(57)【要約】  式（Ｉ）の化合物：2018535226.tif 000023またはその薬学的に許容できる塩（式中、Ｒ１は、ヒドロ、メトキシ、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシであり得；Ｒ２は、ヒドロ、メトキシ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり得；かつＲ３は、ヒドロまたはメトキシであり得る）に関する。式（Ｉ）の化合物は、グルタミナーゼ、例えばＧＬＳ１を阻害し得る。
2018535226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2018535226.tif 000022
またはその薬学的に許容できる塩（式中、
Ｒ１は、ヒドロ、メトキシ、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシであり；
Ｒ２は、ヒドロ、メトキシ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり；かつ
Ｒ３は、ヒドロまたはメトキシである）。
【請求項２】
Ｒ１がメトキシ、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシである、請求項１に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項３】
Ｒ１がメトキシである、請求項２に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項４】
Ｒ２がヒドロである、請求項１〜３のいずれか一項に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項５】
Ｒ２がメトキシである、請求項１〜３のいずれか一項に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項６】
Ｒ３がメトキシである、請求項１〜５のいずれか一項に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項７】
Ｒ３がヒドロである、請求項１〜５のいずれか一項に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項８】
Ｒ１がメトキシ、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシであり；
Ｒ２がヒドロであり；かつ
Ｒ３がメトキシである、
請求項１に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項９】
Ｒ１がヒドロであり；
Ｒ２がメトキシ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり；かつ
Ｒ３がヒドロである、
請求項１に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項１０】
式（Ｉ）の化合物が、
（２Ｓ）−２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド；
（２Ｓ）−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド；
（２Ｓ）−２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド；
２−（２−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド；
Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］−２−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミド；および
Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］−２−［２−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アセトアミド
から選択される、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
治療に用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項１３】
がんの治療に用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項１４】
がんの治療用の薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の使用。
【請求項１５】
かかる治療を必要とする温血動物におけるがんを治療するための方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に請求される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を治療有効量で前記温血動物に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、一般に、ビス−ピリダジン化合物およびその薬学的に許容できる塩に関する。これらの化合物は、グルタミナーゼ１酵素（「ＧＬＳ１」）に作用し、それ故、本明細書はまた、がんを含むＧＬＳ１媒介性疾患を治療または予防するためのかかる化合物およびその塩の使用に関する。本明細書は、さらに、ビス−ピリダジン化合物およびその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物；かかる化合物および塩を含むキット；かかる化合物および塩を作製する方法；かかる化合物および塩の作製に有用な中間体；ならびにがんを含むＧＬＳ１キナーゼ媒介性疾患をかかる化合物および塩を用いて治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミンは、最も豊富な血漿アミノ酸であり、多数の成長促進経路に関与する。特に、グルタミンは、トリカルボン酸回路における酸化および細胞のレドックス平衡の維持に関与し、ひいてはヌクレオチドおよびアミノ酸合成に窒素を提供する（非特許文献１；非特許文献２）。多数のがん細胞が、解糖のピルビン酸がアセチルＣｏＡを生成するのに用いられるのでなく乳酸に変換される場合のワールブルグ効果を含む、細胞内での代謝変化の結果としてのグルタミン代謝に依存する（非特許文献３）。グルタミン代謝に対するこの依存性の結果として、かかるがん細胞は、外因性グルタミンレベルにおける変化に対して感受性を示す。さらに、グルタミノリシスが特定のがん型における主要な役割を担い（非特許文献４）、Ｍｙｃなどの公知の発癌性ドライバーに関連する（非特許文献５）ことを示唆する多くの証拠が存在する。
【０００３】
グルタミン酸塩に対するグルタミン異化の最初のステップは、２つのアイソフォーム、ＧＬＳ１およびＧＬＳ２（当初、腎臓および肝臓にて各々発現されるものとして同定された）として存在するグルタミナーゼにより触媒される。腎臓グルタミナーゼ（ＧＬＳ１）は、肝臓グルタミナーゼ（ＧＬＳ２）よりも広範に発現されることが知られており、２つのスプライスバリアント、ＫＧＡおよびより短いＧＡＣアイソフォームを有し、それら双方はミトコンドリア内に位置する（非特許文献６；非特許文献７）。ＧＬＳ１の発現は、多数の疾患型における腫瘍成長および悪性度に関連する（非特許文献８；非特許文献９）。したがって、ＧＬＳ１の阻害剤は、がんの単独療法としての治療または他の抗がん剤と組み合わせた治療において有用であることが想定される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃ．２００７，１２，３４４−５７
【非特許文献２】ＤｅＢａｒｄｉｎｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００９，３１３−３２４
【非特許文献３】Ｋｏｐｐｅｎｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１１，１１，３２５−３３７
【非特許文献４】Ｈｅｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３，１２３，３６７８−３６８４
【非特許文献５】Ｄａｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０，７０，８５９−８６３
【非特許文献６】Ｅｌｇａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９９，１，５１−６２
【非特許文献７】Ｃａｓｓａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１２，１０９，１０９２−１０９７
【非特許文献８】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１０，１８，２０７−２１９
【非特許文献９】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｕｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏ．Ｔｈｅｒ．２０１２，１３，１１８５−１１９４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
簡潔に述べると、本明細書は、部分的に、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2018535226.tif 000003
またはその薬学的に許容できる塩（式中、
Ｒ１は、ヒドロ、メトキシ、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシであり；
Ｒ２は、ヒドロ、メトキシ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり；かつ
Ｒ３は、ヒドロまたはメトキシである）
を説明する。
【０００６】
本明細書はまた、部分的に、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物を説明する。
【０００７】
本明細書はまた、部分的に、治療に用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を説明する。
【０００８】
本明細書はまた、がんの治療に用いられる、部分的に、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を説明する。
【０００９】
本明細書はまた、部分的に、がんの治療用の薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の使用を説明する。
【００１０】
本明細書はまた、部分的に、かかる治療を必要とする温血動物におけるがんを治療するための方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を治療有効量で前記温血動物に投与するステップを含む、方法を説明する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
多数の実施形態が、本明細書全体を通じて詳述され、当該技術分野に精通した読者にとって明白になるであろう。本発明は、その任意の特定の実施形態に限定されるものとして解釈されるべきでない。
【００１２】
第１の実施形態では、式（Ｉ）の化合物：
【化２】
2018535226.tif 000004
またはその薬学的に許容できる塩（式中、
Ｒ１は、ヒドロ、メトキシ、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシであり；
Ｒ２は、ヒドロ、メトキシ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり；かつ
