(57)【要約】  本発明は、ジユビキチンのＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位から選択された１２、１３又は１４の配置で改変されたジユビキチンに基づく新規の結合タンパク質に関するものであり、選択された標的に高い親和性で特異的に結合することができる。本発明は更に、この結合タンパクの生成方法を提供する。また、Ｒ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位から選択された１２、１３又は１４の配置で改変されたジユビキチン変異タンパク質に基づくこの結合タンパクをコードするライブラリーが提供される。【選択図】図１
2018520675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジユビキチン（配列番号４）に由来する結合タンパク質の生成方法であって、少なくとも１０００ｎＭの解離定数（ＫＤ）で所定の標的に結合する結合タンパク質の生成方法において、
ａ．ジユビキチン（配列番号４）核酸分子のヌクレオチドトリプレットを、ジユビキチンの直鎖ポリペプチド配列（配列番号４）のアミノ酸Ｒ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位をコードする１２、１３又は１４の配置における変異に供するステップと、
ｂ．１又は複数の変異タンパク質の核酸分子を生成するステップと、
ｃ．適切な発現系においてステップ（ｂ）で得られた１又は複数の核酸分子を発現させるステップと、
ｄ．選別及び／又は単離によって、所定の標的に対して少なくとも１０００ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有する前記１又は複数のジユビキチン変異タンパク質を濃縮するステップと、
を具え、
前記結合タンパク質が、ジユビキチン（配列番号４）と８５％乃至９２％の配列相同性を有し、前記標的への親和性がジユビキチン（配列番号４）よりも１０倍高いことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記標的がペプチド、タンパク質又はタンパク質のドメインであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記標的がＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３又はｅｐＣＡＭから選択されることを特徴とする方法。
【請求項４】
ジユビキチン（配列番号４）の変異タンパク質をコードする核酸ライブラリーにおいて、配列番号４のＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６６位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位のうち１２、１３又は１４の配置から選択されたアミノ酸残基が、前記変異タンパク質において置換されることを特徴とするライブラリー。
【請求項５】
ジユビキチンよりも少なくとも１０倍高い標的親和性を有する結合タンパク質を同定する方法において、請求項４に記載のライブラリーをスクリーニングして、所定の標的に結合するポリペプチドを同定するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、請求項４に記載のライブラリーを提供して、前記ライブラリーに潜在的な標的を提供するステップと；前記標的を前記ライブラリーに接触させるステップと；スクリーニングプロセスによって結合タンパク質を同定するステップであって、前記結合タンパク質が、少なくとも１０００ｎＭの特異的結合親和性で前記標的に結合する、ステップと；選択的に、前記結合親和性を有する前記結合タンパクを単離するステップと；を具えることを特徴とする方法。
【請求項７】
標的への親和性を有する結合タンパク質において、前記結合タンパク質が、ジユビキチン（配列番号４）のＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位から選択された１２、１３又は１４個のアミノ酸において置換されたアミノ酸配列を含み、前記結合タンパク質が、ジユビキチン（配列番号４）と８５％−９２％の配列相同性を有し、前記標的親和性が、ジユビキチン（配列番号４）よりも少なくとも１０倍高いことを特徴とする、結合タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載の結合タンパク質において、当該結合タンパク質が、ジユビキチンの１、２、３、４、５又は６個の更なるアミノ酸の置換を含むことを特徴とする結合タンパク質。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の結合タンパク質において、当該結合タンパク質が、ペプチド、タンパク質又はタンパク質のドメイン、好適にはＨｅｒ２又はＥＧＦＲ又はＣＤ３又はＥｐＣＡＭから選択された標的に対して、少なくとも７００ｎＭ、好適には少なくとも１００ｎＭ、より好適には少なくとも１０ｎＭの特異的結合親和性を有することを特徴とする結合タンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載の結合タンパク質において、前記アミノ酸配列が配列番号５―４２のアミノ酸配列から選択されることを特徴とする結合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の結合タンパク質において、好適には、（ｉ）ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合ペプチド又は免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント、多糖から選択される薬物動態の調節部分、（ｉｉ）モノクローナル抗体又はそのフラグメント、サイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物、酵素又はその誘導体、又は放射性核種から選択的に選択される治療有効成分（ｉｉｉ）選択的に蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、又は放射性核種から選択される診断成分、からなる群（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つの群から選択された、少なくとも１つの追加の分子を更に含むことを特徴とする結合タンパク質。
【請求項１２】
請求項７乃至１１の何れか１項に記載の結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
請求項７乃至１１の何れか１項に記載の結合タンパク質、請求項１２に記載の核酸、又は請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞又は非ヒト宿主。
【請求項１５】
請求項７乃至１１の何れか１項に記載の結合タンパク質、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１３に記載のベクター、又は請求項１４に記載の宿主細胞の医薬への使用。
【請求項１６】
請求項７乃至１１の何れか１項に記載の結合タンパク質、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１３に記載のベクター及び／又は請求項１４に記載の宿主細胞を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位、及びＴ１４２位から選択された１２、１３又は１４の位置が改変されたジユビキチンに基づく新規結合タンパク質であって、選択された標的に高親和性で特異的に結合できるタンパク質を開示するものである。この結合タンパク質は、リンカーなしで直接結合した２つのユビキチン変異タンパク質部分に基づいている。更に本発明は、この結合タンパク質の生成方法を提供する。また、Ｒ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位から選択された１２、１３又は１４の位置を改変したジユビキチン変異タンパク質に基づく、結合タンパク質をコードするライブラリーを提供する。
【背景技術】
【０００２】
非免疫グロブリンに基づく結合剤は、疾患の診断、予防及び治療の医療分野において有益に使用できる。組織の浸透性を改善し良好な生体分布特性を有するより小さいサイズの分子と組み合わせた、特異的標的に対する同等あるいは、より良好な親和性と特異性をもつポリペプチドを提供することで、疾患の診断、予防及び治療用抗体での課題が解決するものと考えられる。
【０００３】
非免疫グロブリン由来低分子タンパク質の中でも、改変ユビキチンに基づく分子は、抗体と比較して代替的な治療や代替的な診断の可能性を有しているため、特に興味深い。ユビキチンは、全ての既知の真核細胞でよく保存された低分子単一ドメインタンパク質であり、全ての脊椎動物間で１００％保存されている。ユビキチンは、更に、免疫原性を低下させる血清中に、天然に存在している。このことから、毒物学及び有効性研究に必要な、異種における前臨床開発を容易に進めることができる。
【０００４】
標的特異的ユビキチン変異タンパク質は、Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨの登録商標）タンパク質として知られている（例えば、ＥＰ１６２６９８５Ｂ１、ＥＰ２３７９５８１Ｂ１、ＥＰ２０９４８４５Ｂ１及びＷＯ２０１２／１７２０５５を参照）。Ａｆｆｉｌｉｎタンパク質は、所望の標的に対してデノボ結合親和性をもつように設計されており、生体分子の標的化と、捕捉を必要とする用途に理想的なものに適している。更に、Ａｆｆｉｌｉｎをベースとした分子は、標的化並びに半減期を調節する化学的結合用の他の機能性分子とコンジュゲートすることができる（例えば、ＷＯ２０１２／１７２０５８、ＷＯ２０１４／０９４７９９を参照）。
【０００５】
本発明の目的は、新規結合タンパク質と、標的に対して高い結合能力を有するジユビキチン変異タンパク質の生成及び同定方法とを提供することである。本発明の更なる目的は、ジユビキチン変異タンパク質に基づく新規結合タンパク質を同定するライブラリーを提供することである。
【０００６】
上述の目的及び利点は、添付の独立請求項の主題により達成される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項ならびに以下の説明、実施例及び図面に含まれる。上記の概要は、本発明によって解決される全ての課題を必ずしも説明するものではない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一様態は、所定の標的、好適にはタンパク質又はペプチド又はタンパク質のドメインに、少なくとも１０００ｎＭの解離定数（ＫＤ）で結合する結合タンパク質を生成する方法に関するものであり、この方法は、ジユビキチン（配列番号４）の核酸分子のヌクレオチドトリプレットを、ジユビキチン直鎖ポリペプチド配列の Ｒ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位のアミノ酸をコードする少なくとも１２、１３又は１４の配置において変異誘発に供して、１又は複数のジユビキチン変異核酸分子とするステップと、適切な発現システムにおいて（ｂ）で得られた１又は複数のジユビキチン核酸分子を発現させるステップとを含み、この結合タンパク質は、ジユビキチン（配列番号４）と８５％−９２％の配列相同性を有しており、標的への親和性は、ジユビキチンよりも少なくとも１０倍高い。
【０００８】
更なる様態は、ジユビキチン変異タンパク質をコードする核酸ライブラリーに関するものであり、ジユビキチンのＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位の配列の１２、１３及び１４の配置から選択されたアミノ酸残基は変異タンパク質において置換されている。
【０００９】
別の様態は、ジユビキチンよりも少なくとも１０倍高い標的親和性を有する結合タンパク質を同定する方法に関するものであり、ライブラリーをスクリーニングして、所定の標的に結合するポリペプチドを同定するステップを含む。また別の様態において、本願発明は、アミノ酸配列を具える標的への親和性を有する結合タンパク質に関するものであり、ジユビキチン（例えば配列番号４又は配列番号４３）のＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位から選択された少なくとも１２、１３又は１４のアミノ酸が置換されており、結合タンパク質は、ジユビキチン（例えば配列番号４又は配列番号４３のように少なくとも９５％の相同性を有する配列）と８５％−９２％の配列相同性を有するものであり、標的に対する親和性は、ジユビキチン（例えば、配列番号４又は配列番号４３のように少なくとも９５％の同一性を有する配列）よりも少なくとも１０倍高い。結合タンパク質は、選択的に、ジユビキチンの１、２、３、４、５又は６の更なるアミノ酸置換を含んでいる。更に結合タンパク質は、好適にはペプチド、タンパク質、タンパク質のドメイン等の標的に対する、少なくとも１０００ｎＭ、好適には少なくとも５００ｎＭ、好適には少なくとも１００ｎＭ、好適には少なくとも１０ｎＭの特異的結合親和性（ＫＤ）を有するものであってもよい。この標的への親和性は、ジユビキチンの少なくとも１０倍高い。
【００１０】
更なる様態において、本発明は、好適には（ｉ）ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ペプチド、又は免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンフラグメント、多糖から選択される薬物動態の挙動を調節する薬物動態部分、（ｉｉ）モノクローナル抗体又はそのフラグメント、サイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物、酵素又はその誘導体、又は放射性核種から任意に選択される治療上の有効成分、及び（ｉｉｉ）蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、又は放射性核種から任意に選択される診断成分、からなる群（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つの員から選択される少なくとも１つの追加分子を含む結合タンパク質に関する。
【００１１】
本発明はまた、更なる態様において、本発明の変異タンパク質を含むか、或いは実質的に本発明の変異タンパク質から成るか、あるいは本発明の変異タンパク質から成る結合タンパク質をコードする１又は複数の核酸を提供する。また、この１又は複数の核酸を含む１又は複数のベクターや、１又は複数のベクターを含む１又は複数の宿主細胞も提供する。
【００１２】
本発明の概要は、必ずしも本発明の全ての特徴を説明するものではない。  他の実施形態は、以下の発明の詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ジユビキチンのモデルを示す。ＳＰＩＦライブラリーの生成に選択されたアミノ酸残基は黒色で示されている。
