(57)【要約】  本開示は、アンドロゲン受容体のＮ末端及びＣ末端に結合する（抗体等の）結合体を用いて前立腺がんを評価するための材料及び方法に関する。前立腺試料はアンドロゲン受容体のＮ末端及びＣ末端について組織化学的に標識され、Ｎ末端抗体とＣ末端抗体の結合の間の比が決定される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における前立腺がんの進行を追跡する方法であって、
（ａ）患者からの前立腺腫瘍試料への第１の結合体及び第２の結合体の結合を顕微鏡によって検出する工程であって、第１の結合体がアンドロゲン受容体（ＡＲ）のＮ末端ドメインに特異的に結合し、第２の結合体がＡＲのＣ末端リガンド結合ドメインに特異的に結合する、工程、
（ｂ）Ｂ１／Ｂ２の比を計算する工程であって、
Ｂ１が第１の結合体の前立腺腫瘍試料への結合であり、
Ｂ２が第２の結合体の前立腺腫瘍試料への結合である、工程、及び
（ｃ）（ｂ）の比を、より早い時点で患者から採取した同じ腫瘍の試料について（ｂ）に従って計算した参照比と比較する工程
を含み、参照比と比較して前記比が増大していることが、前立腺がんの進行を示す、方法。
【請求項２】
患者における前立腺がんを予測する方法であって、
（ａ）患者からの前立腺腫瘍試料への第１の結合体及び第２の結合体の結合を顕微鏡によって検出する工程であって、第１の結合体がアンドロゲン受容体（ＡＲ）のＮ末端ドメインに特異的に結合し、第２の結合体がＡＲのＣ末端リガンド結合ドメインに特異的に結合する、工程、
（ｂ）Ｂ１／Ｂ２の比を計算する工程であって、
Ｂ１が第１の結合体の前立腺腫瘍試料への結合であり、
Ｂ２が第２の結合体の前立腺腫瘍試料への結合である、工程、及び
（ｃ）（ｂ）の比を参照比と比較する工程
を含み、参照比と比較して（ｂ）の比が高いことが、予後不良を示す、方法。
【請求項３】
参照比が、より早い時点で患者から採取した同じ腫瘍の試料について（ｂ）に従って計算した比である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
参照比が、一般的な患者集団から採取した代表的な数の前立腺腫瘍について（ｂ）に従って計算した比である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
参照比が、ＡＲ標的治療剤又は化学療法剤に反応すると予想される患者を同じＡＲ標的治療剤及び／又は化学療法剤に抵抗すると予想される患者から区別するカットオフである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＡＲ指向治療剤がＡＲアンタゴニストである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＡＲ指向治療剤がアンドロゲン合成の阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＡＲ標的治療剤が、アビラテロン、エンザルタミド、オルテロネル、ガレテロン、ＡＲＮ−５０９、ＯＤＭ−２０１、ＡＺＤ３５１４、ＥＺＮ−４１７６、及びＢＭＳ−６４１９８８からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＡＲ標的治療剤が、アビラテロン又はエンザルタミドである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
化学療法剤がタキサンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
タキサンがパクリタキセル又はドセタキセルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前立腺がんを有する患者のアンドロゲン受容体（ＡＲ）標的治療剤及び／又は化学療法剤に対する抵抗性を予測する方法であって、
（ａ）患者からの前立腺腫瘍試料への第１の結合体及び第２の結合体の結合を顕微鏡によって検出する工程であって、第１の結合体がアンドロゲン受容体のＮ末端ドメインに特異的に結合し、第２の結合体がアンドロゲン受容体のＣ末端リガンド結合ドメインに特異的に結合する、工程、
（ｂ）Ｂ１／Ｂ２の比を計算する工程であって、
Ｂ１が第１の結合体の前立腺腫瘍試料への結合であり、
Ｂ２が第２の結合体の前立腺腫瘍試料への結合である、工程、及び
（ｃ）（ｂ）の比を参照比と比較する工程
を含み、参照比と比較して（ｂ）による比が高いことが、前立腺がんがＡＲ標的治療剤及び／又は化学療法剤に反応する可能性が低いことを示す、方法。
【請求項１３】
参照比が、より早い時点で患者から採取した同じ腫瘍の試料について（ｂ）に従って計算した比である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
参照比が、一般的な患者集団から採取した代表的な数の前立腺腫瘍について（ｂ）に従って計算した比である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＲ指向治療剤がＡＲアンタゴニストである、請求項１２から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＲ指向治療剤がアンドロゲン合成の阻害剤である、請求項１２から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＲ標的治療剤が、アビラテロン、エンザルタミド、オルテロネル、ガレテロン、ＡＲＮ−５０９、ＯＤＭ−２０１、ＡＺＤ３５１４、ＥＺＮ−４１７６、及びＢＭＳ−６４１９８８からなる群から選択される、請求項１２から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＲ標的治療剤が、アビラテロン又はエンザルタミドである、請求項１２から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
化学療法剤がタキサンである、請求項１２から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
タキサンがパクリタキセル又はドセタキセルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前立腺がんを有する患者のための治療コースを選択する方法であって、
（ａ）アンドロゲン受容体のＣ末端欠失スプライス変異体の存在に関して前立腺がんを特徴付ける工程であって、
（ａ１）患者からの前立腺腫瘍試料への第１の結合体及び第２の結合体の結合を顕微鏡によって検出する工程であって、第１の結合体がアンドロゲン受容体のＮ末端ドメインに特異的に結合し、第２の結合体がアンドロゲン受容体のＣ末端リガンド結合ドメインに特異的に結合する、工程、
（ａ２）Ｂ１／Ｂ２の比を計算する工程であって、
Ｂ１が第１の結合体の前立腺腫瘍試料への結合であり、
Ｂ２が第２の結合体の前立腺腫瘍試料への結合である、工程、及び
（ａ３）（ａ２）の比を参照比と比較する工程
によってなされる、特徴付ける工程、並びに
（ｂ）（ａ）に基づいて治療コースを選択する工程であって、
（ｂ１）（ａ２）の比が参照比より大きい場合には積極的な治療コースが選択され、
（ｂ２）（ａ２）の比が参照比より小さい場合には保存的な治療コースが選択される工程
を含む、方法。
【請求項２２】
積極的な治療コースが、腫瘍及び／又は前立腺の外科的切除、去勢、並びに／又は放射線治療を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
保存的な治療コースが、観察又はＡＲ指向治療剤及び／又は化学療法剤の投与を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＲ指向治療剤がＡＲアンタゴニストである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＲ指向治療剤がアンドロゲン合成の阻害剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＡＲ標的治療剤が、アビラテロン、エンザルタミド、オルテロネル、ガレテロン、ＡＲＮ−５０９、ＯＤＭ−２０１、ＡＺＤ３５１４、ＥＺＮ−４１７６、及びＢＭＳ−６４１９８８からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＡＲ標的治療剤が、アビラテロン又はエンザルタミドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
