(57)【要約】本発明の態様は、細胞内の標的遺伝子を含む変異拡張ヌクレオチド反復（ＮＲ）の有害な活性を、細胞を有効量のヌクレオシド剤、ならびにそのような方法に使用される組成物と接触させることによって低減する方法を含む。標的遺伝子を含む変異拡張ＮＲの有害な活性（たとえば、毒性および／またはそれによりコード化される産物の機能不全性）は、異なる様々な方法、たとえば、標的遺伝子によりコード化される毒性の発現産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生または活性を低減する（およびいくつかの場合において選択を含む差次的に低減する）ことにより、減少させられる可能性がある。本方法を実施するためのキットおよび組成物も提供される。
2018520111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の標的遺伝子の有害な影響を低減する方法であって、
細胞を、変異拡張ヌクレオチド反復（ＮＲ）ドメインを含む標的遺伝子の細胞内の有害な影響を減少させる有効量のヌクレオシド剤に接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ヌクレオシド剤は、前記標的遺伝子の毒性発現産物の発現を減少させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記毒性発現産物は、リボ核酸の発現産物であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記毒性発現産物は、変異タンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレオシド剤は、前記毒性発現産物の発現を差次的に減少させることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記変異拡張ＮＲドメインは、変異トリヌクレオチド反復（ＴＮＲ）ドメインであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的遺伝子は、アタキシン１、アタキシン２、アタキシン３、アタキシン７、ＴＢＰ、アトロフィン１、アンドロゲン受容体タンパク質、およびハンチンチンタンパク質（ＨＴＴ）遺伝子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的遺伝子は、ＨＴＴ遺伝子であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオシド剤は、細胞内のＳＰＴ４タンパク質の機能を調整することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオシド剤は、以下の式で示す化合物またはそのプロドラッグであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【化１５】
2018520111.tif 000018
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、アシルオキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、リン含有基、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アジド、アミノ、アミノアシルオキシ、および置換アミノから選択され、
Ｚは、プリンもしくはピリミジン、またはその類似体から選択される。
【請求項１１】
前記ヌクレオシド剤は、リボヌクレオシド剤またはそのプロドラッグであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレオシド剤は、６−デアザプリンリボヌクレオシドおよび６−アザウリジンリボヌクレオシドまたはそのプロドラッグから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプル内のＳＰＴ４タンパク質およびＳＰＴ５タンパク質の相互作用を減少させる方法であって、
前記サンプルを、前記ＳＰＴ４タンパク質およびＳＰＴ５タンパク質の相互作用を選択的に減少させる有効量のヌクレオシド剤に接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオシド剤は、Ｓｕｐｔ４ｈとＳｕｐｔ５ｈとの間の相互作用を減少させることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
キットであって、
Ｓｕｐｔ４ｈとＳｕｐｔ５ｈとの間の相互作用を減少させるヌクレオシド剤と、
第２の活性物質と
を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
過去数十年間、コードまたは非コードＤＮＡ領域におけるヌクレオチド反復の異常な拡大は、多くの疾患状態と関連付けられてきた。拡張反復のこれらの変異領域は、異なる様々なメカニズム、たとえば、機能喪失または機能獲得メカニズムを介して、たとえば、毒性ＲＮＡ、改変されたＲＮＡ処理、ミスフォールドした異常タンパク質、低下した遺伝子発現および改変タンパク質機能の結果、疾患を引き起こす変異遺伝子産物をもたらす可能性がある（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＺｏｇｈｂｉ「フォーティーン計数：トリヌクレオチド反復疾患の解明」ヒト分子遺伝学（２０００）９：９０９〜１６）。
【０００２】
長い反復は、拡張または時には収縮の可能性を高めることができる異常なＤＮＡ構造を形成する可能性がある。このような構造は、一本鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡ、四重鎖ＤＮＡ、平行鎖ＤＮＡ、および解かれたＤＮＡのヘアピンを含む（Ｓｉｎｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．「ＤＮＡの反復拡大のメカニズム」核酸および分子生物学（２００６）１９：３）。反復領域の動的挙動を説明するモデルは、ＤＮＡの複製または修復、ミスアライメントおよび削除部分の修復、ならびに不等交差の間のストランド誤対合も含む（Ｚｏｇｈｂｉ「トリヌクレオチド反復障害」分子医学の原則（２００６）１１１４〜１１２２）。反復領域の体細胞および生殖細胞系の不安定性により、反復変異を有する家族は、疾患の重症度の増加および１つの世代から次の世代への発病年齢の若年化に陥る可能性があり、これは予測として知られる現象である。予測は、大略的に次の世代においてより大きな反復長と相関し、父系伝達は拡大したより大きなリスクをもたらす（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＺｏｇｈｂｉ「フォーティーン計数：トリヌクレオチド反復疾患の解明」ヒト分子遺伝学（２０００）９：９０９〜１６）。
【０００３】
特定のトリヌクレオチド反復疾患は非コード配列で発生する反復から生じ、そのような反復は罹患遺伝子の機能の喪失をもたらす可能性がある。疾患に関与するトリヌクレオチド反復配列は、ＣＧＧ、ＧＣＣ、ＧＡＡ、ＣＴＧ、およびＣＡＧユニットを含む。配列自体および反復の位置の性質は、疾患の病因のメカニズムに影響を与えることができる。Ｘ連鎖トリヌクレオチド疾患は、脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、脆弱ＸＥ ＭＲ（ＦＲＡＸＥ）および脆弱Ｘ振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）である。このグループの疾患は、機能変異の喪失および毒性ＲＮＡの産生の両方を含む。常染色体疾患は、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ失調症および２つのタイプの脊髄小脳失調症（ＳＣＡ８およびＳＣＡ１２）を含む（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＺｏｇｈｂｉ「フォーティーン計数：トリヌクレオチド反復疾患の解明」ヒト分子遺伝学（２０００）９：９０９〜１６）。疾患の表現型の発現はきわめて可変であり、発症メカニズムもまた、疾患によって異なる（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＺｏｇｈｂｉ「フォーティーン計数：トリヌクレオチド反復疾患の解明」ヒト分子遺伝学（２０００）９：９０９〜１６）。
【０００４】
ポリグルタミンリピート病は、特定のトリヌクレオチド反復疾患のカテゴリーである。
これらの疾患は、これらの遺伝子によってコード化されるタンパク質におけるポリグルタミン鎖のための遺伝子およびコードのタンパク質コード領域に位置しているエクソン反復から生じる。ニューロンのサブセットは、ポリグルタミンリピート病のメカニズムに対して特に脆弱である（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＺｏｇｈｂｉ「フォーティーン計数：トリヌクレオチド反復疾患の解明」ヒト分子遺伝学（２０００）９：９０９〜１６）、（Ｂｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．「ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）病：発生細胞死プログラムのミスファイアリング」細胞生物学の動向（２０１３）２３：１６８〜７４）。以下の歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、ハンチントン病、球脊髄性筋ジストロフィー、および脊髄小脳失調症１型、２型、３型、６型、７型、および１７型は、公知のポリグルタミンリピート病の例である。研究により、ハンチントン病様２は病原性のポリグルタミンリピートのメカニズムから生じる可能性があることが示唆されている（Ｗｉｌｂｕｒｎ，ｅｔ  ａｌ．「ＪＰＨ３座におけるアンチセンスＣＡＧ反復転写産物は、増大したポリグルタミンタンパク質の毒性をハンチントン病様２のマウスに伝達する」ニューロン（２０１１）７０：４２７〜４０）。
【０００５】
ポリグルタミンリピート病は通常、比較的晩年に発症し、進行性の神経機能障害をもたらし、最終的に深刻な神経変性をもたらす症状を引き起こす（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＺｏｇｈｂｉ「フォーティーン計数：トリヌクレオチド反復疾患の解明」ヒト分子遺伝学（２０００）９：９０９〜１６）。これらの疾患の顕著な特徴は、主に罹患ニューロンの核に見られる、ポリグルタミン鎖を含むタンパク質の凝集体の存在である（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＺｏｇｈｂｉ「フォーティーン計数：トリヌクレオチド反復疾患の解明」ヒト分子遺伝学（２０００）９：９０９〜１６）。ミスフォールドした反復を含むタンパク質は毒性である可能性があり、タンパク質凝集体は転写調節因子との相互作用が異常である可能性がある。しかし、正確な発症メカニズムは複雑である。反復増殖が異なる機能を有するタンパク質をコード化する遺伝子に影響を与えるだけでなく、ポリグルタミンリピート病もまた脳の異なる領域に発現することができる（Ｂｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．「ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）病：発生細胞死プログラムのミスファイアリング」細胞生物学の動向（２０１３）２３：１６８〜７４）。他の研究では、ポリグルタミン反復タンパク質は、細胞死をもたらす、細胞のアポトーシス経路を不適切に活性化する役割を果たす可能性があることが示されている（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＺｏｇｈｂｉ「フォーティーン計数：トリヌクレオチド反復疾患の解明」ヒト分子遺伝学（２０００）９：９０９〜１６）、（Ｂｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．「ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）病：発生細胞死プログラムのミスファイアリング」細胞生物学の動向（２０１３）２３：１６８〜７４）。
【０００６】
ポリアラニン鎖をコード化するヌクレオチド反復もまた、疾患を引き起こすことが分かってきた。たとえば、アラニン鎖をコード化するトリヌクレオチド反復は、先天奇形症候群に関連付けられてきた（ＡｌｂｒｅｃｈｔおよびＭｕｎｄｌｏｓ「他のトリヌクレオチド反復：ポリアラニン拡張障害」遺伝学および発生における現行の見解（２００５）２８５〜９３）。罹患遺伝子は、発生中の役割を果たしている転写因子をコード化し、反復はミスフォールドしたタンパク質およびタンパク質の凝集および劣化をもたらす（ＡｌｂｒｅｃｈｔおよびＭｕｎｄｌｏｓ「他のトリヌクレオチド反復：ポリアラニン拡張障害」遺伝学および発生における現行の見解（２００５）２８５〜９３）。ヌクレオチド反復単位の様々な他のサイズの不安定領域もまた、疾患の根源である。テトラヌクレオチド反復は、筋緊張性ジストロフィー２型を引き起こし、ペンタヌクレオチド反復はＳＣＡ１０およびＳＣＡ３１をもたらす。１２量体反復は、進行性のミオクローヌスてんかんに関連付けられてきた（Ｚｏｇｈｂｉ「トリヌクレオチド反復障害」分子医学の原則（２００６）１１１４〜１１２２）、（Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．「脊髄小脳失調症３１型は「挿入された」ペンタヌクレオチド反復含有（ＴＧＧＡＡ）ｎと関連している」ヒト遺伝学に関するアメリカン・ジャーナル（２００９）８５：５４４〜５７）、（Ｍａｔｓｕｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．「脊髄小脳失調症１０型におけるＡＴＴＣＴのペンタヌクレオチド反復の大幅な拡大」ネイチャージェネティクス（２０００）２６：１９１〜９４）、（Ｃｌａｒｋ「トリヌクレオチド反復疾患概論」神経変性：認知症および運動障害の分子病理学（２０１１）２５５〜２５６）。
【０００７】
タンパク質をコード化しない遺伝子部分におけるトリヌクレオチド反復の拡大は、異常なＲＮＡを生成することによって疾患を引き起こすことができる。さらに、反復の拡大は必ずしもトリヌクレオチドと関連付ける必要はない。たとえば、Ｃ９ＯＲＦ７２の非コード領域におけるＧＧＧＧＣＣのヘキサヌクレオチド反復の拡大は、２つの疾患である、常染色体優性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の最も一般的な原因である。この常染色体優性突然変異を患う個人は、実行機能の欠損および行動の変化（ＦＴＤ）、または運動ニューロンの機能障害（ＡＬＳ）を経験する。ＦＴＤおよびＡＬＳの症状の組み合わせを有する患者がいる可能性がある（Ｒｅｎｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．「Ｃ９ＯＲＦ７２におけるヘキサヌクレオチド反復の拡大が染色体９ｐ２１−リンクＡＬＳ−ＦＴＤの原因である」ニューロン（２０１１）７２：２５７〜６８）、（Ｙｏｋｏｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．「行動および運動ニューロンの疾患におけるＣ９ＯＲＦ７２のヘキサヌクレオチド反復：臨床的異質性および病理学的多様性」神経変性疾患に関するアメリカン・ジャーナル（２０１４）３：１〜１８）。Ｃ９ＯＲＦ７２のヘキサヌクレオチド反復はまた、まれにパーキンソン症候群、仮性認知症、精神障害、および他の神経疾患と関連する場合がある（Ｂｉｅｎｉｅｋ，ｅｔ  ａｌ．「抑うつ型仮性認知症における拡張Ｃ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチド反復」ＪＡＭＡ神経学（２０１４）７１：７７５〜８１）、（Ｙｏｋｏｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．「行動および運動ニューロンの疾患におけるＣ９ＯＲＦ７２のヘキサヌクレオチド反復：臨床的異質性および病理学的多様性」神経変性疾患に関するアメリカン・ジャーナル（２０１４）３：１〜１８）。
【０００８】
Ｃ９ＯＲＦ７２のヘキサヌクレオチド反復数は通常２５未満であるが、変異体反復領域は、最大１５００以上のヘキサヌクレオチド単位を含むことができる（ＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ  ａｌ．「Ｃ９ＯＲＦ７２の非コード領域における拡張ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド反復は、染色体９ｐ−リンクＦＴＤおよびＡＬＳを引き起こす」ニューロン（２０１１）７２：２４５〜５６）。研究により、ヘキサヌクレオチド反復領域は不安定であり、異常に長い反復は拡張しやすい素因ハプロタイプの背景に発生する可能性があることが提示されている（ＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ  ａｌ．「Ｃ９ＯＲＦ７２の非コード領域における拡張ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド反復は、染色体９ｐ−リンクＦＴＤおよびＡＬＳを引き起こす」ニューロン（２０１１）７２：２４５〜５６）、（Ｒｅｎｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．「Ｃ９ＯＲＦ７２におけるヘキサヌクレオチド反復の拡大が染色体９ｐ２１−リンクＡＬＳ−ＦＴＤの原因である」ニューロン（２０１１）７２：２５７〜６８）、（Ｆｒａｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．「ＵＫ筋萎縮性側索硬化症のコホートのスクリーニングによりＣ９ＯＲＦ７２拡張の多様な起源の証拠が提供される」老化の神経生物学（２０１５）３６：５４６．ｅ１〜７）。表現促進現象がＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート病の特徴であるかどうかは完全には明らかではない（ＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ  ａｌ．「Ｃ９ＯＲＦ７２の非コード領域における拡張ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド反復は、染色体９ｐ−リンクＦＴＤおよびＡＬＳを引き起こす」ニューロン（２０１１）７２：２４５〜５６）、（Ｒｅｎｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．「Ｃ９ＯＲＦ７２におけるヘキサヌクレオチド反復の拡大が染色体９ｐ２１−リンクＡＬＳ−ＦＴＤの原因である」ニューロン（２０１１）７２：２５７〜６８）。反復を測定するための技術はサザンブロット法を超えて発展するため、反復自体および周囲の領域の体細胞不安定性とメチル化状態は、さらなる調査が必要である（Ｆｒａｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．「ＵＫ筋萎縮性側索硬化症のコホートのスクリーニングによりＣ９ＯＲＦ７２拡張の多様な起源の証拠が提供される」老化の神経生物学（２０１５）３６：５４６．ｅ１〜７）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の態様は、細胞内の標的遺伝子を含む変異拡張ヌクレオチド反復（ＮＲ）の有害な活性を、細胞を有効量のヌクレオシド剤に接触させることにより低下させる方法、ならびにそのような方法に使用される組成物を含む。標的遺伝子を含む変異拡張ＮＲの有害な活性（たとえば、毒性および／またはそれによりコード化される産物の機能不全性）は、異なる様々な方法、たとえば、標的遺伝子によりコード化される毒性の発現産物（たとえば、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生または活性を低下させる（およびいくつかの場合において選択を含む差次的に低減させる）ことにより、減少させられる可能性がある。本発明の方法の実施のために使用するキットおよび組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
当業者であれば、以下に説明する図面は、例示のみの目的のためのものであることを理解するであろう。図面は、本教示の範囲を一切限定しない。
【００１１】
【図１】遺伝子を含む拡張トリヌクレオチド反復（ＴＮＲ）（たとえば、ＣＡＧ反復）の発現に対するＳｐｔ４（Ｓｕｐｔ４ｈ）阻害の効果および結果を示す図である。ＲＮＡポリメラーゼＩＩが短いＣＡＧ反復を含むＤＮＡ鋳型に沿って移動する場合（灰色の楕円で示す）、Ｓｐｔ４による転写伸長は、遺伝子の正常な対立遺伝子によりコード化されるＲＮＡおよびタンパク質の産生のために必須ではない可能性がある。しかし、長いＣＡＧ伸張が遺伝子中に存在する場合、転写伸長は効率性が低下し、Ｓｐｔ４を必要とする。正常なＳｐｔ４機能を欠く細胞では、ＣＡＧ反復の拡張した伸張を含み、かつ拡大したポリＱタンパク質をコード化する遺伝子のみが影響を受ける。拡大したポリＱ反復（四角形）を含むタンパク質は濃度依存的に凝集する（長方形）。
【図２Ａ】Ｓｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ  ＮＧＮ複合体形成を監視するために二分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）が採用されており、ＢｉＦＣの基礎的なメカニズムを示す模式図である。蛍光タンパク質ＹＦＰはＮ末端（ＹＮ）およびＣ末端（ＹＣ）の部分に分割される。ＹＦＰタンパク質断片は、複合体形成が、ＹＮとＹＣとを結合する一対の相互作用タンパク質によって刺激されて蛍光シグナルの生成をもたらすまで、蛍光シグナルを生成するためにそれ自体で補完することができない。
【図２Ｂ】Ｓｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ  ＮＧＮ複合体形成を監視するために二分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）が採用されており、蛍光顕微鏡下で監視された、指示されたプラスミド構築物でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を示す図である。ＤＩＣは、位相差画像である。Ｓｕｐｔ５ｈ ＮＧＮはＹＮにインフレーム融合されてＮＧＮ−ＹＮを生成し、Ｓｕｐｔ４ｈはＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣを生成するためにＹＣに融合された。Ｓｕｐｔ４ｈ（Ｓ６９Ｌ）はアミノ酸位置６９でロイシン置換のためのセリンを有し、これによりＳｕｐｔ５ｈとの相互作用を阻止する。
【図２Ｃ】Ｓｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ  ＮＧＮ複合体形成を監視するために二分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）が採用されており、ＢｉＦＣの相補的および非相補的ペアからの試料の蛍光シグナルが、それぞれ４８８ｎｍおよび５２７ｎｍでの励起および発光波長の設定でプレートリーダーによって評価されたことを示す図である。
【図３Ａ】２−ＰＮ４および２１−ＶＳ安定発現株は、ＮＧＮ−ＹＮとＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣとの間の相互作用を阻害する化合物の同定のために作成されており、２−ＰＮ４および２１−ＶＳ細胞におけるドキシサイクリンによるタンパク質（単数または複数）の誘導を示す模式図である。２−ＰＮ４はＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣおよびＳｕｐｔ５ｈ／ＮＧＮ−ＹＮの両方を発現し、ＹＮ／ＹＣ相補性を介してＹＦＰ蛍光シグナルを生成する。無傷蛍光タンパク質ビーナスを発現する２１−ＶＳは、コントロール細胞株として含まれる。
【図３Ｂ】指示された細胞が、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＮまたは空ベクターＮＩＳを発現するプラスミド構築物でトランスフェクトされ、その後ＮＧＮ−ＹＮおよびＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣの発現を誘導するためにドキシサイクリンを含有する増殖培地中で培養されたことを示す図である。各試料は蛍光顕微鏡で監視され、位相差画像が含まれ、写真（左側）の隅に示されている。蛍光強度はメタモルフ・ソフトウェアを用いて評価した。ＮＩＳトランスフェクト試料中の蛍光のレベルは１に設定され、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＮでトランスフェクトした細胞における相対ＹＦＰ蛍光レベルが示されている（右）。
【図４Ａ】６−クロロプリンリボシド（６ＣＲ）は、２−ＰＮ４細胞におけるＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣとＮＧＮ−ＹＮとの相互作用を阻害し、マウスの神経細胞における変異Ｈｔｔ遺伝子の発現を減少させており、ドキシサイクリン（４μｇ／ｍｌ）および種々の濃度の６ＣＲを含む増殖培地で２４時間培養された２−ＰＮ４および２１−ＶＳ細胞を示す図である。細胞の画像は、蛍光顕微鏡によって監視され、メタモルフ・ソフトウェアによって定量化された。モック対照と比較して、６ＣＲで処理した細胞における相対蛍光強度が示されている（スチューデントのｔ検定により、ｎ＝３；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１）。
【図４Ｂ】６−クロロプリンリボシド（６ＣＲ）は、２−ＰＮ４細胞におけるＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣとＮＧＮ−ＹＮとの相互作用を阻害し、マウスの神経細胞における変異Ｈｔｔ遺伝子の発現を減少させており、６ＣＲで処理した２−ＰＮ４細胞におけるウエスタンブロット解析によって評価された、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣおよびＮＧＮ−ＹＮのタンパク質レベルを示す図である。ＨＡ−ビーナスのタンパク質レベルはまた、２１−ＶＳ細胞においても分析され、α−チューブリンが、ローディングコントロールの役割を果たした。
