(57)【要約】本発明は、ペプチドマイクロアレイ、ペプチドマイクロアレイを作製する方法、およびマイクロアレイを用いてペプチドバインダーを同定する方法に関する。より具体的には、本発明はペプチドマイクロアレイ、ペプチドマイクロアレイを作製する方法、およびマイクロアレイを用いてペプチドバインダーを同定する方法に関するものであり、その際、マイクロアレイは環状ペプチドを含む。本発明はまた、マイクロアレイ上のペプチドをプロテアーゼで処理することによりマイクロアレイ上の環化ペプチドの数を増大させる方法に関する。さらに、本発明は直鎖状および環状ペプチドサブアレイをマイクロアレイ上に作製する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの少なくとも１つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイ：
【化１】
2018515448.tif 000090
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを、反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である］であって、
ここで、前記少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されており、前記少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、前記ペプチドの集団は独立して選択された目的のアミノ酸配列を含む、前記ペプチドマイクロアレイ。
【請求項２】
Ｚは、アミド結合、
【化２】
2018515448.tif 000091
［ここで、ｖは０から６までの整数であり、ｗは０から６までの整数であり、ｙは０から６までの整数であり、＊＊は環状ペプチドの残部への結合点である］からなる群から選択される部分を含む、請求項１に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項３】
Ｚはペプチド結合を含み、Ｑはカルボニルであり、ｑは０であり、ｒは１であり、ｕは０である、請求項１に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項４】
Ｌ’は６−アミノヘキサン酸である、請求項１に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項５】
Ｌ”はＣＨ２ＣＨ２である、請求項１に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項６】
ｔは０であり、ｐは１〜２０の整数である、請求項１に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項７】
ペプチドの集団の目的のアミノ酸配列が同数のアミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項８】
ペプチドの集団の目的のアミノ酸配列が、メチオニンアミノ酸、システインアミノ酸、同一アミノ酸のアミノ酸リピート、またはヒスチジン（Ｈ）−プロリン（Ｐ）−グルタミン（Ｑ）配列からなるアミノ酸モチーフをいずれも含まない、請求項１に記載のペプチドマイクロアレイ。
【請求項９】
式Ｉの少なくとも１つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイの作製方法であって：
【化３】
2018515448.tif 000092
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である］であって、
式ＩＩの官能化ペプチド：
【化４】
2018515448.tif 000093
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｑ、Ｌ’、Ｌ”、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｔ、ｕ、および＊は、式Ｉについて定めたものであり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨ、Ｃ末端キャッピング基、および
【化５】
2018515448.tif 000094
からなる群から選択され；
Ｒ８はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ９はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｘ’はそれぞれ、独立して、結合、Ｚ”に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺ”に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｙ’はそれぞれ、独立して、結合、Ｚ’に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺ’に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚ’およびＺ”はそれぞれ、独立して、結合、−ＯＨ、水素、チオール、アミン、カルボン酸、アミド、アルキン、アジド、場合により置換されたフミノフェノール、天然アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸側鎖、Ｎ末端保護基、およびＣ末端保護基からなる群から選択され、ただし、Ｚ’およびＺ”は結合してＺを形成する相補基であり；
ｂは、０から５０までの整数であり；
＊＊＊は、官能化ペプチドの残部への結合点である］を、Ｚが形成される条件下で反応させる工程を含み、
ここで、前記少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されており、前記少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、前記ペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項１０】
Ｚはペプチド結合を含み、Ｚ’はＣ末端保護基を含み、またはＺ”はＮ末端保護基を含み、Ｑはカルボニルであり、ｑは０であり、ｒは１であり、ｕは０である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｐは１〜２０の整数であり、ｑは０であり、ｒは１であり、ｔは０であり、ｕは０であり、Ｑはカルボニルであり、Ｚはアミド結合である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
下記を含む、ペプチドマイクロアレイの作製方法：
マイクロアレイ表面に共有結合した第１の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも１つの第１の直鎖状ペプチドサブアレイを作製すること；
マイクロアレイ表面に共有結合した第２の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも１つの第２の直鎖状ペプチドサブアレイを作製すること、ここで、第２の複数の直鎖状ペプチドは第１の複数の直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有する；および
第１の複数の直鎖状ペプチドを環化させて複数の環化ペプチドを含む少なくとも１つの環化ペプチドドサブアレイを生成させる条件下でペプチドマイクロアレイを処理すること、ここで、第２の複数の直鎖状ペプチドは実質的に環化しない。
【請求項１３】
第１の複数の直鎖状ペプチドは第１の複数の保護された直鎖状ペプチドであり、ここで、第１の複数の保護された直鎖状ペプチドのＣ末端は第１保護基により保護されている；
第２の複数の直鎖状ペプチドは第２の複数の保護された直鎖状ペプチドであり、ここで、第２の複数の保護された直鎖状ペプチドは第１の複数の保護された直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、第２の複数の保護された直鎖状ペプチドのＣ末端は第１保護基と異なる第２保護基により保護されている；
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１の複数の直鎖状ペプチドおよび第２の複数の直鎖状ペプチドはそれぞれ、カルボン酸側鎖によりマイクロアレイ表面に付着している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
第１の複数の直鎖状ペプチドを環化させる条件下でのペプチドマイクロアレイの処理が、第１の複数の直鎖状ペプチドのＣ末端のカルボキシル基を活性化して第１の複数の直鎖状ペプチドのＮ末端のアミノ基と反応させてアミド結合を形成することを含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドマイクロアレイ、ペプチドマイクロアレイを作製する方法、およびマイクロアレイを用いてペプチドバインダーを同定する方法に関する。より具体的には、本発明はペプチドマイクロアレイ、ペプチドマイクロアレイを作製する方法、およびマイクロアレイを用いてペプチドバインダーを同定する方法に関するものであり、その際、マイクロアレイは環状ペプチドを含む。ある側面において、本発明は、マイクロアレイ上のペプチドをプロテアーゼで処理することによりマイクロアレイ上の環化ペプチドの割合を直鎖状ペプチドと対比して増大させる方法に関する。さらに他の側面において、本発明は直鎖状および環状ペプチドサブアレイをマイクロアレイ上に作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質−タンパク質相互作用を理解することは、基礎研究ならびに種々の生物医学的用途および他の実際の用途にとって重要である。この種の例には、ペプチドフラグメントまたはエピトープと抗体との結合、タンパク質と他のタンパク質の短いフラグメントとの相互作用、ならびにアプタマーと呼ばれるペプチドとそれらのターゲット分子との結合が含まれる。タンパク質に対するペプチドバインダーを同定する簡単で信頼性のある方法の開発は、タンパク質−タンパク質相互作用のメカニズムを理解するのを補助し、薬物探索のための新たな機会を開くであろう。
【０００３】
代謝および疾患進行において鍵となる役割を果たす細胞経路およびターゲットの同定に伴って、疾患状態の理解は指数関数的に拡大し続けている。疾患の理解は前進したが、既存の薬物プラットホームに固有の限界のため、それらを処理する我々の能力は遅れている。現在、入手できる薬物プラットホームは主に小分子および療法用タンパク質に基づいており、それらは疾患の処置のために同定された療法ターゲットの約１０〜２０パーセントに対処するにすぎない。
【０００４】
ペプチドは生物学的薬物の高特異性と小分子の生物学的利用能を併せ持ち、よって疾患処置のための困難なターゲットに対処する劇的な機会を提供する。事実、ペプチドは細胞外受容体をターゲティングするために用いた場合に有効であることが証明されたが、制限には、体内でのペプチド固有の不安定性および循環プロテアーゼによる破壊が含まれる。ペプチドを用いて細胞内プロセスを調節する概念は数十年間研究されてきたが、ペプチドは細胞に進入する能力をもたないので、まだこれらの戦略は大幅に損なわれている。
【０００５】
環状ペプチドはそれらの立体剛性によって、それらの直鎖状ペプチドカウンターパートと比較して卓越した特性、たとえば向上したターゲットアフィニティーおよび特異性を示す。それらのより高いターゲット特異性およびアフィニティーならびにタンパク質分解に対する抵抗性によって、それらは薬物探索のための魅力的な候補となった。環状ペプチドは大規模コンビナトリアルペプチドライブラリーからファージディスプレイおよびｍＲＮＡ−ディスプレイなどのライブラリースクリーニングツールを用いて単離されてきたが、多数の環状ペプチドをスクリーニングし、環状ペプチドをイン−サイチュ成熟させ、そして着目する環状ペプチドを同定するための改良法が求められている。現在、環状ペプチドを同定および成熟化して最適化された環状ペプチドバインダーを得るための系統的アプローチはない。
【０００６】
ペプチド−タンパク質相互作用を研究するためのもうひとつの強力な方法は、ペプチドマイクロアレイの使用である。ペプチドマイクロアレイは、固相ペプチド合成を用いて合成し、次いで固体支持体に固定したペプチドで作製することができ、あるいはイン−サイチュ合成法で直接作製できる。ペプチドマイクロアレイは市販されているが、比較的低いペプチド密度および高い製造コストによってそれらの適用は限られている。これらの問題は両方ともマスクレス光指向技術(maskless light-directed technology)により対処できる；参照：(Pellois, Zhou et al. (2002) Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips)およびU.S. Pat. No. 6,375,903。
【０００７】
マスクレス光指向マイクロアレイ合成のための機器を用いて、ペプチドマイクロアレイ上に構築すべきペプチド配列の選択はソフトウェア制御され、したがって現在は研究者の特定の要望に基づいて個々にカスタマイズされたアレイを作製することが可能である。一般に、マスクレス光指向マイクロアレイ合成技術は、数百万のユニークなペプチドフィーチャーを標準顕微鏡スライド上のきわめて小さい領域で並行合成できる。ペプチドマイクロアレイは、一般に光を用いてマイクロアレイ上の特定位置にどのペプチドを合成するかを指令することにより合成される。
【０００８】
既存および潜在する新たな薬物ターゲットに対する療法用の環状ペプチド候補を同定する、より効率的かつ有効な方法に対するアンメットニーズがある；その理由の一部は、多数のターゲットおよび疾患が既存の療法方式では現在“新薬開発が困難(undruggable)”だからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】U.S. Pat. No. 6,375,903
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Pellois, Zhou et al. (2002) Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips
【発明の概要】
【００１１】
本出願人は、本明細書に記載する新規なペプチドマイクロアレイ、ペプチドマイクロアレイを作製する方法、およびマイクロアレイを用いてペプチドバインダーを同定する方法を本明細書に開示し、その際、マイクロアレイは環状ペプチドを含む。本明細書に開示する一態様において、環状ペプチドは療法用ペプチドとして使用できる。同様に本明細書には、マイクロアレイ上のペプチドをプロテアーゼで処理することによりマイクロアレイ上の環化ペプチドの割合を直鎖状ペプチドと対比して増大させる方法を開示する。さらに本明細書には、直鎖状および環状ペプチドサブアレイを同じマイクロアレイ上に作製する方法を開示する。
【００１２】
本発明の幾つかの態様を以下の番号付き節に記載する：
１．  式Ｉの少なくとも１つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイ：
【００１３】
【化１】
2018515448.tif 000002
【００１４】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを、反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である］
その際、その少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
【００１５】
２．  Ｚは、アミド結合、
【００１６】
【化２】
2018515448.tif 000003
【００１７】
［これらにおいて、ｖは０から６までの整数であり、ｗは０から６までの整数であり、ｙは０から６までの整数であり、＊＊は環状ペプチドの残部への結合点である］からなる群から選択される部分を含む、項目１に記載のペプチドマイクロアレイ。
【００１８】
３．  Ｚはペプチド結合を含み、Ｑはカルボニルであり、ｑは０であり、ｒは１であり、ｕは０である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
４．  ＱおよびＸは、それぞれシステイン側鎖であり、Ｚはジスルフィド結合であり、ｑは１であり、ｒは１であり、ｔは０であり、ｕは０である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
【００１９】
５．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは＊＊−Ｓ−Ｓ−＊＊を含み、ｑは１であり、ｕは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
６．  Ｚは
【００２０】
【化３】
2018515448.tif 000004
【００２１】
を含み、ｖは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
７．  Ｚは
【００２２】
【化４】
2018515448.tif 000005
【００２３】
を含み、ｗは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
８．  Ｚは
【００２４】
【化５】
2018515448.tif 000006
【００２５】
を含み、ｒは０であり、ｔは０であり、ｕは０であり、ｙは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
９．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【００２６】
【化６】
2018515448.tif 000007
【００２７】
を含み、ｕは１であり、ｙは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
１０．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【００２８】
【化７】
2018515448.tif 000008
【００２９】
を含み、ｑは０であり、ｕは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
１１．  ＸはＺへの結合であり、Ｚは
【００３０】
【化８】
2018515448.tif 000009
【００３１】
を含み、ｑは１であり、ｒは０であり、ｔは０であり、ｕは０である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
１２．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは
【００３２】
【化９】
2018515448.tif 000010
【００３３】
を含み、ｑは１であり、ｕは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
１３．  Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、式ＩI：
【００３４】
【化１０】
2018515448.tif 000011
【００３５】
［式中、Ｒ８およびＲ８’はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、３〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、５〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ９、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＮＲ９Ｒ９’、ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、およびＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ９’からなる群から選択され、その際、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、３〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリールおよび５〜７員ヘテロアリール中の水素原子はそれぞれ、独立して、場合によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、−ＯＲ１１により置換されており；Ｒ９、Ｒ９’、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｄ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ７アルキル、Ｃ２−Ｃ７アルケニル、Ｃ２−Ｃ７アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、３〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリールおよび５〜７員ヘテロアリールからなる群から選択され；ａは１から１０までの整数である］；または式ＩＩＩもしくはＩＶ：
【００３６】
【化１１】
2018515448.tif 000012
【００３７】
［式中、ｂは１から３０までの整数である］である、項目１〜１２のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
１４．  Ｒ８およびＲ８’はそれぞれ水素である、項目１３に記載のペプチドマイクロアレイ。
【００３８】
１５．  Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、
【００３９】
【化１２】
2018515448.tif 000013
【００４０】
である、項目１３または１４に記載のペプチドマイクロアレイ。
１６．  ｍは０である、項目１〜１５のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【００４１】
１７．  ｎは０である、項目１〜１６のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
１８．  Ｒ８およびＲ８’はそれぞれ水素であり、ｍは０であり、ｎは０であり、ａは５であり、Ｌ’は存在し、Ｌ”は存在しない、項目１〜１２または１６〜１７のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【００４２】
１９．  Ｌ’は６−アミノヘキサン酸である、項目１〜１３または１６〜１８のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
２０．  Ｌ”はＣＨ２ＣＨ２である、項目１〜１４、１６〜１７、または１９のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【００４３】
２１．  ｔは０であり、ｐは１〜１００の整数である、項目１〜２０のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
２２．  ｐは１〜２０の整数である、項目１〜２１のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【００４４】
２３．  固体支持体が、プラスチック、ガラス、および炭素複合材料からなる材料の群から選択される、項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
２４．  反応性表面が活性アミンを含む、項目１〜２３のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【００４５】
２５．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が同数のアミノ酸を含む、項目１〜２４のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
２６．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が５つのアミノ酸を含む、項目１〜２５のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【００４６】
２７．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が、メチオニンアミノ酸、システインアミノ酸、同一アミノ酸のアミノ酸リピート、またはヒスチジン（Ｈ）−プロリン（Ｐ）−グルタミン（Ｑ）配列からなるアミノ酸モチーフをいずれも含まない、項目１〜２６のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【００４７】
２８．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれが、さらにＮ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドまたはＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドのうち少なくとも１つを含む、項目１〜２７のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【００４８】
２９．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、同数のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、項目２８に記載のペプチドマイクロアレイ。
３０．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、２０種類のアミノ酸それぞれまたはほぼ等濃度の２０種類のアミノ酸のサブセットを含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目２８または２９に記載のペプチドマイクロアレイ。
【００４９】
３１．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、アミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）をほぼ３（Ｇ）対１（Ｓ）の濃度で含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目２８または２９に記載のペプチドマイクロアレイ。
【００５０】
３２．  Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドがあり、Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドの両方が同数の５以上のアミノ酸を含む、項目２８〜３１のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【００５１】
３３．  式Ｉの少なくとも１つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイの作製方法であって：
【００５２】
【化１３】
2018515448.tif 000014
【００５３】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である］
式ＩＩの官能化ペプチド：
【００５４】
【化１４】
2018515448.tif 000015
【００５５】
を、Ｚが形成される条件下で反応させる工程を含む方法
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｑ、Ｌ’、Ｌ”、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｔ、ｕ、および＊は、式Ｉについて定めたものであり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨ、Ｃ末端キャッピング基、および
【００５６】
【化１５】
2018515448.tif 000016
【００５７】
からなる群から選択され；
Ｒ８はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ９はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｘ’はそれぞれ、独立して、結合、Ｚ”に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺ”に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｙ’はそれぞれ、独立して、結合、Ｚ’に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺ’に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚ’およびＺ”はそれぞれ、独立して、結合、−ＯＨ、水素、チオール、アミン、カルボン酸、アミド、アルキン、アジド、場合により置換されたフミノフェノール、天然アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸側鎖、Ｎ末端保護基、およびＣ末端保護基からなる群から選択され、ただし、Ｚ’およびＺ”は結合してＺを形成する相補基であり；
ｂは、０から５０までの整数であり；
＊＊＊は、官能化ペプチドの残部への結合点である］
その際、その少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
【００５８】
３４．  Ｚは、アミド結合、
【００５９】
【化１６】
2018515448.tif 000017
【００６０】
［これらにおいて、ｖは０から６までの整数であり、ｗは０から６までの整数であり、ｙは０から６までの整数であり、＊＊は環状ペプチドの残部への結合点である］からなる群から選択される部分を含む、項目３３に記載の方法。
【００６１】
３５．  Ｚはペプチド結合を含み、Ｚ’はＣ末端保護基を含み、またはＺ”はＮ末端保護基を含み、Ｑはカルボニルであり、ｑは０であり、ｒは１であり、ｕは０である、項目３３または３４に記載の方法。
【００６２】
３６．  さらにＺ’またはＺ”を官能化ペプチドの残部から除去してペプチド結合を生成させることを含む、項目３５に記載の方法。