化学療法剤がタキサンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
タキサンがパクリタキセル又はドセタキセルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
患者における前立腺がんの治療コースをモニターする方法であって、
（ａ）患者からの前立腺腫瘍試料への第１の結合体及び第２の結合体の結合を顕微鏡によって検出する工程であって、第１の結合体がアンドロゲン受容体（ＡＲ）のＮ末端ドメインに特異的に結合し、第２の結合体がＡＲのＣ末端リガンド結合ドメインに特異的に結合する、工程、
（ｂ）治療コースの間の複数の時点におけるＢ１／Ｂ２の比を計算する工程であって、
Ｂ１が第１の結合体の前立腺腫瘍試料への結合であり、
Ｂ２が第２の結合体の前立腺腫瘍試料への結合である、工程、及び
（ｃ）（ｂ）の比を比較する工程
を含み、治療コースの間の前記比の増大が、前立腺がんの進行及び／又は治療コースへの抵抗を示す、方法。
【請求項３１】
治療コースが、観察又はＡＲ指向治療剤及び／又は化学療法剤の投与を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＡＲ指向治療剤がＡＲアンタゴニストである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＡＲ指向治療剤がアンドロゲン合成の阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＡＲ標的治療剤が、アビラテロン、エンザルタミド、オルテロネル、ガレテロン、ＡＲＮ−５０９、ＯＤＭ−２０１、ＡＺＤ３５１４、ＥＺＮ−４１７６、及びＢＭＳ−６４１９８８からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
ＡＲ標的治療剤が、アビラテロン又はエンザルタミドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
化学療法剤がタキサンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
タキサンがパクリタキセル又はドセタキセルである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記比が増大する場合にはさらなる治療コースが選択され、さらなる治療コースは、腫瘍及び／又は前立腺の外科的切除、去勢、及び／又は放射線治療を含む、請求項３０から３７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
さらなる治療コースの間に（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことをさらに含み、さらなる治療コースの間に前記比が増大する場合にさらなる治療が中止される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第１及び第２の結合剤の結合が免疫組織化学的に検出される、請求項１から３９の何れか一項に記載の方法。
【請求項４１】
Ｂ１及びＢ２がシグナル強度の尺度である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
第１及び第２の結合剤についてＨスコアが計算され、前記比がＨスコアの比である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｈスコアが第１及び第２の結合剤の核及びサイトゾルの染色に基づいて計算される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｈスコアが第１及び第２の結合剤の染色強度に基づいて計算される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
Ｈスコアが腫瘍組織の試料のデジタル画像を用いて自動的に計算される、請求項４２から４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項４６】
Ｈスコアがポジティブピクセル選択的アルゴリズムを用いて計算される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第１の結合体及び／又は第２の結合体が抗体である、請求項１から４６の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
第１の結合体がモノクローナル抗体ＳＰ１０７である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
第１の結合体がアンドロゲン受容体への結合に関してＳＰ１０７と競合する抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
第２の結合体がモノクローナル抗体ＳＰ２４２である、請求項４７から４９の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
第２の結合体がアンドロゲン受容体への結合に関してＳＰ２４２と競合する抗体である、請求項４７から４９の何れか一項に記載の方法。
【請求項５２】
第１の結合体及び第２の結合体がクロモゲン剤又は蛍光剤で標識されている、請求項１から５１の何れか一項に記載の方法。
【請求項５３】
クロモゲン剤又は蛍光剤が、第１の結合体に特異的に結合し得る第３の結合体及び第２の結合体に結合し得る第４の結合体に結合している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
第１の結合体及び第２の結合体が非内因性ハプテンを含み、第３の結合体及び第４の結合体が非内因性ハプテンに特異的に結合し得る抗体又はその断片である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（ａ）プロセッサー及びプロセッサーに連結されたメモリーを含む分析的イメージング解析システム
を含むシステムであって、
メモリーは、プロセッサーによって実行されると、請求項１から５４の何れか一項に記載の方法を含む操作をプロセッサーに実行させるコンピューターで実行可能な命令を保存するためのものである、システム。
【請求項５６】
（ｂ）前立腺腫瘍試料のデジタル化された画像を取り込み、デジタル化された画像を分析的イメージング解析システムに通信するように適合された分析的イメージングハードウェアシステム
をさらに含む、請求項５５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書においては２０１５年３月１６日に出願した米国仮特許出願第６２／１３３７６３号の利益を主張する。該出願の内容は参照により全体として組み込まれる。
【０００２】
本出願は特に前立腺がんの診断の分野における診断アッセイを実施するための材料及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）を通して作用する男性ホルモンのシグナル伝達は、前立腺がんの進行において主要な役割を果たし、去勢抵抗性の前立腺がん（ＣＲＰＣ）の進行は一般に、ＡＲのリガンド非依存性の異常な活性化に関連する。最近の発見によれば、前立腺がん細胞におけるある種のＡＲスプライス変異体の発現は予後及びＡＲ標的治療への抵抗性と相関していることが示唆されている。たとえばＺｅｎｇｅｒｌｉｎｇ等、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｏｒａｆｅｎｉｂ  ｏｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．  １３：１１５３０−１１５４２  （２０１２）；Ｍｏｓｔａｇｈｅｌ等、Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＣＹＰ１７Ａ１  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ：  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １７（１８）：５９１３−２５  （Ｓｅｐ．  １５，  ２０１１）；Ｈａｒａｄａ等、Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ＬＮＣａＰ  ｃｅｌｌｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  １０３巻、６号、ｐ．１０２２−２７  （Ｊｕｎ．  ２０１２）；Ｚｈａｎｇ等、Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｃｃｕｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｉｎ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，  ６：ｅ２７９７０  （２０１１）；Ｔｈａｄａｎｉ−Ｍｕｌｅｒｏ等、Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔａｘａｎｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７４：２２７０−２２８２  （２０１４）；Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ等、ＡＲ−Ｖ７  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ  ａｎｄ  ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ３７１  ：１０２８−１０３８  （２０１４）を参照されたい。しかし発明者らの知見によれば、これらの変異体のスプライス形の１つを発現する患者の何れがＡＲ標的治療及び／又は化学療法に抵抗性があるかを予測することができるアッセイの開発に成功した者はいない。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は一般に、前立腺がんにおけるアンドロゲン受容体（ＡＲ）のＣ末端スプライス変異体を検出するための２つの結合体、即ち（１）ＡＲのＮ末端部分のエピトープと特異的に結合し、ＡＲの完全長及びＣ末端トランケート形の両方に結合する結合体、及び（２）ＡＲのＣ末端リガンド結合ドメインのエピトープと特異的に結合し、アンドロゲン受容体の完全長とのみ結合する結合体の組合せを用いる方法に関する。
【０００５】
ある態様においては、患者における前立腺がんの進行を追跡する方法であって、（ａ）患者からの前立腺腫瘍試料への第１の結合体及び第２の結合体の結合を顕微鏡によって検出する工程であって、第１の結合体がアンドロゲン受容体（ＡＲ）のＮ末端ドメインに特異的に結合し、第２の結合体がＡＲのＣ末端リガンド結合ドメインに特異的に結合する、工程、（ｂ）Ｂ１／Ｂ２の比を計算する工程であって、Ｂ１が第１の結合体の前立腺腫瘍試料への結合であり、Ｂ２が第２の結合体の前立腺腫瘍試料への結合である、工程、及び（ｃ）（ｂ）の比を、より早い時点で患者から採取した同じ腫瘍の試料について（ｂ）に従って計算した参照比と比較する工程を含み、参照比と比較して比が増大していることは、前立腺がんの進行を示す、方法が提供される。
【０００６】
別の態様においては、患者における前立腺がんを予測する方法であって、（ａ）患者からの前立腺腫瘍試料への第１の結合体及び第２の結合体の結合を顕微鏡によって検出する工程であって、第１の結合体がアンドロゲン受容体（ＡＲ）のＮ末端ドメインに特異的に結合し、第２の結合体がＡＲのＣ末端リガンド結合ドメインに特異的に結合する、工程、（ｂ）Ｂ１／Ｂ２の比を計算する工程であって、Ｂ１が第１の結合体の前立腺腫瘍試料への結合であり、Ｂ２が第２の結合体の前立腺腫瘍試料への結合である、工程、及び（ｃ）（ｂ）の比を参照比と比較する工程を含み、参照比と比較して（ｂ）による比が高いことは、予後不良を示す、方法が提供される。ある実施態様においては、参照比は、より早い時点で患者から採取した同じ腫瘍の試料について（ｂ）に従って計算した比である。別の実施態様においては、参照比は、一般的な患者集団から採取した代表的な数の前立腺腫瘍について（ｂ）に従って計算した比である。例として、参照比は、ＡＲ標的治療剤又は化学療法剤に反応すると予想される患者を同じＡＲ標的治療剤及び／又は化学療法剤に抵抗すると予想される患者から区別するカットオフを表わし得る。ある実施態様においては、ＡＲ指向治療剤はＡＲアンタゴニスト又はアンドロゲン合成の阻害剤である。別の実施態様においては、ＡＲ標的治療剤は、アビラテロン、エンザルタミド、オルテロネル、ガレテロン、ＡＲＮ−５０９、ＯＤＭ−２０１、ＡＺＤ３５１４、ＥＺＮ−４１７６、及びＢＭＳ−６４１９８８からなる群から選択される。別の実施態様においては、化学療法剤はパクリタキセル又はドセタキセル等のタキサンである。
【０００７】
別の態様においては、前立腺がんを有する患者のアンドロゲン受容体（ＡＲ）標的治療剤及び／又は化学療法剤に対する抵抗性を予測する方法が提供され、該方法は、（ａ）患者からの前立腺腫瘍試料への第１の結合体及び第２の結合体の結合を顕微鏡によって検出する工程であって、第１の結合体がアンドロゲン受容体のＮ末端ドメインに特異的に結合し、第２の結合体がアンドロゲン受容体のＣ末端リガンド結合ドメインに特異的に結合する、工程、（ｂ）Ｂ１／Ｂ２の比を計算する工程であって、Ｂ１が第１の結合体の前立腺腫瘍試料への結合であり、Ｂ２が第２の結合体の前立腺腫瘍試料への結合である、工程、及び（ｃ）（ｂ）の比を参照比と比較する工程を含み、参照比と比較して（ｂ）による比が高いことは、前立腺がんがＡＲ標的治療剤及び／又は化学療法剤に反応する可能性が低いことを示す。ある実施態様においては、参照比は、より早い時点で患者から採取した同じ腫瘍の試料について（ｂ）に従って計算した比である。別の実施態様においては、参照比は、一般的な患者集団から採取した代表的な数の前立腺腫瘍について（ｂ）に従って計算した比である。ある実施態様においては、ＡＲ指向治療剤はＡＲアンタゴニスト又はアンドロゲン合成の阻害剤である。別の実施態様においては、ＡＲ標的治療剤は、アビラテロン、エンザルタミド、オルテロネル、ガレテロン、ＡＲＮ−５０９、ＯＤＭ−２０１、ＡＺＤ３５１４、ＥＺＮ−４１７６、及びＢＭＳ−６４１９８８からなる群から選択される。別の実施態様においては、化学療法剤はパクリタキセル又はドセタキセル等のタキサンである。
【０００８】
別の態様においては、前立腺がんを有する患者のための治療コースを選択する方法であって、（ａ）アンドロゲン受容体のＣ末端欠失スプライス変異体の存在に関して前立腺がんを特徴付ける工程であって、（ａ１）患者からの前立腺腫瘍試料への第１の結合体及び第２の結合体の結合を顕微鏡によって検出する工程であって、第１の結合体がアンドロゲン受容体のＮ末端ドメインに特異的に結合し、第２の結合体がアンドロゲン受容体のＣ末端リガンド結合ドメインに特異的に結合する、工程、（ａ２）Ｂ１／Ｂ２の比を計算する工程であって、Ｂ１が第１の結合体の前立腺腫瘍試料への結合であり、Ｂ２が第２の結合体の前立腺腫瘍試料への結合である、工程、及び（ａ３）（ａ２）の比を参照比と比較する工程によってなされる、特徴付ける工程、並びに（ｂ）（ａ）に基づいて治療コースを選択する工程であって、（ｂ１）（ａ２）の比が参照比より大きい場合には積極的な治療コースが選択され、（ｂ２）（ａ２）の比が参照比より小さい場合には保存的な治療コースが選択される工程を含む、方法が提供される。ある実施態様においては、積極的な治療コースは、腫瘍及び／又は前立腺の外科的切除、去勢、並びに／又は放射線治療を含み、保存的な治療コースは、観察又はＡＲ指向治療剤及び／又は化学療法剤の投与を含む。ある実施態様においては、ＡＲ指向治療剤はＡＲアンタゴニスト又はアンドロゲン合成の阻害剤である。別の実施態様においては、ＡＲ標的治療剤は、アビラテロン、エンザルタミド、オルテロネル、ガレテロン、ＡＲＮ−５０９、ＯＤＭ−２０１、ＡＺＤ３５１４、ＥＺＮ−４１７６、及びＢＭＳ−６４１９８８からなる群から選択される。別の実施態様においては、化学療法剤はパクリタキセル又はドセタキセル等のタキサンである。
【０００９】
