(57)【要約】本開示の態様はポリヌクレオチドの調製方法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有し、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つがＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結しているポリヌクレオチド；ならびに非目標合成生成物及び試薬を含む第１ポリヌクレオチド組成物を多価カチオン塩と接触させて、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチド塩を沈殿させること；ならびにポリヌクレオチド塩を接触済み第１ポリヌクレオチド組成物から分離して、ポリヌクレオチド塩を含む第２ポリヌクレオチド組成物を生成することを含む。ある実施形態において、本方法は、ポリヌクレオチド塩を逆相クロマトグラフィー担体と接触させること；及びクロマトグラフィー担体からポリヌクレオチドを含む第３ポリヌクレオチド組成物を溶出することをさらに含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有し、前記ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つがＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結しているポリヌクレオチド；ならびに
非目標合成生成物及び試薬；
を含む第１ポリヌクレオチド組成物を多価カチオン塩と接触させて、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含む第１ポリヌクレオチド塩を沈殿させること；ならびに
前記第１ポリヌクレオチド塩を前記接触済み第１ポリヌクレオチド組成物から分離して、前記第１ポリヌクレオチド塩を含む第２ポリヌクレオチド組成物を生成すること；
を含むポリヌクレオチドの調製方法。
【請求項２】
前記第１ポリヌクレオチド塩を逆相クロマトグラフィー担体と接触させること；及び
クロマトグラフィー担体から第２ポリヌクレオチド塩を含む第３ポリヌクレオチド組成物を溶出すること；
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な１３以上のヌクレオシドサブユニットを含む配列を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な１０〜５０の連続したヌクレオシドサブユニットを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な前記ヌクレオシドサブユニットがすべてＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している、請求項３〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号４）、ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）及びＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号５）からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが任意選択のリンカーを介して脂質部分と結合している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２ポリヌクレオチド塩が以下の構造を有し、
【化１６】
2018513127.tif 000021
式中、各Ｍｘ＋が独立して水素またはカチオン対イオンであり、各ｘが独立して１、２または３であり、ｎが５〜１３の整数である、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２ポリヌクレオチド塩が前記ポリヌクレオチドの医薬品として許容可能な塩である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２ポリヌクレオチド塩が前記ポリヌクレオチドの一価カチオン塩である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２ポリヌクレオチド塩が前記ポリヌクレオチドのナトリウム塩である、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドを担体から切断して前記第１ポリヌクレオチド組成物を生成することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１組成物が前記ポリヌクレオチドの一価カチオン塩を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記接触ステップがカチオン交換担体から前記第１ポリヌクレオチド組成物を溶出することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記分離ステップが前記接触済み第１ポリヌクレオチド組成物を遠心分離して前記ポリヌクレオチド塩の沈殿物をスピンダウンすることを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離ステップが前記接触済み第１ポリヌクレオチド組成物から前記ポリヌクレオチド塩を濾過することを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２ポリヌクレオチド組成物を前記逆相クロマトグラフィー担体上に直接添加する、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２ポリヌクレオチド組成物を溶媒中に溶解させることをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンが二価である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンがマグネシウム、亜鉛及びカルシウムからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンが三価である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンがアルミニウムである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチド塩が一価カチオン対イオンをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチドの塩
を含み、前記ポリヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有し、前記ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つがＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している、組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンが二価である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンがマグネシウム、亜鉛及びカルシウムからなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンがマグネシウムである、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンが三価である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンがアルミニウムである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して３ｍｏｌ％以上の前記多価カチオン対イオンを含む、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドに対して１．０重量％以上の前記多価カチオン対イオンを含む、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、沈殿物である、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な１３以上のヌクレオシドサブユニットを含む配列を含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な１０〜５０の連続したヌクレオシドサブユニットを含む、請求項２４〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
ヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な前記ヌクレオシドサブユニットがすべてＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドがＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号４）、ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）及びＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号５）からなる群から選択される配列を含む、請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドが任意選択のリンカーを介して脂質部分と結合している、請求項２４〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドが以下の構造を有し、
【化１７】
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式中、各Ｍｘ＋が独立してカチオン対イオンであり、各ｘが１、２または３であり、ｎが５〜１２である、請求項２４〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）に従い、本出願は２０１５年４月２３日に出願された米国仮出願第６２／１５１，８９１号の出願日の優先権を主張し、その開示を参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
緒言
核酸ポリマー化学は、医薬品、診断、及び分析分野における、より具体的には、アンチセンス及びアンチジーン治療、コンビナトリアル化学、分岐ＤＮＡシグナル増幅、ならびにアレイベースのＤＮＡ診断及び分析の副分野における多くの発展中の技術の一翼を担っている。このポリマー化学の一部は、天然核酸ポリマー、例えばＤＮＡなどの結合強度、特異性、及びヌクレアーゼ耐性を改善することを対象としている。ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート、メチルホスホネート及びホスホルアミデートヌクレオシド間結合が、１つ以上の望ましい特性、例えばヌクレアーゼ耐性、細胞取込及び溶解性などを付与するためにポリヌクレオチドに適用されているいくつかのポリマー化学の例である。
【０００３】
ポリヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートは、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡと安定な二重鎖を、さらにはＤＮＡ二重鎖と三重鎖をも形成することができ、ヌクレアーゼに対して耐性がある。ポリヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートは、インビトロ及びインビボ両方での強力なアンチセンス剤としての用途が見出されている。癌細胞はテロメラーゼ活性を発現し、正常ヒト体細胞は生物学的に意味のあるレベルのテロメラーゼ活性を有しないので、テロメラーゼ活性を阻害する化合物を含有するポリヌクレオチドはテロメラーゼ媒介性障害、例えば癌などを治療するために用いることができる。そのため、そのようなポリヌクレオチドを調製及び単離する方法は関心が高い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示の態様はポリヌクレオチドの調製方法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有し、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つがＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結しているポリヌクレオチド；ならびに非目標合成生成物及び試薬を含む第１ポリヌクレオチド組成物を多価カチオン塩と接触させて、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含む第１ポリヌクレオチド塩を沈殿させること；ならびにポリヌクレオチド塩を接触済み第１ポリヌクレオチド組成物から分離して、第１ポリヌクレオチド塩を含む第２ポリヌクレオチド組成物を生成することを含む。ある実施形態において、本方法は、第１ポリヌクレオチド塩を逆相クロマトグラフィー担体と接触させること；及びクロマトグラフィー担体から第２ポリヌクレオチド塩を含む第３ポリヌクレオチド組成物を溶出することをさらに含む。少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチドの塩を含む組成物も提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンはマグネシウム、亜鉛、アルミニウム、及びカルシウムからなる群から選択される。
【０００５】
当業者は、下記の図面が例示目的のみのものであることを理解するであろう。本図面は、決して本教示の範囲を限定することを目的としていない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】様々なｐＨでの１Ｍ  ＮａＣｌ溶液中のイメテルスタット−ＭｇのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】様々な塩で処理したイメテルスタットナトリウムの元素分析の結果を示す。
【図３】塩化マグネシウム塩の当量を増加させて処理したイメテルスタットナトリウムの元素分析の結果を示す。
【図４】塩化マグネシウム塩の当量を増加させて処理したイメテルスタットＴＥＡの元素分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
例示的な実施形態をより詳細に記載する前に、本明細書において用いる用語の意味及び範囲を例示及び定義するために以下の定義を示す。
【０００８】
以下の用語は特に断らない限り以下の意味を有する。未定義の用語はいずれもその技術分野において認識される意味を有する。
【０００９】
本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドという用語は同じ意味で用いられ、ヌクレオシド間結合またはヌクレオシド間連結によって連結している複数のヌクレオシド部分サブユニットまたはヌクレオシド残基を含有する化合物のことをいう。ポリヌクレオチドを文字の配列、例えば「ＡＴＧＵＣＣＴＧ」などで表す場合は常に、特に注記がない限り、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はチミジンを表し、「Ｕ」はデオキシウリジンを表すと理解される。
【００１０】
本明細書で用いる場合、「ヌクレオシド」は、例えばＫｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  （Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  １９９２）に記載のような２’−デオキシ及び２’−ヒドロキシル形態を含めた天然ヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関する「アナログ」は、例えばＳｃｈｅｉｔ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８０）で概説されている修飾塩基部分及び／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む。そのようなアナログとしては、Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  （Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ９０：５４３−５８４，  １９９０）によって開示されているような結合特性、例えば安定性、特異性などを強化するように設計された合成ヌクレオシドが挙げられる。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログは３’−ヒドロキシル基または３’−アミノ基を含む。
【００１１】
用語「塩基」及び「核酸塩基」は同じ意味で用いられ、本明細書では（ｉ）従来のＤＮＡ及びＲＮＡ塩基（ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、及びシトシン）、ならびに（ｉｉ）修飾塩基または塩基アナログ（例えば５−メチル−シトシン、５−ブロモウラシル、またはイノシン）を含むと定義する。塩基アナログは分子構造が従来のＤＮＡまたはＲＮＡ塩基のものに類似する化学物質である。
【００１２】
本明細書で用いる場合、「ピリミジン」は天然ヌクレオシド中に存在するピリミジンを意味し、シトシン、チミン、及びウラシル、ならびにこれらの一般的なアナログ、例えばオキシ、メチル、プロピニル、メトキシ、ヒドロキシル、アミノ、チオ、ハロのような置換基を含有するものなどを含む。本明細書で用いる場合、この用語は一般的な保護基が付加されたピリミジン、例えばＮ４−ベンゾイルシトシンなどをさらに含む。対象とするさらなるピリミジン保護基としては、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：  ２２２３−２３１１  （１９９２）によって開示されている保護基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
本明細書で用いる場合、「プリン」は天然ヌクレオシド中に存在するプリンを意味し、アデニン、グアニン、及びヒポキサンチン、ならびにこれらの一般的なアナログ、例えばオキシ、メチル、プロピニル、メトキシ、ヒドロキシル、アミノ、チオ、ハロのような置換基を含有するものなどを含む。本明細書で用いる場合、この用語は一般的な保護基が付加されたプリン、例えばＮ２−ベンゾイルグアニン、Ｎ２−イソブチリルグアニン、Ｎ６−ベンゾイルアデニンなどをさらに含む。さらなる一般的なプリン保護基がＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：  ２２２３−２３１１  （１９９２）によって開示されている。本明細書で用いる場合、化学名の一部としての用語「保護」は、化合物の特定の部分に対する当該技術分野において認識されている保護基のことをいい、例えばヌクレオシドに関する「５’−保護ヒドロキシル」としては、トリフェニルメチル（すなわちトリチル）、ｐ−アニシルジフェニルメチル（すなわちモノメトキシトリチルまたはＭＭＴ）、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル（すなわちジメトキシトリチルまたはＤＭＴ）などが挙げられ、核酸塩基に関する保護核酸塩基はジメチルアミノホルムアミジン（ＤＭＦ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、イソブチリルなどの基で保護されたヘテロ原子を含む。当該技術分野において認識されている保護基としては、以下の参照文献に記載されているものが挙げられる：Ｇａｉｔ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８４）；  Ａｍａｒｎａｔｈ  ａｎｄ  Ｂｒｏｏｍ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ７７：  １８３−２１７，  １９７７；  Ｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ６：７６８−７７５，  １９８８；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １０：６５５３−６５７０，  １９８２；  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９９１），  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１），  Ｎａｒａｎｇ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７），  Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：  ２２２３−２３１１  （１９９２）、及び類似の参照文献。
【００１４】
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート」は、少なくとも１つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合によって連結したヌクレオシドサブユニットの通常は直鎖のオリゴマーを意味する。概して、ヌクレオシドサブユニットはヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含むが、化学的に互換性のあるより一般的な部分、例えば脱塩基糖及び他の炭化水素部分など、例えば以下の参照文献に記載されているものなども含み得る：Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２１  ：  １１５５−１１６２  （１９９３）；  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１４：  ７９７６−７９８２  （１９９２）；  Ｊａｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３４：  ３０１−３０４  （１９９２）；  Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ９２／００４２３号；  Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６６３０号；  Ｄｕｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １８：  ６３５３−６３５９  （１９９０）；  Ｓａｌｕｎｋｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１４：  ８７６８−８７７２  （１９９２）など。場合によっては、この用語はすべてのヌクレオシド間結合がＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合によって置き換えられているポリヌクレオチドを意味する。そのため、この用語は部分的に及び完全に「アミド化した」オリゴマーを包含する。場合によっては、この用語は、すべてのヌクレオシド間結合がＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合によって置き換えられており、ヌクレオシドサブユニットが天然ヌクレオシドまたはそのアナログであるポリヌクレオチドを意味する。すべての結合がＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合である（「完全にアミド化した」）本ポリヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートは、「部分的にアミド化した」より大きなオリゴマーを形成するために、他のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに埋め込まれるか、または付加され得る。本ポリヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートは任意の都合の良い３’及び／または５’末端基を含み得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートは３’−ヒドロキシル末端基または３’−アミノ末端基を含む。
