(57)【要約】  機械的伸展または一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーバニロイドメンバー４（Ｔｒｐｖ４）のアゴニストを使用して造血幹細胞（ＨＳＣ）、例えば、自家および／または同種異系ＨＳＣの集団を調製するための方法、ならびに移植におけるＨＳＣの使用の方法を提供する。特に、造血内皮（ＨＥ）細胞を含む集団細胞を準備するステップ、ＨＥ細胞をある量のＴｒｐｖ４のアゴニストと接触させるステップ；および／または内皮からＨＳＣへの移行を刺激するのに十分な時間および条件下で細胞を周期的２次元伸展に供するステップを含む方法。対象に本方法によって得られるＨＳＣの治療有効量を投与するステップを含む、悪性もしくは非悪性の血液、代謝または免疫障害を治療する方法をさらに開示する。
2018535683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を調製する方法であって、
造血内皮（ＨＥ）細胞を含む集団を準備するステップ、
（ｉ）前記ＨＥ細胞をある量の一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーバニロイドメンバー４（Ｔｒｐｖ４）のアゴニストと接触させるステップ；および／または
（ｉｉ）内皮からＨＳＣへの移行を刺激するのに十分な時間および条件下で前記細胞を周期的２次元伸展に供するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記ＨＥ細胞が、ｉＰＳＣから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔｒｐｖ４の前記アゴニストが、アラキドン酸、５，６−ＥＥＴ、８，９−ＥＥＴ、ビスアンドログラホリドＡ（ＢＡＡ）、ホルボールエステル（例えば、４α−ＰＤＤおよび４α−ＰＤＨ）、ＲＮ−１７４７、置換された１，４−ジアミノブタンまたは１，３−ジアミノプロパン類似体；およびＧＳＫ１０１１６７９０Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、血液、骨髄、代謝的または免疫性疾患である対象から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、血液悪性腫瘍ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
血液、骨髄、代謝、および免疫性疾患である対象を処置する方法であって、
造血内皮（ＨＥ）細胞を含む集団を準備するステップ、
（ｉ）前記ＨＥ細胞をある量の一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーバニロイドメンバー４（Ｔｒｐｖ４）のアゴニストと接触させるステップ；および／または
（ｉｉ）内皮からＨＳＣへの移行を刺激するのに十分な時間および条件下で前記細胞を周期的２次元伸展に供するステップ
を含む方法によって得られた造血幹細胞（ＨＳＣ）の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項７】
前記ＨＥ細胞が、ｉＰＳＣから得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｔｒｐｖ４の前記アゴニストが、アラキドン酸、５，６−ＥＥＴ、８，９−ＥＥＴ、ビスアンドログラホリドＡ（ＢＡＡ）、ホルボールエステル（例えば、４α−ＰＤＤおよび４α−ＰＤＨ）、ＲＮ−１７４７、置換された１，４−ジアミノブタンまたは１，３−ジアミノプロパン類似体；およびＧＳＫ１０１１６７９０Ａからなる群から選択される、請求項６に記載の方法
【請求項９】
前記対象が、ヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、多発性骨髄腫；非ホジキンリンパ腫；ホジキン病；急性骨髄性白血病；神経芽細胞腫；胚細胞腫；自己免疫疾患（全身エリテマトーデス［ＳＬＥ］または全身性硬化症）；またはアミロイド症である、請求項６に記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１５年１２月３日に出願の米国特許仮出願第６２／２６２，４６４号および２０１６年５月６日に出願の第６２／３３２，８５３号の利益を主張する。上記の全ての内容を、参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた補助金番号５Ｋ０１ＤＫ０８５２１７、２Ｒ０３ＤＫ１００６７２および５Ｒ０１ＨＬ１３１６４５の政府支援で行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
機械的伸展またはＴｒｐｖ４アゴニシスト（agonisists）を使用する造血幹細胞（ＨＳＣ）、例えば、自家および／または同種異系ＨＳＣの集団を調製するための方法、ならびに移植におけるＨＳＣの使用の方法について本明細書に記述する。
【背景技術】
【０００４】
ＨＳＣ移植（ＨＳＣＴ）は、血液、骨髄、代謝、および免疫疾患の患者を処置するために広く使用されている（１〜５）。臍帯およびハプロタイプ一致幹細胞移植における進歩にもかかわらず、ＨＳＣ移植の治療上の使用は、時宜を得て、特に少数民族および国家的な非血縁ドナー登録が不足する国において適切なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致ドナーを見つける困難さのためしばしば制限される（６〜９）。米国集団の１．６パーセント（９７０万人）を混合人種が占めるが、多民族の志願者は、登録した７００万人のうちわずか３パーセント（２万１千人）しか集まっておらず、骨髄一致がない患者が６千人残っている。たとえ適切な一致を見つけても、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、ドナー拒絶反応などの免疫性合併症および高い処置関連死亡率が、患者生存を損なう可能性がある。しかしながら、これらの合併症は、自家組織移植によって排除される。自家ＨＳＣは、特に血液学的悪性腫瘍に関して、同種異系ＨＳＣを完全に置き換えることはないが、広範囲の悪性および非悪性の血液、免疫、ならびに代謝性障害がある患者に対して利用可能なドナーの不足およびＧＶＨＤを含めたＨＳＣＴにおける主要なハードルを克服することになろう（３〜５、１５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
悪性および非悪性の血液、代謝ならびに免疫性障害を処置するためのヒト造血内皮細胞由来の臨床品質ＨＳＣを開発するための方法について本明細書に記述する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を調製するための方法について本明細書に記述する。本方法は、造血内皮（ＨＥ）細胞を含む集団を準備するステップ、（ｉ）ＨＥ細胞をある量の一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーバニロイドメンバー４（transient receptor potential cation channel-subfamily vanilloid member 4）（Ｔｒｐｖ４）のアゴニストと接触させるステップ；および／または（ｉｉ）内皮からＨＳＣへの移行を刺激するのに十分な時間および条件下で細胞を周期的２次元伸展に供するステップを含む。
【０００７】
一部の実施形態において、対象は血液悪性腫瘍ではない。
【０００８】
骨髄、代謝、および免疫性疾患である対象を処置するための方法が本明細書に提供され；本方法は、本明細書に記述される方法、例えば、造血内皮（ＨＥ）細胞を含む集団を準備するステップ、（ｉ）ＨＥ細胞をある量の一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーバニロイドメンバー４（Ｔｒｐｖ４）のアゴニストと接触させるステップ；および／または（ｉｉ）内皮からＨＳＣへの移行を刺激するのに十分な時間および条件下で細胞を周期的２次元伸展に供するステップを含む方法によって得られた造血幹細胞（ＨＳＣ）の治療有効量を対象に投与するステップを含む。
【０００９】
一部の実施形態において、本明細書に記述される方法において使用されるＨＥ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られ、例えば、表皮またはＣＤ３４＋細胞が、確立された方法を使用して人工多能性幹細胞（好ましくはヒトｉＰＳＣ）に最初に変換される。次いでそのようなヒトｉＰＳＣは、当業者に公知でありおよび／または本明細書に記述される方法を使用してヒトＨＥ細胞に分化される。例えば、ＥＢへのヒトｉＰＳＣの分化を、薬物、成長因子、サイトカインカクテルの存在下で起こさせて、造血内皮運命を誘導することができ、続いて７〜９日目の間で細胞を選別し、確立されたカクテルとさらにインキュベートして、ＨＥ細胞を富化する。
【００１０】
一部の実施形態において、Ｔｒｐｖ４のアゴニストは、アラキドン酸、５，６−ＥＥＴ、８，９−ＥＥＴ、ビスアンドログラホリドＡ（ＢＡＡ）、ホルボールエステル（例えば、４α−ＰＤＤおよび４α−ＰＤＨ）、ＲＮ−１７４７、置換された１，４−ジアミノブタンまたは１，３−ジアミノプロパン類似体；およびＧＳＫ１０１１６７９０Ａからなる群から選択される。
【００１１】
一部の実施形態において、ＨＥ細胞またはｉＰＳＣは、血液、骨髄、代謝、または免疫性疾患である対象から得られる。
【００１２】
一部の実施形態において、Ｔｒｐｖ４のアゴニストは、アラキドン酸、５，６−ＥＥＴ、８，９−ＥＥＴ、ビスアンドログラホリドＡ（ＢＡＡ）、ホルボールエステル（例えば、４α−ＰＤＤおよび４α−ＰＤＨ）、ＲＮ−１７４７、置換された１，４−ジアミノブタンまたは１，３−ジアミノプロパン類似体；およびＧＳＫ１０１１６７９０Ａからなる群から選択される。