ある実施態様においては、患者における前立腺がんの治療コースをモニターする方法が提供され、該方法は、（ａ）患者からの前立腺腫瘍試料への第１の結合体及び第２の結合体の結合を顕微鏡によって検出する工程であって、第１の結合体がアンドロゲン受容体（ＡＲ）のＮ末端ドメインに特異的に結合し、第２の結合体がＡＲのＣ末端リガンド結合ドメインに特異的に結合する、工程、（ｂ）治療コースの間の複数の時点におけるＢ１／Ｂ２の比を計算する工程であって、Ｂ１が第１の結合体の前立腺腫瘍試料への結合であり、Ｂ２が第２の結合体の前立腺腫瘍試料への結合である、工程、及び（ｃ）（ｂ）の比を比較する工程を含み、治療コースの間の比の増大は、前立腺がんの進行及び／又は治療コースへの抵抗を示す。ある実施態様においては、治療コースには観察又はＡＲ指向治療剤及び／又は化学療法剤の投与が含まれる。ある実施態様においては、ＡＲ指向治療剤はＡＲアンタゴニスト又はアンドロゲン合成の阻害剤である。別の実施態様においては、ＡＲ標的治療剤は、アビラテロン、エンザルタミド、オルテロネル、ガレテロン、ＡＲＮ−５０９、ＯＤＭ−２０１、ＡＺＤ３５１４、ＥＺＮ−４１７６、及びＢＭＳ−６４１９８８からなる群から選択される。別の実施態様においては、化学療法剤はパクリタキセル又はドセタキセル等のタキサンである。別の実施態様においては、比が増大する場合にはさらなる治療コースが選択され、さらなる治療コースは、腫瘍及び／又は前立腺の外科的切除、去勢、及び／又は放射線治療、並びに任意選択的にさらなる治療コースの間に（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことを含み、さらなる治療コースの間に比が増大する場合にはさらなる治療が中止される。
【００１０】
上記の方法の何れにおいても、第１及び第２の結合剤の結合は、組織化学的に又は細胞化学的に、好ましくは免疫組織化学的に検出され得る。ある実施態様においては、第１の結合体及び／又は第２の結合体は抗体である。１つの特定の実施態様においては、第１の結合Ｔ体はモノクローナル抗体ＳＰ１０７又はアンドロゲン受容体への結合に関してＳＰ１０７と競合する抗体であり、及び／又は第２の結合体はモノクローナル抗体ＳＰ２４２又はアンドロゲン受容体への結合に関してＳＰ２４２と競合する抗体である。第１の結合体及び第２の結合体はクロモゲン剤又は蛍光剤で標識してよい。１つの特定の実施態様においては、クロモゲン剤又は蛍光剤は、第１の結合体に特異的に結合し得る第３の結合体及び第２の結合体に結合し得る第４の結合体に結合される。別の特定の実施態様においては、第１の結合体及び第２の結合体は非内因性ハプテンを含み、第３の結合体及び第４の結合体は非内因性ハプテンに特異的に結合し得る抗体又はその断片である。別の特定の実施態様においては、第３の結合体及び第４の結合体は抗種抗体である。
【００１１】
ある実施態様においては、Ｂ１及びＢ２はシグナル強度の尺度である。たとえば１つの実施態様においては、Ｂ１及びＢ２は第１及び第２の結合剤について計算したＨスコアであり、Ｂ１：Ｂ２の比はＨスコアの比である。Ｈスコアは好ましくは腫瘍組織の試料のデジタル画像を用いて自動的に計算される。１つの実施例においては、Ｈスコアはポジティブピクセル選択的アルゴリズムを用いて自動計算される。ある実施態様においては、Ｈスコアは第１及び第２の結合剤の核及びサイトゾルの染色に基づいて計算される。別の実施態様においては、Ｈスコアは第１及び第２の結合剤の染色強度に基づいて計算される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】用いた細胞株がＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２ｖ１、及びＰＣ３細胞株において期待されるＡＲ又はＡＲ変異体を発現していることを確かめるために用いたＲＴ−ＰＣＲの画像である。
【図２】用いた細胞株がＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２ｖ１、及びＰＣ３細胞株において期待されるＡＲ又はＡＲ変異体を発現していることを確かめるために用いたウェスタンブロットの画像である。
【図３】ＳＰ１０７及びＳＰ２４２抗体を用いた、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２Ｒｖ１、及びＰＣ３細胞株の免疫組織化学染色の画像である。
【図４】図３に示す免疫組織化学染色から得たＨスコアの棒グラフである。
【図５】完全長ＡＲ（Ｍ１２ＡＲ）又はＡＲ  Ｃ末端スプライス変異体ＡＲｖ７（Ｍ１２ＡＲｖ７）、原発性前立腺腫瘍（ＰＣａ）、及び転移腫瘍（ＣＲＰＣ）でトランスフェクトさせた細胞株の、ＳＰ１０２及びＳＰ２４２を用いたＩＨＣ染色の画像である。
【図６】図５の画像から計算したＨスコアの棒グラフである。
【図７】それぞれの試料について図６から得たＳＰ１０７及びＳＰ２４２のＨスコアの比の棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本方法は、前立腺腫瘍組織を２つの特異的結合体、（１）ＡＲのＮ末端部分に特異的な結合体であって、ＡＲの完全長及びＣ末端トランケート形の両方に結合する結合体、及び（２）ＡＲのＣ末端リガンド結合ドメインに特異的な結合体であって、完全長ＡＲにのみ結合する結合体の組合せによって標識することによって、前立腺腫瘍試料においてアンドロゲン受容体の発現を組織化学的に又は免疫組織化学的に分析し、評価し、及び点数付けする方法に関する。２つの結合体の結合は、それぞれＢ１及びＢ２の量として検出され、表わされる。次いでＢ１とＢ２の比が計算される。これは前立腺がんの進行を追跡するため、前立腺がんを予測するため、アンドロゲン受容体（ＡＲ）標的治療剤及び／又は化学療法剤に対する抵抗性を予測するため、前立腺がんを有する患者の治療コースを選択するため、並びに／又は前立腺がんの治療コースをモニターするために用いることができる。
【００１４】
Ｉ．前立腺腫瘍試料
開示するプロセスにおいて有用な試料は、一般に前立腺がん患者からの前立腺腫瘍試料ということになる。本明細書において用いる「前立腺がん患者」は、前立腺がんを有していると診断され、又はその疑いがある対象又は個体を意味する。本明細書において用いる「対象」又は「個体」は哺乳類である。哺乳類には、これだけに限らないが、家畜（たとえばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（たとえばヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（たとえばマウス及びラット）が含まれる。ある実施態様においては、個体又は対象はヒトである。本明細書において用いる「前立腺腫瘍試料」という用語は、前立腺由来の腫瘍細胞を含む患者からの任意の試料を意味するものとし、原発性腫瘍、転移組織、及び循環腫瘍細胞から得られた試料を含む。例示的な前立腺腫瘍試料には、コア生検又は切除等の固形の前立腺腫瘍試料、微細針吸引等の前立腺腫瘍からの解離した細胞試料、並びに液体生検等によって得られる前立腺由来の循環腫瘍細胞の試料が含まれる。
【００１５】
いくつかの実施態様においては、前立腺腫瘍試料は、防腐剤、抗凝固剤、バッファー、栄養剤、抗生物質等の、本来天然には組織と混合されない化合物を含む。ある実施態様においては、前立腺腫瘍試料は一又は複数の固定剤に曝され、及び／又はこれを含む。本発明の方法及び組成物に用いることができる固定剤には、ホルマリン、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、酢酸、エタノール、アセトン、ピクリン酸、クロロホルム、重クロム酸カリウム及び塩化水銀、並びに／又はマイクロ波加熱又は凍結による安定化が含まれる。
【００１６】
いくつかの実施態様においては、前立腺腫瘍試料は、たとえば保存した試料をパラフィン中に包埋し、前立腺腫瘍試料を小片に切断し、及び／又は前立腺腫瘍試料を顕微鏡スライドに適用することによって、顕微鏡可視化のためにさらに加工してよい。１つの特定の実施態様においては、前立腺腫瘍試料はホルマリン固定、パラフィン包埋試料であって、切断され、顕微鏡スライドに固定されたものである。別の特定の実施態様においては、前立腺腫瘍試料は顕微鏡スライドに固定された循環腫瘍細胞を含む。
【００１７】
ＩＩ．結合体