【００１５】
本明細書で用いる場合、用語「リン酸」及び「リン酸基」はチオリン酸基及びオキソリン酸基を包含することを意味する。
【００１６】
本明細書で用いる場合、用語「ホスホルアミダイトアミノ基」はホスホルアミダイト基のリン原子に結合したアミノ基、−ＮＲ４Ｒ５のことをいい、用語「ホスホルアミダイト窒素」はホスホルアミダイトアミノ基の窒素原子のことをいう。
【００１７】
「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子、例えば１〜６個の炭素原子（例えば「１〜６個の炭素原子のアルキル」）、または１〜５（例えば「１〜５個の炭素原子のアルキル」）、または１〜４（例えば「１〜４個の炭素原子のアルキル」）、または１〜３個の炭素原子（例えば「１〜３個の炭素原子のアルキル」）などを有する一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基のことをいう。この用語は、例として、メチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、ｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、及びネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２−）などの直鎖及び分岐ヒドロカルビル基を含む。
【００１８】
用語「置換アルキル」は、アルキル鎖中の１個以上の炭素原子が任意によりヘテロ原子、例えば−Ｏ−、−Ｎ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−（式中、ｎは０〜２である）、−ＮＲ−（式中、Ｒは水素またはアルキルである）などで置換されている、ならびにアルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシアルキル、チオアリールオキシ、チオへテロアリールオキシ、チオへテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、ならびに−ＮＲａＲｂ（式中、Ｒａ及びＲｂは同一でも異なっていてもよく、水素、任意により置換されたアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環から選択される）からなる群から選択される１〜５個の置換基を有する、本明細書で定義したアルキル基のことをいう。場合によっては、「置換アルキル」は、アルコキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシアルキル、チオール、チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、スルホンアミド、及び−ＮＲａＲｂ（式中、Ｒａ及びＲｂは同一でも異なっていてもよく、水素、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環から選択される）からなる群から選択される１〜５個の置換基を有する本明細書で定義したアルキル基のことをいう。
【００１９】
「アルコキシ」は−Ｏ−アルキル基のことをいい、ここでアルキルは本明細書で定義した通りである。アルコキシとしては、例としてメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシなどが挙げられる。用語「アルコキシ」はアルケニル−Ｏ−、シクロアルキル−Ｏ−、シクロアルケニル−Ｏ−、及びアルキニル−Ｏ−基のこともいい、ここでアルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアルキニルは本明細書で定義した通りである。
【００２０】
用語「置換アルコキシ」は、置換アルキル−Ｏ−、置換アルケニル−Ｏ−、置換シクロアルキル−Ｏ−、置換シクロアルケニル−Ｏ−、及び置換アルキニル−Ｏ−基のことをいい、ここで置換アルキル、置換アルケニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル及び置換アルキニルは本明細書で定義した通りである。
【００２１】
「アシル」は、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−、アルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）−、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アリール−Ｃ（Ｏ）−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−、及び置換ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−基のことをいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、及び置換複素環は本明細書で定義した通りである。例えば、アシルとしては「アセチル」基ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−が挙げられる。
【００２２】
用語「置換アミノ」は−ＮＲＲ基のことをいい、ここで各Ｒは独立して水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルからなる群から選択されるが、ただし、少なくとも１つのＲが水素でない場合に限る。
【００２３】
「ハロ」または「ハロゲン」はフルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードのことをいう。
【００２４】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は−ＯＨ基のことをいう。
【００２５】
「ヘテロアリール」は、１〜１５個の炭素原子、例えば１〜１０個の炭素原子などならびに環内の酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される１〜１０個のヘテロ原子の芳香族基のことをいう。そのようなヘテロアリール基は、単環（例えばピリジニル、イミダゾリルもしくはフリルなど）または環系中の縮合多環（例えばインドリジニル、キノリニル、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾリルもしくはベンゾチエニルなどの基における様なもの）を有することができ、環系中の少なくとも１つの環は芳香族であるが、ただし、結合点が芳香環の原子を介している場合に限る。ある実施形態において、ヘテロアリール基の窒素及び／または硫黄環原子（複数可）は、任意により酸化されてＮ−オキシド（Ｎ→Ｏ）、スルフィニル、またはスルホニル部分となっている。この用語は例としてピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、及びフラニルを含む。ヘテロアリール置換基の定義によって別途制限されない限り、そのようなヘテロアリール基は、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオへテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール及び−ＳＯ２−ヘテロアリール、ならびにトリハロメチルから選択される１〜５個の置換基、または１〜３個の置換基で任意により置換することができる。そのような場合において、１〜５個の置換基（例えば本明細書に記載のもの）で置換されているヘテロアリール基は「置換ヘテロアリール」と呼ばれる。
【００２６】
「複素環」、「複素環式」、「ヘテロシクロアルキル」または「ヘテロシクリル」は、単環または縮合架橋及びスピロ環系を含めた縮合多環を有し、１〜１０個のヘテロ原子を含めた３〜２０個の環原子を有する飽和または不飽和基のことをいう。これらの環原子は、窒素、硫黄、または酸素からなる群から選択され、ここで縮合環系においては、環の１つ以上がシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり得るが、ただし、結合点が非芳香環を介している場合に限る。ある実施形態において、複素環基の窒素及び／または硫黄原子（複数可）は、任意により酸化されてＮ−オキシド、−Ｓ（Ｏ）−、または−ＳＯ２−部分となっている。
【００２７】
複素環及びヘテロアリールの例としては、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル（チアモルホリニルとも呼ばれる）、１，１−ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジン、テトラヒドロフラニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
複素環式置換基の定義によって別途制限されない限り、そのような複素環基は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシアルキル、チオアリールオキシ、チオへテロアリールオキシ、チオへテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、及び縮合複素環から選択される１〜５個、または１〜３個の置換基で任意により置換することができる。
【００２９】
「ニトロ」は−ＮＯ２基のことをいう。
【００３０】
「オキソ」は原子（＝Ｏ）のことをいう。
【００３１】
「チオール」は−ＳＨ基のことをいう。
【００３２】
「チオキソ」または用語「チオケト」は原子（＝Ｓ）のことをいう。
【００３３】
本明細書の開示に加えて、用語「置換」は、指定の基またはラジカルを修飾するために用いる場合、指定の基またはラジカルの１つ以上の水素原子が以下に定義する同一または異なる置換基でそれぞれ互いに独立して置換されていることも意味することができる。
【００３４】
本明細書で個々の用語に関して開示した基に加えて、指定の基またはラジカルにおける１つ以上の水素を置換する（１つの炭素上の任意の２つの水素は＝Ｏ、＝ＮＲ７０、＝Ｎ−ＯＲ７０、＝Ｎ２または＝Ｓで置換することができる）置換基は、特に明記しない限り、−Ｒ６０、ハロ、＝Ｏ、−ＯＲ７０、−ＳＲ７０、−ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｒ７０、−ＳＯ２Ｏ−Ｍ＋、−ＳＯ２ＯＲ７０、−ＯＳＯ２Ｒ７０、−ＯＳＯ２Ｏ−Ｍ＋、−ＯＳＯ２ＯＲ７０、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２（Ｍ＋）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ−Ｍ＋、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｍ＋、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−Ｍ＋、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ７０、−ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−ＮＲ７０ＣＯ２−Ｍ＋、−ＮＲ７０ＣＯ２Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０及び−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、式中、Ｒ６０は任意により置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール及びヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、各Ｒ７０は独立して水素またはＲ６０であり、各Ｒ８０は独立してＲ７０であるか、または代替として、２つのＲ８０は、これらが結合する窒素原子と共に、５、６もしくは７員ヘテロシクロアルキルを形成するが、これはＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１〜４個の同一もしくは異なる追加のヘテロ原子を任意により含んでいてよく、そのＮは−ＨもしくはＣ１−Ｃ３アルキル置換を有してよく、各Ｍ＋は正味一価の正電荷を有する対イオンである。各Ｍ＋は独立して、例えば、アルカリイオン、例えばＫ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋など；アンモニウムイオン、例えば＋Ｎ（Ｒ６０）４など；またはアルカリ土類イオン、例えば［Ｃａ２＋］０．５、［Ｍｇ２＋］０．５、もしくは［Ｂａ２＋］０．５などであり得る（下付きの０．５は、そのような二価のアルカリ土類イオンに対する対イオンのうちの一方を本発明の化合物のイオン化形態、他方を塩化物イオンなどの対イオンとすることができるか、または２つのイオン化された本明細書に開示の化合物がそのような二価のアルカリ土類イオンに対する対イオンの役割を果たすことができるか、または二重イオン化された本発明の化合物がそのような二価のアルカリ土類イオンに対する対イオンの役割を果たすことができることを意味する）。具体例として、−ＮＲ８０Ｒ８０は、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、Ｎ−ピロリジニル、Ｎ−ピペラジニル、４Ｎ−メチル−ピペラジン−１−イル及びＮ−モルホリニルを含むことを意味する。
【００３５】
本明細書の開示に加えて、ある実施形態において、置換されている基は１、２、３、もしくは４個の置換基、１、２、もしくは３個の置換基、１もしくは２個の置換基、または１個の置換基を有する。
【００３６】
上記で定義したすべての置換されている基において、自身に対する置換基をさらに有する置換基を定義することによって得られるポリマー（例えば、置換アリールが置換基としての置換アリール基を有し、その置換基自身が置換アリール基で置換されており、それがさらに置換アリール基で置換されているなど）は、本明細書では包含することを意図していないと理解される。そのような場合において、そのような置換の最大数は３である。例えば、本明細書で具体的に企図される置換アリール基の連続置換は、置換アリール−（置換アリール）−置換アリールに限定される。
【００３７】
特に指示がない限り、本明細書で明示的に定義していない置換基の命名法は、結合点に向けて官能基の末端部から隣接する官能基の名称を続けることによって得られる。
【００３８】
１つ以上の置換基を含有する本明細書に開示の基のいずれについても、当然、そのような基は立体的に非現実的及び／または合成的に実現不可能ないかなる置換または置換パターンも含まないと理解される。さらに、本化合物はこれらの化合物の置換から生じるすべての立体化学異性体を含む。
【００３９】
用語「医薬品として許容可能な塩」は、患者、例えば哺乳類などへの投与に許容可能な塩（所与の投与方法に対して許容可能な哺乳類の安全性を有する対イオンを含む塩）を意味する。そのような塩は、医薬品として許容可能な無機または有機塩基及び医薬品として許容可能な無機または有機酸から誘導することができる。「医薬品として許容可能な塩」は化合物の医薬品として許容可能な塩のことをいい、その塩は当該技術分野において公知の様々な有機及び無機対イオンから誘導され、単なる例示としてではあるがナトリウムなどを含み、また、その分子が塩基性官能基を含有する場合、有機または無機酸の塩、例えば塩酸塩などである。対象とする医薬品として許容可能な塩としては、アルミニウム、アンモニウム、アルギニン、バリウム、ベンザチン、カルシウム、コリネート、エチレンジアミン、リシン、リチウム、マグネシウム、メグルミン、プロカイン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ν，Ν’−ジベンジルエチレン−ジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、ピペラジン、亜鉛、ジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン及びトリエタノールアミン塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
用語「その塩」は、酸のプロトンがカチオン、例えば金属カチオンまたは有機カチオンなどで置換された場合に形成される化合物を意味する。該当する場合、塩は医薬品として許容可能な塩であるが、これは患者への投与を意図していない中間体化合物の塩には要求されない。例として、本化合物の塩としては、化合物が無機または有機酸によってプロトン化されてカチオンを形成しており、その無機または有機酸の共役塩基が塩のアニオン成分であるものが挙げられる。対象とする塩としては、アルミニウム、アンモニウム、アルギニン、バリウム、ベンザチン、カルシウム、セシウム、コリネート、エチレンジアミン、リチウム、マグネシウム、メグルミン、プロカイン、Ｎ−メチルグルカミン、ピペラジン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、亜鉛、Ν，Ν’−ジベンジルエチレン−ジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、ピペラジン、ジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン及びトリエタノールアミン塩が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオシド間結合の主鎖を含む本明細書で示したポリヌクレオチド構造のいずれについても、そのようなポリヌクレオチドは任意の都合の良い塩形態も含み得ると理解される。いくつかの実施形態において、簡単のためにヌクレオシド間結合の酸性形態を示す。場合によっては、本化合物の塩は一価のカチオン塩である。ある場合においては、本化合物の塩は二価のカチオン塩である。場合によっては、本化合物の塩は三価のカチオン塩である。
【００４１】
「溶媒和物」は溶媒分子と溶質の分子またはイオンとの組合せによって形成される複合体のことをいう。溶媒は有機化合物、無機化合物、または両方の混合物とすることができる。溶媒のいくつかの例としては、メタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒が水の場合、形成される溶媒和物は水和物である。
【００４２】
「立体異性体」は、同一の原子結合を有するが、原子の空間配置が異なる化合物のことをいう。立体異性体には、シス−トランス異性体、Ｅ及びＺ異性体、エナンチオマー、ならびにジアステレオマーが含まれる。
【００４３】
「互変異性体」は、原子の電子結合及び／またはプロトンの位置のみが異なる分子の代替形態、例えばエノール−ケト及びイミン−エナミン互変異性体、−ＮＨ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−及び−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−、または−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−ＮＨ−環原子配置を含有するヘテロアリール基の互変異性形態、例えばピラゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾール、及びテトラゾールなどのことをいう。当業者であれば、本明細書に記載の基の他の互変異性配置も可能であると認識するであろう。例えば、以下の構造で記載されるポリヌクレオチド
【化１】
2018513127.tif 000003
は、連結基の１つの可能な代替的互変異性配置を示す以下の構造も包含し、
【化２】
2018513127.tif 000004
式中、「ｎｐｓ」はあるヌクレオシドの３’−炭素を隣接するヌクレオシドの５’−炭素に連結するチオホスホルアミデート結合（−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−または−ＮＨ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−）を表すことが理解される。本化合物のすべての互変異性形態は、たとえ具体的に指定しなくとも、化合物の基の１つの可能な互変異性配置が記載されている構造によって包含されることが理解される。本化合物の基の任意の都合の良い互変異性配置が化合物を記述するのに用いられ得る。
【００４４】
用語「またはその塩もしくは溶媒和物もしくは立体異性体」は、塩、溶媒和物及び立体異性体のすべての変形、例えば対象の化合物の立体異性体の医薬品として許容可能な塩の溶媒和物などを含むことを意図すると理解されよう。用語「またはその塩」は塩のすべての変形を含むことを意図すると理解される。用語「またはその医薬品として許容可能な塩」は塩のすべての変形を含むことを意図すると理解される。用語「またはその溶媒和物」は溶媒和物のすべての変形を含むことを意図すると理解される。用語「またはその立体異性体」は立体異性体のすべての変形を含むことを意図すると理解される。用語「またはその互変異性体」は互変異性体のすべての変形を含むことを意図すると理解される。したがって、例えば、対象の化合物の立体異性体の互変異性体の医薬品として許容可能な塩の溶媒和物を含むことを意図するということになる。
【００４５】
本明細書で用いる場合、用語「単離」は、化合物が自然に存在する環境とは異なる環境にある対象とする化合物を記述することを意図する。「単離」は、対象とする化合物が実質的に富化されている、及び／または対象とする化合物が部分的にもしくは実質的に精製されているサンプル中にある化合物を含むことを意味する。
【００４６】
本明細書で用いる場合、用語「実質的に精製」は、その自然環境から取り出され、本来関連する他の成分を少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％以上含まない化合物のことをいう。
【００４７】
用語「生理的条件」は、生細胞に適合する条件、例えば生細胞に適合する温度、ｐＨ、塩度などのほとんど水性の条件を包含することを意味する。
【００４８】
値の範囲を規定する場合、文脈からそうでないことが明らかに分かる場合を除いて下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間の各値、及び明記した範囲内の任意の他の明記したまたはその間の値が本発明に包含されると理解される。こうしたより小さな範囲の上限及び下限は、独立してそのより小さな範囲に含まれる場合があり、また、明記した範囲内の任意の上下限が具体的に除外されて、本発明に包含される。明記した範囲が上下限の一方または両方を含む場合、そのような包含された上下限のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００４９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈からそうでないことが明らかに分かる場合を除いて、複数形の言及を含むことに留意しなければならない。さらに、特許請求の範囲はあらゆる任意の要素を除外するように起草されている場合があることに留意されたい。そのため、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単独で」、「のみ」などの排他的用語の使用の、または「否定的」限定の使用の先行詞としての役割を果たすことを意図する。
【００５０】
他の用語の定義が明細書全体を通して出現し得る。
【００５１】
例示的な実施形態の説明
