(57)【要約】  ここに提供されるのは、製剤せずに効率的ＲＩＳＣエントリー、最小免疫応答および標的外効果、効率的細胞取り込みおよび効率的および特異的組織分布により特徴付けられる、自己送達オリゴヌクレオチドである。
2018517429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１６連続ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、５’末端、３’末端および標的への相補性を有し、ここで、
(１)オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；
(２)５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドではなく；
(３)ヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合し；そして
(４)３’末端から１〜６位または３’末端から１〜７位のヌクレオチドはホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドと結合する、
オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
標的に完全相補性を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
標的が哺乳動物またはウイルスｍＲＮＡである、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
標的が該ｍＲＮＡのイントロン領域である、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含む二本鎖、化学修飾核酸であって、第一オリゴヌクレオチドが請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであり、
(１)第一オリゴヌクレオチドの一部が第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；
(２)第二オリゴヌクレオチドが交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；
(３)第二オリゴヌクレオチドの３’末端から２位および１４位のヌクレオチドが２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；そして
(４)第二オリゴヌクレオチドのヌクレオチドがホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合により結合される、
核酸。
【請求項６】
第二オリゴヌクレオチドが第二オリゴヌクレオチドの３’末端の疎水性分子に結合される、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
第二オリゴヌクレオチドと疎水性分子間の結合がポリエチレングリコールを含む、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
第二オリゴヌクレオチドと疎水性分子間の結合がトリエチレングリコールを含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドが隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート結合により結合される、請求項５に記載の核酸。
【請求項１０】
第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドの５’末端から１位および２位のヌクレオチドが隣接リボヌクレオチドとホスホロチオエート結合により結合される、請求項５に記載の核酸。
【請求項１１】
化合物(Ｉａ)：
【化１】
2018517429.tif 000014
〔式中、
Ｘは
【化２】
2018517429.tif 000015
からなる群から選択され；
Ａは、各々、独立して２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；
Ｂは、各々、独立して２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；
Ｋは、各々、独立してホスホジエステルまたはホスホロチオエートリンカーであり；
Ｋは、ホスホロチオエートリンカーであり；
Ｒは、各々、水素およびキャッピング基から独立して選択され；
ｊは４、５、６または７であり；
ｒは２または３であり；
ｔは０または１である。〕
の構造を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
化合物(Ｉｂ)
【化３】
2018517429.tif 000016
〔式中、
Ｐはホスホジエステルリンカーであり；
ｍは０または１であり；
ｎは４、５または６であり；
ｑは０または１であり；
ｒは２または３であり；
ｔは０または１である。〕
の構造を有する、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
ｍが１であり；
ｎが５であり；
ｑが１であり；
ｒが２であり；
ｔが１である、
請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ｍが０であり；
ｎが６
ｑが１であり；
ｒが２であり；
ｔが１である、
請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ｍが１であり；
ｎが５
ｑが０であり；
ｒは３であり；
ｔが１である、
請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含む二本鎖、化学修飾核酸であって、ここで、
(１)第一オリゴヌクレオチドが請求項１２〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドから選択され；
(２)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；そして
(３)第二オリゴヌクレオチドは化合物(IIａ)
【化４】
2018517429.tif 000017
〔式中、
Ｃは疎水性分子であり；
Ａは、各々、独立して２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；
Ｂは、各々、独立して２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；
Ｌはエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、アミド、カルバメートまたはこれらの組み合わせを含むリンカーであり；
Ｋは、ホスホロチオエートリンカーであり；
Ｐはホスホジエステルリンカーであり；
Ｒ、は、各々、独立して水素またはキャッピング基であり；
ｍ’は０または１であり；
ｎ’は４、５または６であり；
ｑ’は０または１であり；
ｒ’は０または１であり；
ｔ’は０または１である。〕
の構造を有する、
核酸。
【請求項１７】
疎水性分子がコレステロールである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
第一オリゴヌクレオチドが第二オリゴヌクレオチドより３〜７多いリボヌクレオチドを有する、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１９】
第一オリゴヌクレオチドが構造：
Ｘ(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)(−Ｐ−Ｂ−Ｐ−Ａ)５(−Ｐ−Ｂ−Ｓ−Ａ)(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)２(−Ｓ−Ｂ)−ＯＲ
を有し；
第二オリゴヌクレオチドが構造：
Ｃ−Ｌ−Ｂ(−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｂ)(−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｂ)５(−Ｓ−Ａ)(−Ｓ−Ｂ)−ＯＲ
を有し；
核酸が化合物(IIIａ)
【化５】
2018517429.tif 000018
〔式中、各｜は水素結合相互作用を表す。〕
の構造を有する、請求項１６に記載の核酸。
【請求項２０】
第一オリゴヌクレオチドが配列５’  ＵＡＡＡＵＵＵＧＧＡＧＡＵＣＣＧＡＧＡＧ  ３’を含み；
第二オリゴヌクレオチドが配列３’  ＡＵＵＵＡＡＡＣＣＵＣＵＡＧＧ  ５’を含み；
ＸがＸ３であり；
Ｃがコレステロールである
請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
第一オリゴヌクレオチドが配列５’  ＵＡＵＡＡＡＵＧＧＵＡＧＣＵＡＵＧＡＵＧ  ３’を含み；
第二オリゴヌクレオチドが配列３’  ＡＵＡＵＵＵＡＣＣＡＵＣＧＡＵ  ５’を含み；
ＸがＸ３であり；
Ｃがコレステロールである
請求項１９に記載の核酸。
【請求項２２】
第一オリゴヌクレオチドが配列５’  ＵＵＡＡＵＣＵＣＵＵＵＡＣＵＧＡＵＡＵＡ  ３’を含み；
第二オリゴヌクレオチドが配列３’  ＡＡＵＵＡＧＡＧＡＡＡＵＧＡＣ  ５’を含み；
ＸがＸ３であり；
Ｃがコレステロールである、
請求項１９に記載の核酸。
【請求項２３】
第一オリゴヌクレオチド構造：
Ｘ(−Ｐ−Ｂ−Ｐ−Ａ)６(−Ｐ−Ｂ−Ｓ−Ａ)(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)２(−Ｓ−Ｂ)−ＯＲ
を有し；
第二オリゴヌクレオチドが構造：
Ｃ−Ｌ−Ｂ(−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｂ)(−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｂ)６−ＯＲ
を有し；
核酸が化合物(IIIｂ)：
【化６】
2018517429.tif 000019
〔式中、各ｌは水素結合相互作用を表す。〕
の構造を有する、請求項１６に記載の核酸。
【請求項２４】
第一オリゴヌクレオチドが配列５’  ＵＡＡＡＵＵＵＧＧＡＧＡＵＣＣＧＡＧＡＧ  ３’を含み；
第二オリゴヌクレオチドが配列３’  ＡＵＵＵＡＡＡＣＣＵＣＵＡＧＧ  ５’を含み；
ＸがＸ３であり；
Ｃがコレステロールである、
請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】
第一オリゴヌクレオチドが配列５’  ＵＡＵＡＡＡＵＧＧＵＡＧＣＵＡＵＧＡＵＧ  ３’を含み；
第二オリゴヌクレオチドが配列３’  ＡＵＡＵＵＵＡＣＣＡＵＣＧＡＵ  ５’を含み；
ＸがＸ３であり；
Ｃがコレステロールである、
請求項２３に記載の核酸。
【請求項２６】
第一オリゴヌクレオチドが配列５’  ＵＵＡＡＵＣＵＣＵＵＵＡＣＵＧＡＵＡＵＡ  ３’を含み；
第二オリゴヌクレオチドが配列３’  ＡＡＵＵＡＧＡＧＡＡＡＵＧＡＣ  ５’を含み；
ＸがＸ３であり；
Ｃがコレステロールである、
請求項２３に記載の核酸。
【請求項２７】
第一オリゴヌクレオチドが構造：
Ｘ(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)(−Ｐ−Ｂ−Ｐ−Ａ)５(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)３(−Ｓ−Ｂ)−ＯＲ
を有し；
第二オリゴヌクレオチドが構造：
Ｃ−Ｌ−Ｂ(−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｂ)(−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｂ)５(−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｂ)−ＯＲ
を有し；
核酸が式(IIIｃ)：
【化７】
2018517429.tif 000020
〔式中、各ｌは水素結合相互作用を表す。〕
の構造を有する、請求項１６に記載の核酸。
【請求項２８】
第一オリゴヌクレオチドが配列５’  ＵＵＡＡＵＣＵＣＵＵＵＡＣＵＧＡＵＡＵＡ  ３’を含み；
第二オリゴヌクレオチドが配列３’  ＡＡＵＵＡＧＡＧＡＡＡＵＧＡＣ  ５’を含み；
ＸがＸ３であり；
Ｃがコレステロールである
請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
１以上の請求項５〜１０および１６〜２８のいずれかに記載の二本鎖、化学修飾核酸および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３０】
化合物(IIIａ)の第一核酸(ここで、第一オリゴヌクレオチドが配列５’  ＵＡＡＡＵＵＵＧＧＡＧＡＵＣＣＧＡＧＡＧ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドが配列３’  ＡＵＵＵＡＡＡＣＣＵＣＵＡＧＧ  ５’を含み；ＸがＸ３であり；Ｃがコレステロールである)；および化合物(IIIａ)の第二核酸(ここで、第一オリゴヌクレオチドが配列５’  ＵＡＵＡＡＡＵＧＧＵＡＧＣＵＡＵＧＡＵＧ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドが配列３’  ＡＵＡＵＵＵＡＣＣＡＵＣＧＡＵ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；Ｃがコレステロールである)を含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
疾患または障害を処置または管理する方法であって、そのような処置または管理が必要な対象に治療有効量の請求項２９に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３２】
疾患または障害を処置または管理する方法であって、そのような処置または管理が必要な対象に治療有効量の請求項３０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年４月３日出願の米国仮特許出願番号６２／１４２,７８６号、２０１５年８月１４日出願の米国仮特許出願番号６２／２０５,２１８号および２０１６年１月２６日出願の米国仮特許出願番号６２／２８７,２５５に基づく優先権を主張し、これらの出願の全内容を、引用によりここに包含させる。
【０００２】
連邦援助研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所(ＮＩＨ)により与えられる認可番号ＮＳ０３８１９４およびＴＲ０００８８８ならびにアメリカ国立科学財団(ＮＳＦ)により与えられる認可番号ＯＰＰ１０８６１７０のもとに、政府援助を受けて実施された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、完全化学修飾リボヌクレオチドからなる、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)に有用な新規オリゴヌクレオチドに関する。化学修飾ヌクレオチドおよびリンカーは、予想外に高い効力、取り込みおよび組織分布を達成するように形成されている。
【背景技術】
【０００４】
背景
化学修飾リボヌクレオチド(例えば、２’−フルオロおよび２’−メトキシ修飾)および／または化学修飾リンカー(例えば、ホスホロチオエート修飾)を含むオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉを促進する能力を維持しながら、対応する非修飾オリゴヌクレオチドに比して増強したヌクレアーゼ抵抗性を示すことが知られている。例えば、Fosnaugh, et al.(米国公開２００３／０１４３７３２号)参照。交互の化学修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが知られる。例えば、Bhat et al.(米国公開２００８／０１１９４２７号)参照。治療的ＲＮＡ(例えば、ｓｉＲＮＡ)の疎水性修飾が知られる。例えば、Khvorova, et al.(ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５２４７)参照。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
製剤することなく、効率的ＲＩＳＣエントリー、最小免疫応答および標的外効果、効率的細胞取り込みおよび効率的および特異的組織分布により特徴付けられる、自己送達ｓｉＲＮＡに対する要望がまだある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要約
したがって、ある態様において、次の性質を有するｓｉＲＮＡ化合物がここで提供される：(１)完全に化学的に完全安定化された(すなわち、非修飾２’−ＯＨ残基なし)； (２)非対称； (３)１１〜１６塩基対二本鎖；(４)化学修飾ヌクレオチド(例えば、２’−フルオロおよび２’−メトキシ修飾)の交互のパターン；(５)５〜８塩基の一本鎖、完全ホスホロチオエート化テイル。ホスホロチオエート修飾数は、種々の態様におおいて合計６〜１７で変動する。
【０００７】
ある態様において、ここに記載するｓｉＲＮＡ化合物は、コレステロール、ＤＨＡ、フェニルトロパン、コルチゾール、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ＧａｌＮａｃおよびガングリオシドを含むが、これらに限定されない種々のターゲッティング剤とコンジュゲートさせ得る。コレステロール修飾体は、先に使用された化学安定化パターン(例えば、ピリミジンではなく、全プリンを修飾)に対して広範な細胞型(例えば、ＨｅＬａ、神経細胞、肝細胞、栄養芽細胞)で、インビトロで効力を５〜１０倍改善する。
【０００８】
上記およびここに記載する構造性質を有する本発明のある種の化合物を、“ｈｓｉＲＮＡ−ＡＳＰ”(進化した安定化パターンを備える疎水性修飾、低分子干渉ＲＮＡ；hydrophobically-modified, small interfering RNA, featuring an advanced stabilization pattern)と称することができ、また“ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ”(完全修飾疎水性修飾、低分子干渉ＲＮＡ；Fully Modified hydrophobically-modified, small interfering RNA)とも称し得る。さらに、このｈｓｉＲＮＡ−ＡＳＰパターンは、脳、脊髄にわたる分布、肝臓、胎盤、腎臓、脾臓およびいくつかの他の組織への送達の劇的改善を示し、それらを治療介入に利用可能とする。
【０００９】
肝臓において、ｈｓｉＲＮＡ−ＡＳＰは特に内皮およびクッパー細胞に送達されるが、肝細胞にはされず、この化学修飾パターンを、ＧａｌＮａｃコンジュゲートに対する、競合ではなく、補完的テクノロジーとする。
【００１０】
本発明の化合物を、次の測面および態様で記載し得る。
【００１１】
第一の測面において、ここに提供されるのは、化合物(Ｉ)：少なくとも１６連続ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは５’末端、３’末端および標的への相補性を有し、ここで、
(１)オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；
(２)５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドではなく； 
(３)ヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合し；そして
(４)３’末端から１〜６位または３’末端から１〜７位のヌクレオチドはホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドと結合する。
【００１２】
第二の測面において、ここに提供されるのは、第一オリゴヌクレオチド化合物(Ｉ)および第二オリゴヌクレオチド化合物(II)を含む二本鎖、化学修飾核酸であり、ここで、
(１)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；
(２)第二オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；
(３)第二オリゴヌクレオチドの３’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；そして
(４)第二オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合により結合される。
【００１３】
第三の測面において、ここに提供されるのは、化合物(Ｉａ)
【化１】
2018517429.tif 000003
〔式中、
Ｘは
【化２】
2018517429.tif 000004
からなる群から選択され；
Ａは、各々、独立して２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；Ｂは、各々、独立して２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；Ｋは、各々、独立してホスホジエステルまたはホスホロチオエートリンカーであり；Ｋは、ホスホロチオエートリンカーであり；Ｒは、各々、独立して水素およびキャッピング基(例えば、アセチルのようなアシル基)から選択され；ｊは４、５、６または７であり；ｒは２または３であり；ｔは０または１である。〕
の構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【００１４】
第四の測面において、ここに提供されるのは、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含む二本鎖、化学修飾核酸であり、こここで、
(１)第一オリゴヌクレオチドはここに記載するオリゴヌクレオチドであり(例えば、化合物(Ｉ)、(Ｉａ)または(Ｉｂ))；
(２)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；そして
(３)第二オリゴヌクレオチドは化合物(IIａ)
【化３】
2018517429.tif 000005
〔式中、Ｃは疎水性分子であり；Ａは、各々、独立して２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；Ｂは、各々、独立して２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；Ｌは０〜２０反復単位のエチレングリコール、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートからなる群から選択される１以上の部分を含むリンカーであり；Ｋは、ホスホロチオエートリンカーであり；Ｐはホスホジエステルリンカーであり；Ｒは水素およびキャッピング基(例えば、アセチルのようなアシル基)から選択され；ｍ’は０または１であり；ｎ’ｉｓ４、５または６；ｑ’は０または１であり；ｒ’は０または１であり；ｔ’は０または１である。〕
の構造を有する
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ−１Ｄ】疎水性ｓｉＲＮＡ構造／化学組成、一次ヒト栄養膜細胞層(ＣＴＢ)における取り込みおよび効力を示す。(Ａ)ある態様による疎水性修飾および安定化ｓｉＲＮＡ(ｈｓｉＲＮＡ)を模式的に示す。ｓＦｌｔ１−ｉ１３−２２８３  ｈｓｉＲＮＡおよびマッチングＮＴＣを、示す濃度でＣＴＢに添加した。(Ｂ)ｓＦＬＴ１タンパク質レベルを、処理７２時間後条件培養培地においてＥＬＩＳＡ(#MVR100, R&D systems)で測定した。７２時間にQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定した、(Ｃ)ｓＦｌｔ１−ｉ１３  ｍＲＮＡレベルを記載し、(Ｄ)Ｆｌｔ１−ＦＬ  ｍＲＮＡレベルを記載する(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処置細胞、ＮＴＣ  −  マッチング化学を伴う非ターゲティング対照。
【００１６】
【図２】特定のヌクレオチドおよびリンカー化学修飾を記載する。
【００１７】
【図３】ｓＦＬＴ１のｉ１３およびｉ１４アイソフォームをターゲティングする本発明の化合物の同定および検証を記載する。
【００１８】
【図４Ａ−４Ｂ】肝臓、腎臓および胎盤への送達のｈｓｉＲＮＡ効率を示す。(Ａ)野生型妊娠マウス(Ｅ１５)に、Ｃｙ３−ｓＦＬＴ１−２２８３−Ｐ２(赤色)(１０mg／kg；尾静脈を経るＩＶ)を注射した。組織を２４時間後固定し、処理し、ライカタイリング蛍光顕微鏡で１０ｘおよび６３ｘで画像化した；核をＤＡＰＩ(青色)で染色した。(Ｂ)ＰＮＡアッセイにより分析した注射５日後ｓＦＬＴ１−２２８３(４０mg／kg)の組織分布を示す(ｎ＝７、平均±ＳＥＭ)。
【００１９】
【図５】ＰＮＡアッセイによる本発明の化合物のインビボ定量化を記載する。
【００２０】
【図６】ＷＴ妊娠マウスにおける本発明の化合物によるＦｌｔ１のサイレンシングを示すデータを示す。
【００２１】
【図７Ａ−７Ｃ】胎盤蓄積および分布に対するｈｓｉＲＮＡ化学および投与経路の影響を記載する。(Ａ)野生型妊娠マウス(Ｅ１５)にＣｙ３−ｓＦＬＴ１−２２８３(赤色)(１０mg／kg；尾静脈を経るＩＶ)を注射した。胎盤を２４時間後固定し、処理し、ライカタイリング蛍光顕微鏡で画像化した；核をＤＡＰＩ(青色)で染色した。(Ｂ)２４時間後、ＰＮＡアッセイにより分析したｓＦＬＴ１−ｉ１３−２２８３(１０mg／kg)の蓄積を示す(ｎ＝３、平均±ＳＥＭ)。(Ｃ)種々の修飾パターンのｓＦＬＴ１−ｉ１３−２２８３  ｈｓｉＲＮＡを模式的に表す。Ｐ  −  ５’−ホスフェート；  Ｃｈｏｌ−ｔｅｇ  −  コレステロール−ｔｅｇリンカー；白丸  −  ＲＮＡ；黒丸  −  ２’−Ｏ−メチル；灰色丸  −  ２’−フルオロ；赤丸  −  ホスホロチオエート。
【００２２】
【図８】本発明のｓｉＲＮＡ化合物の構造および安定化パターンを示す。
【００２３】
【図９】本発明の化合物の修飾パターンおよび得られたインビトロ効力の増加を示す。
【００２４】
【図１０】ＡＳＰ(進化した安定化パターン)化学修飾を有しないコンパレーター化合物に対する本発明の化合物の効力増加を示すデータを記載する。
【００２５】
【図１１】ＡＳＰ(進化した安定化パターン)化学修飾を有しないコンパレーター化合物に対する本発明の化合物の効力増加を示すデータを記載する。
【００２６】
【図１２】神経細胞におけるＨＴＴ１０１５０に対するＨＴＴ１０１５０−ＡＳＰ−Ｐ１およびＨＴＴ１０１５０−ＡＳＰ−Ｐ２の効力を記載する。
【００２７】
【図１３】ＨＴＴ１０１５０−ＡＳＰがＱ１４０におけるＲＯＳ調節により強力であることを示すデータを記載する。
【００２８】
【図１４】ＨＴＴ１０１５０−ＡＳＰ−Ｐ２が神経細胞において良好な長期サイレンシングおよび効力を示すデータを記載する。
【００２９】
【図１５】ＨＴＴ１０１５０−ＡＳＰ−Ｐ２が一次神経細胞に低減した毒性を示すことを示すデータを記載する。
【００３０】
【図１６】ＨＴＴ１０１５０に対してＡＳＰパターンを有する化合物が目に見えて低減した毒性を示すデータを記載する。
【００３１】
【図１７】Ｐ０、Ｐ１およびＰ２修飾パターンと比較した、ホスホロチオエート数および修飾ヌクレオチドモノマー数を示す。
【００３２】
【図１８】代替的修飾パターンを示す。
【００３３】
【図１９】代替的修飾パターンを有するｓｉＲＮＡの取り込みに関するデータを記載する。
【００３４】
【図２０】交互の２’−Ｏ−メチル(２’−メトキシ)／２’−フルオロパターンを有するｓｉＲＮＡがインビトロで効力増加を示すことを示すデータを記載する。
【００３５】
【図２１】完全フッ素化アンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡが、対応する交互の２’−メトキシ／２’−フルオロパターンを有するｓｉＲＮＡと比較して効力低減を示すことを示すデータを記載する。
【００３６】
【図２２】フッ素化アンチセンステイルを有するｓｉＲＮＡが、対応する完全交互の２’−メトキシ／２’−フルオロパターンを有するｓｉＲＮＡと比較して、効力改善を示さないことを示すデータを記載する。
【００３７】
【図２３】ｓＦｌｔ１のＩ１３短、Ｉ１３長およびＩ１５ａアイソフォームの種々の化学骨格および独特な配列を現す、効力を有するｓｉＲＮＡの一覧を記載する。この表において、“ガイド”はアンチセンス鎖をいい；“Ｃ”はシチジンをいい；“Ｕ”はウリジンをいい；“Ａ”はアデノシンをいい；“Ｇ”はグアノシンをいい；“ｍ”は２’−メトキシ化学修飾を示し；“ｆ”は２’−フルオロ化学修飾を示し；“＃”はホスホロチオエートリンカーを指し；“Ｐ”は５’−ホスフェートを指し；“ｔｅｇ”はトリエチレングリコールを指し；そして“Ｃｈｏｌ”はコレステロールを指す。
【００３８】
【図２４】ある態様による標的配列、修飾オリゴヌクレオチドおよびその効力を記載する。この表において、“Ｃ”はシチジンをいい；“Ｕ”はウリジンをいい；“Ａ”はアデノシンをいい；“Ｇ”はグアノシンをいい；“ｍ”は２’−メトキシ化学修飾を示し；“ｆ”は２’−フルオロ化学修飾を示し；“＃”はホスホロチオエートリンカーを指し；“Ｐ”は５’−ホスフェートを指し；“.”はホスホジエステル結合を指し；“ｔｅｇ”はトリエチレングリコールを指し；そして“Ｃｈｏｌ”はコレステロールを指す。
【００３９】
【図２５Ａ−２５Ｂ】ＨｅＬａ細胞におけるＨＴＴ１０１５０によるハンチンチンｍＲＮＡの濃度依存的サイレンシングをグラフで示す。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを、７２時間にQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化し、未処置対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処置細胞、ＮＴＣ  −  非ターゲティング対照。Ａ)受動的取り込みにおける１６活性配列の用量応答(製剤なし)。Ｂ)脂質介在取り込み(Invitrogen LIPOFECTAMINE RNAIMAX Transfection Reagent)使用における８選択配列の用量応答。用量応答データをGraphPad Prism 6.03を使用して適合させた。
【００４０】