【図２】図２は、ＳＰＩＦライブラリーの生化学的特性を示している。図２Ａでは、直接連結（すなわち、２つのユビキチン部分間にペプチドリンカーのない）したジユビキチン変異タンパク質（ＳＰＩＦ、ＳＰＫＫ、ＳＰＧＯ、ＳＰＯＯという）又はペプチドリンカーを介して結合されたジユビキチン変異タンパク質（ＳＰＶＦという）に基づく５つの異なるライブラリーによってコードされたタンパク質の溶解性を比較している。ＳＰＶＦライブラリー（アミノ酸ペプチドリンカーを介して連結された両方のユビキチン部分（配列番号１）における６−８位、６２−６６位において無作為に抽出された）を除く、ライブラリーＳＰＩＦ、ＳＰＫＫ、ＳＰＧＯ及びＳＰＯＯは、ジユビキチン（配列番号４；詳細は実施例を参照）の４２−７４位及び１２２−１４２位の間で開始する無作為に抽出された少なくとも１４の配置を有している。縦軸は、ライブラリーによってコードされたタンパク質の７０％を超える溶解度の値を示している。驚くべきことに、ＳＰＩＦライブラリーによってコードされるタンパク質は、試験した他のすべてのライブラリーと比較して、高い可溶性を有している。このタンパク質の凝集レベルは、他のライブラリーによってコードされたタンパク質と比較すると、非常に低い（ＳＰＩＦ）。図２Ｂは、上記の５つの異なるライブラリーによってコードされるタンパク質の発現を比較したグラフである。驚くべきことに、ＳＰＩＦライブラリーによってコードされるタンパク質は、強い総発現値を示している。
【図３】図３は、本発明の結合分子を示す表である。図３Ａには、Ｈｅｒ２結合タンパク質を生成するために置換したジユビキチン（配列番号４）の位置が列挙されている。第１列には、対応するアミノ酸位置が記載されている。すべてのＨｅｒ２結合タンパク質（例えば、配列番号５−３８）は、配列番号４のＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位、Ｔ１４２位から選択された少なくとも１２、１３又は１４の配置が改変されている。表における“．”は、例えば、配列番号：６、３１、３３、３４、３５、３６、３７における野生型位置（変化なし）を示している。図３Ｂは、図３Ａと同じアミノ酸交換を示すが、この交換は、同様の生物物理学的特性を有するアミノ酸をグループ化する以下のコードに従って翻訳される。交換は、類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸をグループ化する以下のコードに従って翻訳される。波線“〜”は、極性アミノ酸（Ｔ、Ｓ、Ｎ又はＱ）の符号であり、“Ｈ”は疎水性アミノ酸（例えばＡ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｉ）の符号であり、“Ｏ”は芳香族アミノ酸（例えばＦ、Ｗ、Ｙ）の符号であり、“＋”は塩基性アミノ酸（例えばＫ、Ｒ、Ｈ）の符号であり、“−”は酸性アミノ酸（例えばＤ、Ｅ）の符号であり、“Ｇ”はグリシンに対応している。図３Ｃには、更なる改変が列挙されている。全てのＨｅｒ２結合タンパク質は、配列番号４の４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位及び１４２位から選択した少なくとも１２の配置に加えて、０、１、２、３、４、５、又は６個の更なる改変部分を有している。図３Ｄは、図３Ｃと同じアミノ酸交換を示しているが、この交換は、図３Ｂに記載されたものと同様の生物物理特性を有するアミノ酸をグループ化するコードに従って、翻訳されている。
【図４】図４は、ＳＰＲを用いたラベルフリーの相互作用アッセイを介した、ジユビキチン変異タンパク質のタンパク質標的についての結合タンパク質の解析結果を示すグラフである。異なる濃度のＡｆｆｉｌｉｎタンパク質を、チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）上に固定したジユビキチン（配列番号４）のタンパク質標的への結合について分析して、Ａｆｆｉｌｉｎとジユビキチンのタンパク質標的間の相互作用を分析した。図４Ａは、Ｈｅｒ２に対するＡｆｆｉｌｉｎ−１４２６２８の結合反応速度を示すグラフである。濃度は：０ｎＭ、０．１４ｎＭ、０．４１ｎＭ、１．２３ｎＭ、３．７０ｎＭ、１１．１１ｎＭ及び３３．３３ｎＭである。図４Ｂは、ＥｐＣＡＭに対するＡｆｆｉｌｉｎ−１４３４８８の結合反応速度を示すグラフである。濃度は、長破線（１５．６ｎＭ）、中破線（３１．２５ｎＭ）、短破線（６．５ｎＭ）、点線（１２５ｎＭ）、一点鎖線（２５０ｎＭ）、二点鎖線（５００ｎＭ）及び２重中破線（ｍｅｄｉｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ）（１０００ｎＭ）である。１：１結合様式（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）に従って、ｅｐＣＡＭに対する１５０ｎＭのＫＤを測定した。図４Ｃは、ＥｐＣＡＭに対するＡｆｆｉｌｉｎ−１４３２８３の結合反応速度を示すグラフである。濃度は、長破線（３．１３ｎＭ）、中破線（６．２５ｎＭ）、ソリッド（Ｓｏｌｉｄ）（１２．５ｎＭ）、短破線（２５ｎＭ）、点線（５０ｎＭ）、一点鎖線（１００ｎＭ）及び二点鎖線（２００ｎＭ）である。１：１結合様式（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）に従って、ｅｐＣＡＭに対する３２ｎＭのＫＤを測定した。図４Ｄは、ＣＤ３に対するＡｆｆｉｌｉｎ−１４４１６０の結合反応速度を示すグラフである。濃度は、長破線（２ｎＭ）、中破線（４ｎＭ）、短破線（８ｎＭ）、点線（１６ｎＭ）、一点鎖線（３２ｎＭ）、二点鎖線（６４ｎＭ）、２重中破線（ｍｅｄｉｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ）（１２５ｎＭ）、３重短破線（ｓｈｏｒｔ  ｓｈｏｒｔ  ｓｈｏｒｔ）（２５０ｎＭ）及び２重短破線（ｓｈｏｒｔ  ｓｈｏｒｔ）（５００ｎＭ）である。１：１結合様式（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）に従って、ＣＤ３に対する４６ｎＭのＫＤを測定された。
【図５】図５は、本発明の結合分子の機能的な特徴を示すグラフである。図５Ａは、ＥＧＦＲに対するＡｆｆｉｌｉｎ−１４２２６５の親和性を示す。この図は、ＦＡＣＳ分析によって決定した外因性のＥＧＦＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（薄灰色）へのＡｆｆｉｌｉｎ−１４２２６５（暗灰色；黒線）の結合を示す。図５Ｂは、５０ｎＭ、５ｎＭ及び０．５ｎＭの濃度における、外因性のＨｅｒ２を発現するＣＨＯ  Ｋ１細胞に対するＨｅｒ２結合タンパク質の高い親和性を示すグラフである。ジユビキチン又はコントロール細胞（空ベクターコントロール細胞）では、結合が観察されなかった。図５Ｃは、ＦＡＣＳ分析により測定した外因性のＨｅｒ２を発現するＳｋＢｒ細胞に対するＨｅｒ２結合タンパク質の親和性を示すグラフである。非発現ＨＥＫ／２９３コントロール細胞又はジユビキチン（１３９０９０）では、結合が観察されなかった。
【図６】免疫蛍光細胞染色による、Ｈｅｒ２を過剰発現したＳｋＢｒ３細胞へのＨｅｒ２結合タンパク質の結合解析を示す。すべてのＡｆｆｉｌｉｎタンパク質はＳｋＢｒ３細胞上で５０ｎＭの強い結合を示すが、ジユビキチンは結合を示さない。
【図７】ＳＫＯＶ−３異種移植腫瘍組織細胞に対するＨｅｒ２結合タンパク質の結合解析（免疫組織学的染色）を示す。この図では、Ｈｅｒ２結合タンパク質はＳＫＯＶ−３腫瘍組織に結合するが、ジユビキチン１３９０９０はＳＫＯＶ−３組織への結合を示さないことを確認するものである。
【図８】図８は、Ａｆｆｉｌｉｎタンパク質が、腫瘍細胞上に発現した細胞外のＥＧＦＲに結合することを確認するものである。ＥＧＦＲを発現するＡ４３１腫瘍細胞の免疫蛍光画像が示されている。ＥＧＦＲを発現するＡ４３１腫瘍細胞の染色により、Ａｆｆｉｌｉｎ−１４２２６５は結合しているが、ジユビキチン（１３９０９０）は結合を示していないことを確認するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明を以下により詳細に記載する前に、本発明は、本明細書に記載した特定の方法論、プロトコール及び試薬に限定されず、これらは変更し得ることを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。
【００１５】
好適には、本明書で使用される用語は、“Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ｌＵＰＡＣ推奨）Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ  Ｋｏｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）”の記載に従って定義される。
【００１６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味を必要としない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という語、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等のその変化形は、記載された整数やステップ、又は整数やステップの群の包含を意味するものであり、他の整数やステップ、又は整数やステップの群を除外することを意味するものではない。
【００１７】
本明細書の本文中には、幾つか文書（例えば、特許、特許出願、科学刊行物、製造仕様書、指示書、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎｓなど）が引用されている。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によってそのような開示よりも先行する権利がないと認めるものとして解釈されるものではない。本明細書で引用される文書の幾つかは、「引用により援用される」ものとして特徴付けられる。そのような援用された文献の定義又は教示と、本明細書に記載した定義又は教示との間に矛盾が生じた場合には、本明細書の記載が優先される。
【００１８】
本明細書中で言及している全配列は、その全体的な内容及び開示が本明細書の一部である添付の配列表に開示されている。
【００１９】
本出願に使用した重要な用語の定義
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結された任意の２つ以上のアミノ酸鎖を指し、特定の長さの生成物を意味するものではない。したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は２つ以上のアミノ酸の鎖を表すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれるものであり、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、又はこれらの用語と交換して使用することができる。また、「ポリペプチド」という用語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、タンパク質分解切断、天然に存在しないアミノ酸の改変、及び当技術分野でよく知られた同様の改変などによる産物に限定されず、ポリペプチドの翻訳後修飾の産物を表すものとする。したがって、２又はそれ以上のタンパク質部分を含む結合タンパク質も、用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」の定義に含まれる。本明細書で使用される「結合タンパク質」という用語は、例えば、表面プラズモン共鳴によって測定した時に、標的に対して、少なくとも１０００ｎＭ、好適には少なくとも５００ｎＭ、好適には少なくとも１００ｎＭ、好適には少なくとも１０ｎＭの特異的結合親和性（ＫＤ）を有する２つのユビキチン変異タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ）を含むか、実質的にこれらのタンパク質からなる、あるいはこれらのタンパク質からなるタンパク質を意味する。ここで、標的に対する親和性は、ジユビキチン（例えば、配列番号４又は配列番号４３等の少なくとも９５％の相同配列）よりも少なくとも１０倍高い。
【００２０】
本発明による「結合可能なタンパク質」、「結合タンパク質」又は「結合親和性」という用語は、定義された標的に対して結合する能力を具えるタンパク質を意味する。「Ｈｅｒ２結合タンパク質」という用語は、Ｈｅｒ２に対する高親和性結合能力を有するタンパク質を意味しており、「ＥＧＦＲ結合タンパク質」という用語は、ＥＧＦＲに対する高親和性結合能力を有するタンパク質を意味し、「ＣＤ３結合タンパク質」という用語は、ＣＤ３に対する高親和性結合能力を有するタンパク質を意味し、用語「ｅｐＣＡＭ結合タンパク質」は、ｅｐＣＡＭに対する高い親和性結合能力を有するタンパク質を意味する。本明細書において、「標的」、「抗原」、「標的抗原」及び「結合パートナー」という用語はすべて同義語で使用され、交換することができる。好適には、この標的は以下に定義される標的のうちの１つである。本明細書で使用される「抗原」という用語は、広義に解釈されるべきであり、本発明の結合タンパク質の結合部分によって結合された任意の標的部分を含む。標的は、無機物質であっても、有機物質であってもよい。この用語は、例えば、薬物、毒素、自己抗体、自己抗原、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、核酸及びその他の分子といった、体液中の小分子を含む。特定の例は、癌標的抗原、免疫細胞上の受容体標的抗原や、例えばホルモン及びサイトカインから選択される可溶性標的抗原である。要約すると、本発明に係る標的抗原として、全ての生体活性分子や関連分子、医学上の有効分子や関連分子が使用されてもよい。可能性のある結合パートナーを例として以下に説明するが、このリストには、可能性のあるその他複数の標的を追加できることに留意されたい。本明細書で使用される「天然結合標的ではない」という用語は、本発明の結合タンパク質に対して、ジユビキチンよりも少なくとも１０倍高い親和性を有する標的を指している。「天然結合標的ではない」とは、更に、本発明の結合分子の結合活性が新規に作製されることを意味する。すなわち、「天然結合標的」は、非改変のユビキチン（例えば、配列番号１又は配列番号２のような少なくとも９５％の相同配列）又は非改変のジユビキチン（例えば、配列番号４又は配列番号４３のような少なくとも９５％の相同配列）に、本発明の結合タンパク質よりも少なくとも１０倍低い親和性で結合する。
【００２１】
用語「解離定数」又は「ＫＤ」は、特異的結合親和性を規定する。高い親和性は、低いＫＤ値に相当する。したがって、「少なくとも例えば１０−７ＭのＫＤ」という表現は、１０−７Ｍ又はそれ以下の値（より強く結合する）を意味する。１×１０−７Ｍは１００ｎＭに相当する。１０−５Ｍから１０−１２Ｍまでの値は、定量可能な結合親和性と考えることができる。用途に応じて、１０−７から１０−１２Ｍの値を、例えばクロマトグラフィーや診断又は治療のアプリケーションに使用することができる。本発明によれば、標的結合に対する親和性は、１×１０−６Ｍ（１０００ｎＭ）未満の範囲内でなければならない。最終的な標的結合親和性は、理想的には１０−９Ｍ（１ｎＭ）より小さくなくてはならない。
【００２２】
