(57)【要約】本発明は、妊娠中の対象の妊娠高血圧腎症の診断又は予後予測の方法であって、妊娠中の対象から得られる試料を用意するステップと、試料中の、（ａ）ｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦのうちの一方又は両方の量と、（ｂ）ヘムの分解生成物及びアルギニンの分解生成物のうちの一方又は両方の量との間の比を測定するステップとを含む、方法を提供する。また、上記方法において使用するためのアッセイキット及び上記方法において使用するように構成されたコンピュータも記載する。また、妊娠高血圧腎症を治療する方法であって、薬学的有効量で、Ｌ−アルギニン及び／又はシトルリン、並びにアルギナーゼの阻害剤又はその薬学的に許容できる塩を投与するステップを含む、方法も記載する。また、癌を治療する方法であって、治療有効量で、抗ＶＥＧＦ化合物、Ｌ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて、対象を治療するステップを含む、方法も記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠中の対象の妊娠高血圧腎症の診断又は予後予測の方法であって、妊娠中の対象から得られる試料を用意するステップと、試料中の、（ａ）ｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦのうちの一方又は両方の量と、（ｂ）ヘムの分解生成物及びアルギニンの分解生成物のうちの一方又は両方の量との間の比を測定するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記比を所定の比と比較して、妊娠高血圧腎症の診断又は予後予測を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定されるヘムの分解生成物が、ビリルビン、ビリベルジン、一酸化炭素及びフェリチンから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
測定されるアルギニンの分解生成物が、尿素、オルニチン、シトルリン、アルギニノコハク酸又はアンモニアから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
試料中でビリルビンの量が測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
試料中で尿素の量が測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、血液、血清、血漿又は尿である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象における早発性又は遅発性の妊娠高血圧腎症の存在を検出する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
試料中のｓＦｌｔ−１の量、ヘムの分解生成物の量、及び任意選択でＰｌＧＦの量、及び任意選択でアルギニンの分解生成物が、イムノアッセイにより決定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）ｓＦｌｔ−１及び／若しくはＰｌＧＦに特異的な結合剤と、（ｉ）ヘムの分解生成物及び／若しくはアルギニンの分解生成物に特異的な結合剤、並びに／又は（ｉｉ）ヘムの分解に特異的なアッセイキットの構成成分を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法における使用のためのアッセイキット。
【請求項１１】
特異的な結合剤が、ｓＦｌｔ−１に又はヘムの分解生成物に特異的な抗体又はその断片を含む、請求項１０に記載のアッセイキット。
【請求項１２】
ヘムの分解生成物が、ビリルビン、ビリベルジン、カルボキシヘモグロビン又はフェリチンである、請求項１０又は１１に記載のアッセイキット。
【請求項１３】
妊娠高血圧腎症を治療する方法であって、薬学的有効量で、Ｌ−アルギニン及び／又はシトルリン、並びにアルギナーゼの阻害剤又はその薬学的に許容できる塩を投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
妊娠高血圧腎症の治療における使用のための、Ｌ−アルギニン及び／又はシトルリン、並びにアルギナーゼの阻害剤又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項１５】
アルギナーゼの阻害剤が、ノル−ＮＯＨＡである、請求項１３又は１４に記載の方法又は使用。
【請求項１６】
Ｌ−アルギニン及び／又はシトルリンが、経口投与される、又は経口投与されるための剤型をなす、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１７】
アルギナーゼの阻害剤が、筋肉内若しくは腹腔内に投与される、又は筋肉内若しくは腹腔内に投与されるための剤型をなす、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
妊娠高血圧腎症の治療方法であって、対象における妊娠高血圧腎症の存在を、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法を使用して同定するステップと、前記対象を請求項１３又は１５〜１７のいずれか一項に記載の方法により治療するステップとを含む、方法。
【請求項１９】
前記対象が、ヘムの分解生成物と比較したｓＦｌｔ−１の高い比を有する、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２０】
薬学的有効量の鉄キレート化剤、好ましくは、デフェロキサミンを投与するステップを含む、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２１】
（ｉ）妊娠中の対象から得られる試料中のｓＦｌｔ−１及び／又はＰｌＧＦの量を示すシグナル、並びに（ｉｉ）妊娠中の対象から得られる試料中のヘムの分解生成物及び／又はアルギニンの分解生成物の量を示すシグナルを受信し、前記シグナルを比較して比を生成するための手段及び前記比を表示するためのディスプレイを有するように構成されたコンピュータ。
【請求項２２】
請求項２１に記載のコンピュータを備える分析用デバイス。
【請求項２３】
癌を治療する方法であって、治療有効量で、抗ＶＥＧＦ化合物、Ｌ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて、対象を治療するステップを含む、方法。
【請求項２４】
癌の治療における使用のための、抗ＶＥＧＦ化合物、及びＬ−アルギニンとアルギナーゼ阻害剤との組合せ。
【請求項２５】
抗ＶＥＧＦ化合物が、抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその断片、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト又はＶＥＧＦ捕捉剤である、請求項２３又は２４に記載の使用のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠高血圧腎症を治療する方法を、根底にある主要な病態生理学的経路を描出することによって提供し、妊娠高血圧腎症（ＰＥ）の診断及び予後予測の方法を、妊娠中の対象から得られる試料中の、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ−１）としてもまた公知である血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）／胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）とヘム及びアルギニンの分解生成物との間の比を測定することによって提供する。これは、妊娠高血圧腎症に合わせたオーダーメード治療のアプローチを提供するための最初の発明である。また、血管新生の増加と関連がある状態、例として、癌の治療において、抗ＶＥＧＦ化合物の副作用を低下させる方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
全世界で、妊娠高血圧腎症は、全ての妊娠のうちの４〜７％に影響を及ぼし、母体及び胎児の病的状態及び死亡の主要な誘因となる高血圧症候群である（Ｈｏｇｂｅｒｇ  Ｕ．Ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２００５：Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ．、２００５年；３３巻（６号）：４０９〜４１１ページ）。米国では、２０例の妊娠中１例が、妊娠高血圧腎症に罹患し；１０００人の妊娠中の女性中３人が冒されている重度の形態（＜３４週の妊娠）（Ｌｉｓｏｎｋｏｖａ，Ｓ．、Ｓａｂｒ，Ｙ．、Ｍａｙｅｒ，Ｃ、Ｙｏｕｎｇ，Ｃ、Ｓｋｏｌｌ，Ａ．及びＪｏｓｅｐｈ，Ｋ．Ｓ、Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ、２０１４年；１２４巻：７７１〜７８１ページ）は増加しつつある（Ａｎａｎｔｈ，Ｃ．Ｖ．、Ｋｅｙｅｓ，Ｋ．Ｍ．及びＷａｐｎｅｒ，Ｒ．、Ｊ．ＢＭＪ、２０１３年；３４７巻：ｆ６５６４ページ）。妊娠高血圧腎症は、全ての未熟分娩のうち、最大３分の１を占めるまでになっている（Ｇｈｕｌｍｉｙｙａｈ，Ｌ及びＳｉｂａｉ，Ｂ．、Ｓｅｍｉｎ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．、２０１２年；３６巻：５６〜５９ページ）。母体の高血圧及び腎臓機能不全が、妊娠高血圧腎症の顕著な特徴である（Ｍｏｒａｎ  Ｐ、Ｌｉｎｄｈｅｉｍｅｒ  ＭＤ、Ｄａｖｉｓｏｎ  ＪＭ、Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２００４年；２４巻（６号）：５８８〜５９５ページ）。胎児の死亡又は重度の身体障害を引き起こすおそれがある未熟児の出産を除いて、療法がない（Ｇｈｕｌｍｉｙｙａｈ，Ｌ及びＳｉｂａｉ，Ｂ．、Ｓｅｍｉｎ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．、２０１２年；３６巻（１号）：５６〜５９ページ）。妊娠高血圧腎症は、タンパク尿性と非タンパク尿性とに分類される（Ｈｏｍｅｒ  ＣＳ、Ｂｒｏｗｎ  ＭＡ、Ｍａｎｇｏｓ  Ｇ、Ｄａｖｉｓ  ＧＫ、Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、２００８年；２６巻（２号）：２９５〜３０２ページ）。タンパク尿性の妊娠高血圧腎症を有する女性は、妊娠２０週以降に、古典的症状、例として、高血圧及びタンパク尿を呈するが、非タンパク尿性の妊娠高血圧腎症を有する女性は、高血圧及び肝臓疾患に罹患する可能性がより高い。これらの群の女性は、妊娠高血圧を有する女性と比較して、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を示す可能性がより高い（Ｈｏｍｅｒ  ＣＳ、Ｂｒｏｗｎ  ＭＡ、Ｍａｎｇｏｓ  Ｇ、Ｄａｖｉｓ  ＧＫ、Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、２００８年；２６巻（２号）：２９５〜３０２ページ）。
【０００３】
妊娠高血圧腎症の正確な病因は不明である。内皮のホメオスタシスの混乱（Ｒｏｄｇｅｒｓ  ＧＭ、Ｔａｙｌｏｒ  ＲＮ、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＪＭ、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１９８８年；１５９巻（４号）：９０８〜９１４ページ）は、細胞保護性の経路の調節不全［Ａｈｍｅｄ、２０００年、＃４５２０］及び血管新生因子の不均衡（Ａｈｍａｄ  Ｓ、Ａｈｍｅｄ  Ａ、Ｐｌａｃｅｎｔａ．、２００１年；２２巻（８−９）：Ａ．７；Ｍａｙｎａｒｄ  ＳＥ、Ｍｉｎ  ＪＹ、Ｍｅｒｃｈａｎ  Ｊ、Ｌｉｍ  ＫＨ、Ｌｉ  Ｊ、Ｍｏｎｄａｌ  Ｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ  ＴＡ、Ｍｏｒｇａｎ  ＪＰ、Ｓｅｌｌｋｅ  ＦＷ、Ｓｔｉｌｌｍａｎ  ＩＥ、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＦＨ、Ｓｕｋｈａｔｍｅ  ＶＰ、Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ  ＳＡ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．、２００３年；１１１巻（５号）：６４９〜６５８ページ；Ａｈｍａｄ  Ｓ、Ａｈｍｅｄ  Ａ．、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．、２００４年；９５巻（９号）：８８４〜８９１ページ）に起因し、妊娠高血圧腎症の主要な特徴であると認識される傾向が高まっている（Ｇｏｕｌｏｐｏｕｌｏｕ  Ｓ、Ｄａｖｉｄｇｅ  ＳＴ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．、２０１５年；２１巻（２号）：８８〜９７ページ）。母体の高血圧、腎臓傷害、及び有害な妊娠の転帰は、ｓＦｌｔ−１、すなわち、ＶＥＧＦの天然のアンタゴニストが高いことの結果としてのＶＥＧＦ活性の損失に起因し得る。
