(57)【要約】  本発明は、ＧＤＦ１５の活性を低減させる薬剤に関し、特に、高い、または望ましくないＧＤＦ１５のレベルに関連する疾患を治療または予防するための、このような薬剤の使用に関する。本発明は、ＧＤＦ１５が、その受容体であるＣＬＰＴＭ１およびＱＲＦＰＲに結合するという発見に基づくものであり、受容体に結合でき、かつＧＤＦ１５と受容体との相互作用を阻害できる結合剤の形態で、このような使用のための薬剤を提供する。さらに、薬剤は、ＧＤＦ１５に結合でき、かつ受容体に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害できる、受容体に由来するポリペプチドを含む。また、その相互作用、または相互作用による効果を検出することに基づく診断方法、およびＣＬＰＴＭ１レベルおよび／またはＣＬＰＴＭ１活性が低減されるように改変された細胞毒性免疫細胞も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体であるＣＬＰＴＭ１および／またはＱＲＦＰＲに結合することができる、治療における使用のための結合剤であって、該結合剤は、ＧＤＦ１５と該受容体との相互作用を阻害することができる、結合剤。
【請求項２】
前記結合剤は、抗体である、請求項１に記載の使用のための結合剤。
【請求項３】
前記抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項２に記載の使用のための結合剤。
【請求項４】
前記抗体は、キメラ抗体もしくはヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用のための結合剤。
【請求項５】
前記結合剤は、配列番号１５、１６、１７、１８、２００、２１２、２１３〜２３９、２７５〜２７８、２８０〜２８６、または３２２の１つ以上に示すアミノ酸配列を有する、または含む、ポリペプチドに結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための結合剤。
【請求項６】
前記結合剤は、請求項７〜３４のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための結合剤。
【請求項７】
ＧＤＦ１５に結合して、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害することができる、治療における使用のためのポリペプチドであって、該ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号５（ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３）、配列番号１２（ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン４）、もしくは配列番号１４（ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン）に示すアミノ酸配列、または配列番号５、１２、もしくは１４に対する配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列を有する、または含む、ポリペプチド、あるいは、
（ｉｉ）配列番号５、１２、もしくは１４における少なくとも６つの連続したアミノ酸を含む、配列番号５、１２、もしくは１４の一部であるか、またはそのような一部を含む、ポリペプチド、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号５、１２、または１４における少なくとも６つの連続したアミノ酸に相当する少なくとも６つのアミノ酸を含み、配列番号５、１２、または１４と同等のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である、ポリペプチド、であり、
前記ポリペプチドは、天然型の受容体ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１の全長アミノ酸配列を含むものでも、そのようなアミノ酸配列からなるものでもなく、前記ポリペプチドは、配列番号２４３〜２４５のいずれか１つに示すアミノ酸配列からなるものではない、ポリペプチド。
【請求項８】
ＧＤＦ１５に結合して、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害することができるポリペプチドであって、該ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号５（ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３）、配列番号１２（ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン４）、もしくは配列番号１４（ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン）に示すアミノ酸配列、または配列番号５、１２、もしくは１４に対する配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列を有する、または含む、ポリペプチド、あるいは、
（ｉｉ）配列番号５、６、もしくは９における少なくとも６つの連続したアミノ酸を含む、配列番号５、１２、もしくは１４の一部であるか、またはそのような一部を含む、ポリペプチド、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号５、１２、または１４における少なくとも６つの連続したアミノ酸に相当する少なくとも６つのアミノ酸を含み、配列番号５、１２、または１４と同等のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である、ポリペプチド、であり、
前記ポリペプチドは、天然型の受容体ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１の全長アミノ酸配列を含むものでも、そのようなアミノ酸配列からなるものでもなく、前記ポリペプチドは、配列番号２４３〜２４９、２８７、または２８８のいずれか１つに示すアミノ酸配列からなるものではない、ポリペプチド。
【請求項９】
治療における使用のための、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、配列番号５、１２、１４、または３１５のいずれか１つに示すアミノ酸配列からなるものではない、請求項７もしくは９に記載の使用のためのポリペプチド、または請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号５（ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３）、配列番号１２（ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン４）、配列番号１４（ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン）、もしくは配列番号３１５（Ｎ末端にメチオニンを含む、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン）に示すアミノ酸配列を含む、ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は、受容体である天然型のＱＲＦＰＲもしくはＣＬＰＴＭ１において該アミノ酸配列に並んで位置するアミノ酸配列が、前記アミノ酸配列の端部のいずれか、もしくは両方に並んで位置していない、ポリペプチドであるか、または、配列番号５、１２、１４もしくは３１５のアミノ酸配列ではないが、配列番号５、１２、１４もしくは３１５に対する配列同一性が少なくとも７５％である、アミノ酸配列を含む、ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は、場合によっては、受容体である天然型のＱＲＦＰＲもしくはＣＬＰＴＭ１において該アミノ酸配列に並んで位置するアミノ酸配列が、前記アミノ酸配列の端部のいずれか、もしくは両方に並んで位置していない、ポリペプチド、あるいは、
（ｉｉ）配列番号５、１２、１４、もしくは３１５の一部であるか、またはそのような一部を含む、ポリペプチドであって、該一部は、配列番号５、１２、１４、もしくは３１５における少なくとも６つの連続したアミノ酸を含んでおり、（ｉ）配列番号５、１２、１４、もしくは３１５における少なくとも２つの連続したアミノ酸、もしくは少なくとも２つの連続していないアミノ酸が欠失している、かつ／または、（ｉｉ）受容体である天然型のＱＲＦＰＲもしくはＣＬＰＴＭ１において該アミノ酸配列に並んで位置するアミノ酸配列が、該一部の末端のいずれか、もしくは両方に並んで位置していない、ポリペプチド、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号５、１２、１４、もしくは３１５における少なくとも６つの連続したアミノ酸に相当する少なくとも６つのアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５、１２、１４、もしくは３１５における同等のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である、ポリペプチドであって、（ｉ）配列番号５、１２、１４、もしくは３１５における少なくとも２つの連続したアミノ酸、もしくは少なくとも２つの連続していないアミノ酸が欠失している、かつ／または、（ｉｉ）受容体である天然型のＱＲＦＰＲもしくはＣＬＰＴＭ１において該アミノ酸配列に並んで位置するアミノ酸配列が、配列番号５、１２、１４、もしくは３１５に相当する前記アミノ酸配列の末端のいずれか、もしくは両方に並んで位置していない、ポリペプチド、
である、請求項７、９、もしくは１０に記載の使用のためのポリペプチド、または請求項８もしくは１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、配列番号５の残基８〜１３に相当する配列であるＦＬＹＥＫ（配列番号２１０）を含む、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０または１１に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドは、配列番号５の残基３〜１５に相当する配列であるＬＥＩＫＹＤＦＬＹＥＫＥＨ（配列番号１８０）を含む、請求項１２に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、配列番号５の残基２２〜２４に相当する配列であるＷＴＳ（配列番号２１１）をさらに含む、請求項１２または１３に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドは、配列番号１１に示す配列（ＦＬＹＥＫＥＨＩＣ）、もしくはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列を有する、または含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドは、配列番号６、７、８、および９からなる群から選択される配列、もしくは、その配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列を有する、または含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドは、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9を含む、ポリペプチドであって、該配列は、
Ｘ1は芳香族アミノ酸であり、
Ｘ2は脂肪族アミノ酸であり、
Ｘ5は塩基性アミノ酸であり、
Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、およびＸ9は、それぞれ独立して任意のアミノ酸であってもよい、配列（配列番号３３７）である、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０または１１に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１８】
Ｘ1は、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ2は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、またはＭであって、好ましくはＬ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ5は、Ｋ、Ｒ、またはＨであって、好ましくはＫまたはＲである（配列番号３３８）、請求項１７に記載の使用ためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１９】
Ｘ3は、芳香族アミノ酸であって、好ましくはＦ、Ｗ、もしくはＹであり、かつ／または、
Ｘ4は、酸性アミノ酸であって、好ましくはＥもしくはＤである（配列番号３３９〜３４４）、請求項１７または１８に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２０】
Ｘ6は、酸性アミノ酸であって、好ましくはＥもしくはＤであり、かつ／または、
Ｘ7は、塩基性アミノ酸であって、好ましくはＫ、Ｒ、もしくはＨであり、より好ましくはＫもしくはＲである（配列番号３４５〜３６９）、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２１】
Ｘ8は、脂肪族アミノ酸であって、好ましくはＬ、Ｖ、Ｉ、Ａ、もしくはＭであり、より好ましくはＬ、Ｖ、もしくはＩであり、かつ／または、
Ｘ9は、任意のアミノ酸であって、好ましくはＣである（配列番号３７０〜４０２）、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドは、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9を含む、ポリペプチドであって、該配列は、
Ｘ1は、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ2は、Ｌ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ3は、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ4は、ＤまたはＥであり、
Ｘ5は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり、
Ｘ6は、ＤまたはＥであり、
Ｘ7は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり、
Ｘ8は、Ｌ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ9は、Ｃである配列（配列番号４０３）である、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２３】
前記配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9は、その一方側または両側に並んで、１〜１０個のアミノ酸が位置しており、好ましくは、該並んだアミノ酸配列は、αヘリックスまたはβシートを形成できるアミノ酸を含む、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２４】
残基Ｘ1に並んで、αヘリックスを形成できるアミノ酸を含むアミノ酸配列が位置し、かつ／または、残基Ｘ9に並んで、βシートを形成できるアミノ酸を含むアミノ酸配列が位置しており、好ましくは、Ｘ9に並んで、Ｃが位置している、請求項２３に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドは、配列番号１３に示す配列（ＥＫＥＹＤＤＶＴＩＫ）、もしくはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列を有する、または含む、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０または１１に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドは、前記配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10を含み、Ｘ1は、ＤまたはＥであり、Ｘ2は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり、Ｘ3は、ＤまたはＥであり、Ｘ4は、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、Ｘ5は、ＤまたはＥであり、Ｘ6は、ＤまたはＥであり、Ｘ7は、Ｌ、Ｖ、またはＩであり、Ｘ8は、Ａ、Ｓ、またはＴであり、Ｘ9は、Ｌ、Ｖ、またはＩであり、Ｘ10は、Ｒ、Ｋ、またはＨである（配列番号４０５）、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０、１１または２６のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号１５に示す配列（ＹＩＳＥＨＥＨ）、もしくはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列、および／または配列番号１６に示す配列（ＬＦＷＥＱＨ）、もしくはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列、を有する、または含む、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０または１１に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドは、配列番号１７に示す配列、もしくはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列、もしくは少なくとも６つの連続したアミノ酸を含む、配列番号１７の一部である配列、を有する、または含む、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０、１１、または２７のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドは、配列番号１８の配列、もしくはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列、を有する、または含む、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０、１１、２７、または２８のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項３０】
前記使用のためのポリペプチドまたは前記ポリペプチドは、配列番号２５８、２５９、２６２、２６３、２６９、２７０、２９７、２９８、３０１、３０２、３０８、３０９のいずれか１つに示す配列、もしくはその配列に対する同一性が少なくとも７５％である配列、もしくは少なくとも６つの連続したアミノ酸を含む、前記配列の一部である配列、を有する、または含む、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０または１１に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項１０または１１に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記使用のためのポリペプチドまたは前記ポリペプチドは、配列番号３０、３１、３２、３９、４６、４７、１７５〜１８９のいずれか１つに示す配列、もしくはその配列に対する同一性が少なくとも７５％である配列、を有する、または含む、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０または１１に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドは、二量体の形態、またはより高次の多量体の形態である、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０〜３１のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項３３】
前記使用のためのポリペプチドまたは前記ポリペプチドは、融合タンパク質として提供される、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０〜３２のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項３４】
前記融合タンパク質の融合パートナーは、アルブミン、トランスフェリン、Ｆｃ、フィブリノゲン、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン−アラニン−セリンポリマー、またはエラスチン様ペプチドであり、前記融合パートナーは、場合によってはリンカー配列と結合している、請求項３３に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドは、環状ポリペプチドである、請求項７または９に記載の使用のためのポリペプチド、あるいは請求項８に記載のポリペプチド、あるいは請求項１０〜３２のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたはポリペプチド。
【請求項３６】
高い、または望ましくないＧＤＦ１５のレベルに関連する疾患を治療または予防するための医薬品の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合剤、および／あるいは請求項７、８、または１０〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３７】
薬学的に許容される少なくとも１つの担体または賦形剤と共に、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合剤、および／あるいは請求項７、８、または１０〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項３８】
高い、または望ましくないＧＤＦ１５のレベルに関連する疾患の治療または予防に、個別に、または順次に、または同時に、用いられる組み合わせ製剤として、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合剤、および請求項７、８、または１０〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、製品。
【請求項３９】
高い、または望ましくないＧＤＦ１５のレベルに関連する疾患を治療または予防する方法であって、該方法は、治療または予防を必要とする被験体に対して、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合剤、および／あるいは請求項７、８、または１０〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４０】
高い、または望ましくないＧＤＦ１５のレベルに関連する疾患の治療または予防における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合剤、および／あるいは請求項７、または９〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド、あるいは請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記疾患は、がん、悪液質、骨障害、心疾患、慢性肺障害、肺動脈高血圧症、腎障害、鎌状赤血球貧血、遺伝性球状赤血球症、または鉄過剰症のうちの１つ以上から選択される、請求項３９に記載の使用のための結合剤、および／または請求項４０に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項４２】
ＧＤＦ１５の免疫抑制効果の低減に用いる、請求項４０または４１に記載の使用のための結合剤および／またはポリペプチド。
【請求項４３】
転移の阻害、特にがんの骨への転移の阻害を含む、がん細胞による免疫回避の阻害に用いる、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の使用のための結合剤および／またはポリペプチド。
【請求項４４】
前記悪液質は、がんによって誘導される、請求項４１に記載の使用のための結合剤および／またはポリペプチド。
【請求項４５】
インビトロにおいて、受容体ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合剤、および／あるいは請求項７、８、または１０〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４６】
請求項１〜８または１０〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび／または結合剤である治療薬による治療または予防を必要とする被験体を検出する方法であって、該方法は、ＧＤＦ１５と、その受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１との相互作用、ならびに／あるいはこのような相互作用の効果を検出することを含む、方法。
【請求項４７】
請求項１〜８または１０〜３５のいずれか１項に記載の結合剤および／またはポリペプチドである治療薬を被験体に投与することによって、治療法または予防法を評価またはモニターする方法であって、該方法は、ＧＤＦ１５と、その受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１との相互作用、ならびに／あるいはこのような相互作用の効果を検出することを含む、方法。
【請求項４８】
高いＧＤＦ１５のレベルに関連する疾患に罹患している、またはそのような疾患を発症するリスクがある、被験体を検出する方法であって、該方法は、該被験体において、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用、ならびに／あるいは該作用の効果、を検出することを含む、方法。
【請求項４９】
前記ＧＤＦ１５とその受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１との相互作用を、インサイチュ近接ライゲーションアッセイによって検出する、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記相互作用は、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの間の相互作用であり、該相互作用の効果は、ＱＲＦＰＲ含有エキソソームレベルが上昇することである、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記相互作用は、ＧＤＦ１５とＣＬＰＴＭ１との間の相互作用であり、該相互作用の効果は、リン酸化ＧＳＫ３ｂレベルが上昇することである、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
細胞毒性免疫細胞であって、該細胞は、改変されていない細胞と比較して、ＣＬＰＴＭ１レベルおよび／またはＣＬＰＴＭ１活性が低下するように改変されている、細胞毒性免疫細胞。
【請求項５３】
前記細胞は、がん細胞表面の抗原に対する特異性を有するＴ細胞受容体を発現する、または発現するように改変されている、細胞毒性Ｔ細胞である、請求項５２に記載の細胞。
【請求項５４】
前記細胞は、がん細胞表面の抗原に対する特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するように改変されている細胞毒性Ｔ細胞である、請求項５２に記載の細胞。
【請求項５５】
前記細胞は、場合によっては、がん細胞表面の抗原に対する特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するように改変されている、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である、請求項５２に記載の細胞。
【請求項５６】
前記改変は、ＣＬＰＴＭ１をコードする遺伝子のノックアウト、ノックダウン、または欠失である、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５７】
治療における使用のための、請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５８】
がんの治療における使用のための、請求項５７に記載の使用のための細胞。
【請求項５９】
がんの治療における使用のための医薬品の製造における、請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項６０】
薬学的に許容される少なくとも１つの担体または賦形剤と共に、請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の細胞を含む、治療用組成物。
【請求項６１】
治療法であって、該治療法を必要とする被験体に、請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の細胞の有効量を投与することを含む、治療法。
【請求項６２】
がんの治療に、個別に、または順次に、または同時に、用いられる組み合わせ製剤として、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合剤、および／または請求項７、８、または１０〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド、および請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の細胞を含む、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体に用いることによって、ＧＤＦ１５の、高い、過剰な、または望ましくない、体内におけるレベルおよび／または活性に関連する疾患を、抑制（すなわち、治療または予防）し得る治療薬を含む、ＧＤＦ１５の活性を低減させる薬剤に関する。本発明は、体内において、異なる２つのＧＤＦ１５受容体が発見されたことに基づくものであり、したがって、新規ＧＤＦ１５受容体の同定に基づくものであって、より具体的には、本発明は、受容体へのＧＤＦ１５の結合の防止、および／または受容体のうちの１つまたは両方におけるＧＤＦ１５の効果（すなわち、ＧＤＦ１５が結合することによる効果）の阻害に用いられる、ＧＤＦ１５受容体の断片、およびＧＤＦ１５受容体に結合する抗体または他の親和性結合試薬を提供する。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージ阻害性サイトカイン１（ＭＩＣ１）としても知られる、増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであり、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーに対する配列相同性は、比較的低い（２４％）。ＧＤＦ１５の高いレベルは、癌、神経性食欲不振、骨粗鬆症、腎臓障害、肺動脈高血圧症、および心疾患に関与していることが示され、また、悪液質や、より一般的には食欲不振または食欲抑制に関与していることが示されている。ＧＤＦ１５は、あらゆる原因による死亡に対するマーカーである。
【０００３】
ＧＤＦ１５は、鎌状赤血球貧血、遺伝性球状赤血球症などの鉄過剰症、Ｉ型先天性赤血球生成異常貧血（Ｔａｍａｒｙら，２００８．Ｂｌｏｏｄ １１２，５２４１〜５２４４）およびＩＩ型先天性赤血球生成異常貧血、地中海貧血症（Ｔａｎｎｏら，２００７．Ｎａｔ Ｍｅｄ １３，１０９６〜１１０１）、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）（Ｒａｍｉｒｅｚら，２００９．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １４４，２５１〜２６２）、ならびにピルビン酸キナーゼ欠損症（Ｆｉｎｋｅｎｓｔｅｄｔら，２００９．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１４４，７８９〜７９３）において、過剰発現していることも見出されている。
【０００４】
ＧＤＦ１５は、１９９７年に初めてクローニングされたが、ＧＤＦ１５受容体は、今のところ不明なままである。
【０００５】
ＧＤＦ１５は、腫瘍病理において２つの役割を有する。初期腫瘍においては、このリガンドによってアポトーシスが誘導されるが、リガンドは、前立腺癌、乳癌、胃癌（Ｋｉｍら，２００８．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２９，７０４〜７１２）、大腸癌、および膠芽細胞腫（Ａｌｂｅｒｔｏｎｉら，２００２．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１，４２１２〜４２１９）などの末期がんにおいて、大量に分泌されている。末期の疾患において、ＧＤＦ１５は、腫瘍の転移に寄与しており、転移性前立腺癌における骨への転移に対する最も重要なバイオマーカーである（Ｓｅｌａｎｄｅｒら，２００７．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ １６，５３２〜５３７；Ｗａｋｃｈｏｕｒｅら，２００９．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６９，６５２〜６６１）。
【０００６】
文献では、転移箇所に応じてＧＤＦ１５の発現の上方制御が行われ、骨に浸潤する前立腺癌細胞の副次集団においてそのレベルが著しく高いということが証明されている。ＧＤＦ１５は、破骨細胞および骨芽細胞の両方に影響を及ぼすことも知られている（Ｗａｋｃｈｏｕｒｅら ２００９．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６９，６５２〜６６１）。
【０００７】
ＧＤＦ１５は、悪液質、すなわち慢性疾患よる身体の消耗にも関与しており、特に、末期がんにおける食欲不振および悪液質に関係している。末期がんの患者の食欲不振を補うために、通常、食欲増進剤が用いられるが、今までのところ、ＧＤＦ１５の分子機構を対象とした臨床的に利用可能な薬剤は、現存しない。したがって、腫瘍によって誘発された悪液質は、回復が困難である。最近では、がんにおける致死的転帰のうち、最大で２５％が悪液質によるものであり得ると推定されている。
【０００８】
ＧＤＦ１５は、視床下部回路に作用することによって、中枢神経系機構を通じて、悪液質におけるその効果を発揮すると考えられる。ＧＤＦ１５を全身投与することによって、視床下部の弓状核において、重要な食欲刺激性ペプチドであるＮＰＹの発現が減少し、食欲抑制物質α−ＭＳＨの前駆体であるＰＯＭＣの発現が増加することが見出されている。弓状核は、摂食行動を調節するものであり、血液脳関門（ＢＢＢ）が全身性要因に対して寛容である最後野に隣接している。このように、ＧＤＦ１５の高いレベルが、食欲抑制に関連していることが示されている。さらに、進行した前立腺癌の患者における体重減少の程度は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、またはＩＬ−８などの、悪液質に関係している他の要因の血清レベルではなく、６ヶ月間のＧＤＦ１５の血清レベルと相関する。
【発明の概要】
【０００９】
ＵＳ２００９／０００４８１において、ブライト（Breit）は、食欲および体重を調節する手段として、体内におけるＧＤＦ１５の量または活性を増加または減少させるＧＤＦ１５（ＭＩＣ−１）調節試薬を用いることを提案した。これは、ＧＤＦ１５が過剰発現されているがんまたは他の疾患に関連する食欲減少および／または体重減少を治療するために、抗ＧＤＦ１５抗体またはその断片を用いることを含むものである。このような、またその他の、ＧＤＦ１５の生理学的役割および病理学上の役割が、これまでに明らかになっているが、この生理学的に重要なタンパク質に対する受容体（または複数の受容体）が何であるかは、不明なままである。発明者らは、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）アッセイを用いて、構造的に無関係な異なる２つのＧＤＦ１５受容体を初めて同定した。これらの知見に基づいて、ＧＤＦ１５の効果を低減させる新規の治療薬を提案する。
