(57)【要約】  本発明は、動物の成長能力を向上させるための方法を提供する。具体的には、本発明者らは、通常の動物用食餌へのタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の添加が、このタンパク質分解酵素がビタミンＣと共に添加および組み合わせられる場合に、成長能力の有意な向上をもたらすことを発見した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
家畜の成長能力を向上させるための方法であって、通常の動物用食餌を、ビタミンＣ、その誘導体または代謝産物と組み合わせた有効量の１種以上のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で処理するステップを含む方法。
【請求項２】
前記成長能力が、動物の日平均体重増加（ａｖｅｒａｇｅ  ｄａｉｌｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ）（ＡＤＷＧ）、日平均飼料摂取量（ａｖｅｒａｇｅ  ｄａｉｌｙ  ｆｅｅｄ  ｉｎｔａｋｅ）（ＡＤＦＩ）、および／または飼料要求率（ｆｅｅｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｒａｔｅ）（ＦＣＲ）として測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼが、ノカルジオプシス・ダソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）亜種ダソンビレイ（ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）ＤＳＭ  ４３２３５（Ａ１９１８Ｌ１）、ノカルジオプシス・プラシナ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｐｒａｓｉｎａ）ＤＳＭ  １５６４９（ＮＮ０１８３３５Ｌ１）、ノカルジオプシス・プラシナ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｐｒａｓｉｎａ）（以前はアルバ）ＤＳＭ  １４０１０（ＮＮ１８１４０Ｌ１）、ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）種ＤＳＭ  １６４２４（ＮＮ０１８７０４Ｌ２）、ノカルジオプシス・アルカリフィラ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｌｋａｌｉｐｈｉｌａ）ＤＳＭ  ４４６５７（ＮＮ０１９３４０Ｌ２）、およびノカルジオプシス・ルセンテンシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｌｕｃｅｎｔｅｎｓｉｓ）ＤＳＭ  ４４０４８（ＮＮ０１９００２Ｌ２）に由来する酸安定性のセリンプロテアーゼ、ならびに同種のプロテアーゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記動物が、非反芻動物および反芻動物からなる群から選択され、反芻動物が、限定はされないが、ヒツジ、ヤギおよびウシを含み、非反芻動物が、限定はされないが、ウマ；ウサギ；限定はされないが、乳児期のブタ、子ブタ、肥育ブタ、雌ブタおよび雄ブタを含む、ブタ；ならびに家禽、例えば、シチメンチョウ、アヒル、およびニワトリを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼの意図される適用量が、食餌１ｋｇあたりプロテアーゼ酵素タンパク質０．０１〜２００ｍｇである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ビタミンＣの意図される適用量が、食餌１ｋｇあたりビタミンＣ５０〜５００ｍｇである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
家畜の体重増加を増大させるおよび／または飼料要求率を向上させるための、通常の動物用食餌中での、ビタミンＣ、その誘導体または代謝産物と組み合わせた１種以上のタンパク質分解酵素の使用。
【請求項８】
前記プロテアーゼが、ノカルジオプシス・ダソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）亜種ダソンビレイ（ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）ＤＳＭ  ４３２３５（Ａ１９１８Ｌ１）、ノカルジオプシス・プラシナ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｐｒａｓｉｎａ）ＤＳＭ  １５６４９（ＮＮ０１８３３５Ｌ１）、ノカルジオプシス・プラシナ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｐｒａｓｉｎａ）（以前はアルバ）ＤＳＭ  １４０１０（ＮＮ１８１４０Ｌ１）、ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）種ＤＳＭ  １６４２４（ＮＮ０１８７０４Ｌ２）、ノカルジオプシス・アルカリフィラ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｌｋａｌｉｐｈｉｌａ）ＤＳＭ  ４４６５７（ＮＮ０１９３４０Ｌ２）、およびノカルジオプシス・ルセンテンシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｌｕｃｅｎｔｅｎｓｉｓ）ＤＳＭ  ４４０４８（ＮＮ０１９００２Ｌ２）に由来する酸安定性のセリンプロテアーゼ、ならびに同種のプロテアーゼである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記動物が、非反芻動物および反芻動物からなる群から選択され、反芻動物が、限定はされないが、ヒツジ、ヤギおよびウシを含み、非反芻動物が、限定はされないが、ウマ；ウサギ；限定はされないが、乳児期のブタ、子ブタ、肥育ブタ、雌ブタおよび雄ブタを含む、ブタ；ならびに家禽、例えば、シチメンチョウ、アヒル、およびニワトリを含む、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
