(57)【要約】  本発明は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に関連する状態、及び特に、ウィルソン病の処置に使用するための、ＡＴＰ７Ｂ変異体を含む核酸構築物及び遺伝子治療ベクターに関する。本発明に従って発明されたＡＡＶベクターは、このベクターで処置されたウィルソン病マウスにおける尿中Ｃｕ排泄及び肝臓Ｃｕ含量を顕著に減少させた。一方で、セルロプラスミン活性は、顕著に回復された。一方、ベクターの投与により、炎症性浸潤の顕著な減少を伴って、血清トランスアミナーゼレベル及び肝臓の組織学の正常化がもたらされた。
2018500904.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）真核生物プロモータのヌクレオチド配列と、
ｂ）Ｎ末端重金属結合部位ＨＭＡ１、ＨＭＡ２、ＨＭＡ３、及びＨＭＡ４が完全に欠失されており、ＨＭＡ５及びＨＭＡ６が欠失していないままである、トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列と、
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列と
を含む、核酸構築物。
【請求項２】
トランケートされたＡＴＰ７Ｂにおける欠失が、配列番号：２の配列のアミノ酸５７〜４８６を含む、請求項１記載の核酸構築物。
【請求項３】
トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２のアミノ酸配列が、配列番号：７である、請求項１又は２記載の核酸構築物。
【請求項４】
トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号：６のコード配列ＣＤＳ、塩基４７３．．３５８０、
ｂ）配列番号：８の配列、及び
ｃ）トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードする、少なくとも８２７、少なくとも８７９、少なくとも９３１、又は少なくとも９８３のコドンが、配列番号：８のコード配列のコドンと同一である配列からなる群より選択される、請求項３記載の核酸構築物。
【請求項５】
真核生物プロモータのヌクレオチド配列が、α１−アンチトリプシン遺伝子プロモータのヌクレオチド配列、又は、アルブミン遺伝子エンハンサーエレメントと組み合わせられたα１−アンチトリプシン遺伝子プロモータ配列を含むキメラプロモータ配列である、請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸構築物。
【請求項６】
真核生物プロモータのヌクレオチド配列が、配列番号：１（ＡＡＴ）の塩基１５６．．４６０又は配列番号：５（ＥａｌｂＰａ１ＡＴ）により範囲設定された配列である、請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸構築物。
【請求項７】
構築物が、ウイルスの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の核酸構築物。
【請求項８】
５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のものである、請求項７記載の核酸構築物。
【請求項９】
ＡＡＶの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及びＡＡＶ４からなる群より選択される血清型のものであり、好ましくは、ＡＡＶ２血清型のものである、請求項８記載の核酸構築物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸構築物を含む、発現ベクター。
【請求項１１】
ベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸構築物、又は、請求項１０もしくは１１記載の発現ベクターを含む、ホスト細胞。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸構築物、又は、請求項１０もしくは１１記載の発現ベクターを含む、ウイルス粒子。
【請求項１４】
ウイルス粒子が、ＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、請求項１３記載のウイルス粒子。
【請求項１５】
ウイルス粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０からなる群より選択される血清型、好ましくは、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９の血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、請求項１２記載のウイルス粒子。
【請求項１６】
核酸構築物の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２血清型のものであり、カプシドタンパク質が、ＡＡＶ８血清型のものである、請求項１５記載のウイルス粒子。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１０もしくは１１記載の発現ベクター、請求項１２記載のホスト細胞、又は請求項１３〜１６のいずれか一項記載のウイルス粒子と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１０もしくは１１記載の発現ベクター、請求項１２記載のホスト細胞、もしくは請求項１３〜１６のいずれか一項記載のウイルス粒子、又は請求項１７記載の医薬組成物を、１つ以上の容器に含み、場合により、核酸構築物、ベクター、ホスト細胞、ウイルス粒子、又は医薬組成物を患者に投与する方法を説明する説明書又は包装材を更に含む、キット。
【請求項１９】
医薬として使用するための、請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１０もしくは１１記載の発現ベクター、請求項１２記載のホスト細胞、又は請求項１３〜１６のいずれか一項記載のウイルス粒子。
【請求項２０】
銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、好ましくは、ウィルソン病の処置に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１０もしくは１１記載の発現ベクター、請求項１２記載のホスト細胞、もしくは請求項１３〜１６のいずれか一項記載のウイルス粒子、又は請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項２１】
銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、好ましくは、ウィルソン病の処置に使用するための医薬の調製における、請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１０もしくは１１記載の発現ベクター、請求項１２記載のホスト細胞、又は請求項１３〜１６のいずれか一項記載のウイルス粒子の使用。
【請求項２２】
患者における銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、好ましくは、ウィルソン病の処置のための方法であって、
治療的に有効な量の、請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項１０もしくは１１記載の発現ベクター、請求項１２記載のホスト細胞、請求項１３〜１６のいずれか一項記載のウイルス粒子、又は請求項１７記載の医薬組成物を、患者に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
ａ）請求項１２記載のホスト細胞を培養培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞培養上清及び／又は細胞内からウイルス粒子を収集する工程とを含む、
請求項１３〜１６のいずれか一項記載のウイルス粒子を製造する方法。
【請求項２４】
ウイルス粒子を製造するための、請求項１〜９のいずれか一項記載の核酸構築物、又は、請求項１０もしくは１１記載の発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルソン病及び他の状態の処置に使用するための核酸構築物及び遺伝子治療ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルソン病の遺伝子治療に関する技術水準は、Merle et al.（Current Gene Therapy 2007; 7: 217-220）にレビューされており、そこで概説されており、その後に開示された参考文献と共に完成されている。
【０００３】
ウィルソン病（ＷＤ）は、平均有病率１：３０，０００の、銅代謝の常染色体性劣性遺伝障害である。ＷＤは、Ｐ型銅輸送ＡＴＰａｓｅをコードするＡＴＰ７Ｂ遺伝子の変異により生じる。同ＡＴＰ７Ｂ遺伝子は、１３番染色体に位置している。ＡＴＰ７Ｂは、肝細胞において主に発現され、銅の膜透過輸送において機能する。ＡＴＰ７Ｂタンパク質の機能欠如又は同機能の低下により、銅の胆汁への低下した肝細胞排泄がもたらされる結果、主に肝臓に銅蓄積がもたらされ、その後、神経系及び他の組織に蓄積がもたらされる。銅をセルロプラスミンに包含させるのを失敗することは、機能的なＡＴＰ７Ｂタンパク質の損失の更なる結果である。
【０００４】
ＷＤは、肝臓疾患として、進行性の神経障害として、又は精神疾患として、臨床的に表れ得る。肝臓ＷＤを患う患者は、通常、小児期後期又は青年期に表れ、急性肝炎、劇症型肝不全、又は進行性慢性肝疾患の特徴を示す。ＷＤの神経兆候は、典型的には、肝疾患より遅く、典型的には、２０代又は３０代に表れ、錐体外路、小脳、及び大脳関連兆候を含む。
【０００５】
ＷＤの医療処置の目的は、銅の毒性堆積物を身体から除去し、その再蓄積を予防することである。３つの抗銅薬剤：Ｄ−ペニシラミン、トリエンチン、及び亜鉛塩が、ＷＤについて現在認可されている。医学療法は、総じて有効であるが、ＷＤを患う全ての患者に有効であるとは限らない。肝臓移植は、劇症型肝不全又は進行性肝不全を表わしているＷＤ患者の治療選択肢である。肝臓移植は、ＷＤの表現型を修正するのが示されており、優れた長期生存を提供する。
【０００６】
しかしながら、治療の中断又は不適切な処置により、数か月以内に死に至るおそれがある。ＷＤの薬物治療は定期的に行われる必要があるため、一部の患者、特に、青年期のＷＤ患者における処置に対するアドヒアランスは乏しい。
【０００７】
治療下において、神経兆候が残るのが、比較的普通であり、進行性兆候も生じるおそれがある。現在の医療処置の選択肢は、ＷＤ患者の全てに有効なわけではなく、治療へのアドヒアランスの問題があるため、より包括的な解決策には、遺伝子治療を必要とする場合がある。
【０００８】
理論的には、肝細胞中での野生型ＡＴＰ７Ｂの発現は、全ての疾患に関連する異常を逆転させ、肝臓及び神経の兆候を救済するであろう。ＷＤに理想的な遺伝子治療の究極の目的は、ＡＴＰ７Ｂを十分な量で、生存している間に肝細胞に特異的に送達することであろう。
【０００９】
ＷＤについてのアデノウイルス遺伝子導入の全ての公表された研究は、一過性の導入遺伝子発現のみを生じる、初期世代のアデノウイルスベクターを使用している。Terada et al.［Terada et al. J. Biol. Chem. 1998; 273:1815-1820；Terada et al. FEBS Lett. 1999; 448: 53-56］には、ＬＥＣラットモデルにおけるアデノウイルス媒介性遺伝子送達による遺伝子導入の成功が示されている。ホロセルロプラスミン合成の回復、血清セルロプラスミンオキシダーゼ活性の回復、及び胆汁への銅排泄の回復が示された。これらは、遺伝子導入の治療的効果を示す。これらの効果は、非常に限られた期間のものであり、３日目に最大レベルとなり、その後低下した。Ha-Hao et al.［Z. Gastroenterol. 2002; 40: 209-216］にも、アデノウイルス媒介性ＡＴＰ７Ｂ遺伝子導入後に、ＬＥＣラットの糞中の銅含量の増大が示された。これは、胆汁への銅排泄の増大を示す。加えて、治療効果は、ホロセルロプラスミン及びそのフェロオキシダーゼ活性の回復により示された。しかしながら、再度、これらの実験における治療効果の持続性は、数日の限られた期間での一過性でしかなかった。
【００１０】
ガットレスアデノウイルスベクターは、従来、この用途には試験されてこなかった。
【００１１】
他の一般的に使用される非組込み型ウイルスベクター系であるアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）も、従来、ＷＤに試験されてこなかった。主には、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子（約４．４kbの大きさ）により、ＡＡＶベクター内に、必要な配列（例えば、プロモータ、ポリＡシグナル配列等）の残り部分を割り当てるための最小空間しか残らないためである。同ＡＡＶベクターのパッケージング能は、４．４〜４．７kbである。ドイツ国特許出願公開公報第１００１５６１２１号（２００３年に公開）では、短縮された金属感受性プロモータ（メタロチオネイン−Ｉプロモータ）を有し、ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子の銅又は亜鉛誘導性発現を生じる、ＷＤの遺伝子治療用のリコンビナントアデノ関連ウイルスベクターが提案された。それにも関わらず、この文献では、治療効率及びベクターの性能に関する情報が何ら提供されておらず、その後に開示されてもいない。
【００１２】
一方、野生型ＡＴＰ７Ｂを有する複数のレンチウイルスベクターが、ＷＤの動物モデルに試験されている。Merle et al.［Scan. J. Gastroenterol. 2006; 41: 974-982］により、ホスホグリセロキナーゼプロモータの制御下においてＡＴＰ７Ｂを発現しているレンチウイルスベクターによるＬＥＣラットにおける全身性遺伝子治療が報告された。遺伝子導入後２４週間で、未処置対照と比較して、処置ラットにおいて、肝臓銅含量が、顕著に低下し、肝臓の組織学が改善したが、その効果は、部分的でしかなかった。血清セルロプラスミンオキシダーゼ活性は、対照と比較して、遺伝子導入後２週間で増大した。しかしながら、処置後２４週間で、より低いレベルに低下した。ごく最近、Roybal et al.［Gene Therapy 2012; 19: 1085-1094］により、アポリポタンパク質Ｅ及びアルファ−１アンチトリプシンのエレメントを含有した肝臓特異的プロモータの転写制御下においてヒトＡＴＰ７Ｂを有するレンチウイルスによるＡＴＰ７Ｂ−／−マウスにおける妊娠初期遺伝子導入が報告されている。子宮へのベクター投与により、肝臓銅レベルの低下、正常な肝臓組織学の維持、セルロプラスミンへの銅取込みの回復、及び改善されたコレステロール生合成が提供された。しかしながら、処置の効率は、マウス間で非常に変動があり、時間と共に低下し、種々の病的に変化したパラメータの完全な修正を達成できなかった。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、種々のトランケート型の酵素ＡＴＰ７Ｂをコードする導入遺伝子を有する複数のウイルスベクター：例えば、ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）［ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１］をコードするベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）、及び、ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２］をコードするベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）を操作し、試験してきた。ＡＴＰ７Ｂノックアウトマウス（ウィルソン病の認識された動物モデル）に投与された場合、ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２を有するＡＡＶベクターにより、処置後少なくとも２４週間、主なウィルソン病の病的な特徴が修正された。一方、ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１を有するＡＡＶベクターは、部分的な効果のみを有した。Ｃｕ排泄（Ｃｕ尿中含量）及び肝臓Ｃｕ含量は、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）ベクターで処置されたウィルソン病マウスにおいて、顕著に低下し、セルロプラスミン活性は、顕著に回復した。一方、このベクターの投与により、血清トランスアミナーゼレベル及び肝臓の組織学の回復がもたらされ、これらと共に、炎症性浸潤、胆管増生及び線維症の顕著な減少がもたらされた。
【００１４】
