(57)【要約】  修飾リソソームタンパク質、修飾リソソームタンパク質を調製する方法、および斯かる修飾タンパク質の治療用途を本明細書中に開示する。リソソーム蓄積症に罹患している哺乳動物を治療する方法をさらに本明細書中に開示する。特に、本開示は、修飾リソソームタンパク質を調製する方法であって、グリコシル化リソソームタンパク質を過ヨウ素酸アルカリ金属塩と反応させ、そして、前記リソソームタンパク質を水素化ホウ素アルカリ金属塩と２時間以下反応させること、を含み、それによって、前記リソソームタンパク質のグリカン部分を修飾し、グリカン認識受容体に関して前記リソソームタンパク質の活性を低下させる前記方法に関する。
2018535654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾リソソームタンパク質を調製する方法であって、該方法が：
ａ）グリコシル化リソソームタンパク質を過ヨウ素酸アルカリ金属塩と４時間以下の期間にわたり反応させ、および
ｂ）前記リソソームタンパク質を水素化ホウ素アルカリ金属塩と２時間以下の期間にわたり反応させること、
を含み、
それによって、該リソソームタンパク質のグリカン部分を修飾し、グリカン認識受容体に関して該リソソームタンパク質の活性を低下させ、但し、前記タンパク質がスルファミダーゼでないことを条件とする、方法。
【請求項２】
ステップｂ）が、以下のｉ）〜ｉｖ）：
ｉ）前記水素化ホウ素アルカリ金属塩が水素化ホウ素ナトリウムである；
ｉｉ）前記水素化ホウ素が、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の３倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５〜４倍以下の濃度にて使用される；
ｉｉｉ）前記反応が、２時間以下、例えば１．５時間以下、例えば１時間以下、例えば０．７５時間以下、例えば約０．５時間の期間にわたりおこなわれる、および、
ｉｖ）前記反応が、０〜８℃の温度にておこなわれる、
のうちの少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、例えばそのすべてによってさらに特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）が、以下のｉ）〜ｖ）：
ｉ）前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩がメタ過ヨウ素酸ナトリウムである；
ｉｉ）前記過ヨウ素酸塩が、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの濃度にて使用される；
ｉｉｉ）前記反応が、０〜２２℃の温度、例えば０〜８℃の温度、例えば０〜４℃の温度、例えば約８℃、例えば約０℃にておこなわれる；
ｉｖ）前記反応が、３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間の期間にわたりおこなわれる；および、
ｖ）前記ステップａ）の反応が、３〜７のｐＨにておこなわれる、
のうちの少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば少なくともすべてによってさらに特徴づけられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）が３時間以下の期間にわたりおこなわれ、およびステップｂ）が１時間以下にわたりおこなわれ、そして、前記水素化ホウ素が、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下の濃度にて任意に使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）およびステップｂ）を、透析、限外濾過、沈殿または緩衝液の交換をおこなうことなく、順におこなわれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
修飾リソソームタンパク質を調製する方法であって、該方法が：
ａ）グリコシル化リソソームタンパク質を過ヨウ素酸アルカリ金属塩と４時間以下の期間にわたり反応させ、および
ｂ）前記リソソームタンパク質を水素化ホウ素アルカリ金属塩と２時間以下の期間にわたり反応させること、
を含み；
それによって、該リソソームタンパク質のグリカン部分を修飾し、グリカン認識受容体に関して該リソソームタンパク質の活性を低下させ、ここで、前記リソソームタンパク質の活性部位または機能的エピトープを、ステップａ）およびｂ）の少なくとも一方の間、酸化および／または還元反応に利用不可能にする、方法。
【請求項７】
ステップｂ）が、以下のｉ）〜ｉｖ）：
ｉ）前記水素化ホウ素アルカリ金属塩が水素化ホウ素ナトリウムである；
ｉｉ）前記水素化ホウ素が、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の３倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５〜４倍以下の濃度にて使用される；
ｉｉｉ）前記反応が、２時間以下、例えば１．５時間以下、例えば１時間以下、例えば０．７５時間以下、例えば約０．５時間の期間にわたりおこなわれる；および、
ｉｖ）前記反応が、０〜８℃の温度にておこなわれる、
のうちの少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、例えばそのすべてによってさらに特徴づけられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップａ）が、以下のｉ）〜ｖ）：
ｉ）前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩がメタ過ヨウ素酸ナトリウムである；
ｉｉ）前記過ヨウ素酸塩が、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの濃度にて使用される；
ｉｉｉ）前記反応が、０〜２２℃の温度、例えば０〜８℃の温度、例えば０〜４℃の温度、例えば約８℃、例えば約０℃にておこなわれる；
ｉｖ）前記反応が、３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間の期間にわたりおこなわれる；および、
ｖ）前記ステップａ）の反応が、３〜７のｐＨにておこなわれる、
のうちの少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば少なくともすべてによってさらに特徴づけられる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）が３時間以下の期間にわたりおこなわれ、およびステップｂ）が１時間以下にわたりおこなわれ、そして、前記水素化ホウ素が、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下の濃度にて任意に使用される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）およびステップｂ）を、透析、限外濾過、沈殿または緩衝液の交換をおこなうことなく、順におこなわれる、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾リソソームタンパク質が、スルファターゼ；グリコシドヒドロラーゼ、またはプロテアーゼである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リソソームタンパク質が、デオキシリボヌクレアーゼ−２−α；β−マンノシダーゼ；リボヌクレアーゼＴ２；リソソームα−マンノシダーゼ；α−Ｌ−イズロニダーゼ；トリペプチジル−ペプチダーゼ１；ヒアルロニダーゼ−３；カテプシンＬ２；セロイド−リポフスチノーシスニューロンタンパク質５；グルコシルセラミダーゼ；組織α−Ｌ−フコシダーゼ；ミエロペルオキシダーゼ；α−ガラクトシダーゼＡ；β−ヘキソサミニダーゼサブユニットα；カテプシンＤ；プロサポシン；β−ヘキソサミニダーゼサブユニットβ；カテプシンＬ１；カテプシンＢ；β−グルクロニダーゼ；プロカテプシンＨ；カテプシンＨ；非分泌性リボヌクレアーゼ；リソソームα−グルコシダーゼ；リソソーム保護タンパク質；γ−インターフェロン誘導性リソソームチオールレダクターゼ；タルトラート−耐性酸性ホスファターゼ５型；アリールスルファターゼＡ；前立腺酸性ホスファターゼ；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ；アリールスルファターゼＢ；β−ガラクトシダーゼ；α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ；スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ；ガングリオシドＧＭ２アクチベーター；Ｎ（４）−（β−Ｎ−アセチルグルコサミニル）−Ｌ−アスパラギナーゼ；イズロン酸２−スルファターゼ；カテプシンＳ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ；リソソーム酸性リパーゼ／コレステリルエステルヒドロラーゼ；リソソームＰｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ；カテプシンＯ；カテプシンＫ；パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１；アリールスルファターゼＤ；ジペプチジルペプチダーゼ１；α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；ガラクトセレブロシダーゼ；精巣上体分泌タンパク質Ｅ１；ジ−Ｎ−アセチルキトビアーゼ；Ｎ−アシルエタノールアミン加水分解酸性アミダーゼ；ヒアルロニダーゼ−１；キトトリオシダーゼ−１；酸性セラミダーゼ；ホスホリパーゼＢ様１；前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型；ＸＶ型ホスホリパーゼＡ２；推定ホスホリパーゼＢ様２；デオキシリボヌクレアーゼ−２−β；γ−グルタミルヒドロラーゼ；アリールスルファターゼＧ；Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ； シアリダーゼ−１；レグミン；シアル酸Ｏ−アセチルエステラーゼ；胸腺特異的セリンプロテアーゼ；カテプシンＺ；カテプシンＦ；プレニルシステインオキシダーゼ１；ジペプチジルペプチダーゼ２；リソソームチオエステラーゼＰＰＴ２；ヘパラナーゼ；カルボキシペプチダーゼＱ；β−グルクロニダーゼ、およびスルファターゼ修飾因子１、から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法のステップａ）およびｂ）の少なくとも一方が、保護リガンドの存在下でおこなわれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法のステップａ）およびｂ）が、リソソームタンパク質を樹脂で固定したままおこなわれる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
リソソームタンパク質の未修飾形態と比較して、グリカン部分の５０％以下が未修飾のまま維持されていることを特徴とする、低い含量の未修飾グリカン部分を有する修飾リソソームタンパク質であって、それによって、グリカン認識受容体について低下した活性を有するが、但し、スルファミダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）またはα−Ｌ−イズロニダーゼでないことを条件とする、タンパク質。
【請求項１６】
前記タンパク質が、デオキシリボヌクレアーゼ−２−α；β−マンノシダーゼ；リボヌクレアーゼＴ２；リソソームα−マンノシダーゼ；ヒアルロニダーゼ−３；カテプシンＬ２；セロイド−リポフスチノーシスニューロンタンパク質５；グルコシルセラミダーゼ；組織α−Ｌ−フコシダーゼ；ミエロペルオキシダーゼ；α−ガラクトシダーゼＡ；β−ヘキソサミニダーゼサブユニットα；カテプシンＤ；プロサポシン；β−ヘキソサミニダーゼサブユニットβ；カテプシンＬ１；カテプシンＢ；プロカテプシンＨ；カテプシンＨ；非分泌性リボヌクレアーゼ；リソソームα−グルコシダーゼ；リソソーム保護タンパク質；γ−インターフェロン誘導性リソソームチオールレダクターゼ；タルトラート−耐性酸性ホスファターゼ５型；アリールスルファターゼＡ；前立腺酸性ホスファターゼ；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ；アリールスルファターゼＢ；β−ガラクトシダーゼ；α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ；スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ；ガングリオシドＧＭ２アクチベーター；Ｎ（４）−（β−Ｎ−アセチルグルコサミニル）−Ｌ−アスパラギナーゼ；イズロン酸２−スルファターゼ；カテプシンＳ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ；リソソーム酸性リパーゼ／コレステリルエステルヒドロラーゼ；リソソームＰｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ；カテプシンＯ；カテプシンＫ；パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１；アリールスルファターゼＤ；ジペプチジルペプチダーゼ１；α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；ガラクトセレブロシダーゼ；精巣上体分泌タンパク質Ｅ１；ジ−Ｎ−アセチルキトビアーゼ；Ｎ−アシルエタノールアミン加水分解酸性アミダーゼ；ヒアルロニダーゼ−１；キトトリオシダーゼ−１；酸性セラミダーゼ；ホスホリパーゼＢ様１；前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型；ＸＶ型ホスホリパーゼＡ２；推定ホスホリパーゼＢ様２；デオキシリボヌクレアーゼ−２−β；γ−グルタミルヒドロラーゼ；アリールスルファターゼＧ；Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ； シアリダーゼ−１；レグミン；シアル酸Ｏ−アセチルエステラーゼ；胸腺特異的セリンプロテアーゼ；カテプシンＺ；カテプシンＦ；プレニルシステインオキシダーゼ１；ジペプチジルペプチダーゼ２；リソソームチオエステラーゼＰＰＴ２；ヘパラナーゼ；カルボキシペプチダーゼＱ、およびスルファターゼ修飾因子１、から選択される、請求項１５に記載の修飾リソソームタンパク質。
【請求項１７】
リソソームタンパク質の未修飾形態と比較して、未修飾グリカン部分の４５％以下が未修飾を維持し、例えば４０％以下、３５％以下、３０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下のグリカン認識受容体のエピトープが、リソソームタンパク質の未修飾形態から維持される、請求項１５または１６に記載の修飾リソソームタンパク質。
【請求項１８】
前記リソソームタンパク質の未修飾グリカン部分が、単結合切断および二重結合切断によって破壊され、単結合切断の程度が、オリゴマンノースグリカンにおいて少なくとも６０％である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の修飾リソソームタンパク質。
【請求項１９】
前記未修飾グリカン部分が、少なくとも１個の前記修飾リソソームタンパク質のＮ−グリコシル化部位を欠き、例えば、前記リソソームタンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２、少なくとも１３個を欠き、好ましくは前記エピトープがすべてのＮ−グリコシル化部位を欠く、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の修飾リソソームタンパク質。
【請求項２０】
前記リソソームタンパク質が、対応する未修飾リソソームタンパク質の触媒活性の少なくとも５０％の触媒活性を維持した、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の修飾リソソームタンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって取得可能な修飾リソソームタンパク質（但し、当該タンパク質はスルファミダーゼでない）。
【請求項２２】
治療法に使用するための、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の修飾リソソームタンパク質。
【請求項２３】
リソソーム蓄積症に罹患している哺乳動物の治療に使用するための、請求項２２に記載の修飾リソソームタンパク質。
【請求項２４】
リソソーム蓄積症に罹患している哺乳動物を治療する方法であって、治療的有効量の、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の修飾リソソームタンパク質を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示は、修飾リソソームタンパク質、修飾リソソームタンパク質を含む組成物、および修飾リソソームタンパク質を調製する方法に関する。さらに、リソソーム蓄積症の処置のような治療における修飾リソソームタンパク質の使用が開示される。
【背景技術】
【０００２】
背景
リソソーム蓄積症
リソソーム画分は、細胞内の廃棄物を分解する異化機構として機能する。分解は、リソソームに特異的に区画されたいくつかの加水分解酵素および輸送体によって達成される。今日、リソソームタンパク質をコードする遺伝子における突然変異と疾患との間に関連性が確立されている遺伝性疾患が４０以上同定されている。これらの疾患は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）と定義され、不十分な分解能力により分解することができない代謝産物（または代謝産物（複数））を蓄積することを特徴とする。代謝産物の過剰なリソソーム蓄積の結果として、リソソームはサイズが増加する。蓄積された蓄積物質がどのように病理を引き起こすかについては完全には理解されていないが、オートファジーの阻害および細胞アポトーシスの誘導などの機構を含む可能性がある（Cox&Cachon-Gonzalez、J Pathol 226:241-254(2012)）。
【０００３】
酵素／タンパク質補充療法
変異したかまたは失われたタンパク質によって引き起こされる失われた機能は、異種起源からのタンパク質を用いた投与および変異した／失われたタンパク質の置き換えによって復元され得る。これは、さまざまな疾患分野について示された。血友病の分野の中で、凝固経路における活性化複合体の一部である、例えばＩＸ因子や因子ＶＩＩなどの酵素と、例えばＶＩＩＩ因子などのタンパク質の両方の投与が、首尾よく利用された。これらの成分はもちろん、血液中に存在し、従って、その作用部位にタンパク質を投与することが簡単である。
【０００４】
リソソーム蓄積症の分野では、蓄積は、異種の供給源からのリソソーム酵素の投与によって減少させることができる。リソソーム酵素の静脈内投与は、受容体媒介エンドサイトーシスと呼ばれる機構を介した、細胞による迅速な取り込みをもたらすことが十分に確立されている。このエンドサイトーシスは、細胞表面上の受容体が媒介しており、特に、２つのマンノース−６リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）は、特定のリソソーム酵素の取り込みに重要であることが示されている（Neufeld;Birth Defects Orig 16:77-84(1980)）。Ｍ６ＰＲは、リソソームタンパク質に特徴的なリン酸化オリゴマンノースグリカンを認識する。
【０００５】
受容体媒介エンドサイトーシスの原理に基づいて、７つのＬＳＤに対し酵素置換療法（ＥＲＴ）が今日利用可能である（ゴーシェ、ファブリー、ポンペ、ならびにムコ多糖症Ｉ、ＩＩ、ＩＶＡおよびＶＩ）。これらの療法は、様々な末梢器官におけるリソソーム蓄積を減少させるのに有効であり、それによって病理に関連するいくつかの症状を改善する。
【０００６】
Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）およびＡｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）は、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ、ＭＰＳＩＩ）を患っている患者およびハーラー／シャイエ症候群（ムコ多糖症Ｉ、ＭＰＳ−Ｉ）を患っている患者の非神経症状の長期治療に適応されるオーファン医薬品の例である。両方の酵素は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）デルマタン硫酸とヘパラン硫酸の両方の加水分解によってリソソーム蓄積を低減するように実質的に機能する。この酵素結果の活性の低減または欠如は、これらのＧＡＧの細胞内蓄積をもたらし、そしてそれが、多臓器および組織障害を伴った進行性かつ臨床的に異種の疾患の原因となる。
【０００７】
しかしながら、ＬＳＤの大部分は中枢神経系（ＣＮＳ）においてリソソーム蓄積の増大を引き起こし、結果としてＣＮＳ関連の徴候および症状のレパートリーを提示する。静脈内投与されたＥＲＴの主な欠点は、ＣＮＳへの不良分布である。ＣＮＳは、ＣＮＳ血管内皮によって形成された血液脳関門（ＢＢＢ）によって、血液を介する化合物への暴露から保護される。傍細胞の通過を妨げるタイトジャンクションを示すＢＢＢの内皮細胞は、制限した受動的エンドサイトーシスを示し、さらに、他の組織に見られるいくつかの受容体媒介トランスサイトーシス能力を欠く。特に、マウスにおいて、ＢＢＢを通過するＭ６ＰＲ媒介輸送は、出生後２週間までしか観察されない（Urayama et al,Mol Ther 16:1261-1266(2008)）。