【図４Ｃ】６−クロロプリンリボシド（６ＣＲ）は、２−ＰＮ４細胞におけるＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣとＮＧＮ−ＹＮとの相互作用を阻害し、マウスの神経細胞における変異Ｈｔｔ遺伝子の発現を減少させており、免疫沈降に供された、ＤＭＳＯ（モック対照）または２０μＭの６ＣＲで処理された２−ＰＮ４細胞から採取されたタンパク質ライセートを示す図である。ＨＡタグ付きＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣタンパク質を、ＨＡエピトープに対する抗体を用いて沈殿させ、その後、抗Ｆｌａｇ抗体を用いたウエスタンブロットによりＦｌａｇタグ付きＮＧＮ−ＹＮとの相互作用を分析した。
【図４Ｄ】６−クロロプリンリボシド（６ＣＲ）は、２−ＰＮ４細胞におけるＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣとＮＧＮ−ＹＮとの相互作用を阻害し、マウスの神経細胞における変異Ｈｔｔ遺伝子の発現を減少させており、６ＣＲ処理試料においてＲＴ−ＰＣＲによって評価されたＨｔｔ遺伝子発現を示す図である。Ｕ６を使用して正常化した後、ｍＲＮＡレベルをモック対照と比較した。ＨｄｈＱ７／Ｑ７およびＨｄｈＱ１１１／Ｑ１１１は、それぞれ、ホモ接合性野生型および変異Ｈｔｔ対立遺伝子を有するマウス線条体細胞株である。
【図５Ａ】６−アザウリジン（６−ＡＺＡ）は、２ＰＮ−４細胞におけるＢｉＦＣの蛍光シグナルを阻害し、マウスの神経細胞における変異Ｈｔｔ遺伝子の発現を減少させており、ドキシサイクリン（４μｇ／ｍｌ）および種々の濃度の６−ＡＺＡを含む増殖培地で２４時間培養された２−ＰＮ４および２１−ＶＳ細胞を示す図である。画像および蛍光強度の定量化の取得は、図３Ａに記載したように実施した。モック対照における蛍光強度を１に設定し、６−ＡＺＡで処理した細胞における相対蛍光強度を下のパネルに示す。
【図５Ｂ】６−アザウリジン（６−ＡＺＡ）は、２ＰＮ−４細胞におけるＢｉＦＣの蛍光シグナルを阻害し、マウスの神経細胞における変異Ｈｔｔ遺伝子の発現を減少させており、６−ＡＺＡ処理細胞におけるウエスタンブロット解析によって分析された、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣおよびＮＧＮ−ＹＮまたはＨＡ−ビーナスのタンパク質レベルを示す図である。α−チューブリンが、ローディングコントロールの役割を果たした。
【図５Ｃ】６−アザウリジン（６−ＡＺＡ）は、２ＰＮ−４細胞におけるＢｉＦＣの蛍光シグナルを阻害し、マウスの神経細胞における変異Ｈｔｔ遺伝子の発現を減少させており、６−ＡＺＡ処理試料においてＲＴ−ＰＣＲによって評価されたＨｔｔ遺伝子の発現を示す図である。１８Ｓ  ｒＲＮＡの正常化後、ｍＲＮＡレベルをモック対照と比較した。マウス線条体細胞株ＨｄｈＱ７／Ｑ７およびＨｄｈＱ１１１／Ｑ１１１は、それぞれ、野生型Ｈｔｔおよび変異Ｈｔｔのホモ接合性対立遺伝子を有する。
【図６Ａ】スプリットルシフェラーゼ相補性アッセイを使用してＳｕｐｔ４ｈ１とＳｕｐｔ５のＮＧＮドメインとの間の相互作用を検出するための実験方法を提供しており、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＮＧＮの相互作用を媒介したガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）活性のメカニズムを示す模式図である。ガウシアルシフェラーゼは最も小さい公知のセレンテラジン使用のルシフェラーゼである。Ｓｕｐｔ４ｈタンパク質またはＳｕｐｔ５ｈ（ＮＧＮ）のアミノ末端ドメインをコード化するヒト遺伝子を、それぞれ、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＧＬ１およびＮＧＮ−ＧＬ２を生成するために、ガウシア・プリンケプス・ルシフェラーゼのサブユニット（ＧＬｕｃ１またはＧＬｕｃ２）をコード化する遺伝子と融合させた。ＧＬｕｃ１とＧＬｕｃ２とがＳｕｐｔ４ｈとＮＧＮ  Ｉとの間の複合体形成によって融合されない限り、分裂したＧＬｕｃは活性を生じることができない。
【図６Ｂ】スプリットルシフェラーゼ相補性アッセイを使用してＳｕｐｔ４ｈ１とＳｕｐｔ５のＮＧＮドメインとの間の相互作用を検出するための実験方法を提供しており、誘導物質であるレオスイッチリガンド（ＲＳＬ１）の非存在下でほとんどまたは全く基底発現を示さないが、ＲＳＬ１の存在下では高い誘導性を有する、誘導性遺伝子発現系であるレオスイッチシステムを示す図である。システムは２つのプラスミドを含む。ｐＮＥＢＲ−Ｒ１が担持するＲＳＬ１受容体は、レオレセプタ１およびレオ活性剤から構成されるヘテロダイマーである。目的の遺伝子は、ｐＮＥＢＲ−Ｘ１におけるＲＳＬ１応答プロモータの３’末端に構成することができる。２つのプラスミドが細胞内に導入される場合、目的の遺伝子の発現は、細胞培養培地にＲＳＬ１を添加することによって速く誘導することができる。我々の研究において、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＧＬ１およびＮＧＮ−ＧＬ２の構築は、ｐＮＥＢＲ−Ｘ１でレオスイッチ応答エレメントの制御下で、双方向に行われ、ＲＳＬ１の添加は同時に同様の発現レベルのＳｕｐｔ４ｈ−ＧＬ１およびＮＧＮ−ＧＬ２の発現を誘発することができる。
【図６Ｃ】スプリットルシフェラーゼ相補性アッセイを使用してＳｕｐｔ４ｈ１とＳｕｐｔ５のＮＧＮドメインとの間の相互作用を検出するための実験方法を提供しており、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＧＬｕｃ１とＮＧＮ−ＧＬｕｃ２との相互作用のみから生じる細胞のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。２つの構築物である、ｐＮＥＢＲ−Ｘ１Ｓｕｐｔ４ｈ−ＧＬｕｃ１およびｐＮＥＢＲＸ１−ＮＧＮ−ＧＬｕｃ２は、ｐＮＥＢＲ−Ｒ１を有する細胞に別々に導入された場合、ＲＳＬ１があってもなくても、ルシフェラーゼ活性の最低レベルを示す。３つのプラスミドがＲＳＬ１の存在下で細胞内に同時導入された場合にのみ、高いルシフェラーゼ活性を検出することができる。
【図６Ｄ】スプリットルシフェラーゼ相補性アッセイを使用してＳｕｐｔ４ｈ１とＳｕｐｔ５のＮＧＮドメインとの間の相互作用を検出するための実験方法を提供しており、Ｓｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの間の相互作用に特化しかつ依存しているルシフェラーゼ活性を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＮＥＢＲ−Ｒ１に加えて指示されたプラスミドでトランスフェクトした。融合タンパク質が相互に結合すると、大幅に増加したルシフェラーゼ活性が検出された。非相互作用Ｇｌｕｃ成分は、相互作用の非存在下でルシフェラーゼ活性を産生することができなかった。Ｓｕｐｔ４ｈ／５ｈ複合体の形成を阻害する、（酵母Ｓｐｔ５上のＳ３２４Ｆに対応する、ヒトＳｕｐｔ５ｈ上のＳ２１４Ｆ）ＮＧＮ上の一点変異は、Ｓｕｐｔ４ｈ／ＮＧＮの相互作用によって媒介されるルシフェラーゼ活性を完全に消失させた。
【図７Ａ】Ｓｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの間の相互作用から生じるルシフェラーゼ信号に対する種々の候補ヌクレオシドの阻害作用を示す図である。安定した細胞株Ｍ２−８は、レオスイッチリガンド刺激によりＳｕｐｔ４ｈ−ＧＬ１およびＮＧＮ−ＧＬ２を同時に発現するように作られたＨＥＫ−２９３細胞クローンである。この細胞株を用いて、Ｓｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの間の相互作用を阻止することができる小分子化合物のハイスループットスクリーニングを実施した。いくつかの候補ヌクレオシドはＳｕｐｔ４ｈ／ＮＧＮの相互作用によって媒介されたＧｌｕｃ活性を低下させることが判明した。指示されたヌクレオシドの濃度を横軸に示した。すべての実験において、ＲＳＬ１濃度は１５０ｎＭであった。すべての実験は少なくとも２回繰り返された。
【図７Ｂ】Ｓｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの間の相互作用から生じるルシフェラーゼ信号に対する種々の候補ヌクレオシドの阻害作用を示す図である。安定した細胞株Ｍ２−８は、レオスイッチリガンド刺激によりＳｕｐｔ４ｈ−ＧＬ１およびＮＧＮ−ＧＬ２を同時に発現するように作られたＨＥＫ−２９３細胞クローンである。この細胞株を用いて、Ｓｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの間の相互作用を阻止することができる小分子化合物のハイスループットスクリーニングを実施した。いくつかの候補ヌクレオシドはＳｕｐｔ４ｈ／ＮＧＮの相互作用によって媒介されたＧｌｕｃ活性を低下させることが判明した。指示されたヌクレオシドの濃度を横軸に示した。すべての実験において、ＲＳＬ１濃度は１５０ｎＭであった。すべての実験は少なくとも２回繰り返された。
【図７Ｃ】Ｓｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの間の相互作用から生じるルシフェラーゼ信号に対する種々の候補ヌクレオシドの阻害作用を示す図である。安定した細胞株Ｍ２−８は、レオスイッチリガンド刺激によりＳｕｐｔ４ｈ−ＧＬ１およびＮＧＮ−ＧＬ２を同時に発現するように作られたＨＥＫ−２９３細胞クローンである。この細胞株を用いて、Ｓｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの間の相互作用を阻止することができる小分子化合物のハイスループットスクリーニングを実施した。いくつかの候補ヌクレオシドはＳｕｐｔ４ｈ／ＮＧＮの相互作用によって媒介されたＧｌｕｃ活性を低下させることが判明した。指示されたヌクレオシドの濃度を横軸に示した。すべての実験において、ＲＳＬ１濃度は１５０ｎＭであった。すべての実験は少なくとも２回繰り返された。
【図７Ｄ】Ｓｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの間の相互作用から生じるルシフェラーゼ信号に対する種々の候補ヌクレオシドの阻害作用を示す図である。安定した細胞株Ｍ２−８は、レオスイッチリガンド刺激によりＳｕｐｔ４ｈ−ＧＬ１およびＮＧＮ−ＧＬ２を同時に発現するように作られたＨＥＫ−２９３細胞クローンである。この細胞株を用いて、Ｓｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの間の相互作用を阻止することができる小分子化合物のハイスループットスクリーニングを実施した。いくつかの候補ヌクレオシドはＳｕｐｔ４ｈ／ＮＧＮの相互作用によって媒介されたＧｌｕｃ活性を低下させることが判明した。指示されたヌクレオシドの濃度を横軸に示した。すべての実験において、ＲＳＬ１濃度は１５０ｎＭであった。すべての実験は少なくとも２回繰り返された。
【図８Ａ】ポリＱタグ付きＧＦＰは、変異／長ポリＱを有するタンパク質のダウンレギュレートにおけるヌクレオシドの特定の効果を調べるためのシステムを提供しており、ポリＱタグ付きＧＦＰおよびプラスミドマップを示す図である。主に、２２または４４のいずれかのポリＱを、ｐＥＧＦＰ１プラスミド中のＧＦＰとインフレーム融合させた。
【図８Ｂ】ポリＱタグ付きＧＦＰは、変異／長ポリＱを有するタンパク質のダウンレギュレートにおけるヌクレオシドの特定の効果を調べるためのシステムを提供しており、ｐＥＧＦＰＣ１−Ｑ４４でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を示す図である。左側パネルの、トランスフェクションの２４時間後では、ＧＦＰ信号は明らかに蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。右側のパネルでは、トランスフェクションの４８時間後の細胞内に凝集したＧＦＰ（矢印）が見られる。
【図９Ａ】長いポリグルタミン（ｐＥＧＦＰＣ１−Ｑ４４）でタグ付けされた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現の優先的な低減におけるＨＤ１０１の効果を示しており、ＨＤ１０１処理の異なる用量の下で異なるポリＱ構築物でトランスフェクトされた細胞の画像を示す図である。
【図９Ｂ】長いポリグルタミン（ｐＥＧＦＰＣ１−Ｑ４４）でタグ付けされた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現の優先的な低減におけるＨＤ１０１の効果を示しており、定量化後にＤＡＰＩの強度で正常化されたＧＦＰの強度を示す棒グラフである。各構築物群において薬物処理を行っていない細胞からの正常化強度を１倍とし、薬物処理を行った試料の強度を薬物処理無しの値と比較して、倍数変化として示した。各棒は、４枚の個々の画像からの平均データを含んでいた。
【図１０】ＨＤ１０１およびＨＤ１０６は、ハンチントン病患者由来のｉＰＳＣにおいて用量依存的に変異ハンチンチンの発現を低減した。ｉＰＳＣを、２４ウェルプレートに播種し、指示された濃度でＨＤ１０１とＨＤ１０６で処理した。２４時間後、細胞を溶解し、タンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をウエスタンブロットのために４％〜１２％のビス−トリスタンパク質ゲルにロードした。内因性の変異ＨＴＴ、総ＨＴＴおよびチューブリンを検出するために、抗ポリグルタミン抗体、抗ＨＴＴ抗体および抗チューブリン抗体を使用した。Ｌｉ−Ｃｏｒ社のオデッセイ・イメージング・システムを用いて、膜組織をスキャンし、バンドを定量した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
より詳細に例示的な実施形態を説明する前に、説明で使用する用語の意味および範囲を説明し明らかにするために、以下に定義を述べる。未定義の用語は、それらの当該技術分野で認められた意味を有する。
【００１３】
開示された化合物を合成するために有用な一般的に公知の化学的合成の方式および条件を提供する、多くの一般的な参考文献が利用可能である（たとえば、スミスおよびマーチ、マーチの高度有機化学：反応、メカニズム、および構造、第５版、ワイリー・インターサイエンス、２００１、またはフォーゲル、定性的有機分析を含む実践的な有機化学の教本、第４版、ニューヨーク：ロングマン、１９７８を参照）。
【００１４】
本明細書に記載の化合物が１つ以上のキラル中心および／または二重結合異性体（すなわち、幾何異性体）、鏡像異性体またはジアステレオマーを含む場合、立体異性体的に純粋な形態（たとえば、幾何学的に純粋、鏡像異性的に純粋またはジアステレオマー的に純粋）および鏡像異性体および立体異性体の混合物を含む化合物のすべての可能な鏡像異性体および立体異性体が、本明細書の化合物の説明に含まれている。鏡像異性体および立体異性体の混合物は、当業者に周知の分離技術またはキラル合成技術を用いてそれらの成分鏡像異性体または立体異性体に分解することができる。化合物はまた、エノール形、ケト形およびそれらの混合物を含むいくつかの互変異性型で存在することができる。したがって、本明細書に示される化学構造は、例示した化合物の全ての可能な互変異性体を包含する。また、記載された化合物は、１つ以上の原子が自然界で通常見られる原子質量とは異なる原子質量を有する同位体標識化合物も含む。本明細書に開示された化合物に組み込むことができる同位体の例としては、これらに限定されないが、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ等が含まれる。化合物は、非溶媒和形態ならびに水和形態を含む溶媒和形態で存在することができる。一般的に、化合物は水和または溶媒和させることができる。ある種の化合物は、複数の結晶形態または非晶質形態で存在することができる。一般的に、すべての物理的形態は、本明細書で企図される使用について均等であり、本開示の範囲内であることが意図される。
【００１５】
「アルキル」は、１〜６個、または１〜５個、または１〜４個、または１〜３個の炭素原子など、１〜１０個の炭素原子を有する一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。この用語の例としては、メチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、ｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、およびネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２−）などの直鎖および分岐ヒドロカルビル基が含まれる。
【００１６】
「置換アルキル」という用語は、本明細書で定義されるアルキル基を意味し、アルキル鎖中の１つ以上の炭素原子は、−Ｏ−、−Ｎ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−（ｎは０〜２である）、−ＮＲ−（Ｒは水素またはアルキルである）などのヘテロ原子で任意に置換され、かつ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、および−ＮＲａＲｂからなる群から選択される１〜５の置換基を有し、Ｒ’およびＲ’’は、同一であっても異なっていてもよく、水素、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールおよび複素環から選択される。
【００１７】
「アルケニル」は単独または別の置換基の一部として、アルケンの単一炭素原子からの１つの水素原子の除去によって誘導される、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和の分岐、直鎖状または環状のアルキルラジカルを意味する。基は、二重結合（単数または複数）周りのシスまたはトランス立体配座である可能性がある。いくつかの場合、アルケニル基には、これらに限定されないが、エテニル；プロパ−１−エン−１−イル、プロパ−１−エン−２−イル、プロパ−２−エン−１−イル（アリール）、プロパ−２−エン−２−イル、シクロプロパ−１−エン−１−イル、シクロプロパ−２−エン−１−イルなどのプロペニル；ブチ−１−エン−１−イル、ブチ−１−エン−２−イル、２−メチル−プロパ−１−エン−１−イル、ブチ−２−エン−１−イル、ブチ−２−エン−１−イル、ブチ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブト−１−エン−１−イル、シクロブト−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イルなどのブテニルなどが含まれる。
【００１８】
「アルキニル」は単独または別の置換基の一部として、アルキンの単一炭素原子からの１つの水素原子の除去によって誘導される、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和の分岐、直鎖状または環状のアルキルラジカルを意味する。いくつかの場合、アルキニル基には、これらに限定されないが、エチニル；プロパ−１−イン−１−イル、プロパ−２−イン−１−イルなどのプロピニル；ブチ−１−イン−１−イル、ブチ−１−イン−３−イル、ブチ−３−イン−１−イルなどのブチニルなどが含まれる。
【００１９】
「アシル」は、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−、アルキル基−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキル基−Ｃ（Ｏ）−、アルケニル基−Ｃ（Ｏ）−、置換アルケニル基−Ｃ（Ｏ）−、アルキニル基−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキニル基−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル基−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルキル基−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルケニル基−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルケニル基−Ｃ（Ｏ）−、アリール基−Ｃ（Ｏ）−、置換アリール基Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール基−Ｃ（Ｏ）−、置換ヘテロアリール基−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロシクリル基−Ｃ（Ｏ）−、および置換ヘテロシクリル基−Ｃ（Ｏ）−を意味し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環は本明細書で定義される通りである。たとえば、アシルは、「アセチル」基ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−を含む。
【００２０】
「アルコキシ」は−Ｏ−アルキル基を意味し、アルキルは本明細書で定義される通りである。アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシなどが含まれる。「アルコキシ」という用語はまた、アルケニル基−Ｏ−、シクロアルキル基−Ｏ−、シクロアルケニル基−Ｏ−、およびアルキニル基−Ｏ−も意味し、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびアルキニルは本明細書で定義される通りである。「置換アルコキシ」という用語は、置換アルキル基−Ｏ−、置換アルケニル基−Ｏ−、置換シクロアルキル基−Ｏ−、置換シクロアルケニル基−Ｏ−、および置換アルキニル基−Ｏ−を意味し、置換アルキル、置換アルケニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニルおよび置換アルキニルは本明細書に定義される通りである。
【００２１】
「アリール」または「Ａｒ」は、（フェニル基中に存在するような）単環、または複数の縮合環を有する環系（そのような芳香族環系の例にはナフチル、アントリルおよびインダニルが含まれる）を有する６〜１８の炭素原子の一価の芳香族炭素環基を意味し、縮合環は、連結箇所が芳香環の原子を介していることを条件として、芳香族であってもなくてもよい。この用語は、たとえば、フェニルおよびナフチルを含む。アリール置換基についての定義によって別段の制約が無い限り、このようなアリール基は任意に、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリールおよびトリハロメチルから選択した、１〜５の置換基、または１〜３の置換基で置換することができる。
【００２２】
「複素環」、「複素環式」、「ヘテロシクロアルキル」および「ヘテロシクリル」は、架橋縮合およびスピロ環系を含む単環または複数の縮合環を有し、かつ１〜１０のヘテロ原子を含む３〜２０の環原子を有する、飽和基または不飽和基を意味する。これらの環原子は窒素、硫黄、または酸素からなる群から選択され、縮合環系において、連結箇所が非芳香環を介していることを条件として、１つ以上の環はシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであることができる。特定の実施形態において、複素環基の窒素および／または硫黄原子（単数または複数）は任意に、Ｎ−オキシド、−Ｓ（Ｏ）−または−ＳＯ２−部分を提供するために酸化される。
【００２３】
複素環およびヘテロアリールの例としては、これらに限定されないが、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル（チアモルホリニルとも呼ばれる）、１，１−ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジン、テトラヒドロフラニルなどが含まれる。
【００２４】
「ヘテロアリール」は、１〜１０の炭素原子および環内の酸素、窒素、および硫黄からなる群から選択される１〜１０のヘテロ原子からなどの、１〜１５の炭素原子からの芳香族基を意味する。そのようなヘテロアリール基は、（たとえば、インドリジニル、キノリニル、ベンゾフラン、ベンズイミダゾリルまたはベンゾチエニルなどの基内のように）環系内の（ピリジニル、イミダゾリルまたはフリルなどの）単環または複数の縮合環を有することができ、環系内の少なくとも１つの環は芳香族であり、連結箇所が芳香環の原子を介していることを条件として、環系内の少なくとも１つの環は芳香族である。特定の実施形態において、ヘテロアリール基の窒素および／または硫黄環原子（単数または複数）は任意に、Ｎ−オキシド（Ｎ→Ｏ）、スルフィニル、またはスルホニル部分に備えて酸化される。この用語は、たとえば、ピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、およびフラニルを含む。ヘテロアリール置換基についての定義によって別段の制約が無い限り、そのようなヘテロアリール基は任意に、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリールおよびＳＯ２−ヘテロアリール、およびトリハロメチルから選択される、１〜５の置換基または１〜３の置換基で置換することができる。
【００２５】
用語「置換複素環」、「置換複素環式」、「置換複素環基」および「置換ヘテロシクロ」は、好ましくは、アルキル、置換アルキル、アルケニル、オキソ、アリール、置換アリール、ヘテロシクロ、置換ヘテロシクロ、カルボシクロ（任意で置換されている）、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ（任意に置換されている）、アリールオキシ（任意に置換されている）、アルカノイル（任意に置換されている）、アロイル（任意に置換されている）、アルキルエステル（任意に置換されている）、アリールエステル（任意に置換されている）、シアノ、ニトロ、アミド、アミノ、置換アミノ、ラクタム、尿素、ウレタン、スルホニル等から選択された１つ以上の基で置換された複素環、複素環式、およびヘテロシクロ基を意味し、任意に１つ以上のペアの置換基はそれらが結合している原子と共に３〜７のメンバーリングを形成する。
【００２６】