さらに、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂベクターの１×１０１０vg/マウス用量が、血清セルロプラスミン活性の正常化及び肝臓におけるＣｕ蓄積の減少の両方を得るための、ｗｔ構築物についての「最適以下用量」であることが示された（図１０Ａ及び図１１Ａ）。一方、トランケート型を有するベクターは、前記最適以下用量において、統計学的に有意な治療効果（対非処置）を提供するのが示された（図１０Ｂ及び図１１Ｂ）。さらに、１×１０１０vg/マウス用量において、全長ＡＴＰ７ＢとＴ２構築物との間の活性に観察された差異も、これら２つの治療効果について、統計学的に有意であることが示された（図１２及び図１４）。
【００１５】
これらの観察から、トランケート型ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）をコードする核酸構築物及びそれを有するベクター、特に、ＡＡＶベクターは、ＡＴＰ７Ｂの欠損又は機能不全に関連する銅の蓄積の最も関連する病的な影響を克服することができるため、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態、例えば、ウィルソン病、又は、ＡＴＰ７Ｂ依存性リソソームエキソサイトーシスの低下及び銅蓄積に関連する疾患及び／もしくは状態に適用される遺伝子治療に非常に適し得ることが示された。さらに、予期しなかったことに、トランケート型ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）及びそれを有するベクターは、全長ＡＴＰ７Ｂタンパク質及びそれをコードするベクターがほとんど効果的でないと証明された用量において、疾患のこれらの病的な兆候の一部の正常化を達成するのが示された。
【００１６】
したがって、第１の態様では、本発明は、ａ）真核生物プロモータのヌクレオチド配列と、ｂ）Ｎ末端重金属結合部位ＨＭＡ１、ＨＭＡ２、ＨＭＡ３、及びＨＭＡ４が完全に欠失されており、ＨＭＡ５及びＨＭＡ６が欠失していないままである、トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードするヌクレオチド配列と、ｃ）ポリアデニル化シグナル配列とを含む、核酸構築物（以下、「本発明の核酸構築物」とも呼ばれる）に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸構築物を含む、発現ベクター（以下、「本発明の発現ベクター」とも呼ばれる）に関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含む、ホスト細胞に関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含む、ウイルス粒子（以下、「本発明のウイルス粒子」とも呼ばれる）に関する。好ましくは、核酸構築物は、ウイルスベクターのゲノム配列を構成している。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本発明の製品、すなわち、本発明の核酸構築物を含む製品と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物に関する。本明細書で使用する場合、「本発明の製品」という用語は、ａ）本発明の核酸構築物、ｂ）本発明の発現ベクター、ｃ）本発明のホスト細胞、及びｄ）本発明のウイルス粒子のいずれかを意味し、区別なく包含する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、更に、本発明の核酸構築物、ベクター、ホスト細胞、ウイルス粒子、又は医薬組成物を、１つ以上の容器に含む、キットに関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、医薬に使用するための（医薬又は医薬組成物としての）、本発明の製品に関する。医薬におけるこの使用は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置を含む。すなわち、本発明は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置に使用するための医薬の調製における、本発明の製品の使用、及び、対象又は患者における銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置のための方法に関する。同方法は、対象又は患者に、治療的に有効な量の本発明の製品を投与することを含む。より特定の態様では、本発明の製品は、ウィルソン病の処置に使用される。
【００２３】
別の態様では、本発明は、更に、本明細書で記載された医薬及び治療方法において提案された使用のための、上記された本発明の製品を含む、医薬組成物に関する。
【００２４】
更なる態様では、本発明は、
ａ）本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含有するホスト細胞を培養培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞培養上清及び／又は細胞内からウイルス粒子を収集する工程とを含む、
本発明のウイルス粒子を製造する方法に関する。
【００２５】
関連する態様では、本発明は、ウイルス粒子の製造のための、本発明の核酸構築物又は本発明の発現ベクターの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１：ヒトＡＴＰ７Ｂを有するベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ；トランケート型ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）［ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１］を有するベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）；及びトランケートされたＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２］を有するベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）の核酸構築物の概略図。構築物のエレメントは、ａ）アルファ−１−アンチトリプシン遺伝子プロモータ（ＡＡＴ）；ｂ）ヒトＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１、又はＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２をそれぞれコードするヌクレオチド配列；ｃ）ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）と隣接するベクターゲノムと、ｄ）ＡＡＶ２の末端逆位配列（ＩＴＲ）とである。
【図２】図２：野生型のオスマウス［ＷＴ］、ＡＴＰ７Ｂ欠損のオスマウス［ウィルソン病マウス、ＷＤ］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ  ＡＡＶ−ＡＴＰ７Ｂ］、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）［ＷＤ  ＡＡＶ−Ｔ１］；又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＡＶ−Ｔ２］で処置されたＷＤオスマウスにおける血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベル。ベクター用量３×１０１０vg/マウスを、動物が６週齢になった時点で投与した。ＡＬＴレベルを、処置後４、９、１４、及び２４週間［週数］で測定し、IU/L（IU：国際単位）として表現する。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図３】図３：野生型のオスマウス［ＷＴ］、ウィルソン病のオスマウス［ＷＤ］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ  ＡＡＶ−ＡＴＰ７Ｂ］、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）［ＷＤ  ＡＡＶ−Ｔ１］；又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２］で処置されたＷＤオスマウスにおける尿中総銅含量。ベクター用量：３×１０１０vg/マウス。銅含量を、処置後４、９、１４、及び２４週間［週数］での２４時間の尿で測定し、Ｃｕのナノグラムとして表現した（ngr/24h）。
【図４】図４：野生型のオスマウス［ＷＴ］、ウィルソン病のオスマウス［ＷＤ］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ  ＡＡＶ−ＡＴＰ７Ｂ］、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）［ＷＤ  ＡＡＶ−Ｔ１］；又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２］で処置されたＷＤオスマウスにおける血清セルロプラスミン活性。ベクター用量：３×１０１０vg/マウス。セルロプラスミン活性を、処置後４週間で測定し、波長５７０nmで測定した吸光度［Ａｂｓ（５７０nm）］として表現した。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図５】図５．野生型のオスマウス［ＷＴ］、ウィルソン病のオスマウス［ＷＤ］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ  ＡＡＶ−ＡＴＰ７Ｂ］、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）［ＷＤ  ＡＡＶ−Ｔ１］；又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２］で処置されたＷＤオスマウスにおける肝臓Ｃｕ含量。ベクター用量：３×１０１０vg/マウス。銅含量を、処置後２４週間で動物を殺処分した後に、原子吸光分光法により決定し、μg/gとして表現した（Ｃｕμg/乾燥肝臓組織g）。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図６】図６：野生型動物のオスマウス［ＷＴ］、ウィルソン病のオスマウス［ＷＤ］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ  ＡＡＶ−ＡＴＰ７Ｂ］、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）［ＷＤ  ＡＡＶ−Ｔ１］；又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２］で処置されたＷＤオスマウスの肝臓の組織学画像。ベクター用量：３×１０１０vg/マウス。画像を、動物（３０週齢）を殺処分した後に撮影した。Ａ：ヘマトキシリン及びエオシンで染色された肝臓断片の画像。Ｂ：銅の堆積を検出するためのＴｉｍｍ’ｓ硫化銀技術により染色された組織学サンプルの画像。
【図７】図７：肝臓の炎症、胆管増生、及び線維症の分析。野生型のオスマウス［ＷＴ］、ウィルソン病のオスマウス［ＷＤ］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ  ＡＡＶ−ＡＴＰ７Ｂ］、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）［ＷＤ  ＡＡＶ−Ｔ１］；又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２］で処置されたＷＤオスマウスの肝臓の画像。ベクター用量：３×１０１０vg/マウス。分析を、動物（３０週齢）を殺処分した後に行った。ＣＤ４５：肝臓の炎症性浸潤を検出するために抗ＣＤ４５で免疫染色された肝臓断片の画像。ＰＡＮＣＫ：胆管増生を検出するために抗ＰＡＮＣＫで免疫染色された肝臓断片の画像。ＳＲ：線維症を検出するためにSirius redで染色された肝臓断片の画像。
【図８】図８：野生型のメスマウス［ＷＴ］、ＷＤメスマウス［ＷＤ］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＡＶ−Ｔ２］で処置されたＷＤメスマウスにおける血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベル。種々の群の６週齢のＷＤメスマウスに、種々の用量のベクター（それぞれ、１×１０１０、３×１０１０、１×１０１１vg/マウス）を投与した。ＡＬＴレベルを、処置後４、９、１４、及び２４週間［週数］で測定し、IU/Lとして表現する。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図９】図９：野生型のメスマウス［ＷＴ］、ＷＤメスマウス［ＷＤ］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＡＶ−Ｔ２］で処置されたＷＤメスマウスにおける尿中Ｃｕ含量レベル。種々の群の６週齢のＷＤメスマウスに、種々の用量のベクター（それぞれ、１×１０１０、３×１０１０、１×１０１１vg/マウス）を投与した。尿中銅レベルを、処置後４、９、１４、及び２４週間［週数］で測定し、２４時間の尿中のＣｕのngr（ngr/24h）として表現する。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図１０】図１０：血清中のセルロプラスミン活性を、野生型のメスマウス［ＷＴ］、ＷＤメスマウス［ＷＤ］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ＋ＡＡＶ−Ｔ２］又はベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ＋ＡＡＶ−ＡＴＰ７Ｂ］で処置されたＷＤメスマウスにおいて測定した。各実験群について、種々の群の６週齢のＷＤメスマウスに、種々の用量のベクター（それぞれ、１×１０１０、３×１０１０、１×１０１１vg/マウス）を投与した。セルロプラスミン活性を、処置後４週間で測定し、波長５７０nmで測定した吸光度［Ａｂｓ（５７０nm）］として表現する。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図１１】図１１：肝臓Ｃｕ含量を、野生型のメスマウス［ＷＴ］、ＷＤマウス［ＷＤ］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ  ＡＡＶ  ＡＴＰ７Ｂ］又はベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＡＶ  Ｔ２］で処置されたＷＤメスマウスにおいて測定した。各実験群について、種々の群の６週齢のＷＤメスマウスに、種々の用量のベクター（それぞれ、１×１０１０、３×１０１０、１×１０１１vg/マウス）を投与した。銅濃度を、処置後２４週間で測定し、μg/乾燥組織gとして表現する。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図１２】図１２：野生型のオスマウス［ＷＴ；ｎ＝１５］、ＷＤオスマウス［ＷＤ；ｎ＝２５］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ  ＡＡＶ  ＡＴＰ７Ｂ；ｎ＝７］又はベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＡＶ  Ｔ２；ｎ＝７］で処置されたＷＤオスマウスにおける肝臓Ｃｕ含量。各実験群について、動物が６週齢になった時点で、ＷＤマウスに、最適以下用量（１×１０１０vg/マウス）のベクターを投与した。銅濃度を、処置後２４週間で測定し、μg/乾燥組織gとして表現する。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図１３】図１３：野生型のオスマウス［ＷＴ；ｎ＝１５］、ＷＤオスマウス［ＷＤ；ｎ＝２５］、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＡＶ  Ｔ２；ｎ＝１３］又はベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＡＶ  ｃｏＴ２；ｎ＝４］で処置されたＷＤオスマウスにおける肝臓Ｃｕ含量。各実験群について、６週齢のＷＤオスマウスに、最適以下用量（１×１０１０vg/マウス）のベクターを投与した。銅濃度を、処置後２４週間で測定し、μg/乾燥組織gとして表現する。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図１４】図１４：野生型のオスマウス［ＷＴ；ｎ＝１５］、ＷＤオスマウス［ＷＤ；ｎ＝２５］、ならびに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ  ＡＡＶ  ＡＴＰ７Ｂ；ｎ＝１０］、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ［ＷＤ  ＡＡＶ  ｃｏＡＴＰ７Ｂ；ｎ＝８］、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＡＶ  Ｔ２；ｎ＝１３］、及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＷＤ  ＡＡＶ  ｃｏＴ２；ｎ＝４］で処置されたＷＤオスマウス群の血清中のセルロプラスミン活性。各実験群について、６週齢のＷＤオスマウスに、最適以下用量（１×１０１０vg/マウス）のベクターを投与した。セルロプラスミンのオキシダーゼ活性を、処置後４週間で測定し、波長５７０nmで測定した吸光度［Ａｂｓ（５７０nm）］として表現する。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【００２７】
