(57)【要約】本発明の方法は、生物学的試料における結合組織増殖因子（CTGF）の発現レベルを検出することによって、個体が情動障害またはその発症リスクを有するか否かを決定するために有用である。本発明の方法は、CTGFの発現レベルまたは活性をモジュレートする（例えば、減少させる）化合物を同定するためにも有用である。本発明は、情動障害の治療のための、CTGFを標的とする治療法をさらに提供する。2018517418.tif 000014
2018517418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、個体が情動障害またはその発症リスクを有するか否かを決定する方法：
（a）該個体由来の生物学的試料における結合組織増殖因子（CTGF）の発現レベルを検出する工程；
（b）該生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベルを、CTGFの対照発現レベルと比較する工程；および
（c）該生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベルがCTGFの対照発現レベルと比較して増加しているとき、該個体が情動障害またはその発症リスクを有すると決定する工程。
【請求項２】
前記情動障害が、気分障害、不安、または不安症である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記気分障害が、大うつ病性障害または双極性障害である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記発現レベルが、CTGFのmRNAレベルである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料が、全血、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、羊水、乳頭吸引液、または組織試料である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記組織試料が、脳組織である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記対照発現レベルが、前記情動障害を有しない個体または個体の集団におけるCTGFの発現レベルである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベルが、CTGFの前記対照発現レベルと比較して約1倍〜約5倍高い、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的試料におけるCTGF経路メンバーの発現レベルを検出する工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記CTGF経路メンバーが、ECM2、EGR1、BCL2L2、IGFBP7、P4HA1、PDGFB、MAPKAPK5、MAPK8IP3、PKN1、PRKAG1、CREB1、RHOG、RHOA、SORL1、SOX4、STK3、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
治療的に有効な量のCTGF阻害剤を前記個体に投与する工程をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程を含む、情動障害を治療するための化合物を同定する方法：
（a）該化合物を結合組織増殖因子（CTGF）と接触させる工程；および
（b）該化合物がCTGFの発現レベルまたは活性を減少させるか否かを決定する工程であって、それによって情動障害を治療するための化合物が同定される、工程。
【請求項１３】
前記情動障害が、気分障害、不安、または不安症である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記気分障害が、大うつ病性障害または双極性障害である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、CTGFを発現する細胞と接触させられる、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
（c）前記化合物を動物モデルに投与する工程
をさらに含む、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
（d）前記動物モデルにおけるCTGFの発現レベルまたは活性に対する前記化合物の効果を決定する工程
をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
（d）前記動物モデルにおける前記化合物の抗うつ効果および/または抗不安効果を決定する工程
をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む、その必要のある個体において情動障害を治療する方法：
（a）請求項16〜18のいずれか一項記載の方法を使用して同定された化合物の治療的に有効な量を該個体に投与する工程。
【請求項２０】
前記情動障害が、気分障害、不安、または不安症である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記気分障害が、大うつ病性障害または双極性障害である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物が、静脈内に、頭蓋内に、脳室内に、くも膜下腔内に、脊髄内に、腹腔内に、筋肉内に、病巣内に、鼻腔内に、経口的に、または皮下に投与される、請求項19〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
以下の工程を含む、その必要のある個体において情動障害を治療する方法：
（a）治療的に有効な量の結合組織増殖因子（CTGF）阻害剤を該個体に投与する工程。
【請求項２４】
前記情動障害が、気分障害、不安、または不安症である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記気分障害が、大うつ病性障害または双極性障害である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記CTGF阻害剤が、抗体、干渉RNA、低分子化合物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項23〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、ヒト抗CTGFモノクローナル抗体、ヒト化抗CTGFモノクローナル抗体、もしくはキメラ抗CTGFモノクローナル抗体、またはそれらの抗原結合断片である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記ヒト抗CTGFモノクローナル抗体がFG-3019である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記CTGF阻害剤が、情動障害に関連するうつ病および/または不安の一つまたは複数の症状を実質的に軽減する、請求項23〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記CTGF阻害剤の治療的に有効な量が、前記個体においてうつ病を低減するため（抗うつ効果）に十分な量である、請求項23〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記CTGF阻害剤の治療的に有効な量が、個体において不安を低減するため（抗不安効果）に十分な量である、請求項23〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記CTGF阻害剤が、静脈内に、頭蓋内に、脳室内に、くも膜下腔内に、脊髄内に、腹腔内に、筋肉内に、病巣内に、鼻腔内に、経口的に、または皮下に投与される、請求項23〜31のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2015年6月15日に出願された米国仮出願第62/175,828号に基づく優先権を主張するものであり、その開示は、参照によって事実上その全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
精神医学的障害には、人間の行動、対人、および/または日常生活上の機能に干渉する精神的な障害または疾病が含まれる。American Psychiatric Associationによって発表されたDiagnostic and Statistical Manual（DSM）of Mental Disorders（非特許文献1）が、精神医学的障害を分類している。最新バージョンDSM-5（第5版）は、以下の精神障害のカテゴリをリストしている：適応障害；不安症；せん妄、認知症、健忘症、および他の認知障害；学習障害またはコミュニケーション症のような、一般的に、乳児期、小児期、または青年期に最初に診断される障害；解離症；摂食障害；作為症；衝動制御障害；全身的な医学的状態による精神障害；気分障害；臨床的に重要な他の状態；人格障害；統合失調症および他の精神病性障害；性障害および性同一性障害；睡眠障害；身体表現性障害；ならびに物質関連障害。http://www.dsm5.orgも参照すること。
【０００３】
大部分の精神医学的障害の正確な原因は不明である。精神医学的障害は、典型的には、遺伝的なまたは遺伝性の素因と誘発イベントとの組み合わせに起因すると、精神保健の専門家は考えている。誘発イベントには、環境要因、様々な種類のストレスが含まれ得、身体的な健康問題すら含まれ得る。精神医学的障害は、米国において極めて一般的である。実際、American Psychiatric Associationによると、米国人集団の5分の1が、毎年、何らかの種類の精神障害に罹患している。
【０００４】
現在、バイオマーカーの欠如ならびに診断および評価の無効性および信頼性が、精神医学的障害の治療についての重要な課題である。例えば、集団の約15％が大うつ病に罹患し、およそ1％が双極性障害に罹患している。しかしながら、これらの2種の障害を区別することは困難であるため、双極性障害患者の少なくとも10〜15％が大うつ病を有すると誤診されている。そのような誤診の結果には、気分安定薬による有効な処置の導入の遅延、および双極性障害のための特別なカウンセリングの要求または入手の遅延が含まれる。
【０００５】
薬物治療は、多様な精神医学的障害を治療するために広く使用されている。例えば、抗うつ薬は、臨床的うつ病を治療するためにも、不安およびその他の障害のためにも使用される。抗不安薬は、不安症、および不眠症のような関連問題のために使用される。気分安定薬は、主に、うつ病ではなく躁病を標的として、双極性障害において第一に使用される。抗精神病薬は、統合失調症のような精神病性障害のために使用される。刺激薬は、特に、注意欠陥多動障害（ADHD）のため、一般的に使用される。しかしながら、効力の不足、遅い作用発現、および副作用に関する懸念が、そのような薬物治療の使用に関連している。
【０００６】
従って、精神医学的障害、具体的には、気分障害のような情動障害（例えば、大うつ病）を正確に信頼性をもって診断するための改善された方法が、当技術分野において必要とされている。さらに、各種の異なる薬物治療の存在にも関わらず、精神医学的障害、具体的には、気分障害のような情動障害（例えば、大うつ病）およびそれらの症状を治療するための改善された薬物が、当技術分野において必要とされている。本発明は、これらの必要性を満たし、関連する利点も提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Diagnostic and Statistical Manual（DSM）of Mental Disorders
【発明の概要】
【０００８】
本発明の方法は、生物学的試料における結合組織増殖因子（CTGF）の発現レベルを検出することによって、個体が情動障害またはその発症リスクを有するか否かを決定するために有用である。本発明の方法は、CTGFの発現レベルまたは活性をモジュレートする（例えば、減少させる）化合物を同定するためにも有用である。本発明は、情動障害を治療するための、CTGFを標的とする治療法をさらに提供する。
【０００９】
一つの局面において、本発明は、
（a）個体由来の生物学的試料におけるCTGFの発現レベルを検出する工程；
（b）生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベルをCTGFの対照発現レベルと比較する工程；および
（c）生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベルがCTGFの対照発現レベルと比較して増加しているとき、個体が情動障害またはその発症リスクを有すると決定する工程
を含む、個体が情動障害またはその発症リスクを有するか否かを決定する方法を提供する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、
（a）化合物を結合組織増殖因子（CTGF）と接触させる工程；および
（b）化合物がCTGFの発現レベルまたは活性を減少させるか否かを決定する工程であって、それによって情動障害を治療するための化合物が同定される、工程
を含む、情動障害を治療するための化合物を同定する方法を提供する。
【００１１】
さらに別の局面において、本発明は、
（a）治療的に有効な量の結合組織増殖因子（CTGF）阻害剤を個体に投与する工程
を含む、その必要のある個体において情動障害を治療する方法を提供する。
【００１２】
本発明のその他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者に明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】抗CTGF抗体の急性投与の後に、強制水泳試験（FST）において、動物の全無動（immobile）時間％の有意な減少および全水泳（swimming）時間％の有意な増加が存在したことを示す図である。
【図２】抗CTGF抗体の慢性投与の後に、強制水泳試験（FST）において、全無動時間％の有意な減少および全よじ登り（climbing）時間％の有意な増加が存在したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
I.導入
本発明は、結合組織増殖因子（CTGF）が、大うつ病性障害（MDD）を有する個体の扁桃において、対照と比べて有意にアップレギュレートされているという発見に基づく。従って、本発明の方法は、個体から入手された生物学的試料におけるCTGFの発現レベルを検出することによって、個体が情動障害またはその発症リスクを有するか否かを決定するために有用である。
【００１５】
本発明は、抗CTGF抗体の投与が動物モデルにおけるうつ病様行動を減少させたという発見にも基づく。従って、本発明の方法は、MDDのような情動障害を治療するため、CTGFの発現または活性を標的とするためにも有用である。具体的な態様において、本明細書に記載された治療法は、MDDのような情動障害を有する個体において抗うつ効果を生じるための抗CTGF抗体治療を含む。
【００１６】
II.定義
「a」、「an」、または「the」という用語は、本明細書において使用されるように、一つのメンバーを含む局面のみならず、複数のメンバーを含む局面も含む。例えば、単数形「a」、「an」、および「the」には、前後関係が明白にそうでないことを指示しない限り、複数の指示物が含まれる。従って、例えば、「細胞（a cell）」との言及には、複数のそのような細胞が含まれ、「薬剤（an agent）」との言及には、当業者に公知の1種または複数種の薬剤への言及が含まれ、他も同様である。
【００１７】
「対象」、「患者」、または「個体」という用語は、ヒトまたは動物をさすために交換可能に本明細書において使用される。例えば、動物対象は、哺乳動物、霊長類（例えば、サル）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、もしくはヤギ）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、トリ）、獣医学的に重要な動物、または経済学的に重要な動物であり得る。
【００１８】
「結合組織増殖因子」または「CTGF」という用語は、細胞外マトリックス関連ヘパリン結合タンパク質のCCNファミリーのマトリックス細胞タンパク質をさす。CTGFは、細胞の接着、遊走、増殖、血管形成、骨格発達、および組織創傷修復を含む多くの生物学的過程において重要な役割を有しており、繊維症および癌のいくつかの型に重大に関与している。CTGFを含むCCNタンパク質ファミリーのメンバーは、構造的には、4個の保存されたシステインリッチドメインを有することを特徴とする。これらのドメインは、N末端からC末端へ、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）ドメイン、フォン・ヴィルブランドC型リピート（vWC）ドメイン、トロンボスポンジン1型リピート（TSR）ドメイン、およびシステインノットモチーフを含むC末端ドメインである。CTGFは、情況依存的に、インテグリン受容体、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）、LRP、およびTrkAを含む様々な細胞表面受容体に結合することによって、その機能を発揮する。さらに、CTGFは、増殖因子および細胞外マトリックスタンパク質に結合する。CTGFのN末端側の半分は、アグリカンと相互作用し、TSRドメインは、VEGFと相互作用し、C末端ドメインは、TGFβスーパーファミリーのメンバー、フィブロネクチン、パールカン、フィビュリン1、スリット、およびムチンと相互作用する。ホモ・サピエンス（Homo sapiens）CTGF mRNA配列は、例えば、GenBankアクセッション番号NM_001901.2に記載されている。ホモ・サピエンスCTGFポリペプチド配列は、例えば、GenBankアクセッション番号NP_001892.1に記載されている。CTGFは、CCNファミリーメンバー2（CCN2）、NOV2、肥大軟骨細胞特異タンパク質24（HCS24）、およびインスリン様増殖因子結合タンパク質8（IGFBP8）としても公知である。
【００１９】
「情動障害」という用語は、気分、感覚、または感情の異常な撹乱を特徴とする精神障害をさす。情動障害の非限定的な例には、例えば、Diagnostic and Statistical Manual（DSM）of Mental Disorders、第5版（DSM-5）に記載されるような、気分障害（例えば、全ての形態および/または型のうつ病、双極性障害等）、不安、ならびに不安症が含まれる。
【００２０】
「気分障害」には、長期間にわたり個体によって経験された感覚、調子、または感情の状態の混乱が含まれる。気分障害には、うつ病（即ち、うつ病性障害）、双極性障害、物質誘発性気分障害、アルコール誘発性気分障害、ベンゾジアゼピン誘発性気分障害、全身的な医学的状態による気分障害、および他の多くのものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、DSM-5を参照すること。
【００２１】
「うつ病」または「うつ病性障害」という用語は、以下の症状のいずれかを含む気分障害をさす：持続的な悲しい、不安な、かつ/または「空虚な」気分；絶望および/または悲観の感覚；罪、無益、および/または無力の感覚；性交を含む、かつては享受されていた趣味および活動における関心または快感の喪失；活力の減少、疲労、および/または「緩徐化」；集中、記憶、および/または意思決定の困難さ；不眠、早朝覚醒、および/または過剰睡眠；食欲の喪失および/または体重減少、過食および/または体重増加；死および/または自殺の思考；自殺の試み；不穏状態および/または過敏性；頭痛、消化器障害、および/または慢性痛のような、処置に応答しない持続性の身体症状；ならびにそれらの組み合わせ。例えば、DSM-5を参照すること。うつ病性障害の非限定的な例には、大うつ病性障害（MDD）、非定型うつ病、メランコリー性うつ病、精神病性大うつ病または精神病性うつ病、カタトニー性うつ病、産後うつ病、季節性情動障害（SAD）、慢性うつ病（気分変調症）、二重うつ病、特定不能のうつ病性障害、うつ病性人格障害（DPD）、再発性短期うつ病（RBD）、小うつ病性障害（小うつ病）、月経前症候群、月経前不快気分障害、慢性の医学的状態（例えば、癌、慢性痛、化学療法、慢性ストレス）によって引き起こされたうつ病、およびそれらの組み合わせが含まれる。うつ病の様々な亜型が、例えば、DSM-5に記載されている。具体的な態様において、うつ病は大うつ病性障害（MDD）である。
