(57)【要約】本発明は、転移後のがんを予防および治療するための医薬品の調製における弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムの遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの使用を提供する。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子がクローニングされた弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９である遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの、転移後のがんを予防および治療するための医薬品の調製における使用。
【請求項２】
前記遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍが、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子がクローニングされたプラスミドを保持する弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記がんが、肺がん、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、肝がん、大腸がん、直腸がん、胃がん、食道がん、咽頭がん、白血病、リンパ腫、メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、皮膚がん、気管支がん、細気管支がん、尿道がん、腎がん、口腔がん、膣がん、胆管がん、膀胱がん又は鼻咽頭がんを含むがそれらに限定されないことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍが、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子をプラスミドにサブクローニングし、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを得て、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを電気穿孔法により弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９に形質転換させる方法で構築されたものであることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記プラスミドは、プラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴ、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１、プラスミドｐＢＲ３２２又はプラスミドｐＥＴ２３ａを含むがそれらに限定されないことを特徴とする、請求項２又は４に記載の使用。
【請求項６】
Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子がクローニングされた弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９である遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤の調製における使用。
【請求項７】
前記遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍが、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子がクローニングされたプラスミドを保持する弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９であることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍが、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子をプラスミドにサブクローニングし、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを得て、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを電気穿孔法により弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９に形質転換させる方法で構築されたものであることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記プラスミドは、プラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴ、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１、プラスミドｐＢＲ３２２又はプラスミドｐＥＴ２３ａを含むがそれらに限定されないことを特徴とする、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
投与形態は、経口投与、局所投与又は注射投与を含むがそれらに限定されないことを特徴とする、請求項１又は６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の技術分野に属し、具体的には、遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの、がんを予防および治療するための医薬品の調製における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は現在社会のヒトの健康や患者の生存を脅かす重大な病気である。世界保健機関（ＷＨＯ）の統計によると、２０１２年は、世界中で、新たにがんに罹った患者が約１４００万人であり、がんで死んだ患者が約８２０万人であった。中国の腫瘍登記センターが発表した２０１２年のデータによると、中国では、毎年新たにがんに罹る患者が約３５０万人であり、そのうち約２５０万人ががんにより死亡している。その中で、腫瘍転移はがん患者死亡の最も主な原因である。腫瘍転移は複雑で、多工程な生物学的過程であり、腫瘍患者体内のがん細胞が一定程度まで発展し、循環系によって遠くまで転移しそこで生き延びて、原発腫瘍と同種の腫瘍を形成する。転移は腫瘍の主要な悪化現象として、腫瘍患者の治療や予後に深刻な影響を与える。臨床診断で原発腫瘍と診断された際、患者の約５０％には既に転移が発生していた。腫瘍の転移は、腫瘍患者の生存を脅かす最大の敵であり、腫瘍治療の最大の障害である。現在、数多くの抗がん剤市場において、臨床最前線で使用される化学療法薬（例えばアドリアシン、ドキソルビシン、パクリタキセルなど）の多くは、腫瘍の生存、増殖、血管形成などの分野で使用され、腫瘍転移を特異性標的とする医薬品は少ない。しかも、数の少ない抗腫瘍転移薬の副作用は大きく、患者の耐薬剤性などの原因で薬効が十分発揮されていない。よって、市場での抗腫瘍転移薬は長い間、深刻な不足状態となり、腫瘍転移を治療する医薬品の開発は極めて重要な現実意義を持つ。
