(57)【要約】  本発明は、cMLCK遺伝子導入のための組成物及び方法に関する。一部の態様において、本発明は、cMLCK遺伝子導入により、特にcMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターの有効量を対象へ投与すること、対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現すること、及び心臓の心室機能を改善することにより、対象において進行した心不全を治療するための組成物及び方法を提供する。別の態様において、本発明は、特に、対象が進行した心不全を有する場合に、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターを対象へ投与すること、及び対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現することにより、対象においてcMLCKタンパク質を発現するための組成物及び方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象における進行した心不全を治療する方法であって、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターの有効量を対象へ投与すること、対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現すること、及び心臓の心室機能を改善することを含む、方法。
【請求項２】
前記対象が、NYHA III度心不全を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、NYHA IV度心不全を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、N-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（NT-proBNP）の4000fmol/ml超の血漿レベルを有する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、ニューレグリン治療に反応しない、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記cMLCKタンパク質が、配列番号:1を含むアミノ酸配列を有する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドベクターが、対象へ局所投与される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記AAVが、アデノ随伴ウイルスベクター9（AAV9）である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記対象の左心室EF値が、少なくとも5％増強される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記対象の左心拡張末期容積（LVEDV）又は左心収縮末期容積（LVESV）が、少なくとも5％減少される、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（1.  発明の分野）
本発明は、cMLCK遺伝子導入のための組成物及び方法に関する。一部の態様において、本発明は、cMLCK遺伝子導入により、特にcMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターの有効量を対象へ投与すること、対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現すること、及び心臓の心室機能を改善することにより、対象において進行した心不全を治療するための組成物及び方法を提供する。別の態様において、本発明は、特に、対象が進行した心不全を有する場合に、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターを対象へ投与すること、及び対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現することにより、対象においてcMLCKタンパク質を発現するための組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（2.  発明の背景）
心不全は、およそ5,000,000人のアメリカ人に影響を及ぼし、毎年550,000を超える新患が、本状態と診断される。心不全のための現在の薬物療法は、主に、血管に拡張を生じさせ、血圧を下げて、心臓の労働負荷を減少させる血管拡張薬であるアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤を対象とする。死亡率の減少率は有意であったものの、ACE阻害剤による実際の死亡率の減少は、平均わずか3％〜4％であり、かついくつかの潜在的な副作用がある。さらなる制限は、心不全を予防し、又は治療するためのその他の選択肢と関連する。例えば、心臓移植術は、薬物療法よりも明らかに高価かつ侵襲性であり、これは、ドナー心臓の入手可能性によって更に制限される。両室ペースメーカーなどの機械装置の使用も同じように侵襲性かつ高価である。従って、現在の療法の欠陥を考慮した新たな療法が必要である。
【０００３】
1つの有望な新療法には、心不全に罹患しているか、又は心不全を発症するリスクのある患者に対するニューレグリン（以下、「NRG」ともいう）の投与を含む。EGF-様成長因子のファミリーであるNRGは、NRG1、NRG2、NRG3、及びNRG4、並びにこれらのアイソフォームを含む構造的に関連した成長因子及び分化因子のファミリーを含み、且つ以下の一連の生物学的反応に関与している：乳癌細胞分化及び乳タンパク質分泌の刺激；シュワン細胞への神経堤細胞分化の誘導；アセチルコリン受容体の骨格筋細胞合成の刺激；並びに、心筋細胞生存及びDNA合成の促進。心室小柱の形成及び後根神経節の発達において重度の欠損を伴う、ニューレグリン遺伝子-標的化されたホモ接合性マウス胚のインビボ試験は、ニューレグリンは、心臓及び神経の発達に必須であることを指摘している。
【０００４】
NRGは、その各々が、細胞の成長、分化及び生存を含む複数の細胞機能において重要な役割を果たす、EGFR、ErbB2、ErbB3及びErbB4を含む、EGF受容体ファミリーに結合する。これらは、細胞外リガンド-結合ドメイン、膜貫通キナーゼドメイン及び細胞質チロシンキナーゼドメインからなる、タンパク質チロシンキナーゼ受容体である。NRGがErbB3又はErbB4の細胞外ドメインへ結合した後、これは高次構造の変化を誘導し、これがErbB3、ErbB4及びErbB2間のヘテロ二量体の形成、又はErbB4それ自身間のホモ二量体の形成につながり、このことが細胞膜の内側の受容体のC-末端ドメインのリン酸化を生じる。リン酸化された細胞内ドメインは次に、細胞の内側の追加のシグナルタンパク質に結合し、対応する下流のAKT又はERKシグナル伝達経路を活性化し、且つ細胞増殖、細胞分化、細胞アポトーシス、細胞遊走又は細胞接着の刺激もしくは抑制など、一連の細胞反応を誘導する。これらの受容体の中でも、主にErbB2及びErbB4は、心臓において発現される。
【０００５】
NRG-1のEGF様ドメインは、サイズが50〜64アミノ酸の範囲であり、これらの受容体に結合して、活性化するために十分であることが示されている。以前の研究により、ニューレグリン-1β（NRG-1β）は、高い親和性でErbB3、及びErbB4に直接結合することができることが示された。オーファン受容体であるErbB2は、ErbB3又はErbB4のホモ二量体よりも高い親和性で、ErbB3及びErbB4とヘテロ二量体を形成することができる。神経発達の研究は、交感神経系の形成には、完全な形のNRG-1β、ErbB2及びErbB3シグナル伝達系を必要とすることを指摘した。NRG-1β又はErbB2又はErbB4の標的化された破壊は、心臓発達の欠損に起因した胚性致死につながる。最近の研究ではまた、心臓血管系発達における、並びに成人の正常心機能の維持における、NRG-1β、ErbB2、及びErbB4の役割が脚光を浴びている。NRG-1βは、成人心筋細胞において筋節組織化を増強することが示された。静脈内注入によるNRGの長期放出は、心不全の異なる動物モデルにおいて、並びに臨床試験において、心筋機能の悪化を顕著に改善し、又は悪化から保護する。これらの結果は、NRG-1を、心不全の治療のためのリード化合物として有望なものとしている。
【０００６】
Zensun社は、ニューレグリンは、心臓型ミオシン軽鎖キナーゼ（cMLCK）発現及び心臓ミオシン調節軽鎖（RLC）リン酸化を増強し、このことは収縮のためのアクチン-ミオシン相互作用を改善し得ること、並びにcMLCKは、心不全の可能性のある治療標的として働き得ることを報告した（例えばWO 08/28405参照）。Guらの論文（Cardiovascular Research, 88:334-343 (2010)）において、Zensun社は、cMLCKのアップレギュレーションは、筋節の再集合を促進し、且つ不全化している心臓の収縮性を増強することを報告したが；しかし、cMLCK遺伝子治療は、心筋梗塞のラットにおけるニューレグリン送達ほどには効果がなかった。
【０００７】
しかし、ニューレグリン治療が無効である場合の心不全の治療の方法が、必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
（3.  実施態様の概要）
本開示は、cMLCK遺伝子導入のための組成物及び方法を提供する。一部の態様において、本発明は、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターの有効量を対象へ投与すること、対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現すること、及び心臓の心室機能を改善することを含む、対象において進行した心不全を治療するための方法を提供する。一部の実施態様において、対象はヒトである。
【０００９】
一部の態様において、本発明は、対象が進行した心不全を有する場合、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターを対象へ投与すること、及び対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現することを含む、対象においてcMLCKタンパク質を発現するための方法を提供する。一部の実施態様において、対象はヒトである。一部の実施態様において、対象は、心臓の心室機能の改善を有する。
【００１０】
一部の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、対象へ全身投与される。他の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、対象へ局所投与される。
【００１１】
一部の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、冠動脈内注入により、対象の心臓へ局所投与される。一部の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、対象のLV腔へ、局所投与される。他の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、対象の心臓へ、外科的に局所投与される（すなわち、ベクター又はトランスフェクションされた細胞の対象の心臓への直接導入により）。更に別の実施態様では、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、リポソーム中で、対象の心臓へ投与される。
【００１２】
開示された方法における対象は、心臓の心室機能の改善について評価される。一部の実施態様において、対象の左心室EF値は、少なくとも5％増強される。一部の実施態様において、対象の左心室EF値は、少なくとも10％増強される。一部の実施態様において、対象の左心室EF値は、少なくとも20％増強される。一部の実施態様において、対象の左室拡張末期容積（LVEDV）又は左室収縮末期容積（LVESV）は、少なくとも5％減少される。一部の実施態様において、対象のLVEDV又はLVESVは、少なくとも10％減少される。一部の実施態様において、対象のLVEDV又はLVESVは、少なくとも20％減少される。
【００１３】
一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:1、配列番号:2、又は配列番号:3に対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:1、配列番号:2、又は配列番号:3に対して少なくとも75％、80％、85％、90％、又は95％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。特定の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:1、配列番号:2、又は配列番号:3のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。
