(57)【要約】本発明は、４Ｄ５抗体骨格またはヒト生殖細胞系ＶＨ３ドメインに対して少なくとも１つの修飾を含む単一ドメイン抗体に関し、この修飾は、Ｈ３５Ｄ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｖ、Ｓ９３Ｇ、およびＷ１０３Ｒからなる群から選択され、位置の付番はカバット付番方式に従う。ジスルフィドを含まないバリアントは、Ｃ２２Ｓ、Ａ２４Ｉ、Ａ２４Ｌ、およびＣ９２Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの追加の修飾を、Ｃ２２ＳおよびＣ９２Ｔの少なくとも一方が存在するという条件でさらに含む。単一ドメイン抗体を含むマルチモジュール型抗体分子および抗体結合体、ならびにそれらを産生する方法がさらに包含される。具体的には、本発明は、この単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子のライブラリー、ならびに抗原と結合する抗体を選択するための方法を提供する。
2018500879.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト生殖細胞系ＶＨドメインまたはＶＨドメインファミリー共通配列に対して少なくとも１つの修飾を含む免疫グロブリンＶＨドメインであり、前記修飾がＨ３５Ｄ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｖ、Ｓ９３Ｇ、およびＷ１０３Ｒからなる群から選択され、位置の付番がカバット付番方式に従う、単一ドメイン抗体。
【請求項２】
前記ヒト生殖細胞系ＶＨドメインまたは前記ＶＨドメインファミリー共通配列に対して少なくとも１つの追加の修飾をさらに含み、前記修飾が、Ｃ２２ＳおよびＣ９２Ｔの少なくとも一方が存在するという条件でＣ２２Ｓ、Ａ２４Ｉ、Ａ２４Ｌ、およびＣ９２Ｔからなる群から選択され、位置の付番がカバット付番方式に従う、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
４Ｄ５抗体骨格またはヒト生殖細胞系ＶＨ３ドメインをベースにしている、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ａ．アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦ−（Ｘａａ）ｎ−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ−（Ｘａａ）ｐ−ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴ−Ｘａａ−ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ−Ｘａａ−（Ｘａａ）ｑ−Ｙ−Ｘａａ−ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）を有し、Ｈ３５Ｄ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｖ、Ｓ９３Ｇ、およびＷ１０３Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含むか、または
ｂ．アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳ−Ｘａａ−Ａ−Ｘａａ−ＳＧＦ−（Ｘａａ）ｎ−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ−（Ｘａａ）ｐ−ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴ−Ｘａａ−ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ−Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｘａａ）ｑ−Ｙ−Ｘａａ−ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）を有し、Ｈ３５Ｄ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｖ、Ｓ９３Ｇ、およびＷ１０３Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの修飾と、Ｃ２２ＳおよびＣ９２Ｔの少なくとも一方が存在するという条件でＣ２２Ｓ、Ａ２４Ｉ、Ａ２４Ｌ、およびＣ９２Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの修飾とを含み、
式中、ｎ、ｐ、およびｑのそれぞれが、独立して０または１〜３０の整数であり、位置の付番がカバット付番方式に従う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ａ．に記載の前記抗体が分子内ジスルフィド架橋を有し、かつｂ．に記載の前記抗体が分子内ジスルフィド架橋を有さない、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体を含むマルチモジュール型抗体分子であって、単一、二重、もしくは多重特異性であり、または一価、二価、もしくは多価であり、または、前記の両方である、マルチモジュール型抗体分子。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体または請求項６に記載のマルチモジュール型抗体分子と、治療薬、検出マーカ、任意の他のペイロード分子、またはそれらの組合せとを含む、抗体結合体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体または請求項６に記載のマルチモジュール型抗体分子のライブラリーであって、各抗体が、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔ−Ｘａａ−Ｉ−Ｄ（配列番号３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、Ｒ−Ｉ−Ｘａａ−Ｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇ−Ｘａａ−Ｔ−Ｘａａ−Ｙ（配列番号４）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、Ｒ−（Ｘａａ）ｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｄ（配列番号５）（式中、ｎは６〜２０の整数である）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３とを含む、ライブラリー。
【請求項９】
ファージディスプレイライブラリーである、請求項８に記載のライブラリー。
【請求項１０】
抗原に結合する抗体分子を選択する方法であって、
ａ．請求項８または９に記載のライブラリーを準備するステップと、
ｂ．前記ライブラリー中の１または複数の抗体分子が前記抗原と結合するように、前記ライブラリーを前記抗原と接触させるステップと、
ｃ．前記抗原と結合する前記抗体分子をコードする核酸を選択するステップと
を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする核酸分子。
【請求項１２】
ベクター中に含まれる、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体、請求項６に記載のマルチモジュール型抗体分子、請求項７に記載の抗体結合体、または請求項１１もしくは１２に記載の核酸分子と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項７に記載の抗体結合体を対象の細胞、腫瘍、組織、または器官に送達するための方法であって、前記対象に前記抗体結合体の有効量を投与するステップを含み、それに含まれる前記抗体が前記細胞、腫瘍、組織、または器官の抗原に特異的である、方法。
【請求項１５】
対象における障害または疾患を診断するための方法であって、前記対象に請求項７に記載の抗体結合体または請求項１３に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含み、前記抗体が検出マーカと連結しており、前記対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、方法。
【請求項１６】
対象における障害または疾患を治療するための方法であって、前記対象に請求項１〜５のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体、請求項６に記載のマルチモジュール型抗体分子、請求項７に記載の抗体結合体、請求項１１もしくは１２に記載の核酸分子、または請求項１３に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含み、前記対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載の核酸分子または請求項１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体または請求項６に記載のマルチモジュール型抗体分子を産生する方法であって、前記単一ドメイン抗体または前記マルチモジュール型抗体分子をコードする核酸を、前記核酸の発現を可能にする条件下で発現させるステップを含む、方法。
【請求項１９】
前記単一ドメイン抗体または前記マルチモジュール型抗体分子が宿主細胞または無細胞系中で発現される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単一ドメイン抗体、請求項６に記載のマルチモジュール型抗体分子、請求項７に記載の抗体結合体、請求項１１もしくは１２に記載の核酸分子、または請求項１３に記載の医薬組成物の、障害または疾患を診断または治療するための方法における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、単一ドメイン抗体に関する。より詳細には、本発明は、抗体ＶＨドメインをベースに構築された安定化かつ自律性単一ドメイン抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
製薬業界は、およそ６０００億米ドルの市場であり、そのうちの１０００億米ドルは、今までに認可された約２００種類の生物製剤によるものである。抗体をベースに作られる製品が、この生物製剤市場の約４０％であり、モノクローナル抗体のリツキサン（非ホプスキンスリンパ腫の治療用）、ハーセプチン（乳癌）、およびアバスチン（様々な癌）などの幾つかのブロックバスターが、毎年約１００億米ドルの売上高である（非特許文献１）。それらの用途は、広範囲の疾患を含むようにだけではなく、最も効果的な方法でこれらを標的にする様々な形態を含むように、引き続き広がっている。依然として全長ＩｇＧが標準であるが、抗体フラグメント、抗体−薬物結合体、および二重特異的抗体が、抗体を用いた治療の最先端を発展させる最も期待される取組みに含まれている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。大部分が依然として未達成のままである１つの分野は、抗体による細胞内標的の標的化であるが、幾つかの成功が報告されている（非特許文献５）。
【０００３】
ＶＨドメインは、ヒト免疫グロブリン重鎖の可変ドメインである。これらは、バインダーの作製および薬学的応用の可能性を有する。小型サイズのＶＨドメインは、高い腫瘍浸潤、血流からの速やかなクリアランスを可能にし、これらＶＨドメインを、いわゆる隠れたエピトープを標的とする優れた候補にする（非特許文献６；非特許文献７）。隠れたエピトープとはすなわち、インタクト抗体にとってアクセスしにくいウィルス表面の抗原に存在する狭い腔である。しかしながら、これらの骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の開発は、インタクト抗体中に存在する軽鎖との相互作用の安定化が損なわれることを主な原因とする不十分な安定性によって妨げられてきた（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００４】
