(57)【要約】  本開示は、関心のあるＤＮＡ配列（または関心のある遺伝子）を細胞または生物のゲノム中の標的化部位に送達するためにウイルスインテグラーゼ、レコンビナーゼまたはトランスポサーゼと連結される、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥおよびジンクフィンガータンパク質などの改変タンパク質の使用に関する。ＤＮＡ切断でのその機能について不活性であるＣａｓ９の使用は、相同組み換えのための他の系で意図されるようなＤＮＡ破壊を引き起こすことなく、ＲＮＡガイドの使用によるＣａｓ９タンパク質のＤＮＡ標的化能の使用を可能にする。ウイルスインテグラーゼまたはレコンビナーゼに連結されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ（ＤＮＡの特異的な配列に結合する改変タンパク質）の使用も開示される。この系は、研究および治療目的で使用され得る。例えば、関心のある遺伝子は、細胞中で正常な遺伝子産物（例えば、遺伝子産物はタンパク質または特殊化されたＲＮＡであり得る）を回収するために、遺伝子がその遺伝子産物の産生能を欠いている細胞中に含まれ得る。【選択図】図１
2018513681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作可能な連結において、
ａ）Ｃａｓ９、不活性Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１またはその一部をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、
ｂ）インテグラーゼ、レコンビナーゼもしくはトランスポサーゼまたはその一部をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、
ｃ）核酸リンカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列と
を含む核酸コンストラクトにおいて、
前記第１のポリヌクレオチド配列が５’および３’末端を含み、かつ前記第２のポリヌクレオチド配列が５’および３’末端を含み、および前記第１のポリヌクレオチドの前記３’末端が前記核酸リンカーによって前記第２のポリヌクレオチドの前記５’末端に連結され、かつ前記第１および第２のポリヌクレオチドが細胞または生物において融合タンパク質として発現されることが可能であることを特徴とする、核酸コンストラクト。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸コンストラクトにおいて、前記第１のポリヌクレオチド配列が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、２７〜４６、４９、５６もしくは６８の何れか１つ、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸コンストラクトにおいて、前記Ｃａｓ９、不活性Ｃａｓ９またはＣｐｆ１が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、５０、５２、６９、７２〜７８もしくは８６〜９２の何れか１つ、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸コンストラクトにおいて、前記第２のポリヌクレオチド配列が配列番号１５、１７、１９、２１、２３、４７、５５、６２、６４、６６、７０もしくは７９の何れか１つ、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸コンストラクトにおいて、前記インテグラーゼ、レコンビナーゼまたはトランスポサーゼが配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２５、２６、４８、６３、６５、６７、７１もしくは８０の何れか１つ、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
【請求項６】
生物において、請求項１に記載の核酸コンストラクトを含むことを特徴とする、生物。
【請求項７】
請求項１に記載の融合タンパク質を含む生物において、修飾されたゲノムを有することを特徴とする、生物。
【請求項８】
ａ）Ｃａｓ９、不活性Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１またはその一部をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、
ｂ）インテグラーゼ、レコンビナーゼもしくはトランスポサーゼまたはその一部をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、
ｃ）核酸リンカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列と
を含む生物において、
前記第１のポリヌクレオチド配列が５’および３’末端を含み、かつ前記第２のポリヌクレオチド配列が５’および３’末端を含み、および前記第１のポリヌクレオチドの前記３’末端が前記核酸リンカーによって前記第２のポリヌクレオチドの前記５’末端に連結され、かつ前記第１および第２のポリヌクレオチドが細胞または生物において融合タンパク質として発現されることが可能であることを特徴とする、生物。
【請求項９】
融合タンパク質において、
ａ）触媒能のないＣａｓ９、Ｃａｓ９、ＴＡＬＥタンパク質、ジンクフィンガータンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である第１のタンパク質であって、標的ＤＮＡ配列を標的とする第１のタンパク質と、
ｂ）インテグラーゼ、レコンビナーゼまたはトランスポサーゼである第２のタンパク質と、
ｃ）前記第１のタンパク質を前記第２のタンパク質に連結するリンカーと
を含むことを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載の融合タンパク質において、前記第２のタンパク質がインテグラーゼであることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載の融合タンパク質において、前記インテグラーゼがＨＩＶ１インテグラーゼまたはレンチウイルスインテグラーゼであることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項９に記載の融合タンパク質において、前記リンカー配列が１以上のアミノ酸長であることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項９に記載の融合タンパク質において、前記第１のタンパク質が触媒能のないＣａｓ９であることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項９に記載の融合タンパク質において、前記リンカー配列が４〜８アミノ酸長であることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１４に記載の融合タンパク質において、前記第１のタンパク質がＴＡＬＥタンパク質であることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項９に記載の融合タンパク質において、前記第１のタンパク質がジンクフィンガータンパク質であることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の融合タンパク質において、前記標的ＤＮＡ配列が約１６〜約２４塩基対長であることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項９に記載の融合タンパク質において、前記第１のタンパク質がＣａｓ９または触媒能のないＣａｓ９であり、１つ以上のガイドＲＮＡが約１６〜約２４塩基対の標的ＤＮＡ配列の標的化のために使用されることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１９】
ＤＮＡ配列をゲノムＤＮＡに挿入する方法において、
ａ）前記ゲノムＤＮＡにおいて標的配列を同定することと、
ｂ）前記ゲノムＤＮＡにおいて前記標的配列に結合するように請求項１に記載の融合タンパク質を設計することと、
３）前記ゲノムＤＮＡに組み込むための関心のあるＤＮＡ配列を選択することと、
ｄ）細胞または生物に対して、前記細胞または生物への前記融合タンパク質および関心のあるＤＮＡ配列の移行を可能にする技術によって前記融合タンパク質および前記関心のあるＤＮＡ配列を提供することと
を含み、前記関心のあるＤＮＡ配列が前記ゲノムＤＮＡ中の前記標的配列において組み込まれるようになることを特徴とする、方法。
【請求項２０】
ａ）標的ＤＮＡ配列に結合するように改変されている、Ｃａｓ９、触媒能のないＣａｓ９、ＴＡＬＥタンパク質、ジンクフィンガータンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である第１のタンパク質に対する第１のコード配列と、
ｂ）インテグラーゼ、レコンビナーゼまたはトランスポサーゼである第２のタンパク質に対する第２のコード配列と、
ｃ）前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間でアミノ酸リンカーを形成する、前記第１のコード配列と前記第２のコード配列との間のＤＮＡ配列と、
ｄ）任意選択により、インテグラーゼによって認識されるａｔｔ部位によって取り囲まれる発現された関心のあるＤＮＡ配列および任意選択により１つ以上のガイドＲＮＡと
を含むヌクレオチドベクターにおいて、前記第１のタンパク質が、決定されたＤＮＡ配列を標的とし、前記第１のタンパク質が前記アミノ酸リンカー配列によって前記第２のタンパク質に連結されることを特徴とする、ヌクレオチドベクター。
【請求項２１】
細胞または生物において遺伝子転写を阻害する方法において、
ａ）遺伝子においてＡＴＧ開始コドンを同定することと、
ｂ）前記遺伝子の前記ＡＴＧ開始コドンの直後の標的配列に結合するように、請求項１に記載の融合タンパク質を用いて融合タンパク質系を設計することと、
ｃ）１つ以上の連続停止コドンである関心のあるＤＮＡ配列を設計することと、
ｄ）細胞または生物に対して、前記細胞または生物への前記融合タンパク質および関心のあるＤＮＡ配列の移行を可能にする技術によって前記融合タンパク質および前記関心のあるＤＮＡ配列を提供することと
を含み、前記関心のあるＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡ中の前記標的配列において組み込まれるようになり、前記遺伝子の転写が阻害されることを特徴とする、方法。
【請求項２２】
請求項９に記載の融合タンパク質において、前記第２のタンパク質がレコンビナーゼであることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項２２に記載の融合タンパク質において、前記レコンビナーゼがＣｒｅレコンビナーゼまたはその修飾型であり、前記修飾型のＣｒｅレコンビナーゼが構成的なレコンビナーゼ活性を有することを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項２０に記載のベクターにおいて、細胞中で発現される逆転写酵素遺伝子をさらに含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項２５】
ＤＮＡ結合タンパク質／インテグラーゼ融合物の精製タンパク質と、約１５〜約１００塩基対長のＲＮＡとを含む組成物において、前記ＤＮＡ結合タンパク質が、ゲノム中の標的化ＤＮＡ配列に対して改変されているＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガータンパク質から選択され、前記インテグラーゼがＨＩＶインテグラーゼ、レンチウイルスインテグラーゼ、アデノウイルスインテグラーゼ、レトロウイルスインテグラーゼまたはＭＭＴＶインテグラーゼであることを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、全ての目的のためにそれぞれの内容全体が参照により組み込まれる、２０１５年３月３１日提出の米国仮特許出願第６２，１４０，４５４号明細書、２０１５年８月２７日提出の米国仮特許出願第６２，２１０，４５１号明細書および２０１５年１０月１２日提出の米国仮特許出願第６２，２４０，３５９号明細書の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、関心のあるＤＮＡ配列（または関心のある遺伝子）を細胞または生物のゲノム中の標的化部位に送達するためにウイルスインテグラーゼ（例えば、ＨＩＶまたはＭＭＴＶインテグラーゼ）またはレコンビナーゼとリンカーにより連結される、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を置いて出現する短いパリンドロームリピート）タンパク質）、ＴＡＬＥおよびジンクフィンガータンパク質などのゲノム特異性を示すＤＮＡ結合タンパク質を有する改変タンパク質の使用に関する。ＤＮＡ切断でのその機能について不活性であるＣａｓ９の使用は、相同組み換えのための他の系で意図されるようなＤＮＡ破壊を引き起こすことなく、ＲＮＡガイド（ｇＲＮＡ）の使用によるＣａｓ９タンパク質のＤＮＡ標的化能の使用を可能にする。ウイルスインテグラーゼまたはレコンビナーゼに連結されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ（ＤＮＡの特異的な配列に結合する改変タンパク質）の使用も開示される。この系は、研究および治療目的のために使用され得る。例えば、従来の方法を通じたオフターゲット切断の可能性なく、関心のある遺伝子を含有するドナーＤＮＡを宿主ゲノムに容易に導入し得る。「ノックアウト」ストラテジーを促進するためにもドナーＤＮＡを改変し得る。Ｃａｓ９標的化の特異性を改善するための新しいストラテジーも論じる。このストラテジーは、何れのガイドＲＮＡがＣａｓ９の特異的標的化をもたらすかを見出すためのアッセイにおいて、ガイドＲＮＡおよびゲノムＤＮＡとともに表面結合ｄＣａｓ９（そのＤＮＡ切断能について不活性であるＣａｓ９）を使用する。これは、特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のインビボ適用において重要であり、現在のイン・シリコ予測モデルの制限を克服するが、アッセイにおいて何れのｇＲＮＡを使用するかということを知識に基づいて決定するため、イン・シリコ予測モデルと組み合わせて使用することもできる。
【背景技術】
【０００３】
ゲノム配列決定技術および分析方法における最近の前進により、多岐にわたる生物学的機能および疾患と関連する遺伝学的／ゲノム因子を分類し、マッピングする能力が顕著に加速された。正確なゲノム標的化技術は、個々の遺伝要素の選択的撹乱を可能にし、かつ合成生物学、バイオテクノロジーおよび医学的応用を進展させることにより、原因となる遺伝的変異の体系的な逆改変を可能にするために必要とされる。標的化ゲノム撹乱を生じさせるためにデザイナージンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技術が利用可能であり、所与のゲノムにおける特異的な位置へのＤＮＡ配列（全長遺伝子配列を含む）の組み込みを可能にする新しいゲノム改変技術が依然として必要とされている。これにより、改変遺伝子を発現する細胞株またはトランスジェニック生物の作製またはそれを必要とする対象における機能障害性遺伝子の置き換えが可能になるであろう。
【０００４】
インテグラーゼは、宿主ゲノム（哺乳動物、ヒト、マウス、ラット、サル、カエル、魚、植物（作物およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のような実験用植物を含む）、研究用または医学生物学的な細胞株または初代細胞培養物、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ハエ（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）など）へのウイルス核酸の挿入を可能にするウイルスタンパク質である。インテグラーゼは、ウイルス核酸配列を宿主ゲノムに組み込むために、宿主のＤＮＡ結合タンパク質を使用してインテグラーゼを宿主ゲノムと結び付ける。インテグラーゼは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）などのレトロウイルス中で見られる。インテグラーゼは、そのゲノムを宿主ＤＮＡに挿入するためのウイルス遺伝子上の配列に依存する。Ｌｅａｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，ｖｏｌｕｍｅ  ２６８，ｐａｇｅｓ  ２１１３−２１１９）は、部位特異的突然変異誘発およびインビトロ研究を使用することにより、ＨＩＶ１インテグラーゼの機能を調べた。Ｌｅａｖｉｔｔはまた、ウイルスインテグラーゼによる宿主ゲノムへのＨＩＶ１  ＤＮＡ（逆転写後に生成）の組み込みに重要であるＵ５およびＵ３  ＨＩＶ１  ａｔｔ部位の配列も示す。
【０００５】
本開示は、所望の核酸（ＤＮＡ）配列をゲノムの指定位置でゲノムに特異的に挿入することを可能にすることにより、現在のゲノム編集技術を改善する。ＤＮＡ結合能を有する組み換え改変インテグラーゼ（またはレコンビナーゼ）は、ゲノム中の所与のＤＮＡ配列に結合し、インテグラーゼ認識ドメイン（ＨＩＶ１（または他のレトロウイルス）ａｔｔ部位など）を有する提供されるＤＮＡ配列および／または相同アームを認識して、部位特異的に所与の核酸配列をゲノムに挿入する。本開示のある態様は、遺伝子の転写開始部位の直後に停止コドン（ＵＡＡ、ＵＡＧおよび／またはＵＧＡ）のＤＮＡ配列を挿入することを含む。これにより、細胞または生物のゲノム中の遺伝子転写の効果的な阻害が可能になる。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ＤＮＡ標的化インテグラーゼを形成させるために、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲタンパク質様Ｃｐｆ１などを含むＤＮＡ標的化技術をレトロウイルスインテグラーゼと連結する。次に、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）がＤＮＡ標的化インテグラーゼとともに提供され得、それが標的化形式でゲノムに組み込まれ得るようになる。ゲノムにおけるその挿入に対する別の特異性レベルを提供するために相同アームを用いてＧＯＩを設計する。
【０００７】
本開示は、特に、レトロウイルスインテグラーゼとの連結のための、ＤＮＡ切断能がない変異体Ｃａｓ９の使用に関する。
【０００８】
本開示は、Ａ）例えば、ＤＮＡ切断能がないＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に共有結合されるウイルスインテグラーゼ（または細菌レコンビナーゼ）を含む系を含む。あるいは、ウイルスインテグラーゼ（またはレコンビナーゼ）は、ＴＡＬＥタンパク質またはジンクフィンガータンパク質に共有結合されるが、この場合、これらのタンパク質はゲノム中のＤＮＡの特異的配列を標的とするように設計されている。これは、発現ベクターにおいてまたは精製タンパク質として提供され得る；Ｂ）所望のゲノムに組み込まれる相同アームがあるかまたはない関心のある遺伝子（または関心のあるＤＮＡ配列）。ＧＯＩまたは関心のあるＤＮＡ配列は、必要に応じて、ウイルスインテグラーゼによって認識されるように修飾され得る。細胞へのポリヌクレオチド形質移入および／またはタンパク質導入に必要とされる他の試薬。ＤＮＡ配列のオフターゲット組み込みに対してアッセイを行う。ある態様において、挿入されるＤＮＡ配列に改変マーカー配列を使用する。
