(57)【要約】  本発明は、ホスファターゼの選択的な阻害剤を発見する方法を開示する。したがって、本発明は、試験化合物をスクリーニングして、化合物が、ホロホスファターゼに選択的にまたは非選択的に結合するかどうかを決定するための方法であって：ｉ）捕捉／固定化されている第１のホロホスファターゼを提供するステップと；ｉｉ）試験化合物を第１のホロホスファターゼに結合するその能力に関して試験するステップと；ｉｉｉ）捕捉／固定化されている第２のホロホスファターゼを提供するステップと；ｉｖ）同じ試験化合物を第２のホロホスファターゼに結合するその能力に関して試験するステップと；ｖ）試験化合物の前記第１のホロホスファターゼとの結合と前記第２のホスファターゼとの結合を比較するステップとを含み、ホロホスファターゼに結合する化合物が、前記第１のホロホスファターゼに選択的に結合するが、前記第２のホスファターゼに結合せず；または、前記第２のホロホスファターゼに結合するが、前記第１に結合せず；またはホロホスファターゼに結合する化合物が、前記第１のホロホスファターゼおよび前記第２のホロホスファターゼの両方に非選択的に結合する、方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物をスクリーニングして、化合物が、ホロホスファターゼに選択的にまたは非選択的に結合するかどうかを決定するための方法であって：
ｉ）捕捉／固定化されている第１のホロホスファターゼを提供するステップと；
ｉｉ）試験化合物を第１のホロホスファターゼに結合するその能力に関して試験するステップと；
ｉｉｉ）捕捉／固定化されている第２のホロホスファターゼを提供するステップと；
ｉｖ）同じ試験化合物を第２のホロホスファターゼに結合するその能力に関して試験するステップと；
ｖ）試験化合物の前記第１のホロホスファターゼとの結合と前記第２のホスファターゼとの結合を比較するステップと
を含み、
ホロホスファターゼに結合する化合物が、前記第１のホロホスファターゼに選択的に結合するが、前記第２のホスファターゼに結合せず；または、前記第２のホロホスファターゼに結合するが、前記第１に結合せず；またはホロホスファターゼに結合する化合物が、前記第１のホロホスファターゼおよび前記第２のホロホスファターゼの両方に非選択的に結合する、方法。
【請求項２】
前記第１および／または前記第２のホロホスファターゼが、触媒および１つまたは複数の調節サブユニットから構成されるオリゴマー酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ホロホスファターゼが、単離され、精製される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１および／または第２のホロホスファターゼの調節および／または触媒サブユニットが、２つのタグとともに発現され、２つのステップの手順において精製を促進する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ホロホスファターゼの調節サブユニットが、切断形態である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ホロホスファターゼが、再構成される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
試験化合物を結合するその能力に関して試験する前記ステップが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アプローチを使用して結合親和性を決定することによる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ホロホスファターゼが、表面に固定化されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ホロホスファターゼが、前記第１または第２の調節サブユニットを添加するステップ前に、最初に表面に触媒サブユニットを捕捉するステップによって再構成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
表面が、ＳＰＲ分析に適するチップである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ホロホスファターゼが、親和性捕捉方法を使用して固定化されている、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
親和性捕捉方法が、ビオチン：ストレプトアビジンを使用することである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１または第２のホロホスファターゼの調節サブユニットが、Ｒ１５Ａである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１または第２のホロホスファターゼの調節サブユニットが、Ｒ１５Ｂである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の触媒サブユニットが、ＰＰ１ｃである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
触媒サブユニットＰＰ１ｃが、チップに最初に固定化され、次にそれは調節サブユニットに結合される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｖｉ）触媒サブユニットが捕捉／固定化されている前記第１および第２のホロホスファターゼの触媒サブユニットを提供するステップと；
ｖｉｉ）前記候補ホスファターゼ阻害剤分子を、触媒サブユニットに結合するその能力に関して試験するステップと
をさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
検証アッセイにおいて候補ホスファターゼ阻害剤として試験化合物の活性を確認するステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載のスクリーニングの方法における使用のためのキット。
【請求項２０】
第１の表面に捕捉される第１のホロホスファターゼおよび第２の表面に捕捉される第２のホロホスファターゼを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２１】
前記第１および／または第２の表面が、ＳＰＲに適するチップである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２２】
ＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドを含む組成物。
【請求項２３】
ＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドを含む医薬組成物。
【請求項２４】
ミスフォールドしたタンパク質の蓄積またはプロテオスタシス障害に関連する障害における使用のための、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２５】
障害がハンチントン病である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２６】
対象に、治療有効量のＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドを投与するステップを含む、ミスフォールドしたタンパク質の蓄積またはプロテオスタシス障害に関連する障害を有する対象を処置する方法。
【請求項２７】
ミスフォールドしたタンパク質の蓄積またはプロテオスタシス障害に関連する障害の処置における使用のための医薬の製造における、ＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファターゼの選択的な阻害剤を発見する方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の可逆的なリン酸化により、細胞および生物体の機能の実質的に全ての側面が制御され、細胞はキナーゼおよびホスファターゼの拮抗作用を通した急激な変化に順応する。結果的に、リン酸化をターゲティングすることにより、幅広い治療機会が提供される、またキナーゼは、３０００種超の承認済み薬物と実験薬物を用いた今日の薬学的研究において最も普及している薬物標的として出現したものである。しかし、ホスファターゼをターゲティングすることは、原理的にキナーゼと同様に魅力的であると予想されるが、ホスファターゼの治療可能性は見過ごされてきた。
【０００３】
タンパク質リン酸化の大多数はセリンおよびトレオニン上で発生し、選択的なセリン／トレオニン脱リン酸化は、何百という多様な調節サブユニットのうちの１つと組み合わせた、ほんのわずかな触媒サブユニットの１つから集合させた何百という異なる二量体または三量体ホロ酵素によって達成される（Ｈｅｒｏｅｓら、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２８０、５８４〜５９５、２０１２）。
【０００４】
ホスファターゼは、いくつかの理由のため薬として開発することが困難であると一般に考えられることになった。例えば、多くのホスファターゼは、オリゴマー性である。したがって、ＰＰ１ｃなどのホロ酵素の触媒要素の阻害は、同じ触媒サブユニットを共有する多く（例えば、何百）のホロホスファターゼの阻害をもたらし、毒性である可能性がある。選択性は薬物の開発に重要な特性であることから、触媒性ホスファターゼの乱雑性のためにそれらを薬として開発することが困難であるとの評判があがることになった。
【０００５】
第２に、ホスファターゼの調節サブユニットは、内因的に無秩序であり（Ｂｏｌｌｅｎら、２０１０；Ｃｈｏｙら、２０１２ａ）、したがって、発現させることが困難であり、不安定である。およそ２００の哺乳動物ＰＰ１（タンパク質ホスファターゼ１）ホロホスファターゼのうち、わずかに８つが結晶化された。したがって、ホロホスファターゼにおける構造情報の欠如があり、このことは構造に基づく薬物設計が、このクラスの酵素には容易に適用可能ではないことを意味する。現在まで、構造情報が利用可能であるホロホスファターゼは、調節サブユニット由来の小ペプチド（およそ１００アミノ酸未満）のみを含有するものであり（Ｒａｇｕｓａ：２０１０ｈｄ；Ｃｈｏｙら、２０１４）、これらの小さい構造では創薬を導くことが困難となっている。
【０００６】
加えて、人工基質の基質の加水分解に基づく酵素アッセイは、一般に選択的ではない触媒阻害剤の発見を主にもたらす。
したがって、ホスファターゼを選択的に阻害する一般的な戦略およびアッセイを開発し、特異的な阻害剤、したがって、治療適用を有する薬物の同定を可能とする必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
最近、選択的にセリン／トレオニンホスファターゼを阻害する実現可能性が実証された。グアナベンズ（Ｔｓａｙｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３２、９１〜９４、２０１１；ＴｓａｙｔｌｅｒおよびＢｅｒｔｏｌｏｔｔｉ、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２８０、７６６〜７７０、２０１２）およびその誘導体は、セリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼ１のストレス誘発性調節サブユニットである、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／ＧＡＤＤ３４（「Ｒ１５Ａ」）を選択的に阻害することが見出され、タンパク質のミスフォールディングストレスに関連する疾患の処置として提案され、そのいくつかはＷＯ２０１４１０８５２０（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）に開示されている。同様に、グアナベンズ誘導体であるＳｅｐｈｉｎ１（Ｄａｓら、２０１５）は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／ＧＡＤＤ３４を選択的に阻害することが示された。したがって、Ｓｅｐｈｉｎ１は、タンパク質のミスフォールディングストレスに関連する疾患の処置として提案されている。他の誘導体は、例えば、ＷＯ２０１６００１３８９Ａ１、ＷＯ２０１６００１３９０Ａ１およびＷＯ２０１４１３８２９８Ａ１に開示され、類似する活性を保有することが提案される。しかし、選択性に関して改善されたアッセイは、これらの分子が、Ｒ１５Ａ阻害に選択的であるかどうかを確認するため必要とされる。
【０００８】
ホスファターゼの他の阻害剤が、予期せず同定されてきた。例えば、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６は、イムノフィリンタンパク質である、シクロフィリンおよびＦＫＢＰ１２にそれぞれ結合し、結果得られた複合体は、触媒サブユニットＰＰＰ３と２つの調節サブユニットＰＰＰ３Ｒ１またはＰＰＰ３Ｒ２のうちの１つから構成されるヘテロ二量体ホスファターゼであるカルシニュリンに結合する。シクロスポリンＡはホスファターゼ阻害剤であるが、それは間接的な経路によりそれを行っており：すなわち、シクロスポリンは、カルシニュリンホロホスファターゼの調節サブユニットを標的としない。
【０００９】
アロステリックなＷＩＰ１ホスファターゼが、報告されている（Ｇｉｌｍａｒｔｉｎら、２０１４）。この阻害剤は、酵素アッセイにおいて発見された。現在まで、ホスファターゼの選択的でアロステリックな阻害剤を同定するために利用可能なアッセイは存在しない。
【００１０】
要約すれば、ホスファターゼ阻害剤は以前に記載されていたが、それらが予期せず発見されたことに留意することが重要である。選択的なホスファターゼ阻害剤を包括的に同定するため利用可能な方法は、存在しない。
【００１１】
ホスファターゼの選択的でアロステリックな阻害剤を同定するための１つの様式は、それらの調節サブユニットをターゲティングすることからなる。Ｒ１５Ａ阻害剤は、予期せず同定され、セリン−トレオニンホスファターゼが、調節サブユニットをターゲティングすることによって選択的に阻害することができるとの概念の証拠が提供された（Ｄａｓら、２０１５；Ｔｓａｙｔｌｅｒら、２０１１）。原理的には、同じパラダイムを活用して多くの他のＰＰ１ホロホスファターゼのうちの１つを選択的に阻害することができるであろう。しかし、ホスファターゼの内因的に無秩序である調節サブユニットの選択的な阻害剤の合理的な発見は、満たされていない難題を代表する。
【００１２】
本発明は、ホロ酵素、例えば、ホスファターゼ（すなわち、ホロホスファターゼ）の選択的な結合を決定するためのアッセイ方法を提供する。適切なホロホスファターゼは、例えば（Ｈｅｒｏｅｓら、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２８０、５８４〜５９５、２０１２）の総説におけるような、Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼ１〜７（ＰＰ１〜７）を含む、リンタンパク質ホスファターゼ（ＰＰＰ）のスーパーファミリーのメンバーを含む。ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ（ＧＡＤＤ３４としても公知であり、本明細書において「Ｒ１５Ａ」と称される）およびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ（ＣＲｅＰとしても公知であり、本明細書において「Ｒ１５Ｂ」と称される）は、ＰＰ１ファミリーのホロホスファターゼである。
【００１３】
したがって、第１の態様において、試験化合物をスクリーニングして、化合物が、ホロホスファターゼに選択的にまたは非選択的に結合するかどうかを決定するための方法であって：
ｉ）捕捉／固定化されている第１のホロホスファターゼを提供するステップと；
ｉｉ）試験化合物を第１のホロホスファターゼに結合するその能力に関して試験するステップと；
ｉｉｉ）捕捉／固定化されている第２のホロホスファターゼを提供するステップと；
ｉｖ）同じ試験化合物を第２のホロホスファターゼに結合するその能力に関して試験するステップと；
ｖ）試験化合物の前記第１のホロホスファターゼとの結合と前記第２のホスファターゼとの結合を比較するステップと
を含み、
ホロホスファターゼに結合する試験化合物が、前記第１のホロホスファターゼに選択的に結合するが、前記第２のホスファターゼに結合せず；または、前記第２のホロホスファターゼに結合するが、前記第１に結合せず；またはホロホスファターゼに結合する化合物が、前記第１のホロホスファターゼおよび前記第２のホロホスファターゼの両方に非選択的に結合する、方法が提供される。
【００１４】
適宜、第１のホロホスファターゼに結合する試験化合物の能力および第２のホロホスファターゼに結合する同じ試験化合物の能力は、比較のため別々にホロホスファターゼの各々に対する試験化合物の結合親和性を決定するため、例えば、本明細書においてより詳細に記載されるような分離チップ、ビーズまたは反応混合物を使用して順次に試験される。
【００１５】
一実施形態において、ホロホスファターゼ、すなわち、前記第１および／または前記第２のホロホスファターゼは、触媒および１つまたは複数の調節サブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。実質的に全ての側面の細胞機能を調節する４００超のホスファターゼが存在し、例えば、Ｈｅｒｏｅｓら（２０１２）において論評される。少数の触媒サブユニットを共有する２００を超える調節サブユニットが存在する。ホスファターゼの調節サブユニットは、内因的に無秩序、すなわち、天然に組織化されておらず（Ｂｏｌｌｅｎら、２０１０；Ｃｈｏｙら、２０１２ａ）、それらの触媒サブユニットとの結合に際してのみ組織化されることになる傾向がある。このような天然に組織化されていない分子の阻害剤を同定するため以前に提供されていた方法は存在せず、このような方法の開発は一般に問題があることがその理由である。単独で使用される場合（タグ化または未タグ化）、ホスファターゼの天然に組織化されていない調節サブユニットは、全体的に不安定であるかまたは沈殿する。したがって、調節サブユニット単独を使用することにより、関連性のある生物学的活性の化合物が同定されることは可能ではなかった。
【００１６】
本方法は、相互作用パートナーに結合したときに天然に組織化されていないタンパク質である調節サブユニットを含有する複合体を生成させ、スクリーニングのためにそれを使用することを可能にし、したがって、このクラスのタンパク質が同定される新薬ターゲティングを可能にする。
【００１７】
適宜、ホロホスファターゼは、単離され、任意の利用可能な方法によって精製される。ホロホスファターゼは、例えば、細菌、昆虫または哺乳動物細胞発現系などの適切な発現系において、サブユニットとして発現することができる。サブユニットは、例えば、クロマトグラフィーなどの任意の適切な方法によって精製することができる。
【００１８】
上記の通り、ホロホスファターゼの調節サブユニットは内因的に無秩序であるので、発現および精製に関する特定の方法が必要とされ得る。したがって、一実施形態において、調節サブユニットをタグ化して、発現および精製を促進し得る。適宜、調節サブユニットは、２つのタグでタグ化され得る。適切なタグは、当業者によく知られており、例えば、親和性タグ、例えば、マルトース結合タンパク質−タグ、ｈｉｓ−タグなどを含む。特定の実施形態において、本明細書において記載される通り、Ｒ１５Ａ（および／またはＲ１５Ｂ）を精製するため、ＭＢＰ−タグをｈｉｓ−タグと組み合わせて使用してもよい。有利なことに、ＭＢＰ−タグ（マルトース結合タンパク質）が、大腸菌において発現される組換えタンパク質の溶解性を増加させる。ｈｉｓ−タグも親和性タグである。したがって、ＭＢＰ−触媒サブユニット−Ｈｉｓタグ化タンパク質は、２つのステップの手順において精製することができ、ＭＢＰ−Ｒ１５Ａ−Ｈｉｓについて本明細書において記載される通り、純粋な相対的に安定なタンパク質をもたらす。別の実施形態において、触媒サブユニットはまた、親和性タグなどのタグを含むように発現されてもよい。
【００１９】
したがって、一実施形態において、ホロホスファターゼは、サブユニットを集合させることによって再構成することができる。あるいは、異なるサブユニットは、適切な発現系（例えば、細菌、昆虫または哺乳動物細胞）において共発現することができ、ホロ酵素は、任意の適切な方法（例えば、クロマトグラフィー）によって精製することができる。
【００２０】
別の実施形態において、ホロホスファターゼは、クロマトグラフィーによるなどの任意の適切な方法による細胞抽出物から精製された内因性タンパク質であり得る。
本発明の任意の態様または実施形態の一実施形態において、調節サブユニットは、完全長サブユニットの切断型バージョンとして提供され得る。適宜、切断型バージョンは、触媒サブユニットに結合し、必要な触媒機能を保持する能力を保持する。例えば、本明細書において記載される通り、Ｒ１５Ａおよび／またはＲ１５Ｂの適切な切断型バージョンは、触媒サブユニットＰＰ１ｃに結合する能力を保持し、ｅＩＦ２αに結合し、脱リン酸化する、その触媒活性を保持するものである。一実施形態において、調節サブユニットがＲ１５Ａである場合、アミノ酸３２５−６３６を含む切断型断片として提供される。一実施形態において、調節サブユニットがＲ１５Ｂである場合、アミノ酸３４０−６９８を含む切断型断片として提供される。Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂのアミノ酸配列は、本明細書において図１６に与えられる。有利なことに、より短い断片を使用することにより、完全長タンパク質を使用して観察される、低いタンパク質収率および低い安定性における問題を克服することができる。しかし、Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂについて例示されているように、本明細書において記載される断片は、１００アミノ酸よりも小さい調節サブユニットの断片のみを含有する、以前に再構成されたＰＰ１ｃホスファターゼのものよりも大きい（Ｃｈｅｎら、２０１５；Ｃｈｏｙら、２０１５）。別の実施形態において、触媒サブユニットは、天然タンパク質の切断形態であり得る。適宜、そのような切断形態は、その調節サブユニットに結合する能力ならびにその触媒活性を保持するであろう。
【００２１】
一実施形態において、試験化合物を前記第１のホロホスファターゼ、前記第２のホロホスファターゼまたは前記触媒サブユニットに結合するその能力に関して試験する前記ステップは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アプローチを使用して結合親和性を決定することによる。
【００２２】
別の実施形態において、ホロホスファターゼは、表面上に固定化されている。適切な表面は、引き続いてなされる結合分析を可能にする任意のものである。例えば、表面は、ＳＰＲ測定に適する、チップ、例えば、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）センサーチップであり得る。他の実施形態において、表面は、ビーズもしくは樹脂または例えばマイクロプレートのウェルであり得る。適宜、ホロホスファターゼは、表面上への固定化によって再構成される。
【００２３】
別の実施形態において、ホロホスファターゼは、親和性捕捉方法または任意の関連性のある捕捉方法を使用して固定化されている。適切な親和性捕捉方法は、ビオチン：ストレプトアビジンまたは他の類似する結合ペア、例えば、ヒスチジン−ニッケル、ＧＳＴグルタチオンなどを使用することを含む。
【００２４】
一実施形態において、例えば、ＰＰ１ｃなどのホロ酵素の触媒サブユニットは、チップに最初に固定化され、次にそれは調節サブユニットに結合する。これは触媒サブユニットＡまたはＢが示される図３３に模式的に示される。
【００２５】