Ｒ３は、ヒドロまたはメトキシである）
が提供される。
【００１３】
ヒドロ基は、単一の水素原子である。例えば、Ｒ３がヒドロである場合、式（Ｉ）中のカルボニル基に隣接した基はメチレン基である。Ｒ１またはＲ２がヒドロである場合、それらおよびそれらが付着される炭素原子は、芳香族ＣＨ基を形成する。
【００１４】
用語「薬学的に許容できる」は、対象（例えば塩、剤形、希釈剤または担体）が患者における使用に適することを明示するために用いられる。薬学的に許容できる塩の事例リストが、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｚｕｅｒｉｃｈ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ／ＶＨＣＡ，２００２中に見出すことができる。式（Ｉ）の化合物の好適な薬学的に許容できる塩は、例えば酸付加塩である。式（Ｉ）の化合物の酸付加塩は、化合物を当業者に公知の条件下で好適な無機酸または有機酸と接触状態にすることにより形成されてもよい。酸付加塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸から選択される無機酸を用いて形成されてもよい。酸付加塩はまた、例えば、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、またはベンゼンスルホン酸から選択される有機酸を用いて形成されてもよい。
【００１５】
したがって、一実施形態では、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供され、ここで薬学的に許容できる塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、またはベンゼンスルホン酸の塩である。
【００１６】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供され、ここで薬学的に許容できる塩は、塩酸または臭化水素酸の塩である。
【００１７】
他の薬学的に許容できる塩を適切なＰＫａの他の好適な酸とともに形成することが可能で有り得、これらが「薬学的に許容できる塩」の定義中に含まれることは理解されるべきである。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物のさらなる好適な薬学的に許容できる塩は、塩基付加塩である。式（Ｉ）の化合物の塩基付加塩は、化合物を当業者に公知の条件下で好適な無機塩基もしくは有機塩基と接触状態にすることにより形成されてもよい。塩基付加塩は、例えば、アルカリ金属水酸化物（ナトリウム、カリウム、またはリチウム水酸化物など）またはアルカリ土類金属水酸化物（水酸化カルシウムまたは水酸化マグネシウムなど）から選択される無機塩基を用いて形成されてもよい。塩基付加塩はまた、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリンおよびトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンから選択される有機塩基を用いて形成されてもよい。
【００１９】
したがって、一実施形態では、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供され、ここで薬学的に許容できる塩は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリン、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンの塩である。
【００２０】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供され、ここで薬学的に許容できる塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリン、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンの塩である。
【００２１】
他の薬学的に許容できる塩基を他の好適な塩基とともに形成することが可能で有り得、これらが「薬学的に許容できる塩」の定義中に含まれることは理解されるべきである。
【００２２】
さらなる実施形態は、本明細書で定義される実施形態のいずれか（例えば請求項１の実施形態）を、実施例１、２、３、４、５および６から選択される１つ以上の特定の実施例（例えば、１つ、２つまたは３つの特定の実施例、または代替的に１つの特定の実施例）が個別に請求されないという条件で提供する。
【００２３】
式（Ｉ）中の変数群の一部の値は以下の通りである。さらなる実施形態を提供するため、かかる値は、本明細書で定義される定義、請求項（例えば請求項１）、または実施形態のいずれかと組み合わせて用いられてもよい。
ａ）Ｒ１は、メトキシ、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシである。
ｂ）Ｒ１は、メトキシまたはジフルオロメトキシである。
ｃ）Ｒ１は、メトキシまたはトリフルオロメトキシである。
ｄ）Ｒ１は、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシである。
ｅ）Ｒ１は、ヒドロである。
ｆ）Ｒ１は、メトキシである。
ｇ）Ｒ１は、ジフルオロメトキシである。
ｈ）Ｒ１は、トリフルオロメトキシである。
ｉ）Ｒ２は、メトキシ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルである。
ｊ）Ｒ２は、ヒドロである。
ｋ）Ｒ２は、メトキシである。
ｌ）Ｒ２は、トリフルオロメトキシである。
ｍ）Ｒ２は、トリフルオロメチルである。
ｎ）Ｒ３は、ヒドロである。
ｏ）Ｒ３は、メトキシである。
【００２４】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩（式中、
Ｒ１は、ヒドロ、メトキシ、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシであり；
Ｒ２は、ヒドロであり；かつ
Ｒ３は、メトキシである）
が提供される。
【００２５】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩（式中、
Ｒ１は、メトキシ、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシであり；
Ｒ２は、ヒドロであり；かつ
Ｒ３は、メトキシである）
が提供される。
【００２６】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩（式中、
Ｒ１は、ヒドロであり；
Ｒ２は、メトキシ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり；かつ
Ｒ３は、ヒドロである）
が提供される。
【００２７】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩が提供され、ここで式（Ｉ）の化合物は、
（２Ｓ）−２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド；
（２Ｓ）−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド；
（２Ｓ）−２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド；
２−（２−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド；
Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］−２−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミド；および
Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］−２−［２−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アセトアミド
から選択される。
【００２８】
一実施形態では、（２Ｓ）−２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
【００２９】
一実施形態では、（２Ｓ）−２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミドが提供される。
【００３０】
一実施形態では、（２Ｓ）−２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミドの薬学的に許容できる塩が提供される。
【００３１】
一実施形態では、（２Ｓ）−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
【００３２】
一実施形態では、（２Ｓ）−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミドが提供される。
【００３３】
一実施形態では、（２Ｓ）−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミドの薬学的に許容できる塩が提供される。
【００３４】
一実施形態では、（２Ｓ）−２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
【００３５】
一実施形態では、（２Ｓ）−２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミドが提供される。
【００３６】
一実施形態では、（２Ｓ）−２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミドの薬学的に許容できる塩が提供される。
【００３７】
一実施形態では、２−（２−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
【００３８】
一実施形態では、２−（２−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミドが提供される。
【００３９】
一実施形態では、２−（２−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミドの薬学的に許容できる塩が提供される。
【００４０】
本明細書に記載の化合物および塩は、溶媒和形態および非溶媒和形態で存在してもよい。例えば、溶媒和形態は、水和形態、例えば、半水化物、一水和物、二水和物、三水和物またはその代替量であってもよい。本発明は、式（Ｉ）の化合物のすべてのかかる溶媒和および非溶媒和形態を包含する。
【００４１】
本明細書に記載の化合物および塩の原子は、それらの同位体として存在してもよい。本発明は、原子がその同位体の１つ以上によって置き換わる場合の式（Ｉ）のすべての化合物（例えば、１つ以上の炭素原子が１１Ｃもしくは１３Ｃ炭素同位体である場合、または１つ以上の水素原子が２Ｈ（ジュウテリウム）もしくは３Ｈ（トリチウム）同位体である場合の式（Ｉ）の化合物）を包含する。
【００４２】
本明細書に記載の化合物および塩は、互変異性体の混合物として存在してもよい。「互変異性体」は、水素原子の転位に起因する平衡状態で存在する構造異性体である。本発明は、式（Ｉ）の化合物のあらゆる互変異性体を含む。
【００４３】
式（Ｉ）の化合物は、それらの不斉炭素原子のために光学活性型で存在する。
【００４４】
式（Ｉ）の特定化合物（例えば、Ｒ３が水素である場合）は、単一の鏡像異性体として存在する。したがって、一実施形態では、≧９５％、≧９８％または≧９９％の鏡像体過剰率（％ｅｅ）で存在する単一の鏡像異性体である、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。一実施形態では、単一の鏡像異性体は、≧９９％の鏡像体過剰率（％ｅｅ）で存在する。
【００４５】