本明細書に個々の用語に関連して開示された基に加えて、指定された基またはラジカル内の飽和炭素原子上の１つ以上の水素（単一の炭素上の任意の２つの水素が＝Ｏ、＝ＮＲ７０、＝Ｎ−ＯＲ７０、＝Ｎ２または＝Ｓで置換することができる）を置換する置換基は、別段の指定が無い限り、−Ｒ６０、ハロ、＝Ｏ、−ＯＲ７０、−ＳＲ７０、−ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｒ７０、−ＳＯ２Ｏ−Ｍ＋、−ＳＯ２ＯＲ７０、−ＯＳＯ２Ｒ７０、−ＯＳＯ２Ｏ−Ｍ＋、−ＯＳＯ２ＯＲ７０、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２（Ｍ＋）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ−Ｍ＋、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｍ＋、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−Ｍ＋、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ７０、−ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−ＮＲ７０ＣＯ２−Ｍ＋、−ＮＲ７０ＣＯ２Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０および−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、Ｒ６０は任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、各Ｒ７０は独立して水素またはＲ６０であり、各Ｒ８０は独立してＲ７０である、あるいは、２つのＲ８０はそれらが結合している窒素原子と共に、任意にＯ、−ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル置換基を有する可能性があるＮ、およびＳからなる群から選択される１〜４の同一かまたは異なるさらなるヘテロ原子を含む可能性がある５員、６員または７員のヘテロシクロアルキルを形成し、各Ｍ＋は、正味単一正電荷を有する対イオンである。各Ｍ＋は独立して、たとえば、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋などのアルカリイオン、＋Ｎ（Ｒ6０）４などのアンモニウムイオン、または［Ｃａ２＋］０．５、［Ｍｇ２＋］０．５、または［Ｂａ２＋］０．５などのアルカリ土類イオンである可能性がある（「下付きの０．５は、そのような二価のアルカリ土類イオンに対する対イオンの内の１つは本発明の化合物のイオン化形態とすることができ、塩化化合物、または本明細書で開示する２つのイオン化化合物などの他の典型的な対イオンはそのような二価のアルカリ土類イオンに対する対イオンとして機能することができ、あるいは本発明の二重イオン化化合物はそのような二価のアルカリ土類イオンに対する対イオンとして機能することができることを意味する）。具体例としては、−ＮＲ８０Ｒ８０は、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、Ｎ−ピロリジニル、Ｎ−ピペラジニル、４Ｎ−メチル−ピペラジン−１−イルおよびＮ−モルホリニルを含むことが意図されている。
【００２７】
本明細書の開示に加えて、「置換された」アルケン、アルキン、アリールおよびヘテロアリール基の不飽和炭素原子上の水素の置換基は、別段の指定が無い限り、−Ｒ６０、ハロ、−Ｏ−Ｍ＋、−ＯＲ７０、−ＳＲ７０、−Ｓ−Ｍ＋、−ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｒ７０、−ＳＯ３−Ｍ＋、−ＳＯ３Ｒ７０、−ＯＳＯ２Ｒ７０、−ＯＳＯ３−Ｍ＋、−ＯＳＯ３Ｒ７０、−ＰＯ３−２（Ｍ＋）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ−Ｍ＋、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、−ＣＯ２−Ｍ＋、−ＣＯ２Ｒ７０、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、−ＯＣＯ２−Ｍ＋、−ＯＣＯ２Ｒ７０、−ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−ＮＲ７０ＣＯ２−Ｍ＋、−ＮＲ７０ＣＯ２Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０および−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、Ｒ６０、Ｒ７０、Ｒ８０およびＭ＋は、置換アルケンまたはアルキンの場合に、置換基が−Ｏ−Ｍ＋、−ＯＲ７０、−ＳＲ７０、または−Ｓ−Ｍ＋ではないことを条件として、先に定義した通りである。
【００２８】
本明細書中の個々の用語に対して開示された基に加えて、「置換された」ヘテロアルキルおよびシクロヘテロアルキル基内の窒素原子上の水素の置換基は、別段の指定が無い限り、−Ｒ６０、−Ｏ−Ｍ＋、−ＯＲ７０、−ＳＲ７０、−Ｓ−Ｍ＋、−ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７０、−Ｓ（０）２Ｏ−Ｍ＋、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ７０、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ７０、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−Ｍ＋、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ７０、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２（Ｍ＋）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ−Ｍ＋、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）（ＯＲ７０）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ７０、−ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０および−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、Ｒ６０、Ｒ７０、Ｒ８０およびＭ＋は、先に定義した通りである。
【００２９】
本明細書の開示に加えて、特定の実施形態では、置換された基は、１つ、２つ、３つ、または４つの置換基、１つ、２つ、または３つの置換基、１つまたは２つの置換基、または１つの置換基を有している。
【００３０】
用語「薬学的に許容される塩」とは、哺乳動物などの患者への投与に対して許容される塩（所与の投与計画に対する許容される哺乳動物の安全性を有する対イオンを有する塩）を意味する。そのような塩は、薬学的に許容される無機塩基または有機塩基および薬学的に許容される無機酸または有機酸から誘導することができる。「薬学的に許容される塩」は、化合物の薬学的に許容される塩を意味し、この塩は当技術分野で周知の様々な有機および無機対イオンから誘導され、例示のみの目的で、たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどを含み、分子が塩基性官能基性を含む場合、塩酸塩、臭化水素酸塩、ギ酸、酒石酸塩、ベシル酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などの有機塩または無機酸の塩を意味する。
【００３１】
「薬学的に有効な量」および「治療的に有効な量」は、所望の治療効果（たとえば、指定された障害または疾患またはその症状の１つ以上の治療および／または疾患もしくは障害の発生の予防）を誘発するために十分な化合物の量を意味する。ポリグルタミン病に関連して、薬学的または治療的に有効な量は、とりわけ、被験体の脳内のタンパク質性沈着物の減少を防止または引き起こすために十分な量を含む。
【００３２】
また、方法の実施形態に使用するための活性剤として目的とするのはプロドラッグである。そのようなプロドラッグは生体内で必要な化合物に容易に変換可能な化合物の一般的な機能性誘導体である。したがって、本開示の方法では、用語「投与」は、明確に開示された化合物を投与すること、または明確に開示されない可能性があるが、必要に応じて被験体に投与された後に生体内で特定の化合物に変換する化合物を投与することを含む。適切なプロドラッグ誘導体の選択および調製のための従来の手順は、たとえば、Ｗｅｒｍｕｔｈ編、医薬品化学の実践、第２版、頁５６１〜５８６（アカデミックプレス２００３年）のＷｅｒｍｕｔｈ「プロドラッグおよび生物学的前駆体の設計」に記載されている。プロドラッグは、本開示の方法および組成物に適した本明細書に記載の化合物を生成するために生体内で（たとえば、人間の体内で）加水分解するエステルを含む。適切なエステル基には、限定するものではないが、各アルキルまたはアルケニル部分が６つ以下の炭素原子を有する、薬学的に許容される、脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸から誘導されるものが含まれる。エステルの例としては、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、アクリル酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、およびエチルスクシナートが含まれる。
【００３３】
本明細書で使用される「試料」という用語は、目的の１つ以上の成分を含む、一般的には、必ずしもそうではないが、液体状、すなわち、水性状である、物質または物質の混合物に関する。試料は、食料品、環境物質、生物学的試料または、これらに限定されないが、たとえば、血漿、血清、脊髄液、精液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器、腸管、および尿生殖路、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官、ならびに生体外の細胞培養成分の試料（これに限定されないが、細胞培養培地中の細胞の増殖、推定ウイルス感染細胞、組換細胞、および細胞成分から得られた馴化培地を含む）を含む、個体から単離された組織などの固体または体液などの様々なソースに由来する可能性がある。方法の特定の実施形態において、試料は細胞を含む。この方法のいくつかの例では、細胞は生体外である。方法のいくつかの例において、細胞は生体内である。
【００３４】
用語の他の定義が明細書の全体にわたって記載される可能性がある。
【００３５】
上記に要約したように、本発明の態様は、細胞内の標的遺伝子を含む変異拡張ヌクレオチド反復（ＮＲ）の有害な活性を、細胞をヌクレオシド剤の有効量と接触させることによって低下させる方法、ならびにそのような方法で使用される組成物を含む。標的遺伝子を含む変異拡張ＮＲの有害な活性（たとえば、毒性および／またはそれによりコード化される産物の機能不全性）は、異なる様々な方法、たとえば、標的遺伝子によりコード化された毒性発現産物（たとえば、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生または活性を低下させる（およびいくつかの場合において選択を含む差次的に低下させる）ことにより、低下する可能性がある。本発明の方法を実施するためのキットおよび組成物も提供される。本発明の方法および組成物は、たとえば、ハンチントン病（ＨＤ）などの、変異拡張トリヌクレオチド反復などの変異拡張ヌクレオチド反復を含む遺伝子の存在に関連した疾患状態の予防または治療を含む、様々な異なる用途への利用が可能である。
【００３６】
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって当然、変更可能であることを理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を説明するためのみに使用されており、限定することを意図するものではないことも理解すべきである。
【００３７】
値の範囲が規定される場合は、文脈に明らかに別段の規定がない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間に介在するそれぞれの値および指定された範囲内の任意の他の指定されたまたは介在する値が本発明に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれる可能性があり、また、指定された範囲内の任意の明確に除外された限界を条件として、本発明に含まれる。指定された範囲が一方または両方の限界を含む場合は、それらの含まれた限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００３８】
特定の範囲は、本明細書において、「約」という用語によって先行される数値と共に提示される。「約」という用語は、本明細書において、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行する数に近いかまたは近似する数に対する文字上の支持を行うために使用される。数が明確に記載された数に近いかまたは近似するかどうかを判定する際に、近いかまたは近似する記載されていない数が、それが提示される文脈において、明確に記載された数の実質的な均等物を提供する数である可能性がある。
【００３９】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書に記載のものと類似または均等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験においても使用することができるが、代表的な例示的方法および材料を以下に記載する。
【００４０】
本明細書で引用したすべての公報および特許は、それぞれ個々の公報または特許が参照により組み込まれると明確かつ個別に表示されていたかのように本明細書に組み込まれ、公報が引用されたものに関連して方法および／または材料を開示し記載するために参照により本明細書に組み込まれる。任意の公報の引用は、出願日以前のその開示のためであり、本発明が先行発明によるそのような公報に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される公報の日付は、独立した確認を必要とする可能性がある実際の公開日と異なっている可能性がある。
【００４１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈に明らかに別段の規定がない限り、複数の対象を含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲は、すべての任意の要素を除外するように記載する可能性があることに留意されたい。このように、この陳述は、クレーム要素の記載に関連する「単独で」、「唯一の」などの排他的用語の使用、または「否定的」制限の使用に対する前提条件を提供することを意図している。
【００４２】
本開示を読めば当業者には明らかであろうように、本明細書に記載および例示した個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に離脱または組み合わせられる可能性がある個別的な構成要素および特徴を有する。すべての記載された方法は、記載されたイベントの順序で、または論理的に可能なあらゆる他の順序で行うことができる。
【００４３】
方法
本発明の態様は、拡張ヌクレオチド反復（ＮＲ）を含む標的遺伝子の細胞内の有害な影響を、細胞を有効量のヌクレオシド剤と接触させることによって低減することを含む。換言すれば、本発明の実施形態は、細胞内の拡張ヌクレオチド反復を含む標的遺伝子の有害なまたは害を与える活性を低下させる方法を含む。本明細書で使用するように、用語「有害な影響」は、標的遺伝子と関連付けられた、すなわち標的遺伝子に起因し、かつ細胞に望ましくない効果をもたらす可能性がある有害なまたは害を与える活性を意味する。「有害な影響を減少させる」とは、有害なまたは害を与える活性、またはそれらの望ましくない効果のレベルが、統計学的に有意な量だけ、いくつかの例では、たとえば、目的とするヌクレオシド剤と接触しない細胞などの対照と比較して、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、またはそれ以上などの、２倍以上減少されることを意味する。対象のヌクレオシド剤によって低減された標的遺伝子の有害な影響または活性は変化する可能性があり、これらに限定されないが、細胞毒性、細胞生存率の減少、細胞機能の喪失、タンパク質凝集体の形成などを含む可能性がある。主題の方法およびヌクレオシド剤は、その全体が本明細書中に参照して組み込まれる、Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．「遺伝子を含む拡張トリヌクレオチド反復の有害な活性の選択的縮小」ＷＯ２０１２０７８９０６に記載される方法を介して、細胞内の標的遺伝子の有害な影響または活性を低下させる可能性がある。
【００４４】
特定の実施形態において、その方法は、標的遺伝子の有害な影響を選択的に減少させることによって、標的遺伝子を含む拡張ＮＲの有害な影響を低減する可能性がある。これらの実施形態の方法は標的遺伝子の有害な影響、すなわち活性を選択的に減少させる方法であるため、それらは少なくとも統計的に測定可能な量の標的遺伝子の、それにより標的遺伝子が有害な活性を生じさせる変異拡張ヌクレオチド反復（たとえば、トリヌクレオチド反復）を含まない細胞である正常なまたは野生型の細胞内に存在する遺伝子の活性を意味する、正常のまたは野生型の、たとえば有益な、活性を保持しながらそのようにする。したがって、これらの実施形態では主題の方法は、標的遺伝子の有害な活性の選択的低減にもかかわらず、標的遺伝子の生理的に望ましい活性を維持または復元する可能性がある。その方法のいくつかの事例では、ヌクレオシド剤は、標的遺伝子によりコード化されるタンパク質の活性を調節する。方法のいくつかの実施形態では、標的遺伝子からのタンパク質の発現を標的遺伝子の正常な対立遺伝子からの発現（たとえば、標的遺伝子の正常な対立遺伝子は８〜２５のＣＡＧ反復を含む）に関して選択的に調節する。特定の場合において、標的遺伝子の正常な対立遺伝子の活性は細胞内で維持され、たとえば、目的のヌクレオシド剤と接触していない対照細胞の対応する活動の２０％以内（１０％以内、５％以内、２％以内または１％以内など）である活性を有する。
【００４５】
さらに他の実施形態では、その方法は、有害な影響も標的遺伝子のあらゆる正常な活性も減少させることによって、標的遺伝子を含む拡張ＮＲの細胞内の有害な影響を低減する可能性がある。これらの実施形態の方法は、非選択的に標的遺伝子の有害な影響、すなわち、活性を低下させる方法であるため、それにより標的遺伝子が有害な活性を生じさせる変異拡張ヌクレオチド反復（たとえば、ＴＮＲ）を含まない細胞である正常なまたは野生型の細胞内に存在する遺伝子の活性を意味する、標的遺伝子の正常なまたは野生型の、たとえば有益な活性を、完全ではない場合、ある程度まで低減しながら、標的遺伝子の有害な影響を減少させる。
【００４６】
いくつかの場合では、有害なまたは害を与える活性は標的遺伝子によりコード化されるタンパク質産物の機能障害であり、機能障害とは、標的遺伝子の正常な対立遺伝子内には存在しないタンパク質産物の望ましくない活性（たとえば、細胞毒性）を意味する。いくつかの事例では、有害な活性を生じさせる変異拡張ヌクレオチド反復を含まない標的遺伝子は、標的遺伝子の正常な対立遺伝子と称される。標的遺伝子の正常な対立遺伝子は、望ましい数のヌクレオチド反復（ＮＲ）を含む可能性がある。ＮＲがＴＮＲである特定の事例において、正常な対立遺伝子は、２５以下のトリヌクレオチド反復（ＴＮＲ）、２０以下または１０以下のＴＮＲなどを含む。特定の場合において、標的遺伝子の正常な対立遺伝子は８〜２５のＴＮＲを含む。いくつかの事例では、正常な対立遺伝子は８〜２５のＣＡＧ反復を含む。
【００４７】
方法の特定の実施形態では、標的遺伝子の有害な影響はタンパク質の毒性であり、ヌクレオシド剤は、細胞内のタンパク質の毒性を減少させる。いくつかの事例では、毒性は望ましくないタンパク質凝集の結果である。したがって、いくつかの事例において、本発明の方法は、標的遺伝子に起因する毒性の減少をもたらし、毒性の減少の大きさは変化する可能性があり、いくつかの事例では、たとえば、目的とするヌクレオシド剤と接触しない細胞などの適切な対照と比較して、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、またはそれ以上などの、２倍以上となる。以下でより詳細に説明するように、毒性は、特定の標的遺伝子に依存する可能性がある多くの異なる方法で低減される可能性がある。いくつかの事例では、たとえば、標的遺伝子が標的遺伝子によりコード化される産物の拡張ポリＱドメインの存在をもたらす拡張ＣＡＧ反復を含む場合、毒性の低減は標的遺伝子によりコード化される産物の凝集の減少を伴う可能性がある。その方法のいくつかの実施形態において、タンパク質は細胞内で凝集体を形成し、３０以上、３５以上、４０以上、５０以上、または６０以上のグルタミン残基などの、２６以上のグルタミン残基を有するポリグルタミン伸長を含む。
【００４８】
このような事例では、凝集の減少の大きさは変化する可能性があり、いくつかの事例では、減少の大きさは、たとえば、目的とするヌクレオシド剤と接触しない細胞などの適切な対照と比較して、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、またはそれ以上などの、２倍以上となる。タンパク質の凝集は、これに限定されないが、そのプロトコルの開示が参照により本明細書に組み込まれる、公開米国特許出願第２０１１０１３０３０５号に記載されたプロトコルを含む、あらゆる好都合なプロトコルを用いて分析される可能性がある。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明の方法によって低減される有害な影響または活性は、標的遺伝子によりコード化される産物の機能の喪失である可能性がある。これらの特定の実施形態では、標的遺伝子によりコード化される産物の野生型または正常な活性は、標的遺伝子が拡張トリヌクレオチド反復を含むため、全部ではないとしても、少なくとも部分的に損なわれる。これらの事例では、機能の喪失は、標的遺伝子の産物の所望の機能を増強することによって、全部ではないとしても、少なくとも部分的に逆転される。コード化される産物の所望の機能は、たとえば、目的とするヌクレオシド剤と接触しない細胞などの適切な対照と比較して、統計学的に有意な量によって増強される可能性があり、所望の活性の増強の大きさは、１０倍以上を含む、５倍以上などの２倍以上である可能性がある。
【００５０】
特定の実施形態において、ヌクレオシド剤は、適切な対照と比較し、たとえば、細胞を細胞に対する本発明の化合物と接触させることによる判定、およびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率測定などの同種の方法を用いた培養中の生存細胞の数の判定などの、細胞生存率測定によって判定されるように、細胞の生存率を増加させる。
【００５１】
標的遺伝子は、ＴＮＲなどの変異拡張ＮＲを含む遺伝子であり、変異拡張ヌクレオチド反復ドメインは、遺伝子の正常なものには存在しない。本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、産物のコード化またはその生成を可能にし、プロモーター、イントロン、エクソンおよびエンハンサーを含む、染色体の規定された領域または部分である。変異拡張ヌクレオチド反復（ＮＲ）は２つ以上のヌクレオチドの単位の複数の隣接する反復を含む遺伝子のドメイン（すなわち、領域）を意味し、ヌクレオチドの所与の繰り返し単位は、いくつかの事例において、３つ〜６つのヌクレオチドなどの２つ〜１０個のヌクレオチドの範囲で、長さが変わる可能性があり、反復単位の長さの例には、２つのヌクレオチド（たとえば、変異拡張ヌクレオチド反復はジヌクレオチド反復である）、３つのヌクレオチド（たとえば、変異拡張ヌクレオチド反復はトリヌクレオチド反復である）、４つのヌクレオチド（たとえば、変異拡張ヌクレオチド反復はテトラヌクレオチド反復である）、５つのヌクレオチド（たとえば、変異拡張ヌクレオチド反復はペンタヌクレオチド反復である）または６つのヌクレオチド（たとえば、変異拡張ヌクレオチド反復はヘキサヌクレオチド反復である）の単位を含む。所与のドメイン内で、ドメインはドメインを構成する繰り返し単位の性質に関して同質または異質である可能性がある。たとえば、所与のドメインは繰り返し単位の単一種類で構成されている可能性があり、すなわちドメインのすべての繰り返し単位はヌクレオチドの同じ（すなわち、同一の）配列を共有し、それによりドメインは同質の変異ＮＲドメインとなる。あるいは、所与のドメインは、２つ以上の異なるタイプの繰り返し単位、すなわち、異なる配列を有する繰り返し単位で構成されている可能性があり、それによりドメインは異質の変異ＮＲドメインとなる。変異拡張ヌクレオチド反復ドメインは、標的遺伝子のコードまたは非コード領域に存在する可能性がある。いくつかの事例では、拡張ヌクレオチド反復ドメインは標的遺伝子のコード領域内に存在する。いくつかの事例では、拡張ヌクレオチド反復ドメインは標的遺伝子の非コード領域に存在する。変異拡張ヌクレオチド反復の長さおよび特定の配列は変化する可能性がある。
【００５２】
いくつかの事例では、変異拡張ヌクレオチド反復は変異拡張トリヌクレオチド反復である。変異拡張トリヌクレオチド反復は同じ３つのヌクレオチドの複数の隣接する反復を含む遺伝子のドメイン（すなわち、領域）を意味し、変異拡張トリヌクレオチド反復の長さおよび特定の配列は変化する可能性があり、変異拡張トリヌクレオチド反復ドメインは、遺伝子の正常なものには存在しない。拡張トリヌクレオチド反復ドメインは、標的遺伝子のコードまたは非コード領域に存在する可能性がある。いくつかの事例では、拡張トリヌクレオチド反復ドメインは標的遺伝子のコード領域内に存在する。いくつかの事例では、拡張トリヌクレオチド反復ドメインは標的遺伝子の非コード領域に存在する。実施形態では、変異反復ドメインは、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）につながる筋強直性ジストロフィータンパク質キナーゼ遺伝子の３’非翻訳領域に位置するＣＴＧ拡張などの、標的遺伝子の非コード領域に存在する。いくつかの事例において、変異反復ドメインは標的遺伝子のコード領域内に存在し、それにより、いくつかの事例では、標的遺伝子内のその存在が遺伝子によってコード化される産物内に対応するドメインまたは領域（たとえば、ポリＱドメイン）をもたらす。その方法のいくつかの事例では、変異拡張ＴＮＲドメインはＣＴＧ反復ドメインである。特定の場合、変異拡張トリヌクレオチド反復ドメインは、２６回以上（たとえば、３０回以上、３５回以上など）のＣＴＧ反復を含む。
【００５３】
変異拡張トリヌクレオチド反復は、ヌクレオチド組成および長さに関して変化する可能性がある。目的とする特定のトリヌクレオチドには、これらに限定されないが、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＧＧ、ＧＣＣ、ＧＡＡ、などが含まれる。いくつかの事例では、変異拡張トリヌクレオチド反復ドメインはＣＡＧ反復ドメインである。反復ドメイン（たとえば、ＣＡＧ反復ドメイン）の特定の長さは、有害な活性をもたらす限り、特定の標的遺伝子に対して変化する可能性があり、いくつかの事例では、３５回以上、４０回以上、５０回以上またはさらに６０回以上の反復を含む、２６回以上、３０回以上の反復などの、２５回以上の反復である。特定の標的遺伝子および目的の発現されたタンパク質、それらに関連する疾患および目的の拡張ＣＡＧ反復の反復配列の特定の長さを含め（これらに限定されないが）、以下の表１に示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
