(57)【要約】  本発明は、細菌の成長を標的にするのに有効なサリチルアミド化合物及びその組成物に関する。本発明の化合物及び組成物は、例えば、細菌感染症の予防又は治療、及びバイオフィルム形成の予防、低減又は排除に、特に有用である。
2018500387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性菌感染症を治療又は予防するための方法であって、処置を必要とする患者にサリチルアミド化合物を患者におけるグラム陽性菌感染症を治療又は予防するのに十分な量で投与することを含む、方法。
【請求項２】
グラム陽性菌を含む細菌バイオフィルムの形成を低減又は排除するための方法であって、サリチルアミド化合物を該バイオフィルムの形成を予防、低減又は排除するのに十分な量で投与することを含む、方法。
【請求項３】
サリチルアミド化合物が、ニクロサミド又はニタゾキサニドである、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
グラム陽性菌が、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、リステリア（Listeria）及びバチルス（Bacillus）からなる１以上の属から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
以下における使用のためのサリチルアミド化合物であって：
（ｉ）患者における細菌感染症を治療若しくは予防すること；又は
（ｉｉ）細菌バイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除すること、
該細菌が引き起こす感染症又はバイオフィルム形成がグラム陽性菌を含む、サリチルアミド化合物。
【請求項６】
患者における細菌感染症を治療若しくは予防することにおける使用のための又は細菌バイオフィルムを低減若しくは排除するための、サリチルアミド化合物を許容し得る賦形剤又は担体と一緒に含む医薬組成物又は生物学的組成物（ここで、該細菌が引き起こす感染症又はバイオフィルム形成は、グラム陽性菌を含む）。
【請求項７】
サリチルアミド化合物が、ニクロサミド若しくはその類似体、又はニタゾキサニド若しくはその類似体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む、併用剤、相乗的併用物、抗菌剤、組成物又は医薬組成物。
【請求項９】
少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物又は組成物の医薬としての使用。
【請求項１０】
細菌感染症を治療又は予防するための方法であって、処置を必要とする患者に少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を患者における細菌感染症（ここで、該細菌が引き起こす感染症は、グラム陰性菌を含む）を治療又は予防するのに十分な量で投与することを含む、方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのサリチルアミド化合物による毒性から細菌細胞を保護するための方法（ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）であって、細胞中の少なくとも１つのニトロレダクターゼ酵素の発現及び／又は活性をサリチルアミド化合物による毒性から保護するのに十分な量で増加させることを含む、方法。
【請求項１２】
患者における細菌感染症を治療若しくは予防するための又は細菌バイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除するための方法（ここで、該細菌は、ニトロ−プロドラッグ抗生物質での処置に耐性を持つようになっている）であって、少なくとも１つのサリチルアミド化合物（ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）を、感染症を治療若しくは予防するのに又はバイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除するのに十分な量で投与することを含む、方法。
【請求項１３】
患者における細菌感染症を治療若しくは予防するための又は細菌バイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除するための方法（ここで、該細菌は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物又は少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物での処置に耐性を持つようになっており、ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）であって、ニトロ−プロドラッグ抗生物質を、感染症を治療若しくは予防するのに又はバイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除するのに十分な量で投与することを含む、方法。
【請求項１４】
抗生物質的に有効な量の以下：
（ｉ）サリチルアミド化合物又はその薬学的に許容し得る塩；及び
（ｉｉ）排出ポンプ阻害化合物又はその薬学的に許容し得る塩；
を含む組成物であって、化合物（ｉ）及び（ｉｉ）が相乗的な抗生物質効果をもたらすのに十分な割合で用いられる、組成物。
【請求項１５】
サリチルアミド化合物が、ニクロサミド又はニタゾキサニドである、請求項８〜１４のいずれか一項に請求されるとおりの併用剤、併用物、組成物、使用、抗菌剤又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陽性菌によって引き起こされる細菌感染症の予防又は治療に有効なサリチルアミド化合物及びその組成物に関する。本発明はさらに、グラム陰性菌によって引き起こされる細菌感染症の予防又は治療に有効な、排出ポンプ阻害剤と併せたサリチルアミド化合物、並びにその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多剤耐性菌の台頭は、２１世紀におけるヒトが直面する最大の健康問題であろうと広く想定されている（Boucher, H. W., Talbot, G. H., Bradley, J. S., Edwards, J. E., Gilbert, D., Rice, L. B., Scheld, M., Spellberg, B. and Bartlett, J. (2009). Bad Bugs, No Drugs: No ESKAPE! An Update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48(1): 1-12; Piddock, L.J. (2012). The crisis of no new antibiotics--what is the way forward? Lancet Infect Dis. 12(3):249-53）。臨床医は、抗生物質耐性の症例にすでに日頃から直面しており、感染症を処置するのに以前は簡単であったことが、より困難になってきており、いくつかの症例では処置することが不可能になっている。ほぼ全てのクラスの抗生物質は、１９７０年以前に発見されており、過去３０年間新しい主要クラスの抗生物質が開発されていない。大半の進歩は、最近では、公知の抗生物質の類似体の開発を通した抗生物質クラスの範囲内であった。しかしながら、ある種の細菌に対して現在の抗生物質クラス全体が無効であるような耐性機序が発生している。
【０００３】
抗生物質耐性率を減少させるために、抗生物質の適正な使用の教育及び感染症の発生を促進する形でのそれらの使用を制限することと共に、感染症の蔓延及び出現を最初の段階で制限するために、より一層の対策が講じられている。しかしながら、依然として、新しい抗生物質、特に、感染性疾患負荷のかなりの割合を占めるグラム陰性病原体に対して有効な抗生物質に対するニーズが存在する。
【０００４】
ニクロサミド（Ｎ−（２’−クロロ−４’−ニトロフェニル）−５−クロロサリチルアミド）は、サリチルアニリド化合物である。サリチルアニリド類は、１９５０年代、マキガイ綱Biomphalaria glabrataに対する２０，０００個の化合物のスクリーニング及び構造最適化の後、巻貝を殺すのに有用なものとして同定された（Goennert, R. (1961). Results of laboratory and field trials with the molluscicide Bayer 73）。Sun 及びZhang（Sun, Z. and Zhang, Y. (1999). Antituberculosis activity of certain antifungal and antihelmintic drugs. Tubercle and Lung Disease 79(5): 319-320）は、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方の「抗酸（acid fast）」細胞壁特性を持つがグラム陽性菌として大別されているマイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核菌）（Mycobacterium tuberculosis）に対する活性について抗真菌薬及び抗蠕虫薬を調査した。彼らは、ニクロサミドが結核菌（M. tuberculosis）に対して０．５〜１μg・mL-1のＭＩＣで非常に活性であることを見いだした。ニクロサミドは、低酸素条件で成長させた非複製結核菌に対して活性であり、これは現在のところ結核菌感染症の長期処置の役目を負っている。この著者等は、組織培養で成長させたマクロファージに対する毒性を観察した。ニクロサミドのサリチルアニリド類似体は、結核菌処置でのそれらの使用をさらに調査するためにスクリーニングされている（Kratky, M., Vinsova, J., Buchta, V., Horvati, K., Boesze, S. and Stolarikova, J. (2010). New amino acid esters of salicylanilides active against MDR-TB and other microbes. European journal of medicinal chemistry 45(12): 6106-6113; Kratky, M., Vinsova, J., Novotna, E., Mandikova, J., Wsol, V., Trejtnar, F., Ulmann, V., Stolarikova, J., Fernandes, S. and Bhat, S. (2012). Salicylanilide derivatives block Mycobacterium tuberculosis through inhibition of isocitrate lyase and methionine aminopeptidase. Tuberculosis 92(5): 434-439）。
【０００５】
また、de Carvalho et. alは、結核菌に対する有効性についてニクロサミド及び構造類似体のニタゾキサニドを調査した（de Carvalho, L. P. S., Darby, C. M., Rhee, K. Y. and Nathan, C. (2011). Nitazoxanide disrupts membrane potential and intrabacterial pH homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS medicinal chemistry letters 2(11): 849-854）。彼らは、ニクロサミド及びニタゾキサニドが結核菌の膜電位を脱共役させたが対照のリファンピシンはそのようにしなかったことを示した。
【０００６】
グラム陰性病原性の間接的阻害剤としてのニクロサミドの可能性は、最近Imperi et al.によって研究されており、彼らは、ＦＤＡ承認薬をスクリーニングして、シュードモナス・エルギノーサ（緑膿菌）（Pseudomonas aeruginosa）におけるクオラムセンシングシステムの任意の阻害剤を同定した（Imperi, F., Massai, F., Ramachandran Pillai, C., Longo, F., Zennaro, E., Rampioni, G., Visca, P. and Leoni, L. (2013). New life for an old drug: the anthelmintic drug niclosamide inhibits Pseudomonas aeruginosa quorum sensing. Antimicrob Agents Chemother 57(2): 996-1005）。試験した薬物の中で、ニクロサミドが最も高い抗クオラムセンシング活性を示した。さらなる分析は、ニクロサミドがシグナル分子の合成よりはむしろクオラムセンシングシグナルへの応答を阻害できることを決定した。しかしながら、著者等は、ニクロサミドの直接的に毒性である役割も、ニクロサミドから細胞を防御する潜在的な薬剤排出の役割も考慮しなかったし、そして、著者等のデータによれば、ニクロサミドはマイクロモル濃度以上でのみクオラムセンシングの阻害において有効であると思われ、このことは、該薬物が実際には細胞の外に輸送されていたことを示唆している。
【０００７】
多剤排出ポンプは、抗生物質のファミリー全体に対する耐性を付与することができる。排出ポンプは、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方において発現されるが、グラム陰性菌においてより強力な耐性機序である。これは、細胞質内への薬物透過性を低下させる二重細胞膜に起因し、そして、薬物が細胞質に達する前にペリプラズムから細胞外へ直ちに排出されるからである。５つの公知の多剤排出トランスポーターファミリーがある：小型多剤耐性タンパク質ファミリー（small multidrug resistance protein family）、多剤・毒性化合物排出タンパク質ファミリー（multidrug and toxic compound extrusion protein family）、主要ファシリテーターファミリー（major facilitator family）、ＡＴＰ結合カセットファミリー（ATP-binding cassette family）及び耐性ノジュレーション細胞分裂ファミリー（resistance nodulation cell division family）（Paulsen, I. T., Chen, J., Nelson, K. E. and Saier Jr, M. H. (2001). Comparative genomics of microbial drug efflux systems. Journal of molecular microbiology and biotechnology 3(2): 145-150）。最後の３つのファミリーは、グラム陰性群の内膜に位置していることが多く、そして、ＴｏｌＣ等の外膜排出タンパク質、及び内膜トランスポーターと外膜トランスポーターとの間の相互作用を可能にするペリプラズム排出タンパク質と一緒に働く（Johnson, J. M. and Church, G. M. (1999). Alignment and structure prediction of divergent protein families: periplasmic and outer membrane proteins of bacterial efflux pumps. Journal of Molecular Biology 287(3): 695-715）。
【０００８】
排出ポンプ阻害剤を抗生物質と一緒に送達することが、耐性であると同定されている菌株に対しても抗生物質の効力を増加させることができることは、公知である。フェニルアラニン−アルギニン β−ナフチルアミド（ＰＡβＮ）は、広域な宿主及び抗生物質範囲を有する排出ポンプ阻害剤である。Lomovskaya et al.（Lomovskaya, O., Warren, M. S., Lee, A., Galazzo, J., Fronko, R., Lee, M., Blais, J., Cho, D., Chamberland, S., Renau, T., Leger, R., Hecker, S., Watkins, W., Hoshino, K., Ishida, H. and Lee, V. J. (2001). Identification and Characterization of Inhibitors of Multidrug Resistance Efflux Pumps in Pseudomonas aeruginosa: Novel Agents for Combination Therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45(1): 105-116）は、臨床分離株においてフルオロキノロン類に対する耐性を付与することが公知である３つの排出ポンプを過剰発現した緑膿菌（P. aeruginosa）株を生成した。彼らは、抗生物質レボフロキサシンの存在下で成長阻害を測定することによって、合成及び天然の化合物ライブラリーをスクリーニングした。ＰＡβＮは、該排出ポンプの各々に対して活性であり、また大腸菌（E. coli）におけるＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣに対しても活性であった。この著者等は、排出ポンプ阻害剤を含めることが、フルオロキノロン類に対する感受性を増加させ、フルオロキノロン類に対する耐性を反転させ、かつ耐性が発生する頻度を減少させることを実証した。
【０００９】
抗生物質耐性がヒト及び動物の健康に与える重大なリスクを考慮すると、感染症を治療及び予防するための新規な薬物／抗菌アプローチを開発するニーズが存在する。本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む併用剤を提供することによってこのニーズに取り組むこと、又は少なくとも現行の抗菌薬の有用な代替物を提供することに努める。
【００１０】
本明細書における先行技術文献へのいかなる言及も、そのような先行技術が広く公知であること又は当分野における共通する一般的な知識の一部を形成することの承認として見なされるべきではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
１つの態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防することにおける使用のためのサリチルアミド化合物を提供する（ここで、該細菌が引き起こす感染症は、グラム陽性菌を含む）。
【００１２】
別の態様において、本発明は、細菌バイオフィルムの形成を予防、低減又は排除することにおける使用のためのサリチルアミド化合物を提供する（ここで、該細菌が引き起こすバイオフィルム形成は、グラム陽性菌を含む）。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、患者における細菌感染症を処置することにおける使用のための又は細菌バイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除することにおける使用のための、サリチルアミド化合物を許容し得る賦形剤、担体又は塩と一緒に含む医薬組成物又は生物学的組成物を提供する（ここで、該細菌が引き起こす感染症又はバイオフィルム形成は、グラム陽性菌を含む）。
【００１４】
別の態様において、本発明は、処置を必要とする患者に少なくとも１つのサリチルアミド化合物を患者における細菌感染症を治療又は予防するのに十分な量で投与することを含む、グラム陽性菌感染症を治療又は予防するための方法を提供する。
【００１５】
なおさらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物をバイオフィルムの形成を低減又は排除するのに十分な量で投与することを含む、グラム陽性菌を含む細菌バイオフィルムの形成を低減又は排除するための方法を提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を処置することにおける又は細菌バイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除するための、サリチルアミド化合物の使用を提供する（ここで、該細菌が引き起こす感染症又はバイオフィルム形成は、グラム陽性菌を含む）。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、患者における細菌感染症を処置するための又は細菌バイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除することにおける使用のための医薬の製造における、サリチルアミド化合物の使用を提供する（ここで、該細菌が引き起こす感染症又はバイオフィルム形成は、グラム陽性菌を含む）。
【００１８】
本発明の上記態様に係るある例では、サリチルアミド化合物は、ニクロサミド若しくはその類似体、ニタゾキサニド若しくはその類似体、又はその任意の併用物である。
【００１９】
本発明の上記態様に係る別の例では、グラム陽性菌は、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、リステリア（Listeria）及びバチルス（Bacillus）からなる１以上の属から選択される。
【００２０】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む併用剤を提供する。
【００２１】
なお別の態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の相乗的併用物を提供する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む組成物を提供する。ある例では、該組成物は、相乗的に有効な量のサリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物を含む。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を許容し得る賦形剤、担体又は塩と一緒に含む医薬組成物又は生物学的組成物を提供する。
【００２４】
本発明に係る併用剤又は組成物は、患者における細菌感染症を治療若しくは予防するために使用され得るか、又は、細菌バイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除するために使用され得る（ここで、該感染症又はバイオフィルムは、グラム陰性菌を含む）。本発明に係る併用剤又は組成物は、１以上の殺菌剤又は静菌剤をさらに含み得る。
【００２５】
したがって、別の態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物の医薬としての使用、又は少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む組成物の医薬としての使用を提供する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、医薬組成物の調製における使用のための、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物を提供する。
【００２７】
なお別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物の使用を提供する。
【００２８】
別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための、薬学的に有効な量の少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む医薬組成物の使用を提供する（ここで、該感染症は、グラム陰性菌を含む）。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む抗菌剤を提供する。抗菌剤は、患者における細菌感染症を治療若しくは予防するために使用され得るか、又は、細菌バイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除するために使用され得る（ここで、該感染症又はバイオフィルムには、グラム陰性菌が存在する）。
【００３０】
ある例では、バイオフィルムは、創傷及び／若しくは火傷内に感染症を引き起こすか又は留置医療機器上若しくは内部に感染症を引き起こし、あるいは、バイオフィルムは、食品業界用の調製用機械（preparative machinery）内部、食品業界によって使用される包装上、水若しくは他の液体に使用される貯蔵タンク内部、又は水処理プラントにおける機械内部に生じる。
【００３１】
別の態様において、本発明は、医薬の製造における、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の使用を提供する。
【００３２】
なお別の態様において、本発明は、医薬の製造における使用のための、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物を提供する。
【００３３】
なお別の態様において、本発明は、別個の単位剤形の少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を使用説明書と一緒に含むキットオブパーツ（ｋit of parts）を提供する。
【００３４】
別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む医薬組成物を提供する（ここで、該感染症は、グラム陰性菌を含む）。
【００３５】
なお別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための医薬の製造における、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の使用を提供する（ここで、該感染症は、グラム陰性菌を含む）。
【００３６】
なお別の態様において、本発明は、細菌感染症を治療又は予防する方法であって、処置を必要とする患者に少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を患者における細菌感染症を治療又は予防するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する（ここで、該感染症は、グラム陰性菌を含む）。
【００３７】
なお別の態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物による毒性から細菌細胞を保護するための方法（ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）であって、細胞中の少なくとも１つのニトロレダクターゼ酵素の発現及び／又は活性をサリチルアミド化合物による毒性から保護するのに十分な量で増加させることを含む方法を提供する。
【００３８】
なお別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための方法（ここで、該細菌は、ニトロ−プロドラッグ抗生物質での処置に耐性を持つようになっている）であって、該患者に少なくとも１つのサリチルアミド化合物（ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）を、感染症を治療又は予防するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。場合により、該方法は、少なくとも１つの排出ポンプ阻害剤を投与することをさらに含む。
【００３９】
なお別の態様において、本発明は、細菌バイオフィルムの形成を予防、低減又は排除するための方法（ここで、該細菌は、ニトロ−プロドラッグ抗生物質での処置に耐性を持つようになっている）であって、少なくとも１つのサリチルアミド化合物（ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）を該バイオフィルムの形成を予防、低減又は排除するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。場合により、該方法は、少なくとも１つの排出ポンプ阻害剤を投与することをさらに含む。
【００４０】
なお別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための方法（ここで、該細菌は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物又は少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物での処置に耐性を持つようになっており、ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）であって、該患者にニトロ−プロドラッグ抗生物質を、感染症を治療又は予防するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。
【００４１】
なお別の態様において、本発明は、細菌バイオフィルムの形成を予防、低減又は排除するための方法（ここで、該細菌は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物又は少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物での処置に耐性を持つようになっており、ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）であって、ニトロ−プロドラッグ抗生物質を該バイオフィルムの形成を予防、低減又は排除するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
本発明はまた、プロドラッグ耐性菌並びにプロドラッグ感受性菌を同時に標的化するために、ニトロ−プロドラッグとニクロサミドの同時投与も検討する。
【００４３】
したがって、なお別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療若しくは予防するための又は細菌バイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除するための方法であって、ニトロ−プロドラッグ抗生物質及びニクロサミドを、該感染症を治療若しくは予防するのに又は該バイオフィルムの形成を予防、低減若しくは排除するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。
【００４４】
ある例では、ニトロ−プロドラッグ抗生物質は、ニトロフラントイン、ニトロフラゾン、メトロニダゾール、チニダゾール、フラゾリドン、ミソニダゾール、エタニダゾール、ニフルチモックス、オルニダゾール、ベンズニダゾール、ジメトリダゾール、ロニダゾール、ＲＳＵ−１０６９、ＲＢ−６１４５、ＣＢ１９５４、ＥＦ３、ＥＦ５、ＨＸ４及びフッ化ミソニダゾールからなる群より選択される。
【００４５】
なお別の態様において、本発明は、新規ニトロレダクターゼ酵素を同定するスクリーニング法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ｉ）存在するニトロレダクターゼ遺伝子の標的又はランダム突然変異誘発を実施し、それによってニトロレダクターゼバリアント遺伝子ライブラリーを作製する工程；
（ｉｉ）該バリアント遺伝子ライブラリーを、ｔｏｌＣ遺伝子が欠失している又はｔｏｌＣ発現産物が阻害されているグラム陰性菌に形質転換し、そして、遺伝子バリアントが発現されるように該細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのサリチルアミド化合物を形質転換された細菌細胞に投与する工程；
（ｉｖ）サリチルアミド毒性に対する感受性を欠いている細胞をスクリーニングし、それによって新規形態のニトロレダクターゼ酵素を発現する細胞を同定する工程；及び
（ｖ）場合により、該ニトロレダクターゼ酵素を精製する工程。
【００４６】
ある例では、グラム陰性菌の内因性ニトロレダクターゼ遺伝子はノックアウトされているか、又は、グラム陰性菌におけるニトロレダクターゼ活性は低減若しくは排除されている。
【００４７】
なお別の態様において、本発明は、環境を起源とするＤＮＡの調製物から新規ニトロレダクターゼ酵素を同定するスクリーニング法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ｉ）その環境を起源とするＤＮＡから細菌遺伝子ライブラリーを作製する工程；
（ｉｉ）該遺伝子ライブラリーを、ｔｏｌＣ遺伝子が欠失している又はｔｏｌＣ発現産物が阻害されているグラム陰性菌に形質転換し、そして、遺伝子ライブラリーが発現されるように該細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのサリチルアミド化合物を形質転換された細菌細胞に投与する工程；
（ｉｖ）サリチルアミドに対する感受性を欠いている細胞をスクリーニングし、それによって新規形態のニトロレダクターゼ酵素を発現する細胞を同定する工程；及び
（ｖ）場合により、該ニトロレダクターゼ酵素を精製する工程。
【００４８】
ある例では、グラム陰性菌の内因性ニトロレダクターゼ遺伝子はノックアウトされているか、又は、グラム陰性菌におけるニトロレダクターゼ活性は低減若しくは排除されている。
【００４９】
別の例では、環境を起源とするＤＮＡは、土壌を起源とする。
【００５０】
なお別の態様において、本発明は、ＴｏｌＣの新規阻害剤を同定するスクリーニング法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ｉ）ＴｏｌＣを発現するグラム陰性菌を少なくとも１つのサリチルアミド化合物及びＴｏｌＣの候補阻害剤の存在下で培養する工程；並びに
（ｉｉ）サリチルアミド毒性に感受性である細胞をスクリーニングし、それによってＴｏｌＣの新規阻害剤を同定する工程。
【００５１】
ある例では、サリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物は、相乗的な抗菌効果を提供する。
【００５２】
別の態様において、本発明は、抗生物質的に有効な量の以下：
（ｉ）サリチルアミド化合物又はその薬学的に許容し得る塩；及び
（ｉｉ）排出ポンプ阻害化合物又はその薬学的に許容し得る塩；
を含む組成物であって、化合物（ｉ）及び（ｉｉ）が相乗的な抗生物質効果をもたらすのに十分な割合で用いられる、組成物を提供する。
【００５３】
ある例では、細菌感染症は、１以上のグラム陰性菌によって引き起こされる細菌感染症である。
【００５４】
別の例では、細菌感染症は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸菌（Escherichia coli）、バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）、シュードモナス・シリンガエ・ｐｖ．アクチニディア（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）（Ｐｓａ−Ｖ）、ナイセリア・ゴノレア（淋菌）（Neisseria gonorrhoeae）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、赤痢菌種（Shigella species）、サルモネラ種（Salmonella species）又はエンテロバクター種（Enterobacter species）によって引き起こされる。
【００５５】
さらなる例では、サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む。
【００５６】
ある例では、サリチルアミド化合物は、サリチルアニリド化合物であり、かつ１以上のニトロ基で置換されていてよい。
【００５７】
別の例では、サリチルアニリド化合物は、式（Ｉ）：
【化１】
2018500387.tif 000003
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素、ヒドロキシ及びハロゲンからなる群より選択されるが、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つはハロゲンであり、そして、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つはヒドロキシであり；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、各々独立して、水素、ニトロ及びハロゲンからなる群より選択されるが、但し、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つはハロゲンであり、そして、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つはニトロである］
で示される化合物又はその薬学的に許容し得る塩である。
【００５８】
特定の例では、式（Ｉ）中の任意のハロゲンは、クロロ、フルオロ及びブロモからなる群より選択される。より好ましくは、式（Ｉ）中の少なくとも１つのハロゲンは、クロロである。
【００５９】
ある例では、式（Ｉ）中のＲ８はニトロである。代替的に、Ｒ９はニトロである。代替的に、Ｒ１０はニトロである。代替的に、Ｒ７はニトロである。
【００６０】
関連する例では、サリチルアニリド化合物は、以下の表１から選択される化合物である。
【００６１】
さらなる関連する例では、サリチルアニリド化合物は、以下の構造を有するニクロサミド又はその薬学的に許容し得る塩である：
【化２】
2018500387.tif 000004
【００６２】
ある例では、薬学的に許容し得る塩は、エタノールアミン塩又はピペリジン塩である。
【００６３】
代替的に、サリチルアミド化合物は、
以下の構造を有するクロサンテル；
【化３】
2018500387.tif 000005
以下の構造を有するオキシクロナジド（oxyclonazide）；
【化４】
2018500387.tif 000006
以下の構造を有するラフォキサニド；
【化５】
2018500387.tif 000007
以下の構造を有するフルサラン；
【化６】
2018500387.tif 000008
以下の構造を有するトリブロムサラン；
【化７】
2018500387.tif 000009
以下の構造を有するレソランテル；
【化８】
2018500387.tif 000010
以下の構造を有するクリオキサニド；
【化９】
2018500387.tif 000011
【化１０】
2018500387.tif 000012
及び
以下の構造を有するブロチアニド；
【化１１】
2018500387.tif 000013
からなる群、又はそのエステル形態若しくはその薬学的に許容し得る塩より選択される。
【００６４】
代替的に、サリチルアニリド化合物は、ニタゾキサニド（２−アセチルオキシ−Ｎ−（５−ニトロ−２−チアゾリル）ベンズアミド）又はその薬学的に許容し得る塩である。
【００６５】
ある例では、排出ポンプ阻害化合物は、グラム陰性菌排出ポンプの阻害剤、例えば、大腸菌ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣ排出ポンプの同族体である。
【００６６】
ある例では、排出ポンプ阻害剤は、フェニルアラニン−アルギニン β−ナフチルアミド（ＰＡβＮ）又は２−３ジブロモマレイミドである。
【００６７】
別の例では、サリチルアミド化合物と排出ポンプ阻害化合物のモル比は、約１：５００〜約１：７である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ｔｏｌＣ遺伝子の欠失が大腸菌をニクロサミドに対して強く感受性にすることを示す。大腸菌７ＫＯ又は７ＫＯΔｔｏｌＣ菌株の一晩培養物を使用してＬＢ培地の新鮮アリコートに植菌し、これを次いで３０℃、２００rpmで２．５時間インキュベートする。その後、各培養物のアリコート ４０μLを、３８４ウェルマイクロプレート内の、２×所望のニクロサミド終濃度（すなわち、５μM〜２０nMの最終２倍希釈系列をもたらす）又は０μM 対照を含有するＬＢ培地 ４０μLに加える。プレートを、３０℃、２００rpmで４時間インキュベートする。菌株毎に０μM 対照に相対的な成長百分率を計算するために、培養物濁度を６００nmでの光学密度によってモニタリングする。データは、少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図２】図２は、ＴｏｌＣ阻害剤ＰａβＮが大腸菌をニクロサミドに対して感受性にできることを示す。大腸菌７ＫＯの一晩培養物を使用してＬＢ培地の新鮮アリコートに植菌し、これを次いで３０℃、２００rpmで２．５時間インキュベートする。その後、各培養物のアリコート ４０μLを、３８４ウェルマイクロプレート内の、２×所望のニクロサミド終濃度（すなわち、１０μM〜１６０nMの最終２倍希釈系列をもたらす）又は０μM 対照、並びに０μM、２５μM又は５０μM ＰａβＮのいずれかを含有するＬＢ培地 ４０μLに加える。７ＫＯΔｔｏｌＣの一晩培養物を、ＰａβＮを添加することなしに同様に処理する。３８４ウェルプレートを３０℃、２００rpmで４時間インキュベートする。各系列について０μM ニクロサミド対照に相対的な成長百分率を計算するために、培養物濁度を６００nmでの光学密度によってモニタリングする。データは、３反復の平均±１標準偏差である。
