(57)【要約】短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質に加えて、コーディング配列およびその調製方法。短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、タンパク質の、医薬組成物およびワクチンを構成し；タンパク質、医薬組成物およびワクチンは、ロタウイルスの感染およびロタウイルスの感染によって引き起こされる疾患（ロタウイルス胃腸炎および下痢等）を予防、低減または治療するために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントであって、該短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質が、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、Ｎ末端の１〜６４個のアミノ酸（例えば５〜６４個のアミノ酸）を欠き（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質の配列番号：４０のアミノ酸位置２７６〜４９７の中の任意の位置に対応する位置で終了するＣ末端を有し；
好ましくは、該短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質が、該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、Ｎ末端の１〜５、５〜２１、２１〜２５または２５〜６４個のアミノ酸を欠き；該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質の配列番号：４０のアミノ酸位置２７６〜４９７（例えばアミノ酸位置２８１〜４９７、２９１〜４９７、３０１〜４９７、３１１〜４９７、３２１〜４９７、３３１〜４９７、３４１〜４９７、３５１〜４９７、３６１〜４９７、３７１〜４９７、３８１〜４９７、３９１〜４９７、４０１〜４９７、４１１〜４９７、４２１〜４９７、４３１〜４９７、４４１〜４９７、４５１〜４９７、４６１〜４９７、４７１〜４９７、４７６〜４９７、４８２〜４９７、４８７〜４９７、または４９２〜４９７）の中の任意の位置に対応する位置で終了するＣ末端を有し；
好ましくは、該短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質が、該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、Ｎ末端の１、５、２１、２５または６４個のアミノ酸を欠き、該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質の配列番号：４０のアミノ酸位置２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４７６、４８２、４８７、４９２または４９７に対応する位置で終了するＣ末端を有し；
好ましくは、該短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質が、該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、Ｎ末端の２５個のアミノ酸を欠き、配列番号：４０のアミノ酸位置３３１、３５１、３８１、４１１、４４１、４６１、４７１、４７６、４８２、４８７、４９２または４９７に対応する位置で終了するＣ末端を有する、該短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質であるか；または、Ｎ末端の１、５、２１、２５または６４個のアミノ酸を欠き、配列番号：４０のアミノ酸位置４７６に対応する位置で終了するＣ末端を有し；
好ましくは、該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質が、ロタウイルスＬＬＲ株、ＳＡ１１株、もしくはＥＤＩＭ株に由来するＶＰ４タンパク質、またはＰ［４］、Ｐ［６］、もしくはＰ［８］遺伝子型のロタウイルスに由来するＶＰ４タンパク質であり；
好ましくは、該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質が、配列番号：４０および８７〜９１から選択されるアミノ酸配列を有し；
好ましくは、該短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質が、配列番号：２〜５および１０〜３９から選択されるアミノ酸配列を有する、
該短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアント。
【請求項２】
請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントをコードする、単離された核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸または請求項３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントを含むかまたはそれからなる、重合体。
【請求項６】
請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項２に記載の単離された核酸、または請求項３に記載のベクター、請求項４に記載の宿主細胞、または請求項５に記載の重合体を含む、組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質もしくはそのバリアントまたは請求項５に記載の重合体、ならびに随意に、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物（例えばワクチン）であって、好ましくは、該医薬組成物が、アジュバント（例えばアルミニウムアジュバント）を更に含み；
好ましくは、該短縮型タンパク質もしくはそのバリアントまたは該重合体が、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防または治療のために効果的な量で存在し；
好ましくは、該医薬組成物が追加の活性成分を更に含み；
好ましくは、該追加の活性成分が、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防または治療することができる、
該医薬組成物。
【請求項８】
短縮型タンパク質またはそのバリアントの発現を可能にする条件下で、請求項４に記載の宿主細胞を培養し；発現された該短縮型タンパク質またはそのバリアントを回収することを含む、請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントを調製する方法であって、
好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉを使用して該短縮型タンパク質またはそのバリアントを発現するステップ、次いでＥ．ｃｏｌｉを溶解するステップ、および該溶解物から該短縮型タンパク質またはそのバリアントを精製するステップを含み、
好ましくは該精製がクロマトグラフィー（例えば２ステップのクロマトグラフィー）を含む、該方法。
【請求項９】
請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質もしくはそのバリアントまたは請求項５に記載の重合体を、薬学的に許容される担体および／または賦形剤、ならびに随意に、アジュバント（アルミニウムアジュバント等）、および／または追加の活性成分（ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防または治療できる追加の活性成分等）と、混合することを含む、ワクチンを調製するための方法。
【請求項１０】
予防上または治療上有効な量の、請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質もしくはそのバリアントまたは請求項５に記載の重合体、または請求項７に記載の医薬組成物を、被験体へ投与することを含む、被験体におけるロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防または治療するための方法であって、
好ましくは、ロタウイルス感染によって引き起こされる該疾患がロタウイルス胃腸炎または下痢であり；
好ましくは、該被験体が哺乳類（マウスおよびヒト等）である、該方法。
【請求項１１】
被験体におけるロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防または治療のための医薬組成物（例えばワクチン）の製造において、請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項５に記載の重合体の使用であって、
好ましくは、ロタウイルス感染によって引き起こされる該疾患がロタウイルス胃腸炎または下痢であり；
好ましくは、該被験体が哺乳類（マウスおよびヒト等）である、該使用。
【請求項１２】
被験体におけるロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防または治療における使用のための、請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項５に記載の重合体であって、
好ましくは、ロタウイルス感染によって引き起こされる該疾患がロタウイルス胃腸炎または下痢であり；
好ましくは、該被験体が哺乳類（マウスおよびヒト等）である、該タンパク質もしくはそのバリアントまたは該重合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学、分子生物学、分子ウイルス学および免疫学の分野に関する。特に、本発明は、短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ロタウイルスＶＰ４タンパク質、それをコードする配列、それを調製するための方法、ならびに該タンパク質を含む医薬組成物およびワクチンに関し、該タンパク質、該医薬組成物および該ワクチンは、ロタウイルス感染、およびロタウイルス感染によって引き起こされる疾患（ロタウイルス胃腸炎および下痢等）を予防、緩和または治療するために有用である。本発明は、更に、ロタウイルス感染、およびロタウイルス感染によって引き起こされる疾患（ロタウイルス胃腸炎および下痢等）を予防、緩和または治療するための医薬組成物またはワクチンの製造における前記タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロタウイルス（ＲＶ）は、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属するロタウイルス属に属し、乳児の下痢に関与する主要な病原体であり、１９７３年にＢｉｓｈｏｐ（Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，２（７８４１），１２８１−１２８３，１９７３）によって、胃腸炎に罹患した患者の十二指腸において見出された。研究から、５歳前に小児の９５％を超える者がロタウイルスに少なくとも１回は感染したことが示された。ＷＨＯの統計によれば、最大６００，０００人が、ロタウイルス感染で毎年死亡し、下痢の症例は最大２億人に達し；米国だけで、ロタウイルス感染によって引き起こされる経済的損失は毎年最大１０億ドルに達し（Ｈｓｕ，Ｓｔａａｔ，Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１１５（１），７８−８２，２００５；Ｔａｔｅ，Ｂｕｒｔｏｎ，Ｂｏｓｃｈｉ−Ｐｉｎｔｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１２（２），１３６−１４１，２０１１）、重大な財政的負担および社会的負担をもたらす。
【０００３】
ロタウイルスはエンベロープのないＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは、６つの構造タンパク質（ＶＰ１〜ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７）および６つの非構造タンパク質（ＮＳＰ１〜ＮＳＰ６）をコードする１１の二本鎖ＲＮＡ分子からなる（Ｅｓｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，５３（４），４１０−４４９，１９８９）。ロタウイルスは二十面体であり、そのカプシドは、３つの同心層（すなわちＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなるコア層、ＶＰ６からなる内殻カプシド、ＶＰ４およびＶＰ７からなる外殻カプシド）からなる。
【０００４】
ＶＰ６タンパク質は、ロタウイルスにおいて最も高い含有物で含まれるカプシドタンパク質である。ＶＰ６の抗原性に依存して、ロタウイルスは７つの群（すなわちロタウイルスＡ〜Ｇ）へと分けることができ、その中でロタウイルスＡは、乳児および若年小児の下痢の原因である主要な病原体である。ＶＰ４およびＶＰ７は主要な中和抗原であり、ロタウイルスＡは抗原性に依存してＰ血清型およびＧ血清型へと分けることができる。Ｇ血清型およびＰ血清型は互いに独立しているが、互いに相互作用し；一般的な組み合わせにはＧ１Ｐ［８］、Ｇ２Ｐ［４］、Ｇ３Ｐ［８］およびＧ４Ｐ［８］が含まれ；近年、Ｇ９Ｐ［８］およびＧ９Ｐ［６］の罹患率が有意に増加している（Ｌｉ，Ｌｉｕ，Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２７  Ｆ４０−Ｆ４５，２００９）。
【０００５】
ロタウイルスに特異的な薬物はまだなく、安全で効果的なワクチンがロタウイルス感染の制御のための重要な手段である。何年もの研究の後に、ワクチン開発は、３つの相（すなわち一価の弱毒化ワクチン、多価の遺伝子組み換え体ワクチン、および遺伝子操作ワクチン）へ進んだ。現在のところ、市場において次々に出現した５つのロタウイルスワクチンがあり、それらには、Ｗｙｅｔｈからの四価のヒト−類人猿遺伝子組み換え体ワクチン、Ｌａｎｚｈｏｕ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの一価の弱毒化ワクチン、Ｍｅｒｃｋからの五価のヒト−ウシ遺伝子組み換え体ワクチン、ＧＳＫからの一価の弱毒化ワクチン、およびＢｈａｒａｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｎｄｉａからの一価の弱毒化ワクチンが含まれる。しかしながら、これらのワクチンは潜在的に安全性に大きな問題がある弱毒化生ワクチンであり、中でも、Ｗｙｅｔｈからのワクチンは、市場に出回って半年後に腸重積症のためにリコールされた（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇａｒｇｉｕｌｌｏ，Ｍａｓｓｏｕｄｉ，ｅｔ  ａｌ．３４４（８），５６４−５７２，２００１）。ＭＥＲＣＫおよびＧＳＫからのワクチンは、多数の臨床試験によって安全で効果的なことが実証されたが（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｓａｃｋ，Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），３５４（９１７５），２８７−２９０，１９９９；Ｖｅｓｉｋａｒｉ，Ｍａｔｓｏｎ，Ｄｅｎｎｅｈｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５４（１），２３−３３，２００６；Ｌｉｎｈａｒｅｓ，Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ，Ｐｅｒｅｚ−Ｓｃｈａｅｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，３７１（９６１９），１１８１−１１８９，２００８；Ｖｅｓｉｋａｒｉ，Ｉｔｚｌｅｒ，Ｋａｒｖｏｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２８（２），３４５−３５１，２００９；Ｓｎｅｌｌｉｎｇ，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｋｉｒｋｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５２（２），１９１−２００，２０１１）、ロタウイルス死亡率の高い国および地域（アジアおよびアフリカ等）において、保護効率（protection efficiency）は、先進国（ヨーロッパおよびアメリカ等）の保護効率よりもはるかに低かった（Ａｒｍａｈ，Ｓｏｗ，Ｂｒｅｉｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，３７６  ６０６−６１４，２０１０；Ｚａｍａｎ，Ａｎｈ，Ｖｉｃｔｏｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，３７６  ５６８−５７０，２０１０；Ｍａｄｈｉ，Ｃｕｎｌｉｆｆｅ，Ｓｔｅｅｌｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３６２（４），２８９−２９８，２０１１）。さらに多くのエビデンスから、２つのワクチンの接種で、ウイルスの排出を生じ、それがウイルスの水平伝播を引き起こし得ることが示された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，８（１０），６４２−９，２００８；Ｒｉｖｅｒａ，Ｐｅｎａ，Ｓｔａｉｎｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２９（５１），９５０８−９５１３，２０１１；Ｙｅｎ，Ｊａｋｏｂ，Ｅｓｏｎａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２９（２４），４１５１−５，２０１１）。重篤な胃腸炎がワクチンの接種の後に免疫不全の小児において発症し得ることも、いくつかの研究において示された（Ｓｔｅｅｌｅ，Ｃｕｎｌｉｆｆｅ，Ｔｕｍｂｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００  Ｓｕｐｐｌ  １  Ｓ５７−６２，２００９；Ｐａｔｅｌ，Ｈｅｒｔｅｌ，Ｅｓｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３６２（４），３１４−９，２０１０）。Ｌａｎｚｈｏｕ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからのワクチンは１０年を超えて商業的に入手可能であり、深刻な問題はまだ見出されていない。しかしながら、それらは重篤な下痢のみを予防できるが、ロタウイルス感染を予防することができない（Ｆｕ，Ｗａｎｇ，Ｌｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２５（５２），８７５６−６１，２００７）。したがって、良い結果がロタウイルスに対する弱毒化ワクチンの研究において得られているが、まだいくつかの問題があり、安全性および有効性を更に改善する必要がある。より安全且つ効果的なワクチンが開発されねばならない。
【０００６】
非複製型ワクチンは、現在ロタウイルスワクチンの研究についての主要な方向であり、遺伝子操作されたワクチンは、低費用、安全性および有効性等の特徴があるので多くの注目を集める。
【０００７】
ＶＰ４およびＶＰ７タンパク質は、ロタウイルスの中和抗原として、生物体における中和抗体の生成を刺激することができ、それによってロタウイルスの感染を阻害する。したがって、ＶＰ４およびＶＰ７の両方は、ロタウイルスサブユニットワクチンのための主要な候補抗原である。ＶＰ７タンパク質（糖鎖が付加したタンパク質である）は４つの鎖内ジスルフィド結合を含み、Ｃａ２＋依存性三量体を形成するが、組換えにより発現されたＶＰ７タンパク質による刺激によって生成された中和抗体のレベルは低い。ＶＰ４タンパク質は糖鎖が付加せず、組換えにより発現されたＶＰ４タンパク質は、生物体における高い免疫応答の生成を刺激し、哺乳中のマウスにおいて下痢の程度を低減させることができる（Ｍａｃｋｏｗ，Ｖｏ，Ｂｒｏｏｍｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，６４（４），１６９８−７０３，１９９０）。別の面では、一般的なＰ血清型が２つだけあるが、Ｇ血清型は５つある。したがって、ＶＰ７タンパク質と比較して、ＶＰ４タンパク質はロタウイルス遺伝子操作ワクチンのために、より好適な候補抗原である。
【０００８】
ＶＰ４タンパク質は７７６のアミノ酸からなり、トリプシンによって切断して２つの部分（すなわちＶＰ８＊（ａａ１〜２３１）およびＶＰ５＊（ａａ２４８〜７７６））を形成することができる。ＶＰ４タンパク質は、頭部ドメイン、本体および柄のドメインならびに脚部ドメインからなり、ロタウイルスのスパイクタンパク質として、ＶＰ４は、ロタウイルス感染において重要な役割を果たす。スパイクの頭部ドメインはＶＰ８タンパク質の２つの分子からなり、ＶＰ８タンパク質は細胞の表面上のシアル酸受容体へ結合し、それによって、ロタウイルスの吸着を媒介することができる。本体および柄のドメインはＶＰ５抗原ドメインの３つの分子からなり、ＶＰ５抗原ドメインの２つの分子は二量体を形成し、他のＶＰ５抗原ドメインは単量体の形態である。ロタウイルスの感染の間に、ＶＰ４の構造は再構成されてＶＰ５中の膜融合部位を曝露し、細胞の中へのロタウイルスの侵入を媒介し、その間に、ＶＰ５抗原ドメインは二量体から三量体へ変化する。脚部ドメインはＶＰ５タンパク質のＣ末端ドメインの３つの分子からなり、当該ドメインによって外殻カプシドおよび内殻カプシドの中へ挿入される。ＶＰ８タンパク質のＮ末端での最初の２５アミノ酸はα−ヘリックスを形成し、３つのα−ヘリックスはＶＰ５脚部ドメインの中へ挿入されるヘリックスの束を形成し、柔軟な接合領域によってＶＰ８頭部ドメインに連結されるが、接合領域の構造はまだ完全に決定されていない（Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅ，Ｃｈｅｎ，Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ，３０（２），４０８−１６，２０１１）。
【０００９】