【００２２】
「双極性障害」には、極端な気分の期間が交互に現れることを特徴とする気分障害が含まれる。双極性障害を有する者は、通常、正常な気分の期間をはさんで、過度の高揚または過敏（躁病）から、悲しみおよび絶望（うつ病）まで揺れ、次いで、再び戻る、気分の循環を経験する。双極性障害の診断は、例えば、DSM-5に記載されている。双極性障害には、双極性障害I型（大うつ病を伴うまたは伴わない躁病）、双極性障害II型（大うつ病を伴う軽躁病）、および気分循環症が含まれる。例えば、DSM-5を参照すること。双極性障害は躁うつ病としても公知である。
【００２３】
「不安」には、典型的には、切迫したイベントまたは不確かな結果を有するものに関する、心配、神経過敏、困惑、および/または緊張の感覚を特徴とする状態が含まれる。不安の症状には、非限定的に、恐怖、パニック、心悸亢進、息切れ、疲労、悪心、頭痛（例えば、緊張性頭痛）、頻脈、筋力低下および/または筋緊張、胸痛、胃痛、蒼白、発汗、振戦、瞳孔散大、パニック発作、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。例えば、DSM-5を参照すること。ある種の場合において、本発明の方法は、不安の一つまたは複数の症状を治療するかまたは緩和する。他の場合において、本発明の方法は、不安または不安症を治療する。不安症の非限定的な例には、全般不安症、強迫性障害、パニック障害、広場恐怖症、心的外傷後ストレス障害（PTSD）、社会不安症、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００２４】
「生物学的試料」という用語は、関心対象の分析物（例えば、CTGF）を含有している可能性のある生物学的起源に由来する生物学的材料を含む試料をさす。例えば、「生物学的試料」には、全血、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、羊水、乳頭吸引液、糞便、胆汁、涙、発汗、精液、膣分泌液、または組織試料（例えば、脳組織）が含まれ得る。いくつかの態様において、生物学的試料は、例えば、細胞、組織、または臓器から、生検によって得られる。ある種の場合において、生物学的試料は、扁桃（例えば、扁桃の副基底核（AB））のような特定の脳領域に由来する組織試料である。
【００２５】
結合、活性、または発現の「阻害剤」、「活性化剤」、および「モジュレーター」には、それぞれ、結合、活性、または発現についてのインビトロおよびインビボのアッセイを使用して同定された、阻害する分子、活性化する分子、またはモジュレートする分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、それらの相同体および模倣体が含まれる。「モジュレーター」という用語には、阻害剤および活性化剤が含まれる。阻害剤は、例えば、ポリペプチドに結合し、ポリペプチドの刺激もしくは酵素活性を阻害するか、部分的にもしくは完全に阻止するか、活性化を減少させるか、防止するか、遅らせるか、活性もしくは発現を不活化するか、脱感作するか、もしくはダウンレギュレートするか；またはポリペプチドをコードするmRNAの発現を減少させるか、低下させるか、もしくはダウンレギュレートする薬剤、例えば、アンタゴニストである。活性化剤は、例えば、ポリペプチドに結合するか、ポリペプチドの活性化もしくは酵素活性を刺激するか、増加させるか、開くか、活性化するか、容易にするか、増強するか、ポリペプチドの活性もしくは発現を感作するかもしくはアップレギュレートするか；またはポリペプチドをコードするmRNAの発現を増加させるか、増強するか、もしくはアップレギュレートする薬剤、例えば、アゴニストである。モジュレーターには、天然に存在するおよび合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小さい化学的分子等が含まれる。
【００２６】
「試験化合物」または「薬物候補」という用語には、天然に存在するかまたは合成の分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、小さい有機分子、多糖、脂質、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等が含まれる。試験化合物は、十分な範囲の多様性を提供するコンビナトリアルライブラリーまたはランダムライブラリーのような試験化合物のライブラリーの形態をとっていてもよい。試験化合物は、任意で、融合パートナー、例えば、ターゲティング化合物、レスキュー化合物、二量体形成化合物、安定化化合物、アドレス可能化合物、およびその他の機能的モエティと機能的に連結される。慣習的に、有用な特性を有する新しい化学的実体は、何らかの望ましい特性または活性、例えば、阻害活性を有する（「リード化合物」と呼ばれる）試験化合物を同定し、リード化合物のバリアントを作出し、それらのバリアント化合物の特性および活性を評価することによって生成される。ある種の態様において、ハイスループットスクリーニング（HTS）法が、そのような分析のために利用される。
【００２７】
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用された場合、核酸またはタンパク質が、それが天然状態において関連している他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。それは、乾燥物中に存在してもよいしまたは水溶液中に存在してもよいが、好ましくは、均質状態にある。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィのような分析化学技術を使用して決定される。調製物中に存在する主要な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。具体的には、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接し、関心対象の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを与える核酸またはタンパク質を意味する。具体的には、それは、核酸またはタンパク質が、少なくとも85％純粋、少なくとも95％純粋、または少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００２８】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそれらのポリマーが含まれる。特に限定されない限り、その用語には、参照核酸と類似した結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有している核酸が包含される。他に示されない限り、具体的な核酸配列には、明示された配列と同様に、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、SNP、および相補配列も暗示的に包含される。具体的には、縮重コドン置換は、1個または複数個の選択された（または全ての）コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基に置換された配列を生成することによって達成され得る（Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；およびCassol et al.(1992)；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコードされたmRNAと交換可能に使用される。
【００２９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを含み、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーと同様に、1個または複数個のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。本明細書において使用されるように、これらの用語には、アミノ酸残基が共有結合性のペプチド結合によって連結されている、全長タンパク質（即ち、抗原）を含む、任意の長さのアミノ酸鎖が包含される。
【００３０】
「アミノ酸」という用語には、天然に存在するアミノ酸および合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体が含まれる。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされたもの、ならびに後に修飾されたそれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体には、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが含まれる。そのような類似体は、修飾されたR基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」には、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する化学的化合物が含まれる。
【００３１】
アミノ酸は、本明細書において、一般的に公知の三文字記号またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨された一文字記号のいずれかによって言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、一般的に認められている一文字コードによって言及され得る。
【００３２】
「保存的に修飾されたバリアント」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に当てはまる。具体的な核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」には、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸が含まれ、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列が含まれる。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは、全て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがあるコドンによって特定される全ての位置において、そのコドンは、コードされたポリペプチドを改変することなく、記載された対応するコドンのいずれかに改変され得る。そのような核酸変動は、保存的に修飾された変動の一種である「サイレント変動」である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列が、核酸の全ての可能性のあるサイレント変動も記載する。当業者は、（通常メチオニンのための唯一のコドンであるAUGおよび通常トリプトファンのための唯一のコドンであるTGGを除き）核酸内の各コドンが、機能的に同一の分子を与えるために修飾され得ることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変動は、記載された各配列に暗に含まれる。
【００３３】
アミノ酸配列に関して、コードされた配列における単一のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を改変するか、付加するか、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、および/または付加は、その改変が化学的に類似したアミノ酸へのアミノ酸の置換をもたらす場合、「保存的に修飾されたバリアント」であることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、多形バリアント、異種間相同体、および/または対立遺伝子に対して付加的なものであり、それらを排除しない。
【００３４】
以下の八つの群は、各々、相互に保存的置換であるアミノ酸を含有している：
（1）アラニン（A）、グリシン（G）；
（2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
（3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
（4）アルギニン（R）、リジン（K）；
（5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
（6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
（7）セリン（S）、トレオニン（T）；および
（8）システイン（C）、メチオニン（M）
（例えば、Creighton,Proteins(1984)を参照すること）。
【００３５】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用された場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入もしくはネイティブの核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていること、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。例えば、組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）型の細胞には見出されない遺伝子を発現するか、または他の方法で異常に発現されるか、過少発現されるか、もしくは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【００３６】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド、または分析物（抗原）に特異的に結合しそれを認識するそれらの断片をさす。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それらが、それぞれ、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを定義する。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、2個の同一のポリペプチド鎖の対から構成され、各対は1本の「軽鎖」（約25kD）および1本の「重鎖」（約50〜70kD）を有する。各鎖のN末端は、抗原認識を主として担う約100〜110アミノ酸またはそれ以上の可変領域を定義する。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をさす。可変領域のアミノ酸配列の変動が、抗原結合部位の莫大な多様性を担っており、最大の可変性は、相補性決定領域（CDR）と名付けられた3個の超可変領域の全体に存在する。Fc領域として公知の抗体のテール領域は、重鎖の各々に由来する2個の定常ドメイン（CH2およびCH3）から構成される。Fc領域は、好中球上およびマクロファージ上のFc受容体の結合を通して、エフェクター機能のリクルートを担う。
【００３７】
抗体は、例えば、完全な免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼによる消化によって作製される多数の十分に特徴決定された断片として存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化し、それ自体、ジスルフィド結合によってVH-CH1に接合された軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'2を作製する。F(ab)'2は、ヒンジ領域のジスルフィド結合を分解し、それによって、F(ab)'2二量体をFab'モノマーに変換するため、温和な条件の下で還元され得る。Fab'モノマーは、本質的には、ヒンジ領域の一部を有するFabである（Paul(Ed.)Fundamental Immunology,Third Edition,Raven Press,NY(1993)を参照すること）。様々な抗体断片が、完全抗体の消化に関して定義されているが、当業者は、そのような断片が化学的にまたは組換えDNA方法論を利用することによって新たに合成されてもよいことを認識するであろう。従って、「抗体」という用語には、本明細書において使用されるように、完全抗体の修飾によって作製された抗体断片、または組換えDNA方法論を使用して新たに合成されたもの（例えば、単鎖Fv）も含まれる。
【００３８】
「ヒト化抗体」という用語は、（アクセプター免疫グロブリンまたはアクセプター抗体と呼ばれる）ヒト抗体鎖に実質的に由来する可変領域フレームワーク残基と、（ドナー免疫グロブリンまたはドナー抗体と呼ばれる）マウス抗体に実質的に由来する少なくとも1個の相補性決定領域（CDR）とを含む鎖を少なくとも1本含む抗体をさす。例えば、Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029 10033(1989)、米国特許第5,530,101号、米国特許第5,585,089号、米国特許第5,693,761号、WO 90/07861、および米国特許第5,225,539号を参照すること。定常領域も、存在する場合、ヒト免疫グロブリンに実質的にまたは完全に由来し得る。ヒト化抗体を作成する方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第7,256,273号を参照すること。
【００３９】
「特異的に結合する」という語句は、特定の分子の、タンパク質またはペプチドとの結合関係を記載する情況において使用される場合、タンパク質およびその他の生体物質の不均一な集団に、そのタンパク質が存在することを決定し得る結合反応をさす。従って、指定された結合アッセイ条件の下で、明示された結合剤（例えば、抗体）は、バックグラウンドの少なくとも2倍、特定のタンパク質に結合し、試料中に存在する他のタンパク質には有意な量で実質的に結合しない。そのような条件の下での抗体の特異的結合は、特定のタンパク質に特異的であるか、またはあるタンパク質に特異的であるが、その類似した「姉妹」タンパク質には特異的でないよう選択された抗体を必要とし得る。特定のタンパク質とまたは特定の形態で特異的に免疫反応性である抗体またはそれらの断片を選択するため、多様なイムノアッセイフォーマットを使用することができる。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するため、ルーチンに使用されている（特異的な免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイのフォーマットおよび条件の説明については、例えば、Harlow & Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988)を参照すること）。典型的には、特異的または選択的な結合反応は、バックグラウンドシグナルもしくはノイズの少なくとも2倍であり、より典型的には、バックグラウンドの10〜100倍を超えるであろう。
【００４０】
「干渉RNA」または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語には、干渉RNAが標的遺伝子または標的配列と同一の細胞に存在する場合、（例えば、干渉RNA配列に相補的であるmRNAの分解を媒介するかまたは翻訳を阻害することによって）標的遺伝子または標的配列の発現を低下させるかまたは阻害することができる、一本鎖RNA（例えば、成熟miRNA、ssRNAiオリゴヌクレオチド、ssDNAiオリゴヌクレオチド）、二本鎖RNA（即ち、低分子干渉RNA（siRNA）、ダイサー基質dsRNA、shRNA、aiRNA、もしくはpre-miRNAのような二重鎖RNA）、DNA-RNAハイブリッド、またはDNA-DNAハイブリッドが含まれる。従って、干渉RNAとは、標的mRNA配列に相補的である一本鎖RNA、または2本の相補的な鎖によってもしくは単一の自己相補的な鎖によって形成された二本鎖RNAをさす。干渉RNAは、標的遺伝子もしくは標的配列との実質的なもしくは完全な同一性を有していてもよいし、またはミスマッチの領域（即ち、ミスマッチモチーフ）を含んでいてもよい。干渉RNAの配列は、全長標的遺伝子に対応してもよいしまたはその部分配列に対応してもよい。いくつかの態様において、干渉RNA分子は、化学的に合成される。干渉RNA分子は、より長いdsRNA（例えば、約25ヌクレオチド長より大きいdsRNA）の大腸菌（E.coli）RNase IIIまたはダイサーによる切断によって生成されてもよい。他の態様において、干渉RNA分子は、プラスミドによってコードされ得る（例えば、ヘアピンループを有する二重鎖へ自動的に折り畳まれる配列として転写され得る）。