式（Ｉ）の特定化合物（例えば、Ｒ３がメトキシである場合）は、単一のジアステレオマーとして存在する。したがって、一実施形態では、≧９５％、≧９８％または≧９９％のジアステレオマー過剰率（％ｄｅ）で存在する単一のジアステレオマーである、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。一実施形態では、単一のジアステレオマーは、≧９９％のジアステレオマー過剰率（％ｄｅ）で存在する。
【００４６】
式（Ｉ）の化合物は、例えば、式（ＩＩ）の化合物：
【化３】
2018535226.tif 000005
と式（ＩＩＩ）の化合物：
【化４】
2018535226.tif 000006
（式中、Ｒ１、  Ｒ２およびＲ３は、本明細書中の実施形態のいずれかに定義され、かつＸは、ハロゲン原子（例えば塩素原子）またはヒドロキシ基などの脱離基である）との反応により調製されてもよい。反応は、好適な溶媒（例えば、ＤＭＦまたはＤＭＡ）中、かつ好適な温度で（例えば、約２０〜３０℃の環境温度でまたは上昇した温度、例えば８０〜１２０℃の間で、または代替的に約１００℃で）塩基（例えばＤＩＰＥＡ）の存在下で便宜的に実施される。Ｘがヒドロキシ基である場合、アミド結合を形成するため、好適なカップリング剤（例えばＨＡＴＵ）が用いられる。
【００４７】
したがって、式（ＩＩ）の化合物、およびその塩は、式（Ｉ）の化合物の調製における中間体として有用であり、さらなる実施形態を提供する。
【００４８】
一実施形態では、６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−アミン、またはその塩が提供される。
【００４９】
一実施形態では、６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−アミンが提供される。
【００５０】
式（ＩＩＩ）の化合物、およびその塩は同様に、式（Ｉ）の化合物の調製における中間体として有用であり、さらなる実施形態を提供する。
【００５１】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物、またはその塩（式中、
Ｒ１は、ジフルオロメトキシまたはトリフルオロメトキシであり；
Ｒ２は、ヒドロであり；
Ｒ３は、メトキシであり；かつ
Ｘは、脱離基である）が提供される。一実施形態では、Ｘは、ヒドロキシまたはクロロである。一実施形態では、Ｘはヒドロキシである。
【００５２】
一実施形態では、２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ酢酸、またはその塩が提供される。
【００５３】
一実施形態では、２−メトキシ−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］酢酸、またはその塩が提供される。
【００５４】
一実施形態では、２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ酢酸が提供される。
【００５５】
一実施形態では、２−メトキシ−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］酢酸が提供される。
【００５６】
式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の化合物は、実施例セクションに示される方法と類似の方法により調製され得る。
【００５７】
式（ＩＩ）の化合物の好適な塩は、例えば酸付加塩である。式（ＩＩ）の化合物の酸付加塩は、化合物を当業者に公知の条件下で好適な無機酸もしくは有機酸と接触状態にすることにより形成されてもよい。かかる酸は、式（ＩＩ）の化合物と対合されるとき、薬学的に許容できる塩を生成する必要はない。酸付加塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸から選択される無機酸を用いて形成されてもよい。酸付加塩はまた、例えば、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸から選択される有機酸を用いて形成されてもよい。
【００５８】
したがって、一実施形態では、式（ＩＩ）の化合物またはその塩が提供され、ここで塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸またはベンゼンスルホン酸の塩である。
【００５９】
式（ＩＩＩ）の化合物の好適な塩は、塩基付加塩である。式（ＩＩＩ）の化合物の塩基付加塩は、化合物を当業者に公知の条件下で好適な無機塩基もしくは有機塩基と接触状態にすることにより形成されてもよい。かかる塩基は、式（ＩＩＩ）の化合物と対合されるとき、薬学的に許容できる塩を生成する必要はない。塩基付加塩は、例えば、アルカリ金属水酸化物（ナトリウム、カリウム、またはリチウム水酸化物など）またはアルカリ土類金属水酸化物（水酸化カルシウムまたは水酸化マグネシウムなど）から選択される無機塩基を用いて形成されてもよい。塩基付加塩はまた、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリンおよびトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンから選択される有機塩基を用いて形成されてもよい。
【００６０】
したがって、一実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩が提供され、ここで塩は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリンまたはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンの塩である。
【００６１】
それらのＧＬＳ１阻害活性の結果として、式（Ｉ）の化合物、およびその薬学的に許容できる塩は、治療、例えば少なくとも一部にはＧＬＳ１により媒介される疾患または医学的状態、例えばがんの治療において有用であることが想定される。
【００６２】
「がん」について言及する場合、これが非転移性がん、さらには転移性がんの双方を含むことから、がんの治療は原発性腫瘍、さらには腫瘍転移の双方の治療を含む。
【００６３】
一実施形態では、がんは、転移性がんである。
【００６４】
一実施形態では、がんは、非転移性がんである。
【００６５】
「ＧＬＳ１阻害活性」は、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の存在に対する直接的または間接的応答としてのＧＬＳ１の活性における、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の不在下でのＧＬＳ１の活性に対する減少を指す。活性におけるかかる減少は、式（Ｉ）の化合物、もしくはその薬学的に許容できる塩とＧＬＳ１との直接的相互作用に起因する、または式（Ｉ）の化合物、もしくはその薬学的に許容できる塩とＧＬＳ１活性に次々に影響する１つ以上の他の因子との相互作用に起因することがある。例えば、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩は、ＧＬＳ１に直接的に結合することにより、別の因子によるＧＬＳ１活性の減少を（直接的または間接的に）引き起こすことにより、または細胞もしくは生物に存在するＧＬＳ１の量を（直接的または間接的に）低減することにより、ＧＬＳ１を減少させることがある。
【００６６】
用語「治療法」は、疾患に対して、その症状の１つ、一部もしくは全部を全体的もしくは部分的に軽減するか、または基礎的病理を矯正もしくは補正するように対処するというその正常な意味を有することが意図される。用語「治療法」はまた、「予防」を、それに対する具体的な指示がない限り、含む。用語「治療的な」および「治療的に」は、対応する様式で解釈されるべきである。
【００６７】
用語「予防」は、その正常な意味を有することが意図され、疾患の発生を予防するための一次予防および疾患が既に発生しており、患者が疾患の増悪もしくは悪化または疾患に関連した新たな症状の発生に対して一時的もしくは持続的に保護される場合の二次予防を含む。
【００６８】
用語「治療」は、「治療法」と同義的に用いられる。同様に、用語「治療する」は、「治療法」が本明細書で定義される通りである場合での治療法を適用するものとして見なされ得る。
【００６９】
一実施形態では、治療に用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
【００７０】
一実施形態では、薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の使用が提供される。
【００７１】
任意の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例から選択される。任意の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例１、２、３、４、５および６から選択される。
【００７２】
一実施形態では、ＧＬＳ１によって媒介される疾患の治療において用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。一実施形態では、ＧＬＳ１によって媒介される前記疾患は、がんである。一実施形態では、前記がんは、乳がん（例えばトリプルネガティブ乳がん）、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、膵がんおよび肝細胞がんから選択される。
【００７３】
「トリプルネガティブ乳がん」は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨｅｒ２／ｎｅｕにおける遺伝子を発現しない任意の乳がんである。
【００７４】
一実施形態では、がんの治療に用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
【００７５】
一実施形態では、ＧＬＳ１によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の使用が提供される。一実施形態では、ＧＬＳ１によって媒介される前記疾患は、がんである。一部の実施形態では、前記がんは、乳がん（例えばトリプルネガティブ乳がん）、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、膵がんおよび肝細胞がんから選択される。
【００７６】
一実施形態では、がんの治療用の薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の使用が提供される。
【００７７】
任意の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例から選択される。任意の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例１、２、３、４、５および６から選択される。
【００７８】
一実施形態では、ＧＬＳ１の阻害がかかる治療を必要とする温血動物において有利である疾患を治療するための方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を治療有効量で前記温血動物に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００７９】