一実施形態において、ホロホスファターゼは、親和性タグ化サブユニットを使用してビーズにおいて再構成され得る。例えば、Ｈｉｓ−ＰＰ１および／またはＭＢＰ−Ｒ１５Ａ−Ｈｉｓは、ビーズにおいて再構成され得る。適切なビーズは、アミロースビーズを含む。適宜、ビオチン化タンパク質／ペプチドは、昆虫細胞においてインビボでのビオチン化を使用して生成され得る。一実施形態において、調節および触媒サブユニットにおいて使用されるタグは、異なっていてもよい。
【００２６】
別の実施形態において、本発明の任意の態様または実施形態に従ってホロホスファターゼ（または触媒サブユニット）に対する試験化合物の結合に関するアッセイは、溶液中で行われる。
【００２７】
一実施形態において、本発明の実施形態の任意の態様に従う試験化合物に関してスクリーニングするための方法は、以下の追加のステップ：
ｖｉ）捕捉／固定化されている前記第１および第２のホロホスファターゼの触媒サブユニットを提供するステップ；
ｖｉｉ）前記候補ホスファターゼ阻害剤分子を、触媒サブユニットに結合するその能力に関して試験するステップ
をさらに含む。
【００２８】
試験化合物の結合プロファイルとホロ酵素の触媒ドメインに対する結合との比較は、結合分子の選択性またはその欠如のプロファイリングにおける重要なステップであり得る。一実施形態において、目的の候補化合物は、触媒サブユニットを結合および／または阻害しないものであるが、１つの特異的な調節サブユニットと併せて触媒サブユニットを含むホロホスファターゼに関して選択的である。
【００２９】
追加のステップｖｉ）およびｖｉｉ）を含むアッセイ方法の文脈において、また図３３を参照して、Ａに結合し、候補選択的なＡ阻害剤（または賦活剤）である化合物は、優先的にチップＡに結合するが、ＢまたはＣには結合しない。Ｂに結合し、候補選択的なＢ阻害剤（または賦活剤）である化合物は、優先的にチップＢに結合するが、ＡまたはＣには結合しない。非選択的な結合剤または阻害剤は、１つより多くのチップに結合することができる。
【００３０】
別の実施形態において、方法は、選択的もしくは非選択的な阻害剤が、触媒サブユニット単独（例えば、酵素アッセイにおいて）に効果を有するまたは調節サブユニット（すなわち、ＡもしくはＢもしくは両方）の阻害剤もしくは賦活剤である阻害剤が触媒サブユニットに効果を有さないかどうかを決定することをさらに含む。
【００３１】
一実施形態において、試験化合物に関してスクリーニングするための方法は、他のアッセイにおいて特定の阻害／賦活活性に関して試験する確認的なアッセイを実施することをさらに含む。例えば、試験阻害剤または賦活剤は、標的エンゲージメントを実証する酵素アッセイまたは細胞に基づくアッセイにおいて検証してもよい。特定のホロ酵素の活性について適切なアッセイは、それらが関与する特定の細胞経路に依存する。ホロ酵素が基質として相互作用する分子の知識における任意の特定のホロ酵素について適切なアッセイは当業者に知られている。
【００３２】
標的エンゲージメントは、標的とされるホスファターゼに関する細胞ノックアウトまたはノックダウンに同じアッセイを反復することによって検証してもよい。ノックアウト細胞は従来の方法（例えば、遺伝子ノックアウトまたはＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓノックアウト）によって生成することができ、遺伝子サイレンシングはｓｉＲＮＡなどの任意の適切な方法によって達成することができる。標的の非存在下、選択的な化合物は、細胞において効果を有さない。
【００３３】
適宜、試験化合物のさらなる検証は、生物学的アッセイにおける検証によってもよい。標的の生物学的活性を明らかにする任意の適切なアッセイを使用することができる。例えば、標的がシグナル伝達に関与する場合、シグナル伝達経路の誘導は任意の方法（例えば、抗体に基づく方法、フローサイトメトリーなど）によってモニターすることができる。ホスファターゼ阻害剤または賦活剤は、シグナル伝達経路を変化させる。任意の他の生物学的アッセイは、標的阻害または活性化をモニターするため使用することができる。例えば、標的活性が細胞成長に影響を及ぼす場合には、アッセイは成長アッセイであり得、（標的活性が細胞生存に重要である場合）アッセイは死滅アッセイ（ｄｅａｔｈ  ａｓｓａｙ）であり得、（経路が化学物質からの保護に関与する場合）アッセイは化学物質からの保護などであり得る。
【００３４】
適宜、選択的なホスファターゼ阻害剤は、その基質のリン酸化を増加または延長する。一実施形態において、選択的な阻害剤は、１０μＭ未満、なおより好ましくは５μＭ未満、なおより好ましくは１μＭ未満およびなおより好ましくは０．５μＭ未満の濃度で提示される場合に、結合親和性または生物学的活性を有するものである。
【００３５】
本発明に従うアッセイ方法の例は、図３３に示される。
この例において、方法は、以下のステップ（図３３）からなる：
１．この例において、ホロホスファターゼ（Ａと呼ばれる）を単離および精製するステップ。
これは、内因性タンパク質の使用、または任意の適切な系（細菌、昆虫または哺乳動物細胞など）でサブユニットを発現させることのいずれかによってそれらを精製すること、およびホロホスファターゼを再構成することによる、任意の利用可能な方法によって実行することができる。この例において、ホスファターゼＰＰ１ｃの触媒サブユニットは、ストレプトアビジンＳＰＲチップにおける高親和性捕捉のためインビボでビオチン化される。
２．チップにホロホスファターゼを固定化するステップ
本明細書における例において、触媒サブユニットＰＰ１ｃは、チップに最初に固定化され、次にそれは調節サブユニット（本明細書における例において、ＡまたはＢ）に結合される。
３．ホロホスファターゼＡ（チップＡ）に結合する分子／試験化合物をスクリーニングするステップ
４．この例においてＢ（チップＢ）と呼ばれる異なるホスファターゼでステップ１〜３を反復するステップ
５．触媒サブユニットを使用してステップ１〜２を反復して、チップＣを生成するステップ
６．試験化合物の選択性を、それらのチップＡ、ＢおよびＣへの結合を試験することによってプロファイリングするステップ。
【００３６】
選択的なＡ阻害剤（または賦活剤）は、チップＡに優先的に結合するが、ＢまたはＣには結合しない。選択的なＢ阻害剤（または賦活剤）は、チップＢに優先的に結合するが、ＡまたはＣには結合しない。非選択的な阻害剤は、１つより多くのチップに結合することができる。
【００３７】
この方法によって同定される試験化合物は、触媒サブユニット単独における、それらの活性について試験することができる。調節サブユニットの選択的な結合剤または阻害剤または賦活剤は、触媒サブユニットに効果を有さない。
【００３８】
この方法によって同定される化合物は、標的エンゲージメントを実証する酵素アッセイまたは細胞に基づくアッセイを含む他のアッセイにおいて検証される。選択的なホスファターゼ阻害剤は、その基質のリン酸化を増加または延長する。標的エンゲージメントを検証するため、同じアッセイは、標的とされるホスファターゼに関するノックアウトまたはノックダウンされる細胞において反復される。標的の非存在下、選択的な化合物は、細胞において効果を有さない。
【００３９】
化合物は、生物学的アッセイにおいて検証され得る。特定の標的の活性を明らかにする適切なアッセイは、当業者によく知られている。
本発明の別の態様によると、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ（「Ｒ１５Ｂ」）を阻害できる候補ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物を同定するステップ、スクリーニングするステップ、評価するステップ、特徴づけするステップにおいて使用するための一連のアッセイ方法が提供される。
【００４０】
本発明のさらなる態様において、阻害剤化合物が記載される。
ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤は以前に記載されたが、異なるセリン／トレオニンホスファターゼの選択的な阻害剤は報告されていない。したがって、別のホスファターゼが選択的に阻害することができるかどうかは未知であった。出願人は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂを選択的に阻害することは可能であるかどうかおよびこのような選択的な阻害が有益となり得るかどうかを調査した。正常であるように見えるＰＰＰ１Ｒ１５Ａノックアウトマウスと反対に、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂが欠如するマウスは、出生後生活期間の初日を生存しない（Ｈａｒｄｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０６、１８３２〜１８３７、２００９）。したがって、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害は安全であると予想されたが、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害は有害であると予想された。しかし、本発明者らは、驚くべきことにＰＰＰ１Ｒ１５Ｂを選択的に阻害することができることおよびこのような阻害が治療の利益をもたらすことを見出した。
ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害の代わりにＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害は有利であり得る、その理由は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤で処置できる治療適応の数は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが発現され、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが疾患作用機序に存在する疾患に限定されると予想されるからである。対照的に、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂは、構成的に発現され、したがって、疾患標的により広く適用可能である。本明細書において記載される通り、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害は、ハンチントン病の処置において使用することができる。本発明において有用なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤は、タンパク質もしくはポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物であり得る。あるいは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂは、遺伝子編集によって不活化され得る。
【００４１】
一態様において、ＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド（本明細書において「ＴＳＴ３」としても称される）が提供される：
【００４２】
【化１】
2018517402.tif 000002
【００４３】
本発明の別の態様によると、療法における使用のための、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤が提供される。
本発明の別の態様によると、対象に、治療有効量のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤を投与するステップを含む、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によって軽減される病状を有する対象を処置する方法が提供される。
【００４４】
本発明の別の態様によると、対象に、治療有効量のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤を投与するステップを含む、対象における、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によって軽減される病状を予防する方法が提供される。
【００４５】
本発明の別の態様によると、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によって軽減される病状の処置または予防における使用のための、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤が提供される。
本発明の別の態様によると、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によって軽減される病状を処置または予防のための医薬の製造における、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤の使用が提供される。
【００４６】
一実施形態において、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によって軽減される病状は、ミスフォールドしたタンパク質の蓄積またはプロテオスタシス障害に関連する障害である。
さらなる実施形態において、疾患は、ハンチントン病、パーキンソン病、タウオパシー、タンパク質輸送疾患またはミエリン障害である。
【００４７】
別の実施形態において、疾患は、任意のポリグルタミン障害である。
さらなる実施形態において、疾患は、シャペロンＨＳＪ１において変異を有する遠位遺伝性運動性ニューロパシー（Ｄｉｓｔａｌ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）である。
【００４８】
本発明の別の態様によると、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害剤として、以下の構造から選択される、化合物または薬学的に許容されるその塩の使用が提供される：
【００４９】
【表１−１】
2018517402.tif 000003
【００５０】
【表１−２】
2018517402.tif 000004
【００５１】
以下、本発明の特定の実施形態は、以下の図面を参照して、例としてのみ記載される：
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例１のＲ１５Ｂ阻害剤とＲ１５Ｂ−ＰＰ１の選択的な結合をＲ１５Ａ−ＰＰ１と対比して示す図である。
【図２】実施例１の選択的なＲ１５Ｂ阻害剤が、ストレスの非存在下で細胞においてｅＩＦ２αの一過性のリン酸化を誘導し、細胞においてＲ１５Ａの発現を誘導することを示す図である。
【図３】実施例１の選択的なＲ１５Ｂ阻害剤が、ストレスから細胞を保護することを示す図である。
【図４】ストレスに続くｅＩＦ２αリン酸化における選択的なＲ１５Ｂ阻害剤の効果を示す図である。実施例１の化合物は、ストレスに続くｅＩＦ２α□リン酸化を延長させる。
【図５】広範な組織分布を呈する、実施例１の化合物の組織分布を示す図である。
【図６】実施例１の化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）でのマウスの処置が、毒性ではないことを示す図である。
【図７】実施例１の化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）でのマウスの処置が、グアナベンズの副作用を生じさせないことを示す図である。
【図８】実施例１の化合物での処置後の哺乳動物におけるＲ１５Ａの誘導を示す図である。
【図９】哺乳動物における疾患を予防することにおける、実施例１のＲ１５Ｂ阻害剤の有効性を示す図である。図９において使用される例は、マウスモデルＨＤ８２Ｇｌｎを使用したハンチントン病である（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、８、３８７〜４０７、１９９９）。ＷＴ：野生型マウス。Ｔｇ：ＨＤ８２Ｇｌｎ。
【図１０】ビヒクルまたは実施例１の化合物で処置された指示された遺伝子型における、培養された後根神経節（ＤＲＧ）からのミエリン節間を赤色（桿形状）および核を青色（球状の「斑点」形状）で示す図である。ＰＭＰ２２−変異体マウスにおけるミエリン節間は、より短い。実施例１の化合物での処置は、変異体ＤＲＧにおけるミエリン節間の長さを増加させたことから、ミエリン形成が改善されたことが明らかになる。
【図１１】実施例１の化合物での処置後の肥満マウスｄｂ／ｄｂ動物（１条件当たりｎ＝５）における血液グルコースレベルを示す図である。
【図１２】組換えタンパク質ＭＢＰ−Ｒ１５Ａ３２５〜６３６−Ｈｉｓ、ＭＢＰ−Ｒ１５Ｂ３４０〜６９８−Ｈｉｓを示すＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｃｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色ゲルを示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ビオチン化（ｂｉｏｔｙｎｉｌａｔｅｄ）グアナベンズ（Ｂｉｏ−ＧＢＺ）とＲ１５ＡおよびＲ１５Ｂの結合親和性を決定するため使用されるＳＰＲ法を例示する画像を示す図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＳＰＲセンサーチップ表面に固定化されたｂｉｏ−ＧＢＺに結合するＲ１５ＡおよびＲ１５ＢのＳＰＲセンサーグラムである。Ｒ１５Ａ／Ｂ濃度＝０．０２４４〜１２．５μＭ。
【図１４】図１３Ｂからの応答単位が、定常状態の結合定数（ＫＤ）を決定するためのタンパク質濃度に対するプロットを示す図である。Ｒ１５Ａ（○、青色）およびＲ１５Ｂ（▲、マゼンタ色）の結合。ｂｉｏ−ＧＢＺに対するＲ１５ＡのＫＤは１１μＭであり、ｂｉｏ−ＧＢＺに対するＲ１５ＢのＫＤは１２３μＭである。
【図１５】上のパネル：組換えｂｉｏ−ＰＰ１（部分的に精製）、ＭＢＰ−Ｒ１５Ａ３２５〜６３６−ＨｉｓおよびＭＢＰ−Ｒ１５Ｂ３４０〜６９８−Ｈｉｓ（インプット）を示すＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色ゲルを示す図である。ＢＡＰ−ＰＰ１ｃは、ニュートラアビジンビーズで精製され、Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂと結合していた（結合）。Ｂｉｏ−ＰＰ１ｃ＝ビオチン化ＰＰ１。下のパネル：ビオチン化ＰＰ１ｃを示す免疫ブロット。
【図１６】ヒトＲ１５ＡおよびＲ１５Ｂのアラインメントの図である。機能上関連するにもかかわらず、Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂは異なっており、わずか２３％の同一性を共有する。
【図１７】ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＳＰＲチップにおけるＲ１５ホロホスファターゼの再構成を描写する画像を示す図である。
【図１８】ＳＰＲセンサーチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃホロホスファターゼに結合するグアナベンズのＳＰＲセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍｓ）を示す図である。
【図１９】ＳＰＲセンサーチップに固定化されたＲ１５Ｂ−ＰＰ１ｃホロホスファターゼに結合するグアナベンズのＳＰＲセンサーグラムを示す図である。
【図２０】ＳＰＲセンサーチップに固定化されたＰＰ１ｃホロホスファターゼに結合するグアナベンズのＳＰＲセンサーグラムを示す図である。
【図２１】本発明のＳＰＲチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃ、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃおよびＰＰ１ｃに対するＧＢＺの定常状態の親和性を示す図である。ストレプトアビジンセンサーチップ表面に固定化されたＲ１５Ａ／ＰＰ１ｃ（○）およびＲ１５Ｂ／ＰＰ１ｃ（▲）に対するＧＢＺの結合。応答単位を、定常状態の結合定数（ＫＤ）を決定するため化合物濃度に対してプロットした。Ｒ１５Ａに対するＧＢＺのＫＤは０．１２２１μＭであり、Ｒ１５Ｂに対するＧＢＺについて結合は検出されなかった。
【図２２】本発明のＳＰＲチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃ、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃおよびＰＰ１ｃに対するＳｅｐｈｉｎ１の定常状態の親和性を示す図である。Ｒ１５Ａに対するＳｅｐｈｉｎ１のＫＤは０．７８６μＭであり、Ｒ１５Ｂに対しては２３μＭである。
【図２３】本発明のＳＰＲチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃ、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃおよびＰＰ１ｃに対するサルブリナルの定常状態の親和性を示す図である。
【図２４】本発明のＳＰＲチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃ、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃおよびＰＰ１ｃに対するＴＳＴ３の定常状態の親和性を示す図である。
【図２５】本発明のＳＰＲチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃ、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃおよびＰＰ１ｃに対する異なる化合物の定常状態の親和性を示す図である。ＧＢＺ、Ｓｅｐｈｉｎ１  Ｓａｌ００３およびＴＳＴ３ならびにｅＩＦ２αホロホスファターゼ（ｈｏｌｏｐｈｏｓｐａｔａｓｅｓ）またはＰＰ１ｃ単独についてのそれらのそれぞれの親和性（ＫＤ）を示す表である。（−−）：結合なし。少なくとも３つの独立した実験の代表的な結果が、各パネルに示される。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３である。ＫＤ値を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００分析ソフトウェア（Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０）による定常状態の親和性モデルで計算した。
【図２６】カリクリンＡ（ＰＰ１の触媒阻害剤）とは対照的に、ＧＢＺおよびＳｅｐｈｉｎ１と同様にＴＳＴ３はＰＰ１ｃを阻害しないことを示す図である。
【図２７】ＴＳＴ３は、Ｒ１５Ｂを選択的に阻害することによってｅＩＦ２αリン酸化を一過性に誘導することを示す図である。ＴＳＴ３を１０μＭで処置したＨｅＬａ細胞溶解物における示されるタンパク質の免疫ブロット。
【図２８】ＴＳＴ３は、Ｒ１５Ｂを選択的に阻害するが、Ｒ１５Ａを阻害しないため、タンパク質合成を一過性に低減させることを示す図である。ＴＳＴ３を１０μＭで示される時間で処置したＨｅＬａ細胞溶解物からの３５Ｓ−メチオニンで放射性標識された新しく合成されたタンパク質のオートラジオグラム。下のパネル：ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色。
【図２９】ＴＳＴ３は、ＧＢＺの存在下でタンパク質合成を持続的に阻害することを示す図である。ＴＳＴ３＋／−ＧＢＺを１０μＭで示される時間で処置したＨｅＬａ細胞溶解物からの３５Ｓ−メチオニンで放射性標識された新しく合成されたタンパク質のオートラジオグラム。下のパネル：ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色。
【図３０】ＴＳＴ３は、ＧＢＺの存在下でｅＩＦ２αリン酸化を持続性に誘導することを示す図である。ＴＳＴ３＋ＧＢＺを１０μＭで処置したＨｅＬａ細胞溶解物における示されるタンパク質の免疫ブロット。
