容体）、アテゾリズマブ（抗ＰＤ‐Ｌ１）、ＭＥＤＩ４７３６（抗ＰＤ‐Ｌ１）、ニボルマブ（抗ＰＤ‐１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ‐４）、アバゴボマブ（抗ＣＡ‐１２５）、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アトリズマブ（抗ＩＬ‐６受容体）、ベンラリズマブ（抗ＣＤ１２５）、オビヌツズマブ（抗ＣＤ２０）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ‐７２）、ＡＢ‐ＰＧ１‐ＸＧ１‐０２６（抗ＰＳＭＡ）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、トシリズマブ（抗ＩＬ‐６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０）、ムロモナブ‐ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、オマリズマブ（抗ＩｇＥ）、ＣＤＰ５７１（抗ＴＮＦ‐α）、インフリキシマブ（抗ＴＮＦ‐α）、セルトリズマブペゴル、アダリムマブ、及びベンリスタからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＤＣによる治療前に少なくとも１つの他の療法で奏効しなかった前記患者に、前記免疫複合体を１ｍｇ／ｋｇ〜１８ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記用量が、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫複合体を、８〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が固形腫瘍であり、前記治療が、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％の腫瘍サイズの縮小をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が転移性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記腫瘍のサイズを縮小するか、または転移を除去することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌が他の療法に対して難治性であるが、ＡＤＣと治療薬の併用に対して奏効する、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が、前記免疫複合体による治療前にイリノテカンを用いた治療で奏効していない、請求項５に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２、Ｇ１ｍ３，１，２、ｎＧ１ｍ１、ｎＧ１ｍ１，２及びＫｍ３アロタイプからなる群から選択されるアロタイプを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体に、非複合体化抗体、放射能標識抗体、薬剤連結抗体、毒素連結抗体、遺伝子治療、化学療法、治療用ペプチド、サイトカイン療法、オリゴヌクレオチド、局所照射療法、手術及び干渉ＲＮＡ療法からなる群から選択される１つ以上の追加の治療法を施すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療法が、５‐フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ‐１０１、ＡＶＬ‐２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン‐１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０‐ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ‐２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）、ＳＮ‐３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、クリゾチニブ、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２‐ピロリノドキソルビシン（２Ｐ‐ＤＯＸ）、シアノ‐モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フラボピリドール、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３′，５′‐Ｏ‐ジオレオイル‐ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ‐ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ‐０８３４、ＧＳ‐１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ‐アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリドアミド、ロイコボリン、ＬＦＭ‐Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６‐メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソ尿素、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ‐３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ‐３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド及びＺＤ１８３９からなる群から選択される薬剤を用いた治療を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌が、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、骨髄性白血病、骨髄腫、結腸癌、胃癌、食道癌、甲状腺髄様癌、腎臓癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、肝臓癌、皮膚癌、骨癌、脳癌、直腸癌、及びメラノーマからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫が、緩慢性Ｂ細胞リンパ腫、進行性Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、毛状細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌が、三種陰性乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、尿路上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌及び転移性結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、２０１６年３月１４日に出願された米国特許出願第１５／０６９，２０８号の一部継続出願である。本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０１５年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／１８４，３３１号、２０１５年８月５日に出願された第６２／２０１，３６１号、２０１５年１１月４日に出願された第６２／２５０，７１５号、及び２０１５年１２月４日に出願された第６２／２６３，１３４号の利益を主張する。各優先権出願の全文は、参照として本明細書に援用する。
【０００２】
［配列リスト］
本願には、ＥＦＳ‐Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出し、その全体を参照として本明細書に援用する配列リストが含まれる。２０１６年６月２３日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、ファイル名がＩＭＭ３６５ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、ファイルサイズは６１，０３１バイトである。
【背景技術】
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、抗ＴＡＡ抗体または免疫複合体、例えばＨＬＡ‐ＤＲまたはＴｒｏｐ‐２に対する抗体または免疫複合体を１つ以上の薬剤と併用して治療的に使用することに関し、そこにおいて前記併用療法は、抗体単独、薬剤単独、または薬剤と抗体単独の併用効果よりも、より効果的である。好ましい実施形態では、前記併用は相乗効果を示す。他の好ましい実施形態では、使用する薬剤は、ＤＮＡ鎖切断を誘導するもの、例えば、オーリスタチン、コルチアマイシン、カンプトテシン（例えば、ＳＮ‐３８）または２‐ピロリノドキソルビシンのプロドラッグ形態（Ｐ２ＰＤｏｘ）などであってもよい。ＤＮＡ鎖切断を誘導する薬剤の例として、ＳＮ‐３８、Ｐ２ＰＤｏｘ、トポテカン、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、オキサリプラチン、またはカルボプラチンが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。別の実施形態では、併用療法に使用する薬剤は、微小管阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤またはホスホイノシチド３‐キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤のカテゴリーに属する。薬剤は、抗体とは別個にもしくは一緒に投与してもよく、または投与前に抗体に複合体化してもよい。後者の場合、細胞内での切断により治療効果を高めることが可能な結合を介して、抗体及び薬剤を連結してもよい。他の代替的な実施形態では、抗体を、異なる薬剤（ＳＮ‐３８など）と複合体化して免疫複合体を形成してもよく、免疫複合体は、微小管阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤と併用して投与してもよい。好ましくは、免疫複合体は、特定の投与量及び／または特定の投与スケジュールで投与してその治療効果を最適化してもよい。本明細書中に開示するヒト治療用の抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）の最適投与量及びスケジュールは、動物モデル研究からは予測不可能な予想外の優れた効力を示し、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）、パクリタキセルまたはＤＮＡ鎖切断を誘導する他の化合物をはじめとする標準的な抗癌治療に耐性を有する癌の有効な治療を可能にする。驚くべきことに、抗体‐ＳＮ３８免疫複合体と、微小管阻害剤またはＰＡＲＰ阻害剤との併用療法は、予想外の相乗効果を示す。特に好ましい実施形態では、使用するＳＮ‐３８複合抗体は、ＩＭＭＵ‐１３２（サシツズマブ・ゴビテカン、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８またはＩＭＭＵ‐１３２としても知られる）などの抗Ｔｒｏｐ‐２抗体である。より好ましくは、本方法は、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、転移性結腸直腸癌、ＳＣＬＣまたはＮＳＣＬＣ、ならびに他のＴｒｏｐ‐２発現癌の治療に使用する。他のＳＮ‐３８複合体、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＤ７４、ＨＬＡ‐ＤＲ、ＩＧＦ‐１Ｒ、葉酸受容体、及び以下に列挙する他のものなどの他の癌関連抗原を標的とする抗体などとの複合体もまた、類似のクラスの薬剤と併用した場合に、相乗的に有効であるか、または少なくとも用量制限毒性を増加させることなく相加的であり得る。別の好ましい実施形態では、使用する抗ＨＬＡ‐ＤＲ抗体は、ヒト化Ｌ２４３抗体（ｈＬ２４３）である。
【０００４】
［発明の背景］
長年にわたり、ヒト癌に対する毒性物質を特異的に送達するためにモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いることは、特異的標的薬物療法の分野における科学者の目標とされてきた。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び適切な毒性物質を標的とするＭＡｂ複合体が開発されているが、ヒトの癌治療において部分的に成功してはいるものの、感染性及び自己免疫疾患などの他の疾患への適用はほとんどなされていない。毒性物質は、最も一般的には化学療法薬であるが、特に癌の治療に対しては、粒子放出性放射性核種、または細菌性もしくは植物性毒素もまた、ＭＡｂに複合体化され（Ｓｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２００６  Ｊｕｌ‐Ａｕｇ；５６（４）：２２６‐２４３）、最近では、特定の感染性疾患の臨床前治療に対して放射性免疫複合体が用いられている（Ｄａｄａｃｈｏｖａ  ａｎｄ  Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｑ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００６；５０（３）：１９３‐２０４）。
【０００５】
ＭＡｂ‐化学療法薬複合体を使用する利点は、（ａ）化学療法薬自体が構造的に明確に定義されており；（ｂ）化学療法薬が、非常に明確な複合体化学を用いて、しばしばＭＡｂの抗原結合領域から離れた特定の部位で、ＭＡｂタンパク質を連結し；（ｃ）ＭＡｂ及び細菌性または植物性毒素を含む化学複合体よりも、より再現性良く、通常はより低い免疫原性でＭＡｂ‐化学療法薬複合体を作製することができ、商業的開発及び規制当局の承認をより受け入れやすく；ならびに（ｄ）ＭＡｂ‐化学療法薬複合体が、特に放射線感受性の骨髄に対して、放射性核種ＭＡｂ複合体に比べて全身的に桁単位で毒性が低いことである。
【０００６】
カンプトテシン（ＣＰＴ）及びその誘導体は、強力な抗腫瘍剤のクラスである。イリノテカン（ＣＰＴ‐１１とも呼ばれる）及びトポテカンは、ＣＰＴ類似体であって、これらは認可されている癌治療薬である（Ｉｙｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｔａｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．４２：Ｓ３１‐Ｓ４３（１９９８））。ＣＰＴは、トポイソメラーゼＩ‐ＤＮＡ複合体を安定化させ、トポイソメラーゼＩ酵素を阻害することによって作用する（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ：Ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｌｉｅｈｒ  Ｊ．Ｇ．，Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ，Ｂ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｖｅｒｓｃｈｒａｅｇｅｎ（ｅｄｓ），ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，ＮＹ  ９２２：１‐１０（２０００））。ＣＰＴは複合体の調製における特定の問題を提示している。一つの問題は、ほとんどのＣＰＴ誘導体が水性緩衝液中で不溶性であるという点である。第二に、ＣＰＴは、巨大分子への複合体化のための構造改変において特定の課題を有する。例えば、ＣＰＴ自体は、Ｅ環中に第三級ヒドロキシル基のみを含有する。ＣＰＴの場合、そのヒドロキシル官能基は、その後のタンパク質複合体化に適したリンカーにカップリングする必要があり；強力なＣＰＴ誘導体、例えば化学療法剤ＣＰＴ‐１１の活性代謝物であるＳＮ‐３８、ならびにトポテカン及び１０‐ヒドロキシ‐ＣＰＴなどの他のＣ‐１０‐ヒドロキシル含有誘導体などにおいては、Ｃ‐１０位置におけるフェノール性ヒドロキシル基の存在は、必要なＣ‐２０‐ヒドロキシル誘導体化を複雑化させる。第三に、カンプトテシンのＥ‐環のδ‐ラクトン部分の生理学的条件下での不安定性は、抗腫瘍力価を大きく低下させる。したがって、複合体化プロトコールをｐＨ７以下で実施してラクトン開環を避けるようにする。しかしながら、活性エステルなどのアミン反応性基を有する二官能性ＣＰＴの複合体化には、通常、８以上のｐＨが必要である。第四に、細胞内において切断可能となる部分は、ＣＰＴと抗体または他の結合部分とを接続するリンカー／スペーサーに含まれるのが好ましい。
【０００７】
抗体‐ＳＮ‐３８複合体などの抗体‐薬剤複合体の、より効果的な調製及び投与方法、ならびに抗体または免疫複合体と、微小管阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤などの薬剤との、より効果的な併用療法が必要である。
【０００８】
［発明の概要］
好ましい実施形態では、本発明は、抗ＨＬＡ‐ＤＲもしくは抗Ｔｒｏｐ‐２抗体、またはその免疫複合体と、微小管阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤、またはホスホイノシチド３‐キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤からなる群から選択される薬剤とを併用して用いる併用療法に関する。より好ましくは、併用療法は、抗体もしくは免疫複合体単独、薬剤単独、または抗体もしくは免疫複合体と薬剤の効果の合計よりも効果的である。最も好ましくは、この併用は、ヒト被験体における癌などの疾患の治療に対して相乗効果を示す。免疫複合体の使用を含む実施形態では、抗体を、好ましくは、ＳＮ‐３８などのＣＰＴ部分、またはプロ‐２ＰＤＯＸなどのアントラサイクリンに複合体化させる。
【０００９】
本明細書中で使用する略語「ＣＰＴ」は、特に明記しない限り、カンプトテシンまたはその誘導体、例えばＳＮ‐３８などのいずれかを指し得る。本発明は、ＣＰＴ‐抗体免疫複合体を調製及び投与するための改善された方法及び組成物を提供する。好ましくは、カンプトテシンはＳＮ‐３８である。開示する方法及び組成物は、他の治療法に対して不応性または低反応性であるとともに、選択的標的化のための適切な抗体または抗原結合抗体断片を開発し得るか、または入手可能であるか、もしくはそれらが公知である疾患を含み得る様々な疾患及び病態の治療に用いられる。本発明の抗体または免疫複合体で治療し得る好ましい疾患または病態として、例えば、癌または自己免疫疾患が挙げられる。最も好ましくは、免疫複合体を、癌、特に標準的な癌療法を用いた前治療に不応性であることが確かめられている癌の治療に用いる。
【００１０】
好ましくは、標的化部分は、抗体、抗体断片、二重特異性もしくは他の多価抗体、または他の抗体に基づく分子または化合物である。抗体は、様々なアイソタイプ、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり、より好ましくはヒトＩｇＧ１ヒンジ及び定常領域配列を含み得る。抗体またはその断片は、キメラヒト‐マウス、キメラヒト‐霊長類、ヒト化（ヒトフレームワーク及びマウス超可変領域（ＣＤＲ）領域）、または完全ヒト抗体、ならびにその改変体、例えばｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているような半ＩｇＧ４抗体（「ユニボディ」と呼ばれる）であり得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７：１５５４‐１５５７）。より好ましくは、抗体またはその断片は、特定のアロタイプに属するヒト定常領域配列を含むように設計または選択してもよく、抗体または免疫複合体をヒト被験体に投与する場合、免疫原性が低下し得る。投与のための好ましいアロタイプとして、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２またはＧ１ｍ３，１，２などの非Ｇ１ｍ１アロタイプ（ｎＧ１ｍ１）が挙げられる。より好ましくは、アロタイプは、ｎＧ１ｍ１、Ｇｌｍ３、ｎＧｌｍｌ，２及びＫｍ３アロタイプからなる群から選択される。
【００１１】
使用する抗体は、当該分野で公知の任意の疾患関連抗原に結合し得る。疾患状態が癌である場合、例えば、非限定的に、炭酸脱水酵素ＩＸ、α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α‐アクチニン‐４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ‐４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ‐１、ＣＡＳＰ‐８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤｌａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ‐ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ‐４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ‐４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ‐１α、結腸特異抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ‐Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ‐１（Ｔｒｏｐ‐２）、ＥＧＰ‐２、ＥＬＦ２‐Ｍ、Ｅｐ‐ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ‐１、Ｆｌｔ‐３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ‐β、ＨＬＡ‐ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ‐１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ‐１）、ＨＳＰ７０‐２Ｍ、ＨＳＴ‐２、Ｉａ、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＦＮ‐γ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＦＮ‐λ、ＩＬ‐４Ｒ、ＩＬ‐６Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１５Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、ＩＬ‐１８Ｒ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２３、ＩＬ‐２５、インスリン様増殖因子‐１（ＩＧＦ‐１）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＫＳ１‐４、Ｌｅ‐Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ‐３、ＭＡＲＴ‐１、ＭＡＲＴ‐２、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１、ＴＲＡＧ‐３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣｌ６、ＭＵＭ‐１／２、ＭＵＭ‐３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓癌ムチン、ＰＤ‐１受容体、ＰＤ‐Ｌ１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ‐１Ｒ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン‐２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ‐７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ‐α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ‐Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン、ＷＴ‐１、１７‐１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ‐２、ｂｃｌ‐６、Ｋｒａｓ、癌遺伝子マーカー及び腫瘍遺伝子産物（例えばＳｅｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ��，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６，１２：５０２３‐３２；Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，１７８：１９７５‐７９；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００５，５４：１８７‐２０７参照）。好ましくは、抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＥＧＰ‐１（Ｔｒｏｐ‐２）、ＭＵＣ‐１６、ＡＦＰ、ＭＵＣ５ａ，ｃ、ＣＤ７４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＨＬＡ‐ＤＲに結合する。より好ましくは、抗体はＴｒｏｐ‐２またはＨＬＡ‐ＤＲに結合する。
【００１２】
利用し得る例示的な抗体として、ｈＲ１（抗ＩＧＦ‐１Ｒ、米国特許出願第１３／６８８，８１２号、１１／２９／１２出願）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，１５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第５，７８９，５５４号、ｈＭｕ‐９（抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７２号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ‐ＤＲ、米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ‐１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ‐１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第８，２８７，８６５号）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ‐１、米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ‐３（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，５４１，４４０号）、Ａｂ１２４及びＡｂ１２５（抗ＣＸＣＲ４、米国特許第７，１３８，４９６号）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではなく、引用する各特許または出願の実施例セクションは、参照として本明細書に援用する。より好ましくは、抗体は、ＩＭＭＵ‐３１（抗ＡＦＰ）、ｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ‐２）、ｈＭＮ‐１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ‐３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＭＮ‐１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＬ２４３またはＩＭＭＵ‐１１４（抗ＨＬＡ‐ＤＲ）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）またはｈＡ２０（抗ＣＤ２０）である。本明細書中で使用する場合、用語エパラツマブとｈＬＬ２は同じ意味で用い、ベルツズマブとｈＡ２０、ｈＬ２４３ｇ４Ｐ、ｈＬ２４３γ４Ｐ及びＩＭＭＵ‐１１４もまた同様に同じ意味で用いる。最も好ましい実施形態では、抗体はｈＲＳ７などの抗Ｔｒｏｐ−２抗体、またはｈＬ２４３などの抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体である。
【００１３】
使用する別の抗体として、アブシキシマブ（抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）、ランブロリズマブ（抗ＰＤ‐１受容体）、アテゾリズマブ（抗ＰＤ‐Ｌ１）、ＭＥＤＩ４７３６（抗ＰＤ‐Ｌ１）、ニボルマブ（抗ＰＤ‐１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ‐４）、アバゴボマブ（抗ＣＡ‐１２５）、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アツリズマブ（抗ＩＬ‐６受容体）、ベンラリズマブ（抗ＣＤ１２５）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ‐７２）、ＡＢ‐ＰＧ１‐ＸＧ１‐０２６（抗ＰＳＭＡ、米国特許出願１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ‐４４０５及びＰＴＡ‐４４０６として寄託）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ、ＷＯ２００９／１３０５７５）、トシリズマブ（抗ＩＬ‐６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０；Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｒｏｃｈｅ）、ムロモナブ‐ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、オマリズマブ（抗ＩｇＥ）；抗ＴＮＦ‐α抗体、例えばＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：８８１‐８５）、ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ、Ｍ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、イリノイ）、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、モルバーン、ペンシルバニア）、セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ、ブリュッセル、ベルギー）、抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ、ブリュッセル、ベルギー）、アダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ、アボットパーク、イリノイ）、ベンリスタ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ａｌｚ５０（Ｋｓｉｅｚａｋ‐Ｒｅｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：７９４３‐４７）、ガンテネルマブ、ソラネズマブ及びインフリキシマブなどのアルツハイマー病の治療用抗体；５９Ｄ８、Ｔ２Ｇ１ｓ、ＭＨ１などの抗フィブリン抗体；ＭＯＲ０３０８７（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＡＧ）、ＭＯＲ２０２（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＨｕＭａｘ‐ＣＤ３８（Ｇｅｎｍａｂ）またはデラツムマブ（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）などの抗ＣＤ３８抗体；（Ｐ４／Ｄ１０（米国特許８，３３３，９７１）、Ａｂ７５、Ａｂ７６、Ａｂ７７（Ｐａｕｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５８：１７８１‐９０）などの抗ＨＩＶ抗体）、ならびにＰｏｌｙｍｕｎ（Ｖｉｅｎｎａ，オーストリア）に記載され、販売されるとともに、米国特許５，８３１，０３４、米国特許５，９１１，９８９、及びＶｃｅｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  ２００７；２１（１６）：２１６１‐２１７０ならびにＪｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３‐９に記載される抗ＨＩＶ抗体が挙げられるが、必ずしもこ��らに限定するものではなく、これらのすべてを参照として本明細書に援用する。
【００１４】
好ましい実施形態では、本発明の抗体に複合体化した薬剤部分は、カンプトテシン（ＣＰＴ）ならびにその類似体及び誘導体から選択され、より好ましくはＳＮ‐３８である。しかしながら、タキサン（例えば、バッカチンＩＩＩ、タキソール）、オーリスタチン（例えばＭＭＡＥ）、カリチアマイシン、エポチロン、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン（モルホリノ‐ＤＯＸ）、シアノモルホリノ‐ドキソルビシン（シアノモルホリノ‐ＤＯＸ）、２‐ピロリノドキソルビシン（２‐ＰＤＯＸ）、２‐ＰＤＯＸのプロドラッグ形態（プロ‐２‐ＰＤＯＸ）、トポテカン、エトポシド、シスプラチン、オキサリプラチンまたはカルボプラチン；例えば、Ｐｒｉｅｂｅ  Ｗ（ｅｄ．），ＡＣＳ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｓｅｒｉｅｓ  ５７４，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９９５（３３２ｐｐ）  ａｎｄ  Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：２４６４‐２４６９，１９９６）参照。あるいは、薬剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ‐３２７６５）、ＰＣＩ‐４５２９２、ＣＣ‐２９２（ＡＶＬ‐２９２）、ＯＮＯ‐４０５９、ＧＤＣ‐０８３４、ＬＦＭ‐Ａ１３もしくはＲＮ４８６などのブルトンキナーゼ阻害剤、またはイデラリシブ、ウォルトマニン、デメトキシビリジン、ペリホシン、ＰＸ‐８６６、ＩＰＩ‐１４５（デュベリシブ）、ＢＡＹ８０‐６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ１２０２、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＧＤＣ‐０９４１、ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００‐１１５、ＣＡＬ２６３、ＰＩ‐１０３、ＧＮＥ４７７、ＣＵＤＣ‐９０７、ＡＥＺＳ‐１３６もしくはＬＹ２９４００２などのＰＩ３Ｋ阻害剤である。好ましくは、抗体またはその断片は、少なくとも１つの化学療法部分に結合し；好ましくは１〜約５個の薬剤部分；より好ましくは６〜８個の薬剤部分、最も好ましくは約６〜１２個の薬剤部分を含む。
【００１５】
水溶性ＣＰＴ誘導体の一例は、ＣＰＴ‐１１である。ＣＰＴ‐１１の薬理学及びその活性ＳＮ‐３８へのｉｎ  ｖｉｖｏ変換に関する広範な臨床データが利用可能である（Ｉｙｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｔａｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：Ｓ３１‐４３（１９９８）；Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７：２１８２‐２１９４（２００２）；Ｒｉｖｏｒｙ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９２２：２０５‐２１５，２０００）。活性型ＳＮ‐３８は、ＣＰＴ‐１１より約２〜３桁強力である。特定の実施形態では、免疫複合体は、ｈＭＮ‐１４‐ＳＮ‐３８、ｈＭＮ‐３‐ＳＮ‐３８、ｈＭＮ‐１５‐ＳＮ‐３８、ＩＭＭＵ‐３１‐ＳＮ‐３８、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８、ｈＡ２０‐ＳＮ‐３８、ｈＬ２４３‐ＳＮ‐３８、ｈＬＬ１‐ＳＮ‐３８またはｈＬＬ２‐ＳＮ‐３８複合体であってもよい。
【００１６】
様々な実施形態は、本発明の方法及び組成物を用いて、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性及び慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ腫及び白血病、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、癌腫、メラノーマ、肉腫、神経膠腫、骨癌及び皮膚癌を含むが必ずしもこれらに限定されない癌を治療することに関し得る。癌腫は、口腔、食道、消化管、肺動脈、肺、胃、結腸、直腸、乳、卵巣、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頸部、膀胱、膵臓、骨、脳、結合組織、甲状腺、肝、胆嚢、膀胱（尿路上皮）、腎臓、皮膚、中枢神経系及び精巣の癌腫を含み得る。
【００１７】
癌の治療を含む特定の実施形態において、抗体または免疫複合体を、手術、放射線療法、化学療法、チェックポイント阻害抗体などの裸の抗体による免疫療法、放射免疫療法、免疫調節薬、ワクチンなどと組み合わせて使用してもよい。最も好ましくは、抗体または免疫複合体を、ＰＡＲＰ阻害剤、微小管阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤及び／またはＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせて使用する。これらの併用療法は、そのような組合せにおいて各治療剤の投与量を少なくすることができ、したがってある種の重度の副作用を低減し、潜在的に必要な治療の経過を低減する可能性がある。重複毒性がないかまたは最小である場合、それぞれの全用量を与えることもできる。
【００１８】
免疫複合体の好ましい最適投与として、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは４〜１６ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは８〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量が挙げられ、好ましくは毎週、週に２回、１週間おきに、または３週間ごとに投与してもよい。最適な投薬計画として、２週間連続の治療の後、１、２、３もしくは４週間の休止、または週ごとに治療と休止を交互に行うか、または１週間の治療の後、２、３もしくは４週間の休止、３週間の治療の後の１、２、３もしくは４週間の休止、または４週間の治療の後の１、２、３もしくは４週間の休止、または５週間の治療の後の１、２、３もしくは４週間の休止のような治療サイクル、または２週間に１回、３週間に１回もしくは１か月に１回の投与が挙げられ得る。治療は、任意のサイクル数、好ましくは少なくとも２回、少なくとも４回、少なくとも６回、少なくとも８回、少なくとも１０回、少なくとも１２回、少なくとも１４回、または少なくとも１６回にわたって延長してもよい。用いる用量の例として、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇが挙げられ得る。当業者であれば、免疫複合体の最適な用量を選択する際に、年齢、全身健康状態、特定の臓器機能または体重、及び特定の器官系（例えば骨髄）に対する前治療の効果を考慮してもよいこと、ならびに治療の最中に用量及び／または頻度を増減させてもよいことを認識するであろう。必要に応じて投与を繰り返してもよく、わずか４〜８回の投与後には腫瘍の収縮の証拠が観察される。本明細書中に開示する最適投与量及びスケジュールは、ヒト被験体内で予想外の優れた有効性及び低毒性を示すが、このことは動物モデル研究からは予測し得なかったことである。驚くべきことに、この優れた有効性ゆえに、ＳＮ‐３８のｉｎ  ｖｉｖｏでの由来元の親化合物ＣＰＴ‐１１を含む１種以上の標準的な抗癌療法に耐性であることが以前に見出された腫瘍を、治療することが可能である。
【００１９】
本発明の方法は、ＣＴ及び／またはＰＥＴ／ＣＴ、またはＭＲＩを使用して、一定の間隔で腫瘍反応を測定することを含み得る。ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＡ１９‐９、ＡＦＰ、ＣＡ１５．３、またはＰＳＡなどの腫瘍マーカーの血中レベルも、モニタリングし得る。用量及び／または投与スケジュールは、画像化及び／またはマーカー血中レベルの結果に従って、必要に応じて調整してもよい。
【００２０】
本発明の組成物及び方法の驚くべき結果は、高用量の抗体‐薬剤複合体を患者に与える際の予想外の忍容性であって、たとえ繰り返し投与する場合であっても、比較的悪性度の低い吐き気及び嘔吐の観察を伴うか、または処置可能な範囲の好中球減少症を伴う程度で済む。好ましくは、貧血、下痢、吐き気、嘔吐または好中球減少症などの悪性度３以上の副作用の発生率は、治療集団の２６％以下にとどまる。より好ましくは、悪性度３以上の下痢及び好中球減少の発生率は、治療集団の２６％以下で生じる。さらなる驚くべき結果は、アルブミン、ＰＥＧまたは他の担体にＳＮ‐３８を複合体化した他の生成物とは異なり、非標的組織か、またはＭＡｂが到達不可能な標的組織への抗体‐薬剤複合体の蓄積が起こらないことである。この蓄積の欠如が、忍容性の向上、及び投与の繰り返しまたは増加の後でも重篤な毒性が生じない結果に関連している。これらの驚くべき結果により、用量及び送達スケジュールを最適化して、予想外に高い有効性及び低い毒性；すなわち、ＳＮ‐３８の親薬剤であるイリノテカンを単独で、または他の薬剤と組み合わせて投与する場合よりも高い治療指数を得ることが可能になる。これは、ＦＤＡの要求により、イリノテカン治療に起因して早期及び後期において重度の下痢が伴うことを記載する、イリノテカンの製品ラベル上のブラックボックス警告によって強調されている。ＳＮ‐３８を含有するＡＤＣにおいては、これと同程度及び頻度で経験することはない。発熱性好中球減少症でさえ、本明細書に記載のＳＮ‐３８‐ＡＤＣでは、イリノテカン療法に比べて、はるかに低い程度及び頻度である。
【００２１】
特許請求の範囲に記載の方法は、以前は耐性であった癌を有する個体内で、固形腫瘍のサイズ（ＲＥＣＩＳＴまたはＲＥＣＩＳＴ１．１による標的病変の最長直径の合計によって測定する）を、１５％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上収縮させる。当業者であれば、全腫瘍体積、任意の次元の最大腫瘍サイズ、またはいくつかの次元のサイズ測定値の組合せなど、腫瘍の大きさを様々な異なる技術によって測定してもよいことを理解するであろう。これは、コンピュータ断層撮影法、磁気共鳴画像法、超音波検査法、及び／または陽電子放出断層撮影法などの標準的な放射線手順を用いて行ってもよい。抗体または免疫複合体処理で腫瘍サイズを縮小させ、好ましくは腫瘍の排除をもたらす傾向を観察することに比べれば、サイズの測定手段はそれほど重要ではない。しかしながら、ＲＥＣＩＳＴガイドラインに従うためには、ＣＴまたはＭＲＩを連続して行うことが好ましく、繰り返し行って測定値を確認する必要がある。
【００２２】
抗体または免疫複合体は、周期的なボーラス注射として投与してもよいが、別の実施形態では、抗体または免疫複合体を、連続注入によって投与してもよい。Ｃｍａｘを上昇させ、血中の抗体または免疫複合体のＰＫを向上させるために、例えば留置カテーテルによって連続注入で投与してもよい。このような器具は、ＨＩＣＫＭＡＮ（登録商標）、ＢＲＯＶＩＡＣ（登録商標）またはＰＯＲＴ‐Ａ‐ＣＡＴＨ（登録商標）カテーテル（例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔ  ３２：７４１‐４８，２０１０参照）として公知であり、そのような公知のカテーテルのいずれを使用してもよい。様々な連続注入ポンプも当該技術分野において公知であり、そのような公知の注入ポンプのいずれを使用してもよい。連続注入のための投薬量範囲は、１日あたり０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇであってもよい。より好ましくは、これらの免疫複合体を、静脈内注入によって、２〜５時間、より好ましくは２〜３時間の比較的短い期間にわたって投与することができる。
【００２３】
特に好ましい実施形態では、抗体または免疫複合体及び投薬スケジュールは、標準的療法に耐性がある患者において有効である場合がある。例えば、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８免疫複合体を、ＳＮ‐３８の親薬剤であるイリノテカンによる前治療で奏効しない患者に対して投与してもよい。驚くべきことに、イリノテカン耐性患者が、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８に対する部分または完全奏効を示す場合がある。腫瘍組織を特異的に標的化する免疫複合体の能力により、治療剤の標的化及び送達を向上させることで、腫瘍の耐性を克服する可能性がある。特に好ましい被験体は、Ｔｒｏｐ２陽性の、乳、卵巣、子宮頸部、子宮内膜、肺、前立腺、結腸、直腸、胃、食道、膀胱（尿路上皮）、腎臓、膵臓、脳、甲状腺、上皮または頭頸部癌を有する患者であってもよい。好ましくは、癌は転移性癌である。より好ましくは、患者は、少なくとも１つの標準的な抗癌療法での前治療に失敗している。最も好ましくは、患者は、ＳＮ‐３８の親化合物であるイリノテカン（ＣＰＴ‐１１）による治療に以前に失敗している。代替の好ましい実施形態では、癌はＴＮＢＣ、非ＴＮＢＣ、子宮内膜、肺または卵巣癌である。
【００２４】
特定の好ましい実施形態では、抗体または免疫複合体（例えば、サシツズマブ・ゴビテカン）を、少なくとも１つの微小管阻害剤との併用療法に用いてもよい。ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル）、マイタンシノイド（例えば、メルタンシン）及びオーリスタチンなどの多数の微小管阻害剤が当該分野で公知である。他の公知の微小管阻害剤として、デメコルチン、ノコダゾール、エポチロン、ドセタキセル、ディスコデルモリド、コルヒチン、コンブレスタチン、ポドフィロトキシン、ＣＩ‐９８０、フェニラヒスチン、ステガナシン、クラシン、２‐メトキシエストラジオール、Ｅ７０１０、メトキシベンゼンスルホンアミド、ビノレルビン、ビンフルニン、ビンデシン、ドラスタチン、スポンジスタチン、リゾキシン、タシドチン、ハリコンドリン、ヘミアステリン、クリプトフィシン５２、ＭＭＡＥ及びエリブリンメシル酸塩（例えば、Ｄｕｍｏｎｔｅｔ＆Ｊｏｒｄａｎ，２０１０，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ９：７９０‐８０３参照）。そのような公知の微小管阻害剤のいずれかを、抗体または抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）と組み合わせて使用してもよい。好ましくは、微小管阻害剤は、抗体またはＡＤＣと組み合わせて使用する場合に、相乗効果を示すものである。１つの有力な例は、多くの固形癌が発現するサシツズマブ・ゴビテカンまたはラベツズマブ・ゴビテカン（ＣＥＡＣＡＭ５を標的とする）などのＳＮ‐３８結合抗体である。最も好ましくは、微小管阻害剤は、パクリタキセルまたはエリブリンメシル酸塩である。
【００２５】
他の好ましい実施形態では、抗体またはＡＤＣを、少なくとも１つのＰＡＲＰ阻害剤との併用療法に用いてもよい。そのようなＡＤＣの１つは、サシチズマブ・ゴビテカンまたはラベツズマブ・ゴビテカンのような腫瘍標的化抗体に複合体化したＳＮ‐３８からなる。多くのＰＡＲＰ阻害剤、例えば、オラパリブ、タラゾパリブ（ＢＭＮ‐６７３）、ルカパリブ、ベリパリブ、ニラパリブ、イニパリブ、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＢＧＢ‐２９０、ＡＢＴ‐８８８、ＡＧ０１４６９９、ＢＳＩ‐２０１、ＣＥＰ‐８９８３及び３‐アミノベンズアミド（例えば、Ｒｏｕｌｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １０：２９３‐３０１，Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２２，２０１５］参照）。このような公知のＰＡＲＰ阻害剤のいずれかは、抗体またはＡＤＣ、例えばＳＮ‐３８‐抗体複合体またはＰ２ＰＤｏｘ‐抗体複合体などと併用してもよい。好ましくは、ＰＡＲＰ阻害剤は、抗体またはＡＤＣと併用する場合に相乗効果を示すものである。これは、例えば、サシチズマブ・ゴビテカンなどのＳＮ‐３８結合抗体を使用する場合に有効である。最も好ましくは、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブまたはルカパリブである。
【００２６】
さらに他の実施形態では、抗体または免疫複合体を、ブルトンキナーゼ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤と併用してもよい。ブルトンキナーゼ阻害剤の例として、イブルチニブ（ＰＣＩ‐３２７６５）、ＰＣＩ‐４５２９２、ＣＣ‐２９２（ＡＶＬ‐２９２）、ＯＮＯ‐４０５９、ＧＤＣ‐０８３４、ＬＦＭ‐Ａ１３またはＲＮ４８６が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。ＰＩ３Ｋインヒビターの例として、イデラリシブ、ウォルトマニン、デメトキシビリジン、ペリホシン、ＰＸ‐８６６、ＩＰＩ‐１４５（デュベリシブ）、ＢＡＹ８０‐６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ１２０２、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＧＤＣ‐０９４１、ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００‐１１５、ＣＡＬ２６３、ＰＩ‐１０３、ＧＮＥ４７７、ＣＵＤＣ‐９０７、ＡＥＺＳ‐１３６またはＬＹ２９４００２が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。当該技術分野で公知の任意のブルトンキナーゼまたはＰＩ３Ｋ阻害剤を、特許請求の範囲に記載の併用療法において利用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】ＢＲＣＡ１／２野生型ＴＮＢＣ（ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８）におけるＩＭＭＵ‐１３２とオラパリブとの相乗効果。各薬剤単独での用量／反応曲線を最初に試験し、９６時間のインキュベーション後に単剤ＩＣ１０、ＩＣ２０、またはＩＣ３０値を測定した。併用アッセイでは、１つの薬剤（例えば、ＩＭＭＵ‐１３２）を、所与の細胞株で、ある濃度範囲（すなわち、用量／反応曲線）にわたって試験した。１つのウェルセットにはＩＭＭＵ‐１３２のみを入れた。別のセットには、ＩＭＭＵ‐１３２と、一定量（例えば、ＩＣ１０濃度）の用量／反応を有するオラパリブを入れた。それ以外の２つのセットには、オラパリブをＩＣ２０またはＩＣ３０濃度で用いた。これらのデータから、各ＩＭＭＵ‐１３２用量／反応曲線についてＩＣ５０値を決定した。図１Ａは、一定量のＩＭＭＵ‐１３２（ＳＮ‐３８当量が０．６、１．１または１．８ｎＭ）と併用した場合のオラパリブのＩＣ５０値の変化を示す。
【図１Ｂ】ＢＲＣＡ１／２野生型ＴＮＢＣ（ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８）におけるＩＭＭＵ‐１３２とオラパリブとの相乗効果。各薬剤単独での用量／反応曲線を最初に試験し、９６時間のインキュベーション後に単剤ＩＣ１０、ＩＣ２０、またはＩＣ３０値を測定した。併用アッセイでは、１つの薬剤（例えば、ＩＭＭＵ‐１３２）を、所与の細胞株で、ある濃度範囲（すなわち、用量／反応曲線）にわたって試験した。１つのウェルセットにはＩＭＭＵ‐１３２のみを入れた。別のセットには、ＩＭＭＵ‐１３２と、一定量（例えば、ＩＣ１０濃度）の用量／反応を有するオラパリブを入れた。それ以外の２つのセットには、オラパリブをＩＣ２０またはＩＣ３０濃度で用いた。これらのデータから、各ＩＭＭＵ‐１３２用量／反応曲線についてＩＣ５０値を決定した。図１Ｂは、同じ細胞株において一定量のオラパリブ（１、２または３ｍＭ）と併用した場合のＩＭＭＵ‐１３２のＩＣ５０値の変化を示す。
【図１Ｃ】ＢＲＣＡ１／２野生型ＴＮＢＣ（ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８）におけるＩＭＭＵ‐１３２とオラパリブとの相乗効果。各薬剤単独での用量／反応曲線を最初に試験し、９６時間のインキュベーション後に単剤ＩＣ１０、ＩＣ２０、またはＩＣ３０値を測定した。併用アッセイでは、１つの薬剤（例えば、ＩＭＭＵ‐１３２）を、所与の細胞株で、ある濃度範囲（すなわち、用量／反応曲線）にわたって試験した。１つのウェルセットにはＩＭＭＵ‐１３２のみを入れた。別のセットには、ＩＭＭＵ‐１３２と、一定量（例えば、ＩＣ１０濃度）の用量／反応を有するオラパリブを入れた。それ以外の２つのセットには、オラパリブをＩＣ２０またはＩＣ３０濃度で用いた。これらのデータから、各ＩＭＭＵ‐１３２用量／反応曲線についてＩＣ５０値を決定した。図１Ｃは、ＩＭＭＵ‐１３２とオラパリブの相互作用を試験する３つの別個の実験から取得した正規化ＩＣ５０値のアイソボログラムを示し、この結果は明らかに相乗的な相互作用を示している。
【図２Ａ】ＩＭＭＵ‐１３２及びオラパリブの併用によるＴＮＢＣ：ＢＲＣＡ１／２及びＰＴＥＮ欠損腫瘍の腫瘍増殖阻害。腫瘍保有マウス（ＴＶ約０．３ｃｍ３）をオラパリブ（１ｍｇ；Ｍ‐Ｆスケジュールに従って腹腔内へ約５０ｍｇ／ｋｇ；白矢印）またはＩＭＭＵ‐１３２（静脈内、毎週、黒矢印）で処置した。非腫瘍標的化抗ＣＤ２０  ＳＮ‐３８‐ＡＤＣを対照として用いた。ＨＣＣ１８０６は、ＢＲＣＡ１／２欠損ＴＮＢＣ腫瘍株である。オラパリブ単独は、有意な抗腫瘍効果を有していなかった。ＩＭＭＵ‐１３２単独は、すべての対照群と比較して有意に腫瘍増殖を阻害した（Ｐ＜０．０１０６、ＡＵＣ）。ＩＭＭＵ‐１３２及びオラパリブでは、すべての群と比較して有意に抗腫瘍応答が改善した（Ｐ＜０．００１９；ＡＵＣ）。併用群のマウスは、生存期間中央値（＞８０．５日）に達することがなく、その値は、ＩＭＭＵ‐１３２またはオラパリブ単独療法に比べて２倍以上及び４倍以上長い（Ｐ＜０．００８３）。
【図２Ｂ】ＩＭＭＵ‐１３２及びオラパリブの併用によるＴＮＢＣ：ＢＲＣＡ１／２及びＰＴＥＮ欠損腫瘍の腫瘍増殖阻害。腫瘍保有マウス（ＴＶ約０．３ｃｍ３）をオラパリブ（１ｍｇ；Ｍ‐Ｆスケジュールに従って腹腔内へ約５０ｍｇ／ｋｇ；白矢印）またはＩＭＭＵ‐１３２（静脈内、毎週、黒矢印）で処置した。非腫瘍標的化抗ＣＤ２０  ＳＮ‐３８‐ＡＤＣを対照として用いた。ＢＲＣＡ１／２野生型ＰＴＥＮ欠損ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８腫瘍においては、ＩＭＭＵ‐１３２単独は、すべての対照群と比較して有意な抗腫瘍効果を有していなかった（Ｐ＜０．００９８；ＡＵＣ）。しかしながら、ＩＭＭＵ‐１３２とオラパリブの併用では、ＩＭＭＵ‐１３２単独またはオラパリブ単独と比較して有意に腫瘍増殖を阻害した（Ｐ＝０．００４；ＡＵＣ）。すなわち、すべての他の群と比較して有意な延命効果を有するものと解される（Ｐ＜０．０４５）。
【図３Ａ】ＩＭＭＵ‐１３２と微小管阻害剤との併用によるヒトＴＮＢＣ腫瘍異種移植片の腫瘍増殖阻害。示すように、腫瘍保有マウス（ＴＶ約０．３ｃｍ３）に対し、パクリタキセルまたはエリブリンメシル酸塩のいずれかを単独で、またはＩＭＭＵ‐１３２と併用して処置した。治療は、２週間にわたって週１回の投与を行い、再投与の前には１週間空けるようにした。非腫瘍標的化抗ＣＤ２０  ＳＮ‐３８‐ＡＤＣを対照ＡＤＣとして用いた。ＩＭＭＵ‐１３２とパクリタキセルを併用して処置したＨＣＣ１８０６腫瘍保有マウスは、ＩＭＭＵ‐１３２単独と比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した（ｐ＜０．０１９５、ＡＵＣ）。
【図３Ｂ】ＩＭＭＵ‐１３２と微小管阻害剤との併用によるヒトＴＮＢＣ腫瘍異種移植片の腫瘍増殖阻害。示すように、腫瘍保有マウス（ＴＶ約０．３ｃｍ３）に対し、パクリタキセルまたはエリブリンメシル酸塩のいずれかを単独で、またはＩＭＭＵ‐１３２と併用して処置した。治療は、２週間にわたって週１回の投与を行い、再投与の前には１週間空けるようにした。非腫瘍標的化抗ＣＤ２０  ＳＮ‐３８‐ＡＤＣを対照ＡＤＣとして用いた。ＩＭＭＵ‐１３２とパクリタキセルを併用して処置したＨＣＣ１８０６腫瘍保有マウスは、他のすべての処置と比較して、有意な延命効果を示した（Ｐ＜０．００６、対数ランク）。
【図３Ｃ】ＩＭＭＵ‐１３２と微小管阻害剤との併用によるヒトＴＮＢＣ腫瘍異種移植片の腫瘍増殖阻害。ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８腫瘍を有するマウスは、ＩＭＭＵ‐１３２（１００または２００ｍｇ）とパクリタキセルを併用した場合に、単剤療法を受けたマウスと比較して、有意な抗腫瘍効果を示した（Ｐ＜０．０３２８、ＡＵＣ）。
【図３Ｄ】ＩＭＭＵ‐１３２と微小管阻害剤との併用によるヒトＴＮＢＣ腫瘍異種移植片の腫瘍増殖阻害。エリブリンメシル酸塩単独は、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８腫瘍増殖を有意に阻害する（Ｐ＝０．００１９、ＡＵＣ）。重要な点として、ＩＭＭＵ‐１３２とエリブリンメシル酸塩の併用は有意な腫瘍退縮をもたらし、その平均腫瘍体積が、ＩＭＭＵ‐１３２及びエリブリン単独療法群ではそれぞれ０．１７７±０．０８７ｃｍ３及び０．３４４±３０２ｃｍ３であったのに対し、０．０２６±０．０３３ｃｍ３にまで縮小した（他のすべての治療群に対し、併用ではＰ＜０．０００９、ＡＵＣ）。
【図３Ｅ】ＩＭＭＵ‐１３２と微小管阻害剤との併用によるヒトＴＮＢＣ腫瘍異種移植片の腫瘍増殖阻害。ＩＭＭＵ‐１３２＋エリブリンメシル酸塩は、他のすべての治療群と比較して有意な抗腫瘍効果を与えた（Ｐ＜０．０４３２；対応両側ｔ検定）。
【図３Ｆ】ＩＭＭＵ‐１３２と微小管阻害剤との併用によるヒトＴＮＢＣ腫瘍異種移植片の腫瘍増殖阻害。ＩＭＭＵ‐１３２＋エリブリンメシル酸塩は、エリブリンメシル酸塩＋対照ＡＤＣの併用の場合を除いて、すべての群と比較して有意な延命効果を与えた（Ｐ＜０．０２８４）。
【図４】様々なヒトＴＮＢＣ細胞株におけるＩＭＭＵ‐１３２及びオラパリブの相乗的活性。記載する様々な細胞株について計算した併用指数（ＣＩ）値のまとめ。ＣＩ番号は、次式を用いて計算する：ＣＩ＝Ｄａ／Ｄｘａ＋Ｄｂ／Ｄｘｂ、式中、Ｄａ＝一定量のオラパリブと併用した場合のＩＭＭＵ‐１３２のＩＣ５０用量Ｄｂ＝一定量のＩＭＭＵ‐１３２と併用した場合のオラパリブのＩＣ５０用量Ｄｘａ＝単独で使用した場合のＩＭＭＵ‐１３２のＩＣ５０用量Ｄｘｂ＝単独で使用した場合のオラパリブのＩＣ５０用量ａオラパリブと併用した場合のＩＭＭＵ‐１３２のＩＣ５０値（ｎＭ）ｂＩＭＭＵ‐１３２と併用した場合のオラパリブのＩＣ５０値（ｎＭ）ＣＣＩ併用指数（ＣＩ＜１．０ならば相乗効果があることを示す）
【図５Ａ】ＩＭＭＵ‐１１４がイブルチニブのＩＣ５０に与える影響
【図５Ｂ】ＩＭＭＵ‐１１４がイデラリシブのＩＣ５０に与える影響
【図６Ａ】ヒトＣＬＬ細胞株におけるＩＭＭＵ‐１１４とブルトンキナーゼ阻害剤（イブルチニブ）との併用による相加的効果を示すアイソボログラム。ヒト慢性Ｂ細胞白血病細胞（ＪＶＭ‐３）を、９６ウェルプレート中、１×１０−５〜３．９×１０−９Ｍの範囲の用量のブルトンキナーゼ阻害剤（イブルチニブ）の存在下でインキュベートした。１セットの細胞には阻害剤のみを加え、他のセットには阻害剤＋一定量のＩＭＭＵ‐１１４（０．２５、０．５、０．７５または１ｎＭ）を加えた。プレートを９６時間インキュベートした。ＭＴＳアッセイにより細胞生存率を評価し、各条件について用量／反応曲線を作成した。Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈ‐Ｐａｄを用いてＩＣ５０値を決定した。データを正規化し、アイソボログラムを生成した。アイソボログラムはＩＭＭＵ‐１１４と併用した場合のイブルチニブの相加効果を示した。
【図６Ｂ】ヒトＣＬＬ細胞株におけるＩＭＭＵ‐１１４とＰＩ３Ｋ阻害剤（イデラリシブ）との併用による相加的効果を示すアイソボログラム。試験は、図６Ａの説明に記載のように行った。アイソボログラムは、ＩＭＭＵ‐１１４と併用した場合のイデラリシブの相加効果を示した。
【図７】Ｃａｐａｎ１ヒト膵臓癌を有する胸腺欠損ヌードマウスのＭＡｂ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体によるｉｎ  ｖｉｖｏ治療。
【図８】ＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌を有する胸腺欠損ヌードマウスのＭＡｂ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体によるｉｎ  ｖｉｖｏ治療。
【図９】ＬＳ１７４Ｔヒト結腸癌を有する胸腺欠損ヌードマウスのｈＭＮ‐１４‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体によるｉｎ  ｖｉｖｏ治療。
【図１０】ＧＷ‐３９肺転移性疾患を有するｈＭＮ１４‐ＣＬ‐ＳＮ‐３８処置マウスの生存曲線。
【図１１Ａ】ヒト非小細胞肺腫瘍異種移植片を有するマウスにおけるｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣの治療効果。Ｃａｌｕ‐３腫瘍（Ｎ＝５〜７）を保有するマウスに、ｈＲＳ７‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８を４日ごとに計４回注射した（ｑ４ｄｘ４）。すべてのＡＤＣ及び対照を、記載した量（用量当たりのＳＮ‐３８の量として表記；長い矢印＝複合体の注射、短い矢印＝イリノテカンの注射）で投与した。
【図１１Ｂ】ヒト結腸直腸腫瘍異種移植片を有するマウスにおけるｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣの治療効果。ＣＯＬＯ２０５腫瘍を保有するマウス（Ｎ＝５）に、ＡＤＣを８回（ｑ４ｄｘ８）、または最大耐量のイリノテカンを２日ごとに合計５回（ｑ２ｄｘ５）注射した。すべてのＡＤＣ及び対照を、記載した量（用量当たりのＳＮ‐３８の量として表記；長い矢印＝複合体の注射、短い矢印＝イリノテカンの注射）で投与した。