用語「治療有効量」は、被験者における「治療法」を提供する、または被験者における疾患もしくは障害を「治療する」のに有効である、本明細書中の実施形態のいずれかに記載のような式（Ｉ）の化合物の量を指す。がんの場合、治療有効量は、上記の「治療法」、「治療」および「予防」の定義において記載の通り、被験者において観測可能または測定可能な変化のいずれかを引き起こすことがある。例えば、有効量は、がんまたは腫瘍細胞の数を低減し得る；総腫瘍サイズを低減し得る；腫瘍細胞の例えば軟部組織および骨を含む末梢臓器への浸潤を阻害または停止し得る；腫瘍転移を阻害および停止し得る；腫瘍成長を阻害および停止し得る；がんに関連する症状の１つ以上をある程度まで軽減し得る；罹患率および死亡率を低減し得る；生活の質を改善し得る；またはかかる効果の組み合わせであり得る。有効量は、ＧＬＳ１活性の阻害に対して応答する疾患の症状を低減するのに十分な量であってもよい。がん療法については、インビボでの有効性は、例えば、生存の持続時間、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、応答速度（ＲＲ）、応答の持続時間、および／または生活の質を評価することにより測定され得る。当業者によって理解されるように、有効量は、投与経路、賦形剤の使用、および他の薬剤との同時使用に応じて変動してもよい。例えば、併用療法が用いられる場合、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容できる塩の量および他の薬学的活性剤の量は、組み合わされるとき、動物患者における標的化された障害を治療するのに一緒に有効である。これに関連して、組み合わされた量は、組み合わされるとき、上記のようなＧＬＳ１活性の阻害に対して応答する疾患の症状を低減するのに十分である場合、「治療有効量」に含まれる。典型的には、かかる量は、例えば、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩についての本明細書に記載の用量範囲に始まり、他の薬学的活性化合物の認可されたまたはそうでなければ公表された用量範囲により、当業者によって決定されてもよい。
【００８０】
「温血動物」は、例えばヒトを含む。
【００８１】
一実施形態では、かかる治療を必要とする温血動物におけるがんを治療するための方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を治療有効量で前記温血動物に投与するステップを含む、方法が提供される。一実施形態では、前記がんは、乳がん（例えばトリプルネガティブ乳がん）、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、膵がんおよび肝細胞がんから選択される。
【００８２】
任意の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例から選択される。任意の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例１、２、３、４、５および６から選択される。
【００８３】
本明細書に記載の抗がん治療は、唯一の治療として適用されてもよく、または式（Ｉ）の化合物の投与に加えて、通常の手術、放射線療法、もしくは化学療法；もしくはかかる追加的な治療法の組み合わせを含んでもよい。かかる通常の手術、放射線療法、または化学療法は、式（Ｉ）の化合物を用いる治療に対して、同時に、連続的に、または別々に施されてもよい。
【００８４】
したがって、一実施形態では、がんの治療に用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも１つの追加的な抗腫瘍物質が提供される。
【００８５】
一実施形態では、がんの同時の、別々のまたは連続的な治療に用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも１つの追加的な抗腫瘍物質が提供される。
【００８６】
一実施形態では、がんの治療に用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩が提供され、ここで式（Ｉ）の化合物は、少なくとも１つの追加的な抗腫瘍物質に対して同時に、別々に、または連続的に投与される。
【００８７】
一実施形態では、かかる治療を必要とする温血動物におけるがんを治療する方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩および少なくとも１つの追加的な抗腫瘍物質を前記温血動物に投与するステップを含む、方法が提供され、ここで式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および追加的な抗腫瘍物質の量は、抗がん効果をもたらす上で一緒に有効である。
【００８８】
一実施形態では、かかる治療を必要とする温血動物におけるがんを治療する方法であって、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を前記温血動物に投与するステップと、少なくとも１つの追加的な抗腫瘍物質を同時に、別々にまたは連続的に前記温血動物に投与するステップと、を含む、方法が提供され、ここで式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および追加的な抗腫瘍物質の量は、抗がん効果をもたらす上で一緒に有効である。
【００８９】
任意の実施形態では、追加的な抗腫瘍物質はタキサンである。一実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。一実施形態では、タキサンはドセタキセルである。
【００９０】
任意の実施形態では、追加的な抗腫瘍物質は白金治療薬である。一実施形態では、白金治療薬は、シスプラチン、オキサリプラチン、またはカルボプラチンである。
【００９１】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの追加的な抗腫瘍物質を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、医薬組成物はまた、少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む。
【００９２】
一実施形態では、がんの治療に用いられる、式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの追加的な抗腫瘍物質を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、医薬組成物はまた、少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む。
【００９３】
一実施形態では、追加的な抗腫瘍物質はタキサンである。一実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。一実施形態では、タキサンはドセタキセルである。
【００９４】
一実施形態では、追加的な抗腫瘍物質は白金治療薬である。一実施形態では、白金治療薬は、シスプラチン、オキサリプラチン、またはカルボプラチンである。
【００９５】
任意の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例から選択される。任意の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例１、２、３、４、５および６から選択される。
【００９６】
さらなる実施形態によると、
ａ）第１の単位剤形中の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩；
ｂ）さらなる単位剤形中のさらなる追加的な抗腫瘍物質；
ｃ）前記第１の単位剤形およびさらなる単位剤形を含有するための容器；および任意選択的には
ｄ）使用説明書
を含むキットが提供される。
【００９７】
一実施形態では、追加的な抗腫瘍物質はタキサンである。一実施形態では、タキサンはパクリタキセルである。一実施形態では、タキサンはドセタキセルである。
【００９８】
一実施形態では、追加的な抗腫瘍物質は白金治療薬である。一実施形態では、白金治療薬は、シスプラチン、オキサリプラチン、またはカルボプラチンである。
【００９９】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例から選択される。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例１、２、３、４、５および６から選択される。
【０１００】
式（Ｉ）の化合物、およびその薬学的に許容できる塩は、１つ以上の薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物として投与されてもよい。
【０１０１】
したがって、一実施形態では、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物が提供される。
【０１０２】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例から選択される。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例１、２、３、４、５および６から選択される。
【０１０３】
本発明の組成物は、経口使用（例えば、錠剤、トローチ剤、硬もしくは軟カプセル剤、水性もしくは油性懸濁液、乳剤、分散性散剤もしくは顆粒剤、シロップ剤またはエリキシル剤として）、局所使用（例えば、クリーム、軟膏剤、ゲル剤、または水性もしくは油性の溶液または懸濁液として）、吸入による投与（例えば、微粉化粉末または液体エアロゾルとして）、ガス注入による投与（例えば、微粉化粉末として）または非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内もしくは筋肉内投与用の滅菌水性もしくは油性溶液として）、または直腸投与用の坐剤として好適な形態であってもよい。本発明の組成物は、当該技術分野で周知の、通常の医薬賦形剤を用いる通常の手順により得てもよい。したがって、経口使用を意図した組成物は、例えば、１つ以上の着色剤、甘味剤、香味剤、および／または防腐剤を含有してもよい。
【０１０４】
一実施形態では、治療に用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物が提供される。
【０１０５】
一実施形態では、がんの治療に用いられる、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、前記がんは、乳がん（例えばトリプルネガティブ乳がん）、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、膵がんおよび肝細胞がんから選択される。
【０１０６】
任意の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例から選択される。任意の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、実施例１、２、３、４、５および６から選択される。
【０１０７】
式（Ｉ）の化合物は通常、５〜５０００ｍｇ／ｍ２（動物の体面積）、すなわち例えば約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内の単位用量で温血動物に投与されることになり、これは通常、治療有効用量をもたらす。錠剤またはカプセル剤などの単位用量形態は通常、例えば１〜２５０ｍｇの活性成分を含有することになる。一日量は、必然的に、治療される宿主、特定の投与経路、同時投与されている任意の治療薬、および治療中の疾病の重症度に応じて変動することになる。したがって、任意の特定患者を治療中の施術者が、最適用量を決定してもよい。
【実施例】
【０１０８】
様々な実施形態が以下の実施例によって例示される。本発明は、実施例に限定されるものとして解釈されるべきではない。実施例の調製に際して、一般に次のことが言える。
ｉ．操作は、特に指定のない限り、環境温度、すなわち約１７〜３０℃の範囲内でかつ窒素などの不活性ガスの雰囲気下で実施した；
ｉｉ．回転蒸発または真空でＧｅｎｅｖａｃ機器を利用することにより蒸発を行い、固形残留物の濾過による除去後に精査手順を実施した；
