(57)【要約】  ３次元細胞成長培地が記載される。該細胞成長培地は、液体細胞成長培地で膨潤したヒドロゲル粒子であって、適用された応力が降伏応力を超える場合に固体相から液体様相に相変換する顆粒状ゲル降伏応力材料を形成する、ヒドロゲル粒子を含むことができる。細胞は、任意の形状または幾何学的構造に応じて、３次元細胞成長培地に配置することができ、３次元細胞成長培地内でその場にとどまることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のヒドロゲル粒子と； 
液体細胞培養培地
とを含み、
前記ヒドロゲル粒子は、液体細胞培養培地で膨潤して顆粒状ゲルを形成する、３次元細胞成長培地。
【請求項２】
降伏応力を超える剪断応力の適用により、第１の固体相から第２の液体相に相変化するような降伏応力を有する、請求項１に記載の３次元細胞成長培地。
【請求項３】
降伏応力が１０Ｐａのオーダーである、請求項２に記載の３次元細胞成長培地。
【請求項４】
ヒドロゲル粒子の濃度が０．０５重量％から約１．０重量％の間である、請求項１に記載の３次元細胞成長培地。
【請求項５】
ヒドロゲル粒子が、液体細胞培養培地で膨潤したときに、約０．１μｍから約１００μｍの範囲内のサイズを有する、請求項１に記載の３次元細胞成長培地。
【請求項６】
ヒドロゲル粒子が、液体細胞培養培地で膨潤したときに、約１μｍから約１０μｍの範囲内のサイズを有する、請求項５に記載の３次元細胞成長培地。
【請求項７】
３次元細胞成長培地の領域に配置された複数の細胞と組み合わされた、請求項１に記載の３次元細胞成長培地。
【請求項８】
複数の細胞が、スフェロイド、胚様体、腫瘍、または嚢胞の少なくとも１つとして配置されている、請求項５に記載の３次元細胞成長培地。
【請求項９】
顆粒状ゲル粒子中に、および顆粒状ゲル全体に拡散した分子をさらに含む、請求項１に記載の３次元細胞成長培地。
【請求項１０】
前記分子が低分子またはタンパク質を含む、請求項９に記載の３次元細胞成長培地。
【請求項１１】
前記分子が低分子であり；および
前記低分子が栄養素または溶解した気体を含む、
請求項１０に記載の３次元細胞成長培地。
【請求項１２】
ヒドロゲル粒子を液体細胞培養培地と混合して顆粒状ゲルを形成させるステップと；
混入した気泡を顆粒状ゲルから除去するステップ
とを含む、３次元細胞成長培地を製作する方法。
【請求項１３】
顆粒状ゲルのｐＨを調節することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｐＨを調節することが、塩基および酸の少なくともいずれか１つを添加することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｐＨを調節することが、ｐＨが７．２から７．６の範囲内になるような量の酸を添加することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒドロゲル粒子の濃度を調節することにより、３次元細胞成長培地の降伏応力を調節することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
液体細胞培養培地で膨潤した複数のヒドロゲル粒子を含む顆粒状ゲルを用いて、一定のパターンに細胞を配置することを含む、細胞を３次元細胞成長培地に配置する方法。
【請求項１８】
細胞を配置することが、細胞を、３次元細胞成長培地内に所定の幾何学的構造で配置することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記所定の幾何学的構造が、スフェロイド、胚様体、腫瘍、または嚢胞の少なくとも１つである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒドロゲル粒子が生体適合性ポリマーを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ヒドロゲル粒子が１０Ｐａ＋／−２５％の降伏応力を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記パターンが、顆粒状ゲルによって包囲された少なくとも１つの領域を含むことにより、前記領域において成長する細胞が、顆粒状ゲルの降伏応力未満の圧力を受けるようにする、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０１５年５月８日出願の「３次元細胞培養のための成長培地」と題する米国特許仮出願第６２／１５９１３７号、および２０１６年３月４日出願の「充填された顆粒状ヒドロゲルから作製された３次元細胞培養のための成長培地」と題する米国特許仮出願第６２／３０４０８４号（これらの各々は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
（政府の支援）
本願に記載される研究は、アメリカ国立科学財団により、交付番号ＤＭＲ−１３５２０４３で支援された。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
開示された実施形態は、３次元細胞培養のための成長培地に関する。
【背景技術】
【０００４】
従来の細胞培養技法は、２次元の（２Ｄ）基材、例えば、ミクロウェルプレートまたはペトリ皿などの上に成長する細胞を含む。そのような２Ｄ細胞培養は、しばしば、細胞成長を促進するために、基材上に配置された成長培地を含む。しかしながら、従来の細胞培養の２Ｄ環境は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞が経験する３次元（３Ｄ）環境のためには、しばしば不満足な代用である。例えば、細胞の挙動は、しばしば、細胞周囲の微小環境に高度に依存する。２Ｄ細胞培養では、細胞周囲の微小環境は、細胞が３Ｄの微小環境で経験するものと異なることもある。
【０００５】
３Ｄ細胞培養のために、ハンギングドロッププレート（hanging drop plate）、磁性浮揚、または生体材料足場の使用を含む数通りの技法が開発されてきた。しかしながら、これらの技法は、通常、費用がかかり、および／または時間を消費して、成長および／または試験され得る組織が、特別の構造または幾何学的形状に限定されることもある。
【発明の概要】
【０００６】
幾つかの実施形態において、３次元細胞成長培地は、複数のヒドロゲル粒子および液体細胞培養培地を含む。ヒドロゲル粒子は、液体細胞培養培地で膨潤して顆粒状ゲルを形成する。
【０００７】
幾つかの実施形態において、３次元細胞成長培地を調製する方法は、ヒドロゲル粒子を液体の細胞成長培地と混合して顆粒状ゲルを形成させることを含む。混入した気泡は顆粒状ゲルから除去される。
【０００８】
幾つかの実施形態において、３次元細胞成長培地の物理的性質は、細胞の空間的位置が構造的支持を必要とせずに維持され得るように、３Ｄ流体体積中における個々の細胞を所定のように置くことを可能にするように調整することができる。したがって、実施形態は、細胞培養および培養された細胞を使用するアッセイに関することもある。
【０００９】
本開示はこの関係に限定されないので、前述の構想、および下記に論ずる追加の構想も、任意の適当な組合せで手配され得ることが理解されるべきである。さらに、本開示の他の利点および新規な特徴は、添付図と合わせて考慮されれば、限定するものではない種々の実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
添付図面は、スケールに合わせて描かれることは意図されていない。図面では、種々の図に例示されている各同一のまたは殆ど同一の成分が、同様な数字により表されていることがある。明瞭にする目的で付言すると、全ての成分が全ての図面で明示されているとは限らない。
【００１１】
【図１】図１は、細胞を３Ｄ細胞成長培地中に配置するための装置の１実施形態の模式的描写である。
【００１２】