「ユビキチン」又は「非改変ユビキチン」という用語は、配列番号１（野生型ユビキチン）と、配列番号２（標的への結合に影響を及ぼさないＦ４５Ｗ位、Ｇ７５Ａ位、Ｇ７６Ａ位の点変異体）と、配列番号４（例えば位置Ｇ７５Ａ位、Ｇ７６Ａ位、Ｆ１２１Ｗ位、Ｇ１５１Ａ位、Ｇ１５２Ａ位の点変異体；本明細書では「ジユビキチン」とも呼ばれる；クローン１３９０９０に相当する）と、配列番号４３（追加のペプチドリンカーなしで直接融合された２つの野生型ユビキチン部分；本明細書において「ジユビキチン」とも呼ばれる）と、以下の定義によるユビキチンを意味する。例えば、ヒト、霊長類、ブタ、げっ歯類等哺乳動物由来のユビキチンが特に好ましい。一方、当技術分野では、すべての真核生物ユビキチンが高度に保存されており、これまで分析された哺乳動物ユビキチンは、それらのアミノ酸配列に関してほぼ同一であるため、ユビキチンの由来は関係しない。更に、任意のその他の真核生物源由来のユビキチンを使用することもできる。例えば、酵母のユビキチンは、野生型ヒトユビキチン（配列番号１）とは３つのアミノ酸のみが異なっている。
【００２３】
「ジユビキチン」という用語は、２つのユビキチン部分が頭−尾の向きに互いに直接融合している線状タンパク質を表す。「ジユビキチン」という用語は、配列番号４（位置Ｇ７５Ａ位、Ｇ７６Ａ位、Ｆ１２１Ｗ位、Ｇ１５１Ａ位、Ｇ１５２Ａ位における点変異体；クローン１３９０９０に相当する；  ２つのユビキチン部分が互いに直接融合している）又は、例えば配列番号４３（２つの野生型ユビキチン部分が直接融合したもの）のような、配列番号４に少なくとも９５％のアミノ酸が一致するタンパク質を意味する。本発明による「ジユビキチン変異タンパク質」は、少なくとも１２、１３又は１４個のアミノ酸の配置、好適には位置、Ｒ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位、及びＴ１４２位において改変されており、選択された標的に結合することができる配列番号４３又は配列番号４のジユビキチンを意味する。
【００２４】
用語「Ａｆｆｉｌｉｎ」、「ユビキチン変異タンパク質」及び「改変ユビキチン」はすべて同義語として使用され、交換することができる。本明細書中で使用されている、「ユビキチン変異タンパク質」、「Ａｆｆｉｌｉｎ」及び「改変ユビキチン」という用語は、アミノ酸交換、挿入、欠損又はそれらの任意の組み合わせによって誘導された、非改変ユビキチン又はジユビキチンとは異なるユビキチンの誘導体を表している。改変ユビキチン、ユビキチン変異タンパク質又はジユビキチン変異タンパク質は、特異的結合親和性を有しているが、非改変ユビキチン又はジユビキチンは、少なくとも１０倍低い親和性を有するか、親和性が全くない。このジユビキチン変異タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ）の機能的特性は、新たに創出された機能である。
【００２５】
用語「Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）」（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨの登録商標）は、ユビキチン変異タンパク質に基づく非免疫グロブリン由来の結合タンパク質を意味する。Ａｆｆｉｌｉｎは、天然に存在する、あるいは自然物から単離された天然のユビキチンではない。本発明の範囲は、非改変ユビキチンを除外している。本発明によるＡｆｆｉｌｉｎ分子は、頭−尾融合において互いに連結した２つの異なる改変ユビキチン部分（ジユビキチン変異タンパク質）を含むか、実質的にこの改変ユビキチン部分からなる。「頭−尾融合」は、例えば、参照により本明細書に組み込まれているＥＰ２３７９５８１Ｂ１に記載されているように（頭部）Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−（尾部）（タンデム分子）方向にそれらを結合させることによって２つのタンパク質を互いに融合させることと理解すべきである。頭部は第１部分として示され、尾部は第２部分として示される。この頭−尾融合において、本発明に示されるように、ユビキチン部分は、リンカーなしで直接結合できる。代替的に、ユビキチン部分の融合は、リンカー、例えばポリペプチドリンカー（例えば、ライブラリーＳＰＶＦについては、表２参照）を介して行うことができる。
【００２６】
用語「置換」は、保存的及び非保存的置換の両方を含む。「保存的置換」は、例えば、関連するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。アミノ酸は、以下の標準アミノ酸グループに分類することができる：（１）疎水性側鎖：Ａｌａ（Ａ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、（２）酸性極性側鎖：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、（３）塩基性側鎖極性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）（４）芳香族アミノ酸：Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、（５）極性アミノ酸：Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｉｎ（Ｑ）、（６）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）及び（７）Ｃｙｓ（Ｃ）。本明細書中で使用される場合、「保存的置換」は、上記の標準アミノ酸グループと同じグループ内に列挙された別のアミノ酸によるアミノ酸の交換物として定義される。例えば、ＧｌｕでＡｓｐを交換しても、そのように改変されたポリペプチド中の１つの負電荷が維持される。更に、Ｇｌｙ及びＰｒｏは、α−ヘリックスを中断させるそれらの能力に基づいて、互いに置換できる。上記のグループ内の幾つかの好ましい保存的置換は、以下のサブグループ内での交換である：（ｉ）Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ；（ｉｉ）Ｓｅｒ及びＴｈｒ；（ｉｉ）Ａｓｎ及びＧｉｎ；（ｉｖ）Ｌｙｓ及びＡｒｇ；（ｖ）Ｔｙｒ及びＰｈｅ。既知の遺伝子コード、組換え及び合成ＤＮＡ技術によって、熟練した科学者は、保存性アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。「非保存的置換」又は「非保存的アミノ酸交換」は、本明細書中で使用される場合、上記の標準アミノ酸グループ（１）−（７）とは異なるグループに列挙された別のアミノ酸によるアミノ酸交換として定義される。
【００２７】
用語「融合」は、成分（例えば、２つのユビキチン部分又は２つのユビキチン変異タンパク質）が、直接又はペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
【００２８】
「融合タンパク質」という用語は、少なくとも第２のタンパク質と遺伝的に結合した少なくとも第１のタンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、もともとは別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子を連結することによって作製される。したがって、融合タンパク質は、単一の直鎖ポリペプチドとして発現される、相違又は相同の結合タンパク質の多量体を含んでもよい。そのような融合タンパク質は、更に、標的の結合に関与しない追加のドメインを含んでもよい。ドメインは、例えば多量体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカーなどであるがこれらに限定されない。
【００２９】
本明細書で使用される「コンジュゲート」という用語は、第２のタンパク質又は非タンパク性部分等の他の物質に、化学的に結合した少なくとも第１のタンパク質を含むか、実質的にこのタンパク質からなるタンパク質に関する。コンジュゲーションは、有機合成又は酵素の翻訳後改変の自然作用を含む酵素の使用により行うことができる。タンパク質コンジュゲートの例は、糖タンパク質（糖質成分とコンジュゲートされたタンパク質）又はリポタンパク質（脂質成分とコンジュゲートされたタンパク質）である。この分子は、例えば、任意形態のリンカーを介して１又は複数の部位に結合してもよい。化学的結合は、置換（例えばＮ−スクシンイミジルケミストリー）、付加、環化付加（例えばマレイミドケミストリー又はクリックケミストリー）又は酸化化学（例えばジスルフィド形成）を含む当業者によく知られた化学方法によって行うことができる。本発明のタンパク質に化学的に結合した非タンパク性ポリマー分子の幾つかの例は、ヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、樹枝状ポリマー、又はポリオキシアルキレン等である。
【００３０】
融合タンパク質又はタンパク質コンジュゲートは、標的や、放射性核種又は毒素等のような治療又は診断に関連する分子等の、１またはそれ以上の反応基又はペプチド又は非ペプチド部分を更に含んでいてもよい。これは、例えば糖、オリゴ糖類又は多糖類や脂肪酸等のような、低分子の有機化合物や非アミノ酸ベースの化合物を含んでいてもよい。目的のタンパク質をこのような非タンパク質成分に結合させる方法は、当該技術分野においてよく知られているため、ここでは更に詳細には説明しない。  
【００３１】
用語「アミノ酸配列の相同性」は、２又はそれ以上のタンパク質のアミノ酸配列の相同性（又は差異）の定量的比較を意味する。基準ポリペプチドの配列に対する「アミノ酸配列相同パーセント（％）」は、最大の配列相同性を達成するために、必要に応じて配列をアライメントしギャップを挿入した後、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と相同の配列内アミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
【００３２】
配列相同性を決定するために、クエリータンパク質の配列を、基準タンパク質、例えば配列番号４の配列とアラインメントされる。アラインメント方法は当該技術分野においてよく知られている。  例えば、配列番号４のアミノ酸配列に対する任意のポリペプチドのアミノ酸配列相同性の程度を決定するためには、ＳＩＭ  Ｌｏｃａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｘｉａｏｑｕｉｎ  Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９９１）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、ｖｏｌ．１２：３３７−３５７）を用いるのが好ましく、これは、無料で入手できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍ−ｐｒｏｔ．ｈｔｍｌも参照）。多重アライメント分析には、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２２（２２）：４６７３−４６８０）又はＣｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるのが好ましい。
【００３３】
本発明の文脈において、改変された配列と、それが由来する配列（「親配列」とも称される）との間の配列相同性の程度は、別段の明示的な定めがない限り、一般的に、改変されていない配列の全長に対して計算される。所定の位置における基準アミノ酸配列と相違するクエリー配列の各アミノ酸は、１つの差としてカウントされる。クエリー配列における挿入あるいは削除も、１つの差としてカウントされる。例えば、２つのユビキチン部分間へのリンカーの挿入は、基準配列と比較して１つの差としてカウントされる。その際、差の合計は、基準配列の長さに対して非相同性のパーセンテージを算出する。相同性の定量的パーセンテージは、１００から差し引いた非相同性のパーセンテージとして計算される。本発明では、ジユビキチン（例えば、配列番号４又は配列番号４３）とアラインメントさされたユビキチン変異タンパク質の相同性を決定する特定の場合において、ジユビキチンの４５位、７５位、７６位、１２１位、１５１位及び／又は１５２位における差は、ユビキチン変異タンパク質の新規の結合能力には関係がないため、特にカウントされない。ユビキチン部分は、その結合能力に影響を及ぼすことなく、ジユビキチンのアミノ酸残基４５位、７５位、７６位、１２１位、１５１位及び／又は１５２位において改変され得るが、この改変は、ユビキチン変異タンパク質の生化学的特性における改変の達成と関連し得る。一般的に、改変の出発物質として使用されるジユビキチン配列は、配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸、少なくとも９６％又は少なくとも９７％のアミノ酸相同性を有する。したがって、例えば基準配列と９５％「相同」であるポリペプチドは、配列番号４の基準配列と比較して、１００個のアミノ酸につき、例えば置換による５つの点変異、あるいは４つの点変異と１つの挿入を含むことができる。その一例は配列番号４３である。
【００３４】
本発明の結合タンパク質は、ジユビキチン変異タンパク質を含むものであり、２つのユビキチン変異タンパク質部分が、リンカーなしで直接結合して、ジユビキチンとの８５％−９２％の配列相同性を有するジユビキチンのＲ４２、Ｉ４４、Ｈ６８、Ｖ７０、Ｒ７２、Ｌ７３、Ｒ７４、Ｋ８２、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位、及びＴ１４１位から選択される少なくとも１２、１３、又は１４個の配置の置換部分を有する特異的かつ高度な親和性をもたらす。更に、本発明の結合タンパク質は、その他の機能性タンパク質部分に遺伝的に融合することができる。本発明のこのような融合タンパク質の文脈において、用語「リンカー」は、少なくとも２つの他タンパク質分子を共有結合で結合させ単一のアミノ酸あるいはポリペプチドを意味する。このリンカーは、第１及び第２のタンパク質又はタンパク質部分に遺伝的に融合し、単一の直鎖ポリペプチド鎖を生成する。リンカーの長さや組成は、少なくとも１から最大で約５０アミノ酸の間で変化し得る。リンカーの長さは、好適には１乃至３０アミノ酸である。より好ましくは、このペプチドリンカーは１乃至２０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のアミノ酸長である。
【００３５】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、ヒトに対して免疫原性ではなく、プロテアーゼに対して安定であり、選択的に二次構造を形成しないことが好ましい。一例は、グリシン、セリン又はアラニンのような小さなアミノ酸から構成されるリンカーである。リンカーは、グリシンリッチであってもよい（例えば、リンカー中の残基の５０％超がグリシン残基であってもよい）。グリシン及びセリン残基のみからなる、可変長のグリシン−セリンのリンカーが好ましい。一般的には、（ＳＧＧＧ）ｎ構造や、例えば（ＧＧＧＳ）ｎのようなＳＧＧＧ並び替え配列のリンカーを使用することができ、ここでｎは１から６の任意の数、好適には１、２又は３である。更なるアミノ酸を含むリンカーも好ましい。タンパク質の遺伝的融合用のその他のリンカーは、当技術分野でよく知られており、使用することができる。
