(57)【要約】  本発明は、一般式（Ｉ）の化合物：【化１】2018515461.tif 000049［式中、Ｒ１〜Ｒ８は、それぞれ異なる意味を有する］、これらを含有する医薬組成物、ならびに医療における、特には、癌の処置および／または予防のためのこれらの使用に関する。
2018515461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物：
【化１】
2018515461.tif 000038
［式中、
Ａ---はＯ＝またはＯＨを表し；
Ｒ１は水素またはヒドロキシル保護基であり、かつ、Ｒ２は
【化２】
2018515461.tif 000039
から選択されるか；または
Ｒ１およびＲ２は一緒になって、
【化３】
2018515461.tif 000040
から選択される環を形成し；
Ｒ３は水素またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ４はメチルであり；
Ｒ５は水素またはハロゲンであり；
Ｒ６は水素またはヒドロキシル保護基であり、かつ、Ｒ７はＣＨＯまたはＣＨ２（ＯＨ）であるか；または
Ｒ６およびＲ７は一緒に単結合を形成し；
Ｒ８は水素またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素またはヒドロキシル保護基を表し；
但し、化合物２，３’，５’，６−テトラヒドロキシ−２’−ホルミル−６’−（３−メチル−２−ブテニル）−４−メチル−ベンゾフェノンは含まれない］。
【請求項２】
Ｒ１が水素またはヒドロキシル保護基であり、かつ、Ｒ２が
【化４】
2018515461.tif 000041
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が水素またはメチルであり、かつ、Ｒ２が
【化５】
2018515461.tif 000042
であるか、または
Ｒ１およびＲ２が一緒になって、
【化６】
2018515461.tif 000043
から選択される環を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３が水素である、前記いずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ５が水素またはクロロである、前記いずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ６が水素であり、Ｒ７がＣＨＯである、前記いずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ８が水素である、前記いずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１，Ｒ３，Ｒ６，Ｒ８，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４およびＲ１５のヒドロキシル保護基が、独立に、
−  式−Ｒ’のエーテル；
−  式−Ｃ（＝ＯＲ）Ｒ’のエステル；および
−  式−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’のカーボネート
から選択される（ここで、Ｒ’は、独立に、置換または非置換のアルキルおよび置換または非置換のアリールから選択することができる）、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
下記化合物：
【化７】
2018515461.tif 000044
またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
式（Ｉ）：
【化８】
2018515461.tif 000045
［式中、
Ａ---はＯ＝またはＯＨを表し；
Ｒ１は水素またはヒドロキシル保護基であり、かつ、Ｒ２は
【化９】
2018515461.tif 000046
から選択されるか；または
Ｒ１およびＲ２は一緒になって、
【化１０】
2018515461.tif 000047
から選択される環を形成し；
Ｒ３は水素またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ４はメチルであり；
Ｒ５は水素またはハロゲンであり；
Ｒ６は水素またはヒドロキシル保護基であり、かつ、Ｒ７はＣＨＯまたはＣＨ２（ＯＨ）であるか；または
Ｒ６およびＲ７は一緒に単結合を形成し；
Ｒ８は水素またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素またはヒドロキシル保護基を表す］
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物の少なくとも１つと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１１】
式（Ｉ）の化合物が
【化１１】
2018515461.tif 000048
から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
医療における使用のための、請求項１０または１１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１３】
癌の処置および／または予防に使用するための、請求項１０または１１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１４】
ＣＢＳに受託番号ＣＢＳ１３９２３０で寄託されたオニココラ属（Ｏｎｙｃｈｏｃｏｌａ  ｓｐ．）菌株。
【請求項１５】
請求項１０または１１のいずれか一項に定義される一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物を得る方法であって、制御された液内好気条件下で、資化性の炭素源および窒素源ならびに塩を有する水性栄養培地においてオニココラ属（Ｏｎｙｃｈｏｃｏｌａ  ｓｐ．）ＣＢＳ１３９２３０菌株を培養し、次いで、培養ブロスから一般式（Ｉ）の化合物を回収および精製する工程を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物、これらを含有する医薬組成物および医療における、特には、癌を処置および／または予防し得る薬剤としてのこれらの使用に関する。本発明はまた、このような化合物および組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードは、正常細胞の増殖、生存および分化の調節に関与する重要なシグナル伝達経路である。ＭＡＰＫカスケードの異常な調節は、癌および他のヒト疾患の一因となる。特に、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）ＭＡＰＫ経路は、癌の処置のための薬理学的阻害剤の開発につながる入念な研究対象となっている。
【０００３】
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路（Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路としても知られる）では、シグナル伝達分子が受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に結合するとシグナル伝達が始まり、Ｒａｓタンパク質が活性化される。続いて、３段階のリン酸化カスケードが起こる：活性化されたＲａｓはＲａｆセリン／スレオニンキナーゼのプロテインキナーゼ活性を活性化し、次いでＲａｆキナーゼはＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼ１および２（ＭＥＫ１／２）二重特異性プロテインキナーゼを活性化し、これは次にＥＲＫ１／２を活性化する（Robert PJ and Der CJ Oncogene 2007）。
【０００４】
現在、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の調節不全とヒトの発癌との関連を示す多数の証拠がある。Ｒａｓは、最も一般的にはＫ−Ｒａｓアイソフォームで、ヒト癌の約３０％において過剰活性化される。より具体的には、膵臓癌の約９０％、結腸癌の５０％、肺癌の３０％、および骨髄性白血病の約３０％においてＲａｓ活性化変異が報告されている。Ｒａｆの活性化変異は、ヒト癌の約７％で報告されている。特に、Ｂ−ＲＡＦの変異は、メラノーマの６０％以上、卵巣癌の約３０％、結腸直腸癌の約２０％、およびいくつかの他の悪性腫瘍においてより低い頻度で観察されている。構成的活性型のＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２タンパク質は、比較的多数のヒト腫瘍、特に大腸、肺、膵臓、卵巣および腎臓由来の腫瘍に存在する（Yap, JL et al. ChemMedChem 2011）。
【０００５】
多くのＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤が開発され、前臨床試験および早期臨床試験において評価されている。
【０００６】
したがって、この経路の新しい阻害剤の提供は、多くの治療の機会と癌治療のための大きな挑戦の双方を提供するものである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を阻害することができる新規の化合物を提供することにより前記課題を解決する。
【０００８】
１つの測面において、本発明は、一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物（明瞭を目的として、いくつかの例において炭素原子の番号付けが示されている）：
【化１】
2018515461.tif 000003
［式中、
Ａ---はＯ＝またはＯＨを表し；
Ｒ１は水素またはヒドロキシル保護基であり、かつ、Ｒ２は
【化２】
2018515461.tif 000004
から選択されるか；または
Ｒ１およびＲ２は一緒になって、
【化３】
2018515461.tif 000005
から選択される環を形成し；
Ｒ３は水素またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ４はメチルであり；
Ｒ５は水素またはハロゲンであり；
Ｒ６は水素またはヒドロキシル保護基であり、かつ、Ｒ７はＣＨＯまたはＣＨ２（ＯＨ）であるか；または
Ｒ６およびＲ７は一緒に単結合を形成し；
Ｒ８は水素またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素またはヒドロキシル保護基を表し；
但し、化合物２，３’，５’，６−テトラヒドロキシ−２’−ホルミル−６’−（３−メチル−２−ブテニル）−４−メチル−ベンゾフェノンは含まれない。］。
【０００９】
特開平７−６１９５０号公報は、毛髪化粧料組成物のためのＵＶ光吸収剤として有用なテストステロン５アルファ−レダクターゼ阻害活性を有するベンゾフェノン誘導体に関し、特に、ＳＢ８７−Ｈとして特定されている２，３’，５’，６−テトラヒドロキシ−２’−ホルミル−６’−（３−メチル−２−ブテニル）−４−メチル−ベンゾフェノン（または２−（２，６−ジヒドロキシ−４−メチル−ベンゾイル）−４，６−ジヒドロキシ−３−（３−メチル−ブタ−２−エニル）−ベンズアルデヒド）化合物を開示し、これは本明細書でＭＤＮ−００９０と称する化合物に相当し、化学式が以下に示される
【化４】
2018515461.tif 000006
【００１０】
