(57)【要約】本明細書には、細孔システムを用いて、サンプル中の酵素または酵素活性を電気的に検出しかつ/または定量化するための方法および組成物が開示される。2018503830.tif 000003
2018503830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在すると予想される標的分子の存在または非存在を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
サンプルを、切断可能なリンカーを含む融合分子と接触させる段階であって、該切断可能なリンカーが該標的分子の存在下で特異的に切断される、段階；
該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；
該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該融合分子の第1部分が該ポリマー足場に結合し、かつ該融合分子の第2部分がペイロード分子に結合し、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；および
該切断可能なリンカーが切断されたかどうかを該センサで判定し、それによりサンプル中の標的分子の存在または非存在を検出する段階。
【請求項２】
サンプルを融合分子と接触させる段階が、前記デバイスにサンプルを投入する前に実施される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
サンプルを前記デバイスに投入する段階が、サンプルを前記融合分子と接触させる前に実施される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
融合分子がポリマー足場結合ドメインを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
サンプルをポリマー足場と接触させる段階をさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ポリマー足場をポリマー足場結合ドメインに結合させる段階をさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
ポリマー足場が、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介してポリマー足場結合ドメインに結合する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
ポリマー足場結合ドメインがアジド基を含む、請求項4記載の方法。
【請求項９】
ポリマー足場結合ドメインが、DNA、RNA、PNA、ポリペプチド、コレステロール/DNAハイブリッド、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
ポリマー足場結合ドメインが、ロックド核酸(LNA)、架橋核酸(BNA)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文型反復配列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat:CRISPR)、アプタマー、DNA結合タンパク質、および抗体フラグメントからなる群より選択される分子を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
DNA結合タンパク質がジンクフィンガータンパク質を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
抗体フラグメントがフラグメント抗原結合(Fab)フラグメントを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
ポリマー足場結合ドメインが化学修飾を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１４】
前記融合分子がペイロード分子結合ドメインを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
サンプルをペイロード分子と接触させる段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ペイロード分子をペイロード分子結合ドメインに結合させる段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
ペイロード分子が、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介してペイロード分子結合ドメインに結合する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
ペイロード分子結合ドメインがDBCOを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
前記融合分子がポリマー足場結合ドメインとペイロード分子結合ドメインとを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
前記融合分子の第1部分が、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介してポリマー足場に直接的または間接的に結合される、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
前記融合分子の第2部分が、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介してペイロード分子に直接的または間接的に結合される、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
ペイロード分子またはポリマー足場が直接的な共有結合テザリング(tethering)を介して前記融合分子に結合される、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
前記融合分子が、切断可能なリンカーへのポリマー足場または融合分子の直接的な共有結合テザリングのためのコネクタを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ポリマー足場が前記融合分子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
前記検出が、前記融合分子を介してポリマー足場がペイロード分子に結合しているかどうかをセンサで判定することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
前記センサが前記ナノ細孔内の電気信号を検出する、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
電気信号が電流である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
標的分子がヒドロラーゼまたはリアーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
切断可能なリンカーが、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびポリペプチドからなる群より選択される分子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
切断可能なリンカーが、アゾ化合物、ジスルフィド架橋、スルホン、エチレングリコールジスクシネート、ヒドラゾン、アセタール、イミン、ビニルエーテル、ビシナルジオール、およびピコリン酸エステルからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
標的分子が、炭素-酸素結合、炭素-硫黄結合、炭素-窒素結合、および炭素-炭素結合からなる群より選択される切断可能なリンカー中の結合を特異的に切断する、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
ポリマー足場が、デオキシリボ核酸(DNA)、デンドリマー、ペプチド核酸(PNA)、リボ核酸(RNA)、ポリペプチド、ナノロッド、ナノチューブ、コレステロール/DNAハイブリッド、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
ペイロード分子が、デンドリマー、二本鎖DNA、一本鎖DNA、DNAアプタマー、フルオロフォア、タンパク質、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、フラーレン、PEG分子、リポソーム、およびコレステロール-DNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３４】
前記センサが電極対を含み、該電極対が、前記2つの容積の間に電圧差を印加して、ナノ細孔を通って流れる電流を検出する、請求項1記載の方法。
【請求項３５】
前記融合分子が2つ以上の切断可能なリンカーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３６】
前記デバイスが少なくとも2つのナノ細孔を直列に含み、ポリマー足場が該少なくとも2つのナノ細孔内で同時に捕捉され、かつ検出される、請求項1記載の方法。
【請求項３７】
ポリマー足場の移動が、ナノ細孔の各々に固有の電圧を印加することによって制御される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の存在または非存在を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
サンプルを、切断可能なリンカーを含む融合分子と接触させる段階であって、該切断可能なリンカーが該標的分子または状態の存在下で特異的に切断される、段階；
該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；
該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該融合分子の第1部分が該ポリマー足場に結合し、該融合分子の第2部分がペイロード分子に結合し、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；および
該切断可能なリンカーが切断されたかどうかを該センサで判定し、それによりサンプル中の標的分子または状態の存在または非存在を検出する段階。
【請求項３９】
サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の存在または非存在を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法：
サンプルを融合分子、ポリマー足場およびペイロード分子と接触させる段階であって、該融合分子が切断可能なリンカーを含み、該標的分子が切断可能なリンカー、ポリマー足場結合ドメインおよびペイロード分子結合ドメインを特異的に切断する、段階；
該融合分子、ポリマー足場、ペイロード分子、および該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；
該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；および
該切断可能なリンカーがペイロード分子に結合しているかどうかを該センサで判定し、それにより標的分子または状態の存在または非存在を検出する段階。
【請求項４０】
標的分子がヒドロラーゼまたはリアーゼを含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記標的分子または状態が、10nm〜550nmの波長を含む光への切断可能なリンカーの曝露を介して、切断可能なリンカーを光分解によって切断する、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
光分解切断に感受性の切断可能なリンカーが、オルト-ニトロベンジル誘導体およびフェナシルエステル誘導体からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記標的分子または状態が、求核試薬、塩基性試薬、求電子試薬、酸性試薬、還元試薬、酸化試薬、および有機金属化合物からなる群より選択される試薬への切断可能なリンカーの曝露を介して、切断可能なリンカーを化学的に切断する、請求項39記載の方法。
【請求項４４】
前記デバイスにおける2つの容積の少なくとも1つが、融合分子のポリマー足場への結合および融合分子のペイロード分子への結合を可能にする条件を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４５】
融合分子が、サンプルを該融合分子と接触させる前に、ポリマー足場およびペイロード分子に結合される、請求項39記載の方法。
【請求項４６】
融合分子が、該融合分子をデバイスに投入する前に、ポリマー足場およびペイロード分子に結合される、請求項39記載の方法。
【請求項４７】
前記デバイス内の1つ以上の容積が、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態による切断可能なリンカーの切断を可能にする条件を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４８】
サンプルを融合分子と接触させる段階が、前記デバイスにサンプルを投入する前に実施される、請求項39記載の方法。
【請求項４９】
サンプルを前記デバイスに投入する段階が、サンプルを融合分子と接触させる前に実施される、請求項39記載の方法。
【請求項５０】
ポリマー足場が、デオキシリボ核酸(DNA)、デンドリマー、ペプチド核酸(PNA)、リボ核酸(RNA)、ポリペプチド、ナノロッド、ナノチューブ、コレステロール/DNAハイブリッド、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む、請求項39記載の方法。
【請求項５１】
切断可能なリンカーが、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびポリペプチドからなる群より選択される分子を含む、請求項39記載の方法。
【請求項５２】
前記標的分子または状態が、炭素-酸素結合、炭素-硫黄結合、炭素-窒素結合、および炭素-炭素結合からなる群より選択される切断可能なリンカー中の結合を特異的に切断する、請求項39記載の方法。
【請求項５３】
切断可能なリンカーが、アゾ化合物、ジスルフィド架橋、スルホン、エチレングリコールジスクシネート、ヒドラゾン、アセタール、イミン、ビニルエーテル、ビシナルジオール、およびピコリン酸エステルからなる群より選択される、請求項39記載の方法。
【請求項５４】
ペイロード分子が、デンドリマー、二本鎖DNA、一本鎖DNA、DNAアプタマー、フルオロフォア、タンパク質、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、フラーレン、PEG分子、リポソーム、およびコレステロール-DNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む、請求項39記載の方法。
【請求項５５】
ポリマー足場と融合分子が、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介して結合する、請求項39記載の方法。
【請求項５６】
ポリマー足場と融合分子が直接的な共有結合テザリングを介して結合する、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
融合分子がポリマー足場への直接的な共有結合テザリングのためのコネクタを含み、該コネクタが切断可能なリンカーに結合する、請求項55記載の方法。
【請求項５８】
前記コネクタがポリエチレングリコールを含む、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
融合分子が、DNA、RNA、PNA、ポリペプチド、コレステロール/DNAハイブリッド、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含むポリマー足場結合ドメインを含む、請求項55記載の方法。
【請求項６０】
融合分子が、ロックド核酸(LNA)、架橋核酸(BNA)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文型反復配列(CRISPR)、アプタマー、DNA結合タンパク質、および抗体フラグメントからなる群より選択される分子を含む、請求項55記載の方法。
【請求項６１】
DNA結合タンパク質がジンクフィンガータンパク質を含む、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
抗体フラグメントがフラグメント抗原結合(Fab)フラグメントを含む、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
融合分子が化学修飾を含む、請求項55記載の方法。
【請求項６４】
切断可能なリンカーとペイロード分子が、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介して直接的または間接的に結合する、請求項39記載の方法。
【請求項６５】
前記センサが電極対を含み、該電極対が、前記2つの容積の間に電圧差を印加して、ナノ細孔を通って流れる電流を検出する、請求項39記載の方法。
【請求項６６】
融合分子が2つ以上の切断可能なリンカーを含む、請求項39記載の方法。
【請求項６７】
サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法：
サンプルをポリマー足場と接触させる段階であって、該足場が切断可能なドメインを含み、該切断可能なドメインが該標的分子の存在下で特異的に切断される、段階；
該ポリマー足場および該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；
該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；および
該切断可能なドメインが切断されたかどうかを該センサで判定し、それによりサンプル中の標的分子または状態の存在または非存在を検出する段階。
【請求項６８】