【図２６Ａ−２６Ｃ】受動的(Ａ)および脂質介在送達(Ｂ)両者の、ＨＴＴ１０１５０によるハンチンチンｍＲＮＡの濃度依存的サイレンシングを記載する。化学修飾は、ｓｉＲＮＡ  ＲＩＳＣ(RNA Induced Silencing Complex)エントリーに負の影響なく、受動的取り込みを可能とする。ＨｅＬａ細胞を、示す濃度の修飾(疎水性および塩基化学修飾の両者を含む)または非修飾ＨＴＴ１０１５０と、ＲＮＡＩＭＡＸ非存在下(Ａ)および存在下(Ｂ)、インキュベートした。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを７２時間にQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化し、未処置対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処置細胞。ＩＣ５０値をここに記載するとおり計算した(Ｃ)。
【００４１】
【図２７Ａ−２７Ｂ】一次神経細胞におけるＨＴＴ１０１５０によるハンチンチンｍＲＮＡおよびタンパク質の濃度依存的サイレンシングをグラフ的に記載する(受動的取り込み)。一次神経細胞を、示す濃度でＨＴＴ１０１５０とインキュベートした。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化し、未処置対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処置細胞。(Ａ)一次皮質および線条体神経細胞における、１週間。(Ｂ)ＨＴＴ１０１５０と１週間インキュベーション後のハンチンチンタンパク質レベルをウェスタンブロットで検出し、β−チューブリンに対して正規化した。
【００４２】
【図２８】ハンチンチンｍＲＮＡレベルを記載する。一次皮質神経細胞を、示す濃度の３ＨＴＴ  ｈｓｉＲＮＡ配列ＨＴＴ１０１５０、ＨＴＴ１０１４６およびＨＴＴ１２１５とインキュベートした。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化し、未処置対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処置細胞。
【００４３】
【図２９Ａ−２９Ｆ】ｈｓｉＲＮＡおよびそれらの性質を記載する。(Ａ)慣用修飾ｈｓｉＲＮＡおよび完全修飾ｈｓｉＲＮＡ(ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ)の模式的構造。(Ｂ)ｈｓｉＲＮＡにおける使用された修飾。(Ｃ)ＨｅＬａ細胞におけるｈｓｉＲＮＡＨＴＴ効力。(Ｄ)一次神経細胞におけるｈｓｉＲＮＡＨＴＴ効力。(Ｅ)一次栄養芽細胞におけるｈｓｉＲＮＡＰＰＩＢ効力。(Ｆ)一次栄養芽細胞におけるｈｓｉＲＮＡＳＦＬＩ効力。
【００４４】
【図３０Ａ−３０Ｇ】インビボでのコンジュゲート介在ｓｉＲＮＡ送達における完全代謝安定化を記載する。(Ａ)部分的(ｈｓｉＲＮＡ)および完全代謝安定化ｈｓｉＲＮＡ−ＦＭＳ化合物の模式図。(Ｂ)ＩＶ投与後ｈｓｉＲＮＡＦＬＴ蓄積レベル。(Ｃ)ＳＣ投与後ｈｓｉＲＮＡＦＬＴ蓄積レベル。(Ｄ)ＩＶ投与後ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＦＬＴ蓄積レベル。(Ｅ)ＳＣ投与後ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＦＬＴ蓄積レベル。(Ｆ)ｈｓｉＲＮＡＦＬＴＩＶ投与後１２０時間の肝臓および腎臓におけるｓＦＬＴ１  ｍＲＮＡ発現。(Ｇ)ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＦＬＴＩＶ投与後１２０時間の肝臓および腎臓におけるｓＦＬＴ１  ｍＲＮＡ発現。
【００４５】
【図３１Ａ−３１Ｇ】ｈｓｉＲＮＡＨＴＴおよびＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴの線条体内投与。(Ａ)脳断面のｈｓｉＲＮＡＨＴＴ発現レベル。(Ｂ)脳断面のＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴ発現レベル。(Ｃ)皮質のＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴ発現レベル。(Ｄ)線条体のＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴ発現レベル。(Ｅ)小脳のＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴ発現レベル。(Ｆ)３μg、６μgおよび１２μg用量を使用するｈｓｉＲＮＡＨＴＴおよびＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴサイレンシング。(Ｇ)注射１、２および４週間後ｈｓｉＲＮＡＨＴＴおよびＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴサイレンシング。
【００４６】
【図３２】一定範囲の濃度にわたるＨｔｔのｈｓｉＲＮＡＨＴＴ(ｈｓｉＲＮＡ−Ｆ１)とＬＮＡ−ＧＡＰＭＥＲサイレンシングの比較を記載する。
【００４７】
【図３３】ＨＴＴ１０１５０による核Ｈｔｔ  ｍＲＮＡを超える細胞質Ｈｔｔ  ｍＲＮＡの優先的排除を記載する。
【００４８】
【図３４】インビボで用量依存的サイレンシングを誘発する単回ｈｓｉＲＮＡ線条体内注射の結果を記載する。
【００４９】
【図３５】ＨＴＴ１０１５０注射部位での炎症性応答の定量化を記載する。
【００５０】
【図３６】ヌクレオチド間結合の例を記載する。
【００５１】
【図３７】ヌクレオチド間主鎖結合の例を記載する。
【００５２】
【図３８】完全代謝安定化ｈｓｉＲＮＡ(ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ)を記載する。(Ａ)部分的および完全修飾ｈｓｉＲＮＡの模式図。(Ｂ)ｈｓｉＲＮＡおよびＦＭ−ｈｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣに入る同等な能力を有する(ＨｅＬａ、７２時間、QuantiGene(登録商標))。(Ｃ)ネイキッドｓｉＲＮＡではなく、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡが受動的送達を支持する。(Ｄ)代謝安定５’−Ｅ−ＶＰは５’−Ｐとして活性である。(Ｅ)５’−Ｅ−ＶＰは、遠位組織への持続した送達が可能である(注射７日後、ＰＮＡアッセイ)。
【００５３】
【図３９】インビボでのコンジュゲート介在ｓｉＲＮＡ送達および効果期間を記載する。ｈｓｉＲＮＡ(Ａ)および完全修飾ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ(Ｂ)をＩＶ(１０mg／kg)またはＩＣＶ(６０μg)で注射し、分布を顕微鏡により評価した(１０ｘ、Ｌｅｉｃａ、Ｄａｐｉ、青色、核、Ｃｙ３、赤色、ｈｓｉＲＮＡ)。完全安定化は、組織保持を劇的に増強する。(Ｃ)。インタクトガイド鎖定量化を、ＰＮＡアッセイ(ｎ＝３、平均±ＳＥＭ)により、ＩＶ注射５日後肝臓および腎臓で分析した。(Ｄ)ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡは、注射(ＩＳ、１２μg)１ヶ月後、マウス線条体におけるＨｔｔ  ｍＲＮＡをサイレンシングする、QuantiGene(登録商標)。部分的修飾ｈｓｉＲＮＡは、１週間後サイレンシングを失う。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
詳細な記載
第一の側面において、ここに提供されるのは、化合物(Ｉ)：少なくとも１６連続ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは５’末端、３’末端および標的への相補性を有し、ここで、
(１)オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；
(２)５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドではなく；
(３)ヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合し；そして
(４)３’末端から１〜６位または３’末端から１〜７位のヌクレオチドはホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドと結合する。
【００５５】
ある態様において、オリゴヌクレオチドは、標的とハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。ある態様において、相補性は＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは標的に完全相補性を有する。
【００５６】
オリゴヌクレオチドのある態様において、標的は哺乳動物またはウイルスｍＲＮＡである。他の態様において、標的は該ｍＲＮＡのイントロン領域である。他の態様において、標的は該ｍＲＮＡの５’  ＵＴＲ領域である。他の態様において、ｍＲＮＡは、可溶性Ｆｌｔ１(ｓＦｌｔ１)の一部に対応する。特定の態様において、ｍＲＮＡは、ｓＦｌｔ  ｉ１３(例えば、ｓＦｌｔ−ｉ１３長またはｓＦｌｔ−ｉ１３短)の一部(例えば、イントロン領域)に対応する。他の特定の態様において、ｍＲＮＡはｓＦｌｔ  ｉ１５ａの一部(例えば、イントロン領域)に対応する。他の態様において、ｍＲＮＡは、ハンチンチン遺伝子(例えば、変異体ハンチンチン遺伝子)の一部に対応する。
【００５７】
第二の側面において、ここに提供されるのは、第一オリゴヌクレオチド化合物(Ｉ)および第二オリゴヌクレオチド化合物(II)を含む二本鎖、化学修飾核酸であり、ここで、
(１)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；
(２)第二オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；
(３)第二オリゴヌクレオチドの３’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；そして
(４)第二オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合により結合される。
【００５８】
ある態様において、第一オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖であり、第二オリゴヌクレオチドはセンス鎖である。
【００５９】
ある態様において、二本鎖核酸は、第一および第二オリゴヌクレオチドの相補性部分内に１以上のミスマッチを含む。特定の態様において、二本鎖核酸は、第一および第二オリゴヌクレオチドの相補性部分に１ミスマッチを含む。
【００６０】
核酸のある態様において、第二オリゴヌクレオチドは、第二オリゴヌクレオチドの３’末端の疎水性分子に結合される。ある態様において、第二オリゴヌクレオチドと疎水性分子間の結合はポリエチレングリコールを含む。特定の態様において、第二オリゴヌクレオチドと疎水性分子間の結合はトリエチレングリコールを含む。
【００６１】
核酸の他の態様において、第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドは、隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート結合により結合される。さらに他の態様において、第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドの５’末端から１位および２位のヌクレオチドは、隣接リボヌクレオチドとホスホロチオエート結合により結合される。
【００６２】
第三の側面において、ここに提供されるのは、化合物(Ｉａ)
【化４】
2018517429.tif 000006
〔式中、
Ｘは
【化５】
2018517429.tif 000007
からなる群から選択され；
Ａは、各々、独立して２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；
Ｂは、各々、独立して２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；
Ｋは、各々、独立してホスホジエステルまたはホスホロチオエートリンカーであり；
Ｋは、ホスホロチオエートリンカーであり；
Ｒは、各々、独立して水素およびキャッピング基(例えば、アセチルのようなアシル基)から選択され；
ｊは４、５、６または７であり；
ｒは２または３であり；
ｔは０または１である。〕
の構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【００６３】
特定の態様において、Ｒは水素である。他の特定の態様において、ＸはＸ１である。さらに他の特定の態様において、ＸはＸ３である。
【００６４】
ある態様において、化合物(Ｉａ)のオリゴヌクレオチドは、化合物(Ｉｂ)：
【化６】
2018517429.tif 000008
〔式中、
Ｘは上に定義したとおりであり；
Ａは、各々、独立して２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；
Ｂは、各々、独立して２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；
Ｋは、ホスホロチオエートリンカーであり；
Ｐはホスホジエステルリンカーであり；
Ｒは上に定義したとおりであり；
ｍは０または１であり；
ｎは４、５または６であり；
ｑは０または１であり；
ｒは２または３であり；
ｔは０または１である。〕
の構造を有する
【００６５】
化合物(Ｉｂ)の第一の特定の態様において、ｍは０であり；ｎは６であり；ｑは１であり；ｒは２であり；ｔは１である。例えば、図７の種Ｐ１および図１７の種ＨＴＴ１０１５０−ＡＳＰ−Ｐ１参照。
【００６６】
化合物(Ｉｂ)の第二の特定の態様において、ｍは１であり；ｎは５であり；ｑは１であり；ｒは２であり；ｔは１である。例えば、図７の種Ｐ２参照。
【００６７】
化合物(Ｉｂ)の第三の特定の態様において、ｍは１であり；ｎは５であり；ｑは０であり；ｒは３でありｔは１である。例えば、図１７の種ＨＴＴ１０１５０−ＡＳＰ−Ｐ２参照。
【００６８】
特定の態様において、Ｒは水素である。他の特定の態様において、ＸはＸ１である。さらに他の特定の態様において、ＸはＸ３である。
【００６９】
第四の側面において、ここに提供されるのは、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含む二本鎖、化学修飾核酸であり、ここで、
(１)第一オリゴヌクレオチドはここに記載するオリゴヌクレオチドであり(例えば、化合物(Ｉ)、(Ｉａ)または(Ｉｂ))；
(２)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；そして
(３)第二オリゴヌクレオチドは化合物(IIａ)
【化７】
2018517429.tif 000009
〔式中、
Ｃは疎水性分子であり；
Ａは、各々、独立して２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；
Ｂは、各々、独立して２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；
Ｌはエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、アミド、カルバメートまたはこれらの組み合わせを含むリンカーであり；
Ｋは、ホスホロチオエートリンカーであり；
Ｐはホスホジエステルリンカーであり；
Ｒは、各々、独立して水素およびキャッピング基(例えば、アセチルのようなアシル基)から選択され；
ｍ’は０または１であり；
ｎ’は４、５または６であり；
ｑ’は０または１であり；
ｒ’は０または１であり；そして
ｔ’は０または１である。〕
の構造を有する。
【００７０】
ある態様において、Ｌは、０〜２０、０〜１０または０〜４反復単位のエチレングリコールを含むリンカーである。特定の態様において、Ｌは、３反復単位のエチレングリコールを含むリンカー(すなわち、トリエチレングリコール)であり。他の特定の態様において、ＬはＬ１、Ｌ２およびＬ３
【化８】
2018517429.tif 000010
から選択される。
【００７１】
二本鎖核酸のある態様において、疎水性分子はコレステロールである。他の態様において、第一オリゴヌクレオチドは、第二オリゴヌクレオチドより３〜７多いリボヌクレオチドを有する。他の特定の態様において、各Ｒは水素である。
【００７２】
ある態様において、二本鎖核酸は、第一および第二オリゴヌクレオチドの相補性部分内に１以上のミスマッチを含む。特定の態様において、二本鎖核酸は、第一および第二オリゴヌクレオチドの相補性部分に１ミスマッチを含む。
【００７３】
ある態様において、二本鎖核酸は１１〜１６塩基対二本鎖を含み、ここで、各塩基対二本鎖のヌクレオチドは異なる化学修飾を有する(例えば、一方のヌクレオチドが２’−フルオロ修飾を有し、他方のヌクレオチドが２’−メトキシを有する)。特定の態様において、二本鎖核酸は１５塩基対二本鎖を有する。
【００７４】
二本鎖核酸のある態様において、第一オリゴヌクレオチドは、構造Ｘ(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)(−Ｐ−Ｂ−Ｐ−Ａ)５(−Ｐ−Ｂ−Ｓ−Ａ)(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)２(−Ｓ−Ｂ)−ＯＲを有し；第二オリゴヌクレオチドは構造Ｃ−Ｌ−Ｂ(−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｂ)(−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｂ)５(−Ｓ−Ａ)(−Ｓ−Ｂ)−ＯＲを有する。例えば、図７の種Ｐ２参照。特定の態様において、二本鎖核酸は化合物(IIIａ)
【化９】
2018517429.tif 000011
〔式中、各ｌは水素結合相互作用を表す(すなわち、塩基対形成相互作用)。〕
の構造を有する
【００７５】
化合物(IIIａ)の特定の態様において、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＡＡＡＵＵＵＧＧＡＧＡＵＣＣＧＡＧＡＧ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＵＵＵＡＡＡＣＣＵＣＵＡＧＧ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；Ｃはコレステロールである。さらなる態様において、Ｒは水素である。さらなる態様において、Ｌはトリエチレングリコールを含む。特定の態様において、ＬはＬ３である。
【００７６】
化合物(IIIａ)の他の特定の態様において、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＡＵＡＡＡＵＧＧＵＡＧＣＵＡＵＧＡＵＧ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＵＡＵＵＵＡＣＣＡＵＣＧＡＵ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；Ｃはコレステロールである。さらなる態様において、Ｒは水素である。さらなる態様において、Ｌはトリエチレングリコールを含む。特定の態様において、ＬはＬ３である。
【００７７】
化合物(IIIａ)の他の特定の態様において、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＵＡＡＵＣＵＣＵＵＵＡＣＵＧＡＵＡＵＡ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＡＵＵＡＧＡＧＡＡＡＵＧＡＣ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；Ｃはコレステロールである。さらなる態様において、Ｒは水素である。さらなる態様において、Ｌはトリエチレングリコールを含む。特定の態様において、ＬはＬ３である。
【００７８】
二本鎖核酸の他の態様において、第一オリゴヌクレオチドは構造Ｘ(−Ｐ−Ｂ−Ｐ−Ａ)６(−Ｐ−Ｂ−Ｓ−Ａ)(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)２(−Ｓ−Ｂ)−ＯＲを有し；第二オリゴヌクレオチドは構造Ｃ−Ｌ−Ｂ(−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｂ)(−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｂ)６−ＯＲを有する。例えば、図７の種Ｐ１参照。特定の態様において、二本鎖核酸は、化合物(IIIｂ)
【化１０】
2018517429.tif 000012
〔式中、各ｌは水素結合相互作用を表す(すなわち、塩基対形成相互作用)。〕
の構造を有する。
【００７９】
化合物(IIIｂ)の特定の態様において、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＡＡＡＵＵＵＧＧＡＧＡＵＣＣＧＡＧＡＧ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＵＵＵＡＡＡＣＣＵＣＵＡＧＧ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；Ｃはコレステロールである。さらなる態様において、Ｒは水素である。さらなる態様において、Ｌはトリエチレングリコールを含む。特定の態様において、ＬはＬ３である。
【００８０】
化合物(IIIｂ)の他の特定の態様において、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＡＵＡＡＡＵＧＧＵＡＧＣＵＡＵＧＡＵＧ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＵＡＵＵＵＡＣＣＡＵＣＧＡＵ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；Ｃはコレステロールである。さらなる態様において、Ｒは水素である。さらなる態様において、Ｌはトリエチレングリコールを含む。特定の態様において、ＬはＬ３である。
【００８１】
化合物(IIIｂ)の他の特定の態様において、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＵＡＡＵＣＵＣＵＵＵＡＣＵＧＡＵＡＵＡ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＡＵＵＡＧＡＧＡＡＡＵＧＡＣ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；Ｃはコレステロールである。さらなる態様において、Ｒは水素である。さらなる態様において、Ｌはトリエチレングリコールを含む。特定の態様において、ＬはＬ３である。
【００８２】
二本鎖核酸の他の態様において、第一オリゴヌクレオチドは構造Ｘ(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)(−Ｐ−Ｂ−Ｐ−Ａ)５(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)３(−Ｓ−Ｂ)−ＯＲ；第二オリゴヌクレオチドは構造Ｃ−Ｌ−Ｂ(−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｂ)(−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｂ)５(−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｂ)−ＯＲを有し；核酸は式(IIIｃ)
【化１１】
2018517429.tif 000013
〔式中、各ｌは水素結合相互作用を表す(すなわち、塩基対形成相互作用)。〕
の構造を有する。
【００８３】
化合物(IIIｃ)の他の特定の態様において、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＵＡＡＵＣＵＣＵＵＵＡＣＵＧＡＵＡＵＡ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＡＵＵＡＧＡＧＡＡＡＵＧＡＣ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；Ｃはコレステロールである。さらなる態様において、Ｒは水素である。さらなる態様において、Ｌはトリエチレングリコールを含む。特定の態様において、ＬはＬ３である。
【００８４】
ある態様において、化合物(Ｉ)、(Ｉａ)および(Ｉｂ)は、図２３の“ガイドＰＯ”種または図２４の“アンチセンス鎖”に対応する配列を含む。ある態様において、化合物(II)および(IIａ)は、図２３の“センスＰＯ”種または図２４の“センス鎖”種に対応する配列を含む。
【００８５】
他の面において、ここに提供されるのは、化合物(IIIａ)の第一核酸(ここで、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＡＡＡＵＵＵＧＧＡＧＡＵＣＣＧＡＧＡＧ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＵＵＵＡＡＡＣＣＵＣＵＡＧＧ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；ＬはＬ３であり；Ｃはコレステロールである)；および化合物(IIIａ)の第二核酸(ここで、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＡＵＡＡＡＵＧＧＵＡＧＣＵＡＵＧＡＵＧ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＵＡＵＵＵＡＣＣＡＵＣＧＡＵ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；ＬはＬ３であり；Ｃはコレステロールである)を含む、組成物である。
【００８６】
定義
特に断らない限り、ここに使用する科学的および技術的用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有する。何らかの曖昧さが潜在している場合、ここに提供する定義が、あらゆる辞書的または外的定義に優先する。文脈から他の解釈が必要でない限り、単数表現は複数を含み、複数表現は単数を含む。“または”の使用は、特に断らない限り“および／または”を意味する。用語“含む”ならびに“含み”および“含まれる”のような他の形態は限定的ではない。
【００８７】
オリゴヌクレオチド配列で使用される限り、“Ａ”は塩基アデニン(例えば、アデノシンまたはその化学修飾誘導体)を含むヌクレオシドを表し、“Ｇ”は塩基グアニン(例えば、グアノシンまたはその化学修飾誘導体)を含むヌクレオシドを表し、“Ｕ”は塩基ウラシル(例えば、ウリジンまたはその化学修飾誘導体)を含むヌクレオシドを表し、“Ｃ”は塩基シトシン(例えば、シチジンまたはその化学修飾誘導体)を含むヌクレオシドを表す。
【００８８】
“可溶性ＦＬｔ１(ｓＦＬＴ１)”(ｓＶＥＧＦ−Ｒ１としても知られる)は、ｓＦＬＴ１生物学的活性を有するＦＬＴ１受容体の可溶性形態を意味する(例えば、例えば、ｓＦｌｔ１−ｉ１３短、ｓＦｌｔ１−ｉ１３長および／またはｓＦｌｔ１−ｉ１５ａ)。ｓＦＬＴ１ポリペプチドの生物学的活性は、あらゆる標準法、例えば、ＰＥ、子癇および／またはＨＥＬＬＰの１以上の臨床症状のアッセイ、ｓＦＬＴ１  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルのアッセイ、ＶＥＧＦへのｓＦＬＴ１結合のアッセイなどを使用して、アッセイし得る。ｓＦＬＴ１タンパク質はＦＬＴ１受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質チロシンキナーゼドメインを欠く。ｓＦＬＴ１タンパク質はＶＥＧＦに結合でき、ＰｌＧＦは高親和性で結合するが、増殖または血管形成を誘発できず、それゆえに、Ｆｌｔ−１およびＫＤＲ受容体と機能的に異なる。ｓＦＬＴ１は、最初にヒト臍部内皮細胞から精製され、後にインビボで栄養芽細胞により産生されることが示された。ここで使用するｓＦｌｔ−１は、あらゆるｓＦｌｔ−１ファミリーメンバーまたはアイソフォーム、例えば、ｓＦＬＴ１−ｉ１３(例えば、ＦＬＴ１−ｉ１３短および／またはｓＦＬＴ１−ｉ１３長(ｓＦＬＴ１＿ｖ１)、ｓＦｌｔ１−ｉ１５ａ(ｓＦＬＴ１＿ｖ２)、ｓＦＬＴ１−ｅ１５ａ、ｓＦＬＴ１＿ｖ３、ｓＦＬＴ１＿ｖ４などを含む。
【００８９】
“栄養芽細胞”は、子宮粘膜を侵食し、それにより、胚が母体から栄養分を受け取る、胚盤胞を覆う中外胚葉細胞層を意味する。栄養芽細胞は胎盤の形成に寄与する。
【００９０】
用語“ヌクレオチドアナログ”または“変改ヌクレオチド”または“修飾ヌクレオチド”は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準ヌクレオチドをいう。ヌクレオチドアナログの例は、ヌクレオチドのある化学的性質を変えるために何れかの位置が修飾されているが、ヌクレオチドアナログがその意図する機能を発揮する能力はなお保持する。誘導体化し得るヌクレオチドの位置は、５位、例えば、５−(２−アミノ)プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジンなど；６位、例えば、６−(２−アミノ)プロピルウリジン；アデノシンおよび／またはグアノシンについては８位、例えば、８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシンなどを含む。ヌクレオチドアナログはデアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ修飾(例えば、アルキル化、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンまたは他に当分野で知られるように)ヌクレオチド；およびHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記載のもののような他のヘテロ環修飾ヌクレオチドアナログも含む。
【００９１】
ヌクレオチドアナログはまたヌクレオチドの糖部分にも修飾を含み得る。例えば、２’  ＯＨ基をＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲまたはＯＲ(ここで、Ｒは置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである)に置き換えてよい。他の可能な修飾は、米国特許５,８５８,９８８号および６,２９１,４３８号に記載のものを含む。
【００９２】
