(57)【要約】  本出願は、エクスビボおよびインビボの両方において、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の患者を治療するための材料および方法を提供する。さらに、本出願は、ゲノム編集により細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するための材料および方法を提供する。
2018535691.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム編集によりヒト細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集する方法であって、ヒト細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、永続的な欠失、挿入、または、発現もしくは機能の修正もしくは調節、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の発現もしくは機能への影響を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させるステップを含む方法。
【請求項２】
ゲノム編集によりヒト細胞にＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を挿入する方法であって、ヒト細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入し、セーフハーバー座位の内部またはその近傍に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらすことにより、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入と、ＡＡＴ活性の回復とを生じることを含む方法。
【請求項３】
アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのエクスビボ法であって、
ｉ）患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製すること；
ｉｉ）ｉＰＳＣの、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、あるいは、ｉＰＳＣの、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集すること；
ｉｉｉ）ゲノム編集したｉＰＳＣを肝細胞へ分化させること；および
ｉｖ）肝細胞を患者に移植すること：
のステップを含む方法。
【請求項４】
作製ステップが、
ａ）患者から体細胞を単離すること；および
ｂ）体細胞に、一連の多能性関連遺伝子を導入することにより、体細胞を多能性幹細胞に誘導すること：
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
体細胞が線維芽細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
一連の多能性関連遺伝子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧおよびｃＭＹＣからなる群から選択される１つ以上の遺伝子である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
編集ステップが、ｉＰＳＣに、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、永続的な欠失、挿入、または、発現もしくは機能の修正もしくは調節、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の発現もしくは機能への影響を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
分化ステップが、ゲノム編集したｉＰＳＣを肝細胞へ分化させる以下のステップのうち１つ以上を含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法：ゲノム編集したｉＰＳＣを、アクチビン、Ｂ２７サプリメント、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、オンコスタチンＭ、デキサメタゾンの１つ以上と接触させること。
【請求項１０】
移植ステップが、該幹細胞を、移植、局所注射、または全身注入、またはこれらの組み合わせにより、患者に移植することを含む、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのエクスビボ法であって、
ｉ）患者の肝臓の生検を行うこと；
ｉｉ）肝臓特異的な前駆細胞または初代肝細胞を単離すること；
ｉｉｉ）前駆細胞または初代肝細胞の、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で編集すること、あるいは、前駆細胞または初代肝細胞の、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集すること；および
ｉｖ）ゲノム編集した前駆細胞または初代肝細胞を患者に移植すること：
のステップを含む方法。
【請求項１２】
単離ステップが、消化酵素による新鮮な肝臓組織の灌流、細胞の分画遠心、細胞培養、およびこれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
編集ステップが、前駆細胞または初代肝細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、永続的な欠失、挿入、修正、または、発現もしくは機能の調節、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の発現もしくは機能への影響を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
移植ステップが、移植、局所注射、または全身注入、またはこれらの組み合わせによりゲノム編集した前駆細胞または初代肝細胞を患者に移植することを含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのエクスビボ法であって、
ｉ）患者の骨髄の生検を行うこと；
ｉｉ）患者から間葉系幹細胞を単離すること；
ｉｉｉ）間葉系幹細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で編集すること、または、間葉系幹細胞のセーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集すること；
ｉｖ）ゲノム編集した間葉系幹細胞を肝細胞へ分化させること；および
ｖ）肝細胞を患者に移植すること：
のステップを含む方法。
【請求項１７】
間葉系幹細胞が、患者の骨髄または末梢血から単離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
単離ステップが、骨髄の吸引、およびパーコール（商標）を用いた密度遠心分離による間葉系細胞の単離を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
編集ステップが、間葉系幹細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、永続的な欠失、挿入、修正、または、発現もしくは機能の調節、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の発現もしくは機能への影響を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
分化ステップが、ゲノム編集した幹細胞を肝細胞へ分化させる以下のステップのうち１つ以上を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法：ゲノム編集した間葉系幹細胞をインスリン、トランスフェリン、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、または胆汁酸のうち１つ以上と接触させること。
【請求項２２】
移植ステップが、該幹細胞を、移植、局所注射、または全身注入、またはこれらの組み合わせにより、患者に移植することを含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのインビボ法であって、患者の細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列を編集すること、あるいは、患者の細胞内のセーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集することのステップを含む方法。
【請求項２４】
細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、永続的な欠失、挿入、または、修正もしくは調節を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；または、それらのホモログ、天然分子の遺伝子組換え、それらのコドン最適化バージョン、または改変バージョン、およびこれらの組み合わせである、請求項１、２、７、１３、１９または２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、細胞に導入することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を、細胞に導入すること含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
１つ以上のポリヌクレオチドまたは1つ以上のＲＮＡが、1つ以上の改変型ポリヌクレオチドまたは１つ以上の改変型ＲＮＡである、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＤＮＡエンドヌクレアーゼがタンパク質またはポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を細胞に導入することをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上のｇＲＮＡが単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変型ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合化されている、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
さらに、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型を細胞へ導入することを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、ミニ遺伝子、またはｃＤＮＡの、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、ミニ遺伝子、またはｃＤＮＡの、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、イントロン領域、それらのフラグメントまたは組み合わせ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子全体、野生型調節エレメントをコードするＤＮＡ配列である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ドナー鋳型が、１本鎖ポリヌクレオチドまたは２本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
ドナー鋳型が、１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを、導入することをさらに含み、かつ、
１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部もしくはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、ＤＳＢ遺伝子座において１つの２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、これは、該遺伝子座またはセーフハーバー座位における、染色体ＤＮＡへのポリヌクレオチドドナー鋳型由来の新規配列の挿入を促進させ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、該遺伝子座またはセーフハーバー座位に近位の、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、染色体ＤＮＡの一部の永続的な挿入または修正を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させ、かつ、ｇＲＮＡが、該遺伝子座またはセーフハーバー座位のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む、請求項１、２、７、１３、１９、または２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
近位が、遺伝子座またはセーフハーバー座位の上流および下流の両方のヌクレオチドを意味する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを、導入することをさらに含み、かつ、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部もしくはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、ＤＳＢ遺伝子座において一対の２本鎖切断（ＤＳＢ）（第一は５’ＤＳＢ遺伝子座で、第二は３’ＤＳＢ遺伝子座で）をもたらす２つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、これは、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間での、染色体ＤＮＡへのポリヌクレオチドドナー鋳型由来の新規配列の挿入を促進させ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部もしくはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間に染色体ＤＮＡの永続的な挿入または修正を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させ、かつ、第一のガイドＲＮＡが５’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含み、第二のガイドＲＮＡが３’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む、請求項１、２、７、１３、１９、または２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
１つまたは２つのｇＲＮＡが、１つまたは２つの単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
１つもしくは２つのｇＲＮＡ、または、１つもしくは２つのｓｇＲＮＡが、１つもしくは２つの改変型ｇＲＮＡ、または、１つもしくは２つの改変ｓｇＲＮＡである、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは２つのｇＲＮＡ、または、１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと予め複合化されている、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、ミニ遺伝子、またはｃＤＮＡの、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、イントロン領域、それらのフラグメントまたは組み合わせ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子全体、野生型調節エレメントをコードするＤＮＡ配列である、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ドナー鋳型が、１本鎖ポリヌクレオチドまたは２本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ドナー鋳型が、１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載に方法。
【請求項４７】
ＤＳＢ、または、５’ＤＳＢおよび３’ＤＳＢが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、第一、第二、第三、第四、第五エクソンまたはイントロン、に存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、以下の病的変異のうち１つ以上を指向する、請求項１、２、７、１３、１９、２４、３０〜３３、または３８−４１のいずれか一項に記載の方法：ｒｓ７６４３２５６５５、ｒｓ１２１９１２７１３、ｒｓ２８９２９４７４、ｒｓ１７５８０、ｒｓ１２１９１２７１４、ｒｓ７６４２２０８９８、ｒｓ１９９４２２２１１、ｒｓ７５１２３５３２０、ｒｓ１９９４２２２１０、ｒｓ２６７６０６９５０、ｒｓ５５８１９８８０、ｒｓ２８９３１５７０。
【請求項４９】
挿入または修正が相同組換え修復（ＨＤＲ）による、請求項１、２、７、１３、１９、または２４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含み、かつ、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部もしくはその近傍で、一対の２本鎖切断（ＤＳＢ）（第一は５’ＤＳＢ遺伝子座で、第二は３’ＤＳＢ遺伝子座で）をもたらす２つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、これは、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間での、染色体ＤＮＡの欠失を引き起こし、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間に染色体ＤＮＡの永続的な欠失を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させ、かつ、第一のガイドＲＮＡが５’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含み、第二のガイドＲＮＡが３’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む、請求項１、２、７、１３、１９、または２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
２つのｇＲＮＡが、２つの単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡが、２つの改変型ｇＲＮＡまたは２つの改変ｓｇＲＮＡである、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは２つのｇＲＮＡ、または、１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと予め複合化されている、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
５’ＤＳＢおよび３’ＤＳＢの両方が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソン、第二エクソン、第三エクソン、第四エクソンまたは第五エクソンのいずれかまたはその近傍に存在する、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
欠失が、１ｋｂ以下の欠失である、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ別々の脂質ナノ粒子に含まれているか、あるいは、全て共に脂質ナノ粒子に含まれている、請求項１、２、７、１３または１９〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ別々の脂質ナノ粒子に含まれているか、あるいは、全て共に脂質ナノ粒子に含まれている、請求項１、６、１１、１５または１９〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＡＡＶベクターがＡＡＶ６ベクターである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ドナー鋳型がそれぞれ別のエキソソームに含まれているか、あるいは、全て共に１つのエキソソームに含まれている、請求項１、２、７、１３、１９または２４〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡが１つの脂質ナノ粒子に含まれており、ｇＲＮＡがエレクトロポレーションにより細胞に送達され、かつ、ドナー鋳型が１つのウイルスベクターで細胞に送達される、請求項１、２、７、１３、１９または２４〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ６ベクターである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子が、１４番染色体：１，４９３，３１９−１，５０７，２６４（ゲノムリファレンスコンソーシアム−ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置している、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
ＡＡＴタンパク質活性の回復を、野生型の、または正常なＡＡＴのタンパク質活性と比較する、請求項１、２、７、１３、１９または２４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
ヒト細胞が肝細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６７】
細胞が肝細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項６８】
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の発現を開始させる外来性プロモーターと作動可能に連結している、請求項１、２，７、１３、１９または２４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
１つ以上のＤＳＢが、内在性プロモーター遺伝子座の３’末端に直結する位置で生じる、請求項１、２、７、１３、１９または２４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の患者由来の細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するための１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者由来の細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するための、配列番号５４，８６０〜６８，２９７の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つ以上のｇＲＮＡ。
【請求項７１】
１つ以上のｇＲＮＡが１つ以上の単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項７０に記載の１つ以上のｇＲＮＡ。
【請求項７２】
１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変型ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである、請求項７０または７１に記載の１つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項７３】
細胞が肝細胞である、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項７４】
アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の患者由来の細胞中のセーフハーバー座位を編集するための１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者由来の細胞中のセーフハーバー座位を編集するための、配列番号１〜５４，８５９の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む１つ以上のｇＲＮＡであり、ここでは、セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択される、１つ以上のｇＲＮＡ。
【請求項７５】
１つ以上のｇＲＮＡが１つ以上の単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項７４に記載の１つ以上のｇＲＮＡ。
【請求項７６】
１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変型ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである、請求項７４または７５に記載の１つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項７７】
細胞が肝細胞である、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１２月１日に出願された米国仮特許出願第６２／２６１，６６１号および２０１６年４月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３２４，０５６号の優先権を主張するものであり、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本出願は、エクスビボおよびインビボの両方において、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の患者を治療するための材料および方法を提供する。さらに、本出願は、ゲノム編集により、細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子および／またはアルファ−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質の発現、機能、および／または活性を調節するための材料および方法を提供する。
【０００３】
配列表の参照による組み込み
本出願は、コンピューター可読形式の配列表（ファイル名：CRIS010001WO_ST25.txt; 13,706,379 bytes - ASCII text file；２０１６年１１月３０日作成）を含有し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本開示の一部を形成する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）は、４０代〜５０代の成人における明らかな症状である、肺気腫、気流閉塞、および／または慢性気管支炎を含む、慢性閉塞性肺疾患；ＡＡＴＤ患者のうち少数において、閉塞性黄疸として症状が現れる肝臓病；および生後早期におけるアミノトランスフェラーゼレベルの上昇：のリスクが上昇することを特徴とする、常染色体劣性遺伝疾患である。小児期に肝臓の合併症の病歴が無い場合でも、線維症および肝硬変として成人期における肝臓病が見られる可能性がある。ＡＡＴＤの患者はまた、肝細胞がんの発症率が高い（例えば、Stoller JK, Aboussouan LS, “A review of alpha1-antitrypsin deficiency. ” Am J Respir Crit Care Med 2012, 185(3):246-259; Teckman JH, “Liver disease in alpha-1 antitrypsin deficiency: current understanding and future therapy. ” COPD 2013, 10 Suppl 1:35-43; and Stoller JK, et al, “Alpha-1 Antitrypsin Deficiency. ” In: GeneReviews(R). Edited by Pagon RA, et al. Seattle (WA); 1993を参照されたい）。
【０００５】
ＡＡＴＤの診断は、血清中の低濃度のアルファ−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を認めることと、それに続く機能欠損したＡＡＴタンパク質の検出、またはアルファ−１アンチトリプシンをコードする遺伝子であるＳＥＲＰＩＮＡ１の両アレル病原性変異の検出とにより確認する（例えば、Aboussouan LS, Stoller JK; “Detection of alpha-1 antitrypsin deficiency: a review. ” Respir Med 2009, 103(3):335-341を参照されたい）。ＡＡＴＤの有症率は、約４０：１０００００（スウェーデン系では５０〜６０：１０００００）である。ＡＡＴ遺伝子（SERPINA1）の１００を超える変異体が記載されているが、患者（少なくとも肝臓の表現型を有する）の大半はＰＩＺホモ接合性である(PI, GLU342LYS ON M1A [dbSNP:rs28929474])。
【０００６】
現在のＡＡＴＤの治療法は、気管支拡張薬、吸入ステロイド薬、肺リハビリテーション、酸素投与、およびワクチン接種（インフルエンザおよび肺炎球菌など）を含む、慢性閉塞性疾患の標準的治療法を含む。貯蔵ヒト血清アルファアンチトリプシンの定期的な静脈内注入（増強療法）を含む、ＡＡＴＤの特異的な治療法もまた、用いられる（例えば、Mohanka M, Khemasuwan D, Stoller JK, “A review of augmentation therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. ” Expert Opin Biol Ther 2012, 12(6):685-700を参照されたい）。末期肺疾患の患者はしばしば、肺移植を受けなければならない。従来療法（化学シャペロン、オートファジーの刺激、抗線維化療法）などの他の手法はしばしば最小限の効果であるため、肝臓病を患う患者の主な治療は、肝臓移植である。
【０００７】
いくつかの新しい手法が、近年試験されている（例えば、Wewers MD, et al., “Replacement therapy for alpha 1-antitrypsin deficiency associated with emphysema. ” N Engl J Med 1987, 316(17):1055-1062; Wewers MD, Crystal RG, “Alpha-1 antitrypsin augmentation therapy. ” COPD 2013, 10 Suppl 1:64-67; およびTeckman JH, “Lack of effect of oral 4-phenylbutyrate on serum alpha-1-antitrypsin in patients with alpha-1-antitrypsin deficiency: a preliminary study. ” J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004, 39(1):34-37を参照されたい）。ＡＲＣ−ＡＡＴは単回投与の第１相臨床試験であり、ＡＬＮＹ−ＡＡＴは第１相臨床試験である。両研究は、肝細胞に蓄積した変異ＡＡＴの量を減少させるＲＮＡ干渉の手法を利用している。しかしながら、これらの手法は循環血中の正常ＡＡＴの欠損には対処しておらず、増強療法との組み合わせに頼っている。さらに、ｒＡＡＶ１−ＣＢ−ｈＡＡＴは、マイクロＲＮＡによる内因性ＡＡＴのダウンレギュレーションと、外因性ＡＡＴの同時アップレギュレーションとを組み合わせた第２相臨床試験である（例えば、Flotte TR, et al., “Phase 2 clinical trial of a recombinant adeno-associated viral vector expressing alpha1-antitrypsin: interim results. ” Hum Gene Ther 2011, 22(10):1239-1247; Mueller C, et al., “Sustained miRNA-mediated knockdown of mutant AAT with simultaneous augmentation of wild-ＴｙｐｅAAT has minimal effect on global liver miRNA profiles. ” Mol Ther 2012, 20(3):590-600を参照されたい。）
【０００８】
ゲノム工学は、生物の遺伝情報（ゲノム）の、標的を定めた、特定の改変のための戦略および技術を指す。ゲノム工学は、特にヒトの健康の分野において可能性のある用途が幅広いために、非常に活発な研究分野である；例えば、有害な変異を有する遺伝子の修正、あるいは、遺伝子の機能の探索を目的とする。生細胞に遺伝子を挿入するために開発された初期の技術、例えば遺伝子組換え（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）は、新規の配列のゲノムへの挿入がランダムであることにより、しばしば制限された。新規の遺伝子はたいてい無分別に配置され、他の遺伝子を不活性化するか、または、阻害し得、あるいはいくつかの望ましくない効果を引き起こしさえし得る。さらに、新規の配列が２つの異なる細胞の同じ場所に挿入される保証はなかったため、これらの技術は一般的に再現性がなかった。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥおよびＭｅｇａＴＡＬなどの、より最近のゲノム工学の戦略により、ＤＮＡの特異的領域の改変が可能となっており、それにより、初期の技術と比較して修正または挿入の精度が上昇し、ある程度の再現性を示している。それにもかかわらず、これらの最近のゲノム工学戦略には制限がある。
【０００９】
ＡＡＴＤへ取り組もうと試みている世界中の研究者および医療従事者の努力にもかかわらず、また、ゲノム工学の手法が約束されているにもかかわらず、ＡＡＴＤの安全かつ効果的な治療法を開発するための重大な必要性が依然として存在している。
【００１０】
ＡＡＴＤを対象とする先の手法には、成功が限定的であることや、適切で有用な治療法がないことなどの、いくつかの制限がある。本発明は、ゲノムに永続的な変更を加え、一回の処理でＡＡＴタンパク質活性を回復させることができるゲノム工学ツールを用いて、これらの課題を解決するものである。従って、本発明は、ＡＡＴＤを引き起こす、根底となる遺伝子異常を修正するものである。
【発明の概要】
【００１１】
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、挿入、欠失、修正、または、発現もしくは機能の調節、またはゲノム編集によるＳＥＲＰＩＮＡ１のｃＤＮＡまたはミニ遺伝子のセーフハーバー座位へのノックインにより、ゲノムに永続的な変化を作製して、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させるための、細胞の、エクスビボの、およびインビボの方法であって、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を治療するために用いることができる方法が提供される。該方法を実施するための構成成分、キット、および組成物もまた提供される。それらにより生産した細胞もまた提供される。
【００１２】
ゲノム編集によりヒト細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集する方法が提供され、本方法は、ヒト細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または１つ以上の２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で、１つ以上の変異またはエクソンの永続的な挿入、欠失、修正、または、発現もしくは機能の調節の少なくとも１つを生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させるステップを含む。
【００１３】
ゲノム編集によりヒト細胞にＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を挿入する方法もまた提供され、本方法は、ヒト細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させるステップを含む。
【００１４】
１つの局面において、ゲノム編集によりヒト細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集する方法であって、該細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、該細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で、１つ以上の変異またはエクソンの永続的な欠失、挿入、または修正を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む方法が提供される。
【００１５】
別の局面において、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのエクスビボ法であって、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製すること；ｉＰＳＣのＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、またはｉＰＳＣのＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で編集すること、あるいは、ｉＰＳＣのセーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集すること；ゲノム編集したｉＰＳＣを肝細胞へ分化させること；および肝細胞を患者に移植すること：のステップを含む方法が提供される。
【００１６】
いくつかの態様において、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製するステップは、患者から体細胞を単離すること、および一連の多能性関連遺伝子を体細胞に導入して、体細胞を多能性幹細胞に誘導することを含む。いくつかの態様において、体細胞は線維芽細胞である。いくつかの態様において、一連の多能性関連遺伝子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧおよびｃＭＹＣからなる群から選択される１つ以上の遺伝子である。
【００１７】
ｉＰＳＣのＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子もしくはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の内部またはその近傍で編集するステップ、または、ｉＰＳＣのＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のセーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集するステップ、または、ｉＰＳＣのＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソンの遺伝子座の内部または近傍で編集するステップは、ｉＰＳＣに、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で、１つ以上の変異またはエクソンの永続的な挿入、修正、欠失、または、発現もしくは機能の調節を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の永続的な挿入を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させることを含み得る。セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択することができる。セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１のエクソン１−２（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢのエクソン１−２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１−２、ＡｐｏＣ３のエクソン１−２、ＡＳＧＲ２のエクソン１−２、ＣＣＲ５のエクソン１−２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１−２、Ｇ６ＰＣのエクソン１−２、Ｇｙｓ２のエクソン１−２、ＨＧＤのエクソン１−２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１−２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１−２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１−２、ＴＦのエクソン１−２、およびＴＴＲのエクソン１−２からなる群から選択することができる。
【００１８】
いくつかの態様において、ｉＰＳＣのＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するステップは、ｉＰＳＣに１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で１つ以上の２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらすことにより、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で、１つ以上の変異の永続的な欠失、挿入、または修正と、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性の回復とを生じることを含む。
【００１９】
いつくかの態様において、ゲノム編集したｉＰＳＣを肝前駆細胞または肝細胞へ分化させるステップは、１つ以上の以下のステップを含む：ゲノム編集したｉＰＳＣを、アクチビン、Ｂ２７サプリメント、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、オンコスタチンＭ、またはデキサメタゾンの１つ以上と接触させること。
【００２０】
いくつかの態様において、肝細胞を患者に移植するステップは、移植、局所注射、または全身注入、またはこれらの組み合わせにより、幹細胞を患者に移植することを含む。
【００２１】
別の局面において、患者の肝臓の生検を行うこと;肝臓特異的な前駆細胞または初代肝細胞を単離すること; 前駆細胞または初代肝細胞の、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で編集すること、あるいは、前駆細胞または初代肝細胞の、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集すること;およびゲノム編集した前駆細胞または初代肝細胞を患者に移植すること：のステップを含む、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのエクスビボ法が提供される。
【００２２】
いくつかの態様において、患者から肝臓特異的前駆細胞または初代肝細胞を単離するステップは、消化酵素による新鮮な肝臓組織の灌流、細胞の分画遠心、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２３】
いくつかの態様において、前駆細胞もしくは初代肝細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、前記細胞もしくは初代肝細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で編集すること、あるいは、前駆細胞または初代肝細胞の白血球のセーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集するステップは、前駆細胞または初代肝細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で、１つ以上の変異またはエクソンの永続的な挿入、修正、欠失、または、発現もしくは機能の調節を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で、１つ以上の変異の永続的な欠失、挿入、または修正を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む。セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択することができる。セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１のエクソン１−２（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢのエクソン１−２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１−２、ＡｐｏＣ３のエクソン１−２、ＡＳＧＲ２のエクソン１−２、ＣＣＲ５のエクソン１−２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１−２、Ｇ６ＰＣのエクソン１−２、Ｇｙｓ２のエクソン１−２、ＨＧＤのエクソン１−２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１−２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１−２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１−２、ＴＦのエクソン１−２、およびＴＴＲのエクソン１−２からなる群から選択することができる。
【００２４】
いくつかの態様において、前駆細胞または初代肝細胞を患者に移植するステップは、移植、局所注射、または全身注入、またはこれらの組み合わせにより、前駆細胞または初代肝細胞を患者に移植することを含む。
【００２５】
ある局面において、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのエクスビボ法であって、ｉ）患者から間葉系幹細胞を単離すること；ｉｉ）間葉系幹細胞の、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で編集すること、または、間葉系細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のセーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集すること；ｉｉｉ）ゲノム編集した間葉系幹細胞を肝細胞へ分化させること；およびｉｖ）肝細胞を患者に移植すること：のステップを含む方法が提供される。
【００２６】
ある局面において、患者の骨髄の生検を行うこと；間葉系幹細胞を単離すること；間葉系幹細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集すること；間葉系幹細胞を肝細胞へ分化させること；および肝細胞を患者に移植すること：のステップを含む、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのエクスビボ法が提供される。
【００２７】
間葉系幹細胞は、患者の骨髄の生検を行うことにより患者の骨髄から単離することができるか、あるいは、末梢血から単離することができる。
【００２８】
いくつかの態様において、間葉系幹細胞を単離するステップは、骨髄の吸引、およびパーコール（商標）を用いた密度遠心分離による間葉系細胞の単離を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、幹細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、間葉系幹細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列を編集するステップは、間葉系幹細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で、１つ以上の変異またはエクソンの永続的な欠失、挿入、修正、または、発現もくしは機能の調節、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の発現もしくは機能への影響を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部または近傍に１つ以上の変異を生じて、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む。セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択することができる。セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１−２、ＡＬＢのエクソン１−２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１−２、ＡｐｏＣ３のエクソン１−２、ＡＳＧＲ２のエクソン１−２、ＣＣＲ５のエクソン１−２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１−２、Ｇ６ＰＣのエクソン１−２、Ｇｙｓ２のエクソン１−２、ＨＧＤのエクソン１−２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１−２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１−２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１−２、ＴＦのエクソン１−２，およびＴＴＲのエクソン１−２からなる群から選択することができる。
【００３０】
いくつかの態様において、ゲノム編集した間葉系幹細胞を肝細胞へ分化させるステップは、ゲノム編集した間葉系幹細胞を肝細胞へ分化させる以下のステップのうち１つ以上を含む：ゲノム編集した間葉系幹細胞を、インスリン、トランスフェリン、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、または胆汁酸のうち１つ以上と接触させること。
【００３１】
いくつかの態様において、肝細胞を患者に移植するステップは、移植、局所注射、または全身注入、またはこれらの組み合わせにより、幹細胞を患者に移植することを含む。
【００３２】
別の局面において、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのインビボ法であって、患者の細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列を編集すること、あるいは患者の細胞内のセーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集することを含む方法が提供される。
【００３３】
いくつかの態様において、患者の細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するステップは、細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部に１つ以上の変異またはエクソンの永続的な欠失、挿入、または修正、または調節を生じ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させることを含む。
【００３４】
いくつかの態様において、患者の細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するステップは、細胞に、１つ以上の２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードするＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、あるいは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のセーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集して、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で、１つ以上のエクソンの永続的な欠失、挿入、修正、または発現もしくは機能の修正もしくは調節を生じ、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の発現または機能への影響を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む。
【００３５】
いくつかの態様において、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；それらのホモログ、天然分子の遺伝子組換え、それらのコドン最適化バージョン、または改変バージョン、および前述のいずれかの組み合わせである。
【００３６】
いくつかの態様において、本方法は、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを細胞へ導入することを含む。いくつかの態様において、本方法は、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を、細胞に導入することを含む。いくつかの態様において、１つ以上のポリヌクレオチドまたは1つ以上のＲＮＡは、１つ以上の改変型ポリヌクレオチドまたは１つ以上の改変型ＲＮＡである。いくつかの態様において、本方法は、タンパク質またはポリペプチドである１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼを、細胞へ導入することを含む。
【００３７】
いくつかの態様において、本方法はさらに、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を細胞に導入することを含む。いくつかの態様において、１つ以上のｇＲＮＡが単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの態様において、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の改変型ｇＲＮＡ、１つ以上の改変ｓｇＲＮＡ、またはこれらの組み合わせである。
【００３８】
いくつかの態様において、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡ、またはこれらの組み合わせと、予め複合化されている。
【００３９】
いくつかの態様において、本方法はさらに、細胞に、野生型 ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子 (天然のまたは合成のエンハンサーおよびプロモーター、１つ以上のエクソン、並びに、天然のまたは合成のイントロン、並びに、天然のまたは合成の３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナルから成る）、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の野生型調節エレメントをコードするＤＮＡ配列、および／またはｃＤＮＡの一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することを含む。いくつかの態様において、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはｃＤＮＡの一部は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、イントロン領域、それらのフラグメントまたは組み合わせ、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはｃＤＮＡ全体であり得る。いくつかの態様において、ドナー鋳型は、１本鎖ポリヌクレオチドまたは２本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである。いくつかの態様において、ドナー鋳型は、１４ｑ３２．１３領域に対する相同アーム（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｒｍ）を有する。
【００４０】
いくつかの態様において、本方法は、細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを、導入することをさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、コドン最適化または改変ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを含む。１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子（または、コドン最適化もしくは改変ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子）の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、ＤＳＢ遺伝子座において、１つの２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のＣａｓ９ヌクレアーゼであり、これは、該遺伝子座またはセーフハーバー座位における、染色体ＤＮＡへのポリヌクレオチドドナー鋳型由来の新規配列の挿入を促進させ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、該遺伝子座またはセーフハーバー座位に近位の、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、染色体ＤＮＡの一部の永続的な挿入または修正を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させる。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、該遺伝子座またはセーフハーバー座位のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む。いくつかの態様において、近位は、遺伝子座またはセーフハーバー部位の上流および下流の両方のヌクレオチドを意味する。
【００４１】
いくつかの態様において、本方法は、細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを、導入することをさらに含み、かつ、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部もしくはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、ＤＳＢ遺伝子座において一対の２本鎖切断（ＤＳＢ）（第一は５’ＤＳＢ遺伝子座で、第二は３’ＤＳＢ遺伝子座で）をもたらす２つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、これは、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間での、染色体ＤＮＡへのポリヌクレオチドドナー鋳型由来の新規配列の挿入を促進させ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部もしくはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間に染色体ＤＮＡの永続的な挿入または修正を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させ、かつ、第一のガイドＲＮＡが５’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含み、第二のガイドＲＮＡが３’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む。
【００４２】
いくつかの態様において、１つ以上のｇＲＮＡは、１つ以上の単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの態様において、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の改変型ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである。
【００４３】
いくつかの態様において、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合化されている。
【００４４】
いくつかの態様において、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはｃＤＮＡの一部は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはｃＤＮＡ全体である。
【００４５】
いくつかの態様において、ドナー鋳型は、１本鎖または２本鎖のいずれかである。いくつかの態様において、ドナー鋳型は、１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する。
【００４６】
いくつかの態様において、ＤＳＢ、または、５’ＤＳＢおよび３’ＤＳＢは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、第一エクソン、第一イントロン、または第一エクソンおよび第一イントロンの両方に存在する。
【００４７】
いくつかの態様において、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、以下の病的変異のうち１つ以上を指向する：ｒｓ７６４３２５６５５、ｒｓ１２１９１２７１３、ｒｓ２８９２９４７４、ｒｓ１７５８０、ｒｓ１２１９１２７１４、ｒｓ７６４２２０８９８、ｒｓ１９９４２２２１１、ｒｓ７５１２３５３２０、ｒｓ１９９４２２２１０、ｒｓ２６７６０６９５０、ｒｓ５５８１９８８０、ｒｓ２８９３１５７０。
【００４８】
いくつかの態様において、挿入または修正が相同組換え修復（ＨＤＲ）による。
【００４９】
いくつかの態様において、本方法は、細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含み、かつ、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部もしくはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、ＤＳＢ遺伝子座において一対の２本鎖切断（ＤＳＢ）（第一は５’ＤＳＢ遺伝子座で、第二は３’ＤＳＢ遺伝子座で）をもたらす２つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、これは、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間での、染色体ＤＮＡの欠失を引き起こし、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部もしくはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間に染色体ＤＮＡの永続的な欠失を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させ、かつ、第一のガイドＲＮＡが５’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含み、第二のガイドＲＮＡが３’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む。
【００５０】
いくつかの態様において、２つのｇＲＮＡは、２つの単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの態様において、２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡは、２つの改変型ｇＲＮＡまたは２つの改変型ｓｇＲＮＡである。
【００５１】
いくつかの態様において、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つもしくは２つのｇＲＮＡ、または、１つもしくは２つのｓｇＲＮＡを複合化されている。
【００５２】
いくつかの態様において、５’ＤＳＢおよび３’ＤＳＢの両方が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソン、第二エクソン、第三エクソン、第四エクソン、もしくは第五エクソン、またはイントロンのいずれかまたはその近傍に存在する。
【００５３】
いくつかの態様において、修正は相同組換え修復（ＨＤＲ）による。
【００５４】
いくつかの態様において、欠失は、１ｋｂ以下の欠失である。
【００５５】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ別々に脂質ナノ粒子に含まれているか、あるいは、全て共に脂質ナノ粒子に含まれている。
【００５６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、別々のエキソソームに含まれているか、あるいは、共に１つのエキソソームに含まれている。
【００５７】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡが１つの脂質ナノ粒子に含まれており、ｇＲＮＡおよびドナー鋳型の両方が１つのウイルスベクターで細胞に送達される。いくつかの態様において、ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ６ベクターである。
【００５８】
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子に製剤化され得、ｇＲＮＡはエレクトロポレーションにより細胞に送達され得、かつ、ドナー鋳型は１つのウイルスベクターで細胞に送達され得る。いくつかの態様において、ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ６ベクターである。
【００５９】
いくつかの態様において、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子は、１４番染色体：１，４９３，３１９−１，５０７，２６４（ゲノムリファレンスコンソーシアム−ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置している。
【００６０】
ＡＡＴタンパク質活性の回復は、野生型の、または正常なＡＡＴのタンパク質活性と比較することができる。
【００６１】
別の局面において、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者由来の細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するための、実施例１〜６および配列番号５４，８６０〜６８，２９７の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）が提供される。いくつかの態様において、１つ以上のｇＲＮＡは１つ以上の単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの態様において、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変型ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである。
【００６２】
別の局面において、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者由来の細胞中のセーフハーバー座位を編集するための、配列番号１〜５４，８５９の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）が提供され、ここでは、セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択される。いくつかの態様において、１つ以上のｇＲＮＡは１つ以上の単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの態様において、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変型ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである.