【図１１Ｃ】ヒト膵臓癌異種移植片を有するマウスにおけるｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣの治療効果。Ｃａｐａｎ‐１（Ｎ＝１０）腫瘍を保有するマウス（Ｎ＝１０）を、記載した薬剤で週２回、４週間にわたって処置した。すべてのＡＤＣ及び対照を、記載した量（用量当たりのＳＮ‐３８の量として表記；長い矢印＝複合体の注射、短い矢印＝イリノテカンの注射）で投与した。
【図１１Ｄ】ヒト膵臓癌異種移植片を有するマウスにおけるｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣの治療効果。ＢｘＰＣ‐３腫瘍を保有するマウス（Ｎ＝１０）を、記載した薬剤で週２回、４週間にわたって処置した。すべてのＡＤＣ及び対照を、記載した量（用量当たりのＳＮ‐３８の量として表記；長い矢印＝複合体の注射、短い矢印＝イリノテカンの注射）で投与した。
【図１１Ｅ】ヒト扁平上皮細胞肺癌異種移植片を有するマウスにおけるｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣの治療効果。週２回、４週間にわたってＡＤＣを与えることに加えて、ＳＫ‐ＭＥＳ‐１腫瘍保有（Ｎ＝８）マウスに最大耐量のＣＰＴ‐１１（ｑ２ｄｘ５）を与えた。すべてのＡＤＣ及び対照を、記載した量（用量当たりのＳＮ‐３８の量として表記；長い矢印＝複合体の注射、短い矢印＝イリノテカンの注射）で投与した。
【図１２】（Ａ）皮下Ｒａｍｏｓモデルにおけるエプラツズマブ（Ｅｍａｂ）‐ＳＮ‐３８及びベルツズマブ（Ｖｍａｂ）‐ＳＮ‐３８複合体の効力比較。平均約０．３５ｃｍ３（０．２０〜０．５５ｃｍ３）の腫瘍を有するヌードマウス（１群につきＮ＝１０）に、０．２５ｍｇのＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８を週２回、４週間にわたって投与した。（Ｂ）皮下Ｒａｍｏｓモデルにおけるエプラツズマブ（Ｅｍａｂ）‐ＳＮ‐３８及びベルツズマブ（Ｖｍａｂ）‐ＳＮ‐３８複合体の効力比較。平均約０．３５ｃｍ３（０．２０〜０．５５ｃｍ３）の腫瘍を有するヌードマウス（１群につきＮ＝１０）に、０．２５ｍｇのＶｍａｂ‐ＳＮ‐３８を週２回、４週間にわたって投与した。（Ｃ）皮下Ｒａｍｏｓモデルにおけるエプラツズマブ（Ｅｍａｂ）‐ＳＮ‐３８及びベルツズマブ（Ｖｍａｂ）‐ＳＮ‐３８複合体の効力比較。平均約０．３５ｃｍ３（０．２０〜０．５５ｃｍ３）の腫瘍を有するヌードマウス（１群につきＮ＝１０）に、０．５ｍｇのＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８を週２回、４週間にわたって投与した。（Ｄ）皮下Ｒａｍｏｓモデルにおけるエプラツズマブ（Ｅｍａｂ）‐ＳＮ‐３８及びベルツズマブ（Ｖｍａｂ）‐ＳＮ‐３８複合体の効力比較。平均約０．３５ｃｍ３（０．２０〜０．５５ｃｍ３）の腫瘍を有するヌードマウス（１群につきＮ＝１０）に、０．５ｍｇのＶｍａｂ‐ＳＮ‐３８を週２回、４週間にわたって投与した。
【図１３】（Ａ）皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍を有するヌードマウスにおけるＥｍａｂ抗ＣＤ２２‐ＳＮ‐３８複合体（実線）と、関連性のないラベツズマブ（Ｌｍａｂ）‐ＳＮ‐３８複合体（破線）の特異性。動物に、１投与当たり７５μｇの各複合体（２２ｇの平均体重を基準に５４．５μｇ／ｋｇのＳＮ‐３８）を腹腔内に週２回、４週間にわたって投与した。平均サイズ０．４ｃｍ３で開始する腫瘍が３．０ｃｍ３に進行するまでの時間（ＴＴＰ）に基づく生存率。Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体とＬｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体との生存期間中央値（図中に記載）の比較におけるＰ値を各パネルに示す。Ｃ、イリノテカン（６．５μｇ／用量；２５０μｇ用量のＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体とほぼ同等のＳＮ‐３８当量）の週１回の腹腔内注射を行った別の群の動物の生存曲線（純グレー）。（Ｂ）皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍を有するヌードマウスにおけるＥｍａｂ抗ＣＤ２２‐ＳＮ‐３８複合体（実線）と、関連性のないラベツズマブ（Ｌｍａｂ）‐ＳＮ‐３８複合体（破線）の特異性。動物に、１投与当たり１２５μｇの各複合体（２２ｇの平均体重を基準に９１μｇ／ｋｇのＳＮ‐３８）を腹腔内に週２回、４週間にわたって投与した。平均サイズ０．４ｃｍ３で開始する腫瘍が３．０ｃｍ３に進行するまでの時間（ＴＴＰ）に基づく生存率。Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体とＬｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体との生存期間中央値（図中に記載）の比較におけるＰ値を各パネルに示す。Ｃ、イリノテカン（６．５μｇ／用量；２５０μｇ用量のＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体とほぼ同等のＳＮ‐３８当量）の週１回の腹腔内注射を行った別の群の動物の生存曲線（純グレー）。（Ｃ）皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍を有するヌードマウスにおけるＥｍａｂ抗ＣＤ２２‐ＳＮ‐３８複合体（実線）と、関連性のないラベツズマブ（Ｌｍａｂ）‐ＳＮ‐３８複合体（破線）の特異性。動物に、１投与当たり２５０μｇの各複合体（２２ｇの平均体重を基準に１８２μｇ／ｋｇのＳＮ‐３８）を腹腔内に週２回、４週間にわたって投与した。平均サイズ０．４ｃｍ３で開始する腫瘍が３．０ｃｍ３に進行するまでの時間（ＴＴＰ）に基づく生存率。Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体とＬｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体との生存期間中央値（図中に記載）の比較におけるＰ値を各パネルに示す。イリノテカン（６．５μｇ／用量；２５０μｇ用量のＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体とほぼ同等のＳＮ‐３８当量）の週１回の腹腔内注射を行った別の群の動物の生存曲線（純グレー）も示す。
【図１４】ＩＭＭＵ‐１３０（ラベツズマブ‐ＳＮ‐３８）を投与する前の、患者の前治療歴。前治療には、ＩＶ期ＣＲＣ大腸切除術／肝切除術（葉切除）、肝転移のラジオ波焼灼療法、肺転移の楔状切除術、ならびにイリノテカン／オキサリプラチン、フォルフィリノックス、フォルフィリノックス＋ベバシズマブ、ベバシズマブ＋５‐ＦＵ／ロイコボリン、フォルフィリ、フォルフィリ＋セツキシマブ、及びセツキシマブ単独を用いた抗がん剤治療が含まれていた。患者に対し、合計１７回の治療投与を隔週ごとに、緩やかな静脈内注入によって１６ｍｇ／ｋｇの用量のＩＭＭＵ‐１３０を与えた。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
［発明の詳細な説明］
定義
以下の説明では、いくつかの用語を使用し、特許請求の範囲に記載の本発明の理解を容易にするために以下の定義を提供する。本明細書中に明示的に定義していない用語は、その通常及び平凡な意味に従って用いる。
【００２９】
他に特段の指定のない限り、［ａ］または［ａｎ］は、「１つ以上」を意味する。
【００３０】
用語［約］は、本明細書中では値の±１０％（１０％）を意味するように用いる。例えば、「約１００」とは、９０と１１０の間の任意の数を指す。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、［抗体］とは、完全長（すなわち、天然または通常の免疫グロブリン遺伝子断片の組換えプロセスによって形成される）の免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）、または免疫グロブリン分子の抗原結合部分、例えば抗体断片などを指す。抗体または抗体断片は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内において複合体化するか、または他の方法で誘導体化してもよい。そのような抗体として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（及びＩｇＧ４サブフォーム）、ならびにＩｇＡアイソタイプが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。以下で使用するように、略語「ＭＡｂ」は、抗体、抗体断片、モノクローナル抗体または多重特異性抗体を指すものとして、同じ意味で用いられ得る。
【００３２】
［抗体断片］とは、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、単一ドメイン抗体（ＤＡＢまたはＶＨＨ）などの抗体の一部分であり、例えば、上記のＩｇＧ４の半体分子が挙げられる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７（１４  Ｓｅｐｔ）：１５５４‐１５５７）。構造にかかわらず、使用する抗体断片はインタクトな抗体が認識するものと同じ抗原に結合する。「抗体断片」という用語は、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する合成または遺伝子改変タンパク質を包含する。例えば、抗体断片は、可変領域からなる単離断片、例えば、重鎖及び軽鎖可変領域ならびに軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結した組換え単鎖ポリペプチド分子からなる「Ｆｖ」断片（「ｓｃＦｖタンパク質」）を包含する。断片を、異なる方法で構築して多価及び／または多特異性結合形態を生じさせてもよい。
【００３３】
［裸の抗体］とは、通常、治療剤へ複合体化させていない全長の抗体である。裸の抗体は、例えば、補体結合（ＣＤＣ）及びＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）などのＦｃ依存性の機能によって、治療効果及び／または細胞毒性効果を示し得る。しかしながら、アポトーシス、抗血管新生、抗転移活性、抗接着活性、異型または同型接着の阻害、及びシグナル伝達経路における干渉などの他の機構もまた、治療効果を提供し得る。裸の抗体には、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体などの天然または組換え抗体及びその断片が含まれる。いくつかの場合には、「裸の抗体」はまた、「裸の」抗体断片を指す場合がある。本明細書中の定義では、「裸の」は、「複合体化していない」と同義語であり、治療剤に連結させていない、すなわち複合体化させていないことを意味する。
【００３４】
［キメラ抗体］とは、抗体の重鎖と軽鎖両方の可変ドメインを有し、その可変ドメインが、１つの種に由来する抗体、好ましくはげっ歯類抗体、より好ましくはマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、その一方で、その抗体分子の定常ドメインがヒト抗体に由来する組換えタンパク質である。獣医学的用途では、キメラ抗体の定常ドメインは、霊長類、ネコまたはイヌのような他の種のドメインに由来するものであってもよい。
【００３５】
［ヒト化抗体］とは、１つの種由来の抗体；例えばマウス抗体に由来するＣＤＲについて、マウス抗体の重鎖及び軽鎖の可変鎖からヒト重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（フレームワーク領域）に転換させた組換えタンパク質である。その抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。いくつかの場合には、ヒト化抗体のフレームワーク領域の特定の残基、特にＣＤＲ配列に隣接するか、またはその近傍に位置する残基を、例えば元のマウス、げっ歯類、ヒト以外の霊長類、または他の種の抗体由来の対応する残基で置換するなどの改変を行ってもよい。
【００３６】
［ヒト抗体］とは、例えば抗原チャレンジに応答してヒト抗体を産生するように「改変した」トランスジェニックマウスから得られる抗体である。同技術では、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座のエレメントを、胚性幹細胞株由来マウス株に導入し、それに伴って内在性重鎖及び軽鎖遺伝子座を標的破壊する。トランスジェニックマウスは、様々な抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、マウスを用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載されている。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体形質移入法、ならびにファージディスプレイ技術によって構築することができ、これらの技術はいずれも当該分野で公知である。未免疫ドナー由来免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト抗体及びその断片の産生については、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２‐５５３（１９９０）を参照されたい。本技術では、ヒト抗体の可変ドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片として提示する。フィラメント状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを有するため、抗体の機能的特性に基づいて選択することにより、結果的に、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子を選択することになる。このようにして、前記ファージは、Ｂ細胞の特性を模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で行うことができ、それらのレビューについては、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４‐５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化させたＢ細胞によって生成してもよい。米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたく、その各々の実施例の節は参照として本明細書に援用する。
【００３７】
［治療剤］とは、疾患の治療に有用な原子、分子または化合物のことである。治療剤の例として、抗体、抗体断片、免疫複合体、薬剤、細胞傷害剤、プロアポトーシス剤、毒素、ヌクレアーゼ（ＤＮＡａｓｅ及びＲＮＡｓｅｓを含む）、ホルモン、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、放射性核種、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、抗血管新生剤、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、プロドラッグ、酵素、結合タンパク質もしくはペプチド、またはそれらの組合せが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【００３８】
［免疫複合体］とは、少なくとも１つの治療剤に複合体化させた抗体、抗原結合抗体断片、抗体複合体または抗体融合タンパク質である。結合は、共有または非共有結合であってもよい。好ましくは、結合は共有結合である。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、用語［抗体融合タンパク質］とは、組換えによって生成した抗原結合分子であって、分子内で１つ以上の天然抗体、一本鎖抗体または抗体断片が、別の部分、例えばタンパク質またはペプチド、毒素、サイトカイン、ホルモンなどに結合しているものである。特定の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、同じエピトープに結合することができる２つ以上の同一または異なる抗体、抗体断片または一本鎖抗体を一つに融合させたものであり、融合タンパク質は、同じエピトープ、同じ抗原上の異なる抗原、または異なる抗原に結合し得る。
【００４０】
［免疫調節剤］とは、存在する場合、身体の免疫系を変化させ、抑制または刺激する治療剤のことである。一般的には、使用する免疫調節剤は、免疫細胞を刺激し、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、及び／またはＴ細胞などの免疫応答カスケードにおいて免疫細胞を増殖させるか、または活性化する。しかしながら、いくつかの場合には、免疫調節剤が免疫細胞の増殖または活性化を抑制することがある。本明細書中に記載する免疫調節剤は、例えばサイトカインであり、それは、特定の抗原と接触した１つの細胞集団（例えば、プライミングしたＴリンパ球）が放出する約５〜２０ｋＤａの可溶性小タンパク質であって、細胞間の細胞間メディエーターとして作用する。当業者であれば理解するように、サイトカインの例として、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びインターフェロンなどのいくつかの関連するシグナル伝達分子が挙げられる。ケモカインは、サイトカインのサブセットである。特定のインターロイキン及びインターフェロンは、Ｔ細胞または他の免疫細胞増殖を刺激するサイトカインの一例である。インターフェロンの例として、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ及びインターフェロンλが挙げられる。
【００４１】
［ＣＰＴ］は、カンプトテシンの略語であり、本願で使用する場合、ＣＰＴは、カンプトテシン自体またはＳＮ‐３８のようなカンプトテシン類似体または誘導体を表す。カンプトテシン及びその類似体のいくつかの構造を、番号を付し、その環にＡ〜Ｅの文字でラベル付けするとともに、下記の図表１の式１に示す。
【００４２】
【化１】
2018520140.tif 000003
【００４３】
一般的な抗体技術
実質的に任意の標的抗原に対するモノクローナル抗体を調製するための技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）、及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１，ｐａｇｅｓ  ２．５．１‐２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９１）参照。当業者であれば、ヒト被験体を治療する場合に、抗体がヒト抗原に結合することが好ましいことは理解するであろう。要約すると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射し、脾臓を除去してＢリンパ球を採取し、Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、及びハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより取得することができる。
【００４４】
十分に確立された様々な技術によって、ハイブリドーマ培養物からＭＡｂを単離及び精製することができる。そのような単離技術として、プロテインＡまたはプロテインＧセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．７．１‐２．７．１２及びｐａｇｅｓ  ２．９．１‐２．９．３参照。また、Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），”ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９‐１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）参照。
【００４５】
免疫原に対する抗体の最初の産生後、抗体を配列決定し、続いて組換え技術によって調製することができる。マウス抗体及び抗体断片のヒト化及びキメラ化は、以下に説明するように、当業者には周知である。
【００４６】
当業者であれば、特許請求の範囲に記載の方法及び組成物は、当該分野で公知の多種多様な任意の抗体を利用し得ることを理解するであろう。使用する抗体は、様々な公知の供給元から購入することができる。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ株を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア）から入手可能である。腫瘍関連抗原を含むが必ずしもこれに限定されない様々な疾患標的に対する多数の抗体がＡＴＣＣに寄託されており、及び／または可変領域配列を公開しており、特許請求の範囲に記載の方法及び組成物において利用可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；第７，２８２，５６７号；第７，１５１，１６４号；第７，０７４，４０３号；第７，０６０，８０２号；第７，０５６，５０９号；第７，０４９，０６０号；第７，０４５，１３２号；第７，０４１，８０３号；第７，０４１，８０２号；第７，０４１，２９３号；第７，０３８，０１８号；第７，０３７，４９８号；第７，０１２，１３３号；第７，００１，５９８号；第６，９９８，４６８号；第６，９９４，９７６号；第６，９９４，８５２号；第６，９８９，２４１号；第６，９７４，８６３号；第６，９６５，０１８号；第６，９６４，８５４号；第６，９６２，９８１号；第６，９６２，８１３号；第６，９５６，１０７号；第６，９５１，９２４号；第６，９４９，２４４号；第６，９４６，１２９号；第６，９４３，０２０号；第６，９３９，５４７号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，５３３号；第６，９１９，４３３号；第６，９１９，０７８号；第６，９１６，４７５号；第６，９０５，６８１号；第６，８９９，８７９号；第６，８９３，６２５号；第６，８８７，４６８号；第６，８８７，４６６号；第６，８８４，５９４号；第６，８８１，４０５号；第６，８７８，８１２号；第６，８７５，５８０号；第６，８７２，５６８号；第６，８６７，００６号；第６，８６４，０６２号；第６，８６１，５１１号；第６，８６１，２２７号；第６，８６１，２２６号；第６，８３８，２８２号；第６，８３５，５４９号；第６，８３５，３７０号；第６，８２４，７８０号；第６，８２４，７７８号；第６，８１２，２０６号；第６，７９３，９２４号；第６，７８３，７５８号；第６，７７０，４５０号；第６，７６７，７１１号；第６，７６４，６８８号；第６，７６４，６８１号；第６，７６４，６７９号；第６，７４３，８９８号；第６，７３３，９８１号；第６，７３０，３０７号；第６，７２０，１５５号；第６，７１６，９６６号；第６，７０９，６５３号；第６，６９３，１７６号；第６，６９２，９０８号；第６，６８９，６０７号；第６，６８９，３６２号；第６，６８９，３５５号；第６，６８２，７３７号；第６，６８２，７３６号；第６，６８２，７３４号；第６，６７３，３４４号；第６，６５３，１０４号；第６，６５２，８５２号；第６，６３５，４８２号；第６，６３０，１４４号；第６，６１０，８３３号；第６，６１０，２９４号；第６，６０５，４４１号；第６，６０５，２７９号；第６，５９６，８５２号；第６，５９２，８６８号；第６，５７６，７４５号；第６，５７２；８５６号；第６，５６６，０７６号；第６，５６２，６１８号；第６，５４５，１３０号；第６，５４４，７４９号；第６，５３４，０５８号；第６，５２８，６２５号；第６，５２８，２６９号；第６，５２１，２２７号；第６，５１８，４０４号；第６，５１１，６６５号；第６，４９１，９１５号；第６，４８８，９３０号；第６，４８２，５９８号；第６，４８２，４０８号；第６，４７９，２４７号；第６，４６８，５３１号；第６，４６８，５２９号；第６，４６５，１７３号；第６，４６１，８２３号；第６，４５８，３５６号；第６，４５５，０４４号；第６，４５５，０４０号，６，４５１，３１０号；第６，４４４，２０６号；第６，４４１，１４３号；第６，４３２，４０４号；第６，４３２，４０２号；第６，４１９，９２８号；第６，４１３，７２６号；第６，４０６，６９４号；第６，４０３，７７０号；第６，４０３，０９１号；第６，３９５，２７６号；第６，３９５，２７４号；第６，３８７，３５０号；第６，３８３，７５９号；第６，３８３，４８４号；第６，３７６，６５４号；第６，３７２，２１５号；第６，３５９，１２６号；第６，３５５，４８１号；第６，３５５，４４４号；第６，３５５，２４５号；第６，３５５，２４４号；第６，３４６，２４６号；第６，３４４，１９８号；第６，３４０，５７１号；第６，３４０，４５９号；第６，３３１，１７５号；第６，３０６，３９３号；第６，２５４，８６８号；第６，１８７，２８７号；第６，１８３，７４４号；第６，１２９，９１４号；第６，１２０，７６７号；第６，０９６，２８９号；第６，０７７，４９９号；第５，９２２，３０２号；第５，８７４，５４０号；第５，８１４，４４０号；第５，７９８，２２９号；第５，７８９，５５４号；第５，７７６，４５６号；第５，７３６，１１９号；第５，７１６，５９５号；第５，６７７，１３６号；第５，５８７，４５９号；第５，４４３，９５３号，第５，５２５，３３８号を参照されたく、その各々の実施例の節は参照として本明細書に援用する。これらは単なる例示に過ぎず、多種多様な他の抗体及びそれらのハイブリドーマが当該分野で公知である。当業者であれば、目的の選択した疾患関連標的に対する抗体について、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ及び／またはＵＳＰＴＯデータベースを単純に検索することによって、ほとんどの疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマを取得し得ることを理解するであろう。クローニングした抗体の抗原結合ドメインは、当該技術分野で周知の標準技術を使用して、増幅し、切除し、発現ベクターに連結し、適合する宿主細胞に形質移入し、タンパク質産生のために使用し得る。単離した抗体は、本明細書中に開示する技術を使用して、カンプトテシンまたはアントラサイクリンのようなＤＮＡ鎖切断を誘導する治療剤に複合体化してもよい。
【００４７】
キメラ及びヒト化抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域を、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域で置換した組換えタンパク質である。キメラ抗体は、被験体に投与した場合に、免疫原性を低下させ、及び安定性を高める。キメラ抗体を構築する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９）。
【００４８】
キメラモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変鎖由来マウスＣＤＲをヒト抗体の対応する可変ドメインに移入することによってヒト化し得る。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もまた、ヒトＦＲ配列に置換する。ヒト化モノクローナル抗体の安定性及び抗原特異性を保存するために、１つ以上のヒトＦＲ残基をマウスの対応する残基に置換してもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、被験体の治療的処置のために用いてもよい。ヒト化モノクローナル抗体の製造技術は当該技術分野において周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７；Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６；Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９３，１５０：２８４４）。
【００４９】
他の実施形態は、非ヒト霊長類抗体に関する場合がある。ヒヒにおける治療的に有用な抗体を産生するための一般的な技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）、及びＬｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０（１９９０）に見出し得る。別の実施形態では、抗体はヒトモノクローナル抗体であってもよい。そのような抗体は、後述するように抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように改変したトランスジェニックマウスから取得してもよい。
【００５０】
ヒト抗体
コンビナトリアルアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換したトランスジェニック動物のいずれかを用いて完全ヒト抗体を産生する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５‐２８；Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７‐２６；Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４‐５０；それぞれ参照として本明細書中に援用する）。そのような完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体よりも副作用がより少なく、実質的に内在性のヒト抗体としてｉｎ  ｖｉｖｏで機能することが期待される。特定の実施形態では、特許請求の範囲に記載の方法及び手順は、そのような技術によって生成したヒト抗体を利用する場合がある。
【００５１】
１つの代替方法として、ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体を生成してもよい（例えば、Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６‐４０、参照として本明細書に援用する）。ヒト抗体は、正常なヒトから、または癌などの特定の疾患状態を呈するヒトから生成してもよい（Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。疾患状態の個体からヒト抗体を構築する利点は、循環抗体のレパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏る可能性があることである。
【００５２】
本方法論の１つの非限定的な例において、Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）は、骨肉腫患者由来ヒトＦａｂ抗体断片のファージディスプレイライブラリーを構築した。一般に、全ＲＮＡは循環血液リンパ球から取得した（同書）。組換えＦａｂをμ、γ及びκ鎖抗体レパートリーからクローニングし、ファージディスプレイライブラリーに挿入した（同書）。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、それを使用して重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列に対する特異的プライマーを用いたＦａｂ  ｃＤＮＡライブラリーを作製した（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１‐９７、参照として本明細書中に援用する）。ライブラリー構築は、Ａｎｄｒｉｓ‐Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ｐｐ．９．１〜９．２２、参照として本明細書に援用する）に従って実施した。最終Ｆａｂ断片を制限エンドヌクレアーゼで消化し、バクテリオファージゲノムに挿入して、ファージディスプレイライブラリーを作製した。そのようなライブラリーを、標準的なファージディスプレイ法によってスクリーニングしてもよい。当業者であれば、本技術が単なる例示に過ぎず、ファージディスプレイによるヒト抗体または抗体断片を作製及びスクリーニングするための任意の公知の方法を利用してもよいことを理解するであろう。
【００５３】
別の代替方法では、ヒト抗体を産生するように遺伝子改変したトランスジェニック動物を使用して、上記の標準免疫プロトコールを使用して、実質的に任意の免疫原性標的に対する抗体を生成し得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載されている。このような系の非限定的な例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（フリーモント、カリフォルニア）のＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１‐２３、参照として本明細書に援用する）である。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）及び類似の動物では、マウス抗体遺伝子は不活性化され、機能的なヒト抗体遺伝子に置換されており、その一方でそれ以外のマウス免疫系は無傷のままである。
【００５４】
アクセサリー遺伝子及び調節配列に沿って可変領域配列の大部分を含む、ヒトＩｇＨ及びＩｇκ遺伝子座の部分を有する生殖系列配置のＹＡＣ（酵母人工染色体）でＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）を形質転換した。ヒト可変領域レパートリーを使用して抗体産生Ｂ細胞を生成してもよく、これを公知の技術によってハイブリドーマへと加工してもよい。標的抗原で免疫化したＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）は、正常な免疫応答によってヒト抗体を産生し、これを上記の標準的な技術によって採集及び／または産生してもよい。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）の様々な株が利用可能であり、それぞれが異なるクラスの抗体を産生することができる。トランスジェニック産生したヒト抗体は、正常なヒト抗体の薬物動態学的特性を保持する一方で、治療可能性を有することが示されている（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。当業者であれば、特許請求の範囲に記載の組成物及び方法は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）系の使用に限定されるものではなく、ヒト抗体を産生するように遺伝子改変した任意のトランスジェニック動物を利用し得ることを理解するであろう。
【００５５】
抗体断片の製造
特許請求の範囲に記載の方法及び／または組成物のいくつかの実施形態は、抗体断片に関する場合がある。例えば、従来の方法による全抗体のペプシン消化またはパパイン消化によってそのような抗体断片を取得してもよい。例えば、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって抗体断片を産生し、Ｆ（ａｂ′）２と表される５Ｓ断片を提供してもよい。この断片は、チオール還元剤、及び必要に応じてジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のためのブロッキング基を用いてさらに切断し、３．５Ｓ  Ｆａｂ′一価断片を生成してもよい。あるいは、ペプシンを用いる酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂ断片とＦｃ断片とを産生させる。抗体断片を産生するための例示的な方法は、米国特許第４，０３６，９４５号；米国特許第４，３３１，６４７号；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９；Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｐａｇｅ  ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９１，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に開示されている。
【００５６】
無傷の抗体が認識する抗原に断片が結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば、重鎖の分離による一価の軽鎖‐重鎖断片の形成、断片のさらなる切断または他の酵素的、化学的または遺伝子的技術などを使用してもよい。例えば、Ｆｖ断片は、ＶＨ及びＶＬ鎖の会合を有する。この会合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２６５９に記載されているように、非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結させるか、またはグルタルアルデヒドのような化学物質によって架橋させてもよい。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１２：４３７参照。
【００５７】
好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結したＶＨ及びＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、ＶＨ及びＶＬドメインをオリゴヌクレオチドリンカー配列で連結したものをコードするＤＮＡ配列を有する構造遺伝子を構築することによって調製する。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、続いてＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖの産生方法は、当該技術分野で周知である。Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９４６，７７８；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１、及びＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７参照。
【００５８】
抗体断片の別の形態は、時に一本鎖抗体と呼ばれる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）である。単一ドメイン抗体を産生する技術は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｏｓｓｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００７，５１：２５３‐５９；Ｓｈｕｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６，４３：１９１２‐１９；Ｔａｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：２４７７４‐７８０参照）。他のタイプの抗体断片は、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって取得することができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製する。Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６；Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，ｐａｇｅｓ  １６６‐１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ  １３７‐１８５（Ｗｉｌｅｙ‐Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）参照。
【００５９】
抗体の変異
特定の実施形態では、抗体のＦｃ部分などの抗体の配列は、血清中の半減期などの複合体の生理学的特性を最適化するように変更してもよい。タンパク質中のアミノ酸配列の置換方法は、部位特異的突然変異誘発（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，１９８９）など、当該技術分野で広く知られている。好ましい実施形態では、変異は、Ｆｃ配列中の１つ以上のグリコシル化部位の付加または除去を含んでいてもよい（例えば、米国特許第６，２５４，８６８号であり、その実施例の節は、参照として本明細書に援用する）。他の好ましい実施形態では、Ｆｃ配列中の特定のアミノ酸置換を行ってもよい（例えば、Ｈｏｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４１：３５５‐６２；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：３４６‐５６；Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：１７５９‐６９；米国特許第７，２１７，７９７号；それぞれ、参照として本明細書に援用する）。
【００６０】
標的抗原及び例示的抗体
好ましい実施形態では、標的細胞上で高レベルに発現し、正常細胞と比較して疾患状態の細胞上で優勢にまたは専ら発現するヒト抗原を認識及び／または結合する抗体を使用する。より好ましくは、抗体は結合後に迅速に内部移行する。例示的な迅速内部移行性抗体は、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）抗体であり、１細胞あたり約８×１０６抗体分子／日の内部移行速度を有する（例えば、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３２０：２９３‐３００）。したがって、「迅速内部移行性」抗体は、１細胞あたり約１×１０６〜約１×１０７抗体分子／日の内部移行速度を有する抗体であり得る。特許請求の範囲に記載の組成物及び方法において使用する抗体は、上記の特性を有するＭＡｂを含み得る。例えば癌などの治療のための抗体の例として、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２またはＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ラムブロリズマブ（抗ＰＤ‐１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ‐１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ‐４）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質‐１（ＥＧＰ‐１、Ｔｒｏｐ‐２としても知られる））、ＰＡＭ４またはＫＣ４（どちらも抗ムチン）、ＭＮ‐１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅまたはＣＥＡＣＡＭ５としても知られる）、ＭＮ‐１５またはＭＮ‐３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ‐９（抗結腸特異的抗原‐ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗α‐フェトプロテイン）、Ｒ１（抗ＩＧＦ‐１Ｒ）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、ＴＡＧ‐７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１またはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、ＡＢ‐ＰＧ１‐ＸＧ１‐０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ  ＭＡｂ）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ‐ＤＲ）アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ・チウキセタン（抗ＣＤ２０）；パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）；トシツモマブ（抗ＣＤ２０）；ＰＡＭ４（別名クリバツズマブ、抗ムチン）及びトラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。そのような抗体は、当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号；第５，８７４，５４０号；第６，１０７，０９０号；第６，１８３，７４４号；第６，３０６，３９３号；第６，６５３，１０４号；第６，７３０．３００号；第６，８９９，８６４号；第６，９２６，８９３号；第６，９６２，７０２号；第７，０７４，４０３号；第７，２３０，０８４号；第７，２３８，７８５号；第７，２３８，７８６号；第７，２５６，００４号；第７，２８２，５６７号；第７，３００，６５５号；第７，３１２，３１８号；第７，５８５，４９１号；第７，６１２，１８０号；第７，６４２，２３９号；及び米国特許出願公開第２００５０２７１６７１号；第２００６０１９３８６５号；第２００６０２１０４７５号；第２００７００８７００１号；それぞれの実施例の節は、参照として本明細書に援用する）。特定の公知の使用抗体として、ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２��５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，１５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ‐３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第５，７８９，５５４号）、ｈＭｕ‐９（米国特許第７，３８７，７７２号）、ｈＬ２４３（米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ‐１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ‐１５（米国特許第８，２８７，８６５号）、ｈＲ１（米国特許出願第１４／０６１，１７６７号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ‐３（米国特許第７，５４１，４４０号）、ＡＢ‐ＰＧ１‐ＸＧ１‐０２６（米国特許出願第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ‐４４０５及びＰＴＡ‐４４０６として寄託）及びＤ２／Ｂ（ＷＯ２００９／１３０５７５）が挙げられ、引用する各特許または出願のテキストは、その図及び実施例の節に関して、参照として本明細書に援用する。
【００６１】
記載した複合体を用いて標的とし得る他の有用な抗原としては、炭酸脱水酵素ＩＸ、Ｂ７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、Ｃ２Ｂ８、ｈＡ２０、１Ｆ５  ＭＡｂ）、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＴＬＡ‐４、α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦ（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、フィブロネクチン・スプライシング変異型）、ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン（例えば、Ｌ１９）、ＥＧＰ‐１（Ｔｒｏｐ‐２）、ＥＧＰ‐２（例えば、１７‐１Ａ）、ＥＧＦ受容体（ＥｒｂＢ１）（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、Ｈ因子、ＦＨＬ‐１、Ｆｌｔ‐３、葉酸受容体、Ｇａ７３３、ＧＲＯ‐β、ＨＭＧＢ‐１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、ＩＦＮ‐γ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＦＮ‐λ、ＩＬ‐２Ｒ、ＩＬ‐４Ｒ、ＩＬ‐６Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１５Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、ＩＬ‐１８Ｒ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２５、ＩＰ‐１０、ＩＧＦ‐１Ｒ、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ガングリオシド、ＨＣＧ、Ｌ２４３が結合するＨＬＡ‐ＤＲ抗原、ＣＤ６６抗原、すなわちＣＤ６６ａ〜ｄまたはその組合せ、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ、ＰＡＭ４抗原、ＰＤ‐１受容体、ＮＣＡ‐９５、ＮＣＡ‐９０、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ‐ＣＡＭ、ＫＳ‐１、Ｌｅ（ｙ）、メソセリン、Ｓ１００、テネイシン、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍａｓ‐Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管新生抗原、ＴＮＦ‐α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、Ｔｒｏｐ‐２、ＶＥＧＦＲ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ならびに癌幹細胞抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、及び癌遺伝子産物が挙げられる。
【００６２】
フローサイトメトリーによって示され、薬剤結合免疫療法のための適切な抗体を選択する上での指針となる、造血器悪性腫瘍細胞上の適切な抗原（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ、またはＣＤ）標的の包括的な分析は、２００８年１月１５日にオンライン上に事前掲載されたＣｒａｉｇ  ａｎｄ  Ｆｏｏｎ，Ｂｌｏｏｄ；ＤＯＬ１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ‐２００７‐１１‐１２０５３５に記載されている。
【００６３】
ＣＤ６６抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーメンバーであるＢＣＧ、ＣＧＭ６、ＮＣＡ、ＣＧＭ１及びＣＥＡによってそれぞれコードされる類似の構造を有する５つの異なる糖タンパク質、ＣＤ６６ａ〜ｅからなる。これらのＣＤ６６抗原（例えば、ＣＥＡＣＡＭ６）は、主に顆粒球、消化管の正常上皮細胞及び様々な組織の腫瘍細胞において発現する。この他、癌の適切な標的として挙げられるのは、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１（Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；１２０（１１）：２４１１‐７）のような癌精巣抗原、ならびに骨髄性白血病（Ｋｏｚｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２００５；１６３（１）：６２‐７）及びＢ細胞疾患におけるＣＤ７９ａ、及び非ホジキンリンパ腫に対するＣＤ７９ｂ（Ｐｏｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１０（２）：６１６‐６２３）である。前述の抗原のいくつかは、２００２年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／４２６，３７９号、発明の名称「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｎｏｎ‐ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」に開示されている。より治療抵抗性の高い前駆悪性細胞集団であると考えられる癌幹細胞（Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００７；９９：１４３５‐４０）は、前立腺癌（Ｍａｉｔｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐｏｓ．Ｐｒｏｃ．２００６；５：１５５‐７９）、非小細胞肺癌、（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００７；１２２（３）：３８５‐９１）、及び神経膠芽腫（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（９）：４０１０‐５）におけるＣＤ１３３、ならびに結腸直腸癌（Ｄａｌｅｒｂａ  ｅｒ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（２４）１０１５８‐６３）、膵臓癌（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（３）：１０３０‐７）及び頭頸部扁平上皮癌（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（３）９７３‐８）におけるＣＤ４４などの、ある種の癌で標的とし得る抗原を有する。
【００６４】
多発性骨髄腫の治療については、例えばＣＤ３８及びＣＤ１３８（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００６；１２（１１‐１２）：３４５‐３４６；Ｔａｓｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４（１２）：３６８８‐９６）、ＣＤ７４（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，同書）、ＣＳ１（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８，１１２（４）：１３２９‐３７）及びＣＤ４０（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（１３）：５８９８‐５９０６）に対して、適切な標的化抗体が記載されている。
【００６５】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、生得的かつ適応的な免疫及びアポトーシスの重要な調節因子である。ＣＤ７４はＭＩＦの内在性受容体であることが報告されている（Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７‐７６）。ＭＩＦを介した細胞内経路に対する拮抗的な抗ＣＤ７４抗体の治療効果は、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌及び慢性リンパ球性白血病（例えば、Ｍｅｙｅｒ‐Ｓｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：３４；Ｓｈａｃｈａｒ＆Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６‐５４）；慢性関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患（Ｍｏｒａｎｄ＆Ｌｅｅｃｈ，２００５，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １０：１２‐２２；Ｓｈａｃｈａｒ＆Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６‐５４）；腎同種移植片拒絶（Ｌａｎ，２００８，Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０９：ｅ７９‐８３）などの腎疾患；及び多数の炎症性疾患（Ｍｅｙｅｒ‐Ｓｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  ｅｐｕｂ  Ｍａｒｃｈ  ２２，２００９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ  １０：３３などの幅広い範囲の疾患状態の治療に使用してもよく；ミラツズマブ（ｈＬＬ１）は、ＭＩＦ媒介性疾患の治療に用いる例示的な抗ＣＤ７４抗体である。
【００６６】
抗ＴＮＦ‐α抗体は当該分野で公知であり、自己免疫疾患、免疫機能不全（例えば、移植片対宿主病、臓器移植拒絶）または糖尿病などの免疫疾患の治療に有用であり得る。ＴＮＦ‐αに対する公知の抗体として、ヒト抗体ＣＤＰ５７１、マウス抗体ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ及びＭ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ロックフォード、イリノイ）；インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、マルバーン、ペンシルバニア）；セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ、ブリュッセル、ベルギー）；ならびにアダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ、アボットパーク、イリノイ）が挙げられる（Ｏｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：８８１‐８５）。これら及び多くの他の公知の抗ＴＮＦ‐α抗体は、特許請求の範囲に記載の方法及び組成物において使用してもよい。免疫調節不全または自己免疫疾患の治療に使用する他の抗体としては、ベルツズマブ、エプラツズマブ、ミラツズマブまたはｈＬ２４３などの抗Ｂ細胞抗体；トシリズマブ（抗ＩＬ‐６受容体）；バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）；ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）；エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）；ムロモナブ‐ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）；抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ、ブリュッセル、ベルギー）；ナタリズマブ（抗α４インテグリン）及びオマリズマブ（抗ＩｇＥ）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【００６７】
１型及び２型糖尿病は、ＣＤ２２（エプラツズマブ及びｈＲＦＢ４）、ＣＤ７４（ミラツズマブ）、ＣＤ１９（ｈＡ１９）、ＣＤ２０（ベルツズマブ）またはＨＬＡ‐ＤＲ（ｈＬ２４３）などのＢ細胞抗原に対する公知の抗体を用いて治療してもよい（例えば、Ｗｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １７：６１０‐１８参照）。抗ＣＤ３抗体もまた、１型糖尿病の治療のために提案されている（Ｃｅｒｎｅａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｖ  ２６：６０２‐０５）。
【００６８】
別の好ましい実施形態では、迅速に内部移行し、その後、再発現し、プロセシングを受け、そして細胞表面上に提示される抗体を使用して、細胞が循環する複合体を連続的に取り込み、及び癒着させることを可能にする。最も好ましい抗体／抗原対は、例えば、抗ＣＤ７４  ＭＡｂ（インバリアント鎖、クラスＩＩ特異的シャペロン、Ｉｉ）であるＬＬ１（例えば、米国特許第６，６５３，１０４号；第７，３１２，３１８号；その実施例の節は参照として本明細書に援用する）である。ＣＤ７４抗原は、Ｂ細胞リンパ腫（多発性骨髄腫を含む）及び白血病、特定のＴ細胞リンパ腫、黒色腫、結腸、肺及び腎臓の癌、神経膠芽腫、ならびにある種の他の癌で高度に発現する（Ｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９８：２９６‐３０２（１９９９））。癌におけるＣＤ７４抗体の使用の概説は、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｓｅｐ  １５；１３（１８  Ｐｔ２）：５５５６ｓ‐５５６３ｓに記載されており、前記文献は参照として本明細書に援用する。
【００６９】
好ましくは抗ＣＤ７４抗体で治療する疾患として、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、メラノーマ、肺癌、腎臓癌、結腸癌、多形神経膠芽腫、組織球腫、骨髄性白血病、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。ＣＤ７４抗原を標的細胞の表面上で短時間連続して発現させ、続いて抗原を内部移行させ、抗原を再発現させることにより、標的化ＬＬ１抗体を、それが保有する薬剤部分と共に内部移行させることが可能になる。これにより、そのような細胞の内部に、高濃度及び治療濃度のＬＬ１‐薬剤複合体を蓄積させることができる。内部移行させたＬＬ１‐薬剤複合体は、リソソーム及びエンドソームを介して循環し、薬剤部分は、標的細胞内において活性形態で放出される。
【００７０】
自己免疫疾患または免疫系機能不全（例えば、移植片対宿主病、臓器移植拒絶）を治療するために使用する抗体は、当該分野で公知であり、開示する方法及び組成物を用いてＳＮ‐３８と複合体化させてもよい。自己免疫／免疫不全疾患を治療するために使用する抗体は、ＢＣＬ‐１、ＢＣＬ‐２、ＢＣＬ‐６、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５５、ＣＤ７４、ＴＮＦ‐α、インターフェロン及びＨＬＡ‐ＤＲを含むが必ずしもこれらに限定されない例示的な抗原に結合し得る。上述のこれら及び他の標的抗原に結合する抗体を、自己免疫疾患または免疫機能不全疾患を治療するために使用してもよい。抗体または免疫複合体で治療してもよい自己免疫疾患として、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、アジソン病、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維性肺胞炎が挙げられ得る。
【００７１】
特許請求の範囲に記載の方法及び組成物の実施において、上記の抗体及び疾患関連抗原に対する他の公知の抗体をＣＰＴ複合体、より好ましくはＳＮ‐３８複合体として使用してもよい。
【００７２】
二重特異性及び多重特異性抗体