【図３】図３は、ニクロサミド曝露に対する大腸菌株７ＫＯ及びＤＨ５αの相対感受性を示す。大腸菌７ＫＯ又はＤＨ５αの一晩培養物を使用してＬＢ培地の新鮮アリコートに植菌し、これを３０℃、２００rpmで２．５時間インキュベートする。その後、各培養物のアリコート ４０μLを、３８４ウェルマイクロプレート内の、２×所望のニクロサミド終濃度（すなわち、４０μM〜２０nMの最終２倍希釈系列をもたらす）又は０μM 対照を含有するＬＢ培地 ４０μLに加える。プレートを３０℃、２００rpmで４時間インキュベートする。菌株毎に０μM 対照に相対的な成長百分率を計算するために、培養物濁度を６００nmでの光学密度によってモニタリングする。データは、少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図４】図４は、異なる天然のニトロレダクターゼ候補を過剰発現する大腸菌７ＫＯΔｔｏｌＣ菌株のニクロサミド成長阻害を示す。表示のとおりの異なるニトロレダクターゼ候補遺伝子を過剰発現する大腸菌７ＫＯΔｔｏｌＣ菌株の一晩培養物を使用してＬＢ培地の新鮮アリコートに植菌し、これを３０℃、２００rpmで２．５時間インキュベートする。その後、各培養物のアリコート ４０μLを、３８４ウェルマイクロプレート内の、２×所望のニクロサミド終濃度（すなわち、４μM〜１６nMの最終２倍希釈系列をもたらす）又は０μM 対照を含有するＬＢ培地 ４０μLに加える。プレートを３０℃、２００rpmで４時間インキュベートする。菌株毎に０μM 対照に相対的な成長百分率を計算するために、培養物濁度を６００nmでの光学密度によってモニタリングする。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図５】図５は、２．５μM ニクロサミドでの曝露に対する異なるニトロレダクターゼ候補の防御能を示す。オキシドレダクターゼを過剰発現する大腸菌７ＫＯΔｔｏｌＣ菌株（各オキシドレダクターゼの起源及び命名法は、ＷＯ２０１２／００８８６０号及びProsser, G.A., Copp, J.N., Mowday, A.M., Guise, C.P., Syddall, S.P., Williams, E.M., Horvat, C.N., Swe, P.S., Ashoorzadeh, A., Denny, W.A., Smaill, J.B., Patterson, A.V. and Ackerley, D.F. (2013). Creation and screening of a multi-family bacterial oxidoreductase library to discover novel nitroreductases that efficiently activate the bioreductive prodrugs CB1954 and PR-104A. Biochemical Pharmacology 85:1091-1103 に記載のとおり）の一晩培養物を使用してアッセイ培地（１００μg・mL-1 アンピシリン、０．４％w/v グルコース及び５０μM ＩＰＴＧを補充したＬＢ培地）の新鮮アリコートに植菌し、これをその後３０℃、２００rpmで２．５時間インキュベートする。次いで、各培養物のアリコート ４０μLを、３８４ウェルマイクロプレート内の、２×所望のニクロサミド終濃度（５μM）を含有するアッセイ培地又は培地のみの対照のアリコート ４０μLに加える。次いで、プレートを３０℃、２００rpmで４時間インキュベートする。菌株毎に０μM対照（すなわち、１００％成長）に相対的な成長阻害百分率を計算するために、培養物濁度を６００nmでの光学密度によってモニタリングする。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図６】図６は、ニクロサミド事前選択がニトロ−プロドラッグ抗生物質メトロニダゾールを生体内還元的に活性化できる機能性ニトロレダクターゼを強く富化することを示す。大腸菌ｎｆｓＡについてのバリアント遺伝子ライブラリーを７つの活性部位コドン位置でのコドンランダム化によって生み出し、プラスミドｐＵＣＸにクローニングし、そして大腸菌ＳＯＳ−Ｒ４細胞に形質転換する。Ａ．ＬＢ寒天；又はＢ．５００nM ニクロサミドを含有するＬＢ寒天のいずれかから５７個のクローンをランダムに選択する。次いで、５７個の選択されたクローン（標準９６ウェルプレート上の位置に従って命名される）の各々を、５０μM メトロニダゾール（構造を差し込む）の存在下での成長阻害について試験する（ここで、値が大きいほど、成長阻害レベルが高いこと、したがってそのクローンによるメトロニダゾール活性化レベルが高いことを示す）。また、各プレート上に野生型ｎｆｓＡ（ｎｆｓＡ＿Ｅｃ）、空プラスミド（ｐＵＣＸ）、及び培地のみの対照（参照目的のためのみ）も含める。相当多くの数のメトロニダゾール活性クローンがニクロサミド事前選択コホート中に存在する。成長阻害データは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図７】図７は、ニクロサミド事前選択がニトロ−プロドラッグ抗生物質チニダゾールを生体内還元的に活性化できる機能性ニトロレダクターゼを強く富化することを示す。大腸菌ｎｆｓＡについてのバリアント遺伝子ライブラリーを７つの活性部位コドン位置でのコドンランダム化によって生み出し、プラスミドｐＵＣＸにクローニングし、そして大腸菌ＳＯＳ−Ｒ４細胞に形質転換する。Ａ．ＬＢ寒天；又はＢ．５００nM ニクロサミドを含有するＬＢ寒天のいずれかから５７個のクローンをランダムに選択する。次いで、５７個の選択されたクローン（標準９６ウェルプレート上の位置に従って命名される）の各々を、５０μM チニダゾール（構造を差し込む）の存在下での成長阻害について試験する（ここで、値が大きいほど、成長阻害レベルが高いこと、したがってそのクローンによるチニダゾール活性化レベルが高いことを示す）。また、各プレート上に野生型ｎｆｓＡ（ｎｆｓＡ＿Ｅｃ）、空プラスミド（ｐＵＣＸ）、及び培地のみの対照（参照目的のためのみ）も含める。相当多くの数のチニダゾール活性クローンがニクロサミド事前選択コホート中に存在する。成長阻害データは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図８】図８は、β−ラクタム耐性肺炎桿菌に対するニクロサミド／ＰＡβＮ相乗効果のヒートマップを示す。この図は、０．１M ＭｇＳＯ４並びに表示のとおりのニクロサミド及びＰＡβＮで修正されたＬＢ中の、β−ラクタム耐性肺炎桿菌（Klebsiella pneumonia）（ＮＺ分離株ＮＩＬ０５／２６）の非曝露対照に相対的な成長百分率を示す。データは、３つの独立した反復の平均である。
【図９】図９は、β−ラクタム耐性大腸菌に対するニクロサミド／ＰＡβＮ相乗効果のヒートマップを示す。この図は、０．１M ＭｇＳＯ４並びに表示のとおりのニクロサミド及びＰＡβＮで修正されたＬＢ中の、β−ラクタム耐性大腸菌（ＮＺ分離株ＡＲＬ０６／６２４）の非曝露対照に相対的な成長百分率を示す。データは、３つの独立した反復の平均である。
【図１０】図１０は、セフタジジム／ピペラシリン耐性緑膿菌に対するニクロサミド／ＰＡβＮ相乗効果のヒートマップを示す。この図は、０．１M ＭｇＳＯ４並びに表示のとおりのニクロサミド及びＰＡβＮで修正されたＬＢ中の、セフタジジム／ピペラシリン耐性緑膿菌（ＮＺ分離株ＡＲ００／５３７）の非曝露対照に相対的な成長百分率を示す。データは、３つの独立した反復の平均である。
【図１１】図１１は、セフタジジム／シプロフロキサシン／コリスチン／メロペネム／ピペラシリン／トブラマイシン耐性バークホルデリア・マルチボランスに対するニクロサミド／ＰＡβＮ相乗効果のヒートマップを示す。この図は、０．１M ＭｇＳＯ４並びに表示のとおりのニクロサミド及びＰＡβＮで修正されたＬＢ中の、セフタジジム／シプロフロキサシン／コリスチン／メロペネム／ピペラシリン／トブラマイシン耐性バークホルデリア・マルチボランス（ＮＺ分離株ＡＲＬ０３／４５２）の非曝露対照に相対的な成長百分率を示す。データは、３つの独立した反復の平均である。
【図１２】図１２は、大腸菌実験室株Ｗ３１１０に対するニクロサミド／ＰＡβＮ相乗効果のヒートマップを示す。この図は、０．１M ＭｇＳＯ４並びに表示のとおりのニクロサミド及びＰＡβＮで修正されたＬＢ中の、大腸菌実験室株Ｗ３１１０の非曝露対照（左端から２番目の列の７ＫＯΔｔｏｌＣニクロサミドのみの対照からのデータ）に相対的な成長百分率を示す。データは、３つの独立した反復の平均である。
【図１３】図１３は、緑膿菌実験室株ＰＡＯ１に対するニクロサミド／ＰＡβＮ相乗効果のヒートマップを示す。この図は、０．１M ＭｇＳＯ４並びに表示のとおりのニクロサミド及びＰＡβＮで修正されたＬＢ中の、緑膿菌実験室株ＰＡＯ１の非曝露対照に相対的な成長百分率を示す。データは、３つの独立した反復の平均である。
【図１４】図１４は、病毒性シュードモナス・シリンガエ・ｐｖ．アクチニディア（Ｐｓａ−Ｖ）の野生分離株に対するニクロサミド／ＰＡβＮ相乗効果のヒートマップを示す。この図は、０．１M ＭｇＳＯ４並びに表示のとおりのニクロサミド及びＰＡβＮで修正されたＬＢ中の、Ｐｓａ−Ｖ（Ｌａｎｄｃａｒｅ分離株ＩＣＭＰ１８８００）の非曝露対照に相対的な成長百分率を示す。データは、３つの独立した反復の平均である。
【図１５】図１５は、ニクロサミド及び２−クロロ−４−ニトロアニリンに対する大腸菌株７ＫＯΔｔｏｌＣの相対感受性を示す。大腸菌７ＫＯΔｔｏｌＣの一晩培養物を使用してＬＢ培地の新鮮アリコートに植菌し、これを３０℃、２００rpmで２．５時間インキュベートする。次いで、各培養物のアリコート ４０μLを、３８４ウェルマイクロプレート内の、２×所望の終濃度のニクロサミド若しくは２−クロロ−４−ニトロアニリン（すなわち、各化合物について１０μM〜１６０nMの最終２倍希釈系列をもたらす）を含有するＬＢ培地又は０μM 培地のみの対照のアリコート ４０μLに加える。プレートを、３０℃、２００rpmで４時間インキュベートする。菌株毎に０μM 対照に相対的な成長百分率を計算するために、培養物濁度を６００nmでの光学密度によってモニタリングする。データは、少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図１６】図１６は、異なる天然のニトロレダクターゼ候補を過剰発現する大腸菌７ＫＯΔｔｏｌＣ菌株のニタゾキサニド成長阻害を示す。大腸菌ＮｆｓＡ（ＮｆｓＡ＿Ｅｃ）、大腸菌ＮｆｓＢ（ＮｆｓＢ＿Ｅｃ）のいずれかを過剰発現する又はプラスミドのみ（ｐＥＴ２８）対照を含有する大腸菌７ＫＯΔｔｏｌＣ（ＤＥ３）菌株の一晩培養物を使用してアッセイ培地（５０μg・mL-1 カナマイシン及び５０μM ＩＰＴＧを補充したＬＢ培地）の新鮮アリコートに植菌し、これを３０℃、２００rpmで２．５時間インキュベートする。次いで、各培養物のアリコート ４０μLを、２×所望の終濃度のニタゾキサニド（すなわち、２０〜２．５μMの最終２倍希釈系列をもたらす）を含有するアッセイ培地又は０μM培地のみの対照のアリコート ４０μLに加える。次いで、プレートを３０℃、２００rpmで４時間インキュベートする。菌株毎に０μM対照に相対的な成長百分率を計算するために、培養物濁度を６００nmでの光学密度によってモニタリングする。データは、少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。ニタゾキサニドの構造を差し込む。
【図１７】図１７は、大腸菌染色体由来の候補ニトロレダクターゼ遺伝子及びｔｏｌＣ遺伝子のインフレーム欠失に使用されるプライマーを示す。Ｒｅｄリコンビナーゼを使用したインフレーム欠失によって遺伝子ノックアウトを実施する（Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645）。簡潔に述べると、プラスミドｐＫＤ４を鋳型として使用して、ｆｌｐ−リコンビナーゼ認識部位のいずれかの側に隣接するカナマイシン耐性遺伝子をＰＣＲ増幅する。増幅用のプライマーは、ｐＫＤ４からのプライミング及び増幅のために３’端に１５〜２０bpの配列を含有する。該プライマーの５’端の残りの約４０bpは、欠失のために標的化されたゲノム領域のいずれかの端に相同である。場合によりノックアウト効率を改善するために、鋳型としての第一のＰＣＲ産物及び増幅用のノックアウト伸長プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅されたカナマイシンカセットの各端のゲノム相同領域を第二のＰＣＲを介して伸ばす。プライマーは、ノックアウト（ＫＯ）されるべき遺伝子に従って命名され、ここで、接尾辞ＦＷはフォワードプライマー、ＲＶはリバースプライマー、そしてＥＸＴは伸長プライマーを示す（例えば、ＮＦＳＡ＿ＫＯ＿ＦＷは、遺伝子ｎｆｓＡのノックアウト用のフォワードプライマーである）。
【図１８】図１８は、様々なニクロサミド及びＰＡβＮの濃度にわたる、４反復の成長阻害の「ヒートマップ」測定についての３８４ウェルプレートフォーマットを示す。ニクロサミド及びＰＡβＮの終濃度がウェル毎に示される。この例では、Ｈ行、１列及び３列についての培養培地は、後続の細菌培養物での１／２希釈を考慮して４０μM ニクロサミド及び１５０μM ＰＡβＮを含有するだろう。
【図１９】図１９は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）に及ぼす併用又は個々のニクロサミド処置及びＰＡβＮ処置の効果のヒートマップを示す。この図は、０．１M ＭｇＳＯ４並びに表示のとおりのニクロサミド及びＰＡβＮで修正されたＬＢ中の、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ；ＡＴＣＣ４３３００）の非曝露対照に相対的な成長百分率を示す。データは、３つの独立した反復の平均である。
【図２０】図２０は、グラム陽性菌がＴｏｌＣ阻害剤の同時投与の必要性なしにニクロサミドに対して直接感受性であることを示す。様々なニクロサミドの濃度にわたるグラム陽性菌株である黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ４３３００、リステリア・ウェルシメリ（L. welshimeri）ＡＴＣＣ３５８９７及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）P.1.IPS-80 serovar israelensisについての菌株毎の非曝露対照に相対的な成長阻害％曲線が示される。データは、２つの独立した反復（独立実験毎に２反復の技術的反復を使用する）の平均であり、エラーバーは平均の標準誤差を示す。これらの曲線から計算されたＩＣ５０値は、表１に提示される。
【図２１】図２１は、グラム陽性菌がＴｏｌＣ阻害剤の同時投与の必要性なしにニタゾキサニドに対して直接感受性であることを示す。様々なニタゾキサニド濃度にわたるグラム陽性菌株である黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ４３３００、リステリア・ウェルシメリＡＴＣＣ３５８９７及びバチルス・チューリンゲンシス P.1.IPS-80 serovar israelensisについての菌株毎の非曝露対照に相対的な成長阻害％曲線が示される。データは、２つの技術的反復の平均である。これらの曲線から計算されたＩＣ５０値は、表１に提示される。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
詳細な説明
本発明は、サリチルアミド化合物がグラム陽性菌の直接成長阻害を呈するという驚くべきかつ予想外の発見に基づくものである。したがって、本発明は、サリチルアミド化合物が関与する、細菌感染症の予防若しくは治療、及び／又はバイオフィルム形成の予防、低減若しくは排除に有効な組成物及び方法に関する。
【００７０】
グラム陽性菌のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ；ＡＴＣＣ４３３００）の臨床分離株を試験した。図１９を参照されたい。驚くべきことに、この菌株は、マイクロモルレベルのＰａβＮに対して感受性であり、ニクロサミドに対してはナノモル濃度で感受性である。ＴｏｌＣ排出機序を欠いているグラム陽性菌と一致して、ニクロサミドがＰａβＮの非存在下で有効であり；及びニクロサミド処置とＰａβＮ処置の併用効果が相乗的というよりむしろ相加的であるように見える（図１９）。
【００７１】
これらのデータは、グラム陽性菌に及ぼすサリチルアミド化合物の直接成長阻害効果をさらに調査するように本出願人を駆り立てた。図２０及び２１を参照して、表２に提示されるデータと併せて読んだ場合（以下の実施例を参照されたい）、ニクロサミド及びニタゾキサニドは、黄色ブドウ球菌、リステリア・ウェルシメリ（Listeria welshimeri）及びバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に対して、nM範囲のＩＣ５０値の直接成長阻害活性を実証する。これは、重要な知見を表しており、細菌感染症の原因となる及び／又は細菌バイオフィルム（一部）を形成するグラム陽性菌の成長阻害にサリチルアミド化合物が有用であることを実証する。
【００７２】
したがって、本発明の１つの態様において、患者における細菌感染症を処置することにおける使用のためのサリチルアミド化合物が提供される（ここで、該細菌が引き起こす感染症は、グラム陽性菌を含む）。
【００７３】
別の態様において、本発明は、細菌バイオフィルムの形成を予防、低減又は排除することにおける使用のためのサリチルアミド化合物を提供する（ここで、該細菌が引き起こすバイオフィルム形成は、グラム陽性菌を含む）。
【００７４】
サリチルアミド化合物は、許容し得る賦形剤又は担体と一緒に医薬組成物又は生物学的組成物として製剤化され得る。サリチルアミド化合物はまた、薬学的塩としても製剤化され得る。
【００７５】
本発明は、グラム陽性菌を含む細菌感染症を治療若しくは予防するための又はグラム陽性菌を含むバイオフィルム形成を予防、低減若しくは排除するための本発明に係るサリチルアミド化合物を含む方法及び使用をさらに提供する。
【００７６】
本明細書において、用語「患者」は、例えば、感染症を伴う又は感染症のリスクを有する傾向にある患者、並びに、感染症を伴う又は感染症を獲得するリスクを有する傾向にある患者の処置のために１以上の活性物質を投与する医療従事者を含み得る。例えば、本発明は、手術前に外科医が使用するための手指消毒剤として製剤化される、サリチルアミド化合物を場合により排出ポンプ阻害剤と併せて含む生物学的組成物を提供し得る。追加的又は代替的に、例えば、本発明は、感染症を有する患者を処置するか又は手術中の１以上の細菌による感染症の獲得から患者を予防するかのいずれかのために、手術中の患者への投与のための、サリチルアミド化合物を場合により排出ポンプ阻害剤と併せて含む医薬組成物を提供し得る。
【００７７】
本発明はまた、グラム陰性菌の成長阻害が、排出ポンプ阻害剤と併せてサリチルアミド化合物を使用して達成され得るという驚くべきかつ予想外の発見に基づくものである。
【００７８】
本発明の併用物及び組成物は、それ故、他の適用の中でも、感染症（特にヒトにおける）の治療又は予防に、及びバイオフィルム形成の予防、低減又は排除に有用である。
【００７９】
いくつかの例では、サリチルアミド化合物と排出ポンプ阻害化合物のモル比は、約１：５００〜約１：７、例えば約１：４００〜約１：７、例えば約１：３５０〜約１：７、例えば約１：３００〜約１：７、例えば約１：２５０〜約１：７、例えば約１：２００〜約１：７、例えば約１：１５０〜約１：７、例えば約１：１００〜約１：７、例えば約１：５０〜約１：７、例えば約１：２０〜約１：７、例えば約１：１０〜約１：７である。
【００８０】