ポリマー足場が、デオキシリボ核酸(DNA)、デンドリマー、ペプチド核酸(PNA)、リボ核酸(RNA)、ポリペプチド、ナノロッド、ナノチューブ、コレステロール/DNAハイブリッド、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
切断可能なドメインが、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびポリペプチドからなる群より選択される分子を含む、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
前記標的分子または状態が、炭素-酸素結合、炭素-硫黄結合、炭素-窒素結合、および炭素-炭素結合からなる群より選択される切断可能なドメインの結合を特異的に切断する、請求項67記載の方法。
【請求項７１】
切断可能なドメインが前記標的分子または状態の存在下で光分解によって切断され、かつ切断可能なドメインがオルト-ニトロベンジル誘導体およびフェナシルエステル誘導体からなる群より選択される分子を含む、請求項67記載の方法。
【請求項７２】
切断可能なドメインが前記標的分子または状態の存在下で化学的に切断され、かつ切断可能なドメインが、アゾ化合物、ジスルフィド架橋、スルホン、エチレングリコールジスクシネート、ヒドラゾン、アセタール、イミン、ビニルエーテル、ビシナルジオール、またはピコリン酸エステルからなる群より選択される分子を含む、請求項67記載の方法。
【請求項７３】
前記デバイスが少なくとも2つのナノ細孔を直列に含み、ポリマー足場が移動中に該少なくとも2つのナノ細孔内に同時に存在する、請求項67記載の方法。
【請求項７４】
サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態を定量化する方法であって、以下の段階を含む方法：
サンプルを融合分子、ポリマー足場、およびペイロード分子と接触させる段階であって、該融合分子が切断可能なリンカーを含み、該切断可能なリンカーが該標的分子または状態、ポリマー足場結合ドメイン、およびペイロード分子結合ドメインの存在下で特異的に切断される、段階；
融合分子、ポリマー足場、ペイロード分子、および該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；
該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；
ポリマー足場がペイロード分子に結合しているかどうかを該センサで判定し、それにより標的分子の存在または非存在を検出する段階；および
該センサからの測定値を使用して、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の濃度または活性を推定する段階。
【請求項７５】
前記濃度または活性の決定が、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の検出に対して数字で表した信頼値を割り当てることを含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
サンプルを融合分子と接触させる段階と、融合分子、ポリマー足場、ペイロード分子、およびサンプルをデバイスに投入する段階と、該デバイスを設定する段階と、ポリマー足場がペイロード分子に結合されているかどうかを判定する段階が、ポリマー足場、融合分子、ペイロード分子、またはサンプル中の標的分子もしくは状態のうちの1つ以上の濃度または活性を変化させて繰り返される、請求項74記載の方法。
【請求項７７】
サンプル中に存在すると予想される標的分子を定量化する方法であって、以下の段階を含む方法：
サンプルを、切断可能なリンカーを含む融合分子と接触させる段階であって、該切断可能なリンカーが該標的分子の存在下で特異的に切断される、段階；
該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；
該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該融合分子の第1部分が該ポリマー足場に結合し、該融合分子の第2部分がペイロード分子に結合し、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；
該切断可能なリンカーが切断されているかどうかを該センサで判定し、それによりサンプル中の標的分子の存在または非存在を検出する段階；および
該センサからの測定値を使用して、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の濃度を推定する段階。
【請求項７８】
前記濃度の決定が、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の検出に対して数字で表した信頼値を割り当てることを含む、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
サンプルを融合分子と接触させる段階と、サンプルをデバイスに投入する段階と、該デバイスを設定する段階と、切断可能なリンカーが切断されているかどうかを判定する段階が、ポリマー足場、融合分子、ペイロード分子、またはサンプル中の標的分子もしくは状態のうちの1つ以上の濃度を変化させて繰り返される、請求項77記載の方法。
【請求項８０】
ナノ細孔を含むデバイスであって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分け、該デバイスが、1つ以上の細孔を通して核酸を通過させるように設定され、該デバイスが、該ナノ細孔を通過する物体を識別するように構成された各細孔のためのセンサを備える、デバイス；
切断可能なリンカーを含む融合分子であって、該切断可能なリンカーが標的分子の存在下で特異的に切断される、融合分子；
ペイロード分子；
ポリマー足場；および
サンプル中の標的分子の存在または非存在を検出するための使用のための使用説明書
を含むキット。
【請求項８１】
前記融合分子がペイロード分子に結合する、請求項80記載のキット。
【請求項８２】
前記融合分子がポリマー足場に結合する、請求項80記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年2月2日に出願された米国仮特許出願第62/111,073号の恩典を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
サンプル中に存在する酵素活性は、毒素、障害、または生物の他の疾患の存在を示すことができる。例えば、プロテアーゼは、ヒトにおいて見出される極めて重要な分子であって、創傷治癒、細胞シグナル伝達、アポトーシスなど、多種多様の正常なヒト生理学的過程を調節している。人体内でのそれらの重要な役割のために、異常なプロテアーゼ活性は、関節リウマチ、アルツハイマー病、心血管疾患および広範囲の悪性疾患を含むがこれらに限定されない、多くの病態に関連している。前立腺特異的抗原(PSA)は、貴重な診断用プロテアーゼの一例であって、男性の前立腺癌の診断およびモニタリングにおける至適基準(gold standard)である。プロテアーゼは、ほぼ全てのヒトの体液および組織に見出され、その活性レベルは疾患の存在を知らせることができる。
【０００３】
サンプル中の酵素の存在を判定するための戦略は複数存在するが、多くの場合、問題の酵素そのものの有無よりも該酵素の活性が重要である。サンプル中に存在する酵素活性のレベルを評価するための戦略は存在するものの、これらの技術はしばしば高価であり、多大な時間への投資とデバイスのインフラを必要とし、かつ/または使用するのが難しく、携帯できない。したがって、必要とされるものは、溶液中の酵素活性を判定する方法であって、迅速であり、単に存在するだけの非活性酵素から活性酵素を判別し、標識フリーであり、かつ/または精製もしくは非精製サンプルで実施できる方法である。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本明細書で開示される様々な局面は、上述の必要性の1つ以上を満たすことができる。本明細書に記載のシステムおよび方法は、それぞれがいくつかの側面を持ち、そのうちの1つがその望ましい属性に単独で関与するものではない。後続の特許請求の範囲によって表される本開示の範囲を限定することなく、より顕著な特徴をここで簡潔に述べることにする。この記述を検討した後で、特に「詳細な説明」という表題のセクションを読んだ後で、本明細書に記載のサンプル特徴が改善されたシステムおよび方法をどのように提供するかを理解するであろう。
【０００５】
いくつかの実施態様においては、サンプル中の標的分子または状態の存在または非存在を検出する方法が本明細書で提供され、この方法は、標的分子または状態による不安定なリンカー(例えば、切断可能なリンカー)の切断を、該切断の産物を同定するためのナノ細孔デバイスを用いて検出することによるものである。いくつかの実施態様では、標的分子は酵素であり、本明細書に記載の方法は、サンプル中の活性標的酵素の存在または非存在を検出する。
【０００６】
特定の好ましい実施態様では、ポリマー足場はdsDNAである。特定の好ましい実施態様では、融合物はdsDNAに共有結合で直接的に結合し、ペイロードは該融合物に非共有結合で直接的に結合する。
【０００７】
いくつかの実施態様では、酵素による切断可能なリンカーの切断の前に、足場/融合物/ペイロードは、ナノ細孔を通って移動する時に固有の検出可能な電流を与える。いくつかの実施態様では、酵素による切断可能なリンカーの切断の後、足場(または足場＋融合物の残存成分)とペイロード(またはペイロード＋融合物の残存成分)はもはや結合されておらず、それぞれがナノ細孔を通って移動する時に、足場/融合物/ペイロード複合体とは異なる、固有の検出可能な電流を与える。
【０００８】
特定の実施態様では、融合分子は、DNA足場に結合されるPNAと、コネクタによって該PNAに共有結合でテザリング(tethering)される切断可能なリンカーを含む。特定の実施態様では、ペイロードは切断可能なリンカーに結合されるPEGである。特定の実施態様では、ペイロードのサイズ、形状、および/または電荷を改変することによって、特定の形状またはサイズの細孔における電流インピーダンスに基づく分解能(resolution)を上げ、足場/融合物/ペイロード複合体と足場とペイロードとの間の判別を改善することができる。
【０００９】
特定の実施態様では、ポリマー足場は、1種以上の標的エンドヌクレアーゼによって切断される切断可能なドメインを含む1つ以上の配列部位を有するdsDNAである。特定の実施態様では、ポリマー足場は切断前に線状dsDNAである。特定の実施態様では、ポリマー足場は切断前に環状dsDNAである。
【００１０】
また、ナノ細孔デバイスからのデータを分析して、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の存在を定量化する方法も本明細書で提供される。特定の好ましい実施態様では、検出に対する数字で表した信頼値が割り当てられる。特定の好ましい実施態様では、標的の濃度は、融合物、足場、ペイロード、および/または標的分子のうちの1つ以上の濃度を変化させる反復実験に数学的ツールを適用することによって推定される。
【００１１】
いくつかの実施態様では、サンプル中に存在すると予想される標的分子の存在または非存在を検出する方法が本明細書で提供され、該方法は以下の段階を含む：サンプルを、切断可能なリンカーを含む融合分子と接触させる段階であって、該切断可能なリンカーが該標的分子の存在下で特異的に切断される、段階；該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該融合分子の第1部分が該ポリマー足場に結合し、かつ該融合分子の第2部分がペイロード分子に結合し、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；および該切断可能なリンカーが切断されたかどうかを該センサで判定し、それによりサンプル中の標的分子の存在または非存在を検出する段階。
【００１２】
いくつかの実施態様では、サンプルを融合分子と接触させる段階は、該デバイスにサンプルを投入する前に実施される。いくつかの実施態様では、サンプルを該デバイスに投入する段階は、サンプルを融合分子と接触させる前に実施される。
【００１３】
いくつかの実施態様では、融合分子はポリマー足場結合ドメインを含む。いくつかの実施態様では、標的分子の存在または非存在を検出する前記方法は、サンプルをポリマー足場と接触させる段階をさらに含む。いくつかの実施態様では、標的分子の存在または非存在を検出する前記方法は、ポリマー足場をポリマー足場結合ドメインに結合させる段階をさらに含む。いくつかの実施態様では、ポリマー足場は、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介してポリマー足場結合ドメインに結合する。いくつかの実施態様では、ポリマー足場結合ドメインはアジド基を含む。いくつかの実施態様では、ポリマー足場結合ドメインは、DNA、RNA、PNA、ポリペプチド、コレステロール/DNAハイブリッド、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む。いくつかの実施態様では、ポリマー足場結合ドメインは、ロックド核酸(LNA)、架橋核酸(BNA)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文型反復配列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat:CRISPR)、アプタマー、DNA結合タンパク質、および抗体フラグメントからなる群より選択される分子を含む。いくつかの実施態様では、DNA結合タンパク質はジンクフィンガータンパク質を含む。いくつかの実施態様では、抗体フラグメントは、フラグメント抗原結合(Fab)フラグメントを含む。いくつかの実施態様では、ポリマー足場結合ドメインは化学修飾を含む。
【００１４】
いくつかの実施態様において、融合分子はペイロード分子結合ドメインを含む。いくつかの実施態様では、標的分子の存在または非存在を検出する前記方法は、サンプルをペイロード分子と接触させる段階をさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施態様では、標的分子の存在または非存在を検出する前記方法は、ペイロード分子をペイロード分子結合ドメインに結合させる段階をさらに含む。いくつかの実施態様では、ペイロード分子は、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介してペイロード分子結合ドメインに結合する。いくつかの実施態様では、ペイロード分子結合ドメインはDBCOを含む。
【００１６】
いくつかの実施態様では、融合分子はポリマー足場結合ドメインとペイロード分子結合ドメインとを含む。いくつかの実施態様では、融合分子の第1部分は、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介してポリマー足場に直接的または間接的に結合する。いくつかの実施態様では、融合分子の第2部分は、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介してペイロード分子に直接的または間接的に結合する。
【００１７】
いくつかの実施態様では、ペイロード分子またはポリマー足場は、直接的な共有結合テザリングを介して融合分子に結合する。いくつかの実施態様では、融合分子は、切断可能なリンカーへのポリマー足場または融合分子の直接的な共有結合テザリングのためのコネクタを含む。いくつかの実施態様では、ポリマー足場は融合分子を含む。いくつかの実施態様では、サンプル中の標的分子の存在または非存在の検出は、ポリマー足場が融合分子を介してペイロード分子に結合しているかどうかをセンサで判定することを含む。いくつかの実施態様では、センサはナノ細孔内の電気信号を検出する。いくつかの実施態様では、電気信号は電流である。
【００１８】
いくつかの実施態様では、標的分子はヒドロラーゼまたはリアーゼである。いくつかの実施態様では、切断可能なリンカーは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびポリペプチドからなる群より選択される分子を含む。いくつかの実施態様では、切断可能なリンカーは、アゾ化合物、ジスルフィド架橋、スルホン、エチレングリコールジスクシネート、ヒドラゾン、アセタール、イミン、ビニルエーテル、ビシナルジオール、およびピコリン酸エステルからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、標的分子は、炭素-酸素結合、炭素-硫黄結合、炭素-窒素結合、および炭素-炭素結合からなる群より選択される切断可能なリンカー中の結合を特異的に切断する。
【００１９】
いくつかの実施態様では、ポリマー足場は、デオキシリボ核酸(DNA)、デンドリマー、ペプチド核酸(PNA)、リボ核酸(RNA)、ポリペプチド、ナノロッド、ナノチューブ、コレステロール/DNAハイブリッド、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む。いくつかの実施態様では、ペイロード分子は、デンドリマー、二本鎖DNA、一本鎖DNA、DNAアプタマー、フルオロフォア、タンパク質、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、フラーレン、PEG分子、リポソーム、およびコレステロール-DNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む。いくつかの実施態様では、融合分子は2つ以上の切断可能なリンカーを含む。
【００２０】
いくつかの実施態様では、センサは電極対を含み、該電極対は、前記2つの容積の間に電圧差を印加して、ナノ細孔を通って流れる電流を検出する。いくつかの実施態様では、前記デバイスは少なくとも2つのナノ細孔を直列に含み、この場合、ポリマー足場は該少なくとも2つのナノ細孔内で同時に捕捉され、かつ検出される。いくつかの実施態様では、ポリマー足場の移動は、ナノ細孔の各々に固有の電圧を印加することによって制御される。
【００２１】