［発明の詳細な説明］
本明細書で使用する場合、本願における全ての用語は、特に断りない限り、当技術分野において公知のその通常の意味を有すると理解されたい。本願に使用される特定の用語についての他のより特別な定義は、以下で説明された通りであり、他の方法で明確に述べられた定義がより広い定義を提供しない限り、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して一様に適用することを意図している。
【００２８】
「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」という用語は、単量体ヌクレオチドから構成されるか、又は、同ヌクレオチドを含む任意の分子を意味するのに、互換的に使用することができる。核酸は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであることができる。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。ヌクレオチド配列は、化学的に修飾され、又は、人工的であることができる。ヌクレオチド配列は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む。これらの配列はそれぞれ、天然のＤＮＡ又はＲＮＡとは、分子の骨格に対する変化により区別される。また、ホスホロチオアートヌクレオチドも使用することができる。他のデオキシヌクレオチド類似物は、メチルホスホナート、ホスホラミダート、ホスホロジチオアート、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホラミダート、ならびにオリゴリボヌクレオチドホスホロチオアート及びその２’−０−アリル類似物及び２’−０−メチルリボヌクレオチドメチルホスホナートを含む。これらは、本発明のヌクレオチドに使用することができる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「核酸構築物」という用語は、リコンビナントＤＮＡ技術の使用により生じる人工の核酸分子を意味する。核酸構築物は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子であり、他の方法で天然には存在しないであろう方法において組み合わせられ、並べられた核酸配列のセグメントを含有するように修飾されている。核酸構築物は、通常、「ベクター」、すなわち、外因的に作製されたＤＮＡをホスト細胞内に送達するのに使用される核酸分子である。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「発現ベクター」又は「ベクター」という用語は、このような配列に適合したホスト細胞又はホスト生物中で遺伝子（導入遺伝子）を発現させることができる、リコンビナントヌクレオチド配列を意味する。導入遺伝子と共に、発現ベクターは、典型的には、少なくとも適切な転写レギュラトリー配列を含み、場合により、３’転写終了シグナルを含む。発現を達成するのに必須であるか、又は、同達成に有用な更なる因子、例えば、的確な誘導性シグナル（外因性又はキメラ転写因子）に応答可能であるか、又は、特定の細胞、臓器、もしくは組織に特異的な発現エンハンサーエレメントも存在することができる。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「対象」又は「患者」という用語は、哺乳類を意味する。開示された処置方法により利益を得ることができる哺乳類種は、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、類人猿；チンパンジー；サル、及びオランウータン、飼育動物（イヌ及びネコを含む）、ならびに家畜、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヤギ、又は、他のほ乳類種（マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターを含むが、これらに限定されない）等を含むが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「パッケージング細胞」という用語は、ヘルパーベクターもしくはウイルス又はＤＮＡ構築物によりトランスフェクションすることができる細胞又は細胞株を意味し、ウイルスベクターの完全な複製及びパッケージングに必要な失われた機能を全てトランスに提供する。典型的には、パッケージング細胞は、構成的又は誘導性の方法において、１つ以上の前記失われたウイルス機能を発現する。
【００３３】
本発明の核酸構築物
真核生物プロモータのヌクレオチド配列
本明細書で使用する場合、「真核生物プロモータ」という用語は、真核生物細胞における、特定の遺伝子又は１つ以上のコード配列の転写を開始するＤＮＡ配列領域を意味する。プロモータは、遺伝子又はコード配列の転写レベルを指示するために、他のレギュラトリー領域又はエレメントと共同して作用することができる。これらのレギュラトリーエレメントは、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータタンパク質結合部位、ならびに、プロモータからの転写量をレギュレーションするのに直接的又は間接的に作用することが当業者に公知の任意の他のヌクレオチド配列（例えば、アテニュエータ、エンハンサ、及びサイレンサを含む）を含むが、これらに限定されない。プロモータは、同じ鎖上のＤＮＡ配列上流（センス鎖の５’領域に向かう）に操作可能に連結された遺伝子又はコード配列の転写開始部位近くに位置している。プロモータは、長さが約１００〜１０００塩基対であることができる。プロモータにおける位置は、特定の遺伝子についての転写開始部位に対して指定される（すなわち、位置上流は、−１から逆に数える負の数字であり、例えば、−１００は、１００塩基対上流の位置である）。
【００３４】
「コアプロモータ」又は「ミニマルプロモータ」という用語は、転写を適切に開始するのに必要なプロモータ配列の最小部分を意味する。コアプロモータ又はミニマルプロモータは、直接上流の転写開始部位（ＴＳＳ）及びエレメント；ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）に対する結合部位、及び一般的な転写因子結合部位を含む。一般的に、プロモータは、他の一次レギュラトリーエレメント（例えば、エンハンサ、サイレンサ、バウンダリーエレメント／インシュレータ）を含有する近位プロモータ配列（コアプロモータの上流）、及び、更なるレギュラトリーエレメントを含有する場合があり、通常、遺伝子の転写レベルに、より弱い影響を有する遠位プロモータ配列（コアプロモータの下流）も含む。
【００３５】
本発明によれば、真核生物プロモータの配列は、トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される。本明細書で使用する場合、「操作可能に連結され」という用語は、機能的な関係における、ポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメントの連結を意味する。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係にある場合に、「操作可能に連結され」ている。例えば、プロモータ又は転写レギュラトリー配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に操作可能に連結されている。操作可能に連結され、は、連結されているＤＮＡ配列が典型的には連続的であることを意味する。この場合、２つのタンパク質コード領域を連結させる必要がある。それらは連続的であり、リーディングフレーム内にある。
【００３６】
本発明によれば、本核酸構築物の真核生物プロモータ配列は、コアプロモータを少なくとも含み、場合により、同じ遺伝子又は異なる遺伝子の他のレギュラトリー領域又はエレメントを含む（すなわち、ハイブリッド又はキメラプロモータ）。
【００３７】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、真核生物プロモータは、構成的プロモータ、組織特異的プロモータ、又は誘導性プロモータである。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「構成的」プロモータは、大部分の生理学的及び発達条件下において、大部分の真核生物組織中で活性なプロモータである。
【００３９】
「組織特異的プロモータ」は、特定種の組織又は細胞においてのみ活性なプロモータである。すなわち、本発明の文脈において、組織特異的プロモータは、他の組織においてより、１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、又は４つ）の特定の組織において活性なプロモータである（すなわち、このプロモータは、それに操作可能に連結しているコード配列を他のものより特異的な組織においてより高く発現させることができる）。典型的には、「組織特異的」プロモータの下流の遺伝子は、プロモータが任意の他の組織においてより特異的である組織において、非常に高い度合いに活性である。この場合、プロモータが特異的である組織以外の任意の組織において、プロモータの活性がほとんどない、又は、同活性が実質的にないことができる。
【００４０】
「誘導性」プロモータは、例えば、化学誘導剤の適用により、生理学的に又は発達的にレギュレーションされるプロモータである。
【００４１】
多くのプロモータが、当技術分野において公知である［Sambrook and Russell (Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Third Edition; 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press)；及びGreen and Sambrook (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, cuarta edicion, 2012 Cold Spring Harbor Laboratory Press)］。
【００４２】
適切な組織特異的プロモータは、the Tissue-Specific Promoter Database, TiProD（Nucleic Acids Research 2006; J4: D104-D107）に見出すことができる。
【００４３】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、真核生物プロモータは、肝臓特異的プロモータである。本発明の文脈において、「肝臓特異的プロモータ」は、身体の任意の他の組織におけるより、肝臓において活性なプロモータである。典型的には、肝臓特異的プロモータの活性は、他の組織におけるより肝臓において相当高いであろう。例えば、このようなプロモータは、（例えば、他の細胞又は組織において発現させるその能力との比較において、所定の組織において発現させるその能力により決定した場合）少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、より活性であることができる。したがって、肝臓特異的プロモータは、それに連結している遺伝子の肝臓における活発な発現を可能にし、他の細胞又は組織におけるその発現を防止する。
【００４４】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、真核生物プロモータは、α１−アンチトリプシン遺伝子プロモータ（ＡＡＴ）のヌクレオチド配列又は、アルブミン遺伝子エンハンサエレメント（Ｅａｌｂ）と組み合わせられたα１−アンチトリプシン遺伝子プロモータ配列（ＡＡＴもしくはＰａｌＡＴ）を含むキメラプロモータ配列ＥａｌｂＰａ１ＡＴである。両プロモータ配列は、肝臓特異的プロモータの特性を有する。
【００４５】
特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、真核生物プロモータ配列は、配列番号：１（ＡＡＴ）の塩基１５６．．４６０；又は配列番号：５（ＥａｌｂＰａ１ＡＴ）により範囲設定された配列である。
【００４６】
トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）
銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）は、銅を細胞外に排出するのに機能するＰ型カチオン輸送ＡＴＰａｓｅである。
【００４７】
ヒト酵素をコードする遺伝子は、１３番染色体に位置している（染色体位置１３ｑ１４．３；遺伝子名ＡＴＰ７Ｂ）。ヒトＡＴＰ７Ｂポリペプチドの情報（アミノ酸配列、構造、ドメイン、及び他の特徴）は、例えば、Uniprotにおいて、アクセッションナンバー：Ｐ３５６７０（http://www.uniprot.org/uniprot/P35670；エントリーバージョン１６８（２０１４年９月３日）、配列バージョン４（２００９年６月１６日））で利用可能である。この酵素をコードするＡＴＰ７Ｂ遺伝子の情報は、Entrezにおいて、アクセッションナンバー遺伝子ＩＤ：５４０（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/540；２０１４年９月１９日に更新）で利用可能である。選択的スプライシングにより生成される４つのアイソフォームが、ＡＴＰ７Ｂについて記載されている。アイソフォーム１（識別子Ｐ３５６７０−１、１４６５個のアミノ酸長）が、正準配列として選択される。
【００４８】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の核酸構築物は、トランケート型のヒトＡＴＰ７Ｂ、好ましくは、アミノ酸配列が正準配列（配列番号：２）であるヒトＡＴＰ７Ｂ（本明細書において、ｗｔＡＴＰ７Ｂとも呼ばれる）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
複数の保存されたモチーフが、Ｐ型ＡＴＰａｓｅタンパク質ファミリーに特徴的なＡＴＰ７Ｂに存在する。これらのモチーフは、ＡＴＰ触媒に必要であり、ヌクレオチド結合ドメイン（Ｎ−ドメイン）、リン酸化ドメイン（Ｐ−ドメイン）、及びアクチュエータドメイン（Ａ−ドメイン）を含む。高度に保存されたシグネチャー残基：Ｎ−ドメインにおけるＳＥＨＰＬ、Ｐ−ドメインにおけるＤＫＴＧ、及びＡ−ドメインにおけるＴＧＥが、これらのモチーフに存在する。ヒトＡＴＰ７Ｂのアミノ末端テイルは、「６つの金属結合部位（ＭＢＳ）」（「重金属結合（ＨＭＡ）」部位又はドメインとも区別なく命名され、それぞれ、コア配列ＭｘＣｘｘＣを含有する）を含有する。これらのＨＭＡは、ＨＭＡ当たりに１つのＣｕ（Ｉ）原子の化学量論において、Ｃｕ（Ｉ）に結合する。ＡＴＰ７Ｂのこれらのアミノ末端ＨＭＡは、その機能の複数の態様に必要である。同機能は、銅移行、銅のキュプロ酵素への包含、ＡＴＰａｓｅ活性、局在、及び細胞内輸送、ならびに、タンパク質−タンパク質相互作用を含む。ＨＭＡ部位は、アミノ末端から開始して、ドメインＨＭＡ１（正準配列におけるアミノ酸５９〜１２５）、ＨＭＡ２（アミノ酸１４４〜２１０）、ＨＭＡ３（２５８〜３２７）、ＨＭＡ４（３６０〜４２６）、ＨＭＡ５（４８９〜５５５）、及びＨＭＡ６（５６５〜６３１）として特定される。
【００５０】
本発明によれば、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物は、Ｎ末端重金属結合部位ＨＭＡ１、ＨＭＡ２、ＨＭＡ３、及びＨＭＡ４が完全に又は部分的に欠失されている、トランケートされたＡＴＰ７Ｂをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、トランケートされたＡＴＰ７Ｂをコードするヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７ＢのＮ末端シグナル配列の５６個のアミノ酸を維持している。
【００５２】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、トランケートされたＡＴＰ７Ｂにおける欠失は、正準配列のアミノ酸５７〜４８６を含む。
【００５３】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ヌクレオチド配列は、アミノ酸配列が配列番号：７である、トランケートされたＡＴＰ７Ｂをコードする。
【００５４】
コドン重複性のために、同じアミノ酸配列を有するＡＴＰ７Ｂポリペプチドをコードして生成することができる数多くのヌクレオチド配列が存在する。
【００５５】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：６のコード配列ＣＤＳ、塩基４７３．．３５８０である。
【００５６】
別の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列は、ヒト細胞に最適化されたコドン利用バイアスを有する配列である配列番号：８である。