【０００８】
ＬＳＤの神経学的な要素に加えて、末梢病変もまた、ある程度、現在の酵素置換療法において準最適に対処される。患者は、重篤な運動の制限をもたらす関節痛および凝りという形で臨床的に表される関節症に罹患していることが多い。そのうえ、胸郭における進行性の変化は、呼吸制限を引き起こしかねない。
そのうえ、心臓の壁と併せて心臓弁の硬化につながる蓄積の蔓延は、心臓機能の進行性の低下をもたらす可能性がある。また、肺機能は、酵素置換療法にもかかわらず、さらに退縮し得る。
【０００９】
リソソーム（lysomal）酵素のグリコシル化
一般に、Ｎ−グリコシル化は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列モチーフで起こり得る。このモチーフに対して、Ｎ−グリカンの最初のコア構造は、グリコシルトランスフェラーゼオリゴサッカリルトランスフェラーゼによって、網状管腔内（reticular lumen）に転移される。すべてのＮ−結合型グリカンのこの共通基盤は１４残基;３グルコース、９マンノース、および２Ｎ−アセチルグルコサミン、から構成されている。この前駆体は、次に、初期コアをトリミングして新しい糖部分を追加する多数の酵素の作用により、３つの一般的なタイプのＮ−グリカン；オリゴマンノース、複合体およびハイブリッド（図７）へと変換される。各成熟Ｎ−グリカンは、Ａｓｎがタンパク質への結合点を表す、共通のコア、Ｍａｎ（Ｍａｎ）２−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎを含んでいる。酵母では、オリゴマンノースグリカンは、図７でさらに右側に示した反復様式で最大２００個のマンノース残基を含むように伸長され得る（Dean, Biochimica et Biophysica Acta 1426:309-322 (1999)）。
【００１０】
さらに、リソソームを指向するタンパク質は、リン酸化された１つ以上のＮ−グリカンを保持する。リン酸化はゴルジ体で起こり、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンのマンノース残基のＣ−６にＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の付加によって開始される。Ｎ−アセチルグルコサミンは、Ｍ６ＰＲによって認識され、リソソームタンパク質のリソソームへの輸送を開始するマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を生成するように切断される。次いで、得られたＮ−グリカンを、Ｍ６ＰがＮ−グリカン鎖の末端基であるポイントまでトリミングする（Essentials of Glycobiology. 2nd edition.Varki A,Cummings RD,Esko JD,et al,editors.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press;2009)）。
【００１１】
糖部分およびリン酸基の両方が受容体への結合に関与するので、Ｍ６ＰＲの結合部位は、完全な末端Ｍ６Ｐ基を必要とする（Kim et al,Curr Opin Struct Biol 19:534-42(2009)）。
【００１２】
グリカン修飾による脳を標的とする酵素補充療法
リソソーム酵素のＣＮＳへの分布を増加させる潜在的な戦略は、ＷＯ２００８／１０９６７７に開示されている。これらの公開された出願では、メタ過ヨウ素酸ナトリウムおよび水素化ホウ素ナトリウムを使用するβ−グルクロニダーゼの化学修飾が記載されている（Grubb et al,Proc Natl Acad Sci USA 105:2616-2621(2008)も参照のこと）。２０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムによる６．５時間の酸化、その後のクエンチング、透析および１００ｍＭの水素化ホウ素ナトリウムでの一晩の還元（以後、既知の方法と呼ぶ）からなるこの修飾は、β−グルクロニダーゼのＣＮＳ分布を実質的に改善し、ＬＳＤムコ多糖症ＶＩＩのマウスモデルにおける神経記憶のクリアランスをもたらす。脳の分布の根底にあるメカニズムは不明であるが、化学修飾がβ−グルクロニダーゼ上のグリカン構造を破壊することに注目し、Ｍ６ＰＲによる受容体媒介エンドサイトーシスが著しく減少することがさらに証明された。
【００１３】
化学修飾戦略は、他のリソソーム酵素についても研究されている。例えば、既知の方法による修飾は、静脈内投与されたプロテアーゼトリペプチジルペプチダーゼＩの脳への分布を改善しなかった（Meng et al, PLoS One (2012)）。スルファターゼについても満足のいく結果は実証されていない。既知の方法に従って化学的に修飾されたスルファターゼは、実際にはマウスで半減期の増加を示したが、ＭＰＳ ＩＩＩＩＡマウスの脳では効果を示さなかった。化学的に修飾されたスルファターゼは、静脈内投与によって繰り返し投与された場合、脳実質には分布しなかった（Rozaklis et al,Exp Neurol 230:123-130(2011)）。
【００１４】
従って、神経学的に関与があるＬＳＤの治療に有効なＥＲＴが依然として必要とされている。機能的に活性を維持したまま、ＢＢＢを通過して輸送することができる新規タンパク質は、ＣＮＳ関連病理を有するＬＳＤを治療するための酵素／タンパク質補充療法用の全身投与に好適な化合物の開発において多大な価値がある。
【発明の概要】
【００１５】
発明の開示
本発明の目的は、異なるＬＳＤのための酵素補充療法の開発を可能にする新規な修飾リソソームタンパク質を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、哺乳動物の血液脳関門を通過して輸送され得、新規な修飾リソソームタンパク質を提供することである。加えて、前記タンパク質は、哺乳動物の脳において、例えば酵素的（触媒的）活性などの、前記哺乳動物の脳における生物学的活性を有利なことに有するであろう。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、特に、ＬＳＤの末梢病変に関与する末梢組織において触媒活性を有する新規な修飾リソソームタンパク質を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、従来技術の方法に従って修飾されたリソソームタンパク質と比較して、改善された構造的完全性などの改善された品質および安定性を示す新規な修飾リソソームタンパク質を提供することである。
【００１８】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、実施例４に開示される発明者によって開発された化学修飾方法と、ＷＯ２００８／１０９６７７に開示されている既知の方法との違いを概説する図である。
【図２Ａ】図２Ａは、スルファミダーゼ（レーン１）、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼ（レーン２）、イズロン酸２−スルファターゼ（レーン３）および既知の方法に従って修飾したされたイズロン酸２−スルファターゼ（レーン４）、α−Ｌ−イズロニダーゼ（レーン５）および既知の方法に従って修飾されたα−Ｌ−イズロニダーゼ（レーン６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに示す。スルファミダーゼのグリカン修飾手順によって生成された４つのタンパク質バンド（１〜４で示す）が同定された（レーン２）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、既知の方法に従って修飾された（レーン１、３、および５）、ならびに本明細書中に開示した新規方法に従って修飾された（レーン２、４、６、７、および８）スルファミダーゼ、イズロン酸２−スルファターゼ、およびα−Ｌ−イズロニダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼのＳＥＣクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本明細書に開示される新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼのＳＥＣクロマトグラムを示す。矢印によって示されているのは、修飾されたスルファミダーゼの多量体形態のピークである。
【図４Ａ】図４Ａは、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼの動的光散乱によって測定された散乱強度を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本明細書に記載の新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼの動的光散乱によって測定された散乱強度を示す。
【図５】図５は、未修飾組換えスルファミダーゼ、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼ、および本明細書に記載の新規方法１および４に従って修飾されたスルファミダーゼのＭＥＦ−１細胞における受容体媒介エンドサイトーシスを視覚化する図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＭＰＳ−ＩＩ欠損マウスのインビボ処置の結果を示す。この図は、新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼを３０ｍｇ／ｋｇで１日おきにｉ．ｖ．投与（１３回投与）した後のマウスの脳におけるヘパラン硫酸蓄積のクリアランスを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＭＰＳ−ＩＩ欠損マウスのインビボ処置の結果を示す。この図は、新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼを３０ｍｇ／ｋｇで１日おきにｉ．ｖ．投与（１３回投与）した後のマウスの脳におけるヘパラン硫酸蓄積のクリアランスを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＭＰＳ−ＩＩ欠損マウスのインビボ処置の結果を示す。この図は、新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼを３０ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇそれぞれを、毎週１回ｉ．ｖ．投与（１０回投与）した後のマウスの脳におけるヘパラン硫酸蓄積のクリアランスを示す。
【図７】図７は、哺乳類起源のタンパク質中に一般的に存在する３つの典型的なＮ−グリカン構造および酵母タンパク質中に存在する典型的なＮ−グリカンの概略図である。左のグリカンはオリゴマンノース型、左から二番目は複合型、および右から二番目はハイブリッド型を表す。いちばん右のものはポリマンノース型の酵母タンパク質である。図では、以下の化合物が示されている：黒塗りのダイヤモンドは、Ｎ−アセチルノイラミン酸に対応する；黒塗りの円はマンノースに対応する；四角はＮ−アセチルグルコサミンに対応する；黒塗りの三角はフコースに対応する；円はガラクトースに対応する。アスタリスクでマークされた糖部分は、本明細書に開示されている過ヨウ素酸／水素化ホウ素塩処理によって修飾され得る。
【図８Ａ】図８Ａは、化学修飾後のマンノースの予想される結合切断を示す概略図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｍａｎ−６グリカンのモデルを示す概略図である。過ヨウ素酸塩で酸化した場合に結合の切断に感受性を有する糖部分が示される。灰色の円はマンノースに対応し、黒い四角はＮ−アセチルグルコサミンに対応し、Ｔ１３はＮ−グリコシル化部位Ｎ（１３１）を含むスルファミダーゼ（配列番号４４）のトリプシンペプチドＮＩＴＲに対応する。
【図９】図９は、既知の方法に従って化学修飾する前（Ａ）および化学修飾後（Ｂ〜Ｄ）のＮ（１３１）に結合したＭａｎ−６グリカンを有するスルファミダーゼ（配列番号４４）のトリプシンペプチドＴ１３（Ｔ１３＋Ｍａｎ−６グリカン）に対応する二価荷電イオンの質量スペクトルを示す（Ｓ．＝単結合切断；Ｄ．＝二重結合切断；例えばＤ．ｘ３＝三重結合切断）。
【図１０Ａ】図１０Ａは、既知の方法（黒色バー）、新規方法１（黒色ドット）、新規方法３（白色）、および新規方法４（クロスチェッカー）に従ってスルファミダーゼ（配列番号４４）を化学修飾した後のトリプシンペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンの結合切断合の程度を視覚化する図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、既知の方法（黒色バー）、新規方法１（黒色ドット）、新規方法３（白色）、および新規方法４（クロスチェッカー）に従ってスルファミダーゼ（配列番号４４）を化学修飾した後のトリプシンペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンの単結合切断の相対的存在量を視覚化する図である。
【図１１】図１１は、イズロン酸２−スルファターゼ、ならびに新規方法１０および１１に従って修飾されたイズロン酸２−スルファターゼの活性を示す略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示から当業者には明らかであろうこれらの目的および他の目的は、添付の特許請求の範囲において定義され、本明細書に一般的に開示される本発明の異なる態様によって達成される。
【００２１】
本発明の一態様において、リソソームタンパク質の未修飾形態と比較して、５０％以下の未修飾グリカン部分が無傷のまま維持されていることを特徴とし、それによって、前記タンパク質がグリカン認識受容体について低下した活性を有するが、但し、前記タンパク質がスルファミダーゼでない、低い含量の未修飾グリカン部分を有する修飾リソソームタンパク質を提供する。一実施形態において、前記タンパク質はβ−グルクロニダーゼでない。別の実施形態において、前記タンパク質はトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）でない。別の実施形態において、前記タンパク質はα−Ｌ−イズロニダーゼでない。
【００２２】
グリカン認識受容体とは、主としてリソソームタンパク質のグリカン部分を介してリソソームタンパク質を認識して結合する受容体を意味する。そのような受容体は、マンノース６−リン酸受容体に加えて、マンノース受容体によって例示され得；グリカンが露出した末端マンノース残基を示すタンパク質に選択的に結合する。レクチンは、グリカン上の末端ガラクトース残基を認識するアシアロ糖タンパク質受容体１を認識する末端ガラクトースによって例示され得るグリカン認識受容体の別の大きなファミリーを構成する。
【００２３】
従って、本発明による修飾リソソームタンパク質は、天然グリカン部分を取り除くことで修飾される。特に、前記リソソームタンパク質は、グリカン認識受容体のエピトープをグリカン部分から取り除くことで修飾される。グリカン認識受容体のエピトープは、本明細書中では、斯かる受容体によって認識されるグリカン部分（の一部）を表すと理解されるべきであり、そして、Ｎ−グリカンの末端におけるマンノース、マンノース６ホスファート、ｎ−アセチルグルコサミンまたはガラクトース起源の糖部分として構造的に記載され得る。天然または未修飾グリカン部分の少なくとも部分的な欠損が、グリカン認識受容体に関する修飾リソソームタンパク質の活性を低減する。結果として、末梢組織における修飾リソソームタンパク質の受容体媒介エンドサイトーシスが低減され、そしてそのことは、それが、例えば哺乳動物に静脈内投与されたとき、血漿からの修飾タンパク質の低減されたクリアランスを順にもたらし得る。添付の実施例において、特定の代表的なリソソームタンパク質について実証されるように、本明細書中に記載した修飾リソソームタンパク質は、例えば２つのマンノース−６−リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）などのグリカン認識受容体のエピトープの除去の結果である細胞取り込む傾向が少ない（実施例５および６参照）。
【００２４】
投薬予測から、修飾リソソームタンパク質の低減されたクリアランスは、有利なことに、より低い頻繁で患者に投与され得る長時間作用する薬物の開発を可能にする。加えて、前記タンパク質の修飾はまた、ＣＮＳへの修飾リソソームタンパク質の分布を可能にし得る。本明細書中に記載した修飾タンパク質は、血液脳関門を通じて、それが生物学的活性を有する哺乳動物の脳の中に輸送され得る。修飾タンパク質のこの有利な特性は、複数のＬＳＤの臨床成果を潜在的に改善し得る。
【００２５】
一実施形態において、リソソームタンパク質の未修飾形態と比較して、未修飾グリカン部分の４５％以下、例えば４０％以下、３５％以下、３０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下のグリカン部分が、リソソームタンパク質の未修飾形態から維持される。従って、いくつかの実施形態において、修飾リソソームタンパク質は、無傷の天然または未修飾グリカン部分を実質的に含まないので、結果的にグリカン認識受容体のエピトープを実質的に含まない。これは、グリカン認識エピトープのほとんど完全な不存在と理解され得る。好ましい実施形態において、修飾リソソームタンパク質は、（検出可能な）グリカン認識受容体のエピトープを含まない。場合によっては、前記エピトープのほとんど完全な不存在は、グリカン認識受容体に関して修飾タンパク質の活性をさらに低減し、そして、血漿半減期を延長するだろう。これはおそらく、（実施例５の細胞取り込み調査で実証されるように）タンパク質の化学修飾後の末梢組織における受容体媒介性取り込みの阻害に少なくとも一部に起因するである。
【００２６】
特に、修飾リソソームタンパク質は、エンドサイトーシスＭ６ＰＲタイプ１および２、マンノース受容体、ｎ−アセチルグルコサミン結合レクチンおよびガラクトース受容体それぞれのエピトープを構成する（検出可能な）マンノース−６−リン酸部分、マンノース部分、Ｎ−アセチルグルコサミン部分またはガラクトース部分を含まない。先に規定されたとおり、天然または未修飾グリカン部分で見出された前記エピトープは、マンノース−６−リン酸部分、マンノース部分、ｎ−アセチルグルコサミン部分、およびガラクトース部分から選択され得る。特定の実施形態において、これらは、本明細書中に開示される修飾リソソームタンパク質には存在しない。
【００２７】
修飾リソソームタンパク質の前記天然グリカン部分は、先に説明されるように、修飾リソソームタンパク質で少なくとも部分的に欠如していてもよい。この不存在は、前記修飾リソソームタンパク質の天然グリカン部分の中の、単結合の切断や二重結合の切断から成る破壊に相当し得る。単結合切断によるグリカン破壊は、一般的に優位になり得る。特に、前記リソソームタンパク質の天然グリカン部分は、単結合切断および二重結合切断によって破壊され得、ここで、該単結合切断の程度は、オリゴマンノースグリカンにおいて少なくとも６０％であり得る。特に、単結合切断の程度は、オリゴマンノース型のグリカンの少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８５％であり得る。単結合切断対二重結合切断の程度は、代表的なタンパク質（スルファミダーゼ）に関する実施例１０および１１において記載されるように決定され得る。
【００２８】
一実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質は、対応する未修飾リソソームタンパク質のそれの９５％超の分子量、例えば対応する未修飾リソソームタンパク質のそれの９６％超、例えば対応する未修飾リソソームタンパク質のそれの９７％超、例えば対応する未修飾リソソームタンパク質のそれの９８％超、例えば対応する未修飾リソソームタンパク質のそれの９９％超を有する。添付の実施例４では、本発明による修飾リソソームタンパク質の具体例は、（図８Ａに示される）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では対応する未修飾リソソームタンパク質と区別できず、主に単結合の切断が示唆された。添付の実施例２では、既知の方法により修飾したリソソームタンパク質は、（図８Ａに示される）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では対応する未修飾リソソームタンパク質より小さく、より高い程度の二重結合の切断が示唆された。
【００２９】
本明細書中に開示した態様の一実施形態において、前記グリカン部分は、少なくとも１個の前記修飾リソソームタンパク質のＮ−グリコシル化部位を欠き、例えば、前記リソソームタンパク質のＮ−グリコシル化部位の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２、少なくとも１３個を欠き、好ましくは、前記グリカン部分はすべてのＮ−グリコシル化部位を欠く。例えば、これは、２つのＮ−グリコシル化部位を有するリソソームタンパク質に関して、その２つの部位のうちの少なくとも１つのは、無傷のまたは完全なグリカン部分を欠いていることを意味する。
【００３０】
本明細書中に開示した態様の一実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質は、非共有結合形態で提供される。有利なことには、前記リソソームタンパク質は、タンパク質の凝集を引き起こすことなく、および／またはより小さいペプチド断片へのタンパク質骨格の切断を引き起こすことなく、修飾された。
【００３１】