したがって、ＭＤＮ−００９０は、本出願では請求されていない。しかしながら、ＭＤＮ−００９０は以下に示す本発明の残りの側面に含まれ、式（Ｉ）の化合物を含有する医薬または医薬組成物、医療における、特には、癌の処置および／または予防におけるこれらの使用、ならびにこのような化合物および組成物の製造方法に関する。
【００１１】
本発明の他の側面としては、上記で定義される式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物の少なくとも１つと薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬または医薬組成物に関する。
【００１２】
本発明の他の側面としては、医療における使用、特には、癌の処置および／または予防のための、上記で定義される式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物に関する。
【００１３】
本発明の他の側面としては、癌の処置および／または予防のための医薬の製造における、上記で定義される式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物の使用に関する。
【００１４】
本発明の他の側面としては、癌を処置および／または予防する方法であって、そのような処置または予防を必要とする対象に、上記で定義される式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物の有効量を投与することを含んでなる方法に関する。
【００１５】
よって、本発明は、一般式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物が、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を阻害することを確立する。本発明の化合物は、種々の癌処置のためのＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路において阻害活性を示すことが見出された。
【００１６】
本発明はまた、それらを生産することができる微生物、具体的には、オニココラ属（Ｏｎｙｃｈｏｃｏｌａ  ｓｐ．）として同定される菌類、より具体的には、オニココラ属ＣＢＳ１３９２３０菌株からの式（Ｉ）の化合物の取得、および得られた化合物からの誘導体の形成に関する。好ましい態様においては、式（Ｉ）の化合物を得る方法は、制御された液内好気条件下で、資化性の炭素源および窒素源ならびに塩を有する水性栄養培地においてオニココラ属ＣＢＳ１３９２３０などのこれらを生産することができる微生物系統を培養する工程と、その後培養ブロスから本発明による化合物を回収および精製する工程とを含んでなる。
【００１７】
本発明の他の側面としては、受託番号ＣＢＳ１３９２３０のオニココラ属菌株である。
【００１８】
本発明のこれらの側面および他の側面は、以下に記載される態様を参照して明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】化合物ＭＤＮ−００９０との７２時間のインキュベーションでのＭｉａＰａｃａ＿２およびＢｘＰＣ３細胞株におけるＭＴＴアッセイの結果（すなわち、腫瘍膵臓細胞株に対する増殖阻害効果）。実施例６を参照。
【図２】Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ  Ｓｕｒｅｆｉｒｅ＿ｐＥＲＫアッセイの結果。実施例９を参照。
【図３】異種移植における化合物ＭＤＮ−００９０の抗腫瘍活性の結果（腫瘍体積対インキュベーション後日数）。実施例１２を参照。
【図４】ＣＳＣに対する化合物ＭＤＮ−００９０の抗腫瘍活性の結果（腫瘍体積対インキュベーション後日数）。実施例１３を参照。
【図５】化合物ＭＤＮ−００９０のイン・ビボ（in vivo）腫瘍形成能アッセイの結果（腫瘍体積対インキュベーション後日数）。実施例１４を参照。
【発明の具体的説明】
【００２０】
癌はヒトの主要な死因であり、それは機能不全の細胞シグナル伝達に本質的に起因する。Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路はシグナルを伝達することができ、アポトーシスまたは細胞周期の進行を阻止または誘導する。従って、それは治療的介入の標的となる適切な経路である。したがって、抗癌剤を開発する努力は、大部分において、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤の同定に集中してきた。
【００２１】
本発明は、癌を処置および／または予防することができる新規化合物に関する。一般式（Ｉ）のこれらの化合物は、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤として特に有用である。
【００２２】
これらの化合物において、各基は以下の指針に従って選択することができる。
【００２３】
アルキル基は、分岐鎖または非分岐鎖であってよく、好ましくは、１〜約１８個の炭素原子、例えば、１〜約１２個の炭素原子を有する。より好ましいアルキル基は、１〜約６個の炭素原子を有し、さらに好ましくは、１、２、３または４個の炭素原子を有するアルキル基である。本発明の化合物においては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピルならびにｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｉｓｏ−ブチルを含むブチルが特に好ましいアルキル基である。環状基は少なくとも３個の炭素環員を含んでなるが、本明細書で使用されるアルキルとの用語は、特に明記しない限り、環状基および非環状基の双方を意味する。
【００２４】
本発明の化合物におけるアルケニルおよびアルキニル基は、分岐鎖または非分岐鎖であってよく、１または複数の不飽和結合および２〜約１８個の炭素原子、例えば、２〜約１２個の炭素原子を有する。より好ましいアルケニルおよびアルキニル基は、２〜約６個の炭素原子を有し、さらに好ましくは、２、３または４個の炭素原子を有するアルケニルおよびアルキニル基である。環状基は少なくとも３個の炭素環員を含んでなるが、本明細書で使用されるアルケニルおよびアルキニルとの用語は、環状基および非環状基の双方を意味する。
【００２５】
本発明の化合物における適切なアリール基としては、分離（separate）および／または縮合アリール基を含有する多環式化合物を含む単環式および多環式化合物が挙げられる。典型的なアリール基は、１〜３個の分離および／または縮合環および６〜約１８個の炭素環原子を含有する。好ましくは、アリール基は、６〜約１０個の炭素環原子を含有する。特に好ましいアリール基としては、置換または非置換フェニル、置換または非置換ナフチル、置換または非置換ビフェニル、置換または非置換フェナントリルおよび置換または非置換アントリルが挙げられる。
【００２６】
上述した各基は、１または複数の利用可能な位置でＯＲ’、＝Ｏ、ＳＲ’、ＳＯＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＯＳＯ２Ｒ’、ＯＳＯ３Ｒ’、ＮＯ２、ＮＨＲ’、Ｎ（Ｒ’）２、＝Ｎ−Ｒ’、Ｎ（Ｒ’）ＣＯＲ’、Ｎ（ＣＯＲ’）２、Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２Ｒ’、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（＝ＮＲ’）Ｎ（Ｒ’）Ｒ’、ＣＮ、ハロゲン、ＣＯＲ’、ＣＯＯＲ’、ＯＣＯＲ’、ＯＣＯＯＲ’、ＯＣＯＮＨＲ’、ＯＣＯＮ（Ｒ’）２、ＣＯＮＨＲ’、ＣＯＮ（Ｒ’）２、ＣＯＮ（Ｒ’）ＯＲ’、ＣＯＮ（Ｒ’）ＳＯ２Ｒ’、ＰＯ（ＯＲ’）２、ＰＯ（ＯＲ’）Ｒ’、ＰＯ（ＯＲ’）（Ｎ（Ｒ’）Ｒ’）、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニルおよび置換または非置換アリール（ここで、各Ｒ’基は、独立に、水素、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＨ、ＣＮ、ハロゲン、ＣＯＨ、ＣＯアルキル、ＣＯＯＨ、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニルおよび置換または非置換アリールからなる群から選択される。）などの１または複数の適切な基により置換されていてもよい。当該基自体が置換されている場合は、置換基は前述のリストから選択されてもよい。
【００２７】
本発明の化合物における適切なハロゲン基または置換基としては、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩが挙げられる。
【００２８】
適切な保護基は当業者によく知られている。有機化学における保護基の一般的概説については、Wuts, PGM and Greene TW in Protecting Groups in Organic Synthesis, 4th Ed. Wiley-Interscience, and by Kocienski PJ in Protecting Groups, 3rd Ed. Georg Thieme Verlagにより提供される。これらの文献はヒドロキシ基のための保護基についてのセクションを提供する。これらの文献はいずれも全体として参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００２９】
当該保護されたＯＨの例としては、エーテル、シリルエーテル、エステル、スルホネート、スルフェネートおよびスルフィネート、カーボネートならびにカルバメートが挙げられる。エーテルの場合、ＯＨの保護基は、メチル、メトキシメチル、メチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル、［（３，４−ジメトキシベンジル）オキシ］メチル、ｐ−ニトロベンジルオキシメチル、ｏ−ニトロベンジルオキシメチル、［（Ｒ）−１−（２−ニトロフェニル）エトキシ］メチル、（４−メトキシフェノキシ）メチル、グアヤコールメチル、［（ｐ−フェニルフェニル）オキシ］メチル、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、２−シアノエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、メントキシメチル、ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル、テトラヒドロピラニル、フルオラステトラヒドロピラニル、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル、１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル、１−（４−クロロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−ヒドロキシエチル、２−ブロモエチル、１−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、１−メチル−１−フェノキシエチル、２，２，２−トリクロロエチル、１，１−ジアニシル−２，２，２−トリクロロエチル、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−フェニルイソプロピル、１−（２−シアノエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（ベンジルチオ）エチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、シクロヘキシル、１−メチル