【００３６】
本発明の結合タンパク質の化学的コンジュゲートの場合、「リンカー」という用語は、例えば、互いにハイブリダイズする２つの異なる部分に結合した２つの相補的な核酸分子、又はポリエチレングリコール等の化学的ポリマー等の、例えば水素結合、イオン結合又はファンデルワールス作用を介して、共有結合又は非共有結合によって結合タンパク質をその他のタンパク又は非タンパク性部分と結合させる化学的部位を意味する。このようなリンカーは、アミノ酸の側鎖を介したタンパク質への化学的結合を可能にする反応基を有していてもよい。このようなリンカーと反応基は当業者によく知られているため、更なる記載は行わない。
【００３７】
本発明の効果
従来のモノクローナル抗体と比較して、本発明の結合タンパク質の顕著な利点は、（ｉ）小さいサイズ（例えば最大約１５２アミノ酸）、（ｉｉ）単純な分子構造（例えば、抗体における４つの鎖と比較すると１つの鎖であること）、及び（ｉｉｉ）完全な機能のために翻訳後改変を必要としない、という観点から複雑さが低減されていることである。これらの利点によって、単純な遺伝子工学を含む分子の取り扱いが容易になるとともに、生産や精製方法も容易となる。
【００３８】
抗体の形式に基づく結合分子はよく知られているが、これらの分子には、非最適な物理化学的特性や、低い生産収率など重大な欠点が依然として存在する。本発明の結合タンパク質は、操作しやすい単純な分子型を提供し、得られる分子は好ましい物理化学的性質（溶解性及び安定性など）、高レベルの発現を有し、製造方法が容易である。
【００３９】
１つのユビキチン部分（配列番号１）の２位、４位、６位、６２位、６３位、６４位、６５位及び６６位から選択した改変を有するユビキチン変異タンパク質の生成方法が記載されている（ＥＰ１６２６９８５Ｂ１参照）。ヘテロ多量体改変ユビキチン分子を同定する別の方法は、ペプチドリンカー（ＥＰ２３７９５８１Ｂ１参照）と融合した２つのユビキチン部分の２位、４位、６位、８位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位及び６８位から選択した置換を有するヘテロ多量体改変ユビキチン分子に関連する。
【００４０】
これらのユビキチン変異タンパク質は、高親和性結合タンパク質とそれらを産生、同定する効率的な方法を提示しているが、そのような結合分子の同定に必要なライブラリーの溶解性が低い等の欠点がある。当技術分野で知られているライブラリーは、溶解性及び発現率が低くなりがちであり、その結果スクリーニング手順が非効率になりプロセスが複雑で、収率が低下するため、コストが上昇してしまう。
【００４１】
要約すると、既知の結合タンパク質やその生成方法及び同定方法には問題が存在するため、従来技術においては特性を改善した新規結合タンパク質を提供することが強く求められていた。これに関連して、特に、ジユビキチン変異タンパク質に基づく結合タンパク質をコードする、高可溶性で発現可能なライブラリーのための新規の生成方法及び同定方法が求められていた。
【００４２】
本発明の利点は、溶解度及び発現率を強化したライブラリーを提供することによる、新規結合タンパク質の生成方法及び同定方法にある。本発明の新規結合タンパク質の利点は、それらが高効率で標的に結合することである。
【００４３】
本発明は、標的に結合するのに特に適しているが従来技術の欠点を克服しているジユビキチン変異タンパク質に基づいて、人工結合タンパク質を同定するランダム化のために定義した位置を組み合わせたライブラリーを提供する。
【００４４】
本発明の好適な実施形態の説明
本発明の一態様は、標的に対する結合親和性（ＫＤ）が１０００ｎＭより小さい本発明の結合タンパク質に関するものであり、結合タンパク質の標的に対する親和性は、配列番号４の親和性よりも少なくとも１０倍高い。結合タンパク質は、ジユビキチンのＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位から選択された少なくとも１２個のアミノ酸が置換されており、結合タンパク質が、ジユビキチンと少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は実質的にこのアミノ酸配列を含む又はこれらのアミノ酸から成る。したがって、結合タンパク質は、ジユビキチンに対して最大９２％の配列相同性を示す。この配置における少なくとも１２のアミノ酸の特定の組み合わせが、標的に対して高親和性を有する結合タンパク質を生成しており、この標的親和性が配列番号４の親和性よりも少なくとも１０倍高いことは意外であり、驚くべきことである。
【００４５】
好適な結合タンパク質は、ジユビキチン（配列番号４）のＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位から選択された少なくとも１２の配置が置換されていれば、ジユビキチン（配列番号４）と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８７％の相同性を有する１５２のアミノ酸を含む。驚くべきことに、ジユビキチン（配列番号４）の１２、１３又は１４の配置における置換の特定の組み合わせが、高親和性結合タンパク質をもたらす。これらのタンパク質は、新規に作製された人工タンパク質である。本発明の結合タンパク質は自然界には存在しない。新規に作製された結合タンパク質の実施例は、配列番号５−４２に提供されている。
【００４６】
本発明の結合タンパク質は、更に０、１、２、３、４、５又は６個の置換を有することが好ましい。言い換えると、本発明の結合タンパク質は、ジユビキチン（配列番号４）と９２％の配列相同性を有する配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、好適には少なくとも８５％又は８７％、最大で９２％の配列相同性を有することが好ましい。本発明の結合タンパク質は、ジユビキチンのＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位において置換されており、更なる置換（例えば、配列番号２９、３３、３９、４０、４１、４２）、１つの追加の置換（例えば、配列番号２７、２８、３１、３２）、２つの追加の置換（例えば、配列番号１４、１６、２１、２５、２６、３０、３５）、３つの追加の置換（例えば、配列番号６、１２、１３、１５、１７、１８、２０、３４、３６）、４つの追加の置換（例えば、配列番号１０、１１、１９、２２、２３、２４）、５つの追加の置換（例えば、配列番号５、７、８、９）、又は６つの追加の置換（例えば、配列番号３７）を含まない。例えば、ジユビキチンのＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位の置換に加えて、更なる１、２、３、４、５又は６の置換は、好適には、ジユビキチンの６位、１０位、１１位、１５位、２０位、２１位、２３位、２８位、３１位、３４位、３６位、４０位、４６位、４８位、４９位、５２位、５８位、６２位、６３位、７５位、７８位、８８位、９２位、９５位、９６位、９８位、１１４位、１２０位、１２４位、１３１位、１３３位、１４４位、１４７位から選択され、より好適には４６位、７８位、９２位、２３位、５２位から選択できる。
【００４７】
本発明の結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定したとき、標的に対して、少なくとも１０００ｎＭ、好適には少なくとも１００ｎＭ、好適には少なくとも１０ｎＭの特異的結合親和性（ＫＤ）を有するものであり、この標的は、ジユビキチンの天然結合標的ではない（すなわち、結合タンパク質の標的への親和性は、ジユビキチンよりも少なくとも１０倍高い）。例えば、本発明の結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定したとき、例えば、Ｈｅｒ２、ＣＤ３、ＥＧＦＲ、又はＥｐＣＡＭのようなペプチド標的に対して少なくとも７００ｎＭ、好適には少なくとも１００ｎＭ、好適には少なくとも１０ｎＭの特異的結合親和性を有する。
【００４８】
本発明は、以下の代表的なタンパク質標的：Ｈｅｒ２、ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ、及びＥＧＦＲに成功裏に実証されている。これらのタンパク質標的は、本明細書で提供される情報を受け取った後、過度の負担なしに、本明細書に記載の方法が当業者によってうまく行えることを示すために選択されただけであることは理解されるべきである。本発明は、これら特定のタンパク質標的に限定されるものではなく、当該分野でよく知られた標的分子の全て、あるいは大部分に対して実施することができる。これらの標的は、当業者が当該技術分野の一般的な知識の範囲内で選択することができる。
【００４９】
Ｈｅｒ２（ヒト上皮成長因子受容体２；同義語名はＥｒｂＢ−２、Ｎｅｕ、ＣＤ３４０又はｐ１８５）は、１９８４年のＳｃｈｌｅｃｈｔｅｒらによるＮａｔｕｒｅ  ３１２：５１３−５１６にて最初に発表された１８５ｋＤａの受容体である。この遺伝子の増幅や過剰発現は、特定の急速進行型乳癌の発症や進行において重要な役割を果たすことが示されており、Ｈｅｒ２は、この疾患の重要なバイオマーカー及び治療の標的として知られている。Ｈｅｒ２が役割を担う他の腫瘍には、卵巣癌及び胃癌が含まれる。
【００５０】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；同義語名はＨＥＲ１又はＥｒｂＢ１）は、上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦ−ファミリー）の員に対する細胞表面受容体である。ＥＧＦＲは、肺癌、頭頸部癌及び大腸癌における役割が知られている。この多くの癌への関与により、ＥＧＦＲが有効な治療ターゲットとして認証されており、このことが受容体生物学のより深い理解や改良療法開発の探索を支援している。現在のＥＧＦＲアンタゴニストの有効性が低いことの潜在的原因には、特に自己分泌シグナル伝達の存在下で標的と効果的に競合できないこと；レセプターのダウンレギュレーションが不十分であること；構造的活性型であるＥＧＦＲｖＩＩＩの阻害が不足していること；脱変異していること；が含まれる。したがって、異なる作用様式を介してのダウンレギュレーション及び／又は阻害が可能な新規結合物質は有益であり、ＥＧＦＲに対する多価及び／又は多特異的な結合物質はこの点でより有効である。
【００５１】
ｅｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）は、細胞シグナル伝達、移動、増殖、及び分化に関与する３０−４０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質である。このタンパク質は、上皮由来の新生物に発現し、したがって、様々な癌診断用マーカーの１つである。
【００５２】
ＣＤ３（分化３のクラスター）は、Ｔ細胞上の細胞表面共受容体である。タンパク質複合体ＣＤ３は、Ｔリンパ球で活性化シグナルを生成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と会合する４つの異なる鎖から構成される。ＣＤ３に結合する薬物は、例えば、Ｉ型糖尿病等の自己免疫疾患の免疫抑制療法に有用であり得る。
【００５３】
用語「Ｈｅｒ２」、「ＥＧＦＲ」、「ＥｐＣＡＭ」又は「ＣＤ３」は、それぞれ、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿００４４３９（Ｈｅｒ２）、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿００５２１９（ＥＧＦＲ）、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿００２３５４．２（ＥｐＣＡＭ）又はａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０７７６６１と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％あるいは９７％、又はそれ以上か１００％の配列相同性を示す全てのポリペプチドを含み、それぞれＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、又はＣＤ３の機能を有する。Ｈｅｒ２の細胞外ドメインは、ユニプロットａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０４６２６（１−６５２残基）で表される。ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインは、ユニプロットａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ００５２２（１−６４５残基）で表される。ヒトＥｐＣＡＭの細胞外ドメインは、ユニプロットａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１６４２２（１−２６５残基）で表される。
【００５４】
ジユビキチンの４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位及び１４２位において少なくとも１２個の置換を有する結合タンパク質の選択された多数の実施例が本発明において提供されている。本発明の結合タンパク質は、１０００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満（例えば、配列番号：６、１４、１５、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３５、３６、３８）、より好適には１ｎＭ未満（例えば、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２３）の測定可能な結合親和性により、ジユビキチンの非天然標的に結合する。非改変ジユビキチン（配列番号４）は、如何なる測定可能な結合親和性を有していても、例えばＨｅｒ２、ｅｐＣＡＭ、ＣＤ３、又はＥＧＦＲ等のタンパク質標的に自然に結合しない。本発明の全ての結合タンパク質は、高い親和性で標的に対してデノボ形成した結合を示すものである。すなわち、結合タンパク質の標的に対する親和性は、ジユビキチンに対するものより少なくとも１０倍高い。結合タンパク質の特定の実施例は、図３、表１及び表４に示されている。Ｈｅｒ２結合タンパク質の実施例は配列番号５−３８に、ＣＤ３結合タンパク質の実施例は配列番号３９に、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質の実施例は配列番号４０及び４１に、ＥＧＦＲ結合タンパク質の実施例は配列番号４２に示されている。
【００５５】
別の好適な結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ−１４１９７５）は、ジユビキチンの２０個のアミノ酸において置換されている（４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位及び５２位、７５位、７８位、９６位、１１４位、１３１位におけるアミノ酸置換）。Ｈｅｒ２結合タンパク質Ａｆｆｉｌｉｎ−１４１８８４は、ジユビキチン（配列番号４）と８７％の相同性を示している。Ｈｅｒ２の結合能力は、ＦＡＣＳ解析（ＳＫ−Ｂｒ−３細胞）によって確認した。