３７．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは＊＊−Ｓ−Ｓ−＊＊を含み、Ｘ’はＺ”への結合であり、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’およびＺ”はシステイン側鎖を含み、ｑは１であり、ｕは１である、項目３３または３４に記載の方法。
【００６３】
３８．  さらに、官能化ペプチドに酸化条件を施して−Ｓ−Ｓ−を形成させることを含む、項目３７に記載の方法。
３９．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【００６４】
【化１７】
2018515448.tif 000018
【００６５】
を含み、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’は
【００６６】
【化１８】
2018515448.tif 000019
【００６７】
を含み、Ｚ”はアジドを含み、ｕは１であり、ｖは１である、項目３３または３４に記載の方法。
４０．  さらに、官能化ペプチドを銅触媒と接触させて
【００６８】
【化１９】
2018515448.tif 000020
【００６９】
を形成させることを含む、項目３９に記載の方法。
４１．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【００７０】
【化２０】
2018515448.tif 000021
【００７１】
を含み、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’は
【００７２】
【化２１】
2018515448.tif 000022
【００７３】
を含み、Ｚ”はアジドを含み、ｕは１であり、ｖは１である、項目３３または３４に記載の方法。
４２．  さらに、官能化ペプチドを銅触媒と接触させて
【００７４】
【化２２】
2018515448.tif 000023
【００７５】
を形成させることを含む、項目４１に記載の方法。
４３．  Ｚは
【００７６】
【化２３】
2018515448.tif 000024
【００７７】
を含み、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’は
【００７８】
【化２４】
2018515448.tif 000025
【００７９】
を含み、ｒは０であり、ｕは１であり、ｙは１である、項目３３または３４に記載の方法。
４４．  さらに、官能化ペプチドをフェリシアン化カリウムと接触させて
【００８０】
【化２５】
2018515448.tif 000026
【００８１】
を形成させることを含む、項目４３に記載の方法。
４５．  Ｒ３およびＲ８は官能化ペプチドがブテラーゼ１認識配列を含むように定められ、ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【００８２】
【化２６】
2018515448.tif 000027
【００８３】
を含み、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’はアスパラギンまたはアスパラギン酸側鎖であり、ｑは０であり、ｕは１である、項目３３または３４に記載の方法。
４６．  さらに、官能化ペプチドをブテラーゼ１と接触させて
【００８４】
【化２７】
2018515448.tif 000028
【００８５】
を形成させることを含む、項目４５に記載の方法。
４７．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは
【００８６】
【化２８】
2018515448.tif 000029
【００８７】
を含み、Ｘ’はＺ”への結合であり、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’はグルタミン側鎖でありかつＺ”はリジン側鎖であるか、またはＺ’はリジン側鎖でありかつＺ”はグルタミン側鎖であり、ｑは１であり、ｕは１である、項目３３または３４に記載の方法。
【００８８】
４８．  さらに、官能化ペプチドを微生物トランスグルタミナーゼと接触させて
【００８９】
【化２９】
2018515448.tif 000030
【００９０】
を形成させることを含む、項目４７に記載の方法。
４９．  Ｌ’は６−アミノヘキサン酸である、項目３３〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【００９１】
５０．  Ｌ”はＣＨ２ＣＨ２である、項目３３〜４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．  ｍは０である、項目３３〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．  ｎは０である、項目３３〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【００９２】
５３．  ｔは０であり、ｐは１〜１００の整数である、項目３３〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．  ｐは１〜２０の整数である、項目３３〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【００９３】
５５．  Ｑはカルボニルであり、Ｚはアミド結合であり、ｒは１であり、ｕは０であり、ｑは０である、項目３３または３４のいずれか１つに記載の方法。
５６．  固体支持体が、プラスチック、ガラス、および炭素複合材料からなる材料の群から選択される、項目３３〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【００９４】
５７．  反応性表面が活性アミンを含む、項目３３〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が同数のアミノ酸を含む、項目３３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【００９５】
５９．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が５つのアミノ酸を含む、項目３３〜５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が、メチオニンアミノ酸、システインアミノ酸、同一アミノ酸のアミノ酸リピート、またはヒスチジン（Ｈ）−プロリン（Ｐ）−グルタミン（Ｑ）配列からなるアミノ酸モチーフをいずれも含まない、項目３３〜５９のいずれか１つに記載の方法。
【００９６】
６１．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれが、さらにＮ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドまたはＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドのうち少なくとも１つを含む、項目３３〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【００９７】
６２．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、同数のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、項目６１に記載の方法。
６３．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、２０種類のアミノ酸それぞれまたはほぼ等濃度の２０種類のアミノ酸のサブセットを含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目６１または６２に記載の方法。
【００９８】
６４．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、アミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）をほぼ３（Ｇ）対１（Ｓ）の濃度で含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目６１または６２に記載の方法。
【００９９】
６５．  Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドがあり、Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドの両方が同数の５以上のアミノ酸を含む、項目６１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０１００】
６６．  下記を含む、ペプチドマイクロアレイの作製方法：
マイクロアレイ表面に共有結合した第１の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも１つの第１の直鎖状ペプチドサブアレイを作製する；
マイクロアレイ表面に共有結合した第２の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも１つの第２の直鎖状ペプチドサブアレイを作製し、その際、第２の複数の直鎖状ペプチドは第１の複数の直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有する；そして
第１の複数の直鎖状ペプチドを環化させて複数の環化ペプチドを含む少なくとも１つの環化ペプチドドサブアレイを生成させる条件下でペプチドマイクロアレイを処理し、その際、第２の複数の直鎖状ペプチドは実質的に環化しない。
【０１０１】
６７．  第１の複数の直鎖状ペプチドは第１の複数の保護された直鎖状ペプチドであり、その際、第１の複数の保護された直鎖状ペプチドのＣ末端は第１保護基により保護されている；
第２の複数の直鎖状ペプチドは第２の複数の保護された直鎖状ペプチドであり、その際、第２の複数の保護された直鎖状ペプチドは第１の複数の保護された直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、第２の複数の保護された直鎖状ペプチドのＣ末端は第１保護基と異なる第２保護基により保護されている；
項目６６に記載の方法。
【０１０２】
６８．  さらに下記を含む、項目６７に記載の方法：
ペプチドマイクロアレイを第１の脱保護試薬と接触させて第１保護基を選択的に除去して、第１の複数の脱保護された直鎖状ペプチドを含む少なくとも１つの第１の脱保護された直鎖状ペプチドサブアレイを得る；そして
ペプチドマイクロアレイを第２の脱保護試薬と接触させて第２保護基を選択的に除去して、第２の複数の脱保護された直鎖状ペプチドを含む少なくとも１つの第２の脱保護された直鎖状ペプチドサブアレイを得る。
【０１０３】
６９．  第１の複数の直鎖状ペプチドおよび第２の複数の直鎖状ペプチドはそれぞれ、アミノ酸側鎖によりマイクロアレイ表面に付着している、項目６６〜６８のいずれか１つに記載の方法。
【０１０４】
７０．  第１の複数の直鎖状ペプチドおよび第２の複数の直鎖状ペプチドはそれぞれ、カルボン酸側鎖によりマイクロアレイ表面に付着している、項目６９に記載の方法。
７１．  カルボン酸側鎖はグルタメートまたはアスパルテート側鎖である、項目７０に記載の方法。
【０１０５】
７２．  第アミノ酸側鎖はＣ末端アミノ酸の一部である、項目６９〜７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．  第１の複数の直鎖状ペプチドのうち少なくとも１つの分子は環化できない、項目６６〜７２のいずれか１つに記載の方法。
【０１０６】
７４．  第１の複数の直鎖状ペプチドのうち環化できない少なくとも１つは、第１の脱保護された直鎖状ペプチドサブアレイから除去されない、項目７３のいずれか１つに記載の方法。
【０１０７】
７５．  第１保護基がＯＡｌｌである、項目６７〜７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．  第１の脱保護試薬がパラジウム触媒である、項目６７〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０１０８】
７７．  パラジウム触媒がテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）である、項目７６に記載の方法。
７８．  第２保護基がＯｔＢｕである、項目６７〜７７のいずれか１つに記載の方法。
【０１０９】
７９．  第２の脱保護試薬が酸である、項目６７〜７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．  酸がトリフルオロ酢酸である、項目７９に記載の方法。
８１．  第１の複数の直鎖状ペプチドを環化させる条件下でのペプチドマイクロアレイの処理が、第１の複数の直鎖状ペプチドのＣ末端のカルボキシル基を活性化して第１の複数の直鎖状ペプチドのＮ末端のアミノ基と反応させてアミド結合を形成することを含む、項目６６〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【０１１０】
８２．  第１の複数の直鎖状ペプチドを環化させる条件下でのペプチドマイクロアレイの処理が、第１の複数の直鎖状ペプチドをＨＯＢｔおよびＨＢＴＵと接触させることを含む、項目６６〜８１のいずれか１つに記載の方法。
【０１１１】
８３．  項目６６〜８２のいずれか１つに記載の方法に従ってペプチドマイクロアレイを作製し、そのペプチドマイクロアレイを潜在結合基と接触させ、接触工程後にペプチドマイクロアレイ上の潜在結合基の存在を測定することを含む、活性環状ペプチドの同定方法。
【０１１２】
８４．  測定工程が蛍光活性を測定することを含む、項目８３に記載の方法。
８５．  式ＩＩＩの少なくとも１つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイの作製方法であって、下記を含む方法：
【０１１３】
【化３０】
2018515448.tif 000031
【０１１４】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｑは、カルボニルであり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である］；
複数の第１ペプチドを環状ペプチドサブアレイ上において作製し、その際、第１ペプチドは式ＩＶのものであり：
【０１１５】
【化３１】
2018515448.tif 000032
【０１１６】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｑ、Ｌ’、Ｌ”、ｍ、ｎ、ｐ、ｔ、および＊は、式ＩＩＩについて定めたものであり；
Ｚ１は、第１カルボキシル保護基であり；
Ｚ２は、水素である］；
複数の第２ペプチドを直鎖状ペプチドサブアレイ上において作製し、その際、第２ペプチドは式Ｖのものであり：
【０１１７】
【化３２】
2018515448.tif 000033
【０１１８】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｑ、Ｌ’、Ｌ”、Ｚ２、ｍ、ｎ、ｐ、ｔ、および＊は、式ＩＶについて定めたものであり；
Ｚ３は、第１カルボキシル保護基と異なる第２カルボキシル保護基であり;
は、水素である］；
第１ペプチドを処理して第１の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させ、その際、直鎖状脱保護ペプチドは式ＶＩのものであり：
【０１１９】
【化３３】
2018515448.tif 000034
【０１２０】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｑ、Ｌ’、Ｌ”、Ｚ２、ｍ、ｎ、ｐ、ｔ、および＊は、式ＩＶについて定めたものであり；
Ｚ１は、−ＯＨである］；
続いて、
直鎖状脱保護ペプチドを処理して環状ペプチドを形成させ；
続いて、
第２ペプチドを処理して式ＶＩの第２の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させ：
その際、第１ペプチドおよび第２ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
８６．  Ｌ’は６−アミノヘキサン酸である、項目８５に記載の方法。
８７．  Ｌ”はＣＨ２ＣＨ２である、項目８５または８６に記載の方法。
８８．  ｍは０である、項目８５〜８７のいずれか１つに記載の方法。
【０１２２】
８９．  ｎは０である、項目８５〜８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．  ｔは０であり、ｐは１〜１００の整数である、項目８５〜８９のいずれか１つに記載の方法。
【０１２３】
９１．  ｐは１〜２０の整数である、項目８５〜９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．  環状ペプチドサブアレイ上の直鎖状の脱保護ペプチドのうち少なくとも１つの分子は環化できない、項目８５〜９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１２４】
９３．  環状ペプチドサブアレイ上の直鎖状の脱保護ペプチドは、環状ペプチドサブアレイから除去されない、項目８５〜９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．  第１カルボキシル保護基がＯＡｌｌである、項目８５〜９３のいずれか１つに記載の方法。
【０１２５】
９５．  第１ペプチドを処理して第１の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させることが、第１ペプチドをパラジウムと接触させることを含む、項目８５〜９４のいずれか１つに記載の方法。
【０１２６】
９６．  第２カルボキシル保護基がＯｔＢｕである、項目８５〜９５のいずれか１つに記載の方法。
９７．  第２ペプチドを処理して第２の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させることが、第２ペプチドを酸と接触させることを含む、項目８５〜９６のいずれか１つに記載の方法。
【０１２７】
９８．  酸がトリフルオロ酢酸である、項目９７に記載の方法。
９９．  第１ペプチドを処理して環状ペプチドを形成させることが、第１ペプチドのカルボキシル基を活性化して第１ペプチドの遊離アミノ基と反応させてＺを形成することを含む、項目８５〜９８のいずれか１つに記載の方法。
【０１２８】
１００．  第１ペプチドを処理して環状ペプチドを形成させることが、第１の複数の直鎖状ペプチドをＨＯＢｔおよびＨＢＴＵと接触させることを含む、項目８５〜９９のいずれか１つに記載の方法。
【０１２９】
１０１．  項目８５〜１００のいずれか１つに記載の方法に従ってペプチドマイクロアレイを作製し、そのペプチドマイクロアレイを潜在結合基と接触させ、接触工程後にペプチドマイクロアレイ上の潜在結合基の存在を測定することを含む、活性環状ペプチドの同定方法。
【０１３０】
１０２．  測定工程が蛍光活性を測定することを含む、項目１０１に記載の方法。
１０３．  ペプチドバインダーの同定方法であって、下記の工程を含む方法：
ａ．  着目するターゲットを、式Ｉの環状ペプチドを含む第１集団のペプチドバインダーを含むペプチドマイクロアレイに曝露する：
【０１３１】
【化３４】
2018515448.tif 000035
【０１３２】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを、第１の反応性表面を有する第１の固体支持体上に固定する共有結合である］；それによって着目するターゲットは環状ペプチドに結合する；
ｂ．  第１集団のペプチドバインダーのうち着目するターゲットを結合するペプチドバインダー配列におけるオーバーラップを同定し、それによってコアバインダー配列を決定する；
ｃ．  コアバインダー配列に対するアミノ酸の単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸挿入から選択される少なくとも１つの改変を実施し、それによって第２集団のコアバインダー配列を作製する；
ｄ．  第２集団のコアバインダー配列を着目するターゲットに曝露し、それによって着目するターゲットは第２集団のコアバインダー配列の少なくとも１つのペプチド配列に結合し、その際、第２集団のコアバインダー配列は式Ｉの環状ペプチドを含む：
【０１３３】
【化３５】
2018515448.tif 000036
【０１３４】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを、第２の反応性表面を有する第２の固体支持体上に固定する共有結合である］；
ｅ．  着目するターゲットに対する強い結合特性を示す第２集団のコアバインダー配列の１以上の配列を同定し、それによって成熟コアバインダー配列を決定する;
ｆ．  工程ｅにおいて決定した成熟コアペプチドバインダー配列の少なくとも１つのＮ末端およびＣ末端伸長を実施し、それによって伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を作製する;
ｇ．  着目するターゲットを、工程ｆにおいて作製された伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を含むペプチドマイクロアレイに曝露し、その際、伸長した成熟ペプチドバインダーの集団は式Ｉの環状ペプチドを含む：
【０１３５】
【化３６】
2018515448.tif 000037
【０１３６】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを、第３の反応性表面を有する第３の固体支持体上に固定する共有結合である］；
ｈ．  伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を含むペプチドのＮ末端またはＣ末端ペプチドバインダー配列におけるオーバーラップを同定し、それによって伸長した成熟ペプチドバインダー配列を決定する。
【０１３７】
１０４．  Ｚは、アミド結合、
【０１３８】
【化３７】
2018515448.tif 000038
【０１３９】
［これらにおいて、ｖは０から６までの整数であり、ｗは０から６までの整数であり、ｙは０から６までの整数であり、＊＊は環状ペプチドの残部への結合点である］からなる群から選択される部分を含む、項目１０３に記載の方法。
【０１４０】
１０５．  Ｚはペプチド結合を含み、Ｑはカルボニルであり、ｑは０であり、ｒは１であり、ｕは０である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１０６．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは＊＊−Ｓ−Ｓ−＊＊を含み、ｑは１であり、ｕは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
【０１４１】
１０７．  Ｚは
【０１４２】
【化３８】
2018515448.tif 000039
【０１４３】
を含み、ｖは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１０８．  Ｚは
【０１４４】
【化３９】
2018515448.tif 000040
【０１４５】
を含み、ｗは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１０９．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０１４６】
【化４０】
2018515448.tif 000041
【０１４７】
を含み、ｕは１であり、ｙは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１１０．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０１４８】
【化４１】
2018515448.tif 000042
【０１４９】
を含み、ｑは０であり、ｕは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１１１．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０１５０】
【化４２】
2018515448.tif 000043
【０１５１】
を含み、ｑは１であり、ｕは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１１２．  Ｌ’は６−アミノヘキサン酸である、項目１０３〜１１１に記載の方法。
１１３．  Ｌ”はＣＨ２ＣＨ２である、項目１０３〜１１２に記載の方法。
【０１５２】
１１４．  ｍは０である、項目１０３〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
１１５．  ｎは０である、項目１０３〜１１４のいずれか１つに記載の方法。
１１６．  ｔは０であり、ｐは１〜１００の整数である、項目１０３〜１１５のいずれか１つに記載の方法。
【０１５３】
１１７．  ｐは１〜２０の整数である、項目１０３〜１１６のいずれか１つに記載の方法。
１１８．  伸長した成熟ペプチドバインダー配列のラベルフリーおよびアフィニティー分析のうち少なくとも１つを実施する、項目１０３〜１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１５４】
１１９．  第１、第２、および／または第３固体支持体が、ガラス、プラスチック、および炭素複合材料のうち少なくとも１つを含む、項目１０３〜１１８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５５】
１２０．  第１集団のペプチドバインダーが同数のアミノ酸を含む、項目１０３〜１１９のいずれか１つに記載の方法。
１２１．  第１集団のペプチドバインダーが、アミノ酸システインもしくはメチオニン、またはヒスチジン−プロリン−グルタミンモチーフ、または２以上のアミノ酸のアミノ酸リピートを含まない、項目１０３〜１２０のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
１２２．  伸長した成熟ペプチドバインダーの集団の環状ペプチドバインダーが、Ｎ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドおよびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドのうち少なくとも１つを含む、項目１０３〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１５７】
１２３．  コアバインダー配列が、第１集団のペプチドバインダーを構成する各ペプチドのアミノ酸の数より多い数のアミノ酸を含む、項目１０３〜１２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１５８】
１２４．  工程ｅおよびｈがprincipled clustering analysis（原則に基づくクラスタリング分析）を含む、項目１０３〜１２３のいずれか１つに記載の方法。
１２５．  伸長した成熟ペプチドバインダー配列について工程ｃ〜ｈを繰り返す、項目１０３〜１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
１２６．  ペプチドマイクロアレイが１以上の直鎖状ペプチドを含み、方法がさらに、ペプチドマイクロアレイ上の１以上の直鎖状ペプチドを、その１以上の直鎖状ペプチドを消化することができるプロテアーゼと接触させることを含む、項目１０３〜１２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６０】
１２７．  プロテアーゼがアミノプロテアーゼまたはアミノプロテアーゼ混合物である、項目１２６に記載の方法。
１２８．  プロテアーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶ、アミノペプチダーゼｍ、またはその組合わせである、項目１２７に記載の方法。
【０１６１】
１２９．  ブテラーゼ１認識配列がＮＨＶである、項目４５または４６に記載の方法。
１３０．  グルタミン側鎖が配列［ＷＹ］［ＤＥ］［ＤＥ］［ＹＷ］ＡＬＱ［ＧＳＴ］ＹＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９４）の一部であり、リジン側鎖が配列ＲＳＫＬＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５）の一部である、項目４７または４８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、フォトリソグラフィーマスクを用いるフォトリソグラフィー法（先行技術）によるアレイ合成のためのマイクロアレイシステムの模式図である。
【図２】図２は、マスクレスフォトリソグラフィーを用いるフォトリソグラフィー法（先行技術）によるアレイ合成のためのマイクロアレイシステムの模式図である。
【図３】図３は、本開示に従ってその上にペプチドプローブを含むアレイを描いた模式図である。
【図４】図４は、本開示の方法の態様を模式的に描いたものである。
【図５】図５は、本開示に従ってその上にペプチドプローブを含むアレイの他の態様を描いた模式図である。
【図６】図６は、図４の方法の態様を表わす模式図である。
【図７】図７は、表面におけるペプチドライブラリーのヘッド−ツゥー−テイル（頭−尾方向）(head-to-tail)（アミド結合形成）環化についての反応スキームを表わす模式図である。
【図８Ａ】図８Ａは、それぞれがグルタメートリンカーアミノ酸を有するペプチドのサブアレイのスライドイメージであり、（下）直鎖状ペプチドライブラリーはグルタメートリンカーアミノ酸のＯｔＢｕ保護バリアントから脱保護およびビオチン標識化の後に形成され、（上）環状ペプチドライブラリーはグルタメートリンカーのＯＡｌｌ保護バリアントから脱保護およびビオチン標識化の後に形成される。
【図８Ｂ】図８Ｂは、（下）グルタメートのＯｔＢｕ保護バリアントの脱保護に続くビオチン標識化および（上）グルタメートのＯＡｌｌ保護バリアントに続くビオチン標識化を表わす模式図である。
【図９Ａ】図９は、直鎖状および環状ペプチドライブラリーのサブアレイを形成するためのプロセスを表わす模式図であり、その際、環化できない環状ライブラリーのペプチドは直鎖状ライブラリーのものと同じである。
【図９Ｂ】図９は、直鎖状および環状ペプチドライブラリーのサブアレイを形成するためのプロセスを表わす模式図であり、その際、環化できない環状ライブラリーのペプチドは直鎖状ライブラリーのものと同じである。