【図２】図２（ａ）は３Ｄ細胞成長培地中の複雑な通路に沿って材料を入れるインジェクターの１実施形態例示する図であり、図２（ｂ）はヒドロゲル粒子間を通して移動するインジェクターの尖端を例示する図であり、および図２（ｃ）は軟質顆粒状ゲルの応力−歪み応答を例示する図である。
【００１３】
【図３】図３は、細胞を３Ｄ細胞成長培地に配置する方法の１実施形態のフローチャートである。
【００１４】
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、複数の細胞を含む３Ｄ細胞成長培地の実施形態の模式的描写である。
【００１５】
【図５】図５は、３Ｄ細胞成長培地を調製する方法の１実施形態のフローチャートである。
【００１６】
【図６ａ−６ｆ】図６ａ〜６ｆは、３Ｄ培養培地として使用される液体様固体（ＬＬＳ）の典型的実施形態を例示するスケッチである。図６ａでは、低濃度のミクロゲルが充填されて液体様固体を形成し、内訳１、２、３は分割が減少する培養培地の部分を示す。
【００１７】
図６ｂは、３Ｄ培養培地が、細胞集成体が創り出されること（ａ）または分離された細胞が有意の制限なく分散することを可能にすることを例示する図である。ミクロゲルの大きいメッシュサイズは、図６Ｃに例示したように、この培地を、栄養素、廃棄物、および分子試薬、例えば、薬剤、色素など、およびタンパク質に対して高度に透過性にする。図６ｄに示したように、非常に低いレベルの弾性応力が経時的な細胞集成体の膨張に抵抗して、１、２および３の時に細胞集成体の変化を示す。この膨張は、図６ｅ、ｆにより例示されるように、細胞増殖または細胞移動、すなわち、単一の細胞が、液体様固体で同様にうまく働くことができるプロセスによって推進され得る。
【００１８】
【図７ａ−ｂ】図７ａおよび７ｂは、典型的液体様固体培地のレオロジーのキャラクタリゼーションを例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、３Ｄ細胞成長培地が、本明細書に記載された材料および方法を使用して供給され得ることを理解し且つ認識した。本発明者らは、本明細書に記載された材料を使用して３Ｄ成長培地を創出することが、典型的な２Ｄ細胞培養技法と比較して複雑なｉｎ  ｖｉｖｏの成長環境をより正確に模倣する細胞成長環境を可能にすることができることを理解し且つ認識した。例えば、本明細書に記載された３Ｄ培養で細胞を培養することは、細胞−細胞の相互作用および細胞の分化を含む生物学的プロセスの誘発を容易にすることができる。それにも拘わらず、これらの技法は、急速なおよび／または高い処理能力の試験を可能にし得る細胞群の容易な配置および／または回収を可能にすることができる。そのような試験は、新しい薬剤の開発の一部としての前臨床動物試験の必要性を減少または排除することもできる。例えば、癌細胞を癌性腫瘍における動的環境を模倣する構造で成長させることを可能にすることもできる。薬剤をそのような腫瘍に適用することもできて、その結果、そのような薬剤の効力の指示を、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験技法を使用するよりも信頼性のある様式で得ることができる。
【００２０】
それに加えて、本発明者らは、本明細書に記載された３Ｄ細胞成長培地は、スフェロイド、胚様体、腫瘍、嚢胞、および微小組織を含むが、これらに限定されない成長する多様な細胞の構造を可能にすること、および細胞を搭載する操作された組織構築物の構造を保存することに使用され得ることを理解し且つ認識した。
【００２１】
本発明者らは、液体様固体（ＬＬＳ）が、３次元培養中における生きている細胞を維持するための支持材料の設計のために活用できる輸送、弾性、および降伏の性質の組合せを提供する性質を有することをさらに理解し且つ認識した。これらの材料は、主に自由に拡散してそれらの体積の９９％超を占めることができる溶媒で主として構成され得るが、それらは、それらの固体状態でも有限のモジュラスおよび極端に低い降伏応力を有する。降伏すると、これらの材料は剪断されて典型的な流体のようにふるまう。充填された顆粒状ミクロゲルは、繊細な材料の精密な３次元製作のための堅牢な培地として最近採用された液体様固体のクラスである。栄養素、低分子、およびタンパク質の制限されない拡散は、細胞の代謝の必要性を支持して、コンビナトリアルスクリーニング法の開発への容易な経路を提供することができる。かき乱されないＬＬＳ材料は、細胞および細胞集成体に対する支持および安定性を提供して、精密な多細胞構造の開発および維持を容易にすることができる。
【００２２】
調整可能な降伏応力は、個々の細胞および細胞集成体の移動、成長、および膨張を許容しながら、機械的応力の長期の高まりを防止する乗り越え可能な物理的障壁を提供することができる。この培養培地の穏やかな降伏および急速な固化挙動は、細胞および細胞集成体の培地内における奥行きのある制限のない配置および回収を可能にする。流動化された状態と固体状態の間を優美に且つ繰り返し移動する材料の能力は、目標とされたアッセイのための空間における特定の位置から選択された細胞群を捕集することを容易にする。細胞および細胞集成体を３Ｄで精密におよび制御できるように位置させて維持することは、新しい高処理量のスクリーニング方法および個人別の治療計画が、既存のインフラストラクチュアで且つ高価なまたは煩雑な計装なしで開発されることを可能にする。
【００２３】
幾つかの実施形態において、３Ｄ細胞成長培地は、液体細胞成長培地中に分散されたヒドロゲル粒子を含むことができる。本発明者らは、任意の適当な液体細胞成長培地を使用することができること；特定の液体細胞成長培地を、３Ｄ細胞成長培地内に入れるべき細胞のタイプに応じて選択することができることを理解し且つ認識した。適当な細胞成長培地は、ヒトの細胞成長培地、マウスの細胞成長培地、ウシの細胞成長培地または任意の他の適当な細胞成長培地であってもよい。特定の実施形態に応じて、ヒドロゲル粒子と液体細胞成長培地とを任意の適当な組合せで組み合わせてもよい。例えば、幾つかの実施形態において、３Ｄ細胞成長培地は、約０．５重量％から１重量％のヒドロゲル粒子を含む。
【００２４】
幾つかの実施形態によれば、ヒドロゲル粒子は、生体適合性ポリマーから作製することもできる。
【００２５】
ヒドロゲル粒子は、液体成長培地で膨潤して顆粒状ゲル材料を形成することができる。特定の実施形態に依存して、膨潤したヒドロゲル粒子は、ミクロンまたはサブミクロン規模で特徴的なサイズを有することもできる。例えば、幾つかの実施形態において、膨潤したヒドロゲル粒子は、約０．１μｍと１００μｍの間のサイズを有することができる。さらに、３Ｄ細胞成長培地は、機械的性質の任意の適当な組合せを有することもできて、幾つかの実施形態では、機械的性質を、ヒドロゲル粒子および液体細胞成長培地の相対濃度により調整することができる。例えば、ヒドロゲル粒子のより高い濃度は、より高い弾性モジュラスおよび／またはより高い降伏応力を有する３Ｄ成長培地を生じることができる。
【００２６】
本発明者らは、そのような調整可能性は、３Ｄ細胞成長培地に入れられた細胞群の周囲の環境を制御するために有利であり得ることを理解し且つ認識した。例えば、３Ｄ細胞成長培地は、ｉｎ  ｖｉｖｏで見出されるのと同様であるように調整された機械的性質を有することができて、その結果、細胞３Ｄ成長培地は、細胞の天然環境に匹敵し得る。しかしながら、本開示はそのように限定されていないので、３Ｄ細胞成長培地の機械的性質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで見出されるのと同様でなくてもよく、または任意の適当な値に調整されてもよいことが理解されるべきである。
【００２７】
