(57)【要約】シート状細胞成長粒子及びそれらを調製及び使用するための方法が記載されている。粒子は、パンチを使用して又は形状及びサイズが比較的均一な粒子集団を提供する他の切り抜き動作を使用して調製することができ、望ましくは複数枚の開始材料のシートの積重体と複数のパンチが採用される。シート状細胞成長足場粒子を使用して細胞化移植片及び／又は細胞馴化培地を調製することができる。【選択図】図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞成長足場粒子を調製するための方法であって、
少なくとも１つのパンチを、少なくとも１枚の細胞成長足場材料のシートを貫いて押し進めて前記シートからシート状足場粒子を切り離す段階と、
前記押し進める段階で前記シートから切り離された前記シート状足場粒子を収集する段階と、
を備えている方法。
【請求項２】
前記押し進める段階中に前記少なくとも１枚のシートへ張力を印加する段階、を更に備えている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記張力を印加する段階は、弾性部材を前記少なくとも１枚のシートに押し当てる段階を含んでいる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記押し当てる段階は、前記押し進める段階中に起こり、前記パンチを前記少なくとも１枚のシートから退かせる当該パンチの運動中には解放される、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記弾性部材は、先導端を有する弾性管状壁を備え、前記押し当てる段階は前記管状壁の前記先導端を前記少なくとも１つの層に押し当てる段階を含んでいる、請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記押し当てる段階中、前記先導端の外周は前記パンチを取り囲んでいる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
細胞成長足場粒子が前記１枚又はそれ以上のシートの少なくとも４０重量％、より好適には少なくとも５０重量％、なおいっそう好適な５０−６０重量％を構成するように行われる請求項１乃至６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記押し進める段階を複数回実施して、前記１枚又はそれ以上のシートに互いに離間されている複数孔を作成して前記細胞成長足場粒子を切り離す、上記請求項１乃至７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記孔の隣り合う孔同士は互いから少なくとも約０．１ｍｍだけ離間されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記収集する段階は、前記パンチ内の通路の中に前記シート状支持体を集める段階を含んでいる、上記請求項の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記パンチは前記少なくとも１枚のシートへ当該シートの第１面から進入し、前記収集する段階は、前記細胞成長足場粒子を前記少なくとも１枚のシートの第２面を貫き通して排出する段階を含んでいる、請求項１から請求項８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１枚のシートは少なくとも２枚のシートを積重された構成とされており、好適には２枚乃至１０枚のシートを積重された構成とされており、上記請求項１乃至１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのパンチは少なくとも２つのパンチを含んでおり、好適には２つ乃至２０のパンチを含んでいる、上記請求項１乃至１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記押し進める段階は、前記少なくとも２つのパンチを、好適には前記２つ乃至２０のパンチを、少なくとも１枚の細胞成長足場材料のシートを貫いて同時に押し進めてシート状足場粒子を前記シートから切り離す段階を含んでいる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１枚の足場材料は細胞外基質組織材料を備え、好適には該組織材料はその源組織にネイティブの１つ又はそれ以上の生理活性作用物質を保持しており、より好適には該１つ又はそれ以上の生理活性作用物質は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、軟骨由来成長因子（ＣＤＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、グリコプロテイン、プロテオグリカン、及び／又はグリコサミノグリカン、を含んでいる、上記請求項１乃至１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１枚の足場材料のシートは、組織源から単離された際にシート構造を有する膜質組織である細胞外基質組織材料を備えている、上記請求項１乃至１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
上記請求項１から請求項１６の何れか一項により調製されたシート状細胞成長足場粒子。
【請求項１８】
微粒子状細胞成長足場組成物であって、
シート状細胞成長足場粒子の集団を備え、前記粒子は切断縁によって画定される外周を有している、組成物。
【請求項１９】
前記切断縁は機械的に切断された縁である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記切断縁は熱変性コラーゲン不含有であり、コラーゲン繊維の露出した切断縁を呈している、請求項１８又は請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記粒子は、円形、卵形、又は多角形の形状を有している、請求項１８から請求項２０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記足場粒子は細胞外基質組織材料を備え、好適には該組織材料はその源組織にネイティブの１つ又はそれ以上の生理活性作用物質を保持しており、より好適には前記１つ又はそれ以上の生理活性作用物質は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、軟骨由来成長因子（ＣＤＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、グリコプロテイン、プロテオグリカン、及び／又はグリコサミノグリカン、を含んでいる、請求項１８から請求項２１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記足場粒子は膜質細胞外基質組織材料を備えている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記足場粒子は、細胞培地、血液、又は血液分画、を組み入れている、請求項１８から請求項２３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記足場粒子は乾燥状態にある、請求項１８から請求項２３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記足場粒子は凍結乾燥状態にある、請求項１８から請求項２３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物は更に細胞を備え、好適には以上に識別されている前記細胞のうちの何れか１つ又は何れかの組合せである、請求項１８から請求項２４の何れか一項に記載の組成物。  
【請求項２８】
前記組成物は更に前記足場粒子へ付着させた細胞を備え、好適には前記識別されている細胞のうちの何れか１つ又は何れかの組合せである、請求項１８から請求項２７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
シート状足場粒子は、約２０ミクロンから約２０００ミクロン、より好適には約１００ミクロンから約１０００ミクロン、なおいっそう好適には約１００ミクロンから５００ミクロン、の最大断面寸法を有しており、好適には更に前記シート状足場粒子は前記最大断面寸法より小さいシート厚さを有している、請求項１８から請求項２８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
組成物を調製するための方法であって、
細胞を懸濁液の中で上記請求項１８から請求項２９の何れか一項に記載の組成物の存在下にインキュベートして前記シート状足場粒子へ付着させる段階、
を備えている方法。
【請求項３１】