本出願人は、驚くべきことに、ニクロサミドが、活性ニトロレダクターゼを過剰発現しない大腸菌ＳＯＳ−Ｒ２細胞に対して毒性であるが、活性ニトロレダクターゼがニクロサミドの存在下でＳＯＳ−Ｒ２の成長を増強することが認められることを見いだした。しかしながら、異なる大腸菌宿主菌株（「６ＫＯ」、ノックアウトされた６つの内因性ニトロレダクターゼ候補遺伝子を有する大腸菌Ｗ３１１０の派生物）では、該菌株が活性ニトロレダクターゼを過剰発現しなくも、ニクロサミドはもはや毒性であると認められない。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本出願人は、ニクロサミド感受性ＳＯＳ−Ｒ２菌株とニクロサミド耐性６ＫＯ菌株との間の重要な違いは、前者が、多数の生体異物及び他の化合物をグラム陰性菌細胞の両細胞膜を直接横断して運び去ることができる排出ポンプをコードする、ｔｏｌＣ遺伝子の欠失を保有していることにあると仮説を立てる。
【００８１】
図１は、ｔｏｌＣ遺伝子の欠失が大腸菌をニクロサミドに対して感受性にすることを示す。この実験は、２つの別の同質遺伝子大腸菌株（一方は無傷のｔｏｌＣ遺伝子を有し、他方はｔｏｌＣのインフレーム欠失を保有する）のニクロサミドに対する相対感受性を測定する。ニトロレダクターゼ活性に起因するあらゆる潜在的な交絡効果を回避するために、この研究のために選択された基礎菌株は、５つの検証されたニトロレダクターゼ遺伝子（ｎｆｓＡ、ｎｆｓＢ、ａｚｏＲ、ｎｅｍＡ、ｍｄａＢ）及び２つの疑いをかけられたニトロレダクターゼ（ｙｉｅＦ、ｙｃａＫ）のインフレーム欠失を保有する、７ＫＯ−大腸菌Ｗ３１１０である。内因性ｔｏｌＣ遺伝子は、Datsenko及びWarnerのＲｅｄリコンビナーゼ法（Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645）を使用してこの菌株からインフレーム欠失されて、菌株７ＫＯΔｔｏｌＣを与える。
【００８２】
７ＫＯ及び７ＫＯΔｔｏｌＣの反復培養物の成長を２倍希釈系列のニクロサミド（５μM〜２０nM）にわたって比較すると、ｔｏｌＣ突然変異がニクロサミドに対する極めて高い感受性を付与することが明らかである（図１）。これらのデータから、ニクロサミドＩＣ５０（ニクロサミドが曝露された反復物の成長が非曝露対照の成長の５０％であると予測されるニクロサミドの濃度）は、７ＫＯΔｔｏｌＣでは１２０nMであると計算されるが、７ＫＯではＩＣ５０を計算できない（すなわち、５μMより相当大きい）。
【００８３】
ｔｏｌＣ遺伝子の欠失がインフレームで構成されるため、ニクロサミド感受性の表現型が極性効果の結果である可能性は低い（すなわち、ｔｏｌＣ突然変異それ自体というよりむしろ隣接する遺伝子への欠失されたＤＮＡ領域の影響に起因する）。これは、図２に示される実験によって確認され、これは、ＴｏｌＣ排出ポンプの化学阻害がまた大腸菌をニクロサミドに対して感受性にすることを実証する。大腸菌７ＫＯのレプリカ培養物は、０μM、２５μM又は５０μMのいずれかのフェニルアラニン−アルギニン β−ナフチルアミド（ＰＡβＮ）（ＴｏｌＣ排出ポンプの化学阻害剤）の存在下、２倍希釈系列のニクロサミド（１０μM〜１５６nM）にわたって成長する（Lomovskaya, O., Warren, M. S., Lee, A., Galazzo, J., Fronko, R., Lee, M., Blais, J., Cho, D., Chamberland, S., Renau, T., Leger, R., Hecker, S., Watkins, W., Hoshino, K., Ishida, H. and Lee, V. J. (2001). Identification and Characterization of Inhibitors of Multidrug Resistance Efflux Pumps in Pseudomonas aeruginosa: Novel Agents for Combination Therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45(1): 105-116）。ＰＡβＮの添加は、７ＫＯ菌株においてニクロサミド感受性を用量依存的に促進することが認められるが、試験濃度では、その効果は、ＴｏｌＣ活性が完全に排除されている７ＫＯΔｔｏｌＣについて観察されたものよりも低い。
【００８４】
したがって、本出願人は、遺伝学的手段及び化学的手段の両方によって、ＴｏｌＣがニクロサミドから大腸菌を防御できることを実証する。図３に示される実験は、ニクロサミドに対するニトロレダクターゼ酵素の防御能を、高レベルのニクロサミド曝露から機能性ｔｏｌＣ遺伝子を含有する細胞を防御する内因性ニトロレダクターゼ酵素（すなわち、大腸菌において天然に見いだされる天然の染色体ニトロレダクターゼ遺伝子から発現される）の効果を調べることによって比較する。本出願人は、７ＫＯ菌株（候補ニトロレダクターゼ遺伝子ｎｆｓＡ、ｎｆｓＢ、ａｚｏＲ、ｎｅｍＡ、ｍｄａＢ、ｙｉｅＦ、ｙｃａＫの欠失を保有する）の成長を、全ての７つの候補ニトロレダクターゼ遺伝子が無傷である市販のクローニング菌株ＤＨ５αと比較した。反復培養物の成長を２倍希釈系列のニクロサミド（４０μM〜２０nM）にわたって比較すると、ＤＨ５αがニクロサミドに対して７ＫＯ菌株よりも耐性であることが明らかである（図３）。
【００８５】
図４は、過剰発現されたニトロレダクターゼ遺伝子がニクロサミド曝露に対して高レベルの防御を提供することができることを示す。この実験は、マルチコピープラスミド上の強力なプロモーターの制御下にあるニトロレダクターゼ遺伝子の高レベル発現が大腸菌７ＫＯΔｔｏｌＣ（すなわち、ＴｏｌＣ媒介防御系を有しないために、ニクロサミドに対してあらかじめ感受性である細胞）に対して高レベルの防御を提供するか否かを調べる。プラスミドｐＵＣＸから各ニトロレダクターゼ候補を過剰発現する反復培養物の成長（Prosser, G.A., Copp, J.N., Syddall, S.P., Williams, E.M., Smaill, J.B., Wilson, W.R., Patterson, A.V. and Ackerley, D.F. (2010). Discovery and evaluation of Escherichia colinitroreductases that activate the anti-cancer prodrug CB1954.  Biochemical Pharmacology 79: 678-687）を２倍希釈系列のニクロサミド（４μM〜１６nM）にわたって比較すると、ニトロレダクターゼＮｆｓＡ、ＮｆｓＢ及びＡｚｏＲがニクロサミドに対して高レベルの保護を提供できるが（ニクロサミドに対して低いマイクロモルＩＣ５０値を有する、これらの酵素を過剰発現する菌株）、一方で、ＮｅｍＡは遥かに低いレベルの保護を提供することが分かる（ＩＣ５０＝３００nM）（図４）。別の以前に立証された大腸菌ニトロレダクターゼであるＭｄａＢでは、ＭｄａＢを過剰発現する菌株のＩＣ５０が８３nMであり、これは空プラスミド対照のＩＣ５０（ＩＣ５０＝４７nM）よりそれほど高くない。
【００８６】
図５は、高レベルのニクロサミド曝露から宿主細胞を防御することができるニトロレダクターゼを同定するための、７ＫＯΔｔｏｌＣ細胞における、単一濃度のニクロサミド（２．５μM）での、１１の異なるオキシドレダクターゼファミリー（ＷＯ２０１２／００８８６０号; Prosser, G.A., Copp, J.N., Mowday, A.M., Guise, C.P., Syddall, S.P., Williams, E.M., Horvat, C.N., Swe, P.S., Ashoorzadeh, A., Denny, W.A., Smaill, J.B., Patterson, A.V. and Ackerley, D.F. (2013). Creation and screening of a multi-family bacterial oxidoreductase library to discover novel nitroreductases that efficiently activate the bioreductive prodrugs CB1954 and PR-104A. Biochemical Pharmacology 85:1091-1103）のメンバーを含有する５８個からなるオキシドレダクターゼｐＵＣＸライブラリーのスクリーニングの結果を示す。ＮｆｓＡ、ＮｆｓＢ及びＡｚｏＲファミリーのメンバーは一貫して活性であるが、他の８つのオキシドレダクターゼファミリーのいずれのメンバーもそのニクロサミド濃度で７ＫＯΔｔｏｌＣ細胞の成長を可能にしない。
【００８７】
図６及び７は、ニクロサミドを使用して、ｔｏｌＣ突然変異体宿主細胞において発現された突然変異遺伝子ライブラリーから機能性ニトロレダクターゼを事前選択することができることを示す。ニトロレダクターゼは、生物工学において広範な潜在的適用を有する。環境適用について特に興味深いのは、毒性の生体異物汚染物質からより毒性の小さい形態への変換を触媒するニトロレダクターゼ酵素の能力である（Roldan, M.D., Perez-Reinado, E., Castillo, F. and Moreno-Vivian, C. (2008). Reduction of polynitroaromatic compounds: the bacterial nitroreductases. FEMS Microbiol Rev 32(3):474-500）。反対に、プロドラッグから細胞毒性の高い形態への変換は、医学（例えば、抗癌戦略の遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（Schellmann, N., Deckert, P.M., Bachran, D., Fuchs, H. and Bachran C. (2010). Targeted enzyme prodrug therapies. Mini Rev Med Chem. 10: 887-904））又は細胞生物学（例えば、遺伝子導入モデル生物における標的化組織切除）（Curado Rosenthal, V. D., Maki, D. G., Jamulitrat, S., Medeiros, E. A., Todi, S. K., Gomez, D. Y., Leblebicioglu, H., Abu Khader, I., Miranda Novales, M. G., Berba, R., Ramirez Wong, F. M., Barkat, A., Pino, O. R., Duenas, L., Mitrev, Z., Bijie, H., Gurskis, V., Kanj, S. S., Mapp, T., Hidalgo, R. F., Ben Jaballah, N., Raka, L., Gikas, A., Ahmed, A., Thu, L. T. A. and Guzman Siritt, M. E. (2010). International Nosocomial Infection Control Consortium (INICC) report, data summary for 2003-2008, issued June 2009. American Journal of Infection Control 38(2): 95-104）において適用を有する。ニトロレダクターゼはまた、生物触媒作用、すなわち、化学合成（例えば、医薬品製造）中のニトロ基の還元にも興味深い。これらの状況の全てで、ニトロレダクターゼは、一般に、それらの典型的な基質無差別性（substrate promiscuity）に依存して、非生理学的基質の還元に適用されている（Roldan et al., 2008）。したがって、おそらく、天然のニトロレダクターゼ酵素は、所望の基質に特に効率的ということはなく、それらの無差別な活性の開始レベルを指向性進化等の工学戦略によって実質的に改善できる可能性がある。
【００８８】
典型的には、指向性進化において、標的遺伝子が突然変異されるほど、それが不活性になる可能性が高くなる。したがって、多数の突然変異を含有する進化酵素を達成するには、典型的には、改善された活性についてスクリーニングされている極めて多くの数のクローンが必要である。しかしながら、望ましい活性についての多くのスクリーニングは、あまり高いスループット能力を有していない。
【００８９】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本出願人は、実質的に突然変異されたニトロレダクターゼライブラリーのニクロサミド事前選択が機能性ニトロレダクターゼを強く富化して、成長阻害アッセイ等の低いスループットスクリーニングアプローチが特定の基質に対して増強された活性を有するバリアントを回収することを可能にするだろうという仮説を立てる。突然変異体遺伝子ライブラリーは、大腸菌ｎｆｓＡに基づいて、７つの活性部位残基に対するコドンを部分的に（ＮＤＴコドンセット）又は完全に（ＮＮＫコドンセット）ランダム化させて合成される（GenScriptによって）。全てにおいて、該ライブラリーは約９５００万個の遺伝子バリアントを含有し、その圧倒的大部分は不活性ニトロレダクターゼをコードすると予想される。このライブラリーを、大腸菌ＳＯＳ−Ｒ４細胞（ｎｆｓＡ、ｎｆｓＢ、ａｚｏＲ、ｎｅｍＡ及びｔｏｌＣ遺伝子のノックアウト、並びにプラスミド媒介ＳＯＳ調節ＧＦＰ遺伝子を含有する）に形質転換し（Copp, J.N., Williams, E.M., Rich, M.H., Patterson, A.V., Smaill, J.B. and Ackerley, D.F. (2014). Toward a high-throughput screening platform for directed evolution of enzymes that activate genotoxic prodrugs. Protein Eng Des Sel. 27(10):399-403）、そして、様々な希釈物を未修正の又は５００nM ニクロサミドで修正されたレプリカＬＢ寒天プレート上にプレーティングする。未修正のＬＢ寒天プレートから５７個のコロニーをランダムに選択し、これを、空プラスミド及び野生型ＮｆｓＡ対照コロニー並びに無細胞対照と一緒に９６ウェルプレートの６０の最深ウェル内のＬＢ中に植菌する。この手順を、ニクロサミドで修正されたＬＢ寒天プレート（＋同じ３つの対照）からランダムに選択された５７個のコロニーを使用して異なる９６ウェルプレートで繰り返す。この後に、成長阻害アッセイを用いて、１プレート当たりどれだけ多くのウェルが、ニトロ−プロドラッグ抗生物質であるメトロニダゾール（図６Ａ、６Ｂ）又はチニダゾール（図７Ａ、７Ｂ）に関して活性である酵素バリアントを発現するクローンを含有したかを測定する。
【００９０】
ニクロサミド事前選択の非存在下では、５７個のランダムに選択されたクローンのうち１つだけが、メトロニダゾール（図６Ａ）又はチニダゾール（図７Ａ）に関して野生型ＮｆｓＡより活性であるニトロレダクターゼバリアントを発現することが認められる。しかしながら、ニクロサミド事前選択の後では、５７個のクローンのうち５０個がメトロニダゾールに関して野生型ＮｆｓＡよりも活性であり（図６Ｂ）、そして、５７個のクローンのうち５２個がチニダゾールに関して野生型ＮｆｓＡよりも活性である（図７Ｂ）。これらのデータは、ニクロサミド事前選択が、突然変異体遺伝子ライブラリーからの機能性ニトロレダクターゼ酵素バリアントをコードする遺伝子の強力な富化を提供できることを示している。
【００９１】
したがって、１つの態様において、本発明は、新規ニトロレダクターゼ酵素を同定するスクリーニング法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ｉ）存在するニトロレダクターゼ遺伝子の標的又はランダム突然変異誘発を実施し、それによってニトロレダクターゼバリアント遺伝子ライブラリーを作製する工程；
（ｉｉ）該バリアント遺伝子ライブラリーを、ｔｏｌＣ遺伝子が欠失している又はｔｏｌＣ発現産物が阻害されているグラム陰性菌に形質転換し、そして、遺伝子バリアントが発現されるように該細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのサリチルアミド化合物を形質転換された細菌細胞に投与する工程；
（ｉｖ）サリチルアミド毒性に対する感受性を欠いている細胞をスクリーニングし、それによって新規形態のニトロレダクターゼ酵素を発現する細胞を同定する工程；及び
（ｖ）場合により、該ニトロレダクターゼ酵素を精製する工程。
【００９２】
ある例では、グラム陰性菌の内因性ニトロレダクターゼ遺伝子はノックアウトされているか、又は、グラム陰性菌におけるニトロレダクターゼ活性は低減若しくは排除されている。
【００９３】
なお別の態様において、本発明は、環境を起源とするＤＮＡの調製物から新規ニトロレダクターゼ酵素を同定するスクリーニング法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ｉ）その環境を起源とするＤＮＡから細菌遺伝子ライブラリーを作製する工程；
（ｉｉ）該遺伝子ライブラリーを、ｔｏｌＣ遺伝子が欠失している又はｔｏｌＣ発現産物が阻害されているグラム陰性菌に形質転換し、そして、遺伝子ライブラリーが発現されるように該細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのサリチルアミド化合物を形質転換された細菌細胞に投与する工程；
（ｉｖ）サリチルアミドに対する感受性を欠いている細胞をスクリーニングし、それによって新規形態のニトロレダクターゼ酵素を発現する細胞を同定する工程；及び
場合により、該ニトロレダクターゼ酵素を精製する工程。
【００９４】
ある例では、グラム陰性菌の内因性ニトロレダクターゼ遺伝子はノックアウトされているか、又は、グラム陰性菌におけるニトロレダクターゼ活性は低減若しくは排除されている。
【００９５】
別の例では、環境を起源とするＤＮＡは、土壌を起源とする。
【００９６】
また、本発明によって検討されるものは、サリチルアミド毒性、例えばニクロサミド及びニクロサミド類似体に感受性の細菌が関与するスクリーニングアッセイに基づく、新規ＴｏｌＣ阻害剤をスクリーニングする方法である。
【００９７】
したがって、なお別の態様において、本発明は、ＴｏｌＣの新規阻害剤を同定するスクリーニング法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ｉ）ＴｏｌＣを発現するグラム陰性菌を少なくとも１つのサリチルアミド化合物及びＴｏｌＣの候補阻害剤の存在下で培養する工程；並びに
（ｉｉ）サリチルアミド毒性に感受性である細胞をスクリーニングし、それによってＴｏｌＣの新規阻害剤を同定する工程。
【００９８】
本出願人はまた、ニクロサミド及びＴｏｌＣの化学阻害剤が、驚くべきことに、多剤耐性臨床分離株を含む広範なグラム陰性菌に対して有効な相乗的抗菌併用物を提供することも示している。有利なことには、ニクロサミドは、ヒトにおいて高用量で耐容性を示すことが公知であり、そして、本出願人の仕事はまた、ニクロサミドが、グラム陰性ＴｏｌＣ排出ポンプに対して幅広い範囲の活性を有するＰａβＮ等の化学阻害剤と併せて適用されて、グラム陰性菌に対して有効な抗生物質であることを実証する。本出願人の仕事は、成長阻害アッセイを使用して、ＥＳＲ微生物株保存機関（http://www.esr.cri.nz/competencies/Health/Pages/nzrcc.aspx）から得られる様々な細菌性病原体の薬物耐性臨床分離株、並びにキウイフルーツ病原体シュードモナス・シリンガエ・ｐｖ．アクチニディア（Ｐｓａ−Ｖ）（Ｌａｎｄｃａｒｅ分離株ＩＣＭＰ１８８００）の高病原性野生分離株並びに本出願人の在庫からの大腸菌Ｗ３１１０及び緑膿菌ＰＡＯ１の実験室株における、ニクロサミド及びＰａβＮ処置の併用効果を試験する。
【００９９】
したがって、１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害剤を含む併用剤を提供する。
【０１００】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の相乗的併用物を提供する。
【０１０１】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む組成物を提供する。ある例では、該組成物は、相乗的に有効な量のサリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物を含む。