ＶＰ４タンパク質の中和エピトープは、主にＶＰ８頭部ドメインおよびＶＰ５抗原ドメイン中に存在し、ＶＰ８に対する中和抗体はロタウイルスの吸収を阻害でき、ＶＰ５に対する中和抗体は交差中和活性を有し、細胞の中へのロタウイルスの侵入を阻害できること示す研究がある（Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ，Ｎａｓｏｎ，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍ  Ｐｒａｓａｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４３０（７００３），１０５３−１０５８，２００４；Ａｂｄｅｌｈａｋｉｍ，Ｓａｌｇａｄｏ，Ｆｕ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ，１０（９），ｅ１００４３５５，２０１４）。加えて、合成ペプチドスキャニングの結果は、中和エピトープがＶＰ８タンパク質のＮ末端のα−ヘリックス領域および接合領域中にもあることを示す（Ｋｏｖａｃｓ−Ｎｏｌａｎ，Ｙｏｏ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３７６（Ｐｔ  １），２６９−７５，２００３）。
【００１０】
ＶＰ４タンパク質が生物体における保護的免疫応答を刺激できることを示す、多くの研究結果がある（Ｄｕｎｎ，Ｆｉｏｒｅ，Ｗｅｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ，１４０（１１），１９６９−７８，１９９５；Ｇｉｌ，Ｄｅ  Ｓｏｕｚａ，Ａｓｅｎｓｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３（２），１８７−２００，２０００）。しかしながら、真核細胞系によるＶＰ４タンパク質の発現は、長いサイクル、高コストおよび低発現レベルという短所を有する。加えて、全長ＶＰ４タンパク質は、原核細胞系において主に封入体の形態で存在し、精製が難しく、その天然の立体配座を保持することができない。Ｗｅｎ  Ｘｉａｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．は、その短縮型形状の発現の手段によって原核細胞系における封入体の形態でのＶＰ８タンパク質の発現に関する問題を解決し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で可溶性形態で効果的に発現させることができる短縮型ＶＰ８タンパク質（△ＶＰ８＊、ａａ６５〜２２３）を得た（Ｗｅｎ，Ｃａｏ，Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，３０（４３），６１２１−６，２０１２）。しかしながら、短縮型ＶＰ８タンパク質の免疫原性は全長ＶＰ８タンパク質よりも有意に低い。短縮型ＶＰ８タンパク質の低免疫原性に関する問題を解決するために、困難な研究の後に、本発明者の研究室はより高い免疫原性を備えた新しい短縮型ＶＰ８タンパク質を得て、それはフロイントのアジュバントの存在下において免疫付与に際してマウスにおいて高力価の中和抗体の生成をそれにより刺激することができ、哺乳中のマウスにおいて下痢の程度を低減させることができ；短縮型ＶＰ８タンパク質がより高い免疫原性および免疫的な保護を備えた融合タンパク質（ＣＮ２０１５１０１６５７４６．２）を産生するように、分子内アジュバントと共に融合発現を行うことができた。新しい短縮型ＶＰ８タンパク質およびその融合タンパク質は有意に有利な技術的効果を達成したが、欠点がまだある。例えば、ＶＰ８タンパク質に対する抗体は主に血清型特異抗体であり、したがって、ワクチンとしての新しい短縮型ＶＰ８タンパク質は、異なる血清型のウイルス株に対して、同じ血清型のウイルス株に対する中和活性よりも有意により低い中和活性を有する（Ｗｅｎ，Ｃａｏ，Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，３０（４３），６１２１−６，２０１２）。加えて、新しい短縮型ＶＰ８タンパク質の免疫的な保護がアルミニウムアジュバントの存在下において十分に満足なものでなく、更に改善される必要があることがその後の研究においても判明している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、高発現レベルでより好都合に産生することができ（例えば可溶性発現および精製の手段によって）、既存のワクチン（例えば上記の短縮型ＶＰ８タンパク質）よりも強い免疫原性を有することができ、生物体においてロタウイルスに対する高力価中和抗体の生成を（特にアルミニウムアジュバントの存在下において）誘導することができ、したがって、ロタウイルスに対する高度に効果的なワクチンの大規模工業的産生において使用することができる、ロタウイルスに対する新しいワクチンを開発する需要が、当該技術分野において依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本出願の本発明者は、広範囲の研究の後に、Ｎ末端の１〜６４のアミノ酸（例えば５〜６４のアミノ酸）を欠き（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、アミノ酸位置２７６〜４９７の中の位置で終了するＣ末端を有する、ＶＰ４タンパク質を、意外にも、可溶性形態でＥ．ｃｏｌｉ中で発現させることができ、クロマトグラフィーによって容易に精製できること；更に、このようにして得られた高純度の短縮型タンパク質（少なくとも５０％以上、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％に達し得る純度を備えた）が、良好な均一性および免疫原性を有し、生物体においてアルミニウムアジュバントの存在下においてロタウイルスに対する高力価の中和抗体の生成を誘導でき、したがって、上述の技術的課題を効果的に解決することを見出した。
【００１３】
したがって、一態様において、本発明は、Ｎ末端の１〜６４個のアミノ酸（例えば５〜６４個のアミノ酸）を欠き、アミノ酸位置２７６〜４９７の中の位置で終了するＣ末端を有する、短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントに関する。
【００１４】
一態様において、本発明は、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、Ｎ末端の１〜６４個のアミノ酸（例えば５〜６４個のアミノ酸）を欠き、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質の配列番号：４０のアミノ酸位置２７６〜４９７の中の任意の位置に対応する位置で終了するＣ末端を有する、短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントに関する。
【００１５】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、Ｎ末端の１〜６４個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３または６４個のアミノ酸（例えば１〜５、５〜２５、５〜２１、２１〜２５、２１〜６４、または２５〜６４個のアミノ酸、例えば１、５、２１、２５、または６４個のアミノ酸）を欠き；野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質の配列番号：４０のアミノ酸位置２７６〜４９７（例えばアミノ酸位置２８１〜４９７、２９１〜４９７、３０１〜４９７、３１１〜４９７、３２１〜４９７、３３１〜４９７、３４１〜４９７、３５１〜４９７、３６１〜４９７、３７１〜４９７、３８１〜４９７、３９１〜４９７、４０１〜４９７、４１１〜４９７、４２１〜４９７、４３１〜４９７、４４１〜４９７、４５１〜４９７、４６１〜４９７、４７１〜４９７、４７６〜４９７、４８２〜４９７、４８７〜４９７、または４９２〜４９７）の中の任意の位置に対応する位置で終了するＣ末端を有し、例えば、配列番号：４０のアミノ酸位置２７６、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４７６、４８２、４８７、４９２または４９７に対応する位置（例えば配列番号：４０のアミノ酸位置３３１、３５１、３８１、４１１、４４１、４６１、４７１、４７６、４８２、４８７、４９２または４９７に対応する位置）で終了するＣ末端を有する。
【００１６】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、Ｎ末端の１、５、２１、２５、または６４個のアミノ酸を欠き、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質の配列番号：４０のアミノ酸位置２７６、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４７６、４８２、４８７、４９２または４９７に対応する位置（例えば配列番号：４０のアミノ酸位置３３１、３５１、３８１、４１１、４４１、４６１、４７１、４７６、４８２、４８７、４９２または４９７に対応する位置）で終了するＣ末端を有する。
【００１７】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、
（１）Ｎ末端の２５のアミノ酸を欠き、配列番号：４０のアミノ酸位置２７６、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４７６、４８２、４８７、４９２または４９７に対応する位置（好ましくは、配列番号：４０のアミノ酸位置３３１、３５１、３８１、４１１、４４１、４６１、４７１、４７６、４８２、４８７、４９２または４９７に対応する位置）で終了するＣ末端を有すること；
（２）Ｎ末端の１個のアミノ酸を欠き、配列番号：４０のアミノ酸位置４７６に対応する位置で終了するＣ末端を有すること；
（３）Ｎ末端の５個のアミノ酸を欠き、配列番号：４０のアミノ酸位置４７６に対応する位置で終了するＣ末端を有すること；
（４）Ｎ末端の２１個のアミノ酸を欠き、配列番号：４０のアミノ酸位置４７６に対応する位置で終了するＣ末端を有すること；および
（５）Ｎ末端の６４個のアミノ酸を欠き、配列番号：４０のアミノ酸位置４７６に対応する位置で終了するＣ末端を有すること
から選択される特徴を有する。
【００１８】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、ロタウイルスＬＬＲ株、ＳＡ１１株、もしくはＥＤＩＭ株に由来するＶＰ４タンパク質、またはＰ［４］、Ｐ［６］、もしくはＰ［８］遺伝子型のロタウイルスに由来するＶＰ４タンパク質である。
【００１９】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、配列番号：４０および８７〜９１から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２０】
いくつかの好ましい実施形態において、短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質（省略のために短縮型タンパク質とも呼ばれる）は、配列番号：２〜５および１０〜３９から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、短縮型タンパク質またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、およびそのポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００２２】
対象となるポリヌクレオチドの挿入のためのベクターは当技術分野において周知であり、それらにはクローニングベクターおよび発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージなどである。
【００２３】
別の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に更に関する。かかる宿主細胞には、原核生物細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞等）および真核生物細胞（酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞（哺乳類細胞等、例えばマウス細胞、ヒト細胞など）等）が含まれるが、これらに限定されない。本発明に記載の宿主細胞は、株化細胞（２９３Ｔ細胞等）であり得る。しかしながら、本発明に記載の宿主細胞は、原核生物細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞等）であることが特に好ましい。
【００２４】
別の態様において、本発明は、短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントを含むかまたはそれらからなる重合体に更に関する。いくつかの好ましい実施形態において、重合体は三量体である。いくつかの好ましい実施形態において、重合体は少なくとも６００ｋＤａの分子量を備えた重合体である。いくつかの好ましい実施形態において、重合体は短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質を含み、それは、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、Ｎ末端の２５個のアミノ酸を欠き、配列番号：４０のアミノ酸位置４７６に対応する野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質の位置で終了するＣ末端を有する。いくつかの好ましい実施形態において、重合体は短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質を含み、そのアミノ酸配列は配列番号：３０中で示される。いくつかの好ましい実施形態において、重合体は少なくとも６００ｋＤａの分子量を備えた三量体または重合体であり、配列番号：３０中で示される短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質を含む。
【００２５】
別の態様において、本発明は、短縮型タンパク質もしくはそのバリアント、またはポリヌクレオチド、またはベクター、または宿主細胞、または重合体を含む組成物に更に関する。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、本発明に記載の短縮型タンパク質またはそのバリアントを含む。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は本発明に記載の重合体を含む。
【００２６】
別の態様において、本発明は、本発明に記載の短縮型タンパク質もしくはそのバリアントまたは本発明に記載の重合体、ならびに随意に薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物（例えばワクチン）に更に関する。本発明に記載の医薬組成物（例えばワクチン）は、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患（ロタウイルス胃腸炎または下痢等）の予防または治療のために有用である。
【００２７】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に記載の短縮したタンパク質もしくはそのバリアントまたは本発明に記載の重合体は、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防または治療のために効果的な量で存在する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明に記載の医薬組成物（例えばワクチン）は追加の活性成分を更に含む。好ましくは、追加の活性成分はロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防または治療することができる。いくつかの好ましい実施形態において、本発明に記載の医薬組成物（例えばワクチン）はアジュバント（アルミニウムアジュバント等）を更に含む。
【００２８】
いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、または医薬組成物の投与（例えばヒト被験体への投与）に有利な特性を提供できる追加の薬剤を更に含む。好適な医薬担体には、例えば滅菌水、食塩水、グルコース、ヒマシ油およびエチレンオキシドの縮合産物、液体酸、低級アルコール（例えばＣ１−４アルコール）、油（例えばトウモロコシ油、落花生油、胡麻油；随意に乳化剤（脂肪酸モノグリセリドまたは脂肪酸ジグリセリド等）、またはリン脂質（レシチン等）を更に含む）、エチレングリコール、ポリアルキレングリコール、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、および同種のものが含まれる。随意に、担体には、アジュバント、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透促進剤、および同種のものが更に含まれる。いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は滅菌される。加えて、医薬組成物の粘度は、好適な溶媒または賦形剤の選択によって制御および維持することができる。いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は、４．５〜９．０、５．０〜８．０、６．５〜７．５、または６．５〜７．０のｐＨを有するように製剤化される。
【００２９】
本発明に記載の医薬組成物（例えばワクチン）は当技術分野において周知の手段によって投与することができ、例えば、それらには経口投与または注射が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、本発明に記載の医薬組成物（例えばワクチン）は単位用量の形状で投与される。
【００３０】
具体的な病態を予防または治療するために必要な本発明に記載の医薬組成物（例えばワクチン）の量は、投与経路、治療される病態の重症度、患者の性別、年齢、体重および一般的な健康条件、ならびに同種のものに依存し、実際の病態に従って医師によって合理的に決定することができる。
【００３１】
別の態様において、本発明は、短縮型タンパク質またはそのバリアントの発現を可能にする条件下で本発明に記載の宿主細胞を培養すること；および発現された短縮型タンパク質またはそのバリアントを回収することを含む、短縮型ロタウイルスタンパク質またはそのバリアントを調製するための方法に関する。
【００３２】
いくつかの好ましい実施形態において、方法は、Ｅ．ｃｏｌｉを使用して本発明に記載の短縮型タンパク質またはそのバリアントを発現すること、および次いでＥ．ｃｏｌｉを溶解すること、および溶解物から短縮型タンパク質またはそのバリアントを精製することを含む。いくつかの好ましい実施形態において、精製にはクロマトグラフィーが含まれる。いくつかの好ましい実施形態において、精製には２ステップのクロマトグラフィーが含まれる。いくつかの好ましい実施形態において、２ステップのクロマトグラフィーには、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えばＱ−セファロース−ＨＰを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー）；および後続の疎水性アフィニティークロマトグラフィー（例えばフェニルセファロース−ＨＰを使用する疎水性アフィニティークロマトグラフィー）が含まれる。
【００３３】
別の態様において、本発明は、本発明に記載の短縮型タンパク質もしくはそのバリアントまたは本発明に記載の重合体を、薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、随意に、アジュバント（アルミニウムアジュバント等）、および／または追加の活性成分（ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防または治療できる追加の活性成分等）と、混合することを含む、ワクチンを調製するための方法に更に関する。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンを調製するための方法は、以下のステップ：本発明に記載の短縮型タンパク質もしくはそのバリアントまたは本発明に記載の重合体をアジュバント（例えばアルミニウムアジュバント）と混合することを含む。
【００３４】
上述のように、得られたワクチンは、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患（ロタウイルス胃腸炎および下痢等）の予防または治療のために有用である。
【００３５】
別の態様において、本発明は、予防上または治療法上効果的な量の、本発明に記載の短縮型タンパク質もしくはそのバリアントまたは本発明に記載の重合体または本発明に記載の医薬組成物を、被験体へ投与することを含む、被験体におけるロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防または治療するための方法に関する。いくつかの好ましい実施形態において、ロタウイルス感染によって引き起こされる疾患には、ロタウイルス胃腸炎および下痢が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、被験体は哺乳類（マウスおよびヒト等）である。
【００３６】
別の態様において、本発明は、被験体におけるロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防または治療のための医薬組成物（例えばワクチン）の製造において、本発明に記載の短縮型タンパク質もしくはそのバリアントまたは本発明に記載の重合体の使用に更に関する。いくつかの好ましい実施形態において、ロタウイルス感染によって引き起こされる疾患には、ロタウイルス胃腸炎および下痢が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、被験体は哺乳類（マウスおよびヒト等）である。
【００３７】
別の態様において、本発明は、被験体におけるロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防または治療における使用のための短縮型タンパク質もしくはそのバリアントまたは重合体に更に関する。いくつかの好ましい実施形態において、ロタウイルス感染によって引き起こされる疾患には、ロタウイルス胃腸炎および下痢が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、被験体は哺乳類（マウスおよびヒト等）である。
【００３８】
本発明における関連用語の定義および説明