【００１３】
一部の実施形態において、対象は哺乳動物、例えば、ヒトである。
【００１４】
一部の実施形態において、対象は多発性骨髄腫；非ホジキンリンパ腫；ホジキン病；急性骨髄性白血病；神経芽細胞腫；胚細胞腫；自己免疫疾患（全身エリテマトーデス［ＳＬＥ］または全身性硬化症）；またはアミロイド症である。
【００１５】
別段の規定がない限り、本明細書において使用される技術および科学用語の全ては、この発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明に使用するための方法および材料は、本明細書に記述されるが；当分野で公知の他の適切な方法および材料を使用することもできる。材料、方法および例は、単なる例示であり、制限することを目的としない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース入力および他の参照文献は、その全部を参照により組み込む。一致しない場合、本明細書が、定義を含めて、優先されることになる。
【００１６】
本発明の他の特徴および優位性は、以下の詳細な説明および図、ならびに請求項から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−１】造血幹細胞が、ずり応力経路の阻害および初期の循環停止にもかかわらず発生することを示す図である。（Ａ〜Ｂ）３０〜４２ｈｐｆの間の対照およびｃｄｈ５サイレンシング胚におけるｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ+内皮細胞から発生するｃｄ４１：ｅＧＦＰ+ＨＳＣの低速度共焦点画像化は、ｃｄｈ５の喪失、したがって循環低下がｃｄ４１：ｅＧＦＰ+ＨＳＣの内皮発生に影響を及ぼさないことを示唆する（例に、矢印で記す）。
【図１−２】造血幹細胞が、ずり応力経路の阻害および初期の循環停止にもかかわらず発生することを示す図である。（Ｃ）ｚｆ−ｒｕｎｘ１およびｚｆ−ｃ−Ｍｙｂ発現レベルのｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｃｄｈ５−モルファント胚におけるｃｄｈ５の喪失およびＮＯＳ経路の阻害にもかかわらず、ＨＳＣ代替マーカーの発現レベルが正常であることを例証する。（Ｄ〜Ｅ）野生型（対照）ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍａｌｂｅｃ：：ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙの共焦点画像化は、動脈および静脈が、ｃｄｈ５の非存在下で形成されることを例証する。
【図１−３】造血幹細胞が、ずり応力経路の阻害および初期の循環停止にもかかわらず発生することを示す図である。（Ｆ〜Ｇ）２１〜４８ｈｐｆの間のｌｃｒ：ｅＧＦＰ+赤血球およびｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ+脈管構造形成の低速度共焦点画像化。２１ｈｐｆにおいて、一次造血由来赤血球は、ＡＧＭ領域に存在する。２３ｈｐｆにおいて鼓動が開始するとすぐに、対照胚において赤血球は循環を開始し、２５〜４８ｈｐｆの間で脈管構造形成を例証する内皮マーカーの発現が見える。それに対し、ｃｄｈ５−モルファントにおいてｌｃｒ：ｅＧＦＰ+赤血球は、鼓動および脈管形成の開始にもかかわらずＡＧＭ領域に蓄積され、これは初期の循環停止を例証する。
【図２−１】ｃｄｈ５−モルファント胚が、正常な心拍数、心拍出量低下および異常な心臓形態を有することを示す図である。（Ａ）対照およびｃｄｈ５−モルファント胚（０．２〜０．４ｍＭ）におけるゼブラフィッシュ心臓の心電図記録は、ｃｄｈ５−モルファントが、正常な心拍数を有することを例証する。（Ｂ）対照およびｃｄｈ５−モルファント胚（０．２〜０．４ｍＭ）における心拍出量は、ｃｄｈ５−モルファントが、心拍出量がないことを例証する。（Ｃ）ｃｄｈ５−モルファントの微小血管造影法は、心膜浮腫で見られるように、ｃｄｈ５−モルファント心臓に注射された蛍光色素が、心臓の心房に捕捉されていることを例証する。*Ｐ＜０．０５
【図２−２】ｃｄｈ５−モルファント胚が、正常な心拍数、心拍出量低下および異常な心臓形態を有することを示す図である。（Ｄ）心筋細胞ミオシン重鎖（ＭＦ２０）および内皮細胞（Ｆｌｋ１）に対する抗体を使用する、対照ならびにｃｄｈ５−モルファント胚から単離した心臓の免疫組織化学は、心房、心室および流出路が変形していることを示唆する。*Ｐ＜０．０５
【図３−１】血管における脈動が、鼓動によることを示す図である。（Ａ）野生型およびｃｄｈ５−モルファント胚における脈拍数を測定する３次元ドップラー分析は、ｃｄｈ５−モルファントが血流の非存在下で正常な脈拍数を有することを例証する。
【図３−２】血管における脈動が、鼓動によることを示す図である。（Ｂ〜Ｃ）対照胚におけるｌｃｒ：ｅＧＦＰ：：ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙの低速度共焦点画像化、それに続く血管を脈動させる運動頻度相関値の機械学習（人工知能）に基づく測定は、血管における脈動が、鼓動および血流と同期していることを例証する。
【図４】図４は、Ｅ１１．５  ＡＧＭに由来し、選別された内皮、造血内皮、脈管、間葉性間質細胞に対して標準化された特注のバイオリアクタを使用する２次元円周方向伸展状態を要約する略図である。底が柔軟な培養プレートのナイロン膜に取り付けられたコンピュータ制御の真空ポンプシステム（ＦｌｅｘＣｅｌｌ張力システム）を使用し、その後ＣＦＵ、遺伝子発現、ＦＡＣＳ、長期生着（連続移植を含む）、および限界希釈アッセイを使用して発生するＨＳＣの機能的潜在性を分析する。
【図５】２次元円周方向伸展が、ＨＳＣ形成を刺激することを示す図である。（Ａ）Ｅ１１．５  ＡＧＭ細胞の２次元周期的緊張（６％、２４時間）および一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーバニロイドメンバー４（Ｔｒｐｖ４）アゴニスト（ＧＳＫ１０１１６７９０Ａ、本明細書でＧＳＫ１０１と記載する）処置後の複数性ＧＥＭＭのコロニー（ＨＳＰＣのマーカー）を測定するためのコロニー形成単位アッセイ。（Ｂ）８週間後の静止Ｅ１１．５  ＡＧＭ、２次元周期的緊張処置したＥ１１．５  ＡＧＭ、およびＴｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ  １０１）処置したＡＧＭを移植されたレシピエントにおけるＣＤ４５．２+末梢血キメラ現象のパーセンテージ。各レシピエントは、２つのｅ．ｅ．ＡＧＭで移植された。（Ｃ）８週間後における、静止Ｅ１１．５  ＡＧＭ、２次元周期的緊張処置したＥ１１．５  ＡＧＭ、およびＴｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ  １０１）処置したＥ１１．５  ＡＧＭを移植したマウス由来末梢血の定量的系統分析。ＧＥＭＭ、％ＣＤ４５．２末梢血キメラ現象、および％複数系統再構成の増加は、２次元周期的緊張およびＴｒｐｖ４活性化が、このカスタマイズされたオーガンオンチップモデルにおいてＨＳＣ形成を刺激することを例証した。ｎ＝６；*Ｐ＜０．０５対静止対照。
【図６】図６はＥ１１．５  ＡＧＭに由来し、選別された細胞に対する２次元円周方向伸展適用後の潜在的帰結を解釈するための決定樹である。
【図７】図７は伸展活性化型イオンチャネルの阻害が、ＨＳＣ形成を減少させることを示す図である。ＧｄＣｌ3、ルテニウムレッド、ＧＳＫ２０５（Ｔｒｐｖ４アンタゴニスト）、およびＧＳＫ１０１（Ｔｒｐｖ４アゴニスト）処置したゼブラフィッシュ胚におけるｚｆ−ｒｕｎｘ１およびｚｆ−ｃ−Ｍｙｂ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。*Ｐ＜０．０５対対照；各群においてｎ＝１２０。
【図８】Ｔｒｐｖ４の活性化が、正常な胚におけるＨＳＰＣ形成を増強し、無拍動心臓（ｓｉｈ）胚におけるＨＳＣ形成を救済することを示す図である。ＨＳＰＣマーカー（ｃ−ｍｙｂ）発現に対する全組織ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、Ｔｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１）と対照胚のインキュベーションが、ＨＳＰＣ形成を増強し（図８Ａ対図８Ｂ）、一方でＴｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１）と無拍動心臓（ｓｉｈ）−ＭＯ胚とのインキュベーションが、ＨＳＰＣ形成を救済する（図８Ａ対図８Ｃ対図８Ｄ）ことを例証する。各群においてｎ＝１２０；ｃ−ｍｙｂ+ＨＳＰＣクラスタの例が、矢印で表示される。
【図９】Ｔｒｐｖ４の活性化が、ＨＳＰＣ形成を刺激することを示す図である。（Ａ）伸展感受性イオンチャネルモジュレータを持つ外植片培養におけるマウスＥ１１．５  ＡＧＭ由来造血内皮細胞、その後の造血機能の分析の概要。（Ｂ）外植片培養システムを使用して、全部のＥ１１．５  ＡＧＭを伸展活性化型イオンチャネル（ＳＡＣ）の非特異的阻害剤（ＧｄＣｌ３）、Ｔｒｐｖの汎阻害剤（ルテニウムレッド；Ｒ．Ｒ．）、Ｔｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１および４α−ＰＤＤ）、Ｔｒｐｖ４アンタゴニスト（ＧＳＫ２０５）、ならびにＴｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１）およびＣＲＥＢリン酸化阻害剤（ＫＴ５７２０）と２４時間インキュベートし、続いてコロニー形成アッセイを行った。Ｔｒｐｖ４の活性化は、複数性プロジェニター（ＧＥＭＭ）形成を刺激するが、ＳＡＩおよびＴｒｐｖ４の阻害は、ＧＥＭＭ形成を減弱することを見出した。ＨＳＰＣ形成におけるＣＲＥＢリン酸化の阻害（ＫＴ５７２０）は、Ｔｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１）の刺激的影響を減弱することを確立した。ｎ＝８；*Ｐ＜０．０５対静止対照；**Ｐ＜０．０５対ＧＳＫ１０１処置。