上記の病原反復長は近似値であり、病原反復長の最も一般的な範囲を表示している。各病原反復長に対して示す２つの数値の小さいほうの数値は、拡大する病原性の影響が発生し始める長さを示している。ＮＲ疾患の原因となる常染色体遺伝子の両方の細胞のコピーがＮＲドメインを含んでいる可能性があるが、一般的に標的遺伝子の一方のコピーは拡大したＮＲセグメントを有するように変異し、他方のコピー（すなわち、対立遺伝子）は拡大していないＮＲを含む。
【００５６】
上記に要約したように、標的遺伝子を含む変異拡張ＮＲの有害な活性（たとえば、毒性および／またはそれによりコード化される産物の機能不全）は、たとえば、以下でより詳細に説明するように、標的遺伝子によりコード化される毒性の発現産物（たとえば、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生または活性を低下させる（およびいくつかの例では、選択的に低下させる）などの、様々な異なる方法でヌクレオシド剤により低減される可能性がある。
【００５７】
その方法のいくつかの実施形態において、ヌクレオシド剤は、標的遺伝子によりコード化されるタンパク質の活性を調整する。たとえば、ポリＱ反復に関して、特定の実施形態において、標的遺伝子はＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、ＤＲＰＬＡ、ケネディ病およびハンチントン病の疾患を生じる遺伝子から選択される。特定の事例では、対象疾患はＳＣＡ１である。特定の事例において、対象疾患はＳＣＡ２である。場合によっては、対象疾患はＳＣＡ３である。特定の事例において、対象疾患はＳＣＡ７である。特定の事例において、対象疾患はＳＣＡ１７である。特定の事例において、対象疾患はＤＲＰＬＡである。特定の事例において、対象疾患はケネディ病である。特定の事例において、対象疾患はハンチントン病である。遺伝子およびこれらの疾患を引き起こすそれらのコード化されるタンパク質が上記の表１に列挙されている。標的遺伝子によりコード化されるあらゆるタンパク質は調整され、翻訳後変更されたタンパク質を含む可能性がある。調整されたタンパク質は、遺伝子のあらゆる発現産物、またはその転写後に変更されたバージョンである可能性がある。いくつかの場合、タンパク質はＨｔｔタンパク質である。特定の場合では、タンパク質は変異Ｈｔｔタンパク質である。目的のハンチンチン（Ｈｔｔ）タンパク質のあらゆる翻訳後変更は調整される可能性がある。目的のタンパク質の翻訳後変更は、タンパク質の安定性、局在化、機能、および他の分子との相互作用を調節する可能性がある。翻訳後変更は、ＳＵＭＯ化、リン酸化、パルミトイル化、アセチル化などを含むアミノ酸残基に化学修飾として生じる可能性がある。翻訳後変更は、酵素的開裂を含んでいる可能性がある。翻訳後変更は、Ｈｔｔの代謝、タンパク質−タンパク質相互作用および細胞毒性のような様々な細胞プロセスの調節および制御に関与している可能性がある。
【００５８】
いくつかの事例では、薬剤は、発現後のタンパク質の、たとえば、結着性、活性などの機能を調整し、それにより薬剤は、標的遺伝子からのタンパク質の発現後の標的遺伝子によってコード化されるタンパク質の機能を変更するものとなる。いくつかの場合において、薬剤は、コード化されるタンパク質の、たとえば、凝集などの有害な機能を選択的に減少させるが、コード化されるタンパク質の有益な活性を、少なくとも検出可能なレベルに、保持または増強するものである可能性がある。特定の実施形態では、このような薬剤は、タンパク質の凝集の阻害剤ではないが、代わりに、たとえば、凝集のために利用可能である細胞内のタンパク質の量を減少させること、その凝集傾向とは無関係に細胞に有害なタンパク質の産生を減少させること、などにより別のメカニズムを介してタンパク質の有害な活性または機能を選択的に低下させる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ヌクレオシド剤は遺伝子からのＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を調整し、それにより何らかの方法で標的遺伝子からのＲＮＡまたはタンパク質の発現を変更する。その方法の特定の実施形態において、ヌクレオシド剤は、標的遺伝子からのタンパク質の発現を調整する。その方法の特定の場合において、ヌクレオシド剤は、標的遺伝子によりコード化されるタンパク質の細胞内の毒性を低減するために、標的遺伝子の転写を差次的に、かついくつかの事例では選択的に、減少させる。たとえば、目的のヌクレオシド剤と接触していない細胞などの対照に対して本発明のヌクレオシド剤を用いて細胞内の転写の減少を判定するために、あらゆる好都合な分析を使用する可能性があり、転写の減少の大きさは、２０％以上、３０％以上、５０％以上、１００％以上などの１０％以上、あるいは２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、またはそれ以上である可能性がある。その方法のいくつかの事例では、ヌクレオシド剤は、細胞内のタンパク質の機能を増強するために、標的遺伝子の転写を差次的に、かついくつかの事例では選択的に、減少させる。機能を増強することは、標的遺伝子によりコード化されるタンパク質の天然の、望ましい機能または活性を、たとえば、目的のヌクレオシド剤と接触していない細胞などの対照に対して、２０％以上、３０％以上、５０％以上、１００％以上などの１０％以上、あるいは２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、またはそれ以上、増加させることを意味する。目的のタンパク質の機能または活性のレベルを判定するために、あらゆる好都合な分析を利用する可能性がある。標的遺伝子の転写を差次的に減少させることは、標的遺伝子の転写が、たとえば、対応する野生型遺伝子などの、非標的のあらゆる減少よりも大きい程度に低減されることを意味する。薬剤の投与によってもたらされる転写のあらゆる差異の大きさは変化する可能性があり、いくつかの事例では、対応する非標的遺伝子の転写に対する標的遺伝子の転写の減少の大きさは、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、またはそれ以上である。いくつかの事例では、標的遺伝子の転写を低減しつつ、薬剤の投与により、対応する非標的遺伝子の転写を、あるとしても実質的にわずかにする。そのような事例では、薬剤の投与は標的遺伝子の転写を選択的に減少させると見なされる可能性がある。
【００６０】
いくつかの場合において、ヌクレオシド剤は、遺伝子産物、たとえば、ＲＮＡまたはタンパク質の発現を変化させる可能性がある。その方法の特定の実施形態において、ヌクレオシド剤は、細胞内のＳＰＴ４タンパク質の機能を調整する、たとえば、結合相互作用を変化させることにより、有害な影響を減少させる。本明細書においてＳＰＴ４タンパク質という用語は、酵母Ｓｐｔ４タンパク質のみならず、その哺乳類同族体、たとえば、ヒトＳＵＰＴ４Ｈ、マウスＳｕｐｔ４ｈなどもまとめて意味するために使用される。したがって、その活性が選択的ＳＰＴ４調整剤によって調整される可能性がある目的のＳＰＴ４タンパク質は、これらに限定されないが、出芽酵母Ｓｐｔ４、ヒトＳＵＰＴ４ＨおよびマウスＳｕｐｔ４ｈを含む。本発明のヌクレオシド剤は、ＳＰＴ４調整剤と称する可能性がある。ＳＰＴ４調整剤は、細胞内のＳＰＴ４活性を変化させる、たとえば、細胞内のＳＰＴ４活性を減少させる薬剤である。薬剤は、選択的ＳＰＴ４調整剤である可能性がある。いくつかの事例では、活性剤によって調整された、たとえば、低減された目標ＳＰＴ４活性は転写活性であり、特に、長いトリヌクレオチド反復ドメイン、たとえば、長いＣＡＧ反復ドメインを介してＲＮＡポリメラーゼＩＩ処理能力を促進する活性である。そのような薬剤によって調整される標的ＳＰＴ４活性はＳＰＴ４タンパク質に起因する活性である。
【００６１】
本発明の方法で採用されるヌクレオシド剤がＳＰＴ４調整剤である場合、採用される調整剤は、細胞への導入時に、細胞内のＳＰＴ４機能を変更し、少なくとも被験体内で拡張トリヌクレオチド反復を媒介したＳＰＴ４転写活性を差次的に低減する、あらゆる好都合なヌクレオシド剤である可能性がある。ＳＰＴ４調整剤は、様々な方法、たとえば、ＳＰＴ４などと相互作用する別のタンパク質（たとえば、Ｓｐｔ５またはＳＵＰＴ５ＨなどのＳＰＴ５タンパク質）などの、別のタンパク質へのＳＰＴ４タンパク質の結合を阻害することによって、機能を調整する可能性がある。いくつかの事例において、ヌクレオシド剤はＳＰＴ４タンパク質と第２のタンパク質との相互作用を減少させる。特定の事例において、第２のタンパク質はＳＰＴ５タンパク質である。本明細書においてＳＰＴ５タンパク質という用語は、酵母Ｓｐｔ５タンパク質のみならず、その哺乳類同族体、たとえば、ヒトＳＵＰＴ５Ｈ、マウスＳｕｐｔ５ｈなどもまとめて意味するために使用される。その方法の特定の実施形態において、ヌクレオシド剤はＳｕｐｔ４ｈとＳｕｐｔ５ｈとの間の相互作用を減少させる。ヒトＳｕｐｔ４ｈは、転写伸長の調節のために、その酵母相同分子種のように、Ｓｕｐｔ５ｈと複合体を形成する可能性がある（Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．「酵母ｓｐｔ４−ｓｐｔ５複合体のコア構造：転写伸長の調節のための保存モジュール」Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００８）１６：１６４９〜１６５８、Ｈａｔｚｏｇ，ｅｔ  ａｌ．「Ｓｐｔ４、Ｓｐｔ５、およびＳｐｔ６の、出芽酵母内のＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写伸長の制御の証拠」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（１９９８）２３：３５７〜３６９、Ｗａｄａ，ｅｔ  ａｌ．「ＲＮＡポリメラーゼＩＩ処理能力を調節する新規な転写伸長因子であるＤＳＩＦは、ヒトＳｐｔ４およびＳｐｔ５同族体で構成されている」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（１９９８）１２：３４３〜３５６、Ｗｅｎｚｅｌ，ｅｔ  ａｌ．「ｈＳｐｔ５二量体化インターフェースとの複合体におけるヒト転写伸長因子ＤＳＩＦ  ｈＳｐｔ４サブユニットの結晶構造」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（２００９）４２５：３７３〜３８０）。その方法の特定の実施形態において、ヌクレオシド剤はＳｕｐｔ５ｈとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの間の相互作用を減少させる。たとえば、ヌクレオシド活性剤は、Ｓｕｐｔ５ｈのＲＮＡポリメラーゼＩＩへの結合を妨害する可能性があり、Ｓｕｐｔ４ｈとＳｕｐｔ５ｈとの間の相互作用へのその影響は間接的である可能性がある。
【００６２】
また、ＳＰＴ４タンパク質と第２のタンパク質との相互作用を、選択的ではなくても、差次的に減少させる有効量のヌクレオシド剤と試料を接触させることによって、試料内の（たとえば、本明細書に記載されるように）ＳＰＴ４タンパク質と第２のタンパク質との相互作用を減少させる方法も提供する。特定の事例において、第２のタンパク質は（たとえば、本明細書に記載されるように）ＳＰＴ５タンパク質である。「相互作用を減少させる」とは、ＳＰＴ４タンパク質の第２のタンパク質への結合の程度（たとえば、全ＳＰＴ４と比較した結合ＳＰＴ４の割合）を、たとえば、目的のヌクレオシド剤と接触していない細胞などの適切な対照と比較して、２０％以上、３０％以上、５０％以上、１００％以上などの１０％以上、あるいは２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、またはそれ以上、減少させることを意味する。ＳＰＴ４タンパク質の第２のタンパク質への結合の程度を判定するために、あらゆる好都合な方法が利用される可能性がある。その方法の特定の実施形態において、ヌクレオシド剤はＳｕｐｔ４ｈとＳｕｐｔ５ｈとの間の相互作用を減少させる。ヌクレオシド剤は特に、ＳＰＴ４タンパク質に結合し、ＳＰＴ４タンパク質のＳＰＴ５タンパク質との相互作用を崩壊させる可能性がある。いくつかの事例では、ヌクレオシド剤は特に、ＳＰＴ５タンパク質に結合し、ＳＰＴ４とＳＰＴ５タンパク質との相互作用を崩壊させる。
【００６３】
いくつかの事例では、ヌクレオシド剤の有効量は、相互作用低減量、すなわち、ヌクレオシド剤の非存在下におけるＳＰＴ４複合体の形成と比較して、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、またはさらには９０％以上など、２０％以上のＳＰＴ４複合体（たとえば、ＳＰＴ４／ＳＰＴ５複合体）の形成を阻害するヌクレオシド剤の量である。複合体形成阻害または競合する阻害の測定のために、たとえば、その測定方法の開示が本明細書中に参照して組み込まれる、Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．「遺伝子を含む拡張トリヌクレオチド反復の有害な活性の選択的縮小」ＷＯ２０１２０７８９０６に記載される方法などの、あらゆる好都合な測定方法が利用される可能性がある。
【００６４】
あらゆる好都合な細胞を本方法で使用するための標的とする可能性がある。いくつかの事例では、その中でヌクレオシド剤が活性を呈するタイプの細胞が、変異拡張トリヌクレオチド反復を含む標的遺伝子を含む細胞である。その方法のいくつかの実施形態では、細胞は動物細胞または酵母細胞である。場合によっては、細胞は哺乳動物の細胞である。
【００６５】
本発明の実施形態による方法の実施において、有効量のヌクレオシド剤、たとえば、ＳＰＴ４調整剤が、標的細胞（単数または複数）内に供給される。いくつかの事例では、有効量の調整剤は、細胞を調整剤に接触させることによって細胞内に供給される。細胞と調整剤との接触は、あらゆる好都合なプロトコルを使用して発生する可能性がある。プロトコルは、標的細胞の位置に応じて、生体外または生体内で調整剤の標的細胞との接触を提供する可能性がある。いくつかの事例では、細胞は生体外である。特定の事例では、細胞は生体内である。接触は、細胞内への薬剤の侵入を含むまたは含まない可能性がある。たとえば、標的細胞が単離された細胞であり、調整剤がＳＰＴ４の発現を調整する薬剤である場合、調整剤は、標的細胞の生存能力を許容する細胞培養条件下で細胞に直接、導入される可能性がある。このような技術としては、必ずしもこれらに限定されないが、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション法、ウイルスベクター送達、などが含まれる。方法の選択は、接触される細胞の種類およびヌクレオシド剤の性質、および形質転換が行われる状況に大略的に依存している（たとえば、生体外、体外、または生体内）。これらの方法の一般的な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．の、分子生物学でのショートプロトコル、第３版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９５に見出すことができる。
【００６６】
あるいは、標的細胞（単数または複数）が多細胞生物の一部である場合、調整剤は、薬剤が標的細胞（単数または複数）に接触することができるような方法、たとえば、生体内または生体外プロトコルを介して、生体または被験体に投与される可能性がある。「生体内で」とは、目標構築物が動物の生体に投与されることを意味している。「生体外で」とは、細胞または臓器が身体の外部で変更されることを意味する。このような細胞または臓器は、いくつかの場合、生体に戻される。
【００６７】
特定の実施形態において、その方法は生体内法であり、被験体内の標的遺伝子に起因する疾患の進行を変更するために、標的遺伝子の有害な影響を選択的に減少させる有効量のヌクレオシド剤を、それを必要とする被験体に投与することを含む。本明細書中で使用される「治療する」または「治療」という用語は、哺乳動物（ヒトなど）などの患者の疾患または医学的状態の治療または処置を意味し、（ａ）被験体の予防処置など、疾患または医学的状態の発生を防止すること、（ｂ）患者の疾患または医学的状態を除去または退縮させるなどの、疾患または医学的状態を改善すること、（ｃ）たとえば、患者の疾患または医学的状態の発症を遅延または阻止することにより、疾患または医学的状態を抑制すること、または（ｄ）患者の疾患または医学的状態の症状を緩和することを含む。本明細書で使用される場合、「宿主」、「被験体」、「個体」および「患者」という用語は互換的に使用され、開示された方法に従って、このような治療を必要とするあらゆる哺乳動物を意味する。このような哺乳類には、たとえば、ヒト、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、マウス、およびラットが含まれる。特定の実施形態において、被験体は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態において、被験体は、家畜である。他の実施形態では、被験体はペットである。いくつかの実施形態において、被験体は哺乳動物である。場合によっては、被験体はヒトである。
【００６８】
いくつかの事例において、本方法は、疾患に関連する症状の発生を遅延させる。場合によっては、本方法は、疾患に関連する症状の大きさを減少させる。目的の疾患状態は、変異拡張トリヌクレオチド反復ドメインを含む遺伝子の有害な活性に関連するものを含む。「進行を変更する」という用語は、（たとえば、疾患状態の１つ以上の症状の発生の遅延に現れるように）進行速度の低減、ならびに（たとえば、疾患状態の１つ以上の症状の大きさの低減に現れるように）疾患状態の治療を含む進行の逆転の両方を包含するように採用される。本発明の方法および組成物を使用できる特定の疾患状態は、これらに限定されないが、上記背景技術に記載されているものを含み、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１７型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、およびハンチントン病などのポリＱ疾患状態；他のトリヌクレオチド反復疾患、たとえば、脆弱Ｘ症候群、脆弱ＸＥＭＲ、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症８（ＳＣＡ８）、および脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡ１２）；ポリアラニン拡張障害、たとえば、筋緊張性ジストロフィー２型、脊髄小脳失調症１０、脊髄小脳失調症３１、進行性ミオクローヌスてんかん；ヘキサヌクレオチド反復疾患状態、たとえば、常染色体優性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などを含む。
【００６９】
「代理マーカー」という用語は、特定の疾患の治療の効果の指標を意味するか、臨床試験の結果を予測するために、その従来の意味で採用されている。代理マーカーは、検査室測定値または臨床的に意味がある決定点の代用として治療試験において使用されている理学的徴候として定義することができる。厳密に第ＩＩＩ相臨床試験で検証された信頼性の高い代理マーカーは、患者がどのように感じ、機能し、または生き残るかに基づいて、治療の長期的な効果を予測することができる（Ｋａｔｚ「バイオマーカーおよび代理マーカー：ＦＤＡの展望」ＮｅｕｒｏＲｘ（２００４）１：１８９〜９５）。これらのマーカーはまた、試験の間に薬物の有効性を比較するために使用される可能性もあり、さらに新薬が市販のための管轄当局の認可を得るための根拠になる可能性もある（Ｔｗａｄｄｅｌｌ「研究および臨床実践における代理結果マーカー」Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｒ（２００９）３２：４７〜５０）。それらの使用は大規模な研究や臨床試験のサイズ、期間、およびコストを削減することができるので、予測された薬物効果が死亡を防止または他の極めて重要な成果を促進する場合、これらのマーカーは特に貴重である。いくつかの進行性疾患については、代理マーカーは病期を判定することができる可能性がある（Ｗｅｓｔｏｎ「心血管疾患および糖尿病における代理エンドポイントの使用」Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ（２００８）１５：Ｓ６〜Ｓ７）。特定の疾患状態に応じて、代理マーカーは広範囲に変化する可能性がある。本発明の実施形態はしたがって、疾患状態の１つ以上の代理マーカーを調整、たとえば改善するために、たとえば本明細書に記載されるように、活性剤を投与することを含む。
【００７０】
たとえば、治療されている標的疾患状態がハンチントン病である場合、疾患およびそれに対する治療の効果を監視するために様々な異なる代理マーカーが採用される可能性がある。ハンチントン病の臨床的特徴および臨床経過を評価する標準的な方法と考えられるプロトコルは、統一ハンチントン病評価尺度（ＵＨＤＲＳ）である。方法は、運動機能、認知機能、行動異常および機能的能力の４つの領域でハンチントン病患者を評価する。運動機能部は、眼球運動機能、構音障害、舞踏病、筋緊張異常、歩行、および姿勢の安定性に対して０から４までの範囲の尺度を提供する。より高い合計スコアは、より重度の運動障害を示す。次に、患者の認知機能は音声発話障害検査、符号数字モダリティ検査、およびストループ干渉検査の３つの検査で評価される。ここで、各検査のより高い素得点は、より良い認知能力を示している。プロトコルの行動部分は、行動が現れないことを示す０から行動が激しく現れる４までの範囲のスケールで、気分、行動、および精神病の異常の頻度および重症度を測定する。行動の合計スコアはすべての反応の和であり、より高いスコアは行動症状のより大きい重症度を示す。行動セクションはまた、評価者に、患者が混乱、認知症、またはうつ病の証拠を示しているかどうかの判定を行わせる。疾患の進行のＸ線写真の手段を取り入れることにより、機能的な評価には、総機能的能力スコア、独立性スケール、および課題のチェックリストが含まれる。総機能的能力スコアは、正常に動作することができないことを示す０および正常な機能的能力を表す２または３を含む、０から２または３の範囲のスケールから得られる。独立性スケールは、１０の各増分が特別なケア、援助、および管理の必要性の減少を表す、０から１００までの範囲である。課題を実行する患者の能力に関する質問のチェックリストは、すべての「はい」の回答に対して１のスコアを与えることによって合計される。より高いスコアは低いスコアよりも良好な患者の機能を表す（Ｋｉｅｂｕｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．「統一ハンチントン病評価尺度：確実性および一貫性」運動障害（１９９６）１１：１３６〜４２）。方法の実施形態の実施により、ＵＨＤＲＳパラメータのすべてを含む１つ以上の改善がもたらされ、いくつかの事例では改善は、１０％以上などの５％以上であり、いくつかの事例では、１００％、またはさらに大きい可能性がある。
【００７１】
他の行動および課題完了の検査の結果は、本発明の実施形態においてハンチントン病のための代理マーカーとして機能する可能性がある。目で心を読む検査（ＲＭＥＴ）は、たとえば、ハンチントン病のすべての病期にわたり臨床的に有用な扁桃体機能の代用尺度である。それは、自分自身からまたは現実と異なり得る、信念、感情、意思や他の人々への関心の存在を理解する個人の能力に基づいている。患者は、目の絵を見せられ、絵の周りに配置された４つの感情／精神状態の単語のうちのいずれが目の中に描かれた考えや感情を最もとらえているかを判定するよう求められる。正しい回答の合計数によって判定されるこの検査のパフォーマンスは、疾患発症への近接性に負に相関することが見出され、疾患の各段階で次第に悪化した（Ｍａｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病における感情処理中の扁桃体の役割：発症前から疾患後期まで」Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉａ（２０１５）７０：８０〜９）。患者の会話のパターンもハンチントン病のマーカーとして使用するために分析されてきた。患者は、一節を読むまたはモノローグを作るように要求され得る。研究により、変異ハンチンチン（Ｈｔｔ）遺伝子を有する患者は、健常者に比べて、発話の速度が遅く、言葉をしゃべるのに時間がかかり、言葉と言葉の間および言葉内により多く沈黙することが示されてきた（Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病の初期段階および前駆段階の発話音響マーカー：疾患発症のマーカー？」Ｎｅｕｒｏｓｐｙｃｈｏｌｏｇｉａ（２０１２）５０：３２７３〜８）。他のマーカーには二重課題のパフォーマンス検査が含まれ、ハンチントン病患者は、単純な課題を単独または一緒に実行すること、および眼球運動がより遅く、より不正確であり、この検査は疾患の重症度および進行度に関する情報を提供できる（Ｖａｐｏｒｔｚｉｓ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病における二重課題の円のトレース中の課題の難易度の影響」神経学ジャーナル（２０１５）２６２：２６８〜７６）、（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  ＭａｃＡｓｋｉｌｌ「神経変性障害の患者の眼球運動」Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、神経学（２０１３）９：７４〜８５）。他のマーカーには、これらに限定されないが、敏感な運動の機能障害を評価するための選択反応課題、エピソード記憶を評価するためのホプキンス言語学習検査、視空間処理を評価するためのコンピュータ化されたメンタルローテーション課題、およびセットシフト課題が含まれる（Ｒｏｓａｓ，ｅｔ  ａｌ．「ＰＲＥＣＲＥＳＴ：ハンチントン病のリスクのあるクレアチンの第二相の予防およびバイオマーカー試験」神経学（２０１４）８２：８５０〜７）、（Ｂｅｓｔｅ，ｅｔ  ａｌ．「縦断的データで確証された発症前のハンチントン病における新規な認知神経生理学的状態のバイオマーカー」Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１３）３：１〜８）。方法の実施形態の実施により、採用された特定の検査において測定されるパラメータの改善がもたらされ、この改善は、いくつかの事例では１０％以上など、５％以上であり、いくつかの事例では１００％、またはさらに大きい可能性がある。
【００７２】
