(57)【要約】本発明は、肥満細胞からの胸腺間質性リンホポイエチン(TSLP)分泌を阻害するための化合物、およびその使用に関する。本発明の化合物は、肥満細胞からのTSLP分泌を有意に阻害することが確認された。従って、本発明の化合物は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎および／または炎症性腸疾患の処置および予防についての候補材料として使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式1〜4
2018536638.tif 000017
[式1]
2018536638.tif 000018
[式2]
2018536638.tif 000019
[式3]
2018536638.tif 000020
[式4]
によって示される化合物またはその薬学的に許容される塩より選択される、化合物。
【請求項２】
肥満細胞からのTSLP(胸腺間質性リンホポイエチン（thymic stromal lymphopoietin）)分泌を阻害する、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
アトピー性皮膚炎の処置に有効である、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
請求項1に記載の化合物を活性成分として含む、アトピー性皮膚炎を予防および処置するための薬学的組成物。
【請求項５】
請求項1に記載の化合物を活性成分として含む、アレルギーを予防および処置するための薬学的組成物。
【請求項６】
請求項1に記載の化合物を活性成分として含む、アトピー性皮膚炎を緩和および軽減するための化粧品組成物。
【請求項７】
請求項1に記載の化合物を活性成分として含む、アレルギーを緩和および軽減するための化粧品組成物。
【請求項８】
請求項1に記載の化合物を活性成分として含む、アトピー性皮膚炎を緩和および軽減するための食品組成物。
【請求項９】
請求項1に記載の化合物を活性成分として含む、アレルギーを緩和および軽減するための食品組成物。
【請求項１０】
請求項1に記載の化合物を活性成分として含む、炎症性腸疾患を処置するための薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項1に記載の化合物を活性成分として含む、炎症性腸疾患を緩和および軽減するための食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満細胞からの胸腺間質性リンホポイエチン（Thymic Stromal Lymphopoietin）(TSLP)の分泌を阻害するための化合物、ならびに炎症性腸疾患およびアトピー性皮膚炎の処置のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは、外因性物質と接触している生体が、正常な応答とは異なる、物質に対する応答を示す現象である。生物が外因性物質と接触すると、抗原-抗体反応は、それに応答するために身体の能力の急激な変化を引き起こし、これはアレルギーと呼ばれる。異種物質について、生物は、抗原と特異的に反応する抗体およびリンパ球を産生し、生物が再び抗原と接触すると、それは様々な免疫応答を引き起こす。この免疫応答または免疫反応は、生体の自己防衛のための重要な防御機構の1つであり、通常、生体に対して保護的に作用するが、時には、この機構は生体に対して不利に作用し、従って障害を引き起こす。アレルギーは、「過敏な」を意味し、ギリシア語の単語allosに由来し、これは「変わった」を意味する。用語「アレルギー」は、1906年にフランスの学者フォン・ピルケによって初めて使用された。アレルギーは、英語ではア-レル-ジー（al-ler-gi）またはエ-レル-ジー（el-ler-gi）と発音され、ドイツ語ではア-レ-ル-ギー（al-le-r-gie）と発音され、両方とも韓国において互換的に使用されている。アレルギー反応を引き起こす抗原はアレルゲンと呼ばれ、典型的なアレルゲンとしては、花粉、薬物、植物繊維、細菌、食物、染料、化学物質などが挙げられる。免疫系は、抗原から身体を保護するためにいくつかの防御機構を有する。これらの機構の最も一般的なタイプは、特異的抗原に応答するように指定され、B細胞およびT細胞を含む、リンパ球である。B細胞は、抗原へ結合し、抗体を産生し、これは、抗原を破壊および中和するタンパク質である。T細胞は、抗体を産生する代わりに、抗原へ直接結合し、それによって攻撃を刺激する。アレルギー反応は、即時型アレルギーまたは遅延型アレルギーとして生じ、抗原がB細胞およびT細胞のいずれと反応するかに依存して決定される。アレルギーによって引き起こされる疾患として、自己免疫疾患、膠原病などを含む様々な疾患があり、アレルギー性疾患は、古典的アレルギー性疾患、例えば、アナフィラキシーショック、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎、花粉症、気管支喘息、薬物アレルギー、植物アレルギー、じんま疹、湿疹、およびアレルギー性接触皮膚炎を一般に含む。これらは、アレルギーによって引き起こされる疾患であるが、他のインビボ条件がそれらの発症に必要である症例がある。加えて、同じ症状が、非アレルギー性機構によって引き起こされる場合がある。
【０００３】
アトピー性皮膚炎は、主に乳児期または小児期に始まる慢性高再発性炎症性皮膚疾患であり、痒み(そう痒)、乾燥皮膚、および特徴的な湿疹を伴う。乳児期に、それは、顔面および四肢の折り畳まれていない部分上の湿疹を伴って始まるが、乳児が成長するとともに、腕の屈曲部および膝の裏側の屈曲部上の湿疹として特徴的に現れる。多くの場合、アトピー性皮膚炎は、小児が成長するとともに自然に緩和する傾向がある。成人において、折り畳まれた皮膚部分の肥厚の状態である苔癬化が現れ、小児期におけるものとは異なり、多くの成人症例は顔面上に湿疹を示す。アトピー性皮膚炎は世界的に増加する傾向があり、罹患率は人口の20%と報告された。
【０００４】
アレルギー患者の進歩したアレルギー処置および優れたアレルギー治療剤の売り上げのさらなる増加にもかかわらず、人々のアレルギー症状は重篤になり、アレルギー患者の数は急速に増加している。
【０００５】
これらは、様々な他の経路によるアレルギー性疾患の増幅、一時的な改善効果などを含む、既存の治療剤の制限に起因する。
【０００６】
既存のアトピー性皮膚炎治療剤は、痒みを緩和し、損傷した皮膚表面を回復させ、大半は、副作用を有することが認識されている免疫抑制薬またはステロイド剤である。
【０００７】
従って、副作用を有すると以前に報告された免疫抑制薬またはステロイド剤とは異なり、アトピー処置においてアトピーの根本的な原因に取り組むことによって、免疫過敏症としてのアトピーを処置することができる治療剤を開発する必要性がある。
【０００８】
その一方で、炎症性腸疾患(IBD)は2つの疾患：潰瘍性大腸炎およびクローン病に分類され、これらは、臨床的に類似しているが、組織学的、内視鏡的および免疫学的局面で互いと異なり、炎症細胞の活性化がIBDの重要な病因であることが公知である。腸内免疫系の継続的または不適切な活性化は、慢性粘膜炎症の病態生理学において重要な役割を果たし、特に、好中球、マクロファージ、リンパ球、および肥満細胞の浸潤は、最終的に粘膜破壊および潰瘍化をもたらす。浸潤しそして活性化された好中球は、活性酸素種および活性窒素種の発生をもたらし、これらの活性種は、架橋されたタンパク質、脂質、および核酸による細胞の酸化ストレスを誘発し、上皮の機能不全および損傷を引き起こす、細胞傷害性物質である。
【０００９】