【０１０２】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を薬学的に許容し得る賦形剤又は塩と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【０１０３】
本発明に係る一例では、サリチルアミド化合物は、ニクロサミド又はニクロサミド類似体である。ニクロサミド類似体の例は、以下に列挙される。
【０１０４】
本発明の併用剤及び組成物における使用のための好適な排出ポンプの例は、以下に列挙される。本発明の特定の実施態様において、排出ポンプ阻害剤は、ＴｏｌＣ排出ポンプ阻害剤である。ＴｏｌＣ排出ポンプ阻害剤の例は、ＰａβＮ及び２，３−ジブロモマレイミド（2,3-dibromomaleide）を含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
試験フォーマットは、各試験菌株のレプリカ培養物が増加する濃度のＰａβＮ（横軸）及び増加する濃度のニクロサミド（縦軸）で曝露される、２次元３８４ウェルプレートアッセイである（各々２倍希釈系列として調製される、ＰａβＮは右から左へ、ニクロサミドは下から上へ）。各３８４ウェルプレートを、各四分円中の左上のウェルがＰａβＮとニクロサミドのいずれも含有しないように、一方で、各四分円中の右下のウェルが最高濃度のＰａβＮ及びニクロサミドの各々を含有するように、４つの四分円に分ける。次いで、各試験菌株をプレート毎に４反復で評価する。
【０１０６】
このフォーマットで試験するグラム陰性菌株は、以下を含む：
β−ラクタム耐性肺炎桿菌（Klebsiella pneumonia）（ＮＺ分離株ＮＩＬ０５／２６）（図８）
β−ラクタム耐性大腸菌（ＮＺ分離株ＡＲＬ０６／６２４）（図９）
セフタジジム／ピペラシリン耐性緑膿菌（ＮＺ分離株ＡＲ００／５３７）（図１０）
セフタジジム／シプロフロキサシン／コリスチン／メロペネム／ピペラシリン／トブラマイシン耐性バークホルデリア・マルチボランス（ＮＺ分離株ＡＲＬ０３／４５２）（図１１）
大腸菌Ｗ３１１０（野生型）（図１２）
緑膿菌ＰＡＯ１（野生型）（図１３）
Ｐｓａ−Ｖ（Ｌａｎｄｃａｒｅ分離株ＩＣＭＰ１８８００）（図１４）。
【０１０７】
各々の場合に、試験した菌株は、相乗的併用物としてのＰａβＮ及びニクロサミドに感受性である。しかしながら、臨床分離株のいずれもニクロサミド単独には特に感受性ではない（ＰａβＮの非存在下でＩＣ５０＞２０μM；図８〜１１）。
【０１０８】
本発明に係る併用剤又は組成物は、それ故、患者における細菌感染症を治療若しくは予防するために使用され得るか、又は、細菌バイオフィルムの形成を低減若しくは排除するために使用され得る（ここで、該細菌が引き起こす感染症又はバイオフィルム形成は、グラム陰性菌を含む）。
【０１０９】
したがって、別の態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物又は少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む組成物の医薬としての使用を提供する。
【０１１０】
別の態様において、本発明は、医薬組成物の調製における使用のための、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物を提供する。
【０１１１】
なお別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物の使用を提供する（ここで、該細菌が引き起こす感染症は、グラム陰性菌を含む）。
【０１１２】
別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための、薬学的に有効な量の少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む医薬組成物の使用を提供する（ここで、該細菌が引き起こす感染症は、グラム陰性菌を含む）。
【０１１３】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む抗菌剤を提供する。抗菌剤は、患者における細菌感染症を治療若しくは予防するために使用され得るか、又は、該抗菌剤は、細菌バイオフィルムの形成を低減若しくは排除するために使用され得る（ここで、該細菌が引き起こす感染症又はバイオフィルム形成は、グラム陰性菌を含む）。
【０１１４】
バイオフィルムは、創傷及び／若しくは火傷内に感染症を引き起こすか又は留置医療機器上若しくは内部に感染症を引き起こす可能性を有する。代替的に、細菌バイオフィルムの形成は、食品業界用の調製用機械内部、食品業界によって使用される包装上、水若しくは他の液体に使用される貯蔵タンク内部、又は水処理プラントにおける機械内部に生じ、その全ては、ヒト又は動物が消耗品と接触することから生じる感染症のリスクを増加させる可能性を有する。さらに、病院のベッド、浴室及び病棟に通じるドア等の表面のバイオフィルム形成を介した細菌の蓄積も、ヒトを感染症のリスクに曝す能力を有する。
【０１１５】
したがって、ヒト（及び動物）における細菌感染症を治療又は予防するだけでなく、細菌バイオフィルムの形成を低減又は排除する能力は、本発明の併用剤及び組成物の使用についての同様に重要な考慮事項である。
【０１１６】
本発明の併用物及び組成物はまた、植物における感染症、例えば、マタタビ（Actinidia）属のキウイフルーツ植物におけるシュードモナス・シリンガエ・ｐｖ．アクチニディア（Ｐｓａ−Ｖ）によって引き起こされる細菌感染症の治療又は予防に有用である。ある例では、本発明の併用物及び組成物は、細菌感染症の治療又は予防に関して相乗効果を示す。
【０１１７】
特定の実施態様において、本発明に係る併用剤又は組成物は、１以上の殺菌剤又は静菌剤をさらに含み得る。殺菌剤の例は、ベータラクタム抗生物質（例えば、ペニシリン誘導体、セファロスポリン類、モノバクタム類、カルバペネム類）、バンコマイシン、ダプトマイシン、フルオロキノロン類、メトロニダゾール、ニトロフラントイン、コトリモキサゾール又はテリスロマイシンを含むが、これらに限定されない。静菌剤の例は、テトラサイクリン類、マクロライド類、スルホンアミド類、リンコサミド類、オキサゾリジノン、チゲサイクリン、ノボビオシン、ニトロフラントイン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、クロラムフェニコール、エタンブトール又はクリンダマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
抗生物質耐性の台頭は、医療保険業界に深刻な影響を有しており、そして、細菌感染症に対抗する（すなわち、感染症を治療又は予防する）代替医療を提供するニーズは、ますます重要になっている。したがって、別の態様において、本発明は、医薬の製造における少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の使用、又は医薬の製造における使用のための少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物を提供する。
【０１１９】
別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を含む医薬組成物を提供する（ここで、該細菌が引き起こす感染症は、グラム陰性菌を含む）。
【０１２０】
なお別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための医薬の製造における、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の使用を提供する（ここで、該細菌が引き起こす感染症は、グラム陰性菌を含む）。
【０１２１】
なお別の態様において、本発明は、別個の単位剤形の少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を使用説明書と一緒に含むキットオブパーツを提供する。本発明に係るキットは、感染症に対抗する新たな方法として医療従事者によって処方及び／又は投与され得る。
【０１２２】
なお別の態様において、本発明は、細菌感染症を治療又は予防する方法であって、処置を必要とする患者に少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を患者における細菌感染症を治療又は予防するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する（ここで、該細菌が引き起こす感染症は、グラム陰性菌を含む）。
【０１２３】
ニクロサミドの加水分解は、５−クロロサリチル酸及び２−クロロ−４−ニトロアニリンを生成すると予測される。変異原性研究（Espinosa-Aguirre, J. J., Reyes, R. E. and Cortinas de Nava, C. (1991). Mutagenic activity of 2-chloro-4-nitroaniline and 5-chlorosalicylic acid in Salmonella typhimurium: two possible metabolites of niclosamide. Mutation Research Letters 264(3): 139-145）は、２−クロロ−４−ニトロアニリンは変異原性産物であるが、一方、５−クロロサリチル酸は非変異原性であることを示唆している。図１５は、大腸菌株７ＫＯΔｔｏｌＣの成長を阻害するニクロサミド及び２−クロロ−４−ニトロアニリンの相対能力を示す。２−クロロ−４−ニトロアニリンは、ニクロサミドよりも少なくとも３桁小さい毒性であるが、このことは、この加水分解されたニクロサミド誘導体が、ニクロサミド毒性がもたらされる主要な抗菌剤ではないことを示唆している。
【０１２４】
ニタゾキサニド（図１６、差し込み図）は、本発明の併用物及び組成物において使用することができるサリチルアニリド化合物である。ニタゾキサニドは、クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）及びジアルジア・ランブル（Giardia lambia）感染症のための好ましい処置コースである（Anderson, V.R. and Curran, M.P. (2007). Nitazoxanide: a review of its use in the treatment of gastrointestinal infections. Drugs. 67(13):1947-1967）。ニタゾキサニドは、結核菌において膜電位及びｐＨ恒常性を崩壊させ、ヘリコバクター（Helicobacter）及びカンピロバクター（Campylobacter）並びに他の嫌気性細菌及び寄生生物においてピルビン酸オキシドレダクターゼを阻害する（de Carvalho, L. P. S., Darby, C. M., Rhee, K. Y. and Nathan, C. (2011). Nitazoxanide disrupts membrane potential and intrabacterial pH homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS medicinal chemistry letters 2(11): 849-854）。大腸菌７ＫＯΔｔｏｌＣ（ＤＥ３）細胞（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター制御下で遺伝子の誘導性発現を可能にする、一体型λＤＥ３プロファージを有する菌株７ＫＯΔｔｏｌＣ）では、ニタゾキサニドは、ニクロサミドよりもおよそ２桁小さい毒性である（ＩＣ５０＝５．２μM）。しかしながら、ニクロサミドと同様に、大腸菌ニトロレダクターゼＮｆｓＡ及びＮｆｓＢの過剰発現（この場合、７ＫＯΔｔｏｌＣ（ＤＥ３）においてプラスミドｐＥＴ２８から過剰発現される；Novagen）は、ニタゾキサニド毒性から防御することができる（図１６）。
【０１２５】
サリチルアミド化合物
当業者は、抗生物質活性を有する任意の好適なサリチルアミド化合物が、本発明の併用物及び組成物において使用され得ることを理解するだろう。好ましくは、サリチルアミド化合物は、グラム陰性菌に対して抗生物質活性を示す。本発明における使用のための好適なサリチルアミド化合物は、好ましくは、以下の構造部分を含む：
【化１２】
2018500387.tif 000014
式中、Ａは、アリール又はヘテロアリール環、例えばフェニル環であり、（Ｒ）ｎは、アリール又はヘテロアリール環が１以上の置換基で場合により置換されていてよいことを示し、そして、Ｘは、酸素又は別のヘテロ原子（硫黄等）である。基−Ｃ（＝ｘ）−ＮＨ−は、炭素又は窒素原子を介して環Ａに連結することができる。好ましくは、サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む。
【０１２６】
好ましくは、サリチルアミド化合物は、例えば、以下の式（Ｉ）に示されるとおり、各々場合により置換されていてよい２以上のアリール基、例えば２以上のフェニル環を含むサリチルアニリド化合物である。代替的に、サリチルアミド化合物は、１以上のヘテロアリール基を含み得る。サリチルアミド化合物は、アミド基の酸素の代わりに硫黄等のヘテロ原子を含み得る。用語「サリチルアミド化合物」は、全てのそのような類似体を含むことを意図する。
【０１２７】
好ましいサリチルアミド化合物は、サリチルアニリド化合物であるニクロサミド（Ｎ−（２’−クロロ−４’−ニトロフェニル）−５−クロロサリチルアミド）であり、その構造は、以下に示される。
【化１３】
2018500387.tif 000015
【０１２８】
エタノールアミン塩及びピペリジン塩を含むニクロサミドの塩形態が公知である。さらに、ニクロサミドの一水和物形態も公知である。任意の好適な薬学的に許容し得る塩又は水和物形態が本発明の組成物及び併用物に使用され得る。
【０１２９】
他の好ましいサリチルアミド化合物は、ニクロサミドの類似体を含む。そのような類似体、例えば参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２０１１／０１８３８８９号に記載されている類似体もまた公知である。本発明の併用物及び組成物における使用のための好適なニクロサミド類似体は、以下の表１に列挙されているものを含む一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１〜Ｒ１０は、本明細書に定義されるとおりである）によって記載される類似体を含むが、これらに限定されない。本発明における使用のための他の好適なニクロサミド類似体は、ニクロサミドの承認薬類似体を含む。
【０１３０】
【化１４】
2018500387.tif 000016
【０１３１】
【表１】
2018500387.tif 000017
2018500387.tif 000018
2018500387.tif 000019
【０１３２】
本発明の併用物及び組成物における使用に好適な他のサリチルアミド化合物は、オキシクロザニド（２，３，５−トリクロロ−Ｎ−（３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシベンズアミド）、クロサンテル（Ｎ−［５−クロロ−４−［（４−クロロフェニル）−シアノメチル］−２−メチルフェニル］−２−ヒドロキシ−３，５−ジヨードベンズアミド）、ラフォキサニド（Ｎ−［３−クロロ−４−（４−クロロフェノキシ）フェニル］−２−ヒドロキシ−３，５−ジヨードベンズアミド）、フルサラン（３，５−ジブロモ−２−ヒドロキシ−Ｎ−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミド）、トリブロムサラン（３，５−ジブロモ−Ｎ−（４−ブロモフェニル）−２−ヒドロキシベンズアミド）、ジブロムサラン（５−ブロモ−Ｎ−（４−ブロモフェニル）−２−ヒドロキシベンズアミド）、レソランテル（Ｎ−（４−ブロモフェニル）−２，６−ジヒドロキシベンズアミド）、クリオキサニド（酢酸２−（４−クロロ−フェニルカルバモイル）−４，６−ジヨード−フェニルエステル）、４’−クロロ−５−ニトロサリチルアニリド、２’−クロロ−５’−メトキシ−３−ニトロサリチルアニリド、２’−メトキシ−３，４’−ジニトロサリチルアニリド、２’，４’−ジメチル−３−ニトロサリチルアニリド、４’，５’−ジブロモ−３−ニトロサリチルアニリド、２’−クロロ−３，４’−ジニトロサリチルアニリド、２’−エチル−３−ニトロサリチルアニリド、２’−ブロモ−３−ニトロサリチルアニリドを含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
本発明はまた、他のサリチルアミド化合物、例えば、１以上のヘテロアリール環を含有するサリチルアミド化合物の使用を含む。ヘテロアリール環（単数又は複数）は、１以上の置換基を有し得る。そのような化合物の一例は、以下に示されるニタゾキサニド（２−アセチルオキシ−Ｎ−（５−ニトロ−２−チアゾリル）ベンズアミド）である。
【０１３４】
【化１５】
2018500387.tif 000020
【０１３５】
本発明はさらに、他のサリチルアミド化合物、例えば、アミド基の酸素が別のヘテロ原子に置き換わっているサリチルアミド化合物の使用を含む。そのような化合物の一例は、ブロチアニド（３，４’−ジブロモ−５−クロロチオサリチルアニリド）（以下に示される）である。
【０１３６】
【化１６】
2018500387.tif 000021
【０１３７】
上記のサリチルアミド化合物のいくつかは市販されている。他のものは、当業者に公知の方法によって容易に調製され得る。例えば、参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２００４／００６９０６号は、ニクロサミド類似体を調製するための方法を記載している。
【０１３８】
当業者は、サリチルアミド化合物とニトロ−プロドラッグ抗生物質が、両方の化合物クラスがその化学構造内にニトロ基（単数又は複数）を含むにしても異なることを理解するだろう。本明細書において使用される場合、用語「ニトロ−プロドラッグ抗生物質」は、初期の投与時に、細菌に非毒性又は実質的に非毒性であるが、１以上の細菌のニトロレダクターゼ酵素（単数又は複数）によって還元を受け、それによって細菌に毒性である薬物に変換されるプロドラッグ化合物を意味する。一方で、本出願人によって意外にも見いだされたとおり、本発明のサリチルアミド化合物、例えばニクロサミドは、細菌に毒性であるが、１以上のニトロレダクターゼ酵素（単数又は複数）によって細菌に非毒性である種に変換される化合物である。
【０１３９】
好ましくは、本発明において使用することができるニトロ−プロドラッグ抗生物質化合物はニトロイミダゾール誘導体であるが、当業者は、他の種類の化合物もニトロ−プロドラッグ抗生物質であり得ることを理解するだろう。好適なニトロ−プロドラッグ抗生物質の例は、ニトロフラントイン、ニトロフラゾン、メトロニダゾール、チニダゾール、フラゾリドン、ミソニダゾール、エタニダゾール、ニフルチモックス、オルニダゾール、ベンズニダゾール、ジメトリダゾール、ロニダゾール、ＲＳＵ−１０６９（１−（１−アジリジニル）−３−（２−ニトロ−１−イミダゾリル）−２−プロパノール）、ＲＢ−６１４５（１Ｈ−イミダゾール−１−エタノール、アルファ−（（（２−ブロモエチル）アミノ）メチル）−２−ニトロ−、モノヒドロブロミド）、ＣＢ１９５４（５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド）、ＥＦ３（２−（２−ニトロイミダゾール−１Ｈ−イル）−Ｎ−（３，３，３−トリフルオロプロピル）アセトアミド）、ＥＦ５（２−（２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）アセトアミド）、ＨＸ４（３−フルオロ−２−（４−（（２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−プロパン−１−オール）又はフッ化ミソニダゾールを含むが、これらに限定されない。
【０１４０】
排出ポンプ阻害化合物
排出ポンプは、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方で発現されるが、グラム陰性菌においてより強力な耐性機序である。大腸菌ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣ排出ポンプの同族体は、グラム陰性菌の主な排出ポンプであると考えられる。