ｉｉｉ．フラッシュクロマトグラフィー精製は、Ｇｒａｃｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅプレパックシリカカラムを用いた自動化されたＩｓｃｏ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ、ＲｅｄｉＳｅｐ  Ｇｏｌｄ  Ｃ１８カラムを用いたＩｓｃｏ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  Ｒｆ（逆相フラッシュ）上で実施した；
ｉｖ．収量（存在する場合）は必ずしも最大の達成可能な収量とは限らない；
ｖ．式（Ｉ）の最終生成物の構造は、δスケールで測定されるＮＭＲ化学シフトを用いた核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光により確認した。プロトン磁気共鳴スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ７００（７００ＭＨｚ）、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００（５００ＭＨｚ）、Ｂｒｕｋｅｒ  ４００（４００ＭＨｚ）またはＢｒｕｋｅｒ  ３００（３００ＭＨｚ）機器を用いて測定し；１９Ｆ  ＮＭＲは、２８２ＭＨｚまたは３７６ＭＨｚで測定し；１３Ｃ  ＮＭＲは、７５ＭＨｚまたは１００ＭＨｚで測定し；測定値は、特に指定されない限り、約２０〜３０℃で取得し；以下の略称：ｓ，一重線；ｄ，二重線；ｔ，三重線；ｑ，四重線；ｍ，多重線；ｄｄ，二重線の二重線；ｄｄｄ，二重線の二重線の二重線；ｄｔ，三重線の二重線；ｂｓ，幅広いシグナル、を用いている。
ｖｉ．式（Ｉ）の最終生成物はまた、２９９６  ＰＤＡおよび２０００  ａｍｕ  ＺＱ単一四重極質量分析計を有するＷａｔｅｒｓ  ２７９０／９５ＬＣシステムに基づくＨＰＬＣシステムを用いての液体クロマトグラフィー後の質量分析（ＬＣＭＳ）により特徴づけた。用いた溶媒は、Ａ＝水、Ｂ＝アセトニトリル、Ｃ＝５０：５０のアセトニトリル：水／０．１％ギ酸およびＤ＝５０：５０のアセトニトリル：水／０．１％水酸化アンモニウムであった。１．１ｍＬ／分の流速で、試料５μＬを５０×２．１  ５μｍのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＮＸカラム上に注入した。勾配は、４．０分間で９５％のＡから９５％のＢへ移行し、Ｃ（酸分析用、Ｄは塩基分析用に用いる）の５％一定注入を伴った。開始条件に戻す前、９５％のＢで０．５分間フローを保持した。データは、質量分析計で正および負モードの双方にて１５０〜８５０ａｍｕ、およびＰＤＡで２２０〜３２０ｎｍが得られた。ＬＣＭＳはまた、サンプルマネージャーを有するＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｂｉｎａｒｙポンプ、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＰＤＡおよびＳＱＤ質量分析計を用いたＵＰＬＣシステム上で実施した。用いた溶媒は、Ａ１＝０．１％ギ酸（水性）、Ｂ１＝アセトニトリル中０．１％ギ酸、Ａ２＝０．１％水酸化アンモニウム（水性）およびＢ２＝アセトニトリル中０．１％水酸化アンモニウムであった。１ｍＬ／分の流速で、試料１μＬは、５０×２．１  １．７ｕｍのＷａｔｅｒｓ  ＢＥＨカラム（４０℃）上に注入した。０．２分間保持され、開始条件に戻す前、勾配は１．３０分かけて９７％のＡ１から９７％のＢ１へ移行した（塩基分析においては、Ａ１およびＢ１をＡ２およびＢ２に置き換える）。データは、質量分析計で正および負イオンモードにて１５０〜１０００ａｍｕ、およびＰＤＡで２４５〜３２０ａｍｕが得られた。
ｖｉｉ．中間体は、完全に特徴づけることは一般的でなく、純度は、薄層クロマトグラフィー、質量スペクトル、ＨＰＬＣおよび／またはＮＭＲ分析により評価した。
ｖｉｉｉ．以下の略称：ｈ＝時間；ｒ．ｔ．＝室温（約１７〜３０℃）；ｃｏｎｃ．＝濃縮された；ＦＣＣ＝シリカを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー；ＤＣＭ＝ジクロロメタン；ＤＩＰＥＡ＝ジ−イソプロピルエチルアミン；ＤＭＡ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド；Ｅｔ２Ｏ＝ジエチルエーテル；ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル；ＥｔＯＨ＝エタノール；ＨＡＴＵ＝１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート；Ｋ２ＣＯ３＝炭酸カリウム；ＭｅＯＨ＝メタノール；ＭｅＣＮ＝アセトニトリル；ＭｇＳＯ４＝無水硫酸マグネシウム；Ｎａ２ＳＯ４＝無水硫酸ナトリウム；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；ｓａｔ．＝飽和水溶液、を用いている。
ｉｘ．ＩＵＰＡＣ名は、ＯｐｅｎＥｙｅ  Ｌｅｘｉｃｈｅｍツールキットに基づいて構築された専売プログラム「ＳｍｉＴｏＳｄ」を用いて生成した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｙｅｓｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｌｅｘｉｃｈｅｍ−ｔｋ）。
【０１０９】
実施例１
（２Ｓ）−２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド
【化５】
2018535226.tif 000007
ＨＡＴＵ（９３１ｍｇ、２．４５ミリモル）を、ＤＭＦ（１２ｍＬ）中、６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−アミン（中間体１、５２５ｍｇ、２．０４ミリモル）、２−（３−（ジフルオロメトキシ）フェニル）−２−メトキシ酢酸（中間体６、５２１ｍｇ、２．２４ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（１．０６６ｍＬ、６．１２ミリモル）に添加した。得られた溶液を、０℃で５分間、次いで室温で３時間撹拌した。この溶液をＭｅＯＨ（７ｍＬ）で希釈し、２０ｇのＳＣＸ−２カートリッジに通過させ、ＭｅＯＨを流して不純物を除去し、次いでＭｅＯＨ中アンモニアの１Ｎ溶液を流すことで、生成物を得た。溶媒を低圧下で蒸発させ、粗生成物を得た。残渣をＦＣＣ（溶出勾配がＤＣＭ中ＭｅＯＨ０〜６％）により精製した。生成物を含有する画分を蒸発させて乾燥し、２−（３−（ジフルオロメトキシ）フェニル）−２−メトキシ−Ｎ−（６−（（Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル）ピリダジン−３−イル）アセトアミド（４９０ｍｇ、５０％）を固体として得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＦカラム、２０μｍのシリカ、５０ｍｍの直径、２５０ｍｍの長さ）により精製し、１５０ｍＬ／分、ＭｅＯＨ１００％で溶出した。所望される化合物を含有する画分を蒸発させて乾燥し、次を得た。
【０１１０】
（２Ｓ）−２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド（実施例１）を第１溶出異性体として（１６９ｍｇ、１８％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，３０℃）δ  ２．０−２．１（１Ｈ，ｍ），２．２９−２．３９（１Ｈ，ｍ），３．３７（３Ｈ，ｓ），３．３９−３．４５（１Ｈ，ｍ），３．５１−３．６６（２Ｈ，ｍ），３．８３（１Ｈ，ｄｄ），４．５８−４．６７（１Ｈ，ｍ），５．０２（１Ｈ，ｓ），６．８１（１Ｈ，ｄｄ），６．９８（１Ｈ，ｄ），７．０４−７．４８（７Ｈ，ｍ），７．９１（１Ｈ，ｄ），８．４６（１Ｈ，ｄｄ），１０．５８（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋４７２．
【０１１１】
（２Ｒ）−２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド（副生成物１）を第２溶出異性体として（１７８ｍｇ、１９％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，３０℃）δ  ２．０４−２．１５（１Ｈ，ｍ），２．３２−２．４４（１Ｈ，ｍ），３．４１（３Ｈ，ｓ），３．４６（１Ｈ，ｄｄ），３．５５−３．７１（２Ｈ，ｍ），３．８７（１Ｈ，ｄｄ），４．６２−４．７２（１Ｈ，ｍ），５．０７（１Ｈ，ｓ），６．８６（１Ｈ，ｄ），７．０２（１Ｈ，ｄ），７．０９−７．５３（７Ｈ，ｍ），７．９５（１Ｈ，ｄ），８．５０（１Ｈ，ｄ），１０．６５（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋４７２．
【０１１２】
実施例２
（２Ｓ）−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド
【化６】
2018535226.tif 000008
ＨＡＴＵ（３５５ｍｇ、０．９３ミリモル）を、２１℃でＤＭＦ（４ｍＬ）中の２−メトキシ−２−（３−（トリフルオロメトキシ）フェニル）酢酸（中間体７、２１４ｍｇ、０．８６ミリモル）、６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−アミン（中間体１、２００ｍｇ、０．７８ミリモル）、およびＤＩＰＥＡ（０．４０６ｍＬ、２．３３ミリモル）に添加した。次に得られた溶液を環境温度で１時間撹拌した。粗生成物を、ＳＣＸカラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。粗生成物を、１Ｍアンモニア／ＭｅＯＨを用いてカラムから溶出し、シリカに吸着させた。粗生成物を、ＤＣＭ中ＭｅＯＨ（７Ｍアンモニア／ＭｅＯＨの場合）０〜７％の溶出勾配でのＦＣＣにより精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、ジアステレオ異性体の混合物をガム状物として得た（１５０ｍｇ）。次に混合物を、ＭｅＯＨを溶出剤として用いる分取キラルＨＰＬＣ（２０μｍのシリカ、５０ｍｍの直径、２５０ｍｍの長さ）を用いて分離した。所望される化合物を含有する画分を蒸発させて乾燥し、次を得た。
【０１１３】
（２Ｒ）−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド（副生成物２）を第１溶出異性体として（４７．０ｍｇ、１２％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，３０℃）δ  ２−２．１４（１Ｈ，ｍ），２．２６−２．４３（１Ｈ，ｍ），３．３８（３Ｈ，ｓ），３．４２（１Ｈ，ｍ），３．５１−３．６６（２Ｈ，ｍ），３．８３（１Ｈ，ｍ），４．５３−４．７１（１Ｈ，ｍ），５．０７（１Ｈ，ｓ），６．８１（１Ｈ，ｄｄ），６．９７（１Ｈ，ｄ），７．０８（１Ｈ，ｄ），７．２４（１Ｈ，ｄｄ），７．３−７．４（１Ｈ，ｍ），７．４８（１Ｈ，ｓ），７．５２−７．５９（２Ｈ，ｍ），７．９０（１Ｈ，ｄ），８．４５（１Ｈ，ｄｄ），１０．６３（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋４９０．
【０１１４】
（２Ｓ）−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド（実施例２）を第２溶出異性体として（１７８ｍｇ、１９％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，３０℃）δ  ２−２．１４（１Ｈ，ｍ），２．２６−２．４３（１Ｈ，ｍ），３．３８（３Ｈ，ｓ），３．４２（１Ｈ，ｍ），３．５１−３．６６（２Ｈ，ｍ），３．８３（１Ｈ，ｍ），４．５３−４．７１（１Ｈ，ｍ），５．０７（１Ｈ，ｓ），６．８１（１Ｈ，ｄｄ），６．９７（１Ｈ，ｄ），７．０８（１Ｈ，ｄ），７．２４（１Ｈ，ｄｄ），７．３−７．４（１Ｈ，ｍ），７．４８（１Ｈ，ｓ），７．５２−７．５９（２Ｈ，ｍ），７．９０（１Ｈ，ｄ），８．４５（１Ｈ，ｄｄ），１０．６３（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋４９０．