一実施形態において、修飾リソソームタンパク質は、対応する未修飾リソソームタンパク質のそれの少なくとも５０％、例えば対応する未修飾リソソームタンパク質のそれの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の維持された触媒活性などの触媒活性を有する。触媒活性は、インビトロにおける触媒活性であっても、またはインビボにおける触媒活性であってもよい。インビトロにおいて触媒活性を計測するための方法、および少なくとも５０％の触媒活性を有する修飾リソソームタンパク質は、実施例１２で開示されている。
【００３２】
リソソームタンパク質は、静脈内注射によって投与されると、通常、循環から急速に取り除かれる。先に記載したように、細胞外区画からの細胞取り込みは、リソソームタンパク質の独特のマンノースやマンノース６−ホスファートの豊富なグリカンを認識する受容体によって容易にされる。従って、リソソームタンパク質の分布は、様々な細胞上のこれらの受容体の密度によって通常制御される。マンノース認識受容体が肝臓の組織定住マクロファージおよび類洞内皮細胞に大量に存在するのに対して、陽イオン非依存性マンノース−６−ホスファート受容体は、肝細胞に大量に存在する。それによって、静脈内によって投与された治療用酵素の用量の大半が、肝臓に分布する可能性があり、そしてそのことは、ほとんどの治療適用に関して準最適である。例えば、ファブリー病の治療として使用される２つの治療用α−ガラクトシダーゼＡ製剤は共に、マウスにおける単回投与後に肝臓に分布された用量の６０〜７０％を示す（Lee et al, Glycobiology 13: 305-313 (2003)）。対照的に、血液がそれほど十分に供給されていない、および／または少量の受容体しか有していない組織内の細胞は、これらの取り込み機構によって十分に標的化されない。グリカン依存性経路を介した急速な取り込みを予防することによって、循環からのクリアランスが顕著に低下し、そして、異なった分布プロファイルをもたらす他のより遅い工程が細胞内への取り込みを容易にする。これは、未修飾リソソーム酵素にわずかしか晒されない組織の細胞への治療用修飾リソソームタンパク質の分布を可能にし得る。特定の実施形態において、本明細書中に開示した修飾リソソームタンパク質は、静脈内注入によって投与されると、関節、結合組織、軟骨、および骨により良好な分布を提供し得る。また、骨格筋、心臓、および肺もより良好に標的化され得る。これらは、重篤な病理がリソソーム蓄積の結果として通常見られるすべての組織である。
【００３３】
一実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質は、哺乳動物に投与されると末梢組織に分布する。末梢組織の例は先に与えられている。そのうえ、前記リソソームタンパク質は、前記末梢組織において、例えば維持された酵素活性または触媒活性などの（維持された）生物学的活性を示し得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した態様による修飾リソソームタンパク質は、哺乳動物に投与されると脳に分布することができ、そして、前記哺乳動物の脳において、例えば維持された酵素活性または触媒活性などの（維持された）生物学的活性を示すこともある。一実施形態において、修飾リソソームタンパク質は脳において触媒活性を有する。
【００３５】
維持された生物学的活性とは、修飾リソソームタンパク質の生物学的活性が、未修飾形態のリソソームタンパク質から少なくとも一部が維持されていることを意味する。修飾によってリソソームタンパク質の活性が完全に失われないように、修飾は慎重に行われなければならない。修飾は、修飾タンパク質が不活性になるようなタンパク質の機能的エピトープまたは活性部位を変更はできない。従って、本明細書中に開示した修飾リソソームタンパク質は、例えばリソソーム蓄積、例えば脂質、ＧＡＧ、糖脂質、糖タンパク質、アミノ酸またはグリコーゲンのリソソーム蓄積、を減少させるなど、哺乳動物の脳、内臓または末梢組織においてリソソーム蓄積に影響を及ぼし得る。
【００３６】
修飾リソソームタンパク質が修飾スルファターゼである特定の実施形態において、維持された触媒活性は、例えば、スルファターゼの活性部位における触媒アミノ酸残基の保存対修飾のレベルに依存し得る。スルファターゼは、種々の基質からの硫酸エステル結合の加水分解を触媒する共通の進化的起源を有するタンパク質ファミリーである。従って、本明細書で使用する修飾スルファターゼの「触媒活性」は、好ましくは哺乳動物の脳における末梢組織のリソソームおよび／またはリソソームにおける、硫酸エステル結合の加水分解を指してもよい。従って、修飾スルファターゼの触媒活性は、リソソーム蓄積症に罹患している哺乳動物の脳における、ＧＡＧ、例えばデルマタン硫酸やヘパラン硫酸の蓄積などのリソソーム蓄積の減少をもたらし得る。触媒活性は、例えば、実施例７に記載されるように、動物モデルにおいて測定され得る。代表的なスルファターゼであるスルファミダーゼのグリカン修飾は、従来技術において開示された（Rozaklis et al、前掲）。しかしながら、スルファミダーゼを修飾するための既知の方法は、マウスの脳において触媒活性を欠いている修飾スルファミダーゼをもたらす。よって、このことは、触媒活性を危険にさらさないように酵素の修飾が慎重に実施されなければならないことを示している。スルファターゼの活性部位は、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に翻訳後修飾された、保存されたシステインを一般的に含む。この反応は、小胞体においてＦＧｌｙ生成酵素によって起こる。位置５９のこのＦＧｌｙ残基（ＦＧｌｙ５９）は、硫酸エステル結合の加水分解に直接関与しており、該修飾が活性化には必要であるようである。特に、アリールスルファターゼＡおよびＢ中の保存されたシステインからセリン（Ｓｅｒ）への変異は、ＦＧｌｙの形成を妨げ、不活性酵素を生じる（Recksiek et al, J Biol Chem 13;273(11):6096-103(1998)）。スルファターゼの活性部位の保存が本明細書中で議論されるとき、それは、前記スルファターゼにおける翻訳後ＦＧｌｙの保存として主に理解されるべきである。
【００３７】
一実施形態において、修飾リソソームタンパク質は、膜貫通ヘリックスを欠き、かつ、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するリソソームタンパク質である。斯かるリソソームタンパク質の例は、以下の表で列挙されている：
【００３８】
【表１−１】
2018535654.tif 000003
【表１−２】
2018535654.tif 000004
【表１−３】
2018535654.tif 000005
【表１−４】
2018535654.tif 000006
【表１−５】
2018535654.tif 000007
【表１−６】
2018535654.tif 000008
【表１−７】
2018535654.tif 000009
【００３９】
表Ｉには、多数のリソソームタンパク質が記載されている。一部のタンパク質は、以下の別名で知られているだろう。先に列挙したタンパク質はありとあらゆる代替名も包含することは理解されるべきである。一実施形態において、修飾リソソームタンパク質は、デオキシリボヌクレアーゼ−２−α；β−マンノシダーゼ；リボヌクレアーゼＴ２；リソソームα−マンノシダーゼ（Ｌａｍａｎ）；ペプチダーゼ−トリペプチジル１（ＴＰＰ−１）；ヒアルロニダーゼ−３（Ｈｙａｌ−３）；カテプシンＬ２；セロイド−リポフスチノーシスニューロンタンパク質５；グルコシルセラミダーゼ；組織α−Ｌ−フコシダーゼ；ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）；α−ガラクトシダーゼＡ；β−ヘキソサミニダーゼサブユニットα；カテプシンＤ；プロサポシン；β−ヘキソサミニダーゼサブユニットβ；カテプシンＬ１；カテプシンＢ；β−グルクロニダーゼ；プロカテプシンＨ；カテプシンＨ；非分泌性リボヌクレアーゼ；リソソームα−グルコシダーゼ；リソソーム保護タンパク質；γ−インターフェロン誘導性リソソームチオールレダクターゼ；タルトラート−耐性酸性ホスファターゼ５型（ＴＲ−ＡＰ）；アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ；アリールスルファターゼＢ（ＡＳＢ）；β−ガラクトシダーゼ；α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ；スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ；ガングリオシドＧＭ２アクチベーター；Ｎ（４）−（β−Ｎ−アセチルグルコサミニル）−Ｌ−アスパラギナーゼ；イズロン酸２−スルファターゼ；カテプシンＳ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ；α−Ｌ−イズロニダーゼ；リソソーム酸性リパーゼ／コレステリルエステルヒドロラーゼ（酸性コレステロールエステルヒドロラーゼ）（ＬＡＬ）；リソソームＰｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ；カテプシンＯ；カテプシンＫ；パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ−１）；スルファミダーゼ；アリールスルファターゼＤ（ＡＳＤ）；ジペプチジルペプチダーゼ１；α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣＥＲａｓｅ）；精巣上体分泌タンパク質Ｅ１；ジ−Ｎ−アセチルキトビアーゼ；Ｎ−アシルエタノールアミン加水分解酸性アミダーゼ；ヒアルロニダーゼ−１（Ｈｙａｌ−１）；キトトリオシダーゼ−１；酸性セラミダーゼ（ＡＣ）；ホスホリパーゼＢ様１；前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型；ＸＶ型ホスホリパーゼＡ２；推定ホスホリパーゼＢ様２；デオキシリボヌクレアーゼ−２−β；γ−グルタミルヒドロラーゼ；アリールスルファターゼＧ（ＡＳＧ）；Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＬＡＡＯ）（ＬＡＯ）； シアリダーゼ−１；レグミン；シアル酸Ｏ−アセチルエステラーゼ；胸腺特異的セリンプロテアーゼ；カテプシンＺ；カテプシンＦ（ＣＡＴＳＦ）；プレニルシステインオキシダーゼ１；ジペプチジルペプチダーゼ２；リソソームチオエステラーゼＰＰＴ２（ＰＰＴ−２）；ヘパラナーゼ；カルボキシペプチダーゼＱ；β−グルクロニダーゼ、およびスルファターゼ修飾因子１、から成る群から選択される。
【００４０】
本明細書中に開示した態様の特定の実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質はスルファターゼである。前記スルファターゼには、その活性部位にＦＧｌｙ部分を好ましくは有する。いくつかの実施形態において、前記スルファターゼは、従って、アリールスルファターゼＡ；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ；イズロン酸２−スルファターゼ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ；スルファミダーゼ；アリールスルファターゼＤ、およびアリールスルファターゼＧから選択される。特に、前記スルファターゼはアリールスルファターゼＡ；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ；アリールスルファターゼＢ；イズロン酸２−スルファターゼ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼまたはスルファミダーゼである。好ましくは、前記スルファターゼはアリールスルファターゼＡである。スルファミダーゼは、一部の実施形態において除外されるであろう。
【００４１】
本明細書中に開示した態様の実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質はグリコシドヒドロラーゼである。いくつかの実施形態において、前記グリコシドヒドロラーゼは、α−ガラクトシダーゼＡ；組織α−Ｌ−フコシダーゼ；グルコシルセラミダーゼ；リソソームα−グルコシダーゼ；β−ガラクトシダーゼ；β−ヘキソサミニダーゼサブユニットα；β−ヘキソサミニダーゼサブユニットβ；ガラクトセレブロシダーゼ；リソソームα−マンノシダーゼ；β−マンノシダーゼ；α−Ｌ−イズロニダーゼ；α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；β−グルクロニダーゼ；ヒアルロニダーゼ−１；α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ；シアリダーゼ−１；ジ−Ｎ−アセチルキトビアーゼ；キトトリオシダーゼ−１；ヒアルロニダーゼ−３、およびヘパラナーゼから選択される。好ましくは、前記グリコシドヒドロラーゼは、α−Ｌ−イズロニダーゼまたはリソソームα−マンノシダーゼである。好ましくは、前記グリコシドヒドロラーゼはリソソームα−マンノシダーゼである。
【００４２】
本明細書中に開示した態様の実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質はプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、前記プロテアーゼは、カテプシンＤ；カテプシンＬ２；カテプシンＬ１；カテプシンＢ；プロカテプシンＨ；カテプシンＳ；カテプシンＯ；カテプシンＫ；ジペプチジルペプチダーゼ１；カテプシンＺ；カテプシンＦ；レグミン；γ−グルタミルヒドロラーゼ；ペプチダーゼ−トリペプチジル１；カルボキシペプチダーゼＱ；リソソーム保護タンパク質；リソソームプロ−Ｘカルボキシペプチダーゼ；胸腺特異的セリンプロテアーゼ；ジペプチジルペプチダーゼ２、および前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型から選択される。一実施形態において、前記プロテアーゼはトリペプチジルペプチダーゼ１である。別の実施形態において、トリペプチジルペプチダーゼは先に列挙したプロテアーゼの群から除外される。
【００４３】
本明細書中に開示した態様の一実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質は、配列番号１〜７４のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列、または配列番号１〜７４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％が配列同一性を有するポリペプチドから成るポリペプチドを含む。限定されることのない例では、前記ポリペプチドは、配列番号１〜７４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性、例えば、配列番号１〜７４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１〜７４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００４４】
具体的な実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質は、修飾スルファターゼであって、そして、配列番号２６；２８；２９；３５；３７；４４；４５、および６１のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号２６；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３５；配列番号３７および配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号２６に提示されたアミノ酸配列を有する。
【００４５】
別の実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質は、修飾グリコシドヒドロラーゼであって、そして、配列番号１２；配列番号１０；配列番号９；配列番号２２；配列番号３０；配列番号１３；配列番号１６；配列番号４８；配列番号４；配列番号２；配列番号３８；配列番号４７；配列番号１９；配列番号５２；配列番号３１；配列番号６３；配列番号５０；配列番号５３；配列番号６、および配列番号７２のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号４または配列番号３８に提示されたアミノ酸配列を有する。
【００４６】
別の実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質は、修飾プロテアーゼであって、そして、配列番号１４；配列番号６８；配列番号５；配列番号２３；配列番号５６；配列番号４６；配列番号４２；配列番号７；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号３６；配列番号４１；配列番号６７；配列番号６４；配列番号６０；配列番号７３；配列番号４０；配列番号６６、および配列番号７０のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号５に提示されたアミノ酸配列を有する。
【００４７】
さらなる実施形態において、前記ポリペプチドは、しかしながら、１若しくは複数のＣ−および／またはＮ末端アミノ酸によって伸長されてもよく、配列番号１〜７４の配列より長い実際の修飾リソソームタンパク質配列を作り出してもよい。同様に、他の例では、修飾リソソームタンパク質は配列番号１〜７４のアミノ酸配列に比べてより短いアミノ酸配列を有する可能性があり、長さの違いは、例えば、該配列の（単数若しくは複数の）特定の位置における（単数若しくは複数の）アミノ酸残基の（単数若しくは複数の）欠失に起因する。
【００４８】
一実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質は単離される。
一実施形態において、前記リソソームタンパク質はヒトリソソームタンパク質である。
一実施形態において、修飾前の前記リソソームタンパク質はグリコシル化される。
一実施形態において、前記修飾リソソームタンパク質は遺伝子組換え体である。特に、リソソームタンパク質は、ヒト連続細胞株で遺伝子組換えによって製造され得る。
【００４９】
一実施形態において、前記修飾タンパク質は、哺乳動物、チャイニーズハムスター卵巣、植物または酵母細胞において発現される。従って、得られたタンパク質は、修飾前に１若しくは複数のオリゴマンノースＮ−グリカンによってグリコシル化される。
【００５０】
一態様において、低減された含量の天然または未修飾グリカン部分を有し、リソソームタンパク質の未修飾形態と比較して天然または未修飾グリカン部分の５０％以下が維持されていて、それによって、血液脳関門を通じて、そして、前記修飾リソソームタンパク質が生物学的活性を有する哺乳動物の脳の中への前記リソソームタンパク質の輸送を可能にすることを特徴とする、修飾リソソームタンパク質を含む組成物を提供する。一実施形態において、前記タンパク質は、スルファミダーゼでもなく、β−グルクロニダーゼでもなく、またはトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）でもない。別の実施形態において、前記タンパク質はα−Ｌ−イズロニダーゼではない。
【００５１】
リソソームタンパク質がスルファターゼである特定の実施形態において、前記組成物は、前記修飾スルファターゼの活性部位におけるＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）対セリン（Ｓｅｒ）比が１超であることを特徴とし得る。例えば、前記修飾リソソームタンパク質は、配列番号２６；２８；２９；３５；３７；４４；４５、および６１のうちのいずれか１つで規定されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；または、配列番号２６；２８；２９；３５；３７；４４；４５、および６１で規定されるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、を含むスルファターゼである。好ましくは、ＦＧｌｙ対Ｓｅｒの比は１．５を超え、より好ましくは２．３、より好ましくは４を超え、最も好ましくは、その比は約９である。より大きな比は、より大きいほど、修飾スルファターゼの触媒活性が、スルファターゼの未修飾形態から維持され得ることを示す。
【００５２】
他の態様に関して開示した利点もまた、組成物の態様に適用される。同様に、他の態様に関して開示した実施形態もまた、組成物の態様に適用される。特に、グリカン部分の含量、タンパク質活性、およびリソソームタンパク質（上記の表Ｉおよび一覧表を参照）の特定の例に関連する実施形態もまたこの態様に適用可能である。
【００５３】
組成物の態様の１つの実施形態において、１０％（重量）以下、例えば７．５％（重量）以下、５％（重量）以下、２．５％（重量）以下、１％（重量）以下の前記修飾リソソームタンパク質は、１０１０ｋＤａを超える分子量を有する多量体型で存在する。
【００５４】
組成物の態様の１つの実施形態において、前記修飾されたリソソームタンパク質の１０％（重量）以下は共有結合したオリゴマー形態で存在する。該オリゴマー形態は、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマーおよびオクタマーから選択される。オリゴマー、多量体または凝集形態の存在は、例えば、動的光散乱によってまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる。この文脈において、凝集形態は、ネイティブに折り畳まれたモノマーから折り畳まれていないモノマーまでの範囲の構造から構成される高分子量タンパク質形態として理解されるべきである。タンパク質の凝集形態は、タンパク質のモノマー形態に対する免疫応答を増強することができる。増強された免疫応答の最も可能性の高い説明は、抗原の多価提示がＢ細胞受容体にクロスリンクし、従って免疫応答を誘導することである。これは、高い免疫応答を確実にするために、凝集形態にて抗原が宿主に提示されるワクチン製造に利用されている現象である。治療用タンパク質の場合、定説（dogma）とは反対である。免疫応答を最小限に抑えるために、高分子量形態の任意の含量を最小限にするか、または避けるべきである（Rosenberg,AAPS J,8:E501-7(2006)）。従って、オリゴマー、多量体および／または凝集体の形態の減少は、治療における使用により適した酵素を提供し得る。