【０１４１】
排出ポンプ阻害化合物は、別の化合物、例えば抗生物質を細胞から運び去る排出ポンプの能力に干渉する化合物である。排出ポンプ阻害化合物を抗生物質と一緒に送達することにより、耐性であると同定されている菌株に対してさえも抗生物質の効力を増加させることができることは公知である。そのような排出阻害化合物は、排出ポンプの競合阻害剤であり得る。例えば、ＰＡβＮ（フェニルアラニン−アルギニン β−ナフチルアミド）は、ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣの競合阻害剤であり、このことは、それが細胞外に優先的に運び去られることを意味し、それによって抗生物質の輸送率を低下させ、かつ抗生物質を毒性レベルまで蓄積させる。
【０１４２】
当業者は、任意の好適な排出ポンプ阻害化合物が本発明の併用物及び組成物において使用され得ることに気付くであろう。好ましい排出ポンプ阻害化合物は、広範な細菌株にわたって活性である化合物、特定すると大腸菌ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣ排出ポンプの同族体等のグラム陰性菌の排出ポンプに対して活性である化合物である。参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ９６／３３２８５号は、微生物の排出ポンプ阻害剤の阻害剤をスクリーニングするための方法を記載している。当業者は、そのようなスクリーニング法を使用して、本発明において用いられ得る排出ポンプ阻害剤を同定できることを認識するだろう。
【０１４３】
本発明の併用物及び組成物における使用のための好適な排出ポンプ阻害化合物は、参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ６，３９９，６２９号に記載されている化合物を含むが、これらに限定されない。そのような排出ポンプ阻害化合物は、（２Ｒ，４Ｓ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ−）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｓ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−フェニル）プロピルカルバモイル］プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノプロピオンアミド］−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（アミノプロピオンアミド（aminompropionamido））−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル（carbamolyl））プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−［３−（アミノプロピオンアミド］）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（アミノ−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル（pheynl）−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−メチル−１−［（３−キノリルカルバモイル）ブチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｓ）−４−（２−アミノ−Ｎ−メチルアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−３−メチル−１−（６−メトキシ−８−メチル−３−キノリルカルバモイル）ブチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（６，７−ジメチル−３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−２−（４−メトキシフェニル）−１−（３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−メチル−１−キノリルカルバモイル）ブチル（bulyl）］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（６−エチル−３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−メチル−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（６−エチル−３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−メチル−１−（６−エチル−３−キノリルカルバモイル）ブチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−２−（４−フルオロフェニル）−１−（３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−２−（４−フルオロフェニル）−１−（３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジン（pyrrolidne）カルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（６−メトキシ−８−メチル−３−キノリルカルバモイル）プロピル］２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−１−（３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｓ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、
（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−１−（６−エチル−３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（４，５−ジメチル−２−ヒドロキシフェニルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（６−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（８−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−２−（４−フルオロフェニル）−１−（３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−［３−キノリルメチル）カルバモイル］プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−メチル−１−（３−キノリルカルバモイル（carbamoly））ブチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（６−フルオロ−３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−４−メチル−１−（３−キノリルカルバモイル）ペンチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（５−フルオロ−２−ヒドロキシフェニルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−［（１Ｒ）−３−メチル−１−（６−エチル−３−キノリルカルバモイル）ブチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｓ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−（２−フェニルエチル）−Ｎ−（３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２−アミノプロピオンアミド］−Ｎ−（２−フェニルエチル）−Ｎ−（３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−（２−フェニルエチル）−Ｎ−（３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｓ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−（２−メチルプロピル）−Ｎ−（７−エチル−３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−（２−フェニルエチル）−Ｎ−（３−キノリルカルバモイル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−（２−フェニルエチル）−Ｎ−（３−キノリルカルバモイル）メチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２−アミノプロピオンアミド］−Ｎ−（３，３−ジメチルブチル）−Ｎ−（３−キノリルカルバモイル）メチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−［（２−キノリルオキシ）メチル］プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｓ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−メチル−１−［（２−ナフチルオキシ）メチル］ブチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、
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（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−２−（２−キノリルオキシメチル）ピロリジン、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−２−（６−メチル−３−キノリルカルボキサミドメチル）ピロリジン、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−２−（５−ベンジル−２−ベンズイミダゾリル（benzmidazolyl））ピロリジン、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−２−（５−ベンジル−２−ベンズイミダゾリル）ピロリジン、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−２−（１−（２−フェニル）エチル−２−ベンズイミダゾリル）ピロリジン、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−２−（１−（３−アミノプロピル）−２−ベンズイミダゾリル）ピロリジン、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（２−ベンゾオキサゾリル）−３−フェニルプロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（２−ベンズイミダゾリル）−３−フェニルプロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（５−ベンジル−２−ベンズイミダゾリル）メチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１−（２−フェニル）エチル−２−ベンズイミダゾリル）メチル］−２−ピロリジンカルボキサミド（pyrrolidinexarboxamide）、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（５−１，１−ジメチル）エチル−２−ベンズイミダゾリル）メチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（５−（１−ヒドロキシ−１−フェニル）メチル−２−ベンズイミダゾリル）メチル］−２−ピロリジンカルボキサミド（pyrrolidinecarboxaniide）、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（５−ベンジル−２−ベンズイミダゾリル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（２−ベンズチアゾリル）−３−フェニルプロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（２−ベンゾオキサゾリル）−３−フェニルプロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（５−ベンジル−２−ベンズイミダゾリル）メチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｓ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（５−ベンジル−２−ベンズイミダゾリル）メチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（５−フェニルオキシ−２−ベンズイミダゾリル）メチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（５−フェニル−２−ベンズイミダゾリル（benzimidaxolyl））メチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノエチルチオ）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノエチルオキシ）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノエチルオキシ）−Ｎ−（６−（１，１−ジメチル）エチル−３−キノリル）−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４ＲＳ）−４−（３−アミノプロピル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［５−（ｐ−クロロフェニル）テトラヒドロ−３−チエニル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（グアナジニル（guanadinyl））−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−（３−キノリルカルバモイル）プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［７−エチル−３−キノリル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［６−（１，１−ジメチル）エチル−３−キノリル］−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−（５−ベンジル−２−ヒドロキシフェニル）−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−［４−ベンジル−２−ベンズイミダゾリル）エチル］−２−ピロリジンカルボキサミド、
（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−（６−エチル−３−キノリル）−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−（５−ベンジル−２−ベンズイミダゾリル）−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−（５−ベンジル−２−ベンズイミダゾリル）−２−ピロリジンカルボキサミド、（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（１Ｒ）−３−フェニル−１−［（３−キノリルカルボキサミド）メチル］プロピル］−２−ピロリジンカルボキサミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｄ−プロリル−Ｄ−プロリン−（６−イソプロピル）−３−キノリルアミド、trans−４−アミノ−Ｌ−プロリル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル（butryl）アミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、cis−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｄ−プロリル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、trans−４−（Ｎ−メチルグリシルアミノ）−Ｌ−プロリル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、trans−４−（（Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロピオニルアミノ）−Ｌ−プロリル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、trans−４−アミノメチル−Ｌ−プロリル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、４−（２−アミノエチル）−Ｌ−プロリル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、１−（Ｎ−メチルグリシル）−trans−４−アミノ−Ｌ−プロリル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、trans−４−アミノ−Ｌ−ピペコリノイル（pipecolinoyl）−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、cis−４−アミノ−Ｌ−ピペコリノイル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−ピペコリノイル−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、cis−４−グリシルアミノ−Ｌ−ピペコリノイル（pipecolinoyol）−trans−４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリルアミノ）−Ｌ−プロリン ３−キノリルアミド、Ｄ−オルニチル−trans−４−（４−フェニルブタノイル）アミノ−Ｌ−プロリン−５−インダニルアミド、Ｌ−オルニチル−cis−４−（４−フェニルブタノイル）アミノ−Ｌ−プロリン−５−インダニルアミド、Ｄ−オルニチル−cis−４−（４−フェニルブタノイル）アミノ−Ｌ−プ���リン ５−インダニルアミド、４−ヒドロキシ−Ｌ−オルニチル−trans−４−（４−フェニルブタノイル）アミノ−Ｌ−プロリン ５−インダニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル−Ｄ−ホモフェニルアラニン ３−キノリルアミド、trans−４−アミノ−Ｌ−プロリル−Ｄ−ホモフェニルアラニン ３−キノリルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル−Ｄ−ホモフェニルアラニン ５−インダニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル−Ｄ−ホモフェニルアラニン ３，４−ジメチルフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル−Ｄ−ホモフェニルアラニン ３，５−ジメチルフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル−Ｄ−ホモフェニルアラニン ４−クロロ−３−メチルフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリルグリシン ４−ベンジルフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ（glyclamino）−Ｌ−プロリン ４−フェノキシフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ４−（４’−メチルフェノキシ）フェニルアミド、
trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ４−（４’−クロロフェノキシ）フェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ４−フェニルアミノフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン  ３−ビフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｄ−プロリン ３−ビフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ４−ベンジルフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ４−tert−ブチルフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ４−フェニルベンジルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ４−ベンジルオキシフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ３−ベンジルオキシフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ４−（フェニルチオメチル）フェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ４−ベンジルチオフェニルアミド、trans−４−（（Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロピオニルアミノ）−Ｌ−プロリン ４−フェノキシフェニルアミド、trans−４−（２−アミノエチルスルホニルアミノ）−Ｌ−プロリン ４−フェノキシフェニルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ４−フェニルチアゾール−２−イルアミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリン ３−（６−ベンジル）キノリルアミド、trans−４−アミノ−Ｌ−ピペコリノイル−（４−フェノキシフェニル）アミド、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−ピペコリノイル ４−フェノキシフェニルアミド、trans−４−アミノメチル−Ｌ−プロリン ４−フェノキシフェニルアミド、１−（trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル）−４−（３−クロロフェニル）ピペラジン、１−［trans−４−（（２Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロピオニルアミノ）−Ｄ−プロリル］−４−（３−クロロ−２−メチルフェニル）ピペラジン、１−（Ｎ−trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル）−４−（４−クロロフェニル）ピペラジン、１−（trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル）−４−（２−クロロフェニル）ピペラジン、１−（trans−４−アミノメチル−Ｌ−プロリル）−４−（３−クロロ−２−メチルフェニル）ピペラジン、１−（trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル）−４−（４−フェニルブタノイル）ピペラジン、（２Ｒ）−４−ベンジル−１−（trans−４−グリシルアミノ−Ｄ−プロリル）−２−フェネチルピペラジン、１−（trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル）−４−（４−ベンジルオキシフェノキシ）ピペリジン、１−（trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル）−４−（３，５−ジクロロフェノキシ）ピペリジン、１−（trans−４−グリシルアミノ−Ｄ−プロリル）−４−（３，５−ジクロロフェノキシ）ピペリジン、trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリル−４−（２−クロロ−５−メチルフェノキシ）ピペリジン、（２Ｓ，４Ｒ）−４−グリシルアミノ−２−（４−ビフェニルオキシ）メチルピロリジン、（２Ｓ，４Ｒ）−４−グリシルアミノ−２−（３−ビフェニルオキシ）メチルピロリジン、（２Ｒ，４Ｓ）−４−グリシルアミノ−２−（４−ビフェニルオキシ）メチルピロリジン、（２Ｒ，４Ｓ）−４−グリシルアミノ−２−（３−ビフェニルオキシ）メチルピロリジン、trans−４−��３−ビフェニルオキシ）−Ｌ−プロリン ２−アミノエチルアミド、（２Ｓ，４Ｒ）−２−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−４−（３−ビフェニルオキシ）ピロリジン、１−（Ｎ−trans−４−グリシルアミノ−Ｌ−プロリルアミノ）−３−（４−フェニルプロパノイルアミノ）ベンゼン、２−（trans−４−グリシルアミノ（glycylanino）−Ｌ−プロリルアミノ）−６−（４−フェニルプロパノイルアミノ）ピリジン又は（２Ｓ，４Ｒ）−４−グリシルアミノ−２−（（Ｅ及びＺ）−４−フェニルスチリル）ピロリジンを含むが、これらに限定されない。
【０１４４】
本発明の併用物及び組成物における使用に好適な他の排出ポンプ阻害化合物は、グロボマイシン（グリシン、Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（３−ヒドロキシ−２−メチル−１−オキソノニル）−Ｎ−メチルロイシル）−Ｌ−アロイソロイシル）−Ｌ−セリル）−Ｌ−アロトレオニル）−、rho−ラクトン）、カルボニルシアニド ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、ピリドキノロン、ＭＣ−０４，１２４（（２Ｒ，４Ｒ）−４−（アミノメチル）−Ｎ−［（２Ｒ）−１−オキソ−４−フェニル−１−（キノリン−６−イルアミノ）ブタン−２−イル］ピロリジン−２−カルボキサミド）、又はＭＣ−０２，５９５（Ｄ−オルニチン−Ｄ−ホモフェニルアラニン−３−アミノキノリン）を含むが、これらに限定されない。
【０１４５】
本発明の併用物及び組成物における使用に好適な排出ポンプ化合物のクラスは、アルコキシキノリン誘導体、例えば、２，８−ジメチル−４−（２’−ピロリジノエチル）−オキシキノリン；ピペリジン及びピペリジン類似体；フェノチアジン類、例えば、クロロプロマジン；モノテルペン誘導体、例えば、ゲラニルアミン；又はアルギニン誘導体、例えば、参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ６，２５１，８６９号に記載されるものを含むが、これらに限定されない。
【０１４６】
本発明の併用物及び組成物における使用に好適な排出ポンプ阻害剤の別の例は、２−３ジブロモマレイミドである。
【０１４７】
本発明の併用物及び組成物における使用に好適な好ましい排出ポンプ阻害剤は、フェニルアラニン−アルギニン β−ナフチルアミド（ＰＡβＮ）である。
【０１４８】
他の態様
サリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物は、個別に、連続的に又は同時に投与され得る。例えば、サリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物の併用物は、患者への投与のための組成物として一緒に製剤化され得る。代替的に、サリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物は、各々、患者への個別又は連続投与のために個別に製剤化され得る。
【０１４９】
サリチルアミド化合物又はサリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物は、経口、非経口、吸入スプレーによる、局所、直腸、経鼻、口腔、静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は埋め込み型リザーバー（implanted reservoir）を介する経路を含む種々の経路によって、好ましくは静脈内によって、患者に投与され得る。投与されるべき各化合物の量は、患者の特質並びに処置されるべき障害の特質及び程度に応じて広く変化するだろう。成人についての典型的な投与量は、サリチルアミド化合物では最大で約５ｇ、好ましくは最大で約２ｇ、そして、排出ポンプ阻害化合物では最大で約５ｇ、好ましくは最大で約２ｇであろう。任意の特定の患者に必要な具体的な投与量は、患者の年齢、体重、総体的な健康状態、性別等を含む種々の要因に依存するだろう。
【０１５０】
個別、連続又は同時経口投与のために、サリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物は、固体又は液体製剤、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤及び分散剤へと製剤化され得る。そのような製剤は、ここに列挙していない他の経口投与計画と同様に当技術分野において周知である。錠剤形態において、該化合物は、ラクトース、スクロース及びトウモロコシデンプン等の従来の錠剤基剤を結合剤、崩壊剤及び滑剤と一緒に用いて錠剤化され得る。結合剤は、例えば、トウモロコシデンプン又はゼラチンであり得、崩壊剤はジャガイモデンプン又はアルギン酸であり得、そして、滑剤はステアリン酸マグネシウムであり得る。カプセル剤の形態での経口投与のために、ラクトース及び乾燥トウモロコシデンプン等の希釈剤が用いられ得る。着色剤、甘味料又は香料等の他の成分が加えられ得る。
【０１５１】
水性懸濁剤が経口使用に必要とされる場合、サリチルアミド化合物又はサリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物は、水及びエタノール等の担体と組み合わせられ得、そして、乳化剤、懸濁化剤及び／又は界面活性剤が使用され得る。着色剤、甘味料又は香料もまた加えられ得る。
【０１５２】
サリチルアミド化合物又はサリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物はまた、水又は生理食塩水等の生理学的に許容し得る希釈剤中の注射によって、個別に、連続的に又は同時に投与され得る。希釈剤は、エタノール、プロピレングリコール、油又は薬学的に許容し得る界面活性剤等の１以上の他の成分を含み得る。一例では、該化合物は、希釈剤がスクロース、Ｌ−ヒスチジン及び薬学的に許容し得る界面活性剤（例えば、Tween 20）の水溶液を含む静脈内注射によって、個別に、連続的に又は同時に投与される。
【０１５３】
サリチルアミド化合物又はサリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物はまた、個別に、連続的に又は同時に局所投与され得る。該化合物の局所投与のための担体は、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水を含む。該化合物は、皮膚又は粘膜への局所投与のために、ローション剤又はクリーム剤中の成分として存在し得る。そのようなクリーム剤は、１以上の薬学的に許容し得る担体中に懸濁又は溶解された活性化合物を含有し得る。好適な担体は、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水を含む。
【０１５４】
サリチルアミド化合物又はサリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物は、さらに、持続放出系によって、個別に、連続的に又は同時に投与され得る。例えば、これらは、ゆっくり溶解する錠剤又はカプセル剤中へ組み込まれ得る。
【０１５５】
植物における感染症、例えば、マタタビ属のキウイフルーツ植物におけるシュードモナス・シリンガエ・ｐｖ．アクチニディア（Ｐｓａ−Ｖ）によって引き起こされる細菌感染症の処置のために、サリチルアミド化合物及び排出ポンプ阻害化合物は、場合により、例えば植物への適用のためのスプレー剤として、１以上の担体を用いて製剤化され得る。該化合物は、個別に、連続的に又は同時に適用され得る。植物への適用のために、本発明の併用物及び組成物は、植物への適用に好適な１以上の補助剤、例えば乳化剤、分散剤、鉱油及び植物油、又はそれらの混合物をさらに含み得る。該併用物及び組成物はまた、果樹園間の細菌感染症の蔓延を防止するために、フィールド用具（例えば、剪定ばさみ）用の滅菌剤として使用され得る。
【０１５６】
本発明はまた、細菌感染症を治療又は予防するための機器及びキットに関する。好適なキットは、個別、連続又は同時使用のための、少なくとも１つの細菌感染症の少なくとも１つの処置に十分な少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物を、該治療／予防を実施するための説明書と一緒に含む。
【０１５７】
キットの及び細菌感染症の治療／予防の使用説明書は、ラベリングの形態であり得、それは、製造、輸送、販売又は使用中のあらゆる時点においてキットに添付されている又はそうでなければ付属されている任意の文書体又は記録体を指す。例えば、用語「ラベリング」は、広告リーフレット及びパンフレット、包装材料、説明書、オーディオ又はビデオカセット、コンピューターディスク、並びにキットに直接印刷された文書を包含する。
【０１５８】
本明細書に提示される本出願人の結果は、驚くべきことに、ニトロ−プロドラッグ抗生物質並びに１以上のニトロ基を含有するサリチルアミド、例えばニクロサミド及びニクロサミド類似体を含む特定の薬物を細菌がどのようにして代謝するかの分子基礎への興味深い見識を提供する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本出願人は、ニトロ−プロドラッグ抗生物質での処置に耐性を持つようになっている細菌が、次いで、内因性ニトロレダクターゼ遺伝子の自然突然変異のために、１以上のニトロ基含有サリチルアミド化合物での処置に感受性になるだろうということを提唱する。一方で、野生型と比較した内因性ニトロレダクターゼ活性の喪失又は低減は、一旦細菌細胞内に入ってもプロドラッグは毒性抗生物質を産生するように開裂されないので、細菌細胞がニトロ−プロドラッグ抗生物質に耐性であることを意味する。一方で、内因性ニトロレダクターゼ活性の喪失又は低減は、ニトロレダクターゼ活性の非存在下では細菌細胞がもはや毒性のニクロサミドを非毒性形態に変換することができないので、細菌細胞が１以上のニトロ基含有サリチルアミド化合物、例えばニクロサミド及びニクロサミド類似体により感受性であることを意味する。排出ポンプ阻害剤は、場合により１以上のニトロ基含有サリチルアミド化合物と共に含まれ、該薬物に対する感受性を増強させ得る。
【０１５９】
したがって、なお別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための方法（ここで、該細菌は、ニトロ−プロドラッグ抗生物質での処置に耐性を持つようになっている）であって、該患者に少なくとも１つのサリチルアミド化合物を、感染症を治療又は予防するのに十分な量で投与することを含む方法（ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）を提供する。場合により、該方法は、少なくとも１つの排出ポンプ阻害剤を投与することをさらに含む。
【０１６０】
なお別の態様において、本発明は、細菌バイオフィルムの形成を低減又は排除するための方法（ここで、該細菌は、ニトロ−プロドラッグ抗生物質での処置に耐性を持つようになっている）であって、少なくとも１つのサリチルアミド化合物を該バイオフィルムの形成を低減又は排除するのに十分な量で投与することを含む方法（ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）を提供する。場合により、該方法は、少なくとも１つの排出ポンプ阻害剤を投与することをさらに含む。
【０１６１】
反対に、１以上のニトロ基含有サリチルアミド化合物での処置（排出ポンプ阻害剤が存在する又はしない）に耐性を持つようになっている細菌は、ニトロレダクターゼ酵素活性の増加を引き起こす内因性ニトロレダクターゼ遺伝子の突然変異を介してそのようになっている可能性がある。一方で、野生型と比較した内因性ニトロレダクターゼ活性の増加は、細菌細胞がもはや毒性のニトロ基含有サリチルアミド化合物、例えばニクロサミド及びニクロサミド類似体を非毒性形態に変換することができないので、細菌細胞がニトロ基含有サリチルアミド化合物（排出ポンプ阻害剤の存在下又は非存在下）に耐性であることを意味する。一方で、内因性ニトロレダクターゼ活性の増加は、細菌細胞がプロドラッグを開裂して活性形態の抗生物質を形成するので、細菌細胞が１以上のニトロ−プロドラッグ抗生物質により感受性であることを意味する。
【０１６２】
したがって、なお別の態様において、本発明は、患者における細菌感染症を治療又は予防するための方法（ここで、該細菌は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出阻害化合物での処置に耐性を持つようになっており、ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）であって、該患者にニトロ−プロドラッグ抗生物質を、感染症を治療又は予防するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。
【０１６３】
なお別の態様において、本発明は、細菌バイオフィルムの形成を低減又は排除するための方法（ここで、該細菌は、少なくとも１つのサリチルアミド化合物又は少なくとも１つのサリチルアミド化合物及び少なくとも１つの排出ポンプ阻害化合物の併用物での処置に耐性を持つようになっており、ここで、該サリチルアミド化合物は、１以上のニトロ基を含む）であって、ニトロ−プロドラッグ抗生物質を該バイオフィルムの形成を低減又は排除するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。
【０１６４】
特定の実施態様において、ニトロ−プロドラッグ抗生物質は、ニトロフラントイン、ニトロフラゾン、メトロニダゾール、チニダゾール、フラゾリドン、ミソニダゾール、エタニダゾール、ニフルチモックス、オルニダゾール、ベンズニダゾール、ジメトリダゾール、ロニダゾール、ＲＳＵ−１０６９、ＲＢ−６１４５、ＣＢ１９５４、ＥＦ３、ＥＦ５、ＨＸ４及びフッ化ミソニダゾールからなる群より選択される。
【０１６５】
定義
用語「患者」は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、トリ並びに哺乳動物、特に、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ及びフクロネズミを含むが、これらに限定されない。用語「患者」及び「被験体」は、本明細書において互換的に使用され、細菌感染症を予防又は治療する状況下で、医療健康従事者、並びに処置を受けている患者を含む。
【０１６６】
「処置」及び類似の用語は、医学的疾患、障害若しくは状態を予防、治療若しくは改善する、及び／又はそのような疾患若しくは障害の少なくとも１つの症状を低減させる、方法及び組成物を指す。特に、これは、医学的疾患、障害若しくは状態の発症を予防若しくは遅延させる；医学的疾患、障害若しくは状態の身体的若しくは発生上の影響を治療、修正、低減、減速若しくは改善する；及び／又は医学的疾患、障害若しくは状態によって引き起こされる疼痛若しくは苦痛を予防、終焉、低減若しくは改善する、方法及び組成物を含む。
【０１６７】
用語「予防する」は、事態又は事象、例えば、予防されるべき細菌感染症の生成又は出現を全体的若しくは部分的に予防すること、又は改善若しくは制御すること、又は低減若しくは停止することを意味する。
【０１６８】