【０１１５】
実施例３
（２Ｓ）−２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド
【化７】
2018535226.tif 000009
ＨＡＴＵ（３５５ｍｇ、０．９３ミリモル）を、２１℃でＤＭＦ（４ｍＬ）中の２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）酢酸（中間体８、１６８ｍｇ、０．８６ミリモル）、６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−アミン（中間体１、２００ｍｇ、０．７８ミリモル）、およびＤＩＰＥＡ（０．４０６ｍＬ、２．３３ミリモル）に添加した。次に得られた溶液を環境温度で１時間撹拌した。粗生成物を、ＳＣＸカラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。所望される生成物を、１Ｍアンモニア／ＭｅＯＨを用いてカラムから溶出し、純粋画分をシリカに吸着させた。粗生成物を、ＤＣＭ中ＭｅＯＨ（７Ｍアンモニア／ＭｅＯＨの場合）０〜７％の溶出勾配でのＦＣＣにより精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、ジアステレオ異性体の混合物を固体として得た。粗生成物を、１００ｍＬ／分、５０／５０のＥｔＯＨ／ＭｅＯＨでのキラル分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ  Ｌｕｘ  Ｃ２カラム、２０μｍのシリカ、５０ｍｍの直径、２５０ｍｍの長さ）により精製した。所望される化合物を含有する画分を蒸発させて乾燥し、次を得た。
【０１１６】
（２Ｓ）−２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド（実施例３）を第１溶出異性体として（８０ｍｇ、２４％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，３０℃）δ  １．９５−２．１６（１Ｈ，ｍ），２．２１−２．４２（１Ｈ，ｍ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．４２（１Ｈ，ｍ），３．５２−３．６８（２Ｈ，ｍ），３．７６（３Ｈ，ｓ），３．８２（１Ｈ，ｍ），４．５５−４．７（１Ｈ，ｍ），４．９５（１Ｈ，ｓ），６．８２（１Ｈ，ｄ），６．８６−６．９３（１Ｈ，ｄ），６．９８（１Ｈ，ｄ），７．０４−７．１５（３Ｈ，ｍ），７．２５（１Ｈ，ｄｄ），７．２８−７．３２（１Ｈ，ｄｄ），７．９１（１Ｈ，ｄ），８．４６（１Ｈ，ｄｄ），１０．４７（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋４３６．
【０１１７】
（２Ｒ）−２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド（副生成物３）を第２溶出異性体として（７５ｍｇ、２２％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，３０℃）δ  １．９５−２．１６（１Ｈ，ｍ），２．２１−２．４２（１Ｈ，ｍ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．４２（１Ｈ，ｍ），３．５２−３．６８（２Ｈ，ｍ），３．７６（３Ｈ，ｓ），３．８２（１Ｈ，ｍ），４．５５−４．７（１Ｈ，ｍ），４．９５（１Ｈ，ｓ），６．８２（１Ｈ，ｄ），６．８６−６．９３（１Ｈ，ｄ），６．９８（１Ｈ，ｄ），７．０４−７．１５（３Ｈ，ｍ），７．２５（１Ｈ，ｄｄ），７．２８−７．３２（１Ｈ，ｄｄ），７．９１（１Ｈ，ｄ），８．４６（１Ｈ，ｄｄ），１０．４７（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋４３６．
【０１１８】
実施例４
２−（２−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド
【化８】
2018535226.tif 000010
６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−アミン（中間体１、０．０３ｇ、０．１１７ミリモル）および（２−メトキシフェニル）酢酸（０．０２ｇ、０．１１７ミリモル）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。その後、ＨＡＴＵ（０．０４ｇ、０．１１７ミリモル）を添加し、反応物を５分間撹拌した。次にＤＩＰＥＡ（０．０４ｇ、０．２９１ミリモル）を少しずつ添加し、混合物を室温で１５時間撹拌しておいた。溶媒を低圧下で除去し、粗生成物をシリカ上に吸収させ、１００％ＤＣＭから１０％ＭｅＯＨ９０％ＤＣＭにかけての溶媒勾配でのＦＣＣにより精製した。画分を結合させ、低圧下で濃縮し、無色ガム状物を得た（３０ｍｇ）。この材料のＬＣＭＳによると、それが不純物であることが示されたことから、固体をＤＭＳＯに溶解し、溶出剤として水（０．１％のギ酸を含有）およびアセトニトリル（０．１％のギ酸を含有）の減少する極性の混合物を用いて、分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  ＳｕｎＦｉｒｅカラム、５μｍの孔径、４．６０ｍｍの直径、５０ｍｍの長さ）により精製した。所望される化合物を含有する画分を蒸発させて乾燥し、ＭｅＯＨに溶解し、ＳＣＸカラムに通過させ、ＭｅＯＨを流し、次に生成物をＭｅＯＨ中２Ｍアンモニアで溶出した。溶媒を低圧下で蒸発させ、２−（２−メトキシフェニル）−Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］アセトアミド（１７ｍｇ、４７％）をクリーム色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，２１．８℃）δ  ２．０４−２．１２（１Ｈ，ｍ），２．３２−２．４１（１Ｈ，ｍ），３．４４−３．４７（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．６８（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｓ，２Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．８５（ｄｄ，１Ｈ），４．６２−４．６９（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｄｄ，１Ｈ），６．９３（ｔｄ，１Ｈ），７．０１（ｄ，２Ｈ），７．１７（ｄ，１Ｈ），７．２３−７．３０（ｍ，３Ｈ），８．０１（ｄ，１Ｈ），８．４９（ｄｄ，１Ｈ），１０．６５（ｓ，１Ｈ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋４０６．３．
【０１１９】
実施例５
Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］−２−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミド
【化９】
2018535226.tif 000011
乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中、６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−アミン（中間体１、０．０４１ｇ、０．１５９ミリモル）、２−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］酢酸（０．０３２ｇ、０．１５９ミリモル）およびＨＡＴＵ（０．０６１ｇ、０．１５９ミリモル）の撹拌混合物をＤＩＰＥＡ（０．０５２ｇ、０．３９８ミリモル）に添加し、混合物を窒素雰囲気下で１５時間撹拌放置した。溶媒を低圧下での蒸発により除去し、褐色ガム状物を得て、それをＤＭＳＯに溶解し、溶出剤として水（０．１％のギ酸を含有）およびアセトニトリル（０．１％のギ酸を含有）の減少する極性の混合物を用いて、分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  ＳｕｎＦｉｒｅカラム、５μｍの孔径、４．６０ｍｍの直径、５０ｍｍの長さ）により精製した。所望される化合物を含有する画分を蒸発させて乾燥し、Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］−２−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミドを無色粉末として得た（０．０６５ｇ、４１％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，２１．８℃）δ  ２．０７−２．１２（１Ｈ，ｍ），２．３０−２．３８（１Ｈ，ｍ），３．４８−３．５１（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．６６（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｄｄ，１Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），４．５９−４．６１（ｍ，１Ｈ），７．０１（ｄ，１Ｈ），７．１１（ｄ，１Ｈ），７．４３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．４７−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．６３−７．６６（ｍ，１Ｈ），７．７０−７．７３（ｍ，２Ｈ）８．００（ｄ，１Ｈ），８．５３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１０．９５（ｓ，１Ｈ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋４４４．
【０１２０】
実施例６
Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］−２−［２−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アセトアミド
【化１０】
2018535226.tif 000012