前記細胞が当該細胞に内在性の細胞外基質タンパク質を前記シート状足場粒子の中及び／又は上に堆積させた細胞化体、が形成されるよう十分に前記細胞を培養する段階を更に備えている請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養する段階は、前記細胞化体中のコラーゲンの少なくとも１％、好適には少なくとも２％、より好適には少なくとも１０％、が当該細胞に内在するよう十分に実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞を前記シート状足場粒子から又は前記細胞化体から離脱させる段階を更に備えている請求項３０から請求項３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記離脱させる段階に際し又は後に、前記細胞から単独型細胞懸濁液を形成する段階を更に備えている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記離脱させる段階は、前記シート状足場粒子又は前記細胞化体を酵素と接触させる段階を備え、好適には前記酵素はトリプシン及び／又はコラゲナーゼである、請求項３３又は請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記離脱させる段階の後、前記シート状足場粒子のレムナントを前記細胞から分離させる段階を更に備えている、請求項３３から請求項３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記インキュベートする段階中及び／又は前記培養する段階中に馴化された液体培地を収集する段階を更に備えている、請求項３０から請求項３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記液体培地を滅菌する段階を更に備えている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
患者を治療するための方法であって、上記請求項１から請求項１６の何れか一項により調製された細胞成長足場粒子、又は上記請求項１８から請求項２９の何れか一項に記載の微粒子状細胞成長足場組成物、又は上記請求項３０から請求項３８の何れか一項により調製された組成物、を前記患者へ投与する段階を備えている方法。
【請求項４０】
前記投与する段階は注入による、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
以上に識別されているものの何れかを含む、損傷組織、病変組織、又は不足組織の治療のための請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、２０１５年５月２７日出願の米国仮特許出願第６２／１６７，２６３号の恩典を主張し、同仮出願をこれにより参考文献として援用する。
【０００２】
本発明の態様は、生物製剤ベースの材料及び方法に関し、特定の態様では、細胞を含有する何らかの形態をしている医療用移植片及びそれらの調製又は使用のための材料及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞外基質及び／又は生存細胞を含む植え込み式移植片材料は知られている。特定の実践では、患者の中へ導入されることになる細胞を基体と組み合わせて細胞含有植え込み式移植片が形成されていることもある。ときにより、これらの使用は、足場材料への塗布後に細胞数を拡大させる培養期間を伴う。他の使用モードはその様な拡大を伴わない。むしろ細胞が基体へ塗布されると細胞数の拡大無しに植え込まれている。他の実践では、細胞が培養されていた培地が細胞から分離され、その後に患者へ投与されている。その様な「細胞馴化」培地は、細胞によって産生され細胞によって培地の中へ分泌される生物製剤物質であって療法上の有益性を有し得る生物製剤物質を含有している。更にまた他の形態では、細胞外基質移植片が細胞添加無しに患者へ投与されている。
【０００４】
有望性が実証されているにもかかわらず、生物製剤ベースの医療技術の臨床的実施は比較的遅れている。生物製剤ベースの医学的又は研究的技術の実践において有用である改善された及び／又は代わりの材料に対する必要性が存在する。本発明は、その特定の見地から、これらの必要性の解決に取り組んでいる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国仮特許出願第６２／１６７，２６３号
【特許文献２】米国特許第６，２０６，９３１号
【特許文献３】米国特許出願第１２／１７８，３２１（米国特許出願公開第２００８２８６２６８号）
【特許文献４】米国特許出願第１１／０５５，１８２号（米国特許出願公開第２００５０２６６５５６号）
【特許文献５】米国特許出願第１１／８３７，９９９号（米国特許出願公開第２００８００２５９５６号）
【特許文献６】米国特許第６，８６６，８４２号
【特許文献７】米国特許第７，１５５，４１７号
【特許文献８】米国特許第６，７７７，２３１号
【特許文献９】米国特許第７，５９５，０４３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃ・ヒーシェン他、ネイチャー・メディスン、７（２００１年）、第７号、８３３−８３９頁（Ｃ．Ｈｅｅｓｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（２００１），Ｎｏ．７，８３３−８３９）
【非特許文献２】Ｃ・ジョンソン他、サーキュレーション・リサーチ、９４（２００４年）、第２号、２６２−２６８頁（Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９４，（２００４），Ｎｏ．２，２６２−２６８）
【発明の概要】
【０００７】
本発明の特定の態様は、シート状細胞成長足場粒子、それらの調製及び使用のための方法、及びそれらを含む組成物に関する。１つの実施形態によれば、細胞成長足場粒子を調製するための方法が提供されている。方法は、少なくとも１つのパンチを、少なくとも１枚の細胞成長足場材料のシートを貫いて押し進めてシートからシート状足場粒子を切り離す段階と、押し進める段階でシートから切り離されたシート状足場粒子を収集する段階と、を含んでいる。その様な方法は、更に、押し進める段階中に当該少なくとも１枚のシートへ張力を印加する段階を含むことができ、張力は弾性部材を少なくとも１枚のシートに押し当てることによって印加することができる。その様な押し当てる段階は、押し進める段階中に起こり、パンチが少なくとも１枚のシートから退却する運動中は解放されるようにすることができる。弾性部材は、先導端を有し外周を画定している弾性管状壁を備え、押し当てる段階は管状壁の先導端を少なくとも１つの層に押し当てる段階を含んでいてもよい。好適な形態では、その様な方法は、２つ乃至２０のパンチの様な複数のパンチを使用して、２枚乃至２０枚のシートの様な複数枚の細胞成長足場材料のシートを同時に打ち抜かせることもできる。追加的又は代替的に、（単数又は複数の）パンチが離間された孔のパターンを（単数又は複数の）開始シートに作成するようにして、孔が間隔を空けて配置され、当該シートの一体に打ち抜かれたレムナントが残存するようにすることもできる。
【０００８】
別の実施形態では、シート状細胞成長足場粒子の集団を含んでいる微粒子状細胞成長足場組成物において、粒子が切断縁によって画定される外周を有している、微粒子状細胞成長足場組成物が提供されている。切断縁は、機械的に切られた縁であって、熱変性コラーゲン不含有でありコラーゲン繊維の露出した切断縁を呈することができるのが望ましい。好適な細胞成長足場粒子は細胞外基質組織材料を含んでおり、好適には組織材料は当該細胞外基質組織材料の源組織にネイティブの１つ又はそれ以上の生理活性作用物質を保持しており、より好適には当該１つ又はそれ以上の生理活性作用物質は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、軟骨由来成長因子（ＣＤＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、グリコプロテイン、プロテオグリカン、及び／又はグリコサミノグリカンを含んでいる。その様な足場粒子と足場細胞を含んでいる組成物も提供されている。
【０００９】
別の実施形態では、組成物を調製するための方法であって、細胞を懸濁液の中で、ここに記載のシート状細胞成長足場粒子を含む組成物の存在下にインキュベートする段階を含んでいる方法が提供されている。インキュベートする段階は、細胞が当該細胞に内在性の細胞外基質タンパク質をシート状足場粒子の中及び／又は上に堆積させた細胞化体、が形成されるよう十分に細胞を培養する段階を含むことができる。一部の形態では、培養する段階は、前記細胞化体中のコラーゲンの少なくとも１％が当該細胞に内在するよう十分に行われる。一部の形態では、方法は、更に、細胞を足場粒子又は細胞化体から離脱させて、例えば細胞の単独型細胞懸濁液を形成する段階を含んでいる。追加的又は代替的に、方法は、培養段階中に馴化された液体培地を収集して、療法利用に投じることのできる「細胞馴化培地」を提供することもできる。
【００１０】
更に他の実施形態では、患者を治療するための方法であって、ここに記載のシート状細胞成長足場粒子、ここに記載の細胞移植片、又はここに記載の馴化培地、を患者へ投与する段階を含んでいる方法が提供されている。
【００１１】
追加の実施形態並びにそれらの特徴及び利点は本明細書の記述から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】シート状細胞成長足場粒子の例示としての実施形態のデジタル画像を提供している。
【図２】シート状細胞成長足場粒子を調製するためのパンチ配列の説明図を提供している。