【００６３】
別の局面において、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の１つ以上の変異を永続的に修正し、ＡＡＴタンパク質活性を回復させる、前述の方法により改変した細胞が提供される。さらに、前述の方法により改変した細胞をＡＡＴＤ患者に投与することにより、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を寛解させるための方法が提供される。
【００６４】
いくつかの態様において、本開示の方法および組成物は、１つ以上の改変型ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含む。改変の非限定的な例は、糖の第２位で改変された１つ以上のヌクレオチドを含み得、いくつかの態様において、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ改変ヌクレオチドである。いくつかの態様において、ＲＮＡ改変は、ピリミジンのリボース上の、２’−フルオロ、２’−アミノもしくは２’Ｏ−メチル改変、脱塩基残基、デソキシヌクレオチド（ｄｅｓｏｘｙ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、または、ＲＮＡの３’末端の逆位塩基を含む。
【００６５】
いくつかの態様において、１つ以上の改変型ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）は、天然のオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に耐性のある改変型ｇＲＮＡを作る改変を含む。これらの改変の非限定的な例には、改変型骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロチオス（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｙｏｓ）、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または、短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間結合を含む改変が含まれる。
【００６６】
他の様々な局面が本明細書に記載、および、例示されている。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
本明細書に開示、および、記載されているアルファ−１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の治療のための材料および方法の様々な局面は、以下の添付の図を参照することにより、よりよく理解することができる。
【００６８】
【図１Ａ】図１Ａは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのコドン最適化遺伝子を含むプラスミド（本明細書では「ＣＴｘ−１」と呼ぶ）の図である。ＣＴｘ−１プラスミドはまた、実施例１および８で挙げられる配列由来の２０ｂｐのスペーサー配列を含む、ｇＲＮＡ  ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含む。
【００６９】
【図１Ｂ】図１Ｂは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの、別のコドン最適化遺伝子を含むプラスミド（本明細書では「ＣＴｘ−２」と呼ぶ）の図である。ＣＴｘ−２プラスミドはまた、実施例１および８で挙げられる配列由来の２０ｂｐのスペーサー配列を含む、ｇＲＮＡ  ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含む。
【００７０】
【図１Ｃ】図１Ｃは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの、さらに別のコドン最適化遺伝子を含むプラスミド（本明細書では「ＣＴｘ−３」と呼ぶ）の図である。ＣＴｘ−３プラスミドはまた、実施例１および８で挙げられる配列由来の２０ｂｐのスペーサー配列を含む、ｇＲＮＡ  ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含む。
【００７１】
【図２Ａ】図２Ａは、タイプＩＩＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを表した図である。
【００７２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、タイプＩＩＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを表した別の図である。
【００７３】
【図３】図３は、インビトロで転写され、恒常的にＣａｓ９を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、メッセンジャーＭａｘを用いて遺伝子導入されたｇＲＮＡの、ＴＩＤＥ解析を用いて評価した切断効率を示すグラフである。
【００７４】
配列表の簡単な説明
配列番号１−２，０３２は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００７５】
配列番号２，０３３−２，２０３は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００７６】
配列番号２，２０４−２，２２１は、サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００７７】
配列番号２，２２２−２，２３０は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００７８】
配列番号２，２３１−２，３０５は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００７９】
配列番号２，３０６−３，４８１は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【００８０】
配列番号３，４８２−３，６４９は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ａｌｂ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００８１】
配列番号３，６５０−３，６７７は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ａｌｂ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００８２】
配列番号３，６７８−３，６９５は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ａｌｂ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００８３】
配列番号３，６９６−３，７００は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ａｌｂ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００８４】
配列番号３，７０１−３，７２４は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ａｌｂ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００８５】
配列番号３，７２５−４，１０３は、Ａｌｂ遺伝子アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、Ａｌｂ遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【００８６】
配列番号４，１０４−４，４４８は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ａｎｇｐｔ１３遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００８７】
配列番号４，４４９−４，４８４は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ａｎｇｐｔ１３遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００８８】
配列番号４，４８５−４，５０７は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ａｎｇｐｔ１３遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００８９】
配列番号４，５０８−４，５２０は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ａｎｇｐｔ１３遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００９０】
配列番号４，５２１−４，５８３は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ａｎｇｐｔ１３遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００９１】
配列番号４，５８４−５，４３１は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、Ａｎｇｐｔ１３遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【００９２】
配列番号５，４３２−５，８３４は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡｐｏＣ３遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００９３】
配列番号５，８３５−５，８５９は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡｐｏＣ３遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００９４】
配列番号５，８６０−５，８６２は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡｐｏＣ３遺伝子を標的とするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００９５】
配列番号５，８６３−５，８６４は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡｐｏＣ３遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００９６】
配列番号５，８６５−５，８７６は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡｐｏＣ３遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００９７】
配列番号５，８７７−６，１０８は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、ＡｐｏＣ３遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【００９８】
配列番号６，１０９−７，８７６は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡＳＧＲ２遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【００９９】
配列番号７，８７７−８，０８２は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡＳＧＲ２遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１００】
配列番号８，０８３−８，１０６は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡＳＧＲ２遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１０１】
配列番号８，１０７−８，１１８は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡＳＧＲ２遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１０２】
配列番号８，１１９−８，２０１は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＡＳＧＲ２遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１０３】
配列番号８，２０２−９，６４１は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、ＡＳＧＲ２遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１０４】
配列番号９，６４２−９，８４４は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＣＣＲ５遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１０５】
配列番号９，８４５−９，８７６は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＣＣＲ５遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１０６】
配列番号９，８７７−９，８９０は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＣＣＲ５遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１０７】
配列番号９，８９１−９，８９２は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＣＣＲ５遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１０８】
配列番号９，８９３−９，９２０は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＣＣＲ５遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１０９】
配列番号９，９２１−１０，２２０は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、ＣＣＲ５遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１１０】
配列番号１０，２２１−１１，６８６は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｆ９遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１１１】
配列番号１１，６８７−１１，８４９は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｆ９遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１１２】
配列番号１１，８５０−１１，９１０は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｆ９遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１１３】
配列番号１１，９１１−１１，９３５は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｆ９遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１１４】
配列番号１１，９３６−１２，０８８は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｆ９遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１１５】
配列番号１２，０８９−１４，２２９は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、Ｆ９遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１１６】
配列番号１４，２３０−１５，２４５は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｇ６ＰＣ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１１７】
配列番号１５，２４６−１５，３６２は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｇ６ＰＣ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１１８】
配列番号１５，３６３−１５，３８６は、サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｇ６ＰＣ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１１９】
配列番号１５，３８７−１５，３９５は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｇ６ＰＣ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２０】
配列番号１５，３９６−１５，４８５は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｇ６ＰＣ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２１】
配列番号１５，４８６−１６，５８０は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、Ｇ６ＰＣ遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２２】
配列番号１６，５８１−２２，０７３は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｇｙｓ２遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２３】
配列番号２２，０７４−２２，７４９は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｇｙｓ２遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２４】
配列番号２２，７５０−２０，３２７は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｇｙｓ２遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２５】
配列番号２３，０２８−２３，１４１は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｇｙｓ２遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２６】
配列番号２３，１４２−２３，８２１は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｇｙｓ２遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２７】
配列番号２３，８２２−３２，２５３は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、Ｇｙｓ２遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２８】
配列番号３２，２５４−３３，９４６は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＨＧＤ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２９】
配列番号３３，９４７−３４，１６０は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＨＧＤ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３０】
配列番号３４，１６１−３４，２４３は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＨＧＤ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３１】
配列番号３４，２４４−３４，２６２は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＨＧＤ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３２】
配列番号３４，２６３−３４，４６３は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＨＧＤ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３３】
配列番号３４，４６４−３６，７８８は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、ＨＧＤ遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３４】
配列番号３６，７８９−４０，５８３は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｌｐ（ａ）遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３５】
配列番号４０，５８４−４０，９９３は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｌｐ（ａ）遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３６】
配列番号４０，９９４−４１，１２９は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｌｐ（ａ）遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３７】
配列番号４１，１３０−４１，１６４は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｌｐ（ａ）遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３８】
配列番号４１，１６５−４１，５３２は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、Ｌｐ（ａ）遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３９】
配列番号４１，５３３−４６，１５３は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、Ｌｐ（ａ）遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１４０】
配列番号４６，１５４−４８，１７３は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１４１】
配列番号４８，１７４−４８，３６０は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１４２】
配列番号４８，３６１−４８，３９６は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１４３】
配列番号４８，３９７−４８，４１０は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１４４】
配列番号４８，４１１−４８，５５０は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１４５】
配列番号４８，５５１−５０，３４４は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、ＰＣＳＫ９遺伝子遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１４６】
配列番号５０，３４５−５１，４８２は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、セーフハーバー座位としてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１４７】
配列番号５１，４８３−５１，５７５は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、セーフハーバー座位としてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１４８】
配列番号５１，５７６−５１，５８７は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、セーフハーバー座位としてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１４９】
配列番号５１，５８８−５１，５９０は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、セーフハーバー座位としてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１５０】
配列番号５１，５９１−５１，６４１は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、セーフハーバー座位としてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１５１】
配列番号５１，６４２−５２，４４５は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、セーフハーバー座位としてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１５２】
配列番号５２，４４６−５３，２７７は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＴＦ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１５３】
配列番号５３，２７８−５３，３６３は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＴＦ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１５４】
配列番号５３，３６４−５３，３７５は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＴＦ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１５５】
配列番号５３，３７６−５３，３８２は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＴＦ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１５６】
配列番号５３，３８３−５３，４２６は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＴＦ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１５７】
配列番号５３，４２７−５４，０６２は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、ＴＦ遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１５８】
配列番号５４，０６３−５４，３６２は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＴＴＲ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１５９】
配列番号５４，３６３−５４，４０３は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＴＴＲ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１６０】
配列番号５４，４０４−５４，４２０は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＴＴＲ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１６１】
配列番号５４，４２１−５４，４２２は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＴＴＲ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１６２】
配列番号５４，４２３−５４，４５７は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、ＴＴＲ遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１６３】
配列番号５４，４５８−５４，８５９は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、ＴＴＲ遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【０１６４】
配列番号５４，８６０−６１，３２４は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、（セーフハーバー座位としてではなく）ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１６５】
配列番号６１，３２５−６１，９３６は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、（セーフハーバー座位としてではなく）ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１６６】
配列番号６１，９３７−６２，０６９は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、（セーフハーバー座位としてではなく）ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１６７】
配列番号６２，０７０−６２，１２０は、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、（セーフハーバー座位としてではなく）ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１６８】
配列番号６２，１２１−６２，５６３は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと共に、（セーフハーバー座位としてではなく）ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１６９】
配列番号６２，５６４−６８，２９７は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと共に、（セーフハーバー座位としてではなく）ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするための、２２ｂｐのスペーサー配列である。
【発明を実施するための形態】
【０１７０】
詳細な説明
アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）
【０１７１】
ＡＡＴＤは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異、あるいはさらに珍しくは欠失により、引き起こされる。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子は、ゲノム座標（ＧＲＣｈ３８）のｃｈｒ１４：１，４９３，３１９−１，５０７，２６４である、１４ｑ３２．１３に位置する。ＳＥＲＰＩＮＡ１は、５つのエクソンで構成され、全長１２．２ｋｂを有する。該遺伝子は、２つのプロモーターを有し、１つはマクロファージにおける発現を調節している。複数の転写変異体が報告されている；しかしながら、それらは全て同じＡＡＴタンパク質をコードしている。ＡＡＴＤの約９５％が、病的対立遺伝子ＰＩ  ＺまたはＰＩ  Ｓまたはこれらの組み合わせを原因とする。
【０１７２】
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子は、プロテアーゼインヒビター（ＰＩ）、主な血漿セリンプロテアーゼインヒビターとしても知られる、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）をコードしている。ＡＡＴはエラスターゼと優先的に複合体を形成するが、他のセリンプロテアーゼとも複合体を形成する。ＡＡＴの重要な阻害作用は、細胞壁のエラスチンと様々な組織の他の構造タンパク質とを分解するプロテアーゼである、好中球エラスターゼに対するものである。
【０１７３】
治療方法
【０１７４】
既知のＡＡＴＤの形態は、劣性遺伝による単一遺伝子疾患であるため、細胞ごとの変異対立遺伝子の１つを修正することは、ＡＡＴＤの機能の修正および回復または部分的回復に、おそらく十分であろう。１つの対立遺伝子の修正は、元の変異を維持する１コピーと、または、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により切断および修復され正しく修正されなかった１コピーと、同時に起こり得る。両対立遺伝子の修正もまた、起こり得る。特定の変異のために用い得る様々な編集戦略を、以下に述べる。
【０１７５】
変異対立遺伝子の１つ、または、場合により両方の修正は、レンチウイルスによる送達および組み込みによるＳＥＲＰＩＮＡ１発現カセットの導入などの、既存の、または、可能性のある治療よりも、重要な改善を提供する。遺伝子編集は、例えば、変異が、ＮＨＥＪ修復経路により生じる挿入または欠失により修正することができるなどの、正確なゲノムの改変およびより低い有害作用などの利点を有する。患者のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子が挿入または欠失した塩基を有する場合、標的切断は、読み枠を回復させるＮＨＥＪ媒介挿入または欠失を生じ得る。ミスセンス変異はまた、１つ以上のガイドＲＮＡを用いて、ＮＨＥＪ媒介修正により、修正することができる。変異を修正する切断の能力または可能性は、局所的配列およびマイクロホモロジーに基づいて、設計または評価することができる。ＮＨＥＪはまた、直接、または、いくつかの位置を標的とするｇＲＮＡ、もしくは、いくつかのｇＲＮＡによる切断によるスプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位を改変することにより、遺伝子のセグメントを欠失させるために用いることができる。これは、アミノ酸、ドメインまたはエクソンが変異を含有し、除去または反転し得る場合、あるいはそうでなければ、欠失がタンパク質に機能を回復させる場合に、有用であり得る。ガイド鎖の対が、本発明の欠失または修正に用いられている。
【０１７６】
あるいは、ＨＤＲによる修正のためのドナーは、アニーリングを可能にするために、小さい、または、大きいフランキング相同アームを有する修正配列を含有する。ＨＤＲは、本質的に、ＤＳＢ修復中に、鋳型として供給された相同なＤＮＡ配列を用いる、誤りのないメカニズムである。ＨＤＲの割合は、変異と切断部位との間の距離の関数であるため、重複する標的部位、または、近傍の標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接する余分な配列を含むことができ、あるいは、ゲノム配列とは異なる配列を含有することができ、従って、配列の編集が可能である。
【０１７７】
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによる変異の修正に加えて、種々の他の選択肢も可能である。小さい、または、大きい欠失、または複数の変異がある場合、影響を受けたエクソンを含むｃＤＮＡをノックインすることができる。完全長ｃＤＮＡは、好適な制御配列の有無にかかわらず、任意の「セーフハーバー」、すなわち、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子自体ではない有害ではない挿入点、にノックインすることができる。この構築物が、ＳＥＲＰＩＮＡ１調節エレメントの近くにノックインされる場合、正常な遺伝子と同様に、生理的制御を有するべきである。２つ以上の（例えば、一対の）ヌクレアーゼを用いて、変異した遺伝子領域を欠失させることができるが、通常は機能を回復させるためにドナーを提供する必要がある。この場合、２つのｇＲＮＡと１つのドナー配列が供給される。
【０１７８】
Ｃａｓ９と１つのｓｇＲＮＡによる１つの２本鎖切断を誘導することにより、または、２つの適切なｓｇＲＮＡを用いて変異の周辺に一対の２本鎖切断を誘導することにより、遺伝子内の特定の変異？を修正し、相同配向型修復（ＨＤＲ）を誘導するためのドナーＤＮＡテンプレートを提供する方法が、提供される。いくつかの態様において、ドナーＤＮＡテンプレートは、短鎖１本鎖オリゴヌクレオチド、短鎖２本鎖オリゴヌクレオチド、長鎖１本鎖ＤＮＡ分子、または長鎖２本鎖ＤＮＡ分子であり得る。これらの方法は、ＳＥＲＰＩＮＡ１変異体のそれぞれに対するｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡ分子を用いる。
【０１７９】
対応する遺伝子の遺伝子座に、ＳＥＲＰＩＮＡ１  ｃＤＮＡまたはミニ遺伝子（１つ以上のエクソンおよびイントロン、すなわち天然のまたは合成のイントロンから構成される）をノックインする方法が提供される。これらの方法は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソンおよび／または第一イントロンを標的とする一対のｓｇＲＮＡを用いる。いくつかの態様において、ドナーＤＮＡは、１７ｑ２１領域に対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡである。
【０１８０】
ＳＥＲＰＩＮＡ１  ｃＤＮＡまたはミニ遺伝子（１つ以上のエクソンおよびイントロン、すなわち天然のまたは合成のイントロンから構成される）を、ホットスポットの遺伝子座、例えばＡｌｂ遺伝子にノックインする方法が提供される。これらの方法は、肝臓のホットスポットに位置する遺伝子の、第一エクソンおよび／または第一イントロンを標的とする一対のｓｇＲＮＡを用いる。いくつかの態様において、ドナーＤＮＡは、対応する領域に対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡである。
【０１８１】
１）不正確なＮＨＥＪ経路に起因して生じる挿入または欠失により、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異を修正すること、２）ＨＤＲにより、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異を修正すること、または、３）変異領域を欠失させること、および／または、ＳＥＲＰＩＮＡ１  ｃＤＮＡまたはミニ遺伝子（天然のまたは合成のエンハンサーおよびプロモーター、１つ以上のエクソン、並びに、天然のまたは合成のイントロン、並びに、天然のまたは合成の３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナルから成る）を遺伝子座位へノックインすることで、ＡＡＴタンパク質活性を回復させることにより、ゲノム工学ツールを用いて、ゲノムに永続的な変更を加えるための、細胞の方法、エクスビボ法、およびインビボ法が、提供される。該方法は、永続的に１つ以上のエクソンもしくはその一部を欠失、挿入、編集、修正、もしくは置換する（すなわち、コード配列および／またはスプライシング配列の内部またはその近傍の変異）、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子もしくはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、ゲノム上の遺伝子座に挿入する、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）などの、エンドヌクレアーゼを用いる。このように、本開示に記載の実施例は、（患者の生涯に渡って見込みのある治療を提供するのではなく）一回の処置で、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の読み枠または野生型配列の回復、すなわち言い換えれば修正を助け得る。
【０１８２】
ＡＡＴＤの患者を治療するための方法が提供される。該方法のある態様は、エクスビボの細胞ベースの治療である。例えば、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する。その後、これらのｉＰＳ細胞の染色体ＤＮＡを、本明細書に記載の材料および方法を用いて編集する。次に、ゲノム編集したｉＰＳＣを、肝細胞へ分化させる。最後に、肝細胞を患者に移植する。
【０１８３】
該方法の別の態様は、エクスビボの細胞ベースの治療である。例えば、患者の肝臓の生検を行う。その後、肝臓特異的な前駆細胞または初代肝細胞を、例えば生検により、患者から単離する。次に、これら前駆細胞または初代肝細胞の染色体ＤＮＡを、本明細書に記載の材料および方法を用いて編集する。最後に、ゲノム編集した前駆細胞または初代肝細胞を患者に移植する。
【０１８４】
該方法のさらに別の態様は、エクスビボの細胞ベースの治療である。例えば、患者の骨髄の生検を行う。その後、間葉系幹細胞を患者から単離するが、例えば生検により患者の骨髄から、または末梢血から単離することができる。次に、これらの間葉系間細胞の染色体ＤＮＡを本明細書に記載の材料および方法を用いて編集する。次に、ゲノム編集した間葉系幹細胞を肝細胞へ分化させる。最後に、これらの肝細胞を患者に移植する。
【０１８５】
エクスビボの細胞治療手法の１つの利点は、投与前に、治療薬の包括的な解析ができることである。ヌクレアーゼベースの治療薬は全て、あるレベルのオフターゲット効果を有する。エクスビボで遺伝子修正を行うことは、移植前に修正された細胞集団の完全な特徴付けを行うことを可能にする。本発明の局面は、修正された細胞の全ゲノムをシーケンシングして、オフターゲットの切断が、たとえ存在したとしても、患者にとって最小限のリスクに関係するゲノム位置に存在することを確認することを含む。さらに、クローン集団を含む特定の細胞の集団を、移植の前に単離することができる。
【０１８６】
エクスビボの細胞治療の別の利点は、他の初代細胞源と比較した、ｉＰＳＣにおける遺伝子の修正に関する。ｉＰＳＣは多産（ｐｒｏｌｉｆｉｃ）であるため、細胞ベースの治療に必要とされるであろう多数の細胞を得ることが簡単である。さらに、ｉＰＳＣは、クローン単離を行うのに、理想的な細胞型である。これにより、生存率の低下を招くことなく、正しいゲノム修正をスクリーニングすることが可能になる。対照的に、初代肝細胞などの他の可能性のある細胞型は、ほんのわずかな継代のみ生存可能であり、クローン的に増やすことが難しい。従って、ＡＡＴＤのｉＰＳＣの操作が、はるかに簡単で、所望の遺伝子の修正を行うのに必要な時間を短縮させるであろう。
【０１８７】
該方法の別の態様は、インビボベースの治療である。本方法では、患者の体内の細胞の染色体ＤＮＡを、本明細書に記載の材料および方法を用いて修正する。
【０１８８】
インビボ遺伝子治療の利点は、治療薬の生産と投与が簡単なことである。同じ治療方法および治療が、複数の患者、例えば、同一または同様の遺伝子型または対立遺伝子を有する多数の患者を、処置するために用いられる可能性があるだろう。対照的に、エクスビボの細胞治療は、通常患者自身の細胞を用いる必要があり、細胞を単離、操作して、同一の患者に戻す。
【０１８９】
ゲノム編集により細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するための細胞の方法もまた提供される。例えば、細胞を患者または動物から単離する。その後、細胞の染色体ＤＮＡを本明細書に記載の材料および方法を用いて編集する。
【０１９０】
本発明の方法は、細胞の方法であるか、エクスビボ法であるか、インビボ法であるかに関わらず、以下、あるいは以下の組み合わせを包含する：１）不正確なＮＨＥＪ経路に起因して生じる挿入または欠失により、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異を修正すること、２）ＨＤＲにより、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異を修正すること、または、３）変異領域を欠失させること、および／または、ＳＥＲＰＩＮＡ１  ｃＤＮＡまたはミニ遺伝子（１つ以上のエクソンもしくはイントロン、または、天然のもしくは合成のイントロンから成る）をノックインさせること、または、外因性のＳＥＲＰＩＮＡ１  ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントを、ゲノムの該遺伝子の該遺伝子座、または非相同の位置（例えば、セーフハーバー座位、例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、Ａｌｂ遺伝子、Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子、ＡｐｏＣ３遺伝子、ＡＳＧＲ２遺伝子，ａＣＣＲ５遺伝子，ａＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子，ａＧ６ＰＣ遺伝子、Ｇｙｓ２遺伝子、ＨＧＤ遺伝子、Ｌｐ（ａ）遺伝子、Ｐｃｓｋ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、ＴＦ遺伝子、およびＴＴＲ遺伝子を標的とする）に導入すること。ｃＤＮＡの第一エクソンへのＨＤＲ媒介ノックインの効率の評価は、以下の領域、例えばＡｐｏＣ３（ｃｈｒ１１：１１６８２９９０８−１１６８３３０７１）、Ａｎｇｐｔｌ３（ｃｈｒ１：６２，５９７，４８７−６２，６０６，３０５）、Ｓｅｒｐｉｎａ１（ｃｈｒ１４：９４３７６７４７−９４３９０６９２）、Ｌｐ（ａ）（ｃｈｒ６：１６０５３１４８３−１６０６６４２５９）、Ｐｃｓｋ９（ｃｈｒ１：５５，０３９，４７５−５５，０６４，８５２）、ＦＩＸ（ｃｈｒＸ：１３９，５３０，７３６−１３９，５６３，４５８）、ＡＬＢ（ｃｈｒ４：７３，４０４，２５４−７３，４２１，４１１）、ＴＴＲ（ｃｈｒ１８：３１，５９１，７６６−３１，５９９，０２３）、ＴＦ（ｃｈｒ３：１３３，６６１，９９７−１３３，７７９，００５）、Ｇ６ＰＣ（ｃｈｒ１７：４２，９００，７９６−４２，９１４，４３２）、Ｇｙｓ２（ｃｈｒ１２：２１，５３６，１８８−２１，６０４，８５７）、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）（ｃｈｒ１９：５５，０９０，９１２−５５，１１７，５９９）、ＨＧＤ（ｃｈｒ３：１２０，６２８，１６７−１２０，６８２，５７０）、ＣＣＲ５（ｃｈｒ３：４６，３７０，８５４−４６，３７６，２０６）、ＡＳＧＲ２（ｃｈｒ１７：７，１０１，３２２−７，１１４，３１０）の１つに対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡなどの「セーフハーバー」部位への、ｃＤＮＡノックインを利用できる。修正およびノックインの両戦略は、相同配向型修復（ＨＤＲ）において、ドナーＤＮＡテンプレートを利用する。いずれの戦略におけるＨＤＲも、１つ以上のエンドヌクレアーゼを利用することによってゲノムの特異的部位に１つ以上の２本鎖切断（ＤＳＢ）を生じることで、達成することができる。
【０１９１】
例えば、ＮＨＥＪ修正戦略は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび１つのｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）で、目的の遺伝子に１つの１本鎖切断または２本鎖切断を誘導すること、または、２つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび２つ以上のｓｇＲＮＡで、目的の遺伝子に２つ以上の１本鎖切断または２本鎖切断を誘導することにより、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の読み枠を回復させることを包含し得る。本手法は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のためのｓｇＲＮＡの開発と最適化を必要とし得る。
【０１９２】
例えば、ＨＤＲ修正戦略は、細胞性ＤＳＢ応答を相同配向型修復に向かわせるために外因的に導入されたドナーＤＮＡテンプレートの存在下で（ドナーＤＮＡテンプレートは、短鎖１本鎖オリゴヌクレオチド、短鎖２本鎖オリゴヌクレオチド、長鎖１本鎖ＤＮＡ分子、または長鎖２本鎖ＤＮＡ分子であり得る）、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）で、目的の遺伝子に１つの２本鎖切断を誘導することにより、または、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび２つ以上の適切なｓｇＲＮＡで、２つ以上の２本鎖切断を誘導することにより、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の読み枠を回復させることを包含する。本手法は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の主な変異体（ＰＩ  Ｚ）のためのｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡ分子の開発と最適化を必要とする。
【０１９３】
例えば、ノックイン戦略は、ＳＥＲＰＩＮＡ１  ｃＤＮＡまたはミニ遺伝子（天然のまたは合成のエンハンサーおよびプロモーター、１つ以上のエクソン、並びに、天然のまたは合成のイントロン、並びに、天然のまたは合成の３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナルから成る）を、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の上流、または、第一エクソンもしくは他のエクソン、および／またはイントロン、または、セーフハーバー部位（ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、および／またはＴＲなど）を標的とする、ｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）または一対のｓｇＲＮＡを用いて、該遺伝子の該遺伝子座にノックインすることを包含する。ドナーＤＮＡは、１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡであるだろう。
【０１９４】
例えば、欠失戦略は、１つ以上のエンドヌクレアーゼおよび２つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを用いて、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の５つのエクソンのうち１つ以上において、１つ以上の変異を欠失させることを包含する。
【０１９５】
上記の戦略（修正およびノックインおよび欠失）の利点は、原則として短期的にも長期的にも有益な臨床的および実験的効果を含んで、同様である。さらに、ＡＡＴ活性の低いパーセンテージしか、治療効果を提供するために必要でないことがあり得る。全ての戦略の別の利点は、ほとんどの患者が低レベルの遺伝子およびタンパク質活性を有していることであり、従って、例えば遺伝子修正後のさらなるタンパク質発現が、必ずしも標的遺伝子産物に対する免疫応答をもたらさないことを示唆している。ノックイン手法は、修正または欠失の手法よりも１つの利点を提供する−すなわち、患者のサブセットのみを治療するのに対して、全ての患者を治療する能力である。該遺伝子には共通の変異が存在するが、他にも多くの可能性のある変異が存在し、ノックイン方法を用いると、これら全てを治療できる。このように、遺伝子編集の他の問題は、ＨＤＲのためのＤＮＡドナーの必要性である。
【０１９６】
上記のゲノム編集戦略に加えて、別の戦略は、制御配列における編集により、ＳＥＲＰＩＮＡ１の発現、機能、または活性を調節することを包含する。