【００１４】
他の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6、又はそれらの相補体から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、もしくは2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも75％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、もしくは2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも75％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、もしくは2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも85％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、もしくは2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも85％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも90％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、もしくは2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも90％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも95％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、もしくは2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも95％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6又はそれらの相補体の核酸配列から選択された少なくとも約500個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6、又はそれらの相補体の核酸配列から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、もしくは2400個のヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、配列番号:5、もしくは配列番号:6の核酸配列、又はそれらの相補体を含む。
【００１５】
一実施態様において、開示された方法における対象は、NYHA III度心不全を有する。別の実施態様において、本対象は、NYHA IV度心不全を有する。更に別の実施態様において、本対象は、N-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（NT-proBNP）の4000fmol/ml超の血漿レベルを有する。更に別の実施態様において、本対象は、ニューレグリン治療に反応しない。
【００１６】
一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、ウイルスベクターである。更なる実施態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。更に別の実施態様において、AAVは、アデノ随伴ウイルスベクター9（AAV9）である。
【００１７】
一部の実施態様において、開示された方法における投与量は、約1×1010〜1×1015gc/患者である。一部の実施態様において、投与量は、約1×1010〜5×1014gc/患者である。一部の実施態様において、投与量は、約1×1011〜1×1014gc/患者である。一部の実施態様において、投与量は、約1×1011〜5×1013gc/患者である。一部の実施態様において、投与量は、約5×1010〜5×1011 gc/患者である。一部の実施態様において、投与量は、約2×1011〜5×1011 gc/患者である。一実施態様において、投与量は、約1×1010 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約2×1010 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約5×1010 gc/患者である。一実施態様において、投与量は、約1×1011 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約2×1011 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約5×1011 gc/患者である。一実施態様において、投与量は、約1×1012 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約2×1012 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約5×1012 gc/患者である。一実施態様において、投与量は、約1×1013 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約2×1013 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約5×1013 gc/患者である。一実施態様において、投与量は、約1×1014 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約2×1014 gc/患者である。更に別の実施態様において、投与量は、約5×1014 gc/患者である。
【００１８】
別の態様において、本開示は、cMLCK遺伝子治療のための組成物を提供する。一部の実施態様において、本組成物は、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターである。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、ウイルスベクターである。一実施態様において、本ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。具体的実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、AAV9である。
【００１９】
別の態様において、本開示は、医薬組成物を提供する。かかる組成物は、治療的有効量のcMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクター及び医薬として許容し得る担体を含有する。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、ウイルスベクターである。一実施態様において、本ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。具体的実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、AAV9である。一部の実施態様において、水が、医薬として許容し得る担体である。一部の実施態様において、塩類溶液並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液が、特に注射用溶液についての、液体担体として利用される。
【００２０】
別の態様において、本開示は、様々な開示された方法において使用するための本明細書に開示された組成物を提供する。一部の実施態様において、本明細書に開示された組成物は、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターの有効量を対象へ投与すること、対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現すること、及び心臓の心室機能を改善することを含む、対象における進行した心不全の治療のために使用される。一部の実施態様において、本組成物は、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターである。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、ウイルスベクターである。一実施態様において、本ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。具体的実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、AAV9である。
【００２１】
他の実施態様において、本明細書に開示された組成物は、対象が進行した心不全を有する場合に対象においてcMLCKタンパク質を発現するために使用され、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターを対象へ投与すること、及び対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現することを含む。一部の実施態様において、本組成物は、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターである。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、ウイルスベクターである。一実施態様において、本ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。具体的実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、AAV9である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
（4.  図面の簡単な説明）
【図１】図1は、AAV9.cMLCKのゲノム構造を示している。cMLCK-コーディングポリヌクレオチド（配列番号:4）は、AAV9ベクターに構築された。ITR：逆方向末端反復配列；CMV：サイトメガロウイルス；SVpA：SV40ウイルスゲノム由来のポリ(A)。
【００２３】
【図２】図2は、シスプラスミドpZac2.1-cMLCKの構造及び品質管理を示す。(A) pZac2.1-cMLCKのプラスミドマップ。(B) pZac2.1-cMLCKの制限酵素消化。(C)HEK293細胞へのpZac2.1-cMLCKのトランスフェクション後の、cMLCK導入遺伝子発現のウェスタンブロット。
【００２４】
【図３】図3は、(A)HEK293細胞、及び(B)単離された心筋細胞における、cMLCK導入遺伝子発現を示す。様々な用量のAAV9.cMLCKを使用し、細胞及び心筋細胞を感染させた。GAPDHを、内部対照として使用した。
【００２５】
【図４】図4は、AAV9.cMLCKの間接的冠動脈遺伝子導入の5週間後の、LV試料中のcMLCK導入遺伝子mRNA発現の定量を示す。間接的冠動脈注射を使用し、様々な用量のAAV9.cMLCKをマウスに送達した。PBSを、対照として使用した。
【００２６】
【図５】図5は、圧過負荷をかけたマウス心臓におけるAAV9.cMLCK遺伝子導入の前後の心エコー検査での検出を示す。横行大動脈縮窄術（TAC）を、マウスに行った。TACの3週間後、これらのマウスを無作為に2群に分けた。一群のマウスは、間接的冠動脈内送達により、AAV9.cMLCK遺伝子導入を受け、別の群のマウスは、同じ方法による、PBS注射を受けた。測定を、TAC後3週目、及びAAV9.cMLCK遺伝子導入又はPBS注射後5週目に行った。
【００２７】
【図６】図6は、圧過負荷をかけたマウス心臓におけるAAV9.cMLCK遺伝子導入後の、インビボ血行動態決定を示している。測定は、AAV9.cMLCK遺伝子導入又はPBS注射後、5週目に行った。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（5.  発明の詳細な記載）
本発明は、進行した心不全患者は、ニューレグリン治療に反応しないという発見を一部基にしている。本発明の範囲内で、外因性cMLCKの進行した心不全患者の心臓への送達、及びそこでの外因性cMLCKの発現は、患者の心臓血管系機能の改善及び心不全の治療に有効である。従って、本発明は、進行した心不全患者の治療を提供する。
【００２９】