【０００３】
ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２は、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）の中のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する成分であり、主に３つのメチル基をヒストン３の２７番目のリジン（Ｈ３Ｋ２７）に付加することで、クロマチンの凝集に関与し、関連遺伝子（例えばがん抑制遺伝子）の転写を阻害する。研究により、ＥＺＨ２およびヒストンＨ３Ｋ２７のメチル化は、がんと密接な関係があることが分かった。ＥＺＨ２はまずリンパ腫、転移性前立腺がんおよび乳がんで高発現されており、乳がんの浸潤と関連すると発見された。また、ＥＺＨ２は、肺がん、リンパ腫、白血病、膵臓がん、子宮頸がん、大腸がん、肝がん、胃がん、メラノーマ、腎がん、膀胱がんなど多くのヒト悪性腫瘍で過剰に発現され、しかもその発現レベルが転移した腫瘍で著しく上昇しており、がん患者の予後不良と密接な関わりがある。ＥＺＨ２を標的とする医薬品の臨床前モデルでは、脳がんや前立腺がんの進行が抑制されることが示された。よって、ＥＺＨ２はがん転移治療用医薬品の潜在的な標的とすることができ、ＥＺＨ２の発現および活性を低減させることによって、ヒストンのメチル化を低下させ、がん抑制遺伝子の発現を増加させることで、腫瘍を治療することが可能となる。
【０００４】
細菌やウイルスの標的性および遺伝子組換え技術の発展に伴い、１９９０年代半ば以降、細菌による腫瘍の治療に関する研究が急増している。研究者は、サルモネラ・ティフィムリウムがとても良い遺伝子キャリアとして、マウス体内でがん細胞を標的とし且つ有効に殺すことを発見した。サルモネラ属菌はヒトや動物の腸内に寄生するグラム陰性の侵襲性細胞内通性嫌気性菌である。ＶＮＰ２０００９はｍｓｂＢ、ｐｕｒＩ遺伝子欠失の弱毒化サルモネラ・ティフィムリウム株であり、遺伝子の発現が安定であり、抗生物質に対して感受性である。ｍｓｂＢ遺伝子は、脂質を内毒素にアシル化するために必要とされ、その欠失により類脂質Ａの末端がアシル化できないため、毒性が低減される。ｐｕｒＩ遺伝子は、プリン代謝に関与し、その欠失により細菌の増殖には外因性アデニンを必要とする。ＶＮＰ２０００９は、自己誘導有機体により発生した腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）をも低減し、それによって炎症反応を低減できる。よって、その低病原性により臨床治療の安全性が高められる。ＶＮＰ２０００９は、既にがんの研究に広く利用され、メラノーマ、肺がん、大腸がん、乳がん、腎がんなど数多くの固形腫瘍のマウスモデルへ作用することができる。ＶＮＰ２０００９の腫瘍遺伝子治療のベクターとしての主な利点の１つは、腫瘍部位を的確に標的しそこに集中することが可能なことである。研究者は、数多くの固形腫瘍のマウスモデルにおいて、ＶＮＰ２０００９の腫瘍内での量が肝臓などの主要器官内における量より２００〜１０００倍高いことを発見した。ＶＮＰ２０００９は腫瘍組織酸素欠乏壊死区域に優先的に凝集し増殖し、同じ時間で、腫瘍組織内での細菌の増殖の継代数が正常組織内での継代数よりも著しく高いから、弱毒化サルモネラ菌を新規の抗がん剤や腫瘍標的治療のベクターとすることが可能である。サルモネラ菌による腫瘍増殖減速の可能なメカニズムとしては、腫瘍増殖に必要な栄養物質が細菌に消耗され、細菌により産生された酵素、例えばアスパラギナーゼが腫瘍増殖に必要なアミノ酸を消耗し尽くすこと、細菌が細胞外の微小環境へ分泌した局部毒素又は発生した腫瘍壊死因子αは、いずれも腫瘍の血管形成に影響すること、また、細菌増殖部位での非特異的炎症反応が抗腫瘍Ｔ細胞を潜在的に活性化することを含む。しかし、ＶＮＰ２０００９の腫瘍転移への阻害作用はまだ発見されていない。
【０００５】
腫瘍細胞はその高増殖率を維持するために、十分な栄養を必要とする。糖のほか、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、Ｍｅｔ）、グルタミン、アルギニンなどの需要量が特に多い。研究により、メチオニン依存性は、乳がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、腎がん、膀胱がん、メラノーマ、神経膠腫など殆どの腫瘍細胞の共通の特徴であり、正常細胞はＭｅｔ依存性を持たないことが実証された。いくつかの体内外実験により、メチオニン欠如の食事を直接することで、腫瘍細胞の増殖を遅らせることができることが相次いで実証された。しかし、食事にＭｅｔが長期間にわたって欠如や不足になると、有機体の栄養不良や代謝障害が引き起こされ、ＤＮＡが長期間にわたって低メチル化の状態にあるので、癌化を促すことになる。それで、メチオニナーゼ（Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）によりＭｅｔを特異的に分解し、体内のメチオニンを低減すれば、腫瘍細胞の増殖をより効果的に抑制し、腫瘍細胞を死滅させることができる。しかし、哺乳類動物自身はメチオニナーゼを発現しないので、外因的に投与されると、ある程度の副作用があり、身体の免疫反応をよく引き起こす。メチオニンは必須アミノ酸であり、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼによる触媒作用で、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、ＳＡＭ）を生成する。ＳＡＭは、活性化メチオニンとも呼ばれ、体内で最も重要な直接メチルドナーであり、体内のＤＮＡやタンパク質などの様々な物質のメチル転移触媒反応に関与する。その中で、ＥＺＨ２は、ＳＡＭの活性化メチルをヒストンの特定アミノ酸に転移させることができ、それによって染色体の後成的修飾に関与し、関連遺伝子の転写を阻害する。我々は、以前既にメチオニナーゼを発現する弱毒化サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍを調製し、この弱毒化サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、乳がん、膵臓がん、前立腺がんに対してアポトーシスを促すことができ、良好の抗腫瘍効果を有する。