また、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の存在または非存在を検出する方法が本明細書で提供され、該方法は以下の段階を含む：サンプルを、切断可能なリンカーを含む融合分子と接触させる段階であって、該切断可能なリンカーが該標的分子または状態の存在下で特異的に切断される、段階；該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該融合分子の第1部分が該ポリマー足場に結合し、該融合分子の第2部分がペイロード分子に結合し、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；および該切断可能なリンカーが切断されたかどうかを該センサで判定し、それによりサンプル中の標的分子または状態の存在または非存在を検出する段階。
【００２２】
いくつかの実施態様では、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の存在または非存在を検出するための方法が本明細書で提供され、該方法は以下の段階を含む：該サンプルを融合分子、ポリマー足場およびペイロード分子と接触させる段階であって、該融合分子が切断可能なリンカーを含み、該標的分子が切断可能なリンカー、ポリマー足場結合ドメインおよびペイロード分子結合ドメインを特異的に切断する、段階；融合分子、ポリマー足場、ペイロード分子、および該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；および該切断可能なリンカーがペイロード分子に結合しているかどうかを該センサで判定し、それにより標的分子または状態の存在または非存在を検出する段階。
【００２３】
いくつかの実施態様では、標的分子はヒドロラーゼまたはリアーゼを含む。いくつかの実施態様では、標的分子または状態は、10nm〜550nmの波長を含む光への切断可能なリンカーの曝露を介して、切断可能なリンカーを光分解によって切断する。いくつかの実施態様では、光分解切断に感受性の切断可能なリンカーは、オルト-ニトロベンジル誘導体およびフェナシルエステル誘導体からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、標的分子または状態は、求核試薬、塩基性試薬、求電子試薬、酸性試薬、還元試薬、酸化試薬、および有機金属化合物からなる群より選択される試薬への切断可能なリンカーの曝露を介して、切断可能なリンカーを化学的に切断する。
【００２４】
いくつかの実施態様では、前記デバイスにおける2つの容積の少なくとも1つは、融合分子のポリマー足場への結合および融合分子のペイロード分子への結合を可能にする条件を含む。いくつかの実施態様では、融合分子は、サンプルを該融合分子と接触させる前に、ポリマー足場およびペイロード分子に結合される。いくつかの実施態様では、融合分子は、該融合分子をデバイスに投入する前に、ポリマー足場およびペイロード分子に結合される。
【００２５】
いくつかの実施態様では、前記デバイス内の1つ以上の容積は、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態による切断可能なリンカーの切断を可能にする条件を含む。いくつかの実施態様では、サンプルを融合分子と接触させる段階は、該デバイスにサンプルを投入する前に実施される。いくつかの実施態様では、サンプルを該デバイスに投入する段階は、サンプルを融合分子と接触させる前に実施される。
【００２６】
いくつかの実施態様では、ポリマー足場は、デオキシリボ核酸(DNA)、デンドリマー、ペプチド核酸(PNA)、リボ核酸(RNA)、ポリペプチド、ナノロッド、ナノチューブ、コレステロール/DNAハイブリッド、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む。
【００２７】
いくつかの実施態様では、切断可能なリンカーは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびポリペプチドからなる群より選択される分子を含む。いくつかの実施態様では、切断可能なリンカーは、アゾ化合物、ジスルフィド架橋、スルホン、エチレングリコールジスクシネート、ヒドラゾン、アセタール、イミン、ビニルエーテル、ビシナルジオール、およびピコリン酸エステルからなる群より選択される。
【００２８】
いくつかの実施態様では、標的分子または状態は、炭素-酸素結合、炭素-硫黄結合、炭素-窒素結合、および炭素-炭素結合からなる群より選択される切断可能なリンカー中の結合を特異的に切断する。
【００２９】
いくつかの実施態様では、ペイロード分子は、デンドリマー、二本鎖DNA、一本鎖DNA、DNAアプタマー、フルオロフォア、タンパク質、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、フラーレン、PEG分子、リポソーム、およびコレステロール-DNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む。
【００３０】
いくつかの実施態様では、ポリマー足場と融合分子は、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介して結合する。いくつかの実施態様では、ポリマー足場と融合分子は直接的な共有結合テザリングを介して結合する。いくつかの実施態様では、融合分子は、ポリマー足場への直接的な共有結合テザリングのためのコネクタを含み、該コネクタは切断可能なリンカーに結合する。いくつかの実施態様では、該コネクタはポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施態様では、融合分子は、DNA、RNA、PNA、ポリペプチド、コレステロール/DNAハイブリッド、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含むポリマー足場結合ドメインを含む。
【００３１】
いくつかの実施態様において、融合分子は、ロックド核酸(LNA)、架橋核酸(BNA)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文型反復配列(CRISPR)、アプタマー、DNA結合タンパク質、および抗体フラグメントからなる群より選択される分子を含む。いくつかの実施態様では、DNA結合タンパク質はジンクフィンガータンパク質を含む。いくつかの実施態様では、抗体フラグメントは、フラグメント抗原結合(Fab)フラグメントを含む。いくつかの実施態様では、融合分子は化学修飾を含む。
【００３２】
いくつかの実施態様では、切断可能なリンカーとペイロード分子は、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介して直接的または間接的に結合する。いくつかの実施態様では、融合分子は2つ以上の切断可能なリンカーを含む。
【００３３】
いくつかの実施態様では、センサは電極対を含み、該電極対は、前記2つの容積の間に電圧差を印加して、ナノ細孔を通って流れる電流を検出する。
【００３４】
また、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の存在または非存在を検出するための方法が本明細書で提供され、該方法は以下の段階を含む：サンプルをポリマー足場と接触させる段階であって、該足場が切断可能なドメインを含み、該切断可能なドメインが該標的分子の存在下で特異的に切断される、段階；該ポリマー足場および該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；および該切断可能なドメインが切断されたかどうかを該センサで判定し、それによりサンプル中の標的分子または状態の存在または非存在を検出する段階。
【００３５】
いくつかの実施態様では、ポリマー足場は、デオキシリボ核酸(DNA)、デンドリマー、ペプチド核酸(PNA)、リボ核酸(RNA)、ポリペプチド、ナノロッド、ナノチューブ、コレステロール/DNAハイブリッド、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される分子を含む。
【００３６】
いくつかの実施態様では、切断可能なドメインは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびポリペプチドからなる群より選択される分子を含む。いくつかの実施態様では、標的分子または状態は、炭素-酸素結合、炭素-硫黄結合、炭素-窒素結合、および炭素-炭素結合からなる群より選択される切断可能なドメインの結合を特異的に切断する。
【００３７】
いくつかの実施態様では、切断可能なドメインは、標的分子または状態の存在下で光分解によって切断され、その場合、切断可能なドメインは、オルト-ニトロベンジル誘導体およびフェナシルエステル誘導体からなる群より選択される分子を含む。いくつかの実施態様では、切断可能なドメインは、標的分子または状態の存在下で化学的に切断され、その場合、切断可能なドメインは、アゾ化合物、ジスルフィド架橋、スルホン、エチレングリコールジスクシネート、ヒドラゾン、アセタール、イミン、ビニルエーテル、ビシナルジオール、またはピコリン酸エステルからなる群より選択される分子を含む。
【００３８】
いくつかの実施態様では、前記デバイスは少なくとも2つのナノ細孔を直列に含み、この場合、ポリマー足場は移動中に該少なくとも2つのナノ細孔内に同時に存在する。
【００３９】
いくつかの実施態様では、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の存在または非存在を定量化する方法が本明細書で提供され、該方法は以下の段階を含む：該サンプルを融合分子、ポリマー足場、およびペイロード分子と接触させる段階であって、該融合分子が切断可能なリンカーを含み、該切断可能なリンカーが該標的分子または状態、ポリマー足場結合ドメイン、およびペイロード分子結合ドメインの存在下で特異的に切断される、段階；融合分子、ポリマー足場、ペイロード分子、および該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；ポリマー足場がペイロード分子に結合しているかどうかを該センサで判定し、それにより標的分子の存在または非存在を検出する段階；および該センサからの測定値を使用して、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の濃度または活性を推定する段階。
【００４０】
いくつかの実施態様では、濃度または活性の決定は、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の検出に対して数字で表した信頼値を割り当てることを含む。いくつかの実施態様では、サンプルを融合分子と接触させる段階と、融合分子、ポリマー足場、ペイロード分子、およびサンプルをデバイスに投入する段階と、該デバイスを設定する段階と、ポリマー足場がペイロード分子に結合されているかどうかを判定する段階は、ポリマー足場、融合分子、ペイロード分子、またはサンプル中の標的分子もしくは状態のうちの1つ以上の濃度または活性を変化させて繰り返される。
【００４１】
また、サンプル中に存在すると予想される標的分子を定量化する方法が本明細書で提供され、該方法は以下の段階を含む：該サンプルを、切断可能なリンカーを含む融合分子と接触させる段階であって、該切断可能なリンカーが該標的分子の存在下で特異的に切断される、段階；該サンプルを、ナノ細孔を含むデバイスに投入する段階であって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分ける、段階；該ナノ細孔を通してポリマー足場を通過させるように該デバイスを設定する段階であって、該融合分子の第1部分が該ポリマー足場に結合し、該融合分子の第2部分がペイロード分子に結合し、該デバイスがナノ細孔を通過する物体を識別するように構成されたセンサを備える、段階；該切断可能なリンカーが切断されているかどうかを該センサで判定し、それによりサンプル中の標的分子の存在または非存在を検出する段階；および該センサからの測定値を使用して、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の濃度を推定する段階。
【００４２】
いくつかの実施態様では、濃度の決定は、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の検出に対して数字で表した信頼値を割り当てることを含む。いくつかの実施態様では、サンプルを融合分子と接触させる段階と、サンプルをデバイスに投入する段階と、該デバイスを設定する段階と、切断可能なリンカーが切断されたかどうかを判定する段階は、ポリマー足場、融合分子、ペイロード分子、またはサンプル中の標的分子もしくは状態のうちの1つ以上の濃度を変化させて繰り返される。
【００４３】
さらに、以下を含むキットが本明細書で提供される：ナノ細孔を含むデバイスであって、該ナノ細孔が該デバイスの内部空間を2つの容積に分け、該デバイスが、1つ以上の細孔を通して核酸を通過させるように設定され、該ナノ細孔を通過する物体を識別するように構成された各細孔のためのセンサを備える、デバイス；標的分子の存在下で特異的に切断される切断可能なリンカーを含む融合分子；ペイロード分子；ポリマー足場；およびサンプル中の標的分子の存在または非存在を検出するための使用のための使用説明書。
【００４４】
いくつかの実施態様では、融合分子はペイロード分子に結合する。いくつかの実施態様では、融合分子はポリマー足場に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
前述のおよび他の目的、特徴および利点は、添付の図面(同様の参照符号は異なる図全体を通して同じ部分を指す)に示される本発明の特定の実施態様の以下の説明から明らかになるであろう。図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の様々な実施態様の原理を説明することに重点が置かれている。また、限定ではなく単なる例示により特徴を示すデータ図も、本開示の実施態様として提供される。
【図１】図1は、ナノ細孔に捕捉された、切断可能なリンカーを有する融合分子、ペイロードに結合した該融合物、および足場に結合した該融合物の一実施態様を示す。
【図２】図2は、ナノ細孔システムを用いて酵素活性を検出するために足場/融合物/ペイロード分子を使用する1つの方法を示す。
【図３】図3は、ナノ細孔を用いてエンドヌクレアーゼ活性を検出するために線状足場分子を使用する方法を示す。
【図４】図4は、ナノ細孔を用いてエンドヌクレアーゼ活性を検出するために環状足場分子を使用する方法を示す。
【図５】図5は、複数の標的部位を有する標的分子を用いたナノ細孔によるエンドヌクレアーゼ活性の多重検出の検出方法を示す。
【図６】図6A、6Bおよび6Cは、マトリックスメタロプロテイナーゼ9(MMP9)によるタンパク質分解を受けやすい、融合分子内に含まれる切断可能なリンカーの具体例を示す。融合分子のリンカー成分は、PEG-ビオチンペイロード(図6A)、またはサイズがより大きいPEG-ビオチン-モノストレプトアビジンペイロード(図6B)に連結される。融合分子はアジド化学基(N3)を含み、このアジド基は「クリック」ケミストリーを介してDNA足場分子に化学的にカップリングすることが可能である(図6C)。
【図７】図7は、MMP9による切断可能なリンカーのタンパク質分解の例を示す。MMP9を含有するサンプルとインキュベートすると、プロテアーゼ感受性構築物は2つの別個の断片に切断される。
【図８】図8は、ナノ細孔を通過するときの3つの例示的分子の理想的な電流プロファイルを示し、それらのインピーダンス値は、切断可能なリンカーがタンパク質分解的に消化されたか否かを示す。パネルAに示される無傷(intact)のDNA足場/融合物/ペイロードのより深くかつより長く続く電流インピーダンスプロファイルは、切断可能なリンカーがMMP9によって分解されなかったことを示す。MMP9による切断可能リンカーの切断後の2つの断片については、より短くかつ/またはより浅い電流インピーダンスプロファイルがパネルBおよびCに示され、これらの断片は完全な足場/融合物/ペイロード複合体よりも小さいために、それぞれがナノ細孔を通過するときに電流をそれほど妨げない。
【図９Ａ】図9Aは、足場分子と、関心対象のエンドヌクレアーゼによる切断を受けやすい特定のDNA配列を含む融合分子の一部とを含む、二本鎖DNAの具体例を示す。該融合分子は、銅フリーの「クリック」ケミストリーを介するペイロード分子への下流コンジュゲーションのためのジベンゾシクロオクチン(DBCO)ケミカルハンドルをも含む。
【図９Ｂ】図9Bでは、DBCOハンドルがPEG-ビオチンペイロードにコンジュゲートされる。
【図１０】図10は、DNAのリンカー領域に含まれる切断可能なドメイン配列のエンドヌクレアーゼEco81Iによる分解の具体例を示す。完全な足場/融合分子/ペイロード構築物を、Eco81Iを含有するサンプルとインキュベートすると、切断可能ドメイン中の該エンドヌクレアーゼによって認識される特定の配列が切断されて、2つの別個の断片を生じる。
【図１１】図11は、3つの例示的分子の理想的な電流プロファイルを示し、それら分子のインピーダンス値は、該DNAの融合物成分中にコードされる配列(すなわち、切断可能ドメイン)がエンドヌクレアーゼによって消化されたか否かを示す。パネルAは、ナノ細孔を通過するときの無傷の足場/融合物/ペイロードの理想的な電流プロファイルを示し、完全な分子構築物の大きなインピーダンスは、エンドヌクレアーゼが切断可能ドメイン配列を切断しなかったことを示す。パネルBは、Eco81IとのインキュベーションおよびEco81Iによる切断後の該DNAの残っている足場部分の理想的な電流プロファイルを示し、ナノ細孔を通過するときに、より浅いかつ/またはより速い事象プロファイルを生じる。パネルCは、ナノ細孔を通過するときの、足場に結合していない残りの断片に一致する理想的な電流プロファイルを示す。
【図１２Ａ】図12Aは、単一の融合物が酵素活性を検出するための2つの異なる酵素切断可能なリンカー、すなわち、MMP9によるタンパク質分解を受けやすい切断可能なリンカーおよびエンドヌクレアーゼEco81Iにより認識されて切断される特定の配列、を含む例示的な構築物を示す。
【図１２Ｂ】図12Bは、該切断可能なリンカーが活性MMP9の非存在下で無傷のままであるのに、該DNA配列リンカーは活性エンドヌクレアーゼEco81Iの存在により切断されるプロセスを示す。完全な足場/融合物/ペイロード構築物を、Eco81Iを含むがMMP9を含まないサンプルとインキュベートすると、該エンドヌクレアーゼによって認識される特定の配列が切断されて、2つの別個の断片を生じる。
【図１２Ｃ】図12Cは、(i)完全な分子構築物と、(ii, iii)切断可能なリンカーのEco81I切断後の断片とを比較した、理想的なナノ細孔事象シグネチャを示す。