本明細書において用いる「結合体」という用語は、タンパク質又は特定のアミノ酸配列又はそのタンパク質の中の特定の構造に特異的に結合し得る任意の化合物又は組成物を意味するものとする。例としては抗体及びその抗原結合断片、並びに操作された特定の結合構造、たとえばＡＤＮＥＣＴＩＮｓ（１０番目のＦＮ３フィブロネクチンに基づくスカフォールド、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．）、ＡＦＦＩＢＯＤＹｓ（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡのＺドメインに基づくスカフォールド、Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＡＶＩＭＥＲｓ（ドメインＡ／ＬＤＬ受容体に基づくスカフォールド、Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ｄＡｂｓ（ＶＨ又はＶＬ抗体ドメインに基づくスカフォールド、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  ＰＬＣ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ＤＡＲＰｉｎｓ（アンキリンリピートタンパク質に基づくスカフォールド、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，ＣＨ）、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮｓ（リポカリンに基づくスカフォールド、Ｐｉｅｒｉｓ  ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，ＤＥ）、ＮＡＮＯＢＯＤＹｓ（ＶＨＨ（カメリッドＩｇ）に基づくスカフォールド、Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ／Ｖ，Ｇｈｅｎｔ，ＢＥ），ＴＲＡＮＳ−ＢＯＤＹｓ（トランスフェリンに基づくスカフォールド、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＳＭＩＰｓ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、及びＴＥＴＲＡＮＥＣＴＩＮｓ（Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）、テトラネクチンに基づくスカフォールド、Ｂｏｒｅａｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ａ／Ｓ，Ａａｒｈｕｓ，ＤＫ）が挙げられる。これらの操作された特定の結合構造の説明はＷｕｒｃｈ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ  ｔｏ  Ｗｈｏｌｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９巻、ｐ．５０２−５０９  （２００８）に概説されている。
【００１８】
本明細書において用いる「特異的結合」、「〜に特異的に結合する」、又は「〜に特異的」という語句は、標的と結合体との間の結合等の、測定可能かつ再現可能な相互作用を意味し、これは生物学的分子を含む分子の不均一な集合の存在の中における標的の存在を決定する。たとえば、標的に特異的に結合する結合体は、これが他の標的に結合するよりも大きな親和性、結合性を有し、より容易に、及び／又はより長く、この標的に結合する抗体である。１つの実施態様においては、無関係な標的に対する結合体の結合の程度は、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定された標的への抗体の結合の約１０％未満である。ある実施態様においては、標的に特異的に結合する結合体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有している。別の実施態様においては、特異的結合には、必ずしも必要ではないが排他的結合が含まれ得る。
【００１９】
本明細書において用いる「抗体」という用語は、所望の生物学的又は結合活性を示す任意の形態の抗体を意味する。したがって、これは最も広い意味で用いられ、これだけに限らないが特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、キメラ抗体及びキャメル化単一ドメイン抗体が包含される。
【００２０】
本明細書において用いる「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、他に指示がなければ、抗体の抗原結合断片、即ち完全長抗体が結合する抗原に特異的に結合する能力を保持した抗体断片、たとえば一又は複数のＣＤＲ領域を保持した断片を意味する。抗体結合断片の例には、これだけに限らないがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体；単鎖抗体分子、たとえばｓｃ−Ｆｖ；抗体断片から生成したナノ抗体及び多重特異性抗体が含まれる。
【００２１】
１つの実施態様においては、Ｎ末端に特異的な結合体は抗体である。これらの抗体は一般に、完全長のＡＲとそのＣ末端トランケーションとの間で保存されたＡＲ内の領域の少なくとも一部に対して産生されることになる。ＡＲのＮ末端に特異的な抗体の例は、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）から市販されているウサギ抗ヒトアンドロゲン受容体（ＡＲ）モノクローナル抗体（クローンＳＰ１０７）（以後「ＳＰ１０７」）である。ＳＰ１０７はヒトアンドロゲン受容体のＮ末端近傍から誘導された合成ペプチドに対して産生されたウサギモノクローナルＩｇＧである。この抗体はヒトＡＲのＮ末端に特異的に結合することが示されている。他のＮ末端特異的抗体がＳＰ１０７の代わりに用い得ることも考えられる。たとえば、ヒトＡＲへの結合に関してＳＰ１０７と競合する抗体は、ＳＰ１０７の代わりに用いることができる。他の抗体の例はＺｈａｎｇ等、Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  Ｏｃｃｕｒ  Ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｉｎ  Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６巻、１１号、ｅ２７９７０  （２０１１）に見られる。
【００２２】
別の実施態様においては、Ｃ末端に特異的な結合体は抗体である。ＡＲのＣ末端に特異的な抗体の例は、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）から市販されているウサギ抗ヒトアンドロゲン受容体（Ｃ末端）（ＳＰ２４２）モノクローナル抗体（以後「ＳＰ２４２」）である。ＳＰ２４２はヒトアンドロゲン受容体タンパク質のＣ末端からの合成ペプチドに対して産生されたウサギモノクローナルＩｇＧである。この抗体はヒトＡＲのＣ末端に特異的に結合することが示されており、相同性によりイヌ、マウス、ブタ、ウサギ、及びラットのＡＲのＣ末端に結合することが予想される。他のＣ末端特異的抗体がＳＰ１０７の代わりに用い得ることも考えられる。たとえば、ヒトＡＲへの結合に関してＳＰ２４２と競合する抗体は、ＳＰ２４２の代わりに用いることができる。
【００２３】
本明細書において用いる参照抗体「と競合する抗体」は、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗体を意味し、逆に参照抗体は競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする。ある実施態様においては、そのような競合抗体は、参照抗体（たとえばＳＰ２４２又はＳＰ１０７）が結合する同じエピトープ（たとえば直鎖状又はコンフォメーショナルエピトープ）に結合する。抗体がそれに結合するエピトープのマッピングの詳細な方法の例は、Ｍｏｒｒｉｓ、“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６６巻  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  １９９６）に提供されている。例示的な競合アッセイにおいては、抗原に結合する第１の標識抗体（たとえばＳＰ２４２又はＳＰ１０７）及び抗原への結合に関して第１の抗体と競合する能力を試験すべき第２の未標識抗体を含む溶液中で固定化抗原（たとえばＡＲ）をインキュベートする。第２の抗体はハイブリドーマの上清に存在してもよい。コントロールとして、第１の標識抗体を含むが第２の未標識抗体を含まない溶液中で固定化抗原をインキュベートする。第１の抗体が抗原に結合できる条件下でインキュベーションした後、結合していない過剰の抗体を除去し、固定化抗原に付随する標識の量を測定する。コントロール試料に比べて試験試料中の固定化抗原に付随する標識の量が実質的に低減していれば、これは第２の抗体が抗原への結合に関して第１の抗体と競合していることを示す。たとえばＨａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１４章  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８８）を参照されたい。