【０００４】
ＶＥＧＦ受容体−１は、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−１）としてもまた公知であり、ｓＦｌｔ−１は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠く、Ｆｌｔ−１受容体の可溶性スプライスバリアントである。内皮細胞中で、ｓＦｌｔ−１は、ＶＥＧＦに高い親和性で結合するが、有糸分裂誘発を刺激しない。
【０００５】
重要なことに、ＶＥＧＦの内因性阻害剤であるｓＦｌｔ−１及び形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）共受容体エンドグリンの切断生成物である可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）の循環レベルが、妊娠高血圧腎症の臨床所見の出現の数週間前に上昇する（Ｌｅｖｉｎｅ  ＲＪ、Ｍａｙｎａｒｄ  ＳＥ、Ｑｉａｎ  Ｃ、Ｌｉｍ  ＫＨ、Ｅｎｇｌａｎｄ  ＬＪ、Ｙｕ  ＫＦ、Ｓｃｈｉｓｔｅｒｍａｎ  ＥＦ、Ｔｈａｄｈａｎｉ  Ｒ、Ｓａｃｈｓ  ＢＰ、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＦＨ、Ｓｉｂａｉ  ＢＭ、Ｓｕｋｈａｔｍｅ  ＶＰ、Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ  ＳＡ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、２００４年；３５０巻（７号）：６７２〜６８３ページ）、（Ｌｅｖｉｎｅ  ＲＪ、Ｌａｍ  Ｃ、Ｑｉａｎ  Ｃ、Ｙｕ  ＫＦ，、Ｍａｙｎａｒｄ  ＳＥ、Ｓａｃｈｓ  ＢＰ、Ｓｉｂａｉ  ＢＭ、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＦＨ、Ｒｏｍｅｒｏ  Ｒ、Ｔｈａｄｈａｎｉ  Ｒ、Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ  ＳＡ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、２００６年；３５５巻（１０号）：９９２〜１００５ページ）。高い母体のｓＦｌｔ−１が、重度の妊娠高血圧腎症及び有害な転帰を惹起する（Ｒａｎａら、２０１２年）。
【０００６】
ｓＦｌｔ−１の臨界閾値未満への低下が療法として提案されてきた（Ｂｅｒｇｍａｎｎ  Ａ、Ａｈｍａｄ  Ｓ、Ｃｕｄｍｏｒｅ  Ｍ、Ｇｒｕｂｅｒ  ＡＤ、Ｗｉｔｔｓｃｈｅｎ  Ｐ、Ｌｉｎｄｅｎｍａｉｅｒ  Ｗ、Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ  Ｇ、Ｇｒｏｓｓ  Ｖ、Ｇｏｎｚａｌｖｅｓ  Ａ、Ｇｒｏｎｅ  ＨＪ、Ａｈｍｅｄ  Ａ、Ｗｅｉｃｈ  ＨＡ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．、２０１０年；１４巻（６Ｂ号）：１８５７〜１８６７ページ；Ｔｈａｄｈａｎｉ  Ｒ、Ｋｉｓｎｅｒ  Ｔ、Ｈａｇｍａｎｎ  Ｈ、Ｂｏｓｓｕｎｇ  Ｖ、Ｎｏａｃｋ  Ｓ、Ｓｃｈａａｒｓｃｈｍｉｄｔ  Ｗ、Ｊａｎｋ  Ａ、Ｋｒｉｂｓ  Ａ、Ｃｏｍｅｌｙ  ＯＡ、Ｋｒｅｙｓｓｉｇ  Ｃ、Ｈｅｍｐｈｉｌｌ  Ｌ、Ｒｉｇｂｙ  ＡＣ、Ｋｈｅｄｋａｒ  Ｓ、Ｌｉｎｄｎｅｒ  ＴＨ、Ｍａｌｌｍａｎｎ  Ｐ、Ｓｔｅｐａｎ  Ｈ、Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ  ＳＡ、Ｂｅｎｚｉｎｇ  Ｔ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．、２０１１年；１２４号（８巻）：９４０〜９５０ページ）にもかかわらず、妊娠高血圧腎症が、高いｓＦｌｔ−１を有する全て女性において発症するわけではない（Ｌｅｖｉｎｅ  ＲＪ、Ｍａｙｎａｒｄ  ＳＥ、Ｑｉａｎ  Ｃ、Ｌｉｍ  ＫＨ、Ｅｎｇｌａｎｄ  ＬＪ、Ｙｕ  ＫＦ、Ｓｃｈｉｓｔｅｒｍａｎ  ＥＦ、Ｔｈａｄｈａｎｉ  Ｒ、Ｓａｃｈｓ  ＢＰ、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＦＨ、Ｓｉｂａｉ  ＢＭ、Ｓｕｋｈａｔｍｅ  ＶＰ、Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ  ＳＡ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、２００４年；３５０巻（７号）：６７２〜６８３ページ；Ｓｏｌｏｍｏｎ  ＣＧ、Ｓｅｅｌｙ  ＥＷ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、２００４年；３５０巻（７号）：６４１〜６４２ページ）。
【０００７】
対照的に、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）は、上記症候群を続いて発症した、第１の三半期の妊娠中の女性において低下している。（Ｔｏｒｒｙ  ＤＳ、Ｗａｎｇ  ＨＳ、Ｗａｎｇ  ＴＨ、Ｃａｕｄｌｅ  ＭＲ、Ｔｏｒｒｙ  ＲＪ、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１９９８年；１７９（６Ｐｔ１）：１５３９〜１５４４ページ）、（Ｔａｙｌｏｒ  ＲＮ、Ｇｒｉｍｗｏｏｄ  Ｊ、Ｔａｙｌｏｒ  ＲＳ、ＭｃＭａｓｔｅｒ  ＭＴ、Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＪ、Ｎｏｒｔｈ  ＲＡ、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．、２００３年；１８８巻（１号）：１７７〜１８２ページ）、（Ｌｅｖｉｎｅ  ＲＪ、Ｔｈａｄｈａｎｉ  Ｒ、Ｑｉａｎ  Ｃ、Ｌａｍ  Ｃ、Ｌｉｍ  ＫＨ、Ｙｕ  ＫＦ、Ｂｌｉｎｋ  ＡＬ、Ｓａｃｈｓ  ＢＰ、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＦＨ、Ｓｉｂａｉ  ＢＭ、Ｓｕｋｈａｔｍｅ  ＶＰ、Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ  ＳＡ、Ｊａｍａ．、２００５年；２９３巻（１号）：７７〜８５ページ）、（Ｂｕｈｉｍｓｃｈｉ  ＣＳ、Ｎｏｒｗｉｔｚ  ＥＲ、Ｆｕｎａｉ  Ｅ、Ｒｉｃｈｍａｎ  Ｓ、Ｇｕｌｌｅｒ  Ｓ、Ｌｏｃｋｗｏｏｄ  ＣＪ、Ｂｕｈｉｍｓｃｈｉ  ＩＡ、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．、２００５年；１９２巻（３号）：７３４〜７４１ページ）、（Ｓａｖｖｉｄｏｕ  ＭＤ、Ｎｏｏｒｉ  Ｍ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＪＭ、Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ  ＡＤ、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ＫＨ、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．、２００８年；３２巻（７号）：８７１〜８７６ページ）、（Ｆｏｉｄａｒｔ  ＪＭ、Ｍｕｎａｕｔ  Ｃ、Ｃｈａｎｔｒａｉｎｅ  Ｆ、Ａｋｏｌｅｋａｒ  Ｒ、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ＫＨ、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．、２０１０年；３５巻（６号）：６８０〜６８７ページ）、（Ｎｏｏｒｉ  Ｍ、Ｄｏｎａｌｄ  ＡＥ、Ａｎｇｅｌａｋｏｐｏｕｌｏｕ  Ａ、Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ  ＡＤ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＤＪ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．、２０１０年；１２２巻（５号）：４７８〜４８７ページ）。胎盤増殖因子は、早期の診断バイオマーカーとして認識されており、妊娠高血圧腎症の診断を援助するためにｓＦｌｔ−１と平行して使用されている。アッセイキットが、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓにより生産され、エレクトロシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｙｓ）ｓＦｌｔ−１イムノアッセイ及びエレクトロシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｙｓ）ＰｌＧＦイムノアッセイの商標名の下で市販されている。こうしたアッセイキットが、Ｖｅｒｌｏｈｒｅｎら（Ａｍ．Ｊ．Ｏｎｓｔｅｔ、Ｇｙｎｅ（２０１０年）１６１ｅ１）による論文で論じられており、著者らは、上記キットが診断の援助となり得ることを示唆している。遅発性ＰＥについての感度は、５８．２％に過ぎない。また、このアッセイは、米国特許７，４０７，６５９号でも論じられている。最近になって、上記症候群が臨床的に疑われる女性において、これらのキットを使用して、ｓＦｌｔ−１：ＰｌＧＦの比を測定して、妊娠高血圧腎症の短期の不在が予測されている（Ｚｅｉｓｌｅｒら、Ｎ  ｅｎｇｌ  ｊ  ｍｅｄ、３７４巻；１ページ、ｎｅｊｍ．ｏｒｇ、２０１６年１月７日）。
【０００８】
ヘムオキシゲナーゼ１（Ｈｍｏｘ１）は、ヘムの分解に関与して、等モル量で、ビリベルジン（これは、ビリルビンに変換される）、遊離の鉄（これは、フェリチン、Ｆｅ−ＩＩＩ−フェリチンの複合体を形成する）、及び抗アポトーシス特性を有する強力な血管拡張剤である一酸化炭素（ＣＯ）を生成する酵素である（Ｇｏｚｚｅｌｉｎｏ，  Ｊｅｎｅｙら、２０１０年）。酸化性ストレスを引き起こす刺激、例として、亜硝酸過酸化物により、Ｈｍｏｘ１の発現が上方制御される。（Ｇｏｚｚｅｌｉｎｏら、２０１０年、Ｍｏｔｔｅｒｌｉｎｉら、２０１０年）。実際に、ヒトＨｍｏｘ１の欠損の結果、重度且つ持続性の内皮損傷が生じ（Ｙａｃｈｉｅら、１９９９年）、こうした内皮損傷はまた、妊娠高血圧腎症と関連がある中心的な現象でもある（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８９年）。ヒト胎盤組織において、Ｈｍｏｘ１の防御的な機能が記載されており（Ａｈｍｅｄら、２０００年）、Ｈｍｏｘ１は、ｓＦｌｔ−１の生成を負に調節し（Ｃｕｄｍｏｒｅら、２００７年）、一般的な現象が、多くの研究により確認されている。例えば、いくつかの薬物が、Ｈｍｏｘ１の上方制御を介してｓＦｌｔ−１を阻害し（Ｏｎｄａら、２０１５年、ＭｃＣａｒｔｈｙら、２０１１年）；シルデナフィルは、Ｈｍｏｘ１を介して、栄養芽細胞からのｓＦｌｔ−１を抑制する（Ｊｅｏｎｇら、２０１４年）。さらに、Ｈｍｏｘ１の誘発が、妊娠中のラットにおける虚血誘発性の高血圧を減弱させ（Ｇｅｏｒｇｅら、２０１１年）、プロテイナーゼ活性化受容体−２媒介性のｓＦｌｔ−１放出も減弱させる（Ａｌ−Ａｎｉら、２０１０年）。さらに、妊娠中のＨｍｏｘ−１＋／−マウスにおいても、拡張期血圧及び可溶性ｓＦｌｔ−１の血漿レベルが顕著に上昇した（Ｚｈａｏら、２００９年）。実際に、Ｈｍｏｘ１転写物が、妊娠高血圧腎症を発症する運命にある女性において減少し（Ｆａｒｉｎａら、２００８年）、Ｈｍｏｘ１プロモーター中の多型が、妊娠高血圧腎症と関連があり（Ｋａａｒｔｏｋａｌｌｉｏら、２０１４年）、妊娠高血圧腎症を有する女性は、健常な妊娠を有する女性と比較して、呼気中のＣＯの顕著に低下したレベルを示し、このことは、Ｈｍｏｘ１活性の減少を示す（Ｂａｕｍら、２０００年）。
【０００９】
Ｌ−アルギニンがｅＮＯＳ及びアルギナーゼのための基質として作用して、ＮＯ及び尿素がそれぞれ生成される。Ｌ−アルギニンの利用能が、ＮＯの生物学的利用率の主要な決定因子であり；Ｌ−アルギニンの利用能の低下により、スーパーオキシドアニオンによるＮＯの捕捉を通して、亜硝酸過酸化物の形成が増加する（Ｇｏｕｌｏｐｏｕｌｏｕら、２０１５年）。重度のＰＥを発症した女性において、Ｌ−アルギニン及びホモアルギニンのレベルの減少が、妊娠１１〜１３週時に観察された（Ｋｈａｌｉｌら、２０１０年）。最近の研究から、早発性ＰＥと遅発性ＰＥとがＬ−アルギニン代謝のパラメータにより区別されることは示されなかったが、Ｌ−アルギニン−ＮＯＳからＬ−アルギニン−アルギナーゼへの経路の変更についての間接的な証拠が得られた（Ｔａｍａｓら、２０１３年）。にもかかわらず、妊娠高血圧腎症においてアルギナーゼ活性が増加した理由も仕組みも不明である。
【００１０】