前記プロテアーゼの意図される適用量が、食餌１ｋｇあたりプロテアーゼ酵素タンパク質０．０１〜２００ｍｇである、請求項７〜９のいずれか一項の使用。
【請求項１１】
前記ビタミンＣの意図される適用量が、食餌１ｋｇあたりビタミンＣ５０〜５００ｍｇである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、動物の成長能力を向上させるための方法に関する。具体的には、本発明は、少なくとも１種のタンパク質分解酵素を、ビタミンＣ、その誘導体または代謝産物と組み合わせて動物に投与することによって、その動物の成長能力を向上させるための方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
動物用飼料におけるタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の使用は、例えば以下の文書などから、周知である。
【０００３】
国際公開第９５／２８８５０号パンフレットは、フィターゼとタンパク質分解酵素を含む動物用飼料添加物を開示している。様々なタンパク質分解酵素が、ｐ７に明記されている。
【０００４】
国際公開第９６／０５７３９号パンフレットは、キシラナーゼとプロテアーゼを含む酵素飼料添加物を開示している。好適なプロテアーゼは、ｐ．２５に列挙されている。国際公開第９５／０２０４４号パンフレットは、糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）に由来するプロテアーゼ、ならびにその動物用飼料における使用を開示している。
【０００５】
米国特許第３９６６９７１号明細書は、酸性フィターゼ、および場合によってはタンパク質分解酵素での処理によって、植物性タンパク質源からタンパク質を得るプロセスを開示している。好適なプロテアーゼは、第２段に明記されている。
【０００６】
ビタミンＣは、アスコルビン酸およびその塩、ならびにデヒドロアスコルビン酸のようないくつかの酸化型の分子を含めた、動物においてビタミンＣ活性を有するいくつかのビタマーを指す。
【０００７】
ビタミンＣまたはＬ−アスコルビン酸または単にアスコルビン酸は、すべての動物および植物における一連の必要不可欠な代謝反応に必要とされる。アスコルビン酸は、ヒトおよびいくつかの種類の鳥および魚では合成されない。一方で、アスコルビン酸またはビタミンＣは、ほとんどすべての家畜では、体内で作られる。例えばブタおよび家禽などの動物は、通常の１日の必要量を満たすのに十分なビタミンＣ（アスコルビン酸）を合成することが十分に可能である。
【０００８】
こういう理由で、商業的条件下では、ビタミンＣは、通常の動物用食餌中の飼料添加物としては使用されない。ビタミンＣは、例外的な場合に（例えば、熱ストレスと闘うための家禽の食餌に、またストレスの期間（早期離乳）中のブタの食餌にのみ、動物用飼料に添加される。
【０００９】
驚いたことに、本発明者らは、通常の動物用食餌へのタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の添加が、このタンパク質分解酵素がビタミンＣと共に添加および組み合わせられる場合に、成長能力の有意な向上をもたらすことを発見した。
【００１０】
［発明の内容］
本発明では、用語「動物」には、すべての家畜が含まれる。これらの動物の例としては、非反芻動物および反芻動物が挙げられる。反芻動物には、限定はされないが、ヒツジ、ヤギおよびウシが含まれる；非反芻動物には、限定はされないが、ウマ；ウサギ；ブタ（限定はされないが、乳児期のブタ、子ブタ、肥育ブタ、雌ブタおよび雄ブタが含まれる）；ならびに家禽、例えば、シチメンチョウ、アヒル、およびニワトリ（限定はさないが、ブロイラー鶏、採卵鶏が含まれる）などが含まれる。
【００１１】
本発明では、用語「成長能力」は、動物の日平均体重増加（ａｖｅｒａｇｅ  ｄａｉｌｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ）（ＡＤＷＧ）、日平均飼料摂取量（ａｖｅｒａｇｅ  ｄａｉｌｙ  ｆｅｅｄ  ｉｎｔａｋｅ）（ＡＤＦＩ）の増大、および／または飼料要求率（ｆｅｅｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｒａｔｅ）（ＦＣＲ）の向上を意味する。
【００１２】
用語「飼料要求率」は、本発明による組成物が動物用飼料に、好適な濃度／ｋｇ（飼料）で添加される第１の処置と、動物用飼料への組成物の添加を行わない第２の処置（対照）を含む、成長試験に基づいて決定される。ＦＣＲが低いほど、利用される飼料が優れている。特定の実施形態では、ＦＣＲは、対照と比較して、少なくとも１．０％、好ましくは少なくとも１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、または少なくとも２．５％向上（すなわち低下）される。さらなる特定の実施形態では、ＦＣＲは、対照と比較して、少なくとも２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、または少なくとも３．０％向上（すなわち低下）される。一層さらなる特定の実施形態では、ＦＣＲは、対照と比較して、少なくとも３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、または少なくとも３．８％向上（すなわち低下）される。
【００１３】
体重増加の向上は、ビタミンＣおよびプロテアーゼを添加されていない対照に対する、毎日、毎週、隔週、または毎月の体重増加（ｇまたはｋｇ／適切な期間）の向上を意味する。
【００１４】