ヌクレオチドのリン酸基も、例えば、リン酸基の酸素の１以上を硫黄に置き換えることにより(例えば、ホスホロチオエート)または、例えば、Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85および米国特許５,６８４,１４３号に記載のように、ヌクレオチドがその意図する機能を発揮することを可能にする他の置換を行うことにより、修飾してよい。上記修飾のいくつか(例えば、リン酸基修飾)は、好ましくはインビボまたはインビトロで、例えば、該アナログを含むポリヌクレオチドの加水分解の速度を低減する。
【００９３】
ある態様において、ここに記載する化合物、オリゴヌクレオチドおよび核酸は、図３６に提供するヌクレオチド間結合を含むように修飾され得る。具体的態様において、ここに記載する化合物、オリゴヌクレオチドおよび核酸は、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートから選択されるヌクレオチド間結合を含む。
【００９４】
例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートを含む、あるここに提供するヌクレオチド間結合が、生理学的ｐＨで−１の形式電荷を形成し、該形式電荷がカチオン性部分、例えば、ナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属、カルシウムまたはマグネシウムのようなアルカリ土類金属またはアンモニウムまたはグアニジニウムイオンと平衡していることは理解される。
【００９５】
ある態様において、ここに記載する化合物、オリゴヌクレオチドおよび核酸は、図３７に提供するヌクレオチド間主鎖結合を含むように修飾され得る。
【００９６】
ある態様において、ここに提供されるのは、ホスフェート部分(例えば、Ｘ１、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６)、ホスホネート部分(例えば、Ｘ３、Ｘ７およびＸ８)を含む化合物である。これらの部分は、該部分のｐＫａおよび環境のｐＨの関数として、一部または完全にイオン化される。負に荷電したイオンは、カチオン性部分、例えば、ナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属、カルシウムまたはマグネシウムのようなアルカリ土類金属またはアンモニウムまたはグアニジニウムイオンと平衡することは理解される。
【００９７】
医薬組成物および投与方法
ある面において、ここに提供されるのは、治療有効量のここに記載する１以上の化合物、オリゴヌクレオチドまたは核酸および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。ある態様において、医薬組成物は、１以上のここに記載する二本鎖、化学修飾核酸および薬学的に許容される担体を含む。特定の態様において、医薬組成物は、一つのここに記載する二本鎖、化学修飾核酸および薬学的に許容される担体を含む。他の特定の態様において、医薬組成物は、二つのここに記載する二本鎖、化学修飾核酸および薬学的に許容される担体を含む。
【００９８】
特定の態様において、医薬組成物は、化合物(IIIａ)の第一核酸(ここで、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＡＡＡＵＵＵＧＧＡＧＡＵＣＣＧＡＧＡＧ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＵＵＵＡＡＡＣＣＵＣＵＡＧＧ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；Ｃはコレステロールである)；および化合物(IIIａ)の第二核酸(ここで、第一オリゴヌクレオチドは配列５’  ＵＡＵＡＡＡＵＧＧＵＡＧＣＵＡＵＧＡＵＧ  ３’を含み；第二オリゴヌクレオチドは配列３’  ＡＵＡＵＵＵＡＣＣＡＵＣＧＡＵ  ５’を含み；ＸはＸ３であり；Ｃはコレステロールである)を含む。
【００９９】
本発明は、下記のとおり予防および／または治療処置のための上記薬剤の使用に関する。従って、本発明のモジュレーター(例えば、ＲＮＡｉ剤)を、投与に適する医薬組成物に組み込み得る。このような組成物は、一般に核酸分子、タンパク質、抗体または調節化合物および薬学的に許容される担体を含む。ここで使用する用語“薬学的に許容される担体”は、医薬投与と適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で周知である。何らかの慣用の媒体または薬剤が活性化合物と非適合性でない限り、組成物におけるその使用が企図される。補助的活性化合物も組成物に組み込み得る。
【０１００】
本発明の医薬組成物を、意図する投与経路に適合するように製剤する。投与経路の例は、非経腸、例えば、静脈内(ＩＶ)、皮内、皮下(ＳＣまたはＳＱ)、腹腔内、筋肉内、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)および経粘膜投与。非経腸、皮内または皮下適用に使用する溶液または懸濁液は、次の成分を含み得る：注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；アセテート、シトレートまたはホスフェートのような緩衝液および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張性調節用薬剤。ｐＨを、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調節できる。非経腸製剤は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製複数用量バイアルに充填する。
【０１０１】
注射可能使用に適する医薬組成物は、無菌水溶液(水可溶性であるとき)または分散剤および無菌注射可能溶液または分散剤即時製剤用無菌粉末を含む。静脈内投与に関して、適当な担体は、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ(BASF、Parsippany、N.J.)またはリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)を含む。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、容易な注射性(syringability)を有する程度に流体でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染に対して保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)および適当なそれらの混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを包含させるのが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを包含させることによりもたらされ得る。
【０１０２】
無菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて、上記成分の一つまたは組み合わせと適切な溶媒に取り込み、続いて滅菌濾過することにより製造できる。一般に、分散剤は、基本分散媒体および上記からの必要な他の成分を含む、無菌媒体に活性化合物を取り込むことにより製造する。無菌注射用溶液の製剤用無菌粉末の場合、製剤の好ましい方法は、先に無菌濾過した溶液から活性成分と何らかの所望の追加成分の粉末を産生する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１０３】
このような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０(集団の５０％に致死の用量)およびＥＤ５０(集団の５０％に治療的に有効な用量)を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的医薬過程により決定できる。毒性と治療効果の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現できる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用できるが、非感染細胞への損傷の可能性を最小化するために罹患組織の部位へこのような化合物を標的化する、それにより、副作用を軽減する、送達系の設計を考慮すべきである。
【０１０４】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトにおける使用のための範囲の用量の公式化に使用できる。このような化合物の用量は、好ましくは毒性がないかまたはわずかで、ＥＤ５０を含む循環血濃度範囲内である。用量は用いる用量形態および利用する投与経路により変わる。本発明の方法において使用するあらゆる化合物について、治療的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから計算できる。用量を、細胞培養で決定されるＥＣ５０(すなわち、最大の半分の応答を達成する試験化合物の濃度)を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて公式化し得る。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより詳細に決定できる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定し得る。
【０１０５】
処置法
ある面において、本発明は、全体または一部が、分泌Ｆｌｔ１タンパク質が原因の、疾患または障害のリスクを有する(または疑われる)対象における予防および治療両者の方法を提供する。ある態様において、疾患または障害は肝疾患または障害である。他の態様において、疾患または障害は腎疾患または障害である。ある態様において、疾患または障害は胎盤疾患または障害である。ある態様において、疾患または障害は妊娠関連疾患または障害である。注意すべき態様において、疾患または障害は、可溶性Ｆｌｔ１タンパク質の発現と関係する障害であり、ここで、可溶性Ｆｌｔ１タンパク質の増幅した発現がＰＥ(子癇前症)、分娩後ＰＥ、子癇および／またはＨＥＬＬＰ(すなわち、ＨＥＬＬＰ症候群)の臨床的顕在化にいたる。
【０１０６】
他の面において、全体または一部が、機能獲得型変異体タンパク質が原因の、疾患または障害のリスクにある(または疑われる)対象における予防および治療両者の方法を提供する。ある態様において、疾患または障害は、トリヌクレオチド反復疾患または障害である。他の態様において、疾患または障害は、ポリグルタミン障害である。好ましい態様において、疾患または障害は、ハンチンチンの発現と関連する障害であり、ハンチンチンの変改、特にＣＡＧ反復コピー数の増幅が、臨床的顕在化がハンチントン病患者に見られるものを含むように、ハンチンチン遺伝子(構造または機能)またはハンチンチンタンパク質(構造または機能または発現)の欠損をもたらす。
【０１０７】
ここで使用する“処置”または“処置する”は疾患または障害、疾患または障害の症状または疾患の素因を治療、治癒、軽減、軽快、改変、矯正、向上、改善または作用を目的とした、患者への治療剤(例えば、ＲＮＡ剤またはそれをコードするベクターまたはトランスジーン)の適用または投与または疾患または障害、疾患または障害の症状または疾患または障害の素因を有する患者から単離した単離組織または細胞株への治療剤の適用または投与として定義する。
【０１０８】
ある面において、本発明は、対象に治療剤(例えば、ＲＮＡｉ剤またはそれをコードするベクターまたはトランスジーン)を投与することによる、対象における上記の疾患または障害を予防する方法を提供する。疾患の危険がある対象は、例えば、ここに記載する診断または予後アッセイのいずれかまたは組み合わせにより道程できる。予防剤の投与は、疾患または障害が阻止される、あるいは、その進行が遅延されるように、疾患または障害の特徴症状の顕在化前に行い得る。
【０１０９】
本発明の他の面は、対象を治療的に処置する、すなわち、疾患または障害の症状の発症を変える方法に関する。例示的態様において、本発明の調節法は、遺伝子での配列特異的干渉が達成されるように、機能獲得型変異体を発現する細胞と、遺伝子内の１以上の標的配列に特異的な治療剤(例えば、ＲＮＡｉ剤またはそれをコードするベクターまたはトランスジーン)を接触させることを含む。これらの方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と培養するにより)、あるいは、インビボで(例えば、対象に薬剤を投与することにより)実施できる。
【０１１０】
神経系細胞への取り込み増強のために修飾されたＲＮＡサイレンシング剤を、約１.４mg／体重kgまたは１０mg／体重kg、５mg／体重kg、２mg／体重kg、１mg／体重kg、０.５mg／体重kg、０.１mg／体重kg、０.０５mg／体重kg、０.０１mg／体重kg、０.００５mg／体重kg、０.００１mg／体重kg、０.０００５mg／体重kg、０.０００１mg／体重kg、０.００００５mg／体重kgまたは０.００００１mg／体重kg未満および２００nmoleのＲＮＡ剤(例えば、約４.４×１０１６コピー)／体重kg未満または１５００nmole、７５０nmole、３００nmole、１５０nmole、７５nmole、１５nmole、７.５nmole、１.５nmole、０.７５nmole、０.１５nmole、０.０７５nmole、０.０１５nmole、０.００７５nmole、０.００１５nmole、０.０００７５nmole、０.０００１５nmoleのＲＮＡサイレンシング剤／体重kg未満の単位用量で投与できる。単位用量は、例えば、注射(例えば、静脈内または筋肉内、髄腔内または直接脳に)、吸入用量または局所適用により投与できる。特に好ましい用量は、２、１または０.１mg／体重kg未満である。
【０１１１】
ＲＮＡサイレンシング剤の臓器への直接送達(例えば、脳、脊柱、胎盤、肝臓および／または腎臓へ直接)は、臓器あたり約０.００００１mg〜約３mgの程度または臓器あたり好ましくは約０.０００１〜０.００１mg、臓器あたり約０.０３〜３.０mg、眼あたり約０.１〜３.０mgまたは臓器あたり約０.３〜３.０mgの程度の投与量であり得る。投与量は、神経学疾患または障害(例えば、ハンチントン病)または肝臓、腎臓または妊娠関連疾患または障害(例えば、ＰＥ、分娩後ＰＥ、子癇および／またはＨＥＬＬＰ)の処置または予防に有効な量であり得る。ある態様において、単位用量を、１日１回より少ない、例えば、２日毎、４日毎、８日毎または３０日毎より少ない頻度で投与する。他の態様において、単位用量を一定頻度で投与しない(例えば、規則的頻度ではない)。例えば、単位用量を一度に投与し得る。ある態様において、有効用量を他の伝統的治療モダリティと投与する。
【０１１２】
ある態様において、対象に、初期用量および１以上の維持用量のＲＮＡサイレンシング剤を投与する。１以上の維持用量は、一般に初期用量より低く、例えば、初期用量の半分である。維持レジメンは、対象を、１日あたり０.０１μg〜１.４mg／体重kg、例えば、１日あたり１０、１、０.１、０.０１、０.００１または０.００００１mg／体重kgの１以上の用量で処置することを含み得る。維持用量は、好ましくは５日、１０日または３０日に１回未満で投与する。さらに、処置レジメンは、特定の疾患の性質、その重症度および患者の全体的状態によって変わる一定期間で終了し得る。好ましい態様において、用量は１日１回未満、例えば、２４時間、３６時間、４８時間以上で１回以下、例えば、５日または８日に１回以下で送達し得る。処置後、患者を、状態の変化および疾患状態の症状の軽減についてモニターし得る。化合物の用量は、患者が現在の用量レベルで顕著に応答しないならば増やしてよくまたは疾患状態の症状の軽減が観察されたならば、疾患状態が消失したらまたは望まない副作用が観察されたならば用量を減らしてよい。
【０１１３】
ある面において、ここに提供されるのは、子癇前症、分娩後子癇前症、子癇またはＨＥＬＬＰ症候群を処置または管理する方法であって、このような処置または管理を必要とする対象に治療有効量のここに記載する化合物、オリゴヌクレオチドまたは核酸または該化合物、オリゴヌクレオチドまたは核酸を含む医薬組成物を投与することを含む、方法である。
【０１１４】
他の面において、ここに提供されるのは、ハンチントン病を処置または管理する方法であって、このような処置または管理を必要とする対象に治療有効量のここに記載する化合物、オリゴヌクレオチドまたは核酸または該化合物、オリゴヌクレオチドまたは核酸を含む医薬組成物を投与することを含む、方法である。
【０１１５】
ｓｉＲＮＡ分子の設計
ある態様において、センス鎖および相補的アンチセンス鎖からなる二本鎖であり、アンチセンス鎖は、ｈｔｔ  ｍＲＮＡに対してＲＮＡｉに介在するのに十分な相補性を有する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は約１０〜５０以上のヌクレオチドの長さであり、すなわち、各鎖は１０〜５０ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)を含む。より好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は各鎖で約１６〜３０、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さを有し、ここで、鎖の一方は、標的領域に十分に相補性である。好ましくは、これらの鎖を、これらの鎖をアニールしたとき、二本鎖の一端または両端に１、２または３残基のオーバーハングが生じるように、鎖の末端に整列しない(すなわち、相補的塩基が反対の鎖に存在しない)少なくとも１、２または３塩基があるように、整列させる。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は約１０〜５０以上のヌクレオチドの長さを有し、すなわち、各鎖は１０〜５０ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)含む。より好ましくは、ｓｉＲＮＡ分は、各鎖約１６〜３０、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さを有し、ここで、鎖の一方は標的配列に実質的に相補性であり、他方の鎖は、第一鎖と同一または実質的に同一である。
【０１１６】
一般に、ｓｉＲＮＡは、当分野で知られる任意の方法、例えば、次のプロトコールを使用して設計され得る。
【０１１７】
１. ｓｉＲＮＡは、標的配列、例えば、図２３に示す標的配列に特異的でなければならない。ある態様において、標的配列はｓＦｌｔ１に見られる。ある態様において、標的配列は変異体ハンチンチン(ｈｔｔ)アレルに見られるが、野生型ハンチンチンアレルには見られない。他の態様において、標的配列は、変異体ハンチンチン(ｈｔｔ)アレルおよび野生型ハンチンチンアレル両者に見られる。他の態様において、標的配列は野生型ハンチンチンアレルに見られる。第一鎖は、標的配列に相補的でなければならず、他方の鎖は第一鎖に実質的に相補性である(センス鎖およびアンチセンス鎖の例について図２３参照)。ある態様において、標的配列は、変異体ハンチンチン(ｈｔｔ)アレルの拡張ＣＡＧ反復の外側である。他の態様において、標的配列は、標的遺伝子のコーディング領域の外側である。標的配列例は、標的遺伝子の５’非翻訳領域(５’−ＵＴＲ)またはイントロン領域から選択される。これらの部位でのｍＲＮＡの開裂は、対応する変異体タンパク質の翻訳を排除すべきである。ｈｔｔ遺伝子の他の領域からの標的配列もターゲティングに適する。センス鎖は、標的配列に基づき設計される。さらに、低Ｇ／Ｃ含量(３５〜５５％)のｓｉＲＮＡは、５５％より高いＧ／Ｃ含量のものより活性であり得る。このようにして、ある態様において、本発明は、３５〜５５％Ｇ／Ｃ含量を有する核酸分子を含む。
【０１１８】
２. ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、選択標的部位の配列に基づき設計される。好ましくは、センス鎖は約１９〜２５ヌクレオチド、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを含む。より好ましくは、センス鎖は、２１、２２または２３ヌクレオチドを含む。しかしながら、当業者は、１９未満のヌクレオチドまたは２５を超えるヌクレオチドの長さを有するｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉの介在に機能できることを認識する。従って、このような長さのｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉに介在する能力を保持する限り、本発明の範囲内である。長いＲＮＡｉ剤は、ある哺乳動物細胞においてインターフェロンまたはＰＫＲ応答を惹起することが示されており、これは望ましくない可能性がある。好ましくは、本発明のＲＮＡｉ剤はＰＫＲ応答を惹起しない(すなわち、十分に短い長さである)。しかしながら、長いＲＮＡｉ剤は、例えば、ＰＫＲ応答を産生できない細胞型またはＰＫＲ応答が代替的に手段により下方制御または減弱されている状況では有用であり得る。
【０１１９】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉに介在できるように、標的配列と十分な相補性を有する。一般に、標的遺伝子のＲＩＳＣ介在開裂を行うために標的遺伝子の標的配列部分と十分に同一であるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡが好ましい。従って、好ましい態様において、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的の一部と十分に同一である配列を有するように設計される。例えば、センス鎖は、標的部位と１００％同一性を有し得る。しかしながら、１００％同一性は必要ではない。センス鎖と標的ＲＮＡ配列の間の８０％を超える同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性が好ましい。本発明は、ＲＮＡｉの効率および特異性を増強するために、ある配列多様性に耐容性であり得るとの利点を有する。ある態様において、センス鎖は、野生型と変異体アレルが少なくとも一つの塩基対により異なる標的領域、例えば、機能獲得型変異を含む標的領域のように、標的領域と４、３、２、１または０不適正ヌクレオチドを有し、他方の鎖は、第一鎖と同一または実質的に同一である。さらに、１または２ヌクレオチドの小挿入または欠失を有するｓｉＲＮＡ配列も、ＲＮＡｉ介在に有効であり得る。あるいは、ヌクレオチドアナログ置換または挿入を有するｓｉＲＮＡ配列は、阻害に有効であり得る。
【０１２０】
配列同一性を、当分野で知られる配列比較およびアライメントアルゴリズムにより決定し得る。２核酸配列(または２アミノ酸配列)の同一性パーセントを決定するために、配列を、最適比較目的で整列させる(例えば、最適アライメントのためにギャップを第一配列または第二配列に挿入し得る)。対応するヌクレオチド(またはアミノ酸)位置のヌクレオチド(またはアミノ酸残基)を続いて比較する。第一配列におけるある位置が、第二配列における対応する位置と同じ残基で占拠されているならば、これら分子はその位置で同一である。２配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数であり(すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００)、所望によりスコアを挿入したギャップ数および／または挿入したギャップの長さのペナルティに付す。
【０１２１】
２配列間の配列比較および同一性パーセント決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。ある態様において、アライメントを、十分な同一性を有する整列配列のある部分にわたり作製するが、低同一性度を有する部分にはしない(すなわち、局所アライメント)。配列の比較のために利用する局所アライメントアルゴリズムの好ましい、非限定的例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77におけるように修飾された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれる。
【０１２２】
他の態様において、アライメントを適切なギャップの挿入により最適化し、同一性パーセントを整列配列の長さにわたり決定する(すなわち、ギャップ付アライメント)。比較目的のためのギャップ付アライメントを得るには、ギャップ付ＢＬＡＳＴを利用できる(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)。他の態様において、アライメントを適切なギャップの挿入により最適化し、同一性パーセントを配列整列の全長にわたり決定する(すなわち、網羅的アライメント)。配列の網羅的比較に利用する数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを使用するとき、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用できる。
【０１２３】
３. ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖またはガイド鎖は、日常的にセンス鎖と同じ長さであり、相補的ヌクレオチドを含む。ある態様において、ガイド鎖およびセンス鎖は、完全相補的であり、すなわち、これら鎖は、整列またはアニールしたとき平滑末端である。他の態様において、ｓｉＲＮＡの鎖は、１〜４、例えば、２、ヌクレオチドヌクレオチドの３’オーバーハングを有するような方法で対合できる。オーバーハングは、標的遺伝子配列(またはその相補体)に対応するヌクレオチドを含む(またはこれからなる)ことができる。あるいは、オーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド、例えばｄＴｓまたはヌクレオチドアナログまたは他の適当な非ヌクレオチド物質を含む(またはこれからなる)ことができる。こうして、他の態様において、核酸分子は、ＴＴのような２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有し得る。オーバーハングヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。上記のとおり、変異体：野生型ミスマッチがプリン：プリンミスマッチである、標的領域を選択するのが望ましい。
【０１２４】
４. 当分野で知られる任意の方法を使用して、潜在的標的を適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラットなど)と比較し、他のコーディング配列と顕著な相同性を有するあらゆる標的配列を考慮から外す。このような配列相同性サーチのための一つのこのような方法が、ＢＬＡＳＴとして知られ、これは、National Center for Biotechnology Information websiteで利用可能である。
【０１２５】
５. 評価基準に合う１以上の配列の選択。
【０１２６】
ｓｉＲＮＡの設計および使用に関するさらなる一般的情報は、The Max-Plank-Institut fur Biophysikalishe Chemie websiteで利用可能な“The siRNA User Guide”に見ることができる。
【０１２７】
あるいは、ｓｉＲＮＡを、標的配列(例えば、４００mM  ＮａＣｌ、４０mM  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６.４、１mM  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間ハイブリダイゼーションし、続いて洗浄)とハイブリダイズできるヌクレオチド配列(またはオリゴヌクレオチド配列)として機能的に定義してよい。さらなる好ましいハイブリダイゼーション条件は、１×ＳＳＣ中７０℃または１×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、続く、０.３×ＳＳＣ中７０℃での洗浄または４×ＳＳＣ中７０℃または４×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、続く、１×ＳＳＣ中６７℃での洗浄を含む。５０塩基対長未満であると推定されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点(Ｔｍ)より５〜１０℃低くなければならず、ここで、Ｔｍは、次の式に従い決定する。１８塩基対長未満のハイブリッドについて、Ｔｍ(℃)＝２(Ａ＋Ｔ塩基数)＋４(Ｇ＋Ｃ塩基数)。１８〜４９塩基対長のハイブリッドについて、Ｔｍ(℃)＝８１.５＋１６.６(ｌｏｇ１０[Ｎａ＋])＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−(６００／Ｎ)であり、ここで、Ｎはハイブリッドにおける塩基数であり、[Ｎａ＋]はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である(１×ＳＳＣの[Ｎａ＋]＝０.１６５Ｍ)。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件のさらなる例(Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11およびCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4)は、引用により本明細書に包含させる。
【０１２８】
陰性対照ｓｉＲＮＡは、選択ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切なゲノムと顕著な配列相補性はないべきである。このような陰性対照を、選択ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混合することにより設計できる。相同性サーチを、陰性対照が適切なゲノムにおける何らかの他の遺伝子との相同性を欠くことを確実にするために実施できる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡを、配列に１以上の塩基ミスマッチを導入することにより設計できる。
【０１２９】
６. ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡ(例えば、野生型または変異体ハンチンチンｍＲＮＡ)を破壊する効果を評価するために、ショウジョウバエベースのインビトロｍＲＮＡ発現系でｓｉＲＮＡをｃＤＮＡ(例えば、ハンチンチンｃＤＮＡ)とインキュベートさせ得る。３２Ｐで放射標識された新たに合成されたｍＲＮＡ(例えば、ハンチンチンｍＲＮＡ)を、アガロースゲル上でオートラジオグラフィーにより検出する。開裂ｍＲＮＡの存在が、ｍＲＮＡヌクレアーゼ活性を示す。適当な対照は、ｓｉＲＮＡの省略および非標的ｃＤＮＡの使用を含む。あるいは、選択ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子に顕著な配列相補性がない対照ｓｉＲＮＡを選択する。このような陰性対照を、選択ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混合することにより設計できる。相同性サーチを、陰性対照が適切なゲノムにおける何らかの他の遺伝子との相同性を欠くことを確実にするために実施できる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡを、配列に１以上の塩基ミスマッチを導入することにより設計できる。
【０１３０】
ｓｉＲＮＡを、上記標的配列のいずれかを標的とするように設計できる。該ｓｉＲＮＡは、標的配列のサイレンシングに介在するのに標的配列と十分に相補的であるアンチセンス鎖を含む。ある態様において、ＲＮＡサイレンシング剤はｓｉＲＮＡである。
【０１３１】
ある態様において、ｓｉＲＮＡは、図２３または２４に示す配列を含むセンス鎖および図２３または２４に示す配列を含むアンチセンス鎖を含む。
【０１３２】
最適ｍＲＮＡ特異性および最大ｍＲＮＡ開裂を生じるｓｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相補性の部位を選択する。
【０１３３】
ｓｉＲＮＡ様分子
本発明のｓｉＲＮＡ様分子は、ＲＮＡｉまたは翻訳抑制により遺伝子サイレンシングを指示するためにｍＲＮＡの標的配列と“十分に相補的”である配列を有する(すなわち、配列を有する鎖を有する)。ｓｉＲＮＡ様分子はｓｉＲＮＡ分子に準じて設計されるが、センス鎖と標的ＲＮＡの間の配列同一性の程度はｍｉＲＮＡとその標的の間で観察されるものに近似する。一般に、ｍｉＲＮＡ配列と対応する標的遺伝子配列の間の配列同一性の程度が下がるに連れて、ＲＮＡｉではなく翻訳抑制により転写後遺伝子サイレンシングに介在する傾向が高まる。それ故に、代替的態様において、標的遺伝子の翻訳抑制による転写後遺伝子サイレンシングが望まれるとき、ｍｉＲＮＡ配列は、標的遺伝子配列と部分的相補性を有する。ある態様において、ｍｉＲＮＡ配列は、標的ｍＲＮＡに分散している１以上の短配列(相補性部位)と部分的相補性を有する(例えば標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ内)(Hutvagner and Zamore, Science, 2002; Zeng et al., Mol. Cell, 2002; Zeng et al., RNA, 2003; Doench et al., Genes & Dev., 2003)。翻訳抑制の機序が協調的であるとき、複数相補性部位(例えば、２、３、４、５または６)がある態様において標的とされ得る。
【０１３４】
ｓｉＲＮＡ様二本鎖がＲＮＡｉまたは翻訳抑制に介在する能力は、相補性の部位での標的遺伝子配列とサイレンシング剤のヌクレオチド配列の間の非同一ヌクレオチドの分布により予測され得る。ある態様において、翻訳抑制による遺伝子サイレンシングが望まれるとき、ｍｉＲＮＡガイド鎖と標的ｍＲＮＡにより形成される二本鎖が中央“隆起”を含むように、少なくとも一つの非同一ヌクレオチドが相補性部位の中央部分に存在する(Doench J G et al., Genes & Dev., 2003)。他の態様において、２、３、４、５または６連続的または非連続的非同一ヌクレオチドが導入される。非同一ヌクレオチドを、揺らぎ塩基対(例えば、Ｇ：Ｕ)または不適正塩基対(Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、Ｕ：Ｕ)を形成するように選択し得る。さらに好ましい態様において、“隆起”は、ｍｉＲＮＡ分子の５’末端のヌクレオチド１２位および１３位に集中させる。
【０１３５】
遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド
ある例示的態様において、遺伝子発現(すなわち、ｈｔｔ遺伝子発現)は、ｈｔｔ遺伝子発現を効果的に阻害または減少させるために２以上の利用可能な３’末端の存在を可能にする、５’末端を経て連結した２以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースの化合物を使用して調節できる。このような連結オリゴヌクレオチドはまた遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド(ＧＳＯ)として知られる(例えば、その全体を全ての目的のために本明細書に引用により包含させる、Idera Pharmaceuticals, Incに譲渡されたＵＳ８,４３１,５４４参照)。
【０１３６】
ＧＳＯの５’末端での結合は他のオリゴヌクレオチド結合と無関係であり、５’、３’または２’ヒドロキシル基を経て直接的でも、ヌクレオシドの２’または３’ヒドロキシル位置を使用する、非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオシドを経て間接的でもよい。結合は５’末端ヌクレオチドの官能化糖または核酸塩基も使用し得る。
【０１３７】
ＧＳＯは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたは非ヌクレオシドリンカーにより５’−５’末端でコンジュゲートされた２つの同一または異なる配列を含み得る。このような化合物は、遺伝子産物のアンチセンス下方制御のための目的のｍＲＮＡ標的の特異的部分と相補的である１５〜２７ヌクレオチドを含み得る。同一配列を含むＧＳＯは、ワトソン・クリック水素結合相互作用により特異的ｍＲＮＡと結合し、タンパク質発現を阻害する。異なる配列を含むＧＳＯは、１以上のｍＲＮＡ標的の２以上の異なる領域と結合し、タンパク質発現を阻害できる。このような化合物は標的ｍＲＮＡに相補的なヘテロヌクレオチド配列からなり、ワトソン・クリック水素結合により安定な二本鎖構造を形成する。ある条件下では、２つの遊離３’末端(５’−５’結合アンチセンス)を含むＧＳＯは、単一遊離３’末端を含むかまたは遊離３’末端を含まないものよりも、遺伝子発現の強力な阻害剤であり得る。
【０１３８】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは、式ＨＯ−(ＣＨ２)ｏ−ＣＨ(ＯＨ)−(ＣＨ２)ｐ−ＯＨ(式中、ｏおよびｐは、独立して１〜約６、１〜約４または１〜約３の整数である)のグリセロールまたはグリセロールホモログである。ある他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。このような誘導体のいくつかは、式ＨＯ−(ＣＨ２)ｍ−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ２−ＮＨＣ(Ｏ)−(ＣＨ２)ｍ−ＯＨ(式中、ｍは０〜約１０、０〜約６、２〜約６または２〜約４の整数である)を有する。
【０１３９】
いくつかの非ヌクレオチドリンカーは、２を超えるＧＳＯ成分の結合を可能とする。例えば、非ヌクレオチドリンカーグリセロールは、ＧＳＯ成分が共有結合し得る３ヒドロキシル基を有する。あるオリゴヌクレオチドベースの本発明の化合物は、それ故に、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーに連結した２以上のオリゴヌクレオチドを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、本発明によって“分枝している”と称される。
【０１４０】
ある態様において、ＧＳＯは少なくとも１４ヌクレオチド長である。ある例示的態様において、ＧＳＯは１５〜４０ヌクレオチド長または２０〜３０ヌクレオチド長である。それ故に、ＧＳＯの成分オリゴヌクレオチドは、独立して１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチド長であり得る。
【０１４１】
これらのオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミデートまたはＨ−ホスホネート化学のような当分野において認識されている方法により製造でき、これらは手動でまたは自動化合成装置により実施できる。これらのオリゴヌクレオチドはまたｍＲＮＡとハイブリダイズする能力を損なうことなく、多様な方法で修飾もできる。このような修飾は、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスフェートエステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カーボネート、ホスフェートヒドロキシル、アセトアミデートまたはカルボキシメチルエステルまたはこれらの組み合わせであるオリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチド間結合およびあるヌクレオチドの５’末端と、５’ヌクレオチドホスホジエステル結合が任意の数の化学基で置換されている他方のヌクレオチドの３’末端の間の他のヌクレオチド間結合を含み得る。
【０１４２】
修飾ＲＮＡサイレンシング剤
本発明のある側面において、上記の本発明のＲＮＡサイレンシング剤(またはその任意の部分)は、該薬剤の活性がさらに改善されるように修飾し得る。例えば、上記セクションIIのＲＮＡサイレンシング剤を、下記修飾のいずれかで修飾し得る。修飾は、一部、さらなる標的識別増強、薬剤の安定性増強(例えば、分解阻止)、細胞の取り込み促進、標的効率増強、(例えば、標的への)結合における有効性改善、薬剤に対する患者耐容性改善および／または毒性軽減に役立つ。
【０１４３】
１)標的識別増強のための修飾
ある態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、単一ヌクレオチド標的識別を増強するために、不安定化ヌクレオチドで置換し得る(２００７年１月２５日出願の米国出願１１／６９８,６８９号および２００６年１月２５日出願の米国仮出願６０／７６２,２２５号参照、これら両者は引用により本明細書に包含させる)。このような修飾は、標的ｍＲＮＡ(例えば機能獲得型変異体ｍＲＮＡ)に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性に明らかに影響することなく、非標的ｍＲＮＡ(例えば野生型ｍＲＮＡ)に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性を排除するのに十分であり得る。
【０１４４】
好ましい態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、そのアンチセンス鎖に少なくとも一つの普遍的ヌクレオチドを導入することにより修飾する。普遍的ヌクレオチドは、４つの慣用のヌクレオチド塩基(例えばＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ)のいずれかと識別をつけずに塩基対形成できる塩基部分を含む。普遍的ヌクレオチドは、ＲＮＡ二本鎖またはＲＮＡサイレンシング剤のガイド鎖と標的ｍＲＮＡにより形成された二本鎖の安定性に比較的影響が少ないため、好ましい。普遍的ヌクレオチドの例は、イノシン塩基部分またはデオキシイノシン(例えば２’−デオキシイノシン)、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２’−アザ−２’−デオキシイノシン、ＰＮＡ−イノシン、モルホリノ−イノシン、ＬＮＡ−イノシン、ホスホロアミデート−イノシン、２’−Ｏ−メトキシエチル−イノシンおよび２’−ＯＭｅ−イノシンからなる群から選択されるイノシンアナログ塩基部分を有するものを含む。特に好ましい態様において、普遍的ヌクレオチドはイノシン残基またはその天然に存在するアナログである。
【０１４５】
ある態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、特異性決定ヌクレオチド(すなわち、疾患関連多型を認識するヌクレオチド)から５ヌクレオチド以内の少なくとも一つの不安定化ヌクレオチドの導入により修飾される。例えば、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから５、４、３、２または１ヌクレオチド内である位置に導入され得る。例示的態様において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから３ヌクレオチドである位置に導入される(すなわち、不安定化ヌクレオチドと特異性決定ヌクレオチドの間に２つの安定化ヌクレオチドがあるように)。２鎖または鎖部分を有するＲＮＡサイレンシング剤(例えばｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ)において、不安定化ヌクレオチドを、特異性決定ヌクレオチドを含まない鎖または鎖部分に導入し得る。好ましい態様において、不安定化ヌクレオチドを、特異性決定ヌクレオチドを含むのと同じ鎖または鎖部分に導入する。
【０１４６】
２)有効性および特異性増強のための修飾
ある態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、非対称設計規則により、介在ＲＮＡｉにおける有効性および特異性の増強を促進するように変改し得る(米国特許８,３０９,７０４号、７,７５０,１４４号、８,３０４,５３０号、８,３２９,８９２号および８,３０９,７０５号参照)。このような変改は、アンチセンス鎖が優先的に標的ｍＲＮＡの開裂または翻訳抑制をガイドし、それにより、標的開裂およびサイレンシングの効率を増加または改善するように、センス鎖のために、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖(例えば、本発明の方法を使用して設計されたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから産生されたｓｉＲＮＡ)のＲＩＳＣへのエントリーを促進する。好ましくは、ＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖５’末端(ＡＳ  ５’)とセンス鎖３’末端(Ｓ  ３’)の間の塩基対強度を、該ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖３’末端(ＡＳ  ３’)とセンス鎖５’末端(Ｓ  ’５)の間の結合強度または塩基対強度に比して低減させることにより増強される。
【０１４７】
ある態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一鎖またはアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖部分の５’末端の間よりも第一鎖またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端の間でＧ：Ｃ塩基対が少ないように増強し得る。他の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一鎖またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端の間に少なくとも一つの不適正塩基対があるように増強し得る。好ましくは、不適正塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：ＣおよびＵ：Ｕからなる群から選択される。他の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一鎖またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端の間に、少なくとも一つの揺らぎ塩基対、例えば、Ｇ：Ｕがあるように増強し得る。他の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、希ヌクレオチド、例えば、イノシン(Ｉ)を含む少なくとも一つの塩基対があるように増強し得る。好ましくは、塩基対をＩ：Ａ、Ｉ：ＵおよびＩ：Ｃからなる群から選択する。さらに他の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性を、修飾ヌクレオチドを含む少なくとも一つの塩基対があるように増強し得る。
【０１４８】
３)安定性が増強されたＲＮＡサイレンシング剤
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、血清または細胞培養用増殖培地における安定性を改善するために修飾できる。安定性を増強するために、３’残基を分解に対して安定化でき、例えば、それらをプリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるように選択し得る。あるいは、ピリミジンヌクレオチドの修飾アナログによる置換、例えば、ウリジンの２’−デオキシチミジンによる置換は耐容性であり、ＲＮＡ干渉の効率に影響しない。
【０１４９】
好ましい側面において、本発明は、第一鎖および第二鎖を含むＲＮＡサイレンシング剤に関し、ここで、第二鎖および／または第一鎖は、対応する非修飾ＲＮＡサイレンシング剤と比較してインビボ安定性が増強されるように、内部ヌクレオチドの修飾ヌクレオチドでの置換により修飾される。ここで定義する“内部”ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端以外のあらゆる位置にあるものである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内でも二本鎖または二重鎖分子の一鎖内でもよい。ある態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも一つの内部ヌクレオチドの置換により修飾される。他の態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の内部ヌクレオチドの置換により修飾される。他の態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の置換により修飾される。さらに他の態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドの全ての置換により修飾される。
【０１５０】
本発明の好ましい態様において、ＲＮＡサイレンシング剤は少なくとも一つの修飾ヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドアナログは、標的特異的サイレンシング活性、例えば、ＲＮＡｉ介在活性または翻訳抑制活性が実質的に影響されない位置、例えば、ｓｉＲＮＡ分子の５’末端および／または３’末端における領域に位置し得る。特に、末端は、修飾ヌクレオチドアナログの取り込みにより安定化され得る。
【０１５１】
ヌクレオチドアナログの例は、糖および／または主鎖修飾リボヌクレオチド(すなわち、ホスフェート−糖主鎖の修飾を含む)を含む。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合を、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも一つを含むように修飾し得る。主鎖修飾リボヌクレオチドの例において、隣接リボヌクレオチドを接続するホスホエステル基を、例えば、ホスホチオエート基の、修飾基に置き換える。糖修飾リボヌクレオチドの例において、２’  ＯＨ基を、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮから選択される基に置き換え、ここで、ＲはＣ１−Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【０１５２】
特定の態様において、修飾は、２’−フルオロ、２’−アミノおよび／または２’−チオ修飾である。特に好ましい修飾は、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２’−フルオロ−アデノシン、２’−フルオロ−グアノシン、２’−アミノ−シチジン、２’−アミノ−ウリジン、２’−アミノ−アデノシン、２’−アミノ−グアノシン、２,６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジンおよび／または５−アミノ−アリル−ウリジンを含む。特定の態様において、２’−フルオロリボヌクレオチドは、全てウリジンおよびシチジンである。修飾のさらなる例は、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−メチル−シチジン、リボ−チミジン、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリル−ピレン−ウリジン、５−フルオロ−シチジンおよび５−フルオロ−ウリジンを含む。２’−デオキシ−ヌクレオチドおよび２’−Ｏｍｅヌクレオチドも、本発明の修飾ＲＮＡサイレンシング剤部分内で使用できる。さらなる修飾残基は、デオキシ−無塩基、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、Ｎ６,Ｎ６−ジメチル−アデノシン、シュードウリジン、プリンリボヌクレオシドおよびリバビリンを含む。特に好ましい態様において、２’部分は、連結部分が２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドであるようにメチル基である。
【０１５３】
例示的態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ロックド核酸(ＬＮＡ)を含む。ＬＮＡは、ヌクレアーゼ活性に抵抗する(高度に安定)およびｍＲＮＡに対する単一ヌクレオチド識別を有する糖修飾ヌクレオチドを含む(Elmen et al., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447; Braasch et al. (2003) Biochemistry 42:7967-7975, Petersen et al. (2003) Trends Biotechnol 21:74-81)。これらの分子は、２’−Ｏ,４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を、２’−デオキシ−２’’−フルオロウリジンのような可能な修飾と共に有する。さらに、ＬＮＡは、糖部分を３’−ｅｎｄｏ立体構造に拘束することによりオリゴヌクレオチドの特異性を増加し、それにより塩基対形成のためにヌクレオチドを前組織化し、オリゴヌクレオチドの融点を塩基あたり１０℃程度上昇させる。
【０１５４】
他の例示的態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ペプチド核酸(ＰＮＡ)を含む。ＰＮＡは、糖−ホスフェート部分が、ヌクレオチドがヌクレアーゼ消化に高度に抵抗性であり、分子への結合特異性の改善を与える、ポリアミド主鎖を形成できる中立２−アミノエチルグリシン部分で置換された、修飾ヌクレオチドを含む(Nielsen, et al., Science, (2001), 254: 1497-1500)。
【０１５５】
また好ましいのは、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも一つの天然に存在しない核酸塩基を含む、リボヌクレオチドである。塩基は、アデノシンデアミナーゼ活性を遮断するよう修飾される。修飾核酸塩基の例は、５位を修飾されたウリジンおよび／またはシチジン、例えば、５−(２−アミノ)プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位を修飾されたアデノシンおよび／またはグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンを含むが、これらに限定されない。上記修飾を組み合わせてよいことは注意すべきである。
【０１５６】
他の態様において、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態を変えるために、例えば、体内の半減期を延長するために、架橋結合を用いることができる。そのために、本発明は、核酸の２つの相補的鎖を有するＲＮＡサイレンシング剤を含み、ここで、２鎖は架橋結合される。本発明はまた、他の部分(例えばペプチドのような非核酸部分)、有機化合物(例えば、色素)など)とコンジュゲートされたまたはコンジュゲートされていない(例えば、３’末端で)ＲＮＡサイレンシング剤も含む。この方法でのｓｉＲＮＡ誘導体の修飾は、対応するｓｉＲＮＡと比較して得られたｓｉＲＮＡ誘導体の細胞の取り込みを改善するかまたは細胞ターゲティング活性を増強でき、細胞におけるｓｉＲＮＡ誘導体の追跡に有用でありまたは対応するｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を改善する。
【０１５７】
他の修飾の例は、(ａ)２’修飾、例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖、特にセンス鎖のＵにおける２’ＯＭｅ部分の提供または、例えば、３’末端での、３’オーバーハングにおける２’ＯＭｅ部分の提供(文脈から示されるとおり、３’末端は分子の３’原子または最も３’部分、例えば、最も３’Ｐまたは２’位を意味する)；(ｂ)例えば、ホスフェート主鎖における、ＰのＳでの置換による、主鎖の修飾、例えば、特にアンチセンス鎖における、ＵまたはＡまたは両者のホスホロチオエート修飾の提供；例えば、ＯのＳでの置換；(ｃ)ＵのＣ５アミノリンカーでの置換；(ｄ)ＡのＧでの置換(配列変化は、アンチセンス鎖ではなくセンス鎖に位置するのが好ましい)；および(ｄ)２’位、６’位、７’位または８’位の修飾。例示的態様は、これらの修飾の１以上がセンス鎖に存在するが、アンチセンス鎖にないまたはアンチセンス鎖が有するこのような修飾が少ない態様である。さらに他の例示的修飾は、例えば、３’末端での３’オーバーハングにおけるメチル化Ｐの使用；２’修飾、例えば、２’ＯＭｅ部分の提供および主鎖の、例えば、ＰのＳでの置換による、修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾の提供または例えば、３’末端でのメチル化Ｐの使用の組み合わせ；３’アルキルでの修飾；例えば、３’末端での、３’オーバーハングにおける脱塩基ピロリドンでの修飾；ナプロキセン、イブプロフェンまたは３’末端での分解を阻害する他の部分での修飾を含む。
【０１５８】
４)細胞の取り込みを増強するための修飾
他の態様において、ＲＮＡサイレンシング剤を、例えば、標的細胞(例えば、神経細胞)による細胞の取り込みを増強するために、化学的部分で修飾し得る。それ故に、本発明は、他の部分(例えばペプチドのような非核酸部分)、有機化合物(例えば、色素)などとコンジュゲートしたまたはコンジュゲートしていない(例えば、３’末端で)ＲＮＡサイレンシング剤を含む。コンジュゲーションは、当分野で知られる方法により、例えば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001)(ポリアルキルシアノアクリレート(ＰＡＣＡ)ナノ粒子に充填された核酸を記載する)；Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998)(ナノ粒子に結合した核酸を記載する)；Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994)(挿入剤、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノ粒子に連結された核酸を記載する)；およびGodard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995)(ナノ粒子に連結された核酸を記載する)の方法を使用して、達成できる。
【０１５９】
特定の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、親油性部分とコンジュゲートする。ある態様において、親油性部分は、カチオン基を含むリガンドである。他の態様において、親油性部分を、ｓｉＲＮＡの一鎖または両鎖に結合する。例示的態様において、親油性部分を、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の一端に結合する。他の例示的態様において、親油性部分をセンス鎖の３’末端に結合する。ある態様において、親油性部分を、コレステロール、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ、葉酸またはカチオン性色素(例えば、Ｃｙ３)からなる群から選択する。例示的態様において、親油性部分はコレステロールである。他の親油性部分はコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１,３−ビス−Ｏ(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１,３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−(オレオイル)リトコール酸、Ｏ３−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジンを含む。
【０１６０】
５)テザーリガンド