【０００９】
操作可能な連結において、ａ）Ｃａｓ９、不活性Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１またはその一部をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、ｂ）インテグラーゼ、レコンビナーゼもしくはトランスポサーゼまたはその一部をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、ｃ）核酸リンカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列とを含み、第１のポリヌクレオチド配列が５’および３’末端を含み、かつ第２のポリヌクレオチド配列が５’および３’末端を含み、および第１のポリヌクレオチドの３’末端が核酸リンカーによって第２のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、かつ第１および第２のポリヌクレオチドが細胞または生物において融合タンパク質として発現されることが可能である、核酸コンストラクトが本明細書中で提供される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、２７〜４６、４９、５６もしくは６８の何れか１つ、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９、不活性Ｃａｓ９またはＣｐｆ１は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、５０、５２、６９、７２〜７８もしくは８６〜９２の何れか１つ、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチド配列は、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、４７、５５、６２、６４、６６、７０もしくは７９の何れか１つ、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、インテグラーゼ、レコンビナーゼまたはトランスポサーゼは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２５、２６、４８、６３、６５、６７、７１もしくは８０の何れか１つ、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。また、本核酸コンストラクトを含む生物も本明細書中で記載される。また、修飾ゲノムを有する、融合タンパク質を含む生物も本明細書中で記載される。
【００１０】
ａ）Ｃａｓ９、不活性Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１またはその一部をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、ｂ）インテグラーゼ、レコンビナーゼもしくはトランスポサーゼまたはその一部をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、ｃ）核酸リンカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列とを含む生物が本明細書中で提供され、ここで、この第１のポリヌクレオチド配列は５’および３’末端を含み、かつ第２のポリヌクレオチド配列は５’および３’末端を含み、および第１のポリヌクレオチドの３’末端は核酸リンカーによって第２のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、かつこの第１および第２のポリヌクレオチドは細胞または生物において融合タンパク質として発現されることが可能である。
【００１１】
また、ａ）触媒能のないＣａｓ９、Ｃａｓ９、ＴＡＬＥタンパク質、ジンクフィンガータンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である第１のタンパク質であって、標的ＤＮＡ配列を標的とする第１のタンパク質と、ｂ）インテグラーゼ、レコンビナーゼまたはトランスポサーゼである第２のタンパク質と、ｃ）第１のタンパク質を第２のタンパク質に連結するリンカーとを含む融合タンパク質も本明細書中で提供される。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質はインテグラーゼであり、このインテグラーゼはＨＩＶ１インテグラーゼまたはレンチウイルスインテグラーゼであり、リンカー配列はアミノ酸長が１以上であるか、または第１のタンパク質は触媒能のないＣａｓ９である。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、４〜８アミノ酸長であり、第１のタンパク質はＴＡＬＥタンパク質であるか、または第１のタンパク質はジンクフィンガータンパク質である。いくつかの実施形態において、本融合タンパク質がＴＡＬＥまたはジンクフィンガータンパク質を含む場合、標的ＤＮＡ配列は約１６〜約２４塩基対長である。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質はＣａｓ９または触媒能のないＣａｓ９であり、約１６〜約２４塩基対の標的ＤＮＡ配列を標的とするために１つ以上のガイドＲＮＡが使用される。
【００１２】
また、ａ）ゲノムＤＮＡにおいて標的配列を同定することと、ｂ）ゲノムＤＮＡ中の標的配列を結合するように請求項１に記載の融合タンパク質を設計することと、３）ゲノムＤＮＡに組み込むための関心のあるＤＮＡ配列を設計することと、ｄ）細胞または生物に対して、細胞または生物への融合タンパク質および関心のあるＤＮＡ配列の移行を可能にする技術によって融合タンパク質および関心のあるＤＮＡ配列を提供することとを含み、関心のあるＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡ中の標的配列で組み込まれるようになる、ゲノムＤＮＡにＤＮＡ配列を挿入する方法も本明細書中で提供される。
【００１３】
また、ａ）標的ＤＮＡ配列に結合するように改変されている、Ｃａｓ９、触媒能のないＣａｓ９、ＴＡＬＥタンパク質、ジンクフィンガータンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である第１のタンパク質に対する第１のコード配列と、ｂ）インテグラーゼ、レコンビナーゼまたはトランスポサーゼである第２のタンパク質に対する第２のコード配列と、ｃ）第１のタンパク質と第２のタンパク質との間でアミノ酸リンカーを形成する、第１のコード配列と第２のコード配列との間のＤＮＡ配列と、ｄ）任意選択により、インテグラーゼによって認識されるａｔｔ部位によって取り囲まれる発現された関心のあるＤＮＡ配列および任意選択により１つ以上のガイドＲＮＡとを含み、第１のタンパク質が、所定のＤＮＡ配列を標的とし、第１のタンパク質がアミノ酸リンカー配列によって第２のタンパク質に連結される、ヌクレオチドベクターも本明細書中で提供される。
【００１４】
細胞または生物において遺伝子転写を阻害する方法が本明細書中で提供され、この方法は、ａ）遺伝子中のＡＴＧ開始コドンを同定することと、ｂ）遺伝子のＡＴＧ開始コドンの直後の標的配列に結合するように、請求項１に記載の融合タンパク質を用いて融合タンパク質系を設計することと、ｃ）１つ以上の連続停止コドンである関心のあるＤＮＡ配列を設計することと、ｄ）細胞または生物に対して、細胞または生物への融合タンパク質および関心のあるＤＮＡ配列の移行を可能にする技術によって融合タンパク質および関心のあるＤＮＡ配列を提供することとを含み、関心のあるＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡ中の標的配列において組み込まれるようになり、遺伝子の転写が阻害される。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質はレコンビナーゼであり、レコンビナーゼはＣｒｅレコンビナーゼまたはその修飾型であり、この修飾型Ｃｒｅレコンビナーゼは構成的なレコンビナーゼ活性を有する。ある実施形態において、細胞で発現される逆転写酵素遺伝子をさらに含むベクターである。
【００１５】
また、ＤＮＡ結合タンパク質／インテグラーゼ融合物の精製タンパク質と、約１５〜約１００塩基対長のＲＮＡとを含む組成物も本明細書中で提供され、この場合、ＤＮＡ結合タンパク質は、ゲノム中の標的化ＤＮＡ配列に対して改変されているＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガータンパク質から選択され、このインテグラーゼはＨＩＶインテグラーゼ、レンチウイルスインテグラーゼ、アデノウイルスインテグラーゼ、レトロウイルスインテグラーゼまたはＭＭＴＶインテグラーゼである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
以下の説明、添付の特許請求の範囲および付随する図面に関して、本開示のこれらおよび他の特性、態様および長所がより詳細に理解される。
【００１７】
【図１】図１は、ａ）代表的な触媒能のないＣａｓ９／ＨＩＶ１インテグラーゼ融合タンパク質、ｂ）代表的なＴＡＬＥ／ＨＩＶ１インテグラーゼ融合タンパク質、ｃ）代表的なジンクフィンガータンパク質／ＨＩＶ１インテグラーゼ融合タンパク質およびｄ）標的化部位でＤＮＡの逆側に設計される代表的なＣａｓ９／ＨＩＶ１インテグラーゼ融合タンパク質を示す。各融合タンパク質はＤＮＡの特異的な標的配列に結合する。「ＺｎＦｎ」は、ジンクフィンガータンパク質である。「インテグラーゼ」は、１インテグラーゼ単位または例えば短いアミノ酸リンカーにより連結される２インテグラーゼ単位に相当する。いくつかの実施形態において、インテグラーゼをレコンビナーゼに置き換え得る。Ｃａｓ９は、触媒能があるかまたはないものであり得る。
【図２】図２は、触媒能のないＣａｓ９／インテグラーゼ融合タンパク質を含むベクター、関心のあるＤＮＡ配列を含むベクターおよび逆転写酵素を含むベクターを含むＤＮＡプラスミド系を示す。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはＲＮＡは別個に提供され得る。ｇＲＮＡを発現させるために別のベクターを使用し得る。「１または２」とは、１つのインテグラーゼまたは例えばアミノ酸リンカーにより連結される２つのインテグラーゼを指す。
【図３】図３は、ヌクレイオチド（ｎｕｃｌｅｉｏｔｉｄｅ）配列、触媒能のないＣａｓ９／インテグラーゼ融合タンパク質、ガイドＲＮＡ、関心のあるＤＮＡ（遺伝子）配列および逆転写酵素を含む代表的なＤＮＡプラスミドを示す。関心のあるＤＮＡ配列にウイルスａｔｔ部位を提供し得、それにより、細胞のゲノムＤＮＡへのインテグラーゼの組み込みが可能になる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはＲＮＡを別個に提供し得る。ｇＲＮＡを発現させるために別のベクターを使用し得る。「１または２」とは、１つのインテグラーゼまたは例えばアミノ酸リンカーにより連結される２つのインテグラーゼを指す。
【図４】図４は、流れ図を示す。図２および図３で示されるベクターを使用する、ある代表的な方法を図４で示し、これは以下のとおりである：１）逆転写酵素は、ベクターから発現されるａｔｔ部位がある関心のあるＤＮＡ配列を逆転写し（あるいはａｔｔ部位がある直線状ＤＮＡを使用する）、２）融合Ｃａｓ９／インテグラーゼは、ガイドＲＮＡに基づくゲノムＤＮＡ上の部位を標的とし、３）インテグラーゼは、関心のあるＤＮＡ配列上のａｔｔ（ＬＴＲ）部位を認識し、標的化部位でゲノムにＤＮＡを組み込み、４）関心のあるＤＮＡ配列の正確な挿入について調べるためにアッセイ（例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行う。非特異的な組み込みについて調べるためにアッセイを行い得る。
【図５】図５は、ガイドＮｒＦ２−ｓｇＲＮＡ２およびｓｇＲＮＡ３を用いた、Ｎｒｆ２のエクソン２を標的とするＡｂｂｉｅ１遺伝子編集を示す。
【図６】図６は、Ａｂｂｉｅ１遺伝子編集により生成された理論的データを示す。
【図７】図７は、ガイドＮｒｆ２−ｓｇＲＮＡ３を使用した、Ｎｒｆ２のエクソン２を標的とするＡｂｂｉｅ１遺伝子編集を示す。
【図８】図８は、プールＨｅｋ２９３Ｔ−細胞におけるＮｒｆ２のＡｂｂｉｅ１ノックアウトを示す。
【図９】図９は、プールＨｅｋ２９３Ｔ−細胞におけるＮｒｆ２のＡｂｂｉｅ１ノックアウトを示す。
【図１０】図１０は、ＣＸＣＲ４エクソン２を標的とするＡｂｂｉｅ１遺伝子編集を示す。
【図１１】図１１は、大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）クーマシー染色ゲルからの単離および精製後のＡＢＢＩＥ１タンパク質の検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
当業者の本開示の実施を支援するために以下の詳細な説明を提供する。それにもかかわらず、本発見の趣旨または範囲から逸脱することなく、本明細書中で論じる実施形態における修正形態および変形形態が当業者によりなされ得るため、本開示を過度に限定するものとしてこの詳細な説明を解釈すべきではない。
【００１９】
本開示および添付の特許請求の範囲中で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容から別段の明らかな指示がない限り、複数への言及を含む。本開示および添付の特許請求の範囲中で使用される場合、「または」という語は、単数であってもよく、または包括的であってもよい。例えば、ＡまたはＢはＡおよびＢであり得る。
【００２０】
内因性
本明細書中で記載される場合、内因性核酸、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主生物との関連において定められる。内因性核酸、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主生物において天然に生じるものである。
【００２１】
外来性
本明細書中で記載される場合、外来性核酸、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主生物との関連において定められる。外来性核酸、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主生物において天然に生じないか、または宿主生物において異なる位置にあるものである。
【００２２】
ノックアウト
（例えば、ランダム挿入または相同組み換えによって）外来性核酸が宿主生物中に形質転換され、その結果、（例えば、欠失、挿入によって）遺伝子が破壊される場合、遺伝子がノックアウトされたとみなされる。
【００２３】
遺伝子をノックアウトすると、対応するタンパク質の活性が低下し得る。例えば、遺伝子がノックアウトされていない同じタンパク質の活性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％である。
【００２４】
遺伝子をノックアウトすると、遺伝子がノックアウトされていない場合と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％だけ遺伝子の転写が低下し得る。
【００２５】
修飾
修飾された生物は、非修飾生物と異なる生物である。例えば、修飾された生物は、標的遺伝子配列のノックアウトを引き起こす本開示の融合タンパク質を含み得る。修飾された生物は、修飾されたゲノムを有し得る。
【００２６】
修飾された核酸配列またはアミノ酸配列は、非修飾核酸配列またはアミノ酸配列と異なる。例えば、核酸配列は、１つ以上の核酸が挿入、欠失または付加され得る。例えば、アミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または付加があり得る。
【００２７】
操作可能な連結
いくつかの実施形態において、ベクターは、プロモーターおよび／または転写終結因子などの１つ以上の調節エレメントに操作可能に連結されるポリヌクレオチドを含む。核酸配列が別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、核酸配列は操作可能に連結されている。例えば、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡがポリペプチドに対するＤＮＡに操作可能に連結され、配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に操作可能に連結され、または翻訳を促進するように置かれる場合、リボソーム結合部位が操作可能にコード配列に連結される。操作可能に連結される配列は近接し得、分泌リーダーの場合、近接し得、リーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）にある。
【００２８】
宿主細胞または宿主生物
宿主細胞は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は多細胞生物の一部である。他の実施形態において、宿主細胞は単細胞生物として培養される。
【００２９】
宿主生物は、何らかの適切な宿主、例えば微生物を含み得る。本明細書中に記載の方法に有用な微生物としては、例えば、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））および植物が挙げられる。生物は原核または真核であり得る。生物は単細胞または多細胞であり得る。
【００３０】
宿主細胞は原核性であり得る。適切な原核細胞としては、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）およびシゲラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）の何らかの様々な研究用の株（例えば、Ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１７６−１１８１；米国特許第６，４４７，７８４号明細書；およびＳｉｚｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２９９−３０２に記載のとおり）が挙げられるが限定されない。本開示で使用され得るサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌種の例としては、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）およびＳ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が挙げられるが限定されない。適切なシゲラ（（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌種としては、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）およびシゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｉｓｅｎｔｅｒｉａｅ）が挙げられるが限定されない。一般的には、研究用の菌種は、非病原性であるものである。他の適切な細菌の非限定例としては、シュードモナス・プディタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・メバロニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドバクター・カプスラツス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドスピリラム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）およびロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）が挙げられるが限定されない。