本発明の方法によれば、ビタミンＣと組み合わせたプロテアーゼの投与は、動物の成長能力を向上させる相乗効果を提供することができる。用語「相乗効果」は、１＋１＞２という事象、すなわち、２種以上の物質が、これらの物質の各々によってもたらされる効果の合計よりも優れた効果を互いに提供すること、または、「互いに促進的な効果」という事象、すなわち、一方の物質によってもたらされる効果が他方の物質の存在下で増強されることを意味する。
【００１５】
投与は、動物に、１日１回、または１日に２回以上実施することができる。さらに、ビタミンＣおよびプロテアーゼを、同時にまたは別に投与することができる。
【００１６】
ビタミンＣおよびプロテアーゼは、飼料組成物として、または動物用飼料プレミックスの構成成分として、および／または動物の飲料水に入れて、動物に直接的に投与することができる。
【００１７】
[発明の詳細な説明]
ビタミンＣは、商業的ルートまたは直接合成を含めた、あらゆる起源から生じることができる。本発明に従う使用のためのビタミンＣ調合物は、ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｋａｉｓｅｒａｕｇｓｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって供給される商標ＳｔａｙＣ（登録商標）５０で、市販品として入手可能である。
【００１８】
ビタミンＣは、プロテアーゼと組み合わせて使用される場合、有効量で、すなわち、動物の成長能力を向上させるのに十分な量（この量は、動物種に依存する）で適用される。
【００１９】
ブロイラーの食餌の好ましい例では、ビタミンＣの意図される適用量は、５０〜５００ｍｇビタミンＣ／ｋｇ（最終の飼料）である。
【００２０】
プロテアーゼは、その触媒機構に基づいて、以下のグループに分類される：セリンプロテアーゼ（Ｓ）、システインプロテアーゼ（Ｃ）、アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ）、メタロプロテアーゼ（Ｍ）、および未知のまたはまだ分類されていないプロテアーゼ（Ｕ）。Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ（ｅｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）、具体的には概略紹介部分を参照されたい。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明に従う使用のためのプロテアーゼは、微生物プロテアーゼであり、用語「微生物プロテアーゼ」は、プロテアーゼが微生物に由来するもしくは微生物に起源を有する、または微生物に由来する類似体、断片、変種、変異体、もしくは合成のプロテアーゼであることを示す。微生物プロテアーゼは、元々の野生型微生物株中で、または別の微生物株中で、または植物中で産生または発現させることができる；すなわち、この用語は、野生型の天然に存在するプロテアーゼの発現、ならびに組換え型の、遺伝子操作された、または合成のプロテアーゼの任意の宿主中での発現を包含する。本発明に従う使用のためのプロテアーゼは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（上記参照）に定義されている通りのグループのうちの１つに属する。
【００２２】
微生物の例は、細菌、例えば、放線菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）ｐｈｙ．ｎｏｖ．の細菌、例えばクラスＩ：放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）のもの、例えばサブクラスＶ：放線菌亜綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｄａｅ）のもの、例えば第Ｉ目：放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）のもの、例えば第ＸＩＩ亜目：ストレプトスポランギネアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｎｅａｅ）のもの、例えば第ＩＩ科：ノカルジオプサセアエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓａｃｅａｅ）のもの、例えば第Ｉ属：ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）のもの、例えばノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）種ＮＲＲＬ  １８２６２およびノカルジオプシス・アルバ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｌｂａ）；またはプロテアーゼ活性を呈するその変異体または変種；およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のものまたはプロテアーゼ活性を呈するその変異体または変種、例えばバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。この分類は、Ｂｅｒｇｅ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（ｐｒｅｐｒｉｎｔ：Ｒｏａｄ  Ｍａｐ  ｔｏ  Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ）に基づいている。
【００２３】
微生物のさらなる例は、真菌、例えば、酵母または糸状菌である。
【００２４】
本発明によるプロテアーゼの意図される適用量は、食餌１ｋｇあたりのプロテアーゼのタンパク質（ｍｇ）として、またはプロテアーゼ活性として定義および算出される。
【００２５】
プロテアーゼ活性は、当該のプロテアーゼの特異性と関連するペプチド結合を含む基質が用いられる、任意の分析を使用して測定することができる。分析ｐＨおよび分析温度は、同様に、当該のプロテアーゼに適合されることとなる。分析ｐＨ値の例は、ｐＨ５、６、７、８、９、１０、または１１である。分析温度の例は、３０、３５、３７、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０℃である。