我々は既に特許出願（出願番号２０１３１００６２２５３．７、２０１３１０６８８９３６．３、２０１４１０１８３１４９．８）を提出して、そのうち２０１３１００６２２５３．７は既に特許を取得した。メチオニナーゼは、体内のメチオニンを分解しその含有量を低減し、がん細胞のアポトーシスを促すだけではなく、ＳＡＭの含有量を低減しＥＺＨ２の活性を効果的に阻害することによって、腫瘍の転移を抑制することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の解決しようとする課題は、弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムの遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの、がん転移を予防および治療するための生物医薬品の調製における用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明では、下記の技術的解決手段を採用する。
【０００８】
Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子がクローニングされた弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９である遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの、転移後のがんを予防および治療するための医薬品の調製における使用。
【０００９】
前記遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子がクローニングされたプラスミドを保持する弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９であることが好ましい。
【００１０】
ある実施形態において、前記遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子をプラスミドにサブクローニングし、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを得て、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを電気穿孔法により弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９に形質転換させる方法で構築されたものである。
【００１１】
ある実施形態において、前記プラスミドは、プラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴ、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１、プラスミドｐＢＲ３２２又はプラスミドｐＥＴ２３ａを含むが、これらに限定されない。
【００１２】
最も好ましくは、遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの構築の工程において、プラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴを用いる場合、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子をプラスミドにサブクローニングし、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを得て、その後Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを電気穿孔法により弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９に形質転換させることで、遺伝子組換え細菌を得ることである。
【００１３】
ある実施形態において、前記電気穿孔法による形質転換の条件は、電圧２４００Ｖ、抵抗４００Ω、電気容量２５μＦ、放電時間４ｍｓである。
【００１４】
ある実施形態において、前記がんは、肺がん、乳がん、前立腺がん、肝がん、膵臓がん、大腸がん、直腸がん、胃がん、食道がん、咽頭がん、白血病、リンパ腫、メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、皮膚がん、気管支がん、細気管支がん、尿道がん、腎がん、口腔がん、膣がん、胆管がん、膀胱がん又は鼻咽頭がんを含むが、これらに限定されない。
【００１５】
前記がんの予防および治療における投与形態は、複数の経路で投与することができ、経口投与、局所投与、注射投与（静脈内、腹膜内、皮下、筋肉、腫瘍内投与を含むが、これらに限定されない）等を含むが、これらに限定されない。
【００１６】
Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子がクローニングされた弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９である遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤の調製における使用。
【００１７】
前記遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子がクローニングされたプラスミドを保持する弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９であることが好ましい。
【００１８】
ある実施形態において、前記Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅおよび遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、下記方法で構築されるものである。Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子をプラスミドにサブクローニングし、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを得て、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを、大腸菌に形質転換させて精製しメチオニナーゼタンパクを得るか、電気穿孔法により弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９に形質転換させる。
【００１９】