アルギナーゼ阻害剤又はＬ−アルギニンの補充を使用して、冠状動脈疾患を有する患者における虚血−再灌流傷害の予防（ＮＣＴ０２００９５２７、Ｋｏｖａｍｅｅｓら、２０１４年）及び胃癌（Ｚｈａｏら、２０１３年）等の第Ｉ／ＩＩ相臨床治験が行われたことがある。妊娠合併症の小規模の臨床治験において、Ｌ−アルギニンの補充が単独で使用されたことがあるが、決定的な成果は得られていない。Ｖａｄｉｌｌｏ−Ｏｒｔｅｇａらによる研究から、Ｌ−アルギニンの補充が、抗酸化性のビタミンと共に投与する場合に、妊娠高血圧腎症のリスクを高リスクの女性において低下させることが示された（Ｖａｄｉｌｌｏ−Ｏｒｔｅｇａら、２０１１年）が、その他の研究からは、上記疾患を治療するのに有益な効果はほとんど又は全く示されなかった（Ｓｔａｆｆら、２００４年）。また、Ｌ−アルギニンの補充は単独でも、非対称性ジメチルアルギニン及びアルギナーゼのレベルを増加させ（Ｓｔａｆｆら、２００４年）、それらの両方が、内皮ＮＯＳの直接的及び間接的な競合阻害剤であり、妊娠高血圧腎症において増加する（Ｓａｎｋａｒａｌｉｎｇａｍら、２０１０年）。Ｌ−シトルリンの補充の使用が、Ｌ−アルギニンの血漿レベル及びＮＯの生成を、Ｌ−アルギニンと同程度に効率的に増加させることが示されており（Ｓｃｈｗｅｄｈｅｌｍら、２００８年）、動物モデルにおいて、Ｌ−シトルリンは、誘導性ＮＯＳの活性を制限するが、内皮細胞内では内皮ＮＯＳの生成を増加させることが示されている（Ｗｉｊｎａｎｄｓら、２０１２年）。
【００１１】
現時点で、妊娠高血圧腎症に利用可能な、予防及び治療に有効な戦略はない。上記疾患の根底にある機構のより良好な理解に基づく、診断及び新たな療法の開発は、重要である。関与する複雑且つ相互作用的な経路の同定及び特徴付けにより、ようやく、診断及び予後予測の新たな方法の開発、並びに効能を示す治療の同定が可能になる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは、試料中の胎仔マーカーを測定し、母体マーカーと比較することによって、妊娠高血圧腎症の診断及び予後予測が改善されることを見出すに至った。こうした比較により、妊娠高血圧腎症のリスクがある対象の同定が援助され、さらに、下記の化合物の群を使用する治療に対して奏功を示す可能性が高い対象も同定される。
【００１３】
本発明は、妊娠高血圧腎症において、低いＨｍｏｘ１活性レベルと高いｓＦｌｔ−１レベルとが結び付き、アルギナーゼ−１の発現の増加及び尿素サイクルの調節不全が伴うことを見出したことに基づく。発明者らはここに、診断マーカーの改善されたセットを見出すに至った。血管新生因子であるｓＦｌｔ−１及び／又はＰｌＧＦを、ヘム及び／又はアルギニンの分解生成物、それぞれ、例として、ビリルビン及び尿素と一緒に測定することができることを、発明者らは見出すに至った。ここに、分解生成物に対するｓＦｌｔ−１及び／又はＰｌＧＦの比が妊娠高血圧腎症についての予測マーカーであることを実証するに至った。こうした予想外の組合せにより、胎児関連マーカー（ｓＦｌｔ−１及び／又はＰｌＧＦ）と母体マーカー（ヘムの分解生成物及び尿素）とが結び付けられる。したがって、この比により、胎盤又は胎仔のみに基づくマーカーではなく、母親及び胎児の両方の健康状態に基づく指標が提供される。Ｌ−アルギニン、アルギナーゼ阻害剤及び／又はシトルリンの組合せを投与するようなオーダーメード療法を、上記比に基づいて提供することができる。
【００１４】
発明者らがヘムオキシゲナーゼ−１（Ｈｍｏｘ１）の研究の間に、この比を同定したことは、予想外なことである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヘムの分解経路を、（Ｒｙｔｅｒら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００６年）８６巻、５８３〜６５０ページから改作して）示す図である。
【図２】尿素サイクルの一部である、アルギニン経路を示す図である。
【図３−１】高いｓＦｌｔ−１の環境下における妊娠中のＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、Ｈｍｏｘ１の部分的な欠損から、重度の妊娠高血圧腎症が生じることを示す図である。（Ａ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の２つのなる用量（０．５×１０９ｐｆｕの低い用量又は１×１０９ｐｆｕの高い用量）を用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスにおいて、妊娠第１８日に記録した平均動脈圧（ＭＡＰ）。Ａｄ−ＣＭＶを、対照群として用いた。（Ｂ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の低い用量及び高い用量又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−マウスから得られた代表的な糸球体。連続切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）、過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）、又はマッソントリクローム（ＭＴ）を用いて染色した。（Ｃ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の低い用量及び高い用量又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスから得られた妊娠第１８日における２４時間にわたるアルブミンの尿中への排泄；尿中クレアチニンに対して正規化し、尿中のアルブミン：クレアチニンの比として表現した。（Ｄ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の低い用量及び高い用量又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスから得られた妊娠第１８日における尿中の腎臓傷害分子−１（ｐｇ／ｍｌ）（ＫＩＭ−１）。
【図３−２】高いｓＦｌｔ−１の環境下における妊娠中のＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、Ｈｍｏｘ１の部分的な欠損から、重度の妊娠高血圧腎症が生じることを示す図である。（Ｅ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の低い用量及び高い用量又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスから得られた妊娠第１８日における尿中のｓＦｌｔ−１（ｎｇ／ｍｌ）。（Ｆ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の低い用量及び高い用量又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスから得られた妊娠第１８日における血漿アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）。（Ｇ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の低い用量及び高い用量又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスから得られた妊娠第１８日における血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）。（Ｈ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の低い用量及び高い用量又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスから得られた妊娠第１８日における血漿可溶性エンドグリン。
【図３−３】高いｓＦｌｔ−１の環境下における妊娠中のＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、Ｈｍｏｘ１の部分的な欠損から、重度の妊娠高血圧腎症が生じることを示す図である。（Ｉ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の低い用量及び高い用量又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスから得られた妊娠第１８日における、仔１匹当たりのグラム数として表現した平均胎仔体重。（Ｊ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の低い用量及び高い用量又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスから得られた妊娠第１８日における、パーセントとして表現した総胎仔吸収率。（Ｋ）時宜を得て妊娠させ、高い用量のＡｄ−ｓＦｌｔ−１又はＡｄ−ＣＭＶを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／＋マウス及びＡｄ−ｓＦｌｔ−１の高い用量を用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−マウスから得られた妊娠第１８日における代表的な仔及び胎盤。（Ｌ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１の低い用量及び高い用量又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／−及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスから得られた妊娠第１８日における血漿ビリルビン。結果は、代表例であるか、又は平均（±ＳＥＭ）として表現し、一元配置反復測定分散分析、続いて、スチューデント−ニューマン−コイルス事後検定により分析されている。
【図４−１】Ｈｍｏｘ−／−マウスにおいて、可溶性Ｆｌｔ−１により、腎臓の重度の損傷の増悪、アルギニン代謝の調節不全、及び酸化性ストレスの促進が生じることを示す図である。（Ａ）Ａｄ−ｓＦｌｔ−１を用いて処置したＨｍｏｘ１−／−マウスから得られた、重度の糸球体硬化及びメサンギウム融解を示す代表的な糸球体。連続切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）、並びに過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）を用いて染色した。（Ｂ）Ａｄ−ｓＦｌｔ−１又は対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ）を用いて処置したＨｍｏｘ１−／−マウスから得られた異常な糸球体について、コード化したスライドの盲検法によるスコア化を行い、連続切片１つ当たりの糸球体全体のうちのパーセントとして表現した結果。（Ｃ）Ａｄ−ｓＦｌｔ−１又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／＋及びＨｍｏｘ１−／−マウスから得られた、２４時間にわたるアルブミンの尿中への排泄；尿中クレアチニンに対して正規化し、尿中のアルブミン：クレアチニンの比（ＡＣＲ）として表現した。（Ｄ）Ａｄ−ｓＦｌｔ−１又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／＋及びＨｍｏｘ１−／−マウスにおける血漿ビリルビン。挿入図：Ａｄ−ＣＭＶ又はＡｄ−ｓＦｌｔ−１を用いて処置したＨｍｏｘ１＋／＋マウスにおける腎臓Ｈｍｏｘ１の発現を示すウエスタンブロット。
【図４−２】Ｈｍｏｘ−／−マウスにおいて、可溶性Ｆｌｔ−１により、腎臓の重度の損傷の増悪、アルギニン代謝の調節不全、及び酸化性ストレスの促進が生じることを示す図である。（Ｅ）Ａｄ−ｓＦｌｔ−１又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／＋及びＨｍｏｘ１−／−マウスの腎臓溶解液中のアルギナーゼ−１の相対的なｍＲＮＡ発現。（Ｆ）Ａｄ−ｓＦｌｔ−１又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／＋及びＨｍｏｘ１−／−マウスの腎臓溶解液中の、ｍＭ／ｍｇタンパク質として表現したアルギナーゼ−１の総活性。（Ｇ）Ａｄ−ｓＦｌｔ−１又は対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ）を用いて処置したＨｍｏｘ１＋／＋及びＨｍｏｘ１−／−マウスの腎臓溶解液中のアルギニノコハク酸リアーゼ（Ａｓｌ）の相対的なｍＲＮＡ発現。（Ｈ）Ａｄ−ｓＦｌｔ−１又は対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ）を用いて処置したＨｍｏｘ１＋／＋及びＨｍｏｘ１−／−マウスの腎臓溶解液中のアルギニノコハク酸シンターゼ−１（Ａｓｓ１）の相対的なｍＲＮＡ発現。
【図４−３】Ｈｍｏｘ−／−マウスにおいて、可溶性Ｆｌｔ−１により、腎臓の重度の損傷の増悪、アルギニン代謝の調節不全、及び酸化性ストレスの促進が生じることを示す図である。（Ｉ）Ａｄ−ｓＦｌｔ−１又は対照ウイルスを用いて処置したＨｍｏｘ１＋／＋及びＨｍｏｘ１−／−マウスの腎臓溶解液中の３−ニトロチロシンの発現を示すウエスタンブロット。β−アクチンを、充填対照として使用した。結果は、代表例であるか、又は平均（±ＳＥＭ）として表現し、一元配置反復測定分散分析、続いて、スチューデント−ニューマン−コイルス事後検定により分析されている。