炎症性疾患が生じる場合、様々な炎症性サイトカインが、腸管粘膜中において分泌される。TNF-αは、潰瘍性大腸炎を有する患者中の結腸管腔および結腸上皮細胞中において高度に発現される。最近の研究によれば、TNF-αが潰瘍性大腸炎の発症において重要な役割を果たすことが分かった。抗TNF-α抗体であるインフリキシマブは、おできの処置においてだけでなく、以前は処置されなかったクローン病の処置においても有効であることが分かった。しかしながら、そのような療法は高価であり、一部の患者において、流体応答または感染合併症のような副作用を引き起こす。
【００１０】
現在、プロスタグランジンの産生をブロックする5-アミノサルチル酸(5-ASA)系の薬物、例えば、スルファサラジンなど、または免疫抑制薬、例えば、ステロイドが、炎症性腸疾患のための治療剤として使用されている。
【００１１】
スルファサラジンは、腹部膨満、頭痛、発疹、肝疾患、白血球減少症、顆粒球減少症、男性不妊などのような副作用または有害効果を引き起こす傾向がある。加えて、スルファサラジンが、切れた腸の患部を有する患者において再発を抑制するか、または患者が改善を示す十分な効果を有するかどうかは不明である。
【００１２】
ステロイド免疫抑制薬は、短期効果を示し得るが、長期予後を改善することができない副腎皮質ステロイドであり、誘発感染症、二次性副腎皮質不全、消化性潰瘍、糖尿病、精神障害およびステロイド腎臓病のような副作用が原因で、急性症例においてのみ使用されるという制限を有する。
【００１３】
従って、炎症性腸疾患についての信頼できる治療薬はまだなく、従って、それについての有効な治療剤を開発する必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】韓国特許出願公開第1020100058104号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
［開示］
［技術的課題］
本発明は上述の課題を考慮してなされ、本発明の目的は、アレルギー性アトピー性皮膚炎を処置するための新規の候補材料を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、炎症性腸疾患を処置するための新規の候補材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
［技術的解決法］
上記目的を達成するために、本発明は、下記式1〜4によって示される化合物またはその薬学的に許容される塩より選択される1つの化合物を提供する。
2018536638.tif 000002
[式1]
2018536638.tif 000003
[式2]
2018536638.tif 000004
[式3]
2018536638.tif 000005
[式4]
【００１８】
本発明の一態様において、化合物は、肥満細胞からの胸腺間質性リンホポイエチン(TSLP)の分泌を阻害し得るが、それに限定されない。
【００１９】
本発明の別の態様において、化合物はアトピー性皮膚炎の処置に有効であり得るが、本発明はそれに限定されない。
【００２０】
本発明の別の態様において、化合物は炎症性腸疾患の処置に有効であり得るが、本発明はそれに限定されない。
【００２１】
本発明の薬学的に許容される塩としては、リチウム(Li)、ナトリウム(Na)、カリウム(K)、カルシウム(Ca)、マグネシウム(Mg)、鉄(Fe)、銅(Cu)、亜鉛(Zn)、およびマンガン(Mn)のような、無機塩基から誘導される塩；N,N'-ジアセチルエチレンジアミン、グルカミン、トリエチルアミン、塩素、水酸化物、ジシクロヘキシルアミン、メトホルミン、ベンジルアミン、トリアルキルアミン、チアミン、およびそれらの同等物のような、有機塩基の塩；キラル塩基、例えば、アルキルフェニルアミン、グリシノール、フェニルグリシノール、およびそれらの同等物；天然アミノ酸塩、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、チロシン、シスチン、システイン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシルプロリン、ヒスチジン、オルニチン、リジン、アルギニン、セリン、およびそれらの同等物；ハロゲン化アルキル、MeI、および(Me)2SO4、ならびにそれらの同等物のようなアルキルスルフェートを有する本発明の化合物の第四級アンモニウム塩；人工アミノ酸、例えば、D異性体、置換アミノ酸など；グアニジン、ニトロ、アミノ、アルキル、アルケニルおよびアルキニルより選択される1つで置換されたグアニン、アンモニウムまたは置換アンモニウム塩、ならびにアルミニウム塩が挙げられる。塩は酸付加塩を含み得、好適な塩の例としては、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、ヒドロハライド（hydrohalide）、酢酸塩、酒石酸塩、マリエート（maliate）、クエン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、パルモエート（palmoate）、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、アスコビル酸塩、グリセロリン酸塩、ケトグルタル酸塩、およびそれらの同等物が挙げられる。薬学的に許容される溶媒化合物としては、結晶化溶媒、例えば、水酸化物またはアルコールが挙げられる。
【００２２】
本発明はまた、本発明の化合物を活性成分として含む、アトピー性皮膚炎を予防および処置するための薬学的組成物を提供する。
【００２３】
本発明はまた、本発明の化合物を活性成分として含む、アレルギーを予防および処置するための薬学的組成物を提供する。
【００２４】
本発明はまた、本発明の化合物を活性成分として含む、炎症性腸疾患を処置するための薬学的組成物を提供する。
【００２５】
本発明の単一単位投薬形態は、経口的に、粘膜内に(例えば、経鼻的に、舌下に、経膣的に、経口的に、もしくは直腸に)、非経口的に(例えば、皮下に、静脈内に、ボーラス注射、筋肉内に、もしくは動脈内に)、または経皮的に、患者へ投与され得る。投薬形態の例としては、錠剤；カプレット剤；カプセル剤、例えば、軟ゼラチンカプセル剤；カシェ剤；トローチ剤；ロゼンジ；分散剤（dispersion）；坐剤；軟膏剤；湿潤剤(パップ剤（cataplasma）)；パスタ剤；粉末；包帯剤；クリーム；硬膏剤；液剤；パッチ；エアロゾル(例えば、点鼻薬または吸入器)；ゲル剤；懸濁剤(例えば、水性または非水性液体懸濁剤、水中油型液体エマルジョン、または油中水型液体エマルジョン、液剤、および、患者への経口投与または粘膜投与に適した、エリキシル剤を含む液体調製物；非経口投与に適した液体調製物、および、非経口投与に適した液体投薬形態へ処理され得る無菌固体調製物(例えば、結晶および非晶質固体)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明の組成物、形状、および投薬形態のタイプは、典型的に、その適用に従って変わる場合がある。例えば、粘膜投与に適した投薬形態は、同じ疾患の処置に使用される経口投与に適した投薬形態中の量よりも少ない量の活性成分を含み得る。本発明のこれらの局面は当業者に十分に明らかであろう(参考文献：Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing, Easton PA)。
【００２７】
典型的な薬学的組成物および投薬形態は1つまたは複数の賦形剤を含む。好適な賦形剤は薬学分野の当業者に明らかであり、本発明は、本明細書に記載される好適な賦形剤の例に限定されない。
【００２８】
特定の賦形剤が薬学的組成物または投薬形態に適しているかどうかは、患者へ投与される調製物を製剤化する方法を含む、当技術において周知の様々な因子に依存するが、それに限定されない。例えば、錠剤のような経口投与用の投薬形態は、非経口投与用の調製物における使用に適していない賦形剤を含み得る。