上記で要約したように、本開示の態様はポリヌクレオチドの調製方法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有し、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つがＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結しているポリヌクレオチド；ならびに非目標合成生成物及び試薬を含む第１ポリヌクレオチド組成物を多価カチオン塩と接触させて、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含む第１ポリヌクレオチド塩を沈殿させること；ならびに第１ポリヌクレオチド塩を接触済み第１ポリヌクレオチド組成物から分離して、第１ポリヌクレオチド塩を含む第２ポリヌクレオチド組成物を生成することを含む。ある実施形態において、本方法は、ポリヌクレオチド塩を逆相クロマトグラフィー担体と接触させること；及びクロマトグラフィー担体からポリヌクレオチドを含む第３ポリヌクレオチド組成物を溶出することをさらに含む。場合によっては、第３ポリヌクレオチド組成物は第２ポリヌクレオチド塩を含む。少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチドの塩を含む組成物も提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンはマグネシウム、亜鉛、アルミニウム、及びカルシウムからなる群から選択される。
【００５２】
様々な実施形態を記載する前に、本開示の教示は記載した特定の実施形態に限定されず、そのため、当然ながら変更できることが理解されるべきである。本教示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるため、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００５３】
本明細書で用いる節の見出しは、単なる構成目的にすぎず、決して主題を限定するものと解釈されるべきではない。様々な実施形態とともに本教示を記載するが、本教示がそのような実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本教示は、当業者であれば理解するように、様々な代替、変更及び均等物を包含する。
【００５４】
別段の定義がない限り、本明細書において用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な任意の方法及び材料を本発明の実施または試験に用いることもできるが、対象とする方法及び材料をこれから記載する。本明細書で言及するすべての刊行物は、引用する刊行物が関連する方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に援用する。
【００５５】
いかなる刊行物の引用も出願日よりも前の開示に関するものであり、こうした刊行物が先行発明であるとして、本特許請求の範囲が先行する権利を有しないとする自認であると解釈されるべきではない。さらに、提供する公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認を必要とし得る。
【００５６】
本発明のある特徴は、明瞭化のために別個の実施形態との関連で記載されるが、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいと理解される。反対に、本発明の様々な特徴は、簡潔のために、単一の実施形態との関連で記載されるが、別々にまたは任意の好適な部分的組合せで提供されてもよい。本発明に関する実施形態のすべての組合せは、そのような組合せが、例えば安定な化合物（すなわち、作製、単離、同定、及び生物活性についての試験が可能な化合物）である化合物という主題を包含する限りにおいて、本発明に明確に包含され、まさにあたかもすべての組合せが個別に及び明示的に開示されたものとして本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びその要素（例えば、そのような変数を記載する実施形態において列挙される化学基の要素）のすべての部分的組合せも、本発明に明確に包含され、まさにあたかもすべてのそのような部分的組合せが本明細書で個別に及び明示的に開示されたものとして本明細書に開示される。
【００５７】
本明細書で参照するすべての特許及び刊行物は、そのような特許及び刊行物中で開示されているすべての配列を含め、参照により明示的に援用する。
【００５８】
本発明についてさらに記載するにあたって、まずポリヌクレオチドの調製方法をより詳細に記載する。次に、本方法を実施するための対象となるポリヌクレオチド組成物について概説する。
【００５９】
調製方法
本開示の態様はポリヌクレオチドの調製方法を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ポリヌクレオチド（例えば本明細書に記載のようなもの）ならびに非目標合成生成物及び薬剤を含む第１ポリヌクレオチド組成物を多価カチオン塩と接触させて、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチド塩を沈殿させることを含む。本方法を用いたポリヌクレオチド塩の沈殿により、すべての可溶性の非目標合成生成物及び薬剤が除去される。いくつかの実施形態において、この方法は、ポリヌクレオチド塩を接触済み第１ポリヌクレオチド組成物から分離して、ポリヌクレオチド塩を含む第２ポリヌクレオチド組成物を生成することを含む。ある実施形態において、第１ポリヌクレオチド組成物、ポリヌクレオチド塩及び第２ポリヌクレオチド組成物はそれぞれ、７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有し、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つがＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合（例えば、本明細書に記載のようなもの）によって連結している目標ポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
第２ポリヌクレオチド組成物は、第１ポリヌクレオチド組成物と比較して少ない量の非目標合成生成物及び薬剤を有し得る。少ない量の非目標合成生成物及び薬剤とは、第２ポリヌクレオチド組成物中の非目標合成生成物及び薬剤が、第１ポリヌクレオチド組成物と比較して１０重量％以上、例えば、１５重量％以上、２０重量％以上、２５重量％以上、３０重量％以上、３５重量％以上、４０重量％以上、４５重量％以上、５０重量％以上、５５重量％以上、６０重量％以上、６５重量％以上、７０重量％以上、７５重量％以上、８０重量％以上、８５重量％以上、９０重量％以上、または９５重量％以上減少していることを意味する。そのため、本方法は非目標合成生成物及び薬剤に対する目標ポリヌクレオチドの選択的沈殿をもたらし得る。ある実施形態において、本方法により、有機溶媒、例えば純エタノールまたはエタノール溶液などを用いたポリヌクレオチド沈殿の対照方法（例えば、Ｃｒｏｕｓｅ  Ｊ，  Ａｍｏｒｅｓｅ  Ｄ  （１９８７）．  ”Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ：  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ  ａｓ  ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ”．  Ｆｏｃｕｓ  ９  （２）：  ３−５を参照）と比較して沈殿の選択性が向上する。沈殿の選択性の向上とは、対照組成物と比較して５重量％以上の非目標合成生成物及び薬剤が第２ポリヌクレオチド組成物から除去されている、例えば１０重量％以上、１５重量％以上、２０重量％以上、２５重量％以上、３０重量％以上、３５重量％以上、４０重量％以上、４５重量％以上、５０重量％以上、５５重量％以上、６０重量％以上、６５重量％以上、７０重量％以上、７５重量％以上、８０重量％以上、８５重量％以上、９０重量％以上、または９５重量％以上などの非目標合成生成物及び薬剤が除去されていることを意味する。第１ポリヌクレオチド組成物と比較して少ない量の非目標合成生成物及び薬剤は、任意の都合の良い方法を用いて、例えばＨＰＬＣ法を用いて判定され得る。
【００６１】
本明細書で用いる場合、用語「目標合成ポリヌクレオチド」及び「目標ポリヌクレオチド」は同じ意味で用いられ、任意の都合の良い段階的固相ポリヌクレオチド合成法（例えば本明細書に記載のようなもの）によって担体上で合成されたヌクレオチドの特定の望ましい配列を有し、ポリヌクレオチドに目標ポリヌクレオチドの合成戦略を実行する目的のみのために用いられる保護基が全くないポリヌクレオチドのことをいう。そのような保護基は、固相合成の最終ステップ、例えば、目標ポリヌクレオチドを生成するための最終脱保護及び担体からのポリヌクレオチドの切断の間に、ポリヌクレオチドから除去され得る。本明細書で用いる場合、用語「非目標」は、任意の都合の良い成分、例えば所望の目標合成生成物ではない化合物、ポリヌクレオチドもしくはその誘導体、薬剤など、またはこれらの混合物のことをいう。
【００６２】
目標ポリヌクレオチドは、任意の都合の良い数のヌクレオシドサブユニット、例えば、７〜５００ヌクレオシドサブユニット、７〜１００ヌクレオシドサブユニット、７〜７５ヌクレオシドサブユニット、７〜５０ヌクレオシドサブユニット、７〜４０ヌクレオシドサブユニット、７〜３０ヌクレオシドサブユニット、７〜２０ヌクレオシドサブユニット、７〜１５ヌクレオシドサブユニット、１０〜１５ヌクレオシドサブユニット、または１３〜１５ヌクレオシドサブユニットなどを含むことができる。場合によっては、目標ポリヌクレオチドは７〜１００ヌクレオシドサブユニット、例えば７〜５０ヌクレオシドサブユニット、１０〜５０ヌクレオシドサブユニット、１０〜４０ヌクレオシドサブユニット、１０〜３０ヌクレオシドサブユニット、１０〜２５ヌクレオシドサブユニット、１０〜２０ヌクレオシドサブユニット、１２〜１８ヌクレオシドサブユニット、または１２〜１６ヌクレオシドサブユニットなどを有する。ある場合において、目標ポリヌクレオチドは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオシドサブユニットを有する。
【００６３】
本明細書で用いる場合、用語「非目標合成生成物及び薬剤」は、固相ポリヌクレオチド合成の粗合成生成物中に存在し得る様々な非目標成分のことを一括して指し、合成の非目標ポリヌクレオチド生成物、例えば切断型ポリヌクレオチド、キャップしたポリヌクレオチド断片（すなわち、サブユニット連結に失敗した後にキャップした配列）、欠失（複数可）を含むポリヌクレオチド（すなわち、例えば本明細書に記載のような目標ヌクレオシドモノマーまたはダイマーが欠けている）、及び誘導体化ポリヌクレオチド（例えば合成または切断中に望ましくない副反応を経たポリヌクレオチド配列）など；ならびに薬剤、例えば切断されたリンカー、脱保護の生成物、例えば除去された保護基生成物、例えばリン保護基生成物及び塩基保護基生成物（例えば環外アミン保護基生成物）など、切断試薬及び／または切断捕捉剤ならびに残留する合成試薬、例えばモノマー、ダイマー、カップリング、キャッピングまたは脱保護試薬などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６４】
ある実施形態において、この方法は、６以下のヌクレオシドサブユニット、例えば５以下、４以下、３以下または２のヌクレオシドサブユニットを有するポリヌクレオチドを含む非目標合成生成物及び薬剤に対する、目標ポリヌクレオチドの選択的沈殿をもたらす。ある場合において、ポリヌクレオチドでないすべての非目標合成生成物及び薬剤は、本方法の選択的沈殿ステップ中において可溶性のままであり、そのため、得られるポリヌクレオチド塩沈殿から容易に除去され得る。
【００６５】
本方法は、非目標合成生成物及び薬剤（例えば、合成試薬、切断試薬、捕捉剤、除去した保護基、切断副生成物（リンカー、キャッピング基など）、及び小さなポリヌクレオチド断片）の量が少ないなど、いくつかの望ましい特性を有するポリヌクレオチド組成物を生成するための粗合成調製物からの沈殿及び分離を含み得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本方法は、クロマトグラフィー精製の前に、粗合成調製物からポリヌクレオチドを多価カチオン塩として沈殿させることを含む。ある場合において、本方法は目標ポリヌクレオチドの精製の方法である。多価カチオン塩を用いた粗ポリヌクレオチド組成物の沈殿により、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチド塩沈殿物が生じる。場合によっては、ポリヌクレオチド塩沈殿物は、ポリアニオン性ポリヌクレオチド主鎖とイオン対を形成する一価及び多価カチオン対イオンの混合物を含む。本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドに関して用いる用語「多価カチオン塩」及び「多価塩」は同じ意味で用いられ、ポリヌクレオチド主鎖のアニオン性サブユニット間連結基とイオン対となる少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチド塩のことをいう。場合によっては、ポリヌクレオチドの多価カチオン塩は一価及び多価カチオンの混合物を含む。いくつかの実施形態において、多価カチオンは、２つ以上のポリヌクレオチド主鎖のアニオン性サブユニット間結合基とイオン対形成することによって目標ポリヌクレオチドの凝集をもたらし得る。ある場合において、二価カチオンは２つの異なるポリヌクレオチドとイオン対となり、二量体を形成する。場合によっては、追加の多価カチオンによって媒介される追加の多価相互作用によって、ポリヌクレオチドのさらなる凝集が達成され得る。そのため、場合によっては、本方法は非目標合成生成物及び薬剤に対する目標ポリヌクレオチドの選択的凝集及び沈殿をもたらし得る。
【００６７】
この方法のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンは二価である。ある実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンはマグネシウム、亜鉛及びカルシウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンは三価である。ある実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンはアルミニウムである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド塩は一価カチオン対イオンをさらに含む。そのような場合において、ポリヌクレオチド塩は混合塩、例えば２つ以上の異なるカチオン対イオンを含む塩である。
【００６８】
ポリヌクレオチドを沈殿させる任意の都合の良い方法が本方法において有用となり得る。第１ポリヌクレオチド組成物を多価カチオン塩と接触させて、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチド塩を沈殿させるステップは、任意の都合の良い方法を用いて達成され得る。任意の都合の良い多価カチオン及びその塩（例えば本明細書に記載のようなもの）が接触ステップにおいて用いられ、沈殿物が生成され得る。ある場合において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチドの塩は、例えばポリヌクレオチドを含む溶液への多価カチオン塩の添加によって、溶液相中で生成される。多価カチオン塩が溶液に添加されたら、沈殿物が形成し得る。場合によっては、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチドの塩はイオン交換担体上で形成され得る。任意の都合の良いイオン交換担体が接触ステップにおいて用いられ得る。場合によっては、イオン交換担体は強カチオン交換樹脂である。この方法のいくつかの実施形態において、接触ステップは多価カチオン対イオンを含むカチオン交換担体から第１ポリヌクレオチド組成物を溶出することを含む。本明細書で用いる場合、用語「カチオン交換担体」は、それ自身はアニオン性であり、カチオン性アナライト、例えば対象とする多価カチオンなどとのイオン対形成が可能である担体のことをいう。任意の都合の良い溶離液が、カチオン交換担体から溶出するステップに用いられ得る。場合によっては、カチオン交換担体からポリヌクレオチド塩を溶出した後の溶出液中で沈殿物が形成する。
【００６９】
本方法は、目標合成ポリヌクレオチドの任意の都合の良い粗合成調製物に対して実施され得る。場合によっては、第１ポリヌクレオチド組成物は目標合成ポリヌクレオチドの粗合成調製物である。ある実施形態において、第１ポリヌクレオチド組成物は、合成後に担体から目標ポリヌクレオチドを切断した生成物である組成物である。そのため、第１ポリヌクレオチド組成物は様々な非目標合成生成物及び薬剤を含み得る。本方法は、非目標合成生成物及び薬剤に対する目標ポリヌクレオチド塩の選択的沈殿をもたらし、非目標合成生成物及び薬剤は溶液中に残留するため、得られる沈殿物から容易に除去することができる。
【００７０】
任意の都合の良い合成方法（例えば本明細書に記載のようなもの）が目標ポリヌクレオチドを合成するために用いられ得る。合成の後、段階的合成を実施した担体から目標ポリヌクレオチドを切断する。切断の後、全長目標ポリヌクレオチドは、望ましくない合成及び切断試薬を除去するために、ならびに非目標ポリヌクレオチド断片、及びその誘導体を除去するために精製され得る。少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチド塩の沈殿を含む本方法は、目標ポリヌクレオチドの調製の任意の都合の良い段階、例えば合成の後及び逆相クロマトグラフィー精製の前などで実施され得る。
【００７１】
本明細書で用いる場合、用語「粗合成調製物」、「粗組成物」及び「粗ポリヌクレオチド」は、合成後に固相合成担体からの切断によって回収される固相ポリヌクレオチド合成の合成生成物を含む組成物のことをいい、この組成物は未精製である、すなわち、組成物に対してクロマトグラフィー精製が実施されていない。クロマトグラフィー精製は、クロマトグラフィー担体への目標ポリヌクレオチドの吸着ならびにその後の非目標ポリヌクレオチドからの目標ポリヌクレオチドの溶出及び分離を含む任意の都合の良い精製方法のことをいう。場合によっては、クロマトグラフィー精製は逆相クロマトグラフィー精製のことをいう。
【００７２】
いくつかの実施形態において、この方法はさらに、第１ポリヌクレオチド組成物を用意することを含み、ここで、組成物は合成後の固相合成担体からの切断によって生成される。得られた組成物を本方法に用いる前に、任意の都合の良い追加のステップ、例えば蒸発、希釈、または濃縮ステップなども粗合成調製物に対して実施され得る。場合によっては、本方法は、目標ポリヌクレオチドを合成すること（例えば、本明細書に記載のように固相合成担体上で）をさらに含む。ある実施形態において、本方法は、ポリヌクレオチドを担体から切断して第１ポリヌクレオチド組成物を生成することをさらに含む。
【００７３】
ポリヌクレオチド塩を含む固体沈殿物は、任意の都合の良い方法を用いて、多価塩と接触させた第１ポリヌクレオチド組成物（すなわち、接触済み第１ポリヌクレオチド組成物）から分離され得る。対象とする分離方法としては、遠心分離、濾過、デカントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
場合によっては、ポリヌクレオチド塩を含む沈殿物の分離は遠心分離によって達成されるが、この場合、例えば遠心分離機中での接触済み第１ポリヌクレオチド組成物への遠心力の印加により、沈殿物が例えば容器の底にペレットを形成する。遠心分離によるペレットの形成は沈殿物のスピンダウンと呼ばれることもある。この方法のある実施形態において、分離ステップは接触済み第１ポリヌクレオチド組成物を遠心分離してポリヌクレオチド塩の沈殿物をスピンダウンすることを含む。上清液はその後、沈殿物を擾乱させることなくチューブからデカントされるか、または例えばパスツールピペットで容器から取り除かれ得る。遠心分離プロセスは洗浄溶液で繰り返すことができる。
【００７５】
場合によっては、ポリヌクレオチド塩を含む沈殿物の分離は濾過によって達成される。この方法のいくつかの実施形態において、分離ステップは接触済み第１ポリヌクレオチド組成物からポリヌクレオチド塩を濾過することを含む。任意の都合の良いフィルター及び濾材が本方法に用いられ得る。ある場合において、分離は、目標ポリヌクレオチドに応じて選択される濾材を用いた深層濾過によって達成される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本方法は、７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有し、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つがＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結しているポリヌクレオチド；ならびに非目標合成生成物及び薬剤を含む第１ポリヌクレオチド組成物を多価カチオン塩と接触させて、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含む第１ポリヌクレオチド塩を沈殿させること；ならびに第１ポリヌクレオチド塩を接触済み第１ポリヌクレオチド組成物から分離して、ポリヌクレオチド塩を含む第２ポリヌクレオチド組成物を生成することを含む。
【００７７】
沈殿物を接触済み第１ポリヌクレオチド組成物から分離することにより、第１ポリヌクレオチド塩を含む第２ポリヌクレオチド組成物が生成される。場合によっては、本方法による多価カチオン塩を用いた第１ポリヌクレオチド塩の選択的沈殿により、少ない量の非目標合成生成物及び薬剤を含む第２ポリヌクレオチド組成物が生成される。
【００７８】
選択的沈殿の後、対象のポリヌクレオチド塩は次に、少なくとも１つの多価カチオン対イオンをポリヌクレオチドから取り除き、目的の別のカチオン対イオン（例えば本明細書に記載のようなもの）と置換するカチオン交換によって、可溶性ポリヌクレオチド塩に変換され得る。そのため、本方法は少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含む第１ポリヌクレオチド塩の可逆的形成をもたらす。本明細書で用いる場合、用語「可逆的形成」及び「可逆的交換」は同じ意味で用いられ、形成された塩がその後に解離し、少なくとも１つの多価カチオン塩が交換されて塩から取り除かれる場合もある、例えば選択的沈殿（例えば本明細書に記載のようなもの）によるポリヌクレオチド塩の調製のことをいう。場合によっては、いかなる溶媒にも不溶性であるポリヌクレオチド塩は不可逆的に形成された塩と呼ばれ得る。いくつかの実施形態において、この方法は、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを交換して第１ポリヌクレオチド塩から取り除き、可溶性の第２ポリヌクレオチド塩を生成することを含み、この交換は多価カチオン対イオンを解離させ、目的の可溶性塩カチオンとイオン対形成させることを含む。ある場合において、可溶性第２ポリヌクレオチド塩は一価塩である。ある場合において、可溶性第２ポリヌクレオチド塩はナトリウム塩である。ある場合において、可溶性第２ポリヌクレオチド塩はトリエチルアンモニウム塩である。場合によっては、第１及び第２ポリヌクレオチドは互いに異なる、すなわち、異なるカチオン対イオンを含む。対象のポリヌクレオチド塩の解離及び少なくとも１つの多価カチオン対イオンの交換は、任意の都合の良い方法を用いて達成され得る。ある場合において、解離は、例えば本明細書に記載のような逆相クロマトグラフィーを用いて達成される。場合によっては、解離を達成するためにイオン交換クロマトグラフィーが用いられ得る。ある実施形態において、第１ポリヌクレオチド塩の解離は目的のカチオン対イオンを含む溶媒中への塩の溶解によって達成される。
【００７９】