【図１０】伸展活性化型イオンチャネルモジュレータを含むマウス胚のｅｘ  ｖｉｖｏ培養、その後のその造血機能の分析の略図である。カスタマイズされたマウス胚インキュベーションユニットを使用してＥ９．５〜Ｅ１０．５（Ａ）、Ｅ１０．５〜Ｅ１１．５（Ｂ）、およびＥ１０．５〜Ｅ１２．５（Ｃ）由来マウス胚を培養するための条件を最適化した。各発達段階で体節の数を計数することによって胚の成長を検証し、造血機能を分析する（Ｄ）。
【図１１】図１１はＴｒｐｖ４活性化後のＨＳＣ形成に対して提案された機序を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
胎児発達中に、造血内皮細胞と称される、大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）にある内皮細胞のサブセットは、その運命を変化させて、胎生期肝臓および骨髄に最終的に定着するＨＳＣになる（１０、１１）。しかしながら、造血内皮細胞を刺激する因子の識別は確認しにくいままであり、機能的ＨＳＣの潜在的供給源としての造血内皮細胞の実用性を限定している。内皮内壁に対する血流に媒介されるずり応力は、ＨＳＣの内皮発生を刺激する唯一公知の生体力学的力である（１２、１３）。Ｃｄｈ５−ヌルゼブラフィッシュおよびマウスモデルを使用して、機能的ＨＳＣが、初期の循環停止にもかかわらず発生することが最近確立された（１４）。これらのｃｄｈ５サイレンシングモデルを要点として使用して、機能的ＨＳＣ発生を誘発するずり応力に非依存的な生体力学的力を研究し、それによって脈拍圧に媒介される円周方向伸展がＨＳＣ発生を支配する追加の機序を調査する。
【００１９】
研究室内で造血内皮細胞からＨＳＣを生成する試みは、一部には、造血内皮細胞からＨＳＣ発生を刺激する因子についての知見の不足により、ほとんど失敗した。
【００２０】
本明細書に記載の通り、微小血管造影法、心エコー検査法、３次元デジタルドップラー超音波法および低速度共焦点画像化により、脈打つ心臓の脈動による円周脈管伸展が、機能的ＨＳＣが造血内皮細胞から発生することを誘発し、そのＨＳＣが、最終的に生着し、二次（definitive）系統に分化し得ることが確立された。加えて、伸展感受性一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーバニロイドメンバー４（Ｔｒｐｖ４）チャネルの活性化は、鼓動および血流がないサイレンシング胚において無拍動心臓（ｔｎｎｔ２；ｓｉｈ）のＨＳＣ形成を救済した。
【００２１】
本発見は、機能的ＨＳＣ形成を刺激するための新たなｅｘ  ｖｉｖｏ方法（２次元円周方向伸展を利用する）および新規の薬理学的標的（複数可）（Ｔｒｐｖ４および／または前初期応答遺伝子のモジュレータ［ＩＥＧ、転写因子クラス；ＣＲＥＢ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｅｌｋ１、ＮＦＡＴ］）を確立する。本方法は、血液、骨髄不全、代謝学および免疫障害の処置における機能的ＨＳＣの骨髄非依存的供給源としての造血内皮細胞の樹立を可能にする。
【００２２】
本明細書に記述されるゼブラフィッシュの偏りのない遺伝的スクリーンは、造血細胞の起源および発達を調査し、ゼブラフィッシュ、マウスおよびヒトにおいてＨＳＣへの内皮の移行を刺激し得る新たな細胞外因性および内因性因子の同定に至った。血流およびずり応力に媒介されるＮＯＳの活性化は、胎児発達中の造血内皮からのＨＳＣ発生の引き金と関係があるとされた（１２、１３）。このモデルの下では、血流がないことが、造血細胞形成を損なうことになると予測できた。しかしながらゼブラフィッシュおよびマウスモデルを使用して、血流がない場合に機能的ＨＳＣが発生することが確立された（１４）。内皮からＨＳＣへの移行を刺激する新規の生体力学的力を分析するために、本実験は、脈拍圧に媒介される円周方向伸展が、Ｔｒｐｖ４シグナル伝達の活性化を介して機能的ＨＳＣ形成を刺激することを例示し、ＨＳＣの内皮発生を刺激する新規の生体力学的力として円周方向伸展、および新規の分子的機序としてＴｒｐｖ４を確立する。したがって、本方法は、ヒト血液、免疫、代謝、および骨髄不全疾患の処置における機能的ＨＳＣの新しく、安全な供給源として造血内皮細胞を使用する基礎を提供する。
【００２３】
本開示は、胎児発達中のＨＳＣへの造血内皮の移行がいかなるものかについて記述し、少なくとも部分的にこの過程を再現するための方法を提供する。本明細書に例証されるように、ＨＳＣは、血液循環の低下および／またはＮＯＳ阻害にもかかわらず、発生、移動、自己新生、生着、および分化する。したがって、ＨＳＣの内皮発生ならびに発達を調節する血流およびずり応力非依存的な細胞外因性機序が存在するにちがいない。微小血管造影法、共焦点画像化、３次元ドップラー超音波法、遺伝子発現分析および心エコー検査法データは、脈拍圧に媒介される円周方向伸展が、ＨＳＣへの内皮の移行を刺激することを例証した。オーガンオンチップを使用して、マウスＥ１１．５  ＡＧＭならびに／またはＡＧＭ由来の内皮、造血内皮、造血、脈管、および間葉性間質細胞に対するｉｎ  ｓｉｔｕ円周方向伸展状態を再現した。円周方向伸展は、内皮および造血組織において発現されるＴｒｐｖ４イオンチャネルを活性化する。加えて、Ｔｒｐｖ４活性化は、ＨＳＣ形成を増加させ、無拍動心臓−サイレンシング胚における造血を救済する。ＨＳＣ発生を刺激する新たな生体力学的、細胞外因性因子としての円周方向伸展の同定は、機能的ＨＳＣの潜在的供給源として造血内皮をモデル化することになる。
【００２４】
造血内皮細胞
本方法は、造血内皮細胞を使用してＨＳＣを生成するステップを含む。造血内皮細胞（例えば、Ｆｌｋ１＋ＣＤ４５＋細胞、Ｆｌｋ１＋ＣＤ４１＋細胞またはＣＤ３１＋ＣＤ４３＋細胞）は、同種異系ドナーから、またはＨＳＣで処置される対象（すなわち、自家造血内皮細胞、例えば、レシピエント由来細胞を使用して作製されるｉＰＳＣから生成される）から得ることを含め、任意の様式で得ることができる。造血内皮細胞を単離するための方法は、当分野で公知であり、ヒト多能性幹細胞からの生成を含む。例えば、本明細書の実施例３ならびにDitadi et al., Nature Cell Biol. 17(5) 580-591 (2015)；Nakajima-Takagi et al., Blood. 2013;121(3):447-458；Zambidis et al., Blood. 2008 Nov 1; 112(9):3601-14 およびPark et al., Cytometry A. 2013 Jan; 83(1): 114-126 (human embryoid body (hEB)-based hemato-endothelial differentiation methods for efficient hiPSC differentiation)；Choi et al., Cell Rep. 2012 Sep 27; 2(3): 553-567. (hPSC differentiation in coculture with OP9)；Sandler et al., 2014 July 17; 511(17509):312-318 (endothelial cells to hematopoietic cells)；Sluvkin, Blood 2013 122:4035-4046も参照のこと。
【００２５】
造血内皮（ＨＥ）細胞からＨＳＣを生成する
本方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＥ細胞からＨＳＣを生成することができ、Ｔｒｐｖ４アゴニストの存在下で細胞をインキュベートするステップおよび／または細胞を伸展、例えば周期的伸展に供するステップを含むことができる。
【００２６】
Ｔｒｐｖ４アゴニスト
Ｔｒｐｖ４は、一過性受容体電位（ＴＲＰ）イオンチャネルのＴＲＰＶサブファミリーのメンバーである。チャネルは、物理的刺激（例えば細胞膨張または伸展および無害な加温、例えば約２７〜３５℃）によって、ならびにアラキドン酸および５，６−ＥＥＴおよび８，９−ＥＥＴを含めた化学リガンド（Watanabe et al., Nature 424:434-438 (2003)、(Vincent and Duncton, Current topics in medicinal chemistry 11(17):2216-26 (2011)）；ビスアンドログラホリドＡ（ＢＡＡ、Smith et al., J Biol Chem 281:29897-29904 (2006)）；４α−ＰＤＤおよび４α−ＰＤＨなどのホルボールエステル（Watanabe et al., J Biol Chem 277:13569-13577 (2002)；Vincent and Duncton, Current topics in medicinal chemistry 11(17):2216-26 (2011)）；ＲＮ−１７４７；置換された１，４−ジアミノブタンまたは１，３−ジアミノプロパン類似体（Vincent and Duncton, Current topics in medicinal chemistry 11(17):2216-26 (2011)）；およびＧＳＫ１０１１６７９０Ａ（Thorneloe et al., J Pharmacol Exp Ther 326:432-442 (2008)）によって活性化することができる。例えば、Vriens et al., Mol Pharmacol 75 (6)1262-1279 (2009)；Vriens et al., Curr Neuropharmacol. 6(1): 79-96 (2008)；Vincent and Duncton, Current topics in medicinal chemistry 11(17):2216-26 (2011)；国際公開第２００７０９８３９３号；国際公開第２００７０３０７６１号；国際公開第２００６１０５４７５号；国際公開第２００７０７０８６５号；国際公開第２００７０８２２６２号；国際公開第２００７０８２２６２号；およびJeong et al., In 238th ACS National Meeting, Washington, DC, United States, August 16-20, 2009; Washington, DC, United States, 2009; MEDI-392に開示される化合物を参照のこと。