【００２４】
ＩＩＩ．前立腺腫瘍試料の標識
前立腺腫瘍試料を、前立腺腫瘍試料の上に検出可能な標識を堆積させるような方法で第１及び第２の結合体と接触させる。
【００２５】
いくつかの実施態様においては、第１及び第２の結合体は標識の堆積を促進するように改質してもよい。たとえば、検出可能な標識を結合体に直接コンジュゲートしてもよい。別の例として、第１及び第２の結合体は、検出可能な標識を有する別の結合体と特異的に結合するペアの一部である部分を含むように改質してもよい。そのような処理の例には、ビオチン化抗体／検出可能な標識を有するストレプトアビジンのペア、及びハプテン化抗体／検出可能な標識を有する抗ハプテン抗体が含まれる。
【００２６】
他の実施態様においては、第１及び／又は第２の結合体は改質されず、第１及び第２の結合体の結合は第１及び第２の結合体に特異的に結合する結合体の使用によって検出される。たとえば、第１及び第２の結合体が非標識抗体である場合には、検出可能な標識を、第１及び第２の結合体に結合することができる二次抗体等の少なくとも第３の結合体にコンジュゲートしてよい。「二次抗体」という用語は、別の抗体に特異的な抗体を意味するものとする。二次抗体はある抗体のクラス、それから抗体が誘導された動物のある種、又はその両方に特異的であってよい。抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の型を意味する。抗体には５つの主なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けられる。したがって、たとえば第１の結合体がウサギＩｇＧ抗体であり、第２の結合体がマウスＩｇＧ抗体である場合には、ウサギＩｇＧに特異的な二次抗体である第３の結合体が提供され得、マウスＩｇＧに特異的な二次抗体である第４の結合体が提供され得る。別の例として、第１及び第２の結合体は同じクラス及び種の抗体（たとえばいずれもウサギＩｇＧ）であってよく、その場合には検出可能な標識を堆積させるために少なくとも２つの方法を用いることができる。第１に「ヒートキル」法を用いることができる。ヒートキル法においては、単一の抗原特異的抗体を組織の上に堆積させ、次いで第１の検出可能な標識を有する二次抗体を堆積させる。次いで試料をマイクロ波で加熱して抗原特異的抗体及び二次抗体を変性させ、第１の検出可能な標識を組織上に堆積させる。次いで異なった抗原特異的抗体及び第１の検出可能な標識とは異なる第２の検出可能な標識を有する二次抗体を用いてこのプロセスを繰り返す。一般にはＴｏｔｈ及びＭｅｚｅｙ、Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ  Ｓｐｅｃｉｅｓ，  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５５巻、６号、ｐ．５４５−５４  （２０１１）を参照されたい。この文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本明細書において用いる「検出可能な標識」という用語は、試料中の標識の存在及び／又は濃度を示す（目視、電子的又はその他の方法で）検出可能なシグナルを生成することができる分子又は材料を意味する。（直接的又は間接的に）結合体に付随する場合には、検出可能な標識は、結合体が指向する標的の位置を示し、及び／又はこれを定量するために用いることができる。それにより、試料中の標的の存在及び／又は濃度は、検出可能な標識によって生成されるシグナルを検出することによって検出することができる。検出可能なシグナルは（ラジオ周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数、及び紫外周波数光子を含む）光子の吸収、発光、及び／又は散乱を含む任意の機構によって発生させることができる。検出可能な標識には、有色、蛍光、リン光及び発光分子及び材料、（たとえば無色の物質を有色物質に変換すること若しくは逆の方法により、又は沈殿を生じるか試料の濁度を増大させることによって）１つの物質を別の物質に変換して検出可能な差異を生じる（酵素等の）触媒、検出可能な標識を有する抗体コンジュゲートを追加的に用いて抗体−ハプテン結合相互作用によって検出することができるハプテン、並びに常磁性及び磁性分子又は材料が含まれる。検出可能な標識の特定の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はβ−グルクロニダーゼ等の酵素；フルオレセイン類、ルミノフォア類、クマリン類、ＢＯＤＩＰＹ色素、レゾルフィン類、及びローダミン類等のフルオルフォア（蛍光分子のさらなる多くの例はThe Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, Oreg.に見ることができる）；量子ドット等のナノ粒子（たとえばＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ  Ｃｏｒｐ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．から得られる。また米国特許第６８１５０６４号、同第６６８２５９６号及び同第６６４９１３８号を参照されたい。これらの特許のそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）；放射活性又はＧｄ３＋等の常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレート等の金属キレート；並びにリポゾーム、たとえばトラップされた蛍光分子を含むリポゾームが含まれる。検出可能な標識が酵素を含む場合には、クロモゲン、蛍光原化合物、又は発光原化合物等の検出可能な基質を酵素と組み合わせて用いて、検出可能なシグナルを発生させることができる（そのような化合物はたとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｏｒｅｇ．から広範囲に市販されている）。クロモゲン化合物の特定の例には、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、リン酸４−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）、ファーストレッド、リン酸ブロモクロロインドリル（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファーストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［スルホン酸３−エチルベンゾチアゾリン］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー及びテトラゾリウムバイオレットが含まれる。或いは、金属組織学的検出スキームにおいて酵素を用いることができる。金属組織学的検出法には、アルカリホスファターゼ等の酵素を水溶性金属イオン及び酵素の酸化還元不活性基質と組み合わせて用いる工程が含まれる。基質が酵素によって酸化還元活性剤に変換され、酸化還元活性剤が金属イオンを還元し、検出可能な沈殿を生成させる（たとえば、同時係属中の２００４年１２月２０日に出願した米国特許出願第１１／０１５６４６号、ＰＣＴ公開番号第２００５／００３７７７号及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照されたい。これらの特許のそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）。金属組織学的検出法には、（ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の）酸化還元酵素を水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤とともに用いて、これも検出可能な沈殿を生成させる工程が含まれる（たとえば、米国特許第６６７０１１３号を参照されたい。この特許は参照により本明細書に組み込まれる）。ハプテンは抗体と特異的に結合する小さな分子であるが、それ自体では動物に免疫反応を引き起こすことはなく、免疫反応を発生させるためには最初にタンパク質等の大きなキャリア分子に結合させなければならない。ハプテンの例にはジニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びフルオレセインが含まれる。オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリペルペン、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン及びシクロリグナンハプテンの追加的な例は２０１３年５月２１日に発行された米国特許第７９８５５５７号に開示されている。この特許は参照により本明細書に組み込まれる。これは全ての可能な標識化スキームを網羅した総説ではなく、他の有用な標識及び標識化スキームが現在利用可能であり、又は将来開発されよう。