【００１０】
本出願において、ＧＤＦ１５受容体が２つ同定されている。１つは、ピログルタミル化ＲＦアミドペプチド受容体（ＱＲＦＰＲ）であり、もう１つは、口唇口蓋裂膜貫通タンパク質１（ＣＬＰＴＭ１）である。
【００１１】
食欲増進性神経ペプチドＱＲＦＰ受容体またはＧタンパク質結合受容体１０３（ＧＰＲ１０３）としても知られるＱＲＦＰＲは、Ｎ末端細胞外ドメインと、さらに３つの細胞外ドメイン（またはループ）とを含む、７回膜貫通型のＧタンパク質結合タンパク質受容体である。ヒトＱＲＦＰＲのアミノ酸配列を、配列番号１に示す。ＱＲＦＰＲのトポロジーのインシリコ予測によって、ＱＲＦＰＲの細胞外Ｎ末端ドメイン（ＥＣＤ１）は、残基１〜４６（配列番号３）を含み、細胞外ドメイン２（ＥＣＤ２；ループ１）は、残基１０３〜１２０（配列番号４）を含み、細胞外ドメイン３（ＥＣＤ３；ループ２）は、残基１８４〜２１２（配列番号５）を含み、細胞外ドメイン４（ＥＣＤ４；ループ３）は、残基２９３〜３１１（配列番号１２）を含むことが示唆されている。ＱＲＦＰＲは、視床下部の弓状核において高発現されている、食欲増進性、すなわち食欲刺激性の受容体である（Ｂｒｕｚｚｏｎｅら，２００７．Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５０３，５７３〜５９１；Ｕｋｅｎａら ２０１３．Ｇｅｎ Ｃｏｍｐ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９０，４２〜４６）。リガンドであるＲＦアミド４３がＱＲＦＰＲに結合すると、食欲刺激性ペプチドであるＮＰＹの発現が誘導され、またＰＯＭＣ（食欲抑制物質）の発現が阻害されて、摂食行動が刺激され、血圧が調節される（Ｔａｋａｙａｓｕら，２００６．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３，７４３８〜７４４３）。このように、ＲＦアミド４３とＧＤＦ１５とは、ＮＰＹおよびＰＯＭＣの発現において、ひいては食欲の調節において、反対の役割を有している。このように、ＧＤＦ１５が、この受容体においてアンタゴニストとして作用し、内因性の作動性リガンドの効果に拮抗し得るという、本発明の基盤を成し、以下でより詳細に報告する、知見は、食欲／悪液質の低下を伴うＧＤＦ１５の高いレベルと矛盾しない。
【００１２】
発明者らは、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用が、ＱＲＦＰＲの食欲刺激機能に干渉し、摂食行動の負の調節に関係するということを提案する。このことから、さらに、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用に干渉する薬剤を治療に用いることによって、食欲抑制および／または体重減少に関連する悪液質などの疾患を治療または予防し得るという、本発明の基盤を成す提案を行う。
【００１３】
食欲の調節に加えて、受容体ＱＲＦＰＲは、骨形成の調節を行う（Ｂａｒｉｂａｕｌｔら，２００６．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２６，７０９〜７１７）。ＱＲＦＰＲノックアウトマウスは、やせており、骨質量の低下を示す。また、破骨細胞の数も減少している。ＱＲＦＰＲは、特に、骨芽細胞などの骨の細胞において発現されることが知られており、発明者らは、いくつかの異なる原発性骨がんおよび二次性骨微小転移巣のいずれにおいても、ＱＲＦＰＲが上方制御されていることを示した。したがって、発明者らは、ここでさらに、原発性骨がんおよび他のがん（前立腺癌など）の骨への転移のいずれをも含む、骨の障害または骨に関連する障害において、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用が重要であるということ、また、この相互作用に干渉する薬剤は、このような疾患を治療または予防するための新規の治療法となるということを提案するものである。
【００１４】
本発明に至る研究において、発明者らは、ＧＤＦ１５が、ＱＲＦＰＲに結合し、２つの機構によって、細胞表面におけるその発現量を低下させ得るということを示した。ＧＤＦ１５は、受容体の内在化およびプロテアソームによる分解を誘導し、また、ＱＲＦＰＲ陽性エキソソームの分泌による、細胞表面からの受容体の放出も誘導する。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞表面において利用可能なＱＲＦＰＲのレベルを下方制御することによって、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用がＱＲＦＰＲの活性に干渉すると考えられる。したがって、上述したような、ＧＤＦ１５の高いレベルに関連する病状に対する可能な治療として、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用を阻害することを提案する。
【００１５】
ＧＤＦ１５受容体として同定された第２の受容体は、ＣＬＰＴＭ１である（ヒトにおけるこの受容体のアミノ酸配列を、配列番号２に示す）。ＣＬＰＴＭ１は、細胞外ドメインが３５０アミノ酸以下である膜貫通タンパク質である（ヒトＣＬＰＴＭ１のＥＣＤのアミノ酸配列を、配列番号１４に示す。これは、３５３アミノ酸を有する（配列番号１のアミノ酸２〜３５４である））。ＣＬＰＴＭ１の発現パターンは他とは異なり、例えば、免疫系の細胞において発現される。特に、ＣＬＰＴＭ１は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）およびマクロファージにおいて発現されることが知られており、発明者らは、さらに、様々なクラスのリンパ球などの他の免疫系の細胞、特に、様々なクラスのＴリンパ球によって発現され得ること、すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の特定のサブセットがＣＬＰＴＭ１を発現し得、また、ＣＤ３−ＣＤ４５＋非Ｔ細胞の特定のサブセットもＣＬＰＴＭ１を発現し得るということを示した。このように、ＣＬＰＴＭ１は、様々な免疫細胞によって発現され得る。
【００１６】
ＱＲＦＰＲとは異なり、ＧＤＦ１５がＣＬＰＴＭ１に結合した場合は、細胞表面から受容体は失われない。むしろ、ＧＤＦ１５がＮＫ−９２細胞を刺激することによって、ＴＧＦｂＲＩ（ＡＬＫ５）およびＴＧＦｂＲＩＩのＣＬＰＴＭ１との共局在化が誘導されることが、本発明の基盤を成す研究において見出され、また、この刺激によって、ＧＳＫ３ｂがリン酸化される。ＧＤＦ１５は、先に、ＧＳＫ３のリン酸化に関わり、リン酸化された（９／２１）ＧＳＫ３ｂは、自然免疫系の細胞の活性化の低減および細胞毒性の低減に関わる。したがって、ＧＤＦ１５からの刺激を受けると、ＣＬＰＴＭ１がＴＧＢｂ受容体複合体と会合するという観察結果によって、ＧＤＦ１５がどのようにＮＫ細胞の細胞毒性を低下させ得るのかが説明される。このことは、ＧＤＦ１５と、受容体、特に、様々な免疫細胞で発現され得るＣＬＰＴＭ１などとの相互作用を阻害することによって、ＧＤＦ１５の免疫抑制効果が低減され得るという提案を支持するものである。
【００１７】
通常の生理学においては、高レベルのＧＤＦ１５は、胎盤細胞によって分泌される。発明者らは、ＧＤＦ１５は、胎盤の免疫調節において、胎盤細胞に対する免疫応答の下方制御や免疫攻撃からの胎盤の保護などの生理学的役割を果たすと考えている。マクロファージおよびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）のいずれもが、胎盤の「異物」細胞にとって大きな脅威となり、局所的に抑制されなければならない。ＧＤＦ１５は、プロペプチドを含む未処理の形態であるプロＧＤＦ１５として分泌される場合があり、プロＧＤＦ１５は、プロＧＤＦ１５を分泌する細胞の細胞外基質の成分と会合して、潜在性ＧＤＦ１５として細胞の近傍に貯蔵されると考えられる。発明者らは、胎盤細胞表面において局所的に高濃度なＧＤＦ１５は、マクロファージおよびＮＫ細胞の両方、ならびに他の潜在的ＧＤＦ１５応答性免疫細胞の活性を低減させる潜在能力を有しているということを提案する。重要なことには、発明者らは、さらに、ＧＤＦ１５は、がんによる免疫回避において同様の役割を果たし得ると考えている。多くの腫瘍においてＧＤＦ１５が分泌されており、胎盤の場合と同様に、腫瘍間質および転移部位におけるＧＤＦ１５の局所濃度を効果的に上昇させる。ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１を標的とすることによって、腫瘍は、ＮＫ細胞、マクロファージ、および／または他の免疫細胞の活性を低減させて、細胞性免疫応答から腫瘍自体を保護し得る。したがって、発明者らは、ここで、ＧＤＦ１５と受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１との相互作用を阻害する薬剤を、さらに、がんの免疫回避を阻害する、またはがんによって誘導される免疫寛容を阻害するのに、特に、転移を阻害するのに、利用すること、ならびに、より一般的に、ＧＤＦ１５によって誘導される免疫抑制を阻害するのに利用することを提案する。
【００１８】
特に、発明者らは、下記実施例において、ＱＲＦＰＲの第３および第４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＱＲＦＰＲのループ２およびループ３）に由来するペプチドのいずれもが、ＧＤＦ１５に結合できることを示している。したがって、発明者らは、内因性の作動性リガンド（endogenous agonistic ligands）の結合部位とは異なると考えられる、ＱＲＦＰＲにおけるＧＤＦ１５結合部位が、ＥＣＤ３（配列番号５）およびＥＣＤ４（配列番号１２）の両方に存在しているということを提案する。これらのタンパク質ループは、それぞれ、２０以下のアミノ酸を含み、ＧＤＦ１５がこの受容体に結合する場合は、これらのループの両方に同時に結合すると考えられる。下記実施例において報告する研究では、さらに、これらのループのアミノ酸配列に対して高い配列同一性を有する配列を含むペプチドが、固有のリガンドによって活性化されるＱＲＦＰＲの能力を残しながら、ＧＤＦ１５が誘導する、細胞表面でのＱＲＦＰＲの減少を防止するのに有効であることを実証しており、このことは、これらのペプチドが、ＧＤＦ１５に結合することによって、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用を特異的に阻害できるということを示している。したがって、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３および細胞外ドメイン４（ループ２およびループ３）由来のペプチドは、ＧＤＦ１５とその受容体との相互作用を阻害する有望な治療薬として期待される。さらに、下記実施例において、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインに結合する抗体も、受容体の活性に影響を与えずに、ＧＤＦ１５が誘導する、細胞表面でのＱＲＦＰＲの減少を防止できることが示されており、これによって、ＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ相互作用を阻害する、追加的または代替的な、有望な薬剤が提供される。したがって、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインに結合可能な薬剤は、ＧＤＦ１５に対して、その細胞外ドメインが及ぼす作用を阻害する、さらなる有望な治療薬である。
【００１９】
下記実施例において、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン領域（配列番号１４）を含むペプチドが、「プルダウン」アッセイにおいてＧＤＦ１５と相互作用し、ＱＲＦＰＲの領域を含むペプチドよりも高い親和性でＧＤＦ１５に結合することが示されている。したがって、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン領域を含むペプチドは、ＧＤＦ１５とその受容体との相互作用を阻害する、さらなる治療薬である。実施例では、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインに結合する抗体をプレインキュベートすることによって、ＧＳＫ３ｂのリン酸化を阻害できることも実証されており、このことは、ＣＬＰＴＭ１に結合する、ＧＤＦ１５−ＣＬＰＴＭ１相互作用を特異的に阻害できるということを示している。ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインに結合可能な薬剤は、ＧＤＦ１５に対して、その細胞外ドメインが及ぼす作用を阻害する、さらなる有望な治療薬である。
【００２０】
したがって、ＧＤＦ１５が、本出願において同定された２つの受容体を介して、骨の発達、悪液質、がんの確立および転移、ならびに免疫機能の低減などに対して、少なくとも部分的に生理的効果を発揮し得るということは、明らかである。よって、特に、ＧＤＦ１５のレベルが高い場合に、上述した疾患、または実際には、ＧＤＦ１５の高い、または望ましくないレベルに関連するあらゆる疾患、を治療または予防するために、ＧＤＦ１５とこれらの受容体との相互作用を阻害することが望ましい。本発明は、この必要性に応えるものであり、したがって、ＧＤＦ１５とその受容体との相互作用、または相互作用の効果を阻害する治療薬を提供する。
【００２１】
第１類の治療薬は、本明細書で同定されたＧＤＦ１５受容体のリガンド結合ドメインに基づくポリペプチドである。これらのポリペプチドは、「デコイ（decoy）
」受容体分子（「デコイペプチド」）として働き、循環血液中に遊離しているＧＤＦ１５、またはＥＣＭおよび／または間質に会合しているＧＤＦ１５に結合し、ＧＤＦ１５が受容体に結合することを防止することができる。第２類の治療薬は、ＧＤＦ１５受容体の細胞外ドメインに結合して受容体へのＧＤＦ１５の結合を阻害し、これによってＧＤＦ１５とその受容体との相互作用を阻害する結合剤、または受容体のうちの１つもしくは両方において、他の方法でＧＤＦ１５の効果を阻害する結合剤である。
【００２２】
したがって、第１の態様においては、本発明は、ＧＤＦ１５に結合して、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害することができるポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号５（ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３）、配列番号１２（ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン４）、もしくは配列番号１４（ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン）に示すアミノ酸配列、または配列番号５、１２、もしくは１４に対する配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列、を有する、または含む、ポリペプチド、あるいは、
（ｉｉ）配列番号５、１２、もしくは１４における少なくとも６つの連続したアミノ酸を含む、配列番号５、１２、もしくは１４の一部であるか、またはそのような一部を含む、ポリペプチド、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号５、１２、または１４における少なくとも６つの連続したアミノ酸に相当する少なくとも６つのアミノ酸を含み、配列番号５、１２、または１４と同等のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である、ポリペプチドである。
【００２３】
このような本発明のポリペプチドは、受容体である天然型ＱＲＦＰＲ自体、また天然型ＣＬＰＴＭ１自体を含まない（より具体的には、あらゆる種由来の、受容体である天然型または野生型の全長ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１が、除外される）。したがって、このポリペプチドは、配列番号１もしくは２からなる、または配列番号１もしくは２を含む、ポリペプチドを含まない。また、配列番号１または２のホモログまたはオルソログである、すなわち他の種に由来する受容体である、天然型または野生型の全長（すなわち、無傷または全体の）ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１であるアミノ酸配列からなる、またはそのようなアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを含まない。したがって、このような本発明のポリペプチドは、配列番号２８７または配列番号２８８からなるものではなく、また、これらを含まない。以下で述べるように、ある特定の実施形態においては、このような本発明のポリペプチドは、さらに、配列番号２４３〜２４９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドではない。
【００２４】
この点に関して、配列番号２４３〜２４５は、受容体ＱＲＦＰＲの断片であり、これらの断片は、ＷＯ０１／８７９３０において配列番号２、４、および５として開示されている細胞外ドメイン（すなわち、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３またはＥＣＤ４を含む受容体断片である）のそれぞれよりも大きい。したがって、一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３またはＥＣＤ４よりも大きい受容体断片、あるいはＣＬＰＴＭ１のＥＣＤ（以下でさらに述べるように、ＣＬＰＴＭ１のＥＣＤは、例えば配列番号２または配列番号３１５に示すように、Ｎ末端のメチオニンを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい）よりも大きい受容体断片を含まない。ＷＯ０１／８７９３０は、一実施形態において少なくともＱＲＦＰＲに相当すると思われる、「ガラニン様ＧＣＰＲ（Ｇタンパク質結合受容体）」と称する受容体に関するものであるが、この文献では、受容体へのガラニンの結合を調節することに焦点を合わせており、ＧＤＦ１５に対して、受容体が及ぼす作用については開示されていない。配列番号２４６〜２４９は、ＷＯ２００５／１２４３４２で同定された異なる２つの受容体ＧＰＲ１０３の配列（ＱＲＦＰＲは、ＧＰＲ１０３としても知られている）の断片、すなわちそれらの配列に由来するポリペプチドであり、それぞれＷＯ２００５／１２４３４２の配列番号４０９、４１１、４２２、および４２６に相当する。本出願の配列番号２８７および２８８は、それぞれ、ＷＯ２００５／１２４３４２において配列番号１０６および１０７として同定された受容体ＧＰＲ１０３の配列に相当する。この文献は、軟骨細胞における軟骨合成を誘導する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて、他の多くの受容体配列の中から、これらの受容体配列を用いることに関するものである。この文献には、ＧＤＦ１５に対して、ＧＰＲ１０３／ＱＲＦＰＲが及ぼす作用については開示されていない。したがって、前記ポリペプチドは、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン全体、すなわち完全な細胞外ドメインや、細胞外ドメイン３および４（ＥＣＤ３または４）の断片または一部、あるいはＣＬＰＴＭ１のＥＣＤの断片または一部以外に、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３もしくはＥＣＤ４、またはＣＬＰＴＭ１のＥＣＤに基づく、または由来するが、天然型の分子の配列を基準にして、例えば１つ以上のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失などの改変が行われているアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよいし、そのようなポリペプチドを含んでいてもよい。したがって、その配列が、ＥＣＤまたはその一部の天然型の配列を基準にして、変異を有していてもよいし、改変されていてもよい、機能的に同等な分子が含まれる。「機能的に同等な」とは、ポリペプチドが、ＧＤＦ１５に結合し、かつ受容体に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害する能力を保持しているということを意味する。
【００２５】
特に、本発明のポリペプチドは、アミノ酸を少なくとも６つ含み、かつ配列番号５、１２、もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列の、少なくとも６つの連続したアミノ酸を含む一部、あるいは配列番号５、１２、もしくは１４のいずれか１つまたは前記一部に対する配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列の一部、からなっていてもよいし、そのような一部を含んでいてもよい、ポリペプチドである。一実施形態においては、配列番号５、１２、もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列の一部は、少なくとも６つの連続したアミノ酸を含み、かつ配列番号５、１２、または１４を基準にして、少なくとも２つの連続したアミノ酸、または少なくとも２つの連続していないアミノ酸が欠失している。同様に、配列番号５、１２、または１４のいずれか１つに対する配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列の一部であるポリペプチドは、少なくとも６つの連続したアミノ酸を含み、かつ配列番号５、１２、または１４に相当する機能的に同等な変異型配列を基準にして、少なくとも２つの連続したアミノ酸、または少なくとも２つの連続していないアミノ酸が欠失していてもよい。
【００２６】
したがって、配列番号５、１２、または１４の一部は、以下でさらに述べるように、同定されてもよく、かつ本発明に係るポリペプチドとして用いられてもよいし、そのようなポリペプチドに用いられてもよい。あるいは、本発明のポリペプチドは、例えば以下で同定するように、該一部のいずれかに対する配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列を有していてもよいし、含んでいてもよい。
【００２７】
配列番号５、１２、または１４のいずれか１つの一部である、代表的な、または例示的な配列を以下に挙げるが、例えば、配列番号６〜９および１１（配列番号５に示すＱＲＦＰＲのＥＣＤ３の一部）、配列番号１３（配列番号１２に示すＱＲＦＰＲのＥＣＤ４のＣ末端部分）、および配列番号１５〜１８（配列番号１４に示すＣＬＰＴＭ１のＥＣＤの一部）が含まれる。本発明のポリペプチドは、配列番号５、１２、または１４の一部である前記配列に対する配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列を有していてもよいし、含んでいてもよい。さらなる実施形態においては、本発明のポリペプチドは、以下、例えば表１または下記実施例のいずれかに挙げる配列番号５、１２、または１４の一部である配列のいずれかに対する配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列を有していてもよいし、含んでいてもよい。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に結合することができる、治療における使用のための結合剤を提供し、該結合剤は、ＧＤＦ１５と該受容体との相互作用を阻害することができる。
【００２９】
特に、前記ポリペプチドおよび／または結合剤は、ＧＤＦ１５の高い、または望ましくないレベルに関連する疾患を、治療または予防するためのものである。
【００３０】
このような疾患については、以下でより詳細に述べるが、ある好ましい実施形態においては、がん、悪液質、免疫抑制、および骨障害が挙げられる。
【００３１】
結合剤は、タンパク性分子であってもよいし、非タンパク性分子であってもよいが、以下でさらに述べるように、好ましくは抗体である。
【００３２】
好ましい実施形態においては、結合剤は、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに結合しない。さらなる好ましい実施形態においては、結合剤は、追加的に、または代替的に、内因性の作動性リガンドが受容体に結合することを阻害せず、ここで、特に、受容体はＱＲＦＰＲである。
【００３３】
本発明のまたさらなる態様は、ＧＤＦ１５の高い、または望ましくないレベルに関連する疾患を治療または予防するための医薬品の製造における、前記定義された本発明のポリペプチドおよび／または前記定義された本発明の結合剤の使用を提供する。
【００３４】
本発明によると、薬学的に許容される少なくとも１つの担体または賦形剤と共に、前記定義された本発明のポリペプチドおよび／または前記定義された本発明の結合剤を含む、医薬組成物も提供される。
【００３５】
本発明のまたさらなる態様は、前記定義された本発明のポリペプチドおよび前記定義された本発明の結合剤を含むキットを提供する。
【００３６】
キットの構成要素は、薬学的送達（すなわち、治療目的の使用）のために提供または処方されてもよく、したがって、ポリペプチドまたは結合剤と、１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物の形態で提供されてもよい。構成要素は、順次投与または同時投与を含む、個別投与のために処方または提供されてもよい。キットは、ＧＤＦ１５の望ましくないレベルに関連する疾患の治療または予防に用いられてもよい。
【００３７】
したがって、本発明の別の態様は、ＧＤＦ１５の望ましくないレベルに関連する疾患の治療または予防に、個別に、または順次に、または同時に、用いられる組み合わせ製剤として、前記定義された本発明のポリペプチドおよび前記定義された本発明の結合剤を含む製品を提供する。
【００３８】
ＧＤＦ１５の高い、または望ましくないレベルに関連する疾患を治療または予防する方法も提供され、当該方法は、治療または予防を必要とする被験体に対して、前記定義された本発明のポリペプチドおよび／または前記定義された本発明の結合剤の有効量を投与することを含む。
【００３９】
本発明は、また、非医学的に用いられてもよく、したがって、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害する非治療的な方法は、本発明のさらなる態様を形成する。このような方法は、本発明に係る受容体を含む細胞または無細胞系とＧＤＦ１５とを、本発明に係るポリペプチドおよび／または結合剤に接触させることを含んでいてもよい。したがって、この態様においては、本発明は、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用をインビトロにおいて阻害するための、前記定義された本発明のポリペプチドおよび／または前記定義された本発明の結合剤の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
「ポリペプチド」なる語は、本明細書において、ペプチド分子、ポリペプチド分子、またはタンパク質分子を含んで広く用いられ、例えばタンパク質／ペプチド／ポリペプチド部が存在するのであれば、他の化学基または化学的部分を含んでいてもよいあらゆるタンパク性分子を含む。上記の通り、本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基を少なくとも６つ含む。
【００４１】
「阻害する」なる語は、防止することのみならず、低減させることも含んでおり、したがって、例えば、受容体のうちのいずれか１つもしくは両方に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用、または本明細書で述べる治療効果、生物学的効果、生理学的効果もしくは活性などの所定の活性または性質を低減、低下、または降下させる効果を含む。したがって、換言すると、本発明のポリペプチドおよび／または結合剤は、受容体のうちのいずれか１つもしくは両方に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害し得るが、このことは、必ずしも、受容体の結合および／または機能を完全に阻害することを伴ったり、必要としたりはせず、単に低減させていればよい。代表的な例としては、受容体へのＧＤＦ１５の結合、および／あるいは、このような結合によって生じる、またはこのような結合によって誘導もしくは刺激される、受容体機能の効果または態様が、本発明のポリペプチドおよび／または結合剤の非存在下において見られる結合および／または受容体活性もしくは受容体機能と比較して、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、または７０％以上低減されてもよい。したがって、受容体へのＧＤＦ１５の結合が阻害されようがされなかろうが、受容体におけるＧＤＦ１５の効果は阻害され得るということがわかるであろう。よって、本発明のポリペプチドは、ＧＤＦ１５が受容体に結合するか結合しないかに関わらず、受容体に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用、またはその作用の効果を阻害し得る。
【００４２】
「相互作用」なる語は、受容体のうちの１つもしくは両方にＧＤＦ１５が結合すること、および／または受容体の活性もしくは受容体におけるあらゆる効果を、刺激もしくは誘導することを含む。したがって、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害することは、上述したように、受容体へのＧＤＦ１５の結合を必ずしも阻害することなく、ＧＤＦ１５が受容体に結合することの（すなわち、結合することによって生じる）効果を阻害することを含む。
【００４３】
受容体へのＧＤＦ１５の結合は、下記実施例において説明する結合アッセイなどの、文献において広く説明され、かつ報告されている公知のリガンド結合アッセイを用いて評価または決定され得る。ＧＤＦ１５が受容体に結合することの効果、または、より具体的には、ＧＤＦ１５が受容体に結合する際の本発明のポリペプチドもしくは結合剤の効果は、ＧＤＦ１５および／または本発明のポリペプチドもしくは結合剤が受容体に結合することによって生じる、または誘導される、または刺激される、効果を決定または評価することによって、評価または決定され得る。したがって、例えば、ＧＤＦ１５がＱＲＦＰＲに結合することによって、受容体の内在化および／または細胞表面からの受容体の放出が起こり得る。このような効果は、例えば、ＱＲＦＰＲ陽性エキソソームまたはＱＲＦＰＲ陽性エンドソームの有無またはその量を、下記実施例で説明するように決定することなどにより、エキソソームおよび／またはＱＲＦＰＲ陽性エンドソームにおける受容体の有無および／またはその量を決定することによって、評価または決定され得る。本発明のポリペプチドまたは結合剤は、このようなＱＲＦＰＲ陽性エンドソームまたはエキソソームを減少させ得る。
【００４４】
受容体活性の他の態様は、ＧＤＦ１５の存在下で、かつ本発明のポリペプチドまたは結合剤の存在下または非存在下で、評価または決定され得、例えば、ＧＤＦ１５の免疫抑制効果の低減は、受容体を発現する免疫細胞（ＮＫ細胞またはマクロファージなど）が発揮する細胞媒介性細胞毒性の程度または量を決定することによって、評価または決定され得る。あるいは、ＧＤＦ１５による受容体の刺激によって生じるシグナル伝達の他の態様は、本発明の結合剤またはポリペプチドの存在下または非存在下で、例えばＧＳＫ３ｂのリン酸化を評価および比較することによって、評価および比較され得る。
【００４５】
「治療する」なる語は、本明細書において広く用いられ、ある疾患を発症している、またはある疾患に罹患している被験体の、疾患または臨床状態を改善または向上させるあらゆる態様を含む。したがって、疾患が完全に治癒することは必要ではなく、「治療する」は、疾患の態様、パラメータ、または症状を改善することを含む。
【００４６】
同様に、「予防する」なる語は、本明細書において広く用いられ、ある疾患を減速または遅延させる、またはある疾患の発症もしくは進行を減速または遅延させる、あらゆる態様を含む。したがって、予防することは、疾患の発症を完全にまたは絶対的に予防することは求められず、疾患の態様、症状、またはパラメータの進行または開始を遅延または減速させることを含み得る。症状、パラメータ、または態様の重症度は低減され得、かつ／または発症時に遅延され得る。特定の実施形態においては、予防することは、がんの転移、より具体的には、骨へのがんの転移を予防する（または低減する）ことを含み得る。他の実施形態においては、疾患の１つ以上の症状または態様の進行または発症が遅延または低減され得、あるいは、実際には発症が防止され得る。例えば、慢性疾患または慢性病（例えば、がん、または関節リウマチなどの炎症性疾患）を発症している被験体の悪液質は、発症が防止され得るか、または、そのような悪液質は、遅延され得る、かつ／もしくは重症度が低減され得る。
【００４７】
上記の通り、本発明のポリペプチドは、受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に基づくものであって、天然型ＥＣＤの断片のみならず、天然型ＥＣＤの配列変異体（ＥＣＤの一部由来の配列変異体を含む）も含み得る。
【００４８】
したがって、別の定義では、本発明のポリペプチドは、ＧＤＦ１５に結合して、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害することができるポリペプチドであってもよく、該ポリペプチドは、
配列（ａ）Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9（式Ｉ）であって、
式中、
Ｘ1は芳香族アミノ酸であり、
Ｘ2は脂肪族アミノ酸であり、
Ｘ5は塩基性アミノ酸であり、
Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、およびＸ9は、それぞれ独立して任意のアミノ酸であってもよい、配列（配列番号３３７）を有する、または含む、ポリペプチド、あるいは、
配列（ｂ）Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（式ＩＩ）であって、
式中、
Ｘ1は、ＤまたはＥなどの酸性アミノ酸であり、
Ｘ2は、Ｋ、Ｒ、またはＨなどの塩基性アミノ酸であって、好ましくはＫまたはＲであり、
Ｘ3は、ＤまたはＥなどの酸性アミノ酸であり、
Ｘ4は、Ｆ、Ｗ、またはＹなどの芳香族アミノ酸であり、
Ｘ5は、ＤまたはＥなどの酸性アミノ酸であり、
Ｘ6は、ＤまたはＥなどの酸性アミノ酸であり、
Ｘ7は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、またはＭなどの脂肪族アミノ酸であって、好ましくはＬ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ8は、Ａ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ9は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、またはＭなどの脂肪族アミノ酸であって、好ましくはＬ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ10は、Ｒ、Ｋ、またはＨなどの芳香族アミノ酸であって、好ましくはＲまたはＫである、配列（配列番号４０４）を有する、または含む、ポリペプチドである。
【００４９】
芳香族アミノ酸は、独立して、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ｔｅｒｔ．−ブチルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｔｅｒｔ．−ブチルフェニルアラニン、ビフェニルアラニン、およびトリｔｅｒｔ．−ブチルトリプトファンから選択され得る。