【００５６】
例えば、好適な結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ−１４２６２８）は、ジユビキチンの１８個のアミノ酸において置換されている（４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位及び２３位、７８位、９２位、４６位におけるアミノ酸置換）。Ｈｅｒ２結合タンパク質Ａｆｆｉｌｉｎ−１４２６２８は、ジユビキチン（配列番号４）と８８％の相同性を示す。Ｈｅｒ２結合タンパク質は、標的を発現する腫瘍組織への強力な結合を示す。
【００５７】
別の好適な結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ−１４１８８４）は、配列番号２４の１６個のアミノ酸が置換されている（４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位及び２７位、７８位のアミノ酸の置換）。Ｈｅｒ２結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ−１４１８８４）は、ジユビキチン（配列番号４）と９０．５％の相同性を示す。Ｈｅｒ２結合タンパク質は、標的を発現する腫瘍組織への強力な結合を示す。
【００５８】
別の好適な結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ−１４１９２６）は、ジユビキチンの１５個のアミノ酸が置換されている（４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位及び７８位におけるアミノ酸の置換）。Ｈｅｒ２結合タンパク質Ａｆｆｉｌｉｎ−１４１８８４は、ジユビキチン（配列番号４）と９０％の相同性を示す。
【００５９】
その他の好適な結合タンパク質（例えば、Ａｆｆｉｌｉｎ−１４４１６０、Ａｆｆｉｌｉｎ−１４３４８８、Ａｆｆｉｌｉｎ−１４３２８３、Ａｆｆｉｌｉｎ−１４２２６５）は、ジユビキチンの１４個のアミノ酸が置換されている（４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位に対応するアミノ酸の置換）。結合タンパク質は、ジユビキチン（配列番号４）と９１％の相同性を示す。
【００６０】
ジユビキチンをベースとしたＨｅｒ２結合タンパク質の好適な置換は、芳香族アミノ酸による、７０位及び１４０位から選択したアミノ酸の置換である。ジユビキチンをベースとしたＨｅｒ２結合タンパク質の更に好適な置換は、アミノ酸の極性アミノ酸による４２位から選択される置換であり、４４位は、疎水性又は極性アミノ酸で置換され、６８位は芳香族アミノ酸で置換され、７２位は極性又は芳香族アミノ酸で置換され、７３位は、塩基性又は酸性アミノ酸ではない任意のアミノ酸で置換され、７４位は、芳香族、塩基性又は極性アミノ酸で置換され、８２位は塩基性又は酸性アミノ酸ではない任意のアミノ酸で置換され、８４位は塩基性又は酸性アミノ酸で置換され、１３８位は塩基性、酸性又は極性アミノ酸で置換され、１３９位は、酸性、疎水性アミノ酸又はグリシンで置換され、１４１位は、疎水性、極性又は塩基性アミノ酸で置換され、及び／又は１４２位は疎水性又は極性アミノ酸で置換される。ジユビキチンをベースとしたＨｅｒ２結合タンパク質の好適な置換は、Ｒ４２Ｔ、Ｒ４２Ｓ、Ｒ４２Ｌ、Ｉ４４Ａ、１４４Ｖ、Ｉ４４Ｓ、Ｉ４４Ｔ、Ｈ６８Ｗ、Ｈ６８Ｙ、Ｈ６８Ｆ、Ｖ７０Ｙ、Ｖ７０Ｗ、Ｒ７２Ｔ、Ｒ７２Ｆ、Ｒ７２Ｇ、Ｒ７２Ｙ、Ｌ７３Ｗ、Ｌ７３Ｓ、Ｌ７３Ｖ、Ｌ７３Ｉ、Ｒ７４Ｙ、Ｒ７４Ｓ、Ｒ７４Ｎ、Ｒ７４Ｋ、Ｋ８２Ｔ、Ｋ８２Ｌ、Ｋ８２Ｎ、Ｋ８２Ｉ、Ｋ８２Ｙ、Ｌ８４Ｈ、Ｌ８４Ｄ、Ｌ８４Ｅ、Ｌ８４Ｓ、Ｑ１３８Ｓ、Ｑ１３８Ｒ、Ｑ１３８Ｅ、Ｋ１３９Ｅ、Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｌ、Ｅ１４０Ｗ、Ｓ１４１Ａ、Ｓ１４１Ｒ、Ｔ１４２Ｉ、Ｔ１４２Ｌ及び／又はＴ１４２Ｎから選択される。更に、例えば少なくともＲ４２Ｔ、Ｉ４４Ａ、Ｈ６８Ｗ、Ｖ７０Ｙ、Ｒ７２Ｔ、Ｌ７３Ｗ、Ｒ７４Ｙ、Ｋ８２Ｔ、Ｌ８４Ｈ（例えば、配列番号７−２９）のような、配列番号４におけるアミノ酸置換の特定の組合せが好ましい。ジユビキチンにおけるアミノ酸置換の特定の組み合わせを有するその他の好適なＨｅｒ２結合タンパク質は、例えば、少なくともＲ４２Ｓ、Ｉ４４Ｖ、Ｈ６８Ｙ、Ｖ７０Ｙ、Ｒ７２Ｆ、Ｌ７３Ｓ、Ｋ８２Ｌ、Ｌ８４Ｄ（例えば、配列番号：３４、３５、３６及び３６）である。更に好ましいのは、例えば、（例えば配列番号：５、７−２９、３３、３６、３７における）Ｑ１３８Ｓ、Ｋ１３９Ｅ、Ｅ１４０Ｗ、Ｓ１４１Ａ、Ｔ１４２Ｉ、又は（例えば配列番号：６、３４、３５における）Ｑ１３８Ｒ、Ｋ１３９Ｇ、Ｅ１４０Ｗ、Ｔ１４２Ｌ又は（例えば配列番号：３０、３１、３２における）Ｑ１３８Ｅ、Ｋ１３９Ｌ、Ｅ１４０Ｗ、Ｓ１４１Ｒ、Ｔ１４２Ｎといったジユビキチンにおけるアミノ酸置換の特定の組み合わせを有するＨｅｒ２結合タンパク質である。
【００６１】
表１に、（図１に加えて）新規結合タンパク質を生成するジユビキチンの置換の実施例を挙げる。全ての結合タンパク質（例えば、配列番号３９−４２）はジユビキチンの４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位及び１４２位から選択した１４の配置で置換されている。配列番号３９はタンパク質標的ＣＤ３に結合し、配列番号４０−４１はタンパク質標的ｅｐＣＡＭに結合し、配列番号４２はタンパク質標的ＥＧＦＲに結合する。
【００６２】
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【００６３】
本発明の結合タンパク質は、配列番号５−４２の１又は複数のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９１％、少なくとも９４％、又は少なくとも９６％の配列相同性を示すアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００６４】
結合タンパク質の更なる特徴付けは、可溶性タンパク質の形態で行うことができる。その適切な方法は当業者によく知られているか、又は文献に記載されている。結合親和性を測定する方法自体は、よく知られており、例えば、この分野でよく知られた以下の方法：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術、バイオ層干渉計（ＢＬＩ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、分析用超遠心分離、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ又はＩＲＭＡ）及び増強化学発光（ＥＣＬ）から選択することができる。これらの方法の幾つかは、以下の実施例に記載されている。
【００６５】
安定した解析系として、例えば化学的又は物理的アンフォールディングに関連する分光あるいは蛍光に基づく方法が、当業者の間でよく知られている。Ｈｅｒ２結合タンパク質を特徴付ける例示的な方法は、本発明の実施例に概説されている。
【００６６】
所定の標的に対する本発明の結合タンパク質の生化学的な結合解析は、表４に要約されており、更に実施例に記載されている。この態様の一実施形態では、Ｈｅｒ２結合タンパク質は、ヒトＨｅｒ２に対する解離定数ＫＤが、０．０１ｎＭ−７００ｎＭ、より好適には０．０５ｎＭ−５００ｎＭ、より好適には０．１ｎＭ−１００ｎＭ、より好適には０．１ｎＭ−２０ｎＭ、より好適には０．１ｎＭ−１０ｎＭの範囲である。解離定数ＫＤは、例えば、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴アッセイによって測定することができる。通常、解離定数ＫＤは２０℃、２５℃又は３０℃で測定される。特に断りのない限り、本明細書に列挙したＫＤ値は、好適には表面プラズモン共鳴によって２５℃で測定される。
【００６７】
本発明のもうひとつの態様は、本発明の結合タンパク質、更には少なくとも１つの更なるタンパク質又は分子に及ぶ。この追加のタンパク質は、第１の結合タンパク質と同じか、又は異なる抗原特異性を有する第２の結合タンパク質であってもよい。本発明の一実施形態は、融合タンパク質、又はＡｆｆｉｌｉｎ抗体融合タンパク質を含むコンジュゲート、又は、（ｉ）ＰＥＧ、ＨＳＡ、アルブミン結合ペプチド、又は免疫グロブリンあるいは免疫グロブリンのフラグメント、多糖類から任意に選択される薬物動態を調節する部分、（ｉｉ）モノクローナル抗体又はそのフラグメント、サイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物、酵素、又はそれらの誘導体、又は放射性核種から任意に選択される治療活性成分、（ｉｉｉ）蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素又は放射性核種から任意に選択される特徴的な成分、からなる群（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくとも１つの員から好適に選択された部分と、選択的に融合したあるいはコンジュゲートしたコンジュゲートに及ぶ。このコンジュゲート分子は、例えば、ペプチドリンカー配列やキャリア分子を介して１又は複数の部位で結合することができる。
【００６８】
本発明のタンパク質のコンジュゲートを生成するに当たり、タンパク性又は非タンパク性部分との更なるコンジュゲーションを、当技術分野でよく知られた化学的方法を用いて実施することができる。具体的には、システイン又はリシン残基を誘導体化するのに特有の化学的結合を用いることができる。非天然アミノ酸を導入する場合には、例えば、「クリックケミストリー」やアルデヒドに特異的な結合等、更なる化学的合成方法を利用することができる。  
【００６９】
このようにして得られたコンジュゲートは、次の１又は複数の実施例から選択することができる。（ｉ）リシン残基を介するタンパク質のコンジュゲーション；（ｉｉ）マレイミド化学によるシステイン残基を介するタンパク質のコンジュゲーションであって、特に、システイン残基が特異的に導入され、追加部分のコンジュゲーションに適した任意のポジションに配置される、コンジュゲーション；（ｉｉｉ）ペプチド性又はタンパク質原性のコンジュゲーション。対象のタンパク質をその他の機能的成分に共有結合及び非共有結合させるこれらの方法及びその他の方法は、この分野でよく知られているため、ここでは更に詳細には説明しない。
【００７０】
更なる実施形態は、好適にはＰＥＧ、ＨＳＡ、又は免疫グロブリン又は例えばＦｃフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントから選択される薬物動態又は成体内分布を調節する成分を更に含む、本発明の結合タンパク質に関する。半減期が長いタンパク質を産生する幾つかの技術は、当技術分野でよく知られている。
【００７１】
本発明の更なる態様において、本発明の結合タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲートは、医学分野、特に医学的な治療方法あるいは診断方法に、好適には癌又は自己免疫疾患に用いられる。
【００７２】
例えば、膜タンパク質Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ及びｅｐＣＡＭは、腫瘍細胞ではアップレギュレートされて、腫瘍細胞の無制御な増殖や転移形成をもたらすことが知られている。癌患者の新たな治療方法は、例えばモノクローナル抗体であるセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））等の標的治療薬によるＥＧＦＲの阻害、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））やペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標））等の標的治療薬によるＨｅｒ２の阻害が含まれる。抗体−薬物コンジュゲートであるＴ−ＤＭ１は、Ｈｅｒ２を過剰発現する乳癌、子宮癌及び卵巣癌肉腫に対して非常に有効である。ＥＧＦＲについては、更なるモノクローナル抗体、例えば、ザルツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ）及びニモツズマブ（ｈ−Ｒ３又はＴｈｅｒａｌｏｃ）が開発中である。ＥｐＣＡＭについては、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｅｌｏｌｏｍａｂ）等のモノクローナル抗体として、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）が開発中である。
【００７３】
Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲの過剰発現は、広範囲の癌で観察された。例えば、Ｈｅｒ２の過剰発現は、乳癌の約１５−３０％、胃／食道癌の１０−３０％で発生しており、卵巣、子宮内膜、膀胱、肺結腸、頭頸部等、その他の癌においても観察されている。したがって、本発明の結合タンパク質を含む医薬組成物は、ターゲットが、特に乳癌、卵巣癌、胃癌のみに限定されるものではなく、頭部、頸部、子宮頸部、前立腺、膵臓等の癌治療にも用いることができる。
【００７４】
ＥｐＣＡＭは様々な役割を果たしており、上皮性悪性腫瘍のみならず癌幹細胞においても不均一に過剰発現する。ＥｐＣＡＭは、腫瘍だけでなく正常上皮にも見られる。更に、ＥｐＣＡＭは、癌リスクを増加させる遺伝性疾患（リンチ症候群）において役割を果たしている。
【００７５】
ＣＤ３は幹細胞に発現し、Ｔ細胞活性化に必要である。自己免疫疾患（例えば、Ｉ型糖尿病）の免疫抑制治療用に、Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ（ＴＲＸ４）等の抗体が開発されている。組成物は、本発明の結合タンパク質の治療上又は診断上有効な用量を含む。投与すべきタンパク質の量は、治療すべき生物、疾患のタイプ、患者の年齢及び体重、ならびにそれ自体知られている追加の要因により変わる。
【００７６】
本発明は、結合タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲート、又は本発明の核酸分子、本発明のベクター、及び／又は宿主細胞又はウイルス、及び医薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に及ぶ。本発明は更に、本発明の結合タンパク質又はコンジュゲート又は核酸分子、本発明のベクター、及び／又は診断上許容される担体を有する宿主細胞又は非ヒト宿主を含む診断薬に及ぶ。この組成物は、医薬学的又は診断学的に許容される担体を含み、選択的に、それ自体よく知られた更なる補助剤及び賦形剤を含んでいてもよい。これらには、例えば安定化剤、界面活性剤、塩、緩衝剤、着色剤等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
この結合タンパク質を含む医薬組成物は、液体製剤、凍結乾燥物、クリーム、局所適用のローション、エアロゾル、粉末や顆粒の形態、エマルジョン又はリポソーム製剤の形態であってもよい。この組成物は、好適には滅菌した、非発熱性且つ等張性のものであり、それ自体よく知られた医薬学的に慣用されており許容できる添加剤を含むものであってもよい。更に、米国薬局方又は“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０））”の規制を参照されたい。