【図１０】図１０は、ストレプトアビジン−Ｃｙ５に結合したフォーマットＸＸＸＸＵのペプチドライブラリーについて環状−対−直鎖状の蛍光強度を示すチャートである。
【図１１】図１１は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状ＮＱｐＷＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）ペプチドの表面プラズモン共鳴(surface plasmon resonance)（ＳＰＲ）結合曲線を示すチャートである。
【図１２】図１２は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状ＮＱｐＷＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合をペプチド濃度に対して示すチャートである。破線は結合定数を示す。
【図１３】図１３は、ストレプトアビジン−Ｃｙ５に結合したフォーマットＪＸＸＨＰＱＸＸＪＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）のペプチドライブラリーについて環状−対−直鎖状の蛍光強度を示すチャートである。
【図１４】図１４は、ストレプトアビジン−Ｃｙ５に結合したフォーマットＪＸＸＨＰＱＸＸＪＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）のペプチドライブラリーについて環状と直鎖状との間の蛍光強度の環状蛍光強度を対数変化倍率(log fold change)（ｌｏｇＦＣ）に対して示すチャートである。より濃い点は上位１００のＪＸＸＨＰＱＸＸＪＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）環状ペプチドを指示する。
【図１５】図１５は、ストレプトアビジン−Ｃｙ５に結合したフォーマットＪＸＸＨＰＱＸＸＪＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）のペプチドライブラリーについて環状と直鎖状との間の蛍光強度の環状蛍光強度を対数変化倍率（ｌｏｇＦＣ）に対して示すチャートであり、その際、各ＸＸＨＰＱＸＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７）は図１４に示したチャートの上位１００の環状ペプチドのうちの１つに対応し、Ｊはランダムである。図１５にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２３０〜２３１それぞれを出現順に開示する。
【図１６】図１６は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへの、種々のペプチド濃度におけるヘッド−ツゥー−テイル環状ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合曲線を示すチャートである。
【図１７】図１７は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合をペプチド濃度に対して示すチャートである。破線は結合定数を示す。
【図１８】図１８は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへの、種々のペプチド濃度におけるヘッド−ツゥー−テイル直鎖状ＮＨ２−ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合曲線を示すチャートである。
【図１９】図１９は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル直鎖状ＮＨ２−ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合をペプチド濃度に対して示すチャートである。破線は結合定数を示す。
【図２０】図２０は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへの、種々のペプチド濃度におけるヘッド−ツゥー−テイル環状ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合曲線を示すチャートである。
【図２１】図２１は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合をペプチド濃度に対して示すチャートである。破線は結合定数を示す。
【図２２】図２２は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへの、種々のペプチド濃度におけるヘッド−ツゥー−テイル直鎖状ＮＨ２−ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合曲線を示すチャートである。
【図２３】図２３は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル直鎖状ＮＨ２−ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合をペプチド濃度に対して示すチャートである。破線は結合定数を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６３】
本開示は、ペプチドマイクロアレイ、ペプチドマイクロアレイを作製する方法、およびマイクロアレイを用いてペプチドバインダー（たとえば、環状ペプチド）を同定する方法を提供し、それによって新規ペプチドバインダー（たとえば、環状ペプチド）を合成、最適化および同定することができる。ある態様において、本明細書に記載する方法に従った最終最適化工程は、ペプチドバインダーをペプチドマイクロアレイ上で成熟化および伸長した後の環化である。
【０１６４】
ある態様によれば、本明細書に開示するペプチドマイクロアレイは、ペプチドマイクロアレイ上に固定された包括的ペプチドの集団を構成する小分子ペプチドへの着目するターゲットのオーバーラップ結合を同定し、次いで単離されたコアバインダー配列の徹底的なペプチド成熟化、続いてＮ末端およびＣ末端伸長操作、そして一態様においては続いて環化を実施することにより、ペプチドバインダー（たとえば、環状ペプチド）を同定する。ある態様において、伸長した成熟ペプチドバインダー配列にさらなる成熟化プロセス、ならびに新たな一連のＮ末端およびＣ末端伸長プロセス、続いてたとえば環化を施すことができる。
【０１６５】
本発明の幾つかの態様を概要のセクションに記載した；本出願のこの詳細な記載のセクションに記載する態様はそれぞれ、以下の番号付き節に記載する態様を含めて、概要に記載した態様に該当する。
【０１６６】
１．  式Ｉの少なくとも１つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイ：
【０１６７】
【化４３】
2018515448.tif 000044
【０１６８】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを、反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である］
その際、その少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
【０１６９】
２．  Ｚは、アミド結合、
【０１７０】
【化４４】
2018515448.tif 000045
【０１７１】
［これらにおいて、ｖは０から６までの整数であり、ｗは０から６までの整数であり、ｙは０から６までの整数であり、＊＊は環状ペプチドの残部への結合点である］からなる群から選択される部分を含む、項目１に記載のペプチドマイクロアレイ。
【０１７２】
３．  Ｚはペプチド結合を含み、Ｑはカルボニルであり、ｑは０であり、ｒは１であり、ｕは０である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
４．  ＱおよびＸは、それぞれシステイン側鎖であり、Ｚはジスルフィド結合であり、ｑは１であり、ｒは１であり、ｔは０であり、ｕは０である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
【０１７３】
５．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは＊＊−Ｓ−Ｓ−＊＊を含み、ｑは１であり、ｕは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
６．  Ｚは
【０１７４】
【化４５】
2018515448.tif 000046
【０１７５】
を含み、ｖは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
７．  Ｚは
【０１７６】
【化４６】
2018515448.tif 000047
【０１７７】
を含み、ｗは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
８．  Ｚは
【０１７８】
【化４７】
2018515448.tif 000048
【０１７９】
を含み、ｒは０であり、ｔは０であり、ｕは０であり、ｙは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
９．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０１８０】
【化４８】
2018515448.tif 000049
【０１８１】
を含み、ｕは１であり、ｙは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
１０．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０１８２】
【化４９】
2018515448.tif 000050
【０１８３】
を含み、ｑは０であり、ｕは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
１１．  ＸはＺへの結合であり、Ｚは
【０１８４】
【化５０】
2018515448.tif 000051
【０１８５】
を含み、ｑは１であり、ｒは０であり、ｔは０であり、ｕは０である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
１２．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０１８６】
【化５１】
2018515448.tif 000052
【０１８７】
を含み、ｑは１であり、ｕは１である、項目１または２に記載のペプチドマイクロアレイ。
１３．  Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、式ＩI：
【０１８８】
【化５２】
2018515448.tif 000053
【０１８９】
［式中、Ｒ８およびＲ８’はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、３〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、５〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ９、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＮＲ９Ｒ９’、ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、およびＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ９’からなる群から選択され、その際、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、３〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリールおよび５〜７員ヘテロアリール中の水素原子はそれぞれ、独立して、場合によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、−ＯＲ１１により置換されており；Ｒ９、Ｒ９’、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｄ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ７アルキル、Ｃ２−Ｃ７アルケニル、Ｃ２−Ｃ７アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、３〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリールおよび５〜７員ヘテロアリールからなる群から選択され；ａは１から１０までの整数である］；または式ＩＩＩもしくはＩＶ：
【０１９０】
【化５３】
2018515448.tif 000054
【０１９１】
［式中、ｂは１から３０までの整数である］である、項目１〜１２のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
１４．  Ｒ８およびＲ８’はそれぞれ水素である、項目１３に記載のペプチドマイクロアレイ。
【０１９２】
１５．  Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、
【０１９３】
【化５４】
2018515448.tif 000055
【０１９４】
である、項目１３または１４に記載のペプチドマイクロアレイ。
１６．  ｍは０である、項目１〜１５のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【０１９５】
１７．  ｎは０である、項目１〜１６のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
１８．  Ｒ８およびＲ８’はそれぞれ水素であり、ｍは０であり、ｎは０であり、ａは５であり、Ｌ’は存在し、Ｌ”は存在しない、項目１〜１２または１６〜１７のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【０１９６】
１９．  Ｌ’は６−アミノヘキサン酸である、項目１〜１３または１６〜１８のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
２０．  Ｌ”はＣＨ２ＣＨ２である、項目１〜１４、１６〜１７、または１９のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【０１９７】
２１．  ｔは０であり、ｐは１〜１００の整数である、項目１〜２０のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
２２．  ｐは１〜２０の整数である、項目１〜２１のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【０１９８】
２３．  固体支持体が、プラスチック、ガラス、および炭素複合材料からなる材料の群から選択される、項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
２４．  反応性表面が活性アミンを含む、項目１〜２３のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【０１９９】
２５．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が同数のアミノ酸を含む、項目１〜２４のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
２６．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が５つのアミノ酸を含む、項目１〜２５のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【０２００】
２７．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が、メチオニンアミノ酸、システインアミノ酸、同一アミノ酸のアミノ酸リピート、またはヒスチジン（Ｈ）−プロリン（Ｐ）−グルタミン（Ｑ）配列からなるアミノ酸モチーフをいずれも含まない、項目１〜２６のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【０２０１】
２８．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれが、さらにＮ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドまたはＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドのうち少なくとも１つを含む、項目１〜２７のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【０２０２】
２９．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、同数のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、項目２８に記載のペプチドマイクロアレイ。
３０．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、２０種類のアミノ酸それぞれまたはほぼ等濃度の２０種類のアミノ酸のサブセットを含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目２８または２９に記載のペプチドマイクロアレイ。
【０２０３】
３１．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、アミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）をほぼ３（Ｇ）対１（Ｓ）の濃度で含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目２８または２９に記載のペプチドマイクロアレイ。
【０２０４】
３２．  Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドがあり、Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドの両方が同数の５以上のアミノ酸を含む、項目２８〜３１のいずれか１つに記載のペプチドマイクロアレイ。
【０２０５】
３３．  式Ｉの少なくとも１つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイの作製方法であって：
【０２０６】
【化５５】
2018515448.tif 000056
【０２０７】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である］
式ＩＩの官能化ペプチド：
【０２０８】
【化５６】
2018515448.tif 000057
【０２０９】
を、Ｚが形成される条件下で反応させる工程を含む方法
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｑ、Ｌ’、Ｌ”、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｔ、ｕ、および＊は、式Ｉについて定めたものであり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨ、Ｃ末端キャッピング基、および
【０２１０】
【化５７】
2018515448.tif 000058
【０２１１】
からなる群から選択され；
Ｒ８はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ９はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｘ’はそれぞれ、独立して、結合、Ｚ”に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺ”に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｙ’はそれぞれ、独立して、結合、Ｚ’に共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺ’に共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚ’およびＺ”はそれぞれ、独立して、結合、−ＯＨ、水素、チオール、アミン、カルボン酸、アミド、アルキン、アジド、場合により置換されたフミノフェノール、天然アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸側鎖、Ｎ末端保護基、およびＣ末端保護基からなる群から選択され、ただし、Ｚ’およびＺ”は結合してＺを形成する相補基であり；
ｂは、０から５０までの整数であり；
＊＊＊は、官能化ペプチドの残部への結合点である］
その際、その少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
【０２１２】
３４．  Ｚは、アミド結合、
【０２１３】
【化５８】
2018515448.tif 000059
【０２１４】
［これらにおいて、ｖは０から６までの整数であり、ｗは０から６までの整数であり、ｙは０から６までの整数であり、＊＊は環状ペプチドの残部への結合点である］からなる群から選択される部分を含む、項目３３に記載の方法。
【０２１５】
３５．  Ｚはペプチド結合を含み、Ｚ’はＣ末端保護基を含み、またはＺ”はＮ末端保護基を含み、Ｑはカルボニルであり、ｑは０であり、ｒは１であり、ｕは０である、項目３３または３４に記載の方法。
【０２１６】
３６．  さらにＺ’またはＺ”を官能化ペプチドの残部から除去してペプチド結合を生成させることを含む、項目３５に記載の方法。
３７．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは＊＊−Ｓ−Ｓ−＊＊を含み、Ｘ’はＺ”への結合であり、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’およびＺ”はシステイン側鎖を含み、ｑは１であり、ｕは１である、項目３３または３４に記載の方法。
【０２１７】
３８．  さらに、官能化ペプチドに酸化条件を施して−Ｓ−Ｓ−を形成させることを含む、項目３７に記載の方法。
３９．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０２１８】
【化５９】
2018515448.tif 000060
【０２１９】
を含み、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’は
【０２２０】
【化６０】
2018515448.tif 000061
【０２２１】
を含み、Ｚ”はアジドを含み、ｕは１であり、ｖは１である、項目３３または３４に記載の方法。
４０．  さらに、官能化ペプチドを銅触媒と接触させて
【０２２２】
【化６１】
2018515448.tif 000062
【０２２３】
を形成させることを含む、項目３９に記載の方法。
４１．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０２２４】
【化６２】
2018515448.tif 000063
【０２２５】
を含み、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’は
【０２２６】
【化６３】
2018515448.tif 000064
【０２２７】
を含み、Ｚ”はアジドを含み、ｕは１であり、ｖは１である、項目３３または３４に記載の方法。
４２．  さらに、官能化ペプチドを銅触媒と接触させて
【０２２８】
【化６４】
2018515448.tif 000065
【０２２９】
を形成させることを含む、項目４１に記載の方法。
４３．  Ｚは
【０２３０】
【化６５】
2018515448.tif 000066
【０２３１】
を含み、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’は
【０２３２】
【化６６】
2018515448.tif 000067
【０２３３】
を含み、ｒは０であり、ｕは１であり、ｙは１である、項目３３または３４に記載の方法。
４４．  さらに、官能化ペプチドをフェリシアン化カリウムと接触させて
【０２３４】
【化６７】
2018515448.tif 000068
【０２３５】
を形成させることを含む、項目４３に記載の方法。
４５．  Ｒ３およびＲ８は官能化ペプチドがブテラーゼ１認識配列を含むように定められ、ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０２３６】
【化６８】
2018515448.tif 000069
【０２３７】
を含み、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’はアスパラギンまたはアスパラギン酸側鎖であり、ｑは０であり、ｕは１である、項目３３または３４に記載の方法。
４６．  さらに、官能化ペプチドをブテラーゼ１と接触させて
【０２３８】
【化６９】
2018515448.tif 000070
【０２３９】
を形成させることを含む、項目４５に記載の方法。
４７．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０２４０】
【化７０】
2018515448.tif 000071
【０２４１】
を含み、Ｘ’はＺ”への結合であり、Ｙ’はＺ’への結合であり、Ｚ’はグルタミン側鎖でありかつＺ”はリジン側鎖であるか、またはＺ’はリジン側鎖でありかつＺ”はグルタミン側鎖であり、ｑは１であり、ｕは１である、項目３３または３４に記載の方法。
【０２４２】
４８．  さらに、官能化ペプチドを微生物トランスグルタミナーゼと接触させて
【０２４３】
【化７１】
2018515448.tif 000072
【０２４４】
を形成させることを含む、項目４７に記載の方法。
４９．  Ｌ’は６−アミノヘキサン酸である、項目３３〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【０２４５】
５０．  Ｌ”はＣＨ２ＣＨ２である、項目３３〜４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．  ｍは０である、項目３３〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．  ｎは０である、項目３３〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【０２４６】
５３．  ｔは０であり、ｐは１〜１００の整数である、項目３３〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．  ｐは１〜２０の整数である、項目３３〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【０２４７】
５５．  Ｑはカルボニルであり、Ｚはアミド結合であり、ｒは１であり、ｕは０であり、ｑは０である、項目３３または３４のいずれか１つに記載の方法。
５６．  固体支持体が、プラスチック、ガラス、および炭素複合材料からなる材料の群から選択される、項目３３〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４８】
５７．  反応性表面が活性アミンを含む、項目３３〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が同数のアミノ酸を含む、項目３３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０２４９】
５９．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が５つのアミノ酸を含む、項目３３〜５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．  ペプチドの集団の着目するアミノ酸配列が、メチオニンアミノ酸、システインアミノ酸、同一アミノ酸のアミノ酸リピート、またはヒスチジン（Ｈ）−プロリン（Ｐ）−グルタミン（Ｑ）配列からなるアミノ酸モチーフをいずれも含まない、項目３３〜５９のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
６１．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれが、さらにＮ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドまたはＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドのうち少なくとも１つを含む、項目３３〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０２５１】
６２．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、同数のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、項目６１に記載の方法。
６３．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、２０種類のアミノ酸それぞれまたはほぼ等濃度の２０種類のアミノ酸のサブセットを含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目６１または６２に記載の方法。
【０２５２】
６４．  ペプチドの集団の環状ペプチドそれぞれのゆらぎ合成オリゴペプチドが、アミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）をほぼ３（Ｇ）対１（Ｓ）の濃度で含むアミノ酸混合物からランダムに誘導される、項目６１または６２に記載の方法。
【０２５３】
６５．  Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドがあり、Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドの両方が同数の５以上のアミノ酸を含む、項目６１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０２５４】
６６．  下記を含む、ペプチドマイクロアレイの作製方法：