【図３１】ＴＳＴ３活性は、ｒ１５ｂノックアウト細胞において消失することを示す図である。ＴＳＴ３を１０μＭで示される時間で処置したｒ１５ａｍｕｔ／ｍｕｔまたはｒ１５ｂｍｕｔ／ｍｕｔ  ＭＥＦｓ溶解物における示されるタンパク質の免疫ブロット。
【図３２】ＴＳＴ３は、ｒ１５Ｂ−／−細胞においてタンパク質合成に効果を有さないことを示す図である。上のパネル：ＴＳＴ３を１０μＭで示される時間で処置したｒ１５ａｍｕｔ／ｍｕｔまたはｒ１５ｂｍｕｔ／ｍｕｔ  ＭＥＦｓ溶解物からの３５Ｓ−メチオニンで放射性標識された新しく合成されたタンパク質のオートラジオグラム。
【図３３】本発明に従うアッセイ方法の例が示される。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
ｅＩＦ２αのαサブユニットのリン酸化は、種々のストレスに対する防御の第一線であり、アンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）および統合ストレス応答（ＩＳＲ）の２つの部分的にオーバーラップするシグナル伝達経路の中心的な要素である。ｅＩＦ２αリン酸化を逆転させるために、哺乳動物細胞は２つのｅＩＦ２αホスファターゼを有する。ｅＩＦ２αホスファターゼは、約２００の他のホスファターゼと触媒サブユニットＰＰ１ｃを共有する二量体ホロ酵素であり、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ（Ｎｏｖｏａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５３、１３４５〜１３５５、２００１）ストレス誘導性タンパク質または構成的に発現されるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ（Ｊｏｕｓｓｅら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６３、７６７〜７７５、２００３）の２つの関連した調節サブユニットのうちの１つに結合される。
【００５４】
ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ（「Ｒ１５Ａ」）阻害はＰＰＰ１Ｒ１５ＡおよびＰＰ１から構成されるストレス誘発性ｅＩＦ２αホスファターゼを選択的に阻害し、一方で、高度に関連する、構成的なホスファターゼＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１を節約する。ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害は、ストレスを受けた細胞におけるｅＩＦ２αリン酸化を延長し、これによりストレスを受けた細胞において長期的な翻訳の減弱がもたらされる。結果として、シャペロン有効性がストレスを受けた細胞において増加する、その理由は、新しく合成されたタンパク質のフォールディングの補助に通常従事するシャペロンは翻訳が低下した場合に有効となるからである。これにより、タンパク質フォールディングが支持され、細胞をタンパク質プロテオスタシス欠陥からレスキューする。したがって、原理的に、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤は、タンパク質のミスフォールディングストレスが関与する哺乳動物疾患を処置し得る。ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／ＧＡＤＤ３４ノックアウトマウスが大部分は野生型マウスと区別不能であるので安全と予想されることから、哺乳動物におけるＰＰＰ１Ｒ１５Ａの阻害は魅力的な治療可能性を有する（Ｍａｒｃｉｎｉａｋら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１８、３０６６〜３０７７、２００４）。しかし、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤で処置できる治療適応の数は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが発現され、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが疾患作用機序に存在する疾患に限定されると予想される。したがって、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａの阻害は、強力かつ安全であり得るが、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが関与する疾患に限定される。
【００５５】
ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害に関連する制限にかかわらず、シャペロン有効性を増加させるため翻訳を精密に調整することによってプロテオスタシスを回復させるアプローチは、ミスフォールドしたタンパク質が関与する広範囲の疾患を癒すため、理論上、強力であり、直接的であり、適用可能である。上記のように、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤の使用は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが発現され、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが疾患作用機序に存在する疾患に限定される可能性が最も高い。
【００５６】
選択的なＰＰ１阻害が使用され得る疾患の範囲を広がるため、本発明は、選択的なおよび／または非選択的なＰＰ１阻害剤を同定する方法を提供しようとするものである。
本明細書において使用する場合、用語「ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物からなる群から選択される選択的な阻害剤を指す。用語「ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ」は用語「Ｒ１５Ａ」と交換可能に使用される。適宜、「ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤」は、Ｒ１５Ｂおよび／またはＰＰＩｃと対比してＲ１５Ａに選択的な阻害剤である。選択的な阻害のためのアッセイは、本明細書において記載される。
【００５７】
本明細書において使用する場合、用語「ＰＰＰ１Ｒ１５ＡおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物からなる群から選択される選択的な阻害剤を指す。適宜、「ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤およびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤」は、Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂ両方に結合するおよび／またはそれらを阻害する阻害剤である。そのような阻害剤のためのアッセイは、本明細書において記載される。
【００５８】
本明細書において使用する場合、用語「ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物からなる群から選択される選択的な阻害剤を指す。用語「ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ」は用語「Ｒ１５Ｂ」と交換可能に使用される。適宜、「ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤」は、Ｒ１５Ａおよび／またはＰＰＩｃと対比してＲ１５Ｂに選択的な阻害剤である。選択的な阻害のためのアッセイは、本明細書において記載される。
【００５９】
一実施形態において、「選択的な阻害剤」は、Ｒ１５ＡまたはＲ１５Ｂなどの１つのホロホスファターゼと別のものとの間のＫＤ値における差が、領域において、３倍および、好ましくは３倍超、またはなおより好ましくは１０または２０倍である化合物として定義されてもよい。
【００６０】
試験化合物
本発明の実施形態の任意の態様に従うアッセイにおける使用のための試験化合物は、タンパク質もしくはポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物であり得る。一実施形態において、アッセイは、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物のライブラリーの試験化合物のライブラリーをスクリーニングすることを包含し得る。適切なハイスループットスクリーニング方法は、当業者に知られる。例えば、ハイスループットＳＰＲは、アレイを使用して行われ得る。
アッセイ
一実施形態において、本発明は、Ｒ１５Ｂに対して特異的な阻害剤に関するアッセイを参照して記載される。しかし、本明細書において記載される方法が、より一般に本発明の任意の態様または実施形態に従ってホロホスファターゼの特異的なまたは非特異的な阻害剤を同定するためのアッセイに等しく適用可能であることが理解されよう。
【００６１】
本明細書の実施例１〜４において記載される阻害剤は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１複合体に選択的に結合するが、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ−ＰＰ１複合体には結合しないか、または結合は有意に少ない。好ましくは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１複合体について１μＭ以下のＫＤを呈し、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ−ＰＰ１複合体について５倍超、好ましくは、１０倍超、またはなおより好ましくは少なくとも２０倍超の結合を呈する。
【００６２】
例えば、実施例１の化合物はＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１について０．０３５μＭおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ａ−ＰＰ１について１μＭのＫＤならびに実施例２の化合物はＰＰＰ１Ｒ１５Ａ−ＰＰ１について５μＭのＫＤおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１について０．１４３μＭのＫＤを有する。実施例２の化合物は、非選択的な阻害剤であると以前に考えられた（ＷＯ２０１４１０８５２０）。しかし、以前には、ＫＤ値を測定することは可能ではなかった。本明細書において記載される新規アッセイで、本発明者らはＫＤ値を確立し、実施例２の化合物について、親和性における差が３０倍超であることを明らかにした。したがって、実施例２は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１の選択的な阻害剤であると考えられた。実施例３はＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１について０．１４９μＭおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ａ−ＰＰ１について３．９３μＭのＫＤを有することが見出されたならびに実施例４の化合物はＰＰＰ１Ｒ１５Ａ−ＰＰ１について０．４５７μＭのＫＤおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１について０．０２２μＭのＫＤを有することが見出された。
【００６３】
本発明の一実施形態において、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａと対比してＰＰＰ１Ｒ１５Ｂを選択的に阻害する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物を決定するためのアッセイが提供される。別の実施形態において、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂと対比してＰＰＰ１Ｒ１５Ａを選択的に阻害する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物を決定するためのアッセイが提供される。さらなる実施形態において、ＰＰＰ１Ｒ１５ＢおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ａ両方を阻害する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物を決定するためのアッセイが提供される。
【００６４】
選択的な結合は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ単独に対してまたはＰＰ１との複合体におけるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂに対してであり得る。同様に、選択的な結合は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ単独に対してまたはＰＰ１との複合体におけるＰＰＰ１Ｒ１５Ａに対してであり得る。
【００６５】
別の実施形態において、競合的な結合アッセイであって、本明細書において開示される化合物をＰＰＰ１Ｒ１５Ｂおよび候補ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、もしくはその断片、ペプチド、または小分子化合物と接触させるステップならびに化合物とＰＰＰ１Ｒ１５Ｂとの間の相互作用における任意の変化を検出するステップを含む、アッセイが提供される。
【００６６】
あるいは、競合的な結合アッセイは、本明細書において開示される化合物をＰＰＰ１Ｒ１５ＢとＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの公知の基質の存在下で接触させるステップならびにＰＰＰ１Ｒ１５Ｂと前記公知の基質との間の相互作用における任意の変化を検出するステップを含み得る。
【００６７】
任意選択で、アッセイは、スクリーニングまたはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）として使用される。
結合アッセイを使用してＰＰＰ１Ｒ１５Ｂに結合する候補に関するスクリーニングに使用することができるが、候補の特性は必ずしも結合アッセイによって予想されない。したがって、候補がＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ機能を阻害するかどうかを評価するため他のアッセイが必要とされる。
【００６８】
本発明の別の実施形態において、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物から選択される候補のＰＰＰ１Ｒ１５ＢまたはＰＰＰ１Ｒ１５Ａの選択的な阻害を決定するための一揃いのアッセイであって：
ｉ）哺乳動物細胞を候補で処置するステップ；
ｉｉ）ｅＩＦ２αリン酸化を長期にわたりモニターするステップ；
を含み、
ｅＩＦ２αリン酸化の一過性の誘導は、ＰＰＰ１Ｒ１５ＢまたはＰＰＰ１Ｒ１５Ａの選択的な阻害を示すアッセイが提供される。
【００６９】
任意選択で、アッセイは、ハイスループットスクリーニングとして使用される。例えば、ｅＩＦ２αリン酸化は、これらに限定されないが、ｅＩＦ２αリン酸化の免疫学的検出（例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（商標）ホスホ−ｅＩＦ２α（Ｓｅｒ５１）アッセイ）などのＨＴＳに適した方法によって検出することができる。
【００７０】
選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は一過性のｅＩＦ２αリン酸化を誘導する、その理由は、ｅＩＦ２αがＰＰＰ１Ｒ１５Ａによって最終的に脱リン酸化されるからである。したがって、一過性にのみｅＩＦ２αリン酸化を誘導する化合物についてのスクリーニングにより、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤の同定がもたらされる。あるいは、ｅＩＦ２αリン酸化を直接的または間接的にモニターする任意の他の方法は、ＨＴＳに使用することができる。例えば：翻訳率をモニターすることにより、ｅＩＦ２αリン酸化が反映され；選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、翻訳率を一過性にのみ低減し、この特性をＨＴＳに使用して選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を同定することができる。ｅＩＦ２αリン酸化がＡＴＦ４、ＰＰＰ１Ｒ１５ＡおよびＣＨＯＰを誘導するので、これらの遺伝子またはタンパク質は、ｅＩＦ２αリン酸化がわずか一過性である場合に、本明細書において記載される条件下で選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を同定するスクリーニングにおけるレポーターとして使用することができる。
【００７１】
一実施形態において、候補化合物は、任意の実施例１〜４の化合物の従来のＳＡＲ修飾によって生成される。
別の実施形態において、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、なおより好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、およびよりなお好ましくは、少なくとも９０％によるストレスから細胞を保護できる。
【００７２】
例えば、実施例１の阻害剤は、ツニカマイシンによって引き起こされる細胞傷害性ＥＲストレスから細胞を保護する。ＥＲストレスに対する細胞保護作用は、任意の適切なアッセイによって測定することができる。例えば、Ｎ−グリコシル化をブロックすることにより、タンパク質フォールディングを阻止し、アンフォールドタンパク質応答を誘導する薬物であるツニカマイシンを含有する培地の添加によってＥＲストレスが誘発されるＨｅＬａ細胞で、細胞保護作用を測定することができる。標準的な細胞生存度キット（例えば、ＤｏｊｉｎｄｏのＣｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８）を使用してＷＳＴ−８からホルマザンへの還元を測定することによって設定期間後にＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤の存在下および非存在で細胞生存度を検出することができる。ＥＲストレスからの細胞保護作用は、ＥＲストレス後の生細胞（対照との比較）における百分率増加の観点で測定される。
【００７３】
拡大解釈すれば、実施例１の化合物は、ツニカマイシン誘導性ストレスに加えて、これらに限定されないが、例えば、タプシガルジンによって誘導されるストレス、タンパク質のミスフォールディングによって引き起こされるストレス、アミノ酸アナログ（例えば、アゼチジン、カナバニン）、還元剤（ＤＴＴ）および酸化的ストレスなどの他のタイプのストレスからも細胞を保護できる。
【００７４】
ストレスからの細胞保護作用を使用して、さらなるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を同定することができる。任意選択で、アッセイは、ハイスループットスクリーニングとして使用される。例えば、新しいＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を同定するために、ＨＴＳを使用して、ストレス下で細胞生存を測定することができる。
【００７５】
一実施形態において、ｉ）ＰＰＰ１Ｒ１５ＡおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂノックアウト細胞をＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤で処置するステップ、ならびに次にｉｉ）野生型、ＰＰＰ１Ｒ１５ＡおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂノックアウト細胞の生存度を比較するステップを含むＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤の選択性を決定する比較細胞生存度アッセイが提供される。
【００７６】
このアッセイは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤の選択性を実証するために使用されるアッセイに類似する。ＰＰＰ１Ｒ１５ＡまたはＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ活性が欠如する細胞は生存可能であるが、構成的（ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１）およびストレス誘発性（ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ−ＰＰ１）ｅＩＦ２αホスファターゼ両方が欠如する細胞は生存可能ではない（Ｈａｒｄｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０６、１８３２〜１８３７、２００９；Ｔｓａｙｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３２、９１〜９４、２０１１）。ＰＰＰ１Ｒ１５ＡおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂノックアウト細胞は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤の選択性を査定するため使用されてきた。グアナベンズは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂが欠如する細胞の生存度を低減させ、その理由は、ＰＰＰ１Ｒ１５ＡおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ活性両方の欠如が有害であるからである（Ｔｓａｙｔｌｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２８０、７６６〜７７０、２０１１）。したがって、本発明者らは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤での処置後に野生型、ＰＰＰ１Ｒ１５ＡおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂノックアウト細胞の生存度を比較することによって、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤の選択性が細胞において明らかにすることができることに理由を付けた。ＰＰＰ１Ｒ１５ＡおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ両方の不活性化は、致死性である（Ｈａｒｄｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０６、１８３２〜１８３７、２００９）。したがって、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤で処置されたＰＰＰ１Ｒ１５Ａ活性が欠如する細胞は、これらの生存度を選択的に低減させられ、これにより選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤の存在が確認される。
【００７７】