【０１９７】
上述の編集の選択肢に加えて、Ｃａｓ９または同様のタンパク質を用いて、編集のために特定したものと同一の標的部位に対する効果ドメイン、または、効果ドメインの範囲内にあるさらなる標的部位を、標的とすることができる。種々のクロマチン修飾酵素、メチラーゼ、またはデメチラーゼを用いて、標的遺伝子の発現を変更することができる。１つの可能性は、変異が活性の低下につながる場合に、ＡＡＴタンパク質の発現を増加させることである。これらのタイプのエピジェネティックな調節には、特に、可能なオフターゲット効果に制限があるために、いくつかの利点がある。
【０１９８】
多くのタイプのゲノムを標的とする部位が、コード配列およびスプライシング配列の変異に加えて、存在する。
【０１９９】
転写および翻訳の調節は、細胞のタンパク質またはヌクレオチドと相互作用する、多くの異なるクラスの部位を示唆している。転写因子または他のタンパク質のＤＮＡ結合部位は、遺伝子発現を変化させるために標的とすることもできるが、しばしば、該部位の役割を研究するために変異または欠失の標的とすることができる。部位は、非相同末端結合  （ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）による直接のゲノム編集により、加えることができる。ゲノム配列決定、ＲＮＡ発現、および転写因子結合のゲノムワイドな研究の利用の増加は、該部位が、いかにして発達的または時間的遺伝子調節に繋がるかを特定する能力を増大させた。これらのコントロールシステムは、直接的であってもよく、複数のエンハンサー由来の活性の統合を必要とし得る、大規模な協調的調節を包含してもよい。転写因子は、通常、６〜１２ｂｐの縮重したＤＮＡ配列に結合する。個々の部位が提供する特異性のレベルの低さは、複雑な相互作用および規則が、結合および機能的結果に関与していることを示唆している。縮重の少ない結合部位は、より簡単な調節の手段を提供し得る。人工転写因子は、ゲノム中のより類似性の低い配列を有するより長い配列を特定して、オフターゲット切断の可能性が低いように、設計することができる。これらのタイプの結合部位はいずれも、遺伝子調節または発現を変化させるように、変異、欠失、または作製することさえ可能である（Canver, M.C. et al., Nature (2015)）。
【０２００】
これらの特徴を有する遺伝子調節領域の別のクラスは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位である。ｍｉＲＮＡは、転写後遺伝子調節において重要な役割を果たすノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、全ての哺乳動物のタンパク質コード遺伝子の３０％の発現を調節することができる。２本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）による特異的かつ強力な遺伝子サイレンシングが発見され、さらに小さなノンコーディングＲＮＡが発見された（Canver, M.C. et al., Nature (2015)）。遺伝子サイレンシングに重要なノンコーディングＲＮＡの最大のクラスは、ｍｉＲＮＡである。哺乳動物では、ｍｉＲＮＡはまず、長い転写物として転写され、これは、別々の転写ユニット、タンパク質のイントロンの一部、または他の転写物であり得る。長い転写物は、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、不完全な塩基対を形成したヘアピン構造を含む。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａを包含する核内タンパク質複合体である、マイクロプロセッサー（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）により、１つ以上の短いｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に切断される。
【０２０１】
ｍｉＲＮＡ前駆体は、約７０ヌクレオチドの長さの短いステムループであり、２ヌクレオチドの３’側突出を有し、核外に輸送され、成熟型の１９〜２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊デュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）となる。低い塩基対形成安定性を有するｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）が、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。パッセンジャーガイド鎖（＊印）は機能的であるが、通常は分解される。成熟型ｍｉＲＮＡは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内で主に見出される、標的ＲＮＡ内の相補的配列に部分的にＲＩＳＣをつなぎ止め、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する(Bartel, D.P. Cell 136, 215-233 (2009); Saj, A. & Lai, E.C. Curr Opin Genet Dev 21, 504-510 (2011))。
【０２０２】
ｍｉＲＮＡは、哺乳動物および他の多細胞生物において、発達、分化、細胞周期および増殖の調節、ならびに実質的に全ての生物学的経路において、重要である。ｍｉＲＮＡはまた、細胞周期のコントロール、アポトーシスおよび幹細胞分化、血球新生、低酸素、筋肉発生、神経発生、インスリン分泌、コレステロール代謝、老化、ウイルス複製および免疫応答に関与している。
【０２０３】
単一のｍｉＲＮＡは、数百の異なるｍＲＮＡ転写物を標的とすることができるが、それぞれの転写物は多くの異なるｍｉＲＮＡが標的とすることができる。ｍｉＲＢａｓｅの最新リリース（ｖ．２１）では、２８６４５を超えるマイクロＲＮＡが注釈されている。いくつかのｍｉＲＮＡは、複数の遺伝子座によってコードされ、そのいくつかは、タンデムに同時転写されるクラスターから発現される。これらの特徴は、複数の経路およびフィードバック制御を有する、複雑な調節ネットワークを可能にする。ｍｉＲＮＡは、これらのフィードバックおよび調節回路の不可欠な部分であり、タンパク質生産を限度内に留めることにより、遺伝子発現の調節を助け得る(Herranz, H. & Cohen, S.M. Genes Dev 24, 1339-1344 (2010); Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014))。
【０２０４】
ｍｉＲＮＡはまた、異常なｍｉＲＮＡ発現に関連する数多くのヒト疾患において、重要である。本関連性は、ｍｉＲＮＡ調節経路の重要性を強調している。最近のｍｉＲＮＡ欠失の研究は、ｍｉＲＮＡと、免疫応答の調節とを関連づけている（Stern-Ginossar, N. et al., Science 317, 376-381 (2007)）。
【０２０５】
ｍｉＲＮＡはまた、癌と強い関連があり、複数のタイプの癌において役割を果たし得る。ｍｉＲＮＡは、多くの腫瘍において、ダウンレギュレートされていることが分かってきている。ｍｉＲＮＡは、細胞周期コントロールおよびＤＮＡ損傷応答などの、主要な癌関連経路の調節において重要であり、それゆえ、診断において用いられ、臨床的に標的にされている。マイクロＲＮＡは、血管新生のバランスを微妙に調節しており、全てのマイクロＲＮＡを枯渇させる実験では、腫瘍の血管新生を抑制する（Chen, S. et al.,Genes Dev 28, 1054-1067 (2014)）。
【０２０６】
タンパク質をコードする遺伝子について示されているように、ｍｉＲＮＡ遺伝子もまた、癌で生じるエピジェネティック変化を受ける。多くのｍｉＲＮＡ座位が、ＤＮＡメチル化による調節の機会を増しているＣｐＧアイランドに関連している(Weber, B., Stresemann, C., Brueckner, B. & Lyko, F. Cell Cycle 6, 1001-1005 (2007))。研究の大半が、エピジェネティックにサイレンシングされたｍｉＲＮＡを明らかにするために、クロマチンリモデリング薬による処理を用いている。
【０２０７】
ＲＮＡサイレンシングにおける役割に加えて、ｍｉＲＮＡは翻訳もまた活性化する（Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014)）。これらの部位をノックアウトすることは、標的遺伝子の発現を減少させ得るが、これらの部位を導入することは、発現を増加させ得る。
【０２０８】
個々のｍｉＲＮＡは、結合特異性に重要である、シード配列（マイクロＲＮＡの２〜８塩基）を変異させることにより最も効果的にノックアウトすることができる。本領域の切断と、それに続くＮＨＥＪによる誤った修復は、標的部位への結合をブロックすることにより、ｍｉＲＮＡの機能を効果的に消滅させることができる。ｍｉＲＮＡはまた、パリンドローム配列に隣接する特別なループ領域を特異的に標的とすることによって、阻害され得る。触媒作用が不活性のＣａｓ９はまた、ｓｈＲＮＡの発現を阻害するために用いることができる（Zhao, Y. et al., Sic Rep 4, 3943 (2014)）。ｍｉＲＮＡを標的化することに加えて、結合部位を、ｍｉＲＮＡによるサイレンシングを防ぐために、標的化および変異させることもできる。
【０２０９】
ヒト細胞
【０２１０】
本明細書に記載および例示されるように、ＡＡＴＤを寛解させるための、遺伝子編集の主要な標的はヒト細胞である。例えば、エクスビボ法において、ヒト細胞は、記載された技術を用いて改変された後に、肝細胞または前駆細胞を生み出すことができる、体細胞である。例えば、インビボ法において、ヒト細胞は、肝細胞、腎細胞、または他の罹患器官由来の細胞である。
【０２１１】
必要な患者に由来しているが故に、該患者にすでに完全に適合している自家細胞において、遺伝子編集を行うことにより、患者に安全に再導入することができる細胞を産生し、患者の疾病に関連する１つ以上の臨床状態を寛解させる上で効果的であろう細胞集団を効率的に生み出すことが可能である。
【０２１２】
前駆細胞（本明細書では幹細胞とも呼ばれる）は、増殖およびより多くの前駆細胞を生じることが可能であり、これらは次に、分化した、または分化可能な娘細胞を生じることができる、多数の母細胞を生産する能力を有する。娘細胞それ自体は増殖し、子孫を産生し、続いて1つ以上の成熟細胞型に分化し、親の発生能を有する１つ以上の細胞も保持することができる。「幹細胞」という用語は、特定の状況下で、より特殊化または分化した表現型に分化する能力または可能性を有する細胞を指し、ある状況下では、実質的に分化することなく増殖する能力を保持する。ある態様において、前駆細胞または幹細胞という用語は、子孫が分化により、例えば、完全に個々の特性を獲得することにより、胚細胞および組織の進行性多様化において生じるように、しばしば異なる方向に特殊化する、一般化された母細胞を指す。細胞の分化は、多くの細胞により通常起こる、複雑なプロセスである。分化細胞は、それ自身が多分化能細胞から由来した多分化能細胞に由来することができ、以下同様である。これらの多分化能細胞のそれぞれは、幹細胞と考えられてよいが、それぞれが生じさせる細胞型の範囲はかなり変動する可能性がある。いくつかの分化細胞はまた、より大きな発生能を持つ細胞を生じさせる能力を有する。この能力は、天然であってもよく、人工的に様々なファクターで処理されることにより誘導されてもよい。多くの生物学的な例において、幹細胞は複数の異なる細胞型の子孫を産生することができるために「多分化能」であるが、これは「幹細胞性」には必要ない。
【０２１３】
自己複製は幹細胞の別の重要な局面である。理論的には、自己複製は、２つの主なメカニズムのいずれかによって起こり得る。幹細胞は、非対称的に分裂し、一方の娘細胞は幹細胞の状態を保持し、他方の娘細胞はいくつかの異なる特定の機能および表現型を発現する。あるいは、集団中のいくつかの幹細胞は、集団中のいくつかの幹細胞を全体として維持しながら、集団中の他の細胞が分化した子孫のみを生じる間、集団中のいくつかの幹細胞を対称的に２つの幹細胞に分けることができる。一般的に、「前駆細胞」は、より原始的な細胞表現型である（すなわち、完全に分化した細胞よりも発生経路または進化の初期段階にある）。しばしば、前駆細胞はまた、有意な、または、非常に高い、増殖能を有する。前駆細胞は、発生経路および細胞が発生し分化する環境に依存して、複数の異なる分化した細胞型または単一の分化した細胞型を生じさせることができる。
【０２１４】
細胞の個体発生の文脈において、「分化した」または「分化する」という形容詞は相対的な用語である。「分化細胞」とは、比較される細胞よりも発達経路をさらに進んだ細胞である。従って、幹細胞は、系列が制限された前駆細胞（例えば、筋細胞前駆細胞）に分化することができ、次に、さらに経路を進んだ他のタイプの前駆体細胞（例えば、筋細胞前駆体）に分化することができ、その後、特定の組織タイプで特徴的な役割を担う、筋細胞などの最終段階の分化細胞に分化することができ、さらに増殖する能力を保持していてもいなくてもよい。
【０２１５】
人工多能性幹細胞
【０２１６】
いくつかの態様において、本明細書で記載される遺伝子改変ヒト細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。ｉＰＳＣを使用する利点は、細胞が、前駆細胞を投与する同じ対象に由来し得ることである。すなわち、体細胞は、対象から得て、人工多能性幹細胞へ再プログラムさせ、その後、対象へ投与する前駆細胞へ再分化させることができる（例えば、自家細胞）。前駆細胞は、本質的に自家供給源に由来するため、移植拒絶またはアレルギー反応のリスクは、他の対象または対象群由来の細胞の使用と比較して低減される。さらに、ｉＰＳＣの使用は、胚供給源から得られた細胞の必要性を否定する。従って、ある態様において、開示された方法で用いられる幹細胞は、胚性幹細胞ではない。
【０２１７】
分化は一般的に、生理的状況において不可逆であるが、体細胞をｉＰＳＣへと再プログラムさせるいくつかの方法が、最近開発されている。例示的な方法は、当業者に周知されており、本明細書の下記に端的に記載する。
【０２１８】
「再プログラム」という用語は、分化細胞（例えば体細胞）の分化状態を、変更または逆戻りさせるプロセスを指す。言い換えれば、再プログラムは、細胞の分化を後方に動かし、より未分化の、またはより原始的な細胞型にするプロセスを指す。注目すべきは、多くの初代細胞を培養すると、完全に分化した特性がいくらか欠損する可能性があることである。従って、単に分化細胞という用語に含まれるこのような細胞を培養しても、これらの細胞を非分化細胞（例えば未分化の細胞）または多能性の細胞にすることはできない。分化細胞の多能性への移行には、培養における分化した特性の部分欠損につながる刺激を超える再プログラム刺激が必要である。再プログラムした細胞はまた、一般に、培養において限られた数の分裂のみの能力を有する初代細胞の親細胞と比較して、増殖能力を失うことなく継代を延長させる能力の特性を有する。
【０２１９】
再プログラムされるべき細胞は、再プログラムに先立ち、部分的に分化され得るか、あるいは、最終分化され得る。いくつかの態様において、再プログラムは、分化細胞（例えば体細胞）の分化状態から、多能性の状態または多分化能の状態への完全な復帰を包含する。いくつかの態様において、再プログラムは、分化細胞（例えば体細胞）の分化状態から、未分化の細胞（例えば胚様細胞）への、完全な、または、部分的な復帰を包含する。再プログラムは、細胞による特定の遺伝子の発現を生じ、その発現はさらに、再プログラムに寄与する。本明細書に記載される特定の態様において、分化細胞（例えば体細胞）の再プログラムは、分化細胞が未分化状態（例えば、未分化細胞である）をとるようにする。得られた細胞は、「再プログラムした細胞」あるいは「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）」と呼ばれる。
【０２２０】
再プログラミングは、細胞分化の間に生じる、核酸改変（例えば、メチル化）、染色体凝縮、エピジェネティック変化、ゲノムインプリンティングなどの遺伝的パターンの少なくとも一部の改変、例えば逆転を包含し得る。再プログラミングは、既に多能性である細胞の既存の未分化状態を単に維持するか、またはすでに多能性細胞である細胞（例えば、筋原性幹細胞）の完全に分化していない状態を維持することとは異なる。再プログラムはまた、既に多能性または多分化能である細胞の、自己複製または増殖を促進させこととは異なるが、本明細書に記載の組成物および方法は、いくつかの態様において、これらの目的のためにも使用することができる。
【０２２１】
体細胞から多能性肝細胞を産生するために用いることができる多くの方法が、当業界で知られている。体細胞を多能性表現型へ再プログラムさせるこれらのいずれの方法も、本明細書に記載される方法において用いるのに適しているであろう。
【０２２２】
転写因子の規定の組み合わせを用いて多能性細胞を産生させるための再プログラムの方法論が、記載されている。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを直接形質導入することにより、マウス体細胞を、発生能が拡大されたＥＳ細胞様細胞に変換することができる；Takahashi and Yamanaka, Cell 126(4): 663-76 (2006)を参照されたい。ｉＰＳＣは、多能性に関連する転写回路（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）および多くのエピジェネティックな状況（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ）を回復させるために、ＥＳ細胞に似ている。さらに、マウスのｉＰＳＣは、多能性のための全ての標準的アッセイを満たす：具体的には、３つの胚葉の細胞型へのインビトロ分化、テラトーマ形成、キメラへの寄与、生殖系列伝達［例えば、Maherali and Hochedlinger、Cell Stem Cell． 3（6）：595-605（2008）参照］、および四倍体相補性が挙げられる。
【０２２３】
ヒトｉＰＳＣは、同様の形質導入方法を用いて得ることができ、３つの転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧは、多能性を司る基本的なセットとして確立されている；例えば、Budniatzky and Gepstein, Stem Cells Transl Med. 3(4):448-57 (2014); Barrett et al., Stem Cells Trans Med 3:1-6 sctm.2014-0121 (2014); Focosi et al., Blood Cancer Journal 4: e211 (2014)；およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。ｉＰＳＣの生産は、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸配列を、歴史的にウイルスベクターを用いて、成人の体細胞に導入することにより、達成することができる。
【０２２４】
ｉＰＳＣは、最終分化した体細胞、および成体幹細胞または体性幹細胞から、産生または由来することができる。すなわち、非多能性前駆細胞は、再プログラミングによって多能性または多分化能を付与することができる。このような場合、最終分化細胞を再プログラムするのに必要なほど多くの再プログラミング因子を含む必要はない。さらに、再プログラムは、再プログラミング因子の非ウイルス性導入によって、例えばタンパク質自体を導入することによって、または再プログラミング因子をコードする核酸を導入することによって、または翻訳の際に再プログラミング因子を産生するメッセンジャーＲＮＡを導入することによって、誘導することができる（例えば, Warren et al., Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010)を参照）。再プログラムは、例えば、Ｏｃｔ−４（Ｏｃｔ−３／４またはＰｏｕｆ５１としてもまた知られる）、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＮＡＮＯＧ、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ−Ｍｙｃ、１−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｒｅｍ２、Ｔｅｒｔ、およびＬＩＮ２８を含む幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組み合わせを導入することにより、達成され得る。ある態様において、本明細書に記載される方法および組成物を用いる再プログラムは、さらに、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘファミリーのメンバー、Ｋｌｆファミリーのメンバー、およびＭｙｃファミリーのメンバーの１つ以上を体細胞に導入することを含み得る。ある態様において、本明細書に記載される方法および組成物はさらに、再プログラムのために、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ＭＹＣおよびＫｌｆ４のそれぞれを１つ以上導入することを含む。上述のように、再プログラムに使用される正確な方法は、本明細書に記載の方法および組成物にとって必ずしも重要ではない。しかし、再プログラムされた細胞から分化した細胞を、例えばヒトの治療に使用する場合、ある態様において、再プログラムはゲノムを変更する方法によって影響されない。従って、これらの態様において、再プログラムは、例えばウイルスベクターまたはプラスミドベクターを用いることなく達成される。
【０２２５】
出発細胞の集団に由来する再プログラムの効率（すなわち、再プログラムした細胞の数）は、様々な薬剤、例えば、小分子の添加によって増強することができ、Shi et al., Cell-Stem Cell 2:525-528 (2008); Huangfu et al., Nature Biotechnology 26(7):795-797 (2008)およびMarson et al., Cell- Stem Cell 3: 132-135 (2008)によって示されている。従って、人工多能性幹細胞の生産の効率または割合を増強させる薬剤、または薬剤の組み合わせを、患者特異的な、または、疾病特異的なｉＰＳＣの生産において用いることができる。再プログラム効率を増強させる薬剤のいくつかの非限定的な例には、可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ馴化培地、ＢＩＸ−０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５−アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリド、ヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ビタミンＣ、およびトリコスタチン（ＴＳＡ）などが含まれる。
【０２２６】
再プログラム増強剤の他の非限定的な例には、以下が含まれる：スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ（例えばＭＫ０６８３、ボリノスタット）および他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ−２１０、デプデシン（例えば、（−）−デプデシン）、ＨＣ毒素、Ｎｕｌｌｓｃｒｉｐｔ（４−（１，３−ジオキソ−１Ｈ、３Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド）、フェニルブチラート（例えばフェニル酪酸ナトリウム）およびバルプロ酸（（ＶＰＡ）および他の短鎖脂肪酸）、Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、アピシジン、酪酸ナトリウム、ピバロイルオキシメチルブチレート（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ−９）、トラポキシンＢ、クラミドモニン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８またはＦＫ２２８としても知られる）、ベンズアミド（例えば、ＣＩ−９９４（例えば、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｄｉｎａｌｉｎｅ）およびＭＳ−２７−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４、ＣＢＨＡ（ｍ−カルボキシシンナミン酸ビスヒドロキサム酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、Ｔｕｂａｃｉｎ、Ａ−１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ（例えば、６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロイックヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９、１０−エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１およびＣＨＡＰ５０。他の再プログラム増強剤には、ＨＤＡＣのドミナントネガティブ型（例えば、触媒的に不活性な形態）、ＨＤＡＣのｓｉＲＮＡインヒビター、およびＨＤＡＣに特異的に結合する抗体が含まれる。このような阻害剤は、例えば、ＢＩＯＭＯＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅおよびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
【０２２７】
本明細書に記載される方法で使用するための多能性幹細胞の誘導を確認するために、単離したクローンに対して、幹細胞マーカーの発現を試験することができる体細胞に由来する細胞におけるこれらの発現により、該細胞が人工多能性幹細胞であると特定される。幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔｌ、Ｅｓｇｌ、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘｌ、Ｕｔｆｌ、およびＮａｔｌを含む非限定的な群から選択される。ある態様において、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現する細胞は、多能性であると特定される。これらのマーカーの発現を検出する方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲや、ウェスタンブロットまたはフローサイトメトリー解析などの、コードされたポリペプチドの存在を検出する免疫学的な方法を含み得る。いくつかの態様において、検出は、ＲＴ−ＰＣＲを包含するのみならず、タンパク質マーカーの検出も含む。細胞内マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲ、または、免疫細胞化学などのタンパク質検出方法により、最もよく特定され得、一方、細胞表面マーカーは、例えば免疫細胞化学により、容易に特定される。
【０２２８】
単離した細胞の多能性幹細胞の特性は、ｉＰＳＣが、３つの胚葉のそれぞれの細胞に分化する能力を評価する試験により、確認することができる。一例として、ヌードマウスにおけるテラトーマ形成は、単離したクローンの多能性の特性を評価するために、用いることができる。細胞をヌードマウスに導入し、組織学的検査および／または免疫組織化学的検査を、細胞から生じる腫瘍に対して行う。例えば、３つの胚葉全てに由来する細胞を含む腫瘍の成長はさらに、細胞が多能性幹細胞であることを示す。 
【０２２９】
肝細胞
【０２３０】
いくつかの態様において、本明細書に記載される遺伝子改変ヒト細胞は、肝細胞である。肝細胞は肝臓の主な実質組織の細胞である。肝細胞は、肝臓の質量の７０〜８５％を構成する。肝細胞は、タンパク質合成；タンパク質貯蔵：炭水化物の変換；コレステロール、胆汁酸塩およびリン脂質の合成；外因性物質および内因性物質の解毒、改変および排泄；並びに胆汁の形成および分泌の開始：に関連する。
【０２３１】
ＳＥＲＰＩＮＡ１は、主に肝細胞（肝実質細胞）で発現され、単球および好中球での二次発現を伴う、循環血液中のタンパク質の主な供給源である。それゆえ、肝細胞および肝臓において、ＳＥＲＰＩＮＡ１の修正が、主に標的とされるのであろう。
【０２３２】
患者特異的ｉＰＳＣの作製
【０２３３】
本発明のエクスビボ法の１ステップは、１つの患者特異的ｉＰＳ細胞、複数の患者特異的ｉＰＳ細胞、または患者特異的ｉＰＳ細胞株を作製することを包含する。Takahashi and Yamanaka 2006; Takahashi, Tanabe et al. 2007に記載されているように、患者特異的ｉＰＳ細胞を作製するための多くの方法が、当業界で確立されている。例えば、該作製ステップは、ａ）患者由来の皮膚細胞または線維芽細胞などの、体細胞を単離すること；およびｂ）細胞を多能性幹細胞になるように誘導するために、一連の多能性関連遺伝子を体細胞に導入すること：を含む。いくつかの態様において、一連の多能性関連遺伝子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、およびｃＭＹＣからなる群から選択される１つ以上の遺伝子である。
【０２３４】
患者の肝臓または骨髄の、生検または穿刺の実施
【０２３５】
生検組織または穿刺液は、生体から得た組織または液体のサンプルである。多くの異なる種類の生検組織または穿刺液が存在する。これらのほぼ全てが、少量の組織を除去するための鋭利なツールを用いることを包含する。生検が皮膚または他の敏感な領域において行われる場合、最初に麻酔薬を投与する。生検または穿刺は、当業界で知られる任意の方法に従い行ってよい。例えば、肝臓の生検において、ニードルを、腹部の皮膚を貫通させて肝臓へ注入し、肝組織を捕らえる。例えば、骨髄穿刺において、太いニードルを用いて骨盤の骨に挿入し、骨髄を回収する。
【０２３６】
肝臓特異的な前駆細胞または初代肝細胞の単離
【０２３７】
肝臓特異的な前駆細胞および初代肝細胞は、当業界で知られる任意の方法に従い単離することができる。例えば、ヒト肝細胞を、新鮮な外科検体（例えば自家サンプル）から単離する。健常な肝組織を、コラゲナーゼ消化により肝細胞を単離するために用いる。得られた細胞懸濁液を、１００ｍｍナイロンメッシュを通して濾過し、５０ｇで５分間遠心分離することにより沈降させ、再懸濁し、冷たい洗浄培地で２〜３回洗浄する。新鮮な肝臓標本から得られた肝細胞を、ストリンジェントな条件で培養することにより、ヒト肝臓幹細胞を得る。肝細胞をコラーゲン被覆プレートに播種し、２週間培養する。２週間後、生存細胞を取り除き、幹細胞マーカーの発現について特徴づける(Herrera et al, STEM CELLS 2006;24: 2840 -2850)。
【０２３８】
間葉系幹細胞の単離
【０２３９】
間葉系幹細胞は、当業界で知られる任意の方法に従い、例えば患者の骨髄または末梢血から、単離することができる。例えば、骨髄穿刺液を、ヘパリンを含むシリンジに集める。細胞を、パーコール（商標）を用いて洗浄し、遠心分離する。血液細胞、肝細胞、間質細胞、マクロファージ、マスト細胞、および胸腺細胞などの細胞を、パーコール（商標）を用いて分離する。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）で培養する(Pittinger MF, Mackay AM, Beck SC et al., Science 1999; 284:143-147)。
【０２４０】
ゲノム編集
【０２４１】
ゲノム編集は、一般的には、ゲノムのヌクレオチド配列を、好ましくは正確な、または予め決められた方法で、改変するプロセスを指す。本明細書に記載されるゲノム編集の方法の例には、部位特異的ヌクレアーゼを用いて、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をゲノム上の正確な標的位置で切断し、それによりゲノム内の特定の位置に２本鎖または１本鎖ＤＮＡ切断を作製する方法が含まれる。これらの切断は、相同配向型修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの、天然の、内因性細胞内プロセスによって、修復され得、また、通常は修復され、最近Cox et al., Nature Medicine 21(2), 121-31 (2015)において概説された。これら２つの主なＤＮＡ修復プロセスは、代替経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪは、２本鎖切断で生じたＤＮＡ末端を、時にヌクレオチド配列の欠損または付加を伴って、直接的に連結させ、遺伝子発現を破壊または増強し得る。ＨＤＲは、規定のＤＮＡ配列を切断ポイントに挿入するための鋳型として、相同配列、またはドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体などの、内因性ゲノム内に存在し得る。あるいは、ドナーは、プラスミド、１本鎖オリゴヌクレオチド、２本鎖オリゴヌクレオチド、デュプレックスオリゴヌクレオチドまたはウイルスなどの外因性核酸であってよく、これは、ヌクレアーゼ切断遺伝子座と高い相同性を有する領域を有するが、切断された標的遺伝子座に組み込むことができる欠失を含むさらなる配列または配列の変化もまた含有することができる。第三の修復メカニズムは、「代替的ＮＨＥＪ」とも呼ばれる、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり、ここでは、小さな欠失および挿入が切断部位で生じ得る点において、遺伝子上の結果がＮＨＥＪと同様である。ＭＭＥＪは、ＤＮＡ切断部位に隣接する数個の塩基対の相同配列を利用することで、より好ましいＤＮＡ末端修復結果を引き起こし、最近の報告では、本プロセスの分子メカニズムをさらに解明している；例えば、Cho and Greenberg, Nature 518, 174-76 (2015); Kent et al. Nature Structural and Molecular Biology, Adv. Online doi:10.1038/nsmb.2961(2015); Mateo's-Gomez et al., Nature 518, 254-57 (2015); Ceccaldi et al., Nature 528, 258-62 (2015)を参照されたい。ある場合には、ＤＮＡ切断部位での潜在的なマイクロホモロジーの解析に基づき、修復の可能性が高いことを予測することが可能であろう。
【０２４２】
これらのゲノム編集メカニズムはそれぞれ、所望のゲノム変化を作製するために用いることができる。ゲノム編集プロセスのあるステップは、意図された変異の部位にできるだけ近い標的遺伝子座において、１つまたは２つのＤＮＡ切断を作製することであり、２つのＤＮＡ切断は、２本鎖切断として、または２つの１本鎖切断としてである。これは、本明細書に記載および例示されるように、部位特異的ポリペプチドの使用を通じて達成することができる。
【０２４３】
ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの、部位特異的ポリペプチドは、例えばゲノムＤＮＡなどの核酸に、２本鎖切断または１本鎖切断を導入することができる。２本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存修復または非相同末端結合または代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合）を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同な鋳型を必要とすることなく、切断された標的核酸を修復できる。これは時に、切断部位において、標的核酸に小さな欠失または挿入を引き起こし得、遺伝子発現の破壊または変更につながり得る。ＨＤＲは、相同な修復用鋳型またはドナーが利用可能である場合に、生じ得る。相同なドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同な配列を含む。姉妹染色分体は、一般的に、修復用鋳型として、細胞に用いられる。しかしながら、ゲノム編集の目的では、修復用鋳型は、プラスミド、デュプレックスオリゴヌクレオチド、１本鎖オリゴヌクレオチド、２本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルスの核酸などの、外因性核酸としてしばしば供給される。外因性ドナー鋳型では、さらなる、または、変更された核酸配列もまた標的遺伝子座に組み込まれるように、ホモロジーの隣接領域の間に、さらなる核酸配列（例えばトランスジーン）または改変（例えば単一または複数の塩基変化または欠失）を導入することが一般的である。ＭＭＥＪは、小さな欠失および挿入が切断部位で起こり得る点で、ＮＨＥＪと同様の遺伝子上の結果を生じる。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接する数個の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復の結果を生み出す。ある場合には、ヌクレアーゼ標的領域において、潜在的なマイクロホモロジーの解析に基づいて、可能性のある修復結果を予測することが可能であり得る。
【０２４４】
従って、ある場合において、相同組換えは、外因性ポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入するために用いられる。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書において、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーまたはドナー配列またはポリヌクレオチドドナー鋳型）と呼ばれる。いくつかの態様において、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が、標的核酸切断部位に挿入される。いくつかの態様において、ドナーポリヌクレオチドは外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位で天然に生じない配列である。
【０２４５】
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの改変は、例えば、変異、欠失、変更、組み込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タギング、トランスジーン挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座および／または遺伝子変異につながり得る。ゲノムＤＮＡの欠失および非天然核酸のゲノムＤＮＡへの組み込みのプロセスは、ゲノム編集の例である。
【０２４６】
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム
【０２４７】
ＣＲＩＳＰＲ(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（例えば、細菌（bacteria）または古細菌（古細菌））のゲノムにおいて見つけることができる。原核生物において、ＣＲＩＳＰＲ座位は、ウイルスやファージなどの外来性の侵入者から原核生物を守るのを手助けする、一種の免疫システムとして機能する産物をコードする。ＣＲＩＳＰＲ座位の機能には、３つの段階がある：新規配列のＣＲＩＳＰＲ座位への組み込み、CRISPR RNA (ｃｒＲＮＡ）の発現、および外来性の侵入者である核酸のサイレンシングである。５つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステム（ＴｙｐｅＩ、ＴｙｐｅＩＩ、ＴｙｐｅＩＩＩ、ＴｙｐｅＵ、およびＴｙｐｅＶ）が特定されている。
【０２４８】
ＣＲＩＳＰＲ座位には、「リピート」と呼ばれる、多くの短い反復配列が含まれる。リピートは、発現される際、二次ヘアピン構造（例えばヘアピン）を形成し、かつ／または、非構造の１本鎖配列を含む。リピートは、たいてい、クラスターで生じ、しばしば種間で分枝する。リピートは、「スペーサー」と呼ばれる特有の介在配列が、規則的に間を介しており、リピート−スペーサー−リピート遺伝子座構造を生じる。スペーサーは、既知の外来性の侵入者の配列に、同一であるか、あるいは、高い相同性を有する。スペーサー−リピート単位は、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードし、成熟型のスペーサー−リピート単位へとプロセシングされる。ｃｒＲＮＡは「シード」、すなわち、標的核酸を標的とすることに関連するスペーサー配列を含む（原核生物における天然型では、スペーサー配列は外来性の侵入者の核酸を標的とする）。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’または３’末端に位置する。
【０２４９】
ＣＲＩＳＰＲ座位はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ））遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物において、ｃｒＲＮＡ機能の生合成および干渉の段階に関連している。いくつかのＣａｓ遺伝子は、相同な、二次および／または三次構造を含む。
【０２５０】
ＴｙｐｅＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステム
【０２５１】
天然のＴｙｐｅＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるｃｒＲＮＡ生合成は、トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ)を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性ＲＮａｓｅＩＩＩにより改変され、その後、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列のｃｒＲＮＡリピートにハイブリダイズする。内因性ＲＮａｓｅＩＩＩは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの切断に用いられる。切断されたｃｒＲＮＡは、エキソリボヌクレアーゼトリミングを受け、成熟ｃｒＲＮＡ形態を生産する（例えば、５’トリミング）。ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたままであり、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）に結合している。ｃｒＲＮＡ-ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、該複合体を、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズできる標的核酸へと導く。ｃｒＲＮＡの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、標的核酸切断についてＣａｓ９を活性化する。ＴｙｐｅＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムにおける標的核酸は、ロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる。実際、ＰＡＭは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の標的核酸への結合を容易にするのに不可欠である。ＴｙｐｅＩＩシステム（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも呼ばれる）は、さらに、ＴｙｐｅＩＩ−Ａ（ＣＡＳＳ４）およびＩＩ−Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）に細分される。Jinek et al., Science, 337(6096):816-821 (2012) により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ＲＮＡプログラム可能なゲノム編集にとって有用であることが示され、また、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／１７６７７２により、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの膨大な数の実施例および応用が提供されている。
【０２５２】
ＴｙｐｅＶ  ＣＲＩＳＰＲシステム
【０２５３】
ＴｙｐｅＶ  ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴｙｐｅＩＩシステムとの、いくつかの重要な違いを有する。例えば、Ｃｐｆ１は単一のＲＮＡが誘導するエンドヌクレアーゼであり、ＴｙｐｅＩＩシステムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く。実際、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、さらなるトランス活性化型ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされる。ＴｙｐｅＶ  ＣＲＩＳＰＲアレイは、４２−４４ヌクレオチドの長さの短い成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、各成熟ｃｒＲＮＡは１９ヌクレオチドのダイレクトリピートで始まり、２３−２５ヌクレオチドのスペーサー配列が続く。対照的に、ＴｙｐｅＩＩシステムの成熟ｃｒＲＮＡは、２０−２４ヌクレオチドのスペーサー配列で始まり、約２２ヌクレオチドのダイレクトリピートが続く。また、Ｃｐｆ１は、ＴｙｐｅＩＩシステムの標的ＤＮＡに続くＧリッチＰＡＭとは対照的な、短いＴリッチＰＡＭが先行する標的ＤＮＡを、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体が効率的に切断するような、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用する。従って、ＴｙｐｅＶシステムはＰＡＭから遠い位置で切断するが、ＴｙｐｅＩＩシステムはＰＡＭに隣接した位置で切断する。さらに、ＴｙｐｅＩＩシステムとは対照的に、Ｃｐｆ１は４または５個のヌクレオチドの５’突出を有する、付着ＤＮＡ２本鎖切断を介して、ＤＮＡを切断する。ＴｙｐｅＩＩシステムは、平滑２本鎖切断を介して、切断する。ＴｙｐｅＩＩシステムと同様に、Ｃｐｆ１は、予測されるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、ＴｙｐｅＩＩシステムと対照的に、第二ＮＨＮエンドヌクレアーゼドメインを含まない。
【０２５４】
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチドおよびプロトスペーサー隣接モチーフ
【０２５５】
代表的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドには、Fonfara et al., Nucleic Acids Research, 42: 2577-2590 (2014)の図１に記載される、Ｃａｓ９ポリペプチドが含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子の命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、大幅な書き換えを行った。上記のＦｏｎｆａｒａの図５は、様々な種のＣａｓ９ポリペプチドに対するＰＡＭ配列を提供している。
【０２５６】
部位特異的ポリペプチド
【０２５７】
部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを切断するためにゲノム編集で用いられるヌクレアーゼである。部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチド、または、ポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡのいずれかとして、細胞または患者に投与され得る。
【０２５８】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムに関連して、部位特異的ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合することができ、次に、ガイドＲＮＡは、該ポリペプチドが指向する標的ＤＮＡ中の部位を特定する。本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの態様において、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼである。
【０２５９】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含む。２つ以上の核酸切断ドメインは、リンカーを介して連結することができる。いくつかの態様において、リンカーは可動性リンカーを含む。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０以上の長さのアミノ酸を含んでよい。
【０２６０】
天然の野生型Ｃａｓ９酵素は、２つのヌクレアーゼドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン、およびＲｕｖＣドメインを含む。本明細書において、「Ｃａｓ９」は、天然のＣａｓ９と組換え型のＣａｓ９との両方を指す。本明細書で企図されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、および／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。
【０２６１】
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様フォールドを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行βストランドおよび１つのαヘリックスを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の１本鎖を切断することができる（例えば、ｃｒＲＮＡ標的鎖の相補鎖）。
【０２６２】
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮａｓｅＨまたはＲＮａｓｅＨ−様フォールドを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に作用することを含む、多様な核酸ベースの機能に関与している。ＲＮａｓｅＨドメインは、複数のαヘリックスに囲まれた５βストランドを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、標的核酸の１本鎖（例えば、２本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）を切断することができる。
【０２６３】
部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えばゲノムＤＮＡに、１本鎖切断または１本鎖切断を導入することができる。２本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路を刺激することができる（例えば、相同性依存修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））。ＮＨＥＪは、相同な鋳型を必要とすることなく、切断された標的核酸を修復できる。これは、時に、標的核酸の切断部位において、小さな欠失および挿入（インデル）を生じ、遺伝子発現の破壊または変更につながり得る。ＨＤＲは、相同な修復用鋳型、つまりドナーが利用可能である場合に、起こり得る。相同なドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列相同な配列を含む。姉妹染色分体は、一般的に、細胞により、修復用鋳型として用いられる。しかし、ゲノム編集の目的では、修復用鋳型はしばしば、プラスミド、デュプレックスオリゴヌクレオチド、１本鎖オリゴヌクレオチドまたはウイルスの核酸などの、外因性核酸として、供給される。外因性ドナー鋳型では、ホモロジーの隣接領域の間にさらなる核酸配列（導入遺伝子など）または改変（単一または複数の塩基変化または欠失など）を導入して、さらなる核酸配列、または、改変された核酸配列もまた、標的遺伝子座に組み込まれる。ＭＭＥＪは、小さな欠失および挿入が切断部位で起こり得るという点で、ＮＨＥＪと同様の遺伝子上の結果を生じる。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接する数個の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復の結果を生み出す。
ある場合には、ヌクレアーゼ標的領域において、潜在的なマイクロホモロジーの解析に基づいて、可能性のある修復結果を予測することが可能であり得る。