他の物を、本発明のＲＮＡサイレンシング剤にテザーできる。リガンドを、例えば、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞型へのターゲティングまたは、例えば、エンドサイトーシス依存的または非依存的機序による細胞透過性の改善のためにＲＮＡサイレンシング剤にテザーする。リガンドおよび関連する修飾は、配列特異性を増加し、結果として標的外ターゲティングを減少させ得る。テザーリガンドは、介入物として機能できる１以上の修飾塩基または糖を含み得る。これらは、好ましくは、ＲＮＡサイレンシング剤／標的二本鎖の隆起におけるような、内部領域に位置する。介入物は芳香族、例えば、多環式芳香族またはヘテロ環式芳香族化合物であり得る。多環式介入物は、スタッキング能を有することができ、２、３または４縮合環を有する系を含み得る。ここに記載する普遍的塩基は、リガンド上に挿入され得る。ある態様において、リガンドは、標的核酸の開裂により標的遺伝子阻害に寄与する開裂基を含み得る。開裂基は、例えば、ブレオマイシン(例えば、ブレオマイシン−Ａ５、ブレオマイシン−Ａ２またはブレオマイシン−Ｂ２)、ピレン、フェナントロリン(例えば、Ｏ−フェナントロリン)、ポリアミン、トリペプチド(例えば、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド)または金属イオンキレート基であり得る。金属イオンキレート基は、例えば、Ｌｕ(III)またはＥＵ(III)大環状複合体、Ｚｎ(II)２,９−ジメチルフェナントロリン誘導体、Ｃｕ(II)テルピリジンまたはアクリジンを含み得て、これは、Ｌｕ(III)のような遊離金属イオンにより隆起の部位での標的ＲＮＡの選択的開裂を促進できる。ある態様において、ペプチドリガンドを、例えば、隆起領域での、標的ＲＮＡの開裂促進のためにＲＮＡサイレンシング剤にテザーできる。例えば、１,８−ジメチル−１,３,６,８,１０,１３−ヘキサアザシクロテトラデカン(シクラム)を、ペプチドにコンジュゲートさせて(例えば、アミノ酸誘導体により)、標的ＲＮＡ開裂を促進できる。テザーリガンドは、ＲＮＡサイレンシング剤のハイブリダイゼーション性質改善または配列特異性改善をもたらし得る、アミノグリコシドリガンドであり得る。アミノグリコシドの例は、グリコシル化ポリリシン、ガラクトース化ポリリシン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡおよびアミノグリコシドのアクリジンコンジュゲート、例えばＮｅｏ−Ｎ−アクリジン、Ｎｅｏ−Ｓ−アクリジン、Ｎｅｏ−Ｃ−アクリジン、Ｔｏｂｒａ−Ｎ−アクリジンおよびＫａｎａＡ−Ｎ−アクリジンを含む。アクリジンアナログの使用は配列特異性を増加させ得る。例えば、ネオマイシンＢは、ＤＮＡと比較してＲＮＡに高親和性を有するが、低配列特異性である。アクリジンアナログ、ｎｅｏ−５−アクリジンは、ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答配列(ＲＲＥ)に対して増加した親和性を有する。ある態様において、アミノグリコシドリガンドのグアニジンアナログ(グアニジノグリコシド)を、ＲＮＡサイレンシング剤にテザーする。グアニジノグリコシドにおいて、アミノ酸のアミン基をグアニジン基について交換する。グアニジンアナログの結合は、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞透過性を増加させる。テザーリガンドは、ポリアルギニンペプチド、��プトイドまたはペプチド模倣体であってよく、これは、オリゴヌクレオチド剤の細胞の取り込みを増強できる。
【０１６１】
リガンドの例は、リガンドコンジュゲート担体に、直接的にまたはテザーを経て間接的に、好ましくは共有結合により、結合する。例示的態様において、リガンドは、担体に介在テザーを経て結合する。例示的態様において、リガンドは、取り込まれるＲＮＡサイレンシング剤の分布、ターゲティングまたは寿命を変える。例示的態様において、リガンドは、例えば、このようなリガンドを欠く種と比較して、選択標的、例えば、分子、細胞または細胞型、区画、例えば、細胞または臓器区画、組織、臓器または体の領域に対する親和性の増強を提供する。
【０１６２】
リガンドの例は、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性の特性を改善でき、また得られる天然または修飾ＲＮＡサイレンシング剤またはここに記載する単量体の任意の組み合わせを含む重合分子および／または天然または修飾リボヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗性も改善し得る。リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増強するための治療修飾因子；例えば、分布をモニタリングするための診断化合物またはレポーター基；架橋結合剤；ヌクレアーゼ−抵抗性付与部分；および天然または異常核酸塩基を含み得る。一般的例は、脂溶性物、脂質、ステロイド(例えば、ウバオール、ヘコゲニン(hecigenin)、ジオスゲニン)、テルペン(例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸)、ビタミン(例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール)、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリンターゲティング分子、ポリカチオン性物、ペプチド、ポリアミンおよびペプチド模倣物を含む。リガンドは、天然に存在する物質(例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)またはグロブリン)；炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸)；アミノ酸または脂質を含み得る。リガンドはまた組み換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例は、ポリアミノ酸を含み、ポリリシン(ＰＬＬ)、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン無水物コポリマー、Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(ＨＭＰＡ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリウレタン、ポリ(２−エチルアクリル酸)、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンである。ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリリシン(ＰＬＬ)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩またはアルファ螺旋状ペプチドを含む。
【０１６３】
リガンドはまた、腎細胞のような特定の細胞型に結合する、ターゲティング基、例えば、細胞または組織ターゲティング剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体も含み得る。ターゲティング基は、チロトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンまたはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。リガンドの他の例は、色素、挿入剤(例えばアクリジンおよび置換アクリジン)、クロスリンカー(例えばソラレン、マイトマイシンＣ)、ポルフィリン(ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン)、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジニウムアミノグリコリド、人工エンドヌクレアーゼ(例えばＥＤＴＡ)、親油性分子、例えば、コレステロール(およびそのチオアナログ)、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール(例えば、エステル(例えば、モノ、ビスまたはトリス脂肪酸エステル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０脂肪酸)およびそのエーテル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０アルキル；例えば、１,３−ビス−Ｏ(ヘキサデシル)グリセロール、１,３−ビス−Ｏ(オクタデシル)グリセロール)、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１,３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸(例えば、ジステアリン酸グリセリル)、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−(オレオイル)リトコール酸、Ｏ３−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン)およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ(例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ)、ＭＰＥＧ、[ＭＰＥＧ]２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えばビオチン)、輸送／吸収促進剤(例えば、アスピリン、ナプロキセン、ビタミンＥ、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状環のＥｕ３＋複合体)、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰを含む。
【０１６４】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質またはペプチド、例えば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞または骨細胞のような特定の細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドはまたホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。それらはまた脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノースまたは多価フコースのような非ペプチド種でもあり得る。リガンドは、例えば、リポサッカライド、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクティベーターまたはＮＦ−κＢのアクティベーターであり得る。
【０１６５】
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格の破壊、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメントおよび／または中間径フィラメントの破壊により、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞への取り込みを増加できる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはmyoservinであり得る。リガンドは、例えば、炎症性応答の活性化により、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞への取り込みを増加できる。このような効果を有するリガンドの例は、腫瘍壊死因子アルファ(ＴＮＦα)、インターロイキン−１ベータまたはガンマインターフェロンを含む。ある側面において、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートの、標的組織、例えば、体の非腎臓標的組織への分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合できる他の分子もリガンドとして使用できる。例えば、neproxinまたはアスピリンを使用できる。脂質または脂質ベースのリガンドは、(ａ)コンジュゲートの分解に対する抵抗性の増加、(ｂ)標的細胞または細胞膜へのターゲティングまたは輸送の増加ができおよび／または(ｃ)血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合の調整に使用できる。脂質ベースのリガンドは、標的組織へのコンジュゲートの結合の調節、例えば、制御に使用できる。例えば、ＨＳＡにより強力に結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性が低く、それ故に体内から浄化される可能性が低い。あまり強くなくＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドを使用して、コンジュゲートを腎臓に標的化できる。好ましい態様において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分布するようにＨＳＡと十分な親和性で結合できる。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が保持できないほどには強くないのが好ましい。他の好ましい態様において、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分布するように、ＨＳＡに弱く結合するかまたは全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部も、脂質ベースのリガンドに代えてまたはそれに加えて使用できる。
【０１６６】
他の側面において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞により取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性タイプの、望まない細胞増殖、例えば、癌細胞により特徴付けられる障害の処置に特に有用である。ビタミンの例は、ビタミンＡ、ＥおよびＫを含む。ビタミンの他の例は、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは癌細胞により取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素である。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)も包含される。
【０１６７】
他の側面において、リガンドは、細胞浸透剤、好ましくは螺旋状細胞浸透剤である。好ましくは、薬剤は両親媒性である。薬剤の例は、ｔａｔまたはアンテナペディアのようなペプチドである。薬剤がペプチドであるならば、修飾でき、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたはシュード−ペプチド結合およびＤ−アミノ酸の使用を含む。螺旋状薬剤は、好ましくはアルファ螺旋状剤であり、これは、好ましくは親油性および疎油性相を有する。
【０１６８】
リガンドはペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体(ここではオリゴペプチド模倣体とも称する)は、天然ペプチドに類似する規定の三次元構造に折りたたまれることができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のオリゴヌクレオチド剤への結合は、細胞の認識および吸収の増加によるなどのように、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態分布に影響する。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド(例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる)であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。ペプチド部分はＬ−ペプチドまたはＤ−ペプチドであり得る。他の代替において、ペプチド部分は、疎水性膜転座配列(ＭＴＳ)を含むことができる。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリーまたはone-bead-one-compound(ＯＢＯＣ)コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドのような、ＤＮＡの無作為配列によりコードされ得る(Lam et al., Nature 354:82-84, 1991)。例示的態様において、組み込まれた単量体単位によりＲＮＡサイレンシング剤にテザーされたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(ＲＧＤ)−ペプチドまたはＲＧＤ模倣体のような細胞ターゲティングペプチドである。ペプチド部分は、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性を増加させるためまたは立体構造的性質を指示するための、構造的修飾を有し得る。下記構造的修飾のいずれかを利用できる。
【実施例】
【０１６９】
実施例１. 子癇前症(ＰＥ)の背景および意義
疫学的および実験的研究からの圧倒的証拠が、現在、ＰＥが母体血流におけるＦｌｔ１遺伝子(ＶＥＧＦＲ１)からの“可溶性デコイ”タンパク質(可溶性ＦＬＴ１(ｓＦＬＴ１))のレベル増加が原因であることを示している(Young, B.C., Levine, R.J. & Karumanchi, S.A. Pathogenesis of preeclampsia. Annual review of pathology 5, 173-192 (2010); Maynard, S.E. et al. Excess placental soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) may contribute to endothelial dysfunction, hypertension, and proteinuria in preeclampsia. The Journal of clinical investigation 111, 649-658 (2003); Levine, R.J. et al. Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia. The New England journal of medicine 350, 672-683 (2004); Heydarian, M. et al. Novel splice variants of sFlt1 are upregulated in preeclampsia. Placenta 30, 250-255 (2009))。ＦＬＴ１は、胎盤に主に発現される受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)である。ＲＴＫ調節の一般的機構は、全体的シグナル伝達経路のドミナントネガティブレギュレーターとして作用する、受容体の切断、分泌型の産生である。このような可溶性デコイによるリガンド隔離は、完全長受容体による細胞内シグナル伝達を阻害し、それによりシステムをリガンド濃度に対して脱感作する(Vorlova, S. et al. Induction of antagonistic soluble decoy receptor tyrosine kinases by intronic polyA activation. Molecular cell 43, 927-939 (2011))。ＦＬＴ１の場合、可溶性デコイは、完全長ＦＬＴ１(ｆｌ−ＦＬＴ１)膜貫通(ＴＭ)およびキナーゼドメインをコードするエキソン上流の２イントロン(ｉ１３およびｉ１５)内のポリアデニル化により産生される切断ｍＲＮＡから発現される。
【０１７０】
哺乳動物において、ＦＬＴ１は胎盤で主に発現され、ヒト胎盤でＦｌｔ１  ｍＲＮＡレベルは他の成体組織で観察されるより１０〜１００倍高い(Cerdeira, A.S. & Karumanchi, S.A. Angiogenic factors in preeclampsia and related disorders. Cold Spring Harbor perspectives in medicine 2 (2012))。完全長アイソフォームが非妊娠成人(Ｉｄ.)における全組織で優勢であるが、胎盤発現は３切断アイソフォーム、ｓＦｌｔ１−ｉ１３短、ｓＦｌｔ１−ｉ１３長およびｓＦｌｔ１−ｉ１５ａにより支配され、この全てがｓＦＬＴ１タンパク質をコードする。胎盤における高Ｆｌｔ１および他の非妊娠成体組織における低発現の類似パターンが齧歯類で観察される。しかしながら、齧歯類がイントロン１４ポリアデニル化部位を欠くため、単一可溶性デコイ形態、ｓＦｌｔ１−ｉ１３しか発現しない。ＰＥにおいて、完全長(ｆｌ−Ｆｌｔ１)および切断Ｆｌｔ１  ｍＲＮＡ両者が、正常妊娠より高いレベルで胎盤に蓄積され、切断アイソフォームがはるかに著しい。ｍＲＮＡレベルでのこの変化は、ＰＥ中の母体血流におけるｓＦＬＴ１タンパク質の顕著な上昇を説明する可能性がある。
【０１７１】
１.１  ＰＥの処置のためのｓｉＲＮＡの適用性
ｓｉＲＮＡベースの治療剤がＰＥ処置のために設計された。前臨床および臨床データ両者が、ＰＥ妊娠延長のための価値ある治療的戦略としてｓＦＬＴ１減少を支持する(Thadhani, R. et al. Pilot study of extracorporeal removal of soluble fms-like tyrosine kinase 1 in preeclampsia. Circulation 124, 940-950 (2011)))。さらに、各ｓＦＬＴ１タンパク質に特異的な独特な領域は極めて小さく、ほんの一握りの独特なアミノ酸が各Ｃ末端に付加される。この小さな標的サイズは、ｆｌ−ＦＬＴ１ではなく、ｓＦＬＴ１のみをターゲティングする慣用の薬物(例えば、小分子および抗体)開発の障害であった。他方で、ＲＮＡレベルでの標的窓ははるかに大きく、ｉ１３およびｉ１５  ｍＲＮＡアイソフォームはそれぞれ４３５および５６７の独特な塩基を有し、そのいずれもｆｌ−Ｆｌｔ１  ｍＲＮＡに存在しない。ＲＮＡｉがわずか１９〜２２ヌクレオチドの標的サイズしか必要としないため、これは、複数アイソフォーム選択的ｓｉＲＮＡを設計するために、十分すぎるヌクレオチド空間であることが決定された。臨床的展望から、皮下送達された単回用量が、数週間脱走ｓＦＬＴ１発現を阻止するのに十分である可能性は、処置を単純かつ手頃とする。
【０１７２】
自己送達疎水性修飾ｓｉＲＮＡ(ｈｓｉＲＮＡ)として知られる新規化学修飾オリゴヌクレオチド(図１Ａ)は、費用効果の高い治療剤の最も顕著な利益を提供する。化学合成の現在の価格(ｇあたり＄２００、１mg／kg用量レベルでの用量で約＄２０)は比較的高いが、kgレベルスケールアップで、費用は劇的に下がる(１０〜５０倍)と予測される。さらに、ｈｓｉＲＮＡは、１０時間未満の固相支持化学を使用して完全合成できる。他のオリゴヌクレオチドと同様、乾燥ｈｓｉＲＮＡは高度に安定であり、長期(すなわち、年単位)環境温度で保存でき、注射直前に溶液にできる。さらに、インビボでのｈｓｉＲＮＡ半減期は、単一静脈内用量がｓＦＬｔ１産生の２〜６週間阻害によく適合させるのに十分な期間である。
【０１７３】
ここに記載するｓＦｌｔ１を中和するＯＮＴは、疾患の機序理解に基づく最初の新規子癇前症治療であり、世界中で費用効果的かつ用意に投与される。
【０１７４】
１.２  ＰＥのＲＮＡｉベースの処置のためのパイロット製品プロファイル
ＰＥのためのＲＮＡｉベースの処置の開発のための具体的懸念を下に記載する。
【０１７５】
１.３  複数ｓＦＬＴ１  ｍＲＮＡアイソフォーム
複数正常およびＰＥ胎盤からの総ＲＮＡのポリアデニル化部位配列決定((PAS-Seq (Heyer, E.E., Ozadam, H., Ricci, E.P., Cenik, C. & Moore, M.J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Res 43, e2 (2015)))の実施により、ＰＥ胎盤がｉ１３およびｉ１５  ｓＦＬＴ１バリアントを過発現し、ｉ１５が５５％の読み込みを担い、ｉ１３が約４５％の読み込みを担うことが決定された。科学的理論に縛られることを意図しないが、種々のサンプルにおけるアイソフォーム比の内因性変動は、両アイソフォームのターゲティングが、ＰＥ患者の大多数をカバーするための最良の選択肢であることを示す。それ故に、候補医薬品は、２ｈｓｉＲＮＡの等モル混合物として定義された：一つは両短および長ｓＦＬＴ１−ｉ１３をターゲティングし、他方はｓＦｌｔ１−ｉ１５ａをターゲティングする。ＦＤＡは、すでにｓｉＲＮＡ混合物を、成分ｓｉＲＮＡが同様に製剤または化学修飾され、そのＰＫ／ＰＤプロファイルが極めて類似するとき、単一薬物として定義するとして認めている(例えば、ＶＥＧＦ−Ａ／ＫＳＰをターゲティングする多ｓｉＲＮＡ製剤(Tabernero, J. et al. First-in-humans trial of an RNA interference therapeutic targeting VEGF and KSP in cancer patients with liver involvement. Cancer Discovery 3, 406-417 (2013)); HBV (Wooddell, C.I. et al. Hepatocyte-targeted RNAi Therapeutics for the Treatment of Chronic Hepatitis B Virus Infection. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy 21, 973-985 (2013)), Arrowheadなど)。混合物の使用はＣＭＣに複雑さを加えるが(化学、製造および制御)、混合物がアイソフォームバリアント過発現比と無関係に広いＰＥ集団の処置を可能にするとの利点がこれを凌ぐ。ある態様において、２候補の混合物を、添加物として食塩水中皮下(ＳＣ)投与する。
【０１７６】
ある態様において、ｓＦＬＴ１サイレンシングの所望のレベルは、高程度のサイレンシングが不利であるはずため、わずか３０〜４０％である。予備的データは、１０〜２０mg／kg用量がマウスで＞５０％サイレンシングを生じ、ゆえに、少ないサイレンシングが単純に低用量で達成される可能性がある。所望の製品プロファイルは１回注射であるが、しかしながら、高用量が作用期間を伸ばすために必要であるはずである。それ故に、ある態様において、ｉ１３またはｉ１５を単独で臨床的候補として使用し得る。
【０１７７】
１.４  全体的安全性および毒性考察
ＯＮＴ関連毒性は、標的特異的効果(例えば、ｓＦｌｔ１アイソフォームをサイレンシングしすぎ)、標的独立効果(すなわち、非標的ｍＲＮＡの意図的ではないサイレンシング)またはクラス関連化学特異的事象によるものであり得る。ｉ１３およびｉ１５バリアントを別々に標的とする能力は、あらゆる主要な標的関連毒性を劇的に減少させる。さらに、ｉ１３およびｉ１５バリアントは胎盤および妊娠特異的であり、他の成体組織は低いまたは検出不能発現である。それ故に、臨床的に制限となる毒性は標的非依存である可能性が最も高い。これらのタイプの効果は、ｓｉＲＮＡオフターゲティング、自然免疫応答のＲＮＡベースの誘発および選択送達と関連する一般的毒性(例えば、ホスホロチオエートと組み合わせた疎水性修飾)を含む。最も高度なバイオインフォマティクスが、標的外事象の可能性最小化のためのオリゴヌクレオチド設計最適化のために最初に用いられた(Uchida, S. et al. An integrated approach for the systematic identification and characterization of heart-enriched genes with unknown functions. BMC Genomics 10, 100 (2009))。さらに、シード配列における全リボース(すなわち、ガイド鎖のヌクレオチド２〜８)を２’−Ｆおよび２’−Ｏ−メチル修飾しており、この修飾それ自体は標的外事象最小化のために十分確立されている(Jackson, A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces “off-target” transcript silencing. RNA 12, 1197-1205 (2006))。同時にオフターゲティング署名の評価はインビトロおよびマウスサンプルでマイクロアレイプロファイリングにより確立できた(Jackson, A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. RNA 12, 1197-1205 (2006); Anderson, E., Boese, Q., Khvorova, A. & Karpilow, J. Identifying siRNA-induced off-targets by microarray analysis. Methods in molecular biology 442, 45-63 (2008); Anderson, E.M. et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA 14, 853-861 (2008); Birmingham, A. et al. 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods 3, 199-204 (2006); Fedorov, Y. et al. Off-target effects by siRNA can induce toxic phenotype. RNA 12, 1188-1196 (2006))。組織培養／動物モデルおよびヒトにおけるｓｉＲＮＡオフターゲティング署名の重複が一般に最小であるため(Burchard, J. et al. MicroRNA-like off-target transcript regulation by siRNAs is species specific. RNA 15, 308-315 (2009))、このような試験の価値は疑問である。各ｓＦＬＴ１アイソフォームについて、２つの異なる配列をインビボ評価のために選択した(一つのリードおよび一つのバックアップ)(図３)。リードがオフターゲティング誘発毒性により失敗したら、第二配列をバックアップとして使用する(Jackson, A.L. & Linsley, P.S. Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application. Nature Reviews. Drug Discovery 9, 57-67 (2010))。ｓｉＲＮＡ治療に特異的な公式ガイダンスが現在ないため、２動物モデルHughes M, I.J., Kurtz A, et al. (ed. C.N. Sittampalam GS, Nelson H, et al., editors) (Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD); 2012))における安全性証明を含む、ＮＣＥ(新規化学物質)開発の標準的推奨に従う。
【０１７８】