【００２７】
伸展
別法としてまたは加えて、機械的手段を使用して、細胞に伸展力を加えることができる。例えば、底が柔軟な培養プレートのナイロン膜に取り付けられたコンピュータ制御の真空ポンプシステム（例えばＦｌｅｘＣｅｌｌ［商標］張力システム）を使用して、例えば、本明細書に記載の通り、規定および制御された周期的緊張状態下で、ＨＥ由来細胞に２次元円周方向伸展をｅｘ  ｖｉｖｏで加えることができる。
【００２８】
使用の方法
本明細書に記述される方法を使用して、移植プロトコールに使用するためのＨＳＣの集団を生成し、それにより例えば、血液（悪性および非悪性）、骨髄、代謝、および免疫性疾患を処置することができる。一部の実施形態において、ＨＳＣは、自家細胞に由来し、例えば、レシピエント対象由来の細胞を使用して作製されるｉＰＳＣから生成される。例えば、自己由来細胞が使用される一部の実施形態において、レシピエント対象は、多発性骨髄腫；非ホジキンリンパ腫；ホジキン病；急性骨髄性白血病；神経芽細胞腫；胚細胞腫；自己免疫疾患（全身エリテマトーデス［ＳＬＥ］、全身性硬化症）；アミロイド症から選択される状態；または自家組織のＨＳＣ移植を使用して処置可能な他の状態である。自家由来細胞（例えば、ＨＳＣが、レシピエント対象の細胞から生成される）が使用される一部の実施形態において、レシピエント対象は、血液悪性腫瘍ではない。一部の実施形態において、レシピエント対象は、急性骨髄性白血病；急性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性リンパ性白血病；骨髄増殖性障害；骨髄異形成症候群；多発性骨髄腫；非ホジキンリンパ腫；ホジキン病；再生不良性貧血；赤芽球癆；発作性夜間ヘモグロビン尿症；ファンコニ貧血；サラセミアメジャー；鎌状赤血球性貧血；重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）；ウィスコット−アルドリッチ症候群；血球貪食性リンパ組織球増多症；先天性代謝異常；表皮水泡症；重度先天性好中球減少症；シュワックマン−ダイアモンド症候群；ダイアモンド−ブラックファン貧血；または白血球接着不全症であり；これらの実施形態において、好ましくは同種異系由来細胞（例えば、ＨＳＣが、レシピエント対象以外の対象、例えば、血液型およびヒト白血球抗原［ＨＬＡ］タイピングに基づいてレシピエント対象と一致する対象の細胞から生成される）が使用される。
【００２９】
本方法は、対象に本明細書に記述される方法を使用して生成されるＨＳＣを、例えば、静脈注入または骨髄内移植により投与するステップを含むことができる。本方法は、骨髄破壊的、骨髄非破壊的、または免疫毒素に基づく（例えば抗ｃ−Ｋｉｔ、等）前処置措置の後に実施することができる。
[実施例]
【００３０】
本発明については、以下の例においてさらに記述され、その例は請求項に記述される本発明の範囲を限定しない。
[実施例１]
【００３１】
ＨＳＣの内皮発生に対する円周方向伸展の効果の細胞生理学の分析
導入
胚発達中に、血流は、大動脈内膜の内面壁に対するずり応力を生成し、ＨＳＣへの内皮の移行を刺激する（１２）。ずり応力は、内皮ＮＯＳ経路をさらに活性化し、その活性化は、ＨＳＣの内皮発生を誘発する（１３）。機能的ＨＳＣが、活動的な血液循環の非存在下で複数系統成人血液を発生、発達、生着、および再構成することが最近例証された（１４）。したがって、この実施例では、ＨＳＣの内皮発生を刺激する新しい細胞外因性機序を調査した。３次元ドップラー超音波法、微小血管造影法、心エコー検査法および共焦点画像化を使用して、脈拍圧が血管において円周方向伸展を生成することを例証した（図１〜図３）。ＡＧＭオンチップを開発して、ＦｌｅｘＣｅｌｌウェルの柔軟なナイロン膜に重層されたＥ１１．５  ＡＧＭ造血内皮細胞の単一細胞懸濁液に周期的緊張を加えることによって円周方向伸展状態をｅｘ  ｖｉｖｏで再現した（図４）。Ｅ１１．５  ＡＧＭ細胞に対する２次元円周方向伸展が、ＨＳＣ形成を刺激することを見出した（図５）。
【００３２】
研究設計
マウスにおいて、ＨＳＣは、Ｅ１０．５〜Ｅ１２．５のＡＧＭ造血内皮細胞から発生を開始する。これらのＨＳＣは、Ｅ１２．５〜Ｅ１５．５で胎生期肝臓に定着し、骨髄に最終的に生着し、複数系統血液を再構成する（１０、２１〜２６）。時期を合わせた妊娠マウスからＥ１０．５または１１．５胚を採取し、ＡＧＭを解剖し、単一細胞懸濁液を用意して、内皮、造血内皮、造血、脈管、および／または間葉性間質細胞を選別した。
【００３３】
ＡＧＭ由来細胞を使用してｉｎ  ｓｉｔｕ円周方向伸展状態を再現するために、ＦｌｅｘＣｅｌｌ  ＦＸ−５０００張力システムに基づくオーガンインディッシュ手法（organ-in-a-dish）（ａ．ｋ．ａ．オーガンオンチップまたはバイオリアクタ）を使用した。コンピュータ調節されている真空圧に基づくバイオリアクタは、底が柔軟な培養プレートのナイロン膜上で成長している細胞に規定および制御された周期的緊張状態を加えることによって、ＡＧＭ由来細胞に対して２次元円周方向伸展をｅｘ  ｖｉｖｏで生成する（図４）。
【００３４】
最初にフィブロネクチン／マトリゲルを使用して６ウェルＦｌｅｘＣｅｌｌプレートの各ウェルをコーティングし、各ウェルのナイロン膜に定着させた。次いで、フィブロネクチン／マトリゲルのコーティングが、ＡＧＭ由来細胞（選別されているまたは選別されていない）がウェルの底部に接着することを可能にする各ＦｌｅｘＣｅｌｌウェルにＡＧＭ（内皮、造血内皮、造血、脈管平滑筋［ＶＳＭＣ］および間葉性間質細胞で構成される）由来細胞の２つの同等の胚（ｅ．ｅ．）の単一細胞懸濁液を播種した。Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔおよび成長因子を含有する外植片培養培地で各ウェルを満たした（２７、２８）。これらの６ウェルプレートをＦｌｅｘＣｅｌｌ機械に入れ、各ウェルの底部に掛けられたカスタマイズされたピンを使用して周期的緊張（４〜１２％）を６〜４８時間加えた。同様に静止対照状態を模するために、いくつかのウェルにカスタマイズしたゴムガスケットを挿入した。次に、外的周期的緊張を受けるいくつかのウェルに伸展活性化型イオンチャネルシグナル伝達をモジュレートする薬物を添加した。円周方向伸展の外的刺激の６〜４８時間後に、ＦｌｅｘＣｅｌｌプレートからＡＧＭ由来細胞を採取し、造血細胞を作製するそれらの能力を分析した：（Ｉ）ＡＧＭに由来し、選別された細胞を播種した７日後に、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ培地を使用してＣＦＵアッセイを実施して、複数性潜在性顆粒白血球（multi-potential granulocyte）、赤芽球、マクロファージ、巨核球前駆細胞（ＧＥＭＭ）、顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−Ｇ）および赤芽球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）コロニーを計数した。（ＩＩ）Ｒｕｎｘ１、ｃ−Ｍｙｂ、Ｌｍｏ２、Ｇａｔａ２、ＣＤ１４４およびＧａｔａ１の発現レベルを分析した。（ＩＩＩ）ＡＧＭ由来細胞を蛍光標識されコンジュゲートされた抗体で染色して、Ｆｌｋ１、ＣＤ１４４、ＣＤ４１、ｃ−ＫｉｔおよびＣＤ４５．２の発現レベルも測定した。（ＩＶ）亜致死に照射を受けたＣＤ４５．１（ＳＪＬ；レシピエント）マウスに２つのｅ．ｅ．ＡＧＭ（ドナー；ＣＤ４５．２）由来細胞を注射した。ドナー細胞の長期生着および複数系統再構成潜在性を１６週間分析し、その後連続移植してＨＳＣと造血内皮細胞の間で分化させた。（Ｖ）限界希釈アッセイも実施して、２次元円周方向伸展の後にＡＧＭ由来細胞当たりに生成されるＨＳＣの数を分析した。
【００３５】
結果
ゼブラフィッシュの偏りのない化学変異誘発スクリーンにより、ｍａｌｂｅｃ、血管内皮カドヘリン（ｖｅ−ｃｄｈ、ｃｄｈ５）に対する変異体を得た。Ｃｄｈ５は、内皮透過性および内膜の完全性を保つのに役立つ細胞接着分子である（１６〜１８）。ｃｄｈ５の喪失により、心拍出量がなくなり、活動的な血液循環が低下した。ｍａｌｂｅｃ、ｃｄｈ５−モルファント胚、Ｃｄｈ５-/-Ｇｆｐ+：Ｃｄｈ５+/+Ｇｆｐ-キメラおよびＣｄｈ５fl/fl：Ｓｃｌ−Ｃｒｅ−ＥＲＴマウス胚は、初期の循環停止にもかかわらず正常な一次および二次造血があった（１４）。
【００３６】
ゼブラフィッシュにおいて、心臓は、およそ２３ｈｐｆに脈打ち始め、血液循環は、およそ２４〜２６ｈｐｆに開始し、二次ＨＳＣは、２６〜４８ｈｐｆの間にＡＧＭ領域中の造血内皮細胞から発生する（１１）。血流は、大動脈内皮の内面壁に対するずり応力を生成し、ＮＯＳ経路を活性化することによって内皮からＨＳＣへの移行を刺激する（１２、１３）。３０〜４８ｈｐｆの間で対照とｃｄｈ５サイレンシングｃｄ４１：ｅＧＦＰ：：ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ胚の両方で低速度共焦点画像化を実施した場合、初期の循環停止にもかかわらずｃｄｈ５サイレンシングｃｄ４１：ｅＧＦＰlow  ＨＳＣが、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ+内皮細胞から発生することを見出した（図１Ａ〜Ｂ）。加えて、１９〜４８ｈｐｆの間にＮＯＳの薬理学的阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥの存在下でｃｄｈ５サイレンシング胚をインキュベートした（１２）。ｃｄｈ５サイレンシング胚においてＮＯＳ阻害は、ＨＳＣ形成を無効にしないことを見出した（図１Ｃ）。したがって、循環低下およびＮＯＳ阻害にもかかわらず、ＨＳＣは造血内皮細胞から発生することになった。これらの特筆すべきデータにより、ＨＳＣへの内皮の移行に関与するずり応力非依存的な生体力学的および分子的機序を調査することになった。