幾つかの実施形態によれば、３Ｄ細胞成長培地は、顆粒状ゲル材料が、適用された応力に基づいて一時的相変化を経るような材料から作製することもできる（例えば揺変性のまたは「降伏応力」材料）。そのような材料は、固体であってもまたはそれらの降伏応力未満のレベルで適用された応力下でそれらの形状を保持する何か他の相であってもよい。降伏応力を超えて適用された応力で、これらの材料は、流体になることも、またはそれらがそれらの形状を変化させることができる何か他のより順応性のある相になることもできる。適用された応力が除去されたときに、降伏応力材料は再び固体になることができる。応力は、そのような材料に任意の適当なやり方で適用されてもよい。例えば、エネルギーを、そのような材料に、相変化を起こすように加えることもできる。エネルギーは、機械的、電気的、放射線の、または光子の、その他を含む任意の適当な形態であってもよい。
【００２８】
本発明者らは、上で記載したように降伏応力材料から作製された３Ｄ細胞成長培地を提供することは、３Ｄ成長培地内の任意の所望の位置における群の細胞の容易な配置および／または回収を可能にすることができることを理解し且つ認識した。例えば、細胞の配置は、細胞が注入されたときにまたは他の方法で所望の位置に置かれるときに、降伏応力材料が流動して別の所へ移されるように、降伏応力材料の領域における所望の位置で固体に液体相への変化を起こさせることにより達成することができる。注入後、降伏応力材料は、置かれた細胞の周囲で固化することができて、それ故細胞を所望の位置で捕捉する。
【００２９】
しかしながら、任意の適当な技法が、細胞または他の生物学的材料を、３Ｄ成長培地内に置くことに使用され得ることが認識されるべきである。例えば、注射器、ピペットまたは他の適当な器具を使用して、細胞を、３Ｄ成長培地中の１箇所または２箇所以上の位置に注入することもできる。幾つかの実施形態においては、注入された細胞を、遠心分離などによりペレットとして成形することもできる。しかしながら、本明細書に記載される３Ｄ成長培地は、液体中に懸濁された細胞の注入を可能にして、それは試験を実施するときに遠心分離ステップを避けることができることが認識されるべきである。
【００３０】
どのようにして細胞が培地に入れられるかに関わらず、降伏応力材料の降伏応力は、３Ｄ成長培地内における細胞の位置が経時的に実質的に一定にとどまることができるように、細胞によってかけられる重力および／または拡散力に基づく降伏を防止するために十分大きいことも可能である。細胞は位置に固定されるので、それらは、アッセイするかまたは試験するために、後刻、降伏応力材料における相変化を起こさせて細胞を取り出すことにより、同じ位置から回収することができる。下記にさらに詳細に説明するように、細胞群の配置および／または回収は、用手でもまたは自動的にも行うことができる。
【００３１】
本明細書に記載される降伏応力材料は、任意の適当な機械的性質を有することができる。例えば、幾つかの実施形態において、降伏応力材料は、該材料が降伏応力未満のレベルで適用された応力下でその形状を保持する固体相または他の相にあるときに、約１Ｐａと１０００Ｐａの間の弾性モジュラスを有することができる。幾つかの実施形態において、降伏応力材料を流体様の相に変換させるために必要な降伏応力は、約１Ｐａと１０００Ｐａの間であってもよい。幾つかの実施形態において、降伏応力は、１０Ｐａのオーダー、例えば１０Ｐａ＋／−２５％などであってもよい。流体様相に変換されたときに、降伏応力材料は、約１Ｐａ・ｓと１０，０００Ｐａ・ｓの間の粘度を有することもできる。しかしながら、降伏応力材料の弾性モジュラス、降伏応力、および／または粘度についての他の値も、本開示はそのように限定されないので、可能であることが理解されるべきである。
【００３２】
幾つかの実施形態において、降伏応力は、上に記載されたようにｉｎ  ｖｉｖｏで細胞群により経験される圧縮応力と釣り合うように調整することができる。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まず、明確に定義された応力値で降伏する降伏応力材料は、細胞群の不確定のおよび／または無制限の成長または膨張を可能にすることができる。特に、細胞群は成長するにつれて、それは周囲の降伏応力材料に静水学的圧力をかけることができる。この静水学的応力は、降伏応力材料の降伏を起こさせるために十分であり、それにより細胞群の膨張を可能にすることができる。そのような実施形態では、細胞群の成長中の降伏応力材料の屈伸性は、成長中に細胞群に対する一定の圧力を維持する降伏応力材料を生じることができる。それに加えて、降伏応力材料は適用された応力が降伏応力を超えたときに降伏することになるので、降伏応力材料から作製された３Ｄ成長培地は、降伏応力を超える応力を細胞群に適用することができないこともある。本発明者らは、細胞群に適用される応力におけるそのような上界は、細胞が異常に圧迫され、損傷されるかまたは別なふうに大きい圧縮応力の適用に基づいて変化させられることのないことを確実にするのに役立ち得ることを理解し且つ認識した。
【００３３】
幾つかの実施形態によれば、降伏応力材料から作製された３Ｄ成長培地は、降伏して、３Ｄ成長培地内に配置された細胞群からの流体または他の細胞外材料などの排出物を収容することができる。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まず、細胞群からの流体または他の材料の排出は、細胞外の場所における圧力の上昇を生じ得る。圧力が３Ｄ成長培地の降伏応力を超えるならば、３Ｄ成長培地は降伏して排出物を収容することができて、細胞群は流体または他の材料を制限なく排出することができる。細胞の排出を収容する３Ｄ成長培地のそのような能力は、３Ｄ成長培地がｉｎ  ｖｉｖｏ環境にさらに密に調和することを可能にし得る。それに加えて、本発明者らは、降伏応力材料から作製された３Ｄ成長培地は、下記にさらに詳細に説明するように、アッセイ、試験、または任意の他の適当な目的のために、細胞の排出物の容易な除去を可能にすることができることを理解し且つ認識した。
【００３４】
細胞群は、降伏応力材料から作製された３Ｄ成長培地に任意の適当な方法によって入れられてもよい。例えば、幾つかの実施形態において、細胞は、３Ｄ成長培地内の特定の位置に、注入されるかまたは別なふうに注射器、ピペット、または他の適当な配置デバイスまたは注入デバイスを用いて入れることができる。幾つかの実施形態では、自動化された細胞分注器のアレイを、多数の細胞試料を３Ｄ成長培地のコンテナ中に注入するために使用することができる。３Ｄ成長培地を通る配置デバイスの尖端の動きは、十分量のエネルギーを尖端の周りの領域に与えて降伏を生じさせることができて、その結果、配置器具を３Ｄ成長培地内の任意の位置に容易に移動させることができる。幾つかの場合に、細胞群を３Ｄ成長培地内に置くために配置器具によって適用される圧力も、降伏を生じさせるのに十分であることができて、その結果、３Ｄ成長培地は流動して細胞群を収容する。配置器具の動きは、用手で（例えば「手によって」）実施されてもよく、または機械または任意の他の適当な機構により実施されてもよい。
【００３５】
幾つかの実施形態では、多数の独立の細胞群を、３Ｄ細胞成長培地の単一の体積内に入れることもできる。例えば、３Ｄ細胞成長培地の体積は、少なくとも２群、少なくとも５群、少なくとも１０群、少なくとも２０群、少なくとも５０群、少なくとも１００群、少なくとも１０００群、または任意の他の適当な数の独立の細胞群を収容するために十分大きいことが可能である。あるいは、３Ｄ細胞成長培地の体積は、１つの細胞群を有することができるだけであってもよい。さらに、細胞群は、任意の適当な数の細胞を含むことができること、および細胞は１種または複数の異なったタイプであってもよいことが理解されるべきである。
【００３６】
特定の実施形態に応じて、細胞群を、任意の適当な形状、幾何学的配列、および／またはパターンに従って３Ｄ細胞成長培地内に入れることができる。例えば、独立の細胞群は、スフェロイドとして置くこともできて、スフェロイドは３Ｄ格子、または任意の他の適当な３Ｄパターンに配列されてもよい。独立のスフェロイドが、全ておよそ同じ数の細胞を含み、およそ同じサイズであってもよく、またはそうではなくて異なったスフェロイドが異なった数の細胞を含み、異なったサイズであってもよい。幾つかの実施形態において、細胞は、胚様体または器官様体、管、円筒、円錐曲線回転面、階層的に分岐した脈管網、高いアスペクト比の物体、薄い閉じたシェル、または組織、脈管または他の生物学的構造の幾何学的構造に対応し得る他の複雑な形状などの形状で配列されてもよい。