【００３１】
いくつかの実施形態において、宿主生物は真核性である。適切な真核宿主細胞としては、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞および藻類細胞が挙げられるが限定されない。
【００３２】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド［核酸およびタンパク質］
本開示のタンパク質は当技術分野で公知の何らかの方法により作製され得る。固相ペプチド合成を使用するか、または液相ペプチド合成としても知られる古典的な溶液ペプチド合成によるかの何れかでタンパク質を合成し得る。Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、出発鋳型としてエナラプリルおよびリシノプリルを使用し、固相または液相ペプチド合成を使用して、いくつかの一連のペプチド類似体、例えばＸ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｘ−Ａｌａ−ＰｒｏおよびＸ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏなど（式中、Ｘは何らかのアミノ酸残基に相当する）を合成し得る。可溶性のオリゴマー支持体にカップリングされたペプチドおよびオリゴヌクレオチドのライブラリの液相合成を行うための方法は既に記載されている。Ｂａｙｅｒ，Ｅｒｎｓｔ  ａｎｄ  Ｍｕｔｔｅｒ，Ｍａｎｆｒｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ２３７：５１２−５１３（１９７２）；Ｂａｙｅｒ，Ｅｒｎｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６：７３３３−７３３６（１９７４）；Ｂｏｎｏｒａ，Ｇｉａｎ  Ｍａｒｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３１５５−３１５９（１９９０）。液相合成法は、固相への反応物質の連結に適切な第１の反応物質上に存在する構造を必要としないという点で固相合成法を上回る長所がある。また、液相合成法は、固相と第１の反応物質（または中間体産物）との間の結合を切断し得る化学的条件を回避する必要がない。さらに、均一溶液中での反応は、固相合成中に存在するものなど、不均一な固相／液相系で得られるものよりも良好な収率および完全な反応を与え得る。
【００３３】
オリゴマー支持液相合成において、伸長生成物は大きい可溶性のポリマー基に連結される。次いで、本合成の各段階からの生成物は、比較的大きいポリマーに連結された生成物と未反応の反応物との間のサイズの大きい相違に基づいて未反応反応物から分離し得る。これにより、均一溶液中で反応を行うことが可能になり、従来の液相合成に伴う冗漫な精製段階が削除される。オリゴマー支持液相合成はペプチドの自動液相合成にも適応させられている。Ｂａｙｅｒ，Ｅｒｎｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２６−４３２。
【００３４】
固相ペプチド合成の場合、手順には、伸長するペプチドの末端を不溶性支持体に連結すると同時に、所望の配列のペプチドに適切なアミノ酸を連続的にアセンブリすることが伴う。通常、ペプチドのカルボキシル末端はポリマーに連結されるが、これは切断試薬での処理時にポリマーから遊離し得る。一般的な方法において、アミノ酸はレジン粒子に結合され、アミノ酸の鎖を生成させるために、保護されたアミノ酸の連続的付加によって段階的にペプチドが生成する。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより記載される技術の改変が一般的に使用される。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６：２９８９−９３（１９６４）を参照されたい。自動化固相法において、ペプチドは、カルボキシ末端アミノ酸を有機リンカー（例えば、ＰＡＭ、４−オキシメチルフェニルアセトアミドメチル）上にローディングし、これをジビニルベンゼンで架橋された不溶性のポリスチレンレジンに共有結合させることによって合成される。末端アミンは、ｔ−ブチルオキシカルボニルでブロックすることによって保護し得る。ヒドロキシルおよびカルボキシル基は、Ｏ−ベンジル基でブロックすることによって一般的に保護される。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なものなど、自動化ペプチド合成装置において合成を遂行する。合成後、レジンから生成物を取り出し得る。確立された方法に従い、フッ化水素酸またはトリフルオロメチルスルホン酸を使用することにより、ブロッキング基を除去する。通常の合成では０．５ｍｍｏｌｅのペプチドレジンが生じ得る。切断および精製後、一般的にはおよそ６０〜７０％の収率が得られる。生成物ペプチドの精製は、例えば、メチル−ブチルエーテルなどの有機溶媒からペプチドを結晶化し、次いで蒸留水中で溶解させ、および透析（対象ペプチドの分子量が約５００ダルトンを超える場合）またはペプチドの分子量が５００ダルトン未満である場合には逆高圧液体クロマトグラフィー（例えば、溶媒として０．１％トリフルオロ酢酸およびアセトニトリルを用いてＣ１８カラムを使用）を使用することによって遂行される。精製ペプチドを凍結乾燥し、使用まで乾燥状態で保存し得る。得られたペプチドの分析は、分析的高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびエレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）の一般的な方法を使用して遂行され得る。
【００３５】
他の場合において、タンパク質、例えばタンパク質は組み換え法により作製される。本明細書中に記載のタンパク質の何れかの作製のために、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞を使用し得る。宿主細胞は、高等真核細胞、例えば哺乳動物細胞など、または下等真核細、例えば酵母などであり得るか、または宿主は、細菌細胞などの原核細胞であり得る。宿主細胞への発現ベクターの導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストランが介在する形質移入、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、核への直接的なマイクロインジェクション、スクレイプローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、微粒子銃形質転換およびエレクトロポレーションを含む様々な方法によって遂行され得る。組み換え生物からのタンパク質の大規模産生は、商業スケールで実施されるよく確立された工程であり、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００３６】
コドン最適化
コードポリヌクレオチドの１つ以上のコドンは、宿主生物のコドン使用を反映させるために「偏向」または「最適化」され得る。例えば、コードポリヌクレオチドの１つ以上のコドンは、葉緑体コドン使用または核コドン使用を反映させるために「偏向」または「最適化」され得る。殆どのアミノ酸は、２つ以上の異なる（縮重）コドンによりコードされ、様々な生物が他よりも優先して一定のコドンを利用することはよく認識されている。「偏向」または「最適化」コドンは、本願全体を通して交換可能に使用され得る。コドン偏向は、タバコと比較した場合、例えば藻類を含め、様々な植物において様々に歪められ得る。一般に、選択されるコドン偏向は、本開示の核酸で形質転換されている植物（またはその中の小器官）のコドン使用を反映する。
【００３７】
特定のコドン使用に対して偏りがあるポリヌクレオチドは、デノボ合成され得るか、または葉緑体コドン使用について偏りがあるように１つ以上のコドンを変化させるため、通常の組み換えＤＮＡ技術を用いて例えば部位特異的突然変異誘発法によって遺伝的に修飾され得る。
【００３８】
パーセント配列同一性
核酸またはポリペプチド配列間でパーセント配列同一性または配列類似性を決定するための適切であるアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公開されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５に記載のとおり）を使用する。パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析も行い得る（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記載のとおり）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性のある目安は、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約０．１未満、約０．０１未満、および約０．００１未満である場合、参照配列と同様とみなされる。
【００３９】
本開示は、Ａ）例えばＤＮＡ切断能について不活性であるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に共有結合されるウイルスインテグラーゼ（またはレコンビナーゼ）を含む系を含む。あるいは、ＴＡＬＥタンパク質またはジンクフィンガータンパク質がゲノム中のＤＮＡの特異的な配列を標的とするように設計される場合、ＴＡＬＥタンパク質またはジンクフィンガータンパク質にウイルスインテグラーゼ（または細菌またはファージレコンビナーゼ）が共有結合される。
【００４０】
これは、発現ベクターにおいてまたは精製タンパク質として提供され得る。Ｂ）所望のゲノムに組み込まれる相同アームがあるかまたはない関心のある遺伝子（または関心のあるＤＮＡ配列）。必要に応じて、ウイルスインテグラーゼにより認識させるためにＧＯＩまたは関心のあるＤＮＡ配列を修飾し得る。例えば、ＤＮＡ配列の末端にウイルスａｔｔ部位を付加し得る。Ｃ）細胞へのポリヌクレオチド形質移入および／またはタンパク質導入に必要とされる他の試薬。
【００４１】
核酸
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本開示において交換可能に使用される。これらは、あらゆる長さのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの何れかのヌクレオチドのポリマー形態またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、何らかの三次元構造を有し得、既知または未知の何らかの機能を発揮し得る。以下のものはポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定められる遺伝子座（複数の遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、何らかの配列の単離ＤＮＡ、何らかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などを含み得る。存在する場合、ポリマーのアセンブリ前または後にヌクレオチド構造に対する修飾が与えられ得る。ヌクレオチドの配列には非ヌクレオチド構成要素が割り込み得る。ポリヌクレオチドは、標識化構成成分との抱合反応などによってポリマー化後にさらに修飾され得る。
【００４２】
ガイドＲＮＡ
本開示の態様において、「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単ガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」という用語は、交換可能に使用され、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメート（ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ）配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「ガイド配列」という用語は、標的部位を規定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐ（１２〜３０ｂｐ）配列を指し、「ガイド」または「スペーサー」という用語と交換可能に使用され得る。「ｔｒａｃｒメート配列」という用語は、「ダイレクトリピート」という用語とも交換可能に使用され得る。
【００４３】
野生型
本明細書中で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者により理解される当技術分野の用語であり、突然変異体または変異体形態と区別される場合、天然で生じるような生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。
【００４４】
変異体
本明細書中で使用される場合、「変異体」または「突然変異体」という用語は、天然に生じるものから逸脱するパターンを有する質の提示を意味するものと解釈すべきである。遺伝子と関連して、これらの用語は、とりわけ、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、遺伝子シフトを含め、それを野生型遺伝子と異なるものとする遺伝子における多くの変化を示す。
【００４５】
改変
「非天然」または「改変」という用語は、交換可能に使用され、人為的な技術の関与を指す。これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、核酸分子またはポリペプチドが、それらが自然界で天然に結び付き、かつ天然で見られるような少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【００４６】
相補性
「相補性」とは、古典的なワトソン−クリックまたは他の非古典的タイプの何れかにより、核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合を形成し得る（例えば、ワトソン−クリック塩基対）核酸分子中の残基のパーセンテージを指す（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）。「完全に相補性」とは、核酸配列の全ての近接残基が第２の核酸配列中の同じ数の近接残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補性」とは、本明細書中で使用される場合、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％または８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれを超えるヌクレオチドの領域にわたる間のパーセンテージである相補性の度合いを指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する２個の核酸を指す。
【００４７】
アミノ酸
正式名称、３文字コード、１文字コード
アスパラギン酸  Ａｓｐ  Ｄ
グルタミン酸  Ｇｌｕ  Ｅ
リジン  Ｌｙｓ  Ｋ
アルギニン  Ａｒｇ  Ｒ
ヒスチジン  Ｈｉｓ  Ｈ
チロシン  Ｔｙｒ  Ｙ
システイン  Ｃｙｓ  Ｃ
アスパラギン  Ａｓｎ  Ｎ
グルタミン  Ｇｌｎ  Ｑ
セリン  Ｓｅｒ  Ｓ
スレオニン  Ｔｈｒ  Ｔ
グリシン  Ｇｌｙ  Ｇ
アラニン  Ａｌａ  Ａ
バリン  Ｖａｌ  Ｖ
ロイシン  Ｌｅｕ  Ｌ
イソロイシン  Ｉｌｅ  Ｉ
メチオニン  Ｍｅｔ  Ｍ
プロリン  Ｐｒｏ  Ｐ
フェニルアラニン  Ｐｈｅ  Ｆ
トリプトファン  Ｔｒｐ  Ｗ
【００４８】
「アミノ酸」という表現は、本明細書中で使用される場合、天然および合成両方のアミノ酸およびＤおよびＬアミノ酸の両方を含むものとする。「標準アミノ酸」とは、天然のタンパク質／ペプチドにおいて一般的に見られる２０種類の標準的なＬ−アミノ酸の何れかを意味する。「非標準アミノ酸残基」とは、合成により調製されるかまたは天然起源であるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の何らかのアミノ酸を意味する。本明細書中で使用される場合、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）および置換を含むが限定されない、化学的に修飾されたアミノ酸を包含する。本開示のペプチド内に、および特にカルボキシまたはアミノ末端で含有されるアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化または活性に悪影響を与えることなくペプチドの循環半減期を変化させ得る他の化学基での置換により修飾され得る。さらに、ジスルフィド結合がペプチド中に存在してもよいかまたは存在しなくてもよい。
【００４９】
アミノ酸は、側鎖Ｒに基づいて７個の群に分類され得る：（１）脂肪族側鎖；（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含有する側鎖；（３）硫黄原子を含有する側鎖；（４）酸性またはアミド基を含有する側鎖；（５）塩基性基を含有する側鎖；（６）芳香環を含有する側鎖；および（７）プロリン、側鎖がアミノ基に融合されるイミノ酸。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、以下の５つの群の１つ内の交換として本明細書中で定義される。
Ｉ．小さい脂肪族、非極性または僅かに極性のある残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性、負荷電残基およびそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ；
ＩＩＩ．極性、正荷電残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．大きい脂肪族、非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ（Ｉｌｅ；オートコレクトはリテレート（ｌｉｔｅｒａｔｅ）ではない）
Ｖ．大きい芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｉｐ（同様にＴｒｐ）
【００５１】
本開示は、別段の提供がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノムおよび組み換えＤＮＡの従来技術を利用し、これは、当技術分野の技術の範囲内である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。
【００５２】
ベクター
細胞または組織において融合インテグラーゼを発現させ、かつ関心のあるＤＮＡ（または遺伝子）を宿主種または細胞のゲノムに組み込むためのインテグラーゼまたはレコンビナーゼに必要とされる適切な部位がある関心のあるＤＮＡ配列（または遺伝子）を提供するために遺伝子発現ベクター（ＤＮＡに基づくかまたはウイルス性）を使用する。多くの遺伝子発現ベクターが当技術分野で公知である。ベクターは、関心のある遺伝子（または関心のあるＤＮＡ配列）に対する使用である。当技術分野で公知の多くの制限酵素を用いてベクターを切断し得る。