−１’−シクロプロピルメチル、アリル、プレニル、シンナミル、２−フェナリル、プロパルギル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、２，３，５，６−テトラフルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、２，６−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ペンタジエニルニトロベンジル、ペンタジエニルニトロピペロニル、ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、２，４−ジクロロベンジル、２，６−ジフルオロベンジル、ｐ−シアノベンジル、フルオラスベンジル、４−フルオラスアルコキシベンジル、トリメチルシリルキシリル、ｐ−フェニルベンジル、２−フェニル−２−プロピル、ｐ−アシルアミノベンジル、ｐ−アジドベンジル、４−アジド−３−クロロベンジル、２−トリフルオロメチルベンジル、４−トリフルオロメチルベンジル、ｐ−（メチルスルフィニル）ベンジル、ｐ−シレタニルベンジル、４−アセトキシベンジル、４−（２−トリメチルシリル）エトキシメトキシベンジル、２−ナフチルメチル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、２−キノリニルメチル、６−メトキシ−２−（４−メチルフェニル−４−キノリンメチル、１−ピレニルメチル、ジフェニルメチル、４−メトキシジフェニルメチル、４−フェニルジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、トリス（４−ｔ−ブチルフェニル）メチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル、４，４’，４’’−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、４，４’−ジメトキシ−３’’−［Ｎ−（イミダゾリルメチル）］トリチル、４，４’−ジメトキシ−３’’−［Ｎ−（イミダゾリルエチル）カルバモイル］トリチル、ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、４−（１７−テトラベンゾ［ａ，ｃ，ｇ，ｉ］フルオレニルメチル）−４，４’’−ジメトキシトリチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−フェニルチオキサンチル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イルおよび４，５−ビス（エトキシカルボニル）−［１，３］−ジオキソラン−２−イル、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシドから選択することができる。シリルエーテルの場合、ＯＨの保護基は、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、ジエチルイソプロピルシリル、ジメチルヘキシルシリル、２−ノルボルニルジメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル、ジ−ｔ−ブチルメチルシリル、ビス（ｔ−ブチル）−１−ピレニルメトキシシリル、トリス（トリメチルシリル）シリル、（２−ヒドロキシスチリル）ジメチルシリル、（２−ヒドロキシスチリル）ジイソプロピルシリル、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル、ｔ−ブトキシジフェニルシリル、１，１，３，３−テトライソプロピル−３−［２−（トリフェニルメトキシ）エトキシ］ジシロキサン−１−イルおよびフルオラスシリルから選択することができる。エステルの場合、ＯＨの保護基は、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリクロロアセトアミデート、トリフルオロアセテート、メト���シアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、フェニルアセテート、ジフェニルアセテート、３−フェニルプロピオネート、ビスフルオラス鎖型プロパノイル、４−ペンテノエート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、５［３−ビス（４−メトキシフェニル）ヒドロキシメチルフェノキシ］レブリネート、ピバレート（pivaloate）、１−アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、４−ブロモベンゾエート、２，５−ジフルオロベンゾエート、ｐ−ニトロベンゾエート、ピコリネート、ニコチネート、２−（アジドメチル）ベンゾエート、４−アジドブチレート、（２−アジドメチル）フェニルアセテート、２−｛［（トリチルチオ）オキシ］メチル｝ベンゾエート、２−｛［（４−メトキシトリチルチオ）オキシ］メチル｝ベンゾエート、２−｛［メチル（トリチルチオ）アミノ］メチル｝ベンゾエート、２−｛｛［（４−メトキシトリチル）チオ］メチルアミノ｝−メチル｝ベンゾエート、２−（アリルオキシ）フェニルアセテート、２−（プレニルオキシメチル）ベンゾエート、６−（レブリニルオキシメチル）−３−メトキシ−２−ニトロベンゾエート、６−（レブリニルオキシメチル）−３−メトキシ−４−ニトロベンゾエート、４−ベンジルオキシブチレート、４−トリアルキルシリルオキシブチレート、４−アセトキシ−２，２−ジメチルブチレート、２，２−ジメチル−４−ペンテノエート、２−ヨードベンゾエート、４−ニトロ−４−メチルペンタノエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、２−ホルミルベンゼンスルホネート、４−（メチルチオメトキシ）ブチレート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２−（クロロアセトキシメチル）ベンゾエート、２−［（２−クロロアセトキシ）エチル］ベンゾエート、２−［２−（ベンジルオキシ）エチル］ベンゾエート、２−［２−（４−メトキシベンジルオキシ）エチル］ベンゾエート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシノエート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、α−ナフトエート、ニトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルホスホロジアミデートおよび２−クロロベンゾエートから選択することができる。スルホネート、スルフェネートおよびスルフィネートの場合、ＯＨの保護基は、サルフェート、アリルスルホネート、メタンスルホネート、ベンジルスルホネート、トシレート、２−［（４−ニトロフェニル）エチル］スルホネート、２−トリフルオロメチルベンゼンスルホネート、４−モノメトキシトリチルスルフェネート、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェネート、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−オン−１−スルフィネート、ボレートおよびジメチルホスフィノチオリルから選択する��とができる。カーボネートの場合、ＯＨの保護基は、メチルカーボネート、メトキシメチルカーボネート、９−フルオレニルメチルカーボネート、エチルカーボネート、ブロモエチルカーボネート、２−（メチルチオメトキシ）エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−［ジメチル（２−ナフチルメチル）シリル］エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート、ｃｉｓ−［４−［［（メトキシトリチル）スルフェニル］オキシ］テトラヒドロフラン−３−イル］オキシカーボネート、イソブチルカーボネート、ｔ−ブチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネート、シンナミルカーボネート、プロパルギルカーボネート、ｐ−クロロフェニルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、４−エトキシ−１−ナフチルカーボネート、６−ブロモ−７−ヒドロキシクマリン−４−イルメチルカーボネート、ベンジルカーボネート、ｏ−ニトロベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、ｐ−メトキシベンジルカーボネート、３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、アントラキノン−２−イルメチルカーボネート、２−ダンシルエチルカーボネート、２−（４−ニトロフェニル）エチルカーボネート、２−（２，４−ジニトロフェニル）エチルカーボネート、２−（２−ニトロフェニル）プロピルカーボネート、アルキル２−（３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニル）プロピルカーボネート、２−シアノ−１−フェニルエチルカーボネート、２−（２−ピリジル）アミノ−１−フェニルエチルカーボネート、２−［Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）］アミノ−１−フェニルエチルカーボネート、フェナシルカーボネート、３’，５’−ジメトキシベンゾインカーボネート、メチルジチオカーボネートおよびＳ−ベンジルチオカーボネートから選択することができる。カルバメートの場合、ＯＨの保護基は、ジメチルチオカルバメート、Ｎ−フェニルカルバメート、Ｎ−メチル−Ｎ−（ｏ−ニトロフェニル）カルバメートから選択することができる。これらの基についての記載は、ＯＨについての保護基を単に説明するものとして記載されるものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈され
るべきではなく、前記機能を有するさらなる基も当業者であれば分かり、本発明に包含されると理解される。
【００３０】
「塩」との用語は、イオン型をとる、または、荷電し、対イオン（陽イオンまたは陰イオン）と結合する、または、溶液中にあるといった本発明による活性化合物の任意の形態を意味すると理解される。また、活性化合物と他の分子およびイオンとの複合体、特には、イオン相互作用を介して複合体化される複合体も意味する。この定義は特に生理学的に許容可能な塩を含み、この用語は「薬理学的に許容可能な塩」または「薬学的に許容可能な塩」と同等と理解される。
【００３１】
「生理学的に許容可能な塩」または「薬学的に許容可能な塩」との用語は、本発明に照らして、特には、生理学的に許容される酸と形成される（上記で定義されたような）塩、すなわち、特定の活性化合物と生理学的に許容される（特にヒトおよび／または哺乳類に使用される場合に）無機または有機酸との塩、または生理学的に許容される（特にヒトおよび／または哺乳類に使用される場合に）少なくとも１つの（好ましくは無機の）陽イオンと形成される（上記で定義されたような）塩と理解することができる。特定の酸の生理学的に許容される塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、臭化水素酸塩、一臭化水素酸塩、一塩酸塩もしくは塩酸塩、メチオジド、メタンスルホン酸、ギ酸、酢酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、マンデル酸、フマル酸、乳酸、クエン酸、グルタミン酸、馬尿酸、ピクリン酸および／またはアスパラギン酸の塩である。特定の塩基の生理学的に許容される塩の例は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩ならびにＮＨ４との塩である。
