(57)【要約】  本発明は、概して、単一の化学実体によって多標的核酸の遺伝子発現を調節するのに有用な化合物、組成物及び方法に関する。
2018520683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのエフェクター分子を含む多標的分子であって、前記エフェクター分子が一緒に連結され、少なくとも１つのリガンドが前記多標的分子と共役され、前記多標的分子が、前記エフェクター分子が一緒に連結されていない場合と比べてそれぞれ少なくとも７０％だけ少なくとも２つの標的核酸の遺伝子発現を調節し、前記少なくとも２つのエフェクター分子が互いに重ならない、多標的分子。
【請求項２】
前記少なくとも２つのエフェクター分子が互いに非共有的に連結され、及び前記少なくとも２つのエフェクター分子の各々が少なくとも１つのリガンドと共役される、請求項１に記載の多標的分子。
【請求項３】
前記非共有結合が前記少なくとも２つのエフェクター分子間のヌクレオチドのハイブリダイゼーションである、請求項２に記載の多標的分子。
【請求項４】
前記エフェクター分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ又は抗ｍｉｒ、スーパーｍｉｒ、アンタゴｍｉｒ、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、免疫刺激オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化剤、Ｕ１アダプター、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ及びこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の多標的分子。
【請求項５】
前記エフェクター分子が一緒に連結されていない場合と比べてそれぞれ少なくとも７５％だけ少なくとも２つの標的核酸の遺伝子発現を調節する、請求項１に記載の多標的分子。
【請求項６】
前記少なくとも２つのエフェクター分子の１つが第１の標的核酸の遺伝子発現を調節し、及び前記少なくとも２つのエフェクター分子のもう１つが第２の核酸の遺伝子発現を調節する、請求項５に記載の多標的分子。
【請求項７】
前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が同じである、請求項６に記載の多標的分子。
【請求項８】
前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が同じヌクレオチド配列をターゲティングする、請求項７に記載の多標的分子。
【請求項９】
前記リガンドが前記少なくとも２つのエフェクター分子の１つの３’末端において共役される、請求項１に記載の多標的分子。
【請求項１０】
前記リガンドが前記少なくとも２つのエフェクター分子の１つの５’末端において共役される、請求項１に記載の多標的分子。
【請求項１１】
第１の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子及び第２の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む多標的分子であって、前記第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖がその３’末端に一本鎖突出部を含み、及び前記第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がその３’末端に一本鎖突出部を含み、前記センス鎖の前記一本鎖突出部の核酸配列が前記アンチセンス鎖の前記一本鎖突出部のヌクレオチド配列と実質的に相補的であり、前記２つの一本鎖突出部が二重鎖を形成し、前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡがそれぞれ少なくとも１つのリガンドと共役される、多標的分子。
【請求項１２】
前記第１及び第２のｓｉＲＮＡが、独立に、前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡが一緒に連結されていない場合と比べて少なくとも７０％だけそれらのそれぞれの標的核酸の遺伝子発現を調節する、請求項１１に記載の多標的分子。
【請求項１３】
前記第１のｓｉＲＮＡが第１の標的核酸の遺伝子発現を調節し、及び前記第２のｓｉＲＮＡが第２の核酸の遺伝子発現を調節する、請求項１１又は１２に記載の多標的分子。
【請求項１４】
前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が同じである、請求項１３に記載の多標的分子。
【請求項１５】
前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡが同じ核酸配列をターゲティングする、請求項１４に記載の多標的分子。
【請求項１６】
少なくとも１つのリガンドが前記センス鎖の１つと共役される、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項１７】
少なくとも１つのリガンドが前記センス鎖の１つの前記３’末端、５’末端又は内部位置において共役される、請求項１６に記載の多標的分子。
【請求項１８】
少なくとも１つのリガンドが前記アンチセンス鎖の１つと共役される、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項１９】
少なくとも１つのリガンドが前記アンチセンス鎖の１つの前記３’末端、５’末端又は内部位置において共役される、請求項１８に記載の多標的分子。
【請求項２０】
第１のリガンドがセンス鎖と共役され、及び第２のリガンドがアンチセンス鎖と共役される、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項２１】
前記第１のリガンドと共役される前記センス鎖が前記第２のｓｉＲＮＡに由来し、及び前記第２のリガンドと共役される前記アンチセンス鎖が前記第１のｓｉＲＮＡに由来する、請求項２０に記載の多標的分子。
【請求項２２】
前記第１のリガンドと共役される前記センス鎖が前記第１のｓｉＲＮＡに由来し、及び前記第２のリガンドと共役される前記アンチセンス鎖が前記第２のｓｉＲＮＡに由来する、請求項２０に記載の多標的分子。
【請求項２３】
前記第１のリガンドと共役される前記センス鎖が前記第１のｓｉＲＮＡに由来し、及び前記第２のリガンドと共役される前記アンチセンス鎖も前記第１のｓｉＲＮＡに由来する、請求項２０に記載の多標的分子。
【請求項２４】
前記第１のリガンドと共役される前記センス鎖が前記第２のｓｉＲＮＡに由来し、及び前記第２のリガンドと共役される前記アンチセンス鎖も前記第２のｓｉＲＮＡに由来する、請求項２０に記載の多標的分子。
【請求項２５】
前記センス鎖の前記一本鎖突出部が全てＤＮＡ、全てＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドの混合物を含み、前記ＤＮＡ及びＲＮＡが天然又は修飾されたものであり得る、請求項１１〜２４のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項２６】
前記アンチセンス鎖の前記一本鎖突出部が全てＤＮＡ、全てＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドの混合物を含み、前記ＤＮＡ及びＲＮＡが天然又は修飾されたものであり得る、請求項１１〜２５のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項２７】
前記２つの一本鎖突出部によって形成される前記二重鎖の５％未満がヌクレアーゼによって切断される、請求項１１〜２６のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項２８】
前記２つの一本鎖突出部によって形成される前記二重鎖の少なくとも５０％がヌクレアーゼによって切断される、請求項１１〜２６のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項２９】
修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの修飾が、センス鎖、アンチセンス鎖、前記センス鎖の一本鎖突出部、前記アンチセンス鎖の一本鎖突出部又はこれらの任意の組合せに含まれる、請求項２９に記載の多標的分子。
【請求項３１】
第１の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子及び第２の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む多標的分子であって、前記第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が３’末端に一本鎖突出部を含み、及び前記第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が３’末端に一本鎖突出部を含み、前記２つの一本鎖突出部核酸配列の核酸配列が互いに対して実質的に相補的であり、及び前記２つの一本鎖突出部が二重鎖を形成し、前記２つの一本鎖突出部が二重鎖を形成し、前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡがそれぞれ少なくとも１つのリガンドと共役される、多標的分子。
【請求項３２】
前記第１及び第２のｓｉＲＮＡが、独立に、前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡが一緒に連結されていない場合と比べて少なくとも７０％だけそれらのそれぞれの標的核酸の遺伝子発現を調節する、請求項３１に記載の多標的分子。
【請求項３３】
前記第１のｓｉＲＮＡが第１の標的核酸の遺伝子発現を調節し、及び前記第２のｓｉＲＮＡが第２の核酸の遺伝子発現を調節する、請求項３１又は３２に記載の多標的分子。
【請求項３４】
前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が同じである、請求項３３に記載の多標的分子。
【請求項３５】
前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡが同じ核酸配列をターゲティングする、請求項３４に記載の多標的分子。
【請求項３６】
前記リガンドの少なくとも１つがセンス鎖の１つと共役される、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項３７】
前記リガンドの少なくとも１つが前記センス鎖の１つの３’末端、５’末端又は内部位置において共役される、請求項３６に記載の多標的分子。
【請求項３８】
前記リガンドの少なくとも１つが前記アンチセンス鎖の１つと共役される、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項３９】
前記リガンドの少なくとも１つが前記アンチセンス鎖の１つの前記３’末端、５’末端又は内部位置において共役される、請求項３８に記載の多標的分子。
【請求項４０】
第１のリガンドがセンス鎖と共役され、及び第２のリガンドがアンチセンス鎖と共役される、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項４１】
前記第１のリガンドと共役される前記センス鎖が前記第２のｓｉＲＮＡに由来し、及び前記第２のリガンドと共役される前記アンチセンス鎖が前記第１のｓｉＲＮＡに由来する、請求項４０に記載の多標的分子。
【請求項４２】
前記第１のリガンドと共役される前記センス鎖が前記第１のｓｉＲＮＡに由来し、及び前記第２のリガンドと共役される前記アンチセンス鎖が前記第２のｓｉＲＮＡに由来する、請求項４０に記載の多標的分子。
【請求項４３】
前記第１のリガンドと共役される前記センス鎖が前記第１のｓｉＲＮＡに由来し、及び前記第２のリガンドと共役される前記アンチセンス鎖も前記第１のｓｉＲＮＡに由来する、請求項４０に記載の多標的分子。
【請求項４４】
前記第１のリガンドと共役される前記センス鎖が前記第２のｓｉＲＮＡに由来し、及び前記第２のリガンドと共役される前記アンチセンス鎖も前記第２のｓｉＲＮＡに由来する、請求項４０に記載の多標的分子。
【請求項４５】
前記第１のｓｉＲＮＡの前記アンチセンス鎖の前記一本鎖突出部が全てＤＮＡ、全てＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドの混合物を含む、請求項３１〜４４のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項４６】
前記第２のｓｉＲＮＡの前記アンチセンス鎖の前記一本鎖突出部が全てＤＮＡ、全てＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドの混合物を含む、請求項３１〜４５のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項４７】
前記２つの一本鎖突出部によって形成される前記二重鎖の５％未満がヌクレアーゼによって切断される、請求項３１〜４６のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項４８】
前記２つの一本鎖突出部によって形成される前記二重鎖の少なくとも５０％がヌクレアーゼによって切断される、請求項３１〜４６のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項４９】
修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む、請求項３１〜４８のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの修飾が、センス鎖、アンチセンス鎖、前記第１のｓｉＲＮＡの前記アンチセンス鎖の一本鎖突出部、前記第２のｓｉＲＮＡの前記アンチセンス鎖の一本鎖突出部、又はこれらの任意の組合せに含まれる、請求項３９に記載の多標的分子。
【請求項５１】
第１の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子及び第２の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む多標的分子であって、前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡが互いに共有結合され、少なくとも１つのリガンドが前記多標的分子と共役される、多標的分子。
【請求項５２】
前記第１のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖が前記第２のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖に共有結合される、請求項５１に記載の多標的分子。
【請求項５３】
前記第１のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖が前記第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖に共有結合される、請求項５１に記載の多標的分子。
【請求項５４】
前記第１のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が前記第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖に共有結合される、請求項５１に記載の多標的分子。
【請求項５５】
前記第１及び第２のｓｉＲＮＡが、独立に、前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡが前記多標的分子の一部でない場合と比べて少なくとも７０％だけそれらのそれぞれの標的核酸の遺伝子発現を調節する、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項５６】
前記第１のｓｉＲＮＡが第１の標的核酸の遺伝子発現を調節し、及び前記第２のｓｉＲＮＡが第２の核酸の遺伝子発現を調節する、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項５７】
前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が同じである、請求項５６に記載の多標的分子。
【請求項５８】
前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡが同じ核酸配列をターゲティングする、請求項５７に記載の多標的分子。
【請求項５９】
前記リガンドが前記センス鎖の１つと共役される、請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項６０】
前記リガンドが前記センス鎖の１つの３’末端において共役される、請求項５９に記載の多標的分子。
【請求項６１】
前記リガンドが前記センス鎖の１つの５’末端において共役される、請求項５９に記載の多標的分子。
【請求項６２】
前記リガンドが前記アンチセンス鎖の１つの３’末端において共役される、請求項５９に記載の多標的分子。
【請求項６３】
前記リガンドが前記アンチセンス鎖の１つの５’末端において共役される、請求項５９に記載の多標的分子。
【請求項６４】
前記第１のｓｉＲＮＡ分子及び前記第２のｓｉＲＮＡ分子がヌクレオチドベースのリンカーを介して互いに連結される、請求項５１〜６０のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項６５】
前記リンカーが一本鎖である、請求項６４に記載の多標的分子。
【請求項６６】
前記リンカーが二本鎖である、請求項６４に記載の多標的分子。
【請求項６７】
前記二本鎖リンカーが一本鎖領域を含む、請求項６６に記載の多標的分子。
【請求項６８】
前記第１のｓｉＲＮＡ分子及び前記第２のｓｉＲＮＡ分子が非ヌクレオチドベースのリンカーを介して互いに連結される、請求項５１〜６０のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項６９】
前記２つのセンス鎖を連結する前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項７０】
前記リガンドが前記リンカーに共役される、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項７１】
修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む、請求項５１〜７０のいずれか一項に記載の多標的分子。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの修飾が、センス鎖、アンチセンス鎖又は前記少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子を連結する前記リンカーに含まれる、請求項７１に記載の多標的分子。
【請求項７３】
前記リンカーが、ロックド核酸、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド、２’−ハロヌクレオシド、２’−アミノヌクレオシド、２’−Ｓ−アルキルヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’−シアノヌクレオシド、２’−メルカプトヌクレオシド；２’−ＭＯＥヌクレオシド、アクリルヌクレオシド、Ｓ−ｃＥｔヌクレオシド、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの核酸修飾を含む、請求項７１又は７２に記載の多標的分子。
【請求項７４】
前記リンカーが、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホン酸水素、アルキル又はアリールホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、メチレンメチルイミノ、チオジエステル、チオノカルバメート、Ｎ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、アミド、ヒドロキシアミノ、シロキサン、ジアルキルシロキサン、カルボキサミド、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、カルボン酸エステル、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、硫化物、スルホン酸塩、スルホンアミド、スルホン酸エステル、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンカルボニルアミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノ、エーテル、チオエーテル、チオアセトアミド、これらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項５１〜７３のいずれか一項に記載の多標的分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２０１５年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／１９４，００３号明細書の利益を主張するものであり、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、概して、複数の標的の遺伝子発現を調節するのに有用な化合物、組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２つ以上の標的をターゲティングすることが可能な分子が当技術分野で必要とされている。本開示は、その必要性に対するいくつかの解決策を与えるものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、多標的分子が本明細書において提供される。概して、多標的分子は、互いに共有結合又は非共有結合された少なくとも２つの核酸ベースのエフェクター分子を含む。限定なしに、標的の遺伝子発現を調節することが可能な任意の核酸ベースのエフェクター分子が、本明細書に開示する多標的分子に含まれ得る。
【０００５】
「核酸ベースのエフェクター分子」とは、標的遺伝子の遺伝子発現を調節することが可能な修飾又は非修飾一本鎖又は二本鎖核酸分子を意味する。標的遺伝子の遺伝子発現を調節することが可能な例示的な核酸ベースのエフェクター分子としては、限定はしないが、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡ干渉剤（ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ、並びに本明細書においてｄｓＲＮＡ剤と呼ばれるものなど）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ又は抗ｍｉｒ（ａｎｔｉｍｉｒ）、スーパーｍｉｒ（ｓｕｐｅｒｍｉｒ）、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化剤、Ｕ１アダプター、ＣＲＩＳＰＲ  ＣａｓのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などが挙げられる。
【０００６】
前記少なくとも２つのエフェクター分子が２つの別個のエフェクター分子であることに留意する。換言すれば、少なくとも２つのエフェクター分子は、互いに重ならない。従って、本明細書に開示する多標的分子は、１つのエフェクター分子が２つの異なる標的に向けられた分子、例えば、各鎖が異なる標的に向けられた二本鎖エフェクター分子又は配列の少なくとも一部が２つの異なる標的配列と相補的であるか、又はそれとハイブリダイズすることができる配列を含むエフェクター分子と異なる。
【０００７】
一部の実施形態では、多標的分子又は多標的分子中のエフェクター分子は、２つの異なる機構によって非特異的な遺伝子発現を調節しない。例えば、多標的分子又は多標的分子中のエフェクター分子は、ＲＮＡ干渉及びマイクロＲＮＡのシード領域のターゲティングによって遺伝子発現を調節しない。
【０００８】
一部の実施形態では、多標的分子中の各核酸ベースのエフェクター分子は、標的核酸の遺伝子発現を調節することができる。限定なしに、多標的分子中の各エフェクター分子は、同じ標的遺伝子、異なる標的遺伝子、同じ標的遺伝子による異なる位置、又は同じ標的遺伝子の異なる転写物に向けられ得る。さらに、本明細書に開示する多標的分子に含まれる前記エフェクター分子は、本明細書に記載する核酸修飾、モチーフ又は構造のいずれかを含み得ることに留意する。
【０００９】
さらに、本明細書に記載する多標的分子に含まれるエフェクター分子は、前記エフェクター分子が多標的分子の一部でない場合の遺伝子発現調節活性と比較して同等の遺伝子発現調節活性を有する。換言すれば、エフェクター分子は、それが多標的分子の一部でない場合と比べて、それが本明細書に開示する多標的分子の一部である場合、同様の遺伝子発現調節活性を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載する多標的分子に含まれるエフェクター分子は、独立に、多標的分子の一部でない場合の遺伝子発現のそれらの調節と比べて、少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上）だけそれらのそれぞれの標的核酸の遺伝子発現を調節することができる。一部の実施形態では、多標的分子中のエフェクター分子の１つは、前記多標的分子中の他のエフェクター分子と比べてより高いレベルで遺伝子発現を調節する。一部の実施形態では、多標的分子中の前記少なくとも２つのエフェクター分子は、同様のレベル（例えば、互いに１０％、７．５％、５％、２．５％以下の範囲内）で遺伝子発現を調節する。
【００１０】
本発明者らは、リガンドと共役された多標的分子が遺伝子発現を調節するのに特に有効であることを見出した。従って、一部の実施形態では、少なくとも１つのリガンドを多標的分子と共役させる。従って、少なくとも１つのリガンドと共役された多標的分子は、本明細書において「共役多標的分子」とも呼ばれる。限定なしに、リガンドは、多標的分子中のエフェクター分子のいずれかに存在し得る。さらに、リガンドは、エフェクター分子及び／又は多標的分子の任意の位置に存在し得る。例えば、リガンドは、多標的分子中のエフェクター分子の５’末端、３’末端、内部位置、又はこれらの組合せにおいて共役させることができる。一部の実施形態では、少なくとも２つのリガンドを多標的分子と共役させる。前記少なくとも２つのリガンドは、同じか、異なるか、又は同じ及び異なるものの任意の組合せであり得る。２つのリガンドは、独立に、多標的分子中の任意の位置において共役され得る。一部の実施形態では、多標的分子中の少なくとも２つのエフェクター分子には、少なくとも１つのリガンドが結合されている。特定の理論に拘束されることは意図しないが、リガンドは、共役多標的分子の送達又は薬物動態プロファイルを向上させることができる。
【００１１】
本明細書に開示する多標的分子中の少なくとも２つのエフェクター分子は、当技術分野において一般に公知であるような、及び本明細書に記載するヌクレオチドベースのリンカー又は非ヌクレオチドベースのリンカーを介して互いに共有結合され得る。従って、一部の実施形態では、２つのエフェクター分子は、ヌクレオチドベースのリンカーを介して互いに結合される。一部の他の実施形態では、２つのエフェクター分子は、非ヌクレオチドベースのリンカーを介して互いに結合される。
【００１２】
本明細書に開示されるように、本明細書に記載する多標的分子中の少なくとも２つのエフェクター分子は、互いに非共有結合され得る。従って、一部の実施形態では、多標的分子は、２つのエフェクター分子から組み立てられ、ここで、各エフェクター分子には、少なくとも１つのリガンドが結合されている。この一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、少なくとも１つのリガンドは、各ｓｉＲＮＡと共役される。
【００１３】
本明細書に開示されるように、本明細書に記載する多標的分子中の少なくとも２つのエフェクター分子は、ヌクレオチドベースのリンカーを介して互いに共有結合され得る。限定なしに、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、全てＤＮＡ、全てＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの混合物であり得る。一部の実施形態では、２つのエフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、全てＤＮＡである。ＲＮＡ及びＤＮＡは、天然及び修飾されたものであり得る。さらに、２つのエフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、非修飾であるか、又は本開示に記載する１つ又は複数の核酸修飾を含み得る。従って、一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む。
【００１４】
エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、１つ又は２つの核酸鎖を含むことができ、一本鎖であるか、二本鎖であるか、又は一本鎖及び二本鎖領域を含み得る。一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、二本鎖構造を形成しない２つの核酸鎖を含む。換言すれば、ヌクレオチドベースのリンカーは、互いにハイブリダイズしない２つの鎖を含む。一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、２つの核酸鎖を含み、鎖の１つが全てＤＮＡを含み、他の鎖がＤＮＡ及び２’−Ｏアルキル修飾の混合物を含む。一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するリンカーは、ヌクレオチド配列ｕｕｕ又は（ｄＴ）ｎ（ここで、ｎが１〜２０である）を含む。一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するリンカーは、−（ＣＨ２）１２−（Ｃ１２リンカー又はＱ５０）、−（ＣＨ２）６−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）６−（Ｃ６−Ｓ−Ｓ−Ｃ６リンカー又はＱ５１）、Ｑ１５１、Ｑ１７３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ここで、ｎが０又は１〜２０である）；−（ＣＨ２）９−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−（ここで、ｎが０又は１〜２０である）；リガンドと任意選択で共役されるモノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−又はポリプロリノール；リガンドと任意選択で共役される、モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−又はポリヒドロキシプロリノールからなる群から選択される分子を含む。一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するリンカーは、図１６〜２３及び２６に示されるものから選択される分子を含む。一部の実施形態では、リンカーは、「例示的なリガンドモノマー」と題されたセクションにおいて後述されるモノマーから選択されるモノマーを含む。例えば、段落［００３１６］〜［００３６５］において後述されるモノマー１〜３０である。例示的なリンカーが本開示の実施例セクション、例えば、実施例１〜２３にも記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一部の実施形態に係る多標的単一体コンジュゲートの設計を示す。
【図２】例示的な試験設計の概略図である。
【図３Ａ−３Ｂ】２つの異なる標的に対して向けられた２つのｓｉＲＮＡの混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。
【図４−１２】多標的分子の例示的実施形態のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。
【図１３】相対的タンパク質濃度によって測定した際の多標的分子の例示的実施形態の活性を示す。
【図１４】多標的単一体コンジュゲートの一実施形態からの二重鎖分析及び熱融解プロフィールを示す。
【図１５】いくつかの例示的な多標的分子の３つの基本設計の概略図である。
【図１６−１７】本発明の一部の実施形態に係る多標的分子−ＧａｌＮＡｃコンジュゲート（例えば、ビス（ｓｉＲＮＡ）−ＧａｌＮａｃコンジュゲート）の概略図である。
【図１８】本発明の一部の実施形態に係るいくつかの例示的な多標的分子設計の概略図を示す。
【図１９】多標的分子設計のためのいくつかの三分岐（ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）モノマーを示す。
【図２０】例示的なＧａｌＮＡｃ共役多標的分子（例えば、ビス（ｓｉＲＮＡ）−ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）の合成試薬の概略図を示す。
【図２１】いくつかの例示的なプロリノールベースのリンカーの分子を示す。
【図２２】例示的な合成後共役スキームを示す。
【図２３】架橋／リンカーにおける（１＋１）又は（１＋１＋１）型設計の例を示す。
【図２４−２５】本発明の実施形態に係るビス（ｓｉＲＮＡ）−ＧａｌＮＡｃ配向の概略図である。
【図２６】いくつかの例示的なリンカー及びモノマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以上の概要及び以下の詳細な説明のいずれも、例示及び説明を意図するものであり、特許請求の範囲に記載する通り、本発明を限定するものではないことは理解すべきである。本明細書において、単数形の使用は、特に別の記載がない限り、複数形を含む。本明細書で使用されるとき、「又は」の使用は、別に記載のない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、用語「含んでいる」並びに「含む」及び「含まれる」などの他の形態の使用も限定的ではない。また、「要素」又は「成分」などの用語は、特に別の記載がない限り、１単位を含む要素及び成分と、２サブユニット以上を含む要素及び成分との両方を包含する。
【００１７】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成を目的とするに過ぎず、記載される主題を限定するものとして解釈すべきではない。本願に引用される全ての文献、又は文献の一部、例えば、限定はしないが、特許、特許出願、論文、書籍、及び専門書は、あらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００１８】
本明細書に記載する様々な態様は、それぞれが標的遺伝子の遺伝子発現を調節することができる少なくとも２つの核酸ベースのエフェクター分子を含む多標的分子に基づくものである。限定なしに、多標的分子中の各エフェクター分子は、同じ標的遺伝子、異なる標的遺伝子、又は同じ標的遺伝子による異なる位置に向けられ得る。概して、多標的分子は、少なくとも２つのエフェクター分子を含む。
【００１９】
付着末端
本明細書に開示されるように、一部の実施形態では、多標的分子中の少なくとも２つのエフェクター分子は、エフェクター分子間のヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって互いに非共有結合され、各エフェクター分子は、それぞれ少なくとも１つのリガンドと共役される。例えば、第１のエフェクター分子のオリゴヌクレオチド鎖の一部は、第２のエフェクター分子のオリゴヌクレオチド鎖の一部とハイブリダイズする。
【００２０】
一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、２つのｓｉＲＮＡは、互いに非共有結合され得、各ｓｉＲＮＡには、少なくとも１つのリガンドが結合されている。従って、一部の実施形態では、多標的分子は、第１のｓｉＲＮＡ及び第２のｓｉＲＮＡを含み、ここで、第１のリガンドが第１のｓｉＲＮＡと共役され、及び第２のリガンドが第２のｓｉＲＮＡと共役される。概して、第１のｓｉＲＮＡの一部が第２のｓｉＲＮＡ分子の一部にハイブリダイズする。限定なしに、第１のｓｉＲＮＡの５’又は３’末端の一部のいずれかが、一本鎖（センス鎖又はアンチセンス鎖）の性質に応じて第２のｓｉＲＮＡの一部にハイブリダイズすることができる。
【００２１】
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、第１の鎖及び第２の鎖を含む。従って、一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の１つの一部が第２のｓｉＲＮＡ中の鎖の１つの一部にハイブリダイズする。ハイブリダイズする第１及び第２のｓｉＲＮＡの鎖は、両方ともセンス鎖、両方ともアンチセンス鎖又は一方のセンス鎖及びもう一方のアンチセンス鎖であり得る。
【００２２】
一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子の鎖の３’末端と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上）相補的である。一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端と完全に相補的である。一部の他の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端と完全に相補的である。一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端と完全に相補的である。一部の他の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端と完全に相補的である。
【００２３】
一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子の鎖の５’末端と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上）相補的である。一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端と完全に相補的である。一部の他の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５’末端と完全に相補的である。一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５’末端と完全に相補的である。一部の他の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端と完全に相補的である。一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の３’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子の鎖の５’末端と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上）相補的である。一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端と完全に相補的である。一部の他の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５’末端と完全に相補的である。一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５’末端と完全に相補的である。一部の他の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端は、第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端と完全に相補的である。
【００２４】
概して、第２のｓｉＲＮＡの鎖の一部と相補的な第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の一部は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり得る。同様に、第１のｓｉＲＮＡの鎖の一部と相補的な第２のｓｉＲＮＡ中の鎖の一部は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり得る。２つの部分が、同じ長さのものである必要がないことに留意する。従って、一方は他方より短くてもよい。
【００２５】
限定なしに、第１のｓｉＲＮＡ及び第２のｓｉＲＮＡの鎖間で相補的な長さは、生理学的条件下でハイブリダイゼーションに十分であるべきである。従って、相補的配列の長さは、約１ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの範囲であり得る。例えば、相補的配列の長さは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドであり得る。上述されるように、第１のｓｉＲＮＡ及び第２のｓｉＲＮＡの鎖間の完全な相補性は必要とされなくてもよい。従って、相補的部分は、１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上）のヌクレオチドミスマッチ、バルジ又はループを含み得る。
【００２６】
第２のｓｉＲＮＡの鎖との相補性を有する第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の部分は、全てＤＮＡ、全てＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの混合物であり得る。ＲＮＡ及びＤＮＡは、天然及び修飾されたものであり得る。従って、第２のｓｉＲＮＡの鎖との相補性を有する第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の部分は、非修飾であるか、又は本明細書に記載する１つ又は複数の核酸修飾を含み得る。
【００２７】
同様に、第１のｓｉＲＮＡの鎖との相補性を有する第２のｓｉＲＮＡ中の鎖の部分は、全てＤＮＡ、全てＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの混合物であり得る。ＲＮＡ及びＤＮＡは、天然及び修飾されたものであり得る。従って、第１のｓｉＲＮＡの鎖との相補性を有する第２のｓｉＲＮＡ中の鎖の部分は、非修飾であるか、又は本明細書に記載する１つ又は複数の核酸修飾を含み得る。
【００２８】
一部の実施形態では、第２のｓｉＲＮＡの鎖の一部と相補的な第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の一部は、全てＲＮＡである。一部の実施形態では、第２のｓｉＲＮＡの鎖の一部と相補的な第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の一部は、全てＤＮＡである。さらに、前記相補的領域は、非修飾であるか、又は本開示に記載する１つ又は複数の核酸修飾を含み得る。従って、一部の実施形態では、前記相補的領域は、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む。
【００２９】
一部の実施形態では、第２のｓｉＲＮＡの鎖との相補性を有する第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の部分は、全てＲＮＡであり、第１のｓｉＲＮＡの鎖との相補性を有する第２のｓｉＲＮＡ中の鎖の部分は、全てＤＮＡである。
【００３０】
別の実施形態では、第２のｓｉＲＮＡの鎖との相補性を有する第１のｓｉＲＮＡ中の鎖の部分及び第１のｓｉＲＮＡの鎖との相補性を有する第２のｓｉＲＮＡ中の鎖の部分は、両方ともＤＮＡである。
【００３１】
一部の実施形態では、多標的分子は、２つの別個のｓｉＲＮＡ分子から組み立てられ、ここで、各ｓｉＲＮＡには、少なくとも１つのリガンドが結合され、ここで、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の一部が第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の一部にハイブリダイズする。一部の他の実施形態では、多標的分子は、２つの別個のｓｉＲＮＡ分子から組み立てられ、各ｓｉＲＮＡには、少なくとも１つのリガンドが結合され、ここで、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の一部が第２のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の一部にハイブリダイズする。さらに他の実施形態では、多標的分子は、２つの別個のｓｉＲＮＡ分子から組み立てられ、ここで、各ｓｉＲＮＡには、少なくとも１つのリガンドが結合され、ここで、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の一部が第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の一部にハイブリダイズする。さらに他の実施形態では、多標的分子は、２つの別個のｓｉＲＮＡ分子から組み立てられ、ここで、各ｓｉＲＮＡには、少なくとも１つのリガンドが結合され、ここで、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の一部が第２のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の一部にハイブリダイズする。
【００３２】
それぞれ少なくとも１つのリガンドを有する少なくとも２つのｓｉＲＮＡが互いに非共有結合される、多標的分子の様々な実施形態では、多標的分子中のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端におけるリガンドと共に、その３’末端における一本鎖突出部を含み得る。本発明に関連して、一本鎖突出部とは、センス鎖の３’末端がその相補的なアンチセンス配列の５’末端を越えて伸長していることを意味する。限定なしに、突出部は、約１ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含み得る。例えば、一本鎖突出部は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドであり得る。
【００３３】
それぞれ少なくとも１つのリガンドを有する少なくとも２つのｓｉＲＮＡが互いに非共有結合される、多標的分子の様々な実施形態では、多標的分子中のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、センス鎖の３’末端におけるリガンドと共に、その３’末端における一本鎖突出部を含み得る。本発明に関連して、一本鎖突出部とは、アンチセンス鎖の３’末端がその相補的なセンス配列の５’末端を越えて伸長していることを意味する。限定なしに、突出部は、約１ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含み得る。例えば、一本鎖突出部は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドであり得る。
【００３４】
限定なしに、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖中の一本鎖突出部は、全てＤＮＡ、全てＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの混合物であり得る。一部の実施形態では、前記一本鎖突出部は、全てＲＮＡである。一部の実施形態では、前記一本鎖突出部は、全てＤＮＡである。さらに、一本鎖突出部は、非修飾であるか、又は本開示に記載する１つ又は複数の核酸修飾を含み得る。従って、一部の実施形態では、前記一本鎖突出部は、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖中の一本鎖突出部は、全てＲＮＡであり、第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖中の相補的な一本鎖は、全てＤＮＡである。別の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖中の一本鎖突出部は、全てＲＮＡであり、第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖中の相補的な一本鎖は、全てＤＮＡである。一部の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡ中の一本鎖突出部及び第２のｓｉＲＮＡ中の一本鎖突出部は両方ともＤＮＡである。
【００３６】
第１のｓｉＲＮＡ中の一本鎖突出部は、第２のｓｉＲＮＡのその相補的な鎖中の一本鎖突出部と同様の長さのものであり得る。さらに、他の配列の一本鎖突出部中に相補的な核酸塩基を有さない一本鎖突出部の５’末端において、０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の核酸塩基があり得る。従って、多標的分子中の２つのｓｉＲＮＡが一緒に組み立てられるとき、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖及び第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖の一本鎖突出部の３’末端間に０（例えば、切れ目）、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の核酸塩基のギャップがあり得る。また、同様に、多標的分子中の２つのｓｉＲＮＡが一緒に組み立てられるとき、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖及び第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖の一本鎖突出部の３’末端間に０（例えば、切れ目）、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の核酸塩基のギャップがあり得る。
【００３７】
それぞれ少なくとも１つのリガンドを有する少なくとも２つのｓｉＲＮＡが互いに非共有結合される、多標的分子の様々な実施形態では、前記少なくとも２つのリガンドは同じであり得、又はそれらは異なり得る。さらに、前記少なくともリガンドは、独立に、それぞれのｓｉＲＮＡの任意の位置において共役され得る。例えば、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され得、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され得るか、又は１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され得、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に結合され得るか、又は１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に結合され得、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に結合され得る。限定なしに、第１のリガンドは、独立に、第１のｓｉＲＮＡの１つの鎖（センス又はアンチセンス）の５’末端、３’末端又は内部位置において結合され得る。同様に、第２のリガンドは、独立に、第２のｓｉＲＮＡの１つの鎖（センス又はアンチセンス）の５’末端、３’末端又は内部位置において結合され得る。
【００３８】
一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の内部位置において共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖の内部位置において共役される。
【００３９】
一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の内部位置に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の内部位置において共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の内部位置に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の内部位置において共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の内部位置において共役される。
【００４０】
共有結合
一部の実施形態では、多標的分子中の少なくとも２つの核酸ベースのエフェクター分子は、当技術分野において一般に公知であるような、及び本明細書に記載するヌクレオチドベースのリンカー又は非ヌクレオチドベースのリンカーを介して互いに共有結合され得る。従って、一部の実施形態では、多標的分子中の少なくとも２つのエフェクター分子は、ヌクレオチドベースのリンカーを介して結合される。一部の他の実施形態では、少なくとも２つのエフェクター分子は、非ヌクレオチドベースのリンカーを介して結合される。
【００４１】
ヌクレオチドベースのリンカーが、一緒に結合される一方又は両方のエフェクター分子の一部を形成し得ることに留意する。これが意味することは、リンカーのヌクレオチド配列の少なくとも一部が、エフェクター分子の１つの機能に必要とされることである。好ましい実施形態では、リンカーのヌクレオチド配列は、エフェクター分子の一部を形成しない。換言すれば、エフェクター分子のいずれかは、遺伝子発現を調節するリンカーのヌクレオチド配列の任意の部分を必要としない。例えば、リンカー配列が、エフェクター分子から除去される場合、エフェクター分子は、依然として、リンカーが存在する場合と比べて同様のレベル（例えば、９５％以内）で遺伝子発現を調節することができる。エフェクター分子が、活性のために標的遺伝子との相補性を必要とする場合、リンカーは、標的配列との相補性のために必要とされるエフェクター分子の一部であっても又はそうでなくてもよい。一部の実施形態では、リンカーは、標的配列と相補性を有さないか（例えば、５％未満の相補性）又は標的配列にハイブリダイズする。
【００４２】
一部の実施形態では、２つのエフェクター分子を連結する二本鎖ヌクレオチドベースのリンカーの第１の鎖は、前記二本鎖ヌクレオチドベースのリンカーの第２の鎖と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、リンカーの第１の鎖は、リンカーの第２の鎖の核酸塩基配列と少なくとも７５％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上）相補的である核酸塩基配列を含む。一部の実施形態では、リンカーの第１の鎖は、２つのエフェクター分子を連結するリンカーの第２の鎖の核酸塩基配列と完全に相補的である核酸塩基配列を含む。
【００４３】
限定なしに、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、全てＤＮＡ、全てＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの混合物であり得る。一部の実施形態では、２つのエフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、全てＤＮＡである。ＲＮＡ及びＤＮＡは、天然及び修飾されたものであり得る。従って、一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む。リンカーの例示的な修飾としては、限定はしないが、ロックド核酸（例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ及びＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド、２’−ハロヌクレオシド（２’−Ｆヌクレオチドなど）、２’−アミノヌクレオシド、２’−Ｓ−アルキルヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’−シアノヌクレオシド、２’−メルカプトヌクレオシド；２’−ＭＯＥヌクレオシド、アクリルヌクレオシド、（Ｓ）−ｃＥｔモノマー、及び修飾ヌクレオチド間結合（リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホン酸水素、アルキル又はアリールホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチレンメチルイミノ、チオジエステル、チオノカルバメート、Ｎ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ボラノリン酸エステル、アミド、ヒドロキシアミノ、シロキサン、ジアルキルシロキサン、カルボキサミド、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、カルボン酸エステル、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、硫化物、スルホン酸塩、スルホンアミド、スルホン酸エステル、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンカルボニルアミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノ、エーテル、チオエーテル、及びチオアセトアミドなど）が挙げられる。核酸修飾が、本開示において以下により詳細に記載されている。
【００４４】
一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するリンカーと、エフェクター分子との間のヌクレオシド間結合の少なくとも１つは、修飾ヌクレオシド間結合である。一部の実施形態では、リンカーの５’末端をエフェクター分子の１つの３’末端に連結するヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。一部の実施形態では、リンカーの３’末端をエフェクター分子の１つの５’末端に連結するヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
【００４５】
一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するリンカーの５’及び／又は３’末端における第１の（例えば、第１、第２、第３、第４又は第５の）ヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。一部の実施形態では、リンカーの５’及び／又は３’末端からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
【００４６】
一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するリンカーは、リンカーの内部位置における少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上）の修飾ヌクレオシド間結合を含む。
【００４７】
限定なしに、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、任意の所望の長さのものであり得る。例えば、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、１ヌクレオチド〜５ヌクレオチド長の長さの範囲であり得る。特定の実施形態では、２つのエフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、４ヌクレオチド長である。
【００４８】
エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーが核酸修飾を含む場合、このような修飾は、リンカーにおける任意の位置に配置され得る。例えば、修飾は、リンカーの５’−ヌクレオチド、３’−ヌクレオチド又は内部ヌクレオチドにあり得る。一部の実施形態では、リンカーの５’及び／又は３’末端における第１の（例えば、第１、第２、第３、第４又は第５の）ヌクレオチドは、核酸修飾を含む。一部の実施形態では、リンカーの５’及び／又は３’末端からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のヌクレオチドは、核酸修飾を含む。一部の実施形態では、リンカーの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の内部ヌクレオチドは、核酸修飾を含む。一部の実施形態では、リンカーの内部ヌクレオチドは、センス鎖における全てのＤＮＡを含む。別の実施形態では、リンカーの内部ヌクレオチドは、アンチセンス鎖におけるＤＮＡ及び２’−Ｏアルキル修飾の混合物を含む。
【００４９】
エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、１つ又は２つの核酸鎖を含むことができ、一本鎖であるか、二本鎖であるか、又は一本鎖及び二本鎖領域を含み得る。一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、二本鎖構造を形成しない２つの核酸鎖を含む。換言すれば、ヌクレオチドベースのリンカーは、互いにハイブリダイズしない２つの鎖を含む。
【００５０】
一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、２つの核酸鎖を含み、ここで、リンカーの第１の鎖のヌクレオチド配列は、リンカーの第２の鎖のヌクレオチド配列との少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上）のヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態では、リンカーの鎖の少なくとも１つは、バルジ又はループを含む。例えば、リンカー鎖の少なくとも１つは、他のリンカー鎖との少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の連続又は不連続）の非相補的核酸塩基を含む。
【００５１】
限定なしに、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、本明細書に開示する１つ又は複数の核酸修飾を含み得る。エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーが２つの核酸鎖を含む場合、各鎖は、独立に、非修飾であるか、又は本明細書に開示する１つ又は複数の核酸修飾を含み得る。従って、一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、２つの核酸鎖を含み、ここで、各鎖は、非修飾である。一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、２つの核酸鎖を含み、ここで、１つの鎖は、非修飾であり、他の鎖は、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む。一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、２つの核酸鎖を含み、両方の鎖は、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びこれらの任意の組合せからなる群から独立に選択される少なくとも１つの修飾を含む。
【００５２】
一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、２つの核酸鎖を含み、鎖の１つが全てＤＮＡを含み、他の鎖がＤＮＡ及び２’−Ｏアルキル修飾の混合物を含む。
【００５３】
エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、一本鎖又は二本鎖ヌクレアーゼによる分解又は切断に対して耐性があり得る。或いは、エフェクター分子を連結するヌクレオチドベースのリンカーは、切断可能なリンカーであり得る。例えば、エフェクター分子を連結するリンカーは、一本鎖又は二本鎖ヌクレアーゼによって切断を行うことができる。
【００５４】
本明細書に記載されるように、多標的分子中のエフェクター分子を連結するリンカーは、非ヌクレオチドベースのリンカーであり得る。一部の実施形態では、２つのオリゴヌクレオチドを連結する非ヌクレオチドベースのリンカーは、切断可能な基を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、２つのオリゴヌクレオチドを連結する非ヌクレオチドベースのリンカーは、少なくとも１つのジスルフィド基を含む。
【００５６】
本明細書に開示されるように、一部の実施形態では、多標的分子中の少なくとも２つのエフェクター分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカーを介して互いに共有結合され、多標的分子は、少なくとも１つのリガンドとさらに共役される。限定なしに、リガンドは、多標的分子中のいずれの箇所に存在してもよい。例えば、リガンドは、リンカーによって共有結合される少なくとも２つのエフェクター分子の１つの端部、リンカーによって共有結合される少なくとも２つのエフェクター分子の１つにおける内部位置、又はリンカーにおける位置に存在し得る。
【００５７】
一部の実施形態では、一緒に共有結合される少なくとも２つのエフェクター分子を含む多標的分子は、少なくとも１つのリガンドと共役される。限定なしに、リガンドは同じであり得、又はそれらは異なり得る。２つのリガンドは、独立に、多標的分子中の任意の位置において共役され得る。例えば、第１のリガンドは、第１のエフェクター分子中に存在してもよく、第２のリガンドは、第１のエフェクター分子を第２のエフェクター分子に連結するリンカー中に存在してもよく、又は第１のリガンドは、第１のエフェクター分子中に存在してもよく、第２のリガンドは、第１のエフェクター分子に共有結合される第２のエフェクター分子中に存在してもよく；又は両方のリガンドが同じエフェクター分子中に存在してもよく；又は両方のリガンドが、エフェクター分子を連結するリンカー中に存在してもよい。
【００５８】
一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するリンカーは、Ｑ１５１（図２６）、Ｑ１７３（図２６）、図１９〜２４に示されるモノマー及び「例示的なリガンドモノマー」と題されたセクションにおいて後述されるモノマーからなる群から選択されるモノマーを含む。例えば、段落［００３１６］〜［００３６５］に記載されるモノマーである。限定なしに、リガンドは、リンカーにおける任意の位置に存在し得る。例えば、リガンドは、中央位置又はリンカーの中央の１、２、若しくは３モノマー又は単位以内に共役され得る。一部の実施形態では、モノマーを有するリガンドはリンカーとしての役割を果たす。
【００５９】
一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、２つのｓｉＲＮＡは、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカーを介して互いに共有結合される。一部の実施形態では、２つのｓｉＲＮＡを連結するリンカーは、ヌクレオチド配列ｕｕｕ又は（ｄＴ）ｎ（ここで、ｎが１〜２０である）を含む。一部の実施形態では、エフェクター分子を連結するリンカーは、−（ＣＨ２）１２−（Ｃ１２リンカー又はＱ５０）、−（ＣＨ２）６−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）６−（Ｃ６−Ｓ−Ｓ−Ｃ６リンカー又はＱ５１）、Ｑ１５１、Ｑ１７３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ここで、ｎが０又は１〜２０である）；−（ＣＨ２）９−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−（ここで、ｎが０又は１〜２０である）；リガンドと任意選択で共役されるモノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−又はポリプロリノール；リガンドと任意選択で共役される、モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−又はポリヒドロキシプロリノールからなる群から選択される分子を含む。一部の実施形態では、２つのｓｉＲＮＡを連結するリンカーは、図１６〜２３及び２６に示されるものから選択される分子を含む。一部の実施形態では、リンカーは、「例示的なリガンドモノマー」と題されたセクションにおいて後述されるモノマーから選択されるモノマーを含む。例えば、段落［００３１６］〜［００３６５］において後述されるモノマー１〜３０である。例示的なリンカーが本開示の実施例セクション、例えば、実施例１〜２３にも記載されている。
【００６０】
一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖が第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖に共有結合される。限定なしに、２つのセンス鎖は、任意の配向で互いに結合され得る。例えば、第１のセンス鎖の３’末端は、第２のセンス鎖の５’末端に結合され得；第１のセンス鎖の３’末端は、第２のセンス鎖の３’末端に結合され得；又は第１のセンス鎖の５’末端は、第２のセンス鎖の５’末端に結合され得る。
【００６１】
一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に共有結合される。限定なしに、２つのアンチセンス鎖は、任意の配向で互いに結合され得る。例えば、第１のアンチセンス鎖の３’末端は、第２のアンチセンス鎖の５’末端に結合され得；第１のアンチセンス鎖の３’末端は、第２のアンチセンス鎖の３’末端に結合され得；又は第１のアンチセンス鎖の５’末端は、第２のアンチセンス鎖の５’末端に結合され得る。
【００６２】
一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖が第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に共有結合される。限定なしに、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、任意の配向で第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に結合され得る。例えば、センス鎖の３’末端は、アンチセンス鎖の５’末端に結合され得；センス鎖の３’末端は、アンチセンス鎖の３’末端に結合され得；又はセンス鎖の５’末端は、アンチセンス鎖の５’末端に結合され得る。
【００６３】
一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖が第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖に共有結合され、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に共有結合される。一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖に共有結合され、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に共有結合される。
【００６４】
エフェクター分子
当業者であれば、２０〜２３、特に２１塩基対の二重螺旋構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチドがＲＮＡ干渉を誘導するのに特に有効であるとして認められていることは十分認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、他に、これより短い又は長い二本鎖オリゴヌクレオチドも有効となり得ることが見出されている。
【００６５】
一部の実施形態では、多標的分子中の少なくとも１つのエフェクター分子は、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくともｓｉＲＮＡを含む。本明細書で使用されるとき、用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する物質を指す。これらの物質は、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる細胞質多タンパク質複合体と結合する。ＲＮＡ干渉を誘導する上で有効な物質は、本明細書においてｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ剤、又はｉＲＮＡ剤とも呼ばれる。本明細書で使用されるとき、用語ｓｉＲＮＡは、マイクロＲＮＡ及びｐｒｅ−マイクロＲＮＡを含む。本明細書で使用されるとき、用語「ｓｉＲＮＡ活性」及び「ＲＮＡｉ活性」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングを指す。
【００６６】
二本鎖オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズして、二重螺旋構造を形成するのに十分に相補的である２つのオリゴヌクレオチド鎖を含む。一般に、二重螺旋構造は、１５〜３５、より一般的には１８〜２５、さらに一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１塩基対の長さである。一部の実施形態では、長さが２５〜３０塩基対と、より長い二本鎖オリゴヌクレオチドが好ましい。一部の実施形態では、長さが１０〜１５塩基対と、より短い二本鎖オリゴヌクレオチドが好ましい。別の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２１ヌクレオチド長である。
【００６７】
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、ここで、アンチセンスＲＮＡ鎖は、標的配列の少なくとも一部と相補的である相補性の領域を有し、二重螺旋領域は、１４〜３０ヌクレオチド長である。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、１４〜３０、より一般的には１８〜２５、さらに一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１ヌクレオチド長である。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、語句「アンチセンス鎖」は、目的とする標的配列に対して実質的に相補的、又は１００％相補的であるオリゴマー化合物を指す。「アンチセンス鎖」という語句は、２つの個別の鎖から形成される両オリゴマー化合物のアンチセンス領域、並びにヘアピン又はダンベル型構造を形成することができる単分子化合物を含む。用語「アンチセンス鎖」及び「ガイド鎖」は、本明細書では置き換え可能に使用される。
【００６９】
語句「センス鎖」は、メッセンジャーＲＮＡ又はＤＮＡの配列などの標的配列と、全部又は一部が同じヌクレオシド配列を有するオリゴマー化合物を指す。「センス鎖」及び「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書では置き換え可能に使用される。
【００７０】
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、若しくはそれを上回るヌクレオチチド対と等しいか、又は少なくともその長さである。
【００７１】
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、若しくはそれを上回るヌクレオチチド対と等しいか、又は少なくともその長さである。
【００７２】
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、若しくはそれを上回るヌクレオチチド対と等しいか、又は少なくともその長さである。
【００７３】
一部の実施形態では、１つの鎖は、二本鎖領域内に１〜１０個の一本鎖ヌクレオチドの少なくとも１区間を有する。「二本鎖領域内に一本鎖ヌクレオチドの区間」とは、別のヌクレオチドと塩基対を形成しない二本鎖領域内の少なくとも１つのヌクレオチドが存在することを意味する。一本鎖ヌクレオチドの区間が二本鎖領域の内部に存在する場合、一本鎖区間の両端に少なくとも１つのヌクレオチド塩基対が存在し得る。二本鎖領域の端部に存在する場合、一本鎖ヌクレオチドの区間は、一本鎖突出部であり得る。二本鎖領域内の一本鎖ヌクレオチドの区間は、バルジ又は１つ又は複数のミスマッチヌクレオチドの形態であり得る。一部の実施形態では、両方の鎖が、二本鎖領域内に１〜５（例えば、１、２、３、４、又は５）個の一本鎖ヌクレオチドから構成される少なくとも１区間を有する。両方の鎖が、二本鎖領域内に１〜５（例えば、１、２、３、４、又は５）個の一本鎖ヌクレオチドから構成される１区間を有する場合、このような一本鎖ヌクレオチドは、互いに反対（例えば、ミスマッチの区間）であってもよく、又は第２の鎖が第１の鎖の一本鎖オリゴヌクレオチドと反対の非塩基対ヌクレオチドを含まないようにこれらを配置することもでき、またその逆（例えば、一本鎖ループ）も可能である。一部の実施形態では、一本鎖ヌクレオチドは、いずれかの末端から８ヌクレオチド以内、例えば、２つの鎖の間の相補性の領域の５’又は３’末端のいずれかから８、７、６、５、４、３、若しくは２ヌクレオチドに存在する。
【００７４】
ヘアピン及びダンベルタイプオリゴヌクレオチドは、少なくとも１４、１５、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド対以上の二重螺旋領域を有し得る。二重螺旋領域は、２００、１００、又は５０以下の長さであってよい。一部の実施形態では、二重螺旋領域の範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、及び１９〜２１ヌクレオチド対の長さである。
【００７５】
一部の実施形態では、核酸ベースのエフェクター分子は、一部の実施形態では３’に、また一部の実施形態ではヘアピンのアンチセンス側に一本鎖突出部又は末端非対合領域を有し得るヘアピンオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、突出部は、１〜４、より一般的には２〜３ヌクレオチド長であった。ＲＮＡ干渉を誘導することができるヘアピンオリゴヌクレオチドは、本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とも呼ばれる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、２つのオリゴヌクレオチド鎖は、特定の結合が要望される条件下、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ若しくは治療処置の場合、生理学的条件下で、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合、アッセイが実施される条件下で、非標的核酸配列とアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に特異的にハイブリダイズする。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、「緊縮ハイブリダイゼーション条件」又は「緊縮条件」は、アンチセンス化合物がその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とは最小数にハイブリダイズする条件を指す。緊縮条件は、配列依存的であり、様々な状況で異なり、アンチセンス化合物が標的配列とハイブリダイズする「緊縮条件」は、アンチセンス化合物の性質及び組成、並びにそれらが試験されるアッセイによって決定される。
【００７８】
当技術分野では、ヌクレオチド親和性修飾の組み込みにより、非修飾活性化と比較して、より多くのミスマッチ数を達成し得ることが理解される。同様に、特定のオリゴヌクレオチド配列は、他のオリゴヌクレオチド配列よりミスマッチに対してより耐性であり得る。当業者は、オリゴヌクレオチド同士、又はオリゴヌクレオチド及び標的核酸同士の適切な数のミスマッチを、例えば、融解温度（Ｔｍ）の決定により、決定することができる。Ｔｍ又はΔＴｍは、当業者に周知である技術によって計算することができる。例えば、Ｆｒｅｉｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５，２２：４４２９−４４４３）に記載される技術により、当業者は、ヌクレオチド修飾を、それらがＲＮＡ：ＤＮＡ及びＲＮＡ：ＲＮＡ二重螺旋の融解温度を高める能力について評価することができる。
【００７９】
一部の実施形態では、エフェクター分子は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤、すなわちｓｉＲＮＡである。ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチドは、別の記載がない限り同義的に使用され得ることが理解される。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、各々、１４〜４０ヌクレオチドを有する。ｄｓＲＮＡ剤は、式（Ｉ）：
【化１】
2018520683.tif 000003
により表される。
【００８０】
式（Ｉ）中、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’は、各々独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’は、各々、２’−ＯＭｅ修飾を含む。
【００８１】
Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）とは反対の部位に配置される熱不安定化ヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位のヌクレオチドと対合するセンス鎖の１つの位置にある。Ｃ１ヌクレオチドは、熱不安定化修飾を担持し、これは、脱塩基修飾；二重螺旋中の反対側ヌクレオチドとのミスマッチ；並びに２’−デオキシ修飾又は非環状ヌクレオチド、例えば、アンロックド核酸（ＵＮＡ）若しくはグリセロール核酸（ＧＮＡ）などの糖修飾を含み得る。一部の実施形態では、Ｃ１は、ｉ）アンチセンス鎖の反対側ヌクレオチドとのミスマッチ；ｉｉ）
【化２】
2018520683.tif 000004
からなる群から選択される脱塩基修飾；及びｉｉｉ）
【化３】
2018520683.tif 000005
からなる群から選択される糖修飾からなる群から選択される熱不安定化修飾を有し、ここで、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、若しくはアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール若しくは糖である。一部の実施形態では、Ｃ１における熱不安定化修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、及びＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチ；及び任意選択で、ミスマッチ対における少なくとも１つの核酸塩基は、２’−デオキシ核酸塩基である。一例では、Ｃ１における熱不安定化修飾は、ＧＮＡ又は
【化４】
2018520683.tif 000006
である。
【００８２】
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに付与する修飾を含むヌクレオチドを示す。修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位にあるか、又は非リボースヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、又はヌクレオチドの骨格に対する修飾であってよく、この修飾は、リボース糖の２’位と類似又は均等であり、且つ２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに付与する。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルから選択される。一部の実施形態では、Ｔ１はＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｔ１’は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡである。一部の実施形態では、Ｔ２’は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。一部の実施形態では、Ｔ３’は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００８３】
ｎ１、ｎ３、及びｑ１は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長である。
【００８４】
ｎ５、ｑ３、及びｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長である。
【００８５】
ｎ４、ｑ２、及びｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長である。
【００８６】
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長である。
【００８７】
ｎ２及びｑ４は、独立に、０〜３ヌクレオチド長である。
【００８８】
或いは、ｎ４は、０〜３ヌクレオチド長である。
【００８９】
一部の実施形態では、ｎ４は、０であってよい。一例では、ｎ４は、０で、ｑ２及びｑ６は、１である。別の例では、ｎ４は、０で、ｑ２及びｑ６は、１であり、ここで、センス鎖の１〜５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（センス鎖の５’末端から数えて）を有し、アンチセンス鎖の１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を、また１８〜２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）を有する。
【００９０】
一部の実施形態では、ｎ４、ｑ２、及びｑ６は、各々、１である。
【００９１】
一部の実施形態では、ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４、及びｑ６は、各々、１である。
【００９２】
一部の実施形態では、センス鎖が、１９〜２２ヌクレオチド長であり、且つｎ４が１であるとき、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１４〜１７位にある。
【００９３】
一部の実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位で開始する。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は、１に等しい。
【００９４】
一部の実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位で開始する。一例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は、１に等しい。
【００９５】
一部の実施形態では、Ｔ１’及びＴ３’は、長さ１１ヌクレオチドだけ隔てられている（すなわち、Ｔ１’及びＴ３’ヌクレオチドを計数しない。
【００９６】
一部の実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にある。一例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は、１に等しく、非リボース、非環状若しくは骨格における１つ又は複数の２’位の修飾は、２’−ＯＭｅリボース修飾より小さい立体的嵩高さを付与する。
【００９７】
一部の実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にある。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は、１に等しく、非リボース、非環状若しくは骨格におけ１つ又は複数のる２’位の修飾は、２’−ＯＭｅリボース修飾より小さい立体的嵩高さを付与する。
【００９８】
一部の実施形態では、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にある。一例では、センス鎖が、１９〜２２ヌクレオチド長であり、且つｎ２が１であるとき、Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位にある。
【００９９】
一部の実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６位で開始する。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６〜１０位にあり、ｑ４は、１である。
【０１００】
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’−Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。
【０１０１】
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’−Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１〜５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（センス鎖の５’末端から数えて）を有し、アンチセンス鎖の１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を、また１８〜２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）を有する。
【０１０２】
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。
【０１０３】
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１〜５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（５’末端から数えて）を有し、アンチセンス鎖の１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を、また１８〜２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（５’末端から数えて）を有する。
【０１０４】
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’−Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−Ｆであり、ｑ７は、１である。
【０１０５】
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’−Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−Ｆであり、ｑ７は、１であり；ここで、センス鎖の１〜５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（センス鎖の５’末端から数えて）を有し、アンチセンス鎖の１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を、また１８〜２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）を有する。
【０１０６】
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−Ｆであり、ｑ７は、１である。
【０１０７】
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−Ｆであり、ｑ７は、１であり；ここで、センス鎖の１〜５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（センス鎖の５’末端から数えて）を有し、また、アンチセンス鎖の１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と、１８〜２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）を有する。
【０１０８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤の１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％又は３０％が、修飾されている。
【０１０９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス及びアンチセンス鎖の各々は、独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、又は２’−アラ−Ｆで修飾されている。
【０１１０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの異なる修飾を含有する。
【０１１１】
一部の実施形態では、式（Ｉ）のｄｓＲＮＡ剤は、１〜１０ヌクレオチド長の３’及び／又は５’突出部をさらに含む。一例では、式（Ｉ）のｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に３’突出部を含み、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。別の例では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端に５’末端突出部を有する。
【０１１２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２’−Ｆ修飾を一切含まない。
【０１１３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の２’−Ｆ修飾を含む。一例では、本発明のエフェクター分子は、９又は１０個の２’−Ｆ修飾を含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つ又は複数のブロックを含む。一例では、センス鎖は、２つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つのブロックを含む。一例では、アンチセンス鎖は、２つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含む。例えば、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックは、１６〜１８リン酸ヌクレオチド間結合により隔てられている。
【０１１５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス及びアンチセンス鎖の各々は、１５〜３０ヌクレオチドを有する。一例では、センス鎖は、１９〜２２ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、１９〜２５ヌクレオチドを有する。別の例では、センス鎖は、２１ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチドを有する。
【０１１６】
一部の実施形態では、二重螺旋におけるアンチセンス鎖の５’末端の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、及びｄＴからなる群から選択される。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から１番目、２番目、及び３番目の塩基対の少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。
【０１１７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡと１００％相補的であり、これとハイブリダイズして、ＲＮＡ干渉によりその発現を阻害する。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡと少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、又は少なくとも５０％相補的である。
【０１１８】
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有する。センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含有し、ここで、少なくとも１つの前記熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域とは反対の部位（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）又はその付近に存在する。例えば、センス鎖が、２１ヌクレオチド長のとき、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求性のある２’−ＯＭｅ修飾より小さい、少なくとも２つの修飾核酸を含有する。好ましくは、立体的要求性のある２’−ＯＭｅ修飾より小さい、２つの修飾核酸は、長さ１１ヌクレオチドだけ隔てられている。例えば、２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２及び１４位にある。
【０１１９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖配列は、式（Ｉｓ）：
【化５】
2018520683.tif 000007
により表され、
式中、
Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３は、各々独立に、２’−Ｏアルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）とは反対の部位に位置する熱不安定化ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡ又はＧＮＡ、ミスマッチ、脱塩基、若しくはＤＮＡなどの非環状ヌクレオチド）であり；
Ｔ１は、非リボース、非環状又は骨格の２’位又は均等な位置に化学修飾を含むヌクレオチドを示し、この修飾は、２’−ＯＭｅ修飾より小さい立体的嵩高さをヌクレオチドに付与し；例えば、Ｔ１は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択され；
ｎ１又はｎ３は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５は、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４は、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｎ２は、０〜３ヌクレオチド長である。
【０１２０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤の１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチド長のセンス鎖配列は、式（Ｉｓ）：
【化６】
2018520683.tif 000008
により表され、
式中、
Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３は、各々独立に、２’−Ｏアルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）とは反対の部位に位置する熱不安定化ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡ又はＧＮＡ、ミスマッチ、脱塩基、若しくはＤＮＡなどの非環状ヌクレオチド）であり；
Ｔ１は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを示し；
ｎ１又はｎ３は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５は、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４は、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｎ２は、０〜３ヌクレオチド長である。
【０１２１】
一部の実施形態では、式（Ｉｓ）のｄｓＲＮＡ剤は、１〜１０ヌクレオチド長の３’及び／又は５’突出部をさらに含む。一例では、式（Ｉｓ）のｄｓＲＮＡ剤は、５’突出部を含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、Ｃ１は、センス鎖の５’末端から１４、１５、１６又は１７位に１つの熱不安定化ヌクレオチドを含む。例えば、Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡ若しくはＧＮＡ）、ミスマッチ、脱塩基、又はＤＮＡである。１つの具体的な例では、Ｃ１は、ＧＮＡである。
【０１２３】
一部の実施形態では、Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位にＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、又は２’−Ｆ−５’−メチルを含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖（Ｉｓ）を含み、ここで、Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡ若しくはＧＮＡ）、ミスマッチ、脱塩基、又はＤＮＡであり；Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位にＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、又は２’−Ｆ−５’−メチルを含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、式（Ｉａ）：
【化７】
2018520683.tif 000009
により表され、
式中、
Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’は、各々独立に、２’−Ｏアルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、非リボース、非環状又は骨格の２’位又は均等な位置に化学修飾を含むヌクレオチドを示し、この修飾は、２’−ＯＭｅ修飾より低い立体的嵩高さをヌクレオチドに付与し；例えば、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択され；
ｑ１は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｑ３又はｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｑ２又はｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ４は、独立に、０〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長である。
【０１２６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤の１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長のアンチセンス鎖配列は、式（Ｉａ）：
【化８】
2018520683.tif 000010
により表され、
式中、
Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’，及びＢ４’は、各々独立に、２’−Ｏアルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを示し；
ｑ１は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｑ３又はｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｑ２又はｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ４は、独立に、０〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長である。
【０１２７】
一部の実施形態では、式（Ｉａ）のｄｓＲＮＡは、１〜１０ヌクレオチド長の３’及び／又は５’突出部をさらに含む。一例では、式（Ｉａ）のｄｓＲＮＡ剤は、３’突出部を有する。
【０１２８】
一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、各鎖が１４〜４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖：
【化９】
2018520683.tif 000011
を含み、
式中、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’は、各々独立に、２’−Ｏアルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡ又はＧＮＡ）であり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを示し；
ｎ１、ｎ３、又はｑ１は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３又はｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２又はｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｎ２又はｑ４は、独立に、０〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；
ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス及び／又はセンス鎖の１〜１０ヌクレオチド長の３’及び／又は５’突出部を有する。
【０１２９】
一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、各鎖が１４〜４０ヌクレオチドを有する、センス及びアンチセンス鎖：
【化１０】
2018520683.tif 000012
を含み、
式中、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’，及びＢ４’は、各々独立に、２’−Ｏアルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡ又はＧＮＡ）であり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを示し；
ｎ１、ｎ３、又はｑ１は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３又はｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２又はｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｎ２又はｑ４は、独立に、０〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；
ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド長の３’突出部を含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、各鎖が１５〜３０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖：
【化１１】
2018520683.tif 000013
を含み、
式中、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’は、各々独立に、２’−ＯＭｅ修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチドＧＮＡであり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、ＤＮＡ又はＲＮＡであり；
ｎ１、ｎ３、又はｑ１は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３又はｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２又はｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｎ２又はｑ４は、独立に、０〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；
ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に１〜６ヌクレオチド長の３’突出部を有する。
【０１３１】
一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、各鎖が１９〜２３ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖：
【化１２】
2018520683.tif 000014
を含み、
式中、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’は、各々独立に、２’−ＯＭｅ修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチドＧＮＡであり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、ＤＮＡ又はＲＮＡであり；
ｎ１、ｎ３、ｑ１、又はｑ３は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３又はｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２又はｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｎ２、ｑ４又はｑ５は、独立に、０〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；
ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド長の３’突出部を有する。
【０１３２】
一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、各鎖が１４〜４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖：
【化１３】
2018520683.tif 000015
を含み、
式中、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’は、各々独立に、２’−ＯＭｅ修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチドＧＮＡであり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、ＤＮＡ又はＲＮＡであり；
ｎ１、ｎ３、ｑ１、又はｑ３は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３又はｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２又はｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｎ２、ｑ４又はｑ５は、独立に、０〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；
ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド長の３’突出部を有する。
【０１３３】
一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、各鎖が１４〜４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖：
【化１４】
2018520683.tif 000016
を含み、
式中、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’は、各々独立に、２’−Ｏアルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡ又はＧＮＡ）であり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを示し；
ｎ１、ｎ３、又はｑ１は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３又はｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２又はｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｎ２又はｑ４は、独立に、０〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；
ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端に１〜１０ヌクレオチド長の５’突出部を有する。
【０１３４】
一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、各鎖が１４〜４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖：
【化１５】
2018520683.tif 000017
を含み、
式中、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’は、各々独立に、２’−Ｏアルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドを示し；
Ｃ１は、非環状ヌクレオチド（例えば、ＵＮＡ又はＧＮＡ）であり；
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’は、各々独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルからなる群から選択される化学修飾を含むヌクレオチドを示し；
ｎ１、ｎ３、又はｑ１は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長であり；
ｎ５、ｑ３又はｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長であり；
ｎ４、ｑ２又はｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長であり；
ｎ２又はｑ４は、独立に、０〜３ヌクレオチド長であり；
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長であり；
ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端に１〜１０ヌクレオチド長の５’突出部を有し、アンチセンス鎖の５’末端に１〜１０ヌクレオチドの３’突出部を有する。
【０１３５】
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、マイクロＲＮＡである。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば、本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合されるマイクロＲＮＡを少なくとも含む。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ又はｍｉｒ）は、植物及び動物のゲノム中のＤＮＡから転写されるが、タンパク質へと翻訳されない小ＲＮＡ分子の高度に保存されたクラスである。Ｐｒｅ−マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。プロセシングされるマイクロＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、発達、細胞増殖、アポトーシス及び分化の主要調節因子として同定された一本鎖約１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ分子である。それらは、特定のｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に結合することにより、遺伝子発現の調節に役割を果たすものと考えられる。ＲＩＳＣは、翻訳阻害、転写物切断、又はその両方により遺伝子発現の下方制御を媒介する。ＲＩＳＣは、広範囲にわたる真核生物の核内の転写サイレンシングにも関与している。
【０１３６】
マイクロＲＮＡは、宿主における病原体の調節にも関与している。例えば、Ｊｏｐｌｉｎｇ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）ｖｏｌ．３０９，ｐｐ  １５７７−１５８１を参照されたい。特定の理論に拘束されることは意図しないが、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物、及び／又は抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドの投与は、病原体の生存、増殖、発達、及び／又は複製の調節をもたらす。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物、及び／又は抗マイクロＲＮＡであり、ここで、マイクロＲＮＡは、宿主マイクロＲＮＡである。
【０１３７】
これまでに同定されたｍｉＲＮＡ配列の数は、多く且つ増加し続けており、その例示的な例は、例えば、“ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ  ＲＪ，ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ  Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ  ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４；“Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１；及びさらにワールドワイドウェブでｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｄｏｔ．ｓａｎｇｅｒ．ｄｏｔ．ａｃ．ｄｏｔ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／に見出される。
【０１３８】
成熟ｍｉＲＮＡは、概して５’末端の塩基２〜７を含む「シード領域」によって特徴付けられる。シード領域は、主に、その標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対するｍｉＲＮＡの特異性を定義するものと考えられ、コンピュータによる標的予測に使用されている。各ｍｉＲＮＡについて数百の標的ｍＲＮＡが予測されるが、比較的少ない標的がこれまでに実験により実証されている。最近のディープシーケンシング（ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）手法は、現在のｍｉＲＮＡデータベースの変化をもたらし、ｍｉＲＮＡ＊を有効なｍｉＲＮＡ分子として暗示している。さらに、ｍｉｒ−３０２ｂなどのいくつかのｍｉＲＮＡステムループでは、両方の５’及び３’ステムループ配列が成熟ｍｉＲＮＡとして注釈を付けられ、これは、両方のｍｉＲＮＡ鎖が機能特性を有し得ることを示唆している。
【０１３９】
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、リボザイムである。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合される少なくとも２つのリボザイムを含む。
【０１４０】
リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するオリゴヌクレオチドである（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８７  Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９８７  Ａｐｒ  ２４；４９（２）：２１１−２０）。少なくとも６つの基本的な種類の天然酵素ＲＮＡが現在知られている。概して、酵素核酸は、まず、標的ＲＮＡに結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断する役割を果たす分子の酵素部分にごく近接して保持される酵素核酸の標的結合部分によって行われる。従って、酵素核酸は、まず標的ＲＮＡを認識し、次に相補的な塩基対合によって標的ＲＮＡに結合し、適切な部位に結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされたタンパク質の直接合成のその能力を破壊するであろう。酵素核酸が、そのＲＮＡ標的に結合し、それを切断した後、それは、別の標的を探すためにそのＲＮＡから放出され、新たな標的に繰り返し結合し、それを切断することができる。
【０１４１】