本発明において、特別の定めのない限り、本明細書において使用される科学用語および専門用語は当業者によって一般的に理解されるような意味を有する。更に、本明細書において使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、および免疫学の実験室での操作は、対応する分野において広く使用される常用の操作である。加えて、より良好に本発明を理解するために、関連用語の定義および説明が以下のように提供される。
【００３９】
本発明によれば、「Ｎ末端のＸ個のアミノ酸を欠く（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」という表現は、開始コドンによってコードされるメチオニン残基を備えたタンパク質のＮ末端での、位置１〜Ｘのアミノ酸残基の置き換えを指す。例えば、Ｎ末端の２５個のアミノ酸を欠くロタウイルスＶＰ４タンパク質は、開始コドンによってコードされるメチオニン残基を備えた野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質の位置１〜２５のアミノ酸残基の置き換えによって得られるタンパク質を指す。
【００４０】
本発明によれば、「アミノ酸位置Ｘで終了するＣ末端」という表現は、アミノ酸位置Ｘに後続するすべてのアミノ酸残基の欠失（すなわちアミノ酸位置Ｘ＋１から開始される）を指す。例えば、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質のアミノ酸位置４４１で終了するＣ末端は、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質のアミノ酸位置４４１に後続するすべてのアミノ酸残基の欠失（すなわちアミノ酸位置４４２から開始される）を指す。
【００４１】
本発明によれば、「バリアント」という用語は、アミノ酸配列が、１つまたは複数（例えば１〜１０または１〜５または１〜３）のアミノ酸で、本発明に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質のアミノ酸配列と異なる（例えば保存的アミノ酸置換）タンパク質、または本発明に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質のアミノ酸配列と比較して、少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する一方で、短縮型タンパク質の必要な特性を保持するタンパク質を指す。本明細書において使用される「必要な特性」という用語は以下の特性のうちの１つまたは複数であり得る。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ中で可溶性形態で発現させることが可能；
（ｉｉ）クロマトグラフィーによって容易に精製することが可能；
（ｉｉｉ）精製の後に良好な均一性および安定性（容易に劣化しない）を有する；
（ｉｖ）ウイルスによる細胞の感染をインビトロで阻害できる抗ＶＰ４の抗体へ特異的に結合することが可能；
（ｖ）細胞受容体への結合をロタウイルスと競合し、ウイルスによる細胞の感染を阻害することが可能；
（ｖｉ）ロタウイルスに対する高力価中和抗体の生成を生物体において誘導することが可能；および
（ｖｉｉ）ロタウイルス感染から被験体（ヒトおよびマウス等）を保護することが可能。
【００４２】
好ましくは、本発明に記載の「バリアント」は、短縮型タンパク質の上述の特性をすべて保持する。
【００４３】
本明細書において使用される時、「同一性」という用語は、２つのポリペプチドの間または２つの核酸の間の一致の程度を指す。比較のための２つの配列がある特定の部位で同じ塩基またはアミノ酸の単量体サブユニットを有する（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々はある特定の部位でアデニンを有するか、または２つのポリペプチドの各々はある特定の部位でリジンを有する）場合、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列の間のパーセント同一性は、比較のための部位の合計の数にわたる２つの配列によって共有される同一部位の数×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０の部位のうちの６つが一致するならば、これらの２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは５０％の同一性を共有する（６つの部位のうちの３つは一致する）。一般的に、２つの配列の比較は最大の同一性をもたらす様式で遂行される。かかるアライメントは、コンピュータープログラム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）の方法に基づくＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）等）の使用によって遂行することができる。２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）の中へ組込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して、決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性のパーセンテージは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムの中へ組込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムによって決定することができる。
【００４４】
本明細書において使用される時、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの生物学的活性に不利に影響しないかまたはそれを変化させないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、当技術分野において公知の標準的な技法（部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発等）によって導入され得る。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば対応するアミノ酸残基に物理的にまたは機能的に類似する（類似のサイズ、形、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有する等）残基と、置換される置換が含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニンおよびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（スレオニン、バリン、イソロイシン等）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、対応するアミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と置換される。アミノ酸の保存的置換を同定する方法は当技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４１２−４１７（１９９７）を参照、これらは参照により本明細書に援用される）。
【００４５】
本発明によれば、「Ｅ．ｃｏｌｉ発現系」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉ（株）およびベクターからなる発現系を指し、そこで、Ｅ．ｃｏｌｉ（株）には、ＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）、および同種のものが含まれるが、これらに限定されず、そしてこれらは市場で入手可能である。
【００４６】
本発明によれば、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドをその中に挿入することができる核酸担体ツールを指す。ベクターがその中に挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合に、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。「ベクター」は、宿主細胞の中への形質転換、形質導入およびトランスフェクションによって、宿主細胞中で発現される保有される遺伝的エレメントを有し得る。ベクターは当業者に周知であり、それらには、プラスミド、ファージ、コスミドおよび同種のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明によれば、「ＶＰ４タンパク質」、「ＶＰ４全長タンパク質」および「ロタウイルスＶＰ４タンパク質」という用語は互換的に使用することができ、ＲＶウイルス粒子の外殻カプシドをＶＰ７と一緒に形成する構造タンパク質を指す。ＶＰ４タンパク質のアミノ酸配列は当業者に公知であり、様々な公開データベース（例えばＧｅｎＢａｎｋデータベース）中で見出すことができる。例えば、ＶＰ４タンパク質の例示的なアミノ酸配列は配列番号：４０および８７〜９１中で示される。
【００４８】
本発明によれば、「短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ロタウイルスＶＰ４タンパク質」という用語は、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端での１つまたは複数アミノ酸の欠失からもたらされるタンパク質を指し、そこで、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質のアミノ酸配列は、公開データベース（ＧｅｎＢａｎｋデータベース等）中で、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＶ５３３２９．１、ＢＡＡ０３８５０．１、ＡＡＢ９４７５８．２、ＡＩＳ９３０８７．１、ＡＣＪ０６２１６．１およびＡＡＡ６６９５３．１下で、容易に見出すことができる。
【００４９】
本発明において、野生型ロタウイルスＬＬＲのＶＰ４タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号：４０中で示される。したがって、ＶＰ４タンパク質の配列が本発明に関与する場合、配列番号：４０中で示される配列によって記載される。例えば、「ＶＰ４タンパク質のアミノ酸位置２７６〜４９７」という表現は、配列番号：４０のアミノ酸位置２７６〜４９７を指す。しかしながら、当業者は、突然変異または変動（置換、欠失および／または添加が含まれるが、これらに限定されない）が、ＶＰ４タンパク質の生物学的特性を影響せずに、配列番号：４０中で天然に存在し得るか、またはその中に人工的に導入され得ることを理解する。例えば、ロタウイルスの異なるウイルス株からのＶＰ４タンパク質は、アミノ酸配列に関して天然に異なり得るが、実質的に同じ生物学的特性を有する。したがって、本発明において、「ＶＰ４タンパク質」という用語には、すべてのかかるポリペプチドおよびバリアントが含まれることを意図し、それらには配列番号：４０中で示されるポリペプチドおよびその天然または人工的なバリアントが含まれ、そこでバリアントはＶＰ４タンパク質の生物学的特性を保持する。加えて、ＶＰ４タンパク質の配列断片およびアミノ酸位置が記載される場合、それらには、配列番号：４０中で示されるポリペプチドの配列断片およびアミノ酸位置だけでなく、ポリペプチドの天然または人工的なバリアントの対応する配列断片およびアミノ酸位置も含まれる。例えば、「ＶＰ４タンパク質のアミノ酸位置２７６〜４９７」という表現には、配列番号：４０のアミノ酸位置２７６〜４９７、および配列番号：４０中で示されるポリペプチドのバリアント（天然または人工的なバリアント）の対応するアミノ酸位置が含まれることを意図する。
【００５０】
本発明において、野生型ロタウイルスＳＡ１１、ＥＤＩＭ、Ｐ［４］、Ｐ［６］およびＰ［８］のＶＰ４タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号：８７〜９１中でそれぞれ示される。
【００５１】
本発明によれば、「対応する配列断片」または「対応する断片」という表現は、配列に最適化されたアライメントが行われる（すなわち、配列が同一性の最も高いパーセンテージを得るようにアライメントされる）場合、配列の等しい位置に所在する断片を指す。本発明によれば、「対応するアミノ酸位置」という表現は、配列に最適化されたアライメントが行われる（すなわち、配列が同一性の最も高いパーセンテージを得るようにアライメントされる）場合、配列の等しい位置に所在するアミノ酸位置／残基を指す。
【００５２】
本発明において、「ロタウイルスＶＰ４タンパク質の短縮型遺伝子断片」という用語は、野生型短縮型ロタウイルスＶＰ４遺伝子と比較して、５’末端または３’末端で１つまたは複数の欠失されたアミノ酸をコードするヌクレオチドを有するような遺伝子断片を指し、そこで、野生型短縮型ロタウイルスＶＰ４遺伝子の全長配列は、公開データベース（例えばＧｅｎＢａｎｋデータベース）中で、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ０１３５０６．１、Ｄ１６３４６．１、ＡＦ０３９２１９．２、ＫＪ９４００７５．１、ＦＪ１８３３５６．１およびＬ３４１６１．１下で、容易に見出すことができる。例えば、野生型ロタウイルスＬＬＲのＶＰ４遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号：４１中で示される。
【００５３】
本発明によれば、「重合体」という用語は、単量体としてのポリペプチド分子（例えば本発明に記載の短縮型タンパク質）からなる重合体を指し、一般的にはそれは少なくとも２つ（例えば３、４、５以上）のポリペプチド単量体（例えば本発明に記載の短縮型タンパク質）を含む。かかる重合体において、単量体分子は分子間相互作用（例えば水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用）によって多量体を形成するように重合される。本発明のいくつかの実施形態において、重合体は３つの単量体を含む三量体である。本発明のいくつかの実施形態において、重合体は、複数の単量体を含み、少なくとも６００ｋＤａの分子量を有する多量体である（かかる多量体は本文脈中で重合体とも呼ばれる）。
【００５４】
本発明によれば、「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」という用語は、被験体および活性成分に対して薬理学的および／または生理学的に適合性のある担体および／または賦形剤を指し、それらは当技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ編、第１９版、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年を参照）、それらには、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、およびイオン強度強化剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調節剤には、リン酸バッファーが含まれるが、これらに限定されず；界面活性剤には、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、または非イオン性界面活性剤（ツイーン８０等）が含まれるが、これらに限定されず；アジュバントには、水酸化アルミニウム（例えば水酸化アルミニウム）およびフロイントのアジュバント（例えばフロイントの完全アジュバント）が含まれるが、これらに限定されず；イオン強度強化剤には、ＮａＣｌが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明によれば、「アジュバント」という用語は、生物体へ抗原と一緒に送達されるかまたは先立って生物体に送達される場合に、生物体における、抗原への免疫応答を促進できるかまたは免疫応答のタイプを変化できる、非特異的免疫増進物質を指す。様々なアジュバントがあり、それらには、アルミニウムアジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、フロイントのアジュバント（例えばフロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバント）、Ｃｏｒｙｎｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、リポポリサッカライド、サイトカイン、および同種のものが含まれるが、これらに限定されない。フロイントのアジュバントは、現在動物実験において最も一般に使用されるアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験においてより一般に使用される。本発明において、特に好ましくは、アジュバントはアルミニウムアジュバントである。
【００５６】
本発明によれば、「効果的な量」という用語は、期待される効果を達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（ロタウイルス感染等）の予防または治療のために効果的な量は、疾患（ロタウイルス感染等）の出現を予防、抑制、もしくは遅延するために効果的であるか、または存在する疾患（ロタウイルス感染によって引き起こされる疾患等）の重症度を緩和、軽減、もしくは治療するために効果的である量を指す。かかる効果的な量の決定は当業者の能力内である。例えば、治療法的な使用のために効果的な量は、治療される疾患の重症度、患者における免疫系の全体的な状態、患者の全体的な病態（年齢、体重および性別等）、薬物の投与経路、同時に使用される追加療法、および同種のものに依存する。
【００５７】
本発明によれば、「クロマトグラフィー」という用語には、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換クロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー（例えばハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾液クロマトグラフィー（ゲル排除クロマトグラフィー）、およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明によれば、宿主細胞の破壊は、当業者に周知の様々な方法によって実行することができ、それらには、ホモジナイザーによる破壊、ホモジネートマシンによる破壊、超音波処理、粉砕、高圧押出し、リゾチーム処理、および同種のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明によれば、「免疫原性」という用語は、生物体において、特異的な抗体または感作リンパ球の形成を刺激する能力を指す。この用語は、特異的な免疫細胞を刺激して、最終的に免疫学的効果物質（抗体および感作リンパ球等）を生成するように、免疫細胞を活性化し、増殖させ、分化させる、抗原の特性を指すだけではなく、抗原により生物体を刺激した後に、抗体または感作Ｔリンパ球が生物体の免疫系において形成され得る、特異的な免疫応答も指す。
【００６０】
本発明によれば、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同じ意味を有し、互換的に使用することができる。更に、本発明において、アミノ酸は、一般的には１文字コードおよび３文字コードとして表現される。例えば、アラニンはＡまたはＡｌａとして表現され得る。
【００６１】
本明細書において使用される時、「被験体」という用語は動物（例えば脊椎動物）を指す。好ましくは、被験体は、哺乳類（ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類または霊長類等）である。特に好ましい被験体はヒトである。本明細書において使用される時、本用語および「患者」という用語は互換的に使用することができる。
【発明の効果】
【００６２】
本発明において効果的に提供されるような短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質およびその調製物は、当技術分野における技術的問題を解決する。
【００６３】
第１に、本発明に記載の短縮型タンパク質またはそのバリアントは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可溶性形態で発現させることができ、それは高収率を達成する。このことは、大規模な工業的産生のための利点を提供する。
【００６４】
第２に、本発明に記載の短縮型タンパク質またはそのバリアントの精製は比較的単純であり、容易に実行することができる。特に、可溶性発現がＥ．ｃｏｌｉ中で実行された後に、Ｅ．ｃｏｌｉを溶解することができ、次いで溶解物は、クロマトグラフィーによって（例えば陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性アフィニティークロマトグラフィーによって）処理され、それによって高純度を備えた短縮型タンパク質をもたらす（それは少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上に達し得る）。このことは、大規模な工業的産生のための利点を提供する。
【００６５】
第３に、本発明中で得られるような高純度を備えた短縮型タンパク質は良好な均一性および安定性を有する。特に、本発明に記載の精製された短縮型タンパク質は均一な形状で存在することができ、容易に劣化しない。これは、バッチでの産生のための利点を提供し、異なるバッチの間の変動を回避し、精密な医薬物のために良いことである。
【００６６】
第４に、本発明に記載の短縮型タンパク質またはそのバリアントは、生物体においてアルミニウムアジュバントの存在下においてロタウイルスに対する高力価の中和抗体の生成を誘導することができる。一般的にはフロイントのアジュバントではなくアルミニウムアジュバントが診療所において使用されるので、本発明に記載の短縮型タンパク質またはそのバリアントは、ロタウイルス感染から被験体を保護するために、臨床状態で有利に使用することができる。
【００６７】