【００２６】
プロテアーゼ基質の例は、カゼイン、およびｐＮＡ−基質、例えばＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ＮＡ（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｓ７３８８から入手可能）である。このｐＮＡ−基質における大文字は、一文字アミノ酸表記を指す。別の例は、Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｔ−ＰＲＡＫによって錠剤として調製された、アズリン染色された架橋カゼイン）である。ｐＨ活性およびｐＨ安定性研究のためには、ｐＮＡ基質が好ましいのに対して、温度活性研究のためには、Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ基質が好ましい。
【００２７】
ｐＮＡプロテアーゼ活性分析の原理は、次の通りである：プロテアーゼが、基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡを切断し、色素原パラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を放出する。反応条件は、以下である：基質濃度＝０．５６ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝９．０、温度＝３７℃、インキュベーション時間＝２５０秒。放出される黄色のｐＮＡの量は、酵素のプロテアーゼ活性に比例し、４０５ｎｍの波長で測光法で測定される。最後に、プロテアーゼ活性を、プロテアーゼ標準の検量線を使用して決定する。ｐＮＡ活性分析によって測定および算出される１プロテアーゼ単位（ＰＲＯＴ）は、１ｍＭ基質（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）から、ｐＨ９．０および３７℃で、１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを放出させる酵素の量である。
【００２８】
本発明によるプロテアーゼの例は、酸安定性のプロテアーゼ、具体的には酸安定性のセリンプロテアーゼ、すなわちバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰＷＤ−１に由来するプロテアーゼである。
【００２９】
用語「セリンプロテアーゼ」は、上述のＨａｎｄｂｏｏｋに定義されている通りのセリンペプチダーゼおよびその仲間を指す。このｈａｎｄｂｏｏｋの１９９８年版では、セリンペプチダーゼおよびその仲間は、第１〜１７５章で扱われている。セリンプロテアーゼは、触媒機構が、ペプチド結合を攻撃する求核剤として作用するセリン残基のヒドロキシル基に依存する、ペプチダーゼと定義することができる。本発明に従う使用のためのセリンプロテアーゼの例は、上述のＨａｎｄｂｏｏｋに定義されている通りの、ＳＡ族（Ｃｌａｎ）、例えばＳ２科（ストレプトグリシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｇｒｉｓｉｎ））、例えばＳ２Ａ亜科（α−溶菌プロテアーゼ）のプロテアーゼである。
【００３０】
本発明に従う使用のための酸安定性のセリンプロテアーゼの起源に対する制約は存在しない。したがって、用語「プロテアーゼ」には、天然または野生型のプロテアーゼだけでなく、プロテアーゼ活性を呈するそのあらゆる変異体、変種、断片など、ならびに合成のプロテアーゼ、例えばシャッフルされたプロテアーゼ、およびコンセンサスプロテアーゼが含まれる。こうした遺伝子操作されたプロテアーゼは、当技術分野で一般に知られている通りに、例えば部位特異的変異誘発によって、またはＰＣＲ（ＰＣＲ反応におけるプライマーの１つとして所望の変異を含有するＰＣＲ断片を使用する）によって、またはランダム変異誘発によって調製することができる。コンセンサスタンパク質の調製は、例えば欧州特許第０８９７９８５号明細書に記載されている。
【００３１】
本発明に従う使用のための酸安定性のプロテアーゼの例は、ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）種ＮＲＲＬ  １８２６２およびノカルジオプシス・アルバ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｌｂａ）に由来するプロテアーゼ、およびこれらのプロテアーゼのいずれかに対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または少なくとも９５％アミノ酸同一性のプロテアーゼである。
【００３２】
同一性の割合を計算するために、当技術分野で公知の任意のコンピュータプログラムを使用することができる。こうしたコンピュータプログラムの例は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９），Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ），７３，２３７−２４４；およびＧＣＧバージョン８プログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１）中に提供されるＧＡＰプログラムである（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８，４４３−４５３。
【００３３】
本発明の状況では、用語「酸安定性の」は、Ａ２８０＝１．０に相当する希釈での、かつ、以下の緩衝液：
・１００ｍＭ  コハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、
・１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ３．５