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての専門用語、及び科学用語は、本発明が属する技術分野の業者によって共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において言及した全ての特許、出願、公表された出願、及びその他の刊行物は、これらの全体が参照により組み込まれる。この節に記載した定義が、参照により本明細書に組み込まれる、特許、出願、公表された出願、及びその他の刊行物に記載された定義に反するか、又はそうでなければ不一致である場合、この節に記載された定義が、参照により本明細書に組み込まれた定義に優先する。
【００３０】
本明細書に使用される単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、及び「該（the）」は、そうでないことを文脈が他にはっきり指示しない限り、「少なくとも1つ」、又は「1つ以上」を意味する。
【００３１】
本明細書に使用される、「ニューレグリン」、又は「NRG」は、全てのニューレグリンアイソフォーム、ニューレグリンEGFドメイン単独、ニューレグリンEGF様ドメインを含むポリペプチド、ニューレグリン突然変異体又は誘導体、及び以下に詳細に記載するように上記の受容体を同じく活性化する任意の種類のニューレグリン様遺伝子産物を含むが、これらに限定されない、ErbB2、ErbB3、ErbB4、又はこれらの組合せに結合し及び活性化することができるタンパク質又はペプチドをいう。ニューレグリンは、ErbB2／ErbB4、又はErbB2／ErbB3ヘテロ二量体に結合し、及び活性化する。また、ニューレグリンは、NRG-1、NRG-2、NRG-3、及びNRG-4タンパク質、ペプチド、断片、並びにニューレグリンの活性を模倣する化合物を含む。ニューレグリンは、上記ErbB受容体を活性化して、これらの生体反応を調節すること、例えば乳癌細胞分化及び乳タンパク質分泌を刺激すること；神経堤細胞のシュワン細胞への分化を誘導すること；骨格筋細胞におけるアセチルコリン受容体合成を刺激すること；並びに／又は心筋細胞の分化、生存、及びDNA合成を改善することができる。また、ニューレグリンには、これらの生物活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換をもつこれらの変異体も含む。アミノ酸の適切な保存的置換は、当業者に公知であり、一般に、生じる分子の生物活性を変化させずに作製されるであろう。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、生物活性を実質的に変化させないことを認識する（例えば、Watsonらの文献、遺伝子の分子生物学（Molecular Biology of Gene）、第4版、Benjamin／Cummings Pub.社、p.224（1987）を参照されたい）。ニューレグリンタンパク質は、ニューレグリンタンパク質、及びペプチドを包含する。ニューレグリン核酸は、ニューレグリン核酸、及びニューレグリンオリゴヌクレオチドを包含する。
【００３２】
本明細書で使用される「cMLCK」は、配列番号:1、配列番号:2、又は配列番号:3と同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド、並びに配列番号:1、配列番号:2、又は配列番号:3のアミノ酸配列と、例えば70％、75％、80％、85％、90％、95％以上の％同一性など、配列類似性を共有するタンパク質を含む、心臓型ミオシン軽鎖キナーゼを意味する。更にこれらのタンパク質は、非限定的に、抗原との交差反応性、自己抑制、リン酸化活性などを含む、配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3のアミノ酸配列を有するポリペプチドと共通の生物活性を有する。また、かかる配列変更を有するタンパク質が、配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3のポリペプチドと先に説明されたような生物活性を共有する限りは、cMLCKタンパク質は、配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3のアミノ酸配列からの、1以上の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、又は付加又は欠失を有することができることが、意図されている。また、cMLCKは、cMLCK遺伝子の異なる突然変異、異なるスプライシング型及び様々な配列多型から発現されたタンパク質又はペプチドも含む。cMLCKは、cMLCKの1以上のその機能を維持しているその変異体を含む。cMLCKをコードしている遺伝子又はcDNAは、1以上のcMLCK機能を実質的に変更することなく、相当に突然変異され得ることが認められる。第一に、遺伝暗号は、縮重されることが周知であり、結果的に異なるコドンは、同じアミノ酸をコードすることができる。第二に、アミノ酸置換が導入されたとしても、この突然変異は、保存的であることができ、且つcMLCKの本質的機能に対し実質的影響をもたらさない。第三に、cMLCKポリペプチドの一部は、その機能の全てを損なうことも又は除外することもなく、欠失されることができる。第四に、例えば、エピトープタグの追加などの、挿入又は付加は、その機能を損なうことも又は除外することもなく、cMLCKにおいて行うことができる。例えば、通常でないアミノ酸を組込む、インビボ又はインビトロにおける化学的及び生化学的修飾など、他の修飾を、cMLCKの1以上の機能を実質的に損なうことなく、行うことができる。かかる修飾は、当業者により容易に理解されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、放射性核種による標識、及び様々な酵素修飾を含む。タンパク質及び置換基を標識するための様々な方法又はかかる目的に有用な標識物は、当該技術分野において周知であり、且つ標識されたアンチリガンド（例えば抗体）に結合するリガンドなどの放射性同位元素、発蛍光団、化学発光剤、酵素、及びアンチリガンドを含む。機能性断片及び変異体は、長さが変動することができる。例えば、一部の断片は、少なくとも10、25、50、75、100、又は200もしくはそれ以上のアミノ酸残基を有する。
【００３３】
本明細書で使用される、「cMLCKの機能性断片及び変異体」は、cMLCKの1以上の機能を維持しているそれらの断片及び変異体をいう。cMLCKをコードしている遺伝子又はcDNAは、1以上のcMLCK機能を実質的に変更することなく、かなり変異され得ることが認められる。第一に、遺伝暗号は、縮重されることが周知であり、結果的に異なるコドンは、同じアミノ酸をコードすることができる。第二に、アミノ酸置換が導入されたとしても、この突然変異は、保存的であることができ、且つcMLCKの本質的機能に対し実質的影響をもたらさない。第三に、cMLCKポリペプチドの一部は、その機能の全てを損なうことも又は除外することもなく、欠失されることができる。第四に、例えば、エピトープタグの追加などの、挿入又は付加は、その機能を損なうことも又は除外することもなく、cMLCKにおいて行うことができる。例えば、通常でないアミノ酸を組込む、インビボ又はインビトロにおける化学的及び生化学的修飾など、他の修飾を、cMLCKの1以上の機能を実質的に損なうことなく、行うことができる。かかる修飾は、当業者により容易に理解されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、放射性核種による標識、及び様々な酵素修飾を含む。タンパク質及び置換基を標識するための様々な方法又はかかる目的に有用な標識物は、当該技術分野において周知であり、且つ標識されたアンチリガンド（例えば抗体）に結合するリガンドなどの放射性同位元素、発蛍光団、化学発光剤、酵素、及びアンチリガンドを含む。機能性断片及び変異体は、長さが変動することができる。例えば、一部の断片は、少なくとも10、25、50、75、100、又は200もしくはそれ以上のアミノ酸残基を有する。
【００３４】
本明細書に使用される「ミオシン軽鎖」は、ミオシン重鎖と会合し、かつミオシンの力を発生するATPase活性の制御に関与する約18kDaのタンパク質をいう。2つの主要なMLCの分類があり：MLC1は、時にミオシン必須軽鎖と呼ばれ、ELCと略記され；及びMLC2は、時にミオシン調節軽鎖と呼ばれ、RLCと略記される。RLCは、ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）を媒介したリン酸化の主要な生物学的標的である。MLCKによってリン酸化されたときに、RLCのリン酸化された形態は、RLC-Pと略記される。骨格筋、平滑筋、及び心筋に存在するELC並びにRLCのアイソフォームが記述されている。一例として、ヒト心臓RLC遺伝子、及びcDNAは、Maceraらの論文、Genomics 13：829-831（1992）；（GenBankアクセッション番号NM00432）によって記述されている。
【００３５】
本明細書に使用される「ミオシン軽鎖の機能性断片又は変異体」は、ミオシン軽鎖キナーゼ生物活性を有するタンパク質によってリン酸化することが可能であるポリペプチドをいう。これには、ミオシン軽鎖キナーゼ生物活性を有するタンパク質によってリン酸化することが可能である6以上の長さのアミノ酸残基の任意のポリペプチドを含む。
【００３６】
本明細書に使用される「ミオシン軽鎖キナーゼ生物活性」は、ミオシン調節軽鎖への共有結合によるホスフェートの組込みを媒介するポリペプチドもしくはタンパク質の、インビトロ又はインビボにおける酵素の能力をいう。この用語には、任意のMLCKのアイソフォーム（例えば、平滑筋、骨格筋、及び心臓MLCKアイソフォーム）で観察されるこのような酵素活性、並びにMLCKアイソフォームの断片及び変異体（例えば、天然に存在する突然変異体；組換えDNA技術を介して導入された突然変異、挿入、及び欠失；並びにタンパク質分解によって生じた断片）で観察されるこのような酵素活性を包含する。
【００３７】
本明細書に使用される「タンパク質」は、そうでないことを文脈が他に明確に指示しない限り、「ポリペプチド」、又は「ペプチド」と同義である。
【００３８】
本明細書で使用される用語「核酸」、「ヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボ核酸、リボヌクレオチド、及びリボ核酸、並びにそれらのポリマー形状をいい、且つ一本鎖-又は二本鎖の形状のいずれかを含む。一部の実施態様において、かかる用語は、デオキシリボ核酸（例えば、cDNA又はDNA）をいう。他の実施態様において、かかる用語は、リボ核酸（例えば、mRNA又はRNA）をいう。
【００３９】
本明細書で使用される用語「対象」及び「患者」は、互換的に使用され、且つ非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）及び霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物をいい、最も好ましくはヒトである。
【００４０】
本明細書に使用される「ベクター」は、その発現又は複製のいずれかのために異種DNAを細胞に導入するために使用される別個のエレメントをいう。このような媒体の選択及び使用は、当業者の技術の範囲内で、周知である。発現ベクターは、かかるDNA断片の発現を誘起することが可能であるプロモーター領域などの制御配列と機能的に連結されたDNAを発現することが可能であるベクターを含む。従って、発現ベクターは、適切な宿主細胞への導入により、クローン化DNAの発現を生じるプラスミド、ファージ、組換えウイルス、もしくはその他のベクターなどの、組換えDNA又はRNA構築物をいう。適切な発現ベクターは、当業者に周知であり、真核細胞及び／又は原核細胞において複製可能であるもの、並びにエピソームのままであるもの、又は宿主細胞ゲノムに組込むものを含む。
【００４１】
本明細書に使用される「駆出率」、又は「EF」は、鼓動の結果として、満たされた左心室（LV）から送り出される血液の部分を意味する。これは、以下の式によって定義され得る：（LV拡張期容積-LV収縮期容積）／LV拡張期容積。
【００４２】
本明細書に使用される「左室内径短縮率」、又は「FS」は、収縮状態と弛緩状態との間の左心室の直径の変化の比を意味する。これは、以下の式によって定義され得る：（LV拡張末期直径−LV収縮末期直径）／LV拡張末期直径。
【００４３】
本明細書に使用される「心不全」は、心臓が代謝する組織の要求に必要とされる速度で血液を送り出さない心機能の異常を意味する。心不全には、鬱血性心不全、心筋梗塞、頻脈性不整脈、家族性肥大性心筋症、虚血性心疾患、特発性拡張型心筋症、心筋炎、その他などの広範囲にわたる疾病状態を含む。心不全には、虚血性、先天性、リウマチ性、又は特発性の形態を含むが、限定されない、多くの要因によって生じ得る。慢性心肥大は、鬱血性心不全、及び心停止の前兆である重大な病気にかかった状態である。