【００５７】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列は、トランケートされた銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするコドンの内の少なくとも８２７、少なくとも８７９、少なくとも９３１、又は少なくとも９８３がコード配列である配列番号：８のコドンと同一である、配列である。
【００５８】
ポリアデニル化シグナル配列
本明細書で使用する場合、「ポリアデニル化シグナル」又は「ポリ（Ａ）シグナル」という用語は、遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の特異的認識配列を意味する。ポリアデニル化シグナル又はポリ（Ａ）シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体分子に転写され、遺伝子転写の終了をガイドする。ポリ（Ａ）シグナルは、新たに形成されたｍＲＮＡ前駆体のその３’−端におけるヌクレオチド鎖開裂用のシグナル、及び、アデニン塩基のみからなるＲＮＡストレッチのこの３’−端への付加（ポリアデニル化プロセス；ポリ（Ａ）テイル）用のシグナルとして機能する。ポリ（Ａ）テイルは、ｍＲＮＡの核外移行、翻訳、及び安定性に重要である。本発明の文脈において、ポリアデニル化シグナルは、哺乳類細胞において、哺乳類遺伝子及び／又はウイルス遺伝子のポリアデニル化を指示することができる認識配列である。
【００５９】
ポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、ａ）プレメッセンジャーＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ）の３’−端開裂及びポリアデニル化の両方に必要であり、下流での転写終了を促進することが示されているコンセンサス配列ＡＡＵＡＡＡと、ｂ）ポリ（Ａ）シグナルとしてＡＡＵＡＡＡの利用効率を制御するＡＡＵＡＡＡの上流及び下流の更なるエレメントとからなる。哺乳類遺伝子のこれらのモチーフにおいて、かなりの変異性が存在する。
【００６０】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の核酸構築物のポリアデニル化シグナル配列は、哺乳類遺伝子又はウイルス遺伝子のポリアデニル化シグナル配列である。適切なポリアデニル化シグナルは、中でも、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５Ｅｌｂポリアデニル化シグナル、成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＰＢＧＤポリアデニル化シグナル、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計されたポリアデニル化シグナル（合成）等を含む。
【００６１】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物のポリアデニル化シグナル配列は、トランケートされたＡＴＰ７Ｂをコードするヌクレオチド配列の転写から生じたｍＲＮＡ前駆体のヌクレオチド鎖開裂及びポリアデニル化を指示し、達成することもできる合成ポリ（Ａ）シグナル配列である。
【００６２】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物のポリアデニル化シグナル配列は、配列番号：１の塩基４８７７．．４９３２により範囲設定された合成ポリ（Ａ）シグナル配列である。
【００６３】
他のヌクレオチドエレメント
一実施態様において、本発明の核酸構築物は、遺伝子治療用の発現ベクターである本発明の発現ベクター、とりわけ、遺伝子治療用のウイルスベクターのリコンビナントゲノムを構成する。
【００６４】
このため、一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の核酸構築物は、ウイルスの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを更に含む。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「末端逆位配列（ＩＴＲ）」という用語は、パリンドローム配列を含有し、ＤＮＡ複製の開始中にプライマーとして機能するＴ型ヘアピン構造を形成するように折り畳むことができる、ウイルスの５’−端に位置しているヌクレオチド配列（５’ＩＴＲ）及び３’−端に位置しているヌクレオチド配列（３’ＩＴＲ）を意味する。また、ホストゲノムへのウイルスゲノムの組込み、ホストゲノムからのレスキュー、及び成熟ビリオン内でのウイルス核酸のカプシド形成にも必要である。ＩＴＲは、ベクターゲノムの複製及びウイルス粒子内へのそのパッケージングにシスで必要である。
【００６６】
一実施態様において、本核酸構築物は、ウイルスの５’ＩＴＲ、Ψパッケージングシグナル、及び３’ＩＴＲを含む。「Ψパッケージングシグナル」は、ウイルスゲノムのシス作用型ヌクレオチド配列である。同配列は、一部のウイルス（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス．．．）において、複製中にウイルスゲノムをウイルスカプシド内にパッケージングするプロセスに必須である。
【００６７】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物は、パルボウイルス（特に、アデノ関連ウイルス）、アデノウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス（特に、ガンマレトロウイルス及びレンチウイルス）、ヘルペスウイルス、及びＳＶ４０からなる群より選択されるウイルスの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含む。好ましい実施態様では、ウイルスは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）、又はレンチウイルスである。
【００６８】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物は、ＡＡＶの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含む。
【００６９】
ＡＡＶゲノムは、４６８１個の塩基を含有する、直線状の一本鎖ＤＮＡ分子から構成される（Berns and Bohenzky, (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307）。このゲノムは、ＤＮＡ複製起点及びウイルスについてのパッケージングシグナルとしてシスに機能する末端逆位配列（ＩＴＲ）を各端部に含む。ＩＴＲは、長さが約１４５bpである。このゲノムの内部非繰返し部分は、それぞれＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子として公知の２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。これらの遺伝子は、ビリオンの複製及びパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。特に、少なくとも４つのウイルスタンパク質は、その見掛けの分子量に従って命名された、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０から合成される。ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、少なくとも３つのタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ＡＡＶゲノムの詳細な説明については、例えば、Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129を参照のこと。
【００７０】
リコンビナントＡＡＶビリオンの構築は、当技術分野において一般的に公知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び同第５，１３９，９４１号；国際公開公報第９２／０１０７０号、同第９３／０３７６９号に記載されている（Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996；Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129；及びKotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801）。
【００７１】
本発明は、任意のＡＡＶ血清型のＩＴＲを使用することにより行うことができる。同血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、鳥類のＡＡＶ、ウシのＡＡＶ、イヌ科のＡＡＶ、ウマのＡＡＶ、ヒツジのＡＡＶ、及び、現在公知又は後に発見される任意の他のＡＡＶ血清型を含む。
【００７２】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及びＡＡＶ４からなる群より選択される血清型のＡＡＶの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含む。好ましい実施態様では、本核酸構築物は、配列番号：１の塩基１．．１４１及び塩基４９６８．．５１０７により範囲設定されたＩＴＲ配列を含む。同ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２のＩＴＲ配列である。
【００７３】
ＩＴＲは、ＡＡＶゲノム複製及びウイルス粒子内へのそのパッケージングにシスで必要とされるＡＡＶウイルスエレメントのみである。
【００７４】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物は、分類サブクラス（Ａ〜Ｆ）いずれかの中のいずれかの血清型のアデノウイルスの５’ＩＴＲ、Ψパッケージングシグナル、及び３’ＩＴＲを含む。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、これらの５’ＩＴＲ、Ψシグナル、及び３’ＩＴＲ配列は、サブクラスＣのアデノウイルスに由来し、より好ましくは、血清型２（Ａｄ２）又は血清型５（Ａｄ５）のアデノウイルスに由来する。
【００７５】
一方、他の実施態様では、本発明は、合成の５’ＩＴＲ及び／又は３’ＩＴＲを使用することにより、また、種々の血清型のウイルスに由来する５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを使用することによっても行うことができる。
【００７６】
ウイルスベクター複製に必要な全ての他のウイルス遺伝子は、以下に記載されたウイルス産生細胞（パッケージング細胞）内にトランスに提供することができる。したがって、本発明のウイルスベクターゲノムの核酸構築物中へのその包含は任意である。
【００７７】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、発現ベクターは、ＡＡＶベクターである。
【００７８】
特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、
ａ）ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列、ＡＡＴプロモータ配列、ならびにトランケートされたヒトＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、
ｂ）ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列、ＡＡＴプロモータ配列、ならびにトランケートされたヒトＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）をコードする配列番号：８のコドン最適化ヌクレオチド配列を含むベクター、
ｃ）ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列、ＥａｌｂＰａ１ＡＴハイブリッドプロモータ配列、ならびにトランケートされたヒトＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、ならびに
ｄ）ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列、ＥａｌｂＰａ１ＡＴハイブリッドプロモータ配列、ならびにトランケートされたヒトＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）をコードする配列番号：８のコドン最適化ヌクレオチド配列を含むベクターからなる組み合わせの群より選択されるＡＡＶベクターを構成する。
【００７９】
これらのＡＡＶベクターの実施態様はそれぞれ、ポリアデニル化シグナル配列、例えば、配列番号：１の合成のポリ（Ａ）シグナル配列又は任意の他の適切なポリ（Ａ）シグナルも、他の任意のヌクレオチドエレメントを伴って、又は、同エレメントを伴わずに含む。
【００８０】
別の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、発現ベクターは、アデノウイルスベクターである。本発明のこのアデノウイルスベクターは、特に、第１世代、第２世代、又は第３世代のアデノウイルス［Adenovirus. Methods and Protocols. Chillon M. and Bosch A. (Eds); third Edition; 2014 Springerを参照のこと］又は既知もしくは後に記載される任意の他のアデノウイルスベクター系であることができる。
【００８１】
特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明のウイルスベクターは、「第３世代のアデノウイルス」である。同アデノウイルスは、「ガットレスアデノウイルス」、「ヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤ−Ａｄ）」、又は「高性能アデノウイルス（ＨＣ−Ａｄ）」と呼ぶこともできる。第３世代のアデノウイルスは、全てのウイルスコード領域が除去されており（ガットレス）、複製をヘルパーアデノウイルスに依存し（ヘルパー依存性）、最大３６kbpインサートの外来性の遺伝子材料を、ホスト細胞内に輸送し、送達することができる（高容量）。ガットレスアデノウイルスは、末端逆位配列ＩＴＲ（５’及び３’）及びパッケージングシグナル（Ψ）を維持している。
【００８２】
本明細書で記載された本発明の核酸構築物及び発現ベクターは、当業者に公知の従来法：Sambrook and Russell (Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Third Edition; 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press)；及びGreen and Sambrook (Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Fourth Edition; 2012 Cold Spring Harbor Laboratory Press)により調製し、得ることができる。
【００８３】
遺伝子治療用の本発明のウイルス粒子
「ウイルス粒子」及び「ビリオン」という用語は、本明細書において、互換的に使用され、カプシド、場合により、カプシドを囲う脂質エンベロープ内にパッケージングされたウイルスゲノム（すなわち、発現ウイルスベクターの核酸構築物）を含む感染性で、典型的には、複製欠損のウイルス粒子に関する。
【００８４】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明のビリオンは、本発明のＡＡＶベクターの核酸構築物をタンパク質シェル中にパッケージングすることにより得られる「リコンビナントＡＡＶビリオン」又は「ｒＡＡＶビリオン」である。
【００８５】
アデノ関連ウイルスのウイルスカプシドのタンパク質（カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）は、１つのウイルス遺伝子（ｃａｐ遺伝子）から生成される。種々のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質配列間の差異により、細胞内侵入のために種々の細胞表面レセプターを使用することになる。別の細胞内処理経路との組み合わせで、これは、各ＡＡＶ血清型について別箇の組織向性を生じさせる。
【００８６】
