(57)【要約】本発明は、ダイナミックＢＨ３プロファイリングを使用して毒性を評価する方法を提供する。一部の態様では、本開示は、毒性を決定するために複数の作用因子をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、ａ）複数の作用因子を提供するステップ；ｂ）細胞の試料を提供するステップであって、前記細胞が非がん性細胞である、ステップ；ｃ）複数の作用因子のそれぞれについて細胞の試料の試験アリコートを提供するステップ；ｄ）各試験アリコートをそのそれぞれの作用因子と個別に接触させるステップ；ｅ）細胞の試料の対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが複数の作用因子のいずれとも接触していない、ステップなどを含む。
2018520638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒性を決定するために複数の作用因子をスクリーニングする方法であって、
ａ）複数の作用因子を提供するステップ；
ｂ）細胞の試料を提供するステップであって、前記細胞が非がん性細胞である、ステップ；
ｃ）前記複数の作用因子のそれぞれについて前記細胞の試料の試験アリコートを提供するステップ；
ｄ）各試験アリコートをそのそれぞれの作用因子と個別に接触させるステップ；
ｅ）前記細胞の試料の対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが前記複数の作用因子のいずれとも接触していない、ステップ；
ｆ）各アリコート中の前記細胞を透過化するステップ；
ｇ）透過化された前記細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
ｈ）前記試験アリコートのそれぞれの中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）パーセントの値を決定するステップ；
ｉ）前記対照アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；および
ｊ）前記試験アリコートのそれぞれについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｈ）で決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｉ）で決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップ
を含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、前記試験アリコート中の前記細胞と接触した前記作用因子が、前記細胞に有毒であることを示す、方法。
【請求項２】
前記デルタパーセントプライミングが、２０パーセントもしくはそれ未満、１８パーセントもしくはそれ未満、１６パーセントもしくはそれ未満、１４パーセントもしくはそれ未満、１２パーセントもしくはそれ未満、１０パーセントもしくはそれ未満、８パーセントもしくはそれ未満、６パーセントもしくはそれ未満、４パーセントもしくはそれ未満、２パーセントもしくはそれ未満、または１パーセントもしくはそれ未満ならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非がん性細胞が健康な細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｋ）細胞の試料を提供するステップであって、前記細胞が、がん性細胞である、ステップ；
ｌ）前記複数の作用因子のそれぞれについて前記がん性細胞の試料の試験アリコートを提供するステップ；
ｍ）各試験アリコートをそのそれぞれの作用因子と個別に接触させるステップ；
ｎ）前記がん性細胞の試料の対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが前記複数の作用因子のいずれとも接触していない、ステップ；
ｏ）各アリコート中の前記がん性細胞を透過化するステップ；
ｐ）透過化された前記がん性細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
ｑ）前記試験アリコートのそれぞれの中の前記がん性細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；
ｒ）前記対照アリコート中の前記がん性細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；および
ｓ）前記試験アリコートのそれぞれについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｑ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｒ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップ
をさらに含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、前記試験アリコート中の前記がん性細胞と接触した前記作用因子が、前記がん性細胞に対して有毒であることを示す、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングが、２０パーセントを超える、３０パーセントを超える、４０パーセントを超える、５０パーセントを超える、６０パーセントを超える、７０パーセントを超える、８０パーセントを超える、９０パーセントを超える、９５パーセントを超える、または１００パーセントならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングが、前記非がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングよりも大きいならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングが、前記非がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングよりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、または少なくとも２００％大きいならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングが、前記非がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングよりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍大きいならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記がん性細胞が初代ヒト腫瘍細胞である、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記がん性細胞が、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）から得られる、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の作用因子が、２０種またはそれ超の作用因子を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の作用因子が、１００種またはそれ超の作用因子を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記各試験アリコートが、そのそれぞれの作用因子と２４時間またはそれ未満接触する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
透過化された前記細胞が、前記アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと３時間またはそれ未満接触する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試験アリコートのそれぞれの中の前記細胞が、ジギトニンまたはサポニンを用いて透過化される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントが、
ｉ）前記細胞を電位差測定用色素と接触させ、前記電位差測定用色素の発光を測定すること；
ｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定すること；および
ｉｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定すること
のうち１つまたは複数によって決定される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記電位差測定用色素が、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ミトコンドリア膜間腔からの分子が、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号１〜１６からなる群より選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数の作用因子からの作用因子が、１種または複数の化合物を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の作用因子からの作用因子が抗がん剤である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の作用因子からの作用因子が化学療法剤である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の作用因子のうち１種または複数が、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、ならびにそれらの組合せおよびプロドラッグから選択される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の作用因子のうち１種または複数が、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、およびエアロゾルから選択される、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
組織に対する作用因子の毒性を予測する方法であって、
ａ）作用因子を提供するステップ；
ｂ）非がん性細胞を含む複数の細胞試料を提供するステップであって、各細胞試料が組織から得られる、ステップ；
ｃ）前記複数の細胞試料のそれぞれの試験アリコートを提供するステップ；
ｄ）各試験アリコートを前記作用因子と個別に接触させるステップ；
ｅ）前記複数の細胞試料のそれぞれの対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが前記作用因子と接触していない、ステップ；
ｆ）各試験アリコートおよび対照アリコート中の前記細胞を透過化するステップ；
ｇ）透過化された前記細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
ｈ）各試験アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；
ｉ）各対照アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ならびに
ｊ）各試験アリコートについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｈ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｉ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップ
を含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、前記細胞が得られた前記組織に対して前記作用因子が有毒であることを示す、方法。
【請求項２７】
前記デルタパーセントプライミングが、２０パーセントもしくはそれ未満、１８パーセントもしくはそれ未満、１６パーセントもしくはそれ未満、１４パーセントもしくはそれ未満、１２パーセントもしくはそれ未満、１０パーセントもしくはそれ未満、８パーセントもしくはそれ未満、６パーセントもしくはそれ未満、４パーセントもしくはそれ未満、２パーセントもしくはそれ未満、または１パーセントもしくはそれ未満ならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記非がん性細胞が健康な細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、動物の生検または剖検によって得られた試料に由来する、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
各試験アリコート中の前記細胞が、前記作用因子と２４時間またはそれ未満接触する、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
透過化された前記細胞が、前記アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと３時間またはそれ未満接触する、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、ジギトニンまたはサポニンを用いて透過化される、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントが、
ｉ）前記細胞を電位差測定用色素と接触させ、前記電位差測定用色素の発光を測定すること；
ｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定すること；および
ｉｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定すること