【００４１】
「情動障害の発症リスクを有する」個体とは、一般集団または対照集団の平均的な個体（例えば、ヒト）と比較された場合、気分障害、不安、または不安症のような情動障害の発症の傾向またはより高い可能性を有する個体（例えば、ヒト）をさす。
【００４２】
「治療的に有効な量」には、所望の治療的または予防的な結果を達成するため、必要な投薬量および期間で、有効な量または含量が含まれる。
【００４３】
III.態様の詳細な説明
一つの局面において、本発明は、
（a）個体由来の生物学的試料におけるCTGFの発現レベルを検出する工程；
（b）生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベルをCTGFの対照発現レベルと比較する工程；および
（c）生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベルがCTGFの対照発現レベルと比較して増加しているとき、個体が情動障害またはその発症リスクを有すると決定する工程
を含む、個体が情動障害またはその発症リスクを有するか否かを決定する方法を提供する。
【００４４】
いくつかの態様において、情動障害は、気分障害、不安、または不安症である。ある種の場合において、気分障害は、大うつ病性障害（MDD）または双極性障害（BP）である。好ましい態様において、個体は、ヒトである。
【００４５】
いくつかの態様において、CTGFの発現レベルは、CTGFのmRNAレベルである。mRNAレベルは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅ベースのアッセイのようなアッセイによって検出または測定され得る。ある種の場合において、
2018517418.tif 000003
のような配列またはその断片を含むプローブを使用して、ハイブリダイゼーションを検出することによって、CTGF mRNAレベルを決定するかまたは定量化するため、マイクロアレイ分析が実施される。ある種の他の場合において、
2018517418.tif 000004
のような順方向プライマー配列またはその断片、および
2018517418.tif 000005
のような逆方向プライマー配列またはその断片を含むプライマー対を使用して、増幅を検出することによって、CTGF mRNAレベルを決定するかまたは定量化するため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）が実施される。
【００４６】
他の態様において、CTGFの発現レベルは、CTGFのタンパク質レベルである。タンパク質レベルは、例えば、イムノアッセイ（例えば、ELISA）、免疫組織化学的アッセイ、または多重イムノアッセイのようなアッセイによって検出または測定され得る。
【００４７】
いくつかの態様において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、羊水、乳頭吸引液、または組織試料である。ある種の場合において、組織試料は、脳組織である。脳組織は、前頭皮質（例えば、背外側前頭前野）、前帯状皮質、小脳皮質、上側頭回、頭頂葉皮質、側坐核、扁桃、またはそれらの組み合わせを含む脳領域に由来し得る。他の態様において、方法は、工程（a）の前に、個体から生物学的試料を入手する工程をさらに含む。
【００４８】
ある種の態様において、対照発現レベルは、情動障害を有しない個体または個体の集団、即ち、年齢および/または性別が一致する対照個体またはそのような対照個体の集団におけるCTGFの発現レベル（例えば、mRNAまたはタンパク質のレベル）である。具体的な態様において、生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベル（例えば、mRNAまたはタンパク質のレベル）は、CTGFの対照発現レベルと比較して、1倍超、増加している。例えば、生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベル（例えば、mRNAまたはタンパク質のレベル）は、CTGFの対照発現レベルと比較して、約1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、もしくは10倍を超えて、または約1〜2倍、1〜3倍、1〜4倍、1〜5倍、1〜6倍、1〜7倍、1〜8倍、1〜9倍、1〜10倍、2〜3倍、2〜4倍、もしくは2〜5倍、増加していてよい。ある種の場合において、CTGFの発現レベル（例えば、mRNAまたはタンパク質のレベル）は、1種または複数種のハウスキーピング遺伝子に対して標準化され、次いで、CTGFの発現レベルの差が何倍であるかを決定するため、情動障害を有しない対照個体または対照個体の集団におけるCTGFの標準化された発現レベル（例えば、mRNAまたはタンパク質のレベル）と比較される。具体的な態様において、情動障害（例えば、大うつ病性障害）またはその発症リスクを有する個体（例えば、ヒト）の扁桃またはその核（例えば、副基底核（AB）、AAA、AHA、基底核、および/もしくは外側核）において検出されたCTGFの発現レベル（例えば、mRNAまたはタンパク質のレベル）は、CTGFの対照発現レベルと比較して、約1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、もしくは2.1倍高いか、または約1〜2倍、1〜3倍、1.5〜2.5倍、もしくは1.5〜2倍高い。
【００４９】
他の態様において、方法は、生物学的試料における、例えば、ECM2、EGR1、BCL2L2、IGFBP7、P4HA1、PDGFB、MAPKAPK5、MAPK8IP3、PKN1、PRKAG1、CREB1、RHOG、RHOA、SORL1、SOX4、STK3、および/または当技術分野において公知のCTGF経路の他のメンバーなどのCTGF経路メンバーの発現レベルを検出する工程をさらに含む。
【００５０】
関連する局面において、本発明は、
（a）個体由来の生物学的試料における結合組織増殖因子（CTGF）の発現レベルを検出する工程；
（b）生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベルをCTGFの対照発現レベルと比較する工程；
（c）生物学的試料における検出されたCTGFの発現レベルがCTGFの対照発現レベルと比較して増加しているとき、個体が情動障害を有すると診断する工程；および
（d）治療的に有効な量のCTGF阻害剤を診断された個体に投与する工程
を含む、個体（例えば、ヒト）における情動障害（例えば、大うつ病性障害）を診断し治療する方法を提供する。
【００５１】
別の局面において、本発明は、
（a）化合物を結合組織増殖因子（CTGF）と接触させる工程；および
（b）化合物がCTGFの発現レベルまたは活性を減少させるか否かを決定する工程であって、それによって情動障害を治療するための化合物が同定される、工程
を含む、情動障害を治療するための化合物を同定する方法を提供する。
【００５２】
いくつかの態様において、情動障害は、気分障害、不安、または不安症である。ある種の場合において、気分障害は、大うつ病性障害（MDD）または双極性障害（BP）である。好ましい態様において、個体は、ヒトである。
【００５３】
ある種の態様において、化合物は、CTGFを発現する細胞と接触させられる。具体的な態様において、化合物は、CTGFの発現レベルまたは活性を、化合物と接触させられていないCTGFの発現レベルまたは活性と比較して、1倍超、減少させる。例えば、化合物と接触させられたCTGFの発現レベルまたは活性は、化合物と接触させられていないCTGFの発現レベルまたは活性と比較して、約1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、もしくは10倍を超えて、または約1〜2倍、1〜3倍、1〜4倍、1〜5倍、1〜6倍、1〜7倍、1〜8倍、1〜9倍、1〜10倍、2〜3倍、2〜4倍、もしくは2〜5倍、減少し得る。ある種の場合において、化合物と接触させられたCTGFの発現レベルまたは活性は、1種または複数種のハウスキーピング遺伝子に対して標準化され、次いで、CTGFのレベルまたは活性の差が何倍であるかを決定するため、化合物と接触させられていないCTGFの標準化されたレベルと比較される。
【００５４】
他の態様において、方法は、例えば、ECM2、EGR1、BCL2L2、IGFBP7、P4HA1、PDGFB、MAPKAPK5、MAPK8IP3、PKN1、PRKAG1、CREB1、RHOG、RHOA、SORL1、SOX4、STK3、および/または当技術分野において公知のCTGF経路の他のメンバーのようなCTGF経路メンバーと化合物を接触させる工程をさらに含む。関連する態様において、細胞は、1種または複数種のCTGF経路メンバーをさらに発現する。
【００５５】
いくつかの態様において、方法は、化合物を動物モデルに投与する工程をさらに含む。具体的な態様において、動物モデルは、関心対象の行動、例えば、不安様行動および/またはうつ病様行動の個体差を同定し評価することができる。ある種の場合において、動物モデルは非近交系ラットを含む。ある種の他の場合において、動物モデルは、高度の不安様行動およびうつ病様行動を有するラットモデル（「高応答」またはbLR）、低度の不安様行動およびうつ病様行動を有するラットモデル（「低応答」またはbHR）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。例えば、Clinton et al.,Eur.J.Neuroscl,34:994-1005(2011)；Flagel et al.,Neuropharmacology,76:425-436(2014)；Jama et al.,Psychopharmacology,198:333-340(2008)；およびStead et al.,Behavior Genetics,36:697-712(2006)を参照すること。ある種の態様において、方法は、動物モデルにおけるCTGFの発現レベルまたは活性に対する化合物の効果を決定する工程をさらに含む。他の態様において、方法は、動物モデルにおける化合物の抗うつ効果および/または抗不安効果を決定する工程をさらに含む。
【００５６】
さらに別の局面において、本発明は、
（a）本明細書に記載された方法を使用して同定された化合物の治療的に有効な量を個体に投与する工程
を含む、その必要のある個体における情動障害を治療する方法を提供する。
【００５７】
いくつかの態様において、情動障害は、気分障害、不安、または不安症である。ある種の場合において、気分障害は、大うつ病性障害（MDD）または双極性障害（BP）である。好ましい態様において、個体は、ヒトである。
【００５８】
他の態様において、化合物は、静脈内に、頭蓋内に、脳室内に、くも膜下腔内に、脊髄内に、腹腔内に、筋肉内に、病巣内に、鼻腔内に、経口的に、または皮下に投与される。
【００５９】
さらなる局面において、本発明は、
（a）結合組織増殖因子（CTGF）阻害剤の治療的に有効な量を個体に投与する工程
を含む、その必要のある個体における情動障害を治療する方法を提供する。
【００６０】
いくつかの態様において、情動障害は、気分障害、不安、または不安症である。ある種の場合において、気分障害は、大うつ病性障害（MDD）または双極性障害（BP）である。好ましい態様において、個体は、ヒトである。
【００６１】
ある種の態様において、CTGF阻害剤は、抗体またはその断片、干渉RNA、低分子化合物  、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００６２】
いくつかの態様において、抗体は、ヒト抗CTGFモノクローナル抗体、ヒト化抗CTGFモノクローナル抗体、もしくはキメラ抗CTGFモノクローナル抗体、またはそれらの抗原結合断片である。具体的な態様において、抗CTGF抗体は、中和抗体である。ある種の態様において、抗CTGF抗体は、米国特許第7,405,274号および国際特許公開WO 2004/108764に記載されたような組換えヒトIgG1κモノクローナル抗体、FG-3019（CLN-1）である。具体的な態様において、抗CTGF抗体は、ヒトCTGFのドメイン2内のエピトープを認識する（例えば、FG-3019）。（例えば、CTGFの結合または活性を阻止することによって）情動障害を治療するために適当な他の抗CTGF抗体の非限定的な例には、米国特許第5,408,040号、第6,562,618号、第7,541,438号、第7,871,617号、および第8,865,173号；国際特許公開WO 99/33878、WO 1999/007407、WO 2000/035936、WO 2007/066823、WO 2012/100262、およびWO 2013/094723；ならびに日本特許公開JP-A-2000-232884に記載された抗CTGF抗体が含まれる。（例えば、CTGFの結合また活性を阻止することによって）情動障害を治療するために適当な付加的な抗CTGF抗体の非限定的な例には、Ikawa et al.（J.Cell Physiol,216:680-7(2008)）に記載された抗CTGF中和モノクローナル抗体、Gao et al.（PLoS ONE,9(12):el 13980(2014)）に記載された抗CTGFヒト化単鎖可変断片抗体（scFv）の単量体および二量体、ならびにPeproTech（Catalog Number 500-P252；London,UK）から入手可能な抗CTGF中和抗体が含まれる。
【００６３】
（例えば、CTGFの発現を低下させるかまたは阻害することによって）情動障害を治療するために適当な干渉RNA構築物の非限定的な例には、RXI-109（RXi Pharmaceuticalsから入手可能なCTGFの発現を低下させる自己送達RNAi）、Lu et al.（Ann.Hematol.,93:485-492(2014)）に記載されたレンチウイルスCTGFノックダウン低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、Winkler et al.（Mol Vis.,18:874-86(2012)；Winkler et al.の表1を参照すること）に記載されたCTGF特異的低分子干渉RNA（siRNA）配列、Luo et al.（Transplant Proc.,40:2365-9(2008)）に記載されたCTGF分子を標的とするsiRNA、Biognostik GmbH（Gottingen,Germany）から入手可能なCTGFアンチセンスオリゴヌクレオチド、米国特許第7,709,630号に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、Croci et al.（Cancer Res.,64:1730-1736(2004)）に記載されたCTGF mRNA（GenBankアクセッション番号NM_001901）の開始コドンの最初のヌクレオチドに対するコード領域のヌクレオチド360〜380を標的とするCTGF siRNA配列、およびCTGF mRNA配列（例えば、GenBankアクセッション番号NM_001901.2）を標的とし、CTGFの発現をノックダウンする本明細書に記載された方法のような周知の技術を使用して設計された干渉RNA構築物が含まれる。
【００６４】
（例えば、CTGFの結合もしくは活性を阻止することによって、またはCTGFの発現を低下させるかもしくは阻害することによって）情動障害を治療するための低分子阻害剤の非限定的な例には、PBI-4050（ProMetic Life Sciences Inc.）、DN-9693（Daiichi Pharmaceutical Co.Ltd.）、米国特許第7,351,407号に記載された低分子化合物（例えば、GW-8510、プルバラノール（purvalanol）A、ロスコビチン（roscovitine）、SB-216763、アルステルパウロン（alsterpaullone）、9-シアノパウロン（cyanopaullone）、ケンパウロン、トログリタゾン、シグリタゾン、15(S)HETE等）、米国特許公開2012/0156216に記載されたHMG-CoA還元酵素阻害化合物（例えば、アトルバスタチン、ベリバスタチン（berivastatin）、セリバスタチン、コンパクチン、ダルバスタチン、ジヒドロメビノリン、フルバスタチン、グレンバスタチン（glenvastatin）、ロバスタチン、メバスタチン、ニスバスタチン（nisvastatin）、プラバスタチン、ピタバスタチン、リバスタチン（rivastatin）、ロスバスタチン、シンバスタチン、ビサスタチン（visastatin）等）、およびCTGFの発現レベルまたは活性を減少させる本明細書に記載されたスクリーニング法を使用して同定された化合物、ならびにそれらの誘導体、それらの類似体、およびそれらのプロドラッグが含まれる。
【００６５】
いくつかの態様において、CTGF阻害剤は、静脈内に、頭蓋内に、脳室内に、くも膜下腔内に、脊髄内に、腹腔内に、筋肉内に、病巣内に、鼻腔内に、経口的に、または皮下に投与される。他の態様において、CTGF阻害剤は、個体へ急性投与または慢性投与される。具体的な態様において、本発明の方法は、治療的に有効な量の抗CTGF抗体（例えば、FG-3019）の個体への急性投与または慢性投与を含む。
【００６６】
ある種の態様において、CTGF阻害剤の治療的に有効な量には、例えば、1日当たり、約0.5mg、1mg、2mg、5mg、10mg、20mg、40mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、250mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、750mg、800mg、もしくは900mg、または約1グラム（g）、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g、もしくは10gの阻害剤という用量が含まれる。ある種の他の態様において、CTGF阻害剤の治療的に有効な量には、例えば、1日当たり、約0.001mg/kg〜約1,000mg/kg、約0.01mg/kg〜約1,000mg/kg、約0.1mg/kg〜約1,000mg/kg、約0.1mg/kg〜約100mg/kg、約1〜約10mg/kg、約1mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約50mg/kg、約100mg/kg、約200mg/kg、約300mg/kg、約400mg/kg、約500mg/kg、約600mg/kg、約700mg/kg、約800mg/kg、約900mg/kg、または約1,000mg/kgの阻害剤という用量が含まれる。所望の用量は、便利に、単回投与として投与されてもよいし、または適切な間隔で投与される複数回投与として、例えば、1日2回、3回、4回、もしくはそれ以上の分割投与として投与されてもよい。
【００６７】
いくつかの態様において、治療的に有効な量のCTGF阻害剤は、例えば、単回投与として、または短期間（例えば、約24時間未満のスパン）での複数回投与として、個体へ急性投与される。他の態様において、治療的に有効な量のCTGF阻害剤は、例えば、数時間（例えば、24時間毎、48時間毎、もしくは72時間毎）、数日、数週、数ヶ月、または数年のスパンでの反復投与として、対象へ慢性投与される。非限定的な例として、本明細書に記載されたCTGF阻害剤を含む薬学的組成物は、少なくとも1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、もしくはそれ以上、または1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、もしくはそれ以上の期間にわたり、少なくとも週1日、2日、3日、4日、5日、6日、または7日、少なくとも1日1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、またはそれ以上、投与され得る。ある種の場合において、数日（例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、またはそれ以上）から数週（例えば、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、またはそれ以上）の範囲の休止期間が、治療の耐容性および/または効力を改善するために導入されてもよい。