【図５−１】高いｓＦｌｔ−１の環境下における妊娠中のＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、アルギニン経路のシフト（ｓｈｉｆｔ）により、妊娠高血圧腎症の表現型に回復が生じたことを示す図である。（Ａ）アルギナーゼ阻害剤（ノル−ＮＯＨＡ）、Ｌ−アルギニン、又はアルギナーゼ阻害剤及びＬ−アルギニンを用いて処置したＡｄ−ｓＦｌｔ−１注射Ｈｍｏｘ１−／−マウスから得られた代表的な糸球体。連続切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）、並びに過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）を用いて染色した。（Ｂ）アルギナーゼ阻害剤（ノル−ＮＯＨＡ）、Ｌ−アルギニン、又はアルギナーゼ阻害剤及びＬ−アルギニンを用いて処置したＡｄ−ｓＦｌｔ−１注射Ｈｍｏｘ１−／−マウスから得られた、２４時間にわたるアルブミンの尿中への排泄；尿中クレアチニンに対して正規化し、尿中のアルブミン：クレアチニンの比として表現した。（Ｃ）アルギナーゼ阻害剤（ノル−ＮＯＨＡ）、Ｌ−アルギニン、又はアルギナーゼ阻害剤及びＬ−アルギニンを用いて処置したＡｄ−ｓＦｌｔ−１注射Ｈｍｏｘ１−／−マウスから得られた尿中の腎臓傷害分子−１（ｐｇ／ｍｌ）（ＫＩＭ−１）。（Ｄ）アルギナーゼ阻害剤及びＬ−アルギニンを用いて処置したＡｄ−ｓＦｌｔ−１注射Ｈｍｏｘ１−／−マウス、又は未処置の対照から得られた腎臓切片中の３−ニトロチロシンの免疫組織化学的局在。
【図５−２】高いｓＦｌｔ−１の環境下における妊娠中のＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、アルギニン経路のシフト（ｓｈｉｆｔ）により、妊娠高血圧腎症の表現型に回復が生じたことを示す図である。（Ｅ）Ａｄ−ｓＦｌｔ−１を注射した妊娠中のＨｍｏｘ１＋／−マウスから得られた、Ｈｍｏｘ１＋／＋及びＨｍｏｘ１−／−の胎盤中のアルギナーゼ−１の相対的なｍＲＮＡ発現。（Ｆ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１を注射したＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、アルギナーゼ阻害剤、Ｌ−アルギニン、若しくはＬ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて処置した場合、又は未処置の対照の場合に、妊娠第１８日に記録した平均動脈圧（ＭＡＰ）。（Ｇ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１を注射したＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、アルギナーゼ阻害剤、Ｌ−アルギニン、若しくはＬ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて処置した場合、又は未処置の対照の場合の、妊娠第１８日における２４時間にわたる尿中のアルブミン：クレアチニンの比。（Ｈ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１を注射したＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、アルギナーゼ阻害剤、Ｌ−アルギニン、若しくはＬ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて処置した場合、又は未処置の対照の場合の、妊娠第１８日における尿中の腎臓傷害分子−１（ｐｇ／ｍｌ）（ＫＩＭ−１）。
【図５−３】高いｓＦｌｔ−１の環境下における妊娠中のＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、アルギニン経路のシフト（ｓｈｉｆｔ）により、妊娠高血圧腎症の表現型に回復が生じたことを示す図である。（Ｉ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１を注射したＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、アルギナーゼ阻害剤、Ｌ−アルギニン、若しくはＬ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて処置した場合、又は未処置の対照の場合の、妊娠第１８日におけるパーセントとして表現した総胎仔吸収率。（Ｊ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１を注射したＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、アルギナーゼ阻害剤、Ｌ−アルギニン、若しくはＬ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて処置した場合、又は未処置の対照の場合の、妊娠第１８日における仔１匹当たりのグラム数として表現した平均胎仔体重。（Ｋ）時宜を得て妊娠させ、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１を注射したＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、アルギナーゼ阻害剤及びＬ−アルギニンを用いて処置した場合、又は未処置の対照の場合の、妊娠第１８日における代表的な仔及び胎盤。結果は、代表例であるか、又は平均（±ＳＥＭ）として表現し、一元配置反復測定分散分析、続いて、スチューデント−ニューマン−コイルス事後検定により分析されている。
【図６−１】妊娠高血圧腎症のＲＵＰＰモデルにおけるＬ−Ａｒｇとアルギナーゼ阻害剤とを組み合わせた処置の効果を示す図である。（Ａ）収縮期動脈圧（ＳＢＰ）。（Ｂ）第１８日における仔１匹当たりのグラム数として表現した平均胎仔体重。（Ｃ）時宜を得て妊娠させ、ＲＵＰＰ又はシャム手術を施したＣ５７／ｂｌ６マウスにおいて、Ｌ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて処置した場合又はしなかった場合から得られた、妊娠第１８日におけるパーセントとして表現した総胎仔吸収率。（Ｄ）時宜を得て妊娠させ、ＲＵＰＰ又はシャム手術を施したマウスにおいて、Ｌ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて処置した場合又はしなかった場合の、妊娠第１８日における尿中のアルブミン：クレアチニンの比。
【図６−２】妊娠高血圧腎症のＲＵＰＰモデルにおけるＬ−Ａｒｇとアルギナーゼ阻害剤とを組み合わせた処置の効果を示す図である。（Ｅ）時宜を得て妊娠させ、ＲＵＰＰ又はシャム手術を施したＣ５７／ｂｌ６マウスにおいて、Ｌ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて処置した場合又はしなかった場合から得られた、妊娠第１８日における尿中の腎臓傷害分子−１（ｐｇ／ｍｌ）（ＫＩＭ−１）。（Ｆ）時宜を得て妊娠させ、ＲＵＰＰ又はシャム手術を施したＣ５７／ｂｌ６マウスにおいて、Ｌ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて処置した場合又はしなかった場合から得られた、妊娠第１８日における循環型ｓＦｌｔ−１レベル。
【図７−１】ｓＦｌｔ−１レベルの上昇を示す妊娠高血圧腎症患者は、アルギニン生合成経路の変化を有することを示す図である。（Ａ）早発性妊娠高血圧腎症の妊娠及び妊娠期間が一致する対照群におけるｓＦｌｔ−１の血漿レベル。（Ｂ）早発性妊娠高血圧腎症の妊娠及び妊娠期間が一致する対照群におけるビリルビンの血漿レベル。（Ｃ）早発性妊娠高血圧腎症の妊娠及び妊娠期間が一致する対照群における、比として表現したｓＦｌｔ−１：ビリルビンのレベル。（Ｄ〜Ｆ）ｓＦｌｔ１の有意に上昇したレベルを示す早発性妊娠高血圧腎症の胎盤のサブセットを、妊娠期間が一致する対照群と比較した場合の、アルギナーゼ１、アルギニノコハク酸リアーゼ（Ａｓｌ）及びアルギニノコハク酸シンターゼ−１（Ａｓｓ１）の相対的なｍＲＮＡ発現。
【図７−２】ｓＦｌｔ−１レベルの上昇を示す妊娠高血圧腎症患者は、アルギニン生合成経路の変化を有することを示す図である。（Ｄ〜Ｆ）ｓＦｌｔ１の有意に上昇したレベルを示す早発性妊娠高血圧腎症の胎盤のサブセットを、妊娠期間が一致する対照群と比較した場合の、アルギナーゼ１、アルギニノコハク酸リアーゼ（Ａｓｌ）及びアルギニノコハク酸シンターゼ−１（Ａｓｓ１）の相対的なｍＲＮＡ発現。（Ｇ〜Ｋ）正常妊娠及び妊娠高血圧腎症の合併症を伴う妊娠から得られた胎盤中のアルギナーゼ１、Ａｓｌ及びＡｓｓ１のウエスタンブロット及び濃度測定分析：β−アクチンを、充填対照として用い、濃度測定分析の結果は全て、β−アクチンに対して正規化した。
【図７−３】ｓＦｌｔ−１レベルの上昇を示す妊娠高血圧腎症患者は、アルギニン生合成経路の変化を有することを示す図である。（Ｇ〜Ｋ）正常妊娠及び妊娠高血圧腎症の合併症を伴う妊娠から得られた胎盤中のアルギナーゼ１、Ａｓｌ及びＡｓｓ１のウエスタンブロット及び濃度測定分析：β−アクチンを、充填対照として用い、濃度測定分析の結果は全て、β−アクチンに対して正規化した。
【図７−４】ｓＦｌｔ−１レベルの上昇を示す妊娠高血圧腎症患者は、アルギニン生合成経路の変化を有することを示す図である。（Ｌ）正常な女性及び妊娠高血圧腎症の女性の胎盤の溶解液中の３−ニトロチロシンの発現を示すウエスタンブロット分析。（Ｍ）ｓＦｌｔ−１：ビリルビンの比を使用する、有害な転帰の予測のためのＲＯＣ曲線。
【図８−１】妊娠高血圧腎症を発症する運命にある女性についての、ｓＦｌｔ−１とビリルビンとの間の比、又はビリルビン：尿素に対するｓＦｌｔ−１：ＰｌＧＦの比を示す図である。（Ａ）早発性妊娠高血圧腎症の合併症を伴う妊娠及び遅発性妊娠高血圧腎症の合併症を伴う妊娠を、年齢が一致する正常妊娠と比較した場合の、血漿ビリルビン（μｍｏｌ／ｄＬ）レベル。（Ｂ）早発性妊娠高血圧腎症の合併症を伴う妊娠及び遅発性妊娠高血圧腎症の合併症を伴う妊娠を、年齢が一致する正常妊娠と比較した場合の、血漿尿素（ｍｍｏｌ／ｄＬ）レベル。（Ｃ）早発性妊娠高血圧腎症の合併症を伴う妊娠を、年齢が一致する正常妊娠と比較した場合の、可溶性Ｆｌｔ１：ビリルビンの比。（Ｄ）ｓＦｌｔ−１：ビリルビンの比を使用する、有害な転帰の予測のためのＲＯＣ曲線。
【図８−２】妊娠高血圧腎症を発症する運命にある女性についての、ｓＦｌｔ−１とビリルビンとの間の比、又はビリルビン：尿素に対するｓＦｌｔ−１：ＰｌＧＦの比を示す図である。（Ｅ）早発性妊娠高血圧腎症の合併症を伴う妊娠及び遅発性妊娠高血圧腎症の合併症を伴う妊娠を、年齢が一致する正常妊娠と比較した場合の、ｓＦｌｔ１：ＰｌＧＦ対ビリルビン：尿素の比。（Ｆ）ｓＦｌｔ−１：ＰｌＧＦ対ビリルビン：尿素の比を使用する、有害な転帰の予測のためのＲＯＣ曲線。
【図９】ｓＦｌｔ−１処置Ｈｍｏｘ１−／−マウスにおける鉄の沈着を示す、ペルルスのプルシアンブルー染色を示す図である。
【図１０】妊娠高血圧腎症に合わせたオーダーメード治療のアプローチを説明するために提案する概略化した経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、妊娠高血圧腎症がＶＥＧＦ及びＨｍｏｘ１活性の部分的な喪失に起因して発症するという仮説に基づく。
【００１７】
低いＨｍｏｘ１活性下における高いｓＦｌｔ−１の誘発が重度の妊娠高血圧腎症を引き起こすという着想を直接試験するために、発明者らは、ｓＦｌｔ−１を、妊娠中のハプロ不全Ｈｍｏｘ１（Ｈｍｏｘ１＋／−）マウスに、ｓＦｌｔ−１を発現するアデノウイルス（Ａｄ−ｓＦｌｔ−１）の静脈内注射により全身に送達し、これにより、母体の循環中のｓＦｌｔ−１のレベルを増加させた（図３−１、３−２、３−３）。高いｓＦｌｔ−１レベルは、妊娠中のＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、妊娠中の野生型（Ｈｍｏｘ１＋／＋）動物と比較して、より高い血圧のみならず、また、より大きな程度の腎臓及び肝臓の傷害も誘発した（図３−１、３−２、３−３）。妊娠高血圧腎症についての診断基準のうちの１つが高血圧であることから、発明者らは、妊娠第１８．５日に、これらのマウスにおいて平均動脈血圧（ＭＡＰ）を測定し、より高いｓＦｌｔ−１レベルでは、ハプロ不全マウスが、それらの野生型同腹仔と比較して、重度の高血圧であることを見出した（図３−１  ａ）。妊娠高血圧腎症の別の主要な特徴である糸球体内皮炎は、広範な母体の内皮損傷の良好な指標であり（Ｓｔｉｌｌｍａｎ  ＩＥ、Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ  ＳＡ、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２００７年；１８巻（８号）：２２８１〜２２８４ページ）、妊娠２０週以降に、不十分なろ過及び尿中のタンパク質の増加をもたらす（Ｍｏｒａｎ  Ｐ、Ｌｉｎｄｈｅｉｍｅｒ  ＭＤ、Ｄａｖｉｓｏｎ  ＪＭ、Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２００４年；２４巻（６号）：５８８〜５９５ページ）。したがって、発明者らは、腎臓組織像の盲検法による分析を実施し、この分析により、重度の糸球体内皮炎に典型的な分葉及び糸球体の瘢痕化が明らかになった（図３−１  ｂ）。腎臓の損傷と合致して、アルブミンの尿中への排泄が、ハプロ不全動物において、野生型対照と比較して有意に増加した（図３−１  ｃ）。重度の腎臓傷害についてのさらなる直接的な証拠も、重度の妊娠高血圧腎症と関連がある近位尿細菅の傷害に特異的なマーカーである腎臓傷害分子−１（ＫＩＭ−１）の尿中レベルの増加、（Ｂｕｒｗｉｃｋ  ＲＭ、Ｅａｓｔｅｒ  ＳＲ、Ｄａｗｏｏｄ  ＨＹ、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＨＳ、Ｆｉｃｈｏｒｏｖａ  ＲＮ、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  ＢＢ、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．