【００５５】
そのうえ、試料中の凝集タンパク質のごく少量の発生が、正常に折りたたまれたタンパク質のさらなる凝集を誘導し得ることである。凝集した材料は、一般に、残存活性がない、または低い残存活性であり、不十分な溶解性を有する。凝集体の出現は、生物学的薬剤の貯蔵寿命を決定する因子の１つであり得る（Wang,Int J Pharm,185:129-88(1999)）。
【００５６】
本明細書で使用される用語「組成物」は、固体および液体の形態を含むものとして理解されるべきである。組成物は、好ましくは、患者（例えば、哺乳動物）に、例えば注射または経口投与するのに適した医薬組成物であり得る。
【００５７】
一態様において、修飾リソソームタンパク質を提供するものであって、ここで、前記リソソームタンパク質は、過ヨウ素酸アルカリ金属塩（alkali metal periodate）および水素化ホウ素アルカリ金属塩（alkali metal borohydride）との逐次反応によって調製され、それによってリソソームタンパク質のグリカン認識受容体のエピトープを修飾し、リソソームタンパク質の生物学的活性を保持しながら、前記グリカン認識受容体に関して前記リソソームタンパク質の活性を低下させる。従って、リソソームタンパク質は、修飾前のその天然のグリコシル化形態で存在するそのエピトープまたはグリカン部分が前記修飾によって本質的に不活性化されている点で修飾されている。従って、グリカン認識受容体に関してエピトープの存在は、修飾リソソームタンパク質において低減されている。修飾リソソームタンパク質、組成物および調製方法に関連する態様のような、本明細書に開示される他の態様に関連して開示される実施形態およびその利点は、この態様の実施形態でもあることを理解すべきである。特に、以下に開示される様々な方法の実施形態は、特異的反応条件の点で前記修飾リソソームタンパク質の調製のさらなる例示的な定義を提供する。同様に、上記の修飾リソソームタンパク質および組成物の態様に関して開示された実施形態は、修飾リソソームタンパク質のさらなる例示的な定義を提供する。
【００５８】
一態様において、修飾リソソームタンパク質を調製する方法を提供し、前記方法は：ａ）グリコシル化リソソームタンパク質を過ヨウ素酸アルカリ金属塩と反応させ、およびｂ）前記リソソームタンパク質を水素化ホウ素アルカリ金属塩と２時間以下反応させること、を含み；それによって、前記リソソームタンパク質のグリカン部分を修飾し、グリカン認識受容体に関して前記リソソームタンパク質の活性を低下させるが、但し、前記タンパク質はスルファミダーゼではない。
【００５９】
一態様において、修飾リソソームタンパク質を調製する方法を提供し、前記方法は：ａ）グリコシル化リソソームタンパク質を過ヨウ素酸アルカリ金属塩と反応させ、およびｂ）前記リソソームタンパク質を水素化ホウ素アルカリ金属塩と２時間以下反応させること、を含み；それによって、前記リソソームタンパク質のグリカン部分を修飾し、グリカン認識受容体に関して前記リソソームタンパク質の活性を低下させるが、但し、前記タンパク質はスルファミダーゼではない。
【００６０】
関連する態様において、修飾リソソームタンパク質を調製する方法を提供し、前記方法は：ａ）グリコシル化リソソームタンパク質を過ヨウ素酸アルカリ金属塩と反応させ、およびｂ）前記リソソームタンパク質を水素化ホウ素アルカリ金属塩と、任意で２時間以下反応させること、を含み；それによって、前記リソソームタンパク質のグリカン部分を修飾し、グリカン認識受容体に関してリソソームタンパク質の活性を低下させ、ここで、前記リソソームタンパク質の活性部位または機能的エピトープは、ステップａ）およびｂ）のうちの少なくとも一方の間、酸化および／または還元反応に利用不可能にされる。
【００６１】
「機能的エピトープ」という用語は、これに関連して、タンパク質には酵素活性がないが、リソソームの必須機能を有するタンパク質の一部と理解されるべきである。必須機能は、例えば、分解酵素に対する基質を提示することによって、酵素のソーティングに影響を及ぼすことによって、または機能的酵素に対する結合パートナーとして機能することによって、提供される場合がある。次に、着目のタンパク質の機能的エピトープは、その機能に関与するタンパク質残基、例えばタンパク質の機能を規定するリガンド結合残基またはタンパク質‐タンパク質結合に関与する残基、によって規定される。
【００６２】
従って、上記の方法は、グリカン認識受容体のエピトープの存在を減少させるリソソームタンパク質のマイルドな化学修飾を提供し、前記エピトープは、例えば、本明細書に記載の天然または未修飾のグリカン部分によって表される。これは、有利には、哺乳動物の脳、および／または内臓、および／または他の未修飾リソソームタンパク質があまり分布していない末梢組織を標的化するのに適した修飾リソソームタンパク質を提供し得る。特に、該方法は、例えば、静脈内注入によって投与されると、末梢組織、例えば関節、結合組織、軟骨および骨など、においてより高い曝露を有するリソソームタンパク質を提供し得る。マイルドな方法はさらに、生物学的活性の完全な喪失に至ることなく前記エピトープを有利に修飾する。特定の実施形態において、マイルドな方法は、その生物学的活性が失われるようにリソソームタンパク質の機能的エピトープを修飾することは無い。前記リソソームタンパク質がスルファターゼであるとき、生物学的活性は、修飾リソソームタンパク質の活性部位にＦＧｌｙを維持することにより、触媒活性を維持することができる。従って、タンパク質または酵素の分布特性を改善する一方で、この方法は、生物学的活性、例えば触媒活性を排除しない。マイルドな方法によって調製された修飾リソソームタンパク質のさらなる利点は、上記に説明されているように、例えば、リソソームタンパク質および組成物の態様に対するものである。
【００６３】
この方法は、グリカン（炭水化物）部分の２つの隣接するヒドロキシル基間の炭素結合の過ヨウ素酸切断によるグリカン修飾を可能にする。一般に、過ヨウ素酸酸化切断は、隣接のジオールが存在する場所で起こる。ジオールは、赤道−赤道または軸−赤道位置に存在しなければならない。ジオールが剛性軸−軸位置に存在する場合、反応は起こらない（Kristiansen et al.,Car.Res(2010)）。過ヨウ素酸塩処理は、Ｍ６Ｐ部分のＣ２とＣ３および／またはＣ３とＣ４の間の結合を切断し、Ｍ６Ｐ受容体に結合することができない構造を生じる。一般的に、他の末端ヘキソースも同様の方法で処理される。非末端の１−４結合残基は、Ｃ２とＣ３の間のみが切断されるが、一方で、非末端（１−３）結合残基は、切断に耐性である。図７において、可能性がある修飾のポイントは、３つの一般的なタイプのＮ−グリカン；オリゴマンノース、複合体およびハイブリッド、にアスタリスクでマークされている。添付の実施例にさらに示されるように、本明細書に開示される方法は、限られた数の結合の切断によって天然のグリカン部分が破壊された修飾リソソームタンパク質を提供する。一般的に、既知の方法の使用による修飾は、ポリペプチドスルファミダーゼの比較実験で実証されたように、大規模な破壊への増大をもたらす。ステップａ）で使用される過ヨウ素酸塩は、リソソームタンパク質に自然に生じるグリカン部分の構造を破壊し得る。修飾リソソームタンパク質のグリカン構造の維持は、少なくとも１つの過ヨウ素酸塩が触媒した切断、すなわち少なくとも１つの単結合切断が天然に存在するグリカン部分のそれぞれで起きた際に、少なくとも部分的に破壊された。現在開示している方法は、リソソームタンパク質のグリカン部分の糖部分における単独型の結合切断を主にもたらし得る（図８参照）。二重結合切断対単結合切断の傾向に関する既知の方法と本明細書中に開示した方法の間の違いは、例えば、主に二重結合切断に向かう傾向がモノマータンパク質の分子量のより明白な低下につながるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察できる。主に単結合切断がグリカン部分で起こる修飾タンパク質では、モノマータンパク質の分子量の低下は、タンパク質の未修飾形態と比較して、あまり明白ではないか、または無視できるほどでさえある。主に単独型の結合切断を示す修飾グリカン部分のレパートリーは、生きている動物の脳内における静脈内投与後のリソソームタンパク質の分布および活性に有益であり得る。単独型の結合切断を主に示す修飾グリカン部分のレパートリーは、同様にして、静脈内投与後に生きている動物の脳におけるリソソームタンパク質の分布および活性に有益であり得る。
【００６４】
本明細書に記載の修飾リソソームタンパク質を調製する方法、および修飾リソソームタンパク質は、従来技術の方法および化合物よりも改善されている。主に、新規な修飾リソソームタンパク質が哺乳動物の脳に分布して生物学的活性を示し得る。実施例２および４はさらに、既知の方法に従って修飾されたリソソームタンパク質と、本明細書中に開示される方法に従って修飾されたリソソームタンパク質との間に比較を提供する。これらの実施例の結果は、既知の方法に従って修飾されたリソソームタンパク質がアミノ酸配列、ポリペプチド鎖切断、およびタンパク質凝集の変化を示すことを示す。特に、活性部位に触媒作用のＦＧｌｙ残基を含んでいるスルファターゼでは、既知の修飾方法がＦＧｌｙ部分のＳｅｒ部分への前駆タンパク質転換酵素サブチリシンにつながることが、観察された。従って、本明細書中に開示した方法は、そのうえ、例えば構造的完全性、に関して改善された品質および安定性を有する修飾リソソームタンパク質を提供し得る。
【００６５】
方法の態様の一実施形態において、前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩は、グリカン部分のｃｉｓ−グリコール基をアルデヒド基に酸化する。
【００６６】
方法の態様の一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記アルデヒドをアルコールに還元する。
【００６７】
方法の態様の一実施形態において、ステップａ）およびステップｂ）は、中間ステップを実行することなく、順番に実行される。
【００６８】
ステップｂ）を、ステップａ）の直後に、または以下に記載される任意のクエンチングステップａ２）の後に実施することによって、例えば、限外濾過、沈殿または緩衝液の交換によって、反応試薬を除去することなどの任意の中間ステップが省かれ、従って、リソソームタンパク質が反応性アルデヒド中間体に長時間さらされることを回避する。ステップａ）、または任意にａ２）の後にステップｂ）を進行させると、全体の反応時間も有利に短縮される。
【００６９】
以下の段落において、ステップａ）の特定の実施形態が開示される。他に定義されない限り、本明細書に開示される態様の特定の実施形態を組み合わせることができることを理解すべきである。
【００７０】
一実施形態において、前記過ヨウ酸アルカリ金属塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
【００７１】
一実施形態において、ステップａ）の前記反応は、４時間以下、例えば３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間、実施される。特定の実施形態において、ステップａ）の反応は、０．５時間未満、例えば約２０分間、実施される。反応は、好ましくは、約３時間、２時間、１時間、または１時間未満の持続時間を有する。本発明者らは、ステップａ）の持続時間が４時間以下であることにより、グリカン認識受容体のエピトープを効率的に不活性化することを見出した。さらに、４時間以下の比較的に限定された持続時間は、ポリペプチド鎖の鎖切断の限定された程度を生じさせると仮定される。
【００７２】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、（最終）濃度が２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭで使用される。過ヨウ素酸塩は、８〜２０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭの濃度で使用することができる。あるいは、過ヨウ素酸塩は、２０ｍＭ未満、例えば１０ｍＭ〜１９ｍＭの濃度で使用される。より低濃度の過ヨウ素酸アルカリ金属塩、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムが、ポリペプチド鎖の鎖切断の程度、ならびにアミノ酸側鎖上の関連する酸化、例えば、メチオニン残基の酸化を減少させ得る。
【００７３】
一実施形態において、ステップａ）の前記反応は、周囲温度、好ましくは０〜２２℃の温度で実施される。好ましい実施形態において、前記ステップａ）の反応は、０〜８℃の温度、例えば０〜４℃の温度で実施される。好ましい実施形態において、ステップａ）の反応は、約８℃の温度、約４℃の温度または約０℃の温度で実施される。
【００７４】
一実施形態において、ステップａ）の前記反応は、ｐＨ３〜７ので実施される。当該ｐＨは、反応の開始時のｐＨとして理解されるべきである。特定の実施形態において、ステップａ）で使用されるｐＨは３〜６、例えば４〜５である。特定の実施形態において、ステップａ）で使用されるｐＨは、約６、約５、または約４である。ステップａ）のｐＨを低下させることによって、過ヨウ素酸塩の濃度またはステップａ）の反応時間を短縮してもよい。
【００７５】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの（最終）濃度で使用される。一実施形態において、前記メタ過ヨウ素酸ナトリウムは、８〜２０ｍＭの濃度で使用される。好ましい実施形態において、メタ過ヨウ素酸ナトリウムは、約１０ｍＭの濃度で使用される。
【００７６】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの（最終）濃度で使用され、ステップａ）の前記反応が、４時間以下、例えば３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間実施される。２０ｍＭの過ヨウ素酸塩の濃度および４時間以下の反応時間は、有利なことには、より少ない鎖切断および酸化をもたらし得る。
【００７７】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの（最終）濃度で使用され、ステップａ）の前記反応が４時間以下の時間、例えば３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間、０〜２２℃の温度で、例えば約８℃、例えば約０℃で実施される。
【００７８】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、２０ｍＭ以下の濃度、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭで使用され、ステップａ）の前記反応は、４時間以下、例えば約３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間の期間、０〜２２℃の温度で、例えば０〜８℃の温度で、例えば０〜４℃の温度で、例えば約８℃で、例えば約０℃で、実施される。
【００７９】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記ステップａ）の反応は、４時間以下、例えば約３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間の期間、０〜２２℃の温度で、例えば０〜８℃の温度で、例えば０〜４℃の温度で、例えば約８℃で、例えば約０℃で実施される。
【００８０】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、２０ｍＭ以下の濃度、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭで使用されるメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記ステップa）の反応は、０〜２２℃の温度で、例えば０〜８℃の温度で、例えば０〜４℃の温度で、例えば約８℃で、例えば約０℃で、実施される。
【００８１】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、約１０ｍＭの濃度で使用されるメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記ステップａ）の反応は、約８℃の温度で、２時間以下の期間実施される。
【００８２】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩は、約１０ｍＭの濃度で使用されるメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記ステップａ）の反応は、０〜８℃の温度で、３時間以下の期間実施される。
【００８３】
以下の段落において、ステップｂ）の特定の実施形態が開示される。他に定義されない限り、特定の実施形態、特にステップａ）およびステップｂ）の特定の実施形態を組み合わせることができることを理解されたい。
【００８４】
一実施形態において、前記水素化ホウ素は、１０〜８０ｍＭの濃度にて使用される。一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、水素化ホウ素ナトリウムである。
【００８５】
いくつかの例において、ステップｂ）に使用される条件は、ステップａ）に使用される条件に部分的に依存することが見出されている。ステップｂ）において使用される水素化ホウ素塩（borohydride）の量は、好ましくは、できるだけ低く保たれる一方、水素化ホウ素塩対過ヨウ素酸塩（periodate）のモル比は、そのような場合０．５〜４：１である。従って、ステップｂ）において、水素化ホウ素塩は、ステップａ）において使用される過ヨウ素酸塩の量の４倍のモルで使用される。一実施形態において、前記水素化ホウ素塩は、前記過ヨウ素酸塩の（最終）濃度の４倍以下の（最終）モル濃度で使用される。例えば、水素化ホウ素塩は、過ヨウ素酸塩の濃度の３倍以下の濃度、例えば過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下、例えば過ヨウ素酸塩の濃度の２倍以下、前記過ヨウ素酸塩の濃度の１．５倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度におおよそ対応する濃度で使用されてもよい。しかし、特定の実施形態において、過ヨウ素酸塩濃度の半分、または過ヨウ素酸塩濃度の０．５倍に相当する濃度で、水素化ホウ素塩が使用される。従って、過ヨウ素酸塩が約２０ｍＭの濃度で使用される場合、水素化ホウ素塩は、８０ｍＭ以下の濃度、または１０〜８０ｍＭの濃度、例えば１０〜５０ｍＭの濃度で使用されてもよい。過ヨウ素酸塩が１０〜２０ｍＭの濃度で使用される場合、水素化ホウ素塩は５〜８０ｍＭ、例えば５０ｍＭの濃度で使用され得る。同様に、過ヨウ素酸塩が約１０ｍＭの濃度で使用される場合、水素化ホウ素塩は、４０ｍＭ以下の濃度、例えば、２５ｍＭ以下の濃度で使用され得る。さらに、そのような実施形態において、水素化ホウ素塩は、好ましくは、１２ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で使用され得る。リソソームタンパク質がスルファターゼである実施形態において、水素化ホウ素塩の濃度が活性部位における触媒アミノ酸残基の保存度に影響を及ぼす。
【００８６】
一実施形態において、前記ステップｂ）の反応は、１．５時間以下、例えば１時間以下、例えば０．７５時間以下、例えば約０．５時間の期間実施される。反応時間は、好ましくは約１時間、または１時間未満である。さらなる例において、ステップｂ）の反応は、約０．２５時間の持続時間を有する。さらなる実施形態において、ステップｂ）の反応は、０．２５時間〜２時間の期間実施することができる。上記で説明されるように、還元ステップの持続時間は、リソソームタンパク質の生物学的活性、特にスルファターゼなどの酵素の触媒活性、に影響を及ぼし得る。そのうえ、比較的短い反応時間は、酵素の全体的な構造的完全性に有利に影響し得る。特に、リソソームタンパク質の高分子量形態ならびに鎖切断の発生を生じるタンパク質凝集は、少なくとも部分的に反応時間と関連し得る。
【００８７】
一実施形態において、前記ステップｂ）の反応は、０〜８℃の温度で実施される。ステップｂ）の反応温度は、反応生成物の生物学的活性に少なくとも部分的に影響を及ぼし得る。従って、ステップｂ）を８℃未満の温度で実施することが有利であり得る。温度は好ましくは約０℃である。
【００８８】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムである。
【００８９】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記ステップｂ）の反応は、１時間以下、例えば約０．５時間の期間実施される。
【００９０】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記ステップｂ）の反応は、１時間以下、例えば約０．５時間の期間、０〜８℃の温度で実施される。
【００９１】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度で、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用され、前記ステップｂ）の反応は１時間以下、例えば約０．５時間、０〜８℃の温度で実施される。
【００９２】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は水素化ホウ素ナトリウムであり、前記ステップｂ）の反応は、１時間以下、例えば約０．５時間、０〜８℃の温度で実施される。