【００４４】
本明細書において使用される「進行した心不全」は、以下の特徴の少なくとも1つを伴う「心不全状態」を意味する：(1)NYHA III度及びIV度への、特にIV度への疾患進行、(2)体液貯留及び／又は末梢低循環の臨床徴候を伴うエピソード、(3)30％未満の左室駆出率、ドップラー-心エコー検査での偽正常又は制限された僧帽弁流入パターン；高い左心室及び／又は右心室の充満圧；N-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド(NT-proBNP)又はBNPの上昇した血漿レベル：の少なくとも1つにより示される、重度の心機能障害の客観的証拠、(4)運動不能、300m未満の6分間歩行試験距離、又は12〜14ml/kg/分未満の最大酸素摂取量のいずれかにより明らかにされた、機能的能力の重度の障害、(5)過去6ヶ月で2回以上の心不全での入院の病歴、あるいは(6)従来の心臓治療及び症状管理戦略にもかかわらず前述の5つの特徴のいずれかの存在。
【００４５】
患者の心不全は、それらの症状の重症度に従い分類することができることは、当該技術分野において周知である。最も一般的に使用される分類システムは、ニューヨーク心臓協会（NYHA）の心機能分類である。これは、身体活動時に患者がどの程度制限されるかを基にした以下の4つのカテゴリーの1つに、患者を配置する：I度：心疾患を伴うが、身体活動にいかなる制限も生じない患者。日常的な身体活動で、著しい疲労、動悸、呼吸困難あるいは狭心痛を生じない；II度：軽度の身体活動の制限がある、心疾患を伴う患者。安静時には無症状。日常的な身体活動で、疲労、動悸、呼吸困難又は狭心痛を生じる；III度：高度な身体活動の制限のある、心疾患を伴う患者。安静時には無症状。日常的な身体活動以下の労作で、疲労、動悸、呼吸困難又は狭心痛を生じる；IV度：不快感のないいかなる身体活動も継続が困難である、心疾患を伴う患者。心不全又は狭心症症候群の症状が、安静時にも存在することがある。もしあれば、身体活動が低下し、不快感が増大する。
【００４６】
本明細書に使用される「N-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド」又は「NT-proBNP」は、BNPのプロホルモンである、不活性のレムナントN-末端proBNPを意味する。BNPは、左心室壁内の心筋細胞から主に放出されるホルモン活性のあるナトリウム利尿ペプチドである。心筋壁の伸展及び収縮する反応において、proBNPは、タンパク質分解性切断により、BNPとホルモン的に不活性のレムナントNT-proBNPへ分割される。血漿NT-proBNPレベルは、市販のキットにより分析することができる。異なるキットは、同じ試料に関して異なる結果をもたらすことがあるが；しかし、異なるキットの結果は、互いに変換することができる。本開示における血漿NT-proBNPレベルの数値は、Biomedica社（オーストリア）による市販のキット（CE No. Q1530510）を用いて、測定される。
【００４７】
本明細書に使用される、特定の疾患を治療するための活性薬剤の「有効量」は、疾患と関連する症状を改善させるために、又はいくつかの様式において、軽減させるために十分である量である。該量は、疾患を治癒し得るが、典型的には疾患の症状を改善させるために投与される。
【００４８】
「治療」、「治療すること」、及びその他同様の用語は、本明細書において一般に、状態に能動的に(actively)罹患している対象における所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、その疾患、もしくは症候を完全に、又は部分的に治療してもよく、及び従って、疾患及び／もしくは疾患に起因する有害作用についての部分的、又は完全な治癒の点から治療的であってもよい。本明細書に使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける任意の疾患の治療を対象とし、疾患を阻害すること、すなわちその発症を抑えること；又は疾患を緩解すること、すなわち疾患の退行を生じさせることを含む。一つの例において、治療は、心疾患及び関連状態、例えば進行した心不全を発症しているか、又は発症するリスクのある患者を治療することをいう。より具体的には、「治療」は、心疾患に罹患している患者に対して治療的に検出可能な及び有益な効果を提供することを意味することが意図される。
【００４９】
「予防する」、「予防すること」、及びその他同様の用語は、本明細書において一般に、疾患にかかりやすいであろうが、いまだ疾患に罹患していると診断されていない対象において疾患の発症を予防することをいうために使用される。従って、「予防する」とは、その目的が心肥大を予防するか、もしくは遅らせる（少なくする）ことである保護的又は予防的な手段をいうことができる。
【００５０】
本明細書に使用される「組換え発現ベクター」は、真核生物又は原核生物において発現可能なポリペプチドを機能的にコードしているポリヌクレオチドシステムをいう。
【００５１】
本明細書に使用される「医薬として許容し得る」という用語は、連邦政府、もしくは州政府の規制機関によって承認されたか、又は動物に、及びより詳細にはヒトに使用するための、米国薬局方、又はその他の一般に認識された薬局方に収載されたことを意味する。
【００５２】
本明細書に使用される「担体」という用語は、本発明の治療が共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は媒体をいう。このような製薬的担体は、水、及びピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む油などの滅菌液であることができる。
【００５３】
一部の態様において、本開示は、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターの有効量を対象に投与すること、対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現すること、及び心臓の心室機能を改善することを含む、対象において進行した心不全を治療する方法を提供する。一部の実施態様において、対象はヒトである。
【００５４】
一部の態様において、本開示は、対象が進行した心不全を有する場合において、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターを対象へ投与すること、及び対象の心臓細胞において、ポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現することを含む、対象においてcMLCKタンパク質を発現する方法を提供する。一部の実施態様において、対象はヒトである。一部の実施態様において、対象は、心臓の心室機能の改善を有する。
【００５５】
一部の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、対象へ全身投与される。他の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、対象へ局所投与される。投与方法は、静脈内、冠動脈内、及び心室内を含むが、これらに限定されるものではない。ポリヌクレオチドベクターは、例えば、注入又はボーラス注射によるなど、任意の通常の経路により、投与されてよく、並びに他の生物学的活性物質と一緒に投与されてよい。
【００５６】
一部の具体的実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターを対象の心臓へ局所的に投与することは望ましいであろう。これは、例えば、非限定的に、冠動脈内注入により、手術時の局所注入により、注射により、カテーテルを使って、又はインプラントを使って、達成されてよく、該インプラントは、シリコン(sialastic)メンブレンなどのメンブレン、又はファイバーを含む、多孔性、無孔性、又はゼラチン性物質である。冠動脈内注入は、例えばポンプに接続された、冠動脈内カテーテルにより促進されてよい。一部の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、冠動脈内注入を介して、対象の心臓へ局所投与される。一部の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、対象のLV腔へ局所投与される。他の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、対象の心臓へ外科的に（すなわち、対象の心臓へのベクター又はトランスフェクションされた細胞の直接導入により）局所投与される。
【００５７】
一部の実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターは、リポソーム中で、対象の心臓へ投与される。様々な送達システムが公知であり、且つ本発明においてcMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターを投与するために使用することができ、これには例えば、リポソーム中の封入；微粒子；マイクロカプセル；受容体-媒介性エンドサイトーシス（例えば、Wu及びWuの論文, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)参照）；天然ポリマー及び合成ポリマーを含む、ミセル状生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖；リポ多糖体；人工のウイルスエンベロープ；金属粒子；並びに、細菌、又はバキュロウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、及び典型的には当該技術分野において使用される他の組換え媒体がある。具体的実施態様において、cMLCK-コーディングポリヌクレオチドは、小胞、特にリポソーム中で送達されることができる（Langerの論文, Science 249:1527-1533 (1990)；Treatらの文献、「感染症及び癌の治療におけるリポソーム(Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer)」、 Lopez-Berestein及びFidler(編集), Liss, New York, pp. 317-372, 353-365 (1989)を参照されたい）。
【００５８】
開示された方法における対象は、非限定的に、左心室EF値、左室拡張末期容積（LVEDV）、左室収縮末期容積（LVESV）、左室拡張末期圧（LVEDP）、左室収縮圧（LVSP）を含む、数多くのパラメータを使用し、心臓の心室機能の改善について、評価される。これらのパラメータは、当該技術分野において周知の方法を使用し、例えば心エコー検査により、モニタリングされてよい。一部の実施態様において、対象の左心室EF値は、少なくとも5％増強される。一部の実施態様において、対象の左心室EF値は、少なくとも10％増強される。一部の実施態様において、対象の左心室EF値は、少なくとも20％増強される。一部の実施態様において、対象のLVEDV又はLVESVは、少なくとも5％減少される。一部の実施態様において、対象のLVEDV又はLVESVは、少なくとも10％減少される。一部の実施態様において、対象のLVEDV又はLVESVは、少なくとも20％減少される。
【００５９】
cMLCKをコードしているポリヌクレオチドベクターは、天然のcMLCKにおいて認められるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードしているそれらのポリヌクレオチドベクター、並びに機能的に重要でないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列をコードしているもの、従って天然の配列のそれとは異なるアミノ酸配列を有するものを含む。例には、一つの塩基残基の別のものへの置換（例えばArgをLysへ）、一つの疎水性残基の別のものへの置換（例えばLeuのIleへの）、又は一つの芳香族残基の別のものへの置換（例えばPheのTyrへの）を含む。
【００６０】
cMLCKをコードしているポリヌクレオチドベクターはまた、cMLCKの断片も含む。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト遺伝子、及びその他の種の関連した遺伝子（相同体）を含む。一部の実施態様において、このポリヌクレオチド配列は、脊椎動物由来、より特定すると哺乳動物由来である。一部の実施態様において、このポリヌクレオチド配列は、ラット起源である。本発明の一部の実施態様において、このポリヌクレオチド配列は、ヒト起源である。
【００６１】