のうち１つまたは複数によって決定される、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記電位差測定用色素が、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ミトコンドリア膜間腔からの前記分子が、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する、請求項２６から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号１〜１６からなる群より選択される、請求項２６から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記作用因子が、１種または複数の化合物を含む、請求項２６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記作用因子が抗がん剤である、請求項２６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記作用因子が化学療法剤である、請求項２６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記作用因子が、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、またはそれらの一部の組合せもしくはプロドラッグである、請求項２６から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記作用因子が、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、またはエアロゾルである、請求項２６から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
作用因子の毒性を予測する方法であって、
ａ）非ヒト動物を致死量以下の用量の作用因子と接触させるステップ；
ｂ）前記動物を屠殺するステップ；
ｃ）１つまたは複数の細胞試料を提供するステップであって、各細胞試料が前記動物からの組織から得られる、ステップ；
ｄ）前記１つまたは複数の細胞試料のそれぞれの試験アリコートを提供するステップ；
ｅ）各試験アリコートを前記作用因子と個別に接触させるステップ；
ｆ）前記１つまたは複数の細胞試料のそれぞれの対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが前記作用因子と接触していない、ステップ；
ｇ）各アリコート中の前記細胞を透過化するステップ；
ｈ）透過化された前記細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
ｉ）前記試験アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；
ｊ）前記対照アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；および
ｋ）前記試験アリコートについてのデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｉ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｊ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップ
を含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、前記細胞が得られた前記動物の前記組織に対して前記作用因子が有毒であることを示す、方法。
【請求項４５】
前記動物が哺乳動物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物が、非ヒト霊長類または齧歯類である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記動物が、注射、吸入、局所投与、または経口投与によって前記作用因子と接触する、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記動物が、前記作用因子と２４時間またはそれ未満接触する、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
透過化された前記細胞が、前記アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと３時間またはそれ未満接触する、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、ジギトニンまたはサポニンを用いて透過化される、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントが、
ｉ）前記細胞を電位差測定用色素と接触させ、前記電位差測定用色素の発光を測定すること；
ｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定すること；および
ｉｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定すること
のうち１つまたは複数によって決定される、請求項４４から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記電位差測定用色素が、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ミトコンドリア膜間腔からの前記分子が、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子である、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する、請求項４４から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号１〜１６からなる群より選択される、請求項４４から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記作用因子が、１種または複数の化合物を含む、請求項４４から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記作用因子が抗がん剤である、請求項４４から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記作用因子が化学療法剤である、請求項４４から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記作用因子が、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、またはそれらの一部の組合せもしくはプロドラッグである、請求項４４から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記作用因子が、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、またはエアロゾルである、請求項４４から５９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１５年４月２７日に出願された米国仮出願第６２／１５３，４７５号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ダイナミックＢＨ３プロファイリングは、試験化合物または治療法に対する細胞の感受性を測定するために使用される技法である。ダイナミックＢＨ３プロファイリングががん細胞試料に適用されると、その試料中のがん細胞をプログラム細胞死の閾値により近づける薬物が、容易に特定され得る。そのように特定された薬物は、がん細胞試料が由来する被験体に臨床的な抗がん利益を提供することにより、個々のがん患者のための個別化治療を提供する見込みがある薬物である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、ダイナミックＢＨ３プロファイリングの原理を非がん性細胞における作用因子の毒性を評価するために利用することができるという発見に関する。様々な態様では、本開示は、作用因子が非がん性細胞のアポトーシス感受性をどのように変化させるかを決定するための方法を提供する。
【０００４】
したがって一部の態様では、本開示は、毒性を決定するために複数の作用因子をスクリーニングする方法であって、ａ）複数の作用因子を提供するステップ；ｂ）細胞の試料を提供するステップであって、前記細胞が非がん性細胞である、ステップ；ｃ）複数の作用因子のそれぞれについて細胞の試料の試験アリコートを提供するステップ；ｄ）各試験アリコートをそのそれぞれの作用因子と個別に接触させるステップ；ｅ）細胞の試料の対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが複数の作用因子のいずれとも接触していない、ステップ；ｆ）各アリコート中の細胞を透過化するステップ；ｇ）透過化された細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；ｈ）試験アリコートのそれぞれの中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）パーセントの値を決定するステップ；ｉ）対照アリコート中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；およびｊ）試験アリコートのそれぞれについてデルタパーセントプライミング（ｄｅｌｔａ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｐｒｉｍｉｎｇ）の値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｈ）で決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｉ）で決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップを含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、試験アリコート中の細胞と接触した作用因子が、細胞に有毒であることを示す、方法を提供する。
【０００５】
一部の実施形態では、方法は、デルタパーセントプライミングが、２０パーセントもしくはそれ未満、１８パーセントもしくはそれ未満、１６パーセントもしくはそれ未満、１４パーセントもしくはそれ未満、１２パーセントもしくはそれ未満、１０パーセントもしくはそれ未満、８パーセントもしくはそれ未満、６パーセントもしくはそれ未満、４パーセントもしくはそれ未満、２パーセントもしくはそれ未満、または１パーセントもしくはそれ未満ならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。
【０００６】
一部の実施形態では、非がん性細胞は健康な細胞である。
【０００７】
一部の実施形態では、方法は、ｋ）細胞の試料を提供するステップであって、前記細胞が、がん性細胞である、ステップ；ｌ）複数の作用因子のそれぞれについてがん性細胞の試料の試験アリコートを提供するステップ；ｍ）各試験アリコートをそのそれぞれの作用因子と個別に接触させるステップ；ｎ）複数の作用因子のいずれとも接触していない、がん性細胞の試料の対照アリコートを提供するステップ；ｏ）各アリコート中のがん性細胞を透過化するステップ；ｐ）透過化されたがん性細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；ｑ）試験アリコートのそれぞれの中のがん性細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ｒ）対照アリコート中のがん性細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；およびｓ）試験アリコートのそれぞれについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｑ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｒ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップをさらに含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、試験アリコート中のがん性細胞と接触した作用因子が、がん性細胞に対して有毒であることを示す。一部の実施形態では、方法は、がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングが、２０パーセントを超える、３０パーセントを超える、４０パーセントを超える、５０パーセントを超える、６０パーセントを超える、７０パーセントを超える、８０パーセントを超える、９０パーセントを超える、９５パーセントを超える、または１００パーセントならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。
【０００８】
一部の実施形態では、方法は、がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングが、非がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングよりも大きいならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。
【０００９】
一部の実施形態では、方法は、がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングが、非がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングよりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、または少なくとも２００％大きいならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。
【００１０】
一部の実施形態では、方法は、がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングが、非がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングよりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍大きいならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。
【００１１】
一部の実施形態では、がん性細胞は、初代ヒト腫瘍細胞である。一部の実施形態では、がん性細胞は、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）から得られる。
【００１２】