中での３７℃での２時間のインキュベーション後の、純粋なプロテアーゼ酵素のプロテアーゼ活性が、本明細書の実施例１に記載した分析（基質：Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ、ｐＨ９．０、２５℃）を使用して測定した場合に、基準活性の少なくとも４０％であることを意味する。
【００３４】
上述の酸安定性定義の特定の実施形態では、プロテアーゼ活性は、基準活性の、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または少なくとも９７％である。
【００３５】
用語「基準活性」は、Ａ２８０＝１．０に相当する希釈での、以下の緩衝液：１００ｍＭ  コハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ｐＨ９．０）中での、５℃での２時間のインキュベーション後の、純粋な形態での、同じプロテアーゼのプロテアーゼ活性（ここでは、活性は、上に記載した通りに決定される）を指す。
【００３６】
言い換えれば、酸安定性を決定するための方法は、以下のステップを含む：
ａ）試験されることとなるプロテアーゼ試料（純粋な形態、Ａ２８０＝１．０）を、２つの一定分量（ＩおよびＩＩ）に分ける；
ｂ）一定分量Ｉを、３７℃かつｐＨ３．５で２時間インキュベートする；
ｃ）一定分量Ｉの残存活性を測定する（ｐＨ９．０かつ２５℃）；
ｄ）一定分量ＩＩを、５℃かつｐＨ９．０で２時間インキュベートする；
ｅ）一定分量ＩＩの残存活性を測定する（ｐＨ９．０かつ２５℃）；
ｆ）一定分量ＩＩの残存活性に対する一定分量Ｉの残存活性の割合を算出する。
【００３７】
上述の酸安定性定義では、用語「Ａ２８０＝１．０」は、緩衝液ブランクに対して、１ｃｍパス長キュベット内で２８０ｎｍで１．０の吸収を生じる、前記純粋なプロテアーゼの濃度（希釈）を意味する。
【００３８】
また、上述の酸安定性定義では、用語「純粋なプロテアーゼ」は、１．７０以上のＡ２８０／Ａ２６０比を有する試料を指す。
【００３９】
別の特定の実施形態では、本発明に従う使用のためのプロテアーゼは、酸安定であることに加えて、熱安定性でもある。
【００４０】
用語「熱安定性」は、以下のうちの１以上を意味する：温度最適値が、少なくとも５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、６６℃、°６８Ｃ、または少なくとも°７０Ｃである。
【００４１】
本発明による使用のためには、プロテアーゼは、このように純粋である必要はなく；例えば、他の酵素、さらには他の酸安定性プロテアーゼを含むことができ、この場合には、酵素またはプロテアーゼ調製物と呼ばれる可能性がある。しかし、明確に定義された酵素／プロテアーゼ調製物は、好都合である。例えば、干渉するまたは夾雑する他のプロテアーゼを本質的に含まないプロテアーゼを飼料に正確に配合することは、かなり容易である。用語「正確に配合する」は、具体的には、一貫性がありかつ不変の結果を得るという目的、および所望の効果に基づいて適用量を最適化する能力を指す。
【００４２】
プロテアーゼは、ビタミンＣと組み合わせて使用される場合、有効量で、すなわち、動物の能力を向上させるのに適した量で適用される。
【００４３】
本明細書では、有効量は、２００ｍｇ未満の酵素タンパク質／ｋｇ（食餌乾燥物質）、好ましくは、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８未満の、または７ｍｇ未満の酵素タンパク質／ｋｇ（食餌乾燥物質）（ｐｐｍ）であることが意図される。一方で、有効量は、０．０１ｍｇ超の酵素タンパク質／ｋｇ（食餌乾燥物質）、好ましくは０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．７５、１、２、３超の、または４ｍｇ超の酵素タンパク質／ｋｇ（食餌乾燥物質）（ｐｐｍ）であり得る。したがって、好ましい用量範囲の非限定的な例は、以下である：０．１０〜５０ｍｇの酵素タンパク質／ｋｇ、好ましくは０．５０〜１０、１〜９、２〜８、３〜８、または４〜７ｍｇの酵素タンパク質／ｋｇ。
【００４４】
好ましい実施形態では、プロテアーゼおよびビタミンＣは、飼料添加物の形態で使用される。
【００４５】
本明細書で上に例示した通りの飼料添加物の組成物の、動物用飼料、例えば家禽飼料への組み込みは、実際には、濃縮物またはプレミックスを使用して実施される。プレミックスは、１以上の微量成分と希釈剤および／または担体との、好ましくは均一な混合物を指す。プレミックスは、より大きな混合物中の微量成分の分散を均一にしやすくするために使用される。本発明によるプレミックスは、固体として（例えば水溶性の粉末として）または液体として、飼料成分に、または飲料水に添加することができる。
【００４６】
本発明の動物用飼料プレミックスは、酸安定性のプロテアーゼおよびビタミンＣとは別に、少なくとも１種の脂溶性ビタミン、および／または少なくとも１種の他の水溶性ビタミン、および／または少なくとも１種の微量ミネラル、および／または少なくとも１種のマクロミネラルを含有する。
【００４７】
さらなる任意選択の飼料添加物成分は、着色剤、例えば、ベータカロテン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、アポエステル（ａｐｏｅｓｔｅｒ）、およびルテインなどのカロテノイド；芳香化合物；安定剤；抗菌ペプチド；多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）；活性酸素発生種；および／または、フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８または３．１．３．２６）；キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）；ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）；αガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）；プロテアーゼ（ＥＣ３．４．、ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）；ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）；リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５）；ホスホリパーゼＣ（ＥＣ３．１．４．３）；ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）；アミラーゼ、例えば、αアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）；および／またはβグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４またはＥＣ３．２．１．６）の中から選択される少なくとも１種の酵素である。