【図３】シート状細胞成長足場粒子を調製するための別のパンチ配列の説明図を提供している。
【図４】細胞移植片組成物の例示としての実施形態の説明図を提供している。
【図５】以下の実験の中で説明されている、ＥＣＭディスク粒子へ付着された１１日目のイヌＵＲＣの、カルセインＡＭ生死判定染色されたものを示すデジタル画像である。
【図６】以下の実験の中で説明されている、培地単独、ＥＣＭディスク粒子単独、又はＳＩＳディスク粒子上に培養された細胞、から評価した、ＭＣＰ−１、ＫＣ−Ｌｉｋｅ、及びＩＬ−８のサイトカイン分析を表すグラフを示している。
【図７】以下の実験の中で説明されている、ＥＣＭディスク粒子の、注入時に細胞を保全及び保護する能力を実証するデジタル画像を提供しており、１０００万個のＲＦＰ−ＨｅＬａ細胞＋注入可能なＥＣＭディスク粒子によって実演しＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａで画像化したものであって、（ａ）０日目の２３Ｇ針付き１ｃｃシリンジ内、（ｂ）１００μリットルを筋肉内的にＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスへ注入し、凡そ４８時間後に画像化したもの、である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の原理の理解を促すことを目的に、これより実施形態を参照してゆくことにするが、実施形態の幾つかは図面を参照しながら例示されており、特定の言葉遣いを用いて同実施形態を説明してゆく。とはいえ、それにより発明の範囲の何らの制限も意図されるものではないことを理解しておきたい。説明されている実施形態における何れかの変更及び更なる修正並びにここに記載の発明の原理の更なる適用が、本発明が関係する分野の当業者には普通に想起されることであろう。加えて、以下の詳細な説明では、材料の組成又はサイズに或いは方法を実施する形態に関係する様々な特徴について、数多くの代替形が与えられている。それぞれのその様な開示されている代替形又はその様な開示されている代替形の組合せを、以上の発明の概要に論じられているか又は以下の特許請求の範囲に示されているより一般化された特徴と組み合わせて追加の開示される実施形態をここに提供することもできるものと理解しておきたい。
【００１４】
以上に開示されている様に、本発明の態様は、例えば、医学又は研究に関係する実践で有用とされる材料及び方法に関する。特定の実施形態では、シート状細胞成長足場粒子並びにそれらの調製及び使用の方法が提供されており、例えば、組織移植片として使用できる細胞化された組成物を作る場合におけるそれらの使用、及び療法に有益に利用できる細胞馴化培地を作る場合におけるそれらの使用、が提供されている。
【００１５】
ここでの一部の実施形態では、シート状細胞成長足場粒子は、約２０ミクロンから約２０００ミクロン、又は約１００ミクロンから約１０００ミクロン、又は約１００ミクロンから５００ミクロン、の最大断面直径を有することができる。シート状足場粒子は互いに対してサイズが実質的に均一であってもよく、例えば、互いの約２０％内又は１０％内での最大断面寸法を有することもできるし、又は互いに関してサイズが異なっていてもよい（例えば、一部の小さい粒子と一部の大きい粒子を有し、おそらくは２つ又はそれ以上の実質的に均一な粒子集団であって互いに異なるサイズの集団を混合することによって作成される制御された全体的集団を有している）。好都合な形態では、粒子はシート状をしていて、約２０ミクロンから約１０００ミクロン、又は約２０ミクロンから約５００ミクロン、又は約２０ミクロンから約３００ミクロン、のシート厚さを有することができる。追加的又は代替的に、シート状粒子は、シートの平面内で考察した最大断面軸長さ（例えば高さ又は幅）をシート厚さより大きくとることができる。シート状足場粒子は、互いに関して規則的な形状又は互いに関して不規則的な形状を有することができる。特定の実施形態では、シート状足場粒子は連続曲線によって画定されている外周縁（例えば略円形又は卵形又は環状（一例として「ワッシャ」）の形状をしているシート粒子などの場合）を有することができ、他の形態では、多角形の外周縁（例えば、３つから１０の辺を有する、一例として、三角形、方形、又はそれ以外に矩形、五角形、六角形、星形、など）の形状を有することができる。例えば、シートの平面内で考察した場合の足場粒子又は組成物中足場粒子の相当な割合（例えば約２５％強）は、最大断面寸法軸について当該最大断面寸法軸に垂直に且つ最大断面寸法軸上に中心を合わせて取られた断面寸法軸の長さの約二倍以下の最大断面寸法軸を有することができ、好適には基体粒子の少なくとも約５０％がこの特徴を有するものとし、より好適には基体粒子の少なくとも約７０％がこの特徴を有するものとする。その様な微粒子状足場材料が、単独で（例えば、無細胞組織移植片材料として）又はここに論じられている細胞と組み合わせて使用されて、本発明の実施形態を構成している。
【００１６】
以上に論じられている小さいシート状の細胞成長足場粒子は、細胞成長足場材料のより大きいシートから切ることができる。特定の実施形態では、より大きい材料シートは、ここに論じられている様に組織源から採取され脱細胞化されている細胞外基質シート材料ということになる。上述の特性を有するシート状粒子は、特定の実施形態では、より大きいＥＣＭシートから、パンチ及び／又ダイの様な機械式用具を使用して機械的に切られている。望ましい実施形態では、使用される切断方法は、ここに更に詳細に論じられているネイティブな生理活性ＥＣＭ特性又はネイティブな生理活性ＥＣＭ分子が加工対象のより大きな開始ＥＣＭシートに常在している場合に、この特性又はこれらの分子を除外しないようにしている。加えて、加工対象のＥＣＭシート及び結果として得られるＥＣＭシート粒子は、保持されたネイティブの上皮基底膜をシート材料の一面又は両面に有することもでき、又は生合成的に堆積させた基底膜成分をシートの一面又は両面に有することもできる。生合成的に堆積させた非ネイティブ基底膜成分で粒子を調製するには、脱細胞化されたＥＣＭシートの一面又は両面上に上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、又は他の細胞を成長させて基底膜成分を堆積させることによってシートを馴化すればよい。次いで基底膜成分を残して細胞を除去し、次いでシートを加工してここに説明されているシート状の粒子を調製することができる。
【００１７】
図１は、より大きなＥＣＭシートからパンチで切り抜かれた例示としての小さいＥＣＭディスクのデジタル画像を提供している。見て分かる様に、例示としてのシート状足場粒子は形状が略円形で約２５０ミクロンの直径を有している。しかもシート状足場粒子は、粒子への細胞付着にとって有益となり得るコラーゲン繊維の露出した切断端を呈する切断外周縁を有している。その様な粒子が、パンチ又はパンチとダイの様な機械式切断用具を使用して摩擦やそれ以外による熱の有意生成を回避しながら切られたとき、切断外周縁は一部の実施形態では熱変性コラーゲン不含有又は実質的に不含有となれる。同様に、他の繊維質足場シート材料から切り取られたシート状粒子は、シート形成元の繊維の露出した切断端を有することができる。
【００１８】
さて図２を参照すると、パンチ及びダイ・システムを使用してシート状足場粒子を作成するための配列の或る例示としての実施形態が示されている。具体的には、細胞成長足場材料の３枚のシート１１０、１１２、及び１１４の積重体が示されている。ここに論じられている様に、シート１１０、１１２、及び１１４は概してＸ−Ｙ軸（図２の紙面でＸ軸は左右方向、Ｙ軸は手前奥方向）に敷かれているのに対し、Ｚ軸はそれらシートの平面に垂直（図２で上下方向）である。例示されている配列は３枚の細胞成長足場材料のシートを含んでいるが、１枚のシート、２枚又はそれ以上のシート、或いは特定の形態では２枚乃至１０枚のシート、を含め、他の枚数のシートを使用することもできるものと理解しておきたい。パンチヘッド１１６が、２つのパンチ１１８及び１２０の様な、複数のパンチを含んでいる。他の実施形態では、パンチ１１８及び１２０と同様の例えば２つ乃至２０のパンチをその様な配列内に使用することもできる。パンチ１１８及び１２０の周りには、弾性のスリーブ又は管１２２及び１２４（点線で図示）が取り付けられている。スリーブ１２２及び１２４は、パンチ１１８及び１２０の先導端１３０及び１３２を越えて延びているそれぞれの遠位端１２６及び１２８を有している。ＥＣＭシート１１０、１１２、及び１１４の積重体の下方には、パンチ及びダイ切り抜き動作でパンチ１１８及び１２０の一部分をそれぞれ受け入れるサイズの第１孔１３６及び第２孔１３８を有するダイ部片１３４が設置されている。使用時、パンチヘッド１１６はＥＣＭシート１１０、１１２、及び１１４の積重体に向かって（Ｚ軸に）方向づけられ、弾性スリーブ１２２及び１２４を、パンチの先導端１３０及び１３２が積重体に接触するより前に積重体に押し付けさせる。この方式では、スリーブ１２２及び１２４は、パンチ１１８及び１２０及びそれら各々のダイ孔１３６及び１３８によって切り抜かれることになっているシート１１０、１１２、及び１１４の領域を安定させ好適にも当該領域に張力を印加することができる。