要約して言えば、本発明に記載の短縮型タンパク質またはそのバリアントは容易に発現および精製される等の特徴を有するだけでなく、良好な均一性および安定性を有する。より重要なことには、本発明に記載の短縮型タンパク質またはそのバリアントは強い免疫原性を有し、生物体においてアルミニウムアジュバントの存在下において高力価の中和抗体を誘導することができ、したがって臨床状態下の被験体のために強い保護を提供する。したがって、本発明に記載の短縮型タンパク質またはそのバリアントは、ロタウイルスに対する高度に効果的なワクチンの大規模工業的産生において使用することができ、それによって、当技術分野における技術的問題を解決するのに効果的な解決策を提供する。
【００６８】
本発明の実施形態は、以下の図面および実施例への参照によって詳細に例証される。しかしながら、本発明の保護範囲を限定するのではなく、本発明を例証する目的のためのみに以下の図面および実施例が使用されることが、当業者によって理解される。以下の図面および好ましい実施形態の詳細な記載によれば、本発明の様々な目的および利点は当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１Ａは、精製ＶＰ８−５タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。結果は、得られた精製ＶＰ８−５タンパク質が９０％より上の純度を有していたことを示す。図１Ｂは、ＶＰ８−５タンパク質、およびＶＰ８−５タンパク質によるＢａｌｂ／ｃマウスの免疫付与によって得られた免疫血清による間接ＥＬＩＳＡ分析の結果を示し、そこで、横座標は、実験群（ＶＰ８−５）、陽性対照群（ＬＬＲ）および陰性対照群（ＮＣ）を表わし、縦座標は、ＶＰ８−５タンパク質との反応性を有する免疫血清の最も高い希釈（すなわち抗体価）を表わす。結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で、ＶＰ８−５がマウスにおいて抗体の生成を誘導できたが、その効率が不活性化ウイルスＬＬＲの効率よりも低かったことを示す。この結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、ＶＰ８−５タンパク質が免疫原性を有し、マウスにおいて抗体の生成を誘導することができたが、動物において抗体の生成を誘導するその能力が不活性化ウイルスＬＬＲよりも低かったことを示す。図１Ｃは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＶＰ８−５により誘導された免疫血清の中和抗体価の分析の結果を示し、そこで、横座標は、実験群（ＶＰ８−５）、陽性対照群（ＬＬＲ）および陰性対照群（ＮＣ）を表わし、縦座標は、５０％の感染阻害率を達成する免疫血清の最も高い希釈のｌｏｇ値（ｌｏｇ２ＮＴ５０、中和抗体価）を表わす。結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で（３回の免疫付与後に）、ＶＰ８−５がマウスにおいて中和抗体の生成を誘導できたが、免疫血清の中和抗体価（ＮＴ５０）が不活性化ウイルスＬＬＲよりも低かったことを示す。免疫付与手順が完了した後に、ＶＰ８−５タンパク質により誘導された免疫血清の中和抗体価（ＮＴ５０）は、高々約６４に達した。この結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、ＶＰ８−５が生物体において中和抗体の生成を誘導できたが、それにより誘導された免疫血清の中和抗体価（ＮＴ５０）が不活性化ウイルスＬＬＲよりも低かったことを示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、保護的実験における下痢のスコアリング尺度を示す。哺乳中のマウスにおける下痢の程度に応じて、スコアは、３つのグレードへと分割される。正常な便は１ポイントとしてスコアリングされ（図２Ｃ）、軟便は２ポイントとしてスコアリングされ（図２Ｂ）、形が崩れた水様便は３ポイントとしてスコアリングされる（図２Ａ）。
【図３】ウイルスによる攻撃投与後の異なる免疫付与群における哺乳中のマウスの下痢スコアを示し、そこで、縦座標軸は下痢スコアを表わし；横座標軸はウイルスによるマウスの攻撃投与後の日数を表わす。結果は、実験群（ＶＰ８−５）における哺乳中のマウスの下痢スコアが陰性対照群（ＮＣ）のものとは有意に異なっていなかったことを示す。このことは、アルミニウムアジュバントの存在下において、ＶＰ８−５はロタウイルス感染から生物体を保護する能力が低く（不活性化ウイルスよりも低い）、ロタウイルス感染によって引き起こされる下痢を十分に緩和できなかったことを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された短縮型タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。結果は、比較的低い発現レベルの２６−３１１、２６−３３１および２６−３８１を除いて、高レベルで他の短縮型タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現できたことを示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、精製された短縮型ＶＰ４タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図５Ａ中で、左側から右側のレーンは、タンパク質分子量マーカー（マーカー）、１−４７６、６−４７６、２２−４７６、２６−４７６、６５−４７６、２６−２３１、２６−２７１、２６−３３１および２６−３５１である。図５Ｂ中で、左側から右側のレーンは、タンパク質分子量マーカー（マーカー）、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２および２６−４９７である。結果は、精製ステップ後に、短縮型タンパク質が０．２ｍｇ／ｍｌを超える濃度および８０％を超える純度を有していたことを示す。
【図６】短縮型タンパク質１−４７６、６−４７６、２２−４７６、２６−４７６、２６−２７１、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、および２６−４９７による、Ｇ３０００ＰＷＸＬ分子篩の分析の結果を示す。横座標軸は保持時間を表わし、縦座標軸は２８０ｎｍでの吸光度を表わす。結果は、ＴＢ８．０の存在下において、短縮型タンパク質１−４７６が、サンプル中で重合体の形状で存在し（ピークは約１０〜１１分で出現した）；２６−２７１が、９０％を超える含有量で単量体の形状であり（ピークは約１６分で出現した）；他の短縮型タンパク質（６−４７６、２２−４７６、２６−４７６、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７）が、ほとんど９０％を超える含有量で三量体の形状であった（ピークは約１３〜１４分で出現した）ことを示す。塩の存在下において（ＴＢ８．０＋１ＭのＮａＣｌ）、短縮型タンパク質２６−４７６、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、および２６−４９７は、９０％を超える含有量で、単量体へ変換された（ピーク時間は約１３〜１４分から約１５〜１６分へ変化したようであった）。これは、塩の存在下において、２６−４７６、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、および２６−４９７の立体配置が塩イオンによって影響を受け、三量体の脱重合および単量体の形成をもたらすことを示す。
【図７】短縮型タンパク質２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、および２６−４６１による、Ｇ５０００ＰＷＸＬ分子篩分析の結果を示す。横座標軸は保持時間を表わし、縦座標軸は２８０ｎｍでの吸光度を表わす。結果は、ＴＢ８．０の存在下において、すべてのこれらの短縮型タンパク質がサンプル中で重合体の形状で存在した（ピークは約１０〜１１分で出現した）ことを示す。  図６および７中の結果は、得られた短縮型ＶＰ４タンパク質の主吸収ピークが、およそ８０％を超えるかまたは場合によっては９０％を超えて占めることも示し、これらの短縮型タンパク質が良好な均一性を有していたことを指摘する。
【図８Ａ】５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に３７℃で１２時間放置した後の短縮型タンパク質２６−４７６による分子篩分析の結果を示す。横座標軸は保持時間を表わし、縦座標軸は２８０ｎｍでの吸光度を表わす。結果は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に３７℃で１２時間放置した後に、短縮型タンパク質２６−４７６が均一な重合体を（１２．４分の保持時間を備えた）を形成することができ、重合体が最大９７．２％を占めたことを示す。
【図８Ｂ】５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に３７℃で１２時間放置した後の短縮型タンパク質２６−４７６の電子顕微鏡の結果を示す。結果は、短縮型タンパク質２６−４７６が均一の重合体へとインビトロでアセンブルされ得たことを示す。
【図９】酵素によって切断したかまたはしなかったかのいずれかである、短縮型タンパク質２６−４７６、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、および２６−４９７のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レーン上で、番号「１」は、サンプルがトリプシンにより処理されないことを表わし；番号「２」は、サンプルが０．１ｍｇ／ｍｌのトリプシンにより処理されたことを表わす。結果は、すべてのこれらの短縮型タンパク質がトリプシンによって認識および切断できたこと、すなわちそれらの酵素切断部位が曝露されたことを示す。
【図１０】短縮型ＶＰ４タンパク質（１−４７６、６−４７６、２２−４７６、６５−４７６、２６−２７１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４７６、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７）および中和抗体Ａ３（図１０Ａ）、Ｂ１（図１０Ｂ）、Ｂ５（図１０Ｃ）、Ｂ６（図１０Ｄ）、Ｄ６（図１０Ｅ）、Ｅ２（図１０Ｆ）、Ｅ５（図１０Ｇ）、８Ｆ６（図１０Ｈ）による間接ＥＬＩＳＡ分析の結果を示し、そこで、横座標は短縮型タンパク質を表わし、縦座標は、短縮型タンパク質との反応性を有する一次抗体（Ａ３、Ｂ１、Ｂ５、Ｂ６、Ｄ６、Ｅ２、Ｅ５、８Ｆ６）を表わす。結果は、すべてのこれらの短縮型タンパク質が良好な抗原性（すなわち抗体反応性）を有していたことを示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、短縮型タンパク質２６−４７６、および試験されるサンプル（１−４７６、６−４７６、２２−４７６、６５−４７６、２６−２７１、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４７６、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７、２６−４７６の三量体、２６−４７６の重合体、不活性化ウイルス）によるＢａｌｂ／ｃマウスの免疫付与によって得られた免疫血清による間接ＥＬＩＳＡ分析の結果を示し、そこで、横座標は、免疫血清の産生のためのタンパク質サンプルを表わし；縦座標は、２６−４７６との反応性を有する免疫血清の最も高い希釈（すなわち抗体価）を表わす。ＲＶ：不活性化ロタウイルス；ＮＣ：陰性対照（ＰＢＳ）；三量体：２６−４７６の三量体；重合体：２６−４７６の重合体。図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄは、異なる免疫付与バッチの結果を示す。結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で、これらのタンパク質がマウスにおいて抗体の生成を誘導でき（免疫血清の抗体価（幾何平均抗体価）は１０２〜１０５以上を達することができた）；２６−２７１を除いて、他のタンパク質サンプルによって誘導された抗体価が、ＲＶによって誘導された抗体価よりも高かったか（１−４７６、６−４７６、２２−４７６、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４７６、２６−４８７、２６−４９２、２６−４７６の三量体、および２６−４７６の重合体）、またはＲＶによって誘導された抗体価に少なくとも同等であった（６５−４７６、２６−４８２、および２６−４９７）ことを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、タンパク質サンプル（１−４７６、６−４７６、２２−４７６、６５−４７６、２６−２７１、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４７６、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７、２６−４７６の三量体、２６−４７６の重合体、不活性化ウイルス）によりＢａｌｂ／ｃマウスにおいて誘導された免疫血清の中和抗体価の分析の結果を示し、そこで、横座標は、免疫血清の産生のためのタンパク質サンプルを表わし；縦座標は、５０％の感染阻害率を達成する免疫血清の最も高い希釈（ＮＴ５０、中和抗体価）を表わす。ＲＶ：不活性化ロタウイルス；ＮＣ：陰性対照（ＰＢＳ）；三量体：２６−４７６の三量体；重合体：２６−４７６の重合体。図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄは、異なる免疫付与バッチの結果を示す。結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で（３回の免疫付与後に）、すべてのこれらのタンパク質サンプルがマウスにおいて中和抗体の生成を誘導でき、それらの中和抗体価（ＮＴ５０）が２８〜２１４以上に達することができ；２６−２７１を除いて、他のタンパク質サンプルによって誘導された中和抗体価が、ＲＶによって誘導された中和抗体価に同等であったか（６−４７６、２２−４７６、２６−４７６、６５−４７６、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７、および２６−４７６の三量体）、またはＲＶによって誘導された中和抗体価よりもさらに高かった（１−４７６、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、および２６−４７６の重合体）ことを示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、ウイルスによる攻撃投与後１〜７日目の、異なる免疫付与群（２２−４７６、２６−４７６、６５−４７６、２６−２７１、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７、２６−４７６の三量体、２６−４７６の重合体、不活性化ロタウイルス（ＲＶ、陽性対照）またはＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照）により免疫付与された）における、哺乳中のマウスの下痢スコアを示し、そこで、縦座標軸は平均下痢スコアを表わし；横座標軸は、ウイルスによるマウスの攻撃投与後の日数を表わす。ＲＶ：不活性化ロタウイルス；ＮＣ：陰性対照（ＰＢＳ）；三量体：２６−４７６の三量体；重合体：２６−４７６の重合体。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄは、異なる免疫付与群（２２−４７６、２６−４７６、６５−４７６、２６−２７１、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７、２６−４７６の三量体、２６−４７６の重合体、不活性化ロタウイルス（ＲＶ、陽性対照）またはＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照）により免疫付与された）中の哺乳中のマウスにおける、ウイルスによる攻撃投与後４８時間の、ウイルスによる攻撃投与後の下痢の平均継続期間および平均下痢スコアを示し、そこで、下痢の平均継続時間（日）は棒グラフによって表わされ、平均下痢スコアは曲線グラフによって表わされ、左側の縦座標軸は下痢の平均継続時間（日）を表わし；右側の縦座標軸は下痢スコアを表わし；横座標軸は、タンパク質サンプルの対応する免疫付与群を表わす。ＲＶ：不活性化ロタウイルス；ＮＣ：陰性対照（ＰＢＳ）；三量体：２６−４７６の三量体；重合体：２６−４７６の重合体。  図１３〜１４中の結果は、平均下痢スコアおよび下痢の平均継続時間（日）に関して、タンパク質サンプルの対応する免疫付与群がＮＣ群よりも優れていたことを示す。このことは、タンパク質サンプルが有意な保護的効果を有し、マウスがロタウイルス感染、およびロタウイルス感染によって引き起こされる下痢と闘うことを支援できたことを指摘する。加えて、図１３〜１４中の結果は、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７６、２６−４７６の三量体、および２６−４７６の重合体の保護的効果がＲＶのものに同等であったかまたはＲＶよりもさらに良好であったことも示す。実施例１の実験結果によれば、アルミニウムアジュバントの存在下において、これらのタンパク質サンプルの保護的効果は動物においてＶＰ８−５のものよりも優れていた。加えて、図１３Ｄおよび図１４Ｄ中の実験結果は、動物において短縮型タンパク質２６−４７６の重合体の保護的効果が２６−４７６の三量体のものより有意に優れ、より高い有効性を有するワクチンの調製に使用できるだろうことも示す。
【図１５】異なるウイルス株からの２６−４７６のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、そこで、左側から右側へのレーンは、ロタウイルスＬＬＲからの短縮型タンパク質２６−４７６；ロタウイルスＳＡ１１からの短縮型タンパク質２６−４７６−ＳＡ１１；ロタウイルスＥＤＩＭからの短縮型タンパク質２６−４７６−ＥＤＩＭ；ロタウイルスＰ［８］からの短縮型タンパク質２６−４７６−Ｐ［８］；ロタウイルスＰ［６］からの短縮型タンパク質２６−４７６−Ｐ［６］；ロタウイルスＰ［４］からの短縮型タンパク質２６−４７６−Ｐ［４］；およびタンパク質分子量マーカー（マーカー）である。結果は、本発明に記載の方法がロタウイルスの異なる株に適用可能であり；異なるウイルス株からの短縮型ＶＰ４タンパク質（２６−４７６）をＥ．ｃｏｌｉ中で効果的に発現することができ、クロマトグラフィーによる精製後に８０％の純度を有していたことを示す。
【図１６】異なるウイルス株に由来する短縮型ＶＰ４タンパク質２６−４７６による分子篩分析の結果を示す。横座標軸は保持時間を表わし、縦座標軸は２８０ｎｍでの吸光度を表わす。結果は、ＴＢ８．０の存在下において、異なるウイルス株に由来する２６−４７６タンパク質が８０％を超える含有量で、主に三量体の形状で存在した（ピークは約１３〜１４分で出現した）ことを示す。このことは、ＴＢ８．０の存在下において、異なるウイルス株に由来する２６−４７６タンパク質が良好な均一性を有していたことを指摘する。
【図１７】短縮型タンパク質（２６−４７６−Ｐ［４］、２６−４７６−Ｐ［６］、２６−４７６−Ｐ［８］、２６−４７６−ＥＤＩＭ、２６−４７６−ＳＡ１１、およびＬＬＲに由来する２６−４７６）、および対応する短縮型タンパク質によるＢａｌｂ／ｃマウスの免疫付与によって得られた免疫血清による間接ＥＬＩＳＡ分析の結果を示し、そこで、横座標は、免疫血清の産生のための短縮型タンパク質が由来するウイルス株を表わし、縦座標は、対応する短縮型タンパク質との反応性を有する免疫血清の最も高い希釈（すなわち抗体価）を表わす。Ｐ［４］：２６−４７６−Ｐ［４］；Ｐ［６］：２６−４７６−Ｐ［６］；Ｐ［８］：２６−４７６−Ｐ［８］；ＳＡ１１：２６−４７６−ＳＡ１１；ＥＤＩＭ：２６−４７６−ＥＤＩＭ；ＬＬＲ：実施例４において調製された２６−４７６。結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で（３回の免疫付与後に）、異なるウイルス株に由来するすべてのこれらの２６−４７６タンパク質がマウスにおいて抗体の生成を誘導でき、それによって誘導された免疫血清中の抗体価（幾何平均抗体価）が、実質的に同等であった（抗体価は１０４〜１０５以上に達することができ、陰性対照群よりもはるかに高い）ことを示す。これらの結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、異なるウイルス株に由来する２６−４７６タンパク質が良好な免疫原性を有し、動物において抗体の生成を効果的に誘導でき；異なるウイルス株に由来する２６−４７６タンパク質が、免疫原性に関して実質的に同等であり、ＶＰ８−５よりも優れていたことを示す。
【図１８】異なるウイルス株に由来する２６−４７６タンパク質（２６−４７６−ＳＡ１１、２６−４７６−ＥＤＩＭ、ＬＬＲに由来２６−４７６）によりＢａｌｂ／ｃマウス中で誘導された免疫血清の中和抗体価の分析の結果を示し、そこで、横座標は、免疫血清の産生のためのタンパク質サンプルが由来するウイルス株を表わし；縦座標は、５０％の感染阻害率を達成する最も高い希釈（ＮＴ５０、中和抗体価）を表わす。ＳＡ１１：２６−４７６−ＳＡ１１；ＥＤＩＭ：２６−４７６−ＥＤＩＭ；ＬＬＲ：実施例４において調製された２６−４７６。結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で（３回の免疫付与後に）、ＳＡ１１、ＥＤＩＭおよびＬＬＲのウイルス株に由来する２６−４７６のタンパク質がマウスにおいて高力価の中和抗体の生成を誘導でき、それらの中和抗体価（ＮＴ５０）が２１０〜２１４以上に達することができ；２６−４７６−ＳＡ１１および２６−４７６−ＥＤＩＭによって誘導された中和抗体価が、ＬＬＲに由来する２６−４７６によって誘導されたものよりもさらに高かったことを示す。