ある実施形態において、前記プラスミドは、プラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴ、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１、プラスミドｐＢＲ３２２又はプラスミドｐＥＴ２３ａを含むが、これらに限定されない。
【００２０】
最も好ましくは、遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍ構築の過程において、プラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴを用いる場合、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子をＫｐｎ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素の切断部位においてプラスミドにサブクローニングすることによって、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを得て、その後Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを電気穿孔法により弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９に形質転換させることで、遺伝子組換え細菌を得ることである。
【００２１】
ある実施形態において、前記電気穿孔法による形質転換の条件は、電圧２４００Ｖ、抵抗４００Ω、電気容量２５μＦ、放電時間４ｍｓである。
【００２２】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤の投与形態は、複数の経路で投与することができ、経口投与、局所投与、注射投与（静脈内、腹膜内、皮下、筋肉、腫瘍内投与を含むが、これらに限定されない）等を含むが、これらに限定されない。
【発明の効果】
【００２３】
有益な効果：本発明は、従来技術に比べて、下記の有益な効果を有する。
【００２４】
（１）遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは、抗腫瘍効果を有することだけではなく、腫瘍の転移を効果的に阻害することができる。
【００２５】
（２）本発明で提供されるメチオニナーゼ発現弱毒化サルモネラ・ティフィムリウム（ＶＮＰ２０００９−Ｍ）は、メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の発現と活性を阻害することで、メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の阻害剤となり、ヒストンＨ３Ｋ２７メチル化レベルを低下し、それによって腫瘍の浸潤、転移を阻害し、悪性腫瘍、特にがんの転移を予防および治療する使用において、幅広い応用展開が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、プラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅを制限酵素で切断して同定した、１％アガロースゲルの電気泳動図である。
【図２】図２は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔでメチオニナーゼ発現を同定した結果を示す図である。
【図３】図３は、サルモネラ菌におけるメチオニナーゼ活性を検出した結果を示す図である。
【図４】図４は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌで、遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍが前立腺がん細胞の浸潤を抑制したことを検出した結果を示す（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図５】図５は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌで、メチオニナーゼが前立腺がん細胞の浸潤を抑制したことを検出した結果を示す（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図６】図６は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔで、メチオニナーゼを高発現した後の、前立腺がん細胞ＰＣ−３細胞におけるＥＺＨ２およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の発現を同定した結果を示す図である。
【図７】図７は、高速液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法により、前立腺がん腫瘍組織における遊離メチオニンの含有量を定量分析した結果を示す図である（＊、ｐ＜０．０５）。
【図８】図８は、高速液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法により、前立腺がん腫瘍組織におけるアデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の含有量を定量分析した結果を示す図である（＊＊、ｐ＜０．０１、＊、ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、ヌードマウスの体重に対するサルモネラ菌注射の影響の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、２×１０5ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後に、生体イメージングにより前立腺がんのシグナルの経時変化を観察した図である。
【図１１】図１１は、２×１０5ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後の、前立腺がんのシグナル変化の曲線図である。
【図１２】図１２は、２×１０5ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後５５日目の、前立腺がんのマウスの脊椎の腫瘤の大きさの結果を示す図である。
【図１３】図１３は、２×１０5ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後５５日目の、前立腺がんのマウスの脊椎のＨＥ染色法による病理切片の結果を示す。
【図１４】図１４は、２×１０5ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後５５日目の、前立腺がんのマウスの精巣および副精巣のＨＥ染色法による病理切片の結果を示す図である。