二重特異性抗体は、多数の生物医学的用途において有用である。例えば、腫瘍細胞表面抗原及びＴ細胞表面受容体に対する結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞による特異的腫瘍細胞の溶解を誘導することができる。神経膠腫及びＴ細胞上のＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体は、ヒト患者における脳腫瘍の治療に効果的に利用されている（Ｎｉｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ．１９９０；３５５：３６８‐３７１）。好ましい二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９抗体である。別の実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその断片を、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２２、抗ＣＤ３×抗ＨＬＡ‐ＤＲ、または抗ＣＤ３×抗ＣＤ７４などの別のＢ細胞関連抗原に対する抗体または断片に結合させてもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示する治療剤複合体化のための技術及び組成物を、標的化部分として二重特異性または多重特異性抗体と共に使用してもよい。
【００７３】
二重特異性または多重特異性抗体を産生するための多くの方法が公知であり、それらは、例えば米国特許第７，４０５，３２０号に開示されており、前記文献の実施例の節は参照として本明細書に援用する。二重特異性抗体は、それぞれ異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体を産生する２つの異なるハイブリドーマを融合させることを含むクアドローマ法によって産生することができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３；３０５：５３７‐５４０）。
【００７４】
二重特異性抗体を産生するための別の方法は、ヘテロ二官能性クロスリンカーを用いて２つの異なるモノクローナル抗体を化学的につなぎ合わせる（Ｓｔａｅｒｚ，ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１４：６２８‐６３１；Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１６：３５４‐３５６）。二重特異性抗体はまた、２つの親モノクローナル抗体の各々を、それぞれの半分子に還元し、次いで混合し、再酸化させてハイブリッド構造を得ることによっても産生することができる（Ｓｔａｅｒｚ  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８６；８３：１４５３‐１４５７）。別の代替方法は、別々に精製した２つまたは３つのＦａｂ′断片を、適切なリンカーを用いて化学的に架橋することを含む。（例えば、欧州特許出願第０４５３０８２号参照）。
【００７５】
他の方法として、レトロウイルス由来シャトルベクターを介して、それぞれの親ハイブリドーマへ別個の選択マーカーを遺伝子導入し、後に融合させることによって、ハイブリッドハイブリドーマの生成効率を向上させる（ＤｅＭｏｎｔｅ，ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０，８７：２９４１‐２９４５）か；または異なる抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を有する発現プラスミドを用いてハイブリドーマ細胞株を形質移入することが挙げられる。
【００７６】
同種ＶＨ及びＶＬドメインを、適切な組成及び長さ（通常は１２アミノ酸残基以上からなる）のペプチドリンカーと結合させ、結合活性を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。ｓｃＦｖの製造方法は、米国特許第４，９４６，７７８号及び米国特許第５，１３２，４０５号に開示されており、これらの各々の実施例の節は、参照として本明細書に援用する。ペプチドリンカーの長さを１２アミノ酸残基未満に減少させると、同じ鎖上のＶＨ及びＶＬドメインの対形成が妨げられ、ＶＨ及びＶＬドメインと他の鎖上の相補的ドメインとの対形成が強制され、その結果、機能的多量体が形成される。３〜１２アミノ酸残基のリンカーと結合しているＶＨ及びＶＬドメインのポリペプチド鎖は、主に二量体（二重特異性抗体と呼ばれる）を形成する。０〜２アミノ酸残基のリンカーでは、三量体（三重特異性抗体と呼ばれる）及び四量体（四重特異性抗体と呼ばれる）が選好されるが、オリゴマー化の正確なパターンは、リンカー長に加えて、組成物ならびにＶドメインの配向（ＶＨ‐リンカー‐ＶＬまたはＶＬ‐リンカー‐ＶＨ）に依存する。
【００７７】
多重特異性または二重特異性抗体を産生するためのこれらの技術は、低収率、精製の必要性、低い安定性または技術に労力を要する点で様々な困難を呈している。より最近では、「ドックアンドロック」（ＤＮＬ）として知られる技術を利用して、実質的に任意の所望の抗体、抗体断片及び他のエフェクター分子の組合せが産生されている（例えば米国特許第７，５２１，０５６号；第７，５２７，７８７号；第７，５３４，８６６号；第７，５５０，１４３号；第７，６６６，４００号；第７，８５８，０７０号；第７，８７１，６２２号；第７，９０６，１２１号；第７，９０６，１１８号；第８，１６３，２９１号；第７，９０１，６８０号；第７，９８１，３９８号；第８，００３，１１１号及び第８，０３４，３５２号を参照されたく、これらの各々の実施例の節は参照として本明細書に援用する）。この技術は、アンカードメイン（ＡＤ）ならびに二量体化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）と呼ばれる相補的タンパク質結合ドメインを利用し、これらのドメインは相互に結合して、二量体、三量体、四量体、五量体及び六量体に及ぶ複雑な構造の集合を可能にする。これらは、大規模な精製を必要とすることなく、高収率で安定な複合体を形成する。ＤＮＬ技術は、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体の集合を可能にする。二重特異性または多重特異性抗体を作製するための当該分野で公知の技術のいずれかを、本請求の方法の実施において利用してもよい。
【００７８】
様々な実施形態において、本明細書中に開示する複合体は、複合型多重特異性抗体の一部であってもよい。そのような抗体は、異なる特異性を有する２つ以上の異なる抗原結合部位を有する場合がある。多重特異性複合体は、同じ抗原の異なるエピトープに結合してもよく、あるいは２つの異なる抗原に結合してもよい。いくつかのより好ましい標的組合せとして、表１に列挙するものが挙げられる。これは、好ましい組合せの例を示すリストであるが、これがすべてであるということを意図するものではない。
【表１】
2018520140.tif 000004
2018520140.tif 000005
【００７９】
癌治療に好ましい他の組合せとして、ＣＤ２０＋ＣＤ２２抗体、ＣＤ７４＋ＣＤ２０抗体、ＣＤ７４＋ＣＤ２２抗体、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）＋ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ）抗体、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）＋ＣＥＡＣＡＭ５抗体、ＥＧＰ‐１（例えばＲＳ‐７）＋ＩＬＧＦ抗体、ＣＥＡＣＡＭ５＋ＥＧＦＲ抗体、ＩＬ６＋ＣＥＡＣＡＭ６抗体、ＣＤ７４及びＨＬＡ‐ＤＲ抗体、ならびにＣＤ２２及びＨＬＡ‐ＤＲ抗体が挙げられる。各々の実施例の節を参照として本明細書に援用する米国特許第６，０８３，４７７号、第６，１８３，７４４号及び第６，９６２，７０２号ならびに米国特許出願公開第２００３０１２４０５８号；第２００３０２１９４３３号；第２００４０００１８２５号；第２００４０２０２６６６号；第２００４０２１９１５６号；第２００４０２１９２０３号；第２００４０２３５０６５号；第２００５０００２９４５号；第２００５００１４２０７号；第２００５００２５７０９号；第２００５００７９１８４号；第２００５０１６９９２６号；第２００５０１７５５８２号；第２００５０２４９７３８号；第２００６００１４２４５号及び第２００６００３４７５９号に記載されているように、このような抗体は、組み合わせて用いる必要があるだけでなく、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの様々な形態の融合タンパク質として組み合わせることもできる。
【００８０】
ＤＯＣＫ‐ＡＮＤ‐ＬＯＣＫ（登録商標）（ＤＮＬ（登録商標））
好ましい実施形態において、二価または多価抗体は、ＤＯＣＫ‐ＡＮＤ‐ＬＯＣＫ（登録商標）（ＤＮＬ（登録商標））複合体として形成される（例えば、米国特許第７，５２１，０５６号；第７，５２７，７８７号；第７，５３４，８６６号；第７，５５０，１４３号；第７，６６６，４００号；７，８５８，０７０号；第７，８７１，６２２号；第７，９０６，１２１号；第７，９０６，１１８号；第８，１６３，２９１号；第７，９０１，６８０号；第７，９８１，３９８号；第８，００３，１１１号及び第８，０３４，３５２号参照）。一般的に、この技術は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットの二量体化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列と、様々なＡＫＡＰタンパク質のいずれかに由来するアンカードメイン（ＡＤ）配列との間に生じる特異的かつ高親和性の結合相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４．  Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＤＤＤ及びＡＤペプチドは、任意のタンパク質、ペプチドまたは他の分子に結合させてもよい。ＤＤＤ配列は自発的に二量体化してＡＤ配列に結合するため、この技術によってＤＤＤまたはＡＤ配列に結合し得る任意の選択した分子間の複合体を形成することができる。
【００８１】
標準的なＤＮＬ（登録商標）複合体は、１つのＡＤ連結分子に結合する２つのＤＤＤ結合分子を有する三量体を含むが、複合体構造の変化により、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体及び他の多量体の形成が可能である。いくつかの実施形態では、ＤＮＬ（登録商標）複合体は、同じ抗原決定基または２つ以上の異なる抗原に結合する２つ以上の抗体、抗体断片または融合タンパク質を含み得る。ＤＮＬ（登録商標）複合体はまた、１つ以上の他のエフェクター、例えば、タンパク質、ペプチド、免疫調節剤、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、結合タンパク質、ペプチドリガンド、担体タンパク質、毒素、オンコナーゼなどのリボヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡなどの阻害性オリゴヌクレオチド、抗原もしくは異種抗原、ＰＥＧなどのポリマー、酵素、治療剤、ホルモン、細胞傷害剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、または任意の他の分子もしくは凝集体も含む場合がある。
【００８２】
ＲサブユニットへのセカンドメッセンジャーｃＡＭＰの結合によって誘発されるシグナル伝達経路の最もよく研究されているものの１つにおいて中心的な役割を果たすＰＫＡは、１９６８年にウサギ骨格筋から初めて単離された（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットによって不活性形態に保持される２つの触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは２種類のＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）で見出され、各タイプはα及びβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。したがって、ＰＫＡ調節サブユニットの４つのアイソフォームは、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα及びＲＩＩβである。Ｒサブユニットは、安定な二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは、ＲＩＩαの最初の４４アミノ末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。以下に論じるように、他の調節サブユニットのアミノ酸配列の同様の部分は、二量体化及びドッキングに関与し、それぞれ、調節サブユニットのＮ末端近傍に位置する。ｃＡＭＰがＲサブユニットへ結合すると、広範なスペクトルのセリン／スレオニンキナーゼ活性のための活性触媒サブユニットが放出され、それは、ＡＫＡＰとのドッキングによるＰＫＡの区画化を介して選択した基質に向けられる（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５；２１５６１）。
【００８３】
最初のＡＫＡＰである微小管関連タンパク質２が１９８４年に特徴付けられて以来（Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）、細胞膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア、及び小胞体を含む様々な細胞内部位に局在する５０を上回るＡＫＡＰが、酵母からヒトに及ぶ種において多様な構造で同定されている（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性ヘリックスである（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰ間でかなり異なっており、ＲＩＩ二量体について報告されたその結合親和性は２〜９０ｎＭの範囲である（Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。ＡＫＡＰは二量体Ｒサブユニットにのみ結合する。ヒトＲＩＩαについては、ＡＤは２３残基のアミノ末端残基によって形成される疎水性表面に結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）。したがって、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメイン及びＡＫＡＰ結合ドメインは両方とも、同じＮ末端４４アミノ酸配列内に位置し（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１；２０：１６５１）、本明細書中ではその配列をＤＤＤと呼ぶ。
【００８４】
発明者らは、ヒトＰＫＡ調節サブユニットのＤＤＤ及びＡＫＡＰのＡＤを、以下でＡ及びＢと呼ぶ任意の２つのエンティティをドッキングさせて非共有複合体にし、さらに、戦略的位置でシステイン残基をＤＤＤ及びＡＤへ導入してジスルフィド結合の形成を促進することを介してＤＮＬ（登録商標）複合体に固定するための優れたリンカーモジュール対として利用するためのプラットフォーム技術を開発した。このアプローチの一般的な方法論は以下の通りである。エンティティＡは、ＤＤＤ配列をＡの前駆体に連結することによって構成され、以下ａと呼ぶ第一の成分をもたらす。ＤＤＤ配列は二量体の自発的形成に影響を与えると考えられるため、Ａはａ２からなる。エンティティＢは、ＡＤ配列をＢの前駆体に連結することによって構築され、以下ｂと呼ぶ第二の成分をもたらす。ａ２に含まれるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含まれるＡＤ配列への結合のためのドッキング部位を創出し、ａ２とｂとの容易な会合を促進してａ２ｂからなる二元三量体複合体を形成する。この結合事象は、ジスルフィド架橋形成を介して２つのエンティティを共有結合的に固定するその後の反応によって不可逆なものとされ、前記結合事象は、有効な局所濃度の原理に基づいて非常に効率的に起こり、なぜならば、最初の結合相互作用が、ＤＤＤとＡＤの両方に位置する反応性チオール基を近傍に位置させて部位特異的に連結するであろうからである（Ｃｈｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）。リンカー、アダプターモジュール及び前駆体の様々な組合せを使用して、異なる化学量論の多様なＤＮＬ（登録商標）構築物を作製及び使用してもよい（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号；第７，５２１，０５６号；第７，５３４，８６６号；第７，５２７，７８７号及び第７，６６６，４００号参照）。
【００８５】
２つの前駆体の官能基から離れた位置でＤＤＤとＡＤとを結合させることによって、そのような部位特異的連結はまた、２つの前駆体の元の活性を保持すると期待される。このアプローチは本質的にモジュール式であり、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、及び広範囲の活性を有する他のエフェクター部分を含む広範囲の物質を、部位特異的及び共有結合的に連結するために適用することができる。以下の実施例に記載のＡＤ及びＤＤＤ結合エフェクターを構築する融合タンパク質法を利用して、実質的に任意のタンパク質またはペプチドをＤＮＬ（登録商標）構築物に組み込み得る。しかしながら、必ずしもこの技術に限定するものではなく、他の複合体化法を利用してもよい。
【００８６】
核酸を合成、ハイブリダイゼーション、及び／または増幅して、目的の融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を産生することを含む、融合タンパク質の様々な作製方法が公知である。そのような二本鎖核酸は、標準的な分子生物学技術によって、融合タンパク質産生用の発現ベクターに挿入することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ，１９８９参照）。そのような好ましい実施形態において、ＡＤ及び／またはＤＤＤ部分を、エフェクタータンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合させてもよい。しかしながら、当業者であれば、エフェクター部分の化学的性質及びエフェクター部分の生理学的活性に関与する部分（複数可）に応じて、エフェクター部分へのＡＤまたはＤＤＤ部分の結合部位が変化し得ることを理解するであろう。様々なエフェクター部分の部位特異的結合を、当該技術分野で公知の技術、例えば、二価架橋試薬の使用及び／または他の化学的複合体化技術などを用いて行ってもよい。
【００８７】
様々な実施形態において、抗体または抗体断片を、例えば、以下に詳細に記載するように、ＤＤＤまたはＡＤ部分を抗体重鎖のＣ末端に結合させることによってＤＮＬ（登録商標）複合体に組み込んでもよい。より好ましい実施形態では、ＤＤＤまたはＡＤ部分、より好ましくはＡＤ部分を、抗体軽鎖のＣ末端に結合させてもよい（例えば、２０１３年５月２４日に出願された米国特許出願第１３／９０１，７３７号を参照されたく、その実施例の節は参照として本明細書に援用する）。
【００８８】
ＡＤ及びＤＤＤ部分における構造‐機能関連性
異なるタイプのＤＮＬ（登録商標）構築物に対して、異なるＡＤまたはＤＤＤ配列を利用してもよい。ＤＤＤ及びＡＤ配列の例を以下に示す。
ＤＤＤ１
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号ｌ）
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２）
ＡＤ１
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号４）
【００８９】
当業者であれば、ＤＤＤ１及びＤＤＤ２がプロテインキナーゼＡのヒトＲＩＩαアイソフォームのＤＤＤ配列に基づくことを理解するであろう。しかしながら、代替的な実施形態では、ＤＤＤ及びＡＤ部分は、プロテインキナーゼＡのヒトＲＩα型のＤＤＤ配列、及び以下のＤＤＤ３、ＤＤＤ３Ｃ及びＡＤ３に例示するような対応するＡＫＡＰ配列に基づく場合がある。
ＤＤＤ３
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号５）
ＤＤＤ３Ｃ
ＭＳＣＧＧＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号６）
ＡＤ３
ＣＧＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＧＣ（配列番号７）
【００９０】
他の代替的な実施形態では、ＡＤ及び／またはＤＤＤ部分の他の配列変異型をＤＮＬ（登録商標）複合体の構築に利用してもよい。例えば、ヒトＰＫＡ  ＤＤＤ配列には、ＰＫＡ  ＲＩα、ＲＩＩα、ＲＩβ及びＲＩＩβのＤＤＤ部分に相当するわずか４つの変異体のみが存在する。ＲＩＩα  ＤＤＤ配列は、上記で開示したＤＤＤ１及びＤＤＤ２の由来元である。４つのヒトＰＫＡ  ＤＤＤ配列を以下に示す。ＤＤＤ配列は、ＲＩＩαの１〜４４、ＲＩＩβの１〜４４、ＲＩαの１２〜６１及びＲＩβの１３〜６６残基までを示している（ＤＤＤ１の配列は、ヒトＰＫＡ  ＲＩＩαのＤＤＤ部分からわずかに改変していることに留意されたい）。
ＰＫＡ  ＲＩα
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＶＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＫＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号８）
ＰＫＡ  ＲＩβ
ＳＬＫＧＣＥＬＹＶＱＬＨＧＩＱＱＶＬＫＤＣＩＶＨＬＣＩＳＫＰＥＲＰＭＫＦＬＲＥＨＦＥＫＬＥＫＥＥＮＲＱＩＬＡ（配列番号９）
ＰＫＡ  ＲＩＩα
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＧＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＲＱ（配列番号１０）
ＰＫＡ  ＲＩＩβ
ＳＩＥＩＰＡＧＬＴＥＬＬＱＧＦＴＶＥＶＬＲＨＱＰＡＤＬＬＥＦＡＬＱＨＦＴＲＬＱＱＥＮＥＲ（配列番号１１）
【００９１】
ＡＤ及びＤＤＤドメインの構造‐機能関連性が研究の対象となっている（例えば、Ｂｕｒｎｓ‐Ｈａｍｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：２９８２‐９２；Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２‐３８；Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５‐５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７‐３０６；Ｓｔｏｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３‐９９；Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３‐９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７‐４０８を参照されたく、各々の全文は参照として本明細書に援用する）。
【００９２】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７‐４０８）は、ＡＤ‐ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造を調べ、ヒトＤＤＤ配列が、以下の配列番号１において下線を付して示す、二量体形成またはＡＫＡＰ結合のいずれかにおいて重要な多数の保存アミノ酸残基を含むことを突き止めた（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６の図１参照、参照として本明細書に援用）。当業者であれば、ＤＤＤ配列の配列変異型を設計する際には、下線を付した残基はいずれも変化させないことが望ましく、その一方で、二量体化及びＡＫＡＰ結合にあまり重要ではない残基については、保存的アミノ酸置換を作製してもよいことを理解するであろう。
【化２】
2018520140.tif 000006
【００９３】
以下により詳細に議論するように、２０種の一般的なＬ‐アミノ酸のそれぞれについて、保存的アミノ酸置換が特徴付けられている。したがって、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ（２００６）のデータ及び保存的アミノ酸置換に基づいて、配列番号１に基づく潜在的な代替ＤＤＤ配列を表２に示す。表２を考案するにあたっては、高度に保存的なアミノ酸置換のみを考慮した。例えば、荷電残基は同じ電荷の残基でのみ置換し、小さな側鎖を有する残基は同様のサイズの残基で置換し、ヒドロキシル側鎖は他のヒドロキシルでのみ置換した、などである。アミノ酸二次構造に与える影響が独特であることから、プロリンについては他の残基への置換は行わなかった。そのような潜在的な代替的ＤＤＤ部分の配列を、数を限定して、以下の配列番号１２〜配列番号３１に示す。当業者であれば、ＤＤＤ部分の属内のほぼ無限の数の代替種を、例えば市販のペプチド合成機または周知の部位特異的突然変異誘発技術を用いて、標準的技術によって構築できることを理解するであろう。ＡＤ部分結合に対するアミノ酸置換の効果もまた、例えばＡｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５‐５０）に開示されているような標準的な結合アッセイによって容易に決定し得る。
【表２】
2018520140.tif 000007
2018520140.tif 000008
【００９４】
Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５‐５０）は、様々なＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列のバイオインフォマティクス分析を行い、ＤＤＤに対する結合定数が０．４ｎＭのＡＫＡＰ‐ＩＳ（配列番号３）と呼ばれるＲＩＩ選択的ＡＤ配列を設計した。ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列は、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合のペプチド拮抗薬として設計した。置換がＤＤＤへの結合を減少させる傾向のあるＡＫＡＰ‐ＩＳ配列中の残基には、以下の配列番号３において下線を付している。当業者であれば、ＡＤ配列の配列変異型を設計する際に、下線を付した残基のいずれかを変更することを避けることが望ましく、その一方で、ＤＤＤ結合にあまり重要ではない残基については保存的アミノ酸置換を行ってもよいことを理解するであろう。表３は、上記表２のＤＤＤ１（配列番号１）について示したものと同様の、ＡＫＡＰ‐ＩＳ（ＡＤ１、配列番号３）の配列における潜在的な保存的アミノ酸置換を示している。
【００９５】
そのような潜在的な代替ＡＤ部分の配列を、以下の配列番号３２〜配列番号４９に、数を限定して示す。ここでもまた、当業者であれば、Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）のデータに基づいて、可能性のあるＡＤ部分配列の属内の極めて多数の種を、作製、試験及び使用することができる。Ａｌｔｏ（２００３）の図２は、実際の結合実験に基づいて、ＤＤＤ部分への結合活性を保持しながらも作製し得る多数の潜在的なアミノ酸置換を示していることに留意されたい。
【化３】
2018520140.tif 000009
【表３】
2018520140.tif 000010
【００９６】
Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ（２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３‐９５）は、結晶学及びペプチドスクリーニングを利用して、ＰＫＡのＲＩアイソフォームに比べてＲＩＩアイソフォームに対して５桁高い選択性を示すＳｕｐｅｒＡＫＡＰ‐ＩＳ配列（配列番号５０）を開発した。下線を付した残基は、ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列に比べてＲＩＩαのＤＤＤ部分への結合を高めるアミノ酸置換の位置を示す。この配列において、Ｎ末端のＱ残基は残基番号４として番号付けされ、Ｃ末端のＡ残基は残基番号２０である。置換してＲＩＩαに対する親和性に影響を及ぼすことができる残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９、及び２０であった（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。特定の代替の実施形態では、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ‐ＩＳ配列をＡＫＡＰ‐ＩＳ  ＡＤ部分の配列の代わりに用いてＤＮＬ（登録商標）構築物を調製し得ると考えられる。ＡＫＡＰ‐ＩＳ  ＡＤ配列を置換し得る他の代替配列を配列番号５１〜５３に示す。ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列に対する置換には下線を付している。配列番号４に示すＡＤ２配列と同様に、ＡＤ部分は付加的なＮ末端残基システイン及びグリシンならびにＣ末端残基グリシン及びシステインも含み得ることが予想される。
【化４】
2018520140.tif 000011
【００９７】
Ｇｏｌｄらの図２は、以下に示す様々なＡＫＡＰタンパク質由来のさらなるＤＤＤ結合配列を開示した。
［ＲＩＩ特異的ＡＫＡＰ］
ＡＫＡＰ‐ＫＬ
ＰＬＥＹＱＡＧＬＬＶＱＮＡＩＱＱＡＩ（配列番号５４）
ＡＫＡＰ７９
ＬＬＩＥＴＡＳＳＬＶＫＮＡＩＱＬＳＩ（配列番号５５）
ＡＫＡＰ‐Ｌｂｃ
ＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫ（配列番号５６）
［ＲＩ特異的ＡＫＡＰ］
ＡＫＡＰｃｅ
ＡＬＹＱＦＡＤＲＦＳＥＬＶＩＳＥＡＬ（配列番号５７）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＶＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴ（配列番号５８）
ＰＶ３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦ（配列番号５９）
［二重特異的ＡＫＡＰ］
ＡＫＡＰ７
ＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶ（配列番号６０）
ＭＡＰ２Ｄ
ＴＡＥＥＶＳＡＲＩＶＱＶＶＴＡＥＡＶ（配列番号６１）
ＤＡＫＡＰ１
ＱＩＫＱＡＡＦＱＬＩＳＱＶＩＬＥＡＴ（配列番号６２）
ＤＡＫＡＰ２
ＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ（配列番号６３）
【００９８】
Ｓｔｏｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３‐９９）はまた、配列番号６４〜６６に示すＰＫＡに結合するＡＫＡＰのペプチド競合物を開発した。ペプチド拮抗薬は、Ｈｔ３１（配列番号６４）、ＲＩＡＤ（配列番号６５）及びＰＶ‐３８（配列番号６６）と命名された。Ｈｔ‐３１ペプチドはＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対してより大きな親和性を示したが、一方で、ＲＩＡＤ及びＰＶ‐３８はＲＩに対してより高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号６４）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号６５）
ＰＶ‐３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号６６）
【００９９】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７‐３０６）は、ＲＩＩ型のＰＫＡのＤＤＤに対して０．４ｎＭという低い結合定数を有する、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合に対するさらに他のペプチド競合物質を開発した。様々なＡＫＡＰ拮抗薬ペプチドの配列は、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒらの表１に提供されており、以下の表４にそれらを再掲する。ＡＫＡＰＩＳは合成ＲＩＩサブユニット結合ペプチドを表す。他のすべてのペプチドは、示したＡＫＡＰのＲＩＩ結合ドメインに由来する。
【表４】
2018520140.tif 000012
【０１００】
異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン間で高度に保存された残基を、ＡＫＡＰ  ＩＳ配列（配列番号３）を参照して下線を付すことにより以下に示す。これらの残基は、Ｃ末端アラニン残基の付加とともに、Ａｌｔｏら（２００３）によって観察されたものと同じである。（Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）の図４参照、参照として本明細書に援用）。ＲＩＩ  ＤＤＤ配列に対して特に高い親和性を有するペプチド拮抗薬の配列は、ＡＫＡＰ‐ＩＳ、ＡＫＡＰ７δ‐ｗｔ‐ｐｅｐ、ＡＫＡＰ７δ‐Ｌ３０４Ｔ‐ｐｅｐ及びＡＫＡＰ７δ‐Ｌ３０８Ｄ‐ｐｅｐのものであった。
【化５】
2018520140.tif 000013
【０１０１】
Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２‐３８）は、ヒト及び非ヒトタンパク質由来の異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の程度を調べ、異なるＤＤＤ部分の中で最も高度に保存されていると思われるＤＤＤ配列中の残基を同定した。これらを、配列番号１のヒトＰＫＡ  ＲＩＩαＤＤＤ配列を参照して下線を付して示す。特に保存された残基は、イタリック体でさらに示す。これらの残基は、ＡＫＡＰタンパク質への結合に重要な残基としてＫｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）が提案したものと重複するが、同一ではない。当業者であれば、ＤＤＤの配列変異型を設計する際に、最も保存された残基（イタリック体）の変更を避けることが最も好ましく、保存された残基（下線部）の変更も避けることが好ましく、一方で、下線でもイタリック体でもない残基については、考慮してもよいことを理解するであろう。
【化６】
2018520140.tif 000014
【０１０２】
Ｃａｒｒら（２００１）のデータに基づいて、ＤＤＤ１（配列番号１）配列について改変した保存的アミノ酸置換のセットを表５に示す。置換配列を減少させたこのセットであっても、過度の実験をすることなく、当業者が生成、試験及び使用してもよい多数の可能な代替のＤＤＤ部分の配列が存在する。当業者であれば、表２及び表３について上記に開示したようなそのような代替のＤＤＤアミノ酸配列を容易に誘導することができる。
【表５】
2018520140.tif 000015
【０１０３】
当業者であれば、ＤＤＤまたはＡＤアミノ酸配列中のこれら及び他のアミノ酸置換を利用して、当該分野において標準的な技術と通常の実験のみを用いて、ＡＤまたはＤＤＤ部分の属内で代替種を産生し得ることを理解するであろう。
【０１０４】
抗体アロタイプ
治療用抗体の免疫原性は、注入反応の危険性の増加及び治療応答の持続時間の低下に関連する（Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：６０２‐０８）。治療用抗体が宿主において免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプによって部分的に決定し得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３‐２１）。抗体アロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置でのアミノ酸配列変化に関連する。重鎖γ型定常領域を含むＩｇＧ抗体のアロタイプは、Ｇｍアロタイプ（１９７６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７：１０５６‐５９）と呼ばれる。
【０１０５】
一般的なＩｇＧ１ヒト抗体については、最も一般的なアロタイプはＧ１ｍ１である（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３‐２１）。しかしながら、Ｇ１ｍ３アロタイプは、白人でも頻繁に発生する（同書）。Ｇ１ｍ１抗体は、Ｇ１ｍ３患者などの非Ｇ１ｍ１（ｎＧ１ｍ１）レシピエントに投与した場合に免疫応答を誘導する傾向があるアロタイプ配列を有することが報告されている（同書）。非Ｇ１ｍ１アロタイプ抗体は、Ｇ１ｍ１患者に投与した場合、免疫原性ではない（同書）。
【０１０６】
ヒトＧ１ｍ１アロタイプは、重鎖ＩｇＧ１のＣＨ３配列内のＫａｂａｔ位置３５６にアミノ酸アスパラギン酸及びＫａｂａｔ位置３５８にロイシンを有する。ｎＧ１ｍ１アロタイプは、Ｋａｂａｔ位置３５６にグルタミン酸及びＫａｂａｔ位置３５８にメチオニンを有する。Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１アロタイプの両方は、Ｋａｂａｔ位置３５７にグルタミン酸残基を有し、アロタイプはＤＥＬ及びＥＥＭアロタイプと呼ばれることがある。例示的な抗体リツキシマブ（配列番号８５）及びベルツズマブ（配列番号８６）について、Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１アロタイプ抗体の重鎖定常領域配列の非限定的な例を示す。
リツキシマブ重鎖可変領域配列（配列番号８５）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＡＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ベルツズマブ重鎖可変領域（配列番号８６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１０７】
Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９，ｍＡｂｓ  １：１‐７）は、ＩｇＧアロタイプに特徴的な配列変異及び免疫原性に対するそれらの効果をレビューした。彼らは、Ｇ１ｍ３アロタイプがＫａｂａｔ２１４位のアルギニン残基を特徴とすることを、Ｇ１ｍ１７アロタイプのＫａｂａｔ  ２１４のリジン残基と比較して報告した。ｎＧ１ｍ１，２アロタイプは、Ｋａｂａｔ３５６位のグルタミン酸、Ｋａｂａｔ３５８位のメチオニン及びＫａｂａｔ４３１位のアラニンを特徴としていた。Ｇ１ｍ１，２アロタイプは、Ｋａｂａｔ３５６位のアスパラギン酸、Ｋａｂａｔ３５８位のロイシン及びＫａｂａｔ４３１位のグリシンを特徴としていた。重鎖定常領域配列変異型に加えて、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｅｆｒａｎｃ（２００９）は、Ｋａｂａｔ１５３位のバリン及びＫａｂａｔ１９１位のロイシンを特徴とするＫｍ１アロタイプ、Ｋａｂａｔ１５３位のアラニン及びＫａｂａｔ１９１位のロイシンを特徴とするＫｍ１，２アロタイプ、ならびにＫａｂａｔ１５３位のアラニン及びＫａｂａｔ１９１位のバリンを特徴とするＫｍ３アロタイプを有するκ軽鎖定常領域のアロタイプ変異型を報告した。
【０１０８】
治療用抗体に関して、ベルツズマブ及びリツキシマブは、広範多種の血液悪性腫瘍の治療に使用するための、ＣＤ２０に対する、それぞれヒト化及びキメラＩｇＧ１抗体である。表６は、リツキシマブとベルツズマブのアロタイプ配列を比較する。表６に示すように、リツキシマブ（Ｇ１ｍ１７，１）は、ＤＥＬアロタイプＩｇＧ１であり、Ｋａｂａｔ２１４位（重鎖ＣＨ１）に追加の配列変異を有し、ベルツズマブではアルギニンであるのに対し、リツキシマブではリジンである。ベルツズマブは、リツキシマブよりも被験体において免疫原性が低いことが報告されており（例えば、Ｍｏｒｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：３３４６‐５３；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１３：１０６２‐７０；Ｒｏｂａｋ＆Ｒｏｂａｋ，２０１１，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５：１３‐２５）、これはヒト化抗体とキメラ抗体の違いに起因する。しかしながら、ＥＥＭとＤＥＬアロタイプの間のアロタイプの差異も、ベルツズマブの低い免疫原性の原因である可能性が高い。
【表６】
2018520140.tif 000016
【０１０９】
ｎＧ１ｍ１遺伝子型の個体における治療用抗体の免疫原性を低下させるために、Ｋａｂａｔ２１４位のアルギニンを特徴とするＧ１ｍ３アロタイプ、ならびにＫａｂａｔ３５６位のグルタミン酸、Ｋａｂａｔ３５８位のメチオニン、及びＫａｂａｔ４３１位のアラニンを特徴とするｎＧ１ｍ１，２ヌル‐アロタイプを特徴とする抗体のアロタイプを選択することが望ましい。驚くべきことに、長期間にわたるＧ１ｍ３抗体の皮下投与の繰り返しが、有意な免疫応答をもたらさないことを見出した。代替実施形態では、Ｇ１ｍ３アロタイプと共通するヒトＩｇＧ４重鎖は、Ｋａｂａｔ２１４にアルギニン、Ｋａｂａｔ３５６にグルタミン酸、Ｋａｂａｔ３５９にメチオニン、Ｋａｂａｔ４３１にアラニンを有する。それらの位置は、少なくとも部分的に免疫原性に関係していると考えられ、治療用抗体にヒトＩｇＧ４重鎖定常領域配列を用いることも、好ましい実施形態である。Ｇ１ｍ３  ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体との併用もまた、治療的投与に有用である場合がある。
【０１１０】
［アミノ酸置換］
別の実施形態では、開示する方法及び組成物は、１つ以上の置換アミノ酸残基を有するタンパク質またはペプチドの生成及び使用を含む場合がある。例えば、ＤＮＬ（登録商標）構築物の作製に使用するＤＤＤ及び／またはＡＤ配列を、上記のように改変してもよい。
【０１１１】
当業者であれば、一般的に、アミノ酸置換は、通常、あるアミノ酸から比較的類似の性質の別のアミノ酸への置換（すなわち、保存的アミノ酸置換）を伴うことを認識するであろう。様々なアミノ酸の特性ならびにタンパク質構造及び機能に対するアミノ酸置換の効果は、当該分野における広範な研究及び知識の対象である。
【０１１２】
例えば、アミノ酸の疎水性度を考慮してもよい（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５‐１３２）。アミノ酸の相対的な疎水性の特性は、得られたタンパク質の二次構造に寄与し、これは次にタンパク質と他の分子との相互作用を規定する。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）に基づいて疎水性度を割り当てられており、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；アルギニン（−４．５）である。保存的置換を行うには、疎水性度が±２以内であるアミノ酸の使用が好ましく、±１以内がより好ましく、±０．５以内がさらに好ましい。
【０１１３】
アミノ酸置換には、アミノ酸残基の親水性を考慮に入れてもよい（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。親水性値は、アミノ酸残基に以下のように割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０）；グルタミン酸（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。親水性が類似する他のアミノ酸への置換が好ましい。
【０１１４】
他の考慮事項としては、アミノ酸側鎖の大きさが挙げられる。例えば、コンパクトな側鎖、例えばグリシンまたはセリンを有するアミノ酸と、嵩高い側鎖、例えばトリプトファンまたはチロシンを有するアミノ酸とを置換することは、一般的に好ましくない。タンパク質の二次構造に及ぼす様々なアミノ酸残基の影響も考慮すべきである。経験的研究を通じて、タンパク質ドメインがαヘリカル、βシートまたは逆ターンの二次構造をとる傾向に及ぼす、異なるアミノ酸残基の効果が決定されており、当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｈｏｕ＆Ｆａｓｍａｎ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２‐２４５；１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１‐２７６；１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７‐３８４参照）。
【０１１５】
そのような考慮及び広範な実験的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の表が構築されており、当該分野で公知である。例えば：アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；バリン、ロイシン及びイソロイシンである。あるいは：Ａｌａ（Ａ）  ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）  ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）  ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）  ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）  ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）  ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）  ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）  ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）  ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）  ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）  ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）  ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）  ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）  ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）  ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）  ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）  ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）  ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）  ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａである。
【０１１６】
アミノ酸置換に関する他の考慮事項として、残基がタンパク質の内部に位置するか、または溶媒に露出するかが挙げられる。内部残基については、保存的置換として、ＡｓｐとＡｓｎ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＳｅｒとＡｌａ；ＴｈｒとＡｌａ；ＡｌａとＧｌｙ；ＩｌｅとＶａｌ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＬｅｕとＭｅｔ；ＰｈｅとＴｙｒ；ＴｙｒとＴｒｐが挙げられる。（例えば、ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕのＰＲＯＷＬウェブサイト参照）。溶媒に露出する残基の場合、保存的置換として、ＡｓｐとＡｓｎ；ＡｓｐとＧｌｕ；ＧｌｕとＧｌｎ；ＧｌｕとＡｌａ；ＧｌｙとＡｓｎ；ＡｌａとＰｒｏ；ＡｌａとＧｌｙ；ＡｌａとＳｅｒ；ＡｌａとＬｙｓ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＬｙｓとＡｒｇ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＩｌｅとＶａｌ；ＰｈｅとＴｙｒが挙げられる（同書）。ＰＡＭ２５０スコアマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、Ｌｅｖｉｎマトリックス及びＲｉｓｌｅｒマトリックスなどのアミノ酸置換の選択を支援する様々なマトリックスが構築されている（同書）。
【０１１７】
アミノ酸置換を決定する際に、正に荷電した残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負に荷電した残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）との間のイオン結合（塩橋）、または近くのシステイン残基間のジスルフィド結合の形成などの、分子間または分子内結合の存在を考慮してもよい。
【０１１８】
コードするタンパク質配列中の任意のアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換する方法は、当業者には周知及び日常的実験事項であって、例えば部位特異的突然変異誘発の技術によって、またはアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドの合成及び組立て、ならびにつなぎ合わせて発現ベクター構築物にすることによって、これを行う。
【０１１９】
アビマー
特定の実施形態では、本明細書に記載の結合部分は、１つ以上のアビマー配列を含む場合がある。アビマーは、様々な標的分子に対するそれらの親和性及び特異性の点で、抗体と幾分類似した結合タンパク質のクラスである。それらは、ヒト細胞外受容体ドメインを元に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏエキソンシャッフリング及びファージディスプレイによって開発された（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３‐９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）。得られたマルチドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質に比べて高い親和性（いくつかの場合ではｎＭ以下）及び特異性を示し得る複数の独立した結合ドメインを有し得る（同書）。様々な実施形態において、特許請求の範囲に記載の方法及び組成物において使用するために、アビマーを、例えばＤＤＤ及び／またはＡＤ配列に結合させてもよい。アビマーの構築方法及び使用方法に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、第２００５００４８５１２号、第２００５００５３９７３号、第２００５００８９９３２号及び第２００５０２２１３８４号に開示されており、その各々の実施例の節は、参照として本明細書に援用する。
【０１２０】
ファージディスプレイ
特許請求の範囲に記載の組成物及び／または方法の特定の実施形態は、様々な標的分子、細胞または組織の結合ペプチド及び／またはペプチド模倣物に関する場合がある。結合ペプチドは、ファージディスプレイ技術を含むが必ずしもこれに限定されない当該技術分野で公知の任意の方法によって同定してもよい。様々なファージディスプレイ法及びペプチドの多様な集団を作製するための技術は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；第５，６２２，６９９号及び第６，０６８，８２９号は、ファージライブラリーの調製方法を開示している。ファージディスプレイ技術は、低分子ペプチドがその表面に発現できるように遺伝子改変したバクテリオファージを含む（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５‐１３１７；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１：２２８‐２５７）。ペプチドに加えて、一本鎖抗体などのより大きなタンパク質ドメインを、ファージ粒子の表面上に提示させてもよい（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７‐３８０）。
【０１２１】
所与の臓器、組織、細胞型または標的分子に選択的な標的化アミノ酸配列を、パニングによって単離してもよい（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４‐３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９‐１６２）。簡潔に述べると、推定上の標的化ペプチドを含有するファージのライブラリーを、インタクトな生物に、または単離した器官、組織、細胞型もしくは標的分子に投与し、結合したファージを含有する試料を回収する。標的に結合するファージを、標的の臓器、組織、細胞型または標的分子から溶出し、次いでそれらを宿主細菌中で増殖させることによって増幅してもよい。
【０１２２】
特定の実施形態では、ファージを、パニングのラウンドの間に宿主細菌内で増殖させてもよい。ファージによって溶解されるのではなく、バクテリアは代わりに、特定の挿入物を提示するファージの複数のコピーを分泌し得る。所望であれば、増幅したファージを標的器官、組織、細胞型または標的分子に再度曝露し、さらなるラウンドのパニングのために回収してもよい。選択的または特異的結合剤の集団が得られるまで、複数ラウンドのパニングを行ってもよい。ファージゲノム中の標的化ペプチド挿入物に対応するＤＮＡを配列決定することによって、ペプチドのアミノ酸配列を決定してもよい。次いで、同定した標的化ペプチドを、標準的なタンパク質化学技術（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）によって合成ペプチドとして産生してもよい。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、サブトラクションプロトコールを使用して、バックグラウンドファージ結合をさらに減少させてもよい。サブトラクションの目的は、目的の標的以外の標的に結合するファージをライブラリーから除去することである。代替の実施形態において、ファージライブラリーを、対照の細胞、組織または器官に対して予めスクリーニングしてもよい。例えば、腫瘍結合ペプチドを、対照の正常細胞株に対してライブラリーを予めスクリーニングした後に同定してもよい。サブトラクションの後に、ライブラリーを目的の分子、細胞、組織または器官に対してスクリーニングしてもよい。サブトラクションプロトコールの他の方法が公知であり、例えば米国特許第５，８４０，８４１号、第５，７０５，６１０号、第５，６７０，３１２号及び第５，４９２，８０７号に開示されているように、特許請求の範囲に記載の方法の実施において使用してもよい。
【０１２４】
アプタマー
特定の実施形態では、使用する標的化部分は、アプタマーであってもよい。アプタマーの結合特性を構築及び決定する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、そのような技術は、米国特許第５，５８２，９８１号、第５，５９５，８７７号及び第５，６３７，４５９号に記載されており、各々の実施例の節は、参照として本明細書に援用する。目的の特定の標的に結合するアプタマーの調製方法及びスクリーニング方法は、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、米国特許第５，２７０，１６３号で周知であり、各々の実施例の節は、参照として本明細書に援用する。
【０１２５】
アプタマーは、合成、組換え、及び精製方法を含む任意の公知の方法によって調製してもよく、単独で、または同じ標的に特異的な他のリガンドと併用してもよい。一般的に、特異的結合を達成するためには、最小約３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５ヌクレオチドが必要である。１０、２０、３０または４０ヌクレオチドのアプタマーが好ましい場合があるが、１０塩基より短い配列のアプタマーが実現可能であり得る。
【０１２６】
アプタマーは、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ分子として単離、配列決定、及び／または増幅もしくは合成してもよい。あるいは、目的のアプタマーは、修飾オリゴマーを有していてもよい。アプタマーに通常存在する任意のヒドロキシル基は、ホスホン酸基、リン酸基で置換するか、標準的な保護基で保護するか、もしくは活性化して他のヌクレオチドとのさらなる結合を調製してもよく、または固体支持体に結合させてもよい。１つ以上のホスホジエステル結合を代替の結合基で置換してもよく、例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏを、Ｐ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ′、ＣＯ、またはＣＮＲ２で置換してもよく、式中、Ｒは、Ｈまたはアルキル（１〜２０Ｃ）であり、Ｒ′はアルキル（１〜２０Ｃ）であり；さらに、この基は、ＯまたはＳを介して隣接するヌクレオチドに結合させてもよい。オリゴマー中のすべての結合が同一である必要はない。
【０１２７】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ及びＦｙｎｏｍｅｒ
特定の代替の実施形態は、抗体の代わりにＡｆｆｉｂｏｄｙを利用する場合がある。Ａｆｆｉｂｏｄｙは、Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ（ソルナ、スウェーデン）から市販されている。Ａｆｆｉｂｏｄｙは、抗体模倣物として機能し、標的分子への結合に用いる小タンパク質である。Ａｆｆｉｂｏｄｙは、αヘリックスタンパク質骨格（Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ８：６０１‐８；Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：７７２‐７７）上におけるコンビナトリアルエンジニアリングによって開発された。Ａｆｆｉｂｏｄｙ設計は、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインを備える３つのヘリックスバンドル構造に基づいている（Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；１９９７）。広範囲の結合親和性を有するＡｆｆｉｂｏｄｙは、細菌プロテインＡのＦｃ結合活性に関与する１３個のアミノ酸の無作為化によって産生し得る（Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；１９９７）。無作為化後、突然変異タンパク質のファージディスプレイによるスクリーニングのために、ＰＣＲ増幅ライブラリーをファージミドベクターにクローニングした。標的抗原に対する１つ以上のＡｆｆｉｂｏｄｙを同定するために、ファージディスプレイライブラリーを、標準的なファージディスプレイスクリーニング技術（例えば、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４‐３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９‐１６２）を用いてスクリーニングしてもよい。
【０１２８】
ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な１７７Ｌｕ標識Ａｆｆｉｂｏｄｙは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＥＲ２発現異種移植片を標的とすることが実証されている（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：２７７３‐８２）。低分子量放射性標識化合物の蓄積による腎毒性は当初問題であったが、アルブミンへの可逆的結合が腎臓蓄積を低減し、標識Ａｆｆｉｂｏｄｙによる放射性核種に基づく治療を可能にした（同書）。
【０１２９】
放射性標識したＡｆｆｉｂｏｄｙをｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍画像化に利用する可能性が、近年、示された（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ２２：８９４‐９０２）。マレイミド誘導体化ＮＯＴＡを抗ＨＥＲ２  Ａｆｆｉｂｏｄｙに結合させ、１１１Ｉｎで放射性標識した（同書）。ＨＥＲ２発現ＤＵ‐１４５異種移植片を有するマウスへの投与と、その後のガンマカメラ画像化により、異種移植片を視覚化することができた（同書）。
【０１３０】
Ｆｙｎｏｍｅｒもまた、抗体と同様の親和性及び特異性を有する標的抗原に結合することができる。Ｆｙｎｏｍｅｒは、結合分子の集合のための足場としてのヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに基づいている。Ｆｙｎ  ＳＨ３ドメインは、細菌中で、高収率で産生可能な、完全ヒト型の６３アミノ酸からなるタンパク質である。Ｆｙｎｏｍｅｒ同士を連結して、２つ以上の異なる抗原標的に対する親和性を有する多重特異性結合タンパク質を生成してもよい。Ｆｙｎｏｍｅｒは、ＣＯＶＡＧＥＮ  ＡＧ（チューリッヒ、スイス）から市販されている。
【０１３１】
当業者であれば、ＡｆｆｉｂｏｄｙまたはＦｙｎｏｍｅｒが、特許請求の範囲に記載の方法及び組成物の実施において標的分子として用い得ることを理解するであろう。
【０１３２】
複合体化プロトコール
好ましい複合体化プロトコールは、中性または酸性ｐＨで促進されるチオール‐マレイミド、チオール‐ビニルスルホン、チオール‐ブロモアセトアミドまたはチオール‐ヨードアセトアミド反応に基づく。これは、例えば、活性エステルを使用する場合に必要とされるような、複合体化のためのより高いｐＨ条件の必要性を排除する。例示的な複合体化プロトコールのさらなる詳細を、以下の実施例の節に記載する。
【０１３３】
治療処置