【００３７】
幾つかの実施形態によれば、降伏応力材料から作製された３Ｄ細胞成長培地は、所望のパターンを３次元で形成するために、細胞の３Ｄプリントを可能にすることができる。例えば、コンピューターで制御されたインジェクターの尖端は、３Ｄ細胞成長培地内の空間的通路をなぞって、その通路に沿った位置に細胞を注入して所望の３Ｄパターンまたは形状を形成することができる。３Ｄ細胞成長培地を通るインジェクター尖端の動きは、十分な機械的エネルギーを与えてインジェクター尖端の周りの領域で降伏を起こさせて、インジェクター尖端が３Ｄ細胞成長培地を通して容易に移動することを可能にし、細胞の注入にも適応させることができる。注入後、３Ｄ細胞成長培地は、固体様相に逆変換され、プリントされた細胞を支持して、プリントされた幾何学的構造を維持することができる。しかしながら、３Ｄプリント技法は、本明細書に記載される３Ｄ成長培地を使用するために必要とされるものではないことは理解されるべきである。
【００３８】
本発明者らは、降伏応力材料から作製された３Ｄ細胞成長培地は、細胞を置くために使用されたステップの反転により、細胞成長培地内からの細胞群の容易な回収を可能にし得ることも理解し且つ認識した。例えば、細胞は、注射器またはピペットなどの取り出しデバイスの尖端を細胞群が配置されている位置に単に移動させて、細胞成長培地から細胞を引くために吸引を適用することにより取り出すことができる。上に記載されたように、３Ｄ細胞成長培地を通る取り出しデバイスの尖端の動きは、十分なエネルギーを材料に与えて降伏を起こさせ、３Ｄ細胞成長培地からの細胞の取り出しの便宜をはかることができる。そのような手法は、例えば、多数の細胞試料が３Ｄ成長培地に置かれる試験プロセスの一部として使用することもできる。これらの置かれた細胞は同じ条件下で培養されてもよいが、試料の異なったものを異なった薬剤または他の治療条件に曝すこともできる。１つまたは複数の試料を、異なったときに採取して、治療条件の細胞に対する影響を試験することもできる。
【００３９】
本発明者らは、細胞が流体または他の材料を細胞外の場所に排出する幾つかの実施形態で、細胞を取り出さないままで、細胞成長培地から同様な方法を用いて排出物を除去することもできることを理解し且つ認識した。例えば、３Ｄ細胞成長培地は、細胞を支持して、細胞の排出物を除去するときに、細胞を実質的に静止したままに保つこともできる。幾つかの実施形態では、降伏した３Ｄ細胞成長培地は流れて、取り出された細胞および／または細胞の排出物により以前占拠されていた空間を満たすこともできる。
【００４０】
幾つかの実施形態において、３Ｄ細胞成長培地は、細胞を搭載する操作された組織構築物の構造を支持および／または保存するために使用することもできる。例えば、足場または複数の細胞が配置された他の適当な構造を含む組織構築物が３Ｄ細胞培養培地中に入れられてもよい。３Ｄ細胞培養培地は、組織構築物の複雑な構造を保存するための支持を提供することができる一方で、ｉｎ  ｖｉｖｏで見出される環境を模倣することができる細胞成長のための３Ｄ環境も提供する。
【００４１】
幾つかの実施形態によれば、３Ｄ細胞成長培地は、ヒドロゲル粒子を液体細胞成長培地中に分散させることにより調製することができる。ヒドロゲル粒子は、遠心混合機、振盪機、または任意の他の適当な混合デバイスを使用して、液体細胞成長培地と混合することができる。混合中に、ヒドロゲル粒子は、液体細胞成長培地で膨潤して、適用された剪断応力が降伏応力未満である場合には、上に記載されたように、実質的に固体である材料を形成することができる。混合後、混入した空気または混合プロセス中に導入された気泡は、遠心分離、攪拌、または３Ｄ細胞成長培地から泡を除去するために他の適当な任意の方法によって除去することができる。
【００４２】
幾つかの実施形態において、３Ｄ細胞成長培地の調製は、ヒドロゲル粒子と液体細胞成長培地の混合物のｐＨを所望の値に調節するために緩衝することも含むことができる。例えば、一部のヒドロゲル粒子は、細胞成長培地が過度に酸性である（所望の値未満のｐＨを有する）原因となり得る、主に負電荷を有するポリマーから作製されることもある。細胞成長培地のｐＨは、強塩基を添加して酸を中和して、所望の値に達するようにｐＨを上げることにより、調節することができる。あるいは、混合物は、所望の値より高いｐＨを有していてもよく；そのような混合物のｐＨは、強酸を添加することにより低下させることができる。幾つかの実施形態によれば、所望のｐＨ値は、約７．０から７．４、または、幾つかの実施形態において７．２から７．６の範囲以内であってもよく、またはそれは、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件に対応していてもいなくてもよい任意の他の適当なｐＨ値であってもよい。ｐＨ値は、例えば約７．４であってもよい。幾つかの実施形態において、溶解されたＣＯ２のレベルが所望の値、例えば約５％などに調節されたら、ｐＨは調節され得る
【００４３】
限定するものではない１例において、３Ｄ細胞成長培地は、約０．２質量％から約０．７質量％のカルボポール粒子（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ）を含む。カルボポール粒子は、任意の適当な液体の細胞成長培地と混合されて膨潤し、上に記載されたように、約９９．３質量％から約９９．８質量％細胞成長培地を含む３Ｄ細胞成長培地を形成する。膨潤後、粒子は、約１μｍから約１０μｍの特徴的なサイズを有する。混合物のｐＨは、ＮａＯＨなどの強塩基を添加することにより、約７．４の値に調節される。生じる３Ｄ細胞成長培地は、モジュラスが約１００〜３００Ｐａ、および降伏応力が約２０Ｐａの固体である。この降伏応力を超える応力がこの３Ｄ細胞成長培地に適用されると、細胞成長培地は粘度が約１Ｐａｓから約１０００Ｐａｓの液体様相に変換される。上に記載されたように、特定の機械的性質は、カルボポールの濃度を変化させることにより調節または調整することができる。例えば、より高い濃度のカルボポールを有する３Ｄ細胞成長培地は、より堅くおよび／またはより大きい降伏応力を有することができる。
【００４４】
別の例では、液体様固体培地を、０．９％（ｗ／ｖ）カルボポールＥＴＤ２０２０ポリマー（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ  Ｃｏ．）を添加して調製し、細胞成長培地に滅菌条件下で分散した。培地のｐＨは、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーション条件下でｐＨ７．４に達するまでＮａＯＨを添加することにより調節して、完全に調合された材料を高速遠心混合機で均質化する。カルボポールＥＴＤ２０２０は、このｐＨで膨潤して、上記材料を細胞培養用途のために適当にする。ゲル培地を３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。その後、３Ｄプリント技法を使用して、細胞をこの培地に入れた。
【００４５】
図７ａおよび７ｂは、多数の典型的ＬＬＳ培地のレオロジーの特性を例示する。液体様固体を、本明細書に記載されたように３通りの異なったカルボポール濃度で調製した。（ａ）液体様固体成長培地の降伏応力は、３Ｄプリントされた細胞集成体の品質および３Ｄ細胞培養の支持を制御することができる。降伏応力は、歪み速度の掃引を実施することにより測定され、そこで応力が多くの一定の歪み速度で測定される。降伏応力は、これらのデータを、古典的なＨｅｒｓｃｈｅｌ−Ｂｕｌｋｌｅｙモデル
【数１】