一部の実施形態では、複数の作用因子は、２０種またはそれ超の作用因子を含む。一部の実施形態では、複数の作用因子は、１００種またはそれ超の作用因子を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、各試験アリコートは、そのそれぞれの作用因子と２４時間またはそれ未満接触する。一部の実施形態では、透過化された細胞は、アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと３時間またはそれ未満接触する。
【００１４】
一部の実施形態では、試験アリコートのそれぞれの中の細胞は、ジギトニンまたはサポニンを用いて透過化される。
【００１５】
一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントは、ｉ）細胞を電位差測定用色素と接触させ、前記電位差測定用色素の発光を測定すること；ｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定すること；およびｉｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定することのうち１つまたは複数によって決定される。一部の実施形態では、電位差測定用色素は、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である。一部の実施形態では、ミトコンドリア膜間腔からの分子は、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子である。
【００１６】
一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１〜１６からなる群より選択される。
【００１７】
一部の実施形態では、複数の作用因子からの作用因子は、１種または複数の化合物を含む。一部の実施形態では、複数の作用因子からの作用因子は抗がん剤である。一部の実施形態では、複数の作用因子からの作用因子は化学療法剤である。一部の実施形態では、複数の作用因子のうち１種または複数は、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、ならびにそれらの組合せおよびプロドラッグから選択される。一部の実施形態では、複数の作用因子のうち１種または複数は、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、およびエアロゾルから選択される。
【００１８】
別の態様では、本開示は、組織に対する作用因子の毒性を予測する方法であって、ａ）作用因子を提供するステップ；ｂ）非がん性細胞を含む複数の細胞試料を提供するステップであって、各細胞試料が組織から得られる、ステップ；ｃ）複数の細胞試料のそれぞれの試験アリコートを提供するステップ；ｄ）各試験アリコートを作用因子と個別に接触させるステップ；ｅ）複数の細胞試料のそれぞれの対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが作用因子と接触していない、ステップ；ｆ）各試験アリコートおよび対照アリコート中の細胞を透過化するステップ；ｇ）透過化された細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；ｈ）各試験アリコート中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ｉ）各の対照アリコート中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ならびにｊ）各試験アリコートについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｈ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｉ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップを含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、細胞が得られた組織に対して作用因子が有毒であることを示す、方法を提供する。
【００１９】
一部の実施形態では、方法は、デルタパーセントプライミングが、２０パーセントもしくはそれ未満、１８パーセントもしくはそれ未満、１６パーセントもしくはそれ未満、１４パーセントもしくはそれ未満、１２パーセントもしくはそれ未満、１０パーセントもしくはそれ未満、８パーセントもしくはそれ未満、６パーセントもしくはそれ未満、４パーセントもしくはそれ未満、２パーセントもしくはそれ未満、または１パーセントもしくはそれ未満ならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。
【００２０】
一部の実施形態では、非がん性細胞は健康な細胞である。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、動物の生検または剖検によって得られた試料に由来する。
【００２１】
一部の実施形態では、各試験アリコート中の細胞は、作用因子と２４時間またはそれ未満接触する。一部の実施形態では、透過化された細胞は、アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと３時間またはそれ未満接触する。
【００２２】
一部の実施形態では、細胞は、ジギトニンまたはサポニンを用いて透過化される。
【００２３】
一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントは、ｉ）細胞を電位差測定用色素と接触させ、前記電位差測定用色素の発光を測定すること；ｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定すること；およびｉｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定することのうち１つまたは複数によって決定される。一部の実施形態では、電位差測定用色素は、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である。一部の実施形態では、ミトコンドリア膜間腔からの分子は、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子である。
【００２４】
一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１〜１６からなる群より選択される。
【００２５】
一部の実施形態では、作用因子は、１種または複数の化合物を含む。一部の実施形態では、作用因子は抗がん剤である。一部の実施形態では、作用因子は化学療法剤である。一部の実施形態では、作用因子は、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、またはそれらの一部の組合せもしくはプロドラッグである。一部の実施形態では、作用因子は、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、またはエアロゾルである。
【００２６】
別の態様では、本開示は、作用因子の毒性を予測する方法であって、ａ）非ヒト動物を致死量以下の用量の作用因子と接触させるステップ；ｂ）動物を屠殺するステップ；ｃ）１つまたは複数の細胞試料を提供するステップであって、各細胞試料が動物からの組織から得られる、ステップ；ｄ）１つまたは複数の細胞試料のそれぞれの試験アリコートを提供するステップ；ｅ）各試験アリコートを作用因子と個別に接触させるステップ；ｆ）１つまたは複数の細胞試料のそれぞれの対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが作用因子と接触していない、ステップ；ｇ）各アリコート中の細胞を透過化するステップ；ｈ）透過化された細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；ｉ）試験アリコート中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ｊ）対照アリコート中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；およびｋ）試験アリコートについてのデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｉ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｊ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップを含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、細胞が得られた動物の組織に対して作用因子が有毒であることを示す、方法を提供する。
【００２７】
一部の実施形態では、動物は哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は非ヒト霊長類または齧歯類である。
【００２８】
一部の実施形態では、動物は、注射、吸入、局所投与、または経口投与によって作用因子と接触する。一部の実施形態では、動物は、作用因子と２４時間またはそれ未満接触する。
【００２９】
一部の実施形態では、透過化された細胞は、アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと３時間またはそれ未満接触する。
【００３０】
一部の実施形態では、細胞は、ジギトニンまたはサポニンを用いて透過化される。
【００３１】
一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントは、ｉ）細胞を電位差測定用色素と接触させ、前記電位差測定用色素の発光を測定すること；ｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定すること；およびｉｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定することのうち１つまたは複数によって決定される。一部の実施形態では、電位差測定用色素は、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である。一部の実施形態では、ミトコンドリア膜間腔からの分子は、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子である。
【００３２】
一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１〜１６からなる群より選択される。
【００３３】
一部の実施形態では、作用因子は、１種または複数の化合物を含む。一部の実施形態では、作用因子は抗がん剤である。一部の実施形態では、作用因子は化学療法剤である。一部の実施形態では、作用因子は、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、またはそれらの一部の組合せもしくはプロドラッグである。一部の実施形態では、作用因子は、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、またはエアロゾルである。
【００３４】
提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、細胞は、接着性固体表面上にて、血清を有する培養培地中で、作用因子の存在下および非存在下において培養される。提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、細胞をＢＨ３プロファイリング緩衝液およびアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させる前に、細胞からの培養培地を洗浄することをさらに含む。
【００３５】
一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、２×、３×または４×の濃度で添加される。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、２×の濃度で添加され、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量は、顕微鏡法によって測定される。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、３×または４×の濃度で添加され、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定される。
【００３６】
一部の実施形態では、接着性固体表面は、１種または複数の接着促進化合物でコーティングされている。一部の実施形態では、１種または複数の接着促進化合物は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質である。一部の実施形態では、ＥＣＭタンパク質は、コラーゲン１、ラミニン、コラーゲン４およびフィブロネクチンからなる群より選択される。一部の実施形態では、１種または複数の接着促進化合物は抗体である。一部の実施形態では、１種または複数の接着促進化合物はストレプトアビジンである。
【００３７】
一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、トレハロース由来実験緩衝液（Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＤＴＥＢ）またはミトコンドリア実験緩衝液（ＭＥＢ）に由来する。一部の実施形態では、細胞は、ＢＨ３ドメインペプチドとの接触の後、前、または同時に透過化される。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液に、透過化剤が補充される。一部の実施形態では、透過化剤はジギトニンまたはサポニンである。
【００３８】
特に定義しない場合、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料に類似または等価の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるものの、適切な方法および材料が下に記載される。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優先されるものとする。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例証であって、限定することを意図するものではない。