【００２９】
特定の賦形剤の適切性はまた、投薬形態の特定の活性成分に依存し得る。例えば、ある活性成分の分解は、ラクトースのような賦形剤によってまたは水溶液への曝露によって加速され得る。第一級または第二級アミンを含む、活性成分(例えば、N-デスメチルベンラファキシンおよびN,N-ジデスメチルベンラファキシン)は、そのような加速された分解に特に敏感である。
【００３０】
本発明はまた、活性成分の分解速度を低減する1つまたは複数の化合物を含む薬学的組成物および投薬形態を提供する。これらの化合物としては、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、pH緩衝液、および塩緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
賦形剤の量およびタイプと同様に、投薬形態中の活性成分の量およびタイプは、患者への投与方法のような因子に従って変わる場合があるが、本発明はそれに限定されない。しかしながら、本発明の典型的な投薬形態は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を、約1 mg〜約1,000 mg、好ましくは約50 mg〜約500 mg、最も好ましくは約75 mg〜約350 mgの範囲の量で含む。特定の患者についての好適な投薬量または投薬形態の決定は、本発明が属する技術分野の範囲内にある。
【００３２】
本発明はまた、本発明の化合物を活性成分として含む、アトピー性皮膚炎を緩和および軽減するための化粧品組成物を提供する。
【００３３】
本発明はまた、本発明の化合物を活性成分として含む、アレルギーを緩和および軽減するための化粧品組成物を提供する。
【００３４】
本発明の化粧品組成物は、様々な形態、例えば、エマルジョン、ローション、クリーム(水中油型、油中水型、多相)、溶液、懸濁液(無水および水性)、無水製品(オイルおよびグリコール)、ジェル、マスク、パック、粉末などに調製され得る。
【００３５】
本発明はまた、本発明の化合物を活性成分として含む、アトピー性皮膚炎を緩和および軽減するための食品組成物を提供する。
【００３６】
本発明はまた、本発明の化合物を活性成分として含む、アレルギーを緩和および軽減するための食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の前述の説明から明らかであるように、本発明の化合物は、肥満細胞からのTSLP分泌を有意に阻害することが分かった。従って、本発明の化合物は、アトピー性皮膚炎および／またはアレルギー性皮膚炎ならびに炎症性腸疾患を処置および予防するための候補材料として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】カスパーゼ-1およびChemBridgeライブラリー化合物のドッキング結果を示す。
【図２】ヒト肥満細胞(HMC-1細胞)中のTSLPの量の測定結果を示す。
【図３】HMC-1細胞中の細胞傷害性測定結果を示す。
【図４】IPS-07001(5182436)によるHMC-1細胞中のTSLPおよびmRNA発現の測定結果を示す：1)IPS-07001によるTSLPの量の測定、および2)IPS-07001によるmRNA発現の測定。
【図５】IPS-07001(5182436)によるHMC-1細胞中のカスパーゼ-1活性の測定結果を示す：1)カスパーゼ-1活性に対するIPS-07001の効果の測定、および2)ウエスタンブロッティングによるIPS-07001の活性によるカスパーゼ-1発現の変化。
【図６】カスパーゼ-1活性に対するIPS-07001(#5182436)の阻害効果の測定結果を示す。
【図７】HMC-1細胞中の炎症性サイトカインmRNA発現の測定結果を示す。
【図８】DNCB誘発アトピー性皮膚炎を有するbalb/cマウスの血清中の発現測定結果を示す。
【図９】DNCB誘発アトピー性皮膚炎を有するbalb/cマウス背部皮膚中のカスパーゼ-1活性の測定結果を示す。
【図１０】DNCB誘発アトピー性皮膚炎を有するbalb/cマウス背部皮膚中の炎症性サイトカインの調節を示す。
【図１１】DNCB誘発アトピー性皮膚炎を有するbalb/cマウス背部皮膚中の炎症性サイトカインの調節を示す：1)RT-PCR電気泳動結果、および2)デンシトメータを使用して測定された電気泳動結果。
【図１２】IPS-07001およびデキサメタゾン(それぞれ、0.01μM、0.1μM、および1μM)での、DNCB誘発アトピー性皮膚炎を有するbalb/cマウスの処置の結果を示す画像を示す。
【図１３】H&E染色された背部皮膚の組織学的特徴を示す：1)表皮厚み値の測定結果、および2)DNCB誘発アトピー性皮膚炎を有するbalb/cマウについて(表皮の深さ)(##p<0.01 正常対照対DNCB；*p<0.01 DNCB 対 0.01μM、0.1μM、および1μMで処置、**p<0.01 DNCB 対 0.01μM、0.1μM、および1μMでそれぞれ処置)。
【図１４】トルイジンブルー染色された背部皮膚の組織学的特徴を示す：1)染色された皮膚組織の画像、および2)DNCB誘発アトピー性皮膚炎障害を有するbalb/cマウス中の肥満細胞の量の測定結果(##p<0.01 正常対照対DNCB；*p<0.01 DNCB 対 0.01μM、0.1μM、1μMで処置、**p<0.01 DNCB 対 0.01μM、0.1μM、および1μMでそれぞれ処置)。
【図１５】DNCB誘発アトピー性皮膚炎を有するbalb/cマウス血清中のIgEの測定結果を示す(##p<0.01 正常対照対DNCB；*p<0.01 DNCB 対 0.01μM、0.1μM、1μMで処置、**p<0.01 DNCB 対 0.01μM、0.1μM、1μMでそれぞれ処置)。
【図１６】サイトカインおよびケモカイン抗体マイクロアレイタンパク質チップの分析を示し、ここで、1)において、対照は、1% DNCBのみで処理された皮膚組織サンプルを意味し、IPS-07001は、1% DNCBおよび1μM IPS-07001で処理された皮膚組織サンプルを意味し、INR蛍光画像において、赤色は増加した発現を意味し、緑色は減少した発現を意味し、黒色は発現の差が無いことを意味する；ならびに2)1.1以上のINR値は増加した発現を示し、0.9以下のINR値は減少した発現を示す。
【図１７】DNCB誘発アトピー性皮膚炎を有するbalb/cマウス背部皮膚中のサイトカインタンパク質の発現の変化を示す：1)ウエスタンブロッティング画像、および2)バンドの強度の測定結果を示すグラフ。
【図１８】DSS誘発動物モデル中の急性炎症性腸疾患(IBD)に対するIPS-07001(式1)の阻害効果を示す。
【図１９】DSS誘発動物モデル中の慢性IBDに対するIPS-07001(式1)の阻害効果を示す。
【図２０】DSS誘発動物モデル中の下痢スコアに対するIPS-07001(式1)の効果を示す。
【図２１】DSS誘発動物モデル中の脾臓重量に対するIPS-07001(式1)の阻害効果を示す。
【図２２】HaCat細胞増殖に対するIPS-07004(式4)の効果を示す。
【図２３】ヒト組換えカスパーゼ-1活性に対するIPS-07001(式1)およびIPS-07004(式4)の阻害効果を示す。
【図２４】HMC-1細胞中のヒトカスパーゼ-1活性に対するIPS-07004(式4)の効果を示す。
【図２５】DSS誘発動物モデル中の急性IBDに対するIPS-07004(式4)の阻害効果を示す。
【図２６】DSS誘発動物モデル中の体重変化に対するIPS-07004(式4)の阻害効果を示す。
【図２７】DSS誘発動物モデル中の出血スコアに対するIPS-07004(式4)の阻害効果を示す。