特定の実施態様では、本発明のリコンビナントＡＡＶビリオンは、特定のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶベクター／ゲノムの核酸構築物を、同じ特定の血清型のＡＡＶに対応する天然のＣａｐタンパク質により形成されたウイルス粒子にカプシド形成させることにより調製することができる。それにも関わらず、複数の技術が、天然のＡＡＶウイルス粒子の構造的及び機能的特性を修飾し、改善するのに開発されてきた（Bunning H et al. J Gene Med 2008; 10: 717-733）。このため、本発明の別のＡＡＶウイルス粒子では、所定のＡＡＶ血清型のＩＴＲに隣接するウイルスベクターのヌクレオチド構築物は、例えば、ａ）同じかもしくは異なるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質［例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質；ＡＡＶ２  ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質等］から構成されるウイルス粒子；ｂ）種々のＡＡＶ血清型もしくは変異体由来のカプシドタンパク質［例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲとＡＡＶ１及びＡＡＶ５カプシドタンパク質］の混合物から構成されるモザイクウイルス粒子；ｃ）種々のＡＡＶ血清型又は変異間でドメインスワッピングによりトランケートされているカプシドタンパク質［例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲとＡＡＶ３ドメインを有するＡＡＶ５カプシドタンパク質］から構成されるキメラウイルス粒子；又はｄ）ターゲット細胞特異的レセプターとのストリンジェントな相互作用を可能にする選択性結合ドメイン［例えば、ＡＡＶ４  ＩＴＲとペプチドリガンドの挿入により遺伝的にトランケートされたＡＡＶ２カプシドタンパク質；又はカプシド表面にペプチドリガンドをカップリングさせることにより非遺伝的に修飾されたＡＡＶ２カプシドタンパク質］を提示するように操作されたターゲット化ウイルス粒子内にパッケージングすることができる。
【００８７】
当業者であれば、本発明のＡＡＶビリオンが任意のＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を含むことができることを理解するであろう。一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ウイルス粒子は、ＡＡＶのカプシドタンパク質を含む。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ＡＡＶウイルス粒子は、肝臓細胞への送達により適したＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９からなる群より選択される血清型由来のカプシドタンパク質（Nathwani et al. Blood 2007; 109: 1414-1421；Kitajima et al. Atherosclerosis 2006; 186:65-73）を含む。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本ウイルス粒子は、本核酸構築物の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列がＡＡＶ２血清型のものであり、カプシドタンパク質がＡＡＶ８血清型のものである、本発明の核酸構築物を含む。
【００８８】
特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ＡＡＶウイルス粒子は、肝臓、筋肉、及び網膜をターゲット化するのに非常に強力な遺伝子治療ベクターとして挙動する、ウイルスＡＡＶ血清型１、２、８、及び９の予想される祖先であるＡｎｃ８０由来のカプシドタンパク質（Zinn et al. Cell Reports 2015; 12:1-13）を含む。より特定の実施態様では、ウイルス粒子は、Ａｎｃ８０Ｌ６５  ＶＰ３カプシドタンパク質（Genbankアクセッションナンバー：KT235804）を含む。
【００８９】
ウイルスグリカン相互作用は、ホスト細胞侵入の重要な決定因子である。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ＡＡＶウイルス粒子は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、そしてここで、この置換は、新たなグリカン結合部位をＡＡＶカプシドタンパク質に導入する、カプシドタンパク質を含む。より特定の実施態様では、アミノ酸置換は、ＡＡＶ２におけるアミノ酸２６６、アミノ酸４６３〜４７５、及びアミノ酸４９９〜５０２、又は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくは任意の他のＡＡＶ血清型（Ａｎｃ８０及びＡｎｃ８０Ｌ６５も含む）において対応するアミノ酸位置においてである。
【００９０】
導入された新たなグリカン結合部位は、ヘキソース結合部位［例えば、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）、又はフコース（ｆｕｃ）結合部位］；シアル酸（Ｓｉａ）結合部位［例えば、Ｓｉａ残基は、例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＳＡｃ）又はＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＳＧｃ）］；又は二糖類結合部位であることができる。この場合、二糖類は、例えば、Ｓｉａ（アルファ２，３）Ｇａｌ又はＳｉａ（アルファ２，６）Ｇａｌの形態において、ガラクトースに結合しているシアル酸である。別の血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質におけるＡＡＶ血清型由来の新たな結合部位を導入するための詳細なガイダンスは、国際公開公報第２０１４１４４２２９号及びShen et al. (J. Biol. Chem. 2013; 288(40):28814-28823)に与えられる。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ＡＡＶ９由来のＧａｌ結合部位は、ＡＡＶ２  ＶＰ３骨格内に導入され、細胞内侵入のためにＨＳ及びＧａｌレセプターの両方を使用することができる二重グリカン結合ＡＡＶ株を生じる。好ましくは、前記二重グリカン結合ＡＡＶ株は、ＡＡＶ２Ｇ９である。Shen et al.は、ＡＡＶ９  ＶＰ３カプシドタンパク質サブユニットのＧａｌ認識部位に直接関与し、同部位のすぐ隣りのアミノ酸残基を、ＡＡＶ２  ＶＰ３サブユニットコード領域における対応する残基上に置換することにより、ＡＡＶ２Ｇ９を生成した（ＡＡＶ２  ＶＰ３ナンバリング、Ｑ４６４Ｖ、Ａ４６７Ｐ、Ｄ４６９Ｎ、Ｉ４７０Ｍ、Ｒ４７１Ａ、Ｄ４７２Ｖ、Ｓ４７４Ｇ、Ｙ５００Ｆ、及びＳ５０１Ａ）。
【００９１】
別の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明のビリオンは、アデノウイルスビリオン、例えば、Ａｄ５ビリオンである。ＡＡＶビリオンの場合、Ａｄビリオンのカプシドタンパク質は、その向性及び細胞ターゲット化特性を改変するのにも操作することができる。代替的なアデノウイルス血清型も利用することができる。
【００９２】
ウイルス粒子の製造
本発明の発現ウイルスベクターの核酸構築物を有するウイルス粒子の製造は、従来の方法及びプロトコールにより行うことができる。同方法及びプロトコールは、製造される核酸構築物及びベクターのウイルス粒子の実際の実施態様に選択される構造的特徴を考慮して選択される。
【００９３】
簡潔に、ウイルス粒子は、ヘルパーベクターもしくはウイルス又は他のＤＮＡ構築物の存在下において、パッケージングされるベクターの核酸構築物によりトランスフェクションされる、特異的なウイルス産生細胞（パッケージング細胞）中で製造することができる。
【００９４】
したがって、一態様において、本発明は、ウイルス粒子を製造するための、本発明の核酸構築物又は発現ベクターの使用に関する。
【００９５】
関連する態様では、本発明は、
ａ）本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含むホスト細胞を、培養培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞培養上清及び／又は細胞内からウイルス粒子を収集する工程とを含む、本発明のウイルス粒子を製造する方法に関する。
【００９６】
好ましくは、前記ホスト細胞は、以下に記載されたパッケージング細胞である。適切な培養培地は、当業者に公知であろう。このような培地を構成する成分は、培養される細胞種に応じて変化させることができる。栄養組成に加えて、浸透圧及びｐＨが、培養培地の考慮される重要なパラメータである。細胞増殖培地は、当業者に周知の数多くの成分を含む。同成分は、アミノ酸、ビタミン、有機塩及び無機塩、炭水化物の供給源、脂質、微量元素（ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＺｎＳＯ４．．．）を含む。各成分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞の培養（すなわち、細胞の生存及び増殖）を支援する量で存在する。また、成分は、種々の補助物質、例えば、緩衝物質（例えば、炭酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、Ｔｒｉｓ．．．）、酸化安定剤、機械的応力を打ち消す安定剤、プロテアーゼ阻害剤、動物成長因子、植物加水分解物、抗凝集剤、消泡剤を含むこともできる。細胞増殖培地の特徴及び組成は、具体的な細胞要求に応じて変化する。市販の細胞増殖培地の例は、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）ＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s Medium）、Ｉｓｃｏｖｅｓ  ＤＭＥＭ（Iscove’s modification of Dulbecco’s Medium）、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５、ＣＨＯ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、ＨＥＫ２９３、Ｈａｍ（Ham’s Media）Ｆ１０及び派生品であるＨａｍ  Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等である。
【００９７】
本発明のホスト細胞
別の態様では、本発明は、本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含む、ホスト細胞に関する。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「ホスト細胞」という用語は、対象となるウイルスによる感染に感受性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養に適している、任意の細胞株を意味する。
【００９９】
本発明のホスト細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療目的で使用することができる。このような実施態様では、細胞は、本発明の核酸構築物又はウイルスベクターによりトランスフェクションされ、その後に、患者又は対象に移植される。移植される細胞は、自家、同種、又は異種起源を有することができる。臨床使用のために、細胞の単離は、一般的には、医薬品の製造及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の条件下において行われるであろう。移植前に、典型的には、細胞の品質及び微生物又は他の汚染物質が存在しないことが確認され、例えば、放射線及び／又は免疫サプレッション処理による肝臓の前処理が行われる場合がある。さらに、ホスト細胞は、細胞増殖及び／又は分化を刺激する成長因子、例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）と共に移植することができる。
【０１００】
特定の実施態様では、ホスト細胞は、肝臓におけるｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療に使用される。好ましくは、前記細胞は、真核生物細胞、例えば、哺乳類細胞である。これらは、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、類人猿；チンパンジー；サル及びオランウータン、飼育動物（イヌ及びネコを含む）、ならびに家畜、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヤギ、又は、他のほ乳類種（マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターを含むが、これらに限定されない）等を含むが、これらに限定されない。当業者であれば、移植される患者又は対象に応じて、より適切な細胞を選択するであろう。
【０１０１】
前記ホスト細胞は、自己複製能及び多能性を有する細胞、例えば、幹細胞又は誘導多能性幹細胞であることができる、幹細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、又は筋細胞の内の少なくとも１つに分化可能であり、任意の種類の組織から単離することができる。一般的には、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯、又は末梢血から単離されるであろう。それを得るための方法は、当業者に周知である。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣとしても公知）は、成熟細胞から直接生じさせることができる種類の多能性幹細胞である。Yamanaka et al.は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子を、マウス及びヒト繊維芽細胞内に導入し、これらの細胞にこれらの遺伝子を発現させることにより、ｉＰＳ細胞を誘導した（国際公開公報第２００７／０６９６６６号）。Thomson et al.は、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃに代えてＮａｎｏｇ及びＬｉｎ２８を使用して、ヒトｉＰＳ細胞を後に生じさせた（国際公開公報第２００８／１１８８２０号）。
【０１０２】
前記ホスト細胞は、肝細胞であることもできる。細胞単離及びヒト又はマウスレシピエントへのその後の移植を含む肝細胞移植法は、例えば、Filippi and Dhawan, Ann NY Acad Sci. 2014, 1315 50-55；Yoshida et al., Gastroenterology 1996, 111: 1654-1660；Irani et al. Molecular Therapy 2001, 3:3, 302-309；及びVogel et al. J Inherit Metab Dis 2014, 37:165-176に記載されている。ウイルスベクターを肝細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入するための方法は、例えば、Merle et al., Scandinavian Journal of Gastroenterology 2006, 41:8, 974-982に記載されている。
【０１０３】
別の特定の実施態様では、ホスト細胞は、パッケージング細胞である。前記細胞は、付着細胞又は懸濁細胞であることができる。パッケージング細胞及びヘルパーベクター又はＤＮＡ構築物は共に、ウイルスベクターの完全な複製及びパッケージングに必要な全ての損なわれた機能をトランスに提供する。
【０１０４】
好ましくは、前記パッケージング細胞は、真核生物細胞、例えば、哺乳類細胞であり、類人猿、ヒト、イヌ、及びげっ歯類の細胞を含む。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（国際公開公報第０１／３８３６２号）、ＭＲＣ−５（ATCC CCL-171）、ＷＩ−３８（ATCC CCL-75）、ＨＥＫ−２９３細胞（ATCC CRL-1573）、ＨｅＬａ細胞（ATCC CCL2）、及びアカゲザル胎児肺細胞（ATCC CL-160）である。非ヒト霊長類細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ATCC CCL81）、ＣＯＳ−１細胞（ATCC CRL-1650）、又はＣＯＳ−７細胞（ATCC CRL-1651）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ATCC CCL-34）である。げっ歯類細胞の例は、ハムスター細胞、例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、又はＣＨＯ細胞である。
【０１０５】
哺乳類ソースの代替として、本発明の使用するための細胞株は、鳥類ソース、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、又はキジから得ることができる。鳥類細胞株の例は、鳥類胚性幹細胞（国際公開公報第０１／８５９３８号及び同第０３／０７６６０１号）、不死化アヒル網膜細胞（同第２００５／０４２７２８号）、鳥類胚性幹細胞由来の細胞（ニワトリ細胞（同第２００６／１０８８４６号）又はアヒル細胞、例えば、ＥＢ６６細胞株（同第２００８／１２９０５８号及び同第２００８／１４２１２４号）を含む）を含む。
【０１０６】
別の実施態様では、前記ホスト細胞は、昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞（ATCC CRL-1711）、Ｓｆ２１細胞（IPLB-Sf21）、ＭＧ１細胞（BTI-TN-MG1）、又はHigh Five（商標）細胞（BTI-TN-5B1-4）である。