【図１５】図１５は、２×１０6ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後に、生体イメージングにより膵臓がんのシグナルの経時変化を観察した図である。
【図１６】図１６は、２×１０5ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後に、生体イメージングにより乳がんのシグナルの経時変化を観察した図である。
【図１７】図１７は、２×１０5ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後の、乳がんのマウスのシグナル変化の曲線図である。
【図１８】図１８は、２×１０6ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後の、乳がんのマウスの肺部のＨＥ染色法による病理切片の結果を示す。矢印先は、マウスの肺組織に乳がん腫瘍の浸潤があることを示す。
【図１９】図１９は、２×１０6ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後の、マウスの肺がんモデルの生存率を示す。
【図２０】図２０は、２×１０6ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後の、マウスの肺腫瘍の結果を示す図である。矢印先は、マウスの肺の腫瘍であることを示す。
【図２１】図２１は、２×１０5ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後の、肝がんのマウスモデルの腫瘍の大きさの結果を示す図である。
【図２２】図２２は、２×１０5ＣＦＵの投与量でサルモネラ菌を静脈内投与した後の、肝がんのマウスモデルの肺部の病理切片の結果である。矢印先は、マウスの肺組織中に肝がん腫瘍の浸潤があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
下記実施例により本発明をよりよく理解することができる。しかし、実施例に記載された内容は、本発明を説明するためのものであり、特許請求の範囲に詳しく記載された本発明を限定すべきものではなく、限定するものでもないことは、当業者は容易に理解する。
【００２８】
［実施例１］遺伝子組換え細菌の構築
（１）Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子発現プラスミドを構築する。
まず、Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ４３１３３．１）遺伝子を合成してプラスミドｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）にサブクローニングし、次に、Ｋｐｎ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素の切断部位によってプラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、ｐＳＶＳＰＯＲＴ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドを得た。具体的な構築工程は以下の通りである。
【００２９】
プラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴをＫｐｎ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩの２種類の制限酵素で切断した。２μｇのプラスミドＤＮＡ、３μＬの１０×ｂｕｆｆｅｒ、１．５μＬ  の制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ、１．５μＬの制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩに、ｄｄＨ2Ｏを添加し容量を３０μＬとし、３７℃で３時間インキュベートし、制限酵素切断システムとした。その後、制限酵素切断システムを１％アガロースゲルでの電気泳動により分離し、４．１ｋｂサイズのＤＮＡバンドを切り出し、ゲル抽出キットによりＤＮＡを精製した。
【００３０】
全遺伝子合成によりＬ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅコード領域のＤＮＡ断片を得てプラスミドｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）にサブクローニングし、Ｋｐｎ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩの２種類の制限酵素で切断した。３μｇのプラスミドＤＮＡ、３μＬの１０×ｂｕｆｆｅｒ、１．５μＬ  の制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ、１．５μＬの制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩに、ｄｄＨ2Ｏを添加し容量を３０μＬとし、３７℃で３時間インキュベートし、制限酵素切断システムとした。その後、制限酵素切断システムを１％アガロースゲルでの電気泳動により分離し、１．２ｋｂサイズのＤＮＡバンドを切り出し、ゲル抽出キットによりＤＮＡを精製した。
【００３１】
ｐＳＶＳＰＯＲＴ（Ｋｐｎ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）とＬ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅコード領域のＤＮＡ断片（Ｋｐｎ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）とを結合し、結合反応において、２μＬのベクター、６μＬの挿入断片、１μＬ  のＴ４  ＤＮＡリガーゼを加え、１６℃で１６時間インキュベートした。
【００３２】
結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ）コンピテントセルに形質転換させた。５０μＬのＤＨ５αコンピテントセルを取って氷上に置き、融解させてから、そこに５μＬの上記結合生成物を加え、軽く叩いて均一に混ぜた後、氷上に３０分間インキュベートし、４２℃で６０秒間熱処理した後、氷上に２分間静置した。５００μＬの抗生物質不含有ＬＢ液体培地を加え、３７℃で１時間振盪培養した後、アンピシリン含有ＬＢ培地プレートに塗布し、一晩培養した。
【００３３】