【００３９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｅは、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）に関する例示的なＢＨ３プロファイリングを示す。健康なＨＦＦ細胞に関するＢＨ３プロファイリングを示すために、合成ＢＨ３ペプチドに応答したミトコンドリアからのチトクロームｃの消失を測定した。様々な濃度の合成Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチドでチトクロームｃの免疫蛍光（図１Ａ〜１Ｄ）を用量応答曲線に沿って評価した（図１Ｅ）。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｅは、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）に関する例示的なＢＨ３プロファイリングを示す。健康なＨＦＦ細胞に関するＢＨ３プロファイリングを示すために、合成ＢＨ３ペプチドに応答したミトコンドリアからのチトクロームｃの消失を測定した。様々な濃度の合成Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチドでチトクロームｃの免疫蛍光（図１Ａ〜１Ｄ）を用量応答曲線に沿って評価した（図１Ｅ）。
【００４１】
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、健康なヒト包皮線維芽細胞のＢＨ３プロファイルにおける例示的な薬物誘導型変化を示す。健康なＨＦＦを化合物ライブラリーまたはＤＭＳＯ（実験対照として使用した不活性化学物質）で２０時間処理した後、細胞死感受性の増加をＢＨ３プロファイリングによって決定した。具体的には、アポトーシス感受性（デルタパーセントプライミング）を増加させる化合物は、チトクロームｃの消失を加速させる化合物である。図２Ａは、細胞死感受性（デルタパーセントプライミング）の増加のデルタａヒストグラムを示し、図２Ｂは、２Ａのｙ軸（ライブラリー中の化合物のパーセンテージ）の拡大図を示す。
【００４２】
【図３】図３は、マウス乳腺腫瘍細胞（ｙ軸）と健康なヒト包皮線維芽細胞との間のＢＨ３プロファイルにおける薬物誘導型変化の例示的な比較を示す。健康なＨＦＦ細胞または腫瘍細胞における細胞死感受性に対する約２４００種の化合物の効果を比較すると、数種の化合物が、健康な細胞ではなく腫瘍を死滅に向けて感作するように見える（網がけした領域）。逆に、数種の化合物は、健康なＨＦＦ細胞およびマウス乳腺腫瘍細胞の両方をアポトーシスに向けて感作するように見える（円で囲んだ領域）。
【００４３】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｅは、成体マウス肝細胞の例示的なＢＨ３プロファイリングを示す。合成ＢＨ３ペプチドに応答したミトコンドリアからのチトクロームｃの消失を測定した。０．１μＭ（図４Ａ）、１．５６μＭ（図４Ｂ）、２５μＭ（図４Ｃ）、および１００μＭ（図４Ｄ）の合成Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチドを使用してチトクロームｃの免疫蛍光を評価した。対応する用量応答曲線をさらに示す（図４Ｅ）。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｅは、成体マウス肝細胞の例示的なＢＨ３プロファイリングを示す。合成ＢＨ３ペプチドに応答したミトコンドリアからのチトクロームｃの消失を測定した。０．１μＭ（図４Ａ）、１．５６μＭ（図４Ｂ）、２５μＭ（図４Ｃ）、および１００μＭ（図４Ｄ）の合成Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチドを使用してチトクロームｃの免疫蛍光を評価した。対応する用量応答曲線をさらに示す（図４Ｅ）。
【００４４】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｅは、成体マウス肝細胞における細胞死感受性を増加させる化合物の例を示す。ＤＭＳＯ対照（図５Ａ）、ナビトクラックス（Ｎａｖｉｔｏｃｌａｘ）（図５Ｂ）、ドキソルビシン（図５Ｃ）、およびタネスピマイシン（図５Ｄ）に応答したミトコンドリアからのチトクロームｃの消失を測定した。細胞死感受性の増加を、アポトーシス感受性の増加、またはデルタプライミング（例えば、デルタパーセントプライミング）として定量されるチトクロームｃの消失によって示し、図５Ｅに示す。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｅは、成体マウス肝細胞における細胞死感受性を増加させる化合物の例を示す。ＤＭＳＯ対照（図５Ａ）、ナビトクラックス（Ｎａｖｉｔｏｃｌａｘ）（図５Ｂ）、ドキソルビシン（図５Ｃ）、およびタネスピマイシン（図５Ｄ）に応答したミトコンドリアからのチトクロームｃの消失を測定した。細胞死感受性の増加を、アポトーシス感受性の増加、またはデルタプライミング（例えば、デルタパーセントプライミング）として定量されるチトクロームｃの消失によって示し、図５Ｅに示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本開示は、非がん性細胞における作用因子の毒性を評価するためにダイナミックＢＨ３プロファイリングの原理を利用することができるという発見に関する。様々な態様では、本開示は、作用因子が非がん性細胞のアポトーシス感受性をどのように変化させるかを迅速および有効に決定するための方法を提供する。例えば前臨床毒性は、高価で、時間がかかり、信頼できない可能性がある、哺乳動物における試験に大きく依存するので、薬物を開発する間に薬物の毒性を評価する多数の現行の手段は限定的である。本明細書に提供されるダイナミックＢＨ３プロファイリング方法は、従来の前臨床毒性試験に対する安価で堅固な代替法を提供する。例えば、正常な一次組織を用いて薬物の毒性スクリーニングを行うために、正常細胞、例えば正常細胞のパネルにダイナミックＢＨ３プロファイリングが実施される場合がある。別の例として、特定の環境（例えば、部屋、建物、街路、都市）が有毒であるかどうかを評価する多数の現行の手段は、潜在的毒物の予備知識を要するクロマトグラフィー分析に依存する。本明細書に提供されるダイナミックＢＨ３プロファイリング方法は、正常細胞のプロファイリングが環境中の毒性作用因子（例えば、放射線、ガス、生物学的作用因子など）の存在を迅速に検出できるようにする。
【００４６】
一部の態様では、本開示は、毒性を決定するために複数の作用因子をスクリーニングする方法であって、ａ）複数の作用因子を提供するステップ；ｂ）細胞の試料を提供するステップであって、前記細胞が非がん性細胞である、ステップ；ｃ）複数の作用因子のそれぞれについて細胞の試料の試験アリコートを提供するステップ；ｄ）各試験アリコートをそのそれぞれの作用因子と個別に接触させるステップ；ｅ）複数の作用因子のいずれとも接触していない、細胞の試料の対照アリコートを提供するステップ；ｆ）各アリコート中の細胞を透過化するステップ；ｇ）透過化された細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；ｈ）試験アリコートのそれぞれの中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ｉ）対照アリコート中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；およびｊ）試験アリコートのそれぞれについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｈ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｉ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップを含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、試験アリコート中の細胞と接触した作用因子が、細胞に対して有毒であることを示す、方法を提供する。一部の態様では、本開示は、組織に対する作用因子の毒性を予測する方法であって、ａ）作用因子を提供するステップ；ｂ）非がん性細胞を含む複数の細胞試料を提供するステップであって、各細胞試料が組織から得られる、ステップ；ｃ）複数の細胞試料のそれぞれの試験アリコートを提供するステップ；ｄ）各試験アリコートを作用因子と個別に接触させるステップ；ｅ）複数の細胞試料のそれぞれの対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが作用因子と接触していない（例えば、対照アリコートは、作用因子と接触していない細胞を含有する、または作用因子と接触していない動物からの細胞を含有する）、ステップ；ｆ）各試験アリコートおよび対照アリコート中の細胞を透過化するステップ；ｇ）透過化された細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；ｈ）各試験アリコート中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ｉ）各対照アリコート中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ならびにｊ）各試験アリコートについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｈ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｉ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップを含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、細胞が得られた組織に対して作用因子が有毒であることを示す、方法を提供する。
【００４７】
一部の実施形態では、非がん性細胞は、健常細胞（例えば、いかなる明白なまたは潜伏した病的状態も有さない細胞）である。一部の実施形態では、非がん性細胞は、感染作用因子、例えばウイルスまたは細胞内細菌に感染している。一部の実施形態では、非がん性細胞は、その他の点では正常に機能していない器官からのものである。一部の実施形態では、非がん性細胞は、ストレス、例えばとりわけ低酸素、卒中、心筋梗塞などの血管ストレスを受けやすい。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、動物の生検または剖検によって得られる試料に由来する。一部の実施形態では、細胞は、非悪性のヒトまたはマウス初代細胞である。
【００４８】
一部の実施形態では、提供される方法は、ｋ）細胞の試料を提供するステップであって、前記細胞が、がん性細胞である、ステップ；ｌ）複数の作用因子のそれぞれについてがん性細胞の試料の試験アリコートを提供するステップ；ｍ）各試験アリコートをそのそれぞれの作用因子と個別に接触させるステップ；ｎ）複数の作用因子のいずれとも接触していない、がん性細胞の試料の対照アリコートを提供するステップ；ｏ）各アリコート中のがん性細胞を透過化するステップ；ｐ）透過化されたがん性細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；ｑ）試験アリコートのそれぞれの中のがん性細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ｒ）対照アリコート中のがん性細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；およびｓ）試験アリコートのそれぞれについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｑ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｒ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップをさらに含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、試験アリコート中のがん性細胞と接触した作用因子が、がん性細胞に対して有毒であることを示す。
【００４９】
一部の実施形態では、方法は、がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングが、非がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングよりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、または少なくとも２００％大きいならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。
【００５０】
一部の実施形態では、方法は、がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングが非がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングよりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍大きいならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。
【００５１】
一部の実施形態では、がん性細胞は、不死化がん細胞株を含む。一部の実施形態では、細胞は、不死化マウスまたはヒトがん細胞株である。樹立されたがん細胞株は当技術分野において周知であり、それらには、例えば膵臓がん細胞株（例えば、ＹＡＰＣ、Ｐａｎｃ０２．０３およびＳＵ８６．８６など）、乳がん細胞株（例えば、ＡＵ５６５、ＢＴ−２０、ＣＡＬ−１２０、ＨＭＥＬおよびＫＰＬ−１など）、腎臓がん株（例えば、７６９−Ｐ、ＡＣＮＨ、ＨＥＫ  ＴＥ、ＳＬＲ２０およびＵＭＲＣ２など）、骨がん細胞株（例えば、ＣＡＬ−７８、ＨＯＳ、ＭＧ−６３およびＳＫ−ＥＳ−１など）およびリンパ系がん細胞株（例えば、ＡＭＬ−１９３、ＢＤＣＭ、ＣＭＬ−Ｔ１およびＪＭ１など）が含まれる。当業者は、他のがん細胞株、例えばＢａｒｒｅｔｉｎａら（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２年３月２８日；４８３巻（７３９１号）：６０３〜７頁。ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１００３）に開示されているものを認識している。
【００５２】