【００２８】
前立腺腫瘍試料は、標準的な組織学的又は細胞学的手法を用いて、結合体及び検出可能な標識によって標識される。本発明の方法を実施する際には、解剖病理学研究室において組織学技師等の人物が染色手順を実施することができる。或いは、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ及びＶＥＮＴＡＮＡ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ自動化染色器等の自動化システムを用いて染色手順を実施することができる。何れの場合にも、本発明の方法による使用のための染色手順は、当技術において確立された標準的な手法及びプロトコルに従って実施される。
【００２９】
ＩＶ．検出及び定量
標識された前立腺腫瘍試料は顕微鏡によって可視化され、第１の結合体及び第２の結合体の標識の程度が定量される。
【００３０】
１つの実施態様においては、検出及び定量は手作業で行なわれる。たとえば、スライドは訓練を受けた解読者（病理学者等）によって顕微鏡上で可視化することができる。次いで訓練を受けた解読者は染色を目視でスコア化することができる。たとえば、訓練を受けた解読者は第１及び第２の結合体のそれぞれについての染色強度に基づいて組織試料を分類することができる。たとえば、訓練を受けた解読者はスライドを評価し、それぞれのマーカーについて強い染色、弱い染色、及び無染色を有する細胞の百分率を推定することができる。別の例として、訓練を受けた解読者は、たとえば（１００倍等の）高倍率における複数の異なった視野を検査して、複数の強度レベルのそれぞれにおける細胞の数をカウントし、強度レベルが低下すれば減少する値を有する数値をそれぞれの強度レベルに割り当てることによって、Ｈスコアを発生させることができる。たとえば、３つの強度レベル（たとえば３＝高強度、２＝中強度、１＝低強度）を割り当てること、又は６つの強度レベル（たとえば５＝高強度、４＝中高強度、３＝中強度、２＝中低強度、１＝低強度、０＝無染色）を割り当てることができる。次いでＨスコアを下式：
Σ（Ｉ＊％Ｉ）  式Ｉ
に従って計算することができる。
ここでＩは強度レベルに割り当てた数値であり、％Ｉは指定した強度レベルで染色された細胞の百分率である。
【００３１】
別の実施態様においては、検出及び定量は、前立腺腫瘍試料のデジタル化された顕微鏡画像を発生させ、検出可能な標識についてデジタル画像を解析することによって自動的に実施される。たとえばＡｐｅｒｉｏのＳＣＡＮＳＣＯＰＥ  ＸＴデバイス等の、このプロセスを実施できる数多くのデジタル画像スキャナーが知られている。スキャナーによって、予め定義された複数の強度レベルの１つで染色されたピクセルの数がカウントされ、予め定義された強度レベルのそれぞれに数値が割り当てられる。次いで以下の式：
Σ（Ｐ＊％Ｐ）  式ＩＩ
に従ってＨスコアを計算することができる。
ここでＰはピクセルの強度レベルに割り当てられた数値であり、％Ｐは指定した強度レベルで染色されたピクセルの百分率である。
【００３２】
Ｖ．進行の追跡
前立腺がんの進行を追跡するため、同じ患者からの前立腺腫瘍試料を少なくとも２つの異なった時点で採取する。第１及び第２の結合体を用いた染色レベルを決定し、試料のそれぞれにおいて第１及び第２の結合体のそれぞれについて結合スコアを計算する。以下の式：
Ｂ１／Ｂ２  式ＩＩＩ
に従ってそれぞれの試料について比を計算する。
ここでＢ１は前立腺腫瘍試料への第１の結合体の結合スコアであり、Ｂ２は前立腺腫瘍試料への第２の結合体の結合スコアである。比を互いに比較し、前の時点から後の時点にかけて比が増大すれば、腫瘍が進行していると考えられる。比が有意に変化しなければ、腫瘍は安定であると考えられる。比が前の時点から後の時点にかけて減少すれば、腫瘍は縮小していると考えられる。
【００３３】
ＶＩ．予後及び治療抵抗性の予測
がんを予測するためには、患者から前立腺腫瘍試料を採取し、第１及び第２の結合体のそれぞれについて結合スコアを計算する必要がある。次いで式ＩＩＩに従って試料について比を計算する。次いで比を参照比と比較する。
【００３４】
参照比は同じ患者から前の時点において得られたベースライン比であってよく、その場合、参照比と比較して比が増大していることは、不良な予後を示す。
【００３５】
或いは、参照比は代表的な患者集団から計算された「カットオフ」比であってよく、その場合にはカットオフを超える比は不良な予後と有意に相関し、カットオフ未満の比は良好な予後と有意に相関する。「参照比」が比の範囲として表わされ、それにより比の範囲内に含まれる比が不良な予後又は良好な予後の何れかと統計的に有意な相関を有しない可能性がある。本明細書において用いる「良好な予後」及び「不良な予後」は、（１）前立腺がんが定義された期間内に進行する可能性があるか否かの指標、（２）患者が治療コース（ＡＲ標的治療剤又は化学療法剤の投与等）に反応する可能性があるか否かの指標、（３）定義された期間にわたる死亡率の指標を表わし得る。
【００３６】
本明細書において用いる「ＡＲ指向治療」という語句は、ＡＲ媒介シグナル伝達に干渉することを意図した任意の治療コースを意味する。ＡＲ指向治療の種類には、ＡＲアンドロゲン類の間の相互作用を妨害することによって作用するＡＲアンタゴニスト；及びアンドロゲン類が産生されることを妨害することによって作用するアンドロゲン合成阻害剤が含まれる。ＡＲ指向治療の具体的な例には、アビラテロン、エンザルタミド、オルテロネル、ガレテロン、ＡＲＮ−５０９、ＯＤＭ−２０１、ＡＺＤ３５１４、ＥＺＮ−４１７６、及びＢＭＳ−６４１９８８が含まれる。
【００３７】
本明細書において用いる「化学療法剤」という語句は、前立腺がんを治療するために用いられるＡＲ指向治療以外の任意の薬剤を包含する。特定の例には、パクリタキセル及びドセタキセル等のタキサン類が含まれる。
【００３８】
ＶＩＩ．治療コースの選択
治療コースを選択するために、患者から前立腺腫瘍試料を採取し、結合スコアを計算する。次いで式ＩＩＩに従って試料について比を計算し、参照比と比較する。比が参照比より大きい場合には積極的な治療コースを選択する。比が参照比より小さい場合には保存的な治療コースを選択する。
【００３９】
本明細書において用いる「積極的な治療コース」という用語は、腫瘍及び／又は前立腺の外科的切除、去勢、及び／又は放射線治療等の侵襲的又は特に危険な治療を意味する。
【００４０】
本明細書において用いる「保存的な治療コース」という用語には、観察又はＡＲ指向治療剤及び／又は化学療法剤の投与を含む、積極的な治療コースではない任意の治療コースが含まれる。
【００４１】
参照比は同じ患者から前の時点において得られたベースライン比であってよく、その場合、参照比と比較して有意な比の増大は、積極的な治療コースを示唆し、参照比と比較して比が安定又は低減していることは、保存的な治療コースを指示する。
【００４２】
或いは、参照比は代表的な患者集団から計算された「カットオフ」比であってよく、その場合にはカットオフを超える比は不良な予後と有意に相関し、カットオフ未満の比は良好な予後と有意に相関する。「参照比」が比の範囲として表わされ、それにより比の範囲内に含まれる比が不良な予後又は良好な予後の何れかと統計的に有意な相関を有しない可能性がある。本明細書において用いる「良好な予後」及び「不良な予後」は、（１）前立腺がんが定義された期間内に進行する可能性があるか否かの指標、（２）患者が治療コース（ＡＲ標的治療剤又は化学療法剤の投与等）に反応する可能性があるか否かの指標、（３）定義された期間にわたる死亡率の指標を表わし得る。