【０２６４】
従って、ある場合において、相同組換えは、外因性ポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入するために用いられる。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書では、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーまたはドナー配列）と呼ばれる。いくつかの態様において、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が、標的核酸切断部位に挿入される。いくつかの態様において、ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列であり、すなわち、標的核酸切断部位にて天然に生じない配列である。
【０２６５】
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの改変は、例えば、変異、欠失、変更、組み込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タギング、トランスジーン挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座および／または遺伝子変異につながり得る。ゲノムＤＮＡの欠失、および、非天然の核酸のゲノムＤＮＡへの組み込みのプロセスは、ゲノム編集の例である。
【０２６６】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、野生型の代表的な部位特異的ポリペプチド［例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、ＵＳ２０１４／００６８７９７の配列番号８、またはSapranauskas et al., Nucleic Acids Res, 39(21): 9275-9282 (2011)］、および他の様々な部位特異的ポリペプチドに、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６７】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、野生型の代表的な部位特異的ポリペプチド（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）のヌクレアーゼドメインに、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６８】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性である、１０を超える連続アミノ酸を含む。いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）に、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性である、１０を超える連続アミノ酸を含む。いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）に、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性である、１０を超える連続アミノ酸を、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメインに含む。いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）に、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性である、１０を超える連続アミノ酸を、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメインに含む。いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）に、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性である、１０を超える連続アミノ酸を、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメインに含む。いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）に、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性である、１０を超える連続アミノ酸を、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメインに含む。
【０２６９】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、野生型の代表的な部位特異的ポリペプチドの改変型を含む。野生型の代表的な部位特異的ポリペプチドの改変型は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低減させる変異を含む。いくつかの態様において、野生型の代表的な部位特異的ポリペプチドの改変型は、野生型の代表的な部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記）の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満または１％未満の核酸切断活性を有する。部位特異的ポリペプチドの改変型は、実質的な核酸切断活性を有さなことがあり得る。部位特異的ポリペプチドが実質的な核酸切断活性を有さない改変型である場合、本明細書では、「酵素的に不活性」と呼ばれる。
【０２７０】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドの改変型は、標的核酸上の１本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導することができるような変異を含む（例えば、２本鎖標的核酸の糖−リン酸骨格の１本のみを切断することによる）を含む。いくつかの態様において、変異は、野生型部位特異的ポリペプチド(例えば, 化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、上記)の複数の核酸切断ドメインのうち１つ以上において、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満または１％未満の核酸切断活性を生じる。いくつかの態様において、変異は、標的核酸の相補鎖の切断能力を保持するが、標的核酸の非相補鎖の切断能力を減少させる、複数の核酸切断ドメインのうち１つ以上を生じる。いくつかの態様において、変異は、標的核酸の非相補鎖の切断能力を保持するが、標的核酸の相補鎖の切断能力を減少させる、複数の核酸切断ドメインのうち１つ以上を生じる。例えば、野生型代表的な化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドにおける残基、例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４およびＡｓｎ８５６を、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメインｓ）のうち１つ以上を不活性化させるように変異させる。いくつかの態様において、変異させた残基は、野生型代表的な化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドにおいて、残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４およびＡｓｎ８５６に対応している（例えば、配列および／または構造のアラインメントによって決定される）。変異の非限定的な例には、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４ＡまたはＮ８５６Ａが含まれる。当業者であれば、アラニン置換以外の変異が好適であることを認識するであろう。
【０２７１】
いくつかの態様において、Ｄ１０Ａ変異を、実質的にＤＮＡ切断活性を失った部位特異的ポリペプチドを生産するために、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせる。いくつかの態様において、Ｈ８４０Ａ変異を、実質的にＤＮＡ切断活性を失った部位特異的ポリペプチドを生産するために、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせる。いくつかの態様において、Ｎ８５４Ａ変異を、実質的にＤＮＡ切断活性を失った部位特異的ポリペプチドを生産するために、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせる。いくつかの態様において、Ｎ８５６Ａ変異を、実質的にＤＮＡ切断活性を失った部位特異的ポリペプチドを生産するために、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせる。実質的に不活性のヌクレアーゼドメインを１つ含む部位特異的ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。
【０２７２】
ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）のニッカーゼ変異体は、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集の特異性を増加させるために用いることができる。野生型Ｃａｓ９は、通常、標的配列（例えば、内因性ゲノム遺伝子座）の特定の約２０ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計された単一のガイドＲＮＡによって導かれる。しかし、いくつかのミスマッチが、ガイドＲＮＡと標的遺伝子座との間で許容され得、標的部位における必要なホモロジーの長さを、例えば、わずか１３ｎｔのホモロジーまで効果的に減少させ、それにより、標的ゲノムの他の場所のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合および２本鎖核酸切断（オフターゲット切断としても知られる）の可能性が上昇する。Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体はそれぞれ１本鎖のみを切断するので、２本鎖切断を作製するためには、一対のニッカーゼが近接して標的核酸の反対鎖に結合して、それにより一対ニックを作製することが必要であり、これは２本鎖切断と同等である。これは、２つの別々のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼに１つずつ）が、近接して、かつ標的核酸の反対側の鎖に結合することを必要とする。この必要性は、２本鎖切断が起こるのに必要な最小のホモロジーの長さを本質的に２倍にし、２本鎖切断現象がゲノムの他の場所で起こる可能性を減少させ、ゲノムの他の場所では、２つのガイドＲＮＡ部位（存在する場合）は、２本鎖切断が形成できるように互いに十分接近している可能性は低い。当業界で記載されるように、ニッカーゼはまたは、ＮＨＥＪに対してＨＤＲを促進するために用いることができる。ＨＤＲは、所望の変化を効果的に媒介する特定のドナー配列の使用を通じて、ゲノム中の標的部位に、選択された変化を導入するために使用することができる。遺伝子編集で使用するための様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの説明をき、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／１７６７７２、およびNature Biotechnology 32, 347-355 (2014)、およびそれらに引用されている参考文献において、見出すことができる。
【０２７３】
企図される変異には、置換、付加、および欠失、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、変異は、変異されるアミノ酸をアラニンに変換させる。いくつかの態様において、変異は、変異されるアミノ酸を別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシンまたはアルギニン）に変換させる。いくつかの態様において、変異は、変異されるアミノ酸を非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換させる。いくつかの態様において、変異は、変異されるアミノ酸をアミノ酸模倣体（例えば、リン酸模倣体）に変換させる。いくつかの態様において、変異は、保存的変異である。例えば、変異は、変異されるアミノ酸を、サイズ、形状、電荷、極性、コンホーメーションが類似しているアミノ酸、および／または、変異されるアミノ酸の回転異性体に変換することができる（例えば、システイン／セリン変異、リシン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。いくつかの態様において、変異は、読み枠のシフト、および／または未成熟終止コドンの作製を引き起こす。いくつかの態様において、変異は、１つ以上の遺伝子の発現に影響する、遺伝子または遺伝子座の調節領域に変化を引き起こす。
【０２７４】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体、変異により酵素的に不活性な、および／または、条件的に酵素的に不活性な、部位特異的ポリペプチド）は、核酸を標的とする。いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体、変異により酵素的に不活性な、および／または、条件的に酵素的に不活性な、エンドリボヌクレアーゼ）は、ＤＮＡを標的とする。いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体、変異により酵素的に不活性な、および／または、条件的に酵素的に不活性な、エンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡを標的とする。
【０２７５】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上の非天然の配列を含む（例えば、部位特異的ポリペプチドは融合タンパク質である）。
【０２７６】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９に、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含む。
【０２７７】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９に、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン)を含む。
【０２７８】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９に、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメインを含み、ここでは、核酸切断ドメインの１つまたは両方が、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメインに、少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含む。
【０２７９】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９に、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および非天然の配列（例えば、核移行シグナル）、または、部位特異的ポリペプチドを非天然の配列に連結させるリンカーを含む。
【０２８０】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９に、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン (すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン)を含み、ここでは、部位特異的ポリペプチドが、核酸切断ドメインの１つまたは両方に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減させる変異を含む、
【０２８１】
いくつかの態様において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９に、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン(すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン)を含み、ここでは、ヌクレアーゼドメインの１つがアスパラギン酸１０の変異を含み、および／または、ヌクレアーゼドメインの１つがヒスチジン８４０の変異を含み、および、該変異がヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減させる。
【０２８２】
本発明のいくつかの態様において、１つ以上の部位特異的ポリペプチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム上の特定の遺伝子座で、１つの２本鎖切断を共にもたらす２つのニッカーゼを含むか、あるいは、ゲノム上の特定の遺伝子座で、２つの２本鎖切断を共にもたらす４つのニッカーゼを含む。あるいは、１つの部位特異的ポリペプチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム上の特定の遺伝子座で、１つの２本鎖切断をもたらす。
【０２８３】
ゲノムを標的とする核酸
【０２８４】
本開示は、結合したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を、標的核酸内の特異的標的配列に指向させることができる、ゲノムを標的とする核酸を提供する。いくつかの態様において、ゲノムを標的とする核酸はＲＮＡである。ゲノムを標的とするＲＮＡは、本明細書において、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、少なくとも、目的の標的核酸配列にハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とを含む。ＴｙｐｅＩＩシステムにおいて、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第二のＲＮＡを含む。ＴｙｐｅＩＩガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、相互にハイブリダイズして、デュプレックス（デュプレックス）を形成する。ＴｙｐｅＶガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ｃｒＲＮＡはデュプレックスを形成する。両システムにおいて、デュプレックスは部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果ガイドＲＮＡおよび部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する。ゲノムを標的とする核酸は、部位特異的ポリペプチドと結合することにより、複合体に標的特異性を提供する。従って、ゲノムを標的とする核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を方向づける。
【０２８５】
代表的なガイドＲＮＡは、配列番号１−６８，２９７、例えば配列番号５４，８６０−６８，２９７におけるスペーサー配列を含み、これらは、その標的配列および結合するＣａｓ９またはＣｐｆ１の切断部位のゲノム位置と共に示されており、ここでは、ゲノム位置はＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８ヒトゲノムアセンブリに基づいている。当業者であれば理解するように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノムを標的とする配列に相補的なスペーサー配列を含むように、設計される。例えば、配列番号１−６８，２９７、例えば、配列番号５４，８６０−６８，２９７における各スペーサー配列は、単一ＲＮＡキメラまたはｃｒＲＮＡに入れることができる（対応するｔｒａｃｒＲＮＡに加えて）。Jinek et al., Science, 337, 816-821 (2012) and Deltcheva et al., Nature, 471, 602-607 (2011) を参照されたい。
【０２８６】
いくつかの態様において、ゲノムを標的とする核酸は、二分子ガイドＲＮＡである。いくつかの態様において、ゲノムを標的とする核酸は単分子ガイドＲＮＡである。
【０２８７】
二分子ガイドＲＮＡは、２本のＲＮＡの鎖を含む。第一の鎖は、５’から３’の方向に、場合により存在するスペーサー延長配列、スペーサー配列、および最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第二の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に相補的な）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および、場合により存在するｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。
【０２８８】
ＴｙｐｅＩＩシステムの単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’の方向に、場合により存在するスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および場合により存在するｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。場合により存在するｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、ガイドＲＮＡにさらなる機能性（例えば、安定性）を付与する要素を含み得る。単分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結させ、ヘアピン構造を形成する。場合により存在するｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１つ以上のヘアピンを含む。
【０２８９】
ＴｙｐｅＶシステムの単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’の方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列およびスペーサー配列を含む。
【０２９０】
実例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで用いられるガイドＲＮＡ、または他のより小さなＲＮＡは、以下に例示され当業界で記載されるように、化学的手段により容易に合成することができる。化学合成手順は絶え間なく拡大しているが、高速液体クロマトグラフィー（ＰＡＧＥなどのゲルの使用を避けるＨＰＬＣ）などの手順によるこのようなRNAの精製は、ポリヌクレオチドの長さがおよそ百ヌクレオチドを大幅に超えて増加するにつれてより困難になる傾向がある。より長いＲＮＡを産生するために用いられる１つの手法は、互いに連結された２つ以上の分子を生産することである。Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなどの、はるかに長いＲＮＡは、酵素的に、より容易に産生される。当業界で記載されているように、ＲＮＡの化学合成および／または酵素的産生の間に、またはその後に、種々のタイプのＲＮＡ改変、例えば安定性を増強する、自然免疫応答の可能性または程度を低減する、および／または、他の特性を増強する改変が、導入され得る。
【０２９１】
スペーサー延長配列
【０２９２】
ゲノムを標的とする核酸のいくつかの態様において、スペーサー延長配列は、安定性を提供することができ、および／または、ゲノムを標的とする核酸の改変の位置を提供することができる。スペーサー延長配列は、オンターゲットまたはオフターゲットの、活性または特異性を改変することができる。いくつかの態様において、スペーサー延長配列が提供される。スペーサー延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７０００個以上を超えるヌクレオチドの長さを有してよい。スペーサー延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００個以上を下回るヌクレオチドの長さを有してよい。いくつかの態様において、スペーサー延長配列は、１０個未満のヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、スペーサー延長配列は、１０〜３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、スペーサー延長配列は、３０〜７０個のヌクレオチドの長さである。
【０２９３】
いくつかの態様において、スペーサー延長配列は、別の部分（例えば、安定性調節配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含む。いくつかの態様において、該部分は、核酸を標的とする核酸の安定性を減少、または増加させる。いくつかの態様において、該部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）である。いくつかの態様において、該部分は、真核細胞で機能する。いくつかの態様において、該部分は、原核細胞で機能する。いくつかの態様において、該部分は、真核細胞および原核細胞の両方で機能する。好適な部分の非限定的な例には、以下が含まれる：５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７  Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、安定性の制御、および／または、タンパク質およびタンパク質複合体によるアクセシビリティの制御を可能にする）、ｄｓＲＮＡデュプレックス（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体）にＲＮＡを標的化させる配列、トラッキングを提供する改変または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を促進させる部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、および／またはタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写制御因子、ＤＮＡメチル化酵素、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチル化酵素、ヒストン脱アセチル化酵素などを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）のための結合部位を提供する改変または配列。
【０２９４】
スペーサー配列
【０２９５】
スペーサー配列は、目的の標的核酸のある配列にハイブリダイズする。ゲノムを標的とする核酸のスペーサーは、配列特異的方法で、ハイブリダイゼーションを介して（すなわち、塩基対形成）、標的核酸と相互作用する。従って、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列によって変化する。
【０２９６】
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、スペーサー配列は、該システムで用いられるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’に位置する標的核酸にハイブリダイズするように設計される。スペーサーは、標的配列に完全に適合してもよいし、あるいは、ミスマッチを有してもよい。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡ中で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸中で、配列５’-ＮＲＧ-３’を含むＰＡＭを認識し、ここでは、ＲはＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎｈａ任意のヌクレオチドであり、かつ、Ｎはスペーサー配列が標的とする標的核酸配列の３’に直結している。
【０２９７】
いくつかの態様において、標的核酸配列は２０ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的核酸は、２０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的核酸は、２０個を超えるヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的核酸は、少なくとも、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的核酸配列は、ＰＡＭの第一ヌクレオチドの５’に直結する２０塩基を含む。例えば、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＲＧ−３’を含む配列（配列番号６８，２９８）において、標的核酸はＮｓに対応する配列を含み、ここでは、Ｎは任意のヌクレオチドであり、下線を引いたＮＲＧ配列は化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＰＡＭである。
【０２９８】
いくつかの態様において、標的核酸にハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有する。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５、約６ｎｔ〜約４０、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔである。いくつかの態様において、スペーサー配列は２０ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、スペーサーは１９ヌクレオチドを含む。
【０２９９】
いくつかの態様において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。いくつかの態様において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大約３０％、最大約４０％、最大約５０％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％、または１００％である。いくつかの態様において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の、６個の連続する５’末端のヌクレオチドに対して、１００％である。いくつかの態様において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約２０個の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも６０％である。スペーサー配列および標的核酸の長さは、１〜６個のヌクレオチドが異なり得、１つのバルジまたは複数のバルジと考えられ得る。
【０３００】
いくつかの態様において、スペーサー配列は、コンピュータープログラムを用いて設計または選択される。コンピュータープログラムは、例えば、予測される融解温度、二次構造形成、予測されるアニーリング温度、配列同一性、ゲノムの文脈（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｎｔｅｘｔ）、クロマチンアクセシビリティ、ＧＣ％、ゲノム発生の頻度（同一である配列の、あるいは、同様であるがミスマッチ、挿入または欠失の結果、１つ以上のスポットで変化している配列の）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を用いることができる。
【０３０１】
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列
【０３０２】
いくつかの態様において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、参照ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｃｒＲＮＡ）に少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％ 配列同一性を有する配列である。
【０３０３】
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、細胞内で最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズできるヌクレオチドを含む。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、デュプレックス、すなわち、塩基対２本鎖構造を形成する。共に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、部位特異的ポリペプチドに結合する。少なくとも、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズする。いくつかの態様において、少なくとも最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的な配列を含む。いくつかの態様において、少なくとも最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、最大約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的な配列を含む。
【０３０４】
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約７ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔである。いくつかの態様において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、およそ９ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、およそ１２ヌクレオチドの長さである。
【０３０５】
いくつかの態様において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８の連続したヌクレオチドに渡って、参照最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｃｒＲＮＡ）に、少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８の連続したヌクレオチドに渡って、参照最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一または１００％同一である。
【０３０６】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
【０３０７】
いくつかの態様において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列である。
【０３０８】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内で最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズできるヌクレオチドを含む。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とは、デュプレックス、すなわち、塩基対２本鎖構造を形成する。共に、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲリピートとは、部位特異的ポリペプチドに結合する。少なくとも、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの態様において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的である。
【０３０９】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチドｓ（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さであり得る。いくつかの態様において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ９ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、および１２ヌクレオチドである。いくつかの態様において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、上記のJinek et al.に記載される、２３−４８ｎｔのｔｒａｃｒＲＮＡからなる。
【０３１０】
いくつかの態様において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８の連続したヌクレオチドに渡って、参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して、少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８の連続したヌクレオチドに渡って、参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一または１００％同一である。
【０３１１】
いくつかの態様において、最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスは、二重らせんを含む。いくつかの態様において、最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスは、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のヌクレオチドを含む。
【０３１２】
いくつかの態様において、デュプレックスはミスマッチ（すなわち、デュプレックスの２本鎖が１００％相補的ではない）を含む。いくつかの態様において、デュプレックスは少なくとも約１、２、３、４、または５個以上のミスマッチを含む。いくつかの態様において、デュプレックスは最大約１、２、３、４、または５個以上のミスマッチを含む。いくつかの態様において、デュプレックスはわずか２個のミスマッチを含む。
【０３１３】
バルジ
【０３１４】
いくつかの態様において、最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスには「バルジ」が存在する。バルジは、デュプレックス内の、ヌクレオチドの非対合領域である。いくつかの態様において、バルジはデュプレックスの部位特異的ポリペプチドへの結合に寄与している。バルジは、デュプレックスの一方の側に、非対合５’−ＸＸＸＹ−３’を含み、ここでＸは任意のプリンであり、Ｙは反対鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドを含み、かつ、デュプレックスの他方の側に、非対合ヌクレオチド領域を含む。デュプレックスの両側における非対合ヌクレオチドの数は、異なり得る。
【０３１５】
一例として、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上に、非対合プリン（例えば、アデニン）を含む。いくつかの態様において、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の非対合５’−ＡＡＧＹ−３’を含み、ここでＹは最小ＣＲＩＳＰＲリピート上のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成し得るヌクレオチドを含む。
【０３１６】
いくつかの態様において、デュプレックスの最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、または５個以上の非対合ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、デュプレックスの最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、最大１、２、３、４、または５個以上の非対合ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、デュプレックスの最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、１個の非対合ヌクレオチドを含む。
【０３１７】
いくつかの態様において、デュプレックスの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の非対合ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、デュプレックスの第二の側のバルジ（例えば、デュプレックスの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）は、４つの非対合ヌクレオチドを含む。
【０３１８】
いくつかの態様において、バルジは少なくとも１つのゆらぎ塩基対形成を含む。いくつかの態様において、バルジは最大１つのゆらぎ塩基対形成を含む。いくつかの態様において、バルジは少なくとも１個のプリンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、バルジは少なくとも３個のプリンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、バルジ配列は少なくとも５個のプリンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、バルジ配列は少なくとも１個のグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、バルジ配列は少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含む。
【０３１９】
ヘアピン
【０３２０】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ
様々な態様において、１つ以上のヘアピンが、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡの３’側に位置している。
【０３２１】
いくつかの態様において、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とのデュプレックスにおける、最後の対のヌクレオチドの３’から、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０個以上のヌクレオチドから開始する。いくつかの態様において、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とのデュプレックスにおける、最後の対のヌクレオチドの３’から、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のヌクレオチドから開始することができる。
【０３２２】
いくつかの態様において、ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０個以上の連続したクレオチドを含む。いくつかの態様において、ヘアピンは、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，以上の連続したヌクレオチドを含む。
【０３２３】
いくつかの態様において、ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続したシトシンヌクレオチド）を含む。
【０３２４】
いくつかの態様において、ヘアピンはデュプレックスのヌクレオチド（例えば、ヘアピン中の、ハイブリダイズして一緒になったヌクレオチド）を含む。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピンデュプレックス中の、ＧＧジヌクレオチドにハイブリダイズしたＣＣジヌクレオチドを含む。
【０３２５】
１つ以上のヘアピンが、部位特異的ポリペプチドのガイドＲＮＡ相互作用領域と、相互作用し得る。
【０３２６】
いくつかの態様において、２つ以上のヘアピンが存在し、いくつかの態様において、３つ以上のヘアピンが存在する。
【０３２７】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
【０３２８】
いくつかの態様において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）に少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％配列同一性を有する配列を含む。
【０３２９】
いくつかの態様において、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有する。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有し得る。いくつかの態様において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４ヌクレオチドの長さを有する。
【０３３０】
いくつかの態様において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８の連続したヌクレオチドに渡って、参照３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に、少なくとも約６０％同一である。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８の連続したヌクレオチドに渡って、参照３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に、少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一である。
【０３３１】
いくつかの態様において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つ以上のデュプレックスの領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズした領域）を含む。いくつかの態様において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つのデュプレックスの領域を含む。
【０３３２】
いくつかの態様において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列はステムループ構造を含む。いくつかの態様において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ構造は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ステムループ構造は、機能性部分を含む。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含んでよい。いくつかの態様において、ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、または５個以上の機能性部分を含む。いくつかの態様において、ステムループ構造は、最大約１、２、３、４、または５個以上の機能性部分を含む。
【０３３３】
いくつかの態様において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピンは、Ｐドメインを含む。いくつかの態様において、Ｐドメインは、ヘアピン中の２本鎖領域を含む。
【０３３４】
ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列
【０３３５】
ｔｒａｃｒＲＮＡが単分子ガイドに関連していても、二分子ガイドに関連していても、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は提供され得る。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチドを超える長さを有する。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、約２０〜約５０００以上のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０００ヌクレオチドを超える長さを有する。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００以上のヌクレオチドを下回る長さを有する。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０００未満のヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０未満のヌクレオチドの長さを含む。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０〜３０のヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、３０〜７０のヌクレオチドの長さである。
【０３３６】
いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、機能性部分（例えば、安定性調節配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含む。いくつかの態様において、機能性部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を含む。いくつかの態様において、機能性部分は、全長約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、ｏｒ約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔを有する。いくつかの態様において、機能性部分は真核細胞で機能する。いくつかの態様において、機能性部分は原核細胞で機能する。いくつかの態様において、機能性部分は、真核細胞および原核細胞の両方で機能する。
【０３３７】
ｔｒａｃｒＲＮＡ延長（配列？）の機能性部分の非限定的な例には、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列（例えば、安定性の制御、および／または、タンパク質およびタンパク質複合体によるアクセシビリティの制御を可能にする）、ｄｓＲＮＡデュプレックス（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にＲＮＡを標的化させる配列、トラッキングを提供する改変または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を促進させる部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、および／またはタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写制御因子、ＤＮＡメチル化酵素、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチル化酵素、ヒストン脱アセチル化酵素などを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）のための結合部位を提供する改変または配列）が含まれる。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、プライマー結合部位、または、分子指標（例えば、バーコード配列）を含む。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１個以上の親和性タグを含む。
【０３３８】
単分子ガイドリンカー配列
【０３３９】
いくつかの態様において、単分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有する。上記のJinek et al.によって、例えば簡単な４ヌクレオチド「テトラループ」（−ＧＡＡＡ−）が用いられた（Science, 337(6096):816-821 (2012)）。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔ、約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの態様において、単分子ガイド核酸のリンカーは、４〜４０ヌクレオチドである。いくつかの態様において、リンカーは少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００以上のヌクレオチドである。いくつかの態様において、リンカーは最大約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００以上のヌクレオチドである。