【００４８】
抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の例は、ＣＡＰ１８、ロイコシン（Ｌｅｕｃｏｃｉｎ）Ａ、プロテグリン（Ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）−１、タナチン（Ｔｈａｎａｔｉｎ）、ディフェンシン（Ｄｅｆｅｎｓｉｎ）、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、ラクトフェリシン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ）、およびオビスピリン（Ｏｖｉｓｐｉｒｉｎ）、例えばノビスピリン（Ｎｏｖｉｓｐｉｒｉｎ）（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌｅｈｒｅｒ，２０００）、プレクタシン（Ｐｌｅｃｔａｓｉｎ）、およびスタチン（Ｓｔａｔｉｎ）である。
【００４９】
多価不飽和脂肪酸の例は、Ｃ１８、Ｃ２０、およびＣ２２多価不飽和脂肪酸、例えば、アラキドン酸、ドコソヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓｏｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、エイコサペンタエン酸、およびガンマリノレン酸である。
【００５０】
活性酸素発生種の例は、過ホウ酸塩、過硫酸塩、または過炭酸塩などの化学物質；およびオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、またはシンテターゼなどの酵素である。
【００５１】
通常、脂溶性および水溶性ビタミン、ならびに微量ミネラルが、飼料への添加が意図されるいわゆるプレミックスの一部を形成するのに対して、マクロミネラルは通常、飼料に別途添加される。
【００５２】
以下は、これらの構成成分の例の非排他的なリストである：
−  脂溶性ビタミンの例は、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、およびビタミンＫ、例えばビタミンＫ３である。
−  追加の水溶性ビタミンの例は、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸、およびパントテン酸、例えばＣａ−Ｄ−パントテン酸である。
−  微量ミネラルの例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン、およびコバルトである。
−  マクロミネラルの例は、カルシウム、リン、およびナトリウムである。
【００５３】
上に記載した通りの飼料添加物またはプレミックスは、動物用飼料組成物に、最後に添加される。この飼料添加物またはプレミックスは、プロテアーゼの量が、０．１〜２００ｇプロテアーゼタンパク質／ｔ（飼料）／食餌の意図される添加に相当し、かつ、ビタミンＣの量が、１００〜２００ｍｇビタミンＣ／ｋｇ（飼料）／食餌の意図される添加に相当するように調製および添加される。
【００５４】
動物用飼料組成物または食餌は、タンパク質の含有量が比較的に高い。上に言及したＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＲＣ）刊行物によれば、家禽およびブタ食餌は、国際公開第０１／５８２７６号パンフレットの表Ｂに示されている通りに特徴付けることができる。本発明による動物用飼料組成物は、粗タンパク質含有量が５０〜８００ｇ／ｋｇであり、本明細書で主張する通りの少なくとも１種のプロテアーゼをさらに含む。
【００５５】
さらに、または（上に示した粗タンパク質含有量に対する）代替形態では、本発明の動物用飼料組成物は、１０〜３０ＭＪ／ｋｇの代謝エネルギーの含有量；および／または０．１〜２００ｇ／ｋｇのカルシウムの含有量；および／または０．１〜２００ｇ／ｋｇの有効リンの含有量；および／または０．１〜１００ｇ／ｋｇのメチオニンの含有量；および／または０．１〜１５０ｇ／ｋｇのメチオニン＋システインの含有量；および／または０．５〜５０ｇ／ｋｇのリジンの含有量を有する。
【００５６】
特定の実施形態では、代謝エネルギー、粗タンパク質、カルシウム、リン、メチオニン、メチオニン＋システイン、および／またはリジンの含有量は、国際公開第０１／５８２７６号パンフレットの表Ｂに開示された通りの範囲２、３、４、または５のいずれか１つの範囲内である。
【００５７】
飼料１ｋｇあたりのプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）を決定するために、プロテアーゼを、飼料組成物から精製し、精製されたプロテアーゼの特異的活性を、適切な分析（下のプロテアーゼ活性、基質、および分析を参照のこと）を使用して決定する。飼料組成物それ自体のプロテアーゼ活性も、同じ分析を使用して決定し、これらの２つの決定に基づいて、飼料１ｋｇあたりのプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）における適用量を算出する。
【００５８】
飼料添加物中のプロテアーゼタンパク質（ｍｇ）を決定するために、同じ原理を適用する。
【００５９】