分離の後、第２ポリヌクレオチド組成物にさらなる精製ステップが実施され得る。いくつかの実施形態において、本方法は、第１ポリヌクレオチド塩を逆相クロマトグラフィー担体と接触させること；及びクロマトグラフィー担体からポリヌクレオチドを含む第３ポリヌクレオチド組成物を溶出することをさらに含む。ある実施形態において、第３ポリヌクレオチド組成物は第２ポリヌクレオチド塩を含む。任意の都合の良い逆相クロマトグラフィー法がポリヌクレオチド塩を精製するために用いられ得る。対象とする逆相クロマトグラフィー法及び担体としては、イオン対逆相クロマトグラフィー、Ｃ１８逆相クロマトグラフィー、ならびにＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １２８８，  ３  Ｍａｙ  ２０１３，  Ｐａｇｅｓ  ７３−８１；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １３５４，  ８  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１４，  Ｐａｇｅｓ  ４３−５５によって記載されている方法及び担体を用いたクロマトグラフィー精製が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、第２ポリヌクレオチド組成物を逆相クロマトグラフィー担体上に直接添加する。担体上に直接添加とは、本方法を用いて生成された第２ポリヌクレオチド組成物を例えば単離した固体沈殿物として逆相クロマトグラフィー担体に直接加えることを意味する。場合によっては、逆相クロマトグラフィー担体はカラムとして構成された樹脂であり、ポリヌクレオチド組成物は樹脂床の頂部に加えられる。ある実施形態において、本方法は、第２ポリヌクレオチド組成物を溶媒中に溶解させることをさらに含む。任意の都合の良い溶媒を用いてよく、水性バッファー、水と混和する有機溶媒及びこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。そのような場合において、第２ポリヌクレオチド組成物の溶液が逆相クロマトグラフィー担体と接触させられ、溶出前にポリヌクレオチドが担体に吸着させられ得る。
【００８０】
場合によっては、接触させることは、ポリヌクレオチドを逆相クロマトグラフィー担体上に吸着させること、ならびにその後にポリヌクレオチドを溶出して組成物中に存在する非目標ポリヌクレオチド及び残留する合成剤から目標ポリヌクレオチドをクロマトグラフィー分離することを含む。目標ポリヌクレオチドを含有する溶出液を収集する。ポリヌクレオチドを逆相クロマトグラフィー担体から溶出するために任意の都合の良い溶離液が用いられ得る。溶離液は様々な要因、例えば逆相クロマトグラフィー担体の性質、目標オリゴヌクレオチド、目標ポリヌクレオチドの特定の望ましい塩などに応じて選択され得る。場合によっては、第１ポリヌクレオチド塩の少なくとも１つの多価カチオン対イオンは、溶離液中に含まれる目的の別のカチオン対イオンと逆相クロマトグラフィー担体上でイオン交換される。そのような場合において、ポリヌクレオチドは、逆相クロマトグラフィー担体から溶出された時には、少なくとも１つの多価カチオン対イオンが交換されてポリヌクレオチドから取り除かれているので、添加された時とは異なる塩形態（すなわち、第２ポリヌクレオチド塩）である。ある場合において、第３ポリヌクレオチド組成物中の担体から溶出されたポリヌクレオチドの塩形態は、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含む第１ポリヌクレオチド塩よりも水溶性が高い。
【００８１】
ある実施形態において、第３ポリヌクレオチド組成物は、ポリヌクレオチドの医薬品として許容可能な塩である第２ポリヌクレオチド塩を含む。ある場合において、第３組成物は、ポリヌクレオチドの一価カチオン塩である第２ポリヌクレオチド塩を含む。ある場合において、第３組成物はポリヌクレオチドのトリエチルアンモニウム塩である第２ポリヌクレオチド塩を含む。ある場合において、第３組成物はポリヌクレオチドのナトリウム塩である第２ポリヌクレオチド塩を含む。逆相クロマトグラフィーによってポリヌクレオチドを精製した後、ポリヌクレオチドの所望の塩形態を生成するために、任意の回数のさらなるカチオン対イオン交換ステップがポリヌクレオチド塩に実施され得ることが理解される。いくつかの実施形態において、この方法は、第２ポリヌクレオチド塩からカチオン対イオンをイオン交換して第３ポリヌクレオチド塩を生成することをさらに含む。ある実施形態において、第３ポリヌクレオチド塩はポリヌクレオチドの医薬品として許容可能な塩である。ある場合において、第３ポリヌクレオチド塩はポリヌクレオチドの一価カチオン塩である。ある場合において、第３ポリヌクレオチド塩はポリヌクレオチドのナトリウム塩（例えば本明細書に記載のようなもの）である。
【００８２】
ある場合において、第１組成物はポリヌクレオチドの一価カチオン塩を含む。ある場合において、一価カチオン塩はナトリウム、アンモニウム及びアルキルアンモニウムからなる群から選択される。ある場合において、アルキルアンモニウムは、ジメチルアンモニウム、メチルアンモニウム、エチルアンモニウム及びトリエチルアンモニウムからなる群から選択される。ある場合において、第１組成物はポリヌクレオチドのアンモニウム塩を含む。ある場合において、第１組成物はポリヌクレオチドのアルキルアンモニウム塩を含む。ある場合において、第１組成物はポリヌクレオチドのトリエチルアンモニウム塩を含む。ある場合において、第１組成物はポリヌクレオチドのナトリウム塩を含む。第１ポリヌクレオチド組成物を多価カチオン塩と接触させて、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含む第１ポリヌクレオチド塩を沈殿させることができる。そのため、ある実施形態において、接触済み第１ポリヌクレオチド組成物は、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含む第１ポリヌクレオチド塩を含む。
【００８３】
ポリヌクレオチドが本明細書に記載のものである上記した本方法の実施形態のうちのあらゆる実施形態が本発明の範囲内に包含されると考えられる。
【００８４】
合成方法
任意の都合の良いポリヌクレオチド合成方法、戦略及び化学が、本調製方法において有用である粗合成生成物ポリヌクレオチド組成物を調製するために用いられ得る。本方法の用途に適応し得る対象とするポリヌクレオチド合成化学及び方法としては、ホスホルアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ホスホジエステル法、ホスホトリエステル法、亜リン酸トリエステル法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物のポリヌクレオチドコンポーネントは、任意の従来の手順を選択した化学的性質の種類に適応させることによって合成され得る。Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートの化学的性質を有するオリゴヌクレオチドの合成のための対象とする方法としては、Ｕ．Ｓ．  ５，８２４，７９３，  ＭｃＣｕｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３８：２０７−２１０；  Ｐｏｎｇｒａｃｚ  ＆  Ｇｒｙａｚｎｏｖ，  （１９９９）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ４９：７６６１−７６６４；  ＵＳ  ６，８３５，８２６，  ＵＳ  ７，４９４，９８２，  ＵＳ  ７，４８５，７１７及びＵＳ  ５，６８４，１４３に記載されている方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
場合によっては、目的のポリヌクレオチドは、目標ポリヌクレオチド配列の５’末端から始まり、３’末端へと続く逐次的カップリングによって合成される。ある場合において、目的のポリヌクレオチドは、目標ポリヌクレオチド配列の３’末端から始まり、５’末端へと続く逐次的カップリングによって合成される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの伸長末端へのモノマーホスホルアミダイトの逐次的カップリングによって合成される。５’末端ヌクレオシドサブユニットは、任意選択の連結基または５’末端基を介して任意の都合の良い固体担体に付着され得る。最初のサブユニットが固体担体に付着されたら、サブユニットを脱保護して遊離の固定化された３’末端基を生成することができる。その後、伸長オリゴヌクレオチド鎖へのサブユニットカップリングが達成され得る。場合によっては、この方法は、担体に結合した３’末端基を３’保護ヌクレオチド−５’−ホスホルアミダイトモノマーとカップリングさせることを含む。ある実施形態において、３’末端基は３’−ヒドロキシル基である。ある実施形態において、３’末端基は３’−アミノ基である。
【００８６】
場合によっては、ポリヌクレオチド合成の方法は、（ａ）固相担体に付着した末端ヌクレオシドの保護３’−アミノ基を脱保護して遊離３’−アミノ基を形成するステップ；（ｂ）求核触媒の存在下で遊離３’−アミノ基を３’−保護アミノ−ヌクレオシド−５’−ホスホルアミダイトモノマーと接触させて、ヌクレオシド間Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミダイト結合を形成するステップ；及び（ｃ）この結合を酸化してＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を生成するステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、（ｄ）ポリヌクレオチドが合成されるまでステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことを含む。
【００８７】
場合によっては、この方法は、担体に結合した３’末端基を３’保護ジヌクレオチド−５’−ホスホルアミダイトダイマーとカップリングさせることを含む。対象とするポリヌクレオチド合成方法としては、その出願が米国仮出願第６１／９８７，３９６号の利益を主張するＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１６８３１０号に記載のようなジヌクレオチドダイマーの少なくとも１回のカップリングを含む固相合成の方法が挙げられるが、これらに限定されない。目標ポリヌクレオチド配列は、伸長オリゴヌクレオチド鎖の３’末端基へのダイマー及びモノマーサブユニット両方の逐次的カップリングを含む逆合成戦略によって合成され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、伸長ポリヌクレオチド鎖の遊離３’末端基へのジヌクレオチドダイマーの少なくとも１回のカップリングを含む方法を用いて合成される。
【００８８】
場合によっては、ポリヌクレオチド合成の方法は、（ａ）固相担体に付着した末端ヌクレオシドの保護３’−アミノ基を脱保護して遊離３’−アミノ基を形成するステップ；（ｂ）求核触媒の存在下で遊離３’−アミノ基を３’−保護アミノ−ジヌクレオチドチオホスホルアミデートまたはホスホルアミダイト−５’−ホスホルアミダイトダイマーと接触させて、ヌクレオシド間Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミダイト結合を形成するステップ；及び（ｃ）この結合をＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合に酸化するステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、（ｄ）ポリヌクレオチドが合成されるまでステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことを含み、ステップ（ｂ）では、３’−保護アミノ−ジヌクレオチドチオホスホルアミデート−５’−ホスホルアミダイトダイマーまたは３’−保護アミノヌクレオチド−５’−ホスホルアミダイトモノマーが用いられ得る。
【００８９】
塩基、ホスホルアミダイト、ホスホルアミデート、ポリヌクレオチドの５’、２’及び／または３’基を保護するために、任意の都合の良い保護基戦略が本方法において用いられ得る。対象とする保護基としては、Ｏｈｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．，  ２０１０，  １２  （１１），  ｐｐ  ２４９６−２４９９；及びＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：  ２２２３−２３１１  （１９９２）によって記載されている保護基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
本明細書で用いる場合、用語「リン酸保護基」はオリゴヌクレオチドのリン含有サブユニット間結合に付加され得る保護基のことをいう。リン酸保護基が存在する場合、リン酸保護基が付加されている位置のリン含有結合の反応を防止（すなわち、遮断）し得る。任意の都合の良いリン含有サブユニット間結合（例えばＰ（ＩＩＩ）及びＰ（Ｖ）結合）が本リン酸保護基によって保護され得るが、これには、ホスホルアミダイト、オキソホスホルアミデート、チオホスホルアミデート、リン酸エステル、チオリン酸エステル、ホスホジエステル結合などが挙げられるがこれらに限定されない。リン酸保護基は、リン含有サブユニット間結合の有効酸素原子に付加され得る。任意の都合の良い保護基がリン酸保護基として用いられ得る。ある実施形態において、リン酸保護基はメチル、またはβ−シアノエチルである。
【００９１】
場合によっては、伸長ポリヌクレオチド鎖の３’末端基は、３’−ヒドロキシル、３’−アミノ基またはこれらの保護型を含み得る。ポリヌクレオチド合成中、任意の都合の良いヒドロキシル及び／またはアミノ保護基が３’末端基に用いられ得る。いくつかの実施形態において、３’末端基は保護３’−アミノ基であり、この方法は、保護基を脱保護または除去して遊離３’−アミノ基を生成することを含む。本明細書で用いる場合、用語「遊離アミノ基」は、新たに結合するモノマーまたはダイマーのホスホルアミダイト基との反応に利用可能なアミノ基を意味する。いくつかの実施形態において、遊離アミノ基は一級アミンである。脱保護（例えば脱トリチル化）ステップの後、アミノ基は塩（例えば脱トリチル化に用いられた酸の共役塩基の塩）の形態であり得る。この塩は、脱トリチル化ステップの後で任意により塩基性溶液、例えばアセトニトリル中の２％トリエチルアミンまたはピリジンなどで中和され得る。
【００９２】
新たに結合するサブユニットのホスホルアミダイトの３’保護は鎖の望ましくない重合を防止する。いくつかの実施形態において、３’末端基は保護３’−ヒドロキシル基であり、この方法は、保護基を脱保護または除去して遊離３’−ヒドロキシル基を生成することを含む。いくつかの実施形態において、３’末端基は保護３’−アミノ基であり、この方法は、保護基を脱保護または除去して遊離３’−アミノ基を生成することを含む。保護３’−アミノまたは３’−ヒドロキシル基はトリチル保護基で保護され得る。ある実施形態において、トリチル保護基はトリフェニルメチル（ＴｒまたはＴｒｔ、Ｐｈ３Ｃ−）である。ある実施形態において、トリチル保護基は４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）である。３’−末端アミノまたはヒドロキシル基の脱保護は任意の都合の良い方法を用いて達成され得る。対象とする方法としては、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：  ２２２３−２３１１  （１９９２）によって記載されている方法が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、末端ヌクレオシドの保護３’−アミノ基の脱保護は遊離３’末端基を生成する脱トリチル化、例えば酸触媒脱トリチル化を含む。場合によっては、ダイマーまたはモノマーサブユニットホスホルアミダイトは、固体担体に付着している末端ヌクレオシドの３’末端基と同じ保護３’−ヒドロキシルまたは３’−アミノ基を含む。
【００９３】
任意の都合の良い固相担体が本方法に従うポリヌクレオチドの合成のために用いられ得る。対象とする固体担体としては、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）で作製された微粒子、高度に架橋したポリスチレン（例えばＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ  ＨＬ  ４００またはＧＥ  Ｐｒｉｍｅｒ  ３５０）、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなど、例えば次の例示的な参照文献：Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ，  ｐａｇｅｓｌ  １−１４７，  ｖｏｌ．４４  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７６）；米国特許第４，６７８，８１４号；第４，４１３，０７０号；及び第４，０４６；７２０号；ならびにＰｏｎ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １９，  ｉｎ  Ａｇｒａｗａｌ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２０，  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．，  １９９３）に開示されているものなどが挙げられるが、これらに限定されない。対象とするさらなる担体としては、ポリスチレンビーズ；ポリエチレングリコールをグラフト重合したポリスチレン（ＴｅｎｔａＧｅｌ（商標）、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ  ドイツ）；などが挙げられる。担体の特性、例えば材料、多孔率、サイズ、形状など、及び用いられる連結部分の種類の選択は、用いられる保護基、最終生成物の長さ、最終生成物の量などの様々な要因に依存する。例示的な連結部分は、Ｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ６：７６８−７７５  （１９８８）；  Ｗｅｂｂ，米国特許第４，６５９，７７４号；  Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６１０３号；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃｏｍｍｕｎ，  １９８９：  ８９１−８９３；  Ｄａｍｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １８：  ３８１３−３８２１（１９９０）；  Ｂｅａｔｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３９：  ７１９−７２２  （１９９３）；  Ｍａｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０：  １６７９−１６８４  （１９９２）などに開示されている。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本方法において有用となる固体担体は、ＣＰＧ及びポリエチレングリコールでグラフト重合されており、末端アミノ基を有するポリスチレン（例えばＴｅｎｔａＧｅｌ−ＮＨ２（商標）、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ  ドイツ）を含む。アミノプロピル基がＣＰＧ及びヌクレオシド連結間のスペーサーとして用いられ得る。場合によっては、最初のヌクレオシドの５’−ヒドロキシルへの連結は、合成後に水性アンモニアで切断され得る塩基不安定性エステル結合をもたらすスクシニル基である。
【００９５】
脱保護の後、担体に結合したヌクレオシドは、ダイマーまたはモノマーサブユニットホスホルアミダイトと反応してヌクレオシド間結合を形成することができる。担体に結合したヌクレオシドは、固体担体に付着している単一の残基のことをいう場合もあれば、担体に付着しているオリゴヌクレオチド鎖の末端残基のことをいう場合もあると理解される。任意の都合の良いカップリング化学、カップリング試薬及び方法が本方法において用いられ得る。カップリング条件、保護基、固相担体、連結基、脱保護試薬、固相担体から生成物を切断する試薬、生成物の精製などに関する任意の都合の良い選択が、例えば、Ｇａｉｔ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８４）；  Ａｍａｒｎａｔｈ  ａｎｄ  Ｂｒｏｏｍ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｖｏｌ．  ７７，  ｐｇｓ．  １８３−２１７  （１９７７）；  Ｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｖｏｌ．  ６，  ｐｇｓ．  ７６８−７７５  （１９８８）；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．  １０，  ｐｇｓ．  ６５５３−６５７０  （１９８２）；  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  ｅｄｉｔｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９９１），  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ  ”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９，  Ｎａｒａｎｇ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７），  Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：  ２２２３−２３１１  （１９９２）、及び類似の参照文献の教示に従って本方法との関係においてなされる。
【００９６】
場合によっては、カップリング後に、担体に結合したポリヌクレオチドの伸長鎖の未反応３’−アミノ基は、次の脱保護ステップ（例えば脱トリチル化ステップ）の前に、都合の良いキャッピング剤で任意によりキャップしてその後のカップリングステップに不活性とされ得る。このキャッピングステップにより、調製物のＨＰＬＣプロファイルが改善されて精製がより容易となる場合があり、生成物の全収率も改善される場合がある。本方法に有用なキャッピング試薬としては、求電子試薬、例えば無水酢酸及び無水イソ酪酸など、酸塩化物、例えばアダマンチルカルボニルクロライド、ピバオイル（ｐｉｖａｏｙｌ）クロライドなど、イソチオシアネート、クロロホルメートなどが挙げられる。活性化剤と併用し、その後酸化させるホスホルアミダイト、及びピバオイル（ｐｉｖａｏｙｌ）クロライドまたはアダマンチルカルボニルクロライドなどの酸塩化物とともに用いるＨ−ホスホン酸塩、例えばイソプロピル−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウムなども有用である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、この方法は、ヌクレオシド間Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミダイト結合を酸化することを含む。本明細書で用いる場合、リン含有ヌクレオシド間結合に関する用語「酸化する」、「酸化」、「酸化すること」などは、結合のリン原子をリン（ＩＩＩ）形態からリン（Ｖ）形態に変換するためのプロセスまたは処理を意味する。ヌクレオチド間結合の酸化は、合成中の任意の都合の良い時点で任意の都合の良い方法を用いて実施され得る。いくつかの実施形態において、酸化は段階的に、例えば各カップリングサイクルの間に実施される。他の実施形態において、複数のヌクレオチド間結合の酸化が合成の最後に実施される。場合によっては、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミダイト結合を酸化すること（例えばヨウ素／水系酸化剤を用いて）により、オキソ−ホスホルアミデート結合が生成される。他の場合では、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミダイト結合を酸化することは、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を生成する硫化を含む。硫化は任意の都合の良い方法を用いて実施され得る。対象とする硫化方法としては、ＷＯ２００１０１８０１５及びＵＳ６，１１４，５１９においてＧｒｙａｚｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されているものが挙げられる。対象とする硫化剤としては、元素状硫黄、チウラムジスルフィド、例えばテトラエチルチウラムジスルフィドなど、アシルジスルフィド、例えばフェナシルジスルフィド、フェニルアセチルジスルフィドなど、ホスフィノチオイルジスルフィド、例えばＳ−Ｔｅｔｒａ（商標）など、及び１，１−ジオキソ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、硫化は２，６−ルチジン中でフェニルアセチルジスルフィドを用いて実施され得る。ある実施形態において、硫化はＢｅａｕｃａｇｅ試薬を用い、Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５：４６９３−４６９９，  １９９０に記載されている方法を用いて実施され得る。