【０３４０】
リンカーは、様々な配列のいずれかを含むことができるが、好ましくは、リンカーは、ガイドの他の機能領域を妨害する分子内結合を引き起こし得る、ガイドＲＮＡの他の部分との広範な相同性領域を有する配列を含まない。上述ののJinek et al.において、単純な４ヌクレオチド配列−ＧＡＡＡ−がScience、337（6096）：816-821（2012）に使用されたが、より長い配列を含む多くの他の配列も同様に使用することができる。
【０３４１】
いくつかの態様において、リンカー配列は機能性部分を含む。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含む、１つ以上の特徴を含んでよい。いくつかの態様において、リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、または５個以上の機能性部分を含む。いくつかの態様において、リンカー配列は、最大約１、２、３、４、または５個以上の機能性部分を含む。
【０３４２】
遺伝子内部またはその近傍で、１つ以上の変異またはエクソンの挿入、修正、欠失または置換によって細胞を修正するための、またはＳＥＲＰＩＮＡ１ｃＤＮＡまたはミニ遺伝子を対応する遺伝子の遺伝子座またはセーフハーバー部位にノックインすることによって細胞を修正するための、ゲノム工学戦略
【０３４３】
本開示の方法は、変異対立遺伝子の１つまたは両方の修正を包含し得る。変異を修正する遺伝子編集は、正しい発現レベルおよび時間的制御の回復の利点を有する。患者のＳＥＲＰＩＮＡ１対立遺伝子を配列決定することにより、特定された変異を最も良く修正するための遺伝子編集戦略の設計が可能になる。
【０３４４】
本発明のエクスビボ法のステップは、ゲノム工学を用いて患者特異的ｉＰＳ細胞を編集／修正することを包含する。あるいは、本発明のエクスビボ法のステップは、前駆細胞、初代肝細胞、間葉系幹細胞、または肝前駆細胞を編集／修正することを包含する。同様に、本発明のインビボ法のステップは、ゲノム工学を用いてＡＡＴＤ患者の細胞を編集／修正することを包含する。同様に、本発明の細胞の方法におけるステップは、ゲノム工学によってヒト細胞中のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集／修正することを包含する。
【０３４５】
ＡＡＴＤ患者は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子に１つ以上の変異を持つ。従って、異なる患者は一般的に、異なる修正戦略を必要とする。いずれのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼも、本発明の方法に使用することができ、各ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、疾病特異的であってもなくてもよい、それ自身の関連するＰＡＭを有する。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、配列番号５４，８６０−６１，３２４で特定されている。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、配列番号６１、３２５−６１、９３６で特定されている。Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、配列番号６１、９３４７−６２、０６９で特定されている。Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、配列番号６２、０７０−６２、１２０で特定されている。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、配列番号６２、１２１−６２、５６３で特定されている。アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを用いてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、配列番号６２、５６４−６８、２９７で特定されている。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、例えば、ＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲのエクソン１−２を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、実施例７で特定されている。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、例えばＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲのエクソン１−２を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、実施例８で特定されている。Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ���ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲのエクソン１−２を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、実施例９で特定されている。Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲのエクソン１−２を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、実施例１０で特定されている。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲのエクソン１−２を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、実施例１１で特定されている。アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、およびフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲのエクソン１−２を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列が、実施例１２で特定されている。
【０３４６】
例えば、変異は、不正確なＮＨＥＪ修復経路により生じる挿入または欠失により修正することができる。患者のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子が挿入または欠失した塩基を有する場合、標的切断により、読み枠を回復させるＮＨＥＪ媒介挿入または欠失を生じ得る。ミスセンス変異はまた、１つ以上のガイドＲＮＡを用いて、ＮＨＥＪ媒介修正により、修正することができる。変異を修正する切断の能力または可能性は、局所的配列およびマイクロホモロジーに基づいて、設計または評価することができる。ＮＨＥＪはまた、直接、または、いくつかの位置を標的とするｇＲＮＡ、もしくは、いくつかのｇＲＮＡによる切断によるスプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位を改変することにより、遺伝子のセグメントを欠失させるために用いることができる。これは、アミノ酸、ドメインまたはエクソンが変異を含有し、除去または反転し得る場合、あるいはそうでなければ、欠失がタンパク質に機能を回復させる場合に、有用であり得る。ガイド鎖の対が、本発明の欠失または修正に用いられている。
【０３４７】
あるいは、ＨＤＲによる修正のためのドナーは、アニーリングを可能にするために、小さい、または、大きいフランキング相同アームを有する修正配列を含有する。ＨＤＲは、本質的に、ＤＳＢ修復中に、鋳型として供給された相同なＤＮＡ配列を用いる、誤りのないメカニズムである。相同組換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異と切断部位との間の距離の関数であるため、重複する標的部位、または、最も近い標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接する余分な配列を含むことができ、あるいは、ゲノム配列とは異なる配列を含有することができ、従って、配列の編集が可能である。
【０３４８】
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによる変異の修正に加えて、種々の他の選択肢も可能である。小さい、または、大きい欠失、または複数の変異がある場合、影響を受けたエクソンを含むｃＤＮＡをノックインすることができる。完全長ｃＤＮＡは、任意の「セーフハーバー」にノックインすることができるが、供給された、あるいは、他のプロモーターを用いなければならない。この構築物が、正しい位置にノックインされる場合、正常な遺伝子と同様に、生理的制御を有するであろう。対のヌクレアーゼを用いて、変異した遺伝子領域を欠失させることができるが、通常は機能を回復させるためにドナーを提供する必要がある。この場合、２つのｇＲＮＡと１つのドナー配列が供給される。
【０３４９】
いくつかのゲノム工学戦略は、相同組換え（ＨＲ）としても知られる、相同組換え修復（ＨＤＲ）による、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍の１つ以上の変異の修正、またはＳＥＲＰＩＮＡ１  ＤＮＡの変異体の欠失、および／またはＳＥＲＰＩＮＡ１  ｃＤＮＡまたはミニ遺伝子（１つ以上のエクソンおよびイントロン、すなわち天然のまたは合成のイントロンから構成される）の対応する遺伝子の遺伝子座またはセーフハーバー座位へのノックインを包含する。相同組換え修復は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍に不活性化させる変異を有する患者を治療するための１つの戦略である。これらの戦略は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を回復させ、疾病状態を完全に逆転させ、治療し、および／または緩和する。この戦略は、患者の不活性化させる変異の位置に基づいてよりカスタムな手法を必要とする。変異を修正するためのドナーヌクレオチドは小さい（＜３００ｂｐ）。これは、ＨＤＲ効率がドナー分子のサイズに反比例し得るために、有利である。また、ドナー鋳型は、ドナー鋳型送達の効果的な手段であることが示されているサイズ制限されたウイルスベクター分子、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）分子に適合可能であることが期待される。また、ドナー鋳型は、非限定的な例として、血小板および／またはエキソソームまたは他の微小胞を含む、他のサイズ制限された分子に適合可能であることが期待される。
【０３５０】
相同組換え修復は、２本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための細胞メカニズムである。最も一般的な形態は相同組換えである。ＨＤＲには、１本鎖アニーリングや代替ＨＤＲなどを含む、さらなる経路が存在する。ゲノム工学ツールは、研究者がゲノムへの部位特異的な改変を作製するために細胞相同組換え経路を操作することを可能にする。細胞は、トランスで提供される合成ドナー分子を用いて２本鎖切断を修復することができることが見出されている。したがって、特定の変異の近くに２本鎖切断を導入し、適切なドナーを提供することによって、標的とする変化をゲノムにおいて作製することができる。特異的切断は、相同なドナー単独を投与された１０６個の細胞中の１個の割合を、１，０００倍を超えて上回って、ＨＤＲの割合を増加させる。特定のヌクレオチドでの相同組換え修復（ＨＤＲ）の割合は、切断部位までの距離の関数であるため、重複または最も近い標的部位を選択することが重要である。遺伝子編集は、その位置で編集するのでゲノムの残りの部分は影響を受けず、遺伝子の付加よりも利点を提供する。
【０３５１】
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは著しく様々であるが、一般的に、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にするために、小さな、または、大きな隣接する相同アームを有する、意図された配列を含む。導入された遺伝的変化に隣接する相同性領域は、３０ｂｐ以下であってよく、またはプロモーター、ｃＤＮＡなどを含むことができる数キロベースのカセットと同じくらい大きくてもよい。１本鎖および２本鎖のオリゴヌクレオチドドナーの両方が使用されている。これらのオリゴヌクレオチドの大きさは１００ｎｔ未満から数ｋｂを超えるまでであるが、より長いｓｓＤＮＡも生成して使用することができる。ＰＣＲ増幅産物、プラスミドおよびミニサークルを含む２本鎖ドナーがしばしば使用される。一般的に、ＡＡＶベクターは、個々のドナーのパッケージング限度が＜５ｋｂであるにもかかわらず、ドナー鋳型の送達の非常に有効な手段であることが見出されている。ドナーの能動的転写はＨＤＲを３倍に増加させ、プロモーターの包含が変換を増加させることを示した。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は遺伝子発現およびＨＤＲを減少させた。
【０３５２】
Ｃａｓ９なとの野生型エンドヌクレアーゼに加えて、一方または他方のヌクレアーゼドメインが不活性化されているニッカーゼ変異体が存在し、その結果わずか１本のＤＮＡ鎖切断が生じる。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから指向させることができ、または標的領域に隣接する一対のニッカーゼを使用することができる。ドナーは、１本鎖、ニック、またはｄｓＤＮＡであり得る。
【０３５３】
ドナーＤＮＡはヌクレアーゼと共に、または例えば遺伝子導入、ナノ粒子、マイクロインジェクションまたはウイルス形質導入などの様々な異なる方法によって独立して供給することができる。ＨＤＲに対するドナーの利用可能性を高めるために、種々の連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）オプションが提案されている。例には、ドナーをヌクレアーゼに結合させること、近くに結合するＤＮＡ結合タンパク質に結合させること、またはＤＮＡ末端結合または修復に関与するタンパク質に結合させることが含まれる。
【０３５４】
修復経路の選択は、細胞周期に影響を及ぼす培養条件などの、多くの培養条件によって、またはＤＮＡ修復および関連タンパク質を標的とすることによって、導くことができる。例えば、ＨＤＲを増加させるために、ＫＵ７０、ＫＵ８０またはＤＮＡリガーゼＩＶなどの重要なＮＨＥＪ分子を抑制することができる。
【０３５５】
ドナーが存在しない場合、ＤＮＡ切断由来の末端または異なる切断由来の末端は、ＤＮＡ末端が接合部でほとんどまたは全く塩基対合で結合されていない、いくつかの非相同修復経路を用いて結合され得る。標準的なＮＨＥＪに加えて、ａｌｔ−ＮＨＥＪなどの同様の修復メカニズムがある。２つの切断がある場合、介在するセグメントを欠失または反転させることができる。ＮＨＥＪ修復経路は、結合部における挿入、欠失または変異に繋がり得る。
【０３５６】
ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼ切断後に、ヒト細胞株で、１５ｋｂの誘導性の遺伝子発現カセットを規定の遺伝子座に挿入するために、用いられた。Maresca, M., Lin, V.G., Guo, N. & Yang, Y., Genome Res 23, 539-546 (2013)参照。
【０３５７】
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路およびＨＲの両方を用いる部位特異的遺伝子挿入が行われている。組み合わせの手法は、場合によりイントロン／エクソン境界を含む、ある状況下で適用可能であり得る。ＮＨＥＪはイントロンにおけるライゲーションに効果的であり得、誤りのないＨＤＲはコード領域において、より適し得る。
【０３５８】
既に述べたように、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子は５個のエクソンを含有する。変異を修正して、不活性のＡＡＴタンパク質を回復させるために、５個のエクソンまたはその近傍のイントロンのうち任意の１つ以上が修復され得る。あるいは、ＡＡＴＤに関連する様々な変異が存在し、これらは、ＡＡＴを不活性化させる共通の作用を有する、ミスセンス、なンセンス、フレームシフトおよび他の変異の組み合わせである。不活性のＡＡＴを回復させるために、変異のうち任意の１つ以上が修復され得る。例えば、以下の病的変異のうち１つ以上が修正され得る：ｒｓ７６４３２５６５５、ｒｓ１２１９１２７１３、ｒｓ２８９２９４７４、ｒｓ１７５８０、ｒｓ１２１９１２７１４、ｒｓ７６４２２０８９８、ｒｓ１９９４２２２１１、ｒｓ７５１２３５３２０、ｒｓ１９９４２２２１０、ｒｓ２６７６０６９５０、ｒｓ５５８１９８８０、ｒｓ２８９３１５７０（表１参照）。これらの変異体は、欠失、挿入、および一塩基多型を含む。さらなる代替として、ＳＥＲＰＩＮＡ１ｃＤＮＡまたはミニ遺伝子（天然のまたは合成のエンハンサーおよびプロモーター、１つ以上のエクソンおよび天然のまたは合成のイントロン、並びに天然のまたは合成の３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナル）が、対応する遺伝子の遺伝子座にノックインされてもよく、あるいは、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、および／またはＴＲなどのセーフハーバー部位にノックインされてもよい。セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１−２、ＡＬＢのエクソン１−２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１−２、ＡｐｏＣ３のエクソン１−２、ＡＳＧＲ２のエクソン１−２、ＣＣＲ５のエクソン１−２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１−２、Ｇ６ＰＣのエクソン１−２、Ｇｙｓ２のエクソン１−２、ＨＧＤのエクソン１−２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１−２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１−２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１−２、ＴＦのエクソン１−２，およびＴＴＲのエクソン１−２からなる群から選択することができる。いくつかの態様において、本方法は、ポリヌクレオチドドナー鋳型由来の新規配列を組み込んで、１つ以上の変異を修正するか、あるいは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはｃＤＮＡ全体の一部をノックインすることを容易にするために用いることができる、１つのｇＲＮＡまたは一対のｇＲＮＡを提供する。
【表１】
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【０３５９】
本方法のいくつかの態様は、遺伝子を２回切断することにより欠失を生じさせるｇＲＮＡペアを提供し、一方のｇＲＮＡ切断は１つ以上の変異の５’末端で生じ、他方のｇＲＮＡ切断は１つ以上の変異の３’末端で生じ、これにより、ポリヌクレオチドドナー鋳型からの新しい配列の挿入を促進させて１つ以上の変異を置換するか、あるいは、欠失は、変異アミノ酸またはそれに隣接するアミノ酸（例えば、未成熟終止コドン）を除外して、機能タンパク質の発現を導くか、もしくは、オープンリーディングフレームを回復させてもよい。切断は、ゲノム上にＤＳＢをそれぞれ生じる一対のＤＮＡエンドヌクレアーゼによって、あるいは、ゲノム上にＤＳＢを共に生じる複数のニッカーゼによって、達成され得る。
【０３６０】
あるいは、本方法のいくつかの態様は、１つ以上の変異の周辺に１つの２本鎖切断を生じる１つのｇＲＮＡを提供し、これにより、ポリヌクレオチドドナー鋳型からの新しい配列の挿入を促進させて１つ以上の変異を置換する。２本鎖切断は、単一のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、または、共にゲノム上にＤＳＢを生じる複数ニッカーゼにより生じてよく、あるいは、単一のｇＲＮＡは、欠失を導き（ＭＭＥＪ）、変異アミノ酸（例えば、未成熟終止コドン）を除外して、機能タンパク質の発現を導くか、もしくは、オープンリーディングフレームを回復させてもよい。
【０３６１】
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の例示的な改変には、例えば特定の変異の３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満上流、または下流の領域内などの、上述した変異の内部または近傍（近位の）の置換を含む。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異のバリエーションが比較的広範囲にわたる場合、上述の置換の多数のバリエーション（より大きい欠損およびより小さい欠損を含むが、これらに限定されない）によりＡＡＴタンパク質活性の回復が生じることが期待されることは、理解されるであろう。
【０３６２】
これらの変異体は、問題の特定の変異よりも、５’および／もしくは３’方向に大きい、または、いずれかの方向に小さい置換を含む。従って、特定の置換に関して「近傍」または「近位の」とは、所望の置換の境界（本明細書ではまたエンドポイントと呼ぶ）に関連するＳＳＢまたはＤＳＢ遺伝子座が、注目した参照遺伝子座から、約３ｋｂ未満である領域内であり得ることを意図している。いくつかの態様において、ＤＳＢ遺伝子座は、より近位であり、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、または０．１ｋｂ以内である。小さな置換の場合、所望のエンドポイントは、参照遺伝子座に、またはそれに「隣接して」存在し、これは、エンドポイントが参照遺伝子座から１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、または約１０ｂｐ〜５ｂｐ未満に存在することを意図している。
【０３６３】
より大きなまたはより小さな置換を含む態様は、ＡＡＴタンパク質活性が回復する限り、同一の利益を提供することが期待される。従って、本明細書に記載および例示される置換の多くのバリエーションが、ＡＡＴＤを寛解させるために有効であることが期待される。
【０３６４】
別のゲノム工学戦略には、エクソン欠失が包含される。特定のエクソンの標的欠失は、単一の治療用カクテルで、大きなサブセットの患者を治療するには、魅力的な戦略である。欠失は、単一のエクソン欠失、あるいは、複数のエクソン欠失のいずれかであり得る。複数のエクソン欠失は、大多数の患者に有効であり得るが、欠失が大きい場合、欠失の大きさが大きいほど、欠失の効率は大幅に下がる。従って、欠失は、４０〜１０，０００塩基対（ｂｐ）の大きさの範囲であり得る。例えば、欠失は、４０〜１００；１００〜３００；３００〜５００；５００〜１，０００；１，０００〜２，０００；２，０００〜３，０００；３，０００〜５，０００；または５，０００〜１０，０００塩基対の大きさの範囲であってよい。
【０３６５】
欠失は、遺伝子発現の発現増加につながるエンハンサー、プロモーター、第一イントロン、および／または３’ＵＴＲにおいて、並びに／または調節エレメントの欠失を介して起こり得る。
【０３６６】
既に述べたように、ＡＡＴ遺伝子は５つのエクソンを含有する。５つのエクソンのうち任意の１つ以上、または、異常なイントロンのスプライスアクセプター部位もしくはスプライスドナー部位を、ＡＡＴ読み枠を回復させるために、欠失させてよい。いくつかの態様において、本方法は、エクソン１、２、３、４、または５、またはこれらの任意の組み合わせを欠失させるために用いることができるｇＲＮＡペアを提供する。
【０３６７】
エクソン欠失に引き続き、プレｍＲＮＡが適切にプロセシングされることを保証するために、周辺のスプライシングシグナルを欠失させることができる。スプライシングドナーおよびアクセプターは、一般的に、隣接するイントロンの１００塩基対内に存在する。従って、いくつかの例において、本方法は、目的のエクソン／イントロン結合部のそれぞれに関して、およそ＋／−１００〜３１００ｂｐを切断する全てのｇＲＮＡを提供することができる。
【０３６８】
いずれのゲノム編集戦略に対しても、遺伝子編集は、配列決定またはＰＣＲ解析により、確認することができる。
【０３６９】
標的配列の選択
【０３７０】
本明細書でさらに説明および図示されているように、特定の参照遺伝子座と比較した、５’境界および／または３’境界の位置のシフトは、遺伝子編集のために選択されたエンドヌクレアーゼシステムに部分的に依存する、遺伝子編集の特定の適用を容易にするか、または増強するために使用される。
【０３７１】
これらの標的配列の選択の第一の、非限定的な例として、多くのエンドヌクレアーゼシステムは、例えばＣＲＩＳＰＲ  ＴｙｐｅＩＩまたはＴｙｐｅＶエンドヌクレアーゼの場合、ＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置におけるＰＡＭ配列モチーフを必要とするなど、切断の潜在的な標的部位の最初の選択を導く規則または基準を有する。
【０３７２】
標的配列の選択または最適化の別の非限定的な例として、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼとの特定の組み合わせに対する「オフターゲット」活性の頻度（すなわち、選択した標的配列以外の部位で生じるＤＳＢの頻度）を、オンターゲット活性の頻度と比較して評価する。ある場合において、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、他の細胞と比較して、選択上の利点を有し得る。例示的であるが非限定的な選択上の利点の例としては、複製速度、持続性、特定の条件に対する耐性、患者への導入後のインビボでの成功した生着または持続性の割合の上昇などの属性の獲得、またはそれらの細胞の維持、または数または生存率の増加に関連する他の属性の獲得が含まれる。他の場合において、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、正しく編集された細胞を同定、ソート、または選択するために用いられる１つ以上のスクリーニング方法で正の選択を受けることができる。選択上の利点の方法および方向を持った選択の方法は共に、修正に関連する表現型を利用してよい。いくつかの態様において、細胞は、対象とする細胞集団を選択または純化するために用いられる新しい表現型を作製する第二の改変を作製するために、２回以上編集されてもよい。この第二の改変は、選択可能な、またはスクリーニング可能なマーカーのために、第二のｇＲＮＡを加えることにより、作製することができる。ある場合において、細胞は、ｃＤＮＡおよび選択マーカーもまた含有するＤＮＡフラグメントを用いて、所望の遺伝子座で正しく編集することができる。
【０３７３】
任意の選択上の利点が適用可能であろうと、任意の方向を持った選択が特定の場合に適用されようと、標的配列の選択はまた、適用の有効性を増強するために、および／または、所望の標的以外の部位での、望まない変更の可能性を減らすために、オフターゲットの頻度を考慮することにより導かれる。本明細書および当業界でさらに記載され、例示されるように、オフターゲット活性の出現は、標的部位と様々な非標的部位との間の類似点および相違点、並びに用いられる特定のエンドヌクレアーゼを含む多くのファクターによって影響を受ける。オフターゲット活性の予測において、手助けとなるバイオインフォマティクスツールが利用可能であり、しばしばこれらのツールはまた、オフターゲット活性の可能性が最も高い部位を特定するために用いることができ、これらの部位はその後、オンターゲット活性に対するオフターゲット活性の相対頻度を調べる実験的な条件で評価することができ、それにより、より高い相対的オンターゲット活性を有する配列を選択できる。これらの技術の例示的な例が本明細書において提供され、他の例は当業界で知られている。
【０３７４】
標的配列の選択の別の局面は、相同組換え現象に関する。相同領域を有する配列は、介在配列の欠失をもたらす相同的組換え現象の中心として働くことができる。これらの組換え現象は、染色体および他のＤＮＡ配列の正常な複製プロセスの間に、および、ＤＮＡ配列が合成されている他の時（例えば、正常な細胞複製周期における定型的な塩基上で起こる２本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合）にも起こるが、様々な現象（ＵＶ光およびＤＮＡ切断の他の誘導因子）の出現、または特定の薬剤（種々の化学誘導因子など）の存在によっても増強され得る。これらの多くの誘導因子により、ＤＳＢがゲノム内で無差別に起こり、ＤＳＢは正常細胞において定期的に誘導および修復される。修復の間、元の配列は、完全な忠実度で再構築され得るが、ある場合において、小さな挿入または欠失（「インデル」と呼ばれる）が、ＤＳＢ部位に導入される。
【０３７５】
選択された染色体上の位置で、方向を持った、または、優先的な遺伝子改変現象を引き起こすために使用され得る、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼシステムの場合のように、特定の位置でＤＳＢを特異的に誘導することもできる。相同配列がＤＮＡ修復（および複製）に関連して組換えを受ける傾向は、多くの状況において利用され得、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集システムの１つの適用の基礎であり、ここで、相同組換え修復は、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用によって提供される目的の配列を、所望の染色体上の位置に挿入するために使用される。
【０３７６】
わずか１０塩基対以下を含み得る「マイクロホモロジー」の小領域であり得る、特定の配列間の相同領域も、所望の欠失をもたらすために使用することができる。例えば、単一のＤＳＢは、近傍の配列を有するマイクロホモロジーを示す部位に導入される。これらのＤＳＢの修復の通常のプロセスの間に、組換えがＤＳＢおよび付随する細胞修復プロセスによって促進される結果として、介在配列の欠失が、高い頻度で生じる。
【０３７７】
しかしながら、状況によっては、相同領域内での標的配列の選択はまた、（欠失がコード領域に存在する場合）遺伝子融合を含むはるかに大きな欠失を生じ得、これは特定の状況では望ましいかもしれないし、望ましくないかもしれない。
【０３７８】
本明細書で提供される実施例は、さらに、ＡＡＴタンパク質活性の回復を生じる置換を誘導するように設計されたＤＳＢを作製するための様々な標的領域の選択と、並びに、オンターゲット現象と比較したオフターゲット現象を最小限にするよう設計された標的領域内の特異的標的配列の選択とを例示する。
【０３７９】
核酸改変
【０３８０】
いくつかの態様において、本明細書にさらに記載され当業界に知られているように、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、個々に、または組み合わせて使うことできる１つ以上の改変であって、例えば、活性、安定性、もしくは特異性を増強させるための、送達を変更するための、ホスト細胞での自然免疫応答を減らすための、または、他の増強のための改変を含むことができる。
【０３８１】
特定の態様において、改変型ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで用いられ、その場合、細胞に導入されるガイドＲＮＡ（単分子ガイドもしくは二分子ガイドのいずれか）、および／または、ＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、以下に記載および例示されるように、改変することができる。これらの改変型ポリヌクレオチドは、任意の１つ以上のゲノム遺伝子座を編集するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムにおいて、用いることができる。
【０３８２】
これらの使用の非限定的な例示を目的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを用いる際に、ガイドＲＮＡ（単分子ガイドであっても二分子であってもよい）およびＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性の増強のために、ガイドＲＮＡの改変を用いることができる。ガイドＲＮＡの改変はまた、あるいは代わりに、ゲノム編集複合体と、ゲノム上の標的配列との相互作用の開始、安定性、または動態の増強のために、用いることができ、例えば、オンターゲット活性を増強するために、用いることができる。ガイドＲＮＡの改変はまた、あるいは代わりに、特異性、例えば他の（オフターゲット）部位での作用と比較した、オンターゲット部位でのゲノム編集の相対的割合を増強するために、用いることができる。
【０３８３】
改変はまた、あるいは代わりに、例えば、細胞に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対する耐性を増すことで、細胞における半減期の増大を引き起こすことにより、ガイドＲＮＡの安定性を増すために用いることができる。ガイドＲＮＡの半減期を増強する改変は、エンドヌクレアーゼを産生するために翻訳される必要があるＲＮＡを介して、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが編集される細胞に導入される態様において特に有用であり得る。なぜなら、エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されたガードＲＮＡの半減期を長くすることにより、ガードＲＮＡとコードされたＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが細胞内に共存する時間を増加させることができるからである。
【０３８４】
改変はまた、あるいは代わりに、細胞に導入されたＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性または程度を減らすために、用いることができる。これらの応答は、下記および当業界で記載されるように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関連してよく特徴づけられているが、ＲＮＡの半減期の減少、および／または、サイトカインまたは免疫応答に関連する他のファクターの誘発に関連する傾向がある。
【０３８５】
１つ以上のタイプの改変はまた、細胞に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに対して行うことができ、ＲＮＡの安定性を増強する改変（例えば、細胞に存在するＲＮＡｓｅによる分解への耐性を増すことによる）、得られた産物（すなわちエンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強する改変、および／または細胞に導入されたＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性または程度を減らす改変を含むが、これらに限定されない。
【０３８６】
前述および他のものなどの、改変の組み合わせは、同様に用いることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合において、１つ以上のタイプの改変を、ガイドＲＮＡ（上記に例示したものを含む）に対して行うことができ、および／または、１つ以上のタイプの改変を、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上記に例示したものを含む）に対して行うことができる。
【０３８７】
実例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで用いられるガイドＲＮＡ、あるいは、他のより小さなＲＮＡは、以下に例示され当業界で記載されるように、化学的手段により容易に合成することができ、それにより、多くの改変を容易に組み込むことができる。化学合成手順は絶えず発展しているが、これらのＲＮＡの高速液体クロマトグラフィー（ＰＡＧＥなどのゲルを使用しない、ＨＰＬＣ）などの手順による精製は、ポリヌクレオチドの長さがおよそ１００ヌクレオチドを有意に超えて増加するにつれて、より困難になる傾向がある。より長い化学改変型ＲＮＡを産生するために用いられる１つの手法は、共に連結する２つ以上の分子を生産することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなどの、はるかに長いＲＮＡは、酵素的により容易に生産される。酵素的に生産されたＲＮＡには、一般的に利用可能な改変のタイプはより少ないが、下記および当業界でさらに記載されるように、例えば、安定性を増強するため、自然免疫応答の可能性または程度を減少させるため、および／または他の特性を増強させるために用いることができる改変が依然として存在し、また、新しいタイプの改変が定期的に開発されている。
【０３８８】
様々なタイプの改変の実例として、特により小さな化学合成ＲＮＡでしばしば用いられるが、改変は糖の第２位で改変された１つ以上のヌクレオチドを含み得、いくつかの態様において２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ改変ヌクレオチドである。いくつかの態様において、ＲＮＡ改変は、ピリミジンのリボースにおける２’−フルオロ、２’−アミノまたは２’Ｏ−メチル改変、脱塩基の残基、またはＲＮＡの３’末端での逆位の塩基を含む。これらの改変はルーチン的にオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して、２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。
【０３８９】
多くのヌクレオチドおよびヌクレオシド改変により、それらが組み込まれたオリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ消化に対して天然のオリゴヌクレオチドよりも、より耐性をもつことが示されている；これらの改変オリゴは、非改変オリゴヌクレオチドよりも長時間、無傷で生き残る。改変オリゴヌクレオチドの特定の例には、改変骨格を含むもの、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または、短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間結合が含まれる。いくつかのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチドであり、特にＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格、ここで天然のホスホジエステル骨格はＯ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨと表す；アミド骨格［De Mesmaeker et al., Ace. Chem. Res., 28:366-374 (1995) 参照］；モルフォリノ骨格構造（Summerton and Weller, 米国特許第５，０３４，５０６号参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここでオリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置換され、ヌクレオチドはポリアミド骨格のアザ窒素原子に、直接または間接に結合している、Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497参照）である。リン含有結合には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、および逆極性を有するものが含まれるが、これらに限定されず、ここで、隣接するヌクレオシドユニットの対は、３’−５’から５’−３’、または２’−５’から５’−２’に連結している；米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；および第５，６２５，０５０号を参照されたい。
【０３９０】
モルフォリノベースのオリゴマー化合物が、Braasch and David Corey, Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002);Genesis, Volume 30, Issue 3, (2001); Heasman, Dev. Biol., 243: 209-214 (2002); Nasevicius et al., Nat.Genet., 26:216-220 (2000); Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9591-9596 (2000); および１９９１年７月２３日発行の米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。
【０３９１】
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド類似体が、Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 122: 8595-8602 (2000) に記載されている。
【０３９２】
リン原子を含まない改変オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルまたはシクロアルキルの混合ヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらは、モルフォリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合したＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有する他の骨格を有するものを含む；米国特許第５，０３４，５０６号；５，１６６，３１５号；５，１８５，４４４号；５，２１４，１３４号；５，２１６，１４１号；５，２３５，０３３号；５，２６４，５６２号；５，２６４，５６４号；５，４０５，９３８号；５，４３４，２５７号；５，４６６，６７７号；５，４７０，９６７号；５，４８９，６７７号；５，５４１，３０７号；５，５６１，２２５号；５，５９６，０８６号；５，６０２，２４０号；５，６１０，２８９号；５，６０２，２４０号；５，６０８，０４６号；５，６１０，２８９号；５，６１８，７０４号；５，６２３，０７０号；５，６６３，３１２号；５，６３３，３６０号；５，６７７，４３７号；および５，６７７，４３９号（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０３９３】
１つ以上の置換された糖部分が含まれていてもよく、例えば、２’位に以下のうち１つが含まれていてもよい：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３  ＯＣＨ３、ＯＣＨ３  Ｏ（ＣＨ２）ｎ  ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ  ＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎ  ＣＨ３であり、ここでｎは１〜約１０であり；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリルまたはアラルキルであり；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキルであり；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニルであり；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２  ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基である。いくつかの態様において、改変は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）を含む（Martin et al, HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486）。他の改変には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２  ＣＨ２ＣＨ３）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位で同様の改変を行うこともできる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖類似体を有していてもよい。
【０３９４】
いくつかの態様において、ヌクレオチド単位の糖結合およびヌクレオシド間結合（すなわち、主鎖）の両方が新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。これらのオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド類自体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、骨格を含むアミノ酸で置換されている（例えば、アミノエチルグリシン骨格）。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Nielsen et al, Science, 254: 1497-1500 (1991)に見ることができる。
【０３９５】
ガイドＲＮＡはまた、核酸塩基（しばしば当業界では単に「塩基」と呼ばれる）の改変または置換を、さらに含むか、または、代替として含むことができる。本明細書中で使用される場合、「非改変」または「天然」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。改変核酸塩基には、天然の核酸においてまれにまたは一時的にしか見出されない核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’−デオキシシトシンとも呼ばれ、しばしば当業界で５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれる）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビオシル（ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｙｌ）ＨＭＣなどが含まれ、並びに、合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２―（メチルアミノ）アデニン、２―（イミダゾリルアルキル）アデニン、２―（アミノアルキルアミノ（ａｍｉｎｏａｌｋｌｙａｍｉｎｏ））アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２―チオウラシル、２―チオチミン、５―ブロモウラシル、５―ヒドロキシメチルウラシル、８―アザグアニン、７―デアザグアニン、Ｎ６（６―アミノヘキシル）アデニン、および２、６―ジアミノプリンが含まれる。Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp75-77 (1980); Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res. 15:4513 (1997)を参照のこと。当業界で知られる「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンも含められ得る。５―Ｍｅ―Ｃ置換は、核酸デュプレックスの安定性を０．６〜１．２℃高めることが示されており（Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、塩基置換の態様である。
【０３９６】
改変核酸塩基には、他の合成および天然の核酸塩基（例えば、５―メチルシトシン（５―ｍｅ―Ｃ）、５―ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２―アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６―メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２―プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２―チオウラシル、２―チオチミンおよび２―チオシトシン、５―ハロウラシルおよび５―ハロシトシン、５―プロピニルウラシルおよび５―プロピニルシトシン、６―アゾウラシル、６―アゾシトシンおよび６―アゾチミン、５―ウラシル（シュードウラシル）、４―チオウラシル、８―ハロアデニン、８―アミノアデニン、８―チオールアデニン、８―チオアルキルアデニン、８―ヒドロキシルアデニンおよび他の８―置換アデニン、８―ハログアニン、８―アミノグアニン、８―チオールグアニン、８―チオアルキルグアニン、８―ヒドロキシルグアニンおよび他の８―置換グアニン、５―ハロウラシル、特に、５―ブロモウラシル、５―トリフルオロメチルウラシルおよび他の５―置換ウラシル、５―ハロシトシン、特に、５―ブロモシトシン、５―トリフルオロメチルシトシンおよび他の５―置換シトシン、７―メチルグアニン（ｍｅｔｈｙｌｑｕａｎｉｎｅ）および７―メチルアデニン、８―アザグアニンおよび８―アザアデニン、７―デアザグアニンおよび７―デアザアデニンならびに３―デアザグアニンおよび３―デアザアデニンが含まれる。
【０３９７】
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されたもの、‘The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering’, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990で開示されたもの、Englisch et al., Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, page 613で開示されたもの、および、Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications’, pages 289- 302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993で開示されたものを含む。これらの核酸塩基のいくつかは、特に、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増すのに有用である。これらには、２―アミノプロピルアデニン、５―プロピニルウラシルおよび５―プロピニルシトシンを含む、５―置換ピリミジン、６―アザピリミジンならびにＮ―２、Ｎ―６および０―６置換プリンが含まれる。５―メチルシトシン置換は、核酸デュプレックスの安定性を０．６〜１．２℃高めることが示されており（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds, ‘Antisense Research and Applications’, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、より詳細には２’―Ｏ―メトキシエチル糖改変と組み合わされるときの、塩基置換の態様である。改変核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、並びに第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６８１，９４１号；第５，７５０，６９２号；第５，７６３，５８８号；第５，８３０，６５３号；第６，００５，０９６号；および米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号に記載されている。
【０３９８】
従って、「改変」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡとエンドヌクレアーゼの両方に組み込まれた、非天然の糖、リン酸、または塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチドの全ての位置が、一様に改変される必要はないが、実際、上述の複数の改変が、単一オリゴヌクレオチド、または、オリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにも、組み込まれ得る。
【０３９９】