、２０１４年；６４巻（４号）：８３３〜８３８ページ）（図３−１  ｄ）、及びｓＦｌｔ−１の尿中レベルの増加（Ｂｕｈｉｍｓｃｈｉ  ＣＳ、Ｎｏｒｗｉｔｚ  ＥＲ、Ｆｕｎａｉ  Ｅ、Ｒｉｃｈｍａｎ  Ｓ、Ｇｕｌｌｅｒ  Ｓ、Ｌｏｃｋｗｏｏｄ  ＣＪ、Ｂｕｈｉｍｓｃｈｉ  ＩＡ、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．、２００５年；１９２巻（３号）：７３４〜７４１ページ）（図３−２  ｅ）により立証された。肝臓機能の異常な試験結果は、有害な母体の転帰についてのリスクの増加と関連があることが報告されている（Ｋｏｚｉｃ  ＪＲ、Ｂｅｎｔｏｎ  ＳＪ、Ｈｕｔｃｈｅｏｎ  ＪＡ、Ｐａｙｎｅ  ＢＡ、Ｍａｇｅｅ  ＬＡ、ｖｏｎ  Ｄａｄｅｌｓｚｅｎ  Ｐ、Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  Ｃａｎ．、２０１１；３３巻（１０号）：９９５〜１００４ページ）。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）（図３−２  ｆ）及びアスパラギン酸ア��ノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（図３−２  ｇ）は、肝臓機能の欠陥のマーカーであり、これらの両方が、高いｓＦｌｔ−１下のＨｍｏｘ１不全マウスにおいて有意に増加した。興味深いことに、可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）は、ｓＦｌｔ−１と協働して重度の妊娠高血圧腎症を誘発することが報告されたことがあり（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈａ  Ｓ、Ｔｏｐｏｒｓｉａｎ  Ｍ、Ｌａｍ  Ｃ、Ｈａｎａｉ  Ｊ、Ｍａｍｍｏｔｏ  Ｔ、Ｋｉｍ  ＹＭ、Ｂｄｏｌａｈ  Ｙ、Ｌｉｍ  ＫＨ、Ｙｕａｎ  ＨＴ、Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ  ＴＡ、Ｓｔｉｌｌｍａｎ  ＩＥ、Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｄ、Ｄ’Ａｍｏｒｅ  ＰＡ、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＦＨ、Ｓｅｌｌｋｅ  ＦＷ、Ｒｏｍｅｒｏ  Ｒ、Ｓｕｋｈａｔｍｅ  ＶＰ、Ｌｅｔａｒｔｅ  Ｍ、Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ  ＳＡ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、２００６年；１２巻（６号）：６４２〜６４９ページ）、これもまた、増加した（図３−２  ｈ）。重度の妊娠高血圧腎症の表現型と合致して、胎仔の成長の低下（図３−３  ｉ）及び胎仔吸収の増加（図３−３  ｊ）が、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１が投与されたＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて顕著であった。
【００１８】
Ｈｍｏｘ１活性の増加がビリルビンの血漿濃度を増加させることは公知であり（Ｈａｙａｓｈｉ  Ｓ、Ｔａｋａｍｉｙａ  Ｒ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｔ、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ、Ｔｏｊｏ  ＳＪ、Ｔａｍａｔａｎｉ  Ｔ、Ｋｉｔａｊｉｍａ  Ｍ、Ｍａｋｉｎｏ  Ｎ、Ｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ、Ｓｕｅｍａｔｓｕ  Ｍ、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．、１９９９年；８５巻（８号）：６６３〜６７１ページ）、したがって、発明者らは、血漿ビリルビンを、Ｈｍｏｘ１活性のマーカーとして測定した。ｓＦｌｔ−１は、妊娠中の野生型マウスにおいて、血漿ビリルビンの劇的な増加を誘発した（図３−３  ｌ）が、Ｈｍｏｘ１＋／−マウスにおける血漿ビリルビンの増加は鈍かった（図３−３  ｌ）；野生型動物においては、高いｓＦｌｔ−１がＨｍｏｘ１の活性化をストレス応答機構として誘発する可能性が高まることは、予想外の知見であった。こうした研究の間の発明者らによる、これらの発見から、発明の段階を得て、高いｓＦｌｔ−１及び低いＨｍｏｘ１活性により、妊娠高血圧腎症の重度の形態が生じると考え、このことをここに、オーダーメード療法開発のための診断テストとして使用することができた。
【００１９】
アルギナーゼ活性の上昇、アルギニノコハク酸リアーゼ（Ａｓｌ）及びアルギニノコハク酸シンテターゼ（Ａｓｓ）の発現の減少に起因した、高いｓＦｌｔ−１レベルの環境下におけるＨｍｏｘ１の喪失が、妊娠高血圧腎症の重度の形態を引き起こし、この形態は、アルギニン代謝（尿素サイクル）の調節不全を引き起こして、組織のニトロソ化ストレスの増加をもたらす（図４−１、４−２、４−３）。さらに、高いレベルのｓＦｌｔ−１を有するＨｍｏｘ１−／−マウスおいて、腎臓の鉄過剰の増加も観察された（図９）。観察された尿素経路の調節不全は、異常に高いｓＦｌｔ−１及び低いビリルビンを示す重度の妊娠高血圧腎症を有する女性における調節不全に酷似した（図７−１、７−２、７−３、７−４）。この妥当性確認群の患者において、胎盤アルギナーゼが、ｍＲＮＡ（図７−１  ｄ）及びタンパク質（図７−２  ｇ）のレベルの両方で劇的に増加した。対照的に、Ａｓｌ（図７−２  ｅ、７−２  ｇ、７−３  ｊ）及びＡｓｓ１（図７−２  ｆ、７−２  ｇ、７−３  ｋ）の転写物及びタンパク質のレベルは、有意に減少した。早発性の患者において、ｓＦｌｔ−１とビリルビンとの間の比は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積の０．９７以上の統計学的差を示した（図７−４  ｍ）。さらに、２０＋０週の妊娠以降に妊娠高血圧腎症が疑われる徴候を示す、単生児妊娠を有する患者においても、アルギナーゼによるアルギニンの加水分解の生成物である尿素のレベルは、有意に増加し、一方、ビリルビンのレベルは減少した（図８−１、８−２）。ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦとビリルビン／尿素との間の比が、重要な予測値をもたらし、早発性疾患では、感度が９１．６７％であり、特異性が９６％であり、遅発性疾患では、感度が８５．７％であり、特異性が９６％であることが証明された（図８−２  ｆ）。妊娠高血圧腎症おいてアルギナーゼの増加をもたらす機構は、Ｈｍｏｘ１の発現又は活性の喪失、及び高いｓＦｌｔ−１に起因する。
【００２０】
妊娠高血圧腎症の症状を矯正するために、高いｓＦｌｔ−１の存在下のＨｍｏｘ１欠損マウスにおいて、アルギナーゼ阻害剤（Ν−ω−ヒドロキシ−Ｌ−ノルアルギニン）を、Ｌ−アルギニンと一緒に投与した。高いｓＦｌｔ−１が傷害を引き起こした後に、処置の結果、腎臓の糸球体硬化、並びにメサンギウム融解（図５−１  ａ〜ｂ）、タンパク尿（図５−１  ｃ）及びＫＩＭ−１の尿中レベル（図５−１  ｄ）の低下が生じた。ニトロソ化ストレスが低下し、この場合、処置の後に、腎臓の３−ニトロチロシンの免疫染色が減少するように見えた（図５−２  ｅ）。Ｌ−アルギニン又はアルギナーゼ阻害剤を単独で投与した場合には、これらの改善は存在しなかった（図５−１  ａ〜ｃ）。ｓＦｌｔ−１への曝露の後の妊娠中のＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、胎盤アルギナーゼの転写物が上方制御され（図５−２  ｅ）、妊娠中のＨｍｏｘ１＋／−動物において、Ｌ−アルギニンの補充と組み合わせたアルギナーゼ阻害剤により、高血圧（図５−２  ｆ）、タンパク尿（図５−２  ｇ）、尿中Ｋｉｍ−１レベル（図５−２  ｈ）、及び胎仔吸収率（図５−３  ｉ）を含めた、妊娠高血圧腎症様の症状が回復した。胎仔の体重が増加し（図５−３  ｊ）、処置後は正常に見えた（図５−３  ｋ）。ハプロ不全動物において、アルギナーゼ阻害剤又はＬ−アルギニンの補充の単独投与は、妊娠高血圧腎症のいずれの徴候も消滅させることができなかった（図５−２  ｆ〜５−３  ｊ）。さらに、妊娠高血圧腎症の子宮内灌流圧低下（ＲＵＰＰ）モデルにおけるアルギナーゼ阻害剤とＬ−アルギニンとの組合せ投与もまた、有効であることが証明された（図６−１、６−２）。本発明の妊娠高血圧腎症のための新たな治療により、妊娠高血圧腎症の症状が改善され、例として、血圧の正常化、タンパク尿及び腎臓の損傷の減少、並びに胎仔の成長の改善及び胎仔吸収の阻害がもたらされ得る。上記データは、妊娠高血圧腎症がＨｍｏｘ１及びアルギニン代謝の調節不全から発症する直接的な証拠を提供しており、Ｈｍｏｘ１の上方制御及びアルギナーゼの下方制御により、妊娠高血圧腎症の臨床徴候から保護されることを示唆している。
【００２１】
本発明の第１の態様は、妊娠中の対象の妊娠高血圧腎症の診断又は予後予測の方法であって、妊娠中の対象から得られる試料を用意するステップと、試料中の、（ａ）ｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦのうちの一方又は両方の量と、（ｂ）ヘムの分解生成物及びアルギニンの分解生成物のうちの一方又は両方の量との間の比を測定するステップとを含む、方法を提供する。
【００２２】
遅発性の妊娠高血圧腎症の診断において、ｓＦｌｔ−１は、特に単独で測定して、適切なマーカーとして使用されてきたが、ヘムの分解生成物、例として、ビリルビンと組み合わせて測定し、比較する場合にはとりわけ、適切なマーカーとして使用されるようになる。
【００２３】
また、ｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦを併せて測定して、比を得ることもでき、この比は、ヘムの分解生成物、例として、ビリルビンと組み合わせて測定し、比較する場合にはとりわけ、遅発性の妊娠高血圧腎症を示すのに有用である。
【００２４】
また、ヘムの分解生成物、例として、ビリルビン、及びアルギニンの分解生成物、例として、尿素と組み合わせて、ｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦを併せて測定して、比を得ることもでき、ヘム及びアルギニンの分解生成物もまた、併せて測定して、比を得ることもでき、これらの２つの比を、相互に比較することができる。このことは、遅発性の妊娠高血圧腎症を示すのにとりわけ有用である。
【００２５】
また、ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、ヘムの分解生成物、例として、ビリルビン、及びアルギニンの分解生成物、例として、尿素を、併せて測定して、比を得ることができ、この比は、遅発性の妊娠高血圧腎症を示すのにとりわけ有用である。
【００２６】
アルギニンの分解生成物は、尿素、オルニチン、シトルリン、アルギニノコハク酸及びアンモニアを含むことができる。尿素は、アルギナーゼによるアルギニンの加水分解生成物であり（図２を参照されたい）、尿素の血中レベルは、アルギナーゼ活性と高度に相関し（Ｌｉｅｎｅｒら、１９５０年）、したがって、妊娠高血圧腎症のリスクがある対象において正常よりも高い濃度で見出されることが予測される。
【００２７】
さらに、本発明は、対象から得られる試料中のアルギニン及びアルギナーゼの発現及び活性の量を測定することもできる。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、妊娠中の対象の妊娠高血圧腎症の診断又は予後予測の方法であって、妊娠中の対象から得られる試料を用意するステップと、試料中の、ｓＦｌｔ−１の量と腎臓又は腎臓機能のマーカーの量との間の比を測定するステップとを含む、方法を提供する。腎臓又は腎臓の損傷のマーカーは、ＫＩＭ−１（尿中の腎臓傷害分子１）であり得る。
【００２９】
上記比を、所定の比と比較して、妊娠高血圧腎症の予後予測又は診断を決定することができる。典型的には、特定のレベルを上回る上記比の増加により、対象が、妊娠高血圧腎症を有すること、及び妊娠高血圧腎症の芳しくない予後予測を示すことが示される。
【００３０】
また、対象から採取する試料中の上記比をモニタリングすることによって、対象の妊娠高血圧腎症をモニタリングする方法も提供する。
【００３１】
ヘムの分解経路に、Ｈｍｏｘ１が関与する。図１は、Ｒｙｔｅｒ  Ｓ．Ｗ．ら（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．、（２００６年）８６巻、５８３〜６５０ページ）による論文から改作されており、ヘムの分解生成物を要約している。
【００３２】
図１に示すように、Ｈｍｏｘ１は、ヘムを、遊離の鉄（これは、フェリチン、Ｆｅ−ＩＩＩ−フェリチンの複合体を形成する）、一酸化炭素、ビリベルジン（これは、ビリルビンに変換される）に分解する。したがって、それらの生成物のうちの１つ又は複数、最も典型的には、ビリルビンをアッセイすることができる。
【００３３】