ＶＨドメインを安定化する以前の試みは、幾つかの成功をもたらした。ウィンター  Ｇ（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．）およびその同僚は、熱に強くかつｉｎ  ｖｉｔｒｏで可逆的な折りたたみを示すＶＨドメインを同定する方法を開発した（非特許文献８）。この方法を使用して、ウィンター  Ｇ（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．）およびその同僚は、βラタクタマーゼに結合したドメイン抗体を同定した（非特許文献９）。ディミトロフ  Ｄ．Ｓ．（Ｄｉｍｉｔｒｏｖ  Ｄ．Ｓ．）およびその同僚は、良好な安定性を有する自律性ＶＨドメインを偶然に同定した。この骨格を使用して、ディミトロフ  Ｄ．Ｓ．（Ｄｉｍｉｔｒｏｖ  Ｄ．Ｓ．）およびその同僚は、ドナー由来のヒトＣＤＲのグラフトに基づくファージディスプレイライブラリーを作製し、牛痘タンパク質Ｂ５Ｒ、ＩＧＦ−１、およびＩＧＦ−２に対するバインダーを同定することを可能にした（非特許文献１０；非特許文献１１）。サイデュ  Ｓ．Ｓ．（Ｓｉｄｈｕ  Ｓ．Ｓ．）およびその同僚は、４Ｄ５抗体（トランスツズマブ）ＶＨドメインの安定化を試み、自律性の折りたたみおよび安定性を可能にする変異を同定した。この骨格を使用して合成ファージディスプレイライブラリーを作製した場合、ＶＥＧＦに対するバインダーを同定することができる。しかしながら、この分子は特殊な方法で標的に結合した。すなわち、その結合の大部分は、ＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、および−Ｈ３からなる通常の抗体結合部位ではなく、ＣＤＲ−Ｈ３および先の軽鎖相互作用表面によってもたらされた（非特許文献６；非特許文献１２）。
【０００５】
さらに、自律性で安定なＶＨドメインの作製の進歩にもかかわらず、細胞内用途に使用することができる安定でジスルフィドを含まないＶＨドメインの作製には成功していない
。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１０年、第２８巻、ｐ．９１７〜９２４
【非特許文献２】バイルン（Ｂｙｒｎｅ）ら著、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１３年、第３１巻、ｐ．６２１〜６３２
【非特許文献３】ゾロット（Ｚｏｌｏｔ）ら著、ネイチャー・レヴュー・ドラッグ・ディスカバリー（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ）、２０１３年、第１２巻、ｐ．２５９〜２６０
【非特許文献４】ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）著、ｍＡｂｓ、２０１０年、第２巻、ｐ．７７〜８３
【非特許文献５】ホン（Ｈｏｎｇ）およびゼン（Ｚｅｎｇ）著、フェブス・レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ）、２０１４年、第５８８巻、ｐ．３５０〜３５５
【非特許文献６】バーテレミ（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ）ら著、生化学学会誌（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、２００８年、第２８３巻、ｐ．３６３９〜３６５４
【非特許文献７】ホリンガー（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ）およびハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００５年、第２３巻、ｐ．１１２６〜１１３６
【非特許文献８】ジェスパース（Ｊｅｓｐｅｒｓ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００４年、第２２巻、ｐ．１１６１〜１１６５
【非特許文献９】クリスト（Ｃｈｒｉｓｔ）ら著、プロテイン・エンジニアリング・デザイン・アンド・セレクション：ＰＥＤＳ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ：ＰＥＤＳ）、２００７年、第２０巻、ｐ．４１３〜４１６
【非特許文献１０】チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）、２００８年、第３８２巻、ｐ．７７９〜７８９
【非特許文献１１】チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、モレキュラー・イミュノロジー（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２０１０年、第４７巻、ｐ．９１２〜９２１
【非特許文献１２】マー（Ｍａ）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）、２０１３年、第４２５巻、ｐ．２２４７〜２２５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、既存の手法の欠点を克服する安定化された抗体に対する当技術分野のニーズは依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の発明者らは、前記ニーズを本発明の単一ドメイン抗体の提供によって満たし得ることを発見した。
第１の態様において、本発明は単一ドメイン抗体に関し、その抗体は、ヒト生殖細胞系ＶＨドメインまたはＶＨドメインファミリー共通配列に対して少なくとも１つの修飾を含む免疫グロブリンＶＨドメインであり、この修飾はＨ３５Ｄ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｖ、Ｓ９３Ｇ、およびＷ１０３Ｒからなる群から選択され、位置の付番はカバット（Ｋａｂａｔ）付番方式に従う。
【０００９】
様々な実施形態において、この抗体は、ヒト生殖細胞系ＶＨドメインまたはＶＨドメインファミリー共通配列に対して少なくとも１つの追加の修飾をさらに含み、その修飾は、
Ｃ２２ＳおよびＣ９２Ｔの少なくとも一方が存在するという条件でＣ２２Ｓ、Ａ２４Ｉ、Ａ２４Ｌ、およびＣ９２Ｔからなる群から選択され、位置の付番はカバット付番方式に従う。
【００１０】
様々な実施形態において、この抗体は、４Ｄ５抗体骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）またはヒト生殖細胞系ＶＨ３ドメインをベースにしている。
様々な実施形態において、この抗体は、アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦ−（Ｘａａ）ｎ−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ−（Ｘａａ）ｐ−ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴ−Ｘａａ−ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ−Ｘａａ−（Ｘａａ）ｑ−Ｙ−Ｘａａ−ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）を有し、その抗体が、Ｈ３５Ｄ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｖ、Ｓ９３Ｇ、およびＷ１０３Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含むか、またはアミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳ−Ｘａａ−Ａ−Ｘａａ−ＳＧＦ−（Ｘａａ）ｎ−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ−（Ｘａａ）ｐ−ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴ−Ｘａａ−ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ−Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｘａａ）ｑ−Ｙ−Ｘａａ−ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）を有し、その抗体が、Ｈ３５Ｄ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｖ、Ｓ９３Ｇ、およびＷ１０３Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの修飾と、Ｃ２２ＳおよびＣ９２Ｔの少なくとも一方が存在するという条件でＣ２２Ｓ、Ａ２４Ｉ、Ａ２４Ｌ、およびＣ９２Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの修飾とを含み、式中、ｎ、ｐ、およびｑのそれぞれは、独立して０または１〜３０の整数であり、位置の付番はカバット付番方式に従う。
【００１１】
様々な実施形態において、その抗体は、１個の分子内ジスルフィドを有するか、または分子内ジスルフィドを有さない。
第２の態様において、本発明は、単一ドメイン抗体を含むマルチモジュール型抗体分子を対象とし、その分子は、単一、二重、もしくは多重特異性であり、かつ／または一価、二価、もしくは多価である。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子と、治療薬、検出マーカ、任意の他のペイロード分子、またはそれらの組合せとを含む、抗体結合体を包含する。
【００１３】
第４の態様において、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子のライブラリーを提供する。各抗体は、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔ−Ｘａａ−Ｉ−Ｄ（配列番号３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、Ｒ−Ｉ−Ｘａａ−Ｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇ−Ｘａａ−Ｔ−Ｘａａ−Ｙ（配列番号４）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、Ｒ−（Ｘａａ）ｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｄ（配列番号５）（式中、ｎは６〜２０の整数である）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３とを含む。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、抗原に結合する抗体分子を選択する方法を提供し、前記方法は、ａ．本発明のライブラリーを準備するステップと、ｂ．このライブラリー中の１または複数の抗体分子が抗原と結合するように、ライブラリーを抗原と接触させるステップと、ｃ．抗原と結合する抗体分子をコードする核酸を選択するステップとを含む。
【００１５】
第６の態様において、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を提供する。
様々な実施形態において、この核酸分子はベクター中に含まれる。