任意の標的配列にターゲティングされたリボザイムを産生する方法が当技術分野において公知である。リボザイムは、国際特許出願公開国際公開第９３／２３５６９号パンフレット及び国際特許出願公開国際公開第９４／０２５９５号パンフレット（それぞれ参照により本明細書に明確に組み込まれる）に記載されるように設計され、これらの文献に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで試験されるように合成され得る。
【０１４２】
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、アプタマーである。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合される少なくとも２つのアプタマーを含む。アプタマーは、高い親和性及び特異性を有する該当する特定の分子に結合する核酸又はペプチド分子である（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５（１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８（１９９０））。大きいタンパク質からの多くの様々な実体を、小さい有機分子に結合するＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーが問題なく産生された。Ｅａｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１０−１６（１９９７）、Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：３２４−９（１９９９）、及びＨｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８２０−５（２０００）を参照されたい。アプタマーは、ＲＮＡ又はＤＮＡベースであり得る。概して、アプタマーは、ｖｉｔｒｏ選択又は同等にＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）を複数回にわたり繰り返すことにより、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織及び生物などの様々な分子標的に結合するように改変される。アプタマーは、合成、組み換え、及び精製方法を含む任意の公知の方法によって調製され得、単独で又は同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用され得る。さらに、本明細書により完全に記載されるように、用語「アプタマー」は、特に、２つ以上の公知のアプタマーを、所与の標的と比較することから得られるコンセンサス配列を含有する「二次アプタマー」を含む。
【０１４３】
転写因子が、周囲のゲノムＤＮＡの非存在下でさえ、それらの比較的短い結合配列を認識するため、特定の転写因子のコンセンサス結合配列を有する短いオリゴヌクレオチドは、生細胞内の遺伝子発現を操作するためのツールとして使用され得る。この手法は、このような「デコイオリゴヌクレオチド」の細胞内輸送を含み、次に、デコイオリゴヌクレオチドは、標的因子によって認識され、結合される。従って、一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、デコイオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合される少なくとも２つのデコイオリゴヌクレオチドを含む。
【０１４４】
デコイによる転写因子のＤＮＡ結合部位の占有により、転写因子は、標的遺伝子のプロモーター領域に後に結合することができなくなる。デコイは、転写因子によって活性化される遺伝子の発現を阻害するため、又は転写因子の結合によって抑制される遺伝子を上方制御するため、治療剤として使用され得る。デコイオリゴヌクレオチドの利用の例は、Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００，１０６：１０７１−１０７５に見出され、これは、全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｍｉＲＮＡ模倣物である。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ模倣物を含む。マイクロＲＮＡ模倣物（ｍｉＲＮＡ模倣物）は、１つ又は複数のｍｉＲＮＡの遺伝子調節活性を模倣するのに使用され得るクラスの分子を表す。従って、用語「マイクロＲＮＡ模倣物」は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡの源からの精製によって得られない）を指す。ｍｉＲＮＡ模倣物は、成熟分子（例えば、一本鎖）又は模倣物前駆体（例えば、ｐｒｉ−又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）として設計され得る。１つの設計では、ｍｉＲＮＡ模倣物は、（例えば、約１６〜約３１ヌクレオチド長の二重螺旋領域を有する）二本鎖分子であり、所与のｍｉＲＮＡの成熟鎖との同一性を有する１つ又は複数の配列を含む。二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は、二本鎖オリゴヌクレオチドについて上述されるのと同様の設計を有する。
【０１４６】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣物は、１６〜３１ヌクレオチドの二重螺旋領域及び以下の化学修飾パターンの１つ又は複数を含む：センス鎖は、（センスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２、並びにＣｓ及びＵｓの全ての２’−Ｏ−メチル修飾を含有し；アンチセンス鎖修飾は、Ｃｓ及びＵｓの全ての２’Ｆ修飾、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化、及び２ヌクレオチド３’突出部と結合された安定化ヌクレオチド間結合を含み得る。
【０１４７】
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、スーパーｍｉｒである。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合される少なくとも２つのスーパーｍｉｒを含む。スーパーｍｉｒは、ｍｉＲＮＡと実質的に同一であり、且つその標的に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する、例えば、一本鎖、二本鎖又は部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドを指す。この用語は、同様に機能する少なくとも１つの非天然部分を含むオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、スーパーｍｉｒは、センス鎖を含まず、別の好ましい実施形態では、スーパーｍｉｒは、かなりの程度まで自己ハイブリダイズしない。本発明の主題であるスーパーｍｉｒは、二次構造を有し得るが、それは、生理学的条件下で実質的に一本鎖である。実質的に一本鎖であるスーパーｍｉｒは、スーパーｍｉｒの約５０％未満（例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、又は５％未満）が、それ自体と二本鎖を形成する程度に一本鎖である。スーパーｍｉｒは、ヘアピンセグメントを含むことができ、例えば、配列は、好ましくは、３’末端において、自己ハイブリダイズし、二重螺旋領域、例えば、少なくとも１、２、３、又は４つ、好ましくは、８、７、６、又は５つ未満のヌクレオチド、例えば、５つのヌクレオチドの二重螺旋領域を形成することができる。二重螺旋領域は、リンカー、例えば、ヌクレオチドリンカー、例えば、３、４、５、又は６ｄＴ、例えば、修飾ｄＴによって連結され得る。別の実施形態では、スーパーｍｉｒは、例えば、３’及び５’末端の一方又は両方又は１つの端部及びスーパーｍｉｒの非末端又は中央において、例えば、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長のより短いオリゴと二本鎖を形成する。
【０１４８】
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、抗ｍｉｒである。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合される少なくとも２つの抗ｍｉｒを含む。用語「抗ｍｉｒ」、「マイクロＲＮＡ阻害剤」又は「ｍｉＲ阻害剤」は、同義であり、特定のｍｉＲＮＡの活性に干渉するオリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドを指す。阻害剤は、一本鎖、二本鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖）、及びヘアピン設計を含む様々な形態を取ることができ、概して、マイクロＲＮＡ阻害剤は、ターゲティングされるｍｉＲＮＡの成熟鎖（又は鎖）と相補的であるか又は部分的に相補的である１つ又は複数の配列又は配列の部分を含み、さらに、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲＮＡと逆相補的な配列の５’及び３’に位置するさらなる配列も含み得る。さらなる配列は、成熟ｍｉＲＮＡが得られるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡにおいて成熟ｍｉＲＮＡに隣接する配列と逆相補的であり得、又はさらなる配列は、任意配列であり得る（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、又はｄＴの混合物を有する）。一部の実施形態では、さらなる配列の一方又は両方は、ヘアピンを形成することが可能な任意配列である。従って、一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡと逆相補的な配列には、５’側及び３’側にヘアピン構造が配置されている。マイクロＲＮＡ阻害剤は、二本鎖である場合、逆鎖にヌクレオチド間のミスマッチを含み得る。さらに、マイクロＲＮＡ阻害剤は、細胞中への阻害剤の取り込みを促進するために、コンジュゲート部分に結合され得る。
【０１４９】
ヘアピンｍｉＲＮＡ阻害剤を含むマイクロＲＮＡ阻害剤は、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ａｒｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＲＩＳＣ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，ＲＮＡ  １３：７２３−７３０（２００７）並びに国際公開第２００７／０９５３８７号パンフレット及び国際公開第２００８／０３６８２５号パンフレット（これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。当業者は、所望のｍｉＲＮＡのデータベースから配列を選択し、本明細書に開示する方法に有用な阻害剤を設計することができる。
【０１５０】
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、アンタゴｍｉｒである。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合される少なくとも２つのアンタゴｍｉｒを含む。アンタゴｍｉｒｓは、ＲＮＡｓｅ保護並びに向上した組織及び細胞取り込みなどの薬理学的特性のために様々な修飾を有するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖の完全な２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート糖間結合、及び例えば３’末端におけるコレステロール−部分が通常のＲＮＡと異なる。好ましい実施形態では、アンタゴｍｉｒは、全てのヌクレオチドにおける２’−Ｏ−メチル修飾、３’末端におけるコレステロール部分、５’末端の最初の２つの位置における２つのホスホロチオエート糖間結合及び分子の３’末端における４つのホスホロチオエート結合を含む。アンタゴｍｉｒは、アンタゴｍｉｒ及び内在性ｍｉＲＮＡを含む二重鎖を形成することによって内在性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングするのに使用され得、それにより、ｍｉＲＮＡに誘導される遺伝子サイレンシングを防ぐ。アンタゴｍｉｒに媒介されるｍｉＲＮＡサイレンシングの一例は、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９（これは、全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる）に記載される、ｍｉＲ−１２２のサイレンシングである。
【０１５１】
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、Ｕ１アダプターである。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合される少なくとも２つのＵ１アダプターを含む。Ｕ１アダプターは、ポリＡ部位を阻害し、標的遺伝子の末端エキソン中の部位に相補的な標的ドメイン及びＵ１  ｓｎＲＮＰのＵ１のより小さい核ＲＮＡ成分に結合する「Ｕ１ドメイン」を有する二官能価オリゴヌクレオチドである。例えば、国際特許出願公開国際公開第２００８／１２１９６３号パンフレット及びＧｏｒａｃｚｎｉａｋ，ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７（３），２５７−２６３（これらのそれぞれは、全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる）を参照されたい。Ｕ１  ｓｎＲＮＰは、主に、ｐｒｅ−ｍＲＮＡエキソン−イントロン境界への結合によってスプライセオソーム形成における初期段階を指令するように機能するリボヌクレオタンパク質複合体である（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｐｓｏｎ，１９９８，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ４９：７７−９５）。
【０１５２】
一部の実施形態では、Ｕ１アダプターは、少なくとも１つのエフェクタードメイン（Ｕ１ドメイン）に結合された少なくとも１つのアニーリングドメイン（ターゲティングドメイン）を含み、ここで、アニーリングドメインは、標的遺伝子配列にハイブリダイズし、エフェクタードメインは、Ｕ１  ｓｎＲＮＰのＵ１  ｓｎＲＮＡにハイブリダイズする。一部の実施形態では、Ｕ１アダプターは、１つのアニーリングドメインを含む。一部の実施形態では、Ｕ１アダプターは、１つのエフェクタードメインを含む。
【０１５３】
特定の理論に拘束されることは意図しないが、アニーリングドメインは、典型的に、約１０〜約５０ヌクレオチド長、より典型的に、約１０〜約３０ヌクレオチド又は約１０〜約２０ヌクレオチドである。一部の好ましい実施形態では、アニーリングドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチド長である。アニーリングドメインは、標的遺伝子と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又はより好ましくは、１００％相補的であり得る。一部の実施形態では、アニーリングドメインは、末端コード領域及び３’ＵＴＲ及びポリアデニル化シグナル配列（例えば、ポリアデニル化部位を介して）を含む、ｐｒｅ−ｍＲＮＡの３’末端エキソン内の標的部位とハイブリダイズする。別の実施形態では、標的配列は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのポリ（Ａ）シグナル配列の約５００塩基対、約２５０塩基対、約１００塩基対、又は約５０塩基対以内である。一部の実施形態では、アニーリングドメインは、標的遺伝子配列との１、２、３、又は４つのミスマッチを含む。
【０１５４】
エフェクタードメインは、約８ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、又は約１０〜約１５ヌクレオチド長であり得る。Ｕｌドメインは、Ｕｌ  ｓｎＲＮＡ、特に、５’末端と、より特定的に、ヌクレオチド２〜１１とハイブリダイズすることができる。別の実施形態では、Ｕｌドメインは、内在性Ｕｌ  ｓｎＲＮＡのヌクレオチド２〜１１と完全に相補的である。一部の実施形態では、Ｕ１ドメインは、５’−ＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ−３’、５’−ＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ−３’、５’−ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ−３’、５’−ＣＡＧＧＵＡＡＧＵ−３’、５’−ＣＡＧＧＵＡＡＧ−３’及び５’−ＣＡＧＧＵＡＡ−３’からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｕ１ドメインは、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡ−３’を含む。特定の理論に拘束されることは意図しないが、ステム１への塩基対合及び／又はＵｌ  ｓｎＲＮＡの位置１への塩基対合を含むためにＵｌドメインの長さを増加させることにより、Ｕｌ  ｓｎＲＮＰに対するＵｌアダプターの親和性を向上させる。
【０１５５】
Ｕｌアダプターのアニーリング及びエフェクタードメインは、エフェクタードメインがアニーリングドメインの５’末端及び／又は３’末端にあるように結合され得る。２つのドメインは、一方のドメインの３’末端が他方のドメインの５’末端に結合されるか、又は一方のドメインの３’末端が他方のドメインの３’末端に結合されるか、又は一方のドメインの５’末端が他方のドメインの５’末端に結合されるように結合され得る。アニーリング及びエフェクタードメインは、互いに直接又はヌクレオチドベース若しくは非ヌクレオチドベースのリンカーによって結合され得る。リンカーがヌクレオチドベースである場合、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大１５、最大２０、又は最大２５ヌクレオチドを含み得る。
【０１５６】
一部の実施形態では、アニーリングドメインとエフェクタードメインとの間のリンカーは、多価、例えば、三価、四価又は五価である。特定の理論に拘束されることは意図しないが、多価リンカーは、単一のアニーリングドメインを複数のアダプタードメインと一緒に結合するのに使用され得る。
【０１５７】
Ｕ１アダプターが、本明細書に記載する任意のオリゴヌクレオチド修飾を含み得ることは理解すべきである。Ｕ１アダプターのための例示的な修飾としては、アニーリング親和性、特異性、細胞及び生物内におけるバイオアベイラビリティ、細胞及び／又は核輸送、安定性、及び／又は分解に対する耐性を向上させるものが挙げられる。
【０１５８】
最近の研究では、ｄｓＲＮＡが遺伝子発現も活性化することができること、すなわち、「小さいＲＮＡに誘導される遺伝子活性化」又はＲＮＡａ（活性化ＲＮＡ）と呼ばれている機構が見出された。例えば、Ｌｉ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（２００６），１０３（４６）：１７３３７−４２及びＬｉ  Ｌ．Ｃ．（２００８）．“Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”．ＲＮＡ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｈｉｄｄｅｎ  Ｌａｙｅｒ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ．Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ  ９７８−１−９０４４５５−２５−７を参照されたい。ｄｓＲＮＡターゲティング遺伝子プロモーターが関連遺伝子の強力な転写活性化を誘導することが示されている。ＲＮＡａを引き起こす内在性ｍｉＲＮＡは、ヒトにおいても見出されている。Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ（２００７）．４４８（７１５６）：８５５−８５８を確認されたい。
【０１５９】
別の驚くべき観察は、ＲＮＡａによる遺伝子活性化が長続きすることである。遺伝子発現の誘導は、１０日間以上続くことが分かった。ＲＮＡａの長期の効果は、ｄｓＲＮＡ標的部位における後成的変化に起因し得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ活性化剤は、遺伝子の発現を増加させることができる。一部の実施形態では、増加した遺伝子発現は、生存、成長発達、及び／又は複製を阻害する。
【０１６０】
従って、一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、活性化ＲＮＡである。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合される少なくとも２つの活性化ＲＮＡを含む。
【０１６１】
従って、一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）である。一部の実施形態では、多標的分子は、ヌクレオチドベース又は非ヌクレオチドベースのリンカー、例えば本開示に記載するリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合される少なくとも２つのＴＦＯを含む。最近の研究では、配列特異的に二重螺旋ＤＮＡ中のポリプリン／ポリピリミジン領域を認識し、それに結合することができる三重鎖形成性オリゴヌクレオチドが設計され得ることが示された。これらの認識規則は、Ｍａｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）ｖｏｌ．２４５，ｐｐ  ７２５−７３０；Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）ｖｏｌ．２３８，ｐｐ  ６４５−６３０；Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）ｖｏｌ．２５１，ｐｐ  １３６０−１３６３；Ｃｏｎｎｅｙ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）ｖｏｌ．２４１，ｐｐ  ４５６−４５９及びＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ３７５４０８に概説されている。挿入剤の導入及び糖間結合置換などのオリゴヌクレオチドの修飾、及び結合条件（ｐＨ及びカチオン濃度）の最適化は、電荷斥力及び不安定性などのＴＦＯ活性に対する固有の障害を克服するのに役立ち、合成オリゴヌクレオチドが特定の配列にターゲティングされ得ることが最近示された（最近の論述については、Ｓｅｉｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００３；ｌ  １２：４８７−９４を参照されたい）。概して、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、以下の配列対応を有する。
オリゴ３’−Ａ  Ｇ  Ｇ  Ｔ
二重鎖５’−Ａ  Ｇ  Ｃ  Ｔ
二重鎖３’−Ｔ  Ｃ  Ｇ  Ａ
【０１６２】
しかしながら、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣトリプレットが最大の三重螺旋安定性を有することが示された（Ｒｅｉｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｊｅｌｔｓｃｈ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，Ｓｅρｔｌ２，Ｅｐｕｂ）。同じ著者が、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣ規則に従って設計されたＴＦＯが非特異的三重鎖を形成しないことを実証しており、これは、三重鎖形成が実際に配列特異的であることを示す。
【０１６３】
従って、任意の所与の配列について三重鎖形成性配列が考案され得る。三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１５、より好ましくは、２５、さらにより好ましくは、３０以上のヌクレオチド長、最大５０又は１００ヌクレオチドである。
【０１６４】
標的ＤＮＡによる三重螺旋構造の形成は、立体及び機能変化を誘導し、転写の開始及び伸長を妨げ、内在性ＤＮＡにおける所望の配列変化の導入を可能にし、遺伝子発現の特異的な下方制御をもたらす。ＴＦＯで処理された細胞内の遺伝子発現のこのような抑制の例としては、哺乳動物細胞内のエピソームｓｕｐＦＧｌ及び内在性ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウト（Ｖａｓｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９９；２７：１１７６−８１、及びＰｕｒｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００１；２７６：２８９９１−９８）、並びに前立腺癌の病因において重要なＥｔｓ２転写因子（Ｃａｒｂｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２００３；３１：８３３−４３）、及び炎症誘発性ＩＣＡＭ−Ｉ遺伝子（Ｂｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００２；２７７：３２４７３−７９）の発現の配列特異的及び標的特異的な下方制御が挙げられる。さらに、Ｖｕｙｉｓｉｃｈ及びＢｅａｌは、最近、配列特異的ＴＦＯがｄｓＲＮＡに結合することができ、ＲＮＡ依存性キナーゼなどのｄｓＲＮＡ依存性酵素の活性を阻害することを示した（Ｖｕｙｉｓｉｃｈ  ａｎｄ  Ｂｅａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０００；２８：２３６９−７４）。
【０１６５】
さらに、上記の原理に従って設計されたＴＦＯは、ＤＮＡ修復を行うことが可能な定方向突然変異誘発を誘導し、従って、内在性遺伝子の発現の下方制御及び上方制御の両方を提供することができる（Ｓｅｉｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００３；１１２：４８７−９４）。有効なＴＦＯの設計、合成及び投与の詳細な説明は、Ｆｒｏｅｈｌｅｒらの米国特許出願公開第２００３  ０１７０６８号明細書及び同第２００３  ００９６９８０号明細書、並びにＥｍａｎｕｅｌｅらの同第２００２  ０１２８２１８号明細書及び同第２００２  ０１２３４７６号明細書、及びＬａｗｎに付与された米国特許第５，７２１，１３８号明細書（その内容は、全体として本明細書に組み込まれる）に見出される。
【０１６６】
核酸修飾
一部の実施形態では、多標的分子は、本明細書に記載する少なくとも１つの核酸修飾を含む。例えば、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾である。限定なしに、このような修飾は、多標的分子の中のいずれの箇所に存在してもよい。例えば、修飾は、エフェクター分子又は２つのエフェクター分子を連結するリンカーのうちの１つに存在し得る。
【０１６７】
核酸修飾（核酸塩基）
ヌクレオシドの天然に存在する塩基部分は、典型的に、複素環式塩基である。このような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基を糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分に連結することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際、これらのリン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて、直鎖ポリマー化合物を形成する。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものを指す。ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に存在する結合又は骨格は、３’−５’リン酸ジエステル結合である。
【０１６８】
プリン核酸塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン核酸塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）などの「非修飾」又は「天然」核酸塩基以外にも、当業者に周知の多くの修飾核酸塩基又は核酸塩基模倣物が本明細書に記載する化合物で使用可能である。非修飾又は天然核酸塩基は、改善された特性を有するオリゴヌクレオチドを提供するために修飾又は置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基又は合成及び天然核酸塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、若しくはツベルシジン）並びに本明細書に記載のオリゴマー修飾のいずれか１つを用いて調製することができる。或いは、上記塩基及び「ユニバーサル塩基」のいずれかの置換若しくは修飾類似体を使用することができる。天然塩基を非天然及び／又はユニバーサル塩基により置換する場合、本明細書において、このヌクレオチドは、修飾核酸塩基及び／又は核酸塩基修飾を含むと言われる。修飾核酸塩基及び／又は核酸塩基修飾はまた、共役部分、例えば、本明細書に記載のリガンドを含む天然、非天然及びユニバーサル塩基も含む。核酸塩基との共役のための好ましいコンジュゲート部分は、カチオン性アミノ基を含み、これらは、適切なアルキル、アルケニル、又はアミド結合を有するリンカーを介して核酸塩基と共役され得る。
【０１６９】
本明細書に記載するオリゴマー化合物は、核酸塩基（当技術分野では単純に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾又は置換も含むことができる。本明細書で使用されるとき、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。例示的な修飾核酸塩基として、限定はしないが、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２−（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２−（アミノプロピル）アデニン、２−（メチルチオ）−Ｎ６−（イソペンテニル）アデニン、６−（アルキル）アデニン、６−（メチル）アデニン、７−（デアザ）アデニン、８−（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８−（アルキニル）アデニン、８−（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８−（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６−（メチル）アデニン、Ｎ６，Ｎ６−（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２−（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６−（メチル）グアニン、７−（アルキル）グアニン、７−（メチル）グアニン、７−（デアザ）グアニン、８−（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８−（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８−（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８−（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ−（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３−（デアザ）−５−（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３−（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５−（ハロ）シトシン、５−（メチル）シトシン、５−（プロピニル）シトシン、５−（プロピニル）シトシン、５−（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４−（アセチル）シトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２−（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−４−（チオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−４−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−２，４−（ジチオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２，４−（ジチオ）ウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５−（アミノアリル）ウラシル、５−（アミノアルキル）ウラシル、５−（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５−（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５−（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５−（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５−（プロピニル）ウラシル、５−（プロピニル）ウラシル、５−（トリフルオロメチル）ウラシル、６−（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３−（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわち、プソイドウラシル）、２−（チオ）プソイドウラシル、４−（チオ）プソイドウラシル、２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１−置換プソイドウラシル、１−置換２（チオ）−プソイドウラシル、１−置換４−（チオ）プソイドウラシル、１−置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−４−（チオ）プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４−（チオ）プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンズイミダゾール、４−（メチル）ベンズイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２−（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５−置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、Ｏ６−置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イルなどの他の合成若しくは天然核酸塩基、又はこれらの任意のＯ−アルキル化若しくはＮ−アルキル化誘導体が挙げられる。或いは、上に挙げた塩基及び「ユニバーサル塩基」のいずれかの置換又は修飾類似体を使用することもできる。
【０１７０】
本明細書で使用されるとき、ユニバーサル核酸塩基は、融解挙動、細胞内酵素による認識又はオリゴヌクレオシド二重螺旋の活性に実質的に影響することなく、４つの天然に存在する核酸塩基の全てと塩基対合することができる任意の核酸塩基である。一部の例示的なユニバーサル核酸塩基として、限定はしないが、２，４−ジフルオロトルエン、ニトロピロリル、ニトロインドリル、８−アザ−７−デアザアデニン、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダズル、４−メチルベンズイミダズル、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナトラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、及びこれらの構造的誘導体（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照されたい）が挙げられる。
【０１７１】
さらなる核酸塩基として、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの；２００９年３月２６日に出願された国際出願ＰＣＴ／米国特許出願第０９／０３８４２５号明細書に開示されているもの；Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３により開示されているもの；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｉｎ，Ｐ．Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されているもの；並びにＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３により開示されているものが挙げられる。これら文献全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、例えば、７−デアザプリン、５−メチルシトシン、又はＧ−クランプなどの親核酸塩基と構造がかなり類似する核酸塩基である。いくつかの実施形態では、核酸塩基模擬物は、例えば、三環式フェノキサジン核酸塩基模擬物などのように、より複雑な構造を含む。前述した修飾核酸塩基の調製方法は、当業者に周知である。
【０１７３】
核酸修飾（糖）
本発明において提供される多標的分子は、修飾糖部分を有する、ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回る）のモノマーを含み得る。例えば、ヌクレオシドのフラノシル糖環は、いくつかの方法で修飾することができ、こうした方法として、限定はしないが、置換基の付加、２つの非ジェミナル環原子の架橋によるロックド核酸又は二環式核酸の形成などがある。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、ＬＮＡである１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回る）のモノマーを含む。
【０１７４】
ロックド核酸の一部の実施形態では、フラノシルの２’位は、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｏ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−、−［Ｃ（Ｒ１Ｒ２）］ｎ−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ１）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−及び−Ｎ（Ｒ１）−から独立に選択されるリンカーによって４’位に連結され；
式中、
ｘは、０、１、又は２であり；
ｎは、１、２、３、又は４であり；
各Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり；
各Ｊ１及びＪ２は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル又は保護基である。
【０１７５】
一部の実施形態では、ＬＮＡ化合物のリンカーの各々は、独立に、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１Ｒ２）−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−又は−Ｃ（Ｒ１Ｒ２）−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−である。別の実施形態では、前記リンカーの各々は、独立に、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−２’及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−２’−であり、ここで、各Ｒ１は、独立に、Ｈ、保護基又はＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０１７６】
いくつかのＬＮＡは、特許文献並びに科学文献で調製及び開示されている（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２；国際公開第９４／１４２２６号パンフレット；国際公開第２００５／０２１５７０号パンフレット；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９；ＬＮＡを開示する発行米国特許及び公開出願の例として、例えば、米国特許第７，０５３，２０７号明細書；同第６，２６８，４９０号明細書；同第６，７７０，７４８号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第７，０３４，１３３号明細書；及び同第６，５２５，１９１号明細書；並びに米国特許出願公開第２００４−０１７１５７０号明細書；同第２００４−０２１９５６５号明細書；同第２００４−００１４９５９号明細書；同第２００３−０２０７８４１号明細書；同第２００４−０１４３１１４号明細書；及び同第２００３００８２８０７号明細書が挙げられる。
【０１７７】
リボシル糖環の２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結され、これにより、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）結合を形成して、二環式糖部分を形成するＬＮＡも本明細書において提供される（Ｅｌａｙａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８  １−７；及びＯｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３に論述される；米国特許第６，２６８，４９０号明細書及び同第６，６７０，４６１号明細書も参照されたい）。連結は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ２−）基であってよく、その場合、この二環式部分には用語メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡが用いられ；この位置にエチレン基がある場合、用語エチレンオキシ（４’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡが用いられる（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６：Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，１１，２２１１−２２２６）。メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及び他の二環式糖類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡとの非常に高い二重螺旋熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性及び良好な溶解性を示す。ＢＮＡを含む強力且つ非毒性アンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）。
【０１７８】
同じく取り上げられているメチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡの異性体は、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡであり、これは、３’−エキソヌクレアーゼに対する優れた安定性を有することが示されている。α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡは、アンチセンスギャップマー及びキメラに組み込まれて、これらは、強力なアンチセンス活性を示した（Ｆｒｉｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。
【０１７９】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡモノマーアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー化及び核酸認識特性と共に記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＢＮＡ及びその調製も国際公開第９８／３９３５２号パンフレット及び国際公開第９９／１４２２６号パンフレットに記載されている。
【０１８０】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡの類似体、ホスホロチオエート−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡも調製されている（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキリボヌクレオチド二重螺旋を含むロックドヌクレオシド類似体の調製も記載されている（Ｗｅｎｇｅｌらの国際公開第９９／１４２２６号パンフレット）。さらにまた、新規の配座固定された高親和性オリゴヌクレオチド類似体である２’−アミノ−ＬＮＡの合成も当技術分野で記載されている（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９）。さらには、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＬＮＡが調製され、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖とのそれらの二重螺旋の熱安定性が既に報告されている。
【０１８１】
修飾糖部分は、よく知られており、その標的に対するアンチセンス化合物の親和性を改変する、典型的には、増大する、及び／又はヌクレアーゼ耐性を増大するために使用することができる。好ましい修飾糖の代表的なリストには、限定はしないが、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及びエチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’架橋）ＥＮＡを含む二環式修飾糖；置換された糖、特に、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３又は２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３置換基を有する２’置換糖；及び４’−チオ修飾糖が含まれる。また、糖は、とりわけ糖模擬基で置換することもできる。修飾糖の調製方法は、当業者に周知である。こうした修飾糖の調製を教示するいくつかの代表的な特許及び刊行物として、限定はしないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；同第５，７９２，７４７号明細書；同第５，７００，９２０号明細書；同第６，５３１，５８４；及び同第６，６００，０３２号明細書；並びに国際公開第２００５／１２１３７１号パンフレットが挙げられる。
【０１８２】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例として、アルコキシ又はアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール若しくは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、ｎ＝１〜５０；ヌクレオシドのフラノース部分が、フラノース環上の２つの炭素原子を連結する架橋を含み、それにより二環式環系を形成する「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ又はＯ−（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（ｎ＝１〜１０、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノ）；及びＯ−ＣＨ２ＣＨ２（ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２が挙げられる。
【０１８３】
「デオキシ」修飾として、水素（すなわち、突出一本鎖と特に関連するデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ）；−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖）；シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；チオアルキル；アルキル；シクロアルキル；アリール；アルケニル及びアルキニルが挙げられ、これらは、任意選択で、例えば、アミノ官能基で置換することができる。
【０１８４】
他の好適な２’−修飾、例えば、修飾ＭＯＥが、米国特許出願公開第２０１３０１３０３７８号明細書（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１８５】
２’位の修飾は、アラビノース立体配置に存在し得る。用語「アラビノース立体配置」は、アラビノースにおける２’−ＯＨと同じ立体配置のリボースのＣ２’上の置換基の配置を指す。
【０１８６】
糖は、糖の同じ炭素に２つの異なる修飾、例えば、ｇｅｍ修飾を含むことができる。糖基は、リボースにおける対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する１個又は複数個の炭素を含有することもできる。従って、オリゴマー化合物は、糖として、例えば、アラビノースを含有する１つ又は複数のモノマーを含み得る。モノマーは、糖の１’位にα−結合、例えば、α−ヌクレオシドを有してもよい。モノマーはまた、４’位に反対の立体配置を有してもよく、例えば、Ｃ５’及びＨ４’又はこれらを置換する置換基同士が交換される。Ｃ５’及びＨ４’又はこれらを置換する置換基同士が交換されている場合、この糖は、４’位で修飾されていると言う。
【０１８７】
本明細書に開示する多標的分子は、脱塩基糖、すなわち、Ｃ−１’に核酸塩基が欠落しているか、又はＣ１’の核酸塩基の代わりに別の化学基を有する糖も含み得る。例えば米国特許第５，９９８，２０３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらの脱塩基糖はまた、１個又は複数個の構成糖原子に修飾をさらに含むこともできる。多標的分子は、Ｌ異性体、例えばＬ−ヌクレオシドである１つ又は複数の糖を含有することもできる。糖基に対する修飾は、硫黄、任意選択で置換された窒素若しくはＣＨ２基による４’−Ｏの置換も含み得る。一部の実施形態では、Ｃ１’と核酸塩基との連結は、α立体配置である。
【０１８８】
糖修飾はまた、リボース炭素同士のＣ−Ｃ結合（例えば、Ｃ１’−Ｃ２’、Ｃ２’−Ｃ３’、Ｃ３’−Ｃ４’、Ｃ４’−Ｏ４’、Ｃ１’−Ｏ４’）が存在しない、且つ／又はリボース炭素又は酸素（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’又はＯ４’）の少なくとも１つが独立に若しくは組合せでヌクレオチドに存在しない、非環状ヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、
【化１６】
2018520683.tif 000018
であり、ここで、Ｂは、修飾若しくは非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、又はアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール若しくは糖である）。
【０１８９】
一部の実施形態では、糖修飾は、２’−Ｈ、２’−Ｏ−Ｍｅ（２’−Ｏ−メチル）、２’−Ｏ−ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−Ｆ、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｓ−メチル、２’−Ｏ−ＣＨ２−（４’−Ｃ）（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−（４’−Ｃ）（ＥＮＡ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）及びアラビノース立体配置に２’−Ｏ−Ｍｅを有するｇｅｍ  ２’−ＯＭｅ／２’Ｆからなる群から選択される。
【０１９０】
特定のヌクレオチドがその２’位を介して次のヌクレオチドと連結している場合、本明細書に記載の糖修飾は、その特定のヌクレオチド、例えば、その２’位を介して連結しているヌクレオチドについて、糖の３’位に配置することができることは理解すべきである。３’位の修飾は、キシロース立体配置で存在し得る。用語「キシロース立体配置」は、キシロース糖の３’−ＯＨと同じ立体配置でのリボースのＣ３’上の置換基の配置を指す。
【０１９１】
Ｃ４’及び／又はＣ１’に結合した水素は、直鎖又は分岐状の、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニルにより置換することができ、アルキル、アルケニル及びアルキニルの骨格は、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ’）、Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、ＣＨ（Ｚ’）、リン含有結合、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、任意選択で置換された複素環式又は任意選択で置換されたシクロアルキルのうちの１つ又は複数を含有することができ、ここで、Ｒ’は、水素、アシル又は任意選択で置換された脂肪族であり、Ｚ’は、ＯＲ１１、ＣＯＲ１１、ＣＯ２Ｒ１１、
【化１７】
2018520683.tif 000019
ＮＲ２１Ｒ３１、ＣＯＮＲ２１Ｒ３１、ＣＯＮ（Ｈ）ＮＲ２１Ｒ３１、ＯＮＲ２１Ｒ３１、ＣＯＮ（Ｈ）Ｎ＝ＣＲ４１Ｒ５１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（＝ＮＲ３１）ＮＲ２１Ｒ３１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ３１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｓ）ＮＲ２１Ｒ３１、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ３１、ＳＣ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ３１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｓ）ＯＲ１１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｏ）ＳＲ１１、Ｎ（Ｒ２１）Ｎ＝ＣＲ４１Ｒ５１、ＯＮ＝ＣＲ４１Ｒ５１、ＳＯ２Ｒ１１、ＳＯＲ１１、ＳＲ１１、及び置換若しくは非置換複素環式からなる群から選択され；Ｒ２１及びＲ３１は、それぞれの存在について、独立に、水素、アシル、非置換若しくは置換脂肪族、アリール、ヘテロアリール、複素環式、ＯＲ１１、ＣＯＲ１１、ＣＯ２Ｒ１１、又はＮＲ１１Ｒ１１’であるか；或いはＲ２１及びＲ３１は、それらが結合する原子と一緒に、複素環を形成し；Ｒ４１及びＲ５１は、それぞれの存在について、独立に、水素、アシル、非置換若しくは置換脂肪族、アリール、ヘテロアリール、複素環式化合物、ＯＲ１１、ＣＯＲ１１、若しくはＣＯ２Ｒ１１、又はＮＲ１１Ｒ１１’であり；Ｒ１１及びＲ１１’は、独立に、水素、脂肪族、置換脂肪族、アリール、ヘテロアリール、又は複素環式である。一部の実施形態では、５’末端ヌクレオチドのＣ４’に結合した水素は、置換されている。
【０１９２】
一部の実施形態では、Ｃ４’及びＣ５’は、一緒に、好ましくは、少なくとも１つの−ＰＸ（Ｙ）−を含む、任意選択で置換された複素環式を形成し、ここで、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ＯＭ、ＳＨ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルキルチオ、任意選択で置換されたアルキルアミノ又は任意選択で置換されたジアルキルアミノであり、ここで、Ｍは、それぞれの存在について、独立に、総電荷が＋１のアルキル金属又は遷移金属であり；Ｙは、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ’であり、ここで、Ｒ’は、水素、任意選択で置換された脂肪族である。この修飾は、オリゴヌクレオチドの５末端にあるのが好ましい。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、ＬＮＡは、式：
【化１８】
2018520683.tif 000020
を有する二環式ヌクレオシドを含み、
式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ１は、Ｈ又はヒドロキシル保護基であり；
Ｔ２は、Ｈ、ヒドロキシル保護基又は反応性リン基であり；
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、又は置換アミドである。
【０１９４】
一部の実施形態では、置換された基の各々は、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２及びＣＮ（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である）から独立に選択される、任意選択で保護された置換基で一又は多置換されている。
【０１９５】
いくつかのこうした実施形態では、置換された基の各々は、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、及びＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、若しくは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ若しくはＮＪ１である）から独立に選択される置換基で一又は多置換されている。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、Ｚ基は、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮ（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である）である。別の実施形態では、Ｚ基は、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）、置換アルコキシ又はアジドである。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、Ｚ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮ（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である）である。別の実施形態では、Ｚ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
【０１９８】
いくつかのこうした実施形態では、Ｚ基は、（Ｒ）−配置：
【化１９】
2018520683.tif 000021
である。
【０１９９】
いくつかのこうした実施形態では、Ｚ基は、（Ｓ）−配置：
【化２０】
2018520683.tif 000022
である。
【０２００】