【００９３】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記ステップｂ）の反応は０〜８℃の温度で実施される。
【００９４】
一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記ステップｂ）の反応は、約０℃の温度で約０．５時間の期間実施される。
【００９５】
一実施形態において、前記過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は水素化ホウ素ナトリウムである。
【００９６】
一実施形態において、ステップａ）およびステップｂ）のそれぞれは、２時間以下、例えば１時間以下、例えば約１時間または約０．５時間の期間、個別に実施される。任意に、前記水素化ホウ素塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５〜４倍、好ましくは前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５〜２．５倍の濃度で使用される。特定の実施形態において、前記水素化ホウ素塩は、過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍の濃度で、または前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍の濃度で使用される。
【００９７】
一実施形態において、ステップａ）は３時間以下の期間実施され、ステップｂ）は１時間以下実施される。任意に、前記水素化ホウ素塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下、好ましくは前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下で使用される。
【００９８】
一実施形態において、ステップａ）は０．５時間以下の期間実施され、ステップｂ）は１．５時間以下実施される。任意に、前記水素化ホウ素塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下、好ましくは前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下で使用される。
【００９９】
当業者は、化学反応の反応持続時間、例えばステップａ）およびｂ）のそれぞれの反応持続時間を制御する方法を認識している。従って、一実施形態において、前記方法の態様は、ａ２）ステップａ）から生じる反応のクエンチングをさらに含む。前記クエンチングは、３０分未満、例えば１５分未満の持続時間を有する。いくつかの例において、前記クエンチングは、ステップａ）の直後に実施される。クエンチングは、例えば、エチレングリコールまたは別のジオール、例えばｃｉｓ−シクロ−ヘプタン−１，２−ジオールなどの添加によって実施してもよい。好ましくは、ステップｂ）は、クエンチングの直後に続く。これにより、リソソームタンパク質が反応性アルデヒド基に暴露される期間を最短にすることができる。反応性アルデヒドは、タンパク質の不活性化および凝集を促進することができる。
【０１００】
一実施形態において、前記方法は、ｂ２）ステップｂ）から生じる反応の停止をさらに含む。このクエンチングは、ケトンまたはアルデヒド基、例えばシクロヘキサノンまたはアセトンを含有する分子を添加することによって実施することができ、前記分子は好ましくは水に可溶性であるか、あるいは、酢酸または他の酸の添加によって反応混合物をｐＨ６以下に低下させることによって実施することができる。任意のクエンチングステップは、ステップｂ）の反応時間の正確な制御を可能にする。
【０１０１】
従って、一実施形態において、方法のステップａ）およびｂ）のうちの少なくとも一方は、保護リガンドの存在下で行われる。特に、ステップａ）は、保護リガンドの存在下で行われ得る。リガンド、例えば前記リソソームタンパク質の基質などは、酸化および／または還元ステップ中、および（単数若しくは複数の）任意のクエンチングステップ中、タンパク質の機能的エピトープまたは活性部位を保護し得る。あるいは、リガンドはタンパク質の阻害剤である可能性がある。別の実施形態において、方法のステップａ）およびｂ）は、リソソームタンパク質が樹脂で固定されたままで行われる。従って、リソソームタンパク質は最初に、樹脂または媒質で固定され得る。次に、ステップａ）およびｂ）の反応、ならびに任意のａ２）およびｂ２）の反応が、タンパク質が樹脂または媒質に固定されたまま行われ得る。好適な樹脂または媒質が当業者に知られている。例えば、陰イオン交換性媒質または親和性媒質が使用され得る。
【０１０２】
方法態様の一実施形態において、ステップａ）およびｂ）のうちの少なくとも一方は、保護リガンドの存在下で行われ、そして、ステップａ）およびｂ）は、前記リソソームタンパク質が樹脂に固定されたままで行われる。
【０１０３】
一実施形態において、方法のステップａ）およびｂ）が連続工程で行われる。特に、ステップａ）、ａ２）、ｂ）、ｂ２）は、連続工程で行われ得る。「連続工程」という用語、本明細書中で使用される場合、連続的に操作されるプロセスと理解されるべきであり、そして、ここで、試薬はプロセスユニットに連続的に補給される。例えばアルカリ金属過ヨウ素酸塩やアルカリ金属水素化ホウ素などの試薬を、リソソームタンパク質を含んでいる流れに加えることによって、反応は連続方式で実施され得る。連続工程は、例えばマルチポンプＨＰＬＣシステムにおいて行われ得る。
【０１０４】
従って、本明細書に開示される方法は、改善された特性を有する修飾リソソームタンパク質を提供する。リソソームタンパク質ポリペプチド鎖の構造的完全性に対する最小の負の影響を伴うリソソームタンパク質の化学修飾条件が予想され、同時に、天然または未修飾グリカンエピトープの実質的な不存在をもたらした。この方法の例示的な実施形態は、図１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄに示す。
【０１０５】
関連する態様において、タンパク質を作製する方法を提供し、前記方法は：
哺乳動物、植物または酵母細胞において前記タンパク質を発現させ、それによって、グリコシル化タンパク質を提供し；そして、
前記グリコシル化タンパク質のグリカン認識受容体のエピトープを修飾し、それによって、前記グリカン認識受容体に関してタンパク質の活性を低減すること、を含む。
【０１０６】
一実施形態において、前記修飾は、アルカリ金属過ヨウ素酸塩およびアルカリ金属水素化ホウ素を用いた連続反応によって行われる。植物および酵母発現系の例は、当業者に知られているが、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）およびオガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）などの種の発現系を含んでもよい。哺乳動物細胞株の例はＣＨＯ細胞株である。前記方法の他の実施形態は先に開示されている。
【０１０７】
一態様において、先に規定した方法態様の方法によって取得可能な修飾リソソームタンパク質を提供するが、但し、前記タンパク質はスルファミダーゼでない。
【０１０８】
本明細書中に開示した態様の一実施形態において、先に期待した方法態様のいずれか１つによって取得可能な、前記修飾リソソームタンパク質、前記リソソームタンパク質組成物または修飾リソソームタンパク質は、治療法に使用するためのものである。
本明細書中に開示した態様の一実施形態において、方法態様のうちのいずれか１つによって取得可能な、前記修飾リソソームタンパク質、前記リソソームタンパク質組成物または修飾リソソームタンパク質は、リソソーム蓄積症に罹患している哺乳動物の治療に使用するためのものである。
【０１０９】
本明細書中に開示した態様の一実施形態において、前記哺乳動物の脳はヒトの脳である。関連する実施形態において、従って、前記哺乳動物はヒトである。従って、一実施形態において、前記哺乳動物の脳はマウスの脳である。関連する実施形態において、従って、前記哺乳動物はマウスである。
【０１１０】
一態様において、哺乳動物の脳における、リソソーム蓄積症を治療するために血液脳関門を通過する、修飾のリソソームタンパク質の薬物製造における使用が提供されるものであって、前記修飾は、酵素を過ヨウ素酸アルカリ金属塩および水素化ホウ素アルカリ金属塩で逐次処理することによって化学的に修飾されたグリカン部分を有することを含み、それによって、前記リソソームタンパク質の生物学的活性を維持しながら、グリカン認識受容体、例えばマンノースおよびマンノース−６−リン酸細胞送達系に対するリソソームタンパク質の活性を減少させる、但し、前記リソソームタンパク質は、スルファミダーゼ、β−グルクロニダーゼ、またトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはα−Ｌ−イズロニダーゼでないことを条件とする。
【０１１１】
一態様において、影響を受けた内臓または末梢組織における、リソソーム蓄積症を治療するための、哺乳動物の影響を受けた内臓および／または末梢組織への（促進された）分布のために、修飾のリソソームタンパク質の薬物製造における使用が提供されるものであって、前記修飾は、タンパク質を過ヨウ素酸アルカリ金属塩および水素化ホウ素アルカリ金属塩で逐次処理することによって化学的に修飾されたグリカン部分を有することを含み、それによって、前記リソソームタンパク質の生物学的活性を維持する一方、グリカン認識受容体、例えばマンノースおよびマンノース−６−リン酸細胞送達系に対する修飾リソソームタンパク質の活性を減少させる。特定の実施形態において、前記リソソームタンパク質は、スルファミダーゼ、β−グルクロニダーゼ、またトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはα−Ｌ−イズロニダーゼでない。
【０１１２】
本明細書中に開示した態様の施形態において、前記リソソーム蓄積症は、マンノシドーシスβＡ；リソソーム；白質脳症；嚢胞性；巨大脳髄脳症を伴わない（ＬＣＷＭ）；マンノシドーシス、αＢ；リソソーム（ＭＡＮＳＡ）；セロイドリポフスチノーシス、ニューロン性２（ＣＬＮ２）；脊髄小脳失調；常染色体劣性７（ＳＣＡＲ７）；セロイドリポフスチノーシス、ニューロン性；５（ＣＬＮ５）；ゴーシェ病（ＧＤ）；フコース症（ＦＵＣＡ１Ｄ）；ミエロペルオキシダーゼ欠損症（ＭＰＯＤ）；ファブリー病（ＦＤ）；ＧＭ２−ガングリオシドーシス１（ＧＭ２Ｇ１）；セロイドリポフスチノーシス、ニューロン性、１０（ＣＬＮ１０）；混合型サポシン欠損症（ＣＳＡＰＤ）；サポシンＢ欠損症に起因する異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ−ＳＡＰＢ）；サポシンＣ欠損症（寒天ゲル内拡散法）に起因する非定型的ゴーシェ病；サポシンＡ欠損症（ＡＫＲＤ）に起因する非定型的クラッベ病；ＰＳＡＰサポシンＤ領域における欠陥がテイ−サックス病の変異体で見出された（ＧＭ２−ガングリオシドーシス）；ＧＭ２−ガングリオシドーシス２（ＧＭ２Ｇ２）；ムコ多糖症７（ＭＰＳ７）；グリコーゲン蓄積症２（ＧＳＤ２）；ガラクトシアリドーシス（ＧＳＬ）；免疫調節不全を伴った脊椎内軟骨異形成（ＳＰＥＮＣＤＩ）；異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）；ムコ多糖症３Ｄ（ＭＰＳ３Ｄ）；ムコ多糖症６（ＭＰＳ６）；ＧＭ１−ガングリオシドーシス１（ＧＭ１Ｇ１）；ＧＭ１−ガングリオシドーシス２（ＧＭ１Ｇ２）；ＧＭ１−ガングリオシドーシス３（ＧＭ１Ｇ３）；ムコ多糖症４Ｂ（ＭＰＳ４Ｂ）；シンドラー病（ＳＣＨＩＮＤ）；カンザキ病（ＫＡＮＺＤ）；ニーマン−ピック病Ａ（ＮＰＤＡ）；ニーマン−ピック病Ｂ（ＮＰＤＢ）；ＧＭ２−ガングリオシドーシスＡＢ（ＧＭ２ＧＡＢ）；アスパルチルグルコサミン尿（ＡＧＵ）；ムコ多糖症２（ＭＰＳ２）；ムコ多糖症４Ａ（ＭＰＳ４Ａ）；ムコ多糖症１Ｈ（ＭＰＳ１Ｈ）；ムコ多糖症１Ｈ／Ｓ（ＭＰＳ１Ｈ／Ｓ）；ムコ多糖症１Ｓ（ＭＰＳ１Ｓ）；ウォルマン病（ＷＯＤ）；コレステリルエステル蓄積病（ＣＥＳＤ）；ピクノディスオストーシス（ＰＫＮＤ）；セロイドリポフスチノーシス、ニューロン性、１（ＣＬＮ１）；ムコ多糖症３Ａ（ＭＰＳ３Ａ）；パピヨン−ルフェーブル症候群（ＰＬＳ）；ムンク−ハイム症候群（ＨＭＳ）；歯周炎、侵襲性、１（ＡＰ１）；ムコ多糖症３Ｂ（ＭＰＳ３Ｂ）；白質ジストロフィー、グロボイド細胞（ＧＬＤ）；ニーマン−ピック病Ｃ２（ＮＰＣ２）；ムコ多糖症９（ＭＰＳ９）；ファーバー病（ＦＬ）；進行性ミオクローヌス癲癇を伴った背髄性筋萎縮症（ＳＭＡＰＭＥ）；高コレステロール血症、常染色体優性、３（ＨＣＨＯＬＡ３）；シアリドーシス（ＳＩＡＬＩＤＯＳＩＳ）；自己免疫疾患６（ＡＩＳ６）；セロイドリポフスチノーシス、ニューロン性、１３（ＣＬＮ１３）；および多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）、から選択される。
【０１１３】
一実施形態において、治療法において使用するための、方法態様によって取得可能な、前記修飾リソソームタンパク質、リソソームタンパク質組成物、または修飾リソソームタンパク質は、前記哺乳動物の脳におけるリソソーム蓄積を低減する。特に、前記蓄積は、例えば動物モデルにおいて、少なくとも３０％、例えば少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％低減される。
【０１１４】
一態様において、リソソーム蓄積症に罹患した哺乳動物を治療する方法が提供され、該方法は、哺乳動物に、治療上有効量の修飾リソソームタンパク質を投与することを含み、前記修飾リソソームタンパク質は、以下：
ａ）本明細書に開示された態様および実施形態に記載の、またはそれらから取得可能な修飾リソソームタンパク質；そして、
ｂ）本明細書の態様および実施形態に記載のリソソームタンパク質組成物、
から選択される。
【０１１５】
その一実施形態において、前記治療が、７０日間の期間にわたり、１０用量の修飾リソソームタンパク質の投与後に、哺乳動物の脳からの少なくとも約５０％のリソソーム蓄積のクリアランスをもたらす。
【実施例】
【０１１６】
実施例
以下の実施例は、スルファミダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、およびイズロン酸２−スルファターゼによって例示される修飾リソソームタンパク質の開発について開示する。
材料と方法
以下の実施例に使用する遺伝子組換えα−Ｌ−イズロニダーゼは医薬品Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）であったのに対して、遺伝子組換えイズロン酸２−スルファターゼは医薬品Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）であった。両方を、薬局（Apoteket farmaci, Sweden）から購入し、製造者の仕様書どおりに保存し、そして、無菌条件下で治療した。
【０１１７】
スルファミダーゼを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを用いたＨＥＫ２９３細胞、およびｐＱＭＣＦ１ベクターを用いた、Ｑｕａｔｔｒｏｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Icosagen AS）を備えたＣＨＯにおける、クローニングならびに一過性発現によって製造した。スルファミダーゼは、２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で平衡化したＱセファロースカラム（GE Healthcare）上の陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＩＥＸ）によって培地から捕獲し、ＮａＣｌ勾配で溶出させた。捕獲されたスルファミダーゼを、４−メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）クロマトグラフィーによりさらに精製した。スルフェアミダーゼ含有画分を、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌクロマトグラフィーカラムにロードし、続いて５０ｍＭ ＮａＡｃ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ４．６の定組成溶出によって溶出した。最終精製は、２５ｍＭ ＮａＡｃ、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ４．５で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（GE Healthcare）カラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）によって達成した。溶出にはＮａＣｌ勾配を用いた。
【０１１８】
実施例１：
既知の方法によるリソソームタンパク質スルファミダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、およびイズロン酸２−スルファターゼの化学修飾
【０１１９】
材料と方法
ＷＯ２００８／１０９６７７による化学修飾：グリカン部分を修飾するために、上記リソソームタンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、０℃で６．５時間、２０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムとともに最初にインキュベートした。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止（ｑｕｅｎｃｈ）した。クエンチングを０℃で１５分間進行させた後、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に対して４℃で一晩透析をおこなった。透析後、反応混合物に１００ｍＭの最終濃度で水素化ホウ素ナトリウムを添加して還元をおこなった。還元反応を一晩進行させた。最後に、酵素調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に対して透析した。全てのインキュベーションは暗所でおこなった。
【０１２０】
実施例２：
既知の方法に従って修飾したリソソームタンパク質スルファミダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、およびイズロン酸２−スルファターゼの分析
【０１２１】
材料と方法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：実施例１に記載の既知の方法に従って修飾したリソソーム酵素を、ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに添加したタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。Ｓｅｅｂｌｕｅ２プラスマーカーを分子量較正に使用し、そして、ゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ（C.B.S Scientific）で染色した。
【０１２２】
トリプシン断片のＬＣ／ＭＳによるグリカン分析：グリコシル化パターンを、実施例１の３種類のリソソームタンパク質のトリプシン断片のＬＣ／ＭＳによって測定した。タンパク質を還元し、アルキル化し、トリプシンで消化した。タンパク質の還元は、７０℃で１時間（α−Ｌ−イズロニダーゼでは７０℃）、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中の５μＬのＤＴＴ １０ｍＭ中でインキュベーションした。その後のアルキル化を５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の５５ｍＭヨードアセトアミド５μＬを用いて室温（ＲＴ）および暗所で４５分間おこなった。最後に、トリプシン消化を、３０μＬの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８、および５０ｍＭ酢酸中の０．２μｇ／μＬトリプシン（プロテアーゼ：タンパク質比１：２０（ｗ／ｗ））の添加によって実施した。消化は３７℃で一晩おこなった。
【０１２３】
５つのトリプシンペプチドフラグメントの可能なグリコシル化変異体を、糖ペプチド分析によって調べた。これは、液体クロマトグラフィーに続き、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５１０四極子飛行時間型質量分析計（Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ）に連結したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを用いた質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によっておこなった。いずれのシステムもＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎによって制御した。Ｗａｔｅｒｓ ＸＳＥＬＥＣＴ ＣＳＨ １３０ Ｃ１８カラム（１５０×２．１ｍｍ）を用いてＬＣ分離を行い、カラム温度を４０℃に設定した。移動相Ａは、５％アセトニトリル、０．１％プロピオン酸、および０．０２％ＴＦＡから成り、移動相Ｂは、９５％アセトニトリル、０．１％プロピオン酸および０．０２％ＴＦＡからなる。０％〜１０％Ｂの勾配で１０分間、次いで１０％〜７０％Ｂでさらに２５分間、０．２ｍＬ／分の流速で使用した。注入量は１０μＬであった。Ｑ−ＴＯＦは、正のエレクトロスプレーイオンモードで操作した。データ取得の過程で、フラグメンター電圧、スキマー電圧、およびオクトポールＲＦはそれぞれ９０、６５および６５０Ｖに設定した。質量範囲は３００〜２８００ｍ／ｚであった。
【０１２４】
以下の分析を、スルファミダーゼ調製物のためだけにおこなった。