第７の態様において、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体、マルチモジュール型抗体分子、抗体結合体、または核酸分子と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００１６】
第８の態様において、本発明は、本発明の抗体結合体を対象の細胞、腫瘍、組織、または器官に送達するための方法であって、前記対象に抗体結合体の有効量を投与するステップを含み、それに含まれる抗体はその細胞、腫瘍、組織、または器官の抗原に特異的である、方法を提供する。
【００１７】
第９の態様において、本発明は、対象における障害または疾患を診断するための方法であって、前記対象に本発明の抗体結合体またはその医薬組成物の有効量を投与するステップを含み、抗体は検出マーカと連結しており、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである、方法を提供する。
【００１８】
第１０の態様において、本発明は、対象における障害または疾患を治療するための方法であって、前記対象に本発明の抗体、マルチモジュール型抗体分子、抗体結合体、核酸分子、または医薬組成物の有効量を投与するステップを含み、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである、方法を提供する。
【００１９】
第１１の態様において、本発明は、本発明の核酸分子またはベクターを含む、宿主細胞を提供する。
第１２の態様において、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子を産生する方法であって、単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子をコードする核酸を、その核酸の発現を可能にする条件下で発現させるステップを含む、方法を提供する。
【００２０】
様々な実施形態において、その単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子は、宿主細胞または無細胞系中で発現される。
最後の態様において、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体、マルチモジュール型抗体分子、抗体結合体、核酸分子、または医薬組成物の、障害または疾患を診断または治療するための方法における使用に関する。
【００２１】
本発明は、非限定的な実施例および添付図面と一緒に考察された場合、この詳細な説明に関してより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】改良型ＶＨ−ＮＴＵ（＋）ドメインの配列（Ａ）、ＶＨ−ＮＴＵ（−）ドメインの配列（Ｂ）、およびジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のＶＨ  １Ｂ１（ＧＮＥ；Ｃ）との比較を示す。４Ｄ５  ＶＨドメインの元の配列が示され、好ましい安定化変異が野生型アミノ酸の下方に示される（それらは囲いで強調されている）。位置の付番は、カバット付番方式に従う。白色の囲いは、タンパク質の安定性を向上させるために変異される位置であり、灰色の囲いは、そのタンパク質のジスルフィドを含まないバージョンを作製するために変異される位置であり、また下線部は、任意の所与の標的と結合するＶＨドメインのバリアントを作製するために任意の配列で置き換えることができるＣＤＲの位置である。
【図２】発現および安定性について比較した骨格ＶＨ−ＮＴＵ（−）の配列（Ａ）およびジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のＶＨ骨格１Ｂ１の配列（Ｂ）を示す。４Ｄ５  ＶＨドメインの元の配列が示され、好ましい安定化変異が野生型アミノ酸の下方に示される（それらは囲いで強調されている）。位置の付番は、カバット付番方式に従う。ＣＤＲ−Ｈ３は、多様な標的に対する異なるバインダーを作製する場合、このＣＤＲ中の予想される変動を補償するために９５〜１００ａ位をフレキシブル配列ＳＳＳで置き換えた。白色の囲いは、タンパク質の安定性を向上させるために変異される位置であり、灰色の囲いは、そのタンパク質のジスルフィドを含まないバージョンを作製するために変異される位置であり、また下線部は、任意の所与の標的と結合するＶＨドメインのバリアントを作製するために任意の配列で置き換えることができるＣＤＲの位置である。淡い灰色の配列は、発現および検出にとって必要な追加の配列である。
【図３】ウェスタンブロットによるＧＮＥおよびＶＨ−ＮＴＵ（−）の可溶性発現レベルの比較を示す。ＧＮＥの可溶性画分の未希釈試料が、ＶＨ−ＮＴＵ（−）の可溶性画分の１：２段階希釈物と比較される。
【図４】ＧＮＥおよびＶＨ−ＮＴＵについて得られる融解温度を示す。Ｔｍの決定は３回行われた。平均Ｔｍおよび標準偏差がプロットされている。
【図５】ＶＨライブラリー１およびＶＨライブラリー２の設計を示す。（Ａ）ＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、および−Ｈ３中の変異した位置。ＣＤＲ−Ｈ３において［Ｘａａ］７〜１２は、ライブラリー１について頻度「Ｘａａ」で導入された残基の数（７〜１２個の残基）を表し、一方、「Ｘａａ」６〜２０は、ライブラリー２について頻度「Ｘａａ」で導入された残基の数（６〜２０個の残基）を表すことに注目されたい。これらのライブラリーにおいて、「Ｘａａ」は、縮重コドンｘｙｚによってコードされ、ｘ＝０．２Ｇ＋０．２Ａ＋０．５Ｔ＋０．１Ｃであり、ｙ＝０．４Ａ＋０．２Ｔ＋０．４Ｃであり、またｚ＝０．１Ｇ＋０．９Ｃである。（Ｂ）「Ｘａａ」として示される位置に対して設計され、得られた変異の頻度。「Ｘ」はアンバーコドンを表す。
【図６】Ｇｒｂ２（表面プラズモン共鳴法によって測定される反応速度）、ＳＨＥＰ１（表面プラズモン共鳴法によって測定される反応速度）、ＤＨＦＲ−ＴＳ（表面プラズモン共鳴法によって測定される反応速度）、Ｈｅｒ３（生物層干渉分光法によって測定される反応速度）、およびＥＩＦ４ｃ（生物層干渉分光法によって測定される反応速度）に対して得られたＶＨ−ＮＴＵ（−）ドメインの親和性測定値を示す。得られた親和性（ＫＤ）をグラフ中に示す。抗Ｇｒｂ２  ＶＨは、Ｇｒｂ２が固定化され、６２５ｎＭから出発する段階的１：２希釈における抗Ｇｒｂ２  ＶＨである。抗ＳＨＥＰ１  ＶＨは、ＳＨＥＰ１が固定化され、２５０ｎＭから出発する段階的１：２希釈における抗ＳＨＥＰ１  ＶＨである。抗ＤＨＦＲ−ＴＳ  ＶＨは、ＤＨＦＲ−ＴＳが固定化され、１２５ｎＭから出発する段階的１：２希釈における抗ＤＨＦＲ−ＴＳ  ＶＨである。抗Ｈｅｒ３  ＶＨは、ＶＨが固定化され、２００ｎＭから出発する段階的１：２希釈におけるＨｅｒ３である。抗ＥＩＦ４ｅ  ＶＨは、ＥＩＦ４ｅが固定化され、１２５ｎＭから出発する段階的１：２希釈における抗ＥＩＦ４ｅ  ＶＨである。
【図７】対照ＶＨ−ＥＧＦＰ（上部）および抗Ｇｒｂ２  ＶＨ−ＥＧＦＰ（下部）を発現させる細胞の蛍光像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
下記の詳細な説明は、実例により、本発明を実施することができる具体的細部および実施形態に言及する。これらの実施形態は、当業者による本発明の実施を可能にするのに十分な細部が記述される。他の実施形態も利用することができ、本発明の範囲から逸脱することなく構造上および論理上の変更を行うこともできる。これらの様々な実施形態は、必ずしも相互に排他的ではなく、したがって幾つかの実施形態を１つまたは複数の他の実施形態と組合せて新しい実施形態を形成することができる。
【００２４】
別段の規定がない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。不一致の場合、定義を含めて本明細書が優先される。
【００２５】
本発明の目的は、安定化かつ自律性単一ドメイン抗体を提供することである。
この目的に対して本発明の発明者らは、指向性進化の手法と組合せて、タンパク質の溶解度（コロニーフィルタブロット法、すなわちＣｏＦｉを使用する）、耐凝集性、および熱安定性（ホットコロニーフィルタブロット法、すなわちＨｏｔ−ＣｏＦｉによる）を進化させることにより、本発明者らによって開発された抗体ＶＨドメインをベースに単一ドメイン抗体を作製した（アシアル（Ａｓｉａｌ）ら著、ネイチャー・コミュニケーション
ズ（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ）、２０１３年、第４巻、ｐ．２９０１；コーンビック（Ｃｏｒｎｖｉｋ）ら著、ネイチャー・メソッド（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００５年、第２巻、ｐ．５０７〜５０９）。
【００２６】
第１の態様において、本発明は単一ドメイン抗体に関し、この抗体は、ヒト生殖細胞系ＶＨドメインまたはＶＨドメインファミリー共通配列に対して少なくとも１つの修飾を含む免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）ドメインであり、その修飾はＨ３５Ｄ（３５位でＨｉｓ→Ａｓｐ）、Ａ７８Ｖ（７８位でＡｌａ→Ｖａｌ）、Ｓ９３Ｖ（９３位でＳｅｒ→Ｖａｌ）、Ｓ９３Ｇ（９３位でＳｅｒ→Ｇｌｙ）、およびＷ１０３Ｒ（１０３の位置でＴｒｐ→Ａｒｇ）からなる群から選択され、位置の付番はカバット付番方式に従う。
【００２７】
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書中ではこの冠詞の文法的目的語の１個または２個以上（すなわち少なくとも１個）を指すために使用される。一例として「要素」とは、少なくとも１個の要素を意味し、２個以上の要素を含むこともできる。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、非共有結合により、可逆的にかつ特異的に対応する抗原に結合することができるタンパク質性分子を指す。抗体の典型的な例は、免疫グロブリンおよびその結合特異性を依然として保持しているその誘導体または機能的フラグメントである。
【００２９】
当技術分野で確立されている「免疫グロブリン」は、一般には、ジスルフィド結合によって結合した少なくとも２個の重（Ｈ：ｈｅａｖｙ）鎖および２個の軽（Ｌ：ｌｉｇｈｔ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ではＶＨとして省略される）および重鎖定常領域（ＣＨ）を有する。用語「可変」とは、免疫グロブリン配列の可変性を示すとともに特定の抗体の特異性および結合親和性の決定に関与する免疫グロブリンドメインの部分（すなわち「可変ドメイン」）を指す。可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布しておらず、重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存されている（すなわち非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）と呼ばれる。天然に産生される重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβサンドイッチ形状を採用している４個のＦＲ領域を含んでおり、これらは３個の超可変領域によって連結されている。３個の超可変領域は、βシート構造を連結し、また幾つかのケースではβシート構造の一部を形成する、ループを形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって直近にまとまっており、その他の鎖由来の超可変領域と共に抗原結合部位の形成に寄与する。一般に天然に産生される免疫グロブリンは６個のＣＤＲ、すなわちＶＨ中に３個（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）およびＶＬ中に３個（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３）を含む。抗体のＶＨドメインは、４個のフレームワーク領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含み、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の構造でＣＤＲが散在している。天然に産生する免疫グロブリンでは、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は、６個のＣＤＲのうちで最も大きい多様性を示し、特にＣＤＲ−Ｈ３は、免疫グロブリンに精密な特異性を与える独自の役割を果たすと考えられる。