パンチヘッド１１６をシート１１０、１１２、及び１１４の積重体の方向へ（Ｚ軸に）動かし続け、パンチ１１８及び１２０をシート１１０、１１２、及び１１４に押し付け、引き続きダイ１３４の孔１３６及び１３８の中へ押圧して、シート状足場粒子をシート１１０、１１２、及び１１４から分断させる。シート状足場粒子は、シート１１０、１１２、及び１１４から分離された後、孔１３６及び１３８を（例えば重力の助けを借りて）通り抜け、バイアル又は他のチャンバの様な収集容器１４０に収集されることができる。例示としての実施形態では、パンチ１１８及び１２０及びそれら各々の孔１３６及び１３８は略円形であるので、結果として略円形のシート状足場粒子が形成されることになる。以上に論じられている様に、他の規則的な形状を、パンチ及び随意的には対応する形状のダイ孔を有するダイを使用して形成することもできるものと理解しておきたい。打ち抜き動作がパンチヘッド１１６をＸ軸及び／又はＹ軸に動かすことを伴う場合、ダイ１３４がパンチ１１８及び１２０とそれら各々のダイ孔１３６及び１３８の整列を維持してパンチヘッド１１６と位置合わせに動かされるようになっていてもよく、代わりに、パンチヘッド１１６側にあるパンチより多くの孔を静止ダイ１３４に設け、パンチヘッド１１６をＸ軸及び／又はＹ軸に動かして、動かされる都度そのパンチをダイの新たな孔セットの上に位置決めさせるようになっていてもよい。また同じく理解しておきたいこととして、他の動作では、パンチヘッド１１６とダイ１３４はＸ軸及びＹ軸に静止に保持されていて、シート１１０、１１２、及び１１４の積重体が、シート１１０、１１２、及び１１４の新たな領域を打ち抜かせるために打ち抜きストロークの間にＸ軸及び／又はＹ軸に動かされるようになっていてもよい。好適な実施形態ではシート１１０、１１２、及び１１４（又は提供されている任意の枚数のシート）は互いに結着されたりそれ以外に接着されたりしていないということを理解しておきたい。この様式では、それぞれのシート１１０、１１２、及び１１４から打ち抜き動作によって作成されるシート状粒子は、打ち抜き動作の間及び／又は後に互いから容易に分離する。他の実施形態では、積重体内のシートの一部又は全部を互いに結着させて、結果として多層から成るシート状細胞成長足場粒子が形成されるようにすることもできる。
【００１９】
以上に説明されている打ち抜き動作に加え、他の打ち抜き又は切り抜き動作がシート状足場粒子を作成するのに使用されてもよい。例えば、図３を参照すると、パンチシステムを使用しているシート状足場粒子を作成するための別の例示としての配列が示されている。具体的には、先と同じく細胞成長足場材料の３枚のシート１５０、１５２、及び１５４の積重体が示されている。先と同じく、例示されている配列は３枚の細胞成長足場材料のシートを含んでいるが、１枚のシート、２枚又はそれ以上のシート、或いは特定の形態では２枚乃至１０枚のシート、を含め、他の枚数のシートを使用することもできるものと理解しておきたい。パンチヘッド１５６が、２つのパンチ１５８及び１６０の様な、複数のパンチを含んでいる。他の実施形態では、例えば、パンチ１５８及び１６０と同様の２つ乃至２０のパンチをその様な配列に使用することもできる。パンチ１５８及び１６０の周りには、弾性のスリーブ又は管１６２及び１６４（点線で図示）が取り付けられている。スリーブ１６２及び１６４は、パンチ１５８及び１６０の先導端１７０及び１７２を越えて延びているそれぞれの遠位端１６６及び１６８を有している。ＥＣＭシート１５０、１５２、及び１５４の積重体の下方には、パンチ裏当て１７４が設置されている。パンチ裏当て１７４はパンチへの損傷を回避するのに十分な伸展性があるが、パンチによって裏当ての片々が切り抜かれないほどには丈夫である。パンチ１５８及び１６０は長手方向にそれらを貫いて延びているそれぞれの通路１７６及び１７８を有している。通路１７６は、先導端１７０から延びていて第１直径を有している第１部分１８０と、第２直径を有する第２部分１８２と、を有しており、第２直径は第１直径より大きい。同様に、通路１７８は、先導端１７２から延びていて第１直径を有している第１部分１８４と、第２直径を有する第２部分１８６と、を有しており、第２直径は第１直径より大きい。第１部分１８０及び１８４は形成されるべきシート状粒子の直径に対応する直径を有している。通路１７６及び１７８は、パンチヘッド１５６の壁１９２の開口部１８８及び１９０と流体連通している。使用時、パンチヘッド１５６はＥＣＭシート１５０、１５２、及び１５４の積重体に向かって方向づけられ、弾性スリーブ１６２及び１６４を、パンチの先導端１７０及び１７２が積重体に接触するより前に積重体に押し付けさせる。この方式では、スリーブ１６２及び１６４は、パンチ１５８及び１６０によって切り抜かれることになっているシート１５０、１５２、及び１５４の領域を安定させ好適にも当該領域に張力を印加することができる。パンチヘッド１５６を、シート１１０、１１２、及び１１４の積重体の方向へ動かし続け、パンチ１５８及び１６０をシート１５０、１５２、及び１５４に押し付け、それらシートを切り抜かせ、シート状足場粒子をシート１５０、１５２、及び１５４から分断させる。シート状足場粒子はパンチ動作中に通路１７６及び１７８内で、まず第１部分１８０及び１８４に収集され、複数回のパンチストローク中にこれらが満杯になった後は部分１８２及び１８６に収集される。十分な回数のパンチストロークで通路１７６及び１７８がシート状粒子で一杯になったその後、引き続く打ち抜きが一番上の粒子を開口部１８８及び１９０を通して推し進め、それら粒子はパンチヘッド１５６内のチャンバ又はそれ以外に収集されることができる。所望であれば、通路１７６及び１７８の中での及びそれら通路を通しての粒子の収集は、粒子をパンチヘッドに向けて及びおそらくはパンチヘッドの中へ引き出すようにそれら通路１７６及び１７８への真空の印加によって支援されてもよい。他の実施形態では、パンチが通路１７６及び１７８の様な内部通路又はパンチ全体を通して一定したサイズを有する通路を有している場合、粒子が１つ又はそれ以上の打ち抜きストロークを通して通路内に収集された後、例えば自動化された動作で押し出し棒をパンチヘッド１５６から先導端１７２及び１７８の方向に通路を押し通して粒子を通路から先導端１７２及び１７８の外へ射出させるようにしてもよい。その様な射出粒子は、例えば、バイアル、ビン、又は他の収集用チャンバの中へ射出されるようにしてもよい。
【００２０】
図３に示されている配列を用いての打ち抜き動作は、下向き打ち抜きストローク中にパンチヘッド１５６をＸ軸及び／又はＹ軸に、及びＺ軸に、動かすことを伴っていてもよく、代替的にはパンチヘッド１５６がＸ軸及び／又はＹ軸に静止に保たれていて、シート１５０、１５２、及び１５４の積重体と裏当て１７４が、Ｚ軸への打ち抜きストローク中にシート１１０、１１２、及び１１４の新たな領域を打ち抜かせるためにＸ軸及び／又はＹ軸に動かされるようにしてもよい。先と同じく、好適な実施形態では、シート１５０、１５２、及び１５４（又は提供されている任意の枚数のシート）は互いに結着されたりそれ以外に接着されたりしていないということを理解しておきたい。この様式では、それぞれのシート１５０、１５２、及び１５４から打ち抜き動作によって作成されるシート状粒子は、打ち抜き動作の間及び／又は後に互いから容易に分離する。他の実施形態では、積重体内のシートの一部又は全部を互いに結着させて、結果として多層から成るシート状細胞成長足場粒子が形成されるようにすることもできる。
【００２１】
ここに説明されているシート状足場粒子を調製するためのパンチ動作は、適宜、パンチヘッド、ダイ、シートの積重体、及び／又はパンチ裏当て、を動かすように及び動作させるようにコンピュータ化数値制御（ＣＮＣ）を使用する自動化された様式で行われるのが望ましい。複数の電気的にパワー供給されるリニアアクチュエータをＣＮＣ制御下に使用して打ち抜きのために必要な動作を実現させることもできる。好適な動作では、少なくとも約５０％のパンチ効率が実現され（打ち抜き動作を受けた（単数又は複数の）原シートの少なくとも約４０重量％がシート状足場粒子として回収されることを意味する）、典型的には４０％から６０％の範囲、好適には５０％から６０％の範囲のパンチ効率が実現される。パンチは、タングステンカーバイド製又は別の類似の硬質金属製であるのが望ましい。
【００２２】
以上、図２及び図３に関連付けて打ち抜き配列及び打ち抜き動作を説明してきたが、当業者には、本明細書の記述から、他の適した機械式切り抜き動作又はシート状足場粒子の調製に適した他の切り抜き動作が自明であるものと理解している。
【００２３】
以上に指摘している様に、シート状足場粒子を調製するのに使用されるシート材料は細胞外基質（ＥＣＭ）組織を備えることができる。ＥＣＭ組織は、温血脊椎動物、例えばヒツジ、ウシ、又はブタのような動物から得ることができる。例えば、適したＥＣＭ組織は、粘膜下組織、腎被膜、真皮コラーゲン、硬膜、心膜、大腿筋膜、漿膜、腹膜、又は肝臓基底膜を含む基底膜の層、を備えるものを含む。これらの目的に適う粘膜下組織材料は、例えば、小腸粘膜下組織を含む腸粘膜下組織、胃粘膜下組織、膀胱粘膜下組織、及び子宮粘膜下組織、を含む。本発明に有用な粘膜下組織を（他の関連組織と併せて）備えるＥＣＭ組織は、その様な組織源を採取し、平滑筋層、粘膜層、及び／又は組織源に起こる他の層から粘膜下組織含有基質を離層することによって得ることができる。粘膜下組織含有ＥＣＭ組織を含むＥＣＭ組織を採取するには、ブタ組織源が好適な源である。