【００３２】
当業者には、薬学的に許容可能でない塩も、薬学的に許容可能な塩を得るための可能な手段として、本発明の範囲に含まれることが明らかであろう。
【００３３】
本発明による「溶媒和物」との用語は、本発明による化合物が非共有結合を介して他の分子（最も可能性が高いのは極性溶媒）に付着するといった本発明による化合物の任意の形態（特に、水和物やアルコール和物、例えば、メタノール和物を含む）を意味すると理解される。溶媒化の方法は当技術分野において一般的に知られている。本発明の化合物は種々の多形形態を示し得るものであって、本発明はこのようなすべての形態を包含することが意図される。
【００３４】
本明細書に記載される任意の化合物は、当該特定の化合物も一定の変形または形態も意図される。上記の式（Ｉ）で表される本発明の化合物は立体異性体を含む。本明細書で用いられる「立体異性体」との用語は、当該化合物の任意のエナンチオマー、ジアステレオマーまたは幾何異性体（Ｅ／Ｚ）を含む。特には、本明細書に記載される化合物は不斉中心を有し得、それゆえ、種々のエナンチオマーまたはジアステレオマー型が存在する。よって、本明細書に記載される任意の所定の化合物は、ラセミ化合物、１または複数のエナンチオマー型、１または複数のジアステレオマー型およびこれらの混合物のいずれかを表すことが意図される。同様に、二重結合についての立体異性または幾何異性もまた可能であり、それゆえ、いくつかの場合では、分子は（Ｅ）−異性体または（Ｚ）−異性体（トランスおよびシス異性体）として存在することができる。分子がいくつかの二重結合を含有する場合、各二重結合は、その分子の他の二重結合の立体異性と同一でも異なっていてもよい独自の立体異性を有することになる。本明細書に記載される化合物のエナンチオマー、ジアステレオマーおよび幾何異性体を含むあらゆる立体異性体ならびにこれらの混合物は本発明の範囲内であるとみなされる。
【００３５】
さらに、本明細書に記載される任意の化合物は、互変異性体として存在し得る。具体的には、互変異性体との用語は、平衡状態で存在し、ある異性体から他の異性体へ直ちに変換される２または複数の化合物の構造異性体の１つを意味する。一般的な互変異性体は、エナミン−イミン、アミド−イミド酸、ケト−エノール、ラクタム−ラクチムなどである。
【００３６】
特に明記しない限り、本発明の化合物は、同位体で標識された形態、すなわち、１または複数の同位体が濃縮された原子が存在することのみが異なる化合物も意味する。例えば、少なくとも１つの水素原子を重水素もしくは三重水素に置き換える、または、少なくとも１つの炭素を１３Ｃ−もしくは１４Ｃ−濃縮炭素に置き換える、または、少なくとも１つの窒素を１５Ｎ−濃縮窒素に置き換える以外は現在の構造を有する化合物は本発明の範囲内である。
【００３７】
式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩もしくは溶媒和物は、好ましくは、薬学的に許容可能または実質的に純粋な形態である。薬学的に許容可能な形態とは、とりわけ、希釈剤や担体などの通常の医薬品添加物を除き、薬学的に許容可能な純度のレベルを有し、かつ、通常の投与量レベルで毒性と考えられる物質を含まないことを意味する。薬剤物質の純度レベルは、好ましくは、５０％を上回り、より好ましくは、７０％を上回り、最も好ましくは、９０％を上回る。好ましい態様において、式（Ｉ）の化合物またはその塩、溶媒和物もしくはプロドラッグは９５％を上回る。
【００３８】
より簡潔に説明するために、本明細書に記載される量的表現のいくつかは「約」との用語で特定されていない。「約」との用語が明確に使用されていてもいなくても、本明細書に記載されるあらゆる量は、実際の所定の値に言及することを意味するとともに、当該所定の値についての実験および／または測定条件に起因する等価量および近似値を含む、当技術分野における通常の技術に基づいて合理的に推測できる当該所定の値の近似値に言及することも意味すると理解される。
【００３９】
本発明の化合物において、Ａ---はＯ＝またはＯＨを表す。特定の態様では、Ａ---はＯ＝である。
【００４０】
特定の態様によれば、本発明の化合物において、Ｒ１は水素またはヒドロキシル保護基であり、かつ、Ｒ２は
【化５】
2018515461.tif 000007
から選択される。
【００４１】
より詳細には、Ｒ１は水素またはヒドロキシル保護基であり、かつ、Ｒ２は
【化６】
2018515461.tif 000008
である。
【００４２】
さらにより詳細には、Ｒ１は水素またはメチルであり、かつ、Ｒ２は
【化７】
2018515461.tif 000009
である。
【００４３】
別の特定の態様によれば、本発明の化合物において、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、
【化８】
2018515461.tif 000010
から選択される環を形成する。
【００４４】
より詳細には、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、
【化９】
2018515461.tif 000011
から選択される環を形成する。
【００４５】
本発明の化合物において、Ｒ３は水素またはヒドロキシル保護基である。特定の態様では、Ｒ３は水素である。
【００４６】
本発明の化合物において、Ｒ５は水素またはクロロなどのハロゲンである。特定の態様では、Ｒ５は水素またはクロロである。
【００４７】
特定の態様によれば、本発明の化合物において、Ｒ６は水素であり、かつ、Ｒ７はＣＨＯまたはＣＨ２（ＯＨ）である。より詳細には、Ｒ６は水素であり、かつ、Ｒ７はＣＨＯである。
【００４８】
別の特定の態様によれば、本発明の化合物において、Ｒ６およびＲ７は一緒に単結合を形成する。
【００４９】
本発明の化合物において、Ｒ８は水素またはヒドロキシル保護基である。特定の態様において、Ｒ８は水素である。
【００５０】
Ｒ１，Ｒ３，Ｒ６，Ｒ８，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４およびＲ１５の代表的なヒドロキシル保護基は、
−  式−Ｒ’のエーテル；
−  式−Ｃ（＝ＯＲ）Ｒ’のエステル；および
−  式−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’のカーボネート
（ここで、Ｒ’は、独立に、置換または非置換のアルキルおよび置換または非置換のアリールから選択することができる。）である。
【００５１】
当業者であれば分かるように、ヒドロキシル保護基は酸素原子を考慮して一般的に命名される。従って、「エーテル」、「エステル」および「カーボネート」などの用語は、本明細書においては実際には酸素原子により形成される化学基、すなわち、それぞれ−ＯＲ’、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’または−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ’を意味する。
【００５２】
より具体的には、ヒドロキシ保護基としては、メチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、アリルエーテル、メトキシメチルエーテル、２−メトキシエトキシメチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチルエーテル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、１−メトキシエチルエーテル、１−エトキシエチルエーテル、１−ｎ−プロポキシエチルエーテル、１−イソプロポキシエチルエーテル、１−ｎ−ブトキシエチルエーテル、１−イソブトキシエチルエーテル、１−ｓｅｃ−ブトキシエチルエーテル、１−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルエーテル、１−エトキシ−ｎ−プロピルエーテル、メトキシプロピルエーテル、エトキシプロピルエーテル、１−メトキシ−１−メチルエチルエーテル、１−エトキシ−１−メチルエチルエーテル；テトラヒドロピラニルおよび関連エーテルなどのエーテル； アセテート、ベンゾエート、ピバレート、メトキシアセテート、クロロアセテート、レブリネートなどのエステル；ベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、ｔｅｒｔ−ブチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル)エチルカーボネート、アリルカーボネートなどのカーボネート、が挙げられる。
【００５３】
本発明の特に好ましい化合物は、以下の化合物：
【化１０】
2018515461.tif 000012
またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体もしくは溶媒和物である。
【００５４】
さらなる好ましい態様においては、上記式中における種々の基および置換基について上述される好ましい選択肢が組み合わされる。本発明はこのような組み合わせにも向けられる。
【００５５】
化合物ＭＤＮ−００８９からＭＤＮ−００９４は、オニココラ属として同定された菌から単離された。該菌はメディナ財団（Fundacion MEDINA）の微生物株保存機関に受託番号ＣＦ−１０７６４４で寄託され、また、ブダペスト条約の下、ＣＢＳ真菌生物多様性センター（Centraalbureau voor Schimmelcultures）（ウップサララン  ８，３５８４  ＣＴ  ユトレヒト、オランダ）の微生物株保存機関に受託番号ＣＢＳ１３９２３０で寄託される。
【００５６】
本発明の１つの側面は、受託番号ＣＢＳ１３９２３０でＣＢＳに寄託されたオニココラ属の前記菌株、ならびに生物学的に純粋な培養物を含むその培養物である。この微生物の説明は、以下の実験部分で提供される。
【００５７】
したがって、本発明の抗腫瘍化合物は、発酵において相当量が蓄積されるまで、以下に示すような適切な栄養培地においてオニココラＣＦ−１０７６４４菌株  ＣＢＳ１３９２３０を培養することにより得てもよい。
【００５８】