【図２８】DSS誘発動物モデル中の下痢スコアに対するIPS-07004(式4)の阻害効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３９】
以下に、下記の非限定的な実施例を参照して本発明をさらに詳細に記載する。しかしながら、これらの実施例は、説明の目的のために提供され、本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【００４０】
実施例1：治療薬候補材料の発見
CADD技術を使用しての構造ベースのインシリコスクリーニング
A．実験方法：カスパーゼ-1標的タンパク質についてのインシリコスクリーニングを行うために、コンピューター支援分子ドッキングシミュレーションを行った。
【００４１】
(1)タンパク質調製：Protein Data Bank(PDB)カスパーゼ-1構造(PDB id 2HBQ)を標的タンパク質の最初の構造として使用し、モデリングソフトウェアを使用し、欠けている水素原子を補いそして非結晶水分子を除去し、それによって標的タンパク質の分子モデルを完成させた。完成したタンパク質モデルをエネルギー最小化によって安定化させ、次いでシミュレーションのために使用した。
【００４２】
(2)リガンド調製：化合物ライブラリーのうち、ChemBridgeの636,565個の化合物を、Ligprepモジュールを使用して塩除去およびイオン化へ供した。
【００４３】
(3)受容体格子生成：ドッキング部位を、3-[2-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオニルアミノ]-4-オキソ-ペンタン酸(z-VAD-FMK)の結合部位付近の30個のボックスに限定した。計算のために使用したソフトウェアは、Schrodingerから入手可能なGlideプログラムである。Glide関数をスコアリング関数として使用し、最終結果についてのGlideスコアを得た。
【００４４】
(4)リガンドドッキング：各リガンド化合物1個あたり最大10個のドッキングポーズを計算し、結果がスコアの降順で得られ、出力ファイルが得られた。構造検索をGlide-SPモードで行い、最高の最終スコアから最低の最終スコアへの順序で化合物についての結果を得、これらをドッキング計算の結果として修正した。
【００４５】
実施例2：アレルギー性アトピー性皮膚炎のインビトロモデル中のアトピー関連因子の調節に対する活性成分の効能の研究
インビトロ細胞ベースの候補材料のアレルギー阻害活性の分析
A．実験方法
(1)細胞培養：ヒト肥満細胞株(HMC-1)を、37℃および5% CO2で、10% FBSが補われたIMDM中において培養した。候補材料をDMSO中に溶解し、次いで、0.22μmフィルターを使用して濾過した。得られた候補材料をDMSOで希釈し、HMC-1細胞をそれで処理した。
【００４６】
(2)細胞傷害性(MTT-アッセイ)：肥満細胞(3 x 105細胞/ml)を1時間安定化させ、次いで、10μM候補材料で処理し、続いて、PMAおよびA23187(PMACI)で処理し、次いで、8時間培養した。培養後、培地を新鮮な培地で置き換え、次いで、5 mg/mlのMTT溶液をそれへ添加し、肥満細胞を37℃で4時間インキュベートした。250 DMSOを肥満細胞へ添加し、MTTホルマザンをそこから抽出し、各ウェルの吸光度を、ELISAリーダーを使用して540 nmで測定した。
【００４７】
(3)酵素免疫測定法(ELISA)：肥満細胞(3 x 106細胞/ml)を1時間安定化させ、次いで、0.1μM、1μM、および10μMの候補材料で処理し、続いて、PMACIで8時間処理した。肥満細胞を遠心分離し、上澄みを得た。細胞から分泌されたTSLPの量を測定するために、ELISAを使用した。1μg/ウェルのTSLP捕捉Abがコーティングされた96ウェルプレート中において、ELISAを行った。コーティングされたプレートをPBSで2回洗浄した。細胞を、2時間、10% FBSを含有するPBSで処理した。その後、細胞を、0.05% Tween-20(Sigma)を含有するPBSで洗浄し、組換えTSLPを使用して標準曲線を描いた。その後、プレートを、ビオチン化TSLP抗体、アビジンペルオキシダーゼ、30% H2O2溶液を含有するABTS基質へ曝露し、次いで、405 nmで測定した。
【００４８】
(4)カスパーゼ-1アッセイ：組換えカスパーゼ-1および薬物を反応させ、次いで、カスパーゼ-1アッセイキット(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)を使用して活性測定を行った。
【００４９】
(5)逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)定量的リアルタイムPCR：全RNAを細胞および組織から単離し、逆転写酵素を使用してcDNAを合成し、次いで、分析されるべきサイトカインプライマーと反応させ、続いて、PCRおよびリアルタイムPCRを行った。RT-PCR産物を、分析のために1.5%アガロースゲルを使用する電気泳動へ供した。
【００５０】
(6)ウエスタンブロッティング分析：細胞を6ウェルプレート中に播種し、次いで薬物で処理し、一定期間後、細胞を採取した。採取後、細胞をPBSで洗浄し、次いで溶解させた。50μgの組織タンパク質および細胞抽出タンパク質を12%ゲル上の電気泳動へ供し、ニトロセルロース紙へ転写し、次いで、2時間6%ウシ血清アルブミンでブロッキングした。各タンパク質を一晩一次抗体と反応させ、PBS-tweenで洗浄した。その後、得られたタンパク質を2時間二次抗体と反応させ、洗浄し、次いで、ECL溶液キットを使用して検出した。
【００５１】
(7)統計解析：実験結果を、少なくとも3つの実験を行うことによって得、それらの平均値を記録し、SPSS ver 11.5を使用して解析を行った。統計的有意性を処理群間で比較し、独立t検定およびTukeyの事後検定と共にANOVAによって比較し、P < 0.05の結果を統計的に有意と見なした。
【００５２】
実施例3：インビボ実験の構築
実験方法
A．実験動物：Daehan Biolink (Eumseong, Chungbuk)から得られた5週齢雄BALB/cマウスを、環境条件：温度22±3℃；相対湿度50±20%；換気頻度10〜15回/時間；照明12時間；および照度150 Lux〜300 Lux下に設定された、Hoseo University Safety Evaluation Centerのクリーンな動物飼育室(小さな動物室#2-302)中に2週間適応させ、次いで実験に使用した。
【００５３】
4匹の実験動物をポリカーボネートケージ(270×500×200 mm, KYERYONG SCIENCE)の各々中に収容した。飼料(5053-Picolab Rodent 20, PMI Nutrition International)および飲料水(紫外線殺菌濾過水)を自由に摂取させた。実験の全ての手順を、Hoseo University Safety Evaluation Centerの倫理委員会(HTRC-15-19)によって承認された後に行った。
【００５４】
B．皮膚炎誘発：各マウスの背部上の体毛を除去し、24時間維持し、次いで、150μlの1% 2,4-ジニトロクロロベンゼン(DNCB)溶液(アセトン:オリーブ油= 3:1)を、3週間、週1回、体毛除去部位へ適用した。第3週後、DNCB溶液を、3週間、週2回、部位上に適用し、アトピー性皮膚炎を誘発した。
【００５５】
C．処置：マウスを6つの群へ分割し、0.5% DMSOを対照として動物上へ適用し、0.01μM、0.1μMおよび1μM試験材料のそれぞれ200μlを、3週間、実験群として動物上へ適用した。粗製アルコール中に溶解された0.1%デキサメタゾン50μlを、2日間隔で陽性対照として動物上へ適用した。