【００７８】
ヒトや動物の医学的な治療や予防分野において、本発明による少なくとも１つの結合タンパク質を有する医薬学的に有効な薬剤は、それ自体よく知られた方法により調製できる。これらの組成物は、ガレヌス製剤の場合には、注射又は注入、全身的、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮又はその他の従来使用される適用方法によって、非経口投与することができる。医薬製剤のタイプは、治療する疾患の種類、投与経路、疾患の重症度、治療される患者や医学分野の当業者に知られている他の要因に依存する。  
【００７９】
更なる態様において、本発明は、診断上許容される担体と共に、特定の標的又はそのアイソフォームに特異的に結合する本発明の結合タンパク質を含む、診断用組成物を開示している。向上したＨｅｒ２、ＥＧＦＲ及びｅｐＣＡＭの発現は、腫瘍悪性度と相関関係にあることから、患者におけるＨｅｒ２、ＥＧＦＲ及びｅｐＣＡＭの発現情報を得るための非侵襲性画像診断を開発することが望ましい。更に、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ及びｅｐＣＡＭのイメージングは、治療処置に対する患者の反応を評価するのに有用である。例えば、適切な放射性同位体又は蛍光色素分子で標識した本発明のタンパク質を非侵襲的イメージングに使用して、腫瘍の位置や転移を決定することができる（ＭｉｌｅｎｉｃらによるＣａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２３：６１９−６３１（２００８）；ＨｏｅｂｅｎらによるＩｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：８７０−８７８（２０１１）参照）。インタクトな抗体は、それらの薬物動態学的な特徴から通常の撮像には適していない。本発明の標識融合タンパク質は、サイズが小さく高親和性を有するため、イメージング用の診断薬としての使用により適していると考えられる。
【００８０】
本発明のタンパク質は、治療に有利に適用されると考えられる。具体的には、この分子が、優れた腫瘍標的化効果や所望の生体内分布を示し、それによって副作用が低減すると考えられている。本発明の医薬組成物は、従来の方法で製造することができる。
【００８１】
本発明の一実施形態では、好適にはタンパク質又はペプチドの標的等の標的が与えられた新規結合タンパク質が提供され、この結合タンパク質は、ジユビキチンの４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位及び１４２位に対応する１２、１３又は１４の配置における置換を含む。本発明の更なる重要な様態は、結合タンパク質の生成と、ジユビキチン変異タンパク質の選択とに及ぶ。
【００８２】
本発明の結合分子は、単純な有機合成方法、固相化による合成技術、又は商業的に入手可能な自動シンセサイザなど、従来のよく知られた技術によって調製することができる。一方、それらはまた、従来の組換え技術単独で、あるいは従来の合成技術と組み合わせて調製することもできる。上述したように、本発明のコンジュゲートは、例えばリジン又はシステインをベースとする化学反応等の化学的方法で化合物を組み合わせることにより、得ることができる。
【００８３】
本発明の別の態様によれば、本発明の結合タンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチドが提供されている。
【００８４】
更なる実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。ベクターとは、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用できる分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。
【００８５】
本発明は更に、本発明の核酸分子又は本発明のベクターを含む単離された細胞に関する。適切な宿主細胞には、原核生物又は真核生物が含まれる。様々な哺乳動物や昆虫の細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることもできる。本発明は、また、本発明のベクターを担持する宿主細胞に関連する。宿主細胞は、核酸配列で形質転換された、又は形質転換が可能な細胞であり、それによって目的の遺伝子を発現する。この用語は、目的の遺伝子が存在するのであれば、形態学的に同一であるかどうか、あるいは遺伝的にもとの親細胞に取り入るかどうかに関わらず、親細胞の子孫を含む。
【００８６】
別の態様では、ａ）本発明の宿主細胞を、結合タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップと、ｂ）産生された結合タンパク質を単離するステップと、を含む本発明の結合タンパク質の製造方法が提供されている。
【００８７】
本発明の一実施形態は、上記で詳述した本発明による結合タンパク質の調製方法に関し、この方法は、以下のステップ、（ａ）上記に定義した結合タンパク質をコードする核酸を調製するステップ；（ｂ）この核酸を発現ベクターに導入するステップ；（ｃ）この発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；（ｄ）この宿主細胞を培養するステップ；（ｅ）この宿主細胞を、結合タンパク質が発現する培養条件に供し、それによって上記の結合タンパク質を生成するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）で生成された結合タンパク質を、選択的に単離するステップ、を含む。
【００８８】
原核生物の又は真核生物の宿主を培養する適切な条件は、当業者によく知られている。タンパク質生成を目的とした細胞培養とタンパク質発現は、当業者によく知られた技術を適用して、小容量の振とうフラスコから大型発酵槽まで、任意の規模で行うことができる。
【００８９】
本発明によるジユビキチン変異タンパク質を発現させた後に、結合タンパク質を選択的に単離する。生成したポリペプチドの単離方法は、当該分野でよく知られるものであり、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法の工程を含むが、これらに限定されない。結合タンパク質の更なる精製は、当業者によく知られた方法を含む。選択された方法は、使用した発現ベクター、宿主生物、使用の目的分野、タンパク質のサイズや他の要因等、当業者に既に知られた幾つかの要因により決定する。簡単な精製を行うために、本発明により改変されたタンパク質は、離れている物質に対して高親和性を有する他のペプチド配列と融合することができる。好適には、ジユビキチン変異タンパク質の機能性に有害な影響を与えないような、又は特定のプロテアーゼ切断部位を導入するために精製後に分離できるような融合が選択される。そのような方法も当業者によく知られている。
【００９０】
精製されたタンパク質の単離は、遠心分離、沈殿、凝集、クロマトグラフィーの様々な実施形態、濾過、透析、濃縮及びそれらの組み合わせ等、当技術分野で知られている従来方法及び技術を適用して行うことができる。
【００９１】
本発明の更なる態様は、１０００ｎＭ又はそれ以下の解離定数（ＫＤ）で所定の標的に結合する、本発明の結合タンパク質の生成方法に関するものであり、この方法は、（ａ）ジユビキチンの核酸分子のヌクレオチドトリプレットを、ジユビキチン（配列番号４）の直鎖ポリペプチド配列のＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位に対応するアミノ酸の配置をコードする１２、１３又は１４の配置において変異誘発に供するステップと；（ｂ）１又は複数のジユビキチン変異タンパクの核酸分子を生じさせるステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）で得た１又は複数のジユビキチン変異タンパクの核酸分子を適切な発現系で発現させるステップと；（ｄ）選別及び／又は単離により、所定の標的に対して１０００ｎＭ又はそれ以下の解離定数（ＫＤ）を有する１又はそれ以上のジユビキチン変異タンパク質を濃縮するステップと、を含み、（ｅ）標的への親和性はジユビキチンの場合よりも少なくとも１０倍高い。部位特異的な変異誘発方法、ランダムな変異誘発方法、ＰＣＲ法を用いる変異誘発方法、又は同様の方法等、周知の様々な方法が変異誘発に利用可能である。すべての方法は、当業者によく知られたものである。
【００９２】
本発明の好適な実施形態では、２つのユビキチン部分が、頭−尾方向に直接連結されており、１５２のアミノ酸のタンパク質となる。各変異タンパク質は、アミノ酸配列ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＸＬＸＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＸＬＸＬＸＸＸＡＡＭＱＩＦＶＸＴＸＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＸＸＸＸＸＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡ（配列番号３）によって表される共通のスキャフォールドに基づいており、ここでＸは、Ｓ、Ｙ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｋ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｌ、Ｉ又はＦから選択されるアミノ酸残基にそれぞれ相当する（Ｍ、Ｃ及びＰは該当しない）。  
【００９３】
ライブラリー合成の最先端の手法であるｆａｖｏｒａｂｌｅ  ｔｒｉｐｌｅｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ）は、例えば２０個の天然アミノ酸の均一な（又は必要であれば不均一な）分散であると仮定して、ランダムなライブラリーを合成することができる。例えば１４の配置において２０個の天然アミノ酸をランダムに分布させると仮定すると、理論上は２０の１４乗のジユビキチン変異タンパク質のプール（２０１４）が生成され、各プールが多様なアミノ酸組成及び潜在的に異なる結合特性を有することとなる。好適には、全てのランダムな位置でアミノ酸システインの挿入が回避され、理論上は１９１４のジユビキチン変異タンパク質となる。この巨大な遺伝子プールは、様々なＡｆｆｉｌｉｎ分子のライブラリーを構成している。
【００９４】
「ランダムに改変されたヌクレオチド又はアミノ酸配列」とは、複数の位置において、その性質を予測することができないヌクレオチド又はアミノ酸による置換、挿入又は欠損に供されたヌクレオチド又はアミノ酸配列である。多くの場合、挿入したランダムなヌクレオチド（アミノ酸）又はヌクレオチド（アミノ酸）配列は、「完全にランダムである」（例えば、ランダムな合成又はＰＣＲを介した変異誘発の結果）。しかしながら、このランダムな配列は、共通の機能的特徴（例えば、発現産物の標的に対する反応性など）を有する配列を含んでいてもよく、又はこのランダムな配列は、例えば様々なアミノ酸が均一に分布した最終発現産物が完全なランダムな配列であるという意味で、ランダムである。
【００９５】
配列のＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位から選択された１２、１３又は１４の配置をコードする、ランダム化したヌクレオチドトリプレットを含む変異核酸分子は、適切な発現系において、（ｂ）で得られた１又は複数の変異タンパク質を発現する、１又は複数の変異タンパク質の核酸分子が生じる。
【００９６】
本出願は、幾つかの実施形態において、本明細書に記載のジユビキチン変異タンパク質に基づく、複数の非天然結合ポリペプチドを含むライブラリーを提供する。本明細書で提供されるライブラリーは、例えば、少なくとも約１０１２、約１０１３、約１０１４又はそれ以上のポリペプチドの配列多様性があり、このポリペプチドは、それぞれ任意選択的に様々なアミノ酸配列を含む。本発明の一実施形態には、ジユビキチン変異タンパク質をコードする核酸ライブラリーが提供されており、配列番号３の４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位及び１４２位のアミノ酸の配置に対応する１２、１３又は１４の配置から選択されるアミノ酸残基（配列番号４）は、変異タンパク質においてＭ、Ｃ又はＰを除く任意のアミノ酸により置換されている。このライブラリーは、各々が異なるアミノ酸配列を含む少なくとも１９１２個のポリペプチドを含むことが最も好ましい。ライブラリー員間の配列の差に応じて、ライブラリーに多様性が生じる。ライブラリーは、ポリペプチド又は核酸（集団；複数）の単純な混合物の形態であってもよい。核酸が発現ベクターに組み込まれており、核酸でコードされるポリペプチドを産生することが有利である。
【００９７】
ライブラリーは、ファージミドベクター（例えば、ｐＣＤ８７ＳＡ（Ｐａｓｃｈｋｅ、Ｍ．ａｎｄ  Ｗ．Ｈｏｈｎｅ（２００５）、Ｇｅｎｅ３５０（１）：７９−８８））にクローニングすることができる。ライブラリーは、リボソーム、バクテリオファージ、ウイルス、バクテリア又は酵母細胞、好適にはバクテリオファージの表層上に提示され、それぞれの標的に対して、反復ラウンドのパンニングを受けることができる。濃縮したファージプールからのジユビキチン変異タンパク質は、それぞれのタンパク質を発現させるために、発現ベクターにクローニングされる。好適には、ジユビキチン変異タンパク質の発現によって、自動ハイスループットスクリーニングプラットフォーム上のＥＬＩＳＡ等、確立された技術を用いた、特異的結合タンパク質のスクリーニングが可能になる。次いで、所望の結合特性を有する同定されたクローンが配列決定され、Ａｆｆｉｌｉｎ分子のアミノ酸配列が明らかとなる。同定された結合タンパク質は、例えば同定された配列の改変に基づく追加ライブラリーを作成することによる更なる成熟化ステップや、上記のように反復ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、パンニング及びスクリーニングのステップに供されてもよい。
【００９８】
上記のようにして得た遺伝子プールのライブラリーは、ディスプレイ法等の選別法によりタンパク質発現を可能にする適切な機能的遺伝要素と組み合わせることができる。ジユビキチンより少なくとも１０倍高い標的親和性をもつ結合タンパク質を同定する方法が提供されている。この方法は、ライブラリーをスクリーニングして所定の標的に結合するポリペプチドを同定するステップを具える。したがって、結合タンパク質を同定する方法は、以下のステップ：ａ．配列番号３の４２位、４４位、６８位、７０位、７２位、７３位、７４位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位及び１４２位に対応する１２、１３又は１４の配置から選択されるアミノ酸残基（配列番号４）がランダム化されたライブラリーを提供するステップと、ｂ．このライブラリーに潜在的な標的（例えば、この標的はタンパク質、ペプチド、あるいはタンパク質のドメインである）を提供するステップと、ｃ．このライブラリーと標的を接触させるステップと、ｄ．スクリーニングプロセスによって結合タンパク質を同定するステップであって、結合タンパク質が標的と少なくとも１０００ｎＭの特異的結合親和性で結合し、選択的に、結合親和性を有する結合タンパク質を単離する、ステップとを含む。