マイクロアレイ表面に共有結合した第１の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも１つの第１の直鎖状ペプチドサブアレイを作製する；
マイクロアレイ表面に共有結合した第２の複数の直鎖状ペプチドを含む、少なくとも１つの第２の直鎖状ペプチドサブアレイを作製し、その際、第２の複数の直鎖状ペプチドは第１の複数の直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有する；そして
第１の複数の直鎖状ペプチドを環化させて複数の環化ペプチドを含む少なくとも１つの環化ペプチドドサブアレイを生成させる条件下でペプチドマイクロアレイを処理し、その際、第２の複数の直鎖状ペプチドは実質的に環化しない。
【０２５５】
６７．  第１の複数の直鎖状ペプチドは第１の複数の保護された直鎖状ペプチドであり、その際、第１の複数の保護された直鎖状ペプチドのＣ末端は第１保護基により保護されている；
第２の複数の直鎖状ペプチドは第２の複数の保護された直鎖状ペプチドであり、その際、第２の複数の保護された直鎖状ペプチドは第１の複数の保護された直鎖状ペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、第２の複数の保護された直鎖状ペプチドのＣ末端は第１保護基と異なる第２保護基により保護されている；
項目６６に記載の方法。
【０２５６】
６８．  さらに下記を含む、項目６７に記載の方法：
ペプチドマイクロアレイを第１の脱保護試薬と接触させて第１保護基を選択的に除去して、第１の複数の脱保護された直鎖状ペプチドを含む少なくとも１つの第１の脱保護された直鎖状ペプチドサブアレイを得る；そして
ペプチドマイクロアレイを第２の脱保護試薬と接触させて第２保護基を選択的に除去して、第２の複数の脱保護された直鎖状ペプチドを含む少なくとも１つの第２の脱保護された直鎖状ペプチドサブアレイを得る。
【０２５７】
６９．  第１の複数の直鎖状ペプチドおよび第２の複数の直鎖状ペプチドはそれぞれ、アミノ酸側鎖によりマイクロアレイ表面に付着している、項目６６〜６８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５８】
７０．  第１の複数の直鎖状ペプチドおよび第２の複数の直鎖状ペプチドはそれぞれ、カルボン酸側鎖によりマイクロアレイ表面に付着している、項目６９に記載の方法。
７１．  カルボン酸側鎖はグルタメートまたはアスパルテート側鎖である、項目７０に記載の方法。
【０２５９】
７２．  第アミノ酸側鎖はＣ末端アミノ酸の一部である、項目６９〜７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．  第１の複数の直鎖状ペプチドのうち少なくとも１つの分子は環化できない、項目６６〜７２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６０】
７４．  第１の複数の直鎖状ペプチドのうち環化できない少なくとも１つは、第１の脱保護された直鎖状ペプチドサブアレイから除去されない、項目７３のいずれか１つに記載の方法。
【０２６１】
７５．  第１保護基がＯＡｌｌである、項目６７〜７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．  第１の脱保護試薬がパラジウム触媒である、項目６７〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０２６２】
７７．  パラジウム触媒がテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）である、項目７６に記載の方法。
７８．  第２保護基がＯｔＢｕである、項目６７〜７７のいずれか１つに記載の方法。
【０２６３】
７９．  第２の脱保護試薬が酸である、項目６７〜７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．  酸がトリフルオロ酢酸である、項目７９に記載の方法。
８１．  第１の複数の直鎖状ペプチドを環化させる条件下でのペプチドマイクロアレイの処理が、第１の複数の直鎖状ペプチドのＣ末端のカルボキシル基を活性化して第１の複数の直鎖状ペプチドのＮ末端のアミノ基と反応させてアミド結合を形成することを含む、項目６６〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【０２６４】
８２．  第１の複数の直鎖状ペプチドを環化させる条件下でのペプチドマイクロアレイの処理が、第１の複数の直鎖状ペプチドをＨＯＢｔおよびＨＢＴＵと接触させることを含む、項目６６〜８１のいずれか１つに記載の方法。
【０２６５】
８３．  項目６６〜８２のいずれか１つに記載の方法に従ってペプチドマイクロアレイを作製し、そのペプチドマイクロアレイを潜在結合基と接触させ、接触工程後にペプチドマイクロアレイ上の潜在結合基の存在を測定することを含む、活性環状ペプチドの同定方法。
【０２６６】
８４．  測定工程が蛍光活性を測定することを含む、項目８３に記載の方法。
８５．  式ＩＩＩの少なくとも１つの環状ペプチドを含むペプチドマイクロアレイの作製方法であって、下記を含む方法：
【０２６７】
【化７２】
2018515448.tif 000073
【０２６８】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｑは、カルボニルであり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを反応性表面を有する固体支持体に結合させる結合点である］；
複数の第１ペプチドを環状ペプチドサブアレイ上において作製し、その際、第１ペプチドは式ＩＶのものであり：
【０２６９】
【化７３】
2018515448.tif 000074
【０２７０】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｑ、Ｌ’、Ｌ”、ｍ、ｎ、ｐ、ｔ、および＊は、式ＩＩＩについて定めたものであり；
Ｚ１は、第１カルボキシル保護基であり；
Ｚ２は、水素である］；
複数の第２ペプチドを直鎖状ペプチドサブアレイ上において作製し、その際、第２ペプチドは式Ｖのものであり：
【０２７１】
【化７４】
2018515448.tif 000075
【０２７２】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｑ、Ｌ’、Ｌ”、Ｚ２、ｍ、ｎ、ｐ、ｔ、および＊は、式ＩＶについて定めたものであり；
Ｚ３は、第１カルボキシル保護基と異なる第２カルボキシル保護基であり;
は、水素である］；
第１ペプチドを処理して第１の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させ、その際、直鎖状脱保護ペプチドは式ＶＩのものであり：
【０２７３】
【化７５】
2018515448.tif 000076
【０２７４】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｑ、Ｌ’、Ｌ”、Ｚ２、ｍ、ｎ、ｐ、ｔ、および＊は、式ＩＶについて定めたものであり；
Ｚ１は、−ＯＨである］；
続いて、
直鎖状脱保護ペプチドを処理して環状ペプチドを形成させ；
続いて、
第２ペプチドを処理して式ＶＩの第２の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させ：
その際、第１ペプチドおよび第２ペプチドは反応性表面に固定されており、その少なくとも１つの環状ペプチドは反応性表面に固定されたペプチドの集団の一部であり、そのペプチドの集団は独立して選択された着目するアミノ酸配列を含む。
【０２７５】
８６．  Ｌ’は６−アミノヘキサン酸である、項目８５に記載の方法。
８７．  Ｌ”はＣＨ２ＣＨ２である、項目８５または８６に記載の方法。
８８．  ｍは０である、項目８５〜８７のいずれか１つに記載の方法。
【０２７６】
８９．  ｎは０である、項目８５〜８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．  ｔは０であり、ｐは１〜１００の整数である、項目８５〜８９のいずれか１つに記載の方法。
【０２７７】
９１．  ｐは１〜２０の整数である、項目８５〜９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．  環状ペプチドサブアレイ上の直鎖状の脱保護ペプチドのうち少なくとも１つの分子は環化できない、項目８５〜９１のいずれか１つに記載の方法。
【０２７８】
９３．  環状ペプチドサブアレイ上の直鎖状の脱保護ペプチドは、環状ペプチドサブアレイから除去されない、項目８５〜９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．  第１カルボキシル保護基がＯＡｌｌである、項目８５〜９３のいずれか１つに記載の方法。
【０２７９】
９５．  第１ペプチドを処理して第１の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させることが、第１ペプチドをパラジウムと接触させることを含む、項目８５〜９４のいずれか１つに記載の方法。
【０２８０】
９６．  第２カルボキシル保護基がＯｔＢｕである、項目８５〜９５のいずれか１つに記載の方法。
９７．  第２ペプチドを処理して第２の複数の直鎖状脱保護ペプチドを形成させることが、第２ペプチドを酸と接触させることを含む、項目８５〜９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２８１】
９８．  酸がトリフルオロ酢酸である、項目９７に記載の方法。
９９．  第１ペプチドを処理して環状ペプチドを形成させることが、第１ペプチドのカルボキシル基を活性化して第１ペプチドの遊離アミノ基と反応させてＺを形成することを含む、項目８５〜９８のいずれか１つに記載の方法。
【０２８２】
１００．  第１ペプチドを処理して環状ペプチドを形成させることが、第１の複数の直鎖状ペプチドをＨＯＢｔおよびＨＢＴＵと接触させることを含む、項目８５〜９９のいずれか１つに記載の方法。
【０２８３】
１０１．  項目８５〜１００のいずれか１つに記載の方法に従ってペプチドマイクロアレイを作製し、そのペプチドマイクロアレイを潜在結合基と接触させ、接触工程後にペプチドマイクロアレイ上の潜在結合基の存在を測定することを含む、活性環状ペプチドの同定方法。
【０２８４】
１０２．  測定工程が蛍光活性を測定することを含む、項目１０１に記載の方法。
１０３．  ペプチドバインダーの同定方法であって、下記の工程を含む方法：
ａ．  着目するターゲットを、式Ｉの環状ペプチドを含む第１集団のペプチドバインダーを含むペプチドマイクロアレイに曝露する：
【０２８５】
【化７６】
2018515448.tif 000077
【０２８６】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを、第１の反応性表面を有する第１の固体支持体上に固定する共有結合である］；それによって着目するターゲットは環状ペプチドに結合する；
ｂ．  第１集団のペプチドバインダーのうち着目するターゲットを結合するペプチドバインダー配列におけるオーバーラップを同定し、それによってコアバインダー配列を決定する；
ｃ．  コアバインダー配列に対するアミノ酸の単一アミノ酸置換、二重アミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸挿入から選択される少なくとも１つの改変を実施し、それによって第２集団のコアバインダー配列を作製する；
ｄ．  第２集団のコアバインダー配列を着目するターゲットに曝露し、それによって着目するターゲットは第２集団のコアバインダー配列の少なくとも１つのペプチド配列に結合し、その際、第２集団のコアバインダー配列は式Ｉの環状ペプチドを含む：
【０２８７】
【化７７】
2018515448.tif 000078
【０２８８】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを、第２の反応性表面を有する第２の固体支持体上に固定する共有結合である］；
ｅ．  着目するターゲットに対する強い結合特性を示す第２集団のコアバインダー配列の１以上の配列を同定し、それによって成熟コアバインダー配列を決定する;
ｆ．  工程ｅにおいて決定した成熟コアペプチドバインダー配列の少なくとも１つのＮ末端およびＣ末端伸長を実施し、それによって伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を作製する;
ｇ．  着目するターゲットを、工程ｆにおいて作製された伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を含むペプチドマイクロアレイに曝露し、その際、伸長した成熟ペプチドバインダーの集団は式Ｉの環状ペプチドを含む：
【０２８９】
【化７８】
2018515448.tif 000079
【０２９０】
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、天然アミノ酸側鎖または非天然アミノ酸側鎖であり；
Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、独立して、水素またはＮ末端キャッピング基であり；
Ｒ７はそれぞれ、独立して、−ＯＨまたはＣ末端キャッピング基であり；
Ｑは、カルボニル、天然アミノ酸側鎖、および非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
ＸおよびＹはそれぞれ、独立して、結合、Ｚに共有結合した天然アミノ酸側鎖、およびＺに共有結合した非天然アミノ酸側鎖からなる群から選択され；
Ｚは、アミド結合、ジスルフィド結合、イソペプチド結合、１，２，３−トリアゾール、および場合により置換された１，２−キノンからなる群から選択される部分を含む基であり；
Ｌ’およびＬ”はそれぞれ、独立して、任意選択的な二価連結基または結合であり；
ｍは、０から６までの整数であり；
ｎは、０から６までの整数であり；
ｐは、０から１００までの整数であり；
ｑは、０または１であり；
ｒは、０または１であり；
ｔは、０から１００までの整数であり；
ｕは、０または１であり；
＊は、その少なくとも１つの環状ペプチドを、第３の反応性表面を有する第３の固体支持体上に固定する共有結合である］；
ｈ．  伸長した成熟ペプチドバインダーの集団を含むペプチドのＮ末端またはＣ末端ペプチドバインダー配列におけるオーバーラップを同定し、それによって伸長した成熟ペプチドバインダー配列を決定する。
【０２９１】
１０４．  Ｚは、アミド結合、
【０２９２】
【化７９】
2018515448.tif 000080
【０２９３】
［これらにおいて、ｖは０から６までの整数であり、ｗは０から６までの整数であり、ｙは０から６までの整数であり、＊＊は環状ペプチドの残部への結合点である］からなる群から選択される部分を含む、項目１０３に記載の方法。
【０２９４】
１０５．  Ｚはペプチド結合を含み、Ｑはカルボニルであり、ｑは０であり、ｒは１であり、ｕは０である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１０６．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは＊＊−Ｓ−Ｓ−＊＊を含み、ｑは１であり、ｕは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
【０２９５】
１０７．  Ｚは
【０２９６】
【化８０】
2018515448.tif 000081
【０２９７】
を含み、ｖは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１０８．  Ｚは
【０２９８】
【化８１】
2018515448.tif 000082
【０２９９】
を含み、ｗは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１０９．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０３００】
【化８２】
2018515448.tif 000083
【０３０１】
を含み、ｕは１であり、ｙは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１１０．  ＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０３０２】
【化８３】
2018515448.tif 000084
【０３０３】
を含み、ｑは０であり、ｕは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１１１．  ＸおよびＹはＺへの結合であり、Ｚは
【０３０４】
【化８４】
2018515448.tif 000085
【０３０５】
を含み、ｑは１であり、ｕは１である、項目１０３または１０４に記載の方法。
１１２．  Ｌ’は６−アミノヘキサン酸である、項目１０３〜１１１に記載の方法。
１１３．  Ｌ”はＣＨ２ＣＨ２である、項目１０３〜１１２に記載の方法。
【０３０６】
１１４．  ｍは０である、項目１０３〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
１１５．  ｎは０である、項目１０３〜１１４のいずれか１つに記載の方法。
１１６．  ｔは０であり、ｐは１〜１００の整数である、項目１０３〜１１５のいずれか１つに記載の方法。
【０３０７】
１１７．  ｐは１〜２０の整数である、項目１０３〜１１６のいずれか１つに記載の方法。
１１８．  伸長した成熟ペプチドバインダー配列のラベルフリーおよびアフィニティー分析のうち少なくとも１つを実施する、項目１０３〜１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０３０８】
１１９．  第１、第２、および／または第３固体支持体が、ガラス、プラスチック、および炭素複合材料のうち少なくとも１つを含む、項目１０３〜１１８のいずれか１つに記載の方法。
【０３０９】
１２０．  第１集団のペプチドバインダーが同数のアミノ酸を含む、項目１０３〜１１９のいずれか１つに記載の方法。
１２１．  第１集団のペプチドバインダーが、アミノ酸システインもしくはメチオニン、またはヒスチジン−プロリン−グルタミンモチーフ、または２以上のアミノ酸のアミノ酸リピートを含まない、項目１０３〜１２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３１０】
１２２．  伸長した成熟ペプチドバインダーの集団の環状ペプチドバインダーが、Ｎ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドおよびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチドのうち少なくとも１つを含む、項目１０３〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０３１１】
１２３．  コアバインダー配列が、第１集団のペプチドバインダーを構成する各ペプチドのアミノ酸の数より多い数のアミノ酸を含む、項目１０３〜１２２のいずれか１つに記載の方法。
【０３１２】
１２４．  工程ｅおよびｈがprincipled clustering analysis（原則に基づくクラスタリング分析）を含む、項目１０３〜１２３のいずれか１つに記載の方法。
１２５．  伸長した成熟ペプチドバインダー配列について工程ｃ〜ｈを繰り返す、項目１０３〜１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０３１３】
１２６．  ペプチドマイクロアレイが１以上の直鎖状ペプチドを含み、方法がさらに、ペプチドマイクロアレイ上の１以上の直鎖状ペプチドを、その１以上の直鎖状ペプチドを消化することができるプロテアーゼと接触させることを含む、項目１０３〜１２５のいずれか１つに記載の方法。
【０３１４】
１２７．  プロテアーゼがアミノプロテアーゼまたはアミノプロテアーゼ混合物である、項目１２６に記載の方法。
１２８．  プロテアーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶ、アミノペプチダーゼｍ、またはその組合わせである、項目１２７に記載の方法。
【０３１５】
１２９．  ブテラーゼ１認識配列がＮＨＶである、項目４５または４６に記載の方法。
１３０．  グルタミン側鎖が配列［ＷＹ］［ＤＥ］［ＤＥ］［ＹＷ］ＡＬＱ［ＧＳＴ］ＹＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９４）の一部であり、リジン側鎖が配列ＲＳＫＬＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５）の一部である、項目４７または４８に記載の方法。
【０３１６】
本明細書に記載する種々の態様において、着目するターゲットはいかなる分子であってもよく、それには下記のものが含まれるが、それらに限定されない：生体高分子、たとえばタンパク質、ペプチド、核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ポリカーボハイドレート(polycarbohydrate)、または小分子、たとえば有機化合物もしくは有機金属錯体、または下記に挙げる疾患などの疾患に関与する他のいずれかの分子（たとえば、療法用ペプチドに対する受容体、療法用ペプチドによって阻害もしくは活性化される酵素、または療法用ペプチドによってその分子の活性が変化する他のいずれかの分子）。一態様において、着目するターゲットは疾患状態に関与する分子であってもよく、環状ペプチドは療法用ペプチドであってもよい。
【０３１７】
環状ペプチドが療法用ペプチドである態様において、処置される疾患は下記のものからなる群から選択することができる：癌、感染性疾患、心疾患（たとえば、アテローム性硬化症）および他のコレステロール関連疾患、発作、創傷、痛み、炎症性疾患、たとえば関節炎（たとえば、関節リウマチ）、炎症性腸疾患、乾癬、糖尿病、または自己免疫疾患、呼吸器疾患、たとえば喘息もしくは慢性閉塞性肺疾患、下痢症、遺伝子疾患、神経障害、たとえばアルツハイマー病、筋ジストロフィー、もしくはパーキンソン病、精神障害、または療法用ペプチド（たとえば、環状ペプチド）で処置できる他のいずれかのタイプの疾患。
【０３１８】
他の態様において、疾患は癌、肉腫、リンパ腫、メラノーマ、中皮腫、上咽頭癌、白血病、腺癌、および骨髄腫からなる群から選択される癌であってもよい。さらに他の態様において、疾患は下記のものからなる群から選択される癌であってもよい：肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、子宮内膜癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮頚癌、ホジキン病、食道癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、中皮腫、膀胱癌、バーキットリンパ腫、腎癌、および脳癌、または療法用ペプチド（たとえば、環状ペプチド）で処置できる他のいずれかのタイプの癌。
【０３１９】
ある例において、前駆体である直鎖状ペプチドの環化反応が不十分であって完了できずに直鎖状ペプチドと環状ペプチドの混合物が生じる場合、マイクロアレイ上における環状ペプチドライブラリーの作製は難しい可能性がある。環化反応は配列特異的である可能性があるので、非効率的な環化は対処するのが困難な可能性がある。環化が完了しない状況では、得られる混合物は直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドを含み、その際、環状ペプチドと直鎖状ペプチドの比率は一定ではなく、あるいは当技術分野で既知の方法に基づいて推定するのは簡単ではない。環状ペプチドをそれらの直鎖状カウンターパートから分離精製することによりこれらの問題に対処するのは、きわめて困難である。
【０３２０】
一態様において、ペプチドマイクロアレイ上の直鎖状ペプチドに対するマイクロアレイ上の環化ペプチドの割合を高める工程を実施できる。この側面において、ペプチドマイクロアレイは環化が不十分であるため環状ペプチドと共に１以上の直鎖状ペプチドを含む。よって、この側面において、環化方法はさらに１以上の直鎖状ペプチドを消化できるプロテアーゼとペプチドマイクロアレイ上の１以上の直鎖状ペプチドとを接触させる工程を含むことができる。この態様において、ペプチドマイクロアレイ上の環状ペプチドの収率を高めるために、本明細書に記載する成熟化／伸長／環化方法の工程を次いで繰り返すことができる。
【０３２１】
ある態様において、環化の収率を高めるかあるいは環状ペプチドをそれらの直鎖状前駆体から精製する代わりに、環状ペプチドを直鎖状標準品と共に形成する。後記にさらに詳細に述べるように、環化できないペプチドと同一の直鎖状ペプチドを作製することにより、それらの直鎖状ペプチドとターゲットタンパク質との相互作用を測定することができる。したがって、同じ配列の直鎖状ペプチドと環状ペプチドの差を測定して、高い環化活性をもつペプチドを同定することができる。
【０３２２】
具体的な一態様において、プロテアーゼはアミノプロテアーゼ、たとえばアミノペプチダーゼｍ、システイニルアミノペプチダーゼ、グルタミルアミノペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、もしくはピログルタミルペプチダーゼ、またはアミノプロテアーゼ混合物であってもよい。他の具体的側面において、プロテアーゼはジペプチダーゼ、たとえばジペプチジルペプチダーゼＩＶ、カルボキシペプチダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、メタロエキソペプチダーゼ、またはその組合わせであってもよい。
【０３２３】
本明細書に記載する成熟化／伸長／環化方法の一態様において、イソペプチド結合を形成してペプチドをペプチドマイクロアレイ上で環化することができる。一側面において、連結させることができるアミノ酸は同じペプチド中のグルタミン残基およびリジン残基であってもよく、連結はトランスグルタミナーゼを用いて形成することができる。
【０３２４】
この態様において、ペプチドのグルタミン含有部分はＧＤＹＡＬＱＧＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の配列モチーフを含むことができる。配列モチーフがＧＤＹＡＬＱＧＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である態様において、ペプチドのグルタミン含有部分は下記のものからなる群から選択される配列を含むことができる：
【０３２５】
【化８５】
2018515448.tif 000086
【０３２６】
またはその組合わせ。他の態様において、ペプチドのグルタミン含有部分は配列ＤＹＡＬＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を含むことができる。
他の態様において、ペプチドのグルタミン含有部分はＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、ＷＤＧＤＹＡＬＱＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、ＧＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、およびＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、またはその組合わせからなる群から選択される配列を含むことができる。他の態様において、ペプチドのグルタミン含有部分は配列ＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）を含むことができる。
【０３２７】
さらに他の態様において、ペプチドのグルタミン含有部分は［ＹＦ］［ＶＡ］ＬＱＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）の配列モチーフを含むことができる。この態様において、ペプチドのグルタミン含有部分は下記のものからなる群から選択される配列を含むことができる：
【０３２８】
【化８６】
2018515448.tif 000087
【０３２９】
またはその組合わせ。
さらに他の具体的側面において、ペプチドのグルタミン含有部分はＤＹＦＬＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ＥＹＶＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ＤＹＶＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ＤＦＹＬＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ＥＹＦＬＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、またはその組合わせからなる群から選択される配列を含むことができる。
【０３３０】
さらに他の態様において、ペプチドはリジンを含有することができ、ペプチドのリジン含有部分はＳＫ［ＬＳ］Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）または［ＫＲ］［ＳＴ］ＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）の配列モチーフを含むことができる。この態様において、ペプチドのリジン含有部分は下記のものからなる群から選択される配列を含むことができる：
【０３３１】
【化８７】
2018515448.tif 000088
【０３３２】
またはその組合わせ。
他の具体的態様において、ペプチドはリジンを含有することができ、ペプチドのリジン含有部分はＲＧＴＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９６）、ＦＰＫＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９７）、ＫＬＫＹＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９８）、ＲＡＫＹＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９９）、ＫＴＫＹＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２００）、およびＧＹＫＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０１）、またはその組合わせからなる群から選択される配列を含むことができる。