いくつかの態様において、ガイドＲＮＡおよび／またはエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（あるいはＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、または細胞内への取り込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲートに化学的に連結している。これらの部分には、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556 (1989)）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 4: 1053-1060 (1994)）、チオエーテル、例えば、ヘキシル―Ｓ―トリチルチオール（Manoharan et al, Ann. N. Y. Acad. Sci., 660: 306-309 (1992) and Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 3: 2765-2770 (1993)）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 20: 533-538 (1992)）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Kabanov et al., FEBS Lett., 259: 327-330 (1990) and Svinarchuk et al., Biochimie, 75: 49- 54 (1993)）、リン脂質、例えば、ジ―ヘキサデシル―ｒａｃ―グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２―ジ―Ｏ―ヘキサデシル―ｒａｃ―グリセロ―３―Ｈ―ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995) and Shea et al., Nucl. Acids Res., 18: 3777-3783 (1990)）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Mancharan et al., ヌクレオシドs & ヌクレオチドs, 14: 969-973 (1995)）、アダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995)）、パルミチル部分（(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1264: 229-237 (1995)）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ―カルボニル―ｔオキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277: 923-937 (1996)）が含まれるが、これらに限定されない。米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７，５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１，５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３，５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号および第５，６８８，９４１号もまた、参照されたい。
【０４００】
糖および他の部分は、タンパク質、および、陽イオン性のポリソームおよびリポソームなどの、ヌクレオチドを含む複合体を、特定の部位に向かわせるために用いられ得る。例えば、幹細胞が指示する移送は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を介して媒介され得る：例えば、Hu, et al., Protein Pept Lett. 21(10):1025-30 (2014)を参照されたい。当業界で知られ、定期的に開発される他のシステムは、本願で用いられる生体分子および／またはその複合体を、目的の特定の標的細胞に向かわせるために、用いられ得る。
【０４０１】
これらの標的部分またはコンジュゲートは、第１級または第２級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。本発明のコンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態特性を高める基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。本発明の文脈において、薬力学的特性を増強する基には、取り込みを改善し、分解に対する耐性を増強し、および/または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本発明の文脈において、薬物動態特性を増強する基には、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝または排泄を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基が、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６、および米国特許第６，２８７，８６０号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。コンジュゲート部分には、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル-5-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７，５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１，５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３，５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６��７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号および第５，６８８，９４１号を参照されたい。
【０４０２】
化学合成の影響を受けにくく、通常酵素合成により生産される、より長いポリヌクレオチドはまた、様々な手段で改変することができる。これらの改変には、例えば、いくつかのヌクレオチドアナログの導入、分子の５’または３’末端での特定の配列または他の部分の組み込み、およびその他の改変が含まれ得る。実例として、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、およそ４ｋｂの長さであり、インビトロ転写により合成することができる。例えば、ｍＲＮＡに対する改変は、（例えば、細胞での分解への耐性を増すことにより）翻訳または安定性を増すために、あるいは、外因性ＲＮＡ、特にＣａｓ９をコードするようなより長いＲＮＡの導入後に細胞でしばしば観察される自然免疫応答を、ＲＮＡが誘発する傾向を減らすために、適用され得る。
【０４０３】
多数のこれらの改変は、当業界で記載されており、例えば、ポリＡテイル、５’キャップアナログ（例えば、Ａｎｔｉ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）またはｍ７Ｇ（５’ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、改変された５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、改変された塩基の使用（シュード−ＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）またはＮ６−Ｍｅｔｈｙｌ−ＡＴＰなど）、または５’末端リン酸を除去するためのホスファターゼ処理が挙げられる。これらおよび他の改変は当業界で知られており、ＲＮＡの新しい改変は、定期的に開発されている。
【０４０４】
莫大な数の、改変型ＲＮＡの商業的供給元が存在し、例えば、TriLink Biotech, AxoLabs, Bio-Synthesis Inc., Dharmaconおよびその他の多くを含む。例えば、TriLinkにより記載されている通り、５−メチル−ＣＴＰは、ヌクレアーゼ安定性の増加、翻訳の増加、または自然免疫受容体とインビトロ転写ＲＮＡとの相互作用の減少などの、所望の特性を与えるために、用いることができる。Kormann et al.により刊行物で例示され、Warren et al.が以下で言及しているように、５−メチルシチジン−５’三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−Ｍｅｔｈｙｌ−ＡＴＰ、並びにシュード−ＵＴＰおよび２−チオ−ＵＴＰもまた、自然免疫刺激を減らす一方、翻訳を増強すること示されている
【０４０５】
インビボで送達される化学的に改変されたｍＲＮＡは、治療効果の改善を達成するために用いることができることが示されている；例えば、Kormann et al., Nature Biotechnology 29, 154-157 (2011)を参照されたい。これらの改変は、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増し、および／または、その免疫原性を低減させるために、用いることができる。シュード−Ｕ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕおよび５−メチル−Ｃなどの化学的改変を用いることで、マウスにおいて、ウリジンおよびシチジン残基のちょうど４分の１が、それぞれ２−チオ−Ｕおよび５−メチル−Ｃに置換され、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が媒介するｍＲＮＡの認識の顕著な減少をもたらすことが見出された。これらの改変は、自然免疫システムの活性化を低減させることによってインビボでのｍＲＮＡの安定性および寿命を効果的に増加させるために、用いることができる；例えば、上記のKormann et al.を参照されたい。
【０４０６】
自然の抗ウイルス応答を迂回するように設計された改変を組み込んだ合成メッセンジャーＲＮＡは、分化したヒト細胞を、多能性への再プログラムすることができることもまた、示されている。例えば、Warren, et al., Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010)を参照されたい。主要な再プログラムタンパク質として働く、これらの改変ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞タイプを再プログラムする、有効な手段であり得る。これらの細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれ、５−メチル−ＣＴＰ、シュード−ＵＴＰおよびＡｎｔｉ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）を組み込んだ酵素合成されたＲＮＡを、効果的に細胞の抗ウイルス応答を逃れるために用いることができることが発見された；例えば、上述のWarren et al.を参照されたい。
【０４０７】
当業界で記載されるポリヌクレオチドの他の改変には、例えば、ポリＡテイルの使用、５’キャップアナログ（例えばｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））の付加、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、または５’末端リン酸を除去するためのホスファターゼによる処理が含まれ、新しいアプローチが定期的に開発されている。
【０４０８】
本明細書で用いられる改変型ＲＮＡの産生に適用可能な多くの組成物および技術が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の改変に関連して開発されている。ｍＲＮＡ干渉を介した遺伝子サイレンシングに対するそれらの影響は、一般的に一過性であり、反復投与を必要とするため、ｓｉＲＮＡは、インビボで特定の課題を提示している。さらに、ｓｉＲＮＡは２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳動物細胞は、しばしばウイルス感染の副産物であるｄｓＲＮＡを検出して中和するよう進化した免疫応答を有する。従って、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介することができる、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−応答性キナーゼ）、および潜在的なレチオニン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）などの哺乳動物の酵素、並びに、これらの分子に応答してサイトカイン誘導の引き金を引くＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８など）が存在する。例えば、Angart et al., Pharmaceuticals (Basel) 6(4): 440-468 (2013); Kanasty et al., Molecular Therapy 20(3): 513-524 (2012); Burnett et al., Biotechnol J. 6(9):1130-46 (2011); Judge and MacLachlan, Hum Gene Ther 19(2):111-24 (2008)によるレビュー;およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。
【０４０９】
本明細書に記載されるように、ＲＮＡ安定性の増強、自然免疫応答の減少、および／またはヒト細胞へのポリヌクレオチドの導入と関連して役立ち得る他の利益の達成ために、多種多様な改変が、開発され適用されている。例えば、Whitehead KA et al., Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering, 2: 77-96 (2011); Gaglione and Messere, Mini Rev Med Chem, 10(7):578-95 (2010); Chernolovskaya et al, Curr Opin Mol Ther., 12(2):158-67 (2010); Deleavey et al., Curr Protoc Nucleic Acid Chem Chapter 16: Unit 16.3 (2009); Behlke, Oligonucleotides 18(4):305-19 (2008); Fucini et al., Nucleic Acid Ther 22(3): 205-210 (2012); Bremsen et al., Front Genet 3:154 (2012) によるレビューを参照されたい。
【０４１０】
上述のように、改変型ＲＮＡの多くの商業的供給元が存在し、これらの多くは、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計した改変を専門としている。様々な手法が、文献で報告された様々な発見に基づき、提案されている。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社は、Kole, Nature Reviews Drug Discovery 11:125-140 (2012)により報告されているように、非架橋酸素の硫黄による置換（ホスホロチオエート、ＰＳ）が、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するために、広く使われていると述べている。リボースの第２位の改変は、デュプレックス安定性（Ｔｍ）を増しながら、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善させることが報告されており、免疫活性化からの保護を提供することもまた示されている。Soutschek et al. Nature 432:173-178 (2004) により報告されているように、中程度のＰＳ骨格改変と、小さな、よく許容される２’置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）との組み合わせは、インビボに適用される高度に安定なｓｉＲＮＡと関連している；また、Volkov, Oligonucleotides 19:191-202 (2009) により報告されているように、２’−Ｏ−メチル改変は安定性を改善する上で有効であることが報告されている。自然免疫応答の融合を減少させることに関して、特定の配列を２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロで改変することは、一般的にサイレンシング活性を保ちながら、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を低減させることが報告されている；例えば、Judge et al., Mol. Ther. 13:494-505 (2006); およびCekaite et al., J. Mol. Biol. 365:90-108 (2007) を参照されたい。２−チオウラシル、シュードウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、およびＮ６−メチルアデノシンなどのさらなる改変もまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８により媒介される免疫効果を最小限にすることが示されている：例えば、Kariko, K. et al., Immunity 23:165-175 (2005)を参照されたい。
【０４１１】
当業界においても知られ市販されている、多くのコンジュゲートは、ＲＮＡなどの、本明細書で用いられるポリヌクレオチドに適用することができ、それらの送達および／または細胞による取り込みを増強することができる。これらのコンジュゲートは、例えば、コレステロール、トコフェロールおよび葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカーおよびアプタマーを含む；例えば、Winkler, Ther. Deliv. 4:791-809によるレビューおよびそれに引用されている参考文献を参照されたい。
【０４１２】
コドン最適化
【０４１３】
部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的の標的ＤＮＡを含有する細胞において発現させるために、当業界で標準的な方法に従い、コドン最適化される。例えば、目的の標的核酸がヒト細胞内にある場合、Ｃａｓ９をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９ポリヌクレオチドの生産のために用いられることが企図される。
【０４１４】
ゲノムを標的とする核酸と、部位特異的ポリペプチドとの複合体
【０４１５】
ゲノムを標的とする核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９などの核酸ガイドヌクレアーゼ）と相互作用し、それにより複合体を形成する。ゲノムを標的とする核酸は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸へと導く。
【０４１６】
ＲＮＰ
【０４１７】
既に述べたように、部位特異的ポリペプチドとゲノムを標的とする核酸とは、それぞれ、細胞または患者に、別々に投与されてよい。一方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、または、１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡを伴うｃｒＲＮＡと、予め複合化されていてよい。予め複合化された物質は、次に、細胞または患者に投与されてよい。該予め複合化された物質は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られる。
【０４１８】
システム構成成分をコードする核酸
【０４１９】
別の局面において、本開示は、本開示のゲノムを標的とする核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実行するのに必要な任意の核酸またはタンパク質性分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【０４２０】
いくつかの態様において、本開示のゲノムを標的とする核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実行するのに必要な任意の核酸またはタンパク質性分子をコード掏る核酸は、ベクターを含む（例えば、組換え発現ベクター）。
【０４２１】
「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を移送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、さらなる核酸セグメントが連結され得る環状２本鎖ＤＮＡループのことを指す。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、ここではさらなる核酸セグメントがウイルスゲノムに連結され得る。いつくかのベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよび、エピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）は、宿主細胞のゲノムに、宿主細胞への導入の際に組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。
【０４２２】
いくつかの態様において、ベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。これらのベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」、あるいはさらに単純に「発現ベクター」と呼ばれ、同等の機能を果たす。
【０４２３】
「作動可能に連結した」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現を可能にするように、制御配列と連結していることを意味する。「制御配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図されている。これらの制御配列は、当業界でよく知られ、記載されており、例えばGoeddel;Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)において記載されている。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞において、ヌクレオチド配列の恒常的な発現を指示するもの、および、ある種の宿主細胞においてのみ、ヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば組織特異的制御配列）を含む。発現ベクターの設計は、標的細胞の選択、所望の発現レベルなどのファクターに依存し得ることは、当業者に理解されるであろう。
【０４２４】
企図される発現ベクターには、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓ）、および乳癌ウイルス（ｍａｍｍａｒｙｔｕｍｏｒｖｉｒｕｓ）など）のウイルスベクター、および、他の組換えベクターが含まれるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞に対して企図される他のベクターには、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞に対して企図されるさらなるベクターには、ベクターｐＣＴｘ−１、ｐＣＴｘ−２、およびｐＣＴｘ−３（図１Ａ〜１Ｃに記載されている）が含まれるが、これらに限定されない。他のベクターは、宿主細胞に適合する限り、使用されてよい。
【０４２５】
いくつかの態様において、ベクターは、１つ以上の転写および／または翻訳調節エレメントを含む。利用するホスト／ベクターシステムに応じて、構成的および誘導型プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、多くの好適な転写および翻訳調節エレメントのいずれかが、発現ベクターにおいて用いられてよい。いくつかの態様において、ベクターは、ウイルス配列、または、ＣＲＩＳＰＲ機構の構成成分、または他のエレメントのいずれかを不活性化させる、自己不活性化ベクターである。
【０４２６】
好適な真核生物のプロモーター（すなわち、真核細胞において機能するプロモーター）の非限定的な例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の末端反復配列（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子１プロモーター（ＥＦ１）、トリβアクチンプロモーター（ＣＡＧ）と融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネイン−Ｉ由来のプロモーターが含まれる。
【０４２７】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して用いられるガイドＲＮＡを含む、低分子ＲＮＡを発現させるために、例えば、Ｕ６およびＨ１を含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの様々なプロモーターが、有利であり得る。これらのプロモーターの使用を増強させる記載およびパラメーターは、当業界で知られており、さらなる情報および手法が定期的に記載されている；例えば、Ma, H. et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids 3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12を参照されたい。
【０４２８】
発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および、転写ターミネーターを含有してよい。発現ベクターはまた、発現を増幅させるための適切な配列を含んでよい。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合して、その結果融合タンパク質を生じる非天然のタグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含んでよい。
【０４２９】
いくつかの態様において、プロモーターは、誘導型の（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲンレセプター調節プロモーターなど）である。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。いくつかの態様において、プロモーターは、空間的に制限されたプロモーターおよび／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的なプロモーター、細胞型特異的なプロモーターなど）である。
【０４３０】
いくつかの態様において、本開示のゲノムを標的とする核酸および／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞に送達するための送達媒体の内部、または表面にパッケージされる。企図される送達媒体には、ナノスフェア（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、ポリエチレングリコール粒子、ハイドロゲル、およびミセルが含まれるが、これらに限定されない。当業界で記載されるように、様々な標的部分が、これらの媒体と、所望の細胞型または位置との優先的な相互作用を増強するために、用いられ得る。
【０４３１】
本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の細胞への導入は、ウイルスにより起こるか、あるいは、バクテリオファージ感染、遺伝子導入、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介遺伝子導入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介遺伝子導入、リポソーム媒介遺伝子導入、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などにより起こり得る。
【０４３２】
送達
【０４３３】
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）および／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、当業界で知られている、ウイルス性または非ウイルス性の送達媒体で、送達され得る。あるいは、エンドヌクレアーゼポリペプチドは、エレクトロポレーションまたは脂質ナノ粒子などの、当業界で知られている非ウイルス性の送達媒体により、送達されてもよい。いくつかの態様において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のポリペプチドとして、単独で、あるいは、１つ以上のガイドＲＮＡと、もしくは、１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡを伴うｃｒＲＮＡと予め複合化されて、送達されてもよい。
【０４３４】
ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正電荷を持つペプチド、小分子ＲＮＡ−コンジュゲート、アプタマー−ＲＮＡキメラ、およびＲＮＡ−融合タンパク質複合体を含むが、これらに限定されない、非ウイルス性の送達媒体により、送達されてもよい。いくつかの体表的な非ウイルス性の送達媒体は、Peer and Lieberman, Gene Therapy, 18: 1127-1133 (2011) （本文献は、他のポリヌクレオチドにとっても有用であるｓｉＲＮＡのための非ウイルス性送達媒体に着目している）に記載されている。
【０４３５】
ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）により、細胞または患者に送達されてもよい。
【０４３６】
ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。あるいは、ナノ粒子は、１〜１０００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜２５０ｎｍ、２５〜２００ｎｍ、２５〜１００ｎｍ、３５〜７５ｎｍ、または２５〜６０ｎｍの範囲のサイズであってよい。
【０４３７】
ＬＮＰは、陽イオン性、陰イオン性、または中性の脂質から作られてよい。膜融合のリン脂質ＤＯＰＥまたは膜構成成分コレステロールなどの、中性の脂質は、遺伝子導入活性およびナノ粒子安定性を増強するために、「ヘルパー脂質」としてＬＮＰに含まれてよい。陽イオン性の脂質の欠点には、安定性に乏しいことと、クリアランスが速いことによる効率の低さ、並びに、炎症性または抗炎症性応答の産生が含まれる。
【０４３８】
ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性脂質と親水性脂質の両方で、構成されてもよい。
【０４３９】
当業界で知られている、任意の脂質または脂質の組み合わせが、ＬＮＰを生産するために用いられてよい。ＬＮＰを生産するために用いられる脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＴＡＰ−コレステロール、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ-ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ−ＤＯＰＥ−ＤＭＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。陽イオン脂質の例は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１である。中性の脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭである。ＰＥＧ修飾脂質の例は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、およびＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０である。
【０４４０】
脂質は、ＬＮＰを生産するために、任意のモル比で組み合わせてよい。さらに、ポリヌクレオチドは、ＬＮＰを生産するために、広範囲のモル比で脂質と組み合わせてよい。
【０４４１】
既に述べたように、部位特異的ポリペプチドおよびゲノムを標的とする核酸は、それぞれ、細胞または患者に、別々に投与されてよい。一方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、または、１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡを伴うｃｒＲＮＡと、予め複合化されていてよい。予め複合化された物質は、次に、細胞または患者に投与されてよい。該予め複合化された物質は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られる。
【０４４２】
ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡと、特異的な相互作用を形成することができる。該特性は、多くの生物学的プロセスで活用されているが、核酸リッチの細胞環境においては、乱雑な相互作用の危険性も伴う。この問題への１つの解決策は、ＲＮＡがエンドヌクレアーゼと予め複合化されている、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成である。ＲＮＰの別の利点は、ＲＮＡを分解から保護することである。
【０４４３】
ＲＮＰ内のエンドヌクレアーゼは、改変されていても、改変されていなくてもよい。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、改変されていても、改変されていなくてもよい。多数の改変が当業界で知られており、用いられ得る。
【０４４４】
エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡは、一般的に、１：１のモル比で組み合わせられる。あるいは、エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、一般的に、１：１：１のモル比で組み合わせられる。しかしながら、広範囲のモル比が、ＲＮＰの生産のために用いられてよい。
【０４４５】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、送達のために用いられてよい。送達されるポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むようにＡＡＶゲノムがパッケージされ、ヘルパーウイルス機能が細胞に提供されたｒＡＡＶ粒子を生産する技術は、当業界ではスタンダードである。ｒＡＡＶの生産は、以下の構成成分が単一の細胞（本明細書ではパッケージング細胞として示される）に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから離れた（すなわち、ｒＡＡＶゲノムに存在しない）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルス機能。ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換え体ウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってよく、また、ｒＡＡＶゲノム末端逆位配列（ＩＴＲ）とは異なるＡＡＶ血清型由来であってよく、これらのＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３およびＡＡＶｒｈ．７４を含むがこれらに限定されない。シュードタイプ化したｒＡＡＶは、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。表２を参照されたい。
【表２】
2018535691.tif 000004
【０４４６】
パッケージング細胞を産生する方法には、ＡＡＶ粒子生産に必要な全ての構成成分を安定的に発現する細胞株を作製することを包含する。例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いたｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから離れたＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、および、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを含む１個のプラスミド（または複数のプラスミド）を、細胞のゲノムに組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（ＧＣ  ｔａｉｌｉｎｇ）(Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081)、制限エンドヌクレアーゼ切断部を含有する合成リンカーの付与(Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73)などの手順、または直接の平滑末端のライゲーション（Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666）により、細菌のプラスミドに導入した。パッケージング細胞株はその後、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。本方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶのラージスケールでの生産に好適であることである。他の好適な方法の例では、プラスミドよりもアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。
【０４４７】
ｒＡＡＶ生産の一般的原理は、例えば、Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539;およびMuzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129に概説されている。様々な手法が、Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); および Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988)、Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); 米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８．７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; 米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。
【０４４８】
ＡＡＶベクター血清型は、標的細胞型に適合し得る。例えば、以下の代表的な細胞型は、とりわけ示されたＡＡＶ型によって形質導入され得る。
【表３】
2018535691.tif 000005
【０４４９】
アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターを用いることができる。これらのウイルスベクターには、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス，バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パポーバウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０４５０】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の１つまたは２つの座位を標的とするｓｇＲＮＡ、およびドナーＤＮＡは、それぞれ別々に脂質ナノ粒子に含まれているか、あるいは、全て共に１つの脂質ナノ粒子に含まれているか、あるいは、共に２つ以上の脂質ナノ粒子に含まれている。
【０４５１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子に含まれているが、ｓｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡはＡＡＶベクターで送達される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡは共に脂質ナノ粒子に含まれているが、ドナーＤＮＡはＡＡＶベクターで送達される。
【０４５２】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして、またはタンパク質として送達する選択肢が利用可能である。ガイドＲＮＡは同一のＤＮＡから発現することができ、あるいは、ＲＮＡとしてもまた送達することができる。ＲＮＡはその半減期を変更もしくは改善するために、または、免疫応答の可能性もしくは程度を減少させるために、化学的に改変することができる。エンドヌクレアーゼタンパク質は、送達に先立ち、ｇＲＮＡと複合体を形成することができる。ウイルスベクターは、効率的な送達を可能にする；ＨＤＲのドナーと同様に、Ｃａ９の分割バージョンおよびＣａｓ９のより小さなオーソログをＡＡＶにパーケージすることができる。これらの構成成分をそれぞれ送達できる種々の非ウイルス性の送達方法もまた存在し、あるいは、非ウイルス性の方法とウイルス性の方法とを、並行して用いることができる。例えば、ナノ粒子を、タンパク質およびガイドＲＮＡを送達するために用いることができ、一方でＡＡＶを、ドナーＤＮＡを送達するために用いることができる。
【０４５３】
エキソソーム
【０４５４】
エキソソームは、リン脂質二重層に囲まれた一種の微小胞であり、特定の組織に核酸を送達するために用いられ得る。体内の多くの異なるタイプの細胞が、エキソソームを天然に分泌している。エキソソームは、エンドソームが陥入して多胞性エンドソーム（ＭＶＥ）を形成する際に、細胞質内に形成される。ＭＶＥが細胞膜と融合すると、エキソソームは細胞外空間に分泌される。直径３０〜１２０ｎｍの範囲の大きさであるエキソソームは、細胞間コミュニケーションの形で、ある細胞から別の細胞へ様々な分子をやりとりすることができる。マスト細胞などの、天然にエキソソームを生産する細胞は、遺伝的に変化させて特定の組織を標的とする表面タンパク質を有するエキソソームを生産することができ、また、エキソソームは血流から単離することができる。特定の核酸は、エレクトロポレーションで、改変されたエキソソーム内に入れることができる。エキソソームは、全身に導入すると、核酸を特定の標的組織に送達することができる。
【０４５５】
遺伝的に改変された細胞
【０４５６】
「遺伝的に改変された細胞」という用語は、ゲノム編集により（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて）導入された、少なくとも１つの遺伝的改変を含む細胞を指す。本明細書のいくつかのエクスビボの態様において、遺伝的に改変された細胞は、遺伝的に改変された前駆細胞である。本明細書のいくつかのインビボの態様において、遺伝的に改変された細胞は、遺伝的に改変された肝細胞である。外因性のゲノムを標的とする核酸および／またはゲノムを標的とする核酸をコードする外因性核酸を含む、遺伝的に改変された細胞が、本明細書において企図される。
【０４５７】
「コントロール処理集団」という用語は、ゲノム編集構成成分の付与を除いて、同一の培地、ウイルス誘導、核酸配列、温度、培養密度、フラスコサイズ、ｐＨなどで処理された細胞集団を表す。例えば、ＡＡＴタンパク質のウェスタンブロット解析、あるいは、ＳＥＲＰＩＮＡ１  ｍＲＮＡの定量などの、当業界で知られる方法はいずれも、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはタンパク質の発現または活性の回復を測定するために用いることができる。 
【０４５８】
「単離した細胞」という用語は、元々発見された生物から取り出された細胞、またはその細胞の子孫を指す。場合により、該細胞はインビトロで、例えば、規定の条件で、あるいは、他の細胞の存在下で、培養されている。場合により、該細胞はその後第二の生物に導入されるか、あるいは、該細胞（あるいは、該細胞が由来する細胞）が単離された生物に再導入される。
【０４５９】
単離した細胞集団に関する「単離した集団」という用語は、混合の、または、不均一な細胞集団から、取り出して分離された細胞集団のことを指す。いくつかの態様において、単離した集団は、該細胞が単離または濃縮された不均一な集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団である。いくつかの態様において、単離した集団は、ヒト前駆細胞の単離した集団であり、例えば、ヒト前駆細胞および該ヒト前駆細胞が由来する細胞を含む、不均一な細胞集団と比較して、実質的に純粋なヒト前駆細胞の集団である。
【０４６０】
特定の細胞集団に関する「大幅に増強された」という用語は、特定の細胞型の出現が、既存または参照のレベルと比較して、例えば、ＡＡＴＤを寛解させるためのこれらの細胞の所望のレベルに応じて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９，少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍以上、増加している細胞集団を指す。
【０４６１】
特定の細胞集団に関する「実質的に濃縮された」という用語は、細胞集団全体を構成する細胞に関して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％以上である細胞集団を指す。
【０４６２】
特定の細胞集団に関する「実質的に濃縮された」または「実質的に純粋な」という用語は、細胞集団全体を構成する細胞に関して少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。すなわち、前駆細胞集団に関する「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」という用語は、本明細書において用語で規定された前駆細胞ではない細胞を、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または１％未満より少ない割合で含有する細胞集団を指す。
【０４６３】
ゲノム編集したｉＰＳＣの肝細胞への分化
【０４６４】
本発明のエクスビボ法の別のステップは、ゲノム編集したｉＰＳＣを肝細胞へ分化させることを包含する。分化ステップは、当業界で知られる任意の方法に従い行ってよい。例えば、ｈｉＰＳＣは、アクチビンおよびＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む様々な処理を用いて、胚体内胚葉に分化させる。胚体内胚葉はさらに、以下を含む処理を用いて、肝細胞に分化させる：ＦＧＦ４、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、オンコスタチンＭ、デキサメタゾンなど（Duan et al, STEM CELLS; 2010;28:674-686, Ma et al, STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE 2013;2:409-419 )。
【０４６５】
ゲノム編集した間葉系幹細胞の肝細胞への分化
【０４６６】
本発明のエクスビボ法の別のステップは、ゲノム編集した間葉系幹細胞を肝細胞へ分化させることを包含する。分化ステップは、当業界で知られる任意の方法に従い行ってよい。例えば、ｈＭＳＣは、インスリン、トランスフェリン、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、胆汁酸を含む、様々な因子およびホルモンで処理される(Sawitza I et al, Sci Rep. 2015; 5: 13320)。
【０４６７】
患者への細胞の移植
【０４６８】
本発明のエクスビボ法の別のステップは、患者への肝細胞の移植を包含する。本移植ステップは、当業界で知られる任意の移植方法を用いて達成されてよい。例えば、遺伝的に改変された細胞を患者の肝臓に直接注入してもよく、あるいは、患者に投与してもよい。
【０４６９】
本発明のエクスビボ法の別のステップは、患者への前駆細胞または初代肝細胞の移植を包含する。本移植ステップは、当業界で知られる任意の移植方法を用いて達成されてよい。例えば、遺伝的に改変された細胞を患者の肝臓に直接注入してもよく、あるいは、患者に投与してもよい。遺伝的に改変された細胞は、選択マーカーを用いてエクスビボで精製されてよい。
【０４７０】
医薬上許容される担体 
【０４７１】
本明細書で企図される、対象に前駆細胞を投与するエクスビボ法は、前駆細胞を含む治療用組成物の使用を包含する。
【０４７２】
治療用組成物は、細胞組成物と共に、および場合により、有効成分としてその中に溶解または分散された、本明細書に記載の少なくとも１つのさらなる生物活性剤とともに生理学的に許容される担体を含有する。いくつかの態様において、望まれない限り、治療用組成物は、治療目的で哺乳動物またはヒト患者に投与される場合、実質的に免疫原性ではない。
【０４７３】
一般的に、本明細書に記載される前駆細胞は、医薬上許容される担体との懸濁液として投与される。当業者であれば、細胞組成物で用いられる医薬上許容される担体は、緩衝剤、化合物、凍結保存剤、保存剤または他の薬剤を、対象に送達される細胞の生存率を実質的に阻害する量では含まないことを理解するであろう。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の完全性を維持できようにする浸透圧緩衝剤を含み得、また、投与の際の細胞の生存率を維持するか、あるいは生着を強化する栄養分を、場合により含み得る。これらの製剤および懸濁液は、当業者に知られており、かつ／または、本明細書に記載されるように、通例の実験法を用いて、前駆細胞との使用に適合させることができる。
【０４７４】
細胞組成物はまた、乳化手順が細胞生存率に悪影響を与えないならば、乳化させるか、あるいは、リポソーム組成物として提示することができる。細胞および他の任意の有効成分は、医薬上許容でき、かつ、有効成分と互換できる賦形剤と混合することができ、本明細書に記載の治療方法での使用に好適な量であり得る。
【０４７５】
細胞組成物に含まれるさらなる薬剤は、細胞組成物の構成成分の医薬上許容できる塩を含むことができる。医薬上許容できる塩は、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸など）で形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）を含む。遊離のカルボキシル基で形成された塩はまた、無機塩基（例えば、など）および有機塩基（など）に由来し得る。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩または水酸化第二鉄などの無機塩基、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【０４７６】
生理学的に許容される担体は、当業界でよく知られている。代表的な液体担体は、有効成分および水を含有するが、金属は含有しない滅菌水溶液、または、生理的ｐＨのリン酸ナトリウム、生理食塩水、またはその両方（例えばリン酸緩衝食塩水）などのバッファーを含有する。さらに、水性担体は、複数の緩衝塩、並びに、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、ブドウ糖、ポリエチレングリコールおよび他の溶質などの塩を含有し得る。液体組成物はまた、水に加えて、および、水を除いて、液相を含有し得る。これらのさらなる液相の代表的な液相は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水−油エマルションである。特定の疾患または症状の治療において有効な、細胞組成物で用いられる活性化合物の量は、疾患または症状の性質によるであろうし、標準的な臨床技術により決定することができる。
【０４７７】
投与および有効性
【０４７８】
「投与」、「導入」および「移植」という用語は、細胞の配置に関連して、互換的に用いられ、例えば、前駆細胞を、対象に、損傷または修復部位などの所望の部位での導入細胞の少なくとも部分的な局在を生じる方法または経路で、所望の効果が生まれるように、配置する場合に用いられる。細胞、例えば前駆細胞またはそれらの分化した子孫は、適切な任意の経路で投与することができ、それにより対象の所望の位置への送達を生じ、ここでは、少なくとも移植細胞の一部または該細胞の構成成分は、生存している。対象に投与した後の細胞の生存期間は、数時間もの短さであることができ、例えば、２４時間、数日まで、数年もの長さまで、あるいはさらに患者の一生（すなわち長期生着）であることができる。例えば、本明細書に記載されるいくつかの態様において、筋原性前駆細胞の有効量は、腹腔内または静脈内経路などの、全身の投与経路により、投与される。