【００５６】
【表１】
2018536638.tif 000006
【００５７】
D．生検：試験材料の適用が完了した後、各実験動物の背部皮膚を心臓麻酔下で切開し、それらの一部を、分析前に液体窒素を使用して急速に凍結して-70℃で保存し、残りを10%中性緩衝ホルマリンで24時間固定した。固定された組織を、一般的な組織処理によってスライド中へ調製し、次いで、ヘマトキシリン&エオシン(H&E)染色へ供し、表皮層の厚みを測定した。加えて、トルイジンブルー染色を行い、肥満細胞の定量的変化を観察した。染色された組織を光学顕微鏡によって観察した一方、表皮層の厚みおよび肥満細胞の数を、画像分析器(Olympus DP-21)を使用して得た。
【００５８】
E．IgEレベル測定：剖検を行った際に収集した血清を使用して、血液中のIgE濃度を(SHIBAYAGI, Japan)によって測定した。50μLのIgE標準溶液およびサンプルを、抗体結合化96ウェル中に置き、2時間反応させ、次いで、50μLのビオチンコンジュゲート化抗IgE抗体溶液を各ウェルへ添加し、2時間反応させた。その後、得られたサンプルを、1時間にわたってHRP-アビジン溶液および20分間にわたって発色基質(TBM)試薬と反応させ、そして、反応停止剤を使用して反応を停止させた。サンプルの吸光度を、ELISA(Molecular devices Emax)を使用して450 nmで測定した。
【００５９】
実施例4：急性皮膚毒性試験
実験方法
A．飼育環境
(1)環境条件：本実験において、実験動物を、環境条件：温度22±3℃；相対湿度50±20%；換気頻度10〜15回/時間；照明期間12時間；および照度150 Lux〜300 Lux下に設定された、Hoseo University Safety Evaluation Centerのクリーンな動物飼育室(小さな動物室#2-302)中において飼育した。
【００６０】
(2)ケージおよび敷物：1性別当たり2匹または3匹の動物を、順化期間中、ステンレス鋼メッシュ蓋を備えたポリカーボネートケージ(270×500×200 mm, KYERYONG SCIENCE)のそれぞれの中に収容し、群分割後、1性別当たり1匹の動物をその中に収容した。敷物として、ガンマ線が照射された無菌ベータチップ(NEPCO)を使用した。
【００６１】
(3)飼料および飲料水：動物に、PMI Nutrition Internationalによって製造された実験動物用のマウス飼料(5053-Picolab Rodent 20)を自由に与え、紫外線殺菌で処理された濾過水(R/O水)を飲料水として自由に供給した。
【００６２】
(4)飼料および飲料水中の汚染物質の検査：飼料中の汚染物質を飼料製造業者から試験結果を受け取ることによって調べ、飲料水の品質を、本試験研究所の対応のSOPに従う定期検査によって汚染について点検し、汚染物質がなかったことが確認された。
【００６３】
B．試験方法
(1)実験群の構成
【００６４】
【表２】
2018536638.tif 000007
【００６５】
(2)投与：
【００６６】
【表３】
2018536638.tif 000008
【００６７】
(3)実験方法
(A)投与の約24時間前に、背部上の体毛を、体毛除去部位がその全表面積の約10%以上を占めように除去し、皮膚を傷つけないように注意を払った。
【００６８】
(B)投与の日に、各個体についての投薬量を計算し、次いで、試験材料を溶媒で十分に湿らせ、次いで、全表面積の約10%(約44 cm)に対応する部位上へ適用した。
【００６９】
(C)24時間曝露期間中、多孔性ガーゼ、非刺激性テープおよび包帯を使用して、試験材料を皮膚と接触した状態で維持した。
【００７０】
(D)曝露期間が終了した時に、残存する試験材料を、ぬるま湯を使用して除去した。
【００７１】
(4)観察事項
(A)全身症状観察：全ての動物を投与後30分〜4時間集中的に観察し、全身症状を14日間の間1日1回観察した。観察時に、死および臨床症状を個別に記録した。
【００７２】
(B)体重測定：全ての動物を、受取時に、群分割時に、投与直前に(投与日)、ならびに投与開始後第1日、第4日、第7日、第10日、および第14日に、測定した。
【００７３】
(C)剖検：試験の間、死んだ動物を直ちに剖検し、臓器を肉眼で検査し、そして試験終了時に、全ての生きている動物を、CO2ガス吸入によって安楽死させ、静脈切開し、次いで、臓器を視覚によって調べた。
【００７４】
(D)致死用量(LD50)計算：この試験の投薬量では死が観察されなかったため、致死用量(LD50)を計算しなかった。
【００７５】
(E)統計解析：体重データを平均値および標準偏差として表し、体重の統計解析を行わなかった。
【００７６】
実施例5：抗体マイクロアレイシステムの構築
実験方法
A．組織サンプルの調製：マウス皮膚組織を液体窒素中に凍結し、次いで、乳鉢中において細かくすりつぶした。液体窒素を断続的に添加し、組織が解凍されるのを防いだ。細かくすりつぶされた皮膚組織を、溶解Mバッファー中に置き、組織サンプル溶解物を調製した。
【００７７】
B．組織溶解物の蛍光標識：一定期間サンプルで処理された組織溶解物および未処理組織溶解物の各々からタンパク質を抽出し(Lysis M抽出溶液, Roche)、蛍光物質(Cy3またはCy5)(GE Healthcare)で標識した。先ず、各組織溶解物からのタンパク質の量を、少なくとも1 mgとなるように調節し、次いで、カップリング緩衝液(0.1M炭酸ナトリウム緩衝液, pH 9.3)を添加し、十分に混合した。Cy3およびCy5色素を、カップリング緩衝液が添加されていた各組織溶解物へ添加し、4℃で16時間標識のために十分に混合した。DNCBのみで処理された対照をCy3およびCy5で標識し、サンプルで処理された実験群もまたCy3およびCy5で標識した。蛍光色素での標識後、Post-reactive Spinカラム(Sigma)を使用して遊離色素を除去した。
【００７８】
C．抗体マイクロアレイの製作：ProteoChip（商標）(Proteogen, Inc., Seoul, Korea)をタンパク質チップとして使用し、ProteoChip（商標）上に200μg/mlのプロテインAが固定化された支持体上に、細胞中の26個のタンパク質に対する抗体をスポッティングすることによって、抗体マイクロアレイを製作した。先ず、抗体を、30%グリセロールを含有するリン酸緩衝液で100μg/mlへ希釈し、抗体アレイを4℃で一晩固定した。抗体チップをPBSTで3回洗浄し、スターラー中において室温で1時間3% BSAでブロッキングした。ブロッキング後、チップをPBST溶液(0.05% Tween 20を含有するリン酸緩衝液)で洗浄して過剰なBSAを除去し、N2ガスで乾燥させた。
【００７９】
D．抗体アレイのハイブリダイゼーション：蛍光物質で標識された組織溶解物を定量化し(Bradford法)、30μgのそれぞれ蛍光標識されたサンプルを、10 mlの反応溶液中において混合した。抗体チップを緩衝液中に浸し、この中に、蛍光標識されたサンプルを置き、30℃で1時間反応させた。反応後、抗体チップをPBST溶液で2回洗浄し、窒素ガスで乾燥させた。蛍光マイクロアレイスキャナーを使用して、各スライドを分析した。Cy3およびCy5の主要ピークが約10,000となるようにPMT値を調節した後に、スキャニングを行った。各スポット中のCy3に対するCy5の比率を、ソフトウェア(Genepix 6.0)を使用して計算した。INR値を、サンプル-Cy5 /対照-Cy3 x サンプル-Cy3 /対照-Cy5によって計算した。発現の差が無い場合、理想的なINR値は1であり、1以上の値は発現の増加を意味し、1未満の値は発現の減少を意味する。
【００８０】