スルファミダーゼの動的光散乱（ＤＬＳ）分析：修飾スルファミダーゼを１２０００ｒｐｍで３分間室温（ＲＴ）遠心分離することによって脱気した。ＤｙｎａＰｒｏ Ｔｉｔａｎ装置（Wyatt Technology Corp）上で２５％レーザー出力を用いて、それぞれ７５μＬを３回反復でＤＬＳ実験をおこなった。スルファミダーゼのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析：修飾酵素をＡＫＴＡｍｉｃｒｏシステム（GE Healthcare）で実施した、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。４０μＬ／分の製剤緩衝液の流速を有するＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＰＣ ３．２／３０カラムを使用した。サンプル量は１０μＬであり、１０μｇの酵素を含有していた。
【０１２５】
ゲル内消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、いくつかの余分なバンドが明らかとなり、切り取り、脱染色し、トリプシンを用いたゲル内消化で処理した。３７℃で一晩消化した。上清を新しいチューブに移し、室温で６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ（３×２０分）で抽出した。得られた上清をＳｐｅｅｄ Ｖａｃで乾燥近くまで蒸発させた。濃縮溶液をα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）と１：１で混合し、０．６μＬをＭＡＬＤＩプレートに適用した。
【０１２６】
Ｓｃｉｅｘ ５８００マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ）を用いてトリプシンペプチドフラグメントの分子質量を測定した。分析は、３５５０ショットおよび４００ショットのレーザーエネルギーを用いた陽イオンリフレクトロンモードでおこなった。
【０１２７】
活性部位の保存：スルファミダーゼの活性部位に対する化学修飾の影響をＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いて調べた。サンプルは、グリコシル化分析セクションに記載されたＬＣ−ＭＳ法に従って調製した。システイン５０変異体（システイン５０（アルキル化）、酸化システイン５０、ＦＧｌｙ５９およびＳｅｒ５０）を含む得られたトリプシンペプチドを、再構成されたイオンクロマトグラムを利用して半定量化した。ペプチドの同一性は、ＭＳＭＳシークエンスによって確認した。ＭＳＭＳパラメータは、以下の通りであった：衝突エネルギーを１０、１５、２０Ｖ、走査範囲１００〜１８００ｍ／ｚ、スキャン速度１スキャン／秒に設定した。
【０１２８】
結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で明らかなように、全長タンパク質とは異なるサイズのいくつかの主要なペプチドが、既知の方法による化学修飾の結果、形成された（図２Ａ）。ペプチド切断生成物を表している低分子量のペプチドバンドが、３種類のリソソームタンパク質のすべて明らかであったが、それは、スルファミダーゼに関して最も際立っていた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された４つのゲルバンド＃１−４（図２Ａ、レーン２）は、化学修飾中に鎖切断によって生成されたスルファミダーゼのフラグメントとして同定することができた。ゲルバンド＃１および＃２は、化学修飾の結果形成された、６ｋＤａおよび３０ｋＤａの分子量を有する２つのＣ末端トランケーションとして、ゲルバンド＃３は１つの４１ｋＤａのＮ末端トランケーションとして決定された。
【０１２９】
また、公知の方法による化学修飾により、スルファミダーゼ上のいくつかのメチオニン残基、特に、ほぼ完全に酸化された、メチオニン１８４およびメチオニン４４３に酸化が導入されることも見出された。メチオニン２２６（アミノ酸残基２２６〜２３８に対応するトリプシンペプチドに見出される）は、はるかに低い程度しか酸化されないが、この酸化はスルファミダーゼよりも不安定なタンパク質を生じ、４１ｋＤａのＮ末端トランケーションを生じる。従って、ＭＳ分析で観察されるように、メチオニン２２６の酸化および鎖切断は相関しているようであった。
【０１３０】
特に、既知の方法による化学修飾の結果として共有結合による多量体形成を示す高分子量のバンドは、３種類のリソソームタンパク質のすべてで明らかであった。スルファミダーゼに関しては、主なバンドは１１１ｋＤａの分子量の二量体として同定され得る（図２Ａ、レーン２、バンド＃４）。最も重大な多量体形成は、α−Ｌ−イズロニダーゼに関して見られた（図２Ａ、レーン６）。
【０１３１】
従って、既知の方法（ＷＯ２００８／１０９６７７）によるスルファミダーゼの化学修飾が、グリカンを修飾するだけではなく、ポリペプチド鎖切断、共有結合による多量体形成、および酵素の構造的完全性に重要なアミノ酸部分の酸化も生じることがわかった。
【０１３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析はまた、未修飾タンパク質と比較したときに、３種類のリソソームタンパク質の全てに関して、主たるモノマーバンドの位置の共通する低下も明確に示した（図２Ａレーン１対レーン２；レーン３対レーン４；レーン５対レーン６）。これは、約５００〜１５００Ｄａの分子量の低下を示唆しており、主にグリカン部分が二重結合切断によって修飾される化学反応が予想される（図８）。
【０１３３】
ＳＥＣによるスルファミダーゼのさらなる分析は、既知の方法による化学修飾手順が、図３Ａのクロマトグラムのプレピークとして示されるように、スルファミダーゼの凝集を促進することを明らかにした。クロマトグラムにおけるプレピークのピーク高さは、主ピークの高さの約３％であることが見出された。さらに、ＤＬＳ分析は、同じ物質が、高分子量形態（すなわち、１０１０ｋＤａを超える）の全タンパク質含量の１５〜２０％のタンパク質を含有することを明らかにした（図４Ａ）。
【０１３４】
さらに、ＬＣ−ＭＳＭＳの使用により、還元ステップ（図１Ａ）は、スルファミダーゼ（配列番号４４）の活性部位５０位のＦＧｌｙ残基をＳｅｒに還元することが判明した。この位置のＳｅｒは、効率的な触媒作用に適合しない（Recksiek et al,J Biol Chem 273(11): 6096-103 (1998)）。ＦＧｌｙから生成した相対量のＳｅｒを、ＦＧｌｙ５９およびＳｅｒ５０を含む２つのトリプシンペプチド断片に対応する、質量スペクトル中の二価荷電イオンのピーク面積測定に基づいて推定した。ピーク面積は、イオン化効率の補正を伴わないＭＳ反応に基づくものであった。以下の表２は、既知の方法（実施例４、表３も参照）によるＦＧｌｙからＳｅｒへの変換率が約５６％であることを示す。
【０１３５】
【表２】
2018535654.tif 000010
【０１３６】
従って、上記の修飾に加えて、既知の化学修飾手順は、スルファミダーゼの触媒活性にとって重要なアミノ酸残基の還元を引き起こす。ＦＧｌｙ残基は、すべてのスルファターゼに存在し、酵素活性に重要である。
【０１３７】
トリプシン断片のＬＣ／ＭＳによるグリカン分析は、グリカンの完全な修飾を示す、非天然グリカンが化学修飾後に試験したリソソームタンパク質に存在しないことを確認した。
【０１３８】
実施例３：
リソソーム酵素スルファミダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、およびイズロン酸２−スルファターゼの化学修飾のための新規方法
新規方法１による化学修飾：上記リソソームタンパク質を、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液中にて、２０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムと０℃にて１２０分間暗所にてインキュベートすることにより酸化した。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止させた。クエンチングを６℃にて１５分間進行させ、その後、反応混合物に水素化ホウ素ナトリウムを５０ｍＭの最終濃度まで添加した。暗所にて０℃にて１２０分間インキュベートした後、得られたタンパク質調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０に対して限外濾過をおこなった。化学修飾のための新規方法１を図１Ｂに示す。
【０１３９】
新規方法２による化学修飾：上記リソソームタンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３７ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中にて、１５ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムと０℃にて０．５時間インキュベートすることにより酸化した。エチレングリコールを最終濃度９６ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止させた。０℃にて１５分間クエンチングを進行させた。その後、反応液に水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度が３８ｍＭになるまで加え、得られた混合物を０℃にて０．５時間保持した。最後に、得られた酵素調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０に対して限外濾過した。すべてのインキュベーションを暗所にておこなった。化学修飾のための新規方法２を図１Ｃに示す。
【０１４０】
新規方法３による化学修飾：上記リソソームタンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３７ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中にて、１０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムと０℃にて０．５時間インキュベートすることにより酸化した。エチレングリコールを最終濃度９６ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止させた。０℃にて１５分間クエンチングを進行させた。その後、反応液に水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度が１５ｍＭになるまで加え、得られた混合物を０℃にて１時間保持した。最後に、得られた酵素調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０に対して限外濾過した。すべてのインキュベーションを暗所にておこなった。化学修飾のための新規方法３を図１Ｄに示す。
ここで、以下の新規方法に関する実施例を、１種類の特定のリソソーム酵素を用いて評価および例示した。
【０１４１】
新規方法４：スルファミダーゼについて例示する。還元ステップにおける水素化ホウ素ナトリウムの濃度が１０ｍＭであったことを除き、新規方法１のように実施した。
【０１４２】
新規方法５：スルファミダーゼについて例示する。スルファミダーゼを、初期のｐＨが４．５〜６の酢酸塩緩衝液中、０℃、暗所で１８０分間、メタ過ヨウ素酸ナトリウム１０ｍＭと共にインキュベートすることによって酸化させた。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化をクエンチングした。反応混合液に水素化ホウ素ナトリウムを２５ｍＭの最終濃度まで添加する前に、６℃にて１５分間クエンチングを進行させた。暗所にて０℃にて６０分間インキュベートした後、得られたスルファミダーゼ調製物を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して限外濾過した。
【０１４３】
新規方法６：スルファミダーゼについて例示する。スルファミダーゼを、初期ｐＨ４．５の酢酸緩衝液中、暗所で８℃にて、１０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムと共に６０分間インキュベートすることによって酸化させた。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化をクエンチングした。反応混合液に水素化ホウ素ナトリウムを２５ｍＭの最終濃度まで添加する前に、６℃にて１５分間クエンチングを進行させた。暗所にて０℃にて６０分間インキュベートした後、得られたスルファミダーゼ調製物を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して限外濾過した。
【０１４４】
新規方法７：スルファミダーゼについて例示する。スルファミダーゼを、初期ｐＨ４．５の酢酸塩緩衝液中、暗所にて８℃にて、１０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムと共にインキュベートすることにより酸化させた。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化をクエンチングした。反応混合液に水素化ホウ素ナトリウムを２５ｍＭの最終濃度まで添加する前に、６℃にて１５分間クエンチングを進行させた。暗所にて０℃にて３０分間インキュベートした後、得られたスルファミダーゼ調製物を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して限外濾過をおこなった。
【０１４５】
新規方法８：α−Ｌ−イズロニダーゼについて例示する。α−Ｌ−イズロニダーゼを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３７ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中にて、１５ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムと０℃にて２０分間インキュベートすることにより酸化した。エチレングリコールを最終濃度９６ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止させた。０℃にて１５分間クエンチングを進行させた。その後、反応液に水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度が３７ｍＭになるまで加え、得られた混合物を０℃にて１時間保持した。最後に、得られた酵素調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０に対して限外濾過した。すべてのインキュベーションを暗所にておこなった。
【０１４６】
新規方法９：α−Ｌ−イズロニダーゼについて例示する。反応条件は、新規方法８について記載したとおりのものであったが、酸化工程中に保護リガンドとして機能する、過ヨウ素酸酸化を１００μＭの４−メチルウンベリフェロンイズロニダーゼの存在下で実施したというただ一つの例外を伴った。
【０１４７】
結果
既に本明細書の他の部分で説明したように、メタ過ヨウ素酸ナトリウムは、炭水化物のｃｉｓ−グリコール基をアルデヒド基に変換する酸化剤であるのに対し、水素化ホウ素塩は、アルデヒドをより不活性なアルコールに還元する還元剤である。従って、炭水化物構造は不可逆的に破壊される。
【０１４８】
グリカンの化学修飾の改良方法を提供するために、特に改善された特性を有する修飾リソソームタンパク質を提供する手順を提供するために、異なる反応条件が評価された。メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化と水素化ホウ素ナトリウムによる還元の両方が、触媒活性および免疫原性傾向に悪影響を与える特性の、ポリペプチドの修飾および凝集を導入したと結論付けることができた。
【０１４９】
改善された化学修飾手順についての条件を発見した（新規方法１〜９によって例示する）。驚いたことに、リソソームタンパク質の構造的完全性および活性は、水素化ホウ素ナトリウム還元ステップが、メタ過ヨウ素酸ナトリウム酸化のクエンチングの直後に続き、かつ、反応物質濃度および反応時間のバランスを保ち、既知の方法と比較して顕著に低い／短いという状況で維持できる。新規方法は、リソソームタンパク質の緩衝液交換および反応性アルデヒド中間体への長時間の暴露を省略した。新規化学修飾手順の例を図１Ｂ〜１Ｄに示す。
【０１５０】
実施例４：
新規方法に従って修飾したスルファミダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、およびイズロン酸２−スルファターゼの分析
実施例２に記載の実験法を、新規方法に従って修飾したリソソームタンパク質を分析するために使用した。
【０１５１】
結果
ペプチド切断生成物を表す低分子量のペプチドバンドは、ごくわずかな程度ではあったが、新規方法に従って修飾された材料についても明らかであった（図２Ｂ、レーン１対レーン２；レーン３対レーン４；レーン５対レーン６、７、および８）。新規方法８に従って修飾されたα−Ｌ−イズロニダーゼに関して、モノマーのバンドだけが明らかであった（図２Ｂレーン７）。重要なことに、活性部位を保護するリガンドの使用（新規方法９、図２Ｂレーン８）は、手順に適合し、リガンドが省略された場合がＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって区別可能である修飾α−Ｌ−イズロニダーゼをもたらした（新規方法８）。
【０１５２】
結論として、修飾方法によって製造される薬物の工程に関連した不純物、品質の制限および安全性は、既知の方法と比較して、新規方法によって顕著に低減される。
【０１５３】
選択されたトリプシンペプチド断片のグリカン分析は、化学修飾後に天然のグリカン構造が存在しないか、または場合によっては５％未満しか存在しないことを示し、グリカン修飾の完了または完了に近いことを暗示した。
【０１５４】
ＳＥＣによるスルファミダーゼのさらなる分析は、新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼは、既知の方法によって修飾されたスルファミダーゼと比較して凝集体が少ないことを示した。これは、図３のクロマトグラムで実証されており、高分子量の形態がクロマトグラムにプレピークとして存在している。図３Ｂのプレピークのピーク高さは、メインピーク高さに対して０．５％であり、図３Ａのピーク高さ（３％）と比較して減少している。これは、新規方法５および６によって修飾されたスルファミダーゼの場合にも当てはまる（データ未掲載）。ＤＬＳ分析（図４Ｂ）は、ＳＥＣ分析の結果を確認した。新規方法に従って製造されたスルファミダーゼは、高分子量形態（１０１０ｋＤａ以上）で５％のタンパク質を含有した。従って、スルファミダーゼの凝集の形成は、新規方法によって制限されると結論づけることができた。
【０１５５】
スルファミダーゼを活性部位の保存の程度を評価することによってさらに試験した：スルファミダーゼの活性部位における位置５０のＦＧｌｙからＳｅｒへの還元をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定し、ＦＧｌｙおよびＳｅｒを含有するトリプシンペプチドを陽性に同定した。ペプチドフラグメントの相対量を、二重荷電イオンの再構成イオンクロマトグラムからのピーク面積（イオン化効率の補正なし）を測定することによりＬＣ−ＭＳで分析した。化学修飾のために実施例３に記載した４種類の新規方法によって生成された試料を調製し、二連または三連で分析した（表３）。
【０１５６】
【表３】
2018535654.tif 000011
【０１５７】
活性部位ＦＧｌｙの欠損は、新規方法によってかなり制限される。スルファミダーゼ上のグリカンを修飾する４種類の新規方法は、ＷＯ２００８／１０９６７７に記載の手順を用いた５６％（表２、実施例２参照）から、４５％、４４％、および３４％（それぞれ新規方法１、５、および６、表３）までＳｅｒ形成量を有意に減少させた。新規方法４のＳｅｒ形成は約１１％であり、従ってＦＧｌｙのＳｅｒへの変換は水素化ホウ素ナトリウム濃度に大きく依存することが示された。
【０１５８】
実施例５：
インビトロでの化学的に修飾したリソソームタンパク質の受容体媒介エンドサイトーシス
【０１５９】
材料と方法
スルファミダーゼを、公知の方法、ならびに新規方法１および４に従って調製し、修飾した（実施例１および３）。エンドサイトーシスはＭ６Ｐ受容体を発現するＭＥＦ−１線維芽細胞で評価した。ＭＥＦ−１細胞を、７５ｎＭのスルファミダーゼを補充したＤＭＥＭ培地中で２４時間インキュベートした。細胞をＤＭＥＭで２回、０．９％ＮａＣｌで１回洗浄した後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を用いて細胞溶解した。溶解物スルファミダーゼ活性および総タンパク質含量を決定し、溶解物比活性を計算した。活性は、１４．５ｍＭジエチルバルビツール酸、１４．５ｍＭ酢酸ナトリウム、０．３４％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、および０．１％ＢＳＡ中の基質として、０．２５ｍＭ ４メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−Ｎ−スルホグルコサミニドを用いて、４６０ｎｍの蛍光強度でモニターした。全タンパク質濃度は、標準としてＢＳＡを含むＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として示される。
【０１６０】
結果
エンドサイトーシスアッセイで評価された全ての調製物について、細胞ホモジネート中でスルファミダーゼ活性を検出することができた。既知の方法ならびに新規の方法１および２によって調製された修飾スルファミダーゼは、未修飾組換えスルファミダーゼで得られたものの１０％未満の細胞ホモジネートで特異的活性を示した（図５）。スルファミダーゼとともに最初にロードされ、次いでスルファミダーゼの非存在下で２日間増殖された細胞に保持された活性は、化学修飾がリソソームの安定性に悪影響を及ぼさないことを示す全ての調製物と同等であった。