また、上記アッセイを、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）についてのアッセイと組み合わせて使用して、診断の精度をさらに改善することもできる。すでに論じたように、ＰｌＧＦについてのアッセイは当技術分野で一般に公知である。
【００３４】
典型的には、妊娠高血圧腎症を有さない健常対象において、ｓＦｌｔ−１の正常レベル（第１の三半期：１１０７ｐｇ／ｍｌ；第２の三半期：１４３７ｐｇ／ｍｌ；第３の三半期：２３９５ｐｇ／ｍｌ）、及びビリルビンの正常レベル（第１の三半期：１．７〜６．８μｍｏｌ／ｄＬ；第２の三半期：１．７〜１３．７μｍｏｌ／ｄＬ；第３の三半期：１．７〜１８．８μｍｏｌ／ｄＬ）が見出される。典型的には、血中の正常な比は、２３９ｐｇ／μｍｏｌ未満である。
【００３５】
７２５ｐｇ／μｍｏｌ超の比は、対象のＰＥを示唆する。
【００３６】
典型的には、妊娠高血圧腎症を有さない健常対象において、正常レベルのＰｌＧＦ（３０〜６２６ｐｇ／ｍｌ）が見出される。
【００３７】
第２の三半期における、ＰｌＧＦの典型的には２７９ｐｇ／ｍｌ未満のレベルは、ＰＥのさらなる証拠を提供する。
【００３８】
典型的には、妊娠高血圧腎症を有さない健常対象において、尿素の正常レベル（２．５〜７１ｍｍｏｌ／ｄＬ）が見出される。典型的には、血中のｓＦｌｔ−１：ＰｌＧＦとビリルビン：尿素との間の正常な比は、１０未満である。
【００３９】
典型的には、血中のｓＦｌｔ−１：ＰｌＧＦとビリルビンとの間の正常な比は、３．３未満である。
典型的には、血中のｓＦｌｔ−１：ＰｌＧＦと尿素との間の正常な比は、５．２未満である。
典型的には、血中のｓＦｌｔ−１：尿素の正常な比は、１０２０未満である。
典型的には、血中のｓＦｌｔ−１とビリルビン：尿素との間の正常な比は、６９８．４未満である。
典型的には、血中のＰｌＧＦとビリルビン：尿素との間の正常な比は、１６１．４超である。
典型的には、血中のＰｌＧＦとビリルビンとの間の正常な比は、３３．９４超である。
典型的には、血中のＰｌＧＦと尿素との間の正常な比は、４５．０９超である。
【００４０】
妊娠高血圧腎症は、早発性又は遅発性の疾患であり得る。
【００４１】
ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、ヘムの分解生成物又はアルギニンの分解生成物は、分析対象に特異的な結合剤、例として、抗体、又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２若しくはｓｖＦｖのような、その断片を使用して測定することができる。ｓＦｌｔ−１又はヘムの分解生成物は、イムノアッセイ、例として、ＥＬＩＳＡ又は当技術分野で一般に公知のその他のイムノアッセイにより決定することができる。
【００４２】
典型的には、ＣＯレベルを、ＣＯ呼気分析装置を使用して呼気中で、又は血清若しくは血漿の試料分析から測定することができるであろう。
【００４３】
ビリルビンを、血清又は血漿の試料から、例えば、ジアゾ法を使用して、高速液体クロマトグラフィーを使用して、ビリルビンオキシダーゼの変換を介して酵素的に、又は４７３ｎｍにおけるビリルビンの最大吸光度を分光光学的に測定することができる。
【００４４】
ビリベルジンを、血清又は血漿の試料から、例えば、赤外蛍光を使用して、分光光学的に、又はビリベルジンレダクターゼ活性アッセイの測定を通して測定することができる。
【００４５】
フェリチンのレベルを、血清又は血漿の試料から、イムノアッセイ又は免疫放射線法を使用して、Ａｂｂｏｔｔ社のアーキテクト（Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ）又はＲｏｃｈｅ社のエクリア（ＥＣＬＩＡ）等のアッセイプラットフォーム上で測定することができる。
【００４６】
典型的には、アルギニン又は尿素を、高速液体クロマトグラフィーを使用して測定すること、或いは特異的な結合剤、例として、抗体、又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２若しくはｓｖＦｖのような、その断片を使用して測定することができる。レベルを、イムノアッセイ、例として、ＥＬＩＳＡ又は当技術分野で一般に公知のその他のイムノアッセイにより決定することができる。
【００４７】
アルギナーゼを、特異的な結合剤、例として、抗体、又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２若しくはｓｖＦｖのような、その断片を使用して測定することができる。レベルを、イムノアッセイ、例として、ＥＬＩＳＡ又は当技術分野で一般に公知のその他のイムノアッセイにより決定することができる。
【００４８】
アルギナーゼ活性を、血清又は血漿の試料から、分光光学的に測定することができる。生成された尿素を、基質と特異的に反応させて、存在するアルギナーゼ活性に比例する有色の生成物を得る。
【００４９】
上記試料は、血液、尿、血清又は血漿の試料であり得る。試料は、妊娠中のヒト対象から得ることができる。例えば、試料を、典型的には母親がまた超音波スキャンも受ける妊娠第２０週時に得ることができる。或いは、試料を妊娠の間のその他の時期に得て、例えば、既存のＰＥをモニターすること、又はＰＥの治療が有効であるかどうかを観察することもできる。上記試料を分離し、異なるアッセイで使用することができる。或いは、異なる試料を、異なる分析対象について使用することもできる。したがって、血液を１つの分析対象について使用し、尿を別の分析対象について使用することができる。
【００５０】
また、本発明の方法における使用のためのアッセイキットも提供する。
【００５１】
アッセイキットは、典型的には、特異的な結合剤、及びヘムの分解生成物を特異的に検出するための１つ又は複数の薬剤、例として、特異的な結合剤を含む。特異的な結合剤は、上記の定義に従う抗体又はその断片であり得る。ヘムの分解生成物は、上記の定義に従うことができる。
【００５２】
上記アッセイキットは、ヘムの分解生成物の分析に特異的なアッセイキット構成成分、例えば、ビリルビンの検出ためのビリルビンオキシダーゼ、又はビリベルジンの検出のためのビリベルジンレダクターゼを含むことができる。
【００５３】
上記アッセイキットは、アルギニンの加水分解生成物、例として、尿素の分析に特異的な構成成分を含むことができる。
【００５４】
Ｈｍｏｘ１の調節不全が、高いｓＦｌｔ−１レベル下においては、アルギニン代謝（尿素サイクルの一部）の調節不全を引き起こして、アルギナーゼ活性、例えば、アルギナーゼＩ又はＩＩの活性の上昇、アルギニノコハク酸リアーゼ（Ａｓｌ）及びアルギニノコハク酸シンテターゼ（Ａｓｓ）の発現の減少をもたらすことを発明者らは見出すに至った；アルギニン代謝の調節不全は、腎臓及び胎盤において、ｅＮＯＳ／尿素経路の調節不全を引き起こす。尿素サイクル経路を、図２に要約する。
【００５５】
ここに、このアルギニン代謝の調節不全が矯正可能であることを、発明者らは同定するに至った。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、妊娠高血圧腎症を治療する方法であって、薬学的有効量で、Ｌ−アルギニン及び／又はシトルリン、並びにアルギナーゼの阻害剤又はアルギニノコハク酸リアーゼ（Ａｓｌ）及びアルギニノコハク酸シンテターゼ（Ａｓｓ）の活性化剤を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００５７】
アルギナーゼ阻害剤は、当技術分野で公知である。例えば、上記阻害剤は、ノル−ＮＯＨＡ（Ｎ−ヒドロキシ−ノル−アルギニン）であり得る。この阻害剤は、虚血性傷害において、内皮の機能を修復するためにすでに使用されている（Ｋｏｖａｍｅｅｓ  Ｏ．ら、ＰＬＯＳ  ｏｎｅ（２０１４年、９巻（７号）ｅ１０３２６０）。上記阻害剤は、静脈内から送達された。例えば、上記阻害剤は、アルギナーゼＩ又はＩＩの阻害剤であり得る。
【００５８】
Ｌ−アルギニンによる治療は、抗酸化性のビタミンの補充がある場合もない場合も、当技術分野で公知である。例えば、Ｌ−アルギニンは、妊娠高血圧腎症を有する妊娠中の女性に投与されてきた（Ｖａｄｉｌｌｏ−Ｏｒｔｅｇａ  Ｆ．ら、ＢＭＪ（２０１１年、３４２巻：ｄ２９０１）。
【００５９】
典型的には、Ｌ−アルギニンを、アルギナーゼ阻害剤と共に投与する。
【００６０】
また、Ｌ−シトルリンによる治療も試験されたことがあり、Ｌ−シトルリンは、１型糖尿病マウスにおいて、腎臓の損傷から保護する（Ｒｏｍｅｒｏ  ＭＪら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１３年、４：ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００４８０）。
【００６１】
また、妊娠高血圧腎症を治療する方法であって、
（ｉ）シトルリンと、ＡＳｌ及びＡＳＳの活性化剤と、又は
（ｉｉ）アルギニノコハク酸と、ＡＳＳの活性化剤と
の組合せを使用する、方法も提供する。これらは、図１０に示す経路の構成成分であり、これらにより、妊娠高血圧腎症を治療することが可能になることが予測される。
【００６２】
アルギナーゼ阻害剤とＬ−アルギニンとの組合せもまた、喘息、鎌状赤血球症及び肺高血圧を治療するためにすでに使用されている（ＥＰ２，３９７，１２８）。
【００６３】
使用することができるその他のアルギナーゼ阻害剤は、Ｎ（オメガ）−ヒドロキシ−ノル−Ｌ−アルギニン（ＮＯＨＡ）、２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸（ＡＢＨ）、Ｓ−（＋）−アミノ−５−Ｃ−ヨードアセトアミドヘキサン酸、Ｓ−（＋）−アミノ−５−ヨードアセトアミドペンタン酸、Ｌ−ノルバリン、及びＬ−ＨＯ  Ａｒｇを含む。典型的には、上記阻害剤は、ノル−ＮＯＨＡ又はＮＯＨＡである。
【００６４】
また、妊娠高血圧腎症の治療における使用のための、Ｌ−アルギニン及び／又はシトルリン、並びにアルギナーゼの阻害剤も提供する。典型的には、Ｌ−アルギニンを、アルギナーゼの阻害剤と組み合わせて投与する。
【００６５】
典型的には、Ｌ−アルギニン又はシトルリンは、経口投与することができるが、また、注射により、例えば、アルギナーゼの阻害剤と組み合わせて投与することもできる。
【００６６】
アルギナーゼ阻害剤は、経口投与してもよいが、より典型的には、注射により投与することができる。
【００６７】
注射は、静脈内、皮下、筋肉内又は腹腔内注射であり得る。
【００６８】
治療すべき患者は、本発明に記載の方法を使用して同定しておく。
【００６９】
本発明の治療の方法は、患者の身体、例として、血液、血清、血漿又は尿中の、ヘムの分解生成物及び／又はアルギニンからの生成物に対する、ｓＦｌｔ−１及び／又はＰｌＧＦの高い比を有する患者に対して、とりわけ良好に働く。したがって、上記患者は、そのような高い比を有する患者であり得る。
【００７０】
また、本発明は、妊娠高血圧腎症を治療する方法であって、薬学的有効量で、Ｌ−アルギニン及び／又はシトルリン、並びにアルギナーゼの阻害剤、並びに鉄キレート化剤、例として、デフェロキサミンを投与するステップを含む、方法も提供する。高いレベルのｓＦｌｔ−１を有する患者において、腎臓の鉄過剰の増加を観察する場合があり、鉄キレート化剤を使用して、この腎臓の鉄過剰の増加を是正することができる。
【００７１】
また、上記の定義に従って、診断、予後予測の方法を計算し、モニタリングするための手段を含むコンピュータ及び分析用デバイスも提供する。
【００７２】
コンピュータを、（ｉ）妊娠中の対象から得られる試料中のｓＦｌｔ−１及び／又はＰｌＧＦの量を示すシグナル、並びに妊娠中の対象から得られる試料中の（ｉｉ）ヘムの分解生成物及び／又はアルギニンの分解生成物の量を示すシグナル、（ｉｉｉ）腎臓機能又は肝臓機能のマーカーを示すシグナルを受信し、上記シグナルを比較して比を生成するための手段及び上記比を表示するためのディスプレイを有するように構成することができる。マーカー及びマーカーを検出する方法は、上記の定義に従うことができる。
【００７３】
上記コンピュータは、読取り専用メモリを含む。
【００７４】
上記シグナルは、例えば、上記構成成分のうちの１つについてアッセイから得られる色を示すシグナルであり得る。このシグナルを、コンピュータ中の所定の濃度曲線と比較して、分析対象の量を較正し、次いで、第２の分析対象と比較して、割当て量を生成することができる。
【００７５】
癌患者に投与される抗ＶＥＧＦ薬はいずれも、「妊娠高血圧腎症様症候群」を誘発する可能性がある（Ｖｉｇｎｅａｕ，Ｃ．ら、２０１４年）。
【００７６】
発明者らは、抗ＶＥＧＦ療法を受けている癌患者における「妊娠高血圧腎症様の徴候」を低下させるための新たな療法を提供する；その理由は、「妊娠高血圧腎症の表現型」についての病態生理学的経路を描出するに至ったからである。本発明者により、癌の治療に、二剤療法（Ｌ−アルギニン＋アルギナーゼ阻害剤）の使用が追加されることになり、この場合、ＶＥＧＦ中和抗体（例として、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ））、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（例として、ソラフェニブ、スニチニブ及びブリバニブ）、並びにＶＥＧＦ捕捉剤（例として、アフリベルセプト）を用いて、癌患者は治療される又は治療されることになる。
【００７７】
血管新生活性及び抗酸化酵素活性の不均衡が生じる、いずれの疾患又は療法においても、継続中の療法における症状又は副作用を低下させるために、発明者らの二剤療法（Ｌ−アルギニン＋アルギナーゼ阻害剤）を提案する。