この細胞生存度アッセイは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが欠如するまたはＰＰＰ１Ｒ１５Ａが阻害されている細胞に対して選択的に毒性である、他のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を同定するＨＴＳのため使用することができる。そのような細胞は、従来の遺伝子不活性化法（例えば、ノックアウト、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９、ｓｉＲＮＡ）によって生成することができる。あるいは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａは、グアナベンズまたは任意の他の選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤で薬理学的に阻害することができる。選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤のみで処置された細胞よりもより高い程度まで、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤で処置された細胞の生存度を低減させる。
【００７８】
ホスファターゼ活性アッセイも、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤に関するスクリーニングのため使用してもよい。
一実施形態において、本発明は、選択的なホスファターゼ阻害剤を同定する方法を記載する。
【００７９】
キットおよび装置
本発明の他の態様または実施形態において、本発明に従う、使用のため配置されるおよび／またはスクリーニング方法のために使用される場合の、キットおよび／または装置が提供される。適切なキットおよび／または装置は、ＳＰＲチップまたはチップまたは固体表面（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）に対して付着する表面を通して第１および／または第２のホロホスファターゼを「提示する」ため生成される他の固体表面を含み得る。適宜、チップまたはビーズは、本明細書において記載される通りスクリーニング方法が行われることを可能にするような様式で配置され得る。
したがって、別の態様において、本発明の実施形態の任意の態様に従うスクリーニングの方法における使用のためのキットが提供される。適宜、前記キットは、第１の表面に捕捉される第１のホロホスファターゼおよび第２の表面に捕捉される第２のホロホスファターゼを含み得る。そのような第１および／または第２の表面は、ＳＰＲによる結合反応の分析に適したチップまたはビーズであり得る。一実施形態において、本発明の本態様に従うキットまたは装置は、本明細書において記載される通り、スクリーニング方法のために使用される場合のものである。
【００８０】
治療適用
ＰＰＰ１Ｒ１５Ａおよび／またはＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害剤を含む、本発明の任意の態様または実施形態に従うアッセイを使用して同定される阻害剤は、種々の疾患および障害を処置することおよび予防することにおいて、潜在的な治療適用を有する。ｅＩＦ２α脱リン酸の阻害は翻訳を低下させ、結果として、フォールディングを支持するシャペロンの有効性を増加させる。
【００８１】
本発明者らは、例えば、以下を示した：
・ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤（実施例１に記される化合物によって例示される）は、良好な組織分布を有する；
・ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害は、哺乳動物において安全である（図５、６、７）；
・ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害は、哺乳動物において疾患を予防する（図９）；および
・ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害は、哺乳動物において代謝性障害を低減させる（図１１）。
【００８２】
本発明の１つの態様は、療法における使用のためのＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤に関する。
本発明の別の態様は、対象に、治療有効量のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を投与するステップを含む、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によって軽減される病状を有する対象を処置する方法に関する。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、対象に、治療有効量のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を投与するステップを含む、対象における、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によって軽減される病状を予防する方法に関する。
【００８４】
本発明の別の態様は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によって軽減される病状の処置または予防における使用のための、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤に関する。
本発明のさらに別の態様は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によって軽減される病状を処置または予防のための医薬の製造における、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤の使用に関する。
【００８５】
ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ関連疾患は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂを阻害することによって改善させることができる疾患である。これらには、ミスフォールドしたタンパク質の蓄積またはタンパク質ホメオスタシス（プロテオスタシス）の混乱に関連する障害が含まれ、例えば、ハンチントン病ならびに別のポリグルタミン障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、運動失調症および他のポリグルタミン障害ならびに網膜変性、緑内障、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびプリオン病；微小管結合タンパク質タウの凝集に関連する障害、ならびに、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症およびパーキンソン認知症症候群、嗜銀顆粒性疾患（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性外傷性脳症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、ダウン症候群、家族性英国型認知症（ＦＢＤ）、家族性デンマーク型認知症（ＦＤＤ）、前頭側頭葉認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）および１７番染色体連鎖パーキンソン症候群（ＦＴＤＰ−１７）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカ病、グアドループパーキンソン症候群（Ｇａｕｄｅｌｏｕｐｅａｎ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、筋緊張性ジストロフィー、脳の鉄蓄積を伴う神経変性、Ｃ型ニーマンピック病、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン病（ｎｏｎ−Ｇｕａｍａｎｉａｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）、ピック病、脳炎後パーキンソン症候群、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、ＳＬＣ９Ａ６関連性精神遅滞、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、および球状のグリア封入を伴う白質タウオパシー；ミエリン障害、例えば、多発性硬化症、ペリツェウスメルツバッハー病、白質消失病、急性散在性脳脊髄炎、脳室周囲白質軟化症、脳室周囲白質傷害、脊髄癆、デビック病、視神経炎、進行性多巣性白質脳症、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、抗ＭＡＧ末梢性ニューロパシー（ａｎｔｉ−ＭＡＧ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、副腎脳白質ジストロフィー、副腎脊髄神経症、びまん性白質傷害（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ）、ギランバレー症候群、橋中央ミエリン溶解、白質ジストロフィーなどの遺伝性脱髄疾患、およびシャルコ−マリートゥース病；小胞体（ＥＲ）において作られる任意のタンパク質のミスフォールディングまたは輸送欠陥によって引き起こされる疾患、例えば、嚢胞性線維症、先天性甲状腺機能低下性甲状腺腫、家族性神経下垂体性糖尿病（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｎｅｕｒｏｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）、骨形成不全を含むプロコラーゲン生合成障害、高コレステロール血症、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、リソソーム障害、網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）（ＲＰ）、および炎症性腸疾患；代謝疾患、例えば、糖尿病、ウォルコットラリソン症候群、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、脂肪性肝疾患およ���アテローム性動脈硬化症；および関節リウマチ、１型糖尿病および白斑を含む他の障害が含まれる。
【００８６】
１つの好ましい実施形態において、例えば、任意の実施例１〜４の化合物に限定されないＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害剤は、病理学的なＵＰＲまたはＩＳＲおよび／またはタンパク質ホメオスタシスにおける欠陥に関連する障害を処置することにおける使用のためのものである。
【００８７】
一実施形態において、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、任意の実施例１〜４の化合物の構造を有する。
一実施形態において、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、実施例１の化合物の構造を有する。
【００８８】
別の実施形態において、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、実施例２の化合物の構造を有する。
さらなる実施形態において、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、実施例３の化合物の構造を有する。
【００８９】
さらに別の実施形態において、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、実施例４の化合物の構造を有する。
本明細書において使用する場合、用語「方法」は、化学、薬理学、生物学、生化学および医学技術分野の実務家に公知であるか、または該実務家によって公知の様式、手段、技術および手順から容易に開発されるかのいずれかである様式、手段、技術および手順を含むがこれらに限定されない、所与の作業を達成するための様式、手段、技術および手順を指す。
【００９０】
用語「治療有効量」は、治療されている疾患または障害の症状の１つまたは複数をある程度緩和するであろう、投与される化合物の量を指す。
本明細書において、用語「処置すること」は、疾患もしくは障害の進行を、抑止し、実質的に阻害し、遅らせ、もしくは逆行させること、疾患もしくは障害の臨床症状を実質的に改善させること、または疾患もしくは障害の臨床症状の出現を実質的に予防することを含む。
【００９１】
語句「医薬の製造」は、さらなる活性剤についてのスクリーニングプログラムにおけるまたはそのような医薬の製造の任意の段階における、その使用に加えて、直接的に医薬としての上記の化合物を含む。
【００９２】
作用機序において潜在的なタンパク質またはペプチドミスフォールディングおよび／または凝集を伴う疾患
疾患原因タンパク質（Ｄｉｓｅａｓｅ−ｃａｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、生涯を通じて発現されるが、変性疾患は主として遅発性である。このことは、異なる疾患原因タンパク質が、時間を経て次第に有害になることを示唆する。ミスフォールドしたタンパク質が別個の変性疾患の原因であることは現在十分に確立されているが、それらがなぜ蓄積するかは大部分が不確かなままである。細胞は、通常、タンパク質が、正確にフォールドし、実際全ての細胞が、数十年間も潜在的に有害なタンパク質を非常に効率的に取り扱う強力で洗練されたタンパク質品質管理システムを有することを保証するようにしている。しかし、タンパク質品質管理機構は年齢とともに次第に機能しないようであり、ミスフォールドしたタンパク質の蓄積につながるとともに、細胞および生物にとって結果的に破局的な結末をもたらす。これらのミスフォールドした／凝集性のタンパク質またはペプチドは、細胞の内側または外側に存在することができ、あらゆる位置に見出され得る。原理的には、ミスフォールドしたタンパク質に対する自然の細胞防御をブーストすることは、ミスフォールドした／凝集傾向タンパク質がその病理に存在する多様なタンパク質ミスフォールディング疾患における病状を低減させるために、一般的なアプローチを提示するはずである。本発明は、そのようなアプローチを記載し、哺乳動物においてその安全性および有効性の両方を実証する。
【００９３】
神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、運動失調症および他のポリグルタミン障害、タウオパシーならびに、網膜変性、緑内障、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびプリオン病は、致命的であり、加齢集団における多数の個体に影響を及ぼす。これらの疾患は、臨床的に多様であるが、共通の機構を共有する。それらは、異常型形状の特定のタンパク質の蓄積に起因して脳の選択的な領域中の特定の神経細胞の進行性の機能不全および死によって引き起こされる。ミスフォールドしたおよび凝集傾向タンパク質には、Ａβ４２、α−シヌクレイン、ＴＡＵ、ＴＤＰ−４３、ＴＬＳ／ＦＵＳ、ＳＯＤ１、ハンチントンおよびポリグルタミン伸張を有する他のタンパク質、プリオンおよびＣ９ＯＲＦ７２の翻訳産物が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
出願人は、実施例１の化合物が、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１を選択的に阻害し、マウスにおけるタンパク質ミスフォールディング疾患を癒すことを実証した。したがって、本発明において記載されるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害剤は、ミスフォールドしたタンパク質が、特にミスフォールドしたタンパク質の蓄積を伴って関与する種々の疾患の処置に治療適用を有する。
【００９５】
例として、出願人は、実施例１の化合物が、哺乳動物においてハンチントン病を改善させることを示した。したがって、理論に縛られるものではないが、例えば、任意の実施例１〜４の化合物であるが、限定されない、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害剤は、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、運動失調症および他のポリグルタミン障害ならびに、網膜変性、緑内障、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、タウオパシーおよびプリオン病が含まれるが、これらに限定されない、ミスフォールドした／凝集性タンパク質によって引き起こされる多様な疾患に対して保護作用を有することが考えられる。
【００９６】
本発明は、ポリグルタミン障害の療法を提供する。ハンチントン病は、無関係のタンパク質中でグルタミンに翻訳されるＣＡＧコドンの伸張を特徴とする「ポリグルタミン障害」という広範囲のグループの障害に属する。ハンチントン病は、ハンチントンをコードする遺伝子における伸張によって引き起こされ；脊髄性および延髄性筋萎縮、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、および脊髄小脳運動失調は、それぞれ、アンドロゲンレセプター、アトロフィン１、アタキシン１、２、３、α−電位依存性カルシウムチャネルサブユニットおよびＴＢＰをコードする遺伝子における伸張によって引き起こされる。ＣＡＧ伸張は、ポリグルタミンに翻訳され、影響を受けたタンパク質の凝集を引き起こす。したがって、これらのようなポリグルタミン障害の予防および／または処置は、本発明の範囲内である。
【００９７】
疾患は、ミスフォールディング／凝集が、今日公知のおよび上記のタンパク質とともに関与する任意の疾患を含むが、新しいタンパク質およびおそらく将来における新しい疾患にも適用される。
【００９８】
好ましい実施形態において、本発明は、プロテオスタシス疾患の療法を提供する。
別の実施形態において、例えば、任意の実施例１〜４の化合物であるが、限定されない、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害剤は、ミスフォールドしたタンパク質の蓄積が作用機序に関与する疾患を処置することにおける使用のためのものである。
【００９９】
さらなる実施形態において、疾患または障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、運動失調症または他のポリグルタミン障害、網膜変性、緑内障、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、タウオパシーまたはプリオン病である。
【０１００】
特定の実施形態において、任意の実施例１〜４のいずれかの化合物は、ハンチントン病の処置における使用のためのものである。
別の特定の実施形態において、任意の実施例１〜４のいずれかの化合物は、パーキンソン病の処置における使用のためのものである。
【０１０１】
一実施形態において、疾患または障害は、微小管結合タンパク質タウの凝集に関連する。
出願人は、実施例１の化合物が、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１を選択的に阻害し、マウスにおけるタンパク質ミスフォールディング疾患を癒すことを実証した。ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、同じ機構であるミスフォールドしたタンパク質の蓄積によって引き起こされる疾患の進行を、予防または停止するのにも有用であり得る。
【０１０２】
そのような疾患の例には、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン症候群および認知症、嗜銀顆粒性疾患、慢性外傷性脳症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、ダウン症候群、家族性英国型認知症（ＦＢＤ）、家族性デンマーク型認知症（ＦＤＤ）、前頭側頭葉認知症および１７番染色体連鎖パーキンソン症候群（ＦＴＤＰ−１７）（ＭＡＰＴ変異によって引き起こされる）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）（いくつかの事例はＣ９ＯＲＦ７２変異によって引き起こされる）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカ病、グアドループパーキンソン症候群、筋緊張性ジストロフィー、脳の鉄蓄積を伴う神経変性、Ｃ型ニーマンピック病、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン病、ピック病、脳炎後パーキンソン症候群、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、ＳＬＣ９Ａ６関連性精神遅滞、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、球状のグリア封入を伴う白質タウオパシーが含まれる。
【０１０３】
一実施形態において、疾患は、ミエリン障害である。
ミエリンは、中枢および末梢神経系の両方に豊富なタンパク質である。ミエリンは、末梢神経系中の中枢神経系中のオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞の２つの細胞型によって産生される。ミエリンは、軸索の周囲に鞘を形成して軸索に沿う電気的インパルスの伝導の速度を保証し、軸索からの散逸からの電流を防止する。ミエリン機能は、神経系にとって必須である。
【０１０４】
ミエリン障害は、世界中で２５０万人超に影響を及ぼし、ミエリンにおける損傷に関連する任意の疾患として定義される。ミエリン障害は、運動機能障害、感覚機能障害、認知機能不全、感情障害、および協調運動障害を含むが、これらに限定されない多様な症状によって顕在化する。
【０１０５】
多くの脱髄性障害が存在し、そのうちで最も共通するものは多発性硬化症（ＭＳ）である。多発性硬化症は、自己免疫疾患であり、脳および脊髄に影響を及ぼし、脳において脱髄を生じさせる。ＭＳに加えて、他の脱髄性障害には、ペリツェウスメルツバッハー病および白質消失病、急性散在性脳脊髄炎、脳室周囲白質軟化症、脳室周囲白質傷害、脊髄癆、デビック病、視神経炎、進行性多巣性白質脳症、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、抗ＭＡＧ末梢性ニューロパシー、副腎脳白質ジストロフィー、副腎脊髄神経症、びまん性白質傷害、ギランバレー症候群、橋中央ミエリン溶解、白質ジストロフィーなどの遺伝性脱髄疾患、およびシャルコ−マリートゥース（ＣＭＴ）病を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
ＣＭＴ疾患は、いくつかの遺伝子中の変異によって引き起こされるミエリンニューロパシーのグループである。末梢性ミエリンタンパク質ＰＭＰ２２中の変異は、ＣＭＴの最も共通する原因である。ＰＭＰ２２（Ｔｒｅｍｂｌｅｒ−Ｊ）中の変異は、ＰＭＰ２２のミスフォールディングを引き起こし、末梢神経系中のミエリンにおける欠陥に起因して、マウスにおいてヒトにおけるＣＭＴに似た疾患をもたらす。出願人は、実施例１の化合物が、神経障害性マウスからの外植片におけるミエリン形成を改善することができることを実証した。出願人は、神経障害性マウスからの外植片におけるミエリン形成を改善することが、哺乳動物における有効性を予想することを実証した（Ｄａｓら  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。したがって、実施例１の化合物は、機構が類似するおよびｅＩＦ２α経路が関与する（ＬｉｎおよびＰｏｐｋｏ、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１２、３７９〜３８５、２００９）ことが公知である、哺乳動物におけるＣＭＴおよび他のミエリン障害を処置することにおいて有用である。
【０１０７】
一実施形態において、Ｒ１５Ｂの阻害剤は、ミエリン障害を処置することにおける使用のためのものである。