一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:1に対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:1に対して少なくとも75％、80％、85％、90％、又は95％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。特定の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:1のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。
【００６２】
他の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、又はそれらの相補体から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも75％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも75％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも85％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも85％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも90％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも90％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも95％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも95％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、又はそれらの相補体の核酸配列から選択された少なくとも約500個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、又はそれらの相補体の核酸配列から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個のヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:4、又はそれらの相補体の核酸配列を含む。
【００６３】
一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:2に対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:2に対して少なくとも75％、80％、85％、90％、又は95％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。特定の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。
【００６４】
他の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5、又はそれらの相補体から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも75％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも75％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも85％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも85％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも90％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも90％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも95％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも95％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5、又はそれらの相補体の核酸配列から選択された少なくとも約500個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5、又はそれらの相補体の核酸配列から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個のヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:5、又はそれらの相補体の核酸配列を含む。
【００６５】
一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:3に対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:3に対して少なくとも75％、80％、85％、90％、又は95％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。特定の実施態様において、本ポリヌクレオチドベクターは、配列番号:3のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている。
【００６６】
他の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6、又はそれらの相補体から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも75％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも75％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも85％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも85％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも90％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも90％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも95％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも95％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6、又はそれらの相補体の核酸配列から選択された少なくとも約500個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6、又はそれらの相補体の核酸配列から選択された少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、2000、又は2400個のヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、配列番号:6、又はそれらの相補体の核酸配列を含む。
【００６７】
cMLCK-コーディングポリヌクレオチドのクローニングは、WO 08/28405に開示されており、その内容は引用により組み込まれている。これらのポリヌクレオチドは、クローン化DNA（例えば、DNA「ライブラリー」）からの当該技術分野において公知の標準的方法によって、化学合成によって、cDNAクローニングによって、又は所望の細胞から精製したゲノムDNA、もしくはその断片をクローニングすることによって、又はPCR増幅及びクローニングによって得てもよい。例えば、Sambrookらの文献、「分子クローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、New York（2001）；Glover D.M.（編）、「DNAクローニング：実用的アプローチ（DNA Cloning：A Practical Approach）」、第2版、MRL press, Ltd., Oxford、U.K.（1995）を参照されたい。ゲノムDNAに由来するクローンは、コード領域に加えて調節領域及びイントロンDNA領域を含んでいてもよく；cDNAに由来するクローンは、エキソン配列のみを含むであろう。供給源が何であれ、遺伝子は、遺伝子の伝播のために適したベクター内にクローン化してもよい。
【００６８】
cMLCK-コーディングポリヌクレオチドは、次に適切なクローニングベクターに挿入することができる。当該技術分野において公知の多数のベクター-宿主系を使用してもよい。可能なクローニングベクターには、プラスミド、又は修飾されたウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。発現ベクターの構築技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Sambrookらの文献、「分子クローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor、NY（2001）、及びAusubelら編集の文献、最新版「分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、NYを参照されたい。クローニングベクターへの挿入は、例えば相補的付着末端を有するクローニングベクター内にDNA断片を連結することによって達成することができる。しかし、DNAを断片化するために使用される相補的な制限部位がクローニングベクターに存在しない場合、DNA分子の末端を酵素で修飾してもよい。あるいは、DNA末端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結することにより、任意の望まれる部位を産生してもよい。これらの連結されたリンカーには、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学合成されたオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。代替法において、切断されたベクター、及びcMLCK-コーディングポリヌクレオチド配列を、ホモポリマーテーリングによって修飾してもよい。
【００６９】
一実施態様において、開示された方法における対象は、NYHA III度心不全を有する。別の実施態様において、本対象は、NYHA IV度心不全を有する。NYHA III度心不全及びNYHA IV度心不全は、先に定義されている。
【００７０】
更に別の実施態様において、本対象は、4000 fmol/ml超のN-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（NT-proBNP）の血漿レベルを有する。BNP及びNT-proBNPの血漿レベルは、疑わしいか又は確立した心不全の日々の管理における有望なツールである。臨床実践におけるBNP及びNT-proBNPの使用に関するほとんどの研究は、それらの診断特性について説明し、且つ次第に量が増える証拠が、BNP及びNT-proBNPの予後の値を裏付けるものとして利用可能である。NT-proBNPはBNPよりも約6倍長い血中半減期を有するので、これは心不全の診断マーカー又は予後マーカーとしてより広範に使用される。血漿NT-proBNPレベルは、市販のキットにより分析することができる。異なるキットは、同じ試料に関する異なる結果を有し得るが；しかし、異なるキットの結果は、互いに変換することができる。
【００７１】
BNP及びNT-proBNPの両方のマーカーは、典型的には転帰の悪い患者においてより高いので、血液中のBNP及びNT-proBNPの両方のレベルが、心不全のスクリーニング及び診断に使用され、心不全の予後を確立するのに有用である。従って、有意に上昇したBNP又はNT-proBNPの血漿レベルは、cMLCK遺伝子導入による心不全治療に適している患者の指標であることがわかる。本発明の組成物及び方法は、進行した心不全を伴うヒト患者に適しており、例えば、Biomedica社（オーストリア）による市販のキット（CE No. Q1530510）を使用し測定した場合、この患者は、4000 fmol/ml超のN-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（NT-proBNP）の血漿レベルを有する。
【００７２】
更に別の実施態様において、本対象は、ニューレグリン治療に反応しない。この対象は、ニューレグリンが改善に有効でない、又は一部の様式においてこの状態に関連した症状を軽減しない場合、ニューレグリン治療に反応しない。対象がニューレグリン治療に反応するかどうかは、当業者に周知の標準の臨床技術により決定することができ、これは、NYHA分類、左心室EF値、LVESV、LVEDV、6分間歩行距離、BNPもしくはNT-proBNPの血漿レベル、生活の質分類（カンサスシティ心筋症質問票）、あらゆる原因の死亡率、及びあらゆる原因の入院などの、この状態に関連した症状又はパラメータの試験を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