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に適合させることにより決定することができる。（ｂ）降伏していないＬＬＳ培地の弾性および粘稠モジュラスを決定するために、周波数掃引を１％歪みで実施する。弾性および粘稠モジュラスは、広い範囲の周波数にわたって平坦で分離されたままであり、減衰しながらＫｅｌｖｉｎ−Ｖｏｉｇｔ線状固体のように挙動する。まとめると、これらのレオロジーの性質は、固体相と液体相の間の平滑な遷移が顆粒状ミクロゲルで起こり、細胞プリント、培養、およびアッセイするための３Ｄ支持マトリックスとしてのそれらの使用を容易にすることを示す。
【００４６】
以下の考察から認識されるように、降伏応力材料（すなわち、Ｈｅｒｓｃｈｅｌ−Ｂｕｌｋｌｅｙ降伏応力を有する材料）は、望ましくは細胞を支持するために使用することができて、例えば、実施形態で３Ｄプリンターに置かれ得る。特定の降伏応力材料についての以下の考察から認識されるように、本発明者らは、１パスカルから１０００パスカルの範囲内、および有利には１から１００パスカルまたは１０から１００パスカルの範囲内の降伏応力を有する降伏応力材料が、３Ｄプリント中の支持材料として使用するために望ましいことを理解し且つ認識した。例えば、１ないし１００パスカルの間の降伏応力を有するカルボマーポリマー（カルボポール（登録商標）など）が３Ｄプリントで使用される実施形態は、下に記載される。幾つかの実施形態は、Ｈｅｒｓｃｈｅｌ−Ｂｕｌｋｌｅｙの降伏応力における下方の物理的限界によってのみ定義される最小降伏応力で１００パスカル未満の任意の降伏応力を有する降伏応力材料で機能することができる。
【００４７】
別に、本発明者らは、１から１００パスカルまたは１０から１００パスカルのこれらの同じ範囲内の降伏応力を有する降伏応力材料の望ましさを、下記に論ずるように、理解し且つ認識した。本発明者らは、降伏応力材料で３Ｄプリント中に、降伏応力材料の浴内のプリントノズルの運動が、望まれない（および望ましくない）「裂け目」を材料中に創り出すことがあることを理解し且つ認識した。降伏応力材料の浴中におけるプリントは、望ましくない裂け目が自発的に形成されることなく、降伏応力が１００パスカル未満の材料（下記に記載するカルボポール（登録商標）材料のような）などの低い降伏応力を有する降伏応力材料を使用することにより避けることができる。ヒドロゲルである降伏応力材料に対して、降伏応力の上限は、ρ・ｇ・ｈ（ここで、ρは降伏応力材料の密度であり、ｇは重力に基づく加速度であり、およびｈは表面下のプリントの深さである）により決定されるヒドロゲルの静水学的圧力である。
【００４８】
生きている細胞が、ヒドロゲル（カルボポール（登録商標）など）を含有するペトリ皿および／またはウェルプレートに３Ｄプリントされる幾つかの実施形態で、細胞は、例えば、１ｃｍまでの深さでプリントされ得る。そのような実施形態では、降伏応力における上限（静水学的圧力から決定される）は、約１００パスカルである。降伏応力が１００または１０００パスカルまでの望ましいヒドロゲル材料（カルボポール（登録商標）材料を含む）は下記に詳細に論ずる。
【００４９】
当業者は、降伏応力を有する材料は、揺変性時間および揺変性指数などの一定の揺変性の性質を有することを認識するであろう。
【００５０】
本明細書において使用する揺変性時間とは、剪断の供給源の除去後のプラトーにかかる剪断応力の続く時間のことである。本発明者らは、揺変性時間が異なった方法で測定され得ることを認識している。別なふうに指示されない限り、本明細書において使用する揺変性時間は、材料に、数秒の間、材料の降伏応力の１０倍に等しい応力を適用して、続いて応力を降伏応力の０．１倍に落とすことにより決定される。応力の低下の後で剪断速度がプラトーになるための時間の長さが揺変性時間である。
【００５１】
本明細書において使用する、揺変性指数（降伏応力材料についての）は、２ｓ−１の歪み速度における粘度の２０ｓ−１の歪み速度における粘度に対する比として定義される。
【００５２】
望ましい降伏応力を有する降伏応力材料は、望ましい揺変性指数または揺変性時間などの望ましい揺変性の性質を有することができる。例えば、望ましい降伏応力材料（１００パスカル未満の降伏応力を有するヒドロゲル材料を含む。カルボポール（登録商標）材料などのその幾つかは、下記に詳細に説明する）は、２．５秒未満、１．５秒未満、１秒未満、または０．５秒未満、および０．２５秒超または０．１秒超の揺変性時間を有することができる。典型的カルボポール（登録商標）溶液は、１００パスカル未満（および幾つかの実施形態においては２５パスカル未満）の降伏応力、ならびに短い揺変性時間を示し得る。１００パスカル未満の降伏応力を有するカルボポール（登録商標）溶液の揺変性時間は、２．５秒未満、１．５秒未満、１秒未満、または０．５秒未満、および０．２５秒超または０．１秒超であってもよい。
【００５３】
幾つかの実施形態において、１００パスカル未満の降伏応力を有するヒドロゲル降伏応力材料（カルボポール（登録商標）溶液のような下記に詳細に説明するものを含む）に対して、揺変性指数は７未満、６．５未満、または５未満、および４超、または２超、または１超である。
【００５４】
本明細書に記載されるカルボポール（登録商標）溶液などのヒドロゲルのような望ましい降伏応力材料は、したがって、２．５未満、１．５秒未満、１秒未満、または０．５秒未満、および０．２５秒超または０．１秒超の揺変性時間、および／または７未満、６．５未満、または５未満、および４超、または２超、または１超の揺変性指数を有することができる。
【００５５】
降伏応力材料の降伏応力挙動の故に、降伏応力材料中に置かれた材料（本明細書に記載される３Ｄプリント技法によるような）は、降伏応力材料中でその場に固定されてとどまることができて、降伏応力材料または置かれた材料が硬化処理されるかまたは相変化を逆行させるために別なふうに処理される（例えば、プリント後に架橋するために加熱することにより）必要がない。むしろ、降伏応力材料は、降伏応力材料内における細胞クラスターのプリントを含む、降伏応力材料の内側に材料を置くことに限界のない作業時間を許容する。
【００５６】
前述のことから認識されるように、幾つかの実施形態によれば、培養されるべき細胞をカプセル化する３Ｄ構築物として役立ち得る降伏応力材料は、１種または複数種のヒドロゲルを含むこともできる。幾つかのそのようなヒドロゲルは、生体適合性ポリマーであってもよい。ヒドロゲルは、溶液（例えば、細胞成長培地を含む溶液）中に種々の濃度で分散されていてもよい。濃度の１例は、２重量％未満である。別の濃度の例は、約０．５重量％から１重量％のヒドロゲル粒子であり、および別の例は約０．２質量％から約０．７質量％である。当業者は、他の濃度も使用され得ることを認識するであろう。当業者は、ここで論ずるように、溶液中に配置されたときに、本明細書の別の所で論ずるようにヒドロゲル粒子は、溶媒で膨潤して顆粒状ゲル材料を形成することができることをさらに認識するであろう。そのような顆粒状ゲルは、ミクロンまたはサブミクロン規模で特徴的なサイズを有する膨潤したヒドロゲル粒子を含むことができる。例えば、幾つかの実施形態において、膨潤したヒドロゲル粒子は、上で論じたように５μｍを含む約０．１μｍと１００μｍの間のサイズを有することができる。
【００５７】
それを用いて幾つかの実施形態が機能し得るヒドロゲルの例は、カルボポール（登録商標）などのカルボマーポリマーである。カルボマーポリマーは、多価電解質であり得て、変形し得るミクロゲル粒子を含むことができる。
【００５８】
カルボマーポリマーは、粒子状の、３０億〜４０億ダルトンまでの分子量を有するアクリル酸の高分子量の架橋ポリマーである。カルボマーポリマーは、アクリル酸と他の水性モノマーとのコポリマーおよびポリエチレングリコールなどのポリマーも含むことができる。
【００５９】