【図１３】図13は、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によるプロテアーゼ感受性分子構築物のコンジュゲーションを示す。500bpの二本鎖DNA足場(レーン1)はMMP9感受性の切断可能リンカーを含む融合物にテザリングされ、該融合物はペイロード分子にもテザリングされる(レーン2、上方のバンド)。さらなるペイロードの嵩高さのために、タンパク質モノストレプトアビジンが該複合体のペイロード部分に結合される(レーン3、上方のバンド)。
【図１４】図14は、プロテアーゼMMP9とのインキュベーション前および後のプロテアーゼ感受性構築物の電気泳動移動度を比較するゲルを示す。500bp DNA足場はMMP9切断可能リンカーを含む融合物にコンジュゲートされ、該融合物はペイロードにテザリングされる(レーン1および3)。MMP9とのインキュベーションの後、該構築物はDNAバンドのシフトダウンによって示される電気泳動移動度の増加を示し、切断可能なリンカーの完全消化を暗示する(レーン2)。
【図１５】図15は、SauIのアイソシゾマーであるEco81Iによる分解の前および後に生じたエンドヌクレアーゼ感受性構築物の断片を示す。ペイロードに共有結合で連結された500bp DNA足場内の部位のEco81Iによる分解は、コード化配列CC/T(N)AGG (500bp DNAの融合部分内に含まれる)での完全な加水分解をもたらす。加水分解は、306bpの足場と、ペイロードにテザリングされた194bp DNAを含む融合物：ペイロードとの、2つの断片を生成する(レーン3)。
【図１６】図16は、ヒト尿の滴定におけるMMP9感受性構築物の切断を実証する。ペイロードが結合したMMP9感受性構築物を含む融合物にテザリングされた300bp足場(レーン5)を、0〜30％の範囲で増加する濃度の尿の存在下にMMP9と共にインキュベートした。効率的な切断は5％までの尿中で起こり(レーン2)、一方該酵素の完全な阻害は、溶液中の＞15％尿で明らかであり(レーン3および4)、これは、無傷のDNA足場：融合物：ペイロードを示す上方バンドに変化がないことにより示される。
【図１７】図17は、ナノ細孔デバイスを用いた単一分子センシングを示す。(a)電圧V＝100mV (1M LiCl)で直径27nmのナノ細孔を通過する3.2kb dsDNAによって引き起こされる代表的な電流シフト事象。事象は、コンダクタンスシフト深度(δG＝δI/V)および持続時間によって定量化される。(b)10分にわたって記録された744事象についてのδG対持続時間の散布図。
【図１８】図18は、DNA単独(500bp)、DNA-ペイロード、およびDNA-ペイロード-モノストレプトアビジン(DNA-ペイロード-MS)についてのナノ細孔事象特性を比較する。DNA-ペイロードは、DNA単独と比較してδG＞1nSの事象の数の増加をもたらす。DNA-ペイロードへのMSの付加は、(a)δG対持続時間の散布図および(b)δG＞1nSの事象のパーセンテージにおいて観察されるように、事象シグネチャの深度および持続時間をさらに増加させることにある。
【図１９】図19は、DNA足場単独(300bp)、DNA：融合物：ペイロード、およびMMP9プロテアーゼの活性後のDNA：融合物：ペイロードについてのナノ細孔事象を比較するものであり、該融合分子にはMMP9切断可能なリンカーが含まれる。0.1msより長い事象のパーセンテージは、99％の信頼度でMMP9酵素の活性を検出するためのシグネチャを提供する。
【図２０】図20は、DNA単独(500bp)、足場：融合物：ペイロード、およびEco81Iエンドヌクレアーゼとのインキュベーション後の足場：融合物：ペイロードについてのナノ細孔事象を比較するものであり、該DNAの融合部分にはEco81IのためのDNA切断可能リンカーが含まれる。0.06msより長い事象のパーセンテージは、99％の信頼度でEco81I酵素の活性を検出するためのシグネチャを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
本出願全体を通して、本文は、本デバイス、組成物、システムおよび方法の様々な実施態様に言及する。記載された種々の実施態様は、説明に役立つ様々な例を提供するものであり、代替種(alternative species)の記載として解釈されるべきではない。むしろ、本明細書に提供された様々な実施態様の説明は、重複する範囲のものであってもよいことに留意すべきである。本明細書で述べられる実施態様は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
また、本開示を通じて、様々な刊行物、特許および公開特許明細書は、識別引用(identifying citation)によって参照される。これらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、その全体が参照により本開示に組み入れられる。
【００４８】
本明細書で使用する用語「含む」は、システム、デバイスおよび方法が列挙された構成要素または段階を含むが、その他を排除しないことを意味することが意図される。システム、デバイスおよび方法を定義するために使用する場合の「から本質的になる」とは、その組み合わせに対して本質的に意義のある他の構成要素または段階を排除することを意味するものとする。「からなる」とは、他の構成要素または段階を排除することを意味するものとする。これらの接続語の各々によって定義される実施態様は、本発明の範囲内にある。
【００４９】
範囲を含めて、全ての数字表示、例えば距離、サイズ、温度、時間、電圧および濃度は、0.1きざみで(＋)または(−)に変化する近似値である。必ずしも明記されるわけではないが、全ての数字表示の前に用語「約」が付されることは理解されるべきである。また、必ずしも明記されるわけではないが、本明細書に記載された構成要素は単なる例示であり、その均等物が当技術分野で公知であることも理解されるべきである。
【００５０】
本明細書で使用する「内部空間を分けるナノ細孔を含むデバイス」は、内部空間を2つの容積またはチャンバに分ける構造体内の開口部を含む細孔を有するデバイスを指すものとする。該デバイスはまた、2つ以上のナノ細孔を有することができ、細孔の各対の間に1つの共通チャンバを有する。
【００５１】
本明細書で使用する用語「融合分子」は、サンプル中に存在すると予想される標的分子または標的状態による酵素的、光分解的または化学的切断に感受性の切断可能なリンカーを含む分子または化合物を指す。該融合物はまた、ポリマー足場およびペイロード分子に結合する。ナノ細孔を通過する際に、電流シグネチャは、ペイロード分子がポリマー足場に結合しているか否かを決定する。この方法では、融合分子内の切断可能なリンカーの切断が検出および/または定量化され得る。
【００５２】
本明細書で使用する用語「切断」は、ある分子または化合物をより単純な構造に分離するために化学結合を破壊するプロセスまたは状態を指す。分子(例えば、酵素)または一連の状態(例えば、光分解)は、本明細書に記載の切断可能なリンカーと接触する場合、該リンカーの切断を引き起こして、切断されたリンカーを生成し得る。本明細書で使用する特異的切断とは、該リンカーと標的酵素または状態との間の既知の関係を指し、ここでは、該標的分子または状態は切断可能なリンカーを切断することが知られている。したがって、該リンカーの切断を用いて標的分子または状態の存在を推測する場合には、該分子または標的は該リンカーを特異的に切断する。
【００５３】
本明細書で使用する用語「切断可能なリンカー」または「不安定なリンカー」は、標的分子または状態による酵素的、光分解的または化学的切断に感受性の基質リンカーを指す。いくつかの実施態様では、切断可能なリンカーは、デオキシリボ核酸(DNA)、ポリペプチド、炭素-酸素結合、炭素-硫黄結合、炭素-窒素結合、または炭素-炭素結合であり得る。いくつかの実施態様では、光分解切断に感受性の切断可能なリンカーは、オルト-ニトロベンジル誘導体またはフェナシルエステル誘導体であり得る。いくつかの実施態様では、化学的切断に感受性の切断可能なリンカーは、アゾ化合物、ジスルフィド架橋、スルホン、エチレングリコールジスクシネート、ヒドラゾン、アセタール、イミン、ビニルエーテル、ビシナルジオール、またはピコリン酸エステルであり得る。
【００５４】
いくつかの実施態様において、本明細書で使用する用語「切断可能なドメイン」は、標的分子または状態による酵素的、光分解的または化学的切断に感受性である分子のドメインを指す。切断可能なドメインは、該ドメインがポリマー足場またはペイロード分子と同じタイプの分子の成分である場合、切断可能なリンカーと交換可能に使用され得る。例えば、切断可能なドメインがポリマー足場上にある実施態様では、そのポリマー足場を、ポリマー足場と切断可能なリンカーを含む融合分子(すなわち、切断可能なドメイン)とを含むものとして考えることもでき、その場合、融合分子とポリマー足場の両方が同じタイプの分子(例えば、dsDNA)であるとしても、該融合分子は該ポリマー足場に結合される。
【００５５】
本明細書で使用する用語「標的分子」は、サンプル中で検出される関心対象の分子であり、切断可能なリンカー領域またはドメインを(例えば、酵素的切断を介して)切断することができる分子(例えば、ヒドロラーゼまたはリアーゼ)を指す。標的分子は、本明細書に記載の方法によって、ナノ細孔を通過するポリマー足場に結合された融合分子内の切断可能なリンカーのその切断を介して検出され、特定の電流インピーダンスまたは電流シグネチャを提供することができる。
【００５６】
本明細書で使用する用語「標的状態」は、10nm〜550nmの波長範囲内の光への曝露によって切断可能なリンカーを光分解によって改変することができる状態を指す。あるいは、標的状態は、求核試薬もしくは塩基性試薬、求電子試薬もしくは酸性試薬、還元試薬、酸化試薬または有機金属化合物への曝露によって切断可能なリンカーを化学的に改変することができる。
【００５７】
本明細書で使用する用語「足場」または「ポリマー足場」は、電圧印加時にナノ細孔を通って移動する負または正に荷電したポリマーを指す。いくつかの実施態様では、ポリマー足場は、切断可能なドメインまたは切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施態様では、ポリマー足場は、切断可能なリンカーを含む融合分子に結合されるか、結合することができ、電圧印加時にナノ細孔を通って移動することができる。いくつかの局面では、ポリマー足場は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ペプチド核酸(PNA)、DNA/RNAハイブリッド、またはポリペプチドを含む。足場はまた、天然に存在する分子または生物学的な分子ではなく、化学的に合成されたポリマーであってもよい。好ましい実施態様では、ナノ細孔を通って移動する時に、より予測可能な信号を可能にし、かつssDNAまたはRNAに存在する二次構造を低減させるため、ポリマー足場はdsDNAである。いくつかの実施態様では、ポリマー足場は、足場の一端または足場の両端に存在し得る融合分子結合部位を含む。足場と融合分子とは、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介して連結され得る。あるいは、切断可能なリンカー成分の足場への直接共有結合テザリングが、足場と融合分子とを連結してもよい。あるいは、融合物のコネクタ成分が、切断可能なリンカーを直接共有結合テザリングにより足場に連結してもよい。好ましい実施態様では、融合分子は、足場結合ドメインを含み、DNA、RNA、PNA、ポリペプチド、コレステロール/DNAハイブリッド、またはDNA/RNAハイブリッドであり得る。
【００５８】
本明細書で使用する用語「ペイロード」は、ナノ細孔における検出の選択性および/または感度を高めるために融合分子に結合される分子または化合物を指す。いくつかの実施態様では、ペイロード分子は、デンドリマー、二本鎖DNA、一本鎖DNA、DNAアプタマー、フルオロフォア、タンパク質、ポリペプチド、ナノロッド、ナノチューブ、フラーレン、PEG分子、リポソーム、またはコレステロール-DNAハイブリッドであり得る。好ましい実施態様では、切断可能なリンカーとペイロードとは、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン-π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合によって直接または間接的に連結される。ペイロードは、足場：融合分子にサイズを追加し、かつ足場：融合物：ペイロードが、ナノ細孔を通過する時に、切断可能なリンカーの切断(例えば、加水分解酵素による切断可能なリンカーの切断)後に残存する足場：融合物および融合物：ペイロード成分とは著しく異なる電流シグネチャを有して、切断可能なリンカーの切断の検出を容易にする。
【００５９】
本明細書で使用する用語「結合ドメイン」は、ある分子の存在下で別の分子に特異的に結合する該分子のドメインを指す。いくつかの実施態様では、ポリマー足場に特異的に結合するポリマー足場結合ドメイン、およびペイロード分子に特異的に結合するペイロード分子結合ドメインが本明細書に開示される。
【００６０】
本明細書で使用する用語「コネクタ」は、互いに空間的に離れている2つの分子を架橋するように作用し、それらがコネクタを介して結合することを可能にする分子を指す。いくつかの実施態様では、ポリエチレングリコール(PEG)は、例えば、融合分子とポリマー足場またはペイロード分子との間の、コネクタとして作用することができる。
【００６１】
本明細書で使用する用語「ナノ細孔」は、特定のサイズのポリマーの通過を可能にするのに十分な大きさの開口部(孔またはチャンネル)を指す。増幅器により、電圧が印加されると、負に荷電したポリマーがナノ細孔を通って駆動され、該細孔を流れる電流によって、分子が該細孔を通過しているかどうかが検出される。
【００６２】
本明細書で使用する用語「センサ」は、ナノ細孔デバイスからの信号を収集する機器を指す。多くの実施態様では、センサは、分子または他の物質、特にポリマー足場、が細孔を通過する時に細孔を横切るイオン電流を測定するために、細孔の両側に配置された1対の電極を含む。電極に加えて、追加のセンサ、例えば光学センサを用いて、ナノ細孔デバイスの中の光信号を検出することができる。電流遮断、電子トンネリング電流、電荷誘起電界効果、ナノ細孔通過時間、光信号、光散乱、およびプラズモン共鳴のような特性を検出するために、他のセンサを使用してもよい。
【００６３】
本明細書で使用する用語「電流測定」は、ナノ細孔を通って流れる印加電圧での電流の経時的な一連の測定を指す。電流は事象を定量化するための測定値として表され、電圧によって正規化された電流(コンダクタンス)もまた事象を定量化するために使用される。
【００６４】
本明細書で使用する用語「オープンチャンネル」(open channel)は、電流が解析ソフトウェアによって規定された閾値から外れない場合に、ノイズ範囲内でナノ細孔チャンネルを流れる電流のベースラインレベルを指す。
【００６５】
本明細書で使用する用語「事象」は、電流測定がオープンチャンネル値から規定された閾値だけ外れる時に開始して、電流がオープンチャンネル値の閾値内に戻る時に終了する、電流インピーダンス測定のセットを指す。
【００６６】
本明細書で使用する用語「電流インピーダンスシグネチャ」は、検出された事象内で同定される電流測定および/またはパターンの収集を指す。分子タイプ間の判別を向上させるために、1つの事象内に複数のシグネチャが存在することもできる。
【００６７】
酵素活性の検出
修飾された切断可能なリンカーを用いて酵素活性を検出するための方法および組成物が本明細書で提供される。図1に示すように、酵素活性の存在を検出するために設計された分子は、足場、ペイロード、および分解を受けやすいリンカーを含む融合物を含む。この足場：融合物(リンカー)：ペイロード分子は、サンプル中の酵素活性の存在を検出するためにナノ細孔システムにおいて使用することができる。特に、図2は、酵素活性の存在を検出するために該分子(図1)をナノ細孔と共に使用する方法を示す、概念的な例を提供する。図2において、切断可能なリンカーは、プロテアーゼの基質であるポリペプチド配列である。プロテアーゼがサンプルに存在しないと、足場/融合物(リンカー)/ペイロード分子は、無傷のままであり、印加電圧下でナノ細孔を通過する際により長くより深い信号を生成する。しかし、関心対象のプロテアーゼがサンプル中に存在しかつ活性である場合、それは切断可能なリンカーのポリペプチド配列を消化して、別個のペイロード分子と足場分子を生成し、これらの分子が印加電圧下でナノ細孔を通過する際に、各分子は固有の電流遮断シグネチャを生成する。電流遮断および分解能は、印加電圧および他の条件(塩濃度、pH、温度、ナノ細孔の形状、ナノ細孔の材料など)を変えることによって調整することができる。また、酵素活性の分解能は、ナノ細孔と接触する溶液中の標的分子の濃度を調節することによっても調整することができる。
【００６８】
切断可能なリンカーは、形態が様々であり得る。本発明者らのナノ細孔活性アッセイにその特異性を与えるのは、標的酵素のその基質に対する特異性である。すなわち、サンプルからのバックグラウンド分子は、切断可能なリンカーを認め得るほどに改変または切断する可能性が低いが、標的分子または状態は、ナノ細孔測定が基質の切断および/または改変を分解・検出できる程度に、基質を切断および/または改変することに対して高い親和性を有する。
【００６９】
本明細書に記載のペイロード分子は、切断可能なリンカー分子の改変(例えば、切断)のナノ細孔における検出を助ける任意の分子であり得る。これには、例えば、デンドリマー、DNAアプタマー、フルオロフォア、タンパク質、またはポリエチレングリコール(PEG)ポリマーが含まれる。
【００７０】
足場：融合物：ペイロード構築物の融合成分中の切断可能なリンカーは、関心対象の標的酵素の活性の基質である任意の基質を含み得る。これは、例えば、ポリペプチド配列、ヌクレオチド配列、または他の酵素基質を含むことができる。このリンカーはまた、環境状態(例えば、pH、UV、および/または光)による切断に対して感受性であってもよい。
【００７１】
別の実施態様では、足場：融合物：ペイロードは、特に切断可能なリンカーがポリヌクレオチド配列を含む場合、足場構築物のみにまとめることができる。このような実施態様では、足場は二本鎖DNAを含む。これは、例えば、図3および図4に示すように、エンドヌクレアーゼ活性の検出によって細菌汚染を検出することに関連する。DNA足場内のDNA配列を含むエンドヌクレアーゼ標的は、ナノ細孔と接触する溶液中に提供される。エンドヌクレアーゼの非存在下では、各標的分子の移動中により長い電流シグネチャが生じる。関心対象のエンドヌクレアーゼを含むサンプルを添加すると、標的分子が消化され、その結果として、消化されたDNA断片が印加電圧でナノ細孔を通過する時のより短い電流シグネチャと、全長標的配列からの電流シグネチャ持続時間の減少が生じる。エンドヌクレアーゼ活性の検出のために、線状(図3)または環状(図4)の足場分子を使用することができる。