一部の実施態様において、ポリヌクレオチドベクターは、ウイルスベクターである。更なる実施態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)である。更に別の実施態様において、AAVは、アデノ-随伴ウイルスベクター9(AAV9)である。
【００７４】
本明細書において使用される遺伝子送達、遺伝子導入、形質導入、及び同類のものは、導入に関して使用される方法とは関わりなく、外因性ポリヌクレオチド（時には導入遺伝子と称される）の宿主細胞への導入を意味する用語である。かかる方法は、裸のポリヌクレオチドの送達を促進する技術(例えば、電気穿孔法、「遺伝子銃」送達及びポリヌクレオチドの導入に使用される様々な他の技術)、並びにベクター-媒介した遺伝子導入（例えばウイルス感染/トランスフェクションによる、又は様々な他のタンパク質-ベースもしくは脂質-ベースの遺伝子送達複合体による）などの、様々な周知の技術を含む。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定して又は一過性に維持される。安定した維持は、典型的には、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性がある複製起源を含むか、又は染色体外レプリコン（例えばプラスミド）もしくは核又はミトコンドリア染色体などの、宿主細胞のレプリコンへ組込むかのいずれかを必要とする。当該技術分野において公知であるように、数多くのベクターが、遺伝子の哺乳動物細胞への導入を媒介することが可能であることがわかっている。
【００７５】
ウイルスベクターは、宿主細胞へ送達されるべきポリヌクレオチドを含む、組換えにより作製されたウイルス又はウイルス粒子をいう。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクターなどのRNAウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター及び同類のものが挙げられる。セムリキ森林熱ウイルス-ベースのベクター及びシンドビスウイルス-ベースのベクターなどのアルファウイルスベクターもまた、遺伝子治療及び免疫療法において使用するために開発されている（Schlesinger及びDubenskyの論文, Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 (1999)、並びにYingらの論文, Nat. Med. 5(7):823-827 (1999)参照）。
【００７６】
遺伝子導入がレトロウイルスベクターにより媒介される実施態様において、ベクター構築体は、レトロウイルスゲノム又はそれらの一部を含むポリヌクレオチド、並びに治療的遺伝子をいう。本明細書で使用されるレトロウイルス媒介性遺伝子導入又はレトロウイルス形質導入は、同じ意味を保持し、並びにそれにより細胞に侵入し且つ宿主細胞ゲノムへそのゲノムを組込むウイルスのおかげで、遺伝子又は核酸配列が宿主細胞へ安定して伝達されるプロセスをいう。ウイルスは、感染のその通常の機序を介して、宿主細胞へ侵入するか、又はそれが様々な宿主細胞表面受容体もしくはリガンドに結合し、細胞へ侵入するように修飾されることができる。本明細書で使用されるレトロウイルスベクターは、ウイルス又はウイルス-様侵入機序を介した、外因性核酸の細胞への導入が可能であるウイルス粒子をいう。レトロウイルスは、それらの遺伝子情報をRNAの形で保持するが；しかし、一旦このウイルスが細胞に感染すると、そのRNAは、DNA型へ逆転写され、これが感染した細胞のゲノムDNAへと組込まれる。組込まれたDNA型は、プロウイルスと称される。単独の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）ベクター、ハーベーマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）ベクター、マウス乳腺癌ウイルス（MuMTV）ベクター、及びラウス肉腫ウイルス（RSV）ベクターを含むが、これらに限定されるものではない。数多くの追加のレトロウイルスベクターが、導入された細胞が同定され且つ作製され得るように、選択マーカーの遺伝子を組込むことができる。
【００７７】
遺伝子導入がアデノウイルス（Ad）又はアデノ随伴ウイルス（AAV）などのDNAウイルスベクターにより媒介される実施態様において、ベクター構築体は、ウイルスゲノム又はその一部、並びに導入遺伝子を含むポリヌクレオチドをいう。アデノウイルス（Ad）は、50を超える血清型を含むウイルスの同質群で、かなり良く特徴付けられている（例えば、WO 95/27071参照）。Adは、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。組換えAd由来のベクター、特に野生型ウイルスの組換え及び作製の可能性を低下するものもまた、構築されている（例えば、WO 95/00655及びWO 95/11984参照）。
【００７８】
野生型AAVは、宿主細胞のゲノムへの高い感染能及び特異性の組込みを有する（例えば、Hermonat及びMuzyczkaの論文, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984)、並びにLebkowskiらの論文, Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)を参照されたい）。本明細書で使用されるアデノ随伴ウイルス又はAAVは、全ての亜型、血清型及び偽型、並びに天然生成型及び組換え型を包含している。様々なAAV血清型及び株が、当該技術分野において公知であり、且つATCCなどの供給源、並びに学術的又は商業的供給源から、公的に入手可能である。あるいは、公開され及び／又はさまざまなデータベースから入手可能であるAAV血清型及び株由来の配列が、公知の技術を用いて合成されてよい。アデノ随伴ウイルス（AAV）は、ディペンドウイルス属に属するパルボウイルスである。これらは、複製するためにヘルパーウイルスを必要とする、小型の、エンベロープを持たない、1本鎖のDNAウイルスである。ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス）との共感染が、機能的に完全なAAVビリオンを形成するために必要である。インビトロにおいて、ヘルパーウイルスとの共感染が存在しない場合、AAVは、ウイルスゲノムがエピソーム型で存在するが、感染性ビリオンは生成されない潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによるそれに続く感染は、このゲノムを「レスキュー」し、これが複製され且つウイルスキャプシドへパッケージングされるようにし、これにより感染性ビリオンを再構成する。最新のデータは、インビボにおいて野生型AAV及び組換えAAVの両方が、大型エピソームコンカテマーとして主に存在することを指摘している。
【００７９】
AAVは、任意の公知のヒト疾患に関連せず、一般に病原性ではないと考えられ、且つ組込み時に宿主細胞の生理的特性を変更するようには見えない。AAVは、非分裂細胞を含む、広い範囲の宿主細胞に感染することができ、且つ異なる種由来の細胞に感染することができる。細胞反応及び体液性反応の両方により、迅速にクリアランスされるか又は失活されるいくつかのベクターとは対照的に、AAVベクターは、インビボで様々な組織における持続性発現を示した。インビボでの非分裂細胞における組換えAAVベクターの持続性は、天然のAAVウイルス遺伝子の欠乏及びエピソームコンカテマーを形成するベクターの能力に起因している。
【００８０】
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、エピソームコンカテマーとして高頻度の持続性を有し且つこれは非分裂細胞に感染することができ、結果的にこれを例えば組織培養及びインビボなどにおいて哺乳動物細胞への遺伝子の送達に有用なものにするので、AAVは本開示の細胞形質導入において使用するための魅力的なベクターシステムである。遺伝子送達におけるAAVの使用を明らかにしている研究は、Flotteらの論文, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10613-10617 (1993)、及びWalshらの論文, J. Clin. Invest. 94:1440-1448 (1994)がある。組換えAAVベクターは、マーカー遺伝子及びヒト疾患に関与した遺伝子のインビトロ及びインビボにおける形質導入のために、巧く使用されている（例えば、Walshらの論文, J. Clin. Invest. 94:1440-1448 (1994)参照）。AAVは、感染性に関して広い宿主範囲を有する。rAAVベクターの作製及び使用に関する詳細は、米国特許第5,139,941号及び第4,797,368号に説明されている。
【００８１】
典型的には、組換えAAV（rAAV）は、2つのAAV末端反復配列に隣接した関心対象の遺伝子を含むプラスミド及び／又は末端反復配列を伴わない野生型AAVコード配列を含む発現プラスミド、例えばpIM45の共トランスフェクションにより作製される。これらの細胞はまた、アデノウイルス及び／又はAAVヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子を保持するプラスミドにより感染及び／又はトランスフェクションされる。このような様式で作製されたrAAVウイルスストックは、rAAV粒子から物理的に分離されなければならない（例えば、塩化セシウム密度遠心分離又はカラムクロマトグラフィーにより）アデノウイルスが夾雑している。あるいは、AAVコード領域を含むアデノウイルスベクター及び／又はAAVコード領域を含む細胞株及び／又はアデノウイルスヘルパー遺伝子の一部もしくは全てが、使用され得る。組込まれたプロウイルスとしてrAAV DNAを保持する細胞株も、使用することができる。
【００８２】
AAVの複数の血清型が、天然に存在し、少なくとも12の血清型（AAV1−AAV12）が現在わかっている。高度の相同性にもかかわらず、異なる血清型は、異なる組織への指向性を有する。AAV1の受容体は不明であるが；しかし、AAV1は、AAV2よりもより効率的に骨格筋及び心筋を形質導入することがわかっている。ほとんどの研究は、AAV2 ITRと隣接されるベクターDNAが代替血清型のキャプシドへパッケージングされている偽型ベクターで行われるので、生物学的差異は、ゲノムよりもキャプシドに関連していることは明らかである。最新の証拠は、AAV1キャプシドにパッケージングされたDNA発現カセットは、AAV2キャプシドにパッケージングされたものよりも、心筋細胞の形質導入時に少なくとも1 log10 より効率的であることを指摘している。一部の実施態様において、対象において免疫応答を生じないAAVが使用される。一部の実施態様において、本発明のAAVは、アデノ随伴ウイルスベクター9（AAV9）である。本明細書に使用されるAAV9.cMLCKベクターは、組換えAAV9を基にしたcMLCK遺伝子導入ベクターをいう。
【００８３】