いくつかの実施形態では、各Ｔ１及びＴ２は、ヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基の好ましいリストは、ベンジル、ベンゾイル、２，６−ジクロロベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、メシレート、トシレート、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ１は、アセチル、ベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル及びジメトキシトリチルから選択されるヒドロキシル保護基であり、より好ましいヒドロキシル保護基は、４，４’−ジメトキシトリチルであるＴ１である。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、Ｔ２は、反応性リン基であり、好ましい反応性リン基として、ジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイト及びＨ−ホスホネートが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｔ１は、４，４’−ジメトキシトリチルであり、Ｔ２は、ジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイトである。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、式：
【化２１】
2018520683.tif 000023
又は式：
【化２２】
2018520683.tif 000024
又は式：
【化２３】
2018520683.tif 000025
の少なくとも１つのモノマーを含み、
式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ３は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結したコンジュゲート基、又はヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、モノマーサブユニット若しくはオリゴマー化合物に結合したヌクレオシド間結合基であり；
Ｔ４は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結したコンジュゲート基、又はヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、モノマーサブユニット若しくはオリゴマー化合物に結合したヌクレオシド間結合基であり；
ここで、Ｔ３及びＴ４の少なくとも１つは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、モノマーサブユニット若しくはオリゴマー化合物に結合したヌクレオシド間結合基であり；
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、又は置換アミドである。
【０２０３】
一部の実施形態では、置換された基の各々は、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２及びＣＮ（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である）から独立に選択される、任意選択で保護された置換基で、一又は多置換されている。
【０２０４】
一部の実施形態では、置換された基の各々は、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、及びＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ若しくはＮＪ１である）から独立に選択される置換基で、一又は多置換されている。
【０２０５】
いくつかのこうした実施形態では、少なくとも１つのＺは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル又は置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキル又は置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、メチルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、メチルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、エチルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、エチルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、独立に、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、置換メチルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、置換メチルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、置換エチルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、置換エチルである。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの置換基は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシである（例えば、少なくとも１つのＺは、１つ又は複数のＣ１〜Ｃ６アルコキシで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。別の実施形態では、各置換基は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシである（例えば、各Ｚは、独立に、１つ又は複数のＣ１〜Ｃ６アルコキシで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣ１〜Ｃ６アルコキシ置換基は、ＣＨ３Ｏ−である（例えば、少なくとも１つのＺは、ＣＨ３ＯＣＨ２−である）。別の実施形態では、各Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ置換基は、ＣＨ３Ｏ−である（例えば、各Ｚは、ＣＨ３ＯＣＨ２−である）。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの置換基は、ハロゲンである（例えば、少なくとも１つのＺは、１つ又は複数のハロゲンで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。いくつかの実施形態では、各置換基は、独立に、ハロゲンである（例えば、各Ｚは、独立に、１つ又は複数のハロゲンで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのハロゲン置換基は、フルオロである（例えば、少なくとも１つのＺは、ＣＨ２ＦＣＨ２−、ＣＨＦ２ＣＨ２−又はＣＦ３ＣＨ２−である）。いくつかの実施形態では、各ハロ置換基は、フルオロである（例えば、各Ｚは、独立に、ＣＨ２ＦＣＨ２−、ＣＨＦ２ＣＨ２−又はＣＦ３ＣＨ２−である）。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの置換基は、ヒドロキシルである（例えば、少なくとも１つのＺは、１つ又は複数のヒドロキシルで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。いくつかの実施形態では、各置換基は、独立に、ヒドロキシルである（例えば、各Ｚは、独立に、１つ又は複数のヒドロキシルで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、ＨＯＣＨ２−である。別の実施形態では、各Ｚは、ＨＯＣＨ２−である。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ２ＯＣＨ３−、ＣＨ２Ｆ−又はＨＯＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、各Ｚは、独立に、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ２ＯＣＨ３−、ＣＨ２Ｆ−又はＨＯＣＨ２−である。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である。別の実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、各Ｚ基は、独立に、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である。別の実施形態では、各Ｚ基は、独立に、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、各Ｚ基は、独立に、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である。別の実施形態では、各Ｚ基は、独立に、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、ＣＨ３−である。別の実施形態では、各Ｚは、ＣＨ３−である。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのモノマーのＺ基は、式：
【化２４】
2018520683.tif 000026
又は式：
【化２５】
2018520683.tif 000027
又は式：
【化２６】
2018520683.tif 000028
により表される（Ｒ）−配置である。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、上記式の各モノマーのＺ基は、（Ｒ）−配置である。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのモノマーのＺ基は、式：
【化２７】
2018520683.tif 000029
又は式：
【化２８】
2018520683.tif 000030
又は式：
【化２９】
2018520683.tif 000031
により表される（Ｓ）−配置である。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、上記式の各モノマーのＺ基は、（Ｓ）−配置である。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、Ｔ３は、Ｈ又はヒドロキシル保護基である。いくつかの実施形態では、Ｔ４は、Ｈ又はヒドロキシル保護基である。別の実施形態では、Ｔ３は、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はモノマーサブユニットに結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ４は、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はモノマーサブユニットに結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ３は、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ４は、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ３は、オリゴマー化合物に結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ４は、オリゴマー化合物に結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ３及びＴ４の少なくとも１つは、リン酸ジエステル又はホスホロチオエートから選択されるヌクレオシド間結合基を含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、式：
【化３０】
2018520683.tif 000032
又は式：
【化３１】
2018520683.tif 000033
又は式：
【化３２】
2018520683.tif 000034
の少なくとも２つの連続したモノマーの少なくとも１つの領域を含む。
【０２２２】
いくつかのこうした実施形態では、ＬＮＡとして、限定はしないが、
【化３３】
2018520683.tif 000035
に示すように、（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＬＮＡ及び（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＬＮＡが挙げられる。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、上の式の少なくとも２つの連続したモノマーの少なくとも２つの領域を含む。いくつかの実施形態では、多標的分子は、ギャップモチーフを含む。いくつかの実施形態では、多標的分子は、約８〜約１４個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシルヌクレオシドの少なくとも１つの領域を含む。いくつかの実施形態では、多標的分子は、約９〜約１２個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシルヌクレオシドの少なくとも１つの領域を含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、式：
【化３４】
2018520683.tif 000036
（式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分である）
の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回る）の（Ｓ）−ｃＥｔモノマーを含む。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、モノマーは、糖模倣物を含む。いくつかのこうした実施形態では、糖又は糖−ヌクレオシド間結合組合せの代わりに、模倣物を使用し、核酸塩基は、選択される標的とのハイブリダイゼーションのために維持する。糖模倣物の代表的な例として、限定はしないが、シクロヘキセニル又はモルホリノが挙げられる。糖−ヌクレオシド間結合組合せの模倣物の代表的な例として、限定はしないが、非荷電アキラル結合により連結されたペプチド核酸（ＰＮＡ）及びモルホリノ基が挙げられる。一部の事例では、核酸塩基の代わりに模倣物を用いる。代表的な核酸塩基模倣物は当技術分野でよく知られており、限定はしないが、三環式フェノキサジン類似体及びユニバーサル塩基（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２０００，２８：２９１１−１４、参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。糖、ヌクレオシド及び核酸塩基模倣物の合成方法は、当業者に周知である。
【０２２６】
核酸修飾（糖間結合）
本明細書には、モノマー（限定はしないが、修飾及び非修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを含む）を互いに連結し、それによってオリゴマー化合物、例えば、オリゴヌクレオチドを形成する結合基を記載する。こうした結合基は、糖間結合とも呼ばれる。２つの主要なクラスの結合基は、リン原子の存在又は非存在によって区別される。代表的なリン含有結合として、限定はしないが、リン酸ジエステル（Ｐ＝Ｏ）、リン酸トリエステル、ホスホン酸メチル、ホスホロアミデート、及びホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられる。代表的な非リン含有結合基として、限定はしないが、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）；シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）；及びＮ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）が挙げられる。天然のリン酸ジエステル結合と比較して、修飾された結合は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を改変、典型的には増大するために使用することができる。いくつかの実施形態では、キラル原子を有する結合は、個別の鏡像体として、ラセミ混合物として調製することができる。代表的なキラル結合として、限定はしないが、ホスホン酸アルキル及びホスホロチオエートが挙げられる。リン含有及び非リン含有結合の調製方法は、当業者に周知である。
【０２２７】
結合基中のリン酸基は、酸素の１つを異なる置換基で置換することにより修飾することができる。この修飾による結果の１つは、核酸分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性増大であり得る。修飾リン酸基の例として、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びリン酸トリエステルが挙げられる。一部の実施形態では、連結における非架橋リン酸酸素原子の１つは、Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、Ｃ（すなわち、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは、水素、任意選択で置換されたアルキル、アリールである）、又はＯＲ（Ｒは、任意選択で置換されたアルキル又はアリールである）のいずれかにより置換することができる。非修飾リン酸基中のリン原子は、アキラルである。しかし、上記原子又は原子団の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、リン原子をキラルにする。換言すれば、このように修飾されたリン酸基中のリン原子は、立体中心である。立体形成性リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書では、Ｒｐ）又は「Ｓ」配置（本明細書では、Ｓｐ）のいずれかを有し得る。
【０２２８】
ホスホロジチオエートは、硫黄により置換された両方の非架橋酸素を有する。ホスホロジチオエート中のリン中心は、オリゴヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除するアキラルである。従って、特定の理論に拘束されることは意図しないが、両方の非架橋酸素に対する修飾は、キラル中心、例えばホスホロジチオエート形成を排除し、それらがジアステレオマー混合物を生成することができないことから、望ましい場合がある。従って、非架橋酸素は、独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、又はＯＲ（Ｒは、アルキル又はアリールである）のいずれかであり得る。
【０２２９】
リン酸リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）及び炭素（架橋ホスホン酸メチレン）による、架橋酸素（すなわち、リン酸塩をモノマーの糖に連結する酸素）の置換によって修飾することもできる。この置換は、連結酸素のいずれか一方又は両方の連結酸素で実施することができる。架橋酸素が、ヌクレオシドの３’−酸素であるとき、炭素による置換が好ましい。架橋酸素が、ヌクレオシドの５’−酸素であるとき、窒素による置換が好ましい。
【０２３０】
リン酸塩に連結した酸素の少なくとも１つが置換されているか、又はリン酸基が非リン基によって置換されている修飾リン酸結合は、「非リン酸ジエステル糖間結合」又は「非リン酸ジエステルリンカー」とも呼ばれる。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、リン酸基は、非リン含有コネクター、例えばデホスホリンカーにより置換することができる。デホスホリンカーは、本明細書において、非リン酸ジエステルリンカーとも呼ばれる。特定の理論に拘束されることを意図しないが、荷電リン酸ジエステル基は、核酸分解の反応中心であるため、中性構造模倣物によるその置換は、増強されたヌクレアーゼ安定性を付与すると考えられる。やはり特定の理論に拘束されることは意図しないが、一部の実施形態では、荷電リン酸基を中性部分で置換する改変を導入することが望ましい場合もある。
【０２３２】
リン酸基を置換することができる部分の例として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：アミド（例えば、アミド−３（３’−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５’）及びアミド−４（３’−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−５’））、ヒドロキシアミノ、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボキサミド、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、カルボン酸エステル、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、硫化物、スルホン酸塩、スルホンアミド、スルホン酸エステル、チオホルムアセタール（３’−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−５’）、ホルムアセタール（３’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−５’）、オキシム、メチレンイミノ、メチレンカルボニルアミノ、メチレンメチルイミノ（ＭＭＩ、３’−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−５’）、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノ、エーテル（Ｃ３’−Ｏ−Ｃ５’）、チオエーテル（Ｃ３’−Ｓ−Ｃ５’）、チオアセトアミド（Ｃ３’−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−Ｃ５’、Ｃ３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ）−Ｏ−ＳＳ−Ｃ５’、Ｃ３’−ＣＨ２−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ５’、３’−ＮＨＰ（Ｏ）（ＯＣＨ３）−Ｏ−５’及び３’−ＮＨＰ（Ｏ）（ＯＣＨ３）−Ｏ−５’及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成部分を含むノニオン結合。例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ  Ｅｄｓ．ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０；Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ３  ａｎｄ  ４，（ｐｐ．４０−６５）を参照されたい。好ましい実施形態として、メチレンメチルイミノ（ＭＭＩ）、メチレンカルボニルアミノ、アミド、カルバメート及びエチレンオキシドリンカーが挙げられる。
【０２３３】
当業者であれば、いくつかの事例において、非架橋酸素の置換が、隣接する２’−ＯＨによる糖間結合の切断増強をもたらし得るため、多くの事例で、非架橋酸素の修飾が、２’−ＯＨの修飾、例えば、隣接する糖間結合、例えば、アラビノース糖、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、ＬＮＡ及びＥＮＡの切断に参加しない修飾を必要とし得ることを十分に認識している。
【０２３４】
好ましい非リン酸ジエステル糖間結合は、ホスホロチオエート、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％  ９５％又はそれを上回る鏡像体過剰率のＳｐ異性体を含むホスホロチオエート、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％  ９５％又はそれを上回る鏡像体過剰率のＲｐ異性体を含むホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキル−ホスホネート（例えば、メチル−ホスホネート）、セレノホスフェート、ホスホロアミデート（例えば、Ｎ−アルキルホスホロアミデート）、及びボラノホスホネートを含む。
【０２３５】
一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回る、並びに各数値を含めてそれを下回る）の修飾若しくは非リン酸ジエステル結合を含む。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回る、並びに各数値を含めてそれを下回る）のホスホロチオエート結合を含む。
【０２３６】
リン酸リンカー及び糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド又はヌクレオチドサロゲートにより置換されている、多標的分子を構築することもできる。特定の理論に拘束されることは意図しないが、繰り返し荷電された骨格の非存在は、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）に対する結合を弱めると考えられる。やはり特定の理論に拘束されることは意図しないが、一部の実施形態では、塩基が中性サロゲート骨格により係留される改変を導入するのが望ましい場合もある。例として、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、アミノエチルグリシルＰＮＡ（ａｅｇＰＮＡ）及び骨格伸張ピロリジンＰＮＡ（ｂｅｐＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。好ましいサロゲートは、ＰＮＡサロゲートである。
【０２３７】
本明細書に記載する多標的分子は、１つ又は複数の非対称中心を含み、従って、鏡像体、ジアステレオマー、その他の立体配置を生成し得るが、これらは、絶対立体化学に関して、糖アノマーなどの場合、（Ｒ）若しくは（Ｓ）として、又はアミノ酸などの場合、（Ｄ）若しくは（Ｌ）として定義され得る。本明細書において提供される多標的分子には、このような考えられるあらゆる異性体並びにそれらのラセミ形態及び任意選択で純粋形態が含まれる。
【０２３８】
核酸修飾（末端修飾）
多標的分子又は多標的分子に含まれるエフェクター分子の末端を修飾することができる。このような修飾は、一方又は両方の末端で可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの３’及び／又は５’末端を標識部分、例えば、発蛍光団（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３若しくはＣｙ５色素）又は保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素若しくはエステル系）などの他の機能性分子実体と共役させることができる。機能性分子実体は、リン酸基及び／又はリンカーを介して糖に結合することができる。リンカーの末端原子は、リン酸基の結合原子、又は糖のＣ−３’若しくはＣ−５’Ｏ、Ｎ、Ｓ若しくはＣ基に連結するか、又はそれを置換することができる。或いは、リンカーは、ヌクレオチドサロゲート（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に連結するか、又はそれを置換することができる。
【０２３９】
リンカー／リン酸−機能分子実体−リンカー／リン酸アレイが二本鎖オリゴマー化合物の２つの鎖の間に配置されているとき、このアレイは、ヘアピンタイプのオリゴマー化合物中のヘアピンループを置換し得る。
【０２４０】
活性を調節する上で有用な末端修飾には、リン酸塩又はリン酸塩類似体によるオリゴヌクレオチドの５’末端の修飾がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端は、リン酸化されているか、又はホスホリル類似体を含む。例示的な５’−リン酸修飾として、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングと適合性であるものが挙げられる。５’末端の修飾は、対象の免疫系を刺激又は阻害する上でも有用となり得る。一部の実施形態では、オリゴマー化合物の５’末端は、修飾
【化３５】
2018520683.tif 000037
を含み、ここで、Ｗ、Ｘ及びＹは、各々独立に、Ｏ、ＯＲ（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、ＢＨ３−、Ｃ（すなわち、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、又はＯＲ（Ｒは、水素、アルキル又はアリールである）からなる群から選択され；Ａ及びＺは、それぞれの存在について各々独立に、非存在、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＮＲ（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、又は任意選択で置換されたアルキレンであり、ここで、アルキレンの骨格は、内部及び／又は末端に、Ｏ、Ｓ、ＳＳ及びＮＲ（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）の１つ又は複数を含むことができ；ｎは、０〜２である。一部の実施形態では、ｎは、１又は２である。Ａは、糖の５’炭素に連結した酸素を置換することは理解される。ｎが０であるとき、Ｗ及びＹは、それらが結合されるＰと一緒に、任意選択で置換された５〜８員複素環式化合物を形成することができ、ここで、Ｗ及びＹは、各々独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’又はアルキレンである。複素環式は、アリール又はヘテロアリールで置換されているのが好ましい。一部の実施形態では、５’末端ヌクレオチドのＣ５’上の一方又は両方の水素が、ハロゲン、例えば、Ｆで置換されている。
【０２４１】
例示的な５’−修飾として、限定はしないが、５’−一リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸塩（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸塩（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；５’−α−チオ三リン酸塩；５’−β−チオ三リン酸塩；５’−γ−チオ三リン酸塩；５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）が挙げられる。他の５’−修飾として、５’−アルキルホスホン酸塩（Ｒ（ＯＨ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’、Ｒ＝アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど）、５’−アルキルエーテルホスホン酸塩（Ｒ（ＯＨ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’、Ｒ＝アルキルエーテル、例えば、メトキシメチル（ＣＨ２ＯＭｅ）、エトキシメチルなど）が挙げられる。他の例示的な５’−修飾として、Ｚが、任意選択で少なくとも１回置換されたアルキルであるもの、例えば、（（ＨＯ）２（Ｘ）Ｐ−Ｏ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、（（ＨＯ）２（Ｘ）Ｐ−Ｏ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、（（ＨＯ）２（Ｘ）Ｐ−［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’；ジアルキル末端リン酸塩及びリン酸塩模倣物：ＨＯ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｍｅ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、ＨＯ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｍｅ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’が挙げられ、ここで、ａ及びｂは、各々独立に、１〜１０である。他の実施形態は、ＢＨ３、ＢＨ３−及び／又はＳｅによる酸素及び／又は硫黄の置換を含む。
【０２４２】
末端修飾は、分布をモニターする上でも有用となり得、このような場合、付加するのに好ましい基には、発蛍光団、例えば、フルオレセイン又はＡｌｅｘａ色素、例えば、Ａｌｅｘａ  ４８８がある。末端修飾はまた、取り込みを増強するのにも有用となり得、このための有用な修飾としては、ターゲティングリガンドがある。末端修飾は、別の部分にオリゴヌクレオチドを架橋する上でも有用となり得；このための有用な修飾として、マイトマイシンＣ、プソラレン、及びそれらの誘導体が挙げられる。
【０２４３】
熱不安定化修飾
アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）とは反対の部位で、センス鎖に熱不安定化ヌクレオチドを導入することにより、ｄｓＲＮＡ二重螺旋が解離又は融解する傾向を高める（二重螺旋会合の自由エネルギーを低減する）ことにより、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ剤等のエフェクター分子をＲＮＡ干渉について最適化することができる。この修飾は、二重螺旋が、アンチセンス鎖のシード領域内で解離又は融解する傾向を高めることができる。
【０２４４】
熱不安定化修飾は、脱塩基修飾；反対側の鎖における反対側ヌクレオチドとのミスマッチ；並びに２’−デオキシ修飾又は非環状ヌクレオチド、例えば、アンロックド核酸（ＵＮＡ）若しくはグリセロール核酸（ＧＮＡ）などの糖修飾を含み得る。
【０２４５】
例示される脱塩基修飾は、以下の通りである。
【化３６】
2018520683.tif 000038
【０２４６】
例示される糖修飾は、以下の通りである。
【化３７】
2018520683.tif 000039
【０２４７】
用語「非環状ヌクレオチド」は、非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指し、例えば、その際、リボース炭素同士の結合（例えば、Ｃ１’−Ｃ２’、Ｃ２’−Ｃ３’、Ｃ３’−Ｃ４’、Ｃ４’−Ｏ４’、若しくはＣ１’−Ｏ４’）のいずれかが存在しない、且つ／又はリボース炭素若しくは酸素（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’  Ｃ３’、Ｃ４’又はＯ４’）の少なくとも１つが、独立に又は組合せで、ヌクレオチドから欠失している。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、
【化３８】
2018520683.tif 000040
であり、ここで、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、又はアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である）。用語「ＵＮＡ」は、アンロックド非環状核酸を指し、糖の結合のいずれかが除去されて、アンロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡは、Ｃ１’−Ｃ４’（すなわち、Ｃ１’及びＣ４’炭素同士の共有結合炭素−酸素−炭素結合）が除去されたモノマーも包含する。別の例では、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’及びＣ３’炭素同士の共有結合炭素−炭素結合）が除去されている（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ  ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）；及びＦｌｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）を参照されたい；これらは、全体として参照により本明細書に組み込まれる）。非環状誘導体は、ワトソン−クリック対合に影響を及ぼすことなく、より大きい骨格柔軟性を付与する。非環状ヌクレオチドは、２’−５’又は３’−５’結合を介して連結することができる。
【０２４８】
用語「ＧＮＡ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似しているが、リン酸ジエステル結合：
【化３９】
2018520683.tif 000041
により連結される反復グリセロール単位から構成される点で、「骨格」の組成が異なるポリマーであるグリコール核酸を指す。
【０２４９】
熱不安定化修飾は、ｄｓＲＮＡ二重螺旋内の熱不安定化ヌクレオチドと、反対側の鎖の反対側ヌクレオチドとのミスマッチ（すなわち、非相補的塩基対）であってよい。例示的なミスマッチ塩基対は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ、又はこれらの組合せを含む。当技術分野で知られる他のミスマッチ塩基対合も本発明に適している。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれのヌクレオチド間でも起こり得る。すなわち、ミスマッチ塩基対合は、ヌクレオチドのリボース糖に対する修飾とは関係なく、それぞれのヌクレオチドからの核酸塩基同士で起こり得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ剤等のエフェクター分子は、ミスマッチ対合に少なくとも１つの核酸塩基を含有し、それは、２’−デオキシ核酸塩基であり；例えば、２’−デオキシ核酸塩基は、センス鎖に存在する。
【０２５０】
脱塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド修飾（ＵＮＡ及びＧＮＡなど）、並びにミスマッチ修飾のさらなる例は、国際公開第２０１１／１３３８７６号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２５１】
熱不安定化修飾は、反対側塩基との水素結合を形成する能力が低減又は無効化されたユニバーサル塩基、さらにはリン酸修飾も含み得る。
【０２５２】
反対側の鎖における塩基との水素結合を形成する能力が障害又は完全に無効化された核酸塩基修飾が、国際公開第２０１０／００１１８９５号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ｄｓＲＮＡ二重螺旋の中央領域の不安定化について評価されている。例示的な核酸塩基修飾は、
【化４０】
2018520683.tif 000042
である。
【０２５３】
天然のリン酸ジエステル結合と比較して、ｄｓＲＮＡ二重螺旋の熱安定性を低下させることがわかっている例示的なリン酸修飾は、
【化４１】
2018520683.tif 000043
である。
【０２５４】
一部の実施形態では、多標的分子中のエフェクター分子は、２’−５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅとの、及びＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓとの）を含む。例えば、２’−５’結合修飾を用いて、ヌクレアーゼ耐性を促進するか、又はセンス鎖とアンチセンス鎖の結合を阻害することができ、或いは上記修飾をセンス鎖の５’末端に用いて、ＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避することができる。
【０２５５】
別の実施形態では、多標的分子中のエフェクター分子は、Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを含むＬリボース、Ｌ−アラビノース）を含む。例えば、これらのＬ糖修飾を用いて、ヌクレアーゼ耐性を促進するか、又ははセンス鎖とアンチセンス鎖との結合を阻害することができ、或いは上記修飾をセンス鎖の５’末端に用いて、ＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避することができる。
【０２５６】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、担体を介してリガンドに共役され、担体は、環状基又は非環状基であってよく；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル及びデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格から選択される。
【０２５７】
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中の少なくとも１つのエフェクター分子の少なくとも１つの鎖は、５’リン酸化されているか、又は５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’−リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングと適合性のものを含む。好適な修飾としては、以下のものが挙げられる：５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化又は非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、及び任意の修飾若しくは非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸及び三リン酸（例えば、５’−α−チオトリホスフェート、５’−γ−チオトリホスフェートなど）、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、５’−アルキルホスホネート（すなわち、ビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）の任意の組合せ。
【０２５８】
標的遺伝子
限定なしに、ｓｉＲＮＡの標的遺伝子として、限定はしないが、不要な細胞増殖を促進する遺伝子、増殖因子遺伝子、増殖因子受容体遺伝子、遺伝子発現キナーゼ、アダプタータンパク質遺伝子、Ｇタンパク質スーパーファミリー分子をコードする遺伝子、転写因子をコードする遺伝子、血管新生を媒介する遺伝子、ウイルス遺伝子、ウイルス複製に必要な遺伝子、ウイルス機能を媒介する細胞遺伝子、細菌性病原体の遺伝子、アメーバ性病原体の遺伝子、寄生体病原体の遺伝子、真菌性病原体の遺伝子、不要な免疫応答を媒介する遺伝子、痛みのプロセシングを媒介する遺伝子、神経疾患を媒介する遺伝子、ヘテロ接合性の喪失を特徴とする細胞に見出されるａｌｌｅｎｅ遺伝子、又は多型遺伝子の１つのａｌｌｅｇｅ遺伝子が挙げられる。
【０２５９】
ｓｉＲＮＡの特定の例示的な標的遺伝子として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ＰＣＳＫ−９、ＡｐｏＣ３、ＡＴ３、ＡＧＴ、ＡＬＡＳ１、ＴＭＰＲ、ＨＡＯ１、ＡＧＴ、Ｃ５、ＣＣＲ−５、ＰＤＧＦベータ遺伝子；Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子；ＣＲＫ遺伝子；ＧＲＢ２遺伝子；ＲＡＳ遺伝子；ＭＥＫＫ遺伝子；ＪＮＫ遺伝子；ＲＡＦ遺伝子；Ｅｒｋ１／２遺伝子；ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子；ＭＹＢ遺伝子；ｃ−ＭＹＣ遺伝子；ＪＵＮ遺伝子；ＦＯＳ遺伝子；ＢＣＬ−２遺伝子；サイクリンＤ遺伝子；ＶＥＧＦ遺伝子；ＥＧＦＲ遺伝子；サイクリンＡ遺伝子；サイクリンＥ遺伝子；ＷＮＴ−１遺伝子；β−カテニン遺伝子；ｃ−ＭＥＴ遺伝子；ＰＫＣ遺伝子；ＮＦＫＢ遺伝子；ＳＴＡＴ３遺伝子；サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子；Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子；トポイソメラーゼＩ遺伝子；トポイソメラーゼＩＩα遺伝子；ｐ７３遺伝子；ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子；ＰＰＭ１Ｄ遺伝子；カベオリンＩ遺伝子；ＭＩＢ  Ｉ遺伝子；ＭＴＡＩ遺伝子；Ｍ６８遺伝子；腫瘍抑制遺伝子；ｐ５３遺伝子；ＤＮ−ｐ６３遺伝子；ｐＲｂ腫瘍抑制遺伝子；ＡＰＣ１腫瘍抑制遺伝子；ＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子；ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子；ＭＬＬ融合遺伝子、例えば、ＭＬＬ−ＡＦ９、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子；ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子；ＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子；ＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子；ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子；ＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子；αｖ−インテグリン遺伝子；Ｆｌｔ−１受容体遺伝子；チューブリン遺伝子；ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｆ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｆ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｇ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｇ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｈ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｈ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  Ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  Ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、ＪＣウイルス（ＪＣ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ＪＣウイルス（ＪＣ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要なヒト遺伝子、ミクソウイルス遺伝子、ミクソウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、ライノウイルス遺伝子、ライノウイルス複製に必要な遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コロナウイルス複製に必要な遺伝子、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、セントルイス脳炎（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）遺伝子、セントルイス脳炎（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）複製に必要な遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ）４０遺伝子、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ）４０複製に必要な遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、モロニー−マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ−Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、モロニー−マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ−Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、脳心筋炎ウイルス遺伝子、脳心筋炎ウイルス複製に必要な遺伝子、はしかウイルス遺伝子、はしかウイルス複製に必要な遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖｅｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖｅｒ��ｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、アデノウイルス遺伝子、アデノウイルス複製に必要な遺伝子、黄熱病ウイルス遺伝子、黄熱病ウイルス複製に必要な遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ポリオウイルス複製に必要な遺伝子、ポックスウイルス遺伝子、ポックスウイルス複製に必要な遺伝子、プラスモジウム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）遺伝子、プラスモジウム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）遺伝子複製に必要な遺伝子、ミコバクテリア・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）遺伝子、ミコバクテリア・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）複製に必要な遺伝子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）遺伝子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）遺伝子に必要な遺伝子、癩菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）遺伝子、癩菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）複製に必要な遺伝子、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）遺伝子、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）複製に必要な遺伝子、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）遺伝子、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）複製に必要な遺伝子、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、肺炎ミコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、肺炎ミコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、インテグリン遺伝子、セレクチン遺伝子、補体系遺伝子、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、ＧＣＳＦ遺伝子、Ｇｒｏ１遺伝子、Ｇｒｏ２遺伝子、Ｇｒｏ３遺伝子、ＰＦ４遺伝子、ＭＩＧ遺伝子、前血小板塩基性タンパク質遺伝子、ＭＩＰ−１Ｉ遺伝子、ＭＩＰ−１Ｊ遺伝子、ＲＡＮＴＥＳ遺伝子、ＭＣＰ−１遺伝子、ＭＣＰ−２遺伝子、ＭＣＰ−３遺伝子、ＣＭＢＫＲ１遺伝子、ＣＭＢＫＲ２遺伝子、ＣＭＢＫＲ３遺伝子、ＣＭＢＫＲ５ｖ、ＡＩＦ−１遺伝子、Ｉ−３０９遺伝子、イオンチャネルの構成要素の遺伝子、神経伝達物質受容体の遺伝子、神経伝達物質リガンドの遺伝子、アミロイドファミリー遺伝子、プレセニリン遺伝子、ＨＤ遺伝子、ＤＲＰＬＡ遺伝子、ＳＣＡ１遺伝子、ＳＣＡ２遺伝子、ＭＪＤ１遺伝子、ＣＡＣＮＬ１Ａ４遺伝子、ＳＣＡ７遺伝子、ＳＣＡ８遺伝子、ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）細胞に見出される対立遺伝子、多型遺伝子のうちの１つの対立遺伝子、並びにこれらの組合せ。
【０２６０】
ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）は、ＬＯＨの領域に、配列、例えば、遺伝子のヘミ接合を引き起こし得る。これにより、正常細胞と疾患状態の細胞、例えば、癌細胞との間に有意な遺伝的差異が生じ得るが、これは、正常細胞と疾患状態の細胞、例えば、癌細胞との間の有用な差異を提供する。この差異は、遺伝子又は他の配列が、二倍体細胞においてヘテロ接合性であるが、ＬＯＨを有する細胞ではヘミ接合性であるために、起こり得る。ＬＯＨの領域は、多くの場合、喪失によって不要な増殖を促進する遺伝子、例えば、腫瘍抑制遺伝子、並びに例えば、他の遺伝子、一部の事例では正常な機能、例えば、成長に不可欠な遺伝子を含む他の配列を含む。本発明の方法は、部分的に、本発明の組成物による必須遺伝子の１つの対立遺伝子の特異的な調節を利用するものである。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、本発明は、マイクロＲＮＡを調節する多標的分子を提供する。
【０２６２】
リガンド
いくつかの実施形態では、多標的分子は、１つ又は複数のコンジュゲート基の共有結合により修飾される。一般に、コンジュゲート基は、結合された多標的分子の１つ又は複数の特性を修飾し、こうした特性として、限定はしないが、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷及びクリアランスが挙げられる。コンジュゲート基は、化学分野で常用的に使用されており、オリゴマー化合物などの親化合物に直接又は任意選択の連結部分若しくは結合基を介して連結される。コンジュゲート基の好ましいリストは、限定はしないが、挿入剤、リポータ分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸塩、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び染料を含む。
【０２６３】
本発明に適した好ましいコンジュゲート基としては、以下のものが挙げられる：コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３）；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０５３）；チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５）；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３）；脂肪族鎖、例えば、ドデカジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９）；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ラク−グリセロール又はトリエチルアンモニウム−１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ラク−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸塩（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７）；ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９）；アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９）；又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３）。
【０２６４】
一般に、非常に多様な実体、例えば、リガンドを本明細書に記載のオリゴマー化合物に結合させることができる。リガンドは、天然に存在する分子、又は組換え若しくは合成分子を含み得る。例示的なリガンドとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコライド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ−２Ｋ、ＰＥＧ−５Ｋ、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−１２Ｋ、ＰＥＧ−１５Ｋ、ＰＥＧ−２０Ｋ、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、ポリホスファジン、ポリエチレンイミン、カチオン基、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第４級塩、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、アプタマー、アシアロフェチュイン、ヒアルロナン、プロコラーゲン、免疫グロブリン（例えば、抗体）、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、糖−アルブミンコンジュゲート、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（例えば、ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えば、ステロイド、胆汁酸、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、若しくはフェノキサジン）、ペプチド（例えば、α螺旋ペプチド、両親媒性ペプチド、ＲＧＤペプチド、細胞透過ペプチド、エンドソーム溶解性／融合性ペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、ナプロキセン、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、ＡＰ、抗体、ホルモン及びホルモン受容体、レクチン、炭水化物、多価炭水化物、ビタミン（例えば、ビタ���ンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン及びピリドキサール）、ビタミン補因子、リポ多糖、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化剤、ＮＦ−κＢの活性化剤、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、ミオセルビン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、γインターフェロン、天然若しくは組換え低密度リポタンパク（ＬＤＬ）、天然若しくは組換え高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、並びに細胞透過剤（例えば、螺旋状細胞透過剤）。
【０２６５】
ペプチド及びペプチド模倣リガンドとしては、天然又は修飾ペプチド、例えば、Ｄ又はＬペプチド；α、β、若しくはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ又は複数のアミドを有するペプチド、すなわち、ペプチド、１つ又は複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、若しくはスルホニル尿素結合で置換された結合；又は環状ペプチドを有するものがある。ペプチド模倣物（本明細書では、オリゴペプチド模倣物とも呼ばれる）は、天然のペプチドに類似した明確な３次元構造にフォールディングすることができる分子である。ペプチド又はペプチド模倣リガンドは、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸長であってよい。
【０２６６】
例示的な両親媒性ペプチドとして、限定はしないが、セクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、ブホリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）、Ｓ．クラバ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ（ｈａｇｆｉｓｈ）腸抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎｅ）、ブレビニン−２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ペプチド、エスクレンチニス−１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ−１）、及びカエリンが挙げられる。
【０２６７】