クローンができてから、単クローンを３ｍＬのアンピシリン含有のＬＢ培養液にピックアップし、３７℃で１６時間振盪培養し、プラスミドＤＮＡを抽出し、Ｋｐｎ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素で切断し同定を行い、陽性クローンから４．１ｋｂおよび１．２ｋｂの２本のＤＮＡバンドを得た。結果は図１に示す。さらに、シークエンシングにより陽性クローンの配列を確認したところ、完全に正しかった。
【００３４】
（２）プラスミドを保持するＶＮＰ２０００９菌およびＬ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子がクローニングされたプラスミドを保持するＶＮＰ２０００９菌の構築
ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびｐＳＶＳＰＯＲＴ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ発現プラスミドをそれぞれ電気穿孔法によりＶＮＰ２０００９菌株（ＹＳ１６４６、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０２１６５）に形質転換させ、それぞれＶＮＰ２０００９−ＶおよびＶＮＰ２０００９−Ｍと命名した。具体的な構築工程は以下の通りである。
【００３５】
コンピテントセルＶＮＰ２０００９を氷上に置き、融解させてから、予め冷却された電気穿孔用キュベットに移し、そこに２μＬのプラスミドを加え、軽く叩いて均一に混ぜ、氷上に１分間インキュベートした。電気穿孔用キュベットを電気穿孔用デバイスにいれ、電圧２４００Ｖ、抵抗４００Ω、電気容量２５μＦ、放電時間４ｍｓの条件とした。電気穿孔後、直ちに１ｍＬのＳＯＣ培地を加え、軽く均一に混ぜ、３７℃で１時間振盪培養した。ピペットでピペッティングにより菌体ペレットを均一に混ぜた後、アンピシリン含有ＬＢ−Ｏ培地プレートに塗布した。その後、プレートを３７℃のインキュベータに置き１６時間インキュベートした。ＶＮＰ２０００９−ＶおよびＶＮＰ２０００９−ＭをＬＢ−Ｏで培養後、プラスミドを抽出し、制限酵素で切断し、正しいと同定した。
【００３６】
１×１０8のサルモネラ菌を取って細胞破砕液でタンパク質を抽出し、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、定電圧、氷浴下でＰＶＤＦ膜に転写し、ＢＳＡにて室温で１時間ブロッキングした後、ＴＢＳＴにて３×５分間洗浄し、抗ウサギＬ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ抗体（１：１０００）を加え、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴにて１回ごとに５分間で３回洗浄し、さらにＨＲＰ標識抗ウサギ二次抗体（１：１００００）を加え、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴにて１回ごとに５分間で３回洗浄し、ＥＣＬ化学発光法により現像させた。結果は図２に示す。分子量約４３ｋＤに特異的なバンドがあることから、ＶＮＰ２０００９−Ｍは、ＶＮＰ２０００９とＶＮＰ２０００９−Ｖに比べてＬ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅの発現量が顕著に増加することが示された。
【００３７】
Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅとピリドキサールをそれぞれＶＮＰ２０００９−ＶおよびＶＮＰ２０００９−Ｍ菌体と混合し、３７℃で１０分間インキュベートした後、５０％のトリクロロ酢酸にて終止し、遠心分離で上清を回収し、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩水和物（ＭＢＴＨ）と均一に混ぜ、５０℃で３０分間インキュベートした後、３２０ｎｍにおける吸光度を測定し、１分間で１μｍｏｌのα−ケトブタン酸を触媒し転化する酵素量を１酵素活性単位と定義した。結果（図３）に示されるように、サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍのメチオニナーゼ活性がＶＮＰ２０００９−Ｖよりも１０倍高い。
【００３８】
［実施例２］遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの抗腫瘍転移効果。
１．  前立腺がん細胞の浸潤性に対する遺伝子組換え細菌ＶＮＰ２０００９−Ｍの影響。対数増殖期の前立腺がん細胞ＰＣ−３（アンドロゲン非依存性）を採取し、６ウェルプレートに接種し、細胞密度が７０％−８０％程度まで増加した時、それぞれ１×１０6ＣＦＵ／ウェルでＶＮＰ２０００９−ＶおよびＶＮＰ２０００９−Ｍを加えた。また、対照群を別途設けた。細菌と細胞を３０分間共培養した後、ＰＢＳで５回洗浄し、細胞をトリプシンで処理し、遠心分離により細胞を収集し計数し、５×１０4／チャンバーで細胞をｍａｔｒｉｇｅｌゲルに覆われたｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーにいれ、上層チャンバーには無血清培地を使用し、下層チャンバーにはウシ胎児血清２０％含有培地を使用した。ＰＢＳおよび培地のいずれも１２μｇ／ｍＬのペニシリン、２０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有した。細胞を３６時間培養した後、クリスタルバイオレット染色を行い、チャンバーを透過した細胞を対して撮影・細胞計数を行い、細胞計数の結果は図４に示す。＊＊＊はＰ＜０．００１である。結果に示されるように、ＶＮＰ２０００９−Ｍは前立腺がん細胞と共培養された後、チャンバーを透過した細胞数がＰＢＳ群、ＶＮＰ２０００９−Ｍ群よりも明らかに減少しており、ＶＮＰ２０００９−Ｍは腫瘍細胞の浸潤性を顕著に抑制していることがわかる。
【００３９】
２．  前立腺がん細胞の浸潤性に対するメチオニナーゼの影響。対数増殖期の前立腺がん細胞ＰＣ−３を採取し、６ウェルプレートに接種し、細胞密度が７０％−８０％程度まで増加した時、Ｒｏｃｈｅ社のトランスフェクション試薬を使用してそれぞれブランクプラスミド（ｖｅｃｔｏｒ）およびメチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）高発現プラスミドをトランスフェクションした。また、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）を別途設けた。２４時間トランスフェクションした後、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ浸潤試験を行い、操作方法は上記１と同様であった。結果は図５に示されるように、メチオニナーゼを高発現した後、チャンバーを透過した前立腺がん細胞が減少しており、細胞の浸潤性が低下していることがわかる。４８時間トランスフェクションした後、細胞総タンパク質を抽出し、ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによりヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の検出を行った。７２時間トランスフェクションした後、細胞核タンパク質を抽出し、ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによりＥＺＨ２下流の標的分子ヒストンＨ３Ｋ２７の検出を行った。結果は図６に示されるように、メチオニナーゼを高発現した後、メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の発現量が減少し、ヒストンＨ３Ｋ２７のメチル化レベルが低下しており、ＥＺＨ２の活性が顕著に低下していることがわかる。