別の実施形態において、例えば、任意の実施例１〜４の化合物であるが、限定されない、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害剤は、シャルコ−マリートゥース病を処置することにおける使用のためのものである。
【０１０８】
さらなる実施形態において、本発明のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、多発性硬化症などの中枢神経系のミエリン障害を処置することにおける使用のためのものである。ＣＭＴおよびＭＳの機構がミエリン産生細胞（ＣＭＴにおいてシュワン細胞およびＭＳにおいてオリゴデンドロサイト）の消耗に類似し、ｅＩＦ２α−ＲＲＲ１Ｒ１５Ａ経路の病理学的なシグナル伝達が関与することが公知である（ＬｉｎおよびＰｏｐｋｏ、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１２、３７９〜３８５、２００９）。出願人は、実施例１が、髄鞘障害に有効であることを実証し、中枢および末梢神経系の両方における実施例１の化合物のバイオアベイラビリティーも実証したので（図５）、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤が、多発性硬化症を処置することにおいて有用であることが見込まれる。
【０１０９】
一実施形態において、疾患は、ミスフォールディングおよびミスロカリゼーションまたは輸送欠陥を生じさせるタンパク質における変異の結果として出現する疾患である。
出願人は、実施例１の化合物が、小胞体（ＥＲ）において合成される１つのミスフォールドしたタンパク質ＰＭＰ２２によって引き起こされる欠陥をレスキューすることができることを実証した。作用機序（フォールディングを増加させる翻訳の減少）に起因して、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害剤が、本発明に従って、膜貫通または分泌タンパク質を含む、ＥＲにおいて作られる任意のタンパク質のミスフォールディングまたは輸送欠陥に起因する疾患の処置に関しても有用である。
【０１１０】
そのような疾患の例には、膜貫通タンパク質（ＣＦＴＲ）のフォールディングを損なわせる変異によって引き起こされる嚢胞性線維症；ホルモン  チログロブリンのミスフォールディングおよび／または輸送欠陥に起因するチログロブリン欠乏を伴う先天性甲状腺機能低下性甲状腺腫；循環性アルギニンバソプレッシンのミスフォールディングおよび非存在によって引き起こされる家族性神経下垂体性尿崩症（これには、特定の形態の遺伝的に受け継いだ腎性尿崩症も含まれ得る）；疾患がコラーゲンのフォールド、集合および合成の失敗によって引き起こされるプロコラーゲン生合成障害、例えば、骨形成不全であるが、これに限定されない；より一般には、タンパク質のミスフォールディング／合成の欠乏またはミスロカリゼーションが作用機序に存在する結合組織の任意の遺伝的な疾患、例えば、細胞外マトリックスのタンパク質の欠陥に関連する成長板異形成；合成の欠乏、細胞内輸送の変化、または異常な機能の原因となるＬＤＬレセプターにおける変異によって引き起こされる分子の欠陥を伴う、高コレステロール血症；アルファ１アンチトリプシンのミスフォールディングに起因するアルファ−１アンチトリプシン欠損症；リソソーム機能に関連するタンパク質のミスフォールディングに起因するリソソーム障害、例えば、ゴーシェ病、ニーマンピック病およびアンダーソンファブリー病；網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）（ＲＰ）、これはロドプシンタンパク質のミスフォールディング、それらのＥＲ滞留、そして結果的なＥＲストレスおよび細胞死によって引き起こされる遺伝性網膜変性の最も一般的な形態である；ならびにＥＲストレスに関連する炎症性腸疾患が含まれる。
【０１１１】
同じ理由により、本発明によるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害剤を使用して病理学的なＵＰＲおよび／または膜貫通タンパク質における欠陥に関連する以下の障害を処置することができる（ＬｉｎおよびＰｏｐｋｏ、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１２、３７９〜３８５、２００９）。これらの障害には、膜プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子における変異に関連するペリツェウスメルツバッハー病、および白質消失（ＶＷＭ）病ならびに多発性硬化症、一般的なミエリン障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
一実施形態において、本発明は、タンパク質のミスフォールディングおよびミスロカリゼーションまたは輸送欠陥をもたらすタンパク質における変異から発生する疾患の処置における使用のためのＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤に関する。
【０１１３】
別の実施形態において、タンパク質のミスフォールディングおよびミスロカリゼーションまたは輸送欠陥をもたらすタンパク質における変異から発生する疾患は、嚢胞性線維症、先天性甲状腺機能低下性甲状腺腫、家族性神経下垂体性尿崩症、プロコラーゲン生合成障害、例えば、骨形成、高コレステロール血症、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、リソソーム障害、例えば、ゴーシェ病、ニーマンピック病およびアンダーソンファブリー病、網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）および炎症性腸疾患から選択される。
【０１１４】
一実施形態において、疾患は、代謝疾患である。
代謝疾患、例えば、糖尿病、肥満、インスリン抵抗性、高脂血症、肝脂肪疾患、およびアテローム性動脈硬化症が、病理学的なＥＲストレスに関連することが公知であり、ＵＰＲの薬理学的なモジュレーターが、治療の利益を有し得ることが考えられる（ＣａｏおよびＫａｕｆｍａｎ、２０１２、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、ｖｏｌ．２２（１６））。しかし、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤が以前に利用可能ではなく、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害が有害であると予想されたので、さらにホスファターゼを阻害することが挑戦であったので、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂが代謝疾患における治療標的であり得るかについては不確かであった。
【０１１５】
本発明者らは、実施例１の化合物が、哺乳動物における代謝性障害を改善することができることを実証した（図１１）。したがって、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、例えば、糖尿病、肥満、肝脂肪疾患、およびアテローム性動脈硬化症に限定されない、代謝性障害を処置するため有用である。
【０１１６】
一実施形態において、本明細書において記載されるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、代謝性障害の処置における使用のためのものである。
好ましい実施形態において、代謝性障害は、糖尿病、肥満、肝脂肪疾患、およびアテローム性動脈硬化症から選択される。
【０１１７】
ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤は、作用機序にＵＰＲが関与する、関節リウマチ、糖尿病、ウォルコットラリソン症候群（Ｗｏｌｋｏｔｔ  Ｒａｌｌｉｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、炎症性腸疾患および白斑を含む、他の障害の処置においても有用である（ＣａｏおよびＫａｕｆｍａｎ、２０１２、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、ｖｏｌ．２２（１６））。
【０１１８】
タンパク質合成を低減させることにより、寿命が増加することが記載された（例えば、Ｔａｖｅｒｎａｒａｋｉｓ，Ｎ．（２００８）．（Ａｇｅｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｂａｌａｎｃｉｎｇ  ａｃｔ？Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１８（５）、２２８〜２３５．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｔｃｂ．２００８．０２．００４．を参照されたい）。したがって、Ｒ１５Ｂを阻害することによってタンパク質合成を低減させることが実証された本発明に従う化合物は、寿命を増加させる／加齢を低減させるための処置において使用され得る。
【０１１９】
化合物
本発明の一実施形態において、実施例１〜４の化合物およびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤としてのその使用が提供される：
【０１２０】
【表２−１】
2018517402.tif 000005
【０１２１】
【表２−２】
2018517402.tif 000006
【０１２２】
本明細書において記載される化合物は、グアナベンズなどの先行技術による化合物と比較してアドレナリン作動性α２Ａレセプターに向かう活性を有利に呈さない。このアルファ−２アドレナリン作動性活性における欠損は、化合物を、本明細書において開示される疾患および障害の処置において治療的に有用にする。対照的に、アドレナリン作動性活性を有するグアナベンズ誘導体は、治療的に使用することができない、その理由は、副作用、例えば、低血圧、傾眠、嗜眠および昏睡さえも引き起こすからである（Ｈａｌｌｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １０２、７８７〜７８８、１９８５）。アルファ−２アドレナリン作動性活性の非存在は、本発明の化合物が、血圧に何らかの有意な影響なく、前述の疾患を処置するために適した投薬量で投与することができることを意味する。
【０１２３】
塩およびエステル
本明細書の化合物は、塩またはエステル、特に薬学的に許容される塩またはエステルとして存在し得る。
【０１２４】
本明細書の化合物の薬学的に許容される塩は、その適切な酸付加塩または塩基塩を含む。適切な薬学的塩の総説は、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、６６、１〜１９（１９７７）中に見出され得る。薬学的にまたは獣医学的に許容されない塩であっても、中間体として価値のあるものとなり得る。
【０１２５】
エステルは、エステル化される官能基に応じて、有機酸またはアルコール／水酸化物のいずれかを使用して形成される。
鏡像異性体／互変異性体
先に論じた本発明の全ての態様において、本発明は、適切な場合、本発明の化合物の全ての鏡像異性体、ジアステレオ異性体および互変異性体を含む。当業者であれば、光学的性質（１つまたは複数のキラル炭素原子）または互変異性特性を保有する化合物を認識する。対応する鏡像異性体および／または互変異性体は、当技術分野において公知の方法によって単離／調製できる。鏡像異性体は、そのキラル中心の絶対配置によって特徴づけられ、Ｃａｈｎ、ＩｎｇｏｌｄおよびＰｒｅｌｏｇのＲおよびＳの順序付けルールにより表される。このような従来法は、当技術分野において周知である（例えば、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第３版、Ｍａｒｃｈ，Ｊ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５を参照されたい）。
【０１２６】
立体異性体および幾何異性体
本発明の化合物のいくつかは、立体異性体および／または幾何異性体として存在し得、例えば、それらは、１つまたは複数の不斉および／または幾何中心を保有し得るため、２以上の立体異性および／または幾何形態で存在し得る。本発明は、それらの阻害剤の個々の立体異性体および幾何異性体全て、ならびにそれらの混合物の使用を企図する。特許請求の範囲において使用される用語は、これらの形態が（必ずしも同程度までとは限らないが）適切な機能的活性を保持する限り、前記形態を包含する。
【０１２７】
本発明は、薬剤または薬学的に許容されるその塩の全ての適切な同位体変種も含む。本発明の薬剤または薬学的に許容されるその塩の同位体変種は、少なくとも１個の原子が、同じ原子番号を有するが自然界において通常見られる原子質量とは異なる原子質量を有する原子によって置き換えられているものとして定義される。薬剤および薬学的に許容されるその塩に組み込まれ得る同位体の例は、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆおよび３６Ｃｌなどの水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体を含む。薬剤および薬学的に許容されるその塩のある特定の同位体変種、例えば、３Ｈまたは１４Ｃ等の放射性同位体が組み込まれている変種は、薬物および／または基質組織分布研究において有用である。トリチウム化、すなわち３Ｈ、および炭素−１４、すなわち１４Ｃ同位体は、それらの調製の容易さおよび検出性によって特に好ましい。さらに、重水素、すなわち２Ｈ等の同位体による置換は、より優れた代謝安定性から生じるある特定の治療上の利点、例えば、インビボ半減期の増大または必要投薬量の低減を生じさせることができ、それ故、いくつかの状況においては好ましいことがある。例えば、本発明は、任意の水素原子が重水素原子によって置き換えられた実施例１〜４の化合物を含む。本発明の薬剤および本発明の薬学的に許容されるその塩の同位体変種は、概して、適切な試薬の適切な同位体変種を使用し、従来の手順によって調製され得る。
【０１２８】
プロドラッグ
本発明は、プロドラッグ形態の本発明の化合物、すなわち、任意の例示的な化合物による活性親薬物をインビボで放出する共有結合化合物をさらに含む。そのようなプロドラッグは、概して、ヒトまたは哺乳類対象への投与時に修飾を逆転できるように１つまたは複数の適切な基が修飾された本発明の化合物である。逆転は通常、そのような対象において自然に存在する酵素によって実施されるが、逆転をインビボで実施するために、そのようなプロドラッグと一緒に第２の薬剤を投与することが可能である。そのような修飾の例は、エステル（例えば、上述したもののいずれか）を含み、ここで、逆転はエステラーゼ等によって行われ得る。他のそのようなシステムは、当業者には周知である。
【０１２９】
溶媒和物
本発明は、本発明の化合物の溶媒和物形態も含む。特許請求の範囲において使用される用語は、これらの形態を包含する。
【０１３０】
多形体
本発明は、その種々の結晶形態、多形体形態および（無水）水和形態である本発明の化合物にさらに関する。そのような化合物の合成的調製において使用される精製および／または溶媒からの単離の方法をわずかに変更することにより、化学化合物がそのような形態のいずれかで単離され得ることは、製薬業界内で十分に確立されている。
【０１３１】
抗体
「抗体」の参照は、モノクローナル、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体を含むが、これらに限定されない。抗体は、ＶＨまたはＶＬドメインを含む、抗体断片または単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）であり得る。一実施形態において、抗体は、ヒトである。
【０１３２】
医薬組成物
本発明のさらなる態様によると、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を含む医薬組成物が提供される。一実施形態において、医薬組成物は、任意の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルと組み合わせた療法における使用のためのものである。
【０１３３】
用語「医薬組成物」は、本発明の文脈において、活性剤、または薬学的に許容されるその塩、および追加の１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を意味する。
【０１３４】
適切な薬学的に許容される賦形剤は、当業者に知られており、本発明のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を動物に投与するために適した許容される組成物、材料、担体、希釈剤またはビヒクルを一般に含む。
【０１３５】
一実施形態において、動物は哺乳動物である。別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
医薬製剤は、経口、局所（真皮、頬側、経眼および舌下を含む）、直腸または非経口（皮下、皮内、筋肉内および静脈内を含む）、例えば吸入による経鼻、眼内および経肺投与に適するものを含む。製剤は、適切な場合には、好都合なことに個別の投薬単位で提示されてよく、薬学技術分野において周知である任意の方法によって調製できる。
【０１３６】
投薬量は、患者の要求、処置される状態の重症度および採用される活性成分の特性に応じて変動してもよい。有効用量の決定は、過度の負荷なく当業者の権限の範囲内である。ヒトを含む哺乳動物への投与についての適切な剤形は、通常、最大で１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、または、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０１３７】
本発明のさらなる態様によれば、活性化合物を、例えば混合によって担体と会合させるステップを含む、上述した通りの医薬組成物の調製のためのプロセスが提供される。
概して、製剤は、活性剤を液体担体もしくは微粉化した固体担体または両方と均一で密接に会合させ、次いで、必要ならば、生成物を成形することによって調製される。本発明は、本明細書において開示される化合物を薬学的に許容される担体またはビヒクルと併用するかまたはそれらと連携させるステップを含む、医薬組成物を調製するための方法にまで及ぶ。いずれの方法も、活性化合物を液体担体もしくは微粉化した固体担体または両方と会合させるステップと、次いで、必要ならば、生成物を所望の製剤に成形するステップとを含む。
【０１３８】
一態様において、本明細書において記載される通り、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害によって軽減される疾患または障害の処置における使用のための医薬の製造における、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤の使用が提供される。
【０１３９】
組合せ
特に好ましい実施形態において、１つまたは複数の本発明のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、１つまたは複数の他の活性剤、例えば、市場で入手可能な既存の薬物と組み合わせて投与される。そのような事例では、本発明の阻害剤は、１つまたは複数の他の活性剤と連続的に、同時にまたは順次に投与され得る。
【０１４０】
概して、薬物は組み合わせて使用するとより有効である。特に、主要な毒性、作用機序および耐性機序の重複を回避するために、併用療法が望ましい。さらに、大部分の薬物は、それらの最大忍容用量で、そのような用量間の時間間隔を最小にして投与することも望ましい。薬物を組み合わせることの主要な利点は、生化学的相互作用により相加作用または考えられる相乗作用を促進し得ること、また耐性の発生を減少させ得ることである。
【０１４１】
有益な組合せは、特定の障害の治療において価値があることが公知のまたは疑われる薬剤を有する、試験阻害剤の阻害活性を研究することによって示唆され得る。この手順を使用して、薬剤の投与順序、すなわち、送達の前か、同時か、後かを決定することもできる。そのようなスケジューリングは、本明細書において同定される全ての活性剤の特色となり得る。
【０１４２】
別の態様または実施形態において、本発明は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤およびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤に関するスクリーニングの方法に関する。本発明は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂを選択的に阻害する化合物および療法におけるその使用にさらに関する。
【０１４３】
したがって、本発明のさらなる態様および実施形態は、発明のステートメントとして提供される以下の番号が付けられた条項において提供される：
１．ＰＰＰ１Ｒ１５Ａと対比してＰＰＰ１Ｒ１５Ｂを選択的に結合する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物を同定するおよび／または決定するためのアッセイ方法。
２．ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤をＰＰＰ１Ｒ１５Ｂおよび候補ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチド、または小分子化合物と接触させるステップならびにＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤とＰＰＰ１Ｒ１５Ｂとの間の相互作用における任意の変化を検出するステップを含む、競合的な結合アッセイである、条項１に記載のアッセイ。
３．スクリーニングまたはハイスループットスクリーニングとして使用される、条項２に記載のアッセイ。
４．ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物から選択される候補のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害を決定するためのアッセイであって：
ｉ）哺乳動物細胞を候補で処置するステップ；
ｉｉ）ｅＩＦ２αリン酸化を長期にわたりモニターするステップ；
を含み、
ｅＩＦ２αリン酸化の一過性の誘導は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害を示すアッセイ。
５．ハイスループットスクリーニングとして使用される、条項４に記載のアッセイ。
６．ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤の選択性を決定するための細胞生存度アッセイであって：
ｉ）細胞をＰＰＰ１Ｒ１５１Ｂ阻害剤で処置するステップ；
ｉｉ）生存度を野生型、ＰＰＰ１Ｒ１５１ＡおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂノックアウト細胞の生存度と比較するステップ；
を含み、
処置された細胞における生存度における低減は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤の存在を示すアッセイ。
７．ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチドまたは小分子化合物から選択される候補のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害を決定するためのアッセイであって：
ｉ）哺乳動物細胞または生物を候補で処置するステップ；
ｉｉ）ＰＰＰ１Ｒ１５Ａを長期にわたりモニターするステップ；
を含み、
一過性の誘導ＰＰＰ１Ｒ１５Ａは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害を示すアッセイ。
８．療法における使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