本発明によるノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）種ＮＲＲＬ  １８２６２のプロテアーゼは、一般に国際公開第０１／５８２７６号パンフレットに記載されている通りに、従来の方法を使用して調製することができる。ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）種ＮＲＲＬ  １８２６２のプロテアーゼを含む飼料添加物はまた、（例えば、ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｋａｉｓｅｒａｕｇｓｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって供給されるＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔとして）市販品として入手可能であるし、従来の技術において周知のプロセスおよび方法を使用して、当業者によって容易に調製することもできる。Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔは、念頭においたｐＮＡプロテアーゼ活性を特徴とする。７５’０００  ＰＲＯＴ／ｇは、６．５％〜８％のプロテアーゼタンパク質を含有する。
【００６０】
本明細書に記載および主張した本発明は、本明細書に開示した具体的実施形態によって範囲が制限されるべきではない。なぜなら、これらの実施形態は、本発明のいくつかの態様の例示を目的とするからである。いかなる同等の実施形態も、本発明の範囲内であることが意図される。実際、本明細書に提示および記載したものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から、当業者に明らかとなるであろう。こうした改変も、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【００６１】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。
【００６２】
［実施例１  ｐＨ安定性分析］
ｐＨ安定性プロフィールを得るために、Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ−７３８８）を使用することができる。
【００６３】
分析緩衝液：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ｐＨ値をＨＣｌまたはＮａＯＨで２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６  ０、７．０、８．０、９．０、１０．０、または１１．０に調整）。
【００６４】
プロテアーゼ試料の調製：試料（１ｍＭコハク酸、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、かつＡ２８０吸収＞１０）を、各ｐＨ値の分析緩衝液で希釈し、Ａ２８０＝１．０まで試験しなければならない。
【００６５】
３７℃での２時間のインキュベーション後、プロテアーゼ試料を、１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ｐＨ９．０）で希釈し、すべての試料のｐＨをｐＨ９．０にしなければならない。
【００６６】
２５℃での活性測定については、３００μｌの希釈したプロテアーゼ試料を、１．５ｍｌのｐＨ９．０分析緩衝液と混合し、１．５ｍｌ  ｐＮＡ基質（５０ｍｇを１．０ｍｌ  ＤＭＳＯに溶解し、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００でさらに４５倍希釈する）を添加することによって活性反応を開始する。混合後、（残存）プロテアーゼ活性の測定値として、分光光度計によって、Ａ４０５の増大をモニタリングする。
【００６７】
［実施例２−ブロイラー鶏における能力に対するタンパク質分解酵素とビタミンＣの組み合わせの効果］
［実験設計］
［製品］
タンパク質分解酵素（Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔ）およびビタミンＣ（ＳｔａｙＣ（登録商標）５０）は、ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓによって、粉末形態かつすぐに使用できる調合物で提供された。
【００６８】
［鳥および食餌処置］
雄のブロイラー（Ｒｏｓｓ  ３０８）ひな鳥を、生後１日齢として地元の孵化場から入手し、環境的に制御された室内のケージ内で飼育した。第０日に、ひな鳥をそれぞれ計量し、６４０羽の鳥を、体重に基づいて８０ケージ（ケージあたり８羽のひな鳥）に割り振った。次いで、８種の食餌処置（表１）を、１０反復実験ケージそれぞれにランダムに割り当てた。実験用食餌は、０〜２１および２２〜３５日に与えた。第１週の間に、すべてのひな鳥に、ブロイラーコクシジウム症ワクチン（Ｉｍｍｕｃｏｘ，Ｐａｃｉｆｉｃｖｅｔ，Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）を、飲料水を介して与えた。
【００６９】
温度は、第１日には３２℃に維持し、その後徐々に、第２１日までに２４℃まで低下させた。鳥達は、２０時間の蛍光灯照射を受け、食餌および水には自由に接近させた。鳥達は、毎日少なくとも３回（午前９．００、午後１．００、および午後４．００）、検査を行い、鳥の行動または状態の普通ではないいかなる様子も記録した。病気のまたは負傷した動物は、計量し、研究から排除した。
【００７０】
【表１】
2018505668.tif 000002
【００７１】
［食餌］
実験設計は、２つの基本の対照食餌（陽性対照および陰性対照）、２つのレベルの酵素（含むおよび含まない）、および２つのレベルのビタミンＣ（含むおよび含まない）を用いる、処置の２×２×２の階乗的組み合わせである。
【００７２】