【００４３】
ＶＩＩＩ．治療コースのモニタリング
治療コースをモニターするために、治療コースの開始時又はその付近で、及び治療コースの間又はその後の少なくとも１つの時点でも、患者から前立腺腫瘍試料を採取し、それぞれの前立腺腫瘍試料について結合スコアを計算する。試料について式ＩＩＩに従って比を計算し、比を互いに比較する。治療コースの間に比が増大すれば、前立腺がんは進行している、及び／又は治療コースに抵抗していると考えられ、治療コースを変更するか中止し、及び／又はさらなる治療コースを開始する。たとえば、最初の治療コースには観察又はＡＲ指向治療剤及び／又は化学療法剤の投与が含まれ得る。比が一定又は低下する場合には、最初の治療コースを継続する。比が増大する場合には、さらなる治療コースは、腫瘍及び／又は前立腺の外科的切除、去勢、及び／又は放射線治療を含む。次いでさらなる治療の後にモニタリングを継続し、さらなる治療コースの間に比が増大し続ければさらなる治療を中止する。
【実施例】
【００４４】
Ｉ．材料及び方法
Ａ．抗体
本研究にはヒトＡＲのＮ末端及びＣ末端を標的とする２つの一次ウサギモノクローナル抗体を用いる。Ｎ末端を標的とする抗体として抗アンドロゲン受容体（ＳＰ１０７）ウサギモノクローナル一次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ｃａｔ＃７６０−４６０５）を用いる。Ｃ末端を標的とする抗体としてアンドロゲン受容体（ＡＲ）（Ｃ末端）（ＳＰ２４２）ウサギモノクローナル一次抗体（Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｃａｔ＃Ｍ５４２４）を用いる。
【００４５】
Ｂ．コントロール細胞株
ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２ｖ１、ＰＣ３前立腺細胞株をＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロットで解析し、それらのＡＲ−ＦＬ及びＡＲ−ｖ７状態を確認した。さらに、Ｍ１２ＡＲ及びＭ１２ＡＲ−ｖ７（ワシントン大学）をＩＨＣによって染色した。
【００４６】
Ｃ．臨床試料
前立腺がん（原発ナイーブ前立腺がんコア８０例及びＣＲＰＣ軟部及び骨転移コア１６０例）の進行を表わす前立腺組織（ワシントン大学）のＦＦＰＥ、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を両方の抗体で染色した。ＴＭＡから選択した画像は画像解析に利用可能であった（原発腫瘍２例及び転移腫瘍４例）。
【００４７】
Ｄ．ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ＡＲ−ＦＬ、ＡＲ−ｖ７についてプライマーを設計し、合成して、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥＡＳＹミニキットを用いてオンカラムＤＮａｓｅＩ処理でハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３ＡのＲＮＡ抽出を行ない、Ｑｉａｇｅｎ  ｇＤＮＡを用いて抽出後クリーンアップを行なった。ｃＤＮＡライブラリーの調製にはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩＩファーストストランド合成システムを用いた。細胞株試料についてのアッセイセットアップの間に並行してＲＮＡ陰性（ＲＮＡなし）コントロール及びｇＤＮＡコンタミネーション（ＲＴなし）コントロールを行なった。ＰＣＲを行ない、ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル（ＧＥＮＥＷＩＺ，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）で解析した。
【００４８】
Ｅ．ウェスタンブロット
ＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＬＹＳＩＳ−Ｍキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）を用いて細胞溶解液を調製した。全タンパク質１０μｇをそれぞれのレーンに負荷した。次いで特定した抗体を用いて細胞溶解液をイムノブロットした。抗体の作用濃度はＳＰ１０７について４．４μｇ／ｍｌ、ＳＰ２４２について２４μｇ／ｍｌであった。
【００４９】
Ｆ．ＩＨＣ性能特性法
ＦＦＰＥコントロール細胞株及び上記の臨床試料の連続切片について、アリゾナ州ツーソンとワシントン州シアトルの両方で、ＶＥＮＴＡＮＡ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ装置を用いてＩＨＣ染色を行なった。ＯＰＴＩＶＩＥＷ  ＤＡＢキット（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を用いて抗原抗体複合体を検出した。
【００５０】
Ｇ．スコアリング／画像解析（手作業及びデジタルＨスコア）
カテゴリー法（染色なし、弱い、及び強い）によって目視でスライドをスコア付けした。スライドはまた、ＡｐｅｒｉｏのＳＣＡＮＳＣＯＰＥ  ＸＴデバイスによって走査した。組織全体又は細胞ペレットを代表する領域を画像解析のために注記した。解析は陽性ピクセル選択アルゴリズムによって行なった。ＤＡＢによって弱く（Ｗ）、中程度に（Ｍ）、及び強く（Ｓ）染色されたピクセルによる染色強度に基づいて「ヒートマップ」を作成する。データ解析工程を行なって全ピクセル中のＷ、Ｍ及びＳピクセルの百分率を得た。次いで等価のＨスコアを用いて以下の式によって染色を表わした（１（Ｗ）＊１００における１＊％ピクセル染色＋２（Ｍ）＊１００における２＊％ピクセル染色＋３（Ｓ）における３＊％ピクセル染色］＝デジタルＨスコア範囲０〜３００）。
【００５１】
ＩＩ．結果
細胞株及び抗体の検証
用いた細胞株が予想されるＡＲ変異体を発現していることを確認するため、ＲＴ−ＰＣＲを用いた。図１に見られるように、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ及びＣＷＲ２２ｖ１細胞株（陽性コントロール）で完全長のＡＲ−ＦＬ及びＡＲ−ｖ７の存在が確認されたが、ＰＣ３細胞株（陰性コントロール）ではＡＲ−ＦＬとＡＲ−ｖ７の何れも検出されなかった。図１を参照されたい。
【００５２】
検証した細胞株で抗体の特異性を検証した。ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ及びＣＷＲ２２Ｒｖ１等のＡＲ陽性細胞株ではＳＰ１０７とＳＰ２４２の両方の抗体を用いたウェスタンブロットによってＡＲ−ＦＬが定常的に検出されたが、ＡＲ陰性細胞株ＰＣ３では何れの抗体によってもＡＲ−ＦＬは検出できなかった。図２を参照されたい。
【００５３】
ＳＰ１０７及びＳＰ２４２細胞株を用いて、検証した細胞株を免疫組織化学的に染色した。図３に見られるように、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ及びＣＷＲ２２Ｒｖ１はＳＰ１０７とＳＰ２４２のそれぞれによって陽性に染色されたが、ＰＣ３では染色は検出できなかった。Ｈスコアを計算し、その結果を図４及び表１に示す。
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【００５４】
臨床試料における有用性
完全長ＡＲ（Ｍ１２ＡＲ）又はＡＲ  Ｃ末端スプライス変異体ＡＲｖ７（Ｍ１２ＡＲｖ７）でトランスフェクトした細胞株、原発前立腺腫瘍（ＰＣａ）、及び転移腫瘍（ＣＲＰＣ）について、ＳＰ１０７及びＳＰ２４２を用いてＩＨＣ染色を行なった。代表的な画像を図５（倍率４０倍）に示す。トランスフェクトした細胞株、ＰＣａ、及びＣＲＰＣについて、ＳＰ１０７とＳＰ２４２の両方でデジタルＨスコア（表２及び図６）及び手作業のカテゴリースコアリング（表３）、並びにそれらの比較の比を計算した。比較の比を計算した（図７）。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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