一部の実施形態では、細胞は被験体に由来する。例えば、がん細胞は、外科的技法（例えば、生検）によって被験体から単離される場合がある。したがって、一部の実施形態では、細胞は初代腫瘍細胞である。一部の実施形態では、細胞は、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を含む。本明細書に使用される用語「患者由来異種移植片」（ＰＤＸ）は、免疫不全マウスへのがん性一次腫瘍の移植によって生成した組織を指す。
【００５３】
一部の実施形態では、細胞を接触させることは、作用因子の存在下または非存在下において細胞を培養することを含む。一部の実施形態では、細胞は、適切な培養条件で作用因子の存在下または非存在下の培養培地中で培養される。「培養培地」（本明細書において「細胞培養培地」または「培地」とも呼ばれる）は、細胞の生存度を維持して増殖を支援する栄養素を含有する、細胞を培養するための培地である。本開示は、細胞を培養するための様々なパラメーターおよび条件を企図する。一部の実施形態では、培養培地は血清を含有する。細胞培養培地は、以下の栄養素：塩、緩衝剤、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物、およびペプチド増殖因子などの他の構成要素のいずれかを適切な量および組合せで含有し得る。細胞培養培地は、当技術分野において公知であり、天然培地または人工培地として分類され得る。細胞培養培地の例には、非限定的に、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）が含まれる。細胞を培養するために適切な培地の選択は、当業者の能力の範囲内である。適切な条件は、細胞を細胞培養インキュベーターで標準的な細胞培養条件下（例えば、相対湿度＞８０％の空気および５〜１０％ＣＯ２という加湿雰囲気中で３７℃）で成長させることを含む。
【００５４】
一部の実施形態では、細胞は、作用因子と少なくとも３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、または少なくとも４日間接触する、例えば作用因子の存在下において培養される。一部の実施形態では、細胞は、作用因子と４８時間もしくはそれ未満、３６時間もしくはそれ未満、２４時間もしくはそれ未満、または１２時間もしくはそれ未満接触する、例えば作用因子の存在下において培養される。
【００５５】
一部の態様では、本開示は、作用因子の毒性を予測する方法であって、ａ）非ヒト動物を致死量以下の用量の作用因子と接触させるステップ；ｂ）動物を屠殺するステップ；ｃ）１つまたは複数の細胞試料を提供するステップであって、各細胞試料が動物からの組織から得られる、ステップ；ｄ）１つまたは複数の細胞試料のそれぞれの試験アリコートを提供するステップ；ｅ）各試験アリコートを作用因子と個別に接触させるステップ；ｆ）１つまたは複数の細胞試料のそれぞれの対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが作用因子と接触していない、ステップ；ｇ）各アリコート中の細胞を透過化するステップ；ｈ）透過化された細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；ｉ）試験アリコート中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ｊ）対照アリコート中の細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；およびｋ）試験アリコートについてのデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｉ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｊ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップを含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、細胞が得られた動物の組織に対して作用因子が有毒であることを示す、方法を提供する。
【００５６】
本明細書に使用される「被験体」は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシである。一部の実施形態では、哺乳動物は非ヒト霊長類または齧歯類である。一部の実施形態では、被験体は、遺伝的に改変された動物である。例えば、特定のがんを発生するようにマウスを遺伝的に操作することができる。一部の実施形態では、被験体は、以前にがんを有すると診断されていない。あるいは、一部の実施形態では、被験体は、以前にがんを有すると診断されており、すでにがんの処置を受けている可能性がある。
【００５７】
本明細書に記載するように、本開示の態様は、被験体（例えば、非ヒト動物）を致死量以下の用量の作用因子と接触させることに関する可能性がある。当技術分野において公知の方法によって、非ヒト動物を作用因子と接触させることができる。一部の実施形態では、作用因子は、例えば注射、吸入、局所投与、または経口投与によって動物に投与される。例えば、作用因子は、局所投与（例えば、皮膚上（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ）または吸入投与）、経腸投与（例えば、経口、胃内、または直腸投与）、または非経口投与（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、髄腔内、または皮下投与）によって投与することができる。
【００５８】
作用因子に対する細胞感受性は、細胞または細胞構成要素（例えば、ミトコンドリア）を、ＢＨ３プロファイリング緩衝液およびアポトーシス促進性ＢＣＬ−２ファミリーからのＢＨ３ドメインペプチドまたは直接ミトコンドリア活性を有する小型分子と接触させることによって決定される。これには、非限定的にＡＢＴ−１９９、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、ＷＥＨＩ−５３９、Ａ−１２１０４７７、およびＡＢＴ−１９９が含まれる。ＢＨ３ペプチドがＭＯＭＰを誘導する能力は、作用因子に曝露された細胞（または細胞構成要素、例えばミトコンドリア）および作用因子に曝露されなかった対照細胞（または細胞構成要素、例えばミトコンドリア）において測定される。作用因子の非存在下において培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較して、作用因子の存在下において培養された細胞においてＢＨ３ペプチド誘導型ＭＯＭＰが増加することは、細胞が作用因子に対して応答性である（例えば、細胞死が誘導される）ことを示す。作用因子の非存在下において培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較して、作用因子の存在下において培養された細胞においてＭＯＭＰが変化しないことは、薬物が細胞死の誘導に効果を有さないことを示す。作用因子の非存在下において培養された細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量と比較して、作用因子の存在下において培養された細胞においてＭＯＭＰが減少することは、作用因子が細胞に脱感作効果または保護効果を有することを示す。
【００５９】
作用因子に曝露されていない細胞のＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰのレベルと比較した、作用因子に曝露された細胞のＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰのレベルにおける差は、統計的に有意である。統計的に有意であるということは、変化が、単なる偶然で起こると予想され得る変化よりも大きいことを意味する。有意差は、適切な統計検定を使用することによって特定され得る。統計的有意性の検定は、当技術分野において周知であり、Ｐｅｔｒｕｃｃｅｌｌｉ、ＣｈｅｎおよびＮａｎｄｒａｍによるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ、１９９９年、再版に例示されている。
【００６０】
本明細書に使用される用語「ＢＨ３プロファイリング緩衝液」は、糖、ｐＨ緩衝剤、塩、キレート剤およびＭＯＭＰの測定を行うために有用な電子伝達鎖のための炭素源を含む水溶液を指す。
【００６１】
アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ＢＨ３タンパク質およびペプチドには、Ｂｃｌ−２相互作用性細胞死媒介因子（ＢＩＭ）；その変異体（ＢＩＭ  ＡＶ）；ＢＨ３相互作用性ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ）；Ｂｃｌ−２関連死プロモーター（ＢＡＤ）；ＮＯＸＡ；アポトーシスのｐ５３アップレギュレーション型モジュレーター（ＰＵＭＡ）；Ｂｃｌ−２改変因子（ＢＭＦ）およびハラキリ（ｈａｒａｋｉｒｉ）（ＨＲＫ）が含まれる（表１参照）。
【００６２】
一部の実施形態では、方法は、ＢＨ３ドメインペプチドとの接触の後、前、または同時に細胞を透過化するステップを含む。一般的に、透過化は、ミトコンドリア外膜を透過化することなしに細胞膜が透過性になるように、細胞を試薬で処理する工程を指す。透過化のために使用される試薬には、有機溶媒（例えば、アセトンおよびメタノール）および洗剤（例えば、ジギトニン、サポニン、トリトンＸ−１００およびＴｗｅｅｎ−２０）が含まれる。任意の特定の理論に縛られることを望むわけではないが、細胞は、ミトコンドリアへのＢＨ３ペプチドの接近を可能にするように透過化される。細胞は、当技術分野において公知の方法によって透過化される。例えば、細胞は、細胞をジギトニン、サポニン、メタノール、トリトンＸ−１００または当技術分野において認知されている他の細胞透過化剤と接触させることによって透過化される。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、ジギトニンまたはサポニンなどの透過化試薬を含む。
【００６３】
一部の実施形態では、透過化された細胞は、アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと３時間もしくはそれ未満、２時間もしくはそれ未満、または１時間もしくはそれ未満接触する。
【００６４】
当業者は、細胞を作用因子、ＢＨ３プロファイリング緩衝液および／またはＢＨ３ドメインペプチドと接触させるためのいくつかの方法を認識している。例えば、高スループット薬物スクリーニングのために、一般的に自動液体取り扱いシステムが利用される。自動液体取り扱いシステムは、アッセイプレートのウェルに一定体積の液体を分配するために、ロボットアームによって制御される液体分注容器のアレイを利用する。一般的に、アレイは、９６、３８４または１５３６個の液体分注チップを含む。自動液体取り扱いシステムの非限定的な例には、デジタル分注器（例えば、ＨＰ  Ｄ３００デジタル分注器）およびピンニングマシン（ｐｉｎｎｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ）（例えば、ＭＵＬＴＩ−ＢＬＯＴ（商標）Ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＣｙＢｉｏ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｊａｎｕｓ）が含まれる。本開示により非自動化方法も企図されており、それには、非限定的に、手動デジタル式繰り返しマルチチャンネルピペットが含まれる。
【００６５】
細胞をＢＨ３ドメインペプチドで処理した後、ＭＯＭＰが測定される。外膜の透過化はいくつかの方式で測定することができる。例えば、外膜の透過化は、ミトコンドリア膜電位の消失を決定することによって測定することができる。ミトコンドリア膜電位の消失は、例えば電位差測定用色素または放射測定用色素（ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｙｅ）で細胞を処理することによって測定される。電位差測定用色素の例には、非限定的に、蛍光ＪＣ−１プローブ（５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド）もしくはジヒドロローダミン１２３、またはテトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）もしくはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）が含まれる。これらおよび他の電位差測定用色素は、当技術分野において周知である。
【００６６】
あるいは、外膜の透過化は、ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定することによって、またはミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定することによって決定される。ミトコンドリア膜間腔からの分子の例には、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）が含まれる。ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出または保留は、当技術分野において周知の方法によって測定することができる。例えば、分子の放出または保留は、分子に対する抗体、すなわち、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２またはアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）に対する抗体を使用することによって測定することができる。検出は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、免疫ブロット、免疫蛍光法、免疫組織化学法、プレート蛍光定量法、蛍光イメージングまたは自動画像解析による可能性がある。細胞の分析は、顕微鏡を使用して手動で、または例えば核の位置を特定するためにＣｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒなどのソフトウェアを使用することによって自動で成し遂げることができる。
【００６７】
外膜の透過化を測定する前に、任意選択で、細胞は固定される。細胞は、アルデヒド（例えばホルムアルデヒド）またはメタノールを使用することによってなどの、当技術分野において公知の方法によって固定される。
【００６８】
ミトコンドリア外膜の透過化は、単一細胞レベルまたは多細胞レベルで測定することができる。追加的に、本明細書に開示の方法の一部は、細胞の亜集団をアッセイすることを可能にする。例えば、腫瘍特異的マーカーまたは腫瘍関連マーカー（例えばＥｐＣａｍ）を使用して腫瘍細胞を特定することができる。これは、正常細胞と腫瘍細胞とを識別できるようにする。次に、腫瘍細胞においてＭＯＭＰが本明細書に記載のように測定される。