【０３３３】
さらに他の態様において、ペプチドはトランスグルタミナーゼ  グルタミン基質ペプチドおよびトランスグルタミナーゼ  リジン基質ペプチドを含むことができる。さらに他の態様において、トランスグルタミナーゼ  グルタミンおよび／またはリジン基質ペプチドはＤＹＡＬＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）の配列を含むことができ、あるいは［ＦＹ］［ＦＹＴ］ＬＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）、［ＹＦ］ＶＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０）、Ｋ［ＹＬＳ］Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）、またはＴＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）を含む配列モチーフをもつことができる。
【０３３４】
他の態様において、トランスグルタミナーゼ基質ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜８２のいずれかとの約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の相同性をもつものとする。配列間の同一性または類似性のパーセントの決定は、たとえばＧＡＰプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ソフトウェア；Ａｃｃｅｌｒｙｓによりhttp://www.accelrys.comにおいて入手できる）を用いて行うことができ、アラインメントは、たとえばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（ＶＮＴＩソフトウェア，ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．）を用いて行うことができる。比較すべきペプチド配列を用いて配列データベースを検索できる。データベース検索のためのアルゴリズムは、一般にＢＬＡＳＴソフトウェア(Altschul et al., 1990)に基づく。
【０３３５】
具体的な一態様において、トランスグルタミナーゼ  グルタミン基質ペプチドおよびトランスグルタミナーゼ  リジン基質ペプチドを連結してイソペプチド結合を形成し、その結果、トランスグルタミナーゼを用いたペプチドの環化を実施できる。他の態様において、微生物トランスグルタミナーゼ（たとえば、ストレプトベルティシリウム属の種(Streptoverticillium sp.))のトランスグルタミナーゼ）または哺乳動物トランスグルタミナーゼを使用できる。酵素が哺乳動物トランスグルタミナーゼである態様において、哺乳動物トランスグルタミナーゼは、たとえばヒト第ＸＩＩＩＡ因子トランスグルタミナーゼ、ヒト第ＸＩＩＩＢ因子トランスグルタミナーゼ、第ＸＩＩＩ因子トランスグルタミナーゼ、表皮細胞トランスグルタミナーゼ、組織型トランスグルタミナーゼ、上皮トランスグルタミナーゼ、前立腺トランスグルタミナーゼ、神経トランスグルタミナーゼ、ヒトトランスグルタミナーゼ５、およびヒトトランスグルタミナーゼ７からなる群から選択される。
【０３３６】
Ｉ．ペプチド：
本明細書に開示および記載するペプチドはライフサイエンスおよびヘルスケアの分野において多数の用途をもつ一群の分子を構成する。本明細書に開示および記載するように、本明細書に記載するペプチド（または“ペプチドバインダー”（たとえば、環状ペプチド)）は環状もしくは構造規制(constrained)（マクロサイクル）形態、または環化前には直鎖状である可能性がある。
【０３３７】
本明細書中で用いる用語“ペプチド”、“オリゴペプチド”または“ペプチドバインダー”は、アミノ酸から構成される有機化合物を表わし、それは環化前には直鎖（隣接アミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基の間のペプチド結合により互いに連結したもの）、または環状もしくは構造規制形態（たとえば、“マクロサイクル”）のいずれかにアレンジされている可能性がある。本明細書中で用いるマクロサイクル（または構造規制ペプチド）はそれの慣用される意味で、環状小分子、たとえば約５００ダルトン〜約２，０００ダルトンのペプチドを記述するために用いられる。
【０３３８】
用語“天然アミノ酸”は、一般にタンパク質中にみられ、タンパク質生合成に使われる２０種類のアミノ酸のうちの１つ、および翻訳に際してタンパク質に取り込まれる可能性のある他のアミノ酸（ピロリジンおよびセレノシステインを含む）を表わす。２０種類の天然アミノ酸には、ヒスチジン、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、アルギニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、およびリジンが含まれる。
【０３３９】
用語“非天然アミノ酸”は、標準的遺伝子コードによりコードされるものまたは翻訳に際してタンパク質に取り込まれるものには含まれない有機化合物を表わす。したがって、非天然アミノ酸には下記のアミノ酸またはアミノ酸アナログが含まれるが、それらに限定されない：Ｄ−立体異性体(D-isostereomer)のアミノ酸、アミノ酸のベータ−アミノ−アナログ、シトルリン、ホモシトルリン、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ホモプロリン、オルニチン、４−アミノ−フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−グリシン、ノルロイシン、Ｎ−メチル−グルタミン酸、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、α−アミノ酪酸、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、２−アミノイソ酪酸、α−アミノイソ酪酸、２−アミノインダン−２−カルボン酸、セレノメチオニン、デヒドロアラニン、ランチオニン(lanthionine)、γ−アミノ酪酸、およびその誘導体であってアミン窒素がモノ−またはジ−アルキル化されたもの。
【０３４０】
本開示の態様によれば、固体支持体（たとえば、マイクロアレイ）上に固定した新規な環状ペプチドを記載する。より詳細に後記に述べるように、ペプチドバインダー（たとえば、環状ペプチド）は、抗体のプロファイリング、エピトープ同定、試料プロファイリング、抗体単離、タンパク質同定、ならびに診断および療法適用などの探索手法を可能にすることができる。ある態様において、潜在薬物候補を作製するためにペプチドバインダーを環化前に伸長および成熟化（たとえば、天然または非天然アミノ酸を用いて)することができる。
【０３４１】
本開示の一側面において、同一アレイ上の隣接フィーチャーにおける直鎖状および環状ペプチドは、精製の必要なしに作製される。まず、環状ペプチドを形成するためのサブアレイ上にペプチドを作製する。本明細書中で用いる用語“サブアレイ”は、マイクロアレイの一部またはセクションを表わす。マイクロアレイは１以上のサブアレイをもつことができる。ある態様において、分子の比較を容易にするために、マイクロアレイ上の異なる分子を異なるサブアレイに配置することができる。各ペプチドは遊離アミノ基および保護されたカルボキシル基をもつ。本明細書中で用いる“カルボキシル基”はプロトン化されていてもよく（カルボン酸）、あるいは脱プロトンされていてもよい（カルボキシレート）。直鎖状ペプチドを形成するためのサブアレイ上に同一ペプチドを作製するが、ただし直鎖状ペプチドを形成するためのサブアレイ上のペプチドのカルボキシル基は、環状ペプチドサブアレイ上のペプチドのカルボキシル基とは異なる保護基をもつ。ある態様において、カルボキシル基は対象ペプチドのＣ末端カルボキシル基であり、アミノ基は対象ペプチドのＮ末端アミノ基である。合成に際して、Ｃ末端およびアミノ酸側鎖を保護しておくことができる。
【０３４２】
本明細書中で用いる用語“保護基”は、官能基の反応性を変化させる、一般に官能基の反応性を低減または遮閉する、当技術分野で一般に知られているいずれかの基を表わす。本開示に関して有用な保護基にはカルボキシル保護基、たとえばGreene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition, Copyright (c) 2007 John Wiley & Sons, Inc.（本明細書に援用する）に記載されたものが含まれるが、それらに限定されない。本開示に関して有用な代表的カルボキシル保護基には、エステル、たとえばアルキル、アリル、ベンジル、フェニル、アリール、およびシリルエステル；オキサゾール；オルトエステル；ならびに有機金属錯体、たとえばコバルトおよびスズ錯体が含まれるが、これらに限定されない。カルボキシル保護基の限定ではないリストには、下記のものが含まれる：ヘプチル、２−Ｎ−（モルホリノ）エチル、コリン、（メトキシエトキシ）エチル、メトキシエチル、メチル、９−フルオレニルメチル、メトキシメチル、メトキシエトキシメチル、メチルチオメチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、ベンジルオキシメチル、トリイソプロピルシロキシメチル、ピバロイルオキシメチル、フェニルアセトキシメチル、トリイソプロピルシリルメチル、シアノメチル、アセトール(acetol)、フェナシル、デシル、カルボキサミドメチル、ｐ−アゾベンゼンカルボキサミドメチル、６−ブロモ−７−ヒドロキシクマリン−４−イルメチル、Ｎ−フタルイミドメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−ハロエチル、ω−クロロアルキル、２−（トリメチルシリル）エチル、（２−メチル−２−トリメチルシリル）エチル、（２−フェニル−２−トリメチルシリル）エチル、２−メチルチオエチル、１，３−ジチアニル−２−メチル、２−（ｐ−ニトロフェニルスルフェニル）エチル、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチル、２−（２’−ピリジル）エチル、２−（ジフェニルホスフィノ）エチル、（ｐ−メトキシフェニル）エチル、１−メチル−１−フェニルエチル、２−（４−アセチル−２−ニトロフェニル）エチル、１−［２−（２−ヒドロキシアルキル）フェニル］エタノン、２−シアノエチル、ｔ−ブチル、３−メチル−３−ペンチル、ジシクロプロピルメチル、２，４−ジメチル−３−ペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アリル、メタリル、２−メチルブタ−３−エン−２−イル、３−メチルブタ−２−エニル、３−ブテン−１−イル、４−（トリメチルシリル）−２−ブテン−ｌ−イル、シンナミル、α−メチルシンナミル、プロパ−２−イニル（プロパルギル）、フェニル、２，６−ジメチルフェニル、２，６−ジイソプロピルフェニル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェニル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メトキシフェニル、ｐ−（メチルチオ）フェニル、ペンタフルオロフェニル、２−（ジメチルアミノ）−５−ニトロフェニル、ベンジル、トリフェニルメチル、２−クロロフェニルジフェニルメチル、２，３，４，４’，４”，５，６−ヘプタフルオロトリフェニルメチル、ジフェニルメチル、ビス（ｏ−ニトロフェニル）メチル、９−アントリルメチル、２−（９、１０−ジオキソ）アントリルメチル、５−ジベンゾスベリル、１−ピレ���ルメチル、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチル、２，４，６−トリメチルベンジル、ｐ−ブロモベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−メトキシベンジル、２，６−ジメトキシベンジル、４−（メチルスルフィニル）ベンジル、４−スルホベンジル、４−アジドメトキシベンジル、４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］アミノ｝ベンジル、ピペロニル、４−ピコリル、ｐ−ポリマー−ベンジル、２−ナフチルメチル、３−ニトロ−２−ナフチルメチル、４−キノリルメチル、８−ブロモ−７−ヒドロキシキノリン−２−イルメチル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル、１，２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、ｔ−プロピルジメチルシリル、フェニルジメチルシリル、ジ−ｔ−ブチルメチルシリル、トリイソプロピルシリル、およびトリス（２，６−ジフェニルベンジル）シリル。
【０３４３】
代表的なアミノ保護基には、Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition, Copyright (c) 2007 John Wiley & Sons, Inc.（本明細書に援用する）に記載されたものが含まれる。本開示に関して有用な代表的アミノ保護基には、カルバメート、尿素タイプ誘導体、アミド、Ｎ−スルフェニル誘導体、およびＮ−スルホニル誘導体が含まれるが、これらに限定されない。アミノ保護基の限定ではないリストには、下記のものが含まれる：９−フルオレニルメチル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−９−フルオレニルメチル、２，７−ビス（トリメチルシリル）フルオレニルメチル、９−（２−スルホ）フルオレニルメチル、９−（２，７−ジブロモ）フルオレニルメチル、１７−テトラベンゾ［ａ，ｃ，ｇ，ｉ］フルオレニルメチル、２−クロロ−３−インデニルメチル、ベンズ［ｆ］インデン−３−イルメチル、１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメチル、２−メチルスルホニル−３−フェニル−１−プロパ−２−エニルオキシ、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、（２−フェニル−２−トリメチルシリル）エチル、２−フェニルエチル、２−クロロエチル、１，１−ジメチル−２−ハロエチル、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチル、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチル、２−（２’−および４’−ピリジル）エチル、２，２−ビス（４’−ニトロフェニル）エチル、２−［（２−ニトロフェニル）ジチオ］−１−フェニルエチル、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチル、ｔ−ブチル、１−アダマンチル、２−アダマンチル、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチル、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エチル、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチル、トリイソプロピルシロキシル、ビニル、アリル、プレニル、１−イソプロピルアリル、シンナミル、４−ニトロシンナミル、３−（３’−ピリジル）プロパ−２−エニル、ヘキサジエニルオキシ、プロパルギルオキシ、ブタ−２−イニルビスオキシ、８−キノリル、Ｎ−ヒドロキシピペリジニル，アルキルジチオ、ベンジル、３，５−ジ−ｔ−ブチルベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−クロロベンジル、２，４−ジクロロベンジル、４−メチルスルフィニルベンジル、４−トリフルオロメチルベンジル、フルオラスベンジル(fluorous benzyl)、２−ナフチルメチル、９−アントリルメチル、ジフェニルメチル、４−フェニルアセトキシベンジル、４−アジドベンジル、４−アジドメトキシベンジル、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジル、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジル、５−ベンゾイソオキサゾリルメチル、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチル、２−メチルチオエチル、２−メチルスルホニルエチル、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチル、２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エチル、２−（２，４−ジニトロフェニルスルホニル）エトキシ、２−（４−トリフルオロメチルフェニルスルホニル）エチル、［２−（１，３−ジチアニル）］メチル、２−ホスホニオ��チル、２−［フェニル（メチル）スルホニオ］エチル、１−メチル−１−（トリフェニルホスホニオ）エチル、１，１−ジメチル−２−シアノエチル、２−ダンシルエチル(2-dansylethyl)、２−（４−ニトロフェニル）エチル、４−メチルチオフェニル、２，４−ジメチルチオフェニル、ｍ−ニトロフェニル、３，５−ジメトキシベンジル、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチル、α−メチルニトロピペロニル、ｏ−ニトロベンジル、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジル、３，４−ジ置換−６−ニトロベンジル、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチル、２−ニトロフェニルエチル、６−ニトロベラトリル、４−メトキシフェナシル、３’，５’−ジメトキシベンゾイン、９−キサンテニルメチル、Ｎ−メチル−Ｎ−（ｏ−ニトロフェニル）、Ｎ−（２−アセトキシエチル）アミン、ｔ−アミル、１−メチルシクロブチル、１−メチルシクロヘキシル、１−メチル−１−シクロプロピルメチル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、イソブチル、イソボルニル、シクロプロピルメチル、ｐ−デシルオキシベンジル、ジイソプロピルメチル、２，２−ジメトキシカルボニルビニル、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジル、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピル、ブチニル、１，１−ジメチルプロピニル、２−ヨードエチル、１−メチル−１−（４’−ピリジル）エチル、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチル、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジル、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、イソニコチニル、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジル、ｐ−シアノベンジル、ジ（２−ピリジル）メチル、２−フラニルメチル、フェニル、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニル、１−メチル−１−フェニルエチル、Ｓ−ベンジルチオカルバメート、尿素、フェノチアジニル−（１０）−カルボニル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノカルボニル、Ｎ’−フェニルアミノチオカルボニル、４−ヒドロキシフェニルアミノカルボニル、３−ヒドロキシトリプタミノカルボニル、Ｎ’−フェニルアミノチオカルボニル、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ペンタ−４−エンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド、２，２−ジメチル−２−（ｏ−ニトロフェニル）アセトアミド、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンナミド、ｏ−ニトロベンズアミド、３−（４−ｔ−ブチル−２，６−ジニトロフェニル）−２，２−ジメチルプロパンアミド、ｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミド、２−（アセトキシメチル）ベンズアミド、２−［（ｔ−ブチルジフェニルシロキシ）メチル］ベンゾイル、３−（３’，６’−ジオキソ−２’，４’，５−トリメチルシクロヘキサ−１’，４’−ジエン）−３，３−ジメチルプロピオンアミド、ｏ−ヒドロキシ−ｔｒａｎｓ−シンナミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、４−クロロブタンアミド、アセトアセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ）アセトアミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジクロロフタルイミド、Ｎ−テトラクロロフタルイミド、Ｎ−４−ニトロフタルイミド、Ｎ−チオジグリコリル、Ｎ−ジチアスクシンイミド、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，３−ジメチルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−２，５−ビス（トリイソプロピルシロキシ）ピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物、Ｎ−１，１，３，３−テトラメチル−ｌ，３−ジシライソインドリン、Ｎ−ジフェニルシリルジエチレン基、Ｎ−５−置換ｌ，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、Ｎ−５−置換ｌ，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、１，３，５−ジオキサジン、ベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロベンゼンスルフェンアミド、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、１−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジフェニル）エチルスルフェンアミド、Ｎ−３−ニトロ−２−ピリジンスルフェンアミド、メタンスルホンアミド、トリフルオロメタンスルホンアミド、ｔ−ブチルスルホンアミド、ベンジルスルホンアミド、２−（トリメチルシリル）エタンスルホンアミド、ｐ−トルエンスルホンアミド、ベンゼンスルホンアミド、アニシルスルホンアミド、２−または４−ニトロベンゼンスルホンアミド、２，４−ジニトロベンゼンスルホンアミド、２−ナフタレンスルホンアミド、４−（４’，８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド、２−（４−メチルフェニル）−６−メトキシ−４−メチルスルホンアミド、９−アントラセンスルホンアミド、ピリジン−２−スルホンアミド、ベンゾチアゾール−２−スルホンアミド、フェナシルスルホンアミド、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド、ペンタメチルベンゼンスルホンアミド、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド、４−メトキシベンゼンスルホンアミド、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド、３−メトキシ−４−ｔ−ブチルベンゼンスルホンアミド、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド。
【０３４４】
マイクロアレイを作製した後、環状ペプチドを形成するためのサブアレイ上のペプチドの保護されたカルボキシル基を脱保護する。脱保護の結果、環状ペプチドを形成するためのサブアレイ上の各ペプチドはこの時点で遊離カルボキシル基をもつ。環状ペプチドを形成するためのサブアレイ上のペプチドはこの工程で脱保護されるが、直鎖状ペプチドを形成するためのサブアレイ上のペプチドのカルボキシル基は除かれない。よって、直鎖状ペプチドサブアレイ上のペプチドはこの工程に際して保護されたままである。
【０３４５】
保護基は当技術分野で既知の多様な方法に従って除去できる（あるいは、脱保護）。カルボキシル保護基の脱保護（または除去）のための代表的方法には、Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition, Copyright (c) 2007 John Wiley & Sons, Inc.（本明細書に援用する）に記載された方法が含まれるが、それらに限定されない。本開示に関して有用な、カルボキシル保護基の脱保護のための代表的方法には、加水分解、たとえば水酸化物塩基、たとえばＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＣｓＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｂａ（ＯＨ）２などと接触させることによるカルボン酸エステルの加水分解、カルボキシル保護基の求核置換、たとえばＬｉＳ−ｎ−Ｐｒ、ＮａＳｅＰｈ、ＬｉＣｌ、ＫＯ−ｔ−Ｂｕ、ＮａＣＮ、ＮａＴｅＨ、ＫＯ２、ＬｉＩ、およびＰｈＳＨと接触させることによるものが含まれるが、これらに限定されない。ある態様において、特にアリル保護基の場合、保護基の除去はパラジウム源、たとえばＰｄ／Ｃ、Ｐｄ（０）、Ｐｄ（ＩＩ）などの添加を含むことができる。Ｐｄ（０）の一例はＰｄ（ＰＰｈ３）４である。Ｐｄ（ＩＩ）の例にはＰｄＣｌ２およびＰｄ（ＯＡｃ）２が含まれる。さらに、カルボキシル保護基は酸、たとえばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの添加により除去できることを考慮する。
【０３４６】
次に、環状ペプチドを形成するためのサブアレイ上のペプチドは、それらの遊離したアミノ基とカルボキシル基の間のアミド結合の形成を促進する条件下に置かれる。このアミド結合形成によって、環状ペプチドを形成するためのサブアレイ上のペプチドは環化されて環状ペプチドを形成する。この環化工程に際して、ある程度の非効率性を予想すべきであり、すべてのペプチドが環化するわけではない。環化していないペプチドは脱保護された直鎖状のままである。直鎖状ペプチドを形成するためのサブアレイ上のペプチドは保護されたカルボキシル基をもつので、これらのペプチドについてはこの工程に際してアミド結合形成は起きず、それらは保護された直鎖状形態のままである。
【０３４７】
ある態様において、本明細書に記載する直鎖状ペプチドは、直鎖状ペプチドのＣ末端カルボキシル基とＮ末端アミノ基の間でアミド結合を形成することにより環化して環状ペプチドを形成する。そのような反応は当技術分野で一般に知られているアミド結合形成条件によって促進することができ、それにはＣ末端カルボキシル基の活性化のための条件が含まれるが、それらに限定されない。本開示に関して有用な代表的アミド結合形成条件には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：カルボジイミド、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、および（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド・ＨＣｌ；添加物、たとえば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシ−７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール、エチル  ２−シアノ−２−（ヒドロキシイミノ）アセテート、および４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン；ホスホニウム試薬、たとえばベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリピロリジノ−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート、ブロモ−トリピロリジノ−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート、７−アザ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート、エチル  シアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト−Ｏ２）−トリ−（１−ピロリジニル）−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート、および３−（ジエトキシ−ホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾ［ｄ］トリアジン−４（３Ｈ）−オン；アミニウム／ウロニウム−イモニウム(imonium)試薬、たとえば２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート／ヘキサフルオロホスフェート、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアミニウム  ヘキサフルオロホスフェート、（Ｎ−［（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−ジメチルアミノ−モルホリノ］−ウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート  Ｎ−オキシド、２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアミニウム  ヘキサフルオロホスフェート、（１−［１−（シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）−ジメチルアミノ−モルホリノ］−ウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート、（２−（１−オキシ−ピリジン−２−イル）−１，１，３，３−テトラメチルイソチオウロニウム  テトラフルオロボレート、およびテトラメチルフルオロホルムアミジニウム  ヘキサフルオロホスフェート；ならびに他のカップリング試薬、たとえばＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン、２−プロパンホスホン酸無水物、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム塩類、トリホスゲン、および１，１’−カルボニルジイミダゾール。