【００７８】
本発明のさらなる態様は、Ｌ−アルギナーゼ及びアルギナーゼ阻害剤（例えば、上記の定義に従うアルギナーゼ阻害剤）を使用して、癌の治療における抗ＶＥＧＦ化合物の副作用を低下させる。
【００７９】
本発明ではまた、癌を治療する方法であって、癌の治療における使用のために、治療有効量で、抗ＶＥＧＦ化合物、並びにＬ−アルギニン及びアルギナーゼ阻害剤を用いて、対象を治療するステップを含む、方法も提供する。
【００８０】
ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）は、血管形成及び血管新生を刺激する細胞が生成するシグナルタンパク質である。ＶＥＧＦを発現する癌は、成長し、転移することが可能である。したがって、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦの効果の阻害は、癌を治療する方法である。
【００８１】
上記抗ＶＥＧＦ化合物は、抗ＶＥＧＦ抗体又はその機能性断片であり得る。これらの抗ＶＥＧＦ化合物は、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ−Ａに対するヒト化モノクローナル抗体）、及び循環型ＶＥＧＦの活性を遮断するＶＥＧＦ捕捉剤（デコイ（ｄｅｃｏｙ）のＶＥＧＦ受容体、例えば、アフリベルセプト）を含み、一方、ソラフェニブ、スニチニブ及びブリバニブは、ＶＥＧＦシグナル経路（とりわけ、ＶＥＧＦ受容体）の多重標的チロシンキナーゼ阻害剤（ＭＴＫＩ）である。
【００８２】
ここに、本発明を、以下の図を参照しながら記載するが、そうした記載は、例に過ぎない。
【実施例】
【００８３】
材料及び方法
患者の試料
予測研究：これは、前向き研究であり、２０１２年９月〜２０１４年１２月の間に、Ｓｔ  Ｇｅｏｒｇｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｎｄｏｎにて行われた。上記研究に参加することを合意する全て女性から、書面によるインフォームドコンセントを得た。上記研究は、Ｌｏｎｄｏｎ−Ｓｔａｎｍｏｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ倫理委員会により承認された。この研究についての組入れ基準は、２０＋０週の妊娠以降に妊娠高血圧腎症が疑われる症状又は徴候を示す、単生児妊娠を有する女性であった。アッセイのオペレーターは、参加者の臨床情報について知らされなかった。母体の血液を、静脈穿刺により、抗凝固薬を用いずに収集した。試料を、２０００×ｇで遠心分離し、血清を、ピペット採取し、試験するまで−８０℃で保存した。Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、ドイツ製のエレクシス（Ｅｌｅｃｓｙｓ）プラットフォーム上の市販されているアッセイにより、ｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦの濃度を、平行して決定し、次いで、測定した。母体の血清ビリルビンレベルを、比色分析アッセイキットを使用して測定した。
【００８４】
妥当性確認研究：上記機関の倫理委員会が、血液及び組織の収集を承認し、書面によるインフォームドコンセントを得た。低リスク及び高リスクの診療所並びに分娩／出産ユニットにおいて動員された、単生児妊娠を有する女性から、血液試料を得た。全ての女性を、登録から出産まで前向きに追跡した。母体の血液を、静脈穿刺により、抗凝固薬を用いずに収集した。試料を、２０００×ｇで遠心分離し、血清を、ピペット採取し、試験するまで−８０℃で保存した。市販されているＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）により、ｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦの濃度を、平行して決定し、次いで、測定した。母体の血清ビリルビンレベルを、比色分析アッセイキットを使用して測定した。
【００８５】
実験動物
妊娠していないマウスを用いる研究を、１２週齢のＨｍｏｘ１−／−マウス及びＨｍｏｘ１＋／＋マウスにおいて実施した。１×１０９ＰＦＵのＡｄ−ｓＦｌｔ−１アデノウイルス又はＡｄ−ＣＭＶ（対照）アデノウイルスを、尾静脈への注射により、動物に注射した。アデノウイルスを投与した９日後に、マウスを個々に、代謝ケージに２４時間入れた。体重、食餌及び水の摂取、並びに尿体積を測定した。尿測定に続き、血液試料を第１０日に採取し、動物を安楽死させ、動物の腎臓及び肝臓を収集して、さらなる分析を行った。また、アルギナーゼ阻害剤及び／又はＬ−アルギニンの補充を使用する、併用処置による回復研究も、妊娠していないＨｍｏｘ１−／−マウス及びＨｍｏｘ１＋／＋動物において行った。マウスに、ノル−ＮＯＨＡ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）を１日１回腹腔内注射した。Ａｄ−ｓＦｌｔ−１アデノウイルスの注射の１週間前から、研究の終了まで、Ｌ−アルギニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、動物に投与し、この投与は、飲料水に２５ｇ／Ｌを補充することによって行った。
【００８６】
妊娠しているマウスを用いる研究を、１０〜１２週齢のＨｍｏｘ１＋／−マウス及びＨｍｏｘ１＋／＋マウス又は野生型Ｃ５７／Ｂｌ６マウスにおいて実施した。妊娠第１日（Ｅ０．５）を、翌朝の膣栓の存在により定義した。Ｅ１０．５（第２の三半期）に、１×１０９ＰＦＵのＡｄ−ｓＦｌｔ−１アデノウイルス又はＡｄ−ＣＭＶ（対照）アデノウイルスを、尾静脈への注射により、妊娠中のマウスに注射した。ＲＵＰＰ研究のために、妊娠第１３日に、時宜を得て妊娠させたＣ５７／Ｂｌ６マウスに、麻酔を施した。身体の正中に沿って切開し、腹部大動脈を単離した。次いで、大動脈上に配置した（およそ１ｍｍ２の直径の）平滑針の周囲に結び付けた７．０の縫合糸を用いて、血管を拘束した。次いで、針を除去した。７．０の縫合糸を用いて、右卵巣動脈を拘束した。切開部分を閉じ、マウスを５日間回復（ｒｅｃｏｖｅｒ）させた。低い用量のｓＦｌｔ−１の実験のために、１×１０８ＰＦＵの、ｓＦｌｔ−１を発現するアデノウイルスを使用した。Ｅ１７．５に、マウスを個々に、代謝ケージに２４時間入れ、Ｅ１８．５に、以前の記載（Ｗａｎｇら、２０１３年）に従って、動脈圧を測定した。手短に述べると、ケタミン／キシラジンのカクテルを使用することによって、マウスに麻酔を施し、頚動脈を単離し、圧力トランスデューサー（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）に接続されているミラー１−フレンチミクロ−チップ（Ｍｉｌｌａｒ  １−Ｆｒｅｎｃｈ  Ｍｉｋｒｏ−Ｔｉｐ）圧力カテーテルを用いてカニューレ処置した。３０分間の血圧安定化の後に、その後の１０分の間にわたり、動脈圧を記録し、平均した。測定の後に、血液試料を採取し、動物を安楽死させ、動物の腎臓、肝臓及び胎盤を収集した。生存している胎仔、及び胎盤を計数し、重量を測定した。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ、１９８６年に従って、全ての実験を実施し、上記大学の倫理審査委員会が承認する手順を使用した。
【００８７】
血液及び尿の生化学的測定
尿中アルブミンを、アルブウエル（Ａｌｂｕｗｅｌｌ）−Ｍキット（Ｅｘｏｃｅｌｌ  Ｉｎｃ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を使用して決定した。ヒト及びマウスのｓＦｌｔ−１、ＫＩＭ−１及びＰｌＧＦのための酵素結合免疫吸着アッセイキットを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得、製造元の指定に従って実施した。
【００８８】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
試料の調製及びリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を、以前の記載（Ｗａｎｇら、２０１３年）に従って実施した。
モノクローナル抗３−ニトロチロシン（１：１０００の希釈度、Ａｂｃａｍ）、抗アルギニノコハク酸シンターゼ（１：５００、Ａｂｃａｍ）、抗アルギニノコハク酸リアーゼ（１：５００、Ａｂｃａｍ）、抗アルギナーゼ−１抗体（１：５００、Ｇｅｎｅｔｅｘ）、及び抗ベータアクチン（１：１００００、Ｓｉｇｍａ）。
【００８９】
免疫組織化学的検査
ヒト及びマウスの胎盤組織を、免疫組織化学的検査のために、以前の記載に従って調製した。免疫組織化学的検査を、アルギナーゼ−１、Ａｓｓ１、Ａｓｌ及び３−ニトロチロシンに対する抗体を使用することによって実施した。以下の抗体を使用した：（１）抗アルギナーゼ−１抗体（１：５０、Ｇｅｎｅｔｅｘ）；（２）抗アルギニノコハク酸シンターゼ（１：１００、Ａｂｃａｍ）；（３）抗アルギニノコハク酸リアーゼ（１：１００、Ａｂｃａｍ）、及び（４）抗３−ニトロチロシン（１：１００の希釈度、Ａｂｃａｍ）。マウス腎臓、又はヒト胎盤の生検から得られた切片を再水和させ、正常血清を使用してブロックし、一次抗体と共に室温で２時間インキュベートした。ベクタステイン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）ＡＢＣキットを使用することによって、ＤＡＢを用いて、可視化を実施した。ヘマトキシリンを用いて、スライドを対比染色した。Ｎｉｋｏｎ製の倒立顕微鏡及びイメージプロ−プラス（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓ）画像解析ソフトウエアを使用することによって、染色を分析した。
【００９０】
遺伝子アレイ
ＲＮＡ試料を、上記の記載に従って、マウス腎臓組織から調製し、ＡＲＫ−Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに提出し、ＡＲＫ−Ｇｅｎｏｍｉｃｓで、品質の分析が行われた。
【００９１】
ウエスタンブロット分析
腎臓溶解液を精査し、試料を、液体窒素中で急速凍結した。モノクローナル抗３−ニトロチロシン（１：１０００の希釈度、Ａｂｃａｍ）、抗アルギニノコハク酸シンターゼ（１：５００、Ａｂｃａｍ）、抗アルギニノコハク酸リアーゼ（１：５００、Ａｂｃａｍ）、抗アルギナーゼ−１抗体（１：５００、Ｇｅｎｅｔｅｘ）、及び抗ベータアクチン（１：１００００、Ｓｉｇｍａ）を用いて、ウエスタンブロットを実施した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせた抗ウサギ又は抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：１０００の希釈度、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。
【００９２】
統計学的分析
結果を、平均±ＳＥＭとして示し、複数群間の比較を、分散分析を使用して行った。Ｐ＜０．０５の場合に、差が有意であると報告する。
【００９３】
結果
我々は、重度の妊娠高血圧腎症は、ＶＥＧＦ及びＨｍｏｘ１活性の部分的な喪失に起因して発症するおそれがあるという概念を試験するため、並びにヒトのＰＥ様状態を正確に反映するために、妊娠中の、（単一のＨｍｏｘ１対立遺伝子を担持する）ハプロ不全Ｈｍｏｘ１（Ｈｍｏｘ１＋／−）マウスに、ｓＦｌｔ−１をコードするアデノウイルス（Ａｄ−ｓＦｌｔ−１）の静脈内注射を２回投与することによって、ｓＦｌｔ−１を全身に送達した。我々は、このアプローチを使用して、妊娠中のマウスの血漿中のｓＦｌｔ−１の顕著な増加を再現した。妊娠高血圧腎症についての診断基準のうちの１つが高血圧であることから、平均動脈血圧（ＭＡＰ）を、妊娠第１８．５日に測定し（図３−１  ａ）、又は収縮期血圧（ＳＢＰ）を、埋め込んだ無線遠隔測定装置を連続的に使用して測定した。測定の両方のモードが、Ｅ１８．５時に、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１処置Ｈｍｏｘ１＋／−群において、それらの野生型同腹仔と比較して、より高い循環型ｓＦｌｔ−１レベルでは、大幅に上昇した血圧を示した。さらに、無線遠隔測定による研究から、ＳＢＰの連続的な急速な増加も示され、ＳＢＰは、ｓＦｌｔ−１処置Ｈｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、Ｅ１８．５時に最大に達した。糸球体内皮炎は、重度の妊娠高血圧腎症の主要な特徴であり、広範な母体の内皮損傷の良好な指標である。これらのマウスから得られた腎臓の組織学的分析から、重度の糸球体内皮炎に典型的な分葉及び糸球体の瘢痕化が明らかになった（図３−１  ｂ）。腎臓の損傷と合致して、アルブミンの尿中への排泄もまた、これらのハプロ不全動物において、野生型マウスと比較して有意に増加した（図３−１  ｃ）。腎臓傷害分子−１（重度の妊娠高血圧腎症と関連がある近位尿細菅の傷害に特異的なマーカー）の尿中レベルの増加（図３−１  ｄ）、及び（重度の妊娠高血圧腎症と関連がある）ｓＦｌｔ−１の尿中レベルの上昇（図３−２  ｅ）により、重度の腎臓傷害がさらに立証された。
【００９４】