９．ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害によって軽減される疾患または障害の予防または処置における使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
１０．疾患または障害がプロテオスタシス疾患である、条項９に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
１１．プロテオスタシス疾患がハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、タウオパシー、運動失調症、網膜変性、緑内障、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはプリオン病である、条項１０に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
１２．疾患がハンチントン病である、条項１１に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
１３．疾患がパーキンソン病である、条項１１に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
１４．疾患がタウオパシーである、条項１１に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
１５．疾患がタンパク質輸送疾患である、条項９に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
１６．疾患または障害がミエリン障害である、条項９に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
１７．ミエリン障害が、多発性硬化症、ペリツェウスメルツバッハー病、白質消失病、急性散在性脳脊髄炎、脳室周囲白質軟化症、脳室周囲白質傷害、脊髄癆、デビック病、視神経炎、進行性多巣性白質脳症、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙｌ）、抗ＭＡＧ末梢性ニューロパシー、副腎脳白質ジストロフィー、副腎脊髄神経症、びまん性白質傷害（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ）、ギランバレー症候群、橋中央ミエリン溶解、白質ジストロフィーまたはシャルコ−マリートゥース病である、条項１６に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
１８．疾患または障害が、嚢胞性線維症、先天性甲状腺機能低下性甲状腺腫、家族性神経下垂体性糖尿病（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｎｅｕｒｏｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）、骨形成不全を含むプロコラーゲン生合成障害、高コレステロール血症、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、リソソーム障害、網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）または炎症性腸疾患である、条項９に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
１９．疾患または障害が代謝疾患である、条項９に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
２０．代謝疾患が、糖尿病、ウォルコットラリソン症候群、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、脂肪性肝疾患またはアテローム性動脈硬化症である、条項１９に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
２１．疾患または障害が、関節リウマチ、１型糖尿病または白斑である、条項９に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
２２．疾患または障害が、微小管結合タンパク質タウの凝集に関連する、条項９に記載の使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤。
２３．対象に、治療有効量のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を投与するステップを含む、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によって軽減される病状を有する対象を処置する方法。
２４．条項１から４のいずれか一項に記載のアッセイ、条項８から２２のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤または条項２３に記載の処置の方法、ここで、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤は、以下から選択される化合物である：
（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；
（Ｅ）−２−（２−クロロ−４−フルオロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；
（Ｅ）−２−（３，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；および
（Ｅ）−２−（２，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド。
２５．ハンチントン病の処置における使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤、ここで、阻害剤は、以下から選択される化合物である：
（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；
（Ｅ）−２−（２−クロロ−４−フルオロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；
（Ｅ）−２−（３，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；および
（Ｅ）−２−（２，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド。
２６．パーキンソン病の処置における使用のための、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤、ここで、阻害剤は、以下から選択される化合物である：
（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；
（Ｅ）−２−（２−クロロ−４−フルオロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；
（Ｅ）−２−（３，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；および
（Ｅ）−２−（２，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド。
２７．ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ選択的な阻害剤としての
（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；
（Ｅ）−２−（２−クロロ−４−フルオロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；
（Ｅ）−２−（３，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド；および
（Ｅ）−２−（２，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド
から選択される化合物の使用。
【実施例】
【０１４４】
実施例Ａ
本発明による化合物の調製
本発明による化合物は、以下の手順により調製することができる：
一般的手順Ａ：
エタノール（３００ｍｌ）中のベンズアルデヒドの溶液（１当量）に、順次に塩酸アミノグアニジン（１当量）および酢酸ナトリウム（１当量）を２５℃で添加した。得られた反応混合物を、８０℃で次の約６時間加熱した。反応完了を、ジクロロメタン／メタノール（８／２）を移動相として使用したＴＬＣでモニターした。反応の完了後、反応混合物を、２５℃に冷却させ、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液（７００ｍｌ）に入れた。得られた沈殿物を、真空下で濾別し、水（１００ｍｌ）で洗浄した。得られた固形物を、ジエチルエーテル（２×２５ｍｌ）で粉砕して、真空下で乾燥して、所望の置換されたアミノグアニジン誘導体を得た。
以下の化合物を、一般的手順Ａにより調製した：
実施例１：（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド
一般的手順Ａに従って２，３−ジクロロベンズアルデヒドから８５％収率で調製した（モノアセタート塩と考慮）ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２３１．２３（Ｍ＋Ｈ）。1H-NMR (DMSO-d6): δ(ppm) 11.85 (brs, 1H); 8.35 (s, 1H); 8.19-8.21 (dd, 1H); 7.56-7.59 (dd, 1H); 7.32-7.36 (t, 1H); 7.04 (brs, 4H); 1.84 (s, 3H); MS (ESI+): m/z = 231.23 [M+H]+
実施例２：（Ｅ）−２−（２−クロロ−４−フルオロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド
一般的手順Ａに従って２−クロロ−４−フルオロベンズアルデヒドから６７％収率で調製した。1H-NMR (DMSO-d6): δ(ppm) 5.80 (brs, 2H); 5.84 (brs, 2H); 7.19-7.34 (m, 4H); 8.16 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 215.1 [M+H]+
実施例３：（Ｅ）−２−（３，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド
一般的手順Ａに従って３，４，５−トリクロロベンズアルデヒドから７０．８８％収率で調製した。
1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 7.96 (s, 2H); 7.89 (s, 1H); 6.20 (brs, 2H); 5.69 (brs, 2H); MS (ESI+): m/z = 265.1 [M+H]+
実施例４：（Ｅ）−２−（２，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド
一般的手順Ａに従って２，４，５−トリクロロベンズアルデヒドから７８．７６％収率で調製した。
1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 8.43 (s, 1H); 8.12 (s, 1H); 7.77 (s, 1H); 6.33 (brs, 2H); 5.83 (brs, 2H); MS (ESI+): m/z =265.17 [M+H]+
タンパク質発現、精製および表面プラズモン共鳴による分析
タンパク質発現および精製
ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ３２５−６３６およびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ３４０−６９８を発現させ、次の通り精製した：ＰＰＰ１Ｒ１５Ａの３２５−６３６およびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの３４０−６９８のアミノ酸をコードするｃＤＮＡをＨｉｓ−タグ化し、ｐＭＡＬ−ｃ５ｘにクローニングした。Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂのアミノ酸配列は、図１６に記される。組換えＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／ＢをＢＬ２１−Ｇｏｌｄ細胞において発現させ、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＭＢＰＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ヒトＰＰ１γ（ＰＰ１ｃ）をコードするｃＤＮＡを、バキュロウイルストランスファーベクターｐＤＷ４６４にクローニングしてビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）を付加した。ベクターは、大腸菌ビオチンホロ酵素合成酵素（ＢｉｒＡ）もコードするため、ＢＡＰ−タグ化タンパク質をＳｐｏｄｏｐｔｅｒｅ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞中でインビボでビオチン化することができる（Ｄｕｆｆｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６２、１２２〜１２８、１９９８）。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して組換えバクミドＤＮＡを生成し、Ｓｆ９昆虫細胞を使用してウイルスストックを増幅した。培養物を１，２００ｇで１５分間遠心分離することによって採取し、細胞ペレットを溶解緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ、５％グリセロール、１ＰｉＣ錠剤（Ｒｏｃｈｅ）／５０ｍｌおよび０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）に再懸濁し、続いて穏やかに超音波処理した。タンパク質を最初に５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって確認された陽性画分を、プールし、約１μＭに濃縮し、−８０℃で貯蔵した。
【０１４５】
ＳＡセンサーチップにおけるビオチン−ＰＰ１の捕捉
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムを全ての実験に使用し、ビオチン化ＰＰ１をセンサーチップＳＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００５−３１）を使用して捕捉した。ストレプトアビジンでコーティングした表面を、５０ｍＭ  ＮａＯＨおよび１Ｍ  ＮａＣｌの溶液の１分間注入によって活性化した。ビオチン−ＰＰ１を、ランニング緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈し、およそ３００ｎＭ濃度で、直接的にストレプトアビジンでコーティングした表面に１００秒または約７０００ＲＵに対応するビオチン−ＰＰ１の固定化レベルに達するまで注入した。ブランク固定化を、参照として使用するため、ＳＡセンサーチップ表面の１つについて実施した。
【０１４６】
ビオチン−ＰＰ１表面を使用した小分子とｅＩＦ２αホロホスファターゼ複合体の定常状態の結合定数の決定
軽微な偏りはあるが、同じ手順および条件を全ての結合実験に使用した。小分子を、１００％ＤＭＳＯ中に５０ｍＭ貯蔵溶液として貯蔵した。結合定数の決定の前、化合物の１２または８つの濃度のいずれかの連続希釈を、９６ウェルプレートのランニング緩衝剤で調製した。各々の化合物希釈系列より前に、調節サブユニットＲ１５ＡまたはＲ１５Ｂを、ランニング緩衝剤で１５μＭに希釈し、ビオチン−ＰＰ１表面に捕捉させ、センサーチップ表面にホロホスファターゼ複合体を形成させた。次いで、表面を再生することなく、化合物希釈系列をチップの表面上に注入した。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００査定ソフトウェアを使用して分析し、結合定数を定常状態モデルに基づいて決定した。速度実験は異なる濃度の化合物を使用して行い、それらそれぞれの平衡結合レベルを決定した。これらの平衡応答レベル（Ｒｅｑ）は、濃度に対してプロットされ、グローバルフィットを使用してフィッティングされ、これにより定常状態親和性定数を決定できる（すなわち、５０％飽和での濃度がＫＤである）（Ｆｒｏｓｔｅｌｌ−Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４３、１９８６〜１９９２、２０００）。
【０１４７】
哺乳動物細胞培養
ＨｅＬａ細胞を、それぞれ、ペニシリン、ストレプトマイシンを補充し、５％および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＭＥＦ細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、５５μＭ  β−メルカプトエタノール、１×非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。示される場合、細胞を、２．５μｇ／ｍｌツニカマイシン、１ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）および／または示した化合物を示した濃度で処理した。
【０１４８】
免疫ブロットによるタンパク質分析
免疫ブロットに関して、ＨｅＬａ細胞（細胞８０，０００個／ｍｌ）を、各実験の２４時間前に１２ウェルプレートにプレーティングした。示した処理の直後、細胞を、７５μｌ  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝剤に溶解し、９５℃で５分間ボイルし、超音波処理した。タンパク質を、分離し、ホスホ−ｅＩｆ２α［ｐＳ５２］およびＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／ＧＡＤＤ３４（１０４４９−１−ＡＰ；ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ、１／１０００希釈）の抗体で記載（Ｔｓａｙｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３２、９１〜９４、２０１１）の通り分析した。
【０１４９】
細胞生存度の評価
細胞を、処理の２４時間前に１５，０００（ＨｅＬａ）または細胞１２，０００個／ｍｌ（ＭＥＦｓ）の密度で２４ウェルプレートにプレーティングした。ＥＲストレスを、２．５μｇ／ｍｌツニカマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する新鮮な培地を添加することによって誘発した。実施例１の化合物を、ＤＭＳＯに溶解し、示される通り添加した。ＤＭＳＯを、模擬処理として使用した。細胞生存度を、ツニカマイシン処理の４８時間後、供給者の推奨に従ってＣｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を使用してＷＳＴ−８［２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］のホルマザンへの還元を測定することによって評価した。
【０１５０】
動物試験
全ての動物ケアおよび手順を、地域の倫理的な承認を受けた研究における動物の使用における規則（１９８６の英国動物科学的処置法）に準拠して実施した。
【０１５１】
体重における実施例１の化合物の効果を研究するため、Ｃ３Ｈ／Ｂ６マウスに実施例１の化合物を１日に１回経口的に強制飼養し、マウス体重を２週間毎日記録した。
疾患表現型の改善における実施例１の化合物の有効性を評価するため、２８日齢のトランスジェニックマウスまたは同腹仔対照に実施例１の化合物（２ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを経口的に４週の期間毎日投与した。疾患進行を、処置の間にマウスを秤量することおよび処置の４週後のそれらの運動能力を評価することによって査定した。
【０１５２】
実施例１の化合物がグアナベンズの副作用を有するかどうかを評価するため、マウス（ｎ＞３）に１０ｍｇ／ｋｇの化合物またはグアナベンズを経口的に強制飼養させた。それらの活性を、投薬に続いて３０分間モニターした。グアナベンズ処置マウスは、グアナベンズの降圧活性に起因して、未処置マウスと同程度に活動的であった実施例１の化合物で処置されたマウスとは対照的に、投薬後の３０分間動かなかった。
【０１５３】
８週齢ＨＤ−Ｎ１７１−８２Ｑマウスおよびそれらの野生型同腹仔を、最初に静止したローターに１分、そして定常速度（４ｒｐｍ）に１分で慣れさせた。慣れを反復させた。試験セッションは、１５分の間隔を間においた４回の試行から構成された。各々の試行について、５匹のマウスを加速させたローター（４〜４０ｒｐｍ）に配置し、個々の動物に関して最大限度を３００ｓにセットして、落下するまでの反応時間を記録した。
【０１５４】
代謝性障害の処置に関して、Ｄｂ／ｄｂ動物（条件あたりｎ＝５）を、１日に１回で１ｍｇ／ｋｇの実施例１の化合物を３週間処置した。血液グルコースレベルを、９〜１０ａｍの間に血液グルコースメーター（ＤＳＩ）で測定した。データは平均＋／−Ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１５５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
脳からのＲＮＡを、トリゾール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に抽出した。ＲＮＡ濃度をＮＡＮＯＤＲＯＰ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して１μｇをｃＤＮＡに逆転写した。プライマーＧＡＰＤＨ（ｆ）：ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ、ＧＡＰＤＨ（ｒ）：ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ（ｆ）：ＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴ；およびＰＰＰ１Ｒ１５Ａ（ｒ）：ＧＣＴＧＴＧＡＴＧＴＧＧＧＡＴＡＡＧＣＧでの定量的ＰＣＲを、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｅｆ４４７２９０８、ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＣｏｒｂｅｔｔ  Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅバージョン６０００に使用して実施した。各遺伝子の発現を、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して標準化し、Ｐａｆｆｌ式を使用して計算される倍率変化として表した。
【０１５６】
ＤＲＧ培養