アクリル酸は、ポリアクリル酸を形成するために使用される一般的な主たるモノマーであるが、該用語はそれらに限定されずに、カルボキシル側鎖基またはジカルボン酸の酸無水物を有する一般的に全てα，β不飽和モノマーおよび米国特許第５，３４９，０３０号に記載された加工助剤を含む。他の有用なカルボキシル含有ポリマーは、不飽和カルボン酸およびアルキル基が１０から３０個の炭素原子を含有する、少なくとも１種のアルキルアクリル系またはメタクリル系エステルのポリマーに向けられた米国特許第３，９４０，３５１号、および無水マレイン酸とビニルエーテルとのコポリマーに向けられた米国特許第５，０３４，４８６号；第５，０３４，４８７号；および第５，０３４，４８８号に記載されている。そのようなコポリマーの他のタイプは、米国特許第４，０６２，８１７号に記載されており、その中で米国特許第３，９４０，３５１号に記載されたポリマーは、それに加えて別のアルキルアクリル系またはメタクリル系エステルを含有し、該アルキル基は１から８個の炭素原子を含有する。カルボキシルポリマーおよびコポリマー、例えば、アクリル酸およびメタクリル酸のそれらなども、米国特許第２，３４０，１１０号；第２，３４０，１１１号；および第２，５３３，６３５号に開示されたように、ジビニルベンゼン、不飽和ジエステル等のような多官能性材料で架橋されていてもよい。これらの米国特許の全ての開示は、ポリアクリル酸中で使用されたときに本明細書で別なふうに開示されたように降伏応力材料を形成するカルボキシルポリマーおよびコポリマーのそれらの考察について参照により本明細書に組み込まれる。特定のタイプの架橋されたポリアクリル酸としては、米国薬局方２３ＮＲ１８におけるカルボマーホモポリマー、カルボマーコポリマーおよびカルボマー共重合体規格、ならびにＰＣＰＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１２版（２００８）に記載されたカルボマーおよびＣ１０−３０アクリル酸アルキルのクロスポリマー、アクリレートクロスポリマーが含まれる。
【００６０】
カルボマーポリマーの分散液は、酸性でｐＨは約３である。６〜１０のｐＨに中和されると、粒子は劇的に膨潤する。膨潤したカルボマーへの塩の添加は、粒子サイズを減少させてそれらのレオロジー的性質に強く影響することができる。膨潤したカルボマーは、水およびエタノールのような溶媒と屈折率が殆ど一致して、それは光学的に透明になる。元の合成粉末化されたカルボマーは、カルボポール（登録商標）として商標を登録されており、１９５８年にＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ（現在Ｌｕｂｒｉｚｏｌとして知られている）により市販されたが、カルボマーは多くの異なった製品で市販されている。
【００６１】
ヒドロゲルは、直径約５μｍの架橋ポリマーから作製された充填されたミクロゲル、すなわち顕微鏡サイズのゲル粒子を含むことができる。カルボポール（登録商標）の降伏応力は、含水率により制御される。カルボポール（登録商標）の降伏応力は、おおまかに１〜１０００Ｐａの間で変化させることができる。したがって、両方の材料で、応力を細胞が通常生じさせるレベルの範囲で調整することができる。上で論じたように、材料は１〜１０００Ｐａの範囲内に降伏応力を有することができるが、幾つかの実施形態では、１〜１００Ｐａまたは１０〜１００Ｐａの範囲内に降伏応力を有する降伏応力材料を使用することが有利なこともある。それに加えて、幾つかのそのような材料は、２．５秒未満、１．５秒未満、１秒未満、または０．５秒未満、および０．２５秒超または０．１秒超の揺変性時間、および／または７未満、６．５未満、または５未満、および４超、または２超、または１超の揺変性指数を有することもできる。
【００６２】
幾つかの実施形態において、シリコーンエラストマー分散液も、それで幾つかの実施形態が機能し得る降伏応力材料として役立つこともできる。
【００６３】
幾つかの実施形態では、化合物が顆粒状ゲル成長培地に導入されてもよい。これらの化合物は、顆粒状ゲル全体にわたって拡散することができるかまたは顆粒状ゲルを構成する粒子中に拡散することができる分子であってもよい。幾つかの実施形態において、これらの分子は、低分子および／またはタンパク質であってもよい。低分子は栄養素または溶解した気体であってもよい。
【００６４】
ここで、図に注意を向けると、３Ｄ細胞成長培地およびそれらの調製方法および／または使用の限定にならない特定の実施形態がより詳細に記載されている。
【００６５】
図１は、細胞群を３Ｄ細胞成長培地１２０に入れるための装置１００の１実施形態の模式的表示を描く図である。装置１００は、コンテナ１１０、焦点を合わせたエネルギーの供給源１３０、およびインジェクター１５０を含むことができる。コンテナ１１０は、３Ｄ細胞成長培地１２０を保持することができる。焦点を合わせたエネルギー供給源１３０は、焦点を合わせたエネルギーを領域１４０に適用することにより、３Ｄ細胞成長培地１２０の領域１４０で相変化を起こさせることができる。インジェクター１５０は、３Ｄ細胞成長培地１２０を複数の細胞を含むことができる材料１６０で置き換えることができる。
【００６６】
幾つかの実施形態によれば、コンテナ１１０は、槽、鉢、箱、または３Ｄ細胞成長培地１２０のための任意の他の適当なコンテナであってもよい。上に記載されたように、３Ｄ細胞成長培地１２０は、揺変性材料または降伏応力材料、または一時的相変化のために適当な任意の材料を含むことができる。幾つかの例で、揺変性材料または降伏応力材料は、軟質顆粒状ゲルを含むことができる。軟質顆粒状ゲルは、液体細胞培養培地で膨潤するポリマーのヒドロゲル粒子から作製することができる。特定の実施形態に応じて、ヒドロゲル粒子は、膨潤したときに、直径が０．５μｍと５０μｍの間、約１μｍと１０μｍの間、または約５μｍであってもよい。
【００６７】
例えば、図２は（ａ）材料１６０が３Ｄ細胞成長培地１２０中に注入されるときに、空間で複雑なパターンを掃引するミクロスケールの尖端１５５を有する毛細管を含むインジェクター１５０を例示する。任意のアスペクト比のパターンを生じさせることができて、その理由は、構造自体が固化する必要がないかまたはそれ自体でいかなる支持も発生する必要もないからである。それに加えて、図２は、（ｂ）３Ｄ細胞成長培地１２０を含む、完全に充填されたヒドロゲル粒子を横断する尖端１５５を例示する。尖端１５５の動きは、粒子を流動化させ、次に急速に固化させることができて、その通った跡に引かれた円筒を残す。図２は、（ｃ）軟質顆粒状ゲル培地を、低い剪断歪みで弾性的に変形し、中程度の歪みで軟化し、および高い歪みで流動化し得る降伏応力材料の適例として例示する。
【００６８】
幾つかの実施形態によれば、焦点を合わせたエネルギーは、最初の材料１２０に対するインジェクター１５０の移動に基づく運動エネルギーなどの機械的エネルギーを含むことができる。この例では、焦点を合わせたエネルギー供給源１３０は、インジェクター１５０を含むことができる。幾つかの実施形態によれば、インジェクター１５０は、細い中空尖端を含むことができて、それは、材料１６０を注入しながら、注意深く３Ｄ細胞成長培地１２０内の空間的通路をなぞることができる。尖端の動きは、３Ｄ細胞成長培地１２０を、注入箇所で（すなわち、領域１４０において）、局所的に降伏させて流動化させることができる。機械的エネルギーの別の例は、超音波圧力波を含むことができる。あるいはまたはそれに加えて、焦点を合わせたエネルギーは、高周波放射線などの放射線エネルギーを含むことができて、それを領域１４０に向けることができる。インジェクターの動きは、用手で（例えば「手」によって）実施されてもよく、または自動化されてもよい（例えば、コンピューターまたは機械で制御される）ことが認識されるべきである。それに加えてまたはあるいは、焦点を合わせたエネルギー供給源１３０は、３Ｄ細胞成長培地１２０の領域１４０で相変化を起こさせて、上で論じたように、細胞およびまたは細胞の排出物を含む材料１６０の除去を可能にすることができる。
【００６９】