【００５０】
塩基性アミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、メチルリジン（ＭｅＫ）、およびアセチルリジン（ＡｃＫ）から選択され得る。
【００５１】
脂肪族アミノ酸は、独立して、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）、およびノルロイシン（Ｎｏｒ）から選択され得る。
【００５２】
より具体的な実施形態においては、式Ｉのポリペプチドにおいて、
Ｘ1は、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ2は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、またはＭであって、好ましくはＬ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ5は、Ｋ、Ｒ、またはＨであって、好ましくはＫまたはＲである（配列番号３３８）。
【００５３】
追加的に、または代替的に、式Ｉのポリペプチドにおいて、
Ｘ3は、芳香族アミノ酸であって、好ましくはＦ、Ｗ、またはＹであり、かつ／あるいは、
Ｘ4は、酸性アミノ酸であって、好ましくはＥまたはＤである（配列番号３３９〜３４４）。
【００５４】
さらに、追加的に、または代替的に、式Ｉのポリペプチドにおいて、
Ｘ6は、酸性アミノ酸であって、好ましくはＥまたはＤであり、かつ／あるいは、
Ｘ7は、塩基性アミノ酸であって、好ましくはＫ、Ｒ、またはＨであり、より好ましくはＫまたはＲである（配列番号３４５〜３６９）。
【００５５】
さらに、追加的に、または代替的に、式Ｉのポリペプチドにおいて、
Ｘ8は、脂肪族アミノ酸であって、好ましくはＬ、Ｖ、Ｉ、Ａ、またはＭであり、より好ましくはＬ、Ｖ、またはＩであり、かつ／あるいは、
Ｘ9は、任意のアミノ酸であって、好ましくはＣである（配列番号３７０〜４０２）。
【００５６】
特定の実施形態においては、式Ｉのポリペプチドは、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9（配列番号４０３）を有していてもよいし、含んでいてもよい、ポリペプチドであって、
Ｘ1は、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ2は、Ｌ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ3は、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ4は、ＤまたはＥであり、
Ｘ5は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり、
Ｘ6は、ＤまたはＥであり、
Ｘ7は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり、
Ｘ8は、Ｌ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ9は、Ｃである、ポリペプチドである。
【００５７】
さらなる実施形態においては、式Ｉのポリペプチドにおいて、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9は、その一方側または両側に並んで、１〜１０個のアミノ酸が位置しており、好ましくは、該並んだアミノ酸配列は、αヘリックスまたはβシートを形成できるアミノ酸を含む。
【００５８】
このような式Ｉのポリペプチドの代表的な実施形態においては、残基Ｘ1に並んで、αヘリックスを形成できるアミノ酸を含むアミノ酸配列が位置し、かつ／または、残基Ｘ9に並んで、βシートを形成できるアミノ酸を含むアミノ酸配列が位置しており、好ましくは、Ｘ9に並んで、Ｃが位置している。
【００５９】
式ＩＩの特定の実施形態においては、Ｘ1は、ＤまたはＥであり、Ｘ2は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり、Ｘ3は、ＤまたはＥであり、Ｘ4は、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、Ｘ5は、ＤまたはＥであり、Ｘ6は、ＤまたはＥであり、Ｘ7は、Ｌ、Ｖ、またはＩであり、Ｘ8は、Ａ、Ｓ、またはＴであり、Ｘ9は、Ｌ、Ｖ、またはＩであり、Ｘ10は、Ｒ、Ｋ、またはＨである（配列番号４０５）。
【００６０】
本発明に係るポリペプチドの任意の態様の特定の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号２１０に示す配列（ＦＬＹＥＫ）を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明に係るポリペプチドの任意の態様のさらなる実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号２１１に示す残基配列（配列番号１の残基２５５〜２５７のＷＴＳに相当）を含んでいてもよい。
【００６２】
上記の通り、代表的な実施形態においては、本発明のポリペプチドは、配列番号５、１２、または１４のＥＣＤ配列のうちのいずれか１つの一部であるか、または一部に相当する、配列を有していてもよいし、含んでいてもよい。このような配列は、配列番号５、１２、または１４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの一部に対する配列同一性が少なくとも７５％であってもよく、例えば、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３に由来する配列である配列番号１１、配列番号７、または配列番号６、８、もしくは９、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ４に由来する配列である配列番号１３、ＣＬＰＴＭ１のＥＣＤに由来する配列である配列番号１７、配列番号１８、配列番号１５（ＹＩＳＥＨＥＨ）、または配列番号１６（ＬＦＷＥＱＨ）などが挙げられる。
【００６３】
さらなる実施形態においては、本発明のポリペプチドは、配列番号１５に示す配列（ＹＩＳＥＨＥＨ）、またはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列、および配列番号１６に示す配列（ＬＦＷＥＱＨ）、またはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列、を含んでいてもよい。
【００６４】
本発明に係る他の代表的なポリペプチドは、下記表１に挙げたようなアミノ酸配列、またはそのような配列のうちのいずれかの配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列、または、該当する場合は、そのような配列のうちのいずれかの配列の一部であって、少なくとも６つの連続したアミノ酸を含む、配列、を有していてもよいし、含んでいてもよい。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
したがって、本発明は、ＧＤＦ１５とその受容体との相互作用を阻害することによって、被験体におけるＧＤＦ１５の活性または効果を低減することができる、治療薬（結合剤およびポリペプチド）を提供する。このような薬剤は、ＧＤＦ１５の受容体であるＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン、あるいはＥＣＤに基づく、もしくはＥＣＤに由来するポリペプチド、またはその一部から得られる部分、特に可溶性の部分と、これらのＧＤＦ１５受容体のうちの一方の細胞外ドメインに特異的に結合する結合剤と、からなる群から選択される。
【００６７】
ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインの一部に対する配列同一性が高いポリペプチドのことを、ＧＤＦ１５受容体の細胞外ドメインに「基づいている」または「由来している」と言ってもよいし、ＧＤＦ１５受容体の細胞外ドメインに「基づいている」または「由来している」配列を有する、もしくは含むと言ってもよい。したがって、このようなポリペプチドは、ＥＣＤまたはその一部に相当するが、配列番号５、１２、または１４に示す天然型ヒトＥＣＤの配列と比較して、配列の変異または改変をいくらか含む、配列を含んでいてもよいし、有していてもよい。よって、「相当する」配列は、配列番号５、１２、または１４のＥＣＤに含まれる配列（すなわち、該配列の一部）と相関関係があってもよいし、整合されていてもよいが、該配列を基準にして、１つ以上の配列の変異を含み得る。
【００６８】
本発明のポリペプチドは、他の種由来の受容体ＱＲＦＰＲもしくはＣＬＰＴＭ１から得られる、またはこれらに由来する、変異体またはホモログを含んでいてもよい。したがって、ポリペプチドは、他の種由来の、特に、イヌまたはマウスなどの他の哺乳動物種由来の、同等な、または相当する受容体のＥＣＤに由来していてもよいし、それらに基づくものであってもよい。
【００６９】
本発明で同定された受容体は、いずれも膜貫通タンパク質であるので、本発明の様々な態様の好ましい実施形態においては、本明細書に記載のポリペプチドは、このタンパク質の１つまたは複数の細胞外ドメインの細胞外にある一部であるか、またはこの一部を含むものである。したがって、好ましくは、ポリペプチドは、全長タンパク質ではなく、また全長タンパク質を含まない。特に、全長の野生型受容体タンパク質でも天然型受容体タンパク質でもなく、またこのようなタンパク質を含まないものであり、例えば、ポリペプチドは、配列番号１または２に示す配列も、マウス、ラットなどの他の種由来の同等の配列も有さない（または、このような配列からなるものではない）。他の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号２８７に示す配列も配列番号２８８に示す配列も有さず、また含まない。
【００７０】
ある好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、受容体（すなわち、受容体配列に相当するアミノ酸配列）に由来するか、またはそれから得られるアミノ酸配列であって、それぞれの受容体タンパク質の細胞外ドメインの一部を形成しない、アミノ酸配列を含まない。すなわち、アミノ酸配列は、それぞれの受容体タンパク質の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを形成するものである。具体的には、好ましい実施形態においては、ＱＲＦＰＲに由来するポリペプチドは、ＱＲＦＰＲのＮ末端および／またはＣ末端から細胞外ドメインまでの残基（アミノ酸配列）、あるいはその一部、を含み得ず、特に、ＱＲＦＰＲのＮ末端および／またはＣ末端からＥＣＤ３および／またはＥＣＤ４の残基（アミノ酸配列）（すなわち、配列番号１内の、Ｎ末端またはＣ末端から、配列番号５または１２で表される配列までの残基／配列、あるいはその一部）を含み得ない。また、ＣＬＰＴＭ１に由来するポリペプチドは、ＣＬＰＴＭ１のＣ末端から細胞外ドメインまでの残基（アミノ酸配列）、またはその一部（すなわち、配列番号２内の、Ｃ末端から、配列番号１４で表される配列までの残基／配列、またはその一部）を含み得ない。したがって、ある実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号１の１〜１８３、２１３〜２９２、または３１２〜４３１のアミノ酸を含まない（ＱＲＦＰＲに由来するポリペプチドの場合）。他の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号２の３５５〜６６９のアミノ酸を含まない（ＣＬＰＴＭ１に由来するポリペプチドの場合）。
【００７１】
本発明の様々な態様のうちのいずれかにおけるある実施形態においては、ポリペプチドは、天然型細胞外ドメインの全長アミノ酸配列からなるものではない。すなわち、このような実施形態においては、ポリペプチドは、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３およびＥＣＤ４、またはＣＬＰＴＭ１のＥＣＤからなるものではない。したがって、このような一実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号５、１２、または１４のいずれか１つの配列からなるものではない。他の実施形態においては、ポリペプチドは、ＱＲＦＰＲ配列またはＣＬＰＴＭ１配列に由来せず、またこれらの配列に相当しない１つ以上の追加的なアミノ酸配列と、天然型細胞外ドメインの全長とを含んでいてもよい。換言すると、ポリペプチドは、受容体である天然型ＱＲＦＰＲまたは天然型ＣＬＰＴＭ１由来の配列ではないアミノ酸配列の１つ以上、より具体的には、天然型受容体におけるそれぞれのＥＣＤに並んで位置している、または隣接している、配列ではないアミノ酸配列の１つ以上と、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３もしくはＥＣＤ４、および／またはＣＬＰＴＭ１のＥＣＤ（または、実際には、このようなＥＣＤのうちのいずれかの一部）とからなるものであってもよい。この場合、追加的なアミノ酸配列は、アミノ酸を２つ以上含んでいてもよい。このような実施形態においては、ポリペプチドは、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３および／もしくはＥＣＤ４またはその一部、ならびに／あるいは、ＣＬＰＴＭ１のＥＣＤまたはその一部に由来する、またはそれに相当する配列以外の、受容体である天然型／野生型ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１に由来する、またはそれに相当するアミノ酸配列を含有しないということがわかるであろう。
【００７２】
したがって、より長いアミノ酸配列の一部として、ポリペプチドがＥＣＤまたはその一部を含む、ある実施形態においては、ＥＣＤまたはその一部の配列は、「非天然型」配列構造に含まれていてもよい。すなわち、ＥＣＤまたはその一部に相当するアミノ酸配列の一方側または両側に並んで位置する配列は、ＥＣＤまたはその一部が得られるまたは由来する、あるいは相当する全長天然型受容体において（例えば、配列番号１（全長ＱＲＦＰＲ）またはＣＬＰＴＭ１（全長ＣＬＰＴＭ１）において）、ＥＣＤまたはその一部の配列（例えば、配列番号５、１２、または１４、あるいはその一部）に並んで位置する配列ではない。したがって、ある実施形態においては、（Ｎ末端および／またはＣ末端から）配列番号５または１２に並んで位置する、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つの連続したアミノ酸は、配列番号１由来のものではない。他のある実施形態においては、（Ｃ末端から）配列番号１４に並んで位置する、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つの連続したアミノ酸は、配列番号２由来のものではない。このことから、並んで位置するアミノ酸は、配列番号１において配列番号５、１２で定義される細胞外ドメイン、または配列番号２において配列番号１４で定義される細胞外ドメインに隣接しているアミノ酸であることが理解されるであろう。
【００７３】
本発明の様々な態様のうちのいずれかにおけるまたさらなる実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３および／またはＥＣＤ４の一部、ならびに／あるいはＣＬＰＴＭ１のＥＣＤの一部であってもよいし（すなわち、このような一部からなるものであってもよいし）、このような一部を含むものであってもよい。特定の実施形態においては、このような一部は、ＥＣＤから、少なくとも２つの連続したアミノ酸、または少なくとも２つの連続していないアミノ酸が欠失したものであってもよい。したがって、代表的な実施形態においては、本発明に係るポリペプチドは、１つ以上（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上）のアミノ酸（連続していてもよいし、連続していなくてもよい）が欠失した、配列番号５、１２、または１４に相当する、またはこれらの配列である、アミノ酸配列からなるものであってもよいし、このようなアミノ酸配列を含むものであってもよい。換言すると、欠失させたアミノ酸は、配列番号５、１２、または１４のＮ末端および／またはＣ末端に見られるものであってもよい。
【００７４】
上記の通り、ある実施形態においては、ポリペプチド配列は、配列番号２４３〜２４９のいずれでもない。またさらなる実施形態においては、ポリペプチド配列は、配列番号２８７でも、配列番号２８８でもない。
【００７５】
したがって、ある特定の実施形態においては、本発明は、ＧＤＦ１５に結合して、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害することができるポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号５（ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３）、配列番号１２（ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン４）、もしくは配列番号１４（ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン）に示すアミノ酸配列を含む、ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は、受容体である天然型のＱＲＦＰＲもしくはＣＬＰＴＭ１において該アミノ酸配列に並んで位置するアミノ酸配列が、前記アミノ酸配列の端部のいずれか、もしくは両方に並んで位置していない、ポリペプチドであるか、または、配列番号５、１２、もしくは１４のアミノ酸配列ではないが、配列番号５、１２、もしくは１４に対する配列同一性が少なくとも７５％である、アミノ酸配列を含む、ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は、場合によっては、受容体である天然型のＱＲＦＰＲもしくはＣＬＰＴＭ１において該アミノ酸配列に並んで位置するアミノ酸配列が、前記アミノ酸配列の端部のいずれか、もしくは両方に並んで位置していない、ポリペプチド、あるいは、
（ｉｉ）配列番号５、１２、もしくは１４の一部であるか、またはそのような一部を含む、ポリペプチドであって、該一部は、配列番号５、１２、もしくは１４における少なくとも６つの連続したアミノ酸を含んでおり、（ｉ）配列番号５、１２、もしくは１４における少なくとも２つの連続したアミノ酸、もしくは少なくとも２つの連続していないアミノ酸が欠失している、かつ／または、（ｉｉ）受容体である天然型のＱＲＦＰＲもしくはＣＬＰＴＭ１において該アミノ酸配列に並んで位置するアミノ酸配列が、該一部の末端のいずれか、もしくは両方に並んで位置していない、ポリペプチド、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号５、１２、もしくは１４における少なくとも６つの連続したアミノ酸に相当する少なくとも６つのアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５、１２、もしくは１４における同等のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である、ポリペプチドであって、（ｉ）配列番号５、１２、もしくは１４における少なくとも２つの連続したアミノ酸、もしくは少なくとも２つの連続していないアミノ酸が欠失している、かつ／または、（ｉｉ）受容体である天然型のＱＲＦＰＲもしくはＣＬＰＴＭ１において該アミノ酸配列に並んで位置するアミノ酸配列が、配列番号５、１２、もしくは１４に相当する前記アミノ酸配列の末端のいずれか、もしくは両方に並んで位置していない、ポリペプチド、である。
【００７６】
上記の通り、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３および４に由来する配列を含むペプチドは、インビトロにおいてＧＤＦ１５と相互作用することが見出されており、このようなペプチドは、ＧＤＦ１５に結合できるだけではなく、ＱＲＦＰＲとＧＤＦ１５との相互作用を阻害できるということを示すデータが、下記実施例において提供されている。
【００７７】
上記式Ｉまたは式ＩＩに示す配列を有する、または含む、ポリペプチドは、それぞれ、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３およびＥＣＤ４に由来するポリペプチドであるか、またはＥＣＤ３およびＥＣＤ４に基づくポリペプチドであってもよい。
【００７８】
上記の通り、ＧＤＦ１５は、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３および４の両方と、同時に結合することが見出されている。したがって、ＱＲＦＰＲのＧＤＦ１５結合部位は、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３および４の両方の一部を含むと考えられる。したがって、本発明に係るポリペプチドは、配列番号５、６〜９、もしくは１１のいずれか１つに示す第１の配列、またはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列と、配列番号１２もしくは１３に示す第２の配列、またはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列とを含む、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３および４の両方に由来する配列を含んでいてもよい。さらなる特定の実施形態においては、該第１の配列および第２の配列は、リンカーによって区別されている。それらは、いずれの順番で存在していてもよい。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号１７８または１７９に示す第１の配列と、配列番号１２に示す第２の配列とを含んでいてもよい。
【００７９】
ＧＤＦ１５は、ＱＲＦＰＲを含有するエキソソームの放出を誘導すること、またはＱＲＦＰＲの内在化を誘導することによって、細胞表面におけるＱＲＦＰＲの発現を下方制御するように作用する。しかしながら、ＱＲＦＰＲは、作動効果を有し、ＱＲＦＰＲを介したシグナル伝達を誘導する他のリガンド（例えば、Ｐ５１８およびＲＦアミド４３）を有する。本発明の好ましい実施形態においては、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインに由来する配列を有するポリペプチド、またはそのような配列を含むポリペプチドは、ＱＲＦＰＲアゴニストに結合せず、かつＱＲＦＰＲアゴニストの、ＱＲＦＰＲを介したシグナル伝達を活性化する能力を低減させない。
【００８０】
ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインに由来する配列を含むポリペプチドも、ＧＤＦ１５と相互作用することが見出されており、ＧＤＦ１５とその受容体との相互作用を阻害するのに用いられ得る。特定の実施形態においては、このようなポリペプチドは、配列番号１７または１８に示す配列を有していてもよいし、含んでいてもよい。ＱＲＦＰＲと同様に、受容体ＣＬＰＴＭ１は、２つのＧＤＦ１５結合部位を含み得、すなわち、ＧＤＦ１５は、受容体ＣＬＰＴＭ１内に、または、より具体的にはそのＥＣＤ内に、接点を少なくとも２つ有していてもよい。特に、発明者らは、現在のところ、下記実施例において報告する研究に基づいて、２つのＧＤＦ１５結合部位またはＧＤＦ１５との接点は、配列番号１４（ヒトＣＬＰＴＭ１のＥＣＤ）の１０８〜１３８のアミノ酸である配列番号１７に存在していると考えている。これらは、配列番号１５（ＹＩＳＥＨＥＨ）および１６（ＬＦＷＥＱＨ）として提供されるが、これらの結合部位の一部であるか、一部を含むか、または一部からなるものである。本発明の代表的なポリペプチドは、これらの配列のうちの一方もしくは両方に相当する、または基づく、または由来する、配列を含んでいてもよい。結合部位を両方含む代表的なポリペプチドは、配列番号１８またはそれに対する配列同一性が少なくとも７５％である配列を有しているか、または含んでいる。本発明の代表的なポリペプチドは、配列番号１４の１２３〜１３８のアミノ酸である、配列番号１８に示す配列を有するポリペプチド、またはこの配列を含むポリペプチドも含み、これは、推定上の結合部位を１つ含んでいる。
【００８１】
さらなる実験によって、ＣＬＰＴＭ１には、ＧＤＦ１５の他の結合部位または追加的な結合部位があるということが示唆されている（例えば、実施例１９を参照）。したがって、このような追加的な結合部位のうちの１つは、配列番号２００（ＹＦＮＤＹＷＮＬＱ）で表されてもよいし、この配列を含んでいてもよい。本発明の代表的なポリペプチドは、この配列に相当する、または基づく、または由来する、配列を含んでいてもよい。したがって、代表的なポリペプチドは、配列番号２００、またはそれに対する配列同一性が少なくとも７５％である配列を有しているか、または含んでおり、例えば、ポリペプチドは、配列番号２０１〜２０９のいずれか１つ、またはそれに対する配列同一性が少なくとも７５％である配列を有していてもよいし、含んでいてもよい。
【００８２】
一実施形態においては、ＣＬＰＴＭ１から得られる、またはＣＬＰＴＭ１に由来する、ポリペプチドは、ＣＬＰＴＭ１への内因性のリガンドの結合を阻害せず、かつ／または、内因性のリガンドが受容体を活性化する、または刺激することを阻害しない。しかしながら、他の実施形態においては、内因性のリガンドが結合すること、および／または内因性のリガンドが受容体を活性化する、もしくは刺激することが、望ましい場合、または有利な場合がある。
【００８３】
さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の配列を含む、ＱＲＦＰＲから得られるアミノ酸配列、またはＱＲＦＰＲに由来するアミノ酸配列、および本明細書に記載の配列を含む、ＣＬＰＴＭ１から得られるアミノ酸配列、またはＣＬＰＴＭ１に由来するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００８４】
本発明は、異なる受容体および／または異なるＥＣＤから得られてもよいし、それらに由来していてもよく、大きさが異なっていてもよく、またＧＤＦ１５の結合部位を１つ以上を含有していてもよい、様々な異なるポリペプチドを提供するということがわかるであろう。したがって、異なるポリペプチドのレパートリー、またはパネル、またはライブラリ、またはセットが提供され得る。異なるポリペプチドは、ＧＤＦ１５に対する親和性が異なっていてもよく、また、例えばＧＤＦ１５に対する結合活性が異なるように、好みに応じて用いられてもよい。それらは、単独で用いられてもよいし、組み合わせて用いられてもよい。したがって、異なるポリペプチドによって、治療が延長され得る、または継続され得る。例えば、治療中の被験体が、特定のポリペプチドに対する免疫応答を起こした場合には、別のポリペプチドを選択して用い得る。より大きな治療効果を得るために、ポリペプチドを組み合わせて用いてもよい。
【００８５】
上記の通り、本発明のポリペプチドは、アミノ酸を最小限６つ含む。しかしながら、有利には、より長いポリペプチドの方が、より高い親和性でＧＤＦ１５に結合し得るので、ポリペプチドは、アミノ酸を少なくとも７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、またはそれ以上、含んでいてもよい。
【００８６】
例えば、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３（配列番号５）から得られるポリペプチド、またはそれに由来するポリペプチドに関しては、これらのポリペプチドは、配列番号５もしくはその一部に由来するアミノ酸、またはそれに相当するアミノ酸を、６〜２９個、例えば６〜２８個、また例えば、６つ、７つ、８つ、９つもしくは１０個のうちのいずれか以上、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、もしくは１８個のうちのいずれか以下、有していてもよいし、含んでいてもよい。ある実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号５のうちの２７個以下のアミノ酸からなるものであってもよいし、そのようなアミノ酸を含むものであってもよい。
【００８７】
驚くべきことに、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３の細胞外ドメインにおける短い一部が、溶液中でＧＤＦ１５と結合できるということが見出された（実施例１６を参照）。マウスＱＲＦＰＲに由来するＥＣＤ３のアミノ酸のうちの１５個を含むポリペプチド（配列番号１８４）を、柔軟なリンカーを有するＦｃ融合タンパク質として供したところ、プルダウンアッセイにおいて、ＧＤＦ１５とよく結合することが見出された（配列番号２４０を参照）。このポリペプチドは、配列番号１７６に示す配列を有する、ヒトＱＲＦＰＲに由来する配列に相当する。マウスにおける配列は、ヒトにおける配列と相同性が高く、配列番号１７６（ヒト）の第２位がグルタミン残基である代わりに、配列番号１８４（マウス）の第２位がアルギニン残基であることのみが異なっている。この配列に由来する配列、またはこの配列との関係が近い配列を有するポリペプチドが、特に興味深い。したがって、この配列との関係が近い、アミノ酸を１３〜１８個含むポリペプチドは、本発明の特に好ましい実施形態である。特に、配列番号３０、３１、３２、３９、４６、４７、もしくは１７５〜１８９のいずれか１つに示す配列、またはその配列に対する同一性が少なくとも７５％である配列、を有する、または含む、ポリペプチドは、本発明の様々な態様における好ましいポリペプチドである。
【００８８】
上記の通り、ＥＣＤ３に由来するこのようなアミノ酸配列は、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ４に由来する配列と組み合わされてもよい。したがって、ポリペプチドは、上記段落で定義された、前記ＥＣＤ３由来の配列である第１の配列を、配列番号１２もしくは１３に示す第２の配列、またはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列と共に含んでいてもよい。第１の配列および第２の配列は、場合によってはリンカー配列またはスペーサー配列を介して、いずれの順番で連結されていてもよいし、以下でより詳細に述べるように、Ｆｃ融合タンパク質のヘテロダイマーなどのヘテロダイマーとして、組み合わせて提供されてもよい。
【００８９】
ＱＲＦＰＲのＥＣＤ４（配列番号１２）から得られるポリペプチド、またはそれに由来するポリペプチドは、配列番号１２もしくはその一部に由来するアミノ酸、またはそれに相当するアミノ酸を、６〜１９個、例えば６〜１８個、また例えば、６つ、７つ、８つ、もしくは９つのうちのいずれか以上、１９個、１８個、１７個、１６個、もしくは１５個のいずれか以下、有していてもよいし、含んでいてもよい。ある実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号１２のうちの１７個以下のアミノ酸からなるものであってもよいし、そのようなアミノ酸を含むものであってもよい。
【００９０】
ＣＬＰＴＭ１のＥＣＤ（配列番号１４）から得られるポリペプチド、またはそれに由来するポリペプチドは、配列番号１４もしくはその一部に由来するアミノ酸、またはそれに相当するアミノ酸を、６〜３５４個、例えば、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、もしくは２０個のうちのいずれか以上、３５４個、３５３個、３５０個、３２０個、３００個、２８０個、２６０個、２５０個、２４０個、２２０個、２００個、１８０個、１６０個、１５０個、１４０個、１２０個、１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５０個、４０個、３０個、もしくは２０個のいずれか以下、含んでいてもよい。例えば、ポリペプチドは、配列番号１４から得られるかもしくはそれに由来するアミノ酸、またはその一部に相当するアミノ酸を、６つ、７つ、８つもしくは９つ以上、５０個、４５個、４０個、３５個、もしくは３０個以下、有していてもよいし、含んでいてもよい。
【００９１】
配列番号１７に示す配列に相当する、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインの３１アミノ酸からなる部分を含むポリペプチドは、溶液中でＧＤＦ１５に結合でき（実施例１６を参照）、かつＣＤ１４＋免疫細胞において、ＣＬＰＴＭ１活性に対するＧＤＦ１５の効果を阻害できる（実施例１７を参照）ということが見出された。ＧＧＧＧＳリンカー配列の３回繰り返し配列を含む柔軟なリンカーによって、ＣＬＰＴＭ１に由来する上記ポリペプチドがＦｃと連結された融合タンパク質を供した（配列番号２４１を参照）。したがって、配列番号１７の配列、またはその配列に対する同一性が少なくとも７５％である配列を有する、または含む、ポリペプチド、あるいは、少なくとも６個の連続したアミノ酸を含む、配列番号１７の一部である配列を含むポリペプチドは、本発明の様々な態様における好ましいポリペプチドである。
【００９２】
実施例１８において、ＣＬＰＴＭ１に由来するポリペプチドのうちのいくつかに対するＧＤＦ１５の結合を、ＥＬＩＳＡアッセイで試験した（図３２を参照）。ポリペプチドのうちのいくつかは、ＧＤＦ１５と結合することが見出され、したがって、これらは、本発明の好ましいポリペプチドとなり得る。よって、配列番号２５８、２５９、２６１、２６２、２６９、２７０、２９７、２９８、３０１、３０２、３０８、３０９のいずれか１つに示す配列、またはその配列に対する同一性が少なくとも７５％である配列を有する、または含む、ポリペプチドは、本発明の様々な態様における好ましいポリペプチドである。
【００９３】
特に、配列番号２７０に示すアミノ酸配列（すなわち、配列ＧＤＹＹＰＩＩＹＦＮＤＹＷＮＬＱＫＤＹＹＧ）または配列番号３０９に示すアミノ酸配列（すなわち、配列ＧＤＹＹＰＩＩＹＦＮＤＹＷＮＬＱＫＤＹＹであり、これはすなわち、天然型のＣＬＰＴＭ１のＥＣＤには存在しないＣ末端のＧ残基を欠いた配列番号２７０である）を有する、または含む、あるいはそのようなアミノ酸配列に基づくか由来する（例えば、その一部が、少なくとも６つの連続したアミノ酸を含むか、またはそのようなアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列を含む）、ポリペプチドが好ましい。例えば、ポリペプチドは、配列番号２７０または３０９の配列を有するポリペプチド、または少なくとも６つの連続したアミノ酸を含む、配列番号２７０または３０９の一部である配列を有するポリペプチド、または配列番号２７０または３０９に対する同一性が少なくとも７５％である配列を有するポリペプチド、を含む融合タンパク質の形態であってもよい。別の実施形態においては、ポリペプチドは、融合パートナーを有するのではなく、ネイキッドポリペプチド（naked polypeptide）であってもよいし、ポリペプチドは、以下でさらに述べるような非ペプチド系のポリマーなどの、他の部分と抱合されていてもよい。例えば、ポリペプチドは、少なくとも配列ＤＹＹＰＩＩを含む、配列番号２７０または３０９の一部を含んでいてもよい（配列番号３２６）。
【００９４】
ポリペプチドが、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインから得られるか、またはそれに由来する、本発明のある実施形態においては、ポリペプチドは、ＣＬＰＴＭ１遺伝子にコードされている天然型Ｎ末端メチオニン残基を含んでいてもよく、この場合、例えば、天然型ＣＬＰＴＭ１または内因性のＣＬＰＴＭ１の開始コドンが、ポリペプチドをコードしている核酸配列に含まれている。したがって、ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１から、１３７、１３８、１３９、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、２８８、２９０、３００、３２０、３４０、３５０、または３５４までのアミノ酸を含んでいてもよい。よって、さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを有する、配列番号１４に相当するアミノ酸配列を有していてもよいし、含んでいてもよい。このようなポリペプチドを、配列番号３１５に示す。したがって、本明細書において、例えば配列番号１４またはその一部を含むポリペプチドに関連して、配列番号１４について言及する場合は、このような言及は、配列番号３１５についての言及と置き換えられてもよいし、配列番号３１５についての言及で補足されてもよい。換言すると、本明細書における配列番号１４についての言及は、配列番号３１５についての言及も含むものと見なされてもよい。