【０１６１】
従って、化学修飾により、Ｍ６ＰＲとしてのグリカン認識受容体に対するエピトープの除去の結果、スルファミダーゼの細胞への取り込みが起こりにくくなると結論付けることができる。巨視的レベルでは、この分子相互作用の喪失は、静脈内投与された場合に、血漿からのクリアランスの減少につながる。タンパク質クリアランスの減少は、患者への投与頻度を低減することが可能となる。修飾α−Ｌ−イズロニダーゼおよびイズロン酸２−スルファターゼで同様の結果を得た（データ未掲載）。
【０１６２】
実施例６：
新規方法に従って修飾したリソソームタンパク質スルファミダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、およびイズロン酸２−スルファターゼのインビボでの血漿／血清クリアランス
【０１６３】
材料と方法
生活相において：血漿／血清クリアランス（ＣＬ）を、未修飾、修飾リソソームタンパク質スルファミダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、およびイズロン酸２−スルファターゼについてマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）において調査した。マウスには、尾静脈に単回静脈内投与した。投与後２４時間までの異なる時点（時間点あたり３匹のマウス）で、血液サンプルを採取し、そして、血漿／血清を調製した。リソソーム酵素の血漿／血清レベルを電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイによって分析した。血漿クリアランスは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアバージョン６．３（非コンパートメント分析、Phoenix, Pharsight Corp., USA）を用いて計算した。
【０１６４】
スルファミダーゼおよび新規方法１に従って修飾したスルファミダーゼに関しては、用量は、２ｍｇ／ｍＬにて処方し、５ｍＬ／ｋｇにて投与した１０ｍｇ／ｋｇであった。イズロン酸２−スルファターゼおよび新規方法２に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼに関しては、用量は、０．２ｍｇ／ｍＬにて処方し、５ｍＬ／ｋｇにて投与した１ｍｇ／ｋｇであった。α−Ｌ−イズロニダーゼおよび新規方法３に従って修飾したα−Ｌ−イズロニダーゼに関しては、用量は、０．６ｍｇ／ｍＬにて処方し、５ｍＬ／ｋｇにて投与した３ｍｇ／ｋｇであった。
【０１６５】
ＥＣＬによるスルファミダーゼおよび修飾スルファミダーゼの定量：血漿ＰＫサンプル中のスルファミダーゼおよび修飾スルファミダーゼを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームを用いたＥＣＬイムノアッセイにより決定した。ストレプトアビジン被覆ＭＳＤプレートをＰＢＳ中の５％ブロッカー−Ａでブロックした。プレートを洗浄し、標準およびＰＫサンプルの異なる希釈液をプレートに分注した。ビオチン化抗スルファミダーゼマウスモノクローナル抗体とＳｕｌｆｏ−Ｒｕ−標識ウサギ抗スルファミダーゼ抗体との混合物を加え、プレートを室温でインキュベートした。スルファミダーゼおよび標識抗体の複合体は、ビオチン化ｍＡｂを介してストレプトアビジン被覆プレートに結合するであろう。洗浄後、ウェルに読み取り緩衝液を添加することによって結合複合体量を決定し、プレートをＭＳＤ ＳＩ２４００装置で読み取った。記録されたＥＣＬカウントは、試料中のスルファミダーゼの量に比例し、比較のスルファミダーゼ標準に対して評価した。
【０１６６】
ＥＣＬによるα−Ｌ−イズロニダーゼおよび修飾α−Ｌ−イズロニダーゼの定量：血漿ＰＫサンプル中のα−Ｌ−イズロニダーゼおよび修飾α−Ｌ−イズロニダーゼを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームを用いたＥＣＬイムノアッセイにより決定した。９６ウェルストレプトアビジン金プレート（＃Ｌ１５ＳＡ−１、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ））のウェルを、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中の１％のＦｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎでブロッキングし、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、そして、ビオチン化、アフィニティー精製ヤギ−ａ−ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼポリクローナル抗体（ＢＡＦ２４４９、R&D）と共にインキュベートし、洗浄後に、サンプル希釈剤（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０＋１％のＣ５７ＢＬ６血清プール中の１％のＦｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎ）中の標準およびＰＫサンプルの様々な希釈物を、プレート内で７００ｒｐｍの振盪、ＲＴにて２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、α−Ｌ−イズロニダーゼ特異的Ｒｕｔｅｎｉｕｍ（ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ、ＭＳＤ）タグ付与ヤギポリクローナル抗体（ＡＦ２４４９、R&D）を加え、捕捉されているα−Ｌ−イズロニダーゼまたは化学修飾α−Ｌ−イズロニダーゼに結合させた。プレートを洗浄し、そして、２×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ）を加えた。プレート内容物を、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ２４００ Ｉｍａｇｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して分析した。該器具は、プレート電極に電位をかけ、形成された免疫複合体を介して電極面に結合したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識を発光させる。器具は、サンプル中のα−Ｌ−イズロニダーゼまたは化学修飾α−Ｌ−イズロニダーゼの量に比例する発光強度を計測する。α−Ｌ−イズロニダーゼまたは化学修飾α−Ｌ−イズロニダーゼの量を、関連するα−Ｌ−イズロニダーゼまたは化学修飾α−Ｌ−イズロニダーゼ標準に対して決定した。
【０１６７】
ＥＣＬによるイズロン酸２−スルファターゼおよび修飾イズロン酸２−スルファターゼの定量：血漿ＰＫサンプル中のイズロン酸２−スルファターゼおよび修飾イズロン酸２−スルファターゼを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームを用いたＥＣＬイムノアッセイにより決定した。９６ウェルストレプトアビジン金プレート（＃Ｌ１５ＳＡ−１、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ））のウェルを、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中の１％のＦｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎでブロッキングし、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、そして、ビオチン化、アフィニティー精製ヤギ−ａ−ヒトイズロン酸２−スルファターゼポリクローナル抗体（ＢＡＦ２４４９、R&D）と共にインキュベートし、洗浄後に、サンプル希釈剤（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０＋１％のＣ５７ＢＬ６血清プール中の１％のＦｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎ）中の標準およびＰＫサンプルの様々な希釈物を、プレート内で７００ｒｐｍの振盪、ＲＴにて２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、イズロン酸２−スルファターゼ特異的Ｒｕｔｅｎｉｕｍ（ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ、ＭＳＤ）タグ付与ヤギポリクローナル抗体（ＡＦ２４４９、R&D）を加え、捕捉されているイズロン酸２−スルファターゼまたは化学修飾イズロン酸２−スルファターゼに結合させた。プレートを洗浄し、そして、２×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ）を加えた。プレート内容物を、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ２４００ Ｉｍａｇｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して分析した。該器具は、プレート電極に電位をかけ、形成された免疫複合体を介して電極面に結合したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識を発光させる。器具は、サンプル中のイズロン酸２−スルファターゼまたは化学修飾イズロン酸２−スルファターゼの量に比例する発光強度を計測する。イズロン酸２−スルファターゼまたは化学修飾イズロン酸２−スルファターゼの量を、関連するイズロン酸２−スルファターゼまたは化学修飾イズロン酸２−スルファターゼ標準に対して決定した。
【０１６８】
結果
修飾スルファミダーゼ、イズロン酸２−スルファターゼ、およびα−Ｌ−イズロニダーゼのマウスにおける血漿／血清クリアランスは、未修飾対応物と比較して有意に低下した（下記表４参照）。これはおそらく、少なくとも部分的に、化学修飾後の末梢組織における受容体媒介性取り込み阻害によるものであろう。
【０１６９】
【表４】
2018535654.tif 000012
【０１７０】
実施例７：
脳ヘパラン硫酸蓄積に対する修飾スルファミダーゼのインビボ効果
【０１７１】
材料および方法
インビボでの脳ヘパラン硫酸蓄積に関し、全体的な材料と方法に記載のようにＱｕａｔｔｒｏｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Icosagen AS）で産生し、実施例３の新規方法１に従って修飾した修飾スルファミダーゼの静脈内（ｉｖ）投与の効果を調べた。
【０１７２】
試験物の調製：修飾スルファミダーゼを６ｍｇ／ｍＬで調製し、滅菌濾過し、使用するまで−７０℃にて凍結させた。凍結修飾スルファミダーゼおよび対応するビヒクル溶液を、注射する日に使用前に室温で最低１時間、最高２時間解凍した。クロロフェニラミンを等張食塩水に０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、−２０℃にて保存した。
【０１７３】
動物：ｍｐｓ３ａ遺伝子に自発的ホモ接合突然変異を有する雄マウス、Ｂ６．Ｃｇ−Ｓｇｓｈｍｐｓ３ａ／ＰｓｔＪ（ＭＰＳ−ＩＩ）（Jackson Laboratories, ME, USA）を使用した。動物は２３±１℃および湿度４０〜６０％のケージに単独で飼育し、水および標準実験室用飼料を自由に摂取した。１２時間／１２時間の明／暗サイクルは、午後７時に点灯するように設定した。研究を開始する前に、動物を少なくとも２週間調整した。同じ育種単位由来の野生型兄弟を対照として含めた。研究Ａでは、マウスは２３〜２４週齢であったが、研究Ｂではマウスは９〜１０週齢であった。
【０１７４】
実験手順研究Ａ：３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）およびビヒクル（ｎ＝７）の修飾スルファミダーゼを、ＭＰＳ−ＩＩマウスに２５日間、２日に１度（１３回の注射）静脈内投与した。修飾スルファミダーゼまたはビヒクルの投与の３０〜４５分前に、クロルフェニラミンを皮下投与した（２．５ｍｇ／ｋｇ）。投薬は、朝の７時頃に開始した。試験品およびビヒクルを５ｍＬ／ｋｇで投与した。最終投与量は、各投与機会において実際の体重に対して補正した。このスキームはビヒクルにも繰り返した。この試験は、最後の注射の２時間後に終了した。未処置の月齢が一致した野生型マウス（ｎ＝５）を、試験物質処置群と併せて含めた。マウスをイソフルランで麻酔した。血液は後眼窩叢から採取した。灌流後、心臓の左心室に２０ｍＬの生理食塩水を流した。組織を解剖（脳、肝臓、脾臓、肺、および心臓）し、秤量し、液体窒素中で急速に凍結させた。組織および血液は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてヘキソサミンＮ−硫酸［α−１，４］ウロン酸（ＨＮＳ−ＵＡ）レベルを測定するために調製した。ＨＮＳ−ＵＡはヘパラン硫酸蓄積の二糖マーカーであり、従ってＨＮＳ−ＵＡレベルの減少はヘパラン硫酸の分解を反映する。ＨＮＳ−ＵＡデータは、ｍｇ組織当たりで表され、対照群の平均に対して標準化し、相対的単位対内部標準で計算した。全体的な有意性が、グループ間の有意性の試験のためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定でも実証された場合、データは一元配置ＡＮＯＶＡ検定によって分析した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０１７５】
実験手順研究Ｂ：３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）、１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）の修飾スルファミダーゼおよびビヒクル（ｎ＝６）をＭＰＳ−ＩＩマウスに週１回１０週間（１０回）静脈内投与した。修飾スルファミダーゼまたはビヒクルの投与の３０〜４５分前に、クロルフェニラミンを皮下投与した（２．５ｍｇ／ｋｇ）。最終投与量は、各投与機会において実際の体重に対して補正した。このスキームをビヒクルにも繰り返した。研究は最後の注射の２４時間後に終了した。未処置の月齢が一致した野生型マウス（ｎ＝６）を、試験物処置群と併せて含めた。マウスをイソフルランで麻酔した。血液は後眼窩叢から採取した。灌流後、心臓の左心室に２０ｍＬの生理食塩水を流した。組織を解剖（脳、肝臓、脾臓）し、秤量し、液体窒素中で迅速に凍結させた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてＨＮＳ−ＵＡレベルを測定するために組織および血液を調製した。ＨＮＳ−ＵＡデータは、ｍｇ組織当たりで表し、対照群の平均に対して標準化し、相対的単位対内部標準で計算した。全体的な有意性が、グループ間の有意性の試験のためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定でも実証された場合、データは一元配置ＡＮＯＶＡ検定によって分析した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０１７６】
組織試料のＨＮＳ−ＵＡのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：組織試料中のヘキソサミンＮ−硫酸［α−１，４］ウロン酸（ＨＮＳ−ＵＡ）の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析は、Fullerら（Pediatr Res 56:733-738(2004)）およびRamsayら（Mol Genet Metab 78:193-204(2003)）に記載された方法に従って部分的に実施した。Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄ装置（MP Biomedicals、LCC、Ohaio、US）を用いて、基質緩衝液（２９ｍＭジエチルバルビツール酸、２９ｍＭ酢酸ナトリウム、０．６８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１００ｍＬ水、ｐＨ６．５）中でホモジナイズした。Ｓａｖａｎｔ ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０／Ｂｉｏ１０１ホモジナイザー（LabWrench、ON、Canada）で２５秒間ホモジナイズし、ホモジネートを１００００ｒｃｆにてエッペンドルフ遠心分離機５４１７Ｒで遠心分離した。上清を蒸発乾固させた。１５０μLの誘導化溶液（２５０ｍＭの３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（ＰＭＰ）、４００ｍＭのＮＨ３、ｐＨ９．１）および内部標準コンドロイチン二糖Δジ−４Ｓナトリウム（ΔＵＡ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ、０．１ｍｇ／ｍＬ）ストック溶液を添加した。誘導は、７０℃にて９０分間攪拌した後、溶液を２００μＬの８００ｍＭギ酸で酸性化した。脱イオン水を試料に加えて最終容量５００μＬとし、抽出をクロロホルム（３×５００μＬ）で行い、過剰のＰＭＰを除去した。遠心分離を１３０００×ｇで５分間行い、上相を新しいバイアルに移した。過剰のギ酸およびＮＨ４ＣＯＯＨを除去するために、水相をスピードバック（Savant Instruments Inc.、Farmingdale、NY）で蒸発乾固させた。サンプルを合計１００μＬの５％アセトニトリル／０．１％酢酸／０．０２％ＴＦＡに再構成した。
【０１７７】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００三重四極子質量分析計に連結したＷａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＰＬＣ）でおこなった。機器の制御、データの取得と評価はＡｎａｌｙｓｔソフトウェアでおこなった。
【０１７８】
Ａｃｑｕｉｔｙ Ｃ１８ ＣＳＨカラム（５０×２．１ｍｍ、１．７μｍ）を用いてＬＣ分離をおこなった。移動相Ａは５％アセトニトリル／０．５％ギ酸から成り、移動相Ｂは９５％アセトニトリル／０．５％ギ酸から構成された。７分間で１％〜９９％Ｂの勾配を流速０．３５ｍＬ／分で使用した。注入量は１０μＬであった。ＡＰＩ４０００は、エレクトロスプレー陰イオン多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作した。イオンスプレー電圧は４．５ｋＶで動作し、ソース温度は４５０℃にてあった。アルゴンを衝突ガスとして使用した。衝突エネルギーは３４Ｖであった。ＭＲＭ遷移は７６４．４／３３１．２（ＰＭＰ−ＨＮＳ−ＵＡ）および７８８．３／５３４．３（ＰＭＰ−内部標準）であった。ＨＮＳ−ＵＡの相対量は、内部標準のレベルに対して計算した。
【０１７９】
結果
図６Ａに示される研究Ａの結果は、新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼが、３０ｍｇ／ｋｇの用量で２５日間、１日おき（１３回）に静脈内投与を繰り返した後に脳内のＨＮＳ−ＵＡのレベルを３０％減少させることを示している。
【０１８０】
さらに、修飾スルファミダーゼによる処理は、肝臓（図６Ｂ）および肺（図示せず）におけるＨＮＳ−ＵＡレベルを完全に消失させた。
【０１８１】
研究Ｂの結果は図６Ｃに示されており、新規方法１による修飾スルファミダーゼは、週３０ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで１０週間それぞれ繰り返し静脈内投与した後、脳内のＨＮＳ−ＵＡレベルを４８％および１４％減少させることを示している。
【０１８２】
従って、これらの結果は、本明細書に記載の新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼタンパク質が、長期治療後に、脳におけるＨＮＳ−ＵＡレベルの堅牢な低下、ならびに末梢器官におけるＨＮＳ−ＵＡレベルの本質的に完全な低下を引き起こすことを実証する。
【０１８３】
実施例８：
スルファミダーゼ修飾の最適化
【０１８４】
化学修飾ステップは、酸化ステップが第１ステップであり（以下ではＲ１と称される）、還元が第２ステップである（Ｒ２で表される）２つの部分に分けられる。２つのステップを最適化するために、２つのステップの温度、濃度、および時間の影響を調べる完全な設計の実験（ＤｏＥ）を設定した。
【０１８５】
材料および方法
Ｑｕａｔｔｒｏｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Icosagen AS）において実施例１に記載のように製造したスルファミダーゼは、新規方法１に関して本質的に実施例３に記載したように修飾したが、調査するパラメータは、表５（以下）に従って変更した。Ｒ１の調査は、実施例３（新規方法１）に記載されているのと同様の減少およびパラメータ精密検査（ｗｏｒｋ−ｕｐ）を実施した。分析のエンドポイントは、実施例２に記載されたグリカンの酸化の程度、および実施例５に記載の修飾タンパク質の細胞取り込みのレベルである。
【０１８６】
【表５】
2018535654.tif 000013
【０１８７】
パラメータの数および選択された設計のタイプにより、各ステップについて１０回の実験が行われ、その結果はＭＯＤＤＥ １０ソフトウェア（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ ＡＢ）を用いて評価した。
【０１８８】