【０１０７】
したがって、特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ホスト細胞は、
ａ）一般的には、プラスミドとしての、本発明の核酸構築物もしくは発現ベクター（すなわち、リコンビナントＡＡＶゲノム）、
ｂ）ＩＴＲ配列を有さない、ＡＡＶ  ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ遺伝子をコードする、一般的には、プラスミドである核酸構築物、ならびに／又は
ｃ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む、一般的には、プラスミドもしくはウイルスである核酸構築物
を含む。
【０１０８】
ＡＡＶ複製に必須のウイルス遺伝子は、本明細書において、ウイルスヘルパー遺伝子と呼ばれる。典型的には、ＡＡＶ複製に必須の前記遺伝子は、アデノウイルスヘルパー遺伝子、例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、又はＶＡ  ＲＮＡである。好ましくは、アデノウイルスヘルパー遺伝子は、Ａｄ５又はＡｄ２血清型のものである。
【０１０９】
従来法は、ＡＡＶベクターのウイルス粒子を製造するのに使用することができる。同方法は、本発明のリコンビナントＡＡＶベクター／ゲノムを有する核酸構築物（例えば、プラスミド）；ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするが、ＩＴＲ配列を有さない核酸構築物（例えば、ＡＡＶヘルパープラスミド）；及び、ＡＡＶ複製に必須のアデノウイルス機能を提供する第３の核酸構築物（例えば、プラスミド）による一過性細胞共トランスフェクションからなる。
【０１１０】
このため、特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、前記ホスト細胞は、
ｉ）本発明の核酸構築物又は発現ベクター（すなわち、リコンビナントＡＡＶゲノム）、
ｉｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードし、ＩＴＲ配列を有さない核酸構築物、ならびに
ｉｉｉ）アデノウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物
を含むことにより特徴付けられる。
【０１１１】
あるいは、ｒｅｐ、ｃａｐ、及びアデノウイルスヘルパー遺伝子は、１つのプラスミド上で組み合わせることができる（Blouin Vet al. J Gene Med. 2004; 6(suppl): S223-S228；Grimm D. et al. Hum. Gene Ther. 2003; 7: 839-850）。このため、別の特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、前記ホスト細胞は、
ｉ）本発明の核酸構築物又は発現ベクター（すなわち、リコンビナントＡＡＶゲノム）、ならびに
ｉｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードし、ＩＴＲ配列を有さず、アデノウイルスヘルパー遺伝子を更に含むプラスミド
を含むことにより特徴付けられる。
【０１１２】
更なる特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、前記ホスト細胞は、
ａ）本発明の核酸構築物又は発現ベクター（すなわち、リコンビナントＡＡＶゲノム）、
ｂ）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードし、ＩＴＲ配列を有さないプラスミド、ならびに
ｃ）アデノウイルスヘルパー遺伝子Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ  ＲＮＡを含むプラスミド
を含み、そしてここで、共トランスフェクションは、アデノウイルスＥ１遺伝子を構成的に発現しており、トランス相補している（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）細胞、好ましくは、哺乳類細胞、例えば、ＨＥＫ−２９３細胞（ATCC CRL-1573）中で行われる。
【０１１３】
本発明のＡＡＶベクターの大規模生産は、例えば、リコンビナントバキュロウイルスの組み合わせによる、昆虫細胞の感染によっても行うことができる（Urabe et al. Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935-1943）。ＳＦ９細胞は、それぞれＡＡＶ  ｒｅｐ、ＡＡＶ  ｃａｐを発現するバキュロウイルスベクターと、パッケージングされるＡＡＶベクターとにより共感染される。リコンビナントバキュロウイルスベクターは、ウイルスの複製及び／又はパッケージングに必要なウイルスヘルパー遺伝子機能を提供するであろう。
【０１１４】
ＡＡＶ血清型のｒｅｐ  ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）と、異なる血清型ＡＡＶのｃａｐ  ＯＲＦとをコードするヘルパープラスミドを使用することにより、所定のＡＡＶ血清型のＩＴＲに隣接するベクターを異なる血清型のカプシド構造タンパク質から構築されたビリオン内にパッケージングするのが可能である。この同じ手法により、モザイク、キメラ、又はターゲット化ベクターをパッケージングするのも可能である。
【０１１５】
一方、本発明のＨＣ−Ａｄベクターの製造は、アデノウイルスＥ１遺伝子及びＣｒｅリコンビナーゼをも構成的に発現しており、トランス相補している哺乳類細胞（例えば、２９３Ｃｒｅ細胞）により行うことができる。これらの細胞は、ＨＣ−Ａｄベクターゲノムでトランスフェクションされ、第１世代のアデノウイルスヘルパーウイルス（Ｅ１欠失）により感染される。同ウイルスにおいて、パッケージングシグナルは、ｌｏｘＰ配列に隣接している［Parks RJ et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 13565-13570；２９３Ｃｒｅ細胞については、Palmer and Engel. Mol. Ther. 2003; 8:846-852を参照のこと］。ＨＣ−Ａｄベクター、例えば、ＡｄＡｄＬＣ８ｃｌｕｃをパッケージングするのに使用することができる複数のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系ヘルパーウイルス系又は最適化された自己不活性化ＡｄＴｅｔＣｒｅヘルパーウイルスが記載されている（欧州特許第２２９５５９１号；Gonzalez-Aparicio et al. Gene Therapy 2011; 18: 1025-1033）。
【０１１６】
本発明の遺伝子治療用のウイルスベクターの構築及び製造のための更なるガイダンスは、以下に見出すことができる。
Viral Vectors for Gene Therapy, Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 737. Merten and Al-Rubeai (Eds.); 2011 Humana Press (Springer)
Gene Therapy. M. Giacca. 2010 Springer-Verlag
Heilbronn R. and Weger S. Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics. In: Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology 197; M. Schafer-Korting (Ed.). 2010 Springer-Verlag; pp. 143-170
Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols. R.O. Snyder and P. Moulllier (Eds). 2011 Humana Press (Springer)
Bunning H. et al. Recent developments in adeno-associated virus technology. J. Gene Med. 2008; 10:717-733
Adenovirus: Methods and Protocols. M. Chillon and A. Bosch (Eds.); Third Edition. 2014 Humana Press (Springer)
【０１１７】
治療的使用
更なる態様では、本発明は、医薬として使用するための、発明の概要内で定義された本発明の製品に関する。
【０１１８】
更なる態様では、本発明は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、ならびに、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の発現及び活性のアップレギュレーションにより治療的利益又は改善が生じる可能性がある任意の他の状態及び疾患、特に、ＡＴＰ７Ｂ依存性リソソームエキソサイトーシスの低下及びリソソーム中の銅蓄積に関連する疾患又は状態、例えば、胆汁うっ滞性障害、アルツハイマー病、及び／又はガン（Polishchuck et al. Dev Cell. 2014, 29(6), 686-700；Gupta and Lutsenko, Future Med. Chem. 2009, 1, 1125-1142）の処置に使用するための、発明の概要内で定義された本発明の製品に関する。
【０１１９】
処置される対象は、哺乳類、及び特に、ヒトの患者であることができる。
【０１２０】
特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、銅輸送ＡＴＰａｓｅの欠損又は機能不全に起因する状態は、ウィルソン病（ＷＤ、Online Mendelian Inheritance in Man catalog accession number OMIN 277900；http://www.omim.org/entry/277900）である。
【０１２１】
関連する態様では、本発明は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、ならびに、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の発現及び活性のアップレギュレーションにより治療的利益又は改善が生じる可能性がある任意の他の状態及び疾患の処置、好ましくは、ウィルソン病の処置に使用するための医薬の調製における、発明の概要内で定義された本発明の製品の使用に属する。
【０１２２】
更なる態様では、本発明は、治療的に有効な量の、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ホスト細胞、ウイルス粒子、又は医薬組成物を患者に投与することを含む、患者における、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、ならびに、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の発現及び活性のアップレギュレーションにより治療的利益又は改善が生じる可能性がある任意の他の状態及び疾患の処置、好ましくは、ウィルソン病の処置における使用に関する。
【０１２３】
本発明の製品による処置は、ＷＤの１つ以上の兆候の重症度を、緩和し、改善し、又は低下させることができる。例えば、処置は、ホロセルプラスミン合成、セルロプラスミンオキシダーゼ活性、及び／又は胆汁中への銅排泄を増大させ、及び／又は、回復させ（これにより、血清、肝臓、脳、及び尿中の銅蓄積を減少させ）、その結果として、腹痛、疲労、黄疸の重症度、制御不能な運動、筋肉のこわばり、会話、嚥下、又は肉体的整合を伴う問題を緩和し、改善し、又は低下させることができる。
【０１２４】
本発明の製品は、典型的には、医薬組成物又は医薬中に、場合により、医薬担体、希釈剤、及び／又は補助剤との組み合わせで含まれるであろう。このような組成物又は医薬品は、本発明の製品を、所望の治療効果を提供するのに十分な有効量で含み、薬学的に許容し得る担体又は賦形剤を含む。
【０１２５】
したがって、更なる態様では、本発明は、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ホスト細胞、又はウイルス粒子と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物に関する。
【０１２６】
任意の適切な薬学的に許容し得る担体又は賦形剤が、本発明の医薬組成物を調製するのに使用することができる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, April 1997を参照のこと）。医薬組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下において無菌であり、安定している。医薬組成物は、液剤（例えば、生理食塩水、デキストロース溶液、もしくは緩衝溶液、又は、他の薬学的に許容し得る無菌流体）、微小エマルション剤、リポソーム剤、又は、高い製品濃度を収容するのに適した他の規則正しい構造体（例えば、微粒子又はナノ粒子）として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散剤の場合には、必要とされる粒径の維持により、及び、界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。注入用組成物の延長した吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含ませることによりもたらすことができる。本発明の製品は、例えば、組成物中に徐放性ポリマー又は急速な放出から本製品を保護する他の担体を含む放出制御製剤（インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む）において投与することができる。生分解性及び生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセタート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）を使用することができる。好ましくは、前記医薬組成物は、液剤として、より好ましくは、場合により緩衝生理食塩水溶液として製剤化される。
【０１２７】
補助的な活性化合物も、本発明の医薬組成物中に包含することができる。更なる治療剤の共投与のガイダンスは、例えば、the Compendium of Pharmaceutical and Specialties (CPS) of the Canadian Pharmacists Associationに見出すことができる。
【０１２８】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の医薬組成物は、非経口医薬組成物であり、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内投与に適した組成物を含む。これらの医薬組成物は、単なる例示であり、他の非経口及び経口投与経路に適した医薬組成物を制限するものではない。
【０１２９】
本発明の文脈において、「有効量」は、治療的に有効な量を意味する。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、「治療的に有効な量」は、所望の治療的結果、例えば、銅輸送活性の向上による、胆汁中の銅の増大ならびに血清、感情、脳、及び尿中の銅の減少を達成するのに必要とされる用量及び期間において有効な量を意味する。本発明の製品又はそれを含む医薬組成物の治療的に有効な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに製品又は医薬組成物が個体中で所望の応答を引き出す能力等の要因に応じて変動する場合がある。投与計画は、最適な治療応答を提供するのに調節することができる。治療的に有効な量は、典型的には、治療的に有益な効果が本製品又は医薬組成物の任意の毒性又は有害な作用を上回る量でもある。
【０１３１】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の製品を有する医薬組成物は、対象又は患者に非経口経路により投与される。
【０１３２】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内経路により投与される。
【０１３３】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の製品を含む医薬組成物は、間質経路により、すなわち、組織の隙間への注入、又は、組織の隙間内への注入により投与される。組織ターゲットは、例えば、肝臓組織に特異的であることができ、又は、複数の組織の組み合わせ、例えば、筋肉及び肝臓組織であることができる。例示的な組織ターゲットは、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪堆積物、腎臓、肺、血管内皮、上皮及び／又は造血細胞を含むことができる。好ましい実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の製品を含む医薬組成物は、肝臓内注入、すなわち、肝臓組織の間質空間内への注入により投与される。