【００９５】
実際のところ、本発明のポリペプチドは、上記に含まれる任意の整数間に相当する範囲の長さ、または上記範囲内の任意の範囲の長さを含んでいてもよいし、有していてもよい。さらに、以下でより詳細に述べるように、本発明のポリペプチドは、ＱＲＦＰＲおよび／もしくはＣＬＰＴＭ１から得られる、あるいはそれらに由来する、ペプチド配列に、付加または連結された１つ以上の他のアミノ酸配列を含む、融合形態、またはその他の延長形態もしくは伸長形態で提供されてもよい。
【００９６】
本発明の特定の実施形態においては、ポリペプチドは、ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインの全て、または実質的に全て、を含んでいてもよい。
【００９７】
ＧＤＦとその受容体との相互作用を、ポリペプチドが阻害できるようにするためには、このようなポリペプチドがＧＤＦ１５に結合できることが必要である。理論に拘束されることを望むものではないが、ＧＤＦ１５におけるＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１に対する結合部位は、（完全に、または部分的に）重複していると考えられるため、ＧＤＦ１５に結合するこれらの受容体のいずれかの細胞外ドメインに由来するポリペプチドは、いずれかの受容体へのＧＤＦ１５の結合を阻害することができると考えられる。換言すると、ＧＤＦ１５に結合するＱＲＦＰＲの細胞外ドメインから得られる、またはそれに由来する、ポリペプチドは、ＧＤＦ１５が、ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１のいずれかに結合することを防止することができ、また、ＧＤＦ１５に結合するＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインから得られる、またはそれに由来する、ポリペプチドは、ＧＤＦ１５が、ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１のいずれかに結合することを防止することができる。
【００９８】
このことは、ＱＲＦＰＲのＥＣＤ３と、ＣＬＰＴＭ１のＥＣＤとの間に、配列が類似した領域が存在していることを示す、下記実施例２０で報告されているさらなる研究によって支持される。ＥＣＤ４との配列類似性についても、いくらか示されている。興味深いことに、これらは、２つの受容体を比較した場合にバックグラウンドにおいて類似性を有する唯一の領域であり、その類似性は、ＧＤＦ１５の結合を媒介する部位または領域に存在している。
【００９９】
本発明のポリペプチドは、例えば可溶性ポリペプチドとして、すなわち、可溶化基および／または可溶化部を備えたペプチドとして、可溶性形態で提供されてもよい。
【０１００】
ポリペプチドは、単量体の形態で提供されてもよいし、二量体の形態で提供されてもよいし、より高次の多量体の形態で提供されてもよい。すなわち、ポリペプチドは、本明細書に記載の、または本明細書で定義される、ポリペプチドのうちのいずれかの二量体またはより高次の多量体であってもよいし、それらを含むものであってもよい。下記実施例で提供されるデータによって、ポリペプチドが、単量体の形態または二量体の形態のいずれかにおいて、活性を有し得ることが示される。ＧＤＦ１５は、二量体として存在しているので、二量体の形態でポリペプチドを提供することが有利な場合がある。
【０１０１】
二量体またはより高次の多量体は、当該技術分野において公知の技術によって、簡便に形成され得る。例えば、二量体は、融合タンパク質の形成中に、自発的に形成されてもよいし、工学的に形成されてもよい。
【０１０２】
ポリペプチドを、さらなる部位を有する融合タンパク質、コンストラクト、または抱合体の形態で提供することが有利である、または望ましい場合がある。
【０１０３】
ある実施形態においては、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド、または多糖などの天然高分子または合成高分子に、ポリペプチドを抱合または連結させて、その薬物動態学的性質を改良してもよい。したがって、様々な実施形態においては、ポリペプチドは、その全ての開示が参照により本明細書に援用される、Ｓｔｒｏｈｌ．２０１５．ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２９，２１５〜２３９に記載されているように、直鎖状もしくは分岐鎖状モノメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ；ＰＥＧ化）、ヒアルロン酸、デキストランもしくはデキストリン、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ；ＨＡＰ化）、プロリン−アラニン−セリンポリマー（ＰＡＳ；ＰＡＳ化）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ；ＥＬＰ化）に抱合させてもよい。実際のところ、当該技術分野において公知であり、治療効果のあるタンパク質と共に用いられる、公知の融合パートナーまたは抱合パートナーが用いられ得る。
【０１０４】
例えば、ポリペプチドの血清半減期を増加させ、かつ／またはポリペプチドにさらなる機能を付加するために、本発明のポリペプチドは、いずれも、融合タンパク質またはキメラタンパク質として提供されてもよい。「融合タンパク質」なる語は、２つ以上の異なる供給源由来のポリペプチド配列を含む、単一ポリペプチド鎖のことをいう。本発明のポリペプチドは、アルブミン、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、トランスフェリン、ストレプトアビジンもしくはストレプトアビジン様タンパク質、または免疫グロブリン、あるいはその一部、特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４など）のＦｃ部位、またはその一部と組み合わせて、融合タンパク質として（例えば、Ｆｃ融合タンパク質として）提供されてもよい。本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質内において、本発明のポリペプチドは、融合タンパク質のＮ末端に位置していてもよいし、融合タンパク質のＣ末端に位置していてもよい。あるいは、本発明のポリペプチドは、融合タンパク質の内部、例えば、融合タンパク質のループまたは他の表面形状内に、位置していてもよい。
【０１０５】
好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域と組み合わせて、融合タンパク質として提供されてもよい。すなわち、Ｆｃ融合タンパク質として提供されてもよい。Ｆｃ融合タンパク質は、二量体を形成するので、この実施形態においては、本発明のポリペプチドの複製物２つが、単一体として提供され得る。このような実施形態においては、二量体は、同一の本発明のポリペプチドを２つ含むホモ二量体であってもよいし、同一ではない本発明のポリペプチドを２つ含むヘテロ二量体として提供されてもよい。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に記載のＱＲＦＰＲの第３の細胞外ドメインから得られる、またはそのドメインに由来する、同一のポリペプチドを２つ含むホモ二量体であってもよいし、本明細書に記載のＱＲＦＰＲの第４の細胞外ドメインから得られる、またはそのドメインに由来する、同一のポリペプチドを２つ含むホモ二量体であってもよい。また、Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に記載のＱＲＦＰＲの第３の細胞外ドメインから得られる、またはそのドメインに由来する、異なるポリペプチドを２つ含むヘテロ二量体であってもよいし、本明細書に記載のＱＲＦＰＲの第４の細胞外ドメインから得られる、またはそのドメインに由来する、異なるポリペプチドを２つ含むヘテロ二量体であってもよい。特定の実施形態においては、Ｆｃ融合タンパク質は、ＱＲＦＰＲの第３の細胞外ドメインから得られる、またはそのドメインに由来する、第１のポリペプチドと、本明細書に記載のＱＲＦＰＲの第４の細胞外ドメインから得られる、またはそのドメインに由来する、第２のポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体であってもよい。また、Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に記載のＣＬＰＴＭ１に由来する、同一のポリペプチドを２つ含むホモ二量体であってもよいし、本明細書に記載のＣＬＰＴＭ１に由来する、異なるポリペプチドを２つ含むヘテロ二量体であってもよい。特定の実施形態においては、Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１５の配列、またはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列を含む、第１のペプチドと、配列番号１６の配列、またはその配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列を含む、第２のペプチドとを含む、ヘテロ二量体であってもよい。
【０１０６】
単量体および二量体と並んで、例えば三量体やそれ以上の、より高次の多量体の形態であるＦｃ融合体も知られており、これらは、本発明に含まれる。
【０１０７】
Ｆｃ融合タンパク質は、免疫原性を有するＦｃドメインを含んでいてもよい。換言すると、Ｆｃ融合タンパク質は、例えば自然免疫系の細胞による応答などの、免疫応答を誘導することが知られている配列を含んでいてもよい。したがって、一実施形態においては、Ｆｃ融合タンパク質は、免疫原性を有していてもよい。特定の実施形態においては、免疫原性を有する配列は、抗体依存性細胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞媒介性食作用（antibody dependent cell mediated phagocytosis、ＡＤＣＰ）を誘導し得る。免疫原性を有するＦｃタグ配列の例は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｌａｚａｒら ２００６．ＰＮＡＳ １０３，４００５〜４０１０；Ｓｈｉｅｌｄｓら ２００１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，６５９１〜６６０４；およびＳｔｅｗａｒｔら ２０１１．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２４，６７１〜６７８を参照）。このような用途に限定されないが、このような免疫原性を有するＦｃ融合タンパク質は、ＧＤＦ１５を過剰発現し、細胞表面付近のＧＤＦ１５濃度が高いがんの治療において特に有用な場合がある。このようなＦｃ融合タンパク質は、被験体の免疫系の細胞を、がんの部位に集めるように作用し、ＧＤＦ１５とその受容体との相互作用を単に阻害するだけでなく、免疫応答を誘導し得る。
【０１０８】
しかしながら、Ｆｃ融合タンパク質において、免疫原性活性が最低限であること、すなわち、免疫応答を誘導することなく、Ｆｃ融合タンパク質がＧＤＦ１５に結合する（ひいては、ＧＤＦ１５を隔離する）ことが、望ましい場合がある。したがって、さらなる実施形態においては、Ｆｃ融合タンパク質は、免疫原性を有さない。
【０１０９】
別の好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、ビスホスホネートとの抱合体として提供されてもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、このようなコンストラクトは、骨において富化する（すなわち、集積する）ものと考えられる。このような集積は、骨において、受容体に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を防止するのに特に有利な場合があり、このことが、特に、骨へのがんの転移を阻害するのに役立つ場合がある。
【０１１０】
本発明において検討される融合タンパク質または抱合体のいずれにおいても、ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１に由来するポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端において、リンカー配列および／またはリンカー基もしくはスペーサー基によって、抱合パートナーまたは融合パートナーに連結されてもよい。ポリペプチド／ペプチド系融合パートナーを含む融合タンパク質の場合、リンカーは、好都合にはペプチド／ポリペプチドリンカーであって、その多くが、当該技術分野において公知であり、かつ説明されている。リンカーは、柔軟なリンカー配列（柔軟なリンカー配列モチーフを繰り返し含んでいてもよい）であってもよい。当該技術分野において公知である典型的なリンカーは、小さな非極性残基（グリシンなど）または小さな極性残基（セリンもしくはスレオニンなど）に富むものであり、一般的に、グリシン残基およびセリン残基（ＧＳ）のつながりからなる。一般的に用いられるリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）リンカー（配列番号２４２）であって、これは、リンカーにおいて、繰り返しユニット（（ＧＧＧＧＳ）n）として用いられてもよく、ここでコピー数ｎは調整され得る。このようなリンカーは、３回繰り返し（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）3）として、実施例１６の融合タンパク質コンストラクトに用いられている。
【０１１１】
非ポリペプチド／ペプチドポリマー（ＰＥＧもしくは多糖など）との抱合体、または他の抱合パートナーとの抱合体の場合、本発明のポリペプチドは、公知の、または望ましい、結合化学反応またはリンカー／結合基を用いて、他の部分（抱合パートナー）に結合または連結（抱合）されていてもよい。これらは、様々なものが、当該技術分野において説明されている。
【０１１２】
さらに別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、環状ペプチドとして提供されてもよい。環状ペプチドは、典型的には、タンパク質分解に対する抵抗性が高く、よって、消化管のタンパク質分解酵素によって分解されないので、タンパク質系治療薬またはペプチド系治療薬の経口投与において特に有用である。しかしながら、環状ペプチドは、構造的に関連する直鎖ペプチドと比べると、典型的には、血清半減期の増加も示す。
【０１１３】
本明細書においては、野生型のＧＤＦ１５受容体の細胞外ドメインの配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の置換を含むが、ＧＤＦ１５に対する結合能は保持している、ポリペプチドについて説明している。好ましくは、本発明のポリペプチドは、天然型タンパク質に見出される同等の配列区画を有するポリペプチドに対する配列同一性が高い。本発明のポリペプチドは、天然型タンパク質に見出される同等の配列区画を有するポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも７５％であり、好ましくは、配列同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。しかしながら、本発明の特定の態様においては、ＧＤＦ１５に結合することによって、ＧＤＦ１５と受容体との相互作用を阻害するために用いられるポリペプチドは、天然型タンパク質に見出される同等の配列区画を有するポリペプチドと同一の配列を含んでいてもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、このようなポリペプチドの方が、天然型タンパク質と比べて１つ以上の置換を有するポリペプチドよりも、免疫応答を誘発しない（すなわち、免疫原性が低い）という可能性がある。なぜなら、非天然型配列を有するポリペプチドは、被験体の免疫系によって「外来」と認識され得るからである。
【０１１４】
配列同一性は、当該技術分野において公知であって、かつ容易に使用可能な方法およびソフトウェアによって、容易に決定され得る。したがって、配列同一性は、任意の簡便な方法によって評価されてもよい。しかしながら、配列間の配列同一性の程度を決定するためには、例えばＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：４６７３〜４６８０）などの、多重配列アラインメントを行うコンピュータプログラムが有用である。ＡＬＩＧＮ（Ｍｙｅｒｓら，（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１〜１７）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎら，（１９８８）ＰＮＡＳ，８５：２４４４〜２４４８；Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３：６３〜９８）、ＢＬＡＳＴおよびｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９〜３４０２）のような、配列対を比較してアラインメントを行うプログラムも、この目的において有用であり、初期設定で用いられてもよい。さらに、欧州バイオインフォマティクス研究所のＤａｌｉサーバにおいて、構造に基づいたタンパク質配列のアラインメントが提供されている（Ｈｏｌｍ（１９９３）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２３３：１２３〜３８；Ｈｏｌｍ（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．，２０：４７８〜４８０；Ｈｏｌｍ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２６：３１６〜９）。多重配列アラインメントおよび同一性パーセントの算出は、標準的なＢＬＡＳＴのパラメータを用いて（例えば、有効な全ての生物の配列と、マトリクスとしてＢｌｏｓｕｍ６２と、ギャップコストとしてｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １とを用いて）決定されてもよい。あるいは、以下のプログラムおよびパラメータが用いられてもよい：プログラム：Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ ４、バージョン４．１０（Ｓｃｉ Ｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｓｕｉｔｅ）；ＤＮＡ比較：全体比較、標準的直線スコアリングマトリクス、不一致ペナルティ＝２、オープンギャップペナルティ＝４、延長ギャップペナルティ＝１；アミノ酸比較：全体比較、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス。本明細書で定義される天然ポリペプチド配列の変異体は、例えば、部位特異的変異導入またはランダム変異導入（例えば、遺伝子シャッフリングまたはエラープローンＰＣＲを用いる）などの標準的な変異導入技術など、当該技術分野において公知の標準的な分子生物学的技術を用いることなどによって、合成的に生成させることができる。このような変異導入技術を用いて、結合性および／または阻害性が向上した、または異なった、ポリペプチドを開発することができる。
【０１１５】
また、本明細書で定義されるポリペプチドの誘導体が用いられてもよい。誘導体とは、天然のアミノ酸の代わりに、当該アミノ酸の構造類似体を含有する、上述したポリペプチドまたはその変異体を意味する。ポリペプチドの機能に悪影響を及ぼさない限りにおいて、誘導体化または改変（ポリペプチドにおけるアミノ酸の標識化、グリコシル化、メチル化など）が行われてもよい。
【０１１６】
「構造類似体」とは、非標準的なアミノ酸を意味する。このような、用いられ得る非標準的なアミノ酸またはアミノ酸構造類似体としては、例えば、Ｄアミノ酸、アミド等価体（Ｎ−メチルアミド、レトロインベルソアミド、チオアミド、チオエステル、ホスホン酸塩、ケトメチレン、ヒドロキシメチレン、フルオロビニル、（Ｅ）−ビニル、メチレンアミノ、メチレンチオ、もしくはアルカンなど）、Ｌ−Ｎメチルアミノ酸、Ｄ−βメチルアミノ酸、またはＤ−Ｎ−メチルアミノ酸などが挙げられる。
【０１１７】
ポリペプチドが、天然型タンパク質の配列と比べてアミノ酸置換を含んでいる場合、その置換は、好ましくは、保存的置換であり得る。「保存的アミノ酸置換」なる語は、アミノ酸が、類似の物理化学的性質を有するアミノ酸、すなわち同じ分類／群のアミノ酸と入れ替わった（置換された）アミノ酸置換のことをいう。例えば、小さい残基であるグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；疎水性または脂肪族残基であるロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）またはメチオニン（Ｍ）；親水性残基であるアスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；酸性残基であるアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；正に荷電した（塩基性）残基であるアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）またはヒスチジン（Ｈ）；あるいは芳香族残基であるフェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）が、ポリペプチドのＧＤＦ１５に対する結合能を実質的に変化させることなしに、区別なく置換され得る。
【０１１８】
第２類の薬剤は、ＧＤＦ１５受容体に結合でき、かつＧＤＦ１５とその受容体との相互作用を阻害するのに用いられ得る結合剤を含む。このような結合剤を用いると、受容体の細胞外ドメインに結合し、ＧＤＦ１５が該受容体に結合することを防止することによって、または、受容体に結合したＧＤＦ１５の効果を阻害もしくは低減する（上記の通り、これは、ＧＤＦ１５の結合を防止することを、必ずしも含まなくてもよい）ことによって、ＧＤＦ１５とその受容体との相互作用を低減させ得る。
【０１１９】
このような結合剤は、受容体におけるＧＤＦ１５の結合、効果、または活性を、阻害または低減するように作用するので、少なくとも、受容体におけるリガンドＧＤＦ１５の効果に対して、結合剤を受容体アンタゴニストと見なし得る。このようなアンタゴニストは、部分的アンタゴニストを含む（すなわち、結合剤は、ＧＤＦ１５に対して所望の拮抗効果を有していてもよいが、受容体において、受容体における他の効果／他のリガンドに対する作動活性を発揮してもよい）。
【０１２０】
一実施形態においては、本薬剤は、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインに結合して、ＧＤＦ１５に対するＱＲＦＰＲの結合能、および／または受容体においてＧＤＦ１５がその効果を発揮する能力を低減させ得る。上述したように、ＱＲＦＰＲは、細胞外ドメインを４つ含む。結合剤は、ＧＤＦ１５結合部位に直接結合する（ひいては、ＧＤＦ１５がＱＲＦＰＲに結合することを阻害する）こと、またはＧＤＦ１５が受容体に結合するのを立体的に防止するのに、または阻害するのに、十分なほど、ＧＤＦ１５結合部位の近くに結合すること、のいずれかによってＧＤＦ１５の結合を防止する様式で、これらのドメインに結合することによって、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用を阻害してもよい。
【０１２１】
特定の実施形態においては、結合剤は、ＧＤＦ１５と相互作用することが見出されているのと同じ、ＱＲＦＰＲの領域（リガンド結合部位）に結合してもよい。すなわち、ＱＲＦＰＲの第３の細胞外ドメインおよび第４の細胞外ドメインのうちの一方または両方に結合してもよい。したがって、一実施形態においては、本薬剤は、ＱＲＦＰＲの第３の細胞外ドメイン（すなわち、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド）に結合してもよいし、ＱＲＦＰＲの第４の細胞外ドメイン（すなわち、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド）に結合してもよいし、ＱＲＦＰＲの第３の細胞外ドメインおよび第４の細胞外ドメインの両方（すなわち、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわち、より具体的には、配列番号５および１２の両方を含むポリペプチド）に結合してもよい。さらなる実施形態においては、本薬剤は、ＱＲＦＰＲの第３の細胞外ドメインおよび／または第４の細胞外ドメインの一部のみに結合してもよい。
【０１２２】
さらなる実施形態においては、結合剤は、ＧＤＦ１５結合部位に結合しない場合がある。この実施形態においては、本薬剤は、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用を、この相互作用を立体的に妨げることによって、阻害することができる。したがって、結合剤は、ＱＲＦＰＲの第１の細胞外ドメインおよび／または第２の細胞外ドメインに結合することによって、ＱＲＦＰＲへのＧＤＦ１５の結合を防止してもよい。一実施形態においては、本薬剤は、ＱＲＦＰＲの第１の細胞外ドメイン（すなわち、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド）に結合してもよい。さらなる実施形態においては、結合剤は、ＱＲＦＰＲの第２の細胞外ドメイン（すなわち、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド）に結合してもよい。また別の実施形態においては、結合剤は、ＱＲＦＰＲの第１の細胞外ドメインおよび第２の細胞外ドメインの両方（すなわち、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、すなわち、配列番号３および４の両方を含むポリペプチド）に結合してもよい。
【０１２３】
別の実施形態においては、本薬剤は、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインに結合して、ＧＤＦ１５に対するＣＬＰＴＭ１の結合能、および／または受容体においてＧＤＦ１５がその効果を発揮する能力を低減させ得る。したがって、第１の実施形態においては、本薬剤は、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合してもよい。特定の実施形態においては、本薬剤は、配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するか、または含む、ポリペプチドに結合してもよい。さらなる実施形態においては、本薬剤は、配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するか、または含む、ポリペプチドに結合してもよい。また別の実施形態においては、本薬剤は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するか、もしくは含む、ポリペプチド、および／または配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するか、もしくは含む、ポリペプチド、に結合してもよい。他の実施形態においては、本薬剤は、配列番号２００に示すアミノ酸配列を有するか、または含む、ポリペプチドに結合してもよい。
【０１２４】
下記実施例１９では、ＣＬＰＴＭ１のＥＣＤ（配列番号１４）における、この受容体に対して拮抗活性を示す抗ＣＬＰＴＭ１抗体の結合部位の解明について述べている。この抗体の共通点は、配列番号２の９８〜１００位のＰＫＤ（配列番号３２２）であることが示されている。したがって、またさらなる実施形態においては、薬剤は、例えば、配列番号２１２に示すアミノ酸配列（ＰＫＤＴ）を有するか、または含む、ポリペプチド、あるいは配列番号２１３〜２３９のうちのいずれか１つ、または配列番号２７５〜２７８のうちのいずれか１つを有するか、または含む、ポリペプチドなどの、配列ＰＫＤ（配列番号３２２）を有するか、または含む、ポリペプチドに結合し得る。実施例１９では、第２のエピトープも同定されている。よって、またさらなる実施形態においては、薬剤は、配列番号２８０〜２８６のうちのいずれか１つに示すアミノ酸配列を有するか、または含む、ポリペプチドに結合し得る。
【０１２５】
本発明の結合剤は、例えば、ＱＲＦＰＲに対する結合能、特に、ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインに対する結合能を有する化合物、分子、または実在物（entity)などの、どのような薬剤であってもよい。特に、結合剤は、ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１（あるいはそれらの細胞外ドメイン）に特異的に結合してもよい。「特異的に結合する」とは、薬剤が、非標的分子への結合とは区別される様式で、ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１（あるいはそれらの細胞外ドメイン）に結合できるということを意味する。したがって、非標的分子への結合は、無視してもよいし、ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１への結合と比較して、実質的に低減されていてもよい。よって、結合剤は、ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対する結合親和性を有する薬剤であってもよく、すなわち、ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１、あるいは、より具体的には、それらの細胞外ドメインに対する親和性結合パートナーであってもよい。
【０１２６】
したがって、本発明の結合剤は、抗体またはその断片もしくは誘導体などの、タンパク質またはポリペプチドや、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、またはその他のペプチドディスプレイシステムを組み合わせて得られたポリペプチド、ＧＤＦ１５の非拮抗的な断片（ＧＤＦ１５の一部を含むポリペプチドなど）、アプタマーなどの核酸分子、あるいはそれらの組み合わせから選択されてもよい。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態においては、結合剤は、タンパク質であり、好ましくは、抗体またはその誘導体もしくは断片である。当該技術分野においても、アフィボディなどの様々な抗体様分子が公知であり、かつ説明されている。
【０１２８】
好ましい実施形態においては、結合剤は、抗体である。抗体は、都合のよいまたは所望の、あらゆる種、分類、またはサブタイプのものであってもよい。さらに抗体は、天然のものであってもよいし、誘導体化されたものであってもよいし、合成されたものであってもよい。したがって、本明細書における「抗体」なる語は、全ての種類の抗体分子および抗体断片を含む。
【０１２９】
より具体的には、本発明に係る「抗体」は、
（ａ）例えば、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、もしくはマウス、または卵黄などの、従来用いられている動物のいずれかである、動物に由来する、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどの様々なクラスまたはサブクラスの免疫グロブリンのいずれか、
（ｂ）モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体、
（ｃ）完全なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはこれらの断片であって、この断片は、例えば、Ｆｃ部を欠く断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）や、完全な抗体の重鎖成分を結合しているジスルフィド結合を還元的に切断することによって得られる、いわゆる「半分子」断片などの、抗体の結合領域を含有する断片であり、ここで、Ｆｖは、軽鎖の可変領域、および２本の鎖として発現される重鎖の可変領域を含有する断片として定義され得る、完全なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはこれらの断片、
（ｄ）組み換え型ＤＮＡまたは他の合成技術によって産生または改変された抗体であって、該抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体、キメラ抗体、または合成的に作成された、もしくは改変された抗体様構造体を含み、単鎖抗体などの、抗体の機能的誘導体または機能的「等価物」も含まれる、抗体、
を含む、抗体である。
【０１３０】
単鎖抗体は、適切なポリペプチドリンカーで連結された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する、融合単鎖分子として、遺伝子工学的に作成された分子として定義され得る。
【０１３１】
このような抗体断片ならびに合成抗体および誘導体化抗体を作成する方法は、当該技術分野においてよく知られている。抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）または高度可変領域を含有する抗体断片もまた、含まれる。これらの領域は、抗原結合部位の形成に寄与する立体ループ構造を形成する、抗体の軽鎖および重鎖上のアミノ酸配列を含む領域として定義され得る。ＣＤＲを用いて、ＣＤＲ移植抗体を生成してもよい。本明細書における「ＣＤＲ移植」とは、軽鎖ドメインおよび／または可変ドメインの１つ以上の配列の少なくとも一部が、与えられた抗原に対して異なる結合特異性を有する抗体に由来する、ＣＤＲ配列の類似した部分で置換されたアミノ酸配列を有する抗体として定義される。当業者であれば、当該技術分野においてよく知られている方法を用いて、このようなＣＤＲ移植抗体を容易に産生することができる。
【０１３２】
キメラ抗体は、ある種の抗受容体抗体の可変ドメインを、異なる種に由来する抗体の定常領域と組み合わせることによって、調製され得る。治療用途で用いるために、このような技術を用いて抗体をヒト化し得る。
【０１３３】
モノクローナル抗体ならびにその断片および誘導体は、本発明に係る好ましい抗体である。
【０１３４】
好ましくは、抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。すなわち、ヒトＧＤＦ１５受容体を認識する結合ドメイン（相補性決定領域（ＣＤＲ）など）と、ヒトにおいて自然に生じる抗体変異体に対する類似性が高くなるように改変された固定ドメイン（Ｆｃドメインなど）とを含むように改変または作成された抗体である。特定の態様においては、ヒト化モノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体は、ＩｇＧ４サブタイプのものであってもよい。この種の改変によって、望ましくは、免疫原性効果が最低限となった抗体が提供される。
【０１３５】
別の好ましい実施形態においては、抗体は、ヒト抗体であってもよい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するように改変されたトランスジェニックマウスまたは他のトランスジェニック動物を用いて調製され得る。ヒト抗体は、ファージディスプレイによって得られてもよく、実際のところ、ヒト抗体は、ヒト被験体、すなわち、例えばヒト自己免疫患者などの、抗受容体抗体が生まれつき存在している、または抗受容体抗体が存在している（すなわち、抗体産生のために、被験体を免疫化する必要がない）、ヒト被験体から単離されてもよい。