【００２４】
ＥＣＭ材料は、本発明に使用される場合、脱細胞化され高度に純化されているのが望ましく、例えば、クックらへの米国特許第６，２０６，９３１号、又は２００８年６月２３日出願の米国特許出願第１２／１７８，３２１を公開している２００８年１１月２０日付の米国特許出願公開第２００８２８６２６８号に説明されている通りであり、それら特許全てをこれによりここに参考文献としてそっくりそのまま援用する。好適なＥＣＭ組織材料は、１グラム当たり約１２エンドトキシン活性単位（ＥＵ）未満、より好適には１グラム当たり約５ＥＵ未満、最も好適には１グラム当たり約１ＥＵ未満、のエンドトキシンレベルを示すものということになろう。追加の選好として、粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料は、１グラム当たり約１コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満、より好適には１グラム当たり約０．５ＣＦＵ未満、の汚染微生物数を有するものとすることができる。真菌レベルは同様に低いのが望ましく、例えば、１グラム当たり約１ＣＦＵ未満、又はより好適には１グラム当たり約０．５ＣＦＵ未満である。核酸レベルは、好適には約５μｇ／ｍｇ未満、より好適には約２μｇ／ｍｇ未満であり、ウイルスレベルは、好適には１グラム当たり約５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）未満、より好適には１グラム当たり約５ＰＦＵ未満である。米国特許第６，２０６，９３１号又は米国特許出願公開第２００８２８６２６８号に教示されている粘膜下組織又は他のＥＣＭ組織のこれら及び追加の性質を、本発明に使用される何れかのＥＣＭの特性とすることができる。
【００２５】
特定の実施形態では、シート材料として使用される又はシート材料中に使用されるＥＣＭ組織材料は、組織源から単離された際にシート構造を有する膜組織ということになる。単離された際のＥＣＭ組織は、完全水和時に約５０ミクロンから約２５０ミクロンの範囲にある層厚さ、より典型的には完全水和時に約５０ミクロンから約２００ミクロンの範囲にある層厚さ、を有することができるが、他の厚さを有する単離層を取得し使用することもできる。これらの層厚さは、組織源として使用される動物の種類及び年齢により変わってもよい。同じく、これらの層厚さは動物源から得られる組織の源により変わってもよい。
【００２６】
利用されるＥＣＭ組織材料は、非ランダムに配向されているコラーゲン及び／又はエラスチンの様な構造的繊維たんぱく質を含む、源組織からの構造的マイクロアーキテクチャを保持しているのが望ましい。その様な非ランダムコラーゲン及び／又は他の構造的タンパク質繊維は、特定の実施形態では、引っ張り強さに関して非等方的であるＥＣＭ組織を提供していて、よって１つの方向への引っ張り強さが少なくとも１つの他の方向への引っ張り強さと異なっている、というのであってもよい。
【００２７】
ＥＣＭ組織材料は、ＥＣＭ組織材料の源にネイティブの１つ又はそれ以上の生理活性作用物質であって加工を通してＥＣＭ組織材料中に保持される生理活性作用物質を含んでいてもよい。例えば、粘膜下組織又は他の再構築可能な（remoderable）ＥＣＭ組織材料は、限定するわけではないが、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、軟骨由来成長因子（ＣＤＧＦ）、及び／又は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の様な、１つ又はそれ以上のネイティブな成長因子を保持していてもよい。同じく、本発明に使用される場合の粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料は、限定するわけではないが、タンパク質、グリコプロテイン、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンの様な、他のネイティブな生理活性作用物質を保持していてもよい。例えば、ＥＣＭ材料は、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、サイトカイン、など、を含んでいてもよい。よって、一般的に言えば、粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料は、細胞形態学、増殖、成長、タンパク質発現又は遺伝子発現の様な、細胞応答を直接的又は間接的に生じさせる１つ又はそれ以上の生理活性成分を源組織から保持していてもよい、ということになる。
【００２８】
本発明に使用される粘膜下組織含有ＥＣＭ材料又は他のＥＣＭ材料は、何れかの適した臓器又は他の組織源、大抵は結合組織を含有する源、に由来していてもよい。本発明での使用のために加工されるＥＣＭ材料は、典型的には豊富なコラーゲンを含んでいる、最も一般的には乾燥重量ベースで少なくとも約８０重量％がコラーゲンである、ということになる。その様な天然由来ＥＣＭ材料は、大部分については、非ランダム配向コラーゲン繊維、例えば全体的には単軸又は多軸であるが規則的に配向された繊維として起こっているコラーゲン繊維、を含んでいるであろう。ネイティブな生理活性因子を保持するように加工される場合、ＥＣＭ材料はこれらの因子を固体としてコラーゲン繊維の間及び／又は上及び／又は内に散在させて保持することができる。特に、本発明での使用にとって望ましい天然由来ＥＣＭ材料は、適切な染色法を用いた光学顕微鏡検査下に容易に確定可能である有意量のその様な散在非コラーゲン性固体ということになる。その様な非コラーゲン性固体は、特定の進歩的な実施形態では、ＥＣＭ材料の乾燥重量の有意割合を占めることができ、例えば、本発明の様々な実施形態では、少なくとも約１重量％、少なくとも約３重量％、及び少なくとも約５重量％、を占めることができる。
【００２９】
本発明に使用される粘膜下組織含有ＥＣＭ材料又は他のＥＣＭ材料は、更に、血管形成特質を示し、而して当該材料を移植された宿主に血管形成を生じさせるうえで有効なものであってもよい。これに関し、血管形成とは、身体が組織への増加した血液供給を現出させるべく新しい血管を作ってゆくプロセスである。よって、血管形成性材料は、宿主組織と接触すると、当該材料の中への新しい血管の形成を促進又は後押しする。生体材料植え込みに応えた生体内血管形成を測定するための方法が近年開発された。例えば、１つのその様な方法は、材料の血管形成特質を求めるために皮下インプラントモデルを使用している。Ｃ・ヒーシェン他、ネイチャー・メディスン、７（２００１年）、第７号、８３３−８３９頁（Ｃ．Ｈｅｅｓｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（２００１），Ｎｏ．７，８３３−８３９）を参照されたし。このモデルを蛍光マイクロアンギオグラフィ技法と組み合わせれば生体材料への血管形成の定量的測測定値と定性的測定値の両方を提供することができる、Ｃ・ジョンソン他、サーキュレーション・リサーチ、９４（２００４年）、第２号、２６２−２６８頁（Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９４，（２００４），Ｎｏ．２，２６２−２６８。
【００３０】
また、その様なネイティブ生理活性成分の包含に加えて又はそれに代替して、遺伝子組み換え技術又は他の方法によって合成的に作製されたもの（例えば、ＤＮＡの様な遺伝子材料）の様な非ネイティブ生理活性成分が、本発明に使用されるＥＣＭ材用へ組み入れられてもよい。これらの非ネイティブ生理活性成分は、天然由来のタンパク質であってもよいし、又は遺伝子組み換えにより作製されたタンパク質であってＥＣＭ材料中にネイティブに起こるものに対応してはいるがおそらくは異なる種のタンパク質であってもよい。これらの非ネイティブ生理活性成分は、更に、原薬であってもよい。材料へ添加されてもよい例示としての原薬は、例えば、抗凝固剤であって一例としてヘパリン、抗生物質、抗炎症剤、血液凝固因子の様な血栓促進物質であって一例としてトロンビンやフィブリノゲンなど、及び抗増殖剤であって一例としてパクリタキセルの様なタキソール誘導体、を含む。その様な非ネイティブ生理活性成分は、ＥＣＭ材料の中へ及び／又は上へ任意の適切なやり方で組み入れることができ、数例を挙げるなら例えば表面処理（一例として噴霧）及び／又は含浸（一例として浸漬）がある。更に、これらの物質はＥＣＭ材料へ製造前の段階で適用されてもよいし、又は処置の直前に（例えばセファゾリンの様な適する抗生物質を含有する溶液中に材料を浸漬することにより）適用されてもよいし、又は患者への材料の移植中又は移植後に適用されてもよい。
【００３１】
本願の進歩的な移植片組成物は、異種移植片ＥＣＭ材料（即ち、ヒトでないドナーからの組織材料をヒトのレシピエントへという様な異種間材料）、同種移植片ＥＣＭ材料（即ち、レシピエントと同じ種のドナーからの組織材料による種間材料）、及び／又は自家ＥＣＭ移植片（即ち、ドナーとレシピエントが同一個体である場合）、を組み入れることができる。また、ＥＣＭ材料へ組み入れられる何れかの外来性生理活性物質は、ＥＣＭ材料の由来元と同じ動物種から（例えばＥＣＭ材料に対して自家性又は同種性）であってもよいし、又はＥＣＭ材料源とは異なる種から（ＥＣＭ材料に対して異種性）であってもよい。特定の実施形態では、ＥＣＭ組織材料は移植片を受け入れる患者に対して異種性であり、何れかの添加される細胞又は他の（単数又は複数の）外来性材料は移植片を受け入れる患者と同じ種から（例えば自家性又は同種性）ということになっている。例示として、ヒト患者は、外来性ヒト細胞及び／又は血清タンパク質及び／又はここに記載の他の（単数又は複数の）材料で修飾された異種性ＥＣＭ材料（例えばブタ由来、ウシ由来、又はヒツジ由来）で処置されてもよく、それら外来性材料は天然由来である及び／又は遺伝子組み換えで作製されている。