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体または免疫複合体の治療有効量を、好ましくはＰＡＲＰ阻害剤、微小管阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤及び／またはＰＩ３Ｋ阻害剤と併用して、被験体に投与することを含む、被験体の治療方法に関する。本明細書に記載の抗体または免疫複合体で治療し得る疾患として、例えば別のＣＤ２２エピトープ（ｈＲＦＢ４）に対するｈＬＬ２  ＭＡｂ（エプラツズマブ、米国特許第６，１８３，７４４号参照）などの抗ＣＤ２２抗体、または、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０もしくはＨＬＡ‐ＤＲのような他のＢ細胞抗原に対する抗体を用いるＢ細胞悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病）が挙げられるが、必ずしもこれに限定するものではない。他の疾患として、内皮由来消化器系上皮腺癌、乳癌及び非小細胞肺癌などの癌、及び他の癌腫、肉腫、グリア系腫瘍、骨髄性白血病などが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。特に、例えば、胃腸管、胃、結腸、食道、肝臓、肺、乳、膵臓、肝臓、前立腺、卵巣、精巣、脳、骨もしくはリンパ性腫瘍、肉腫またはメラノーマなどの悪性固形腫瘍もしくは造血器腫瘍が産生するか、またはそれらに関連する抗原、例えば癌胎児性抗原に対する抗体が効果的に使用される。そのような治療剤は、病状及び複合体の忍容性に応じて、１回または反復して投与することができ、必要に応じて、手術、体外放射線、放射免疫療法、免疫療法、化学療法、アンチセンス療法、干渉ＲＮＡ療法、遺伝子治療などの他の治療様式と組み合わせることができる。各々の組合せは、腫瘍の種類、段階、患者の状態及び前治療、ならびに管理医師が考慮する他の要因に適合させる。
【０１３４】
本明細書中で使用する場合、用語「被験体」とは、ヒトを含む哺乳類を含むが、必ずしもこれに限定されない任意の動物（すなわち、脊椎動物及び無脊椎動物）を指す。本用語は、特定の年齢または性別に限定することを意図するものではない。したがって、成人及び新生児被験体、ならびに胎児（雌雄に関わらず）は、この用語に包含される。本明細書中で指定する用量はヒトに対するものであるが、体重または平方メートルの大きさに応じて、他の哺乳類ならびに子供のサイズに調整することができる。抗体または免疫複合体をヒト被験体に投与する場合、当業者であれば、抗体または免疫複合体が結合する標的抗原がヒト抗原であることを理解するであろう。
【０１３５】
好ましい実施形態では、その実施例の節を本明細書に援用する、米国特許第７，２３８，７８５号；第７，５１７，９６４号及び第８，０８４，５８３号に記載されるように、ｈＲＳ７  Ｍａｂなどの抗ＥＧＰ‐１（抗Ｔｒｏｐ‐２）抗体を含む抗体または免疫複合体を使用して、癌腫、例えば、食道、膵臓、肺、胃、結腸及び直腸、膀胱、乳、卵巣、子宮、腎臓ならびに前立腺などの癌腫を治療することができる。ｈＲＳ７抗体は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号９０）；ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号９１）；及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号９２）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号９３）；ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号９４）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号９５）を有するヒト化抗体である。
【０１３６】
別の好ましい実施形態では、各々の実施例の節を参照として本明細書に援用する、米国特許第７，５４１，４４０号；第７，９５１，３６９号；第５，８７４，５４０号；第６，６７６，９２４号及び第８，２６７，８６５号に開示されているように、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体（例えば、ｈＭＮ‐１４、ラブレツズマブ）及び／または抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体（例えば、ｈＭＮ‐３またはｈＭＮ‐１５）を含む抗体または免疫複合体を使用して、ＣＥＡＣＡＭ５及び／またはＣＥＡＣＡＭ６を発現する様々な癌を治療してもよい。抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＣＥＡＣＡＭ６、またはその２つを併用して治療し得る固形腫瘍として、乳癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、口腔癌及び胃癌が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。胃腸、呼吸器、尿生殖器及び乳癌を含む腺癌の大部分は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現し、本発明の抗体または免疫複合体で治療し得る。ｈＭＮ‐１４抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＧＴＳＶＡ；配列番号９６）、ＣＤＲ２（ＷＴＳＴＲＨＴ；配列番号９７）及びＣＤＲ３（ＱＱＹＳＬＹＲＳ；配列番号９８）ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＴＹＷＭＳ；配列番号９９）、ＣＤＲ２（ＥＩＨＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ；配列番号１００）及びＣＤＲ３（ＬＹＦＧＦＰＷＦＡＹ；配列番号１０１）を有するヒト化抗体である。ｈＭＮ‐３抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、配列番号１０２）、ＣＤＲ２（ＫＶＳＮＲＦＳ、配列番号１０３）及びＣＤＲ３（ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ、配列番号１０４）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１０５）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号１０６）及びＣＤＲ３（ＫＧＷＭＤＦＮＳ  ＳＬＤＹ、配列番号１０７）を有するヒト化抗体である。ｈＭＮ‐１５抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＳＡＳＳＲＶＳＹＩＨ（配列番号１０８）を有するヒト化抗体である。ＧＴＳＴＬＡＳ（配列番号１０９）；及びＱＱＷＳＹＮＰＰＴ（配列番号１１０）；ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列ＤＹＹＭＳ（配列番号１１１）；ＦＩＡＮＫＡＮＧＨＴＴＤＹＳＰＳＶＫＧ（配列番号１１２）；及びＤＭＧＩＲＷＮＦＤＶ（配列番号１１３）を有するヒト化抗体である。
【０１３７】
別の好ましい実施形態では、抗ＣＤ７４抗体（例えばｈＬＬ１、すなわちミラツズマブであり、これは、米国特許第７，０７４，４０３号；第７，３１２，３１８号；第７，７７２，３７３号；第７，９１９，０８７号；及び第７，９３１，９０３号に開示されており、各々の実施例の節は参照として本明細書に援用する）を含む抗体または免疫複合体を使用して、腎臓癌、肺癌、腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌または卵巣癌、ならびに多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫及びホジキンリンパ腫などのいくつかの血液癌を含むが必ずしもこれらに限定されないＣＤ７４を発現する様々な癌のいずれかを治療してもよい。ｈＬＬ１抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ；配列番号１１４）、ＣＤＲ２（ＴＶＳＮＲＦＳ；配列番号１１５）及びＣＤＲ３（ＳＱＳＳＨＶＰＰＴ；配列番号１１６）、ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＶＮ；配列番号１１７）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ；配列番号１１８）及びＣＤＲ３（ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ；配列番号１１９）を有するヒト化抗体である。
【０１３８】
別の好ましい実施形態では、抗ＣＤ２２抗体（例えば、米国特許第５，７８９，５５４号；第６，１８３，７４４号；第６，１８７，２８７号；第６，３０６，３９３号；第７，０７４，４０３号及び第７，６４１，９０１号に開示され、各々の実施例の節を参照として本明細書に援用するｈＬＬ２、すなわちエプラツズマブか、またはキメラもしくはヒト化ＲＦＢ４抗体）を含む抗体もしくは免疫複合体を使用して、緩慢性Ｂ細胞リンパ腫、進行性Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫またはびまん性Ｂ細胞リンパ腫を含むが必ずしもこれらに限定されないＣＤ２２を発現する任意の様々な癌を治療してもよい。ｈＬＬ２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＡＮＨＫＹＬＡ、配列番号１２０）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＥＳ、配列番号１２１）及びＣＤＲ３（ＨＱＹＬＳＳＷＴＦ、配列番号１２２）、ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＹＷＬＨ、配列番号１２３）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＲＮＤＹＴＥＹＮＱＮＦＫＤ、配列番号１２４）及びＣＤＲ３（ＲＤＩＴＴＦＹ、配列番号１２５）を有するヒト化抗体である。
【０１３９】
好ましい実施形態では、各々の実施例の節を参照として本明細書に援用する米国特許第６，９６２，７０２号；第７，３８７，７７２号；第７，４１４，１２１号；第７，５５３，９５３号；第７，６４１，８９１号及び第７，６７０，８０４号に開示されているように、ｈＭｕ‐９  ＭＡｂなどの抗ＣＳＡｐ抗体を含む抗体または免疫複合体を使用して、結腸直腸ならびに膵臓及び卵巣癌を治療することができる。さらに、各々の実施例の節を参照として本明細書に援用する米国特許第７，２３８，７８６号及び第７，２８２，５６７号に開示されているように、ｈＰＡＭ４  ＭＡｂを含む抗体または免疫複合体を使用して、膵臓癌または他の固形腫瘍を治療することができる。ｈＭｕ‐９抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、配列番号１２６）、ＣＤＲ２（ＫＶＳＮＲＦＳ、配列番号１２７）、及びＣＤＲ３（ＦＱＧＳＲＶＰＹＴ、配列番号１２８）、ならびに重鎖可変ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＥＹＶＩＴ、配列番号１２９）、ＣＤＲ２（ＥＩＹＰＧＳＧＳＴＳＹＮＥＫＦＫ、配列番号１３０）、及びＣＤＲ３（ＥＤＬ、配列番号１３１）を有するヒト化抗体である。ｈＰＡＭ４抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹ、配列番号１３２）；ＣＤＲ２（ＳＴＳＮＬＡＳ、配列番号１３３）；及びＣＤＲ３（ＨＱＷＮＲＹＰＹＴ、配列番号１３４）；ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＹＶＬＨ、配列番号１３５）；ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号１３６）及びＣＤＲ３（ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹ、配列番号１３７）を有するヒト化抗体である。
【０１４０】
別の好ましい実施形態では、その実施例の節を参照として本明細書に援用する米国特許第７，３００，６５５号に開示されているように、ヒト化、キメラ及びヒト抗体形態を用いた肝細胞癌、胚細胞腫瘍、及び他のＡＦＰ産生腫瘍の治療に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）ＭＡｂ、例えばＩＭＭＵ３１を含む抗体または免疫複合体を使用することができる。ＩＭＭＵ３１抗体は、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＳＹＶＩＨ、配列番号１３８）、ＣＤＲ２（ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号１３９）及びＣＤＲ３（ＳＧＧＧＤＰＦＡＹ、配列番号１４０）ならびに軽鎖ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧ、配列番号１４１）、ＣＤＲ２（ＹＴＳＡＬＬＰ、配列番号１４２）及びＣＤＲ３（ＬＱＹＤＤＬＷＴ、配列番号１４３）を有するヒト化抗体である。
【０１４１】
別の好ましい実施形態では、その実施例の節を参照として本明細書に援用する米国特許第７，６１２，１８０号に開示されているように、ｈＬ２４３（ＩＭＭＵ‐１１４）などの抗ＨＬＡ‐ＤＲ  ＭＡｂを含む抗体または免疫複合体を使用して、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、皮膚、食道、胃、結腸、直腸、膵臓、肺、乳房、卵巣、膀胱、子宮内膜、子宮頸部、精巣、腎臓、肝臓、メラノーマまたは他のＨＬＡ‐ＤＲ産生腫瘍を治療することができる。ｈＬ２４３抗体は、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１４４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＲＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号１４５）、及びＣＤＲ３（ＤＩＴＡＶＶＰＴＧＦＤＹ、配列番号１４６）ならびに軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ、配列番号１４７）、ＣＤＲ２（ＡＡＳＮＬＡＤ、配列番号１４８）、及びＣＤＲ３（ＱＨＦＷＴＴＰＷＡ、配列番号１４９）を有するヒト化抗体である。
【０１４２】
別の好ましい実施形態では、各々の実施例の節を参照として本明細書に援用する米国特許第７，４３５，８０３号または第８，２８７，８６４号に開示されているように、ベルツズマブ（ｈＡ２０）、１Ｆ５、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、またはリツキシマブなどの抗ＣＤ２０  ＭＡｂを含む抗体または免疫複合体を使用して、リンパ腫、白血病、免疫性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、エヴァンズ症候群、関節炎、尋常性天疱瘡、腎移植拒絶、心移植拒絶、リウマチ性関節炎、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、Ｉ型糖尿病、ＧＶＨＤ、または多発性硬化症を治療することができる。ｈＡ２０（ベルツズマブ）抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ、配列番号１５０）、ＣＤＲＬ２（ＡＴＳＮＬＡＳ、配列番号１５１）及びＣＤＲＬ３（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ、配列番号１５２）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１（ＳＹＮＭＨ、配列番号１５３）、ＣＤＲＨ２（ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ、配列番号１５４）及びＣＤＲＨ３（ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ、配列番号１５５）を有するヒト化抗体である。
【０１４３】
別の好ましい実施形態では、ｈＡ１９などの抗ＣＤ１９  ＭＡｂを含む抗体または免疫複合体を使用して、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病または急性リンパ芽球性白血病などのＢ細胞関連リンパ腫及び白血病を治療することができる。各々の実施例の節を参照として本明細書に援用する米国特許第７，１０９，３０４号、第７，４６２，３５２号、第７，９０２，３３８号、第８，１４７，８３１号及び第８，３３７，８４０号に記載されているように、治療し得る他の疾患状態として、急性または慢性免疫性血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、及び線維性肺胞炎などの自己免疫疾患が挙げられる。ｈＡ１９抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１  ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号１５６）；ＣＤＲ２  ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号１５７）；及びＣＤＲ３  ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号１５８）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１  ＳＹＷＭＮ（配列番号１５９）；ＣＤＲ２  ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号１６０）及びＣＤＲ３  ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号１６１）を有するヒト化抗体である。
【０１４４】
別の好ましい実施形態では、抗テネイシン抗体を含む抗体または免疫複合体を用いて造血及び固形腫瘍を治療することができ、テネイシンに対する抗体を含む複合体を用いて、固形腫瘍、好ましくは神経膠芽腫のような脳腫瘍を治療することができる。
【０１４５】
マウス及びキメラバージョンの抗体を使用することもできるが、好ましい実施形態では、ヒト疾患の治療に使用する抗体は、抗体のヒト及びヒト化（ＣＤＲ移植）バージョンである。免疫応答を最小化するために、送達する薬剤と同じ種のＩｇＧ分子が最も好ましい。これは、繰り返し治療を検討する場合に特に重要である。ヒトの場合、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体は、患者からの抗ＩｇＧ免疫応答を生成する可能性がより低い。ｈＬＬ１及びｈＬＬ２などの抗体は、標的細胞上の内部移行抗原に結合後に、迅速に内部移行し、これは、保有する薬剤もまた、細胞内に急速に内部移行することを意味する。しかしながら、内部移行の速度が遅い抗体も、選択的治療を行うために使用することができる。
【０１４６】
別の好ましい実施形態では、抗体または免疫複合体を使用して、自己免疫疾患または免疫系機能不全（例えば、移植片対宿主病、臓器移植拒絶）を治療することができる。自己免疫疾患／免疫系機能不全疾患を治療するために使用する抗体は、ＢＣＬ‐１、ＢＣＬ‐２、ＢＣＬ‐６、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＦＭＣ‐７及びＨＬＡ‐ＤＲを含むが必ずしもこれらに限定されない例示的な抗原に結合し得る。上述のこれら及び他の標的抗原に結合する抗体を使用して、自己免疫疾患または免疫機能不全疾患を治療してもよい。抗体または免疫複合体を用いて治療し得る自己免疫疾患として、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、アジソン病、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維性肺胞炎が挙げられる。
【０１４７】
別の好ましい実施形態では、本発明の免疫複合体と併用する治療剤は、１つ以上の同位体を含む場合がある。疾患状態の組織の治療に有用な放射性同位体として、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２２７Ｔｈ及び２１１Ｐｂが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。治療用放射性核種は、好ましくは、２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、オーガー放射体については好ましくは６０〜２００ｋｅＶの範囲、β放射体については１００〜２５００ｋｅＶ、及びα放射体については４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。有用なβ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２５００ｋｅＶである。オーガー放出粒子で実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ‐５８、Ｇａ‐６７、Ｂｒ‐８０ｍ、Ｔｃ‐９９ｍ、Ｒｈ‐１０３ｍ、Ｐｔ‐１０９、Ｉｎ‐１１１、Ｓｂ‐１１９、Ｉ‐１２５、Ｈｏ‐１６１、Ｏｓ‐１８９ｍ、Ｉｒ‐１９２である。有用なβ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。また、α粒子の生成により実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。そのような放射性核種として、Ｄｙ‐１５２、Ａｔ‐２１１、Ｂｉ‐２１２、Ｒａ‐２２３、Ｒｎ‐２１９、Ｐｏ‐２１５、Ｂｉ‐２１１、Ａｃ‐２２５、Ｆｒ‐２２１、Ａｔ‐２１７、Ｂｉ‐２１３、Ｔｈ‐２２７及びＦｍ‐２５５が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。有用なα粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。さらなる利用可能性のある放射性同位体として、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂなどが挙げられる。
【０１４８】
放射性核種及び他の金属は、例えば、抗体または免疫複合体に結合したキレート基を用いて送達してもよい。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡなどの大環状キレート剤は、様々な金属及び放射性金属、特に、それぞれ、ガリウム、イットリウム及び銅の放射性核種とともに使用する。そのような金属キレート錯体は、環の大きさを目的の金属に合わせることによって非常に安定にすることができる。２２３Ｒａを錯体化するための大環状ポリエーテルなどの他の環型キレート剤を使用してもよい。
【０１４９】
本明細書に記載の抗体または免疫複合体と併用する治療剤として、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤、微小管阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ‐２阻害剤、有糸分裂阻害薬、抗血管新生剤及びアポトーシス促進剤、特にドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、他のカンプトテシン、ならびにこれら及び他の種類の抗癌剤由来の他のものが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。他の癌化学療法薬として、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、ホルモンなどが挙げられる。適切な化学療法剤は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、及びＧＯＯＤＭＡＮ  ＡＮＤ  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）、ならびにこれらの出版物の改訂版に記載されている。試験薬のような他の適切な化学療法剤は、当業者に公知である。
【０１５０】
使用する薬剤の例として、５‐フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ‐１０１、ＡＶＬ‐２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン‐１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０‐ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ‐２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）、ＳＮ‐３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２‐ピロリノドキソルビシン（２ＰＤＯＸ）、プロ‐２ＰＤＯＸ、シアノ‐モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３′，５′‐Ｏ‐ジオレオイル‐ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ‐ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ‐０８３４、ＧＳ‐１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ‐アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリドアミド、ロイコボリン、ＬＦＭ‐Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６‐メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソ尿素、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ‐３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ‐３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド及びＺＤ１８３９が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。そのような薬剤は、本明細書に記載の複合体の一部であってもよく、あるいは、記載の複合体と併用して、複合体の前に、同時に、または後に投与してもよい。あるいは、当該技術分野で公知の１つ以上の治療用の裸の抗体を、記載の複合体と併用してもよい。例示的な治療用の裸の抗体は上記に記載されている。
【０１５１】
好ましい実施形態では、ＤＮＡ破壊抗体複合体（例えば、ＳＮ‐３８‐ＡＤＣ）と併用する治療剤は、ビンカアルカロイド、タキサン、マイタンシノイドまたはオーリスタチンなどの微小管阻害剤である。公知の微小管阻害剤の例として、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルタンシン、エポチロン、ドセタキセル、ディスコデルモリド、コンブレスタチン、ポドフィロトキシン、ＣＩ‐９８０、フェニラヒスチン、ステガナシン、クラシン、２‐メトキシエストラジオール、Ｅ７０１０、メトキシベンゼンスルホンアミド、ビノレルビン、ビンフルニン、ビンデシン、ドラスタチン、スポンジスタチン、リゾキシン、タシドチン、ハロコンドリン、ヘミアステリン、クリプトフィシン５２、ＭＭＡＥ及びエリブリンメシル酸塩が挙げられる。
【０１５２】
別の好ましい実施形態では、ＳＮ‐３８‐抗体複合体などのＤＮＡ破壊ＡＤＣと併用する治療剤は、オラパリブ、タラゾパリブ（ＢＭＮ‐６７３）、ルカパリブ、ベリパリブ、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＢＧＢ‐２９０、ＡＢＴ‐８８８、ＡＧ０１４６９９、ＢＳＩ‐２０１、ＣＥＰ‐８９８３または３‐アミノベンズアミドなどのＰＡＲＰ阻害剤である。
【０１５３】
別の代替案では、抗体または免疫複合体と併用する治療剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ‐３２７６５）、ＰＣＩ‐４５２９２、ＣＣ‐２９２（ＡＶＬ‐２９２）、ＯＮＯ‐４０５９、ＧＤＣ‐０８３４、ＬＦＭ‐Ａ１３またはＲＮ４８６などのブルトンキナーゼ阻害剤である。
【０１５４】
さらに別の代替案では、抗体または免疫複合体と併用する治療剤は、イデラリシブ、ウォルトマニン、デメトキシビリジン、ペリホシン、ＰＸ‐８６６、ＩＰＩ‐１４５（デュベリシブ）、ＢＡＹ８０‐６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ１２０２、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＧＤＣ‐０９４１、ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００‐１１５、ＣＡＬ２６３、ＰＩ‐１０３、ＧＮＥ４７７、ＣＵＤＣ‐９０７、ＡＥＺＳ‐１３６またはＬＹ２９４００２などのＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【０１５５】
抗体または免疫複合体と共同して使用し得る治療剤として、標的化部分に複合体化した毒素が挙げられ得る。その際、使用し得る毒素として、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、及びシュードモナス内毒素が挙げられる。（例えば、Ｐａｓｔａｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８６），４７：６４１、及びＳｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２００６  Ｊｕｌ‐Ａｕｇ；５６（４）：２２６‐４３参照）。本明細書においての使用に適した追加の毒素は当業者には公知であり、米国特許第６，０７７，４９９号に開示されている。
【０１５６】
さらに別のクラスの治療剤は、１つ以上の免疫調節剤を含み得る。使用する免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン及びそれらの組合せから選択してもよい。特に有用なものは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロンα、β、γまたはλなどのインターフェロン、及び「Ｓ１因子」と呼ばれるような幹細胞増殖因子である。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ‐メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子α及びβ；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ‐βのような神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ‐α及びＴＧＦ‐βなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロンα、β、γなどのインターフェロン；マクロファージ‐ＣＳＦ（Ｍ‐ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ‐１、ＩＬ‐１α、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１２；ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１４、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１６、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２１、ＩＬ‐２５、ＬＩＦ、キットリガンドまたはＦＬＴ‐３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子及びリンホトキシン（ＬＴ）などのインターロイキン（ＩＬ）である。本明細書で使用する場合、サイトカインという用語は、自然発生源由来の、または天然配列サイトカインの組換え細胞培養及び生物学的に活性な均等物由来のタンパク質を包含する。
【０１５７】
使用するケモカインとして、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１-α、ＭＩＰ１-β及びＩＰ‐１０が挙げられる。
【０１５８】
当業者であれば、本発明の抗体または免疫複合体を、単独で、または二次抗体、二次抗体断片、二次免疫複合体、放射性核種、毒素、薬剤、化学療法剤、放射線治療、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節剤、酵素、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡなどの１つ以上の他の治療剤と組み合わせて使用してもよいことを理解するであろう。好ましくは、治療剤は、ＰＡＲＰ阻害剤、微小管阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤である。公知のＰＡＲＰ阻害剤の例として、オラパリブ、タラゾパリブ（ＢＭＮ‐６７３）、ルカパリブ、ベリパリブ、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＢＧＢ‐２９０、ＡＢＴ‐８８８、ＡＧ０１４６９９、ＢＳＩ‐２０１、ＣＥＰ‐８９８３または３‐アミノベンズアミドが挙げられる。公知の微小管阻害剤として、ビンカアルカロイド、タキサン、マイタンシノイド、オーリスタチン、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルタンシン、エポチロン、ドセタキセル、ディスコデルモリド、コンブレスタチン、ポドフィロトキシン、ＣＩ‐９８０、フェニラヒスチン、ステガナシン、クラシン、２‐メトキシエストラジオール、Ｅ７０１０、メトキシベンゼンスルホンアミド、ビノレルビン、ビンフルニン、ビンデシン、ドラスタチン、スポンジスタチン、リゾキシン、タシドチン、ハロコンドリン、ヘミアステリン、クリプトフィシン５２、ＭＭＡＥ及びエリブリンメシル酸塩が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。ブルトンキナーゼ阻害剤の例として、イブルチニブ（ＰＣＩ‐３２７６５）、ＰＣＩ‐４５２９２、ＣＣ‐２９２（ＡＶＬ‐２９２）、ＯＮＯ‐４０５９、ＧＤＣ‐０８３４、ＬＦＭ‐Ａ１３またはＲＮ４８６が挙げられる。ＰＩ３Ｋ阻害剤の例として、イデラリシブ、ウォルトマニン、デメトキシビリジン、ペリホシン、ＰＸ‐８６６、ＩＰＩ‐１４５（デュベリシブ）、ＢＡＹ８０‐６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ１２０２、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＧＤＣ‐０９４１、ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００‐１１５、ＣＡＬ２６３、ＰＩ‐１０３、ＧＮＥ４７７、ＣＵＤＣ‐９０７、ＡＥＺＳ‐１３６またはＬＹ２９４００２が挙げられる。そのような追加の治療剤は、本発明の抗体または免疫複合体とは別個に、併用して、またはそれらと結合させて投与してもよい。
【０１５９】
製剤化及び投与
抗体、免疫複合体及び／または薬剤の適切な投与経路として、限定するものではないが、非経口、皮下、直腸内、経粘膜、腸内、筋肉内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が挙げられる。好ましい投与経路は非経口である。あるいは、化合物を全身的ではなく局所的に、例えば、化合物を固形腫瘍に直接注射することによって投与してもよい。微小管阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤などの特定の薬剤を、経口投与するように設計してもよい。
【０１６０】
抗体または免疫複合体を、公知の方法に従って製剤化し、薬学的に有用な組成物を調製することができ、それによって、抗体または免疫複合体を、薬学的に適切な賦形剤との混合物中で組み合わせる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に適切な賦形剤の一例である。他の適切な賦形剤は、当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、ならびにそれらの改訂版を参照されたい。
【０１６１】
好ましい実施形態では、抗体または免疫複合体を、Ｎ‐（２‐アセトアミド）‐２‐アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）；Ｎ‐（２‐アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）；Ｎ，Ｎ‐ビス（２‐ヒドロキシエチル）‐２‐アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）；４‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐１‐エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；２‐（Ｎ‐モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）；３‐（Ｎ‐モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；３‐（Ｎ‐モルホリニル）‐２‐ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）；及びピペラジン‐Ｎ，Ｎ′‐ビス（２‐エタンスルホン酸）［Ｐｉｐｅｓ］からなる群から選択される緩衝液を用いて、Ｇｏｏｄの生物学的緩衝液（ｐＨ６〜７）中に製剤化する。より好ましい緩衝液は、好ましくは２０〜１００ｍＭ、より好ましくは約２５ｍＭの濃度のＭＥＳまたはＭＯＰＳである。最も好ましいのは２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５である。製剤は、賦形剤として２５ｍＭトレハロース及び０．０１％ｖ／ｖポリソルベート８０をさらに含み、賦形剤の添加の結果として最終緩衝液濃度を２２．２５ｍＭに改変してもよい。好ましい保存方法は、複合体の凍結乾燥製剤を−２０℃〜２℃の温度範囲で保存することであり、最も好ましくは２℃〜８℃で保存する。
【０１６２】
抗体または免疫複合体は、静脈内投与用に、例えば、ボーラス注射、低速注入または連続注入を介して製剤化することができる。好ましくは、本発明の抗体を、約４時間未満の期間にわたって、より好ましくは約３時間未満の期間にわたって注入する。例えば、最初の２５〜５０ｍｇを３０分以内に、好ましくは１５分以内に注入し、残りを次の２〜３時間にわたって注入することができる。注射用製剤は、単位剤形、例えばアンプル中に、または多回投与用容器中に、防腐剤を加えて提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤及び／または分散剤のような調合剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えばパイロジェンフリーの滅菌水で構成するための粉末形態であり得る。
【０１６３】
追加の薬学的方法を用いて、治療用複合体の作用持続時間を制御してもよい。制御放出調製物は、免疫複合体を複合体化または吸着するポリマーを使用することで調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとして、ポリ（エチレン‐ｃｏ‐酢酸ビニル）のマトリックス、及びステアリン酸二量体とセバシン酸とのポリ酸無水物コポリマーのマトリックスが挙げられる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６（１９９２）。そのようなマトリックスからの抗体または免疫複合体の放出速度は、分子量、マトリックス内の抗体または免疫複合体の量、及び分散した粒子のサイズに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，上記。他の固体剤形は、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、ならびにその改訂版に記載されている。
【０１６４】
一般的に、ヒトに対して投与する抗体または免疫複合体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及び以前の病歴などの要因に応じて様々に異なる。単一の静脈内注入として約１ｍｇ／ｋｇ〜２４ｍｇ／ｋｇの範囲の免疫複合体の用量をレシピエントに提供することが望ましい場合があるが、より低いまたはより高い用量を状況に応じて投与してもよい。例えば、７０ｋｇの患者に対しての１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量とは、７０〜１，４００ｍｇであり、すなわち１．７ｍの患者に対しては４１〜８２４ｍｇ／ｍ２である。用量は、必要に応じて、例えば、週１回を４〜１０週間、週１回を８週間、または週１回を４週間、繰り返してもよい。また、維持療法の必要に応じて、隔週で数か月間、または月１回もしくは四半期ごとに数か月間投与するなど、頻度を少なくしてもよい。好ましい用量として、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、及び１８ｍｇ／ｋｇが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。前記用量は、好ましくは、週１回もしくは週２回、または、まれに３週間もしくは４週間ごとに１回の頻度で複数回投与する。４週間、より好ましくは８週間、より好ましくは１６週間以上の最小投与スケジュールを使用してもよい。投与スケジュールは：（ｉ）週ごと；（ｉｉ）隔週；（ｉｉｉ）１週間の治療とその後の２、３または４週間の休止；（ｉｖ）２週間の治療とその後の１、２、３または４週間の休止；（ｖ）３週間の治療とその後の１、２、３、４または５週間の休止；（ｖｉ）４週間の治療とその後の１、２、３、４または５週間の休止；（ｖｉｉ）５週間の治療とその後の１、２、３、４または５週間の休止；（ｖｉｉｉ）月ごと、及び（ｉｘ）３週間ごと、からなる群から選択されるサイクルで週１回または週２回投与することを含み得る。このサイクルを、２、４、６、８、１０、１２、１６または２０回以上繰り返してもよい。
【０１６５】
あるいは、抗体または免疫複合体を、２週間または３週間ごとに１回の投薬で、少なくとも合計３回の投薬を、繰り返し投与してもよい。または、週２回を４〜６週間でもよい。用量を約２００〜３００ｍｇ／ｍ２（１．７ｍの患者に対して１用量あたり３４０ｍｇ、すなわち７０ｋｇの患者に対して４．９ｍｇ／ｋｇ）に低下させる場合、４〜１０週間にわたって週１回または週２回投与する。あるいは、投薬スケジュールを減少させ、すなわち２〜３か月にわたって２または３週間に１回としてもよい。しかしながら、１２ｍｇ／ｋｇを週１回または２〜３週間に１回のような、より高い用量でさえ、緩やかな静脈内注入によって、反復的な投薬サイクルで投与することができると判定された。投薬スケジュールは、必要に応じて他の間隔で繰り返すことができ、投薬量及びスケジュールの適切な調整の下に、投薬量を、様々な非経口経路によって投与してもよい。
【０１６６】
好ましい実施形態では、抗体または免疫複合体を、癌の治療に使用する。癌の例として、癌腫、リンパ腫、神経膠芽腫、メラノーマ、肉腫、及び白血病、骨髄腫、またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。そのような癌のより具体的な例を以下に記載するとともに、それらの例として：扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、小細胞肺癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌、腹膜癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、多形性神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、肝細胞癌、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、分化甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎癌または腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌、頭頸部癌が挙げられる。用語「癌」は、原発性悪性細胞または腫瘍（例えば、その細胞が元の悪性腫瘍または腫瘍の部位以外の被験体の部位に移動していないもの）及び二次悪性細胞または腫瘍（例えば、転移、すなわち元の腫瘍の部位とは異なる二次部位への悪性細胞または腫瘍細胞の移動に起因するもの）を包含する。
【０１６７】
癌または悪性腫瘍の他の例として、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発）肝癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂及び尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部及び視経路グリオーマ、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果腺及びテント上原発性神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視経路及び視床下部グリオーマ、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、毛状細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼球内黒色腫、膵島細胞癌、膵島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、転移性不顕性原発性頸部扁平上皮癌、転移性原発性頸部扁平上皮癌、転移性頸部扁平上皮癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄球性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非メラノーマ皮膚癌、非小細胞肺癌、不顕性原発性転移性頸部扁平上皮癌、中咽頭癌、骨肉腫／悪性線維肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、真性赤血球増加症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、頸部扁平上皮癌、胃癌、テント上原発性神経外胚葉及び松果腺腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌、移行性腎盂及び尿管上皮癌、絨毛性腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視経路及び視床下部グリオーマ、外陰癌、ワルデンストレームのマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、及び上記の臓器系に位置する腫瘍以外の任意の他の過剰増殖性疾患が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【０１６８】
本明細書に記載し、特許請求する方法及び組成物を使用して、悪性または前悪性状態を治療し、上記の障害を含むが必ずしもそれらに限定されない腫瘍または悪性状態への進行を予防してもよい。腫瘍または癌への上記の進行、特に、過形成、化生、または特に異形成からなる非腫瘍性細胞増殖が生じていることが周知であるか、または疑われる状態において、そのような使用を指示する（そのような異常増殖状態のレビューについては、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ，Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８‐７９（１９７６）参照）。
【０１６９】
異形成はしばしば癌の前兆であり、主に上皮に認められる。これは、個々の細胞の均一性及び細胞の構造的配向の喪失を含む、非腫瘍性細胞増殖の最も無秩序な形態である。異形成は、慢性的な刺激または炎症が存在する場合に特徴的に生じる。治療可能な異形成障害として、無汗性外胚葉異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、脳異形成、子宮頚部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、片肢性骨端骨異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、線維性骨異形成、開花性骨異形成、遺伝性腎‐網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少症性外胚葉異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ奇形、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成、眼下顎異形成、根尖性セメント質異形成、多発性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成、及び心室橈骨異形成が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【０１７０】
治療可能なさらなる前腫瘍障害として、良性増殖異常性障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープまたは腺腫、及び食道異形成）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、太陽性口唇炎、ならびに日光角化症が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【０１７１】
好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して、癌、特に上に列挙した癌の増殖、進行及び／または転移を阻害する。
【０１７２】
さらなる過剰増殖性疾患、障害、及び／または状態として、白血病（急性白血病；例えば急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病［骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病を含む］）及び慢性骨髄性白血病（例えば、慢性骨髄球性［顆粒球性］白血病及び慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖疾患、ならびに、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫などの肉腫及び癌腫を含むが必ずしもこれらに限定されない固形腫瘍などの悪性疾患及び白血病などの関連障害の進行、及び／または転移が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【０１７３】
抗体または免疫複合体で治療し得る自己免疫疾患として、急性及び慢性免疫性血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、アジソン病、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維性肺胞炎が挙げられる。
【０１７４】
キット
様々な実施形態は、患者の疾患組織を治療するのに適した成分を含むキットに関する。例示的なキットは、本明細書に記載の少なくとも１つの抗体または免疫複合体を含む場合がある。キットはまた、微小管阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤及び／またはＰＩ３Ｋ阻害剤から選択される薬剤を含む場合がある。投与のための成分を含有する組成物を、例えば経口送達による消化管を介した送達用に製剤化していない場合、他の経路を介してキット成分を送達することができる器具を含めてもよい。非経口送達などの用途のための器具の１つのタイプは、組成物を被験体の体内に注入するために使用する注射器である。吸入器を使用してもよい。
【０１７５】
キット構成要素は、一緒に包装してもよく、または２つ以上の容器に分けてもよい。いくつかの実施形態では、容器は、再構成に適した組成物の滅菌凍結乾燥製剤を含有するバイアルであってもよい。キットはまた、他の試薬の再構成及び／または希釈に適した１つ以上の緩衝液を含む場合がある。使用してもよい他の容器として、パウチ、トレイ、ボックス、チューブなどが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。キットの成分は、容器内で無菌的に包装し、維持してもよい。含み得る別の構成要素は、キットを使用する人へのキット使用の指示書である。
【実施例】
【０１７６】
本発明の様々な実施形態を、以下の実施例によって例示するが、その範囲を限定するものではない。
【０１７７】
実施例１：ＡＤＣ  ＩＭＭＵ‐１３２及び微小管阻害剤またはＰＡＲＰ阻害剤による併用療法
現在の臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、ＮＣＴ０１６３１５５２）では、抗Ｔｒｏｐ‐２抗体に結合させた、イリノテカンの活性代謝産物であるＳＮ‐３８からなるＩＭＭＵ‐１３２で処置した三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）患者は、再発性／難治性の症例において、処置可能な毒性及び非常に有望な奏効を示す。
【０１７８】
合成致死性とは、２つの可能な遺伝子またはタンパク質欠損のうちの１つを有する細胞は生存可能だが、両方の欠損を含む細胞は生存できないという概念のことである。ＢＲＣＡ１／２変異は、ＤＮＡ修復の欠損に関連し、ＴＮＢＣと関連している。他の修復機構は、ポリ（アデノシンジホスホリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）に関するものであり、癌細胞はそれを利用してＢＲＡＣＡ１／２の欠損を克服することができる。ＴＮＢＣ細胞をＩＭＭＵ‐１３２またはパクリタキセルのいずれかで処理すると、ＰＡＲＰの切断及び失活が生じるが、小分子のオラパリブはＰＡＲＰを直接阻害する。したがって、ＩＭＭＵ‐１３２をパクリタキセルまたはオラパリブと組み合わせてＰＡＲＰ活性を効果的にノックアウトすることの理論的根拠をＴＮＢＣ異種移植片において調査し、これらの組合せが合成致死性をもたらすかどうかを確かめた。
【０１７９】
本研究の目的は、癌（例えば、ＴＮＢＣ異種移植片を保有するヌードマウス）におけるサシツズマブ・ゴビテカン（ＩＭＭＵ‐１３２、抗Ｔｒｏｐ‐２  ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８としても知られる）などのＤＮＡ鎖切断を誘発する抗体‐薬剤複合体と、微小管阻害剤（例えば、パクリタキセルまたはエリブリンメシル酸塩）またはポリ（アデノシンジホスホリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（例えば、オラパリブ）との併用が、抗腫瘍効果を改善するかどうかを判定することであった。当業者であれば、抗体‐ＳＮ‐３８複合体とＰＡＲＰまたは微小管阻害剤との併用の予想外の優れた効果は、特定の例示的な抗体、薬剤、ＰＡＲＰ阻害剤または微小管阻害剤に限定されるものではなく、むしろ、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体のクラス、ＤＮＡ鎖切断を誘導する薬剤、ＰＡＲＰ阻害剤及び微小管阻害剤の特徴である。
【０１８０】
実験手順
非限定的な例において、ヒトＴＮＢＣ（三種陰性乳癌）異種移植片（ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８またはＨＣＣ１８０６；約０．３ｃｍ３）を保有するマウスを、最大耐量のパクリタキセル（毎週１５ｍｇ／ｋｇ×５週間）ならびに１、８、２２、及び２９日目に１０ｍｇ／ｋｇまたは１２．５ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ‐１３２で処置した。ＨＣＣ１８０６腫瘍（約０．２８ｃｍ３）を保有するマウスを、２１日間のサイクルで２週間にわたって毎週、ＩＭＭＵ‐１３２（１２．５ｍｇ／ｋｇ）及び０．５ｍｇ／ｋｇのエリブリンメシル酸塩（１．４ｍｇ／ｍ２のヒト用量に相当）で２サイクル処置した。ＰＡＲＰ阻害を調べる試験は、オラパリブ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｑｄｘ５ｄ、×４週間；ヒト用量の３３％＝１日あたり８００ｍｇ）及びＩＭＭＵ‐１３２（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回×４週間）を用いて処置したＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８腫瘍（約０．３２ｃｍ３）を保有するマウスを用いた。オラパリブは、反復する前に２日間の休息を入れて５日間、毎日腹腔内注射した（ｑｄｘ５）。これを４週間実施した。ＩＭＭＵ‐１３２は、週２回、４週間にわたって腹腔内投与した。対照動物には、抗ＣＤ２０  ＡＤＣ  ｈＡ２０‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８を標的とする非腫瘍標的を、単独で、またはオラパリブと併用して投与した。主要エンドポイントは、腫瘍が１．０ｃｍ３まで進行するのに要する時間として定義される生存期間中央値（ＭＳＴ）であった。
【０１８１】
別の実施形態では、相乗効果についてのアッセイを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって決定してもよい。クローン原性アッセイを用いて、細胞の生存率を測定してもよい（Ｉｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：１０３６‐４７）。簡潔に述べると、３５０〜８００個の細胞を６ウェル平底細胞培養プレートに２連で播種する。プレーティングの２４時間後、細胞を洗浄し、ＡＤＣ及び／またはＰＡＲＰもしくは微小管阻害剤（例えば、オラパリブ）の漸増用量の単独または併用しての存在下または非存在下で、新鮮な培地を添加する。薬剤を含有する培地を、４日目にリフレッシュする。処理の７日後に、１．５ｍｌの６．０％グルタルアルデヒド及び０．５％クリスタルバイオレットを用いてコロニーを固定及び染色し、標準的手順によってコロニーをカウントする。細胞の生存率（ＳＦ）は以下のように計算する：
【化７】
2018520140.tif 000017
【０１８２】
ＡＤＣとＰＡＲＰまたは微小管阻害剤との間の相互作用は、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ（１９８４，Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ  ２２：２７‐５５）の多剤効果分析法を用いて評価する。本方法は、２つ以上の薬剤間の相互作用を定量的に記載するものであり、１未満の値は相乗的相互作用を示し、１より大きい値は拮抗的相互作用を示し、１と等しい値は相加的相互作用を示す。
【０１８３】
結果
ＩＭＭＵ‐１３２とパクリタキセルとを併用投与したＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８腫瘍を有するマウスは、優れた抗腫瘍効果を示し（図１Ａ〜１Ｃ）、ＩＭＭＵ‐１３２単独での腫瘍の収縮が１．４倍であり（ｐ＝０．０００３；曲線下面積ＡＵＣ）、または、パクリタキセルのみで処置したマウスで腫瘍サイズが１１．４倍増加した（Ｐ＜０．０００１；ＡＵＣ）のに対して、腫瘍の収縮が１１倍を超えた。
【０１８４】
ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８では、２００μｇのＩＭＭＵ‐１３２とパクリタキセルとの併用は、他のすべての群と比較した場合に、曲線下面積（ＡＵＣ）に関して優れた抗腫瘍効果を有する（表７、Ｐ＜０．００１３）。パクリタキセルとともに投与するＩＭＭＵ‐１３２の量を１００μｇに低下させると、パクリタキセル単独、ＩＭＭＵ‐１３２単独（１００μｇ）で処置したマウス、または未処置動物に比べて、有意な抗腫瘍効果が得られる（表８、ｐ＜０．０３２８）。パクリタキセルまたは未処置の対照群では、治療の４９日目の時点で疾患の進行（すなわち、ＴＶ＞１．０ｃｍ３）のためにそれぞれがマウスを失い始めたため、成長曲線間のさらなる比較は行うことができない。
【表７】
2018520140.tif 000018
【表８】
2018520140.tif 000019
【０１８５】
急速に進行するＨＣＣ１８０６異種移植片（図２Ａ〜２Ｂ）では、ＩＭＭＵ‐１３２とパクリタキセルとの併用は、ＩＭＭＵ‐１３２単独療法（Ｐ＝０．０１９５、ＡＵＣ１７ｄａｙｓ）に比べて優れた抗腫瘍効果を有することが判明した。これは、非常に高悪性度の腫瘍であり、未処置対照動物に対する生存期間中央値（ＭＳＴ）は、治療開始後わずか１０日である（腫瘍細胞接種後１８日）。生存度に関して、ＭＳＴが３８日に達した組合せは、他のすべての療法に比べて有意な延命効果をもたらした（Ｐ＜０．０１７；対数ランク）。これがわずか１ｍｇ／ｋｇのヒト用量に相当するわずか０．２５ｍｇの低用量で達成されたことに留意すべきである。
【０１８６】
ＩＭＭＵ‐１３２＋エリブリンメシル酸塩（図３Ａ〜３Ｅ）の併用で処置したマウスは、他のすべての単独療法群（Ｐ＜０．０４３２；対応ｔ検定）よりも有意に高い抗腫瘍応答を示した。これにより、エリブリンまたはＩＭＭＵ‐１３２単独療法（それぞれ、ＭＳＴ＝１８及び１４日；Ｐ＜０．００４４；対数ランク）に比べて、併用では有意な延命効果（ＭＳＴ＝２３日）が得られた。
【０１８７】
同様に、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８腫瘍を有するマウスにおけるＩＭＭＵ‐１３２療法とオラパリブとの併用は、単剤療法よりも優れていた（Ｐ＜０．００３２；ＡＵＣ）（図４）。結果を表９にまとめる。すべてのＩＭＭＵ‐１３２併用処置は良好な忍容性を有していた。
【表９】
2018520140.tif 000020
【０１８８】
［薬剤‐抗体比（ＤＡＲ）測定］  ５つの臨床ロットのＩＭＭＵ‐１３２を、ＤＡＲが６、７及び８の種を表す３つのピークを分解する疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ‐ＨＰＬＣ）により評価し、ＤＡＲ＝８を含む最大画分（データは示さず）を解析した。ＩＭＭＵ‐１３２は、この製造プロセスによって一貫して製造され、５つの臨床ロットの中で全体のＤＡＲ（ＤＡＲＡＶＥ）は７．６０±０．０３であった。ＨＩＣ‐ＨＰＬＣの結果を、液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ‐ＭＳ）によって確認した。この分析は、利用可能な８つのスルフヒドリル基の＞９９％がＳＮ‐３８の存在下または非存在下でのＣＬ２Ａリンカーとカップリングすることを示した（データは示さず）。非置換の（またはＮ‐エチルマレイミドキャップされた）重鎖または軽鎖は検出されなかった。したがって、種間のＤＡＲの差異は、製造中のリンカーからのＳＮ‐３８遊離の結果であって、低い初期置換比に起因するものではない。いったん調製して凍結乾燥すると、ＩＭＭＵ‐１３２は数年間安定していた。