本明細書で使用されるとき、用語「エンドソーム溶解性リガンド」は、エンドソーム溶解性を有する分子を指す。エンドソーム溶解性リガンドは、本発明の組成物若しくはその成分の溶解、及び／又は本発明の組成物若しくはその成分の、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、微小管、ペロキシソーム、又は細胞内の他の小胞体などの細胞内コンパートメントから細胞の細胞質への輸送を促進する。いくつかの例示的なエンドソーム溶解性リガンドとして、限定はしないが、イミダゾール、ポリ若しくはオリゴイミダゾール、直鎖若しくは分岐状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖及び分岐状ポリアミン、例えば、スペルミン、カチオン性直鎖若しくは分岐状ポリアミン、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスクオリゴ若しくはポリカチオン又はアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスク若しくは非マスクカチオン又はアニオン電荷を有する直鎖若しくは分岐状ポリマー、マスク若しくは非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するデンドリマー、ポリアニオン性ペプチド、ポリアニオン性ペプチド模倣薬、ｐＨ感受性ペプチド、天然及び合成融合性脂質、天然及び合成カチオン性脂質が挙げられる。
【０２６８】
例示的なエンドソーム溶解性／融合性ペプチドとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ＡＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＡＡＡＧＧＣ（ＧＡＬＡ）（配列番号１）；ＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＡＡＡＧＧＣ（ＥＡＬＡ）（配列番号２）；ＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡ（配列番号３）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧ（ＩＮＦ−７）（配列番号４）；ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ（Ｉｎｆ  ＨＡ−２）（配列番号５）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤ  ＧＷＹＧＣ（ｄｉＩＮＦ−７）（配列番号６）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＣＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＣ（ｄｉＩＮＦ−３）（配列番号７）；ＧＬＦＧＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡＧＧＳＣ（ＧＬＦ）（配列番号８）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡＧＧＳＣ（ＧＡＬＡ−ＩＮＦ３）（配列番号９）；ＧＬＦ  ＥＡＩ  ＥＧＦＩ  ＥＮＧＷ  ＥＧｎＩ  ＤＧ  Ｋ  ＧＬＦ  ＥＡＩ  ＥＧＦＩ  ＥＮＧＷ  ＥＧｎＩ  ＤＧ（ＩＮＦ−５、ｎは、ノルロイシンである）（配列番号１０）；ＬＦＥＡＬＬＥＬＬＥＳＬＷＥＬＬＬＥＡ（ＪＴＳ−１）（配列番号１１）；ＧＬＦＫＡＬＬＫＬＬＫＳＬＷＫＬＬＬＫＡ（ｐｐＴＧ１）（配列番号１２）；ＧＬＦＲＡＬＬＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＬＲＡ（ｐｐＴＧ２０）（配列番号１３）；ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（ＫＡＬＡ）（配列番号１４）；ＧＬＦＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＣ（ＨＡ）（配列番号１５）；ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）（配列番号１６）；Ｈ５ＷＹＧ（配列番号１７）；及びＣＨＫ６ＨＣ（配列番号１８）。
【０２６９】
特定の理論に拘束されることは意図しないが、融合性脂質は、膜と融合し、その結果、膜を不安定化する。融合性脂質は、通常、小さい頭部基及び不飽和アシル鎖を有する。例示的な融合性脂質として、限定はしないが、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（Ｄｉ−Ｌｉｎ）、Ｎ−メチル（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡ）及びＮ−メチル−２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）エタンアミン（本明細書では、ＸＴＣとも呼ばれる）が挙げられる。
【０２７０】
本発明に適したエンドソーム溶解活性を有する合成ポリマーは、米国特許出願公開第２００９／００４８４１０号明細書；同第２００９／００２３８９０号明細書；同第２００８／０２８７６３０号明細書；同第２００８／０２８７６２８号明細書；同第２００８／０２８１０４４号明細書；同第２００８／０２８１０４１号明細書；同第２００８／０２６９４５０号明細書；同第２００７／０１０５８０４号明細書；同第２００７００３６８６５号明細書；及び同第２００４／０１９８６８７号明細書に記載されており、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７１】
例示的な細胞透過性ペプチドとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ペネトラチン）（配列番号１９）；ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（Ｔａｔ断片４８〜６０）（配列番号２０）；ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（シグナル配列ベースのペプチド）（配列番号２１）；ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（ＰＶＥＣ）（配列番号２２）；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（トランスポルタン）（配列番号２３）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（両親媒性モデルペプチド）（配列番号２４）；ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ａｒｇ９）（配列番号２５）；ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ（細菌細胞壁透過性ペプチド）（配列番号２６）；ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ（ＬＬ−３７）（配列番号２７）；ＳＷＬＳＫＴＡＫＫＬＥＮＳＡＫＫＲＩＳＥＧＩＡＩＡＩＱＧＧＰＲ（セクロピンＰ１）（配列番号２８）；ＡＣＹＣＲＩＰＡＣＩＡＧＥＲＲＹＧＴＣＩＹＱＧＲＬＷＡＦＣＣ（α−デフェンシン）（配列番号２９）；ＤＨＹＮＣＶＳＳＧＧＱＣＬＹＳＡＣＰＩＦＴＫＩＱＧＴＣＹＲＧＫＡＫＣＣＫ（β−デフェンシン）（配列番号３０）；ＲＲＲＰＲＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＰＦＦＰＰＲＬＰＰＲＩＰＰＧＦＰＰＲＦＰＰＲＦＰＧＫＲ−ＮＨ２（ＰＲ−３９）（配列番号３１）；ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ−ＮＨ２（インドリシジン）（配列番号３２）；ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（ＲＦＧＦ）（配列番号３３）；ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＲＦＧＦ類似体）（配列番号３４）；及びＲＫＣＲＩＶＶＩＲＶＣＲ（バクテネシン）（配列番号３５）。
【０２７２】
例示的なカチオン性基として、限定はしないが、例えば、Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノアルコキシ、例えば、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ、（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸）；並びにＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ）から得られる、プロトン化アミノ基が挙げられる。
【０２７３】
本明細書で使用されるとき、用語「ターゲティングリガンド」は、選択される標的、例えば、細胞、細胞型、組織、臓器、身体の領域、又はコンパートメント、例えば、細胞、組織若しくは臓器コンパートメントに対し、増大した親和性を付与する任意の分子を指す。いくつかの例示的なターゲティングリガンドとして、限定はしないが、抗体、抗原、葉酸塩、受容体リガンド、炭水化物、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ及びＨＤＬリガンドが挙げられる。
【０２７４】
炭水化物ベースのターゲティングリガンドとして、限定はしないが、Ｄ−ガラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、多価ＧａｌＮＡｃ、例えばＧａｌＮＡｃ２及びＧａｌＮＡｃ３；Ｄ−マンノース、多価マンノース、多価ラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸及びレクチンが挙げられる。多価という用語は、２つ以上の単糖単位が存在することを示す。このような単糖サブユニットは、グリコシド結合を介して互いに連結するか、又はスカフォールド分子に連結することができる。
【０２７５】
リガンドとして、本発明に適したいくつかの葉酸塩及び葉酸塩類似体が米国特許第２，８１６，１１０号明細書；同第５，５５２，５４５号明細書；同第６，３３５，４３４号明細書及び同第７，１２８，８９３号明細書に記載されており、これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７６】
本明細書で使用されるとき、用語「ＰＫ調節リガンド」及び「ＰＫモジュレータ」は、本発明の組成物の薬剤動態を調節することができる分子を指す。いくつかの例示的なＰＫモジュレータとして、限定はしないが、親油性分子、胆汁酸、ステロール、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ビタミン、脂肪酸、フェノキサジン、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、スプロフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ＰＥＧ、ビオチン、及びトランスサイレチア−結合リガンド（例えば、テトラヨードチロ酢酸、２，４，６−トリヨードフェノール及びフルフェナム酸）が挙げられる。いくつかのホスホロチオエート糖間結合を含むオリゴマー化合物は、血清タンパク質と結合することも知られており、従って、短いオリゴマー化合物、例えば、約５〜３０ヌクレオチド（例えば、５〜２５ヌクレオチド、好ましくは５〜２０ヌクレオチド、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ヌクレオチド）を含み、骨格に複数のホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドもリガンド（例えば、ＰＫ調節リガンド）として本発明に適している。ＰＫ調節オリゴヌクレオチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回るホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート結合を含み得る。一部の実施形態では、ＰＫ調節オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート結合である。さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーもＰＫ調節リガンドとして本発明に適している。血清成分（例えば、血清タンパク質）との結合は、Ｏｒａｖｃｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ（１９９６），６７７：１−２７に記載されているものなどのアルブミン結合アッセイから予測することができる。
【０２７７】
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有してもよく、全てが異なる特性を有するか、又は一部のリガンドが同じ特性を有し、残りは異なる特性を有してもよい。例えば、リガンドは、ターゲティング特性を有するか、エンドソーム溶解活性を有するか、又はＰＫ調節特性を有することができる。好ましい実施形態では、リガンドは全て異なる特性を有する。
【０２７８】
リガンド又は係留されたリガンドは、前記モノマーが多標的分子の構成要素（例えば、エフェクター分子又はリンカー）に組み込まれている場合、このモノマー上に存在してもよい。一部の実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーを多標的分子の構成要素（例えば、エフェクター分子又はリンカー）に組み込んだ後、カップリングによってこの「前駆体」モノマーに組み込むことができる。例えば、例としてアミノ末端テザーを有する（すなわち、リガンドが結合していない）モノマー、例えば、モノマー−リンカー−ＮＨ２は、多標的分子の構成要素（例えば、エフェクター分子又はリンカー）に組み込むことができる。次の操作で、すなわち、多標的分子の構成要素（例えば、エフェクター分子又はリンカー）への前駆体モノマーの組み込み後、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステル又はアルデヒド基を有するリガンドを、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基とのカップリングにより前駆体モノマーに結合することができる。
【０２７９】
別の例では、クリックケミストリー反応に参加するのに好適な化学基を有するモノマー、例えば、アジド又はアルキン末端テザー／リンカーを組み込むことができる。次の操作で、すなわち、鎖への前駆体モノマーの組み込み後、相補的化学基を有するリガンド、例えば、アルキン又はアジドを、アルキン及びアジドとのカップリングにより前駆体モノマーに結合することができる。
【０２８０】
一部の実施形態では、リガンドは、多標的分子の核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間結合に共役させることができる。プリン核酸塩基又はその誘導体への共役は、環内及び環外原子を含む任意の位置で実施してよい。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２−、６−、７−、又は８位をコンジュゲート部分に結合する。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体への共役も任意の位置で実施してよい。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２−、５−、及び６位をコンジュゲート部分で置換することができる。リガンドを核酸塩基に共役させる場合、好ましい位置は、ハイブリダイゼーションを妨害しない、すなわち、塩基対合に必要な水素結合相互作用を妨害しない位置である。
【０２８１】
ヌクレオシドの糖部分への共役は、任意の炭素原子で実施してよい。コンジュゲート部分に結合することができる糖部分の例示的な炭素原子として、２’、３’、及び５’炭素原子がある。また、１’位もコンジュゲート部分、例えば、脱塩基残基に結合することができる。ヌクレオシド間結合は、コンジュゲート部分を担持することもできる。リン含有結合（例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなど）の場合、コンジュゲート部分をリン原子に直接、又はリン原子に結合したＯ、Ｎ、若しくはＳ原子に結合することができる。アミン−又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分を、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合することができる。
【０２８２】
オリゴヌクレオチドのコンジュゲートを調製する多くの方法がある。一般に、オリゴヌクレオチドの反応性基（例えば、ＯＨ、ＳＨ、アミン、カルボキシル、アルデヒドなど）をコンジュゲート部分の反応性基と接触させることにより、オリゴヌクレオチドをコンジュゲート部分に結合する。一部の実施形態では、一方の反応性基は求電子性であり、他方は求核性である。
【０２８３】
例えば、求電子基は、カルボニル含有官能基であってよく、求核基は、アミン又はチオールであってよい。結合基を用いる又は用いない核酸及び関連オリゴマー化合物の共役方法は、例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  ＬｅＢｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９３，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの文献に十分に記載されている。
【０２８４】
リガンドは、担体モノマー、例えば、リガンド担体を介して多標的分子に結合することができる。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは２つの「骨格結合点」と、（ｉｉ）少なくとも１つの「係留結合点」とを含む。本明細書で使用する「骨格結合点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、又は一般に、骨格、例えば、オリゴヌクレオチドのリン酸、若しくは修飾リン酸（例えば、硫黄含有）骨格への担体モノマーの組み込みに利用可能であり且つ好適な結合を指す。「係留結合点」（ＴＡＰ）は、担体モノマーの原子、例えば、炭素原子又はヘテロ原子（骨格結合点を付与する原子と異なる）を指し、これは、選択された部分を連結する。選択された部分は、例えば、炭水化物、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であってよい。任意選択で、選択された部分は、介在テザーにより担体モノマーに連結される。従って、担体は、官能基、例えば、アミノ基を含むことが多く、又は一般に、別の化学実体、例えば、構成原子へのリガンドの組み込み又は係留に好適な結合を提供する。
【０２８５】
核酸のコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許として、限定はしないが、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，１４９，７８２号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書；同第５，６７２，６６２号明細書；同第５，６８８，９４１号明細書；同第５，７１４，１６６号明細書；同第６，１５３，７３７号明細書；同第６，１７２，２０８号明細書；同第６，３００，３１９号明細書；同第６，３３５，４３４号明細書；同第６，３３５，４３７号明細書；同第６，３９５，４３７号明細書；同第６，４４４，８０６号明細書；同第６，４８６，３０８号明細書；同第６，５２５，０３１号明細書；同第６，５２８，６３１号明細書；同第６，５５９，２７９号明細書が挙げられ、これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、
【化４２】
2018520683.tif 000044
に示す構造を有するリガンドを含み、
式中、
ＬＧは、それぞれの存在について独立に、リガンド、例えば、炭水化物、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、多糖であり；
Ｚ’、Ｚ’’、Ｚ’’’及びＺ’’’’は、それぞれの存在について各々独立に、Ｏ又はＳである。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）：
【化４３】
2018520683.tif 000045
のリガンドを含み、
式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃは、それぞれの存在について独立に、０〜２０を表し、反復単位は、同じか又は異なっていてもよく；
Ｑ及びＱ’は、それぞれの存在について独立に、非存在、−（Ｐ７−Ｑ７−Ｒ７）ｐ−Ｔ７−又は−Ｔ７−Ｑ７−Ｔ７’−Ｂ−Ｔ８’−Ｑ８−Ｔ８であり；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｐ７、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃ、Ｔ７、Ｔ７’、Ｔ８及びＴ８’は、それぞれの存在について各々独立に、非存在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｂは、−ＣＨ２−Ｎ（ＢＬ）−ＣＨ２−であり；
ＢＬは、−ＴＢ−ＱＢ−ＴＢ’−Ｒｘであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃ、Ｑ７、Ｑ８及びＱＢは、それぞれの存在について独立に、非存在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つ又は複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）の１つ又は複数によって分断若しくは終結することができ；
ＴＢ及びＴＢ’は、それぞれの存在について各々独立に、非存在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｒｘは、親油性物質（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸，Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解性成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、又はカチオン性脂質であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ７は、それぞれの存在について各々独立に、非存在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化４４】
2018520683.tif 000046
又はヘテロシクリルであり；
Ｌ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、それぞれの存在について各々独立に、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり；
Ｒ’及びＲ’’は、各々独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、又はＮ（ＲＮ）２であり；
ＲＮは、それぞれの存在について独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル又はベンジルであり；
Ｒａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ’’、Ｚ’’’及びＺ’’’’は、それぞれの存在について各々独立に、Ｏ又はＳであり；
ｐは、それぞれの存在について独立に、０〜２０を表す。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化４５】
2018520683.tif 000047
のリガンドを含む。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化４６】
2018520683.tif 000048
のリガンドを含む。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化４７】
2018520683.tif 000049
のリガンドを含む。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化４８】
2018520683.tif 000050
のリガンドを含む。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化４９】
2018520683.tif 000051
のリガンドを含む。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化５０】
2018520683.tif 000052
のリガンドを含む。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化５１】
2018520683.tif 000053
のリガンドを含む。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化５２】
2018520683.tif 000054
のリガンドを含む。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化５３】
2018520683.tif 000055
のリガンドを含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化５４】
2018520683.tif 000056
のリガンドを含む。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化５５】
2018520683.tif 000057
のリガンドを含む。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化５６】
2018520683.tif 000058
のモノマーを含む。
【０３００】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化５７】
2018520683.tif 000059
のリガンドを含む。
【０３０１】
例示的なリガンドモノマー
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化５８】
2018520683.tif 000060
のモノマーを含む。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化５９】
2018520683.tif 000061
のモノマーを含む。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化６０】
2018520683.tif 000062
のモノマーを含む。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化６１】
2018520683.tif 000063
のモノマーを含む。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化６２】
2018520683.tif 000064
のモノマーを含む。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化６３】
2018520683.tif 000065
のモノマーを含む。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化６４】
2018520683.tif 000066
のリガンドを含む。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化６５】
2018520683.tif 000067
のリガンドを含む。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化６６】
2018520683.tif 000068
のリガンドを含む。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化６７】
2018520683.tif 000069
のリガンドを含む。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化６８】
2018520683.tif 000070
のリガンドを含む。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化６９】
2018520683.tif 000071
のリガンドを含む。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化７０】
2018520683.tif 000072
のリガンドを含む。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化７１】
2018520683.tif 000073
のリガンドを含む。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化７２】
2018520683.tif 000074
のリガンドを含む。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化７３】
2018520683.tif 000075
のモノマーを含む。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化７４】
2018520683.tif 000076
のモノマーを含む。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化７５】
2018520683.tif 000077
のモノマーを含む。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化７６】
2018520683.tif 000078
のモノマーを含む。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化７７】
2018520683.tif 000079
のモノマーを含む。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化７８】
2018520683.tif 000080
のモノマーを含む。
【０３２２】
一部の実施形態では、Ｌ２Ａ及びＬ２Ｂはいずれも異なる。
【０３２３】
一部の好ましい実施形態では、Ｌ３Ａ及びＬ３Ｂはいずれも同じである。
【０３２４】
一部の実施形態では、Ｌ３Ａ及びＬ３Ｂはいずれも異なる。
【０３２５】
一部の好ましい実施形態では、Ｌ４Ａ及びＬ４Ｂはいずれも同じである。
【０３２６】
一部の実施形態では、Ｌ４Ａ及びＬ４Ｂはいずれも異なる。
【０３２７】
一部の好ましい実施形態では、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは全て同じである。
【０３２８】
一部の実施形態では、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃのうちの２つが同じである。
【０３２９】
一部の実施形態では、Ｌ５Ａ及びＬ５Ｂは同じである。
【０３３０】
一部の実施形態では、Ｌ５Ａ及びＬ５Ｃは同じである。
【０３３１】
一部の実施形態では、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは同じである。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化７９】
2018520683.tif 000081
のモノマーを含む。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化８０】
2018520683.tif 000082
のモノマーを含む。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化８１】
2018520683.tif 000083
のモノマーを含む。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化８２】
2018520683.tif 000084
のモノマーを含み、ここで、Ｙは、Ｏ又はＳであり、ｎは、１〜６である。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化８３】
2018520683.tif 000085
のモノマーを含み、ここで、Ｙ＝Ｏ又はＳである。ｎは、１〜６であり、Ｒは、水素又は核酸であり、Ｒ’は核酸である。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化８４】
2018520683.tif 000086
のモノマーを含み、ここで、Ｙは、Ｏ又はＳであり、ｎは、１〜６である。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化８５】
2018520683.tif 000087
の少なくとも１、２、３又は４つのモノマーを含む。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化８６】
2018520683.tif 000088
のモノマーを含み、ここで、Ｘは、Ｏ又はＳである。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化８７】
2018520683.tif 000089
のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
【０３４１】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化８８】
2018520683.tif 000090
のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化８９】
2018520683.tif 000091
のモノマーを含み、ここで、Ｒは、Ｏ又はＳである。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化９０】
2018520683.tif 000092
のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化９１】
2018520683.tif 000093
のモノマーを含む。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化９２】
2018520683.tif 000094
のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化９３】
2018520683.tif 000095
のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化９４】
2018520683.tif 000096
のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化９５】
2018520683.tif 000097
のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化９６】
2018520683.tif 000098
のモノマーを含む。
【０３５０】
前述したモノマーにおいて、Ｘ及びＹは、それぞれの存在について各々独立に、Ｈ、保護基、リン酸基、リン酸ジエステル基、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ−オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、又はオリゴヌクレオチドであり；Ｚ’及びＺ’’は、それぞれの存在について各々独立に、Ｏ又はＳである。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化９７】
2018520683.tif 000099
のリガンドと共役される。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化９８】
2018520683.tif 000100
のリガンドを含む。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
【化９９】
2018520683.tif 000101
のモノマーを含む。
【０３５４】
前述したリガンド及びモノマーの合成は、例えば、米国特許第８，１０６，０２２号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０３５５】
当技術分野で公知のものなどの結合基又は二官能価結合部分は、本明細書において提供される化合物に適している。結合基は、例えばオリゴマー化合物などの親化合物中の選択性部位に対する、化学官能基、コンジュゲート基、リポータ基及びその他の基の結合に有用である。一般に、二官能価結合部分は、２つの官能基を有するヒドロカルビル部分を含む。官能基の一方は、親分子又は目的の化合物に結合するように選択され、他方は、化学官能基又はコンジュゲート基などの選択された任意の基に、本質的に結合するように選択される。一部の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール若しくはアミノ酸単位などの反復単位の鎖構造又はオリゴマーを含む。二官能価結合部分に常用的に用いられる官能基の例として、限定はしないが、求核基と反応させるための求電子基及び求電子基と反応させるための求核基が挙げられる。一部の実施形態では、二官能価結合部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば、二重又は三重結合）などを含む。二官能価結合部分のいくつかの非限定的な例として、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）及び６−アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸ又はＡＨＡ）が挙げられる。他の結合基として、限定はしないが、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル又は置換若しくは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルが挙げられ、好ましい置換基の非限定的リストは、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含む。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、リガンドは、リンカーを介して多標的分子と共役される。
【０３５７】
本明細書で使用されるとき、用語「リンカー」は、化合物の２つの部分を連結する有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合又は酸素若しくは硫黄などの原子、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、又は置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニル、置換若しくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールなどの原子鎖を含み、ここで、１つ又は複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ１）２、Ｃ（Ｏ）、切断可能な連結基、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換複素環式で分断又は終結されていてもよく；ここで、Ｒ１は、水素、アシル、脂肪族又は置換脂肪族である。
【０３５８】
一部の実施形態では、リンカーは、−［（Ｐ−Ｑ’’−Ｒ）ｑ−Ｘ−（Ｐ’−Ｑ’’’−Ｒ’）ｑ’］ｑ’’−Ｔ−であり、式中、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｐ’、Ｒ’及びＴは、それぞれの存在について各々独立に、非存在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ；ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化１００】
2018520683.tif 000102
又はヘテロシクリルであり；
Ｑ’’及びＱ’’’は、それぞれの存在について各々独立に、非存在、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ１）（Ｒ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−、又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり；
Ｘは、非存在であるか又は切断可能な結合基であり；
Ｒａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれの存在について各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ又はＮ（ＲＮ）２であり；
ＲＮは、それぞれの存在について独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル又はベンジルであり；
ｑ、ｑ’及びｑ’’は、それぞれの存在について各々独立に、０〜２０であり、反復単位は、同じか又は異なっていてもよく；
ｎは、それぞれの存在について独立に、１〜２０であり；
ｍは、それぞれの存在について独立に、０〜５０である。
【０３５９】
一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの切断可能な結合基を含む。
【０３６０】
一部の実施形態では、リンカーは、分岐状リンカーである。分岐状リンカーの分岐点は、少なくとも三価であってもよいが、四価、五価若しくは六価の原子、又はそのような多価を示す基であってもよい。一部の実施形態では、分岐点は、−Ｎ、−Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｏ−Ｃ、−Ｓ−Ｃ、−ＳＳ−Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−Ｃ、又は−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃであり；式中、Ｑは、それぞれの存在について独立に、Ｈ又は任意選択で置換されたアルキルである。一部の実施形態では、分岐点は、グリセロール又はグリセロール誘導体である。
【０３６１】
切断可能な結合基は、細胞外部では十分に安定しているが、標的細胞に進入すると、切断されて、リンカーが一緒に保持する２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は、対象の血液若しくは血清中、又は第２の基準条件下（例えば、血液若しくは血清中に見出される条件を模倣又は表すために選択することができる）より、標的細胞内又は第１の基準条件下（例えば、細胞内の条件を模倣又は表すために選択することができる）で、少なくとも１０倍以上、好ましくは少なくとも１００倍以上速く切断される。
【０３６２】
切断可能な結合基は、切断作用剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位又は分解分子の存在に対して感受性である。一般に、切断作用剤は、血清又は血液中よりも細胞内部で、より行き渡っているか、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。そのような分解作用剤の例として、特定の基質のために選択される酸化還元剤又は基質特異性のない酸化還元剤が挙げられ、これは、例えば、酸化若しくは還元酵素、又は還元によって酸化還元的に切断可能な結合基を分解することができる、細胞に存在するメルカプタンなどの還元剤；エステラーゼ；アミダーゼ；エンドソーム又は酸性環境を作り出すことができる作用剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であってよい）及びプロテアーゼ、並びにホスファターゼとして作用することにより、酸で切断可能な結合基を加水分解又は分解することができる酵素を含む。
【０３６３】
リンカーは、特定の酵素により切断可能である切断可能な結合基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基のタイプは、ターゲティングしようとする細胞に応じて変わり得る。例えば、肝臓ターゲティングリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結することができる。肝細胞は、エステラーゼに富んでおり、従って、リンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも肝細胞中で効率的に切断されるであろう。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、及び精巣の細胞がある。
【０３６４】
肝細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼが豊富な細胞型をターゲティングする場合、ペプチド結合を含有するリンカーを使用することができる。
【０３６５】
一部の実施形態では、切断可能な結合基は、血液若しくは血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するように選択されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下）で少なくとも１．２５、１．５、１．７５、２、３、４、５、１０、２５、５０、又は１００倍速く切断される。一部の実施形態では、切断可能な結合基は、細胞内（又は細胞内条件を模倣するように選択されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下）と比較して、血液中（又は細胞外条件を模倣するように選択されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下）で、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満切断される。
【０３６６】
例示的な切断可能な結合基として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：酸化還元的に切断可能な結合基（例えば、−Ｓ−Ｓ−及び−Ｃ（Ｒ）２−Ｓ−Ｓ−、ここで、Ｒは、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、少なくとも１つのＲは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、例えばＣＨ３若しくはＣＨ２ＣＨ３である）；ホスフェートベースの切断可能な結合基（例えば、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、及び−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−、ここで、Ｒは、任意選択で置換された直鎖若しくは分岐状Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである）；酸で切断可能な結合基（例えば、ヒドラゾン、エステル、並びにアミノ酸のエステル、−Ｃ＝ＮＮ−及び−ＯＣ（Ｏ）−）；エステルベースの切断可能な結合基（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）；ペプチドベースの切断可能な結合基（例えば、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される結合基、例えば、−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−、ここで、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接アミノ酸から構成されるＲ基である）。ペプチドベースの切断可能な結合基は、２つ以上のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドベースの切断結合は、細胞に見出されるペプチダーゼ又はプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。
【０３６７】
一部の実施形態では、酸で切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、約６．−、５．５、５．０、又はそれを下回る）のｐＨを有する酸性環境中で、又は一般酸として作用し得る酵素などの作用剤により切断可能である。
【０３６８】
オリゴヌクレオチドでないか、又はヌクレオチド若しくはヌクレオシドを含まないリンカーは、非ヌクレオチドベースのリンカーとも呼ばれる。
【０３６９】
モチーフ
本発明は、キメラ化合物である多標的分子も含む。本発明に関連して、「キメラ」化合物又は「キメラ」は、２つ以上の化学的に異なる領域を含む化合物であり、各領域は、少なくとも１つのモノマー単位、例えば、オリゴヌクレオチドの場合、修飾若しくは非修飾ヌクレオチドから構成される。キメラ化合物は、特定のモチーフを有するものとして記載することができる。一部の実施形態では、モチーフとして、限定はしないが、交互モチーフ、ギャップモチーフ、ヘミマーモチーフ、均質に完全に修飾されたモチーフ及び位置修飾モチーフが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「化学的に異なる領域」という語句は、化合物の他所には存在しない修飾を有する点で、又は化合物の他所に存在する修飾がない点で、他の領域と異なる多標的分子の領域を指す。多標的分子は、２つ以上の化学的に異なる領域を含み得る。本明細書で使用されるとき、修飾を含まない領域も化学的に異なるとみなされる。
【０３７０】
化学的に異なる領域は、多標的分子化合物内で反復することができる。従って、多標的分子内の化学的に異なる領域のパターンは、第１の化学的に異なる領域に、１つ又は複数の第２の化学的に異なる領域が続くように実現することができる。化学的に異なる領域のこうした配列は、１回又は複数回反復することができる。好ましくは、２回以上配列を反復する。例えば、二本鎖エフェクター分子の両方の鎖がこれらの配列を含むことができる。化学的に異なる領域の各々は、実際に、わずかに単一モノマー、例えば、ヌクレオチドを含むことがある。一部の実施形態では、化学的に異なる領域の各々は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８モノマー、例えば、ヌクレオチドを含む。
【０３７１】
一部の実施形態では、交互ヌクレオチドは、同じ修飾を含み、例えば、鎖内の全ての奇数ヌクレオチドは、同じ修飾を有する、及び／又は鎖内の全ての偶数ヌクレオチドは、第１の鎖と類似の修飾を有する。一部の実施形態では、二本鎖エフェクター分子又は多標的分子中の全ての奇数ヌクレオチドは、同じ修飾を有し、全ての偶数ヌクレオチドは、奇数ヌクレオチドには存在しない修飾を有し、その逆も同じである。
【０３７２】
二本鎖分子の両方の鎖が交互修飾パターンを含む場合、一方の鎖のヌクレオチドは、類似修飾された第２の鎖のヌクレオチドに対して相補的位置であってよい。別の実施形態では、第２の鎖の類似修飾のパターンに対して、それぞれ第１の鎖の修飾のパターンの間に位相シフトが存在する。このシフトは、第１の鎖及び第２の鎖の類似修飾ヌクレオチドが、互いに相補的位置ではないようにするのが好ましい。
【０３７３】
一部の実施形態では、第１の鎖は、交互ヌクレオチドが、２’−修飾、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾を含む、交互修飾パターンを有する。一部の実施形態では、第１の鎖が、交互２’−Ｏ−メチル修飾を含み、第２の鎖が、交互２’−フルオロ修飾を含む。他の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の鎖が、交互２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【０３７４】
二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の鎖が交互２’−Ｏ−メチル修飾を含む場合、このような２’−修飾ヌクレオチドは、二重螺旋領域において相補的位置であってよい。或いは、このような２’−修飾ヌクレオチドは、二重螺旋領域において相補的位置ではない。
【０３７５】
一部の実施形態では、多標的分子中に存在するオリゴヌクレオチドは、２つの化学的に異なる領域を含み、ここで、各領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長である。
【０３７６】
他の実施形態では、多標的分子中に存在するオリゴヌクレオチドは、３つの化学的に異なる領域を含む。中央の領域は、約５〜１５、（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５）ヌクレオチド長であり、各フランキング又はウィング領域は、独立に、１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）ヌクレオチド長である。３つの領域の全てが、異なる修飾を有してもよく、又はウィング領域が、互いに類似の修飾を有してもよい。一部の実施形態では、ウィング領域は、同じ長さ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長である。
【０３７７】
本明細書で使用されるとき、用語「交互モチーフ」は、モノマーサブユニットが、化合物のほぼ全配列にわたって交互に繰り返す２つの異なるタイプの糖基を有する、連結モノマーサブユニットから構成される連続配列を含む化合物を指す。交互モチーフを有するオリゴヌクレオチドは、式：５’−Ａ（−Ｌ−Ｂ−Ｌ−Ａ）ｎ（−Ｌ−Ｂ）ｍ−３’により表すことができ、式中、Ａ及びＢは、異なる糖基を有するモノマーサブユニットであり、各Ｌは、ヌクレオシド間結合基であり、ｎは、約４〜約１２であり、ｍは、０又は１である。これにより、長さが約９〜約２６モノマーサブユニットの交互モチーフを有する化合物が可能になる。これより長い及び短い化合物も本発明に適していることから、この長さ範囲が限定的であるわけではない。一部の実施形態では、Ａ及びＢの一方は、本明細書において提供される２’−修飾ヌクレオシドである。
【０３７８】
本明細書で使用されるとき、ある「タイプ」のヌクレオシド又はヌクレオシドに関して「修飾のタイプ」は、ヌクレオシドの修飾を指し、修飾及び非修飾ヌクレオシドを含む。従って、別に指定されない限り、「第１タイプの修飾を有するヌクレオシド」は、非修飾ヌクレオシドであってもよい。
【０３７９】
本明細書で使用されるとき、「タイプ領域」は、化合物の一部を指し、ここで、上記領域内のヌクレオシド及びヌクレオシド間結合は全て同じタイプの修飾を含み；任意の隣接部分のヌクレオシド及び／又はヌクレオシド間結合は、少なくとも１つの異なるタイプの修飾を含む。本明細書で使用されるとき、用語「均質な完全修飾モチーフ」は、各々同じタイプの糖基を有する連結モノマーサブユニットの連続的配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、均質な完全修飾モチーフは、本発明のヌクレオシドの連続的配列を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるヌクレオシドの連続的配列の３’及び５’末端の一方又は両方は、１つ又は複数の非修飾ヌクレオシドなどの末端基を含む。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、化合物、例えば、多標的分子又はエフェクター分子の５’末端モノマーは、５’末端にリン含有部分を含む。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーは、２’−修飾を含む。いくつかのこうした実施形態では、５’末端モノマーの２’−修飾は、カチオン性修飾である。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーは、５’−修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーは、２’−修飾及び５’−修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーは、５’−安定化ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーの修飾は、５’−リン酸塩を安定化する。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーの修飾を含む化合物は、エキソヌクレアーゼに対して耐性である。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーの修飾を含む化合物は、改善された遺伝子発現調節特性を有する。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、５’末端モノマーは、改変された結合により、残りの化合物に結合される。いくつかのこうした実施形態では、５’末端モノマーは、ホスホロチオエート結合により、残りの化合物に結合される。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物は、１つ又は複数の交互修飾の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、１つ又は複数の交互ヌクレオシド修飾の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、１つ又は複数の交互結合修飾の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、１つ又は複数の交互ヌクレオシド及び結合修飾の領域を含む。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物は、１つ又は複数の交互２’−Ｆ修飾ヌクレオシド及び２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドの領域を含む。いくつかのこうした実施形態では、交互２’Ｆ修飾及び２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシドのこのような領域も交互結合を含む。いくつかのこうした実施形態では、２’−Ｆ修飾ヌクレオシドの３’末端での結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかのこうした実施形態では、２’ＯＭｅヌクレオシドの３’末端での結合は、リン酸ジエステル結合である。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、このような交互領域は：
（２’−Ｆ）−（ＰＳ）−（２’−ＯＭｅ）−（ＰＯ）
である。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のこうした交互領域を含む。こうした領域は、連続的であってもよく、又は異なる修飾ヌクレオシド若しくは結合によって分断されていてもよい。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、交互モチーフ中の１つ又は複数の交互領域は、複数のあるタイプの単一ヌクレオシドを含む。例えば、本発明のオリゴマー化合物は、以下のヌクレオシドモチーフ：
ＡＢＡ；
ＡＢＢＡ；
ＡＡＢＡ；
ＡＡＢＢＡＡ；
ＡＢＢＡＢＢ；
ＡＡＢＡＡＢ；
ＡＢＢＡＢＡＡＢＢ；
ＡＢＡＢＡＡ；
ＡＡＢＡＢＡＢ；
ＡＢＡＢＡＡ；
ＡＢＢＡＡＢＢＡＢＡＢＡＡ；
ＢＡＢＢＡＡＢＢＡＢＡＢＡＡ；又は
ＡＢＡＢＢＡＡＢＢＡＢＡＢＡＡ；