【００３２】
本発明に使用される場合、ＥＣＭ材料は、追加の非ネイティブ架橋を不含有又は本質的に不含有とすることもできるし、又は追加の架橋を含有していてもよい。その様な追加の架橋は、光架橋技法によって、又は化学的架橋剤によって、又は脱水又は他の手段によって引き起こされるタンパク質架橋によって、実現させることができる。但し、一部の特定の架橋技法、一部の特定の架橋剤、及び／又は一部の特定の架橋度は再構築可能な材料の再構築性を破壊しかねないので、再構築性の保全が所望される場合には、再構築可能ＥＣＭ材料の何れかの架橋は、材料がその再構築性の少なくとも一部を保持できる程度までで又は保持できる様式で遂行されればよい。使用されてもよい化学的架橋剤は、例えば、グルタルアルデヒドの様なアルデヒド類、カルボジイミドの様なジイミド類であって一例として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩、リボース又は他の糖類、アシルアジ化物、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、又はポリエポキシド化合物類が挙げられ、例えば、日本の大阪のナガセケミカル株式会社から商標名ＤＥＮＡＣＯＬ  ＥＸ８１０の下に入手可能なエチレングリコールジグリシジルエーテル及び同じくナガセケミカル株式会社から商標名ＤＥＮＡＣＯＬ  ＥＸ３１３の下に入手可能なグリセロールポリグリセロールエーテルの様な、ポリグリシジルエーテル類が含められる。典型的には、使用される場合にポリグリセロールエーテル類又は他のポリエポキシド化合物類は１分子当たり２から約１０のエポキシド基を有しているものということになろう。
【００３３】
ＥＣＭ材料に加えて又はＥＣＭ材料に代わるものとして、本発明に使用される足場材料は他の適した材料で構成されていてもよい。例示としての材料は、例えば、天然又は合成のポリマーから成る合成的に作製された基体を含んでいる。例示としてのポリマーは、非分解吸収性の合成生体適合性ポリマー類であって、例えば、セルロースアセテート、セルロースナイトレート、シリコン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリアミド、ポリエステル、ポリオルソエステル、ポリ無水物、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、高分子量ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、又はそれらの混合物類又はコポリマー類、など、或いは分解吸収性の合成ポリマー材料であって、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はそのコポリマー類、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ−ブチレートバレレート、ポリヒドロキシアルカノエート、又は別の生態分解性ポリマー又はその混合物、など、を含むことができる。これらの材料又は他の材料で構成された好適な足場材料は、基質への細胞侵入及び内成長を許容するように構成されている多孔質基質材料ということになろう。
【００３４】
好適なモードでは、細胞成長足場材料のシート又は複数シートは打ち抜き動作又は他の切り抜き動作中は乾燥した状態にある。例えば、細胞外基質組織材料又はここに説明されている他の材料は、凍結乾燥、空気乾燥、オーブン乾燥、真空乾燥、又は他のやり方で乾燥されて、打ち抜き動作又は切り抜き動作のための開始材料を提供することができる。一部の実施形態では、細胞外基質組織材料又は他のシート材料は、打ち抜き／切り抜き動作中は、約１５重量％未満又は約１０重量％未満の含水量を有することができる。
【００３５】
特定の形態では、本発明に使用されるシート状足場材料は、細胞との接触に先立って、細胞培地及び／又は血液若しくは血液分画で処理することができる。例えば、ここに説明されているシート状細胞成長足場粒子を調製するのに使用される細胞成長足場材料のシートは、細胞培地及び／又は血液若しくは血液分画で前処理されてもよく、パンチ動作又は他の切り抜き動作中にその様な（単数又は複数の）物質を足場材料のシートの中に組み入れ（例えば、乾燥した状態で足場材料のシートの中に組み入れられ、それが次いで乾燥状態で打ち抜かれ又は切り抜かかれ）て、シート状の粒子を作成するようにしてもよい。追加的又は代替的に、形成されたシート状粒子が細胞との接触に先立ってその様な物質で処理されてもよい。
【００３６】
細胞播種移植片組成物を調製するには、シート状足場粒子又はここに説明されているその様な粒子の集団を備える組成物を細胞調製物と組み合わせることができる。流動性移植片の場合は、（単数又は複数の）足場粒子を水性培地の様な液体培地中に懸濁させることができる。投与に先立ち、細胞及び（単数又は複数の）粒子は、一部の実践では、細胞が粒子に付着するように細胞付着期間の間はずっとインキュベートされてもよい。（単数又は複数の）粒子のサイズ及びシート形状が、好都合な懸濁及び細胞付着特性を提供し、当該特性は、細胞外基質シート材料の様な可撓性基体材料が使用されると強化される。患者へ投与する場合、（単数又は複数の）細胞播種粒子をシリンジ又は他の送達装置に装填し、移植片を移植のための目標とされる組織へ送達させることができる。例示として、図４を参照すると、シリンジ３０２に装填された流動性細胞移植片組成物３０１を含んでいる医療装置３００が示されている。細胞移植片組成物３０１は、ここに論じられているシート状足場粒子３０４と各粒子３０４へ付着させた細胞３０５の集団と、を含む複数の細胞化体３０３を含んでいる。特定の実施形態では、細胞３０５は基質粒子３０４を覆う全体的に融合性の細胞層を形成することができる。細胞化体３０３は、随意的には細胞のための栄養素を含有する水性培地の様な液体培地３０６であってヒト又は他の患者と生理的に適合性のある液体培地中に懸濁されている。細胞移植片組成物３０１は、流動性であり、シリンジ３０２のバレル３０７内に受け入れられる。プランジャー３０８が、バレル３０７内に受け入れられていて、直線的に作動させられると組成物３０１を流体連結されている針３０９を通して推し進め、その開口部３１０から出す。従って、医療装置３００を使用すれば、組成物３０１を患者の組織の中へ投与することができる。特定の好適な実施形態では、目標組織は血管再開通術の必要性があり、細胞移植片体３０３は血管を形成する能力のある細胞３０５、例えば内皮細胞又は内皮始原細胞、を含んでおり、特定の実施形態ではここに論じられている内皮コロニー形成細胞が含まれる。目標組織の中へ注入されると、基質粒子３０４は目標とされる領域内の細胞３０５の保持を支援するであろう。特に好適な実施形態では、粒子３０４はここに説明されている細胞外基質粒子である。
【００３７】
以上に開示されている様に、特定の実施形態では、細胞移植片は、細胞をシート状粒子の存在下に、粒子への細胞付着にとって十分な期間に亘ってインキュベートすることによって調製することができる。更なる実施形態では、細胞は、細胞付着にとって必要とされるより長い期間に亘って、培地中に粒子と共にインキュベートされてもよい。これらの実施形態では、細胞は足場粒子を再構築することができ、例えば、細胞にとって外来性であるコラーゲンの様な細胞外基質タンパク質を堆積させ、及び見込み的には更に足場粒子のコラーゲンの様な細胞外基質タンパク質を分解吸収することもできる。一部の形態では、足場粒子の存在下での細胞の培養は、細胞化体３１０中に存在するコラーゲンの少なくとも１％、少なくとも５％、又は少なくとも１０％が細胞に内在となるような時間に亘ることになろう。他の形態では、細胞化体中のコラーゲンのより高い割合、例えば少なくとも５０％、が細胞に内在となるようにしてもよく、又は場合によっては細胞化体３１０中に存在するコラーゲンの全量又は本質的に全量（９９．５％より上）が細胞に内在となる。その様な培養期間中は、細胞数が拡大することもあり、及び／又は分化可能な細胞の場合には、それら細胞のうち少なくとも幾らかが分化を経験することもある。例示としての培養期間は、例えば、２時間より長い、６時間より長い、又は１２時間より長いとすることができ、一部の実施形態では、培養期間は約１２時間乃至７２時間の範囲ということになろう。上記培養期間の後、細胞化体を含む組成物は、例えばここに説明されている病態を治療するために、患者へ投与することができる。
【００３８】