E．ウエスタンブロッティング分析：ウエスタンブロッティング分析を行い、上記抗体アレイ実験におけるタンパク質発現の差異を確認した。組織溶解物からのタンパク質をSDS-PAGE上で分離した。電気泳動されたタンパク質を、次いで、PVDF膜上へ転写した。PBST溶液で洗浄後、PVDF膜を1時間5%脱脂粉乳でブロッキングし、次いで、一次抗体と4℃で一晩反応させた。膜をPBST溶液で洗浄し、室温で1時間、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)がコンジュゲートされた二次抗体(抗IgG)と反応させ、フォトレジスト膜で調べた。
【００８１】
上記実施例の結果を下記において説明する。
【００８２】
CADD技術を使用しての構造ベースのインシリコスクリーニング
ドッキング計算の結果として修正された最も高い最終スコアを有する50個の化合物についての結果が得られ、その分子構造を表に示した。
【００８３】
A．化合物のスコア結果を下記表に示す。
【００８４】
【表４】
2018536638.tif 000009
【００８５】
【表５】
2018536638.tif 000010
【００８６】
B．化合物の構造についての情報を下記表に示す。
【００８７】
【表６】
2018536638.tif 000011
【００８８】
候補材料のアレルギー阻害活性のインビトロ細胞ベースの分析
A．アトピー性皮膚炎原因物質TSLPの調節因子のスクリーニング
カスパーゼ-1は、アトピー性皮膚炎原因物質である、TSLPの分泌を誘発する。TSLP調節物質を探るために、アトピー性皮膚炎の原因細胞である肥満細胞を、PKC活性化剤PMAおよびカルシウムイオノフォアA23187(PMACI)で刺激した。刺激された肥満細胞からのTSLP分泌は、非刺激細胞(ブランク)からのそれと比較して有意に増加することが分かり、様々な候補材料の効果を調べた。結果として、5182436、5211084、および5356744物質は、肥満細胞からのTSLP分泌を有意に阻害したことが分かった(図2を参照のこと)。
【００８９】
B．TSLP調節物質の細胞傷害性の検証
有効な材料の細胞傷害性を調べるために、MTT-アッセイを行い、MTT-アッセイ結果は、IPS-07002(5211084)およびIPS-07003(5356744)は10μMの濃度で細胞傷害性を示さなかったことを示した。しかしながら、IPS-07001(5182436)は10μMの濃度で細胞傷害性を示したことが確認された。様々な濃度で繰り返し行った実験の結果として、IPS-07001(5182436)は1μMまでは細胞傷害性を示さなかった(図3を参照のこと)。
【００９０】
C．TSLP産生の調節に対するIPS-07001(5182436)の効果についての反復実験
反復実験を行い、非細胞傷害性濃度でのTSLP産生の調節に対するIPS-07001の効果を調べ、反復実験結果から、IPS-07001は0.011μMの濃度でTSLP産生を有意に調節したことが確認された。IPS-07001はまたTSLP mRNA発現を有意に阻害した(図4を参照のこと)。
【００９１】
D．カスパーゼ-1活性の調節に対するIPS-07001(5182436)の効果の分析
カスパーゼ-1活性に対する#5182436の調節効果を調べるために、カスパーゼ-1アッセイを、細胞抽出物を使用して行った。結果として、IPS-07001は濃度依存様式でカスパーゼ-1活性を有意に阻害したことが分かった。加えて、IPS-07001は活性カスパーゼ-1の発現を阻害したことが分かった(図5を参照のこと)。
【００９２】
E．カスパーゼ-1活性に対するIPS-07001(5182436)の調節効果のキネティックアッセイベースの検証
カスパーゼ-1活性に対するIPS-07001の調節効果を調べるために、カスパーゼ-1アッセイを行った。結果として、IPS-07001は濃度依存様式でカスパーゼ-1活性を有意に阻害したことが分かった(図6を参照のこと)。
【００９３】
F．ヒト肥満細胞(HMC-1)中の炎症性サイトカイン産生に対する#5182436の調節効果についての実験
IPS-07001(#5182436)は、様々な炎症性サイトカインの産生およびmRNA発現を有意に阻害した(図7を参照のこと)。
【００９４】
G．DNCB適用balb/cマウスの血清中のヒスタミン、IL-4およびIgEレベルに対するIPS-07001(#5182436)の調節効果の分析
ヒスタミン、IL-4、およびIgEレベルを、DNCB適用balb/cマウス血清中において測定した。IPS-07001(#5182436)は0.011μMの濃度で血清ヒスタミン、IL-4およびIgEレベルを有意に調節したことが分かった(図8を参照のこと)。
【００９５】
H．DNCB適用balb/cマウスの背部皮膚中のカスパーゼ-1活性に対するIPS-07001(#5182436)の調節効果の分析
インビボアトピー性皮膚炎モデルにおいて、カスパーゼ-1活性に対するIPS-07001(#5182436)の調節効果を調べるために、カスパーゼ-1アッセイを、DNCB適用balb/cマウスの背部皮膚を使用して行った。結果として、IPS-07001(#5182436)は濃度依存様式でカスパーゼ-1活性を有意に阻害したことが分かった(図9を参照のこと)。
【００９６】
I．DNCB適用balb/cマウスの背部皮膚中の炎症性サイトカインに対するIPS-07001(#5182436)の調節効果の分析
炎症性サイトカインレベルを、DNCB適用balb/cマウスの背部皮膚中において分析した。IPS-07001(#5182436)は0.011μMの濃度でIL-4およびIL-6レベルを有意に調節したことが分かった(図10を参照のこと)。
【００９７】
J．DNCB適用balb/cマウスの皮膚組織中の炎症性サイトカインmRNA発現に対する#5182436の調節効果の分析
炎症性サイトカインmRNA発現がDNCB適用balb/cマウスの皮膚組織中において調節されたかどうかの分析の結果として、IPS-07001(#5182436)はアトピー性皮膚病巣中のTARC、TNF-aおよびIL-6 mRNA発現を調節したことが分かった(図11を参照のこと)。
【００９８】
接触アトピー性皮膚炎動物モデル中のアトピー関連因子に対するDNCBの調節効果の研究
A．目視観察
乾癬およびアトピー性皮膚炎は、皮膚の乾燥を示す代表的な疾患として公知である。これらの中で、特に、アトピー性皮膚炎は、皮膚の乾燥に加えて、過角化、紅斑、浮腫、重篤な痒み、滲出物、おでき、および痂皮を特徴とし、かつ、皮膚炎症など、例えば、急性期における水疱および慢性期における皮膚の肥厚のような様々な症状を伴う、皮膚疾患である(Bieber T. Atopic dermatitis. N Engl J Med. 2008;358:1483-94)。従って、本実験において、紅斑、乾燥皮膚、浮腫および表皮剥離、びらん、ならびに苔癬化に主に焦点を絞って、皮膚臨床症状を観察した。観察の結果として、明瞭な乾燥、紅斑、表皮剥離、および苔癬化が、正常対照と比較して、DNCBのみで処置された群において観察された。対照的に、紅斑を除いて、DNCB誘発皮膚症状が、デキサメタゾン処置群においてほとんど排除された。有意な視覚的変化は、試験材料処置群において0.01μMおよび0.1μMで観察されなかったが、紅斑、表皮剥離および苔癬化が、DNCB群と比較して1μMで低減した(図12を参照のこと)。
【００９９】
B．表皮厚み変化