【００３０】
抗体の構造および機能を研究している研究者らは、任意の特定のＶＨまたはＶＬ領域のアミノ酸配列内に存在する重鎖および軽鎖ＣＤＲを同定するための様々なスキーマを開発した。これらのスキーマの多くは、可変重および軽領域の周囲のフレームワークと関係のある不変またはほとんど不変のパターンによりＣＤＲを同定する。次いでＣＤＲは、ＶＨ
およびＶＬ領域の環境内のそれらの構成残基の位置に対応する数値範囲を使用して境界を定められる。ＣＤＲ、特に第３のＣＤＲは長さが変わる可能性があるため、これらの方式は構成残基の境界を定めるために文字を使用することもある。このような最初の方式の１つは、カバット付番システムとして知られ、これはその当時知られていたＶＨおよびＶＬ配列を整列させることに基づき、そのより高度に保存されているフレームワーク領域の環境内の可変ＣＤＲのサブ配列の位置を決定する。カバット付番方式は、例えば「治療用抗体のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、２００７年、ステファン・デュベル（Ｓｔｅｆａｎ  Ｄｕｂｅｌ）編、ワイリー−ＶＣＨ出版有限株式合資会社（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫｇａＡ）、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）により詳細に記載されており、これは参照により本明細書中に援用される。
【００３１】
配列表（下記参照）を除き、本発明の特許請求の範囲においておよび詳細な説明の全体を通じて採用される位置の付番は、カバット方式による付番であることに留意されたい。
本出願は、「単一ドメイン抗体」、すなわち他の可変領域またはドメインとは無関係に抗原またはエピトープに特異的に結合する単一タンパク質ドメインを含む抗体フラグメントに関する。単一ドメイン抗体は、一般には抗体の最小の機能的結合単位であり、抗体の重（ＶＨ）または軽（ＶＬ）鎖の可変領域に該当する。単一ドメイン抗体は、約１３ｋＤａの分子量または全長抗体の１０分の一未満のサイズを有する。本発明による抗体は、ＶＨドメインをベースにしている単一ドメイン抗体であり、そのアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨドメインまたはＶＨドメインファミリー共通配列に一致する。
【００３２】
用語「生殖細胞系抗体」とは、体細胞超変異の不在下でゲノムＤＮＡ配列によってコードされる抗体と高いアミノ酸配列相同性を有する抗体を指す。生殖細胞系抗体は、一般に、その可変領域において、最も近い生殖細胞系遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と比較して少なくとも６０％、好ましくは６０％〜１００％の範囲にある、またはより好ましくは、７５％〜９９％の配列相同性のアミノ酸配列相同性を示す。このような抗体は、非生殖細胞系抗体の特徴を示す体細胞超変異の経験が最小限であるか、または全くない。
【００３３】
本明細書中で開示されるアミノ酸配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、最大パーセントの配列同一性を達成すべく配列を整列させるとともに必要に応じてギャップを導入した後の参照配列、すなわち本開示の抗体分子中のアミノ酸配列、と対として同一の候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、配列同一性の一部としての任意の保存的置換を考慮に入れない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアライメントは、当技術分野における技能の範囲内にある様々な方法で、例えばブラスト（ＢＬＡＳＴ）、アライン（ＡＬＩＧＮ）、またはメグアライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）（ディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ））ソフトウェアなどの公表されているコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される完全長の配列全体にわたって最大アライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、アライメントを測定するための適切なパラメータを決めることができる。
【００３４】
これら抗体配列は、配列相同性に基づく分類法（トムリンソン（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）、１９９２年、第２２７巻（３）、ｐ．７７６〜７９８；ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）およびウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、１９９３年、第２３巻（７）、ｐ．１４５６〜１４６１；コックス（Ｃｏｘ）ら著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、１９９４年、第２４巻（４）、ｐ．８２７〜３６）に従って別個のファミリーに分類される。本明細書中で使用される用語「ＶＨドメインファミリー
共通配列」とは、少なくとも７０％の配列相同性を共有するＶＨドメイン配列を整列させ、グループ化することによって取り出される共通配列を指す。様々なＶＨドメインファミリーの共通配列が当技術分野でよく知られており、例えばカバット，Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．）ら著、１９９１年、「免疫学的に関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、アメリカ合衆国保健福祉省、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２中に見出すことができる。
【００３５】
一例として、４Ｄ５フレームワークは、ヒト共通配列由来の人工フレームワークであり、本質的に生殖細胞系配列ＩＧＶＨ  ３−６６およびＩＧＶＫ  １−３９（ＩＭＧＴ命名法）に一致し（カータ（Ｃａｒｔｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ）、１９９２年、第８９巻（１０）、ｐ．４２８５〜９）、当初は抗ｃ−ｅｒｂＢ２（ｐ１８５ＨＥＲ２−ＥＣＤ）ｍＡｂ  ４Ｄ５のヒト化のために使用された。
【００３６】
とりわけ本発明の単一ドメイン抗体は、ヒト生殖細胞系ＶＨドメインまたはＶＨドメインファミリー共通配列に対して少なくとも１つの修飾を含み、その修飾がＨ３５Ｄ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｖ、Ｓ９３Ｇ、およびＷ１０３Ｒからなる群から選択され、位置の付番はカバット付番方式に従う。これらの修飾は、本発明者らによる広範な実験により同定されており、タンパク質の安定性を向上させるために導入される。４Ｄ５抗体骨格では、ＶＨドメインの７８、９３、および１０３位がフレームワーク領域内にあるのに対し、３５位はＣＤＲ−Ｈ１内にある。このＣＤＲ配列は、任意の所与の標的と結合するＶＨドメインバリアントを作製するために任意のアミノ酸残基で置き換えることができるが、本発明者らが、ＣＤＲ−Ｈ１内の３５位でのＡｓｐ残基の使用により４Ｄ５骨格の安定性を向上させることを見出したことに注目されたい。これは、可変ドメイン中の少数の残基も保存されるという最近の発見（スー（Ｈｓｕ）ら著、ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、２０１４年１月７日、第２２巻（１）、ｐ．２２〜３４）と一致する。
【００３７】
様々な実施形態において抗体は、ヒト生殖細胞系ＶＨドメインまたはＶＨドメインファミリー共通配列に対して少なくとも１つの追加の修飾をさらに含み、その修飾は、Ｃ２２ＳおよびＣ９２Ｔの少なくとも一方が存在するという条件でＣ２２Ｓ（２２位でのＣｙｓ→Ｓｅｒ）、Ａ２４Ｉ（２４位でのＡｌａ→Ｉｌｅ）、Ａ２４Ｌ（２４位でのＡｌａ→Ｌｅｕ）、およびＣ９２Ｔ（９２位でのＣｙｓ→Ｔｈｒ）からなる群から選択され、位置の付番はカバット付番方式に従う。これらの修飾は、タンパク質のジスルフィドを含まないバージョンを作製するために導入される。
【００３８】
ジスルフィド架橋の除去は、そのＶＨドメインを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質中で組み換え技術により可溶型で発現させる可能性を与えるために有利である。大部分の治療用抗体は、それらがジスルフィド架橋の形成および翻訳後修飾を必要とするため、現在は哺乳動物の細胞系中で分泌型で発現させている（ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１０年、第２８巻、ｐ．９１７〜９２４）。幾種類かの抗体フラグメントは細菌中で産生することができるが、それらは一般には不溶型で産生され、後にｉｎ−ｖｉｔｒｏでリフォールドされることになる（フアン（Ｈｕａｎｇ）ら著、ジャーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１２年、第３９巻、ｐ．３８３〜３９９）。これは、開発時間を遅らせる面倒な工程である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム中での産生が可能なこともあるが、発現条件の有効な最適化が必要であり、かつ収率が一般に低い（フアン（Ｈｕａｎｇ）ら著、ジャーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０
１２年、第３９巻、ｐ．３８３〜３９９；クオン（Ｋｗｏｎｇ）およびレーダ（Ｒａｄｅｒ）著、「タンパク質科学カレント・プロトコル／編集委員会（Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ／ｅｄｉｔｏｒｉａｌ  ｂｏａｒｄ）」、ジョン  Ｅ．コリガン（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ）．．．［ら］、２００９年、第６章、ユニット６  １０）。ＶＨドメインは、折りたたみ、結合、または安定性のための翻訳後修飾を必要とせず、したがってジスルフィドを含まないＶＨを高収率で、細菌中で、かつ可溶な折りたたみ型で発現させることができる。哺乳動物細胞と比べて細菌細胞の増殖速度が速いこと、培養条件が単純なこと、およびそれらの分子を可溶型で産生することによって得ることができる合理化された精製工程は、他の免疫グロブリン形態と比べてそれらの分子を産生し精製するために必要とされる時間およびコストを低減する。
【００３９】
様々な実施形態において、この抗体は、４Ｄ５抗体骨格またはヒト生殖細胞系ＶＨ３ドメインをベースにしている。ＶＨ３生殖細胞系は、刊行物、すなわちトムリンソン（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ）ら著、ＪＭＢ、１９９２年、第２２７巻、ｐ．７７６〜７９８、およびマツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ）、１９９３年、第３巻（１）、ｐ．８８〜９４で明確に定義されており、これらは参照により本明細書中で援用される。