図３で例示したように、本明細書に記載された３Ｄ細胞成長培地は、３次元的にプリントするかまたは別なふうに３Ｄ細胞成長培地内に所望のパターンで細胞を位置させるための方法で使用することができることが、前述のことから認識されるべきである。方法３００は、焦点を合わせたエネルギー供給源を使用して、焦点を合わせたエネルギーを領域に適用することにより、３Ｄ細胞成長培地の領域で、相変化を起こさせることができる行為３１０で開始される。３Ｄ細胞成長培地は、エネルギーの導入であまり流体的でない状態からより流体の状態に変化し得る材料であることもできる。行為３２０において、３Ｄ細胞成長培地を、細胞を含有する材料で置き換えることにより、細胞を３Ｄ細胞成長培地に入れることができる。
【００７０】
図４Ａは、コンテナ４１０の中に配置された３Ｄ細胞成長培地４２０を含む３Ｄ細胞培養４００の１実施形態の断面図を描く図である。１個または複数の細胞を含む複数のスフェロイド４３０が３Ｄ細胞成長培地４２０中に配置されている。描かれた実施形態では、スフェロイド４３０はおよそ同じサイズであり、均等に間隔を置いて分かれている。幾つかの実施形態において、スフェロイドは、全てが同じサイズでなくてもよく、および／または間隔は同じでなくてもよい。例えば、図４Ｂは、小さいスフェロイド４６０、中間のサイズのスフェロイド４７０、および大きいスフェロイド４８０を含む３Ｄ細胞培養４５０の別の実施形態を描いている。上のことに照らして、細胞の細胞スフェロイドは、任意の適当なサイズの組合せおよび／または間隔を有していてもよいことが理解されるべきである。スフェロイドが描かれているが、開示はそのように限定されていないので、細胞群はスフェロイドでなくてもよく、胚様体、器官様体であってもよく、または任意の他の適当な形状を有していてもよいことが理解されるべきである。
【００７１】
図４Ａおよび図４Ｂは、ここでは球として示される多数の細胞クラスターの同じ容器中における発生を例示する。図４Ｃおよび４Ｄは、多数の同一の球または種々のサイズの球の数多くの個別の容器中における発生を例示する。例示された容器は、整理箱４１０でまたは高い処理能力試験を容易にする他の適当な担体（carrier）で形成され得る。しかしながら、１個または複数の任意の適当な容器を使用することができることは認識されるべきである。
【００７２】
使用される容器のタイプに関わらず、細胞が置かれたら、細胞を含有する培地は、その化学的性質を変化させて、順送りで内部に含有された３Ｄ培養の成長環境を改変することができる多様な環境でインキュベートされもよい。例えば、培地中の細胞は、低い酸素または低酸素の環境中でインキュベートされてもよい。
【００７３】
１種または複数種の化合物が、細胞と一緒におよび／または隣接して置かれてもよいことが認識されるべきである。例えば、可溶で非細胞の成分は、細胞と一緒に置くことができた。これらは、構造タンパク質（例えばコラーゲン、ラミニン）、シグナル伝達分子（成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ペプチド）、化学的化合物（薬理学的活性物質）、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）、その他（ナノ粒子、ウイルス、遺伝子移動のためのベクター）を含むことができる。
【００７４】
３Ｄ細胞成長培地を調製するための方法５００を図５に例示する。該方法は、ヒドロゲル粒子が液体細胞培養培地と混合される行為５１０で開始される。混合は、遠心混合機、振盪機などの機械的混合機、またはヒドロゲル粒子を液体細胞培養培地中に分散させるために役立つ任意の他の適当な混合デバイスを用いて実施することができる。混合中に、ヒドロゲル粒子は、上で論じたように、液体細胞培養培地で膨潤して顆粒状ゲルを形成することができる。幾つかの場合に、混合行為５１０は、空気の泡またはゲルに混入し得る他の気泡の導入を生じることもある。そのような混入した気泡は、行為５２０で遠心分離、穏やかな攪拌、または任意の他の適当な技法により除去される。混合物のｐＨは、ステップ５３０で調節することができる。混合物のｐＨが所望の値に達するまで、ｐＨを上げるために塩基を添加することができ、またはあるいはｐＨを下げるために酸を添加することができる。幾つかの実施形態において、調節後の最終ｐＨ値は約７．４である。
【００７５】
図６ａ〜６ｅは、細胞成長のシナリオの例を例示する。３Ｄで細胞を培養および研究するための障壁は、全て研究のための単一の理想的マトリックスがないことである。細胞は、コラーゲンおよびマトリゲルのような天然バイオポリマーネットワークならびに、接着および細胞移動を容易にする酵素的分解のための組み込まれたモチーフで操作された材料中で生育する。残念ながら、これらのマトリックスは、細胞の精密な配置および組み立てのために、または流体交換中の一連の移動、収穫、および直接アッセイを使用する連続細胞培養のためにはデザインされていない（図６ａ、ｂ）。液体細胞成長培地で膨潤した充填されたミクロゲル粒子から作製されたＬＬＳは、これらの課題のために殆ど理想的に適している。この材料は、＞９９％（ｗ／ｗ）の液体成長培地から調製することができて、コンテナ中に注ぎ込むことができ、材料はそこに自発的に流れて固化する。これらの軟質顆粒状ゲルは、約１００ｎｍのメッシュサイズを有して、このサイズは、殆ど妨げられない栄養素、廃棄物、および低分子の拡散を可能にするが（図６ｃ）、対流を抑制して、それにより全て分子の輸送が拡散によることを確実にする。低いポリマー濃度および相対的に大きいメッシュサイズは、このＬＬＳ調合物に約１０Ｐａの降伏応力を与えて、そのことが順送りで細胞および細胞集成体が経験する歪み応力に上限を設ける（図６ｄ）。そのような低い降伏応力が、細胞移動および分割中の圧力の高まりを制限して（図６ｅ、ｆ）、それが３Ｄにおける長い持続時間の細胞生存能力にとって最も重要な貢献要因であり得る。
【００７６】
ＬＬＳ中に包埋された組織細胞の動きは興味をそそる。細胞が動くにつれて、顆粒状ゲルは、移動の方向に転置されて、自発的に流れて細胞の後ろの空間を満たす。これは、その中で３Ｄ移動が酵素的分解による永続性トンネルの創出を通して可能にされるポリマーネットワーク中における移動挙動とはっきりした対照である。３Ｄ細胞移動の本発明者らの初期の研究は、細胞を標準的プラスチックの組織培養表面に広げて、細胞を収穫し、次に細胞分散液を用手で混合してＬＬＳ  ３Ｄ培養培地中に入れることにより実施した。これらの軟質顆粒状ミクロゲルは、本発明者らが８種の異なった細胞タイプに対して非細胞傷害性であることを見出した軽く架橋された型ポリアクリル酸コポリマーから作製される。本発明者らは、ＭＤＣＫおよびＭＣＦ１０Ａ上皮細胞、ＭＳ１およびＨＡＥＣ内皮細胞、ＨｕＨ−７肝細胞、ＣＴＬＬ−２キラーＴ細胞、および間葉系の幹細胞のＬＬＳ培養において２４時間後に約９０％の絶対生存能力を見出した。本発明者らは、原発性骨肉腫細胞で同じ生存能力を見出している。細胞外基質前駆体と混合されたＨｕＨ−７肝細胞とＭＳ１内皮細胞の３Ｄプリントされた共培養は、２週間カルセリン染色を示して、用手で培養皿の間で移されたときに、物理的完全性を示した。本発明者らは、ＭＣＦ１０Ａ細胞のクラスターも新鮮ＬＬＳ成長培地のコンテナ中に逐次移した。
【００７７】
本発明者らは、インテグリン結合ドメインを有する天然または合成細胞外基質の添加なしで、分散された細胞における固定を必要とすると一般的に考えられている広範囲の複雑な挙動を観察した。例えば、ＭＣＦ１０Ａ細胞は、組織の無生命の連続体を通して航行するかのように、３Ｄ空間を曲がりくねって探る長い糸状偽足を伸ばして、他の細胞の受容体を探し求める。これらの糸状偽足は、しばしば、中央の細胞本体よりも大きく、長さが３０μｍを超える。移動中に、細胞は、周期的に方向をもった突出部を伸ばして、次にそれらの体を同じ方向で前に進ませ、引きずる突出部を残し、それを最終的に前方に引っ込ませることを本発明者らは観察している。１０Ｐａの降伏応力を有するＬＬＳで、このサイクルを送り返すことにより進行する移動は、約３００ｎｍの間隔で細胞表面にわたって分布する１ｐＮのオーダーで突出力の発生を必要とし、それはアクチンの重合力および細胞骨格メッシュのサイズの範囲内に十分入る。
【００７８】