【００３７】
循環が、ｃｄｈ５サイレンシング胚において低下しているかどうかを立証するために、ｃｄｈ５サイレンシング胚において脈管構造および血液循環を分析した。対照およびｃｄｈ５サイレンシングｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ胚において血管の共焦点画像化を最初に実施した。動脈および静脈の両方が、ｃｄｈ５サイレンシング胚において完全であることを見出した（図１Ｄ〜Ｅ）。次に、対照およびｃｄｈ５サイレンシングｌｃｒ：ｅＧＦＰ：：ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ胚の低速度共焦点画像化を使用して、心臓が脈打ち始める前後に血管内の赤血球細胞の循環を分析した。心臓が脈打ち始めた後でも、ｌｃｒ：ｅＧＦＰ+赤血球が、ｃｄｈ５サイレンシング胚の血管内に蓄積されたことを見出した（図１Ｆ〜Ｇ）。これらのデータは、ｃｄｈ５−モルファントが、血管の形成にもかかわらず活動的な循環がなかったことを例証する。
【００３８】
ｃｄｈ５サイレンシングゼブラフィッシュ胚における２室心臓の形態および機能の分析を開始するために、ｃｄｈ５−モルファント心臓の微小血管造影法、免疫組織化学、心エコー検査法および電気生理学判定を実施した。電気生理学および心エコー検査法を使用して、ｃｄｈ５−モルファントにおける心拍数は、対照と同程度であった（図２Ａ）が、ｃｄｈ５−モルファントにおいて一回拍出量は、ヌルに近いことを例証した。したがって、心拍出量（＝一回拍出量×心拍数）が、ｃｄｈ５−モルファントにおいて低下していることを同様に見出した（図２Ｂ）。ｃｄｈ５−モルファントの心臓に蛍光ビーズを注射し、その通行をたどった。対照胚とは異なり、蛍光ビーズは心臓内に捕捉されたので、ｃｄｈ５−モルファント胚において、それらが主要な大動脈循環に入らなかったことが判明した（図２Ｃ〜Ｄ）。心臓の構造的完全性を調べるために、対照およびｃｄｈ５サイレンシングｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ：：ｃｍｌｃ２：ｅＧＦＰ胚から心臓を単離し、内膜（ＧＦＰ）および心筋細胞（ＭＦ２０）に対する免疫組織化学を実施した。ｃｄｈ５−モルファントにおいて心房、房室（ＡＶ）弁、心室および流出路が形成され、収縮するが、伸長し、変形していることが判明した（図２Ｅ）。加えて、ｃｄｈ５−モルファント心臓腔において有意な心膜浮腫を観察したが、それは心臓からの血液の逆流による可能性がある（図２Ｃ）。心膜スペースにおける液体の蓄積は、心室充満の減少および以降の血行力学的欠陥をもたらす（１９、２０）。心臓タンポナーデが、心膜スペースにおける液体の蓄積の因子であるか調べるために、心臓腔に穴をあけ（心嚢穿刺のように）、心膜液を吸引して、心臓における流体圧力の集積を減少させた。しかしながら、ｃｄｈ５−モルファント心臓の心拍出量不全を救済することはできなかった（ビデオデータ不掲載）。これらのデータは、ｃｄｈ５−モルファントにおいて鼓動は正常であるが、心臓の構造的欠陥のためその心拍出量は低下し、心膜腔に血液の蓄積をもたらすことを例証する。
【００３９】
心臓が鼓動しており、血管が形成されたにもかかわらず、心拍出量はほぼなく、血液細胞は、血管内を活動的に循環していなかった。したがって、血管内でＨＳＣ発生を刺激するずり応力非依存的な生体力学的手がかりに重点を置いた。驚くべきことに、血流の欠如にもかかわらず、血管が脈動することが判明した。これらの特筆すべきデータにより、血管における脈動が、リンパ管で見られるのと同様に血管の固有の特性によるのか、または鼓動によって生成される脈拍圧によるのかを調査することになった。したがって、対照胚およびｃｄｈ５−モルファントにおいて３次元デジタルドップラー法を使用して、脈動頻度を測定した。正常な脈拍頻度であるが、対照と比較してｃｄｈ５−モルファントにおいて振幅が低いことが判明した（図３Ａ）。脈拍数の振幅は、鼓動と血流に支配されるので、ｃｄｈ５−モルファントにおけるより低い振幅は、血流がないためと予想された。しかしながら、対照とｃｄｈ５−モルファントの両方が、血管における円周方向伸展を発達させるのに最適な脈拍頻度を有すると考えられる。したがって、ｃｄｈ５−モルファント胚は、本発明者らが、ＨＳＣの内皮発生において脈拍圧に媒介される円周方向伸展の役割を調査するための要点になる。
【００４０】
循環およびずり応力に非依存的な生体力学的機序が、野生型胚においても同様に活動的であることを立証するために、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ：：ｌｃｒ：ｅＧＦＰ胚において脈動血管の低速度共焦点画像化を実施して脈動の起源を調査し、血管における脈動が鼓動と同期しているかどうか調べた（図３Ｂ）。機械学習アルゴリズム（人工知能）をその後使用して、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙチャネルから個々の運動頻度相関値を測定し、それは脈動血管および血液循環中の赤血球を表すｌｃｒ：ｅＧＦＰチャネルを図示する（図３Ｃ）。ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙチャネルの運動頻度相関値を重ね合わせたとき、それらの頻度が重複することが判明した。これらのデータは、脈拍が、血管の固有の特性であるという可能性を排除する。したがって、鼓動に媒介される脈拍圧が、血管を振動させ、円周方向伸展をその後生み出す。活動的な血液循環の非存在下でＨＳＣが発生したので、ＨＳＣ形成における造血内皮細胞に対する円周方向伸展の直接効果を研究した。
【００４１】
要約すると、これらの分析は、鼓動および脈拍に媒介される円周方向伸展が、機能的ＨＳＣの内皮発生を刺激することを例示した。
【００４２】
オーガンオンチップに基づくカスタマイズされたバイオリアクタ（図４）を使用して、２つのｅ．ｅ．Ｅ１１．５  ＡＧＭ細胞の単一細胞懸濁液に２次元円周方向伸展（６％周期的緊張、２４時間）を加えた。並行して、２つのｅ．ｅ．Ｅ１１．５  ＡＧＭ静止細胞をＴｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１［２９］）とインキュベートした。２次元円周方向伸展とＴｒｐｖ４アゴニスト処置の両方が、ＧＥＭＭ形成を増強するだけでなく、生着および複数系統再構成のパーセンテージも増加させることが判明した。これらのデータは、Ｅ１１．５  ＡＧＭ由来細胞に対する２次元円周方向伸展およびＴｒｐｖ４チャネルの活性化が、機能的ＨＳＣ形成を増強し得ることを例証する。
【００４３】
マウスＡＧＭは、異質な組織である。円周方向伸展の役割を細胞レベルでさらに吟味するために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用してＥ１１．５  ＡＧＭから内皮細胞、造血内皮細胞、血管平滑筋細胞、間葉性間質細胞および造血細胞を選別する。ＦｌｅｘＣｅｌｌウェル上に各細胞型の単一細胞懸濁液を重層し、２次元円周方向伸展を加え、ＣＦＵ形成能力、遺伝子発現変化（ＦＡＣＳおよびｑＲＴ−ＰＣＲ）、限界希釈ならびに長期生着および複数系統再構成能力を分析し、続いて連続移植アッセイを行った（図４、図６）。
【００４４】
円周方向伸展に媒介される内皮からＨＳＣへの移行が、内皮または造血内皮細胞とＡＧＭのＶＳＭＣまたは間葉性細胞との間のクロストークによるのかどうかも分析する。したがって、ＶＳＭＣまたは間葉性細胞と前もって混合したＡＧＭ由来内皮細胞もしくは造血内皮細胞に２次元周期的緊張を加え、その後ＨＳＣ機能的アッセイを行う（図４、図６）。
【００４５】
造血内皮細胞生着からの潜在的ノイズを除外し、造血内皮細胞とＨＳＣとを区別するために、確立された方法を使用して限界希釈および自己新生（連続長期移植）アッセイを実施する（図４、図６）（１４、３０〜３２）。
【００４６】
内皮細胞の造血の指定の過程およびＨＳＣの内皮発生は動的であり、優遇されている（１３、１４、２４〜２６）。本明細書に例証されるように、ＨＳＣは、ずり応力非依存的機序により、活動的な血液循環の非存在下で発生、発達、生着、分化する。ＦｌｅｘＣｅｌｌ張力システムにおいて成長中の細胞に対して制御された２次元円周方向伸展状態を再現するための実験条件をすでに成功裏に最適化した（図４、図５）。鼓動は、血管に脈動を生じさせ、したがって円周方向伸展を生成する（図１〜図３）ので、円周方向伸展のｅｘ  ｖｉｖｏ再構成は、ＨＳＣへの内皮の移行を刺激する独立の、追加的なまたは相乗的な細胞外因性生体力学的力の形をとる可能性がある。
【００４７】
Ｅ１１．５  ＡＧＭ細胞の単一細胞懸濁液に対する２次元円周方向伸展が、ＨＳＣ形成を刺激した（図５）ので、選別された造血内皮細胞に加えられる２次元円周方向伸展は、ＨＳＣ形成を同様に増加させると予想される。
【００４８】
造血細胞へのヒト内皮細胞のリプログラミングは、脈管誘導を必要とする（３３）。加えて、脈管ニッチは、造血複数性プロジェニター形成を促進する（３４）。したがって、選別されたＶＳＭＣと前もって混合した内皮または造血細胞に対する２次元円周方向伸展は、内皮または造血内皮細胞単独に対する２次元円周方向伸展より実質的に高い造血の影響があるであろうと予想される。