【図１９】図１９Ａは、ＳＡ１１ウイルスによる攻撃投与後１〜７日目の、異なる免疫付与群（２６−４７６−ＳＡ１１またはＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照）により免疫付与された）における、哺乳中のマウスの下痢スコアを示し；図１９Ｂは、ＥＤＩＭウイルスによる攻撃投与後１〜１２日目の、異なる免疫付与群（２６−４７６−ＥＤＩＭまたはＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照）により免疫付与された）における、哺乳中のマウスの下痢スコアを示し；そこで、横座標はウイルスによる攻撃投与後の日数を表わし、縦座標は平均下痢スコアを表わす。結果は、ＬＬＲに由来する２６−４７６タンパク質に類似して、ＳＡ１１およびＥＤＩＭに由来する両方の２６−４７６タンパク質が有意な保護的効果を有し、マウスがロタウイルス感染、およびロタウイルス感染によって引き起こされる下痢と闘うことを支援できたことを示す。図１９Ｃは、ＥＤＩＭによる攻撃投与後１〜７日目の、２６−４７６−ＥＤＩＭまたはＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照）により免疫付与されたマウスの便懸濁物サンプルのウイルス負荷を示し、そこで、横座標はウイルスによる攻撃投与後の日数を表わし、縦座標は、１ｍｌの便懸濁物サンプル中に含有されるＥＤＩＭゲノムのコピー数を表わす。結果は、ウイルスによる攻撃投与後に、ＰＢＳにより免疫付与されたマウスの便中でウイルスの有意な分泌が検出され、２６−４７６−ＥＤＩＭにより免疫付与されたマウスの便中でウイルスの分泌が検出されなかったことを示す。  図１９Ａ〜１９Ｃ中の結果は、２６−４７６−ＥＤＩＭにより、マウスがロタウイルス感染およびロタウイルス感染によって引き起こされる下痢と闘うことができるだけでなく、マウスの便中のウイルスの分泌（すなわちウイルスの分泌）も阻害できたことを示す。
【００７０】
配列情報
本発明に関与する配列に対する情報は以下の表１中で提供される。
【表１−１】
2018520651.tif 000002
【表１−２】
2018520651.tif 000003
【００７１】
配列１（配列番号：１）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲ
【００７２】
配列２（配列番号：２）：
ＭＡＳＬＩＹＲＱＬＬＴＮＳＹＴＶＮＬＳＤＥＩＱＬＩＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＩＲＤＧＥＥＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＤＦＮＹＮＧＧＳＬＰＴＤＦＶＩＳＲＹＥＶＩＫＥＮＳＹＶＹＩＤＹＷＤＤＳＱＡＦＲＮＭＶＹＶＲＳＬＡＡＤＬＮＥＶＴＣＡＧＧＴＹＮＦＱＬＰＶＧＱＷＰＶＭＳＧＧＳＶＳＬＲＳＡＧＶＴＬＳＴＱＦＴＤＦＶＳＬＮＳＬＲＦＲＦＳＬＡＶＥＥＰＰＦＳＩＳＲＴＲＩＳＧＬＹＧＬＰＡＡＮＰＮＮＧＲＤＦＹＥＩＡＧＲＦＳＬＩＬＬＶＰＳ
【００７３】
配列３（配列番号：３）：
ＭＹＲＱＬＬＴＮＳＹＴＶＮＬＳＤＥＩＱＬＩＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＩＲＤＧＥＥＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＤＦＮＹＮＧＧＳＬＰＴＤＦＶＩＳＲＹＥＶＩＫＥＮＳＹＶＹＩＤＹＷＤＤＳＱＡＦＲＮＭＶＹＶＲＳＬＡＡＤＬＮＥＶＴＣＡＧＧＴＹＮＦＱＬＰＶＧＱＷＰＶＭＳＧＧＳＶＳＬＲＳＡＧＶＴＬＳＴＱＦＴＤＦＶＳＬＮＳＬＲＦＲＦＳＬＡＶＥＥＰＰＦＳＩＳＲＴＲＩＳＧＬＹＧＬＰＡＡＮＰＮＮＧＲＤＦＹＥＩＡＧＲＦＳＬＩＬＬＶＰＳ
【００７４】
配列４（配列番号：４）：
ＭＩＱＬＩＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＩＲＤＧＥＥＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＤＦＮＹＮＧＧＳＬＰＴＤＦＶＩＳＲＹＥＶＩＫＥＮＳＹＶＹＩＤＹＷＤＤＳＱＡＦＲＮＭＶＹＶＲＳＬＡＡＤＬＮＥＶＴＣＡＧＧＴＹＮＦＱＬＰＶＧＱＷＰＶＭＳＧＧＳＶＳＬＲＳＡＧＶＴＬＳＴＱＦＴＤＦＶＳＬＮＳＬＲＦＲＦＳＬＡＶＥＥＰＰＦＳＩＳＲＴＲＩＳＧＬＹＧＬＰＡＡＮＰＮＮＧＲＤＦＹＥＩＡＧＲＦＳＬＩＬＬＶＰＳ
【００７５】
配列５（配列番号：５）：
ＭＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＩＲＤＧＥＥＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＤＦＮＹＮＧＧＳＬＰＴＤＦＶＩＳＲＹＥＶＩＫＥＮＳＹＶＹＩＤＹＷＤＤＳＱＡＦＲＮＭＶＹＶＲＳＬＡＡＤＬＮＥＶＴＣＡＧＧＴＹＮＦＱＬＰＶＧＱＷＰＶＭＳＧＧＳＶＳＬＲＳＡＧＶＴＬＳＴＱＦＴＤＦＶＳＬＮＳＬＲＦＲＦＳＬＡＶＥＥＰＰＦＳＩＳＲＴＲＩＳＧＬＹＧＬＰＡＡＮＰＮＮＧＲＤＦＹＥＩＡＧＲＦＳＬＩＬＬＶＰＳ
【００７６】
配列６（配列番号：６）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲ
【００７７】
配列７（配列番号：７）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮ
【００７８】
配列８（配列番号：８）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬ
【００７９】
配列９（配列番号：９）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩ
【００８０】
配列１０（配列番号：１０）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩ
【００８１】
配列１１（配列番号：１１）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷ
【００８２】
配列１２（配列番号：１２）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹ
【００８３】
配列１３（配列番号：１３）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＩＲＤＧＥＥ
【００８４】
配列１４（配列番号：１４）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＩＲＤＧＥＥＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮ
【００８５】
配列１５（配列番号：１５）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＩＲＤＧＥＥＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＤＦＮＹＮＧＧ
【００８６】
配列１６（配列番号：１６）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＩＲＤＧＥＥＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＤＦＮＹＮＧＧＳＬＰＴＤＦＶＩＳＲ
【００８７】
配列１７（配列番号：１７）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＩＲＤＧＥＥＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＤＦＮＹＮＧＧＳＬＰＴＤＦＶＩＳＲＹＥＶＩＫＥＮＳＹＶ
【００８８】
配列１８（配列番号：１８）：
ＭＧＳＥＫＴＱＲＴＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＶＮＷＧＰＧＥＴＳＤＳＴＴＶＥＰＶＬＮＧＰＹＱＰＴＴＦＮＰＰＶＥＹＷＭＬＬＡＰＴＳＥＧＶＶＶＥＧＴＮＧＴＤＲＷＬＡＴＩＬＩＥＰＮＶＰＥＴＴＲＮＹＴＬＦＧＥＴＡＳＩＳＶＡＮＰＳＱＳＫＷＲＦＶＤＶＡＫＴＴＡＮＧＴＹＳＱＹＧＰＬＬＳＤＴＫＬＹＧＶＭＫＹＮＧＫＬＹＴＹＮＧＥＴＰＮＡＴＴＮＹＹＳＴＴＮＹＤＳＶＮＭＴＳＹＣＤＦＹＩＩＰＲＡＱＥＳＫＣＴＥＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＡＬＳＳＲＳＩＶＡＲＲＡＡＶＮＥＤＩＶＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＡＮＳＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＩＲＤＧＥＥＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＤＦＮＹＮＧＧＳＬＰＴＤＦＶＩＳＲＹＥＶＩＫＥＮＳＹＶＹＩＤＹＷＤＤＳＱＡ
【００８９】
配列１９（配列番号：１９）：
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【００９０】
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【００９１】
配列２１（配列番号：２１）：
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【００９２】
配列２２（配列番号：２２）：
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【００９３】
配列２３（配列番号：２３）：
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【００９４】
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【００９５】
配列２５（配列番号：２５）：
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【００９７】
配列２７（配列番号：２７）：
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【００９８】
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【０１００】
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【０１０２】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】
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【０１０７】
配列３７（配列番号：３７）：
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【０１０８】
配列３８（配列番号：３８）：
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【０１０９】
配列３９（配列番号：３９）：
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【０１１０】
配列４０（配列番号：４０）：
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【０１１１】
配列４１（配列番号：４１）：
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【０１５８】
配列８８（配列番号：８８）：
ＭＡＳＬＩＹＲＱＬＬＴＮＳＦＴＶＤＩＳＤＥＩＥＴＩＧＡＥＫＴＱＮＶＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＧＹＡＰＡＮＷＧＰＧＥＴＮＤＳＴＴＶＥＰＶＬＤＧＰＹＱＰＩＡＦＳＰＰＰＥＹＹＩＬＬＳＰＴＡＰＧＶＩＡＥＣＴＮＴＶＮＲＷＩＡＩＩＡＩＥＰＮＶＳＰＴＮＲＴＹＴＬＦＧＩＴＥＱＬＴＶＥＮＳＳＶＤＫＷＫＦＩＤＦＭＫＴＰＴＴＧＳＹＶＲＹＮＩＬＬＳＳＴＫＬＣＡＶＡＫＨＴＤＮＬＹＳＹＶＧＥＴＰＴＡＧＱＡＹＹＳＳＦＮＩＦＮＬＴＡＨＣＤＦＹＩＩＰＷＳＱＱＳＬＣＴＱＹＶＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＲＨＬＳＡＲＳＩＩＴＱＲＡＱＡＮＥＤＩＶＶＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＦＮＲＤＩＴＩＲＦＫＦＡＮＡＩＩＫＳＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＰＡＮＹＱＹＴＹＴＲＤＧＥＥＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＮＦＤＦＦＧＧＳＬＰＴＤＦＧＩＳＲＹＥＶＩＫＥＮＳＦＶＹＩＤＹＷＤＤＳＱＡＦＲＮＭＶＹＶＲＳＬＡＡＤＬＮＴＶＥＣＴＧＧＡＹＳＦＳＬＰＶＧＱＷＰＶＭＴＧＧＡＶＳＬＲＡＡＧＶＴＬＳＴＱＦＴＤＦＶＳＬＮＳＬＲＦＲＦＲＬＳＶＥＥＰＳＦＳＩＴＲＴＲＶＳＧＬＹＧＬＰＡＡＤＰＮＮＧＲＥＹＹＥＩＡＧＲＦＳＬＩＳＬＶＰＳＮＤＮＹＱＴＰＩＭＮＳＶＴＶＲＱＤＬＥＲＱＬＧＥＬＲＥＥＦＮＡＬＳＱＥＩＡＬＳＱＬＶＤＬＡＬＬＰＬＤＭＦＳＭＦＳＧＩＫＡＴＬＤＶＡＫＳＭＡＴＮＶＭＫＫＦＫＫＳＧＬＡＴＳＩＳＡＭＴＥＳＬＳＤＡＡＳＳＶＳＲＳＧＡＩＲＳＶＳＳＴＳＳＡＷＴＤＶＳＳＲＶＡＮＶＥＮＡＡＳＴＶＳＴＱＴＡＴＩＳＲＲＬＲＬＫＥＩＴＴＱＴＥＧＭＮＦＤＤＩＳＡＡＶＬＫＴＫＬＤＫＳＶＲＩＡＰＮＴＬＰＤＩＶＴＥＡＳＥＫＦＩＰＮＲＳＹＲＶＩＮＮＮＥＡＦＥＴＧＴＤＧＲＦＦＡＹＲＶＤＴＬＥＥＬＰＦＤＶＱＫＦＡＤＬＶＡＥＳＰＶＩＳＡＩＩＤＦＫＴＬＫＮＬＮＤＮＹＧＩＳＫＥＱＡＦＳＬＬＲＳＤＰＲＶＬＲＥＦＩＮＱＧＮＰＩＩＲＮＲＩＥＱＬＩＭＱＣＲＬ
【０１５９】
配列８９（配列番号：８９）：
ＭＡＳＬＩＹＲＱＬＬＴＮＳＹＳＶＤＬＨＤＥＩＥＱＩＧＳＥＫＴＱＮＶＴＶＮＰＧＰＦＡＱＴＲＹＡＰＶＮＷＧＨＧＥＩＮＤＳＴＴＶＥＰＶＬＤＧＰＹＱＰＴＴＦＫＰＰＮＤＹＷＬＬＩＳＳＮＴＤＧＶＶＹＥＳＴＮＮＳＤＦＷＴＡＶＩＡＶＥＰＨＶＳＱＴＮＲＱＹＶＬＦＧＥＮＫＱＦＮＩＥＮＳＳＤＫＷＫＦＬＥＭＦＲＧＳＧＱＳＤＦＳＮＲＲＴＬＴＳＮＮＲＬＶＧＭＬＫＹＧＧＲＶＷＴＦＨＧＥＴＰＲＡＴＴＤＳＳＮＴＡＤＬＮＮＩＳＩＩＩＨＳＥＦＹＩＩＰＲＳＱＥＳＫＣＮＥＹＩＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＳＬＳＳＲＳＩＱＹＲＲＡＱＶＮＥＤＩＴＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＧＮＳＶＩＫＬＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＹＫＡＡＮＹＱＹＳＹＳＲＤＧＥＱＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＮＦＳＹＮＧＧＳＬＰＴＤＦＳＩＳＲＹＥＶＩＫＥＮＳＹＶＹＩＤＹＷＤＤＳＫＡＦＲＮＭＶＹＶＲＳＬＡＡＮＬＮＳＶＫＣＶＧＧＳＹＤＦＲＬＰＶＧＥＷＰＩＭＮＧＧＡＶＳＬＨＦＡＧＶＴＬＳＴＱＦＴＤＦＶＳＬＮＳＬＲＦＲＦＳＬＴＶＤＥＰＳＦＳＩＩＲＴＲＴＭＮＬＹＧＬＰＡＡＮＰＮＮＧＮＥＹＹＥＶＳＧＲＦＳＬＩＳＬＶＰＴＮＤＤＹＱＴＰＩＭＮＳＶＴＶＲＱＤＬＥＲＱＬＮＤＬＲＥＥＦＮＳＬＳＱＥＩＡＭＳＱＬＩＤＬＡＬＬＰＬＤＭＦＳＭＦＳＧＩＫＳＴＩＤＬＴＫＳＭＡＴＳＶＭＫＫＦＲＫＳＫＬＡＴＳＩＳＥＭＴＮＳＬＳＤＡＡＳＳＡＳＲＳＡＳＩＲＳＮＬＳＴＩＳＮＷＳＤＡＳＫＳＶＬＮＶＴＤＳＶＮＤＶＳＴＱＴＳＴＩＳＫＫＬＲＬＲＥＭＩＴＱＴＥＧＩＳＦＤＤＩＳＡＡＶＬＫＴＫＩＤＭＳＴＱＩＧＫＮＴＬＰＤＩＶＴＥＡＳＥＫＦＩＰＫＲＳＹＲＶＬＫＤＤＥＶＭＥＶＮＴＥＧＫＦＦＡＹＫＶＤＴＬＮＥＩＰＦＤＩＮＫＦＡＥＬＶＴＤＳＰＶＩＳＡＩＩＤＦＫＴＬＫＮＬＮＤＮＹＧＩＴＲＩＥＡＬＮＬＩＫＳＮＰＮＶＬＲＮＦＩＮＱＮＮＰＩＩＲＮＲＩＥＱＬＩＬＱＣＫＬ
【０１６０】
配列９０（配列番号：９０）：
ＭＡＳＬＩＹＲＱＬＬＴＮＳＹＴＶＥＬＳＤＥＩＮＴＩＧＳＥＫＳＱＮＶＴＩＮＰＧＰＦＡＱＴＮＹＡＰＶＴＷＳＨＧＥＶＮＤＳＴＴＩＥＰＶＬＤＧＰＹＱＰＴＮＦＫＰＰＮＤＹＷＩＬＬＮＰＴＮＱＱＶＶＬＥＧＴＮＫＴＤＩＷＶＡＬＬＬＶＥＰＮＶＴＮＱＳＲＱＹＴＬＦＧＥＴＫＱＩＴＶＥＮＮＴＮＫＷＫＦＦＥＭＦＲＳＮＶＮＡＥＦＱＨＫＲＴＬＴＳＤＴＫＬＡＧＦＭＫＦＹＮＳＶＷＴＦＨＧＥＴＰＨＡＴＴＤＹＳＳＴＳＮＬＳＥＶＥＴＶＩＨＶＥＦＹＩＩＰＲＳＱＥＳＫＣＳＥＹＩＮＴＧＬＰＰＭＱＮＴＲＮＩＶＰＶＡＬＳＳＲＳＶＴＹＱＲＡＱＶＮＥＤＩＩＩＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＮＮＳＩＶＫＬＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＦＫＡＡＮＹＱＹＳＹＬＲＤＧＥＱＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＮＦＳＹＮＧＧＳＬＰＴＤＦＳＶＳＲＹＥＶＩＫＥＮＳＹＶＹＶＤＹＷＤＤＳＱＡＦＲＮＭＶＹＶＲＳＬＡＡＮＬＮＳＶＫＣＳＧＧＮＹＮＦＱＩＰＶＧＡＷＰＶＭＳＧＧＡＶＳＬＨＦＡＧＶＴＬＳＴＱＦＴＤＦＶＳＬＮＳＬＲＦＲＦＳＬＴＶＥＥＰＰＦＳＩＬＲＴＲＶＳＧＬＹＧＬＰＡＦＮＰＮＮＧＨＥＹＹＥＩＡＧＲＦＳＬＩＳＬＶＰＳＮＤＤＹＱＴＰＩＭＮＳＶＴＶＲＱＤＬＥＲＱＬＧＤＬＲＥＥＦＮＳＬＳＱＥＩＡＭＴＱＬＩＤＬＡＬＬＰＬＤＭＦＳＭＦＳＧＩＫＳＴＩＤＶＡＫＳＭＶＴＫＶＭＫＫＦＫＫＳＧＬＡＴＳＩＳＥＬＴＧＳＬＳＮＡＡＳＳＶＳＲＳＳＳＩＲＳＮＩＳＳＩＳＶＷＴＤＶＳＥＱＩＡＧＳＳＤＳＶＲＮＩＳＴＱＴＳＡＩＳＫＲＬＲＬＲＥＩＴＴＱＴＥＧＭＮＦＤＤＩＳＡＡＶＬＫＴＫＩＤＲＳＴＨＩＳＰＤＴＬＰＤＩＩＴＥＳＳＥＫＦＩＰＫＲＡＹＲＶＬＫＤＤＥＶＭＥＡＤＶＤＧＫＦＦＡＹＫＶＧＴＦＥＥＶＰＦＤＶＤＫＦＶＤＬＶＴＤＳＰＶＩＳＡＩＩＤＦＫＴＬＫＮＬＮＤＮＹＧＩＴＲＳＱＡＬＤＬＩＲＳＤＰＲＶＬＲＤＦＩＮＱＮＮＰＩＩＫＮＲＩＥＱＬＩＬＱＣＲＬ
【０１６１】
配列９１（配列番号：９１）：
ＭＡＳＬＩＹＲＱＬＬＴＮＳＹＳＶＤＬＨＤＥＩＥＱＩＧＳＥＫＴＱＮＶＴＩＮＰＳＰＦＡＱＴＲＹＡＰＶＮＷＧＨＧＥＩＮＤＳＴＴＶＥＰＭＬＤＧＰＹＱＰＴＴＦＴＰＰＮＤＹＷＩＬＩＮＳＮＴＮＧＶＶＹＥＳＴＮＮＳＤＦＷＴＡＶＶＡＩＥＰＨＶＮＰＶＤＲＱＹＴＩＦＧＥＳＫＱＦＮＶＳＮＤＳＮＫＷＫＦＬＥＭＦＲＳＳＳＱＮＥＦＹＮＲＲＴＬＴＳＤＴＲＦＶＧＩＬＫＹＧＧＲＶＷＴＦＨＧＥＴＰＲＡＴＴＤＳＳＳＴＡＮＬＮＮＩＳＩＴＩＨＳＥＦＹＩＩＰＲＳＱＥＳＫＣＮＥＹＩＮＮＧＬＰＰＩＱＮＴＲＮＶＶＰＬＰＬＳＳＲＳＩＱＹＫＲＡＱＶＮＥＤＩＩＶＳＫＴＳＬＷＫＥＭＱＹＮＲＤＩＩＩＲＦＫＦＧＮＳＩＶＫＭＧＧＬＧＹＫＷＳＥＩＳＹＫＡＡＮＹＱＹＮＹＬＲＤＧＥＱＶＴＡＨＴＴＣＳＶＮＧＶＮＮＦＳＹＮＧＧＦＬＰＴＤＦＧＩＳＲＹＥＶＩＫＥＮＳＹＶＹＶＤＹＷＤＤＳＫＡＦＲＮＭＶＹＶＲＳＬＡＡＮＬＮＳＶＫＣＴＧＧＳＹＮＦＳＩＰＶＧＡＷＰＶＭＮＧＧＡＶＳＬＨＦＡＧＶＴＬＳＴＱＦＴＤＦＶＳＬＮＳＬＲＦＲＦＳＬＴＶＤＥＰＰＦＳＩＬＲＴＲＴＶＮＬＹＧＬＰＡＡＮＰＮＮＧＮＥＹＹＥＩＳＧＲＦＳＬＩＹＬＶＰＴＮＤＤＹＱＴＰＩＭＮＳＶＴＶＲＱＤＬＥＲＱＬＴＤＬＲＥＥＦＮＳＬＳＱＥＩＡＭＡＱＬＩＤＬＡＬＬＰＬＤＭＦＳＭＦＳＧＩＫＳＴＩＤＬＴＫＳＭＡＴＳＶＭＫＫＦＲＫＳＫＬＡＴＳＩＳＥＭＴＮＳＬＳＤＡＡＳＳＡＳＲＮＶＳＩＲＳＮＬＳＡＩＳＮＷＴＮＶＳＮＤＶＳＮＶＴＮＳＬＮＤＩＳＴＱＴＳＴＩＳＫＫＦＲＬＫＥＭＩＴＱＴＥＧＭＳＦＤＤＩＳＡＡＶＬＫＴＫＩＤＭＳＴＱＩＧＫＮＴＬＰＤＩＶＴＥＡＳＥＫＦＩＰＫＲＳＹＲＩＬＫＤＤＥＶＭＥＩＮＴＥＧＫＦＦＡＹＫＩＮＴＦＤＥＶＰＦＤＶＮＫＦＡＥＬＶＴＤＳＰＶＩＳＡＩＩＤＦＫＴＬＫＮＬＮＤＮＹＧＩＴＲＴＥＡＬＮＬＩＫＳＮＰＮＭＬＲＮＦＩＮＱＮＮＰＩＩＲＮＲＩＥＱＬＩＬＱＣＫＬ
【発明を実施するための形態】
【０１６２】
本発明の実施形態は以下の実施例への参照によって例証される。当業者は、以下の実施例が本発明の保護範囲を限定すると見なすのではなく、本発明を例証する目的のためのみのものであることを理解するだろう。
【０１６３】
特別の指示のない限り、本発明において使用される分子生物学的実験方法および免疫学的分析は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５年中で記載されるような方法に従って、または製品の指示に従って、実質的に実行される。製造者が表示されない試薬または装置は商業的に入手可能な従来の製品である。当業者は、本発明の例証のために実施例が使用されるが、本発明の保護範囲を限定するように意図されないことを理解する。本発明の趣旨および本質から逸脱することなしに、本発明の方法、ステップまたは条件へ行われた修飾または置き換えはすべて、本発明の範囲の中に収まる。
【０１６４】
実施例において使用される生物学的材料および試薬の供給源は以下の通りである。
【０１６５】
ロタウイルスＬＬＲ株はＢｅｉｊｉｎｇ  Ｗａｎｔａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ＣＯ．，ＬＴＤによる寄贈として与えられ；ロタウイルスＳＡ１１株はＣｈｉｎｅｓｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから購入され；ロタウイルスＷａおよびＤＳ−１株はＡＴＣＣから購入され；ロタウイルスＥＤＩＭ株はＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙによって寄贈として与えられ；原核生物発現ベクターＰＴＯ−Ｔ７は本研究室によって構築され；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６およびＢＬ２１（ＤＥ３）はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入され；使用されるプライマーはＳａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成された。
【実施例１】
【０１６６】
短縮型ＶＰ８タンパク質（ＶＰ８−５）の免疫原性および免疫的な保護についての研究
中国特許出願ＣＮ２０１５１０１６５７４６．２中で記載されるような方法に従って、短縮型ロタウイルスＶＰ８タンパク質（ＶＰ８−５（そのアミノ酸配列は配列番号：１中で示される））を発現させ精製した。簡潔には、ロタウイルスのゲノムのＲＮＡをロタウイルスＬＬＲ株の培養から抽出し、ＶＰ４タンパク質をコードするｃＤＮＡを逆転写によって得た。次いで、得られたｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＶＰ８−５をコードする遺伝子断片をＰＣＲ増幅によって得た。次いで得られた遺伝子断片を使用してＶＰ８−５についての発現ベクターを構築し、発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉの中へ形質転換した。ＶＰ８−５発現ベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉをＯＤ６００が約０．６になるまで３７℃で培養し、次いで温度を２５℃へ下げた。ＩＰＴＧを０．８ｍＭの最終濃度で添加し、Ｅ．ｃｏｌｉを６時間更に培養した。培養後に、細菌を遠心分離によって収集し、超音波で破壊し、可溶性画分を収集した。次いで、ＶＰ８−５タンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーによって可溶性画分から収集し、そこで、使用する機器システムは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙによって生産されたＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍであり；使用するクロマトグラフィーメディアはＱ−セファロース−ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）であり；使用するバッファーは、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および５０ｍのＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌであった。溶出プログラムは以下の通りであった。純粋でないタンパク質は１０００ｍＭのＮａＣｌにより溶出し、対象となるタンパク質は５０ｍＭのＮａＣｌにより溶出し、５０ｍＭのＮａＣｌにより溶出された産物を収集した。得られた溶出産物を１３．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、結果を図１中で示した。図１中の結果は、精製されたＶＰ８−５タンパク質が得られ、９０％を超える純度を有していたことを示した。