進行した心不全の治療において有効である開示された方法におけるcMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターの用量は、標準臨床技術により決定することができる。cMLCKタンパク質を発現するための開示された方法におけるcMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクターの用量もまた、この方法の臨床効果により決定することができる。加えて、インビトロアッセイが任意に、最適用量範囲の同定を助けるために利用されてよい。製剤化において利用されるべき正確な投与量もまた、投与経路及び心不全の重篤度によって決まり、且つ医師の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。一部の実施態様において、開示された方法における投与量は、約1×1010〜1×1015gc/患者である。一部の実施態様において、投与量は、約1×1010〜5×1014gc/患者である。一部の実施態様において、投与量は、約1×1011〜1×1014gc/患者である。一部の実施態様において、投与量は、約1×1011〜5×1013gc/患者である。一部の実施態様において、投与量は、約5×1010〜5×1011 gc/患者である。一部の実施態様において、投与量は、約2×1011〜5×1011 gc/患者である。一実施態様において、投与量は、約1×1010 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約2×1010 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約5×1010 gc/患者である。一実施態様において、投与量は、約1×1011 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約2×1011 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約5×1011 gc/患者である。一実施態様において、投与量は、約1×1012 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約2×1012 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約5×1012 gc/患者である。一実施態様において、投与量は、約1×1013 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約2×1013 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約5×1013 gc/患者である。一実施態様において、投与量は、約1×1014 gc/患者である。別の実施態様において、投与量は、約2×1014 gc/患者である。更に別の実施態様において、投与量は、約5×1014 gc/患者である。
【００８４】
別の態様において、本開示は、cMLCK遺伝子治療のための組成物を提供する。一部の実施態様において、本組成物は、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターである。一部の実施態様において、このポリヌクレオチドベクターは、ウイルスベクターである。一実施態様において、このウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。具体的実施態様において、このポリヌクレオチドベクターは、AAV9である。
【００８５】
別の態様において、本開示は、医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療上有効量のcMLCK-コーディングポリヌクレオチドベクター、及び医薬として許容し得る担体を含む。一部の実施態様において、このポリヌクレオチドベクターは、ウイルスベクターである。一実施態様において、このウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。具体的実施態様において、このポリヌクレオチドベクターは、AAV9である。一部の実施態様において、水は、医薬として許容し得る担体である。一部の実施態様において、塩類溶液、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液を液体担体として、特に注射用溶液のために使用する。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、その他が含まれる。組成物には、また、望ましいなら、微量の湿潤剤、もしくは乳化剤、又はpH緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。適切な薬剤担体の例は、E.W. Martinによる「レミントンの医薬品科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」に記述されている。このような組成物は、好ましくは精製された形態で、患者に対して適当な投与のための形態を提供するように、適切な量の担体と共に、治療薬の治療上有効量を含むであろう。製剤は、投与様式に合わせるべきである。
【００８６】
具体的実施態様において、本組成物は、ヒトに対する静脈内投与又は冠動脈内注入のために適応された医薬組成物として、ルーチン手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与又は冠動脈内注入のための組成物は、無菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。一般に、成分は、個別に、又は単位剤形に共に混合されて、例えば活性薬剤の量を示すアンプル又はサッシェなどの密閉して封をした容器内の乾燥凍結乾燥粉末、又は水を含まない濃縮物として供給される。組成物を注入により投与する場合は、無菌の薬品級の水、又は食塩水を含有する輸液ボトルにより分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合されるように、注射用滅菌水、又は塩類溶液のアンプルを提供することができる。
【００８７】
別の態様において、本開示は、様々な開示された方法において使用するための本明細書に開示された組成物を提供する。一部の実施態様において、本明細書に開示された組成物は、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターの有効量を対象へ投与すること、対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現すること、及び心臓の心室機能を改善することを含み、対象において進行した心不全を治療するために使用される。一部の実施態様において、本組成物は、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターである。一部の実施態様において、ポリヌクレオチドベクターは、ウイルスベクターである。一実施態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。具体的実施態様において、ポリヌクレオチドベクターは、AAV9である。
【００８８】
他の実施態様において、本明細書に開示された組成物は、対象が進行した心不全を有する場合に、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターを対象へ投与すること、及び対象の心臓細胞においてポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質を発現することを含み、対象においてcMLCKタンパク質を発現するために使用される。一部の実施態様において、本組成物は、cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターである。一部の実施態様において、ポリヌクレオチドベクターは、ウイルスベクターである。一実施態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。具体的実施態様において、ポリヌクレオチドベクターは、AAV9である。
【実施例】
【００８９】
本発明は、いかなる様にも限定されることは意図されない以下の実施例によって例証される。
【００９０】
（実施例1：AAV9.cMLCKウイルスベクターの構築、作製及び品質管理）
本実施例は、AAV9ベクター中のcMLCK-コーディングポリヌクレオチドの構築、作製、及び品質管理を説明している。
【００９１】
ヒトcMLCK(hcMLCK)-コーディングポリヌクレオチド(配列番号:4)導入遺伝子の発現が、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターにより駆動されるシスプラスミドpZac2.1-cMCLKを、構築した。図1は、AAV9ベクター中のcMLCK-コーディングポリヌクレオチドのゲノム構造を示している。cMLCKのhcDNA(配列番号:4)を、AAV9シスプラスミドpZac2.1-CMVのKpn I/Not I部位へとクローニングした。cMLCKの発現は、CMV極初期プロモーター／エンハンサー及びSV40のポリアデニル化部位の制御下であった。
【００９２】
293細胞を、シスプラスミドpZac2.1-hcMCLK、AAV2 rep遺伝子及びAAV9由来のキャプシドタンパク質遺伝子を含むトランスプラスミドpAAV2/9、及びアデノウイルスヘルパープラスミドpAdΔF6により、トランスフェクションした。これらの細胞を、15％、25％、40％、及び54％の漸増濃度のイオジキサノールによる勾配超遠心分離により精製し、並びに純度分析を、SDS-PAGE及びエンドトキシンアッセイ（放出判定は、大型動物試験に関する＜5エンドトキシン単位/mlである）により行った。図2は、シスプラスミドpZac2.1-cMLCKの構築及び品質管理を示している。プラスミドDNAの純度及び濃度は、吸光度260nm及び280nmにより決定し、並びにcMLCK cDNA及び調節エレメント(ITR、CMVエンハンサー及びプロモーター、イントロン、及びSV40 polyA)の同一性は、両鎖の制限酵素消化及び完全長配列決定により確認した。ヒトcMLCK導入遺伝子発現は更に、ヒト胎児腎293細胞（HEK293細胞）のpZac2.1-cMLCKによるトランスフェクション後の、ウェスタンブロットにより確認した。
【００９３】
AAV9.cMLCKを、良好に得た。ひとつのバッチのデータは、以下のように列挙された。ロット番号#1：ゲノム力価：1.68×1013 GC/ml；収量：3.19×1013 GC；純度：100％；エンドトキシン：＜1 EU/ml。
【００９４】
（実施例2：インビトロにおけるcMLCK遺伝子発現）
実施例2は、HEK293細胞、H9C2細胞（心臓細胞株）、及びラット新生仔の心筋細胞を含む、インビトロにおけるcMLCK導入遺伝子の発現を説明している。
【００９５】
mRNAレベル及び／又はタンパク質レベルでのcMLCK導入遺伝子の発現を、HEK293細胞及びH9C2細胞において確認した。定量的RT-PCRを行い、cMLCKのmRNAレベルを測定し、並びにウェスタンブロットを、細胞溶解液を用いて実行し、cMLCKのタンパク質含量を測定した。
【００９６】
HEK293細胞及びH9C2細胞におけるcMLCK導入遺伝子発現の確認後、単離された心筋細胞におけるcMLCK導入遺伝子発現を、更に評価した。心筋細胞を、Laiらの論文, Hum Gene Ther, 23(3):255-261 (2012)に先に説明されたように、ラット新生仔から単離した。全RNAを、STAT-60（Tel-Test社, TX）を使用し、細胞から単離し、引き続きRNeasyミニキット（Qiagen社）精製及びDNase処理を行い、残存するゲノムDNAの夾雑を除いた。定量的RT-PCRを行い、cMLCKのmRNA含量を比較した。ウェスタンブロットを、細胞溶解液を用いて実行し、cMLCK導入遺伝子発現のタンパク質含量を測定した。図3は、cMLCK導入遺伝子は、HEK293細胞（図3A）及びAAV9.cMLCK遺伝子導入後単離された心筋細胞（図3B、ロット番号#1 AAV9.cMLCK）の両方において発現されたことを示している。異なる用量のAAV9.cMLCKを使用し、細胞及び心筋細胞を感染させ、GAPDHを内部対照として用いた。
【００９７】
（実施例3：AAV9.cMLCKの心臓遺伝子導入の条件の最適化）
実施例3は、AAV9.cMLCK遺伝子導入の条件を最適化する、一連の試験を説明している。
【００９８】
間接的冠動脈注射を使用し、AAV9.cMLCKをマウスへ送達した。10〜12週齢の雄のC57BL/6Jマウス（The Jackson Laboratories社, Bar Harbor, ME）に、麻酔をかけ、挿管した。開胸術を、第二肋骨と第三肋骨の間の空間に行い、近位大動脈と肺動脈を剥離し、血管クランプを用いて閉塞した（Rothらの論文, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 287(1):H172-177 (2004)）。AAV9.cMLCKを、LV腔へ注射した。クランプを、閉塞後60秒間開放した。
【００９９】
ウイルスベクター及びcMLCK導入遺伝子の生体分布を、PCR及びRT-PCRにより評価した。ゲノムDNAを、様々な臓器（LV、肺、肝臓、骨格筋、脾臓、腸、腎臓、胃、及び性腺）から、DNeasyミニキット（Qiagen社）を用いて単離した。定量的PCRを行い、各臓器中のAAV9.cMLCKのDNAコピーを定量した。全RNAを、STAT-60（Tel-Test社, TX）を使用し、様々な臓器から単離し、引き続きRNeasyミニキット（Qiagen社）精製及びDNase処理を行い、残存するゲノムDNAの夾雑を除いた。定量的RT-PCRを行い、cMLCKのmRNA含量を比較した。ウェスタンブロットを、LVホモジネートを用いて実行し、cMLCK導入遺伝子発現のタンパク質含量を測定した。
【０１００】
2、5、10週目での心臓中のcMLCK導入遺伝子のmRNA発現及びタンパク質発現を、0、5×1010、2×1011、及び5×1011 gc/マウスでのAAV9.cMLCKの注射後に比較した。図4は、AAV9.cMLCKの間接冠動脈遺伝子導入後5週目での、LV試料中のcMLCK導入遺伝子mRNA発現の定量を示している。5×1011 gc/マウスでのAAV9.cMLCKの間接遺伝子導入後5週目に、全RNA 1μg当たり1.41×105のcMLCK導入遺伝子mRNA分子が存在した。