【０１８９】
［マウスにおける薬物動態及び抗腫瘍効果に及ぼすＤＡＲの影響］  Ｔｒｏｐ‐２＋ヒト胃癌異種移植片（ＮＣＩ‐Ｎ８７）を保有するマウスに、それぞれ６．８９、３．２８、または１．６４のＤＡＲを有する等しいタンパク質（０．５ｍｇ）用量のＩＭＭＵ‐１３２を、７日間間隔を空けて２回処置した。ＤＡＲ６．８９のＡＤＣで治療した動物は、ＤＡＲ３．３８または１．６４のＡＤＣを与えたマウスに比べて、有意に向上した生存期間中央値（ＭＳＴ）を有していた（それぞれ、ＭＳＴ＝３９日に対し、２５日及び２１日；Ｐ＜０．００１４）（データは示さず）。ＤＡＲ３．２８または１．６４の複合体で処置した群と生理食塩水対照群との間に差異はなかった。
【０１９０】
高いＤＡＲの重要性をさらに解明するために、ＮＣＩ‐Ｎ８７胃腫瘍を保有するマウスに、２週間にわたり６．８９のＤＡＲを有する０．５ｍｇのＩＭＭＵ‐１３２を週２回投与した（データは示さず）。別の群には、３．２８のＤＡＲを有するＩＭＭＵ‐１３２複合体を、２倍のタンパク質（１ｍｇ）用量で与えた。両方の群には、各投薬スキームで同じ総量のＳＮ‐３８（３６μｇ）を与えたが、ＤＡＲ６．８９の複合体で処置した群は、ＤＡＲ３．２８複合体で処置した腫瘍保有動物よりも有意に腫瘍増殖を阻害した（Ｐ＝０．０２２７；ＡＵＣ）（データは示さず）。さらに、より低いＤＡＲでの処置は、未処置対照に対して有意差がなかった。まとめると、これらの試験結果は、ＤＡＲが低いと有効性が低下することを示している。
【０１９１】
これらの異なる比率で調製した複合体の薬物動態学的挙動の検査を、０．２ｍｇの各複合体、非複合体化ｈＲＳ７  ＩｇＧ、または還元後にＮ‐エチルマレイミドでキャップしたｈＲＳ７  ＩｇＧを与えた非腫瘍保有マウスで行った。血清を０．５〜１６８時間の５つの間隔で採取し、ｈＲＳ７  ＩｇＧについてＥＬＩＳＡによりアッセイした。これらの複合体のクリアランスは、非複合体化ＩｇＧに比べて有意差がなかった（データは示さず）。したがって、置換レベルは複合体の薬物動態に影響を及ぼさず、同様に重要なことに、鎖間ジスルフィド結合の還元は抗体を不安定化させないと考えられた。
【０１９２】
［ＴＮＢＣにおけるＩＭＭＵ‐１３２の作用機序］  組み込まれたＳＮ‐３８に基づくＡＤＣ機能を確かめるために、ＩＭＭＵ‐１３２が利用するアポトーシス経路を、ＴＮＢＣ細胞株、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８、及びＨＥＲ２＋  ＳＫ‐ＢＲ‐３細胞株において調べた。細胞を１μＭのＳＮ‐３８、ＳＮ‐３８相当のＩＭＭＵ‐１３２、またはタンパク質相当量のｈＲＳ７に曝露した。細胞を採取し、ウエスタンブロットを行った。ＳＮ‐３８単独及びＩＭＭＵ‐１３２は、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８において２４時間以内にｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の２倍を上回るアップレギュレーションを媒介し、及び４８時間までにこれらの細胞内のｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の量が減少し始めた（ＳＮ‐３８またはＩＭＭＵ‐１３２で、それぞれ３１％及び４３％）（データは示さず）。興味深いことに、ＨＥＲ２＋  ＳＫ‐ＢＲ‐３腫瘍株において、ＳＮ‐３８もＩＭＭＵ‐１３２も、最初の２４時間では構成的レベルを上回るｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１のアップレギュレーションを媒介しなかったが、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８細胞においては、ＳＮ‐３８またはＩＭＭＵ‐１３２への４８時間の曝露の後で認められたように、ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の量は５７％を上回る割合で減少した（データは示さず）。ＳＮ‐３８及びＩＭＭＵ‐１３２の両方は、２４時間以内にプロカスパーゼ‐３からその活性断片への切断をもたらしたが、４８時間の曝露後に、より多くの活性断片が観察された。注目すべきことに、両方の細胞株において、ＩＭＭＵ‐１３２は、ＳＮ‐３８に曝露した細胞に比べてより多くのプロカスパーゼ３切断を媒介し、４８時間後に最高レベルが観察された（データは示さず）。最終的に、ＳＮ‐３８及びＩＭＭＵ‐１３２は両方とも、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂を媒介し、２４時間目から開始して４８時間後にはほぼ完全に切断した（データは示さず）。まとめると、これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与した場合、ＩＭＭＵ‐１３２が遊離ＳＮ‐３８と同様の作用機序を有することを確認するものである。
【０１９３】
［ヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるＩＭＭＵ‐１３２またはイリノテカンによるＳＮ‐３８の送達］  イリノテカン（７７３μｇ；ＳＮ‐３８当量＝４４８μｇ）及びＩＭＭＵ‐１３２（１．０ｍｇ；ＳＮ‐３８当量＝１６μｇ）を投与したヒト膵臓癌異種移植片（Ｃａｐａｎ‐１）を皮下注射で移植したマウスの血清及び腫瘍中で、イリノテカンまたはＩＭＭＵ‐１３２に由来する構成的産物を測定した。投与後、５段階の間隔で各群から３匹の動物を、目的の生成物を抽出した血清で安楽死させた。
【０１９４】
イリノテカンは血清から非常に迅速に消失し、ＳＮ‐３８及びＳＮ‐３８Ｇへの変換が５分以内に認められた（データは示さず）。生成物はいずれも２４時間時点では検出されなかった。イリノテカン、ＳＮ‐３８、及びＳＮ‐３８Ｇについて、それぞれ６時間にわたるＡＵＣは、２１．０、２．５、及び２．８μｇ／ｍＬ・ｈであった（マウス中でのＳＮ‐３８変換＝［（２．５＋２．８）／２１＝２５．２％］）。ＩＭＭＵ‐１３２を与えた動物は、血清中の遊離ＳＮ‐３８濃度がはるかに低かったものの、４８時間を通じて検出された（データは示さず）。遊離ＳＮ‐３８Ｇは１時間及び６時間でのみ検出され、遊離ＳＮ‐３８より３〜７倍低かった（データは示さず）。
【０１９５】
イリノテカン処置動物から切除したＣａｐａｎ‐１腫瘍では、イリノテカンレベルは６時間にわたって高かったが、２４時間時点では検出できなかった（ＡＵＣ５ｍｉｎ‐６ｈ＝４８．４μｇ／ｇ・ｈ）。ＳＮ‐３８はそれよりはるかに低く、２時間にわたって検出されたのみであり（すなわち、ＡＵＣ５ｍｉｎ‐２ｈ＝０．４μｇ／ｇ・ｈ）、ＳＮ‐３８Ｇ値はほぼ３倍高かった（ＡＵＣ＝１．１μｇ／ｇ・ｈ）（データは示さず）。ＩＭＭＵ‐１３２を与えた動物から採取した腫瘍は、検出可能な遊離のＳＮ‐３８またはＳＮ‐３８Ｇを有していなかったが、腫瘍のすべてのＳＮ‐３８はＩＭＭＵ‐１３２に結合した。重要なことに、腫瘍においてＳＮ‐３８Ｇが検出されなかったことから、これは、ＩＭＭＵ‐１３２に結合したＳＮ‐３８がグルクロン酸化されなかったことを示唆するものである。イリノテカンを与えたマウスに、ＩＭＭＵ‐１３２を投与したマウスに比べて２８倍のＳＮ‐３８当量（すなわち、それぞれにＳＮ‐３８当量４４８μｇと１６μｇ）を与えたにも関わらず、これらの腫瘍においてＩＭＭＵ‐１３２に結合したＳＮ‐３８のＡＵＣは５４．３μｇ／ｇ・ｈであり、これは、ＳＮ‐３８を検出可能であった２時間にわたってのイリノテカンで処置した動物の腫瘍中のＳＮ‐３８の量よりも１３５倍高かった。
【０１９６】
結論
ＩＭＭＵ‐１３２は、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるイリノテカンの活性代謝物である７．６分子のＳＮ‐３８と複合体化したヒト化抗Ｔｒｏｐ‐２抗体である。臨床では、ＩＭＭＵ‐１３２は、再発性／難治性ＴＮＢＣ患者（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、ＮＣＴ０１６３１５５２）において処置可能な毒性及び強い奏効を示した。ＩＭＭＵ‐１３２単独の治療は、ヒトＴＮＢＣ異種移植片において、臨床的に使用する用量（すなわち、１０ｍｇ／ｋｇ）の５倍少ないヒト当量で有意な抗腫瘍効果を示した。前臨床試験において、ＩＭＭＵ‐１３２が、２つの異なる微小管阻害剤または１つのＰＡＲＰ阻害剤と併用可能であり、有意に増強された抗腫瘍活性を有することが示されており、そのため、これらのデータは、ＩＭＭＵ‐１３２及びＤＮＡ切断を引き起こす他の抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）と、一般的に微小管阻害剤及び／またはＰＡＲＰ阻害剤、ならびに微小管阻害を介した細胞分裂またはＤＮＡ修復機構を標的とする他の化学療法剤との併用利用性を裏付けるものである。Ｔｒｏｐ‐２が、多数の癌において多量に発現し、癌細胞の細胞表面上及び細胞質内に局在化する標的であることから、ＴＮＢＣ、転移性大腸癌、ＳＣＬＣ及びＮＳＣＬＣを含むが必ずしもこれらに限定されないＴｒｏｐ‐２陽性癌を有する患者における抗Ｔｒｏｐ‐２抗体複合体は、好ましいＡＤＣクラスの代表である。しかしながら、他の癌抗原標的も、それらがＳＮ‐３８のようにトポイソメラーゼＩを標的としてＤＮＡ切断を同様に引き起こす薬剤を保有する場合には、そのＡＤＣをこの用途に用いることができる。
【０１９７】
ＢＲＣＡ１／２欠損を有するＴＮＢＣ腫瘍株、ならびにＰＴＥＮ欠損のみを有するものを含む野生型の発現を有するＴＮＢＣ腫瘍株において、ＩＭＭＵ‐１３２をＰＡＲＰ阻害剤（例えば、オラパリブ）と併用した場合に相乗効果が得られた。このことは、ＩＭＭＵ‐１３２が、ＤＮＡ相同組換え経路に何らかの種類の破損を有する腫瘍と相乗作用し得ることを示唆する。オラパリブと併用することにより、ＩＭＭＵ‐１３２療法は、単独療法でそれぞれ観察される効果を上回る有意な抗腫瘍効果を達成し、その結果、有意な延命効果をもたらした。ＩＭＭＵ‐１３２と微小管阻害剤（例えば、パクリタキセルまたはエリブリンメシル酸塩）との併用もまた、各薬剤での単独療法に比べて有意に有効性が向上した。
【０１９８】
全体として、これらのデータは、癌細胞を標的とし、ＤＮＡ鎖切断を誘発するＩＭＭＵ‐１３２などの抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）と、微小管阻害剤またはＰＡＲＰ阻害剤との併用療法の予想外の有意な利点を証明している。ＩＭＭＵ‐１３２療法とパクリタキセルまたはオラパリブのいずれかとを併用してＢＲＣＡ１／２突然変異型ＴＮＢＣ腫瘍のＰＡＲＰ  ＤＮＡ修復経路を標的とすることによって、観察可能な毒性を伴わずにこの疾患モデルにおいて合成致死性を達成した。例示的な実施形態では、ＩＭＭＵ‐１３２とＰＡＲＰまたは微小管阻害剤との併用は、ＴＮＢＣなどのＴｒｏｐ‐２陽性癌の治療に有用である。これらのデータは、ＴＮＢＣまたは同様の腫瘍を有する患者のＤＮＡ修復機構を同様に標的とする他の化学療法剤とＩＭＭＵ‐１３２を併用する利用性の裏付けを提供する。
【０１９９】
実施例２．慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）におけるＩＭＭＵ‐１１４（抗ＨＬＡ‐ＤＲ）＋ブルトンキナーゼ阻害剤による併用療法
実験計画
ヒト慢性Ｂ細胞白血病細胞（ＪＶＭ‐３）を９６ウェルプレートに播種した。次いで、細胞を、様々な用量のブルトンキナーゼ阻害剤イブルチニブ（１×１０−５〜３．９×１０−９Ｍ）と一定量のＩＭＭＵ‐１１４（０．２５、０．５、０．７５、または１ｎＭ）とともに９６時間インキュベートした。細胞生存率をＭＴＳアッセイによって評価し、用量／反応曲線を、未処理対照細胞と比較した場合の増殖阻害割合に基づいて生成した。Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈ‐Ｐａｄを用いてＩＣ５０値を決定した。データを正規化し、アイソボログラムを生成し、ＪＶＭ‐３細胞におけるイブルチニブに対するＩＭＭＵ‐１１４の効果を示した。
【０２００】
結果
ＩＭＭＵ‐１１４がイブルチニブのＩＣ５０をどのようにシフトさせたかの一例を図５Ａに示す。イブルチニブ単独でインキュベートした細胞は、ＩＣ５０が２．２×１０−６Ｍであった。しかしながら、０．５ｎＭのＩＭＭＵ‐１１４をイブルチニブと併用した場合、ＩＣ５０値は２倍低下し、１．０８×１０−６Ｍになった。０．５ｎＭのＩＭＭＵ‐１１４は、約２２％の増殖阻害しかもたらさないことに留意すべきである。同様に、０．７５ｎＭのＩＭＭＵ‐１１４は、イブルチニブのＩＣ５０値を５．７倍下方にシフトさせた。
【０２０１】
この相互作用が相乗的であるか、相加的であるか、または拮抗的であるかどうかを確かめるために、これらのデータを、２つの他のアッセイ結果と共に、正規化し、アイソボログラムを生成した（図６Ａ）。示すように、ＩＭＭＵ‐１１４と組み合わせたイブルチニブとともにＪＶＭ‐３細胞をインキュベートした場合、相加効果が明らかである。これらのデータは、各薬剤がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて単独でＣＬＬの増殖を阻害できる一方で、併用した場合に相加効果が得られ、ＣＬＬ患者におけるＩＭＭＵ‐１１４及びブルトンキナーゼ療法の併用をサポートすることを示している。
【０２０２】
実施例３．慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）におけるＩＭＭＵ‐１１４（抗ＨＬＡ‐ＤＲ）＋ホスファチジルイノシチド３‐キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤の併用療法
実験計画
ヒト慢性白血病Ｂ細胞（ＪＶＭ‐３）を９６ウェルプレートに播種した。次いで、細胞を、様々な用量のＰＩ３Ｋ阻害剤イデラリシブ（１×１０−５〜３．９×１０−９Ｍ）と一定量のＩＭＭＵ‐１１４（０．２５、０．５、０．７５、または１ｎＭ）とともに９６時間インキュベートした。細胞生存率をＭＴＳアッセイによって評価し、用量／反応曲線を、未処理対照細胞と比較した場合の増殖阻害割合に基づいて生成した。Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈ‐Ｐａｄを用いてＩＣ５０値を決定した。データを正規化し、アイソボログラムを生成し、ＪＶＭ‐３細胞におけるイブルチニブに対するＩＭＭＵ‐１１４の効果を示した。
【０２０３】
結果
イブルチニブと同様に、ＩＭＭＵ‐１１４はＪＶＭ‐３細胞においてイデラリシブのＩＣ５０をシフトさせた（図５Ｂ）。イデラリシブ単独でインキュベートした細胞は、ＩＣ５０が１．５１×１０−６Ｍであった。しかしながら、０．５ｎＭのＩＭＭＵ‐１１４をイデラリシブと併用した場合、ＩＣ５０値は２倍低下し、０．７７×１０−６Ｍになった（ＩＭＭＵ‐１１４は０．５ｎＭでおよそ２６％の増殖阻害しかもたらさない）。同様に、１ｎＭのＩＭＭＵ‐１１４は、イブルチニブのＩＣ５０値を１８倍よりも多く下方にシフトさせた。
【０２０４】
これらのデータを、他の１つのアッセイからの結果とともに、正規化し、アイソボログラムを生成した（図６Ｂ）。示すように、ＩＭＭＵ‐１１４と組み合わせたイデラリシブとともにＪＶＭ‐３細胞をインキュベートした場合、相加効果が得られた。これらのデータは、臨床においてＣＬＬを治療するためのＩＭＭＵ‐１１４とＰＩ３Ｋ阻害剤との併用の有用性を示している。
【０２０５】
実施例４．ＩＭＭＵ‐１１４及びイブルチニブによる再発性慢性リンパ球性白血病の治療
慢性リンパ球性白血病に関する国際ワークショップ及び世界保健機構分類によって定義されたＣＬＬの病歴を有する６５歳の女性は、フルダラビン、デキサメタゾン、及びリツキシマブによる前治療後の再発性疾患、ならびにＣＶＰのレジメンを有する。患者は現在、全身のリンパ節拡大、ヘモグロビン及び血小板産生の減少、ならびに急速に上昇する白血球数に関連した発熱及び夜間の発汗を有する。ＬＤＨは上昇しており、β２ミクログロブリンはほぼ正常の２倍である。患者には、２００ｍｇの抗ＨＬＡ‐ＤＲ  ＩＭＭＵ‐１１４（ＩｇＧ４  ｈＬ２４３）を週２回、皮下投与する療法を施す。抗体を、ブルトンキナーゼ阻害剤イブルチニブと併用して、１日あたり４２０ｍｇの用量で経口投与する。６週間後、患者の血液学的検査値及びＬａｂ値の評価から、患者が併用療法に対して部分奏効を示したことが明らかになる。
【０２０６】
実施例５．ＩＭＭＵ‐１１４及びイデラリシブによる再発性／難治性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療
リツキシマブ及びアルキル化剤で奏効しなかった濾胞性ＮＨＬに罹患するか、またはこれらの療法を受けてから６か月以内に再発した１７人の患者に、疾患が進行するか、または患者が試験から退くまで、週２回、皮下注射で２００ｍｇのＩＭＭＵ‐１１４を、ＰＩ３Ｋ阻害剤イデラリシブ１５０ｍｇの１日２回の経口投与と併せて投与した。奏効を、有害事象、Ｂ細胞血中レベル、血清ＩＭＭＵ‐１１４レベル及びヒト抗ＩＭＭＵ‐１１４（ＨＡＨＡ）力価を含む他の評価とともに、ＣＴスキャンによって評価する。
【０２０７】
時々、軽度から中等度の一時的な注射反応のみが認められ、悪性度３までの好中球減少を除いては安全性の問題は観察されない（しかしながら、治療を中断してから悪性度１に低下するまで可逆性が認められる）。一過性のＢ細胞の枯渇（約２５％まで）が観察される。客観的奏効率（部分奏効＋完全奏効＋不確定完全奏効）は４７％（８／１７）で、完全奏効／不確定完全奏効率は２４％（４／１７）である。８つの客観的反応のうち４つは３０週間以上続く。ヒト抗ＩＭＭＵ‐１１４抗体（ＨＡＨＡ）について評価したすべての血清試料は陰性である。
【０２０８】
実施例６．軽度還元抗体に対する二官能性ＳＮ‐３８産物の複合体化
抗ＣＥＡＣＡＭ５ヒト化ＭＡｂであるｈＭＮ‐１４（ラベツズマブとしても知られる）、抗ＣＤ２２ヒト化ＭＡｂであるｈＬＬ２（エプラツズマブとしても知られる）、抗ＣＤ２０ヒト化ＭＡｂであるｈＡ２０（ベルツズマブとしても知られる）、抗ＥＧＰ‐１ヒト化ＭＡｂであるｈＲＳ７、及び抗ムチンヒト化ＭＡｂであるｈＰＡＭ４（クリバツズマブとしても知られる）をこれらの試験で使用した。５．４ｍＭのＥＤＴＡを含有する４０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を５０〜７０倍モル過剰で使用し、各抗体を３７℃（湯浴）で４５分間、還元した。還元した生成物をサイズ排除クロマトグラフィー及び／またはダイアフィルトレーションにより精製し、ｐＨ６．５の適切な緩衝液にバッファー交換した。Ｅｌｌｍａｎのアッセイによってチオール含量を決定したところ、６．５〜８．５のＳＨ／ＩｇＧ範囲にあった。あるいは、抗体をトリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いてリン酸緩衝液中、ｐＨ５〜７において還元し、次いでｉｎ  ｓｉｔｕで複合体化させた。還元したＭＡｂを、７〜１５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを共溶媒として用いて約１０〜１５倍モル過剰のＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８（米国特許第７，９９９，０８３号に開示されているように調製した）と反応させ、周囲温度で２０分間インキュベートした。複合体を、ＳＥＣで遠心分離し、疎水性カラムを通過させ、最後に限外ろ過‐ダイアフィルトレーションにより精製した。生成物を、３６６ｎｍでの吸光度及び標準値との関連付けによってＳＮ‐３８についてアッセイしたが、タンパク質濃度については、この波長でのＳＮ‐３８吸光度のスピルオーバーに対して補正した２８０ｎｍでの吸光度から推定した。このようにして、ＳＮ‐３８／ＭＡｂ置換率を測定した。精製した複合体を凍結乾燥製剤としてガラスバイアル中に保存し、真空下でキャップし、−２０℃冷凍庫に保存した。これらの複合体のいくつかについて得られたＳＮ‐３８モル置換比（ＭＳＲ）は、通常５〜７の範囲にあったが、これらを表１０に示す。当業者であれば、その複合体化方法が、開示する方法において使用する任意の抗体に適用し得ることを理解するであろう。
【表１０】
2018520140.tif 000021
【０２０９】
実施例７．ヒト膵臓または結腸癌の前臨床モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ治療効力
皮下ヒト膵臓または結腸腫瘍異種移植片を保有する免疫無防備状態胸腺欠損ヌードマウス（メス）を、特異的ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体もしくは対照複合体のいずれかで処置するか、または未処置のままとした。特定の複合体の治療効果が観察された。図７は、Ｃａｐａｎ１膵臓腫瘍モデルを示しており、そこにおいてｈＲＳ７（抗ＥＧＰ‐１）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、及びｈＭＮ‐１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）抗体の特異的ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体は、対照ｈＡ２０‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体（抗ＣＤ２０）及び未処置対照よりも優れた効力を示した。同様に、ヒト膵臓癌のＢＸＰＣ３モデルにおいて、特異的ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８は、対照処置群よりも優れた治療効果を示した（図８）。同様に、ヒト結腸癌の高悪性度ＬＳ１７４Ｔモデルでは、特異的なｈＭＮ‐１４‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８での治療は、非処置群よりも効果的であった（図９）。
【０２１０】
実施例８．ｈＭＮ‐１４‐［ＣＬ１‐ＳＮ‐３８］及びｈＭＮ‐１４‐［ＣＬ２‐ＳＮ‐３８］を用いたヌードマウスにおけるＧＷ‐３９ヒト結腸腫瘍の肺転移のｉｎ  ｖｉｖｏ治療
ＧＷ‐３９ヒト結腸腫瘍懸濁液の静脈内注射によって、ヌードマウスの結腸癌肺転移モデルを確立し、１４日後に治療を開始した。特異的抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体複合体、ｈＭＮ１４‐ＣＬ１‐ＳＮ‐３８及びｈＭＮ１４‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８、ならびに非標的化抗ＣＤ２２ＭＡｂ対照複合体であるｈＬＬ２‐ＣＬ１‐ＳＮ‐３８及びｈＬＬ２‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８ならびにｈＭＮ１４及びＳＮ‐３８の等用量混合物を、異なる用量を用いてｑ４ｄｘ８の用量スケジュールで注射した。図１０（ＭＳＲ＝ＳＮ‐３８／抗体モル置換率）は、ｈＭＮ‐１４複合体による選択的治療効果を示す。ｈＭＮ１４‐ＣＬ１‐ＳＮ‐３８またはｈＭＮ１４‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８を同等の用量２５０μｇで処置したマウスは、１０７日を超える生存期間中央値を示した。肺癌細胞を特異的に標的としない対照結合抗体ｈＬＬ２‐ＣＬ１‐ＳＮ‐３８及びｈＬＬ２‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８で処置したマウスは、５６及び７７日の生存期間中央値を示したが、一方、非複合体化ｈＭＮ１４  ＩｇＧ及び遊離ＳＮ‐３８は、４３．５日の未処理の生理食塩水対照と同等の４５日の生存期間中央値を示した。複合体化した癌細胞標的化抗体‐ＳＮ‐３８複合体の有効性の、有意で驚くべき増加が明白に認められ、それは、非複合体化抗体及び遊離化学療法剤単独よりも実質的により効果的であった。複合体化抗体の治療効果の用量反応性もまた観察された。これらの結果は、同じｉｎ  ｖｉｖｏヒト肺癌系において、非複合体化抗体と遊離ＳＮ‐３８の両方を併用する効果に比べて、ＳＮ‐３８‐抗体複合体が明確に優位であることを示している。
【０２１１】
実施例９．多様な上皮がんの効果的な治療のためのヒト化抗Ｔｒｏｐ‐２  ＩｇＧ‐ＳＮ‐３８複合体の使用
概要
本試験の目的は、抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）であるＳＮ‐３８‐抗Ｔｒｏｐ‐２のいくつかのヒト固形腫瘍型に対する有効性を評価すること、ならびに、マウス、及びヒトと同様のｈＲＳ７に対する組織交差反応性を有するサルにおける忍容性を評価することであった。２つのＳＮ‐３８誘導体、ＣＬ２‐ＳＮ‐３８及びＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８を抗Ｔｒｏｐ‐２ヒト化抗体ｈＲＳ７に複合体化した。安定性、結合能、及び細胞傷害性について免疫複合体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴決定した。Ｔｒｏｐ‐２抗原を発現する５つの異なるヒト固形腫瘍異種移植モデルで有効性を試験した。マウス及びカニクイザルにおいて毒性を評価した。
【０２１２】
２つのＳＮ‐３８誘導体のｈＲＳ７複合体は、薬剤置換（約６）、細胞結合（Ｋｄ約１．２ｎｍｏｌ／Ｌ）、細胞傷害性（ＩＣ５０  約２．２ｎｍｏｌ／Ｌ）、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血清安定性（ｔ／１／２  約２０時間）の点で同等であった。ＡＤＣへの細胞の曝露は、ＰＡＲＰ切断を導くシグナル伝達経路を示したが、ｐ５３及びｐ２１アップレギュレーションにおける遊離ＳＮ‐３８との差異が認められた。Ｃａｌｕ‐３（Ｐ≦０．０５）、Ｃａｐａｎ‐１（Ｐ＜０．０１８）、ＢｘＰＣ‐３（Ｐ＜０．００５）、及びＣＯＬＯ２０５腫瘍（Ｐ＜０．０３３）を保有するマウスにおいて、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８は、無毒性用量で有意な抗腫瘍効果を生成した。マウスは、ＡＬＴ及びＡＳＴ肝臓酵素レベルの短期間の上昇のみで２×１２ｍｇ／ｋｇ（ＳＮ‐３８当量）の用量に忍容性を示した。２×０．９６ｍｇ／ｋｇを注入したカニクイザルは、血球数の一時的な低下を示したが、重要なことに、値は正常範囲を下回らなかった。
【０２１３】
発明者らは、抗Ｔｒｏｐ‐２  ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣが、ある範囲のヒト固形腫瘍型に対して有意で特異的な抗腫瘍効果を示すと結論づける。前記ＡＤＣは、ヒトと同様の組織Ｔｒｏｐ‐２発現を有するサルにおいて忍容性が良好であった（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７‐６９．）。
【０２１４】
固形腫瘍を有する患者のイリノテカン治療は、大部分がＣＰＴ‐１１プロドラッグから活性ＳＮ‐３８代謝産物への低い転化率に起因して、限定的な成功にとどまっている。他の研究者は、この変換の必要性を迂回し、ＳＮ‐３８を受動的に腫瘍に送達する手段として、非標的形態のＳＮ‐３８を試験した。発明者らは、ＳＮ‐３８をヒト化抗Ｔｒｏｐ‐２抗体ｈＲＳ７に共有結合で複合体化した。この抗体‐薬剤複合体は、非小細胞肺癌、膵臓、結腸直腸、及び肺扁平上皮癌を含むある範囲の皮下注射によるヒト癌異種移植片モデルにおいて、いずれも非毒性用量（例えば、累積ＳＮ‐３８等量≦３．２ｍｇ／ｋｇ）で特異的な抗腫瘍効果を有する。
【０２１５】
Ｔｒｏｐ‐２は、多くの上皮癌及びいくつかの正常組織においても広く発現しており、したがって、カニクイザルにおける用量漸増試験を行い、この複合体の臨床的安全性を評価した。サルは、軽度で可逆的な毒性のみを伴う２４ｍｇＳＮ‐３８当量／ｋｇに対し、忍容性を示した。ＨＲＳ７‐ＳＮ‐３８は、その腫瘍標的化及び安全性特性を考慮すると、イリノテカン応答性の固形腫瘍の管理を向上させる可能性がある。
【０２１６】
序論
ＧＡ７３３‐１（胃抗原７３３‐１）、ＥＧＰ‐１（上皮糖タンパク質１）、及びＴＡＣＳＴＤ２（腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサ）としても知られるヒト栄養膜細胞表面抗原（Ｔｒｏｐ‐２）は、様々なヒト癌腫において発現しており、いくつかは予後の有意性を有し、より悪性度の高い疾患と関連している（例えば、Ａｌｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １１：５３９‐４５；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８‐４６；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ  ８：９８‐１０２参照）。マウスＴｒｏｐ‐２を形質移入したマウス膵臓癌細胞株におけるＴｒｏｐ‐２の機能的役割の研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの低血清条件下の増殖、遊走、及び足場非依存性増殖の増大、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでのＫｉ‐６７の発現の増大を伴う増殖速度の促進及び高い転移可能性を明らかにした（Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：２５３）。
【０２１７】
Ｔｒｏｐ‐２抗原は多くの上皮癌に分布しているため、魅力的な治療標的である。多くの固形腫瘍に存在するＥＧＰ‐１に結合するＲＳ７‐３Ｇ１１（ＲＳ７）と命名した抗体をＳｔｅｉｎら（１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８‐４６）が特徴付けたが、この抗原は、いくつかの正常組織においても、通常、より低い強度で、または制限された領域で発現している。放射性標識ＲＳ７を使用して、多数のヒト腫瘍異種移植片において標的化及び治療効力が示された（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５８５７ｓ‐６３ｓ；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  ８０：２６３６‐４１；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ８４：１７３‐８２）が、この内部移行性抗体は非複合体形態で治療活性を示さなかった（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５８５７ｓ‐６３ｓ）。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、Ｔｒｏｐ‐２陽性癌腫に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示した。
【０２１８】
発明者らは、イリノテカン、すなわちＣＰＴ‐１１の活性成分であり、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるＳＮ‐３８のいくつかの誘導体に結合した抗ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＤ６６ｅ）ＩｇＧを使用する抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）の調製を報告した（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６‐２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２‐６１）。その誘導体はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血清安定性が様々に異なり、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、より高いまたはより低い安定性を有する他の結合に比べて、ヒト結腸癌及び膵臓癌異種移植片の成長を予防または阻止するのに、より効果的である１つの形態（ＣＬ２と称する）を見出した。
【０２１９】
重要なことに、これらの効果は無毒性用量で生じ、初期試験では用量制限毒性を決定することができなかった（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２‐６１）。これらの結果は、勇気づけるものであるとともに、ＣＥＡＣＡＭ５抗体が、ＡＤＣの有効性に重要と考えられる特性である内部移行をしないことから、驚くべきことでもある。発明者らは、抗ＣＥＡＣＡＭ５‐ＳＮ‐３８複合体の治療活性が、抗体が局在化した後の腫瘍内のＳＮ‐３８の徐放に関連すると推測した。イリノテカンは、増殖サイクルのＳ期に細胞に曝露する場合に最も優れているため、徐放が奏効を高めると考えられる。実際、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはミセルなどの非標的化血漿増量剤に結合したＳＮ‐３８は、イリノテカンまたはＳＮ‐３８単独よりも高い有効性を示しており（例えば、Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８‐５６）、この機構をさらに支持するものとなっている。
【０２２０】
ＲＳ７抗体が上皮癌に対する広範な反応性と内部移行能力を有することから、ＲＳ７‐ＳＮ‐３８複合体は、薬剤の徐放だけでなく、直接細胞内送達の点でも利点を有し得ると仮定した。したがって、発明者らは、マウスＲＳ７抗体（ｈＲＳ７）のヒト化バージョンを用いてＳＮ‐３８複合体を調製し、その有効性を試験したが、そこにおいて、複合体の質を向上させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性を変化させることなくｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を向上させる改良したＣＬ２Ａリンカーを用いて、ＳＮ‐３８を抗体に結合させた。この新規誘導体（ＣＬ２Ａと称する）は、抗体へのＳＮ‐３８の結合に好ましい薬剤である。
【０２２１】
本明細書において、発明者らは、非毒性用量でヌードマウスに移植したいくつかの上皮癌細胞株におけるｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８複合体の有効性を、実質的により高い用量でも許容可能であることを明らかにする他の研究とともに示す。さらに重要なことに、ヒトと同様の組織において同様にＴｒｏｐ‐２を発現するサルにおける毒性試験の結果は、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８が、マウスにおける治療有効量よりもかなり高い量に対して忍容性を有することを示した。
【０２２２】
材料及び方法
［細胞株、抗体、及び化学療法剤］  本研究で使用したすべてのヒト癌細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から購入した。それらには、Ｃａｌｕ‐３（非小細胞肺癌）、ＳＫ‐ＭＥＳ‐１（肺扁平上皮癌）、ＣＯＬＯ２０５（結腸腺癌）、Ｃａｐａｎ‐１及びＢｘＰＣ‐３（膵臓腺癌）、及びＰＣ‐３（前立腺癌）が含まれる。ヒト化ＲＳ７  ＩｇＧ及び対照ヒト化抗ＣＤ２０（ｈＡ２０  ＩｇＧ、ベルツズマブ）抗体及び抗ＣＤ２２（ｈＬＬ２  ＩｇＧ、エプラツズマブ）抗体は、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．で調製した。イリノテカン（２０ｍｇ／ｍＬ）はＨｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．から入手した。
【０２２３】
［ＳＮ‐３８免疫複合体及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの態様］  ＣＬ２‐ＳＮ‐３８の合成は従前に記載されている（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６‐２６）。ｈＲＳ７  ＩｇＧへのその結合及び血清安定化を、記載されているように実施した（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６‐２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２‐６１）。従前に記載されているように、ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８（分子量１４８０）及びそのｈＲＳ７複合体の調製、ならびに安定性、結合及び細胞傷害性試験を実施した（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６‐２６）。細胞溶解物を調製し、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ、ｐ５３、及びＰＡＲＰ（ポリ‐ＡＤＰ‐リボースポリメラーゼ）のイムノブロッティングを実施した。
【０２２４】
［ｉｎ  ｖｉｖｏ治療試験］  すべての動物試験において、ＳＮ‐３８免疫複合体及びイリノテカンの用量はＳＮ‐３８当量で示す。平均ＳＮ‐３８／ＩｇＧ置換比６に基づくと、２０ｇのマウスに対する５００μｇのＡＤＣの用量（２５ｍｇ／ｋｇ）は、０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ‐３８を含有する。イリノテカンの用量は、同様にＳＮ‐３８当量として示す（すなわち、イリノテカン  ４０ｍｇ／ｋｇは、ＳＮ‐３８  ２４ｍｇ／ｋｇに相当する）。４〜８週齢の雌のＮＣｒ胸腺欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス及び１０週齢の雄のＳｗｉｓｓ‐ＷｅｂｓｔｅｒマウスをＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓから購入した。忍容性試験は、ＳＮＢＬ  ＵＳＡ，Ｌｔｄ．において、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；２．５〜４ｋｇの雄及び雌）で実施した。異なるヒト癌細胞株を動物に皮下移植した。腫瘍体積（ＴＶ）は、ノギスを用いて２次元で測定し、体積を以下のように定義して決定した：Ｌ×ｗ２／２、式中、Ｌは腫瘍の最長寸法、ｗは最短寸法である。治療開始時の腫瘍の大きさは０．１０〜０．４７ｃｍ３の範囲であった。各実験における治療レジメン、用量、及び動物の数を、結果の項に記載する。凍結乾燥したｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８及び対照ＡＤＣを再構成し、必要に応じて滅菌生理食塩水で希釈した。静脈内投与したイリノテカンを除いて、すべての試薬を腹腔内投与した（０．１ｍＬ）。投与レジメンは、発明者らによる従前の調査の影響を受けたが、ＡＤＣを、４日ごとに、または週２回、様々に異なる期間にわたって投与した（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６‐２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２‐６１）。この投薬頻度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複合体の血清半減期を考慮して反映したものとなっており、ＡＤＣへのより連続的な曝露を可能にした。
【０２２５】
［統計］  増殖曲線は、初期ＴＶの経時的な変化率として求めた。腫瘍増殖の統計解析は、曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいた。個々の腫瘍増殖の特性は、線形曲線モデリングから取得した。増殖曲線の統計解析の前に、ｆ検定を用いて群間の等分散性を測定した。片側ｔ検定を用いた生理食塩水対照以外は、両側ｔ検定を用いて、様々な処置群と対照との間の統計的有意性を評価した（Ｐ≦０．０５での有意性）。ＡＵＣの統計的比較は、癌の進行により群内の最初の動物を安楽死させた時点までに限って実施した。
【０２２６】
［薬物動態及び生体内分布］  皮下にＳＫ‐ＭＥＳ‐１腫瘍（約０．３ｃｍ３）を有するヌードマウスに、１１１Ｉｎ放射性標識ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８及びｈＲＳ７  ＩｇＧを注射した。一方の群には、２０μＣｉ（２５０μｇタンパク質）の１１１Ｉｎ‐ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８を静脈内注射し、別の群には、２０μＣｉ（２５０μｇタンパク質）の１１１Ｉｎ‐ｈＲＳ７  ＩｇＧを与えた。様々な時点において、マウス（時間点あたり５匹）を麻酔し、心臓穿刺により採血し、次いで安楽死させた。腫瘍及び様々な組織を取り出し、秤量し、γシンチレーションによって計数して、組織１ｇあたりの注入量の割合（％ＩＤ／ｇ）を決定した。第３の群には、１１１Ｉｎ‐ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８の投与の３日前に、２５０μｇの非標識ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８を注射し、同様に剖検した。ｆ検定を用いて等分散性を決定した後、両側ｔ検定を用いて、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８及びｈＲＳ７  ＩｇＧの取り込みを比較した。血液クリアランスの薬物動態解析は、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（Ｐａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．）を用いて行った。
【０２２７】
［Ｓｗｉｓｓ‐Ｗｅｂｓｔｅｒマウス及びカニクイザルにおける忍容性］  簡潔に述べると、結果の項に記載するように、マウスをそれぞれ４つの群に分けて、０日目及び３日目に、酢酸ナトリウム緩衝液対照または３つの異なる用量のｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８（４、８または１２ｍｇ／ｋｇのＳＮ‐３８）のいずれかを２ｍＬの腹腔内注射で与え、続いて、血液及び血清を採取した。カニクイザル（３匹の雄及び３匹の雌；２．５〜４．０ｋｇ）に２種類の用量のｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８を投与した。可能性のある血液毒性及び血清化学を評価するために、採血した用量、時間、及びサルの頭数を、結果の項に記載する。
【０２２８】
結果
［ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８の安定性及び効力］  ２つの異なる結合を使用してＳＮ‐３８をｈＲＳ７  ＩｇＧに複合体化した。第一のものは、ＣＬ２‐ＳＮ‐３８と呼ばれ、従前に記載されている（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６‐２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２‐６１）。フェニルアラニン部分の除去という点で、ＣＬ２リンカーの合成に変更を加えた。この変更点は合成を単純化したが、複合体化の結果には影響を及ぼさなかった（例えば、ＩｇＧ分子あたり約６個のＳＮ‐３８を組み込んだＣＬ２‐ＳＮ‐３８及びＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８の両方で）。対照比較を行い、血清安定性、抗原結合、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性に有意差がないことを見出した（データは示さず）。
【０２２９】
ＣＬ２からＣＬ２ＡへのＳＮ‐３８リンカーの変更が、ｉｎ  ｖｉｖｏ効力に影響を及ぼさないことを確認するために、ＣＯＬＯ２０５またはＣａｐａｎ‐１腫瘍を保有するマウスにおいて、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ及びｈＲＳ７‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８を比較し、それぞれ０．４ｍｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇのＳＮ‐３８を週２回×４週間使用し、両方の試験において開始時のサイズが０．２５ｃｍ３の腫瘍を用いた（データは示さず）。ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ及びＣＬ２‐ＳＮ‐３８複合体はいずれも、未処理のもの（ＣＯＬＯ２０５モデルにおける生理食塩水に対するＡＵＣ１４ｄａｙｓＰ＜０．００２；Ｃａｐａｎ‐１モデルにおける生理食塩水に対するＡＵＣ２１ｄａｙｓＰ＜０．００１）、及び非標的化抗ＣＤ２０対照ＡＤＣであるｈＡ２０‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８（ＣＯＬＯ２０５モデルにおけるＡＵＣ１４ｄａｙｓＰ＜０．００３；Ｃａｐａｎ‐１モデルにおけるＡＵＣ３５ｄａｙｓＰ＜０．００２）に比べて腫瘍増殖を有意に阻害した。Ｃａｐａｎ‐１モデルにおける試験の終わり（１４０日目）に、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８で処置したマウスの５０％及びｈＲＳ７‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８で処置したマウスの４０％が腫瘍を有していなかったのに対し、ｈＡ２０‐ＡＤＣで処置した動物では、目に見える病気の徴候を示さなかったのは２０％のみであった。
【０２３０】
［作用機序］  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性試験の結果は、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８がいくつかの異なる固形腫瘍株に対してｎｍｏｌ／Ｌ範囲のＩＣ５０値を有することを示した（表１１）。すべての細胞株において、遊離ＳＮ‐３８のＩＣ５０は複合体よりも低かった。Ｔｒｏｐ‐２発現とｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８に対する感受性との間に相関はなかったが、遊離ＳＮ‐３８に対するＡＤＣのＩＣ５０比は、Ｔｒｏｐ‐２を高度に発現する細胞においてより低く、このことはおそらく、より多くの抗原が存在する場合に薬剤を内部移行させる能力がより高いことを反映したものである。
【表１１】
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【０２３１】
ＳＮ‐３８は細胞内のいくつかのシグナル伝達経路を活性化し、アポトーシスを引き起こすことが知られている。発明者らの最初の試験は、初期シグナル伝達事象（ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１及びｐ５３）に関与する２つのタンパク質及び１つの後期アポトーシス事象［ポリ‐ＡＤＰ‐リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断］をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べたものである（データは示さず）。ＢｘＰＣ‐３では、ＳＮ‐３８はｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現を２０倍増加させた一方で、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８は１０倍増加させたに過ぎなかったが、この知見は、この細胞株での遊離ＳＮ‐３８に伴う高い活性に合致する（表１１）。しかしながら、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８は、Ｃａｌｕ‐３におけるｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現を遊離ＳＮ‐３８より２倍以上増加させた（データは示さず）。
【０２３２】
ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８を介したシグナル伝達事象と遊離ＳＮ‐３８を介したシグナル伝達事象とでは、ｐ５３の発現により大きな差異が観察された。ＢｘＰＣ‐３とＣａｌｕ‐３の両方において、遊離ＳＮ‐３８では、ｐ５３アップレギュレーションは４８時間まで明らかでなかった一方で、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８は、２４時間以内にｐ５３をアップレギュレートした（データは示さず）。さらに、ＡＤＣに曝露した細胞におけるｐ５３発現は、両方の細胞株においてＳＮ‐３８に比べてより高かった（データは示さず）。興味深いことに、ｈＲＳ７  ＩｇＧは、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現に対しては認識可能な効果を有してはいなかったが、４８時間の曝露後に限ってではあるものの、ＢｘＰＣ‐３及びＣａｌｕ‐３の両方においてｐ５３のアップレギュレーションを誘導した。後期のアポトーシス事象に関しては、ＳＮ‐３８または複合体のいずれかの存在下でインキュベートした場合、両方の細胞株においてＰＡＲＰの切断が明らかであった（データは示さず）。切断されたＰＡＲＰの存在量は、ＢｘＰＣ‐３において２４時間でより高かったが、これはｐ２１の高い発現及びそのより低いＩＣ５０と相関する。遊離ＳＮ‐３８を用いた場合、ＡＤＣに比べて切断の程度がより高かったことは、細胞傷害性の知見と一致した。
【０２３３】
［ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８の有効性］  Ｔｒｏｐ‐２はいくつかのヒト癌腫で広く発現しているため、いくつかの異なるヒト癌モデルで試験を行い、ｈＲＳ７‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８結合の評価から開始したが、後に、ＣＬ２Ａ結合を用いた複合体を使用した。０．０４ｍｇ  ＳＮ‐３８／ｋｇのｈＲＳ７‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８を４日ごとに４回投与したＣａｌｕ‐３保有ヌードマウスは、同等量のｈＬＬ２‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８を投与した動物に比べて、有意に高い奏効を有していた（それぞれ、ＴＶ＝０．１４±０．２２ｃｍ３、０．８０±０．９１ｃｍ３；ＡＵＣ４２ｄａｙｓＰ＜０．０２６；図１１Ａ）。用量を０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ‐３８に高めた場合の用量反応を観察した。このより高い用量レベルでは、特異的なｈＲＳ７複合体を与えたすべてのマウスは、２８日以内に「治癒」し、１４７日目の試験終了まで腫瘍を有することがないままであった一方で、無関係のＡＤＣで処置した動物では、腫瘍が再増殖した（無関係に対する特異的ＡＵＣ９８ｄａｙｓ：Ｐ＝０．０５）。ｈＲＳ７  ＩｇＧとＳＮ‐３８との混合物を投与したマウスでは、腫瘍は５６日目までに４．５倍超に進行した（ＴＶ＝１．１０±０．８８ｃｍ３；ｈＲＳ７‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８に対するＡＵＣ５６ｄａｙｓＰ＜０．００６）。
【０２３４】
ヒト結腸（ＣＯＬＯ２０５）及び膵臓（Ｃａｐａｎ‐１）腫瘍異種移植片においても有効性を検討した。ＣＯＬＯ２０５腫瘍を保有する動物（図１１Ｂ）では、ｈＲＳ７‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８（０．４ｍｇ／ｋｇ、ｑ４ｄｘ８）は、２８日間の治療期間にわたって腫瘍増殖を妨げ、対照抗ＣＤ２０  ＡＤＣ（ｈＡ２０‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８）またはｈＲＳ７  ＩｇＧに比べて有意に小さい腫瘍を有していた（それぞれ、ＴＶ＝０．１６±０．０９ｃｍ３、１．１９±０．５９ｃｍ３、及び１．７７±０．９３ｃｍ３；ＡＵＣ２８ｄａｙｓＰ＜０．０１６）。マウス血清はヒト血清よりも、イリノテカンをＳＮ‐３８により効率的に変換することができるため、最大耐量のイリノテカンの（２４ｍｇ  ＳＮ‐３８／ｋｇ、ｑ２ｄｘ５）は、ｈＲＳ７‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８と同程度に有効であったが、イリノテカン中のＳＮ‐３８用量（累積２，４００μｇ）は複合体（合計６４μｇ）よりも３７．５倍高かった。
【０２３５】
Ｃａｐａｎ‐１を保有する動物は、イリノテカンを単独で、ｈＲＳ７‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８複合体と同等のＳＮ‐３８用量で投与した場合、有意な奏効を示さなかった（例えば、３５日目において、０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ‐３８を投与した動物における平均腫瘍サイズは、イリノテカンを処置した動物において１．７８±０．６２ｃｍ３であったのに対し、０．４ｍｇ  ＳＮ‐３８／ｋｇのｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８を投与した動物において、０．０４±０．０５ｃｍ３であった；ＡＵＣｄａｙ３５Ｐ＜０．００１；図１１Ｃ）。イリノテカンの用量を、４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ‐３８の１０倍に高めた場合、奏効は改善したが、それでもなお、０．４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ‐３８の用量レベルの複合体ほど有意ではなかった（ＴＶ＝０．１７±０．１８ｃｍ３対１．６９±０．４７ｃｍ３、ＡＵＣｄａｙ４９Ｐ＜０．００１）。等用量の非標的化ｈＡ２０‐ＣＬ２‐ＳＮ‐３８も、イリノテカンを処置した動物に比べて有意な抗腫瘍効果を有していたが、特異的ｈＲＳ７複合体は無関係のＡＤＣより有意に良好であった（ＴＶ＝０．１７±０．１８ｃｍ３対０．８０±０．６８ｃｍ３、ＡＵＣｄａｙ４９Ｐ＜０．０１８）。
【０２３６】
ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣを用いた試験を、ヒト上皮癌の２つの他のモデルに拡張した。ＢｘＰＣ‐３ヒト膵臓腫瘍を保有するマウスにおいても（図１１Ｄ）、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８は、生理食塩水または同量の非標的化ｈＡ２０‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８で処置した対照マウス（それぞれ、ＴＶ＝０．２４±０．１１ｃｍ３対１．１７±０．４５ｃｍ３及び１．０５±０．７３ｃｍ３；ＡＵＣｄａｙ２１Ｐ＜０．００１）、または１０倍高いＳＮ‐３８当量のイリノテカン（それぞれ、ＴＶ＝０．２７±０．１８ｃｍ３対０．９０±０．６２ｃｍ３）；ＡＵＣｄａｙ２５Ｐ＜０．００４）に比べて、腫瘍増殖を有意に阻害した。興味深いことに、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＤＣで処置したＳＫ‐ＭＥＳ‐１ヒト扁平上皮細胞肺腫瘍を保有するマウスにおいて（図１１Ｅ）、腫瘍増殖阻害は、生理食塩水または非結合ｈＲＳ７  ＩｇＧよりも優れていた（ＴＶ＝０．３６±０．２５ｃｍ３対１．０２±０．７０ｃｍ３及び１．３０±１．０８ｃｍ３；ＡＵＣ２８ｄａｙｓ、Ｐ＜０．０４３）が、非標的化ｈＡ２０‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８または最大耐量のイリノテカンは、特異的ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８複合体と同等の抗腫瘍効果を示した。すべてのマウスの試験において、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣは、体重減少に関して良好な忍容性を示した（データは示さず）。
【０２３７】
［ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８の生体内分布］  ＳＫ‐ＭＥＳ‐１ヒト肺扁平上皮癌異種移植片（データは示さず）を保有するマウスにおいて、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８または非複合体化ｈＲＳ７  ＩｇＧの生体分布を、それぞれの１１１Ｉｎ標識基質を用いて比較した。薬物動態解析を実施して、非複合体化ｈＲＳ７（データは示さず）と比較したｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８のクリアランスを測定した。ＡＤＣは、同量の非複合体化ｈＲＳ７よりも速く排出され、ＡＤＣは、約４０％短い半減期及び平均滞留時間を示した。それにもかかわらず、腫瘍への取り込みに対する影響は最小限であった（データは示さず）。２４時間及び４８時間の時点で有意差があったものの、７２時間（ピーク吸収）まで、腫瘍中の両方の薬剤の量は同程度であった。正常組織のうち、肝臓及び脾臓の相違が最も顕著であった（データは示さず）。注射後２４時間時点で、ｈＲＳ７‐ＩｇＧの２倍を上回るｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８が肝臓に存在した。逆に、脾臓では、ピーク取り込み時（４８時間時点）にｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８に比べて３倍多くの親ｈＲＳ７  ＩｇＧが存在した。残りの組織における取り込み及びクリアランスは、概して血中濃度の差異を反映していた。
【０２３８】
治療のために週２回の投与を与えたため、１１１Ｉｎ標識抗体の注射の３日前に最初に０．２ｍｇ／ｋｇ（２５０μｇタンパク質）のｈＲＳ７  ＡＤＣを前投与した動物群における腫瘍への取り込みを調べた。前投与したマウスの腫瘍への１１１Ｉｎ‐ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８の取り込みは、前投与していない動物に比べてすべての時点において実質的に低下した（例えば、７２時間時点で、前投与した場合の腫瘍への取り込みは１２．５％±３．８％ＩＤ／ｇであったのに対し、前投与していない動物では２５．４％±８．１％ＩＤ／ｇであった；Ｐ＝０．０１２３）。前投与は、血液クリアランスまたは組織への取り込みに顕著な影響を及ぼさなかった（データは示さず）。これらの試験は、いくつかの腫瘍モデルにおいて、特異的抗体の腫瘍への付着が前述の用量（複数可）によって低減し得ることを示唆しており、このことは、ＡＤＣ用量を増加させると治療応答の特異性が低下する理由、そしてさらなる用量の増加を指示しない理由を説明している可能性がある。
【０２３９】
［Ｓｗｉｓｓ‐Ｗｅｂｓｔｅｒマウス及びカニクイザルにおけるｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８の忍容性］  Ｓｗｉｓｓ‐Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、４、８、及び１２ｍｇ  ＳＮ‐３８／ｋｇのｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８の、それぞれ３日間にわたる２回の投与に忍容性を示し、一過性の体重減少は最小限であった（データは示さず）。造血毒性はなく、血清化学は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼの上昇のみを示した（データは示さず）。処置の７日後、ＡＳＴは、３つの処置群すべてにおいて正常レベル（＞２９８Ｕ／Ｌ）を上回り（データは示さず）、最も多い割合のマウスが２×８ｍｇ／ｋｇ群にあった。しかしながら、処置後１５日までに、ほとんどの動物は正常範囲内になった。ＡＬＴレベルもまた、処置の７日以内に正常範囲（＞７７Ｕ／Ｌ）を上回り（データは示さず）、１５日目までに正常化した。これらのマウスすべての肝臓が、組織損傷の組織学的証拠を示さなかった（データは示さず）。腎機能に関しては、処置群においてグルコース及び塩化物レベルのみが幾分上昇した。２×８ｍｇ／ｋｇでは、７匹のマウスのうち５匹が、グルコースレベルをわずかに上昇させ（２７３〜３２０ｍｇ／ｄＬの範囲、正常範囲の上限は２６３ｍｇ／ｄＬ）、それらは注入後１５日までに正常に戻った。同様に、２つの最高投与量群（２×８ｍｇ／ｋｇ群で５７％及び２×１２ｍｇ／ｋｇ群で１００％のマウス）において、塩化物濃度がわずかに上昇し、その範囲は１１６〜１２７ｍｍｏｌ／Ｌであり（正常範囲の上限は１１５ｍｍｏｌ／Ｌ）、注射後１５日まで上昇したままであった。これは、大部分の塩化物が消化管による吸収によって得られることから、胃腸毒性の指標にもなり得るが；しかしながら、終了時には、検査した臓器系に組織損傷の組織学的証拠は存在しなかった（データは示さず）。
【０２４０】
マウスは、ｈＲＳ７が結合するＴｒｏｐ‐２を発現しないため、ｈＲＳ７複合体の臨床利用への可能性を決定するためにより適切なモデルが必要であった。免疫組織学的試験により、ヒト及びカニクイザルの複数の組織における結合性を明らかにした（乳房、眼、胃腸管、腎臓、肺、卵巣、卵管、膵臓、副甲状腺、前立腺、唾液腺、皮膚、胸腺、甲状腺、扁桃腺、尿管、膀胱、及び子宮；データは示さず）。この交差反応性に基づいて、忍容性試験をサルで実施した。
【０２４１】
２×０．９６ｍｇ  ＳＮ‐３８／ｋｇのｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８を投与した群は、注入後及び試験終了後に有意な臨床徴候を有していなかった。体重減少は７．３％を超えず、１５日目に順応体重に戻った。血球数データの大部分（データは示さず）に一過性の減少が記録されたが、値は正常範囲を下回ることはなかった。血清化学において異常な値は見出されなかった。１１日目（最後の注射後８日目）に剖検した動物の組織病理学は、造血器官（胸腺、下顎及び腸間膜リンパ節、脾臓、及び骨髄）、胃腸器官（胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸及び直腸）、女性の生殖器（卵巣、子宮、及び膣）、ならびに注射部位における微視的変化を示した。これらの変化は、最小から中程度の範囲であり、胸腺及び胃腸管以外のすべての組織において回復期間（３２日）の終わりに完全に逆転し、後の時点で完全回復する傾向にあった。
【０２４２】
複合体の２×１．９２ｍｇ  ＳＮ‐３８／ｋｇの用量レベルでは、胃腸合併症及び骨髄抑制に起因する死亡が１例あり、この群内の他の動物は、同様の、しかし２×０．９６ｍｇ／ｋｇ群よりも深刻な有害事象を示す。これらのデータは、用量制限毒性がイリノテカンと同一；すなわち、腸管及び血液への毒性であったことを示している。したがって、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８の最大耐量は、２×０．９６〜１．９２ｍｇ  ＳＮ‐３８／ｋｇであり、これはヒト等量で表すと、２×０．３〜０．６ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ‐３８である。
【０２４３】
考察