【００６８】
ある種の態様において、治療的に有効な量のCTGF阻害剤は、例えば、投与後約15分以上、約30分以上、約1時間以上、約1日以上、約1週以上、約2週以上、または約4週以上、情動障害に関連するうつ病および/または不安の一つまたは複数の症状を実質的に軽減する。いくつかの態様において、CTGF阻害剤の治療的に有効な量は、個体におけるうつ病を低減するため（抗うつ効果）に十分な量である。他の態様において、CTGF阻害剤の治療的に有効な量は、個体における不安を低減するため（抗不安効果）に十分な量である。
【００６９】
いくつかの態様において、CTGF阻害剤の治療的に有効な量には、解離性の副作用を本質的に伴うことなく、抗うつ効果を生じるために十分な量が含まれる。他の態様において、CTGF阻害剤の治療的に有効な量には、鎮静を本質的に伴うことなく、抗うつ効果を生じるために十分な量が含まれる。さらに他の態様において、CTGF阻害剤の治療的に有効な量には、乱用の可能性を有しない（例えば、習慣性であり得ない）量が含まれる。
【００７０】
いくつかの態様において、本明細書に記載されたCTGF阻害剤は、血液脳関門（BBB）透過性の改善を提供し、BBBを容易に通過することができる。他の態様において、本明細書に記載されたCTGF阻害剤は、インビボ効力、および/または、例えば、血漿レベルと比べた、脳レベル濃度の改善を提供する。さらに他の態様において、本明細書に記載されたCTGF阻害剤は、広い治療指数を有するか、高い治療指数を提供するか、またはそれらの組み合わせである。
【００７１】
IV.遺伝子発現の検出
本発明による結合組織増殖因子（CTGF）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルの検出は、診断的適用のため、例えば、個体が情動障害またはその発症リスクを有するか否かを決定するために有用である。さらに、遺伝子発現の検出は、CTGFポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドの発現レベルのモジュレーターを同定するために有用である。
【００７２】
ある種の場合において、CTGFの存在またはレベルは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅ベースのアッセイのようなアッセイによって、核酸（例えば、mRNA）発現のレベルで検出される。ある種の他の場合において、CTGFの存在またはレベルは、例えば、イムノアッセイ（例えば、ELISA）、免疫組織化学的アッセイ、または多重イムノアッセイを使用して、タンパク質発現のレベルで検出される。
【００７３】
核酸ハイブリダイゼーション技術を使用した特異的なDNAおよびRNAの測定の多様な方法が、当業者に公知である。いくつかの方法は、電気泳動による分離を含むが（例えば、DNAを検出するためのサザンブロットおよびRNAを検出するためのノーザンブロット）、（例えば、ドットブロットによって）電気泳動による分離の非存在下で、DNAおよびRNAの測定を実施することもできる。
【００７４】
核酸ハイブリダイゼーションフォーマットの選択は、重大ではない。多様な核酸ハイブリダイゼーションフォーマットが、当業者に公知である。例えば、一般的なフォーマットには、サンドイッチアッセイおよび競合アッセイまたは置換アッセイが含まれる。ハイブリダイゼーション技術は、Hames and Higgins Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press(1985)；Gall and Pardue,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,63:378-383(1969)；およびJohn et al.Nature,223:582-587(1969)に一般に記載されている。
【００７５】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、標的ポリヌクレオチドまたは標的核酸とプローブポリヌクレオチドまたはプローブ核酸との二重鎖へのシグナル生成複合体の結合を必要とし得る。典型的には、そのような結合は、リガンドにコンジュゲートしたプローブとシグナルにコンジュゲートした抗リガンドとの間のような、リガンドと抗リガンドとの相互作用を通して起こる。シグナル生成複合体の結合は、超音波エネルギーへの曝露による加速も容易に受け入れる。
【００７６】
標識は、ハイブリダイゼーション複合体の間接検出を可能にしてもよい。例えば、標識がハプテンまたは抗原である場合、抗体を使用することによって試料を検出することができる。これらの系において、シグナルは、蛍光分子もしくは酵素分子の抗体への付着によって、または、いくつかのケースにおいて、放射標識への付着によって生成される（例えば、Tijssen,"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Burdon and van Knippenberg Eds.,Elsevier(1985),pp.9-20を参照すること）。
【００７７】
プローブは、典型的には、直接的に、例えば、同位体、発色団、発光団、色素原によって、または間接的に、例えば、ストレプトアビジン複合体が後に結合するビオチンによって標識される。従って、検出可能標識は、一次標識（この場合、標識は、直接検出されるかもしくは直接検出可能な要素を生じる要素を含む）または二次標識（この場合、検出された標識は、例えば、免疫学的標識において一般的であるように、一次標識に結合する）であり得る。典型的には、標識されたシグナル核酸は、ハイブリダイゼーションを検出するために使用される。相補的な核酸またはシグナル核酸は、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの存在を検出するために典型的に使用されるいくつかの方法のいずれかによって標識され得る。最も一般的な検出の方法は、3H、125I、35S、14C、または32Pによって標識されたプローブ等によるオートラジオグラフィの使用である。
【００７８】
他の標識には、例えば、標識された抗体に結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドの特異的結合対のメンバーとして役立つことができる抗体が含まれる。標識への導入、標識の手法、および標識の検出は、Polak and Van Noorden Introduction to Immunocytochemistry,2nd ed.,Springer Verlag,NY(1997)；およびHaugland Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,a combined handbook and catalogue Published by Molecular Probes,Inc.(1996)に見出される。
【００７９】
一般に、特定のプローブまたはプローブの組み合わせをモニタリングする検出器が、検出試薬標識を検出するために使用される。典型的な検出器には、分光光度計、光電管およびフォトダイオード、顕微鏡、シンチレーションカウンター、カメラ、フィルム等、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。適当な検出器の例は、当業者に公知の多様な商業的供給元から広く入手可能である。一般的に、結合した標識モエティを含む基質の光学像は、その後のコンピュータ分析のためにデジタル化される。
【００８０】
最も典型的には、RNAの量は、検出試薬の結合によって固体支持体に固定された標識の量を定量化することによって測定される。典型的には、インキュベーション中のモジュレーターの存在は、モジュレーターを含まない対照インキュベーションと比べてまたは特定の反応型のために確立された基線と比較して、固体支持体に固定される標識の量を増加させるかまたは減少させるであろう。標識を検出し定量化する手段は、当業者に周知である。
【００８１】
好ましい態様において、標的核酸または標的プローブは、固体支持体上に固定化される。本発明のアッセイにおいて使用するために適当な固体支持体は、当業者に公知である。本明細書において使用されるように、固体支持体とは、実質的に固定された配置の材料のマトリックスである。
【００８２】
多様な自動固相アッセイ技術も適切である。例えば、Affymetrix,Inc.（Santa Clara,CA）から入手可能な極めて大規模な固定化されたポリマーアレイ（VLSIPS（商標））を、同一の制御経路に関与する複数の遺伝子の発現レベルの変化を同時に検出するために使用することができる。Tijssen（前記）、Fodor et al.(1991)Science,251:767-777；Sheldon et al.(1993)Clinical Chemistry 39(4):718-719、およびKozal et al.(1996)Nature Medicine 2(7):753-759を参照すること。
【００８３】
検出は、例えば、二重鎖核酸に特異的に結合する標識された検出モエティ（例えば、RNA-DNA二重鎖に特異的な抗体）を使用することによって達成され得る。一つの好ましい例は、（典型的には、組換えまたは共有結合性の化学結合によって）酵素に連結された、DNA-RNAヘテロ二重鎖を認識する抗体を使用する。抗体は、酵素がその基質と反応し、検出可能な生成物を生じる時に検出される。Coutlee et al.(1989)Analytical Biochemistry 181:153-162；Bogulavski(1986)et al.J.Immunol.Methods 89:123-130；Prooijen-Knegt(1982)Exp.Cell Res.141:397-407；Rudkin(1976)Nature 265:472-473、Stollar(1970)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 65:993-1000；Ballard(1982)Mol.Immunol.19:793-799；Pisetsky and Caster(1982)Mol.Immunol.19:645-650；Viscidi et al.(1988)J.Clin.Microbial.41:199-209；およびKiney et al.(1989)J.Clin.Microbiol.27:6-12は、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖を含むRNA二重鎖に対する抗体を記載している。DNA:RNAハイブリッドに特異的な抗体を含むキットは、例えば、Digene Diagnostics,Inc.（Beltsville,MD）から入手可能である。
【００８４】
入手可能な抗体に加えて、当業者は、既存の技術を使用して、核酸二重鎖に特異的な抗体を作成するか、または市販されているかもしくは公に入手可能な抗体を修飾することが容易にできる。前述の技術に加えて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための一般法は、当業者に公知である（例えば、Paul(3rd ed.)Fundamental Immunology Raven Press,Ltd.,NY(1993)；Coligan Current Protocols in Immunology Wiley/Greene,NY(1991)；Harlow and Lane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press,NY(1988)；Stites et al.(eds.)Basic and Clinical Immunology(4th ed.)Lange Medical Publications,Los Altos,CAおよびその中に引用された参照；Goding Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2d ed.)Academic Press,New York,NY,(1986)；ならびにKohler and Milstein Nature 256:495-497(1975)を参照すること）。抗体調製のために適当な他の技術には、ファージまたは類似したベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択が含まれる（Huse et al.Science 246:1275-1281(1989)；およびWard et al.Nature 341:544-546(1989)を参照すること）。特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗血清は、一般的に、少なくとも約0.1μM、好ましくは、少なくとも約0.01μM以下、最も典型的に、好ましくは、0.001μM以下のKDで結合するであろう。
【００８５】
本発明において使用される核酸は、陽性プローブまたは陰性プローブのいずれかであり得る。陽性プローブは、標的に結合し、二重鎖形成の存在が、標的の存在の証拠となる。陰性プローブは、疑わしい標的に結合せず、二重鎖形成の欠如が、標的の存在の証拠となる。例えば、野生型に特異的な核酸プローブまたはPCRプライマーの使用は、関心対象のヌクレオチド配列のみが存在するアッセイ試料において陰性プローブとして役立ち得る。
【００８６】
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増幅する核酸増幅系の使用を通して増強され得る。そのような系の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）系、具体的には、RT-PCRまたはリアルタイムPCR、およびリガーゼ連鎖反応（LCR）系が含まれる。当技術分野において最近記載された他の方法は、核酸配列ベース増幅（NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario）およびQβレプリカーゼ系である。選択された配列が存在する時にのみPCRプライマーまたはLCRプライマーが伸長するかまたはライゲートされるよう設計されているこれらの系は、変異体を直接同定するために使用され得る。あるいは、選択された配列を、例えば、非特異的なPCRプライマーを使用して一般に増幅し、後に、増幅された標的部位を、変異を示す特異的な配列について探索することができる。
【００８７】
本発明の核酸の発現のレベルを決定するための別の手段は、インサイチューハイブリダイゼーションである。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイは、周知であり、Angerer et al.,Methods Enzymol.152:649-660(1987)に一般に記載されている。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイにおいては、細胞、好ましくは、扁桃のような脳領域に由来するヒト細胞を、固体支持体、典型的には、ガラススライドに固定する。DNAが探索される場合には、細胞を熱またはアルカリによって変性させる。次いで、標識された特異的プローブのアニーリングを可能にするため、細胞を中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させる。プローブは、好ましくは、放射性同位体または蛍光レポーターによって標識される。
【００８８】
核酸を含有している材料は、個体からルーチンに入手される。そのような材料は、核酸を調製することができる任意の生物学的物体である。非限定的な例として、材料は、全血、血清、血漿、唾液、頬スワブ、痰、または核酸を含有しているその他の体液もしくは組織であり得る。一つの態様において、本発明の方法は、非侵襲的な手段によって容易に入手され、全RNAまたはゲノムDNAを調製するために使用され得る全血によって実施される。別の態様において、CTGFの発現レベルの検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用した個体の核酸の増幅を含む。核酸の増幅のためのPCRの使用は、当技術分野において周知である（例えば、Mullis et al.(Eds.),The Polymerase Chain Reaction,Birkhauser,Boston,(1994)を参照すること）。さらに別の態様において、PCR増幅は、1種または複数種の蛍光標識されたプライマーを使用して実施される。さらなる態様において、PCR増幅は、DNA副溝結合剤を含有している1種または複数種の標識されたプライマーまたは未標識のプライマーを使用して実施される。
【００８９】
本発明の方法においてCTGFの発現レベルを検出するため、PCRによって個体の核酸を増幅するため、多様な異なるプライマーのいずれかを使用することができる。そのようなプライマーは、一般に、増幅反応における安定的なアニーリング工程を可能にする、高い融解温度に到達するために十分なグアニンおよびシトシンの含量を有するよう設計される。Primer Selectのようないくつかのコンピュータプログラムが、PCRプライマーの設計を支援するために利用可能である。
【００９０】
適用可能なPCR増幅技術は、例えば、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.New York(1999),Chapter 7 and Supplement 47；Theophilus et al,"PCR Mutation Detection Protocols," Humana Press,(2002)；およびInnis et al.,PCR Protocols,San Diego,Academic Press,Inc.(1990)に記載されている。一般の核酸ハイブリダイゼーション法は、Anderson,"Nucleic Acid Hybridization," BIOS Scientific Publishers,1999に記載されている。複数の転写された核酸配列（例えば、mRNAまたはcDNA）の増幅またはハイブリダイゼーションを、マイクロアレイに配置されたmRNAまたはcDNAの配列から実施することもできる。マイクロアレイ法は、Hardiman,"Microarrays Methods and Applications:Nuts & Bolts," DNA Press,2003；およびBaldi et al.,"DNA Microarrays and Gene Expression:From Experiments to Data Analysis and Modeling," Cambridge University Press,2002に一般に記載されている。
【００９１】
様々な抗体ベースの技術を使用する特異的なタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの測定の多様な方法が、当業者に公知である（Sambrook（前記）を参照すること）。ある種の場合において、競合イムノアッセイおよび非競合イムノアッセイを含む多様なイムノアッセイ技術を、本明細書に記載された方法に従って、CTGFの存在またはレベルを検出するために使用することができる。イムノアッセイという用語には、非限定的に、酵素増幅イムノアッセイ技術（enzyme multiplied immunoassay technique）（EMIT）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、抗原キャプチャーELISA、サンドイッチELISA、IgM抗体キャプチャーELISA（MAC ELISA）、および微粒子酵素イムノアッセイ（MEIA）のような酵素イムノアッセイ（EIA）；キャピラリー電気泳動イムノアッセイ（CEIA）；ラジオイムノアッセイ（RIA）；イムノラジオメトリックアッセイ（IRMA）；蛍光偏光イムノアッセイ（FPIA）；ならびに化学発光アッセイ（CL）を含む技術が包含される。所望により、そのようなイムノアッセイは自動化されてもよい。イムノアッセイは、レーザー誘起蛍光と共に使用されてもよい（例えば、Schmalzing and Nashabeh,Electrophoresis,18:2184-2193(1997)；Bao,J.Chromatogr.B.Biomed.Set,699:463-480(1997)を参照すること）。フローインジェクションリポソームイムノアッセイおよびリポソームイムノセンサーのようなリポソームイムノアッセイも、本発明において使用するために適当である（例えば、Rongen et al.,J.Immunol.Methods,204:105-133(1997)を参照すること）。さらに、タンパク質/抗体複合体の形成が、光散乱の増加をもたらし、それが、マーカー濃度の関数としてピーク速度シグナルに変換される比濁分析アッセイが、本発明において使用するために適当である。比濁分析アッセイは、Beckman Coulter（Brea,CA；キット番号449430）から市販されており、Behring Nephelometer Analyzerを使用して実施され得る（Fink et al.,J.Clin.Chem.Clin.Biol.Chem.,27:261-276(1989)）。