【００５３】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、米国特許第８６９７３５９号明細書、同第８８８９３５６号明細書およびＲａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１３，ｖｏｌｕｍｅ  ８，ｐａｇｅｓ  ２２８１−２３０８）に記載されている。Ｃａｓ９タンパク質は、ゲノム中のＤＮＡの特異的な配列に結合するためにＲＮＡガイドを利用する。ＲＮＡガイド（ガイドＲＮＡ）は、１０〜４０、１２〜３５、１５〜３０または例えば１８〜２２または２０ヌクレオチド長になるように設計され得る。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９を使用する、Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１３，ｖｏｌｕｍｅ  ３１，ｐａｇｅｓ  ８２７−８３２を参照されたい。別の重要なＣａｓ９は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ）由来（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）よりも小さいＣａｓ９）である。Ｃａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ配列の特異的領域に結合するためにガイドＲＮＡを利用する。
【００５４】
Ｃａｓ９の触媒能のない形態は、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｒｉｌ  ２５，２０１４，ｖｏｌｕｍｅ  ３２，ｐａｇｅｓ  ５７７−５８２に記載されている。Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒらは、触媒能のないＣａｓ９をＦｏｋ１酵素に連結させて、ゲノムＤＮＡにおいて切断させることにおいてより大きい特異性を達成した。この触媒能のないＣａｓ９により、ゲノムＤＮＡの結合のためにＣａｓ９がＲＮＡガイドを使用できるようになり、同時にこれはこのＤＮＡを切断できない。
【００５５】
Ｃａｓ９は、細胞でのＣａｓ９コンストラクトのより良好な発現のためにその天然ｗｔ型およびまたヒト最適化コドン形態でも利用可能である（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，ｖｏｌｕｍｅ  ３３９，ｐａｇｅｓ  ８２３−８２６を参照されたい）。Ｃａｓ９のコドン最適化は、その発現のための種に依存して行い得る。インテグラーゼ／Ｃａｓ９融合タンパク質（ＡＢＢＩＥ１としても知られる）のタンパク質形態を生成させるかまたはヌクレオチド発現ベクター形態を生成させるかに依存して、最適化または非最適化（ｗｔ）形態を使用し得る。
【００５６】
特異的なＤＮＡ配列に対するＲＮＡガイドは、様々なコンピュータに基づくツールによって設計し得る。
【００５７】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＰＦ１
Ｃｐｆ１は、ゲノムＤＮＡ中の特異的な配列に結合するためにガイドＲＮＡを使用する別のタンパク質である。Ｃｐｆ１はまた、ＤＮＡを切断し、ねじれ型の切断にする。Ｃｐｆ１は、切断能について触媒的に不活性にされ得る。
【００５８】
他のＣＲＩＳＰＲタンパク質
これらは、特異的なＤＮＡ配列を標的とするために、かつそれらがＤＮＡ切断能を有するか否かにかかわらずガイドＲＮＡを利用するタンパク質である。これらのタンパク質の一部は他の酵素／触媒機能を天然に有し得る。
【００５９】
ＴＡＬＥＮ
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって作製される制限酵素との融合タンパク質である。これらの試薬は、効率的でプログラム可能であり、特異的なＤＮＡ切断を可能にし、インサイチューでのゲノム編集のための強力なツールとなる。実際に何らかのＤＮＡ配列に結合するように転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を迅速に改変し得る。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書中で使用される場合、別のＴＡＬＥＮからの支援なく２本鎖ＤＮＡを切断し得る単量体のＴＡＬＥＮを広く含む。ＴＡＬＥＮという用語は、一緒に作用して同じ部位でＤＮＡを切断するために改変されるＴＡＬＥＮのペアの一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に作用するＴＡＬＥＮは、左−ＴＡＬＥＮおよび右−ＴＡＬＥＮと呼ばれ得、これはＤＮＡの硬さに言及する。米国特許第８，４４０，４３２号明細書を参照されたい。
【００６０】
ＴＡＬエフェクターは、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸を除き、保存性が高い３３〜３４アミノ酸配列を含有する。これらの２つの位置は変動性が高く（反復変動二残基（Ｒｅｐｅａｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ）（ＲＶＤ））、特異的なヌクレオチド認識との強い相関を示す。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間のこの単純な関係性により、適切なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組み合わせを選択することによって特異的なＤＮＡ結合ドメインの改変が可能になっている。
【００６１】
酵母または細胞アッセイにおいて活性のあるハイブリッドインテグラーゼまたはレコンビナーゼを構築するためにインテグラーゼまたはレコンビナーゼを使用し得る。これらの試薬は、植物細胞および動物細胞でも活性がある。ＴＡＬＥＮの研究は野生型Ｆｏｋ１切断ドメインを使用したが、一部のその後のＴＡＬＥＮ研究は、切断特異性および切断活性を向上させるように設計された突然変異があるＦｏｋ１切断ドメイン変異体も使用した。ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインとインテグラーゼまたはレコンビナーゼドメインとの間のアミノ酸残基数および２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基数の両方とも、高レベルの活性を達成するためのパラメーターである。ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインとインテグラーゼまたはレコンビナーゼドメインとの間のアミノ酸残基数は、複数のＴＡＬエフェクターリピート配列とインテグラーゼまたはレコンビナーゼドメインとの間のスペーサー（スペーサー配列とは別個）の導入により修飾され得る。スペーサー配列は、６〜１０２または９〜３０個のヌクレオチドまたは１５〜２１個のヌクレオチドであり得る。これらのスペーサーは、通常、ＤＮＡ標的化タンパク質（Ｃａｓ９、ＴＡＬＥまたはジンクフィンガータンパク質）とインテグラーゼまたはレコンビナーゼとの間の連結を提供すること以外に、ハイブリッドタンパク質に対して他の活性を提供しない。本開示におけるスペーサーおよび他の使用に対するアミノ酸である。
【００６２】
ＴＡＬＥＮ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の関係は、明示できるタンパク質を考慮に入れる。この場合、ＴＡＬＥ結合ドメインで見られる反復配列の不適切なアニーリングのために人工的遺伝子合成は問題となる。これに対するある解決策は、２段階ＰＣＲ；オリゴヌクレオチド組み立ておよびそれに続く全遺伝子増幅での組み立てに適切なオリゴヌクレオチドを発見するため、ＤＮＡＷｏｒｋｓという名称の公開ソフトウェアプログラムを使用することである。改変ＴＡＬＥコンストラクトを作製するための多くのモジュラー組み立て方法も当技術分野で報告されている。
【００６３】
ＴＡＬＥＮ遺伝子を一緒に組み立てたら、これらをプラスミドに挿入し、次いでプラスミドを使用して、遺伝子産物を発現させる標的細胞に対して形質移入を行い、核に移行させてゲノムに到達させる。ＴＡＬＥＮは、２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによってゲノムを編集するために使用され得、この細胞はＤＮＡ修復に応答するが、本開示は、関心のあるＤＮＡ配列をゲノム中の標的化部位に挿入するためにウイルスインテグラーゼまたは細菌もしくはファージレコンビナーゼの力を使用しようとするものである。国際公開第２０１４１３４４１２号パンフレットおよび米国特許第８７４８１３４号明細書の開示を参照されたい。
【００６４】
ジンクフィンガータンパク質
ＤＮＡ結合のためのジンクフィンガータンパク質およびそれらの設計は、米国特許第７９２８１９５号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１１１１８８号明細書および米国特許第７９５１９２５号明細書に記載されている。ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡの特異的配列に結合するために、指定の順序でいくつかの連結されるジンクフィンガードメインを利用する。ジンクフィンガータンパク質エンドヌクレアーゼはよく確立されている。
【００６５】
ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は、配列特異的にＤＮＡに結合し得るタンパク質である。ジンクフィンガーは、最初に、アフリカツメガエル、ゼノパス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞からの転写因子ＴＦＩＩＩＡにおいて同定された。ＺＦＰのこのクラスの単一ジンクフィンガードメインは、約３０アミノ酸長であり、いくつかの構造研究から、（２個の保存的システイン残基を含有する）ベータターンおよび（２個の保存的ヒスチジン残基を含有する）アルファヘリックスを含有することが明らかになっており、この２個のシステインおよび２個のヒスチジンによる亜鉛原子の配位を通じて特定の高次構造で保持される。このクラスのＺＦＰは、Ｃ２Ｈ２  ＺＦＰとしても知られる。ＺＦＰのさらなるクラスも示唆されている。例えば、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（Ｃ３Ｈ）ＺＦＰの考察に対するＪｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０７２３−１０７３０を参照されたい。現在までに、数千個の既知または推定転写因子において１０，０００個を超えるジンクフィンガー配列が同定されている。ジンクフィンガードメインは、ＤＮＡ認識だけでなく、ＲＮＡ結合およびタンパク質−タンパク質結合にも関与する。現在、このクラスの分子は全ヒト遺伝子の約２％にのぼると推定される。
【００６６】
多くのジンクフィンガータンパク質は、各フィンガードメインで１個の亜鉛原子を四面配位させる保存的なシステインおよびヒスチジン残基を有する。特に、殆どのＺＦＰは、一般配列：−Ｃｙｓ−（Ｘ）２−４−Ｃｙｓ−（Ｘ）１２−Ｈｉｓ−（Ｘ）３−５−Ｈｉｓ−（配列番号４９、式中、Ｘは何らかのアミノ酸に相当する（Ｃ２Ｈ２  ＺＦＰ））のフィンガー構成要素を特徴とする。この最も幅広く代表される亜鉛−配位配列は、特定のスペーシングがある２個のシステインおよび２個のヒスチジンを含有する。各フィンガーの折り畳まれた構造は、逆平行β−ターン、フィンガーチップ領域および短い両親媒性α−ヘリックスを含有する。金属配位リガンドは、亜鉛イオンに結合し、ｚｉｆ２６８型ジンクフィンガーの場合、短い両親媒性α−ヘリックスがＤＮＡの主溝に結合する。さらに、ジンクフィンガーの構造は、ある種の保存的疎水性アミノ酸残基（例えば、第１の保存的Ｃｙｓの直前の残基およびフィンガーのヘリックスセグメントの位置＋４の残基）により、かつ保存的システインおよびヒスチジン残基を通じた亜鉛配位により安定化される。
【００６７】
ゲノムＤＮＡ中の特異的な標的配列に結合し得る他のＤＮＡ結合タンパク質
本タンパク質は、様々な生物のゲノムＤＮＡ中の特異的な配列に結合し得る、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲタンパク質と無関係なものを含む。これらは、転写因子、転写リプレッサー、メガヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインなどを含み得る。
【００６８】
インテグラーゼ
インテグラーゼおよびそのエンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、米国特許出願公開第２００９／００１１５０９号明細書に記載されている。導入されるインテグラーゼは、レンチウイルスインテグラーゼおよびＨＩＶ１（ヒト免疫不全ウイルス１）インテグラーゼである。本開示は、使用者により選択されるゲノム中のＤＮＡの特異的な領域にインテグラーゼを標的化するため、触媒能のない（または触媒活性のある）Ｃａｓ９、ＴＡＬＥまたはジンクフィンガータンパク質をインテグラーゼに融合させる。
【００６９】
他のレトロウイルスインテグラーゼのように、ＨＩＶ−１インテグラーゼは、長い末端反復配列（ＬＴＲ）のＵ３およびＵ５領域に位置するウイルスＤＮＡ末端の特別な特性を認識可能である（Ｂｒｏｗｎ，１９９７）。ＬＴＲ末端は、レトロウイルスの組み込み機構による認識のためにシスで必要とされると思われる単なるウイルス配列である。短い不完全な逆方向反復は、マウスおよび鳥類レトロウイルスの両方においてＬＴＲの外縁に存在する（Ｒｅｉｃｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５により概説）。レトロウイルスＤＮＡ末端において最も外側の位置３および４に位置するサブターミナル（ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌ）ＣＡと一緒に（位置１および２は３’末端プロセシングヌクレオチドである、これらの配列は、インビトロおよびインビボでの正確なプロウイルス組み込みに必要かつ十分である。ＣＡジヌクレオチドに対して内部にある配列は、最適インテグラーゼ活性のために重要であると思われる（Ｂｒｉｎ＆Ｌｅｉｓ，２００２ａ；Ｂｒｉｎ＆Ｌｅｉｓ，２００２ｂ；Ｂｒｏｗｎ，１９９７）。ＨＩＶ−１  ＬＴＲの末端１５ｂｐは、インビトロでの正確な３’末端プロセシングおよび鎖転移反応にとって重大なものあることが示されている（Ｒｅｉｃｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｂｒｏｗｎ，１９９７）。より長い基質は、結合相互作用がウイルスＤＮＡ末端から内側に少なくとも１４〜２１ｂｐ伸長することを示すＨＩＶ−１  ＩＮにより、短いものよりも効率的に使用される。Ｂｒｉｎ＆Ｌｅｉｓ（２００２ａ）は、ＨＩＶ−１  ＬＴＲの特異的な特性を分析し、Ｕ５  ＬＴＲがインビトロでのＩＮプロセシングに対してより効率的な基質であるにもかかわらず、Ｕ３およびＵ５  ＬＴＲ認識配列の両方がＩＮ−触媒型の協調したＤＮＡ組み込みに必要とされると結論付けた（Ｂｕｓｈｍａｎ＆Ｃｒａｉｇｉｅ，１９９１；Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。協調したＤＮＡ組み込み機序のためにＩＮ認識配列の位置１７〜２０が必要とされるが、ＨＩＶ−１  ＩＮは、不変のサブターミナル（ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌ）ＣＡジヌクレオチドから伸長するＵ３およびＵ５末端の両方において相当な変動を許容する（Ｂｒｉｎ＆Ｌｅｉｓ，２００２ｂ）。本開示は、ゲノムに組み込もうとする関心のあるＤＮＡ配列または遺伝子を収容するための位置の５’および３’末端でウイルス（レトロウイルスまたはＨＩＶ）ＬＴＲ領域を含有するＤＮＡベクターを含む。ＬＴＲ領域は、それらが正確な組み込みのためにインテグラーゼと相互作用するように機能する限り、全長ＬＴＲである必要はない。ＬＴＲ領域は、検出可能な（例えば、蛍光）ＰＣＲ検出または選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性）を含有するように修飾され得る。ベクターは、（制限エンドヌクレアーゼに対する設計された制限部位を介して）ＬＴＲ領域がＤＮＡ断片の５’および３’末端となるように切断され、直線化されるように設計される。
【００７０】
インテグラーゼは、可動性リンカーにより連結される３個のドメインからなる。これらのドメインは、Ｎ末端ＨＨ−ＣＣ亜鉛−結合ドメイン、触媒性コアドメインおよびＣ末端ＤＮＡ結合ドメインである（Ｌｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，ｖｏｌｕｍｅ  ３４，ｐａｇｅｓ  ９８２６−９８３３）。本開示のいくつかの態様において、Ｃａｓ９（または他のＤＮＡ結合分子）に結合されるインテグラーゼはＣ末端結合ドメインを有さない。本開示のある態様において、一方がインテグラーゼのＮ末端亜鉛結合ドメインと融合される触媒能のないＣａｓ９（またはＴＡＬＥもしくはジンクフィンガータンパク質）を有し、他方がインテグラーゼの触媒コアドメインと融合される触媒能のないＣａｓ９（またはＴＡＬＥまたはジンクフィンガータンパク質）を有する、２つの異なる融合タンパク質を作製する。この２つの異なる融合タンパク質は、ＴＡＬＥ−Ｆｏｋ１またはジンクフィンガー−Ｆｏｋ１系で見られるように、ゲノムＤＮＡの逆の鎖に結合するように設計される。このように、ゲノムＤＮＡ上の部位でＮ末端ドメインおよび触媒コアが接触する場合、これはインテグラーゼ活性を示す。インテグラーゼの完全活性がインテグラーゼの四量体を含むことも観察されているため、１〜２０アミノ酸長または４〜１２アミノ酸長であり得る可動性リンカーにより連結される１、２、３、４個のインテグラーゼタンパク質とともに、融合タンパク質が設計され得る。
【００７１】
レコンビナーゼ
Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｒ、Ｄｒｅ、ＫｗおよびＧｉｎレコンビナーゼを含むレコンビナーゼは、米国特許第８８１６１５３号明細書および米国特許出願公開第２００４／０００３４２０号明細書に記載される。Ｃｒｅレコンビナーゼなどのレコンビナーゼは、ゲノムから配列を切り出すためにＬｏｘＰ部位を使用する。レコンビナーゼは、それらの組み換え活性に対して構成的に活性となるように、およびまた部位特異性が低くなるようにも修飾され得る。したがって、本開示の融合タンパク質にそれらを組み込むことにより、ゲノム中のＤＮＡの特異的配列に対する配列特異性がないこのような構成的に活性のあるレコンビナーゼタンパク質を標的とすることが可能である。このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥまたはジンクフィンガータンパク質ドメインは、レコンビナーゼがその組み換え活性に寄与するＤＮＡ配列を指定する。このようなレコンビナーゼタンパク質は、野生型であるか、構成的に活性であるか、またはレコンビナーゼ活性について不活性であり得る。Ｃａｓ９−ＧｉｎまたはＣａｓ９−ＣｒｅなどのＣａｓ９−レコンビナーゼは、リンカー配列の使用または直接的な融合により作製され得る。
【００７２】
融合タンパク質に対する核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）