【００６９】
有利には、ＭＯＭＰの測定（例えば、ミトコンドリア膜電位の測定、ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出の測定、ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留の測定）を規準化して比較評価を容易にすることができる。例えば、本明細書に提供される方法の一部の態様は、複数の作用因子のそれぞれについて細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰを決定することによって毒性を決定するために複数の作用因子をスクリーニングすることに関する。本明細書に記載のように、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰは当技術分野において公知の方法によって測定することができる。測定されたＢＨ３ペプチド誘導型ＭＯＭＰの規準化は、Ｒｙａｎ，  Ｊ．、Ｌｅｔａｉ，  Ａ．（２０１３年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６１巻（２号）：１５６〜１６４頁およびＦｒｉｅｄｍａｎ，  Ａ．、Ｌｅｔａｉ，  Ａ．、Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｄ．、Ｆｌａｈｅｒｔｙ，  Ｋ．（２０１５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １５巻：７４７〜７５６頁に記載されているような、当技術分野において公知の方法によって行うことができ、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により組み込まれている。
【００７０】
以下は、例示的で非限定的な、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの測定を規準化する方法である。細胞の試料の試験アリコートを作用因子と接触させる。試験アリコートをアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させる。これらの「処理」細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰを本明細書に記載のように、および当技術分野において公知の方法によって（例えば、ミトコンドリアの膜分極を測定することによって、ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定することによって、またはミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定することによって）測定する。細胞の試料の別個のアリコートである対照アリコートは、作用因子と接触させない。対照アリコートをアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させる。これらの「未処理」細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰを本明細書に記載のように、および当技術分野において公知の方法によって測定する。一部の実施形態では、細胞の所与の試料におけるＭＯＭＰの測定値についての最大範囲を測定することによって、「処理」細胞および「未処理」細胞において測定されたＭＯＭＰを比較することができる。ＭＯＭＰの測定値についての最大範囲は、ＭＯＭＰについての「上限」値およびＭＯＭＰについての「下限」値を測定することによって決定することができる。例えば、ＭＯＭＰの測定値についての「上限」値は、細胞の試料の別個のアリコートを細胞に有毒であることが公知の分子と接触させること、およびＭＯＭＰの値を測定することによって得ることができる。一部の実施形態では、細胞に有毒であることが公知の分子は、カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）またはカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラジン（ＣＣＣＰ）などの脱共役剤である。ＭＯＭＰの測定値についての「下限」値は、作用因子、アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチド、または細胞に有毒であることが公知の分子と接触していない細胞の別個のアリコートにおけるＭＯＭＰの値を測定することによって得ることができる。ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値は、式：
【化１】
2018520638.tif 000003
［式中、「％ＭＯＭＰ」は、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を表し；「試料」は、試験アリコートにおいて測定されたＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの値または対照アリコートにおいて測定されたＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの値のいずれかを表し；「上限」は、ＭＯＭＰについて測定された「上限」値を表し；「下限」は、ＭＯＭＰについて測定された「下限」値を表す］を使用して試験アリコートおよび対照アリコートについて計算することができる。
【００７１】
一部の態様では、本明細書に提供される方法は、細胞の試料における作用因子の毒性を決定することに関する。一部の実施形態では、作用因子の毒性は、デルタパーセントプライミングの値を決定することによって決定することができる。本明細書に使用される「デルタパーセントプライミング」は、作用因子が細胞をアポトーシスの閾値により近づける程度を指す。一部の実施形態では、ＭＯＭＰの規準化値（例えば、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセント、または「％ＭＯＭＰ」）は、デルタパーセントプライミングの値を決定するために使用される。そのような実施形態では、デルタパーセントプライミングの値は、式：
デルタパーセントプライミング＝（％ＭＯＭＰＴＥＳＴ）−（％ＭＯＭＰＣＯＮＴＲＯＬ）
［式中、「％ＭＯＭＰＴＥＳＴ」は、試験アリコート（作用因子と接触した細胞）において決定されたＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を表し；「％ＭＯＭＰＣＯＮＴＲＯＬ」は、対照アリコート（作用因子と接触しなかった細胞）において決定されたＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を表す］を使用して計算することができる。
【００７２】
デルタパーセントプライミングの値を決定することは、細胞の所与の試料における特定の作用因子に起因する毒性の評価を提供することができる。本明細書に記載するように、作用因子と接触した細胞のデルタパーセントプライミングの値が大きいほど、細胞に対する作用因子の毒性は大きい。したがって、一部の実施形態では、各作用因子について決定されたデルタパーセントプライミングの値を比較することによって、細胞の試料における第１の作用因子の毒性を、細胞の試料における第２の作用因子の毒性と比較することができる。そのような方法は、医師が望む転帰に応じて、細胞の所与の試料に対して毒性がより高いまたは細胞の所与の試料に対して毒性がより低い作用因子についてスクリーニングするために有用であり得る。
【００７３】
さらに他の態様では、本明細書において提供される方法は、複数の細胞試料のそれぞれにおける作用因子の毒性を決定することに関する。したがって、一部の実施形態では、細胞試料のそれぞれにおける作用因子について決定されたデルタパーセントプライミングの値を比較することによって、第１の細胞試料における作用因子の毒性を第２の細胞試料における作用因子の毒性と比較することができる。そのような方法は、異なる細胞型（例えば、異なる組織型から得られた細胞）にわたり所与の作用因子の毒性を評価するために有用であり得る。
【００７４】
一部の態様では、本開示は、非がん性である細胞の試料に対する作用因子の毒性を決定するための方法を提供する。一部の実施形態では、２０％を超えるデルタパーセントプライミングは、作用因子が非がん性細胞に対して有毒であることを示す。一部の実施形態では、０％を超えるデルタパーセントプライミングは、作用因子が非がん性細胞に対して有毒であることを示す。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、非がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングが２０％またはそれ未満であるならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。例えば、非がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングが２０％もしくはそれ未満、１８％もしくはそれ未満、１６％もしくはそれ未満、１４％もしくはそれ未満、１２％もしくはそれ未満、１０％もしくはそれ未満、８％もしくはそれ未満、６％もしくはそれ未満、５％もしくはそれ未満、４％もしくはそれ未満、３％もしくはそれ未満、２％もしくはそれ未満、１％もしくはそれ未満、０．９％もしくはそれ未満、０．８％もしくはそれ未満、０．７％もしくはそれ未満、０．６％もしくはそれ未満、０．５％もしくはそれ未満、０．４％もしくはそれ未満、０．３％もしくはそれ未満、０．２％もしくはそれ未満、０．１％もしくはそれ未満、または０％ならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験が行われる。
【００７５】
本明細書に記載されるように、本開示の態様は、非がん性細胞の試料における作用因子の毒性を決定することに関する方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、がん性細胞の試料における作用因子の毒性を決定することに関するステップをさらに含むことができる。一部の実施形態では、がん性細胞における作用因子の毒性は、本明細書に提供される方法を使用して、例えばデルタパーセントプライミングの値を決定することによって評価することができる。一部の実施形態では、２０％を超えるデルタパーセントプライミングは、作用因子ががん性細胞に対して有毒であることを示す。一部の実施形態では、０％を超えるデルタパーセントプライミングは、作用因子ががん性細胞に対して有毒であることを示す。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングが２０％を超えるならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。例えば、がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングが２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える、３５％を超える、４０％を超える、４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９８％を超える、９９％を超える、または１００％ならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験が行われる。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、非がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングががん性細胞におけるデルタパーセントプライミングよりも低いならば、作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む。
【００７６】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験は、本明細書に提供される方法および作用因子の毒性を決定することに関する当技術分野において公知の方法を含むことができることを認識されたい。例えば、本開示のある特定の態様は、非がん性細胞の試料における毒性を決定するために複数の作用因子をスクリーニングすることに関する。一部の実施形態では、作用因子が非がん性細胞に対して有毒であると決定されないならば、さらなる毒性試験（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験）のために作用因子を選択することができる。そのような実施形態では、細胞の異なる試料（例えば、がん性細胞、異なる種類の組織から得られた細胞、異なる被験体から得られた細胞）における作用因子の毒性を決定することを含むさらなる試験を行うことが有用であり得る。一部の実施形態では、被験体における作用因子の毒性を（例えば、被験体に作用因子を投与することによって、作用因子を、被験体から得られた細胞の試料と接触させることによって）決定することを含むさらなる試験を行うことが有用であり得る。
【００７７】
当業者は、本開示の態様が治療目的の作用因子の最適化に有用であり得ることを認識している。例えば、一部の実施形態では、がん性細胞および非がん性細胞の両方に対する作用因子の毒性を決定する方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、作用因子（例えば治療剤、がん治療薬）が非がん性（例えば健康な）細胞に最小の毒性を有し、がん性細胞に最大の毒性を有することが有利であることを認識されたい。本明細書に記載のように、そのような作用因子は、非がん性細胞においてデルタパーセントプライミングの最小値を有し、がん性細胞においてデルタパーセントプライミングの最大値を有するように現れる。
【００７８】
一部の態様では、本開示は創薬に関する。一部の実施形態では、本開示によって記載される方法は、細胞をプログラム細胞死により近づけない新薬、例えば細胞に対して有毒ではない作用因子を特定するために候補作用因子の大型ライブラリーをスクリーニングするために有用である。一部の実施形態では、候補作用因子のライブラリーは、２０種もしくはそれ超、３０種もしくはそれ超、４０種もしくはそれ超、５０種もしくはそれ超、６０種もしくはそれ超、７０種もしくはそれ超、８０種もしくはそれ超、９０種もしくはそれ超、１００種もしくはそれ超、１５０種もしくはそれ超、２００種もしくはそれ超、２５０種もしくはそれ超、または３００種もしくはそれ超の作用因子を含む。
【００７９】