のいずれかの１つ又は複数の領域を含んでもよく、ここで、Ａは、第１タイプのヌクレオシドであり、Ｂは、第２タイプのヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、Ａ及びＢは、各々、２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、ＬＮＡ、ＤＮＡ及びＭＯＥから選択される。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｂは、ＤＮＡである。一部の実施形態では、Ａは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｂは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡであり、Ｂは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡであり、Ｂは、ＤＮＡである。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅである。いくつかの実施形態では。Ｂは、２’−ＯＭｅである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅであり、Ｂは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡであり、Ｂは、２’−ＯＭｅである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅであり、Ｂは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡであり、Ｂは、２’−ＯＭｅである。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、Ａは、（Ｓ）−ｃＥｔである。一部の実施形態では、Ｂは、（Ｓ）−ｃＥｔである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅであり、Ｂは、（Ｓ）−ｃＥｔである。いくつかの実施形態では、Ａは、（Ｓ）−ｃＥｔであり、Ｂは、２’−ＯＭｅである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡであり、Ｂは、（Ｓ）−ｃＥｔである。いくつかの実施形態では、Ａは、（Ｓ）−ｃＥｔであり、Ｂは、ＤＮＡである。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、Ａは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ｂは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−Ｆであり、Ｂは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡであり、Ｂは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−Ｆであり、Ｂは、（Ｓ）−ｃＥｔである。いくつかの実施形態では、Ａは、（Ｓ）−ｃＥｔであり、Ｂは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−Ｆであり、Ｂは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡであり、Ｂは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅであり、Ｂは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡであり、Ｂは、２’−ＯＭｅである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅであり、Ｂは、ＤＮＡである。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、このような交互モチーフを有するオリゴマー化合物は、リン酸塩安定化修飾を含む５’末端ヌクレオシドも含む。いくつかの実施形態では、このような交互モチーフを有するオリゴマー化合物は、２’カチオン性修飾を含む５’末端ヌクレオシドも含む。いくつかの実施形態では、このような交互モチーフを有するオリゴマー化合物は、５’末端修飾も含む。
【０３９２】
２−２−３モチーフ
いくつかの実施形態では、多標的分子中のオリゴヌクレオチドは、２−２−３モチーフを有する領域を含む。このような領域は、下記のモチーフ：
５’−（Ｅ）ｗ−（Ａ）２−（Ｂ）ｘ−（Ａ）２−（Ｃ）ｙ−（Ａ）３−（Ｄ）ｚ
を含み、
式中、Ａは、第１タイプの修飾ヌクレオシドであり；
Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは、Ａと異なる修飾がなされたヌクレオシドであるが、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは、互いに同じ又は異なる修飾を有していてもよく；
ｗ及びｚは、０〜１５であり；
ｘ及びｙは、１〜１５である。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは全て２’−Ｆ修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドであり、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは全て２’−Ｆ修飾ヌクレオシドである。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、２−２−３モチーフの結合は全て修飾結合である。いくつかの実施形態では、結合は全てホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、第１タイプの各修飾の３’末端の結合は、リン酸ジエステルである。
【０３９５】
いくつかの実施形態では、Ｚは０である。こうした実施形態では、第１タイプの３ヌクレオシドの領域は、オリゴヌクレオチドの３’末端にある。いくつかの実施形態では、このような領域は、オリゴマー化合物の３’末端にあり、第１タイプの３ヌクレオシドの領域の３’末端に他の基は結合していない。いくつかの実施形態では、Ｚが０であるオリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物は、３’末端ヌクレオシドに結合された末端基を含んでもよい。このような末端基は、別のヌクレオシドを含んでもよい。このような別のヌクレオシドは、典型的に、非ハイブリダイズヌクレオシドである。
【０３９６】
いくつかの実施形態では、Ｚは１〜３である。いくつかの実施形態では、Ｚは２である。いくつかの実施形態では、Ｚのヌクレオシドは、２’−ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、Ｚは、非ハイブリダイズヌクレオシドを表す。混乱を避けるために、このような非ハイブリダイズヌクレオシドがＺ＝０の３’末端基としても記載され得ることに留意する。
【０３９７】
組合せモチーフ
前述したモチーフ及び修飾のいくつかを組み合わせてもよいことは理解すべきである。モチーフは、少数のヌクレオチドのみを含み得ることから、特定のオリゴヌクレオチドは、２つ以上のモチーフを含むことができる。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、多標的分子中のオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ、ホスホロチオエート結合、２’−ＯＭｅ、共役リガンドから選択される２つ以上のヌクレオチドモチーフを有し得る。
【０３９８】
限定なしに、本明細書に記載する様々なヌクレオチドモチーフのいずれかを有する本発明の多標的分子は、任意の結合モチーフを有することもできる。例えば、多標的分子中に存在するオリゴヌクレオチドにおいて、５’末端の最初の１、２、３、４又は５糖間結合は、修飾された糖間結合であってよく、３’末端の最初の４、５、６、７又は８糖間結合は、修飾された糖間結合であってよい。こうした修飾オリゴヌクレオチドの中央領域は、本明細書に記載する他のモチーフのいずれかに基づく糖間結合、例えば、均質、交互、ヘミマー、ギャップマーなどを有し得る。一部の実施形態では、多標的分子中に存在するオリゴヌクレオチドは、５’末端の第１及び第２モノマーの間のホスホロチオエート結合、中央領域におけるホスホロチオエート／リン酸ジエステル交互結合、並びに３’末端の６、７、又は８ホスホロチオエート結合を含む。
【０３９９】
ヌクレオチドモチーフにより画定される領域の長さ及び結合モチーフの長さは、同じである必要はないことに留意すべきである。
【０４００】
一部の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチド又は二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの鎖は、以下のモチーフの少なくとも１つを含む：
（ａ）５’−ホスホロチオエート又は５’−ホスホロジチオエート；
（ｂ）５’末端のヌクレオチド１及び２のカチオン性修飾、ここで、カチオン性修飾は、ピリミジンのＣ５位、及びプリンのＣ２、Ｃ６、Ｃ８、環外Ｎ２若しくは環外Ｎ６に位置する；
（ｃ）５’末端の最初の２つの末端ヌクレオチドにおける少なくとも１つのＧクランプヌクレオチド及びカチオン性修飾を有する他のヌクレオチド、ここで、カチオン性修飾は、ピリミジンのＣ５位、又はプリンのＣ２、Ｃ６、Ｃ８、環外Ｎ２若しくは環外Ｎ６位に位置する；
（ｄ）核酸塩基修飾を含む少なくとも１つの２’−Ｆ修飾ヌクレオチド；
（ｅ）核酸塩基修飾を含む少なくとも１つのｇｅｍ−２’−Ｏ−メチル／２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、好ましくは、メチル置換基は、上方配置、例えば、アラビノース配置にある；
（ｆ）３’末端の５’−ＰｕＰｕ−３’ジヌクレオチド、ここで、いずれのヌクレオチドも、米国特許出願公開第２０１３０１３０３７８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように２’位に修飾ＭＯＥを含む；
（ｇ）５’末端の５’−ＰｕＰｕ−３’ジヌクレオチド、ここで、いずれのヌクレオチドも、米国特許出願公開第２０１３０１３０３７８号明細書に記載のように２’位に修飾ＭＯＥを含む；
（ｈ）米国特許出願公開第２０１３０１３０３７８号明細書に記載のように２’位に修飾ＭＯＥを含む、５’末端のヌクレオチド；
（ｉ）３’−Ｆ修飾を有する５’末端のヌクレオチド；
（ｊ）４’−置換基を含む５’末端ヌクレオチド；
（ｋ）Ｏ４’修飾を含む５’末端ヌクレオチド；
（ｌ）４’−置換基を含む３’末端ヌクレオチド；及び
（ｍ）これらの組合せ。
【０４０１】
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の鎖は、独立に、前述したモチーフの少なくとも１つを含む。一部の他の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の鎖は、前述したモチーフの少なくとも１つを含み、これらのモチーフは、同じでも異なっていてもよく、又は同じ及び異なるもののいくつかの組合せであってよい。
【０４０２】
前述の例は、記載されるモチーフをどのように組み合わせて使用できるかを示すために提供されるに過ぎず、特定の組合せ又は組合せの例示に用いた特定の修飾に本発明を限定することは意図しない。さらに、限定はしないが、上の表に示すものなどの本明細書における特定の例は、より一般的な実施形態を包含することを意図する。例えば、上の表の列Ａは、交互に繰り返す２’−ＯＭｅ及び２’−Ｆヌクレオシドの領域を例示する。従って、この同じ開示は、交互に繰り返す別の２’−修飾の領域も例示する。これはまた、交互に繰り返す２’−Ｏ−アルキル及び２’−ハロゲンヌクレオシドの領域も例示する。これはまた、交互に繰り返す異なる修飾ヌクレオシドの領域も例示する。本明細書全体の例の全てがこうした包括的解釈を考慮する。
【０４０３】
化合物、例えば、多標的分子中の存在するオリゴヌクレオチドの長さは、モチーフを破断することなく、記載の領域の１つ又は複数を伸長又は短縮することによって容易に操作し得ることにも留意する。
【０４０４】
一部の実施形態では、多標的分子中のオリゴヌクレオチドは、２つ以上の化学的に異なる領域を含み、２００９年３月２６日に出願された国際出願ＰＣＴ／米国特許出願第０９／０３８４３３号明細書（その内容は、全体として本明細書に組み込まれる）に記載の構造を有する。
【０４０５】
合成、精製及び分析
修飾及び非修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドのオリゴマー化は、ＤＮＡ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｅｄ．Ａｇｒａｗａｌ（１９９３），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）及び／又はＲＮＡ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１），２３，２０６−２１７．Ｇａｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  ＲＮＡ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．Ｓｍｉｔｈ（１９９８），１−３６．Ｇａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），５７，５７０７−５７１３）についての文献に記載の手順に従って、常用的に実施することができる。
【０４０６】
オリゴヌクレオチドなどの核酸は、固相合成の周知の技術によって好都合且つ常用的に製造することができる。こうした合成の装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含む複数の供給業者により販売されている。当技術分野で公知であるこうした合成のための任意の他の手段を追加的又は代替的に使用してもよい。類似の技術を用いて、ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することはよく知られている。本発明は、合成の方法により限定されない。
【０４０７】
核酸の精製及び分析の方法は、当業者に公知である。分析方法としては、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びエレクトロスプレー質量分析が挙げられる。こうした合成及び分析方法は、マルチウェルプレートで実施することができる。本発明の方法は、オリゴマー精製方法により限定されない。
【０４０８】
オリゴヌクレオチドなどの核酸は、液相若しくは固相有機合成を用いて、又は当技術分野で公知の方法により酵素を用いて調製することもできる。有機合成は、非天然又は修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製することができるという利点を提供する。当技術分野で公知のこうした合成のための任意の他の手段を追加的又は代替的に使用してもよい。類似の技術を用いて、糖間結合のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及びアルキル化誘導体を含むものなど、他の核酸を調製することも知られている。二本鎖核酸は、２ステップ法を用いて調製することができる。最初に、二本鎖分子の個々の鎖を別々に調製する。次に、構成鎖をアニーリングする。
【０４０９】
合成の方法とは関係なく、核酸は、製剤化に適切な溶液（例えば、水及び／又は有機溶液）中で調製することができる。例えば、核酸調製物を沈殿させてから、純粋再蒸留水中に再溶解させた後、凍結乾燥させることができる。次に、乾燥させた核酸を、意図する製剤化方法に適した溶液に再懸濁させることができる。
【０４１０】
特定の修飾核酸の合成に関する教示は、以下の米国特許又は係属中の特許出願に見出すことができる：ポリアミン共役オリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，１３８，０４５号明細書及び同第５，２１８，１０５号明細書；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製のためのモノマーに関する米国特許第５，２１２，２９５号明細書；修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，３７８，８２５号明細書及び同第５，５４１，３０７号明細書；骨格修飾オリゴヌクレオチド及び還元性カップリングによるその調製に関する米国特許第５，３８６，０２３号明細書；３−デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基及びその合成方法に関する米国特許第５，４５７，１９１号明細書；Ｎ−２置換プリンに基づく修飾核酸塩基に関する米国特許第５，４５９，２５５号明細書；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するための方法に関する米国特許第５，５２１，３０２号明細書；ペプチド核酸に関する米国特許第５，５３９，０８２号明細書；βラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５５４，７４６号明細書；オリゴヌクレオチドの合成のための方法及び材料に関する米国特許第５，５７１，９０２号明細書；アルキルチオ基を有するヌクレオシド（このような基は、ヌクレオシドの様々な位置のいずれかに結合した他の部分に対するリンカーとして使用することができる）に関する米国特許第５，５７８，７１８号明細書；高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，３６１号明細書及び同第５，５９９，７９７号明細書；２’−Ｏ−アルキルグアノシン及び関連化合物（２，６−ジアミノプリン化合物など）の調製方法に関する米国特許第５，５０６，３５１号明細書；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，４６９号明細書；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，４７０号明細書；いずれも共役４’−デスメチルヌクレオシド類似体に関する米国特許第５，２２３，１６８号明細書、及び米国特許第５，６０８，０４６号明細書；骨格修飾オリゴヌクレオチド類似体に関する米国特許第５，６０２，２４０号明細書、及び同第５，６１０，２８９号明細書；並びにとりわけ２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法に関する米国特許第６，２６２，２４１号明細書、及び同第５，４５９，２５５号明細書。
【０４１１】
医薬組成物を製剤化するための組成物及び方法
多標的分子は、医薬組成物又は製剤の調製のために、薬学的に許容される活性及び／又は不活性物質と混合することができる。医薬組成物の製剤化のための組成物及び方法は、限定はしないが、投与経路、疾患の程度、又は投与しようとする用量などのいくつかの基準に左右される。
【０４１２】
多標的分子は、このようなオリゴマー化合物を好適な薬学的に許容される希釈剤若しくは担体と組み合わせることにより、医薬組成物として使用することができる。薬学的に許容される希釈剤としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。ＰＢＳは、非経口で送達しようとする組成物に使用するのに好適な希釈剤である。従って、一部の実施形態では、アンチセンス化合物及び／又は解毒剤化合物及び薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物が本明細書に記載する方法に使用される。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、ＰＢＳである。
【０４１３】
多標的分子を含む医薬組成物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、又はこうしたエステルの塩を含む。いくつかの実施形態では、多標的分子を含む医薬組成物は、ヒトなどの動物に投与されると、生物学的に活性の代謝物又はその残基を（直接若しくは間接的に）付与することができる１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含む。従って、例えば、本開示は、アンチセンス化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、こうしたプロドラッグの薬学的に許容される塩、並びに他の生物学的均等物にも関する。好適な薬学的に許容される塩として、限定はしないが、ナトリウム及びカリウム塩がある。
【０４１４】
プロドラッグは、活性分子を形成するために、身体内で内在性ヌクレアーゼにより切断される多標的分子の一方又は両方の末端に別のヌクレオシドの組み込みを含むことができる。
【０４１５】
本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療のいずれが要望されるか、並びに治療しようとする部位に応じて様々な方法で投与することができる。投与は、局所（例えば、経皮パッチにより）、肺、例えば、ネブライザーなどを用いて、粉末若しくはエアゾールの吸入又は通気により；気管内、鼻内、表皮及び経皮、経口若しくは非経口であってよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又は注入；皮下、例えば、埋込型デバイスにより；又は頭蓋内、例えば、実質内、髄腔内若しくは脳室内投与が挙げられる。多標的分子は、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定の組織をターゲティングするように送達することができる。
【０４１６】
局所投与用の医薬組成物及び製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴薬、坐薬、スプレー、液体及び粉末を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要となるか、又は望ましい場合がある。また、コーティングされたコンドーム、手袋なども有用となり得る。好適な局所製剤として、本発明の主題である多標的分子が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものが挙げられる。好適な脂質及びリポソームとして、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及びカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明の主題である多標的分子は、リポソーム中に封入するか、又はそれと、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。或いは、多標的分子を脂質、特にカチオン性脂質と複合体化してもよい。好適な脂肪酸及びエステルとして、限定はしないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸エステル、トリカプリン酸エステル、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸エステル、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリスチン酸エステルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、これらの又は薬学的に許容される塩が挙げられる。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１７】
研究され、薬剤の製剤化のために使用されているマイクロエマルション以外にも多くの組織化された界面活性剤構造がある。これらは、単層、ミセル、二層及び小胞を含む。リポソームなどの小胞は、薬剤送達の観点からそれらが提供するその特異性及び作用の持続性のために大きい関心を集めている。本発明に使用されるとき、用語「リポソーム」は、球状二層又は二層内に配置される両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。
【０４１８】
リポソームは、親油性物質及び水性の内部から形成される膜を有する単層又は多層小胞である。水性部分は、送達しようとする組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁に効率的に融合することはできないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでマクロファージにより取り込まれる。
【０４１９】
リポソームのさらなる利点は、以下の通りである：天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性及び生分解性であること；リポソームは、多様な水及び脂溶性薬剤を取り込み得ること；リポソームは、その内部コンパートメント内に封入された薬剤を代謝及び分解から保護し得ること（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製で重要な考慮事項は、脂質表面電荷、小胞サイズ及びリポソームの含水量である。
【０４２０】
リポソームは、作用部位への活性成分の輸送及び送達に有用である。リポソーム膜は、構造的に生物膜と類似していることから、リポソームを組織に適用すると、リポソームは、細胞膜と融合し始め、リポソームと細胞の融合が進行するにつれ、リポソームの内容物は、細胞中に移され、そこで活性剤が作用し得る。
【０４２１】
リポソーム製剤は、多くの薬剤の送達方法として広範囲にわたる研究の対象であった。局所投与の場合、リポソームは、他の製剤に対していくつかの利点を提供するというエビデンスが増えている。このような利点には、投与された薬剤の高度全身吸収に関連する副作用の低減、要望される標的部位での投与薬剤の蓄積増大、並びに親水性及び疎水性両方の多様な薬剤を皮膚中に投与する能力が含まれる。
【０４２２】
複数の報告が、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚中に送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛薬、抗体、ホルモン及び高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に送達されている。ほとんどの場合、適用によって上面表皮のターゲティングが達成された。
【０４２３】
リポソームは、２つの大きいクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、陽荷電リポソームであり、陰荷電ＤＮＡ分子と相互作用して、安定した複合体を形成する。陽荷電ＤＮＡ／リポソーム複合体は、陰荷電細胞表面に結合し、エンドソーム内に内在化される。エンドソーム内は酸性ｐＨであるため、リポソームは破壊され、その内容物を細胞質中に放出する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
【０４２４】
ｐＨ感受性又は陰荷電であるリポソームは、ＤＮＡと複合体化するのではなく、ＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡと脂質はいずれも同様に荷電していることから、複合体形成ではなく、反発が起こる。それでも、一部のＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に送達するために用いられている。外来遺伝子の発現が標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
【０４２５】
一主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えば、ダイズＰＣ、及び卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
【０４２６】
いくつかの研究では、皮膚へのリポソーム薬製剤の局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームをモルモットの皮膚に適用したところ、皮膚ヘルペスの軽減が達成されたのに対し、他の手段（例えば、溶液又はエマルションとして）によるインターフェロンの送達は有効ではなかった（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、別の研究では、水性系を用いたインターフェロンの投与に対して、リポソーム製剤の一部として投与されるインターフェロンの効力を試験し、リポソーム製剤は、水性投与より優れているという結論が出された（ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
【０４２７】
ノニオン性リポソーム系も、特にノニオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系が皮膚への薬剤送達における有用性を決定するために試験されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含むノニオン性リポソーム製剤が、マウス皮膚の真皮にシクロスポリン−Ａを送達するために使用された。結果から、こうしたノニオン性リポソーム系が、皮膚の様々な層へのシクロスポリン−Ａの沈着を促進する上で有効であることがわかった（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
【０４２８】
リポソームはまた、「立体安定化」リポソームも含み、この用語は、本明細書で使用されるとき、１種又は複数種の特殊化脂質を含むリポソームを指し、これらの脂質は、リポソームに組み込まれると、このような特殊化脂質のないリポソームと比較して循環寿命の増加をもたらす。立体安定化リポソームの例として、リポソームの小胞体形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ又は複数の糖脂質を含むもの、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１種又は複数種の親水性ポリマーと誘導体化したものがある。特定の理論に拘束されることは意図しないが、当技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ−誘導体化脂質を含有する立体安定化リポソームについて、これらの立体安定化リポソームの循環寿命の増加は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込み低減によるものと考えられている（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
【０４２９】
１種又は複数種の糖脂質を含む様々なリポソームが当技術分野において公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、リポソームの血中半減期を向上させるモノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸及びホスファチジルイノシトールの能力を報告している。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）により詳細に説明されている。米国特許第４，８３７，０２８号明細書及び国際公開第８８／０４９２４号パンフレット（いずれもＡｌｌｅｎらによる）は、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１又はガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍら）に開示されている。
【０４３０】
１種又は複数種の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、及びその調製方法が当技術分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有するノニオン性洗剤、２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載している。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリマーグリコールによるポリスチレン粒子の親水性コーティングにより、血中半減期が有意に増加したことを記載している。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合により修飾された合成リン脂質が、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号明細書及び同第４，５３４，８９９号明細書）により記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はステアリン酸ＰＥＧを含むリポソームが、血中循環半減期の有意な増加を有することを立証する実験を記載している。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、こうした観察を、他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組合せから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧまで拡大した。外側表面に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームが、Ｆｉｓｈｅｒの欧州特許第０  ４４５  １３１  Ｂ１号明細書及び国際公開第９０／０４３８４号パンフレットに記載されている。ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを１〜２０モルパーセント含有するリポソーム組成物及びその使用方法が、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号明細書及び同第５，３５６，６３３号明細書）及びＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号明細書及び欧州特許第０  ４９６  ８１３  Ｂ１号明細書）によって記載されている。いくつかの他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが、国際公開第９１／０５５４５号パンフレット及び米国特許第５，２２５，２１２号明細書（いずれもＭａｒｔｉｎら）及び国際公開第９４／２００７３号パンフレット（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームが、国際公開第９６／１０３９１号パンフレット（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号明細書（Ｍｉｙａｚａｋｉら）及び米国特許第５，５５６，９４８号明細書（Ｔａｇａｗａら）は、その表面で機能性部分とさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームを記載している。
【０４３１】
核酸を含むいくつかのリポソームが当技術分野で知られている。Ｔｈｉｅｒｒｙらの国際公開第９６／４００６２号パンフレットは、高分子量核酸をリポソームに封入するための方法を開示している。Ｔａｇａｗａらの米国特許第５，２６４，２２１号明細書は、タンパク質結合リポソームを開示し、こうしたリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含み得ることを主張する。Ｒａｈｍａｎらの米国特許第５，６６５，７１０号明細書は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入する特定の方法を記載する。Ｌｏｖｅらの国際公開第９７／０４７８７号パンフレットは、ｒａｆ遺伝子にターゲティングされたｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示する。
【０４３２】
トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）はまた別のタイプのリポソームであり、高度に変形可能な脂質凝集体であり、薬剤送達ビヒクルの魅力的な候補である。トランスファーソームは、脂肪滴と表現することができ、これは、高度に変形可能であるため、この脂肪滴より小さい孔を容易に透過することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応することができ、例えば、自己最適化し（皮膚の孔の形状に適応性）、自己修復し、多くの場合、断片化せずにその標的に到達すると共に自己充填することが多い。トランスファーソームを製造するために、表面端活性剤、通常、界面活性剤を標準的リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するために使用されている。トランスファーソーム媒介による血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に有効であることが判明している。
【０４３３】
研究ツール
いくつかの事例では、遺伝子発現を調節することが可能なオリゴヌクレオチドは、研究ツールとして使用されている。例えば、特定の遺伝子産物の機能を調べている研究者らは、細胞又は動物に存在するその遺伝子産物の量を低減するオリゴヌクレオチドを設計し、細胞又は動物における表現型変化を観察することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞又は動物における２つの異なる標的の量を低減するための方法を提供する。一部の実施形態では、２つの異なる標的は、２つの異なる遺伝子又は遺伝子産物であり得る。一部の実施形態では、２つの異なる標的は、同じ遺伝子又は遺伝子産物であり得る。いくつかの実施形態では、試験者らは、タンパク質又は非翻訳核酸を特性決定するために、こうした技術を使用することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子産物及び／又はいくつかの細胞機能の動力学及び／又はターンオーバを調べるために、こうした実験を使用する。一部の実施形態では、異なる遺伝子又は遺伝子産物間の関係又は相互関係を調べるために、こうした実験を使用する。
【０４３４】
キット
いくつかの実施形態では、本発明は、１種又は複数種の多標的分子を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、こうしたキットは、治療用途のために意図される。いくつかの実施形態では、こうしたキットは、研究用途のために意図される。
【０４３５】
本明細書に記載する特定の化合物、組成物及び方法をいくつかの実施形態に従って詳細に説明してきたが、以下の実施例は、本明細書に記載する化合物を説明するために用いるに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。本願で引用される参照文献、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号などは各々、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０４３６】
定義
具体的な定義が記載されていない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、並びに医学及び薬化学に関連して使用される名称、並びにそれらの手順及び技術は、当技術分野でよく知られ、且つ一般に使用されているものである。化学合成、及び化学分析のために標準的技術を使用することができる。いくつかのこうした技術及び手順は、例えば、“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓａｎｇｖｉ  ａｎｄ  Ｃｏｏｋ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９９４；“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０；及び“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に見出すことができ、これらは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。認められる限り、本開示で言及される全ての特許、出願、公開出願、並びに他の刊行物及び他のデータは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４３７】
別に指示されていない限り、下記の用語は下記の意味を有する。
【０４３８】
本明細書で使用されるとき、用語「標的核酸」は、発現又は活性がｓｉＲＮＡ化合物により調節され得る任意の核酸分子を指す。標的核酸として、限定はしないが、標的タンパク質をコードするＤＮＡから転写されるＲＮＡ（限定はしないが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ又はその部分を含む）、並びにそのようなＲＮＡから得られるｃＤＮＡ、及びｍｉＲＮＡが挙げられる。例えば、標的核酸は、その発現が特定の障害若しくは病態と関連する細胞遺伝子（又は遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）であってよい。一部の実施形態では、標的核酸は、感染因子由来の核酸分子であってよい。
【０４３９】
本明細書で使用されるとき、ＲＮＡ干渉分子による「遺伝子サイレンシング」は、標的遺伝子について、ｍｉＲＮＡ又はＲＮＡ干渉分子が存在しない細胞に見出されるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、１００％までを含む少なくとも約９９％、及びこれらの間のあらゆる整数％の、細胞中のｍＲＮＡレベルの減少を指す。１つの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、１００％までを含む少なくとも約９９％、及び５％〜１００％のあらゆる整数％だけ減少される。
【０４４０】
本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子発現を調節する」は、１種又は複数種のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベルを上方制御又は下方制御して、発現、レベル、若しくは活性がモジュレータの非存在下で観察されるものより高く又は低くなるようにすることを意味する。例えば、用語「調節する」は、「阻害する」を意味し得るが、用語「調節する」の使用は、この定義に限定されない。
【０４４１】
本明細書で使用されるとき、遺伝子発現調節は、１種又は複数種のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベルが、ｓｉＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ剤の非存在下で観察されるものと少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍以上異なる場合に起こる。％及び／又は倍率差は、例えば、対照又は非対照に対して、以下のように計算することができる。
【数１】
2018520683.tif 000103
【０４４２】
本明細書で使用されるとき、遺伝子発現に関して、「阻害する」、「下方制御する」、又は「低減する」という用語は、１種又は複数種のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１種又は複数種のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性がモジュレータの非存在下で観察されるものより低く低減されることを意味する。１種又は複数種のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１種又は複数種のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、対応する非調節対照に比べ少なくとも１０％低く、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は最も好ましくは、１００％（すなわち、遺伝子発現がない）だけ低く低減される場合、遺伝子発現は下方制御される。
【０４４３】
本明細書で使用されるとき、遺伝子発現に関して、「増加する」又は「上方制御する」という用語は、１種又は複数種のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１種又は複数種のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性がモジュレータの非存在下で観察されるものより高く増加されることを意味する。１種又は複数種のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１種又は複数種のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、対応する非調節対照に比べ、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、１００％、１．１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍以上増加される場合、遺伝子発現は上方制御される。
【０４４４】
本明細書で使用されるとき、用語「増加した」又は「増加する」は、概して、統計的に有意な量の増加を意味し；誤解を避けるために、「増加した」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％又は１００％以下の増加又は１０〜１００％の間のあらゆる増加、或いは基準レベルと比較して少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍の増加、又は２倍〜１０倍以上の間のあらゆる増加を意味する。
【０４４５】
本明細書で使用されるとき、用語「低減した」又は「低減する」は、概して、統計的に有意な量の減少を意味する。しかしながら、誤解を避けるために、「低減した」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％又は１００％（すなわち、基準サンプルと比較してゼロレベル）以下の減少、又は１０〜１００％の間のあらゆる減少を意味する。
【０４４６】
「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的な」は、核酸が、伝統的なワトソン−クリック又は他の非伝統的タイプのいずれかにより、別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。本発明の核酸分子に関連して、核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えば、ＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，／．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照されたい）。相補性パーセントは、第２核酸配列と、水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の連続した残基のパーセンテージ（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）を示す。「完全に相補的」又は１００％相補性とは、核酸配列の連続した残基の全てが、第２核酸配列中の同数の連続した残基と水素結合することを意味する。完全ではない相補性は、２つの鎖の一部（全部ではない）のヌクレオシド単位が互いに水素結合することができる状況を指す。「実質的な相補性」は、非相補的であるように選択されたポリヌクレオチド鎖の領域（例えば、突出部）を除いて、９０％以上の相補性を呈示するポリヌクレオチド鎖を指す。特異的結合には、特異的結合が要望される条件下、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ若しくは治療処置の場合、生理学的条件下で、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合、アッセイが実施される条件下で、非標的配列とオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が必要である。非標的配列は、典型的に、少なくとも５ヌクレオチド異なる。
【０４４７】
用語「オフターゲット」及び語句「オフターゲット効果」は、所与の標的に対するエフェクター分子が、別の標的配列、ＤＮＡ配列又は細胞タンパク質若しくは他の部分と直接若しくは間接的のいずれかで相互作用することにより、意図しない作用を引き起こすあらゆる事例を指す。例えば、「オフターゲット効果」は、他の転写物と、ｓｉＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖との間の部分的な相同性又は相補性により、他の転写物の同時分解が生じるときに起こり得る。
【０４４８】
本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオシド」は、核酸塩基及び糖を含むグリコシルアミンを意味する。ヌクレオシドとして、限定はしないが、天然に存在するヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、並びに模擬塩基及び／又は糖基を有するヌクレオシドが挙げられる。
【０４４９】
本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオチド」は、核酸塩基と、リン酸基が共有結合した糖とを含むグリコソミン（ｇｌｙｃｏｓｏｍｉｎｅ）を指す。ヌクレオチドは、様々な置換基のいずれかで修飾されていてもよい。
【０４５０】
本明細書で使用されるとき、用語「核酸塩基」は、ヌクレオシド又はヌクレオチドの塩基部分を指す。核酸塩基は、別の核酸の塩基に水素結合することができる任意の原子又は原子団を含んでもよい。
【０４５１】
本明細書で使用されるとき、用語「複素環式塩基部分」は、複素環を含む核酸塩基を指す。
【０４５２】
本明細書で使用されるとき、用語「オリゴマー化合物」は、２つ以上のサブ構造を含み、核酸分子の領域とハイブリダイズすることができるポリマー構造を指す。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、アンチセンス化合物である。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、解毒剤化合物である。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、コンジュゲート基を含む。
【０４５３】
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオシド」は、ヌクレオシド間結合が、リン原子を含有しないオリゴヌクレオチドを指す。
【０４５４】
本明細書で使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物を指す。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの１つ又は複数のヌクレオチドは、修飾されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然及び／又は若しくは非天然核酸塩基、糖及び共有結合ヌクレオシド間結合から構成され、さらに非核酸コンジュゲートを含み得る。
【０４５５】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド間結合」は、隣接するヌクレオシド同士の共有結合を指す。
【０４５６】
本明細書で使用されるとき、「天然に存在するヌクレオシド間結合」は、３’−５’リン酸ジエステル結合を指す。
【０４５７】
本明細書で使用されるとき、用語「ｓｉＲＮＡ性を検出する」又は「ｓｉＲＮＡ活性を測定する」は、ｓｉＲＮＡ活性を検出又は測定するための試験が特定のサンプルについて実施され、対照サンプルのものと比較されることを意味する。このような検出及び／又は測定は、ゼロの値を含み得る。従って、ｓｉＲＮＡ活性の検出のための試験の結果、ｓｉＲＮＡ活性がないこと（ゼロのｓｉＲＮＡ活性）が判明する場合でも、「ｓｉＲＮＡ活性を検出する」ステップはやはり実施されている。
【０４５８】
本明細書で使用されるとき、用語「対照サンプル」は、リポータオリゴマー化合物と接触させていないサンプルを指す。
【０４５９】
本明細書で使用されるとき、用語「モチーフ」は、オリゴマー化合物中の非修飾及び修飾ヌクレオチドのパターンを指す。
【０４６０】
本明細書で使用されるとき、用語「キメラオリゴマー」は、同じオリゴマー化合物内の少なくとも１つの他の糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合と比較して、異なる様式で修飾されている少なくとも１つの糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合を有するオリゴマー化合物を指す。糖、核酸塩基及びヌクレオシド間結合の残りは、独立に修飾されていても又は非修飾であってもよく、同じでも異なっていてもよい。
【０４６１】
本明細書で使用されるとき、用語「キメラオリゴヌクレオチド」は、同じオリゴヌクレオチド内の少なくとも１つの他の糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合と比較して、異なる様式で修飾されている少なくとも１つの糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを指す。糖、核酸塩基及びヌクレオシド間結合の残りは、独立に修飾されていても又は非修飾であってもよく、同じでも異なっていてもよい。
【０４６２】
本明細書で使用されるとき、用語「混合骨格オリゴマー化合物」は、オリゴマー化合物の少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、オリゴマー化合物の少なくとも１つの他のヌクレオシド間結合と異なるオリゴマー化合物を指す。
【０４６３】
本明細書で使用されるとき、用語「標的タンパク質」は、調節が望まれるタンパク質を指す。
【０４６４】
本明細書で使用されるとき、用語「標的遺伝子」は、標的タンパク質をコードする遺伝子を指す。
【０４６５】
本明細書で使用されるとき、用語「ターゲティングする」又は「ターゲティングされる」は、特定の標的核酸分子又は標的核酸分子内のヌクレオチドの特定の領域に対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の会合を指す。
【０４６６】
本明細書で使用されるとき、用語「核酸塩基相補性」は、別の核酸塩基と塩基対合することができる核酸塩基を指す。例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と相補的である。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）は、ウラシル（Ｕ）と相補的である。いくつかの実施形態では、相補的核酸塩基は、その標的核酸の核酸塩基と塩基対合することができるアンチセンス化合物の核酸塩基を指す。例えば、アンチセンス化合物の特定の位置の核酸塩基が標的核酸の特定の位置の核酸塩基と水素結合することができれば、オリゴヌクレオチドと標的核酸との水素結合の位置は、その核酸塩基対で相補的であるとみなされる。
【０４６７】
本明細書で使用されるとき、用語「非相補的核酸塩基」は、互いに水素結合を形成しないか、或いはハイブリダイゼーションを支持しない核酸塩基の対を指す。
【０４６８】
本明細書で使用されるとき、用語「相補的」は、別のオリゴマー化合物又は核酸と核酸塩基相補性によってハイブリダイズするオリゴマー化合物の能力を指す。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物とその標的とは、各分子内で十分な数の対応する位置が、互いに結合することができる核酸塩基によって占められて、アンチセンス化合物と標的との安定した会合を可能にするとき、互いに相補的である。当業者であれば、会合を維持するオリゴマー化合物の能力を排除することなく、ミスマッチの含有が可能であることは認識される。従って、ミスマッチである（すなわち、標的の対応ヌクレオチドに対して相補的な核酸塩基ではない）最大約２０％のヌクレオチドを含み得るオリゴマー化合物（例えば、ｓｉＲＮａ、多標的分子など）が本明細書に記載される。好ましくは、ｓｉＲＮＡ及び多標的分子などのオリゴマー化合物は、約１５％以下、より好ましくは約１０％以下、最も好ましくは５％以下のミスマッチを含有するか、又はミスマッチを一切含有しない。残りのヌクレオチドは、相補的核酸塩基であるか、或いはハイブリダイゼーションを破壊しない（例えば、ユニバーサル塩基）。当業者であれば、本明細書において提供される化合物は、標的核酸に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％相補的であることは認識されるであろう。
【０４６９】
本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」は、相補的オリゴマー化合物（例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とその標的核酸又はｓｉＲＮＡとのアンチセンス鎖及びセンス鎖）の対合を意味する。特定の機構に限定されないが、対合の最も一般的機構は、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）同士の水素結合を含み、これは、ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）型、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型若しくは逆フーグスティーン（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型水素結合であってよい。例えば、天然の塩基アデニンは、水素結合の形成を介して対合する天然の核酸塩基チミジン及びウラシルと相補的な核酸塩基である。天然の塩基グアニンは、天然の塩基シトシン及び５−メチルシトシンと相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、様々な状況下で起こり得る。
【０４７０】
本明細書で使用されるとき、用語「特異的にハイブリダイズする」は、オリゴマー化合物が１つの核酸部位に、他の核酸部位とハイブリダイズするよりも高い親和性でハイブリダイズする能力を指す。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、２つ以上の標的部位に特異的にハイブリダイズする。
【０４７１】
本明細書で使用されるとき、「設計する」又は「設計される」は、選択された核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴマー化合物を設計するプロセスを指す。
【０４７２】
本明細書で使用されるとき、用語「調節」は、調節前の機能又は活性のレベルと比較した機能又は活性の摂動を指す。例えば、調節は、遺伝子発現の変化、すなわち、増大（刺激若しくは誘導）又は低減（阻害若しくは抑制）のいずれかを含む。別の例として、発現の調節は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡプロセシングのスプライス部位選択の摂動を含み得る。
【０４７３】
本明細書で使用されるとき、用語「発現」は、遺伝子のコードされた情報が、細胞内に存在し、且つ作動する構造へと変換されるあらゆる機能及びステップを指す。こうした構造として、限定はしないが、転写及び翻訳の産物が挙げられる。
【０４７４】
本明細書で使用されるとき、「変異体」は、ＤＮＡの同じゲノム領域から生成され得る別のＲＮＡ転写物を指す。変異体として、限定はしないが、「ｐｒｅ−ｍＲＮＡ変異体」があり、これは、同じゲノムＤＮＡから生成される転写物であり、同じゲノムＤＮＡから生成される他の転写物とその開始位置又は終止位置のいずれかが異なり、イントロン及びエキソン配列の両方を含む。変異体には、限定はしないが、別のスプライス部位、又は別の開始及び終止コドンを有するものもある。
【０４７５】
本明細書で使用されるとき、「高親和性修飾モノマー」は、天然に存在するモノマーと比較して、少なくとも１つの修飾核酸塩基、ヌクレオシド間結合又は糖部分を有し、この修飾が、その標的核酸に対する高親和性修飾モノマーを含むアンチセンス化合物の親和性を高めるようなモノマーを指す。高親和性修飾として、限定はしないが、２’−修飾糖を含むモノマー（例えば、ヌクレオシド及びヌクレオチド）がある。
【０４７６】
本明細書で使用されるとき、用語「２’−修飾」又は「２’−置換」は、Ｈ又はＯＨ以外の２’位に置換基を含む糖を意味する。２’−修飾モノマーとして、限定はしないが、２’−置換基、例えば、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、又はＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）を有するＢＮＡ及びモノマー（例えば、ヌクレオシド及びヌクレオチド）が挙げられ、ここで、各Ｒｍ及びＲｎが、独立に、Ｈ又は置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、式２’−Ｏ（ＣＨ２）ｎＨ（ここで、ｎが１〜６である）がない２’修飾モノマーを含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、式２’−ＯＣＨ３がない２’修飾モノマーを含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、上記式、又は別の実施形態では２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３がない２’修飾モノマーを含む。