【００７２】
別の実施態様では、足場構築物を使用して、エンドヌクレアーゼ活性による細菌汚染の多重検出を行うことができる。このような方法の一例を図5に示す。この例では、切断可能ドメイン含有足場は、関心対象の1種以上の標的エンドヌクレアーゼによる消化のための複数の特異な切断可能ドメインを含む。結果として生じる断片は、その後、ナノ細孔システムによって溶液中で検出される。消化された断片の印加電圧下での移動は、適切な大きさの細孔を通して固有の電流シグネチャを提供し、どの部位が消化されたか、それゆえに、関心対象のサンプル中にどのエンドヌクレアーゼが存在するか、を検出することができる。
【００７３】
他の実施態様では、図1〜2に示される足場：融合物：ペイロード構築物もまた、エンドヌクレアーゼ活性を検出するために使用され得る。その場合、融合分子は標的DNA配列を含み、かつ消化のナノ細孔検出を容易にするペイロードに結合される。
【００７４】
多重化は、様々な方法で、例えば複数の融合物：ペイロードを各足場分子に結合することによって、達成することができる。この構築物を用いて、単一細孔デバイスは、適切に設計された足場および融合物：ペイロード(複数可)に対する、複数の標的分子(例えば、酵素)または標的状態の活性を検出できる可能性がある。あるいは、2細孔デバイス(PCT公開番号WO/2013/012881；その全体が参照により本明細書に組み入れられる)への該足場の投入は、複数の標的分子(例えば、酵素)または標的状態の活性をアッセイするために使用できる可能性がある。
【００７５】
本明細書で使用する標的分子または標的状態の「活性状況」(activity status)とは、融合分子内の切断可能リンカーが無傷である(完全な足場：融合物：ペイロード複合体をもたらす)か、そうでない(ペイロード分子に結合してない足場分子をもたらす）か、を意味する。本質的に、活性状況は、これらの起こり得る2つの状況のうちの1つであり得る。
【００７６】
標的分子または標的状態の活性状況の検出は、種々の方法で行うことができる。一局面では、各状況での分子のサイズが異なるため、足場：融合物：ペイロード複合体が細孔を通過する場合、電流シグネチャは、足場単独またはペイロード単独が細孔を通過する場合とは十分に区別されるであろう。一局面では、正の電圧が印加され、実験緩衝液中のKCl濃度が0.4Mを超えるか、またはLiCl濃度が0.2Mを超える場合、測定された電流信号(図2)は下向きであり、したがって減衰である。図2の3つの信号は、電流シフトの量(深さ)および/もしくは電流シフトの持続時間(幅)によって、または3つの事象タイプを区別する信号の他のいずれかの特徴によって、互いに区別され得る。
【００７７】
別の局面では、正の電圧が印加され、実験緩衝液中のKCl濃度が0.4M未満である場合、測定された電流信号は、DNAからなる該複合体の足場または任意の成分に対して電流増大(current enhancement)を有し得る。このことは、Smeets, Ralph MM, et al. "Salt dependence of ion transport and DNA translocation through solid-state nanopores." Nano Letters 6.1 (2006): 89-95により発表された研究でDNA単独について示された。この場合、3つの信号が異なる電流シフトの量(高さ)および/もしくは電流シフトの持続時間(幅)、または3つの事象タイプを区別する信号の他のいずれかの特徴を一般的に有することに加えて、3つの信号タイプは、オープンチャンネルのベースライン電流レベル(408)に対する事象振幅方向(極性)によっても区別され得る。
【００７８】
図2の実施態様の局面では、センサは電極を含み、該電極は電源に接続されて、電流を検出することができる。したがって、電極の一方または両方が「センサ」として機能する。この実施態様では、同時に細孔に電圧を与えかつ細孔を流れる電流を測定するために、電圧クランプまたはパッチクランプが使用される。
【００７９】
いくつかの局面では、検出を助けるために該複合体にペイロードが追加される。一局面では、ペイロードは検出を容易にするために負または正のいずれかの電荷を含む。別の局面では、検出を容易にするためにペイロードにサイズを追加する。別の局面では、ペイロードは、例えば、ナノ細孔の移動の部位に集束された光学センサを用いて検出され得る、フルオロフォアなどの、検出可能な標識を含む。
【００８０】
ポリマー足場
本技術で使用するのに適したポリマー足場は、ナノ細孔デバイスに投入することができ、かつ一端から他端に該細孔を通過することができる足場である。
【００８１】
ポリマー足場の非限定的な例には、核酸、例えばデオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、またはペプチド核酸(PNA)、デンドリマー、および線状化タンパク質またはペプチドが含まれる。いくつかの局面では、該DNAまたはRNAは、一本鎖もしくは二本鎖とすることができ、DNA/RNAハイブリッド分子であってもよい。
【００８２】
好ましい実施態様では、二本鎖DNAがポリマー足場として使用される。ssDNAと比べて、dsDNAにはポリマー足場としての利点がいくつかある。一般的に、非特異的相互作用および予測不能な二次構造形成はssDNAにおいてよく見られ、このことから、dsDNAはナノ細孔デバイスで再現可能な電流シグネチャを生成するのにより適している。また、ssDNAの弾性応答(elastic response)はdsDNAより複雑であり、さらにssDNAの特性はdsDNAほどには知られていない。したがって、本発明の多くの実施態様は、ここで使用されるペイロードおよび/または融合分子の1つ以上を含むポリマー足場としてdsDNAを包含するように設計される。
【００８３】
一局面では、ポリマー足場は合成であるか、または化学的に修飾される。化学修飾は、ポリマー足場を安定化させ、ポリマー足場に電荷を加えて移動度を増加させ、直線性を維持し、結合特異性を追加または変更し、融合物および/またはペイロードをテザリングするための化学反応部位を追加するのに役立ち得る。いくつかの局面では、化学修飾は、アセチル化、メチル化、SUMO化、酸化、リン酸化、グリコシル化、チオール化、アジドまたはアルキンもしくは活性化アルキン(DBCO-アルキン)の付加、あるいはビオチンの付加である。
【００８４】
いくつかの局面では、ポリマー足場は電荷を帯びている。DNA、RNA、PNAおよびタンパク質は、典型的には、生理学的条件下で帯電している。このようなポリマー足場は、持っている電荷を増加または減少させるようにさらに修飾することができる。他のポリマー足場は、電荷を導入するように修飾され得る。ポリマー足場上の電荷は、ナノ細孔デバイスの細孔を通過するようにポリマー足場を駆動するのに有用であり得る。例えば、荷電したポリマー足場は、細孔に電圧を印加することによって、細孔を横切って移動することができる。
【００８５】
いくつかの局面では、電荷をポリマー足場に導入する場合、その電荷はポリマー足場の端部に付加され得る。いくつかの局面では、電荷はポリマー足場にわたって均一に広がる。
【００８６】
足場：融合物：ペイロードの構築
好ましい実施態様では、融合分子は、1)切断可能なリンカー、2)足場結合部位、および3)ペイロード結合部位を含む。
【００８７】
好ましい実施態様では、融合物：ペイロードの代表的な例が図6に示される。具体的には、図6Aは、左から右へ、次の成分を含む融合物を示す：足場への結合のためのアジドケミカルハンドル；コネクタPEG4；柔軟なGly-Serモチーフ；MMP9感受性ペプチド配列SGKGPRQITA；およびペイロードへの結合のための柔軟なGly-Serモチーフ。図6Aは、左から右へ、次の成分を含むペイロードを示す：Cys-5kDa PEG、およびビオチン。活性検出を容易にするためにペイロードに嵩高さを追加する選択肢は、ビオチン部位にモノストレプトアビジンを結合することによって可能になる(図6B)。追加された嵩高さは、酵素活性前の足場：融合物：ペイロードと、酵素活性後の足場単独およびペイロード単独との間に、より明確に区別されるシグネチャ差を生じさせることができる。
【００８８】
この実施態様において、この例の切断可能なリンカーのペプチド配列は、SGKGPRQITAである。このペプチドは、MMP9活性に対して高度に感受性であると以前に同定されていた(Kridei, Steven J., et al. "Substrate hydrolysis by matrix metalloproteinase-9. Journal of Biological Chemistry 276, 23 (2001): 20572-20578)。
【００８９】
この実施態様では、DNA足場への結合は、様々な方法で達成することができる。この例(図6)では、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)修飾プライマーを用いて、全てのDNA足場分子をDBCO化学基で効果的に標識してDNAを生成し、アジド標識融合分子への銅フリーの「クリック」ケミストリーを介するコンジュゲーション目的で使用して、完全な足場：融合物：ペイロード複合体(図6C)を生成することが可能である。
【００９０】
代表的な例(図6)では、MMP9活性をアッセイするにあたって、MMP9を含むサンプルを足場：融合物：ペイロード試薬と組み合わせ、活性が完了に達するのに十分な時間の後で、活性を可能にする条件下に(図7)、組み合わされた試薬をナノ細孔で測定することができる(図8)。活性は、ナノ細孔により与えられる単一分子測定によってアッセイされ、ここでは、図8に示すように、完全な複合体はより深くかつより長い事象シグネチャをもたらすが、産物はより速くかつ/またはより浅い事象シグネチャをもたらす。
【００９１】
別の好ましい実施態様では、足場：融合物：ペイロードの代表的な例が図9に示される。具体的には、図9Aは、左から右へ、次の成分を含む足場：融合物を示す：DNAを含む足場(1)；エンドヌクレアーゼによる加水分解を受けやすいDNA配列(3)と、ペイロードとしてのアジド担持分子(図示せず)にコンジュゲートするために使用され得るジベンゾシクロオクチン(DBCO)ハンドル(2)とを含む融合物。加水分解を受けやすいDNA配列は、SauI認識配列である。図9Bは、図9Aの分子に結合した、Cys-5kDa PEGとビオチンを含むペイロードを示す。
【００９２】
前記の代表的な例(図9)では、MMP9活性をアッセイするにあたって、Eco81Iを含むサンプルを足場：融合物：ペイロード試薬と組み合わせ、活性が完了に達するのに十分な時間の後で、活性を可能にする条件下に(図10)、組み合わされた試薬をナノ細孔で測定することができる(図11)。SauIアイソシゾマーのEco81Iに曝露されると、該分子構造物はDNA配列CCT(N)AGGで加水分解され、それにより該構築物を2つに切断する。活性は、ナノ細孔により与えられる単一分子測定によってアッセイされ、ここでは、図11に示すように、完全な複合体はより深くかつより長い事象シグネチャをもたらすが、産物はより速くかつ/またはより浅い事象シグネチャをもたらす。
【００９３】
別の実施態様では、足場：融合物：ペイロード構築物の融合分子は、酵素活性を検出および定量化するための切断可能なリンカーを2つ以上含む。代表的な例(図12)では、該融合物は、i)エンドヌクレアーゼEco81Iによる加水分解を受けやすく、DNA足場に隣接するDNA配列CCT(N)AGG、およびii)MMP9感受性ペプチド配列SGKGPRQITAを含む。この方法では、単一の試薬を用いてMMP-9またはEco81Iのいずれかの存在を検出することができる。
【００９４】
別の実施態様では、融合分子の足場結合部位は、それ自体が足場結合ドメインである核酸またはポリペプチドであり得る。いくつかの実施態様において、該融合物の足場結合ドメインは、タンパク質の機能的部分を形成するペプチド配列であるが、該結合ドメインはタンパク質である必要はない。核酸の場合には、例えば、プロモーター、エンハンサー、チミン-チミン二量体、ある種の二次構造、例えば湾曲ヌクレオチドおよび一本鎖破損個所を有する配列、などの配列(モチーフ)を特異的に認識して結合するタンパク質が存在する。
【００９５】
いくつかの局面では、融合物の足場ドメインは、認識と結合を引き起こすかまたは容易にする化学修飾を含む。例えば、メチル化DNA配列は、転写因子、DNAメチルトランスフェラーゼまたはメチル化修復酵素によって認識され得る。他の実施態様では、ビオチンは、アビジンファミリーメンバーに組み込まれ、該メンバーにより認識され得る。このような実施態様において、ビオチンは融合物結合ドメインを形成し、アビジンまたはアビジンファミリーメンバーは、融合物上のポリマー足場結合ドメインである。それらの結合相補性のために、融合物結合ドメインとポリマー足場ドメインは、融合物結合ドメインがポリマー足場結合ドメインとなるように逆転させることができ、その逆もまた同様である。
【００９６】
ヌクレオチド結合モチーフを特異的に認識することができる分子、特にタンパク質は、当技術分野で公知である。例えば、ヘリックスターンヘリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウィングド(winged)ヘリックス、ウィングドヘリックスターンヘリックス、ヘリックスループヘリックスおよびHMGボックスのようなタンパク質ドメインは、ヌクレオチド配列に結合できることが知られている。
【００９７】
いくつかの局面では、融合物結合ドメインは、ロックド核酸(LNA)、架橋核酸(BNA)、あらゆるタイプのタンパク質核酸(例えば、ビスPNA、ガンマ-PNA)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文型反復配列(CRISPR)、またはアプタマー(例えば、DNA、RNA、タンパク質、またはそれらの組み合わせ)であり得る。
【００９８】
いくつかの局面では、融合物結合ドメインは、DNA結合タンパク質(例えば、ジンクフィンガータンパク質)、抗体フラグメント(Fab)、化学合成結合剤(例えば、PNA、LNA、TALENS、またはCRISPR)、または合成ポリマー足場中の化学修飾(すなわち、反応性部分)(例えば、チオレート、ビオチン、アミン、カルボキシレート)の1つ以上である。
【００９９】
いくつかの実施態様では、ポリマー足場は、酵素活性を多重化するために使用される一連の融合物結合ドメインを含み、各ドメインは、関心対象の標的酵素のための固有の切断可能なリンカーを含む固有の融合物：ペイロードを有する。
【０１００】
標的分子および状態
サンプル中に存在する酵素活性は、毒素、障害、または生物の他の疾患の存在を示すことができる。例えば、プロテアーゼは、ヒトにおいて見出される極めて重要な分子であり、創傷治癒、細胞シグナル伝達、およびアポトーシスを含む多種多様の正常なヒト生理学的過程を調節している。人体内でのそれらの重要な役割のために、異常なプロテアーゼ活性は、関節リウマチ、アルツハイマー病、心血管疾患および広範囲の悪性疾患を含むがこれらに限定されない、多くの病態に関連している。プロテアーゼは、ほぼ全てのヒトの体液および組織に見出され、その活性レベルは疾患の存在を知らせることができる。
【０１０１】
本発明者らのアッセイの価値は、例えば加水分解または何か他の手段により、化学結合を開裂することによって、関連した特定の切断可能リンカーを切断する活性酵素(プロテアーゼを含む)の存在を検出する、単一分子方法を提供することである。
【０１０２】
切断可能なリンカー領域を酵素的に改変することができる標的分子は、ヒドロラーゼであり得る。いくつかの実施態様では、ヒドロラーゼは、プロテアーゼ、エンドヌクレアーゼ、グリコシラーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼ、ホスファターゼのサブクラス、またはヒドロラーゼの他のサブクラスからのものであり得る。
【０１０３】
他の実施態様では、切断可能なリンカー領域を酵素的に改変することができる標的分子は、リアーゼであり得る。いくつかの実施態様では、リアーゼは7つのサブクラスのうちのいずれか1つからのものであり得る：炭素-炭素結合を切断するリアーゼ、例えば、デカルボキシラーゼ(酵素委員会(Enzyme Commission: EC)番号4.1.1)、アルデヒドリアーゼ(EC 4.1.2)、オキソ酸リアーゼ(EC 4.1.3)およびその他(EC 4.1.99)；炭素-酸素結合を切断するリアーゼ、例えば、デヒドラターゼ(EC 4.2)；炭素-窒素結合を切断するリアーゼ(EC 4.3)；炭素-硫黄結合を切断するリアーゼ(EC 4.4)；炭素-ハロゲン結合を切断するリアーゼ(EC 4.5)；リン-酸素結合を切断するリアーゼ、例えば、アデニル酸シクラーゼおよびグアニル酸シクラーゼ(EC 4.6)；ならびに他のリアーゼ、例えばフェロケラターゼ(EC 4.99)。
【０１０４】
他の実施態様では、足場：融合物：ペイロード構築物内の融合分子の切断可能なリンカー領域は、検出される標的状態に曝される。一実施態様では、標的状態は、10nm〜550nmの波長範囲内の光への曝露を介して、切断可能なリンカーを光分解によって改変することができる。
【０１０５】
切断可能なリンカー内の結合の開裂を促進する光曝露状態は、いろいろな健康被害、疾病状態、または疾患を引き起こすもしくは疾患を助長する状態と相関し得る環境状態を明らかにすることができる。
【０１０６】
太陽から来る紫外線(UV)光は、様々なヒト疾病状態と強く相関することが知られており、成層圏でのオゾンの経時的減少は、地球の表面に到達する紫外線のレベル上昇につながると考えられている。
【０１０７】
紫外線は人間の生涯にわたって蓄積され、皮膚癌の致命的な形である黒色腫の主要な外部要因であることが分かっている。さらに、UV光はヒトの眼に重大な影響を及ぼし、網膜の劣化を増大させるとともに、白内障の重要なリスク要因であることが示されている。
【０１０８】
他の実施態様において、切断可能なリンカーを化学的に改変することができる標的状態は、求核試薬もしくは塩基性試薬、求電子試薬もしくは酸性試薬、還元試薬、酸化試薬、または有機金属化合物への曝露によるものである。
【０１０９】