リード化合物は、交互の２’−Ｏ−メチル／２’−Ｆパターンを使用した完全化学修飾(非修飾リボースが残っていないことを意味する)であった。２’−ＯＭｅ／２’−Ｆの組み合わせは、自然免疫応答活性化を遮断することが知られている(Nair, J.K. et al. Multivalent N-Acetylgalactosamine-Conjugated siRNA Localizes in Hepatocytes and Elicits Robust RNAi-Mediated Gene Silencing. Journal of the American Chemical Society (2014))。インターフェロン経路活性化の欠如を、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２(ｐ７０)、ＩＰ−１０、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＴＮＦ−α(Bio-Plex Pro Magnetic Cytokine Assay; BioRad Laboratories)を見るインビトロヒト全血サイトカイン活性化アッセイおよびＧ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＫＣおよびＭＣＰ−１(Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel; Millipore)を見るインビボ(マウスに注射後)確認した(Kumar, V. et al. Shielding of Lipid Nanoparticles for siRNA Delivery: Impact on Physicochemical Properties, Cytokine Induction, and Efficacy. Molecular Therapy. Nucleic acids 3, e210 (2014))。
【０１７９】
科学的理論に縛られることを意図しないが、他のオリゴヌクレオチド化学のデータに基づき(Wooddell, C.I. et al. Hepatocyte-targeted RNAi Therapeutics for the Treatment of Chronic Hepatitis B Virus Infection. Molecular Therapy : The Journal of the American Society of Gene Therapy 21, 973-985 (2013); Coelho, T. et al. Safety and efficacy of RNAi therapy for transthyretin amyloidosis. The New England Journal of Medicine 369, 819-829 (2013))、用量規制毒性は肝臓機能と関係している可能性が最も高い。予備的試験は、ｈｓｉＲＮＡ注射用量の最大５０％が肝臓に蓄積され、送達は内皮、クッパーおよび星細胞特異的であり、肝細胞にはないことを決定した(図４)。他のホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドで、肝臓酵素の僅かな可逆性上昇および軽度可逆性注射部位反応が副作用として示されているが(Frazier, K.S. Antisense Oligonucleotide Therapies: The Promise and the Challenges from a Toxicologic Pathologist's Perspective. Toxicologic pathology 43, 78-89 (2015))、通常この肝臓酵素上昇は、高用量レベルの長期連続投薬後にのみ観察される。この処置が短期(１〜２ヶ月の期間にわたり回または２回注射のみ)を必要とし、肝細胞を標的としないため、肝臓毒性はおそらく問題ではない。しかしながら、これらの懸念を詳細に検討する。
【０１８０】
妊婦を標的とするあらゆる治療剤はさらなる安全性懸念がある。大きな懸念は、胎児へのｈｓｉＲＮＡ伝達の可能性およびこれが起こすあらゆる可能性のある毒性である。予備的試験において、胎児への検出可能なオリゴヌクレオチド伝達は、蛍光顕微鏡を使用してまたは高感度ＰＮＡ(ペプチド核酸)ベースの定量的アッセイを使用しても、観察されなかった(図４)。胎児成長、流産数、胎盤組織学または他の催奇形効果への影響も観察されなかった。
【０１８１】
１.５  リード化合物評価のためのアッセイおよびモデルシステム
インサイチュ組織分布の蛍光顕微鏡評価
センス(パッセンジャー)鎖の５’末端に非分解可能リンカーを経て結合したＣｙ３またはＣｙ５.５(低自己蛍光)色素を伴うｈｓｉＲＮＡバリアントを合成した。この化合物は、２４時間以内に検出可能なＣｙ３開裂開裂なく、生物学的に安定であった。その相補的ガイド鎖とハイブリダイズした蛍光センス鎖(故に二本鎖ｈｓｉＲＮＡ形成)を動物に投与し、オリゴヌクレオチド分布パターンを、ＤＡＰＩまたは／および細胞型選択的抗体でまた染色した４μm組織切片で試験した。並行切片を標準組織学マーカーで染色でき、詳細な組織マッピングを可能にする。ｈｓｉＲＮＡがすでに重度に疎水性修飾されているため、色素添加は全体的疎水性にほとんど影響せず、それ故にオリゴヌクレオチド分布に最小の影響である。このアッセイは、組織および細胞型分布の迅速な評価を可能とし、直接ガイド鎖検出についてＰＮＡベースの定量的アッセイにより補われた。
【０１８２】
組織ライセートにおける定量的ガイド鎖検出のためのＰＮＡハイブリダイゼーション
組織に存在するインタクトガイドの直接定量化を可能とするために、ガイド鎖を完全相補的Ｃｙ３標識ＰＮＡ(ペプチド核酸)オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、対応する二本鎖をＨＰＬＣにより過剰な一本鎖ＰＮＡから分離する、新規アッセイを開発し、実行した(図５)。ＰＮＡが非荷電であり、ガイド鎖と高度に密接に結合しているため、ｈｓｉＲＮＡセンス鎖およびあらゆる内因性標的配列の両者を打ち負かす。Ｃｙ３−ＰＮＡ：ガイドハイブリッドの蛍光検出は、組織ライセートにおけるガイド鎖存在量の直接指標を提供する。ＨＰＬＣオートインジェクターと組み合わせて、このアッセイは、一夜で数百のサンプルのガイド鎖定量化を可能とした。アッセイはまた高感度であり、検出限界は１０fmole／ｇ未満であり、完全長、部分的分解、５’−リン酸化および５’−脱リン酸化ガイド鎖含有ハイブリッドを全てＨＰＬＣトレースの別のピークまたはショルダーとして定量できる。このアッセイが標識および非標識化合物両者を検出できたため、臨床サンプル分析のための将来のＣＲＯに直接移行できる。
【０１８３】
細胞および組織におけるＦｌｔ１  ｍＲＮＡバリアントの直接検出のためのQUANTIGENE(Affymetrix)アッセイ
QUANTIGENは、組織および／または細胞ライセートからの直接シグナル増幅によりｍＲＮＡが直接検出される、高感度９６ウェルベースのアッセイである。この直接検出アッセイと１９２ウェル自動TissueLyserを連結することにより、ハイスループットバージョンを開発し、これは、動物あたり数十のサンプルの処理を可能にした。それ故に、標的およびハウスキーピング遺伝子の発現の定量的データを多くの動物で一度に作成できた。パイロット試験において、ｎ＝８が８０％信頼でｓＦｌｔ１  ｍＲＮＡアイソフォーム発現の４０％調節の検出に十分であった。
【０１８４】
条件培地および血液におけるｓＦＬＴ１タンパク質検出のためのＥＬＩＳＡ(#MVR100, R&D systems)
この９６ウェルベースのアッセイは、サンプルあたり１０μLの生物学的流体しか必要としなかった。このアッセイは、インビトロおよびインビボ両方のために長年にわたり最適化されている。臨床的に適合性があり、動物を殺すことなく循環ｓＦＬＴ１タンパク質レベルの評価が可能であり、特に非ヒト霊長類試験に有用である。
【０１８５】
正常マウス妊娠モデル
ｓＦｌｔ１−ｉ１３バリアントは、マウス妊娠中に発現され、ｉ１３レベルが１４〜１９日に指数関数的に増加する。ｓＦＬＴ１−ｉ１３−２２８３化合物とｉ１３マウスバリアントの間の完全相同性は、この単純齧歯類モデルにおける効力および安全性両者の研究を可能とする。
【０１８６】
子癇前症モデル
胎盤虚血の４子宮内潅流圧低下(ＲＵＰＰ)モデルおよび子癇前症の低酸素症モデルをさらに下に記載するように使用する。
【０１８７】
ヒヒ野生型妊娠モデル
ｓＦｌｔ１−ｉ１５ａバリアントは妊娠中の齧歯類で発現されず、そのために全体的組み合わせ効力および安全性を、野生型妊娠ヒヒで、効力のリードアウトとしてＥＬＩＳＡ、非侵襲的アッセイを使用して評価する。
【０１８８】
予備的データ
ｓＦＬＴ１タンパク質の過剰な胎盤発現を制限するためのＲＮＡｉを使用する単純で費用対効果の高いＰＥ治療剤を開発した。これが働くために、次の目的を達成した：(１)ｓＦｌｔ１  ｍＲＮＡにおける適切なｓｉＲＮＡターゲティング部位を同定した；(２)ＲＮＡサイレンシングが、一般的(すなわち、静脈内または皮下)送達を使用して胎盤で可能であるかを確認した；および(３)過剰なｓＦＬＴ１産生を担う細胞型である、胎盤栄養芽細胞への優先的送達を可能にする新規ｓｉＲＮＡ化学を開発した。
【０１８９】
Human Protein Atlas(proteinatlas.org参照)から入手可能な組織特異的ＲＮＡ−Ｓｅｑデータおよび複数正常およびＰＥヒト胎盤からのＰＡＳ−Ｓｅｑデータを使用して、完全長(ｆｌ)アイソフォームが非妊娠成人の全組織において優勢であるが、胎盤発現がそれぞれイントロン１３および１５内のポリアデニル化により産生される３切断アイソフォーム、ｓＦｌｔ１−ｉ１３短、ｓＦｌｔ１−ｉ１３長およびｓＦｌｔ１−ｉ１５ａに支配されることを決定した。ｈｓｉＲＮＡでのイントロン領域のターゲティングは、ｆｌ−Ｆｌｔ１  ｍＲＮＡ存在量を妨害することなく、切断アイソフォームの選択的サイレンシングを可能とした。
【０１９０】
内皮細胞への効率的送達を可能とする新規タイプのｓｉＲＮＡ化学を開発し、胎盤の迷路領域への(すなわち、ｓＦＬＴ１発現を担う細胞型である栄養芽細胞への)選択的転送を示した。さらに製剤することなく、最大１２％の注射用量が、検出可能な胎児移行なく、胎盤に蓄積された。この技術は、何らかのＯＮＴによる選択的迷路ターゲティングを初めて示し、発現主要部位でｓＦＬＴ１タンパク質のサイレンシングを可能とする。
【０１９１】
５０を超えるｓｉＲＮＡバリアントが設計され、スクリーニングされた(図２３参照)。ｆｌ−ＦＬＴ１発現を干渉せずに、ｉ１３およびｉ１５アイソフォームを選択的に標的化する機能亢進、完全化学修飾ｈｓｉＲＮＡが同定された(図３)。これらのｈｓｉＲＮＡを使用して、ｉ１３およびｉ１５の効率的サイレンシングが、製剤せずに一次ヒト栄養芽細胞において示された(図２Ｂ)。ｓＦＬＴ１−ｉ１３−２２８３とｓＦＬＴ−ｉ１５ａ−２５１９  ｈｓｉＲＮＡの組み合わせを、ＰＥ処置のリード候補として選択した(図３)。
【０１９２】
妊娠マウスにおける組織内化合物濃度は、単回皮下(ＳＣ)または静脈内(ＩＶ)注射で１００μg／ｇに達し、ｓＦｌｔ１−ｉ１３  ｍＲＮＡの５０〜８０％を超える減少をもたらした(それぞれ図３および４)。科学的理論に縛られることを意図しないが、この送達レベルで、サイレンシングはヒトで数週間持続し、そのため僅かな注射回数で足りると予測される。実際、１回のＳＣ注射が、数週間のｓＦＬＴ１のサイレンシングに十分であり、十分なＰＥ妊娠延長を、おそらく完全期間もたらす。
【０１９３】
実施例２. 疎水性修飾ｓｉＲＮＡ(ｈｓｉＲＮＡ)：完全化学修飾ｓｉＲＮＡ／アンチセンスハイブリッド
一団の化学および製剤が、胎盤送達の可能性のあるアプローチとして考慮された。これらは、ＬＮＡアンチセンス、ＬＮＰｓ、ｃｈｏｌ−コンジュゲート／ＤＰＣ  ＧａｌＮａｃｓおよびｈｓｉＲＮＡを含む。ｈｓｉＲＮＡは胎盤送達において他の化学を遥かに超え(さらに下記)、さらなる試験に選択した。一次栄養芽細胞におけるｈｓｉＲＮＡ取り込みの有効性を評価した。培地へのＣｙ３標識化合物の添加による、全細胞による効率的取り込みが観察された。ｈｓｉＲＮＡは非対称化合物であり、短二本鎖領域(例えば、１５塩基対)および一本鎖完全ホスホロチオエート化テイルを有し、ここで、全塩基が交互の２’−Ｆ／２’−Ｏ−メチルパターン(安定化およびＰＫＲ応答の回避を提供)を使用して完全修飾され、パッセンジャー鎖(すなわち、センス鎖)の３’末端がリンカー(例えば、ＴＥＧ−コレステロール)を経て疎水性部分にコンジュゲートされる。疎水性部分は急速な膜結合を促進し、一方一本鎖ホスホロチオエート化テイルは、慣用のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるのと類似の気候での細胞内在化に必要である(D. M. Navaroli, J.C., L. Pandarinathan, K. Fogarty, C., Standley, L.L., K. Bellve, M. Prot, A. Khvorova and & Corvera, S. Self-delivering therapeutic siRNA internalization through a distinct class of early endosomes. PNAS, under review, (2015))。Ｃｙ３標識ｈｓｉＲＮＡの何らかの培養細胞型への添加は、エンドサイトーシス経路のＥＥ１関連部分を経る急速かつ効率的内在化を示す。僅か５０％の塩基のみが２’Ｆ／２’−Ｏ−メチル修飾されたこの技術の先行版が、皮膚線維症のフェーズII臨床治験中である(Byrne, M. et al. Novel Hydrophobically Modified Asymmetric RNAi Compounds (sd-rxRNA) Demonstrate Robust Efficacy in the Eye. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association for Ocular Pharmacology and Therapeutics (2013))。
【０１９４】
主要なＲＩＳＣエントリーを妨害しない化学修飾パターンを開発した。広範な化学バリエーションを作製し、交互の２’Ｆ／２’−Ｏ−メチルパターンが、Ａ型ＲＮＡ二本鎖における個々の鎖を精密に模倣する幾何形態に適合させるガイド鎖を最適に構成すると同定された。Ａ型ＲＮＡ二本鎖は、ＲＩＳＣ複合体により認識され、開裂部位内の標的ｍＲＮＡの適切な配置を可能とする(Ameres, S.L., Martinez, J. & Schroeder, R. Molecular basis for target RNA recognition and cleavage by human RISC. Cell 130, 101-112 (2007); Schirle, N.T., Sheu-Gruttadauria, J. & MacRae, I.J. Gene Regulation. Structural basis for microRNA targeting. Science 346, 608-613 (2014))。５’−リン酸化２’−Ｏ−メチルリボース(５’−ホスフェートは、ＰＩＷＩドメイン相互作用、Ａｇｏ２認識に必要である)の交互のパターンから開始して、２’Ｆ修飾を２〜１４位の偶数位置に配置した。２位および１４位は、先に嵩高い２’−リボース修飾に抵抗性であることが示されていた(Jackson, A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. RNA 12, 1197-1205 (2006); Kenski, D.M. et al. siRNA-optimized Modifications for Enhanced In Vivo Activity. Molecular therapy. Nucleic Acids 1, e5 (2012))。
【０１９５】
これらの完全化学安定化化合物は、ＲＩＳＣエントリーにおいてネイキッドｓｉＲＮＡと少なくとも同等またはそれ以上に有効であり、ＲＩＳＣ機能に負に影響しない第一完全化学修飾パターンを表す。この発見は、完全化学安定化が全身投与による組織蓄積に必ず必須であるため、ＰＥプロジェクトに変形させた。図７は、完全長化合物が４０％のリボースがなお２’−ＯＨ(Ｐ０化学)であるバージョンの投与２４時間後にマウス胎盤で検出できなかったことを示す。比較として、完全２’−Ｆ／２’−Ｏ−メチル修飾バージョン(Ｐ１およびＰ２化学)両者は、治療的有効レベルを超えて蓄積された(図７)。ｓｉＲＮＡ含有非ＲＮＡの他の利点は、製造の容易さである−  直交リボース保護の必要がないそのＤＮＡ様化学は脱保護工程を短縮させ、カップリング効率を上げる。最後に、全２’−ＯＨ基の完全排除は、主に２’−ＯＨ相互作用に依る自然免疫応答の回避を助ける(Alexopoulou, L., Holt, A.C., Medzhitov, R. & Flavell, R.A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature 413, 732-738 (2001); Choe, J., Kelker, M.S. & Wilson, I.A. Crystal structure of human toll-like receptor 3 (TLR3) ectodomain. Science 309, 581-585 (2005))。
【０１９６】
この修飾パターンの発見は、治療的ｓｉＲＮＡ設計のための確立されたパラダイムを再定義した。ｓｉＲＮＡの２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロでの部分的修飾は、インビトロの安定性を劇的に向上させ、部分的修飾がインビボでのオリゴヌクレオチドに十分であろうとの誤った仮説を導いた。しかしながら、この仮説は誤りである(図３９Ａ、Ｂ；Hassler et al., 2016 Nature Biotech参照)。目視(蛍光；図３９Ｂ)および定量的(ＰＮＡベース；図３９Ｃ)アッセイは、全２’−ＯＨの化学修飾(ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ)が、全身(静脈内)またはＣＳＦ(側脳室内、ＩＣＶ)投与により、大部分の組織における化合物の安定性、蓄積および保持を顕著に増大することが示された。部分的安定化ｈｓｉＲＮＡ(４０％のリボースが２’−ＯＨを保持)は、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡと比較として性能が悪かった。さらに、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡのＣＮＳ注射は、注射後少なくとも１ヶ月の最大サイレンシングを支持する(図３９Ｄ、より長期の試験実施中)  −  部分的修飾化合物による週長期間のサイレンシングを超える顕著な増強(図３９Ｄ)。
【０１９７】
全２’−ＯＨ基の２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロでの置換は、２つのさらなる利点を有する。２’−ＯＨの不在は、合成を単純化する−  ＤＮＡ様化学は、直交リボース保護の必要性をなくし、それにより脱保護工程を短縮し、カップリング効率を上げる。さらに、２’−ＯＨ基の不在は、自然免疫活性化を最小化し27 28、これは治療指数増大に必須である。
【０１９８】
代謝安定性試験をＦＭ−ｈｓｉＲＮＡで実施し、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡの主要な分解産物(全身投与２時間内に９０％)がガイド鎖からの５’ホスフェートの除去に由来することが判明した。５’ホスフェートなしで、化合物はＲＩＳＣに結合できず、従って、不活性である(図３８Ｃ)。結果として、５’ホスフェートをその安定な立体適合性アナログ５’−(Ｅ)−ビニルホスホネート(５’−Ｅ−ＶＰ)(ここではＸ３とも称する)と置き換えた。５’−Ｅ−ＶＰ修飾ｈｓｉＲＮＡは５’−Ｐ−ｈｓｉＲＮＡと同等に活性であるが(図３８Ｃ)、１週間後注射部位変異の組織においてガイド鎖保持が顕著に増大される(図３８Ｄ)。５’−Ｅ−ＶＰ修飾は、インビボ効果期間をさらに延長することが期待される。
【０１９９】
実施例３. ｈｓｉＲＮＡは、検出可能な胎児移行なく、胎盤迷路栄養芽細胞への選択的送達を可能とした
インビボｈｓｉＲＮＡ分布を評価するために、正常妊娠マウス(１５日)にＣｙ３標識ｓＦｌｔ−ｉ１３−２２８３  ｈｓｉＲＮＡを注射し、分布を２つの独立アッセイにより試験した。総体組織蛍光顕微鏡は、オリゴヌクレオチドの大部分が３組織に蓄積することを確認しおた：肝臓内皮、腎臓内皮および胎盤迷路(図４)。科学的理論に縛られることを意図しないが、この分布プロファイルは、血流／濾過速度および細胞表面のコレステロール受容体濃度の組み合わせにより大部分規定されるようである。上記新規ＦＤＡ準拠ＰＮＡ−ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、胎盤における全体的薬物濃度が有効レベル(約１００ng／ｇ)を、単回１０mg／kg注射で数桁上回ることが示された(図４)。組織送達のこのレベルはＩＶおよびＳＣ投与とほぼ同等であり、注射２４時間後、その約５０％、１０％および１２％の化合物が、それぞれ肝臓、腎臓および胎盤に分布される(図４)。興味深いことに、この半分のみが、５日後肝臓から排除され(腎臓で少し多い)、単回投与が長期サイレンシングの誘発に十分であることを示す。
【０２００】
ＰＫ(薬物動態)における完全２’−Ｆ／２’−Ｏ−メチル修飾の影響の比較に加えて、ホスホロチオエート(ＰＳ)含量はわずかに異なった。Ｐ１化学は、両鎖の３’末端でＰＳ結合を有したが(計８)、Ｐ２化学は他の２ＰＳを各鎖の５’末端に有した(計１２)。末端ＰＳ結合は、エキソヌクレアーゼに対する保護を提供するので、非常に攻撃的なヌクレアーゼ環境での長期安定性に必須である。全体として、これらの二つの化合物は、２４時間のオリゴヌクレオチド送達レベルは同等であったが(図７)、長期組織暴露後の分解プロファイルは異なる可能性があり、サイレンシング効果に影響する。それらはまた僅かに異なる肝臓：胎盤分布比を有し、これは、投与経路によっても幾分影響される(図７)。
【０２０１】
３.１. リード候補の選択および同定：ｉ１３／ｉ１５混合物および一次栄養芽細胞における効力
ｉ１３およびｉ１５  Ｆｌｔ１  ｍＲＮＡアイソフォームは、それぞれ、ｆｌ−Ｆｌｔ１  ｍＲＮＡに存在しない、４３５および５６７の独特なヌクレオチドを含んでいた。残念ながら、この配列空間の大部分はホモポリマー反復に支配され、高ＧＣ含量の領域であり、このいずれもＲＮＡｉによって標的可能ではない。阻止されない、５０を超える一団のｈｓｉＲＮＡを、設計し(Birmingham, A. et al. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nature protocols 2, 2068-2078 (2007))、ＧＣ含量、特異性および低シード補完頻度の評価(Anderson, E.M. et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA 14, 853-861 (2008))、ｍｉＲＮＡシード含有配列の排除および熱力学的バイアスの試験(Khvorova, A., Reynolds, A. & Jayasena, S.D. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115, 209-216 (2003); Schwarz, D.S. et al. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115, 199-208 (2003))を含む標準ｓｉＲＮＡ設計パラメータを使用して、あらゆる実行可能な標的可能に配列に対して設計した。図３Ｂは、高機能であることが同定されたｈｓｉＲＮＡのターゲティング位置を示す。
【０２０２】
設計基準において、他の霊長類と完全相同性を有するターゲティング部位は、下記非ヒト霊長類およびヒヒＰＥモデル両者における正式な毒性および効力試験の単純化を支持した。マウスはｉ１３バリアントしか発現しない。幸運なことに、最も有効なｈｓｉＲＮＡ、ｓＦＬＴ１−ｉ１３−２２８３は、マウスｉ１３アイソフォームに完全相補性をたまたま有し、正常およびＰＥマウス妊娠モデル両者のこの化合物における直接インビボ効力および毒性評価を可能とした。図３Ｃは、ｉ１３およびｉ１５アイソフォームを効率的にサイレンシングすることが同定された最良化合物のターゲティング部位およびＩＣ５０値の表を示す。有効な化合物のＩＣ５０値は、ＨｅＬａ細胞および一次ヒト栄養芽細胞両者で４０〜１００nMの範囲であった。
【０２０３】
図１Ｃは、ＩＣ５０値計算に使用した一次ヒト栄養芽細胞におけるｓＦＬＴ１−ｉ１３−２２８３の用量応答の例を示す。ｈｓｉＲＮＡでのサイレンシングが、栄養芽細胞培地への非製剤化化合物添加により達成されたことを強調することが重要である。ｍＲＮＡノックダウンレベルを、７２時間目に上記QUANTIGENEアッセイを使用して決定した。あらゆる可能性のある非特異的効果を制御するために、ｉ１３またはｉ１５レベルを、常にハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。同一化学の非ターゲティング−対照(ＮＴＣ)を全実験で使用し、化学クラス効果を制御した。完全長Ｆｌｔ１  ｍＲＮＡレベルは影響しなかった(図１Ｄ)。タンパク質レベルでサイレンシングを評価するために、条件培地のｓＦＬＴ１濃度をＥＬＩＳＡ(QUANTIKINE FLT1, MVR100, R&D Systems)を使用して測定した(図１Ｂ)。
【０２０４】
前に進むために、２ｈｓｉＲＮＡ対を選択した：ｓＦＬＴ１−ｉ１３−２２８３(５’  ＣＴＣＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡ  ３’)／ｓＦＬＴ−ｉ１５ａ−２５１９(５’  ＣＡＴＣＡＴＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴ  ３’)およびｓＦＬＴ１−ｉ１３−２３１８(５’  ＡＴＴＧＴＡＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＴ  ３’)／ｓＦＬＴ−ｉ１５ａ−２５８５(５’  ＧＡＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＴＡＡＣＡ  ３)(図１Ｃ)。第一対は、リード薬物候補であり、全試験において使用した。第二対はバックアップであった。配列特異的毒性は問題ではない可能性が高いが、何らかの配列依存性毒性が現れた際の容易に利用可能なバックアップ化合物組み合わせが望まれた。要約すると、ｓＦｌｔ１−ｉ１３およびｓＦｌｔ１−ｉ１５ａアイソフォームを選択的に標的とする機能的疎水性修飾ｓｉＲＮＡが同定された。一次ヒト栄養芽細胞における対応する標的の効率的内在化およびサイレンシングをｍＲＮＡおよびタンパク質レベル両者で決定した。
【０２０５】
これらのデータは、ＰＥ中のｓＦＬＴ１過発現の主要部位である胎盤栄養芽細胞への効率的送達を可能とし、全身投与による循環ｓＦＬＴ１の強力なサイレンシングｏが可能である、新規ｓｉＲＮＡ化学が開発された。
【０２０６】
実施例４. 非製剤化、安定化、疎水性ｓｉＲＮＡでの一次神経細胞およびマウス脳の両方におけるハンチンチン減少
インビボで良好な有効性および分布ならびにインビトロで一次ニューロンにおけるノックダウンの両方を提供する可能性を有する疎水性に修飾されたＡＳＯ−ｓｉＲＮＡハイブリッドを探索した。ハンチンチン遺伝子をｍＲＮＡノックダウンの標的として使用した。ハンチントン病は一遺伝子性であり(Mangiarini, L. et al. Exon 1 of the HTT gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell 87, 493-506 (1996))、疾患病理に至る多数の細胞の機序を有し(Zuccato, C., Valenza, M. & Cattaneo, E. Molecular Mechanisms and Potential Therapeutical Targets in Huntington's Disease. Physiological Reviews 90, 905-981 (2010))、将来的オリゴヌクレオチド治療の可能性の優れた候補となる。
【０２０７】
一団の疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡターゲティングハンチンチン遺伝子を開発した。Ｓｅｅ  図２４。効果および効力が、送達用製剤を行うことなく、単回低用量注射でインビトロで一次ニューロンおよびインビボでマウス脳の両方で観察された。これらの化合物は早期のモデルｉＲＮＡおよびｈｓｉＲＮＡ、ならびにＡＳの両方に見られた多数の化学的および構造的修飾を組み合わせる。安定化塩基修飾、コレステロールコンジュゲーションおよび完全ホスホロチオエート化一本鎖テイルを含むこれらの性質は、これらのｈｓｉＲＮＡを、多数の種々の生物学的に適切な系における使用に適合できる、標的困難一次細胞および臓器における遺伝子機能の研究の優れたツールとする。
【０２０８】
４.１  ｈｓｉＲＮＡ  −  疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡ／アンチセンスハイブリッドは、一次ニューロンに効率的に内在化された
ｈｓｉＲＮＡは非対称化合物であり、短二本鎖領域(例えば、１５塩基対)および一本鎖完全ホスホロチオエート化テイルを有する。これらの化合物における全ピリミジンは２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチル修飾され(安定化する)およびパッセンジャー鎖の３’末端はＴＥＧ−コレステロールにコンジュゲートされた(図１Ａ、図８)。コレステロールコンジュゲートは迅速な膜結合を可能とし、一方一本鎖ホスホロチオエート化テイルは、慣用のアンチセンスオリゴヌクレオチドにより使用されるものに類似する機序による細胞内部移行に必要であった。Ｃｙ３標識ｈｓｉＲＮＡの一次皮質ニューロンへの添加は、即時の(数分以内)細胞結合をもたらした(図１Ｂ)。興味深いことに、取り込みがまず優先的にデンドライトで観察され、続いて細胞体に再局在化した(図９)。取り込みは、皿の全細胞で均一であり、効率的内部移行が確認された。顕著なことに、約６０％のｈｔｔ−ｍＲＮＡが核に局在化することが判明した(データは示していない)。
【０２０９】
４.２  ハンチンチンをターゲティングするｈｓｉＲＮＡの同定