【０４７７】
本明細書で使用されるとき、用語「ロックド核酸」又は「ＬＮＡ」又は「ロックドヌクレオシド」又は「ロックドヌクレオチド」は、ヌクレオシドのフラノース部分が、フラノース環上の２つの炭素原子を連結する架橋を含み、それにより二環式系を形成するヌクレオシド又はヌクレオチドを指す。ロックド核酸は、二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。
【０４７８】
本明細書で使用されるとき、別に指示されない限り、用語「メチレンオキシＬＮＡ」は、単独でβ−Ｄ−メチレンオキシＬＮＡを指す。
【０４７９】
本明細書で使用されるとき、用語「ＭＯＥ」は、２’−Ｏ−メトキシエチル置換基を指す。
【０４８０】
本明細書で使用されるとき、用語「ギャップマー」は、中央領域（「ギャップ」）と、中央領域のいずれかの側の領域（「ウィング」）とを含むキメラオリゴマー化合物を指し、ここで、ギャップは、各ウィングと異なる少なくとも１つの修飾を含む。このような修飾としては、核酸塩基、モノマー結合、及び糖修飾、並びに修飾の非存在（非修飾）がある。従って、いくつかの実施形態では、ウィングの各々におけるヌクレオチド結合は、ギャップ内のヌクレオチド結合と異なる。いくつかの実施形態では、各ウィングは、高親和性修飾を有するヌクレオチドを含み、ギャップは、その修飾を含まないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ギャップ内のヌクレオチド及びウィング内のヌクレオチドは全て高親和性修飾を含むが、ギャップ内の高親和性修飾は、ウィング内の高親和性修飾と異なる。いくつかの実施形態では、ウィング内の修飾は、互いに同じである。いくつかの実施形態では、ウィング内の修飾は、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ギャップ内のヌクレオチドは、非修飾であり、ウィング内のヌクレオチドは、修飾されている。いくつかの実施形態では、各ウィング内の修飾は、同じである。いくつかの実施形態では、一方のウィング内の修飾は、他方のウィング内の修飾と異なる。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、ギャップ内に２’−デオキシヌクレオチドを有し、且つウィング内に高親和性修飾を有するヌクレオチドを有するギャップマーである。
【０４８１】
本明細書で使用されるとき、用語「プロドラッグ」は、内在性酵素又はその他の化学薬品及び／又は若しくは条件の作用により、身体又はその細胞内で活性形態（すなわち、薬剤）へと変換される不活性形態で調製される治療剤を指す。
【０４８２】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される塩」は、活性化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒物学的作用を付与しない活性化合物の塩を指す。
【０４８３】
本明細書で使用されるとき、用語「キャップ構造」又は「末端キャップ部分」は、アンチセンス化合物のいずれかの末端に組み込まれた化学修飾を指す。
【０４８４】
本明細書で使用されるとき、用語「予防」は、数時間から数日、好ましくは数週間から数ヵ月にわたって状態若しくは疾患の発症又は発生を遅延させるか、又は未然に防ぐことを指す。
【０４８５】
本明細書で使用されるとき、用語「改善」は、状態若しくは疾患の少なくとも１つの活性又は１つの重症度の指標の軽減を指す。指標の重症度は、当業者に公知の主観的又は客観的測度により決定することができる。
【０４８６】
本明細書で使用されるとき、用語「治療」は、疾患若しくは状態の変化又は改善をもたらすために、本発明の組成物を投与することを指す。予防、改善、及び／又は治療は、疾患若しくは状態の経過を変化させるために、定期的間隔で又は状態若しくは疾患の発症前に複数回用量の投与を必要とし得る。さらに、状態若しくは疾患の予防、改善、及び治療のためにそれぞれ１個体に単剤を順次又は同時に用いてもよい。
【０４８７】
本明細書で使用されるとき、用語「医薬剤」は、対象に投与されるとき、治療利益をもたらす物質を指す。いくつかの実施形態では、医薬剤は、活性医薬剤である。いくつかの実施形態では、医薬剤は、プロドラッグである。
【０４８８】
本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、動物に治療利益をもたらす医薬剤の量を指す。
【０４８９】
本明細書で使用されるとき、「投与する」は、動物に医薬剤を提供することを意味し、限定はしないが、医療専門家による投与及び自己投与を含む。
【０４９０】
本明細書で使用されるとき、用語「共投与する」は、２種以上の医薬剤を動物に提供することを意味する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、一緒に投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、個別に投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、同時に投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、異なる時点で投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、同じ投与経路により投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、異なる投与経路により投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、同じ医薬製剤に含有されている。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、個別の製剤の形態をしている。
【０４９１】
本明細書で使用されるとき、用語「医薬組成物」は、個体に投与するのに好適な物質の混合物を指す。例えば、医薬組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び滅菌水溶液を含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、医薬剤と希釈剤及び／又は担体を含む。
【０４９２】
本明細書で使用されるとき、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、生物（例えば、動物又は植物）内ではなく、人工的環境、例えば、試験管又は反応容器内、細胞培養内などで起こる事象を指す。本明細書で使用されるとき、用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、生きた生物から取り出され、生物外部（例えば、試験管内）で培養される細胞を指す。本明細書で使用されるとき、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、生物（例えば、動物、植物及び／又は微生物）内で起こる事象を指す。
【０４９３】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」又は「患者」は、例えば、実験、診断、及び／又は治療を目的として、本明細書に開示の組成物を投与することができる任意の生物を指す。典型的な対象として、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）及び／又は植物が挙げられる。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜又は競技用動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ）が挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。家畜及び競技用動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ科種、例えば、家ネコ、イヌ科種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、並びに魚類、例えば、マス、ナマズ及びサケが挙げられる。患者又は対象は、上に挙げた任意のサブセット、例えば、前述の全てを含むが、ヒト、霊長類又はげっ歯類などの１つ又は複数の群若しくは種を除外する。本明細書に記載する態様のいくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。「患者」及び「対象」という用語は、本明細書では同義的に使用される。対象は、男性（雄）又は女性（雌）であり得る。
【０４９４】
好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであってよいが、これらの例に限定されるわけではない。ヒト以外の哺乳動物は、ヒトの疾患及び障害の動物モデルとなる対象として有利に使用することができる。さらに、本明細書に記載する化合物、組成物及び方法は、家畜及び／又はペットに用いることができる。
【０４９５】
一部の実施形態では、対象は、ヒトである。別の実施形態では、対象は、疾患モデルとしての実験動物又は代用動物である。この用語は、特定の年齢又は性別を意味するわけではない。従って、男性（雄）又は女性（雌）にかかわらず、成体及び新生の対象、並びに胎児が包含されることが意図される。対象の例として、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、及びマウスが挙げられる。対象という用語は、さらにトランスジェニック種を含むことも意図される。一部の実施形態では、対象は、欧州系であってよい。一部の実施形態では、対象は、アフリカ系アメリカ人であってよい。一部の実施形態では、対象は、アジア系であってよい。
【０４９６】
ヒト身体に対して実施される方法の特許付与を禁止する管轄区域では、ヒト対象への組成物の「投与」の意味は、ヒト対象がいずれかの方法（例えば、経口、吸入、局所適用、注射、挿入など）により自己投与する規制物質を処方することに限定されることになる。特許を受けることができる主題を定義する法律又は規制に適合する最も広範且つ合理的な解釈が意図される。ヒト身体に対して実施される方法の特許付与を禁止しない管轄区域では、組成物の「投与」は、ヒト身体に対して実施される方法と、前述した活動との両方を包含する。
【０４９７】
本明細書で使用されるとき、用語「非経口投与」は、注射又は注入による投与を指す。非経口投与として、限定はしないが、皮下投与、静脈内投与、又は筋肉内投与が挙げられる。
【０４９８】
本明細書で使用されるとき、用語「皮下投与」は、皮膚の直下への投与を指す。「静脈内投与」は、静脈への投与を意味する。
【０４９９】
本明細書で使用されるとき、用語「用量」は、１回の投与で供給される医薬剤の指定量を指す。いくつかの実施形態では、１用量は、２回以上のボーラス、錠剤、又は注射で投与してもよい。例えば、皮下投与が望まれるいくつかの実施形態では、所望の用量は、１回の注射によって容易に供給できない量を必要とする。こうした実施形態では、２回以上の注射を用いて所望の用量を達成してもよい。いくつかの実施形態では、１用量は、個体の注射部位反応を最小限にするために２回以上の注射で投与してもよい。
【０５００】
本明細書で使用されるとき、用語「単位投与剤形」は、医薬剤が提供される形態を指す。いくつかの実施形態では、単位投与剤形は、凍結乾燥したアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。いくつかの実施形態では、単位投与剤形は、再構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。
【０５０１】
本明細書で使用されるとき、用語「医薬品有効成分」は、所望の効果を付与する医薬組成物中の物質を指す。
【０５０２】
本明細書で使用されるとき、用語「副作用」は、所望の効果以外の治療に起因すると考えられる生理反応を指す。いくつかの実施形態では、副作用として、限定はしないが、注射部位反応、肝機能試験異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、及び筋障害が挙げられる。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼレベル上昇は、肝毒性又は肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの増加は、肝毒性又は肝機能異常を示し得る。
【０５０３】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキル」は、ここで使用される通り、最大２４個の炭素原子を含む飽和直鎖又は分岐状炭化水素ラジカルを指す。アルキル基の例として、限定はしないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどが挙げられる。アルキル基は、典型的に、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には１〜約１２個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ１２アルキル）を含み、１〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書で使用される用語「低級アルキル」は、１〜約６個の炭素原子を含む。本明細書で使用されるアルキル基は、任意選択で、１個又は複数個の別の置換基を含んでもよい。
【０５０４】
本明細書で使用されるとき、用語「アルケニル」は、ここで使用される通り、最大２４個の炭素原子を含み、且つ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖又は分岐状炭化水素鎖ラジカルを指す。アルケニル基の例として、限定はしないが、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、１，３−ブタジエンなどのジエンなどが挙げられる。アルケニル基は、典型的に、２〜約２４個の炭素原子、より典型的には２〜約１２個の炭素原子を含み、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書で使用されるアルケニル基は、任意選択で、１個又は複数個の別の置換基を含んでもよい。
【０５０５】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキニル」は、ここで使用される通り、最大２４個の炭素原子を含み、且つ少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖又は分岐状炭化水素ラジカルを指す。アルキニル基の例として、限定はしないが、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニルなどが挙げられる。アルキニル基は、典型的に、２〜約２４個の炭素原子、より典型的には２〜約１２個の炭素原子を含み、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書で使用されるアルキニル基は、任意選択で、１個又は複数個の別の置換基を含んでもよい。
【０５０６】
本明細書で使用されるとき、用語「アミノアルキル」は、ここで使用される通り、アミノ置換アルキルラジカルを指す。この用語は、任意の位置にアミノ置換基を有するＣ１〜Ｃ１２アルキル基を含むことを意味し、ここで、アルキル基は、アミノアルキル基を親分子に結合する。アミノアルキル基のアルキル及び／又はアミノ部分は、置換基でさらに置換することができる。
【０５０７】
本明細書で使用されるとき、用語「脂肪族」は、ここで使用される通り、最大２４個の炭素原子を含み、いずれか２個の炭素原子の間の飽和が単結合、二重結合若しくは三重結合である、直鎖又は分岐状炭化水素ラジカルを指す。脂肪族基は、好ましくは、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には１〜約１２個の炭素原子を含み、１〜約６個の炭炭素原子がより好ましい。脂肪族基の直鎖又は分岐鎖は、窒素、酸素、硫黄及びリンを含む１個又は複数個のヘテロ原子で分断されていてもよい。ヘテロ原子で分断されたこのような脂肪族基として、限定はしないが、ポリアルコキシ、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、及びポリイミンが挙げられる。本明細書で使用される脂肪族基は、任意選択で、別の置換基を含んでもよい。
【０５０８】
本明細書で使用されるとき、用語「脂環式」又は「アリシクリル」は、環が脂肪族の環系を指す。この環系は、少なくとも１つの環が脂肪族である１つ又は複数の環を含み得る。好ましい脂環式化合物は、環内に約５〜約９個の炭素原子を有する環を含む。本明細書で使用される脂環式は、任意選択で、別の置換基を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、用語「アルコキシ」は、ここで使用される通り、アルキル基と酸素原子との間に形成されるラジカルを指し、ここで、酸素原子は、アルコキシ基を親分子に結合するために用いられる。アルコキシ基の例として、限定はしないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシなどが挙げられる。本明細書で使用されるアルコキシ基は、任意選択で、別の置換基を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、用語「ハロ」及び「ハロゲン」は、ここで使用される通り、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される原子を指す。
【０５０９】
本明細書で使用されるとき、用語「アリール」及び「芳香族」は、ここで使用される通り、１つ又は複数の芳香環を有する、単環若しくは多環式炭素環系ラジカルを指す。アリール基の例として、限定はしないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが挙げられる。好ましいアリール環系は、１つ又は複数の環内に約５〜約２０個の炭素原子を有する。本明細書で使用されるアリール基は、任意選択で、別の置換基を含んでもよい。
【０５１０】
本明細書で使用されるとき、用語「アラルキル」及び「アリールアルキル」は、ここで使用される通り、アルキル基とアリール基との間に形成されるラジカルを指し、ここで、アルキル基は、アラルキル基を親分子に結合するために用いられる。例として、限定はしないが、ベンジル、フェネチルなどが挙げられる。本明細書で使用されるアラルキル基は、任意選択で、ラジカル基を形成するアルキル、アリール又はその両方の基に結合した別の置換基を含んでもよい。
【０５１１】
本明細書で使用されるとき、用語「複素環式ラジカル」は、ここで使用される通り、少なくとも１つのヘテロ原子を含み、不飽和、部分的飽和若しくは完全飽和であり、従って、ヘテロアリール基を含む、ラジカル単環式若しくは多環式環系を指す。複素環式は、縮合環系を含むことも意味し、ここで、縮合環の１つ又は複数は、少なくとも１つのヘテロ原子を含み、他の環は、１つ又は複数のヘテロ原子を含有し得るか、或いは任意選択でヘテロ原子を含まない。複素環式基は、典型的に、硫黄、窒素又は酸素から選択される少なくとも１個の原子を含む。複素環式基の例として、［１，３］ジオキソラン、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルなどが挙げられる。本明細書で使用される複素環式基は、任意選択で、別の置換基を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアリール」、及び「ヘテロ芳香族」は、ここで使用される通り、環の少なくとも１つが芳香族であり、１個又は複数個のヘテロ原子を含む、単環式若しくは多環式芳香環、環系又は縮合環系を含むラジカルを指す。ヘテロアリールはまた、縮合環系を含むことも意味し、これには、１つ又は複数の縮合環がヘテロ原子を含まない系が含まれる。ヘテロアリール基は、典型的に、硫黄、窒素又は酸素から選択される１個の環原子を含む。ヘテロアリール基の例として、限定はしないが、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニルなどが挙げられる。ヘテロアリールラジカルは、直接、又は脂肪族基若しくはヘテロ原子などの連結部分を介して親分子に結合することができる。本明細書で使用されるヘテロアリール基は、任意選択で、別の置換基を含んでもよい。
【０５１２】
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアリールアルキル」は、ここで使用される通り、ヘテロアリールアルキル基を親分子に結合することができるアルキルラジカルを有する、既に定義した通りのヘテロアリール基を指す。例として、限定はしないが、ピリジニルメチル、ピリミジニルエチル、ナフチリジニルプロピルなどが挙げられる。本明細書で使用されるヘテロアリールアルキル基は、任意選択で、ヘテロアリール又はアルキル部分の一方又は両方に別の置換基を含んでもよい。
【０５１３】
本明細書で使用されるとき、用語「単環又は多環式構造」は、本発明で使用される通り、単環又は縮合若しくは連結された環を有する多環式である、全ての環系を包含し、脂肪族、脂環式、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アリールアルキル、複素環式、ヘテロアリール、ヘテロ芳香族、ヘテロアリールアルキルから個々に選択される単環又は混合環系を含むものとする。このような単環及び多環式構造は、均質であるか、又は完全飽和、部分的飽和若しくは完全不飽和などの様々な飽和度を有する環を含むことができる。各環は、Ｃ、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される環原子を含み、それにより複素環、並びに混合モチーフに存在し得る唯一のＣ環原子のみを含む環、例えば、１つの環が炭素環原子のみを有し、縮合環が２つの窒素原子を有するベンズイミダゾールを形成することができる。単環又は多環式構造は、例えば、環の１つに結合した２つの＝Ｏ基を有するフタルイミドなどの置換基でさらに置換することができる。別の態様では、単環又は多環式構造は、環原子を介して直接、置換基又は二官能価連結部分を介して親分子に結合することができる。
【０５１４】
本明細書で使用されるとき、用語「アシル」は、ここで使用される通り、有機酸からのヒドロキシル基の除去により形成されるラジカルを指し、一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｘを有し、ここで、Ｘは、典型的には脂肪族、脂環式又は芳香族である。例として、脂肪族カルボニル、芳香族カルボニル、脂肪族スルホニル、芳香族スルフィニル、脂肪族スルフィニル、芳香族リン酸エステル、脂肪族リン酸エステルなどが挙げられる。本明細書で使用されるアシル基は、任意選択で別の置換基を含んでもよい。
【０５１５】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒドロカルビル」は、Ｃ、Ｏ及びＨを含む基を含む。任意の飽和度を有する直鎖、分岐状及び環状基が含まれる。こうしたヒドロカルビル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含んでもよく、１つ又は複数の置換基でさらに一又は多置換されていてもよい。
【０５１６】
本明細書で使用されるとき、用語「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」及び「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」は、ここで使用される通り、所望の特性を増強する、又は所望の効果を付与するために、他の基若しくは親化合物に典型的に付加される基を含む。置換基は、保護若しくは非保護のいずれでもよく、親化合物内の１つの利用可能な部位、又は多数の利用可能な部位に付加することができる。置換基も他の置換基でさらに置換されていてよく、直接又はアルキル若しくはヒドロカルビル基などの結合基を介して親化合物に結合させてもよい。このような基として、限定はしないが、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル（−Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）、カルボキシル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａａ）、脂肪族基、脂環式基、アルコキシ、置換オキソ（−Ｏ−Ｒａａ）、アリール、アラルキル、複素環式、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ（−ＮＲｂｂＲｃｃ）、イミノ（＝ＮＲｂｂ）、アミド（−Ｃ（Ｏ）Ｎ−ＲｂｂＲｃｃ又は−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）、アジド（−Ｎ３）、ニトロ（−ＮＯ２）、シアノ（−ＣＮ）、カルバミド（−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｂｂＲｃｃ又は−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａａ）、ウレイド（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）ＮＲｂｂＲｃｃ）、チオウレイド（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｓ）ＮＲｂｂＲｃｃ）、グアニジニル（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＮＲｂｂＲｃｃ）、アミジニル（−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）−ＮＲｂｂＲｃｃ又は−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（ＮＲｂｂ）Ｒａａ）、チオール（−ＳＲｂｂ）、スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）Ｒｂｂ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２Ｒｂｂ）、スルホンアミジル（−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｂｂＲｃｃ又は−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｓ（Ｏ）２Ｒｂｂ）及びコンジュゲート基が挙げられる。各Ｒａａ、Ｒｂｂ及びＲｃｃは、独立に、Ｈ、任意選択で連結された化学官能基又は別の置換基であり、好ましいリストは、限定はしないが、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環式及びヘテロアリールアルキルを含む。
【実施例】
【０５１７】
実施例１：平行及び逆平行鎖配向を有するビス（ｓｉＲＮＡ）の合成
【化１０１】
2018520683.tif 000104
スキーム１に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、固体担体及び官能化された第２の鎖、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションから合成される。
【０５１８】
実施例２．ターゲティングリガンドを含む平行及び逆平行鎖配向を有するビス（ｓｉＲＮＡ）の合成
【化１０２】
2018520683.tif 000105
スキーム２に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、固体担体及びリガンドを含む官能化された第２の鎖、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションから合成される。
【０５１９】
実施例３．異なる位置にターゲティングリガンドを含む平行及び逆平行鎖配向を有するビス（ｓｉＲＮＡ）の合成
【化１０３】
2018520683.tif 000106
スキーム３に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、固体担体及び官能化された第２の鎖、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションから合成される。
【０５２０】
実施例４．異なる位置に２つ以上のリガンドを含む平行及び逆平行鎖配向を有するビス（ｓｉＲＮＡ）の合成
【化１０４】
2018520683.tif 000107
スキーム４に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、固体担体、官能化されたモノマー及びリガンドを含む官能化された第２の鎖、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションから合成される。
【０５２１】
実施例５．リガンドが、短鎖体（ｓｈｏｒｔ−ｍｅｒ）相補性オリゴヌクレオチドの１つに共役された、平行及び逆平行鎖配向を有するビス（ｓｉＲＮＡ）の合成
【化１０５】
2018520683.tif 000108
スキーム５に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、固体担体及び官能化された第２の鎖、続いて相補鎖（そのうちの１つがリガンドを含む）とのハイブリダイゼーションから合成される。
【０５２２】
実施例６．第２のｓｉＲＮＡへの共役のためにリガンド及び機能的テザーの両方を含有するモノマーからのビス（ｓｉＲＮＡ）の合成
【化１０６】
2018520683.tif 000109
スキーム６に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、固体担体及び活性化ジスルフィドを含む官能化された第２の鎖、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションから合成される。
【０５２３】
実施例７．第２のｓｉＲＮＡへの共役のためにリガンド及び機能的テザーの両方を含有するモノマーからのビス（ｓｉＲＮＡ）の合成
【化１０７】
2018520683.tif 000110
スキーム７に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、固体担体及びマレイミド部分を含む官能化された第２の鎖、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションから合成される。
【０５２４】
実施例８．官能化リンカー、固体担体及びホスホロアミダイト
【化１０８】
2018520683.tif 000111
【０５２５】
実施例９．多量体ｓｉＲＮＡ固相及び合成後のためのペプチダーゼで切断可能なリンカー
【化１０９】
2018520683.tif 000112
各不斉中心は、ラセミ化合物、又はキラル純粋なＲ若しくはＳ及び（Ｒ，Ｒ）、（Ｒ，Ｓ）、（Ｓ，Ｒ）及び（Ｓ，Ｓ）などの組合せである。ＯＤＭＴｒ保護を有するモノマーが、２つ以上の一本鎖オリゴヌクレオチドの固相共有結合に使用される。ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ３、アセチレン又はジスルフィド部分を含有するモノマーが、カラム及び／又は入ってくる一本鎖における相補性反応基と２つ以上の一本鎖オリゴヌクレオチドとの溶液相合成後共有結合に使用される。
【０５２６】
実施例１０．多量体ｓｉＲＮＡ固相及び合成後のためのグリコシレート（Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）及び／又は酸で切断可能なリンカー
【化１１０】
2018520683.tif 000113
各不斉中心は、ラセミ化合物又はキラル純粋なＲ若しくはＳ及びこれらの組合せである。ＯＤＭＴｒ保護を有するモノマーが、２つ以上の一本鎖オリゴヌクレオチドの固相共有結合に使用される。ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ３、アセチレン又はジスルフィド部分を含有するモノマーが、カラム及び／又は入ってくる一本鎖における相補性反応基と２つ以上の一本鎖オリゴヌクレオチドとの溶液相合成後共有結合に使用される。
【０５２７】
実施例１１．プロリノールＮ−カルバメートリンカー：合成後：
【化１１１】
2018520683.tif 000114
化合物７０２の合成：
ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中のアルコール７００（５０ｇ、７５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＴＢＳＣｌ（１３．６ｇ、９０ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（１２．７５ｇ、１８７．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１４時間撹拌した。５０ｍｌの水を加えた後、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得た。この材料をＤＣＭ（１５０ｍＬ）及びトリクロロ酢酸（１５０ｍＬ）に溶解させ、室温で３時間撹拌した。溶媒の濃縮、続いてカラムクロマトグラフィーによる精製により、生成物７０２（３０ｇ、８５％）を得た。化合物７０２についてのＬＣＭＳ：Ｃ２５Ｈ４２Ｎ２Ｏ５Ｓｉについての計算値：４７８．７０（Ｍ＋）、実測値：ＸＸＸ
【０５２８】
化合物７０４の合成：
ピリジン（１００ｍＬ）中のアルコール７０３（２１．４ｇ、８５．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＤＭＴｒＣｌ（３１．７ｇ、９３．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１４時間撹拌した。５０ｍｌの水を加えた後、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）、塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物７０４（４０ｇ、８５％）を得た。
【０５２９】
化合物７０５の合成：
ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中の７０４（４．２８ｇ、３５．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に１０％のＰｄ／Ｃ（１ｇ）を加え、反応混合物を水素雰囲気下において室温で１４時間撹拌した。触媒のろ去、続いて溶媒の濃縮により、対応する生成物７０５（３．２ｇ、９８％）を得た。
【０５３０】
化合物７０６の合成：
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中のアルコール７０２（５．９ｇ、１２．５３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＣＤＩ（２．０３ｇ、１２．５３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。上記の溶液にアミン７０５（５．３ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。５０ｍＬの水を加えた後、酢酸エチル（２５０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物７０６（６．１８ｇ、５５％）を得た。
Ｃ５３Ｈ７３Ｎ３Ｏ８Ｓ：９０８．２６
【０５３１】
化合物７０８の合成：
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のアルコール７０６（６．０ｇ、６．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＴＨＦ（８．１ｍＬ、８．１ｍｍｏｌ）中１ＭのＴＢＡＦを加え、室温で一晩撹拌した。５０ｍＬの水を加えた後、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料７０７（６．０ｇ）を得て、それをＭｅＯＨ（４０ｍＬ）に溶解させ、１０％のＰｄ／Ｃ（１．０ｇ）を加え、水素雰囲気下において室温で１４時間撹拌した。触媒のろ去、続いて溶媒の濃縮により、対応するアミン（５．５ｇ）を得た。このアミンをＣＨ３ＣＮ（５０ｍＬ）に溶解させた後、トリフルオロ酢酸エチル（２ｍＬ）及びトリエチルアミン（２ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物の濃縮、続いてカラムクロマトグラフィーにより、純粋な生成物７０８（４．０ｇ、８０％）を得た。
【０５３２】
化合物７０９の合成：
ＤＣＭ（８０ｍＬ）中のアルコール７０８（４．０ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＤＩＥＡ（１．３４ｇ、１０．３４ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１．５３ｇ、６．４７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。１０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えた後、ＤＣＭ（５０ｍＬ×２）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物７０９（３．５ｇ、６９％）を得た。
【０５３３】
実施例１２．プロリノールアミドリンカー：
【化１１２】
2018520683.tif 000115
化合物７１１の合成：
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の酸７１０（２．９ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＥＤＣ（２．１ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．５ｇ、９．６ｍｍｏｌ）、アミン７０５（３．７ｇ、８．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．３４ｇ、１０．３４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。５０ｍＬの水を加えた後、ＤＣＭ（５０ｍＬ×２）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物７１１（５．７９ｇ、８０％）を得た。
【０５３４】
化合物７１２の合成：
ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中の７１１（５．７９ｇ、８．７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に１０％のＰｄ／Ｃ（１．０ｇ）を加え、反応混合物を水素雰囲気下において室温で１４時間撹拌した。触媒のろ去、続いて溶媒の濃縮により、対応するアミン（５．０ｇ）を得た。Ｃ３２Ｈ４０Ｎ２Ｏ５について計算されたＬＣＭＳ：５３２．６８（Ｍ＋）；実測値：５５５．２０（Ｍ＋＋Ｎａ＋）
【０５３５】
化合物７１４の合成：
ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の酸７１３（９．２ｇ、４．６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＨＢＴＵ（２．１ｇ、５．５４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．０ｇ、６．４ｍｍｏｌ）、アミン７１２（２．４ｇ、４．６ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．５ｇ、１１．６２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。５０ｍＬの水を加えた後、ＤＣＭ（５０ｍＬ×２）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物７１４（５．０ｇ、４３％）を得た。
化合物７１４についてのＭＡＬＤＩ：Ｃ１２３Ｈ１８６Ｎ１２Ｏ４３についての計算値：２５１９．２７（Ｍ＋）、実測値：２５４２．４３
【０５３６】
化合物７１５の合成：
ＤＣＭ（６０ｍＬ）中のアルコール７１４（３．２ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＤＩＥＡ（０．８ｇ、６．３４ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（３０１ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。１０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えた後、ＤＣＭ（５０ｍＬ×２）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗生成物７１５（３．０ｇ）を得た。
【０５３７】
実施例１３．プロリノールＮ−カルバメートリンカー：
【化１１３】
2018520683.tif 000116
化合物７１７の合成：
ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中のアルコール７１６（２０ｇ、４８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＣｂｚ−ＯＳｕ（１２ｇ、４８ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。１０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えた後、酢酸エチル（２５０ｍＬ×２）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗生成物を得て、それをＤＣＭ  ９２５０ｍＬ）に溶解させた。上記の溶液にＴＢＳＣｌ（８．６ｇ）及びイミダゾール（８．２ｇ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えた後、ＤＣＭ（２５０ｍＬ×２）で抽出し、水（１００ｍＬ）、塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗生成物を得て、それをトリクロロ酢酸（１００ｍＬ）及びＤＣＭ（２５０ｍＬ）に溶解させ、室温で２時間撹拌した。濃縮、続いてカラムクロマトグラフィーにより、生成物７１７（１３ｇ、７４％）を得た。Ｃ１９Ｈ３１ＮＯ４Ｓｉについて計算されたＬＣＭＳ：３６５．２０（Ｍ＋）；実測値：３６６．１  Ｍ＋＋１）
【０５３８】
化合物７１８の合成：
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中のアルコール７１７（１．６５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＣＤＩ（７３０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。上記の溶液にアミン７０５（１．８９ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。５ｍＬの水を加えた後、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物７１７（２．３２ｇ、６４％）を得た。
【０５３９】
化合物７１９の合成：
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のアルコール７１８（２．３２ｇ、２．８６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＴＨＦ（５．２ｍＬ）中１ＭのＴＢＡＦを加え、室温で一晩撹拌した。１０ｍＬの水を加えた後、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物７１９（１．６７ｇ、８４％）を得た。Ｃ４１Ｈ４８Ｎ２Ｏ８について計算されたＬＣＭＳ：６９６．３４（Ｍ＋）；実測値：７３１．２（Ｍ＋＋Ｃｌ−）
【０５４０】
化合物７２１の合成：
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解された７１９（１．６５ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に１０％のＰｄ／Ｃ（２５０ｍｇ）を加え、水素雰囲気下において室温で１４時間撹拌した。触媒のろ去、続いて溶媒の濃縮により、対応するアミン７２０（１．２９ｇ、９７％）を得た。このアミンをＤＣＭ（８０ｍＬ）に溶解させた後、ＨＢＴＵ（１．０６ｇ）、ＨＯＢｔ（４２８ｍｇ）及びＤＩＥＡ（０．７８ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。５０ｍＬの水を加えた後、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物７２１（３．９７ｇ、６６％）を得た。Ｃ１２４Ｈ１８８Ｎ１２Ｏ４４について計算されたＭＡＬＤＩ：２５４９．２８（Ｍ＋）、実測値：２５６９．５３（Ｍ＋＋Ｎａ＋）
【０５４１】
実施例１４．プロリノールエーテルリンカー：
【化１１４】
2018520683.tif 000117
化合物７２４の合成：
ＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）に溶解された７１７（９ｇ、２４．６５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に１０％のＰｄ／Ｃ（２．０ｇ）を加え、水素雰囲気下において室温で１４時間撹拌した。触媒のろ去、続いて溶媒の濃縮により、対応するアミン７２３（６．２ｇ）を得て、それをＤＣＭ（１００ｍＬ）に再溶解させた。上記の溶液にＢｏｃ２Ｏ（６．４ｇ）及びトリエチルアミン（７．６ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。５０ｍＬの水を加えた後、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物７２４（８．０ｇ、９８％）を得た。
【０５４２】
化合物７２５の合成：
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のアルコール７２４（８．０ｇ、２４．１３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＮａＨ（１．２ｇ、鉱油中６０％）を加え、室温で３０分間撹拌した。上記の溶液に０℃で臭化アリル（５．８ｇ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。５ｍＬの水を加えた後、酢酸エチル（２５０ｍＬ）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物７２５（６．４４ｇ、７１％）を得た。
【０５４３】
化合物７２６の合成：
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のアルコール７２５（６．４ｇ、２４．９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に６０ｍＬの１Ｍの９−ＢＢＮを加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。上記の溶液に２０ｍＬの３ＭのＮａＯＡｃ及び２０ｍＬのＨ２Ｏ２を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。５０ｍＬの水を加えた後、酢酸エチル（２５０ｍＬ×２）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物７２６（６．６ｇ、６２％）を得た。Ｃ１９Ｈ３９ＮＯ５Ｓｉについて計算されたＬＣＭＳ：３８９．２６（Ｍ＋）；実測値：３９０．１（Ｍ＋＋１）
【０５４４】
化合物７２９の合成：
ジオキサン（５０ｍＬ）中のアルコール７２６（６．０ｇ）の撹拌溶液にジオキサン中４ＭのＨＣｌを加え、室温で３時間撹拌し、溶媒をデカントし、５０ｍＬのジオキサンですすぎ、得られた粘着性材料を減圧下で乾燥させた。この材料をＤＣＭ中で懸濁させた後、トリフルオロ酢酸エチル（５ｍＬ）及びトリエチルアミン（５ｍＬ）を加え、室温で２４時間撹拌した。濃縮、続いてカラムクロマトグラフィーによる精製により、生成物７２８（１．９ｇ）を得た。ピリジン（３０ｍＬ）中の上記の材料７２８（１．９ｇ、７．０１ｍｍｏｌ）にＤＭＴｒＣｌ（２．６ｇ）を加え、室温で一晩撹拌した。２０ｍＬの水を加えた後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物７２９（３．３６ｇ、８４％）を得た。
【０５４５】
化合物７３０の合成：
アセトニトリル（５０ｍＬ）中の７２９（３．３６ｇ、５．８６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＫＯＨ水溶液（２０ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。２０ｍＬの水を加えた後、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物７３０（２．６５ｇ、９５％）を得た。
【０５４６】
化合物７３１の合成：
ＤＣＭ（６０ｍＬ）中の酸７３０（１．５５ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に７１３（６．５ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２．５ｇ）、ＨＯＢｔ（１．０ｇ）及びＤＩＥＡ（１．６ｇ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。５０ｍＬの水を加えた後、ＤＣＭ（１００ｍＬ×２）で抽出し、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料を得て、それをカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物７３１（３．７ｇ、４６％）を得た。Ｃ１２０Ｈ１８１Ｎ１１Ｏ４３について計算されたＭＡＬＤＩ：２４６４．２３（Ｍ＋）、実測値：２４８４．６１（Ｍ＋＋Ｎａ＋）
【０５４７】
実施例１５．プロリノールエーテルリンカー：合成後アミダイト
【化１１５】
2018520683.tif 000118
【０５４８】
実施例１６．生分解性結合
１．酵素分解
ａ）エステル（エステラーゼによって切断可能）
【化１１６】
2018520683.tif 000119
ｂ）アセタール：糖由来アセタール
【化１１７】
2018520683.tif 000120
【０５４９】
２．アクリルアセタール／ケタール（酸性ｐＨ分解）
【化１１８】
2018520683.tif 000121
【０５５０】
３．酸化還元反応
【化１１９】
2018520683.tif 000122
【０５５１】
１．ａ）エステルの合成：
【化１２０】
2018520683.tif 000123
【０５５２】
ｂ）糖由来アセタールの合成：
【化１２１】
2018520683.tif 000124
【０５５３】
実施例１７．合成後三分岐ＧａｌＮＡｃリガンドのための前駆体の合成：
【化１２２】
2018520683.tif 000125
【０５５４】
実施例１８．直鎖マルチ−ＧａｌＮＡｃリガンド：
【化１２３】
2018520683.tif 000126
前駆体の合成：
【化１２４】
2018520683.tif 000127
【０５５５】
実施例１９．アクリルアセタールの合成：
ｉ）直鎖マルチ−ＧａｌＮＡｃリガンド前駆体の合成
【化１２５】
2018520683.tif 000128
【０５５６】
ｉｉ）直鎖三分岐ＧａｌＮＡｃリガンド前駆体の合成
生分解性アセタールモノ−ＧａｌＮＡｃリガンド前駆体の合成：
（ｉ）トリメチルシリルクロリド、アセトアルデヒド  室温；（ｉｉ）グリシドール、ＤＩＥＡ／ＤＣＭ、室温  ７７％；（ｉｉｉ）アジ化ナトリウム、塩化アンモニウム、Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ、８０℃で還流、９７％；（ｉｖ）ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド、イミダゾール、ＤＣＭ、室温、９７％；（ｖ）トリメチルホスフィン、Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ、室温、９９％；（ｖｉ）モノ−ＧａｌＮＡｃ酸、ＥＤＡＣ塩酸塩、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ／ＤＣＭ、室温、８２％；（ｖｉｉ）Ｈ２／Ｐｄ−Ｃ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、室温、９９％；（ｖｉｉｉ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、室温、９６％（ｉｘ）フッ化テトラブチルアンモニウム、ＴＨＦ、０℃、９９％。
【０５５７】
化合物４２の合成：
【化１２６】
2018520683.tif 000129
４−ベンジルオキシ−１−ブタノール、４１（１９．５ｍＬ、１１０ｍｍｏｌ）及びトリメチルシリルクロリド（７０ｍＬ）を２００ｍＬの丸底フラスコに加え、室温で撹拌した。混合物にアセトアルデヒド（６．２４ｍＬ、１１０ｍｍｏｌ）を加え、反応物を周囲温度で１時間撹拌した。次に、反応混合物を蒸発乾固させ、２時間にわたって高真空下に置いた。次に、得られた粗生成物を無水ジクロロメタン（８０ｍＬ）に溶解させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４０ｍＬ、２２０ｍｍｏｌ）をアルゴン下において周囲温度で撹拌しながら混合物に加えた。混合物にグリシドール（７．３６ｍＬ、１１０ｍｍｏｌ）を加え、反応物をアルゴン下で一晩にわたり周囲温度で撹拌した。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）中で希釈し、飽和重炭酸塩溶液（１５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を収集し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた粗生成物をＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な２２ｇ（７７％）の化合物４２（Ｒｆ＝０．２４、２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を透明の液体として得た。［Ｍ＋１］Ｃ１６Ｈ２４Ｏ４について計算された質量２８１．２  実測値２８１．３。
【０５５８】
化合物４３の合成：
【化１２７】
2018520683.tif 000130
無水アジ化ナトリウム（１８．８ｇ、３１５ｍｍｏｌ）及び塩化アンモニウム（９．６ｇ、１７５ｍｍｏｌ）をメタノール：Ｈ２Ｏ（８：２）溶液（４００ｍＬ）に加えた。化合物４２（２０ｇ、７０ｍｍｏｌ）を混合物に滴下して加え、それをアルゴン下で一晩にわたり８０℃で還流させた。反応をＴＬＣによってモニターし、完了したら、反応混合物をジクロロメタン（２００ｍＬ）で洗浄した。水層を別の分量のジクロロメタン（２００ｍＬ）で洗浄した。次に、有機層を組み合わせて、塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させて、２０ｇ（９７％）の化合物４３を透明の液体として得て、それをさらに精製せずに使用した。［Ｍ＋１］Ｃ１６Ｈ２５Ｎ３Ｏ４について計算された質量３２３．１  実測値３２３．１。
【０５５９】
化合物４４の合成：
【化１２８】
2018520683.tif 000131
化合物４３（１９ｇ、６２ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（１０．５３ｇ、１５５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解させ、それを窒素下において０℃で撹拌した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１１．６２ｇ、７８ｍｍｏｌ）を反応混合物にゆっくりと加え、それをアルゴン下において周囲温度で撹拌した。１８時間後、反応混合物を水（２５０ｍＬ）、続いて飽和塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。次に、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた粗生成物をＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製して、１９．７ｇ（９７％）の化合物４４（Ｒｆ＝０．３３、２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を透明のシロップとして得た。［Ｍ−Ｎ２］Ｃ２２Ｈ３９Ｎ３Ｏ４Ｓｉについて計算された質量４０９．２  実測値４０９．２。
【０５６０】
化合物４５の合成：
【化１２９】
2018520683.tif 000132
化合物４４（１３．６８ｇ、３１．２６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン：Ｈ２Ｏ（３００：２）溶液（３０２ｍＬ）に加えた。トリメチルホスフィン（４０ｍＬ）を溶液に滴下して加え、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、次に、酢酸エチル（３００ｍＬ）中で希釈した。有機層を水（２００ｍＬ）及び塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた粗生成物をＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製して、１６．８ｇ（９９％）の化合物４５（Ｒｆ＝０．３０、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を透明のシロップとして得た。［Ｍ＋１］Ｃ２２Ｈ４１ＮＯ４Ｓｉについて計算された質量４１２．３  実測値４１２．３。
【０５６１】
化合物４６の合成：
【化１３０】
2018520683.tif 000133
モノＧａｌＮＡｃ酸（７．７ｇ、１２ｍｍｏｌ）、ＥＤＡＣ塩酸塩（４．７ｇ、３０ｍｍｏｌ）、及びヒドロキシベンゾトリアゾール（３．３ｇ、２５ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（８０ｍＬ）に溶解させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．５ｍＬ、４５ｍｍｏｌ）をアルゴン下において周囲温度で撹拌しながら、反応混合物に滴下して加えた。無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の化合物４５（５．０ｇ、１２ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に滴下して加え、それをアルゴン下で一晩にわたり周囲温度で撹拌した。完了したら、反応混合物を水（１００ｍＬ）、飽和重炭酸塩溶液（１００ｍＬ）、別の分量の水、続いて塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた粗生成物をＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製して、８．４ｇ（８２％）の化合物４６（Ｒｆ＝０．５３  １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を白色の発泡体として得た。［Ｍ＋１］Ｃ５６Ｈ７４Ｎ２Ｏ１４Ｓｉについて計算された質量１０２７．５  実測値１０２７．５。
【０５６２】
化合物４７の合成：
【化１３１】
2018520683.tif 000134
化合物４６（８．３ｇ、８．０ｍｍｏｌ）を１０％のメタノール／酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物に、湿潤活性炭素Ｄｅｇｕｓｓａタイプ（１００ｍｇ）に担持された１０重量％のパラジウムを加えた。フラスコをアルゴンでパージした。フラスコを水素で２回パージし、次に、水素を１０秒間にわたって反応混合物に通してバブリングした。反応混合物を室温で一晩にわたり水素雰囲気下で撹拌し続けた。反応混合物を、セライトが充填された焼結漏斗へとデカントし、メタノールで２回洗浄した。有機層を蒸発乾固させて、７．５０ｇ（９９％）の化合物４７（Ｒｆ＝０．３２  １０％のメタノール／ジクロロメタン）を白色の固体として得て、それはさらに精製する必要がなかった。［Ｍ＋Ｎａ］Ｃ４９Ｈ６８Ｎ２Ｏ１４ＳｉＮａについて計算された質量９５９．３  実測値９５９．３。
【０５６３】
化合物４８の合成：
【化１３２】