誘発されたアトピーを有するDNCB群において、組織学的観察は、マウスの皮膚組織の過角化を示した。DNCB群の表皮厚みは87.1±13.0μmであり、これは、正常対照群のそれ、即ち、24.5±10.3μmよりも有意に高く、アトピー性皮膚炎に典型的な過角化の発生を示した。陽性対照としてのデキサメタゾン処置群は39.9±9.4μmの表皮厚みを示し、表皮層の厚みの明瞭な減少を示した。0.01μM、0.1μM、および1μMの濃度にて試験材料で処置された群において、表皮厚みは、それぞれ、70.8±4.3μm、74.4±7.1μm、および60.0±8.2μmへ減少した(図13を参照のこと)。
【０１００】
C．皮膚組織中の肥満細胞の数
アトピー性皮膚炎中の肥満細胞の脱顆粒によって分泌されるヒスタミンは、痒みの主な原因として作用しそれによって皮膚バリアを損傷しそして皮膚炎症を誘発することによって、アトピー性皮膚炎の進行において主要な役割を果たすことが公知である(Lee, E.J., G.E. Ji and M.K. Sung. 2010. Inflamm. Res. 59(10):847-854)。3週間の試験材料の適用後、0.1μM試験材料適用群(25.8±3.5, p<0.01)および1μM試験材料適用群(23.8±5.1, p<0.01)は統計的に有意な減少を示した。これらの結果はDNCB処置群のそれと類似し、これは、試験材料が肥満細胞の数を低減することによって痒みの緩和に有効であることを示している(図14を参照のこと)。
【０１０１】
D．血中IgEレベル
血清IgEの増加はアトピー性皮膚炎の指標であることが公知である。特に、IgEは、臨床的重症度と密接な相関関係を有することが公知である(M. Ban and D. Hetich, Toxicol. Lett, 118, 129 (2001)。アトピー性皮膚炎はIgE抗体応答を増加させる(Matsuda, H., Watanabe, N., Geba, G. P., Sperl, J., Tsudzuki, M. and Hiroi, J.: Int. Immunol. 9, 461 (1997)。加えて、増加したIgE産生は、増加した抗体応答および増加したIgE依存性ヒスタミン硝子体活性をもたらし、それによってヒスタミン分泌を促進する。ヒスタミンは、好酸球の浸潤を誘導すること、ならびに急性過敏症および痒みを引き起こすことが公知である(H. C. Sung, W. J. Lee, S. J. Lee, and D. W. Kim, Kor. J. Dermatol, 44, 1051 (2006)。従って、IgEの減少は、アトピー性皮膚炎の緩和の主要指標であると考えられる。本実験において、DNCB群(790.0±151.8)は、正常対照と比較してIgEレベルの70%以上の増加を示し、一方、デキサメタゾン処理群(703.8±86.5)は、僅かに減少したIgEレベルを示したが、統計的有意性は有さなかった。それぞれの濃度にて試験材料で処置された群において、0.1μM試験材料適用群(632.6±138.8, p<0.05)および1μM試験材料適用群(537.9±132.9, p<0.01)は、IgEレベルの統計的に有意な減少を示した(図15を参照のこと)。
【０１０２】
急性皮膚毒性試験
IPS-07001の毒性パターンおよび毒性強度を同定するために、0μMおよび200μMの単回経皮投与を、雌および雄SDラットの両方へ与え、次いで、死んだおよび瀕死の動物の存在および非存在、臨床症状、ならびに体重変化を14日間観察した。観察が完了した後、SDラットを剖検し、異常を各個体について調べ、それによって以下の結果が得られた。
【０１０３】
A．死亡率
死んだ動物は、試験期間中、全ての試験材料投与群において観察されなかった(表7を参照のこと)。
【０１０４】
【表７】
2018536638.tif 000012
【０１０５】
表7は試験材料での処置後の死亡率を示す。
【０１０６】
B．臨床症状
IPS-07001の投与後、皮膚病変を含む臨床症状は、0および200μM/kg bwが投与された群の雄および雌ラットの両方において観察されなかった(表8を参照のこと)。皮膚紅斑が、0μM/kgおよび200μM/kg群の各々の1匹のラットにおいて観察されたが、これは試験材料によって引き起こされたとは考えられず、症状は投与後1日以内に排除された。
【０１０７】
【表８】
2018536638.tif 000013
【０１０８】
表8は試験材料での処置によって誘発された臨床症状を示す。
【０１０９】
C．体重変化
試験材料が投与された雌および雄ラットの全ての群が、投与後の第1日に体重の減少を示した。これらの結果は、試験材料処置のプロセスにおける環境変化に起因すると考えられ、正常な体重増加パターンが第2日から示された。（表9および10）。
【０１１０】
【表９】
2018536638.tif 000014
【０１１１】
表9は試験材料で処置された雄ラット中における体重変化を示す。
a)：14時間絶食後に得られたデータ
b)：0〜14日間計算された体重増加。
【０１１２】
【表１０】
2018536638.tif 000015
【０１１３】
表10は試験材料で処置された雌ラット中における体重変化を示す。
a)：14時間絶食後に得られたデータ
b)：0〜14日間計算された体重増加。
【０１１４】
D．剖検所見
観察期間の完了後、視覚的病理検査を、生きている動物に対して行い、個体はいかなる異常も示さなかった(表11を参照のこと)。
【０１１５】
【表１１】
2018536638.tif 000016
【０１１６】
表11は試験材料処置ラット中における剖検所見を示す。
NGF：異常所見無し
a)：第15日に生きている動物において観察された。
【０１１７】
E．致死用量
試験材料の経皮投与による致死用量(LD50)は、雌および雄ラットの両方において200μM/kg/4ml bw以上であった。
【０１１８】
機構を同定するための抗体マイクロアレイシステムの確立
A．サイトカインおよびケモカイン抗体マイクロアレイタンパク質チップ
DNCBのみで処理された皮膚組織ならびにDNCBおよびIPS-07001で処理された皮膚組織の各々を破壊することによって得られた組織溶解物を、蛍光物質(Cy3またはCy5)で標識し、タンパク質発現プロファイリングを、抗体チップを使用して行った。抗体マイクロアレイタンパク質チップ分析を、ProteoChip上に固定化された抗体マップを参照して行った。26抗体固定化抗体チップ上の発現レベルを比較することによって得られた蛍光画像を図16-1に示す。INR分析結果についてのグラフを図16-2に示す。
【０１１９】
抗体チップベースのプロファイリングの結果として、皮膚組織サンプルは、増加／減少を決定するための閾値としての1±0.1の範囲を超過しなかったが、そのレベルが閾値へ最も接近した3タイプのサイトカインタンパク質、IL-6、IL-22およびIL-33の発現の減少が、皮膚組織サンプル中に見られた。
【０１２０】
Th2細胞から分泌される、IL-6は、アトピー性皮膚炎を有する患者のT細胞中において増加することが報告された(Toshitani, Akito, et al. J Invest Dermatol 100.3 (1993): 299-304)。Th17細胞中において産生される、IL-22は、炎症性皮膚疾患の発症に寄与し、炎症性疾患において重要な役割を果たすことが公知である。加えて、IL-22発現がアトピー性皮膚炎において増加したことが報告された(Cho, Kyung-Ah, et al. International immunology 24.3 (2012): 147-158)。IL-1ファミリーに属する最近公知となったサイトカインである、IL-33は、Th2型免疫応答と関連し、バリア組織の細胞中において発現される。しかしながら、アレルギー性皮膚炎症におけるその役割は十分には知られておらず、しかし、それは、アトピー性皮膚炎に関連することが強く示唆されている。最近の研究によれば、IL-33の発現が、誘発されたアトピー性皮膚炎において増加することが報告された(Savinko, Terhi, et al. Journal of Investigative Dermatology 132.5 (2012): 1392-1400)。