【００４９】
最初にヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を胚体（ＥＢ）に分化させ、次いでそれらを薬物および成長因子で処置して、中胚葉、その後造血および内皮指定を誘導する（実施例３を参照のこと）。ＥＢ分化の７〜８日目の間に、ＣＤ３４＋ＣＤ４３−細胞を選別し、それらを薬物および成長因子で７日間処置して、造血内皮細胞を富化する。次いで、柔軟なナイロン膜上にヒト造血内皮細胞（３５）を播種し、ＣＦＵアッセイ、遺伝子発現分析、およびＮＯＤ−ＳＣＩＤ免疫不全マウスへの移植を使用して、２次元ｅｘ  ｖｉｖｏ円周方向伸展が、それらの造血細胞形成潜在性を刺激するかどうか試験する。
[実施例２]
【００５０】
ＨＳＣ形成中のＴｒｐｖ４シグナル伝達の根底にある分子的機序を調べる
導入
円周方向伸展の影響は、Ｋ１選択的ファミリー、Ｔｒｐファミリー、ＥＮａＣ／ＤＥＧファミリーおよび／またはＰｉｅｚｏファミリーのメンバー（複数可）によって伝達される（３６〜３９）。遺伝子発現分析は、Ｔｒｐｖ４が、内皮および造血細胞の両方で発現されることを例証する。したがって、内皮からＨＳＣへの移行におけるＴｒｐｖ４の役割を調査した。伸展活性化型イオンチャネル（４０、４１）およびＴｒｐｖファミリーチャネル（４１、４２）の非特異的阻害、ならびにＴｒｐｖ４の標的した阻害（４２）が、ゼブラフィッシュおよびマウスにおけるマーカーの発現ならびにＨＳＰＣ数を減少させることを例証した（図７、図９）。ｔｒｐｖ４チャネルの活性化（２９）が、ゼブラフィッシュおよびマウスにおいてＨＳＣ形成を増加させ（図７、図８Ａ〜Ｂ、図９）、一方で鼓動および血流の非存在下で、ｓｉｈ（ｔｎｎｔ２）サイレンシング胚の造血不全を救済する（図８Ａ、Ｃ〜Ｄ）ことを例証することによって、ｔｒｐｖ４シグナル伝達とＨＳＣ生成の間の機能的結びつきも確立した。
【００５１】
Ｔｒｐｖ４活性化後に生成される追加のＨＳＣの機能的潜在性を、ゼブラフィッシュの胚から胚への移植およびＥ１０．５マウス胚のｅｘ  ｖｉｖｏ培養を実施し、続いて長期生着および複数系統再構成アッセイを行うことによって分析する。
【００５２】
伸展活性化型Ｔｒｐｖ４イオンチャネルの刺激は、血液および骨髄の悪性ならびに非悪性障害の処置における臨床品質のＨＳＣの供給源としての患者由来内皮細胞の活用に向けた大きな飛躍になると期待される。
【００５３】
結果
伸展活性化型イオンチャネルの活性化が、ＨＳＣ発生に影響するかどうか例証するために、ゼブラフィッシュ胚を伸展活性化型イオンチャネル（ＳＡＣ）の非特異的阻害剤（塩化ガドリニウム、ＧｄＣｌ3；［４０］）と１９〜４２ｈｐｆの間インキュベートした。ゼブラフィッシュＷＩＳＨおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＨＳＰＣ代替マーカーであるｒｕｎｘ１およびｃ−ｍｙｂの発現が、ＧｄＣｌ3処置ゼブラフィッシュ胚において減少したことが判明した（図７）。これらのデータは、伸展活性化型イオンチャネルによって誘発される細胞シグナル伝達が、ＨＳＣの内皮発生を調節することを例証する。
【００５４】
円周方向伸展の影響は、Ｋ１選択的スーパーファミリー、Ｔｒｐスーパーファミリー、ＥＮａＣ／ＤＥＧスーパーファミリーおよび／またはＰｉｅｚｏファミリーのメンバー（複数可）によって伝達される（３６〜３９）。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子発現分析は、Ｔｒｐｖ４が、内皮および造血細胞の両方で発現されることを例証した。しかしながら、ＨＳＣ発生におけるＴｒｐｖ４の直接的な役割は、確立されていない。したがってゼブラフィッシュ胚を、Ｔｒｐｖチャネルの汎阻害剤（ルテニウムレッド；［４１］）、Ｔｒｐｖ４アンタゴニスト（ＧＳＫ  ２０５；［４２］）およびＴｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１；［２９］）と１９〜４２ｈｐｆの間処置し、その後ＨＳＰＣ代替マーカー（ｃ−ｍｙｂおよびｒｕｎｘ１）に対してｑＲＴ−ＰＣＲおよびＷＩＳＨした。Ｔｒｐｖファミリーチャネルの汎阻害（ルテニウムレッド［４１］を使用する）またはＴｒｐｖ４の特異的阻害（Ｔｒｐｖ４アンタゴニスト；ＧＳＫ２０５；［４２］を使用する）に応じて、ｒｕｎｘ１およびｃ−ｍｙｂ発現の減少を見出した（図７）。ｔｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１；［２９］）と対照胚のインキュベーションが、ＨＳＰＣマーカー、ｃ−ｍｙｂ（図７、図８Ａ〜Ｂ）およびｒｕｎｘ１の発現を増加させることをさらに例証した。これらのデータは、Ｔｒｐｖ４イオンチャネルの活性化をＨＳＣ発生におけるキーシグナル伝達因子と意味づける。同時に、これらの発見は、円周方向伸展がＴｒｐｖ４シグナル伝達を刺激し、したがってＨＳＣの内皮発生を誘発することを例証する。
【００５５】
無拍動心臓心トロポニン（ｓｉｈ、ｔｎｎｔ２）変異体胚は、鼓動および血液循環を欠く（４３）。ｓｉｈ−胚が、ｃ−ｍｙｂ（図８Ａ対図８Ｃ）およびｒｕｎｘ１などの造血幹前駆細胞（hematopoietic stem progenitor cell）（ＨＳＰＣ）マーカーの発現を欠くことを例証した（データ不掲載）。血管に対する鼓動に媒介される脈拍圧がＨＳＣ発生を刺激するので、鼓動および血液循環の非存在下でＴｒｐｖ４イオンチャネルの活性化が、ＨＳＣ形成を誘発するかどうか研究した。したがって、ｓｉｈ−サイレンシング胚（ｃａｓｐｅｒまたはｃｄ４１：ｅＧＦＰ：：ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ）を、ｔｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１）と１９〜４２ｈｐｆの間インキュベートした。ＷＩＳＨ（図８Ａ、図８Ｃ対図８Ｄ）およびｑＲＴ−ＰＣＲ技術を使用するｒｕｎｘ１およびｃ−ｍｙｂのｍＲＮＡ発現レベルに基づいて、ｔｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１）が、ｓｉｈ−胚における造血幹プロジェニター細胞（ＨＳＰＣ）形成を救済することを例証した。ｔｒｐｖ４活性化が、ｔｒｐｖ４−アゴニスト処置したｓｉｈサイレンシングｃｄ４１−ｅＧＦＰ：ｆｌｋ１−ｍＣｈｅｒｒｙ胚においてｃｄ４１：ｅＧＦＰ+ＨＳＣの形成を救済することを確立した。
【００５６】
マウスにおいて、最初の鼓動はＥ８．２５で起こり、ＨＳＣは、Ｅ１０．５〜Ｅ１２．５の間にＡＧＭ由来造血内皮から発生を開始する（１０、１１）。円周方向伸展活性化型イオンチャネルが、哺乳動物のＨＳＣ発生にも関係するかどうか調査するために、Ｅ１１．５  ＡＧＭを、外植片培養培地中で非特異的ＳＡＣチャネル阻害剤（ＧｄＣｌ3）および汎Ｔｒｐｖチャネル阻害剤（ルテニウムレッド）とインキュベートし、その造血ＣＦＵ能力ならびに内皮および造血遺伝子（ＣＤ４１、ＣＤ４５．２、ｃ−Ｋｉｔ、Ｆｌｋ１、ＣＤ１４４）の発現を分析した。ＧｄＣｌ3およびルテニウムレッドが、造血遺伝子の発現（データ不掲載）およびＧＥＭＭコロニー形成能力を減少させることが判明した（図９Ｂ）。これらのデータは、ＨＳＣ発生および発達における円周方向伸展−シグナル伝達経路が、哺乳動物系において保存されていることを例証する。
【００５７】
造血内皮細胞由来ＨＳＣ形成に対するＴｒｐｖ４の影響をさらに調査するために、Ｅ１１．５  ＡＧＭ（２８）を、Ｔｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１、４α−ＰＤＤ［４４］）およびＴｒｐｖ４アンタゴニスト（ＧＳＫ  ２０５）と２４〜４８時間インキュベートした（図９）。Ｔｒｐｖ４の薬理学的活性化が、複数性ＧＥＭＭ形成を刺激したのに対してＴｒｐｖ４の阻害が、複数性ＧＥＭＭ形成を減弱したことが判明した（図９Ｂ）。これらのデータは、Ｔｒｐｖ４チャネルのモジュレーションが、内皮細胞からＨＳＣへの移行を調節することを例証する。
【００５８】
要約すると、データは、Ｔｒｐｖｒ４の活性化、円周方向伸展シグナル伝達分子が、ＨＳＣへの内皮の移行を刺激することを強調する。したがって、これらの発見は、Ｔｒｐｖ４の薬理学的活性化を、ＨＳＣ形成を刺激する新しい方法として確立する。
[実施例２A]
【００５９】
Ｔｒｐｖ４活性化後に生成されるＨＳＣの機能的実用性を調査する
正当性、戦略および分析計画：円周方向伸展は、内皮細胞においてｔｒｐｖ４を活性化する（４５）。ここでは、円周方向伸展に媒介されるｔｒｐｖ４活性化が、内皮からＨＳＣへの移行を刺激することを例証する。Ｔｒｐｖ４活性化の後に産生されるＨＳＣが、機能的であることを示すために、ゼブラフィッシュ胚をＴｒｐｖ４アゴニストとインキュベートし、続いて胚から胚へＨＳＣ移植し、Ｅ１０．５マウス胚をＴｒｐｖ４アゴニストとｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベートし、その後ＡＧＭ移植する。
【００６０】
ゼブラフィッシュ機能的アッセイおよび胚から胚へのＨＳＣ移植：