切断可能なリンカーを化学的に改変することができる標的状態の検出は、毒物の変化、地下水の汚染、またはバイオハザードもしくはバイオトキシンの検出を知らせる検出プロセスを含めて、多くの用途がある。
【０１１０】
一実施態様において、切断可能なリンカーを化学的に改変することができる標的状態は、酸性pHである。局所的な酸性状態が、腫瘍、虚血、炎症などの様々な病的状態と相関することはよく知られている。より具体的には、腫瘍組織において、細胞外酸性pHは、急速に分裂している腫瘍細胞からの嫌気的解糖の結果であり、腫瘍微小環境の主要な特徴である。
【０１１１】
ナノ細孔デバイス
提供されるナノ細孔デバイスは、デバイスの内部空間を2つの容積に分ける構造体に開口部を形成する少なくとも1つの細孔、および該細孔を通過する物体を(例えば、物体を示すパラメータの変化を検出することによって)同定するように構成された少なくとも1つのセンサを含む。本明細書に記載の方法に使用されるナノ細孔デバイスは、PCT公開WO/2013/012881にも開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１２】
ナノ細孔デバイスの細孔(複数可)は、ナノスケールまたはミクロスケールのものである。一局面では、各細孔は、小さいもしくは大きい分子または微生物が通過することができるサイズを有する。一局面では、各細孔は少なくとも約1nmの直径である。あるいは、各細孔は、少なくとも約2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nmまたは100nmの直径である。
【０１１３】
一局面では、該細孔は約100nm以下の直径である。あるいは、該細孔は、約95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm、50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm、または10nm以下の直径である。
【０１１４】
一局面では、該細孔は、約1nm〜約100nmの直径、あるいは約2nm〜約80nm、または約3nm〜約70nm、または約4nm〜約60nm、または約5nm〜約50nm、または約10nm〜約40nm、または約15nm〜約30nmの直径を有する。
【０１１５】
いくつかの局面では、ナノ細孔デバイスは、該細孔を横切ってポリマー足場を動かす手段および/または該細孔を通過する物体を同定する手段をさらに含む。さらなる詳細は以下に提供され、2細孔デバイスとの関連において記載される。
【０１１６】
単一細孔のナノ細孔デバイスと比較して、2細孔デバイスは、該細孔を横切るポリマー足場の移動の速度および方向を良好に制御するように、より容易に設定することができる。
【０１１７】
一実施態様では、ナノ細孔デバイスは複数のチャンバを含み、各チャンバは少なくとも1つの細孔を介して隣接チャンバと連通している。これらの細孔のうち、2つの細孔、すなわち第1の細孔と第2の細孔は、ポリマー足場の少なくとも一部が第1の細孔から出て第2の細孔内へ移動することができるように、配置される。さらに、該デバイスは、移動中にポリマー足場を同定することが可能なセンサを各細孔に含む。一局面では、同定は、ポリマー足場の個々の構成成分を同定することを伴う。別の局面では、同定は、ポリマー足場に結合された融合物：ペイロード分子を同定することを伴う。単一のセンサが使用される場合、その単一センサは、細孔を横切るイオン電流を測定するための、細孔の両端に配置された2つの電極を含むことができる。別の実施態様では、単一センサは電極以外の構成要素を含む。
【０１１８】
一局面では、前記デバイスは、2つの細孔を介して接続された3つのチャンバを含む。3つより多いチャンバを有するデバイスは、3チャンバデバイスのどちらの側にも、または3つのチャンバのいずれか2つの間に、1つ以上の追加のチャンバを含めるように容易に設計することができる。同様に、チャンバ同士を接続するために、2つより多い細孔を該デバイスに含めることができる。
【０１１９】
一局面では、複数のポリマー足場が1つのチャンバから次のチャンバに同時に移動することができるように、2つの隣接チャンバ間に2つ以上の細孔が存在し得る。このような多重細孔設計は、該デバイスにおける酵素活性分析のスループット(処理量)を高めることができる。多重化の場合には、1つのチャンバが1つの標的タイプに対するある切断可能なリンカーを有することができ、別のチャンバは別の標的タイプに対する異なる切断可能なリンカーを有することができ、サンプルは、ナノ細孔センシングの前に全てのチャンバに曝露される。
【０１２０】
いくつかの局面では、前記デバイスは、ポリマー足場を1つのチャンバから別のチャンバに移動させる手段をさらに含む。一局面では、その移動により、ポリマー足場は、第1の細孔と第2の細孔の両方に同時に投入される結果となる。別の局面では、前記手段はさらに、両方の細孔を通って同じ方向にポリマー足場を移動させることを可能にする。
【０１２１】
例えば、3チャンバ2細孔デバイス(「2細孔」デバイス)では、チャンバの各々は、チャンバ間の細孔のそれぞれに別々の電圧を印加することができるように、電源に接続するための電極を含むことができる。
【０１２２】
本開示の一実施態様によれば、上部チャンバと、中間チャンバと、下部チャンバとを備えたデバイスが提供され、ここで、上部チャンバは第1の細孔を介して中間チャンバと連通しており、中間チャンバは第2の細孔を介して下部チャンバと連通している。このようなデバイスは、デュアル細孔デバイス(Dual-Pore Device)と題する米国特許出願公開第2013-0233709号に以前に開示された寸法または他の特性のいずれかを有していてよく、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２３】
一局面では、各細孔は少なくとも約1nmの直径である。あるいは、各細孔は、少なくとも約2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nmまたは100nmの直径である。
【０１２４】
一局面では、各細孔は約100nm以下の直径である。あるいは、該細孔は、約95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm、50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm、または10nm以下の直径である。
【０１２５】
一局面では、該細孔は、約1nm〜約100nmの直径、あるいは約2nm〜約80nm、または約3nm〜約70nm、または約4nm〜約60nm、または約5nm〜約50nm、または約10nm〜約40nm、または約15nm〜約30nmの直径を有する。
【０１２６】
いくつかの局面では、該細孔は実質的に丸い形状を有する。本明細書で使用する「実質的に丸い」とは、円筒の形が少なくとも約80または90％である形状を指す。いくつかの実施態様では、該細孔は、正方形、長方形、三角形、楕円形、または六角形の形状である。
【０１２７】
一局面では、該細孔は、約1nm〜約10,000nmの深さ、あるいは約2nm〜約9,000nm、または約3nm〜約8,000nmなどの深さを有する。
【０１２８】
いくつかの局面では、ナノ細孔は膜を貫通して延びている。例えば、該細孔は、脂質二重層膜に挿入されたタンパク質チャンネルであってよく、あるいは、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、グラフェン、またはこれらの材料もしくは他の材料の組み合わせから形成された層などの固体基板を通してドリリング、エッチングまたは他の方法で細孔を形成することによって作製されてもよい。ナノ細孔は、足場：融合物：ペイロードまたは酵素活性後のこの分子の産物が細孔を通過するのを可能にする大きさである。他の実施態様では、分子タイプの判別のために、該細孔の一時的な遮断が望ましいことがある。
【０１２９】
いくつかの局面では、ナノ細孔の長さまたは深さは、2つの、さもなければ分かれている容積を接続するチャンネルを形成するように十分に大きくする。いくつかのこのような局面では、各細孔の深さは、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、または900nmより大きい。いくつかの局面では、各細孔の深さは、2000nmまたは1000nm以下である。
【０１３０】
一局面では、該細孔は、約10nm〜約1000nmの距離をあけて配置される。いくつかの局面では、細孔間の距離は、1000nm、2000nm、3000nm、4000nm、5000nm、6000nm、7000nm、8000nm、または9000nmより大きい。いくつかの局面では、該細孔は、30000nm、20000nm、または10000nm以下の距離をあけて配置される。一局面では、その距離は、少なくとも約10nm、あるいは少なくとも約20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm、または300nmである。別の局面では、その距離は、約1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、250nm、200nm、150nm、または100nm以下である。
【０１３１】
さらに別の局面では、細孔間の距離は、約20nm〜約800nm、約30nm〜約700nm、約40nm〜約500nm、または約50nm〜約300nmである。
【０１３２】
2つの細孔は、それらがチャンバ間の流体連通を可能にし、かつそれらの間に規定のサイズおよび距離を有する限り、任意の位置に配置することができる。一局面では、該細孔は、それらの間に直接の遮断物がないように配置される。さらに、一局面では、これらの細孔は実質的に同軸である。
【０１３３】
一局面では、前記デバイスは、1つ以上の電源に接続された電極をチャンバ内に有する。いくつかの局面では、電源は、各細孔に電圧を与えかつ各細孔を流れる電流を独立して測定することができる、電圧クランプまたはパッチクランプを含む。これに関して、電源および電極の配置は、両電源の共通接地に中間チャンバを置くことができる。一局面では、電源(複数可)は、上部チャンバ(チャンバA)と中間チャンバ(チャンバB)との間に第1電圧V1を、中間チャンバと下部チャンバ(チャンバC)との間に第2電圧V2を印加するように構成される。
【０１３４】
いくつかの局面では、第1電圧V1および第2電圧V2は、独立して調整可能である。一局面では、中間チャンバは、2つの電圧に対して接地(ground)となるように調整される。一局面では、中間チャンバは、中間チャンバ内の細孔の各々と電極との間にコンダクタンス(伝導性)を与えるための媒体を含む。一局面では、中間チャンバは、中間チャンバ内の細孔の各々と電極との間に抵抗を与えるための媒体を含む。こうした抵抗をナノ細孔抵抗と比べて十分に小さく保つことは、細孔を横切る2つの電圧および電流を切り離すのに有用であり、電圧の独立した調整に役立つ。
【０１３５】
電圧の調整は、チャンバ内の荷電粒子の移動を制御するために使用され得る。例えば、両方の電圧が同じ極性に設定された場合には、適切に荷電された粒子を、上部チャンバから中間チャンバに、そして下部チャンバに、またはその逆の方向に、順次移動させることができる。いくつかの局面において、2つの電圧が反対の極性に設定された場合には、荷電粒子を上部または下部チャンバから中間チャンバに移動させて、そこに保持することができる。
【０１３６】
前記デバイスにおける電圧の調整は、両方の細孔を同時に横切るのに十分な長さの、荷電ポリマー足場のような、大きな分子の移動を制御するのに特に有用であり得る。このような局面では、該分子の移動の方向および速度は、以下に記載されるような電圧の相対的な大きさ(magnitude)および極性によって制御することができる。
【０１３７】
前記デバイスは、液体サンプル、特に生物学的サンプルを保持するのに適した材料、および/またはナノ加工に適する材料を含むことができる。一局面では、このような材料には、限定するものではないが、シリコン、窒化ケイ素、二酸化ケイ素、グラフェン、カーボンナノチューブ、Ti02、Hf02、Al203、もしくは他の金属層、またはこれらの材料の任意の組み合わせなどの、誘電材料が含まれる。いくつかの局面では、例えば、約0.3nmの厚さのグラフェン膜の単一シートを細孔保持膜として使用することができる。
【０１３８】
マイクロ流体用であるデバイス、および2細孔のマイクロ流体チップの実装を収容するデバイスは、様々な手段および方法によって作製することができる。2つの平行な膜からなるマイクロ流体チップの場合、両方の膜を単一のビームで同時に穿孔して2つの同心の細孔を形成することができるが、膜の各側に異なるビームを使用することもまた、任意の適切なアラインメント技術と併せて可能である。一般的に言えば、ハウジングはチャンバA〜Cの密閉された区分けを保証する。
【０１３９】
一局面では、前記デバイスは、スペーサーによって接続された2つの平行な膜から構成されたマイクロ流体チップ(「デュアル細孔チップ」(Dual-pore chip)と表示)を含む。各膜は、膜の中心を通る単一ビームによって開けられた細孔を含む。さらに、前記デバイスは、該チップ用のテフロン(登録商標)ハウジングまたはポリカーボネートハウジングを有することが好ましい。このハウジングは、チャンバA〜Cの密閉された区分けを保証し、かつ電極に最小のアクセス抵抗を提供して、各電圧が主に各細孔に印加されることを確実にする。
【０１４０】
より具体的には、細孔保持膜は、厚さ5〜100nmのシリコン、窒化ケイ素、または二酸化ケイ素の窓を有する透過型電子顕微鏡(TEM)グリッドを用いて作製することができる。スペーサーは、膜を分離するために使用され、SU-8、フォトレジスト、PECVD酸化物、ALD酸化物、ALDアルミナ、またはAg、AuもしくはPtなどの蒸着金属材料のような絶縁体を使用して、膜間のチャンバBのさもなければ水性の部分の内部の小体積を占有する。ホルダーは、チャンバBの最大容積割合からなる水性浴中に取り付けられる。チャンバAおよびCは、膜シールに通じるより大きな直径のチャンネル(アクセス抵抗が低い)によってアクセス可能である。
【０１４１】
集束した電子ビームまたはイオンビームは、膜を貫通する細孔を、当然それらを整列させて、開けるために使用することができる。細孔はまた、各層に正確なビーム集束を適用することによって、より小さなサイズに造形する(縮小させる)こともできる。任意の単一ナノ細孔ドリリング法を用いて、所与の方法に可能なドリル深さおよび膜の厚さに考慮しつつ、2つの膜に細孔の対を開けることもできる。また、ミクロ細孔を所定の深さまで前もって開けておき、その後膜の残部を貫通してナノ細孔を開けることも、膜の厚さをさらに精密化することが可能である。
【０１４２】
前記デバイスの細孔に存在する電圧によって、荷電分子はチャンバ間の細孔を通って移動することができる。移動の速度および方向は、電圧の大きさおよび極性によって制御され得る。さらに、2つの電圧のそれぞれは独立して調整することができるので、荷電分子の移動の方向および速度は、各チャンバ内での微調整が可能である。
【０１４３】
1つの例は、両細孔の深さと2細孔間の距離を合わせた距離よりも長い鎖長を有する、DNAなどの荷電ポリマーに関する。例えば、1000bpのdsDNAは、長さが約340nmであり、2つの深さ10nmの細孔が20nm離れて存在する広がり40nmよりも実質的に長くなる。第1の段階では、該ポリヌクレオチドを上部チャンバまたは下部チャンバのいずれかに投入する。約pH7.4の生理学的条件下でのその負電荷のために、該ポリヌクレオチドは、電圧が加えられた細孔を横切って移動することができる。したがって、第2の段階では、同じ極性で、同じまたは同様の大きさの、2つの電圧を細孔に印加して、両方の細孔を横切って該ポリヌクレオチドを連続して移動させる。
【０１４４】
該ポリヌクレオチドが第2の細孔に達する時点あたりで、一方または両方の電圧を変化させることができる。2つの細孔間の距離は該ポリヌクレオチドの長さよりも短くなるように選択されるので、該ポリヌクレオチドが第2の細孔に到達するとき、それは第1の細孔内にもある。したがって、第1の細孔における電圧の極性の迅速な変化は、該ポリヌクレオチドを第2の細孔から引き離す力を発生させるだろう。
【０１４５】
2つの細孔が同一の電圧印加の影響を有し、かつ|V1|＝|V2|＋δVであると仮定すると、δV＞0(または＜0)の値を、|V1|(またはV2)方向での調節可能な動きに対して調整することができる。実際には、各細孔での電圧誘起力は、V1＝V2の場合に同一ではないが、キャリブレーション実験により、所与の2細孔チップに対して等しい引っ張り力をもたらす適切なバイアス電圧を特定することができる；その後、そのバイアス電圧付近の変動を方向制御のために使用することができる。
【０１４６】
この時点で、第1細孔での電圧誘起力の大きさが第2細孔での電圧誘起力の大きさよりも小さい場合、該ポリヌクレオチドは、第2の細孔に向かって、しかしより遅い速度で、両方の細孔を横断し続ける。この点において、該ポリヌクレオチドの移動の速度および方向は、両方の電圧の極性および大きさによって制御され得ることが容易に理解される。以下でさらに説明するように、このような移動の微調整は広い用途を有する。酵素の活性を定量する場合、2細孔デバイス実現の有用性は、制御された送達および検出の間に、修飾または切断可能なリンカーの切断を繰り返し測定して、検出結果に信頼性を加えることである。加えて、一度に複数の酵素の活性を検出するために、複数の融合物：ペイロードを、足場に沿って別個の部位に加えることができる(多重化)。
【０１４７】
したがって、一局面では、ナノ細孔デバイスを通る荷電ポリマー足場の移動を制御するための方法が提供される。この方法は、以下の段階を含む：荷電ポリマー足場を含むサンプルを、上記実施態様のいずれかのデバイスの上部チャンバ、中間チャンバまたは下部チャンバのうちの1つに投入する段階であって、上部チャンバと中間チャンバとの間に第1電圧を供給し、中間チャンバと下部チャンバとの間に第2電圧を供給するための、1つ以上の電源に、該デバイスが接続されている、段階；ポリマー足場がチャンバ間を移動するように初期の第1電圧および初期の第2電圧を設定し、それによって該ポリマー足場を第1および第2の両方の細孔を横切って位置付ける段階；および荷電ポリマー足場を中間チャンバから引き離す力を両方の電圧が生成するように、第1電圧と第2電圧を調整する段階(電圧競合モード)であって、荷電ポリマー足場がいずれかの方向にかつ制御された方法で両細孔を横切って移動するように、2つの電圧は制御された条件下で大きさが異なる、段階。
【０１４８】