【００４０】
上記修飾のすべてが広範な実験を通じて４Ｄ５骨格の配列の環境内で得られたことに注目されたい。しかしながら、当業者は、これらの修飾が４Ｄ５  ＶＨドメインと顕著な相同性を共有する他のＶＨドメイン、具体的にはＶＨ３生殖細胞系のＶＨドメインに移転可能であることを容易に理解するであろう。
【００４１】
これらの修飾を別のＶＨドメインに移転することができるかどうかを決定するために、それら２つの配列間の均等なまたは一致する相手方の残基が、一般にはその２つのＶＨドメイン配列間の配列相同性または構造的相同性に基づいて決められる。相同性を確立するために、第１のＶＨドメイン、すなわち４Ｄ５抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列が、第２のＶＨドメインの配列と直接比較される。それらの配列を整列させた後、当技術分野でよく知られている相同性アライメントプログラムのうちの１つまたは複数、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して（例えば種間の保存残基を使用して）、アライメントを維持するために必要な挿入または欠失を考慮して（すなわち不定の欠失および挿入による保存残基の排除を回避して）、第１のＶＨドメインの一次配列中の特定のアミノ酸残基と均等なまたは一致する残基が定められる。好ましくは、保存残基のアライメントは、それらの残基の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、さらに一層好ましくは少なくとも９８％、さらに一層好ましくは少なくとも９９％、また最も好ましくは１００％を保存するべきである。均等なまたは一致する相手方の残基は、第１および第２のＶＨドメイン間の構造的相同性、すなわちその構造が決定されているＶＨドメインの三次構造のレベルでの構造的相同性を決定することによって定めることもできる。この場合、均等なまたは一致する残基は、第１のＶＨドメインまたは前駆物質の特定のアミノ酸残基の主鎖原子のうちの２つ以上の原子座標（ＮオンＮ（Ｎ  ｏｎ  Ｎ）、ＣＡオンＣＡ（ＣＡ  ｏｎ  ＣＡ）、ＣオンＣ（Ｃ
ｏｎ  Ｃ）、およびＯオンＯ（Ｏ  ｏｎ  Ｏ））が、アライメント後に０．１３ｎｍ以内、好ましくは０．１ｎｍ以内であるものと定められる。タンパク質の非水素タンパク質原子の原子座標の最大の重なりを与えるように最良のモデルが向きを定められるとともに位置決めされた後に、アライメントが達成される。均等なまたは一致する残基がどのように決定されるかに関係なく、また置換変異が導入される第１のＶＨドメインの同一性に関係なく、伝えることが意図されることは、本発明によるＶＨドメインポリペプチドが、第１のＶＨドメインと顕著な配列相同性または構造的相同性を有する任意の第２のＶＨドメ
インに構築し得ることである。
【００４２】
様々な実施形態において、この抗体は４Ｄ５骨格をベースにしており、アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦ−（Ｘａａ）ｎ−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ−（Ｘａａ）ｐ−ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴ−Ｘａａ−ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ−Ｘａａ−（Ｘａａ）ｑ−Ｙ−Ｘａａ−ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）を有し、その抗体が、Ｈ３５Ｄ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｖ、Ｓ９３Ｇ、およびＷ１０３Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含み（式中、ｎ、ｐ、およびｑのそれぞれは、独立して０または１〜３０の整数である）、位置の付番はカバット付番方式に従う。この抗体は、分子内ジスルフィド架橋を有する。それは、高濃度においてさえ高い安定性および低い凝集性向を有する。
【００４３】
本明細書中で規定されるｎ、ｐ、およびｑのそれぞれは、独立して０または１〜３０の整数であり、ＣＤＲ内の残基のそれぞれは、任意のアミノ酸残基であり得、または存在しなくてもよい。しかしながら、幾つかの実施形態において、独立した折りたたみ分子、例えばアミノ酸１００〜２００個の完全な追加のドメインもＣＤＲ−Ｈ３にグラフトすることができる。これは、ＣＤＲが様々な長さを有し得ることを意味する。しかしながら、位置番号の記号表示のためにカバット付番方式を使用することは、ＣＤＲの長さの変動がＶＨドメイン位置、とりわけフレームワーク位置の付番に影響を与えないことを保証する。
【００４４】
様々な実施形態において、この抗体は、４Ｄ５骨格をベースにしており、アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳ−Ｘａａ−Ａ−Ｘａａ−ＳＧＦ−（Ｘａａ）ｎ−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ−（Ｘａａ）ｐ−ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴ−Ｘａａ−ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ−Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｘａａ）ｑ−Ｙ−Ｘａａ−ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）を有し、その抗体が、Ｈ３５Ｄ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｖ、Ｓ９３Ｇ、およびＷ１０３Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの修飾と、Ｃ２２ＳおよびＣ９２Ｔの少なくとも一方が存在するという条件でＣ２２Ｓ、Ａ２４Ｉ、Ａ２４Ｌ、およびＣ９２Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの修飾とを含み（式中、ｎ、ｐ、およびｑのそれぞれは、独立して０または１〜３０の整数である）、位置の付番はカバット付番方式に従う。この抗体は、上記バージョンの分子内ジスルフィド架橋に関与するシステインを置き換えることができる変異を発見したことによって得られた。
【００４５】
これは、初めて報告されたジスルフィド架橋のない安定な骨格のＶＨであり、細胞内分子の標的化にとって独特の利点を提供する。別の利点は、この骨格を細菌の細胞質中で可溶型で発現させる可能性であり、これは収率を増し、生産および精製の時間を減らし、したがって生産コストを低減する。また、その表面に１個または数個のシステインをさらに導入することもでき、毒性ペイロード、蛍光団、放射性同位元素などの化学架橋のためのアンカーポイントとして使用することができる。
【００４６】
本発明の単一ドメイン抗体は、分子内ジスルフィド架橋を有しても有さなくても、４Ｄ５骨格をベースにしてもしなくても、より高い熱安定性およびより高い耐凝集性を目的に設計される。
【００４７】
第２の態様において、本発明は、この単一ドメイン抗体を含むマルチモジュール型抗体分子を対象とし、この分子は、単一、二重、もしくは多重特異性であり、かつ／または一価、二価、もしくは多価である。
【００４８】
用語「特異性」とは、特定の抗体が結合することができる異なる種類のエピトープの数を指す。抗体が１種類のエピトープのみと結合する場合、その抗体は単一特異性である。
抗体が様々な種類のエピトープと結合する場合、その抗体は多重特異性である。例えば、二重特異性マルチモジュール型抗体は、異なる２種類のエピトープの認識を可能にする。エピトープは、所与の抗体が結合する抗原上の部位である。
【００４９】
用語「結合価」とは、抗体が特定のエピトープに対して有する抗原結合部位の数を指す。例えば一価抗体は、特定のエピトープに対して１個の結合部位を有する。
本発明による単一ドメイン抗体は、自律性結合分子である。したがって、それは独立した結合分子として振る舞う。例えば、ペプチドリンカーを介する遺伝子融合によるこのような幾つかの抗体の集合体は、多重特異性かつ多価結合性分子の作製を可能にする。例えば、異なる標的と結合する２種類の単一ドメイン抗体のペプチドリンカーを介する融合は、二重特異性分子を生成し、異なる標的と結合するこのような３種類の単一ドメイン抗体の融合は、三重特異性分子を生成するなどである。多価分子は、単一の標的と結合する全く同じ単一ドメイン抗体を融合することにより生成され得る。
【００５０】
新しい機能を加えるために他のモジュールを融合することもできる。例えばＦｃ抗体フラグメントの添加は、血中での長い半減期と抗体のエフェクター機能（例えば補体活性化）とを有する分子の作製を可能にすることになる。このＦｃ融合は、本発明の単一特異性の単一ドメイン抗体上で、また幾種類かの単一ドメイン抗体の融合から作製された多重特異性または多価の分子上で生じさせることができる。別の例として、このような単一ドメイン抗体を標準的なＩｇＧと融合して、そのＩｇＧに１つまたは幾つかの結合機能を加えることができる。
【００５１】
マルチモジュール型分子の作製のための手法は、平均的な当業者の知識の範囲内にある。
第３の態様において、本発明は、単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子と、治療薬、検出マーカ、任意の他のペイロード分子、またはそれらの組合せとを含む、抗体結合体を包含する。
【００５２】
本明細書中で使用される用語「治療薬」とは、対象において治療効果を生じることができる任意の薬剤を指し、本明細書中で使用される用語「検出マーカ」とは、対象において任意の手段によって検出可能な診断シグナルを生じることができる任意の薬剤を指す。
【００５３】
本発明の治療薬または検出マーカは、本発明の実施に適した望ましい特性を有するタンパク質、核酸分子、化合物、小分子、有機化合物、無機化合物、または任意の他の分子であり得る。
【００５４】
幾つかの実施形態において、本発明による検出マーカは、造影剤であり得る。造影剤は、細胞、組織、またはバイオフィルムを画像化するのに役立つことが当業者に知られている任意の薬剤、好ましくは医療用造影剤であり得る。医療用造影剤の例には、これらに限定されないが磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ：ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）剤、核磁気共鳴イメージング（ＮＭＲ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）剤、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ：ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）剤、Ｘ線造影剤、光学剤、超音波造影剤、および中性子捕捉療法剤が挙げられる。
【００５５】
幾つかの実施形態において、この検出マーカは、蛍光化合物、例えばフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナプタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリンなど、または検出可能な酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどであり得る。この抗体が検出可能な酵素と結合する場合、それは、この酵素が検出可能な反応生成物