組織およびネットワーク内の細胞は、機械的にそれらの周囲に応力を加えて、ＬＬＳ培養培地は均一な連続体を提供することができて、それを通して細胞と細胞の相互作用は３Ｄ弾性により媒介される。本発明者らは、経時的な細胞の３Ｄ追跡により平均的な細胞−細胞相互作用の程度を特徴づけて、それらの長さにおける変動の二乗平均平方根を測定している。本発明者らは、細胞密度の関数としてこの細胞活性の単調でない傾向を見出している。細胞同士が最も遠く離れている最低の細胞密度で、活性は低く、１μｍのオーダー、例えば０．０５ないし５１μｍの間などでＲＭＳ長さの変動を有する。該変動は、細胞が最密充填に近く、クラスターを形成し始める最高の密度でやはり小さい。細胞活性は、中心から中心が細胞直径の約３倍の平均細胞間隔の中間的細胞密度で最高であり、大きく増幅され、長さは平均で約１００％変動する。この細胞−細胞刺激の根底にある詳細な機構は、化学的または機械的であり得る。排出されるケモカインの濃度は、細胞運動により生じた場を歪ませるので、３Ｄで急速に減衰するであろう。本発明者らは、蛍光性微小球をＬＬＳに包埋して、包埋された蛍光性細胞周囲の塊を撮像することにより細胞−細胞相互作用の１つの興味ある可能性のある機構を観察した。本発明者らは、細胞をＬＬＳから細胞直径の約１倍だけ離す（ＥＤ図５）細胞本体周囲の厚い排除ゾーンを観察している。このゾーンは、多くの細胞タイプが大量に産生する細胞周囲のマトリックスで満たされているようである。可能性のある多様な細胞−細胞相互作用の定量的研究は、液体様固体に基づく顆粒状ゲルの極端に均一な輸送および機械的性質、およびそのような研究で使用される本発明者に記載された技法により容易になる。
【００７９】
別の例によって、本発明者らは、ＬＬＳ培養培地は、それを通して細胞−細胞相互作用が３Ｄ弾性により媒介される均一な連続体、および組織およびネットワーク内の細胞が経験する実質的に低下した機械的応力を提供することを観察している。本発明者らは、細胞の経時的３Ｄ追跡およびそれらの長さの二乗平均平方根変動の測定により、細胞−細胞相互作用の平均的程度を特徴づけている。本発明者らは、細胞密度の関数としてこの細胞活性における単調でない傾向を見出している。細胞同士が最も遠く離れている最低の細胞密度で、活性は低く、ＲＭＳ長さの変動を１μｍのオーダーで有する。該変動は、細胞が最密充填に近く、クラスターを形成し始める最高密度でもやはり小さい。細胞活性は、中心から中心が細胞直径の約３倍の平均細胞間隔の中間的細胞密度で最高であり、大きく増幅され、長さは平均で約１００％変動する。この細胞−細胞刺激の根底にある詳細な機構は、化学的または機械的であり得る。排出されるケモカインの濃度は、細胞運動により生じた場を歪ませるので、３Ｄで急速に減衰するであろう。本発明者らは、蛍光性微小球をＬＬＳに包埋して、包埋された蛍光性細胞周囲の塊を撮像することにより細胞−細胞相互作用の１つの興味ある可能性のある機構を観察した。本発明者らは、細胞をＬＬＳから細胞直径の約１倍だけ離す細胞本体周囲の厚い排除ゾーンを観察している。このゾーンは、多くの細胞タイプが大量に産生する細胞周囲のマトリックスで満たされているようである。可能性のある多様な細胞−細胞相互作用の定量的研究は、液体様固体に基づく顆粒状ゲルの極端に均一な輸送および機械的性質、およびそのような研究で使用される本発明者に記載された技法により容易になる。
【００８０】
別の例で、ＬＬＳ成長培地の機械的性質は、細胞分裂が無視し得る物理的耐性で起こることを可能にすることが観察された。本発明者らは、一対の娘細胞が約１５μｍ／時間で別れ行く単一の細胞の分裂を観察しており、それは２Ｄ培養中における細胞分離の速度と同程度である。本発明者らは、細胞分裂におけるこのステップ中に剪断されるＬＬＳ顆粒状ゲルについて歪み速度を、
【数２】
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により与えられる分離速度νと細胞サイズＲの比から推定しており、そのピークは約１０−４ｓ−１である。本発明者らの降伏中のＬＬＳのレオロジーの試験は、この歪み速度における培地中の応力は、降伏応力が４〜９Ｐａであることを示す。降伏応力のこの値は、典型的であり、成長培地の固体への分配を変化させるかまたは他の材料の性質を調整することにより達成され得る他の降伏応力を有する材料は、他の実施形態について他の範囲であってもよいことが認識されるべきである。例えば、降伏応力は、より低くて１〜５Ｐａの範囲などでもよく、またはより高くて７〜１５Ｐａの範囲内などでもよい。それにも拘わらず、この例では、この値は適当であり、その理由は、細胞分裂を制御する細胞骨格の力は、４〜９Ｐａよりはるかにより高いレベルの応力を発生させることができて、ＬＬＳは３Ｄ中で育成する支持を提供するが、細胞分裂を物理的に妨げないことを示すからである。この例では、増殖は、スフェロイド内で大きい数で起こり、そこでＭＣＦ１０Ａ細胞は、平均分裂時間が４８時間であり、ウェルプレートで見出される時間の約２倍である。インテグリンを通した付着または硬めのミクロ環境を必要とする細胞については、天然または合成ＥＣＭをＬＬＳ培地中に混合して、生存能力を改善することができる。
【００８１】
別の例として、この方法で、本発明者らは、原発性骨肉腫細胞を５００μｍの平均直径および４．５％の標準偏差を有する４０個のスフェロイド中に集合させた。低い降伏応力は、球が８日の過程で妨げられずに膨張することを可能にして、その間にスフェロイドは、体積が５０％増加する。ＭＣＦ１０Ａ細胞から作製されたスフェロイドは、この速度の約２倍で膨張するが、一方、キラーＴ細胞中に直接分散された３Ｄプリントされた骨肉腫スフェロイドは、体積の減少および２２時間を通して細胞死を示す。同一の３Ｄミクロ組織の大きいアレイを創り出してモニターするこの能力は、別のレベルの処理能力および精密さを定量的生物学にもたらす。
【００８２】
別の例で、本明細書に記載された技法は、通常逐次実施される多くの数の試験をしばしば必要とする組み合わせた多数の生物活性作用物質の共同効果のスクリーニングのために使用することができる。３Ｄ細胞集成体におけるコンビナトリアル試験を加速するために、多数の分子の種の時空的な濃度勾配を、ＬＬＳの内側の定量的制御で創出することができる。したがって、ＬＬＳ内の分子の濃度プロファイルの定量的予測は、境界条件が知られれば可能である。本発明者らは、時間放出ポリマーフィルムをＬＬＳ内に包埋して、それらの内容物を一定の速度で放出する２つの垂直な境界を創出する。フィルムは、吸収されたら、生きている細胞内の代謝性作用により蛍光性になる色素を放出する。この取り込みをＨＵＨ７肝細胞スフェロイドの３Ｄプリントされたアレイの時間経過共焦点の蛍光撮像でモニターする。本発明者らは、各球の崩壊で、２つの色素種から、積分された蛍光がフリーパラメータなしの２本のユニバーサル空間−時間スケーリング曲線上に信号を出すことを見出している。
【００８３】
本明細書に記載された３Ｄ細胞成長培地の実施形態は、いかなる特定のタイプの細胞にも限定されないことは理解されるべきである。例えば、３Ｄ細胞成長培地の種々の実施形態を、動物、細菌、植物、昆虫、または任意の他の適当なタイプの細胞で使用することができる。
【００８４】
さらに、特定のＬＳＳ調剤は、例として提供されたことが認識されるべきである。しかしながら、ＬＳＳの輸送および材料の性質が、ＬＬＳ中のポリマー濃度を変化させることにより調整され得ることは認識されるべきである。例えば、濃度は、例で示した量に対して５％、１０％またはそれを超えて増大または減少してもよい。
【００８５】
本教示は、種々の実施形態および例とともに説明したが、本教示がそのような実施形態または例に限定されることは意図されない。反対に、本教示は、当業者によって認識されるような種々の代案、改変、および等価事物を包含する。
【００８６】
したがって、前述の記載および図面は例としてのものにすぎない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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