【０１０１】
LV試料中の投与量-依存型のcMLCK導入遺伝子発現が、冠動脈遺伝子の送達後認められた。これらの結果は、かなりのcMLCK導入遺伝子発現が、5×1011 gc/マウスでのAAV9.cMLCKの注射後生じたことを示した。
【０１０２】
（実施例4：圧過負荷をかけられたマウス心臓の心機能改善におけるAAV9.cMLCK遺伝子導入）
実施例4は、圧過負荷を受けたマウス心臓の心機能の改善における、AAV9.cMLCK遺伝子導入の効果を説明している。持続性高血圧により生じるような、慢性圧過負荷は、臨床心不全発症のより高いリスクに関連している。このプロセスは、一般に患者が発症するまでに数十年を必要とするが、横行大動脈縮窄術（TAC）に関連した重度のLV圧過負荷は、マウスにおいて数週間で、LV肥大及び損なわれたLV機能に繋がる。圧過負荷は、圧ストレスがかけられた心臓に対するAAV9.cMLCK遺伝子導入の効果を研究するための、効率的モデルを提供する。
【０１０３】
横行大動脈縮窄術（TAC）を、C57BL/6Nマウスのコホートについて行った。マウスには、酸素中5％イソフルラン（1l/分）により麻酔をかけ、挿管し、且つ換気した（圧力制御した）。麻酔は、酸素中1％イソフルランで維持した。胸部には、左上部胸骨縁で第二肋骨間空間で侵入させ、腕頭動脈と左頸動脈の間の大動脈弓の区画を、切開した。7-0絹糸を、27-ゲージ針に結びつけ、これは実質的大動脈縮窄を生じた。
【０１０４】
TACの3週間後、心エコー検査を生存マウスに対し行い、室寸法及びLV機能を評価した。これらのマウスは、無作為に2群に分けた。1群のマウスは、間接的冠動脈内送達により、AAV9.cMLCK遺伝子導入を受け、並びに別の群のマウスは、同じ方式でPBS注射を受けた。遺伝子導入の5週間後、室寸法及びLV機能を、心エコー検査により再度評価した。一連の心エコー検査は、麻酔をかけたマウスにおいて行った。LV室寸法、LVEF、及び心筋円周短縮速度（Vcf）を決定した。加えて、LV収縮機能及び弛緩を、インビボにおける血行動態により決定した。1.4Fマイクロマノメーターカテーテル（Millar Instruments社）を、右頸動脈を経由して挿入し、麻酔をかけた動物のLVまで進めた。LV圧、LV±dP/dt、収縮末期圧容積関係（ESPVR）、1回拍出量、心拍出量、及び体血管抵抗を決定した。
【０１０５】
体重、LV重量、肺重量、肝臓重量、及び脛骨長さを、剖検時に決定した。拡張期で停止したLV試料を、3片に分け：短軸左室壁内(midwall)LV輪(ring)を、心筋細胞サイズ、心アポトーシス、及び線維症を決定するためにホルマリン中に固定し、並びに他の2片は、液体窒素中に急速に凍結し、生化学試験及び分子生物学試験のために、-80℃で貯蔵した。
【０１０６】
LV切片を、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。中隔及びLV自由壁の両方からの無作為の視野を、その群の正体が知らされていない観察者により、撮像した。心筋細胞の断面積を、NIH Image Jソフトウェアを用いて決定した。
【０１０７】
末端デオキシヌクレオチジル転移酵素-媒介したdUTPニック末端標識（TUNEL）アッセイを、CardioTACSインサイチュアポトーシス検出キット（R&D Systems社）を用い、LV切片に対して行った。DNA断片化アッセイを使用し、アポトーシス速度の変化を確認した。カスパーゼ3/7の活性を、Caspase-Glo 3/7アッセイキット（Promega社）を用いて測定した。
【０１０８】
LV切片は、ピクロシリウスレッドにより染色した。コラーゲン沈着面積を、NIH Image Jソフトウェアを用いて定量し、且つ分別されたコラーゲン面積を計算した。I型コラーゲン、III型コラーゲン、ペリオスチン、MMP（マトリクス・メタロプロテイナーゼ）、及びTIMP（マトリクス・メタロプロテイナーゼの組織インヒビター）の発現を、定量的RT-PCR及びウェスタンブロットにより測定した。
【０１０９】
全RNAを、STAT-60（Tel-Test社, TX）を用い、LV試料から単離し、引き続きRNeasyミニキット（Qiagen社）精製及びDNase処理を行い、残存するゲノムDNA夾雑を除去した。定量的RT-PCRを行い、Ca2+処理(handling)の調節因子（PLN、SERCA2a、カルセクエストリン、RyR2、FKBP12、L-型Ca2+チャネル、及びNCX）、収縮性の調節因子（cTnI、cTnC、cTnT、及びトロポミオシン）、肥大の調節因子（ANF、BNP、α-SKアクチン、β-MHC, FHL1, MEF2D）、アポトーシスの調節因子（Pim1、sFRP1、Bcl2、Bax、及びカスパーゼ3）、並びに線維症の調節因子（I型コラーゲン、III型コラーゲン、ペリオスチン、MMP、及びTIMP）のmRNA含量を比較した。
【０１１０】
ウェスタンブロットを、LVホモジネートを用いて行い、Ca2+処理の調節因子（PLN、ホスホ-PLN、SERCA2a、カルセクエストリン、RyR2、ホスホル-RyR2、FKBP12、L-型Ca2+チャネル、及びNCX）、収縮性の調節因子（cTnI、ホスホ-cTnI、cTnC、cTnT、及びトロポミオシン）、肥大の調節因子（FHL1、MEF2D）、アポトーシスの調節因子（Pim1、sFRP1、Wif1、Bcl2、Bax、及びカスパーゼ3）、並びに線維症の調節因子（コラーゲン及びペリオスチン）のタンパク質含量を測定した。免疫蛍光顕微鏡で測定し、FHL1、MEF2D、PLN、Pim1、sFRP1、及びWIF1の発現を決定した。
【０１１１】
図5は、AAV9.cMLCK遺伝子導入の前後の心エコー検査での検出を示している。図5に示されたように、AAV9.cMLCK遺伝子導入の群に関する平均FSは、PBS注射群のそれと比べ、有意に増加し、且つETは減少し、このことは、AAV9.cMLCK遺伝子導入は、TACから生じた臨床心不全に罹患したマウスのLV収縮期機能を改善できたことを示唆している。
【０１１２】
図6は、AAV9.cMLCK遺伝子導入後の、インビボにおける血行動態決定を示している。図6に示したように、AAV9.cMLCK遺伝子導入した群の平均+dP/dtは、PBS注射した群のそれと比べ、有意に増加し、このことは、AAV9.cMLCK遺伝子導入は、TACから生じた臨床心不全に罹患したマウスのLV収縮機能を改善できたことを示唆している。平均-dP/dtの有意な増加は、AAV9.cMLCK遺伝子導入は、TACモデルのLV拡張機能を改善できたことを示唆した。平均LV/BWは、AAV9.cMLCK遺伝子導入後に減少し、これは、AAV9.cMLCK遺伝子導入は、臨床心不全から生じた心筋肥大を部分的に改善できたことを示唆している。
【０１１３】
（実施例5：cMLCK遺伝子導入を用いる進行した心不全患者の治療）
実施例5は、AAV9.cMLCK遺伝子導入を用いる、進行した心不全患者の治療を説明している。
【０１１４】
NYHA III度もしくはIV度の心不全の患者又はN-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（NT-proBNP）の血漿レベルが4000fmol/ml超の患者、あるいはニューレグリン治療に反応しない患者を、AAV9.cMLCKの遺伝子導入により治療する。
【０１１５】
AAV9.cMLCKは、投与量1×1011gc/患者〜5×1013gc/患者で、冠動脈内注入により、患者の心臓へ局所的に投与する。概して、経皮的冠動脈内送達は、標準カテーテル（5 Fr又は6 Frガイド付き又は診断用）を用いて達成され、且つMEDRAD Mark V ProVis血管造影注入システム（Indianola社, PA）を用いて注入される。注入は、血管造影後、心カテーテル法検査室において、10分間にわたって行う。冠動脈による標準カテーテルエンゲージメント技術は、冠動脈循環への順行性の前向き注入を確実にするために、良好な同軸位置及び確実な挿管を血管造影により確認しながら、通常の様式で達成される。180日後、患者の左心室EF値、左室拡張末期容積（LVEDV）、又は左室収縮末期容積（LVESV）など、これらの患者の心室機能を心エコー検査によりモニタリングする。このようなパラメータを使用し、患者を、心臓の心室機能の改善について評価する。
【０１１６】
本明細書において引用された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の刊行物、又は特許出願が参照により組み込まれることを、具体的かつ個々に示されたかのように、本明細書に参照により組み込まれる。前述の本発明が理解の明瞭化のために図と例とをあげていくらか詳細に記述したが、当業者には、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神、又は範囲から逸脱することなく、特定の変更、及び修飾をこれに対して行ってよいことが直ちに明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月24日(2018.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
cMLCKタンパク質をコードしているポリヌクレオチドベクターを含む、ヒト対象における進行した心不全を治療するための医薬組成物であって、該ポリヌクレオチドベクターからcMLCKタンパク質が該対象の心臓細胞において発現され、該心臓の心室機能が改善される、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記対象が、NYHA III度心不全を有する、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記対象が、NYHA IV度心不全を有する、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記対象が、N-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（NT-proBNP）の4000fmol/ml超の血漿レベルを有する、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記対象が、ニューレグリン治療に反応しない、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記cMLCKタンパク質が、配列番号:1を含むアミノ酸配列を有する、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記cMLCKタンパク質が、配列番号:1に対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドベクターが、前記対象へ局所投与される、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドベクターが、冠動脈内注入により、前記対象の心臓へ局所投与される、請求項8記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドベクターが、リポソーム中で、前記対象の心臓へ投与される、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記AAVが、アデノ随伴ウイルスベクター9（AAV9）である、請求項11記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記対象の左心室EF値が、少なくとも5％増強される、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記対象の左心室EF値が、少なくとも10％増強される、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記対象の左心室EF値が、少なくとも20％増強される、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記対象の左心拡張末期容積（LVEDV）又は左心収縮末期容積（LVESV）が、少なくとも5％減少される、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記対象のLVEDV又はLVESVが、少なくとも10％減少される、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記対象のLVEDV又はLVESVが、少なくとも20％減少される、請求項1記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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