【０１３６】
ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１に結合する抗体が報告され、かつ市販されている（例えば、下記実施例を参照）。このような抗体の一例として、バイオス・アンチボディ社（Bioss Antibodies）（米国）から市販されている抗ＣＬＰＴＭ１抗体ｂｓ−８０１８Ｒが挙げられる。さらに、受容体に対する抗体は、公知かつ常用の技術を用いて、容易に調製され得る。抗原において、抗体が結合する部位（抗体が結合する部分）を決定する方法も、常法であるので（下記実施例も参照）、ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１のエピトープ、または抗体結合部位は、容易に決定することができる。
【０１３７】
上記の通り、本発明のポリペプチドおよび結合剤は、組成物の形態で提供されてもよく、特に、ＧＤＦ１５の増加に関連する疾患の治療または予防に用いられ得る、あるいはそのような疾患の治療または予防用に提供され得る、医薬組成物の形態で提供されてもよい。このような組成物は、本発明のポリペプチドを１つ以上、および／または本発明の結合剤を１つ以上、含んでいてもよいし、含有していてもよい。ポリペプチドおよび結合剤は、単一組成物に一緒に含まれていてもよいし、共に、すなわち併用して（すなわち、組み合わせ治療として）用いられる別々の組成物中に含まれていてもよい。ポリペプチドおよび結合剤は、順次に投与されるかまたは用いられてもよいし、同時に投与されるかまたは用いられてもよいし、実質的に同時に投与されるか用いられてもよい。したがって、異なるポリペプチド成分および結合剤成分が、実質的に同時に、一緒にまたは別々に、投与されるか用いられてもよいし、それぞれが別々に、異なる時点または異なる時間間隔で、投与されるかまたは用いられてもよい。
【０１３８】
このような組成物または組み合わせ（上述したようなキットまたは組み合わせ製品など）は、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインから得られる、またはこの細胞外ドメインに由来する、ポリペプチドと、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインに結合する結合剤とを含んでいてもよい。さらなる実施形態においては、組成物または組み合わせは、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインから得られる、またはこの細胞外ドメインに由来する、ポリペプチドと、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインに結合する結合剤とを含んでいてもよい。別の実施形態においては、組成物または組み合わせは、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインから得られる、またはこの細胞外ドメインに由来する、ポリペプチドと、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインに結合する結合剤とを含んでいてもよい。またさらなる実施形態においては、組成物または組み合わせは、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインから得られる、またはこの細胞外ドメインに由来する、ポリペプチドと、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインに結合する結合剤とを含んでいてもよい。
【０１３９】
本発明の組成物、キット、または組み合わせ製品は、ＧＤＦ１５受容体から得られる、またはこれに由来する、ポリペプチドと、同じ受容体に結合する結合剤とを含んでいてもよいということは、明らかであろう。この場合、結合剤およびポリペプチドが互いに結合すると、ＧＤＦ１５とその受容体との相互作用を阻害することができないので、結合剤は、同じ受容体に由来するポリペプチドには結合しないことが一般的に望ましい。このことは、様々な方法で実現され得る。一実施形態においては、結合剤は、ＧＤＦ１５の結合に直接関わらない、ＧＤＦ１５受容体の一部に結合してもよく（ひいては、上述したように、立体障害によって間接的にＧＤＦ１５の結合を阻害してもよい）、ポリペプチドは、ＧＤＦ１５に結合する、ＧＤＦ１５受容体の一部に由来するものであってもよい。さらなる実施形態においては、結合剤は、ＧＤＦ１５の結合に関わる、ＧＤＦ１５受容体の一部に結合してもよく、ポリペプチドは、ＧＤＦ１５受容体の異なる一部に由来するものであってもよい。例えば、結合剤は、ＱＲＦＰＲの第４の細胞外ドメインに結合してもよく、ポリペプチドは、ＱＲＦＰＲの第３の細胞外ドメインに由来するものであってもよい。また別の実施形態においては、ポリペプチドは、ＧＤＦ１５に対する結合能は損なわないが、結合剤への結合を防止する、保存的置換などの配列の改変を含んでいてもよい。しかしながら、当業者であれば、特定の結合剤が、特定のポリペプチドに結合し得るかどうかを立証するのは、容易であり、このような組み合わせを避け得るということを理解するであろう。
【０１４０】
したがって、例えば、ＧＤＦ１５の受容体における結合部位に対して、エピトープ変化を引き起こす抗体を用いてもよく、このような抗体を、同じ受容体から得られる、または同じ受容体に由来する、ポリペプチドと共に、互いに干渉することなく、同じ被験体に用いることが可能である。
【０１４１】
本発明のポリペプチドに結合しない、または併用されるポリペプチドに結合しない、結合剤の利点は、両方の成分を併用することができ、また有利には、両方の成分を用いることによって、例えば、循環血液中に遊離している、または腫瘍近辺の部位に位置している、ＧＤＦ１５と、ＧＤＦ１５が結合することによって、有害な、または望まない、効果を発揮し得る受容体との両方に結合するので、相補的効果が得られるという点である。
【０１４２】
上記の通り、病気、障害、および疾患のいくつかは、ＧＤＦ１５の高いレベルに関連している。このようなＧＤＦ１５の高いレベルは、循環血液中、または体内の組織もしくは臓器において、検出可能であり得る。ＧＤＦ１５は、腫瘍が存在する部位、または腫瘍の近辺において局所的に増加する場合もあり、例えば、腫瘍の間質または細胞外基質の中、または周囲に集積する場合がある。
【０１４３】
ＧＤＦ１５の高いレベルに関連する疾患は、循環血液中、および／あるいは、例えばがん（腫瘍など）または他の損傷もしくは障害（炎症部位など）が存在する部位、またはその近辺などにおいて局所的に、ＧＤＦ１５のレベルが高いあらゆる疾患、病気、または障害であってもよい。例えば、ＧＤＦ１５が、がん（腫瘍など）が存在する部位において局所的に増加する場合、その増加は、循環血液中のＧＤＦ１５レベルに顕著な影響を及ぼすようなものではないが、ＧＤＦ１５の局所的な濃度または量が、（例えば、腫瘍の微環境において）上昇するようなものであってもよい。したがって、ＧＤＦ１５のレベルは、問題となる疾患に罹患していない被験体、例えば健常被験体と比較して、または、疾患が存在しない、または存在していなかった、被験体の体内における部位または位置と比較して、上昇していてもよい。
【０１４４】
したがって、ＧＤＦ１５の高いレベルに関連する疾患は、循環血液中であろうと、体内のいずれの部位において局所的にであろうと、ＧＤＦ１５レベルが異常になる、あらゆる疾患を含み得る。本発明によれば、ＧＤＦ１５レベルが望ましくない、例えば、被験体に有害な影響または危険な影響を及ぼすことになる、あらゆる疾患もまた含まれる。さらに、ＧＤＦ１５の活性が高い、または望ましくない、あらゆる疾患が含まれる。
【０１４５】
このような疾患は、上昇した、または高いＧＤＦ１５のレベルに関連していることが知られている、上記の疾患のいずれかを含み得る。したがって、疾患は、特に、悪液質を含み得、該悪液質は、あらゆる原因に関連する、またはあらゆる原因によって発生する、悪液質を含む。悪液質は、鬱血性心不全、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性閉塞性肺高血圧、慢性腎疾患、嚢胞性線維症、多発性硬化症、運動ニューロン病、パーキンソン病、認知症、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、関節リューマチなどの炎症性疾患、あるいは、狼瘡、多発性硬化症、もしくは強直性脊椎炎などのその他の炎症性疾患または自己免疫疾患を含む、あらゆる慢性疾患または長期にわたる疾患に起因し得る。
【０１４６】
特定の実施形態においては、悪液質はがんに誘導される。
【０１４７】
より一般的には、疾患は、望まない、または過剰な、体重減少であってもよいし、食欲抑制および／または体重減少に関連する、またはそれらに起因する、あらゆる疾患であってもよい。体重減少は、患者にとって危険なほどのもの、すなわち臨床的に顕著な体重減少である場合がある。例としては、食欲不振、悪液質、体重減少、または食欲抑制が挙げられ、これらは、循環血液中のＧＤＦ１５の高いレベルに関連するものであり得る。悪液質、体重減少、または食欲抑制に関しては、結合剤は、特に、受容体ＱＲＦＰＲに対する結合剤であってもよい。ポリペプチドは、本発明のいずれのポリペプチドであってもよいが、特に、ＱＲＦＰＲから得られる、またはＱＲＦＰＲに由来する、ポリペプチドであってもよい。
【０１４８】
さらなる疾患としては、がん、骨障害、心疾患や、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺動脈高血圧症といった慢性肺障害などの肺障害、および腎障害または腎疾患が挙げられる。
【０１４９】
いくつかの血液障害および鉄過剰症も、ＧＤＦ１５の増加に関連しており、このような疾患としては、鎌状赤血球貧血、遺伝性球状赤血球症、Ｉ型先天性赤血球生成異常貧血、ＩＩ型先天性赤血球生成異常貧血、地中海貧血症、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、およびピルビン酸キナーゼ欠損症が挙げられる。
【０１５０】
がんは、本発明に係る特に興味深い疾患である。循環血液中であろうと、がんが存在する部位において局所的にであろうと、ＧＤＦ１５の高いレベルは、幅広く異なるがんにおいて、予後が良くないことを示すことが知られており、また多くのがんで、ＧＤＦ１５が過剰発現され、かつ分泌されていることが知られている。例えば、前立腺癌（Ｋａｒａｎら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９；６９（１）：２〜５）、多発性骨髄腫（Ｔａｎｎｏら Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ｊａｎ ３０；１２３（５）：７２５〜３３）、黒色腫（Ｂｏｙｌｅら Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００９ Ｆｅｂ；１２９（２）：３８３〜９１）、大腸癌（Ｂａｒｄｅｒａｓら Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１３ Ｊｕｎ；１２（６）：１６０２〜２０）、胃癌（Ｂａｅｋら Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．２００９ Ｍａｒ；４０１（１〜２）：１２８〜３３）、乳癌（Ｋｉｍら Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００８ Ａｐｒ；２９（４）：７０４〜１２）、卵巣癌（Ｃｈｕｄｅｃｋａ−Ｇｌａｚら Ｏｎｃｏ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ．２０１５ Ｆｅｂ ２３；８：４７１〜８５）、子宮体癌（Ａｌｏｎｓｏ−Ａｌｃｏｎａｄａら Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ．２０１４；１３：２２３）、口腔扁平上皮癌（Ｕｒａｋａｗａら Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５ Ｍａｙ；９５（５）：４９１〜５０３）、膵癌（Ｗａｎｇら ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２０１４ Ａｕｇ ８；１４：５７８）、肺癌（Ｋａｄａｒａら Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００６ Ｍａｙ；５（５）：５１８〜２２）、口腔癌（Ｓｃｈｉｅｇｎｉｔｚら Ｊ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ａｐｒ １６）、食道癌（Ｆｉｓｈｅｒら Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５ Ａｐｒ １４；１１２（８）：１３８４〜９１）、睾丸癌（Ａｌｔｅｎａら ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ｊａｎ １５；１０（１）：ｅ０１１５３７２）、および肝癌（Ｓｉら ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（５）：ｅ１９９６７）が、ＧＤＦ１５の高いレベルに関連している。したがって、受容体に対するＧＤＦ１５の結合活性を低減できる薬剤は、腫瘍学の分野において、魅力的で可能性のある治療法となるであろう。
【０１５１】
特に、ＧＤＦ１５とＣＬＰＴＭ１との相互作用は、多くの異なるがんの病理において、特に、ＧＤＦ１５の高いレベルに関連する免疫機能の調節に関して、特に重要な場合があると考えられる。しかしながら、あるがんにおいて、特に骨癌または他のがんの骨への転移においては、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用が重要な場合がある。
【０１５２】
本明細書において、「がん」なる語は、固形腫瘍および造血性がんなどの非固形腫瘍を含む、悪性新生物、非悪性新生物、または前癌性新生物を含んで広く用いられる。体内のあらゆる組織または細胞のがんを含む、あらゆる公知のがんが想定され、上記挙げたがんを含む、異なる種類のがんが想定されるが、これらに限定されない。しかしながら、ある実施形態においては、がんは、直腸癌でも、結腸癌でも、前立腺癌でもない（または、前立腺癌でも直腸癌でもない）。別の実施形態においては、乳癌、子宮頸癌、または子宮体癌のうちの１つ以上ではなく、あるいは、神経膠腫でも、ユーイング肉腫以外の肉腫でも、中皮腫でも、血液細胞癌でもない。他の実施形態においては、このような癌が含まれる。発明者らのデータによると、ユーイング肉腫は、高レベルのＧＤＦ１５に関連しているように思われる（図２５参照）。上述した組み合わせのいずれかを含む、本発明のポリペプチドおよび／または結合剤が、どれでも用いられ得る。したがって、ポリペプチドは、ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１から得られてもよいし、これらに由来するものであってもよい。このようなポリペプチドが、ＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対する結合剤と併用されてもよい。しかしながら、ある好ましい実施形態においては、結合剤は、ＣＬＰＴＭ１に結合することができる。
【０１５３】
特定の実施形態においては、ポリペプチドは、ＱＲＦＰＲから得られてもよいし、これに由来するものであってもよく、また、ＣＬＰＴＭ１に対する結合剤と併用されてもよい。あるいは、ＣＬＰＴＭ１から得られる、またはこれに由来する、ポリペプチドが、ＣＬＰＴＭ１に対する結合剤と併用されてもよい。
【０１５４】
がんは、原発性がんであってもよいし、二次がん、すなわち、微小転移巣を含む、体内における二次的部位に転移したがんであってもよい。
【０１５５】
がんは、前立腺癌であってもよいし、膀胱癌であってもよいし、多発性骨髄腫であってもよいし、黒色腫であってもよいし、大腸癌（結腸癌および直腸癌を含む）であってもよいし、腎癌であってもよいし、胃癌であってもよいし、乳癌であってもよいし、卵巣癌であってもよいし、子宮体癌であってもよいし、口腔扁平上皮癌であってもよいし、膵癌であってもよいし、肺癌であってもよいし、口腔癌であってもよいし、食道癌であってもよいし、睾丸癌であってもよいし、肝癌であってもよい。
【０１５６】
上記の通り、発明者らは、特に、ＱＲＦＰＲは、原発性がんおよび転移部、特に、前立腺癌の骨への転移部を含む、様々な骨のがん、または骨に関わるがん、において発現され得ることを示している。したがって、がんは、特に、骨癌であってもよいし、ユーイング肉腫、骨肉腫、または多発性骨髄腫などの、骨に関わるがんであってもよいし、二次性前立腺癌またはその他のがんの骨への転移であってもよい。
【０１５７】
ＧＤＦ１５は、例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、および／または樹状細胞などの、いくつかの異なる免疫細胞による免疫応答を下方制御することができる。上記の通り、ＣＬＰＴＭ１は、ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔリンパ球、ＣＤ１４陽性単球／マクロファージ、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞、および／またはＮＫ細胞を含む、様々な免疫細胞によって発現されることが示されている。このように、本発明の基盤を成す研究において、発明者らは、Ｔ細胞および／または他のリンパ球のサブセットが、ＣＬＰＴＭ１を発現し得ることを示している。
【０１５８】
興味深いことに、ＣＤ１４陽性細胞（単球／マクロファージ）の大多数は、ＣＬＰＴＭ１に対して顕著に陽性を示した。ＧＤＦ１５は、マクロファージの活性化を阻害することが以前に報告されており、マクロファージ阻害性サイトカイン１（ＭＩＣ１）として知られている。ＧＤＦ１５がＣＬＰＴＭ１を刺激することによって、ＧＳＫ３ｂのリン酸化が増大し、免疫機能が低下する。本発明へとつながる研究において、ＧＤＦ１５がＣＬＰＴＭ１を刺激することによって、ＮＫＧ２Ｄレベルが低下することも見出されており、また、ＣＬＰＴＭ１結合剤（抗体）を用いて、ＧＤＦ１５のＣＬＰＴＭ１への接近性を阻害することによって、ＮＫＧ２Ｄレベルが低下する程度が低減されることが見出されている。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方において発現される。ＮＫＧ２Ｄは、パーフォリンおよびグランザイムＢの放出などの、細胞溶解機能における重要なエフェクタータンパク質である。ＧＤＦ１５は、細胞毒性細胞においてＮＫＧ２Ｄレベルを低下させる（ひいては、パーフォリンおよびグランザイムなどの細胞溶解機能を阻害する）ことが示されているので、発明者らは、腫瘍由来のＧＤＦ１５によって、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞およびＮＫＧ２Ｄ陽性Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞の、細胞毒性作用を媒介する能力が低減される、免疫腫瘍学の用途に、ＣＬＰＴＭ１結合剤が特に有用であろうと予測している。さらに、発明者らは、ＧＤＦ１５によって誘導される、ＣＬＰＴＭ１の、ＴＧＦｂ受容体複合体（ＴＧＦＢ１（ＡＬＫ５）／ＴＧＦＢＲＩＩ）への接近を阻害することが、免疫細胞に対して阻害的である、この複合体を介した下流へのシグナル伝達を阻害するために役立つであろうと予測している。
【０１５９】
腫瘍間質または転移部位（微小転移巣を含む）におけるＧＤＦ１５の高いレベルによって、がん細胞が免疫系を回避するための重要な機構が提供されると考えられる。したがって、本発明の結合剤および／またはポリペプチドは、ＧＤＦ１５の免疫抑制効果を防止または低減するのに有用であろう。
【０１６０】
したがって、より一般的には、本発明の治療薬は、ＧＤＦ１５による、またはＧＤＦ１５によって生じる、免疫抑制を阻害するのに用いられてもよいし、ＧＤＦ１５の高いレベルに関連する免疫抑制を阻害するのに用いられてもよい。
【０１６１】
このような免疫抑制は、特に、細胞媒介性細胞毒性免疫応答の抑制であってもよい。したがって、免疫抑制は、マクロファージ、ＮＫ細胞、樹状細胞、好中球、および／またはＴ細胞などの、１つ以上の免疫細胞の活性を低減させることによって生じる免疫抑制であっても良い。
【０１６２】
より具体的には、免疫抑制は、がんについてのものであってもよい。すなわち、がんに関連する免疫抑制であってもよい。免疫抑制は、循環血液中におけるＧＤＦ１５の高いレベルによるものであってもよいし、ある好ましい実施形態においては、腫瘍などのがんが存在する部位における、ＧＤＦ１５の高い局所濃度によるものであってもよい。
【０１６３】
特に、本発明の結合剤およびポリペプチドは、がん細胞の免疫回避を阻害するのに有用であってもよいし、がん細胞が誘導する免疫寛容を阻害するのに有用であってもよい。ＧＤＦ１５と、ＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１、特にＣＬＰＴＭ１との相互作用を阻害する本発明の治療薬は、がん細胞による免疫回避を阻害するのに有用であってもよい。したがって、ＣＬＰＴＭ１および／またはＱＲＦＰＲから得られる、またはこれらに由来する、ペプチド、ならびにＣＬＰＴＭ１および／またはＱＲＦＰＲ、特にＣＬＰＴＭ１に結合できる結合剤は、この点において特に有用であってもよい。上述したように、本明細書で述べる治療薬の組み合わせは、いずれも用いられ得る。
【０１６４】
本発明の治療薬は、免疫回避を阻害することによって、被験体の体が、がんを攻撃するのに役立ち得る。したがって、本発明は、がんに対する体の免疫応答を促進する（あるいは、容易にする、もしくは上昇させる、または、どんな形であれ、可能にする、もしくは支援する）ことによって、被験体の体内において、がんを低減または排除することを支援し得る。
【０１６５】
ある特定の態様においては、治療薬を用いて、がんの拡大または転移を阻害してもよい。これは、微小転移巣の発生を阻害することを含んでいてもよいし、微小転移巣の成長または拡大を阻害することを含んでいてもよい。転移は、どのがんが、体内のどの部位に転移することであってもよい。特定の実施形態においては、前立腺癌、乳癌、または肺癌の、例えば骨への転移であってもよい。
【０１６６】
がんの治療において、例えば、他の免疫療法剤もしくは免疫腫瘍薬、または化学療法薬を含む、他の抗癌剤を用いる他の抗癌療法と組み合わせて、あるいはそのような抗癌療法と併用して、本発明の治療薬を用いてもよい。したがって、例えば、本発明の薬剤は、養子細胞導入療法などの細胞系がん療法、および／または抗体系療法と併用されてもよい。
【０１６７】
特定の実施形態においては、養子細胞導入療法、特にＮＫ細胞またはＴ細胞と、本発明の薬剤を併用してもよい。いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞またはＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されていてもよいし、Ｔ細胞は、がん細胞表面に存在する抗原に対する特異性を有している、Ｔ細胞受容体を発現してもよいし、発現するように改変されていてもよい（すなわち、天然型Ｔ細胞受容体または非相同のＴ細胞受容体を含んでいてもよい）。
【０１６８】
また、本発明は、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、または遺伝子欠失などによって改変されており、改変されていない細胞と比較して、ＣＬＰＴＭ１のレベルおよび／または活性が低下している、細胞毒性免疫細胞も提供する。
【０１６９】
したがって、遺伝子（すなわち、細胞において、ＣＬＰＴＭ１タンパク質をコードしている配列）は、ＣＬＰＴＭ１タンパク質の発現量を減少させるように、例えば、細胞表面のＣＬＰＴＭ１受容体の量を減少させる、かつ／または受容体タンパク質の活性を低下させるように、改変されていてもよい。よって、受容体タンパク質は、不活性化されてもよい。これは、例えば、天然型ＣＬＰＴＭ１遺伝子のヌクレオチド配列などの、天然型ヌクレオチド配列に対して挿入または置換を行うことによって、遺伝子配列を改変することを含んでいてもよい。これは、当該技術分野で公知の、標準的な突然変異導入技術および／または相同置換によって実現されてもよい。
【０１７０】
特定の実施形態においては、細胞は、Ｔ細胞受容体を発現する、または発現するように改変された、Ｔ細胞であってもよいし、ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞であってもよい。さらなる実施形態においては、細胞は、場合によってはＣＡＲを発現するように改変された、ＮＫ細胞であってもよい。該改変細胞は、がんの治療に特に有用であってもよく、したがって、一実施形態においては、細胞は、がん細胞表面の抗原に対して特異性を有するＴＣＲまたはＣＡＲを含む。治療、特にがんの治療における該細胞の使用、さらには、該細胞と、本発明のポリペプチドおよび／または結合剤である治療薬とを含む、がんの治療において別々に、または順次、または同時に用いられる組み合わせ製品または製剤（キットなど）も提供される。したがって、がんを治療するための本発明の方法、または使用は、本発明のポリペプチドおよび／または結合剤と、該改変細胞毒性免疫細胞とを（すなわち、共に、または組み合わせて、または併用して）、被験体（特に、それを必要とする被験体）に投与することを含んでいてもよい。細胞および治療薬（ポリペプチドおよび／または結合剤）は、上述したように、例えば別々の処方として、別々に投与されてもよいし、順次投与されてもよいし、同時に投与されてもよい。したがって、本発明のキットは、上述したように、ポリペプチドおよび／または結合剤、ならびに改変細胞を含んでいてもよい。
【０１７１】
本発明の薬剤は、がんの治療において、免疫チェックポイントを標的とする免疫療法剤、すなわち免疫チェックポイント阻害剤と併用されてもよい。チェックポイントタンパク質は、どの細胞が健常で、どの細胞が破壊されるべきかを免疫系に示すことによって、免疫系を抑制する。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化を防止することによって、免疫系に対する「ブレーキ」として働く。細胞の表面に、チェックポイントタンパク質が十分に存在しない場合は、その細胞は、免疫系によって破壊される。がん細胞の場合、細胞が癌性であるというシグナルを出す分子が存在するが、細胞表面にチェックポイントタンパク質が十分に存在する場合は、その細胞は免疫応答を回避し得るため、チェックポイントタンパク質のために、いくつかのがんの免疫療法が不成功に終わることが推測される。
【０１７２】
チェックポイントタンパク質として最もよく知られている例は、ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）である。ＰＤ−Ｌ１の受容体は、ＰＤ−１である。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞が健常細胞を攻撃することを防止する。がん細胞は、防御機構として、ＰＤ−Ｌ１を上方制御し得る。ＰＤ−Ｌ１が、Ｔ細胞表面のＰＤ−１受容体を活性化すると、Ｔ細胞は、シグナルを受けて自身を破壊する。Ｔ細胞が、がん細胞を選択的に攻撃するようにプログラムされている場合、そのＴ細胞のセットは破壊され、がんが優勢となる。
【０１７３】
別のチェックポイントタンパク質は、細胞毒性Ｔリンパ球抗原４、すなわちＣＴＬＡ４である。細胞毒性Ｔ細胞がいったん活性化すると、その表面にＣＴＬＡ４を発現し、その後、互いに共通するリガンドである、抗原提示細胞のＢ７−１およびＢ７−２について、共刺激分子であるＣＤ２８と競合する。このバランスによって細胞毒性活性が抑制される一方、Ｔ細胞の機能を、自己限定的な様式で進行させる。
【０１７４】
他のチェックポイントタンパク質としては、共刺激チェックポイントタンパク質であるＣＤ−１３７（４−１ＢＢ）；寛容Ｔ細胞上のＰＤ−１と共発現されるＣＤ−４関連阻害性受容体である、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３）；Ｂ７スーパーファミリータンパク質であるＢ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４；Ｔ細胞タンパク質ＴＩＭ３；ならびに、アポトーシスの際に外側構成要素の表面に転位することによって、そうでない場合に、壊れつつある細胞内容物の処理および排除の際に生じるであろう過剰な免疫活性化を抑制する、正常細胞におけるリン脂質であるホスファチジルセリン（ＰＳ）が挙げられる。ＰＳの外在化は、間接的に、マクロファージを刺激し、その結果、樹状細胞の抗原提示を抑制する。ＰＤ−Ｌ１と同様に、外在化ＰＳは、いくつかの腫瘍細胞および腫瘍由来の微小胞によって、異常発現される。したがって、ＰＳは、適応腫瘍免疫を防止するために、腫瘍によって利用されると考えられる。
【０１７５】
これらのチェックポイントタンパク質のいずれかを標的とし得る、または阻害し得る、免疫療法剤は、「チェックポイント阻害剤」として知られている。
【０１７６】
チェックポイント阻害剤（免疫チェックポイント調整物質、すなわちＣＰＭとしても知られている）は、チェックポイントタンパク質の効力を低下させるように設計されている。理想的には、ＣＰＭは、免疫系に健常な組織を攻撃させることなく、がんを免疫系に曝露させるべきである。
【０１７７】
チェックポイント阻害剤がいくつか知られており、がんの治療において、本発明の薬剤と併用することができる。例えば、そのような阻害剤は、参照により本明細書に援用されるＣｒｅｅｌａｎ（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ２１：８０〜８９に記載されている。
【０１７８】
チェックポイント阻害剤の例としては、ＣＴＬＡ−４に対する親和性が高いヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であるトレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６）；ＣＴＬＡ−４に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であるイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０）；検出可能な抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を本質的に欠く、ヒトモノクローナル抗ＰＤ１ ＩｇＧ４抗体であるニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）；Ｆｃ媒介性ＡＤＣＣを防止するように設計された、Ｃ２２８Ｐの変異を含有する、ヒト化ＩｇＧ４抗ＰＤ−１抗体であるＭＫ−３４７５（旧ランブロリズマブ）；全長ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗ＣＤ１３７抗体であるウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）；抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体（ＢＭＳ−９８６０１６）；およびＰＳに対するキメラＩｇＧ３抗体であるバビツキシマブ（キメラ３Ｇ４）が挙げられる。これらのチェックポイント阻害剤は、全て、本発明において用いることができる。
【０１７９】
別の方策は、腫瘍細胞表面において、ＰＤ−１のリガンドであるＰＤ−Ｌ１を阻害することであり、したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１−カッパ抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体であるＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６）などの、ＰＤ−Ｌ１の阻害剤を、本発明の薬剤と併用してもよい。ＭＥＤＩ４７３６は、別のＩｇＧ１−カッパＰＤ−Ｌ１阻害剤である。
【０１８０】
また別の手法は、Ｂ７−ＤＣ−Ｆｃ融合タンパク質を用いて、受容体ＰＤ−１を競合的に阻害することであり、したがって、このような融合タンパク質を、本発明において用いることもできる。
【０１８１】
さらなる別の手法においては、キラー細胞免疫グロブリン様受容体に対する抗体を、免疫療法剤として用いてもよい。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）は、ＮＫ細胞の細胞毒性活性を下方制御する、ＮＫ細胞上の受容体である。ＨＬＡクラスＩアリル特異的ＫＩＲ受容体は、細胞溶解性（ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋）ＮＫ細胞において発現されるが、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６−ＮＫサブセットは、これらのＫＩＲを欠いている。この線に沿うと、阻害性ＫＩＲは、腫瘍周囲のＮＫ細胞浸潤物において選択的に発現されていると考えられ、したがって、ＰＤ−Ｌ１と同様に、腫瘍によって取り込まれるチェックポイント経路であると考えられる。したがって、抗体を用いて特定のＫＩＲを阻害することによって、インビボにおいてＮＫ細胞の活性化が維持されるはずである。例えば、リリルマブ（ＩＰＨ２１０２）は、ＫＩＲに対する全長ヒトモノクローナル抗体であり、本発明にしたがって、これを用いることができる。
【０１８２】
がん抗原を認識し、結合する適切な抗体を、本発明の薬剤と併用してもよい。がん抗原、すなわち治療用抗体の標的としては、例えば、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＣＤ１５２、およびＣＤ２７９などの多くの「ＣＤ」タンパク質；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの成長因子；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）またはヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）などの成長因子受容体が挙げられる。
【０１８３】
このような抗原に結合する、またはこのような抗原を標的とする、抗体がいくつか知られており、これらは、がんの治療用として認可されている。これらの抗体のいずれかを、本発明の薬剤と併用してもよい。好ましい抗体は、固形腫瘍の治療に有用な抗体であり、特に、乳癌、卵巣癌、および膵癌などの、ＥＣＭが変化している固形腫瘍の治療に有用な抗体である。
【０１８４】
公知の、認可されている抗体としては、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、セツキシマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ハーセプチン、イブリツモマブ・チウキセタン、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、およびトラスツズマブが挙げられる。
【０１８５】
アレムツズマブは、フルダラビン耐性慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、およびＴ細胞前リンパ球性白血病の治療に適用される、抗ＣＤ５２ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。
【０１８６】
ベバシズマブ（アバスチン）は、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）（通常、接尾語なしでＶＥＧＦと称される）に結合する、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ベバシズマブは、ＶＥＧＦに結合し、これを物理的に阻害することによって、腫瘍の血管成長を招く受容体の活性化を防止する。ベバシズマブは、結腸癌、腎癌、肺癌、卵巣癌、神経膠芽細胞腫、および乳癌に対して認可されている。
【０１８７】