（「ＮＬＳ」とも呼ばれる）シグナルペプチドドメインは、例えば、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９またはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオーマウイルスラージＴタンパク質、ＶＰ１またはＶＰ２カプシドタンパク質、ＳＶ４０  ＶＰ１またはＶＰ２カプシドタンパク質、アデノウイルスＥ１ａまたはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原または哺乳動物ラミン、ｃ−ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ−ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ−ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体またはＭｘタンパク質（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｃａｒ．Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，３，１９３−２２７（１９９３）を参照されたい）、サルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ−抗原（Ｋａｌｄｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，３９，４９９−５０９（１９８４））または既知の核局在化がある他のタンパク質由来である。ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０Ｔ−抗原由来であるが、当技術分野で公知の他のＮＬＳ配列であり得る。タンデムＮＬＳ配列が使用され得る。
【００７３】
リンカー領域
合成される融合タンパク質／ペプチド間で使用される様々なリンカーはアミノ酸から構成される。ＤＮＡレベルにおいて、これらは、遺伝暗号において知られるように３塩基対（ｂｐ）コドンにより表される。リンカーは、１〜１０００アミノ酸長およびこの間の何れかの整数であり得る。例えば、リンカーは、１〜２００アミノ酸長であるか、またはリンカーは１〜２０アミノ酸長である。
【００７４】
発現ベクター
遺伝子の発現をもたらすために多くの核酸が細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび核酸類似体および２本鎖もしくは１本鎖（すなわちセンスまたはアンチセンス１本鎖）である核酸を含む。例えば、核酸の安定性、ハイブリッド形成または溶解度を改善するために塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で核酸類似体を修飾し得る。塩基部分での修飾には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジンおよびデオキシシチジンに対する５−メチル−２’デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−ドキシシチジン（ｄｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）を含む。糖部分の修飾は、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成させるためのリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾を含む。デオキシリボースリン酸骨格は、各塩基部分が６員のモルホリノ環に連結されるモルホリノ核酸またはデオキシリン酸骨格が擬ペプチド骨格により置換され、４個の塩基が保持されるペプチド核酸を生成させるために修飾し得る。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７（３）：１８７；およびＨｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５を参照されたい。さらに、デオキシリン酸骨格は、例えばホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイトまたはアルキルホスホトリエステル骨格と置換され得る。核酸配列は、プロモーターなどの制御領域に操作可能に連結され得る。制御領域はあらゆる種由来であり得る。本明細書中で使用される場合、操作可能に連結されるとは、標的核酸の転写を可能にするかまたは促進するような核酸配列に対する制御領域の配置を指す。あらゆるタイプのプロモーターが核酸配列に操作可能に連結され得る。プロモーターの例としては、組織特異的なプロモーター、構成的プロモーターおよび特定の刺激に対して応答性または非応答性であるプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）が挙げられるが限定されない。
【００７５】
核酸コンストラクトにおいて有用であり得るさらなる領域としては、ポリアデニル化配列、翻訳調節配列（例えば、配列内リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメントまたはイントロンが挙げられるが限定されない。このような制御領域は必要でない可能性があるが、これらは、ｍＲＮＡの転写、安定性、翻訳効率などに影響を及ぼすことによって発現を増加させ得る。このような制御領域は、細胞中の核酸の最適発現を得るため、必要に応じて核酸コンストラクト中に含まれ得る。このようなさらなるエレメントなく、十分な発現が得られることがあり得る。
【００７６】
シグナルペプチドまたは選択可能マーカーをコードする核酸コンストラクトを使用し得る。コードされるポリペプチドが特定の細胞の位置（例えば、細胞表面）に向けられるようにシグナル伝達（マーカー）ペプチドを使用し得る。このような選択可能マーカーの非限定例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。これらのマーカーは、培養において安定的な形質転換体を選択するために有用である。他の選択可能マーカーとしては、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光または黄色蛍光タンパク質が挙げられる。
【００７７】
当技術分野で公知の様々な生物学的技術を使用して、核酸コンストラクトをあらゆるタイプの細胞に導入し得る。これらの技術の非限定例としては、トランスポゾン系、細胞に感染し得る組み換えウイルスまたはリポソームまたは核酸を細胞に送達可能である他の非ウイルス法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクションもしくはリン酸カルシウム沈殿などの使用が挙げられる。ヌクレオフェクション．ＴＭ．と呼ばれる系も使用され得る。
【００７８】
核酸をベクターに組み込み得る。ベクターは、標的ＤＮＡに担体から移動するように設計されるあらゆる特異的なＤＮＡセグメントを含む広義の用語である。ベクターは、発現ベクターまたはベクター系と呼ばれ得、これは、ゲノムまたは他の標的化ＤＮＡ配列、例えばエピソーム、プラスミドまたはさらにウイルス／ファージＤＮＡセグメントへのＤＮＡ挿入を行うために必要とされる一連の構成要素である。ベクターは、殆どの場合、１つ以上の発現調節配列を含む１つ以上の発現カセットを含有し、ここで、発現調節配列は、それぞれ別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を調節および制御するＤＮＡ配列である。
【００７９】
多くの異なるタイプのベクターが当技術分野で公知である。例えば、プラスミドおよびレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターが公知である。哺乳動物発現プラスミドは、一般的には、複製起点、適切なプロモーターおよび任意のエンハンサー、ならびにまたあらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび受容体部位、転写終結配列および５’フランキング非転写配列を有する。このようなベクターとしては、プラスミド（別のタイプのベクターの担体でもあり得る）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、修飾ＨＩＶ−１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）およびトランスポゾン（Ｐ−エレメント、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃなど）が挙げられる。
【００８０】
本開示での使用のための細菌およびウイルス遺伝子およびタンパク質は、以下の「本開示の配列」という題名のセクションで列挙する。他のウイルスインテグラーゼ、例えばマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）およびアデノウイルス由来のものも本明細書中で開示される方法および組成物において使用し得る。
【００８１】
編集された細胞のプール集団は、遺伝子編集を受けている細胞および受けていない細胞の混合物と考えられる。
【００８２】
代表的なＡＢＢＩＥ１インビトロアッセイ
１）ガイドＲＮＡとともにＡＢＢＩＥ１タンパク質を温置し；
２）前開始複合体を形成させるために部分的ＬＴＲを有するドナーＤＮＡとともにＡＢＢＩＥ１／ガイドＲＮＡを温置し；
３）編集される遺伝子（例えば、ＣＸＣＲ４）を含有するプラスミドとともに前開始複合体を温置し；および
４）ドナーＤＮＡ組み込みに対するＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定を確認する。
【００８３】
Ｃａｓ９プロトコールは、例えば、Ｇａｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ｈｔｔｐ：／／ｌａｂｓ．ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｓｃｈｉｅｒ／ＶｅｒｔＥｍｂｒｙｏ／Ｃａｓ９＿Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｐｄｆに記載されている。
【００８４】
インテグラーゼ活性についてのアッセイは、例えばＭｅｒｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９，ｖｏｌｕｍｅ  ４７，ｐａｇｅｓ  ２４３−２４８に記載されている。
【実施例】
【００８５】
以下の実施例は、本開示の適用の例示を提供するものとする。以下の実施例は、本開示の範囲を完全に定義するものではなく、または本開示の範囲を限定するものではない。当業者にとって当然のことながら、本明細書中で具体的に記載されるかまたは参照されるものの代わりに、当技術分野で公知の多くの他の方法で置き換え得る。
【００８６】
実施例１：Ｃａｓ９−インテグラーゼ融合タンパク質を発現させるためのＤＮＡベクター
１２、１５、１８、２１、２４、２７または３０ｂｐスペーサー（Ｃａｓ９とインテグラーゼとの間のリンカーとしての４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸をコードする）およびＨＩＶ１インテグラーゼを用いて、触媒能のないＣａｓ９のＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込む。他の実験において、インテグラーゼではなく、細菌またはファージ起源のレコンビナーゼを使用する。これらには、何れかの他の部位でＤＮＡ組み換えを可能にする突然変異があるかまたはないＨｉｎレコンビナーゼ（配列番号２５）およびＣｒｅレコンビナーゼ（配列番号２６）が含まれる。融合タンパク質を単離するためにＨｉｓまたはｃＭｙｃタグ（またはタンパク質精製に有用な他の配列）が含まれ得る。発現ベクターは、ベクターとともに提供される細胞中で活性化されるプロモーターを使用する。ＣＭＶ（サイトメガロウイルスプロモーター）は哺乳動物細胞用の発現ベクターに対して一般的に使用される。Ｕ６プロモーターも一般的に使用される。Ｔ７プロモーターは、一定の実施形態においてインビトロ転写のために使用され得る。
【００８７】
実施例２：関心のあるＤＮＡ配列（関心のある遺伝子）の発現のためのＤＮＡベクター
関心のあるＤＮＡ配列を適切な発現ベクターに挿入し、関心のあるＤＮＡ配列に部位が適切に付加され、ＨＩＶ１インテグラーゼがゲノムへの組み込みのための配列を認識する。これらの部位はａｔｔ部位（Ｕ５およびＵ３  ａｔｔ部位）と呼ばれる（Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，ｖｏｌｕｍｅ７２，ｐａｇｅｓ  ８３９６−８４０２を参照されたい）。ゲノム中の標的部位に対する相同アームは、関心のあるＤＮＡ（遺伝子）配列の５’および３’末端に隣接する領域に含まれ得る（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２４，２０１４，ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０８２３６を参照されたい）。レコンビナーゼを使用する場合、インテグラーゼ認識部位は含まれなくてもよい。関心のあるＤＮＡ配列の挿入について調べ、かつゲノム中でのランダム挿入についてのアッセイを補助するために薬物耐性マーカー（例えば、ブラストサイジンまたはピューロマイシン）などのマーカーが含まれる。これらの耐性マーカーは、標的化ゲノム着地パッド（ｌａｎｄｉｎｇ  ｐａｄ）からそれらを取り出すように改変され得る。例えば、ＬｏｘＰ部位を有するピューロマイシン耐性遺伝子に隣接することおよび外因的に発現されるＣＲＥの導入により、ＬｏｘＰ部位を含有する瘢痕を残す内部配列が除去される。
【００８８】
実施例３：逆転写酵素発現のためのＤＮＡベクター
逆転写酵素はまた、ベクター中の関心のある設計されたＤＮＡ配列（遺伝子）がＲＮＡとして発現され、インテグラーゼ酵素による組み込みのためにＤＮＡに戻されなければならないような系で同時発現され得る。逆転写酵素はウイルス起源（例えば、ＨＩＶ１などのレトロウイルス）であり得る。これは関心のあるＤＮＡ配列と同じベクター内に組み込まれ得る。
【００８９】
実施例４：関心のあるＤＮＡ配列とのＤＮＡ標的化インテグラーゼ（またはレコンビナーゼ）の同時発現
ゲノム中の標的部位に対して必要とされるＣａｓ９  ＲＮＡガイドと一緒に、上記のベクターに対して細胞にエレクトロポレーションを行った。一部の実験において、構成要素の全て（融合Ｃａｓ９／インテグラーゼ（またはレコンビナーゼ）、Ｃａｓ９  ＲＮＡガイドおよびインテグラーゼ認識部位があり、相同アームがあるかまたはない関心のあるＤＮＡ配列）を発現するベクターを作製した。ベクター中の関心のある設計されるＤＮＡ配列（遺伝子）がＲＮＡとして発現されるようになり、インテグラーゼ酵素による組み込みのためにＤＮＡに戻されなければならないような系において、逆転写酵素も同時発現させ得る。逆転写酵素はウイルス起源（例えば、ＨＩＶ１などのレトロウイルス）であり得る。他の実験において、細胞への導入前に関心のあるＤＮＡ配列を直線化する。標準的な分子生物学プロトコールによる使用前に、Ｃａｓ９  ＲＮＡガイド配列および関心のあるＤＮＡ配列を設計し、ベクターに挿入しなければならない。
【００９０】
実施例５：オフターゲット挿入に対する試験的実験およびアッセイ
関心のある遺伝子が含まれる上記ベクターを用いて、特定の遺伝子の発現が失われている細胞、例えば一定の遺伝子に対してノックアウトが起こるように遺伝子操作されているノックアウトマウスモデルまたは細胞からのマウス胚線維芽細胞などに対して形質移入またはエレクトロポレーションを行う。挿入される遺伝子および隣接ゲノム配列を包含するように設計されたキメラプライマーセットを使用して、編集された細胞の最初のプールをスクリーニングする。次に、単一クローン性を確実にするために限界希釈クローニング（ＬＤＣ）およびまたはＦＡＣＳ分析を行う。単離クローンが設計される編集に対して均一であることを確実にするため、最終的な品質管理段階として次世代配列決定（ＮＧＳ）または一塩基多型（ＳＮＰ）分析を行う。スクリーニングのための他の機序としては、ｑＲＴ−ＰＣＲおよび適切な抗体を用いたウエスタンブロッティングが挙げられ得るが限定されない。タンパク質が細胞のある種の表現型に付随している場合、その表現型のレスキューについて細胞を調べ得る。ＤＮＡ挿入の特異性について、および存在する場合にはオフターゲット挿入の相対数を見出すためにその細胞のゲノムをアッセイする。
【００９１】
実施例６：Ｃａｓ９連結型インテグラーゼタンパク質発現および単離
大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）または昆虫細胞での遺伝子発現のために設計されたベクターを大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）または昆虫細胞に組み込み、所与の時間にわたり発現させる。Ｃａｓ９（または不活性Ｃａｓ９）連結型インテグラーゼタンパク質を作製するためにいくつかの設計を利用する。本ベクターはまた、高純度および高収率でのタンパク質の最終的な単離のためのＨｉｓまたはｃＭｙｃタグに限定されないタグも組み込む。キメラタンパク質の調製には、標準的なクロマトグラフィー技術が含まれるが限定されない。タンパク質は、１つ以上のＮＬＳ（核局在化シグナル配列）および／またはＴＡＴ配列を用いても設計され得る。核局在化シグナルにより、タンパク質が核に移行できるようになる。ＴＡＴ配列により、タンパク質がより容易に細胞に移行できるようになる（これは、細胞透過性ペプチドである）。当技術分野での他の細胞透過性ペプチドも考慮され得る。発現のための十分な時間の経過後、タンパク質溶解液を細胞から回収し、使用したタグに依存して、適切なカラムにおいて精製する。次に、精製タンパク質を適切な緩衝溶液に入れ、−２０または−８０℃の何れかで保存する。
【００９２】
実施例７：転写開始部位の直接上流に停止コドンを組み込むためのＣａｓ９−インテグラーゼの使用
本開示は、ノックアウト細胞株または生物を作製するための方法を含む。１、３、６、１０、１５または２０個の連続停止コドンが標的遺伝子のためのＡＴＧ開始部位の直後に置かれる関心のあるＤＮＡ配列とともに、上記の系を使用する。ＡＴＧ開始部位の直後の停止コドンに到達したときに転写／翻訳が停止されるため、これにより有効な遺伝子ノックアウトが作製される。さらなる停止コドンは、トランスクリプターゼの可能性のある通り抜け（トランスクリプターゼが最初の停止コドンを迂回する場合）を防ぐことを促進する。
【００９３】
実施例８：細胞のゲノムを編集するための精製タンパク質としてのＡＢＢＩＥ１（または他の特異的なＤＮＡ結合ドメインを有する他の変動）の使用
適切な緩衝液中でウイルスＬＴＲ領域を有する挿入可能／組み込み可能なＤＮＡとともに、Ａｂｂｉｅ１単離タンパク質（レトロウイルスインテグラーゼに連結される他の特異的なＤＮＡ配列結合タンパク質）を温置する（その場合に依存する四量体または他の多量体の形成のため）。あるいは、ガイドＲＮＡを伴う単離Ａｂｂｉｅ１タンパク質の予め作製された組成物を挿入可能なＤＮＡ配列と組み合わせ得る。ガイドＲＮＡを含み、ガイドＲＮＡを組み込むために温置する。Ａｂｂｉｅ１／ＤＮＡ標品を細胞に形質移入またはエレクトロポレーション（または細胞にタンパク質を提供する他の技術）する。ゲノム／ＤＮＡ編集が行われる時間を考慮に入れる。細胞のゲノムＤＮＡの特異的部位への、設計された挿入可能なＤＮＡ配列の挿入について調べる。ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により、非特異的な挿入について調べる。
【００９４】