一局面では、荷電ポリマー足場を含有するサンプルを上部チャンバに投入し、その荷電ポリマー足場を上部チャンバから中間チャンバに引っ張るように初期の第1電圧を設定し、そして該ポリマー足場を中間チャンバから下部チャンバに引っ張るように初期の第2電圧を設定する。同様に、サンプルを最初に下部チャンバに投入して、荷電ポリマー足場を中間チャンバおよび上部チャンバに引っ張ることができる。
【０１４９】
別の局面では、荷電ポリマー足場を含有するサンプルを中間チャンバに投入し、その荷電ポリマー足場を中間チャンバから上部チャンバに引っ張るように初期の第1電圧を設定し、そして該荷電ポリマー足場を中間チャンバから下部チャンバに引っ張るように初期の第2電圧を設定する。
【０１５０】
一局面では、段階(c)における第1電圧と第2電圧に対するリアルタイムまたはオンライン調整は、数百メガヘルツまでのクロックレートで、専用のハードウェアおよびソフトウェアを使用するアクティブ制御またはフィードバック制御によって行われる。第1もしくは第2のまたは両方の電圧の自動制御は、第1もしくは第2のまたは両方のイオン電流測定値のフィードバックに基づく。
【０１５１】
センサ
上述したように、様々な局面において、ナノ細孔デバイスは、標的分子(例えば酵素)の活性状況の検出を行うための1つ以上のセンサをさらに含む。
【０１５２】
前記デバイスに使用されるセンサは、標的分子または標的条件による、切断可能なリンカーの切断を識別するのに適した、どのようなセンサであってもよい。例えば、センサは、該ポリマーに関連する電流、電圧、pH値、光学的特性または滞留時間を測定することによって、ポリマー(例えばポリマー足場)を同定するように構成され得る。他の局面では、センサは、ポリマーの1つ以上の個々の構成成分、またはポリマーに結合もしくは付着した1つ以上の成分を同定するように構成され得る。センサは、測定可能なパラメータの変化を検出するように構成された任意の構成要素から形成することができ、この場合には、該変化はポリマー、ポリマーの構成成分、好ましくは、ポリマーに結合または付着した成分を示している。一局面では、センサは、分子または他の物質、特にポリマー足場、が細孔を通って移動するときに、該細孔を流れるイオン電流を測定するための、該細孔の両側に配置された一対の電極を含む。特定の局面において、細孔を通過するポリマー足場セグメントが融合物：ペイロード分子に結合されていると、細孔を流れるイオン電流が測定可能に変化する。このような電流の変化は、例えば、存在する融合物：ペイロード分子の存在、非存在、および/またはサイズに対応して、予測可能かつ測定可能な方法で変化し得る。
【０１５３】
好ましい実施態様では、センサは、電圧を印加する電極を含み、これらの電極はナノ細孔を流れる電流を測定するために使用される。ナノ細孔を通る分子の移動は、オームの法則V＝IZ(ここで、Vは印加される電圧であり、Iはナノ細孔を通って流れる電流であり、Zはインピーダンスである)に従ってナノ細孔を通って流れる電流に影響を及ぼす電気インピーダンス(Z)を提供する。反対に、コンダクタンスG＝1/Zは、ナノ細孔事象を信号化して定量するためにモニターされる。分子が電場の中で(例えば、印加電圧下で)ナノ細孔を通って移動するときの結果は、電流シグネチャであり、この電流シグネチャは、電流信号のさらなる分析の際にナノ細孔を通過する分子に相関させることができる。
【０１５４】
電流シグネチャからの滞留時間測定が使用される場合、構成成分のサイズは、それが検出装置を通過するのにかかる時間の長さに基づいて、特定の構成成分に相関させることができる。
【０１５５】
一実施態様では、ポリマー、ポリマーの構成成分(もしくは単位)、またはポリマーに結合もしくは付着した成分の光学的特性を測定するセンサがナノ細孔デバイスに設けられる。このような測定の一例には、特定の単位に固有の吸収帯を赤外(または紫外)分光法で同定することが含まれる。
【０１５６】
いくつかの実施態様では、センサは電気センサである。いくつかの実施態様では、センサは蛍光シグネチャを検出する。細孔の出口の放射線源を使用して、そのシグネチャを検出することができる。
【０１５７】
バックグラウンドからの判別
いくつかの局面では、サンプル中に存在する標的分子は、無数のバックグラウンド分子の集団を含む、元の(さらにフィルタリングされた)天然の液体(血液、唾液、尿など)由来であり得る。このようなバックグラウンド分子は、正の印加電圧で十分に負に帯電したとき、ナノ細孔を通過する。場合によっては、そのようなナノ細孔事象は、足場：融合物：ペイロード構築物または切断可能なリンカーの切断後の産物(足場、ペイロード)のように見えるかもしれない。こうして、これらのバックグラウンド分子は偽陽性を生じる可能性があり、検出のエラー率が高くなる。より大きな分子を除去するのに十分なサンプル調製を追加することはこれを助けるが、偽陽性事象を生み出すバックグラウンド分子は依然として存在するであろう。
【０１５８】
バックグラウンド分子と足場分子(融合物：ペイロードが結合したまたは結合してない)との間の判別を提供するために、足場ラベリングスキームを使用することができる。足場ラベリングスキームは、米国仮出願第61/993,985号にも開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５９】
具体的には、ある標識または一連の標識が、固有の電流シグネチャをもたらすようにポリマー足場に結合される。こうした固有の電流シグネチャは、ナノ細孔を通って移動したポリマー足場の存在および/または正体(identity)を同定するために使用され得る。同じ事象シグネチャ内で、融合物:ペイロードの存在または非存在は、切断可能なリンカーがその分子上で改変されたかどうかを知らせる。
【０１６０】
別の実施態様では、足場単独の長さが、バックグラウンドと十分異なる判別シグネチャを提供し、同時に足場：融合物：ペイロードと足場単独(切断可能なリンカーの切断後)との間の判別力をも維持する。
【０１６１】
検出への統計的有意性の割り当て
いくつかの実施態様では、経時的に記録されたセンサ測定値のセットを集計し、数学的ツールを適用することは、前のセクションで詳述したように、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の検出に数字で表した信頼値を割り当てるために行われる。
【０１６２】
ナノ細孔事象集団の特性の差に基づいて、ある分子タイプをバックグラウンド(すなわち、他の分子タイプ)から判別する定量的方法が最近開発された(Morin, T.J., et al., "Nanopore-based target sequence detection," PloS Oneに提出, Dec. 31, 2015)。この判別方法は、様々なタイプの他のバックグラウンド分子の存在の中から特定の分子タイプを検出することができ、かつ検出の統計的有意性(例えば、信頼度99％での試薬Xの検出)を割り当てることができることを指す。この方法を下記の実施例に適用するために、初めにこの方法をここで手短に説明することにする。
【０１６３】
一般的に言えば、細孔の上のチャンバには2種類の分子が存在する：タイプ1は全てのバックグラウンド分子であり、タイプ2は関心対象の分子である。以下の実施例3では、例えば、DNA-ペイロードはタイプ2の分子と見なされ、DNA単独はバックグラウンド(タイプ1)と見なされる。実験からのデータに基づいて、タイプ2事象のかなりの割合に存在し、かつタイプ1事象の比較的小さな割合に存在する事象シグネチャ基準が同定される。ある事象に対して該シグネチャ基準が満たされる場合、その事象はタイプ2として「タグ付け」される。シグネチャ基準は、δG、持続時間、各事象内のレベルの数および特徴、ならびに/または事象信号から計算された任意の他の数値または値の組み合わせに依存しうる。本発明者らは、pを捕捉事象がタイプ2である確率と定義する。タイプ2分子を含まない対照実験ではp＝0であり、タイプ2分子を含む実験ではp＞0であるが、その値は不明である。我々は、偽陽性確率q1＝Pr(タグ付き|タイプ1事象)を定義する。タイプ2分子を含まない対照実験または実験のセットにおいて、q1は、多数の捕捉事象から良好な精度で決定される。タイプ2分子がバルク溶液中に存在するかどうかを判定する検出実験では、捕捉事象がタグ付けされる確率はpの関数であり、次式：
Q(p)＝(タグ付け事象の数)/N
として近似され得る。
【０１６４】
上記式中、Nは事象の総数である。99％信頼区間Q(p)±Qsd(p)は、Qsd(p)＝2.57*sqrt{Q(p)*(1-Q(p))/N}を用いて計算することができ、ここでsqrt{ }は平方根関数である。実験の過程で、事象数Nが増加するにつれてQ(p)の値は収束し、かつ不確実性境界は減衰する。記録時間の関数としてのQ(p)±Qsd(p)のプロットは、それが各試薬タイプについてどのように展開するかを示している(実施例3についての図19b)。タイプ2分子を含まない対照実験では、Q(0)＝q1であることに気付く。ある確率p*＞0で存在することが知られているタイプ2分子を含む対照実験では、下記のように、計算値Q(p*)を検出実験に用いて、タイプ2分子が存在しないかどうかを判定することができる。
【０１６５】
検出実験において、下記の基準：
Q(p)−Qsd(p)＞q1          (1)
が当てはまる場合、タイプ2分子は99％の信頼度で存在する。
【０１６６】
上記の基準が当てはまれば、p＞0と結論される；それが当てはまらなければ、p＞0とは言えない。検出実験において、下記の基準：
Q(p)＋Qsd(p)＜Q(p*)        (2)
が当てはまる場合、タイプ2分子は99％の信頼度で存在しない。
【０１６７】
上記の基準が当てはまれば、p＝0と結論される；そうでなければ、結論を下すことができない。このフレームワークは、以下に示す実施例において利用される。
【０１６８】
標的分子濃度の推定
いくつかの実施態様では、サンプル中に存在すると予想される標的分子または状態の濃度を推定するために、経時的に記録されたセンサ測定値のセットが集計されて、数学的ツールが適用される。
【０１６９】
いくつかの実施態様では、足場、融合物、ペイロードおよび/またはサンプル中に存在すると予想される標的分子もしくは状態のうちの1つ以上の濃度を変化させながら、前記プロセス(サンプルを足場：融合物：ペイロード試薬と共にインキュベートして、ナノ細孔実験を行う)を繰り返すことができる。その後データセットを組み合わせて、より多くの情報を収集することができる。一実施態様では、活性酵素の総濃度は、集計されたデータセットに数学的ツールを適用することによって推定される。
【０１７０】
文献(Wang, Hongyun, et al., "Measuring and Modeling the Kinetics of Individual DNA-DNA Polymerase Complexes on a Nanopore." ACS Nano 7, no. 5 (May 28, 2013): 3876-86. doi:10.1021/nn401180j; Benner, Seico, et al., "Sequence-Specific Detection of Individual DNA Polymerase Complexes in Real Time Using a Nanopore." Nature Nanotechnology 2, no. 11 (October 28, 2007): 718-24 (doi:10.1038/nnano.2007.344)に記載の方法に従って、生物物理モデルをナノ細孔データに適用することにより、標的酵素とその基質(例えば、切断可能なリンカーまたは切断可能なドメイン)との間の結合、結合開裂、それに続く解離速度を定量化することができる。
【０１７１】
本発明者らのアッセイでは、ナノ細孔は、バルク相から個々の分子をサンプリングして測定する。標的分子の存在下では、足場：融合物：ペイロード内の切断可能なリンカーが、標的の濃度に比例するある速度で改変(例えば切断)される。足場：融合物：ペイロードの濃度に対して高い標的濃度では、切断は急速に進行して、切断可能なリンカーの全てが切断され、結果的に、足場分子とペイロード分子のみ、およびその他のバックグラウンド分子の検出をもたらすだろう。足場：融合物：ペイロードの濃度に対して低い標的濃度では、切断はゆっくり進行して、10分の記録時間内に、足場事象の大部分は、足場：融合物：ペイロードが無傷のままで細孔を通過することを知らせるだろう。足場：融合物：ペイロード濃度に対して中間の標的濃度では、足場事象の非ゼロパーセントが無傷の足場：融合物：ペイロードであるという信号を出され、このパーセントは、反応が完了へと進行するにつれて経時的に減少するだろう。
【０１７２】
総活性酵素濃度を推定するために、低濃度(1pM)から高濃度(100nM)までの毎回異なる濃度の足場：融合物：ペイロード試薬を使用して、ナノ細孔により反復実験を行うことができ、その際、標的分子濃度は共通サンプルの一部を用いることによって一定に保たれる。無傷の足場：融合物：ペイロードであるという信号を出された足場事象のパーセンテージの時間展開を測定することにより、引用文献に記載のものと類似するモデリングフレームワークを用いて、総酵素濃度を定量化することができる。具体的には、総酵素濃度の推定を明確に可能にするモデルを用いた、Wang, Hongyun, et al., "Measuring and Modeling the Kinetics of Individual DNA-DNA Polymerase Complexes on a Nanopore." ACS Nano 7, no. 5 (May 28, 2013): 3876-86. doi:10.1021/nn401180jにおいて、時間依存測定が使用された。
【０１７３】
総活性酵素濃度を推定するために、マルチナノ細孔アレイを実施することができる。各ナノ細孔は、低濃度(1pM)から高濃度(100nM)までの異なる濃度の足場：融合物：ペイロード試薬を測定する。各ナノ細孔で無傷の足場：融合物：ペイロードであるという信号を出された足場事象のパーセンテージの時間展開を並行して測定することにより、引用文献に記載のものと類似するモデリングフレームワークを用いて、総酵素濃度を定量化することができる。
【実施例】
【０１７４】
本技術は、以下の実施例および実験を参照することによってさらに定義される。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変更が実施され得ることが明らかであろう。
【０１７５】
実施例1：DNA足場のナノ細孔検出
固体(solid-state)ナノ細孔は、2つの水性容積を分ける薄い固体膜に形成されたナノスケールの開口部である。電圧クランプ増幅器は、開いた細孔を流れるイオン電流を測定しながら、膜に電圧Vを印加する。他の単一分子センサとは異なり、ナノ細孔デバイスは、非常に低コストで携帯用のフォームファクタ(form factor)にパッケージングすることができる。二本鎖DNA(dsDNA)などの単一荷電分子が捕捉されて、電気泳動により細孔を通して駆動されるとき、測定された電流シフト、ならびにコンダクタンスシフト深さ(δG＝δI/V)および持続時間がその事象を特徴付けるために使用される(図17a)。
【０１７６】
実験中に多くの事象を記録した後で、対応する分子を特徴付けるために事象の分布を解析する。図17bは、電圧V＝100mV (1M LiCl)で直径27nmのナノ細孔を通過する3.2kb dsDNAについての事象特性を示した。2つの取り囲まれた代表的な事象は、次のことを示している：折りたたまれていない状態で通過するDNAに対応する、より幅広く浅い事象；折りたたまれた状態で通過するDNAに対応する、より速いがより深い事象。約1kb以下の短いdsDNAの場合、該DNAは折りたたまれていない状態でのみ細孔を通過する。
【０１７７】
実施例2：プロテアーゼのための切断可能なリンカーおよびエンドヌクレアーゼのための切断可能なリンカーを含む足場：融合物：ペイロード
本発明者らのアッセイを実験的に実証する目的で、図12に示すように、単一の融合分子内に2つの異なる切断可能なリンカーを含む単一の構築物を設計して構築した。この単一の構築物を用いて、我々はエンドヌクレアーゼ活性の検出を実証しようと試み、別にプロテアーゼ活性の検出を実証しようとした。
【０１７８】
DNA足場を作製するために、ジベンゾシクロクオクチン(DBCO)修飾プライマーを用いて、銅フリーの「クリック」ケミストリーを介するコンジュゲーション目的に使用されるDBCO化学基で該分子を効果的に標識した(図6)。このPCR鋳型には、エンドヌクレアーゼ感受性配列CC/T(N)AGG (/は切断部位を表し、Nは任意のDNA核酸塩基C、G、TまたはAを表す)が含まれていた。エンドヌクレアーゼ活性のアッセイでは、融合分子の一部がその後、該標的DNA配列を含む(図12A)。この修飾されたDNA足場を、続いて、ペプチド配列SGKGPRQITAを含有する1000倍過剰のアジド標識分子と共に37℃で一晩インキュベートした(0.01Mリン酸ナトリウム＋300mM NaCl, pH7.4)。このペプチドは、以前にファージディスプレイライブラリーから単離されたものであり、MMP9活性に対して高度に感受性であると確認されていた(Kridel, Steven J., et al. "Substrate hydrolysis by matrix metalloproteinase-9. Journal of Biological Chemistry 276.23 (2001): 20572-20578)。プロテアーゼMMP9活性のアッセイでは、融合分子の一部がその後、該標的ペプチド配列を含む(図12A)。この足場：融合物：ペイロード分子は、(N末端からC末端に向かって)、DNA足場、DNA融合物(該DNAの端部にエンドヌクレアーゼ配列切断可能なリンカーを含む)、アジドケミカルハンドル、PEG4、柔軟なGly-Serモチーフ、MMP9感受性ペプチド配列SGKGPRQITA、柔軟なGly-Serモチーフ、Cys-5kDa PEG、およびビオチンからなるものであった(図12A、Bio-Synthesis社(Lewisville, TX)により合成)。
【０１７９】
図12Aに示されるペイロード分子の連結の成功は、DNA特異的色素Sybr Greenで染色したEMSAゲルにより確認された(図13、レーン2、上方バンド)。感受性の切断可能なリンカーを含む融合物：ペイロード分子へのDNA足場のコンジュゲーションは、約50％の所望の産物をもたらした(図13、レーン2、上方バンド)。コンジュゲートされた純粋な構築物をコンジュゲートされていないDNA単独から精製するために、該産物をポリアクリルアミドゲルからゲル抽出し、酵素活性緩衝液中にメーカーの指示に従って再懸濁した(このプロセスの結果である純粋なDNA-ペイロードは、図14のレーン1および3に示される)。