【００９８】
固相合成担体からのポリヌクレオチドの切断は任意の都合の良い方法及び試薬を用いて達成され得るが、これらは様々な要因、例えば担体の性質、リンカーの化学的性質及び合成中に用いられる保護基戦略などに応じて選択され得る。目標ポリヌクレオチドの合成及び切断においてなされる選択が、第１ポリヌクレオチド組成物中に存在する非目標合成生成物及び薬剤の素性を決定し得る。
【００９９】
いくつかの実施形態において、切断の前に、ポリヌクレオチドのリン保護基を除去して、ポリヌクレオチドとのあらゆる潜在的な望ましくない切断された保護基（例えばβ−シアノエチル保護基）の付加物の形成を回避する。ポリヌクレオチドの脱保護及び切断に用いるために適応させられ得る対象とする方法としては、ＵＳ７，１９９，２３６に記載されているものが挙げられる。いくつかの実施形態において、あらゆる塩基保護基（例えば環外アミノ保護基）及びあらゆる残りのリン保護基を除去するために、アンモニア溶液を用いて担体からポリヌクレオチドを切断する。ポリヌクレオチド切断反応において任意の都合の良い条件が用いられ得る。場合によっては、４０〜６０℃の範囲の温度で切断を実施する。場合によっては、１２〜２４時間の範囲の時間などの長時間にわたって切断を実施する。ポリヌクレオチドの切断後、担体が次に濾過によって除去されてリンスされ得る。濾液及びリンス溶液の混合液は、この時にはポリヌクレオチドの粗合成調製物を含有しており、さらなる精製ステップに進める前に本調製方法に用いられ得る。場合によっては、ポリヌクレオチド溶液の精製は、例えば４５〜５５℃でＫｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８を用いた分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ＲＰ  ＨＰＬＣを含む。場合によっては、本方法のポリヌクレオチド組成物には、例えば、孔直径カットオフサイズが１，０００Ｄａのポリエーテルスルホン膜を備えたタンジェント流濾過（ＴＦＦ）装置を用いることによって、任意の数の都合の良い脱塩及び濃縮ステップが行われ得る。
【０１００】
ポリヌクレオチド組成物
本開示の態様は、多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチド塩組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチドの塩を含み、ポリヌクレオチドは７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有し、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つはＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している。ある実施形態において、ポリヌクレオチドはヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有する。
【０１０１】
多価カチオン対イオン
【０１０２】
任意の都合の良い多価カチオンが本ポリヌクレオチド塩中の対イオンとして有用となり得る。そのため、多価カチオンは、本ポリヌクレオチド組成物中のポリヌクレオチド主鎖上のアニオン部位とイオン対を形成し得る。ポリヌクレオチドは、リン含有サブユニット間結合（例えばＰ（Ｖ）結合）、例えばホスホルアミデート、チオホスホルアミデート、リン酸エステル、ホスホジエステル結合などによって連結したヌクレオシドサブユニットを含み得る。ポリヌクレオチドのサブユニット間結合は負に荷電し（例えば水溶液中）、カチオン対イオンとイオン対形成し得ることが理解される。そのようなサブユニット間結合はポリヌクレオチド主鎖のアニオン基と呼ばれ得る。
【０１０３】
本明細書で用いる場合、多価カチオンという用語は複数のイオン対を形成可能なカチオン、例えば、二電荷または三電荷カチオンなどの多電荷カチオンのことをいう。任意の都合の良い多価カチオンが本ポリヌクレオチド塩組成物に有用となり得る。いくつかの実施形態において、多価カチオンはポリヌクレオチド主鎖の２つ以上の隣接するアニオン基とイオン対形成する。いくつかの実施形態において、多価カチオンはポリヌクレオチド主鎖の１つのアニオン基とイオン対形成する。いくつかの実施形態において、多価カチオン対イオンは二価である。対象とする二価カチオン対イオンとしては、マグネシウム、亜鉛及びカルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、多価カチオン対イオンは三価である。対象とする三価カチオン対イオンとしては、アルミニウムが挙げられるが、これに限定されない。組成物のある実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンはマグネシウム、亜鉛、アルミニウム及びカルシウムからなる群から選択される。組成物のある実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンはマグネシウムである。組成物のある実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンは亜鉛である。組成物のある実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンはアルミニウムである。組成物のある実施形態において、少なくとも１つの多価カチオン対イオンはカルシウムである。
【０１０４】
ポリヌクレオチド塩中に存在するカチオン対イオンの数は、ポリアニオン主鎖の長さ、塩中のカチオンの価数、溶液のｐＨ、組成物中のポリヌクレオチドの凝集などの様々な要因に依存することが理解される。本組成物は、本ポリヌクレオチド組成物中のポリアニオン性ポリヌクレオチド主鎖に対する少なくとも１つの多価カチオン対イオン、例えば２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、１００以上、またはさらに多くの多価カチオン対イオンを含み得る。ある実施形態において、ｎ個のヌクレオシドサブユニットを有するポリヌクレオチドは、１〜（ｎ−１）／２個（ｎが奇数の場合）の二価カチオン対イオン（複数可）または１〜（ｎ−２）／２個（ｎが偶数の場合）の二価カチオン対イオン（複数可）を含み得る。場合によっては、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチド塩は様々な他のカチオン対イオンをさらに含み得るが、それらは一価、二価または三価であり得る。ある場合において、ｎは７〜５０の範囲、例えば７〜４０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０など、または１２〜１５ヌクレオシドサブユニットの範囲である。
【０１０５】
組成物のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド塩は、ポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して（すなわち、ポリアニオン主鎖の全長にわたって含まれるカチオン対イオンの理論上の最大値に対して）３ｍｏｌ％以上の多価カチオン対イオン、例えば、ポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して４ｍｏｌ％以上、５ｍｏｌ％以上、６ｍｏｌ％以上、７ｍｏｌ％以上、８ｍｏｌ％以上、９ｍｏｌ％以上、１０ｍｏｌ％以上、１１ｍｏｌ％以上、１２ｍｏｌ％以上、１３ｍｏｌ％以上、１４ｍｏｌ％以上、１５ｍｏｌ％以上、１６ｍｏｌ％以上、１７ｍｏｌ％以上、１８ｍｏｌ％以上、１９ｍｏｌ％以上、２０ｍｏｌ％以上、２５ｍｏｌ％以上、３０ｍｏｌ％以上、３５ｍｏｌ％以上、４０ｍｏｌ％以上、４５ｍｏｌ％以上、５０ｍｏｌ％以上、５５ｍｏｌ％以上、６０ｍｏｌ％以上など、またはさらに多くの多価カチオン対イオンを含み得る。本組成物のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して１０ｍｏｌ％以上の多価カチオン対イオンを含み得る。例えば、１０個のヌクレオシド間サブユニット結合のポリアニオン主鎖を含み、これらの結合の２つとイオン対形成している１つの二価カチオンを含むポリヌクレオチド塩は、２０ｍｏｌ％の二価カチオン対イオンを含むと表現される。１つの二価カチオン対イオンが結合のうちの２つではなく１つのみとイオン対形成する場合、ポリヌクレオチド塩は１０ｍｏｌ％の二価カチオン対イオンを含むと表現される。そのため、ｍｏｌ％の値は、ポリヌクレオチド塩中に存在する多価カチオン対イオンによるポリアニオン性ポリヌクレオチド主鎖の占有レベルを指す。例えば、１２ヌクレオシド間サブユニット結合を有する１３マーポリヌクレオチド塩中の１つのＭｇ２＋カチオンでは、主鎖が１６．７ｍｏｌ％占有されていることになる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド塩はポリヌクレオチドの末端に追加のイオン対形成部位（例えば５’−チオリン酸基）を含み得るが、そのような部位が存在する場合、化合物のｍｏｌ％の値に含まれるものとすることが理解される。
【０１０６】
組成物のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド塩は、ポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して９０ｍｏｌ％以下の多価カチオン対イオン、例えば７０ｍｏｌ％以下、６５ｍｏｌ％以下、６０ｍｏｌ％以下、５０ｍｏｌ％以下、またはさらに少ない多価カチオン対イオンを含む。
【０１０７】
組成物のある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は、ポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して３〜９０ｍｏｌ％の多価カチオン対イオン、例えば、ポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して３〜６５ｍｏｌ％（例えば６〜５０ｍｏｌ％、１０〜５０ｍｏｌ％もしくは１０〜４０ｍｏｌ％）、３〜５０ｍｏｌ％、３〜４０ｍｏｌ％、３〜３０ｍｏｌ％、３〜２０ｍｏｌ％または３〜１５ｍｏｌ％などの多価カチオン対イオンを含む。
【０１０８】
組成物のある場合において、ポリヌクレオチド塩は、ポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して３〜６０ｍｏｌ％の二価カチオン対イオン、例えば３〜５０ｍｏｌ％（例えば５〜５０ｍｏｌ％）、３〜４０ｍｏｌ％、３〜３０ｍｏｌ％、３〜２０ｍｏｌ％、３〜１５ｍｏｌ％など、例えば３〜１２ｍｏｌ％などの二価カチオン対イオンを含む。
【０１０９】
組成物のある場合において、ポリヌクレオチド塩は、ポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して３〜６０ｍｏｌ％のマグネシウムカチオン対イオン、例えば５〜５０ｍｏｌ％、５〜４０ｍｏｌ％、１０〜４０ｍｏｌ％または２０〜４０ｍｏｌ％のマグネシウムカチオン対イオンなどを含む。
【０１１０】
組成物のある場合において、ポリヌクレオチド塩は、ポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して１０〜７０ｍｏｌ％の三価カチオン対イオン、例えば１０〜６０ｍｏｌ％、２０〜６０ｍｏｌ％、２０〜５０ｍｏｌ％または３０〜５０ｍｏｌ％の三価カチオン対イオンなどを含む。組成物のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド塩は０．５重量％以上の多価カチオン対イオン（例えばマグネシウム）、例えば０．６重量％以上、０．７重量％以上、０．８重量％以上、０．９重量％以上、１．１重量％以上、１．２重量％以上、１．３重量％以上、１．４重量％以上、１．５重量％以上、１．６重量％以上、１．７重量％以上、１．８重量％以上、１．９重量％以上、２．０重量％以上、２．１重量％以上、２．２重量％以上、２．３重量％以上、２．４重量％以上、２．５重量％以上、２．６重量％以上、２．７重量％以上、２．８重量％以上、２．９重量％以上、３．０重量％以上の多価カチオン対イオンなどを含む。
【０１１１】
ポリヌクレオチド塩は多価及び一価カチオン対イオンの混合物を含む混合塩である。組成物のある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は、モル濃度で少なくとも０．０５以上の一価カチオン対イオンに対する多価カチオン対イオンの比、例えば、モル濃度で０．１０以上、０．１５以上、０．２０以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、０．７０以上、またはさらに大きい一価カチオン対イオンに対する多価カチオン対イオンの比などを含む。
【０１１２】
場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で１：１２の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で１：１１の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で１：１０の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で１：９の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で１：８の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で１：７の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で１：６の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で１：５の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で１：４の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で２：９の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で３：７の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で４：５の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。場合によっては、ポリヌクレオチド塩はモル濃度で５：３の多価カチオン対イオン対一価カチオン対イオンの比を含む。
【０１１３】
混合ポリヌクレオチド塩のある場合において、多価カチオン対イオンはマグネシウムであり、一価カチオン対イオンはナトリウムである。混合ポリヌクレオチド塩のある場合において、多価カチオン対イオンはマグネシウムであり、一価カチオン対イオンはアンモニウムである。混合ポリヌクレオチド塩のある場合において、多価カチオン対イオンはマグネシウムであり、一価カチオン対イオンはトリエチルアンモニウムである。混合ポリヌクレオチド塩のある場合において、多価カチオン対イオンはアルミニウムである。混合ポリヌクレオチド塩のある場合において、多価カチオン対イオンは亜鉛である。混合ポリヌクレオチド塩のある場合において、多価カチオン対イオンはカルシウムである。混合ポリヌクレオチド塩のある場合において、一価カチオン対イオンはナトリウムである。混合ポリヌクレオチド塩のある場合において、一価カチオン対イオンはアンモニウムである。混合ポリヌクレオチド塩のある場合において、一価カチオン対イオンはトリエチルアンモニウムである。ある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は１つの多価カチオン対イオンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は２つの多価カチオン対イオンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は３つの多価カチオン対イオンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は４つの多価カチオン対イオンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は５つの多価カチオン対イオンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は６つの多価カチオン対イオンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は７つの多価カチオン対イオンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は８つの多価カチオン対イオンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は９つの多価カチオン対イオンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド塩は１０個の多価カチオン対イオンを含む。
【０１１４】
目標ポリヌクレオチドに加えて、ポリヌクレオチド合成中に様々な非目標ポリヌクレオチド合成生成物が生成され得る。ポリヌクレオチド調製物中に存在し得る副生成物としては、欠失生成物（例えば１つ以上のヌクレオシド残基を欠く生成物）、１つ以上の保護基を含む生成物、末端処理生成物（例えばキャップしたポリヌクレオチド鎖を含む生成物）、１つ以上の核酸塩基を欠く生成物、部分的に酸化されたホスホルアミダイト結合を含む生成物及び部分的に硫化した結合を含む生成物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本方法は、組成物中の純度が向上した目標ポリヌクレオチドを含む組成物をもたらす。いくつかの実施形態において、組成物は２０重量％以上の目標ポリヌクレオチド、例えば２５重量％以上、３０重量％以上、３５重量％以上、４０重量％以上、４５重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、９０重量％以上、さらには９５重量％以上などの目標ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は５０重量％以上の目標ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は５５重量％以上の目標ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は６０重量％以上の目標ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は６５重量％以上の目標ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は７０重量％以上の目標ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は７５重量％以上の目標ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は８０重量％以上の目標ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は８５重量％以上の目標ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は９０重量％以上の目標ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は９５重量％以上の目標ポリヌクレオチドを含む。
【０１１６】
本方法は、少ない量の非目標合成生成物及び薬剤を含む組成物をもたらす。少ない量とは、組成物中の非目標合成生成物及び薬剤の重量が対照方法に対して小さいことを意味する。いくつかの実施形態において、本組成物は、組成物中の全非目標ポリヌクレオチドの５０％以下の量の非目標合成生成物及び薬剤、例えば４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下さらには５％以下などの非目標合成生成物及び薬剤を含む。
【０１１７】
多種多様なポリヌクレオチド組成物のいずれも本明細書に記載の方法を用いて調製することができる。様々な分類及び種類のポリヌクレオチドが、本方法（例えば本明細書に記載のようなもの）を用いた調製の対象である。本方法に従う調製に適したポリヌクレオチドとしては、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、ＲＮＡｉポリヌクレオチド、ＤＮＡアプタマー、マイクロＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは式（Ｉ）によって記述される：
【化３】
2018513127.tif 000005
式中、
各Ｂは独立してプリン、保護プリン、ピリミジンもしくは保護ピリミジン、またはこれらのアナログであり；
各Ｘは独立して酸素または硫黄であり；
各Ｒ３は独立して水素、フルオロ、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシまたは保護ヒドロキシルであり；
Ｒ６はアミノ、ヒドロキシル、保護アミノ、保護ヒドロキシ、−Ｏ−Ｔ−Ｚまたは−ＮＨ−Ｔ−Ｚであり；
各Ｔは独立して任意選択のリンカーであり；
各Ｚは独立してＨ、脂質、担体、オリゴヌクレオチド、ポリマー、ポリペプチド、検出可能な標識、またはタグであり；
ｎは１〜１０００の整数である。式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドは塩形態で存在し得ることが理解される。そのため、式（Ｉ）のヌクレオシド間結合は任意の都合の良い対イオンを含む塩形態であり得る。そのような形態が本開示の範囲内に含まれることを意図する。式（Ｉ）によって記述されるポリヌクレオチドのヌクレオシド間結合の他の互変異性配置が可能であり得ると理解される。そのような形態が本開示の範囲内に含まれることを意図する。
【０１１９】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、各Ｒ３は水素である。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、各Ｒ３はフルオロである。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、各Ｒ３はヒドロキシルである。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｒ６はアミノである。式（Ｉ）のある実施形態において、Ｒ６はヒドロキシルである。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、ＺはＨである。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｚは脂質（例えば本明細書に記載のようなもの）である。ある場合において、脂質は脂肪酸（例えば本明細書に記載のようなもの）である。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｚは担体である。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｚはオリゴヌクレオチドである。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｚはポリマーである。ある場合において、ポリマーはＰＥＧである。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｚはポリペプチドである。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｚは検出可能な標識である。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｚはタグである。式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｔは不在である。いくつかの実施形態において、各Ｂは独立してＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵから選択される。