他の事例では、ハンチントン病患者の血液、組織および体液から採取された試料を代理マーカーに対して分析する。これらのマーカーは変化する可能性があり、そのようなマーカーの例は、ｐＨまたは血液量などの血清または物理的測定に見られる分析物を含む。体液および組織中のそのようなマーカーの濃度、レベル、または定量的測定は、多くの場合、ハンチントン病の症状の出現と一致することがわかっている。たとえば、遊離２４Ｓ−ヒドロキシコレステロールおよび２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール／総コレステロールの比などのオキシステロールの増大した血清レベルは、精神運動速度と実行機能を評価した課題に対する障害の大きなリスクと関連していた。一方、遊離２７−ヒドロキシコレステロールおよび２７−ヒドロキシコレステロール／総コレステロールの比のより高いレベルは遅延記憶障害の大きなリスクと関連していた（Ｂａｎｄａｒｕ  ａｎｄ  Ｈａｕｇｈｅｙ「ヒト血清からの遊離２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、および２７−ヒドロキシコレステロールの定量的検出」ＢＭＣ神経科学（２０１４）１５：１３７）。体液に見出されるマーカーの他の例はコルチゾールであり、その唾液中のより高い濃度は、発症前または早期のハンチントン病患者の減少した情報コード化および記憶想起および増加した運動機能の徴候の重症度に強く関連していた（Ｓｈｉｒｂｉｎ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病の初期段階におけるコルチゾールと言語記憶との関係」神経学ジャーナル（２０１３）２６０：８９１〜９０２）。物理的測定が代理マーカーとしての用途を有する可能性があることを実証しながら、研究により前駆段階または初期のハンチントン病患者の神経ｐＨおよび脳血流量の増加が発見された（Ｈｕａ，ｅｔ  ａｌ．「前駆段階のハンチントン病における上昇した細動脈脳血流量」運動障害（２０１４）２９：３９６〜４０１）、（Ｃｈａｕｍｅｉｌ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病における神経変性のバイオマーカーとしてのｐＨ：並進げっ歯類−ヒトＭＲＳ研究」脳血流ジャーナル（２０１２）３２：７７１〜９）。分子代理マーカーのさらに別の例は転写産物の発現、特に、健常者と比べて、ハンチントン病の被験者において最初に高いレベルで発現された遺伝子の発現の治療後の減少である（Ｂｏｒｏｖｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．「ヒト血液のゲノムワイド発現のプロファイリングはハンチントン病のためのバイオマーカーを明らかにする」ＰＮＡＳ（２００５）１０２：１１０２３〜０２８）。体液中の他の代理マーカーとしては、これらに限定されないが、Ｃ反応性タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）／白血球（ＷＢＣ）比、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、チオレドキシンレダクターゼ−１（ＴｒＲｄ−１）、チオレドキシン１（Ｔｒｘ−１）、および筋肉アデノシン三リン酸が含まれる（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病患者の血液中の酸化ストレスおよび炎症バイオマーカー、」神経学的研究（２０１２）３４：７２１〜４）、（Ｌｏｄｉ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症における生体内の骨格筋エネルギー代謝の異常」Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２０００）４８：７２〜６）���方法の実施形態の実施により、採用された特定の検査において測定されるマーカー（単数または複数）の改善がもたらされ、この改善は、いくつかの事例では１０％以上など、５％以上であり、いくつかの事例では１００％、またはさらに大きい可能性がある。
【００７３】
さらに、ハンチントン病のための代理マーカーは、たとえば、神経画像処理および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によって得られたマーカーなどの、撮影マーカーである可能性がある。撮像は、脳の領域を横切る白質および灰白質における体積、萎縮のレベル、および活動についての情報を提供するために採用される。ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病におけるＭＲＩバイオマーカー」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）４：１９１０〜２５に、記載されている。一般的なＭＲＩ法は、構造的ＭＲＩ、拡散テンソル撮像法、磁化移動撮像法、磁気共鳴分光法、および機能的ＭＲＩを含む。構造的または容量ＭＲＩは、皮質リボンの局部的な進行する薄化および灰白質および白質の減少を明らかにすることができる。構造的ＭＲＩはまた、疾患の発病前または初期段階に発生すると思われる、脳領域、特に尾状核、淡蒼球、および被殻における萎縮の量および速度も検出することができる。ボクセル単位形態計測（ＶＢＭ）、境界シフト積分（ＢＳＩ）およびＦＭＲＩＢの統合登録分割技術（ＦＩＲＳＴ）などの、様々な半自動または全自動の技術が記載されている（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病におけるＭＲＩバイオマーカー」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）４：１９１０〜２５）。拡散テンソル撮像法（ＤＴＩ）を使用して、組織物質の完全性が、細胞内および細胞外の空間におけるプロトンの拡散特性に基づいて評価される。白質および灰白質内の異方性度（ＦＡ）、見かけの拡散係数（ＡＤＣ）、平均拡散率（ＭＤ）および総拡散率（ＴｒａｃｅＤ）における障害がＤＴＩスキャン中に測定される。０に近いＦＡ値は、すべての方向への等しい拡散を表す。対照的に、１に近いまたは１と等しいＦＡ値は非常に高い指向性拡散を表す。高ＭＤ値は制限されない拡散を表し、低ＭＤ値は制限された拡散を示唆する。脳のいくつかの領域におけるＭＤとＦＡ値の増加は皮質下の灰白質と白質内の接続の選択的な変性を共同して証明しており、これはハンチントン病の線条体中型有棘ニューロンの死に起因すると思われた（Ｄｏｕａｕｄ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病における選択皮質下変性のための生体内の証拠」Ｎｅｕｒｏｌｍａｇｅ（２００９）４６：９５８〜６６）、（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病におけるＭＲＩバイオマーカー」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）４：１９１０〜２５）。別の技術である、磁化移動撮像法（ＭＴＩ）は、組織構造を調べる方法を提供する。技術は、遊離流体中のプロトンと高分子に結合されたプロトンとの間の相互作用に依存している。高分子内の磁化飽和および緩和は観測可能な信号に影響を与える。飽和取得と不飽和取得との間のＭＲ信号の変化の割合を表す磁化移動比（ＭＴＲ）は、臨床研究で使用される尺度である。２つの主要な評価項目である、平均ＭＴＲおよびヒストグラム解析からのＭＴＲのピーク高さが報告されている。ハンチントン病のキャリアの研究において、ＭＴＲは被殻を除くすべての皮質下構造で大幅に低減され、皮質下および皮質の灰白質の変性を明らかにした（Ｇｉｎ���ｓｔｒｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．「磁化移動ＭＲ撮像法は、ハンチントン病における皮質下および皮質の灰白質の変性を証明する」神経放射線学に関するアメリカン・ジャーナル（２０１０）３１：１８０７〜１２）、（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病におけるＭＲＩバイオマーカー」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）４：１９１０〜２５）。さらに別の技術は、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）である。ＭＲＳは、代謝物の濃度を測定する水素のプロトンを使用する。前記の技術とは異なり、ＭＲＳは生理的プロセスの変更に関する情報を提供する。検査される最も一般的な代謝物は、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、神経細胞や軸索の完全性のためのマーカー、クレアチン、脳のエネルギー代謝のためのマーカー、コリン、膜の代謝回転を反映するマーカー、ミオイノシトール、オスモライトおよびアストロサイトのマーカー、乳酸、酸化プロセスの中断および嫌気性解糖の開始のマーカー、およびグルタミン酸、神経伝達物質である。クレアチンおよびＮ−アセチルアスパラギン酸のレベルの減少、および異なる脳領域間の乳酸レベルの増加が、未発症のハンチントン病の研究で報告されてきた（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病におけるＭＲＩバイオマーカー」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）４：１９１０〜２５）。最後に、機能的ＭＲＩ（ｆＭＲＩ）は、変更された活性化を有する脳領域を識別するために、血液酸素レベル依存（ＢＯＬＤ）信号を使用する。脳領域の活性化は、ｆＭＲＩで測定した、エネルギーの増加および、その結果として、血液の需要を必要とする。ｆＭＲＩのスキャン中に、時計読取り課題、言語作業記憶課題、サイモン課題、またはポルテウス迷路課題などの異なる機能的課題を採用することができる。異常な連結性または活性化のパターンは、発症前および発症後のハンチントン病と関連している。たとえば、発症前のハンチントン病患者には、多くの場合、いくつかの領域の活性化の増加が見られるが、「発症が近い」発症前の遺伝子のキャリアの活性化は大略的に減少する（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病におけるＭＲＩバイオマーカー」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）４：１９１０〜２５）。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄによると、体積測定および白質の拡散テンソル撮像の完全性の測定は、ハンチントン病の発症前の段階を評価するための最良の技術である。発症初期のハンチントン病については、磁化移動撮像法および脳全体の萎縮の測定がより適切である（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病におけるＭＲＩバイオマーカー」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）４：１９１０〜２５）。方法の実施形態の実施により、採用される特定の画像検査で測定されたパラメータの改善がもたらされ、いくつかの事例では改善は、１０％以上などの５％以上であり、いくつかの事例では、１００％、またはさらに大きい可能性がある。
【００７４】
ＭＲＩスキャンとは別に、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャンも、発症前のハンチントン病患者の脳の代謝活性を測定するために、基線およびその後の数年間において、採用されてきた。代謝性脳ネットワーク解析は、神経変性を経験している患者に特徴的な空間的共分散パターンの発現を測定するためにますます多く採用されるようになった。［１８Ｆ］−フルオロデオキシグルコーススキャンで測定すると、代謝性ネットワーク活動は、フェノコンバージョン（ｐｈｅｎｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）とも称される、ハンチントン病の臨床的発症中の、その速い速度の進行および高い発現によって証明されるように、疾患の進行に敏感であることが証明された。基準代謝活性の特定の閾値を超える異常な上昇は、今後数年間にフェノコンバージョンの高い可能性を示す（Ｔａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．「発症前のハンチントン病の進行バイオマーカーとしての代謝ネットワーク」臨床試験に関するジャーナル（２０１３）１２３：４０７６〜８８）。両側の前頭、側頭および頭頂皮質における皮質グルコース代謝の減少もまた、早期段階のハンチントン病患者の疾患進行のより急速な形態を識別するための予測因子として提案されている（Ｓｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．「早期段階のハンチントン病における大脳皮質の代謝の減少：疾患進行の可能なバイオマーカー？」臨床神経学に関するジャーナル（２０１３）９：２１〜５）。方法の実施形態の実施により、採用される特定の画像検査で測定されたパラメータの改善がもたらされ、いくつかの事例では改善は、１０％以上などの５％以上であり、いくつかの事例では、１００％、またはさらに大きい可能性がある。
【００７５】
体液に基づくマーカーおよび撮像マーカーの他に、ハンチントン病のための代理マーカーは、様々な栄養、ミネラル蓄積、および含有物の検出方法を含む。ある研究では、フェノコンバージョンに対する地中海沿岸特有の食事への固執の影響を評価し、乳製品の高い消費と、発症後のハンチントン病の進行の促進に関連する尿酸値上昇のリスクの増加との間に何らかの相関関係を発見した（Ｍａｒｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病における地中海沿岸特有の食事とフェノコンバージョンに対するカロリー摂取量との関係」ＪＡＭＡ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２０１３）７０：１３８２〜８）。別の研究では、ハンチントン病発症前の患者およびその症状がある患者の両方の淡蒼球に鉄の蓄積が検出された（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃａｓｔａｎｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．「マルチモーダル、断面基底核撮像法によるハンチントン病のバイオマーカーの探求」ヒト脳マッピング（２０１３）３４：１６２５〜３５）。別の代理マーカーは、拡張ポリグルタミン反復を含むハンチンチンタンパク質およびタンパク質の断片の神経細胞内の凝集体の評価を含む（Ｓｉｅｒａｄｚａｎ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病の神経細胞の選択的脆弱性」神経病理学および応用神経生物学（２００１）２７：１〜２１）、（Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．「ポリグルタミン伸長を有する切断型および全長のハンチンチンを発現する高容量アデノウイルスベクターによる、一次神経細胞培養および生体内におけるハンチンチン介在物形成の誘導」遺伝子医学に関するジャーナル（２００８）１０：２６９〜７９）。マウスでは、抗体ＥＭ４８を用いて免疫染色する歩行分析、およびフィルタートラップ分析が、線条体ニューロンにおける変異型ハンチンチンタンパク質またはタンパク質の断片の初期の核内蓄積が後の線条体変性および運動障害と相関することを示すために、一緒に採用された。線条体フェノタイプは、したがって、特に、疾患の進行は、変異型ハンチンチンタンパク質の断片によって速められ、ハンチントン病の発症を予測する代理マーカーとして機能する可能性があることを証明している（Ｗｈｅｅｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．「遅発性の神経変性疾患を予知する早期フェノタイプは、ＨｄｈＣＡＧノックインマウスにおける改質剤の試験を可能にする」ヒト分子遺伝学（２００２）１：６３３〜４０）。モノクローナール抗体１Ｃ２などの、グルタミン残基の長いストレッチを検出することができる抗体の免疫染色パターンはまた、ハンチントン病の死後の中枢神経系分析における診断支援を提供する可能性も有する（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．「ハンチントン病の脳におけるポリグルタミン免疫反応の神経解剖学的プロファイル」神経病理学および実験的神経学に関するジャーナル（２００９）６８：２５０〜６１）。方法の実施形態の実施により、採用される特定の検査で測定されたパラメータの改善がもたらされ、いくつかの事例では改善は、１０％以上などの５％以上であり、いくつかの事例では、１００％、またはさらに大きい可能性がある。
本発明の方法では、ヌクレオシド剤を、所望の活性をもたらすことができるあらゆる好都合な投与プロトコルを用いて標的細胞に投与する可能性がある。このように、薬剤を、治療的投与のための様々な製剤、たとえば、薬学的に許容されるビヒクルなどの中に組み込むことができる。
【００７６】
ヌクレオシド剤
本発明の態様は、細胞内の標的遺伝子を含む変異拡張トリヌクレオチド反復の有害な活性を低減するヌクレオシド剤を含む。ヌクレオシド剤は、複素環塩基部分に連結された糖部分を含む化合物である。糖部分は、グリコシド結合を介して複素環塩基部分に連結される可能性がある。いくつかの場合において、グリコシド結合は、α−グリコシド結合である。場合によっては、グリコシド結合はβ−グリコシド結合である。
【００７７】
目的の糖部分は、これらに限定されないが、従来のリボースおよびデオキシリボース糖および従来の立体異性体だけでなく、Ｌ鏡像異性体およびアルファアノマー、およびＤ−リボピラノースおよびＤ−リボフラノースなどのその誘導体および類似体、そのデオキシ誘導体、そのリン酸化誘導体、そのアシル化誘導体、そのフッ素化誘導体およびその類似体を含む他の糖も含む。本明細書で使用する「ヌクレオシド剤」という用語は、薬剤を含有する亜リン酸（たとえば、Ｏ−リン酸塩置換糖部分を含むヌクレオシド剤）および亜リン酸部分を欠く薬剤の両方を含むことを意味する。目的のヌクレオシド剤は、糖部分のあらゆる好都合な変更、たとえば、天然に存在するヒドロキシル基がハロゲン原子または脂肪族基で置換される、またはエーテル、アミンなどとして官能化される変更を含む可能性がある。「類似体」とは、類似の構造を有する、模倣体、誘導体として文献において認識される構造的特徴を有する分子または他の同様の用語を意味し、たとえば、非天然の（通常は自然界に存在しない）ヌクレオシド、これらに限定されないが、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護されたＯ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾールを含む２’−修飾ヌクレオシドなどの人工的なヌクレオシドの模倣体、直鎖状および環状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、（ＰＥＧ）含有基、およびロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴマーヌクレオシドホスホネートなどに見られる官能基などの式（Ｏ−アルキル）ｍのポリエーテル、および保護基または結合基などの置換基を追加したあらゆるポリヌクレオチドを含む。糖部分に使用される「デオキシ」置換基は、水素（すなわち、デオキシリボース糖）、ハロ（たとえば、フルオロ）、保護されたアミノ（たとえば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはすべてのアミノが保護されたアミノ酸）、完全に保護されたポリアミノ（たとえば、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン、ここで、アミンはＮＨ２である可能性があり、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノおよびすべてのアミノ基が保護されている）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ、アルキル−チオ−アルキル、チオアルコキシ、および、たとえば、保護されたアミノ官能基で任意に置換される可能性があるアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルを含む。好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリール、２’−Ｃ−アリール、および２’−フルオロである。「リボヌクレオシド剤」は、変更されたリボース糖部分を含む、リボース糖部分を含むヌクレオシド剤である。
【００７８】
「複素環塩基部分」という用語は、たとえば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはウラシル（Ｕ）などの、公知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、他の変更された複素環塩基または核酸塩基も含むそれらの部分を含むことが意図されている。このような変更は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環を含む。そのような変更には、たとえば、ジアミノプリンおよびその誘導体、イノシンおよびその誘導体、アルキル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、チオール化プリンまたはピリミジンなど、または、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジブチルホルムアミジン、Ν，Ν−ジフェニルカルバメート、置換チオ尿素などの保護基の付加が含まれる。プリンまたはピリミジン塩基はまた、上記の類似体である可能性もあり、適切な類似体は、当業者であれば公知となり、関連するテキストおよび文献に記載されている。目的の類似体は、これらに限定されないが、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル、キューオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリンおよび２，６−ジアミノプリンを含む。
【００７９】
本発明の方法および組成物に、あらゆる好都合なヌクレオシド剤を使用する可能性がある。そのようなヌクレオシド剤は、他の方法の中で、その開示されたスクリーニング法が本明細書中に参照して組み込まれる、Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．「遺伝子を含む拡張トリヌクレオチド反復の有害な活性の選択的縮小」ＷＯ２０１２０７８９０６に記載されるスクリーニング法を採用することにより、評価される可能性がある。目的のヌクレオシド剤は、これらに限定されないが、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフールおよび５’−デオキシフルオロウリジン、５−ＦＵプロドラッグ、フルオロウリジン、２’−デオキシフルオロウリジンを含む、フルオロウリジンまたは２’−デオキシフルオロウリジンのプロドラッグ誘導体、フルオロシトシン、トリフルオロ−メチル−２’−デオキシウリジン、アラビノシルシトシンのプロドラッグ、アラビノシルシトシン、シクロシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、アラビノシル５−アザシトシン、６−アザシチジン、Ｎ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）、ピラゾフリン、６−アザウリジン、アザリビン、チミジン、３−デアザウリジン、トリアセチルウリジン、エトキシカルボニルウリジン、トリアセチルシチジン、シクロシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、アラビノシル５−アザシトシン、６−アザシチジン、ベンジルアシクロウリジン、ベンジルオキシベンジルアシクロウリジン、アミノメチル−ベンジルアシクロウリジン、アミノメチル−ベンジルオキシベンジルアシクロウリジン−、ヒドロキシメチル−ベンジルアシクロウリジン、ヒドロキシメチル−ベンジルオキシベンジルアシクロウリジン、２，２’−アンヒドロ−５−エチルウリジン、５−ベンジルバルビツール酸塩、５−ベンジルオキシベンジルバルビツール酸塩、５−ベンジルオキシベンジル−１−［（１−ヒドロキシ−２−エトキシ）ｍ−エチル］バルビツール酸塩、５−ベンジルオキシベンジルアセチル−１−［（１−ヒドロキシ−２−エトキシ）メチル］バルビツール酸塩、５−メトキシベンジルアセチルアシクロバルビツール酸塩、５−エチニルウラシル、ブロモビニルウラシル、シアノジヒドロピリジン、ウラシル、チミン、チミジンおよびベンジルオキシベンジルウラシルを含む。ヌクレオシド剤は、ヌクレオシド剤のあらゆる部分（単数または複数）に独立して付着した１つ以上の保護基（たとえば、ヒドロキシル保護基、二座ジオール保護基、または複素環塩基保護基）を含む可能性がある。
【００８０】
本発明のヌクレオシド剤のあらゆる好都合なプロドラッグが、本発明の方法で利用される可能性がある。上述したように、「プロドラッグ」という用語は、活性剤を放出するために体内での変換を必要とするヌクレオシド剤の誘導体を意味する。特定の実施形態において、変換は酵素的変換である。特定の実施形態において、変換は環化変換である。特定の実施形態において、変換は酵素変換および環化反応の組み合わせである。プロドラッグは、必ずしもそうとは限らないが、活性剤に変換されるまで薬理学的に不活性であることが多い。
【００８１】
特定の実施形態において、ヌクレオシド剤はリボヌクレオシド剤である。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド剤は、式（Ｉ）によって示される。
【００８２】
【化１】
2018520111.tif 000004
【００８３】
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、アシルオキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、リン含有基、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アジド、アミノ、アミノアシルオキシおよび置換アミノなどのあらゆる適切な置換基から独立して選択され、Ｚは、プリンまたはピリミジンなどの複素環塩基部分、またはその類似体である。「リン含有基」は、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド合成に利用されるあらゆる好都合なリン含有基または結合などの、リン原子を含む基である。目的のリン含有基には、これらに限定されないが、リン酸塩、リン酸エステル、チオリン酸、ホスホロアミド酸、チオアミド亜リン酸エステル、亜リン酸エステル、ホスフィンなどが含まれる。式（Ｉ）の特定の事例において、Ｒ１はＨ、ＯＨまたはハロゲン（たとえば、Ｆ）である。式（Ｉ）の特定の事例において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ２またはＮＨＲから独立して選択され、Ｒは、アシル、置換アシル、リン含有基、アルキルまたは置換アルキルである。式（Ｉ）の特定の事例において、薬剤は３’−Ｏリン含有基（たとえば、リン酸塩）および／または５’−Ｏリン含有基（たとえば、リン酸塩）を含む。