ハンチンチンｍＲＮＡをターゲティングする一団の９４ｈｓｉＲＮＡ化合物(図２４)を設計し、合成した。これらの配列は遺伝子にわたっており、ＧＣ含量、特異性および低シード相補性(compliment)頻度の評価(Anderson, E. M. et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA 14, 853-861 (2008))、ｍｉＲＮＡシード含有配列の除去および熱力学バイアスの試験(Khvorova, A., Reynolds, A. & Jayasena, S. D. Functional siRNAs and miRNAs Exhibit Strand Bias. Cell 115, 209-216 (2003); Schwarz, D. S. et al. Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell 115, 199-208 (2003))を含み、標準的ｓｉＲＮＡ設計パラメータに適合するように選択した(Birmingham, A. et al. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nat Protoc 2, 2068-2078 (2007))。５０％を超える塩基が化学修飾され、インビボ安定性および免疫応答の最小化を提供した(Judge, A., Bola, G., Lee, A. & MacLachlan, I. Design of Noninflammatory Synthetic siRNA Mediating Potent Gene Silencing in Vivo. Molecular Therapy 13, 494-505 (2006))。修飾は、さらなる制限を配列空間に付し、ヒット率を低減した。ハンチンチンｍＲＮＡ発現への影響を、QUANTIGENEアッセイによりＨｅＬａ細胞における１.５μM  ｈｓｉＲＮＡ(受動的取り込み、製剤せず)暴露７２時間後に測定し、７％の配列が７０％を超えるサイレンシングを示した。１.５μM  ｈｓｉＲＮＡで、２４  ｈｓｉＲＮＡがＨｔｔ  ｍＲＮＡレベルを対照レベルの５０％未満まで減少させ、対照レベルの３０％未満までＨｔｔ  ｍＲＮＡレベルを減少させる７  ｈｓｉＲＮＡを含んだ。機能的標的部位は、３’ＵＴＲの遠位部分を例外として遺伝子中に広がり、後にＨｅＬａ細胞における短ｈｔｔアイソフォームの優先的発現により説明された(Li, S. H. et al. Huntington's disease gene (IT15))。ＩＣ５０値が、活性および異種間保存の一次スクリーンに基づき選択された１６活性配列で同定された(図１０)。ＩＣ５０値は、受動的取り込みで９０〜７６６nM(製剤せず)および脂質介在取り込みで４〜９１pMの範囲であった(図８)。完全化学的最適化活性化合物は容易に同定され、はるかに小さいライブラリーが他の遺伝子の将来的スクリーニングに十分であるが、ｈｉｔ率は標的毎に異なる可能性がある。１０１５０位をターゲティングするｈｓｉＲＮＡ(ＨＴＴ１０１５０(すなわち、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’))をさらなる試験に使用した。ｈｓｉＲＮＡ化学的骨格がＨＴＴ１０１５０の有効性および効力に負に影響しないことを確実にするために、修飾および非修飾型の化合物を受動的および脂質介在サイレンシングアッセイの両方で試験した(図２６)。予想通り、修飾配列のみが受動的取り込みによる細胞送達およびＨｔｔサイレンシングに成功し(ＩＣ５０＝３３.５nM)、一方修飾および非修飾化合物両者は、脂質介在送達で類似ＩＣ５０値を示し(それぞれ０.９pMおよび３.５pM)、ｈｓｉＲＮＡ骨格修飾がＲＮＡ誘発サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)充填を妨害しないことを示唆した。
【０２１０】
４.３  一次ニューロンにおける非公式化ｈｓｉＲＮＡでの強力および特異的遺伝子サイレンシング
ＨＴＴ１０１５０を、ＦＶＢＮマウスから単離した一次ニューロンにおけるｍＲＮＡサイレンシングについてさらに試験した。有効性を、皮質ニューロンに単純非製剤化化合物添加７２時間および１週間後見られ(図２７Ａ)、最大サイレンシング(７０％)は１.２５μM濃度で見られた。皮質神経細胞のｈｓｉＲＮＡＨＴＴ処置は、核を超えて優先的に細胞質の、Ｈｔｔ  ｍＲＮＡを排除した(図３３)。ＨＴＴ１０１５０はまた一次線条体ニューロンで類似サイレンシングを示した(図２７Ｂ)。タンパク質レベルを１週間後ウェスタンブロットで測定し、１.２５μMの化合物で処置後タンパク質が８５％減少するｍＲＮＡデータを確認した。ＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡは、ハウスキーピング対照(ＰｐｉｂおよびＴｕｂｂ１)の発現レベルまたは主要な神経細胞の全体的生存能に、ALAMARBLUEアッセイで測定して、最大２μM濃度で影響しなかった。類似する結果がＨｔｔ  ｍＲＮＡをターゲティングする他のｈｓｉＲＮＡでも見られ、この観察される現象がＨＴＴ１０１５０に独特ではないことを支持する。他の実験において、細胞生存能へのわずかな影響が３μMで観察された。
【０２１１】
単一ＨＴＴ１０１５０処置での効果持続期間の評価のため、サイレンシングを、１週間、２週間および３週間間隔で測定した。充填ＲＩＳＣ複合体の半減期は数週間であり(Song, E. et al. Sustained Small Interfering RNA-Mediated Human Immunodeficiency Virus Type 1 Inhibition in Primary Macrophages. Journal of Virology 77, 7174-7181 (2003))、サイレンシングは、非分裂細胞で長く続くと予想された。実際、ｈｓｉＲＮＡでの単回処置は、試験した全ての時点でｈｔｔサイレンシング誘発に十分であった。３週間は、最長であり、一次ニューロンは培養で維持できた。他の系を長期実験に使用できる。
【０２１２】
ｈｓｉＲＮＡの神経細胞遺伝子サイレンシングのツールとしての一般的適用性を示し、この化学骨格が神経細胞送達に妥当であることを確認するために、いくつかの他のＨＴＴをターゲティングするｈｓｉＲＮＡおよびハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)をターゲティング一つでの類似実験を実施した(図２８)。７０％および９０％の高いサイレンシングがＨＴＴおよびＰＰＩＢでそれぞれ観察された。
【０２１３】
要約すると、これらのデータは、疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡが一次ニューロンにおける遺伝子サイレンシングの単純かつ簡単なアプローチであり、複数遺伝子標的に適合できることを示す。
【０２１４】
４.４  単回注射によるマウス脳におけるインビボｈｓｉＲＮＡ分布
ＲＮＡは、インビトロで種々のタイプのニューロンにより効率的に内在化される。選択ｈｓｉＲＮＡ、ＨＴＴ１０１５０を、さらにインビボで脳における遺伝子発現をサイレンシングする可能性について評価した。インビボ投与によるＨＴＴ１０１５０の分布プロファイルを確認するために、１２.５μgのＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡ(配列について図７参照)を線条体内注射し、２４時間後、脳を潅流し、切片化し、オリゴヌクレオチド分布を蛍光顕微鏡(ライカDM5500 - DFC365FX)で可視化した。同時に処理した人工ＣＳＦ注入サンプルを、背景組織落射蛍光の対照のために設定した顕微鏡的造影設定のために使用した。
【０２１５】
化合物の大部分は、注射部位から離れる拡散の急勾配を示し、同側性線条体の大部分が被覆された(図５Ａ、５Ｂ)。興味深いことに、ｈｓｉＲＮＡは脳(皮質および線条体の両方)の非注射部位(対側)側で検出されたが、相対的濃度ははるかに低いように見えた。高拡大率画像は、疎水性修飾の存在による可能性が高い、ｈｓｉＲＮＡとファイバートラックの有意な関係を示した。ｈｓｉＲＮＡのこの側面は、脳シグナル伝達構造可視化のための標識試薬として有用とし得る。ファイバートラックおよび神経突起標識に加えて、ｈｓｉＲＮＡは、注射わずか２４時間後のＮｅｕＮ(神経細胞マーカー)染色細胞での共局在化により示されるとおり、ニューロンを含む種々の細胞型の核周囲空間における染色の細点として検出できた。
【０２１６】
４.５  単回注射によるマウス脳におけるインビボでのｈｓｉＲＮＡ有効性
ＨＴＴ１０１５０有効性をインビボで決定するために、野生型ＦＶＢＮマウスを、３〜２５μg(０.１〜０.９mg／kg)の化合物の単回注射により線条体内投与し、ｍＲＮＡサイレンシングを注射部位の同側性および対側性の両方で試験した。８動物を処置群あたり投与し、３の個々のパンチをｍＲＮＡおよびタンパク質定量化のために線条体の各側からとった。ハンチンチン発現レベルをQUANTIGENEアッセイで測定し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。
【０２１７】
統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、ＣＳＦまたはＰＢＳ対照に対して一元配置ＡＮＯＶＡ比較で実施し、反復測定はボンフェローニ補正を用いた(詳細はオンライン方法)。サイレンシングを誘発した全群はＣＳＦ、ＰＢＳおよび非ターゲティング対照処置動物に対して有意であった。投与部位(同側性側)で、統計的有意に達する用量依存性サイレンシングが全濃度で見られた。２５μg処置は７７％サイレンシング(ｐ＜０.０００１)を誘発し、１２.５μg処置は、動物２群で異なる日に反復し、統計的に有意な６６％および４２％のサイレンシングを示した。
【０２１８】
初期分布試験は、注射部位から離れる拡散の急勾配と、対側性部位に移動する最小量の化合物をしめしたが、２５μgおよび１２.５μgの高用量での処置は、非注射部位に統計学的に有意なサイレンシング(ｐ＜０.０００１)をもたらした。しかしながら、サイレンシングレベルは、脳の処置側より有意に低かった(２５μg群でわずか３６％)。
【０２１９】
インビボでＨＴＴ１０１５０効力をさらに測定するために、用量応答試験を、ＨＴＴ１０１５０を３.１μg、６.３μg、１２.５μgまたは２５μg線条体内注射された野生型ＦＶＢ／ＮＪマウスで実施した。対照として、マウスに非ターゲティング対照ｈｓｉＲＮＡ(ＮＴＣ)、人工ＣＳＦまたはＰＢＳを注射した。同側および対側線条体から採ったパンチ生検において、ＨＴＴ１０１５０はＨｔｔ  ｍＲＮＡレベルを用量依存的様式で減少させた(図３４)。
【０２２０】
Ｈｔｔ  ｍＲＮＡは、線条体の対側で顕著に減少される。確固たる用量依存的サイレンシングが観察され、高用量発現レベルでＨｔｔ  ｍＲＮＡ発現レベルの最大７７％(一元配置Ａｎｏｖａ  ｐ＜０.０００１)減少であった。興味深いことに、統計的に有意であるが、あまり顕著ではない、サイレンシングが対側線条体および皮質で観察された。サイレンシングは、一元配置および二元配置Ａｎｏｖａ両者で統計的有意に達した(二元配置Ａｎｏｖａの値を図３４に示す)。ある程度のレベルの蛍光が高レーザー強度でこれらの脳領域で検出可能であったが、自己蛍光する組織に極めて近いために、検出するのは技術的に困難であり、ゆえにここに記載しない。サイレンシング効果レベルは、注射部位からの分布の鋭い勾配と少なくとも相関することは明らかである。
【０２２１】
Ｈｔｔ  ｍＲＮＡサイレンシングは、ＨＴＴ１０１５０で観察されたが、非ターゲティング対照またはＣＳＦではされなかった(図３４)。さらに、ＨＴＴ１０１５０は、数ハウスキーピング遺伝子(ＰＰＩＢ、ＨＰＲＴ)の発現に影響しない。組み合わせにおいて、これは、サイレンシングがＨＴＴ１０１５０  ｍＲＮＡサイレンシングにより起こされ、標的外効果によるものではないとの指標である。
【０２２２】
要約すると、これらのデータは、ｈｓｉＲＮＡの単回線条体内注射が投与部位周囲の強力遺伝子サイレンシング誘発に十分であることを示す。この効果は種々の処置群および独立した実験で再現性があった。
【０２２３】
４.６マウス脳における単回ｈｓｉＲＮＡ注射後の神経細胞生存能
非修飾、ネイキッドｓｉＲＮＡのコレステロール修飾が、ｓｉＲＮＡ脳分布改善のために先に使用されており、高用量での毒性は可能性限界と同定された。脳に対する非特異的化学関連効果の程度を評価するために、線条体における中型有棘ニューロンのドーパミン受容体発現の確立されたマーカーであり、神経細胞生存能を表すＤＡＲＰＰ３２発現を試験した。さらに、免疫応答を誘発する可能性を、ｈｓｉＲＮＡ注射によるミクログリア活性化の評価により実施した。
【０２２４】
インビボでｈｓｉＲＮＡによる自然免疫応答活性化を評価するために、ＩＢＡ１陽性ミクログリア細胞を、１２.５μg  ＨＴ１０１５０または人工ＣＳＦを注射したマウスからの脳切片で定量した。ＩＢＡ−１はミクログリア細胞に特異的であり、脳傷害後上方制御され、休止および活性化ミクログリアの区別を可能とする。総ミクログリア計数は、注射５日後の同側のわずか２５％増加を示し、何ら炎症性応答がないことを示す(図３５)。
【０２２５】
ＤＡＲＰＰ３２発現に対する顕著な影響は１２.５μgまでの用量で観察されず、永続性神経細胞生存能が示された。同様に、修飾ｈｓｉＲＮＡ存在下の限定的な免疫応答の指標である最小ミクログリア活性化が１２.５μg用量で可視化された。２５μg用量は、毒性の指標である注射部位周囲のみのＤＡＲＰＰ３２のいくぶんかの減少を誘発し、示した投与経路によるこの化学的骨格の最大用量レベルを確立した。ｈｓｉＲＮＡの１０〜１２.５μg単回投与は、３つの、十分に力のある、独立した試験でＨＴＴ  ｍＲＮＡを効率的にサイレンシングし、毒性なしで６２％、４２％および５２％の確実なサイレンシングを示した。これらのデータは、このテクノロジーが他の神経学的に有意な標的の機能的試験に広範に使用できることを示す。
【０２２６】
４.７  ＬＮＡ−ＧＡＰＭＥＲオリゴヌクレオチドではなく、ｈｓｉＲＮＡＨＴＴがサイレンシングプラトーを示す
サイレンシングプラトーはＲＮＡｉでのみ見られ(細胞質；ｈｓｉＲＮＡ−Ｆ１)、ＲＮＡｅＨ(主に核；ＬＮＡ−ＧＡＰＭＥＲ)化合物で見られなかった。観察されたサイレンシングプラトー(図３２)はＨＴＴ遺伝子に特異的である。
【０２２７】
４.８  考察
本研究は、一次細胞への送達のための疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡの使用が、神経細胞経路および神経障害の機能試験およびゲノム試験を可能にするための価値あるツールであることを示す。
【０２２８】
毒性製剤を用いずに一次ニューロンにおいて遺伝子サイレンシングを起こす能力は、神経科学研究において相当な影響を与え、一次細胞株の状況における神経学的障害のより深い研究を促進し、最終的にインビボ機能および病理のより有意な理解を提供する。大部分の神経細胞試験は、送達および細胞維持の容易さのために安定な細胞株で行われているが、人工細胞系使用は、一次細胞使用により避けされる問題であるこれらの細胞株の操作に起因し得るデータのアーチファクトをもたらし得る(Cheung, Y.-T. et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. NeuroToxicology 30, 127-135 (2009); Gilany, K. et al. The proteome of the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y: An enlarged proteome. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 1784, 983-985 (2008); Lopes, F. M. et al. Comparison between proliferative and neuron-like SH-SY5Y cells as an in vitro model for Parkinson disease studies. Brain Research 1337, 85-94 (2010); Zhang, W. et al. Cyclohexane 1,3-diones and their inhibition of mutant SOD1-dependent protein aggregation and toxicity in PC12 cells. BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY 1-17 (2011). doi:10.1016/j.bmc.2011.11.039)。一次ニューロンにｓｉＲＮＡを送達する現在の方法は、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)またはリポフェクタミンＴＭ介在トランスフェクションの使用を含む(Karra, D. & Dahm, R. Transfection Techniques for Neuronal Cells. Journal of Neuroscience 30, 6171-6177 (2010))。ｓｉＲＮＡ自体にコレステロールのような疎水性部分を直接コンジュゲートし、取り込み促進のためにさらなる一本鎖ホスホロチオエート化テイルを用いることにより、ここで、ｓｉＲＮＡが最小毒性で効率的に一次ニューロンにインビトロで送達できるだけでなく、なおｍＲＮＡの強力なサイレンサーのままであることが示された。
【０２２９】
科学的理論に縛られることを意図しないが、アンチセンステクノロジーを超えるＲＮＡｉの大きな利点の一つは、充填ＲＩＳＣが非分裂細胞で長時間活性なままであることが予測されることである(Bartlett, D. W. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Research 34, 322-333 (2006))。さらに、限定的な数の充填ＲＩＳＣが、ＲＮＡｉ介在サイレンシングの誘発に十分である(Stalder, L. et al. The rough endoplasmatic reticulum is a central nucleation site of siRNA-mediated RNA silencing. The EMBO Journal 32, 1115-1127 (2013))。ここに示すデータは、インビトロでｈｓｉＲＮＡの単回処置により一次皮質ニューロンの３週間までのサイレンシングを示し、ＲＮＡｉ介在サイレンシングが効率よく、かつ持続的であるとの見解を支持する。ここに示すデータはまたこれらの化合物が、異なる遺伝子の複数領域を標的とできることを示し、これは、代替的神経学経路および疾患の研究のためのｈｓｉＲＮＡの適応性を示す。
【０２３０】
ｈｓｉＲＮＡの単回線条体内注射が、インビボで注射部位近辺で強力な遺伝子サイレンシングをもたらすが、効果は脳全体に均一に拡散しなかった。限定的であるが、脳の他の領域への拡散(インビボ有効性試験により照明)は、多くの機序を介して起こり得た。これらはＣＳＦにおける移動、分布試験におけるＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡの大きな可視密度を有することが示された神経索を経る拡散またはおそらく逆行輸送の可能性を含むが(tewart, G. R. & Sah, D. Retrograde Transport of siRNA and Therapeutic Uses to Treat Neurological Disorders. United States Patent Application Publication US 2008/0039415 A1, 1-18 (2008))、正確な機序の決定にさらなる試験を実施する。
【０２３１】
ここに示すテクノロジーは、特定の脳領域の機能的ゲノムの理解、ならびに複数脳領域間の関係の解明に有用である。さらに、ある神経学的障害の研究(例えば記憶障害(Samuelson, K. W. Post-traumatic stress disorder and declarative memory functioning: a review. Dialogues in Clinical Neuroscience 13, 346-351 (2011)))は、限定的かつ領域的標的分布およびサイレンシングから利益を受け得る。しかしながら、その分布プロファイルにより、現在存在しているｈｓｉＲＮＡは、ハンチントン病のような一般的神経学的障害に実行可能な治療ではない。複数注射は小齧歯類で全体的サイレンシングの増加に作用するが、このテクノロジーを大型動物脳およびヒトでの使用に適合させ、均一かつ広範な分布を達成するために、他の化学的修飾および送達の治療方法が利用されるであろう。これに接近するであろう多数の方法がある。まず、ｈｓｉＲＮＡ組成物自体への化学的調節をなし得る。これらは、種々の脂質へのコンジュゲート、主鎖のさらなるホスホロチオエート基での補助または疎水性部分のヌクレオチド自体への添加を含む(Vaught, J. D., Dewey, T. & Eaton, B. E. T7 RNA Polymerase Transcription with 5-Position Modified UTP Derivatives. J. Am. Chem. Soc. 126, 11231-11237 (2004))。これらの修飾の全ては、より遠い距離を経るより改善された分布を可能にする一定範囲の疎水性によって支持される。バイオアベイラビリティの増大もまた線条体内ではなく、脳全体の暴露の可能性を高めるＣＳＦへのような種々の態様による注射により達成される。しかしながら、ＣＳＦを経る送達は、線条体以外の脳領域へのｈｓｉＲＮＡの局在化を支持し、ハンチントン病処置のためのより理想的送達方法とはならない。他の可能性は、これらの疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡをエキソソームおよびリポソームに包含させることによる製剤化送達であり(現在のリポフェクタミンＴＭ製剤より低毒性)、これらの天然および合成ナノ担体のより均一に分散された形式での積み荷の送達に使用することである(Alvarez-Erviti, L. et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol 1-7 (2011). doi:10.1038/nbt.1807; Marcus, M. & Leonard, J. FedExosomes: Engineering Therapeutic Biological Nanoparticles that Truly Deliver. Pharmaceuticals 6, 659-680 (2013))。しかしながら、送達ｈｓｉＲＮＡの効力および効果は、これらの方法について検証する必要がある。
【０２３２】
結論として、ＨＴＴ１０１５０はインビトロで一次ニューロンおよびインビボでマウス脳への局所的なハンチンチンｍＲＮＡのターゲティングに効率的であった。この化合物は一次細胞への送達のためになんら製剤を必要とせず、ハンチンチンならびに他の標的のための遺伝子機能的試験を可能とし、神経障害研究のために極めて有用なツールとなった。このテクノロジーの潜在的利点は、将来的にハンチントン病ならびに他の神経学疾患のための治療処置としてｈｓｉＲＮＡが機能することを可能とするはずである。
【０２３３】
４.９  方法
細胞培養
ＨｅＬａ細胞を、１０％胎児ウシ血清(Gibco)および１００Ｕ／mLペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen)添加ＤＭＥＭ(Corning Cellgro)に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。細胞は１５継代まで２〜５日に分け、その後廃棄した。
【０２３４】
受動的取り込みのための細胞培養
細胞を、９６ウェル組織培養処置プレートにおいて６％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中、１０,０００細胞／ウェルで播種した。ｈｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ(Gibco)で２×最終濃度まで希釈し、５０μL希釈ｈｓｉＲＮＡを５０μLの細胞に３％ＦＢＳ最終まで添加した。細胞を、７２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２３５】
脂質介在取り込みのための細胞培養
細胞を、９６ウェル組織培養処置プレートにおいて、６％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中１０,０００細胞／ウェルで播種した。ｈｓｉＲＮＡを、ＯｐｔｉＭＥＭで４×最終濃度に希釈した。LIPOFECTAMINE RNAIMAX Transfection Reagent(Invitrogen #13778150)を４×最終濃度に希釈した(最終＝０.３μL／２５μL／ウェル)。ＲＮＡＩＭＡＸおよびｈｓｉＲＮＡを１：１で混合し、５０μLを、５０μLの細胞に３％ＦＢＳ最終について添加した。細胞を、７２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２３６】
一次ニューロンの製造
一次皮質ニューロンをＷＴ(ＦＶＢＮ)マウスのＥ１５.５マウス胚から得た。妊娠雌をアバチン(２５０mg／体重kg)ＩＰ注射で麻酔し、次いで頚椎脱臼させた。胚を除き、氷冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２媒体(Invitrogen)含有ペトリ皿に移した。脳を除き、髄膜を注意深く離した。皮質を単離し、予め温めたパパイン溶液含有１.５mlチューブに２５分、３７℃および５％ＣＯ２で移し、組織を溶解した。パパイン溶液を次のとおり調製した：パパイン(Worthington #54N15251)を２mL  HibernateE(Brainbits)および１mL  ＥＢＳＳ(Worthington)に溶解した。別に、ＤＮａｓｅ(Worthington #54M15168)を０.５mL  HibernateEに再懸濁した。次いで、０.２５mLの再懸濁ＤＮａｓｅを再懸濁パパインに最終溶液のために移した。２５分インキュベーション後、パパイン溶液を除き、２.５％ＦＢＳ添加１mL  NbActiv4(Brainbits)を組織に添加した。次いで皮質を、熱加工、ガラスパスツールピペットを上下することにより解離させた。皮質ニューロンを計数し、１×１０６細胞／mlでプレーティングした。生存細胞造影試験のために、培養プレートをポリＬ−リシン(Sigma #P4707)でプレコートし、２×１０５細胞を、各皿のガラス中心に添加した。サイレンシングアッセイのために、ニューロンを、ポリＬ−リシンプレコート９６ウェルプレート(BD BIOCOAT #356515)に１×１０５細胞／ウェルで播種した。一夜、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーション後、非神経細胞の増殖を阻止するための有糸分裂阻害剤、０.４８４μL／mLの５’ＵｔＰ(Sigma #U6625)および０.２４０２μL／mLの５’ＦｄＵ(Sigma #F3503)添加等体積のNbActiv4(Brainbits)を神経細胞培養に添加した。培地の体積の半分を、ニューロンをｓｉＲＮＡで処置するまで４８時間毎に変えた(有糸分裂阻害剤含有新NbActiv4)。細胞が処置されたら、培地を除かず、添加だけした。全てのこの後の培地添加は有糸分裂阻害剤を含んだ。
【０２３７】
ｍＲＮＡ定量化
ｍＲＮＡをQUANTIGENE 2.0アッセイ(Affymetrix #QS0011)を使用して定量化した。細胞を２５０μL希釈溶解混合物(Affymetrix #13228)、１部溶解混合物、２部Ｈ２Ｏと、０.１６７μg／μLプロテイナーゼＫ(Affymetrix #QS0103)で３０分、５５℃で溶解した。細胞ライセートを徹底的に混合し、４０μL(約８０００細胞)のライセートを、プロテイナーゼＫなしの４０μLのさらなる希釈溶解混合物と共に捕捉プレートに添加した。プローブセットをAffymetrixプロトコールに特定のとおり希釈した。ＨｅＬａ細胞について、２０μLのヒトＨＴＴまたはＰＰＩＢプローブセット(Affymetrix #SA-50339, #SA-10003)を１００μL最終体積まで適切なウェルに添加した。一次ニューロンについて、２０μLのマウスＨＴＴまたはＰＰＩＢプローブセット(Affymetrix #SB-14150, #SB-10002)を使用した。
【０２３８】
組織を、５mg組織パンチについて２μg／μLプロテイナーゼＫを添加した３００μLの均質化緩衝液(Affymetrix #10642)で同様に処置した。次いで組織を９６ウェルプレート形式で、QIAGEN TissueLyser IIで均質化し、４０μLを捕捉プレートに添加した。プローブセットをAffymetrixプロトコールに特定するように希釈し、６０μLのＨＴＴまたはＰＰＩＢプローブセット(Affymetrix #SB-14150, #SB-10002)を、１００μL最終体積まで捕捉プレートの各ウェルに添加した。ＤＡＲＰＰ３２定量化について、１０μLの組織サンプルおよび３０μLの均質化緩衝液のみを、６０μLのマウスＰｐｐ１ｒ１ｂプローブセット(Affymetrix #SB-21622)と共に各ウェルに添加した。シグナルをAffymetrixプロトコールに従い増幅させた。発光をVeritas LuminometeまたはTecan M 1000で検出した。
【０２３９】
生存細胞染色
生存細胞ｈｓｉＲＮＡ取り込みをモニターするために、一次ニューロンの製造について上記のとおり細胞を３５mmガラス底皿あたり２×１０５細胞で播種した。造影前に、細胞核を、製造業者により示されるとおり、NUCBLUE(Life Technologies #R37605によるMolecular Probes)を使用して無フェノールレッドNbActiv4で染色した。造影を無フェノールレッドNbActiv4で実施した。細胞を０.５μMのＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡで処置し、生存細胞造影を経時的に実施した。全生存細胞共焦点画像をツァイス共焦点顕微鏡で獲得し、画像をImageJ(1.47v)ソフトウェアを使用して処理した。
【０２４０】
免疫組織化学／免疫蛍光