を生成するのに使用する追加の試薬を加えることによって検出される。この抗体は、ビオチンで誘導体化し、アビジンまたはストレプトアビジン結合を直接測定することにより検出することもできる。
【００５６】
本明細書中で使用される「任意の他のペイロード分子」とは、本発明の抗体と直接または間接的に結合することができる任意の分子を指す。一例として、血清中の抗体結合体の半減期は複数の要因に左右されるが、抗体フラグメントが小さいほど、血液循環から迅速に除去される傾向がある。したがって、例えば単一ドメイン抗体および小型のペプチド毒素を含むより小形の構築物は、血清の半減期を増大させるポリペプチドと有利に連結する。例えば、それらはＨＳＡと連結することができる。例えば、そうした構築物は、細胞と結合したときにＨＳＡから放出されてＨＳＡなく取り込まれるように、明確な半減期を有するＨＳＡとの結合は不安定であることが好ましい。有用なアプローチは、リガンドもＨＳＡに結合し、血液循環中でそれを維持するような、多重特異的リガンド構築物を使用することである。
【００５７】
幾つかの実施形態において、その治療薬または検出マーカは、共有結合相互作用、静電相互作用、または疎水的相互作用により、この抗体と直接または間接的に連結することができる。
【００５８】
薬物または他の小分子配合薬を抗体フラグメントに付着させる方法はよく知られている。当技術分野では様々なペプチド結合化学が確立されており、それには二官能性化学リンカー、例えばＮ−スクシンイミジル（４−イオドアセチル）−アミノベンゾアート、スルホスクシンイミジル（４−イオドアセチル）−アミノベンゾアート、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−［α］−（２−ピリジルジチオ）トルエン、スルホスクシンイミジル−６−［［α］−メチル−［α］−（ピリジルジチオール）−トルアミド］−ヘキサノアート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロプリオナート、スクシンイミジル−６−［３（−（２−ピリジルジチオ）−プロプリオンアミド］ヘキサノアート、スルホスクシンイミジル−６−［３（−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）］ヘキサノアート、３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインなどが挙げられる。さらなる二官能性結合分子は、米国特許第５，３４９，０６６号明細書、同第５，６１８，５２８号明細書、同第４，５６９，７８９号明細書、同第４，９５２，３９４号明細書、および同第５，１３７，８７７号明細書、ならびにコルソン（Ｃｏｒｓｏｎ）ら著、ＡＣＳケミカルバイオロジー（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ）、２００８年、第３巻（１１）、ｐ．６７７〜６９２中で開示されている。
【００５９】
幾つかの実施形態において、この抗体は、ペイロードの放出のための開裂可能なリンカーを含む。こうした形状は、抗体結合体が意図された作用部位に到着した時に、抗体分子によって課される立体障害などの妨害を免れることによって、あるペイロード分子が適切に機能するために必要であり得る。一実施形態では、そのリンカーは、ヒドラゾン結合などの酸不安定性リンカーであり得る。酸不安定性リンカーの他の例には、ｃｉｓ−アコニット酸、ｃｉｓ−カルボン酸アルカトリエン、ポリ無水マレイン酸を使用することによって形成されるリンカー、ならびに米国特許第５，５６３，２５０号明細書および同第５，５０５，９３１号明細書に記載されているリンカーなどの他の酸不安定性リンカーが挙げられる。一実施形態では、そのリンカーは光解離性リンカーである。光解離性リンカーの例には、米国特許第５，７６７，２８８号明細書および同第４，４６９，７７４号明細書（これらのそれぞれは、その全体が参照により援用される）に記載されているリンカーが挙げられる。
【００６０】
抗体を含めたポリペプチド薬剤およびポリペプチドリガンドは、一方（または両方）の
ポリペプチド上の官能基または反応性基により結合することができる。それらは一般に、そのポリペプチドポリマー中に見出される特定のアミノ酸の側鎖から形成される。そのような反応性基は、システイン側鎖、リシン側鎖、またはＮ末端アミン基もしくは任意の他の適切な反応性基であり得る。反応性基は、その付着されるリガンドと共有結合を形成することができる。官能基は、その官能基を形成する天然または非天然のいずれかのアミノ酸内の原子の特定のグループである。
【００６１】
天然アミノ酸の好適な官能基は、システインのチオール基、リシンのアミノ基、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル基、アルギニンのグアニジニウム基、チロシンのフェノール基、またはセリンのヒドロキシル基である。非天然アミノ酸は、アジド基、ケト−カルボニル基、アルキン基、ビニル基、またはハロゲン化アリール基を含めた広範囲の官能基を提供することができる。そのポリペプチドの末端のアミノおよびカルボキシル基は、所望のリガンドと共有結合を形成するための官能基として機能することもできる。チオールを介する結合に代わるものを使用して、共有結合相互作用によりリガンドをポリペプチドに付着させることもできる。これらの方法は、相補的官能基を有する小分子と組合せて必須の化学官能基を有する非天然アミノ酸を有するポリペプチドを産生することにより、または、選択／単離段階後のその分子の作製時において化学的にもしくは組み換えにより合成されたポリペプチド中にその非天然アミノ酸を組み込むことにより、チオールを介する方法の代わりに（またはそれと組合せて）使用することができる。
【００６２】
抗体を薬物および他の化合物と結合する手法は、カータ（Ｃａｒｔｅｒ）およびセンター（Ｓｅｎｔｅｒ）著、キャンサー・ジャーナル（Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ）、２００８年、第１４巻（３）、ｐ．１５４〜６９、ならびにダクリー（Ｄｕｃｒｙ）およびスタンプ（Ｓｔｕｍｐ）著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ）、２０１０年、第２１巻（１）、ｐ．５〜１３にも記載されている。
【００６３】
第４の態様において、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子のライブラリーを提供し、各抗体は、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔ−Ｘａａ−Ｉ−Ｄ（配列番号３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、Ｒ−Ｉ−Ｘａａ−Ｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇ−Ｘａａ−Ｔ−Ｘａａ−Ｙ（配列番号４）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、Ｒ−（Ｘａａ）ｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｄ（配列番号５）（式中、ｎは６〜２０の整数である）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３とを含む。
【００６４】
本発明によるこのライブラリーは、本明細書中で述べるＣＤＲと一緒に、本発明の単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子をベースに設計される。このライブラリー中に含まれる各単一ドメイン抗体は、４Ｄ５骨格または別のＶＨドメインをベースにしており、分子内ジスルフィド架橋があってもなくてもよい。実例として本明細書の実施例４は、本発明のジスルフィドを含まない単一ドメイン抗体のライブラリーについて記述する。
【００６５】
本発明のライブラリーは、当技術分野の様々な確立されている標準的な方法を使用して作製することができる。好ましい例として、ペリプラズムシグナル配列と、続いてファージ遺伝子ＩＩＩ（ｐＩＩＩをコードする）または遺伝子ＶＩＩＩ（ｐＶＩＩＩをコードする）に融合したＶＨドメインとを含有（５’から３’まで）するファージミドベクターを使用することができる。所望のランダム化ＣＤＲ配列を含有するオリゴヌクレオチドが設計され、適切に設計された制限部位を使用するクローン化により、ＰＣＲによる部位特異的変異導入により、またはクンケル法による変異導入により、ベクター中に組み込まれる（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ）、１９８５年、第８２巻（２）、ｐ．４８８〜９２）。このＤＮＡライブラリーは、ヘルパーファージに感染することができるＴＧ１またはＸＬ１−ｂ
ｌｕｅ  ＭＲＦ’などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞株に形質転換される。このヘルパーファージは、ファージゲノムを含有しており、表面に提示される抗体を含有しその対応するＤＮＡを核に詰め込んだファージ粒子の産生を可能にする。
【００６６】
これらに限定されないが、本発明の第５の態様において、下記に述べるものを含めて様々なライブラリー形態が知られており、それらは本発明の範囲内にある。
様々な実施形態において、ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。
【００６７】
第５の態様において、本発明は、抗原に結合する抗体分子を選択する方法を提供し、前記方法は、ａ．本発明のライブラリーを準備するステップと、ｂ．このライブラリー中の１または複数の抗体分子が抗原と結合するように、ライブラリーを抗原と接触させるステップと、ｃ．抗原に結合する抗体分子をコードする核酸を選択するステップとを含む。
【００６８】
この選択のステップは、抗原と結合している抗体分子の単離を含むことができ、例えば、この抗原は、回収し得ることにより抗体も回収し得る磁気ビーズまたは他の分子に付着させることができる。この抗体分子は、そのコード核酸と結び付けられることができ、例えば、それはこの核酸を含有する粒子または複製可能な遺伝子パッケージの一部であり得る。別法では、この選択のステップは、例えば下記に述べる反復コロニーフィルタスクリーニングの手法により、抗体分子を発現させる細菌を単離することを含むことができる。次いで、必要に応じて、この抗原に結合する抗体分子をコードする核酸を単離することができる。
【００６９】
様々なライブラリー形態および好適なスクリーニング法が知られている。
抗体分子のライブラリーは、細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のライブラリーであり得る。したがって、この抗体分子は、細菌中で発現させることができる。それは、このライブラリーの抗体分子をコードする核酸分子を含有する細菌を準備し、それらが抗体分子を発現するように細菌を培養することによって達成することができる。抗体分子のライブラリーをコードする核酸分子は、細菌がそのような核酸を含有する本発明の一態様である。この細菌は、グリセロールストックとして好都合に貯蔵することができる。
【００７０】