【０３４８】
環化工程の後、直鎖状ペプチドを形成するためのサブアレイ上のペプチドを脱保護する。この脱保護工程の結果、直鎖状ペプチドを形成するためのサブアレイ上のペプチドは構造的に環状ペプチドを形成するためのサブアレイ上の、環化工程に際して環化できないペプチドと同一になる。直鎖状ペプチドサブアレイ上のペプチドと環状ペプチドサブアレイ上のペプチドの結合特性を比較して、特定ターゲットに対する環状と直鎖状の結合優先性を比較することができる。そうすることによって、直鎖状配列が環状フィーチャーにおいて結合に寄与しているかどうかを判定できる。マイクロアレイ上に数対の直鎖状および環状ペプチドサブアレイを形成して、着目するペプチド配列を同定することができる。
【０３４９】
図９を参照すると、ある態様において、リンカーアミノ酸の側鎖を介して対象ペプチドをマイクロアレイに付着させることにより、直鎖状ペプチドライブラリーをマイクロアレイ上において合成する。図９にはグルタメートを示すが、他のアミノ酸側鎖、たとえばアスパルテート側鎖をマイクロアレイ表面の活性基に結合させて対象ペプチドに付着させることができる。マイクロアレイ表面上の活性基と共有結合を形成できる天然または非天然の他のアミノ酸側鎖、たとえばアルコール、アミン、チオール、アシル、ホスホニル、スルホニル、および他の官能基が本発明において考慮される。さらに、リンカーアミノ酸のＣ末端カルボキシル基を反応性表面に結合させることが考慮され、そのリンカーアミノの側鎖がアミノ基とアミド結合できるカルボキシル側鎖基であってもよい。カルボキシル保護基は、第２組のペプチドを環化させることなく一組のペプチドの選択的な脱保護および環化を可能にするいずれか２つの異なるカルボキシル保護基であってもよい。
【０３５０】
ＩＩ．マイクロアレイ：
一態様において、研究およびヘルスケアに使用できるペプチドマイクロアレイを記載する。たとえば、本明細書に記載するペプチドマイクロアレイは生物活性モチーフの同定に利用できる（たとえば、マイクロアレイ上のペプチド（たとえば、環状ペプチド）は対応する受容体への結合をスクリーニングするためのリガンドの潜在活性モチーフを模倣してもよい）。一側面において、本明細書に開示するペプチドマイクロアレイは疾患関連抗原の特異的配列を反映してもよい（よって、診断またはモニタリングの目的で、たとえば患者試料から特定疾患の存在を示唆する抗体を検出するために利用できる）。ペプチドマイクロアレイの他の用途は生化学的相互作用の探索であり、それにはマイクロアレイ上に固定されたペプチド（たとえば、環状ペプチド）へのタンパク質またはＤＮＡの結合、または細胞活性、酵素活性、細胞接着などのプロファイリングが含まれる。
【０３５１】
ペプチドマイクロアレイを製造するための種々の方法が当技術分野で知られている。たとえば、予め製造したペプチドをスポットすること、または試薬をたとえば膜上にスポットすることによるイン−サイチュ合成が既知方法の例である。より高密度のペプチドアレイを作製するために用いられる他の既知方法は、いわゆるフォトリソグラフィー法であり、その場合、希望する生体高分子の合成設計は、電磁線、たとえば光に曝露された際にそれぞれ次の構成要素（アミノ酸）のための連結部位を放出する適切な光分解性保護基(photolabile protecting group)（ＰＬＰＧ）により制御される(Fodor et al., (1993) Nature 364:555-556; Fodor et al., (1991) Science 251:767-773)。２つの異なるフォトリソグラフィー法が最新技術分野で知られている。第１は、合成表面の特定領域へ光線を向けて限局されたＰＬＰＧ脱保護を行なうために用いられるフォトリソグラフィーマスクである（たとえば、図１を参照）。“マスク付き(masked)”方法にはマウント（たとえば、“マスク”）を用いるポリマー合成が含まれ、マウントは基材とかみ合って基材とマウントの間に反応空間を提供する。そのような“マスク付き”アレイ合成の代表的態様は、たとえばU.S. Patent No. 5,143,854および5,445,934に記載されており、それらの開示内容を本明細書に援用する。しかし、この手法の潜在的欠点には、多数のマスキング工程を必要とし、その結果、比較的低い全収率および高いコストになることが含まれる；たとえば、わずか６アミノ酸の長さのペプチドを合成するのに１００を超えるマスクが必要な可能性がある。
【０３５２】
第２のフォトリソグラフィー法は、いわゆるマスクレスフォトリソグラフィーであり、その場合、光線はデジタル投影技術、たとえばマイクロミラーデバイスによって、限局されたＰＬＰＧ脱保護を行なう合成表面の特定の領域へ向けられる(Singh-Gasson et al., Nature Biotechn. 17 (1999) 974-978)。よって、そのような“マスクレス”アレイ合成により、時間および経費のかかる露光マスク製造の必要性が除かれる。本明細書に開示するペプチドマイクロアレイ、ペプチドマイクロアレイの作製方法、およびマイクロアレイを用いたペプチドバインダー（たとえば、環状ペプチド）同定方法の態様は上記の種々のアレイ合成法をいずれも利用できることを理解すべきである。
【０３５３】
フォトリソグラフィーベースのペプチドマイクロアレイ合成の基礎を提供するＰＬＰＧ（光分解性保護基）の使用は当技術分野で周知である。フォトリソグラフィーベースの生体高分子合成のために一般に用いられるＰＬＰＧは、たとえばα−メチル−６−ニトロピペロニル−オキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）(Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:5022-5026)、２−（２−ニトロフェニル）−プロポキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）(Hasan et al. (1997) Tetrahedron 53: 4247-4264)、ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）(Fodor et al. (1991) Science 251:767-773)、および２−ニトロベンジルオキシカルボニル（ＮＢＯＣ）(Patchornik et al. (1970) 21:6333-6335)である。
【０３５４】
光分解性アミノ保護基としてのＮＰＰＯＣで保護されたアミノ酸がペプチドマイクロアレイのフォトリソグラフィー固相ペプチド合成に導入され、その際、ガラススライドが支持体として用いられた(U.S. App. Pub. No. 20050101763)。ＮＰＰＯＣ保護されたアミノ酸を用いる方法は、光で照射した際のすべての（１つを除く）保護されたアミノ酸の半減期が特定条件下でおおよそ２〜３分であるのに対し、ＮＰＰＯＣ保護されたチロシンは同じ条件下でほぼ１０分の半減期を示すという欠点をもつ。合成プロセス全体の速度は最も遅いサブプロセスに依存するので、この現象は合成プロセスの時間を３〜４倍増大させる。同時に、生長しつつあるオリゴマーに対する光発生したラジカルイオンによる損傷の程度は光要求量の増大および過剰度に伴って増大する。
【０３５５】
本明細書中で用いる用語“ペプチドマイクロアレイ”は、固体支持体の表面におけるフィーチャーの二次元配置を表わす。単一ペプチドマイクロアレイ、またはある場合には多重ペプチドマイクロアレイ（たとえば、３、４、５、またはそれ以上のペプチドマイクロアレイ）が１つの固体支持体上に存在することができる。一定寸法をもつ固体支持体について、ペプチドマイクロアレイのサイズは１つの固体支持体上のペプチドマイクロアレイの数に依存する。すなわち、固体支持体当たりのペプチドマイクロアレイの数が多いほど、より小さいペプチドマイクロアレイを固体支持体上に当てはめなければならない。アレイはいかなる形状にも設計できるが、好ましくはそれらは正方形または長方形として設計される。既製品は固体支持体（たとえば、ペプチドマイクロアレイスライド）上のペプチドマイクロアレイである。
【０３５６】
用語“ペプチドマイクロアレイ”（またはペプチドチップまたはペプチドエピトープマイクロアレイ）は、固体支持体、たとえばガラス、炭素複合材料またはプラスチックのアレイ、スライドまたはチップ上にディスプレイされた、ペプチドの集団または集合体を含む。ペプチドマイクロアレイの代表的使用には、生物学、医学および薬理学の分野が含まれ、それはタンパク質−タンパク質相互作用の結合特性、機能性および動態の研究を含む。基礎研究における使用には、タンパク質結合の鍵となる残基を見出すための酵素（たとえば、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアシラーゼ）のプロファイリングおよび抗体エピトープのマッピングを含めることができる。他の用途には、血清マーカー探索、個々の患者の疾患進行中の体液性免疫応答の変化のプロファイリング、療法介入のモニタリング、患者の層別化、ならびに診断および療法用のツールおよびワクチンの開発が含まれる。
【０３５７】
用語“フィーチャー(feature)”は、ペプチドマイクロアレイの表面上の規定領域を表わす。フィーチャーは、生体分子、たとえばペプチドを含む。１つのフィーチャーが、他のフィーチャーと比較して異なる特性、たとえば異なる配列または配向をもつ生体分子を収容することができる。フィーチャーのサイズは２つの要因により決定される：ｉ）ペプチドアレイ上のフィーチャーの数：ペプチドアレイ上のフィーチャーの数が多いほど、それぞれの単一フィーチャーはより小さくなる；およびｉｉ）１つのフィーチャーの照射に用いる個別アドレス指定可能なアルミニウムミラー素子の数。１つのフィーチャーの照射に用いるミラー素子の数が多いほど、単一フィーチャーそれぞれはより大きくなる。ペプチドマイクロアレイ上のフィーチャーの数は、マイクロミラーデバイスに存在するミラー素子（ピクセル）の数により制限される可能性がある。たとえば、Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．からの最新のマイクロミラーデバイスは現在４２０万のミラー素子（ピクセル）を収容し、よってそのような代表的なペプチドマイクロアレイ内のフィーチャーの数はしたがってこの数により制限される。しかし、Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．からのマイクロミラーデバイスは例示のために示されるにすぎず、より高密度のペプチドマイクロアレイが可能であることを理解すべきである。
【０３５８】
用語“固体支持体”は、有機分子を結合形成により付着させるかあるいは電子的または静電相互作用により吸収することができる表面領域をもつ、いずれかの固体材料を表わす；たとえば、特定の官能基による共有結合または複合体形成。固体支持体はガラス上のプラスチック、ガラス上の炭素など、材料の組合わせであってもよい。機能性表面は単純な有機分子であってもよいが、コポリマー、デンドリマー(dendrimer)、分子ブラシ(molecular brush)などを含むこともできる。
【０３５９】
用語“プラスチック”は、合成材料、たとえば有機構築ブロック（モノマー）のホモポリマーまたはヘテロ−コポリマーを表わし、それらは有機分子を共有結合形成により付着させるかあるいは電子的または静電相互作用により吸収することができる（たとえば、官能基による結合形成により）ように機能化された表面を備えている。好ましくは、用語“プラスチック”は、オレフィンの重合により誘導されたポリマーであるポリオレフィンを表わす（たとえば、エチレンプロピレンジエンモノマーのポリマー、ポリイソブチレン）。最も好ましくは、プラスチックは規定の光学特性を備えたポリオレフィンである；たとえば、ＴＯＰＡＳ（登録商標）またはＺＥＯＮＯＲ／ＥＸ（登録商標）。
【０３６０】
用語“官能基”は、化学分子の一部を形成する原子の多数の組合わせのいずれかであって、それ自体で特徴的な反応を行ない、その分子の残部の反応性に影響を及ぼすものを表わす。代表的な官能基にはヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、カルボニル、アミノ、アジド、アルキニル、チオール、およびニトリルが含まれるが、これらに限定されない。潜在的に反応性である官能基には、たとえばアミン、カルボン酸、アルコール類、二重結合などが含まれる。好ましい官能基は、アミノ酸の潜在的に反応性である官能基、たとえばアミノ基またはカルボキシル基である。機能性ペプチドは反応性官能基を含む。
【０３６１】
本明細書中で用いる“実質的に環化しない”は、環化するのが５％未満であることを意味する。
当業者が理解するように、ペプチドマイクロアレイは数千（または本開示の場合は数百万）のペプチド（ある態様においては多重コピーで提示される）を固体支持体（ある態様においては、ガラス、炭素複合材料またはプラスチックのチップまたはスライドを含む）の表面に連結または固定するアッセイ原理を含む。本開示の態様によれば、精製した酵素または抗体、患者または動物の血清、細胞溶解物、受容体に対するリガンド、受容体、酵素に対する基質などを含む着目する多種多様なターゲットと共に、ペプチドマイクロアレイをインキュベートすることができる。
【０３６２】
ある態様において、ペプチドマイクロアレイは、着目するターゲットと共にインキュベートされた後、１回以上の洗浄工程を受け、次いで希望する特異性をもつ二次抗体（たとえば、抗ＩｇＧヒト／マウスまたは抗ホスホチロシンまたは抗ｍｙｃ）に曝露される。通常は、蛍光スキャナーで検出できる蛍光標識により二次抗体をタグ付けする。他の検出法は化学発光、比色法、またはオートラジオグラフィーである。
【０３６３】
ある態様において、ペプチドマイクロアレイスライドをスキャンした後、スキャナーは２０ビット、１６ビットまたは８ビットの数値イメージをタグ付きイメージファイルフォーマット(tagged image file format)（＊ｔｉｆ）で記録する。ｔｉｆ−イメージにより、スキャンしたペプチドマイクロアレイスライド上のそれぞれの蛍光スポットの解釈および定量が可能になる。この定量データは、測定したペプチドマイクロアレイスライド上の結合事象またはペプチド修飾について統計解析を実施するための基礎である。検出した信号の評価および解釈のためには、ペプチドスポット（イメージ中に目視できるもの）および対応するペプチド配列の割付けを実施しなければならない。
【０３６４】
一態様において、ペプチドマイクロアレイは、ペプチドがその上にスポットされたかまたはイン−サイチュ合成によりその表面で直接アセンブリングされたスライドであってもよい。相互作用プロファイリングのために、理想的にはペプチドを選択的化学結合により共有結合させて、同じ配向をもつペプチドにする。別法には非特異的的共有結合および接着固定が含まれる。
【０３６５】
図１および２を参照して、種々のペプチドマイクロアレイ合成装置（マスク付きおよびマスクレスフォトリソグラフィー法それぞれに用いられる）を提示する。ここで図１について具体的に述べると、マスク付きフォトリソグラフィー法（たとえば、U.S. Patent No. 5,445,934に教示されるもの）を実施するための代表的システム１００が示され、システムボディー１０２はその表面に規定されたキャビティー１０４を備えたものとして描かれている。底面１０８に沿って光除去性(photoremovable)保護基（たとえば、介在するリンカー分子を含むかまたは含まないＮＶＯＣなど）をもつ基材（固体支持体）１０６が、キャビティー１０４の上方に取り付けられている。基材（固体支持体）１０６は、たとえば広域の光線に対して透明であってもよく、あるいはある態様においては保護基を除去できる波長（たとえば、ＮＶＯＣの場合はＵＶ）においてのみ透明である。基材（固体支持体）１０６とボディー１０２はキャビティー１０４をシールし（入口と出口以外）、たとえばガスケット（単数または複数）または真空により嵌め合わせることができる。
【０３６６】
光源１１２（たとえば、Ｘｅ（Ｈｇ）光源）からの光線を基材（固体支持体）１０６上へ収束および指向させるために、レンズ１１８、およびある態様において反射ミラー１１６が備えられている。図１に描いた態様には、レンズ１１８と組み合わせてマスクイメージを基材（固体支持体）上へ投影するための第２レンズ１１４が示されている（ある態様においては、備えることができる）（別名“プロジェクションプリンティング(projection printing)”)。光線（光源１１２からの）は、基材（固体支持体）１０６と接触する前にマスク１１０に接触し、それによりその光線は基材（固体支持体）１０６上の選択された位置にのみ達することができる。マスク１１０は、たとえばエッチングされたクロムをその上に備えたスライドガラスであってもよい。ある態様において、マスク１１０は、たとえば透明位置と不透明位置の格子を備えていてもよい。当業者が理解するように、マスク付きアレイ合成を用いると、光線はマスク１１０の“透明”領域を自由に通過するが、マスク１１０の他の（たとえば、“不透明”）領域からは反射され、あるいはそれにより吸収される。よって、基材（固体支持体）１０６の選択された領域のみが露光される。
【０３６７】
同様に、ライトバルブ(light valve)（ＬＣＤの）を一般的なマスクの代わりに使用できる（基材の領域を選択的に露光するために）；光ファイバーフェースプレート(fiberoptic faceplate)を使用できる（マスクのコントラスト増強のために、または光線を適用する領域を制限するための唯一の手段として）；フライアイレンズ(fly’s-eye lense)、テーパー光ファイバーフェースプレート(tapered fiberoptic faceplate)などもコントラスト増強のために使用できる。光線の波長より小さな領域の照射は当技術分野で既知のより精巧な手法で達成できることも理解すべきである（例：たとえばマイクロピペットの先端にある分子微結晶により光線を基材に指向させる）。代表的デバイスがLieberman et al., “A Light Source Smaller than the Optical Wavelength”, Science (1990) 247:59-61に示されている。
【０３６８】
ここで、図２について具体的に述べると、“マスクレス”ペプチドマイクロアレイ合成を説明するために、本開示に従って使用できる代表的“マスクレス”ペプチドマイクロアレイシステム（たとえば、U.S. Patent No. 6,375,903に記載されたもの)を提示する。一般的に２００として示す例示システムは、二次元アレイイメージ作成装置(image former)２０２、およびその上にアレイイメージを投影する基材（固体支持体）２０４を含むものとして表わされる。図２に示す例示態様において、基材（固体支持体）は、露出した進入面２０６、およびその上にペプチド２１０の二次元アレイを作製すべき反対側の活性面２０８をもつ。ただし、ある態様において、基材（固体支持体）２０４は、イメージ作成装置２０２に面した、かつ透明ウィンドウ（光線を活性面２０８上へ投影できる）をもつ反応チャンバーフローセル内に収容された活性面２０８をもつことができる。（固体支持体）態様は不透明または多孔質基材（固体支持体）２０４を含むこともできる。
【０３６９】
この本開示によるマスクレスペプチドマイクロアレイのある態様において、イメージ作成装置２０２は光源２１２（たとえば、紫外線または近紫外線源、たとえば水銀アークランプ）、任意選択的なフィルター２１４（光源２１２からの出力ビーム２１６を受信して、希望する波長、たとえば３６５ｎｍのＨｇ線のみを選択的に通過させるためのもの）、およびコンデンサーレンズ２１８（平行ビーム２２０を形成するためのもの）を含むことができる。透過フィルターではなく光源光線をフィルタリングまたはモノクロメートするための他のデバイス、たとえば回折格子、ダイクロイックミラー(dichroic mirror)、およびプリズムも使用でき、それらを本明細書中では“フィルター”と総称する。
【０３７０】
示されるように、ビーム２２０は、それぞれアレイデバイス２２４に供給されるコントロール信号（コンピューターコントローラー２２８により付与される）に応答する個々のマイクロミラー２２６の二次元アレイをもつ二次元マイクロミラーアレイデバイス２２４を投影して、少なくとも２つの方向のうちの１つに傾く。ある態様において、マイクロミラー２２６は下記のように構築される：Ａ．）第１位置において、個々のマイクロミラー２２６に当たるビーム２２０をビーム２２０に対して斜角(oblique)の方向に偏向させることができる（矢印２３０により指示されるように）；およびＢ．）第２位置において、そのようなミラーに当たるビーム２２０は矢印２３２により指示されるようにビーム２２０に平行に反射される。理解されるように、各ミラー２２６から反射された光線は個々のビーム２３２を構成する。ビーム２３２は投影光学系２３４（たとえば、レンズ２３６、２３８、および調節式絞り２４０からなる）に入射する。投影光学系２３４はマイクロミラーアレイ２２４の個々のビーム２３２（およびこれらのビーム間の暗領域）が基材２０４上の活性面２０８に表わすパターンのイメージを形成する作用をする。前記および本開示全体に記載するように、基材支持体２０４は、それに投影される光線（線２４２により表わされる）が実質的に減衰または拡散することなく基材２０４を通過するように、透明であって、たとえばフューズドシリカまたはソーダライムガラスまたは石英で作成することができる。
【０３７１】
本開示による代表的マイクロミラーアレイ２２４には、デジタルマイクロミラーデバイス(Digital Micromirror Device)（ＤＭＤ）（Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．から市販されている）が含まれ、それはアレイ中のマイクロミラーを電子的にアドレス指定することによってパターン化された光ビームを形成することができる。そのようなアレイは、たとえばLarry J. Hornbeck, “Digital Light Processing and MEMs: Reflecting the Digital Display Needs of the Networked Society,” SPIE/EOS European Symposium on Lasers, Optics, and Vision for Productivity and Manufacturing I, Besancon, France, Jun. 10-14, 1996;ならびにU.S. Pat. No. 5,096,279、5,535,047、5,583,688、5,600,383および6.375,903中に述べられている。そのようなデバイスのマイクロミラー２２６は、紫外線および近紫外線を含めた普通の使用可能な波長を効率的に、ミラー自体に損傷を与えることなく反射できる。
【０３７２】
あるペプチドマイクロアレイの態様において、投影光学系２３４は標準的デザインのものであってもよい。レンズ２３６、２３８はビーム２３２の光線（調節式絞り２４０を通過したもの）を基材２０４の活性面２０８上に収束させる。絞り２４０は、有効開口数を制御すること、および目的外の光線（特にオフアクシス（軸はずれ）(off-axis)ビーム２３０）が基材（固体支持体）２０４へ透過しないように保証することを補助する。そのような光学系で１ミクロンの数分の一ほどの小さな寸法の解像が得られる。当技術分野で知られている種々の別構造のもの（たとえば、加工用途で好まれるものなど）も本出願に従って利用できる。
【０３７３】
代表的態様を本明細書に提示するが、基材（固体支持体）２０４上のペプチド２１０を加工するには種々のアプローチを利用でき、それにはマイクロリソグラフィー手法の適用が含まれることを理解すべきである。たとえば、“直接光学加工法”においては、アミノ酸を結合できる化学物質（たとえば、アミン）の層で基材（固体支持体）２０４をコートし、それをたとえば光と反応してそれにより除去できる化学基で保護することができる。したがって、投影システム２０２により光線を付与し、基材２０４上のアミン基を脱保護してそれらをアミノ酸（選択された部位に通常の化学により結合させるために基材（固体支持体）２０４の活性面２０８上へ流される）の結合に利用できるようにすることができる。このプロセスを多数回繰り返し、それによって他のアミノ酸を異なる一組の位置に結合させる。この方法は単純であり、コンビナトリアル方法を用いれば順列数は指数的に増加する。
【０３７４】
本開示のある態様によれば、マスクレスアレイ合成を基材（固体支持体）２０４上におけるペプチド２１０の加工に利用する。そのような態様によれば、用いるマスクレスアレイ合成によって最大２．９Ｍのユニークペプチドを備えた超高密度ペプチド合成が可能になる。２．９Ｍの合成フィーチャー／領域それぞれは、全長ペプチドを生成できる最大１０７の反応性部位をもつ。より小さなペプチドマイクロアレイも設計できる。たとえば、システインを除いたすべての天然アミノ酸の可能なすべての５−ｍｅｒペプチドの包括的リストを表わすペプチドマイクロアレイは２，４７６，０９９のペプチドをもつであろう。システインおよびメチオニンを除いた１８種類の天然アミノ酸のすべての組合わせを用いることによる５−ｍｅｒペプチドのペプチドマイクロアレイも使用できる。さらに、ペプチドマイクロアレイは他のアミノ酸またはアミノ酸二量体を除外できる。たとえば、いずれかの二量体、または同じアミノ酸のより長いリピート、ならびにＨＲ、ＲＨ、ＨＫ、ＫＨ、ＲＫ、ＫＲ、ＨＰおよびＰＱ配列を含むいずれかのペプチドを除外するように上記に例示した１８−ｍｅｒアレイを設計して、１，３６０，７３２のユニークペプチドのライブラリーを作製することができる。より小さいペプチドマイクロアレイは、ペプチドマイクロアレイデータから引き出す結論の信頼性を高めるために同じペプチドマイクロアレイ上に各ペプチドの複製を含むことができる。
【０３７５】
種々の態様において、本明細書に記載するペプチドアレイは、ペプチドマイクロアレイの固体支持体に付着した少なくとも１．６×１０５のペプチド、少なくとも２．０×１０５のペプチド、少なくとも３．０×１０５のペプチド、少なくとも４．０×１０５のペプチド、少なくとも５．０×１０５のペプチド、少なくとも６．０×１０５のペプチド、少なくとも７．０×１０５のペプチド、少なくとも８．０×１０５のペプチド、少なくとも９．０×１０５のペプチド、少なくとも１．０×１０６のペプチド、少なくとも１．２×１０６のペプチド、少なくとも１．４×１０６のペプチド、少なくとも１．６×１０６のペプチド、少なくとも１．８×１０６のペプチド、少なくとも１．０×１０７のペプチド、または少なくとも１．０×１０８のペプチドをもつことができる。他の態様において、本明細書に記載するペプチドマイクロアレイは、ペプチドマイクロアレイの固体支持体に付着した約１．６×１０５のペプチド、約２．０×１０５のペプチド、約３．０×１０５のペプチド、約４．０×１０５のペプチド、約５．０×１０５のペプチド、約６．０×１０５のペプチド、約７．０×１０５のペプチド、約８．０×１０５のペプチド、約９．０×１０５のペプチド、約１．０×１０６のペプチド、約１．２×１０６のペプチド、約１．４×１０６のペプチド、約１．６×１０６のペプチド、約１．８×１０６のペプチド、約１．０×１０７のペプチド、または約１．０×１０８のペプチドをもつことができる。本明細書に記載するように、特定数のペプチドを含むペプチドマイクロアレイとは、単一固体支持体上の単一ペプチドマイクロアレイを意味することができ、あるいはペプチドを分割して１より多い固体支持体に付着させて、本明細書に記載する数のペプチドを得ることができる。
【０３７６】
そのような態様に従って合成されたペプチドマイクロアレイは、Ｎ−メチルまたは他のＰＴＭなどの修飾を伴うかまたは伴なわない環状ペプチドバインダー探索（本明細書中に明記するように）のために設計することができる。ペプチドマイクロアレイは、ブロック法を用いて反復スクリーニングを実施することにより、潜在ヒットのＮ末端およびＣ末端において潜在バインダーをさらに伸長させるために設計することもできる（本明細書中にさらに詳細に記載するように）。理想的アフィニティーのヒットが見出されると、天然および非天然の両方の種々のアミノ酸のコンビナトリアル挿入、欠失および置換分析が可能な成熟化アレイの組合わせ（本明細書中にさらに記載する）を用いてそれをさらに成熟させることができる。一態様において、成熟化および／または伸長プロセスに続いて環化することができる。
【０３７７】
本開示のペプチドマイクロアレイは、診断または療法用途のために、モノクローナル抗体交差反応性プロファイリング、ポリクローナル血清プロファイリング、エピトープ同定（着目する抗体について）、エリテマトーデス(lupus)免疫反応性プロファイリング、消化管プロファイリング；癌バイオマーカープロファイリング、擬似モノクローナル抗体単離 （ポリクローナル抗体からの単離体）、ペプチド−対−タンパク質相互作用特性分析、アフィニティー精製、ならびに特異的および感受性結合分析に使用できる。一態様において、本明細書中で同定および開示するペプチドバインダーを成熟化および／または伸長することができ（非天然アミノ酸によるものを含む）、形成された環状ペプチドはそのようなバインダーを潜在薬物候補にする。
【０３７８】
ＩＩＩ．ペプチドバインダー探索：