【００９２】
抗原キャプチャーELISAは、本明細書に記載された方法に従ってCTGFの存在またはレベルを検出するために有用であり得る。例えば、抗原キャプチャーELISAにおいては、CTGFに対する抗体を固相に結合させ、CTGFに抗体が結合するよう試料を添加する。未結合のタンパク質を洗浄によって除去した後、結合したCTGFの量を、例えば、ラジオイムノアッセイを使用して定量化することができる（例えば、Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988を参照すること）。サンドイッチELISAも、本発明において使用するために適当であり得る。例えば、2抗体サンドイッチアッセイにおいては、一次抗体を固体支持体に結合させ、CTGFを一次抗体に結合させる。CTGFに結合する二次抗体の量を測定することによって、CTGFの量を定量化する。抗体は、磁性粒子またはクロマトグラフィマトリックス粒子、アッセイプレート（例えば、マイクロタイターウェル）の表面、固体基質材料の薄片または膜（例えば、プラスチック、ナイロン、ペーパー）等のような多様な固体支持体に固定化され得る。アッセイストリップは、固体支持体上にアレイ状に抗体をコーティングすることによって調製され得る。次いで、このストリップを試験試料に浸漬し、有色スポットのような測定可能なシグナルを生成するため、洗浄および検出の工程を通して迅速に処理することができる。
【００９３】
例えば、ヨウ素125（125I）によって標識された二次抗体を使用したラジオイムノアッセイ（Harlow and Lane（前記））も、本発明において使用するために適当である。化学発光マーカーによって標識された二次抗体も、本発明において使用するために適当であり得る。化学発光性の二次抗体を使用した化学発光アッセイは、発現レベルの高感度の非放射性の検出のために適当である。そのような二次抗体は、様々な供給元、例えば、Amersham Lifesciences,Inc.（Arlington Heights,IL）から市販されている。
【００９４】
CTGFに対する抗体の特異的な免疫学的結合は、直接的にまたは間接的に検出され得る。直接標識には、抗体に付着させられる蛍光タグまたは発光タグ、金属、色素、放射性核種等が含まれる。ヨウ素125（125I）によって標識された抗体は、試料中のCTGFレベルを決定するために使用され得る。CTGFに特異的な化学発光性抗体を使用した化学発光アッセイは、CTGFレベルの高感度の非放射性の検出のために適当である。蛍光色素によって標識された抗体も、試料中のCTGFレベルを決定するために適当である。蛍光色素の例には、非限定的に、DAPI、フルオレセイン、ヘキスト33258、R-フィコシアニン、B-フィコエリトリン、R-フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、およびリサミンが含まれる。蛍光色素に連結された二次抗体は、市販されており、例えば、ヤギF(ab')2抗ヒトIgG-FITCは、Tago Immunologicals（Burlingame,CA）から入手可能である。
【００９５】
間接標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、βガラクトシダーゼ、ウレアーゼ等のような当技術分野において周知の様々な酵素が含まれる。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出系は、例えば、450nmにおいて検出可能な可溶性生成物を過酸化水素の存在下で与える発色性基質テトラメチルベンジジン（TMB）と共に使用され得る。アルカリホスファターゼ検出系は、例えば、405nmにおいて容易に検出可能な可溶性生成物を与える発色性基質p-ニトロフェニルリン酸と共に使用され得る。同様に、βガラクトシダーゼ検出系は、410nmにおいて検出可能な可溶性生成物を与える発色性基質o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）と共に使用され得る。ウレアーゼ検出系は、尿素-ブロモクレゾールパープル（Sigma Immunochemicals；St.Louis,MO）のような基質と共に使用され得る。酵素に連結された有用な二次抗体は、多数の商業的供給元から入手され得、例えば、ヤギF(ab')2抗ヒトIgG-アルカリホスファターゼは、Jackson ImmunoResearch（West Grove,PA.）から購入され得る。
【００９６】
直接標識または間接標識からのシグナルは、例えば、発色性基質からの色を検出する分光光度計；125Iの検出のためのガンマカウンターのような放射線を検出する放射線計数管；またはある波長の光の存在下で蛍光を検出する蛍光光度計を使用して分析され得る。酵素に連結された抗体の検出のためには、製造業者の説明に従って、EMAX Microplate Reader（Molecular Devices；Menlo Park,CA）のような分光光度計を使用して、CTGFレベルの量の定量分析を行うことができる。所望により、本明細書に記載されたアッセイを自動化するかまたは機械的に実施することができ、複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。
【００９７】
フローサイトメトリーが、CTGFの存在またはレベルを検出するために使用されてもよい。そのようなフローサイトメトリーアッセイには、ビーズベースのイムノアッセイが含まれる（例えば、Bishop and Davis,J.Immunol.Methods,210:79-87(1997)；McHugh et al.,J.Immunol.Methods,116:213(1989)；Scillian et al.,Blood,73:2041(1989)を参照すること）。
【００９８】
CTGFに特異的な組換え抗原を発現させるためのファージディスプレイテクノロジーも使用され得る。所望により、抗ファージモノクローナル抗体のような抗体を使用して、CTGFに特異的な抗原を発現するファージ粒子を、マルチウェルプレートに固着させることができる（Felici et al.,"Phage-Displayed Peptides as Tools for Characterization of Human Sera" in Abelson(Ed.),Methods in Enzymol.,267,San Diego:Academic Press,Inc.(1996)）。
【００９９】
定量的ウエスタンブロッティングも、試料中のCTGFの存在またはレベルを検出するかまたは決定するために使用され得る。走査型濃度測定またはホスホイメージング（phosphorimaging）のような周知の方法によって、ウエスタンブロットを定量化することができる。非限定的な例として、タンパク質試料を10％SDS-PAGEレムリゲル上で電気泳動させる。一次マウスモノクローナル抗体をブロットと反応させ、予備スロットブロット実験を使用して抗体結合が線形であることを確認することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼとカップリングしたヤギ抗マウス抗体（BioRad）を二次抗体として使用し、例えば、製造業者の説明に従って、Renaissance化学発光キット（New England Nuclear；Boston,MA）を用いて、化学発光を使用して、シグナル検出を実施する。ブロットのオートラジオグラフを、走査型濃度測定器（Molecular Dynamics；Sunnyvale,CA）を使用して分析し、陽性対照に対して標準化する。値は、例えば、実測値と陽性対照との比（デンシトメトリックインデックス）として報告される。そのような方法は、例えば、Parra et al.,J.Vasc.Surg.,28:669-675(1998)に記載されているように、当技術分野において周知である。
【０１００】
あるいは、多様な免疫組織化学的アッセイ技術を、試料中のCTGFの存在またはレベルを検出するかまたは決定するために使用することができる。「免疫組織化学的アッセイ」という用語には、蛍光顕微鏡法または光学顕微鏡法を使用して、CTGFと反応する抗体にカップリングされた（即ち、コンジュゲートした）蛍光色素または酵素の視覚的検出を利用する技術が包含され、非限定的に、直接蛍光抗体アッセイ、間接蛍光抗体（IFA）アッセイ、抗補体免疫蛍光、アビジン-ビオチン免疫蛍光、およびイムノペルオキシダーゼアッセイが含まれる。
【０１０１】
あるいは、精製されたCTGFの量を検出するかまたは定量化することによって、CTGFの存在またはレベルを決定することができる。例えば、単独のまたは質量分析（例えば、MALDI/MS、MALDI-TOF/MS、SELDI-TOF/MS、タンデムMS等）と組み合わせられた高圧液体クロマトグラフィ（HPLC）によって、CTGFの精製を達成することができる。CTGFの定性的または定量的な検出は、非限定的に、ブラッドフォードアッセイ、クーマシーブルー染色、銀染色、放射標識されたタンパク質についてのアッセイ、および質量分析を含む周知の方法によって決定されてもよい。
【０１０２】
CTGFおよび1種または複数種のCTGF経路メンバーの分析は、別々に実施されてもよいしまたは1個の試験試料で同時に実施されてもよい。CTGFおよび1種または複数種のCTGF経路メンバーの別々のまたは連続的なアッセイのため、適当な機器には、ElecSys（Roche）、AxSym（Abbott）、Access（Beckman）、ADVIA（登録商標）、CENTAUR（登録商標）（Bayer）、およびNICHOLS ADVANTAGE（登録商標）（Nichols Institute）イムノアッセイ系のような臨床的実験分析機器が含まれる。好ましい機器またはプロテインチップは、単一の表面においてCTGFおよび1種または複数種のCTGF経路メンバーの同時アッセイを実施する。特に有用な物理的フォーマットには、CTGFおよび1種または複数種のCTGF経路メンバーの検出のための複数の別々のアドレス可能な位置を有する表面が含まれる。そのようなフォーマットには、タンパク質マイクロアレイまたは「プロテインチップ」（例えば、Ng et al.,J.Cell Mol.Med.,6:329-340(2002)を参照すること）およびある種のキャピラリー装置（例えば、米国特許第6,019,944号を参照すること）が含まれる。これらの態様において、別々の表面位置は、各々、各位置における検出のためのCTGFおよび1種または複数種のCTGF経路メンバーを固定化するための抗体を含んでいてよい。あるいは、表面は、表面の別々の位置に固定化された1種または複数種の別々の粒子（例えば、微粒子またはナノ粒子）を含んでいてもよく、その場合、微粒子は、検出のためのCTGFおよび1種または複数種のCTGF経路メンバーを固定化するための抗体を含む。
【０１０３】
V.治療用抗体の選択
ある種の局面において、本発明は、結合組織増殖因子（CTGF）阻害剤として作用する抗体またはその断片を投与することによって、個体における情動障害を治療する方法を提供する。具体的な態様において、CTGF阻害剤は、CTGFタンパク質に結合し、その刺激もしくは活性を阻害するか、部分的にもしくは完全に阻止するか、その活性化を減少させるか、防止するか、もしくは遅延させるか、またはその活性もしくは発現を不活化するか、脱感作するか、もしくはダウンレギュレートすることによって、CTGFタンパク質を中和する抗体またはその断片である。
【０１０４】
「抗体」という用語には、完全抗体およびその抗原結合断片または単鎖が含まれる。従って、抗体には、以下に限定されるわけではないが、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも1個の相補性決定領域（CDR）またはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、フレームワーク（FR）領域、またはそれらの一部分のような、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含むタンパク質またはペプチドを含有している分子が含まれる。抗体には、完全免疫グロブリン分子、ならびにFab断片、F(ab')2断片、およびFv断片のようなその断片が含まれ、エピトープ決定基に結合することができるそれらの組換えバージョン、合成バージョン、および遺伝子改変バージョンも含まれ、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体も含まれる。
【０１０５】
抗CTGF抗体（例えば、CTGFまたはCTGFの断片に結合する抗体）は、免疫感作抗原として、完全CTGFポリペプチドを使用するか、または関心対象の低分子ペプチドを含有している断片を使用して、調製され得る。動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、ヤギ等）を免疫感作するために使用されるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、例えば、CTGFタンパク質のタンパク質分解、CTGF mRNAの翻訳によって得られてもよいし、または化学合成されてもよく、所望により、担体タンパク質にコンジュゲートされてもよい。ペプチドに化学的にカップリングされる一般的に使用されている担体には、例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）、チログロブリン、およびキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）が含まれる。所望の特異性を有する抗体を選択する他の方法（例えば、ファージディスプレイ）は、当技術分野において周知である。
【０１０６】
「抗体」という用語には、さらに、抗体、そのプロテアーゼ消化断片、抗体模倣体を含む、その特定の一部分およびバリアント、または単鎖抗体およびその抗原結合断片を含む、抗体もしくはその特定の断片もしくは一部分の構造および/もしくは機能を模倣する抗体の一部分が包含されるものとする。抗体の抗原結合断片の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない：（i）VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCHドメインからなる一価の断片であるFab断片；（ii）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2個のFab断片を含む二価の断片であるF(ab')2断片；（iii）VHドメインおよびCHドメインからなるFd断片；（iv）抗体の単一アームのVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片；（v）VHドメインからなるdAb断片（例えば、Ward et al.,Nature,341:544-546(1989)を参照すること）；ならびに（vi）単離された相補性決定領域（CDR）。さらに、Fv断片の2個のドメインVLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされるが、VL領域およびVH領域が対合して1価の分子を形成する、単一のタンパク質鎖として作成されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して、それらを接合することができる（単鎖Fv（scFv）として公知；例えば、Bird et al.,Science,242:423-426(1988)；およびHuston et al.,Proc.Natl Acad Sci.USA,85:5879-5883(1988)を参照すること）。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して入手され、断片は、完全抗体と同様に有用性についてスクリーニングされる。
【０１０７】
「中和抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、CTGFの生物学的活性を実質的に阻害するかまたは排除することができる抗体、好ましくは、モノクローナル抗体をさす。典型的には、中和抗体は、TGFなどの補助因子、標的細胞に付随するCTGF特異的な受容体、または別の生物学的標的へのCTGFの結合を阻害するであろう。
【０１０８】
「抗CTGF抗体」という用語は、CTGFに特異的に結合する（例えば、CTGFタンパク質のエピトープまたはその断片を認識する）抗体をさす。本明細書において使用されるように、「特異的な結合」とは、抗体が、高い親和性で、予定された抗原に結合することをさす。典型的には、抗体は、約10-7M以下の解離定数（KD）で抗原に結合し、予定された抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的な抗原（例えば、BSA、カゼイン）との結合についてのKDより少なくとも約1.5倍低い（例えば、少なくとも約2倍低い、少なくとも約5倍低い等）KDで、予定された抗原に結合する。高親和性抗体は、典型的には、少なくとも約10-8M、10-9M、または10-10Mのオーダーの親和性を有する。具体的な態様において、本発明の方法において使用するための抗体は、約10-8M〜10-10M、約10-8M〜10-9M、または約10-9〜10-10MのCTGFに対する結合親和性を有するであろう。具体的な態様において、本発明の方法において使用される抗CTGF抗体は、約10-8M以下のCTGFに対するKDを有する。
【０１０９】
「裸の抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、細胞傷害性モエティまたは放射性同位体にコンジュゲートされていない抗体である。いくつかの態様において、抗CTGF抗体は、裸の抗体である。
【０１１０】
いくつかの態様において、抗CTGF抗体は、FG-3019（CLN-1）、または国際特許公開WO 2004/108764ならびに米国特許第7,405,274号および第8,865,173号に記載されたようなmAb1、同一のエピトープに結合する抗体、またはそれらと実質的に等価であるかもしくはそれらに由来する抗体である。具体的な態様において、抗CTGF抗体はFG-3019（CLN-1）である。他の態様において、抗CTGF抗体は、日本特許公開JPA-2000-232884に記載されたようなヒトモノクローナル抗体M84もしくはM320、または国際特許公開WO 2007/066823に記載されたようなマウスモノクローナル抗体CTGF-m2-1である。本発明の方法において使用するための付加的な例示的な抗体は、例えば、米国特許第5,408,040号、第6,562,618号、第7,541,438号、および第7,871,617号；ならびに国際特許公開WO 99/33878、WO 1999/007407、WO 2000/035936、WO 2012/100262、およびWO 2013/094723に記載されている。いくつかの態様において、抗CTGF抗体は、ATCCアクセッション番号PTA-6006によって同定される細胞株によって産生された抗体のアミノ酸配列を有する。他の態様において、抗CTGF抗体は、ATCCアクセッション番号PTA-6006によって同定される細胞株によって産生された抗体と競争的にCTGFに結合する。さらなる態様において、抗CTGF抗体は、ATCCアクセッション番号PTA-6006によって産生された抗体と同一のエピトープに結合する。
【０１１１】
ある種の態様において、抗CTGF抗体は、抗体模倣体である。抗体模倣体とは、抗体のように高い特異性および親和性で抗原に結合するよう設計されているが、抗体と構造的には無関係である、典型的には、3〜25kDaの範囲のタンパク質である。典型的には、抗体模倣体は、より大きい生体分子に由来する単一ドメインまたは反復ドメインとして見出され得る構造モチーフまたは足場に基づく。
【０１１２】
VI.干渉RNA分子の選択