抗体分子は、細菌から分泌することができる。これは、反復コロニーフィルタスクリーニング（ＩＣＦＳ：ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｉｌｔｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）の手法、すなわち数億個の抗体発現細菌コロニーをスクリーニングすることができる２フィルタサンドイッチアッセイの使用を可能にする（ジョバンノーニ（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ）ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）、２００１年、第１巻、２９（５）、Ｅ２７）。ＩＧＦＳでは、関心のある抗原でコーティングされた第２のフィルタと接触している多孔質マスターフィルタ上で、ライブラリーを発現する細菌細胞（一般には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））を成長させる。抗体分子は細菌によって分泌され、第２のフィルタ上に拡散し、こうして抗原と接触する。第２のフィルタ上に結合する抗原の検出は、関心のある結合特異性を発現させるものを含む複数の細菌細胞の回収を可能にする。続いて、これらの細菌を特定の抗体分子の単離のための２回目のスクリーニングにかけることができる。これらのステップの繰返しは、選択された抗体分子の集団から不純物を除く。この方法を使用して、様々なアミノ酸配列の複数の特異的に結合する抗体を回収することができる。
【００７１】
別法では、ライブラリーの抗体分子は、分泌されるのではなく粒子または分子複合体上に提示させることもできる。好適な複製可能な遺伝子パッケージには、酵母菌、細菌またはバクテリオファージ（例えばＴ７）粒子、ウィルス、細胞、または共有結合、リボソーム、もしくは他のｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ系が挙げられ、それぞれの粒子または分
子複合体は、その上に提示される抗体ＶＨ可変ドメインをコードする核酸を含有する。
【００７２】
細胞またはタンパク質混合物を使用する選択は、文献（リュー（Ｌｉｕ）ら著、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２００４年、第６４巻、ｐ．７０４〜７１０；ムツベリア（Ｍｕｔｕｂｅｒｒｉａ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００４年、第２８７巻、ｐ．３１〜４７；ルビンスタイン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２００３年、第３１４巻、ｐ．２９４〜３００）でも文書化されており、それらの手法は本発明に応用することができる。
【００７３】
ファージディスプレイは、所望の特異性の抗体分子の選択のための確立された手法であり、抗体分子のライブラリーは、繊維状バクテリオファージ上に提示される（マークス（Ｍａｒｋｓ）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）、１９９１年、第２２２巻、ｐ．５８１〜５９７；ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら著、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、１９９４年、第１２巻、ｐ．４３３〜４５５）。繊維状バクテリオファージは、細菌に感染するウィルスであり、したがって、そのファージライブラリーは細菌ライブラリー中で維持することができる。その抗体分子は、ペプチドをコードする合成ＤＮＡをそれぞれファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩ中に挿入することによって、そのファージの内部被膜タンパク質ｐＩＩＩまたは主要被膜タンパク質ｐＶＩＩＩと融合させることができる。ｐＩＩＩの３個の（場合によっては５個の）コピーがファージ粒子の頂部に位置していると考えられ、ファージ１個当たりｐＶＩＩＩの約２５００個のコピーが存在すると考えられる。ｐＩＩＩは、ファージのその細菌のＦ繊毛との付着および感染に関与しており、ｐＶＩＩＩは、一本鎖ファージＤＮＡのコーティングに関与している。ｐＩＩＩタンパク質は、３個のドメインＮ１、Ｎ２、およびＣＴを有する。融合をｐＩＩＩのＮ末端に対して行うこともでき、またＮ末端ドメインＮ１およびＮ２を除去し、融合をＣ末端のＣＴドメインに対して行うこともできる。単一ドメイン抗体をコードする遺伝子を遺伝子ＩＩＩに挿入することができ、それはｐＩＩＩのＮ末端と融合し、かつファージに組み込まれた抗体分子の発現を引き起こし、ファージが抗原に結合することを可能にする。
【００７４】
本明細書中で述べる核酸分子は、繊維状バクテリオファージの被膜タンパク質、例えばｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩと融合した抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。このような核酸分子を使用して、細菌に感染するファージ上に提示される抗体分子のライブラリーを発現させるか、細菌から分泌される可溶性抗体を得ることができる。抗体分子の遺伝子と被膜タンパク質の遺伝子との間にアンバー終止コドンを挿入することにより、ファージを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアンバーサプレッサー細胞株中で成長させる場合、そのアンバーコドンはアミノ酸として読み出され、また被膜タンパク質と融合した抗体はファージの表面に提示される。ファージを非サプレッサー細胞株中で成長させる場合、そのアンバーコドンは終止コドンとして読み出され、可溶性タンパク質が細菌から分泌される。
【００７５】
抗原に結合し得るとともにバクテリオファージもしくは他のライブラリー粒子または分子複合体上に提示される抗体分子の選択の後、前記選択された抗体分子を提示するそのファージもしくは他のライブラリー粒子または分子複合体から核酸分子を取り出すことができる。このような核酸は、前記選択された抗体分子を提示するバクテリオファージもしくは他の粒子または分子複合体から取り出された核酸の配列を有する核酸から発現させることによる後続の単一ドメイン抗体の産生において使用することができる。
【００７６】
したがって、選択後、抗原に結合する抗体分子をコードする核酸を発現させて抗体分子を産生することができる。
１または複数の抗体がライブラリーから選択されると、その抗体分子の意図される目的に従ってそれらの特性を決定するために、抗体分子を様々なアッセイにおいてさらに特徴付けることができる。アッセイには、関心のある１または複数の抗原に結合するための抗体分子の親和性の決定、他の抗原との交差反応性の決定、抗原のいずれの領域が抗体分子と結合するかを決定するためのエピトープマッピング、免疫組織化学、および他のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ試験を挙げることができる。
【００７７】
必要な場合、同定された抗体は、特定の用途に使用するための特性の改良に向けて、当技術分野で確立している手法を使用してさらに成熟または最適化することができる。また、抗体分子は、別の形態になるように操作するか、または追加の特徴を含有するように操作することもできる。
【００７８】
第６の態様において、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を提供する。
本発明による抗体の１または複数の鎖をコードする核酸分子は、一本鎖、二本鎖、またはその組合せなどの任意のあり得る形状の任意の核酸であり得る。核酸には、例えばＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ヌクレオチド構造類似体を使用して、または核酸化学を使用して作製されるＤＮＡまたはＲＮＡの構造類似体、架橋型核酸分子（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、およびタンパク質の核酸分子（ＰＮＡ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノムまたは合成由来のものであり得、また一本または二本鎖であり得る。このような核酸は、例えばｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの共重合体、オリゴヌクレオチドなどであり得る。それぞれの核酸分子はさらに、非天然ヌクレオチド構造類似体を含有することも、親和性タグまたは標識と結合させることもできる。用語「ベクター」とは、それが結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一実施形態では、ベクターは、「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態では、ベクターは、追加のＤＮＡセグメントをそのウィルスのゲノム中にライゲートすることができるウィルスベクターである。本明細書中で開示されるベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律的に複製することができ（例えば、細菌の複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）、または、宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それによって宿主のゲノムと共に複製することもできる（例えば非エピソーム性哺乳動物ベクター）。
【００７９】
様々な実施形態において、本発明による単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子をコードする核酸配列は、プラスミドなどのベクター中に取り込まれる。
第７の態様において、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体、マルチモジュール型抗体分子、抗体結合体、または核酸分子と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００８０】
用語「薬学的に許容できる」は、本明細書中では、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、もしくは他の問題または合併症がなくヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適しており、妥当な効果／リスク比に見合う材料、組成物、または剤形を指すために採用される。
【００８１】
本明細書中で使用される用語「薬学的に許容できる担体」とは、１つの器官または体の部分から別の器官または体の部分への主題の抽出物の運搬または移送に関与する液体または固体フィラー、希釈剤、賦形剤、または溶媒カプセル化剤などの薬学的に許容できる材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤のその他の成分と共存可能であり、かつ患者に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容できる担体として機能することができる材料の幾つかの例には、ラクトース、グルコース
、およびスクロースなどの糖と、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプンと、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体と、粉末状トラガカントと、麦芽と、ゼラチンと、タルクと、カカオバターおよび座薬用ワックスなどの医薬品添加剤と、ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油などの油と、プロピレングリコールなどのグリコールと、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどの多価アルコールと、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステルと、寒天と、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤と、アルギン酸と、滅菌蒸留水と、発熱性物質を含まない水と、等張食塩水と、リンゲル液と、エチルアルコールと、ｐＨ緩衝液と、ポリエステル、ポリカーボネート、またはポリ無水物と、医薬製剤中で使用される他の非毒性の共存可能な物質とが挙げられる。医薬製剤を調製するための一般的な担体および在来の方法を開示している「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第１９版（ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）：マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、１９９５年）を参照されたい。