【００４０】
３．  ２×１０6個のヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３の皮下注射。腫瘍容積が０．１〜０．２ｃｍ3になった時、担がんヌードマウスをＰＢＳ群、ＶＮＰ２０００９−Ｖ群およびＶＮＰ２０００９−Ｍ群にランダムに分けた。２×１０6ＣＦＵ／匹の投与量で腫瘍内注射による投与を行い、対照群には、同容量のＰＢＳを注射した。投与後の１０日目、ヌードマウスの腫瘍を剥ぎ、腫瘍組織タンパク質を抽出し、高速液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法により腫瘍組織における遊離メチオニンの含有量とアデノシルメチオニンの含有量を定量分析した。結果は、サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍ投与後、腫瘍組織における遊離メチオニンの含有量が明らかに減少し、ＰＢＳ群とＶＮＰ２０００９−Ｖ群の約３／４であり（図７）、アデノシンメチオニンの含有量も顕著に減少し、ＰＢＳ群とＶＮＰ２０００９−Ｖ群の約２／３である（図８）ことを示している。これらの結果により、ＶＮＰ２０００９−Ｍはとても良いＥＺＨ２阻害剤として、組織内のメチオニンとアデノシルメチオニンの含有量を有効に減らし、ＳＡＭの含有量を減らすことでＥＺＨ２の活性を有効に阻害できることが提示されている。
【００４１】
上記した実験により、ＶＮＰ２０００９−Ｍはがん細胞に侵入した後、メチオニナーゼを発現し、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の発現および活性を低下させることで、がん細胞の浸潤転移性を低下させることが提示されている。
【００４２】
４．  ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞株の構築。状態が良好で、対数増殖期にある２９３ＦＴ細胞を６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した。翌日、Ｒｏｃｈｅのトランスフェクション試薬にて２９３ＦＴ細胞をトランスフェクションした。ウェルごとに、合わせて１．５μｇのＰＬＪＭ１−ｌｕｃ、１．１２５μｇのｐｓＰＡＸ２、０．３７５μｇのＰＭＤ２．Ｇプラスミドをトランスフェクションした。４８時間トランスフェクションした後、細胞の培養上清を収集し、４℃、３０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、上清、即ちルシフェラーゼレンチウイルスを−８０℃で保存した。前立腺がん細胞ＰＣ−３、膵臓がん細胞ＣＦＰＡＣ−１をそれぞれ６ウェルプレートに接種し、翌日、ウェルごとに、１ｍｌ（約１．０×１０8感染力価）のルシフェラーゼレンチウイルスと最終濃度８μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を加えた。２４時間後、培地にプロマイシンを加えてスクリーニングを行い、２日ごとに液を交換して、２週間後、ルシフェラーゼを安定に発現する腫瘍細胞株ＰＣ−３−ｌｕｃ、ＣＦＰＡＣ−ｌｕｃを得た。
【００４３】
５．  １０％ウシ胎児血清含有Ｆ−１２Ｋ培地で細胞ＰＣ−３−ｌｕｃを培養し、５×１０5細胞／匹の投与量で尾静脈注射にてヌードマウス体内に注射した。担がんヌードマウスをＰＢＳ群、ＶＮＰ２０００９−Ｖ群、ＶＮＰ２０００９−Ｍ群にランダムに分け、各群１０匹とした。
【００４４】
６．  ＬＢ−ＯでＶＮＰ２０００９−ＶおよびＶＮＰ２０００９−Ｍを培養し、ＯＤ≒０．６の時、菌体を収集し、その後、ＰＢＳで再懸濁し、２×１０5ＣＦＵ／匹の投与量で尾静脈注射による投与を行い、対照群には、同容量のＰＢＳを注射した。投与後、ヌードマウスの活動、食事、体重を観察した。結果は図９に示されるように、細菌注射後、マウスの体重は影響を受けず、食事や糞便も異常がなかったから、ＶＮＰ２０００９−ＶおよびＶＮＰ２０００９−Ｍがヌードマウスに明らかな毒性を有しないことがわかる。
【００４５】
７．  投与後、それぞれ１ｄ、１１ｄ、２４ｄ、４４ｄおよび５６ｄに、小動物生体イメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ）にてマウスの腫瘍の転移と増殖状況を観察した。各マウスの腹腔内に１５０μｇ／ｋｇのＤ−フルオレセインカリウムを注射し、腫瘍細胞により発現されたルシフェラーゼと反応し光学シグナルを発生し、測定装置によりイメージングすることで、腫瘍細胞の箇所および量を示す。結果は図１０に示されるように、投与後１日目、各群の腫瘍のシグナル強度は殆ど同じであった。しかし、投与後１１日目から、ＰＢＳ群およびＶＮＰ２０００９−Ｖ群のマウスは、脊椎、副精巣に強いシグナルが現れ、且つ時間がたつにつれて、この２つの群のマウスは、全身のシグナルが直線的に増加した（図１１）。４５日目から、ＰＢＳ群のマウスは、脊椎に大豆粒の大きさの突起が見られ、この突起は、固くて活動度が悪いものであった。解剖したところ、ヌードマウスの脊椎に腫瘍の塊が形成され、転移した腫瘍は灰白色を呈し、腰椎表面に隆起して団塊状になり、直径が約１ｃｍであると発見した（図１２）。これに対し、ＶＮＰ２０００９−Ｍ群のマウスは、腫瘍細胞のシグナル強度がＰＢＳ群およびＶＮＰ２０００９−Ｖ群よりも明らかに低く、一部のマウスは光シグナルが検出されなかった。マウスの病理組織切片の結果（図１３）は小動物生体イメージングの結果と一致し、ＰＢＳ群およびＶＮＰ２０００９−Ｖ群のマウスの脊椎腔に未分化の上皮腫瘍細胞が密集し、乱雑に配置され、異形性が明らかで、細胞核は大きく深く染色され、細胞核に多形で量が不均衡のクロマチンがあり、一部の腫瘍細胞は既に脊椎の骨を破壊した。また、この２つの群のマウスの精巣および副精巣に大量の腫瘍細胞が浸潤している（図１４）ことが分かった。これに対し、ＶＮＰ２０００９−Ｍ群のマウスは、脊椎、精巣および副精巣に少量の腫瘍細胞が観察されただけで、一部のマウスには腫瘍細胞が観察されなかった。また、各群のマウスの肺、肝臓、腎臓などの組織に明らかな腫瘍浸潤が見られなかった。これらの結果は、サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍが該前立腺がんの骨への転移と増殖を顕著に阻害できることを提示している。