新規ペプチドバインダー（たとえば環状ペプチド；たとえば図４，本方法を一般的に４００として表わす）の探索は、本開示に従って達成できる。本明細書中に説明するように、新規ペプチドバインダーは多数の用途に利用でき、それには療法、診断用途および全般的な研究室用途が含まれるが、それらに限定されない。本開示のある特定の態様によれば、数百、数千、数万、数十万、さらには数百万のペプチドの集団を含むペプチドマイクロアレイを設計できる。図３を参照すると、ある態様において、ペプチドの集団３１０は着目するタンパク質、遺伝子、染色体、分子の全体、またはさらには生物全体（たとえば、ヒト）をそれらのペプチドが表わすように構成できる。ある態様において、ペプチドを特定の基準に従って構成し、それによって特定のアミノ酸またはモチーフを除外することができる。他の態様において、各ペプチドが同一長さを含むようにペプチドを構成することができる。たとえば、ある態様において、ペプチドマイクロアレイ３１２上に固定されたペプチド３１０の集団はすべて、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−、１１−、１２−、１３−、１４−、１５−、１６−、１７−、１８−、１９−、２０−ｍｅｒ、またはそれ以上の３０８を含むことができる。ある態様において、ペプチドはそれぞれＮ末端またはＣ末端配列（たとえば、３０６および３０６’）を含むこともでき、その際、各ペプチドは両方が特定の同一長さ（たとえば、３−、４−、５−、６−、７−またはさらには８−、またはそれ以上のペプチド）であるＮ末端およびＣ末端ペプチド配列を含む。ある態様において、Ｎ末端またはＣ末端配列（３０６および３０６’）は存在せず、ペプチドマイクロアレイ３１２上に固定されたペプチド３１０は３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−、１１−、１２−、１３−、１４−、１５−、１６−、１７−、１８−、１９−、または２０−ｍｅｒの３０８を含むにすぎない。ある態様において、ペプチドマイクロアレイ３１２上に固定されたペプチド３１０は本明細書に記載する方法に従って環化された環状ペプチドを含む。
【０３７９】
ある態様によれば、最大２９０万のペプチド３１０の集団を含むペプチドマイクロアレイ３００を設計し、それはその２９０万のペプチドがゲノムの可能な限りすべての５−ｍｅｒペプチド３０８の包括的リストをアレイ３１２上に固定したものであるように構成される。あるそのような態様において、５−ｍｅｒペプチド３０８（２９０万ペプチドのペプチドマイクロアレイを含む）は、下記のものを除外することができる：アミノ酸システイン（Ｃ）（ペプチドの異常なフォールディングの制御を補助するために）；アミノ酸メチオニン（Ｍ）（Ｍはプロテオーム内の稀なアミノ酸と考えられるので）；および／または２以上の同一アミノ酸のアミノ酸リピートすべて（帯電および疎水性相互作用などの非特異的相互作用の制御を補助するために）；またはヒスチジン（Ｈ）−プロリン（Ｐ）−グルタミン（Ｑ）配列からなるアミノ酸モチーフ。ある具体的態様、たとえば図３に示すものにおいて、５−ｍｅｒペプチド３０８は上記に挙げた除外事項のうち１以上を除外することができる。本発明の一態様には、ヒトゲノム全体を表わす最大２９０万の５−ｍｅｒペプチド３１０の集団を含むペプチドマイクロアレイが含まれ、その際、５−ｍｅｒペプチド３０８はアミノ酸ＣおよびＭをいずれも含まず、２以上のアミノ酸のアミノ酸リピートを含まず、かつアミノ酸モチーフＨＰＱを含まない。本発明の他の態様には、ヒトゲノム全体によりコードされるタンパク質含有物を表わす最大２９０万の５−ｍｅｒペプチドを含むペプチドマイクロアレイが含まれ、その際、５−ｍｅｒペプチドはアミノ酸ＣおよびＭをいずれも含まず、２以上のアミノ酸のアミノ酸リピートを含まない。ペプチドマイクロアレイ上の特定位置のペプチドの配列は分かっていることを理解すべきである。この節およびこの開示において述べるように、マイクロアレイ上のペプチドは環状ペプチドであってもよい。
【０３８０】
さらなる態様によれば、ペプチドマイクロアレイ３００の最大２９０万のペプチド３１０の集団を構成する各５−ｍｅｒペプチド３０８は、Ｎ末端およびＣ末端それぞれにおける５サイクルのゆらぎ合成（参照：たとえば３０６および３０６’，図３）を伴う状態で合成できる。本明細書中で用いる“ゆらぎ合成(wobble synthesis)”は、着目する５−ｍｅｒペプチド３０８のＮ末端またはＣ末端に位置するペプチドの配列（一定またはランダムのいずれか；たとえば環状ペプチド）の合成（本明細書に開示するいずれかの手段による）を表わす。図３に示すように、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかにおけるゆらぎ合成を構成する特定のアミノ酸を“Ｚ”により表示する。種々の態様によれば、ゆらぎ合成は、Ｎ末端またはＣ末端に任意数のペプチド、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上、さらにはたとえば１５または２０のペプチド（たとえば、環状ペプチド）を含むことができる。さらに、ゆらぎ合成は同一または異なる数のゆらぎ合成ペプチド（たとえば、環状ペプチド）をもつＮ末端およびＣ末端を構成することができる。
【０３８１】
種々の態様によれば、ゆらぎペプチド構成体３０６、３０６’はアミノ酸組成に関して、およびアミノ酸の比率／濃度に関して、フレキシブルである。たとえば、ゆらぎペプチド構成体は２以上のアミノ酸の混合物を含むことができる。そのようなフレキシブルゆらぎミックスの具体的態様には、３：１の比率のグリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）のゆらぎペプチド構成体３０６、３０６’が含まれる。フレキシブルゆらぎ混合物の他の例には、等濃度（たとえば、等比率）のアミノ酸Ｇ、Ｓ、アデニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、トレオニン（Ｔ）、および／または等濃度（たとえば、等比率）のアミノ酸Ｌ、Ａ、Ｄ、リジン（Ｋ）、Ｔ、グルタミン（Ｑ）、Ｐ、Ｆ、Ｖ、チロシン（Ｙ）が含まれる。他の例には、２０種類の既知アミノ酸のいずれかを等濃度で含むゆらぎペプチド構成体３０６、３０６’が含まれる。
【０３８２】
本明細書に開示するように、種々の態様のゆらぎペプチド合成により、ランダムおよび指向性合成アミノ酸の組合わせをもつペプチドをペプチドマイクロアレイ上に作製することが可能になる。たとえば、ペプチドマイクロアレイ上のペプチドは、下記のフォーマットのペプチド配列をもつ組合わせ１５ｍｅｒペプチドを含むことができる：ＺＺＺＺＺ−５ｍｅｒ−ＺＺＺＺＺ；ここで、Ｚは特定のゆらぎオリゴペプチド混合物からのアミノ酸である。
【０３８３】
ある態様において、フィーチャーは１０７のペプチドを収容することができる。あるそのような態様において、各フィーチャーについての集団複雑度はゆらぎ混合物の複雑度に応じて異なる可能性がある。本明細書に開示するように、準指向性合成でのゆらぎ合成を用いてそのような複雑度を形成することにより、アレイ当たり最大１０１２の多様度をもつペプチドを用いてアレイ上のペプチドバインダーをスクリーニングすることが可能になる。
【０３８４】
一態様において、図３を参照すると、ペプチド３１０の集団（たとえば、ヒトプロテオーム全体を表わす集団）がそれに固定された反応性表面３０４（たとえば、反応性アミン層）をもつ固体支持体３０２を含む、ペプチドマイクロアレイ３００が提供される。そのような態様によるペプチド３１０の集団を構成する代表的な５−ｍｅｒペプチドは、アミノ酸ＣおよびＭをいずれも含まず、２以上のアミノ酸のアミノ酸リピートを含まず、かつアミノ酸モチーフＨＰＱを含まない。そのような具体的態様によれば、ヒトプロテオーム全体を表わすそのようなペプチド３１０の集団は、集団３１０を構成する１，３６０，７３２の個々のペプチドを含むであろう。ある態様において、同じアレイ上に重複(duplicate)またはリピート(repeat)を配置してもよい。たとえば、単一重複を含む集団３１０は２，７２１，４６４の個々のペプチドを含むであろう。さらに、ペプチド３１０の集団はそれぞれＮ末端およびＣ末端ゆらぎ合成オリゴペプチド３０６、３０６’を含み、それらはたとえばそれぞれ３：１の比率のアミノ酸グリシンおよびセリンからなる５つのアミノ酸からなる。そのようなペプチドを本明細書の記載に従って環化することができる。
【０３８５】
ここで一般的に図４のプロセス４００の工程４０２について述べると、使用に際して、代表的ペプチドマイクロアレイ（図３；そのようなペプチドマイクロアレイは本明細書の記載に従って環状ペプチドを含むことができる）を、着目するターゲットに曝露し（標準マイクロアレイ実施と同様に）、それによってその着目するターゲットは集団３１０を構成する他のペプチドと関係なくペプチド集団３１０（たとえば、環状ペプチド）のいずれかに結合する可能性がある。着目するターゲットに曝露した後、たとえばレポート可能な標識（たとえば、ペルオキシダーゼ）がそれに付着した抗体（着目するターゲットに対して特異的なもの）に、集団３１０の個々のペプチド（たとえば、環状ペプチド）と着目するターゲットとの複合体を曝露することにより、ペプチドバインダー（たとえば、環状ペプチド）への着目するターゲットの結合をアッセイする。ペプチドマイクロアレイ上のそれぞれの位置の各５−ｍｅｒのペプチド配列は分かっているので、特異的５−ｍｅｒペプチド配列（たとえば、環状ペプチド）への着目するターゲットの結合のシーケンス（および結合強度）を図表化／定量／比較／対比することが可能である。集団３１０を構成するペプチド（たとえば、環状ペプチド）へのタンパク質の結合を比較するそのような１方法は、たとえば、Standardizing and Simplifying Analysis of Peptide Library Data, Andrew D White et al, J Chem Inf Model, 2013, 53(2), pp 493-499に記載され、本明細書中で説明する、principled analysis distribution-based clustering（分布ベースのクラスタリングの原則に基づく分析）で結合を調べることである。本明細書に例示するように、着目ターゲット−５−ｍｅｒの結合（あるいは“ヒット(hit)”）のクラスタリング(principled analysis distribution-based clusteringにおいて示されるもの）は、オーバーラップしたペプチド配列をもつ５−ｍｅｒの指標となる。より詳細に後記に示すように、オーバーラップしたペプチド配列（各クラスターの）から、“コアヒット(core hit)”ペプチド配列またはコアバインダー配列（たとえば、そのペプチドマイクロアレイのうち目立った着目ターゲット−ペプチド結合事象が共有するペプチド配列）を同定し、あるいはさらなる評価のために少なくとも仮定して構築することができる。(注釈：本明細書に例示するペプチドマイクロアレイは１より多い“コアヒット”ペプチド配列（すなわち、コアバインダー配列）を同定する可能性があることを理解すべきである。さらに、principled analysis distribution-based clusteringに際してはオーバーラップした隣接配列を同定する可能性があるため、“コアヒット”ペプチド配列がたとえばペプチドの集団を構成する５−ｍｅｒペプチドバインダーより多いアミノ酸を含む可能性があることを理解すべきである）。
【０３８６】
ＩＶ．ペプチド成熟化：
図４に図示するプロセス４００の工程４０４について以下に述べると、コアヒットペプチド配列またはコアバインダー配列が同定されると（本明細書に開示、記載および例示するペプチドバインダー探索４０２のプロセスにより）、“ペプチド成熟化”４０４のプロセスを実施し、それによって、適正なコアヒット配列またはコアバインダー配列をさらに最適化／保証するためにコアヒットペプチドまたはコアバインダー配列の各位置においてコアヒットペプチド配列またはコアバインダー配列を種々の方法で変化させる（アミノ酸の置換、欠失および挿入による）。たとえば、ある態様（たとえば、コアヒットペプチド配列（コアバインダー配列）が、ある数の、たとえば７個のアミノ酸を含む場合）に従って、成熟アレイを作製する。本開示によれば、成熟アレイは、それに固定された状態で、コアヒットペプチド（コアバインダー配列）中の各アミノ酸が各位置でアミノ酸置換を受けたコアヒットペプチド（コアバインダー配列）集団を含むことができる。
【０３８７】
ヒット成熟化４０４のプロセスをさらに記載するために、例／仮定コアヒットペプチドまたはコアバインダー配列がアミノ酸配列−Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２）をもつ５−ｍｅｒペプチドからなるものとして記載する。本開示によれば、ヒット成熟化４０４は位置１、２、３、４および５におけるアミノ酸の置換、欠失および挿入のいずれか、またはそのいずれかの組合わせ、またはすべてを伴うことができる。たとえば、仮定コアヒットペプチドまたはコアバインダー配列−Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２）に関して、本開示の態様は、位置１のアミノ酸Ｍが他の１９種類のアミノ酸で置換されたもの（たとえば、Ａ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０３）、Ｐ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０４）、Ｖ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０５）、Ｑ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０６）など）を含むことができる。それぞれの位置（２、３、４および５）も、アミノ酸Ｍが他の１９種類のアミノ酸で置換されるであろう（たとえば位置２について、置換は同様であろう；Ｍ１Ａ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７）、Ｍ１Ｑ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８）、Ｍ１Ｐ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９）、Ｍ１Ｎ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０）など）。コアヒットペプチドまたはコアバインダー配列の置換および／または欠失および／または挿入配列を含むペプチド（アレイ上に固定されたもの）が作製されることを理解すべきである。
【０３８８】
本開示によるヒット成熟化４０４のある態様において、二重アミノ酸置換を実施できる。二重アミノ酸置換には、所定の位置のアミノ酸を変化させ（たとえば位置１において、たとえばＭ→Ｐ置換）、次いで位置２のアミノ酸を他の１９種類のアミノ酸で置換することが含まれる（位置２のアミノ酸）。位置１および２のすべての可能な組合わせが結合するまでこのプロセスを繰り返す。例として、アミノ酸配列−Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２）の５−ｍｅｒペプチドをもつ仮定コアヒットペプチドまたはコアバインダー配列に戻って述べると、位置１および２に関する二重アミノ酸置換は下記のものを含むことができる：たとえば位置１におけるＭ→Ｐ置換、次いで位置２における２０種類すべてのアミノ酸の置換（たとえば、−Ｐ１Ａ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１１）、−Ｐ１Ｆ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１２）、−Ｐ１Ｖ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１３）、−Ｐ１Ｅ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１４）など）、位置１におけるＭ→Ｖ置換、次いで位置２における２０種類すべてのアミノ酸の置換（たとえば、−Ｖ１Ａ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１５）、−Ｖ１Ｆ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１６）、−Ｐ１Ｖ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７）、−Ｖ１Ｅ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８）など）、位置１におけるＭ→Ａ置換、次いで位置２における２０種類すべてのアミノ酸の置換（たとえば、−Ａ１Ａ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９）、−Ａ１Ｆ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２０）、−Ａ１Ｖ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２１）、−Ａ１Ｅ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２２）など）。
【０３８９】
本開示によるヒット成熟化４０４のある態様において、コアヒットペプチドの各アミノ酸位置についてアミノ酸欠失を実施できる。アミノ酸欠失には、コアヒットペプチド配列またはコアバインダー配列を含むけれどもコアヒットペプチド配列またはコアバインダー配列から単一アミノ酸を欠失したペプチドの作製が含まれる（したがって、各ペプチドにおいてアミノ酸が欠失したペプチドが作製される）。例として、アミノ酸配列−Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２）の５−ｍｅｒペプチドをもつ仮定コアヒットペプチドまたはコアバインダー配列に戻って述べると、アミノ酸欠失は下記の配列をもつ一連のペプチドの作製を含むであろう：−Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３）；−Ｍ１Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３）；−Ｍ１Ｍ２Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３）；−Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３）；および−Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３）。仮定５−ｍｅｒのアミノ酸欠失に伴って５つの新たな４−ｍｅｒが作製されることを留意すべきである。本開示のある態様によれば、作製された新たな４−ｍｅｒについてアミノ酸置換または二重アミノ酸置換のスキャンを実施できる。
【０３９０】
上記のアミノ酸欠失スキャンと同様に、本明細書に開示するヒット成熟化４０４のある態様はアミノ酸挿入スキャンを含むことができ、それによって２０種類のアミノ酸それぞれをコアヒットペプチドの各位置の前および後に挿入できる。例として、アミノ酸配列−Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２）の５−ｍｅｒペプチドをもつ仮定コアヒットペプチドまたはコアバインダー配列に戻って述べると、アミノ酸挿入スキャンは下記の配列を含むであろう：−ＸＭ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２４）；−Ｍ１ＸＭ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５）；−Ｍ１Ｍ２ＸＭ３Ｍ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２６）；−Ｍ１Ｍ２Ｍ３ＸＭ４Ｍ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２７）；−Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４ＸＭ５−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２８）；および−Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５Ｘ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２９）（これらにおいて、Ｘは２０種類の既知アミノ酸または特定の規定されたサブセットのアミノ酸から選択される個々のアミノ酸を表わし、それによって２０種類または規定されたサブセットのアミノ酸それぞれについてペプチド複製体(replicate)が作製されるであろう）。
【０３９１】
前記のアミノ酸置換ペプチド、二重アミノ酸置換ペプチド、アミノ酸欠失スキャンペプチドおよびアミノ酸挿入スキャンペプチドがＮ末端およびＣ末端ゆらぎアミノ酸配列のうち一方または両方を含む可能性があることも理解すべきである（図３の３０６、３０６’で記載したと同様）。図３に記載したＮ末端およびＣ末端ゆらぎアミノ酸配列と同様に、Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎアミノ酸配列は１つという少数のアミノ酸、および１５または２０という多数のアミノ酸を含むことができ、かつＮ末端ゆらぎアミノ酸配列はＣ末端ゆらぎアミノ酸配列と同じ長さ、それより長いかまたは短い長さであってもよく、あるいは全部を排除してもよい。さらに、Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎアミノ酸配列は、いずれか特定グループのアミノ酸をいずれか一定の比率で含むことができる（たとえば、グリシンとセリンを３：１の比率で）。
【０３９２】
後記のヒット成熟化４０４の特定の例示態様において、７アミノ酸のコアヒットペプチドまたはコアバインダー配列（たとえば、７−ｍｅｒ）は、徹底的な単一および二重アミノ酸スクリーニングを受け、３つのアミノ酸（すべてグリシン）を含むＮ末端およびＣ末端ゆらぎアミノ酸配列の両方を含む。
【０３９３】
コアヒットペプチドまたはコアバインダー配列の種々の置換、欠失および挿入バリエーションが製造されると（たとえば、固体支持体に固定された様式、たとえばペプチドマイクロアレイで）、精製、濃縮された着目するターゲットの結合強度をアッセイする。
【０３９４】
Ｖ．ペプチド伸長（Ｎ末端およびＣ−末端）：
５−ｍｅｒアレイ実験において同定したモチーフが最適タンパク質バインダーの短いバージョンであるにすぎない可能性がある。５−ｍｅｒアレイ実験から選択された配列のＮ末端およびＣ末端の一方または両方から１以上のアミノ酸を伸長することによってより長いモチーフを同定する戦略を本明細書に記載する。選択されたペプチドから出発し、各末端に１以上のアミノ酸を付加することにより、さらなる選択のための伸長ライブラリーを作製できる。たとえば、単一ペプチドから出発し、２０種類の天然アミノ酸すべてを用いて、１６０，０００のユニークペプチドの伸長ライブラリーを作製できる。ある態様において、伸長ペプチドそれぞれが複製体で合成される。
【０３９５】
図４の工程４０６について述べると、コアヒットペプチドまたはコアバインダー配列が成熟化（したがって、着目するターゲットの結合についてより最適なコアヒットペプチドまたはコアバインダー配列のアミノ酸配列が同定される）した時点で、Ｎ末端および／またはＣ末端位置が伸長工程を受け、それによって、着目するターゲットに対する特異性およびアフィニティーを増大させるために成熟コアヒットペプチド（成熟コアペプチドバインダー配列とも呼ばれる）５１２の長さがさらに伸長される。
【０３９６】
図５を参照した本開示のＮ末端伸長の種々の態様によれば、成熟化プロセス（図４の４０４）により成熟コアヒットペプチド配列（成熟コアペプチドバインダー配列とも呼ばれる）５１２が同定されると、ペプチドバインダー探索工程（３０２，図３）からの集団の特異的ペプチドそれぞれ（５−ｍｅｒの集団として表わされる；図３の３０８）が成熟コアヒットペプチド５１２のＮ末端に付加される（またはその上に合成される）。こうして、図３に５−ｍｅｒの集団として例示される各ペプチド３０８（集団の）の大部分のＣ末端アミノ酸が成熟コアヒットペプチド５１２の大部分のＮ末端アミノ酸に隣接して付加される。
【０３９７】
同様に、図５を参照した本開示のＣ末端伸長の種々の態様によれば、成熟化プロセス（図４の４０４）により成熟コアヒットペプチド配列５１２が同定されると、ペプチドバインダー探索工程（３０２，図３）からの集団の特異的ペプチドプローブそれぞれ（５−ｍｅｒの集団として表わされる；図３の３０８）が成熟コアヒットペプチド５１２のＣ末端に付加される（またはその上に合成される）。こうして、図３に５−ｍｅｒの集団として例示される各ペプチド配列３０８の大部分のＮ末端アミノ酸が成熟コアヒットペプチド５１２の大部分のＣ末端アミノ酸に隣接して付加される。
【０３９８】
本開示のある態様によれば（図５）、Ｃ末端伸長およびＮ末端伸長に用いた成熟コアヒットペプチドのうち一方または両方が、Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎアミノ酸配列（図３の３０６，３０６’として記載したものと同様）のうち一方または両方を含むこともできる。図３に記載したＮ末端およびＣ末端ゆらぎアミノ酸配列と同様に、Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎアミノ酸配列は１つという少数のアミノ酸、および１５または２０（またはそれ以上）という多数のアミノ酸を含むことができ、かつＮ末端ゆらぎアミノ酸配列はＣ末端ゆらぎアミノ酸配列と同じ長さ、それより長いかまたは短い長さであってもよい。さらに、Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎアミノ酸配列は、いずれか特定グループのアミノ酸をいずれか一定の比率で含むことができる（たとえば、グリシンとセリンを３：１の比率で）。
【０３９９】
例として、図５には、Ｎ末端伸長についてのペプチド集団５１４およびＣ末端伸長についてのペプチド集団５１６をもつ、ペプチド伸長アレイ５００を示す。ペプチド５１４、５１６の各集団は、ペプチドマイクロアレイ３００からのペプチド３１０の全集団（ペプチドバインダー探索４０４の工程で用いたもの）を含むことができる。さらに図示したように、ペプチド５１４、５１６の両集団の各ペプチドは、それぞれ異なるペプチド５０８をもつ同じ成熟コアヒットペプチド５１２を含むことができる（図３、ペプチドバインダー探索工程３０２からのペプチドの集団のもの）。同様に図５に示すように、集団５１４、５１６の各ペプチドはＮ末端およびＣ末端ゆらぎアミノ酸配列を含む。
【０４００】
一態様において、伸長アレイ５００（集団５１４および５１６を含む）を濃縮、精製された着目ターゲットに曝露し（プロセス４００のペプチドバインダー探索工程４０１のように）、それによって着目するターゲットは、集団５１４、５１６を構成する他のペプチドと関係なく、集団５１４、５１６のいずれかのペプチド（たとえば、環状ペプチド）に結合する可能性がある。着目するターゲットに曝露した後、たとえば集団５１４、５１６の個々のペプチド（たとえば、環状ペプチド）と着目するターゲットとの複合体をレポート可能な標識（たとえば、ペルオキシダーゼ）がそれに付着した抗体（その着目するターゲットに対して特異的なもの）に曝露することにより、集団５１４、５１６のペプチド（たとえば、環状ペプチド）への着目するターゲットの結合をアッセイする（着目するタンパク質をレポーター分子で直接標識することができることも理解すべきである）。アレイ上の各位置についてペプチド５０８（各５−ｍｅｒの）は既知である（たとえば、環状ペプチド）ので、成熟コアヒットペプチド５１２を各ペプチド５０８（たとえば、環状ペプチド）と共に含む特異的ペプチド（たとえば、環状ペプチド）への着目するターゲットの結合のシーケンス（および結合強度）を図表化／定量／比較／対比することが可能である。成熟コアヒットペプチド５１２−ペプチドプローブ５０８の組合わせ（集団５１４または５１６のいずれかを含む）への着目するターゲットの結合を比較する代表的方法は、Standardizing and Simplifying Analysis of Peptide Library Data, Andrew D. White et al., J Chem Inf Model, 2013, 53(2), pp 493-499に記載され、本明細書中で説明する（たとえば、グラフ３および４）、principled analysis distribution-based clustering（分布ベースのクラスタリングの原則に基づく分析）で結合強度を調べるものである。本明細書に例示するように、principled analysis distribution-based clusteringにおいて示される各ペプチド（たとえば、環状ペプチド）（集団５１４、５１６の）へのタンパク質結合のクラスタリングは、オーバーラップしたペプチド配列をもつペプチドプローブ５−ｍｅｒ  ５０８の指標となる。より詳細に後記に示すように、オーバーラップしたペプチド配列（各クラスターの）から、伸長した成熟コアヒットペプチド配列を同定し、あるいはさらなる評価のために少なくとも仮定して構築することができる。本出願のある態様において、伸長した成熟コアヒットペプチドバインダー配列は成熟化プロセスを受ける（本明細書に記載および例示し、図４の工程４０４に示すように）。
【０４０１】
伸長したペプチドバインダーの追加ラウンドの最適化も可能である。たとえば、第３ラウンドのバインダー最適化は、伸長アレイ実験で同定した配列をグリシン（Ｇ）アミノ酸で伸長することを含んでもよい。他の最適化は、基準配列、すなわち先のいずれかの工程で最適化および選択したペプチドバインダーの、可能なすべての単一および二重置換／欠失バリアントを含む二重置換／欠失ライブラリーの作製を含むことができる。一態様において、本明細書に記載する成熟化および／または伸長のいずれかのプロセスの後または途中で、ペプチドを環化することができる。
【０４０２】
ＶＩ．伸長した成熟コアヒットペプチドバインダーの特異性分析：
伸長した成熟コアヒットペプチドバインダー配列を同定した後、ペプチドのアフィニティーおよび特異性を測定するいずれか当技術分野で得られる方法により特異性分析を実施することができる。特異性分析の一例には、着目するターゲットとの分子相互作用、反応速度（“オン”、結合、および“オフ”、解離の）およびアフィニティー（結合強度）に関して分子を特性分析するために用いられる“ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）”システム分析が含まれる。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）はＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙの商標であり、企業ウェブサイトを介して入手できる。
【０４０３】