更に別の実施形態では、ここに説明されているインキュベーション期間及び／又は培養期間の後、細胞を細胞化体から離脱させて例えば細胞の単独型細胞懸濁液を作成することもできる。離脱は、例えば、一例としてトリプシン及び／又はコラゲナーゼの様な酵素で細胞化体を酵素的に処理することによって実現させることができる。次いで細胞を単独型細胞懸濁液の形態で患者へ投与することもできるし、又は例えばここに説明されている病態を治療するために患者へ投与するための他の移植片形態へ加工する（例えば別の足場又は複数足場上へ播種する）こともできる。所望されるなら、細胞を脱着させた後、初期シート状足場粒子の残部（存在している場合）を、単独型細胞懸濁液の投与又は他の細胞使用に先立って濾過又はそれ以外の方法で細胞から分離させることもできる。
【００３９】
追加の実施形態では、ここに説明されているシート状足場粒子は、医療用、研究用、又は他の目的用に、細胞から単離させることのできる細胞馴化培地を調製するために、懸濁培養液中に細胞成長支持体として使用することができる。シート状足場粒子の存在下に培養液を使用し、例えば細胞にそれらが対応する培養液中でシート状足場粒子の不存在下に分泌するより多量に化学誘因物質及び／又は炎症メディエーターサイトカインを分泌させることによって、細胞のセクレトームを修飾することができる、ということが発見されている。従って、本発明の実施形態は、細胞が培地の中でシート状足場粒子を備える細胞成長支持体上で培養され、そして培地が細胞から分離されるというプロセスを含んでいる。培地は、必要であれば、病原体不含有であることを確約するために処理されたうえで、例えばここに説明されている病態を治療するために患者へ投与されてもよい。
【００４０】
本発明の細胞移植片関連組成物及び方法では、広範に様々な細胞型の何れか１つ又は何れかの組合せを使用することができる。例えば、細胞は、皮膚細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肺細胞、腸間膜細胞、又は脂肪細胞、とすることができる。脂肪細胞は、大網脂肪、腹膜前脂肪、腎臓周囲脂肪、心膜脂肪、皮下脂肪、乳房脂肪、又は副睾丸脂肪、からであってもよい。特定の実施形態では、細胞は、間質細胞、幹細胞、又はそれらの組合せ、を備えていてもよい。ここでの使用に際し、「幹細胞」という用語は広義に使用され、伝統的な幹細胞、脂肪由来幹細胞、始原細胞、前始原細胞（preprogenitor cells）、貯蔵細胞、など、を含む。例示としての幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、筋前駆体幹細胞、内皮始原細胞、骨髄幹細胞、軟骨形成幹細胞、リンパ系幹細胞、間葉系幹細胞（例えば、血液、歯組織、皮膚、子宮組織、臍帯組織、胎盤組織、などに由来）、造血幹細胞、中枢神経系幹細胞、末梢神経系幹細胞、など、を含む。使用することのできる追加の例示としての細胞は、肝細胞、上皮細胞、クッパー細胞、線維芽細胞、神経細胞、心筋細胞、筋細胞、軟骨細胞、膵腺房細胞、ランゲルハンス島、骨細胞、筋芽細胞、衛星細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、胆管上皮細胞、新生細胞、及びこれらの細胞型の何れかの始原細胞を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、細胞移植片に組み入れられる細胞は、内皮始原細胞（ＥＰＣｓ）であるか又は内皮始原細胞を含んでいる。本発明での使用に好適なＥＰＣｓは、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣｓ）、特に高い増殖潜在力を有するＥＣＦＣｓである。適したその様な細胞は、例えば、２００５年２月９日出願の米国特許出願第１１／０５５，１８２号を公開している、２００５年１２月１日公開の米国特許出願公開第２００５０２６６５５６号、及び２００７年８月１３日出願の米国特許出願第１１／８３７，９９９号を公開している２００８年１月１日公開の米国特許出願公開第２００８００２５９５６号に記載されており、それら特許の各々をこれにより参考文献としてそっくりそのまま援用する。その様なＥＣＦＣ細胞は、コロニー集団とすることができ、及び／又はヒト又は他の動物の臍帯血から得ることもできる。追加的又は代替的に、内皮コロニー形成細胞は次の特性を有しており、即ち、（ａ）細胞表面抗原ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、及びＣＤ１４４を発現する、及び／又は（ｂ）ＣＤ４５及びＣＤ１４を発現しない、及び／又は（ｃ）アセチル化ＬＤＬを摂取する、及び／又は（ｄ）単一細胞からプレート播種されたときに少なくとも２０００の細胞からなる少なくとも二次コロニーへ再播種する、及び／又は（ｅ）ＨｅＬａ細胞によって発現されるものの少なくとも３４％である高レベルのテロメラーゼを発現する、及び／又は（ｆ）０．８より大きい核対細胞質比を示す、及び／又は（ｇ）約２２ミクロン未満の細胞直径を有する、という特性を有している。これらの特徴（ａ）−（ｇ）の幾つか又は全部からなる何れかの組合せが、本発明に使用されるＥＣＦＣｓを特徴づけていてもよい。
【００４２】
他の実施形態では、細胞移植片に組み入れられる細胞は、筋由来筋芽細胞及び／又は筋由来幹細胞を含む筋由来の細胞であるか又は筋由来の細胞を含んでいる。適したその様な幹細胞及びそれらを得るための方法は、例えば、米国特許第６，８６６，８４２号及び米国特許第７，１５５，４１７号に記載されており、それら特許の各々をこれによりここに参考文献としてそっくりそのまま援用する。筋由来細胞は、デスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、及び／又はＢｃｌ−２、を発現することができ、ＣＤ４５又はｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーの発現を欠くものとすることができる。
【００４３】
更に他の実施形態では、細胞移植片に組み入れられる細胞は、脂肪組織由来の幹細胞であるか又は脂肪組織由来の幹細胞を含んでいる。適したその様な細胞及びそれらを得るための方法は、例えば、米国特許第６，７７７，２３１号及び米国特許第７，５９５，０４３号に記載されており、それら特許の各々をこれによりここに参考文献としてそっくりそのまま援用する。細胞集団は、ときにより間質血管細胞群とも呼称される脂肪由来再生（幹）細胞（adipose-derived stem and regenerative cells）を含むことができ、当該細胞は、成体由来の、幹細胞、内皮始原細胞、白血球、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞を含む混合集団とすることができる。特定の形態では、本発明の細胞移植片は、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、又は筋細胞うちの２つ又はそれ以上へ分化することのできる脂肪由来細胞で調製することができ、それらを含むことができる。
【００４４】
本発明の移植片材料及び／又は細胞馴化培地であり且つ本発明の態様により調製されている移植片材料及び／又は細胞馴化培地は、広範に様々な臨床用途で、損傷組織、病変組織、又は不足組織を治療するために使用することができ、ヒト又はヒトでない動物に使用することができる。治療されるべきその様な組織は、例えば、筋組織、神経組織、脳組織、血液、心筋組織、軟骨組織、臓器組織、例えば肺組織、腎組織、又は肝組織など、骨組織、動脈又は静脈血管組織、皮膚組織、眼組織、その他、であってもよい。
【００４５】
特定の実施形態では、移植片又は馴化培地は、例えば組織の虚血を緩和するために患者での血管の形成を増進するように使用することができる。血管形成性の細胞移植片、例えば内皮コロニー形成細胞又は他の内皮始原細胞を含有する移植片の、虚血部位への直接投与が、患部での新しい血管の形成を増進し、血流又は他の転帰を改善することができる。治療されるべき虚血組織は、例えば、一例として梗塞後の虚血心筋組織、又は重症虚血肢に起こるような脚又は他の肢部の虚血組織、であってもよい。虚血組織へ投与される細胞移植片は、流動性の移植片材料、具体的にはここに開示されている注入可能な移植片材料、とすることができる。
【００４６】
移植片又は馴化培地は、更に、例えば糖尿病潰瘍や火傷などの皮膚潰瘍の様な部分又は全層真皮創傷の治癒を増進させるのに使用することができる。例示として、内皮コロニー形成細胞又は他の内皮始原細胞、又は幹細胞、又は細胞馴化培地、を含有する移植片の、その様な創傷への投与は、創傷の治癒を増進させることができる。移植片又は馴化培地のこれらの用途又は他の局所用途がここでは企図されている。
【００４７】
他の用途では、移植片又は馴化培地は、目標部位にて筋組織を生成する又は生成を促すのに使用することができ、例えば、骨格筋組織、平滑筋組織、心筋組織、又は他の組織の治療に使用できる。例示として、筋由来の筋芽細胞を含有する本発明の細胞移植片を、例えば注入によって、膀胱括約筋の様な括約筋の筋組織の中へ送達して失禁を治療することができる。
【００４８】
更に他の用途では、ここに記載の移植片は、動脈内注入のために使用することもできるし、又は培養組織（engineered tissue）のための構築ブロックとして使用することもできる。
【００４９】
本発明の態様並びにそれらの特徴及び利点のよりいっそうの理解を促すことを目的に、次の具体的な実験を提供する。この実験の記述は本発明の態様を例示するためであり本発明の態様を限定するものではないことを理解しておきたい。
【００５０】
実験
材料及び方法
［基質（ＳＩＳディスク）作製］