【０１２０】
式（Ｉ）のある実施形態において、ｎは７〜５００、例えば７〜１００、７〜７５、７〜５０、７〜４０、７〜３０、７〜２０、７〜１５、１０〜１５、または１３〜１５などの整数である。ある実施形態において、ｎは７〜１００、例えば７〜５０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１２〜１８、または１２〜１６などの整数である。ある実施形態において、ｎは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５である。
【０１２１】
テロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的なポリヌクレオチド
【０１２２】
本開示の態様は、ヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的なポリヌクレオチドを含む化合物及び組成物、ならびにその調製方法を含む。この化合物は、細胞内でのテロメラーゼ活性を高い効力で阻害し、細胞取込特性を有し得る。
【０１２３】
ある場合において、ポリヌクレオチドは、ヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な７以上のヌクレオシドサブユニット、例えば、ヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、３０以上、５０以上などのヌクレオシドサブユニットの配列を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な３〜５０の連続したヌクレオシドサブユニット、例えば５〜４０、７〜４０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、または１２〜１５などのヌクレオシドサブユニットを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な７以上の連続したヌクレオシドサブユニット、例えば、ヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、３０以上、５０以上などの連続したヌクレオシドサブユニットの配列を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは次の式によって記述される化合物であり、
Ｏ−（ｘ−Ｌ）ｎ
式中、ＯはヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的なヌクレオシドサブユニットの配列を含むポリヌクレオチドを表し、ｘは任意選択のリンカー基であり、Ｌは脂質部分を表し、ｎは１〜５の整数である。場合によっては、ｎは５である。場合によっては、ｎは４である。場合によっては、ｎは３である。場合によっては、ｎは２である。場合によっては、ｎは１である。したがって、化合物の設計は、２つの要素、Ｏ及びＬの選択、ならびに任意選択のリンカー基ｘが関与し得るこれらの要素間の構造的連結（複数可）の決定を必要とする。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド化合物は次の式によって記述され得る：
Ｏ−（ｘ−Ｌ）ｎ
式中、ＯはヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的なヌクレオシドサブユニットの配列を含むポリヌクレオチドを表し、ｘは任意選択のリンカー基であり、Ｌは脂質部分を表し、ｎは１であり、例えば、式（Ｉ）中、Ｚが脂質部分であり、Ｔが任意選択のリンカー（例えば本明細書に記載のようなもの）であり、Ｂ基がヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的なヌクレオシドサブユニットの配列に相当する式（Ｉ）のポリヌクレオチド、またはその塩などである。
【０１２７】
ポリヌクレオチドコンポーネントＯは、テロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに結合することによってテロメラーゼ酵素の阻害をもたらすのがこのコンポーネントであるという点で、化合物の「エフェクタ−」コンポーネントと考えられ得る。したがって、Ｏの配列はテロメラーゼＲＮＡの配列に対して相補的である領域を含むように選択され、これを配列番号１に示す。テロメラーゼＲＮＡコンポーネントに対して相補的な領域は、理論上はテロメラーゼＲＮＡの任意の部分に標的化され得るが、テロメラーゼＲＮＡの特定の領域が阻害性ポリヌクレオチドの好ましい標的である。好ましい１つの標的領域は配列番号１のヌクレオチド３０〜６７に及ぶ領域であり、配列番号１のヌクレオチド４６〜５６に及ぶ配列５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ−３’（配列番号２１）の１１ヌクレオチド領域である「テンプレート領域」を含む。テンプレート領域は、テロメラーゼが染色体末端に付加し、テロメラーゼ酵素の活性に必須であるテロメア反復配列を規定するように機能する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １００：５０３−５１４，  ２０００；  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ９８（１４）：７９８２−７９８７，  ２００１を参照）。したがって、テンプレート領域のすべてまたは一部に相補的な配列を含むポリヌクレオチド部分を含有する目的の化合物が対象となる。対象とする別の標的領域はｈＴＲのヌクレオチド１３７〜１７９に及ぶ領域である（Ｐｒｕｚａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３０：５５９−５８８，  ２００２を参照）。この領域中では、１４１〜１５３に及ぶ配列が好ましい標的である。ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９８／２８４４２号はテロメラーゼを阻害するための少なくとも７ヌクレオチド長のポリヌクレオチドの使用について記載しており、このポリヌクレオチドはｈＴＲのヌクレオチド１３７〜１９６、２９０〜３１９、及び３５０〜３８０をはじめとするテンプレート領域の外側のｈＴＲ配列の接触可能部分に相補的であるように設計される。
【０１２８】
ｈＴＲ配列に標的化されるＯの領域は、場合によっては対応するｈＴＲ配列に対して正確に相補的である。ある場合においてはミスマッチが許容され得るが、得られるポリヌクレオチド結合体の特異性及び活性を減少させると予想される。したがって、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドＯの塩基配列はテロメラーゼＲＮＡに正確に相補的な少なくとも５ヌクレオチドの配列を含むように選択され、より長い相補的配列の長さ、例えば、テロメラーゼＲＮＡに正確に相補的な少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１３または少なくとも１５ヌクレオチドなどが用いられる場合、テロメラーゼ阻害が強化され得る。他の実施形態において、ポリヌクレオチドの配列は、テロメラーゼＲＮＡ配列に正確に相補的な少なくとも７〜２０、少なくとも８〜２０、少なくとも１０〜２０または少なくとも１０〜１５ヌクレオチドの配列を含む。最大限のテロメラーゼ阻害活性は、ポリヌクレオチドＯの全長がテロメラーゼＲＮＡに相補的であるように選択される場合に得られ得る。しかし、ポリヌクレオチドコンポーネントの全長が標的配列に正確に相補的であることは必須ではなく、ポリヌクレオチド配列は標的配列に相補的でない領域を含んでもよい。例えば、他の特性を化合物に付与するために、そのような領域、例えば精製を容易にする配列などが追加され得る。ポリヌクレオチドコンポーネントＯが標的配列に相補的でない領域を含む場合、そのような領域は５’または３’末端の一方または両方に配置され得る。正確に相補的な領域がテンプレート領域に標的化される場合、テロメラーゼ様（Ｇリッチ）配列が５’末端で連結している正確に相補的な短い（５〜８ヌクレオチド）領域で、効果的なテロメラーゼ阻害が達成され得る。
【０１２９】
ヒトテロメラーゼＲＮＡに相補的であり、ポリヌクレオチドコンポーネントＯの一部として含まれ得るか、またはポリヌクレオチドコンポーネントＯ全体として用いられ得る例示的配列としては、以下が挙げられる：
ｈＴＲ相補的配列（米国特許公開第２０１２３２９８５８号のポリヌクレオチド配列、配列番号１の領域）；
ＧＧＧＵＵＧＣＧＧＡＧＧＧＵＧＧＧＣＣＵＧＧＧＡＧＧＧＧＵＧＧＵＧＧＣＣＡＵＵＵＵＵＵＧＵＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣＵＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＵＡＧＧＣＧＣＣＧＵＧＣＵＵＵＵＧＣＵＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＵＧＵＵＵＵＵＣＵＣＧＣＵＧＡＣＵＵＵＣＡＧＣＧＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＣＣＵＣＧＧＣＣＵＧＣＣＧＣＣＵＵＣＣＡＣＣＧＵＵＣＡＵＵＣＵＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＵＣＡＧＣＵＧＣＵＧＧＣＣＣＧＵＵＣＧＣＣＣＣＵＣＣＣＧＧＧＧＡＣＣＵＧＣＧＧＣＧＧＧＵＣＧＣＣＵＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣＣＧＣＣＵＧＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＵＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＵＵＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＵＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＡＧＡＧＵＵＧＧＧＣＵＣＵＧＵＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧＵＣＵＣＵＣＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＵＵＣＡＧＧＣＣＵＵＵＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＵＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＡＵＵＣＣＣＵＧＡＧＣＵＧＵＧＧＧＡＣＧＵＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＵＣＧＧＣＵＣＡＣＡＣＡＵＧＣ（配列番号１）
ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧ  １３７−１６６（配列番号２）
ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧ  １３７−１５１（配列番号６）
ＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧ  １３７−１４９（配列番号７）
ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣＡ  １３９−１５１（配列番号８）
ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧ  １４１−１５１（配列番号９）
ＣＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧ  １４１−１５３（配列番号１０）
ＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧ  １４２−１５４（配列番号１１）
ＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣ  １４３−１５５（配列番号１２）
ＡＴＧＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧ  １４４−１５８（配列番号１３）
ＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＴＣＴＡＧ  １６０−１７９（配列番号１４）
ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ  ４２−５４（配列番号３）
ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ  ４６−５６（配列番号４）
ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣ  ４４−５６（配列番号１５）
ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ  ４２−５６（配列番号１６）
ＧＧＧＴＴＡＧＡＣ  ４４−５２（配列番号１９）
ＣＡＧＴＴＡＧＧＧ  ５０−５８（配列番号２０）
ＣＣＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴ  ５４−６５（配列番号１７）
ＣＧＣＣＣＴＴＣＴＣＡＧ  ５６−６７（配列番号１８）。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号４）；ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）；及びＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号５）からなる群から選択される配列を含む。
【０１３１】
Ｏコンポーネントの合成に用いられるヌクレオシド間結合の種類の選択は、限定はしないがホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、Ｐ３’→Ｎ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート、及びホスホロチオエート結合を含めた、利用可能なポリヌクレオチド化学のいずれからも行われ得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは少なくとも１つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を有する。ある実施形態において、ヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的なヌクレオシドサブユニットはすべてＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している。ある場合において、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間は以下の構造を有する：
３’−Ｈ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）−Ｏ−５’
式中、Ｒは水素、またはその塩である。こうしたサブユニット間結合を含む本明細書に記載のポリヌクレオチドコンポーネントＯのいずれについても、そのようなポリヌクレオチドコンポーネントＯはその結合の任意の都合の良い塩形態も含み得ることが理解される。そのため、サブユニット間結合は任意の都合の良い対イオンを含む塩形態であり得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つはＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結しており、他のサブユニット間結合はそれぞれ独立してＮ３’→Ｐ５’オキソ−ホスホルアミデート及びＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合から選択される。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドサブユニットは、それぞれ独立してＮ３’→Ｐ５’オキソ−ホスホルアミデート及びＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合から選択されるサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドサブユニットは、それぞれ独立してＮ３’→Ｐ５’オキソ−ホスホルアミデート及びＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合から選択されるサブユニット間結合によって連結しているが、ただし、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つはＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドサブユニットはすべてＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも１つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも２つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも３つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも４つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも５つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも６つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも７つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも８つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも９つのＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも１０個のＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは少なくとも１１個のＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を含むサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは、それぞれ独立してＮ３’→Ｐ５’オキソ−ホスホルアミデート及びＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合から選択されるサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットは、それぞれ独立してＮ３’→Ｐ５’オキソ−ホスホルアミデート及びＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合から選択されるサブユニット間結合によって連結しているが、ただし、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つはＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドコンポーネントＯは配列ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）を有し、ヌクレオシドサブユニットはすべてＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している。
【０１３４】
上記及び下記のすべての実施形態において、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合は特に−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−もしくはその互変異性体、またはその塩であり、Ｎ３’→Ｐ５’オキソ−ホスホルアミデートサブユニット間結合は特に−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−もしくはその互変異性体、またはその塩である。より具体的には、上記及び下記のすべての実施形態において、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合は特に−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−もしくはその互変異性体、またはそのナトリウム塩であり、Ｎ３’→Ｐ５’オキソ−ホスホルアミデートサブユニット間結合は特に−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−もしくはその互変異性体、またはそのナトリウム塩である。
【０１３５】
実施形態の１つにおいて、本発明は、任意により１つ以上の、特に１つの、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合がＮ３’→Ｐ５’オキソ−ホスホルアミデートサブユニット間結合で置き換えられている、本明細書に記載の具体的な構造の任意の１つに関する。実施形態の１つにおいて、本発明は、１つ以上の、特に１つの、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合がＮ３’→Ｐ５’オキソ−ホスホルアミデートサブユニット間結合で置き換えられている、本明細書に記載の具体的な構造の任意の１つに関する。
【０１３６】
場合によっては、本化合物は、細胞内のテロメラーゼ阻害をもたらすのに、脂質コンポーネントと結合していない同じポリヌクレオチドよりも効果的である。脂質コンポーネントＬは化合物の細胞取込を強化するように機能する、特に細胞膜の透過を容易にすると考えられる。これが生じる機構は完全に解明されてはいないが、１つの可能性としては、脂質コンポーネントは、単一分子または凝集（ミセル）形態のいずれかとしての細胞膜への化合物の結合を助長し、その後、内在化し得る。しかし、正確な機構の理解は本化合物を用いるのに必要とされない。
【０１３７】
脂質コンポーネントは、非修飾ポリヌクレオチドと比較して細胞取込の強化をもたらす任意の脂質または脂質誘導体であり得る。対象とする脂質としては、炭化水素、脂肪（例えばグリセリド、脂肪酸及び脂肪酸誘導体、例えば脂肪酸アミドなど）ならびにステロールが挙げられるが、これらに限定されない。脂質コンポーネントが炭化水素である場合、Ｌコンポーネントは、置換もしくは非置換環状炭化水素または脂肪族直鎖もしくは分岐鎖炭化水素であり得るが、これらは飽和または不飽和であり得る。例としては、完全飽和または多価不飽和の直鎖非分岐炭化水素が挙げられる。炭化水素鎖の長さはＣ２〜Ｃ３０で様々であり得るが、Ｃ８〜Ｃ２２の炭素鎖で最大限のテロメラーゼ阻害が得られ得る。対象とする飽和炭化水素（アルカン）の例を以下に挙げる。
組織名／炭素鎖
テトラデカンＣ１４Ｈ３０