【０４７９】
「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、診断、処理、または治療が望まれる任意の対象のことを指す。いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。いくつかの態様において、対象はヒトである。
【０４８０】
予防的に提供される場合、本明細書に記載の前駆細胞は、ＡＡＴＤの任意の症状に先立ち、例えば、肺気腫、気流閉塞、慢性気管支炎、または肝臓病の発症に先立ち、対象に投与することができる。従って、肝前駆細胞集団の予防的投与は、ＡＡＴＤの予防に役立つ。
【０４８１】
治療的に提供される場合、肝前駆細胞は、ＡＡＴＤの症状または徴候の発生時点（またはその後）、例えば肺の病気または肝臓病の発症時点で提供される。
【０４８２】
本明細書に記載されるいくつかの態様において、本明細書に記載の方法に従い投与される肝前駆細胞集団は、１つ以上のドナーから得られたアロジェニックな肝前駆細胞を含む。「アロジェニック」とは、１つ以上の座位において遺伝子が同一でない同じ種の１つ以上の異なるドナーから得た、肝前駆細胞、または肝前駆細胞を含む生体試料、または生体試料を指す。例えば、対象に投与される肝前駆細胞集団は、１つ以上の血縁でないドナー対象、または、１つ以上の非同一の同胞に由来し得る。いくつかの態様において、同一遺伝子の肝前駆細胞集団を用いることができ、例えば、遺伝的に同一の動物、または同一の双子から得られたものを用いることができる。他の態様において、肝前駆細胞は自家細胞である；すなわち、肝前駆細胞は、自家細胞である；すなわち、肝前駆細胞は対象から得られ、または、単離され、同じ対象に投与される、すなわち、ドナーとレシピエントが同一である。
【０４８３】
ある態様において、「有効量」という用語は、少なくとも１つ以上のＡＡＴＤの徴候または症状を予防または緩和するのに必要な、前駆細胞またはその子孫の集団の量のことを指し、例えば、ＡＡＴＤを有する対象を治療することなどの、所望の効果を提供するのに十分な組成物の量に関係する。「治療的に有効な量」という用語は、それゆえ、ＡＡＴＤを有するか、または、そのリスクがある対象などの、典型的な対象に投与された場合に特定の効果を促進するのに十分な、前駆細胞または前駆細胞を含む組成物の量を指す。有効量はまた、疾病の症状の発症を予防または遅延させるか、疾病の症状のプロセスを変える（限定されるものではないが、例えば、疾患の症状の進行を遅らせる）か、あるいは、疾病の症状を逆転させるのに十分な量を含むであろう。いかなる場合でも、適切な「有効量」は、当業者により、通例の実験を用いて決定され得ることは、理解される。
【０４８４】
本明細書に記載の様々な態様における使用のための、前駆細胞の有効量は、少なくとも１０２前駆細胞、少なくとも５×１０２前駆細胞、少なくとも１０３前駆細胞、少なくとも５×１０３前駆細胞、少なくとも１０４前駆細胞、少なくとも５×１０４前駆細胞、少なくとも１０５前駆細胞、少なくとも２×１０５前駆細胞、少なくとも３×１０５前駆細胞、少なくとも４×１０５前駆細胞、少なくとも５×１０５前駆細胞、少なくとも６×１０５前駆細胞、少なくとも７×１０５前駆細胞、少なくとも８×１０５前駆細胞、少なくとも９×１０５前駆細胞、少なくとも１×１０６前駆細胞、少なくとも２×１０６前駆細胞、少なくとも３×１０６前駆細胞、少なくとも４×１０６前駆細胞、少なくとも５×１０６前駆細胞、少なくとも６×１０６前駆細胞、少なくとも７×１０６前駆細胞、少なくとも８×１０６前駆細胞、少なくとも９×１０６前駆細胞、またはその倍数を含む。前駆細胞は１つ以上のドナーに由来するか、あるいは、自家供給源から得られる。本明細書に記載されるいくつかの態様において、前駆細胞は、それを必要とする対象に投与される前に、培養で増やされている。
【０４８５】
ＡＡＴＤを有する患者の細胞で発現される機能的ＡＡＴのレベルの、穏やかで漸進的な増加は、該疾病の１つ以上の症状を寛解させるため、長期生存率を増加させるため、および／または、他の治療に関連する副作用を減少させるために有益である。これらの細胞のヒト患者への投与の際、機能的ＡＡＴのレベルの増加を生み出す肝臓前駆細胞の存在は、有益である。いくつかの態様において、対象の効果的な治療は、治療対象のＡＡＴ全体と比較して、少なくとも約３％、５％、または７％の機能的ＡＡＴを生じる。いくつかの態様において、機能的ＡＡＴは、ＡＡＴ全体の少なくとも約１０％であろう。いくつかの態様において、機能的ＡＡＴは、ＡＡＴ全体の少なくとも約２０％〜３０％であろう。いくつかの状況において、正常な細胞は、疾病細胞と比較して、選択上の利点を有するが故に、同様に、有意に上昇したレベルの機能的ＡＡＴを有する細胞の比較的限られた亜集団の導入でさえ、様々な患者において有益であり得る。しかしながら、機能的ＡＡＴレベルが上昇した肝臓前駆細胞の適度なレベルでさえ、患者におけるＡＡＴＤの１つ以上の局面を寛解させるのに有益であり得る。いくつかの態様において、肝臓前駆細胞が投与される患者において、肝臓前駆細胞の、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％以上が、機能的ＡＡＴのレベルの増加を生み出す。
【０４８６】
「投与される」は、所望の部位で細胞組成物の少なくとも部分的な局在を生じる方法または経路により、前駆細胞組成物を対象に送達することを指す。細胞組成物は、対象において効果的な治療をもたらす、任意の適切な経路により投与することができる、すなわち、投与は少なくとも組成物の一部が送達される対象において、所望の位置への送達をもたらす、すなわち、一定期間に所望の部位に少なくとも１×１０４細胞が送達される。投与の方法には、注射、注入、滴下、または経口摂取が含まれる。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脊髄内腔、および胸骨内の注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、経路は静脈内である。細胞の送達のために、注射または注入による投与を行うことができる。
【０４８７】
ある態様において、細胞は全身投与される。「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」、および「末梢投与される」という言い回しは、対象の循環系に入り、代謝および他の同様のプロセスを受けるような、直接的な標的の部位、組織、または器官への投与以外の、前駆細胞集団の投与を指す。
【０４８８】
ＡＡＴＤの治療のための組成物を含む治療の有効性は、熟練した臨床医により決定され得る。しかし、ある例として、機能的ＡＡＴのレベルが有益な様式（例えば、少なくとも１０％の増加）で変化した場合に、または他の臨床的に許容される症状または疾病のマーカーが改善または寛解した場合に、治療は「有効な治療」とみなされる。有効性はまた、入院または医療介入の必要性によって評価されるように、個体が悪化しない（例えば、慢性閉塞性肺疾患、または該疾患の進行が、停止するか、または少なくとも遅くなる）ことによっても測定できる。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られ、および／または、本明細書に記載されている。治療は、個体または動物（いくつかの非限定的な例は、ヒトまたは哺乳動物を含む）における疾病の任意の治療を含み、（１）疾病を抑えること、例えば、症状の進行を停止させること、もしくは、遅延させること；または（２）疾病を緩和させること、例えば、症状の回復（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）；および（３）症状の発症を予防すること、あるいは、発症の可能性を減らすことを含む。
【０４８９】
本発明による治療は、個体の機能的ＡＡＴの量を増加させることにより、ＡＡＴＤに関する１つ以上の症状を寛解させる。通常ＡＡＴＤと関連する初期の徴候には、例えば、肺気腫、気流閉塞、慢性気管支炎、または肝臓病（幼少期における閉塞性黄疸およびアミノトランスフェラーゼの増加、並びに、小児期の肝臓合併症の病歴がない線維症および肝硬変）が含まれる。
【０４９０】
キット
【０４９１】
本開示は、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。キットは、ゲノムを標的
とする核酸、ゲノムを標的とする核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または、本発明の方法の態様を実行するのに必要な任意の核酸またはタンパク質性分子、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０４９２】
いくつかの態様において、キットは、（１）ゲノムを標的とする核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、並びに（２）部位特異的ポリペプチド、または、部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含むベクター、並びに（３）ベクターおよび／またはポリペプチドの再構成および／または希釈のための試薬を含む。
【０４９３】
いくつかの態様において、キットは、（１）（ｉ）ゲノムを標的とする核酸をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、並びに（２）ベクターの再構成および／または希釈のための試薬を含む。
【０４９４】
任意の上述のキットのいくつかの態様において、キットは、単分子ガイドのゲノムを標的とする核酸を含む。任意の上述のキットのいくつかの態様において、キットは二分子のゲノムを標的とする核酸を含む。任意の上述のキットのいくつかの態様において、キットは、２つ以上の二分子ガイドまたは単分子ガイドを含む。いくつかの態様において、キットは、核酸を標的とする核酸をコードするベクターを含む。
【０４９５】
任意の上述のキットのいくつかの態様において、キットはさらに、所望の遺伝的改変をもたらすように挿入されたポリヌクレオチドを含む。
【０４９６】
キットの構成成分は、別々の容器に入っていてよく、または、単一の容器で混合されていてもよい。
【０４９７】
いくつかの態様において、上記に記載されるキットはさらに、１つ以上のさらなる試薬を含み、ここでこれらのさらなる試薬は、バッファー、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞に導入するためのバッファー、洗浄バッファー、コントロール試薬、コントロールベクター、コントロールＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからポリペプチドをインビトロで生産するための試薬、配列決定のアダプターなどから選択される。バッファーは、安定化バッファー、再構成バッファー、希釈バッファー、または同様のものであり得る。いくつかの態様において、キットはまた、エンドヌクレアーゼによるオンターゲット結合またはＤＮＡ切断を促進または増強させるために、あるいは、ターゲティングの特異性を改善させるために用いられ得る、１つ以上の構成成分を含む。
【０４９８】
上述の構成成分に加えて、キットはさらに、本方法を実施するためのキットの構成成分を用いるための説明書を含み得る。本方法を実施するための説明書は、一般的に好適な記録媒体に記録されている。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に印刷されていてよい。説明書は、添付文書としてキットに存在してよく、キットまたはその構成成分の容器のラベルなどに（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに関連して）存在してもよい。説明書は、好適なコンピューター可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する、電子記憶データファイルとして存在してもよい。場合によっては、実際の説明書はキット内に存在しないが、リモート・ソースから（例えば、インターネットにより）説明書を取得するための手段が提供され得る。本態様の一例としては、説明書が閲覧可能なウェブアドレス、および／または、説明書がダウンロード可能なウェブアドレスを含むキットがある。説明書と同様に、説明書を取得するための該手段は、好適な基材に記録され得る。
【０４９９】
ガイドＲＮＡ製剤
【０５００】
本発明のガイドＲＮＡは、特定の投与方法および剤形に応じて、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤などの、医薬上許容できる賦形剤と共に製剤化される。ガイドＲＮＡ組成物は一般的に、生理的に適合するｐＨを達成するように製剤化され、製剤化および投与経路に応じて、約ｐＨ３〜約ｐＨ１１、約ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲である。いくつかの態様において、ｐＨは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲になるように調整される。いくつかの態様において、該組成物は、本明細書に記載される少なくとも１つの化合物の治療的に有効な量を、１つ以上の医薬上許容できる賦形剤と共に含む。場合により、該組成物は、本明細書に記載される化合物の組み合わせを含むか、あるいは、細菌の増殖の治療または予防において有用な第二有効成分（例えば、抗細菌薬または抗菌薬であるが、これらに限定されない）を含んでよく、あるいは、本発明の試薬の組み合わせを含んでよい。
【０５０１】
好適な賦形剤は、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性のウイルス粒子などの、大きくてゆっくりと代謝される巨大分子を含む、担体分子を含む。他の代表的な賦形剤は、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸であるが、これに限定されない）、キレート剤（例えばＥＤＴＡであるが、これに限定されない）、糖（例えばデキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、 aおよびヒドロキシアルキルメチルセルロースであるが、これらに限定されない）、ステアリン酸、液体（例えば油、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールであるが、これらに限定されない）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを含む。
【０５０２】
他の可能な治療方法
【０５０３】
遺伝子編集は、特定の配列を標的とするように操作したヌクレアーゼを用いて、行うことができる。今日までに、４つの主要なタイプのヌクレアーゼが存在する：メガヌクレアーゼおよびその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステムである。特に、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用は主としてＣａｓ９を導くが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性はタンパク質−ＤＮＡ相互作用によるものであるため、ヌクレアーゼプラットフォームは、設計、標的とする密度、および作用様式の難しさが様々である。Ｃａｓ９切断はまた、隣接モチーフ、ＰＡＭを必要とし、ＰＡＭは異なるＣＲＩＳＰＲシステム間で異なる。化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９は、ＮＲＧ  ＰＡＭを用いて切断し、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）由来ＣＲＩＳＰＲは、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＮＧＴＴＴおよびＮＮＮＮＧＣＴＴを含むＰＡＭを有する部位で切断することができる。多くの他のＣａｓ９オーソログは、別のＰＡＭに隣接するプロトスペーサーを標的とする。
【０５０４】
Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、本発明の方法において用いることができる。しかしながら、治療的標的部位などの、本明細書に記載される教示は、エンドヌクレアーゼの他の形態、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、またはＭｅｇａＴＡＬ、または、ヌクレアーゼの組み合わせの使用に適用することができるであろう。しかしながら、本発明の教示をこれらのエンドヌクレアーゼに適用させるためには、とりわけ、タンパク質を操作して特定の標的部位に向かわせる必要があるだろう。
【０５０５】
さらなる結合ドメインを、Ｃａｓ９タンパク質に融合させて、特異性を増加させることができる。これらの構築物の標的部位は、特定のｇＲＮＡ特異的部位に位置するであろうが、例えばジンクフィンガードメインに対するような、さらなる結合モチーフを必要とするであろう。Ｍｅｇａ−ＴＡＬの場合、メガヌクレアーゼはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと融合させることができる。メガヌクレアーゼドメインは、特異性を増加させ、切断を提供することができる。同様に、不活性型Ｃａｓ９、すなわちｄｅａｄ  Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）は、切断ドメインと融合させることができ、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位と、融合したＤＮＡ結合ドメインのための、隣接する結合部位を必要とする。このことは、さらなる結合部位によらない結合を減らすために、触媒作用の失活に加えて、ｄＣａｓ９の何らかのタンパク質操作を必要とするであろう。
【０５０６】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
【０５０７】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＴｙｐｅＩＩエンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに連結した、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインから成る調節タンパク質である。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能するため、一対のＺＦＮは、反対のＤＮＡ鎖に存在する同種の標的「ハーフサイト（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）」配列に結合するように、かつ、それらの配列間に正確なスペーシングを有して触媒活性のあるＦｏｋＩ二量体を形成するように、操作されなければならない。ＦｏｌｋＩドメインは、それ自体は配列特異性を有さないが、二量体化の際に、ゲノム編集の開始ステップとして、ＤＮＡ２本鎖切断がＺＦＮハーフサイト間に生まれる。
【０５０８】
各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、通常、豊富なＣｙｓ２−Ｈｉｓ２構造の３〜６個のジンクフィンガーから成り、各フィンガーは主に標的ＤＮＡ配列の１本鎖上の３塩基のヌクレオチドを認識するが、第４のヌクレオチドとのクロスストランド相互作用もまた重要であり得る。ＤＮＡとの重要な接点を作る位置での、１つのフィンガーのアミノ酸の変更は、所与のフィンガーの配列特異性を変更する。従って、４つのフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、選択的に１２ｂｐの標的配列を認識するであろうし、ここで、選好された３塩基は隣接するフィンガーにより様々な程度に影響され得るが、標的配列は各フィンガーにより与えられる選好された３塩基の複合体である。ＺＦＮの重要な局面は、うまく行うには、かなりの専門知識が必要であるが、個々のフィンガーを改変するだけでほとんど全てのゲノムアドレスに容易に再ターゲティングできることである。ＺＦＮのほとんどの適用において、４〜６個のフィンガーのタンパク質が用いられ、それぞれ１２〜１８ｂｐを認識する。故に、一対のＺＦＮは通常、２４〜３６ｂｐの標的配列の組み合わせを認識し、これらはハーフサイト間の５〜７ｂｐのスペーサーを含まない。結合部位は、１５〜１７ｂｐを含む、より大きなスペーサーでさらに分断され得る。設計プロセス中に、反復配列または遺伝子ホモログが排除されると仮定すると、この長さの標的配列は、おそらくヒトゲノムに特有である可能性が高い。それにもかかわらず、ＺＦＮタンパク質−ＤＮＡ相互作用はその特異性において絶対的ではないので、２つのＺＦＮのヘテロ二量体として、あるいは、１つのＺＦＮ若しくは他のＺＦＮのホモ二量体として、オフターゲットの結合および切断現象が起こる。後者の可能性は、ＦｏｋＩの二量体化の接点を操作して「＋」および「−」変異体（絶対ヘテロ二量体変異体としても知られる）を作製することにより、効果的に排除されており、これは、互いに二量体化することのみ可能であり、それぞれが二量体化することは不可能である。絶対ヘテロ二量体を強制することで、ホモ二量体の形成を予防する。このことは、ＺＦＮ、および、これらのＦｏｋＩ変異体を採用する他の任意のヌクレアーゼの特異性を大幅に増強した。
【０５０９】
様々なＺＦＮベースシステムが当業界で記載されており、その改変が定期的に報告されており、かつ、多数の参考文献がＺＦＮの設計を導くために用いるルールおよびパラメーターについて記載している；例えば、Segal et al., Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758-63 (1999); Dreier B et al., J Mol Biol. 303(4):489-502 (2000); Liu Q et al., J Biol Chem. 277(6):3850-6 (2002); Dreier et al., J Biol Chem 280(42):35588-97 (2005);および Dreier et al., J Biol Chem. 276(31):29466-78 (2001)を参照されたい。
【０５１０】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
【０５１１】
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結され、一対のＴＡＬＥＮが一列に作用して標的ＤＮＡ切断を達成するモジュラーヌクレアーゼの別のフォーマットを表す。ＺＦＮとの主な違いは、ＤＮＡ結合ドメインの性質および関連する標的ＤＮＡ配列の認識特性である。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥタンパク質に由来し、これは元々植物病原Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌に記載されている。ＴＡＬＥＮは３３〜３５個のアミノ酸リピートの縦列配列から成り、それぞれのリピートは通常最大２０ｂｐまでの長さである標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対を認識し、合計で最大４０ｂｐまでの長さの標的配列を与える。各リピートのヌクレオチド特異性は、１２番目と１３番目の２つのアミノ酸のみを含むｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ（ＲＶＤ）により決定される。グアニン、アデニン、シトシン、およびチミンの塩基が、４つの塩基：それぞれＡｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−ＡｓｐおよびＡｓｎ−Ｇｌｙにより、主に認識される。これは、ジンクフィンガーよりもはるかに単純な認識コードを構成しており、従って、ヌクレアーゼ設計の後者よりも優れている。それにもかかわらず、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ相互作用は、ＺＦＮと同様に、その特異性において絶対的ではなく、ＴＡＬＥＮもまた、オフターゲット活性の減少のためにＦｏｋＩの絶対ヘテロ二量体変異体の使用から恩恵を被っている。
【０５１２】
ＦｏｋＩドメインのさらなる変異体は、触媒機能が失活するように作製されている。一対のＴＡＬＥＮまたは一対のＺＦＮのいずれかの片方が不活性のＦｏｋＩドメインを含む場合、標的部位において、ＤＳＢではなく、１本鎖のみのＤＮＡ切断（ニッキング）が起こるであろう。結果は、Ｃａｓ９切断ドメインの一つが失活したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９「ニッカーゼ」変異体の使用と同等である。ＤＮＡニックは、ＨＤＲによるゲノム編集を引き起こすために用いることができるが、ＤＳＢよりも効率が低い。主な利点は、ＮＨＥＪ媒介の誤った修復が起こりがちなＤＳＢと異なり、オフターゲットのニックが、迅速かつ正確に修復されることである。
【０５１３】
様々なＴＡＬＥＮベースシステムが当業界で記載されており、その改変が定期的に報告されている：例えば、Boch, Science 326(5959):1509-12 (2009); Mak et al., Science 335(6069):716-9 (2012);および Moscou et al., Science 326(5959):1501 (2009)を参照されたい。「ゴールデンゲート」プラットフォームに基づくＴＡＬＥＮの使用、またはクローニングスキームが、複数のグループにより記載されている；例えば、Cermak et al., Nucleic Acids Res. 39(12):e82 (2011); Li et al., Nucleic Acids Res. 39(14):6315-25(2011); Weber et al., PLoS One. 6(2):e16765 (2011); Wang et al., J Genet Genomics 41(6):339-47, Epub 2014 May 17 (2014); およびCermak T et al., Methods Mol Biol. 1239:133-59 (2015) を参照されたい。
【０５１４】
ホーミングエンドヌクレアーゼ
【０５１５】
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４〜４４塩基対）を有する配列特異的エンドヌクレアーゼであり、しばしばゲノム内の珍しい部位にて高い特異性でＤＮＡを切断する。構造により分類される、少なくとも６つの既知のＨＥが存在し、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号６８，２９９）、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈｉｓ−Ｃｉｓ  ｂｏｘ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、およびＶｓｒ−ｌｉｋｅを含み、これらは真核生物、原生生物，真正細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌、藍藻およびファージを含む、広い範囲の宿主に由来している。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥはゲノム編集の開始ステップとして、標的遺伝子座でＤＳＢを作製するために用いることができる。さらに、いくつかの天然の、および、操作されたＨＥは、ＤＮＡの１本鎖のみを切断するため、部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きな標的配列と、それが提供する特異性により、ＨＥは、部位特異的ＤＳＢを作製する魅力的な候補となっている。
【０５１６】
様々なＨＥベースのシステムが当業界で記載されており、それらの改変が定期的に報告されている；例えば、Steentoft et al., Glycobiology 24(8):663-80 (2014); Belfort and Bonocora, Methods Mol Biol. 1123:1-26 (2014); Hafez and Hausner, Genome 55(8):553-69 (2012)によるレビュー;およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。
【０５１７】
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ−ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
【０５１８】
ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォームおよびＴｅｖ−ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、触媒活性のあるＨＥとの融合を用い、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合と特異性の両方、および、ＨＥの切断配列特異性を利用する；例えば、Boissel et al., NAR 42: 2591-2601 (2014); Kleinstiver et al., G3 4:1155-65 (2014); およびBoissel and Scharenberg, Methods Mol. Biol. 1239: 171-96 (2015) を参照されたい。
【０５１９】
さらなるバリエーションにおいて、ＭｅｇａＴｅｖ構造は、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）と、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）由来のヌクレアーゼドメインとの融合である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基質上に３０ｂｐ以内の間隔で位置し、非対応の付着末端を有する２つのＤＳＢを産生する；例えば、Wolfs et al., NAR 42, 8816-29 (2014)を参照されたい。既存のヌクレアーゼベースの手法の他の組み合わせが進化して、本明細書に記載される標的ゲノム改変を達成する上で有用となることが、予測される。
【０５２０】
ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩおよび他のヌクレアーゼ
【０５２１】
上記のヌクレアーゼプラットフォームの構造的および機能的特性を組み合わせることで、いくつかの固有の欠点を克服できる可能性がある、ゲノム編集ためのさらなる手法が提供される。一例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムは通常、１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いてＤＳＢを作製する。ターゲティングの特異性は、標的ＤＮＡとワトソン−クリック塩基対を形成するガイドＲＮＡ中の２０または２２個のヌクレオチド配列（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９の場合、隣接するＮＡＧまたはＮＧＧのＰＡＭ配列においてさらなる２塩基が追加される）により引き起こされる。これらの配列は、ヒトゲノムにおいて特有であるのに十分な長さであるが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対的ではなく、特に標的配列の５’側半分において、時に重要な無差別性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）が許容され、特異性を引き起こす塩基の数を効果的に減らしている。この１つの解決策は、Ｃａｓ９触媒機能を完全に失活させることであり（ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合機能のみを保持する）、代わりにＦｏｋＩドメインを失活したＣａｓ９に融合させることであった；例えば、Tsai et al., Nature Biotech 32: 569-76 (2014);および Guilinger et al., Nature Biotech. 32: 577-82 (2014)を参照されたい。ＦｏｋＩが触媒活性を有するようになるには二量体化する必要があるため、二量体を形成してＤＮＡを切断するように、２つのＣａｓ９−ＦｏｋＩ融合体をごく近接してつなぐための２つのガイドＲＮＡが必要である。このことにより、結合した標的部位における塩基の数が本質的に２倍になり、それによってＣＲＩＳＰＲベースシステムによる標的化のストリンジェンシーが増加する。
【０５２２】
さらなる例としては、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、Ｉ−ＴｅｖＩなどの触媒活性のあるＨＥとの融合は、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合と特異性の両方、および、Ｉ−ＴｅｖＩの切断配列特異性を利用するものであり、オフターゲットの切断がさらに減少し得ることを見込んでいる。
【０５２３】
本発明の方法および組成物
【０５２４】
従って、本開示は、特に、以下の非限定的な発明に関する：第１の方法、方法１において、本開示は、ゲノム編集によりヒト細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集する方法であって、ヒト細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、永続的な欠失、挿入、または、発現もしくは機能の修正もしくは調節、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の発現もしくは機能への影響を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させるステップを含む方法を提供する。
【０５２５】
別の方法、方法２において、本開示は、ゲノム編集によりヒト細胞にＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を挿入する方法であって、ヒト細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入し、セーフハーバー座位の内部またはその近傍に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらすことにより、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入と、ＡＡＴ活性の回復とを生じることを含む方法を提供する。
【０５２６】
別の方法、方法３において、本開示は、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのエクスビボ法であって、ｉ）患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製すること；ｉｉ）ｉＰＳＣの、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、あるいは、ｉＰＳＣの、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集すること；ｉｉｉ）ゲノム編集したｉＰＳＣを肝細胞へ分化させること；およびｉｖ）肝細胞を患者に移植すること：のステップを含む方法を提供する。
【０５２７】
別の方法、方法４において、本開示は、作製ステップが、ａ）患者から体細胞を単離すること；およびｂ）体細胞に、一連の多能性関連遺伝子を導入することにより、体細胞を多能性幹細胞に誘導すること：を含む、請求項３に記載の方法を提供する。
【０５２８】
別の方法、方法５において、本開示は、体細胞が線維芽細胞である、方法４に記載の方法を提供する。
【０５２９】
別の方法、方法６において、本開示は、一連の多能性関連遺伝子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧおよびｃＭＹＣからなる群から選択される１つ以上の遺伝子である、方法４に記載の方法を提供する。
【０５３０】
別の方法、方法７において、本開示は、編集ステップが、ｉＰＳＣに、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、永続的な欠失、挿入、または、発現もしくは機能の修正もしくは調節、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の発現もしくは機能への影響を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、ルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む方法であって、方法３〜６のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５３１】
別の方法、方法８において、本開示は、セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択される、方法７に記載の方法を提供する。
【０５３２】
別の方法、方法９において、本開示は、分化ステップが、ゲノム編集したｉＰＳＣを肝細胞へ分化させる以下のステップのうち１つ以上を含む、方法３〜８のいずれかに記載の方法を提供する：ゲノム編集したｉＰＳＣを、アクチビン、Ｂ２７サプリメント、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、オンコスタチンＭ、デキサメタゾンの１つ以上と接触させること。
【０５３３】
別の方法、方法１０において、本開示は、移植ステップが、該幹細胞を、移植、局所注射、または全身注入、またはこれらの組み合わせにより、患者に移植することを含む、方法３〜９のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５３４】
別の方法である方法１１において、本開示は、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのエクスビボ法であって、ｉ）患者の肝臓の生検を行うこと；ｉｉ）肝臓特異的な前駆細胞または初代肝細胞を単離すること；ｉｉｉ）前駆細胞または初代肝細胞の、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で編集すること、あるいは、前駆細胞または初代肝細胞の、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集すること；およびｉｖ）ゲノム編集した前駆細胞または初代肝細胞を患者に移植すること：のステップを含む方法を提供する。
【０５３５】
別の方法、方法１２において、本開示は、単離ステップが、消化酵素による新鮮な肝臓組織の灌流、細胞の分画遠心、細胞培養、およびこれらの組み合わせを含む、方法１１に記載の方法を提供する。
【０５３６】
別の方法、方法１３において、本開示は、編集ステップが、前駆細胞または初代肝細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、永続的な欠失、挿入、修正、または、発現もしくは機能の調節、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の発現もしくは機能への影響を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む方法であって、方法１１または１２に記載の方法を提供する。
【０５３７】
別の方法、方法１４において、本開示は、セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択される、方法１３に記載の方法を提供する。
【０５３８】
別の方法、方法１５において、本開示は、移植ステップが、移植、局所注射、または全身注入、またはこれらの組み合わせによりゲノム編集した前駆細胞または初代肝細胞を患者に移植することを含む、方法１１〜１４のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５３９】
別の方法、方法１６において、本開示は、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのエクスビボ法であって、ｉ）患者の骨髄の生検を行うこと；ｉｉ）患者から間葉系幹細胞を単離すること；ｉｉｉ）間葉系幹細胞のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で編集すること、または間葉系幹細胞のセーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集すること；ｉｖ）ゲノム編集した間葉系幹細胞を肝細胞へ分化させること；およびｖ）肝細胞を患者に移植すること：のステップを含む方法を提供する。
【０５４０】
別の方法、方法１７において、本開示は、間葉系幹細胞が、患者の骨髄または末梢血から単離される、方法１６に記載の方法を提供する。
【０５４１】
別の方法、方法１８において、本開示は、単離ステップが、骨髄の吸引、およびパーコール（商標）を用いた密度遠心分離による間葉系細胞の単離を含む、方法１６に記載の方法を提供する。
【０５４２】
別の方法、方法１９において、本開示は、編集ステップが、間葉系幹細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、永続的な欠失、挿入、修正、または、発現もしくは機能の調節、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の発現もしくは機能への影響を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む方法であって、方法１６〜１８のいずれかに記載を提供する。
【０５４３】
別の方法、方法２０において、本開示は、セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択される、方法１９に記載の方法を提供する。
【０５４４】
別の方法、方法２１において、本開示は、分化ステップが、ゲノム編集した幹細胞を肝細胞へ分化させる以下のステップのうち１つ以上を含む、方法１６〜１９のいずれかに記載の方法を提供する：ゲノム編集した間葉系幹細胞を、インスリン、トランスフェリン、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、または胆汁酸のうち１つ以上と接触させること。
【０５４５】
別の方法、方法２２において、本開示は、移植ステップが、該幹細胞を、移植、局所注射、または全身注入、またはこれらの組み合わせにより、患者に移植することを含む、方法１６〜２１のいずれか一項に記載の方法を提供する。
【０５４６】
別の方法、方法２３において、本開示は、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者を治療するためのインビボ法であって、患者の細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列を編集すること、あるいは、患者の細胞内のセーフハーバー座位の内部またはその近傍で編集することのステップを含む方法を提供する。
【０５４７】
別の方法、方法２４において、本開示は、編集ステップが、細胞に、１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部またはその近傍で、１つ以上の変異もしくはエクソンの、永続的な欠失、挿入、または、修正もしくは調節を生じて、あるいは、セーフハーバー座位の内部またはその近傍で導入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子の永続的な挿入を生じて、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質活性を回復させることを含む方法であって、方法２３に記載の方法を提供する。
【０５４８】
別の方法、方法２５において、本開示は、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；または、それらのホモログ、天然分子の遺伝子組換え、それらのコドン最適化バージョン、または改変バージョン、およびこれらの組み合わせである、方法１、２、７、１３、１９、または２４のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５４９】
別の方法、方法２６において、本開示は、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを細胞へ導入することを含む、方法２５に記載の方法を提供する。
【０５５０】
別の方法、方法２７において、本開示は、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を、細胞に導入することを含む、方法２７に記載の方法を提供する。
【０５５１】
別の方法、方法２８において、本開示は、１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のＲＮＡが、１つ以上の改変型ポリヌクレオチドまたは１つ以上の改変型ＲＮＡである、方法２６または２７に記載の方法を提供する。
【０５５２】
別の方法、方法２９において、本開示は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼがタンパク質またはポリペプチドである、方法２６に記載の方法を提供する。
【０５５３】
別の方法、方法３０において、本開示は、さらに、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を細胞に導入することを含む、方法１〜２９のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５５４】
別の方法、方法３１において、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡが単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、方法３０に記載の方法を提供する。
【０５５５】
別の方法、方法３２において、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変型ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである、方法３０または３１に記載の方法を提供する。
【０５５６】
別の方法、方法３３において、本開示は、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合化されている、方法３０〜３２のいずれか一項に記載の方法を提供する。
【０５５７】
別の方法、方法３４において、本開示は、さらに、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型を細胞へ導入することを含む、方法１〜３３のいずれかに記載の方法の提供する。
【０５５８】
別の方法、方法３５において、本開示は、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、ミニ遺伝子、またはｃＤＮＡの、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、イントロン領域、それらのフラグメントまたは組み合わせ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子全体、野生型調節エレメントをコードするＤＮＡ配列である、方法３４に記載の方法を提供する。
【０５５９】
別の方法、方法３６において、本開示は、ドナー鋳型が、１本鎖ポリヌクレオチドまたは２本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、方法３４または３５に記載の方法を提供する。
【０５６０】
別の方法、方法３７において、本開示は、ドナー鋳型が、１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する方法３４〜３６のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５６１】
別の方法、方法３８において、本開示は、細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを、導入することをさらに含み、かつ、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部もしくはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、ＤＳＢ遺伝子座において、１つの２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、これは、該遺伝子座またはセーフハーバー座位における、染色体ＤＮＡへのポリヌクレオチドドナー鋳型由来の新規配列の挿入を促進させ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、または、該遺伝子座またはセーフハーバー座位に近位の、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、染色体ＤＮＡの一部の永続的な挿入または修正を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させ、かつ、ｇＲＮＡが、該遺伝子座またはセーフハーバー座位のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む方法であって、方法１、２、７、１３、１９、または２４のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５６２】
別の方法、方法３９において、本開示は、近位が、遺伝子座またはセーフハーバー座位の上流および下流の両方のヌクレオチドを意味する方法３８に記載の方法を提供する。
【０５６３】
別の方法、方法４０において、本開示は、細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを、導入することをさらに含み、かつ、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部もしくはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、ＤＳＢ遺伝子座において一対の２本鎖切断（ＤＳＢ）（第一は５’ＤＳＢ遺伝子座で、第二は３’ＤＳＢ遺伝子座で）をもたらす２つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、これは、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間での、染色体ＤＮＡへのポリヌクレオチドドナー鋳型由来の新規配列の挿入を促進させ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、もしくは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の、内部もしくはその近傍で、または、セーフハーバー座位の内部もしくはその近傍で、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間に染色体ＤＮＡの永続的な挿入または修正を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させ、かつ、第一のガイドＲＮＡが５’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含み、第二のガイドＲＮＡが３’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む方法であって、方法１、２、７、１３、１９、または２４のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５６４】
別の方法、方法４１において、本開示は、１つまたは２つのｇＲＮＡが、１つまたは２つの単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、方法３８〜４０のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５６５】
別の方法、方法４２において、本開示は、１つもしくは２つのｇＲＮＡ、または、１つもしくは２つのｓｇＲＮＡが、１つもしくは２つの改変型ｇＲＮＡ、または、１つもしくは２つの改変ｓｇＲＮＡである、方法３８〜４１のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５６６】
別の方法、方法４３において、本開示は、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは２つのｇＲＮＡ、または、１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと予め複合化されている、方法３８〜４２のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５６７】