ゼブラフィッシュトランスジェニック系、ＨＳＣの場合はｃｄ４１：ｅＧＦＰおよび内皮細胞の場合はｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ、発現分析を利用する（１４）。発達の１９〜４２ｈｐｆにゼブラフィッシュ胚にｔｒｐｖ４−モルホリノを注射する、および／またはｃｄ４１：ｅＧＦＰ：：ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙトランスジェニック胚をｔｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１、４αＰＤＤ）とインキュベートする。４２ｈｐｆにＦＡＣＳ分析を実施して、ｃｄ４１：ｅＧＦＰ+ＨＳＣ、ｃｄ４１：ｅＧＦＰ+ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ+造血内皮細胞、およびｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ+内皮細胞の相対的レベルを測定することにする。加えて、低融点アガロース中に薬物処置またはモルホリノを注射したｃｄ４１：ｅＧＦＰ：：ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ胚を封入し、低速度共焦点画像化を実施して、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ+内皮細胞から発生するｃｄ４１：ｅＧＦＰ+ＨＳＣを定量化する。これらの分析は、ｔｒｐｖ４イオンチャネル経路の活性化またはサイレンシングが、造血内皮細胞のＨＳＣ生成能力にどのように影響し得るかを調べる。これらは、確立された技術である（図１Ａ〜Ｂ）。
【００６１】
ゼブラフィッシュＨＳＣ移植：照射を受けたゼブラフィッシュ胚へのｃｄ４１：ｅＧＦＰlow  ＨＳＣの移植は、レシピエント腎髄質における血液前駆細胞（blood progenitors）にこれまで成功裏に寄与しており、このことは、ｃｄ４１：ｅＧＦＰlow  ＨＳＣの機能的潜在性を例証した（４６、４７）。ｔｒｐｖ４活性化後に生成されるＨＳＣの機能的潜在性を調べるために、ｃｄ４１：ｅＧＦＰ+ＨＳＣをｔｒｐｖ４−アゴニスト処置したｃｄ４１：ｅＧＦＰ+胚から選別し、注射のマーカーとして０．５％ローダミンデキストランを含む４００個の細胞／マイクロリットルの懸濁液を調製する。顕微鏡下注射の注射針に細胞懸濁液を入れ、それを較正して、各胚が１、２または４滴で注射され得ることを確実にする。これは、胚当たり０．４、０．８または１．６個の細胞の推定細胞用量を与える。４８ｈｐｆ野生型胚レシピエントの静脈洞（すなわち、キュビエ管）にその滴を注射し、アガロース注射ランプに置いた。用量当たりおよそ３０個の胚を注射し、過去の経験に基づいて群当たり１２〜２６個の胚が成体期（３〜５カ月）まで生存すると予想する。ＦＡＣＳ機械を使用して生着したｃｄ４１+細胞のパーセンテージとしてレシピエント胚および／または全腎髄質中のｃｄ４１：ｅＧＦＰ+血小板を分析する。バックグラウンドより高いＧＦＰ+陽性細胞（＞ＷＫＭの０．００１％）を含む任意のレシピエントを、生着したとして記録する。この方法は、これまでにも記述されている（１４、４８）。
【００６２】
マウスｅｘ  ｖｉｖｏ胚インキュベーション系：
ＨＳＣの内皮発生を刺激する因子を調査するために、ｅｘ  ｖｉｖｏマウス胚培養系を開発して、最新技術のｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーションチャンバー内の培地および温度条件、気体混合物ならびに湿度レベルを最適化することによってＥ９．５からＥ１２．５にマウス胚を成長させる（図１０Ａ〜Ｃ）。したがって、Ｅ９．５〜Ｅ１２．５の間にＴｒｐｖ４を標的する薬理学的薬剤でマウス胚を処置して、ＨＳＣの内皮発生に対するそれらの影響を試験する。これらの分析は、Ｔｒｐｖ４イオンチャネルモジュレータの機能的ＨＳＣ生成効率を検証する（図１０Ｄ）。
【００６３】
Ｔｒｐｖ４が、ｅｘ  ｖｉｖｏ条件において哺乳動物のＨＳＣ形成にどのように影響するかについて調査するために、Ｅ１０．５またはＥ１１．５マウス胚を、Ｔｒｐｖ４モジュレータと２４〜４８時間インキュベートする（図１０Ａ〜Ｃ）。その後、Ｅ１１．５またはＥ１２．５マウス胚からＡＧＭ組織を解剖してＣＦＵアッセイを実施し、ＦＡＣＳおよびｑＲＴ−ＰＣＲ分析を使用してＣＤ４１、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ１４４およびＣＤ４５．２発現を測定する（図１０Ｄ）。また、ＡＧＭ由来二次ＨＳＣを、亜致死の照射を受けたおよび／または免疫不全マウスに移植して、レシピエントにおける血液系統分布を最長１６週間評価することによってその長期生着および複数系統再構成潜在性を検証する。Ｔｒｐｖ４の役割を細胞レベルで吟味するために、公知のＣＦＣアッセイ、ＦＡＣＳおよびｑＲＴ−ＰＣＲ分析、ならびに長期生着分析を使用して、移植前にＥ１１．５  ＡＧＭ由来内皮、造血内皮、および造血細胞を選別する。（１４、３０〜３２、４９、５０）
[実施例２B]
【００６４】
ＨＳＣ発達中にＴｒｐｖ４活性化の根底にある分子的機序
正当性および戦略：Ｔｒｐｖ４の活性化は、細胞内カルシウムレベルを刺激する（５１〜５６）。細胞内カルシウムレベル（［Ｃａ+2］ｉ）の一過性の増加は、ＣＲＥＢ（３８、５９〜６１）、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（６２〜６４）、ＳＲＦ／Ｅｌｋ１（５７、６５）、ＮＦＡＴ（６６、６７）、ＴＣＦ（６８、６９）、ＴＧＦ−β１／ＭＲＴＦ−Ａ（６３）など転写因子の前初期遺伝子クラス（５７、５８）をさらに刺激する。Ｔｒｐｖ４活性化が、内皮からＨＳＣへの形成を刺激するので（図５、図７〜図９）、Ｔｒｐｖ４シグナル伝達が、ＨＳＣへの内皮細胞運命指定において、細胞内イオンレベルおよび転写変化をどのようにモジュレートするかについて調査する。
【００６５】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とＴｒｐｖ４アゴニスト（ＧＳＫ１０１）とのインキュベーションは、［Ｃａ+2］ｉレベルの増加をもたらした。内皮からＨＳＣへの移行の間にＴｒｐｖ４とＣＲＥＢが、クロストークするかどうか分析するために、Ｅ１１．５  ＡＧＭ外植片培養を使用したところ（図９Ａ）、ＣＲＥＢリン酸化の薬理学的阻害（ＫＴ５７２０を使用する；［７０］）、複数性ＧＥＭＭ形成においてＴｒｐｖ４アゴニストに媒介される増加を減弱することが判明した（図９Ｂ）。
【００６６】
Ｔｒｐｖ４活性化、［Ｃａ+2］Ｉ、ＣＲＥＢリン酸化、および／またはＨＳＣ形成における追加の転写因子の機能的相関を確立するために、ゼブラフィッシュおよび／またはマウス胚を、Ｔｒｐｖ４アゴニストおよび特異的な転写因子阻害剤とインキュベートする（図９Ｂ、図１０）。ゼブラフィッシュ胚においてｑＲＴ−ＰＣＲ、全組織ｉｎ  ｓｉｔｕおよび低速度共焦点画像化、ならびに薬物処置したＥ１１．５マウス胚に由来するＡＧＭ細胞に対してＣＦＵ、ＦＡＣＳおよび長期生着アッセイを実施する。
【００６７】
これらの結果は、機能的ＨＳＣの内皮発生におけるＴｒｐｖ４の直接的な役割に関する第１の証拠を提供する。Ｔｒｐｖ４アゴニストによるＥ１１．５  ＡＧＭ処置が、機能的ＨＳＣ形成を刺激することを例証したので、Ｔｒｐｖ４活性化後に生成されるｃｄ４１：ｅＧＦＰ+ＨＳＣが、生着し、したがって機能的になるであろうと予想することは合理的である。同様に、Ｔｒｐｖ４アゴニストとＥ１０．５マウス胚とのｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーション、それに続く移植も、高レベルの機能的ＨＳＣ形成を例証することができる。ｔｒｐｖ４アゴニストとゼブラフィッシュ胚とのインキュベーションが、ＨＳＰＣ遺伝子発現を増加させたので、マウス胚および／または全ＡＧＭのインキュベーションは、機能的ＨＳＣ形成の増加をもたらし、ＧＥＭＭ形成の増加、造血遺伝子発現ならびにより長期の生着および複数系統再構成をもたらすことになろう。Ｔｒｐｖ４活性化は、ＨＵＶＥＣにおいて［Ｃａ+2］ｉレベルを増強させるので、Ｔｒｐｖ４−アゴニスト処置した造血内皮細胞において［Ｃａ+2］ｉレベルの増加を見ることになる。ＩＥＧは、細胞内カルシウムレベル（５７、５８）の一過性増加によって活性化される。したがって、Ｔｒｐｖ４活性化型造血内皮細胞におけるＣＲＥＢのリン酸化の増加（図９Ｂ）および／または他のＩＥＧのより高い発現／活性を見ることを予想する。したがって、ゼブラフィッシュおよびマウスに基づく優遇された手法は、機能的ＨＳＣ発生および発達において保存されている、Ｔｒｐｖ４の役割を確立できる。遺伝的および薬理学的ツールを、外植片ならびにｅｘ  ｖｉｖｏマウス胚培養方法と組み合わせて、内皮細胞をヒト血液疾患の処置における機能的ＨＳＣの供給源として確立する際のＴｒｐｖ４および／またはＩＥＧモジュレータの有望な実用性を例証する。
[実施例３]
【００６８】
ヒトｉＰＳＣからＨＥ細胞を生成するための典型的なプロトコール
以下のプロトコールは、刊行物Ditadi et al., Nat Cell Biol. 2015;17(5):580-91に基づく。
凝集培地Ｄ０〜Ｄ２
３７５ｍｌ  ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０６３９−０１１）
１２５ｍｌＨａｍ’ｓＦ−１２
５ｍｌ  Ｐ／Ｓ（１０ｎｇ／ｍｌ）
５ｍｌ  Ｎ２（ＬｉｆｅＴｅｃｈ  １７５０２−０４８）
１０ｍｌ  Ｂ２７（ＬｉｆｅＴｅｃｈ  １７５０４−０４４）
３．３ｍｌ  ＢＳＡ（０．０５％；７．５％貯蔵物、＋４℃で保管）
（５ｍｌ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎ［２ｍＭ］；通常、ＩＭＤＭにおいて補充される）
８８０ｕＬアスコルビン酸（１ｍＭ；Ｈ2Ｏ中に１００ｍｇ／ｍＬ［０．５７Ｍ］貯蔵物、−２０℃で保管）
７５０ｕＬホロトランスフェリン（１５０ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｔ０６６５−１Ｇ；ＩＭＤＭ中に１００ｍｇ／ｍｌ貯蔵物、−２０℃で保管）
１ｍＬ  ＭＴＧ  ５００×（０．４ｍＭ；５００×貯蔵物を調製：３５ｕＬ／２ｍｌ  ＰＢＳ、滅菌ろ過、受け入れ時の＋４℃で保管）
Ｄ３からのｈＥＢ培地
５００ｍｌ  補助剤を含むＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０６３９−０１１）