さらに、第２のクエンチングステップの影響を、Ｒ１パラメータ８℃、６０分および２０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムで生成したスルファミダーゼについて試験した。ＤｏＥ実験と並行して２つのさらなる反応を行い、０．１Ｍアセトンを用いて、またはｐＨ６．０以下になるまで酢酸を添加することによってクエンチングした。最後の精密検査は、他の反応のスキームに従った。このようにして製造されたスルファミダーゼを、実施例５に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて評価した。
【０１８９】
Ｒ２実験は、Ｒ１のＤｏＥ分析後に最適であることが判明したパラメータに従って修飾されたスルファミダーゼを用いておこなった。
【０１９０】
結果
Ｒ１の結果を以下の表６に要約する。
【０１９１】
【表６】
2018535654.tif 000014
【０１９２】
さらに、実施例２によるグリコシル化分析は、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼについて実施した。残存する元のＮ−グリカンは、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ（２１）、Ｎ（１３１）、Ｎ（２４４）およびＮ（３９３）で検出されなかった。
【０１９３】
Ｒ１（酸化）のＭＯＤＤＥ評価は、約８℃の温度、約１時間の反応持続時間および約１０ｍｍｏｌ／Ｌのメタ過ヨウ素酸ナトリウムの濃度でＲ１に最適性を示した。タンパク質全体の健康状態（例えば、構造的完全性）は、グリカン認識受容体を介した細胞取り込みを新規方法１のレベルに制限する、可能な限り低い酸化剤濃度より利益を得るようである（詳細については実施例５を参照）。
【０１９４】
Ｒ１反応時間に関して開示された種々の条件が、グリカン修飾の程度の重要なパラメータと考えられた。さらに、過ヨウ素酸濃度は、グリカン修飾の程度に影響を及ぼし得る。
【０１９５】
従って、Ｒ２（還元）設計は、Ｒ１についての上記同定された好ましいパラメータを使用した。すなわち、スルファミダーゼの酸化に使用した。Ｒ２の重要な終点は、修飾スルファミダーゼの活性に影響を及ぼすことが判明しているので（実施例２および４参照）、ＦＧｌｙ含量である。結果は下記の表７を参照のこと。ＦＧｌｙ５９およびＳｅｒ５０を含有するペプチドフラグメントの相対量を、ＬＣ−ＭＳを用いて再構成されたイオンクロマトグラム（イオン化効率の補正なし）からピーク面積を測定することによって分析した。
【０１９６】
【表７】
2018535654.tif 000015
【０１９７】
Ｒ２のＤｏＥは、Ｓｅｒ形成が水素化ホウ素ナトリウムの濃度および温度に関連することを示した。Ｓｅｒ形成および高分子量形態の存在を考慮に入れると（データは示さない、結果は実施例３の新規方法４について得られたものと類似している）、Ｒ２の好ましい条件は、約０℃の温度、反応時間が約１時間以下、および水素化ホウ素ナトリウム濃度が１２ｍｍｏｌ／Ｌ超５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。
【０１９８】
還元ステップがクエンチングされた反応で生成されたスルファミダーゼが、クエンチングなしで生成されたスルファミダーゼに匹敵することがＳＤＳ−ＰＡＧＥ（データ示さず）で確認された。これは、０．１Ｍアセトンでクエンチングすること、または酢酸を添加してｐＨ６未満に低下させることによる第２のクエンチングステップの導入が、材料の品質に悪影響を及ぼさないことを示す。
【０１９９】
実施例９：
既知の方法によるスルファミダーゼの化学修飾後のグリカン構造解析
【０２００】
材料と方法
既知の方法による化学修飾：既知の方法によるスルファミダーゼの化学修飾は、実施例１に記載したように実施した。
【０２０１】
グリコシル化分析：化学修飾後のスルファミダーゼ上のグリカン構造の分析を、実施例２に記載のＬＣ−ＭＳ法に従って実施した。
【０２０２】
実施例２に記載されたＮグリコシル化部位Ｎ（２１）、Ｎ（１３１）、Ｎ（２４４）およびＮ（３９３）を含む４つのトリプシンペプチド断片上のグリカン部分の得られた修飾をＬＣ−ＭＳ分析によって調べた。
【０２０３】
結果
グリコシル化分析：化学修飾前の４つのグリコシル化部位に見出されるグリコシル化のタイプは、主にＮ（２１）およびＮ（３９３）上では複合型グリカン、および、Ｎ（１３１）およびＮ（２４４）上ではオリゴマンノース型グリカンであった。
【０２０４】
化学修飾の後、最も豊富に化学的に修飾された糖ペプチド上に対し、修飾されたグリカン構造の詳細な特徴付けを実施した（化学的に修飾した後のグリカンの不均一性が増加した結果、有意な感度の低下が理由でグリカンは検出されなかった）。この実施例では、既知の方法による化学修飾後のＭａｎ−６グリカンの修飾が調べられる。
【０２０５】
グリカンの過ヨウ素酸塩処理は、炭水化物部分の２つの隣接するヒドロキシル基間の炭素結合を切断し、グリカン鎖の分子量を変化させる。図８Ａは、化学修飾後のマンノースの予想される結合切断の例を示す。図８Ｂは、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後に起こりうる理論的な結合切断を示すＭａｎ−６グリカンのモデルを示す。
【０２０６】
図９には、既知の方法による化学修飾の前後に、Ｎ（１３１）に結合したＭａｎ−６グリカンを有するトリプシンペプチドＮＩＴＲ（Ｔ１３＋Ｍａｎ−６グリカン）の質量スペクトルが示されている。様々な程度の結合切断を有する化学修飾された糖ペプチドに対応するイオンが同定された。Ｍａｎ−６グリカンについては、理論的には、最大で３個の二重結合切断および１個の単結合切断があり得る。修飾が既知の方法に従っておこなった場合、質量スペクトルにおいて最も強いイオンシグナルは、２重結合切断および２個の単結合切断に対応し、一方で２番目に強いイオンシグナルは３個の二重結合切断および１個の単結合切断に相当することが見出され、それらは、最も可能性のある広範囲な結合切断である。既知の方法に従って化学修飾後のＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンに見られる結合決断の程度を可視化する図を図１０Ａに示す（観察されたイオンからの同位体分布により、結果は近似的であるが比較可能である）。化学修飾の再現性は、以前に知られている方法に従って製造された化学的に修飾されたスルファミダーゼの３つの異なるバッチを用いて試験された。異なる程度の結合切断に対応するイオンは、３つの異なるバッチからのＭＳスペクトルにおいて非常に類似した分布を示した。
【０２０７】
実施例１０：
新規方法１、４および５によるスルファミダーゼの化学修飾後のグリカン構造の分析
【０２０８】
新規方法１、４および５：新規方法によるスルファミダーゼの化学修飾を、実施例３の記載のように実施した。
【０２０９】
グリコシル化分析：グリコシル化分析は、実施例２に記載のＬＣ−ＭＳ法に従って実施した。Ｎグリコシル化部位Ｎ（２１）、Ｎ（１３１）、Ｎ（２４４）およびＮ（３９３）を含む４つのトリプシンペプチド断片のグリカン変異体上の得られる修飾をＬＣ−ＭＳ分析によって調べた。
【０２１０】
結果
グリコシル化分析：新規方法１、４および５に従って化学的に修飾されたスルファミダーゼ上の修飾されたグリカンプロフィールの詳細な特徴付けを、最も豊富に化学的に修飾された糖ペプチドに対して実施した。この実施例１０では、新規方法１、４および５による化学修飾後のＭａｎ−６グリカンの修飾を調べた。
【０２１１】
様々な程度の結合切断を伴う化学的に修飾された糖ペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンに対応するイオンが同定された。理論的には、最大で３個の二重結合切断および１個の単結合切断が存在し得る（図８Ｂ参照、Ｍａｎ−６グリカンのモデルは、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後に起こり得る結合切断を示す）。修飾を新規方法１に従っておこなった場合、質量スペクトルにおける最も強いイオンシグナルは、１つの二重結合切断および３つの単結合切断に対応することが見出され、２番目に強いイオンシグナルは、２つの二重結合切断および２つの単結合が切断に対応することが見出された。新規方法３および４に従って修飾をおこなった場合、Ｍａｎ−６グリカンの結合切断は、さらに優先的に単結合切断へとシフトした。図１０Ａには、化学修飾後のトリプシンペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンの結合切断の程度を視覚化する図を示す。
【０２１２】
化学的修飾の再現性を、三連（新規方法１）または二連（新規方法３）の化学修飾スルファミダーゼを使用することによって試験した。
【０２１３】
既知の方法に従って化学的に修飾されたスルファミダーゼに由来するＭａｎ−６グリカン修飾と、新規方法１、４および５に従って化学的に修飾されたスルファミダーゼに由来するＭａｎ−６グリカン修飾とを比較すると、結合切断の程度に大きな違いがあった。これは図１０Ａに示されており、異なる程度の結合切断の分布が４つの方法についてプロットされている（観察されたイオンからの同位体分布のため、結果は近似的であるが比較可能である）。
【０２１４】
図１０Ｂは、使用された方法に対する単結合切断の相対的存在量を示す。既知の方法は、調べられたＭａｎ−６グリカン中に４５％の単結合切断を有する修飾スルファミダーゼを提供するが、新規方法１、３および４は、化学修飾後にそれぞれ７０、８０および８２％を有する。
【０２１５】
実施例１１：
公知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼの酵素活性の分析
【０２１６】
材料と方法
実施例１に記載の公知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼの触媒活性を、基質４−メチルウンベリフェロンイズロニダーゼ−スルファートと共にイズロン酸２−スルファターゼの調製物をインキュベートすることによって評価した。反応混合物中の基質の濃度は５０μＭであり、そして、アッセイ緩衝液は５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０、０．１％のＢＳＡ、０．０２５％のＡｎａｐｏｅ Ｘ−１００、１．５ｍＭのアジ化ナトリウム、ｐＨ５であった。インキュベーション後に、更なる脱硫酸化を、０．４Ｍのリン酸ナトリウム、０．２ＭのシトラートｐＨ４．５を含むストップ緩衝液の添加によって阻害した。イズロン酸２−スルファターゼ（アッセイ濃度０．８３μｇ／ｍＬ）を伴った第二の２４時間のインキュベーションを行って、生成物（４−メチルウンベリフェロンイズロニダーゼ）を加水分解し、４−メチルウンベリフェロンを放出させ、そしてそれを、０．５Ｍの炭酸ナトリウム、０．０２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ１０．７を用いて反応を停止させた後に、４６０ｎｍの蛍光によって観察した。
【０２１７】
結果
公知の方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼの活性は、未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれの５０％未満であった（結果未掲載）。
【０２１８】
実施例１２：
新規方法に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼの酵素活性の分析
【０２１９】
材料と方法
イズロン酸２−スルファターゼを新規方法１０および１１に従って修飾し、そしてそれは、実施例３のとおりであったが、水素化ホウ素ナトリウム反応混合物を０℃にて０．５時間維持した点が異なっていた。新規方法１１では、さらに、過ヨウ素酸酸化を、０．５ｍｇ／ｍＬのヘパリンの存在下でおこなった。新規方法１０および１１に従って修飾したイズロン酸２−スルファターゼの触媒活性を、実施例１１に記載の手順に従って測定した。
【０２２０】
結果
新規方法１０および１１に従って調製したイズロン酸２−スルファターゼは、未修飾イズロン酸２−スルファターゼのそれに匹敵する活性を示した（図１１）。
【０２２１】
実施例１３：
活性部位保護リガンドの存在下でのα−Ｌ−イズロニダーゼの化学修飾
【０２２２】
実施例３の新規方法９に記載のとおり、酸化（ステップａ）を様々なリガンドの存在下でおこなった。使用したリガンドは、それぞれ、４−メチルウンベリフェロンイズロニダーゼ、５−フルオロ−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸フルオリド、ヘパリン、ヘパリンスルファートおよびＤ−サッカリン酸１．４−ラクトンであった。
【０２２３】
酵素活性を、「Standardization of α-L-iduronidase Enzyme Assay with Michaelis-Menten Kinetics. Ou L, Herzog TL, Carrie M. Wilmot CM3、およびChester B. Whitley CB. Mol Genet Metab. 2014 111: 113-115」に記載のとおり計測した。
【０２２４】
結果
ステップａ）中に保護リガンドとして５−フルオロ−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸フルオリドを使用したとき、保護リガンドなしで、すなわち、新規方法８に従って、ステップａ）をおこなったときと比較して、修飾α−Ｌ−イズロニダーゼに関して、５２％低い触媒活性を得た。例えばＤ−サッカリン酸１．４−ラクトンなどの文献で知られている他の阻害剤を使用したとき、修飾α−Ｌ−イズロニダーゼに関して、２５％減の触媒活性を得た。触媒活性減少の同様の傾向は、例えば４−ＭＵ−イズロニダーゼ、ヘパリンまたはヘパリンスルファートなどの基質に関して気付いた（データ未掲載）。
【０２２５】
実施例１４：
ゲルマトリックス上に固定したα−Ｌ−イズロニダーゼの化学修飾
【０２２６】
本明細書中に記載した修飾方法、特に実施例３の新規方法３を、α−Ｌ−イズロニダーゼをゲルマトリックスに固定しながらおこなった。α−Ｌ−イズロニダーゼを、２０ｍＭのＮａＣｌを含み、６．７のｐＨを有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と共にＳＯＵＲＣＥ（商標）１５Ｓ Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅカラムに添加することによって固定した。
Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅを、２５０μＬのＳｏｕｒｃｅ１５Ｓゲルマトリックスと共に１時間インキュベートした。その後、ゲルマトリックスをそっとペレット化し、上清中のタンパク濃度が、ゲルとのインキュベーション前のそれの１０％未満であることを見つけ出した。あるサンプルを、化学修飾で処理する前に１日冷蔵庫内で保存した。第二のインキュベーションを化学修飾の直前におこなった。
【０２２７】
α−Ｌ−イズロニダーゼの添加に続いて、カラムを、連続方式で、ステップａ）の溶液で平衡化し、ステップａ）のクエンチング、ステップｂ）、およびステップｂ）のクエンチングをおこなった。１００ｍＭのリン酸ナトリウムおよび７００ｍＭの塩化ナトリウムを含み、５．６のｐＨを有する緩衝液を用いてカラムを洗浄することによって、化学修飾α−Ｌ−イズロニダーゼの溶出をおこなう。
【０２２８】
酵素活性を、「Standardization of α-L-iduronidase Enzyme Assay with Michaelis-Menten Kinetics. Ou L, Herzog TL, Carrie M. Wilmot CM3, and Chester B. Whitley CB. Mol Genet Metab. 2014 111: 113-115」に記載のとおり計測した。
【０２２９】
結果
Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓへのバッチ方式での結合
Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅをゲルマトリックスに固定しながらの、化学修飾の実施は、修飾を溶液中でおこなったときと比較して、得られた修飾α−Ｌ−イズロニダーゼの触媒活性を８％増強した。
【０２３０】
実施例１５
保護リガンドの存在下、ゲルマトリックスに固定したα−Ｌ−イズロニダーゼの化学修飾
【０２３１】
本明細書中に記載した修飾方法、特に実施例３の新規方法３を、α−Ｌ−イズロニダーゼをゲルマトリックスに固定しながら、かつ、リガンドの存在下でおこなった。使用したリガンドは、それぞれ、５−フルオロ−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸フルオリドおよびＤ−サッカリン酸１．４−ラクトンであった。
α−Ｌ−イズロニダーゼを、２０ｍＭのＮａＣｌを含み、６．７のｐＨを有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と共にＳＯＵＲＣＥ（商標）１５Ｓ Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅカラムに添加することによって固定した。Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅを、２５０μＬのＳｏｕｒｃｅ１５Ｓゲルマトリックスと共に１時間インキュベートした。その後、ゲルマトリックスをそっとペレット化し、上清中のタンパク濃度が、ゲルとのインキュベーション前のそれの１０％未満であることを見つけ出した。あるサンプルを、化学修飾で処理する前に１日冷蔵庫内で保存した。第二のインキュベーションを化学修飾の直前におこなった。
【０２３２】
α−Ｌ−イズロニダーゼの添加に続いて、カラムを、連続方式で、ステップａ）の溶液で平衡化し、ステップａ）のクエンチング、ステップｂ）、およびステップｂ）のクエンチングをおこなった。１００ｍＭのリン酸ナトリウムおよび７００ｍＭの塩化ナトリウムを含み、５．６のｐＨを有する緩衝液を用いてカラムを洗浄することによって、化学修飾α−Ｌ−イズロニダーゼの溶出をおこなった。
【０２３３】
酵素活性を、「Standardization of α-L-iduronidase Enzyme Assay with Michaelis-Menten Kinetics. Ou L, Herzog TL, Carrie M. Wilmot CM3, and Chester B. Whitley CB. Mol Genet Metab. 2014 111: 113-115」に記載のとおり計測した。
【０２３４】
結果
ゲルマトリックス上のａｌｄｕｒａｚｙｍｅの固定と組み合わせた、活性部位を保護するための阻害剤の使用の複合アプローチは、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＳＳｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅカラム上への固定と組み合わせた５−フルオロ−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸フルオリドが、修飾を保護リガンドなしで溶液中でおこなったときと比較して、得られた修飾α−Ｌ−イズロニダーゼの触媒活性の３７％の増大をもたらしたという驚くべき知見をもたらした。阻害剤Ｄ−サッカリン酸１．４−ラクトンを使用した対応する結果は、修飾を保護リガンドなしで溶液中でおこなったときと比較して、触媒活性の２５％の減少であった。
【０２３５】
実施例１６：
イズロン酸２−スルファターゼ欠乏マウスにおける脳への修飾イズロン酸２−スルファターゼの分布
【０２３６】
材料と方法
実施例４の新規方法２に従って製造し、静脈内（ｉｖ）に投与された修飾イズロン酸２−スルファターゼのインビボにおける脳への分布を調査した。
【０２３７】
試験物調製：
修飾イズロン酸２−スルファターゼを、２ｍｇ／ｍＬにて処方し、濾過滅菌し、そして、使用するまで−７０℃にて冷凍した。
【０２３８】
動物：
雄マウス、ＩＤＳ−ＫＯ（Ｂ６Ｎ．Ｃｇ−Ｉｄｓｔｍ１Ｍｕｅｎ／Ｊ）（Jackson Laboratories, ME, USA）を使用した。動物を、２３±１℃および４０〜６０％の湿度にてケージ内に単独で収容し、水および標準的な飼料を自由摂取させた。１２／１２時間の光／暗サイクルに設定し、午後７時に点灯した。動物を、試験開始の少なくとも２週間前に馴化した。マウスには、１０ｍｇ／ｋｇの修飾イズロン酸２−スルファターゼを尾静脈に静脈内投与した。最後の注射の２４時間後に、試験を完了した。マウスを、イソフルランで麻酔した。血液を、後眼窩静脈叢放血から採血した。潅流の後に、心臓の左心室を通した２０ｍＬの生理的食塩水のフラッシュが続いた。脳を、摘出し、計量し、そして、液体窒素中で急速に冷凍した。脳ホモジネートを調製し、そして、プロトコールに対する調整として１０ｍＭの酢酸鉛の添加を伴った実施例２に記載の方法を使用して、活性を評価した。
【０２３９】
結果：
ＩＤＳ−ＫＯマウスの灌流脳ホモジネート中の修飾イズロン酸２−スルファターゼの活性を、確認できた。１．８±０．４μＭ／分（ｎ＝４）の平均活性を、使用したアッセイ条件下で測定した。
【図１】
2018535654.tif 000016
【図２Ａ】
2018535654.tif 000017
【図２Ｂ】
2018535654.tif 000018
【図３】
2018535654.tif 000019
【図４】
2018535654.tif 000020
【図５】
2018535654.tif 000021
【図６】
2018535654.tif 000022
【図７】
2018535654.tif 000023
【図８Ａ】
2018535654.tif 000024
【図８Ｂ】
2018535654.tif 000025
【図９】
2018535654.tif 000026
【図１０】
2018535654.tif 000027
【図１１】
2018535654.tif 000028
【配列表】
2018535654000001.app
【国際調査報告】
2018535654.tif 000029
2018535654.tif 000030
2018535654.tif 000031