菌株は通常、資化性の炭素源および窒素源を含有する水性栄養培地において培養する。例えば、培養物は液内（submerged）好気条件下で（例えば、振盪培養、液内培養など）または固体発酵において増殖させてもよい。水性培地は好ましくは発酵プロセスの開始および終了（採取）の時点で約６〜８のｐＨに維持される。所望のｐＨはモルホリノエタン−スルホン酸（ＭＥＳ）、モルホリノプロパン−スルホン酸（ＭＯＰＳ）などの緩衝液の使用や、緩衝特性を本質的に有する栄養物質を選択することにより維持してもよい。栄養培地における適切な炭素源としては、グルコース、キシロース、ガラクトース、グリセリン、デンプン、スクロース、デキストリンなどの炭水化物が挙げられる。使用し得る他の適切な炭素源としては、マルトース、ラムノース、ラフィノース、アラビノース、マンノース、コハク酸ナトリウムなどが挙げられる。適切な窒素源は、酵母抽出物、肉抽出物、ペプトン、グルテンミール、綿実ミール、大豆ミールおよび他の植物ミール（部分的または全体的に脱脂）、カゼイン加水分解物、大豆加水分解物、酵母加水分解物、コーンスティープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、フェザーミール、ピーナッツ粉末、蒸留可溶物など、ならびにアンモニウム塩（硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなど）、尿素、アミノ酸などの無機および有機窒素化合物である。微量の成長因子、ビタミンや大量の無機栄養素を含有する不純物質もまた使用に適していることから、有利には組み合わせて用い得る炭素源および窒素源は、それぞれ純粋な形で用いる必要はない。必要であれば、炭酸ナトリウムまたはカルシウム、リン酸ナトリウムまたはカリウム、塩化ナトリウムまたはカリウム、ヨウ化ナトリウムまたはカリウムなどの無機塩、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩などを培地に加えてもよい。必要であれば、特には培養培地が過剰に泡立つ場合は、１または複数の消泡剤（例えば、流動パラフィン、脂肪油、植物油、鉱油またはシリコーン）を加えてもよい。液内好気培養条件は、膨大な量の細胞を生産するために細胞を培養する典型的な方法である。小規模生産については、フラスコまたは瓶において振盪または表面培養を行ってもよい。大型タンクで増殖を行う場合は、生産プロセスにおける増殖の停滞を避けるために、生産タンクにおいて接種するために生物の栄養型（vegetative forms）を用いることが好ましい。従って、まず、「スラント」またはペトリ皿に生産された生物の胞子または菌糸を有する培養培地の比較的少量を接種し、「種培地」とも呼ばれる前記接種された培地を培養することにより、生物の栄養種菌（vegetative inoculum）を生産し、その後、培養された栄養種菌を無菌で大型タンクに移すことが望ましいであろう。種菌が生産される発酵培地は、一般的には接種前に該培地を滅菌するために加圧滅菌処理される。培地のｐＨは一般的には加圧滅菌処理工程の前に約６〜７に調整する。培養混合物の撹拌および通気は種々の方法で達成されてよい。撹拌は、プロペラもしくは類似の機械的撹拌機器、発酵槽を回転させるもしくは振ること、種々のポンプ機器、または無菌の空気を培地に通過させることにより提供されてよい。発酵は通常、約２０℃および３０℃の間（例���ば、約２２℃および２５℃の間）の温度で約７〜２１日の期間行われ、パラメーターは発酵の条件や規模に従って変化してもよい。発酵を行うための好ましい培養／生産培地としては実施例に記載される培地が挙げられる。ＬＳＦＭまたはＢＲＦＴなどの培養培地が特に好ましい。
【００５９】
本発明の化合物の粗活性抽出物からの分離および精製は、常法のクロマトグラフィー技術の適切な組み合わせを用いて行うことができる。
【００６０】
さらに、本発明の化合物は、天然源から既に得られたものを改変すること、または種々の化学反応、例えば、誘導体化、保護／脱保護および異性化反応を用いて既に改変されたものをさらに改変することにより得ることができる。従って、ヒドロキシル基は、標準的なカップリングまたはアシル化手順により、例えば、ピリジンなどにおいて酢酸、塩化アセチルまたは無水酢酸を用いて、アシル化することができる。ホルメート基は、ギ酸においてヒドロキシル前駆体を加熱することにより得ることができる。カルバメートは、イソシアネートとともにヒドロキシル前駆体を加熱することにより得ることができる。ヒドロキシル基は、ヨウ化物、臭化物または塩化物のために中間体スルホネートを介するか、またはフッ化物のために硫黄トリフルオリドを直接用いてハロゲン基へ変換することができ、あるいは、中間体スルホネートの還元により水素に還元することができる。ヒドロキシル基はまた、臭化、ヨウ化またはスルホン酸アルキルを用いるアルキル化によりアルコキシ基に、または、例えば、保護２−ブロモエチルアミンを用いてアミノ低級アルコキシ基に変換することができる。アミド基は、例えば、ピリジンなどにおいてＫＨおよびヨウ化メチルまたは塩化アセチルをそれぞれ用いることによる標準的なアルキル化またはアシル化手順によりアルキル化またはアシル化することができる。エステル基は、カルボン酸に加水分解またはアルデヒドもしくはアルコールに還元することができる。カルボン酸は、標準的なカップリングまたはアシル化手順により、アミンと一緒にアミドを提供することができる。カルボニル化合物は、標準的な手順によってアルコールに還元することができる。二重結合は、公知の方法によってエポキシ化することができる。必要であれば、置換基に適当な保護基を用いて反応基が影響を受けないようにすることができる。これらの誘導体を調製するのに必要な手順や試薬は当業者に知られており、March’s Advanced Organic Chemistry 6th Edition 2007, Wiley Interscienceなどの一般的な教科書に見出すことができる。当業者であれば分かるように、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）の他の化合物の調製における中間産物として有用であり得る。
【００６１】
上記化合物の重要な特徴は、それらの生物活性、特には、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤としてのそれらの活性、したがって癌治療におけるそれらの有用性である。よって、本発明のさらなる面としては、癌の処置および／または予防に使用するための、少なくとも式（Ｉ）の化合物、場合により、少なくとも他の抗癌剤および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含んでなる、種々の医薬形態の医薬または組成物に関する。
【００６２】
医薬組成物の例としては、経口、局所または非経口（例えば、静脈内）投与のための任意の固体（錠剤、丸剤、カプセル剤、粒剤など）、半固体（クリーム、軟膏など）または液体（液剤、懸濁剤または乳剤）組成物が挙げられる。
【００６３】
個々の医薬は、その投与経路によるが、当業者に知られる１または複数の賦形剤も含有してもよい。本発明による医薬は、当業者に知られる標準的な手順に従って製造してもよい。
【００６４】
「賦形剤」との用語は、有効成分以外の薬剤化合物の成分を意味する（欧州医薬品庁（ＥＭＡ）から得られた定義）。好ましくは、「担体、アジュバントおよび／またはビヒクル」が挙げられる。担体は、薬剤の伝達や有効性を向上させるために、物質が配合される形態である。薬剤担体は、イン・ビボでの薬物作用を延長し、薬物代謝を減らし、薬物毒性を低減させるために、放出制御技術などの薬物伝達システムにおいて使用される。担体は、薬理活性の標的部位への薬物伝達の有効性を増加させるための設計においても使用される（アメリカ国立医学図書館、国立衛生研究所）。アジュバントは、予測可能な形で有効成分の活性に影響を与える、製剤処方物に添加される物質である。ビヒクルは、医薬の投与のために量を増すための媒体として使用される、好ましくは治療作用を有しない賦形剤または物質である（Stedman's Medical Spellchecker, （著作権） 2006 Lippincott Williams & Wilkins）。このような医薬担体、アジュバントまたはビヒクルは、水や、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む油などの滅菌液、賦形剤、崩壊剤、湿潤剤または希釈剤とすることができる。適切な医薬担体はE.W.Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。これらの賦形剤の選択や使用する量は、医薬組成物の適用の形態に依存するであろう。
【００６５】
本明細書において使用される「処置する（treat）」、「処置する（treating）」および「処置」との用語は、一般に、癌をその発症後に根絶、除去、逆転、緩和、調節または制御することを含む。
【００６６】
本明細書において使用される「予防（prevention）」、「予防する（preventing）」、「予防の」、「予防する（prevent）」および「予防（prophylaxis）」との用語は、所定の物質、組成物または医薬が癌の発症または進行をその発症前に回避する、最小にするまたは困難にする能力を意味する。
【００６７】
本発明はまた、式（Ｉ）の化合物と他の抗癌剤との組み合わせを包含する。少なくとも式（Ｉ）の化合物と少なくとも他の抗癌剤との組み合わせは、その同時、個別または逐次投与のために処方されてもよい。このことは、２つの化合物の組み合わせが、
−  同一の医薬処方物の一部であり、ひいては２つの化合物が常に同時に投与される組み合わせとして、
−  同時、逐次または個別投与の可能性を生じさせる、各ユニットが１つの物質を有する２つのユニットの組み合わせとして
投与され得ることを含む。
【００６８】
特定の態様においては、式（Ｉ）の化合物は、他の抗癌剤と独立して（すなわち、２つのユニットにおいて）、しかし同時に投与される。
【００６９】
他の特定の態様においては、まず式（Ｉ）の化合物が投与され、次に他の抗癌剤が個別にまたは逐次投与される。
【００７０】
さらに他の特定の態様においては、まず他の抗癌剤が投与され、次に式（Ｉ）の化合物が上記で定義されるように個別にまたは逐次投与される。
【００７１】
本発明の他の側面としては、癌に罹患している、または癌に罹患する可能性がある患者、特にはヒトを処置する方法であって、そのような処置または予防を必要とする患者に式（Ｉ）の化合物の有効量を投与することを含んでなる方法である。
【００７２】
本発明の式（Ｉ）の化合物が使用され得る癌の例としては、限定されないが、膵臓癌が挙げられる。
【００７３】
薬剤または薬理活性物質の「有効」量または「治療上の有効量」は、毒性を示さないが、該薬剤または物質が所望の効果を提供するのに十分な量を意味する。本発明の療法において、式（Ｉ）の化合物の「有効量」は、所望の効果を提供するのに有効な化合物の量である。「有効」な量は、個人の年齢や一般的な症状、個別の活性物質などに応じて被験者により異なる。従って、正確な「有効量」を特定することが常に可能なわけではない。しかしながら、個々の症例における適当な「有効量」は日常的な実験を用いて当業者により決定され得る。
【００７４】
以下の実施例は本発明の特定の態様を単に例示するものであり、本発明を何等か限定するものとみなされるものではない。
【実施例】
【００７５】
実施例１：菌株の記載
生産菌（ＣＦ−１０７６４４  ＣＢＳ１３９２３０）は、スペインで採取した土壌サンプルから単離した。
【００７６】
菌は、２％麦芽寒天培地で、金色のコロニー、適度に生育した菌糸体、クッション形、黄褐色から赤褐色へと変化する黄色を呈する。菌糸は、幅１〜２μｍの無色透明であり、側方、密接に巻き付けられた繁殖可能な枝を有し、これは分節型分生子に分離し、分生子は空の細胞と交互になる。分生子は、円筒形で端が尖っており、淡黄色で、３−６．５×２．５−４．５μｍである。
【００７７】