５ｍｌ  Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）
８８０ｕＬアスコルビン酸（１ｍＭ；Ｈ2Ｏ中に１００ｍｇ／ｍＬ［０．５７Ｍ］貯蔵物、−２０℃で保管）
７５０ｕＬホロトランスフェリン（１５０ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｔ０６６５−１Ｇ；ＩＭＤＭ中に１００ｍｇ／ｍｌ貯蔵物、−２０℃で保管）
１ｍＬ  ＭＴＧ  ５００×（０．４ｍＭ；５００×貯蔵物を調製：３５ｕＬ／２ｍｌ  ＰＢＳ、滅菌ろ過、受け入れ時の＋４℃で保管）
５ｍｌ  Ｐ／Ｓ（１０ｎｇ／ｍｌ）
【００６９】
Ｄ０．  ＥＢの生成
１）一般に、ｈｉＰＳＣを分割して１週間後、細胞はＥＢを作製する準備が整っている。コロニーは、厚く、高密度で、白く、ほとんど分化がないように見えるべきである。
２）各１５ｃｍディッシュから培地を吸引する。０．２２ｕＭでろ過したＤＭＥＭ／Ｆ１２に希釈した８ｍＬの１×コラゲナーゼＩＶと置き換える
コラゲナーゼＩＶ（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ＃１７１０４−０１９）冷蔵庫に受け入れ。
コラゲナーゼＩＶ  ０．５ｇを秤量し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ５０ｍＬで希釈する。
０．２２ｕＭステリフリップ（５００ｍｇ／５０ｍＬ＝１０×）でろ過する。使用前に、１０×コラゲナーゼを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２で１×（１ｍｇ／ｍＬ）に希釈した。
３）フード内で、室温で５分間インキュベートする。
４）コラゲナーゼＩＶを吸引し、ろ過した８ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２と置きかえる。
５）細胞スクレイパーを使用してコロニーを一度だけかき集め、注意深く全コロニーを保存する。
６）５ｍＬガラスピペットを使用して細胞をＦａｌｃｏｎ−１５管へ穏やかに、ゆっくりと移す。残余のコロニーがある場合、追加の５ｍＬでプレートを洗浄し、同じＦａｌｃｏｎ−１５に添加する。
７）細胞を、重力で、Ｆａｌｃｏｎ−１５中で落ち着かせる（およそ３〜５分間）。上清を吸引して、懸濁液中に残るほとんどのＭＥＦを取り除く。およそ１０ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２を穏やかに添加して細胞を洗浄し、１０００ｒｐｍで１分間遠沈する。
８）細胞を遠沈させている間に、低付着性１０ｃｍディッシュに凝集培地１１ｍＬを添加する。
９）培地を吸引し、細胞を１ｍＬの凝集培地で穏やかに再懸濁する。
１０）１ｍＬの細胞を、凝集培地を含有する各低付着性１０ｃｍディッシュに穏やかに移す。同じピペットを使用して、細胞が全くない、プレートのエリアから１ｍＬをピペットで吸い取り、Ｆａｌｃｏｎ−１５を洗浄する。その１ｍＬをＦａｌｃｏｎ−１５に添加して戻す；ｈｉＰＳＣの開始プレート２枚を現在含有する各プレートの最終容量は、１２ｍＬである。
１１）３７℃で低酸素インキュベーターへ移動。蒸発を予防するためにＰＢＳで満たした１枚のプレートを積み重ねの一番下にして、４〜５枚のプレートを、互いの上に積み重ねることができる。これは、ｈＥＢ培養の０日目である。
Ｄ０．  １０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４を添加する。低酸素下で０〜８日目まで培養（５％ＣＯ２／５％Ｏ２／９０％Ｎ２）。
Ｄ１．  １０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４＋５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ。培地に直接添加する。
Ｄ２．  １０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４＋５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋６μＭ  ＳＢ−４３１５４２＋３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１。色が変化しないまたは多くの細胞残屑がない限り、培地に直接添加する。
Ｄ３．  ５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋１５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ。培地を採集し、１０００ｒｐｍで１分間遠沈し、培地をｈＥＢ培地と置き換える。
Ｄ４〜５．  ５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋１５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ。培地に直接添加する。
Ｄ６〜７．  ５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋１５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６＋５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１１＋２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１＋５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ＋終濃度２Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯ。培地を採集し、１０００ｒｐｍで１分間遠沈し、培地をｈＥＢ培地および造血サイトカインと置き換える。
Ｄ８．  ５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋１５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６＋５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１１＋２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１＋５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ＋終濃度２Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯ＋３０ｎｇ／ｍｌ＋ＴＰＯ＋１０ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３Ｌ＋３０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３
Ｄ９．  ５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋１５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６＋５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１１＋２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１＋５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ＋終濃度２Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯ＋３０ｎｇ／ｍｌ＋ＴＰＯ＋１０ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３Ｌ＋３０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３。細胞を正常なＯ２インキュベーターへ移動させる。
【００７０】
【表１】
2018535683.tif 000003
【００７１】
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【００７２】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記述されたが、前述の説明は、例示目的であり、添付の請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことを理解すべきである。他の態様、利点および改変は、以下の請求項の範囲内である。
【図１−１】
2018535683.tif 000004
【図１−２】
2018535683.tif 000005
【図１−３】
2018535683.tif 000006
【図２−１】
2018535683.tif 000007
【図２−２】
2018535683.tif 000008
【図３−１】
2018535683.tif 000009
【図３−２】
2018535683.tif 000010
【図４】
2018535683.tif 000011
【図５】
2018535683.tif 000012
【図６】
2018535683.tif 000013
【図７】
2018535683.tif 000014
【図８】
2018535683.tif 000015
【図９】
2018535683.tif 000016
【図１０】
2018535683.tif 000017
【図１１】
2018535683.tif 000018
【国際調査報告】
2018535683.tif 000019
2018535683.tif 000020
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