【００９９】
発現したタンパク質は、結合親和性が存在する場合には、本発明によって標的分子と接触しパートナーを互いに結合させることができる。このプロセスによって、標的分子への結合活性を有するタンパク質を同定することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れたＥＰ２３７９５８１Ｂ１を参照されたい。
【０１００】
本発明における接触は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ又は細胞表層ディスプレイ、酵母表層ディスプレイ又は細菌表層ディスプレイ法、好適にはファージディスプレイ法など、適切な提示法や選別法を用いて行われる。完全な開示のために、以下の参考文献も参照されたい：Ｈｏｅｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３（１９９３），５７２−５７９；Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２（１９９２），５９７−６０４；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９６），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．上記方法は、当業者には公知である。本明細書に記載のファージディスプレイ法では、ユビキチンの組換え変異体はフィラメントファージ上に提示され、提示された変異体のコーディングＤＮＡは、同時にファージエンベロープ内の一本鎖の形態でパックされて存在している。したがって、特定の性質を有する親和性の高い変異体をライブラリーから選別して、それらの遺伝情報を、それぞれ、適切な細菌の感染によって増幅するか、あるいは別の濃縮サイクルに加えることができる。ファージ表層のジユビキチン変異タンパク質の提示は、シグナル配列と、ファージの外殻又は表層タンパク質との遺伝子融合によって達成される。更に、コードされたタンパク質には、親和性強化工程におけるアフィニティークロマトグラフィーでの検出及び／又は精製用のアフィニティータグ、抗体エピトープ、又、タンパク質を特異的に切断するプロテアーゼ認識配列が含まれる。更に、ジユビキチン変異タンパク質遺伝子とファージ外殻タンパク質コード領域との間に、適切な抑制株では翻訳中に認識されないアンバー終止コドンが存在してもよい。
【０１０１】
ジユビキチン変異タンパク質の単離に関して記載された選別プロセスに適合して、記載された融合タンパク質の遺伝子カセットが挿入されるバクテリアベクターは、ファージミドと呼ばれる。特に、ファージミドを保有するバクテリア細胞をヘルパーファージによって重複感染させる場合、ファージミドＤＮＡを共有結合で閉鎖してファージミドＤＮＡをファージ外殻内にパッケージングすることにより、ファージミドは繊維状ファージ（例えばＭ１３又はｆ１）の遺伝子間領域、又はその一部を含む。
【０１０２】
得られたファージ粒子は、当業者によく知られた方法を用いて、その上に提示されるジユビキチン変異タンパク質の任意の標的との結合に関して選別される。この目的のために、提示されたジユビキチン変異タンパク質を一時的に標的物質に固定化され、結合しない変異体を分離した後に、特異的に溶出される。このようにして得られたファージ粒子は、選別した標的結合特性を有するジユビキチン変異タンパク質の選別と増幅の連続サイクルによって、再度増幅され濃縮される。結合タンパク質の生化学的及び機能的な更なるキャラクリゼーションは、上述した。
【０１０３】
本発明によって、当業者は、選択したポリペプチドのレパートリーから、特許請求の範囲で特定した親和性で標的に結合できないポリペプチドを除外することができる。本発明により、当業者は、所定の標的に機能的に結合できるジユビキチン変異タンパク質の選択的レパートリーを改良することができる。
【０１０４】
実施例
以下の実施例は、本発明を更に説明するためのものである。本発明は、タンパク質標的Ｈｅｒ２、ＣＤ３、ｅｐＣＡＭ又はＥＧＦＲに対して結合能力を有する、特定のユビキチン変異タンパク質によって具体的に例示される。しかしながら、本発明はこれらに限定されるものではなく、以下の実施例は上述の説明に基づく本発明の実用性を示すに過ぎない。本発明を完全に開示するために、参照により本出願に完全に組み込まれている、本出願に引用された文献にも言及する。
【０１０５】
実施例１．結合タンパク質の同定
ライブラリー構築及びクローニング
バランスの良いアミノ酸分布を実現するため、各々が７つのランダム化したアミノ酸位置をそれぞれ含む２つのユビキチン部分を、ｔｒｉｐｌｅｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。ライブラリーの合成には、（システインを除く）１９アミノ酸をコードする、予め作ってある二本鎖トリプレットの混合物を用いた。両方のユビキチン部分は、頭−尾方向に直接連結して１４個のランダム化したアミノ酸位置を有する１５２のアミノ酸のタンパク質とした。１４の配置がランダム化されたジユビキチン配列は、配列番号３：ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＸＬＸＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＸＬＸＬＸＸＸＡＡＭＱＩＦＶＸＴＸＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＸＸＸＸＸＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡに示されている。ここでＸは、Ｓ、Ｙ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｋ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｌ、Ｉ又はＦから選択されるアミノ酸残基にそれぞれ対応する。
【０１０６】
変異タンパク質中の１４個のランダム化されたアミノ酸は、ジユビキチンのＲ４２位、Ｉ４４位、Ｈ６８位、Ｖ７０位、Ｒ７２位、Ｌ７３位、Ｒ７４位、Ｋ８２位、Ｌ８４位、Ｑ１３８位、Ｋ１３９位、Ｅ１４０位、Ｓ１４１位及びＴ１４２位に対応する。ジユビキチンの配列は、配列番号４：ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡに示されている。
【０１０７】
このコンストラクトは、当業者によく知られた標準的な方法を用いて改変ｐＣＤ８７ＳＡファージミド（本明細書ではｐＣＤ１２という）とライゲーションされた。ｐＣＤ１２ファージミドは、改変ｔｏｒＡリーダー配列（アミノ酸配列ＱＰＡＭＡの欠損）を含んでおり、Ｎ末端に更なるアミノ酸をもたずにタンパク質のプロセシングが達成される。等分したライゲーション混合物のアリコートを用いて、大腸菌ＥＲ２７３８（Ｌｕｃｉｇｅｎ）のエレクトロポレーションを行った。ライブラリーはＳＰＩＦという。他に指示がない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって報告されている、確立された遺伝子組換え法が使用されている。
【０１０８】
標的
組み換えヒト標的−Ｆｃキメラは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ヒトＥＧＦＲ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ００５３３；１−６４５残基）の細胞外ドメインをコードする、又はヒトＨｅｒ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ０４６２６；１−６５２残基）の細胞外ドメインをコードする、又はヒトｅｐＣＡＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ１６４２２；１−２６５残基）の細胞外ドメインをコードする、又はヒトＣＤ３イプシロン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ１６４２２；全ての残基）をコードするＤＮＡ配列をＣ末端でヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と遺伝的に融合した。
【０１０９】
ＴＡＴファージディスプレイによる選別
ＳＰＩＦライブラリーは、選別システムにＴＡＴファージディスプレイを用いて所定のタンパク質標的に対し濃縮した。ＳＰＩＦライブラリーを担持するファージミドｐＣＤ１２を用いて、コンピテントバクテリアＥＲ２７３８細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎｅ）を形質転換した後、当業者によく知られた標準的な方法を用いて、ファージの増幅及び精製を行った。選別に関して、標的タンパク質は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＡ又はＧ上に固定化したＦｃ−融合タンパク質（Ｈｅｒ２−Ｆｃ、ＥＧＦＲ−Ｆｃ、ｅｐＣＡＭ−Ｆｃ又はＣＤ３−Ｆｃ）として提供された。ファージを培養する際の標的濃度は、２００ｎＭ（ラウンド１）から５０ｎＭ（ラウンド３）まで変化した。標的ファージ複合体を磁気的に溶液から分離させ、数回洗浄した。標的結合ファージを、トリプシンによって溶出した。Ｆｃ−結合変異体のファージライブラリーを枯渇させるために、ラウンド２及び３の前に、ＩｇＧ１（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の固定されたＦｃフラグメントを有するファージの前選別を行った。
【０１１０】
標的特異的ファージプールを同定するため、各選別ラウンドで溶出し再増幅したファージを、ファージプールＥＬＩＳＡによって分析した。中結合性のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）のウェルを、２．５μｇ／  ｍｌのＨｅｒ２−Ｆｃ、ＥＧＦＲ−Ｆｃ、ｅｐＣＡＭ−Ｆｃ又はＣＤ３−Ｆｃ及び、ＩｇＧ１のＦｃ断片（５μｇ／ｍｌ）でそれぞれコートした。結合したファージを、α−Ｍ１３  ＨＲＰ結合抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。ラウンド３で溶出し再増幅したファージは、標的に対する特異的結合を示し、次いで変異性ＰＣＲによるプールの成熟化に使用した。単離したファージミドプールは、変異性ＰＣＲ（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のテンプレートとして用いた。ライブラリーの位置と比較して新規の置換を担うＳＰＩＦ変異体の増幅されたプールを、ファージミドｐＣＤ１２で再クローニングし、ファージの増幅及び精製のためＥＲ２７３８に形質転換した。ファージを、上記のように２ラウンドのパンニングに再度用いた。標的は、ラウンド１、ラウンド２においてそれぞれ５ｎＭ、１ｎＭの濃度で用いた。両ラウンドについて、ｌｇＧ１のＦｃ断片による前選別を行った。特異的な標的結合について成熟し選別したプールを分析するため、ファージプールＥＬＩＳＡを上記のように実行した。
【０１１１】
発現ベクターへの標的結合ファージプールのクローニング
選別手順が完了すると、成熟選別したラウンド１及びラウンド２の標的特異的なＤＮＡプールを、当該分野でよく知られた方法に従ってＰＣＲにより増幅し、適切な制限酵素で切断して、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩ（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を含む発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の誘導体にライゲーションさせた。
【０１１２】
シングルコロニーヒット分析
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）へ形質転換を行った後、カナマイシン耐性単一コロニーを増殖させた。標的結合改変ユビキチンは、自己誘導培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ、２００５）を用いて、９６ディープウェルプレート（Ｇｅｎｅｔｉｘ、ＵＫ）内で培養させて発現させた。細胞を採取し、続いて溶解させた。遠心分離を行った後に、結果として得られた上清を、標的でコートしたプレート上でＥＬＩＳＡによりスクリーニングして、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＨＲＰコンジュゲート（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を用いて検出した。検出試薬としてＴＭＢ−Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて黄色を発色させ、プレートリーダーにおいて４５０ｎｍ対６２０ｎｍで測定した。
【０１１３】
実施例２．ライブラリーでコードされたタンパク質の溶解度分析
ＳＰＩＦライブラリーを、当業者に知られた標準的な方法を用いて、発現ベクターにクローニングした。単一のクローンを９６ディープウェルプレートで発現させた。細胞を、自己誘導培地において３７℃で１６−１８時間培養した。ペレット状の細胞を、リゾチームと凍結融解サイクルを用いて溶解した。可溶性画分及び不溶性画分を遠心分離により分離した。８Ｍの尿素を添加して、ペレットからタンパク質を回収した。上清と再懸濁したペレットを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）プレキャストゲル及びＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）により分析した。溶解度の分析には、ＢｉｏＲａｄ社のＩｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを使用した。
【０１１４】
ＳＰＩＦライブラリーでコードされるタンパク質の可溶性及びＳＰＩＦライブラリーでコードされる全タンパク質の発現レベルを、ライブラリーに基づく４つの異なるジユビキチンによってコードされるタンパク質の可溶性及び発現と比較した。６位、８位、６２−６６位、８５位、８７位、１４１−１４５位がランダム化されたＳＰＶＦというライブラリーは、３アミノ酸リンカー（ＧＩＧ）によって連結された２つのユビキチン部分（配列番号１）を含む。更に、ジユビキチン（配列番号４）のアミノ酸４６−６６位と１２２−１４２位との間に１４の異なるランダム化位置を有し、２つのユビキチン部分間にリンカーのないライブラリー（ＳＰＧＯ、ＳＰＯＯ、ＳＰＫＫと呼ばれる）を、ＳＰＩＦと比較した。
【０１１５】
2018520675.tif 000004
【０１１６】