菌株ＣＦ−１０７６４４の系統発生位置を推定するために、麦芽酵母抽出物寒天上で増殖させた菌糸体からゲノムＤＮＡを抽出した。Ｄ１  Ｄ２可変ドメインを含む２８Ｓ  ｒＤＮＡの部分配列を含むｒＤＮＡ領域を、プライマーＮＬ１およびＮＬ４で増幅し（O’Donnell K, 1993. Fusarium and its near relatives. In: Reynolds DR, Tailor JW (eds). The fungal holomorph: mitotic, meiotic and pleomorphic speciation in fungal systematic, CAB international, Wallingford, UK, pp. 225-233）、ＤＮＡ配列を生成した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ  ＣＴ）を用いて、メーカー推奨の手順に従って、約０．１μｇ／ｍＬの二本鎖増幅産物を配列決定した。精製したＰＣＲ産物を、ＰＣＲ反応と同じプライマー対を用いて直接的に配列決定した。配列決定反応で得られた部分配列をＧｅｎｅｓｔｕｄｉｏ  ２．１．１．５（Ｇｅｎｅｓｔｕｄｉｏ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｗａｎｅｅ、ＧＡ、ＵＳＡ）を用いて組み立てた。２８Ｓ  ｒＤＮＡ配列（ｗｗｗ．ｆｕｎｇａｌｂａｒ．ｏｒｇ）とのデータベースマッチングにより、Ａｒａｃｈｎｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｉｄｕｓ  ＩＦＯ  ３２０４８菌株との非常に高い配列類似性（９９％）が得られ、菌株ＣＦ−１０７６４４はＡ．ｎｉｔｉｄｕｓと遺伝的に類似し、おそらく同属であることが示された。他の真正菌株であるＡｒａｃｈｎｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｉｄｕｓ  ＮＢＲＣ  ３２０４８との高い類似のスコア（９９％）は、ＣＦ−１０７６４４がＡｒａｃｈｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｅｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｅｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ、Ａｒａｃｈｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ａｒａｃｈｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）に対してオニココラ属ａｎａｍｏｒｐｈｏｕｓとして分類できることを示した。
【００７８】
実施例２：液体培地での液内における発酵
ＬＳＦＭと名付けられた培地（グリセロール１８．７ｇ、グルコース４０ｇ、ＮＨ４ＳＯ４２ｇ、Ｓｉｇｍａ酵母自己消化物５ｇ、大豆粉５ｇ、トマトペースト５ｇ、クエン酸ナトリウム２ｇ、蒸留水１０００ｍＬ）の抽出物から最も強力な活性がさらなる研究のために選択された。ＭＡＰＫ経路阻害剤活性を特徴付けるための最初のサンプルは、各６０ｍｍプレートから５つの菌糸ディスクを切断し、酵母抽出物および希釈寒天（ＳＭＹＡ）（Ｄｉｆｃｏネオペプトン１０ｇ、マルトース４０ｇ、Ｄｉｆｃｏ酵母エキス１０ｇ、寒天４ｇ、蒸留水１０００ｍｌ）を補充したサブロー・マルトース培養液１２ｍＬおよび２つのカバーグラス（２２×２２ｍｍ）を含むチューブ（２５×１５０ｍｍ）の底部で破砕することによって調製した。チューブをオービタルシェーカー（２２０ｒｐｍ、５ｃｍスロー）上で攪拌して、均質菌糸懸濁液を作製した。７日間の種菌期の培養後、０．３ｍＬアリコートを使用して、２×１０ｍＬのＥＰＡバイアル中の１０ｍＬのＬＳＦＭ培地に接種した。チューブを通気撹拌発酵（２２０ｒｐｍ）で、２１日間、２２℃でインキュベートした。これらのチューブからの菌糸体および培養液をアセトンで抽出し、蒸発によりアセトンを除去した後、水性残渣を用いて一連の活性分子を検出した。活性の原因となる分子をさらに特徴付けるために、１−Ｌ発酵を調製した。１０個の菌糸体ディスクを使用して５０ｍＬのＳＭＹＡに接種した。７日後、この培養物の３ｍＬアリコートを使用してＬＳＦＭ培地（５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中１０×１００ｍＬ培地）に接種した。フラスコを通気撹拌発酵（２２０ｒｐｍ、５ｃｍスロー）、２２℃、相対湿度７０％で２１日間インキュベートした。
【００７９】
実施例３：固体培地における発酵
前記菌のＢＲＦＴ［５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ当たり、褐色米２０ｇ、ベース液（base liquid）４０ｍＬ（酵母抽出物１ｇ、酒石酸ナトリウム０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、蒸留水１０００ｍＬ）］固体培地中での培養も行い、化合物ＭＤＮ−００９０の化学的誘導体のより広いスペクトルがもたらされた。
【００８０】
この実施例において前記分子をさらに特徴付けるために、４００ｍＬの発酵物を調製した。１０個の菌糸体ディスクを使用して、５０ｍＬのＳＭＹＡ培養物に接種した。７日後、この培養物の３ｍＬアリコートを使用してＢＲＦＴ培地（１０個のエルレンマイヤーフラスコ）に接種した。フラスコを静止状態、２２℃、相対湿度７０％で２１日間インキュベートした。
【００８１】
実施例４：ＭＤＮ−００８９からＭＤＮ−００９４までの単離および構造同定
発酵ブロス（フラスコ中の１Ｌ、ＢＲＦＴ培地）を２２０ｒｐｍでの連続振盪の下、２．５時間、アセトン（１Ｌ）で抽出した。菌糸体を遠心分離で分離し、上清（２Ｌ）を窒素気流の下、アセトンの大部分を除去して１Ｌに濃縮した。濾紙による濾過後の残りの１Ｌ溶液に、あらかじめ水と平衡化されたＳＰ−２０７ＳＳ逆相樹脂（臭素化スチレンポリマー、６５ｇ）を詰めたカラムに、連続１：１水希釈とともに充填した。カラムをさらに水（１Ｌ）で洗浄し、その後、最終１００％アセトンの１２分間の洗浄ステップを伴う、１８ｍＬ／分で２０分間の２０％〜１００％の水中アセトンの段階的勾配を用いて溶出し、１８ｍＬの１５のフラクションを収集した。目的化合物は、得られたフラクションのバイオアッセイにより８０〜１００％アセトン−水フラクション（３フラクションで収集）に位置した。
【００８２】
これらのフラクションを、３５分を超える４５％〜８０％のＣＨ３ＣＮ−ＴＦＡで水中ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）の直線勾配を伴う逆相分取ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８、２１．２×２５０ｍｍ、７μｍ；２０ｍＬ／分、２１０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶ検出）によりさらに精製すると、化合物ＭＤＮ−００８９を含有するフラクションは１０．０分で、ＭＤＮ−００９０は１１．１分で、ＭＤＮ−００９１は１３．５分で、ＭＤＮ−００９２は１６．０分で、ＭＤＮ−００９３は１８．４分で、およびＭＤＮ−００９４は２２．０分で溶出された。
【００８３】
ＭＤＮ−００８９およびＭＤＮ−００９０を含むフラクションを、３４分を超える５０％〜６５％の水中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を伴う逆相セミ分取ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ８、９．４×２５０ｍｍ、５μｍ；３．６ｍＬ／分、２１０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶ検出）によりさらに精製すると、化合物ＭＤＮ−００８９（５．８ｍｇ）は１１．２５分で、ＭＤＮ−００９０（６．６ｍｇ）は１３．０分で溶出された。
【００８４】
ＭＤＮ−００９１およびＭＤＮ−００９２を含むフラクションを、３４分を超える５５％〜６５％の水中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を伴う逆相セミ分取ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ８、９．４×２５０ｍｍ、５μｍ；３．６ｍＬ／分、２１０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶ検出）によりさらに精製すると、ＭＤＮ−００９１（４．８ｍｇ）およびＭＤＮ−００９２（６．０ｍｇ）を含有するフラクションはそれぞれ１２．５分および１５．５分で溶出された。
【００８５】
ＭＤＮ−００９３を含むフラクションを、３４分を超える５８％〜７０％の水中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を伴う逆相セミ分取ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ８、９．４×２５０ｍｍ、５μｍ；３．６ｍＬ／分、２１０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶ検出）によりさらに精製すると、化合物ＭＤＮ−００９３（４．０ｍｇ）は１５．２５分で溶出された。
【００８６】
ＭＤＮ−００９４を含むフラクションを、３４分を超える６０％〜６８％の水中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を伴う逆相セミ分取ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ８、９．４×２５０ｍｍ、５μｍ；３．６ｍＬ／分、２１０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶ検出）によりさらに精製すると、化合物ＭＤＮ−００９４（７．２ｍｇ）は１８．０分で溶出された。
【００８７】
ＭＤＮ−００８９：黄色の固体；UV (DAD) λmax 264, 288 & 332(sh) nm; IR (ATR) γ cm-1: 3166, 2978, 1690, 1636, 1573, 1468, 1373, 1342, 1263, 1201, 1161, 1078, 826, 771. HRMS m/z 371.1128 [M+H]+ (C20H19O7+についての計算値, 371.1125, Δ 0.7 ppm);  388.1390 [M+NH4]+ (C20H22NO7+についての計算値, 388.1391, Δ -0.2ppm)；１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータは表１を参照：
【００８８】
【表１】
2018515461.tif 000013
【００８９】
【化１１】
2018515461.tif 000014
【００９０】
ＭＤＮ−００９０：黄色の固体；UV (DAD) λmax 288, 329(sh) nm; IR (ATR) γ cm-1: 3294, 2979, 2914, 2858, 1630, 1575, 1444, 1376, 1297, 1244, 1208, 1173, 1079, 829, 732. HRMS m/z 357.1330 [M+H]+ (calc. for C20H21O6+, 357.1333, Δ -0.7 ppm);  379.1147 [M+Na]+ (C20H20O6Na+についての計算値, 379.1152, Δ -1.3 ppm); 339.1223 [M+H-H2O]+ (C20H19O5+についての計算値, 339.1227, Δ -1.2 ppm)；１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータは表２を参照：
【００９１】
【表２】
2018515461.tif 000015
【００９２】
【化１２】
2018515461.tif 000016
【００９３】
ＭＤＮ−００９１：黄色の固体；UV (DAD) λmax 264, 288, 360(sh) nm; IR (ATR) γ cm-1: 3313, 2977, 2928, 2865, 1635, 1583, 1455, 1374, 1305, 1258, 1212, 1155, 1112, 829. HRMS m/z 355.1179 [M+H]+ (C20H19O6+についての計算値, 355.1176, Δ 0.8 ppm);  377.0994 [M+Na]+ (C20H18O6Na+についての計算値, 377.0996, Δ -0.5 ppm)；１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータは表３を参照：