分布試験について、脳に１nmol(１２.５μg)のＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡを注射した。２４時間後、マウスを屠殺し、脳を取り出し、DERC Morphology Core at UMASS Medical Schoolに送り、パラフィンに包埋させ、４μm切片にスライスし、ガラススライドにマウントした。切片をキシレン中で２回８分脱パラフィン化した。次いで切片を連続エタノール希釈(１００％、９５％、８０％)で各４分再水和し、次いで２回、２分、ＰＢＳで洗浄した。ＮｕｅＮ染色について、スライドを、５分、抗原回収緩衝液で沸騰させ、次いで室温で２０分静置し、続いてＰＢＳで５分洗浄した。次いでスライドを５％正常ヤギ血清でＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１時間遮断し、ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１回、５分洗浄した。一次抗体(ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０中１：１０００希釈)をスライドに１時間インキュベーションのために添加し、続いて３回ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分洗浄した。二次抗体(ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０中１：１０００希釈)をスライドに暗所での３０分インキュベーションのために添加し、続いて３回ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分洗浄した。次いで、スライドをＤＡＰＩ(Life Technologies #D3571のMolecular Probes)で染色し、２５０ng／mLにＰＢＳで１分希釈し、続いて３回、ＰＢＳで１分洗浄した。マウンティング媒体およびカバーグラスをスライドに適用し、一夜乾燥させて、記載する拡大率でライカDM5500 - DFC365FX顕微鏡で造影した。
【０２４１】
毒性およびミクログリア活性化試験のために、抽出、潅流脳を氷冷ＰＢＳ中、ライカ2000T Vibratomeで４０μm切片にスライスした。免疫組織化学を、ＤＡＲＰＰ３２(Millipore、１：１０,０００希釈)およびＩＢＡ−１(Millipore、１：５００希釈)に対して６切片毎に実施した。切片をマウントし、光学顕微鏡で可視化した。４画像を線条体の各切片の注射および非注射部位の両方で２０倍で撮った。ＤＡＲＰＰ３２陽性ニューロン数をＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。活性化ミクログリアをＩＢＡ−１に対する染色細胞の形態学により定量化した。
【０２４２】
動物、定位注射
野生型(ＦＶＢＮ)マウスは、定位的配置で右線条体(協調(ブレグマに相対的)は１.０mm前側、２.０mm側面および３.０mm腹側)のマイクロ注射を受けた。動物を、１.２％アバチンで注射前に深く麻酔した。毒性(ＤＡＲＰＰ３２)および有効性の両方の試験について、マウスはＰＢＳまたは人工脳脊髄液(２μL／線条体、Ｎ＝８マウス)、１２.５μgのＮＴＣ  ｈｓｉＲＮＡ(２μLの５００μM原液／線条体、Ｎ＝８マウス)、２５μgのＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡ(２μLの１mM原液／線条体、Ｎ＝８マウス)、１２.５μgのＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡ(２μLの５００μM原液／線条体、計Ｎ＝１６マウス、２回の異なる日に８マウスの２セット)、６.３μgのＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡ(２μLの２５０μM原液／線条体、Ｎ＝８マウス)または３.１μgのＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡ(２μLの１２５μM原液／線条体、Ｎ＝８マウス)を注射され、５日後屠殺された。脳を取り出しし、３個の３００μm冠状切片を製造した。１個の２mmパンチを各切片の側あたり(注射および非注射)取得し、RNAlater(Ambion #AM7020)で２４時間、４℃に置いた。各パンチを、QUANTIGENEアッセイ解析のための独立したサンプルとして処理した。全動物手順は、the University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC, protocol number A-2411)により承認された。
【０２４３】
統計解析
データ分析を、GraphPad Prism 6 version 6.04ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)を使用して実施した。濃度依存的曲線ＩＣ５０について、曲線をｌｏｇ(阻害剤)対応答−可変傾斜(４パラメータ)を使用して適合させた。曲線の底を０以上に設定し、曲線上部を１００以下に設定した。各独立したマウス実験について、全データが対照の比率として表されるように、各用量でのノックダウンレベルをＰＢＳまたは人工ＣＳＦ群の非注射部位である対照群の平均に対して正規化した。インビボデータを複数比較についてボンフェローニ補正を伴うクラスカル・ワリス検定(一元配置ＡＮＯＶＡ)を使用して分析した。全比較における差異は、０.０５未満のＰ値で有意とみなした。
【０２４４】
受動的取り込み(一次スクリーニングおよび用量応答)のための細胞培養
細胞を、９６ウェル組織培養処置プレートで６％ＦＢＳ(Gibco)添加ＤＭＥＭ(Gibco)中、１０,０００細胞／ウェルで播種した。ＨｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ(Gibco)で２×最終濃度に希釈し、５０μL希釈ｈｓｉＲＮＡを、５０μLの細胞に３％ＦＢＳ最終について添加した。細胞を、７２時間、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２４５】
脂質介在取り込みのための細胞培養
細胞を、９６ウェル組織培養処置プレートで６％ＦＢＳ(Gibco)含有ＤＭＥＭ(Gibco)中、１０,０００細胞／ウェルで播種した。ＨｓｉＲＮＡを、ＯｐｔｉＭＥＭ(Gibco)で４×最終濃度に希釈した。LIPOFECTAMINE RNAIMAX Transfection Reagent(Invitrogen CAT#13778150)を４×最終濃度に希釈した(最終＝０.３μL／２５μL／ウェル)。ＲＮＡＩＭＡＸおよびｈｓｉＲＮＡを１：１で混合し、５０μLを５０μLの細胞に３％ＦＢＳ最終のために添加した。細胞を７２時間、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２４６】
ｍＲＮＡ定量化
ｍＲＮＡを、QUANTIGENE 2.0アッセイ(Affymetrix QS0011)を使用して定量化した。細胞を２５０μL希釈溶解混合物、１部溶解混合物、２部Ｈ２Ｏと、０.１６７μg／μLプロテイナーゼＫ(Affymetrix QS0103)で３０分、５５℃で溶解した。細胞ライセートを徹底的に混合し、４０μL(〜８０００細胞)のライセートをプロテイナーゼＫを含まない４０μLのさらなる希釈溶解混合物と共に捕捉プレートに添加した。組織を、５mg組織パンチについて、２μg／μLプロテイナーゼＫ含有３００μLの均質化緩衝液(Affymetrix)を使用して同様に処置した。次いで組織を、９６ウェルプレート形式でQaigen TissueLyzerで均質化し、４０μLを捕捉プレートに添加した。プローブセットをAffymetrixプロトコールに特定されるように希釈し、２０μLのＨＴＴまたはＰＰＩＢプローブ(Affymetrix：SA-50339, SA-10003)を捕捉プレートの各ウェルに最終体積１００μLまで添加した。シグナルを製造プロトコールに従い増幅させた。発光をVeritas LuminometeまたはTecan M 1000で検出した。
【０２４７】
生存細胞染色および脳切片免疫染色
生存細胞取り込みモニタリングについて、細胞を３５mmガラス底皿あたり２×１０５細胞密度で播種し、一夜増殖させた。造影前に、細胞小器官を、特記しない限り、Life Technologiesから購入した染色試薬を使用してＨＢＳＳ(Gibco)において染色した：細胞核、小胞体およびリソソームを、製造業者の指示どおり、NUCBLUE LIVE READYPROBE、ER-TRACKER Green(Bodipy FL Glibenclamide)およびLYSOTRACKER Deep Red試薬を使用して、各々染色した。造影を、フェノールレッドなしの非補足ＤＭＥＭで実施した(Invitrogen)。細胞を０.５μMのＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡで処置し、生存細胞造影を経時的に実施した。
【０２４８】
共焦点造影
全共焦点画像を、60x Plan/APOオイルレンズおよびCoolsnap HQ2カメラ(Roper)を備えたＴＥ〜２００Ｅ２倒立顕微鏡(Nikon)にマウントしたCSU10B Spinning Disk Confocal System scan head(Solamere Technology Group)で獲得した。画像をImageJ(1.47v)ソフトウェアを使用して処理した。ｈｓｉＲＮＡを伴わないまたは伴うニューロン数をＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計数した。脳切片画像を、１μmのｚ軸スペーシングで獲得した。
【０２４９】
プローブ検証
ＨＴＴ検出プローブセットを神経細胞で検証した。２タイプのプローブセット(エキソン−エキソン−同一ハイブリダイゼーション配列(エキソン２７−３５)；およびエキソン−エキソン−異なるハイブリダイゼーション配列(エキソン２７−３５およびエキソン６０−６７))を特異性検証に使用した。プローブからの大多数の検出シグナルはｈｔｔ−ｍＲＮＡに特異的であることが示された(データは示していない)。２つのさらなるタイプのプローブ−セット(エキソン−イントロン−異なるハイブリダイゼーション配列(エキソン２７−３５およびイントロン６０−６１)；およびエキソン−エキソン−異なるハイブリダイゼーション配列(エキソン２７−３５およびエキソン６０−６７))を使用して、核シグナルがイントロン特異的ではないことを検証した。イントロン特異的プローブは、転写部位に特異的な核でほぼ重複を示さず、エキソン特異的プローブは高程度の重複を示すことが観察された。
【０２５０】
実施例５. 完全代謝安定化はコンジュゲート介在ｓｉＲＮＡ送達インビボに必須である
低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)ベースの薬物は、安定性を促進し、自然免疫を最小化し、そして標的組織への送達を可能とするために化学修飾／製剤を必要とする。部分的修飾ｓｉＲＮＡ(最大７０％の塩基修飾)を、ＲＮＡｉ送達についてのバイオコンジュゲート有効性の探索に一般に使用した。ここに開示するデータは、完全修飾(１００％の塩基修飾)が全身性コンジュゲート介在ｓｉＲＮＡ送達に絶対に必須であることを示す。完全修飾は、局所投与による分布、効力および作用の期間を劇的に改善する。肝臓および腎臓を含む組織は、２桁高いレベルの完全修飾疎水性ｓｉＲＮＡ(ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ)を保持し、これは、標的の確固たるサイレンシングを支持する。
【０２５１】
交互の２’−メトキシ、２’−フルオロパターン骨格に基づく一団の小、非対称、完全修飾バリアントのスクリーニングは、１００％の試験化合物が、サイレンシング効力を損なうことなく、適用が成功したことを示した。それ故に、完全修飾、非対称ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ送達を促進し、ＲＮＡｉの臨床的有用性を拡張する新規化学を発見するための骨格を提供する。
【０２５２】
この実施例は、コンジュゲート介在インビボ分布および効力に対する完全修飾対慣用修飾ｓｉＲＮＡ骨格の影響をサイド・バイ・サイドで比較する。疎水性(例えば、コレステロール)修飾非対称ｓｉＲＮＡを例として使用した(図２９)。部分的修飾ｓｉＲＮＡへのコレステロールコンジュゲーションは、インビトロで確固たる細胞取り込みをもたらし(Khvorova A., S. W., Kamens J., Samarsky D., Woolf T., Cardia J. . Reduced size self-delivering RNAi compounds. USA patent (2014); Lorenz, C., Hadwiger, P., John, M., Vornlocher, H. P. & Unverzagt, C. Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells. Bioorg Med Chem Lett 14, 4975-4977, doi:10.1016/j.bmcl.2004.07.018S0960-894X(04)00908-4 [pii] (2004))、インビボで局所的に強力なサイレンシングをもたらしたが(Byrne, M. et al. Novel hydrophobically modified asymmetric RNAi compounds (sd-rxRNA) demonstrate robust efficacy in the eye. Journal of ocular pharmacology and therapeutics : the official journal of the Association for Ocular Pharmacology and Therapeutics 29, 855-864, doi:10.1089/jop.2013.0148 (2013))、最低限度の全身効力であり(Soutschek, J. et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature 432, 173-178, doi:10.1038/nature03121 (2004))、それゆえに送達における完全ｓｉＲＮＡ修飾の影響の可能性の評価の良好なモデルを表す。
【０２５３】
非修飾ＲＮＡは、エンドヌクレアーゼおよびエイソヌクレアーゼの組み合わせにより迅速に分解され、故に、内部および末端修飾両者が安定性に必要である。ｓｉＲＮＡの完全化学修飾は、RNA Induced Silencing Complex(ＲＩＳＣ)相互作用を妨害できるが、いくつかの配置は、極めて限定的な数の配列の状況においてのみであるが、ネイキット化合物と活性適合性を有することが報告されている(Deleavey, G. F. et al. The 5' binding MID domain of human Argonaute2 tolerates chemically modified nucleotide analogues. Nucleic acid therapeutics 23, 81-87, doi:10.1089/nat.2012.0393 (2013); Stokman, G., Qin, Y., Racz, Z., Hamar, P. & Price, L. S. Application of siRNA in targeting protein expression in kidney disease. Advanced drug delivery reviews 62, 1378-1389, doi:10.1016/j.addr.2010.07.005 (2010))。
【０２５４】
センス鎖の開裂が不可能であることは、完全化学修飾ｓｉＲＮＡ  ＲＩＳＣエントリーの限定的因子の一つである。非対称骨格(センス鎖における１５塩基、ガイド鎖における２０塩基)の使用は、二本鎖Ｔｍを低減し、これにより、効率的ＲＩＳＣ充填に必要なセンス解離を容易とした。さらに、一本鎖、完全ホスホロチオエート化テイルの存在は、慣用のアンチセンス化合物に類似する機構でのこれらのタイプの化合物のコンジュゲート化介在細胞内在化を増強した。
【０２５５】
一団の完全修飾ｈｓｉＲＮＡバリアントの効力を、ＤａｇｍａおよびＢｈａｔ研究室で報告されたパターンに基づき、評価した。最初のスクリーニングを、最近同定されたハンチンチン−ターゲティングｈｓｉＲＮＡの状況で実施した(lterman et al., 2015, Molecular Therapy、審査中)。ガイド鎖の５’位置における化学的リン酸化２’−メトキシ修飾Ｕから開始する、交互の２’−フルオロ、２’−メトキシパターンが最良の性能であることが示されたが、いくつかの他の配置は、ほぼ機能的であった(図２９)。修飾パターンを、アンチセンス鎖の一つの位置における化学的リン酸化２’−メトキシで開始することが重要であることが示された。２’−フルオロに類似するパターンで出発して、少なくとも配列のいくつかで、効力に悪影響を有することが示された。科学的理論に縛られることを意図しないが、これは、重度修飾二本鎖の十分耐性ではない、ガイド鎖における２位および１４位の２’−メトキシの置換と関係する可能性がある。ガイド鎖の化学リン酸化はまた末端２’−メトキシＵが細胞内キナーゼの良好な基質ではないため、必須であると決定された。さらに、末端ホスホロチオエートを、オリゴヌクレオチドの３’および５’末端の両方に添加し、さらにエキソヌクレアーゼ抵抗性を提供した。図２９は、慣用修飾ｈｓｉＲＮＡと比較した、最適な配置の構造およびＰｙＭＯＬモデルを示す。
【０２５６】
この化学修飾パターンを、先に同定されたいくつかの機能的ｈｓｉＲＮ配列に適用し、類似のまたは改善された効力が示された(図２９Ｃ〜２９Ｄ)。興味深いことに、最も顕著な改善効果が懸濁液中の一次栄養芽細胞で見られ、そこで、コレステロール介在取り込みは長くかかり、それ故に、さらなる安定化の相対的影響がより顕著であった。さらに、この化学修飾パターンを、いくつかの公開された配列ターゲティングＴｉｅ−２およびＳｏｄ１に適用し、同様に成功した。
【０２５７】
これらの現象が他のコンジュゲートに関連するかを一般化するために、部分的および完全修飾ＧａｌＮａｃコンジュゲート化ｓｉＲＮＡの効力を初代肝細胞で試験した。類似の、完全代謝化合物が、部分的修飾化合物より肝細胞で顕著に活性であることが示された。
【０２５８】
一般に、化学修飾の導入は、しばしばｓｉＲＮＡ効力に負の影響を有し、ネイキッドの、機能亢進ｓｉＲＮＡは、広範囲の化学修飾パターンの状況で効力を失う。ＲＩＳＣ複合体の効率的認識に必要なＡ型ＲＮＡ螺旋は、Ｃ３’−エンドリボース確認により支持され、優先的に２’−フルオロおよび２’−メトキシ修飾に適合される。交互の修飾は、効率的ＲＩＳＣエントリーに必須の熱力学的安定性を調節し、これは、２’−ＦＡＮＡおよび２’−フルオロハイブリッドで以前詳細に研究されている。
【０２５９】
部分的ｓｉＲＮＡ修飾(全ピリミジン)は、インビトロでの安定性の劇的増加をもたらし(５０％ＦＢＳまたはヒト血清における分単位から日単位の増加)、これは、完全修飾ｓｉＲＮＡで報告された安定増加に類似する。インビボで、オリゴヌクレオチドは組織中に分布し、インビトロでの模倣が困難である条件である、攻撃的ヌクレアーゼ環境に晒される。それ故に、これらの修飾パターンの安定性は全く違う可能性ある。
【０２６０】
インビボでの完全修飾の疎水性ｓｉＲＮＡ効力および分布に対する影響を評価するために、１０mg／kgの部分的修飾および完全修飾Ｃｙ３標識ｈｓｉＲＮＡをマウスに静脈内  (ＩＶ)および皮下(ＳＣ)投与した(図３０)。２４時間後、組織分布を蛍光顕微鏡により評価し、ガイド鎖組織蓄積レベルを、ＰＮＡベースアッセイのＨＰＬＣベースの分離を使用して定量的に測定した。ＰＮＡアッセイは、組織におけるオリゴヌクレオチド保持の定量的評価を可能とする単純ハイスループットアッセイであり、臨床的サンプル評価ための、記載され、Ａｘｏｎ研究室で使用されているものに適合された。
【０２６１】
第一に、主臓器への蛍光保持および分布の劇的増加が、完全代謝安定化化合物でかんさｔ得された(図３０Ａ)。部分的修飾ｈｓｉＲＮＡの単回注射後の蛍光レベルは最低限度であり、主に肝臓および腎臓に限定されるが、完全代謝安定化は、肝臓、腎臓および脾臓への劇的オリゴヌクレオチド蓄積、ならびに脂肪および皮膚を含む他の組織への効率的分布をもたらした。ＩＶおよびＳＣ投与による蓄積レベルは同等であり、類似することが判明した(図３０Ｂおよび３０Ｃ)。興味深いことに、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡは、内皮細胞およびマクロファージに優先的に蓄積され、肝細胞には二次的にしか蓄積しない。それ故に、疎水性修飾化合物は、肝臓肝細胞に優先的に送達されるＧａｌＮａｃと分布が異なった。
【０２６２】
定量的に測定したとき、結果はさらにはるかに顕著であった。部分的修飾化合物は、２４時間で組織で最小レベルのインタクトガイド鎖が検出されたが、完全修飾化合物は、肝臓、腎臓および脾臓に約２００ng／mgのレベルまで(図３０Ｂ、３０Ｃ)および他の数組織でng／mgレベルで蓄積された。著しくは、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡで、類似レベルのインタクトガイド鎖が投与５日後検出され、注射用量の８０％近くを占めた(図３０)。これは、完全修飾化合物が組織に送達されるだけでなく、組織に長期間保持されることも示した。
【０２６３】
これらのデータは、高濃度の化合物、すなわち、５０〜８０mg／kgの反復投与が、何らかのサイレンシング活性の検出に必要であったという、部分的修飾ｓｉＲＮＡの全身送達のために疎水性修飾(コレステロール、脂肪酸など)を使用した先に公開された試みと一致する。
【０２６４】
肝臓および腎臓蓄積レベルが、サイレンシング誘発に一般に必要であるレベル(通常１０〜２０ng／mgを超える)を超えるため、観察される確固たる送達が機能的サイレンシングをもたらすかを確認した。疎水性修飾化合物は、内皮に優先的に送達され、故に内皮に優先的に発現されるＦＬＴ１の可溶性アイソフォーム(ＶＥＧＦＲ１)を、最近同定されたｈｓｉＲＮＡ化合物ターゲティングｓＦＬＴ１を使用して、標的化した(Turanov et al, 2015、発表準備中)。
【０２６５】
化合物を、２つの異なるマウス系統に投与した。両場合共、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡの全身投与は、投与５日後測定した肝臓および腎臓で、ｓＦＴＬ１の確固たるサイレンシングを誘発した。最初の研究において、サイレンシングをＰＢＳ注射動物と比較した。化学関連効果の可能性について制御する第二の研究において、ＰＢＳおよび同じ化学組成の非ターゲティング対照(ＮＴＣ)の両方を使用した。ＮＴＣではなく、ＳＦＬＴ１ターゲティングＦＭ−ｈｓＲＮＡがｓＦＬＴ１発現を低減させた。
【０２６６】
全オリゴヌクレオチドが、肝臓に優先的に分配され、故に、予想どおり、肝臓効力が証明された。さらに、類似レベルの化合物が腎臓に蓄積され、効率的サイレンシングがもたらされた。腎臓ｓｉＲＮＡ送達に対して当分野でデータが少ない(Stokman, G., Qin, Y., Racz, Z., Hamar, P. & Price, L. S. Application of siRNA in targeting protein expression in kidney disease. Advanced drug delivery reviews 62, 1378-1389, doi:10.1016/j.addr.2010.07.005 (2010))。部分的修飾(交互の２’−メトキシ)を、腎臓近位尿細管送達について試験した。大部分は４時間後除去され、２４時間後検出可能でなかった(Molitoris, B. A. et al. siRNA Targeted to p53 Attenuates Ischemic and Cisplatin-Induced Acute Kidney Injury. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 20, 1754-1764, doi:10.1681/ASN.2008111204 (2009))。
【０２６７】
それ故に、ｓｉＲＮＡの完全修飾が、全身送達およびインビボ効力に絶対に必須であることが決定された。医薬品化学における１０年の努力にも関わらず、肝臓は、現在、インビボ効力を有する非製剤化ｍｉＲＮＡの唯一の標的である。科学的理論に縛られることを意図しないが、ここに示すデータは、この事実を一部説明するはずである。種々のコンジュゲート(例えば、ペプチド、抗体、小分子、疎水性修飾など)を探索する試みの大部分が部分的修飾ｓｉＲＮＡの内容で実施されたため、インビボ安定化の欠如は、確固たる効力の欠如に寄与する主要因子の一つであるはずである；コンジュゲートが取り込みの促進に利用可能な時間を制限する。また、効力を示さないか、わずかである文献に記載されているｓｉＲＮＡが、ここに記載する骨格の使用により、劇的に増強された効力を示す可能性もある。
【０２６８】
部分的修飾疎水性ｓｉＲＮＡが全身性に活性ではないのは明らかであるが、インビボで局所投与により眼(Byrne (Supra))、皮膚(Khvorova (Supra))および脳(Alterman et al, Molecular Therapy, 審査中)のような組織に確固たる遺伝子サイレンシングを誘発できる。局所投与によるｓｉＲＮＡ効力に対する完全修飾の影響を評価するために、慣用のおよび完全修飾ｓｉＲＮＡを、脳脊髄液(ＣＳＦ)に脳室内注射した。全身投与に類似して、ＣＳＦ点滴による完全修飾ｈｓｉＲＮＡの使用は、組織におけるオリゴヌクレオチド保持レベルならびに脳にわたる分布の程度の両者を劇的に増強させた(図３１Ａ)。ＣＹ３標識ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡで、化合物は、皮質、線条体、小脳および他の脳組織に分配し(図３１Ｂ〜Ｄ)、劇的な量が注射脳室付近に保持された。慣用の、部分的修飾ｈｓｉＲＮＡで、少量が脳室周囲および直ぐ隣の組織で検出されたが、全体として分布は限定的であった。
【０２６９】
局所投与によるインビボ効力に対する完全安定化の影響を試験するため、脳に直接(線条体内)投与した２タイプの化合物の用量応答および効果期間を試験した。
【０２７０】
線条体に注射したとき、部分的修飾ｈｓｉＲＮＡは、１０μg以上の用量レベルで強力なサイレンシング(図３１)を誘発した。サイレンシングは６μgおよび３μgで消失した。完全修飾ｈｓｉＲＮＡで、類似レベルのサイレンシングが、試験した全用量で観察され(図３１Ｆ)、完全修飾化合物が局所投与によりインビボでより強力であることが示された。
【０２７１】
効果期間を比較するとき、差異はさらに顕著であった。部分的修飾はサイレンシングは２週間で消失したが、完全修飾化合物は、ＨＴＴ遺伝子のサイレンシングを１週間、２週間および４週間続け(図３１Ｇ)、無影響と考えられる調節レベルであった。それ故に、局所的に、完全化学修飾は、効力、および、より重要なことに、効果期間の劇的誘発をもたらした。
【０２７２】
要約すると、ここに記載されるのは、非対称構造枠に適用された交互の２’−フルオロ、２’−メトキシ修飾パターンを有するｓｉＲＮＡ骨格である。ここに記載するとおり、この骨格は、広範な先に同定された機能的ｓｉＲＮＡ化合物に適用して、成功できた。化学修飾パターンはＲＩＳＣエントリーを妨害せず、天然ＲＮＡと同程度に効率的にＲＩＳＣ複合体により認識された、完全化学修飾化合物をもたらした。ＲＩＳＣ開裂動力学に対するこの化学の正確な影響は、単一分子アプローチを使用して試験される。科学的理論に縛られることを意図しないが、短い(例えば、１５塩基)センス鎖の使用が、ＲＩＳＣ充填に必要な非開裂可能センス鎖の解離を容易にでき、故に十分に安定化された化合物のＲＩＳＣ充填における制限的工程の一つを軽減する可能性がある。
【０２７３】
全身的に投与したとき、完全修飾ｈｓｉＲＮＡは、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、皮膚などを含む大部分の組織に蓄積され、肝臓および腎臓においてサイレンシングが確認された。ここで示される腎臓における確固たる効力は、この高度に臨床的に関連する臓器へのコンジュゲート介在送達の初めての例であり、腎臓関連疾患および障害の新規治療の開発のための選択肢を開く。さらに、完全修飾は、脳に局所投与したときの、インビボでの疎水性修飾ｓｉＲＮＡの効力を劇的に増強させ、および、最も重要なことに、効果期間を増強させた。単回注射が、少なくとも１ヶ月、おそらく最も長く続くサイレンシングを誘発し、この化学が、単回投与による長期サイレンシングの見込みを提供することを示す。部分的修飾化合物、サイレンシングが１週間しか持続しなかったのは驚きであった。一般に、充填ＲＩＳＣ複合体は、特に神経細胞のような非分裂細胞において、長期生存した。実際、主要な神経培養において、単回処置は、サイレンシングを少なくとも３週間誘発した。ここに記載するデータは、脳におけるインビボ充填ＲＩＳＣ複合体の半減期(少なくとも試験配列について)が、もともと予測されていたより短いことを示す。
【０２７４】
これらのデータは、完全化学修飾(すなわち、さらなる安定化)は、コンジュゲート送達ｓｉＲＮＡのインビボ効力の主要寄与因子である。ここに提供するデータは、単純、完全修飾非対称ｓｉＲＮＡ骨格を、多数のコンジュゲーションモダリティのスクリーニングに使用でき、肝臓以外のＲＮＡｉの臨床的利用の拡大の大きな進歩をもたらす希望がある。
【０２７５】
引用による取り込み
本明細書を通して引用され得る引用文献(文献、特許、特許出願およびウェブサイトを含む)を、引用文献がここに引用される限り、その全体を、あらゆる目的のために、ここに明示的に包含させる。特に断らない限り、本開示は、当分野で周知の免疫学、分子生物学および細胞生物学の慣用の技術を使用する。
【０２７６】
本開示はまた、分子生物学および薬物送達分野で周知の技術を、その全体として引用により包含させる。これらの技術は、次の刊行物に記載される技術を含むが、これらに限定されない。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２３−６】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２４−５】
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【図２４−６】
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【図２４−７】
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【図２４−８】
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【図２４−９】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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