Ｔｒｏｐ‐２は、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、及び卵巣癌を含む多くの上皮腫瘍で発現するタンパク質であるため、細胞傷害剤を送達するための潜在的に重要な標的である。ＲＳ７抗体は、Ｔｒｏｐ‐２に結合すると内部移行する（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５８５７ｓ‐６３ｓ）ため、細胞傷害剤の直接細胞内送達が可能である。
【０２４４】
抗体への化学療法薬の複合体化は、３０年以上にわたって研究されてきた。ＡＤＣの実質的な部分は、腫瘍によっては処理されず、正常組織によって処理されるため、これらの薬剤は、腫瘍の治療レベルに到達する以前に、正常な器官系に対する毒性が強すぎるというリスクがある。任意の治療薬と同様に、治療濃度域はＡＤＣの潜在能力を決定する重要な因子であり、したがって、「超毒性」薬剤を調べるよりも、Ｔｒｏｐ‐２を標的としたＡＤＣの薬剤成分としてＳＮ‐３８を選択した。
【０２４５】
ＳＮ‐３８は、強力なトポイソメラーゼＩ阻害剤であり、いくつかの細胞株においてナノモル範囲のＩＣ５０値を有する。これは、プロドラッグであるイリノテカンの活性型であり、結腸直腸癌の治療に使用され、肺癌、乳癌、及び脳癌においても活性を有する。発明者らは、ＡＤＣの形態で直接標的化したＳＮ‐３８は、活性型ＳＮ‐３８へのＣＰＴ‐１１の生物変換反応が低調であって、患者によって様々に異なる点を克服することによって、ＣＰＴ‐１１よりも有意に改善した治療剤であると考えられると推論した。
【０２４６】
元のＣＬ２誘導体に挿入されているＰｈｅ‐Ｌｙｓペプチドは、カテプシンＢによる切断を可能にした。合成プロセスを簡略化するために、ＣＬ２Ａにおいては、フェニルアラニンを削除し、カテプシンＢ切断部位を除去した。興味深いことに、この生成物は、ＣＬ２で得られる広範な特性に比べてより明確なクロマトグラフィー特性を有していた（データは示さず）が、より重要なことに、この変化は、対照試験において、複合体の結合、安定性、または効力にマイナスの影響を及ぼさなかった。これらのデータは、ＣＬ２中のＳＮ‐３８が、カテプシンＢ切断部位ではなく、主にＳＮ‐３８のラクトン環に結合するｐＨ感受性ベンジルカーボネートでの切断によって、複合体から放出されたことを示唆する。
【０２４７】
ある範囲の固形腫瘍細胞株に対するｈＲＳ７  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性は、一貫してｎｍｏｌ／Ｌ範囲のＩＣ５０値を有していた。しかしながら、遊離ＳＮ‐３８に曝露した細胞は、ＡＤＣに比べて低いＩＣ５０値を示した。この遊離ＳＮ‐３８と複合体化ＳＮ‐３８との差異は、ＥＮＺ‐２２０８（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１８８８‐９６）及びＮＫ０１２（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８‐５６）にも報告されている。ＥＮＺ‐２２０８は、分枝ＰＥＧを使用してＰＥＧあたり約３．５〜４分子のＳＮ‐３８を結合し、一方、ＮＫ０１２は、２０重量％のＳＮ‐３８を含有するミセルナノ粒子である。発明者らのＡＤＣでは、Ｔｒｏｐ‐２発現レベルが腫瘍細胞で増加するにつれて、この差異（すなわち、遊離ＳＮ‐３８と複合体化ＳＮ‐３８の効力の比）が減少し、薬剤の標的送達の利点が示唆された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血清安定性に関しては、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８のＣＬ２‐及びＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８形態では、いずれも約２０時間のｔ／１／２が得られ、これはＥＮＺ‐２２０８について報告された１２．３分という短いｔ／１／２（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １９：８４９‐５９）とは対照的であるが、２４時間後の生理的条件下でのＮＫ０１２からの５７％のＳＮ‐３８放出と同等である（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８‐５６）。
【０２４８】
ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８（ＣＬ２‐ＳＮ‐３８またはＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８のいずれか）による腫瘍保有マウスの治療は、５つの異なる腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を有意に阻害した。そのうち４例では腫瘍退縮が認められ、Ｃａｌｕ‐３の場合、最高用量のｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８を投与したすべてのマウスは、試験終了時に腫瘍を有していなかった。ヒトの場合と異なり、イリノテカンは５０％以上の変換率でマウスの血漿エステラーゼによってＳＮ‐３８に非常に効率的に変換され、マウスにおいてヒトよりもより高い効力を生じる。イリノテカンをＳＮ‐３８レベルの１０倍または同等のレベルで投与した場合、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８は、有意により良好に腫瘍増殖を制御した。イリノテカンをその最大耐量である２４ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｄｘ５（ＳＮ‐３８の３７．５倍）で投与した場合のみ、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８の有効性と同等であった。患者体内においては、イリノテカンの生物変換反応は実質的により低くなると考えられるため、この利点はｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８をより有利にすると考えられる。
【０２４９】
発明者らはまた、ＳＫ‐ＭＥＳ‐１などのいくつかの抗原発現細胞株において、抗原結合ＡＤＣを使用しても、必ずしもそのことが、結合しない無関係の複合体よりも良好な治療応答を保証するとは限らないことを示した。これは異常または予想外の発見ではない。事実、先述の非結合ＳＮ‐３８複合体は、イリノテカンに比べて治療活性を高めるため、無関係なＩｇＧ‐ＳＮ‐３８複合体はいくらかの活性を有すると予想される。これは、正常な組織よりも巨大分子の通過を可能にする未成熟で漏出性の血管を腫瘍が有するという事実に関連する。発明者らの複合体を用いると、ｐＨがリソソームレベルを模倣するレベル（例えば、３７℃でｐＨ５．３；データは示さず）まで低下する場合、５０％のＳＮ‐３８が約１３時間で放出されるが、中性ｐＨの血清では放出速度はほぼ１／２に低下する。無関係の複合体が酸性腫瘍微小環境に入ると、局所的にいくつかのＳＮ‐３８を放出すると予想される。腫瘍の生理機能や薬に対する先天的感受性などの他の要因もまた、この「ベースライン」活性を規定する役割を果たすであろう。しかしながら、より長い滞留時間を有する特異的複合体は、特異的抗体を捕捉するための十分な抗原が存在する限り、このベースライン応答に対して効力を高めるであろう。ＳＫ‐ＭＥＳ‐１モデルにおける生体内分布試験により、連続投与の結果として腫瘍抗原が飽和する場合に、特異的複合体の腫瘍への取り込みが低下し、その結果、無関係な複合体で認められるものと同等の治療結果が生じることが明らかになった。
【０２５０】
発明者らのＡＤＣと公表された他のＳＮ‐３８送達薬剤の報告とを直接比較することは困難であるが、いくつかの一般的な観察が可能である。発明者らの治療研究において、最も高い個々の用量は０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ‐３８であった。Ｃａｌｕ‐３モデルでは、２０ｇのマウスに４回の注射のみを行い、合計累積投与量１．６ｍｇ／ｋｇのＳＮ‐３８すなわち３２μｇのＳＮ‐３８を投与した。ＥＮＺ‐２２０８を用いた複数の試験をその最大耐量１０ｍｇ／ｋｇ×５を用いて行い、ＮＫ０１２を用いた前臨床試験では、３０ｍｇ／ｋｇ×３の最大耐量を必要とした。したがって、ＥＮＺ‐２２０８及びＮＫ０１２において報告された用量に比べて、それぞれ３０倍及び５５倍少ないＳＮ‐３８当量のｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８を用いて有意な抗腫瘍効果が得られた。１０倍少ないｈＲＳ７  ＡＤＣ（０．０４ｍｇ／ｋｇ）の場合でも有意な抗腫瘍効果が認められた一方で、ＥＮＺ‐２２０８の低用量は示されておらず、ＮＫ０１２用量は、４倍低下させて７．５ｍｇ／ｋｇとした場合に効力が失われた（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８‐５６）。正常マウスは、２４ｍｇ／ｋｇのＳＮ‐３８（１，５００ｍｇ／ｋｇの複合体）の１週間にわたる累積投与量を用いても急性毒性を示さず、最大耐量がより高いことを示した。したがって、腫瘍を保有する動物は、７．５〜１５倍低い量のＳＮ‐３８当量で効果的に治療された。
【０２５１】
トポイソメラーゼＩ阻害剤として、ＳＮ‐３８はｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１のアップレギュレーションとともに細胞のＤＮＡに著しい損傷を誘発し、カスパーゼ活性化及びＰＡＲＰの切断を生じる。ＢｘＰＣ‐３及びＣａｌｕ‐３細胞をＡＤＣに曝露すると、ｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の両方がベースレベルを超えてアップレギュレートされた。さらに、両細胞株においてＰＡＲＰ切断も明らかであり、これらの細胞におけるアポトーシス事象を確認した。興味深いことに、ＢｘＰＣ‐３及びＣａｌｕ‐３において、遊離ＳＮ‐３８及び発明者らのｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８のいずれによっても、ｐ５３に比べてｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１がより高くアップレギュレーションされた。このことは、これら２つの細胞株におけるｐ５３の突然変異状態、及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１を介したアポトーシスにｐ５３非依存性経路が利用されていることを示している可能性がある。
【０２５２】
興味深い観察結果は、ＢｘＰＣ‐３及びＣａｌｕ‐３の両方における２４時間時点でのｐ５３の早期アップレギュレーションが、遊離ＳＮ‐３８よりもｈＲＳ７‐ＡＤＣによって、より媒介されるということであった。裸のｈＲＳ７  ＩｇＧでも、わずか４８時間の曝露の後であっても、これらの細胞株においてｐ５３をアップレギュレートすることができた。Ｔｒｏｐ‐２の過剰発現及び抗体による架橋は、いくつかのＭＡＰＫ関連シグナル伝達事象、ならびに細胞内カルシウム放出に関連している。ｈＲＳ７の結合はＰＡＲＰ切断の欠如によって証明されるように、ＢｘＰＣ‐３及びＣａｌｕ‐３においてアポトーシスを誘導するのに十分ではなかったが、細胞を刺激するのには十分である場合があり、その結果、ｈＲＳ７に結合したＳＮ‐３８を含むことにより、腫瘍増殖阻害に対してより大きな効果をもたらし得る。どの経路がＳＮ‐３８のｈＲＳ７送達に関与しているか、そしてそれらが遊離ＳＮ‐３８とどのように異なり得るか、及びこのシグナル伝達においてｐ５３状態がどのような影響を及ぼし得るかについての研究が現在進行中である。
【０２５３】
生体分布研究により、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８は、親ｈＲＳ７  ＩｇＧと同程度に腫瘍へ取り込まれていたが、ＳＮ‐３８の疎水性に起因する可能性がある２倍高い肝臓への取り込みによって実質的に速く消失していたことが明らかとなった。肝臓を介して排出されるＡＤＣについては、肝臓及び胃腸の毒性が用量制限であると予想された。マウスにおいて肝臓トランスアミナーゼの増加の証拠があったが、胃腸毒性はせいぜい軽度であって、体重の一時的な減少のみであり、組織病理学的検査では異常は認められなかった。興味深いことに、血液には毒性は認められなかった。しかしながら、サルは、イリノテカンについて予想されたものと同じ毒性特性を示し、消化管及び血液毒性は用量制限的であった。
【０２５４】
ｈＲＳ７によって認識されるＴｒｏｐ‐２はマウスにおいて発現しないため、ヒトと同様のＴｒｏｐ‐２の組織発現を有するサルにおいて毒性試験を行うことが非常に重要であった。サルは、０．９６ｍｇ／ｋｇ／回（約１２ｍｇ／ｍ２）に対して忍容性を示し、軽度で可逆的な毒性が伴ったが、これは約０．３ｍｇ／ｋｇ／回（約１１ｍｇ／ｍ２）のヒト用量に相当する。ＮＫ０１２の第Ｉ相臨床試験では、固形腫瘍を有する患者は、３週に１回の２８ｍｇ／ｍ２のＳＮ‐３８に対して忍容性を示し、用量制限毒性として悪性度４の好中球減少を伴っていた（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：５０５８‐６６）。同様に、ＥＮＺ‐２２０８を用いた第Ｉ相臨床試験では、用量制限的な発熱性好中球減少症が明らかとなり、３週に１回の１０ｍｇ／ｍ２の投与、またはＧ‐ＣＳＦ投与の場合には１６ｍｇ／ｍ２の投与が推奨された。サルは２２ｍｇ／ｍ２の累積ヒト等量に忍容性を有するため、ｈＲＳ７が多数の正常組織に結合するにもかかわらず、ｈＲＳ７  ＡＤＣの単回治療の最大耐量は、他の非標的ＳＮ‐３８薬剤の最大耐量と同等であり得る可能性がある。実際、抗Ｔｒｏｐ‐２抗体の特異性は、毒性特性がイリノテカンと類似しているため、用量制限毒性を規定する役割を果たしていないようである。さらに重要なことに、ヒト等量０．０３ｍｇ  ＳＮ‐３８当量／ｋｇ／用量で奏効したマウスのように、抗腫瘍活性がヒトにおいて達成可能な場合、有意な抗腫瘍応答を臨床的に実現することができる。
【０２５５】
結論として、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏヒト癌異種移植片モデルと組み合わせたサルにおける毒物学試験の結果は、Ｔｒｏｐ‐２を標的とするこのＡＤＣが、異なる上皮起源のいくつかの腫瘍に対する有効な治療剤であることを示している。
【０２５６】
実施例１０．２‐ピロリノドキソルビシン（２‐ＰＤｏｘ）のプロドラッグ形態に複合体化した抗Ｔｒｏｐ‐２抗体の有効性
米国特許出願第１４／１７５，０８９号（その実施例１は参照として本明細書に援用する）に開示されているように、プロドラッグ形態の２‐ＰＤｏｘ（プロ‐２‐ＰＤｏｘと称する）を調製し、抗体に複合体化した。以下に特に記載しない限り、抗体分子あたりの薬剤部分の数は、約６．５〜約７．５の範囲であった。
【０２５７】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合試験］―複合体化抗体及び非複合体化抗体の結合を比較する細胞結合アッセイによって、抗体結合の保持を確認した（Ｃｈａｒｉ，２００８，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  ４１：９８‐１０７）。複合体の効力を、適切な標的細胞を用いて４日間のＭＴＳアッセイで試験した。抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣ（ｈＲＳ７‐ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘ）は、胃（ＮＣＩ‐Ｎ８７）、膵臓（Ｃａｐａｎ‐１）、及び乳房（ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８）ヒト癌細胞株において０．３５〜１．０９ｎＭのＩＣ５０値を示し、同じ細胞株において遊離の薬剤は０．０２〜０．０７ｎＭの効力を示した。さらなる研究において、ｈＲＳ７‐ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘは、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８、ＡＧ  Ｓ、ＮＣＩ‐Ｎ８７及びＣａｐａｎ‐１固形腫瘍細胞株に対して細胞傷害性であることが観察された（データは示さず）。
【０２５８】
非結合ｈＲＳ７と、抗体あたり６分子のｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘに複合体化したｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘ‐ｈＲＳ７との間で、ＮＣＩ‐Ｎ８７胃癌細胞に対する抗体部分の結合における有意差は観察されなかった（データは示さず）。ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘの抗体への結合は、抗体‐抗原結合活性に影響を及ぼさないと結論される。
【０２５９】
［血清安定性］―抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣ（ｈＲＳ７‐ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘ）の血清安定性を、３７℃、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で、ヒト血清中でインキュベートすることによって測定した。インキュベート物を、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いたＨＰＬＣによって分析した。分析結果は、複合体からの遊離薬剤の放出がないことを示し、このことは複合体の高い血清安定性を示唆した。ｈＲＳ７‐ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘと同じ切断可能なリンカーを有するｈＲＳ７‐ドキソルビシン複合体を用いて同じ実験を繰り返した場合、遊離薬剤が９６時間の半減期で放出されることを個々に確認し、そこにおいて遊離のドキソルビシンに対応するピークがＨＩＣ  ＨＰＬＣで認められた。
【０２６０】
驚くべきことに、ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘ複合体は、抗体のペプチド鎖を一緒に架橋するため、抗体にしっかりと保持されていることが判明した。架橋は、抗体への薬剤の結合を安定化し、その結果、抗体が代謝された後に薬剤が細胞内にのみ放出される。架橋は、例えば、循環器系への遊離薬剤の放出に起因する心毒性を最小限にとどめるのに役立つ。従前の２‐ＰＤｏｘペプチド複合体の使用は、薬剤によってｉｎ  ｖｉｖｏでペプチドが他のタンパク質またはペプチドと架橋形成したため、成功しなかった。本発明の抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣでは、ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘは、プロドラッグ形態において鎖間ジスルフィドチオール基に結合している。プロドラッグ保護は、注射直後にｉｎ  ｖｉｖｏで迅速に除去され、結果として生じる複合体の２‐ＰＤｏｘ部分は、抗体のペプチド鎖を架橋し、抗体分子内で分子内架橋を形成する。この架橋は、ＡＤＣを安定化させるとともに、循環器系内の他の分子への架橋を防止する。
【０２６１】
［ｉｎ  ｖｉｖｏでの前臨床試験］―腫瘍の大きさは、長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）をキャリパー測定することによって決定し、腫瘍体積は（Ｌ×Ｗ２）／２として計算した。腫瘍を測定し、週２回、マウスの体重を測定した。腫瘍の大きさが１ｃｍ３を超えるか、開始時の体重から１５％超の減少が認められるか、さもなければ瀕死状態になった場合に、マウスを安楽死させた。腫瘍増殖データの統計解析は、曲線下面積（ＡＵＣ）及び生存期間に基づいた。線形曲線モデリングにより個々の腫瘍増殖のプロファイルを得た。増殖曲線の統計解析の前に、ｆ検定を用いて群間の等分散性を測定した。両側ｔ検定を用いて、様々な処置群と非特異的対照の間の統計的有意性を評価した。生理食塩水対照の解析については、片側ｔ検定を用いて有意性を評価した。生存性の試験は、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ４．０３）ソフトウェアパッケージ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．；エンシニータス、カリフォルニア）を使用し、Ｋａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒプロット（ログランク検定）を用いて解析した。前臨床実験におけるすべての用量は抗体量で表す。薬剤に関しては、例えば２０ｇマウス中の１００μｇの抗体（５ｍｇ／ｋｇ）は、薬剤／ＩｇＧ比３〜６を有するＡＤＣを用いる場合、１．４μｇ〜２．８μｇ（０．１４〜０．１７ｍｇ／ｋｇ）のｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘ等量を保有する。
【０２６２】
３００μｇ［約１０μｇのｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘ］を上回る抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣの単一の静脈内投与は致命的であったが、２週間で４５μｇを４回投与したすべての動物が忍容性を示した。この投与レジメンを用いて、２つのヒト腫瘍異種移植片モデル、Ｃａｐａｎ‐１（膵臓癌）及びＮＣＩ‐Ｎ８７（胃癌）における抗Ｔｒｏｐ‐２  ｈＲＳ７‐ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘの治療効果を調べた。治療は、ヌードマウスへの腫瘍移植の７日後に開始した。確立した７日齢のＣａｐａｎ‐１モデルにおいて、確立した腫瘍の１００％が急速に退行し、再増殖の徴候は認められなかった（データは示さず）。この結果は、反復実験で再現された（データは示さず）。ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘの抗Ｔｒｏｐ‐２複合体は、膵臓癌でも発現するＣＥＡＣＡＭ５に対する抗体（ｈＭＮ‐１４）、または膵臓癌で発現しないＣＤ２０（ｈＡ２０）に対する抗体に比べて、より効果的であった。すべての処置は、生理食塩水対照よりも優れていた。
【０２６３】
確立したＮＣＩ‐Ｎ８７モデルにおいても同様の結果が観察され（データは示さず）、７０日後に投与した第２コースの治療は、安全に忍容され、残存腫瘍の更なる退行をもたらした（データは示さず）。Ｔｒｏｐ‐２を標的とする内部移行性ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８複合体は、内部移行しにくい抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ｈＭＮ‐１４（データは示さず）の複合体よりも良好な治療応答を提供した。非標的化抗ＣＤ２０  ＡＤＣであるｈＡ２０‐ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘは効果がなく、このことは選択的な治療効力を示している（データは示さず）。乳癌異種移植片（ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８）及び第二の膵臓癌異種移植片（データは示さず）からのデータは、同じパターンを示し、抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣは非標的化ＡＤＣまたは生理食塩水対照に比べて有意により効果的であった。両方の場合において、抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣの投与は、試験終了まで腫瘍増殖の明らかな阻害を生じた。
【０２６４】
［薬剤／ＩｇＧ比６．８または３．７の置換を有するｈＲＳ７‐ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘのＰＫ及び毒性］―最大８種類の超毒性剤／ＭＡｂを保有する抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）は、未修飾ＭＡｂよりも速く排出され、非特異的毒性を高めることが知られており、この知見が、薬剤置換を４か所以下とする現在の傾向を導いている（Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：７０６３‐７０）。ＡＤＣを、約６：１及び約３：１の平均薬剤／ＭＡｂ置換率（ＭＳＲ）で調製及び評価した。６．８または３．７（同じタンパク質用量）の薬剤置換を有する未修飾ｈＲＳ７またはｈＲＳ７‐ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘの単回用量を正常マウスの群（ｎ＝５）に静脈内投与し、注射後３０分、４時間、２４時間、７２時間、及び１６８時間に血清試料を採取した。これらを抗体濃度についてＥＬＩＳＡで分析した。様々な時点における血清濃度に有意差はなく、このことは、これらが血液と同様のクリアランスを示したことを意味している。ＰＫパラメータ（Ｃｍａｘ、ＡＵＣなど）も同様であった。より高いまたはより低い薬剤置換を有するＡＤＣは、それらを複合体化薬剤と同用量で投与した場合、ヌードマウスにおいて同様の忍容性を有していた。
【０２６５】
［最小有効量（ＭＥＤ）での治療有効性］―ＮＣＩ‐Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を保有するヌードマウスにおいて、タンパク質用量９ｍｇ／ｋｇ、６．７５ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、２．２５ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス投与によって、抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣ（ｈＲＳ７‐ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘ）を評価した。この治療は、平均腫瘍体積（ｍＴＶ）が０．２５６ｃｍ３の時点で開始した。２１日目に、生理食塩水対照群（非処置群）のｍＴＶは０．８０１±０．１８１ｃｍ３であり、これは、９、６．７５、４．５、または２．２５ｍｇ／ｋｇ用量で処置し、ｍＴＶがそれぞれ０．２１１±０．０４２ｃｍ３、０．２３９±０．０．０５４ｃｍ３、０．２６４±０．０８７ｃｍ３、及び０．５６７±０．１７９ｃｍ３であったマウスよりも有意に大きかった（Ｐ＜０．００４７、片側ｔ検定）。これらから、最小有効量は２．２５ｍｇ／ｋｇであると推定され、最大耐量は９ｍｇ／ｋｇであった。
【０２６６】
実施例１１．ｈＲＳ７及びパクリタキセルを有する抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣ
新規抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）を、ｈＲＳ７抗ヒトＴｒｏｐ‐２抗体（ｈＲＳ７‐パクリタキセル）にパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））を複合体化することによって作製した。最終生成物は、平均薬剤対抗体置換比２．２を有していた。このＡＤＣを、２つの異なるＴｒｏｐ‐２陽性細胞株：ＢｘＰＣ‐３（ヒト膵臓腺癌）及びＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８（ヒト三種陰性乳癌）を標的としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ＡＤＣを添加する１日前に、細胞を組織培養から採取し、ウェル当たり２０００細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞を遊離のパクリタキセル（６．１×１０−１１〜４×１０−６Ｍ）またはｈＲＳ７‐パクリタキセルの薬剤均等物に曝露した。比較のために、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８及び遊離ＳＮ‐３８も３．８４×１０−１２〜２．５×１０−７Ｍの範囲で試験した。プレートを３７℃で９６時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、ＭＴＳ基質をすべてのプレートに添加し、未処理の対照ウェルのＯＤ４９２ｎｍが約１．０になるまで、３０分間隔で発色を読み取った。増殖阻害は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＰｒｉｓｍソフトウェア（非線形回帰を用いてシグモイド用量反応曲線を生成し、ＩＣ５０値を取得）を用いて、未処理細胞に対する増殖の割合として測定した。
【０２６７】
ｈＲＳ７‐パクリタキセルＡＤＣは、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８乳房細胞株において細胞傷害活性を示し（データは示さず）、ＩＣ５０値はｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８よりおよそ４．５倍高かった。遊離パクリタキセルは、遊離ＳＮ‐３８よりもはるかに強力であった（データは示さず）。遊離ＳＮ‐３８のＩＣ５０が１．５４×１０−９Ｍであった一方で、遊離パクリタキセルのＩＣ５０は６．１×１０−１１Ｍ未満であった。同様の結果が、ＢｘＰＣ‐３膵臓細胞株で得られ（データは示さず）、そこにおいてｈＲＳ７‐パクリタキセルＡＤＣは、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣよりおよそ２．８倍高いＩＣ５０値を有していた。これらの結果は、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣと同様にナノモル範囲のＩＣ５０値を有する抗Ｔｒｏｐ‐２複合体化パクリタキセルのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性を示している。
【０２６８】
実施例１２．抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣ（ＭＡＢ６５０‐ＳＮ‐３８）の細胞傷害性
ＳＮ‐３８及びＭＡＢ６５０を用いて新規抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣを作製し、平均薬剤対抗体置換率６．８９を得た。細胞傷害性アッセイを行い、２つの異なるヒト膵臓腺癌細胞株（ＢｘＰＣ‐３及びＣａｐａｎ‐１）ならびにヒト三種陰性乳癌腫細胞株（ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８）を標的として使用して、ＭＡＢ６５０‐ＳＮ‐３８とｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣを比較した。
【０２６９】
ＡＤＣを添加する１日前に、細胞を組織培養から採取し、９６ウェルプレートに蒔いた。翌日、細胞を、３．８４×１０−１２〜２．５×１０−７Ｍの薬剤濃度範囲でｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８、ＭＡＢ６５０‐ＳＮ‐３８、及び遊離ＳＮ‐３８に供した。非複合体化ＭＡＢ６５０をＭＡＢ６５０‐ＳＮ‐３８と同等のタンパク質当量で対照として使用した。プレートを３７℃で９６時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、ＭＴＳ基質をすべてのプレートに加え、未処理細胞についてＯＤ４９２ｎｍがおよそ１．０に達するまで、３０分間隔で発色を読み取った。増殖阻害は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＰｒｉｓｍソフトウェア（非線形回帰を用いてシグモイド用量反応曲線を生成し、ＩＣ５０値を取得）を用いて、未処理細胞に対する増殖の割合として測定した。
【０２７０】
ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８及びＭＡＢ６５０‐ＳＮ‐３８は、同様の増殖阻害効果を有し（データは示さず）、これらの細胞株におけるＳＮ‐３８‐ＡＤＣでは一般的な低いｎＭ範囲のＩＣ５０値を有していた。ヒトＣａｐａｎ‐１膵臓腺癌細胞株（データは示さず）において、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣは３．５ｎＭのＩＣ５０を示し、それに対して、ＭＡＢ６５０‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣは４．１ｎＭ及び遊離ＳＮ‐３８は１．０ｎＭであった。ヒトＢｘＰＣ‐３膵臓腺癌細胞株（データは示さず）において、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣは２．６ｎＭのＩＣ５０を示し、それに対して、ＭＡＢ６５０‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣは３．０ｎＭ及び遊離ＳＮ‐３８は１．０ｎＭであった。ヒトＮＣＩ‐Ｎ８７胃腺癌細胞株（データは示さず）において、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣは３．６ｎＭのＩＣ５０を示し、それに対して、ＭＡＢ６５０‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣは４．１ｎＭ及び遊離ＳＮ‐３８は４．３ｎＭであった。
【０２７１】
要約すると、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、２つの抗Ｔｒｏｐ‐２抗体ｈＲＳ７及びＭＡＢ６５０のＳＮ‐３８複合体は、いくつかの腫瘍細胞株に対して同等の効力を示したが、これは遊離ＳＮ‐３８のものと同様であった。抗Ｔｒｏｐ‐２抗体の標的化機能はｉｎ  ｖｉｔｒｏよりｉｎ  ｖｉｖｏではるかに重要な要因であると考えられるため、上記のｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８の実施例で示したように、このデータは、クラスとしての抗Ｔｒｏｐ‐２‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏで非常に効果的であるということをサポートするものである。
【０２７２】
実施例１３．抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣ（１６２‐４６．２‐ＳＮ‐３８）の細胞傷害性
ＳＮ‐３８及び１６２‐４６．２を用いて新規抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣを作製し、薬剤と抗体の置換比６．１４を得た。細胞傷害性アッセイを行い、２つの異なるＴｒｏｐ‐２陽性細胞株、ＢｘＰＣ‐３ヒト膵臓腺癌及びＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８ヒト三種陰性乳癌を標的として用いて１６２‐４６．２‐ＳＮ‐３８とｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣを比較した。
【０２７３】
ＡＤＣを添加する１日前に、細胞を組織培養から採取し、２０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞を３．８４×１０−１２〜２．５×１０−７Ｍの薬剤濃度範囲でｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８、１６２‐４６．２‐ＳＮ‐３８、または遊離ＳＮ‐３８に供した。それぞれ１６２‐４６．２‐ＳＮ‐３８及びｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８と同じタンパク質用量で、非複合体化１６２‐４６．２及びｈＲＳ７を対照として使用した。プレートを３７℃で９６時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、ＭＴＳ基質をすべてのプレートに添加し、未処理の対照ウェルのＯＤ４９２ｎｍの測定値が約１．０になるまで、３０分間隔で発色を読み取った。増殖阻害は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＰｒｉｓｍソフトウェア（非線形回帰を用いてシグモイド用量反応曲線を生成し、ＩＣ５０値を取得する）を用いて、未処理細胞に対する増殖の割合として測定した。
【０２７４】
１６２‐４６．２‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣは、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８に比べて同様のＩＣ５０値を有していた（データは示さず）。ＢｘＰＣ‐３ヒト膵臓腺癌細胞株に対して試験した場合（データは示さず）、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８が５．８ｎＭのＩＣ５０を有していたのに対して、１６２‐４６．２‐ＳＮ‐３８は１０．６ｎＭ、遊離ＳＮ‐３８は１．６ｎＭであった。ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８ヒト乳腺癌細胞株（データは示さず）に対して試験した場合、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８は、ＩＣ５０が３．９ｎＭであり、それに対して１６２‐４６．２‐ＳＮ‐３８は６．１ｎＭ、及び遊離ＳＮ‐３８は０．８ｎＭであった。遊離抗体単独は、Ｔｒｏｐ‐２陽性癌細胞株のいずれに対しても細胞傷害性はほとんど示さなかった。
【０２７５】
要約すると、同じ細胞傷害性薬剤に複合体化した３つの異なる抗Ｔｒｏｐ‐２抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性を比較すると、３つすべてのＡＤＣが、様々なＴｒｏｐ‐２陽性癌細胞株に対して同等の細胞毒性効果を示した。これらのデータは、薬剤に複合体化したＡＤＣに組み込まれた抗Ｔｒｏｐ‐２抗体のクラスが、Ｔｒｏｐ‐２発現固形腫瘍に対する効果的な抗癌治療剤であることを裏付けている。
【０２７６】
実施例１４．ＳＮ‐３８に複合体化したｈＲＳ７抗体を含むＩＭＭＵ‐１３２抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣによる臨床試験
概要
本実施例は、ｐＨ感受性リンカーによってＳＮ‐３８に複合体化した内部移行性ヒト化ｈＲＳ７抗Ｔｒｏｐ‐２抗体のＡＤＣであるＩＭＭＵ‐１３２（平均薬剤‐抗体比＝７．６）による第Ｉ相臨床試験及び進行中の第ＩＩ相用量拡大試験の結果を報告する。Ｔｒｏｐ‐２は、多くのヒト癌腫が、高い濃度（約１×１０５）、頻度、及び特異性で発現するＩ型膜貫通型カルシウム形質導入タンパク質であって、その正常組織での発現は限定的である。Ｃａｐａｎ‐１ヒト膵臓腫瘍異種移植片を保有するヌードマウスの前臨床試験により、ＩＭＭＵ‐１３２は、最大耐量のイリノテカン療法による場合よりも１２０倍も多くＳＮ‐３８を腫瘍に送達することができることが明らかになった。
【０２７７】
本実施例は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、小細胞及び非小細胞肺癌（それぞれＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ）、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、膵臓癌（ＰＤＣ）、食道癌、及び他の癌を含むが必ずしもこれらに限定されない癌における、複数の前治療（トポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害薬を含むものもある）に失敗した２５人の患者（ｐｔｓ）の初期の第Ｉ相試験、及び６９人の患者についての進行中の第ＩＩ相試験について報告する。
【０２７８】
以下に詳述するように、Ｔｒｏｐ‐２は血清中に検出されなかったが、保存されているほとんどの腫瘍において強く発現していた（≧２＋）。３＋３試行設計では、ＩＭＭＵ‐１３２を２１日間の繰り返しサイクルで１日目及び８日目に投与し、用量制限的な好中球減少の前に、８ｍｇ／ｋｇ／回から開始して、次いで１２及び１８ｍｇ／ｋｇを投与した。累積治療を最小の遅延で最適化するために、第ＩＩ相は８及び１０ｍｇ／ｋｇに焦点を当てている（それぞれｎ＝３０及び１４）。この時点で関連するＡＥを報告している４９人の患者では、好中球減少≧Ｇ３が２８％（４％Ｇ４）で生じた。これらの患者の初期の最も一般的な非血液毒性は、疲労（５５％；≧Ｇ３＝９％）、悪心（５３％；≧Ｇ３＝０％）、下痢（４７％；≧Ｇ３＝９％）、脱毛症（４０％）、及び嘔吐（３２％；≧Ｇ３＝２％）であった。ホモ接合性のＵＧＴ１Ａ１＊２８／＊２８が６人の患者に見出され、そのうち２人は、より重篤な血液及び胃腸毒性を有していた。第I相及び用量拡大相では、現在４８人の患者（ＰＤＣを除く）が存在しており、最良効果についてＲＥＣＩＳＴ／ＣＴによってこれらの患者を評価可能である。ＣＲＣ（Ｎ＝１）、ＴＮＢＣ（Ｎ＝２）、ＳＣＬＣ（Ｎ＝２）、ＮＳＣＬＣ（Ｎ＝１）、及び食道癌（Ｎ＝１）に罹患している患者を含む７人（１５％）の患者が部分奏効（ＰＲ）を有し、別の２７人の患者（５６％）が不変（ＳＤ）を有し、合計３８人の患者（７９％）が発病反応を示し；ＣＴ評価可能なＰＤＣ患者１３人のうち８人（６２％）はＳＤを有し、進行までの時間（ＴＴＰ）の中央値は、前回の治療では８．０週間であったのに対し、１２．７週間であった。残りの４８人の患者のＴＴＰは１２．６＋週（範囲６．０〜５１．４週）である。血漿ＣＥＡ及びＣＡ１９‐９は奏効と相関していた。抗ｈＲＳ７抗体または抗ＳＮ‐３８抗体は、数か月にわたって投与したにもかかわらず、検出されなかった。複合体は３日以内に血清から排出され、この点はｉｎ  ｖｉｖｏ動物試験と一致しており、そこでは、５０％のＳＮ‐３８が毎日排出され、血清中の９５％を上回るＳＮ‐３８が、イリノテカンを投与した患者で報告されたＳＮ‐３８よりも１００倍も高い濃度で非グルクロン酸抱合型ＩｇＧに結合した。これらの結果は、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８を含有するＡＤＣが、転移性固形癌において治療活性を有し、下痢及び好中球減少を処置可能であることを示している。
【０２７９】
薬物動態
２つのＥＬＩＳＡ法を用いて、ＩｇＧ（抗ｈＲＳ７イディオタイプ抗体での捕捉）及び完全な複合体（抗ｈＲＳ７イディオタイプ抗体による抗ＳＮ‐３８  ＩｇＧ／プローブでの捕捉）のクリアランスを測定した。ＳＮ‐３８をＨＰＬＣで測定した。周知の、複合体からのＳＮ‐３８の徐放を反映して、全ＩＭＭＵ‐１３２画分（完全複合体）はＩｇＧよりも速く消失した（データは示さず）。ＳＮ‐３８（非結合及び全成分）のＨＰＬＣ測定は、血清中の９５％を上回るＳＮ‐３８がＩｇＧに結合したことを示した。ＳＮ‐３８Ｇが低濃度であったことは、ＩｇＧに結合したＳＮ‐３８がグルクロン酸抱合から保護されていることを示唆している。複合体のＥＬＩＳＡとＳＮ‐３８のＨＰＬＣの結果を比較したところ、両方の結果の重複が明らかとなり、このことは、ＥＬＩＳＡをＳＮ‐３８クリアランスのモニタリングに代用できることを示唆している。
【０２８０】
投薬レジメン及び患者調査の要約を表１２に示す。
【表１２】
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【０２８１】
臨床試験のステータス
３つの前治療の中央値を有する多様な転移性癌を有する合計６９人の患者（第Ｉ相における２５人の患者を含む）を報告した。８人の患者が臨床的進行を有し、ＣＴ評価前に中止した。１３人のＣＴ評価可能な膵臓癌患者を別々に報告した。前回の治療でのＴＴＰ（進行までの時間）中央値８週であったのに対し、ＰＤＣ患者におけるＴＴＰ中央値は１１．９週（範囲２〜２１．４週）であった。
【０２８２】
多様な癌を有する合計４８人の患者に対し、少なくとも１つのＣＴ評価を行い、そこから最良効果（データは示さず）及び進行までの時間（ＴＴＰ；データは示さず）を測定した。最良効果のデータを要約すると、ＴＮＢＣ（三種陰性乳癌）に罹患している評価可能な８人の患者のうち、ＰＲ（部分奏効）が２人、ＳＤ（不変）が４人、及びＰＤ（進行）が２人存在し、奏効［ＰＲ＋ＳＤ］の合計は６／８（７５％）であった。ＳＣＬＣ（小細胞肺がん）については、評価可能な４人の患者のうち、ＰＲが２人、ＳＤが０人及びＰＤが２人存在し、奏効の合計は２／４（５０％）であった。ＣＲＣ（結腸直腸癌）については、１８人の評価可能な患者のうち、ＰＲが１人、ＳＤが１１人及びＰＤが６人存在し、奏効の合計は１２／１８（６７％）であった。食道癌については、評価可能な４人の患者のうち、ＰＲが１人、ＳＤが２人及びＰＤが１人存在し、奏効の合計は３／４（７５％）であった。ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）については、５人の評価可能な患者のうち、ＰＲが１人、ＳＤが３人及びＰＤが１人存在し、奏効の合計は４／５（８０％）であった。治療したすべての患者では、４８人の評価可能な患者のうち、ＰＲが７人、ＳＤが２７人及びＰＤが１４人存在し、奏効の合計は３４／４８（７１％）であった。これらの結果は、抗ＴＲＯＰ‐２  ＡＤＣ（ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８）がヒト患者の広範囲の固形腫瘍に対して有意な臨床効果を示したことを示している。
【０２８３】
報告した治療の副作用（有害事象）を表１３に要約する。表１３のデータから明らかなように、許容可能な低レベルの有害な副作用を示す用量のＡＤＣで、ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８の治療効果が達成された。
【表１３】
2018520140.tif 000024
【０２８４】
抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣに対する例示的な部分奏効を、ＣＴデータによって確認した（データは示さず）。ＣＲＣのＰＲの例として、最初にＣＲＣと診断された６２歳の女性が原発性半結腸切除術を受けた。４か月後、肝転移の肝切除術を受け、ＦＯＬＦＯＸによる７か月及び５ＦＵによる１か月の治療を受けた。患者は、主に肝臓に複数の病変を呈し（免疫組織学による３＋Ｔｒｏｐ‐２）、最初の診断から約１年後に８ｍｇ／ｋｇの開始用量でｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８試験に入った。患者の最初のＣＴ評価では、ＰＲが達成され、標的病変が３７％減少した（データは示さず）。患者は治療を続け、１０か月の治療後に最大６５％の減少を達成し（データは示さず）、その３か月後に進行が起こる前に、ＣＥＡが７８１ｎｇ／ｍＬから２６．５ｎｇ／ｍＬまで減少した。
【０２８５】
ＮＳＣＬＣのＰＲの例として、６５歳の男性はＩＩＩＢ期のＮＳＣＬＣ（平方細胞）と診断された。カポプラチン／エトポシドと７０００ｃＧｙ  ＸＲＴとの併用による初期治療（３か月）は、１０か月持続する奏効をもたらした。患者に対してその後、タルセバ維持療法を開始し、これを、腰椎椎弓切除術に加えてＩＭＭＵ‐１３２試験が検討されるまで続けた。患者は、タルセバの５か月後、右肺に豊富な胸水を伴う５．６ｃｍの病変を呈した時点で、ＩＭＭＵ‐１３２の初回投与を受けた。２か月後に患者はちょうど６回目の投与を完了し、初回のＣＴで主標的病変が３．２ｃｍに縮小したことが示された（データは示さず）。
【０２８６】
ＳＣＬＣにおけるＰＲの例として、６５歳の女性は低分化ＳＣＬＣと診断された。カルボプラチン／エトポシド（Ｔｏｐｏ‐ＩＩ阻害剤）を投与したが、奏効が認められず、２か月で終了し、続いてトポテカン（Ｔｏｐｏ‐Ｉ阻害剤）を投与したが、これも奏効が認められず、２か月で終了し、患者に局所ＸＲＴ（３０００  ｃＧｙ）を施し、１か月後に終了した。しかしながら、進行は翌月まで続いた。翌月、患者にＩＭＭＵ‐１３２投与（１２ｍｇ／ｋｇ；６．８ｍｇ／ｋｇに減少；Ｔｒｏｐ‐２発現度３＋）を開始し、ＩＭＭＵ‐１３２投与開始の２か月後には、主要な肺病変の実質的な縮小を含む標的病変の３８％の縮小が認められた（データは示さず）。この患者では、１２回投与した３か月後に進行が起こった。
【０２８７】
これらの結果は、抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣが、それ以前の複数の療法に失敗するか、または療法後に進行した患者においてさえ有効であることを示しているという点で重要である。
【０２８８】
結論として、使用した用量では、主要な毒性は処置可能な好中球減少症であり、悪性度３の毒性はほとんど認められなかった。ＩＭＭＵ‐１３２は、トポイソメラーゼＩ阻害剤療法における再発病歴を有する患者を含む、三種陰性乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌及び食道癌を有する再発性／難治性の患者において活性（ＰＲ及び耐性ＳＤ）を有する証拠を示した。これらの結果は、既存の療法に耐性のある広範囲の癌における抗Ｔｒｏｐ‐２  ＡＤＣの有効性を示している。
【０２８９】
実施例１５．血液系腫瘍の治療のための抗ＣＤ２２（エプラツズマブ）複合体化ＳＮ‐３８
概要
発明者らは以前に、ＳＮ‐３８と複合体化した緩やかに内部移行する抗体が、ＩｇＧに結合したＳＮ‐３８のおよそ５０％が２４時間ごとに血清中で解離することを可能にするリンカーで調製した場合に、首尾よく使用できることを見出した。本研究では、エプラツズマブ（迅速に内部移行）及びベルツズマブ（緩やかに内部移行）、ヒト化抗ＣＤ２２及び抗ＣＤ２０  ＩｇＧを用いて調製したＳＮ‐３８複合体の、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に対する有効性を試験した。どちらの抗体‐薬剤複合体も、様々なヒトリンパ腫／白血病細胞株に対して同様のナノモル活性を有していたが、ＳＮ‐３８の徐放は、無関係の複合体に対してさえｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効力の識別が損なわれた。ＳＮ‐３８を抗ＣＤ２２複合体に安定に結合させた場合、その効力は４０〜５５倍低下した。したがって、より安定性が低く、ゆっくりと解離するリンカーのみを用いてさらなる試験を行った。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＲａｍｏｓがＣＤ２２よりもＣＤ２０を１５倍多く発現していたにもかかわらず、Ｒａｍｏｓ異種移植片を有するマウスにおいて、ＣＤ２２とＣＤ２０抗体‐薬剤複合体との間に同様の抗腫瘍活性が認められ、このことは、エプラツズマブ‐ＳＮ‐３８複合体（Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８）の内部移行がその活性を増強したことを示唆している。Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８は、結合していない無関係なＩｇＧ‐ＳＮ‐３８複合体よりも、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより効果的であり、確立された多数のＲａｍｏｓ異種移植片を無毒な用量で排除した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験により、より効果的な治療のために、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８を非複合体化ベルツズマブと併用することができることが示された。したがって、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８は、毒性レベルよりも十分に低い用量でリンパ腫及び白血病に活性を示し、したがって、単独または抗ＣＤ２０抗体療法と併用しての治療可能性を有する有望な新規薬剤である（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４‐３４）。
【０２９０】
序論
白血病及びリンパ腫の生物学的療法に、これまで多大な努力が注がれ、非複合体化抗体（例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ）、放射性免疫複合体（９０Ｙ‐イブリツモマブ・チウキセタン、１３１Ｉ‐トシツモマブ）、及び薬剤複合体（ゲムツズマブ・オゾガマイシン）が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認を受けた。別の抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）であるブレンツキシマブ・ベドチン（ＳＧＮ‐３５；抗ＣＤ３０‐オーリスタチンＥ）は、最近、ホジキンリンパ腫及び未分化大細胞リンパ腫に対して、ＦＤＡの迅速承認を受けた。ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ７４、及びＣＤ７９ｂを標的とする前臨床及び臨床開発には、他にも多くのＡＤＣが存在する。
【０２９１】
これらのすべての標的に対する抗体は、それらが内部移行しているため、薬剤のキャリアとしての論理的な選択肢である。ＣＤ２２の内部移行及び特異性は、臨床的検討において、抗ＣＤ２２‐マイタンシン複合体（安定に結合したＭＣＣ‐ＤＭ１）であるＣＭＣ‐５４４（酸不安定性複合体カリチアマイシン）、及びＣＡＴ‐３８８８（正式にはＢＬ２２；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素一本鎖融合タンパク質）を含む少なくとも３つの異なる抗ＣＤ２２複合体とともに、白血病及びリンパ腫にとって特に重要な標的となっている。これらのすべての複合体における活性薬剤は、ナノモル濃度の効力（すなわち、いわゆる超毒性）を有する。
【０２９２】
発明者らは、最近、プロドラッグであるイリノテカンから誘導される低ナノモル効力を有するトポイソメラーゼＩ阻害剤であるＳＮ‐３８に抗体を複合体化する方法を開発した（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２‐６２；Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６‐２６）。４つのＳＮ‐３８結合化学を、緩やかに内部移行する抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体を用いて調製した複合体を使用して、最初に試験した（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２‐６２；Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６‐２６）。複合体はＣＥＡＣＡＭ５結合を保持したが、ヒト血清中でのＳＮ‐３８の解離速度が異なり、その半減期はおよそ１０〜６７時間で様々に異なっていた（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２‐６２）。最終的に、中間安定性（約５０％が２４〜３５時間で解離）を有するＣＬ２と命名したリンカーを、さらなる開発のために選択した。ＣＬ２は最近改変され、カテプシンＢ切断性ジペプチド中のフェニルアラニンを削除し、単純化し、及び製造収率を向上させた。ＣＬ２Ａと命名したこの新規誘導体は、ＳＮ‐３８に対するｐＨ感受性カーボネート結合を保持するが、もはやカテプシンＢによって選択的に切断されることはない。それにもかかわらず、それは元のＣＬ２リンカーと比較して同等の血清安定性及び向上したｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有する（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７‐６９）。緩やかに内部移行する抗ＣＥＡＣＡＭ５‐ＳＮ‐３８を用いると、毒性を伴わずに有意な効力が見出されたことから、発明者らは、その活性が、腫瘍に局在化した後の抗体からのＳＮ‐３８の徐放によって助長されたとの仮説を立てた。したがって、この報告の主な目的は、Ｂ細胞癌に対して高度に特異的であるが、それらの抗原発現及び内部移行特性が異なる２つの抗体ならびにＣＬ２Ａリンカーを用いて調製した複合体の治療可能性を評価することであった。
【０２９３】
エプラツズマブ（Ｅｍａｂ）は、非複合体型または複合体型のリンパ腫及び白血病において広範に評価されている迅速に内部移行する（例えば、１時間以内に≧５０％）ヒト化抗ＣＤ２２  ＩｇＧ１である。ベルツズマブ（Ｖｍａｂ）は、臨床的にも研究されているが、緩やかに内部移行する（例えば、１時間で約１０％）ヒト化抗ＣＤ２０抗体である。ＣＤ２０は通常、非ホジキンリンパ腫ではＣＤ２２よりもはるかに高いレベルで発現するが、ＣＤ２２は急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）では優先的に発現するが、多発性骨髄腫では発現しない。両方の抗体は、非複合体化薬剤として患者において有効であるが、マウス異種移植片モデルにおいてはベルツズマブのみが活性を有する（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：２８６８‐７６）。９０Ｙ‐Ｅｍａｂと非複合体化ベルツズマブとの併用が、ＮＨＬモデルにおいて有効性を高めることを示したこれまでの研究（Ｍａｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６１５４‐６０）に基づいて、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８＋Ｖｍａｂの併用についても試験した。それは、同じ標的抗原に対して競合することなく、または追加の毒性を有することなく、さらなる利点を提供することができるからである。
【０２９４】
材料及び方法
［細胞株］  Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）、及びＪｅＫｏ‐１（マントル細胞リンパ腫）は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から購入した。ＲＥＨ、ＲＳ４；１１、ＭＮ‐６０、及び６９７（ＡＬＬ）は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎから購入した。ＷＳＵ‐ＦＳＣＣＬ（濾胞性ＮＨＬ）は、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｒ．Ｓｍｉｔｈ博士（フォックス・チェイス・キャンサー・センター、フィラデルフィア、ペンシルベニア）から贈呈された。すべての細胞株を、１０〜２０％のウシ胎仔血清を含有する推奨補充培地中、３７℃で加湿ＣＯ２インキュベーター（５％）中で培養し、マイコプラズマについて定期的に検査した。
【０２９５】
［抗体及び複合体化方法］  エプラツズマブ及びベルツズマブは、それぞれヒト化抗ＣＤ２２及び抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ヒト化抗‐ＣＥＡＣＡＭ５  ＩｇＧ１であるラベツズマブ（Ｌｍａｂ）、及びヒト化抗Ｔｒｏｐ‐２抗体であるＲＳ７（両方ともＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．より入手）を、非結合型の無関係な対照として使用した。本明細書中において、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８、Ｖｍａｂ‐ＳＮ‐３８、及びＬｍａｂ‐ＳＮ‐３８とは、上記のＣＬ２Ａリンカーを用いて調製した複合体を指す。ヒト血清中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、活性ＳＮ‐３８部分のおよそ５０％が毎日ＩｇＧから放出されることが明らかになった（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７‐６９）。ＣＬ２Ｅと命名した別のリンカーは、ヒト血清中で１４日間にわたって安定であるが、カテプシンＢ切断部位を備え、リソソーム内での処理時にＳＮ‐３８の放出が促進される。ＣＬ２Ｅの調製方法ならびにＣＬ２Ａ及びＣＬ２Ｅリンカーの構造は、上記の実施例に示されている。複合体は、ＩｇＧ当たりおよそ６個のＳＮ‐３８ユニットを含有していた（例えば、１．０ｍｇのＩｇＧ‐ＳＮ‐３８複合体は約１６μｇのＳＮ‐３８を含む）。
【０２９６】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合及び細胞毒性］  ４℃で１時間インキュベートした非複合体化特異的抗体及び無関係な抗体を用いてフローサイトメトリーを行うとともに、同様に４℃で１時間インキュベートしたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）‐Ｆｃγ断片特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて結合を明らかにした。蛍光の中央値を、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアパッケージを用いて測定した。
【０２９７】
ＭＴＳ色素還元アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞毒性を測定した。用量反応曲線［ヤギ抗ヒトＦｃγＦ（ａｂ′）２の存在下／非存在下；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ］を３回測定の平均から作成し、ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ｖ５）を用いて、データの最良適合曲線についてＦ検定を用いて統計的比較を行うとともにＩＣ５０値を計算した。有意性はＰ＜０．０５に設定した。
【０２９８】
［イムノブロッティング］  試験薬剤に２４時間または４８時間曝露した後、ウエスタンブロッティングによって早期（ｐ２１発現）及び後期（ＰＡＲＰ切断）アポトーシスのマーカーを明らかにした。
【０２９９】
［ｉｎ  ｖｉｖｏ試験］  皮下Ｒａｍｏｓモデルは、４〜６週齢の雌性ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に培養物から１×１０７細胞（０．２ｍＬ）（＞９５％生存率）を移植することによって開始した。移植から３週間後、０．４〜０．８ｃｍ３の範囲の腫瘍（キャリパーで測定、Ｌ×Ｗ×Ｄ）を有する動物を、それぞれが同じ範囲の腫瘍サイズを有する動物群に分離した。腫瘍サイズ及び体重を少なくとも週１回測定し、腫瘍が３．０ｃｍ３に成長した場合、または２０％またはそれ以上の体重減少を経験した場合、動物を試験から除外した。雌性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）において、それぞれ２．５×１０６及び１×１０７個の細胞を静脈内注射することによって、静脈内ＷＳＵ‐ＦＳＣＣＬ及び６９７モデルを開始した。ＷＳＵ‐ＦＳＣＣＬ細胞の投与の５日後及び６９７の接種の７日後に治療を開始した。動物は、後肢麻痺または罹患の他の徴候を代理生存エンドポイントとして使用して、毎日観察した。すべての処置は≦０．２ｍＬで腹腔内に与えた。特定の投与量及び頻度を、結果の節に記載する。マウスはイリノテカンをＳＮ‐３８に効率的に変換するため、イリノテカンの投与をＳＮ‐３８当量に基づいて調整した；ＳＮ‐３８モル当量は、ＡＤＣ質量の１．６％及びイリノテカン質量の６０％に基づく。
【０３００】