ブレンツキシマブ・ベドチンは、ホジキンリンパ腫および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）の治療に用いられる、第二世代のキメラＩｇＧ１抗体薬抱合体である。これは、微小管を破壊することによって細胞分裂を防止する薬物である、モノメチルオーリスタチンＥに抱合された抗体である。この抗体は、ホジキンリンパ腫細胞およびＡＬＣＬ細胞の表面において高発現していることがよく見出されるＣＤ３０に結合し、次いで内在化され、ここで薬物は、抗体から外れて、細胞に対する効果を発揮する。細胞分裂を防止することによって、プログラム細胞死を誘導し、がん細胞を殺傷する。
【０１８８】
セツキシマブ（アービタックス)は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン（細胞の外側にある受容体の一部）を標的とする、キメラＩｇＧ１モノクローナル抗体である。これは、大腸癌および頭頚部癌の治療に用いられる。細胞表面のＥＧＦＲにリガンドがいったん結合すると、細胞内において、悪性の性質に関連するシグナル伝達経路が活性化される。その例としては、がん細胞の増殖、浸潤、分化、およびがん幹細胞再生などを引き起こす、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路およびＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路が挙げられる。セツキシマブは、リガンドの結合を競合的に阻害して、ＥＧＦＲの活性化、ひいては細胞シグナル伝達を防止することによって、機能する。
【０１８９】
ゲムツズマブ・オゾガマイシンは、細胞毒性カリケアマイシン誘導体に化学的に連結されたＩｇＧ４抗ＣＤ３３抗体の「免疫抱合体」であり、急性ミエロイド性白血病（ＡＭＬ）の治療に用いられる場合がある。
【０１９０】
イブリツモマブ・チウキセタン（ゼヴァリン）は、放射性同位体イットリウム９０（９０Ｙ）を結合したキレート剤に化学的に連結された、ネズミ抗ＣＤ２０抗体である。これは、特定の種類の非ホジキンリンパ腫である、Ｂ細胞の腫瘍である濾胞性リンパ腫の治療に用いられる。
【０１９１】
イピリムマブ（イェルボイ）は、Ｔ細胞の活性化を負に調節する役割を有する表面タンパク質ＣＴＬＡ４に結合する、ヒトＩｇＧ１抗体である。ＣＴＬＡ４については、チェックポイント阻害剤の観点から、以下で説明する。
【０１９２】
ニモツズマブは、ヒト−マウスキメラ抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であり、頭頚部の扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）用として認可されている。
【０１９３】
オファツムマブは、ＣＤ２０に結合する、第二世代のヒトＩｇＧ１抗体である。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）のがん細胞は、通常、ＣＤ２０を発現するＢ細胞であるので、オファツムマブは、ＣＬＬの治療に用いられる。ＣＤ２０タンパク質の大型ループに結合するリツキシマブとは異なり、オファツムマブは、それとは別の小型のループに結合する。
【０１９４】
パニツムマブ（ベクティビックス）は、ＥＧＦ受容体に結合するヒトＩｇＧ２抗体である。セツキシマブと同様に、受容体とそのリガンドとの相互作用を阻害することによって、受容体による細胞シグナル伝達を防止する。パニツムマブは、大腸癌の治療に用いられる。
【０１９５】
リツキシマブは、ＣＤ２０に特異的なキメラモノクローナルＩｇＧ１抗体であり、その親抗体であるイブリツモマブから開発された。イブリツモマブと同様に、リツキシマブは、Ｂ細胞に存在するＣＤ２０を標的とする。このため、癌化Ｂ細胞から形成されるある種の悪性腫瘍の治療に有効である。悪性腫瘍の例としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および濾胞性リンパ腫などの中悪性度および低悪性度のリンパ腫、ならびにＢ細胞性慢性リンパ球性白血病などの白血病が挙げられる。
【０１９６】
トシツモマブは、放射性ヨウ素１３１に共有結合したネズミＩｇＧ２ａ抗ＣＤ２０抗体であり、非ホジキンリンパ腫の治療用として認可された「ベクサール」として知られていたが、市場からは自主的に撤退している。
【０１９７】
トラスツズマブ（ハーセプチン）は、上皮成長因子受容体２タンパク質（ＨＥＲ２）に特異的な、モノクローナルＩｇＧ１ヒト化抗体である。１９９８年にＦＤＡの認可を受け、臨床的には乳癌の治療に用いられる。ＨＥＲ−２は、膜貫通型チロシンキナーゼの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。本発明の好ましい実施形態においては、好ましくは卵巣癌の治療に用いられる免疫療法剤、すなわち抗癌剤は、トラスツズマブである。
【０１９８】
別の実施形態においては、抗体は、抗ＣＤ４７抗体、すなわち、ＣＤ４７のシグナル伝達を阻害する抗体である。このような抗体は、実験室における細胞およびマウスの試験において、広範ながんおよび腫瘍を排除する、またはその成長を阻害することが示されている。ＣＤ４７は、多くのがん細胞および多くの健常細胞に存在している。
【０１９９】
さらなる別の実施形態においては、抗体は、がん細胞表面に見出される炭水化物分子に対する抗体である。例えば、このような抗体は、抗ＧＤ２抗体であってもよい。ＧＤ２は、神経芽細胞腫、網膜芽腫、黒色腫、小細胞肺癌、脳腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、平滑筋肉腫、およびその他の軟組織の肉腫などの多くの種類のがん細胞表面に見出されるガングリオシドである。通常は、正常組織の表面では発現されないので、腫瘍に対する特定の作用、および毒性の低減を可能にする、免疫療法の良い標的となる。さらなる実施形態においては、治療薬は、骨障害の治療または予防に用いられてもよい。このような障害としては、あらゆる骨の障害、または骨に関わる障害を挙げることができ、上述した腫瘍性の障害（すなわち、骨のがんまたは骨に関わるがん）および非腫瘍性の障害の両方を含む。上述したように、受容体ＱＲＦＰＲは、骨芽細胞で発現されることが示されており、ＱＲＦＰＲをノックアウトすると、破骨細胞の数が減少する。ユーイング肉腫および骨肉腫由来の臨床材料におけるＱＲＦＰＲ発現の観察結果と同様に、骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞におけるＱＲＦＰＲレベルが、本出願において検出、定量化されており、また、ＧＤＦ１５による刺激によって調節されていることが見出された。
【０２００】
したがって、好ましい実施形態においては、結合剤は、ＱＲＦＰＲに結合することができる。ポリペプチドは、いずれの受容体から得られてもよいし、いずれの受容体に由来するものであってもよいが、一実施形態においては、ＱＲＦＰＲから得られる、またはＱＲＦＰＲに由来するものである。
【０２０１】
特に、骨障害は、骨吸収に関連する障害、例えば、高い、過剰な、または望ましくない、骨吸収に関連する障害であってもよい。一実施形態においては、骨障害は、骨粗鬆症であってもよく、特に、加齢性骨粗鬆症であってもよい。別の実施形態においては、骨障害は、骨減少症であってもよい。被験体は、ヒトであってもよいし、ヒト以外の動物であってもよい。好ましくは、被験体は哺乳動物である。特定の実施形態においては、被験体はヒトであるが、他の実施形態においては、例えば霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ブタ、ウシ、ウマなどの、飼育された動物であってもよいし、家畜であってもよいし、農場の動物であってもよいし、動物園の動物でもよいし、野生動物でもよいし、実験動物でもよいし、競技用（競走用など）の動物であってもよい。
【０２０２】
上述したように、ＧＤＦ１５は、ＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１に独立して結合する。ＧＤＦ１５は、エキソソームが放出されること、およびエンドソームがプロテアソームを標的とすること、による細胞表面におけるＱＲＦＰＲの減少を誘導することが見出されており、また、ＧＤＦ１５は、ＴＧＦ−β受容体複合体を介したＧＳＫＢのリン酸化を上昇させることが見出されている。したがって、細胞表面におけるＱＲＦＰＲの減少を測定することによって、またはＧＳＫＢのリン酸化の程度を測定することによって、これらの受容体のそれぞれに対するＧＤＦ１５の「活性」、すなわち、ＧＤＦ１５が細胞に曝露された場合に、その生体機能が実行される程度、を求めることができる。よって、本発明の結合剤またはポリペプチドが、ＧＤＦ１５の活性を低減させる（すなわち、ＧＤＦ１５が、その生体機能を実行または発揮することを防止する）能力は、特定の結合剤またはペプチドが、ＧＤＦ１５の活性を低減させることができるかどうかを測定することによって、求められてもよい。したがって、本発明の結合剤またはポリペプチドは、好ましくは、ＧＤＦ受容体またはＧＤＦ１５に結合し、実質的に、ＧＤＦ１５の活性を阻害する、または無効にすることができる、すなわち、結合剤またはポリペプチドの非存在下におけるＧＤＦ１５の活性レベルと比較して、ＧＤＦ１５の活性を５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満まで低減させることができる。より好ましくは、結合剤またはポリペプチドは、ＧＤＦ１５の活性を９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、またはそれ以下まで低減させる。すなわち、結合剤またはポリペプチドは、好ましくは、ＧＤＦ１５の活性を効果的に消滅させてもよい。
【０２０３】
治療用組成物は、結合剤、およびタンパク質またはペプチドに加えて、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含んでいてもよい。本明細書における「薬学的に許容される」とは、組成中の他の成分と共存できるだけでなく、受容者に生理学的に許容される、成分のことをいう。組成物、および担体または賦形物質の性質、投与量などは、好みや、望ましい投与経路、ｐＨ、温度などに応じて、常用の様式で選択されてもよい。
【０２０４】
治療薬の投与量は、標準的な臨床的慣習にしたがって、常用の様式で決定されてもよい。服用量としては、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ、０．５〜２ｍｇ／ｋｇ、０．５〜５ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜２ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜５ｍｇ／ｋｇ、２〜１０ｍｇ／ｋｇ、または５〜１０ｍｇ／ｋｇが、病気の進行が観察されるまで、または許容できない毒性が観察されるまで、毎日、毎週、１０日毎、２週間毎、３週間毎、または毎月、投与されてもよい。
【０２０５】
さらに、治療薬は、簡便な様式、または望ましい様式で、例えば、非経口的に投与されてもよいし、経口的に投与されてもよい。例えば、経口投与（薬剤の性質および／または処方による）などの経腸投与によって投与されてもよいし、静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射または点滴によって投与されてもよい。投与は、治療される疾患、薬剤の性質、および／または処方などに応じて、全身投与であってもよいし、局所投与であってもよい。したがって、例えば、薬剤は、点滴または直接的な注射などによって、がんが存在する部位または場所などに、局所的に送達されてもよい。
【０２０６】
ＧＤＦ１５と、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１との相互作用、あるいはＧＤＦ１５が受容体のうちの１つまたは両方に結合することによる効果、が検出され得、このような検出方法は、本明細書で開示される治療法または予防法のためのコンパニオン診断の基礎として、用いられてもよい。
【０２０７】
したがって、その相互作用および／または効果の検出を用いて、被験体が、本発明に係る治療もしくは予防（防止）を必要とする、またはその恩恵を受ける、ということを検出または決定しても、あるいは、本発明に係る治療もしくは予防（防止）を必要とするかどうか、またはその恩恵を受けるかどうか、を検出または決定してもよいし、例えば治療の途中または終了時に、その治療もしくは予防をモニターまたは評価してもよい。したがって、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用が存在すること、あるいは受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１において検出可能なＧＤＦ１５による効果が存在することは、例えば、本発明に係る治療または予防における投与用予測バイオマーカーなどのバイオマーカーとして用いられてもよいし、その治療または予防の効果をモニターまたは評価するために用いられてもよい。さらに、その相互作用および／または効果を検出することによって、被験体が、がん、特に、原発性骨がんまたは骨への転移などの骨がんといった、ＧＤＦ１５の高いレベルに関連する疾患に罹患しているかどうかを決定または検出してもよい。特に、骨への転移を検出するのに用いられてもよい。
【０２０８】
したがって、本発明のさらなる態様は、特に、本発明に係る治療薬（受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害できるポリペプチドおよび／または結合剤であり、例えば本明細書で定義される薬剤である）を投与することによって、治療または予防を必要とする被験体を検出する方法を提供し、該方法は、被験体において、ＧＤＦ１５と、その受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１との相互作用、ならびに／あるいはこのような相互作用の効果を検出することを含む。
【０２０９】
別の態様においては、本発明は、本発明に係る治療薬（受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用を阻害できるポリペプチドおよび／または結合剤であり、例えば本明細書で定義される薬剤である）を被験体に投与することによって、治療法または予防法を評価またはモニターする方法を提供し、該方法は、被験体において、このような相互作用の効果を検出および／またはモニターすることを含む。
【０２１０】
またさらなる態様は、ＧＤＦ１５の高いレベルに関連する疾患に罹患している、またはそのような疾患を発症するリスクがある、被験体を検出する方法を提供し、該方法は、該被験体において、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１に対してＧＤＦ１５が及ぼす作用、あるいは該作用の効果、を検出することを含む。
【０２１１】
その相互作用または効果は、インビボ（すなわち被験体）において検出されてもよいし、インビトロにおいて検出されてもよい。すなわち、その相互作用または効果は、被験体の体内で検出されてもよいし、好ましくは、該被験体由来の試料において検出されてもよい。試料は、適切な臨床試料であればどのようなものであってもよい。より具体的には、試料は、受容体であるＱＲＦＰＲおよび／またはＣＬＰＴＭ１を発現する細胞を含む試料であってもよい。したがって、試料は、細胞を含有する、被験体由来の臨床試料であればどのようなものであってもよい。例えば、組織の生検試料、血液試料もしくは血液由来の試料（血漿、血清、もしくはそれらの画分）、尿、ＣＳＦ、唾液、または糞便などの、組織または体液の試料、あるいはスワブ、洗液またはすすぎ液などの試料であってもよい。
【０２１２】
相互作用は、２つ以上の結合パートナー間における結合または相互作用を検出するための、当該技術分野で公知のいずれの手段によっても検出され得る。したがって、本方法は、ＧＤＦ１５と受容体との間の結合を検出することに基づくいずれの方法であってもよい。例えば、本方法は、近接アッセイに基づく方法であってもよく、特に、ＧＤＦ１５および受容体に対する抗体系結合パートナーを用いることに基づく近接アッセイであってもよい。近接アッセイは、当該技術分野においてよく知られており、文献において広く説明されている。直接的にまたは間接的に検体に結合できる結合パートナー（例えば、中間的検体結合抗体または検体に対する他の結合パートナー）と、プローブが近接して結合した場合に（例えば、相互作用対のパートナー同士が相互作用した、または互いに結合した場合に）、他の近接プローブの核酸ドメインと相互作用して検出可能なシグナルを生じる核酸ドメインと、をそれぞれ含む、対となる（またはそれ以上の）近接プローブに基づく近接アッセイが開発され、オーリンク社（Olink AB）（ウプサラ、スウェーデン）によって商品化されている。近接プローブの核酸ドメイン間の相互作用は、核酸のライゲーション反応および／または伸長反応を含んでいてもよく、また、ライゲーション産物および／または伸長産物を検出することによって、その相互作用が検出されてもよい。核酸ドメイン自体が相互作用してもよいし（例えば、共にライゲーションしてもよいし）、さらなる１つ以上のオリゴヌクレオチドに由来するライゲーション産物および／または伸長産物を形成するための鋳型として機能してもよい。細胞試料または組織試料におけるインサイチュでの相互作用を検出するのに用いられ得る、インサイチュ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）について、特に言及してもよい。このようなアッセイは、オーリンク社によって開発され、デュオリンク（Duolink）（登録商標）のブランド名で販売されている。近接アッセイについては、ＵＳ６８７８５１５、ＵＳ７３０６９０４、ＷＯ２００７／１０７７４３、ＷＯ／ＥＰ２０１２／０５１４７４、およびＷＯ２０１２／１５２９４２に記載がある。
【０２１３】
ＧＤＦ１５と受容体との間の結合を検出するさらなる方法としては、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、または免疫ＰＣＲなどの免疫アッセイが挙げられる。
【０２１４】
ここまで、ＧＤＦがＱＲＦＰＲまたはＣＬＰＴＭ１に結合することによる様々な効果について説明したが、これらの効果は、検出され得る。特に好ましい実施形態においては、ＱＲＦＰＲ陽性エキソソームの生成が、検出されてもよい。ＱＲＦＰＲ陽性エキソソームは、ウエスタンブロットなどによって、例えば、細胞から得られた調整培地において、検出され得る。あるいは、ＱＲＦＰＲ陽性エキソソームは、蛍光顕微鏡法または電子顕微鏡法などの顕微鏡法によって、検出され得る。また、ＱＲＦＰＲ陽性エキソソームに対してＧＤＦ１５が及ぼす作用も、例えば、上記の近接系検出アッセイのいずれかによって、検出され得る。特に、インサイチュＰＬＡが用いられてもよい。さらなる好ましい実施形態においては、ＧＤＦ１５によるＣＬＰＴＭ１の活性化によって生じる、ＧＳＫ３ｂのリン酸化が検出されてもよい。一実施形態においては、これは、例えば、ＧＳＫ３ｂに結合することができる第１のプローブと、リン酸基に結合することができる第２のプローブとを用いることによって、近接系検出アッセイを用いて行われてもよい。一実施形態においては、検出は、ＰＬＡによって行われてもよく、特に、インサイチュＰＬＡによって行われてもよい。
【０２１５】
本発明は、以下の実施例および図面によって、さらによく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】図１は、ＱＲＦＰＲを含むエキソソームが、ＧＤＦ１５に曝露された細胞から放出されることを示す。図１Ａは、ＧＤＦ１５に曝露されたＭＣＦ−７乳癌細胞に由来する調整培地から得られた、エキソソームの電子顕微鏡写真である。図１Ｂは、ＭＣＦ−７細胞に由来する調整培地から得られた、エキソソームのウエスタンブロットであり、ＱＲＦＰＲが、単一バンドとして４９ｋＤａの位置に検出されている。ＧＤＦ１５に曝露された細胞は、調整培地において、ＧＤＦ１５に曝露されていない細胞よりもＱＲＦＰＲレベルが高かった。
【図２】図２は、細胞表面のＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体を示す。図２Ａおよび２Ｂは、ＭＣＦ−７細胞表面のＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。図２Ａは、スリンダクスルフィド曝露後の細胞を示す。細胞は、ｓｉＲＮＡコントロール（スクランブルＲＮＡ）で処理した。図２Ｂは、スリンダクスルフィド曝露後の細胞を示し、ＱＲＦＰＲのｓｉＲＮＡを用いて処理することによって、細胞に存在するＱＲＦＰＲレベルが低減された。
【図３】図３は、ＧＤＦ１５による刺激によって、細胞表面のＡＣＴＲＩＩＢ−ＱＲＦＰＲ複合体レベルが低減され、ＧＤＦ１５によって、初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）がＱＲＦＰＲに集められることを示す。図３Ａおよび３Ｂは、ＭＣＦ−７細胞表面のＡＣＴＲＩＩＢ−ＱＲＦＰＲ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。細胞を、３７℃で２０分間、ＧＤＦ１５で刺激することによって、表面における複合体レベルが低減された。図３Ｃおよび３Ｄは、ＭＣＦ−７細胞表面のＱＲＦＰＲ−ＥＥＡ１複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。細胞を、３７℃で５分間、ＧＤＦ１５で刺激することによって、ＥＥＡ１がＱＲＦＰＲに集められた。
【図４】図４は、ＧＤＦ１５による刺激によって、細胞表面において、ＣＤ９−ＱＲＦＰＲ複合体が形成されることを示す。図４Ａ〜４Ｄは、ＭＣＦ−７細胞表面のＣＤ９−ＱＲＦＰＲ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。図４Ａおよび４Ｃは、ＧＤＦ１５を添加しない、ネガティブコントロール細胞を示す。図４Ｂおよび４Ｄは、３７℃で３０分間、ＧＤＦ１５に曝露した後の細胞を示す。ＣＤ９−ＱＲＦＰＲ複合体は、ＧＤＦ１５で３０分間刺激された細胞において、より高レベルで検出される。
【図５】図５は、ＧＤＦ１５による刺激によって、Ｒａｂ１１−ＱＲＦＰＲ二重陽性エンドソームが形成されることを示す。図５Ａ〜５Ｄは、ＭＣＦ−７細胞におけるＲａｂ１１−ＱＲＦＰＲ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。図５Ａおよび５Ｃは、ＧＤＦ１５を添加しない、ネガティブコントロール細胞を示す。図５Ｂおよび５Ｄは、ＧＤＦ１５に曝露した後の細胞を示す。Ｒａｂ１１−ＱＲＦＰＲ複合体は、ＧＤＦ１５で刺激された細胞において、より高レベルで検出される。
【図６】図６は、ＧＤＦ１５による刺激によって、細胞におけるＱＲＦＰＲレベルが低減され、また、ＱＲＦＰＲがプロテアソームによる分解の標的となることを示す。図６Ａ〜６Ｄは、細胞表面におけるＱＲＦＰＲの検出を示す。図６Ａは、ＧＤＦ１５を添加しない、コントロール細胞を示す。図６Ｂは、ＧＤＦ１５に一晩曝露した後の細胞を示す。図６Ｃは、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２で一晩処理したコントロール細胞を示す。図６Ｄは、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２存在下で、ＧＤＦ１５に一晩曝露した後の細胞を示す。ＭＧ１３２非存在下でＧＤＦ１５に曝露すると、ＱＲＦＰＲレベルは低減される（図６Ｂ）が、ＭＧ１３２存在下では、ＱＲＦＰＲレベルはＧＤＦ１５の影響を受けない。これは、ＧＤＦ１５に誘導されるＱＲＦＰＲの分解が阻害されていることを示す。
【図７】図７は、ＧＤＦ１５による刺激によって、Ｒａｂ４−ＱＲＦＰＲ二重陽性エンドソームが形成されることを示す。図７Ａは、細胞をＧＤＦ１５に曝露した後の、Ｒａｂ４−ＱＲＦＰＲ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。図７Ｂは、細胞をＧＤＦ１５に曝露した後の、Ｒａｂ４−ＱＲＦＰＲ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示し、ここでは、細胞を、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインに結合する抗体とプレインキュベートした。ブロッキング抗体とプレインキュベートした細胞においては、検出されるＲａｂ４−ＱＲＦＰＲ複合体レベルは、低減されている。
【図８】図８は、ＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１に由来するペプチドが、ＧＤＦ１５と相互作用できることを示す。図８Ａは、ＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン由来の、ビオチン標識したペプチドを、ストレプトアビジン−アガロースビーズに固定化したところ、十分な洗浄を行った後もＧＤＦ１５と相互作用していることが見出されたことを示す。図８Ｂは、ＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインに由来するペプチドを含む、ＧＳＴ融合タンパク質を、ＧＤＦ１５と共にインキュベートしたことを示す。これらのペプチドを含む融合タンパク質は、ＧＤＦ１５と相互作用することが見出された。
【図９】図９は、ＱＲＦＰＲの細胞外ループ由来のペプチドが、ＧＤＦ１５が媒介する、ＱＲＦＰＲのエンドソームへの集積を十分に阻害できることを示す。図９Ａ〜９Ｄは、ＭＣＦ７細胞をＧＤＦ１５に曝露した後の、Ｒａｂ１１−ＱＲＦＰＲ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。図９Ａは、コントロールペプチドを添加した場合を示す。図９Ｂは、ＱＲＦＰＲの細胞外Ｎ末端ペプチドを添加した場合を示す。図９Ｃおよび９Ｄは、ＱＲＦＰＲの細胞外ループ３（ドメイン４）ペプチドを添加した場合を示す。ＱＲＦＰＲの細胞外ループ３由来のペプチドによって、Ｒａｂ１１−ＱＲＦＰＲ複合体レベルが低減される。図９Ｅは、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞における、ＱＲＦＰＲの、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。棒グラフは、ＱＲＦＰＲの細胞外ループ３由来ペプチドが、細胞表面で検出されたＱＲＦＰＲのレベルを、ＧＤＦ１５に曝露されていないコントロール細胞と同レベルまで回復できることを示している。
【図１０】図１０は、ＱＲＦＰＲの細胞外ループ由来のペプチドは、細胞表面におけるＱＲＦＰＲレベルに対してＧＤＦ１５が及ぼす効果を低減し得るが、内因性アゴニストであるＰ５１８によるＱＲＦＰＲの活性化には影響を及ぼさないことを示す。図１０Ａ〜１０Ｃは、細胞表面のＱＲＦＰＲの、インサイチュにおける検出を示す。図１０Ａは、ＧＤＦ１５を添加しない、ネガティブコントロール細胞を示す。図１０Ｂは、ＧＤＦ１５に曝露した後の細胞を示す。図１０Ｃは、ＧＤＦ１５、およびＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン４に由来する合成ペプチドＧＥＫＥＹＤＤＶＴＩＫに曝露した後の細胞を示す。ペプチドは、細胞表面からのＱＲＦＰＲの除去を逆転させた。図１０Ｄ〜１０Ｆは、細胞表面のＡＣＴＲＩＩＢの、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。図１０Ｄは、Ｐ５１８を添加しないコントロール細胞を示す。図１０Ｅは、Ｐ５１８に曝露した後の細胞を示す。図１０Ｆは、Ｐ５１８、および１２５モル過剰な、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン４に由来する合成ペプチドＧＥＫＥＹＤＤＶＴＩＫに曝露した後の細胞を示す。Ｐ５１８が、細胞表面におけるＡＣＴＲＩＩＢレベルを上昇させる能力は、ペプチドによる影響を受けなかった。
【図１１】図１１は、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインを標的とする抗体が、ＧＤＦ１５によって誘導されるエンドサイトーシスを防止できることを示す。図１１Ａ〜１１Ｃは、Ｒａｂ４−ＱＲＦＰＲ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。図１１Ａは、ＧＤＦ１５を添加しないネガティブコントロール細胞を示す。図１１Ｂは、ＧＤＦ１５に曝露した後の細胞を示す。図１１Ｃは、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインを標的とする抗体とプレインキュベートした後に、ＧＤＦ１５に曝露した細胞を示す。
【図１２】図１２は、ペプチドアレイ上での結合を測定することによって、ＧＤＦ１５への結合に必要なＱＲＦＰＲの第３の細胞外ドメイン内の残基を同定する、ペプチドスクリーニングの結果を合わせて示す。図１２Ａは、固定化したペプチドに対するＧＤＦ１５の結合結果を示す。図１２Ｂは、ペプチドアレイで試験したペプチドのアラインメントを示す。下線を引いた残基は、アラニンへ置換した場合、または二重置換（ＡＡ）を行った場合に、結合が低減される残基を示す。スクリーニングに用いたペプチドの配列番号を示す。
【図１３】図１３は、一連のペプチドに対する抗体の結合を測定することによる、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインを標的とするポリクローナル抗体のエピトープの同定を示す。図１３Ａは、固定化したペプチドに対するｐＡｂの結合結果を示す。図１３Ｂは、リガンド結合部位の位置と比較した、ｐＡｂのエピトープを示す結合結果の概要を示す。抗体のうちの１つにおけるエピトープは、リガンド結合部位とよく重複している。スクリーニングに用いたアミノ酸配列を、実施例８に示す。
【図１４】図１４は、ＣＬＰＴＭ１を発現するＮＫ細胞をＧＤＦ１５で処理することによって、ＣＬＰＴＭ１−ＴＧＦＢＲＩ複合体レベルが上昇することを示す。図１４Ａおよび１４Ｂは、ＣＬＰＴＭ１−ＴＧＦＢＲＩ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。図１４Ａは、ＧＤＦ１５を添加しないネガティブコントロール細胞を示す。図１４Ｂは、ＧＤＦ１５に曝露した後の細胞を示す。ＧＤＦ１５に応じて、ＣＬＰＴＭ１−ＴＧＦＢＲ１複合体レベルが上昇する。
【図１５】図１５は、ＣＬＰＴＭ１を発現するＮＫ細胞をＧＤＦ１５で処理することによって、ＣＬＰＴＭ１−ＴＧＦＢＲＩＩ複合体レベルが上昇することを示す。図１５Ａおよび１５Ｂは、ＣＬＰＴＭ１−ＴＧＦＢＲＩＩ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。図１５Ａは、ＧＤＦ１５を添加しないネガティブコントロール細胞を示す。図１５Ｂは、ＧＤＦ１５に曝露した後の細胞を示す。ＧＤＦ１５に応じて、ＣＬＰＴＭ１−ＴＧＦＢＲＩＩ複合体レベルが上昇する。
【図１６】図１６は、ＣＬＰＴＭ１を標的とするモノクローナル抗体が、ＧＤＦ１５と、ＮＫ細胞のＣＬＰＴＭ１との相互作用を阻害できることを示す。図１６Ａ〜１６Ｃは、リン酸化されたＧＳＫ３ｂ（ＧＳＫ３ｂ−ｐ（９／２１））の、近接プローブ対を用いたインサイチュＰＬＡによる検出を示す。図１６Ａは、ＧＤＦ１５を添加しないネガティブコントロール細胞を示す。図１６Ｂは、ＧＤＦ１５およびコントロール抗体に曝露した後の細胞を示す。図１６Ｃは、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインを標的とするモノクローナル抗体とプレインキュベートした後に、ＧＤＦ１５に曝露した細胞を示す。図１６Ｄは、リン酸化されたＧＳＫｂ（ｐ−ＧＳＫｂ）のレベルを示すウエスタンブロットである。レーン１は、ＧＤＦ１５を用いないものである。レーン２は、ＧＤＦ１５による刺激（GDF15 stim）を加え、コントロール抗体（ctrl ab）を添加したものである。レーン３は、ＧＤＦ１５による刺激を加え、マウスのモノクローナル抗体（mAb）（インサイチュＰＬＡの実験で用いる抗体）を添加したものである。マウスｍＡｂ抗体は、ＧＤＦ１５に曝露した細胞において、ｐ−ＧＳＫｂレベルを低減することができる。
【図１７】図１７は、ペプチドアレイ上での結合を測定することによって、ＧＤＦ１５への結合に必要なＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン内の残基を同定する、ペプチドスクリーニングの結果を合わせて示す。固定化したペプチドに対するＧＤＦ１５の結合結果を示す。
【図１８】図１８は、一連のペプチドに対する抗体の結合を測定することによる、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインを標的とするモノクローナル抗体のエピトープの同定を示す。図１８Ａは、固定化したペプチドに対するｍＡｂの結合結果を示す。図１８Ｂは、リガンド結合部位の位置と比較した、ｍＡｂのエピトープを示す結合結果の概要を示す。抗体のうちの１つにおけるエピトープは、リガンド結合部位とよく重複している。
【図１９】図１９は、免疫系の細胞が、ＣＬＰＴＭ１を発現することを示す。図１９Ａは、フローサイトメトリーによって、ＳＳＣ−Ａチャンネルおよびアレクサ（Alexa）−４８８チャンネルにおいて検出されたＣＤ４＋Ｔリンパ球を示す。左図は、イソタイプのコントロールである。中図は、０．３μｇの抗ＣＬＰＴＭ１−アレクサを用いた場合である。右図は、３μｇの抗ＣＬＰＴＭ１−アレクサを用いた場合である。図１９Ｂは、フローサイトメトリーによって、ＳＳＣ−Ａチャンネルおよびアレクサ−４８８チャンネルにおいて検出されたＣＤ８＋Ｔリンパ球を示す。左図は、イソタイプのコントロールである。中図は、０．３μｇの抗ＣＬＰＴＭ１−アレクサを用いた場合である。右図は、３μｇの抗ＣＬＰＴＭ１−アレクサを用いた場合である。図１９Ｃは、フローサイトメトリーによって、ＳＳＣ−Ａチャンネルおよびアレクサ−４８８チャンネルにおいて検出されたＣＤ４５＋／ＣＤ３＋（非Ｔリンパ球）を示す。左図は、イソタイプのコントロールである。右図は、抗ＣＬＰＴＭ１−アレクサを用いた場合である。ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球、ならびにＣＤ４５＋／ＣＤ３＋非Ｔ細胞のいずれにおいても、ＣＬＰＴＭ１の発現が検出された。
【図２０】図２０は、免疫系の細胞が、ＣＬＰＴＭ１を発現することを示す。図２０Ａは、フローサイトメトリーによって、ＳＳＣ−Ａチャンネルおよびアレクサ−４８８チャンネルにおいて検出されたＣＤ１４＋単球／マクロファージを示す。左図は、イソタイプのコントロールである。中図は、０．３μｇの抗ＣＬＰＴＭ１−アレクサを用いた場合である。右図は、３μｇの抗ＣＬＰＴＭ１−アレクサを用いた場合である。図２０Ｂは、フローサイトメトリーによって、ＳＳＣ−Ａチャンネルおよびアレクサ−４８８チャンネルにおいて検出されたＣＤ１１ｃ＋樹状細胞を示す。左図は、イソタイプのコントロールである。中図は、０．３μｇの抗ＣＬＰＴＭ１−アレクサを用いた場合である。右図は、３μｇの抗ＣＬＰＴＭ１−アレクサを用いた場合である。
【図２１】図２１は、ＣＬＰＴＭ１を標的とするモノクローナル抗体が、ＧＤＦ１５と、ＮＫ細胞のＣＬＰＴＭ１との相互作用を阻害でき、また、ＧＤＦ１５によるＮＫＧ２Ｄの下方制御を阻害できることを示す。図２１Ａおよび２１Ｂは、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの検出を示す。図２１Ａは、ＧＤＦ１５に曝露した後の細胞を示す。図２１Ｂは、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインを標的とする抗体とプレインキュベートした後に、ＧＤＦ１５に曝露した細胞を示す。
【図２２】図２２は、ＣＬＰＴＭ１−ＧＤＦ１５複合体が、肺扁平上皮細胞癌の転移癌に見出されることを示す。ＣＬＰＴＭ１とＧＤＦ１５との相互作用を、矢印で示す。この相互作用は、免疫系のＣＤ３＋細胞と共存していることが見出され、これは、ＣＬＰＴＭ１が、免疫機能の調節に重要であるかもしれないということを示している。
【図２３】図２３は、前立腺癌の骨への微小転移巣において、高いレベルのＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体が見られることを示す。骨への前立腺微小転移巣において、ＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体をインサイチュＰＬＡによって検出すると、骨に浸潤している前立腺癌微小転移巣の境界において、特異的な兆候が見られることが示される。