【００８４】
いくつかの例では、ヌクレオシド剤は、６−デアザプリンリボヌクレオシドおよび６−アザウリジンリボヌクレオシドから選択されるリボヌクレオシド剤である。いくつかの場合、リボヌクレオシド剤は６−デアザプリンリボヌクレオシドである。６−デアザプリンリボヌクレオシドは、グリコシド結合を介して６−デアザプリン複素環塩基に結合された（たとえば、本明細書に記載されるような）リボース糖部分を含む。６−デアザプリン複素環塩基は、６−アミノ基が非アミノ酸置換基で置換されたプリン類似体である。いくつかの事例では、６−デアザプリン複素環塩基は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、スルホニル、スルホネート、カルボキシ、チオール、ニトロ、シアノおよびそれらの置換バージョンから選択される、６位の置換基を有する。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ヌクレオシド剤は、式（ＩＩ）によって示される６−デアザプリンリボヌクレオシドである。
【００８６】
【化２】
2018520111.tif 000005
【００８７】
式中、各Ｒは、Ｈ、アシル、アミノアシル、アルキル、置換アルキル、リン含有基および酵素的切断可能基から独立して選択され、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリールおよびトリハロメチルからなる群から独立して選択される。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１１はアミノまたは置換アミノではない。式（ＩＩ）の特定の実施形態において、各Ｒは独立してＨまたはアシルであり、Ｒ１１はハロゲンであり、Ｒ１２およびＲ１３は水素である。式（ＩＩ）の特定の実施形態において、各ＲはＨである。式（ＩＩ）の特定の実施形態において、各Ｒはアシルである。式（ＩＩ）の特定の実施形態において、各Ｒはアセチルである。式（ＩＩ）の特定の事例では、各ＲはＨ、アシル、置換アシル、リン含有基、アルキルまたは置換アルキルから独立して選択される。式（ＩＩ）の特定の事例では、薬剤は３’−Ｏリン含有基（たとえば、リン酸塩）および／または５’−Ｏリン含有基（たとえば、リン酸塩）を含む。
【００８８】
特定の事例において、リボヌクレオシド剤は以下の構造を有する６−クロロプリンリボシド（すなわち、ＨＤ１０３）である。
【００８９】
【化３】
2018520111.tif 000006
【００９０】
特定の事例において、リボヌクレオシド剤は６−アザウリジンリボヌクレオシドである。本明細書で使用するように、「６−アザウリジンリボヌクレオシド」および「６−アザウラシルリボシド」という用語は互換的に使用される。６−アザウリジンリボヌクレオシドは、グリコシド結合を介して６−アザウラシル複素環塩基に結合される（たとえば、本明細書に記載されるような）リボース糖部分を含む。６−アザウラシル複素環塩基は、炭素原子の代わりに環の６位に窒素原子を含むピリミジン類似体である。いくつかの事例において、６−アザウラシル複素環塩基は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、スルホニル、スルホン酸塩、カルボキシ、チオール、ニトロ、シアノおよびそれらの置換バージョンから選択されるＮ３および／またはＣ５の位置に置換基を有する。特定の事例において、６−アザウラシル複素環塩基は、メチル置換基がＣ５位置に含まれる場合、６−アザチミン複素環塩基と称される可能性がある。
【００９１】
いくつかの実施形態において、６−アザウリジンリボヌクレオシドは、式（ＩＩＩ）によって示される。
【００９２】
【化４】
2018520111.tif 000007
【００９３】
式中、各Ｒは、Ｈ、アシル、アミノアシル、アルキル、置換アルキル、リン含有基および酵素的切断可能基から独立して選択され、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリールおよびトリハロメチルからなる群から独立して選択される。式（ＩＩＩ）の特定の事例では、各Ｒは、Ｈ、アシル、置換アシル、リン含有基、アルキルまたは置換アルキルから独立して選択される。式（ＩＩＩ）の特定の実施形態において、各Ｒは独立してＨまたはアシルであり、Ｒ２１は水素であり、Ｒ２２は水素である。式（ＩＩＩ）の特定の実施形態において、各ＲはＨである。式（ＩＩＩ）の特定の実施形態において、各Ｒはアシルである。式（ＩＩＩ）の特定の実施形態において、各Ｒはアセチルである。式（ＩＩＩ）の特定の実施形態において、Ｒ２１は、水素、アルキル、置換アルキル、アシルおよび置換アシルから選択される。式（ＩＩＩ）の特定の実施形態において、Ｒ２１は水素である。式（ＩＩＩ）の特定の実施形態において、Ｒ２２は、水素、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、アルコキシ、置換アルコキシ、アシルおよび置換アシルから選択される。式（ＩＩＩ）の特定の実施形態において、Ｒ２２は水素である。式（ＩＩＩ）の特定の事例において、薬剤は３’−Ｏリン含有基（たとえば、リン酸塩）および／または５’−Ｏリン含有基（たとえば、リン酸塩）を含む。
【００９４】
特定の事例において、リボヌクレオシド剤は以下の構造を有する６−アザウリジン（すなわち、ＨＤ１０１）である。
【００９５】
【化５】
2018520111.tif 000008
【００９６】
上述したように、ヌクレオシド剤はプロドラッグとして提供される可能性がある。そのようなプロドラッグは、必要な化合物に生体内で容易に変換可能な化合物の一般的な官能性誘導体である。プロドラッグは、活性ヌクレオシド剤を生成するために生体内で（たとえば、ヒトの体内で）加水分解するエステルを含む。適切なエステル基には、限定するものではないが、各アルキルまたはアルケニル部分が６つ以下の炭素原子を有する、薬学的に許容される、脂肪族カルボン酸、特にアルカン、アルケン、シクロアルカンおよびアルカン二酸から誘導されるものが含まれる。例示的なエステルには、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン塩酸、酪酸塩、アクリル酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、コハク酸エチル塩などが含まれる。本発明の実施形態において使用されるプロドラッグの例は、以下の構造を有するＨＤ１０１のプロドラッグである（−）−６−アザウリジン２’，３’，５’−トリアセテート（すなわち、ＨＤ１０６）である。
【００９７】
【化６】
2018520111.tif 000009
【００９８】
上記に検討したように、本発明の方法は、標的細胞（単数または複数）内の拡張トリヌクレオチド反復遺伝子の有害な活性の低減をもたらし、標的細胞（単数または複数）は生体外または生体内の可能性がある。特定の実施形態では、本発明の方法は、標的細胞（単数または複数）内の標的遺伝子の毒性の低減を、たとえば、それによってコード化されるタンパク質の凝集の減少を介して、もたらす。特定の実施形態において、方法は、標的遺伝子によりコード化されるタンパク質の機能の増強をもたらす。
【００９９】
上記の方法は、異なる様々な用途に使用される。次に、特定の用途を以下の有用性の項で検討する。
【０１００】
有用性
本発明の方法は、変異拡張トリヌクレオチド反復ドメインを含む遺伝子の有害な活性の低減が望まれる様々な用途で使用できる。したがって、本発明の態様は、たとえば、上記成果の１つ以上をもたらすことによって治療できる状態であると診断された被験体などの、それを必要とするあらゆる被験体の、本明細書に記載されるような遺伝子によってコード化されるタンパク質の毒性を低減および／または機能を増強することを含む。本発明の方法および組成物の使用の目的は、変異拡張トリヌクレオチド反復ドメインを含む遺伝子の有害な活性に関連する疾患状態の進行を変更することである。「進行を変更する」という語句は、（たとえば、疾患状態の１つ以上の症状の発生の遅延に現れるような）進行速度の低下、ならびに（たとえば、疾患状態の１つ以上の症状の大きさの軽減に現れるような）治療を含む疾患状態の進行の逆転の両方を包含するように採用される。本発明の方法および組成物が使用できる特定の疾患状態には、ポリＱ疾患状態に限定されないが、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１７型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、およびハンチントン病などが含まれる。
【０１０１】
いくつかの事例では、本発明の方法の実施は、疾患状態の被験体の治療をもたらす。治療とは、被験体を苦しめる疾患状態に関連する１つ以上の症状の少なくとも改善を意味し、改善という用語は、少なくとも、たとえば、認知機能の喪失などの治療対象の病理学的状況に関連付けられる症状などのパラメータの大きさの減少を意味するように広義に使用される。したがって、治療はまた、病理学的状況、または少なくともそれに関連した症状が、たとえば発症の防止など、完全に抑制されて、または、たとえば終結など、停止されて、被験体がもはや、病理学的状況、または少なくとも病理学的状況を特徴づける症状に苦しんでいない状態も含む。治療はまた、上述したように、たとえば、疾患状態の代理マーカーの調整の形で現れる可能性もある。
【０１０２】
様々な宿主が、本発明の方法に従って治療可能である。大略的には、このような宿主は「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食動物（たとえば、イヌおよびネコ）、げっ歯類（たとえば、マウス、モルモットおよびラット）、および霊長類（たとえば、ヒト、チンパンジーおよびサル）を含む、哺乳網内の生物を記述するために広く使用される。いくつかの実施形態では、宿主はヒトである。
【０１０３】
併用療法
本発明の活性剤は被験体に、単独でまたは追加の、すなわち、第２の活性剤と組み合わせて投与することができる。したがって、いくつかの場合において、本発明の方法はさらに、被験体に、少なくとも１つの追加の化合物を投与することを含む。ウイルス感染を治療するために有用な化合物を含む、あらゆる好都合な薬剤を利用する可能性がある。「薬剤」、「化合物」および「薬物」という用語は、本明細書中で交換可能に使用されている。たとえば、選択ＳＰＴ４阻害ヌクレオシド剤は、単独で、またはポリＱ疾患の治療に採用される薬物のような１つ以上の他の薬物と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、方法はさらに、第２の薬剤を併用してまたは順に同時投与することを含む。目的の可能性がある第２の薬剤には、これらに限定されないが、ドーパミン枯渇剤（たとえば、テトラベナジン（キセナジン）またはレセルピン）；ドーパミン受容体拮抗薬（たとえば、神経遮断剤）、アマンタジン、レベチラセタム、抗痙攣薬（たとえば、バルプロ酸）、リスペリドン、ハロペリドール（ハルドール）およびクロザピン（クロザリル）などの抗精神病薬；抗発作薬、ベンゾジアゼピン（たとえば、クロナゼパム（クロノピン））およびジアゼパム（ベイリウム）などの抗不安薬；エスシタロプラム（レクサプロ）、フルオキセチン（プロザック、サラフェム）およびセルトラリン（ゾロフト）などの薬物を含む抗うつ剤；ラキニモド、プリドピジン、ラサギリン、汎ＰＰＡＲアゴニスト（たとえば、ベゾフィブラート）；核酸サイレンシング剤、たとえば、ＨＴＴ一塩基多型（ＳＮＰ）などを目標とするＲＮＡサイレンシング剤などが含まれる。ＳＵＰＴ４Ｈに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉もまた、併用療法の一部である可能性がある。
【０１０４】
「同時投与」および「併用して」という用語は、２つ以上の治療剤を、同時に、共に、または特定の時間制限なしに順次に投与することを含む。一実施形態では、薬剤は、同時に細胞内または被験体の体内に存在するか、あるいは同時にそれらの生物学的効果または治療的効果を発揮する。一実施形態では、治療剤は同じ組成物または単位投与形態である。他の実施形態では、治療剤は別々の組成物または単位投与形態である。特定の実施形態において、第１の薬剤は第２の治療剤の投与の前に（たとえば、数分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、それと併用して、または続けて（たとえば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）投与することができする。
【０１０５】
公知の治療剤の本発明の医薬組成物との「同時投与」は、公知の薬剤および本発明の組成物の両方が治療効果を有するであろうときに薬剤およびヌクレオシド剤を投与することを意味する。そのような同時投与は、本発明のヌクレオシド剤の投与に対して、同時に（すなわち、同じ時に）、事前に、または続けて行う薬剤の投与を含む可能性がある。２つの薬剤の投与経路は変化する可能性があり、代表的な投与経路を以下により詳細に記載する。当業者であれば、特定の薬剤および本発明のヌクレオシド剤の投与の適切なタイミング、手順および用量を支障なく決定するであろう。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、化合物（たとえば、ヌクレオシド剤および少なくとも１つの追加の化合物）は、互いに１２時間以内、互いに６時間以内、互いに３時間以内、または互いに１時間以内など、互いに２４時間以内に被験体に投与される。特定の実施形態において、化合物は互いに１時間以内に投与される。特定の実施形態において、化合物は実質的に同時に投与される。実質的に同時に投与するということは、化合物が、互いに５分以下、または１分以下など、互いに約１０分以下以内に被験体に投与されることを意味する。
【０１０７】
医薬製剤
本発明の化合物の医薬製剤も提供される。本発明の化合物は、被験体に投与するための様々な製剤形態に組み込むことができる。より詳しくは、本発明の化合物は、適切な、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて医薬組成物に配合することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、座薬、注射剤、吸入剤およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体形態の製剤に配合される可能性がある。製剤形態は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内投与などを含む多数の異なる経路を介した投与のために設計される可能性がある。
【０１０８】
製剤投与形態において、化合物は、その薬学的に許容される塩の形態で投与される可能性があり、あるいは、単独で、または他の薬剤的に活性な化合物との適切な関連性で、ならびに組み合わせで使用される可能性がある。以下の方法および賦形剤は単なる例示であり、決して限定するものではない。
【０１０９】
活性成分を含有する医薬組成物は、たとえば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性または油性の懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、硬もしくは軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤として、経口使用に適した形態である可能性がある。経口使用を意図する組成物は医薬組成物製造の技術分野において公知のあらゆる方法に従って調製される可能性があり、そのような組成物は薬学的に上品で口当たりがよい製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含有する可能性がある。錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された活性成分とを含む。これらの賦形剤は、たとえば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、たとえば、コーンスターチ、またはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤、たとえば、デンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、および、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑材である可能性がある。錠剤はコーティングされない可能性があり、あるいはそれらは、胃腸管での分解および吸収を遅らせ、それによってより長い期間にわたる持続作用を提供するために、公知の技術によってコーティングされる可能性がある。たとえば、グリセリルモノステアリン塩酸またはグリセリルジステアリン塩酸などの時間遅延材料が採用される可能性がある。それらはまた、制御放出のための浸透性治療用錠剤を形成するために、米国特許第４，２５６，１０８号、第４，１６６，４５２号、および第４，２６５，８７４号に記載の技術によってコーティングされる可能性もある。
【０１１０】
経口使用のための製剤形態はまた、活性成分がたとえば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性固体希釈剤と混合される硬ゼラチンカプセルとして、あるいは活性成分が水またはたとえば、ピーナッツ油、液体パラフィン、またはオリーブ油などのオイル媒体と混合される軟ゼラチンカプセルとして提示される可能性もある。
【０１１１】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合された活性物質を含む。そのような賦形剤は、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムなどの懸濁剤であり、分散剤または湿潤剤は、天然起源のリン脂質、たとえばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンステアリン塩酸、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、たとえばヘプタデカエチレンオキシセタノール、または脂肪酸およびポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン塩酸などのヘキシトール由来の部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物、たとえばポリエチレンソルビタンモノオレイン塩酸である可能性がある。水性懸濁液はまた、たとえばエチルまたはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸塩などの１つ以上の保存剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、およびスクロース、サッカリンまたはアスパルテームなどの１つ以上の甘味剤も含む可能性がある。
【０１１２】
油性懸濁液は、活性成分を、たとえば落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油などの植物油中、または流動パラフィンなどの鉱物油中に懸濁することによって配合される可能性がある。油性懸濁液は、たとえば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含む可能性がある。上記のような甘味剤、および香味剤は、口当たりがよい経口製剤を提供するために添加される可能性がある。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存される可能性がある。
【０１１３】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つの以上の保存剤と混合した活性成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、既に上述したものによって例示される。追加の賦形剤、たとえば、甘味剤、香味剤および着色剤も存在する可能性がある。
【０１１４】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態である可能性もある。油性相は、たとえばオリーブ油または落花生油などの植物油、たとえば流動パラフィンなどの鉱物油、あるいはこれらの混合物である可能性がある。適切な乳化剤は、天然起源のリン脂質、たとえば大豆、レシチン、および脂肪酸およびヘキシトール無水物由来のエステルまたは部分エステル、たとえばモノオレイン酸ソルビタン、および前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン塩酸である可能性がある。エマルジョンはまた、甘味剤および香味剤を含有する可能性がある。
【０１１５】
シロップおよびエリキシルは、たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤と共に配合される可能性がある。そのような製剤形態はまた、粘滑剤、保存剤、香料および着色剤を含有する可能性がある。医薬組成物は、無菌注射用水性または油脂性懸濁液の形態である可能性がある。この懸濁液は、上述した適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、公知の技術に従って配合される可能性がある。無菌注射用調剤はまた、たとえば１，３−ブタンジオールなどの、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液または懸濁液である可能性もある。採用の可能性がある許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発油は、溶媒または懸濁媒体として従来技術において採用されている。この目的のために、あらゆる無菌の不揮発油が、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含め採用される可能性がある。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製に使用される。
【０１１６】
化合物は、植物油または他の同様の油、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステルまたはプロピレングリコールなどの水性もしくは非水性溶媒に、また所望の場合は、溶解化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および保存剤などの従来の添加剤と共に、溶解、懸濁または乳化することにより注射用製剤に配合することができる。
【０１１７】
化合物は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤形態で利用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴射剤に配合することができる。
【０１１８】
さらに、化合物は、乳化基剤または水溶性基材などの様々な基材と混合することによって座薬にすることができる。本発明の化合物は、座薬を介して直腸投与することができる。座薬は、体温で融解するが、室温で固化するカカオ脂、カーボワックスおよびポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことができる。
【０１１９】
局所投与で活性である本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される塩は、経皮組成物または経皮送達デバイス（「パッチ」）として配合することができる。このような組成物は、たとえば、バッキング、活性化合物レザバー、制御膜、ライナーおよび接触接着剤を含む。そのような経皮パッチは、制御された量で本発明の化合物の連続的または非連続的注入を提供するために使用される可能性がある。薬剤の送達のための経皮パッチの構築および使用は、当該技術分野において周知である。たとえば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、１９９１年６月１１日に発行された、米国特許第５，０２３，２５２号を参照できる。そのようなパッチは、薬剤を連続的に、パルス状に、またはオンデマンド式に送達するように構築される可能性がある。
【０１２０】
任意に、医薬組成物は、他の薬学的に許容される成分、たとえば、緩衝剤、界面活性剤、酸化防止剤、粘度調整剤、保存剤などを含有する可能性がある。これらの成分の各々は当技術分野において周知である。たとえば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９８５，３１０を参照できる。
【０１２１】
本発明の製剤形態に使用するために適した他の成分は、レミントンの薬科学、メイス出版社、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、第１７版（１９８５）に見出すことができる。一実施形態において、シクロデキストリン水溶液は、さらにデキストロース、たとえば、約５％のデキストロースを含む。
【０１２２】
一日あたり体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１４０ｍｇ／ｋｇ、あるいは１日当たり患者当たり約０．５ｍｇから約７ｇの投与量レベルが、代表的な実施形態において有用である。たとえば、炎症は、１日に体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから５０ｍｇの化合物、あるいは１日当たり患者当たり約０．５ｍｇから約３．５ｇの投与によって効果的に治療することができる。当業者であれば、投与量レベルが特定の化合物の機能、症状の重篤度および被験体の副作用に対する感受性によって変化し得ることを容易に理解するであろう。所与の化合物のための投与量は、種々の手段によって当業者によって容易に決定される。
【０１２３】
単回投与形態を生成するために担体材料と組み合わせる可能性がある活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて変化するであろう。たとえば、ヒトの経口投与を意図する製剤形態は、全組成物の約５パーセントから約９５パーセント変化する可能性がある担体材料の適切かつ好都合な量と混合された、０．５ｍｇから５ｇの活性剤を含有する可能性がある。単位剤形は、大略的に、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、または１０００ｍｇなどの、約１ｍｇから約５００ｍｇの活性成分を含有するであろう。
【０１２４】