ある種の局面において、本発明は、結合組織増殖因子（CTGF）の発現を低下させるかまたは阻害する干渉RNA分子を投与することによって、個体における情動障害を治療する方法を提供する。干渉RNAの非限定的な例には、（例えば、CTGF mRNAの分解を媒介するかまたは翻訳を阻害することによって）CTGFの発現を低下させるかまたは阻害することができる、一本鎖RNA（例えば、成熟miRNA、ssRNAiオリゴヌクレオチド、ssDNAiオリゴヌクレオチド）、二本鎖RNA（即ち、低分子干渉RNA（siRNA）、ダイサー基質dsRNA、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、aiRNA、もしくはpre-miRNAのような二重鎖RNA）、DNA-RNAハイブリッド、またはDNA-DNAハイブリッドが含まれる。具体的な態様において、干渉RNAは、siRNAまたはshRNAである。
【０１１３】
適当なsiRNA配列は、当技術分野において公知の手段を使用して同定され得る。典型的には、Elbashir et al.,Nature,411:494-498(2001)およびElbashir et al.,EMBO J.,20:6877-6888(2001)に記載された方法が、Reynolds et al.,Nature Biotech.,22(3):326-330(2004)に示された合理的設計ルールと組み合わせられる。
【０１１４】
非限定的な例として、関心対象の標的遺伝子由来の転写物のAUG開始コドンの3'側のヌクレオチド配列を、ジヌクレオチド配列（例えば、AA、NA、CC、GG、またはUU（N＝C、G、またはU））についてスキャンすることができる（例えば、Elbashir et al.,EMBO J.,20:6877-6888(2001)を参照すること）。ジヌクレオチド配列の直接3'側のヌクレオチドが、可能性のあるsiRNA配列（即ち、標的配列またはセンス鎖配列）として同定される。典型的には、ジヌクレオチド配列の直接3'側の19個、21個、23個、25個、27個、29個、31個、33個、35個、またはそれ以上のヌクレオチドが、可能性のあるsiRNA配列として同定される。いくつかの態様において、ジヌクレオチド配列は、AAまたはNAの配列であり、AAまたはNAのジヌクレオチドの直接3'側の19個のヌクレオチドが、可能性のあるsiRNA配列として同定される。siRNA配列は、一般的には、標的遺伝子上の異なる位置に間隔を置いて配置されている。siRNA配列のサイレンシング効率をさらに増強するため、可能性のあるsiRNA配列は、例えば、標的細胞または標的生物の他のコード配列との相同性を有する領域を含有していない部位を同定するため、分析され得る。例えば、約21塩基対の適当なsiRNA配列は、典型的には、標的細胞または標的生物のコード配列との相同性を有する16〜17個を越える連続塩基対を有しないであろう。siRNA配列がRNA Pol IIIプロモーターから発現される場合、4個を越える連続するAまたはTを欠くsiRNA配列が選択される。
【０１１５】
可能性のあるsiRNA配列が同定された後、相補配列（即ち、アンチセンス鎖配列）を設計することができる。可能性のあるsiRNA配列を、当技術分野において公知の多様な基準を使用して分析することもできる。例えば、サイレンシング効率を増強するため、以下の特色のうちの一つまたは複数を有する配列を同定するための合理的設計アルゴリズムによって、siRNA配列を分析することができる：（1）約25％〜約60％G/CのG/C含量；（2）センス鎖の15〜19位に少なくとも3個のA/U；（3）内部リピートがない；（4）センス鎖の19位にA；（5）センス鎖の3位にA；（6）センス鎖の10位にU；（7）センス鎖の19位にG/Cがない；および（8）センス鎖の13位にGがない。これらの特色の各々の適当な値を割り当てるアルゴリズムが組み込まれており、siRNAの選択のために有用なsiRNA設計ツールは、例えば、http://ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.htmlに見出され得る。前述の特徴のうちの一つまたは複数を有する配列を、可能性のあるsiRNA配列として、さらなる分析および試験のために選択することができることを、当業者は認識するであろう。
【０１１６】
さらに、以下の基準のうちの一つまたは複数を有する、可能性のあるsiRNA配列は、しばしば、siRNAとして排除され得る：（1）4個以上の同一の塩基のストレッチを一列に含む配列；（2）Gのホモポリマーを含む配列（即ち、これらのポリマーの構造的特徴による、可能性のある非特異的効果を低下させるため）；（3）三重塩基モチーフ（例えば、GGG、CCC、AAA、またはTTT）を含む配列；（4）7個以上のG/Cのストレッチを一列に含む配列；および（5）内部折り返し構造をもたらす、4個以上の塩基のダイレクトリピートを候補内に含む配列。しかしながら、前述の特徴のうちの一つまたは複数を有する配列であっても、可能性のあるsiRNA配列として、さらなる分析および試験のためにさらに選択されてもよいことを、当業者は認識するであろう。
【０１１７】
いくつかの態様において、可能性のあるsiRNA配列を、例えば、Khvorova et al.,Cell,115:209-216(2003)；およびSchwarz et al.,Cell,115:199-208(2003)に記載されたように、siRNA二重鎖非対称に基づき、さらに分析することができる。他の態様において、可能性のあるsiRNA配列を、例えば、Luo et al.,Biophys.Res.Commun.,318:303-310(2004)に記載されたように、標的部位における二次構造に基づき、さらに分析することができる。例えば、塩基対合およびステムループの形態の二次構造がより少なく存在する、標的部位における到達可能性にとって好都合なsiRNA配列を選択するため、（http://mfold.burnet.edu.au/rna_formにおいて入手可能な）Mfoldアルゴリズムを使用して、標的部位における二次構造をモデル化することができる。
【０１１８】
「低分子ヘアピン型RNA」または「短鎖ヘアピン型RNA」または「shRNA」には、RNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用され得る、タイトなヘアピンターンを作成する短鎖RNA配列が含まれる。shRNAは、化学合成されてもよいしまたはDNAプラスミド内の転写カセットから転写されてもよい。shRNAヘアピン構造は、細胞機構によってsiRNAへ切断され、次いで、それが、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に結合する。
【０１１９】
shRNAの非限定的な例には、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーまたはループ構造によってセンス領域とアンチセンス領域とが連結された一本鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；および自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域とを有するヘアピン二次構造を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子が含まれる。付加的なshRNA配列には、PCT公開WO 2006/074108およびWO 2009/076321に記載されたもののような非対称shRNA前駆体ポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２０】
「ダイサー基質dsRNA」または「前駆体RNAi分子」には、ダイサーによってインビボでプロセシングされ、標的遺伝子のRNA干渉のためのRISC複合体へ取り込まれる活性siRNAを生じる前駆体分子が含まれる。ダイサー基質dsRNAの設計および合成の方法は、例えば、米国特許公開第20050244858号、第20050277610号、および第20070265220号に記載されている。
【０１２１】
siRNAと同様に、非対称干渉RNA（aiRNA）は、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）をリクルートし、アンチセンス鎖の5'末端に対するヌクレオチド10とヌクレオチド11との間で標的配列の配列特異的な切断を媒介することによって、哺乳動物細胞において多様な遺伝子の効果的なサイレンシングをもたらすことができる（Sun et al.,Nat.Biotech.,26:1379-1382(2008)）。典型的には、aiRNA分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有しておりアンチセンス鎖の3'末端および5'末端に突出部分を含有している、短いRNA二重鎖を含む。aiRNAは、一般に、相補的なアンチセンス鎖と比較された場合、センス鎖が両端においてより短いため、非対称である。いくつかの局面において、aiRNA分子は、siRNA分子のために使用されるものに類似した条件の下で、設計され、合成され、アニーリングされ得る。非限定的な例として、aiRNA配列は、siRNA配列の選択のための前記の方法を使用して、選択され生成され得る。
【０１２２】
一般に、マイクロRNA（miRNA）は、遺伝子発現を制御する約21〜23ヌクレオチド長の一本鎖RNA分子である。miRNAは、遺伝子によってコードされ、そのDNAから転写されるが、miRNAは、タンパク質へ翻訳されず（非コードRNA）；その代わりに、各一次転写物（pri-miRNA）は、pre-miRNAと呼ばれる短いステムループ構造へプロセシングされ、最終的には、機能性の成熟miRNAへプロセシングされる。成熟miRNA分子は、1種または複数種のメッセンジャーRNA（mRNA）分子に部分的にまたは完全に相補的であり、主な機能は、遺伝子発現をダウンレギュレートすることである。miRNA分子の同定は、例えば、Lagos-Quintana et al.,Science,294:853-858；Lau et al.,Science,294:858-862；およびLee et al.,Science,294:862-864に記載されている。
【０１２３】
miRNAをコードする遺伝子は、プロセシングされた成熟miRNA分子よりはるかに長い。miRNAは、キャップおよびポリAテールを有する一次転写物またはpri-miRNAとして最初に転写され、細胞核においてpre-miRNAとして公知の短いおよそ70ヌクレオチドのステムループ構造へプロセシングされる。このプロセシングは、ヌクレアーゼ、ドローシャと、二本鎖RNA結合タンパク質、パシャとからなるマイクロプロセッサー複合体として公知のタンパク質複合体によって動物において実施される（Denli et al.,Nature,432:231-235(2004)）。次いで、これらのpre-miRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）の形成も開始させるエンドヌクレアーゼ、ダイサーとの相互作用によって、細胞質において成熟miRNAへプロセシングされる（Bernstein et al.,Nature,409:363-366(2001)）。DNAのセンス鎖もアンチセンス鎖も、miRNAを生成するための鋳型として機能することができる。
【０１２４】
ダイサーがpre-miRNAステムループを切断するとき、2個の相補的な短いRNA分子が形成されるが、一方のみがRISC複合体へ組み込まれる。この鎖は、ガイド鎖として公知であり、5'末端の安定性に基づき、RISC複合体内の触媒活性RNase、アルゴノートタンパク質によって選択される（Preall et al.,Curr.Biol.,16:530-535(2006)）。アンチガイド鎖またはパッセンジャー鎖として公知の残りの鎖は、RISC複合体基質として分解される（Gregory et al.,Cell,123:631-640(2005)）。活性RISC複合体への組み込みの後、miRNAは相補的なmRNA分子と塩基対合し、標的mRNAの分解および/または翻訳サイレンシングを誘導する。
【０１２５】
哺乳動物miRNA分子は、一般的には、標的mRNA配列の3'UTR内の部位に相補的である。ある種の場合において、miRNAの標的mRNAへのアニーリングは、タンパク質翻訳機構を阻止することによってタンパク質翻訳を阻害する。ある種の他の場合において、miRNAの標的mRNAへのアニーリングは、RNA干渉（RNAi）に類似した過程を通して標的mRNAの切断および分解を容易にする。miRNAは、標的とされたmRNAに相当するゲノム部位のメチル化を標的とする場合もある。一般に、miRNAは、miRNPと集合的に呼ばれるタンパク質の複合体に会合して機能する。
【０１２６】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」という用語には、標的とされたポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選ばれた配列に相補的なDNAまたはRNAの一本鎖である。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、RNAに結合することによって相補的なRNA鎖の翻訳を防止する。アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドは、特異的な相補的な（コードまたは非コード）RNAを標的とするために使用され得る。結合が起こる場合、このDNA/RNAハイブリッドは、酵素RNase Hによって分解され得る。具体的な態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10〜約60個のヌクレオチド、より好ましくは、約15〜約30個のヌクレオチドを含む。この用語には、所望の標的遺伝子に正確に相補的でなくてもよいアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含される。従って、本発明は、アンチセンスによって非標的特異的活性が見出される場合、または標的配列との1個もしくは複数個のミスマッチを含有しているアンチセンス配列が具体的な使用のために最も好ましい場合に利用され得る。
【０１２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製する方法は、当技術分野において公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するために容易に適応し得る。所定の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選ばれた標的配列の分析および二次構造の決定、Tm、結合エネルギー、ならびに相対的安定性に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞における標的mRNAとの特異的な結合を低下させるかまたは妨害する、二量体、ヘアピン、またはその他の二次構造を形成する能力の相対的な欠如に基づき、選択され得る。mRNAの高度に好ましい標的領域には、AUG翻訳開始コドンまたはその周辺の領域、およびmRNAの5'領域に実質的に相補的な配列が含まれる。これらの二次構造の分析および標的部位選択の考慮は、例えば、OLIGOプライマー分析ソフトウェアのv.4（Molecular Biology Insights）および/またはBLASTN 2.0.5アルゴリズムソフトウェア（Altschul et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389-402(1997)）を使用して実施され得る。
【０１２８】
VII.CTGF発現のモジュレーターについてのスクリーニング
細胞、具体的には、哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞における結合組織増殖因子（CTGF）の発現または活性のレベルをモジュレートする化合物を同定するため、多数の異なるスクリーニングプロトコルを利用することができる。一般に、スクリーニング法は、CTGFへの結合、CTGFの発現の阻害、別の分子のCTGFへの結合の阻害等によって、CTGFの発現レベルまたは活性をモジュレートする（例えば、中和する）化合物を同定するための、複数の化合物のスクリーニングを含む。
【０１２９】
A.結合アッセイ
CTGFに結合することができる化合物についてのスクリーニングによる予備スクリーニングを実施することができ、そのようにして同定された化合物のうちの少なくともいくつかは、CTGFの発現および/または活性のモジュレーターである可能性が高い。結合アッセイは、一般的に、CTGFを1種または複数種の試験化合物と接触させる工程、およびCTGFと試験化合物とが結合複合体を形成するために十分な時間を経過させる工程を含む。形成された結合複合体は、多数の確立されている分析技術のいずれかを使用して検出され得る。タンパク質結合アッセイには、共沈殿、非変性SDSポリアクリルアミドゲル上の共移動、およびウエスタンブロット上の共移動を測定する方法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。そのようなアッセイにおいて利用されるCTGFは、天然に発現されたもの、クローニングされたもの、または合成されたものであり得る。結合アッセイは、例えば、CTGFに結合する抗体、受容体、またはその他の分子を同定するためにも有用である。
【０１３０】
B.発現アッセイ
ある種のスクリーニング法は、CTGFの発現（例えば、mRNAまたはタンパク質のレベル）をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートする化合物についてのスクリーニングを含む。そのような方法は、一般に、試験化合物を、CTGFを発現する1種または複数種の細胞と接触させる、細胞ベースのアッセイを実施する工程、次いで、発現（転写物、翻訳産物、または触媒産物）の増加または減少を検出する工程を含む。いくつかのアッセイは、内在性のCTGFを発現する末梢細胞またはその他の細胞によって実施される。
【０１３１】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現は、多数の異なる方式で検出され得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチドの発現レベルは、CTGFの転写物（またはそれに由来する相補核酸）と特異的にハイブリダイズするプローブによって、細胞において発現されたmRNAを探索することによって決定され得る。探索は、細胞を溶解し、ノーザンブロットを実施することによって、または細胞を溶解することなく、インサイチューハイブリダイゼーション技術を使用して実施され得る。あるいは、CTGFに特異的に結合する抗体によって細胞溶解物が探索される免疫学的方法を使用して、ポリペプチドの発現レベルを検出することができる。
【０１３２】
他の細胞ベースのアッセイは、CTGFを発現しない細胞によって実施されるレポーターアッセイである。これらのうちのある種のアッセイは、検出可能な生成物をコードするレポーター遺伝子に機能的に連結されたCTGFをコードするポリヌクレオチドのプロモーターを含む異種核酸構築物によって実施される。多数の異なるレポーター遺伝子が利用され得る。いくつかのレポーターは本質的に検出可能である。そのようなレポーターの例は、蛍光検出器によって検出され得る蛍光を放射する緑色蛍光タンパク質である。他のレポーターは検出可能な生成物を生成する。しばしば、そのようなレポーターは酵素である。例示的な酵素レポーターには、βグルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）（Alton and Vapnek(1979)Nature 282:864-869）、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、ならびにアルカリホスファターゼ（Toh et al.(1980)Eur.J.Biochem.182:231-238；およびHall et al.(1983)J.Mol.Appl.Gen.2:101）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３３】