【０１８０】
実施例3：DNA、DNA-ペイロードおよびDNA-ペイロード-モノストレプトアビジンのナノ細孔検出および判別
500bp DNA足場単独を15nmナノ細孔(0.2nM, 100mV, 1M LiCl, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0)で測定すると、30分で97の事象が生じた(図18a)。少数の事象(8.3％)が少なくとも1nSの深さに達した(図18b）。ナノ細孔に隣接するチャンバから該DNAを除去した後、0.2nMのDNA-ペイロード試薬を加えた；ここで、DNA-ペイロードは、実施例2および図12で言及された複合体を指す。該DNA-ペイロード試薬は、30分間で190の事象を生じ、少なくとも1nSの深さに達する事象が21.1％に増加した(図18b)。該DNA-ペイロード試薬の除去後、モノストレプトアビジンとインキュベートしておいた0.2nMのDNA-ペイロード(図13、レーン3、上方バンド)をナノ細孔測定のためにチャンバに加えた；この場合、モノストレプトアビジンは(図6Bに示すように)ペイロードの端部の遊離ビオチンに結合する。モノストレプトアビジンを付加することにより、各DNA-ペイロード-モノストレプトアビジン分子のサイズが増加し、結果的に、18分間に記録された414事象の大部分について事象深さおよび持続時間の増加をもたらした(図18a)。この集団は、少なくとも1nSの深さに達する事象が43.5％に増加した(図18b)。
【０１８１】
事象集団における視覚的シフト(図18a)は、DNAからDNA-ペイロードへの、次いでDNA-ペイロード-モノストレプトアビジンへの、分子のサイズの増加と一致する。様々なタイプの他のバックグラウンド分子の存在の中で特定の分子タイプを検出するための我々の定量的方法は、検出の統計的有意性を割り当てることができるように、これらのデータに適用され得る。
【０１８２】
DNAがタイプ1と見なされ、DNA-ペイロードがタイプ2と見なされる場合、例示的な基準は、δG＞1nSであるならば事象をタイプ2としてタグ付けすることである。DNA単独の集団を用いてq1＝0.082 (8.2％)を計算することができる。DNA-ペイロード実験をモック検出実験として使用することができ、数学的フレームワークの式(1)を適用することによって、タイプ2分子が存在するかどうかを判定する。その結果は、0.211−0.076＝0.134＞0.082であり、これは、タイプ2 (DNA-ペイロード)分子が99％の信頼度で存在すると言えることを意味する。
【０１８３】
次に、DNAとDNA-ペイロードがタイプ1と見なされ、DNA-ペイロード-モノストレプトアビジンがタイプ2と見なされる場合、同じ基準(δG＞1nS)を用いて、事象をタイプ2としてタグ付けすることができる。DNA単独およびDNA-ペイロード集団を用いて、q1＝0.211 (2つの値0.082および0.211の大きい方を、実行可能な偽陽性確率として使用)を確立することができる。前述と同様に、DNA-ペイロード-モノストレプトアビジン集団をモック検出実験として使用することができ、式(1)を適用することによってタイプ2分子があるかどうかを試験する。その結果は、0.435−0.063＝0.372＞0.211であり、これは、タイプ2 (DNA-ペイロード-モノストレプトアビジン)分子が99％の信頼度で存在すると言えることを意味する。
【０１８４】
DNA-ペイロード-モノストレプトアビジンを関心対象のタイプ2分子として保持して、数学的フレームワークの式(2)が適用されるモック相補的試験をも検討することができる。具体的には、DNA-ペイロードデータを、より嵩高いDNA-ペイロード-モノストレプトアビジンが存在しないかどうかを確認するための「未知」の試薬と見なすことができる。再度、事象をタイプ2としてタグ付けするために基準(δG＞1nS)を使用する。DNA-ペイロード-モノストレプトアビジン対照実験から、Q(p*)＝0.435である。「未知」(DNA-ペイロード)データおよび式(2)の適用から、その結果は、0.211＋0.076＝0.287＜0.435であり、これは、タイプ2 (DNA-ペイロード-モノストレプトアビジン)分子がモック「未知」試薬(DNA-ペイロード、モノストレプトアビジンなし)中に存在しないと99％の信頼度で言えることを意味する。
【０１８５】
実施例4：MMP9感受性分子構築物の消化とそれに続くナノ細孔検出
マトリックスメタロプロテイナーゼ9 (MMP9)は、92kDaの細胞外マトリクス分解酵素(ECM)であり、様々な正常ヒト生理学的過程に関与することが分かっている。ECMの適時分解は、組織修復、形態形成および発達の重要な特徴である。正常なヒト生理学におけるその重要な役割ゆえに、MMP9の異常な発現および/または活性は、心血管疾患、慢性関節リウマチおよび様々な悪性疾患を含むがこれらに限定されない、多くの深刻なヒトの医学的状態に関連している(Nagase, Hideaki, Robert Visse, and Gillian Murphy. "Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs." Cardiovascular research 69.3 (2006): 562-573)。このことを考慮して、MMP9の発現およびタンパク質分解活性は、医学界において価値のある臨床診断バイオマーカーと見なされている。
【０１８６】
MMP9が300bpまたは500bp DNA足場：融合分子：ペイロード構築物内のその標的基質SGKGPRQITAを切断する能力は、EMSAゲルによって最初に確認された。MMP9の活性触媒サブユニット(39kDa、Enzo Life Sciences社)を、ペイロード分子にコンジュゲートしたDNA足場と、MMP9活性緩衝液(50mM Tris, 10mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.05％Brij 35, pH7.5)中でプロテアーゼ対基質比1：10にて37℃で一晩インキュベートして、完全な酵素分解を確実にした(図14、レーン2)。このMMP9とのインキュベーションは、完全な構築物と比較してアクリルアミドゲル中でより可動性である分子を与えたが(図14、レーン1および3)、それはおそらく、標的基質の切断部位であると報告されたグルタミン残基とイソロイシン残基間での構築物の完全な酵素分解のためである(Kridel, Steven J., et al. "Substrate hydrolysis by matrix metalloproteinase-9. Journal of Biological Chemistry 276.23 (2001): 20572-20578)。同一の構築物を用いた不活性MMP9のインキュベーションは、該ゲルにおいてサンプル間のいかなるシフトも生じさせず(データは示さず)、これは、レーン2に見られる電気泳動移動度の変化が、関心対象のプロテアーゼMMP9のタンパク質分解活性にのみ起因することを示している。
【０１８７】
次に、300bp DNA：融合物：ペイロード構築物(ここではDNA-ペイロードという)内の標的基質SGKGPRQITAを切断するMMP9の本発明者らのナノ細孔検出法を試験した。最初に、0.4nMの300bp DNA足場単独を、直径15nmの細孔(100mV、1M LiCl)を用いて試験したところ、30分間で146の事象が生じたが、わずか5.5％が0.1msの持続時間を超えたにすぎなかった(図19a、b)。続いて、MMP9活性に曝露されていないDNA-ペイロードを試験した。このサンプルは30分で49の事象を生じ、16.3％が0.1msの持続時間を超えた(図19a、b)。次に、先に記載したようなDNA-ペイロードとMMP9との間のインキュベーション期間の後、その反応混合物を1.2nMの同等のDNA-ペイロード濃度で該細孔において試験したところ、30分間で327の事象が生じた。MMP9が基質(すなわち、開裂可能なリンカー)の大部分を分解した場合、その反応混合物はDNA単独とペイロード単独を含み、結果として、持続時間が0.1msを超える事象のパーセンテージは、分解されていないDNA-ペイロードと比較して、減少するであろう。実際その通りであり、MMP9分解後のDNA-ペイロードについては0.1msを超える事象が7.6％であり、分解なしのDNA-ペイロードについての16.3％から減少した(図19a、b)。記録時間の関数としてのQ(p)±Qsd(p)のプロットが各試薬タイプについて示される(図19b)。
【０１８８】
次に、ナノ細孔検出アッセイに統計的有意性を割り当てるための以前に記載した方法を実施した。具体的には、式(2)を用いて、MMP9活性を暗示的に検出するために、DNA-ペイロードとMMP9との間の反応混合物によって生成されたデータを用いてDNA-ペイロード分子構築物の非存在について試験することができる。この場合には、DNA-ペイロードが検出されるタイプ2分子であり、0.1msの最小事象持続時間がタイプ2の信号を出す基準として選択される。DNA-ペイロードが(MMP9なしで)存在することが分かっている対照実験において、値Q(p*)＝0.163を確立する。次に、MMP9活性後のDNA-ペイロードを「未知」のデータとして扱って、式(2)を適用する。その結果は、0.0765＋0.038＝0.117＜0.163であり、これは、タイプ2 (DNA-ペイロード)分子が99％の信頼度で存在しないと言えることを意味する。上述したように、DNA-ペイロードが存在しないことは、MMP9がその基質を含む分子の十分な割合を分解したことを暗示している。式(2)を適用したMMP9プロテアーゼ活性の結果を図19cに示す。
【０１８９】
実施例5：漸増濃度の尿の存在下でのMMP9感受性分子構築物の消化
MMP9は、卵巣癌を含めて、多くのヒト悪性腫瘍の尿中に過剰発現されて過活性であることが見出されている(Coticchia, Christine M., et al. "Urinary MMP-2 and MMP-9 predict the presence of ovarian cancer in women with normal CA125 levels." Gynecologic oncology 123.2 (2011): 295-300)。こうした理由で、ヒト尿中に存在するMMP9の濃度および/または活性レベルを分析するために、いくつかの市販のキット(GE Healthcare社、R&D Systems社、Abcam社)が製造されている。この実施例では、漸増濃度の尿の存在下で足場：融合物：ペイロード構築物を分解するMMP9の能力をEMSAゲルによって分析した。
【０１９０】
実施例2に記載したような切断可能なリンカー：ペイロードのDBCO修飾DNA足場へのコンジュゲーションにより、＞75％の最終産物を得た(図16、レーン5の上方バンド)。次いで、精製したこのサンプルを、増加する量のヒト尿の存在下でMMP9と共にインキュベートした。通常の酵素活性緩衝液では、該構築物の完全な切断が上部コンジュゲートバンドの消失を通して観察された(レーン1)。尿の濃度が増加するにつれて、完全な酵素阻害は溶液中の＞15％尿で起こり(図16、レーン3および4)、中程度の酵素活性は5％尿の溶液中で検出されることが見出された(図16、レーン2)。プロテアーゼ阻害のメカニズムは検討されなかったが、pHの変化、尿中の天然阻害剤の存在、またはタンパク質三次構造の尿素媒介アンフォールディングを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因によると考えられる。
【０１９１】
実施例6：エンドヌクレアーゼ感受性構築物の加水分解とその後のナノ細孔検出
細菌細胞において、制限エンドヌクレアーゼは、外来DNAの取り込みに対する重要な防御機構として作用する。エンドヌクレアーゼは特定のDNA配列を認識して分解し、ウイルス感染の場合がそうであるように、潜在的に有害な外来DNAを破壊しつつ「自己」を防護する。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、表在性皮膚病変から重度の全身性疾患に至るまでの、様々なヒト感染症を引き起こすことが分かっている病原性細菌である。この実施例では、制限酵素SauIの認識配列CC/T(N)AGG (NはC、G、TまたはAを表す)を含むDBCO修飾500bp DNA(足場と融合物の一部を含む)が最初に作製される。SauIは、黄色ブドウ球菌の全ての分離株に存在することが見出されたエンドヌクレアーゼである(Veiga, Helena, and Mariana G. Pinho. "Inactivation of the SauI type I restriction-modification system is not sufficient to generate Staphylococcus aureus strains capable of efficiently accepting foreign DNA." Applied and environmental microbiology 75.10 (2009): 3034-3038)。次いで、この融合物のDNA部分をペイロード分子にコンジュゲートさせる。販売会社からのSauIの入手が限られるため、同じ認識配列での加水分解切断が可能なエンドヌクレアーゼであるEco81Iを使用した。
【０１９２】
作製されたDNA足場：融合物：ペイロード構築物を分解するEco81Iの能力を評価するために、これら2つを37℃で一晩一緒にインキュベートして、完全なDNA配列特異的加水分解を確実にした(1X Tango緩衝液中の20UのEco81I、Thermo Scientific社)。該エンドヌクレアーゼと足場：融合物：ペイロードとのインキュベーション後、EMSAゲル電気泳動を行って、生じた酵素反応産物を分析した。コンジュゲートされたDNA足場のサンプルをEco81Iなしでインキュベートすると(図15、レーン1)は、無傷の構築物を代表する上方バンドと、ペイロード分子にコンジュゲートされなかったDNAの下方バンドを示した。しかしながら、レーン1のサンプルをEco81Iと共にインキュベートすると、DNAの完全な分解が観察された(図15、レーン3)。Eco81Iの認識配列はDNA足場の3'末端から194bp離れており、かつペイロード分子中にコードされたプロテアーゼ切断可能リンカーとは独立しているため、コンジュゲートされた物質とコンジュゲートされなかった物質の両方(図15、レーン1、上方および下方バンド)ともEco81Iによって加水分解された。DNAへのEco81Iの加水分解反応後に予想された304bpおよび196bpの産物は、レーン3において明らかである。
【０１９３】
エンドヌクレアーゼ感受性構築物のEco81I媒介分解をゲル確認した後、ナノ細孔分析を行って、生じた断片の電流インピーダンスを評価した。ペイロード分子の存在のため、理想的な電流インピーダンスは、生じた産物と比較したとき、完全な構築物についてより大きな信号を予測する。500bpのDNAを用いて、この仮説を検証するために、足場：融合物：ペイロード構築物(以下、DNA-ペイロードという)を、1M LiClを含むナノ細孔に投入し、Eco81I媒介分解の前と後に比較した(図20)。
【０１９４】
ナノ細孔アッセイでは、最初に、直径18nmの細孔(100mV、1M LiCl)を用いて、1nMのコンジュゲートされていない500bp DNA単独を試験した。このサンプルでは、32分間に530の事象が生じ、わずか7.5％が0.06msの持続時間を超えた(図20a、b)。続いて、DNA-ペイロードを0.2nMで試験したところ、31分で117の事象が生じ、22.2％が0.06msの持続時間を超えた(図20a、b)。次に、前述のようなDNA-ペイロードとEco81Iとの間のインキュベーション期間の後、その反応混合物を0.2nMの同等のDNA-ペイロード濃度で該細孔において試験したところ、40分間で52の事象が生じた。Eco81Iが切断可能なリンカーの大部分を切断した場合、その反応混合物はDNA単独とペイロード単独を含み、結果として、持続時間が0.06msを超える事象のパーセンテージは、分解されていないDNA-ペイロードと比較して、減少するであろう。実際その通りであり、Eco81I分解後のDNA-ペイロードについては0.06msを超える事象が7.7％であり、分解なしのDNA-ペイロードについての22.2％から減少した(図20a、b)。記録時間の関数としてのQ(p)±Qsd(p)のプロットが各試薬タイプについて示される(図20b)。
【０１９５】
再度、ナノ細孔検出アッセイに統計的有意性を割り当てるための以前に記載した方法を実行した。具体的には、式(2)を用いて、Eco81I活性を暗示的に検出するために、DNA-ペイロードとEco81Iとの間の反応混合物によって生成されたデータを用いてDNA-ペイロード分子構築物の非存在について試験する。この場合には、DNA-ペイロードが検出されるタイプ2分子であり、0.06msの最小事象持続時間がタイプ2の信号を出す基準として選択される。DNA-ペイロードが(Eco81Iなしで)存在することが分かっている対照実験において、値Q(p*)＝0.222を確立する。次に、Eco81I活性後のDNA-ペイロードを「未知」のデータとして扱って、式(2)を適用する。その結果は、0.0769＋0.0951＝0.172＜0.222であり、これは、タイプ2(DNA-ペイロード)分子が99％の信頼度で存在しないと言えることを意味する。上述したように、DNA-ペイロードが存在しないことは、Eco81Iが切断可能なリンカーの十分な割合を切断したことを暗示している。式(2)を適用したEco81Iエンドヌクレアーゼ活性の結果を図20cに示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2018503830.tif 000025
【図１８Ａ】
2018503830.tif 000026
【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2018503830.tif 000029
【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
2018503830.tif 000031
【図２０Ｂ】
2018503830.tif 000032
【図２０Ｃ】
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【国際調査報告】
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