用語「アリール」は、４〜１８個の炭素原子を有する芳香族基を意味する。例は、単環式基、並びに二環式基及び三環式基等の縮合基を含む。例は、フェニル、インデニル、１−ナフチル、２−ナフチル、アズレニル、ヘプタレニル、ビフェニル、インダセニル、アセナフチル、フルオレニル、フェナレニル、フェナントレニル、アントラセニル、シクロペンタシクロオクテニル及びベンゾシクロオクテニルを含む。
【０１６９】
用語「ヘテロアリール」は、４〜１８個の炭素原子を有しかつ１以上のヘテロ原子を含む芳香族基を意味する。例は、単環式基、並びに二環式基及び三環式基等の縮合基を含む。例は、ピリジル、ピロリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、キナゾリニル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、トリアジニル、フリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、インドリル、チオフェニル、ベンジルチオフェニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、プリニル、ピラゾリル、インダゾリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾール、ベンズイソオキサゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル及びテトラゾリルを含む。
【０１７０】
用語「薬学的に許容し得る塩」は、例えば以下の酸塩を含む、無機酸又は有機酸から誘導される非毒性の塩に適用されることを意図する：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩（glucoheptanoate）、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩（palmoate）、ペクチン酸塩（pectinate）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩及びウンデカン酸塩。
【０１７１】
本明細書において使用される場合、語「〜を含む（comprises）」、「〜を含む（comprising）」及び類似の語は、排他的又は網羅的意味で解釈されるべきではない。言い換えれば、これらは、「〜を非限定的に含む（including, but not limited to）」を意味することを意図する。
【０１７２】
本発明の目的のために、開示化合物への任意の言及は、全ての可能な形式、構成及び配置、例えば、遊離形態（例えば、遊離酸又は塩基として）、塩若しくは水和物の形態、異性体（例えば、cis/trans異性体）、エナンチオマー、ジアステレオマー及びエピマー等の立体異性体の形態、エナンチオマー若しくはジアステレオマーの混合物の形態、ラセミ体若しくはラセミ体混合物の形態、又は個々のエナンチオマー若しくはジアステレオマーの形態を含む。該化合物の具体的な形態は、本明細書に詳述される。
【０１７３】
例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０に関して、本明細書に開示される下位範囲（sub-scope）のいずれかを、本明細書に開示される他の下位範囲のいずれかと組み合わせて、さらなる下位範囲を生じさせ得ることが理解されよう。
【０１７４】
また、本明細書に開示される数値範囲（例えば、１〜１００）への任意の言及が、その範囲内の全ての有理数（例えば、１．１、２０．５、５５．６、７０、９０）、またその範囲内の有理数の任意の範囲（例えば、１．１〜３．５）を包含することを意図し、それ故、本明細書に明示的に開示される全ての範囲の全ての下位範囲がこれによって明示的に開示されることが理解されよう。これらは、具体的に意図される単なる例であり、そして、列挙される最低値と最高値の間の数値の全ての可能な組み合わせが本明細書に明示的に開示されるものと見なされるべきである。
【実施例】
【０１７５】
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明される。特許請求される本発明がこれらの実施例に限定されることを決して意図していないことが理解されよう。
【０１７６】
大腸菌株の作製
欠失菌株を、Ｒｅｄリコンビナーゼ法を介して、ＰＣＲ増幅破壊カセットを使用したインフレーム欠失によって作製する（Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645）。破壊カセット増幅及びオーバーラップＰＣＲに使用するＰＣＲプライマーを図１７に描写する。大腸菌株７ＫＯを、大腸菌Ｗ３１１０から天然のｎｆｓＡ、ｎｆｓＢ、ａｚｏＲ、ｎｅｍＡ、ｙｉｅＦ、ｙｃａＫ及びｍｄａＢ遺伝子の欠失によって誘導する。大腸菌株７ＫＯΔｔｏｌＣを、７ＫＯから天然のｔｏｌＣ遺伝子の欠失によって誘導する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを介した誘導性発現を可能にする一体化したλＤＥ３プロファージを有する大腸菌株７ＫＯΔｔｏｌＣ（ＤＥ３）を、７ＫＯΔｔｏｌＣからλＤＥ３溶原化キット（Novagen, Merck, Darmstadt, Germany）を使用して誘導する。オキシドレダクターゼを、７ＫＯΔｔｏｌＣ中、プラスミドｐＵＣＸ（ｐＵＣ１９由来の発現プラスミドである）から発現する（Prosser, G.A., Copp, J.N., Mowday, A.M., Guise, C.P., Syddall, S.P., Williams, E.M., Horvat, C.N., Swe, P.S., Ashoorzadeh, A., Denny, W.A., Smaill, J.B., Patterson, A.V. and Ackerley, D.F. (2013). Creation and screening of a multi-family bacterial oxidoreductase library to discover novel nitroreductases that efficiently activate the bioreductive prodrugs CB1954 and PR-104A. Biochemical Pharmacology 85:1091-1103）。オキシドレダクターゼを、７ＫＯΔｔｏｌＣ（ＤＥ３）中、プラスミドｐＥＴ２８から発現する（Novagen, Merck, Darmstadt, Germany）。
【０１７７】
細胞感受性アッセイ
この手順を、以下で又は個々の図の説明で他に指示がない限り、ニクロサミド又は２−クロロ−４−ニトロアニリンの存在下で作製されるグラム陰性菌株の成長曲線を作成する全ての実験に適用する。ＬＢ（７ＫＯΔｔｏｌＣオキシドレダクターゼ過剰発現菌株用の１００μg・mL-1 アンピシリン及び０．４％（w/v）グルコースを補充した）１００μLを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに２反復で植菌し、２００rpmで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートする。翌日、一晩培養物１００μLを使用して、ＬＢ（上記のアンピシリン及びグルコースの他に、オキシドレダクターゼ過剰発現菌株用の５０μM ＩＰＴＧを補充した）２mLに植菌し、３０℃、２００rpmで３．５時間インキュベートする。次いで、各培養物のアリコート ４０μLを、ＬＢ（ＩＰＴＧ、アンピシリン及びグルコース並びに上記のオキシドレダクターゼ過剰発現菌株用の抗生物質を補充した）４０μL中、ニクロサミド又は２−クロロ−４−ニトロアニリンの希釈系列（０μM 対照を含む）を各々含有する滅菌３８４ウェルプレートの個々のウェルに２反復で加える。曝露の４時間後、培養物濁度を６００nmでの光学密度（ＯＤ６００）によってモニタリングする。成長百分率を、初期吸光度値（ｔ＝０時間）を減算した後、ニクロサミド又は２−クロロ−４−ニトロアニリンを曝露した細胞と非曝露０μM 対照との比較によって計算する。全てのマイクロタイタープレートの吸光度読み取り値を、EnSpire（商標）2300 Multilabel Reader（Perkin Elmer, Waltham, MA）を使用して測定する。必要であれば、ＩＣ５０値（所与の菌株について非曝露対照に相対して５０％の成長阻害を引き起こす薬物濃度）を、GraphPad Prism 5（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA）で非線形回帰分析を使用して計算する。
【０１７８】
７ＫＯΔｔｏｌＣオキシドレダクターゼライブラリーのニクロサミド成長阻害アッセイ
この手順を、図５に描写される実験に適用する。１００μg・mL-1 アンピシリン及び０．４％（w/v）グルコースを補充したＬＢ １００μLを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに、７ＫＯΔｔｏｌＣライブラリー菌株（ｐＵＣＸ空プラスミド対照を含む）を２反復で植菌し、２００rpmで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートする。各一晩培養物１００μLを使用して、１００μg・mL-1 アンピシリン及び５０μM ＩＰＴＧを補充したＬＢ ２mLに植菌し、３０℃、２００rpmで３．５時間インキュベートする。次いで、各培養物のアリコート４０μLを、１００μg・mL-1 アンピシリン、５０μM ＩＰＴＧ、及び２．５μM ニクロサミド又は０μM ニクロサミドを含有する（対照ウェル）かのいずれかを補充したＬＢ培地４０μLを含有する滅菌３８４ウェルプレートの個々のウェルに加える。各オキシドレダクターゼ過剰発現菌株を２反復で試験する（独立反復）。曝露の４時間後、培養物濁度を６００nmでの光学密度によってモニタリングする。成長阻害率を、以下の式を使用して、初期吸光度値（ｔ＝０時間）を減算した後、曝露した細胞と非曝露０μM 対照との比較によって計算する：（１−（曝露ＯＤ６００／非曝露ＯＤ６００））×１００％。全てのマイクロタイタープレートの吸光度読み取り値を、EnSpire（商標）2300 Multilabel Reader（Perkin Elmer, Waltham, MA）を使用して測定する。
【０１７９】
バリアント遺伝子ライブラリーからの活性ニトロレダクターゼを発現するクローンを富化するニクロサミドの能力の分析
この手順を、図６及び７に描写される実験に適用する。エレクトロコンピテントＳＯＳ−Ｒ４細胞を、ｐＵＣＸにライゲーションされている約９５００万からなるｎｆｓＡバリアントライブラリーの一部で形質転換する。形質転換後、細胞を、０．５μM ニクロサミド及び０．１μM ＩＰＴＧをプラスした又はプラスしていないのいずれかの１００μg/mL アンピシリン及び５０μg/mL スペクチノマイシン含有寒天プレート上にプレーティングする。プレートを３０℃で一晩成長させ、コロニーを形成させる。次いで、各培地条件のプレートから５７個のコロニーを選び取り、そして、（ｎｆｓＡ、空プラスミド及び培地対照と一緒に）、別々の９６ウェルプレートの内側の６０ウェル内の、１００μg/mL アンピシリン及び５０μg/mL スペクチノマイシンを含有するＬＢ １００μl中に移す。培養物を一晩成長させた後、そこからグリセロールストックを作り、全ての後続のアッセイに植菌する。成長阻害アッセイのために、各グリセロールプレートを使用して、１００μg/mL アンピシリン、５０μg/mL スペクチノマイシン及び０．４％グルコースをプラスしたＬＢ １５０μLを各々含有する新たなマイクロタイタープレートの内側の６０ウェルに植菌する。次いで、プレートを３０℃、２００rpmで一晩インキュベートする。翌日、一晩培養物１５μLを使用して、新たなマイクロタイタープレートの内側の６０ウェルの各々内の、１００μg/mL アンピシリン、５０μg/mL スペクチノマイシン、０．２％グルコース及び５０μM ＩＰＴＧを含有するＬＢ ２００μLに植菌する。各プレートを、３０℃、２００rpmで２．５時間インキュベートする。次いで、これらの一日培養物の各々３０μLを、１００μg/mL アンピシリン、５０μg/mL スペクチノマイシン、０．２％グルコース及び５０μM ＩＰＴＧ並びに１００μM プロドラッグ（図６についてメトロニダゾール、図７についてチニダゾール）又は等価なＤＭＳＯ溶剤のみの対照のいずれかで修正されたＬＢ（３０μL）を含有する３８４ウェルプレートの個々のウェルに移す。各選択されたクローンを、各３８４ウェルプレート上にて２反復で曝露する。次いで、３８４ウェルプレートを３０℃、２００rpmで３時間インキュベートし、その後、プレートリーダー内で各ウェルの６００nmにおける光学密度を読み取る。成長阻害率を、以下の式を使用して、初期吸光度値（ｔ＝０時間）を減算した後、曝露した細胞と非曝露０μM 対照との比較によって計算する：（１−（曝露ＯＤ６００／非曝露ＯＤ６００））×１００％。全てのマイクロタイタープレートの吸光度読み取り値を、EnSpire（商標）2300 Multilabel Reader（Perkin Elmer, Waltham, MA）を使用して測定する。
【０１８０】
異なる細菌株に及ぼす併用又は個々のニクロサミド処置及びＰＡβＮ処置の効果のヒートマップ分析
この手順を、図８〜１５に描写される実験に適用する。所望の菌株をＬＢ ３mLに植菌し、２００rpmで振盪しながら３０℃（Ｐｓａ−Ｖ又は大腸菌実験室株７ＫＯ若しくは７ＫＯΔｔｏｌＣ）又は３７℃（大腸菌実験室株Ｗ３１１０、緑膿菌実験室株ＰＡＯ１又は全ての臨床分離菌株）で１６時間インキュベートする。一晩培養物のＯＤ６００を測定し、そして、細胞を０．１M ＭｇＳＯ４で修正されたＬＢ中で０．２のＯＤ６００まで希釈する（これは、培地で１／２希釈した後に０．１の開始ＯＤ６００を与えるだろう）。培養培地（３８４ウェルプレートの１ウェル当たり３０μL）は、ＬＢ、０．１M ＭｇＳＯ４及び細菌培養物での１／２希釈を考慮して所望の終濃度の２倍のＰＡβＮを含有する。各ＰＡβＮ希釈のための培養培地のアリコート（１ウェル当たり６０μL）に、細菌培養物での１／２希釈を考慮して使用すべき最高終濃度の２倍のニクロサミドを補充する。３８４ウェルプレートの行Ｈ（又はＰ）に、図１８に示されるとおり各ニクロサミド／ＰＡβＮ培地併用物６０μLを加える。行Ａ〜Ｇに、培養培地（ＰＡβＮのみ）３０μLを加える。ニクロサミドの系列希釈を、行Ｈから培地３０μLを取り出し、それを行Ｇに移し、混合し、次いで行Ｇの３０μLを行Ｆに移すことを行Ｂまで続けることによって実施する。行Ｂの後、最後の３０μLを廃棄し、行Ａは０μM ニクロサミドのままにする。次いで、各ウェルに細菌培養物（ＯＤ６００＝０．２）３０μLを植菌し、１ウェル当たり０．１の最終ＯＤ６００を与える。ＯＤ６００を測定し（ｔ＝０）、そして培養物を３０℃又は３７℃（一晩培養物に従って）、２００rpmで４時間インキュベートする。次いで、最終ＯＤ６００（ｔ＝４）を記録する。成長阻害を計算するために、ｔ＝０値をｔ＝４値から減算する。次いで、０μM ニクロサミド及び０ウェルμM ＰａβＮウェル（１００％成長を表す）に相対的な成長百分率を計算する。
【０１８１】
７ＫＯΔｔｏｌＣ（ＤＥ３）細胞感受性アッセイ
この手順を、図１６に描写される実験に適用する。５０μg・mL-1を補充したＬＢ １００μLを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに、大腸菌ｎｆｓＡ、大腸菌ｎｆｓＢ又はｐＥＴ２８空プラスミド対照を過剰発現する７ＫＯΔｔｏｌＣ（ＤＥ３）菌株を２反復で植菌する。９００rpmのHeidolph titramaxプラットフォームシェーカー内で菌株を３０℃で一晩インキュベートする。各一晩培養物３０μLを使用して、９６ウェルディープ培養プレート（Axygen）内の５０μg・mL-1 カナマイシン及び５０μM ＩＰＴＧを補充したＬＢ ６００μLの培養物に２反復で植菌する。培養物を３０℃、１２００rpmで２．５時間インキュベートする。次いで、各培養物のアリコート４０μLを、１００μg・mL-1 カナマイシン、５０μM ＩＰＴＧ及びニタゾキサニドの系列希釈物（０μM 対照を含む）を補充したＬＢ培地４０μLを含有する滅菌３８４ウェルプレートの個々のウェルに加える。各ニトロレダクターゼ過剰発現菌株を２反復で試験する（独立反復）。曝露の４時間後、培養物濁度を６００nmでの光学密度によってモニタリングする。成長百分率値を、初期吸光度値（ｔ＝０時間）を減算した後、ニタゾキサニドを曝露した細胞と非曝露対照との比較によって計算する。マイクロタイタープレートの吸光度読み取り値を、Eon Biotek Reader（BioTek Instruments Inc.）を使用して測定する。
【０１８２】
ニクロサミド又はニタゾキサニドによるグラム陽性菌の成長阻害：ＩＣ５０測定
この手順を、図２０及び２１に描写される実験に適用する。トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）２mLを含有する１５mLのチューブに、グラム陽性菌株の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ４３３００（ＭＲＳＡ）、バチルス・チューリンゲンシス P.1.IPS-80 serovar israelensis、又はリステリア・ウェルシメリＡＴＣＣ３５８９７を植菌した。菌株を２００rpmで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、一晩培養物を新鮮なＴＳＢ中で希釈し、およそ０．３のＯＤ６００を与えた。次いで、この２反復のアリコート ４０μLを、２×ニクロサミド又はニタゾキサニドの系列希釈物（０μM 対照を含む）を補充したＴＳＢ培地４０μLを含有する滅菌３８４ウェルプレートの個々のウェルに加えた。曝露の４時間後、６００nmにおける光学密度によって培養物濁度をモニタリングした。成長阻害率値を、初期吸光度値（ｔ＝０時間）を減算した後、各菌株についてニクロサミド又はニタゾキサニドを曝露した細胞と非曝露対照との比較によって計算した。マイクロタイタープレートの吸光度読み取り値を、EnSpire（商標）2300 Multilabel Reader（Perkin Elmer, Waltham, MA）を使用して測定した。Graphpad Prism 5（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA）を使用して、各菌株に対する化合物毎の阻害濃度（ＩＣ５０；試験菌株の成長が非曝露対照の成長の５０％の濁度レベルに達する化合物の濃度）を計算した。
【０１８３】
様々なニクロサミド又はニタゾキサニドの濃度にわたるグラム陽性菌株の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ４３３００、リステリア・ウェルシメリＡＴＣＣ３５８９７及びバチルス・チューリンゲンシス P.1.IPS-80 serovar israelensisについての図２０及び２１に提示されるデータから導出されたＩＣ５０値を、以下のように表１に提示する：
【０１８４】
【表２】
2018500387.tif 000022
【０１８５】
本発明は、例として説明されているが、特許請求の範囲に定義されるとおりの本発明の範囲から逸脱することなく変形及び改変が行われ得ることが理解されるべきである。さらに、具体的特徴に対して公知の等価物が存在する場合、そのような等価物は、あたかも本明細書において具体的に言及されたかのように組み入れられる。
【図１】
2018500387.tif 000023
【図２】
2018500387.tif 000024
【図３】
2018500387.tif 000025
【図４】
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【図５】
2018500387.tif 000027
【図６】
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【図７】
2018500387.tif 000029
【図８】
2018500387.tif 000030
【図９】
2018500387.tif 000031
【図１０】
2018500387.tif 000032
【図１１】
2018500387.tif 000033
【図１２】
2018500387.tif 000034
【図１３】
2018500387.tif 000035
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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