しかし、あらゆる特定の患者に対する特定の用量レベルが、年齢、体重、健康全般、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄作用の速度、薬物の組合せおよび治療を受けている特定の疾患の重症度を含む様々な要因に依存するということは理解されるであろう。
【０１２５】
したがって、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液などの経口または直腸投与のための単位剤形は、各用量単位、たとえば、茶さじ１杯、テーブルスプーン１杯、錠剤または座薬が、所定量の１つ以上の阻害剤を含む組成物を含む状態で提供される可能性がある。同様に、注射または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、生理食塩水または別の薬学的に許容される担体中の溶液として組成物中に阻害剤（単数または複数）を含む可能性がある。本明細書で使用する「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物の被験体のための単位用量として適した物理的に分離した単位を意味し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルに伴って所望の効果をもたらすために十分な量で計算された、所定量の本発明の化合物を含む。本発明の新規な単位剤形の仕様は、採用される特定のペプチド模倣化合物および達成されるべき効果、ならびに宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。当業者であれば、用量レベルが特定のヌクレオシド剤の機能、送達ビヒクルの性質などによって変化し得ることを容易に理解するであろう。所与のヌクレオシド剤の好ましい用量は、当業者であれば、種々の手段によって容易に判定される。
【０１２６】
キットおよびシステム
また、上述のような方法の実施形態の実施に使用されるキットおよびシステムも提供される。本明細書で使用される「システム」という用語は、本発明の方法を実施する目的のために集められた、単一または異なる組成物内に存在する２つ以上の異なる活性剤の集合体を意味する。キットという用語は、完成単位の活性剤または薬剤を意味する。いくつかの実施形態では、本発明のシステムまたはキットは、（たとえば、本明細書に記載されるように）ヌクレオシド剤および（たとえば、本明細書に記載されるように）第２の活性剤を含む。特定の事例において、第２の活性剤は、ドーパミン枯渇剤（たとえば、テトラベナジンまたはレセルピン）、ドーパミン受容体拮抗薬（たとえば、神経遮断剤）、アマンタジン、レベチラセタム、抗痙攣薬（たとえば、バルプロ酸）、ベンゾジアゼピン剤（たとえば、クロナゼパム）、ラキニモド、プリドピジン、ラサギリン、汎ＰＰＡＲアゴニスト（たとえば、ベンゾフィブラート）、抗精神病薬（たとえば、リスペリドンまたはハロペリドール）およびＨＴＴ一塩基多型（ＳＮＰ）を標的とするＲＮＡサイレンシング剤から選択される。本発明の方法を実施するためのキットおよびシステムは、１つ以上の医薬製剤を含む可能性がある。したがって、特定の実施形態において、（たとえば、本明細書に記載されるように）キットは１つ以上の単位用量として存在する単一の医薬組成物を含む可能性があり、組成物は１つ以上のヌクレオシド化合物を含んでいる可能性がある。いくつかの実施形態では、（たとえば、本明細書に記載されるように）キットは、各々異なる活性剤を含み、そのうちの少なくとも１つがヌクレオシド化合物である、２つ以上の別々の医薬組成物を含んでいる可能性がある。
【０１２７】
また、たとえば上述のように、本発明の方法で使用されるキットおよびシステムも目的とする。そのようなキットおよびシステムは、目的のタンパク質、酵素基質、染料、緩衝液等をコード化する、たとえば、ヌクレオシド剤、細胞、ベクターなどの、本発明の方法の１つ以上の成分を含む可能性がある。種々のキット成分が、たとえば無菌容器などの容器内に存在する可能性があり、成分は同じまたは異なる容器内に存在する可能がある。
【０１２８】
上記の成分に加えて、本発明のキットはさらに、本発明の方法を実施するための使用説明を含むことができる。これらの使用説明は本発明のキット内に様々な形態で存在する可能性があり、そのうちの１つ以上はキット内に存在する可能性がある。これらの使用説明が存在する可能性がある一形態は、たとえば情報が印刷された１枚以上の紙などの適切な媒体または基材上、キットのパッケージ内、パッケージの添付文書内などに印刷された情報として存在する可能性がある。さらに別の手段は、情報が記録されたコンピュータ読み取り可能な媒体、たとえば、フロッピーディスク、ＣＤなどが考えられる。存在する可能性があるさらに別の手段は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用する可能性があるウェブサイトのアドレスである。キット内に、あらゆる好都合な手段が存在する可能性がある。
【０１２９】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定するものではない。
【０１３０】
実験例
以下の方法および材料は、本発明の薬剤および組成物の評価における使用に適切である可能性がある。
Ｉ．Ｓｐｔ４／Ｓｐｔ５タンパク質／タンパク質相互作用阻害剤の識別
Ａ．二分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）の測定
１．材料および方法
ａ．プラスミド構築物
ｉ．ｐＨＡ−Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣおよびｐＦＬＡＧ２−ＮＧＮ−ＹＮ
ヒトＳｕｐｔ４ｈおよびＳｕｐｔ５ｈＮＧＮを、それぞれＹＣおよびＹＮとインフレームで融合させた。ＹＮおよびＹＣは、黄色蛍光タンパク質ビーナスのＮ末端およびＣ末端ドメインを表す。２つのポリペプチドの結合によって引き起こされるタンパク質の折り畳みの変化を防ぐために（Ｋｅｒｐｐｏｌａ「生きた細胞内のタンパク質の相互作用の可視化のための二分子蛍光相補（ＢｉＦＣ）測定のデザインおよび実行」ネイチャー・プロトコル（２００６）１：１２７８〜１２８６）、さらに１０個のアミノ酸残基を含有するタンパク質リンカーが融合タンパク質に含まれていた。また、余剰のアミノ酸ＧＳＨＭが、そのタンパク質の安定性を増大させるためにＳｕｐｔ５ｈＮＧＮに組み込まれた（Ｗｅｎｚｅｌ，ｅｔ  ａｌ．「ｈＳｐｔ５の二量体化界面との複合体におけるヒト転写伸長因子ＤＳＩＦ  ｈＳｐｔ４サブユニットの結晶構造」生化学ジャーナル（２０１０）４２５：３７３〜３８０）。Ｓｕｐｔ４ｈ、ＮＧＮ、ＹＣ、およびＹＮを、タンパク質リンカーのヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を生成するために、ＰＣＲによって増幅した。Ｓｕｐｔ４ｈおよびＮＧＮ  ＰＣＲ産物を、その後、二次重複ＰＣＲのためにＹＮまたはＹＣのＰＣＲ産物と混合した。最後に、得られたＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣおよびＮＧＮ−ＹＮ  ＤＮＡ断片を、それぞれ、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＡおよびｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２にクローン化した。
【０１３１】
ｉｉ．ｐＴＲＥ−ＨＡ−Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣ−ＦＬＡＧ−ＮＧＮ−ＹＮおよびｐＴＲＥ−ＨＡ−ビーナス
ＨＡ−Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣおよびＦＬＡＧ−ＮＧＮ−ＹＮ断片を、上述のようにプラスミド構築物を用いてＰＣＲにより増幅し、テトラサイクリンの制御下で双方向ＣＭＶプロモーターを含むｐＴＲＥ−ｔｉｇｈｔ−ＢＩベクター（クロンテック・ラボラトリーズ）に個々にサブクローン化した。そのＮ末端にＨＡエピトープを有する黄色蛍光タンパク質ビーナスのコード配列を、ｐＴＲＥ−ＨＡ−ビーナスを生成するためにＰＣＲ増幅してベクターにクローン化した。
【０１３２】
ｂ．細胞培養
ＴｅｔオンのＨｅＬａ細胞（クロンテック・ラボラトリーズ）、および安定したライン２−ＰＮ４および２１−ＶＳを、５％のＣＯ２で、３７℃で、１０％のＴｅｔオフのウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）内で培養した。ＨｄｈのＱ７／Ｑ７（マウス）、ＨｄｈＱ１１１／Ｑ１１１（マウス）を、５％のＣＯ２で、３３℃で、１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養した。
【０１３３】
ｃ．安定な細胞株
ＴｅｔオンのＨｅＬａ細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、線形化されたｐＴＲＥ−ＨＡ−Ｓｕｐｔ４ｈ−ＶＣ−Ｆｌａｇ−ＮＧＮ−ＶＮプラスミド構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を、最初にピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有する増殖培地内で培養し、その後、テトラサイクリン（４μｇ／ｍｌ）の存在下にＹＦＰ蛍光を示すクローンを選択した。最も強い蛍光シグナルを有する安定したラインを単離し、２−ＰＮ４と命名した。同様に、２１−ＶＳの安定したラインを、ｐＴＲＥ−ＨＡ−ビーナスを使用して作成した。
【０１３４】
ｄ．蛍光強度の測定
安定したライン２−ＰＮ４および２１−ＶＳを６ウェルプレートで予め培養し、続いて、２４時間、様々な濃度の化学化合物と共にドキシサイクリン（４μｇ／ｍｌ）を培養させた。細胞をＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、顕微鏡（２０倍倍率）により観察した。ＩＳＯ１６００、光画像に対して１／２００シャッター、および蛍光画像に対して１／２シャッターの設定で、ニコンＤ５００カメラを用いて写真を撮影した。蛍光強度の定量化のために、同様の細胞数の５枚の写真を撮影し、蛍光シグナルを個々にＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアによって測定した。全体的な蛍光シグナルの平均を判定し、ＤＭＳＯ処理した対照試料で観察されたものと比較した。
【０１３５】
ｅ．抗体
α−チューブリン（ＤＭ１Ａ、Ｓｉｇｍａ）、ＦＬＡＧ−エピトープ（Ｆ４０４１、Ｓｉｇｍａ）、およびＨＡエ−ピトープ（１６Ｂ１２、Ｃｏｖａｎｃｅ）に対する抗体を購入した。
【０１３６】
ｆ．ウェスタンブロッティング
上述のように（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．「Ｓｐｔ４は選択的に拡張トリヌクレオチド反復の転写に必要とされる」Ｃｅｌｌ（２０１２）１４８：６９０〜７０１）、等量のタンパク質を１２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜上（ニトロセルロース、ウォーターマン、０．４５μΜ、ＮＢＡ０８５Ｃ）に移した。０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝生理食塩水内で５％の低脂肪乳でブロッキングした後、膜を一次抗体でプローブし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合二次抗体で培養し、ＥＣＬ試薬（強化化学発光、パーキンエルマー）により検出した。
【０１３７】
ｇ．共免疫沈降
３６時間の６ＣＲ（Ｃｆ＝２０μΜ）の処置後、２−ＰＮ４細胞を、改質ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１％のＮＰ−４０、１％のデオキシコール酸ナトリウム）で、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｓｉｇｍａ）を補充して、溶解した。収集されたタンパク質溶解物（１ｍｇ）を、改質ＲＩＰＡ緩衝液で最終容量０．５ｍｌに希釈し、次いで一晩、抗ＨＡ抗体（１μｇ）で培養した。さらに６時間のタンパク質Ａアガロースビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）との培養後、ビーズを２０μΜ６ＣＲを含む改質ＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄した。これらはすべて、４℃で実施した。ＨＡ−Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣと共沈したタンパク質の検出のために、免疫複合体を、抗ＨＡおよび抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティング分析に続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。
【０１３８】
ｈ．ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）を用いて、マウスの神経細胞から抽出した。ｃＤＮＡの変換のために、２μｇの全ＲＮＡを５μΜのランダムプライマー、５μΜのＳｎＲＮＡ  Ｕ６のｒｔ−ＰＣＲプライマーおよび５００μΜのｄＮＴＰと混合し、５分間６５℃で培養し、その後、氷上で冷却した。ファーストストランド緩衝液、ＤＴＴ（Ｃｆ＝１０ｍΜ）および１μｌの逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加後、１時間４２℃で反応を行った。等量のｃＤＮＡ産物をＰＣＲ増幅し、２．５％のアガロースゲル上で分解してＵ６または１８ＳリボソームＲＮＡとの正常化後のＨｔｔ転写産物の存在量を判定した。
【０１３９】
２．結果
生きた細胞におけるＳｕｐｔ５ｈＮＧＮとＳｕｐｔ４ｈとの間の相互作用を監視するために、二分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）測定（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．「二分子蛍光相補性を使用した生きた細胞内のｂＺＩＰおよびＲｅｌファミリータンパク質間の相互作用の可視化」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．（２００２）９：７８９〜７９８）を採用した。ヒトＳｕｐｔ５ｈ  ＮＧＮおよびＳｕｐｔ４ｈを、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の別個の断片に融合させた。ＹＦＰの相補性が発生するため、ＹＮおよびＹＣの断片は近接（図２Ａ）でなければならない。ＮＧＮ／Ｓｕｐｔ４ｈ複合体の結晶構造（Ｗｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、前出）は、これらのタンパク質のＣ末端が空間的に互いに整列していることを明らかにした。したがって、我々のデザインでは、ＹＮおよびＹＣの断片を、ＹＦＰ相補および蛍光信号の後続の生成を促進するために、これらのタンパク質のそれぞれのＣ末端に融合させた。
【０１４０】
測定を最初に、ＹＮ、ＹＣ、ＮＧＮ−ＹＮ、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣを過渡的に発現するＨｅＬａ細胞内で、単独で、またはこれらのタンパク質を組み合わせて試験した。ＮＧＮ−ＹＮは、その中でＳｕｐｔ５ｈ  ＮＧＮドメインがＹＦＰ  ＹＮに融合される遺伝子操作タンパク質であり、一方、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣはＳｕｐｔ４ｈおよびＹＦＰ  ＹＣからなる融合タンパク質である。我々は、ＹＮおよび／またはＹＣ発現が蛍光シグナルを生成せず明らかにもしないことを発見した。しかし、ＮＧＮ−ＹＮおよびＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣが同時に発現される場合、強い蛍光シグナルが検出可能である（図２Ｂ）。より重要なことに、Ｓｕｐｔ４ｈ点の変異（Ｓ６９Ｌ）が相互作用の測定に導入される場合、蛍光シグナルは大幅に低減される（図２Ｃ）。Ｓｕｐｔ４ｈ中のセリン６９のアミノ酸残基は、Ｓｕｐｔ４ｈとＳｕｐｔ５ｈ  ＮＧＮとの間の相互作用界面の安定化に重要な役割を果たし、セリンのロイシンへの置換は易感染性のＳｕｐｔ４ｈ／ＮＧＮの相互作用をもたらす。したがって、これらのデータは、ＹＦＰの相補性がそれ自体Ｓｕｐｔ４ｈとＳｕｐｔ５ｈ  ＮＧＮとの相互作用に依存しており、そのような相互作用の阻害が測定において蛍光シグナルの減少によって検出可能であることを示している。
【０１４１】
上述のように、ＢｉＦＣ法に基づき、ハイスループット薬物スクリーニングの目的のために、我々は、ｔｅｔオン誘導性プロモーターの制御下で、ＮＧＮ−ＹＮおよびＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣを同時発現する安定な細胞株を作成した。いったんＹＮおよびＹＣの断片が互いに結合されると、既存の補完ＹＦＰ分子が非常に低い解離速度を有するため（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．「二分子蛍光相補性を使用した生きた細胞内のｂＺＩＰとＲｅｌファミリータンパク質との間の相互作用の可視化」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．（２００２）９：７８９〜７９８）、我々のデザインでは、改変タンパク質は、試験化合物を培養細胞に添加すると同時に、ドキシサイクリンによって誘導される。ＮＧＮとＳｕｐｔ４ｈとの相互作用によって駆動される相補性が所与の試験化合物によって阻害される場合、新規のＹＦＰ蛍光シグナルが影響を受ける。ＹＦＰ蛍光の減少がｔｅｔオン誘導性プロモーターまたはＹＦＰの機能への負の影響によるものであるという可能性を排除するために、別の無傷官能基ＹＦＰを発現するｔｅｔオン誘導性細胞株が対照として含まれる。
【０１４２】
我々は２−ＰＮ４と命名された安定な細胞株を生成し、この細胞株は同時にＮＧＮ−ＹＮおよびＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣを発現し、テトラサイクリン依存的（図３Ａ）にＹＦＰ蛍光シグナルを生成することを特徴としている。加えて、我々は、ＹＮ／ＹＣ相補を必要とせずに直接、ＹＦＰ蛍光シグナルを生成する対照細胞株２１−ＶＳ（図３Ａ）を生成した。これらの二つの安定な細胞株を用いて、我々は、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＮの異所性発現が、２１−ＶＳ細胞ではなく（図３Ｂ）、２−ＰＮ４からの蛍光シグナルの減少をもたらすことを発見した。Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＮは、ＮＧＮ−ＹＮと相互作用し、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣおよびＮＧＮ−ＹＮによって駆動されるＹＦＰの相補性を妨害することができる。したがって、我々のデータは、２−ＰＮ４の蛍光シグナルがＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣとＮＧＮ−ＹＮとの間の相互作用を防止する負の効果を受けやすいことを示している。このデータはまた、安定したライン２−ＰＮ４は、２１−ＶＳの使用と共に、Ｓｕｐｔ４ｈ／５ｈの複合体形成を明確に阻害する化合物の同定および特徴付けに適していることも示している。
【０１４３】
ハイスループットスクリーニングを介して、いくつかのヌクレオシド化合物を同定した。２−ＰＮ４および２１−ＶＳ細胞の蛍光シグナルに対するこれらの化合物の効果を、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣおよびＳｕｐｔ５ｈＮＧＮ−ＹＮのタンパク質相互作用に対するこれらの化合物の影響と共に、さらに特徴付けた。我々は、６−クロロプリンリボシド（６ＣＲ）が濃度依存的に２−ＰＮ４細胞の蛍光シグナルを減少させることを発見した。蛍光強度は１０μΜの６ＣＲで対照試料の半分に、また、より高用量でより大きく減少した（図４Ａ）。そのような阻害は２−ＰＮ４細胞において明らかであるが、２１−ＶＳ細胞の蛍光シグナルは、同じ実験条件下では６ＣＲによって変化せず（図４Ａ）、６ＣＲの阻害作用がＢｉＦＣの蛍光シグナルに特化されることを示している。２−ＰＮ４細胞において、６ＣＲはＳｕｐｔ４ｈ−ＹＣおよびＮＧＮ−ＹＮのタンパク質発現を妨害しないが（図４Ｂ）、しかし、それはこれらの２つのタンパク質の複合体形成を低下させる（図４Ｃ）。これらの実験結果は、ＢｉＦＣの減少が６ＣＲの処理を行った細胞におけるＳｕｐｔ４ｈ／ＮＧＮタンパク質間相互作用の減少によって媒介されることを示している。我々の以前の調査（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２、前出）において、我々は、Ｓｕｐｔ４ｈ欠損または易感染性のＳｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈ複合体形成が変異ハンチンチン（Ｈｔｔ）遺伝子などの拡張トリヌクレオチド反復を含有する遺伝子の転写の減少をもたらすことを示した。したがって、Ｈｔｔ遺伝子の発現に対する６ＣＲの阻害効果を、マウスの神経細胞株でさらに調べた。我々は、変異対立遺伝子から転写されたＨｔｔｍＲＮＡは６ＣＲによって下方制御されるが、そのような下方制御が野生型Ｈｔｔのホモ接合性対立遺伝子を発現する細胞において検出されない（図４Ｄ）ことを発見した。これらの結果は、転写伸長複合体Ｓｕｐｔ４ｈ／Ｓｕｐｔ５ｈを標的とすることにより、６ＣＲがＨＤの発病の要因である遺伝子の発現を特に減少させることを示している。
【０１４４】
６−アザウリジン（６−ＡＺＡ）もまた、２−ＰＮ４細胞内のＢｉＦＣの蛍光シグナルを阻害する。０．０２μΜの濃度で、６−ＡＺＡは模擬対照に比べてＢｉＦＣ信号の約７０％を減少させる（図５Ａ）。ＢｉＦＣの減少の程度はその平坦域に達したが、２１−ＶＳ細胞の蛍光はより高い濃度の６−ＡＺＡによって著しく影響される（図５Ａ）。６ＣＲと同様、６−ＡＺＡはＳｕｐｔ４ｈ−ＹＮおよびＮＧＮ−ＹＮのタンパク質レベルの変化を介してＢｉＦＣ信号を減少させない（図５Ｂ）。さらに、６−ＡＺＡは、変異体の発現を下方制御するが、野生型Ｈｔｔの対立遺伝子を下方制御しない（図５Ｃ）。これらの実験結果は、６ＣＲおよび６−ＡＺＡの両方が、伸長したＣＡＧ反復を含む遺伝子の発現の減少を伴うＳｕｐｔ４ｈとＳｕｐｔ５ｈとの相互作用を抑制するという点で同様の特性を有することを示している。
【０１４５】
Ｂ．スプリットガウシア（Ｇａｕｓｓｓｉａ）ルシフェラーゼ相補性の測定
１．材料および方法
ａ．プラスミド構築物
ｉ：ｐＮＢＲ−Ｘ１−Ｓｕｐｔ４−Ｇｌｕｃ１およびｐＮＥＢＲ−Ｘ１−ＮＧＮ−Ｇｌｕｃ２
ＨＡ−Ｓｕｐｔ４ｈおよびＦｌａｇ−ＮＧＮの断片を、プラスミドｐＨＡ−Ｓｕｐｔ４ｈ−ＹＣおよびｐＦｌａｇ−ＮＧＮ−ＹＮを用いてＰＣＲにより増幅し、個別にｐｃＤＮＡ３．１−Ｇｌｕｃ１およびｐｃＤＮＡ３．１−Ｇｌｕｃ２にサブクローン化した（２００６年１２月発行のＮａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３（１２）：９７７〜９、２００６年１１月１２日付Ｅｐｕｂに掲載の「ガウシア（Ｇａｕｓｓｓｉａ）ルシフェラーゼに基づく高感度のタンパク質−タンパク質相互作用測定」に記載されている）。次いで、ＨＡ−Ｓｕｐｔ４ｈ−Ｇｌｕｃ１およびＦｌａｇ−ＮＧＮ−Ｇｌｕｃ２をＰＣＲによって増幅し、レオスイッチリガンドの制御下でレオスイッチ応答エレメントを含むｐＮＥＢＲ−Ｘ１−Ｈｙｇｒｏ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に挿入した。
【０１４６】
ｉｉ：ｐＮＥＢＲ−Ｘ１−Ｓｕｐｔ４ｈ−Ｇ１−ＮＧＮ−Ｇ２
ｐＮＥＢＲ−Ｘ１−ＮＧＮ−Ｇ２内に５ＸＲＥからポリＡへの配列を含むＰＣＲ産物をＰｃｉｌ部位でｐＮＥＢＲ−Ｘ１−Ｓｕｐｔ４ｈ−Ｇ１に挿入して、同じプラスミド内のそれら自体のレオスイッチ応答エレメントおよびポリＡ下でＳｕｐｔ４ｈ−Ｇ１およびＮＧＮ−Ｇ２の双方向を生成した。
【０１４７】
ｉｉｉ：ｐＥＧＦＰＣ１−Ｑ２２およびｐＥＧＦＰＣ１−Ｑ４４
ＣＡＧ反復およびＨｔｔ遺伝子の第１のエクソン内の隣接領域の一部を、１つの正常なおよび１つの変異の対立遺伝子（Ｑ２２およびＱ４４）を含むＨＤ患者のリンパ芽球様細胞のｃＤＮＡから、側部制限酵素部位ＮｈｅＩを追加して、ＰＣＲ増幅した。次に、ＰＣＲの断片を、ＥＧＦＰ遺伝子の端部でｐＥＧＦＰ−Ｃ１とインフレーム融合させて、ポリＱタグ付けされたＧＦＰを発現させた。
【０１４８】
ｂ．安定したクローン化細胞株
ｉ：２９３−Ｒ１は、ｐＮＥＢＲ−Ｒ１プラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトすることによって構成的にＲＳＬ１受容体／活性化剤を発現するように操作され、ブラストサイジンで選択された、クローン化された細胞である。
【０１４９】
ｉｉ：Ｍ２−８は、ＲＳＬ１の添加によってｐＮＥＢＲ−Ｘ１−Ｓｕｐｔ４ｈ−Ｇ１−ＮＧＮ−Ｇ２を誘導的に発現できるクローン化された２９３−Ｒ１細胞である。二つの点変異（Ｍ４３ＩおよびＭ１１０Ｉ）を、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ、２０１３年７月；１８（６）：６４７〜５８に掲載された「フィビュリン−３分泌のモジュレータを同定するためのハイスループット細胞ベースのガウシアルシフェラーゼレポーターの測定」に従って、安定性をより改善するために、ＧＬ１およびＧＬ２に導入した。細胞株は、ハイグロマイシンによって選択された。
【０１５０】
ｃ．細胞培養およびトランスフェクションの条件
全てのＨＥＫ−２９３細胞および誘導体の細胞クローンを、３７℃、５％のＣＯ２で、１０％のＦＢＳに対応する抗生物質（２５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン、またはその両方）を加えて含有するＤＭＥＭ内で維持した。全てのトランスフェクションは、製造者の指示に従ってリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行われた。
【０１５１】
ｄ．細胞溶解物内の生物発光の測定