【０１２１】
IL-6、IL-22およびIL-33の発現はアトピー性皮膚炎の皮膚において増加し、これらはアトピー性皮膚炎の進行と密接に関連していることが報告された。本発明において、上記の3つのサイトカインは、アトピー性皮膚炎症状の緩和に起因して低減すると考えられる。
【０１２２】
B．ウエスタンブロッティング分析
DNCB単独処理皮膚組織ならびにDNCBおよびIPS-07001処理皮膚組織を破壊することによって得られた組織溶解物を、SDS-PAGEへ供し、次いで、PVDF膜へ転写し、特定のタンパク質の発現レベルを、特異的結合性抗体を使用して調べた。
【０１２３】
結果として、皮膚組織サンプルは、抗体マイクロアレイタンパク質チップ結果の増加／減少を決定するための閾値としての1±0.1の範囲を超過しなかったが、閾値へ最も接近した3つのサイトカイン、IL-6、IL-22およびIL-33についてのウエスタンブロッティングによって、タンパク質発現のレベルが僅かに変化し、しかし減少したことが分かった(図17を参照のこと)。
【０１２４】
実施例6：IPS-07004(式4)およびアトピー性皮膚炎
07001(式1)のスクリーニング後、07001の構造と類似した構造を有する化合物についての文献検索からIPS-07004を見つけ出し、Key Organics (London, UK)から購入した。
【０１２５】
(1)細胞培養：ヒト皮膚細胞株(HaCat細胞)を、37℃および5% CO2で、10% FBSを含有するRPMI中において培養した。候補材料をDMSO中に溶解し、次いで、0.22μmフィルターを使用して濾過した。得られた候補材料をDMSOで希釈し、HaCat細胞をそれで処理した。
【０１２６】
(2)細胞傷害性(MTT-アッセイ)：HaCat細胞(3 x 105細胞/ml)を1時間安定化させた後、それらを、10μMの濃度から様々に始まる候補材料で処理し、続いて、Poly(I:C)で8時間処理した。次いで、培地を新鮮な培地で置き換え、次いで、5 mg/mlのMTT溶液をそれへ添加し、肥満細胞を37℃で4時間インキュベートした。250 DMSOをHaCat細胞へ添加し、MTTホルマザンをそこから抽出し、各ウェルの吸光度を、ELISAリーダーを使用して540 nmで測定した。
【０１２７】
(3)カスパーゼ-1活性分析：
組換えカスパーゼ-1および薬物を反応させ、次いで、カスパーゼ-1アッセイキット(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)を使用して活性を測定した。
【０１２８】
実施例7：炎症性腸疾患
実験動物
6週齢雌SPF(特定病原体除去)C57BL/6マウスをDuPont Biotechから購入した。温度21±3℃、湿度50±20%、および明/暗サイクル12h/12hで維持されたHoseo University Safety Evaluation Centerの動物室中において1週間の順化期間後、マウスに飼料および水を自由に摂取させた。本動物実験における全ての手順を、Hoseo Universityの動物実験倫理委員会(HTRC-15-19、およびHTRC-16-22(2))によって承認された後に行った。
【０１２９】
群分割および腸炎の誘発
大腸炎誘発因子としてのデキストラン硫酸ナトリウム(Mpbio. com製のcat no 160110)を、飲料水中3%濃度へ希釈し、マウスへ経口投与し、腸炎を誘発した。マウスを6つの群へ分割し、DWを対照の動物へ投与し、1.0 mg/kgおよび10 mg/kgの試験材料を5週間の間1日1回実験群の動物へ経口投与した。粗製オリーブ油中に溶解されたスルファサラジン(100 mg/kg)を、陽性対照の動物へ1日1回経口投与した。急性症例において、疾患進行レベルを5日間の投与後に調べた。慢性症例において、疾患進行レベルを5日間の投与後15日および30日に調べた(参考文献：Toxicology Reports 2 (2015) 10391045 -Caryophyllene attenuates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice via modulation of gene expression associated mainly with colon inflammation)。
【０１３０】
体重測定および糞便観察
体重を試験期間中5日間以上の間に1回測定した。測定された体重を、正常対照と比較して差異がなかった場合は0ポイント、15%の体重減少率については1ポイント、510%については2ポイント、1015%については3ポイント、および>15%については4ポイントとして定量化した。糞便観察を行い、下痢の発生を調べ、その結果をスコアとして定量化した(0、正常な便；1、やや柔らかい便；2、非常に柔らかい便；3、非常に柔らかい便(規則形状無し)；4、水様便)。
【０１３１】
組織および血液サンプルの収集
直腸組織および血液を、剖検時間のそれぞれについて5匹の個体から収集した。Yuhanケタミン50（登録商標）(Yuhan Corporation, Korean)およびRompun(Bayer, USA)を3:1の比で混合し、次いで、筋肉注射によって動物を麻酔するために使用した。それぞれの麻酔された動物を開腹術へ供し、腹大動脈から血液を収集し、血液収集後、腹大動脈を切断し、静脈切開へ供し、死なせ、直腸組織を収集した。収集された組織の長さおよび重量を測定し、組織1 cm当たりの重量を計算した。収集された組織の一部を生検に使用し、その一部を分析前に液体窒素中に凍結して-70℃で保存した。
【０１３２】
組織学的検査
組織学的評価のために、直腸の一部の組織を、4%中性緩衝ホルマリン(4% NBF)中に固定し、続いて一般的な組織学的検査を行い、次いで、ミクロトームを使用して4μmの厚みへ薄切片化し、ヘマトキシリン&エオシン染色をそれにおいて行った。炎症の程度を光学顕微鏡下での観察に基づいて5つの段階(正常-0、最小限-1、軽度-2、中程度-3、および重度-4)へ分割した。
【０１３３】
上記実施例の結果を下記において説明する。
【０１３４】
IPS-07004のアトピー阻害効果
IPS-07004の場合、HaCat細胞ベースのアッセイにおいて細胞傷害性は観察されず、化合物はHMC-1細胞中において組換えカスパーゼ-1活性およびカスパーゼ-1活性の両方を阻害し、それによってアトピーを阻害することが分かった(図22〜24を参照のこと)。
【０１３５】
IPS-07001(式1)およびIPS-07004(式4)のIBD腸炎阻害効果
腸炎に対するIPS-07001およびIPS-07004の阻害効果を、上記実験方法によって構築されたDSS誘発動物モデルを使用して観察した。用量を1.0 mg/kgおよび10 mg/kgへ分割し、経口投与を行った。効能を、腸の長さに対する腸の重量の比率(wt/cm)によって分析し、重量変化、下痢、下血などによってさらに分析した。実験の結果として、2つの物質が、DSS対照と比較して10 mg/kgの用量で優れた腸炎阻害活性を示すことが分かった(図18〜20、25、27および28を参照のこと)。重量変化は正常群のそれと類似し、下血はDSS誘発群と比較して有意に減少したことが観察された(図20、26、および27を参照のこと)。この腸炎阻害機構は、インフラマソームの重要なタンパク質であるカスパーゼ-1を阻害することによって、炎症誘発機構を制御すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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