【図２４】図２４は、骨肉腫および前立腺癌の骨への転移において、高いレベルのＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体が見られることを示す。図２４Ａおよび２４Ｂにおいては、骨への前立腺微小転移巣において、ＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体をインサイチュＰＬＡによって検出すると、骨に浸潤している前立腺癌微小転移巣の境界において、高いレベルのＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体が見られることが示される。図２４Ｃは、原発性前立腺癌におけるＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体の、インサイチュＰＬＡによる検出を示す。原発性前立腺癌におけるＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体レベルは、低減されていた。図２４Ｄにおいては、原発性骨肉腫において、ＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体をインサイチュＰＬＡによって検出すると、原発性骨がんにおいて、高いレベルのＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体が見られ得ることが示される。
【図２５】図２５は、ユーイング肉腫において、高いレベルのＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体が見られることを示す。図２５Ａにおいては、原発性骨がんにおいて、ＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体をインサイチュＰＬＡによって検出すると、原発性骨がんにおいて、高いレベルのＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体が見られ得ることが示される。図２５Ｂは、ユーイング肉腫に隣接する組織のＧＤＦ１５−ＣＬＰＴＭ１複合体の、インサイチュにおける検出を示す（ＱＲＦＰＲについて解析した図２５Ａの一部のスライド）。複合体は検出されず、このことは、ＣＬＰＴＭ１が存在していないことを示している。
【図２６】図２６は、悪性骨髄腫において、高いレベルのＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体が見られることを示す。図２６Ａにおいては、骨髄腫において、ＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体をインサイチュＰＬＡによって検出すると、骨髄腫において、高いレベルのＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ複合体が見られ得ることが示される。図２６Ｂは、骨髄腫に隣接する組織のＧＤＦ１５−ＣＬＰＴＭ１複合体の、インサイチュにおける検出を示す（ＱＲＦＰＲについて解析した図２６Ａの一部のスライド）。複合体は検出されず、このことは、ＣＬＰＴＭ１が存在していないことを示している。
【図２７】図２７は、ＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１に由来するポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質は、厳しい洗浄条件を用いたプルダウンアッセイにおいて、ＧＤＦ１５と相互作用することを示す。ＡＰ５は、ＱＲＦＰＲポリペプチドを用いたものであり、ＡＰ２は、ＣＬＰＴＭ１ポリペプチドを用いたものであり、ＡＰ１は、コントロールポリペプチドを用いたものであり、ＡＰ０は、ネガティブコントロールである。
【図２８】図２８は、ＬＰＳで刺激したＣＤ１４＋免疫細胞におけるサイトカインの分泌に対する、抗ＣＬＰＴＭ１抗体の効果を示す。サイトカインは、ＬＰＳ存在下において分泌され、ＧＤＦ１５と接触した細胞においては、分泌が低減される。抗ＣＬＰＴＭ１抗体は、ＩＬ１２（図２８Ａ）およびＴＮＦ（図２８Ｂ）を分泌する能力を回復させる。
【図２９】図２９は、ＬＰＳで刺激したＣＤ１４＋免疫細胞におけるサイトカインの分泌に対する、ＣＬＰＴＭ１ポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質の効果を示す。サイトカインは、ＬＰＳ存在下において分泌され、ＧＤＦ１５と接触した細胞においては、分泌が低減される。ＣＬＰＴＭ１ポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質は、ＩＬ１２（図２９Ａ）およびＴＮＦ（図２９Ｂ）を分泌する能力を回復させる。
【図３０】図３０は、ＬＰＳで刺激したＣＤ１４＋免疫細胞におけるＩＦＮγの分泌に対する、ＣＬＰＴＭ１ポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質の効果を示す。ＬＰＳ存在下および非存在下のいずれにおいても、分泌は検出されないが、ＣＬＰＴＭ１ポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質と接触させた細胞においては、ＩＦＮγが検出され、ＩＬ１２を分泌する能力が回復した。
【図３１】図３１は、ＣＬＰＴＭ１由来のペプチドに対するＧＤＦ１５の結合を示す。配列番号２５０〜２７３に示すアミノ酸を有するポリペプチドを、ストレプトアビジンでコーティングしたウェルに固定化し、各ペプチドに対するＧＤＦ１５の結合を測定した。
【図３２】図３２は、ＣＬＰＴＭ１における、ポリクローナルウサギ抗ＣＬＰＴＭ１抗体（バイオス社）に対するエピトープのマッピングを示す。異なる２つのエピトープが同定された。図３３Ａは、エピトープ１の同定について示し、図３３Ｂはエピトープ２の同定について示す。
【実施例】
【０２１７】
（実施例１−タンデムアフィニティ精製−質量分析）
発明者らは、相互作用するタンパク質をスクリーニングするために、同一のアフィニティタグを有する異なる一連のタンパク質を用いる、タンパク質−タンパク質相互作用捕捉アッセイを設計し、ＧＤＦ１５を加えた。様々ながんを含む人の病理学において重要な役割を果たし、また、相互作用しているタンパク質および受容体についての科学文献において見解の相違が見られるので、ＧＤＦ１５を選択し、パネルに加えた。
【０２１８】
＜複数のベイト（bait）タンパク質の設計と構築＞
生命情報化学（ＳＳＰＲＯ、ＲＡＳＭＯＬ）解析を行うことによって、ベイトに存在する疎水性アミノ酸を排除して、公知の二次構造要素が破壊されるのを回避した。ベイトのインサートを、ＰＣＲによってプラスミドＤＮＡから増幅し、ゲンタマイシンによる選択が可能な真核生物発現ベクターに挿入した。
【０２１９】
発現ベクターを用いて細胞のトランスフェクトを行い、ＧＤＦ１５を含む一連のベイトタンパク質について、過剰発現を行う安定細胞株を同時に開発した。
【０２２０】
クローン選択を行い、続く質量分析による解析を行うのに十分な材料を準備できるほど、十分な量（１０8個の細胞）を得られる範囲まで細胞を増殖させた後、調整培地を、ベクターのフレームにコードされた（したがって、ＧＤＦ１５を含むベイトタンパク質との融合体として発現される）タグに対するアフィニティ精製に供した。このように、ベイトタンパク質は、真核生物の宿主において発現され、正しく折り畳まれる可能性を高くした。さらに、このようにして「人工」自己分泌／傍分泌ループを構築すると、ベイトリガンドで宿主細胞を刺激することによって、例えば、タグ付きのベイトを用いた共精製によって後に捕捉される受容体を含有するエキソソームを放出するなど、ベイトに対する応答が様々な形で行われるようになった。
【０２２１】
要するに、異なる培養で得られる、ＧＤＦ１５などの、タグ付きのタンパク質は、アフィニティ基質を用いて捕捉され、界面活性剤を含有する高い塩濃度の緩衝液で十分に洗浄された後、アフィニティ基質から溶出され、次いで質量分析による解析のために処理された。ＧＤＦ１５に結合したタンパク質を切断し、ＭＳ解析に供した。ＭＳデータに基づいて、タンパク質を同定した。
【０２２２】
様々なベイトを用いて、複数回解析行った。同一のタグを用い、ベイトのみを個別に変更すると、特定のベイトと特異的に共精製するタンパク質を同定することができる。個別のベイトに対する特異的なヒットを容易に同定するために、ソフトウェアスクリプトを書いた。
【０２２３】
これらの複数の解析から、発明者らは、ＧＤＦ１５のベイトと特異的に共精製するＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１を同定した。
【０２２４】
＜安定細胞株の開発＞
安定細胞株を樹立し、増殖後、収集した。血清を含有しない培地で細胞を洗浄し、血清を含有しない培地中で２０時間増殖させた。
【０２２５】
＜フィルター上でのタンパク質のトリプシン消化＞
試料から５００μＬを分取し、３ｋＤａフィルター（ポール・ライフ・サイエンス社（Pall Life Sciences）、アンアーバー、ミシガン州、米国）を用いて、本質的にはＷｉｓｎｉｅｗｓｋｉらのプロトコール（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら、２００９）にしたがって、フィルター上で消化した。トリプシン消化は、暗所にて、一晩、３７℃で行った。その後、試料を遠心分離して、未消化のタンパク質およびトリプシンを濃縮液中に保持しつつ、トリプシンによって生じたペプチドをろ液中に回収した。１００μＬの５０％ＡＣＮ、１％ＨＡｃを追加し、フィルターを１０分間回転させて、最初のトリプシン消化によって生じたペプチドのろ液と共に保存した。最後に、回収したろ液を、スピードバックシステム（Speedvac system）ＩＳＳ１１０（サーモ・サイエンティフィック社（Thermo Scientific）、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を用いて凍結乾燥し、１０μＬの０．１％ＴＦＡに再溶解して、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて同定を行った。
【０２２６】
＜タンパク質同定のためのナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ＞
ナノエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン源を備えた、７ＴハイブリッドＬＴＱ ＦＴ質量分析計（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社（ThermoFisher Scientific）、ブレーメン、ドイツ）を用いて、タンパク質同定実験を行った。アジレント（Agilent）１１００ナノフローシステム（アジレント・テクノロジー社（Agilent Technologies）、ヴァルトブロン、ドイツ）を用いて、オンライン・ナノＬＣ分離を行った。自ら詰めた１５ｃｍの溶融石英エミッター（内径７５μｍ、外径３７５μｍ）で、ペプチドの分離を行った。加圧パッキング装置を５０〜６０ｂａｒで運転して、逆相完全末端被覆レプロシル（Reprosil）−Ｐｕｒ Ｃ18−ＡＱ ３μｍ樹脂（ドクター・マイシュ社（Dr. Maisch GmbH）、アンマーブーフ−エントリンゲン、ドイツ）のメタノールスラリーをエミッターに詰めた。移動相Ａ（０．５％酢酸を含む水）および移動相Ｂ（８９．５％アセトニトリル、１０％水、および０．５％酢酸）を用い、流速２００ｎＬ／分で分離を行った。１００分間、２％Ｂから５０％Ｂまでグラジエントをかけ、その後９８％Ｂを用いた洗浄ステップを５分間行った。
【０２２７】
共通のアフィニティタグおよびリンカーを有するベイトタンパク質を、同一のベクターコンストラクトから産生した。発明者らは、これらのベイトを用いて、Ｇ４１８で選択した、安定細胞から調製された調整培地中で相互作用しているタンパク質をスクリーニングし、質量分析（ＭＳ）によって、相互作用しているタンパク質を同定した。各ベイトに特異的なヒットを分類するために、発明者らは、自ら、データ・ドラッジャー（Data Drudger）というソフトウェアを開発した。発明者らは、この解析から、ＧＤＦ１５をベイトとして用いた場合にのみ、トリプシン消化によって生じたＱＲＦＰＲ由来のペプチドを同定した。発明者らの初期のＴＡＰ−ＭＳスクリーニングにおいて、ＧＤＦ１５のベイトと共精製する第２のタンパク質も見出された。このタンパク質は、口唇口蓋裂膜貫通タンパク質１（ＣＬＰＴＭ１）と同定された。
【０２２８】
（実施例２−調整培地からのＱＲＦＰＲ含有エキソソームの精製）
＜エキソソームの単離＞
調整細胞培養液を、細胞を沈殿させるために３，０００×ｇで５分間、次いで、細胞および細胞片をさらに除去するために１０，０００×ｇで１０分間、順次遠心分離した。その後、上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、最後に、１００，０００×ｇで２時間、４℃で沈殿させた。沈殿したエキソソームをＰＢＳに再懸濁し、プロテアーゼ阻害剤（コンプリート・ミニ（complete mini）、ロシュ社（Roche））を添加した。その後、他で述べるように、さらなる解析のために試料を調製した。
【０２２９】
＜電子顕微鏡法によるエキソソームの同定＞
沈殿したエキソソームを、２０メッシュのフォルムヴァール／カーボン被覆銅製グリッド（ポリサイエンス社（polysciences, Inc.）に付着させて、テックナイ（Technai）Ｇ２（ＦＥＩ社（FEI））を用いた、８０ｋＶの透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって解析した（図１Ａ）。
【０２３０】
＜ウエスタンブロットによるＱＲＦＰＲ陽性エキソソームの同定＞
１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（バイオラッド社（Biorad）を用いて、１５０Ｖで８０分間、超遠心分離で得られた沈殿由来の物質を分離し、イモビロン（Immobilon）Ｋメンブレンへの湿式転写を行い、５％ＢＳＡで１時間ブロックした後、対応するＱＲＦＰＲ抗体と共に、軽く振盪しながら一晩４℃でインキュベートした。メンブレンをＴＢＳＴで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた対応する二次抗体を室温で１時間反応させた後、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ検出試薬を用いて現像した（図１Ｂ）。
【０２３１】
（実施例３−細胞表面のＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲの検出）
ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの複合体が細胞表面に存在しているかを確認するために、発明者らは、スリンダクスルフィド（ＮＳＡＩＤの一種；量が少ない内因性のＧＤＦ１５を増加させるため）で処理したＭＣＦ−７細胞を、インサイチュＰＬＡを用いてＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用を検出することによって解析した。発明者らは、ＱＲＦＰＲのｓｉＲＮＡ（図２Ｂ）またはスクランブル配列を有するコントロールｓｉＲＮＡ（図２Ａ）のいずれかで処理されたＭＣＦ−７細胞において、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとが近接する事象が起こるレベルを比較した。発明者らは、ＱＲＦＰＲのｓｉＲＮＡで処理した細胞において、ＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲのレベルが低下していることを発見し、これによって、抗体の特異性と、この細胞株に受容体が存在していることとを実証した。細胞は、血清飢餓状態としてからＧＤＦ１５処理に供した。
【０２３２】
（実施例４−ＧＤＦ１５による刺激によって細胞表面のＱＲＦＰＲレベルは低下する
ＡＣＴＲＩＩＢ−ＱＲＦＰＲの近接性の検出）
ＴＧＦβスーパーファミリー（ＧＤＦ１５が属している）のメンバーは、Ｉ型受容体を２つとＩＩ型受容体を２つ含む、ヘテロ四量体である受容体複合体を介して、シグナル伝達を行う。ＩＩ型受容体はリガンドに結合して、これをＩ型受容体に提示する。発明者らは、ＧＤＦ１５に対応するＩＩ型受容体を同定することを試みた。
【０２３３】
ＴＧＦｂスーパーファミリーのＩＩ型受容体として知られているのは５つだけであり、まず、ＡＣＴＲＩＩＢが、このような対応するＩＩ型受容体の条件のいくつかを満たすと仮定した。ＡＣＴＲＩＩＢは、系統学的にＧＤＦ１５に近い、ＴＧＦｂスーパーファミリーのメンバーである、ＧＤＦ８の２型受容体である。さらに、ＡＣＴＲＩＩＢは、脂肪の代謝に関わっていることが示唆されている。ＱＲＦＰＲは、脂肪細胞において発現されると説明されている。
【０２３４】
ＭＣＦ７細胞をＧＤＦ１５（アブカム社（Abcam）およびバイオビジョン社（Biovision）から購入した、哺乳動物源から単離されたＧＤＦ１５、または大腸菌（E.coli）由来の組換え体）で刺激した。ＧＤＦ１５の活性をモニターし、また、リガンドによるＱＲＦＰＲの調節などの、受容体の動態を確認するための、アッセイを行った。
【０２３５】
血清飢餓状態のＭＣＦ７細胞をＧＤＦ１５で処理した後、デュオリンクの二次検出試薬を用いることができるように異なる２つの種由来の抗体を用いて、インサイチュＰＬＡ検出アッセイを行い、ＡＣＴＲＩＩＢとＱＲＦＰＲとの相互作用を検出した。ＧＤＦ１５非存在下において、存在するＱＲＦＰＲ−ＡＣＴＲＩＩＢ複合体を検出した（図３Ａ参照、矢印で示す）。しかしながら、まず驚いたことには、得られたシグナルは、ＧＤＦ１５処理による短期の刺激（２０分）によって低下した。このことは、ＧＤＦ１５による動的な調節を示唆している（図３Ｂ参照）。興味深いことには、血清による効果が混同することを回避するために、一晩血清飢餓状態にしたＭＣＦ７細胞を用いた実験において、血清飢餓状態の細胞では、ＱＲＦＰＲの発現が増加していることが見出された。
【０２３６】
文献からは、ＧＤＦ１５およびＱＲＦＰＲは、ＮＰＹおよびＰＯＭＣという下流の２つの標的に対しての効果が逆であることがわかる。したがって、ＧＤＦ１５が、細胞表面のＱＲＦＰＲレベルに干渉し得ることが示唆される。ＱＲＦＰＲを細胞表面から除去した場合、その親水性作動性ペプチドリガンド（２６ＲＦアミドおよびＱＲＦＰ）がＮＰＹおよびＰＯＭＣを調節する効果もまた、阻害される。ＧＤＦ１５が、ＮＰＹおよびＰＯＭＣなどの、哺乳類の代謝の中心となる重要な標的を調節する能力、ならびに悪液質において報告されているＧＤＦ１５の役割は、ＧＤＦ１５によるＱＲＦＰＲの阻害で説明され得る。
【０２３７】
＜ＥＥＡ１−ＱＲＦＰＲの近接性の検出＞
ＱＲＦＰＲが内在化するのに、ＧＤＦ１５が果たす役割を確認するために、エンドソームの形成をモニターできる一連のインサイチュＰＬＡアッセイを行った。
【０２３８】
初期エンドソームマーカー１（ＥＥＡ１）は、急速なエンドソーム形成のマーカーであり、アッセイを行って、ＥＥＡ１およびＱＲＦＰＲの近接性を検出した。ＧＤＦ１５非存在下において、シグナルは得られなかった（図３Ｃ）。しかしながら、ＥＥＡ１およびＱＲＦＰＲに対する抗体を用いた後、デュオリンク二次プローブを用いるインサイチュＰＬＡアッセイで測定されたように、ＧＤＦ１５への短時間（５分間）の曝露が、ＥＥＡ１およびＱＲＦＰＲが近接することによって生じるＲＣＡ産物の数を増加させるのに十分であることが見出された（図３Ｄ参照、矢印で示す）。
【０２３９】
発明者らは、また、ＧＤＦ１５が、ＱＲＦＰＲ陽性エキソソームの放出を誘導することを観察した。このことは、経路が２つに分かれており、２つの方法によって、ＧＤＦ１５が細胞表面のＱＲＦＰＲレベルを低下させ得るということを示唆している。そこで、発明者らは、二重の役割を有する、すなわち、エンドソームの輸送およびエキソソームの輸送の両方において役割を有する、ことが知られているマーカーを含むアッセイを行うことを試みた。
【０２４０】
＜ＣＤ９−ＱＲＦＰＲの近接性の検出＞
テトラスパニンＣＤ９は、二重の役割を有する、すなわち、エンドソームの輸送およびエキソソームの分泌の両方において役割を有する（Ｍａｚｕｒｏｖら）。ＣＤ９およびＱＲＦＰＲに対する抗体を用いて、インサイチュＰＬＡアッセイを行い、ＣＤ９およびＱＲＦＰＲの近接性を検出した。ＧＤＦ１５非存在下においては、低レベルのシグナルしか観察されない（図４Ａおよび４Ｃ）。ＧＤＦ１５で３０分間刺激すると、高レベルのＣＤ９−ＱＲＦＰＲ複合体のシグナルが得られたが、このことは、エンドソームおよびエキソソームが形成されたことを示す（図４Ｂおよび４Ｄ）。
【０２４１】
＜ＲＡＢ１１−ＱＲＦＰＲの近接性の検出＞
ＲＡＢ１１タンパク質は、エンドソームを再循環させて細胞表面へと戻すマーカーであり、また、ＲＡＢ１１経路は、エキソソームの集合にも関わっている（Ｓａｖｉｎａら、２００５；Ｓａｖｉｎａら、２００２）。したがって、ＲＡＢ１１は、ＧＤＦ１５が誘導する、細胞表面におけるＱＲＦＰＲの減少に関わる候補として有力であると考えられた。
【０２４２】
インサイチュＰＬＡアッセイを行い、ＲＡＢ１１およびＱＲＦＰＲの近接性を検出した。ＧＤＦ１５非存在下においては、低レベルのシグナルしか観察されない（図５Ａおよび５Ｃ）。ＧＤＦ１５で刺激すると、細胞質において、ＲＡＢ１１−ＱＲＦＰＲ二重陽性エンドソームが、急速に検出されるようになった（図５Ｂおよび５Ｄ）。
【０２４３】
＜プロテアソームによる分解の阻害＞
ＱＲＦＰＲのエンドソームによる輸送によって、エキソソームが集合し、それに続いて放出されるのか、または、ＱＲＦＰＲが、プロテアソームによる分解の標的となっているのかどうか、を確認するために、長時間、ＧＤＦ１５で細胞を刺激するアッセイを行った。
【０２４４】
以前の実験において、ＧＤＦ１５による刺激によって、細胞表面のＱＲＦＰＲレベルが低下したことが観察されていた。しかしながら、プロテオソーム阻害剤であるＭＧ１３２（最終濃度は１０μＭ）によってプロテオソームを阻害すると、ＭＧ１３２非存在下で、同量のＧＤＦ１５で処理された細胞と比較して、ＱＲＦＰＲレベルが上昇した。図６Ａは、ＧＤＦ１５非存在下の細胞を示し、一方、図６Ｂは、ＧＤＦ１５で一晩刺激した細胞を示しており、こちらは、細胞表面のＱＲＦＰＲが、検出できないレベルである。図６Ｃは、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２に曝露させたコントロール細胞を示し、図６Ｄは、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２に曝露させ、ＧＤＦ１５で一晩刺激した細胞を示す。
【０２４５】
本実験によって、ＧＤＦ１５が、プロテオソームが媒介するＱＲＦＰＲの分解を誘導することが実証される。ＭＧ１３２非存在下においては、ＧＤＦ１５で１８時間処理することによって、ＱＲＦＰＲレベルが劇的に低下した（図６Ｂ）。この効果は、ＭＧ１３２で処理した細胞では見られない（図６Ｄ）。
【０２４６】
＜ＲＡＢ４−ＱＲＦＰＲの近接性の検出＞
ＲＡＢ１１陽性エンドソームは、ＲＡＢ４を含んでいることも報告されているので、ＲＡＢ４−ＲＡＢ１１二重陽性エンドソームが存在し得る。ＲＡＢ４およびＱＲＦＰＲに対する抗体を用いて、アッセイを行い、ＲＡＢ４−ＱＲＦＰＲの近接性を検出した。ＧＤＦ１５非存在下においては、ＲＡＢ４−ＱＲＦＰＲのシグナルは観察されなかった（図７Ａ参照）。ＧＤＦ１５で刺激すると、ＲＡＢ４−ＱＲＦＰＲ二重陽性エンドソームの形成が検出された（図７Ｂ参照）。
【０２４７】
ＲＡＢ４−ＲＡＢ１１二重陽性エンドソームは、エンドソームの公知の形態であり、よって、発明者らは、独立した２つのＲＡＢマーカー（４および１１）によって、細胞がＧＤＦ１５に曝露された後、ＱＲＦＰＲ陽性エンドソームが形成されることを実証するものである。
【０２４８】
ＱＲＦＰＲ陽性エンドソームの形成をアッセイに利用することによって、例えば実施例６において、様々なＧＤＦ１５阻害剤の効果を測定し得る。
【０２４９】
（実施例５−インビトロにおける相互作用アッセイ）
ＧＤＦ１５と相互作用するペプチドの特徴をさらに調べるために、一連のＧＳＴ−融合タンパク質およびビオチン化ペプチドを調製した。ＧＤＦ１５は、バイオビジョン社および／またはアブカム社から入手した。
【０２５０】
＜ＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１に由来するペプチドを用いたＧＤＦ１５のビオチンプルダウン＞
ＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１タンパク質由来の一連のペプチドを設計した。ペプチドを免疫沈降実験および細胞培養に基づくアッセイの両方に用いるために、各ペプチドのＮ末端にビオチンを付加し、対イオンを塩化物イオンに変更した。
【０２５１】
一連のビオチン化ペプチドを用いた（図８Ａ）。レーン１は、ビオチン化されていないコントロールであり、レーン２は、ビオチン−ＧＥＩＫＹＤＦＬＹＥＫＥＨＩＣＣＬＥＥＷＴＳ（配列番号１０；ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３）であり、レーン３は、ビオチン−ＧＩＥＹＳＮＦＥＫＥＹＤＤＶＴＩＫ（配列番号１７４；ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン４）であり、レーン４は、ビオチン−ＧＡＬＦＷＥＱＨＤＬＶＹＧＤＷＴＳ（配列番号１９；ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメイン由来のペプチド)であり、レーン５は、無関係なタンパク質由来のビオチン−ペプチド（Ｃｔｒｌ）である。２つのペプチドが、他のペプチドよりも首尾良くＧＤＦ１５を沈降させた（図８Ａのレーン２および４）。
【０２５２】
また、ペプチドを組み合わせて用いた。レーン１〜５と総量が同じであり、レーン１〜５と比較して、各ペプチドが５０％となるように、１：１の比でペプチドを混合した。レーン６は、ＱＲＦＰＲのＥＣドメイン３およびＥＣドメイン４であり、レーン７は、ＱＲＦＰＲのＥＣドメイン４およびＣＬＰＴＭ１のＥＣドメイン由来のペプチドであり、レーン８は、ＱＲＦＰＲのＥＣドメイン３およびＣＬＰＴＭ１のＥＣドメイン由来のペプチドであり、レーン９は、分子量マーカーであり、レーン１０は、ＧＤＦ１５（ポジティブコントロール）である。
【０２５３】
ＲＡＢ１１−ＱＲＦＰＲエンドソームおよびプルダウンを用いた発明者らの以前の実験では、細胞外ループ４も、ＧＤＦ１５と相互作用して沈殿可能であることが示唆されていた。したがって、ＱＲＦＰＲの細胞外ループ３およびループ４の両方が、ＧＤＦ１５と接触する可能性がある。
【０２５４】
＜ＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１のＧＳＴ−融合断片の作成＞
発明者らは、以前に、ＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１由来のビオチン化ペプチドを用いることによって、ＣＬＰＴＭ１に由来するモチーフに、ＧＤＦ１５がより保持されることを観察した。
【０２５５】
次に、発明者らは、細胞外ドメイン３、４（ＱＲＦＰＲ）またはＣＬＰＴＭ１のいずれかに由来するモチーフに相当する合成ハイブリッド化オリゴヌクレオチドを用いて、ＱＲＦＰＲおよびＣＬＰＴＭ１由来のＧＤＦ１５結合モチーフを形成した。ｐＧＥＸ４Ｔ１骨格にオリゴヌクレオチドを挿入し、ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓ細菌株にて発現させ、精製した。正確な配列を、サンガー（Sanger）の配列決定法で確認した。
【０２５６】
次に、発明者らは、精製したＧＳＴ−融合タンパク質を、同量のＧＤＦ１５とインキュベートし、検体を、高塩濃度の緩衝液で十分に洗浄した。
【０２５７】
ビオチン化ペプチドを用いた以前の結果と同様に、発明者らは、ＧＤＦ１５と、ＣＬＰＴＭ１由来のモチーフとの間に、より強力な親和性があることを観察した。
【０２５８】
要するに、選択された受容体断片を合成オリゴマー（ウルトラマー（ultramer)、ＩＤＴテクノロジー社（IDT technologies））を用いて構築し、フランキング末端を制限酵素で切断し、ｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクター（ファルマシア・バイオテック社（Pharmacia Biotech））に挿入した。コンストラクトを、ライブラリ・エフィシェンシー細菌株（library efficiency bacteria）ＤＨ５（インビトロジェン社（Invitrogen））でクローン化した。２％アガロースゲルを用いた分析的制限酵素切断によって、正常なクローンを同定し、ウプサラ配列解析センター（Uppsala sequencing centre）において、サンガーの配列決定法によって確認した。
【０２５９】
確認したクローンを用いて、ＢＬ２１ｐＬｙｓ細菌株を形質転換した。単一クローンを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢ培地２０ｍＬで一晩培養し、次の日に、１００ｍＬに増やしてから、０．１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導を３時間行った。細菌細胞を遠心分離によって沈殿させ、トリトン（Triton）ｘ−１００（１％）を含むＰＢＳ中で超音波破砕を行った。溶解産物を遠心分離によって清澄化し、上清を、グルタチオンビーズ（ファルマシア社（Pharmacia））と共に一晩インキュベートした。
【０２６０】
＜ＧＤＦ１５のＧＳＴプルダウン＞
等量のＧＳＴ−融合タンパク質を、４℃で４時間、等量のＧＤＦ１５と共に、５００μＬのＰＢＳＴ中で転倒混和しながらインキュベートし、グルタチオンセファロース４Ｂビーズ（ＧＥヘルスケア社（GE healthcare））を用いて捕捉した後、３つの異なる洗浄液（ＰＢＳＴ、２００ｍＭのＮａＣｌを添加したＰＢＳＴ、および細胞溶解緩衝液（０．５％デオキシコール酸塩、ＮＰ−４０））を用いて十分に洗浄した。洗浄時、チューブ壁への非特異的な結合が残らないようにするために、ビーズを新しいエッペンドルフチューブに移してから、ＳＤＳ中で煮沸した。
【０２６１】
＜ＰＢＳ中での最終洗浄＞
ＤＤＴを添加したＳＤＳローディング用染色液中で５分間煮沸することによって、材料を変性させた後、１２％のアクリルアミドゲルを用いて泳動し（１２０Ｖ、７０分間）、ＥＣＬおよびＣＣＤカメラ（バイオラッド社）を用いて解析した。
【０２６２】
レーン３は、ＧＳＴ−ＥＩＫＹＤＦＬＹＥＫＥＨＩＣＣＬＥＥＷＴＳ（配列番号７に示すＧＳＴ融合体；ＱＲＦＰＲのＥＣドメイン３）であり、レーン４は、ＧＳＴ−ＡＬＦＷＥＱＨＤＬＶＹＧＤＷＴＳ（配列番号１８；ＣＬＰＴＭ１のＥＣドメイン由来のペプチド）である。レーン７はＧＳＴコントロール（融合なし）である。ＱＲＦＰＲの細胞外ドメイン３およびＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインの一部に相当するペプチドでは、結合の増加が観察された（図８Ｂ、レーン３および４）。
【０２６３】
（実施例６−ＧＤＦ１５−ＱＲＦＰＲ相互作用の阻害）
＜ペプチドによるＭＣＦ７細胞およびＵ２ＯＳ細胞における内在化の阻害＞
発明者らは、様々な薬剤によってＧＤＦ１５の活性を阻害できるかを確認する方法として、本アッセイを選択し用いた。ＱＲＦＰＲの細胞外ループ３由来の受容体断片によって、ＧＤＦ１５がＲＡＢ１１−ＱＲＦＰＲ二重陽性エンドソームを誘導する能力が実質的に低減された（図９参照）。対照的に、関係のないタンパク質由来のコントロール断片は、ＲＡＢ１１−ＱＲＦＰＲ二重陽性エンドソームの増加を阻害することはない。ＧＤＦ１５が誘導するＲＡＢ１１／ＱＲＦＰＲエンドソームの形成は、ＱＲＦＰＲペプチドによって阻害される（図９Ａ〜９Ｄ）。等量のＧＤＦ１５のマスターミックスを分取し、様々な受容体断片と共にＰＢＳ中でプレインキュベートした後、細胞に添加した。順次、細胞を、ＰＢＳ、ＧＤＦ１５混合液、またはＧＤＦ１５／ＱＲＦＰＲ由来ペプチド混合液のいずれかで処理した。Ｕ２ＯＳ細胞において、細胞表面のＱＲＦＰＲレベルがＧＤＦ１５によって低下したが、ＱＲＦＰＲペプチドによって、正常レベルに回復した（図９Ｅ）。
【０２６４】
＜ペプチドによって内在化は阻害されるが、Ｐ５１８には影響を及ぼさない＞
図１０Ａ〜１０Ｃによって、ＧＤＦ１５が細胞表面のＱＲＦＰＲレベルを低下させること、およびこの低下は、ＱＲＦＰＲの細胞外ループ３（細胞外ドメイン４）に由来するペプチドによって回復され得ることが確認される。
【０２６５】
ＱＲＦＰＲのアゴニストであるｐ５１８の効果を測定した。端的に言うと、ｐ５１８／ＱＲＦＰＲ−２６を、カリフォルニア州のフェニックス・ペプチド社（Phoenix Peptides）から購入し、製造業者の説明書にしたがって処理した。細胞を血清飢餓状態としてから、Ｐ５１８で一晩刺激した。
【０２６６】
Ｐ５１８を、ＰＢＳまたはＰＢＳに溶解したＱＲＦＰＲ受容体断片のいずれかと混合してから、細胞を刺激した。
【０２６７】
発明者らは、ＡＣＴＲＩＩＢレベルを上昇させるのは、ｐ５１８のみで十分なこと、また、興味深いことに、ＱＲＦＰＲ断片が存在していても、Ｐ５１８が誘導したＡＣＴＲＩＩＢレベルは低下しなかったことを実証した。それどころか、発明者らは、ｐ５１８のみで処理した場合と比較して、ｐ５１８およびＱＲＦＰＲ受容体断片の両方で細胞を処理した場合に、ＡＣＴＲＩＩＢがわずかに増加したことを見出した（図１０Ｄ〜１０Ｆを参照）。
【０２６８】
このように、発明者らは、ＱＲＦＰＲ受容体断片は、ＱＲＦＰＲのアゴニストであるＰ５１８を阻害しないことを観察したが、ＱＲＦＰＲレベルに関する別のアッセイにおいて実証された、ＱＲＦＰＲレベルに対するＧＤＦ１５の効果を低減する能力を有している（図１０Ａ〜１０Ｃ）。
【０２６９】
したがって、これらの２つのアッセイを用いることによって、ＧＤＦ１５を阻害するがアゴニスト（ｐ５１８）は阻害しない選択的阻害剤（例えば、本明細書で用いるＱＲＦＰＲ断片、またはｐ５１８に干渉しないエピトープに作用するＱＲＦＰＲ抗体など）を発見、開発することが可能になる。
【０２７０】
＜ｒａｂ４エンドソームを防止する抗体＞
端的に言うと、細胞を一晩血清飢餓状態とした後、ＱＲＦＰＲの細胞外部分に対するブロッキング抗体と共に２時間プレインキュベートしてから、ＧＤＦ１５（１μｇ／ｍＬ）で３０分間処理した。形成されたＲＣＡ産物を、ＰＬＡシステムにおいてデュオリンクを用いて可視化することによって、形成されたＲＡＢ４−ＱＲＦＰＲ複合体のレベルを測定した（図１１参照）。ブロッキング抗体によって、ＲＡＢ４−ＱＲＦＰＲエンドソームの形成が阻害されることが見出された。用いたブロッキング抗体は、ペップスターアレイ（Pep-star array）上において、ＱＲＦＰＲのＧＤＦ１５結合部位と重なることが実証された。
【０２７１】
このアッセイは、ＱＲＦＰＲに対する抗体が、ＧＤＦ１５が媒介するエンドソームの形成を阻害できることを証明するのに有用であった。
【０２７２】
考え得るＧＤＦ１５に対するＩＩ型受容体であるかどうかの可能性を確認するために、まず、ＡＣＴＲＩＩＢを選択した。これは、ＧＤＦ１５が、ＡＣＴＲＩＩＢと相互作用するＧＤＦ８と密接に関わっているという事実に基づくものであった。ＧＤＦ１５が、エンドソームが媒介する（例えば、ＲＡＢ４エンドソームおよびＲＡＢ１１エンドソームが介する）内在化およびＱＲＦＰＲによるエキソソームの放出という少なくとも２つの機構によって、ＱＲＦＰＲとＡＣＴＲＩＩＢとが相互作用する程度（近接する事象が起こる回数の減少として同定される）を低下させることが見出された。
【０２７３】
驚くべきことに、ＱＲＦＰＲに対する２つの公知のアゴニスト（ｐ５１８／２６ＲＦａ（２６ｍｅｒ）およびＱＲＦＰ（４３ｍｅｒ）が、互いに逆の方法で、ＡＣＴＲＩＩＢレベルを調節することが見出された。このことによって、作動性リガンドの結合は阻害しない、ＱＲＦＰＲのＧＤＦ１５結合部位に対する選択的阻害剤の開発を可能にするのに有用な、新規のアッセイが提供され得ることが明らかになった。
【０２７４】
好ましくは、このような結合剤（抗体など）は、ＧＤＦ１５結合部位と重なるエピトープに直接結合することによって、ＧＤＦ１５がＱＲＦＰＲに接近することを阻害してもよいし、隣接するエピトープに結合することによって、例えば立体阻害により、結合を阻害し、ひいてはＧＤＦ１５がＱＲＦＰＲに接近することを間接的に阻害してもよい。