2018520683.tif 000135
化合物４７（５．０ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を２回にわたり無水ピリジン（７５ｍＬ）と同時蒸発させた。次に、化合物を２時間にわたって高真空下に置いた。化合物４７を真空から取り出し、無水ピリジン（７５ｍＬ）に溶解させた。反応混合物をアルゴン下において０℃で撹拌した。次に、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（２．３ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に加えた。この溶液に触媒量のジメチルアミノピリジン（０．２ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を真空下、続いてアルゴン下で撹拌し、室温で一晩にわたりアルゴン下において撹拌を続けた。反応混合物を蒸発乾固させ、ジクロロメタン（８０ｍＬ）中で希釈した。有機層を水（８０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（８０ｍＬ）、別の分量の水、及び塩水（８０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた粗生成物をＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製して、５．０４ｇ（９６％）の化合物４８（Ｒｆ＝０．６  １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を黄色の発泡体として得た。［Ｍ＋１］Ｃ７０Ｈ８６Ｎ２Ｏ１６Ｓｉについて計算された質量１２３８．６  実測値１２３８．６。
【０５６４】
化合物４９の合成：
【化１３３】
2018520683.tif 000136
化合物４８（４．８ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を０℃で撹拌した。ＴＨＦ（４．３０ｍＬ）中のフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液を混合物に滴下して加え、それを０℃で一晩撹拌し続けた。完了したら、反応物を蒸発乾固させた。得られた粗生成物をＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製して、３．６０ｇ（９９％）の化合物４９（Ｒｆ＝０．３  １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を透明のシロップとして得た。［Ｍ＋１］Ｃ６４Ｈ７２Ｎ２Ｏ１６について計算された質量１１２４．５  実測値１１２４．５。
【０５６５】
生分解性アセタール三分岐ＧａｌＮＡｃリガンドの合成：
【化１３４】
2018520683.tif 000137
（ｉ）三分岐ＧａｌＮＡｃ酸、ＥＤＡＣ塩酸塩、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ／ＤＣＭ、室温、（７４％）；（ｖｉｉ）Ｈ２／Ｐｄ−Ｃ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、室温、９９％；（ｖｉｉｉ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、室温、９４％（ｉｘ）フッ化テトラブチルアンモニウム、ＴＨＦ、０℃、９３％；（ｘ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ＴＥＡ／ＤＣＭ、室温、６０％；（ｘｉ）ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ／ＤＭＦ、ＣＰＧ担体、充填５７  ５０μｍｏｌ／ｇ。
【０５６６】
化合物５２の合成：
【化１３５】
2018520683.tif 000138
三分岐ＧａｌＮＡｃ酸（２４．３ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）、ＥＤＡＣ塩酸塩（４．７ｇ、３０ｍｍｏｌ）、及びヒドロキシベンゾトリアゾール（３．３ｇ、２５ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１８０ｍＬ）に溶解させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．５ｍＬ、４５ｍｍｏｌ）をアルゴン下において周囲温度で撹拌しながら、反応混合物に滴下して加えた。次に、無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の化合物４５（５．０ｇ、１２ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に滴下して加え、それをアルゴンで一晩にわたり周囲温度で撹拌した。完了したら、反応混合物を水（２００ｍＬ）、飽和重炭酸塩溶液（２００ｍＬ）、別の分量の水、続いて塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた粗生成物をＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製して、２０．３ｇ（７４％）の化合物５２（Ｒｆ＝０．３３  １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を白色の発泡体として得た。
【０５６７】
化合物５３の合成：
【化１３６】
2018520683.tif 000139
化合物５２（２０．０ｇ、８．７５ｍｍｏｌ）を１０％のメタノール／酢酸エチル（６００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物に、湿潤活性炭素Ｄｅｇｕｓｓａタイプ（１００ｍｇ）に担持された１０重量％のパラジウムを加えた。フラスコをアルゴンでパージした。フラスコを水素で２回パージし、次に、水素を１０秒間にわたって反応混合物に通してバブリングした。反応混合物を室温で一晩にわたり水素雰囲気下で撹拌し続けた。反応混合物を、セライトが充填された焼結漏斗へとデカントし、メタノールで２回洗浄した。有機層を蒸発乾固させて、１９．５ｇ（９９％）の化合物５３（Ｒｆ＝０．３０  ２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を白色の固体として得て、それはさらに精製する必要がなかった。
【０５６８】
化合物５４の合成：
【化１３７】
2018520683.tif 000140
化合物５３（５．０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を２回にわたり無水ピリジン（７５ｍＬ）と同時蒸発させた。次に、化合物を２時間にわたって高真空下に置いた。化合物５３を高真空から取り出し、無水ピリジン（７５ｍＬ）に溶解させた。反応混合物をアルゴン下において０℃で撹拌した。次に、ＤＭＴ−Ｃｌ（９５０ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に加えた。この溶液に触媒量のジメチルアミノピリジン（３０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を真空下、続いてアルゴン下で撹拌し、室温で一晩にわたりアルゴン下において撹拌を続けた。反応混合物を蒸発乾固させ、ジクロロメタン（８０ｍＬ）中で希釈した。有機層を水（８０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（８０ｍＬ）、別の分量の水、及び塩水（８０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた粗生成物をＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製して、５．４ｇ（９４％）の化合物１３（Ｒｆ＝０．３４  １０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）をオレンジ色の発泡体として得た。
【０５６９】
化合物５５の合成：
【化１３８】
2018520683.tif 000141
化合物５４（５．０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を０℃で撹拌した。ＴＨＦ（２．４０ｍＬ）中のフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液を混合物に滴下して加え、それを０℃で一晩撹拌し続けた。完了したら、反応物を蒸発乾固させた。得られた粗生成物をＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製して、４．５ｇ（９３％）の化合物５５（Ｒｆ＝０．３３  ２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を透明のシロップとして得た。
【０５７０】
実施例２０：トリＧａｌＮＡｃアミダイトの合成
【化１３９】
2018520683.tif 000142
ステップ１：化合物２１の合成
化合物１７（３６０ｇ）を窒素雰囲気下において１０Ｌの多口丸底フラスコ中で１．８ＬのＴＨＦに溶解させ、１．８ＬのＴＨＦ中のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，３−プロパンジアミン（２０、４２６ｇ）の溶液を周囲温度で加えた。反応混合物を氷−塩混合物上で０℃に冷却し；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、３５１ｇ）及びＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、８７０ｇ）を撹拌しながら加えた後、ＤＩＥＡ（５９３ｇ）を滴下して加えた。反応の温度をゆっくりと室温にし、一晩にわたり撹拌を続けた。水（３．６Ｌ）を反応混合物に加え、分液漏斗に移し、生成物を酢酸エチル（２×３．６Ｌ）中に抽出した。有機層を１０％のＮａＨＣＯ３水溶液（１．８Ｌ）、水（１．８Ｌ）、１０％のクエン酸水溶液（３×４Ｌ）、水（１．８Ｌ）及び塩水（１．８Ｌ）で連続して洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ；溶媒及び揮発性物質を減圧下で除去して、生成物２１を淡黄色の粘性液体（６９０ｇ、９４％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−Ｄ６）：δ  １．４１（ｓ，２７Ｈ）、１．５７−１．６０（ｔ，３Ｈ）、２．３８−２．４１（ｔ，３Ｈ）、３．１０−３．１１（ｍ，６Ｈ）、３．２３−３．２７（ｍ，６Ｈ）、３．６４−３．６８（ｍ，１２Ｈ）、５．０２（ｓ，２Ｈ）、５．１４（ｍ，３Ｈ）、５．５４（ｓ，１Ｈ）、６．８２（ｓ，３Ｈ）、７．３３（Ｓ，５Ｈ）．
【０５７１】
ステップ２：化合物２２の合成
化合物２１（２３０ｇ）をメタノール（２．３Ｌ）に溶解させ、水素化容器中に充填した。この溶液を窒素で脱気し、１０％のＰｄ−Ｃ（２３ｇ、湿潤）を加え、４０℃で一晩にわたり完了するまで水素化した。室温に冷ました後、混合物をセライトのパッドに通してろ過し、メタノール（２×５００ｍＬ）で洗浄した。組み合わされたろ液を減圧下で蒸発させ、得られた残渣を一晩にわたり高真空下で乾燥させて、化合物２２（１９０ｇ、９６％）を淡黄色のガムとして得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−Ｄ６）：δ  １．３６（ｓ，２７Ｈ）、１．４７−１．５０（ｍ，６Ｈ）、２．２６−２．２９（ｍ，６Ｈ）、２．２８−２．２９（ｍ，６Ｈ）、３．０２−３．０３（ｍ，６Ｈ）、３．１７（ｍ，６Ｈ）、３．５５−３．５７（ｍ，６Ｈ）６．７９（ｍ，３Ｈ）、７．８５（ｍ，３Ｈ）．
【０５７２】
ステップ３：化合物２３の合成
化合物２２（８６０ｇ）及び１８（３７６ｇ）の溶液を窒素下において１０Ｌの丸底フラスコ中でＴＨＦ（８．６Ｌ）中において調製し、溶液を氷−塩浴上で冷却した。ＨＯＢｔ（１７９ｇ）及びＨＢＴＵ（４４５ｇ）を撹拌しながら反応混合物に加えた後、３０分間の期間にわたってＤＩＥＡ（３００ｇ）を滴下して加え、混合物を周囲温度にゆっくりと温めた。反応混合物を一晩撹拌し、冷水（８．６Ｌ）と混合し、生成物を酢酸エチル（２×８Ｌ）中に抽出した。有機層を１０％のＮａＨＣＯ３水溶液（４．３Ｌ）、水（４．３Ｌ）及び１０％のクエン酸水溶液（３×４Ｌ）、１０％の炭酸水素ナトリウム水溶液（４．３Ｌ）及び塩水（４．３Ｌ）で連続して洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。このように得られた残渣を、溶離剤としてジクロロメタン中４％のメタノールを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、生成物２３（７１０ｇ、６０％）を無色のガムとして得た。次のステップに入る前に化合物２３をＮＭＲ及び質量分析によって特性決定した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−Ｄ６）：δ  １．２５−１．２９（１２Ｈ）、１．４３（ｓ，２７Ｈ）、１．６２−１．６５（ｍ，１０Ｈ）、２．１７（ｍ，２Ｈ）、２．３５（ｍ，２Ｈ）、２．４２（ｔ，６Ｈ）、３．１５−３．１６（ｍ，６Ｈ）、３．３０（ｑ、６Ｈ）、３．６７−３．７０（ｍ，１２Ｈ）、５．１１（ｓ，２Ｈ）、５．２６（ｍ，２Ｈ）、６．３（ｓ，１Ｈ）、６．９（ｓ，３Ｈ）、７３３４（ｍ，５Ｈ）．
【０５７３】
化合物２４の合成
化合物２３（１６０ｇ）を窒素下において多口丸底フラスコ中で８００ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、氷水浴上で冷却した。４８０ｍＬのジクロロメタン中の３２０ｍＬのトリフルオロ酢酸の溶液を混合物に加え、ＮＢｏｃアミンの完全な脱保護のために一晩撹拌した。溶媒及び揮発性物質を減圧下で除去し、残渣をトルエン（６×５００ｍＬ）及びジクロロメタン（６×５００ｍＬ）と連続して同時蒸発させ、一晩にわたり高真空下で乾燥させて、化合物２４を淡褐色の粘性液体（１６６ｇ、定量的）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−Ｄ６）：δ  １．２３−１．２７（１２Ｈ）、１．４５（ｔ，２Ｈ）、１．５５（ｔ，２Ｈ）、１．７１（ｔ，６Ｈ）、２．０８（ｔ，２Ｈ）、２．３４（ｓ，８Ｈ）、２．８１（ｄ，６Ｈ）、３．１１−３．１６（ｑ，６Ｈ）、３．５５−３．５９（ｍ，１２Ｈ）、５．０８（ｓ，２Ｈ）、６．９４（ｓ，１Ｈ）７．３４（ｍ，５Ｈ）、７．６７−７．７１（ｓ，９Ｈ）、８．０１−８．０３（ｓ，３Ｈ）、１０．１１（ｂ，６Ｈ）．
【０５７４】
【化１４０】
2018520683.tif 000143
ステップ１：化合物２５の合成
カルボン酸１２（５７．５０ｇ、９０．９０ｍｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（３５ｇ、１８２ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（２５ｇ、１８２ｍｍｏｌ）をアルゴン下においてＤＭＦ（８００ｍＬ）中で一緒にし、混合物を撹拌しながら氷−水混合物上で冷却した。ＤＩＥＡ（６３ｍＬ、３６２ｍｍｏｌ）を混合物に滴下して加え、２０分間撹拌した。ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の化合物２４（２６．２０ｇ、２２．７０ｍｍｏｌ））の溶液を上記の混合物に滴下して加えた。添加後、反応の温度をゆっくりと室温にし、一晩撹拌した。反応混合物を冷水（５Ｌ）に加え、形成された沈殿物を沈降させた。ろ過し、沈殿物をジクロロメタンに溶解させ、炭酸水素ナトリウム溶液、水及び塩水で連続して洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた残渣を、溶離剤としてＥｔＯＡｃ中５〜３３％のメタノールを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物２５（５４．６０ｇ、９０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．００（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、３Ｈ）、７．９２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、１１Ｈ）、７．８４（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、３Ｈ）、７．８０−７．４４（ｍ，２９Ｈ）、７．３７（ｄｄ，Ｊ＝１６．５、８．６Ｈｚ、９Ｈ）、６．９９（ｓ，１Ｈ）、５．７６（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、３Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．３Ｈｚ、３Ｈ）、５．０６（ｓ，２Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、３Ｈ）、４．４６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、６Ｈ）、４．３９−４．２９（ｍ，６Ｈ）、４．１０−３．９５（ｍ，２Ｈ）、３．９１−３．７１（ｍ，３Ｈ）、３．６０−３．５０（ｍ，１４Ｈ）、３．１４−２．９７（ｍ，１１Ｈ）、２．３５−２．２６（ｍ，７Ｈ）、２．１０−１．９５（ｍ  ７Ｈ）、１．７０（ｓ，９Ｈ）、１．６０−１．４５（ｍ，２０Ｈ）、１．２６−１．０８（ｍ，１２Ｈ）．Ｃ１４３Ｈ１７２Ｎ１０Ｏ３９についての質量計算値：２６５３．１８０；実測値：２６７６．２１３［Ｍ＋Ｎａ＋、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、マトリックス：２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）］。
【０５７５】
ステップ２：化合物２６の合成
２Ｌの丸底フラスコ中でメタノール／ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ、２：１）中の化合物２５（５４．５０ｇ、２０．５４ｍｍｏｌ）の溶液を水素で脱気し、Ｐｄ−Ｃ（５ｇ、１０％、湿潤ｄｅｇａｕｓｓタイプ）を溶液に加えた。混合物をバルーン圧下で一晩水素化した。触媒をセライトの小さいパッドに通してろ去し、メタノール（５００ｍＬ）でセライト床を洗浄した。組み合わされたろ液を減圧下で蒸発させて、化合物２６（５０．３０ｇ、９６％）をオフホワイトの固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．９４（ｓ，１Ｈ）、８．０３−７．８６（ｍ，１５Ｈ）、７．８２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、３Ｈ）、７．７７−７．４４（ｍ，２９Ｈ）、７．３８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、６Ｈ）、６．９７（ｓ，１Ｈ）、５．７６（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、３Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．３Ｈｚ、３Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、３Ｈ）、４．５３−４．４０（ｍ，６Ｈ）、４．３５−４．２９（ｍ，６Ｈ）、３．８０（ｄｄ，Ｊ＝１０．４、５．３Ｈｚ、３Ｈ）、３．６０−３．５０（ｍ，１４Ｈ）、３．１０−３．００（ｍ，１１Ｈ）、２．２７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、６Ｈ）、２．１６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．１２−２．０１（ｍ，７Ｈ）、１．７０（ｓ，８Ｈ）、１．６１−１．３６（ｍ，２０Ｈ）、１．３０−１．１８（ｍ，１０Ｈ）．Ｃ１３６Ｈ１６６Ｎ１０Ｏ３９についての質量計算値：２５６３．１３０；実測値：２５８６．１５０［Ｍ＋Ｎａ＋、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、マトリックス：２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）］。
【０５７６】
【化１４１】
2018520683.tif 000144
ステップ１：化合物２９の合成
ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中の化合物２７（４３．００ｇ、１６．７７ｍｍｏｌ）の溶液にＨＢＴＵ（８．３０ｇ、１．３当量）及びＤＩＥＡ（８．８０ｍＬ、３当量）を加えた。混合物をアルゴン下において周囲温度で１０分間撹拌した。この混合物にジクロロメタン中のアミン（７．４０ｇ、１．０５当量）の溶液を加え、一晩撹拌した。ＴＬＣを確認し、混合物を水、重炭酸塩及び塩水で連続して洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗生成物を、ジクロロメタン中３〜１５％のメタノールを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物２８をオフホワイトの固体（３６．２３ｇ、７４％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．１１−７．７８（ｍ，１８Ｈ）、７．７８−７．１２（ｍ，４３Ｈ）、６．９７（ｓ，１Ｈ）、６．９０−６．８４（ｍ，４Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、３Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、３Ｈ）、４．９３（ｄｄ，Ｊ＝３２．６、４．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、３Ｈ）、４．５５−４．２０（ｍ，１３Ｈ）、４．１４（ｄｄ，Ｊ＝８．１、４．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．８５−３．７４（ｍ，３Ｈ）、３．７１（ｓ，５Ｈ）、３．５５−３．４８（ｍ，１５Ｈ）、３．３１（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．０８−２．９８（ｍ，１４Ｈ）、２．２７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、６Ｈ）、２．１８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．０４−１．９８（ｍ，９Ｈ）、１．７０（ｓ，８Ｈ）、１．６２−１．３２（ｍ，２０Ｈ）、１．３２−１．００（ｍ，１４Ｈ）．Ｃ６２Ｈ１９３Ｎ１１Ｏ４２についての質量計算値：２９６４．３３；実測値：２９８７．３５０［Ｍ＋Ｎａ＋、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、マトリックス：２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）］。
【０５７７】
ステップ３：化合物２９の合成
化合物２８（５．１８ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解させ、ジアミダイト試薬（０．６６ｍＬ、２．０９６ｍｍｏｌ）及びエチルチオテトラゾール（０．２２５ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を周囲温度で６時間撹拌した。混合物を炭酸水素ナトリウムの低温の希薄溶液に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。溶媒を除去し、濃縮溶液をエーテル／ヘキサン（１：１）の混合物に滴下して加えて、アミダイトを沈殿させた。ろ過し、化合物を減圧下で乾燥させて、化合物２９を白色の固体（５．６５ｇ、９５％の収率）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．０６−７．１０（ｍ，２２Ｈ）、６．９７（ｓ，１Ｈ）、６．８４（ｄｄ，Ｊ＝８．６、２．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５２−４．２０（ｍ，４Ｈ）、４．１４（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８８−３．６３（ｍ，５Ｈ）、３．６２−３．３９（ｍ，７Ｈ）、３．０３（ｓ，５Ｈ）、２．７３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．１５−２．０８（ｍ，７Ｈ）、１．７０（ｓ，３Ｈ）、１．４７（ｄ，Ｊ＝３０．５Ｈｚ、８Ｈ）、１．３０−０．７９（ｍ，１８Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ  １５１．９２、１５１．７０、１５１．５１、１５１．１８．
【０５７８】
実施例２１：オリゴヌクレオチド共役のためのモノＧａｌＮＡｃ構成単位の合成
【化１４２】
2018520683.tif 000145
ステップ１．３５の合成
ＧａｌＮＡｃ酸１２（８．３９ｇ、１８．７１ｍｍｏｌ）及びアミン３４（１０．００ｇ、１８．７７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン中で一緒にした。ＨＢＴＵ（１０．６８ｇ、２８．１２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（９．８０ｍＬ、３当量）を加え、混合物を周囲温度で２時間撹拌した。ＴＬＣを確認し、反応混合物を分液漏斗に移し、水及び塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。粗生成物を、溶媒としてジクロロメタン及びＭｅＯＨを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、化合物３５を淡黄色のふわりとした固体（１１．７７ｇ、６３％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ  ７．８０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３９−７．０９（ｍ，９Ｈ）、６．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝９．０、５．４、２．１Ｈｚ、４Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．０３−４．８３（ｍ，２Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４１−４．０７（ｍ，２Ｈ）、４．０４−３．９５（ｍ，３Ｈ）、３．８６（ｄｔ，Ｊ＝１１．２、８．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．７９−３．６８（ｍ，６Ｈ）、３．６８−３．３６（ｍ，３Ｈ）、３．２１−２．８８（ｍ，５Ｈ）、２．２６−２．１４（ｍ，２Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．０２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、１．８７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．５３−１．２９（ｍ，７Ｈ）．
【０５７９】
ステップ２．化合物３７の合成
ヒドロキシプロリン誘導体３５（６．００ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、それにＤＩＥＡ（２．２０ｍＬ、３当量）及びアミダイト試薬３６を加え、反応混合物を３０分間撹拌し、ＴＬＣを確認した。それを分液漏斗に移し、水及び炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗生成物を、溶離剤としてジクロロメタン及びＭｅＯＨを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、化合物３７を白色のふわりとした固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ  ７．８０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６８（ｓ，１Ｈ）、７．４２−７．０６（ｍ，８Ｈ）、７．０１−６．７３（ｍ，４Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｓ，１Ｈ）、４．０１（ｓ，３Ｈ）、３．８６（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７０（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ、９Ｈ）、３．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝３７．０、２３．３、１６．４Ｈｚ、６Ｈ）、２．９９（ｄｄ，Ｊ＝１２．３、６．４Ｈｚ、３Ｈ）、２．７４（ｄｄ，Ｊ＝９．２、５．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．２１（ｓ，２Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．０５−１．９５（ｍ，５Ｈ）、１．８８（ｓ，３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．５２−１．１６（ｍ，１１Ｈ）、１．１６−１．０２（ｍ，１１Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ  δ＝１５１．７８、１５１．６１、１５１．５０、１５１．３０．
【０５８０】
実施例２２：後共役（ｐｏｓｔ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のためのモノアミン構成単位の合成
【化１４３】
2018520683.tif 000146
ｉ）トリフルオロ酢酸エチル、ＤＩＥＡ、ＤＣＭ；ｉｉ）ＤＩＥＡ、ＤＣＭ
化合物３８：アミン３４（１７．００ｇ、３１．９０ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって氷−水混合物中でアルゴン下においてジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解させた。トリエチルアミン（ＮＥｔ３、８．６０ｍＬ、６４ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸エチル（６．８０ｇ、４８ｍｍｏｌ）を上記の溶液に加え、混合物を周囲温度にゆっくりと温めた。反応混合物を室温で一晩にわたりアルゴン下で撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（溶離剤：ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．３０）によって確認した。混合物を分液漏斗に移し、水（２００ｍＬ）及び炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で連続して洗浄した後、標準的な後処理（ｗｏｒｋ−ｕｐ）を行った。溶離剤として０．１％のＮＥｔ３を含有するヘキサン中５０〜１００％の酢酸エチルを用いた残渣のフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー精製により、トリフルオロアセトアミド誘導体３８（１８．１０ｇ、９０％）を淡黄色のふわりとした固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６  回転異性体の混合物：メジャー対マイナー比  約７：３）δ  ９．４０（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ３）、７．４１−７．１３（ｍ，９Ｈ、芳香族Ｈ）、６．９３−６．８６（ｍ，４Ｈ、芳香族Ｈ）、４．９９（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ、０．７Ｈ、−ＣＨ（ＯＨ））、４．９０（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ、０．３Ｈ、−ＣＨ（ＯＨ））、４．４４−４．３８（ｍ，０．７Ｈ、−ＣＨ（ＯＨ）−）、４．３５−４．２９（ｍ，０．３Ｈ、−ＣＨ（ＯＨ）−）、４．２０−４．１２（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ、ＯＣＨ３）、３．５８（ｄｄ，Ｊ＝１０．６、５．１Ｈｚ、０．７Ｈ）、３．４６（ｄｄ，Ｊ＝１１．９、３．８Ｈｚ、０．３Ｈ）、３．３３（ｄｄ，Ｊ＝１０．６、３．５Ｈｚ、０．７Ｈ）、３．２６（ｄｄ，Ｊ＝１２．１、５．７Ｈｚ、０．３Ｈ），．３．２１−３．０５（ｍ，４Ｈ）、３．０５−２．９７（ｍ，１Ｈ）、２．１１−１．７８（ｍ，３Ｈ）、１．５９−１．２３（ｍ，６Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １７０．８、１７０．７、１５８．０、１５７．９、１５６．２、１５５．９、１４４．９、１４４．６、１３５．８、１３５．７、１３５．５、１３５．４、１２９．５、１２９．４、１２７．７、１２７．６、１２７．５、１２６．６、１２６．４、１１７．０、１１４．７、１１３．１、１１３．０、８５．７、８５．０、６８．５、６７．４、６５．１、６３．３、５５．５、５５．０、５４．９、５３．３、４５．７、３７．９、３６．２、３３．９、３２．３、２８．０５、２８．０２、２５．８、２４．２、２３．９．１９Ｆ  ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−７６．２７、−７７．１３．Ｃ３４Ｈ４０Ｆ３Ｎ２Ｏ６について計算されたＨＲＭＳ（ＦＡＢ）：６２９．２８３８；実測値  ６２９．２８２８（Ｍ＋Ｈ）．
【０５８１】
化合物３９：無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の化合物３８（１１．１０ｇ、１７．６６ｍｍｏｌ）の溶液にＤＩＥＡ（７．６ｍＬ、４４ｍｍｏｌ）、続いて２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（５．００ｇ、２１．２０ｍｍｏｌ．）をアルゴン下で加え、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（溶離剤：ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ  Ｒｆ＝０．３５）によって確認した。混合物を分液漏斗に移し、水（１５０ｍＬ）及び炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）で連続して洗浄した後、標準的な後処理を行った。溶離剤として０．１％のＮＥｔ３を含有するヘキサン中２０〜５０％の酢酸エチルを用いた残渣のフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー精製により、ホスホロアミダイト３９（１１．５５ｇ、７９％）を白色のふわりとした固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、回転異性体の混合物：メジャー対マイナー比  約７：３）δ  ９．３９（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ３）、７．４２−７．１１（ｍ，９Ｈ、芳香族Ｈ）、６．９８−６．８０（ｍ，４Ｈ、芳香族Ｈ）、４．７１−４．６０（ｍ，０．７Ｈ、−ＣＨ（ＯＨ）−）、４．５９−４．４８（ｍ，０．３Ｈ、−ＣＨ（ＯＨ）−）、４．２４−４．１０（ｍ，１Ｈ）、３．８３−３．６８（ｍ，８Ｈ、−ＯＣＨ３）、３．６５−３．３８（ｍ，４Ｈ）、３．３８−３．１０（ｍ，３Ｈ）、３．０９−３．９５（ｍ，１Ｈ）、２．８０−２．７０（ｍ，２Ｈ）、２．３５−２．０６（ｍ，３Ｈ）、２．０５−１．８９（ｍ，１Ｈ）、１．６４−１．３７（ｍ，４Ｈ）、１．３５−１．２３（ｍ，２Ｈ）、１．２３−１．０２（ｍ，１２Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １４７．０１（メジャー）、１４６．７５（マイナー）、１４６．５５（マイナー）、１４６．１８（メジャー）．
【０５８２】
実施例２３：三分岐ＧａｌＮＡｃ酸（Ｃ１２）ＮＨＳエステルの合成
【化１４４】
2018520683.tif 000147
化合物４１の合成。無水メタノール（１Ｌ）中の酸４０（１５０ｇ、７４．８ｍｍｏｌ）の溶液に触媒量（０．５ｇ）の金属ナトリウムを加え、混合物を室温で３時間撹拌した。反応の進行を、反応物の質量を調べることによってモニターした。何らかのアセチル化生成物に対応する全ての質量スペクトルピークの完全な消失後、反応混合物を酸性樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ１２０、Ｆｌｕｋａ  Ｃａｔ．＃  ０６４２８）でｐＨ＝７．４になるまでゆっくりと酸性化した。反応混合物をろ過し、固体を無水ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で洗浄し、組み合わされた有機層を濃縮し、乾燥させて、純粋な脱保護酸（１２２ｇ）をほぼ定量的収率でオフホワイトの固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．８８−７．６４（ｍ，９Ｈ、ＮＨ）；６．９９（ｓ，１Ｈ、ＮＨ）；５．２５−４．４５（ｍ，９Ｈ、ＯＨ）；４．２０（ｄ，Ｊ＝８．４、３Ｈ、糖Ｈ４）；３．８２−３．６０（ｍ，９Ｈ）；３．６０−３．３７（ｍ，２１Ｈ）、３．３７−３．２１（ｍ，６Ｈ）；３．０６−２．９６（ｍ，１２Ｈ）；２．２７（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）；２．１７−１．９４（ｍ，９Ｈ）；１．７８（ｓ，９Ｈ）；１．５５−１．３７（ｍ，２２Ｈ）；１．２７−１．１６（ｂｓ，１２Ｈ）．Ｃ７３Ｈ１３０Ｎ１０Ｏ３０についての質量計算値：１６２７．８８；実測値：１６４９．３０（Ｍ＋Ｎａ＋、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、マトリックス：ＨＡＢＡ）．
【０５８３】
化合物４２の合成。無水ＤＭＦ（８００ｍＬ）中の酸４１（１２０ｇ、７３ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＣ（３０ｇ、１４６ｍｍｏｌ）を撹拌しながら室温で加えた後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１６．８ｇ、１４６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４２時間撹拌し、その間、尿素副生成物が沈殿した。反応混合物を氷浴中で冷却し、沈殿した尿素をろ去した。反応混合物をロータリーエバポレータにおいて体積が半分になるまで濃縮した。この溶液を酢酸エチル（２Ｌ）に滴下して加え、それを激しく撹拌しながら氷浴中で冷却した。沈殿した固体をろ去し、酢酸エチル（２Ｌ）で洗浄し、減圧下で乾燥させて、純粋な生成物を白色の粉末（１０７ｇ、８４％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．９５（ｓ，１Ｈ、ＮＨ）、７．９０−７．６０（ｍ，８Ｈ、ＮＨ）、６．９８（ｓ，１Ｈ、ＮＨ）；５．０３−４．４１（ｍ，９Ｈ、ＯＨ）；４．２０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、３Ｈ）、３．７４−３．５６（ｍ，９Ｈ）、３．５６−３．２４（ｍ，２４Ｈ）、３．０２（ｂｓ，１０Ｈ）、２．８９（ｓ，３Ｈ）、２．８０（ｓ，１Ｈ）、２．７２（ｓ，２Ｈ）、２．４６（ｓ，２Ｈ）、２．２７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、６Ｈ）、２．０９−１．９８（ｍ，９Ｈ）、１．７９（ｓ，９Ｈ）、１．６０−１．３２（ｍ，２２Ｈ）、１．２８−１．１６（ｍ，１２Ｈ）。Ｃ７７Ｈ１３３Ｎ１１Ｏ３２についての質量計算値：１７２４．９６；実測値：１７４６．４（Ｍ＋Ｎａ＋、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、マトリックス：ＨＡＢＡ）．
【０５８４】
実施例２４．ＧａｌＮＡｃ  Ｃ５−ＮＨＳエステルの合成
【化１４５】
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ステップ１：
ＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）中のＧａｌＮＡｃ酸ペルアセテート４３（１００ｇ、２２３．７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＭｅＯＨ（５００ｍＬ）に予め溶解されたＮａＯＭｅ（１４．５ｇ、２６９ｍｍｏｌ）を加えた。上記の反応混合物を室温で一晩撹拌した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｈ＋樹脂を加え、３０分間撹拌して中和した。樹脂のろ去、続いて溶媒の濃縮により、泡状の固体生成物２（７５ｇ）を得て、それを精製せずに次のステップに使用した。
【０５８５】
ステップ２：
ＤＭＦ（２５０ｍＬ）中の４４（２５ｇ、７７．９ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（１７．９ｇ、１５５．８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＤＣＣ（３２．０９ｍｇ、１５５．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１４時間撹拌した。１Ｌの酢酸エチルを加えた後、ろ過により、生成物４５（２５ｇ、７７％）を得た。Ｃ１７Ｈ２６Ｎ２Ｏ１０について計算されたＬＣＭＳ：４１８．３９９（Ｍ＋）、実測値：４１９．０（Ｍ＋＋１）。
【０５８６】
実施例２５：２つのｓｉＲＮＡを含むいくつかの例示的な二重標的化多標的分子のためのオリゴヌクレオチドの合成プロトコル
【０５８７】
【表１】
2018520683.tif 000149
【０５８８】
オリゴヌクレオチドの説明：２つのｓｉＲＮＡ（ビス−ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を含む二重標的化多標的分子が３つのモチーフで考え出された。最も単純なモチーフは、通常の二重鎖で組になった長いセンス（Ｓ）及びアンチセンス（ＡＳ）鎖を特徴とし、２つの活性ＡＳオリゴを形成するため、細胞内のヌクレアーゼによる切断のためにＡＳ鎖上にＤＮＡの短い区間を含んでいた。第２の手法は、２つの別個のＡＳ鎖とハイブリダイズし得るより長いセンス鎖を特徴としていた。２’ＯＭｅウリジン（ｕｕｕ）、Ｃ１２リンカー（Ｑ５０）、ジスルフィド架橋（Ｑ５１）の区間を含むセンス鎖上でトリ−ＧａｌＮＡｃを鎖（Ｑ１５１）の３’末端から中央へと移動させることにより、様々なスペーサーを使用した。最後のモチーフは、４つの一本鎖を特徴とし、そのうちの２つは、ＤＮＡベースの付着末端を含んでいた。得られる各二重鎖が単一のＤＮＡ付着末端突出部を含むように、２つの別個のＳ及びＡＳ鎖を一緒にアニーリングした。次に、相補的な付着末端突出部のハイブリダイゼーションを介して２つの二重鎖を連結した。
【０５８９】
標準的なカップリング及び酸化：上記のオリゴヌクレオチドの全てをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ又はＭｅｒＭａｄｅ合成装置において合成した。それらは、より大きい規模の要求に対してＡｋｔａ合成装置においてアップスケールすることができる。アミダイトのカップリングを、活性化のためにアセトニトリル中の０．２５Ｍの５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾールを用いて標準的な合成条件下で行った。３−（ジメチルアミノメチレン）アミノ−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＤＤＴＴ）を用いた標準的なチオール化プロトコルを行って、亜リン酸トリエステルをホスホロチオエート結合へと転化した。アミダイトを、２’ＯＭｅシチジン及びウリジンを除いて０．１２〜０．１５Ｍでアセトニトリルに溶解させ、これは、共溶媒として１５％のテトラヒドロフラン又はジメチルホルムアミドを有していた。
【０５９０】
合成の例外：Ｑ１５１モノマーの高分子量のため、鎖Ａ−１３４４７７．１におけるそのカップリングについて特別な配慮を行う必要があった。ホスホロアミダイトを０．０７〜０．０９Ｍでアセトニトリルに溶解させた。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ合成装置において活性化のために０．６Ｍの５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾールによる二重カップリングを使用した。これを行って、混合前に２つの溶液の粘度を適合させた。アミダイトの第１の供給後、９００秒間保持した後、アミダイト及び活性化剤の第２の供給及びさらなる９００のカップリング保持が続いた。その後のアミダイトカップリングを通常の条件下で続行した。
【０５９１】
Ｑ５１ジスルフィドリンカーについても特別な配慮を用いる必要があった。ジスルフィドは、酸化に敏感であるため、アセトニトリル（７０％のＴＢＨＰ水溶液から希釈された）中１０％のｔｅｒｔブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）をＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏ溶液中の通常の０．０２ＭのＩ２の代わりに使用した。この弱い酸化をＱ５１及び全てのその後のカップリングに使用した。
【０５９２】
脱保護及び切断：合成後、オリゴヌクレオチドを６０℃で５時間又は３５℃で１６時間にわたってＮＨ３水溶液及びＥｔＯＨの４：１混合物中で脱保護した。
【０５９３】
精製：オリゴヌクレオチドの全てを、標準的なイオン交換クロマトグラフィー方法及び脱塩手順を用いて８５％超の純度に精製した。
【０５９４】
モノマーＱ５０、Ｑ５１及びＱ１５１の構造が図２６に示される。
【０５９５】
試薬の供給元：試薬の供給元が本明細書に特に示されていない場合、このような試薬は、分子生物学における用途の品質／純度標準で分子生物学用の試薬の任意の供給業者から入手することができる。
【０５９６】
ｓｉＲＮＡ合成：ＦＶＩＩ及びｍＴＴＲ  ｓｉＲＮＡ配列を、固体担体に媒介されるホスホロアミダイト化学反応を用いて、Ｍｅｒｍａｄｅ  １９２合成装置（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）において１μｍｏｌの規模で合成した。固体担体は、特注のＧａｌＮＡｃリガンド又は汎用固体担体（ＡＭ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）が充填された制御細孔ガラス（５００Å）であった。補助的な合成試薬、２’−Ｆ及び２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及びデオキシホスホロアミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及びＨｏｎｇｅｎｅ（Ｃｈｉｎａ）から入手した。Ｑ５０、Ｑ５１及びＱ１５１修飾リンカー（上に示される）を、対応するホスホロアミダイトを用いて導入した。３’ＧａｌＮＡｃ共役一本鎖の合成をＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ担体において行った。特注のＣＰＧ汎用固体担体をアンチセンス一本鎖の合成に使用した。全てのホスホロアミダイト（アセトニトリル中１００ｍＭ）のカップリング時間は、活性化剤（アセトニトリル中０．６Ｍ）として５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）を用いて５分間であった。ホスホロチオエート結合を、無水アセトニトリル／ピリジン（１：１  ｖ／ｖ）中の３−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した）の５０ｍＭの溶液を用いて生成した。酸化時間は、３分間であった。全ての配列をＤＭＴ基の最終的な除去（「ＤＭＴオフ」）により合成した。
【０５９７】
長鎖設計及び短鎖設計を、ヌクレオチド合成ステップの数を調整することによって同様に合成した。リンカー（Ｑ５０、Ｑ５１及びＱ１５１）を標準的なホスホロアミダイトとしてカップリングし、このカップリングは、さらなるヌクレオチド合成ステップとして含まれていた。
【０５９８】
固相合成が完了したら、オリゴリボヌクレオチドを固体担体から切断し、６０℃で２０分間にわたって２００μＬのメチルアミン水溶液試薬を用いて密閉した９６ディープウェルプレート中で脱保護した。切断及び脱保護ステップの最後に合成プレートを室温にし、１ｍＬのアセトニトリル：エタノール混合物（９：１）の添加によって沈殿させた。プレートを−８０℃で２時間冷却し、上清を、マルチチャンネルピペットを用いて慎重にデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液中で再懸濁し、Ａ９０５オートサンプラ及びＦｒａｃ  ９５０フラクションコレクタを備えたＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて、５ｍＬのＨｉＴｒａｐサイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩した。脱塩したサンプルを９６ウェルプレートに収集した。各配列からのサンプルを、同一性を確認するためにＬＣ−ＭＳによって分析し、定量化のためにＵＶ（２６０ｎｍ）を、及び純度を測定するために、選択された組のサンプルをＩＥＸクロマトグラフィーによって分析した。
【０５９９】
３つ以下の一本鎖から構成された多重鎖構築物について、ＦＶＩＩ及びｍＴＴＲ一本鎖のアニーリングを、センス及びアンチセンス一本鎖の等モル混合物を混合することによって行った。相補的な一本鎖を組み合わせた後、９６ウェルプレートを確実に密閉し、オーブン中において１００℃で１０分間加熱し、２〜３時間の期間にわたってゆっくりと室温にした。４つ以上の一本鎖から構成された多重鎖構築物について、水中でセンス及びアンチセンス一本鎖の等モル混合物を混合し、加熱及び冷却する（上述されるように）ことにより、個々の逆相補的なＦＶＩＩ及び長い３’−突出部を有するｍＴＴＲ二重鎖をまず調製した。逆相補的な３’−突出部を有する等モル量の二重鎖を一緒に混合し、乾燥した粉末が得られるまで混合物を水から凍結乾燥させた。次に、多重鎖構築物を、滅菌したエンドトキシンフリー１×ＰＢＳに溶解させた。各多重鎖の濃度を、滅菌したエンドトキシンフリー１×ＰＢＳ中３００μＭに対して正規化した。
【０６００】
全ての場合において、非変性ＩＥＸ−ＨＰＬＣ方法は、単一体の多重鎖構築物に対応する単一のクロマトグラムピークの存在を示した。
【０６０１】
【表２−１】
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【０６０２】
【表２−２】
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【０６０３】
【表３】
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【０６０４】
様々な例示的な多標的分子のＩｎ  ｖｉｔｒｏ自由取り込み及びトランスフェクションが表４に要約されている。
【０６０５】
【表４】
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【０６０６】
実施例２６．Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験：全ての動物を病原体除去環境で飼育し、動物に関わる全ての手順は、該当する場合、地方、州、及び連邦規制に従って、及び実験動物委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認されるように行った。雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（７〜８週齢）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓから入手した。ビス−ｓｉＲＮＡ化合物（ＦＶＩＩ及びＴＴＲをターゲティングする）を、滅菌したＰＢＳ中で適切な濃度に希釈した。マウスに、０日目に１０ｍＬ／ｋｇの体積で皮下（ｓ．ｃ）注射によりＰＢＳ又はビス−ｓｉＲＮＡ化合物のいずれかを投与した。様々な時点（０日目［投与前］、７、１４、２１、及び２８日目）で眼窩後方出血により動物から血液サンプルを採取し、血清に処理した（Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  Ｔｕｂｅｓ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）。第ＶＩＩ因子タンパク質の血中濃度を、活性に基づく発色アッセイ（ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙ）（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＦＶＩＩ，Ａｎｉａｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｓｏｎ，ＯＨ）を用いて決定した。ＴＴＲタンパク質の血中濃度を、マウスＴＴＲ  ＥＬＩＳＡを用いて決定した。
【０６０７】
マウスＴＴＲ血清タンパク質方法：ＴＴＲ血清タンパク質を、製造業者の使用説明書に従って、市販の酵素結合免疫吸着法、４１−ＡＬＢＭＳ−Ｅ０１（ＡＬＰＣＯ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を用いて定量化した。簡潔に述べると、血清サンプルを１倍のＡＬＰＣＯ  Ｋｉｔ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中で４０００倍に希釈した。８点マウスＴＴＲ標準曲線を、０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で２．５倍の連続希釈を用いて作成した。標準及びサンプル（１００μＬ）をプレートに加え、室温で３０分間インキュベートさせた。プレートを１倍のＡＬＰＣＯ  Ｋｉｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ中で洗浄し、安定化緩衝液中の西洋ワサビペルオキシダーゼと共役されたアフィニティー精製抗プレアルブミン抗体と共に室温で２０分間インキュベートした。ＡＬＰＣＯ  Ｋｉｔ  １倍洗浄緩衝液中での洗浄後、プレートを、ｐＨ３．３のクエン酸緩衝液中の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び過酸化水素を用いて暗所において室温で１０分間インキュベートした。反応を１ウェル当たり１００μＬの０．３Ｍの硫酸でクエンチした。４０５ｎｍにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで読み取り、データをＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにおいて計算される４−パラメータ曲線（ｙ＝（Ａ−Ｄ）／（１＋（ｘ／Ｃ）＾Ｂ）＋Ｄ）にフィットさせて、μｇ／ｍＬで表される血清ＴＴＲタンパク質レベルを決定した。各時点でのタンパク質レベルをビヒクル対照血清タンパク質値のそれぞれの群平均に対して正規化した。結果が図４〜１３に示される。
【０６０８】
実施例２７．二重鎖分析
付着末端を有する２つのｓｉＲＮＡを１ｍＭの濃度でヌクレアーゼフリー水に溶解させた。ビス−ｓｉＲＮＡ二重鎖を溶融するために、２０μＬの各二重鎖を一緒に混合し、１００μＬの１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ａｍｂｉｏｎ）を加えた後、８６０μＬのヌクレアーゼフリー水を加えて、１×ＰＢＳ中の１ｍＬのストック二重鎖を得た。ストックビス−ｓｉＲＮＡ二重鎖を１×ＰＢＳ緩衝液で約８倍に希釈し、濃度を各溶融ビス−ｓｉＲＮＡ二重鎖について０．５  ＯＤＵ／ｍＬ（±５％）の２６０ｎｍにおけるＡＵに調整した。融点温度（Ｔｍ）を、Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、Ｍｉｃｒｏ  Ａｕｔｏ  ６  Ｔｍ  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｌｄｅｒ（ストッパを有する６つの３２５μＬのＴｍマイクロセル）及びＴｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを備えたＤＵ  ８００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）において実験的に測定した。二重鎖を、１．０℃／分で上昇する温度で２０．０〜８０．０℃の温度範囲内で測定される二重鎖変性及び再生プロフィールを用いて６つの３２５μＬのサンプルフォーマットにおいて分析した。全てのＴｍ値を、Ｔｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを備えた一次導関数（Ｆｉｒｓｔ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）方法を用いて計算し、それぞれ２つの独立したＴｍ測定からなる２つの別個の実験（独立した二重鎖調製）からの平均値を各溶融二重鎖について計算した。平均値を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて計算した。二重鎖ＡＭ−２６についての二重鎖分析及び熱融解プロフィールが図１４に示される。図から分かるように、ＡＭ−２６は、これらの条件下で単一体として見える。図１４中の非相補的な付着末端ビス−ｓｉＲＮＡは、ＡＭ−２６二重鎖と同じセンス鎖を有するが、各ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖３’末端において７ヌクレオチド（２’ＯＭｅ  ＲＮＡ）の区間を有し、それらが一緒に混合されたとき、二重鎖構造を形成することができないようになっている。第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖３’末端における７ヌクレオチドの区間は、第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖３’末端における７ヌクレオチドの区間とハイブリダイズしない。換言すれば、それらは完全にミスマッチである。非相補的な付着末端ビス−ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列は、５’−ｕｓＵｆｓａｕａＧｆａＧｆＣｆａａｇａＡｆｃＡｆｃｕｇｕｕｓｕｓｕｃａｃａｇｃｇ−３’及び５’−ｕｓＵｆｓａａｇＡｆｃｕＵｆｇａｇａＵｆｇＡｆｕｃｃｕｇｓｇｓｃｇａｃａｃｕｕ−３’である。
【０６０９】
配列、例えば、表１〜３の記載の配列を説明するのに使用される略語を収集し、便宜のために表５に記載する。
【０６１０】
【表５】
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【０６１１】
本明細書及び実施例に明示される全ての特許及び他の刊行物は、あらゆる目的のために参照により明示的に本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、本願の出願日より前に開示のために提供されたに過ぎない。これに関するいかなることも、本発明者らが、先行発明のために又は別の何らかの理由で、こうした開示に先行する資格がないという承認として解釈すべきではない。日付に関する記載又はこれらの文献の内容に関する表示は全て、本出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付又は内容の正確さに関する何らの承認をなすものではない。
【０６１２】
本明細書において好ましい実施形態を示し、詳細に説明してきたが、当業者には、様々な改変形態、追加形態、代替形態などが本発明の趣旨を逸脱することなくなされ得、従って、これらは、以下の特許請求の範囲に定義する通り、本発明の範囲内であるとみなされることは明らかであろう。さらに、当業者であれば、既述していない範囲まで本明細書で説明及び例示した様々な実施形態のいずれか１つをさらに改変して、本明細書に開示する他の実施形態のいずれかに示される特徴を組み込み得ることは理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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