これらのアッセイにおいては、レポーター構築物を保有する細胞を、試験化合物と接触させる。結合することによってプロモーターを活性化するか、またはプロモーターを活性化する分子を生成するカスケードを誘発する試験化合物は、検出可能レポーターの発現を引き起こす。ある種の他のレポーターアッセイは、CTGFをコードするポリヌクレオチドおよびそれに機能的に連結されたレポーターの発現を活性化する転写調節要素を含む異種構築物を保有する細胞によって実施される。この場合にも、転写調節要素に結合してレポーターの発現を活性化するか、または転写調節要素に結合してレポーター発現を活性化する化合物の形成を誘発する化合物を、レポーター発現に関連するシグナルの生成によって同定することができる。
【０１３４】
CTGFの発現または活性のレベルを基線値と比較することができる。前述のように、基線値は、対照試料についての値、または対照集団（例えば、情動障害もしくはそのリスクを有していない健常個体）についての発現レベルを代表する統計値であり得る。CTGFを発現しない細胞についての発現レベルが、陰性対照として決定されてもよい。そのような細胞は、一般に、その他の点においては、試験細胞と実質的に遺伝学的に同一である。
【０１３５】
多様な異なる型の細胞が、レポーターアッセイにおいて利用され得る。内在性のCTGFを発現する細胞には、例えば、前頭皮質（例えば、背外側前頭前野）、小脳、前帯状皮質、扁桃、海馬、または側坐核に由来する細胞を含む脳細胞が含まれる。CTGFを内在性に発現しない細胞は、原核細胞であってもよいが、好ましくは、真核細胞である。真核細胞は、組換え核酸構築物を保有する細胞の生成において典型的に利用される細胞のいずれかであり得る。例示的な真核細胞には、酵母、ならびにCOS細胞株、CHO細胞株、およびHeLa細胞株のような様々な高等真核細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３６】
観察された活性が真であることを確実にするため、レポーター構築物を欠く細胞によって平行反応を実行するか、またはレポーター構築物を保有する細胞を試験化合物と接触させないことによる、様々な対照が、実施され得る。化合物は、下記のように、さらにバリデートされてもよい。
【０１３７】
C.バリデーション
前述のスクリーニング法のいずれかによって最初に同定された化合物は、見かけの活性をバリデートするため、さらに試験され得る。好ましくは、そのような研究は、適当な動物モデルによって実施される。そのような方法の基本的なフォーマットは、一次スクリーニングにおいて同定されたリード化合物を、ヒトのモデルとして役立つ動物に投与する工程、次いで、CTGFの発現または活性が実際にモジュレートされる（例えば、増加するかまたは減少する）か否かを決定する工程を含む。バリデーション研究において利用される動物モデルは、一般に、任意の種類の哺乳動物である。適当な動物の具体例には、霊長類（例えば、サル）、マウス、およびラットが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３８】
具体的な態様において、動物モデルは、非近交系ラット、高度の不安様行動およびうつ病様行動を有するラットモデル（bLR）、低度の不安様行動およびうつ病様行動を有するラットモデル（bHR）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。ある種の態様において、動物モデルにおけるCTGFの発現レベルまたは活性に対する化合物の効果が決定される。他の態様において、動物モデルにおける化合物の抗うつ効果および/または抗不安効果が決定される。
【０１３９】
D.例示的なモジュレーター
CTGFのモジュレーターとして試験される化合物は、低分子化学的化合物、またはタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、糖、多糖、オリゴ糖、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、もしくは脂質のような生物学的実体であり得る。典型的には、試験化合物は、小さい化学的分子、タンパク質もしくはポリペプチド、または抗体もしくはその抗原結合断片であろう。本質的に任意の化学的化合物が、本発明のアッセイにおいて可能性のあるモジュレーターまたはリガンドとして使用され得るが、水性溶液または有機（具体的には、DMSOベースの）溶液に溶解し得る化合物が、最もしばしば、使用される。アッセイは、アッセイ工程を自動化し、任意の便利な起源に由来する化合物をアッセイに提供することによって、大きいケミカルライブラリーをスクリーニングするために設計され、典型的には（例えば、ロボットアッセイにおいてマイクロタイタープレート上でマイクロタイターフォーマットで）平行に実行される。Sigma（St.Louis,MO）、Aldrich（St.Louis,MO）、Sigma-Aldrich（St.Louis,MO）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika（Buchs,Switzerland）等を含む、化学的化合物の多くの供給元が存在することが認識されるであろう。モジュレーターには、CTGF mRNAのレベル（例えば、siRNA分子、shRNA分子、アンチセンス分子、リボザイム、DNAザイム等）またはmRNAからの翻訳のレベルを低下させるために設計された薬剤も含まれる。
【０１４０】
ある種の態様において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の可能性のある治療用化合物（可能性のあるモジュレーターまたはリガンド化合物）を含有しているコンビナトリアルケミカルライブラリーまたはペプチドライブラリーを準備する工程を含む。次いで、所望の特徴的な活性を提示するライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定するため、そのような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、本明細書に記載されるような1種または複数種のアッセイにおいてスクリーニングする。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」として役立つこともできるし、または、それ自体、可能性のあるもしくは実際の治療薬として使用されてもよい。
【０１４１】
コンビナトリアルケミカルライブラリーとは、試薬のような多数のケミカル「ビルディングブロック」を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された多様な化学的化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーのような線形コンビナトリアルケミカルライブラリーは、所定の化合物の長さ（即ち、ポリペプチド化合物内のアミノ酸の数）についてのあらゆる可能な方式でケミカルビルディングブロック（アミノ酸）のセットを組み合わせることによって形成される。ケミカルビルディングブロックのそのようなコンビナトリアル混合を通して、数百万種の化学的化合物が合成され得る。
【０１４２】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。そのようなコンビナトリアルケミカルライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka,Int.J.Pept.Prot.Res.37:487-493(1991)、およびHoughton et al.,Nature 354:84-88(1991)を参照すること）が含まれるが、これに限定されるわけではない。ケミカルダイバーシティライブラリーを生成するための他のケミストリーが使用されてもよい。そのようなケミストリーには、ペプトイド（例えば、PCT公開WO 91/19735）、コードされたペプチド（例えば、PCT公開WO 93/20242）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、PCT公開WO 92/00091）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドのようなダイバーソマー（diversomers）（Hobbs et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90:6909-6913(1993)）、ビニロガス（vinylogous）ポリペプチド（Hagihara et al.,J.Amer.Chem.Soc.114:6568(1992)）、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann et al.,J.Amer.Chem.Soc.114:9217-9218(1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成（Chen et al.,J.Amer.Chem.Soc.116:2661(1994)）、オリゴカルバメート（Cho et al.,Science 261:1303(1993)）、ペプチジルホスホネート（Campbell et al.,J.Org.Chem.59:658(1994)）、核酸ライブラリー（Ausubel、Berger、およびSambrook（全て前記）を参照すること）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083を参照すること）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughn et al.,Nature Biotechnology,14(3):309-314(1996)およびPCT/US96/10287を参照すること）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liang et al.,Science,274:1520-1522(1996)および米国特許第5,593,853号を参照すること）、ならびに小さい有機分子のライブラリーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１４３】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は、市販されている（例えば、357 MPS、390 MPS、Advanced Chem Tech,Louisville KY；Symphony,Rainin,Woburn,MA；433A Applied Biosystems,Foster City,CA；9050 Plus,Millipore,Bedford,MAを参照すること）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーが、それ自体、市販されている（例えば、ComGenex,Princeton,NJ；Tripos,Inc.,St.Louis,MO；3D Pharmaceuticals,Exton,PA；Martek Biosciences,Columbia,MD等を参照すること）
【０１４４】
E.固体および可溶性のハイスループットアッセイ
本発明のハイスループットアッセイにおいて、1日に数千もの異なるモジュレーターまたはリガンドをスクリーニングすることが可能である。具体的には、マイクロタイタープレートの各ウェルを、選択された可能性のあるモジュレーターに対して別々のアッセイを実行するために使用してもよいし、または濃度もしくはインキュベーション時間の効果を観察すべき場合には、5〜10ウェルの全てが単一のモジュレーターを試験してもよい。従って、1枚の標準的なマイクロタイタープレートは、約100（例えば、96）のモジュレーターをアッセイすることができる。1536穴プレートが使用される場合には、1枚のプレートが、約100〜約1500の異なる化合物を容易にアッセイすることができる。1日に数枚の異なるプレートをアッセイすることが可能であり；本発明の集積システムを使用して、約6,000〜20,000もの異なる化合物のアッセイスクリーニングが可能である。さらに最近、試薬操作のためのマイクロフルイディックアプローチが開発されている。
【０１４５】
関心対象の分子は、共有結合性または非共有結合性の結合を介して、例えば、タグを介して、直接的にまたは間接的に固体成分に結合させられてもよい。タグは多様な成分のいずれかであり得る。一般に、タグに結合する分子（タグ結合剤）が固体支持体に固定され、タグ付きの関心対象の分子が、タグとタグ結合剤との相互作用によって固体支持体に付着させられる。
【０１４６】
文献に十分に記載されている公知の分子相互作用に基づき、多数のタグおよびタグ結合剤が、使用され得る。例えば、タグが天然結合剤、例えば、ビオチン、プロテインA、またはプロテインGを有する場合、それは、適切なタグ結合剤（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのFc領域等）と共に使用され得る。ビオチンのような天然結合剤を有する分子に対する抗体も、広く入手可能な適切なタグ結合剤である（SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA,St.Louis MOを参照すること）。
【０１４７】
同様に、ハプテン化合物または抗原性化合物を、タグ/タグ結合剤対を形成するため、適切な抗体と組み合わせて使用することができる。数千の特異的抗体が市販されており、多くの付加的な抗体が文献に記載されている。例えば、一つの一般的な配置において、タグは一次抗体であり、タグ結合剤は一次抗体を認識する二次抗体である。抗体-抗原相互作用に加えて、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、トランスフェリン、c-kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、免疫グロブリン受容体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー等のような細胞受容体-リガンド相互作用；例えば、Pigott & Power,The Adhesion Molecule Facts Book I(1993)を参照すること）のような、受容体-リガンド相互作用も、タグとタグ結合剤との対として適切である。同様に、毒素および毒、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイド等）、（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド、およびビタミンD；ペプチドを含む様々な低分子リガンドの効果を媒介する）細胞内受容体、薬物、レクチン、糖、核酸（直鎖状および環状のポリマー配置）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質、ならびに抗体は、全て、様々な細胞受容体と相互作用することができる。
【０１４８】
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテートのような合成ポリマーも、適切なタグまたはタグ結合剤を形成することができる。本開示を参照することによって当業者には明白であるように、多くの他のタグ/タグ結合剤対も、本明細書に記載されたアッセイ系において有用である。
【０１４９】
ペプチド、ポリエーテル等のような一般的なリンカーも、タグとして役立つことができ、約5〜200アミノ酸のポリGly配列のようなポリペプチド配列を含む。そのようなフレキシブルリンカーは当業者に公知である。例えば、ポリ(エチレングリコール)リンカーは、Shearwater Polymers,Inc.（Huntsville,Alabama）より入手可能である。これらのリンカーは、任意で、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能結合を有する。
【０１５０】
タグ結合剤は、現在利用可能な多様な方法のいずれかを使用して固体基質に固定される。固体基質は、一般的には、タグ結合剤の一部と反応性の表面に化学基を固定する化学的試薬に基質の全部または一部分を曝すことによって誘導体化または官能化される。例えば、より長い鎖部分への付着のために適当な基には、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基が含まれるであろう。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、ガラス表面のような多様な表面を官能化するために使用され得る。そのような固相バイオポリマーアレイの構築は、文献に十分に記載されている（例えば、Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963)（例えば、ペプチドの固相合成を記載している）；Geysen et al.,J.Immun.Meth.102:259-274(1987)（ピン上での固相成分の合成を記載している）；Frank and Doring,Tetrahedron44:60316040(1988)（セルロースディスク上での様々なペプチド配列の合成を記載している）；Fodor et al.,Science,251:767-777(1991)；Sheldon et al.,Clinical Chemistry 39(4):718-719(1993)；およびKozal et al.,Nature Medicine 2(7):753759(1996)（全て、固体基質に固定されたバイオポリマーのアレイを記載している）を参照すること）。タグ結合剤を基質に固定するための非化学的アプローチには、熱、UV線による架橋等のような他の一般的な方法が含まれる。
【０１５１】
ある種の局面において、本発明は、CTGFの発現または活性をモジュレートすることができる化合物をハイスループットフォーマットで同定するためのインビトロアッセイを提供する。いくつかの態様において、本発明の方法は、対照反応を含む。記載されたアッセイフォーマットの各々について、モジュレーターを含まない「モジュレーターなしの」対照反応が、結合活性のバックグラウンドレベルを提供する。
【０１５２】
いくつかのアッセイにおいて、アッセイの成分が適切に機能していることを確実にするための陽性対照を有することが望ましいであろう。少なくとも二つの型の陽性対照が適切である。第一に、CTGFの既知の活性化剤を、アッセイの一つの試料と共にインキュベートすることができ、その結果としてのCTGFの発現レベルまたは活性の増加に起因するシグナルの増加を、本明細書に記載された方法に従って決定することができる。第二に、CTGFの既知の阻害剤を添加し、その結果としての発現または活性についてのシグナルの減少を同様に検出することができる。
【０１５３】
F.コンピュータベースのアッセイ
CTGFの発現または活性をモジュレートする化合物についてのさらに別のアッセイは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列によってコードされた構造的情報に基づきCTGFの三次元構造を生成するためにコンピュータシステムが使用されるコンピュータ支援型の薬物設計を含む。インプット配列は、分子の二次、三次、および四次の構造モデルを与えるためにコンピュータプログラムにおいて予め確立されているアルゴリズムと直接能動的に相互作用する。類似した分析を、CTGFの可能性のあるリガンドまたは結合パートナーに対して実施することができる。次いで、タンパク質構造またはヌクレオチド構造のモデルを、CTGFに結合する能力を有する構造の領域を同定するため、調査する。次いで、これらの領域を、CTGFに結合するポリペプチドを同定するために使用する。
【０１５４】
タンパク質の三次元構造モデルは、CTGFをコードする少なくとも10アミノ酸残基のタンパク質アミノ酸配列または対応する核酸配列をコンピュータシステムへ入力することによって生成される。核酸配列によってコードされたアミノ酸配列は、タンパク質の構造的情報をコードするタンパク質の一次配列または部分配列を表す。コンピュータキーボード、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、およびチップ）、光学媒体（例えば、CD ROM）、インターネットサイトによって配布された情報、ならびにRAMが含まれるが、これらに限定されるわけではないコンピュータ読取り可能な基質から、アミノ酸配列の少なくとも10残基（または10アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）を、コンピュータシステムへ入力する。次いで、タンパク質の三次元構造モデルを、当業者に公知のソフトウェアを使用して、アミノ酸配列およびコンピュータシステムの相互作用によって生成する。
【０１５５】