現在の計画では、細菌発現ベクターはｐＭＡＬ−ｃ５ｅであり、これはＮＥＢからの製造中止製品であり、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔに対する社内クローニング選択肢の１つである。マルトース−結合タンパク質（ＭＢＰ）タグとインフレームでｈｉｓタグおよびＴＥＶプロテアーゼ切断部位を伴い、コドン最適化Ｓｐｙ  Ｃａｓ９をクローニングする。ＯＲＦは誘導性Ｔａｃプロモーター下にあり、ベクターは、より厳格な制御のためにｌａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）もコードする。アミロースレジンは非常に高価であるため、精製タグではなく安定化タグとしてのみＭＢＰを使用する。Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィー上で可溶性の発現物質を精製し、次にＭＢＰからのＴＥＶプロテアーゼによってＣａｓ９を放出させ、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、ゲルろ過によりさらに精製する。
【００９５】
実施例９：融合タンパク質のためのコンストラクトの設計
標的ＤＮＡ配列に対するＣＲＩＳＰＲに基づくアプローチのために配列特異的なジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥまたはガイドＲＮＡを設計する。最適なオンライン設計ソフトウェアを使用する。
【００９６】
部位特異的な融合インテグラーゼタンパク質を形成させるためにインテグラーゼ、トランスポサーゼまたはレコンビナーゼ；適切なアミノ酸リンカー；適切なジンクフィンガー、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）；および核局在化シグナル（またはミトコンドリアの局在化シグナル）に対するコード配列を有するＤＮＡコンストラクトを作製する。これらは複数の配置で想定される。必要に応じて、タンパク質単離および精製のために適切なタグが含まれ得る（例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはＨｉｓタグ）。
【００９７】
ＤＮＡコンストラクトは、当技術分野で一般的である哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌プロモーターを利用し得る（例えば、ＣＭＶ、Ｔ７など）。
【００９８】
起源として大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）を用いて組み換え融合タンパク質を作製し得る。当技術分野における標準的な手段（例えば、ＭＢＰカラム、ニッケル−セファロースカラムなど）によってタンパク質を単離する。
【００９９】
ドナー−ＲＮＰ複合体を組み立てて（ＲＮＡオリゴを２本鎖化、本発明の融合タンパク質と混合する（そのＤＮＡ結合能に対して融合タンパク質がエンドヌクレアーゼ不活性ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を有する場合、例えばＡＢＢＩＥ１）−ＲＮＰ形成のこれらの段階は、ジンクフィンガードメインおよびＴＡＬＥの場合には必要でない。
１．ドナーＤＮＡを適切なＬＴＲドメインおよび挿入可能配列および融合タンパク質と混合し、１０分間温置する（あるいはＲＮＰ複合体形成後、ドナーＤＮＡを添加する）。
２．ヌクレアーゼ不含ＩＤＴＥ緩衝液中で各ＲＮＡオリゴ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を懸濁する。例えば、１００μＭの最終濃度を使用する。
３．滅菌微量遠心管中で等モル濃度でこの２種類のＲＮＡオリゴを混合する。例えば、以下の表を使用して、３μＭの最終２本鎖濃度にする：構成要素量１００μＭ  ｃｒＲＮＡ  ３μＬ、１００μＭ  ｔｒａｃｒＲＮＡ  ３μＬ、ヌクレアーゼ不含２本鎖緩衝液９４μＬ、最終体積１００μＬ。
４．９５℃で５分間加熱する。
５．熱から除去し、卓上で室温（１５〜２５℃）まで冷却する。
６．必要に応じて、ヌクレアーゼ不含２本鎖緩衝液中で作業濃度（例えば、３μＭ）まで２本鎖化ＲＮＡを希釈する。
７．作業用緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）中で作業濃度（例えば、５μＭ）に融合タンパク質を希釈する。
８．各形質移入に対して、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地中で１．５ｐｍｏｌの２本鎖化ＲＮＡオリゴ（段階Ａ５）を１．５ｐｍｏｌの融合タンパク質（段階Ａ６）と合わせ、１２．５μＬの最終体積とする。
９．ＲＮＰ複合体を組み立てるために室温で５分間温置する。
【０１００】
実施例１０：９６ウェルプレートにおいてＧＲＮＡ−融合タンパク質を逆形質移入する。
１．以下のものを室温で２０分間温置して形質移入複合体を形成させる：構成要素の量  ＲＮＰ（段階Ａ８）１２．５μＬリポフェクタミン（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ形質移入試薬、１．２μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地１１．３μＬ総体積２５．０μＬ。
２．温置（段階Ｂ１）中、抗生物質なしの完全培地を使用して培養細胞を細胞４００，０００個／ｍＬに希釈する。
３．温置が完了したら、２５μＬの形質移入複合体（段階Ｂ１より）を９６ウェル組織培養プレートに添加する。
４．１２５μＬの希釈細胞（段階Ｂ２より）を９６ウェル組織培養プレートに添加する（細胞５０，０００個／ウェル、ＲＮＰの最終濃度は１０ｎＭとなる）。
５．組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４８時間、形質移入複合体および細胞を含有するプレートを温置する。オンターゲット突然変異を検出するため、適切なプライマー（ドナー配列内のプライマーおよび標的挿入部位を囲むプライマー）とともにＰＣＲを使用する。
【０１０１】
実施例１１：ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９の特異性を試験するためのプロトコール
ビオチンに連結されるｄＣａｓ９（ＤＮＡ切断不活性Ｃａｓ９）を作製する（ｄＣａｓ９−ビオチン）。Ｃａｓ９（Ｓ．ピオゲネス（ｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（ｓ  ａｕｒｅｕｓ）など）。ビオチン化方法は以下に記載する。
【０１０２】
ビオチン化方法＃１：Ｎ−またはＣ−末端でａｖｉタグ（約１５残基）を操作し、ＷＴ（非タグ付加）タンパク質として発現させ、精製する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）およびビオチンを使用して、ａｖｉタグ付加Ｃａｓ９をビオチン化する。本発明者らは、このスキームを使用してケモカインをビオチン化する。本発明者は、ａｖｉ−タグ技術上のＩＰが数年前に失効したと考える。
【０１０３】
ビオチン化方法＃２．１：サクシニミジル−エステルでのビオチン官能性は、表面露出リジン残基で組み込まれ得る（酵素反応は必要なし）。これは、Ｃａｓ９と同程度の大きさのタンパク質の場合に実行可能な選択肢であり得る。
【０１０４】
ビオチン化方法＃２．２：同じように、ビオチン−マレイミドが市販されており、これらは表面露出システインで複合化され得る（酵素なし）。
【０１０５】
ＤＮＡ−結合および切断に関してビオチン化Ｃａｓ９ダズ（ｄｏｅｓ）を特徴評価するために試験を遂行する。
【０１０６】
ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートは市販されているが、社内でも作製し得る。
【０１０７】
ｄＣａｓ９−ビオチンをプラスチックプレート（９６ウェル、２４ウェル、３８４ウェルなど）に結合させる。
【０１０８】
各ウェルに設計したガイドＲＮＡを提供する。ガイドＲＮＡがＣａｓ９タンパク質と相互作用するための時間を考慮する。
【０１０９】
各ウェルにゲノムＤＮＡまたは標的化される配列があるＤＮＡを提供する。ＤＮＡへのＣａｓ９結合のための時間を考慮する。
【０１１０】
適切な緩衝液でウェルを洗浄する。
【０１１１】
アダプター（ＤＮＡオリゴマー）を提供する。結合のための時間を考慮する。
【０１１２】
ゲノムＤＮＡを制限消化して、扱い易く、アダプターを連結し易くする。
【０１１３】
ウェルの洗浄
結合部位を同定するためにＤＮＡ配列決定を行う（オンターゲット対オフターゲット）。
【０１１４】
実施例１２：ＡＢＢＩＥ１を介するＮＲＦ２編集
図５は、ガイドＮｒＦ２−ｓｇＲＮＡ２およびｓｇＲＮＡ３を用いたＮｒｆ２のエクソン２を標的とするＡｂｂｉｅ１遺伝子編集を示す。ＰＣＲは、Ａｂｂｉｅ１編集を介したノックアウトについて、エクソン２標的化Ｎｒｆ２遺伝子座に対するスクリーニングを行う。ガイドＮｒＦ２−ｓｇＲＮＡ２および３を使用したＮｒｆ２のエクソン２を標的とするＡｂｂｉｅ１形質移入は、標的化領域でドナーの組み込みを示した。特有のバンドを１〜８とする。
【０１１５】
図６は、Ａｂｂｉｅ１遺伝子編集により生成される理論的データを示す。ｓｇＲＮＡ１〜３を用いてゲノム物質を標的とするためのＡｂｂｉｅ１系を介したドナーＤＮＡ挿入を可視化するＤＮＡゲル電気泳動の代表例である。黒色バンドは、ＰＣＲ法に起因するバックグラウンド生成物に相当する。赤色バンドは、挿入物および挿入領域に隣接する遺伝子材料を増殖させることにより生成される特有の生成物に相当する。複数バンドは、標的化領域における可能性がある複数の挿入に相当する。
【０１１６】
図７は、ガイドＮｒｆ２−ｓｇＲＮＡ３を使用した、Ｎｒｆ２のエクソン２を標的とするＡｂｂｉｅ１遺伝子編集を示す。ＰＣＲは、Ａｂｂｉｅ１編集を介したノックアウトについて、エクソン２標的化Ｎｒｆ２遺伝子座に対するスクリーニングを行う。ガイドＮｒＦ２−ｓｇＲＮＡ３を使用したＮｒｆ２のエクソン２標的化から、ドナー配列および予想される挿入の近接部位に対して設計されたＰＣＲプライマーにより示されるようにドナー挿入が示唆された。特有のバンドを１〜４とする。
【０１１７】
図８は、プールされたＨｅｋ２９３Ｔ−細胞におけるＮｒｆ２のＡｂｂｉｅ１ノックアウトを示す。（Ａ）プールされたＨＥＫ２９３Ｔ集団におけるＮｒｆ２のノックアウトを示す、５５ｋＤアイソフォームに対するポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏ）を使用したウエスタンブロット分析である。（Ｂ）ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏ）ローディング対照である。
【０１１８】
図９は、プールされたＨｅｋ２９３Ｔ−細胞におけるＮｒｆ２のＡｂｂｉｅ１ノックアウトを示す。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ−細胞におけるＮｒｆ２プール集団のノックアウトを示す、Ｎｒｆ２に対するモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を利用したウエスタンブロット分析である。（Ｂ）ＧＡＰＤＨローディング対照である。（Ｃ）対照と比較した場合の発現比率の低下を示す濃度測定分析の平均である。
【０１１９】
Ａｂｂｉｅ１処理細胞は、ドナーＤＮＡの組み込みを示す特有のＰＣＲバンドを生じさせる。ＨＥＫ２９３Ｔプール細胞株におけるノックアウトの表現型確認は、特有かつ異なる抗体を用いた２種類のアイソフォームを探るウエスタンブロット分析を介して確認した。２週未満でプール集団において組み込みによる約８０％のノックアウトを観察した。
【０１２０】
実施例１３：ＡＢＢＩＥ１を介したＣＸＣＲ４編集
図１０は、ＣＸＣＲ４エクソン２を標的とするＡｂｂｉｅ１遺伝子編集を示す。ＰＣＲは、Ａｂｂｉｅ１を介して編集されたＣＸＣＲ４のエクソン２の標的化をスクリーニングする。関心のある領域に対して４セットのプライマーを設計した。セット番号２および４は、関心のある領域でのドナーＤＮＡの組み込みを示唆する特有のバンドを生成したと思われる。
【０１２１】
実施例１４：ＡＢＢＩＥ１を用いたＮＲＦ２遺伝子座におけるノックイン実験のための形質移入
注記：１回の反応に対して５００ｎｇタンパク質および１２０ｎｇのｓｇＲＮＡを使用する。ＤＮＡの量はドナーコンストラクトのサイズに依存する。細胞に対して提供／形質移入／エレクトロポレーションを行う前、その最中またはその後にドナーＤＮＡ（ＬＴＲ配列があるＤＮＡ）をＡＢＢＩＥ１とともに温置し得る。全反応物を滅菌バイオセイフティーキャビネット中で調製する。
【０１２２】
第１日：１０％胎仔ヒツジ血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補給した５００μＬ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞をＨＥＫ２９３Ｔ−細胞（ＡＴＣＣ）２００，０００個／ウェルで２４ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。細胞を２４時間回復させた。
【０１２３】
第２日：ＡＢＢＩＥ１調製：
チューブ１：
室温で１０分間、１：１モル比の血清減少形質移入培地（ＯｐｔｉＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の精製ＡＢＢＩＥ１タンパク質（配列番号５８）およびドナーＤＮＡ（配列番号１０１）。ｓｇＲＮＡを１．３倍モル過剰（およそ１２０ｎｇ）までタンパク質／ＤＮＡ複合体に添加し、室温でさらに１０分間温置を継続する。この混合物の体積は２５μＬである。
【０１２４】
チューブ２：
２μＬの形質移入試薬（ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２３μＬのＯｐｔｉＭＥＭに添加した。室温で１０分間温置した。
【０１２５】
チューブ１および試験管２（５０ｍＬ最終体積）を合わせ、室温で１５分間温置した。
【０１２６】
５０μＬ形質移入混合物全てをウェルに添加した。
【０１２７】
プール集団中でのゲノムＤＮＡ編集の検証のために、プールされた編集細胞の半分を形質移入から４８時間後に回収した。編集されたゲノムの検証は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行った。本発明者らは、以下に記載のように、標的化領域に対してＰＣＲを行い（ＰＣＲプロトコールを参照されたい）、残りは、６ｃｍの培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種し、４８時間にわたり回復させた。
【０１２８】
第５日：ウエスタンブロッティングを介した表現型変化のスクリーニング
ＮｒＦ２アイソフォームに対して、５５ｋＤアイソフォームおよび９８ｋＤアイソフォームを標的とする一次抗体（５５ｋＤアイソフォームに対するものはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−７２２）（９８ｋＤアイソフォームに対するものはＡｂｃａｍ、ａｂ−６２３５２）を使用して、標準的なウエスタンブロット分析を行った。ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−５１９０７）。
【０１２９】
実施例１５：ＮＲＦ２およびＣＸＣＲ４遺伝子座に対するＡｂｂｉｅ１を用いた遺伝子編集の検出のためのＰＣＲ条件
ヒトＮｒｆ２に対する受入番号
Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ１６２３６
Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１１６０４４
【０１３０】
Ｎｒｆ２（エクソン２）に対する標的配列およびＰＡＭの編集：ｓｇＲＮＡに対して設計１〜３を使用した。
ＧＣＧＡＣＧＧＡＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＣ  ＴＧＧ
ＴＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧＣＧＡ  ＣＧＧ
ＴＧＧＡＧＧＣＡＡＧＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴ  ＴＧＧ
【０１３１】
Ｎｒｆ２標的での組み込みの検出のためのプライマーキー
プライマーセット１：プライマー１：５’−ＧＴＧＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣ−３’、プライマー２：５’−ＧＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＴＴＴＧ−３’
プライマーセット２：プライマー１：５’−ＧＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ−３’、プライマー２：５’−ＧＡＴＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧ−３’
プライマーセット３：プライマー１：５’−ＴＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＴＧＣ−３’、プライマー２：５’−ＧＡＴＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧ−３’
【０１３２】
ヒトＣＸＣＲ４に対する受入番号
Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ６１０７３
Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１２１９６６
【０１３３】
ＣＸＣＲ４（エクソン２）に対する標的配列およびＰＡＭの編集：ｓｇＲＮＡに対して設計１を使用した。
ＧＧＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣ  ＴＧＧ
【０１３４】
ＣＸＣＲ４標的での組み込みの検出のためのプライマーキー
プライマーセット１：プライマー１：５’−ＴＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＴＧＣ−３’、プライマー２：５’−ＧＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＴＴＴＧ−３’
プライマーセット２：プライマー１：５’−ＴＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＴＧＣ−３’、プライマー２：５’−ＧＡＴＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧ−３’
プライマーセット３：プライマー１：５’−ＧＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ−３’、プライマー２：５’−ＧＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＴＴＴＧ−３’
プライマーセット４：プライマー１：５’−ＧＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ−３’、プライマー２：５’−ＧＡＴＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧ−３’
2018513681.tif 000003
【０１３５】
ビオチン化のためのＡｖｉタグ付加Ｃａｓ９
Ｃａｓ９ビオチン化のために使用したａｖｉタグの配列
アミノ酸配列：
2018513681.tif 000004
【０１３６】
核酸配列：
2018513681.tif 000005
【０１３７】
第一の下線セクション＝Ｃａｓ９Ｃ−末端
斜字体セクション＝制限部位／リンカー
第２の下線セクション＝ａｖｉタグ（ビオチン化部位にハイライト）
【０１３８】
実施例１６：ＡＢＢＩＥ１融合タンパク質に対する発現プロトコール
全長融合タンパク質（配列番号５７）を含有する発現コンストラクトの形質転換。
−８０℃冷凍庫からコンピーテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を取り出す。