ペンタデカンＣ１５Ｈ３２
ヘキサデカンＣ１６Ｈ３４
ヘプタデカンＣ１７Ｈ３６
オクタデカンＣ１８Ｈ３８
ノナデカンＣ１９Ｈ４０
エイコサンＣ２０Ｈ４２
【０１３８】
炭化水素の一価及び多価不飽和形態（アルケンならびにポリエン、例えばアルカジエン及びアルカトリエンなど）が選択されてもよく、１〜３つの二重結合を有する化合物が対象となるが、より多くの二重結合を有する化合物も用いられ得る。アルキン（１つ以上の三重結合を含有）及びアルケニン（三重結合（複数可）及び二重結合（複数可））も用いられ得る。
【０１３９】
炭化水素の置換形態を本化合物に用いてよく、インビボ及びインビトロで不活性な置換基が対象となる。場合によっては、置換基はフッ素である。炭化水素の例示的な一般構造としては、ＣＦ３（ＣＦ２）ｎ−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍは少なくとも１、場合によっては２であり、ｎは１〜３０である）、例えばフルオロトリデカン：ＣＦ３（ＣＦ２）９（ＣＨ２）３など；及びＣＨ３（ＣＨ２）ａ（ＣＦ２）ｂ（ＣＨ２）ｃ−（式中、ａ、ｂ及びｃは独立して１〜３０である）が挙げられる。
【０１４０】
対象とする他の好適な脂質コンポーネントとしては、単純な脂肪酸及び脂肪酸誘導体、グリセリド、ならびにステロールなどのより複雑な脂質、例えばコレステロールが挙げられるが、これらに限定されない。対象とする脂肪酸及びその誘導体は完全飽和または一価もしくは多価不飽和であり得る。炭素鎖の長さはＣ２〜Ｃ３０で様々であり得るが、Ｃ８〜Ｃ２２の炭素鎖で最大限のテロメラーゼ阻害が得られ得る。対象とする飽和脂肪酸の例を以下に挙げる。
組織名／慣用名／炭素鎖
テトラデカン酸／ミリスチン酸／１４：０
ヘキサデカン酸／パルミチン酸／１６：０
オクタデカン酸／ステアリン酸／１８：０
エイコサン酸／アラキジン酸／２０：０
【０１４１】
脂肪酸の一価及び多価不飽和形態を用いてもよく、１〜３つの二重結合を有する化合物が対象となるが、より多くの二重結合を有する化合物も用いられ得る。用いられ得る対象とする一般的な一価及び多価不飽和脂肪酸の例としては、以下が挙げられる。
組織名／慣用名／炭素鎖
シス−９−ヘキサデカン酸／パルミトレイン酸／１６：１（ｎ−７）
シス−６−オクタデカン酸／ペトロセリン酸／１８：１（ｎ−１２）
シス−９−オクタデカン酸／オレイン酸／１８：１（ｎ−９）
９，１２−オクタデカジエン酸／リノール酸／１８：２（ｎ−６）
６，９，１２−オクタデカトリエン酸／ガンマ−リノール酸／１８：３（ｎ−６）
９，１２，１５−オクタデカトリエン酸／アルファ−リノール酸／１８：３（ｎ−３）
５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸／アラキドン酸／２０：４（ｎ−６）
【０１４２】
炭素鎖中に１つ以上の三重結合を有する脂肪酸、及び分岐鎖脂肪酸も本化合物に用いられ得る。脂肪酸の置換形態を本化合物に用いてもよい。炭化水素基と同様に、インビボ及びインビトロで不活性な置換基、例えばフッ素などが対象となる。本発明に用いるのに適した脂肪酸のポリフッ素化誘導体の例示的な一般構造は、ＣＦ３（ＣＦ２）ｎ−（ＣＨ２）ｍＣＯ−（式中、ｍは少なくとも１、好ましくは２であり、ｎは１〜３０である）、及びＣＨ３（ＣＨ２）ａ（ＣＦ２）ｂ（ＣＨ２）ｃＣＯ−（式中、ａ、ｂ及びｃは独立して１〜３０である）である。
【０１４３】
場合によっては、１〜５つのＬコンポーネント（ｎが１、２、３、４または５である）が任意選択のリンカーを介してＯコンポーネントと共有結合している。場合によっては、１または２つのＬコンポーネントを用いる（ｎ＝１または２）。２つ以上のＬコンポーネントがＯコンポーネントに結合している場合、各Ｌコンポーネントは独立して選択される。
【０１４４】
Ｌ部分として特定の炭化水素を有すると記載された本発明の化合物、及び特定の脂肪酸を有すると記載された化合物（特定の炭化水素と同じ数の炭素原子を有する）は密接に関係しており、Ｌ部分をポリヌクレオチドに連結する結合の性質においてのみ構造が異なり、そして、これは化合物を生成するために用いられる合成手順の結果であると理解されよう。例えば、以下でより詳細に記載するように、ポリヌクレオチドの３’−アミノ末端に結合したＬ部分を有する（ホスホルアミデートまたはチオホスホルアミデートヌクレオシド間結合を有する）化合物を合成する場合、出発材料としての脂肪酸のアルデヒド形態（脂肪アルデヒド）の使用は脂質鎖とポリヌクレオチドとの間のアミン結合の形成をもたらし、その結果、脂質基は炭化水素として現れる。対照的に、同一脂肪酸のカルボン酸、酸無水物または酸塩化物形態の使用はアミド結合の形成をもたらし、その結果、脂質基は脂肪酸誘導体、この場合においては特に脂肪酸アミドとして現れる（定義の節に記載のように、簡単のために、用語「脂肪酸」は、結合したＬ基について述べる場合、脂肪酸アミドをはじめとする脂肪酸誘導体を含むものとして本明細書において広く用いられる）。これはＣ１４脂質コンポーネントに連結したホスホルアミデートポリヌクレオチドの３’−アミノ末端を表す以下の図式で示される。図式Ａでは、Ｌはテトラデカン酸（ミリスチン酸）であり、Ｌ基とＯ基との間の結合はアミドである。図式Ｂでは、Ｌはテトラデカンであり、Ｌ基とＯ基との間の結合はアミンである。
【化４】
2018513127.tif 000006
【０１４５】
ＯコンポーネントとＬコンポーネントとの間の結合は、直接結合であってもよく、または任意選択のリンカー部分、例えばｘもしくは式（Ｉ）の任意選択のリンカーＴを介していてもよい。リンカー基は化合物の化学合成を容易にするように働き得る。ＯコンポーネントとＬコンポーネントとの間の結合を媒介するためにリンカー基を用いるか否かにかかわらず、ポリヌクレオチドコンポーネントＯ上にはＬコンポーネント（複数可）が都合よく結合し得る部位が複数ある。好適な連結点としては、ポリヌクレオチドの５’及び３’末端、１つ以上の糖環、ヌクレオシド間主鎖及び核酸塩基が挙げられる。場合によっては、Ｌ部分はポリヌクレオチドの３’または５’末端に結合している。
【０１４６】
Ｌコンポーネントが３’末端に結合する場合、結合は３’置換基に直接的であってよく、この置換基は、好ましいホスホルアミデート及びチオホスホルアミデートポリヌクレオチドの場合では３’−アミノ基であり、他の場合、例えば従来のホスホジエステルポリヌクレオチドなどでは３−ヒドロキシ基である。あるいは、Ｌ部分は３’−連結リン酸基を介して連結していてもよく、ヘキサデカン炭化水素がチオホスホルアミデートポリヌクレオチドの３’リン酸にＯ−アルキルリンカーを介して連結される。Ｌ部分が５’末端に連結する場合、５’−連結リン酸基を介して結合され得る。Ｏ部分上の塩基への結合は任意の好適な原子、例えばグアノシンのＮ２アミノ基を介し得る。ｎ＞１で複数の脂質部分がＯコンポーネントに結合する場合、個別に選択されるＬコンポーネントが任意の都合の良い部位（複数可）で結合し得る。例えば、１つのＬ基が各末端に結合してもよく、様々なＬ基が塩基に結合してもよく、または２つ以上のＬ基が１つの末端で結合してもよい。
【０１４７】
任意選択のリンカーコンポーネントｘが化合物のＯ及びＬコンポーネントを連結するために用いられ得る。任意選択のリンカー（例えばｘまたは式（Ｉ）のＴ）が、末端リン酸基、例えば３’−連結または５’−連結リン酸基を介してポリヌクレオチド（例えばＯ）に結合し得ると理解される。リンカーを用いる場合、本明細書に記載の合成手順中に組み込まれる。好適なリンカー基の例としては、それぞれ以下の一般構造で表すことができるアミノグリセロール及びＯ−アルキルグリセロール系リンカーが挙げられる：
【化５】
2018513127.tif 000007
式中、Ｒ’はＨ、ＯＨ、ＮＨ２またはＳＨであり、ＹはＯ、ＳまたはＮＲであり、ＲはＨ、アルキルまたは置換アルキルであり、ｎ及びｍはそれぞれ独立して１〜１８の整数である。対象とする好適なリンカーの例は以下である。Ｒ’がＯＨ、ＹがＯ、ｍ及びｎがそれぞれ１であるアミノグリセロールリンカー：
【化６】
2018513127.tif 000008
Ｒ’がＯＨ、ＹがＮＨ、ｍ及びｎがそれぞれ１であるビスアミノグリセロールリンカー：
【化７】
2018513127.tif 000009
ならびにＲがＨであるＯ−アルキルグリセロールリンカー：
【化８】
2018513127.tif 000010
【０１４８】
本方法に従って調製され得る例示的な脂質修飾ポリヌクレオチドとしては、Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ”に対する米国特許出願第ＵＳ２０１２０３２９８５８号の図１（例えば図１Ａ〜１ＤＤ）に記載されている化合物が挙げられ、その開示全体を参照により本明細書に援用する。
【０１４９】
ある実施形態において、組成物は、
【化９】
2018513127.tif 000011
の構造によって記述される化合物、またはその塩を含み、式中、「ｎｐｓ」はあるヌクレオシドの３’−炭素を隣接するヌクレオシドの５’−炭素に連結するチオホスホルアミデート結合（例えば−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−もしくはその互変異性体、またはその塩）を表す。上式で記述される化合物は塩形態で存在し得ることが理解される。そのような形態は、存在し得る限り、本開示の範囲内に含まれることを意図する。ある実施形態において、組成物は化合物の医薬品として許容可能な塩を含む。ある場合において、組成物は化合物のナトリウム塩を含む。ある実施形態において、組成物は化合物の二価カチオン塩、例えば化合物のマグネシウム塩などを含む。ある実施形態において、組成物は化合物の三価カチオン塩、例えば化合物のアルミニウム塩などを含む。
【０１５０】
ある実施形態において、組成物は以下の構造によって記述される化合物を含み：
【化１０】
2018513127.tif 000012
式中、各Ｍｘ＋は独立して水素または塩の任意の都合の良い対イオンであり、各ｘは独立して１、２または３であり、ｎは５〜１３の整数である。場合によっては、ｎは５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３である。ある場合において、各ｘは独立して１、２または３であり、ｎは５〜１２の整数である。ある場合において、ｎは１３である。ある場合において、各ｘは１である。ある場合において、各ｘは独立して１または２である。ある場合において、各ｘは独立して１または３である。ある場合において、各Ｍｘ＋は独立してカチオン対イオンである。ある場合において、各Ｍｘ＋は独立してカチオン対イオンであり、各ｘは独立して１、２または３であり、ｎは５〜１２の整数である。ある場合において、各Ｍｘ＋は独立して水素または任意の都合の良いカチオン対イオンであり、各ｘは独立して１、２または３であり、ｎは５〜１２の整数である。ある場合において、Ｍｘ＋は水素である。いくつかの実施形態において、（Ｍｘ＋）ｎは（Ｍｇ２＋）（Ｍ＋）１１である。いくつかの実施形態において、（Ｍｘ＋）ｎは（Ｍｇ２＋）２（Ｍ＋）９である。いくつかの実施形態において、（Ｍｘ＋）ｎは（Ｍｇ２＋）２（Ｍ＋）９である。いくつかの実施形態において、（Ｍｘ＋）３は（Ｍｇ２＋）３（Ｍ＋）７である。いくつかの実施形態において、（Ｍｘ＋）ｎは（Ｍｇ２＋）４（Ｍ＋）５である。いくつかの実施形態において、（Ｍｘ＋）ｎは（Ｍｇ２＋）５（Ｍ＋）３である。いくつかの実施形態において、（Ｍｘ＋）ｎは（Ｍｇ２＋）６（Ｍ＋）である。いくつかの実施形態において、（Ｍｘ＋）ｎは（Ｍｇ２＋）（Ｍ＋）１２であり、Ｍｇ２＋対イオンは別のオリゴヌクレオチドのアニオン主鎖とさらなるイオン対を形成し得る。いくつかの実施形態において、（Ｍｘ＋）ｎは（Ｍｇ２＋）２（Ｍ＋）１１であり、Ｍｇ２＋対イオンは１つまたは２つの他のオリゴヌクレオチド（複数可）のアニオン主鎖（複数可）とさらなる２つのイオン対を形成し得る。ある場合において、混合マグネシウム塩のＭ＋対イオンはナトリウムである。ある場合において、混合マグネシウム塩のＭ＋対イオンはアンモニウムである。ある場合において、混合マグネシウム塩のＭ＋対イオンはトリエチルアンモニウムである。
【０１５１】
ある実施形態において、組成物は以下の構造によって記述される化合物を含み、塩の任意の都合の良いカチオン対イオンを含み得る。
【化１１】
2018513127.tif 000013
【０１５２】
ある実施形態において、組成物は以下の構造によって記述される化合物を含む。
【化１２】
2018513127.tif 000014
【０１５３】
脂質修飾ポリヌクレオチド
【０１５４】
選択された結合の性質に応じて、脂質部分Ｌをポリヌクレオチドに結合させるために様々な合成アプローチを用いることができ、Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １２６４：２２９−２３７、Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：３７７７−３７８３、及びＲｕｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ９：３４１−３４９に記載されているアプローチが挙げられる。脂質部分がポリヌクレオチドの５’または３’末端で結合した化合物の合成は、カルボン酸、酸塩化物、無水物及び活性エステルと反応することができる該当する末端での好適な官能基、場合によりアミノ基またはヒドロキシル基の使用によって達成することができる。チオール基も官能基として用いられ得る（Ｋｕｐｉｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９：１２４１−１２４７を参照）。様々な鎖長のアミノ及びチオール修飾剤は両方ともポリヌクレオチド合成用に市販されている。Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート結合を有するポリヌクレオチドは、３’−アミノ基（ほとんどの従来のポリヌクレオチドの化学的性質に見られる３’−ヒドロキシではなく）を含有し、それゆえに、こうしたポリヌクレオチドは脂質基をポリヌクレオチドの３’−末端に結合させる特有の機会をもたらす。
【０１５５】
Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートの化学的性質を有するポリヌクレオチドの末端に脂質基を結合させるために、様々なアプローチを用いることができる（例えば、パルミトイルアミド−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−スクシニルプロパンジオールリンカー）。３’末端への結合については、完全に保護した固体担体結合ポリヌクレオチドの遊離３’−アミノ基を対応する酸無水物と反応させ、その後、アンモニアでの脱保護及び精製を行うことによって、結合した化合物を合成することができる。あるいは、カルボジイミド、ＨＢＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）または２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージドなどのカップリング剤を用いた、担体に結合したポリヌクレオチドの遊離３’−アミノ基への脂質のカルボン酸のカップリングを用いて脂質を結合させることができる。これらの２つの方法は脂質とポリヌクレオチドとの間でアミド結合を形成する。鎖伸長中にポリヌクレオチドに結合した脂質のホスホルアミダイト誘導体を用いて、脂質をポリヌクレオチド鎖に結合させてもよい。このアプローチにより、脂質及びポリヌクレオチドを連結するホスホルアミデート（例えばチオホスホルアミデート）結合が得られる（プロピル−パルミトイル及び２−ヒドロキシ−プロピル−パルミトイル化合物によって例示される）。さらに別のアプローチは、完全に保護した担体結合ポリヌクレオチドの遊離３’−アミノ基を好適な脂質アルデヒドと反応させ、その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することを伴い、アミン結合を生成する。
【０１５６】
５’末端への結合については、Ｐｏｎｇｒａｃｚ  ＆  Ｇｒｙａｚｎｏｖ  （１９９９）に記載されているように、修飾した脂質含有固体担体を用い、その後、ポリヌクレオチドを５’から３’方向に合成することによって、ポリヌクレオチドを合成することができる。修飾担体の例を以下に示す。ｎ＝１４の場合、脂肪酸はパルミチン酸であり、３−アミノ−１，２−プロパンジオールを塩化パルミトイルと反応させ、その後、ジメトキシトリチル化及びスクシニル化することにより、固体担体へのカップリングに用いる中間体が得られた。場合によっては、Ｒは長鎖アルキルアミン細孔制御ガラスであり得る。ある場合において、Ｒは高分子固体担体である。
【化１３】
2018513127.tif 000015
【０１５７】
効用
例えば上記のような本発明の方法及び組成物は様々な用途において有用となる。対象とする用途としては、以下でより詳細に概説するように、治療用途、診断用途、研究用途、及びスクリーニング用途が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
本化合物は様々な治療用途において有用となる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの生成方法は、治療効果をもたらすポリヌクレオチドを調製するために適用される。本発明の組成物を用いて治療可能な疾患の種類は限定されない。例えば、組成物は多数の遺伝子疾患の治療に用いられ得る。いくつかの実施形態において、本方法及び組成物はアンチセンス用途を有する。いくつかの実施形態において、本方法及び組成物はアンチジーン用途を有する。ある実施形態において、本方法及び組成物はテロメラーゼ阻害用途、例えば米国特許第６，８３５，８２６号、及び米国特許公開第２０１２０３２９８５８号に記載されているものなどを有し、これらの開示全体を参照により本明細書に援用する。
【０１５９】
本開示は、テロメラーゼ活性を特異的かつ強力に阻害することができ、それゆえに、テロメラーゼ陽性細胞、例えば腫瘍細胞などの増殖を阻害するために用いられ得る化合物を提供する。非常に多種多様な癌細胞がテロメラーゼ陽性であるとわかっており、皮膚、結合組織、脂肪、乳房、肺、胃、膵臓、卵巣、子宮頚部、子宮、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、中枢神経系（ＣＮＳ）、網膜の癌及び血液腫瘍（例えば骨髄腫、白血病及びリンパ腫など）由来の細胞が挙げられる。対象とする癌には、骨髄線維症、血小板血症、骨髄異形成症候群及び骨髄性白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
本化合物は、限定はしないが本態性血小板血症（ＥＴ）、真性多血症（ＰＶ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄線維症（ＭＦ）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）をはじめとする血液悪性腫瘍及び骨髄増殖性障害を治療するために用いることができる。本化合物は、不応性貧血、芽球増加型不応性貧血、多血球系統の異形成を伴う不応性血球減少症、単一血球系統の異形成を伴う不応性血球減少症、及び慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）などの疾患が含まれる骨髄異形成症候群を治療するために用いることができる。本化合物は、血液疾患、例えば、２０１３年１１月１５日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／０７０４３７号に記載されているものなどを治療するために用いることができ、その開示全体を参照により本明細書に援用する。
【０１６１】
したがって、本明細書に規定の化合物は幅広い悪性疾患を治療するのに広く有用である。場合によっては、本化合物は、悪性細胞と正常細胞を高度に区別し、分裂細胞を無差別に死滅させる薬剤に依存するほとんどの現在の化学療法レジメンに存在する有害副作用の多くを回避する治療を提供するのに効果的であり得る。その上、場合によっては、本脂質修飾化合物は、同等の非結合オリゴヌクレオチドよりも効力が高く、これは、より少ない投与量で投与することができ、安全性の向上及び治療コストの著しい削減をもたらすことを意味する。テロメラーゼ阻害剤は、原発腫瘍の外科切除、化学療法剤及び放射線治療を含めた他の癌治療アプローチと併せて用いられ得る。したがって、本発明は、医薬品として用いるための本明細書に規定の化合物及び組成物に関する。本発明は、上記の悪性疾患の任意の１つを治療または予防するのに用いるための本明細書に規定の化合物及び組成物にも関する。
【０１６２】
本化合物及び方法は、限定はしないが臨床診断の開発、例えばインビトロ診断またはインビボ腫瘍造影剤をはじめとする様々な診断用途において有用となる。そのような用途は、病状または罹病性を診断するのに、または診断を確認するのに有用である。本方法は、以前に疾患があると診断された患者の疾患進行及び／または治療への反応を監視するのにも有用である。
【実施例】
【０１６３】
実施例１：概要
【０１６４】
これらの実施例は、イメテルスタットのナトリウム塩形態からイメテルスタットの様々な二価または三価形態、例えばＣａ、Ｂａ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｆｅ、Ｃｕ、及びＺｎなどを調製する実験について記載する。これらの実験において、イメテルスタットの１、２または３つのリン酸基と結合することができる二座配位または三座配位カチオンの塩の形成及び単離を伴う調製方法を用いた純度の改善を評価した。得られた塩形態の溶解性及びオスモル濃度も調べた。
【０１６５】
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＢａＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＡｌＣｌ３、ＦｅＣｌ２、及びＦｅＣｌ３を用いて、イメテルスタットカルシウム、イメテルスタットバリウム、イメテルスタットマグネシウム、イメテルスタットアルミニウム、Ｆｅ（ＩＩまたはＩＩＩ）イメテルスタット、及び第二銅イメテルスタット塩の調製を調査した。
【０１６６】
塩交換の３つの方法：強カチオン交換樹脂（ＦＩＮＥＸ  ＭＦＧ  ２１０）の使用、沈殿、及び単純な溶解を調べた。イメテルスタットナトリウムをＣａＣｌ２、ＢａＣｌ２またはＭｇＣｌ２で交換した樹脂に通したところ、溶出液は微細粉末を含有しており、イメテルスタット主鎖からのナトリウム対イオンの交換に成功し、カルシウム、バリウムまたはマグネシウム対イオンで置換されたことを示していた。カチオン交換樹脂を平衡化した他の５つの試薬（ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＡｌＣｌ３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３）について、イメテルスタット溶液を通したところ、カラム内の樹脂の頂部が凝集しており、こちらも、イメテルスタット主鎖からのナトリウム対イオンの交換に成功したことを示していた。
【０１６７】
過剰な塩試薬を用いて沈殿及び溶解方法も試験した。大過剰の塩試薬（例えば９００当量）をイメテルスタットナトリウムで処理したところ、沈殿物が形成された。濾過によって沈殿物を単離した。その後の試験は、イメテルスタットのすべてを沈殿物に変換するためには７〜５０当量の無機塩試薬が必要であったことを示す。
【０１６８】
５当量の３つの無機塩（Ｍｇ、ＢａまたはＣａ）を、それぞれイメテルスタットＴＥＡ（トリエチルアンモニウム）塩形態またはイメテルスタットＮａ塩形態のいずれかで処理した。沈殿が発生しなかったことを確認し、溶液を脱塩して凍結乾燥させた。フレームＡＡ（原子吸光法）による凍結乾燥粉末の分析は、イメテルスタットのナトリウム対イオンのいくつかが交換されたことを示していた。
【０１６９】
ＭｇＣｌ２でイメテルスタット形態に対して１〜９当量のマグネシウムカチオンを用いてさらなる実験を実施した。ナトリウム対イオンはＭｇ対イオンに部分的に交換されており、９当量のＭｇＣｌ２のときに最も多くの交換が発生し、得られた組成物ではＮａが１．２重量％、Ｍｇが１．１重量％と示された。
【０１７０】
実施例２：材料及び機器
【０１７１】