コムギおよびダイズミールをベースにした、２つの対照食餌、すなわち陽性および陰性を、研究の各段階（０〜２１および２２〜３５日）のために混合した（表２）。次いで、これらのＰＣおよびＮＣ食餌を使用して、ＰｒｏＡｃｔ酵素およびビタミンＣ混合物を添加することによって、８種の食餌処置に発展させた。すべての食餌は、ペレット形態で与えた。
【００７３】
【表２】
2018505668.tif 000003
【００７４】
［測定］
成長能力：飼料および水は、３５日の実験期間中、自由に利用可能であった。体重および飼料摂取量は、第７、１４、２１、２８、および３５日に記録した。死亡数は、毎日記録した。飼料／体重増加値を、実験の過程中に死亡したまたは排除したあらゆる鳥の体重に対して補正した。
【００７５】
［統計的分析］
データを、ＳＡＳ（２００４）の一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅｌ）手法を使用するＡＮＯＶＡにかけた。有意差を、Ｐ＜０．０５とみなした。有意なＦ検定が検出された場合、最小有意差検定を使用して、平均値を分離した。
【００７６】
［結果］
［能力データ］
１〜２１および１〜３５日の期間中の平均死亡率は、それぞれ１．３および５．８％であった。食餌処置の、孵化後１〜２１日および１〜３５日の期間中の体重増加、飼料摂取量、および飼料／ブロイラー体重増加に対する効果を、表３および４にまとめて示し、期間１〜３５日についてのＦＣＲ計算値を、図１に、それぞれ示した。
【００７７】
【表３】
2018505668.tif 000004
【００７８】
【表４】
2018505668.tif 000005
【００７９】
これらの結果は、確かに、ビタミンＣとＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔとの組み合わせが、初期の能力に関して、添加物の利点を有することを示す。プロテアーゼ効果（主効果としての）は、ＮＣに対するＰＣの主効果であるので、有意である。ＰｒｏＡｃｔ／ビタミンＣ相互作用は、Ｐ値が０．０７であり、これは有意である。すなわち、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔは、高濃度ビタミンＣと共に、いっそう良く働き、また、確かに、ビタミンＣそれ自体の効果は、食餌中に存在するＰｒｏＡｃｔに依存する。さらに、３５日までのＢＷＧに対する明確ではない効果が見られるが、ＦＣＲ効果は残存する。
【００８０】
［実施例３−ビタミンＣを添加した２種のタンパク質分解酵素の、ブロイラー鶏における能力に対する効果］
合計４９０羽の１日齢のＲｏｓｓ  ３０８雄ブロイラーを、１反復実験あたり７羽の鳥の１０の反復実験を伴う７つの処置群（６実験群＋１対照群）にランダムに割り当てた。２種のレベルのビタミンＣ（０および３００ｍｇ／飼料１ｋｇ）および３種の酵素処置：
−  飼料酵素なし、
−  Ｎｏｖｕｓ  ＣＩＢＥＮＺＡ（３５０ｍｇ／飼料１ｋｇのレベルのバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰＷＤ−１）、
−  ＤＳＭ  ＲＯＮＯＺＹＭＥ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔ（２００ｍｇ／飼料１ｋｇのレベル）
を伴う６実験群（２×３の階乗的設計＋１陽性対照）。陽性対照（ＰＣ）の食餌は、コムギおよびダイズミールがベースであり、すべての栄養素において十分であった。他の６実験群は、コムギおよびダイズミールをベースにするが、ＰＣよりも少ないタンパク質（９７．５％）および可消化アミノ酸（９５．５％）しか含有しない、陰性対照（ＮＣ）食餌を与えられた。これらの鳥には、試験中、スターター（１〜１４日）食餌を与えた。
【００８１】
［実験設計および食餌］
これらの鳥には、試験全体を通して、スターター（１〜１４日）食餌を自由に与え、水に自由に接近させた。各食餌には、それぞれ２００および１００ｍｇ／飼料１ｋｇのレベルのＲＯＮＯＺＹＭＥ（登録商標）ＮＰ（ＣＴ）およびＲＯＮＯＺＹＭＥ（登録商標）ＷＸを含めた。基本の食餌を、表５に示した通りの各食餌調合物について、マッシュ形態で調製し、次いで、この基本のＮＣ食餌を、６種の実験用食餌にさらに分割し、適切な量の酵素製品、および不消化マーカーとしてのＴ１Ｏ２（０．３％）を、プレミックスとして少量の基本の食餌と混合し、次いでこれを、処置に従って、飼料に添加して最終濃度を与えた。混合後、この飼料を７５〜８０℃でペレット化した。
【００８２】
すべての鳥は、環境的に制御された室内のケージ内で飼育し、第１週の間の２３Ｌ：１Ｄおよびその後の試験の終わりまでの２０Ｌ：４Ｄの照明計画を受けた。室温は、到着の日には３２±１℃に維持し、ニワトリの年齢別の要件に適合させた。
【００８３】
第４日に、すべての鳥に、ブロイラーコクシジウム症ワクチン（Ｃｏｃｃｉｖａｃ  Ｂ（登録商標）、ＭＳＤ、Ｃａｎａｄａ）を、経口投与によって、軽度の負荷として与えた。体重および飼料摂取量は、１週間間隔で記録した。死亡数は、毎日記録した。死んだ動物の体重を使用して、飼料要求率（ＦＣＲ）（これは、総飼料摂取量を、ケージあたりの生存鳥の体重増加＋死んだ鳥の体重で割ることによって算出される）をそれぞれ調整した。
【００８４】
【表５】
2018505668.tif 000006
【００８５】
［結果］
ビタミンＣおよび酵素添加の成長能力に対する効果を、表６に提供する。主効果は、ビタミンＣを与えられた鳥のＦＣＲが、第１〜７日の間に、ビタミンＣを与えられていない鳥と比較して向上した（１．１５６対１．２０９、Ｐ＝０．０１１）ことを示した。第１日〜２１日の期間の数値効果（１．４７８対１．５１６、Ｐ＝０．０８０）と同様の効果が、第１〜１４日の期間に認められた（１．４４０対１．５３０、Ｐ＝０．０１６）。
【００８６】
【表６】
2018505668.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、期間１〜３５日についてのＦＣＲ計算値を示す。
【図１】
2018505668.tif 000008
【国際調査報告】
2018505668.tif 000009
2018505668.tif 000010
2018505668.tif 000011