１３．５での胚または発生（Ｅ１３．５）の野生型のまたはＰｍｐ２２Ｔｒ−Ｊ（ＰＭＰ２２変異体）（Ｈｅｎｒｙら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４２、６８８〜７０６、１９８３）から解剖した後根神経節（ＤＲＧ）を、４ｇ／ｌグルコース、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２％Ｂ２７サプリメントおよび５０ｎｇ／ｍｌニューロン成長因子（ＮＧＦ）を補充した神経基礎（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）培地中でコラーゲンでコーティングしたカバーガラスにおいて７日間培養した。シュワン細胞を分化させ、ミエリン形成を誘導させるため、培養したＤＲＧを、次にＣ−培地（４ｇ／ｌグルコース、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦを補充したＭＥＭ培地）において維持した。Ｃ−培地を、新たに添加した５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸±５ｎＭの実施例Ｉの化合物で１日おきに置き換え、シュワン細胞によるミエリン形成のために１４日間培養した。培養したＤＲＧを、次に４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＭＢＰ（ラットミエリン塩基性タンパク質、１／２５０希釈、ａｂ７３４９８）で免疫染色した。
【０１５７】
マウスに関する参照は、ＰｕｂｍｅｄのＩＤ：６３１３８６である。
生化学的アッセイ
アッセイ１：選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１に選択的に結合する（図１）。
【０１５８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、化合物とＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／Ｂ−ＰＰ１ホスファターゼ複合体との結合親和性を測定した。ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）をＰＰ１γのＮ−末端に融合した、これによりＳｆ９昆虫細胞においてＢＡＰ−タグ化タンパク質のビオチン化が可能となる。精製後、ＢＡＰ−ＰＰ１γタンパク質を、約５．０００ＲＵの応答レベルまでストレプトアビジンセンサーチップ（ＳＡ−チップ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉した。制御されたビオチン化を使用することにより、センサーチップ表面において方向づけられた、均一な固定化が可能となる。次いで、ＰＰ１γを使用してＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／Ｂを捕捉し、ストレプトアビジンチップの表面にホロホスファターゼ複合体を形成させた。次に、この複合体を、化合物の試験結合のために使用することができる。１０μＭのＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／Ｂタンパク質濃度を使用して、８０ｓ注入の間にホロホスファターゼ複合体を形成させた。ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／Ｂを捕捉させた後、化合物の濃度系列がチップの表面に注入され、化合物とホロホスファターゼの結合が測定された。濃度系列（８または１２の濃度）を完了した後、表面は３Ｍ  ＮａＣｌで再生され、Ｒ１５Ａ／Ｂを再び捕捉して新たなホロホスファターゼ複合体を形成させて別の化合物の濃度系列の結合を測定することができる。平衡結合のレベルを濃度の関数として分析することにより、相互作用親和性または定常状態の結合親和性（ＫＤ）が得られる。
【０１５９】
図１は、実施例１の化合物に関するＫＤ値を示す。ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１について０．０３５μＭおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ａ−ＰＰ１について１μＭのＫＤは、実施例１の化合物が、ＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１複合体に選択的に結合するが、結合はＰＰＰ１Ｒ１５Ａ−ＰＰ１複合体に対するよりも有意に低いことを実証する。
【０１６０】
アッセイ２：選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、ストレスの非存在下で、細胞においてｅＩＦ２αの一過性のリン酸化を誘導する（図２ＡおよびＢ）
実施例１の化合物の選択性は、組換えタンパク質でのインビトロ結合アッセイを使用して明らかにされた。しかし、結合アッセイを使用してＰＰＰ１Ｒ１５Ｂに結合する選択的な化合物に関するスクリーニングに使用することができるが、化合物の特性は必ずしも結合アッセイによって予想されない。したがって、化合物がＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ機能を阻害するかどうかを評価するため他のアッセイが必要とされる。
【０１６１】
ヒト細胞をＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤で処置し、ｅＩＦ２αリン酸化を長期にわたりモニターした。ストレスの非存在下（細胞がＰＰＰ１Ｒ１５Ａを発現しない条件下）、実施例１の化合物での細胞の処置がｅＩＦ２αリン酸化を誘導することを本発明者らは見出した。これは、実施例１の化合物の添加後の１〜７．５時間の間で顕在化した。しかし、実施例１の化合物の添加後１０時間では、ｅＩＦ２αリン酸化は基礎レベルに戻った。このことは、この時点で活性なｅＩＦ２αホスファターゼが存在することを示唆した。実際、本発明者らは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが、実施例１の化合物の添加に続く遅い時点で誘導されることに気が付いた（アッセイ３を参照されたい）。ｅＩＦ２αリン酸化の一過性の誘導は、化合物が細胞におけるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害剤であることを実証する。このことは、実施例１の化合物が、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａをスペアすることをさらに確立する。このアッセイは、他の選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤の同定に貢献することができる。
【０１６２】
アッセイ３：選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、細胞におけるＰＰＰ１Ｒ１５Ａの発現を誘導する（図２ＡおよびＢ）
通常、細胞および生物は、欠損を補償する機構を有する。したがって、本発明者らは、細胞が、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａを誘導することによってＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害に関して補償し得るかどうかを考えた。ＰＰＰ１Ｒ１５Ａレベルが、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂノックアウトマウスの肝臓中で増加することが以前に報告されていた（Ｈａｒｄｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０６、１８３２〜１８３７、２００９）。この代償性応答が、肝臓に特異的であるかまたは細胞または他の組織において起こり得るかは未知である。さらに、この研究よりも前に、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ誘導が、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの薬理学的な阻害に際して観察することができるかどうかは未知であった、その理由は、この研究よりも前に、それらはＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害剤とされてはいなかったからである。
【０１６３】
図２Ｂは、実施例１の化合物で処置された細胞が、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａを誘導することが見出されたことを示す。この特性（ＰＰＰ１Ｒ１５Ａの誘導）は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤に関してスクリーニングする方法として使用することができる、その理由は、細胞においてＰＰＰ１Ｒ１５Ａ発現を誘導する化合物が、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害特性を保有するからである。例えば、レポーター遺伝子に融合されたＰＰＰ１Ｒ１５Ａ遺伝子またはプロモーターを使用するアッセイを、設計し、ＨＴＳスクリーニングへと開発して、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａを誘導する化合物を同定することができる。
【０１６４】
アッセイ４：選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、ストレスから細胞を保護する（図３）
図３は、選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤がストレスから細胞を保護することを示す。ここで、細胞は、０．２〜５μＭの実施例１の化合物の存在下で、ツニカマイシン（２．５ｕｇ／ｍｌ）でストレスを受けた。細胞生存度を、処置の３日後に測定した。
【０１６５】
実施例１の阻害剤は、ツニカマイシンによって引き起こされる細胞傷害性ストレスから細胞を保護する。ＥＲストレスに対する細胞保護作用は、適切なアッセイによって測定することができる。この実例において、Ｎ−グリコシル化をブロックすることによりタンパク質フォールディングを阻害し、アンフォールドタンパク質応答を誘導する薬物であるツニカマイシンを含有する培地の添加によってＥＲストレスが誘発されたＨｅＬａ細胞で、細胞保護作用が測定された。次いで、Ｄｏｊｉｎｄｏの標準的な細胞生存度キットであるＣｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を使用してＷＳＴ−８からホルマザンへの還元を測定することによって設定期間後に実施例１の化合物の存在下および非存在下で細胞生存度を検出した。ＥＲストレスからの細胞保護作用を、ＥＲストレス後の生細胞（対照との比較）における百分率増加の観点で測定した。
【０１６６】
アッセイ５：選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、ストレス−回復の間のｅＩＦ２ａリン酸化を延長させる（図４）
本発明者らは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤が、ストレスに続いてｅＩＦ２αリン酸化を延長することに理由を付けた。この活性を明らかにするため、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが発現されず、交絡する効果を回避する、条件を探索することが重要であった。本発明者らは、ＤＴＴによるストレス誘導の速い速度および可逆性（Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２、３２６〜３３２、２０００；Ｊｏｕｓｓｅら、２００３）を利用し、１ｍＭ  ＤＴＴで３０分間処理し、洗い流した後に細胞中のｅＩＦ２αリン酸化をモニターした。ＤＴＴを洗い流した後に通常発生するｅＩＦ２αリン酸化における減退が遅延し、これがＰＰＰ１Ｒ１５Ａの何らかの実質的な誘導の前に発生することを本発明者らは見出した。したがって、本明細書において記載されるものなどのストレス−回復パラダイムの初期相におけるｅＩＦ２α脱リン酸化の動態の慎重なモニタリングを使用して他のＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤を同定することができる。
【０１６７】
マウスにおいて実施例１の化合物（図５）は、良好な組織分布を有する
実施例１の化合物の経口での強制飼養後の異なる時間でのマウス組織（血漿、脳、脊髄、膵臓、肝臓）の分析は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤が広範な組織分布を有し、したがって、異なる臓器に影響を及ぼす種々の疾患および障害の処置において適用を示すことを明らかにした。
【０１６８】
実施例１の化合物でのマウスの処置は、マウスに対して毒性ではない（図６）
実施例１でマウスを処置し、任意の臨床的症状を検出するために厳重にモニターした。１日に１回の実施例１の化合物１０ｍｇ／ｍｇまで２週間処置されたマウスが、プラセボで処置されたマウスと区別がつかないことおよびマウスが通常どおり体重を増すことが見出された（図６）。これにより、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害が毒性ではないことが確立される。これは驚くべきかつ予期しないことであった、その理由は、この研究の前には、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、治療可能性も有することはないほどに有害であると予想されたであろうからである。
【０１６９】
実施例１の化合物でのマウスの処置は、グアナベンズによって引き起こされる副作用を生じない（図７）
ヒトにおいて、グアナベンズのアドレナリン作動性アゴニスト活性は、高用量で傾眠および昏睡を含む副作用を有する（Ａ．Ｈ．Ｈａｌｌ、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １０２；７８７〜７８８；１９８５）。これらの副作用に起因して、グアナベンズは、もはやヒトでは使用されない。グアナベンズ誘導体が、アルファ−２アドレナリン作動性活性に関連する、グアナベンズの副作用を有することが見込まれる。グアナベンズとアルファ−２アドレナリン作動性レセプターとの構造−活性相関は入手不可能であるが、本発明者らは驚くべきことに本発明において実施例１が、構造的に非常に類似するが、グアナベンズの副作用を欠いていることを見出した。
【０１７０】
アッセイ６：実施例１の化合物での処置後の哺乳動物におけるＰＰＰ１Ｒ１５Ａの誘導（図８）
ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ誘導を、示される用量の実施例１の化合物で処置されたマウスの脳から抽出されたトータルｍＲＮＡにおけるｑＰＣＲによって評価した。
【０１７１】
細胞において認められていたことに類似して、マウスが実施例１の化合物での処置後にＰＰＰ１Ｒ１５Ａを誘導することおよびこの誘導が用量依存的であることが見出された。これにより、なぜ選択的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤が、マウスでは許容されるかが説明される：ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ誘導がｅＩＦ２αを脱リン酸化し、実施例１の化合物によるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害からもたらされるｅＩＦ２αリン酸化がわずか一過性であることが保証される。これは重要であり、その理由は、ｅＩＦ２αの持続性のリン酸化は有害であるからである。ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤によるインビボでのＰＰＰ１Ｒ１５Ａの誘導は、前臨床または臨床研究において哺乳動物におけるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤の有効性および効能を査定するために使用することができる薬力学的パラメータである。
【０１７２】
実施例１の化合物は、哺乳動物における疾患を予防する（図９）
ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害によりフォールディングを増加させることは、非常に広範囲のヒトの病理に利益がある可能性がある。このことを試験するため、本発明者らは、ミスフォールドしたタンパク質、変異体ハンチントンの蓄積によって引き起こされるプロテオスタシス疾患であるハンチントン病（ＨＤ）に注目した。変異体ハンチントンがＵＰＲを誘導することを示すいくつかの報告がある（ＤｕｅｎｎｗａｌｄおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２２、３３０８〜３３１９、２００８；Ｎｉｓｈｉｔｏｈら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１６、１３４５〜１３５５、２００２）。しかし、本発明者らはハンチントン病のモデルにおいてＰＰＰ１Ｒ１５Ａを検出することに失敗し、このことからＰＰＰ１Ｒ１５ＡがＨＤに関する治療標的ではないことが示唆された。ＨＤは現在まで救済法はないので、本発明者らは、ＨＤがＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害によって予防できるかどうかを試験した。本発明者らは、２ｍｇ／ｋｇの実施例１の化合物でのＨＤマウスの処置が、運動能力機能障害を予防することを見出した（図９）。これは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂが有効な治療標的であること、したがって、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害が疾患の処置および予防において有用であることを示す。
【０１７３】
本明細書において実証された通り、疾患がＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害によって予防または改善することができるかどうかを決定するため、マウスモデルまたはヒトを容認できる用量の阻害剤で処置することができる。インビボでの標的阻害を立証するため、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ経路のマーカーをモニターし、薬力学的マーカーとして使用することができる。そのようなマーカーは、本明細書において示されるように、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ（図８）または任意の他の経路上の標的、例えば、ＵＰＲまたはＩＳＲマーカー（ｅＩＦ２αリン酸化、ＣＨＯＰ、ＡＴＦ４が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。実施例１の化合物に伴って本明細書において示されるように、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、安全である限り治療のために有用であり、これはＰＰＰ１Ｒ１５Ｂに対する化合物の選択性によって決定される。
【０１７４】
神経障害性マウスからの外植片におけるミエリン形成（図１０）
ＣＭＴは、いくつかの遺伝子中の変異によって引き起こされるミエリンニューロパシーのグループである。末梢性ミエリンタンパク質ＰＭＰ２２中の変異は、ＣＭＴの最も共通する原因である。ＰＭＰ２２（Ｔｒｅｍｂｌｅｒ−Ｊ）中の変異は、ＰＭＰ２２のミスフォールディングを引き起こし、末梢神経系中のミエリンにおける欠陥に起因して、マウスにおいてヒトにおけるＣＭＴに似た疾患を引き起こす。ＰＭＰ２２変異体マウスからの外植片は、ヒト疾患において観察される重篤なミエリン形成不全を繰り返す。本発明者らは、ＰＭＰ２２変異体マウスからの後根神経節培養物（ＤＲＧ）の処置が、ミエリン形成を改善することを見出した。変異体マウスからのＤＲＧ培養物が、化合物の治療有効性を予想するための有用なモデルであることが以前に見出された。したがって、本明細書において提示されるデータは、実施例１の化合物が、ＣＭＴ疾患などのＰＭＰ２２の変異または過剰産生によって引き起こされる疾患を処置するために有用であることを実証する。実施例１の化合物はまた、他のミエリン障害の処置において有用である。
【０１７５】
代謝疾患におけるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ有効性の評価（図１１）
代謝疾患、例えば、糖尿病、肥満、肝脂肪疾患、およびアテローム性動脈硬化症が、病理学的なＥＲストレスに関連することが公知であり、ＵＰＲの薬理学的なモジュレーターが、治療の利益を有し得ることが考えられる。本研究の前には利用可能なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は存在しなかったので、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂが代謝疾患における治療標的であり得るかについては不確かであった。本発明者らはこの可能性を試験して、実施例１の化合物での肥満マウスの処置が、これらの哺乳動物において病理学的な高い血液グルコースを低減させることを見出した（図１１）。これにより、実施例１の化合物での処置が、代謝性障害を改善できることが示される。
【０１７６】
１つの疾患モデルにおいて、実施例１の化合物での処置が有益であることが示されたので、本発明の化合物が、他の哺乳動物の代謝性障害、例えば、糖尿病、肥満、肝脂肪疾患、およびアテローム性動脈硬化症に対し有益であることが明白である。
【０１７７】
実施例Ｂ
可逆的なリン酸化により、大部分のタンパク質の活性が制御される。セリン／トレオニンホスファターゼの阻害剤はわずかが予期せず発見されただけであるので、この大きいファミリーの酵素は依然として薬として開発することが困難であると考えられる。本明細書において本発明者らは、表面プラズモン共鳴を使用して、タンパク質ホスファターゼ１の調節サブユニットである、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害剤である、ＴＳＴ３（実施例１に記される化合物）の合理的な発見を可能にする方法を設計した。ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの選択的な阻害により、そのリン酸化基質である、翻訳開始因子２（ｅＩＦ２α）のαサブユニットの急速かつ一過性の蓄積が引き起こされた。これにより、本発明者らが、典型的なタンパク質ミスフォールディング疾患である、ハンチントン病のマウスモデルにおける行動性および分子の欠陥を安全に予防するために治療的に活用した特性である、タンパク質合成の急速かつ一過性の減弱がもたらされた。これにより、セリン／トレオニンホスファターゼの内因的に無秩序である調節サブユニットが、有効で取り扱いやすい薬物標的であり、それらの選択的な阻害剤を同定する一般化可能な方法を提供することが確立される。
【０１７８】
生存するため、細胞は、セリン５１において真核生物の翻訳開始因子２  ｅＩＦ２αのαサブユニットをリン酸化することによって過酷な条件に反応して、タンパク質合成を低減させ、それにより、資源を節約して、難題を帳消しにする（１〜３）。ｅＩＦ２αリン酸化の動的な精密な調整は、不可欠であり、ｅＩＦ２αリン酸化の欠如および過剰の両方が有害である（４）。ｅＩＦ２αの持続性のリン酸化に対するセーフガードに対して、哺乳動物は、触媒サブユニットＰＰ１ｃに結合する、１つまたは２つの調節サブユニットから構成される２つの選択的なｅＩＦ２αホスファターゼである、誘導性ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ（Ｒ１５Ａ）または構成的なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ（Ｒ１５Ｂ）を進化させてきた（５、６）。Ｒ１５Ａ阻害剤は、予期せず同定され、セリン−トレオニンホスファターゼが、調節サブユニットをターゲティングすることによって選択的に阻害することができるとの概念の証拠が提供された（７、８）。原理的には、同じパラダイムを活用して任意の他のＰＰ１ホロホスファターゼを選択的に阻害することができるであろうが、ホスファターゼの内因的に無秩序である調節サブユニットの選択的な阻害剤の合理的な発見は、満たされていない難題を代表する。
【０１７９】