上に示した代理生存エンドポイントとして進行までの時間（ＴＴＰ）を用いて、カプラン‐マイヤー曲線で効力を表した。ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いた対数ランク検定によって統計解析を行った（有意差、Ｐ＜０．０５）。
【０３０１】
結果
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原発現及び細胞傷害性］  すべての細胞株は、ＳＮ‐３８に対して非常に感受性であり、Ｄａｕｄｉに対する０．１３ｎｍｏｌ／Ｌ〜ＲＳ４；１１に対する２．２８ｎｍｏｌ／ＬのＥＣ５０値を有する（表１４）。６９７及びＲＳ４；１１を除いては、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８抗ＣＤ２２複合体は、ＳＮ‐３８より２〜７倍、効果が低かった。これは、発明者らの標的化、ならびに他の非標的化ＳＮ‐３８複合体の共通の知見である。抗原発現の相違にもかかわらず、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８及びＶｍａｂ‐ＳＮ‐３８は、結合していないＬｍａｂ‐ＳＮ‐３８抗ＣＥＡＣＡＭ５複合体と同様の効力を有し、これはおそらく、４日間のＭＴＳアッセイの間におよそ９０％のＳＮ‐３８が解離していたことによるものと考えられた。より短い曝露時間を使用する他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ手順も、複合体の効力の差を識別することにおいて効果がなかった。例えば、１日曝露後のアネキシンＶ染色は、未処理細胞と処理細胞との間に差異を見出すことができなかった（データは示さず）。アポトーシスの早期及び後期マーカーとして、ｐ２１のアップレギュレーション及びＰＡＲＰ切断についても、それぞれ調べた。Ｒａｍｏｓはｐ２１を発現しなかった。しかしながら、ＰＡＲＰ切断は検出され、ただし、４８時間の曝露後のみであって、ＳＮ‐３８処理細胞においてより強く発現していた（データは示さず）。ＷＳＵ‐ＦＳＣＣＬ細胞株はｐ２１を発現したが、ｐ２１アップレギュレーションもＰＡＲＰ切断も、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８曝露後４８時間まで明らかではなかった。しかしながら、いずれも、遊離ＳＮ‐３８で２４時間曝露した後に観察された（データは示さず）。遊離ＳＮ‐３８によるアポトーシス事象の増強された強度及び早期活性化は、ＩｇＧ複合体よりもＥＣ５０が低いことに合致するが、その一方で、この結果は、少なくとも４８時間の曝露期間が必要であると考えられるが、その時点でＳＮ‐３８のおよそ７５％が複合体から放出されるであろうことを示している。
【表１４】
2018520140.tif 000025
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【０３０２】
ＰＡＲＰ切断及びｐ２１発現を、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８＋Ｖｍａｂで処理した細胞において再度検討した。Ｒａｍｏｓにおける初期の研究を確認すると、ＰＡＲＰ切断は、複合体抗体の存在下では変化せず、複合体への４８時間の曝露後に初めて起こる（データは示さず）。ベルツズマブへの４８時間以上の曝露はＰＡＲＰ切断に影響を及ぼさなかったが、架橋抗体を添加した場合には２４時間以内に強い切断を示した（データは示さず）。しかしながら、ベルツズマブ単独（架橋剤なし）をＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８と併用した場合、ＰＡＲＰ切断は２４時間の曝露後に起こり（データは示さず）、このことは、架橋が存在しない場合であっても、ベルツズマブがアポトーシスの開始をより迅速に誘導することができたことを示している。ＷＳＵ‐ＦＳＣＣＬ細胞株における唯一の顕著な相違点は、併用が４８時間時点でｐ２１の発現を大幅に高めたことであり（データは示さず）、このことも、ベルツズマブとＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体を併用した場合のアポトーシス誘導の促進を示唆している。ＷＳＵ‐ＦＳＣＣＬにおけるアポトーシス誘導がＲａｍｏｓに比べて遅い理由は、ＣＤ２２及びＣＤ２０の発現がより低いことで説明されると考えられる。
【０３０３】
超毒性剤は、その早すぎる放出が毒性を増加させるため、血清中で非常に安定なリンカーを使用することが多いが、薬剤を最適に送達するために、これらの複合体を内部移行させなければならない。エプラツズマブは迅速に内部移行するため、発明者らは、ＣＬ２Ａで連結したＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体と血清安定性ＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を比較して、より安定に連結させたＳＮ‐３８による恩恵を受けるか否かを検討した。両方の複合体は類似の結合親和性を示したが（データは示さず）、３細胞株において、より安定なＥｍａｂ‐ＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８は、ＣＬ２Ａ複合体よりも効力がおよそ４０〜５５倍低かった（データは示さず）。特異性はＣＬ２Ａ複合体には欠けていたが、Ｅｍａｂ‐ＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８は一貫して非結合Ｌｍａｂ‐抗ＣＥＡＣＡＭ５‐ＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８複合体よりも効力が約２倍高かった（データは示さず）。発明者らは、より安定に連結した複合体が緩やかに内部移行するベルツズマブ複合体に適切であるとは考えにくいと結論し、したがって、ＣＬ２Ａで連結したＳＮ‐３８複合体のみを用いて試験を継続した。
【０３０４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは限界があるため、異種移植片モデルで有効性を評価した。表１４に示すように、すべてのリンパ腫細胞株は、ＣＤ２２よりもはるかに多くＣＤ２０を発現する。ＤａｕｄｉはＣＤ２２及びＣＤ２０を最も多く発現していたが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、非複合体のベルツズマブに対して非常に感受性が高く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験ではＳＮ‐３８に対して最も高い感受性を示した（表１４）。これらの特性は、特に、動物において非複合体化エプラツズマブが効果的な治療薬ではない場合に、非複合体化抗体とＳＮ‐３８複合体の違いに起因すると考えられる活性の差異を評価することを困難にする可能性が高い。以前からＲａｍｏｓを使用して９０Ｙ‐Ｅｍａｂをベルツズマブと併用する利点が示されてきたため（Ｍａｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６１５４‐６０）、発明者らはＲａｍｏｓヒトＢｕｒｋｉｔｔ細胞株においてＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８とＶｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体を比較することから始めることにした。フローサイトメトリーは、ＣＤ２０の発現がＣＤ２２よりも１５倍高いことを示したにもかかわらず、Ｒａｍｏｓ異種移植片の免疫組織学は、ＣＤ２２及びＣＤ２０の豊富さを示し、表面上ＣＤ２２はＣＤ２０よりも一様に発現していた（データは示さず）。
【０３０５】
未処理の動物におけるＲａｍｏｓ異種移植片は急速に進行し、開始サイズ０．４ｃｍ３から６日以内に終了サイズ３．０ｃｍ３に達し（データは示さず）、以前に報告されているように、ベルツズマブ及びエプラツズマブのいずれも、確立したＲａｍｏｓ異種移植片の進行に明らかな影響を与えなかった（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５０：４４４‐５３）。他のＳＮ‐３８複合体を用いた以前の知見と一致して、４週間にわたって週２回、０．５ｍｇ／用量の治療レジメンで治療した動物のいずれも、顕著な体重減少を示さなかった。どちらの複合体も、腫瘍の増殖を制御するのに非常に有効であって、４週間の治療の終了までに動物の８０％以上が腫瘍の徴候を示さなかった（図１２Ａ〜１２Ｄ）。０．２５ｍｇのＶｍａｂ‐ＳＮ‐３８用量は、最初の４週間にわたって増殖を制御する上でより良好であったが、０．５ｍｇでは、両方の複合体で同様の初期増殖制御が観察された。したがって、ＣＤ２０はＣＤ２２よりも１５倍多く発現しているにもかかわらず、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８はＶｍａｂ‐ＳＮ‐３８と遜色ない水準であった。したがって、以降の試験はＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８単独または非複合体化ベルツズマブとの併用に焦点を当てた。
【０３０６】
［Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８用量反応及び特異性］  特定のＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８及び無関係のＬｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体について、用量反応関係が認められたが、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８は、試験した３つのレベルのうち２つで有意に良好な増殖制御を有し、中間用量で特異的複合体を選好する強い傾向を有していた（図１３Ａ〜１３Ｃ）。さらに、０．２５ｍｇのＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８は、大部分の腫瘍を切除し；ここでは、１２週間のモニタリング期間の終わりに１０匹中７匹が腫瘍を保有しておらず、体重に変化はなかった。イリノテカン単独（６．５μｇ／回；０．２５ｍｇの複合体とほぼ同じＳＮ‐３８当量）を投与した動物は、生存期間中央値が１．９週であり、試験終了時に動物１１匹中３匹が腫瘍を保有しておらず、これは無関係なＬｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体の３．４５週間の生存期間中央値と比較しても有意に異なるものではない（Ｐ＝０．４５２；図１３Ｃ）。
【０３０７】
６９７播種性白血病モデルでは、生理食塩水処置動物の生存期間中央値は腫瘍接種からわずか１７日であった。エプラツズマブ＋イリノテカン（０．５ｍｇの複合体と同じＳＮ−３８モル当量）は同じ生存期間中央値であったが、０．５ｍｇのＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８を、腫瘍接種から７日後に開始して週２回投与した動物は２４．５日まで生存し、これは未処理動物（Ｐ＜０．０００１）、またはイリノテカンとともに非複合体化エプラツズマブを投与した場合（Ｐ＝０．０１６）よりも有意に長かった。しかしながら、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８は無関係の複合体（生存期間中央値＝２２日；Ｐ＝０．３０４）より有意に優れてはおらず、これは、この細胞株におけるＣＤ２２の発現が低いことによるものと考えられる。
【０３０８】
［非複合体化Ｖｍａｂ抗ＣＤ２０と併用したＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８］  発明者らは従前に、皮下Ｒａｍｏｓモデルで９０Ｙ‐Ｅｍａｂを非複合体化ベルツズマブと併用した場合の向上した奏効を報告し（Ｍａｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６１５４‐６０）、したがって、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８を用いてこの可能性を調べた。パイロット試験では、平均およそ０．３ｃｍ３の皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍を保有する５匹の動物に、ベルツズマブ（０．１ｍｇ）、０．１ｍｇのＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８、またはＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８＋Ｖｍａｂを投与した（すべての薬剤は、４週間にわたって毎週２回投与）。２．０ｃｍ３までの平均ＴＴＰは、それぞれ２２日、１４日、及び７７日超であり（ベルツズマブ対Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８単独、Ｐ＝０．５９；Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８＋Ｖｍａｂ対Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８、Ｐ＝０．０１４５）、ベルツズマブとＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８との併用が全体の治療応答を向上させるという初期の示唆を提供した。同じく週２回、４週間にわたる治療レジメンを使用したフォローアップ試験において、０．１ｍｇのＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８と０．１ｍｇのベルツズマブを投与した動物１１匹中６匹には、治療開始から１６週間の腫瘍の徴候はなかったが、ベルツズマブ単独または０．１ｍｇの対照Ｌｍａｂ‐ＳＮ‐３８を投与した動物の生存期間中央値は、それぞれ１．９及び３．３週であり、これらの群の各々において、動物１１匹中３匹が１６週目の時点で腫瘍を保有していなかった（データは示さず）。ＴＴＰの中央値がより長く、生存個体がより多いにもかかわらず、群間に有意差は認められなかった。したがって、豊富なＣＤ２０と中等度のＣＤ２２を有するＲａｍｏｓモデルでは、非毒性用量レベルで投与したＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体は、非複合体化抗ＣＤ２０療法よりも有意に良好ではなかったが、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８を非複合体化抗ＣＤ２０療法に加えると、毒性を伴わずに奏効が改善されるようであった。ＳＮ‐３８複合体を最大耐量よりはるかに低いレベルで投与することを強調することは重要であり、したがって、これらの結果を、非複合体化抗ＣＤ２０療法がＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体による療法と同等であると解釈すべきではない。
【０３０９】
ＣＤ２０及びＣＤ２２を低レベルで発現する（データは示さず）ＷＳＵ‐ＦＳＣＣＬ濾胞性ＮＨＬ細胞株を用いた静脈内移植モデルにおいて、２つのさらなる試験を行った。生理食塩水処置動物の生存期間中央値は、腫瘍移植から４０〜４２日であった。０．３ｍｇのＡＤＣと同じＳＮ‐３８当量を含む用量で投与したイリノテカン単独（データは示さず）は、生存期間中央値（それぞれ４９日と４０日；Ｐ＝０．０４２）を増加させたが、動物１５匹中１４匹が疾患の進行で４９日目に死亡し、同じ日に生理食塩水群の１５匹の動物の最後の４匹が死亡した（データは示さず）。比較的低いＣＤ２０発現にもかかわらず、ベルツズマブ単独（３５μｇ週２回×４週間）はこのモデルにおいて有効であった。生存期間中央値は、第一の試験では９１日まで増加し、２人が治癒し（１６１日）、及び第二の試験では７７日まで増加したが、８９日以後に生存個体はいなかった（ベルツズマブ単独対生理食塩水処置群、両試験ともＰ＜０．００１）。非複合体化エプラツズマブ（０．３ｍｇ／用量）とイリノテカン及びベルツズマブとの併用は、ベルツズマブ単独と同じ生存期間中央値であったが、このことは、エプラツズマブ及びイリノテカンのいずれもが正味の奏効に寄与しなかったことを示唆している。
【０３１０】
ＷＳＵ‐ＦＳＣＣＬの低いＣＤ２２発現から想定されたように、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８単独はＲａｍｏｓほど効果的ではなかった。０．１５ｍｇの投与では、生理食塩水群より有意な効果は認められなかったが、０．３ｍｇでは生存期間中央値が６３日に増加し、生理食塩水を投与した動物に比べて有意な改善を示した（Ｐ＝０．００６）。０．３ｍｇのＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８を用いた第二の試験では、生理食塩水群に比べて生存性が向上することが確認された（７５対４０日；Ｐ＜０．０００１）。この奏効の特異性は第一の試験では明らかではなく、そこでは、無関係なＬｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体及びＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８の生存期間中央値は０．１５または０．３ｍｇの投与量レベルで差異がなかった（２つの用量レベルでのＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８対抗ＣＥＡＣＡＭ５‐ＳＮ‐３８複合体について、それぞれ４２対４９日及び６３日対６３日）。しかしながら、第二の試験では、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８の０．３ｍｇ投与は無関係の複合体より有意に向上した生存をもたらした（７５対４９日；Ｐ＜０．０００１）。ここでも、このモデルで特異性を示すことの困難さは、ＣＤ２２発現の低さに関連する可能性が最も高い。
【０３１１】
特定のＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８とベルツズマブとを併用すると、生存率が実質的に上昇し、対照Ｌｍａｂ‐ＳＮ‐３８よりもロバストな奏効のエビデンスが得られる。例えば、第一の試験では、ベルツズマブと０．１５または０．３ｍｇの対照複合体とで処置した動物の生存期間中央値はそれぞれ９８及び９１日であり、これはベルツズマブ単独（９１日、データは示さず）と同様であった。しかしながら、ベルツズマブ＋０．１５ｍｇの特異的Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体では、生存期間中央値が１４０日増加した。この改善はベルツズマブ単独（Ｐ＝０．２５７）より有意に高くはなかった一方で、ベルツズマブとともにＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８用量を０．３ｍｇに増加させた場合、動物１０匹中６匹が試験終了時に生き残り、対照複合体＋ベルツズマブ（Ｐ＝０．０００２）よりも有意な生存優位性を与えた。第二の試験では、ベルツズマブ単独の生存期間中央値は、第一の試験より短かったが（７７対９１日）、ベルツズマブとの対照複合体の生存期間中央値はなお９１日であり、ベルツズマブ単独に比べて有意な生存優位性が得られた（Ｐ＜０．０００１）。特定のＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体をベルツズマブと併用すると、生存期間中央値が１２６日まで延び、これは、ＥＭａｂ‐ＳＮ‐３８及びベルツズマブ単独のそれぞれ７５及び７７日の生存期間中央値より有意に長いものであった（各々、Ｐ＜０．０００１）。しかしながら、この試験では、その併用は、対照抗ＣＥＡＣＡＭ５‐ＳＮ‐３８複合体との併用と比較して、統計的改善の要件を十分に満たすものではなかった（Ｐ＝０．０７８）。
【０３１２】
考察
過去１０年間、ＡＤＣは癌治療において大きな利点を生み出したが、いくつかの停滞もあった。研究者が、単独で使用するには毒性が強すぎる薬剤を試すことを選択した場合には大きな利点があったが、抗体に結合させた場合、これらのいわゆる超毒性剤は前臨床試験で大幅に向上した奏効をもたらした。ホジキンリンパ腫において、オーリスタチン複合体であるブレンツキシマブ・ベドチンが最近承認されたこと、及び非複合体化トラスツズマブに抵抗性の乳癌において、単剤としてのトラスツズマブ‐ＤＭ１抗ＨＥＲ２‐マイタンシン複合体が臨床的成功を収めたことは、超毒性剤を有するこれらのＡＤＣが、治療法として受け入れられるようになったことを示唆している。しかしながら、抗ＣＤ３３‐カリチアマイシン複合体であるゲムツズマブ・オゾガマイシンを市場から回収するという最近の決定が示唆しているように、それ自体がピコモル範囲で高い効能を有する薬剤を用いて調製した複合体は、毒性のリスクが高い可能性がある（Ｒａｖａｎｄｉ，２０１１，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２９：３４９‐５１）。したがって、ＡＤＣの成功は、薬剤と抗体を一緒に結合させるための適切な化学的性質の同定、ならびに細胞傷害剤を適切に選択的に送達することを可能にするために十分に発現した適切な標的の規定に依存する可能性がある。
【０３１３】
発明者らは、血清中の複合体からＳＮ‐３８を徐放する（約５０％／日）ことを可能にするＳＮ‐３８とＩｇＧとの連結用リンカーを開発した。このリンカーを用いて緩やかに内部移行した抗体は、腫瘍に局在する複合体が、おそらくはそれが内部移行していない場合でさえも局所的に十分な量の薬剤を放出するため、有効な治療剤であり得る。最近、ＣＬ２Ａリンカーもまた、迅速に内部移行すると報告されているＴｒｏｐ‐２に対する抗体と共に用いられた（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７‐６９．）。したがって、徐放機構は、内部移行した抗体と内部移行していない抗体のいずれにも有益であると考えられる。
【０３１４】
本報告では、発明者らは、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のために、迅速に内部移行する抗ＣＤ２２  ＩｇＧであるエプラツズマブ、及び緩やかに内部移行する抗ＣＤ２０  ＩｇＧであるベルツズマブを用いて調製したＳＮ‐３８複合体を比較することによって発明者らのＣＬ２Ａリンカーの評価を拡張するとともに、相乗的な抗腫瘍効果を示す微小管阻害剤及びＰＡＲＰ阻害剤などのＤＮＡ破壊剤との併用を見出した。エプラツズマブのマウス親抗体を用いた以前の研究は、ほとんどの抗体が１時間以内に内部移行し、ＣＤ２２の５０％が５時間以内に細胞表面で再発現することを示した（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５６：５３８‐４５）。この内部移行及び再発現プロセスは、細胞内送達を可能にすると考えられ、それはＣＤ２２のより低い表面発現を補う可能性がある。Ｂ細胞悪性腫瘍の多くがＣＤ２２よりもはるかに多くのＣＤ２０を発現しているため、ＣＤ２０を標的とする複合体は、腫瘍に局在した後にその有毒なペイロードを放出することにより、より多くのモル量の薬剤を送達する可能性がある。
【０３１５】
複合体から培地へＳＮ‐３８が放出されるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性試験では、特異的複合体または無関係な複合体の効力を区別できなかった。実際に、ＳＮ‐３８単独では複合体よりも若干効能が高く、これは、細胞への進入能力及びトポイソメラーゼＩとの結合能力の反映である可能性がある。他の研究により、アポトーシスの早期兆候が認められるまでに４８時間の曝露が必要であったことが明らかとなったため、発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験ではこれらの２つの複合体の効力を識別することができず、したがってｉｎ  ｖｉｖｏ試験に頼ることにしたと結論付けた。
【０３１６】
異種移植片モデルにおいて、ＣＤ２２よりも約１５倍多くＣＤ２０を発現することがフローサイトメトリーで示されたＲａｍｏｓ腫瘍に対して、両方の複合体は同様の抗腫瘍活性を有していた。このことは、特に、いずれかの薬剤が他の薬剤の結合を妨害することを懸念することなく非複合体化Ｖｍａｂ抗ＣＤ２０療法と併用することができることから、Ｅｍａｂ抗ＣＤ２２‐ＳＮ‐３８複合体を選択することに支持を与えた。実際、抗ＣＤ２０‐ＳＮ‐３８複合体を使用する場合、ＳＮ‐３８含量によって用量制限毒性が左右されるであろうことから、投与したＩｇＧタンパク質の合計用量は、有効な非複合体化抗ＣＤ２０抗体処置に通常必要とされるレベルより低いと考えられる。より多くの非標識抗ＣＤ２０を抗ＣＤ２０‐ＳＮ‐３８複合体に加えると、複合体の取り込みが低下し、その効力が低下するリスクがある。しかしながら、発明者らが以前に、非複合体化ベルツズマブとともに放射性標識エプラツズマブを用いた併用試験で示したように、利点は、最大有効量及び安全耐量で投与した両方の薬剤に由来し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、シグナル伝達を増強するために使用する架橋結合がない場合であっても、ベルツズマブは、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８によって開始するアポトーシスの進行を促進することが明らかになった。したがって、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体が抗ＣＤ２０複合体と同じくらい有効である限り、抗原の一方または両方の発現が低い腫瘍においてさえも、より効果的な併用療法が可能になることから、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８複合体を選択することは論理的な選択肢である。
【０３１７】
超毒性剤を使用するほとんどのＡＤＣは安定に結合しているため、発明者らは、血清安定性ではあるが細胞内で切断可能な抗ＣＤ２２‐ＳＮ‐３８複合体についても試験を行ったが、これは、ＣＬ２Ａリンカーに比べて効力が４０〜５５倍低かった。抗ＣＤ２０抗体または抗ＣＤ２２抗体に複合体化した様々な超毒性剤を調べたところ、内部移行する複合体が一般的により活性であることが判明したが、緩やかに内部移行する抗体であっても、放出された薬剤が細胞膜に浸透する場合には有効であり得ることを観測した。ＣＬ２Ａ型リンカーは、ＳＮ‐３８に適切である可能性がある一方で、より毒性の高い薬剤には最適ではない可能性があり、血清中のわずかな徐放でさえも毒性が高まり、治療濃度域を狭めると考えられる。
【０３１８】
Ｅｍａｍ‐ＳＮ‐３８は、Ｒａｍｏｓを保有するマウスにおいて０．６ｍｇの累積投与量（７５μｇを週２回×４週間）で活性を有し、２．５ｍｇ／ｋｇのヒト用量に相当する。したがって、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８は、患者において十分な治療濃度域を有するべきである。さらに、有効で安全な用量の抗Ｔｒｏｐ‐２‐ＳＮ‐３８複合体を、９０Ｙ標識した抗体の最大耐量と併用して、毒性を顕著に増加させることなく有効性を向上させた（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １０：１０７２‐８１）。したがって、これらのＳＮ‐３８抗体複合体の安全及び有効特性は、他の併用療法にとって非常に好ましい。
【０３１９】
イリノテカンは造血幹細胞の治療に日常的に利用されないものの、ＳＮ‐３８は固形腫瘍と同程度にリンパ腫や白血病細胞株において効力を有していた（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７‐６９．）。ＷＳＵ‐ＦＳＣＣＬ細胞株では、特異的及び無関係のＩｇＧ複合体がイリノテカンよりも有意に良好であった一方で、Ｒａｍｏｓでは、無関係の複合体を用いた場合のＴＴＰ中央値はイリノテカンよりも長かったが、有意に良好ではなかった。これらの結果は、非特異的ＩｇＧが薬剤の優れた担体であり、アルブミンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）‐Ｆｃで調製した遊離薬剤または複合体よりもｉｎ  ｖｉｖｏでより強力であることを示した他の研究に合致する。ＰＥＧ‐ＳＮ‐３８複合体は有意な抗腫瘍効果を有していたが、ＳＮ‐３８当量１０〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲となる最大耐量でそれを投与した（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９４：１４５６‐９）。対照的に、Ｒａｍｏｓを保有する動物に対して４週間にわたって投与したＳＮ‐３８の最大累積用量はわずか１．６ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．２５ｍｇのＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８を週２回、４週間にわたって投与）であり、これは無毒性であった。
【０３２０】
Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８の特異的治療活性は、ＣＤ２２をより多く発現する細胞株において向上すると考えられる。例えば、Ｒａｍｏｓでは、試験した３つの異なる用量レベルのうち２つでＥｍａｂ  ＳＮ‐３８単独の特異的治療効果が記録され、かなりの数の腫瘍が完全に切除された。対照的に、ＣＤ２２の発現が約２．５倍低いＷＳＵ‐ＦＳＣＣＬにおいて、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８は、２つの試験のうちの１つにおいて、無関係の抗ＣＥＡＣＡＭ５‐ＳＮ‐３８複合体に比べて有意に生存率を向上させた。しかしながら、非複合体化抗ＣＤ２０療法と併用する場合にＥｍａｂ‐ＳＮ‐３８は治療応答を増幅することを強調することは重要である。したがって、これらの２つの治療の併用は、ＣＤ２２が高度に発現していない状況においてさえ応答を増大させることができる。
【０３２１】
結論として、ＣＤ２０の発現がＣＤ２２のｌｏｇ倍を上回っていたにもかかわらず、不安定なＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐２８リンカーを使用して、Ｅｍａｂ抗ＣＤ２２‐ＳＮ‐３８複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて非毒性用量で、同様の抗ＣＤ２０‐ＳＮ‐３８複合体と同等の活性を有していた。ＣＤ２２の発現が低い場合でさえ、Ｅｍａｂ‐ＳＮ‐３８と非複合体化Ｖｍａｂ抗ＣＤ２０療法との併用によって治療応答が恩恵を享受したことは、両方の抗原が存在する場合、併用療法が多数のＢ細胞悪性腫瘍における奏効を向上し得ることを示唆している。本研究は、この併用が多様なリンパ腫及び白血病の前臨床モデルにおいて非常に効力を有するが、それでもなお、宿主毒性はより低いと考えられることを示唆している。また、このＡＤＣと微小管及びＰＡＲＰ阻害剤との併用は、腫瘍増殖の阻害及び腫瘍を保有する宿主の延命において相乗的であり得る。ＰＡＲＰ阻害剤イニパリブと、シスプラチン、ゲムシタビンまたはパクリタキセルなどの標準的な抗癌剤との併用療法に癌細胞が感作しなかったことが以前に報告されている点を踏まえると、この結果は驚くべきことである（Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２２，２０１５］）。
【０３２２】
実施例１６．ＣＤ７４＋ヒト癌の治療のための抗ＣＤ７４（ミラツズマブ）ＳＮ‐３８複合体
概要
ＣＤ７４は、抗体結合後に内部移行して再循環するため、抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）にとって魅力的な標的である。ＣＤ７４は、ほとんどが血液癌に関連するが、固形癌においても発現する。したがって、ヒト化抗ＣＤ７４抗体であるミラツズマブを用いて調製したＡＤＣの、ＣＤ７４発現型固形腫瘍治療に対する有用性を調べた。ミラツズマブ‐ドキソルビシン、ならびに切断可能なリンカー（ＣＬ２Ａ及びＣＬ２Ｅ）を用いて血清中での安定性及びリソソーム中でのＳＮ‐３８の放出方法が異なる２つのミラツズマブ‐ＳＮ‐３８複合体を調製した。フローサイトメトリー及び免疫組織学によってＣＤ７４発現を測定した。ヒト癌細胞株Ａ‐３７５（メラノーマ）、ＨｕＨ‐７及びＨｅｐ‐Ｇ２（肝癌）、Ｃａｐａｎ‐１（膵臓）、及びＮＣＩ‐Ｎ８７（胃）、ならびにＲａｊｉバーキットリンパ腫において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性及びｉｎ  ｖｉｖｏ治療試験を行った。ミラツズマブ‐ＳＮ‐３８  ＡＤＣを、標的抗原を発現する異種移植片において抗Ｔｒｏｐ‐２抗体及び抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を用いて調製したＳＮ‐３８  ＡＤＣと比較した。
【０３２３】
リンパ腫モデルではミラツズマブ‐ドキソルビシンが最も有効であったが、Ａ‐３７５及びＣａｐａｎ‐１では、ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８のみが治療効果を示した。ＣＤ７４の表面発現は、Ｔｒｏｐ‐２またはＣＥＡＣＡＭ６よりもはるかに低いにもかかわらず、ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８はＣａｐａｎ‐１において抗Ｔｒｏｐ‐２  ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８と同様の有効性を有していたが、ＮＣＩ‐Ｎ８７では抗ＣＥＡＣＡＭ６及び抗Ｔｒｏｐ‐２複合体が優れていた。単回用量レベルでの２種の肝癌細胞株における試験は、生理食塩水処置動物に比べて有意な利点を示したが、無関係のＩｇＧ複合体に対しては有意ではなかった。いくつかの固形腫瘍異種移植片において、ＣＤ７４はＡＤＣの適切な標的であり、ＡＤＣの有効性はＣＤ７４発現の均一性に大きく影響を受け、及びＣＬ２Ａ連結ＳＮ‐３８複合体は最良の治療応答を提供する。
【０３２４】
序論
インバリアント鎖またはＩｉと呼ばれるＣＤ７４は、ＨＬＡ‐ＤＲと会合し、抗原ペプチドのクラスＩＩ抗原提示構造への結合を阻害するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ７４は、インバリアント鎖複合体をエンドソーム及びリソソームに導くシャペロン分子として作用し、ＮＦ‐ｋＢを介した経路を使用するＢ細胞の成熟において、及びＣＤ４４との相互作用を介したＴ細胞応答において、アクセサリー分子として作用し（Ｎａｕｊｏｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７４：２５７‐６８）、ならびにＣＤ４４は炎症促進性サイトカインであるマクロファージ遊走阻止因子の受容体であり（Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７‐７６）、細胞増殖及び生存経路の活性化に関与する。
【０３２５】
正常なヒト組織では、ＣＤ７４は、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、活性化Ｔ細胞のサブセット、及び胸腺上皮において主に発現し（データは示さず）、Ｂ細胞腫瘍の９０％で発現する（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：６６０６‐１１；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ  １０４：３７０５‐１１）。初期の研究は、一因として、インバリアント鎖に対する抗体が分子の細胞質部分に特異的であったことに加え、表面上に比較的少数のコピーしか存在せず、その細胞上での半減期が非常に短いために、ＣＤ７４が膜上に存在するかどうかに関する相反するデータを有していた。細胞表面上のＣＤ７４のおよそ８０％は、ＭＨＣ  ＩＩ抗原ＨＬＡ‐ＤＲと会合している（Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：８５８１‐８５）。マウス抗ＣＤ７４抗体ＬＬ１を用いて、Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞株は４．８×１０４コピー／細胞と推定されたが、細胞内輸送が迅速であるため、１日あたり約８×１０６個の抗体分子が内部移行し、異化された（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２０：２９３‐３００）。このように、ＣＤ７４の内部移行は非常に動的であり、抗体は表面から迅速に移動し、細胞内でアンロードされ、次いで表面上でＣＤ７４が再発現する。Ｆａｂ′の内部移行は、ＩｇＧ結合と同程度に迅速に起こり、このことは二価結合が必要でないことを示している。マウスＬＬ１のＣＤＲグラフト化バージョンであるミラツズマブ（ｈＬＬ１）を用いた後の研究は、抗体が、Ｂ細胞増殖、遊走、及び接着分子発現を変化させ得ることを見出した（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ  １０４：３７０５‐１１；Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４３：２５５；Ｆｒｏｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １４：Ｒ５４）が、抗ＣＤ７４抗体は、例外的な内部移行特性を有するため、癌治療薬を細胞内送達するための効率的な担体である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７‐７１）。臨床前の有効性と毒性の結果に基づいて、多発性骨髄腫（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，１１２：３６９７）、ならびに非ホジキンリンパ腫及び慢性リンパ球性白血病において、ミラツズマブ‐ドキソルビシンを用いた第Ｉ相臨床試験を開始した。
【０３２６】
興味深いことに、ＣＤ７４もまた、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、特定の肉腫、及び神経膠芽腫などの非造血性癌で発現し（例えば、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ４：１‐１２）、したがって、この抗原を発現する固形腫瘍の治療標的であり得る。ミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体は、血液癌のモデルにおいて非常に活性であったため、この評価のための論理的な選択肢であった。しかしながら、発明者らは、最近、非常に強力なトポイソメラーゼＩ阻害剤であるＳＮ‐３８を抗体に連結するための手順を開発した。ＳＮ‐３８は、イリノテカンの活性型であり、その薬理学及び代謝は周知である。これらの複合体は、固形腫瘍細胞株においてナノモル濃度で効力を有し、能動的に内部移行しなかった抗体において活性を有することが見出された。以前の研究では、ＳＮ‐３８が、血清中の複合体から約１日の半減期で解離することを可能にするリンカー（ＣＬ２Ａ）が、血清中でより安定またはより不安定な他のリンカーよりも好ましいことが示された。しかしながら、ミラツズマブの優れた内部移行能力をもとに、血清中で非常に安定だがリソソーム中に取り込まれるとＳＮ‐３８を放出する新規リンカーを開発した。
【０３２７】
本発明では、これらの３つのミラツズマブ抗ＣＤ７４複合体、１つはドキソルビシン、及び２つはＳＮ‐３８複合体を、主に固形腫瘍に対する効果的な治療のために使用するための見通しについて検討する。
【０３２８】
材料及び方法
［ヒト腫瘍細胞株］  Ｒａｊｉバーキットリンパ腫、Ａ‐３７５（メラノーマ）、Ｃａｐａｎ‐１（膵臓腺癌）、ＮＣＩ‐Ｎ８７（胃癌）、Ｈｅｐ‐Ｇ２肝細胞腫及びＭＣ／ＣＡＲ骨髄腫は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナサス、バージニア）から購入した。ＨｕＨ‐７肝癌細胞株は日本ヒューマンサイエンス研究資源バンク（大阪、日本）から購入した。すべての細胞株を、１０％〜２０％のウシ胎仔血清及び栄養補助剤を含有する推奨培地中、３７℃、加湿ＣＯ２インキュベーター（５％）内で培養した。細胞を５０回未満の範囲で継代し、マイコプラズマについて定期的に検査した。
【０３２９】
［抗体及び複合体化の方法］  ミラツズマブ（抗ＣＤ７４  ＭＡｂ）、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（抗ＣＤ２０）、ラベツズマブ（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、及びｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ‐２）は、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＣＬ２Ａ及びＣＬ２ＥリンカーならびにそれらのＳＮ‐３８誘導体を調製し、上記の実施例に記載したように抗体に複合体化した。ミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体は、従前に記載されたように調製した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７‐７１）。すべての複合体は、ＩｇＧのジスルフィド還元、続いてこれらのリンカーと、対応するマレイミド誘導体との反応によって調製した。分光光度分析により、薬剤：ＩｇＧのモル置換率が５〜７であると推定した（タンパク質１．０ｍｇにＳＮ‐３８を約１６μｇ、すなわちドキソルビシン当量２５μｇを含む）。
【０３３０】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合及び細胞毒性］  非複合体化及び複合体化ミラツズマブの抗原陽性細胞への細胞結合を比較するアッセイ及び細胞傷害性試験には、ＭＴＳ色素還元法（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン）を用いた。
【０３３１】
［フローサイトメトリー及び免疫組織学］  フローサイトメトリーを、膜結合型のみ、または膜及び細胞質抗原の評価を提供するように実施した。皮下腫瘍異種移植片のホルマリン固定パラフィン包埋切片について、免疫組織化学染色を行い、抗原賦活法を用いずに１０μｇ／ｍＬの抗体を用いて染色し、抗ヒトＩｇＧ複合体を用いてその染色を明らかにした。
【０３３２】
［ｉｎ  ｖｉｖｏ試験］  雌のヌードマウス（４〜８週齢）または雌のＳＣＩＤマウス（７週齢）をＴａｃｏｎｉｃ（ジャーマンタウン、ニューヨーク）から購入し、１週間の検疫後に使用した。生理食塩水対照を含むすべての薬剤を、週２回、４週間にわたって腹腔内投与した。特定の用量を結果に示す。毒性は、毎週の体重測定によって評価した。Ｒａｊｉバーキットリンパ腫モデルでは、ＳＣＩＤマウスに、０．１ｍＬ培地中２．５×１０６のＲａｊｉ細胞を静脈注射した。５日後、動物に複合体または生理食塩水（Ｎ＝１０／群）を単回静脈内注射（０．１ｍＬ）で投与した。苦痛及び麻痺の徴候についてマウスを毎日観察し、いずれかの後肢麻痺が発生した場合、初回体重から１５％を上回る減少があった場合、またはそうでなければ瀕死状態（代替生存エンドポイント）の場合に、安楽死させた。
【０３３３】
皮下腫瘍を２次元のキャリパーで測定し、腫瘍体積（ＴＶ）をＬ×ｗ２／２として計算したが、式中、Ｌは最長の直径であり、ｗは最短の直径である。測定は、少なくとも週１回行い、腫瘍が１．０ｃｍ３に成長した時点で動物を死亡させた（すなわち、代替生存エンドポイント）。ヌードマウスにＡ‐３７５メラノーマ細胞株（０．２ｍＬ中６×１０６細胞）を移植し、腫瘍が平均して０．２３±０．０６ｃｍ３（Ｎ＝８／群）となった時点で治療を開始した。Ｃａｐａｎ‐１を、継代培養した腫瘍由来の腫瘍懸濁液（０．３ｍＬの１５％ｗ／ｖ腫瘍懸濁液）と組織培養由来の８×１０６細胞とを併用してヌードマウスに皮下移植した。治療は、ＴＶが平均０．２７±０．０５ｃｍ３（Ｎ＝１０／群）の時点で開始した。ＮＣＩ‐Ｎ８７胃腫瘍異種移植片は、マトリゲルと最終培養物由来の１×１０７細胞との１：１（ｖ／ｖ）混合物０．２ｍＬを皮下に注射することによって開始した。治療は、ＴＶが平均して０．２４９±０．０４５ｃｍ３（Ｎ＝７／群）の時点で開始した。ヌードマウスにおけるＨｅｐ‐Ｇ２及びＨｕＨ‐７肝臓癌異種移植片を開発するために同じ手順を続けた。Ｈｅｐ‐Ｇ２が平均０．３６４±０．０６２ｃｍ３（Ｎ＝５／群）、ＨｕＨ‐７が平均０．２９８±０．０５５ｃｍ３（Ｎ＝５／群）の時点で治療を開始した。
【０３３４】
有効性は、生存期間中央値を決定するための上記の代替エンドポイントを用いて、カプラン‐マイヤー生存曲線で表す。解析は、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ラホヤ、カリフォルニア）を用いたログランク（マンテル・コックス）試験によって実施し、その有意性はＰ＜０．０５であった。
【０３３５】
結果
［ヒト腫瘍細胞株及び異種移植片におけるＣＤ７４発現］  固形腫瘍細胞株における膜のみのＣＤ７４のＭＦＩは、非常にしばしばバックグラウンドＭＦＩよりも＜２倍高かったため（Ａ‐３７５メラノーマ細胞株を除く）、４つの異なる固形腫瘍型に由来する６つの細胞株を、主に透過処理した細胞の分析に基づいてＣＤ７４陽性であると同定した（表１５）。Ｒａｊｉにおける表面ＣＤ７４の発現は、固形腫瘍細胞株よりも＞５倍高かったが、透過処理したＲａｊｉ細胞における全ＣＤ７４は、ほとんどの固形腫瘍細胞株と同様であった。
【表１５】
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【０３３６】
免疫組織化学染色は、Ｒａｊｉ皮下異種移植片が、大部分で均一及び強い染色を有し、顕著な細胞表面標識を有することを示した（データは示さず）。Ｈｅｐ‐Ｇ２肝癌細胞株は、固形腫瘍への最も均一な取り込みを有し、中等度に強いが、主に細胞質での染色を有し（データは示さず）、次いでＡ‐３７５メラノーマ細胞株であって、これは幾分均一さに欠けるがより強い染色を有し、大部分が細胞質での発現を有する（データは示さず）。Ｃａｐａｎ‐１膵臓（データは示さず）及びＮＣＩ‐Ｎ８７（データは示さず）胃癌細胞株は中等度（Ｃａｐａｎ‐１）〜強い（ＮＣＩ‐Ｎ８７）ＣＤ７４染色を有していたが、均一に分布していなかった。ＨｕＨ‐７肝癌細胞株（データは示さず）は、最も低い均一性、及び最も弱い染色を有していた。
【０３３７】
［複合体の免疫反応性］  非複合体化ミラツズマブ、ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐及びＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８複合体のＫｄ値は、平均してそれぞれ０．７７ｎＭ、０．５９ｎＭ、及び０．８０ｎＭであり、有意差はなかった。ＭＣ／ＣＡＲ多発性骨髄腫細胞株で測定した非複合体化及びドキソルビシン複合体化ミラツズマブのＫｄ値は、それぞれ０．５±０．０２ｎＭ及び０．８±０．２ｎＭであった（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１８８８‐９６）。
【０３３８】
［複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬剤放出及び血清安定性］  メルカプトエタノールでキャップしたＣＬ２Ａ及びＣＬ２ＥリンカーからのＳＮ‐３８の放出機構は、リソソーム条件、すなわち低ｐＨ（ｐＨ５．０）を部分的にシミュレートする環境で、及びカテプシンＢの存在下または非存在下で測定した。ＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８基質は、酵素の非存在下ではｐＨ５で不活性であった（データは示さず）が、カテプシンＢの存在下では、Ｐｈｅ‐Ｌｙｓ部位での切断が３４分の半減期で迅速に進行した（データは示さず）。活性型ＳＮ‐３８の形成は、ＳＮ‐３８の１０番目の位置でのカルバミン酸結合の分子内環化を必要とし、それはより緩やかに起こり、その半減期は１０．７時間であった（データは示さず）。
【０３３９】
予想通り、カテプシンＢは、ＣＬ２Ａリンカーにおいて活性ＳＮ‐３８の放出に影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＣＬ２Ａは、切断可能なベンジルカーボネート結合を有し、ｐＨ５．０でＣＬ２Ｅリンカーと同様の速度で活性ＳＮ‐３８を放出し、半減期は約１０．２時間である（データは示さず）。ｐＨ感受性アシルヒドラゾン結合を有するミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体は、ｐＨ５．０で７〜８時間の半減期を有していた（データは示さず）。
【０３４０】
これらのリンカーはすべてリソソーム関連の条件下で比較的類似の速度で薬剤を放出するが、血清中で非常に異なる安定性を有する。ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８は、２１．５５±０．１７時間で５０％の遊離ＳＮ‐３８を放出したが、これは他のＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体と一致していた（データは示さず）。しかしながら、ＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８複合体は非常に不活性であり、半減期は約２１００時間に相当した。ミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体は、９８時間で５０％のドキソルビシンを放出し、これは２つの他の抗体‐ドキソルビシン複合体と同様であった（データは示さず）。
【０３４１】
［細胞傷害性］  これらの複合体の評価に関連する重要な問題は、造血細胞及び固形腫瘍細胞株における遊離ドキソルビシン及びＳＮ‐３８の相対的効力であった。発明者らのグループは従前に、ＳＮ‐３８が、０．１３〜２．２８ｎＭの範囲の効力を有するいくつかのＢ細胞リンパ腫及び急性白血病細胞株において活性を有していたことを報告した（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４‐３４）。ｉｎ  ｖｉｖｏ治療試験のために後に使用した固形腫瘍細胞株のうちの４つのＳＮ‐３８効力は、２．０〜６ｎＭの範囲であった（データは示さず）。ドキソルビシンは、まちまちの奏効を示し、Ｒａｊｉリンパ腫及びＡ‐３７５メラノーマ細胞株においては３〜４ｎＭの効力を有していたが、Ｃａｐａｎ‐１、ＮＣＩ‐Ｎ８７、及びＨｅｐ  Ｇ２細胞株に対しては約１０倍低かった。ＳＮ‐３８の効力をドキソルビシンと比較する他の研究では：ＬＳ１７４Ｔ結腸癌では１８対１８（それぞれ、ＳＮ‐３８とドキソルビシンのｎＭ効力）；ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１乳癌では２対２ｎＭ；ＳＫ‐ＯＶ‐４卵巣癌では１８対９０ｎＭ；Ｃａｌｕ‐３肺腺癌では３２対５８２ｎＭ；Ｃａｐａｎ‐２膵臓癌では３７対２２１ｎＭ；及びＮＣＩ‐Ｈ４６６小細胞肺癌では０．１対２ｎＭであることが判明した。したがって、ＳＮ‐３８は、これらの６つの細胞株のうち４つにおいてドキソルビシンより５〜２０倍強力であり、ＬＳ１７４Ｔ及びＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１において同様の効力を有していた。総合的に、これらのデータは、ドキソルビシンがＳＮ‐３８よりも固形腫瘍に対して有効性が低い一方で、ＳＮ‐３８が固形腫瘍及び造血腫瘍において同等に有効であると考えられることを示している。
【０３４２】
予想されたように、薬剤を細胞内へ輸送するために薬剤複合体が抗体に結合することが必要である一方、３つの複合体形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでしばしば遊離薬剤よりも効力が低かった（データは示さず）。４日間のアッセイ期間にわたって９０％以上のＳＮ‐３８が複合体から培地中に放出されるため、ＣＬ２Ａ連結型ＳＮ‐３８複合体は例外である（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７‐６９；Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４‐３４）。したがって、複合体が迅速に内部移行したとしても、遊離薬剤とＣＬ２Ａ連結型薬剤の相違を識別することは困難であろう。
【０３４３】
安定なＣＬ２Ｅ連結型ＳＮ‐３８は、遊離ＳＮ‐３８に比べてＲａｊｉ細胞株で比較的良好に機能したが、４つの固形腫瘍細胞株において実質的に（７〜１６倍）効力が低く、このことは、ＣＤ７４の比較的低い表面発現が、これらの固形腫瘍における薬剤輸送を最小限に抑える役割を果たしている可能性があることを示唆している。ミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体は、すべての細胞株において、遊離ドキソルビシンと比べた場合にその効力に実質的な差異を有し、その程度は、固形腫瘍細胞株におけるＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８複合体と遊離ＳＮ‐３８との差異と同様であった。
【０３４４】
上記の６つの追加の細胞株において、ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体は、ミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体より９〜６０倍強力であった（データは示さず）が、ここでもこの結果は、ＣＬ２Ａ連結型複合体が、４日間のインキュベーション期間にわたってそのＳＮ‐３８の大部分を培地中に放出するが、ドキソルビシン複合体は、同期間にわたって最大でも５０％の薬剤を放出するにとどまるであろう事実に大部分影響を受けたものであった。これらの他の細胞株では、ＣＬ２Ｅ連結型ミラツズマブは試験しなかった。
【０３４５】
［ヒト腫瘍異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ治療］  様々な抗体を用いて調製したミラツズマブ‐ドキソルビシンまたはＳＮ‐３８複合体による従前のｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、それらがそれらの最大耐量よりはるかに低い用量で有効であることを示したため（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７‐７１；Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：５２５７‐６４；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２‐６１；Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７‐６９；Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４‐３４）、ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験は、忍容性が良好なレベルで同等量ではあるが固定量の各複合体を比較することに重点を置いた。
【０３４６】
初期の研究では、ミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体と２つのＳＮ‐３８複合体との比較を測定するために、播種したＲａｊｉモデルのリンパ腫におけるドキソルビシン及びＳＮ‐３８複合体を最初に調べた（データは示さず）。すべての特異的複合体は、生存期間中央値がわずか２０日（Ｐ＜０．０００１）であった非標的化ラベツズマブ‐ＳＮ‐３８複合体または生理食塩水処置動物よりも、有意により良好であった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験ではＲａｊｉにおいてＳＮ‐３８複合体が８倍もの優位性を示したにもかかわらず、最良の生存はミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体で認められ、そこでは、すべての動物に１７．５ｍｇ／ｋｇ（３５０μｇ）の単回用量を投与し、２．０ｍｇ／ｋｇ（４０μｇ）を投与した１０匹中７匹の動物が、試験終了時（１１２日目）に生存していた（例えば、１７．５ｍｇ／ｋｇ用量のミラツズマブ‐ドキソルビシン対ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８、Ｐ＝０．００１２）。内部移行時に両方の複合体が同様の速度で活性型ＳＮ‐３８を放出することがｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で示唆されていたが、より安定なＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８複合体での生存率が有意に低かった（ＣＬ２ＡとＣＬ２Ｅについて、それぞれＰ＜０．０００１及びＰ＝０．０１９７、１７．５及び２．０ｍｇ／ｋｇ用量）。
【０３４７】
５つの固形腫瘍細胞株を試験したが、ドキソルビシン及びＳＮ‐３８の両方に対して最良のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの奏効を有する点から、まずＡ‐３７５メラノーマ細胞株から開始した。Ａ‐３７５異種移植片は急速に増殖し、生理食塩水処理対照動物での生存期間中央値はわずか１０．５日であった（データは示さず）。ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体の週２回の投与量１２．５ｍｇ／ｋｇ（動物１匹あたり０．２５ｍｇ）では、生存期間は２８日（Ｐ＝０．０００６）に延びたが、これは対照のエプラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８の生存期間中央値１７．５日（Ｐ＝０．００８９）よりも有意に良好であり、後者は生理食塩水処置動物と有意差がなかった（Ｐ＝０．１９６７）。ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ複合体は、対照エプラツズマブ‐ＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８複合体と同様に生存期間中央値が１４日間であるミラツズマブ‐ＣＬ２Ｅ‐ＳＮ‐３８複合体（Ｐ＝０．００１４）よりも有意に長い生存期間を提供した。ＳＮ‐３８複合体よりも２倍高い用量のミラツズマブ‐ドキソルビシンを投与したにもかかわらず、生存期間中央値は生理食塩水処置動物と同程度（１０．５日）であった。
【０３４８】
Ａ‐３７５メラノーマモデルと同様に、Ｃａｐａｎ‐１では、ＣＬ２Ａ連結型ＳＮ‐３８複合体のみが有効であり、その生存期間中央値は３５日であり、より低い用量（５ｍｇ／ｋｇ；１００μｇ／動物）（Ｐ＜０．０２）においても未処置動物（Ｐ＜０．０３６）とは有意に異なっていた（データは示さず）。ミラツズマブ‐ＣＬ２Ｅ、非標的化エプラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体、または２倍高用量のミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体のいずれも、生存優位性をもたらさなかった（Ｐ＝０．４４、対生理食塩水）。同用量の内部移行型抗Ｔｒｏｐ‐２  ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体（ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８；ＩＭＭＵ‐１３２）を投与した同じ試験において、生存期間中央値がミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８と同等であったことは注目すべき点である（データは示さず）。ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体は、様々な固形腫瘍を治療するための目的のＡＤＣとして従前に同定された（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７‐６９）。Ｃａｐａｎ‐１の表面結合ｈＲＳ７のＭＦＩは２３７であり（データは示さず）、それに対してミラツズマブでは２２であった（表１５参照）。したがって、表面抗原の発現が実質的により低いにもかかわらず、このモデルでは、ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体は、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体と同様に機能した。
【０３４９】
２つの固形腫瘍異種移植片においてミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体の治療結果が低かったため、多くの固形腫瘍の表面上により高度に発現しているＴｒｏｐ‐２（ｈＲＳ７）またはＣＥＡＣＡＭ６（ｈＭＮ−１５）に対する他のヒト化抗体を用いて調製したミラツズマブ‐ＳＮ‐３８複合体とＳＮ‐３８複合体との比較に焦点をシフトした（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：２；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８‐４６）。３つの追加の異種移植片モデルを調べた。
【０３５０】
胃腫瘍モデルであるＮＣＩ‐Ｎ８７では、１７．５ｍｇ／ｋｇ／回（３５０μｇ）のミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８を投与した動物は、生存期間がいくらか延びたが、生理食塩水処置動物と比較した場合（３１対１４日；Ｐ＝０．０７６０）、または非結合性ベルツズマブ抗ＣＤ２０‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ３９複合体（２１日；Ｐ＝０．３１２８）と比較した場合に統計的有意性を満たさなかった（データは示さず）。しかしながら、ｈＲＳ７‐及びｈＭＮ‐１５‐ＣＬ２Ａ複合体は、生存期間中央値をそれぞれ６６及び６３日に有意に向上させた（Ｐ＝０．０００１）。表面発現Ｔｒｏｐ‐２及びＣＥＡＣＡＭ６のＭＦＩはそれぞれ７９５及び１１２３であり、ＣＤ７４のわずか５よりもはるかに高かった（表１５参照）。この細胞株の異種移植片においてＣＤ７４が細胞質に比較的強く発現していることが免疫組織化学染色で示されたが、重要なことに、ＣＤ７４は散在し、腫瘍内の規定のポケットのみに出現していた（データは示さず）。ＣＥＡＣＡＭ６及びＴｒｏｐ‐２は、ＣＤ７４よりもより均一に発現し（データは示さず）、ＣＥＡＣＡＭ６は細胞質及び膜上の両方において強く発現し、Ｔｒｏｐ‐２は膜上に主に認められた。したがって、抗ＣＥＡＣＡＭ６及び抗Ｔｒｏｐ‐２複合体による生存期間の向上は、ＮＣＩ‐Ｎ８７におけるより高い抗原密度及びより均一な発現の両方を反映している可能性が最も高い。
【０３５１】