アミノ酸配列は、関心対象のタンパク質の二次構造、三次構造、および四次構造を形成するために必要な情報をコードする一次構造を表す。ソフトウェアは、構造モデルを生成するため、一次配列によってコードされたある種のパラメータを見る。これらのパラメータは、「エネルギー項」と呼ばれ、静電ポテンシャル、疎水ポテンシャル、溶媒露出面、および水素結合を主として含む。二次エネルギー項には、ファンデルワールスポテンシャルが含まれる。生物学的分子は、累積的にエネルギー項を最小化する構造を形成する。従って、コンピュータプログラムは、二次構造モデルを作出するため、一次構造またはアミノ酸配列によってコードされたこれらの項を使用する。
【０１５６】
次いで、二次構造によってコードされたタンパク質の三次構造が、二次構造のエネルギー項に基づき形成される。ユーザーは、この時点で、タンパク質が膜結合型であるか可溶型であるか、体内での位置、および細胞内での位置、例えば、細胞質、表面、または核のような付加的な変数を入力することができる。これらの変数は、二次構造のエネルギー項と共に、三次構造のモデルを形成するために使用される。三次構造のモデル化において、コンピュータプログラムは、二次構造の疎水性面を同様のものとマッチさせ、二次構造の親水性面を同様のものとマッチさせる。
【０１５７】
構造が生成された後、可能性のあるリガンド結合領域がコンピュータシステムによって同定される。可能性のあるリガンドについての三次元構造は、前記のように、化合物のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列または化学式を入力することによって生成される。次いで、可能性のあるリガンドの三次元構造が、CTGFの結合部位を同定するため、CTGFのそれと比較される。どのリガンドがCTGFとの結合の増強された可能性を有するかを決定するため、CTGFとリガンドとの間の結合親和性が、エネルギー項を使用して決定される。
【０１５８】
VIII.投与および薬学的組成物
ある種の局面において、本明細書に記載された治療剤（例えば、CTGF阻害剤）は、個体（例えば、ヒト）へ直接投与される。投与は、治療される組織と薬剤を接触させるために通常使用されるルートのいずれかによってなされ、当業者に周知である。複数のルートが特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路が、しばしば、別の経路より即効性の効果的な反応を提供することができる。
【０１５９】
いくつかの態様において、本明細書に記載された治療剤は、情動障害またはその症状を治療するために有用な他の薬物と組み合わせられてもよい。いくつかの態様において、本発明の薬学的組成物は、情動障害またはその症状を治療するために有用な少なくとも1種の付加的な化合物と組み合わせられた1種または複数種のCTGF阻害剤を含んでいてよい。
【０１６０】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含んでいてよい。ある種の局面において、薬学的に許容される担体は、一部分、投与される特定の組成物によって決定され、組成物を投与するために使用される特定の方法によっても決定される。従って、本発明の薬学的組成物の多様な適当な製剤が存在する（例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18TH ED.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990)を参照すること）。
【０１６１】
本発明の薬学的組成物は、投薬製剤と適合性の様式で、治療的に有効であるような量で投与される。投与される量は、例えば、個体の年齢、体重、身体活動、および食事、治療される情動障害、ならびに情動障害のステージまたは重症度を含む多様な要因に依る。ある種の態様において、用量のサイズは、特定の個体における特定の治療剤の投与に伴う有害副作用の存在、性質、および程度によっても決定され得る。一般に、典型的な個体のための治療剤の用量当量は、約1ng/kg〜約10mg/kgである。
【０１６２】
ある種の態様において、用量は、好ましくは、正確な投薬量の単純な投与のために適当な単位剤形で、例えば、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、乳濁液、坐薬、停留浣腸、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、エアロゾル、泡等のような、固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体の剤形の形態をとっていてよい。
【０１６３】
本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内に、頭蓋内に、くも膜下腔内に、脊髄内に、腹腔内に、筋肉内に、病巣内に、鼻腔内に、皮下に、脳室内に、経口的に、局所的に、かつ/または吸入によって投与され得る。
【０１６４】
本明細書において使用されるように、「単位剤形」という用語は、適当な薬学的賦形剤と会合した、所望の作用発現、耐容性、および/または治療効果を生じるよう計算された予定された量の治療剤を各々含有している、ヒトおよびその他の哺乳動物のための単位投薬量として適当な物理的に不連続の単位（例えば、アンプル）をさす。さらに、より濃縮された剤形が調製され、次いで、それからより希薄な単位剤形が作製されてもよい。従って、より濃縮された剤形は、実質的に多い、例えば、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれ以上の量の治療剤を含有しているであろう。
【０１６５】
そのような剤形を調製する方法は、当業者に公知である（例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18TH ED.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990)を参照すること）。剤形は、典型的には、従来の薬学的な担体または賦形剤を含み、他の薬用の薬剤、担体、佐剤、希釈剤、組織浸透増強剤、可溶化剤等をさらに含んでいてもよい。適切な賦形剤は、当技術分野において周知の方法によって、特定の剤形および投与ルートのために最適化され得る（例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（前記）を参照すること）。
【０１６６】
適当な賦形剤の例には、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびカーボポール（Carbopol）、例えば、カーボポール941、カーボポール980、カーボポール981等のようなポリアクリル酸が含まれるが、これらに限定されるわけではない。剤形は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油のような滑沢剤；湿潤剤；乳化剤；懸濁化剤；ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸エチル、およびヒドロキシ安息香酸プロピル（即ち、パラベン）のような保存剤；無機および有機の酸および塩基のようなpH調整剤；甘味剤；ならびに風味剤を付加的に含んでいてもよい。剤形は、生分解性ポリマービーズ、デキストラン、およびシクロデキストリン包接複合体を含んでいてもよい。
【０１６７】
経口投与のため、治療的に有効な用量は、錠剤、カプセル、乳濁液、懸濁液、溶液、シロップ、スプレー、ロゼンジ、粉末、および徐放性製剤の形態であってよい。経口投与のための適当な賦形剤には、薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、ゼラチン、ショ糖、炭酸マグネシウム等が含まれる。
【０１６８】
いくつかの態様において、治療的に有効な用量は、丸薬、錠剤、またはカプセルの形態をとり、従って、剤形は、本明細書に記載された治療剤と共に、乳糖、ショ糖、リン酸水素カルシウム等のような希釈剤；デンプンまたはその誘導体のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等のような滑沢剤；ならびにデンプン、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体のような結合剤：のいずれかを含有していてよい。治療剤は、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）担体内に配置された坐薬へ製剤化されてもよい。
【０１６９】
液体剤形は、例えば、経口投与、局所投与、または静脈内投与のための溶液または懸濁液が形成されるよう、例えば、水性生理食塩水（例えば、0.9％w/v塩化ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等のような担体に、治療剤、および、任意で、1種または複数種の薬学的に許容される佐剤を溶解または分散させることによって調製され得る。治療剤は停留浣腸へ製剤化されてもよい。
【０１７０】
局所投与のため、治療的に有効な用量は、乳濁液、ローション、ゲル、泡、クリーム、ゼリー、溶液、懸濁液、軟膏、および経皮パッチの形態であってよい。吸入による投与のため、治療剤は、噴霧器を介して、乾燥粉末としてまたは液状で送達されてよい。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタンのような加圧された許容される噴霧剤の中に置かれ得る。非経口投与のため、治療的に有効な用量は、無菌の注射可能溶液および無菌の包装された粉末の形態であってよい。好ましくは、注射可能溶液は、約4.5〜約7.5のpHで製剤化される。
【０１７１】
治療的に有効な用量は、凍結乾燥形態で提供されてもよい。そのような剤形は、投与前の再生のための緩衝液、例えば、炭酸水素を含んでいてもよく、または、緩衝液が、例えば、水による再生のための凍結乾燥剤形で含まれていてもよい。凍結乾燥剤形は、さらに、適当な血管収縮剤、例えば、エピネフリンを含んでいてもよい。凍結乾燥剤形は、注射器で提供されてよく、任意で、再生された剤形を個体へ即時に投与することができるよう、再生のための緩衝液と組み合わせて包装されていてよい。
【実施例】
【０１７２】
IX.実施例
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明を例示するために提示されるのであって、限定するために提示されるのではない。
【０１７３】
実施例1.抗CTGF抗体の急性投与および慢性投与はうつ病様行動を減少させた
この実施例は、抗CTGF抗体の急性投与および慢性投与の両方が、動物モデルにおけるうつ病様行動を減少させ、それによって、抗うつ効果を提供するための抗CTGF抗体治療の利用可能性が証明されたことを例示する。
【０１７４】
実験手法
インビボ試験系：非近交系ラットにおいて、組換えヒトIgG1κモノクローナル抗体（FG-3019）を投与し、うつ病様行動および不安様行動を試験した。うつ病様行動および不安様行動の両方について、急性研究および慢性研究を実施した。
【０１７５】
強制水泳試験（FST）
うつ病様行動を評価するため、0800〜1130にFSTを実施した。ラットを、尾が底につかないよう、25℃の水で満たされたシリンダに置いた。1日目のトライアルは15分からなり、2日目のトライアルは5分からなった。1日目の直後に動物に注射した。試験をビデオカメラによって記録し、Observerソフトウェア（Noldus Information Technology）を使用して、実験群を承知していない観察者が、水泳、クライミング、および不動をスコア化した。水泳およびクライミングとは、それぞれ、動物の水平および垂直の動作として定義された。不動とは、動物の浮遊を維持するために必要な最小量の動作として定義された。
【０１７６】
高架式十字迷路（EPM）
4本の高架アーム（床から70cm、長さ45cm、幅12cm）を有する高架式十字迷路は、黒いプレキシグラスから構築されていた。アームは、十字形に配置され、2本の向かい合ったアームは高さ45cmの壁によって包囲されており、他の2本のアームは開放されていた。開放アームと閉鎖アームとの交差点には、全てのアームに通じる12×12cmのセントラルスクエアプラットフォームが存在した。試験室は薄暗く（およそ40ルクス）、行動は、コンピュータビデオ追跡系（Noldus Ethovision,Leesburg,VA）によってモニタリングされた。5分試験の開始時に、各ラットを、閉鎖アームに向けて、セントラルスクエアに置いた。コンピュータ追跡系は、開放アームに最初に入るまでの潜時、5分試験の間、開放アーム、閉鎖アーム、およびセントラルスクエアに滞在した時間の量を記録した。試験は、0800〜1130に実施された。
【０１７７】
付加的な方法
動物の屠殺の方法：断頭。
【０１７８】
死後分析：海馬由来の連続脳切片のマイクロアレイ分析およびmRNAインサイチューハイブリダイゼーションならびに解剖された海馬のqRT-PCRを実施した。
【０１７９】
インビボ試験の実験終点：FST：全クライミング時間％、全水泳時間％、および全不動時間％；EPM：開放アーム、閉鎖アーム、およびセンタースクエアに滞在した時間、ならびに各四分区域への進入の回数；LDB：明るい四分区域および暗い四分区域に滞在した時間ならびに明区域へ進入するまでの潜時。
【０１８０】
死後分析の実験終点：標準化された遺伝子発現、光学濃度積分値、および変化倍率。
【０１８１】
データ分析の方法：各群の各対象についての値を、適切な統計分析を使用して、SPSSで群間で分析した。
【０１８２】
統計的評価の方法：スチューデントt検定；一元配置のANOVA；二元配置のANOVA後のポストホック比較。
【０１８３】
結果
情緒性に対するFG-3019の急性研究
左側脳室へのカニューレ植え込みの5日後、1μl/分の流速で、1μlの体積で、20μgの用量のFG-3019または対照huIgGを、動物へ脳室内（i.c.v.）注射した。5〜10分後、動物を高架式十字迷路（EPM）で5分間試験し、センター、開放アーム、および閉鎖アームへの回数および時間を定量化した。5日後、動物に15分水泳を与えた。水泳の1時間後、動物にFG-3019またはhuIgGのいずれかを注射した。次いで、注射の24時間後（2日目）に、5分間、強制水泳試験（FST）で、クライミング、水泳、および不動について動物を試験した。EPMにおいて、センター、開放アーム、または閉鎖アームで滞在した時間に有意差は存在しなかった。FSTにおいては、動物の全不動時間％の有意な減少および全水泳時間％の有意な増加が存在した（図1）。これらの結果は、この用量のFG-3019が、うつ病様行動を減少させることを証明しており、それが抗うつ薬として作用することを示している。
【０１８４】
情緒性に対するFG-3019の慢性研究
左側脳室へのカニューレ植え込みの5日後、1μl/分の流速で、1μlの体積で、20μgの用量のFG-3019または対照huIgGを、動物へ脳室内（i.c.v.）注射した。ラットは、14日間、48時間毎に全部で7回の注射を受けた。11日目に自発運動活性、12日目にEPM、13日目および14日目にFSTで、ラットを試験した。全不動時間％の有意な減少が存在した（図2）。この結果は、急性研究と一致しており、FG-3019がうつ病様行動を減少させることを証明しており、それが抗うつ薬として作用することを示している。FG-3019による慢性処置（i.c.v.）は、海馬の歯状回におけるCTGF発現も、14.6％、有意に減少させた。
【０１８５】
実施例2.死後ヒト扁桃核におけるCTGF発現の増加
この実施例は、CTGFが、大うつ病性障害（MDD）を有する個体の扁桃において、対照と比べて有意にアップレギュレートされていることを例示する。CTGF遺伝子発現を、Illumina Human Expression BeadChipsによって、異なる扁桃核において最初に査定し、BeadStudioによって分析した。マイクロアレイ分析のために使用されたプローブ配列は、以下の通りであった：
2018517418.tif 000006
。マイクロアレイ実験後、異なる扁桃核から抽出された新鮮なRNAを使用してRT-PCRを実施した。等量の高品質RNAをcDNA合成へ負荷した。次いで、cDNAを1:10に希釈し、PCR反応において使用した。PCRプライマーは、標準曲線および融解曲線を使用して、以前にバリデートされていた。プライマー配列は、以下の通りであった：順方向
2018517418.tif 000007
および逆方向
2018517418.tif 000008
。
【０１８６】
CTGFとMDDとの間の関係は、扁桃の副基底核（AB）において極めて強力であり、一方のプローブは2.44E-11のp値を示し、他方のプローブは1.61E-08のp値を示した。表1を参照すること。いくつかの他の扁桃核は、MDD（AAA、AHA、基底、外側）においてCTGFの類似した有意なアップレギュレーションを有していた。表1を参照すること。注目すべきことに、扁桃において、MDD個体は、扁桃核に依って対照より有意に高いCTGF発現（即ち、1.59倍〜2.06倍）を有していた。
【０１８７】
（表１）扁桃核におけるCTGF発現
2018517418.tif 000009
【０１８８】
実施例3.低不安動物と高不安動物との比較におけるCTGF経路メンバーの改変された発現
この実施例は、高不安ラット（LR）が、海馬において、低不安ラット（HR）より高いCTGF発現（即ち、1.95倍）を有していたことを例示する。歯状回におけるCTGF遺伝子発現を、Illumina Rat Expression BeadChipsによって最初に査定し、BeadStudioによって分析した。マイクロアレイ分析は、LRの歯状回において、HRと比較して有意に高いCTGF発現を示した。マイクロアレイ分析のために使用されたプローブ配列は、以下の通りであった：
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マイクロアレイ実験後、LRおよびHRの海馬全体から抽出された新鮮なRNAを使用して、RT-PCRを実施した。等量の高品質RNAをcDNA合成へ負荷した。次いで、cDNAを1:10に希釈し、PCR反応において使用した。PCRプライマーは、標準曲線および融解曲線を使用して、以前にバリデートされていた。プライマー配列は以下の通りであった：順方向
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および逆方向
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。
【０１８９】
この実施例は、媒体で処置された低不安動物（HR-VEH）が、媒体で処置された高不安動物（LR-VEH）より有意に少ないCTGF発現を示すことも例示した（p＜0.001）。表2を参照すること。さらに、この実施例は、FGF2のような不安を低下させる薬物によって処置された高不安動物（LR-FGF2）が、媒体で処置された高不安動物（LR-VEH）より有意に減少したCTGF発現を有することを例示する（p＜0.001）。表2を参照すること。この実施例は、ECM2、EGR1、BCL2L2、IGFBP7、P4HA1、PDGFB、MAPKAPK5、MAPK8IP3、PKN1、PRKAG1、CREB1、RHOG、RHOA、SOX4、およびSTK3のようなCTGF経路メンバーが、LR-FGF2動物とLR-VEH動物との比較において、そしてHR-VEH動物とLR-VEH動物との比較において、ディファレンシャルに発現されていたことをさらに例示する。表2を参照すること。ECM2は、大うつ病性障害（MDD）を有するヒト個体の扁桃において、対照と比べて有意にアップレギュレートされていた。RHOGは、MDDを有するヒト個体の扁桃において、対照と比べて有意にダウンレギュレートされていた。
【０１９０】
（表２）CTGF経路メンバーの発現
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【０１９１】
以上、理解を明確にするために、例示および例によって、ある程度詳細に本発明が記載されたが、当業者は、ある種の変化および修飾が添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることを認識するであろう。さらに、本明細書に提供された各参照は、各参照が参照によって個々に組み入れられるのと同程度に、参照によってその全体が組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月16日(2018.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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