【００９４】
【表３】
2018515461.tif 000017
【００９５】
【化１３】
2018515461.tif 000018
【００９６】
ＭＤＮ−００９２：黄色の固体；UV (DAD) λmax 232, 288, 332(sh) nm; IR (ATR) γ cm-1: 3289, 2967, 2918, 2855, 1636, 1581, 1439, 1374, 1305, 1250, 1209, 1166, 1082, 981. HRMS m/z 371.1496 [M+H]+ (C21H23O6+についての計算値, 371.1489, Δ 1.9 ppm);  353.1390 [M+H-H2O]+ (C21H21O5+についての計算値, 353.1389, Δ 0.3 ppm)；１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータは表４を参照：
【００９７】
【表４】
2018515461.tif 000019
【００９８】
【化１４】
2018515461.tif 000020
【００９９】
ＭＤＮ−００９３：黄色の固体；UV (DAD) λmax 286, 328(sh) nm; IR (ATR) γ cm-1: 3366, 2965, 2924, 2856, 1632, 1440, 1375, 1323, 1301, 1263, 1237, 1205, 1165, 983, 837. HRMS m/z 405.1099 [M+H]+ (C21H23O6+についての計算値, 405.1099, Δ 0ppm);  387.0994 [M+H-H2O]+ (C21H21O5+についての計算値, 389.0999, Δ -1.3 ppm)；１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータは表５を参照：
【０１００】
【表５】
2018515461.tif 000021
【０１０１】
【化１５】
2018515461.tif 000022
【０１０２】
ＭＤＮ−００９４：黄色の固体；UV (DAD) λmax 236, 266, 300, 324, 396 (sh) nm; IR (ATR) γ cm-1: 3309, 2956, 2917, 2853, 1656, 1590, 1573, 1490, 1458, 1426, 1362, 1320, 1271, 1213, 1100, 978, 827. HRMS m/z 341.1385 [M+H]+ (C20H21O5+についての計算値, 341.1384, Δ 0.3 ppm);  703.2513 [2M+Na]+ (C40H40O10Na+についての計算値, 703.2514, Δ -0.1 ppm)；１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータは表６を参照：
【０１０３】
【表６】
2018515461.tif 000023
【０１０４】
【化１６】
2018515461.tif 000024
【０１０５】
実施例５：ＭＤＮ−００９０単離のスケールアップ
発酵ブロス（フラスコ中の４．５Ｌ、ＬＳＦＭ培地）を濾過し、細胞をすりつぶし、メチルエチルケトン（６×１Ｌ）で抽出した。液体上清も同じ有機溶媒（２×３Ｌ）で抽出した。合わせた有機相を蒸発乾固して１７．７ｇの粗抽出物を得、これを逆相シリカゲル（ＲＰ１８）クロマトグラフィー（７０ｇ  Ｃ１８、４０−６０μｍ）に付した。カラムを、３０％の水中ＣＨ３ＣＮで７分間洗浄し、最終１００％ＣＨ３ＣＮの１０分間の洗浄ステップを伴う、１８ｍＬ／分で４３分間の３０％〜１００％の水中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を用いて溶出し、１８ｍＬの５７フラクションを収集した。化合物ＭＤＮ−００９０は、ＨＰＬＣ−ＭＳにより７０〜８０％ＣＨ３ＣＮ画分に溶出することが検出された。
【０１０６】
これらのフラクションを、３５分を超える４５％〜５５％の水中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を伴う逆相セミ分取ＨＰＬＣ（ｘ−ブリッジＣ１８，１０×１５０ｍｍ、５μｍ；３．６ｍＬ／分、２１０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶ検出）によりさらに精製すると、化合物ＭＤＮ−００９０（６７５ｍｇ）は１２．５分で溶出された。
【０１０７】
実施例６：化合物ＭＤＮ−００８９、ＭＤＮ−００９０、ＭＤＮ−００９１、ＭＤＮ−００９２、ＭＤＮ−００９３およびＭＤＮ−００９４の抗腫瘍活性の評価
腫瘍性膵臓細胞株（ＭｉａＰａｃａ−２およびＢｘＰＣ３）を用いて化合物の活性を検出した。この目的のために、ＭＴＴ試験を用いた。細胞を１０６細胞／ウェルで播種し、７２時間、化合物で処理した。
【０１０８】
【表７】
2018515461.tif 000025
【０１０９】
ＭＤＮ−００９０の腫瘍性膵臓細胞株に対する増殖阻害効果は図１でも確認できる。
【０１１０】
実施例７：化合物ＭＤＮ−００８９、ＭＤＮ−００９０、ＭＤＮ−００９２およびＭＤＮ−００９３の細胞毒性およびアポトーシス活性の評価
ＭｉａＰａｃａ２細胞株をＭＤＮ−００８９、ＭＤＮ−００９０、ＭＤＮ−００９２およびＭＤＮ−００９３活性のさらなる評価に使用した。ＡｐｏＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙを用いて、３つのパラメーター（生存率、細胞毒性およびアポトーシス）を評価した。
【０１１１】
生存率：生細胞プロテアーゼ活性は完全な生存細胞に限定され、蛍光性の細胞浸透性ペプチド基質（グリシルフェニルアラニル−アミノフルオロクマリン；ＧＦ−ＡＦＣ）を用いて測定される。基質は完全な細胞に入り、生細胞プロテアーゼ活性によって切断され、生存細胞の数に比例した蛍光シグナルを生成する。
【０１１２】
細胞毒性：膜の完全性を失った細胞から放出される死細胞プロテアーゼ活性を測定するために、細胞不透過性蛍光ペプチド基質（ビス−アラニルアラニル−フェニルアラニル−ローダミン１１０；ビス−ＡＦＦ−Ｒ１１０）を使用する。ビス−ＡＡＦ−Ｒ１１０は細胞透過性ではないため、この基質からのシグナルは完全な生存細胞によっては本質的に生成されない。
【０１１３】
アポトーシス：このアッセイでは、カスパーゼ活性、ルシフェラーゼ活性および細胞溶解に最適化された試薬中にテトラペプチド配列ＤＥＶＤを含有する発光性カスパーゼ−３／７基質を供給するＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用する。
【０１１４】
【表８】
2018515461.tif 000026
【０１１５】
実施例８：化合物ＭＤＮ−００８９、ＭＤＮ−００９０、ＭＤＮ−００９２およびＭＤＮ−００９３の細胞周期阻害活性の評価
ＭＤＮ−００８９、ＭＤＮ−００９０、ＭＤＮ−００９２およびＭＤＮ−００９３の効力を測定するために、色素ＣＦＳＥおよび高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）装置を使用した。ＭｉａＰａｃａ＿２細胞株を使用した。細胞を１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。培地を除去し、化合物および標準物質を新鮮な培地に異なる濃度（１μＬの化合物／２００μＬの新鮮な培地）で添加した。ＤＭＳＯ濃度はすべてのウェルで０．５％であった。７２時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、ＨＣＳ装置でプレートを読み取った。
【０１１６】
【表９】
2018515461.tif 000027
【０１１７】
実施例９：化合物ＭＤＮ−００８９、ＭＤＮ−００９０、ＭＤＮ−００９２およびＭＤＮ−００９３のＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤の評価
メンブレンを読み取るＯｄｉｓｓｅｙ  Ｌｉｃｏｒ装置を用いてウェスタンブロット技術を使用した。ｐＥＲＫ１＿２抗体を一次抗体として使用し、二次抗体として抗マウス抗体を使用した。次に、β−アクチンを用いてメンブレンを定量した。結果を表１０に示す。
【０１１８】
【表１０】
2018515461.tif 000028
【０１１９】
表１０に示すように、全ての化合物は、２４時間処理後にｐＥＲＫ１＿２量を減少させた。
【０１２０】
この効果を、ｐ−ＥＲＫキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＭＤＮ−００９０について調べた。細胞を７５０００細胞／ウェルで９６ウェル／プレートに播種した。２４時間後、培地を除去し、新鮮な培地とともに化合物を添加した。２４時間処理した後、細胞を溶解した。１５μＬの溶解物および１５μＬの試薬を添加した。２時間インキュベーションした後、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナル（発光／蛍光））を読み取るＥｎＶｉｓｉｏｎ装置を用いてプレートを読み取った。表１１および図２を参照。
【０１２１】
【表１１】
2018515461.tif 000029
【０１２２】
実施例１０：細胞毒性の評価
ＭＤＮ−００８９、ＭＤＮ−００９０およびＭＤＮ−００９２は、ＨｅｐＧ２において７２時間で中程度の活性効果を示した。ＭＤＮ−００９３は、ＨｅｐＧ２において７２時間で高い活性効果を示した。
【０１２３】
【表１２】
2018515461.tif 000030
【０１２４】
実施例１１：膵臓癌幹細胞における化合物ＭＤＮ−００９０の抗腫瘍活性の評価
２つの異なる膵臓腺癌由来の２つの確立された細胞株である、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＳＭＡＤ４およびＴＰ５３について突然変異したＢｘＰＣ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６８７参照）およびｋ−ＲＡＳについて突然変異したＭＩＡ−ＰａＣａ−２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４２０参照）を使用した。別段の指示がない限り、これらの細胞株は７５ｃｍ２培養フラスコ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）で維持した。全ての細胞を、加湿インキュベーター（Ｓｔｅｒｉ−Ｃｕｌｔ  ＣＯ２インキュベーター、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）内で、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。培地を４８〜７２時間ごとに交換し、最大８０％のコンフルエンスを有する培養細胞を継代した。
【０１２５】
ＣＳＣ亜集団の単離と濃縮
ＣＳＣ亜集団の単離のために、国際公開第２０１６／０２０５７２号に記載された方法論を用いた。
【０１２６】
癌幹細胞の特徴づけ
Ａｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイ
生存細胞におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）酵素活性を、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ（登録商標）キットアッセイ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）によって製造者の指示に従って測定した。Ａｌｄｅｆｌｕｏｒは、それ自体がＡＬＤＨの基質ではないＢｏｄｉｐｙ（商標）−アミノアセトアルデヒド−ジエチルアセテート（ＢＡＡＡ−ＤＡ）の形態で供給される。ＢＡＡＡ−ＤＡをＤＭＳＯに溶解し、塩酸に曝露して、完全な生存細胞の原形質膜を自由に拡散できる、ＡＬＤＨの無電荷蛍光基質であるＢｏｄｉｐｙ（商標）−アミノアセトアルデヒド（ＢＡＡＡ）に変換した。ＡＬＤＨの存在下では、ＢＡＡＡはＢｏｄｉｐｙ（商標）−アミノアセテート（ＢＡＡ）に変換され、細胞内に保持される。アッセイを行うために、１×１０６個の細胞を、細胞からのＢＡＡの流出を防止する輸送阻害剤を含む１ｍＬのＡｌｄｅｆｌｕｏｒ（登録商標）アッセイ緩衝液に再懸濁した。次いで、５μＬのＢＡＡＡを細胞懸濁液に添加し、５００μＬを別のチューブに移し、５μＬのジエチルアミノ−ベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）−ＡＬＤＨ阻害剤を添加した。両方のチューブを暗所で３０分間、３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を４℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心沈降し、冷緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。
【０１２７】
このアッセイは、細胞内ＡＬＤＨが、ＢＡＡＡを蛍光化合物ＢＡＡ（正味の負電荷のために細胞内に保持され自由に拡散しない）に変換するという事実に基づいている。明るい蛍光ＡＬＤＨ発現細胞（ＡＬＤＨ＋細胞）は、ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）において製造者が推奨する緑色蛍光チャネル（５２０〜５４０ｎｍ）で検出され、データはＦＡＣＳ  ＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析され、あるいは、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって単離された。
【０１２８】
細胞表面マーカー発現のためのフローサイトメトリー
細胞表面タンパク質の発現を測定するために、まず細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および２ｍＭ  ＥＤＴＡによって希釈することにより調製した、他の細胞表面タンパク質と非特異的結合可能な抗体部位をブロックする、１００μＬのブロッキング緩衝液に再懸濁した。その後、細胞を遠心沈降し、１０μＬのＣＤ４４−フィコエリトリン（ＰＥ）およびＣＸＣＲ４−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）抗ヒト抗体を膵臓癌細胞株（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）の細胞懸濁液に添加した。これらの抗体とのインキュベーションを４℃、暗所で１５分間行った。次いで、細胞を４℃で遠心分離し、冷ＰＢＳに再懸濁した。明るい蛍光ＰＥ、ＡＰＣおよびＦＩＴＣは、ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩを用いて、赤色（５６４−６０６ｎｍ）、青色（６５０−６７０ｎｍ）および緑色（５２０−５４０ｎｍ）の蛍光チャネルでそれぞれ検出され、得られたデータはＦＡＣＳ  ＤＩＶＡソフトウェアで解析された。
【０１２９】
腫瘍スフィア（tumorsphere）形成アッセイ
細胞の自己再生能の指標である、血清悪化条件（serum depravation conditions）下での低付着表面における腫瘍スフィア形成能は、濃縮ＣＳＣにおいて実施し全集団（ＴＰ）と比較した。簡単に述べると、ウェル当たり３×１０３個の細胞を、６ウェルの超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）に播種し、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３７℃、６日間培養した。その後、Ｌｅｉｃａ  ＣＷ４０００ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ、Ｓｏｌｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を装備したＬｅｉｃａ  ＤＭ５５００  Ｂ蛍光顕微鏡を用いて、直径が７５μＭより大きいスフィアを計数し、典型的な画像を撮影した。
【０１３０】
ＭＤＮ−００９０の活性は、膵臓癌幹細胞株（ＭｉａＰａｃａ−２およびＢｘＰＣ３）を用いて検出された。この目的のために、ＭＴＴ試験を使用した。細胞を１０６細胞／ウェルで播種し、表１３に示すように化合物で異なる時間、処理した。
【０１３１】
【表１３】
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【０１３２】
実施例１２：異種移植における抗腫瘍活性の評価
腫瘍増殖に対するＭＤＮ−００９０の効果を評価するために、異所性異種移植をＢｘＰＣ３およびＭＩＡＰａｃａ−２腫瘍細胞株の両方に使用した。８週齢の雌性ＮＯＤ  ｓｃｉｄマウスγ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ＮＳＧ）に５×１０６細胞／マウスを皮下注射して腫瘍形成を誘導した。動物（１群あたり４０匹、１０匹）を２０℃〜２４℃、湿度５０％、明暗サイクル（１４、１０時間）で飼育し、飼料と水を自由に摂取させた。腫瘍を１００ｍｍ３の平均体積まで増殖させた後、無作為に対照群（生理食塩水）とＭＤＮ−００９０（２０ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水に溶解）処置に割り当て、５０日間、週に３回腹腔内注射した。腫瘍増殖は、デジタルカリパスを用いて毎週２回評価し、腫瘍体積は式Ｖ＝（長さ）２×幅×π／６によって計算した。ＭＤＮ−００９０による処置は、図３に示すように腫瘍のサイズを減少させた。
【０１３３】
実施例１３：ＣＳＣに対する抗腫瘍活性の評価
本発明者らは、ＣＳＣから誘導された腫瘍に対するＭＤＮ−００９０の効果を評価した。本発明者らは、以前に記載された方法論（国際公開第２０１６／０２０５７２号）を用いて、ＢｘＰＣ３細胞株から膵臓ＣＳＣを単離し特徴を明らかにした。
【０１３４】
イン・ビボ実験は、雌雄のＮＯＤ  ｓｃｉｄガンママウス（ＮＳＧ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊ１／ＳｚＪ）で行った。すべての動物（１群あたり１０匹）は、１２時間の明／暗サイクルでマイクロ換気ケージシステム（microventilated cage system）中で維持し、特定の病原体のない状態を維持するために、ラミナエアフローキャビネット内で操作した。
【０１３５】
異種移植腫瘍の誘導のために、イソフルランの吸入によりマウスを麻酔し、５×１０４個のＢｘＰＣ３  ＣＳＣを腹部領域に皮下注射することにより接種した。腫瘍を１００ｍｍ３の平均体積まで増殖させた後、週に３回、５２日間の腹腔内投与の対照群（生理食塩水）およびＭＤＮ−００９０を含む処置Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水に溶解）および処置Ｂ（２０ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水に溶解）に無作為に割り当てた。腫瘍増殖は、デジタルカリパスを用いて毎週２回評価し、腫瘍体積は式Ｖ＝（長さ）２×幅×π／６によって計算した。ＭＤＮ−００９０による処置は、図４に示すように腫瘍のサイズを減少させた。
【０１３６】
実施例１４：イン・ビボ腫瘍形成能アッセイの評価
ＣＳＣ様細胞の腫瘍形成能力に対するＭＤＮ−００９０の効果を評価するために、ＢｘＰＣ３およびＭＩＡＰａｃａ−２腫瘍細胞株の両方を用いた異所性異種移植を確立した。まず、細胞をＭＤＮ−００９０でＩＣ５０で２４時間処理した後、細胞を動物に接種した。膵臓癌の非処理細胞を対照として使用した。
【０１３７】
腫瘍形成は、ＮＯＤ  ｓｃｉｄマウスガンマ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊ１／ＳｚＪ、ＮＳＧ）において、イン・ビトロ（in vitro）処理または非処理の１．５×１０４個の細胞／マウスを皮下注射することにより誘導した。動物（１群あたり２０匹、１０匹）を２０℃〜２４℃、湿度５０％、明暗サイクル（１４、１０時間）で飼育し、飼料と水を自由に摂取させた。腫瘍増殖を２日ごとに観察した。腫瘍増殖は、デジタルカリパスを用いて毎週２回評価し、腫瘍体積は式Ｖ＝（長さ）２×幅×π／６によって計算した。ＭＤＮ−００９０による処置は、図５に示すように腫瘍形成を減少させる。
【０１３８】
実施例１５：ゲムシタビンとの相乗作用の評価
ＭＤＮ−００９０による処置が、最も一般的な膵臓化学療法薬（ゲムシタビン）との相乗作用において使用できるかどうかを調べるために、腫瘍細胞株（ＭｉａＰａｃａ＿２およびＢｘＰＣ３）および癌幹細胞（ＭｉａＰａｃａ＿２およびＢｘＰＣ３）を用いてＭＴＴアッセイを行った。このようにして、ＭＤＮ−００９０用量応答曲線（０．３９〜５０μＭ）と共に異なるゲムシタビン濃度（０．０００２５〜５μＭ）を使用し、その逆もまた同様にした。このアッセイにより、本発明者らは、両方の化合物（ゲムシタビンおよびＭＤＮ−００９０）の活性が、一緒に投与された場合に増加することを観察した（表１４〜１９）。
【０１３９】
【表１４】
2018515461.tif 000032
【０１４０】
【表１５】
2018515461.tif 000033
【０１４１】
【表１６】
2018515461.tif 000034
【０１４２】
【表１７】
2018515461.tif 000035
【０１４３】
【表１８】
2018515461.tif 000036
【０１４４】
【表１９】
2018515461.tif 000037
【０１４５】
参考文献リスト
Roberts PJ, Der CJ. (2007). Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. May 14;26(22):3291-310
Yap, J. L., Worlikar, S., MacKerell, A. D., Shapiro, P. and Fletcher, S. (2011), Small-Molecule Inhibitors of the ERK Signaling Pathway: Towards Novel Anticancer Therapeutics. ChemMedChem, 6: 38-48
【図１】
2018515461.tif 000050
【図２】
2018515461.tif 000051
【図３】
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【図４】
2018515461.tif 000053
【図５】
2018515461.tif 000054
【国際調査報告】
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