【０１６７】
フロイントのアジュバントの存在下において、精製されたＶＰ８−５タンパク質が良好な免疫原性および免疫的な保護を有していたことは、中国特許出願ＣＮ２０１５１０１６５７４６．２中でマウスモデルを使用することによって実証されている（本出願の実施例５〜８および図４〜９を参照）。アルミニウムアジュバントの存在下におけるＶＰ８−５タンパク質の免疫的な保護効果を更に調査するために、マウスモデルを使用して、精製されたＶＰ８−５タンパク質＋アルミニウムアジュバントの免疫原性および免疫的な保護を評価した。
【０１６８】
実施形態は以下の通りであった。５〜６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを、３群（１群あたり７匹のマウス）へと無作為に割り当て、そこで、２つの群を対照群として使用し、１つの群を実験群として使用した。精製されたＶＰ８−５タンパク質、等しい用量の不活性化ウイルスのＬＬＲ株、およびＰＢＳを、１：１（ｖ／ｖ）の比でリン酸アルミニウムアジュバントと個別に混合し、次いで１０μｇ／マウスの免疫付与用量で筋肉注入によってマウスを免疫付与し、そこで、実験群におけるマウスをＶＰ８−５により免疫付与し、陽性対照群におけるマウスを不活性化ウイルスＬＬＲにより免疫付与し、陰性対照群におけるマウスをＰＢＳにより免疫付与した。各々の群におけるマウスを、各々の免疫付与について２週間の間隔で３回で免疫付与した。免疫付与手順の０、１４、２８および４２日目で、血液をマウスの眼球からそれぞれ収集し、抗体価および中和抗体価について決定した。
【０１６９】
抗体価の決定
免疫血清に連続希釈を行い、希釈された免疫血清およびプレート上にコーティングされたＶＰ８−５に間接ＥＬＩＳＡ分析を行って（そこで、使用した二次抗体はヤギ抗マウス抗体（Ｗａｎｙｕｍｅｉｌａｎ）であった）、ＶＰ８−５との反応性を有する免疫血清の最大の希釈を決定した。免疫血清の最大の希釈が大きいほど、免疫血清中の抗ＶＰ８−５抗体の力価は高く、免疫血清の産生のためのタンパク質の免疫原性は高かった。
【０１７０】
間接ＥＬＩＳＡ結果が図１Ｂ中で示され、そこで、縦座標は、ＶＰ８−５との反応性を有する免疫血清の最大の希釈（すなわち抗体価）を表わす。結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で、ＶＰ８−５がマウスにおいて抗体の生成を誘導できたが、その効率が不活性化ウイルスＬＬＲの効率よりも低かったことを示した。これらの結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、ＶＰ８−５タンパク質が免疫原性を有し、マウスにおいて抗体の生成を誘導することができたが、動物において抗体の生成を誘導するその能力が不活性化ウイルスＬＬＲよりも低かったことを示した。
【０１７１】
中和抗体価の決定
ＭＡ１０４細胞を９６ウェルの細胞培養プレート（１．９×１０４細胞／ウェル）の上へ播種した。２０時間後に、免疫血清の中和抗体価をＥＬＩＳＰＯＴによって決定した（Ｌｉ，Ｌｉｎ，Ｙｕ，  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０９  ７−１４，２０１４）。特定の方法は以下の通りであった。試験される免疫血清サンプル（試験される中和抗体を含有する）に、トリプシンを含有するＤＭＥＭの使用による２倍の希釈を連続的に行い；次いで１００μＬの各々の希釈されたサンプルをＤＭＥＭ中で希釈されたロタウイルス溶液（ＴＣＩＤ５０＝１．５×１０５）と混合し；３７℃で１時間のインキュベーション後に、混合物を、ＭＡ１０４細胞を前もって播種した９６ウェルの細胞培養プレートへ添加し、３７℃で１４時間培養し；次いで以下の通りに免疫血清サンプルのウイルス感染阻害率を計算した。
【０１７２】
感染阻害率＝（血清なしのウェル中のウイルススポットの数−血清のあるウェル中のウイルススポットの数）／血清なしのウェル中のウイルススポットの数×１００％。
【０１７３】
免疫血清中の中和抗体価は、５０％の感染阻害率を達成する免疫血清の最大の希釈として定義される。５０倍希釈された免疫血清サンプルが５０％を超える感染阻害率をまだ達成することができるならば、サンプルは中和能力を有すると見なされる。
【０１７４】
免疫血清の中和抗体価の分析の結果が図１Ｃ中で示され、そこで、縦座標は、５０％の感染阻害率を達成する免疫血清の最も高い希釈（ＮＴ５０、中和抗体価）を表わす。結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で（３回の免疫付与後に）、ＶＰ８−５がマウスにおいて中和抗体の生成を誘導できたが、免疫血清の中和抗体価（ＮＴ５０）が不活性化ウイルスＬＬＲよりも低かったことを示した。免疫付与手順が完了した後に、ＶＰ８−５タンパク質により誘導された免疫血清の中和抗体価（ＮＴ５０）は、高々約６４に達した。これらの結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、ＶＰ８−５が生物体において中和抗体の生成を誘導できたが、それにより誘導された免疫血清の中和抗体価（ＮＴ５０）が不活性化ウイルスＬＬＲよりも低かったことを示した。
【０１７５】
動物における保護的効果についての分析
免疫付与手順が完了した後（免疫付与後４２日目）に、各々の群におけるマウスを、２匹のメスマウス対１匹のオスマウスの比で交配する。交配の約２０日後に、メスマウスは哺乳中のマウスを出産し、哺乳中のマウスを７日間飼育した。５×１０６ＴＣＩＤ５０／マウスの用量のＬＬＲウイルス株を７日目の哺乳中のマウスの胃内に攻撃投与した。攻撃投与後に、哺乳中のマウスの下痢病態を毎日７日間観察および記録し、排泄物の形および状態に応じてスコアリングした。スコアリング尺度は図２中で示される通りであった。哺乳中のマウスにおける下痢の程度に応じて、スコアは、３つのグレードへと分割される。正常な便は１ポイントとしてスコアリングされ（図２Ｃ）、軟便は２ポイントとしてスコアリングされ（図２Ｂ）、形が崩れた水様便は３ポイントとしてスコアリングされる（図２Ａ）。
【０１７６】
図３は、ウイルスによる攻撃投与後の異なる免疫付与群における哺乳中のマウスの下痢スコアを示し、そこで、縦座標軸は下痢スコアを表わし；横座標軸はマウスにおけるウイルスによる攻撃投与後の日数を表わす。結果は、実験群（ＶＰ８−５）における哺乳中のマウスの下痢スコアが陰性対照群（ＮＣ）のものとは有意に異なっていなかったことを示した。このことは、アルミニウムアジュバントの存在下において、ＶＰ８−５はロタウイルス感染から生物体を保護する能力が低く（不活性化ウイルスよりも低い）、ロタウイルス感染によって引き起こされる下痢を十分に緩和できなかったことを示した。
【実施例２】
【０１７７】
短縮型ＶＰ４タンパク質をコードする発現ベクターの構築
ロタウイルスのＬＬＲ株およびＳＡ１１株を胎児アカゲザル腎臓株化細胞（ＭＡ−１０４）により培養した。使用される培養培地は、２μｇ／ｍｌのトリプシン、０．５ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．４ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、３．７ｍｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウムならびに０．３４ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミンにより補足したＤＭＥＭであった。
【０１７８】
製造者の指示に従って、Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＧｅｎＭａｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって生産されたウイルスＤＮＡ／ＲＮＡキットを使用してロタウイルスのゲノムのＲＮＡを抽出し、ＬＬＲ株のＶＰ４タンパク質をコードするｃＤＮＡを逆転写によって得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として使用し、ロタウイルスＬＬＲ株の短縮型ＶＰ４タンパク質をコードする遺伝子断片をＰＣＲ増幅によって得た。
【０１７９】
使用されるＰＣＲプライマーは以下の通りである。
上流プライマー：
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣ−３’（配列番号：４２）
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＡＣＡＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号：４３）
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＡ−３’（配列番号：４４）
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＧ−３’（配列番号：４５）
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＧＡＣＣＡ−３’（配列番号：４６）
下流プライマー：
2018520651.tif 000004
2018520651.tif 000005
そこで、下線が引かれた配列は酵素制限部位を指摘し、イタリック体は導入された終止コドンを指摘する。
【０１８０】
上述のプライマーの使用によって、短縮型ＶＰ４タンパク質をコードする遺伝子をＰＣＲによって増幅し、使用したＰＣＲシステムは以下の通りである。
【表２】
2018520651.tif 000006
【０１８１】
短縮型ＶＰ４タンパク質をコードする遺伝子の増幅のためのプライマーペアを表２中で示す。
【表３】
2018520651.tif 000007
【０１８２】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった。９５℃で５分間の前変性、３５サイクルの（９５℃、４０秒；５５℃、８０秒；７２℃、１分間）、および７２℃で１０分間の最終伸長。得られた増幅産物は１．５％のアガロースゲル電気泳動を行った。
【０１８３】
ＰＣＲ増幅産物をｐＭＤ１８−Ｔベクターの中へライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの中へ形質転換した。次いで陽性の細菌コロニーをスクリーニングし、プラスミドを抽出し、Ｎｄｅ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ酵素による切断によって同定し、対象となる遺伝子断片が挿入された陽性のクローン性プラスミドを得た。得られた陽性のクローンのプラスミドをシークエンスした。シークエンシング結果は、陽性のクローンのプラスミドの中へ挿入された対象となる断片のヌクレオチド配列が予想された配列と同一であったことを示し、それによってコードされたアミノ酸配列を配列番号：２〜３４中で示した。
【０１８４】
陽性のクローンのプラスミドをＮｄｅ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ酵素によってそれぞれ切断して、短縮型ＶＰ４タンパク質をコードする遺伝子断片を得て、それらを、Ｎｄｅ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ酵素により切断した非融合物発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７へライゲーションし（Ｌｕｏ  Ｗｅｎｘｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，１６：５３−５７）、ベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの中へ形質転換した。陽性の細菌コロニーをスクリーニングし、プラスミドを抽出し、対象となる遺伝子断片が挿入された陽性の発現ベクターをＮｄｅ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ酵素による切断によって同定した。
【０１８５】
１μＬの陽性の発現ベクターを使用して、４０μＬのコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  Ｂｌ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入された）を形質転換した。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、カナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度、以下同じ）を含有する、固体ＬＢ培養培地（ＬＢ培養培地の構成要素：１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの酵母粉末、および１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、以下同じ）の上へコーティングし、単一のコロニーが明らかに識別可能になるまで、３７℃で１０〜１２時間の静置培養を行った。単一のコロニーを取り、４ｍＬの液体ＬＢ培養培地（カナマイシンを含有する）中に置き、次いで２００ｒ／分で３７℃で１０時間振盪下で培養した。培養後に、１ｍＬの細菌溶液へ、グリセロールを１０％の最終濃度で添加し、もたらされた混合物を−７０℃で保存した。
【実施例３】
【０１８６】
短縮型ＶＰ４タンパク質の発現
実施例２において調製された陽性の発現ベクターを保有するＥ．ｃｏｌｉ溶液を、−７０℃の冷却装置から取り出し、カナマイシンを含有する５０ｍｌの液体ＬＢ培養培地の中へ播き、１８０ｒｐｍで３７℃で約４時間培養し；次いで５００ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ培養培地の１０本のボトルへ移した（各々のボトルについて５００ｕｌの細菌溶液）。培養物の吸光度が６００ｎｍの波長で０．５に達したときに、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加し、１８０ｒｐｍで２５℃で６時間更に培養した。
【０１８７】
１ｍｌの前記細菌性溶液を遠心分離し、細菌沈殿物を収集した。細菌沈殿物へ１００μＬの脱イオン水を添加し、細菌を再懸濁した。次いで２０μＬの６×ローディングバッファーを添加し、もたらされた混合物を均一に混合し、１０分間沸騰水浴中でインキュベーションして、細胞を溶解した。１０μＬのサンプルで１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４Ａ〜４Ｄ中で示した。結果は、比較的低い発現レベルの２６−３１１、２６−３３１および２６−３８１を除いて、高レベルで他の短縮型タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現できたことを示した。
【実施例４】
【０１８８】
短縮型ＶＰ４タンパク質の精製および特徴評価
実施例３において得られたＥ．ｃｏｌｉ溶液を遠心分離し、細菌沈殿物を収集した。１５ｍｌ／ｇの湿潤細菌の比で５０ｍＭのＴＢ８．０を使用して、短縮型ＶＰ４タンパク質を発現する細菌を再懸濁した。次いでＥ．ｃｏｌｉ細胞を超音波で破壊し、超音波破壊の条件は以下の通りであった。１グラムの細菌の破壊について、超音波処理を２秒間および休止を４秒間で、４分間の超音波処理期間であった。超音波破壊後に、混合物を２５０００ｇで遠心分離し、上清を収集した（すなわち組換えにより発現された短縮型ＶＰ４タンパク質を含有するＥ．ｃｏｌｉ溶解物の可溶性画分）。
【０１８９】
Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の可溶性画分中の短縮型ＶＰ４タンパク質は、２ステップのクロマトグラフィーによって精製することができた。２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１および２６−４６１については、２ステップのクロマトグラフィーの前に、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の可溶性画分を４０％の硫酸アンモニウムにより処理し、次いで遠心分離して、タンパク質沈殿物を収集し；次いで得られたタンパク質沈殿物を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で溶解し、２ステップのクロマトグラフィーへ適用した。２ステップのクロマトグラフィーの方法は以下の通りであった。
【０１９０】
最初に、一次精製をＱ−ＨＰ陰イオン交換クロマトグラフィーによって実行して、約６０％の純度を備えた短縮型ＶＰ４タンパク質を得て、そこで、精製条件は以下の通りであった。
機器システム：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（もとＡｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃｏｍｐａｎｙ）によって生産されたＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００分取液体クロマトグラフィーシステム。
クロマトグラフィー媒質：Ｑ−セファロース−ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。
カラム体積：５．５ｃｍ×２０ｃｍ。
バッファー：Ａポンプ：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；
Ｂポンプ：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ
流速：６ｍＬ／分。
検出器の波長：２８０ｎｍ。
【０１９１】
上で調製されるように、サンプルは組換えにより発現された短縮型ＶＰ４タンパク質を含有する上清であった（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の可溶性画分または５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で溶解されたタンパク質サンプル）。
【０１９２】
溶出プログラムは以下の通りであった。対象となるタンパク質は５０ｍＭのＮａＣｌにより溶出し、純粋でないタンパク質は１ＭのＮａＣｌにより溶出した。５０ｍＭのＮａＣｌにより溶出された画分を収集し、組換えにより発現された短縮型タンパク質を含有する３０ｍＬの一次精製されたサンプルを得た（注：一次精製の間に、短縮型タンパク質１−４７６、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１および２６−４６１は、クロマトカラムに結合せず、フロースルー画分中に含有されていた。したがって、短縮型タンパク質を含有するフロースルー画分を収集し、一次精製されたサンプルとして使用した）。
【０１９３】
陰イオン交換クロマトグラフィーによって一次精製されたサンプルを、２ＭのＮａＣｌを含有するＴＢ８．０バッファーに対して透析し、次いでフェニルセファロース−ＨＰ疎水性アフィニティークロマトグラフィーによって二次精製を行った。
クロマトグラフィー媒質：フェニルセファロース−ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。
カラム体積：５．５ｃｍ×２０ｃｍ。
バッファー：Ａポンプ：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ；
Ｂポンプ：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
流速：６ｍＬ／分。
検出器の波長：２８０ｎｍ。
【０１９４】
サンプルは、Ｑ−ＨＰクロマトカラムによって精製され、２ＭのＮａＣｌ溶液に対して透析された産物であった。
【０１９５】
溶出プログラムは以下の通りであった。純粋でないタンパク質は１．５ＭのＮａＣｌにより溶出し、対象となるタンパク質は１ＭのＮａＣｌにより溶出し、純粋でないタンパク質は５０ｍＭのＮａＣｌにより溶出した。１ＭのＮａＣｌにより溶出された画分を収集し、３０ｍＬの精製された組換えにより発現された短縮型ＶＰ４タンパク質を得た（注：二次精製の間に、短縮型タンパク質１−４７６、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１および２６−４７１は、５０ｍＭのＴＢ８．０により溶出し、５０ｍＭのＴＢ８．０により溶出した画分を収集した）。
【０１９６】
上述の方法によって精製されたサンプル（１５０μＬ）へ、３０μＬの６×ローディングバッファーを添加し、混合物を均一に混合し、１０分間１００℃の水浴中でインキュベーションし；次いで混合物（１０μｌ）で１３．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中の電気泳動を１２０Ｖの電圧で１２０分間行い；次いで電気泳動ストリップをクマシーブリリアントブルー染色によって示した。電気泳動の結果を図５中で示した。
【０１９７】