２−［２−（トリフルオロメトキシ）フェニル］酢酸（０．０４ｇ、０．１５９ミリモル）および６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−アミン（中間体１、０．０４ｇ、０．１５９ミリモル）を丸底フラスコ中で秤量した。ＤＭＦ（１ｍＬ）およびＨＡＴＵ（０．０６ｇ、０．１５９ミリモル）を添加し、５分間撹拌し、溶解を生じさせた。次にＤＩＰＥＡ（０．０５ｇ、０．３９８ミリモル）を少しずつ添加し、混合物を室温で１５時間撹拌しておいた。溶媒を低圧下で除去し、シリカ上に吸収させ、１００％ＤＣＭから１０％メタノールアンモニア：９０％ＤＣＭに至る溶出勾配でのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物を淡黄色固体として溶出した（５０ｍｇ）。ＬＣＭＳ分析によると、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の不純物が５％存在することが示された。固体をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、質量誘導ＬＣＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  ＳｕｎＦｉｒｅカラム、５μｍの孔径、４．６０ｍｍの直径、５０ｍｍの長さ）により精製した。流速は２５ｍＬ／分であり、水およびアセトニトリルの移動相は０．１％ギ酸を含有した。溶出は、９５％水：５％アセトニトリルで開始し、それを１．５分間保持し、１０分かけて５％水：９５％アセトニトリルまで上昇させた。次にこれを３０秒間保持することで、全実行期間は１２分であった。適切な画分をＳＣＸカートリッジに添加し、メタノールで洗浄し、次に表題化合物をメタノール中２Ｍアンモニアで溶出した。溶媒を低圧下で蒸発させ、Ｎ−［６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−イル］−２−［２−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アセトアミドを白色固体として得た（０．０３８ｇ、５１％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，２１．８℃）δ  ２．０１−２．０８（１Ｈ，ｍ），２．２８−２．３７（１Ｈ，ｍ），３．４２（ｄｄ，１Ｈ），３．５２−３．６４（ｍ，２Ｈ），３．８１（ｄｄ，１Ｈ），３．８５（ｓ，２Ｈ），４．６０−４．６３（ｍ，１Ｈ），６．８１（ｄｄ，１Ｈ），６．９８（ｄ，１Ｈ），７．１３（ｄ，１Ｈ），７．２４（ｄｄ，１Ｈ），７．３２−７．４３（ｍ，３Ｈ），７．４７−７．４９（ｍ，１Ｈ）７．９５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），１０．９０（ｓ，１Ｈ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋４６０．
【０１２１】
中間体１
６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−アミン
【化１１】
2018535226.tif 000013
（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−２−カルボン酸（０．２４０ｇ、１．８３ミリモル）を、乾燥ＤＭＳＯ（１２ｍＬ）中、（Ｒ）−Ｎ−（ピロリジン−３−イル）ピリダジン−３−アミン（中間体２、１．５ｇ、９．１３ミリモル）の溶液に添加した。次に、銅（Ｉ）ヨウ化物（０．１７４ｇ、０．９１ミリモル）、次いで６−ヨードピリダジン−３−アミン（中間体３、２．６２ｇ、１１．８８ミリモル）、次にリン酸カリウム（５．８２ｇ、２７．４０ミリモル）を順に添加した。次に反応混合物を、窒素下、室温で２４時間撹拌した。混合物をＭｅＯＨ（１２ｍＬ）および水（１２ｍＬ）で希釈した。混合物を酢酸で中和し、固体の沈殿を生じさせ、それを収集した。液体層をＳＣＸステップでの使用のためにデカントし、固体をＭｅＯＨ（２×５ｍＬ）で洗浄し、洗浄層を先行ステップからの液体層と結合させ、２０ｇのＳＣＸカートリッジに通過させ、ＭｅＯＨを流して不純物を除去し、次いでＭｅＯＨ中アンモニアの１Ｎ溶液を流すことで、生成物を取り出した。溶媒を低圧下で蒸発させ、残渣をＤＣＭ中（ＭｅＯＨ中７Ｎアンモニア）０〜１０％の溶出勾配でのＦＣＣにより精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、６−［（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−イル］ピリダジン−３−アミン（１．２２０ｇ、５２％）をガム状物として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，３０℃）δ  １．９９（１Ｈ，ｍ），２．２２−２．３７（１Ｈ，ｍ），３．４４（１Ｈ，ｍ），３．５３（１Ｈ，ｍ），３．７３（１Ｈ，ｍ），４．０５（１Ｈ，ｍ），４．５５−４．６６（１Ｈ，ｍ），５．４３（２Ｈ，ｓ），６．７５（１Ｈ，ｄ），６．７９−６．８８（２Ｈ，ｍ），７．０４（１Ｈ，ｄ），７．２３（１Ｈ，ｄｄ），８．４４（１Ｈ，ｄｄ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋２５８．
【０１２２】
中間体２
Ｎ−［（３Ｒ）−ピロリジン−３−イル］ピリダジン−３−アミン
【化１２】
2018535226.tif 000014
ＴＦＡ（１２．００ｍＬ）を、ＤＣＭ（８０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−カルボン酸塩（中間体３、２．２ｇ、８．３２ミリモル）に添加し、黄色溶液を環境温度で１時間撹拌放置した。粗生成物を、ＳＣＸカラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。所望される生成物を７Ｍアンモニア／ＭｅＯＨを用いてカラムから溶出し、純粋画分を蒸発させて乾燥し、Ｎ−［（３Ｒ）−ピロリジン−３−イル］ピリダジン−３−アミン（１．３９ｇ、１０２％）を黄色ガム状物として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，３０℃）δ  １．５７（１Ｈ，ｍ），１．９１−２．１（１Ｈ，ｍ），２．６１（１Ｈ，ｍ），２．７８（１Ｈ，ｍ），２．８９（１Ｈ，ｍ），３．０４（１Ｈ，ｍ），４．１４−４．３８（１Ｈ，ｍ），６．７６（２Ｈ，ｍ），７．２０（１Ｈ，ｄ），８．４０（１Ｈ，ｄ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋１６５．
【０１２３】
中間体３
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−カルボン酸塩
【化１３】
2018535226.tif 000015
炭素上パラジウム１０％（０．８１０ｇ、７．６１ミリモル）を、窒素下、２１℃でエタノール（２００ｍＬ）中、ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ）−３−［（６−クロロピリダジン−３−イル）アミノ］ピロリジン−１−カルボン酸塩（中間体５、７ｇ、１５．２３ミリモル）およびギ酸アンモニウム（１４．４０ｇ、２２８．４４ミリモル）に添加した。得られた混合物を還流しながら３時間撹拌した。反応混合物を、セライトを通して濾過し、ＭｅＯＨ／ＤＣＭで洗浄し終えた。粗生成物を、ＤＣＭ中ＭｅＯＨ０〜１５％の溶出勾配でのＦＣＣにより精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ）−３−（ピリダジン−３−イルアミノ）ピロリジン−１−カルボン酸塩（２．２３０ｇ、５５％）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，３０℃）δ  １．４０（９Ｈ，ｓ），１．８６（１Ｈ，ｍ），２．１６（１Ｈ，ｍ），３．２９−３．４６（３Ｈ，ｍ），３．６０（１Ｈ，ｍ），４．４３（１Ｈ，ｍ），６．８１（１Ｈ，ｄｄ），７．００（１Ｈ，ｄ），７．２４（１Ｈ，ｄｄ），８．４５（１Ｈ，ｄｄ）；ｍ／ｚ：ＥＳ＋［Ｍ＋Ｈ］＋２６５．
【０１２４】
中間体４
６−ヨードピリダジン−３−アミン
【化１４】
2018535226.tif 000016
６−クロロピリダジン−３−アミン（３．７ｇ、２８．５６ミリモル）を、還流コンデンサーおよび磁気攪拌バーを備えた１００ｍＬの丸底フラスコに充填した。次にこれにヨウ化水素（水中５７ｗｔ％溶液、２０ｍＬ、２６５．９６ミリモル）を添加し、得られた暗褐色溶液を加熱して穏やかに還流し、６時間撹拌放置した。混合物を室温に冷却し、粗製固体を濾過除去し、反応容器上のフィルターケーキをさらなる容量の氷冷水（２×約３０ｍＬ）ですすいだ。得られた固体を酢酸エチルおよび２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液間で分配し、有機層を鹹水溶液で洗浄し、乾燥し、濾過し、低圧下で蒸発させ、６−ヨードピリダジン−３−アミン（４．１０ｇ、６５％）を固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，２７℃）δ  ６．５２（２Ｈ，ｓ），６．５５（１Ｈ，ｄ），７．５４（１Ｈ，ｄ）．
【０１２５】
中間体５
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ）−３−［（６−クロロピリダジン−３−イル）アミノ］ピロリジン−１−カルボン酸塩
【化１５】
2018535226.tif 000017
ＤＩＰＥＡ（２２．４４ｍＬ、１２８．８６ミリモル）を、窒素下、２１℃で、ＮＭＰ（１５０ｍＬ）中の３，６−ジクロロピリダジン（６．４０ｇ、４２．９５ミリモル）、ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ）−３−アミノピロリジン−１−カルボン酸塩（８ｇ、４２．９５ミリモル）に添加した。混合物を１５０℃で２４時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）で希釈し、水（２００ｍＬ）で２回洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、シリカに吸着させた。粗生成物を、ヘプタン中ＥｔＯＡｃ２０〜７０％の溶出勾配でのＦＣＣにより精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ）−３−［（６−クロロピリダジン−３−イル）アミノ］ピロリジン−１−カルボン酸塩（７．１０ｇ、５５％）を淡紅色／赤色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，３０℃）δ  １．４０（９Ｈ，ｓ），１．８６（１Ｈ，ｍ），２．１５（１Ｈ，ｍ），３．１６（１Ｈ，ｍ），３．３３−３．４９（２Ｈ，ｍ），３．５９（１Ｈ，ｍ），４．３８（１Ｈ，ｍ），６．９１（１Ｈ，ｄ），７．３１（１Ｈ，ｄ），７．３８（１Ｈ，ｄ）；ｍ／ｚ：ＥＳ−［Ｍ−Ｈ］−２９７．
【０１２６】
中間体６
２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ酢酸
【化１６】
2018535226.tif 000018
固体水酸化カリウム（５．３８ｇ、９５．８６ミリモル）を、０℃で３−（ジフルオロメトキシ）ベンズアルデヒド（３ｇ、１７．４３ミリモル）、ブロモホルム（１．８２９ｍＬ、２０．９１ミリモル）および無水ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）の撹拌溶液に１時間かけて少しずつ添加した。冷却槽を除去し、反応物を環境温度で撹拌した（強い発熱反応が開始された）。反応物を一晩撹拌放置した。無機固体を濾過除去し、ＭｅＯＨで洗浄した。濾液を真空で小容量に濃縮し、水（１００ｍＬ）で希釈し、Ｅｔ２Ｏで２回洗浄し（２×５０ｍＬ）、３７％ＨＣｌの緩徐な添加によりｐＨ２に酸性化した。混合物を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、粗生成物を得た。粗生成物を０．５％のギ酸を有するヘプタン中酢酸エチル０〜６０％の溶出勾配でのＦＣＣにより精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、２−［３−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−２−メトキシ酢酸（１．７１０ｇ、４２％）をガム状物として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，３０℃）δ  ３．３３（３Ｈ，ｓ），４．８２（１Ｈ，ｓ），７．１６（２Ｈ，ｄｄ），７．２８（１Ｈ，ｄ），７．２３（１Ｈ，ｔ），７．４２−７．４７（１Ｈ，ｍ），１２．９３（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ：ＥＳ−［Ｍ−Ｈ］−２３１．２５．
【０１２７】
中間体７
２−メトキシ−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］酢酸
【化１７】
2018535226.tif 000019
ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中、水酸化カリウム（１．８５１ｇ、３３．００ミリモル）の溶液を、０℃でＭｅＯＨ（５．００ｍＬ）中、３−（トリフルオロメトキシ）ベンズアルデヒド（１．１４１ｇ、６ミリモル）およびブロモホルム（０．６３０ｍＬ、７．２０ミリモル）の撹拌混合物に２時間かけて少しずつ添加した。次に混合物を室温に温めておき、一晩撹拌放置した。白色沈殿物が反応混合物中に形成していた。反応物を一晩静置状態にした。固体を低圧下で濾過し、ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）ですすいだ。濾液溶液を蒸発させて濃厚白色ペーストにし、次に水（５０ｍＬ）に再溶解した。次にこれをＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）で洗浄し、次に水相をｐＨ２に酸性化し（約５ｍＬの２Ｍ  ＨＣｌ溶液）、混濁水層を得た。水相を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）中に抽出した。結合した有機物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次に濾過し、溶媒を低圧下で蒸発させ、無色油を得た。粗生成物を、ヘプタン中酢酸エチル１０〜５０％の溶出勾配でのＦＣＣにより精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、２−メトキシ−２−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］酢酸（０．８３２ｇ、５５％）を無色油として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，３０℃）δ  ３．４７（３Ｈ，ｓ），４．８１（１Ｈ，ｓ），７．２−７．２４（１Ｈ，ｍ），７．３３（１Ｈ，ｓ），７．３７−７．４６（２Ｈ，ｍ）；ｍ／ｚ：ＥＳ−［Ｍ−Ｈ］−２４９．４．
【０１２８】
中間体８
２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）酢酸
【化１８】
2018535226.tif 000020
ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中水酸化カリウム（２．２６７ｇ、４０．４０ミリモル）の溶液を、０℃でＭｅＯＨ（５．００ｍＬ）中、３−メトキシベンズアルデヒド（１ｇ、７．３４ミリモル）およびブロモホルム（０．７７１ｍＬ、８．８１ミリモル）の撹拌混合物に２時間かけて少しずつ添加した。次に混合物を室温に温めておき、一晩撹拌放置した。固体を低圧下で濾過し、固体をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）ですすいだ。濾液を蒸発させて濃厚白色ペーストにし、次に水（５０ｍＬ）に再溶解した。次にこれをＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）で洗浄し、次に水性部分をｐＨ＝２に酸性化した（約５ｍＬの２Ｍ  ＨＣｌ溶液）。次に水相を酢酸エチル（３×、５０ｍＬ）で抽出した。結合した有機物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次に濾過し、溶媒を低圧下で蒸発させ、２−メトキシ−２−（３−メトキシフェニル）酢酸を黄色油として得て（１．４ｇ、９７％）、それをさらに精製せずに用いた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，３０℃）δ  ３．１８（３Ｈ，ｓ），３．７５（３Ｈ，ｓ），４．７４（１Ｈ，ｓ），６．８２−７．０５（３Ｈ，ｍ），７．２９（１Ｈ，ｍ），１２．７８（１Ｈ，ｓ）．
【０１２９】
生物検定
本明細書の化合物の効果を測定するため、以下のアッセイ：ａ）ＧＬＳ酵素効力アッセイ；ｂ）ＧＬＳ細胞効力アッセイ；ｃ）ＧＬＳ細胞増殖アッセイを用いた。アッセイの説明に際して、一般に次のことが言える。
ｉ．以下の略称：ＣＯ２＝二酸化炭素；ＤＭＥＭ＝ダルベッコ変法イーグル培地；ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸；ＥＧＴＡ＝エチレングリコールテトラ酢酸；ＦＣＳ＝  胎児子ウシ血清；ｈ＝時間；ＮＢＳ＝非結合表面；ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム；ＴＲＩＳ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、を用いている。
ｉｉ．ＩＣ５０値を、Ｇｅｎｅｄａｔａにおけるスマートフィッティングモデルを用いて算出した。ＩＣ５０値は、生物学的活性の５０％を阻害する試験化合物の濃度であった。
【０１３０】
アッセイａ）：ＧＬＳ酵素効力アッセイ
化合物がインビトロでＧＬＳ１に結合し、ＧＬＳ１の活性を阻害する能力を測定するため、グルタミン酸オキシダーゼ／ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ共役アッセイを用いた。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で発現される６Ｈｉｓタグ化ＧＬＳタンパク質（アミノ酸６３〜６６９）を精製し、一定分量を−８０℃で貯蔵した。ＧＬＳ１を２×作業濃度に希釈し、室温でインキュベートし、四量体／二量体型が定常状態に達することを可能にした。アッセイ測定は、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．８、０．００１％ｖ／ｖのツイーン２０を含む緩衝液中で実施した。精製した組換えＧＬＳ１タンパク質をアッセイ緩衝液で１２ｎＭに希釈し、室温で３０分間予備インキュベートした。試験化合物を１００％ＤＭＳＯでの希釈により調製し、１２点濃度応答における正確な用量範囲および適切な容量（２．５〜６０ｎｌ）を得て、Ｌａｂｃｙｔｅ  Ｅｃｈｏ  ５５５アコースティックディスペンサーを用いて３８４ウェルマイクロアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒの製品コード７８４９００）に分注した。ＤＭＳＯ濃度を、ＤＭＳＯ溶液の戻し充填により２％で維持した。次に、希釈したＧＬＳ１タンパク質（１２ｎＭ）３μＬを、ＢｉｏＲａｐｔｒ自動ディスペンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて各ウェルに分注し、室温で１５分間インキュベートした。次に、アッセイ緩衝液で希釈した１００ｍＭのグルタミン３μＬを添加し、反応物を室温で６０分間インキュベートした。次に、１００ｍＭトリス（ｐＨ７．５）中、４５μＭの６−（２−ブロモエチニル）−２，３−ジメチル−キナゾリン−４−オン、７５μＭのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、０．３７５単位／ｍＬの西洋わさびペルオキシダーゼ、０．１２単位／ｍＬのグルタミン酸オキシダーゼの添加により反応を停止させた。暗所、室温で３０分後、５３５／５９０ｎｍの光学フィルターを用いてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎでプレートを読み取り、生データをＧｅｎｅｄａｔａを用いて分析し、ＩＣ５０値を得た。また、アッセイ成分に対する非特異的効果を除外するため、６Ｈｉｓタグ化ＧＬＳタンパク質およびグルタミンをアッセイ緩衝液と交換する場合のアッセイのアーチファクトバージョンを用いた。
【０１３１】
アッセイｂ）：ＧＬＳ細胞効力アッセイ
化合物を、細胞のＧＬＳ活性をそれらが阻害する可能性について、細胞のグルタミン酸枯渇を測定するＰＣ３共役アッセイの使用により評価した。試験化合物を１００％ＤＭＳＯでの希釈により調製し、１２点濃度応答における正確な用量範囲および適切な容量（５〜１２０ｎｌ）を得て、Ｌａｂｃｙｔｅ  Ｅｃｈｏ  ５５５アコースティックディスペンサーを用いて３８４ウェルマイクロアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇの製品コード３７１２）に分注した。ＤＭＳＯ濃度を、ＤＭＳＯ溶液の戻し充填により０．３％で維持した。ＰＣ３細胞を、フェノールを含まないＤＭＥＭ、１０％透析ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンで成長させ、トリプシン処理による分散後、分注した化合物を含有する３８４ウェルアッセイプレート内に直接的に増殖培地４０μｌ中、５．６×１０３個の細胞／ウェルで蒔いた。３７℃、５％ＣＯ２で６時間のインキュベーション後、増殖培地を吸引し、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＮａＦ、２０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１％トリトンＸ１００、１０％グリセロール、０．１％ＳＤＳおよび０．５％デオキシコール酸塩を含有する緩衝液１５μｌに細胞を溶解した。次に、細胞可溶化物４μｌを３８４ウェルＮＢＳプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇの製品コード３５７５）に移し、３５μｌの２７．５μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、０．１３７５Ｕ／ｍＬの西洋わさびペルオキシダーゼ、０．０４４Ｕ／ｍＬのグルタミン酸オキシダーゼ、１００ｍＭトリス（ｐＨ７．５）を添加した。暗所、室温で３０分後、５３５／５９０ｎｍの光学フィルターを用いてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎでプレートを読み取り、生データを専売ソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ５０値を得た。
【０１３２】
アッセイｃ）：ＧＬＳ細胞増殖アッセイ
化合物が細胞成長を阻害する能力を、３８４ウェルプレートＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞増殖アッセイを用いて測定した。ＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンで成長させ、クリアボトム３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇの製品コード３７１２）内に増殖培地４０μｌ中、７５０細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。試験化合物を１００％ＤＭＳＯでの希釈により調製し、１２点濃度応答における正確な用量範囲および適切な容量（５〜１２０ｎｌ）を得て、蒔いた細胞を含有するアッセイプレート内に直接的に分注した。ＤＭＳＯ濃度を、ＤＭＳＯ溶液の戻し充填により０．３％で維持した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートし、Ｓｙｔｏｘグリーンおよびサポニンを各最終濃度が２μＭおよび０．２５％になるまで添加し、分析前に６時間インキュベートした。４８８ｎｍの励起および放射用のＦＩＴＣフィルターセット（５００〜５３０ｎｍ）を用いてＡｃｕｍｅｎ  ｅＸ３（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ）でプレートを読み取った。ＩＣ５０値を、ＧｅｎｅＤａｔａソフトウェア分析を用いて、０日目成長の最大阻害に対するカーブフィッティングを行うことにより算出した。
【０１３３】
アッセイａ）〜ｃ）における本発明の実施例の効力を表１に示す。結果は、複数の試験の平均であってもよく、異なる実施例は、様々な数の試験で試験していてもよい。結果は、特定の数の小数位に丸める。
【０１３４】
【表１】
2018535226.tif 000021
【国際調査報告】
2018535226.tif 000024
2018535226.tif 000025