水浴にスイッチを入れ、４２℃にする。
コンピーテント細胞を１．５ｍＬチューブ（エッペンドルフまたは同様のもの）に入れる。ＤＮＡコンストラクトの形質転換を行うために５０μＬのコンピーテント細胞を使用する。
チューブを氷上で維持する。
５０ｎｇの環状ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に添加する。氷上で１０分間温置して、コンピーテント細胞を凍結融解する。
ＤＮＡおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）入りのチューブを４２℃の水浴に４５秒間入れる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に対するダメージを減少させるためにチューブを氷上に２分間戻す。
１ｍＬのＬＢ（抗生物質添加なし）を添加する。チューブを３７℃で１時間温置する（チューブを３０分間温置し得る）。
適切な抗生物質入りのＬＢプレート上に約１００μＬの得られた培養物を広げる。
約１２〜１６時間後にコロニーを拾う。
【０１３９】
接種および増殖
ＬＢおよび抗生物質を含有する１Ｌフラスコに接種する。
０．６ＯＤに到達するまで細菌培養物を増殖させ、次いで１ｍＭ最終濃度のイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導する。
６〜８時間にわたり培養物を増殖させ、最低２０００Ｇの力で１０分間、懸濁細菌培養物を遠心分離する。
後のさらなる処理のためにペレットを−８０℃で凍結させる。
【０１４０】
タンパク質調製および精製
全段階を室温で行う。
【０１４１】
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌニワトリ卵白リゾチーム中での２サイクルの凍結−融解によって細胞を溶解させる。６，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を保持する。
【０１４２】
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ塩化ナトリウム中で平衡化したＮｉ−ＩＤＡアガロースカラム上に上清を載せる。イミダゾールの０〜２００ｍＭ勾配でタンパク質を溶出させる。７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって融合タンパク質を含有する分画を同定する。
【０１４３】
分画をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０で希釈して、最終ＮａＣｌ濃度が５０ｍＭになるようにする。Ｑ−セファロースカラム上に載せ、塩化ナトリウムの０〜５００ｍＭ勾配で溶出させる。７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって融合タンパク質を含有する分画を同定する。
【０１４４】
分画をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０で希釈して、最終ＮａＣｌ濃度が１００ｍＭになるようにする。ＳＰ−セファロースカラム上に載せ、塩化ナトリウムの０〜５００ｍＭ勾配で溶出させる。７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって融合タンパク質を含有する分画を同定する。
【０１４５】
分画をプールし、２８０ｎｍでのそのＵＶ吸収によって濃度を測定し、４００μｇ／ｍｌの最終濃度まで遠心フィルターによって濃縮する。５０％の最終濃度になるようにグリセロールを添加する。−２０℃で保存する。
【０１４６】
本明細書中で一定の実施形態を示し、記載してきたが、このような実施形態が単なる例として提供されることは当業者にとって明らかであろう。本開示からの逸脱なく、当業者にとって多くの変形形態、変化形態および置換形態が想起されるであろう。本開示の実施において、本明細書中に記載の開示の実施形態に対して様々な代替物が使用され得ることを理解されたい。続く特許請求の範囲は、本開示の範囲を定め、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれにより包含されるものとする。
【０１４７】
本開示の配列
以下で提供される各配列に対して以下の情報が提供される：配列のタイプ（核酸またはアミノ酸）、起源（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、長さおよび識別番号（可能な場合）。
【０１４８】
本開示の第１のポリヌクレオチドは、例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥまたはＺｎＦｎタンパク質をコードし得る。本開示の第２のポリヌクレオチドは、例えばインテグラーゼ、トランスポサーゼまたはレコンビナーゼをコードし得る。本明細書中に記載の組成物（コンストラクト、融合タンパク質）および方法中で使用され得る代表的な第１および第２のポリヌクレオチド配列およびタンパク質配列を代表的なリンカー配列とともに以下で列挙する。本開示において、以下の表１で列挙されない他のポリヌクレオチド配列、タンパク質配列またはリンカー配列が提供され得るが、本明細書中に記載の組成物（コンストラクト、融合タンパク質）および方法において使用され得る。例えば、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５８および／またはそれらの一部である。
【０１４９】
リンカーは、あらゆる長さ、例えば３〜３００ヌクレオチド長、６〜６０ヌクレオチド長または第１および第２のポリヌクレオチドが融合可能であるあらゆる長さであり得る。ポリペプチドは、生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により産生され得るか、もしくは合成によるか、または両方の組み合わせで作製され得る。
【０１５０】
代表的な核酸配列：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２７〜４７、４９、５５、５６、５７、６２、６４、６６、６８、７０、７９、８２および８３。
【０１５１】
代表的なアミノ酸配列：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２６、４８、５０、５２、５８、６３、６５、６７、６９、７１、７２〜７８および８０。
2018513681.tif 000006
2018513681.tif 000007
【０１５２】
さらなる配列
配列番号１
名称：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃｓｎ１  ｃｄｓ  ＨＱ７１２１２０．１
配列：
2018513681.tif 000008
2018513681.tif 000009
2018513681.tif 000010
【０１５３】
配列番号２
配列：
2018513681.tif 000011
【０１５４】
配列番号３
名称：Ｐ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ｃａｓ９
配列：
2018513681.tif 000012
2018513681.tif 000013
2018513681.tif 000014
【０１５５】
配列番号４
配列：
2018513681.tif 000015
【０１５６】
配列番号５
名称：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｃａｓ９
配列：
2018513681.tif 000016
2018513681.tif 000017
2018513681.tif 000018
2018513681.tif 000019
【０１５７】
配列番号６
配列：
2018513681.tif 000020
【０１５８】
配列番号７
名称：Ｎ．メニンギティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９
配列：
2018513681.tif 000021
2018513681.tif 000022
2018513681.tif 000023
【０１５９】
配列番号８
配列：
2018513681.tif 000024
【０１６０】
配列番号９
配列：
2018513681.tif 000025
2018513681.tif 000026
2018513681.tif 000027
【０１６１】
配列番号１０
名称：ｇｉ｜７７７８８８０６２｜ｇｂ｜ＫＪＱ６９４８３．１｜ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９［ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）］
配列：
2018513681.tif 000028
【０１６２】
配列番号１１
配列：
2018513681.tif 000029
2018513681.tif 000030
2018513681.tif 000031
2018513681.tif 000032
【０１６３】
配列番号１２
名称：ｇｉ｜３５７５８４８６０｜ｇｂ｜ＥＨＪ５２０６３．１｜ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１、サブタイプＩＩ／ＮＭＥＭＩ［ストレプトコッカス・マカカ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃａｃａｅ）ＮＣＴＣ１１５５８］
配列：
2018513681.tif 000033
【０１６４】
配列番号１３
配列：
2018513681.tif 000034
2018513681.tif 000035
2018513681.tif 000036
【０１６５】
配列番号１４
名称：ｇｉ｜４０９６９３０３２｜ｇｂ｜ＡＦＶ３７８９２．１｜ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、Ｃｓｎ１ファミリー［ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ２０］
配列：
2018513681.tif 000037
【０１６６】
配列番号１５
名称：ｇｉ｜１５０３８１３６１｜ｇｂ｜ＥＦ４７２７６０．１｜ＵＳＡインテグラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子からのＨＩＶ−１クローン３９Ｂ、部分的ｃｄｓ
配列：
2018513681.tif 000038
【０１６７】
配列番号１６
名称：ｇｉ｜１５０３８１３６２｜ｇｂ｜ＡＢＲ６８１８２．１｜インテグラーゼ、部分的［ヒト免疫不全ウイルス１］
配列：
2018513681.tif 000039
【０１６８】
配列番号１７
名称：ｇｉ｜４５９９８０｜ｇｂ｜Ｌ２０６５１．１｜ＳＴＬＫＩＡＰＯＬサルＴ−細胞リンパ球向性ウイルスＩ型インテグラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分的ｃｄｓ
配列：
2018513681.tif 000040
【０１６９】
配列番号１８
名称：ｇｉ｜４５９９８１｜ｇｂ｜ＡＡＡ４７８４１．１｜インテグラーゼ、部分的［サルＴ−リンパ球向性ウイルス１］
配列：
ＬＶＥＲＳＮＧＩＬＫＴＬＬＹＫＹＦＴＤＫＰＤＬＰＭＤＮＡＬＳＩＡＬＷＴＩＮＨＬＮＶＬＴＨＣＨ
【０１７０】
配列番号１９
名称：ｇｉ｜３２１１５６７８４：１−１５０９ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）組み込みおよび接合エレメントＩＣＥＳｐｎ１１９３０、株１１９３０
配列：
2018513681.tif 000041
2018513681.tif 000042
【０１７１】
配列番号２０
名称：ｇｉ｜３２１１５６７８５｜ｅｍｂ｜ＣＢＷ３８７６９．１｜インテグラーゼ［ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）］
配列：
2018513681.tif 000043
【０１７２】
配列番号２１
名称：ｇｉ｜４３０９０：ＶＩＩ型ジヒドロ葉酸レダクターゼに対する１−４３６大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｔｎ５０８６）ｄｈｆｒ  ＶＩＩ遺伝子およびｓｕｌ  Ｉ遺伝子、５’末端（インテグラーゼ）
配列：
2018513681.tif 000044
【０１７３】
配列番号２２
名称：ｇｉ｜４３０９１｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ４１３２５．１｜インテグラーゼ、部分的（プラスミド）［エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）］
配列：
2018513681.tif 000045
【０１７４】
配列番号２３
＞ｇｉ｜３９７９１２６０５：４０３７２−４１８９８  サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ファージＴＨＳＡ−４８５Ａ、完全ゲノム−レコンビナーゼ
2018513681.tif 000046
2018513681.tif 000047
【０１７５】
配列番号２４
＞ｇｉ｜３９７９１２６６２｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００６５４６３２６．１｜レコンビナーゼ［サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ファージＴＨＳＡ−４８５Ａ］
2018513681.tif 000048
【０１７６】
配列番号２５
Ｇｉｎレコンビナーゼ
＞ｇｉ｜６５７１９３２４０｜ｓｐ｜Ｑ３８１９９．２｜ＧＩＮ＿ＢＰＤ１０  ＲｅｃＮａｍｅ：Ｆｕｌｌ＝セリンレコンビナーゼｇｉｎ；別名：Ｆｕｌｌ＝Ｇ−セグメントインベルターゼ；略称＝Ｇｉｎ
2018513681.tif 000049
【０１７７】
配列番号２６
Ｃｒｅレコンビナーゼ
＞ｇｉ｜３７５３３１８１３｜ｄｂｊ｜ＢＡＬ６１２０７．１｜Ｃｒｅレコンビナーゼ［Ｃｒｅ−発現ベクターｐＨＶＸ２−ｃｒｅ］
2018513681.tif 000050
【０１７８】
配列番号２７〜４６
これらは、本発明に記載のような、インテグラーゼまたはレコンビナーゼへの連結での使用のためのＴＡＬＥリピートモジュールをコードするポリヌクレオチドの代表的な配列である。
【０１７９】
配列番号２７
名称：ＮＩ
配列：
2018513681.tif 000051
【０１８０】
配列番号２８
名称：ＮＧ
配列：
2018513681.tif 000052
【０１８１】
配列番号２９
名称：ＨＤ
配列：
2018513681.tif 000053
【０１８２】
配列番号３０
名称：ＮＮ
配列：
2018513681.tif 000054
【０１８３】
配列番号３１
名称：ＮＩ−ＮＩ
配列：
2018513681.tif 000055
【０１８４】
配列番号３２
名称：ＮＩ−ＮＧ
配列：
2018513681.tif 000056
【０１８５】
配列番号３３
名称：ＮＩ−ＨＤ
配列：
2018513681.tif 000057
【０１８６】
配列番号３４
名称：ＮＩ−ＮＮ
配列：
2018513681.tif 000058
【０１８７】
配列番号３５
名称：ＮＧ−ＮＩ
配列：
2018513681.tif 000059
【０１８８】
配列番号３６
名称：ＮＧ−ＮＧ
配列：
2018513681.tif 000060
【０１８９】
配列番号３７
名称：ＮＧ−ＨＤ
配列：
2018513681.tif 000061
【０１９０】
配列番号３８
名称：ＮＧ−ＮＮ
配列：
2018513681.tif 000062
【０１９１】
配列番号３９
名称：ＨＤ−ＮＩ
配列：
2018513681.tif 000063
【０１９２】
配列番号４０
名称：ＨＤ−ＮＧ
配列：
2018513681.tif 000064
【０１９３】
配列番号４１
名称：ＨＤ−ＨＤ
配列：
2018513681.tif 000065
【０１９４】
配列番号４２
名称：ＨＤ−ＮＮ
配列：
2018513681.tif 000066
【０１９５】
配列番号４３
名称：ＮＮ−ＮＩ
配列：
2018513681.tif 000067
【０１９６】
配列番号４４
名称：ＮＮ−ＮＧ
配列：
2018513681.tif 000068
【０１９７】
配列番号４５
名称：ＮＮ−ＨＤ
配列：
2018513681.tif 000069
【０１９８】
配列番号４６
名称：ＮＮ−ＮＮ
配列：
2018513681.tif 000070
【０１９９】
配列番号４７
名称：ｇｉ｜７１７９６６１２｜ｇｂ｜ＤＱ０８４３５３．１｜ヒツジレンチウイルス単離株Ｏｖ１０インテグラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分的ｃｄｓ
配列：
2018513681.tif 000071
【０２００】
配列番号４８
名称：ｇｉ｜７１７９６６１３｜ｇｂ｜ＡＡＺ４１３２５．１｜インテグラーゼ、部分的［ヒツジレンチウイルス］
配列：
2018513681.tif 000072
【０２０１】
配列番号４９
＞ｇｂ｜ＡＹＬＴ０１０００１２７．１｜：１１８０４−１２０４６スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）亜種アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）ＳＫ１５８５コンティグ０００１２７、全ゲノムショットガン配列
2018513681.tif 000073
【０２０２】
配列番号５０
＞ｇｉ｜６６９０３５１３０｜ｇｂ｜ＫＦＤ３０４８３．１｜仮説的タンパク質Ｄ４８４＿０２２３４［スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）亜種アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）ＳＫ１５８５］−Ｓ．アウレウス（ｓ  ａｕｒｅｕｓ）ｃａｓ９
2018513681.tif 000074
【０２０３】
配列番号５１
名称：リンカー２のｄｎａ
配列：
ａｇｃｇｇｃａｇｃｇａａａｃｃｃｃｇｇｇｃａｃｃａｇｃｇａａａｇｃｇｃｇａｃｃｃｃｇｇａａａｇｃ
【０２０４】
配列番号５２
名称：ｄＣａｓ９タンパク質
配列：
2018513681.tif 000075
2018513681.tif 000076
【０２０５】
配列番号５３
名称：ＡＴＧを伴うＮＬＳヌクレオチド
配列：
2018513681.tif 000077
【０２０６】
配列番号５４
名称：ＧＧＳリンカーヌクレオチド
配列：
ＧＧＧＧＧＡＡＧＴ
【０２０７】
配列番号５５
名称：合成インテグラーゼ
配列：
2018513681.tif 000078
【０２０８】
配列番号５６
名称：ＡＴＧを伴うｄＣａｓ９ヌクレオチド
配列：
2018513681.tif 000079
2018513681.tif 000080
2018513681.tif 000081
2018513681.tif 000082
2018513681.tif 000083
2018513681.tif 000084
【０２０９】
配列番号５７
名称：ＡＢＢＩＥ１（ＮＬＳ−リンカー１−インテグラーゼ−リンカー２−ｄＣａｓ９）−ＤＮＡ配列
配列：
2018513681.tif 000085
2018513681.tif 000086
2018513681.tif 000087
2018513681.tif 000088
2018513681.tif 000089
2018513681.tif 000090
【０２１０】
配列番号５８
名称：ＡＢＢＩＥ１の翻訳（結合に基づくインテグラーゼエディター）
配列：
2018513681.tif 000091