【０２７５】
好ましくは、このような結合剤は、内因性リガンドに結合することによって媒介される受容体の作動性機能に干渉しない。したがって、本明細書において提供されるこのＡＣＴＲＩＩＢアッセイによって、このような結合剤がリガンドの作動性結合に干渉するかどうかを決定することが可能になる。
【０２７６】
発明者らは、本アッセイを用いて、ＧＤＦ１５を阻害するのに用いたペプチドが、ＱＲＦＰに干渉しないことを決定することができた。したがって、ＡＣＴＲＩＩＢアッセイおよびＲＡＢ１１−ＱＲＦＰＲエンドソームアッセイを用いることによって、ＱＲＦＰＲのアゴニストおよびアンタゴニストの機能を調節する選択的な手段を見出すことができる。
【０２７７】
（実施例７−ペプチドスクリーニング）  
ＱＲＦＰＲの第３の細胞外ドメイン（細胞外ループ２）に存在する重要なアミノ酸および最小限のエピトープを決定するために、発明者らは、ペップスターアレイを設計し、ＪＰＴペプチド社（JPT peptides）から購入した。端的に言うと、アレイは、ＱＲＦＰＲの細胞外ループ２の全範囲を、１５ｍｅｒずつ分割して含んでいた。この長さ（１５ｍｅｒ）のペプチドは、合成効率や、ＦＭＯＣ化学による純度および収率などの要因に基づいて、製造者によって推奨される長さに基づき、選択された。１５ｍｅｒは、アミノ酸ウォーク、あるいは１アラニンスキャンまたは２アラニンスキャンのいずれかにしたがって変化させた。各セットにつき、３回ずつ解析を行った。ＧＤＦ１５をＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で希釈し、オービタルシェーカー上で緩やかに振盪させながら、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＭＩ社（ELMI）のスカイライン（Sky line）オービタルシェーカーＤＯＳ−１０Ｌ上で振盪させながら、洗浄を行った。
【０２７８】
先だってＧＤＦ１５をインキュベートしたウェル、およびＧＤＦ１５を除いた（ＰＢＳ−Ｔのみの）隣のコントロールウェルに、ＧＤＦ１５に対する一次抗体を添加し、オービタルシェーカー上で振盪させながら、室温で１時間インキュベートした。洗浄を繰り返した後、蛍光色素分子を結合した二次抗体を添加し、最終洗浄後に、アジレント・テクノロジー社のＧ２５０２マイクロアレイスキャナーを用いて、アレイを解析した。技術対照およびコントロールウェル（ＧＤＦ１５を含まない）の蛍光値を差し引き、３回の測定で得られた値をエクセル（Excel）およびプリズム（Prism）で解析した。
【０２７９】
本実験によって、発明者らは、ＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用に重要な、最小限の重要アミノ酸セットを決定することができた。アミノ酸ウォーク、およびアラニンスキャンによって、一続きの区間ＦＬＹＥＫＥＨＩＣ（配列番号１１）が、ＧＤＦ１５の結合に必須であることが明らかになった（図１２）。本出願において挙げたように、さらなる区間によっても、ＧＤＦ１５の保持が可能である。
【０２８０】
興味深いことに、ＱＲＦＰＲなどのＧＰＲは、細胞外ループ２（ＥＣＬ２）においてシステイン残基が保存されており、これは、細胞外ループ１のシステインとジスルフィド架橋を形成している。
【０２８１】
アゴニストリガンドおよびアンタゴニストリガンドの結合によって、ＥＣＬ２において、保存されているジスルフィド結合周囲に、種々の蓋のような構造の形成が誘導される。これらは、受容体において異なる機能状態を生じることが示唆されている。発明者らは、自身の実験において、ＧＤＦ１５がこの部位に正確に作用して、素晴らしい調節機構を形成する能力を有することを実証した。その部位に正確に作用することによって、ＧＤＦ１５は、ＱＲＦＰＲの食欲増進機能に拮抗し、これによって、ＮＰＹおよびＰＯＭＣなどの重要な代謝調節ホルモンのレベルを調節する。発明者らは、これが、多くのがんにおいても、他のヒトの障害においても、高レベルのＧＤＦ１５によって誘導される、悪液質および骨代謝の乱れを理解するための、計り知れないほど重要な機構である（また、ＦＬＹＥＫＥＨＩＣＣ（配列番号７８）が主要な結合部位である）ことを提案するものである。したがって、発明者らは、ＱＲＦＰＲのＥＣＬ２（ＥＣＤ３）、またはそこに隣接する部位に結合し、立体阻害によって、ＧＤＦ１５のＱＲＦＰＲに対する結合能を阻害する抗体などの薬剤が、ＧＤＦ１５が増加する障害に対する潜在的な治療薬となることを提案する。
【０２８２】
（実施例８−エピトープマッピング）
細胞培養実験で用いた抗体のエピトープを決定するために、発明者らは、並行するウェルを、様々な受容体結合抗体で処理した。抗体を室温で１時間インキュベートした以外は、図１４のＧＤＦ１５解析に関する実験および解析を行うことによって、発明者らは、ＧＤＦ１５が用いるエピトープに重なる抗体を同定することができた（図１３）。アミノ酸ウォークによって、ＱＱＬＥＩＫ（配列番号３３５）、特にＫがＮ−１５ヤギ抗体の結合に必要であることが実証された。アラニンスキャンによって明らかになったように、Ｎ−１５抗体は、さらに、ＦＬＹＥＫ（配列番号２１０）を必要とした（赤色で示す）。したがって、抗体は、リガンドが占める部位に、部分的に重なる。
【０２８３】
【表２】
2018536657.tif 000008
【０２８４】
（実施例９−ＧＤＦ１５−ＣＬＰＴＭ１）
文献において、ＧＤＦ１５は、ＡＬＫ５（ＴＧＦＢＲＩ）キナーゼドメインが媒介する標準（ＳＭＡＤ）経路、および、ＧＳＫ３ｂのリン酸化などの、非標準的なＴＧＦβ受容体シグナル伝達の両方に類似する、下流のシグナル伝達を媒介することが報告されている。ＣＬＰＴＭ１がこれに関わっているかを確認するために、発明者らは、一連のインサイチュＰＬＡを行って、ＣＬＰＴＭ１と、ＴＧＦβ受容体、およびＴＧＦβ受容体の下流の要素との間の動態を決定した。ＮＫ−９２細胞を、ＧＤＦ１５で４０分間処理し、ＳＭＡＤ２などの核内のリン酸化ＳＭＡＤタンパク質を検出した。発明者らが、ＧＤＦ１５による刺激を行った場合、ＮＫ−９２細胞において、Ｃ末端がリン酸化されたＳＭＡＤ２は検出されなかった。ＴＧＦＢ１による刺激を用いた以前の実験から、発明者らは、本アッセイ（ｐＳＭＡＤ２）が実用的であったことがわかっている。
【０２８５】
驚くべきことに、発明者らは、図１４で実証されたように、ＧＤＦ１５による刺激を行った場合、ＣＬＰＴＭ１とＴＧＦＢＲＩ（ＡＬＫ５）とが近接することが誘導されることを見出した。
【０２８６】
ＴＧＦＢＲＩが、対応するＩＩ型受容体であるＴＧＦＢＲＩＩとは独立して、ＣＬＰＴＭ１と共に局在しているかどうか、または、ＴＧＦＢＲＩ−ＴＧＦＢＲＩＩのヘテロ複合体が、ＧＤＦ１５による刺激を行った際に、ＣＬＰＴＭ１と会合するかどうかは、不明であった。このことを決定するために、別の種由来のＣＬＰＴＭ１抗体と共にＴＧＦＢＲＩＩに対する抗体を用いる、第２のインサイチュＰＬＡアッセイを開発した。そして、発明者らは、ＧＤＦ１５処理によって、ＣＬＰＴＭ１がＴＧＦＢＲＩＩに近接することも誘導されることを発見した（図１５）。
【０２８７】
ヘテロ四量体であるＴＧＦＢＲＩ−ＴＧＦＢＲＩＩ複合体の化学量論および動態に関する、文献における現在の仮説は、細胞表面において、１）リガンドによる刺激（（ＴＧＦＢＩ）など）を行った際に生じる、受容体ＴＧＦＢＲＩが２つと受容体ＴＧＦＢＲＩＩが２つとからなる会合体、または２）以前から（すなわち、リガンドが結合する前から）存在するヘテロ四量体複合体という、二つの異なる形態を提案している。
【０２８８】
文献における現在の仮説は、異なる好ましい下流のシグナル伝達経路を提案しており、前者（リガンドが誘導するヘテロ四量体）は、標準（ＳＭＡＤ）経路をより支持するものであり、後者（リガンドが提示されて、以前から存在するヘテロ四量体に結合する）は、非ＳＭＡＤ基質のリン酸化などの、非標準経路を支持するものである。
【０２８９】
ＳＭＡＤ２がリン酸化されていないこと、ならびに、文献における、ＧＤＦ１５によって開始される非標準的な下流のシグナル伝達についての報告、および発明者らによる、受容体のどちらもが、ＧＤＦ１５による刺激を行った際にＣＬＰＴＭ１と会合するという発見に基づいて、発明者らは、ＣＬＰＴＭ１が、以前から存在するＴＧＦＢＲＩ−ＴＧＦＢＲＩＩのヘテロ四量体複合体にＧＤＦ１５を提示するのに関わるという仮説を立てた。
【０２９０】
この理論を確認するために、ＣＬＰＴＭ１結合剤を用いて、ＣＬＰＴＭ１に結合するＧＤＦ１５の効果を確認するアッセイを開発した（実施例１０を参照）。
【０２９１】
（実施例１０−ＧＤＦ１５−ＣＬＰＴＭ１の阻害）
ＧＤＦ１５が誘導する、ＴＧＦＢヘテロ四量体複合体を介した下流のシグナル伝達の阻害に及ぼす、ＣＬＰＴＭ１に結合する抗体の効果を、インサイチュＰＬＡアッセイにおいて、リン酸化されたＧＳＫ３ｂ-ｐＧＳＫ３ｂ（９／２１）を検出することによって評価した。ＧＳＫ３ｂのリン酸化によって、免疫抑制効果、すなわち、免疫細胞機能の抑制が生じることが知られている。
【０２９２】
ＣＬＰＴＭ１がＧＤＦ１５と関わることを立証するために、また、抗体などの阻害剤によって、ＧＤＦ１５が誘導する下流のシグナル伝達を低減できることを初めて実証するために、発明者らは、コントロール抗体およびＣＬＰＴＭ１抗体の存在下において、ＮＫ−９２細胞をＧＤＦ１５で処理した（図１６参照）。発明者らは、コントロール抗体の存在下において、ＧＤＦ１５が、ＧＳＫ３ｂの９／２１リン酸化を誘導する（文献の通り）ことを実証した。しかしながら、ＣＬＰＴＭ１結合抗体によって、ＧＤＦ１５が誘導するＧＳＫ３ｂのリン酸化が低減された。理論に拘束されることを望むものではないが、このことは、ＣＬＰＴＭ１に結合する抗体によって、ＧＳＫ３ｂのリン酸化を介したＧＤＦ１５の免疫抑制の役割を阻害できることを示唆するものである。
【０２９３】
（実施例１１−ペプチドスクリーニング）
発明者らは、ＱＲＦＰＲに関して実施例７で説明したのと同様に、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインに由来するペプチドを用いて、ＣＬＰＴＭ１へのＧＤＦ１５の結合を確認した。２つの受容体間のＢＬＡＳＴ相同性から、発明者らは、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインにおいて、ＱＲＦＰＲの細胞外ループ２の相当するアミノ酸配列（ＹＩＳＥＨＥＨ（配列番号１５）およびＬＦＷＥＱＨ（配列番号１６））を有する、２つの潜在的な部位を同定した。
【０２９４】
ＣＬＰＴＭ１のエピトープは、潜在的に、アレイで用いた１５ｍｅｒのペプチドよりも大きい区間を含み得、より長く親和性が高いペプチド区間（四量体および二量体）を用いた（実施例５を参照）ビオチン−ペプチド実験およびＧＳＴ−融合体実験の両方によって、直鎖１５ｍｅｒよりも良好なＧＤＦ１５の結合が提供される。
【０２９５】
アレイ実験（図１７）から、ＣＬＰＴＭ１由来ペプチドのいくつかは、ＧＤＦ１５に結合するものであり、本出願において列挙している。
【０２９６】
【表３】
2018536657.tif 000009
【０２９７】
比較的短いペプチド、特に、本明細書で同定された結合モチーフを同定することは、ＧＤＦ１５と受容体との相互作用を阻害するのに用いられ得る、治療用製品の出発点となる。特定の実施形態に限定することを望むものではないが、潜在的ＧＤＦ１５デコイペプチドは、環状ペプチドまたはＦｃ融合体として、治療用に提供されるであろう。
【０２９８】
（実施例１２−エピトープマッピング）
発明者らは、本研究で用いるＣＬＰＴＭ１に対する抗体が、実施例８で説明したように、ＧＤＦ１５結合部位と重なるエピトープを認識することを見出した（図１８参照）。
【０２９９】
【表４】
2018536657.tif 000010
【０３００】
発明者らは、ＣＬＰＴＭ１のＧＤＦ１５結合部位の外側に結合する抗体も、立体阻害によって、ＣＬＰＴＭ１に結合するＧＤＦ１５を阻害し得、したがって、ＣＬＰＴＭ１の結合と関連している、ＧＤＦ１５が媒介するＴＧＦｂ受容体複合体とのクロストークを阻害することが望ましい、免疫腫瘍学などの用途にも有用な場合があることを提案するものである。これによって、ＧＤＦ１５の免疫抑制効果が阻害される。
【０３０１】
（実施例１３−免疫細胞におけるＣＬＰＴＭ１の発現）
ＣＬＰＴＭ１がヒトの免疫細胞において発現される程度を確認するために、発明者らは、健常なドナーのＰＢＭＣ由来の様々な免疫細胞種をＦＡＣＳを用いて分類し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、およびＣＤ４５＋ＣＤ３＋非Ｔリンパ球（図１９）、ならびにＣＤ１１ｃ＋細胞（樹状細胞）およびＣＤ１４＋細胞（単球／マクロファージ）（図２０）におけるＣＬＰＴＭ１発現を検出した。
【０３０２】
ＣＤ４‐Ｔリンパ球およびＣＤ８‐Ｔリンパ球においては、発明者らは、ＣＬＰＴＭ１を高レベルに発現する細胞のサブセットを検出した。ＣＤ１４陽性細胞においては、発明者らは、全体的に多量のＣＬＰＴＭ１を検出した（図２０）。
【０３０３】
健常なドナーのＰＢＭＣの利用、および免疫細胞種の選別に用いたＦＡＣＳにおけるゲーティング法は、ストックホルム、ＫＳの臨床免疫ユニットを通じ、確立されたプロトコールに従って行われた。
【０３０４】
免疫系の細胞においてＣＬＰＴＭ１が発現される程度によって、免疫系の調節に対し広範囲に効果を及ぼし得ること、および広範囲の異なる免疫応答経路において免疫応答を制御できる場合があることが示唆される。
【０３０５】
（実施例１４−ＧＤＦ１５によるＮＫＧ２Ｄの下方制御の阻害）
ＴＧＦｂ１およびＧＤＦ１５などのＴＧＦｂスーパーファミリーのメンバーは、ＮＫおよびＴ細胞などの、ＮＫＧ２Ｄを発現する免疫細胞の細胞溶解機能を抑制することが報告されている。
【０３０６】
ＮＫＧ２Ｄは、パーフォリンおよびグランザイムなどの重要なエフェクタータンパク質の上流に位置するものであり、ＴＧＦｂ１およびＧＤＦ１５が、このような細胞溶解タンパク質レベルを抑制することが報告されている。
【０３０７】
ＣＤ８＋Ｔリンパ球およびＮＫ−９２細胞などの免疫細胞におけるＣＬＰＴＭ１の発現、ならびにＧＤＦ１５が誘導する、ＣＬＰＴＭ１のＴＧＦＢＲＩ−ＴＧＦＢＲＩＩへの近接（これを介してＴＧＦＢ１がシグナル伝達を行う）に関する文献に基づいて、発明者らは、抗体によるＣＬＰＴＭ１の阻害が、ＧＤＦ１５によって延長刺激されたＮＫ−９２細胞において、免疫エフェクターであるＮＫＧ２Ｄのレベルに影響を及ぼし得るかどうかを確認した。図２１Ａは、ＧＤＦ１５で一晩刺激することによって、ＮＫ−９２細胞において検出可能なＮＫＧ２Ｄのレベルが低下したことを示す。ＣＬＰＴＭ１に結合できる結合剤（抗体）で前処理してからＧＤＦ１５で刺激したＮＫ−９２細胞においては、ＮＫＧ２Ｄの減少が回復した（図２１Ｂ）。したがって、ＣＬＰＴＭ１抗体は、ＮＫ−９２細胞におけるＮＫＧ２Ｄレベルを上昇させることができる。発明者らは、このことによって、細胞毒性が上昇するということを提案する。
【０３０８】
（実施例１５−がんの兆候）
＜腫瘍微環境における免疫細胞中のＣＬＰＴＭ１−ＧＤＦ１５の検出＞
発明者らは、ＵＳバイオマックス社（US Biomax）から購入した、市販の組織マイクロアレイを用いて、様々なヒトのがんにおいて、２つの受容体の存在を確認した。
【０３０９】
一連のヒトのがんのＣＬＰＴＭ１−ＧＤＦ１５のＰＬＡ相互作用に対して陽性である浸潤性細胞の存在の例が、肺扁平上皮細胞癌からの転移を示す図２２に示されている。ＦＩＴＣでラベルされたＣＤ３による対比染色によって、発明者らは、二重陽性細胞を検出することができた。しかしながら、発明者らは、ＣＬＰＴＭ１−ＧＤＦ１５陰性のＣＤ３＋細胞も検出した。これは、恐らく、発明者らのＦＡＣＳデータにおいて観察されたように、ＣＬＰＴＭ１陰性の浸潤性細胞の集団を表している。
【０３１０】
さらに、発明者らは、ＣＬＰＴＭ１−ＧＤＦ１５複合体を示すＣＤ３−細胞も検出した。これは、ＣＤ１４＋細胞（単球など）などの他の免疫細胞を表していると考えられた。異なる浸潤性免疫細胞種を有する、腫瘍の転移などの組織の複雑さのために、ＣＤ１４などの他のマーカーを用いたさらなる研究が必要となる。
【０３１１】
ＧＤＦ１５に富む腫瘍の微小環境において、ＧＤＦ１５に結合したＣＬＰＴＭ１も検出可能にする、腫瘍浸潤性ＣＤ３＋細胞の存在が、ＧＤＦ１５のＣＬＰＴＭ１への接近を阻害する、潜在的なＣＬＰＴＭ１結合剤（抗体など）を示唆している。このような産生物が、ＧＤＦ１５が誘導する免疫抑制を低減させるのに役立つ場合がある。
【０３１２】
＜骨癌におけるＱＲＦＰＲ−ＧＤＦ１５の検出＞
ＱＲＦＰＲに関して、発明者らは、骨における前立腺癌微小転移巣の境界において、ＱＲＦＰＲ−ＧＤＦ１５を検出した（図２３、２４Ａ、および２４Ｂを参照）。原発性前立腺癌においては、前立腺癌の骨への転移において検出された高レベルのシグナルと比較して、低レベルのシグナルが検出された（図２４Ｃ参照）。
【０３１３】
前立腺からの骨への転移に対するバイオマーカーとしてＧＤＦ１５を用いるので、このことは特に興味深い。さらに、ＱＲＦＰＲは、骨芽細胞において発現されることが知られており、骨の代謝に関わっている。したがって、ＱＲＦＰＲ結合剤（抗体など）またはＧＤＦ１５のＱＲＦＰＲへの接近を阻害できるポリペプチドは、ＧＤＦ１５が誘導する、前立腺癌における骨芽細胞の代謝の異常調節を低減するのに役立つ場合がある。
【０３１４】
このような抗体は、特に、破骨細胞に作用するビスホスホネートなどの、現在の治療計画とは別に、骨代謝の異常調節の態様を治療するのに用いられる場合に、このような障害において特に臨床的価値を有するであろう。
【０３１５】
ユーイング肉腫（図２５）および骨肉腫（図２４Ｄ）などの原発性骨癌においても、ＱＲＦＰＲの発現が見られた。後者における発現は、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞におけるＱＲＦＰＲ染色の発明者らによる観察、およびＵ２ＯＳ細胞におけるＱＲＦＰＲのＧＤＦ１５による調節と一致する。したがって、ＱＲＦＰＲ結合剤またはＧＤＦ１５とＱＲＦＰＲとの相互作用を阻害するポリペプチドは、特に、破骨細胞に作用するビスホスホネートなどの、現在の治療計画とは別に、骨代謝の異常調節の態様を治療するのに用いられる場合に、このような障害において特に臨床的価値を有するであろう。
【０３１６】
最後に、ＱＲＦＰＲ−ＧＤＦ１５複合体は、骨髄腫において検出され（図２６）、このことは、このような治療薬の、考えられるさらなる兆候を表している。
【０３１７】
（実施例１６−ＱＲＦＰＲペプチドおよびＣＬＰＴＭ１ペプチドがＧＤＦ１５に及ぼすプルダウン作用）
２０μｇのＦｃ融合タンパク質のコンストラクトを、０．５μｇのＧＤＦ１５およびプロテインＧビーズと共に混合しながら、１％ＢＳＡを添加したＰＢＳＴ中、４℃で６時間インキュベートした。洗浄は６回行った。ＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、チューブを変更して、２２０ｍＭのＮａＣｌを添加したＰＢＳＴを用いて２回洗浄した。最終の洗浄はＰＢＳを用いて行った。洗浄と洗浄の間に、５００ｇで５分間、卓上遠心分離装置を用いて、ビーズを回収した。検出については、材料を４〜１２％のグラジエントゲルにロードして、１００ボルトで泳動し、ターボタンク（Turbo Tank）ブロットシステムを用いてＰＶＤＦ膜に転写し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて室温で１時間、ブロックし、ＲＤシステムモノクローナル抗ＧＤＦ１５抗体と共に一晩インキュベートした。マウスＨＲＰ二次抗体を１：２０００に希釈したものを検出に用いた。バンドサイズは、隣のレーンで泳動したシーブルー２（seeblue2）タンパク質ラダーマーカーと比較することによって推定した。
【０３１８】
マウス由来の配列を含むＦｃ融合タンパク質を、以下のように設計した。
【０３１９】
（ＧＧＧＧＳ）×３を柔軟なリンカーとして用いた（配列番号２４２）。
【０３２０】
ＡＰ５（ＱＲＦＰＲペプチド）
ＦｃマウスＩｇＧ１−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＲＬＥＩＫＹＤＦＬＹＥＫＥＨ（配列番号２４０）
ＡＰ１（コントロールタンパク質）
ＡＡＡＱＥＡＤＧＡＲＳＡＶＶＡＡＧＧＧＳＳＧＱＶＴＳＮＧＳＩＧＲＤＰＰＡＥＴＱＰＱＮＰＰＡＱＰＡＰＮＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＦｃマウスＩｇＧ１（配列番号３２３）
ＡＰ２（ＣＬＰＴＭ１ペプチド）
ＦｃマウスＩｇＧ１−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＹＩＳＥＨＥＨＦＴＤＦＮＡＴＳＡＬＦＷＥＱＨＤＬＶＹＧＤＷＴＳ（配列番号２４１）
ＡＰ０
ネガティブコントロール
受容体由来の断片を、ＧＤＦ１５との直接的な相互作用を示すアレイデータを含む以前の結果に基づいて選択した。アレイにおいては、相互作用は、ペプチドモノマーとリガンドとの間のものである。厳しい洗浄条件を用いるプルダウン実験を行い、ＧＤＦ１５を、図２７に示すように検出した。
【０３２１】
考察：十分に洗浄した後、発明者らは、ＱＲＦＰＲ由来のペプチドを含むＡＰ５コンストラクトおよびＣＬＰＴＭ１由来のペプチドを含むＡＰ２コンストラクトが、ＧＤＦ１５をプルダウンできることを見出した。
【０３２２】
結論：発明者らは、ＧＤＦ１５が、両方の受容体に対する親和性を有すること、および、増加したＧＤＦ１５が病理学的役割を有する障害において、両方のコンストラクトが、リガンドトラップとしての治療用途を想定することができることを示した。データはアレイの結果と一致し、ここで、例えば、ＡＰ１におけるポリペプチドはＧＤＦ１５と相互作用しなかったが、ＡＰ２配列では相互作用した。
【０３２３】
理論に拘束されることを望むものではないが、全長のＣＬＰＴＭ１受容体は、潜在的に、より高い親和性を提示し得る。
【０３２４】
（実施例１７−ＧＤＦ１５を阻害する抗体およびペプチド）
免疫細胞に及ぼすＧＤＦ１５の効果が立証され、ＣＬＰＴＭ１を標的とする抗体、およびＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインの一部を含むＦｃ融合コンストラクトによって、この効果を阻害することができることが見出された。
【０３２５】
ＣＤ１４＋細胞を単離し、ＧＤＦ１５の存在下または非存在下において、ＬＰＳによる刺激培養で培養した。ＬＰＳに応答したＴＮＦおよびＩＬ１２の分泌は、ＧＤＦ１５と共にインキュベートした細胞において減少したので、ＧＤＦ１５は免疫抑制効果を示した。図２８において両方のサイトカインの分泌が増加したことによって示されるように、ウサギポリクローナル抗体（バイオス・アンチボディ社が供給するｂｓ−８０１８Ｒ）によって、この免疫抑制効果が低減された。
【０３２６】
ＧＤＦ１５の免疫抑制効果の同様の反転は、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインに由来するポリペプチド（配列番号１７）によっても実証された。ポリペプチドは、Ｎ末端リンカー配列を含むＦｃ融合体として提供され、図２９においてＴＮＦおよびＩＬ１２の分泌が増加したことによって示されるように、そのサイトカインの両方に対して同様の効果を示した。リンカー配列を含むペプチドの配列を、配列番号２４１に示す。
【０３２７】
図３０に示すように、ＣＬＰＴＭ１ポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質の存在下において、ＬＰＳで刺激されたＣＤ１４＋細胞をインキュベートすることによって、炎症性タンパク質であるＩＦＮγが分泌されることも示された。
【０３２８】
＜材料および方法＞
＜末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離＞
バッフィコート細胞の懸濁液、またはヘパリンを添加した血液試料を、滅菌した室温のＰＢＳで希釈した。末梢血試料を１：１で希釈し、バッフィコートは、最終体積が１２０ｍＬとなるように希釈する（標準的なバッフィコートにおいては、これによって、１：１よりも希釈率がわずかに大きくなる）。希釈した細胞懸濁液を、フィコール・ペーク・プラス（Ficoll Paque PLUS）上に積層した。１回分のバッフィーに対して、４×１５ｍＬを分取して用いる（チューブ１本あたり、希釈した細胞懸濁液を３０ｍＬ）。細胞を、４００×ｇで３０分間、室温で遠心分離し、新しい５０ｍＬチューブに移した。細胞を一度洗浄し、２０ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。
【０３２９】
＜ＣＤ１４＋細胞画分の磁気による分類＞
単核細胞の懸濁液を、遠心分離によって沈殿させた。細胞を、１０8個／ｍＬの濃度でステムセル（Stemcell）緩衝液に再懸濁し、丸底の１４ｍＬチューブに移した。細胞１ｍＬあたり１００μＬのイージーセップ・ポジティブ・セレクション・カクテル（EasySep Positive Selection cocktail）を添加し、穏やかにピペッティングすることによって混合し、室温で１５分間インキュベートした。細胞１ｍＬあたり５０μＬのイージーセップ・マグネティック・ナノパーティクル（EasySep Magnetic Nanoparticles）を添加して混合し、室温で１０分間インキュベートした。ステムセル推奨培地を添加して、細胞懸濁液の全体積を５ｍＬとし、穏やかにピペッティングすることによって混合した。チューブ（キャップなし）を磁石内に置き、５分間放置した。５分後に、上清を捨てた。ＣＤ１４＋ラベルされた細胞は、チューブ内に残る。チューブを磁石から取り出し、５ｍＬのステムセル推奨培地をさらに添加して、穏やかにピペッティングすることによって混合した。チューブ（キャップなし）を磁石内に置き、５分間放置した。このステップを繰り返した後、細胞を、５ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。ＣＤ１４＋細胞懸濁液から５０μＬを取り、トリパンブルー溶液で希釈してファスト・リード（Fast Read）１０２計数スライドに載せ、計数を行い、全細胞数を決定した。
【０３３０】
＜培養の手順および刺激＞
０日目
完全ＲＰＭＩ培地中、０．８３３×１０6個／ｍＬの濃度となるようにＣＤ１４＋細胞懸濁液の体積を調整した。３００μＬの細胞懸濁液を４８穴プレートのウェルに加え（１ウェルあたり０．２５×１０6個）、３７℃のインキュベータ内で９０分間、接着させた。培地を穏やかにピペッティングした後、上清を除去することによって、非接着細胞を除去した。あらかじめ温めておいた３００μＬの完全ＲＰＭＩ培地で細胞を一度洗浄し、培地を吸引除去した。各ウェルに、あらかじめ温めておいた３００μＬの完全ＲＰＭＩ培地を加え、３７℃の細胞インキュベータ内で一晩（２０〜２４時間）、細胞をインキュベートした。
１日目
所望のＧＤＦ１５調節物質の１７Ｘの原液を、完全ＲＰＭＩで希釈した（１ウェルあたり２０μＬの物質をアッセイした）。２０μＬの調節物質または培地／担体（ネガティブコントロール）を各ウェルに加え、穏やかにピペッティングすることによって混合した。３７℃の細胞インキュベータ内で３０分間、細胞をインキュベートした。１００μｇ／ｍＬの原液を完全ＲＰＭＩで希釈して濃度を８．５μｇ／ｍＬ（培養における終濃度は０．５μｇ／ｍＬ）とすることによって、１７ＸのＧＤＦ１５溶液を調製した。２０μＬの希釈したＧＤＦ１５を各ウェルに加え、３７℃の細胞インキュベータ内で一晩（１８〜２０時間）、インキュベートした。
２日目
ＬＰＳ原液を完全ＲＰＭＩで希釈して濃度を１８ｎｇ／ｍＬ（培養における終濃度は１ｎｇ／ｍＬ）とすることによって、１８ＸのＬＰＳ溶液を調製した。２０μＬのＬＰＳまたは培地（ネガティブコントロール）を各ウェルに加え、穏やかにピペッティングすることによって混合した。３７℃の細胞インキュベータ内で４時間、細胞をインキュベートした。各ウェルから、２００μＬの上清をＶ底の９６穴プレートに移した。試料を遠心分離し、細胞または破片を除去した。上清をプラスチック製の９６穴ＰＣＲプレートに移した。すぐにＴＮＦ−αの解析を進めるか、またはウェルを接着性プラスチックカバーで覆い、さらなる解析を行うまで−８０℃で保存した。
【０３３１】
＜プロシーク（Proseek）アッセイ＞
細胞培養で分泌されたタンパク質を、多重化近接伸長アッセイである、オーリンク・プロテオミクス・ＡＢ社（Olink Proteomics AB）（ウプサラ、スウェーデン）製のプロシーク（Ａｓｓａｒｓｓｏｎ Ｅら ＰｌｏｓＯｎｅ ２０１４）を用いて定量化した。データは、正規化タンパク質発現（Normalized Protein Expression）（ＮＰＸ ｌｏｇ２）として表される。オンコロジーｖ２ ９２−ｐｌｅｘパネル（Oncology v2 92-plex panel）を実行した。重要な炎症誘発性マーカーであるＩＬ１２、ＴＮＦ、およびＩＦＮｇのデータを提示する。
【０３３２】
（実施例１８−ＣＬＰＴＭ１由来ペプチドに結合するＧＤＦ１５）
＜材料および方法＞
ＣＬＰＴＭ１由来のビオチン化合成ペプチドフラグメント（ＪＰＴペプチド、ドイツ）を、ＰＢＳ中１μＭで、４℃で一晩、ストレプトアビジン９６穴プレート（＃１５５００、ピアス社（Pierce））に固定化した。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（洗浄緩衝液）３００μＬを用いて４回洗浄した。ＰＢＳ、１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ブロッキング緩衝液）を用いて、室温で１．５時間、プレートをブロッキングし、洗浄緩衝液で４回洗浄した。ＧＤＦ１５リガンド（アブカム社）を、１００ｎｇ／ｍＬとなるようにブロッキング緩衝液に添加し、室温で２時間インキュベートした。その後、プレートを、２ＸのＮａＣｌを含む洗浄緩衝液３００μＬを用いて、８回洗浄した。ＧＤＦ１５抗体（ＲｎＤシステムヤギポリクローナル）を１ｕｇ／ｍＬとなるように加え、室温で１時間、ブロック緩衝液中でインキュベートし、３００μＬの洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。ＨＡＦ０１７抗ヤギ−ＨＲＰ抗体を加え、ブロッキング緩衝液中で１時間インキュベートし、洗浄した。ＴＭＢ基質を加え、１５分後にＨ2ＳＯ4で反応を止めた。ＯＤ４５０〜６２０を、ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
【０３３３】
配列番号２５０〜２７３に示す配列を有するポリペプチドについて、ＧＤＦ１５への結合を評価した（図３１において、左から右に示すポリペプチドに相当）。これらのタンパク質は、相当するＣＬＰＴＭ１由来の配列中に存在しない、Ｃ末端のグリシン残基を付加して合成された。各ポリペプチドについて測定されたシグナルを、図３１に示す。ＥＬＩＳＡの値において、約０．１ＯＤ以上のカットオフを、固定化したポリペプチドへのＧＤＦ１５の結合を示すものとして同定した（すなわち、配列番号２５８に示す配列を有するポリペプチドに結合するＧＤＦ１５の場合の、０．０９８ＯＤ値を含む）。以下のペプチドが、ＧＤＦ１５への結合を示した（残基の番号は、配列番号２に対してのものである）。
【０３３４】
ＧＳＩＹＩＨＶＹＦＴＫＳＧＦＨＰＤＰＲＱＧ（１６２〜１８１）（配列番号２５８）
ＫＡＬＹＲＲＬＡＴＶＨＭＳＲＭＩＮＫＹＫＧ（１８２〜２０１）（配列番号２５９）
ＩＴＩＮＩＶＤＤＨＴＰＷＶＫＧＳＶＰＰＰＧ（２４２〜２６０）（配列番号２６２）
ＬＤＱＹＶＫＦＤＡＶＳＧＤＹＹＰＩＩＹＦＧ（２６２〜２８０）（配列番号２６３）
ＹＰＩＮＥＳＬＡＳＬＰＬＲＶＳＦＣＰＬＳＧ（２９２〜３１１）（配列番号２６９）
ＧＤＹＹＰＩＩＹＦＮＤＹＷＮＬＱＫＤＹＹＧ（２７３〜２９２）（配列番号２７０）
【０３３５】
Ｃ末端のグリシン残基を欠く配列番号２５８、２５９、２６２、２６３、２６９、および２７０に相当するポリペプチドは、それぞれ２９７、２９８、３０１、３０２、３０８、および３０９である。このようなポリペプチドまたはその一部、すなわち、これらの配列を含む、またはその一部を含む、または密接に関わる配列を含む、ポリペプチドは、本発明に係る好ましいポリペプチドの一群を代表するものである。
【０３３６】
（実施例１９−ＣＬＰＴＭ１における「バイオス社」ｐＡｂのエピトープマッピング）
＜材料および方法＞
ペプチドアレイ
ＣＬＰＴＭ１のＮ末端アミノ酸１〜３５４アミノ酸の全範囲を、ＪＰＴペプチド・テクノロジー社（JPT peptide Technologies GmbH）製の、１１アミノ酸が重複する８６個の独自の１５ｍｅｒに分割した。バイオス（Bioss）８０１８Ｒポリクローナル抗体を、１μｇ／ｍＬで、４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳＴで十分に洗浄した後、ＰＢＳＴ中、１：６００００に希釈したアレクサ・フルオロ（Alexa flour）６４７（サーモ・サイエンティフィック社）ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル二次抗体（カタログ＃：Ａ−２１２４４）と共に、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴによる洗浄を繰り返した後、Ｇ２５０２マイクロアレイスキャナー（アジレント・テクノロジー社）を用いて検出を行った。用いたポリペプチドおよびその配列参照番号を図３２に示す。
【０３３７】
バイオスＢＳ８０１８Ｒのエピトープ１は、アレイにおいて、中央蛍光強度（ＭＦＩ）（シグナル強度）が最も高く、このことは、この部位に対する結合親和性が最も高いことを実証している。アレイにおける様々なペプチド（配列番号２７４〜２７９）への抗体の結合を、図３２Ａに示す。
【０３３８】
最小の共通点は、ＰＫＤ（配列番号３２２）である。
【０３３９】
最も可能性のあるフランキングアミノ酸も、領域ＧＧＡＰＲＶＡＳＲＮＬＦＰＫＤＴＬＭＮＬＨＶＹＩＳＥＨ（配列番号３１３）に存在する。
【０３４０】
エピトープ２は、わずかに低いＭＦＩを示したが、このことは、この抗体に対する親和性を有する第２の部位であることを示唆する。アレイにおける様々なペプチド（配列番号２８０〜２８６）への抗体の結合を、図３２Ｂに示す。発明者らは、この部位が、ＭＩＣ１の結合部位に部分的に重なることを見出した。したがって、この結合パターンを有するバイオス抗体は、エピトープ２に結合するＭＩＣ１と直接競合することによって、またはエピトープ１への結合による立体阻害によって、ＭＩＣのアンタゴニストになり得る。エピトープ２の領域は、
ＬＤＱＹＶＫＦＤＡＶＳＧＤＹＹＰＩＩＹＦＮＤＹＷＮＬＱＫＤＹＹＰＩＮＥ（配列番号３１４）内に存在する。
【０３４１】
したがって、２４個の異なるＣＬＰＴＭ１由来ペプチドのパネルから得られた、ＭＩＣ１に対する親和性が最も高いＣＬＰＴＭ１由来のポリペプチド（配列番号２７０）は、このバイオス抗体のエピトープに重なっていると思われる。
【０３４２】
（実施例２０−ＣＬＰＴＭ１とＱＲＦＰＲとの間で保存されていると考えられる配列）
実施例７で行ったアレイアッセイ（図１２参照）およびプルダウンアッセイにおいて、ＧＤＦ１５に対する親和性を有することが見出された、ＱＲＦＰＲの細胞外ドメインに由来する配列は、ＢＬＡＳＴによるアラインメントを行うと、ＣＬＰＴＭ１の細胞外ドメインの一部と、ある程度の配列同一性を有することが見出された。
【０３４３】
【表５】
2018536657.tif 000011
【０３４４】
特徴：
ＣＬＰＴＭ１ １２３ ＬＦＷＥＱＨＤＬＶＹＧＤＷＴＳ １３７（配列番号１２５）
Ｌ＋  ＋＋Ｈ          ＋ＷＴＳ
ＱＲＦＰＲ   １９３ ＬＹＥＫＥＨＩＣＣＬＥＥＷＴＳ ２０７（配列番号３２４）
【０３４５】
【表６】
2018536657.tif 000012
【０３４６】
特徴：
ＣＬＰＴＭ１ １０７ ＹＩＳＥＨＥＨＦＴＤＦＮＡＴＳＡＬＦＷＥＱ １２７（配列番号９６）
＋＋  Ｅ  ＥＨ              ＋＋      ＋＋
ＱＲＦＰＲ   １９２ ＦＬＹＥＫＥＨＩＣＣＬＥＥＷＴＳＰＶＨＱＫ ２１２（配列番号６０）
【０３４７】
配列番号３２４に示す配列、もしくはこの配列に対する配列同一性が少なくとも７５％である配列、もしくは少なくとも６つの連続したアミノ酸を含む、配列番号３２４の一部である配列、を有する、または含む、ポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドのさらなる例である。
【図１】
2018536657.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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