【０１３４】
対象又は患者に投与される本発明の製品量は、個々の対象もしくは患者の特定の状態（個体の年齢、性別、及び体重を含む）；疾患の性質及びステージ、疾患の進行性；投与経路；ならびに／又は対象もしくは患者に処方された併用医薬に応じて変動する場合がある。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調節することができる。
【０１３５】
任意の特定の対象について、特別な投与計画が、個々の必要性及び、組成物を投与し、組成物の投与を管理する専門家の判断に従って、経時的に調節することができる。本明細書で説明された投与量範囲は、単なる例示であり、医療実務家が選択することができる投与量範囲を制限するものではない。
【０１３６】
一実施態様において、本発明のＡＡＶベクターは、対象又は患者に、ウィルソン病の処置のために、５×１０１１〜１×１０１４vg/kg（vg：ウイルスゲノム；kg：対象又は患者の体重）の範囲内に含まれる量又は用量で投与することができる。より特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは、１×１０１２〜１×１０１３vg/kgの範囲内に含まれる量で投与される。
【０１３７】
別の実施態様では、本発明のＨＣ−Ａｄベクターは、対象又は患者に、ウィルソン病の処置のために、１×１０９〜１×１０１１iu/kg（iu：ベクターの感染単位）の範囲内に含まれる量又は用量で投与することができる。
【０１３８】
別の態様では、本発明は、更に、本発明の核酸構築物、ベクター、ホスト細胞、ウイルス粒子、又は医薬組成物を、１つ以上の容器中に含む、キットに関する。本発明のキットは、キット内に収容された本発明の核酸構築物、ベクター、ホスト細胞、又はウイルス粒子を患者に投与する方法を説明する説明書又は包装材を含むことができる。本キットの容器は、任意の適切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属等のものであることができ、任意の適切なサイズ、形状、又は構成のものであることができる。特定の実施態様では、本キットは、本発明の核酸構築物、ベクター、ホスト細胞、ウイルス粒子、又は医薬組成物を、適切な液状又は溶液状で収容する、１つ以上のアンプル又はシリンジを含むことができる。
【０１３９】
本説明及び特許請求の範囲の全体を通して、「含む」という語及びその変形例は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又は工程を除外することを意図していない。さらに、「含む」という語は、「からなる」の場合を包含する。本発明の更なる目的、利点、及び特徴は、本説明の検討に基づいて当業者に明らかになるであろう、又は、本発明の実施により知ることができる。下記実施例は、例示として提供され、本発明を限定することを意図するものではない。さらに、本発明は、本明細書に記載された特定の実施態様及び好ましい実施態様の全ての可能性のある組み合わせに及ぶ。
【実施例】
【０１４０】
実施例１．リコンビナント発現ベクターの構築
ヒトＡＴＰ７Ｂ又はトランケート型のヒトＡＴＰ７Ｂを有し、これらのＡＴＰ７Ｂを発現する５種類のＡＡＶベクター：ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）、及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）を、ウィルソン病（ＷＤ）の遺伝子治療を行うために、設計し、生成した。
【０１４１】
１．１  ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ［本明細書において、ＡＡＶ−ｗｔＡＴＰ７Ｂとも命名］
【０１４２】
このベクターのゲノム配列は、配列番号：１として特定される。
【０１４３】
まず、プラスミドｐＵＣ−ＡＴＰ７Ｂを、核酸構築物をｐＵＣ５７プラスミド内にクローニングすることにより、要求に応じて構築した（GenScript）。核酸構築物は、ヒトＡＴＰ７Ｂ（導入遺伝子）をコードするｃＤＮＡ配列を、この導入遺伝子の下流の合成ポリアデニル化シグナル配列（Levitt N. et al. Genes & Development 1989; 3(7):1019-1025）と共に含有した。
【０１４４】
次に、アルファ１アンチトリプシン遺伝子（ＡＡＴ）のミニマルプロモータを、プラスミドｐＵＣ−ＡＴＰ７ＢのＡＴＰ７Ｂ遺伝子上流に導入した。ミニマルプロモータは、ＡＡＴプロモータのｃａｐ部位に対するヌクレオチド−２６１〜ヌクレオチド＋４４の配列からなり（Kramer M.G. et al. Mol. Therapy 2003; 7(3): 375-385）、肝臓機能に必要な組織特異的エレメント（ＴＳＥ）と、プロモータの全体活性に必要な遠位領域（ＤＲＩ）とを含有する。ＡＡＴプロモータは、（M.G. Kramerにより提供された）ｐＥｎｈＡｌｂＡＡＴ−ルシフェラーゼプラスミドをテンプレートとして使用し、下記プライマーを使用するＰＣＲ増幅により得られた。
【０１４５】
プライマーＡＡＴ−フォワード
5’ CTGGTCTAGAACGCGTCGCCACCCCCTCCACCTTGG 3’（配列番号：１０）及び
プライマーＡＡＴ−リバース
5’ ATCATGATGCGGCCGCTTCACTGTCCCAGGTCAGTG 3’（配列番号：１１）
【０１４６】
ＡＡＴ−フォワードプライマーは、ＸｂａＩ及びＭｌｕＩについての制限部位を有する。３’ＡＡＴ−リバースプライマーは、ＮｏｔＩについての制限部位を有する。
【０１４７】
したがって、プラスミドｐＵＣ−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂを得るために、プラスミドｐＵＣ−ＡＴＰ７Ｂを、ＸｂａＩ及びＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で予め消化されたＡＡＴプロモータをライゲーションした。
【０１４８】
その後、発現カセットを、ＡＡＶ導入プラスミドｐＡＡＶ−ＭＣＳ（Agilent technologies）内に、制限酵素ＰｍｌＩ及びＭｌｕＩでの消化によりサブクローニングし、これにより、プラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを生成した。
【０１４９】
プラスミドを構築した後、ＡＡＶベクターを、プラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ及びプラスミドｐＤＰ８（PlasmidFactory, Bielefeld, Germanyから得た；プラスミドｐＤＰ８は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ２  ｒｅｐタンパク質、ならびに、ＡＡＶの生成及びパッケージングに必要なアデノウイルス分子を発現する）の、２９３細胞内への二重トランスフェクションにより作製した。
【０１５０】
このベクターを、イオジキサノール勾配により最終的に精製し、定量ＰＣＲによりタイトレーションした。
【０１５１】
１．２  ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ［本明細書において、ＡＡＶ−ｃｏＡＴＰ７Ｂとも命名］
【０１５２】
このベクターのゲノム配列は、配列番号：３として特定される。
【０１５３】
コドン最適化版のＡＴＰ７Ｂ遺伝子（ｃｏＡＴＰ７Ｂ）を発現するＡＡＶベクターを得るために、まず、プラスミドｐＵＣ−ｃｏＡＴＰ７Ｂを、核酸構築物をｐＵＣ５７プラスミド内にクローニングすることにより、要求に応じて構築した（GenScript）。次に、ｃｏＡＴＰ７Ｂを、制限酵素ＮｏｔＩ及びＫｐｎＩによる消化により、ｐＵＣ−ｃｏＡＴＰ７Ｂから切除し、同じ酵素であるＮｏｔＩ及びＫｐｎＩで予め消化されたｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂプラスミド内にサブクローニングして、プラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂを得た。
【０１５４】
プラスミドを構築した後、ベクターゲノムの生成及びウイルス粒子のパッケージングについて、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂについて先に記載されたように、先に得られたプラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７ＢとプラスミドｐＤＰ８との二重トランスフェクション、精製（イオジキサノール勾配）、及びタイトレーションを行った。
【０１５５】
１．３  ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）［本明細書において、ＡＡＶ−Ｔ１とも命名］
このベクターは、導入遺伝子として、アミノ酸２２３〜３６６が欠失しているトランケート型のヒトＡＴＰ７ＢであるＡＴＰ７Ｂ（ｄ２２３−３６６）をコードする核酸配列（配列番号：１２）を有する。欠失配列は、ＨＭＡ３ドメイン及びＨＭＡ４ドメインの７つのアミノ酸を含む。
【０１５６】
ベクターを得るために、プラスミドｐＵＣ５７−ｗｔＡＴＰ７Ｂを、制限酵素ＭｆｅＩ及びＮａｅＩにより消化して、プラスミドｐＵＣ５７−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１を得た。このようにして、コディファイ領域のサイズを、４３２個のヌクレオチド、タンパク質サイズを、１４４個のアミノ酸に小さくした。
【０１５７】
プラスミドｐＵＣ５７−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１を構築した後、ベクターゲノムの生成及びウイルス粒子のパッケージングについて、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂについて先に記載されたように、ＡＡＴプロモータのライゲーション、プラスミドｐＡＡＶ−ＭＣＳ内へのサブクローニング、先に得られたプラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−Ｔ１とプラスミドｐＤＰ８との二重トランスフェクション、ウイルス精製（イオジキサノール勾配）、及びタイトレーションを行った。
【０１５８】
１．４  ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［本明細書において、ＡＡＶ−Ｔ２とも命名］
【０１５９】
このベクターのゲノム配列は、配列番号：６として特定される。
【０１６０】
このベクターは、導入遺伝子として、アミノ酸５７〜４８６が欠失しているトランケート型のヒトＡＴＰ７ＢであるＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２とも命名される］をコードする核酸配列を有する。このようにして、最初の４つのＨＭＡドメインは除去されているが、アミノ末端領域の５６個のアミノ酸を含むシグナル配列は維持されており、コディファイ領域のサイズを１．２９Kb、タンパク質を４３０個のアミノ酸に小さくした。
【０１６１】
ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）のヌクレオチド配列を、テンプレートとしてｐＵＣ５７−ｗｔＡＴＰ７Ｂを使用し、２つのセットのプライマーを使用するＰＣＲ増幅により得た。
【０１６２】
アミノ末端配列を増幅する第１のセットのプライマー
プライマーＦ１：
5’ CTAGATGCGGCCGCCACCATGCCTG 3’（配列番号：１４）及び
プライマーＲ１：
5’ CTGAGAAGAAGGGCCCAGGCC 3’（配列番号：１５）ならびに
カルボキシ末端領域を増幅する第２のセットのプライマー
プライマーＦ２：
5’ GGCCCTTCTTCTCAGCCGCAGAAGTGCTTCTTACAG 3’（配列番号：１６）及び
プライマーＲ２：
5’ ACCAAAATCGATAAAACCGATTACAATCC 3’（配列番号：１７）
【０１６３】
プライマーＲ１及びＦ２の５’末端配列は相補である。テンプレートとして等量の２つのＰＣＲ精製フラグメントを使用し、プライマーＦ１及びＲ２を使用して、ＰＣＲを、ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）をコードするヌクレオチド配列を得るために行った。ついで、ＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩ及びＣｌａＩにより消化し、両酵素で予め消化されたｐＵＣ５７−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂプラスミド内にクローニングして、プラスミドｐＵＣ５７−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２を得た。
【０１６４】
プラスミドｐＵＣ５７−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２を構築した後、ベクターゲノムの生成及びウイルス粒子のパッケージングについて、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂについて先に記載されたように、ＡＡＴプロモータのライゲーション、プラスミドｐＡＡＶ−ＭＣＳ内へのサブクローニング、先に得られたプラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−Ｔ２とプラスミドｐＤＰ８との二重トランスフェクション、精製（イオジキサノール勾配）、及びタイトレーションを行った。
【０１６５】
１．５  ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）［本明細書において、ＡＡＶ−ＡＡＴ−ｃｏＴ２とも命名］
このベクターは、導入遺伝子として、ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）もコードする、コドン最適化核酸配列［配列番号：８；ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）又はｃｏＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２］を有する。
【０１６６】
ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）のヌクレオチド配列を、テンプレートとしてｐＵＣ５７−ｃｏＡＴＰ７Ｂを使用し、２つのセットのプライマーを使用するＰＣＲ増幅により得た。
【０１６７】
アミノ末端配列を増幅する第１のセットのプライマー
プライマーＦ３：
5’ ACGCGTGCGGCCGCCACCATGCCAG 3’（配列番号：１８）及び
プライマーＲ３：
5’ CTGGGAGCTAGGTCCCAGTCC 3’（配列番号：１９）ならびに
カルボキシ末端領域を増幅する第２のセットのプライマー
プライマーＦ４：
5’ GGACCTAGCTCCCAGCCTCAGAAGTGTTTTCTGCAG 3’（配列番号：２０）及び
プライマーＲ４：
5’ TGTTCCTCGCGAATGATCAGGTTGTCCTC 3’（配列番号：２１）
【０１６８】
プライマーＲ３及びＦ４の５’末端配列は相補である。テンプレートとして等量の２つのＰＣＲ精製フラグメントを使用し、プライマーＦ３及びＲ４を使用して、ＰＣＲを、ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を得るために行った。ついで、ＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩ及ＮｒｕＩにより消化し、両酵素で予め消化されたｐＵＣ５７−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂプラスミド内にクローニングして、プラスミドｐＵＣ５７−ｃｏＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２を得た。
【０１６９】
プラスミドｐＵＣ５７−ｃｏＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２を構築した後、ベクターゲノムの生成及びウイルス粒子のパッケージングについて、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂについて先に記載されたように、ＡＡＴプロモータのライゲーション、プラスミドｐＡＡＶ−ＭＣＳ内へのサブクローニング、先に得られたプラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ｃｏＴ２とプラスミドｐＤＰ８との二重トランスフェクション、ウイルス精製（イオジキサノール勾配）、及びタイトレーションを行った。
【０１７０】
実施例２．ウィルソン病動物モデル：ＡＴＰ７Ｂ  ＫＯ
ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２の治療性能を、ＷＤの代表的な動物モデルである、ＡＴＰ７Ｂノックアウトマウス（ＡＴＰ７Ｂ  ＫＯ、ＡＴＰ７Ｂ−／−、又はＷＤマウス）において試験した。この動物モデルは、Buiakova et al.によって、対向する転写フレーム中に方向付けられたネオマイシンカセットによりＡＴＰ７Ｂ  エクソン２の一部の置換を操作することで、マウスＡＴＰ７Ｂ  ｍＲＮＡに早期終止コドンを導入することにより開発された（Buikova O.I. et al. Human Molecular Genetics 1999; 8(9): 1665-1671）。ＡＴＰ７Ｂノックアウトマウスは、肝臓におけるＡＴＰ７Ｂの発現を示さず、尿中の高いＣｕ排泄、血清中の低いホロセルロプラスミンレベル、高いトランスアミナーゼレベル、肝臓中の高いＣｕ濃度、及び病的な肝臓組織学を示す。これらのマウスは、神経病変（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｆｆｅｃｔａｔｉｏｎ）を除いて、ヒトのウィルソン病の典型的な生化学的特徴を示す（Lutsenko S. Biochemical Society Transactions 2008; 36(Pt 6): 1233-1238）。
【０１７１】
実施例３．ウィルソン病マウスにおけるウイルスベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２の治療効果の決定
６週（６ｗ）齢のオスＡＴＰ７Ｂ−／−マウスを、各５匹のマウスの４つの群に分割した。これらの群の１つに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを、用量３×１０１０vg/マウス（vg：ウイルスゲノム）で静脈内処置した。第２の群は、同じ用量のベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１で静脈内処置した。第３の群は、同じ用量のベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２で静脈内処置した。第４の群は、処置しないままとした。野生型マウスの追加群を、対照群（対照）として処置せずに維持した。動物を、ベクター投与後２４週（ｗ３０）で殺処分した。
【０１７２】
ベクター投与後４週間及びその後３０週まで５週間毎に、血清トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベル及び尿中Ｃｕ含量を、全ての群において決定した。血清セルロプラスミン活性を、処置後４週間で測定した。
【０１７３】
血清トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルを、Hitachi 747 Clinical Analyzer（Hitachi, Tokyo, Japan）を使用するＤＧＫＣ法（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）により決定した。
【０１７４】
血清セルロプラスミン活性を、基質としてのｏ−ジアニシジン二塩酸（４，４’−ジアミノ−３，３’−ジメトキシ−ビフェニル）（Sigma-Aldrich, San Louis, MO, United States）により、Schosinsky and cols.（Clinical Chemistry 1974; 20(12): 1556-1563）に記載されたように決定した。吸光度を、分光計において５４０nmで測定した。
【０１７５】
尿中銅含量を、原子吸光分光法（SIMAA 6000, from Perkin-Elmer GmbH, Bodenseewerk）により決定した。
【０１７６】
殺処分後、肝臓を、組織学的分析のために切除した。
【０１７７】
肝臓銅含量を、乾燥肝臓組織中において、原子吸光分光法（SIMAA 6000、from Perkin-Elmer GmbH, Bodenseewerk）及びＴｉｍｍ’ｓスルフィド銀染色（Danscher G. and Zimmer J. Histochemistry 1978; 55(1): 27-40）により決定した。
【０１７８】
肝臓の構造を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された切片において評価した。
【０１７９】
抗マウスＣＤ４５抗体（BioLegend, San Diego, USA；カタログナンバー１０３１０２）による免疫組織化学を、肝臓における炎症性浸潤を検出するのに行った。
【０１８０】
抗マウスＰａｎＣｋ抗体（Invitrogen/Life Technologies, 18-0132, clon AE1/AE3）による免疫組織化学も、胆管細胞を検出するのに行った。
【０１８１】
線維症を判定するために、コラーゲン定量用の方法として、従来のSirius Red染色を使用した。
【０１８２】
図２に示されたように、トランスアミナーゼレベルは、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２を受けたマウスにおいて正常化されたが、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１で処置された動物では正常化されなかった。さらに、尿中Ｃｕ濃度は、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１、又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２を受けた動物において顕著に低下したが、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１は、尿中Ｃｕ濃度を低下させるのにほとんど効率的ではなかった（図３）。セルロプラスミン活性は、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２を受けた動物において、処置後４週間で回復したが、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１で処置された動物では回復しなかった（図４）。この結果は、ウェスタンブロット分析により確認された。ホロセルロプラスミンは、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２で処置されたマウスにおいて検出されたが、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１で処置された動物では検出されなかった。一方、処置されなかったＷＤマウスでは、アポセルロプラスミン型のみを検出することができた。
【０１８３】
一方、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１、又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２の投与により、肝臓におけるＣｕ含量は有意に減少したが、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１は、肝臓におけるＣｕ濃度を低下させるのにほとんど効率的ではなかった（図５）。この結果は、Ｔｉｍｍ’ｓ染色後に得られた画像において確認された（図６Ｂ）。肝臓の組織学に関して、処置されなかった動物は、巨大な核を含有する巨大な肝細胞を伴う異常な肝臓アーキテクチャを示した。ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２の投与により、肝臓の組織学の正常化がもたらされたが、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１によっては、同正常化がもたらされなかった（図６Ａ）。さらに、ＷＤ動物は、ＣＤ４５陽性細胞により主に構成される強力な肝臓浸潤を表わした。浸潤は、リコンビナントウイルスベクターによる処置後に消失した（図７）。このため、ＡＡＶベクターの投与により、炎症性浸潤の顕著な減少がもたらされた。さらに、胆管増生及び肝臓線維症も、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２、及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ−Ｔ１で処置されたＷＤマウスにおいて顕著に低下した（図７）。
【０１８４】
実施例４．ウィルソン病のメスマウスにおけるウイルスベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）の治療効果
６週（６ｗ）齢のメスＡＴＰ７Ｂ−／−マウスを、各５匹のマウスの４つの群に分割した。群１〜３の動物に、ウイルスベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）を静脈内処置した。各群に、種々の用量（それぞれ、１×１０１０、３×１０１０、及び１×１０１１vg/マウス）を受けさせた。第４の群は、処置しないままとした。野生型マウスの追加群を、対照群（ＷＴ）として処置せずに維持した。
【０１８５】
ベクター投与後４週間及びその後投与後２４週（マウスが３０週齢になる）まで５週間毎に、血清トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベル及び尿中Ｃｕ濃度を、全ての群において、実施例３で記載されたのと同じ方法により決定した。
【０１８６】
図８に示されたように、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）により、ＷＤメスマウスにおいて、２つの最も高い用量（３×１０１０及び１×１０１１vg/マウス）でトランスアミナーゼレベルが正常化された。最も低い用量の１×１０１０vg/マウスにより、トランスアミナーゼレベルが有意に低下したが、肝臓の傷害は消えなかった。一方、３種類の用量での処置により、ＷＴマウスに見出されるレベルに達するＣｕ尿中排泄が低下した（図９）。
【０１８７】
実施例５．ウィルソン病のメスマウスにおける、ウイルスベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）の治療効果の比較
２つの実験群を確立した。各実験群について、６週（６ｗ）齢のメスＡＴＰ７Ｂ−／−マウスを、各５匹のマウスの４つの群に分割した。３つの群に、試験されるウイルスベクターを静脈内処置した。各群に、種々の用量（それぞれ、１×１０１０、３×１０１０、及び１×１０１１vg/マウス）を受けさせた。第４の群は、処置しないままとした。野生型マウスの追加群を、対照群（ＷＴ）として処置せずに維持した。
【０１８８】
第１の実験群（実験群１）において、処置を受けたＷＤマウスに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを投与した。第２の実験群（実験群２）において、処置を受けたＷＤマウスに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）を投与した。
【０１８９】
処置後４週間で決定される血清セルロプラスミン活性及び処置後２４週間で決定される肝臓Ｃｕ含量を、実施例３に記載されたのと同じ方法により測定した。
【０１９０】
血清セルロプラスミン活性
血清セルロプラスミン活性は、最も高い用量のＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂベクターの投与によってのみ修正された（図１０Ａ、実験群１）、２つの最も低い用量の投与後には、効果は観察されなかった。
【０１９１】
逆に、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）ベクターにより、１×１０１０vg/マウスの最も低い用量で、セルロプラスミンレベルが有意に向上した。中間用量のベクターの投与により、セルロプラスミンレベルは正常化した。最も高い用量により、セルロプラスミン活性は、正常レベルを超えて向上した（図１０Ｂ、実験群２）。
【０１９２】
肝臓におけるＣｕ濃度
その上、肝臓におけるＣｕ濃度は、２つの最も高い用量のＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂの投与により低下したが、正常化されなかった。最も低い用量では、効果が観察されなかった（図１１Ａ，実験群１）。対照的に、Ｃｕ濃度は、全ての試験された用量において、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）ベクターの投与後に低下するのが示された。最も高い用量では、レベルは、正常に近づいた（図１１Ｂ、実験群２）。
【０１９３】
したがって、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂベクターの１×１０１０vg/マウス用量は、血清セルロプラスミン活性の正常化及び肝臓におけるＣｕ蓄積の減少の両方に関して、ｗｔ構築物についての「最適以下用量」であることが示された。一方、トランケート型を有するベクターにより、予期せず、前記最適以下用量において、統計学的に有意な治療効果が提供された。
【０１９４】
実施例６．ＷＤマウスにおけるウイルスベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）の治療効果の比較
６週（６ｗ）齢のオスＡＴＰ７Ｂ−／−マウスを、３つのマウス群に分割した。２つの群の動物それぞれを、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ又はベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）の最適以下静脈内用量（１×１０１０vg/マウス）で処置した。第３の群は、処置しないままとした。野生型マウスの追加群を、対照群（ＷＴ）として処置せずに維持した。
【０１９５】
肝臓Ｃｕ含量を、実施例３で記載されたのと同じ方法により測定した。
【０１９６】
図１２に示されたように、最適以下用量で与えられたＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）ベクターの両方により、ＷＤマウスの肝臓における銅蓄積が減少したが、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）により、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂで提供された減少より有意に大きい肝臓銅含量の減少が提供された。
【０１９７】
実施例７．ＷＤマウスにおけるウイルスベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）及びＡＡＶ−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）の治療効果の比較
６週（６ｗ）齢のオスＡＴＰ７Ｂ−／−マウスを、３つのマウス群に分割した。２つの群の動物それぞれを、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）及びＡＡＶ−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）の最適以下静脈内用量（１×１０１０vg/マウス）で処置した。第３の群は、処置しないままとした。野生型マウスの追加群を、対照群（ＷＴ）として処置せずに維持した。
【０１９８】
肝臓Ｃｕ含量を、実施例３で記載されたのと同じ方法により測定した。
【０１９９】
図１３に示されたように、最適以下用量で与えられたＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）ベクターの両方により、ＷＤマウスの肝臓における銅蓄積が減少したが、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）により、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）で提供された減少より有意に大きい肝臓銅含量の減少が提供された。
【０２００】
実施例８．ＷＤマウスにおけるコドン最適化ウイルスベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）の治療効果
６週（６ｗ）齢のオスＡＴＰ７Ｂ−／−マウスを、５つのマウス群に分割した。４つの群の動物それぞれを、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）、又はＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｄ５７−４８６）の最適以下静脈内用量（１×１０１０vg/マウス）で処置した。第５の群は、処置しないままとした。野生型マウスの追加群を、対照群（ＷＴ）として処置せずに維持した。
【０２０１】
血清セルロプラスミン活性を、実施例３で記載されたのと同じ方法により測定した。
【０２０２】
図１４に示されたように、トランケートされたＡＴＰ７Ｂ−Ｔ２のヌクレオチド配列を有する２つのベクターにより、最適以下用量でＷＤマウスに投与された場合、セルロプラスミンオキシダーゼ活性が回復した。一方、完全なヒトＡＴＰ７Ｂをコードするヌクレオチド配列を有するベクターによっては、同じ処置条件で投与された場合、セルロプラスミン活性の有意な改善が何ら提供されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018500904.tif 000018
2018500904.tif 000019
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