一部の実施形態では、作用因子は化合物を含む。一部の実施形態では、作用因子は、１種を超える化合物を含む。例示的な候補作用因子には、非限定的に、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、ならびにそれらの組合せおよびプロドラッグが含まれる。一部の実施形態では、作用因子は、化学療法剤などの抗がん剤である。さらなる例示的な候補作用因子には、非限定的に、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、およびエアロゾルが含まれる。
【００８０】
一部の実施形態では、候補作用因子は化学療法剤である。化学療法剤の非限定的な例には、小型分子、ペプチドまたはタンパク質（例えば、ペプチド抗生物質および抗体）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子が含まれる。小型分子化学療法剤の例には、アルキル化剤（シクロホスファミド、クロルメチン、テモゾロミド）、アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ボリノスタット、ロミデプシン）、トポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害剤（イリノテカン、トポテカン、エトポシド）、キナーゼ阻害剤（ゲフィチニブ、イマチニブ、ボルテゾミブ）、ヌクレオチド類似体および前駆体類似体（アザシチジン、フルオロウラシル、メトトレキセート）、白金系薬剤（シスプラチン、カルボプラチン）、レチノイド（アリトレチノイン、ベキサロテン）ならびにビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）が含まれる。ペプチドおよびタンパク質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、抗腫瘍抗体（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、ブレンツキシマブ）が含まれる。当業者は、がんに関係する遺伝子の発現を標的化するＲＮＡｉ分子としての化学療法ＲＮＡｉ分子を認識している。例えば、ＨｏｘＡ１に対するＲＮＡｉ分子は、Ｂｒｏｃｋら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ６巻２１７ｒａ２頁（２０１４年）によって開示されたように、乳腺腫瘍細胞の形成を阻害することができる。一部の実施形態では、化学療法剤には、非限定的に、キナーゼ阻害剤、アポトーシス誘導因子、血管新生阻害剤、およびモノクローナル抗体が含まれる。
【００８１】
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、環境または環境条件の毒性を決定するために有用であり得る。例えば、一部の実施形態では、環境は、細胞に有毒である可能性があるかまたは有毒ではない可能性がある作用因子を含む。一部の実施形態では、環境または環境条件における作用因子には、非限定的に、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、およびエアロゾルが含まれる可能性がある。環境作用因子は、例えば、国立環境衛生科学研究所（ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｅａｌｔｈ／ｔｏｐｉｃｓ／ａｇｅｎｔｓ／）によって提供されるように、当技術分野において公知である。そのような実施形態では、当技術分野において公知のおよび本明細書に記載の様々な方法を使用して細胞を作用因子と接触させることができることを認識されたい。例えば、放射性であることが疑われるまたは放射性であることが分かっている環境に細胞を曝露することができる。そのような実施形態では、毒性について試験される作用因子は、放射線（例えば、アルファ粒子、ベータ粒子、陽電子粒子、ガンマ線、Ｘ線、およびニュートロン）を含み得る。
【００８２】
一部の態様では、本開示は、個別化医療に関する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、化学療法レジメンのカスタマイズに有用である。例えば、本明細書に提供される方法は、非がん性細胞およびがん性細胞の両方における作用因子の毒性を決定することに関する可能性がある。一部の実施形態では、非がん性細胞およびがん性細胞は、被験体から得られる。被験体からの非がん性細胞（例えば、正常細胞、健康な細胞）における作用因子の毒性を決定し、被験体からのがん性細胞における作用因子の毒性を決定することによって、作用因子を、被験体を処置するためにより適切であるまたはより適切ではないと特定することができる。本明細書に記載のように、がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングの非がん性細胞におけるデルタパーセントプライミングに対する比が増加するほど、作用因子は、被験体を処置するためにより適切になる。例えば、がんを有することが分かっているまたは有する疑いがある被験体を処置するために適切な作用因子を決定する上で、患者の非がん性細胞において最小の毒性（例えば、デルタパーセントプライミングの最小値）を有し、患者のがん性細胞において最大の毒性（例えば、デルタパーセントプライミングの最大値）を有する作用因子を使用することが好ましい。そのような作用因子は、不利な末梢効果を最小化する一方で処置を意図した細胞を選択的に標的化する。
【００８３】
一部の態様では、本開示は、作用因子の毒性を決定する方法であって、作用因子の毒性が、作用因子と接触した試験細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰを、作用因子と接触しなかった対照細胞に対するＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰと比較することによって決定される方法を提供する。一部の実施形態では、対照細胞は、いかなる作用因子とも接触していない。一部の実施形態では、対照細胞は、緩衝液または溶媒、例えば、作用因子のためのビヒクルとして使用される緩衝液または溶媒と接触している。例えば、試験細胞を、適切な緩衝液または溶媒（例えばＤＭＳＯ）中に溶解された作用因子と接触させることができ、対照を、作用因子を欠如する適切な緩衝液または溶媒（例えばＤＭＳＯ）と接触させることができる。
【００８４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、高スループット形式に適切であり得る。例えば、本開示の態様は、毒性を決定するための複数の作用因子のスクリーニングする方法に関する。そのような方法では、マルチウェルプレートを利用することが望ましい可能性がある。一部の実施形態では、プレートは作用因子を含む。一部の実施形態では、プレートは複数の作用因子を含む。例えば、各ウェルが作用因子を含む作用因子のパネルを試験するためにプレートが使用され得る。一部の実施形態では、プレートの１つまたは複数のウェルは、作用因子を含まない。例えば、本明細書に記載のように、対照アリコートは作用因子と接触していない。一部の実施形態では、対照アリコート用に指定された１つまたは複数のウェルは、緩衝液または溶媒（例えばＤＭＳＯ）を含み得る。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、ＢＨ３ドメインペプチドを含む。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１〜１５からなる群より選択される。一部の実施形態では、プレートは、１種超のＢＨ３ドメインペプチドを含む。例えば、一部の実施形態では、プレートは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種のＢＨ３ドメインペプチドを含む。一部の実施形態では、プレートの１つまたは複数のウェルは、ＢＨ３ドメインペプチドを含まない。例えば、本明細書に記載のように、ＭＯＭＰ測定のための下限を確立することが望ましい場合がある。そのような実施形態では、アリコートは、ＢＨ３ドメインペプチドと接触していない。一部の実施形態では、下限の測定用に指定された１つまたは複数のウェルは、緩衝液または溶媒（例えばＤＭＳＯ）を含み得る。
【００８５】
本明細書に記載のダイナミックＢＨ３プロファイリングを行うために細胞を培養プレートから取り出す必要がないことが認識される。細胞培養培地および血清の存在は、ＢＨ３ペプチドがミトコンドリア外膜透過化を誘導する能力を妨害しないことが実証されている。さらに、細胞より上にほとんど残留体積がない洗浄ステップは不必要であることが実証されている。その代わりに、プレートのウェル中で薬物およびＢＨ３ドメインペプチドを用いて細胞を逐次的に処理することができる。提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、細胞は、接着性固体表面上にて、血清を有する培養培地中で、作用因子の存在下および非存在下において培養される。提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、細胞をＢＨ３プロファイリング緩衝液およびアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させる前に細胞から培養培地を洗浄することをさらに含む。
【００８６】
提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、接着性固体表面は、１種または複数の接着促進化合物でコーティングされている。提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、１種または複数の接着促進化合物は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質である。提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、ＥＣＭタンパク質は、コラーゲン１、ラミニン、コラーゲン４およびフィブロネクチンからなる群より選択される。一部の実施形態では、１種または複数の接着促進化合物は抗体である。一部の実施形態では、１種または複数の接着促進化合物はストレプトアビジンである。
【００８７】
提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、トレハロース由来実験緩衝液（ＤＴＥＢ）またはミトコンドリア実験緩衝液（ＭＥＢ）である。提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、細胞は、ＢＨ３ドメインペプチドとの接触の後、前、または同時に透過化される。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液に、透過化剤が補充される。一部の実施形態では、透過化剤はジギトニンまたはサポニンである。
【００８８】
本明細書に使用される用語「ＢＨ３プロファイリング緩衝液」は、糖、ｐＨ緩衝剤、塩、キレート剤およびＭＯＭＰの測定を行うために有用な電子伝達鎖のための炭素源を含む水溶液を指す。提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、トレハロース由来実験緩衝液（ＤＴＥＢ）である。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液はミトコンドリア実験緩衝液（ＭＥＢ）である。ＤＴＥＢは、１３５ｍＭトレハロース、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０μＭ  ＥＧＴＡ、２０μＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡおよび５ｍＭスクシネートから構成される。ＭＥＢは、１５０ｍＭマンニトール、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０μＭ  ＥＧＴＡ、２０μＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡおよび５ｍＭスクシネートから構成される。マンニトールの代わりにスクロースおよび他の糖が使用される場合がある。ＫＣｌのいくらかの増加は許容されるが、ＢＨ３プロファイリングに有害な可能性がある。濃縮緩衝液（２×〜５×）は、上記試薬の濃度を比例的に増加させることを必要とする。
【００８９】
提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、２×、３×または４×の濃度で添加される。提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、２×の濃度で添加され、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量は顕微鏡法によって測定される。提供された方法のいずれかの一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、３×または４×の濃度で添加され、ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定される。
【００９０】
当業者は、培養細胞に作用因子、ＢＨ３プロファイリング緩衝液および／またはＢＨ３ドメインペプチドを添加するためのいくつかの方法を認識している。例えば、高スループット薬物スクリーニングのために、一般的に自動液体取り扱いシステムが利用される。自動液体取り扱いシステムは、アッセイプレートのウェルに一定体積の液体を分配するために、ロボットアームによって制御される液体分注容器のアレイを利用する。一般的に、アレイは、９６、３８４または１５３６個の液体分注チップを含む。自動液体取り扱いシステムの非限定的な例には、デジタル分注器（例えば、ＨＰ  Ｄ３００デジタル分注器）およびピンニングマシン（例えば、ＭＵＬＴＩ−ＢＬＯＴ（商標）Ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＣｙＢｉｏ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｊａｎｕｓ）が含まれる。本開示により非自動化方法も企図されており、それには、非限定的に、手動デジタル式繰り返しマルチチャンネルピペットが含まれる。
【００９１】
アポトーシス促進性ＢＣＬ−２  ＢＨ３ドメインペプチド