Ｇｌｕｃ１およびＧｌｕｃ２を保有するプラスミドを、１：１の比率で、製造者の指示に従ってリポフェクタミン２０００を使用して、組織培養処理済２４ウェルプレート上に蒔いた２９３−Ｒ１細胞に同時トランスフェクトした。安定した細胞Ｍ２−８については、細胞を直接、９６ウェルまたは３８４ウェル白色プレートに播種した。２４時間後、試験化合物を含む／含まないレオスイッチリガンドを、誘導／薬物治療のために細胞に添加した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、プレートを一晩−２０℃の冷凍庫に入れた。冷凍庫からプレートを取り出した後、溶解緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のトリトンＸ−１００）を、１０μｇ／ｍｌの天然のセレンテラジン（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と、直ちに細胞に加えた。細胞を暗所の室温で１時間溶解した。約１分間振とうした後、４０μｌの細胞溶解物を白色９６ウェルプレートに移した。白色マイクロプレート内のＭ２−８については、転送は全く必要なかった。シグナル強度（統合１００ｍｓ）をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００またはＭ１０００上で読み取った。
【０１５２】
ｅ．ウエスタンブロット分析
細胞試料を氷上で１０分間、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のトリトンＸ−１００内で溶解した。スピニング（１０分間１４ｋｒｐｍ）後の上清を回収した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ測定（Ｐｉｅｒｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって判定した。等量のタンパク質を４〜１２％のゲル上にロードした。電気泳動後、ゲルを１６時間、３５Ｖで湿潤転送することによりニトロセルロース膜に移した。変異ＨＴＴ、総ＨＴＴおよびチューブリンのタンパク質レベルを、抗ポリグルタミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭＡＢ１５７４）、抗ハンチンチンタンパク質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭＡＢ２１６６）、および抗アルファチューブリン（ＡＢＧＥＮＴ社のＡＪ１０３４ａ）を用いた免疫ブロット法によって判定した。ブロットは、Ｌｉ−Ｃｏｒのオデッセイ赤外線映像装置上で画像化した。バンドの強度は、Ｌｉ−Ｃｏｒのオデッセイソフトウェアによって決定された。
【０１５３】
２．結果
生きた細胞におけるＳｕｐｔ５ｈＮＧＮとＳｕｐｔ４ｈとの間の相互作用を監視するために、レポーターとしてスプリットガウシアプリンセプルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）を用いたタンパク質−断片相補性測定（ＰＣＡ）を使用した（Ｒｅｍｙ＆Ｍｉｃｊｈｍｉｃｋ「ガウシアルシフェラーゼに基づく高感度のタンパク質−タンパク質相互作用測定」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００６）３：９７７〜９７９）。ＰＣＡで使用される場合、ガウシアルシフェラーゼは、サブ内因性発現内でさえも、タンパク質−タンパク質相互作用の検出を可能にする感受性レポーターであり、２つのスプリットＧＬｕｃの相互作用は完全に可逆的である。
【０１５４】
Ｓｕｐｔ４ｈタンパク質またはＳｕｐｔ５ｈ（ＮＧＮ）のアミノ末端ドメインをコード化するヒト遺伝子を、それぞれＳｕｐｔ４ｈ−ＧＬ１およびＮＧＮ−ＧＬ２を生成するために、ガウシアプリンセプルシフェラーゼのサブユニット（ＧＬｕｃ１またはＧＬｕｃ２）をコード化する遺伝子と融合させた。測定では、２つの分割ＧｌｕｃサブユニットがＳｕｐｔ４ｈとＮＧＮの相互作用によって近接させられる場合、ルシフェラーゼ活性のみ検出可能であるべきである（図６Ａ）。２つの融合タンパク質の発現を制御するために、我々は誘導性遺伝子発現システムであるレオスイッチを用いた（図６Ｂ、ニューイングランドバイオ）。レオスイッチシステムは、レオスイッチリガンド（ＲＳＬ１）受容体を発現する細胞株を必要とする。融合構築物を、レオスイッチリガンド（ＲＳＬ１）によって活性化されるプロモーター（ｐＮＥＢＲ−Ｘ１）の制御下に置いた。我々の構築物の感度および誘導能を試験するために、ＨＥＫ−２９３細胞を過渡的にｐＮＥＢＲ−Ｒ１と、ｐＮＥＢＲＸ１−ｓｕｐｔ４ｈ−Ｇｌｕｃ１、ｐＮＥＢＲＸ１−ＮＧＮ−Ｇｌｕｃ２と、または両方と共にトランスフェクトし、その後ＲＳＬ１を最終濃度１５０ｎＭで細胞培養培地に添加した。ＲＳＬ１添加の２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ガウシアルシフェラーゼ溶解／反応緩衝液で溶解した。ガウシアルシフェラーゼ基質である天然セレンテラジンを、最終濃度１０μｇ／ｍｌで、示された構築物を含む細胞の抽出物に加え、発光の大きさを、ルシフェラーゼによって発せられた光を検出するルミノメーター（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００）を用いて判定した。図６ＣはＳｕｐｔ４ｈ−Ｇ１またはＮＧＮ−Ｇ２またはその両方のいずれかを発現するプロモーターのＲＳＬ１活性化に起因する細胞のルシフェラーゼ活性を示す。ＲＳＬ１または融合構築物をトランスフェクトしただけの細胞の非存在下では、ルシフェラーゼ活性は全く見られない。２つのタンパク質Ｓｕｐｔ４ｈ−Ｇ１およびＮＧＮ−Ｇ２をＲＳＬ１刺激下で一緒に発現させた場合にのみ、ルシフェラーゼ活性の著しい誘導が検出され、ルシフェラーゼ活性がＳｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの相互作用に起因することを示した。検出されるルシフェラーゼ活性は、非常に特異的であり、Ｓｕｐｔ４ｈとＮＧＮとの間の相互作用のみから生じる。図６Ｄは、Ｇ２に連結された他のタンパク質を有するＳｕｐｔ４−Ｇ１またはＮＧＮ−Ｇ２のいずれかがルシフェラーゼ活性を生成しないことを示す。ＮＧＮ上の一点変異（酵母Ｓｐｔ５上のＳ３２４Ｆに対応するヒトＳｕｐｔ５ｈ上のＳ２１４Ｆ）はＳｕｐｔ４ｈ／５ｈ複合体の形成を阻害し、Ｓｕｐｔ４ｈ／ＮＧＮ相互作用によって媒介されるルシフェラーゼ活性を消滅させることができる。
【０１５５】
我々は、１３万の化合物を含む低分子化合物ライブラリーを用いてハイスループットスクリーニングを行う前に、ｐＮＥＢＲ−Ｒ１プラスミドでトランスフェクトした細胞からクローン化された細胞を選択することによってＲＳＬ１受容体を構成的に発現するように操作されたＨＥＫ−２９３細胞クローン（２９３Ｒ１）を作成した。我々はまた、上記のレポーターシステムを変更した。高感度のレポーターであるが、短い半減期を有する発光に触媒作用を及ぼすガウシアルシフェラーゼを、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ、２０１３年７月；１８（６）：６４７〜５８に掲載された「フィビュリン−３分泌のモジュレータを同定するためのハイスループット細胞ベースのガウシアルシフェラーゼレポーターの測定」に従って、２つのアミノ酸置換（Ｍ４３１およびＭ１１０Ｉ）で改質して、はるかに安定した発光を有するレポーターを生成した。同様のレベルで２つの融合タンパク質の発現を確実にするために、Ｓｕｐｔ４ｈ−ＧＬｕｃ１およびＮＧＮ−ＧＬｕｃ２の両方を、それら自体の誘導性プロモーター下で、一つのｐＮＥＢＲＸ１プラスミド内に配置した。構築物をその後、２９３Ｒ１に導入した。抗生物質選択後、誘導時に１５倍超のルシフェラーゼシグナルを表示する細胞クローンＭ２−８を、後の化合物ライブラリーのスクリーニングおよび確認のために選択した。
【０１５６】
ライブラリースクリーニングのために、２０μｌの培養培地内の５０００個の細胞を、白色３８４ウェルプレートの各ウェルに播種した。１６時間後、１５０ｎＭのＲＳＬ１を有する１０μｌの培地を各ウェルに添加し、次いで、化合物を最終濃度１０μΜで添加した。２４時間の培養後、プレートをインキュベーターから取り外し、培養培地をダンピングおよび回転により除去した。プレートをすぐに一晩、マイナス２０℃の冷凍庫に入れた。ルシフェラーゼ活性を測定するために、凍結したプレートを冷凍庫から取り出した直後に２０μｌ／ウェルのＧｌｕｃ溶解緩衝液と混合し（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、５ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のトリトンＸ−１００と１０μｇ／ｍｌの天然のセレンテラジン）、暗所の室温で１時間放置し、暗所で１．５分間振とうした。ルシフェラーゼシグナルをルミノメーター（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００）により測定した。１３万個の小分子化合物による初回のスクリーニングの後、ルシフェラーゼ活性の５０％以上の阻害を示した１００８個の化合物を、８点の用量応答試験を介したさらなる分析のために選択し、これらの化合物の細胞毒性もまた評価した。３３１個の化合物は僅かな毒性またはＬＣ５０より少なくとも２倍低いＩＣ５０を示した。候補の化合物のうち、６−アザウリジンを同定した。上述の独立したＢｉＦＣスクリーニングから、別のヌクレオシドである６−ＣＲもまた同定した。両方のスクリーニングを組み合わせることで、我々は様々なヌクレオシドを試験した。結果はルシフェラーゼ活性の阻害の種々の程度を示し、いくつかの化学修飾が阻害効果を低減させることができることを示した（図７Ａ〜Ｄ）。
【０１５７】
ＩＩ．ポリＱタンパク質発現への６−アザウリジンの影響
Ａ．ＨＤ１０１は、長いポリＱのアミノ末端を有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現レベルを優先的に低下させる。
前項で報告した２つの独立したシステムである、ＹＦＰベースの二分子蛍光相補性の測定（ＢｉＦｃ）およびガウシア（Ｇｕａｓｓｉａ）ルシフェラーゼベースのタンパク質相補性測定（ＰＣＡ）によって、Ｓｕｐｔ４ｈ／ＮＧＮ間の相互作用を阻害するその能力について確認されているヌクレオシドの６−アザウリジン（ＨＤ−１０１）が異なるポリＱ長さのタンパク質の発現に差次的に影響を与えることができるかどうかを試験するために、我々は、蛍光顕微鏡を用いて直接、ポリＱタンパク質発現の定量を可能にする蛍光レポーターシステムを確立した。
【０１５８】
ポリＱ（Ｑ２０）の通常の長さおよびポリＱ（Ｑ４４）の病原性の長さをｅＧＦＰＣ１タンパク質のアミノ末端にインフレーム融合させて、Ｑ４４−およびＱ２０−ＧＦＰを生成した（図８Ａ）。ポリＱタグ付けされたＧＦＰを担持するプラスミドを、９０％を超えるトランスフェクション効率でＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、Ｑ４４−ＧＦＰでトランスフェクトした細胞内にはタンパク質凝集体が見られたが（図８Ｂ）、Ｑ２０−ＧＦＰでトランスフェクトした細胞内の観察では、細胞培養の長期間後でも、タンパク質凝集体は全く存在せず（データは図示せず）、ポリＱタグ付けされたＧＦＰ構築物がポリＱの異なる長さを有するＨｔｔと同じタンパク質の特性を有することを示した。
【０１５９】
ＨＥＫ２９３細胞を上述のＧＦＰ構築物で過渡的にトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後、細胞を２４ウェルプレートのウェル間で分割し、種々の濃度のＨＤ１０１をウェルに添加した。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、次いでＤＡＰＩで核染色した。蛍光顕微鏡で細胞の画像を撮影し（図９Ａ）、各フィールドのＧＦＰおよびＤＡＰＩ強度をＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ６．２ソフトウェアを使用して定量した。定量後、結果は、ＨＤ１０１が、より高い濃度ではＱ２０およびＱ４４−ＧＦＰの両方を著しく下方制御し、ｅＧＦＰＣ１発現に最小の影響を有する一方、低濃度ではＱ４４−ＧＦＰのみを下方制御することを示した（図９Ｂ）。結果は、ＨＤ１０１が、他のタンパク質の発現に影響を与えることなく、ポリＱの病理学的な長さを含むタンパク質の発現に優先的に影響を与えることを示している。
【０１６０】
Ｂ．ＨＤ１０１およびＨＤ１０６は、内因性の変異型ハンチンチンタンパク質の発現レベルを優先的に低下させる。
ヌクレオシド６−アザウリジン（ＨＤ１０１）および（−）−６−アザウリジン２’，３’，５’−トリアセテート（ＨＤ１０６）が長いポリＱドメインを有するタンパク質の発現に影響を与えることができるか否かを試験するために、１８０回のＣＡＧ反復を有する変異ｈｔｔ遺伝子の一方の対立遺伝子を担持するハンチントン病患者から得られた１つのｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）株ＮＤ３６９９９を、コーリエル研究所から購入した。ｉＰＳＣを、マトリゲルでコーティングした２４ウェルプレートに播種した。細胞が約７０％の集密度まで成長した後、ＨＤ１０１またはＨＤ１０６を指示された濃度で添加した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、プレートを一晩−２０℃で凍結した。細胞を溶解し、タンパク質濃度をＢＣＡ測定により決定した。等量のタンパク質を、変異ＨＴＴ、総ＨＴＴおよびチューブリンを認識する抗体を用いたウエスタンブロットのためのタンパク質ゲルにロードした。画像（図１０）を撮影し、Ｌｉ−Ｃｏｒ社のオデッセイ・イメージング・システムによって定量化した。結果は、ＨＤ１０１およびＨＤ１０６の両方が総ハンチンチンタンパク質の発現レベルにほとんど効果が無い用量依存的方法で変異型ハンチンチンタンパク質を優先的に減少させることができたことを示した。
【０１６１】
添付の請求項にもかかわらず、本明細書に記載される開示は、以下の付記によっても定義される。
１．細胞内の標的遺伝子の有害な影響を低減する方法であって、
細胞を、変異拡張ヌクレオチド反復（ＮＲ）ドメインを含む標的遺伝子の細胞内の前記有害な影響を減少させる有効量のヌクレオシド剤に接触させることを含む、方法。
２．ヌクレオシド剤が標的遺伝子の毒性発現産物の発現を減少させる、付記１に記載の方法。
３．毒性発現産物はリボ核酸の発現産物である、付記２に記載の方法。
４．毒性発現産物は変異タンパク質である、付記２に記載の方法。
５．ヌクレオシド剤が毒性発現産物の発現を差次的に減少させる、付記２〜４のいずれか一つに記載の方法。
【０１６２】
６．毒性の発現産物が変異タンパク質である、付記５に記載の方法。
７．細胞内の標的遺伝子の変異対立遺伝子によりコード化されるタンパク質の量が、遺伝子の正常な対立遺伝子によってコード化されるタンパク質の量に比べて減少する、付記６に記載の方法。
８．変異拡張ＮＲドメインが遺伝子のコード領域内に存在する、付記１に記載の方法。
９．変異拡張ＮＲドメインが遺伝子の非コード領域内に存在する、付記１に記載の方法。
１０．変異拡張ＮＲドメインが変異トリヌクレオチド反復（ＴＮＲ）ドメインである、付記１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【０１６３】
１１．変異拡張ＴＮＲドメインがＣＡＧ反復ドメインである、付記１０に記載の方法。
１２．変異拡張ＴＮＲドメインが３５以上のＣＡＧ反復を含む、付記１１に記載の方法。
１３．変異拡張ＴＮＲドメインがＣＴＧ反復ドメインである、付記１０に記載の方法。
１４．変異拡張トリヌクレオチド反復ドメインが２６以上のＣＴＧ反復を含む、付記１３に記載の方法。
１５．変異拡張ＴＮＲドメインがＣＧＧ反復ドメインである、付記１０に記載の方法。
【０１６４】
１６．変異拡張ＴＮＲドメインがＧＣＣ反復ドメインである、付記１０に記載の方法。
１７．変異拡張ＴＮＲドメインがＧＡＡ反復ドメインである、付記１０に記載の方法。
１８．標的遺伝子が、アタキシン１、アタキシン２、アタキシン３、アタキシン７、ＴＢＰ、アトロフィン１、アンドロゲン受容体タンパク質およびハンチンチンタンパク質（ＨＴＴ）遺伝子からなる群から選択される、付記１〜８のいずれか一つまたは付記１０に記載の方法。
１９．遺伝子がＨＴＴ遺伝子である、付記１８に記載の方法。
２０．変異拡張ＮＲドメインが変異拡張ヘキサヌクレオチドドメインである、付記１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【０１６５】
２１．変異拡張ヘキサヌクレオチドドメインがＧＧＧＧＣＣである、付記２０に記載の方法。
２２．ヌクレオシド剤が細胞内のＳＰＴ４タンパク質の機能を調整する、付記１〜２１のいずれか一つに記載の方法。
２３．ヌクレオシド剤がＳＰＴ４タンパク質と第２のタンパク質との相互作用を減少させる、付記２２に記載の方法。
２４．第２のタンパク質がＳＰＴ５タンパク質である、付記２３に記載の方法。
２５．ヌクレオシド剤がＳｕｐｔ４ｈとＳｕｐｔ５ｈとの間の相互作用を減少させる、付記２４に記載の方法。
【０１６６】
２６．ヌクレオシド剤がＳｕｐｔ５ｈとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの間の相互作用を減少させる、付記２５に記載の方法。
２７．細胞が生体外である、付記１〜２６のいずれか一つに記載の方法。
２８．細胞が生体内である、付記１〜２６のいずれか一つに記載の方法。
２９．方法が、細胞を含む被験体にヌクレオシド剤を投与することを含む、付記２８に記載の方法。
３０．被験体が哺乳動物である、付記２９に記載の方法。
【０１６７】
３１．被験体が疾患状態に苦しんでおり、方法が疾患状態の進行を変更する、付記２９または３０に記載の方法。
３２．方法が疾患状態の症状を調整する、付記３１に記載の方法。
３３．方法が疾患状態の代理マーカーを調整する、付記３２に記載の方法。
３４．同時にまたは連続して第２の活性剤を投与することをさらに含む、付記２９〜３３のいずれか一つに記載の方法。
３５．ヌクレオシド剤が、以下の式によって示される化合物またはプロドラッグである、付記１に記載の方法。
【０１６８】
【化７】
2018520111.tif 000010
【０１６９】
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、アシルオキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、リン含有基、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アジド、アミノ、アミノアシルオキシ、および置換アミノから独立して選択され、
Ｚは、プリンもしくはピリミジン、またはその類似体から選択される。
【０１７０】
３６．ヌクレオシド剤がリボヌクレオシド剤またはそのプロドラッグである、付記１に記載の方法。
３７．ヌクレオシド剤が６−デアザプリンリボヌクレオシドおよび６−アザウリジンリボヌクレオシドまたはそのプロドラッグから選択される、付記３６に記載の方法。
３８．６−デアザプリンリボヌクレオシドが以下の式によって示される、付記３７に記載の方法。
【０１７１】
【化８】
2018520111.tif 000011
【０１７２】
式中、
各Ｒは、Ｈ、アシル、アミノアシル、アルキル、置換アルキル、リン含有基および酵素的切断可能基から独立して選択され、
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリールおよびトリハロメチルからなる群から独立して選択される。
３９．各Ｒが、独立して、Ｈまたはアシルであり、Ｒ１１がハロゲンであり、Ｒ１２およびＲ１３が水素である、付記３８に記載の方法。
４０．６−アザウリジンリボヌクレオシドが以下の式によって示される、付記３７に記載の方法。
【０１７３】
【化９】
2018520111.tif 000012
【０１７４】
式中、
各Ｒは、Ｈ、アシル、アミノアシル、アルキル、置換アルキル、リン含有基および酵素的切断可能基から独立して選択され、
Ｒ２１およびＲ２２は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリールおよびトリハロメチルからなる群から独立して選択される。
【０１７５】
４１．各Ｒが、独立して、Ｈまたはアシルであり、Ｒ２１が水素であり、Ｒ２２が水素である、付記４０に記載の方法。
４２．リボヌクレオシド剤が以下の構造の１つから選択される、付記３７に記載の方法。
【０１７６】
【化１０】
2018520111.tif 000013
【０１７７】
４３．試料内のＳＰＴ４タンパク質とＳＰＴ５タンパク質との相互作用を減少させる方法であって、
試料を、ＳＰＴ４タンパク質とＳＰＴ５タンパク質との相互作用を選択的に減少させる有効量のヌクレオシド剤に接触させることを含む、方法。
４４．ヌクレオシド剤がＳｕｐｔ４ｈとＳｕｐｔ５ｈとの間の相互作用を減少させる、付記４３に記載の方法。
４５．ヌクレオシド剤がリボヌクレオシド剤またはそのプロドラッグである、付記４３に記載の方法。
【０１７８】
４６．試料が細胞を含む、付記４３に記載の方法。
４７．細胞が生体外である、付記４３に記載の方法。
４８．細胞が生体内である、付記４３に記載の方法。
４９．キットであって、
ヌクレオシド剤と、
第２の活性剤と、を含む、キット。
５０．ヌクレオシド剤が、以下の式によって示される化合物またはそのプロドラッグである、付記４９に記載のキット。
【０１７９】
【化１１】
2018520111.tif 000014
【０１８０】
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、アシルオキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、リン含有基、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アジド、アミノ、アミノアシルオキシ、および置換アミノから独立して選択され、
Ｚは、プリンもしくはピリミジン、またはその類似体から選択される。
【０１８１】
５１．ヌクレオシド剤がリボヌクレオシド剤またはそのプロドラッグである、付記５０に記載のキット。
５２．ヌクレオシド剤が６−デアザプリンリボヌクレオシドおよび６−アザウリジンリボヌクレオシドまたはそのプロドラッグから選択される、付記５１に記載のキット。
５３．６−デアザプリンリボヌクレオシドが、以下の式によって示される、付記５２に記載のキット。
【０１８２】
【化１２】
2018520111.tif 000015
【０１８３】
式中、
各Ｒは、Ｈ、アシル、アミノアシル、アルキル、置換アルキル、リン含有基および酵素的切断可能基から独立して選択され、
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリールおよびトリハロメチルからなる群から独立して選択される。
５４．各Ｒが、独立して、Ｈまたはアシルであり、Ｒ１１がハロゲンであり、Ｒ１２およびＲ１３が水素である、付記５３に記載のキット。
５５．６−アザウリジンリボヌクレオシドが、以下の式によって示される、付記５２に記載のキット。
【０１８４】
【化１３】
2018520111.tif 000016
【０１８５】
式中、
各Ｒは、Ｈ、アシル、アミノアシル、アルキル、置換アルキル、リン含有基および酵素的切断可能基から独立して選択され、
Ｒ２１およびＲ２２は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリールおよびトリハロメチルからなる群から独立して選択される。
【０１８６】
５６．各Ｒが、独立して、Ｈまたはアシルであり、Ｒ２１が水素であり、Ｒ２２が水素である、付記５５に記載のキット。
５７．リボヌクレオシド剤またはそのプロドラッグが以下の構造の１つから選択される、付記５２に記載のキット。
【０１８７】
【化１４】
2018520111.tif 000017
【０１８８】
前述の発明は、理解を明瞭にする目的のために図面および実施例によって幾分詳細に説明したが、当業者であれば、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変更および改変を行う可能性があることは容易に明らかであることがわかる。
【０１８９】
したがって、前述の説明は、単に本発明の原理を説明しているに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明確に記載または示されていなくても、本発明の原理を具現化し、その精神および範囲内に包含されている、様々な構成を考案することができるであろうことが理解されるであろう。さらに、本明細書に記載した全ての例および条件付きの言語は、主に当該技術の促進のために本発明の原理および発明者によって寄与される概念を理解する上で読者を支援することを意図しており、そのような具体的に記載された例および条件に限定することを意図しないものと解釈されるべきである。また、本明細書において原理、態様、および本発明の実施形態ならびにその特定の例を列挙する全ての記述は、その構造的および機能的均等物の両方を包含することを意図するものである。さらに、そのような均等物は現在公知の均等物および将来開発される均等物、すなわち、構造に関わらず、同じ機能を実行する開発されたあらゆる構成要素の両方を含むことを意図している。本発明の範囲は、従って、本明細書に図示および記載した例示的な実施形態に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲および精神は添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【０１９０】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約ＮＳ０８５８１２およびＴＲ００１０８５に基づき、政府の支援により行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０１９１】
３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）に従い、本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／１６８，５５８号の出願日の優先権を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。 
【図１】
2018520111.tif 000019
【図２Ａ】
2018520111.tif 000020
【図２Ｂ】
2018520111.tif 000021
【図２Ｃ】
2018520111.tif 000022
【図３Ａ】
2018520111.tif 000023
【図３Ｂ】
2018520111.tif 000024
【図４Ａ】
2018520111.tif 000025
【図４Ｂ】
2018520111.tif 000026
【図４Ｃ】
2018520111.tif 000027
【図４Ｄ】
2018520111.tif 000028
【図５Ａ】
2018520111.tif 000029
【図５Ｂ】
2018520111.tif 000030
【図５Ｃ】
2018520111.tif 000031
【図６Ａ】
2018520111.tif 000032
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2018520111.tif 000038
【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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