小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）材料を、腸から、全細胞を除去するが但し基質の天然の繊維質及び多孔質の性質を残すようなやり方で得た（米国クック・バイオテック・インク（Ｃｏｏｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））。慎重な加工が新しい細胞の内成長に利用可能な複合細胞外基質を残す。ＳＩＳ生成物の由来元の小腸の薄くしかも強い層は、密接な細胞接触を可能にさせる３次元アーキテクチャを保有し、主としてタンパク質から成る。ＳＩＳ生成物は、天然の細胞外基質成分の損失を最小限に抑えるプロセスを使用して製造される。患者の安全を確保するため、ＳＩＳ材料は、全体的な消毒、脱細胞化、及びウイルス不活化のプロセスを施される。プロセスの最終段階として、全ＳＩＳ生成物が有効な滅菌法によって滅菌される。培養ディスク基質を生成するため、多数のディスクの一定した生成を可能にさせる打ち抜きシステム（図１参照）を使用してサブミリメートルのディスクを切り取った。
【００５１】
［Ｃ−ＵＲＣｓの単離及びＳＩＳディスク上での一次培養］
地元の低費用卵巣除去去勢クリニックから、卵巣子宮摘出術のために供されたメスイヌからの完全に無傷の子宮を得た。この研究に使用される組織は、そうでなければ医療廃棄物として廃棄されたはずである。試料がラボラトリに到着し次第、卵巣を除去、廃棄し、次いで子宮を大凡１グラムの全層部分へ分けた。
【００５２】
次いで１グラム試料を、無菌のメスを使用して、≦１ｍｍ３の断片に細分化した。細断された組織を、以上に説明されている様に、酵素槽の中へ入れ３７℃で３０分間消化させた。消化が完了したところで、酵素を、培地（１０％ウシ胎児血清と０．２５％ｍｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンーＧ、及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ−ＨＧ）で中和させ、３００ｘｇで５分間遠心分離した後、新鮮な培地中に再懸濁させた。次いで内容物を、２００μｍ無菌膜を通して染色し、２５ｃｍ２のフラスコ内でプレート播種した。１４日間の培養後、ＴｒｙｐＺｅａｍ（商標）溶液（別途表明されていない限り、この研究での全試薬は米国シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から得た）を使用して細胞を継代０（Ｐ０）として分割し、標準的なトリパンブルー染料除外アッセイ及び血球計算板を使用して細胞計数及び生存率を評定した。その結果得られた細胞をイヌ子宮再生細胞（Ｃ−ＵＲＣｓ）と呼ぶことにする。
【００５３】
ＳＩＳディスクを、完全培地中に一晩インキュベートすることによって馴化させた。次いでディスクを１０ｃｍ2／ｍｌで非接着性２４ウェル・プレートへ播種した。イヌＵＲＣｓを次いで実験用ウェルへ７７００細胞／ｃｍ２で添加した。２つのプレートの各々について対照群のウェルも調製した。細胞を、３７℃、６％ＣＯ２で、緩く揺すりながら、９日間、ＵＲＣｓと共にインキュベートした。
【００５４】
３日おき（３日目、６日目、９日目）に、使用済み培地１５０μＬを取り出し、多重分析（実験の最後に施行）のために−２０℃で保存し、新鮮な完全培地で置換した。培地を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＰ−１０、ＫＣ−Ｌｉｋｅ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、及びＴＮＦ−α、について評価した。
【００５５】
［注入後の細胞完全性の評価］
これらの実験のために、赤色蛍光タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞を使用した（ＲＰＦ−ＨｅＬａ）。簡単に言うと、トリプシン処理されたＨｅＬａ細胞（２ｘ１０７）を培養物から取り出し、３００−５００ｇ、４分間、２２℃、で遠心分離した。細胞を、カルシウム及びマグネシウムを有するＰＢＳ中に再懸濁させた。ルア・ツー・ルア・シリンジコネクタを使用して、ＳＩＳ微粒子１．５ｍｌを、シリンジ間を２０回通過させることによってＰＢＳ（カルシム／マグネシウム含有）５００ｕｌと混合した。次いで、ＰＢＳ中のＲＦＰ−ＨｅＬａ細胞の体積に等しいＳＩＳ微粒子の体積分を１ｍＬシリンジへ移し、それを２方ルア・ツー・ルア・コネクタを介してシリンジ間を３−４回通過させることによってＳＩＳディスクと混合した。細胞−ＳＩＳ組合せ物大凡２００μｌを１ｍＬシリンジの一方へ移動させ、シリンジ先端キャップをルアコネクタに装着し、シリンジを３７℃のインキュベータに入れた。
【００５６】
最短３０分後、シリンジをインキュベータから取り出し、２３Ｇ針を取り付け、ＳＩＳディスク＋ＲＦＰ−ＨｅＬａ細胞１００μｌをマウスの後肢筋へ注入した。
【００５７】
結果
ＳＩＳ  ＥＣＭディスクへ付着させたＣ−ＵＲＣは、すぐに優れた形態学を示した（図２）。結果としてられた培養物中の炎症誘発性サイトカイン及び同化性サイトカイン（anabolic cytokine）の測定値は検出可能なパラメータより下のレベルを示している一方で化学誘因物質及び炎症メディエーターサイトカインはアップレギュレートされているようにみえる（図３）。ＳＩＳバイオディスク（ＳＩＳ  ＢｉｏＤｏｓｃｓ）と組み合わされたＨｅＬａ細胞は、注入後４８時間で高い生存性及び安定性を示した（図４）。
【００５８】
結論
・ＳＩＳ  ＥＣＭディスクは、細胞培養及び／又は細胞増殖のための基体において、現在のスケールアップ療法システムに勝る追加の恩恵を提供し得る基体を提供する。
・炎症誘発性サイトカインはＳＩＳ  ＥＣＭディスク上で培養された細胞からの検出可能なパラメータより下である一方、化学誘因物質及び炎症メディエーターサイトカインはアップレギュレートされているようである。
・ＳＩＳ  ＥＣＭディスクは注入に際し細胞を保護するようである。
・細胞化ＥＣＭディスクは、強化された成長因子可用性を持ち尚且つ細胞のトリプシン処理が不要な独立型細胞ベース療法としての有望性を有する。
【００５９】
本発明を記述するという文脈での、原文英語の冠詞「ａ」及び「ａｎ」並びに「ｔｈｅ」の対訳である「或る」及び「当該」という用語並びに同様の言い方の使用は、別途ここに指示されているか文脈によって明らかに矛盾していない限り、単数形及び複数形の両方に及ぶものと解釈されたい。ここでの値の範囲の列挙は、ここに別途指示されていない限り、当該範囲内に含まれるそれぞれ別々の値を個別に指す省略法として役立たせることを意図したにすぎず、それぞれ別々の値は、１つ１つがここで個々に列挙されているかのごとく本明細書に組み入れられる。ここに記載の全ての方法は、別途ここに指示されているか文脈によって明らかに矛盾していない限り、何れの適した順序で遂行されてもよい。ここに提供されているありとあらゆる例の使用又は例示を表す言葉（例えば、原文英語の「ｓｕｃｈ  ａｓ」の対訳である「○○〇の様な」）の使用は、本発明をより十分に啓発することのみを意図したものであり、別途主張されていない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の言葉は、何れかの特許請求されていない要素を本発明の実践にとって必須であるものとして示唆している、と解釈されてはならない。
【００６０】
本発明を図面に示し上記の記述中に詳細に説明してきたが、それらは本質的に例示的であって制限的ではないと考えられるべきであり、好適な実施形態を示し説明しただけであって、本発明の精神の内に入る全ての変更及び修正は保護されることが望まれるものと理解している。加えて、ここに引用されている全ての文献は、当技術における技量のレベルを示すものであり、これにより参考文献としてそっくりそのまま援用する。
【符号の説明】
【００６１】
１１０、１１２、１１４  シート
１１６  パンチヘッド
１１８、１２０  パンチ
１２２、１２４  スリーブ
１２６、１２８  スリーブの遠位端
１３０、１３２  パンチの先導端
１３４  ダイ部片
１３６、１３８  ダイ孔
１４０  収集容器
１５０、１５２、１５４  シート
１５６  パンチヘッド
１５８、１６０  パンチ
１６２、１６４  スリーブ
１６６、１６８  スリーブの遠位端
１７０、１７２  パンチの先導端
１７４  パンチ裏当
１７６、１７８  通路
１８０、１８４  第１部分
１８２、１８６  第２部分
３００  医療装置
３０１  流動性細胞移植片組成物
３０２  シリンジ
３０３  細胞化体
３０４  シート状足場粒子
３０５  細胞
３０６  液体培地
３０７  バレル
３０８  プランジャー
３０９  針
３１０  開口部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2018515295.tif 000006
【図６】
2018515295.tif 000007
【図７】
2018515295.tif 000008
【国際調査報告】
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2018515295.tif 000010
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