図５Ａ〜５Ｂは精製された短縮型ＶＰ４タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図５Ａ中で、左側から右側のレーンは、タンパク質分子量マーカー（マーカー）、１−４７６、６−４７６、２２−４７６、２６−４７６、６５−４７６、２６−２３１、２６−２７１、２６−３３１および２６−３５１である。図５Ｂ中で、左側から右側のレーンは、タンパク質分子量マーカー（マーカー）、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２および２６−４９７である。図５Ａおよび５Ｂ中の結果は、精製ステップ後に、短縮型タンパク質１−４７６、６−４７６、２２−４７６、２６−４７６、６５−４７６、２６−２３１、２６−２７１、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２および２６−４９７はすべて、０．２ｍｇ／ｍｌを超える濃度および８０％を超える純度を有していたことを示した。
【０１９８】
加えて、ＨＰＬＣも異なるバッファー作用条件下で精製されたサンプルの均一性を分析するために使用した。使用した装置はＡｇｉｌｅｎｔ  １２００高速液体クロマトグラフィー装置であり、そこで、クロマトカラムはＧ３０００ＰＷＸＬまたはＧ５０００ＰＷＸＬであり、カラム体積は７．８×３００ｍｍであり、流速は０．５ｍｌ／分間であり、検出波長は２８０ｎｍであり；２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１および２６−４６１の均一性はＧ５０００ＰＷＸＬの使用によって決定し；他のタンパク質はＧ３０００ＰＷＸＬの使用によって検出した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を図６および図７中で示した。
【０１９９】
結果は、ＴＢ８．０の存在下において、短縮型タンパク質１−４７６、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１および２６−４６１が、約１１分間の保持時間および６００ｋＤａを超える分子量を有していたことを示し；このことは、これらの短縮型タンパク質が主に重合体の形状で存在したことを指摘する。短縮型タンパク質２６−２７１は、約１６分間の保持時間を有し；このことは、このタンパク質が主に単量体の形状で存在したことを指摘する。他のタンパク質（６−４７６、２２−４７６、２６−４７６、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７）は、約１３〜４分間の保持時間を有し、それはＩｇＧ（１５０ｋＤａ）の保持時間に同等であり；このことは、これらのタンパク質が主に三量体の形状で存在したことを指摘した。
【０２００】
加えて、ＴＢ８．０＋１ＭのＮａＣｌの存在下において、短縮型ＶＰ４タンパク質２６−４７６、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２および２６−４９７は、約１５分間の保持時間を有し、それはＶＰ８二量体（４０ｋＤａ）のものに同等であり；このことは、これらの短縮型タンパク質がＴＢ８．０＋１ＭのＮａＣｌの存在下において主に単量体の形状で存在したことを指摘した。このことは、塩の存在下において、２６−４７６、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２および２６−４９７の立体配置が塩イオンによって影響を受け、三量体の脱重合および単量体の形成をもたらすことを更に指摘した。
【０２０１】
加えて、図６および７中の結果は、得られた短縮型ＶＰ４タンパク質の主吸収ピークが、およそ８０％を超えるかまたは場合によっては９０％を超えて占めることも示した。このことは、これらの短縮型タンパク質が良好な均一性を有し、バッチでの工業的産生のために好適であり、正確な医薬物のために適していたことを指摘した。
【０２０２】
図６および図７中の実験結果を以下の表３中でも要約する。
【表４】
2018520651.tif 000008
【実施例５】
【０２０３】
短縮型ＶＰ４タンパク質のインビトロのアセンブリーおよび特徴評価
短縮型タンパク質２６−４７６のインビトロのアセンブリーを以下の方法によって行った。室温で、短縮型タンパク質２６−４７６を、ＴＢ８．０バッファーから表４中で規定された透析バッファーに対して透析し、透析バッファーを６時間ごとに１回変えた。透析後に、溶液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を収集した。その後に、上清を、表４中で規定された温度で３０分間〜２４時間の期間の間放置した。放置した後に、上清を氷浴中で迅速に置き、１２０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離した。上清（インビトロでアセンブルした２６−４７６を含有する）を、詳しい分析のために、第２の遠心分離後に収集した。
【０２０４】
ＨＰＬＣを用いて、得られた上清中の短縮型タンパク質２６−４７６のインビトロのアセンブリーによって形成された重合体の均一性を分析した。ＨＰＬＣ分析において使用される装置は、Ａｇｉｌｅｎｔによって生産された１２００高速液体クロマトグラフィー装置またはＷａｔｅｒｓによって生産されたＥ２６９５高速液体クロマトグラフィー装置であり、そこで、クロマトカラムはＧ５０００ＰＷＸＬであり、カラム体積は７．８×３００ｍｍであり、流速は０．５ｍｌ／分間であり、検出波長は２８０ｎｍであった。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析の結果を表４および図８Ａ中で示した。
【表５】
2018520651.tif 000009
【０２０５】
図８Ａは、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に３７℃で１２時間放置した後の短縮型タンパク質２６−４７６による分子篩分析の結果を示した。結果は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に３７℃で１２時間放置した後に、短縮型タンパク質２６−４７６が均一な重合体を（１２．４分の保持時間を備えた）を形成することができ、重合体が最大９７．２％を占めたことを示した。
【０２０６】
７．４〜９．６の範囲のｐＨで３７℃〜５０℃の温度で放置した後に、短縮型タンパク質２６−４７６をアセンブルして均一の重合体を形成することができ、重合体のパーセンテージは９０％よりも多いだろうということを、表４および図８Ａ中の結果から理解することができる。加えて、表４中の結果は、塩イオン（例えばＮａＣｌ）の存在が短縮型タンパク質２６−４７６が重合体を形成することを阻害し得ることも示した。塩イオン（例えばＮａＣｌ）の濃度が高いほど、形成された重合体のパーセンテージは少なかった。
【０２０７】
加えて、電子顕微鏡も使用して、短縮型タンパク質２６−４７６のインビトロのアセンブリーによって重合体が形成されたことを観察し、使用した装置はＦＥＩ  Ｃｏｍｐａｎｙによって生産されたＧ２  Ｓｐｉｒｉｔ電子顕微鏡であった。簡潔には、サンプルを銅グリッドの上へ固定し、２％のリンタングステン酸（ｐＨ７．４）により３０分間ネガティブ染色し、次いで電子顕微鏡によって観察した。結果は図８Ｂ中に示され、そこで半径約１０ｎｍの多数の非対称性粒子が観察された。結果は、短縮型タンパク質２６−４７６が均一の重合体へとインビトロでアセンブルされ得たことを示した。
【実施例６】
【０２０８】
酵素的切断による短縮型ＶＰ４タンパク質の同定
実施例４において得られた精製された短縮型ＶＰ４タンパク質を、トリプシンによって３７℃で１時間切断した。酵素切断された構成要素（１００ｕｌ）へ、２０μＬの６×ローディングバッファーを添加し、もたらされた混合物を均一に混合し、１０分間１００℃の水浴中でインキュベーションした。次いで混合物（１０μｌ）で１３．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中の電気泳動を１２０Ｖの電圧で１２０分間行い；次いで電気泳動ストリップをクマシーブルー染色によって示した。電気泳動の結果を図９中で示した。
【０２０９】
図９は、酵素によって切断したかまたはしなかった、短縮型タンパク質２６−４７６、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、および２６−４９７のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。レーン上で、番号「１」は、サンプルがトリプシンにより処理されないことを表わし；番号「２」は、サンプルが０．１ｍｇ／ｍｌのトリプシンにより処理されたことを表わす。最右端のレーン中で使用されるサンプルは、対照としてのＶＰ８−５であった。図９中の結果は、すべてのこれらの短縮型タンパク質がトリプシンによって認識および切断できたこと、すなわちそれらの酵素認識部位が曝露されたことを示した。
【実施例７】
【０２１０】
短縮型ＶＰ４タンパク質の抗原性の分析
実施例４において得られた精製された短縮型ＶＰ４タンパク質をプレートの上へコーティングして、コーティングプレートを得た。中和抗体Ａ３、Ｂ１、Ｂ５、Ｂ６、Ｄ６、Ｅ２、Ｅ５および８Ｆ６（１ｍｇ／ｍｌの濃度で、研究室においてハイブリドーマ技術によって調製された）に、勾配希釈を行い、次いで実施例１において記載されるように間接ＥＬＩＳＡ方法によって検出した。
【０２１１】
検出結果は図１０中で示され、そこで、横座標は短縮型タンパク質を表わし、縦座標は、短縮型タンパク質と反応することができる最小の抗体濃度を表わす（０．２より大きいＯＤ４５０／６２０）。結果は、短縮型ＶＰ４タンパク質が良好な抗原性（すなわち抗体反応性）を有していたことを示した。
【実施例８】
【０２１２】
短縮型ＶＰ４タンパク質の免疫原性の分析
実施例４において得られた精製された短縮型タンパク質２６−４７６をプレートの上にコーティングして、コーティングプレートを得た。実施例１において記載されるような方法に従って、アルミニウムアジュバントの存在下において、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、試験されるサンプル（短縮型ＶＰ４タンパク質、実施例４において得られた２６−４７６の三量体、実施例５において得られた２６−４７６の重合体、不活性化ウイルス（ＲＶ、陽性対照として）およびＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照））により、それぞれ免疫付与し、マウスの血清を収集した。その後に、実施例１において記載されるような方法に従って、２６−４７６コーティングプレートを使用して、マウス血清中の抗体価を間接ＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２１３】
間接ＥＬＩＳＡの結果は図１１Ａ〜１１Ｄ中に示され、そこで、横座標は、免疫血清の調製のためのタンパク質サンプルを表わし；縦座標は、２６−４７６との反応性を有する免疫血清の最も高い希釈（すなわち抗体価）を表わし；図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄは、異なる免疫付与バッチの結果を示した。結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で、マウスにおけるこれらのタンパク質が抗体の生成を誘導できた（免疫血清の抗体価（幾何平均抗体価）は１０２〜１０５以上に達することができた）こと；および、２６−２７１を除いて、他のタンパク質サンプルによって誘導された抗体価が、ＲＶによって誘導された抗体価よりも高かったか（１−４７６、６−４７６、２２−４７６、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４７６、２６−４８７、２６−４９２、２６−４７６の三量体、および２６−４７６の重合体）、またはＲＶによって誘導された抗体価に少なくとも同等であった（６５−４７６、２６−４８２、および２６−４９７）ことを示した。
【０２１４】
アルミニウムアジュバントの存在下において、すべてのタンパク質サンプル（２６−２７１を除いて）が良好な免疫原性を有し、マウスにおいて高力価抗体の生成を刺激することができ；それらの免疫原性はＶＰ８−５のものよりも有意に高く、免疫血清における抗体価はＶＰ８−５により免疫付与されたマウスの血清のものよりも有意に高かったことは、実施例１における実験結果を組み合わせることによって理解することができる。加えて、図１１Ｄ中の実験結果は、短縮型タンパク質２６−４７６の重合体の免疫原性が２６−４７６の三量体よりも有意に高かったことも示す（ｐ＝０．００５）。
【実施例９】
【０２１５】
短縮型ＶＰ４タンパク質の免疫中和活性の分析
実施例１において記載されるような方法によって、実験群中のＢａｌｂ／ｃマウス（１群あたり７匹のマウス）を、試験されるサンプル（短縮型ＶＰ４タンパク質、実施例４において得られた２６−４７６の三量体、実施例５において得られた２６−４７６の重合体、不活性化ウイルス（ＲＶ、陽性対照として）およびＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照））により、それぞれ免疫付与し、免疫血清を収集した。
【０２１６】
その後に、実施例１において記載されるような検出方法に従って、収集された免疫血清サンプルを中和抗体価のために評価した。免疫血清の中和抗体価の分析の結果が図１２Ａ〜１２Ｄ中で示され、そこで、横座標は、免疫血清の調製のためのタンパク質サンプルが由来するウイルス株を表わし；縦座標は、５０％の感染阻害率を達成する免疫血清の最も高い希釈（ＮＴ５０、中和抗体価）を表わす。図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃおよび１２Ｄは、異なる免疫付与バッチの結果を示した。結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で（３つの免疫付与後に）、すべてのこれらのタンパク質サンプルがマウスにおいて中和抗体の生成を誘導でき、それらの中和抗体価（ＮＴ５０）は２８〜２１４以上に達することができ；２６−２７１を除いて、他のタンパク質サンプルによって誘導された中和抗体価が、ＲＶによって誘導された中和抗体価に同等であったか（６−４７６、２２−４７６、２６−４７６、６５−４７６、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７、および２６−４７６の三量体）、またはＲＶによって誘導された中和抗体価よりもさらに高かった（１−４７６、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、および２６−４７６の重合体）ことを示した。
【０２１７】
アルミニウムアジュバントの存在下において、すべてのタンパク質サンプル（２６−２７１を除いて）が生物体において中和抗体の生成を誘導する強い能力を有し、動物において高い中和抗体価を有する免疫血清を誘導でき、免疫血清はロタウイルス感染を効果的に阻害できたことは、実施例１における実験結果を組み合わせることによって理解することができる。タンパク質サンプル（２６−２７１を除いて）は、生物体において中和抗体の生成を誘導する能力に関してＶＰ８−５より優れており、したがってＲＶ感染と闘う／それを予防するより強い能力を有していた。加えて、図１２Ｄ中の実験結果は、短縮型タンパク質２６−４７６の重合体が生物体において中和抗体の生成を誘導する能力に関して２６−４７６の三量体より有意に優れており（ｐ＜０．００１）、ＲＶ感染と闘う／それを予防する有意により強い能力を有していたことも示した。
【実施例１０】
【０２１８】
動物における短縮型ＶＰ４タンパク質の保護的効果の評価
実施例１において記載されるような方法の使用によって、Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群あたり７匹のマウス）を、試験されるサンプル（短縮型ＶＰ４タンパク質、実施例４において得られた２６−４７６の三量体、実施例５において得られた２６−４７６の重合体、不活性化ウイルス（ＲＶ、陽性対照として）およびＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照））により、それぞれ免疫付与し、血清を収集した。
【０２１９】
実施例１において記載されるような方法に従って、タンパク質サンプルを動物における保護的効果について評価した。１−４７６および６−４７６により免疫付与された群を除いて（２つの群中の動物の交配は成功しなかった）、他の免疫付与群の実験結果を図１３〜１４中で示した。
【０２２０】
図１３Ａ〜１３Ｄは、ウイルスによる攻撃投与後１〜７日目の、異なる免疫付与群（２２−４７６、２６−４７６、６５−４７６、２６−２７１、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７、２６−４７６の三量体、２６−４７６の重合体、不活性化ロタウイルス（ＲＶ、陽性対照）またはＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照）により免疫付与された）における、哺乳中のマウスの下痢スコアを示し、そこで、縦座標軸は平均下痢スコアを表わし；横座標軸はマウスにおけるウイルスによる攻撃投与後の日数を表わす。ＲＶ：不活性化ロタウイルス；ＮＣ：陰性対照（ＰＢＳ）；三量体：２６−４７６の三量体；重合体：２６−４７６の重合体。図１４Ａ〜１４Ｄは、異なる免疫付与群（２２−４７６、２６−４７６、６５−４７６、２６−２７１、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７１、２６−４８２、２６−４８７、２６−４９２、２６−４９７、２６−４７６の三量体、２６−４７６の重合体、不活性化ロタウイルス（ＲＶ、陽性対照）またはＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照）により免疫付与された）中の哺乳中のマウスにおける、ウイルスによる攻撃投与後４８時間の、ウイルスによる攻撃投与後の下痢の平均継続期間および平均下痢スコアを示し、そこで、下痢の平均継続時間（日）は棒グラフによって表わされ；平均下痢スコアは曲線グラフによって表わされ；左側の縦座標軸は下痢の平均継続時間（日）を表わし；右側の縦座標軸は下痢スコアを表わし；横座標軸は、タンパク質サンプルに対応する免疫付与群を表わす。
【０２２１】
結果は、平均下痢スコアおよび下痢の平均継続時間（日）に関して、タンパク質サンプルに対応する免疫付与群がＮＣ群よりも優れていたことを示した。このことは、タンパク質サンプルが有意な保護的効果を有し、マウスがロタウイルス感染、およびロタウイルス感染によって引き起こされる下痢と闘うことを支援できたことを指摘した。加えて、結果は、２６−３３１、２６−３５１、２６−３８１、２６−４１１、２６−４４１、２６−４６１、２６−４７６、２６−４７６の三量体、および２６−４７６の重合体の保護的効果がＲＶのものに同等であったかまたはＲＶよりもさらに良好であったことをさらに示した。実施例１の実験結果によれば、アルミニウムアジュバントの存在下において、これらのタンパク質サンプルの保護的効果は動物においてＶＰ８−５のものよりも優れていた。加えて、図１３Ｄおよび図１４Ｄ中の実験結果は、動物において２６−４７６の短縮型タンパク質重合体の保護的効果が２６−４７６の三量体のものより有意に優れ、より高い有効性を有するワクチンの調製に使用できるだろうことも示した。
【実施例１１】
【０２２２】
異なるウイルス株からの短縮型ＶＰ４タンパク質の発現、精製および免疫的な保護の評価
遺伝子バンクにおいて提供されるＥＤＩＭウイルス株のＶＰ４遺伝子配列（アクセッション番号：ＡＦ０３９２１９．２）に基づいて、ロタウイルスＥＤＩＭ株からの２６−４７６をコードする遺伝子断片はＳａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成された。加えて、遺伝子バンクにおいて提供されるロタウイルスＰ［６］のＶＰ４遺伝子配列（アクセッション番号：ＦＪ１８３３５６．１）に基づいて、ロタウイルスＰ［６］からの２６−４７６をコードする遺伝子断片はＳａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成された。その後に、合成遺伝子断片を鋳型として使用し、ロタウイルスＰ［６］およびＥＤＩＭからの短縮型タンパク質２６−４７６をコードする遺伝子断片をＰＣＲ増幅によって得た。
【０２２３】
加えて、実施例２において記載されるように、ロタウイルスＳＡ１１株を胎児アカゲザル腎臓株化細胞（ＭＡ−１０４）により培養して、ロタウイルスＳＡ１１のウイルス培養を得た。ロタウイルスＰ［４］およびＰ［８］は、２０１３１２８１（Ｐ［４］）の試料番号および２０１３１０２８（Ｐ［８］）の試料番号下で、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって収集された下痢試料に由来した。
【０２２４】
製造者の指示に従って、Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＧｅｎＭａｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって生産されたウイルスＤＮＡ／ＲＮＡキットを使用して、ウイルス培養物またはウイルス試料からロタウイルスＳＡ１１、Ｐ［４］およびＰ［８］のゲノムのＲＮＡを抽出し、異なるウイルス株からのＶＰ４タンパク質をコードするｃＤＮＡを逆転写によって得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として使用し、ロタウイルス株ＳＡ１１、Ｐ［４］およびＰ［８］からの短縮型タンパク質２６−４７６をコードする遺伝子断片を、ＰＣＲ増幅によって得た。
【０２２５】
実施例２において記載されるような方法に従って、クローンのプラスミドおよび発現ベクターを構築し、そこで、使用されるＰＣＲプライマーは以下の通りであった。
上流プライマー：
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＧＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＡ−３’（配列番号：７７）
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴ−３’（配列番号：７９）
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号：８１）
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＣＡ−３’（配列番号：８３）
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＡＣＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号：８５）