研究に用いた無機試薬、有機溶媒、及び他の材料を表１に記載する。Ｇｅｒｏｎによって提供されたＬｏｔ  ＃Ｇ１６３／Ｌ−Ｇ−１３００２のイメテルスタットナトリウム（ＣＡＳ  ＃１００７３８０−３１−５）を研究に用いた。イメテルスタットアンモニウムは、アンモニア及びエタノールを用いた固相合成担体からのイメテルスタットの切断により得られる粗組成物（例えばＵＳ  ２０１２０３２９８５８でＧｒｙａｚｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されている）であり、製造業者の在庫から入手した。イメテルスタットＴＥＡ（トリエチルアンモニウム形態）は、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）含有移動相を用いるＨＰＬＣ精製カラム溶出液から得られる組成物（例えばＵＳ  ２０１２０３２９８５８でＧｒｙａｚｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されている）であり、様々なプロセス開発研究から得られた製造業者の在庫から入手した。限外濾過は、１ＫＤ  ＰＥＳ膜を備えた攪拌式限外濾過セル（Ａｍｉｃｏｎ  ８４００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて実施した。凍結乾燥は高速真空濃縮機（ＳｃａｎＳｐｅｅｄ  ４０、ＬａｂｏＧｅｎｅ）を用いて行った。
【０１７２】
実施例３：手順
【０１７３】
イオン交換樹脂カラムによる交換
強カチオン交換樹脂、ＦＩＮＥＸ  ＭＦＧ  ２１０のカラムを調製してカラム体積を２００ｍＬ（４．６ｃｍ×１２ｃｍ）とし、樹脂を１Ｍ  ＮａＯＨ及び水で洗浄した。その後、対象とする各塩の１Ｍ溶液でカラムを平衡化した。これらの実験において、全部で８つの１Ｍ塩溶液を調製して用いた（ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＢａＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＡｌＣｌ２、ＦｅＣｌ２、及びＦｅＣｌ３）。１００ｍｇ／ｍＬのイメテルスタットナトリウム溶液５０ｍＬをカラムに加えた。
【０１７４】
ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＡｌＣｌ２、ＦｅＣｌ２及びＦｅＣｌ３平衡化カラムの場合、イメテルスタットナトリウムをカラム上に添加した際に、樹脂上のイメテルスタットの凝集がカラムの頂部で観察された。
【０１７５】
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２及びＢａＣｌ２で平衡化した３つのカラムでは、塩溶液からカラム上でのイメテルスタット凝集は発生せず、カラム溶出液からイメテルスタットが回収され、これは濁った溶液として観察された。遠心分離（４０００ｒｐｍ、２０分）によってこれらの溶出液から微細粉末を回収した。遠心分離の後、ＨＰＬＣ分析によって上清はイメテルスタットを含んでいないことが確認された。これは、イメテルスタットのカルシウム、マグネシウム及びバリウム塩の沈殿及び分離が成功したことを示す。
【０１７６】
沈殿による場合
【０１７７】
大過剰の対象とする無機塩（９００当量、重量基準）を用いて、イメテルスタットの二価または三価形態の結晶化または沈殿を調査した。１Ｍ塩溶液ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＢａＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＡｌＣｌ２、ＦｅＣｌ２、及びＦｅＣｌ３を調製した。３種類のイメテルスタット溶液：粗イメテルスタット溶液（アンモニウム塩）、精製イメテルスタット（トリエチルアンモニウム（ＴＥＡ）塩形態）、及びイメテルスタットナトリウム（Ｎａ塩形態）を各塩溶液と混合した。
【０１７８】
すべて混合溶液でイメテルスタットの沈殿物が見られ、Ａｄｖａｎｔｅｃ  ２濾紙での濾過によって容易に単離された。この結果は、イメテルスタットの多価塩の沈殿及び分離が成功したことを示す。
【０１７９】
次の溶媒：水、アセトニトリル、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、ＩＰＡ（イソプロピルアルコール）、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．１Ｍ  ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、及びＮＭＰを用いて、大過剰の塩試薬の条件下で単離した沈殿物の溶解性を最初に調査した。
【０１８０】
大過剰の塩試薬中で沈殿した塩について、イメテルスタットのカルシウム、バリウム、及びマグネシウム塩は０．１Ｍ  ＮａＯＨ及び１Ｍ  ＮａＣｌ溶液に可溶性であった（表２を参照）。大過剰のマグネシウム塩試薬から得られたイメテルスタット沈殿物の溶解性調査を、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で異なる濃度（２ｍｇ／ｍＬ〜６ｍｇ／ｍＬ）及び異なるｐＨ条件（ｐＨ８、９、１０、１１、１２）の下で行い、ＨＰＬＣによって分析した（図１のクロマトグラムを参照）。イメテルスタット沈殿物は６ｍｇ／ｍＬ及びｐＨ１１〜ｐＨ１２で可溶性であると観察された。この化合物はｐＨ１２まで沈殿することなく安定性も示した（図１）。
【０１８１】
溶解による場合
【０１８２】
３０〜５０当量の塩試薬
【０１８３】
対象とする塩試薬を段階的に加えることによって、イメテルスタットの完全な沈殿を達成することができる対象とする塩試薬の当量数を調査した。表３に記載の８つの塩について、沈殿物の完全な形成は加えた塩試薬が７〜５０当量の範囲で観察された。より大きい当量の塩試薬を加えたところ、すべての塩で沈殿によるゲル形成の傾向が観察された。
【０１８４】
３種類のイメテルスタット溶液：粗イメテルスタットアンモニウム（粗形態）、イメテルスタットトリエチルアンモニウム（精製ＴＥＡ塩形態）、及びイメテルスタットナトリウム（Ｎａ塩形態）を用いて、各塩溶液と混合した。イメテルスタットアンモニウム塩はＮＨ４ＯＨ溶液または水溶液のいずれかとして用いた。イメテルスタットアンモニウム及びイメテルスタットＴＥＡ溶液は、完全な沈殿を達成するために、それぞれ約５０当量または３０当量のＭｇ塩試薬を必要とした。
【０１８５】
イメテルスタットＴＥＡ溶液及びイメテルスタットアンモニウム溶液から形成された沈殿物の溶解性をｐＨ８〜ｐＨ１２の様々なｐＨ条件の下で調査した。混合溶液を室温で６時間おいた後、イメテルスタット−Ｍｇ沈殿物の溶解性を２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって分析した。イメテルスタットアンモニウム及びイメテルスタットＴＥＡから得られた沈殿物は両方とも、高ｐＨでより多くのイメテルスタット塩が１Ｍ  ＮａＣｌ溶液に溶解したという点で類似の傾向を示した（表３を参照）。
【０１８６】
この結果は、対象とする塩試薬のイメテルスタットに対する当量数を制御すると、イメテルスタット塩の完全な沈殿が任意の都合の良い方法によって達成され、首尾よく再溶解し得る沈殿物が生成され得ることを示している。
【０１８７】
５当量の塩試薬
【０１８８】
イメテルスタットナトリウム溶液（１ｍＬの水中に１００ｍｇ）を５当量の８つの塩試薬と混合し、攪拌式限外濾過セル及び１ＫＤ膜を用いた限外濾過によって各溶液を脱塩した。その後、限外濾過溶液を凍結乾燥した。得られた粉末をフレームＡＡ（原子吸光分光法）によってＮａ及び対象とする各金属対イオンについて分析した。図２及び３に示すように、最大の金属対イオン含有率はＺｎ、Ａｌ、及びＭｇでの１．１重量％であり、Ｎａ含有率はそれぞれ２．６％、１．７％、及び２．６％であった。
【０１８９】
６〜９当量の塩試薬
【０１９０】
６〜９当量のマグネシウム塩試薬をイメテルスタットナトリウム溶液に加え、その後の限外濾過及び凍結乾燥により完全に水溶性の固体生成物を得た。ナトリウム及びマグネシウム含有率の分析を実施した（図３の結果を参照）。イメテルスタットナトリウム溶液への９当量のＭｇＣｌ２の添加により、Ｎａ及びＭｇ対イオン含有率がそれぞれ１．１重量％及び１．２％重量％である組成物が生成される。
【０１９１】
１〜１０当量の塩試薬
【０１９２】
イメテルスタットナトリウム塩と比較したイメテルスタットＴＥＡ塩中のＴＥＡ対イオンとＭｇとの交換を調査するために、別の一連の実験を計画して実施した。水溶液中の１〜１０当量のＭｇＣｌ２をイメテルスタットＴＥＡ塩溶液（ＨＰＬＣによる純度＞９０％）と混合した。限外濾過及び凍結乾燥後にＭｇ対イオン含有率の分析を実施した。結果を図４に示す。最大１０当量のＭｇＣｌ２試薬の添加により、１．６重量％のＭｇを有する組成物が生成された。
【０１９３】
実施例４：結論
【０１９４】
カルシウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム、バリウム、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）及び銅塩を含むイメテルスタットの二価及び三価塩形態の調製が達成された。ポリヌクレオチドを沈殿させるために、選択した無機塩試薬を制御した過剰量で用いた場合（図２及び３を参照）、その後再溶解することができ、ＨＰＬＣ分析を用いた高速溶出不純物に関して純度の改善を示す沈殿物が形成された。
【０１９５】
マグネシウム塩試薬の使用により、交換ステップ後にイメテルスタットの可溶性固体沈殿物が生成された。１．１重量％のナトリウム対イオンに対して１．２重量％のマグネシウム対イオンを達成した沈殿物が生成された。
【０１９６】
二価または三価塩を用いたイメテルスタットの沈殿は、溶液中に残留する非目標合成生成物及び試薬の除去をもたらす。粗イメテルスタット溶液中に存在するそのような不純物の除去は、その後のイメテルスタットのクロマトグラフィー精製ステップにいくつかの利点、例えばカラム添加量の減少、分離度の改善、クロマトグラフィー精製ステップの数の減少及びクロマトグラフィーカラムの寿命の改善、精製コストの減少及びより高速な精製などをもたらす。
【表１】
2018513127.tif 000016
【表２】
2018513127.tif 000017
【表３】
2018513127.tif 000018
【０１９７】
添付の特許請求の範囲にもかかわらず、本明細書に記載の開示は以下の条項によっても規定される。
【０１９８】
１．７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有し、前記ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つがＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結しているポリヌクレオチド；ならびに
非目標合成生成物及び試薬；
を含む第１ポリヌクレオチド組成物を多価カチオン塩と接触させて、少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含む第１ポリヌクレオチド塩を沈殿させること；ならびに
前記第１ポリヌクレオチド塩を前記接触済み第１ポリヌクレオチド組成物から分離して、前記第１ポリヌクレオチド塩を含む第２ポリヌクレオチド組成物を生成すること；
を含むポリヌクレオチドの調製方法。
【０１９９】
２．前記第１ポリヌクレオチド塩を逆相クロマトグラフィー担体と接触させること；及びクロマトグラフィー担体から第２ポリヌクレオチド塩を含む第３ポリヌクレオチド組成物を溶出することをさらに含む、条項１に記載の方法。
【０２００】
３．前記ポリヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な１３以上のヌクレオシドサブユニットを含む配列を含む、条項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【０２０１】
４．前記ポリヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な１０〜５０の連続したヌクレオシドサブユニットを含む、条項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【０２０２】
５．ヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な前記ヌクレオシドサブユニットがすべてＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している、条項３〜４のいずれか１項に記載の方法。
【０２０３】
６．前記ポリヌクレオチドがＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号４）、ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）及びＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号５）からなる群から選択される配列を含む、条項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【０２０４】
７．前記ポリヌクレオチドが任意選択のリンカーを介して脂質部分と結合している、条項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【０２０５】
８．前記第２ポリヌクレオチド塩が以下の構造を有し、
【化１４】
2018513127.tif 000019
式中、各Ｍｘ＋が独立して水素またはカチオン対イオンであり、各ｘが独立して１、２または３であり、ｎが５〜１３の整数である、条項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【０２０６】
９．前記第２ポリヌクレオチド塩が前記ポリヌクレオチドの医薬品として許容可能な塩である、条項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０２０７】
１０．前記第２ポリヌクレオチド塩が前記ポリヌクレオチドの一価カチオン塩である、条項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【０２０８】
１１．前記第２ポリヌクレオチド塩が前記ポリヌクレオチドのナトリウム塩である、条項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【０２０９】
１２．前記ポリヌクレオチドを担体から切断して前記第１ポリヌクレオチド組成物を生成することをさらに含む、条項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【０２１０】
１３．前記第１組成物が前記ポリヌクレオチドの一価カチオン塩を含む、条項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【０２１１】
１４．前記接触ステップがカチオン交換担体から前記第１ポリヌクレオチド組成物を溶出することを含む、条項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【０２１２】
１５．前記分離ステップが前記接触済み第１ポリヌクレオチド組成物を遠心分離して前記ポリヌクレオチド塩の沈殿物をスピンダウンすることを含む、条項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【０２１３】
１６．前記分離ステップが前記接触済み第１ポリヌクレオチド組成物から前記ポリヌクレオチド塩を濾過することを含む、条項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【０２１４】
１７．前記第２ポリヌクレオチド組成物を前記逆相クロマトグラフィー担体上に直接添加する、条項２に記載の方法。
【０２１５】
１８．前記第２ポリヌクレオチド組成物を溶媒中に溶解させることをさらに含む、条項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【０２１６】
１９．前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンが二価である、条項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【０２１７】
２０．前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンがマグネシウム、亜鉛及びカルシウムからなる群から選択される、条項１９に記載の方法。
【０２１８】
２１．前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンが三価である、条項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【０２１９】
２２．前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンがアルミニウムである、条項２１に記載の方法。
【０２２０】
２３．前記ポリヌクレオチド塩が一価カチオン対イオンをさらに含む、条項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【０２２１】
２４．少なくとも１つの多価カチオン対イオンを含むポリヌクレオチドの塩を含み、前記ポリヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な７以上のヌクレオシドサブユニットの配列を有し、前記ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つがＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している、組成物。
【０２２２】
２５．前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンが二価である、条項２４に記載の組成物。
【０２２３】
２６．前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンがマグネシウム、亜鉛及びカルシウムからなる群から選択される、条項２５に記載の組成物。
【０２２４】
２７．前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンがマグネシウムである、条項２４〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【０２２５】
２８．前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンが三価である、条項２４に記載の組成物。
【０２２６】
２９．前記少なくとも１つの多価カチオン対イオンがアルミニウムである、条項２８に記載の組成物。
【０２２７】
３０．前記ポリヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドのポリアニオン主鎖に対して３ｍｏｌ％以上の前記多価カチオン対イオンを含む、条項２４〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【０２２８】
３１．前記ポリヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドに対して１．０重量％以上の前記多価カチオン対イオンを含む、条項２４〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【０２２９】
３２．沈殿物である、条項２４〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【０２３０】
３３．前記ポリヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な１３以上のヌクレオシドサブユニットを含む配列を含む、条項２４〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【０２３１】
３４．前記ポリヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な１０〜５０の連続したヌクレオシドサブユニットを含む、条項２４〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【０２３２】
３５．ヒトテロメラーゼのＲＮＡコンポーネントに相補的な前記ヌクレオシドサブユニットがすべてＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートサブユニット間結合によって連結している、条項２４〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
【０２３３】
３６．前記ポリヌクレオチドがＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号４）、ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ（配列番号３）及びＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号５）からなる群から選択される配列を含む、条項２４〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【０２３４】
３７．前記ポリヌクレオチドが任意選択のリンカーを介して脂質部分と結合している、条項２４〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【０２３５】
３８．前記ポリヌクレオチドが以下の構造を有し、
【化１５】
2018513127.tif 000020
式中、各Ｍｘ＋が独立してカチオン対イオンであり、各ｘが１、２または３であり、ｎが５〜１２である、条項２４〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【０２３６】
理解を明確にする目的で例証及び例示としてある程度詳細に上記の発明を記載したが、本発明の教示を踏まえて、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、ある程度の変更及び修正がなされ得ることが当業者にとって容易に明らかでる。
【０２３７】
したがって、前述は本発明の原理を単に例示しているに過ぎない。当業者であれば、本明細書で明示的に記載または提示していないが、本発明の原理を具現化し、その精神及び範囲内に含まれている様々な翻案を考案することができると理解されよう。さらに、本明細書で述べたすべての例及び条件的文言は主として、本発明の原理及び当該技術分野を発展させるために本発明者らによって提供された概念に対する読者の理解を助けることを意図しており、そのような具体的に述べた例及び条件に限定するものではないと解釈されるべきである。その上、本発明の原理、態様、及び実施形態、ならびにその具体例を説明する本明細書のすべての記述は、その構造的及び機能的両方の均等物を包含することを意図する。加えて、そのような均等物は、現在公知の均等物及び将来開発される均等物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす任意の開発された要素を含むことを意図する。したがって、本発明の範囲が本明細書に提示及び記載した実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲及び精神は添付の実施形態によって具現化される。上記の実施形態のすべての可能な組合せが本発明の範囲内に包含されると考えられる。
【図１】
2018513127.tif 000023
【図２】
2018513127.tif 000024
【図３】
2018513127.tif 000025
【図４】
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【配列表】
2018513127000001.app
【国際調査報告】
2018513127.tif 000027
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2018513127.tif 000029
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