肝臓機能の異常な試験結果は、有害な母体の転帰についてのリスクの増加と関連があることが報告されており、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は、急性の肝臓傷害のマーカーであり、これらの両方が、高いｓＦｌｔ−１を負荷したＨｍｏｘ１不全マウスにおいて有意に増加した（図３−２  ｆ及びｇ）。さらに、内皮の活性化のマーカーであり、ｓＦｌｔ−１と協働して重度の妊娠高血圧腎症を誘発することが報告されている可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）もまた増加した（図３−２  ｈ）。妊娠高血圧腎症の表現型と合致して、Ｈｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、胎仔体重の低下（図３−３  ｉ）及び胎仔吸収の増加（図３−３  ｊ）も見出された。ｓＦｌｔ−１処置Ｈｍｏｘ１＋／−マウスから採取した仔の代表的な画像から、より小さく、不十分な血管形成を示す胚が認められた。Ｈｍｏｘ１＋／＋の胎盤、及びＡｄ−ｓＦｌｔ−１処置Ｈｍｏｘ１＋／−マウスから採取したＨｍｏｘ１＋／−の胎盤における胎盤Ａｒｇ１レベルから、Ｈｍｏｘ１＋／−の胎盤中の、Ａｒｇ１のｍＲＮＡの顕著な上昇が示された（図３−３  ｋ）。血漿ビリルビンが、Ｈｍｏｘ１活性のマーカーとして認識されているので、我々は、血漿ビリルビンを測定し、ｓＦｌｔ−１が、野生型の妊娠において、血漿ビリルビンの劇的な増加を誘発するが、Ｈｍｏｘ１不全動物においては、血漿ビリルビンの増加は鈍いことを認めた（図３−３  ｌ）。ｓＦｌｔ−１処置Ｈｍｏｘ１＋／＋マウス及びｓＦｌｔ−１処置Ｈｍｏｘ１＋／−マウスにおける胎盤Ｈｍｏｘ活性の研究の結果は、血漿ビリルビンについての結果に酷似しており、ビリルビンをＨｍｏｘ活性の代用マーカーとして使用することの妥当性がさらに確認された。このことにより、正常な妊娠においては、高いｓＦｌｔ−１により、ストレス応答機構として、Ｈｍｏｘ１活性が誘発されるが、Ｈｍｏｘ１活性が制限されている場合には、この機構が損なわれる可能性が高まった。これらの研究は、高いｓＦｌｔ−１及び低いＨｍｏｘ１活性が、妊娠高血圧腎症の表現型の重度の形態をもたらすことを示しており、Ｆｌｔ−１及びＨｍｏｘ１活性を、ここでは、実情に合わせてオーダーメード療法の開発を支援するための代理のマーカーとして使用することができるであろう。
【００９５】
我々は、ｓＦｌｔ−１が上昇しており、Ｈｍｏｘが欠損している環境が、重度の妊娠高血圧腎症を誘発することができるという概念を直接試験するために、Ｈｍｏｘ１−／−マウスに、ｓＦｌｔ−１を全身に送達した。ｓＦｌｔ−１をコードするアデノウイルス（Ａｄ−ｓＦｌｔ−１）の静脈内注射により、腎臓の損傷を示唆する、循環中及び尿中の高いレベルのｓＦｌｔ−１をもたらした。Ｈｍｏｘ１の欠損はまた、マウスを不妊となすので、これらの実験を、妊娠していない状況においても実施し、後の腎臓の損傷に焦点を当てた。Ｈｍｏｘ１の完全な喪失及び高い循環型ｓＦｌｔ−１により、糸球体の毛細血管ループの狭小化又は閉塞、糸球体硬化、メサンギウム融解、分葉及び瘢痕化、並びに一部の細胞における核崩壊を示す、種々の程度の糸球体内皮の腫大により特徴付けられる重度の限局的な糸球体病変が引き起こされた（図４−１  ａ）。このことは、腎臓切片の無作為化単回盲検法によるスコア化により確認された；スコアから、ｓＦｌｔ−１を用いて処置したＨｍｏｘ１−／−マウスにおいて、異常な糸球体のより高いレベルが有意に示された（図４−１  ｂ）。腎臓の重度の損傷と合致して、タンパク尿が増加した（図４−１  ｃ）。野生型マウスにおいては、高いｓＦｌｔ−１により、Ｈｍｏｘ１活性の代理のマーカーである血漿ビリルビン活性の上方制御が引き起こされたが、ノックアウト動物においては、ｓＦｌｔ−１により、Ｈｍｏｘ１活性は増加しなかった（ビリルビンの低い血漿レベル）（図４−１  ｄ）。我々は、ｓＦｌｔ−１が誘発する腎臓傷害に関与する機構を検討するために、マウスを、高いレベルのｓＦｌｔ−１に１０日間曝露させた後の腎臓の遺伝子発現の変化を研究した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製の遺伝子チップマイクロアレイの分析から、ｓＦｌｔ−１を用いて処置したＨｍｏｘ１−／−マウスの腎臓における、（＞２０倍に）上方制御されたいくつかの遺伝子が明らかになった。最も有意に上方制御された遺伝子のうちの１つが、アルギナーゼ−１（Ａｒｇ１）であり、このことは、リアルタイムＰＣＲ（図４−２  ｅ）及びアルギナーゼ活性アッセイ（図４−２  ｆ）により確認された。Ａｒｇ１の基質は、Ｌ−アルギニンである。また、Ｌ−アルギニンの利用能は、一酸化窒素（ＮＯ）の生物学的利用率の主要な決定因子でもあり、ＮＯは、内皮のＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）の基質である。Ｌ−アルギニン合成における律速段階は、ＮＯ生成の副産物であるＬ−シトルリンの変換であり、Ｌ−シトルリンは、アルギニノコハク酸シンテターゼ（Ａｓｓ）によりアルギニノコハク酸に変換され、アルギニノコハク酸は、アルギニノコハク酸リアーゼ（Ａｓｌ）により、Ｌ−アルギニンに変換されて、再利用される。Ｈｍｏｘ１−／−マウスにおいては、ｓＦｌｔ−１の過剰発現により、Ａｓｌ（図４−２  ｇ）及びＡｓｓ１（図４−２  ｈ）のｍＲＮＡ発現が有意に阻害され、このことは、妊娠高血圧腎症におけるＨｍｏｘ１活性の減少は、アルギニン経路の酵素の大きな調節不全をもたらすおそれがあることを示唆している。また、酸化性ストレスマーカーであるニトロチロシンの発現が、正常な妊娠において、妊娠高血圧腎症の胎盤中よりも高いことも公知である。ｓＦｌｔ−��に応答するアルギニン代謝における調節不全及びビリルビンの上昇の欠如が、これらのマウスの腎臓における、ニトロチロシンの反応性の種を検討するように我々を促した。ウエスタンブロット分析を使用して、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１を用いて処置したＨｍｏｘ１−／−マウスにより、腎臓溶解液中の反応性窒素種についてのマーカーである３−ニトロチロシンのより高い存在量が明らかになった（図４−３  ｉ）。
【００９６】
Ｈｍｏｘ１−／−マウスにおけるｓＦｌｔ−１の過剰発現により、Ａｒｇ１活性の増加が生じるので、アルギナーゼ活性の阻害を、Ｌ−アルギニンの補充と一緒に行うと、これらのマウスにおいて認められる重度の腎臓傷害を回復させることができるかどうかを、我々は直接試験した。Ν−ω−ヒドロキシ−Ｌ−ノル−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）の１日１回の腹腔内注射により、アルギナーゼ活性を阻害し、Ｌ−アルギニンを飲料水に添加し、自由に与えた場合に、このことにより、腎臓の糸球体硬化及びメサンギウム融解が回復した（図５−１  ａ）。このことによりまた、高いｓＦｌｔ−１に曝露させたＨｍｏｘ１−／−マウスにおいて、タンパク尿（図５−１  ｂ）により検出される腎臓の損傷が有意に阻害され、尿中ＫＩＭ−１レベル（図５−１  ｃ）も顕著に低下した。また、Ｈｍｏｘ１−／−マウスにおいては、併用療法による処置の後に、腎臓の３−ニトロチロシンの免疫染色が減少するように見えた（図５−１  ｄ）。Ｈｍｏｘ１＋／＋の胎盤、及びＡｄ−ｓＦｌｔ−１処置Ｈｍｏｘ１＋／−マウスから採取したＨｍｏｘ１＋／−の胎盤における胎盤Ａｒｇ１レベルから、Ｈｍｏｘ１＋／−の胎盤中の、Ａｒｇ１のｍＲＮＡの顕著な上昇が示された（図５−２  ｅ）。飲料水に補充し、自由に与えたＬ−アルギニンにより、Ａｄ−ｓＦｌｔ−１処置Ｈｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、平均動脈圧（ＭＡＰ）が有意に低下した（図５−２  ｆ）が、胎仔吸収率及び平均胎仔体重（図５−３  ｊ）の有意な改善は示されなかった。一方、１日１回のノル−ＮＯＨＡ療法により、吸収率は低下した（図５−３  ｉ）が、ＭＡＰ（図５−２  ｆ）に対しても胎仔体重に対しても有意な効果は示されなかった。また、両方の療法が、タンパク尿の有意な改善も示さなかった（図５−２  ｇ）。しかし、アルギナーゼ活性を毎日の処置によって阻害し、一緒にＬ−アルギニンを補充した場合、このことにより、血圧が低下し（図５−２  ｆ）、胎仔体重の分布が、正常なＡｄ−ＣＭＶの領域まで改善した（図５−３  ｊ）。上記併用療法により、健常に見える胎仔が生じ（図５−３  ｋ）、胎仔吸収率の著しく且つ有意な低下を得た（図５−３  ｉ）。また、併用療法は、高いｓＦｌｔ−１に曝露させたＨｍｏｘ１＋／−マウスにおいて、タンパク尿により検出される腎臓の損傷を有意に阻害し（図５−２  ｇ）、尿中ＫＩＭ−１レベル（図５−２  ｈ）も顕著に低下させた。
【００９７】
子宮胎盤灌流の低下、及び結果として生じる胎盤虚血が、妊娠高血圧腎症の別の主要な顕著な特徴である。より最近になって、ラットにおいて子宮胎盤灌流低下（ＲＵＰＰ）モデルにより発生させた胎盤虚血により、ｓＦｌｔ−１及びｓＥｎｇが増加し、Ｈｍｏｘ１発現が顕著に減少することを、Ｇｉｌｂｅｒｔらは示した。我々は、ラットＲＵＰＰモデルをマウスに適するように小型化し、改作して、我々の新規の、ノル−ＮＯＨＡとＬ−アルギニンとの併用療法を試験した。ラットＲＵＰＰに関する以前の報告と同様に、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲＵＰＰ手術により、収縮期血圧（ＳＢＰ）（図６−１  ａ）及びｓＦｌｔ−１レベル（図６−２  ｆ）が、シャム対照と比較して有意に増加した。同様に、ＲＵＰＰ介入の後に、タンパク尿（図６−１  ｄ）及び吸収率（図６−１  ｃ）もまた増加した。しかし、ノル−ＮＯＨＡとＬ−アルギニンとを用いる併用療法は、ＲＵＰＰマウスにおいて、収縮期血圧（ＳＢＰ）（図６−１  ａ）、ｓＦｌｔ−１（図６−２  ｆ）、タンパク尿（図６−１  ｄ）及び吸収率（図６−１  ｃ）、並びに正規化胎仔体重（図６−１  ｂ）を低下させることが可能であった。
【００９８】
我々は、重度の妊娠高血圧腎症は、Ｈｍｏｘ１活性及びＶＥＧＦシグナル伝達に欠陥のある、妊娠中の女性のうちの選択された群において発症するという着想を試験するために、重度の妊娠高血圧腎症を有する女性及び対照において、血漿ｓＦｌｔ−１を測定した。予想通り、血漿ｓＦｌｔ−１が有意に増加し（図７−１  ａ）、高いｓＦｌｔ−１を有するこれらの個体においては、血漿ビリルビンが低いことが見出された（図７−１  ｂ）。さらに、ＰＥ試料においては、ビリルビンに対するｓＦｌｔ−１の比も有意により高かった（図７−１  ｃ）。次に、我々は、正常妊娠及び妊娠高血圧腎症の合併症がある妊娠から得られた胎盤中のアルギニン代謝に関与する酵素の発現を比較して、これらの酵素が、妊娠高血圧腎症の我々のマウスモデルの高いｓＦｌｔ−１及び低いＨｍｏｘ１の環境において観察される様式と類似の様式で変化しているかどうかを観察した。胎盤Ａｒｇ１は、ｍＲＮＡレベル（図７−１  ｄ）並びにタンパク質レベル（図７−２  ｇ及び図７−３  ｉ）の両方において、劇的に増加し、この増加は、妊娠高血圧腎症において、血漿アルギナーゼのレベルが増加することと合致した。対照的に、Ａｓｌ（図７−２  ｅ、７−２  ｇ、７−３  ｊ）及びＡｓｓ１（図７−２  ｆ、７−２  ｇ、７−３  ｋ）の転写物及びタンパク質のレベルは、顕著に減少した。ウエスタンブロット分析から、妊娠高血圧腎症を有する女性から得られた胎盤の溶解液中の３−ニトロチロシンの発現の増加が明らかになった（図７−４  ｌ）。受信者動作特性（ＲＯＣ）分析から、ｓＦｌｔ−１／ビリルビンの比は、早期の重度妊娠高血圧腎症を発症する女性と上記障害を発症しない女性との間で、良好な弁別力を有し、ＲＯＣ曲線下面積は、０．９８であることが示された（図７−４  ｍ）
【００９９】
血管新生の不均衡の調節不全を、Ｈｍｏｘ１活性の減少及びアルギナーゼ活性の増加と組み合わせて、見込みのある診断ツールとして使用することができるかどうかを試験するために、妊娠高血圧腎症が疑われる徴候を有する女性において、妊娠中期に、ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、ビリルビン及び尿素の血漿レベルを測定した。分析により、早発性の妊娠高血圧腎症及び遅発性の妊娠高血圧腎症を発症する患者において、妊娠中期に、血漿ビリルビンが有意に減少し、尿素が有意に増加することが示された（図８−１  ａ及びｂ）。また、早発性の妊娠高血圧腎症及び遅発性の妊娠高血圧腎症の両方において、ビリルビンに対するｓＦｌｔ−１の比が、有意に増加し（図８−１  ｃ）、ＲＯＣ曲線下面積はそれぞれ、０．８６５及び０．９８９である（図８−１  ｄ）ことも示された。しかし、我々の新規の診断アルゴリズムは、４つのパラメータの組合せとして評価し、［ｓＦｌｔ１：ＰｌＧＦ］／［ビリルビン：尿素］の比として表現すると、早発性の妊娠高血圧腎症及び遅発性の妊娠高血圧腎症の群において、正常妊娠と比較する場合に、［ｓＦｌｔ１：ＰｌＧＦ］／［ビリルビン：尿素］の比の有意な増加を示した（図８−２  ｅ）。さらに、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析から、この比は、早期の重度妊娠高血圧腎症を発症する女性と遅発性の妊娠高血圧腎症との間で、上記障害を発症しない女性と比較する場合に、良好な弁別力を有し、ＲＯＣ曲線下面積はそれぞれ、０．９８３及び０．９８５であることも示された（図８−２  ｆ）。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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