アポトーシス促進性ＢＣＬ−２  ＢＨ３ドメインペプチドは、以前にＷＯ２０１４／０４７，３４２に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。特に、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２  ＢＨ３ドメインペプチドは、１９５アミノ酸長未満、例えば、１５０、１００、７５、５０、３５、２５または１５アミノ酸長未満またはそれと等しい。アポトーシス促進性ＢＣＬ−２  ＢＨ３ペプチドの非限定的な例には、Ｂｃｌ−２相互作用性細胞死媒介因子（ＢＩＭ）；その変異体（ＢＩＭ  ＡＶ）；ＢＨ３相互作用性ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ）；Ｂｃｌ−２関連死プロモーター（ＢＡＤ）；ＮＯＸＡ；アポトーシスのｐ５３アップレギュレーション型モジュレーター（ＰＵＭＡ）；Ｂｃｌ−２改変因子（ＢＭＦ）およびハラキリ（ＨＲＫ）が含まれる。
【００９２】
一部の実施形態では、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２  ＢＨ３ドメインペプチドは、表１に示される配列番号１〜１５の配列を含む。ＰＵＭＡ２Ａ（配列番号１６）は、陰性対照ペプチドである。
【表１】
2018520638.tif 000004
【００９３】
一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列ＮＨ２−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＬＸＸＸＸＤＸＸＸＸ−ＣＯＯＨ（配列番号１７）を（全体的または部分的に）含むペプチドを含む。本明細書に使用されるＸは、任意のアミノ酸であり得る。あるいは、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１７の少なくとも５、６、７、８、９、１５個またはそれを超えるアミノ酸を含む。
【００９４】
ＢＨ３ドメインペプチドは、標準的な改変を使用して改変することができる。改変は、アミノ（Ｎ−）末端、カルボキシ（Ｃ−）末端、内部、または前述のいずれかの組合せで起こり得る。本明細書に記載の一態様では、ポリペプチドに１種類を超える改変があり得る。改変には、非限定的に、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化、スルフリル化および環化（ジスルフィド架橋またはアミド環化を介する）、ならびにＣｙｓ３またはＣｙｓ５による改変が含まれる。改変されたＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＨ３ドメインペプチドの生物学的活性を保持する。生物学的活性を保持することにより、必ずしも天然に存在するＢＨ３ドメインポリペプチドと同じレベルの効力ではないにしろ、ＢＨ３ポリペプチドによって細胞死が誘導されることを意味する。誘導されるおよび刺激されるという用語は、本明細書全体にわたり互換的に使用される。
【００９５】
任意選択で、ＢＨ３ドメインペプチドは、形質導入ドメインに付着される。形質導入ドメインは、それが存在するペプチドを所望の細胞の目的地に方向付ける。したがって、形質導入ドメインは、ペプチドが形質膜を横切るように、例えば細胞外から形質膜を通過して細胞質に入るように方向付けることができる。代替的または追加的に、形質導入ドメインは、ペプチドを細胞内の所望の位置、例えば核、リボソーム、ＥＲ、ミトコンドリア、リソソーム、またはペルオキシソームに方向付けることができる。一部の実施形態では、形質導入ドメインは、公知の膜トランスロケーション配列に由来する。あるいは、形質導入ドメインは、ポリエチレングリコール、コレステロール部分、オクタン酸およびデカン酸などの、膜取込みを促進することが公知の化合物である。形質導入ドメインは、ＢＨ３ドメインペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結される場合がある。
【００９６】
ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または両方の組合せのポリマーであり得る。あるいは、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、環状ペプチドである。環状ペプチドは、当技術分野において公知の方法によって調製される。例えば大環状化は、多くの場合にペプチドＮ末端とＣ末端との間、側鎖とＮ末端もしくはＣ末端との間［例えば、ｐＨ８．５でＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を用いる］（Ｓａｍｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３７巻：５１８２〜５１８５頁（１９９６年））、または２つのアミノ酸側鎖の間にアミド結合を形成することによって成し遂げられる。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ、３９巻：５１〜１２４頁（１９８８年）を参照されたい。
【００９７】
ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、現代のクローニング技法を使用して調製される、または固体法もしくは部位特異的変異誘発によって合成され得る。一部の実施形態では、ネイティブなＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、標準的なタンパク質精製技法を使用した適切な精製スキームによって細胞または組織供給源から単離することができる。別の実施形態では、ＢＨ３ドメインポリペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、組換えＤＮＡ技法によって産生される。組換え発現の代わりに、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、標準的なペプチド合成技法を使用して化学合成することができる。
【００９８】
様々な実施形態では、ＢＨ３ペプチドは、その二次構造、例えばα−ヘリックス構造を維持する。ヘリックスの安定化方法は、当技術分野において公知である。
【００９９】
「単離された」または「精製された」ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＨ３ドメインペプチドが由来する細胞もしくは組織供給源からの細胞物質もしくは他の混入タンパク質を実質的に含まない、または化学合成された場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
【０１００】
キット
本発明の一部の態様は、ＢＨ３プロファイリングを行うためのキットを含む。一部の実施形態では、キットは、作用因子およびＢＨ３ドメインペプチドを有するマルチウェルプレートを含む。一部の実施形態では、キットは、作用因子を有するマルチウェルプレートを含む。一部の実施形態では、作用因子は化学療法剤である。一部の実施形態では、キットは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種の作用因子を有するマルチウェルプレートを含む。一部の実施形態では、キットは、各ウェルが異なる作用因子を含むマルチウェルプレートを含む。一部の実施形態では、キットは、ＢＨ３ドメインペプチドを有するマルチウェルプレートを含む。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する。一部の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１〜１５からなる群より選択される。
【０１０１】
一部の態様では、キットは、ＢＨ３プロファイリング緩衝液を収容するバイアルをさらに含む。一部の実施形態では、バイアルは、ガラスまたはプラスチック製バイアルである。一部の実施形態では、バイアルは、その表面に体積測定目盛を備える。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液に、透過化剤が補充される。一部の実施形態では、透過化剤はジギトニンまたはサポニンである。
【０１０２】
一部の実施形態では、キットは、電位差測定用色素をさらに含む。一部の実施形態では、電位差測定用色素は、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である。あるいは、一部の実施形態では、キットは、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２またはアポトーシス誘導因子に対する抗体をさらに含む。
【０１０３】
一部の態様では、キットは、作用因子に対する細胞の感受性を予測するためにキットを使用するための指示をさらに含む。指示は、一般的に印刷されたパンフレットまたは紙シートとして提供されるが、指示がキットに付随すべきものであることを使用者が明らかに認識するように提供された任意の口述または電子的な指示、例えば、オーディオビジュアル（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはウェブベースの通信なども含み得る。
【０１０４】
以下の非限定的な実施例で本発明をさらに例証する。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１：ダイナミックＢＨ３プロファイリングを用いて正常細胞における毒性を予測する）
正常組織に対する作用因子の毒性を予測する大きな必要がある。薬物開発の場合、これは一番はっきりしている。前臨床毒性は、高価であり、信頼できないおそれがある哺乳動物での試験に大きく依存している。ヒト組織を含めた動物由来の正常組織に対するダイナミックＢＨ３プロファイリングを使用した試験は、費用および信頼性に関する懸念を軽減することができよう。概念は、目的の作用因子への正常細胞の曝露後、短い時点での死滅シグナル伝達の誘発を測定することを含む。正常細胞のアレイを使用して、死滅シグナル伝達の測定は、潜在的毒性に関するフラグであると解釈され得る。
【０１０６】
健康なヒト包皮線維芽（ＨＦＦ）細胞に関するＢＨ３プロファイリングを示すために、合成ＢＨ３ペプチドに応答したミトコンドリアからのチトクロームｃの消失を測定した。これを行うために、濃度を増加させた合成Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチドでチトクロームｃの免疫蛍光を評価した（図１Ａ〜Ｄ）。濃度を増加させた合成Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチドについてのチトクロームｃ消失の例示的な用量応答曲線を図１Ｅに示す（標準偏差をエラーバーとして表す）。低濃度のＢｉｍペプチドでチトクロームｃの消失はほとんどまたは全くないが、一方、高いペプチド濃度でチトクロームｃの完全な消失が観察されることに留意されたい。
【０１０７】
次に、健康なヒト包皮線維芽細胞におけるＢＨ３プロファイルの薬物誘導型変化を検討した。健康なＨＦＦを約２４００種の異なる薬物化合物のライブラリーまたはＤＭＳＯ（実験対照として使用した不活性化学物質）で２０時間処理後、細胞死感受性の増加をＢＨ３プロファイリングによって決定した。具体的には、アポトーシス感受性（デルタプライミング）を増加させる化合物は、チトクロームｃの消失を加速させる化合物である（図２）。図２Ａに、デルタパーセントプライミングの値によって表される細胞死感受性における増加（デルタプライミング）の例示的なヒストグラムを示し、図２Ｂにヒストグラムのｙ軸（ライブラリーに占める化合物のパーセンテージ）の拡大図を示す。薬物で処理された健康なＨＦＦ細胞が、ＤＭＳＯ（不活性化学物質）で処理された健康な細胞と比較して、試験された化合物の約２．４１％で細胞死感受性の増加を示すことに留意されたい。これは、効果を有さない対照化合物と比べて、健康な細胞における細胞死感受性を増加させる分子を確実に検出することができることを示している。
【０１０８】
マウス乳腺腫瘍細胞を使用して、図２に例示される実験を繰り返した。マウス乳腺腫瘍細胞（ｙ軸）と健康なヒト包皮線維芽細胞（ｘ軸）との間のＢＨ３プロファイルにおける薬物誘導型変化の比較を図３に示す。増加した細胞死感受性に対する約２４００種の化合物の効果を比較したとき、健康な細胞ではなく腫瘍を死滅に向けて感作する数種の化合物があることが見出された（網がけした領域）。逆に、数種の化合物は、健康なＨＦＦ細胞およびマウス乳腺腫瘍細胞の両方をアポトーシスに向けて感作するように見える。これらの後者の化合物は、腫瘍および健康な細胞の両方に概して毒性効果を有し、ほとんど治療的価値を有さない可能性がある化合物である。しかし、前者の化合物（網がけした領域）は、デルタプライミングがｙ軸に沿って増加するときに健康な細胞よりも腫瘍細胞においてアポトーシスを優先的に標的化する化合物である。
【０１０９】
合成ＢＨ３ペプチドに応答したミトコンドリアからのチトクロームｃの消失を測定することによって、健康な成体マウス肝細胞に関するＢＨ３プロファイリングを検討した。これを行うために、濃度を増加させたＢｉｍ  ＢＨ３ペプチドでチトクロームｃの免疫蛍光を評価した（０．１μＭ（図４Ａ）、１．５６μＭ（図４Ｂ）、２５μＭ（図４Ｃ）、および１００μＭ（図４Ｄ））。チトクロームｃ消失の用量応答曲線を図４Ｅに示す。低濃度のＢｉｍペプチドでチトクロームｃの消失はほとんどまたは全くないが、一方、高いペプチド濃度でチトクロームｃの完全な消失が観察されることに留意されたい。
【０１１０】
次に、成体マウス肝細胞における薬物誘導型細胞死感受性の増加の程度を評価するために様々な薬物化合物を試験した。新鮮単離された成体マウス肝細胞を異なる薬物で２０時間処理し、続いて単一濃度の合成Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチドによって誘導されたチトクロームｃの消失を免疫蛍光法によって評価した（図５Ａ〜Ｄ）。細胞死感受性の増加は、アポトーシス感受性の増加（デルタプライミング、図５Ｅ）として定量されるチトクロームｃの消失によって示される。ナビトクラックス、ドキソルビシン、およびタネスピマイシンは、全てアポトーシス感受性を増加させる。
【０１１１】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に説明したが、前述の説明は本発明の範囲を限定することでなく、例証することを意図するものであり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
2018520638000001.app
【国際調査報告】
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2018520638.tif 000014
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