【００４６】
８．  操作方法は上記５、６および７と同様で、同じ量の膵臓がん細胞ＣＦＰＡＣ−ｌｕｃを尾静脈により注射した。モデル作製後の３日目、２×１０6ＣＦＵ／匹の投与量で尾静脈注射による投与を行い、対照群には、同容量のＰＢＳを注射した。同様にして、定期的に生体イメージングにより腫瘍転移状況を観察した。結果により、ＰＢＳ群およびＶＮＰ２０００９−Ｖ群のいずれにも強い蛍光シグナルが現れ、主に肺に現れるのに対し、ＶＮＰ２０００９−Ｍ群にはシグナルが殆ど観察されなかった（図１５）ことが分かった。これらの結果は、サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは同様に該膵臓腫瘍の転移と増殖を有効に阻害できることを提示している。
【００４７】
９．  操作方法は上記５、６および７と同様で、１．２５×１０5個の乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃを尾静脈により注射した。モデル作製後の３日目、２×１０5ＣＦＵ／匹の投与量で尾静脈注射による投与を行い、対照群には、同容量のＰＢＳを注射した。同様にして、定期的に生体イメージングにより腫瘍転移状況を観察した。結果により、ＰＢＳ群およびＶＮＰ２０００９−Ｖ群のいずれにも強い蛍光シグナルが現れ、主に肺に現れ、且つ時間がたつにつれて、シグナルの強度が顕著に増加する（図１６、図１７）ことが分かった。マウスの病理組織切片の結果は生体イメージングの結果と一致し、ＰＢＳ群およびＶＮＰ２０００９−Ｖ群の肺に腫瘍細胞の浸潤が発生し、これらの細胞核は大きく深く染色され、異形性が明らかである（図１８の矢印先は、腫瘍細胞である）。これらに対し、ＶＮＰ２０００９−Ｍ群にはシグナルが殆ど観察されず、肺病理組織切片の結果により、腫瘍細胞が明らかに減少し、ひいては腫瘍が観察されなかったことが示された。また、ＰＢＳ群のマウスの脊椎にも腫瘍転移が発生し、そのほかの組織には異常が見られなかった。これらの結果も、サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍが同様に該乳がんの転移と増殖を有効に阻害できることを提示している。
【００４８】
１０．  操作方法は上記５、６と同様にして、Ｂ６マウスの尾静脈に５×１０5個の肺がん細胞ＬＬＣを注射した。モデル作製後の３日目、２×１０6ＣＦＵ／匹の投与量で尾静脈注射による投与を行い、対照群には、同容量のＰＢＳを注射した。投与後、定期的に、マウスの体重を測り、マウスの状態を観察し、マウスの死亡時間を記録した。結果により、ＰＢＳ群はすべてのマウスが３８日後には死亡し、ＶＮＰ２０００９群は４０％のマウスが生存したのに対し、ＶＮＰ２０００９−Ｍ群は６０％のマウスが生存したと分かった。生存率の試験結果は、ＶＮＰ２０００９−Ｍががんに罹ったマウスの生存期間を顕著に延長できることをいちおう示している（図１９）。マウスを解剖したところ、ＰＢＳ群およびＶＮＰ２０００９−Ｖ群のマウスは、深刻な肺腫瘍を有するのに対し、ＶＮＰ２０００９−Ｍ群のマウスは、肺の転移病巣が対照群より明らかに小さく且つ量が少ない（図２０）ことがわかった。これらの結果は、サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍは同様に肺がんの増殖と転移を有効に阻害できることを提示している。
【００４９】
１１．  ２×１０6個ヒト高転移肝がん細胞ＨＣＣＬＭ３を皮下注射により注射した。モデル作製後の３日目、担がんヌードマウスを、ＰＢＳ群、ＶＮＰ２０００９−Ｖ群およびＶＮＰ２０００９−Ｍ群にランダムに分けた。２×１０5ＣＦＵ／匹の投与量で尾静脈注射による投与を行い、対照群には、同容量のＰＢＳを注射した。結果により、対照群のマウスは、いずれも腫瘍が正常に増殖し且つ増殖が迅速であるのに対し、サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍが投与された後のマウスは、腫瘍の増殖が停滞し、一部のマウスは腫瘍が消えた（図２１）ことが分かった。マウスの肺病理組織切片の結果により、ＰＢＳ群およびＶＮＰ２０００９−Ｖ群の肺に腫瘍細胞の浸潤が発生し、これらの細胞核は大きく深く染色され、異形性が明らかである（図２２の矢印先は、腫瘍細胞である）のに対し、ＶＮＰ２０００９−Ｍ群の肺部の腫瘍細胞は明らかに減少し、ひいては腫瘍が観察されなかったことが分かった。これらの結果も、サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９−Ｍが同様に該肝がんの転移と増殖を有効に阻害できることを提示している。
【００５０】
上記動物試験は、本発明で使用される弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９−ＭがＥＺＨ２の発現および活性を阻害することにより腫瘍の転移を阻害でき、良好な抗腫瘍効果を有することを示している。
【００５１】
本発明では、弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムＶＮＰ２０００９−Ｍは、腫瘍転移を治療する医薬品の調製に用いられることが示されており、前立腺がん、乳がん、膵臓がん、肺がんおよび肝がんのほか、肝がん、大腸がん、直腸がん、胃がん、食道がん、咽頭がん、白血病、リンパ腫、メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、皮膚がん、気管支がん、細気管支がん、尿道がん、腎がん、口腔がん、膣がん、胆管がん、膀胱がん、鼻咽頭がんおよびそのほかの様々ながんの転移にも効果を有する可能性がある。上記プラスミドは、プラスミドｐＳＶＳＰＯＲＴに限定されず、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１、プラスミドｐＢＲ３２２又はプラスミドｐＥＴ２３ａおよびＬ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ遺伝子がクローニングされた上記プラスミドも、同様の効果を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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