下流プライマー：
2018520651.tif 000010
そこで、下線が引かれた配列は酵素認識部位を指摘し、イタリック体は導入された終止コドンを指摘する。
【０２２６】
遺伝子断片の増幅のためのプライマーペアを表５中で示す。
【表６】
2018520651.tif 000011
【０２２７】
短縮型タンパク質２６−４７６−Ｐ［４］、２６−４７６−Ｐ［６］、２６−４７６−Ｐ［８］、２６−４７６−ＥＤＩＭおよび２６−４７６−ＳＡ１１のアミノ酸配列を、配列番号：３５〜３９中でそれぞれ示す。
【０２２８】
実施例３〜４において記載される方法に従って、異なるウイルス株からの短縮型タンパク質２６−４７６（すなわち２６−４７６−Ｐ［４］、２６−４７６−Ｐ［６］、２６−４７６−Ｐ［８］、２６−４７６−ＥＤＩＭ、２６−４７６−ＳＡ１１）をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、２ステップのクロマトグラフィーによって精製し；精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定した。
【０２２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は図１５中で示され、そこで、左側から右側のレーンは、ロタウイルスＬＬＲからの短縮型タンパク質２６−４７６；ロタウイルスＳＡ１１からの短縮型タンパク質２６−４７６−ＳＡ１１；ロタウイルスＥＤＩＭからの短縮型タンパク質２６−４７６−ＥＤＩＭ；ロタウイルスＰ［８］からの短縮型タンパク質２６−４７６−Ｐ［８］；ロタウイルスＰ［６］からの短縮型タンパク質２６−４７６−Ｐ［６］；ロタウイルスＰ［４］からの短縮型タンパク質２６−４７６−Ｐ［４］；およびタンパク質分子量マーカー（マーカー）である。
【０２３０】
結果は、本発明に記載の方法が異なるウイルス株へ適用可能であったことを示した。異なるウイルス株からの短縮型ＶＰ４タンパク質（２６−４７６）をＥ．ｃｏｌｉ中で効果的に発現させることができ、クロマトグラフィーによる精製後に８０％の純度を有していた。
【０２３１】
加えて、実施例４において記載される方法に従って、ＨＰＬＣを使用して、５０ｍＭのＴＢ８．０の存在下において精製された短縮型タンパク質２６−４７６の均一性を分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析の結果を図１６中で示す。
【０２３２】
結果は、ＴＢ８．０の存在下において、異なるウイルス株からの短縮型ＶＰ４タンパク質２６−４７６が約１３〜１４分間の保持時間を有し、それはＩｇＧ（１５０ｋＤａ）の保持時間へ同等であったことを示し；このことは、これらのタンパク質が主に三量体の形状で存在したことを指摘した。加えて、図１６中の結果は、得られた短縮型タンパク質２６−４７６の主吸収ピークが、およそ８０％を超えて占めることも示し、これらの短縮型タンパク質が良好な均一性を有し、バッチでの工業的産生のために好適であり、正確な医薬物のために適していたことを指摘した。
【０２３３】
さらに、異なるロタウイルス株からの短縮型タンパク質２６−４７６をプレートの上へコーティングして、コーティングプレートを得た。実施例１において記載されるような方法に従って、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、上で得られた精製された短縮型タンパク質２６−４７６（すなわち２６−４７６−Ｐ［４］、２６−４７６−Ｐ［６］、２６−４７６−Ｐ［８］、２６−４７６−ＥＤＩＭ、２６−４７６−ＳＡ１１、ＬＬＲからの２６−４７６およびＰＢＳ（陰性対照））により免疫付与し、マウスの血清を収集した。その後に、実施例１において記載されるような方法に従って、マウスの血清中の抗体価を、コーティングプレートを使用して間接ＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２３４】
間接ＥＬＩＳＡ結果が図１７中で示され、そこで、横座標は、免疫血清の調製のための短縮型タンパク質が由来するウイルス株を表わし、縦座標は、対応する短縮型タンパク質との反応性を有する免疫血清の最も高い希釈（すなわち抗体価）を表わす。Ｐ［４］：２６−４７６−Ｐ［４］；Ｐ［６］：２６−４７６−Ｐ［６］；Ｐ［８］：２６−４７６−Ｐ［８］；ＳＡ１１：２６−４７６−ＳＡ１１；ＥＤＩＭ：２６−４７６−ＥＤＩＭ；ＬＬＲ：実施例４において調製された２６−４７６。
【０２３５】
結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で（３回の免疫付与後に）、異なるウイルス株に由来するすべてのこれらの２６−４７６タンパク質がマウスにおいて抗体の生成を誘導でき、それによって誘導された免疫血清中の抗体価（幾何平均抗体価）が、同等であった（抗体価は１０４〜１０５以上に達することができ、陰性対照群よりもはるかに高い）ことを示した。これらの結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、異なるウイルス株に由来する２６−４７６タンパク質が良好な免疫原性を有し、動物において抗体の生成を効果的に誘導でき；異なるウイルス株に由来する２６−４７６タンパク質が、免疫原性に関して実質的に同等であり、ＶＰ８−５よりも優れていたことを指摘した。
【０２３６】
さらに、実施例１において記載されるような方法の使用によって、実験群中のＢａｌｂ／ｃマウス（１群あたり７匹のマウス）を、異なるウイルス株からの２６−４７６のタンパク質（２６−４７６−ＳＡ１１；２６−４７６−ＥＤＩＭ；ＬＬＲからの２６−４７６）により免疫付与し、免疫血清を収集した。その後に、実施例１において記載される方法に従って、収集された各々の免疫血清サンプルを中和抗体価について評価した。免疫血清の中和抗体価の分析の結果が図１８中で示され、そこで、横座標は、免疫血清の調製のためのタンパク質サンプルが由来するウイルス株を表わし；縦座標は、５０％の感染阻害率を達成する免疫血清の最も高い希釈（ＮＴ５０、中和抗体価）を表わす。ＳＡ１１：２６−４７６−ＳＡ１１；ＥＤＩＭ：２６−４７６−ＥＤＩＭ；ＬＬＲ：実施例４において調製された２６−４７６。
【０２３７】
結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、免疫付与後４２日目で（３回の免疫付与後に）、ＳＡ１１、ＥＤＩＭおよびＬＬＲのウイルス株に由来するすべての２６−４７６のタンパク質がマウスにおいて高力価の中和抗体の生成を誘導でき、それらの中和抗体価（ＮＴ５０）が２１０〜２１４以上に達することができ；２６−４７６−ＳＡ１１および２６−４７６−ＥＤＩＭによって誘導された中和抗体価が、ＬＬＲに由来する２６−４７６によって誘導されたものよりもさらに高かったことを示した。したがって、ＳＡ１１ウイルス株およびＥＤＩＭウイルス株からの２６−４７６タンパク質の免疫中和活性は、ＬＬＲからの２６−４７６のタンパク質のものより優れていた。
【０２３８】
加えて、ロタウイルスＰ［４］、Ｐ［６］およびＰ［８］からの２６−４７６タンパク質が、良好な免疫中和活性を有し、マウスにおける高力価中和抗体の生成を誘導できたことは、類似の方法によっても実証することができる。
【０２３９】
これらの結果は、アルミニウムアジュバントの存在下において、異なるウイルス株からの２６−４７６タンパク質が生物体における中和抗体の生成を誘導する強い能力を有し、動物において高い中和抗体価を有する免疫血清を誘導できたことを示した。
【０２４０】
さらに、実施例１において記載されるような方法の使用によって、Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群あたり７匹のマウス）を、異なるウイルス株からの２６−４７６のタンパク質（２６−４７６−ＳＡ１１、２６−４７６−ＥＤＩＭおよびＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照））により免疫付与し、血清を収集した。その後に、実施例１において記載されるような方法に従って、タンパク質サンプルを動物における保護的効果について評価した。実験結果を図１９Ａ〜１９Ｂ中で示した。
【０２４１】
図１９Ａは、ＳＡ１１ウイルスによる攻撃投与後１〜７日目の、異なる免疫付与群（２６−４７６−ＳＡ１１またはＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照）により免疫付与された）における、哺乳中のマウスの下痢スコアを示し；図１９Ｂは、ＥＤＩＭウイルスによる攻撃投与後１〜１２日目の、異なる免疫付与群（２６−４７６−ＥＤＩＭまたはＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照）により免疫付与された）における、哺乳中のマウスの下痢スコアを示し；そこで、横座標はウイルスによる攻撃投与後の日数を表わし、縦座標は平均下痢スコアを表わす。結果は、ＬＬＲに由来する２６−４７６タンパク質に類似して、ＳＡ１１およびＥＤＩＭに由来する両方の２６−４７６タンパク質が有意な保護的効果を有し、マウスがロタウイルス感染、およびロタウイルス感染によって引き起こされる下痢と闘うことを支援できたことを示した。
【０２４２】
加えて、実施例１において記載されるような方法に従って、成体マウスを、２６−４７６−ＥＤＩＭまたはＰＢＳ（ＮＣ、陰性対照）により免疫付与した（合計で３回の免疫付与）。免疫付与手順が完了した後に、マウスに５００μＬのＥＤＩＭウイルス（２×１０７コピー／ｍｌ）を攻撃投与した。攻撃投与後１〜７日目に、マウスからの便試料を毎日収集し、ＰＢＳ中に再懸濁して１％の便懸濁物を得た。その後に、蛍光の定量的ＰＣＲアッセイによって、各々の便懸濁物サンプル中のウイルスを定量的に決定した。実験結果を図中で１９Ｃ示した。
【０２４３】
図１９Ｃは、ウイルスによる攻撃投与後１〜７日目の、２６−４７６−ＥＤＩＭまたはＰＢＳにより免疫付与されたマウスの便懸濁物サンプルのウイルス負荷を示し、そこで、横座標はウイルスによる攻撃投与後の日数を表わし、縦座標は、１ｍｌの便懸濁物サンプル中に含有されるＥＤＩＭゲノムのコピー数を表わす。蛍光の定量的ＰＣＲアッセイキットは１０４コピー／ｍｌの検出下限を有するので、陰性の検出結果は１０３コピー／ｍｌとして定義される。結果は、ウイルスによる攻撃投与後に、ＰＢＳにより免疫付与されたマウスの便中でウイルスの有意な分泌が検出される一方で、２６−４７６−ＥＤＩＭにより免疫付与されたマウスの便中でウイルスの分泌が検出されなかったことを示した。図１９Ａ〜１９Ｃ中の結果は、２６−４７６−ＥＤＩＭにより、マウスはロタウイルス感染およびロタウイルス感染によって引き起こされる下痢と闘うことができるだけでなく、マウスの便中のウイルスの分泌（すなわちウイルスの分泌）も阻害できたことを示した。
【０２４４】
本発明の実施形態は詳細に記載されたが、当業者は、すべての開示された教示に従って、詳細を補正および修飾することができ、すべてのこれらの修飾は本発明の保護範囲の中へ収まることを理解するだろう。本発明の範囲は請求項および任意のその等価物によって規定される。
【図１】
2018520651.tif 000012
【図２Ａ−２Ｃ】
2018520651.tif 000013
【図３】
2018520651.tif 000014
【図４】
2018520651.tif 000015
【図５】
2018520651.tif 000016
【図６】
2018520651.tif 000017
【図７】
2018520651.tif 000018
【図８】
2018520651.tif 000019
【図９】
2018520651.tif 000020
【図１０】
2018520651.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
2018520651.tif 000023
【図１３−１】
2018520651.tif 000024
【図１３−２】
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【図１４】
2018520651.tif 000026
【図１５】
2018520651.tif 000027
【図１６】
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【図１７】
2018520651.tif 000029
【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
2018520651000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月29日(2018.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントであって、該短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質が、野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、Ｎ末端からの１個以上６４個以下のアミノ酸を欠き（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質における配列番号：４０のアミノ酸位置２７６〜４９７の中の任意の位置に対応する位置で終了するＣ末端を有する、短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアント。
【請求項２】
前記短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質が、前記野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、Ｎ末端からの１個以上５個以下、５個以上２１個以下、２１個以上２５個個以下または２５個以上６４個以下のアミノ酸を欠き；該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質の配列番号：４０のアミノ酸位置２７６〜４９７、２８１〜４９７、２９１〜４９７、３０１〜４９７、３１１〜４９７、３２１〜４９７、３３１〜４９７、３４１〜４９７、３５１〜４９７、３６１〜４９７、３７１〜４９７、３８１〜４９７、３９１〜４９７、４０１〜４９７、４１１〜４９７、４２１〜４９７、４３１〜４９７、４４１〜４９７、４５１〜４９７、４６１〜４９７、４７１〜４９７、４７６〜４９７、４８２〜４９７、４８７〜４９７、または４９２〜４９７の中の任意の位置に対応する位置で終了するＣ末端を有する、請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアント。
【請求項３】
前記短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質が、前記野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、Ｎ末端からの１、５、２１、２５または６４個のアミノ酸を欠き、該野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質の配列番号：４０のアミノ酸位置２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４７６、４８２、４８７、４９２または４９７に対応する位置で終了するＣ末端を有する、請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアント。
【請求項４】
前記短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、前記野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質と比較して、Ｎ末端からの２５個のアミノ酸を欠き、配列番号：４０のアミノ酸位置３３１、３５１、３８１、４１１、４４１、４６１、４７１、４７６、４８２、４８７、４９２または４９７に対応する位置で終了するＣ末端を有するか；または、前記短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、Ｎ末端からの１、５、２１、２５または６４個のアミノ酸を欠き、配列番号：４０のアミノ酸位置４７６に対応する位置で終了するＣ末端を有する、請求項１に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアント。
【請求項５】
前記野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、ロタウイルスＬＬＲ株、ＳＡ１１株、もしくはＥＤＩＭ株に由来するＶＰ４タンパク質であるか、またはＰ［４］、Ｐ［６］、もしくはＰ［８］遺伝子型のロタウイルスに由来するＶＰ４タンパク質である、請求項１から４の何れか１項に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアント。
【請求項６】
前記野生型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、配列番号：４０および８７〜９１から選択されるアミノ酸配列を有し；及び／又は
前記短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質は、配列番号：２〜５および１０〜３９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から５の何れか１項に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアント。
【請求項７】
請求項１から６の何れか１項に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントをコードする、単離された核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の単離された核酸または請求項８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１から６の何れか１項に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントを含むかまたはそれからなる、重合体。
【請求項１１】
請求項１から６の何れか１項に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項７に記載の単離された核酸、または請求項８に記載のベクター、または請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載の重合体を含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１から６の何れか１項に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項１０に記載の重合体と、随意に、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
（１）前記医薬組成物が、アジュバントを更に含み；
（２）前記短縮型タンパク質もしくはそのバリアントまたは前記重合体が、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防または治療のために効果的な量で存在し；
（３）前記医薬組成物が、追加の活性成分を更に含み；および／または
（４）前記医薬組成物は、ワクチンである、
請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記アジュバントは、アルミニウムアジュバントである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
短縮型タンパク質またはそのバリアントの発現を可能にする条件下で、請求項９に記載の宿主細胞を培養し；発現された該短縮型タンパク質またはそのバリアントを回収することを含む、請求項１から６の何れか１項に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質またはそのバリアントを調製する方法。
【請求項１６】
Ｅ．ｃｏｌｉを使用して該短縮型タンパク質またはそのバリアントを発現するステップ、次いでＥ．ｃｏｌｉを溶解するステップ、および該溶解物から該短縮型タンパク質またはそのバリアントを精製するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から６の何れか１項に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項１０に記載の重合体を、薬学的に許容される担体および／または賦形剤、ならびに随意に、アジュバント、および／または追加の活性成分と、混合することを含む、ワクチンを調製するための方法。
【請求項１８】
ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防または治療するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ロタウイルス感染によって引き起こされる該疾患が、ロタウイルス胃腸炎または下痢である、請求項１３または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
被験体におけるロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防または治療のための医薬組成物の製造において、請求項１から６の何れか１項に記載の短縮型ロタウイルスＶＰ４タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項１０に記載の重合体の使用。
【請求項２１】
前記ロタウイルス感染によって引き起こされる疾患がロタウイルス胃腸炎または下痢であり、および／または
前記被験体は、哺乳類である、
請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記被験体は、マウスまたはヒトである、請求項２０または２１の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2018520651.tif 000032
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
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【国際調査報告】
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