図６は、新規なペプチドバインダー同定（たとえば、図４のプロセス４００）の簡単な模式的概観図である。示されるように、ペプチドバインダー探索６０２は、ペプチドマイクロアレイ６０１上にペプチドの集団を作製する（たとえば、マスクレスアレイ合成による）ことにより実施される。図示されるように、各ペプチドは５“サイクル”のＮ末端ゆらぎ合成６０６’およびＣ末端ゆらぎ合成６０６を含む（たとえば、Ｎ末端およびＣ末端ゆらぎ合成は両方とも５つのアミノ酸を含む）。ＣおよびＮ末端のゆらぎ合成は前記のようにいずれかの組成（たとえば、アミノ酸ＧおよびＳのみを３：１［Ｇ：Ｓ］の比率で）を含むことができるのを理解すべきである。各ペプチドも５−ｍｅｒペプチドバインダー６０４を含むものとして示され、それは前記のようにヒトプロテオーム全体が表わされるような最大２９０万の異なるペプチド配列を含むことができる。さらに、特定の“ルール”（たとえば、Ｃアミノ酸を含まない、もしくはＭアミノ酸を含まない、連続した同一アミノ酸のリピートを含まない、ＨＰＱアミノ酸モチーフを含まない）に従って異なるペプチドバインダー６０４を合成できることを留意すべきである。前記のように、着目するターゲット（たとえば、精製および濃縮した形態のもの）をペプチドバインダー６０４に曝露し、結合を採点し（たとえば、principled clustering analysis（原則に基づくクラスタリング分析）による）、それによってオーバーラップした結合モチーフに基づいて“コアヒットペプチド”配列またはコアバインダー配列を同定する。
【０４０４】
コアヒットペプチド配列またはコアバインダー配列が同定されると、徹底的な成熟化プロセス６２０を行なうことができる。ある態様において、Ｎ末端およびＣ末端両方のゆらぎを備えたコアヒットペプチドまたはコアバインダー配列（７−ｍｅｒである６２４として例示）をペプチドマイクロアレイ６０１上で合成する（工程６２０に３サイクルのグリシン（Ｇ）アミノ酸のみのＮ末端およびＣ末端ゆらぎとして示す；ただし、ゆらぎアミノ酸は前記のように変更できる）。ある徹底的な成熟化の態様において、コアヒットペプチドまたはコアバインダー配列６２４の各アミノ酸位置が他の１９種類のアミノ酸それぞれで置換されたペプチドをペプチドマイクロアレイ６０１上で合成し、あるいは二重アミノ酸置換体（前記）をペプチドマイクロアレイ６０１上で合成し、あるいはアミノ酸欠失スキャンをペプチドマイクロアレイ６０１上で合成し、あるいはアミノ酸挿入スキャンをペプチドマイクロアレイ６０１上で合成する。ある場合には、上記の成熟化プロセスすべてを実施する（そしてアミノ酸の欠失および挿入スキャンの結果として生成した新たなペプチドについて上記に従って繰り返す）。種々のペプチドを含む成熟アレイ６２０（本明細書に記載する置換、欠失および挿入を含む）が合成されると、成熟アレイ６２０上で合成されたこの改変されたコアヒットペプチドまたはコアバインダー配列６２４に、着目するターゲットを曝露し、結合強度をアッセイし、それによって“成熟コアヒットペプチド”（成熟コアペプチドバインダー配列）を同定する。
【０４０５】
“成熟コアヒットペプチド”配列（成熟コアペプチドバインダー配列）を同定した後、Ｎ末端およびＣ末端伸長の一方または両方を実施することができる（６３０にＮ末端伸長６３２およびＣ末端伸長６３１の両方を含むものとして示す）。Ｎ末端およびＣ末端伸長は、Ｎ末端またはＣ末端それぞれにおいて合成されたペプチドバインダー６０４（たとえば、５−ｍｅｒ）の集団をもつ成熟コアヒットペプチド（成熟コアペプチドバインダー配列）の合成を伴う。６３１に示すように、Ｃ末端伸長は５ラウンドのゆらぎ合成（上記に従う）６３６を伴って５−ｍｅｒペプチドバインダー６３４の集団が成熟コアヒットペプチド６３８のＣ末端で合成され、次いで別の５サイクルのゆらぎ合成６３６’がＮ末端で行なわれる。同様に、６３２に示すように、Ｎ末端伸長は５ラウンドのゆらぎ合成（上記に従う）６３６を伴って成熟コアヒットペプチド６３８のＣ末端で合成され、次いで５−ｍｅｒペプチドバインダー６３４の集団および別の５サイクルのゆらぎ合成６３６’がＮ末端（成熟コアヒットペプチド（成熟コアペプチドバインダー配列）６３８の）において合成される。種々の伸長ペプチド（Ｃ末端およびＮ末端伸長ペプチドを含む）を含む伸長アレイ６３０が合成されると、伸長アレイ６３０上に合成されたＣ末端およびＮ末端伸長ペプチド集団６３１、６３２に、着目するターゲットを曝露し、結合を採点し（たとえば、principled clustering analysis（原則に基づくクラスタリング分析）による）、それによってＣ末端、Ｎ末端伸長した成熟コアペプチドバインダー配列が同定される。矢印６４０によって示すように、ある態様によれば、伸長した成熟コアペプチドバインダー配列を同定した後、伸長した成熟コアペプチドバインダー配列について成熟化プロセス６２０を繰り返し（上記のいずれかの方法で）、次いでそれから得られた変化したいずれかのペプチドについて伸長プロセスを繰り返すことができる。一態様において、本明細書に記載する成熟化および／または伸長のいずれかのプロセスの後または途中で、本明細書に記載するようにペプチドを環化することができる。
【実施例】
【０４０６】
実施例１
ペプチドライブラリーのＮ末端とＣ末端の間の環化
マスクレス光指向性ペプチドアレイ合成を用いてペプチドアレイを作製した；その際、US 20120238477 A1（本明細書に援用する）の方法に基づいてすべての反応性アミノ酸側鎖を酸分解性(acid labile)基で保護する。この例において、マイクロアレイ表面は三次元アミン層でコートされたスライドガラスからなっていた。ペプチドライブラリーフレームワークは（Ｃ−末端からＮ末端へ）、リンカー分子（たとえば、６−アミノヘキサン酸）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）またはＧｌｕ（ＯＡｌｌ）、およびライブラリーデザインに記載する可変ペプチド配列を含んでいた（後記）。Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）およびＧｌｕ（ＯＡｌｌ）は、Ｃ末端がそれぞれｔ−ブチルエステルまたはアリルエステルで保護されたグルタメートの側鎖のガンマカルボン酸によりリンカー分子に連結していた。代表的なペプチドライブラリーフレームワークを図７に示す。ある態様において、可変ペプチド配列は３〜１５のアミノ酸からなる。ペプチドライブラリーのＮ末端は遊離アミンであった。直鎖状ペプチドライブラリーを環化するために、アレイをまずＴＨＦ中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２ｍＭ）で室温において３時間処理して、ＯＡｌｌ基をペプチドライブラリーのＣ末端から除去した。アレイから残留パラジウムを除去するために、スライドをＤＭＦ中の５％  ＤＩＰＥＡおよび５％ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムで５分間洗浄した。スライドを水で１分間洗浄し、環化前に遠心乾固させた。次いで標準的カップリング法を用いてＮ末端をＣ末端にカップリングさせることによりアレイを環化した：スライドを活性化剤（ＨＯＢｔおよびＨＢＴＵ，それぞれ２０ｍＭ）および塩基（ＤＩＰＥＡ，２Ｍ）で室温において３時間処理した。環化したアレイを次いでトリフルオロ酢酸（４７．５ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（０．２５ｍＬ）、および水（２．２５ｍＬ）中、室温で３０分間、側鎖脱保護した。側鎖脱保護の後、スライドをメタノール中で３０秒間の２回、水中で１０秒間の４回、０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＴＢＳ中で２分間、次いで１×ＴＢＳ中で１分間、洗浄した。最後にスライドを遠心乾固させた。
【０４０７】
実施例２
２つのシステイン残基を用いたペプチドライブラリーの環化
マスクレス光指向性ペプチドアレイ合成を用いてペプチドアレイを作製し、その際、すべての反応性アミノ酸側鎖を酸分解性基で保護する。この例において、マイクロアレイ表面は三次元アミン層でコートされたプラスチックスライドからなる。ペプチドライブラリーフレームワークは（Ｃ−末端からＮ末端へ）、リンカー分子（たとえば、６−アミノヘキサン酸）、システイン、可変ペプチド配列、およびシステインからなる。可変ペプチド配列は３〜１５のアミノ酸からなる。ペプチドライブラリーのＮ末端は遊離アミンである。マイクロアレイをトリフルオロ酢酸（４７．５ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（０．２５）、および水（２．２５ｍＬ）中、室温で３０分間、側鎖脱保護する。次いでスライドをメタノール中で３０秒間の２回、水中で１０秒間の４回、１×ＴＢＳ／０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０中で２分間、次いで１×ＴＢＳ中で１分間、洗浄する。次いでスライドを遠心乾固させる。きわめて緩和な条件下で２つのシステイン間にジスルフィド橋を形成させる。１０％  ＤＭＳＯを含有する１００ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ緩衝液（ｐＨ８．０）で室温において２４時間、アレイを処理する。次いでスライドを水溶液で洗浄し、遠心乾固させる。
【０４０８】
実施例３
グルタメート脱保護
マイクロアレイ表面は三次元アミン層でコートされたスライドガラスからなっていた。図８Ｂを参照すると、アミン基材に、（Ｃ−末端からＮ末端へ）６−アミノヘキサン酸リンカー分子、可変グルタメート誘導体、およびグリシンがカップリングしていた。ペプチドのＮ末端は遊離していた。グルタメート誘導体はＣ末端においてＯＡｌｌ保護されたグルタメート（その際、側鎖のガンマカルボン酸をリンカーに反応させる，上サブアレイ）、または側鎖カルボン酸においてＯｔＢｕ保護されたグルタメート（Ｃ末端をリンカーと反応させる，下サブアレイ）のいずれかを含んでいた。次いでトリフルオロ酢酸（４７．５ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（０．２５ｍＬ）、および水（２．２５ｍＬ）に室温で３０分間浸漬することにより、ＯｔＢｕ基を除去した。痕跡量のＴＦＡをすべて除去するために、スライドをメタノール中で３０秒間の２回、水中で１０秒間の４回、０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＴＢＳ中で２分間、次いで１×ＴＢＳ中で１分間、洗浄した。最後にスライドを遠心乾固させた。次いでスライドをＴＨＦ中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２ｍＭ）で、室温において３時間処理してＯＡｌｌ基を除去した。アレイから残留パラジウムを除去するために、スライドをＤＭＦ中の５％  ＤＩＰＥＡおよび５％ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムで５分間洗浄した。スライドを水で１分間洗浄し、遠心乾固させた。グルタメート脱保護の後、スライドを０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中１００ｍＭのＥＤＣで活性化された５０ｍＭのアミン−ＰＥＧ２−ビオチンと室温で２時間反応させた。スライドを洗浄液１および水で洗浄した後、以下に詳述するようにストレプトアビジン−Ｃｙ５で染色した。
【０４０９】
図８Ａに示すように、アミン−ＰＥＧ２−ビオチン標識したスライドの蛍光をスキャンした。上および下の両方のサブアレイが一貫した蛍光強度を示し（上および下のサブアレイについて、それぞれ２，５００および２，０００蛍光単位）、ＯｔＢｕおよびＯＡｌｌの両方の保護基の除去に成功したことが指示された。
【０４１０】
実施例４
環状／直鎖状ペプチドライブラリー合成
本明細書に記載するペプチドライブラリーを、図９に記載する方法に従って作製した。直鎖状ペプチドサブアレイおよび環状ペプチドサブアレイを含むペプチドライブラリーを同じマイクロアレイスライド上に作製した。両サブアレイ中の各ペプチドはＣ末端グルタメートおよび遊離Ｎ末端アミノ基を含んでいた。実施例３に記載したように、各グルタメート側鎖をアレイ表面に６−アミノヘキサン酸リンカー分子により付着させた。直鎖状ペプチドサブアレイ中の各ペプチドは、それのＣ末端においてＯｔＢｕ保護基により保護されていた。環状ペプチドサブアレイ中の各ペプチドは、それのＣ末端においてＯＡｌｌ保護基により保護されていた。それ以外は、各サブアレイ中のペプチドは同一であった。すべてのペプチドについて、すべての側鎖がＣ末端の２段階脱保護に基づいて酸分解性基で保護されていた。
【０４１１】
さらに図９について述べると、まず実施例３に記載した方法に従ってスライドをパラジウム（０）で処理することによりＣ末端脱保護工程を実施して、環状ペプチドサブアレイのペプチドからＯＡｌｌ保護基を除去した。得られた脱保護ペプチドは遊離Ｃ末端カルボキシル基をもっていた。この脱保護の結果、環状ペプチドサブアレイからＯＡｌｌ保護基が選択的に除去され、直鎖状ペプチドサブアレイ中のペプチドからのＯｔＢｕ保護基、または側鎖保護基は、除去されなかった。
【０４１２】
次に、環化工程を実施して、環状ペプチドサブアレイ中の脱保護されたペプチドを環化した。環化工程を実施するために、実施例１に記載した条件に従って側鎖を処理して、アミド結合形成によりヘッド−ツゥー−テイル環化させた。
【０４１３】
環化工程の後、実施例３に記載した方法に従ってスライドをＴＦＡで処理することによりＣ末端脱保護工程を実施して、環状ペプチドサブアレイのペプチドからＯｔＢｕ保護基を除去した。得られた脱保護ペプチドは遊離Ｃ末端カルボキシル基をもっていた。
【０４１４】
得られたスライドは、直鎖状ペプチドの直鎖状ペプチドサブアレイ、ならびに環化ペプチドおよび若干の直鎖状ペプチドの環状ペプチドサブアレイを含んでいた。この方法に基づけば、２つのサブアレイ中の直鎖状ペプチドは構造的に同一であった。環状ペプチドサブアレイ上の環化できなかったペプチドと同一の直鎖状ペプチドをもつ直鎖状ペプチドサブアレイを作製することにより、直鎖状ペプチドとターゲットタンパク質との相互作用を検出することが可能であった。
【０４１５】
実施例５
ペプチド合成
環状および直鎖状ペプチドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカッタウェイ）により＞９５％の純度で供給された。Ｕとアレイ表面の間の連結を最良に複製するために、アミド化されたグルタメート（Ｕ）の側鎖を備えたペプチドを注文し、よってそのアミノ酸をグルタミン（Ｑ）にした。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔが提供したペプチド重量を用いて水中に５ｍＭ原液を調製した。
【０４１６】
実施例６
ペプチドマイクロアレイへのストレプトアビジン結合
スライドに３０ｍＬの結合用緩衝液中１５０ｍｇのストレプトアビジン−Ｃｙ５を室温で３０分間結合させた。結合用緩衝液は、１％のアルカリ可溶性カゼインおよび０．０５％のｔｗｅｅｎ−２０を１×ＴＢＳ，ｐＨ７．４中に含有していた。３０分後、スライドを１×ＴＢＳ緩衝液中で１分間の２回、水中で３０秒間、洗浄し、遠心乾固させた。
【０４１７】
実施例７
蛍光スキャン／データ解析
ＭＳ２００スキャナー（Ｒｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ）を用いて解像度２ｕｍ、波長６３５ｎｍ、利得２５％およびレーザー強度１００％でアレイのＣｙ５蛍光強度を測定した。Ｉｍａｇｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（イメージ抽出ソフトウェア）（Ｒｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ）を用いてＣｙ５信号強度を抽出した。データの予備処理、正規化および統計学的検定をＲで行なった。データの視覚化および解析をＳｐｏｔｆｉｒｅ  ６．５．０（Ｔｉｂｃｏ，マサチュセッツ週ボストン）ソフトウェアプラットホームで実施した。
【０４１８】
実施例８
表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験をＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋であった。ストレプトアビジンコートしたチップを作製するために、Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（アミンカップリングキット）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＡｃｅｔａｔｅ  ５．０固定用緩衝液中１００ｕｇ／ｍＬのストレプトアビジンをＣＭ５チップのフローセル２にカップリングさせた。水中に０．２ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＮａＯＨを含有する溶液を、作製したチップ上に６０秒間流すことにより、チップを次いでコンディショニングした。多重サイクル実験を用い、各工程間で塩基再生(base regeneration)しながら、作製したストレプトアビジンチップに対する環状および直鎖状ペプチドの結合親和性を測定した。ここでは、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中、７種類の調製濃度のペプチドをストレプトアビジンチップ上に３０秒間流し、次いで６０秒間解離させた。各ペプチド濃度の後、水中０．２ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＮａＯＨをチップ上に３０秒間流し、続いて１２０秒間の安定化期間をおくことにより、ストレプトアビジンチップを再生した。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１を用いて反応速度パラメーターを決定した。
【０４１９】
実施例９
ランダム４ｍｅｒライブラリー設計
実施例１、３および４に記載した方法に従って環状および直鎖状ペプチドを作製した。ライブラリー中のすべてのペプチドがフォーマットＸＸＸＸＵのものであり、Ｘはそれぞれ、独立して選択されたアミノ酸であって特定のセットのＬ−およびＤ−アミノ酸から選択され、Ｕは実施例４に記載したようにＣ末端がアリルエステル（環状フィーチャー）またはｔ−ブチルエステル（直鎖状フィーチャー）のいずれかで保護されたグルタメートであった。このデザインに含まれるアミノ酸はＬ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、およびＤ−Ｔｙｒであった。本明細書中でアミノ酸配列に用いる小文字“ｐ”はＤ−プロリンを表わす。
【０４２０】
実施例６および７の方法に従ってフォーマットＸＸＸＸＵのペプチドについてストレプトアビジン結合アッセイを実施した。結果を図１０に示す；それは、ストレプトアビジン−Ｃｙ５に結合したフォーマットＸＸＸＸＵのペプチドライブラリーについて、環状−対−直鎖状の蛍光強度を示すチャートである。チャート上の各点はユニークペプチド配列を表わす。相関直線からはずれたすべての点が、同じ配列の環状と直鎖状のコンホメーション間の結合の差を表わす。環状ＮＱｐＷＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）ペプチドは最高の環状蛍光強度をもつと同定された。
【０４２１】
実施例１０
ＮＱｐＷＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）のＳＰＲ結果
ヘッド−ツゥー−テイル環状ＮＱｐＷＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）ペプチド（実施例５に従って得られたもの）が、実施例８に従った表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合試験の対象であった。図１１は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状ＮＱｐＷＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合曲線を示す。図１２は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状ＮＱｐＷＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合を、ペプチド濃度に対して示す。破線は結合定数を示す。
【０４２２】
直鎖状ＮＨ２−ＮＱｐＷＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）ペプチド（実施例５に従って得られたもの）に、同様にＳＰＲ試験を施した。環状ＮＱｐＷＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）ペプチドは６１．３μＭの結合定数（ＫＤ）をもっていたが、直鎖状ＮＨ２−ＮＱｐＷＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）ペプチドは測定可能な結合活性を示さなかった（ＫＤ＞２０００μＭ）。それぞれ実施例５に従って作製した環状ＮＱｐＷＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）ペプチドと直鎖状ＮＨ２−ＮＱｐＷＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）ペプチドの間の活性の差は、実施例４に従って別個にマイクロアレイ上に作製した直鎖状と環化ＮＱｐＷＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）ペプチドのサブアレイ間の活性の差と一致する。この結果は、実施例４に従った環化工程が有効であったことを示す。
【０４２３】
実施例１１
ＨＰＱ特異的デザインのライブラリー設計
実施例１、３および４に記載した方法に従って環状および直鎖状ペプチドを作製した。ライブラリー中のすべてのペプチドがフォーマットＪＸＸＨＰＱＸＸＪＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）のものであり、Ｊは２０種類すべての標準的アミノ酸の混合物であり、Ｘはそれぞれ、独立して選択されたアミノ酸であり、Ｕは実施例４に記載したようにＣ末端がアリルエステル（環状フィーチャー）またはｔ−ブチルエステル（直鎖状フィーチャー）のいずれかで保護されたグルタメートであった。
【０４２４】
実施例６および７の方法に従ってフォーマットＪＸＸＨＰＱＸＸＪＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）のペプチドについてストレプトアビジン結合アッセイを実施した。結果を図１３に示す；それは、ストレプトアビジン−Ｃｙ５に結合したフォーマットＪＸＸＨＰＱＸＸＪＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）のペプチドライブラリーについて、環状−対−直鎖状の蛍光強度を示すチャートである。チャート上の各点はユニークペプチド配列を表わす。相関直線からはずれたすべての点が、同じ配列の環状と直鎖状のコンホメーション間の結合の差を表わす。
【０４２５】
このデータは各配列について環状と直鎖状の間の蛍光強度のｌｏｇ倍率（ｌｏｇＦＣ）変化として表わすこともできる。本明細書中で用いる“ｌｏｇＦＣ”は、環状と直鎖状の間の蛍光強度のｌｏｇ倍率変化であり、その際、正のｌｏｇＦＣは環状ペプチドへの結合の優先性の指標であり、負のｌｏｇＦＣは直鎖状ペプチドへの結合の優先性の指標である。フォーマットＪＸＸＨＰＱＸＸＪＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）のペプチドライブラリーについての蛍光強度データを、ｌｏｇＦＣに対する環状蛍光強度として、図１４として示すチャートにプロットする。環状と直鎖状のフィーチャー間で変化を示さないペプチドは、環化できなかったか、あるいはコンホメーション優先性を示さなかった。この最初のＨＰＱ特異的デザインについての上位１００のヒットを表１に示す。
【０４２６】
【表１】
2018515448.tif 000089
【０４２７】
実施例１２
ＨＰＱ特異的デザインの伸長
ＸＸＨＰＱＸＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７）配列をフランキングするＪのいずれの組合わせがストレプトアビジンへの最高結合を与えるかを決定するために、表１に示す配列についてＪ位置に標準的な２０種類のＬ−アミノ酸の可能なすべての組合わせをもつ配列を合成した。表１のペプチドについてのストレプトアビジン結合アッセイを実施例６および７に従って実施した。結果を図１５に示す；それは環状蛍光強度をｌｏｇＦＣに対して示すチャートである。環状ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）ペプチドは最高の環状強度をもつものとして同定され、環状ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９）ペプチドは高い環状強度および高いｌｏｇＦＣをもつものとして同定された。
【０４２８】
実施例１３
ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０）のＳＰＲ結果
ヘッド−ツゥー−テイル環状ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０）ペプチド（実施例５に従って得られたもの）が、実施例８に従った表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合試験の対象であった。図１６は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合曲線を示す。図１７は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状ＮＱｐＷＱＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合を、ペプチド濃度に対して示す。破線は結合定数を示す。
【０４２９】
直鎖状ＮＨ２−ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１）ペプチド（実施例５に従って得られたもの）もＳＰＲ試験の対象であった。図１８は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへの直鎖状ＮＨ２−ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合曲線を示す。図１９は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへの直鎖状ＮＨ２−ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合を、ペプチド濃度に対して示す。破線は結合定数を示す。
【０４３０】
環状ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０）ペプチドは９．４μＭの結合定数（ＫＤ）をもっていたが、直鎖状ＮＨ２−ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１）ペプチドは１００μＭの結合定数（ＫＤ）をもっていた。それぞれ実施例５に従って作製した環状ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０）ペプチドと直鎖状ＮＨ２−ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１）ペプチドとの活性の差は、実施例４に従って別個にマイクロアレイ上に作製した直鎖状と環化ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）ペプチドのサブアレイ間の活性の差と一致する。この結果は、実施例４に従った環化工程が有効であったことを示す。
【０４３１】
実施例１４
ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）のＳＰＲ結果
ヘッド−ツゥー−テイル環状ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）ペプチド（実施例５に従って得られたもの）が、実施例８に従った表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合試験の対象であった。図２０は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合曲線を示す。図２１は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへのヘッド−ツゥー−テイル環状ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合を、ペプチド濃度に対して示す。破線は結合定数を示す。
【０４３２】
直鎖状ＮＨ２−ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３）ペプチド（実施例５に従って得られたもの）もＳＰＲ試験の対象であった。図２２は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへの直鎖状ＮＨ２−ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合曲線を示す。図２３は、ストレプトアビジンコートしたＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップへの直鎖状ＮＨ２−ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３）ペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合を、ペプチド濃度に対して示す。破線は結合定数を示す。
【０４３３】
環状ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）ペプチドは１０．８μＭの結合定数（ＫＤ）をもっていたが、直鎖状ＮＨ２−ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３）ペプチドは３２０μＭの結合定数（ＫＤ）をもっていた。それぞれ実施例５に従って作製した環状ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）ペプチドと直鎖状ＮＨ２−ＱＮＤＨＰＱＮＧＧＱ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３）ペプチドとの活性の差は、実施例４に従って別個にマイクロアレイ上に作製した直鎖状と環化ＬＹＤＨＰＱＮＧＧＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）ペプチドのサブアレイ間の活性の差と一致する。この結果は、実施例４に従った環化工程が有効であったことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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