Ｈｅｐ‐Ｇ２肝癌細胞株（データは示さず）では、免疫組織化学染色の結果から、ＣＤ７４の極めて均一な発現が、中程度の細胞質染色とともに示され、フローサイトメトリーからは、比較的低い表面発現が示された（ＭＦＩ＝９）。ｈＭＮ‐１５のＭＦＩは１７５であり、免疫組織化学染色は、非常に強く膜染色される分離したポケットを有するＣＥＡＣＡＭ６のかなり均一な膜及び細胞質発現を示した（データは示さず）。Ｈｅｐ‐Ｇ２異種移植片を保有する動物の試験は、生理食塩水処置群（Ｐ＝０．００４８）の生存期間が２１日間であったのに対し、ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８は生存期間を４５日間に延ばし、一方、ｈＭＮ‐１５‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体は生存期間を３５日に延ばした。ｈＭＮ‐１５‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８に比べてミラツズマブ複合体に有利な傾向があったが、統計的有意性は得られなかった（４６対３５日；Ｐ＝０．０８０２）。しかしながら、非結合ベルツズマブ‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８複合体は、ミラツズマブ複合体と同様の生存優位性を提供した。発明者らは、非結合型の複合体を用いての治療結果は、特に高タンパク質用量において特異的ＣＬ２Ａ連結型複合体と同様であり得たが、特異的及び対照複合体の力価測定によって、通常、それが選択的に明らかにされたことを以前に観察した。したがって、これらの特異的複合体のいずれも、この細胞株におけるこれらの用量で選択的な治療上の利点をもたらさなかった。
【０３５２】
Ｈｅｐ‐Ｇ２と同様の表面発現を有するが、わずかに低い細胞質レベルを有するＨｕＨ‐７肝細胞腫細胞株（データは示さず）を用いた別の試験（表１５参照）は、ｈＭＮ‐１５‐ＳＮ‐３８複合体が、有意に異ならないにもかかわらず、ミラツズマブ‐ＣＬ２Ａ複合体（Ｐ＝０．２９４４）よりも長い（３５対１８日）生存優位性を提供することを見出した。ｈＭＮ‐１５及びミラツズマブ複合体はいずれも、生理食塩水処置動物に比べて有意に良好であったが（それぞれ、Ｐ＝０．００８及び０．００９）、どちらもこの用量レベルにおいて非標的化ベルツズマブ‐ＳＮ‐３８複合体と有意に異なってはいなかった（それぞれＰ＝０．４６０２及び０．９０３３）。この細胞株ではＣＥＡＣＡＭ６表面発現は比較的低く（ＭＦＩ＝８１）、免疫組織化学染色の結果は、ＣＤ７４（データは示さず）とＣＥＡＣＡＭ６（データは示さず）の両方が、非常にかすかであり、高度に分散していたことを示した。
【０３５３】
考察
腫瘍選択的化学療法のための抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）アプローチは、現在のかなりの関心分野である（例えば、Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２：８７３‐９０；Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０：１１３１‐４９）。最近の臨床上の成功（Ｐｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２：１４１５‐２１；ＬｏＲｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：４３７‐４７）は、大部分が、従前に使用されてきた従来の化学療法剤の代わりに超毒性剤を採用することによって得られた。しかしながら、標的選択、抗体、及び薬剤リンカーはすべてＡＤＣの最適性能に影響する要因である。例えば、トラスツズマブ‐ＤＭ１の場合、ＨＥＲ２はこの抗原を発現する腫瘍において豊富に存在し、抗体は内部移行し、抗体自体は抗腫瘍活性を有し、これらのすべてが組み合わさって治療結果が高まり得る。正反対に、ＣＤ７４は、はるかに低いレベルで細胞表面上に発現するが、そのユニークな内部移行及び細胞表面再発現特性により、ミラツズマブ抗ＣＤ７４  ＡＤＣは、中程度に毒性の薬剤、例えばドキソルビシンを用いる場合でさえも、造血癌異種移植片モデルにおいて有効である（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７‐７１；Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：５２５７‐６４）。ドキソルビシンが造血癌においてより頻繁に使用される一方、ＳＮ‐３８及び他のカンプトテシンは固形腫瘍患者に投与されることから、発明者らは、固形腫瘍におけるミラツズマブと複合体化したドキソルビシン及びＳＮ‐３８の有用性を評価することにした。ミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体は、様々な血液癌の異種移植モデルにおいて有効であり、臨床試験（ＮＣＴ０１１０１５９４及びＮＣＴ０１５８５６８８）につながったが、一方、いくつかのＳＮ‐３８複合体は、固形及び血液腫瘍モデルにおいて有効であり、２つの新規ＳＮ‐３８複合体を、結腸直腸癌及び多様な上皮癌の第１相臨床試験に供した（ＮＣＴ０１２７０６９８及びＮＣＴ０１６３１５５２）。
【０３５４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、非複合体化ドキソルビシン及びＳＮ‐３８は、Ｒａｊｉリンパ腫細胞株に対するドキソルビシンと同様の効力を有していたが、ＳＮ‐３８は、多数の異なる固形腫瘍細胞株においてより強力であった。興味深いことに、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ミラツズマブ‐ドキソルビシン複合体は、ミラツズマブ‐ＳＮ‐３８複合体に比べて、Ｒａｊｉにおいて最良の奏効を提供した。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験においてＡ‐３７５が遊離のＳＮ‐３８に対するのと同程度に遊離のドキソルビシンに対して感受性であることが示されたにもかかわらず、Ｃａｐａｎ‐１及びＡ‐３７５では、ミラツズマブ‐ドキソルビシンはＣＬ２Ａ連結型ＳＮ‐３８ミラツズマブ複合体よりも効果が低かった。２つの他の細胞株、ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１乳癌及びＬＳ１７４Ｔ結腸癌も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＳＮ‐３８と同様の効能を遊離ドキソルビシンに対して示したが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験においてＳＮ‐３８が固形及び血液癌に同等に有効であることが示されたため、ならびに評価したほとんどの固形腫瘍細胞株においてＳＮ‐３８がドキソルビシンより５〜２０倍高い効力を有することから、発明者らは、固形腫瘍治療のための２つのミラツズマブ‐ＳＮ‐３８複合体に焦点を当てることにした。しかしながら、ミラツズマブ‐ＳＮ‐３８複合体の有用性をよりよく評価するために、様々な固形腫瘍に存在する他の抗原に対する抗体を用いて調製したＳＮ‐３８  ＡＤＣに対する比較評価を含めた。
【０３５５】
発明者らは、従前に、Ｃａｐａｎ‐１細胞株における内部移行性ｈＲＳ７抗Ｔｒｏｐ‐２  ＣＬ２Ａ連結型ＳＮ‐３８複合体による治療応答を研究しており（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７‐６９）、ミラツズマブ及びｈＲＳ７  ＳＮ‐３８複合体の効力を比較した。本研究では、どちらの複合体も対照抗体に比べて生存期間を有意に向上させ、いずれにおいてもＣＬ２Ａ連結型ＳＮ‐３８複合体がＣＬ２Ｅ連結型複合体よりも優れていた。フローサイトメトリーによって、Ｃａｐａｎ‐１においてＴｒｏｐ‐２の発現がＣＤ７４よりも高いことが示されたため、この結果は、例外的であることが知られていたＣＤ７４の輸送能力がＴｒｏｐ‐２よりも効率的であることを示唆した。しかしながら、腫瘍内の細胞間の抗原アクセス性（すなわち、膜対細胞質、生理学的及び「結合部位」バリア）及び分布が、特に個々の細胞への産物の適切な細胞内送達に応じた標的療法のあらゆる形態に影響を及ぼす重要な要素であることは周知である（Ｔｈｕｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ  ６０：１４２１‐３４）。腫瘍内のすべての細胞に抗原が均一に発現していない状況において、腫瘍内に局在化した後に緩やかにそのペイロードを放出する標的薬剤、例えばＣＬ２Ａ連結型複合体などを用いることにより、標的ではない近傍の細胞に薬剤を拡散させることができ、それによってその有効性の範囲が高まると考えられる。実際、高い抗原発現は、結合部位の障壁効果によって潜在的に腫瘍浸透を妨げる可能性があるが、細胞外放出機構は腫瘍内で薬剤が拡散する機構を提供し得る。この機構はまた、本明細書中で使用する抗ＣＥＡＣＡＭ５及び抗ＣＥＡＣＡＭ６などの内部移行性の低い抗体を用いて試験した他の複合体の有効性を助長すると考えられる。ミラツズマブに基づく複合体は、細胞表面上での発現量の低さを補い得るＣＤ７４の迅速な内部移行及び再発現を利用して、抗体と腫瘍細胞との直接相互作用に、より大きく依存している。しかしながら、この利点は、ＣＤ７４が腫瘍内で高度に分散し、腫瘍内に複合体を保持する機構がない場合には減少し、複合体からの薬剤の徐放の恩恵は失われる。発明者らのグループによるヒト胃腸腫瘍に関する従前のレビューは、それらが多くの場合に高レベルで良好な均一性で発現を有することを示唆している（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ４：１‐１２）。
【０３５６】
実施例１７．難治性転移性乳癌を治療するためのｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８（ＩＭＭＵ‐１３２）の使用
患者は、２００５年にＩＶ期の三種陰性乳癌（ＥＲ／ＰＲ陰性、ＨＥＲ‐ｎｅｕ陰性）と診断された５７歳の女性であった。患者は２００５年に左乳房腫瘤摘出を受け、続いて２００５年９月にアジュバント設定の投与集中ＡＣＴを受けた。その後、患者は放射線療法を受け、これを１１月に完了した。この疾患の局所再発は、患者に対して２０１２年初頭に対側（右）乳房の塊を触診し、その後、ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキセート、５‐フルオロウラシル）化学療法で治療した際に同定された。患者の病気は同年に再発し、胸壁の皮膚に転移病巣を伴っていた。患者はカルボプラチン＋ＴＡＸＯＬ（登録商標）化学療法レジメンを受け、その間に血小板減少が生じた。患者の病気は進行し、患者に対して週１回のドキソルビシン投与を開始し、６回投与を続けた。皮膚疾患も進行していた。０９／２６／１２のＦＤＧ‐ＰＥＴスキャンは、胸壁及び肥厚した堅い腋窩リンパ節上に疾患の進行を示した。患者に疼痛管理のためのオキシコドンを投与した。
【０３５７】
２０１２年１０月からはＩＸＥＭＰＲＡ（登録商標）を、胸壁病変が開いて出血した２０１３年２月まで（２週に１回×４か月）、患者に投与した。患者はその後、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）を服用したが、これは、手足の神経障害及び便秘のために良好に忍容されなかった。皮膚病変は進行性であり、インフォームド・コンセントを与えた後、患者をＩＭＭＵ‐１３２試験に登録した。患者はまた、甲状腺機能亢進症及び視覚障害の病歴を有し、ＣＮＳ疾患のリスクが高かった（しかしながら、脳ＭＲＩはＣＮＳ疾患に対して陰性であった）。この試験に登録した時点で、右乳房の皮膚病変（標的）は最大直径で４．４ｃｍ及び２．０ｃｍであった。患者は、右乳房に別の非標的病変を、さらに左右の腋窩にそれぞれ１つずつ拡大したリンパ節を有していた。
【０３５８】
２０１３年３月１２日に最初のＩＭＭＵ‐１３２注入（１２ｍｇ／ｋｇ）を開始し、これは良好に忍容された。患者への２回目の注入は、悪性度３の絶対好中球数（ＡＮＣ）の減少（０．９）により、注入予定日の１週間後に延期した。１週間後、ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標）を投与した後、患者への２回目のＩＭＭＵ‐１３２投与を行い、用量は２５％減少させて９ｍｇ／ｋｇとした。その後は、週１回×２週間、その後１週間休薬するというプロトコールに従って予定通りに患者にＩＭＭＵ‐１３２を投与した。３回の治療サイクル後の２０１３年５月１７日における最初の患者の奏効評価では、標的病変の長径の合計が４３％減少し、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分奏効を成した。患者は９ｍｇ／ｋｇの用量レベルで治療を続けている。ＩＭＭＵ‐１３２での治療を開始して以来、患者の全般的な健康状態や臨床症状は相当改善した。
【０３５９】
実施例１８．難治性転移性非小細胞肺癌を治療するためのｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８（ＩＭＭＵ‐１３２）の使用
患者は、非小細胞肺癌と診断された６０歳の男性である。患者は、カルボプラチン、ベバシズマブの化学療法レジメンを６か月間受け、患者は奏効を示し、その後、進行した後に、次の２年間にわたって、カルボプラチン、エトポシド、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ゲムシタビンを用いたさらなる化学療法コースを受け、時折、２か月未満の奏効を伴った。その後、患者は、６．５×４ｃｍの大きさの左縦隔腫瘤及び胸水を呈している。
【０３６０】
インフォームド・コンセントに署名した後、患者は隔週で１８ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭＭＵ‐１３２の投与を受ける。最初の２回の注射では、短時間の好中球減少症及び下痢を経験し、４時間以内に４回の便通が認められるが、これらは対症療法により２日以内に回復または奏効する。ＩＭＭＵ‐１３２を合計６回注入した後、指標病変のＣＴ評価を行うと２２％の減少が認められ、これは部分奏効よりもわずかに低いが、明確な腫瘍の収縮である。患者は、さらに２か月間この療法を続け、この時、この病変の直径の合計に関して４５％の腫瘍収縮を伴う部分奏効がＣＴで認められ、そのようにしてＲＥＣＩＳＴ基準による部分奏効を成す。
【０３６１】
実施例１９．難治性転移性小細胞肺癌を治療するためのｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８（ＩＭＭＵ‐１３２）＋オラパリブの使用
患者は、左肺、縦隔リンパ節に関する小細胞肺癌の診断、及び左頭頂脳葉への転移のＭＲＩエビデンスを有する６５歳の女性である。従前の化学療法には、カルボプラチン、エトポシド、及びトポテカンが含まれるが、奏効は認められない。放射線療法も患者の疾患を制御することができない。患者は２１日間のサイクルでＩＭＭＵ‐１３２＋オラパリブの併用療法を受ける。オラパリブは、サイクルの１〜１０日目に２００ｍｇで１日２回投与する。ＩＭＭＵ‐１３２は、サイクルの１及び８日目に８ｍｇ／ｋｇで投与する。３サイクル後、肺及びリンパ節腫瘍の最長直径の合計に関して３１％の収縮がＣＴで認められ、一方、推定される脳転移はもはや検出されない。４週間後に収縮が確認されたため、これはＲＥＣＩＳＴ  １．１によるＰＲを構成する（すべての標的病変の合計に関して３５％の収縮）。さらに、ＩＭＭＵ‐１３２の投与を３週に１回、３か月間にわたって継続し、客観的かつ主観的な患者の状態に改善を示し続けた。
【０３６２】
実施例２０．ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８（ＩＭＭＵ‐１３２）＋パクリタキセルを用いたＩＶ期転移性疾患を有する胃癌患者の治療
この患者は、喫煙歴及び４０年間の過度のアルコール摂取期間を有する６０歳の男性である。患者は、体重減少、摂食不快感と制酸剤により緩和されない痛み、頻繁な腹痛、腰痛、及び最近では両腋窩内の触知可能なこぶなどを経験する。患者は医師の診察を受け、胃内視鏡を介した生検に基づいて、胃‐食道接合部での扁平上皮の特徴を有する腺癌を有するとの検査結果が示される。放射線検査（ＣＴ及びＦＤＧ‐ＰＥＴ）もまた、左右の腋窩、縦隔領域、腰椎、及び肝臓の転移性疾患を明らかにする（右葉の２つの腫瘍及び左葉の１つの腫瘍、いずれも直径は２〜４ｃｍ）。患者の胃腫瘍を切除し、患者は、その後、エピルビシン、シスプラチン、及び５‐フルオロウラシルを用いた化学療法のコースに参加する。４か月、及び６週間の休薬期間の後、患者は転移性腫瘍及びいくつかの一般的な増悪のＣＴ測定によって確認する進行に基づいて、ドセタキセル化学療法に切り替えるが、これもまた、患者の疾患を制御することができない。
【０３６３】
患者は次に、２１日間のサイクルでＩＭＭＵ‐１３２（ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８）とパクリタキセルの併用療法を受ける。パクリタキセルは、サイクルの１、７及び１４日目に１７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与する。ＩＭＭＵ‐１３２は、サイクルの１日目及び８日目に１０ｍｇ／ｋｇで投与する。３サイクル後、患者の病気の状態を評価するためにＣＴ検査を行う。注入は良好に忍容され、軽度の悪心及び下痢、ならびに対症療法及びＧ‐ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））で制御される悪性度３の好中球減少症を伴う。転移性病変の指標の合計が２８％減少することがＣＴ検査で明らかになるため、患者はこの治療をさらに５サイクル継続する。追跡調査のＣＴ検査では、併用療法前の患者のベースライン測定値からＲＥＣＩＳＴ基準で約３５％減少していることが示され、患者の全身状態も改善していると考えられ、患者は制御下にある疾患に対して楽観的な態度を取り戻す。
【０３６４】
実施例２１．ＩＭＭＵ‐１３０（ラベツズマブ‐ＳＮ‐３８）のみを用いた従前の化学免疫療法に対して難治性の進行性結腸癌患者の治療
患者は、ＩＶ期転移性結腸癌の病歴を有する５０歳の男性であり、２００８年に最初に診断され、原発性及び転移性結腸癌に対して結腸切除術及び部分肝切除術をそれぞれ施している。その後、患者は図１４に示すように、イリノテカン、オキサリプラチン、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（５‐フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン）、及びベバシズマブ、ならびにベバシズマブと５‐フルオロウラシル／ロイコボリンとの併用を含む化学療法を、ほぼ２年間にわたって受けた。その後、セツキシマブ単独またはＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、５‐フルオロウラシル、イリノテカン）と併用した化学療法のコースを翌年またはそれ以降に受けた。２００９年には、患者は、化学療法を受けている期間中、肝転移に対してラジオ波焼灼術を受け、２０１０年後半には、肺転移の楔状切除術を受け、数か月後の２０１１年初頭に再手術を受けた。２０１１年に化学療法を受けているにもかかわらず、２０１１年末に新しい肺転移が出現し、２０１２年には肺転移と肝転移の両方が視認された。患者のベースライン血漿癌胎児性抗原（ＣＥＡ）力価は、ＩＭＭＵ‐１３０による抗体‐薬剤療法を受ける直前において１２．５ｎｇ／ｍＬであった。腫瘍サイズの変化をコンピュータ断層撮影によって測定するために放射線科医が選択する指標病変は、右肺及び肝転移の中央葉であって、ＩＭＭＵ‐１３０（抗ＣＥＡＣＡＭ５‐ＳＮ‐３８）療法を実施する前のベースラインでのそれらの長径の合計は９１ｍｍであった。
【０３６５】
この患者は、隔週で緩やかなＩＶ注入によって１６ｍｇ／ｋｇの用量のＩＭＭＵ‐１３０を、合計１７回の治療投与量で受けた。患者は、治療に良好に忍容し、第一の治療後に悪性度１の悪心、下痢及び疲労のみを有し、これらは４回目及び５回目の治療後に生じたが、患者はこれらの副作用に対して薬物療法を受けたため、その後には生じなかった。３回目の治療後、患者はその後の治療中に存在した脱毛症（悪性度２）を示した。悪心、下痢、及び時折の嘔吐は２〜３日続いたのみであり、第一の注入後の患者の疲労は２週間続いた。そうでなければ、患者は治療によく忍容した。ＳＮ‐３８と複合体化したこのヒト化（ＣＤＲ移植）抗体の投与を長期間受けたため、抗ラベツズマブ抗体について患者の血液を測定したが、１６回の投与後でさえも何も検出されなかった。
【０３６６】
４回目の治療後に、第一のコンピュータ断層撮影（ＣＴ）測定を行ったところ、この治療を行う前のベースライン時の指標病変における測定値の合計から２８．６％の変化が認められた。８回目の治療後には、この減少は４０．６％になり、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分奏効を成した。この奏効は、さらに２か月間持続し、この時、患者のＣＴ値は、指標病変がベースライン測定値よりも３１．９％低いが、以前の４０．６％の減少よりも幾分高いことを示した。したがって、イリノテカン（ＳＮ‐３８の親分子）を含む前治療としての化学療法及び免疫療法に失敗したこの患者は、肺及び肝臓における指標病変の慎重なＣＴ測定に基づいて、抗ＣＥＡＣＡＭ５ヒト化抗体であるラベツズマブ（ｈＭＮ‐１４）を標的とした場合に、イリノテカン（またはカンプトテシン）の活性代謝物であるＳＮ‐３８に対する客観的奏効を示した。イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）はｉｎ  ｖｉｖｏではＳＮ‐３８を放出することによって作用するが、ＳＮ‐３８複合体化抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体の場合、患者が直近のイリノテカンを含む療法に対する奏効に以前に失敗した後に、部分奏効を誘導することによって結腸直腸癌患者に有効であることが判明したことは驚くべきことである。患者の血漿ＣＥＡの力価低下はまた、ＣＴ所見を裏付けた：３回目の治療投与の後、ベースラインレベル１２．６ｎｇ／ｍＬから２．１ｎｇ／ｍＬに低下し、８〜１２回目の投与では１．７〜３．６ｎｇ／ｍＬであった。ＣＥＡの正常血漿力価は通常２．５〜５．０ｎｇ／ｍＬであると考えられているため、この療法は患者の血液中のＣＥＡ力価の正常化に影響を与えた。
【０３６７】
実施例２２．ＩＭＭＵ‐１３０＋エリブリンメシル酸塩を用いた進行性結腸癌患者の治療
この患者は、転移性結腸癌（ＩＶ期）と診断された７５歳の女性である。患者は適切な右半結腸切除と小腸切除を受け、１年半の間、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ＋ベバシズマブ、ＦＯＬＦＩＲＩ＋ラムシルマブ、及びＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブ療法を受け、この時、患者は疾患の進行を示し、後部結膜嚢、大網に疾患の拡散を有し、骨盤に腹水を有し、胸腔の右側に胸水を有する。この療法の直前の患者のベースライン血漿ＣＥＡ力価は１５ｎｇ／ｍＬである。患者は、エリブリンメシル酸塩（１．４ｍｇ／ｍ２）と１０ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ‐１３０（抗ＣＥＡＣＡＭ５‐ＳＮ‐３８）の両方を２１日間のサイクルの１日目と８日目に投与する併用療法を受け、この療法は主要な造血系または非造血系の毒性を伴わずに良好に忍容される。治療の２か月以内に、患者の血漿ＣＥＡ力価は中程度に１．３ｎｇ／ｍＬまで低下するが、８週目の評価では、指標腫瘍病変の２１％の収縮が認められ、１３週目で収縮は２７％に高まる。驚くべきことに、この時点で患者の腹水及び胸水は両方とも減少し（後者については消失する）、したがって患者の全体的な状態が顕著に改善する。患者は試験的治療を継続する。
【０３６８】
実施例２３．ＩＭＭＵ‐１３０＋ルカパリブで処置したＩＶ期転移性疾患を有する胃癌患者
患者は、約６年間に及ぶ胃の不快感及び摂食に関連する痛み、ならびに過去１２か月間の体重減少のために医者の診察を受けた５２歳の男性である。胃の領域の触診で堅い塊が明らかとなり、その後の胃内視鏡検査で胃の下部に潰瘍性の腫瘤が明らかとなる。これを生検し、胃腺癌と診断する。肝機能検査、ＬＤＨ、及び血漿ＣＥＡの１０．２ｎｇ／ｍＬへの上昇を除いては、実験室試験では特異的な異常変化はないことが明らかになった。次いで、患者は全身ＰＥＴスキャンを受け、胃腫瘍に加えて、左腋窩及び肝臓の右葉における転移性疾患（２つの小転移）が明らかになる。患者の胃腫瘍を切除し、その後、転移性腫瘍のベースラインＣＴ測定値を取得する。手術の４週間後、シスプラチンと５‐フルオロウラシル（ＣＦ）レジメンからなる３コースの併用化学療法を受けるが、これは忍容できず、ドセタキセル治療に切り替える。この疾患は、ＣＴスキャンに基づくと、約４か月間安定すると考えられるが、さらなる体重減少、腹痛、食欲不振、及び倦憊に関する患者の訴えにより、ＣＴ検査を繰り返し行うこととなり、その結果、元の胃切除部位における転移及び病変と疑われる部位のサイズは、合計２０％の増加を示す。
【０３６９】
患者は、その後、週１回のスケジュールでＩＭＭＵ‐１３０（抗ＣＥＡＣＡＭ５‐ＳＮ‐３８、８ｍｇ／ｋｇ）とＰＡＲＰ阻害剤ルカパリブ（１２ｍｇ／ｍ２）との併用療法を受ける。患者はこれを忍容するが、３週間後には悪性度３の好中球減少症及び悪性度１の下痢症状を示す。患者への４回目の注入を１週間延期し、その後、週１回の注入を再開し、以後の４回の注射については下痢または好中球減少を示すエビデンスはない。次いで、患者はＣＴ検査を受け、そこで転移性腫瘍サイズを測定し、胃切除の元の領域を見る。放射線科医は、ＲＥＣＩＳＴの基準に従って、転移病巣の合計が併用療法前のベースラインに比べて２３％減少していることを測定する。元の胃切除領域に明確な病変はないと思われる。この時点での患者の血漿ＣＥＡ力価は７．２ｎｇ／ｍＬであり、ベースライン値１４．５ｎｇ／ｍＬよりもはるかに低い。患者は同じ用量で週１回の併用療法を継続し、合計１３回の注入後に、ＣＴスキャンにより、１つの肝転移が消失し、すべての転移病巣の合計が４１％減少することが示され、ＲＥＣＩＳＴによる部分奏効を成す。患者の全身状態は改善し、患者は通常の活動を再開する一方で、さらに４回の注射で、３週に１回、８ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ‐１３０の維持療法を継続して受ける。最終的な血中ＣＥＡ測定値は４．８ｎｇ／ｍＬであり、これはこの患者の場合のような喫煙者にとっては正常範囲内である。ＨＡＨＡ血清測定では、抗抗体または抗ＳＮ‐３８抗体は検出されず、したがって治療は免疫原性ではないと考えられる。
【０３７０】
実施例２４．ＩＭＭＵ‐１３０＋ベリパリブによる再発三種陰性転移性乳癌の治療
以前にベバシズマブ＋パクリタキセルで治療を行ったものの奏効がなかった三種陰性転移性乳癌を有する５８歳の女性は、数本の肋骨、腰椎に転移を有し、左肺に直径３ｃｍの孤立性病変を有し、これらには相当な骨の痛みと疲労が伴う。患者は、抗ＣＥＡＣＡＭ５  ＩＭＭＵ‐１３０（ｈＭＮ‐１４‐ＳＮ‐４８）＋ベリパリブの併用療法を受ける。ＩＭＭＵ‐１３０を、２１日サイクルの１日目及び８日目に１２ｍｇ／ｋｇで投与する一方、ベリパリブは、１日１回、６０ｍｇ投与する。一過性の悪性度２の好中球減少症及び初期の下痢症状を除けば、患者は治療を良好に忍容し、その後、２か月の休憩の後に別のコースで繰り返す。放射線検査では、指標病変の直径の合計が３９％減少するため、患者にＲＥＣＩＳＴ基準による部分奏効があることが示される。骨の痛みを含む患者の全身状態も改善し、疾患以前とほぼ同レベルの活動状態に戻る。
【０３７１】
実施例２５．ｈＭＮ‐１５‐ＳＮ‐３８＋パクリタキセルを用いた再発難治性結腸癌の治療
４６歳の女性は、ＩＶ期転移性結腸癌を有し、原発巣の切除の前病歴があり、また、肝臓の両葉に同時性肝転移を有し、ならびに右肺に単一のフォーカスの広がりを有し；これらの転移はＣＴによって直径２〜５ｃｍの間で測定された。患者は、５‐フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、セツキシマブ、及びベバシズマブを含む、様々なコースの化学療法を３年間にわたって受ける。２つの場合において、疾患の安定化または短期間の奏効のエビデンスが存在するが、測定した患者の病変に３０％以上の減少は認められない。併用療法以前のベースライン時の血漿ＣＥＡ力価は４６ｎｇ／ｍＬであり、指標病変の合計の測定結果は９２ｍｍである。
【０３７２】
ｈＭＮ‐１５‐ＳＮ‐３８とパクリタキセルとの併用療法は、２１日間のサイクルで開始する。ｈＭＮ‐１５‐ＳＮ‐３８を１日目及び８日目に１２ｍｇ／ｋｇで投与し、パクリタキセルをサイクルの１、７及び１４日目に１３５ｍｇ／ｍ２の投与量で投与する。このサイクルを３回繰り返し、これに対しては一時的な好中球減少症及び胃腸の副作用（悪心、嘔吐、下痢）のみが伴う。驚くべきことに、ＦＯＬＦＩＲＩ療法（イリノテカン、またはＣＰＴ‐１１を含む）に対する奏効がなくても、患者は治療を完了した後にＲＥＣＩＳＴ基準による部分奏効を示す。その後、患者は次の６か月間、月に１回、この治療のメンテナンス計画に参加する。追跡調査でのスキャン結果は、患者の疾患が部分奏効（ＰＲ）として制御下に維持されていることを示し、患者は一般的に良好な状態であり、９０％のカルノフスキー・パフォーマンス・ステータスを有する。
【０３７３】
実施例２６．ＩＭＭＵ‐１３０＋オラパリブを用いた再発転移性卵巣癌の治療
ＢＲＣＡ１突然変異に対して陽性であるＦＩＧＯ  ＩＶ期卵巣癌を有する６６歳の女性は、一次手術及び術後パクリタキセル及びカルボプラチン（ＴＣ）を受ける。２０か月のプラチナ系薬剤の無治療期間の後、上昇したＣＡ１２５レベル及び腹膜における再発がＣＴで確認される。ＴＣでの再治療後、カルボプラチンに対して過敏反応が起こり、これがネダプラチンに変化する。完全奏効がＣＴで確認される。８か月間のＰＦＩ後、血清ＣＡ１２５値の上昇及び腹膜及び肝臓における再発が確認される。
【０３７４】
その後、抗ＣＥＡＣＡＭ５  ＩＭＭＵ‐１３０（ｈＭＮ‐１４‐ＳＮ‐３８）＋オラパリブの併用療法を受ける。ＩＭＭＵ‐１３０は、２１日サイクルの１日目及び８日目に１０ｍｇ／ｋｇで投与し、一方、オラパリブは、サイクルの１〜１０日目に２００ｍｇで１日２回投与する。一過性の悪性度２の好中球減少症及び初期の下痢症状を除けば、患者は治療を良好に忍容し、その後、２か月の休憩の後に別のコースで繰り返す。放射線検査では、指標病変の直径の合計が４５％減少していることから、患者にＲＥＣＩＳＴ基準による部分奏効があることが示される。患者の全身状態も改善し、疾患以前とほぼ同レベルの活動状態に戻る。
【０３７５】
実施例２７．抗ＣＳＡｐ‐ＳＮ‐３８複合体＋パクリタキセルで治療するＩＶ期転移性結腸癌患者
この患者は、９ｃｍのＳ状結腸腺癌の切除後、ＦＯＬＩＦＩＲＩ及びセツキシマブによる化学免疫療法を６か月行い、その後、ＦＯＬＦＯＸの後に約９か月間、追加のベバシズマブを投与した後、肝臓の左葉及び両肺に結腸癌転移を呈する。最初の切除及びその後の治療開始の１０か月後に、存在すると考えられる安定した疾患は、増殖する病変による進行を示し、左副腎に新たな転移が現れる。この時点での患者の血漿ＣＥＡは５２ｎｇ／ｍＬであり、患者の全身状態は悪化しており、腹痛、疲労、及び境界性貧血を伴い、これはおそらく内出血を示唆している。
【０３７６】
患者は、その後、２１日間のサイクルで、ｈＭｕ‐９（抗ＣＳＡｐ）抗体のＳＮ‐３８複合体とパクリタキセルの併用療法を受ける。抗体または免疫複合体は、サイクルの１及び８日目に１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、パクリタキセルはサイクルの１、７及び１４日目に１７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与し、これをさらなる治療サイクルに対して繰り返し、週１回、患者の血球数を測定し、アトロピン薬を投与して胃腸の反応を制御する。最初の治療サイクルの後に悪性度２の脱毛症が記録されるが、好中球減少は悪性度１のみが認められる。３回の治療サイクル後、患者の血漿ＣＥＡ力価は１９ｎｇ／ｍｌに低下し、この時点で患者のＣＴ測定値は、肝臓及び肺の指標病変が２４．１％減少していることを示す。追加の３コースの治療の後、患者は、指標病変のＣＴの３１．４％の低下、及び副腎のサイズの約４０％の縮小を示す。この患者は併用療法に対して奏効を示していると考えられ、この療法を継続する。患者の全身状態は改善すると考えられ、疲労感は少なく、腹痛や不快感がなく、一般的によりエネルギッシュである。
【０３７７】
実施例２８．抗ＭＵＣ５ａｃ‐ＳＮ‐３８免疫複合体＋ルカパリブによる転移性膵臓癌の治療
この４４歳の患者は、転移性の膵臓癌の病歴を有し、膵頭部に手術不能な膵管腺癌を有し、肝臓の左右の葉に転移を示し、前者は３×４ｃｍ、後者は２×３ｃｍの大きさである。患者は、ゲムシタビンのコースを受けるが、客観的奏効は示さない。４週間後、患者は静脈内ｈＰＡＭ４‐ＳＮ‐３８との併用療法を受け、８ｍｇ／ｋｇの用量で週２回×２週間投与し、その後１週間休薬し、それに加えてルカパリブ（１２ｍｇ／ｍ２）を週１回投与する。これをさらに２サイクル繰り返す。ＣＴ検査を１週間後に行い、その結果、腫瘍の質量合計（すべての部位）の３２％の減少（部分奏効）、ならびに、患者血液のＣＡ１９‐９力価においてベースライン時の２２０から放射線検査時の７５までの低下を示す。患者は、各治療後に悪性度１の悪心及び嘔吐のみを示し、最終治療サイクルの終わりに悪性度２の好中球減少を示し、これは４週間後に回復する。急性輸液反応を予防するための前投与は行わない。
【０３７８】
実施例２９．治療難治性転移性結腸癌（ｍＣＲＣ）を治療するための抗ＣＤ７４  ｈＬＬ１‐ＳＮ‐３８＋オラパリブの使用
患者は、転移性結腸癌を呈する６７歳の男性である。診断の直後に横行結腸切除を行った後、患者は、ネオアジュバント設定で４サイクルのＦＯＬＦＯＸ化学療法を受け、その後、肝臓の左葉の転移病変を除去するための部分肝切除を受ける。これに続いて、ＦＯＬＦＯＸの合計１０サイクルのアジュバントＦＯＬＦＯＸレジメンを実施する。
【０３７９】
ＣＴは肝臓への転移を示す。患者の標的病変は、肝臓の左葉の３．０ｃｍの腫瘍である。非標的病変は、肝臓内のいくつかの弱毒性腫瘤を含んでいた。ベースラインＣＥＡは６８５ｎｇ／ｍＬである。
【０３８０】
次いで、患者を、ＳＮ‐３８複合体化抗ＣＤ７４ミラツズマブ（ｈＬＬ１‐ＳＮ３８）とオラパリブを併用して治療する。ｈＬＬ１‐ＳＮ‐３８（１０ｍｇ／ｋｇ）は、２１日サイクルの１及び８日目に投与するが、オラパリブは、サイクルの１〜１０日目に２００ｍｇを１日２回投与する。患者は、最初のサイクル中に悪心（悪性度２）及び疲労（悪性度２）を経験し、重大な有害事象を伴わず、治療を継続する。最初に行った奏効評価（３サイクル後）は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）による標的病変の収縮が２６％であり、及び患者のＣＥＡレベルが２４５ｎｇ／ｍＬに低下することを示す。２回目の奏効評価（８サイクル後）では、標的病変は３５％縮小している。患者の全体的な健康と臨床症状は相当改善する。
【０３８１】
実施例３０．ＩＭＭＵ‐１１４‐ＳＮ‐３８及びパクリタキセルによる再発慢性リンパ球性白血病の治療
慢性リンパ球性白血病及び世界保健機構分類に関する国際ワークショップによって定義されたＣＬＬの病歴を有する６７歳の男性は、フルダラビン、デキサメタゾン、及びリツキシマブによる前治療、ならびにＣＶＰのレジメン後に、再発性疾患を呈する。患者は、現在、全身のリンパ節の拡大、ヘモグロビン及び血小板産生の減少、ならびに急速に上昇する白血球数に関連する発熱及び夜間の発汗を有する。患者のＬＤＨは上昇し、β２ミクログロブリンはほぼ正常の２倍である。患者に、２１日間のサイクルで抗ＨＬＡ‐ＤＲ  ＩＭＭＵ‐１１４‐ＳＮ‐３８（ＩｇＧ４  ｈＬ２４３‐ＳＮ‐３８）複合体とパクリタキセルとの併用療法を施す。ＩＭＭＵ‐１１４‐ＳＮ‐３８を１及び８日目に８ｍｇ／ｋｇで投与し、パクリタキセルをサイクルの１、７及び１４日目に１７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与し、次いでサイクルを繰り返す。４サイクル後、評価結果は、患者の血液パラメーターが改善し、患者の循環ＣＬＬ細胞の数が減少していると考えられることを示す。さらに３サイクルの治療を再開し、その後、血液の検査値は、患者が部分奏効を有することを示す。
【０３８２】
実施例３１．ｈＡ１９‐ＳＮ‐３８、ルカパリブ及びパクリタキセルを用いた濾胞性リンパ腫患者の治療
６０歳の男性は、腹痛及び触診可能な腫瘤の存在を呈する。患者は、ＣＴ及びＦＤＧ‐ＰＥＴ試験を受け、縦隔、腋窩、及び頸部リンパ節に病的アデノパシーを有する腫瘤の存在を確認する。ラボ検査は、ＬＤＨ及びβ２ミクログロブリンの上昇以外は、平常な結果である。骨髄生検では、いくつかの小柱近傍及び血管周囲のリンパ系凝集体が明らかになる。免疫染色によると、これらはＣＤ２０、ＣＤ１９、及びＣＤ１０を発現するリンパ球である。最終的な診断結果は、ＦＬＩＰＩスコア４を有するＩＶＡ期、悪性度２の濾胞性リンパ腫である。関与する最も大きなリンパ節の最大径は７ｃｍである。患者には、２１日間のサイクルで、ＳＮ‐３８と複合体化したヒト化抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＩｇＧ（ｈＡ１９）と、ルカパリブ及びパクリタキセルとの併用療法を行う。ＡＤＣは、７及び１４日目に６ｍｇ／ｋｇで投与し、ルカパリブは、１、８及び１５日目に１０ｍｇ／ｍ２で投与し、パクリタキセルは、サイクルの１、７及び１４日目に１２５ｍｇ／ｍ２で投与する。５サイクル後、骨髄及び撮影（ＣＴ）評価は部分奏効を示し、そこでは測定可能な病変は約６０％縮小し、骨髄の浸潤ははるかに少ない。また、ＬＤＨ及びβ２ミクログロブリンの力価も減少する。
【０３８３】
実施例３２．ｈＡ２０‐ＳＮ‐３８＋オラパリブを用いた再発前駆Ｂ細胞ＡＬＬの治療
この５１歳の女性は、フィラデルフィア染色体陰性の前駆Ｂ細胞ＡＬＬの治療を受けており、そのＡＬＬ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ３８、及びＣＤ４５に対して染色を示す。２０％を上回る骨髄及び血液リンパ芽球がＣＤ１９及びＣＤ２０を発現する。患者はクロファラビン及びシタラビンを用いた前治療を受けており、その結果、血液毒性は相当に高いが、奏効はない。高用量のシタラビン（ａｒａ‐Ｃ）の投与も開始したが、患者が忍容できなかった。患者に、２１日間のサイクルでｈＡ２０‐ＳＮ‐３８（ベルツズマブ‐ＳＮ‐３８）とオラパリブを投与し、７及び１４日目に６ｍｇ／ｋｇのｈＡ２０‐ＳＮ‐３８を投与し、サイクルの１〜１０日目にオラパリブを１日２回、２００ｍｇ投与する。
【０３８４】
驚くべきことに、３サイクル後、患者の血液及び骨髄の数に、改善が認められ、それは部分奏効と判定するのに十分なものである。好中球減少（悪性度３）により、２か月間休止した後、別の４コースで治療を再開する。この時点で、患者は非常に改善しており、幹細胞移植の候補者とすることが可能な段階まで進ませることを試みるメンテナンス療法の検討下にある。
【０３８５】
実施例３３．抗ＣＤ２２‐ＳＮ‐３８＋パクリタキセルによるリンパ腫の治療
患者は、再発びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する６２歳の男性である。６コースのＲ‐ＣＨＯＰ化学免疫療法の後、患者は現在、縦隔、腋窩、及び鼠径リンパ節内に広範なリンパ節の拡散を示す。患者に、２１日間のサイクルで抗ＣＤ２２エプラツズマブ‐ＳＮ‐３８＋パクリタキセルを投与する。ＡＤＣは１及び７日目に１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、パクリタキセルはサイクルの１、７及び１４日目に１７５ｍｇ／ｍ２で投与する。３サイクル後、患者をＣＴ画像法によって評価し、患者の全腫瘍体積を測定すると３５％（部分奏効）の縮小が認められ、この状態が以降の３か月間にわたって維持されると考えられる。副作用は、治療後の血小板減少症ならびに悪性度１の悪心及び嘔吐のみであり、これは２週間以内に回復する。急性輸液反応を低減するための前治療は行わない。
【０３８６】
実施例３４．ベルツズマブ‐ＳＮ‐３８及びルカパリブを用いた濾胞性リンパ腫の最先端治療
患者は、低悪性度の濾胞性リンパ腫を呈し、測定可能な両側子宮頸部及び腋窩リンパ節（各々２〜３ｃｍ）、直径４ｃｍの縦隔腫瘤、ならびに脾腫を有する４１歳の女性である。患者に、ベルツズマブ‐ＳＮ‐３８（抗ＣＤ２０‐ＳＮ‐３８）をルカパリブと併用投与し、ＡＤＣは１日目に１０ｍｇ／ｋｇ、ルカパリブは１、８、１５日目に１２ｍｇ／ｍ２を投与する。４サイクル後、ＣＴによる患者の腫瘍測定値は８０％の減少を示す。その後、患者は２つの追加治療コースを受け、ＣＴによる測定結果は、完全奏効の達成を示す。これを、ＦＤＧ‐ＰＥＴ画像法によって確認する。
【０３８７】
実施例３５．プロ‐２‐ピロリノドキソルビシン（Ｐ２ＰＤｏｘ）の合成及び使用
その図及び実施例の節を参照として本明細書に援用する米国特許第８，８７７，２０２号に記載されているように、Ｐｒｏ‐２‐ピロリノドキソルビシン（Ｐ２ＰＤｏｘ）を合成し、抗体に複合体化した。例示的なＰ２ＰＤｏｘ  ＡＤＣを以下の表１６に開示する。
【表１６】
2018520140.tif 000028
【０３８８】
ｈＰＡＭ４‐Ｐ２ＰＤｏｘ、ｈＬＬ２‐Ｐ２ＰＤｏｘ及びＲＦＢ４‐Ｐ２ＰＤｏｘについても、同様のタンパク質回収率及び純度（データは示さず）で、複合体を調製した。
【０３８９】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合試験］―複合体の結合と非複合体化抗体の結合とを比較する細胞結合アッセイによって、抗体結合の保持を確認した（Ｃｈａｒｉ，２００８，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  ４１：９８‐１０７）。複合体の効力を、適切な標的細胞を用いて４日間のＭＴＳアッセイで試験した。ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘ複合体は、胃（ＮＣＩ‐Ｎ８７）、膵臓（Ｃａｐａｎ‐１）、及び乳房（ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８）ヒト癌細胞株において０．３５〜１．０９ｎＭのＩＣ５０値を示し、遊離薬剤は同細胞株において０．０２〜０．０７ｎＭの効力を示した。
【０３９０】
［血清安定性］―プロトタイプのＰ２ＰＤｏｘ複合体、ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘの血清安定性を、ヒト血清中で、３７℃、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度でインキュベートすることによって測定した。遊離薬剤に起因するピークと複合体またはより高分子量の分子種に起因するピークとを良好な保持時間で分離するブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを用いたＨＰＬＣによって、インキュベート物を分析した。この分析結果は、複合体からの遊離薬剤の放出がないことを示し、このことは複合体の高い血清安定性を示唆するものであった。同じ実験を、ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘと同じ切断可能なリンカーを含むｈＲＳ７‐ドキソルビシン複合体で繰り返した場合、遊離薬剤が９６時間の半減期で個々に放出されることが確認され、ＨＩＣ  ＨＰＬＣにおいて遊離薬剤のピーク、すなわちドキソルビシンのピークの明確な形成が認められた。
【０３９１】
驚くべきことに、Ｐ２Ｐｄｏｘ複合体は、抗体のペプチド鎖を一緒に架橋するため、抗体にしっかりと保持されることが判明した。架橋は、抗体への薬剤の結合を安定化させ、その結果、抗体が代謝された後に薬剤は細胞内にのみ放出される。架橋は、循環器への遊離薬剤の放出に起因する毒性、例えば心毒性を最小限にとどめることを補助する。薬剤がｉｎ  ｖｉｖｏでペプチドを他のタンパク質またはペプチドに架橋したため、従前の２‐ＰＤｏｘペプチド複合体の使用は失敗した。本発明の複合体では、Ｐ２ＰＤｏｘを鎖間ジスルフィドチオール基に結合させるが、それはプロドラッグ形態である。プロドラッグ保護は、注射直後にｉｎ  ｖｉｖｏで迅速に除去され、生じる複合体の２‐ＰＤｏｘ部分は、抗体のペプチド鎖を架橋し、抗体分子内で分子内架橋を形成する。これは、ＡＤＣを安定化させ、循環器中の他の分子への架橋を防止する。
【０３９２】
実施例３４．ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
［一般］―腫瘍の大きさは、長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）をキャリパー測定することによって決定し、腫瘍体積は（Ｌ×Ｗ２）／２として計算した。腫瘍を測定し、週２回、マウスの体重を測定した。腫瘍の大きさが１ｃｍ３を超えるか、開始時の体重から１５％超の減少が認められるか、さもなければ瀕死状態になった場合に、マウスを安楽死させた。腫瘍増殖データの統計解析は、曲線下面積（ＡＵＣ）及び生存期間に基づいた。線形曲線モデリングにより個々の腫瘍増殖のプロファイルを得た。増殖曲線の統計解析の前に、ｆ検定を用いて群間の等分散性を測定した。両側ｔ検定を用いて、様々な処置群と非特異的対照の間の統計的有意性を評価した。生理食塩水対照の解析については、片側ｔ検定を用いて有意性を評価した。生存性の試験は、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ４．０３）ソフトウェアパッケージ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．；エンシニータス、カリフォルニア）を使用し、Ｋａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒプロット（ログランク検定）を用いて解析した。前臨床実験におけるすべての用量は抗体量で表す。薬剤に関しては、例えば２０ｇマウス中の１００μｇの抗体（５ｍｇ／ｋｇ）は、薬剤／ＩｇＧ比３〜６を有するＡＤＣを用いる場合、１．４μｇ〜２．８μｇ（０．１４〜０．１７ｍｇ／ｋｇ）のＰ２ＰＤｏｘ等量を保有する。
【０３９３】
３００μｇ［約１０μｇのＰ２ＰＤｏｘ］を上回る複合体の単一の静脈内投与は致命的であったが、２週間で４５μｇを４回投与したすべての動物が忍容性を示した。この投与レジメンを用いて、２つのヒト腫瘍異種移植片モデル、Ｃａｐａｎ‐１（膵臓癌）及びＮＣＩ‐Ｎ８７（胃癌）におけるｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘの治療効果を調べた。治療は、ヌードマウスへの腫瘍移植の７日後に開始した。確立した７日齢のＣａｐａｎ‐１モデルにおいて、確立した腫瘍の１００％が急速に退行し、再増殖の徴候は認められなかった（データは示さず）。この結果は、反復実験で再現された（データは示さず）。確立したＮＣＩ‐Ｎ８７モデルにおいても同様の結果が観察され（データは示さず）、７０日後に投与した第２コースの治療は、安全に忍容され、残存腫瘍の更なる退行をもたらした（データは示さず）。Ｔｒｏｐ‐２を標的とする内部移行性ｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８複合体は、内部移行しにくい抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ｈＭＮ‐１４（データは示さず）の複合体よりも良好な治療応答を提供した。非標的化抗ＣＤ２０  ＡＤＣであるｈＡ２０‐Ｐ２ＰＤｏｘは効果がなく、このことは選択的な治療効力を示している（データは示さず）。乳癌異種移植片（ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８）及び第二の膵臓癌異種移植片（データは示さず）からのデータは、複合体の特異的で有意な抗腫瘍効果に関して同じパターンを示す。
【０３９４】
［薬剤／ＩｇＧ比６．８または３．７の置換を有するｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘのＰＫ及び毒性］―最大８種類の超毒性剤／ＭＡｂを保有する抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）は、未修飾ＭＡｂよりも速く排出され、非特異的毒性を高めることが知られており、この知見が、薬剤置換を４か所以下とする現在の傾向を導いている（Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：７０６３‐７０）。ＡＤＣを、約６：１及び約３：１の平均薬剤／ＭＡｂ置換率（ＭＳＲ）で調製及び評価した。６．８または３．７（同じタンパク質用量）の薬剤置換を有する未修飾ｈＲＳ７またはｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘの単回用量を正常マウスの群（ｎ＝５）に静脈内投与し、注射後３０分、４時間、２４時間、７２時間、及び１６８時間に血清試料を採取した。これらを抗体濃度についてＥＬＩＳＡで分析した。様々な時点における血清濃度に有意差はなく、このことは、これらが血液と同様のクリアランスを示したことを意味している。ＰＫパラメータ（Ｃｍａｘ、ＡＵＣなど）も同様であった。より高いまたはより低い薬剤置換を有する複合体は、それらを複合体化薬剤と同用量で投与した場合、ヌードマウスにおいて同様の忍容性を有していた。
【０３９５】
［最小有効量（ＭＥＤ）での治療有効性］
ＮＣＩ‐Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を保有するヌードマウスにおいて、タンパク質用量９ｍｇ／ｋｇ、６．７５ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、２．２５ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス投与によって、抗Ｔｒｏｐ‐２抗体複合体であるｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘを評価した。この治療は、平均腫瘍体積（ｍＴＶ）が０．２５６ｃｍ３の時点で開始した。２１日目に、生理食塩水対照群（非処置群）のｍＴＶは０．８０１±０．１８１ｃｍ３であり、これは、９、６．７５、４．５、または２．２５ｍｇ／ｋｇ用量で処置し、ｍＴＶがそれぞれ０．２１１±０．０４２ｃｍ３、０．２３９±０．０．０５４ｃｍ３、０．２６４±０．０８７ｃｍ３、及び０．５６７±０．１７９ｃｍ３であったマウスよりも有意に大きかった（Ｐ＜０．００４７、片側ｔ検定）。これらから、最小有効量は２．２５ｍｇ／ｋｇであると推定され、最大耐量は９ｍｇ／ｋｇであった。
【０３９６】
［抗体‐Ｐ２ＰＤｏｘの最大耐量］―プロトタイプ抗体ｈＬＬ１の２‐ＰＤｏｘ及びＰ２ＰＤｏｘ複合体をマウスで比較した最大耐量試験は、Ｐ２ＰＤｏｘ複合体がはるかに強力であったことを示した（データは示さず）。単一の静脈内注射の最大耐量は１００〜３００μｇであった。次に、１回の注射当たり２５μｇ〜１５０μｇのタンパク質用量を用いて、４日に１回のスケジュールで合計４回の注射（ｑ４ｄｘ４）を行う複数回注射の最大耐量を決定した。これらの用量では、１００〜６００μｇの累積用量を動物に投与した。以下の表１７は、様々な群についてまとめたものである。
【表１７】
2018520140.tif 000029
【０３９７】
２５μｇのＰ２ＰＤｏｘ‐ＡＤＣで処置したマウスのみが継続して毒性の徴候を示さない（データは示さず）。これは１００μｇの累積投与量であり、単回注射として投与した場合に忍容された用量であった（データは示さず）。したがって、マウスにおけるＰ２ＰＤｏｘ‐ＡＤＣの複数回注射の最大耐量は、この実験からは２５μｇ  ｑ４ｄｘ４である。データのより詳細な分析及び反復実験により、４日に１回×２週間（４５μｇ、ｑ４ｄｘ４スケジュール）投与した分割投与の最大耐量は、複合体のタンパク質用量で４５μｇと確定した。
【０３９８】
［結合試験］―非複合体化ｈＲＳ７と抗体あたり６分子のＰ２ＰＤｏｘに複合体化したＰ２ＰＤｏｘ‐ｈＲＳ７との間で、ＮＣＩ‐Ｎ８７胃癌細胞への抗体部分の結合に有意差は観察されなかった（データは示さず）。Ｐ２ＰＤｏｘ‐ｈＭＮ‐１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｐ２ＰＤｏｘ‐ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）及びＰ２ＰＤｏｘ‐ｈＭＮ‐２４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）複合体について、標的抗原への抗体結合に及ぼす複合体化の効果がないことを確認した。抗体へのＰ２ＰＤｏｘの複合体化は、抗体‐抗原結合活性に影響を及ぼさないと結論される。
【０３９９】
［細胞傷害性試験］―標的細胞へのＰ２ＰＤｏｘ‐ｍＡｂ複合体の細胞傷害性を調べた。ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘ及びｈＭＮ‐１５‐Ｐ２ＰＤｏｘは、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８、ＡＧ  Ｓ、ＮＣＩ‐Ｎ８７及びＣａｐａｎ‐１固形腫瘍細胞株に対して細胞傷害性であった（データは示さず）。ｈＭＮ‐１４‐Ｐ２ＰＤｏｘは、Ｃａｐａｎ‐１、ＢｘＰＣ‐３及びＡｓＰＣ‐１ヒト膵臓腫瘍株及びＡＧＳ、ＮＣＩ‐Ｎ８７及びＬＳ１４７Ｔヒト胃及び結腸腫瘍株に対して細胞傷害性であった（データは示さず）。ｈＬＬ２‐Ｐ２ＰＤｏｘは、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ及びＪＶＭ‐３造血腫瘍株に対して細胞傷害性であった（データは示さず）。複合体のＩＣ５０値はナノモル濃度範囲であった（データは示さず）。
【０４００】
実施例３５．さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＮＣＩ‐Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片（データは示さず）を移植したヌードマウスでさらなるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験を行った。４×４５μｇのｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘを用いた１回の治療サイクルで、すべての腫瘍が急速に退行した（データは示さず）。第二の治療サイクルは、第一のサイクルが終了してから２か月後に開始し、ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘで治療した動物のうち、１匹を除いたすべてで、完全な退縮を生じた。ｈＡ２０、ｈＬＬ１及びｈＭＮ‐１４複合体は、腫瘍の進行にほとんど影響を与えなかった（データは示さず）。Ｐ２ＰＤｏｘ‐ｈＭＮ‐１５の投与は、胃癌の退行を遅延させ、これはｈＲＳ７複合体よりも効果が低かった。
【０４０１】
投与スケジュールを変化させた場合の抗腫瘍効力に対する影響を調べた（データは示さず）。腫瘍を移植してから９日後、すべての群の平均腫瘍体積が０．３８３ｃｍ３の時点で、実験を開始し、９３日目（治療開始から８４日目）に終了した。この試験では、１８０μｇの単回投与、９０μｇの週１回×２回の投与、及び４５μｇのｑ４ｄｘ４のすべてで、有意に生存率が高まった（データは示さず）。生理食塩水対照については、生存したマウスは９匹中０匹であった（データは示さず）。ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘを４５μｇ  ｑ４ｄｘ４で投与したマウスでは、９４日目の時点で９匹中８匹のマウスが生存していた（データは示さず）。ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘを９０μｇで週１回×２回投与したマウスでは、９４日目に時点で９匹中９匹のマウスが生存していた（データは示さず）。ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘを１８０μｇで単回投与したマウスでは、９４日目に時点で９匹中８匹のマウスが生存していた（データは示さず）。同じ投薬スケジュールでは、対照ｈＡ２０複合体は生存率に影響を与えなかった（データは示さず）。毒性試験は、ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘの３つの投薬スケジュールがもたらす毒性が、同程度に低レベルであったことを示した（データは示さず）。
【０４０２】
ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘ複合体は、Ｃａｐａｎ‐１膵臓癌においても有効であり（データは示さず）、腫瘍増殖を阻害する上でｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８複合体よりも、より有効であった（データは示さず）。ｈＰＡＭ４‐Ｐ２ＰＤｏｘ複合体はまた、Ｃａｐａｎ‐１ヒト膵臓癌の増殖を阻害する上でｈＰＡＭ４‐ＳＮ‐３８複合体よりも、より有効であった（データは示さず）。Ｃａｐａｎ‐１腫瘍注射の６３日後（接種から１日後に治療を開始）、生理食塩水対照では１０匹中０匹のマウスが生存し、４５μｇのｈＰＡＭ４‐Ｐ２ＰＤｏｘを週２回×２週間処置したマウスでは、１０匹中１０匹のマウスが生存し、４５μｇのｈＡ２０‐Ｐ２ＰＤｏｘを週２回×２週間処置したマウスでは１０匹中２匹が生存し、２５０μｇのｈＰＡＭ４‐ＳＮ‐３８を週２回×４週間処置したマウスでは１０匹中０匹のマウスが生存し、２５０μｇのｈ２０‐ＳＮ‐３８を週２回×４週間処置したマウスでは１０匹中０匹が生存していた。
【０４０３】
ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘは、ＰｘＰＣ‐３膵臓癌の増殖阻害においてｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８よりも実質的により有効であり（データは示さず）、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８乳癌の増殖阻害においてｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８よりもわずかに有効であった（データは示さず）。
【０４０４】
ｈＲＳ７‐Ｐ２ＰＤｏｘの異なる単回用量が、ＮＣＩ‐Ｎ８７胃癌異種移植片の増殖に対して与える効果を試験した。９０μｇ以上の単回用量を用いた場合に、腫瘍増殖に対する最大の効果が観察された（データは示さず）。生理食塩水対照（データは示さず）に比べて有意な延命効果が認められるのに最低限必要な単回用量は、４５μｇであった。
【０４０５】
様々なｈＲＳ７‐ＡＤＣ複合体のＡＤＣＣ活性をｈＲＳ７  ＩｇＧ（データは示さず）と比較して測定した。ニュージャージー血液センターから購入した血液からＰＢＭＣを精製した。エフェクター対標的比が１００：１の標的細胞株としてＴｒｏｐ‐２陽性ヒト膵臓腺癌細胞株（ＢｘＰＣ‐３）を用いた。ｈＲＳ７  ＩｇＧを介したＡＤＣＣをｈＲＳ７‐Ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘ、ｈＲＳ７‐ＣＬ２Ａ‐ＳＮ‐３８、及び還元してキャップしたｈＲＳ７‐ＮＥＭと比較した。いずれも３３．３ｎＭで使用した。全般的な活性は低かったが、有意なものであった（データは示さず）。ｈＲＳ７  ＩｇＧについては８．５％の特異的溶解が認められ、これはｈＲＳ７‐Ｐｒｏ‐２‐ＰＤｏｘと有意に異なるものではなかった。両者とも、ｈＬＬ２対照及びｈＲＳ７‐ＮＥＭ及びｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８より有意に良好であった（Ｐ＜０．０２、両側ｔ検定）。ｈＲＳ７‐ＮＥＭとｈＲＳ７‐ＳＮ‐３８との間に差はなかった。
【０４０６】
実施例３６．抗ＣＤ２２  Ｐ２ＰＤｏｘ‐エプラツズマブ＋オラパリブによる非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療
Ｐ２ＰＤｏｘ‐エプラツズマブ  ＡＤＣを、上記のように調製する。これまで未治療の、または再発ＮＨＬを有する１７人の患者に、７０、１００、または１５０ｍｇのＰ２ＰＤｏｘ‐エプラツズマブを４回にわたって２８日サイクルの１及び１４日目に静脈内投与した。オラパリブを１日２００ｍｇ、サイクルの１〜７及び１４〜２１日目に投与する。有害事象、Ｂ細胞の血中濃度、血清中のエプラツズマブ濃度及びヒト抗エプラツズマブ（ＨＡＨＡ）力価を含む他の評価とともに、ＣＴスキャンによって奏効を評価する。
【０４０７】
軽度から中等度の一時的な急性輸液反応のみが認められ、最大で悪性度３の好中球減少症以外の安全性の問題は認められない（しかし、治療を中断してから悪性度１に低下するまで可逆性が認められる）。Ｐ２ＰＤｏｘ‐エプラツズマブとオラパリブの併用におけるすべての投与量レベルで、一過性のＢ細胞枯渇（最大約２５％）が観察される。客観的な奏効率（部分奏効＋完全奏効＋不確定完全奏効）は４７％（８／１７）であり、完全奏効／不確定完全奏効率は２４％（４／１７）である。８つの客観的奏効のうち４つは３０週間以上続く。客観的奏効は、Ｐ２ＰＤｏｘ‐エプラツズマブ＋オラパリブのすべての用量レベルで観察される。ヒト抗エプラツズマブ抗体（ＨＡＨＡ）について評価したすべての血清試料は陰性である。
【０４０８】
実施例３７．Ｐ２ＰＤｏｘ‐ｈＲＳ７＋パクリタキセルによる三種陰性乳癌の治療
抗Ｔｒｏｐ‐２  Ｐ２ＰＤｏｘ‐ｈＲＳ７  ＡＤＣを上記のように調製する。少なくとも２つの標準的な療法で成果がなかった三種陰性乳癌患者に、２１日サイクルの１日目に７０ｍｇのＰ２ＰＤｏｘ‐ｈＲＳ７を静脈内注射し、サイクルの１、７及び１４日目にパクリタキセルを１７５ｍｇ／ｍ２で投与する。３サイクル後、客観的奏効が観察され、そこでの腫瘍体積の平均減少は３５％である。ヒト抗ｈＲＳ７抗体（ＨＡＨＡ）について評価したすべての血清試料は陰性である。
【０４０９】
実施例３８．Ｐ２ＰＤｏｘ‐ｈＭＮ‐１４＋オラパリブによる転移性結腸癌の治療
左右の肝臓葉に転移性結腸癌（直径３〜５ｃｍ）、右肺に５ｃｍの転移、及び１３０ｎｇ／ｍｌの上昇した血中ＣＥＡ値を有する５２歳の男性を、抗ＣＥＡＣＡＭ５  ｈＭＮ‐１４‐Ｐ２ＰＤｏｘ＋オラパリブを併用して治療する。１５０ｍｇ用量のｈＭＮ‐１４‐Ｐ２ＰＤｏｘを、２８日サイクルの１及び１４日目に投与する。オラパリブは、サイクルの１〜１０日目に１日２回、２００ｍｇで投与する。２サイクル後に行うＣＴ評価では、３つの標的病変の合計平均直径が２５％減少していることを測定し、ＲＥＣＩＳＴ１．１基準による良好な安定した疾患の奏効を成す。同時に、患者の血液ＣＥＡ力価は３０ｎｇ／ｍＬに低下する。患者の好中球減少症が正常化するにつれて、治療コースの繰り返しを継続する。
【０４１０】
実施例３９．免疫複合体の保存
ＡＤＣ複合体を精製し、２‐（Ｎ‐モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６．５でバッファー交換し、さらにトレハロース（終濃度２５ｍＭ）及びポリソルベート８０（終濃度０．０１％ｖ／ｖ）で製剤化し、賦形剤添加の結果として緩衝液の終濃度は２２．２５ｍＭになる。製剤化した複合体を凍結乾燥し、密封バイアルに貯蔵し、２℃〜８℃で貯蔵する。凍結乾燥させた免疫複合体は、貯蔵条件下で安定であって、それらの生理活性を維持する。
【０４１１】
以上の説明から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、過度の実験を必要とせずに本発明の様々な変形及び改変を作製し、様々な使用及び条件に適合させることができる。本明細書中で引用するすべての特許、特許出願及び刊行物は、参照として本明細書に援用する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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