別の方法、方法４４において、本開示は、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子またはミニ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、ミニ遺伝子、またはｃＤＮＡの、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、イントロン領域、それらのフラグメントまたは組み合わせ、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子全体、野生型調節エレメントをコードするＤＮＡ配列である、方法３８〜４３のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５６８】
別の方法、方法４５において、本開示は、ドナー鋳型が、１本鎖ポリヌクレオチドまたは２本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、方法３８〜４４のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５６９】
別の方法、方法４６において、本開示は、ドナー鋳型が、１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する、方法３８〜４５のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５７０】
別の方法、方法４７において、本開示は、ＤＳＢ、または、５’ＤＳＢおよび３’ＤＳＢが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の、第一、第二、第三、第四、第五エクソンまたはイントロンに存在する、方法４４に記載の方法。
【０５７１】
別の方法、方法４８において、本開示は、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが以下の病的変異のうち１つ以上を指向する、方法１、２、７、１３、１９、２４、３０−３３、または３８−４１のいずれかに記載の方法を提供する：ｒｓ７６４３２５６５５、ｒｓ１２１９１２７１３、ｒｓ２８９２９４７４、ｒｓ１７５８０、ｒｓ１２１９１２７１４、ｒｓ７６４２２０８９８、ｒｓ１９９４２２２１１、ｒｓ７５１２３５３２０、ｒｓ１９９４２２２１０、ｒｓ２６７６０６９５０、ｒｓ５５８１９８８０、ｒｓ２８９３１５７０。
【０５７２】
別の方法、方法４９において、本開示は、挿入または修正が相同組換え修復（ＨＤＲ）による方法１、２、７、１３、１９、または２４４８のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５７３】
別の方法、方法５０において、本開示は、細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含み、かつ、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部もしくはその近傍で、一対の２本鎖切断（ＤＳＢ）（第一は５’ＤＳＢ遺伝子座で、第二は３’ＤＳＢ遺伝子座で）をもたらす２つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、これは、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間での、染色体ＤＮＡの欠失を引き起こし、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の内部またはその近傍で、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座の間に染色体ＤＮＡの永続的な欠失を生じて、ＡＡＴタンパク質活性を回復させ、かつ、第一のガイドＲＮＡが５’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含み、第二のガイドＲＮＡが３’ＤＳＢ遺伝子座のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む方法であって、方法１、２、７、１３、１９、または２４のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５７４】
別の方法、方法５１において、本開示は、２つのｇＲＮＡが、２つの単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、方法５０に記載の方法を提供する。
【０５７５】
別の方法、方法５２において、本開示は、２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡが、２つの改変型ｇＲＮＡまたは２つの改変ｓｇＲＮＡである、方法５０または５１に記載の方法を提供する。
【０５７６】
別の方法、方法５３において、本開示は、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは２つのｇＲＮＡ、または、１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと予め複合化されている、方法５０〜５２のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５７７】
別の方法、方法５４において、本開示は、５’ＤＳＢおよび３’ＤＳＢの両方が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソン、第二エクソン、第三エクソン、第四エクソンまたは第五エクソンのいずれかまたはその近傍に存在する、方法５０〜５３のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５７８】
別の方法、方法５５において、本開示は、欠失が、１ｋｂ以下の欠失である、方法５０〜５４のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５７９】
別の方法、方法５６において、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ別々の脂質ナノ粒子に含まれているか、あるいは、全て共に脂質ナノ粒子に含まれている、方法１、２、７、１３、または１９〜５５のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５８０】
別の方法、方法５７において、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ別々の脂質ナノ粒子に含まれているか、あるいは、全て共に脂質ナノ粒子に含まれている、方法１、６、１１、１５または１９〜５５のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５８１】
別の方法、方法５８において、本開示は、ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、方法５７に記載の方法を提供する。
【０５８２】
別の方法、方法５９において、本開示は、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ６ベクターである、方法５８に記載の方法を提供する。
【０５８３】
別の方法、方法６０において、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびドナー鋳型がそれぞれ別のエキソソームに含まれているか、あるいは、全て共に１つのエキソソームに含まれている、方法１、２、７、１３、１９または２４〜５５のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５８４】
別の方法、方法６１において、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡが１つの脂質ナノ粒子に含まれており、ｇＲＮＡがエレクトロポレーションにより細胞に送達され、かつ、ドナー鋳型が１つのウイルスベクターで細胞に送達される、方法１、２、７、１３、１９または２４〜５５のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５８５】
別の方法、方法６２において、本開示は、ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、方法６１に記載の方法を提供する。
【０５８６】
別の方法、方法６３において、本開示は、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ６ベクターである、方法６２に記載の方法を提供する。
【０５８７】
別の方法、方法６４において、本開示は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子が、１４番染色体：１，４９３，３１９−１，５０７，２６４（ゲノムリファレンスコンソーシアム−ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置している方法１〜６３のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５８８】
別の方法、方法６５において、本開示は、ＡＡＴタンパク質活性の回復を、野生型の、または正常なＡＡＴのタンパク質活性と比較する、方法１、２、７、１３、１９または２４〜５５のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５８９】
別の方法、方法６６において、本開示は、ヒト細胞が肝細胞である、方法１に記載の方法を提供する。
【０５９０】
別の方法、方法６７において、本開示は、細胞が肝細胞である、方法２３に記載の方法を提供する。
【０５９１】
別の方法、方法６８において、本開示は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の発現を開始させる外来性プロモーターと作動可能に連結している、方法１、２、７、１３、１９または２４〜５５のいずれかに記載の方法を提供する。
【０５９２】
別の方法、方法６９において、本開示は、１つ以上のＤＳＢが、内在性プロモーター遺伝子座の３’末端に直結する位置で生じる、方法１、２、７、１３、１９または２４〜５５のいずれかに記載の方法を提供する
【０５９３】
本開示はまた、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者由来の細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するための１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者由来の細胞内のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するための、配列番号５４，８６０〜６８，２９７の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つ以上のｇＲＮＡの組成物、組成物１を提供する。
【０５９４】
別の組成物、組成物２において、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡが１つ以上の単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、組成物１に記載の組成物を提供する。
【０５９５】
別の組成物、組成物３において、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変型ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである、組成物１または組成物２に記載の組成物を提供する。
【０５９６】
別の組成物、組成物４において、本開示は、細胞が肝細胞である、組成物１または組成物２に記載の組成物を提供する。
【０５９７】
本開示はまた、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者由来の細胞中のセーフハーバー座位を編集するための１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、アルファ１アンチトリプシン欠乏症の患者由来の細胞中のセーフハーバー座位を編集するための、配列番号１〜５４，８５９の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つ以上のｇＲＮＡの組成物、組成物５を提供し、ここでは、セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、およびＴＴＲからなる群から選択される。
【０５９８】
別の組成物、組成物６において、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡが１つ以上の単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、組成物５に記載の組成物を提供する。
【０５９９】
別の組成物、組成物７において、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変型ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである、組成物５または組成物６に記載の組成物を提供する。
【０６００】
別の組成物、組成物８において、本開示は、細胞が肝細胞である、組成物５または組成物６または組成物７に記載の組成物を提供する。
【０６０１】
定義
【０６０２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、本発明に必要不可欠であり、さらに必要不可欠であるかどうかに関わらず、不特定の要素を含むことができる、組成物、方法、およびそれらの個々の構成成分に関して用いられる。
【０６０３】
「本質的になる」という用語は、所与の態様に必要なこれらの要素を指す。該用語は、本発明の該態様の、基本的および新規の、または機能的な特性に実質的に影響を与えないさらなる要素の存在を認める。
【０６０４】
「からなる」という用語は、本明細書に記載された、組成物、方法、およびそれらの各構成成分を指し、本態様のその記載に列挙されていないいかなる要素も排除するものである。
【０６０５】
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の言及を含む。
【０６０６】
本明細書に提示される特定の数値は、「約」という用語が先行する。「約」という用語は、「約」という用語が先行する数値の文字通りのサポートを提供するために用いられ、およそその数値である数値であり、すなわち、それが提示されている文脈において、列挙されていない近似する数値が、特に列挙された数値と実質的に同等であり得るということである。「約」という用語は列挙された数値の±１０％以内の数値を意味する。
【０６０７】
数値の範囲が本明細書で提示される場合、その範囲の下限および上限の間に介在する各値、その範囲の上限値および下限値、およびその範囲で指定した全ての値が、本開示内に包含されることを企図している。その範囲の上限および下限内の、全ての可能な小さな範囲もまた、本開示により企図される。
【実施例】
【０６０８】
本発明は、本発明の、例示的で非限定的な態様を提供する、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。
【０６０９】
本実施例は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子に、本明細書において「ゲノム改変」と呼ばれる、規定の治療的なゲノム置換を作製し、その結果、ゲノム遺伝子座における変異の永続的な修正、あるいは、非相同の遺伝子座での発現をもたらし、ＡＡＴタンパク質活性を回復させる、例示的なゲノム編集技術としてのＣＲＩＳＰＲシステムの使用について記載している。規定の治療的改変の導入は、本明細書に記載および例示されるように、ＡＡＴＤの可能性のある寛解のための、新規の治療戦略となる。
【０６１０】
実施例１−ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位（セーフハーバー座位としてではなく）
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の領域に対して、標的部位をスキャンした。各エリアに対して、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列番号５４，８６０−６１，３２４に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を特定した。
【０６１１】
実施例２−ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位（セーフハーバー座位としてではなく）
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の領域に対して、標的部位をスキャンした。各エリアに対して、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列番号６１，３２４−６１，９３６に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を特定した。
【０６１２】
実施例３−ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位（セーフハーバー座位としてではなく）
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の領域に対して、標的部位をスキャンした。各エリアに対して、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列番号６１，９３７−６２，０６９に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を特定した。
【０６１３】
実施例４−ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位（セーフハーバー座位としてではなく）
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の領域に対して、標的部位をスキャンした。各エリアに対して、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列番号６９，０７０−６２，１２０に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を特定した。
【０６１４】
実施例５−ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位（セーフハーバー座位としてではなく）
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の領域に対して、標的部位をスキャンした。各エリアに対して、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列番号６２，１２１−６２，５６３に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を特定した。
【０６１５】
実施例６−ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位（セーフハーバー座位としてではなく）
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の領域に対して、標的部位をスキャンした。各エリアに対して、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列番号６２，５６４−６８，２９７に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２２ｂｐスペーサー配列を特定した。
【０６１６】
実施例７−セーフハーバー座位のＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
以下のセーフハーバー座位に対して、標的部位をスキャンした：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１−２、ＡＬＢのエクソン１−２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１−２、ＡｐｏＣ３のエクソン１−２、ＡＳＧＲ２のエクソン１−２、ＣＣＲ５のエクソン１−２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１−２、Ｇ６ＰＣのエクソン１−２、Ｇｙｓ２のエクソン１−２、ＨＧＤのエクソン１−２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１−２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１−２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１−２、ＴＦのエクソン１−２、およびＴＴＲのエクソン１−２。各エリアに対して、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。以下の配列に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を特定した：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）：配列番号１−２，０３２；ＡＬＢ：配列番号３，４８２−３，６４９；Ａｎｇｐｔｌ３：配列番号４，１０４−４，４４８；ＡｐｏＣ３：配列番号５，４３２−５，８３４；ＡＳＧＲ２：配列番号６，１０９−７，８７６；ＣＣＲ５：配列番号９，６４２−９，８４４；ＦＩＸ（Ｆ９）：配列番号１０，２２１−１１，６８６；Ｇ６ＰＣ：配列番号１４，２３０−１５，２４５；Ｇｙｓ２：配列番号１６，５８１−２２，０７３；ＨＧＤ：配列番号３２，２５４−３３，９４６；Ｌｐ（ａ）：配列番号３６，７８９−４０，５８３；Ｐｃｓｋ９：配列番号４６，１５４−４８，１７３；Ｓｅｒｐｉｎａ１：配列番号５０，３４５−５１，４８２；ＴＦ：配列番号５２，４４６−５３，２７７；およびＴＴＲ：配列番号５４，０６３−５４，３６２。
【０６１７】
実施例８−セーフハーバー座位のＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
以下のセーフハーバー座位に対して、標的部位をスキャンした：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１−２、ＡＬＢのエクソン１−２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１−２、ＡｐｏＣ３のエクソン１−２、ＡＳＧＲ２のエクソン１−２、ＣＣＲ５のエクソン１−２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１−２、Ｇ６ＰＣのエクソン１−２、Ｇｙｓ２のエクソン１−２、ＨＧＤのエクソン１−２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１−２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１−２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１−２、ＴＦのエクソン１−２、およびＴＴＲのエクソン１−２。各エリアに対して、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。以下の配列に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を特定した：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）：配列番号２，０３３−２，２０３；ＡＬＢ：配列番号３，６５０−３，６７７；Ａｎｇｐｔｌ３：配列番号４，４４９−４，４８４；ＡｐｏＣ３：配列番号５，８３５−５，８５９；ＡＳＧＲ２：配列番号７，８７７−８，０８２；ＣＣＲ５：配列番号９，８４５−９，８７６；ＦＩＸ（Ｆ９）：配列番号１１，６８７−１１，８４９；Ｇ６ＰＣ：配列番号１５，２４６−１５，３６２；Ｇｙｓ２：配列番号２２，０７４−２２，７４９；ＨＧＤ：配列番号３３，９４７−３４，１６０；Ｌｐ（ａ）：配列番号４０，５８４−４０，９９３；Ｐｃｓｋ９：配列番号４８，１７４−４８，３６０；Ｓｅｒｐｉｎａ１：配列番号５１，４８３−５１，５７５；ＴＦ：配列番号５３，２７８−５３，３６３；およびＴＴＲ：配列番号５４，３６３−５４，４０３。
【０６１８】
実施例９−セーフハーバー座位のＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
以下のセーフハーバー座位に対して、標的部位をスキャンした：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１−２、ＡＬＢのエクソン１−２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１−２、ＡｐｏＣ３のエクソン１−２、ＡＳＧＲ２のエクソン１−２、ＣＣＲ５のエクソン１−２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１−２、Ｇ６ＰＣのエクソン１−２、Ｇｙｓ２のエクソン１−２、ＨＧＤのエクソン１−２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１−２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１−２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１−２、ＴＦのエクソン１−２、およびＴＴＲのエクソン１−２。各エリアに対して、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。以下の配列に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を特定した：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）：配列番号２，２０４−２，２２１；ＡＬＢ：配列番号３，６７８−３，６９５；Ａｎｇｐｔｌ３：配列番号４，４８５−４，５０７；ＡｐｏＣ３：配列番号５，８６０−５，８６２；ＡＳＧＲ２：配列番号８，０８３−８，１０６；ＣＣＲ５：配列番号９，８７７−９，８９０；ＦＩＸ（Ｆ９）：配列番号１１，８５０−１１，９１０；Ｇ６ＰＣ：配列番号１５，３６３−１５，３８６；Ｇｙｓ２：配列番号２２，７５０−２０，３２７；ＨＧＤ：配列番号３４，１６１−３４，２４３；Ｌｐ（ａ）：配列番号４０，９９４−４１，１２９；Ｐｃｓｋ９：配列番号４８，３６１−４８，３９６；Ｓｅｒｐｉｎａ１：配列番号５１，５７６−５１，５８７；ＴＦ：配列番号５３，３６４−５３，３７５；およびＴＴＲ：配列番号５４，４０４−５４，４２０。
【０６１９】
実施例１０−セーフハーバー座位のＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
以下のセーフハーバー座位に対して、標的部位をスキャンした：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１−２、ＡＬＢのエクソン１−２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１−２、ＡｐｏＣ３のエクソン１−２、ＡＳＧＲ２のエクソン１−２、ＣＣＲ５のエクソン１−２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１−２、Ｇ６ＰＣのエクソン１−２、Ｇｙｓ２のエクソン１−２、ＨＧＤのエクソン１−２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１−２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１−２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１−２、ＴＦのエクソン１−２、およびＴＴＲのエクソン１−２。各エリアに対して、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。以下の配列に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を特定した：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）：配列番号２，２２２−２，２３０；ＡＬＢ：配列番号３，６９６−３，７００；Ａｎｇｐｔｌ３：配列番号４，５０８−４，５２０；ＡｐｏＣ３：配列番号５，８６３−５，８６４；ＡＳＧＲ２：配列番号８，１０７−８，１１８；ＣＣＲ５：配列番号９，８９１−９，８９２；ＦＩＸ（Ｆ９）：配列番号１１，９１１−１１，９３５；Ｇ６ＰＣ：配列番号１５，３８７−１５，３９５；Ｇｙｓ２：配列番号２３，０２８−２３，１４１；ＨＧＤ：配列番号３４，２４４−３４，２６２；Ｌｐ（ａ）：配列番号４１，１３０−４１，１６４；Ｐｃｓｋ９：配列番号４８，３９７−４８，４１０；Ｓｅｒｐｉｎａ１：配列番号５１，５８８−５１，５９０；ＴＦ：配列番号５３，３７６−５３，３８２；およびＴＴＲ：配列番号５４，４２１−５４，４２２。
【０６２０】
実施例１１−セーフハーバー座位のＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
以下のセーフハーバー座位に対して、標的部位をスキャンした：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１−２、ＡＬＢのエクソン１−２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１−２、ＡｐｏＣ３のエクソン１−２、ＡＳＧＲ２のエクソン１−２、ＣＣＲ５のエクソン１−２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１−２、Ｇ６ＰＣのエクソン１−２、Ｇｙｓ２のエクソン１−２、ＨＧＤのエクソン１−２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１−２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１−２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１−２、ＴＦのエクソン１−２、およびＴＴＲのエクソン１−２。各エリアに対して、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。以下の配列に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を特定した：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）：配列番号２，２３１−２，３０５；ＡＬＢ：配列番号３，７０１−３，７２４；Ａｎｇｐｔｌ３：配列番号４，５２１−４，５８３；ＡｐｏＣ３：配列番号５，８６５−５，８７６；ＡＳＧＲ２：配列番号８，１１９−８，２０１；ＣＣＲ５：配列番号９，８９３−９，９２０；ＦＩＸ（Ｆ９）：配列番号１１，９３６−１２，０８８；Ｇ６ＰＣ：配列番号１５，３９６−１５，４８５；Ｇｙｓ２：配列番号２３，１４２−２３，８２１；ＨＧＤ：配列番号３４，２６３−３４，４６３；Ｌｐ（ａ）：配列番号４１，１６５−４１，５３２；Ｐｃｓｋ９：配列番号４８，４１１−４８，５５０；Ｓｅｒｐｉｎａ１：配列番号５１，５９１−５１，６４１；ＴＦ：配列番号５３，３８３−５３，４２６；およびＴＴＲ：配列番号５４，４２３−５４，４５７。
【０６２１】
実施例１２−セーフハーバー座位のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１−２に対して、標的部位をスキャンした。以下のセーフハーバー座位に対して、標的部位をスキャンした：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１−２、ＡＬＢのエクソン１−２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１−２、ＡｐｏＣ３のエクソン１−２、ＡＳＧＲ２のエクソン１−２、ＣＣＲ５のエクソン１−２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１−２、Ｇ６ＰＣのエクソン１−２、Ｇｙｓ２のエクソン１−２、ＨＧＤのエクソン１−２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１−２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１−２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１−２、ＴＦのエクソン１−２、およびＴＴＲのエクソン１−２。各エリアに対して、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。以下の配列に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２２ｂｐスペーサー配列を特定した：ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）：配列番号２，３０６−３，４８１；ＡＬＢ：配列番号３，７２５−４，１０３；Ａｎｇｐｔｌ３：配列番号４，５８４−５，４３１；ＡｐｏＣ３：配列番号５，８７７−６，１０８；ＡＳＧＲ２：配列番号８，２０２−９，６４１；ＣＣＲ５：配列番号９，９２１−１０，２２０；ＦＩＸ（Ｆ９）：配列番号１２，０８９−１４，２２９；Ｇ６ＰＣ：配列番号１５，４８６−１６，５８０；Ｇｙｓ２：配列番号２３，８２２−３２，２５３；ＨＧＤ：配列番号３４，４６４−３６，７８８；Ｌｐ（ａ）：配列番号４１，５３３−４６，１５３；Ｐｃｓｋ９：配列番号４８，５５１−５０，３４４；Ｓｅｒｐｉｎａ１：配列番号５１，６４２−５２，４４５；ＴＦ：配列番号５３，４２７−５４，０６２；およびＴＴＲ：配列番号５４，４５８−５４，８５９。
【０６２２】
実施例１３−ガイド鎖のバイオインフォマティクス解析
候補ガイドは、理論的結合と実験的に評価された活性の両方を包含する多段階プロセスにおいて、スクリーニングおよび選択されるであろう。実例として、隣接するＰＡＭを有する、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の部位などの特定のオンターゲット部位と適合する配列を有する候補ガイドは、同様の配列を有するオフターゲット部位で切断する能力を、オフターゲット結合を評価するために利用可能な様々なバイオインフォマティクスツール（以下により詳細に記載および例示される）を１つ以上用いて、意図されたものではない染色体上の位置での効果の可能性を評価する目的で、評価できる、オフターゲット活性の可能性が相対的に低いと予測された候補は、その後、様々な部位でのオンターゲット活性を、続いてオフターゲット活性を測定するために、実験的に評価することができる。好ましいガイドは、選択された遺伝子座での所望のレベルの遺伝子編集を達成するために十分高いオンターゲット活性を有し、かつ、他の染色体上の遺伝子座での変更の可能性を減らすために相対的に低いオフターゲット活性を有するオフターゲット活性に対するオンターゲット活性の割合は、しばしばガイドの「特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」と呼ばれる。
【０６２３】
予測されたオフターゲット活性の最初のスクリーニングのために、最も可能性の高いオフターゲット部位を予測するために用いることができる、既知の、公的に利用可能な多くのバイオインフォマティクスツールがある；また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ ヌクレアーゼシステム内の標的部位への結合は、相補的配列間のワトソン−クリック塩基対形成により引き起こされるために、相違の程度（これにより、オフターゲット結合の可能性が減少する）は、基本的に一次配列の違いに関連している：一次配列の違いとは、標的部位と比較した潜在的オフターゲット部位におけるミスマッチおよびバルジ、すなわち非相補的塩基に変化した塩基、および塩基の挿入または欠失である。ＣＯＳＭＩＤ（ミスマッチ、挿入、および欠失を有する、ＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位（CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions））（ウェブでcrispr.bme.gatech.eduから入手可能）と呼ばれる代表的なバイオインフォマティクスツールは、これらの類似点を収集（ｃｏｍｐｉｌｅ）する。他のバイオインフォマティクスツールには、ＧＵＩＤＯ、ａｕｔｏＣＯＳＭＩＤ、およびＣＣｔｏｐが含まれるが、これらに限定されない。
【０６２４】
バイオインフォマティクスは、変異や染色体再編による有害な影響を減少させる目的で、オフターゲットの切断を最小限にするために用いられた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムについての研究は、塩基対ミスマッチおよび／またはバルジ（特に、ＰＡＭ領域から遠位での）を有するＤＮＡ配列への、ガイド鎖の非特異的ハイブリダイゼーションによる、高いオフターゲット活性の可能性を示唆した。従って、塩基対ミスマッチに加えて、ＲＮＡガイド鎖とゲノム配列との間に挿入および／または欠失を有する、潜在的なオフターゲット部位を特定できるバイオインフォマティクスツールを有することが重要である。従って、バイオインフォマティクスベースのツール、ＣＯＳＭＩＤ（ミスマッチ、挿入、および欠失を有する、ＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位）を、潜在的なＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位についてゲノムを検索するために用いた（ウェブでcrispr.bme.gatech.eduから入手可能）。ＣＯＳＭＩＤは、ミスマッチの数と位置に基づき、潜在的オフターゲット部位のランク付けされたリストを出力することで、より多くの情報を得た標的部位の選択を可能にし、かつ、オフターゲットの切断を伴う可能性のより高い部位の使用を回避させた。
【０６２５】
領域内のｇＲＮＡ標的部位の、推定されるオンターゲット活性および／またはオフターゲット活性を比較するさらなるバイオインフォマティクスパイプラインを採用した。活性を予測するために用いてよい他の特徴には、問題の細胞型、ＤＮＡアクセシビリティ、クロマチンの状態、転写因子結合部位、転シーケンス（ＣＨＩＰ−ｓｅｑ）データ写因子結合データ、および他のクロマチン免疫沈降についての情報が含まれる。編集効率を予測するさらなるファクター、例えば、対となるｇＲＮＡの相対的位置および方向、局所的配列特徴、並びにマイクロホモロジーが比較される。
【０６２６】
実施例１４−オンターゲット活性についての、細胞における好ましいガイドの試験
最低のオフターゲット活性を有することが示されたｇＲＮＡはその後、Ｈｕｈ−７細胞などのモデル細胞株において、オンターゲット活性について試験され、ＴＩＤＥまたは次世代シーケンシングを用いて、インデル頻度について評価されるであろう。ＴＩＤＥは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）により決定される標的遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるゲノム編集を、迅速に評価するための、ウェブツールである。２つの標準的なキャピラリーシーケンシング反応からの定量的な配列トレースデータに基づき、ＴＩＤＥソフトウェアは、標的細胞プールのＤＮＡにおいて、編集効率を定量し、挿入および欠失（インデル）の優勢なタイプを特定する。詳細な説明および例は、Brinkman et al, Nucl. Acids Res. (2014) を参照されたい。ハイスループットシーケンシングとしても知られる次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、多くの様々な最新の配列決定技術を説明するために用いられる包括的な用語であり、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、Ｒｏｃｈｅ４５４シーケンシング、Ｉｏｎｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭシーケンシング、およびＳＯＬｉＤシーケンシングが含まれる。これらの最近の技術は、以前に用いられていたＳａｎｇｅｒシーケンシングよりも、はるかに迅速かつ安価にＤＮＡおよびＲＮＡを配列決定することを可能にし、そのため、ゲノミクスおよび分子生物学の得研究に革命をもたらしている。
【０６２７】
組織培養細胞の遺伝子導入は、様々な構築物のスクリーニング、並びに、活性および特異性を試験する頑強な手段を可能にする。Ｈｕｈ−７細胞などの組織培養細胞株は、容易に遺伝子導入され、高い活性をもたらす。これら細胞株または他の細胞株は、最良のサロゲート（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を提供する細胞株を決定するために、調べられるであろう。これらの細胞はその後、多くの初期段階試験に用いられるであろう。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のための個々のｇＲＮＡは、例えば、ヒト細胞での発現に好適な、図１Ａ〜１Ｃに記載されたＣＴｘ−１、ＣＴｘ−２、またはＣＴｘ−３などのプラスミドを用いて、細胞に遺伝子導入されるであろう。数日後、ゲノムＤＮＡを回収して、ＰＣＲにより標的部位を増幅する。切断活性は、フリーのＤＮＡ末端のＮＨＥＪ修復により導入された挿入、欠失、および変異の割合により、測定することができる。本方法は、切断されていないＤＮＡから、正確に修復された配列を区別することができないが、誤った修復の量によって切断のレベルを計測することができる。オフターゲット活性は、特定された推定上のオフターゲット部位を増幅して、切断を検出する同様の方法を用いることにより、観察することができる。特定の切断および転座が起こるかどうかを決定するために、切断部位に隣接するプライマーを用いて、転座を評価することもできる。非ガイドアッセイが開発され、ガイド配列を含むオフターゲット切断の相補的試験が可能となった。その後、顕著な活性を有するｇＲＮＡまたはｇＲＮＡの対は、ＳＥＲＰＩＮＡ１変異の修正を測定するために、培養細胞中で経過観察することができる。オフターゲットの現象も、再度確認することができる。これらの実験は、ヌクレアーゼおよびドナーの、設計および送達の最適化を可能にする。
【０６２８】
実施例１５−オフターゲット活性についての、細胞における好ましいガイドの試験
上述の実施例におけるＴＩＤＥおよび次世代シーケンシング研究から得られた最高のオンターゲット活性を有するｇＲＮＡはその後、全ゲノム配列解析を用いて、オフターゲット活性について試験されるであろう。
【０６２９】
実施例１６−ＨＤＲ遺伝子編集についての様々な手法の試験
オンターゲット活性およびオフターゲット活性の両方についてｇＲＮＡを試験した後、変異の修正およびノックインの戦略が、ＨＤＲ遺伝子編集について試験されるであろう。
【０６３０】
変異の修正の手法については、ドナーＤＮＡテンプレートは、短鎖１本鎖オリゴヌクレオチド、短鎖２本鎖オリゴヌクレオチド（インタクトなＰＡＭ配列／変異ＰＡＭ配列）、長鎖１本鎖ＤＮＡ分子（インタクトなＰＡＭ配列／変異ＰＡＭ配列）または長鎖２本鎖ＤＮＡ分子（インタクトなＰＡＭ配列／変異ＰＡＭ配列）として提供されるであろう。さらに、ドナーＤＮＡテンプレートは、ＡＡＶにより送達されるであろう。
【０６３１】
ｃＤＮＡノックインの手法については、１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソン（最初のコーディングエクソン）のうち４０を超えるヌクレオチド、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の完全なＣＤＳおよびＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、並びに、以下のイントロンのうち少なくとも４０ヌクレオチドを含んでよい。１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡであって、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソンのうち８０を超えるヌクレオチド、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の完全なＣＤＳおよびＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、並びに、以下のイントロンのうち少なくとも８０個のヌクレオチドを含む。１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソンのうち１００を超えるヌクレオチド、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の完全なＣＤＳおよびＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、並びに、以下のイントロンのうち少なくとも１００ヌクレオチドを含んでよい。１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソンのうち１５０を超えるヌクレオチド、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の完全なＣＤＳおよびＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、並びに、以下のイントロンのうち少なくとも１５０ヌクレオチドを含んでよい。１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソンのうち３００を超えるヌクレオチド、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の完全なＣＤＳおよびＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、並びに、以下のイントロンのうち少なくとも３００ヌクレオチドを含んでよい。１４ｑ３２．１３領域に対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第一エクソンの４００を超えるヌクレオチド、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の完全なＣＤＳおよびＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、および以下の第一イントロンのうち少なくとも４００ヌクレオチドを含んでよい。また、ＤＮＡテンプレートはＡＡＶにより送達されるであろう。
【０６３２】
ｃＤＮＡまたはミニ遺伝子のノックイン手法については、１４ｑ３２．１３に対する相同アームを有する１本鎖または２本鎖ＤＮＡであって、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第二エクソン（最初のコーディングエクソン）のうち８０を超えるヌクレオチド、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の完全なＣＤＳおよびＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、並びに、以下のイントロンのうち少なくとも８０ヌクレオチドである。また、ＤＮＡテンプレートはＡＡＶにより送達されるであろう。
【０６３３】
次に、ＳＥＲＰＩＮＡ１のＰＩ  Ｚ対立遺伝子の一般的な変異のＨＤＲ媒介修正、および、ｃＤＮＡミニ遺伝子（天然のまたは合成のエンハンサーおよびプロモーター、１つ以上のエクソン、並びに、天然のまたは合成のイントロン、並びに、天然のまたは合成の３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナルから成る）の第二エクソンへのノックインの効率が、評価されるであろう。
【０６３４】
実施例１７−主なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組み合わせの再評価
ＨＤＲ遺伝子編集のための様々な戦略を試験した後、主なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組み合わせを、欠失、組換えの効率、およびオフターゲットの特異性について、初代培養ヒト肝細胞で評価した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＲＮＰは送達のために脂質ナノ粒子に製剤化されるであろうし、ｓｇＲＮＡはナノ粒子に製剤化されるかＡＡＶとして送達されるであろうし、かつ、ドナーＤＮＡはナノ粒子に製剤化されるかＡＡＶとして送達されるであろう。
【０６３５】
実施例１８−関連するマウスモデルにおけるインビボ試験
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組み合わせを再評価した後、主な製剤が、動物モデルにおいてインビボで試験されるであろう。好適な動物モデルには、非限定的な例として、ヒト肝細胞またはｉＰＳＣ由来肝細胞（正常またはＡＡＴ欠損）で再増殖した肝臓を有するＦＧＲマウスモデルが含まれる。
【０６３６】
ヒト細胞における培養は、上述のように、ヒト標的およびバックグラウンドヒトゲノムに対する直接的な試験を可能にする。
【０６３７】
前臨床の有効性および安全性評価は、ＦＧＲマウスにおける、改変された、マウス肝細胞またはヒト肝細胞の生着により、観察することができる。改変された細胞は、生着後、数ヶ月間観察することができる。
【０６３８】
実施例１９−ｇＲＮＡのスクリーニング
ＳＥＲＰＩＮＡ１  ＤＮＡ標的領域を編集できる広範囲のｇＲＮＡの対を同定するために、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを行った。ＳＥＲＰＩＮＡ１ゲノム配列を、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを用いた解析のために提供した。得られたｇＲＮＡのリストを、配列の独自性（ゲノム上の他のどこかと完全に一致することのないｇＲＮＡのみを選択した）および、最小限の予測されたオフターゲットに基づき、約２００個のｇＲＮＡまで絞り込んだ。ｇＲＮＡの本セットを、インビトロで転写し、メッセンジャーＭａｘを用いて恒常的にＣａｓ９を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入後４８時間で、細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを単離して、ＴＩＤＥ解析を用いて切断効率を調べた。ｇＲＮＡの切断効率（インデル％）を表４に挙げる。
【０６３９】
試験したｇＲＮＡの約１４％が、７０％を超える切断効率を誘導することが判明した（図３）。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【０６４０】
例示的な態様に関する注記
【０６４１】
本開示は、本発明の様々な局面、および／または、可能性のある適用を例示することを目的として、様々な具体的な態様の説明を提供しているが、変化や改変が生じるであろうことは、当業者に理解される。従って、本明細書に記載される本発明は、少なくとも特許請求の範囲に記載されたものと同程度広義に理解されるべきであり、本明細書により提供される特定の例示的な態様によってより狭義に規定されるものではない。
【０６４２】
本明細書で特定された特許、刊行物または他の開示資料は、特に断りのない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれるが、組み込まれる資料が、本明細書で明示的に記載された既存の説明、定義、記述または他の開示資料と矛盾しない範囲内においてのみ組み込まれる。従って、必要に応じて、本明細書に記載される明示的開示は、参照により組み込まれた矛盾するいずれの資料よりも優先する。本明細書に参照により組み込まれると述べているが、本明細書に記載される既存の定義、記述、または他の開示資料と矛盾するいずれの資料、またはその一部も、組み込まれる資料と、既存の開示資料との間に矛盾が生じない範囲でのみ組み込まれる。出願人は、本明細書に参照により組み込まれる、いずれの対象事項またはその一部も明示的に引用するために、本明細書を補正する権利を留保する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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