2018513681.tif 000092
2018513681.tif 000093
停止
ドナーＤＮＡに対する（インテグラーゼ認識のためのＬＴＲ領域のａｔｔ部位）。
【０２１１】
配列番号５９
名称：Ｕ３ａｔｔ
配列：
ＡＣＴＧＧＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＣＡＡＡＧＡＡ
【０２１２】
配列番号６０
名称：Ｕ５ａｔｔ
配列：
ＧＡＣＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴ
ＮＬＳ−リンカー１−インテグラーゼ−リンカー２−ｄＣａｓ９またはインテグラーゼ−リンカー１−ＮＬＳ−リンカー２−ｄＣａｓ９またはインテグラーゼ−リンカー２−ｄＣａｓ９−リンカー１−ＮＬＳまたはインテグラーゼ−リンカー２−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ
リンカー１＝ＧＧＳ
【０２１３】
配列番号６１
名称：リンカー２
配列：
ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ
【０２１４】
配列番号６２
名称：ＭＭＴＶインテグラーゼｃＤＮＡ、ｇｂ｜ＡＦ０７１０１０．１｜：１６−１１１３マウス乳癌ウイルス推定インテグラーゼ、ｅｎｖポリタンパク質およびスーパー抗原ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
配列：
2018513681.tif 000094
【０２１５】
配列番号６３
名称：ｇｉ｜３２７３８６６｜ｇｂ｜ＡＡＣ２４８５９．１｜推定インテグラーゼ［マウス乳癌ウイルス］
配列：
2018513681.tif 000095
【０２１６】
配列番号６４
名称：ｇｂ｜ＡＸＵＮ０２００００５９．１｜：５１１６−８８５０ヨウンギイバクター・フラジリス（Ｙｏｕｎｇｉｉｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）２３２．１コンティグ＿１５１、全ゲノムショットガン配列−レコンビナーゼ
配列：
2018513681.tif 000096
2018513681.tif 000097
2018513681.tif 000098
2018513681.tif 000099
【０２１７】
配列番号６５
名称：ｇｉ｜５６４１３５６４５｜ｇｂ｜ＥＴＡ８１８２９．１｜レコンビナーゼ［ヨウンギイバクター・フラジリス（Ｙｏｕｎｇｉｉｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）２３２．１］
配列：
2018513681.tif 000100
2018513681.tif 000101
【０２１８】
配列番号６６
名称：ｇｉ｜５７１２６４５４３：１６４２３−１６７７０クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トランスポゾンＴｎ６２１８、株Ｏｘ４２トランスポサーゼ
配列：
2018513681.tif 000102
【０２１９】
配列番号６７
名称：ｇｉ｜５７１２６４５５９｜ｅｍｂ｜ＣＤＦ４７１３３．１｜トランスポサーゼ［ぺプトクロストリジウム・ディフィシル（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）］
配列：
2018513681.tif 000103
【０２２０】
配列番号６８
名称：ｇｂ｜ＣＰ００９４４４．１｜：１３１７７２４−１３２０５４３フランシセラ・フィロミラジア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）株ＧＡ０１−２８０１、完全ゲノムＣｐｆ１
配列：
2018513681.tif 000104
2018513681.tif 000105
2018513681.tif 000106
2018513681.tif 000107
【０２２１】
配列番号６９
名称：ｇｉ｜７５４２６４８８８｜ｇｂ｜ＡＪＩ５７２５２．１｜ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１、サブタイプＰＲＥＦＲＡＮ［フランシセラ・フィロミラジア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）］
配列：
2018513681.tif 000108
【０２２２】
配列番号７０
名称：ｇｉ｜４３８６０９｜ｇｂ｜Ｌ２１１８８．１｜ＨＩＶ１ＮＹ５Ａヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ遺伝子、３’末端
配列：
2018513681.tif 000109
【０２２３】
配列番号７１
名称：ｇｉ｜４３８６１０｜ｇｂ｜ＡＡＣ３７８７５．１｜インテグラーゼ、部分的［ヒト免疫不全ウイルス１］
配列：
2018513681.tif 000110
【０２２４】
配列番号７２
名称：ｇｉ｜５４５６１２２３２｜ｒｅｆ｜ＷＰ＿０２１７３６７２２．１｜Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１［アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６］
配列：
2018513681.tif 000111
2018513681.tif 000112
【０２２５】
配列番号７３
名称：ｇｉ｜７６９１４２３２２｜ｒｅｆ｜ＷＰ＿０４４９１９４４２．１｜Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１［ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０］
配列：
2018513681.tif 000113
2018513681.tif 000114
【０２２６】
配列番号７４
名称：ｇｉ｜４８９１３０５０１｜ｒｅｆ｜ＷＰ＿００３０４０２８９．１｜Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１［フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）］
配列：
2018513681.tif 000115
2018513681.tif 000116
【０２２７】
配列番号７５
名称：ｇｉ｜５０２２４０４４６｜ｒｅｆ｜ＷＰ＿０１２７３９６４７．１｜Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１［［ユーバクテリウム］エリゲンス（ｅｌｉｇｅｎｓ）］
配列：
2018513681.tif 000117
2018513681.tif 000118
【０２２８】
配列番号７６
名称：ｇｉ｜５３７８３４６８３｜ｒｅｆ｜ＷＰ＿０２０９８８７２６．１｜Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１［レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）］
配列：
2018513681.tif 000119
2018513681.tif 000120
【０２２９】
配列番号７７
名称：ｇｉ｜７３９００８５４９｜ｒｅｆ｜ＷＰ＿０３６８９０１０８．１｜Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１［ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）］
配列：
2018513681.tif 000121
2018513681.tif 000122
【０２３０】
配列番号７８
名称：ｇｉ｜５１７１７１０４３｜ｒｅｆ｜ＷＰ＿０１８３５９８６１．１｜Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１［プロフィロモナス・マカカ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）］
配列：
2018513681.tif 000123
2018513681.tif 000124
【０２３１】
配列番号７９
名称：Ｕｎｉｐｒｏｔ部位で見られるインテグラーゼタンパク質配列。ＧｅｎＢａｎｋからＤＮＡ配列を得た。
配列：
2018513681.tif 000125
【０２３２】
配列番号８０
名称：ｓｐ｜Ｐ０４５８５｜１１４８−１４３５
配列：
2018513681.tif 000126
【０２３３】
配列番号８１
ジンクフィンガータンパク質を特徴付けるタンパク質ドメイン
ＣＸ（２−４）ＣＸ（１２）ＨＸ（３−５）Ｈ（Ｘ（２−４）は、例えばＸＸまたはＸＸＸまたはＸＸＸＸを意味する）
【０２３４】
配列番号８２
＞ｇｉ｜１６１６６０６｜ｅｍｂ｜Ｘ９７０４４．１｜マウス乳癌ウイルス５’ＬＴＲ  ＤＮＡ
2018513681.tif 000127
2018513681.tif 000128
【０２３５】
配列番号８３
＞ｇｉ｜１４０３３８７｜ｅｍｂ｜Ｘ９８４５７．１｜マウス乳癌ウイルス３’ＬＴＲ
2018513681.tif 000129
2018513681.tif 000130
【０２３６】
配列番号８４
＞ｇｉ｜１１９６６２０９９｜ｅｍｂ｜ＡＭ０７６８８１．１｜ヒト免疫不全ウイルス１プロウイルス５’ＬＴＲ、ＴＡＲエレメントおよびＵ３、Ｕ５およびＲリピート領域、クローンＰＧ２３２．１４
2018513681.tif 000131
【０２３７】
配列番号８５
＞ｇｉ｜１０７２０８１｜ｇｂ｜Ｕ３７２６７．１｜ＨＩＶ１Ｕ３７２６７ヒト免疫不全ウイルス１型３’ＬＴＲ領域
2018513681.tif 000132
【０２３８】
配列番号８６〜９９はない。
【０２３９】
配列番号１００
細胞のゲノムへのｎｅｏの挿入のためのオリゴ（５’および３’ＨＩＶ  ＬＴＲの全配列を使用）
2018513681.tif 000133
2018513681.tif 000134
最初の５’ＬＴＲに下線を付し、標準文字はｎｅｏであり、３’ＬＴＲは太字（１１７９ｂｐ）とする。
【０２４０】
配列番号１０１
（２２４ｂｐ）内にｎｅｏ配列がある５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの短縮型
最初の５’ＬＴＲに下線を付し、標準文字はｎｅｏであり、３’ＬＴＲは太字とする。
2018513681.tif 000135
【０２４１】
配列番号７２に関して
Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質ＩＤ：ＷＰ＿０２１７３６７２２．１
ＮＲデータベースまたはローカルＧＩからのＮＣＢＩタンパク質ＧＩ（ＷＧＳデータベース由来のタンパク質に対する）：５４５６１２２３２
ＷＧＳデータベースにおけるコンティグＩＤ：ＡＷＵＲ０１００００１６．１
コンティグの記述：アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６コンティグ０００２８、全ゲノムショットガン配列
タンパク質完全性：完全
実験的に分析したタンパク質：８
非重複セット：ｎｒ
生物：アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｓｐ．）＿ＢＶ３Ｌ６
分類：
細菌、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、ネガティビキューテス（Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ）、セレノモナダレス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、アシダミノコッカス科（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６
【０２４２】
配列番号７３に関して
Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質ＩＤ：ＷＰ＿０４４９１９４４２．１
ＮＲデータベースまたはローカルＧＩからのＮＣＢＩタンパク質（ＷＧＳデータベース由来のタンパク質に対する）：７６９１４２３２２
ＷＧＳデータベースにおけるコンティグＩＤ：ＪＱＫＫ０１０００００８．１
コンティグの記述：ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０  Ｔ３４８ＤＲＡＦＴ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ００００７．７＿Ｃ、全ゲノムショットガン配列
タンパク質完全性：完全
実験的に分析したタンパク質：９
非重複セット：ｎｒ
生物：ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）＿細菌＿ＭＡ２０２０
分類：細菌、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、クロストリジアレス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、未分類ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０
【０２４３】
開示される組成物および方法で使用され得るさらなる核酸配列およびタンパク質配列  −  ＣＰＦ１アライメント。配列番号８６〜９２；チャートの上から下の順序。
2018513681.tif 000136
2018513681.tif 000137
2018513681.tif 000138
2018513681.tif 000139
【０２４４】
開示される組成物および方法において使用され得るさらなる核酸配列およびタンパク質配列  −  Ｃｆｐ１ヒト切断タンパク質アライメント。配列番号８６（第１列）および配列番号９０（第２列）。
2018513681.tif 000140
2018513681.tif 000141
【０２４５】
開示される組成物および方法において使用され得るさらなる核酸配列およびタンパク質配列。Ｈａｆｔ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００５，Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ  ６，ｐｐ．４７４−４８３から採用された表。配列番号２００〜２５３；チャートの上から下の順序。
2018513681.tif 000142
2018513681.tif 000143
【０２４６】
Ｎｒｆ２（エクソン２）に対する標的配列およびＰＡＭの編集：ｓｇＲＮＡに対して設計１〜３を使用した。
配列番号２５４
ＧＣＧＡＣＧＧＡＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＣ  ＴＧＧ
配列番号２５５
ＴＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧＣＧＡ  ＣＧＧ
配列番号２５６
ＴＧＧＡＧＧＣＡＡＧＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴ  ＴＧＧ
【０２４７】
Ｎｒｆ２標的での組み込みの検出のためのプライマーキー
プライマーセット１：
配列番号２５７
プライマー１：５’−ＧＴＧＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣ−３’、
配列番号２５８
プライマー２：５’−ＧＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＴＴＴＧ−３’
プライマーセット２：
配列番号２５９
プライマー１：５’−ＧＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ−３’、
配列番号２６０
プライマー２：５’−ＧＡＴＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧ−３’
プライマーセット３：
配列番号２６１
プライマー１：５’−ＴＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＴＧＣ−３’、
配列番号２６２
プライマー２：５’−ＧＡＴＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧ−３’
【０２４８】
ヒトＣＸＣＲ４に対する受入番号
Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ６１０７３
Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１２１９６６
【０２４９】
ＣＸＣＲ４（エクソン２）に対する標的配列およびＰＡＭの編集：ｓｇＲＮＡに対して設計１を使用した。
配列番号２６３
ＧＧＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣ  ＴＧＧ
【０２５０】
ＣＸＣＲ４標的での組み込みの検出のためのプライマーキー
プライマーセット１：
配列番号２６４
プライマー１：５’−ＴＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＴＧＣ−３’、
配列番号２６５
プライマー２：５’−ＧＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＴＴＴＧ−３’
プライマーセット２：
配列番号２６６
プライマー１：５’−ＴＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＴＧＣ−３’、
配列番号２６７
プライマー２：５’−ＧＡＴＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧ−３’
プライマーセット３：
配列番号２６８
プライマー１：５’−ＧＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ−３’、
配列番号２６９
プライマー２：５’−ＧＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＴＴＴＧ−３’
プライマーセット４：
配列番号２７０
プライマー１：５’−ＧＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ−３’、
配列番号２７１
プライマー２：５’−ＧＡＴＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧ−３’
【０２５１】
ビオチン化のためのＡｖｉ−タグ付加Ｃａｓ９
Ｃａｓ９ビオチン化のために使用されるａｖｉ−タグの配列
アミノ酸配列：
配列番号２７２
ＧＧＤＬＥＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ＊
核酸配列：
配列番号２７３
2018513681.tif 000144
【図１】
2018513681.tif 000145
【図２】
2018513681.tif 000146
【図３】
2018513681.tif 000147
【図４】
2018513681.tif 000148
【図５】
2018513681.tif 000149
【図６】
2018513681.tif 000150
【図７】
2018513681.tif 000151
【図８】
2018513681.tif 000152
【図９】
2018513681.tif 000153
【図１０】
2018513681.tif 000154
【図１１】
2018513681.tif 000155
【配列表】
2018513681000001.app
【国際調査報告】
2018513681.tif 000156
2018513681.tif 000157
2018513681.tif 000158
2018513681.tif 000159