本明細書に本発明者らは、新しい選択的なホスファターゼ阻害剤を同定する一般化可能な戦略の開発を記す。最初に、本発明者らは、Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂを発現させ、精製して（図１２）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、公知のＲ１５Ａ阻害剤とこれらの標的との結合親和性を測定した。本発明者らは、ＳＰＲチップに固定化されたＲ１５を試したが、この方法は、首尾一貫しない結果を生じた、その原因は、おそらく天然に組織化されていないタンパク質が、チップに沈殿するからである。したがって、本発明者らは、本発明者らがチップに固定化したビオチン化（ｂｉｏｔｙｎｉｌａｔｅｄ）グアナベンズ（ＧＢＺ）（７）を使用し、タンパク質の固定化された化合物における結合を試験した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。本発明者らは、公知のＲ１５Ａ阻害剤ＧＢＺが組換えＲ１５Ａ断片にＲ１５Ｂよりも１０倍高い親和性で結合することを見出し（図１３および１４）、Ｒ１５Ａに対するその選択性が確認された（７）。しかし、ＧＢＺのＲ１５Ａに対する１１μＭ親和性は、細胞におけるＧＢＺのマイクロモル未満の作用強度とは矛盾（７）し、ここで使用されるアッセイがおそらく単離された調節サブユニットが内因的に無秩序であることが原因で細胞状態を繰り返さなかったことを示す（９）。
【０１８０】
したがって、本発明者らは、単離された調節サブユニットでの作業で遭遇する問題を回避する別のアッセイを設計した。
細胞において、ホスファターゼの調節サブユニットは、ＰＰ１ｃとの結合に際してフォールドし（９）、ホロホスファターゼが、関連性のあるアッセイを設計するため必要とされ得ることを示唆する。本発明者らは、ＧＢＺ（７）およびＳｅｐｈｉｎ１（８）に結合することが公知である、インビボビオチン化（ｂｉｏｔｙｎｉｌａｔｅｄ）ＰＰ１ｃおよび大きいＲ１５Ａ断片（アミノ酸３２５〜６３６）を使用して組換えＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃを再構成した。Ｒ１５Ａ−ＰＰ１ｃ複合体を、ニュートラアビジン樹脂における親和性捕捉によって精製した（図１５）。同様に、パラロガスなホロホスファターゼＲ１５Ｂ−ＰＰ１ｃを、精製した（図１５）。Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂは機能上関連するが、非常に異なる配列を有する（図１６）ことが留意される。Ｒ１５−ＰＰ１ｃホロホスファターゼを、ＳＰＲストレプトアビジンセンサーチップに２つのステップで次に固定化した（図１７）。ＧＢＺおよびＳｅｐｈｉｎ１がＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃに強く結合するが、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃ（図１８〜２２）には結合しないかまたは弱く結合し、ＰＰ１ｃ単独（図１８〜２２）には結合しないことをＳＰＲ実験は示し、それらのＲ１５Ａに対する選択性が確認された。Ｒ１５Ａ−ＰＰ１ｃに対するＧＢＺおよびＳｅｐｈｉｎ１の測定された定常状態の親和性（それぞれ０．１２２μＭおよび０．７８６μＭ）は、細胞に基づくアッセイ（７）およびインビボ（８）において阻害剤のマイクロモル未満の作用強度と矛盾しなかった。したがって、組換えホロホスファターゼで実施されたＳＰＲ実験により、関連性のある公知の阻害剤とＲ１５Ａとの結合親和性を測定する定量的な方法が提供される。
【０１８１】
本発明者らは、次に新規の特性を有する選択的なホスファターゼ阻害剤を探索するため、本明細書において確立された方法を使用した。本発明者らは、ＧＢＺ誘導体を合成し、Ｒ１５Ｂに強くかつ選択的に結合（ＫＤ＝０．０３３μＭ）する化合物である、ＴＳＴ３（ホロホスファターゼの合理的な阻害剤）を同定した（図２４）。
【０１８２】
本発明者らは、Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂ両方の公知の阻害剤である、サルブリナル（Ｓａｌ００３）の結合親和性も測定し（図２５）、Ｒ１５Ａ、Ｒ１５ＢならびにＰＰ１（図２３）に親和性＞２０μＭで結合することを見出した（図２５）。
【０１８３】
本発明者らは、次にＴＳＴ３が、酵素アッセイにおいてＰＰ１を阻害しないことを確認し（図２６）し、次に細胞において特徴づけた。基礎条件下で、ＧＢＺはｅＩＦ２αリン酸化または翻訳率に影響しなかった、その理由は、期待される通り、ストレスなしではＰＰＰ１Ｒ１５Ａが発現されないからである（５、７）。ＧＢＺとは対照的に、ＴＳＴ３は、迅速かつ一過性にｅＩＦ２αリン酸化を増加させた（図２７）。翻訳率はｅＩＦ２αリン酸化と並行し、翻訳は迅速かつ一過性にＴＳＴ３によって低下した（図２８）。ＡＴＦ４およびＲ１５Ａをコードする転写物は、ｅＩＦ２αリン酸化から結果的に生じる一般的な翻訳の減弱を避ける（１０、１１）。ＴＳＴ３は、ＡＴＦ４およびＲ１５Ａの発現を誘導した（図２７）。とりわけ、Ｒ１５Ａ発現は、ＴＳＴ３添加後の１０時間後に観察される翻訳回復と一致した（図２７、２８）。これは、Ｒ１５ＡがＴＳＴ３処置細胞におけるｅＩＦ２α脱リン酸および翻訳回復を媒介することを示唆し、ＴＳＴ３が選択的なＲ１５Ｂ−ＰＰ１ｃ阻害剤であることを暗示する。
【０１８４】
もしそうである場合、ＴＳＴ３は、Ｒ１５Ａの非存在下でｅＩＦ２αの持続性のリン酸化およびタンパク質合成の持続的な阻害を誘発するはずである。実際、ＴＳＴ３誘導性ｅＩＦ２αリン酸化および翻訳の減弱は、Ｒ１５Ａ阻害剤ＧＢＺの存在下でまたはＲ１５Ａの一般的な不活性化に際して持続性にされた。重要なことには、ｅＩＦ２αリン酸化および翻訳におけるＴＳＴ３の全ての測定可能な効果は、ｒ１５ｂ−／−細胞において消失した（図３１〜３２）。これは、ＴＳＴ３が、Ｒ１５Ｂの選択的な阻害剤であることを実証する。Ｒ１５Ｂの選択的な阻害により、ｅＩＦ２αの一過性のリン酸化およびタンパク質合成の一過性の減弱が誘発される。
【０１８５】
本明細書において記載されるアッセイの組合せは、Ｒ１５阻害剤の活性を定義する。以前に示されている通り（７）、選択的なＲ１５Ａ阻害剤は、ストレスを受けていない細胞における翻訳またはｅＩＦ２ａリン酸化に影響しない。対照的に、本発明者らは、本明細書において、選択的なＲ１５Ｂ阻害剤が、ストレスの非存在下でｅＩＦ２ａリン酸化を一過性に誘導することを示す。そのようになるのは、Ｒ１５Ａが選択的なＲ１５Ｂ阻害剤によって誘導されるからである。Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂ阻害剤の組合せは、Ｒ１５Ａ／Ｂ阻害剤の活性を定義する：Ｒ１５Ａ／Ｂ阻害剤は、細胞におけるタンパク質合成の持続的な阻害を誘導する。それはＡＴＦ４も誘導し、その目的に適った効果が確認される。
【０１８６】
本明細書において、本発明者らは、構成的なｅＩＦ２αホスファターゼＲ１５Ｂの選択的な阻害剤である、ＴＳＴ３の発見を可能にする方法を記載し、それによって合理的な創薬が、ホスファターゼの内因的に無秩序である調節サブユニットに適用することができることを実証した。Ｒ１５Ｂの選択的な阻害は、マウスにおいてＨＤを安全に予防するために治療的に活用された特性である、タンパク質合成の一過性の減弱をもたらす。選択的なＲ１５Ｂ阻害剤、例えば、ＴＳＴ３は、ミスフォールドしたタンパク質によって引き起こされる多様な疾患の処置のため有用であり得る。その上、本明細書において提供される方法は、原理的には、他のホスファターゼならびに内因的に無秩序であるタンパク質に一般化することができ、創薬のため広範囲に新たな機会を生み出す。方法は、図３３の画像に要約される。
【０１８７】
材料および方法
タンパク質発現および精製
ＭＢＰ−Ｒ１５Ａ３２５−６３６−ＨｉｓおよびＭＢＰ−Ｒ１５Ｂ３４０−６９８−Ｈｉｓを、発現させ、前の記載（Ｄａｓら（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８、２３９−２４２）の通り精製した。ヒトＰＰ１γをコードするｃＤＮＡを、バキュロウイルストランスファーベクターｐＤＷ４６４にクローニングしてＮ末端ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）を付加した。ベクターは、大腸菌ビオチンホロ酵素合成酵素（ＢｉｒＡ）もコードするため、ＢＡＰ−タグ化タンパク質をＳｐｏｄｏｐｔｅｒｅ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞中でインビボでビオチン化（ｂｉｏ−ＰＰ１ｃ）することができる（Ｄｕｆｆｙら（１９９８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６２、１２２〜１２８）。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して組換えバクミドＤＮＡを生成し、Ｓｆ９昆虫細胞を使用してウイルスストックを増幅した。タンパク質を、Ｉｎｓｅｃｔ−Ｘｐｒｅｓｓ培地（Ｌｏｎｚａ）中でＳｆ９昆虫細胞を使用して産生した。ｂｉｏ−ＰＰ１を、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において陰イオン交換クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ）、続いてゲル濾過（ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。タンパク質を、ＢＯＬＴ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、ビオチン化ＰＰ１の存在をＰｉｅｒｃｅ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したウエスタンブロットによって確認した。これは部分的に純粋なタンパク質をもたらし、完全な精製は、ビオチンとストレプトアビジンの高親和性および特異性に起因して後の段階で達した（ＳＰＲチップにおいて）。
【０１８８】
ｂｉｏ−ＰＰ１ｃに対するＲ１５の結合
部分的に精製したｂｉｏ−ＰＰ１ｃ（１００μｌ）を、ニュートラアビジンアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、２時間、４℃で振盪してＩＰ緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮＰ４０）中でインキュベートした。ビーズを、次に３回ＩＰ緩衝剤で洗浄し、１０μＭ  Ｒ１５（ＡまたはＢ）の存在下または非存在下で一晩４℃で振盪してＩＰ緩衝剤中でインキュベートした。ビーズを、次に３回ＩＰ緩衝剤で洗浄し、結合したタンパク質を６０μｌのＬａｅｍｍｌｉ緩衝剤中でボイルすることによって溶出した。結合したタンパク質を、次にＢＯＬＴ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、ビオチン化ＰＰ１ｃの存在をＰｉｅｒｃｅ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したウエスタンブロットによって確認した。
【０１８９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＳＡセンサーチップにおけるｂｉｏ−ＧＢＺまたはｂｉｏ−ＰＰ１ｃの捕捉
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムを全ての実験に使用し、ビオチン化ＧＢＺ（ｂｉｏ−ＧＢＺ）（Ｔｓａｙｌｔｅｒ  ２０１１）またはｂｉｏ−ＰＰ１をセンサーチップＳＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉した。ストレプトアビジンでコーティングした表面を、５０ｍＭ  ＮａＯＨおよび１Ｍ  ＮａＣｌの溶液での３回、流速１０μｌ／分での１分間注入によって活性化した。ｂｉｏ−ＧＢＺまたはｂｉｏ−ＰＰ１ｃを、ランニング緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＤＭＳＯ）で希釈し、およそ３００ｎＭ濃度で流速１０μｌ／分で直接的にストレプトアビジンでコーティングした表面に注入して、それぞれ約２００および６０００ＲＵに相当するｂｉｏ−ＧＢＺまたはｂｉｏ−ＰＰ１ｃの固定化レベルに達した。ブランク固定化を、参照として使用するため、ＳＡセンサーチップ表面の１つについて実施した。
【０１９０】
ｂｉｏ−ＰＰ１ｃ表面を使用した小分子とＲ１５ホロホスファターゼ複合体の定常状態の結合定数の決定
軽微な偏りはあるが、同じ手順および条件を全ての結合実験に使用した。小分子を、１００％ＤＭＳＯ中に５０ｍＭ貯蔵溶液として貯蔵した。結合定数の決定の前、化合物の１２または８つの濃度のいずれかの連続希釈を、９６ウェルプレートのランニング緩衝剤中に調製した。各々の化合物希釈系列より前に、調節サブユニットＭＢＰ−Ｒ１５Ａ３２５−６３６−ＨｉｓまたはＭＢＰ−Ｒ１５Ｂ３４０−６９８−Ｈｉｓを、ランニング緩衝剤で１０μＭに希釈し、流速３０μｌ／分で１分間ｂｉｏ−ＰＰ１ｃ表面に捕捉し、ホロホスファターゼ複合体をセンサーチップ表面に形成させた。これを、続いて１分間の安定化期間をおき、任意の非特異的な結合物を洗い流した。次いで、表面を再生することなく、化合物希釈系列を、チップの表面に流速３０μｌ／分で１分間注入し、続いて２分間の解離時間をおいた。各々の希釈系列の後に、表面を３Ｍ  ＮａＣｌを使用して９０秒間再生した。再生後、ＳＰＲ応答は一般的には基礎レベルに戻り、ｂｉｏ−ＰＰ１ｃ表面は次の化合物希釈系列のために整えられた。サンプル間のＤＭＳＯ濃度における小さな変動を補正可能にするために、０．０６〜８％ＤＭＳＯの範囲の８つの溶媒サンプルを５０サイクルごとに注入した。フローセル温度は、１０℃であった。
【０１９１】
データ分析
センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００査定ソフトウェアを使用して分析し、結合定数を定常状態モデルに基づいて決定した。速度実験は異なる濃度の化合物を使用して行い、それらそれぞれの平衡結合レベルを決定した。これらの平衡応答レベル（Ｒｅｑ）は、濃度に対してプロットされ、グローバルフィットを使用してフィッティングされ、これにより定常状態親和性定数を決定できる（すなわち、５０％飽和での濃度がＫＤである）。ＫＤ値（上記のＦｒｏｓｔｅｌｌ−Ｋａｒｌｓｓｏｎ（２０００））を表１に示す。
【０１９２】
ＰＰ１ｃ触媒活性アッセイ
精製されたＰＰ１ｃ（３０ｎＭ）を、示される濃度のカリクリンＡ、ＧＢＺ、Ｓａｌ００３、Ｓｅｐｈｉｎ１およびＴＳＴ３を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７、１．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、３ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５、０．１５％β−メルカプトエタノールで３０分間４℃でインキュベートした。ＰＰ１ｃの残効性を、次に供給者の指示に従ってＥｎｚＣｈｅｋホスファターゼアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。
【０１９３】
哺乳動物細胞培養
ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。Ｐｐｐ１ｒ１５ａ−／−およびＰｐｐ１ｒ１５ｂ−／−ＭＥＦ細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、５５μＭ  β−メルカプトエタノール、１Ｘ非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した。
【０１９４】
免疫ブロットにおけるタンパク質分析
細胞（細胞９０，０００個／ｍｌ）を、２４ウェルプレートにプレーティングし、示される通り処置した。処置の終了時、細胞を、１５０μｌ  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝剤中で溶解した。溶解物を、９５℃で５分間ボイルし、超音波処理し、４〜１２％Ｂｏｌｔ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｌｕｓ  Ｇｅｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離した。タンパク質を、ｉＢｌｏｔ２系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してニトロセルロース膜に移し、以下の抗体を使用して分析した：ｅ−ＩＦ２α−Ｐ（４４−７２８Ｇ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：１０００）、ｅ−ＩＦ２α（ａｂ５３６９、Ａｂｃａｍ、１：１０００）、チューブリン（Ｔ５１６８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１：４０００）、ＢｉＰ（６１０９７８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：１０００）、ＡＴＦ４（ｓｃ−２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚバイオテクノロジー、１：５００）、Ｐｐｐ１ｒ１５ａ（１０４４９−１−ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１：１０００）およびＰｐｐ１ｒ１５ｂ（１４６３４−１−ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１：１０００）。タンパク質を、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して視覚化した。
【０１９５】
翻訳率の評価
細胞（細胞９０，０００個／ｍｌ）を、１２ウェルプレートにプレーティングし、示される通り処置し、１００μＣｉ／ｍｌ  ３５Ｓ−メチオニン（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ）で１０分間３７℃で標識し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、１２０μｌ  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝剤中で溶解した。溶解物を、９５℃で５分間ボイルし、超音波処理し、４〜１２％Ｂｏｌｔ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｌｕｓ  Ｇｅｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離した。次いで、ゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、蛍光イメージングによって分析した。
【０１９６】
動物
全ての動物ケアおよび手順を、地域の倫理的な承認を受けた研究における動物の使用における規則（１９８６の英国動物科学的処置法およびＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵ）に準拠して実施した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙまたはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。ＨＤ−Ｎ１７１−８２Ｑ（ＨＤ）トランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得て、混合したバックグラウンド（Ｃ３Ｈ／Ｂ６）で維持した。
全てのマウスを、食物および水を自由に摂取させ、換気ケージ中で個別に、群（１ケージ当たり２〜３）で収容し、１２時間の明／暗サイクル（７ａｍ〜７ｐｍ）で維持した。
【０１９７】
薬理学的な処置
ＴＳＴ３またはＧＢＺの酢酸塩を、水に溶解し、１０分間超音波処理した。溶液を、等分し、使用時まで−２０℃で維持した。解凍したら、チューブを、４℃で保持し、２４時間内に使用した。
ＴＳＴ３またはＧＢＺを、（別段の定めがない限り）経口での強制飼養で２ｍｇ／ｋｇで投与した。マウスは、一日当たり一回、単一用量を受けたかまたは長期にわたり処置された。
実験群を作るため、ＨＤ−Ｎ１７１−８２Ｑトランスジェニック雄を、Ｃ３Ｈ／Ｂ６  Ｆ１野生型雌と交配した。４週齢のトランスジェニック雄およびそれらの野生型同腹仔雄対照を、異なる群に無作為化し、ＴＳＴ３で４週間処置した。
【０１９８】
薬物動態試験
薬物動態試験を、ＸｅｎｏＧｅｓｉｓによって実施した。ＴＳＴ３を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄に経口的に投与した。血漿サンプルを、内部標準を含有するメタノールでのタンパク質沈殿によって調製した。組織を、秤量し、均質化（リン酸緩衝生理食塩水中１：３）によって調製し、内部標準を含有するメタノールでタンパク質沈殿させた。メタノールの添加後、血漿および組織サンプルを、−２０℃で＞１時間（または一晩）置いてタンパク質を沈殿させた。サンプルを、次に２，５００×ｇ（３，４００ｒｐｍ）で２０分間４℃で遠心分離した。上清を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０１９９】
ロータロッド
ＨＤ−Ｎ１７１−８２Ｑトランスジェニック雄およびこれらの野生型同腹仔雄対照のＴＳＴ３処置を、４週齢から開始し、試験前４週間続けた。慣れさせる段階の間、マウスを、静止したロッドに１分間配置し、次に１分間固定速度４ｒｐｍで訓練した。慣れさせる段階を、反復した。ロータロッド試験を、３回の試行で実施した。各々の試行でマウスを４〜４０ｒｐｍで加速させたロッド上で３００秒間まで走らせ、落下するまでの反応時間を計数した。提示されるものは、３回の試行の平均である。
【０２００】
急性ＴＳＴ３投与後の運動能力のモニタリング
処置のＧＢＺ様副作用（アドレナリン作動性活性に起因）を評価するために、マウスの運動能力を、ＴＳＴ３の単回投与後にモニターした。この終了時に、マウスを、ＴＳＴ３で処置し、ケージ中に６０分間静置させた。マウスの行動を、１５分間ごとにモニターした。同様に、ＧＢＺで処置したマウスを、対照として使用した。
【０２０１】
統計分析
比較を、スチューデントｔ検定または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して行った。有意な差は、対応する図中に示される。
【０２０２】
化合物合成
合成手順：
メタノール（２２０ｍｌ）中の２，３−ジクロロベンズアルデヒド（２２．００ｇ、０．１２５７０ｍｏｌ）および重炭酸アミノグアニジン（１７．１ｇ、０．１２５７０ｍｏｌ）の懸濁液に、２５℃で酢酸（２２ｍｌ）を添加した。得られた反応混合物を、７０℃で次の約３０分間加熱した。加熱に際して、懸濁液は透明になった。反応完了を、ジクロロメタン／メタノール（８／２）を移動相として使用したＴＬＣでモニターした。反応の完了後、反応混合物を、２５℃に冷却させ、真空下で濃縮した。得られた残留物をジエチルエーテル（１００ｍｌ）に懸濁し、得られた産物を濾過によって収集した。このプロセスを、３回反復した。上記プロセスの終了時に、本発明者らは、所望の（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド（「ＴＳＴ３）を得ることができた。ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２３１．２３（Ｍ＋Ｈ）。得られた産物を、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、電位差滴定、ＨＰＬＣおよびＣＨＮ分析によっても分析した。
【０２０３】
引用文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【国際調査報告】
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