ＳＰＩＦライブラリーによってコードされるタンパク質の溶解性は、ＳＰＶＦライブラリーと比較して予想外に有意に高かった。ＳＰＩＦ以外の様々なランダム化位置を有する他の全てのライブラリーは、ＳＰＶＦライブラリー、ＳＰＧＯライブラリー、ＳＰＯＯライブラリー、又はＳＰＫＫライブラリーでコードされるタンパク質の溶解性レベルがＳＰＩＦライブラリーでコードされるものより有意に低いことを示した。「向上した溶解度」は、別のタンパク質と比較して、溶媒中のタンパク質溶質の割合が高いことを意味する。それは、他のタンパク質と比較して、溶媒中の所定のタンパク質濃度におけるタンパク質の凝集が少ないこと、又はタンパク質の凝集割合が低いことを意味する。驚くべきことに、ＳＰＩＦライブラリーでコードされる全タンパク質の発現レベルは、ＳＰＶＦライブラリー、ＳＰＧＯライブラリー、ＳＰＯＯライブラリー又はＳＰＫＫライブラリーと比較して改善されている。実験を行ったこの他の全ライブラリーが、コードされたタンパク質のより低い発現率を示した（図２及び表３参照）。
【０１１７】
2018520675.tif 000005
【０１１８】
実施例３．ユビキチン変異タンパク質の発現及び精製
当業者によく知られた標準的な方法を用いて、Ａｆｆｉｌｉｎ分子を発現ベクターにサブクローニングし、以下に記載するように精製し分析した。全てのＡｆｆｉｌｉｎタンパク質を発現させ、アフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過によって高度に精製した。アフィニティークロマトグラフィーによる精製後に、Ａｋｔａ  ｓｙｓｔｅｍ及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００  ＨｉＬｏａｄ  １６／６００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ  ＨＰＬＣ又はＳＥＣ）を実施した。カラムは１２０ｍｌの容量で、２ＣＶで平衡化した。サンプルに、流速１ｍｌ／分の精製バッファーＢを適用した。シグナル強度が１０ｍＡＵに達すると、画分の収集が開始される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後、陽性画分をプールして、タンパク質濃度を測定した。更なる分析には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣが含まれている。タンパク質濃度は、モル吸光係数を用いて２８０ｎｍで吸光度を測定して決定した。Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍとＶｙｄａｃ  ２１４ＭＳ５４  Ｃ４（４，６×２５０ｍｍ、５μｍ、３００オングストローム）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＲＰクロマトグラフィー（ＲＰ  ＨＰＬＣ）を行った。
【０１１９】
実施例４．結合タンパク質の溶解度分析
上清と再懸濁したペレットを、ＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳゲルで分析し、クマシー染色した。８Ｍ尿素を添加して、ペレットからタンパク質を回収した。試験を行った全Ａｆｆｉｌｉｎタンパク質が、少なくとも８０％の高い溶解度を示した。
【０１２０】
実施例５．結合タンパク質は高温で安定である
本発明の結合タンパク質の熱安定性を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により測定した。各プローブを、０．１μｇ／μｌの濃度でＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）オプティカル３８４ウェルプレートに移して、適切な希釈度でＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ色素を添加した。毎分１℃の加熱速度で、２５−９５℃の温度上昇をプログラムした（ＶｉｉＡ−７  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。５２０ｎｍの励起波長と６２３ｎｍの発光波長（ＶｉｉＡ−７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で蛍光を常時測定した。選別した変異体の熱変性温度（Ｔｍ、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）の遷移の中点を表４に示す。
【０１２１】
実施例６．標的への親和性の分析
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ランニングバッファーで平衡化した。表面に露出したカルボキシル基を、ＥＤＣ及びＮＨＳの混合物を通過させることによって活性させ、反応性の高いエステル基を得た。７００−１５００ＲＵの「標的」−Ｆｃ（オン−ターゲット）をフローセル上に固定化して、別のフローセル上にＩｇＧ−Ｆｃ（オフ−ターゲット）を、標的に対して１：３（ｈＩｇＧ−Ｆｃ：標的）の割合で固定化した。標的固定化後に、エタノールアミンを注入して、非共有結合した標的を除去した。標的と結合すると、タンパク質分析物が表面上に蓄積され、屈折率が上がる。この屈折率の変化をリアルタイムで測定して、時間応答又はレゾナンスユニット（ＲＵ）としてプロットした。分析物は３０μｌ／分の流速でチップに段階希釈して注いだ。会合を３０秒間、解離を６０秒間行った。各ランの後、チップの表面を３０μｌの再生バッファーで再生し、ランニングバッファーで平衡化した。トラスツズマブの段階希釈はポジティブコントロールとして用いており、一方で非改変ユビキチンの段階希釈はネガティブコントロールを示している。コントロールサンプルを、３０μｌ／分の流速でマトリックスに注入すると同時に、会合を６０秒間、解離を１２０秒間行った。前述したように、再生及び再平衡化を行った。結合の実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。データ評価は、Ｌａｎｇｍｕｉｒの１：１モデル（ＲＩ＝０）を用いて、製造業者によって提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを介して行った。特異的な標的への結合の結果は、図４と表４に示されている。評価した解離定数（ＫＤ）は、オフ−ターゲットに対して標準化して示した。
【０１２２】
表４は、ＳＰＲ（標的への親和性はｎＭで示される；表の第４欄）から得られるような、結合アフィリン分子の生化学的な特徴、特に、結合タンパク質、例えばＨｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ及びＣＤ３等に対する結合親和性（ＫＤ）及び、温度安定性を示す（ＴｍはｏＣで示される；表の第５欄）。
【０１２３】
【表４】
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【０１２４】
実施例７．機能特性評価：細胞表面に発現した標的への結合
Ｈｅｒ２を過剰発現する細胞又はＥＧＦＲを過剰発現する細胞を用いた標的結合解析によって、更なる機能的な特性評価を行った。種々の濃度の特異的Ａｆｆｉｌｉｎ分子を試験した。Ｈｅｒ２細胞標的結合又はＥＧＦＲ細胞標的結合は、図に示すように確認した。フローサイトメトリーを用いて、Ｈｅｒ２結合タンパク質又はＥＧＦＲ結合タンパク質と、表面に露出したＨｅｒ２との相互作用の解析を行った。Ｈｅｒ２が過剰発現しているヒト乳腺癌由来のＳｋＢｒ３細胞、Ｈｅｒ２が過剰発現しているトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞、又はＥＧＦＲが過剰発現しているトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｈｅｒ２を発現しないヒト腎臓細胞株ＨＥＫ／２９３又はＥＧＦＲを発現しない細胞株ＨＥＫ／２９３、及び空ベクターのコントロールであるＣＨＯ―Ｋ１細胞を使用した。抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体であるトラスツズマブ又は抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるセツキシマブを、それぞれポジティブコントロールとして用いた。結果が、図５及び図６に要約されている。
【０１２５】
細胞をトリプシン処理して、ＦＣＳを含有する培地中で再懸濁させ、予め冷却したＦＡＣＳブロッキングバッファー中で洗浄して染色した。細胞染色用に細胞濃度を２×１０  ６細胞／ｍｌに調製し、各細胞株につき９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に三重に分注した。図に示すように、幾つかの実験で、濃度が異なるＡｆｆｉｌｉｎタンパク質を、Ｈｅｒ２又はＥＧＦＲを過剰発現する細胞とコントロール細胞とに加えた。４５分後、上清を除去し、ＦＡＣＳブロッキングバッファーで１：３００に希釈した１００μｌ／ウェルのウサギ抗Ｓｔｒｅｐ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから入手；Ａ００６２６）を添加した。一次抗体を除去した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手；Ａ１１００８）を１：１０００に希釈して使用した。Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＧｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ５ＨＴ装置を用いて、４８８ｎｍの励起波長と５２５／３０ｎｍの発光波長で、フローサイトメトリー測定を行った。同量のクローン１３９０９０を実験のネガティブコントロールとして使用した。
【０１２６】
実施例８．機能的な特性評価：Ｈｅｒ２を発現する細胞表面への結合
ヒトＨｅｒ２を外因的に発現する細胞への本発明のタンパク質の結合を、免疫細胞化学及び蛍光顕微鏡検査により確認した。５０ｎＭのＡｆｆｉｌｉｎ−１４１８８４、Ａｆｆｉｌｉｎ−１４２６２８、Ａｆｆｉｌｉｎ−１４１９２６、Ａｆｆｉｌｉｎ−１４４６３７、Ａｆｆｉｌｉｎ−１４２４１８及びＡｆｆｉｌｉｎ−１４４５６７を、Ｈｅｒ２を発現するＳｋＢｒ３細胞及びネガティブコントロールの細胞株ＨＥＫ／２９３で試験した。Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバースライド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に１×１０５細胞／ｍｌの濃度で細胞を播種した。７２時間の培養後、細胞をメタノールで固定し（２０℃で５分）、次いでブロッキング（ＰＢＳ５％ウマ胎児血清）し４５分間室温で５０ｎＭのＡｆｆｉｌｉｎでインキュベートした。Ａｆｆｉｌｉｎの結合は、ウサギ抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体（１：５００）を１時間インキュベートし、続いて抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８抗体（１：１０００）で１時間インキュベートすることによって検出した。核は４μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで染色した。全てのインキュベーションステップは室温で行った。
【０１２７】
実施例９．機能的な特性評価：Ｈｅｒ２結合タンパク質は、腫瘍由来組織細胞に発現した細胞外のＨｅｒ２に結合する
ＳＫＯＶ−３腫瘍、肺、肝臓、心筋及び卵巣の組織切片を用いて、免疫組織化学及び蛍光顕微鏡検査により本発明の結合タンパク質を分析した。組織切片を氷冷アセトンで１０分間固定して、続いて濃度が異なる（２０ｎＭ及び５０ｎＭ）のＡｆｆｉｌｉｎ−１４１８８４とＡｆｆｉｌｉｎ−１４２６２８を用いてブロッキングとインキュベーションを行った。ネガティブコントロールとして同量のジユビキチンクローン１３９０９０を、ポジティブコントロールとして１０ｎＭのトラスツズマブを、１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ウサギ抗Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ抗体（１：５００）と共に組織を室温で１時間インキュベートし、続いて二次抗体であるヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（１：１０００）又はヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ５９４（１：１０００）でインキュベートした。細胞核はＤＡＰＩで視覚化した。チャンバースライドを外してスライドガラスをＭｏｗｉｏｌとカバーガラスで覆った。切片は、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅで撮影した。Ａ１顕微鏡とイメージを、標準的なソフトウェアパッケージを用いて処理した。図７は、非結合タンパク質のクローンである１３９０９０と比較して、ＳＫＯＶ−３腫瘍切片上でのＨｅｒ２とＡｆｆｉｌｉｎ分子との特異的な結合を示す。
【０１２８】
実施例１０．結合タンパク質は、腫瘍細胞上に発現した細胞外の標的に結合する
Ａ４３１細胞は、類表皮癌に由来しており、ＥＧＦＲが高レベルに発現していることが知られている。Ａ４３１細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバースライド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に播種して、３７℃、５％のＣＯ２で２日間インキュベートした。室温で１０分間３％パラホルムアルデヒドにより細胞を固定して、ＰＢＳで洗浄し、続いてブロッキング溶液（ＢＳ、３％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を用いて４℃で３０分間ブロッキングした。次いで、５００ｎＭの結合タンパク質Ａｆｆｉｌｉｎ−１４２２６５又はコントロールとして１０ｎＭのセツキシマブと共に、細胞を４℃で１時間インキュベートした。非改変ユビキチン（クローン１３９０９０という）は、ネガティブコントロールとして供された。ＰＢＳで洗浄した後、ウサギ抗Ｓｔｒｅｐ抗体（１：５００）と共に細胞を４℃で１時間インキュベートした。次いで、二次抗体であるロバ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（１：１０００）又はヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ  ５９４（１：１０００）と共に細胞をインキュベートし、続いて細胞核がＤＡＰＩで視覚化した。チャンバースライドを外してスライドガラスをＭｏｗｉｏｌとカバーガラスで覆った。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅで細胞を撮影し、Ａ１顕微鏡とイメージを、標準的なソフトウェアパッケージを用いて処理した。ＥＧＦＲを発現するＡ４３１腫瘍細胞を染色することにより、細胞外ＥＧＦＲへのアフィリン１４２２６５の結合が確認される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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