【００８２】
当業者は、適切な配合が、特定の用途のために選択される投与経路によって決まり、また対象に本発明の単一ドメイン抗体、マルチモジュール型抗体分子、抗体結合体、または核酸分子を投与する適切な経路および方式が、ケースバイケースで決められるべきであることも理解するであろう。
【００８３】
本発明の単一ドメイン抗体、マルチモジュール型抗体分子、抗体結合体、または核酸分子は、タンパク質性または核酸系の薬物による治療に効果的な任意の腸管外または非腸管外（経腸）経路により投与することができる。腸管外施用方法には、例えば注射液、注入液、またはチンキ剤の形態での、例えば皮内、皮下、筋内、気管内、鼻腔内、硝子体内、または静脈内への注射および注入の手法と、例えばエアゾール混合剤、スプレー剤、または散剤の形態でのエアゾールの設置および吸入とが挙げられる。例えば、エアゾール（これは鼻腔内投与に使用することもできる）の吸入または気管内設置のいずれかによる経肺薬物送達に関する総覧は、例えばパットン（Ｐａｔｔｏｎ）ら著、アメリカン・ソラシック・ソサエティ紀要（Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃ）、２００４年、第１巻、ｐ．３３８〜３４４によって得られる。非腸管外送達方式は、例えば丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤、もしくは懸濁剤の形態での、例えば経口によるもの、または例えば座剤の形態での経直腸によるものである。本発明の抗体分子は、通常の非毒性の薬学的に許容できる所望の賦形剤または担体と、添加剤と、ビヒクルとを含有する製剤の状態で全身的または局所的に投与することができる。
【００８４】
本発明の一実施形態では、医薬品は、哺乳動物、具体的にはヒトに腸管外投与される。対応する投与方法には、これらに限定されないが、例えば注射液、注入液、またはチンキ剤の形態での、例えば皮内、皮下、筋内、気管内、または静脈内への注射および注入の手法と、例えばエアゾール混合剤、スプレー剤、または散剤の形態でのエアゾールの設置および吸入とが挙げられる。静脈内および皮下への注入および／または注射の併用は、比較的短い血清半減期を有する化合物の場合に最も好都合であることがある。この医薬組成物は、水溶液、水中油型乳剤、または油中水型乳剤であり得る。
【００８５】
メイダン  ＶＭ（Ｍｅｉｄａｎ  ＶＭ）およびミチニアク  ＢＢ（Ｍｉｃｈｎｉａｋ  ＢＢ）著、アメリカン・ジャーナル・オブ・セラピューティクス（Ａｍ  Ｊ  Ｔｈｅｒ）、２００４年、第１１巻（４）、ｐ．３１２〜３１６に記載されているような経皮による送達技術、例えばイオントフォレーシス、ソノフォレーシス、またはマイクロニードル増強送達も、本明細書中で述べた本発明の単一ドメイン抗体、マルチモジュール型抗体分子
、抗体結合体、または核酸分子の経皮による送達に使用することができる。非腸管外送達方式は、例えば丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤、もしくは懸濁剤の形態での、例えば経口によるもの、または例えば座剤の形態での経直腸によるものである。本発明の抗体分子は、多様な通常の非毒性の薬学的に許容できる賦形剤または担体と、添加剤と、ビヒクルとを含有する製剤の状態で全身的または局所的に投与することができる。
【００８６】
施用される本発明の単一ドメイン抗体、マルチモジュール型抗体分子、抗体結合体、または核酸分子の用量は、所望の予防効果または治療応答を達成するために広範囲に変えることができる。例えば、それは選ばれた標的に対する抗体分子の親和性に、また抗体分子とリガンドとの複合体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期によって決まることになる。さらに最適な用量は、抗体分子またはその結合体の生体内分布、投与方式、治療される疾患／障害の重症度、および患者の病状によって決まることになる。例えば、局所塗布用の軟膏に使用される場合、高濃度の抗体分子を使用することができる。しかしながら、必要に応じて、抗体分子はまた徐放性製剤、例えばリポソーム分散液、またはポリアクティブ（ＰｏｌｙＡｃｔｉｖｅ）（商標）またはオクトデックス（ＯｃｔｏＤＥＸ）（商標）（ボス（Ｂｏｓ）ら著、「ビジネス・ブリーフィーング（Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｂｒｉｅｆｉｎｇ）」、ファーマテック（Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ）、２００３年、ｐ．１〜６参照）のようなヒドロゲルから作られたポリマーミクロスフィアの状態で得ることもできる。他の入手可能な徐放性製剤は、例えばＰＬＧＡから作られたポリマー（ＰＲファーマスーティカルズ（ＰＲ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、ＰＬＡ−ＰＥＧから作られたヒドロゲル（メディンセル（Ｍｅｄｉｎｃｅｌｌ））、およびＰＥＡから作られたポリマー（メディバス（Ｍｅｄｉｖａｓ））である。
【００８７】
したがって、本発明の単一ドメイン抗体、マルチモジュール型抗体分子、抗体結合体、または核酸分子は、薬学的に許容できる成分および確立された調製方法（ジェンナロ，Ａ．Ｌ．（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｌ．）およびジェンナロ，Ａ．Ｒ．（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．）著、２０００年、「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２０版（リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ペンシルバニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｒａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ））を使用して組成物に製剤化することができる。医薬組成物を調製するために薬学的に不活性な無機または有機賦形剤を使用することができる。例えば丸剤、散剤、ゼラチンカプセル剤、または坐剤を調製するためにラクトース、タルク、ステアリン酸およびその塩、脂肪、ワックス、固体または液体多価アルコール、天然または硬化油を使用することができる。液剤、懸濁剤、乳剤、エアゾール混合剤、または、使用前に液剤もしくはエアゾール混合剤に再構成するための散剤の製造用の好適な賦形剤には、水、アルコール、グリセロール、多価アルコール、およびこれらの適切な混合物、および植物油が挙げられる。
【００８８】
これらの製剤は、細菌保留フィルタによる濾過を含めた多くの手段により、または使用の直前に滅菌水もしくは他の滅菌媒体中に溶解もしくは分散することができる無菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより滅菌することができる。
【００８９】
第８の態様において、本発明は、第３の態様による抗体結合体を対象の細胞、腫瘍、組織、または器官に送達するための方法であって、前記対象に本発明の抗体結合体の有効量を投与するステップを含み、それに含まれる抗体は、細胞、腫瘍、組織、または器官の抗原に特異的である、方法を提供する。
【００９０】
本発明の抗体結合体の「有効量」という用語は、所望の効果をもたらすためのその結合体の非毒性であるが十分な量を意味する。
第９の態様において、本発明は、対象における障害または疾患を診断するための方法であって、前記対象に本発明の抗体結合体の有効量に投与するステップを含み、抗体は検出マーカと結合しており、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである、方法を提供する。
【００９１】
用語「疾患」または「障害」は、本明細書中では区別なく使用され、機能の遂行を遮断または乱す、または罹患者にもしくは罹患者と接している人々に不快感、機能不全、苦痛、またはさらには死などの症状を引き起こす体または幾つかの器官の状態の変化を指す。疾患または障害はまた、不調、慢性的病的状態、軽い病的状態、疾病、障害、悪心、不健康、病訴、相互素因、または詐病と関係する可能性もある。
【００９２】
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、従来の抗体と比べてそれらの血漿半減期が短いために分子画像化の用途にとって有利であり、画像化にとって必要なより速いコントラストノイズ比を達成する。
【００９３】
第１０の態様において、本発明は、対象における障害または疾患を治療するための方法であって、前記対象に本発明の単一ドメイン抗体、マルチモジュール型抗体分子、抗体結合体、核酸分子、またはその医薬組成物の有効量を投与するステップを含み、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである、方法を提供する。
【００９４】
本明細書中で使用される用語「治療する」および「治療」とは、症状の重症度または頻度の軽減、症状または根本原因の除去、症状または根本原因の発生の予防、および損傷の改善または矯正を指す。例えば、本発明の抗癌剤の投与による患者の治療は、癌が進行しやすい（例えば、遺伝的素因、環境因子などの結果としてのより高いリスクの）患者における、または癌再発のリスクのある癌生存者における化学的予防と、障害もしくは疾患の退行を阻止するまたは引き起こすことによる二様の癌患者の治療とを含む。
【００９５】
本発明による抗体分子は、任意の所望の標的エピトープ／抗原に向けることができる。選択される標的エピトープ／抗原に応じて、この抗体は、ある障害または疾患の治療に適している可能性があり、ケースバイケースで決められるべきである。
【００９６】
ＩｇＧ形態のモノクローナル抗体およびＦａｂは、（現在の技術では）治療用途のための細胞外分子の標的化のみを可能にするが、そのジスルフィドを含まないバージョン中の単一ドメイン抗体は、細胞内標的を標的にすることを可能にする。細胞内の還元環境は、ジスルフィド架橋の解離およびそれに続くＩｇＧおよびＦａｂの凝集を引き起こす。本発明の骨格の単一ドメイン抗体は、ジスルフィド架橋の不在下で安定であるように進化してきたため、細胞内でその安定性は損なわれない。したがって、本明細書中で述べる単一ドメイン抗体を使用して細胞内分子を標的にすることも、細胞内に毒性ペイロードを送達することもできる。その最も近い競合相手は、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の安定性ＶＨドメイン１Ｂ１（ＧＮＥ、図１Ｃ）であり、それは依然としてジスルフィド架橋を含有しており、ジスルフィドが除去された場合、本発明の骨格よりもかなり不安定であり、これは、その分子を細胞内用途と相容れなくする。
【００９７】
加えて、本発明の抗体のサイズが小さいことは、眼科の治療などのニッチの治療用途の利点を提供する（例えば滲出型加齢黄斑変性、この場合、薬物は眼中に注入され、より小さいサイズはより多量の分子を体積当たりで詰め込むことを可能にする）、肺への送達（より小さいサイズは薬物の肺へのより深い浸潤を可能にする）、および固形腫瘍の治療（より小さいサイズは迅速な組織浸潤を可能にする）。より小さいサイズは、薬物の投与の頻度の減少につながる可能性がある。
【００９８】
本発明の抗体をコードする核酸分子を使用する遺伝子治療も本発明の範囲内にあること
を理解されたい。そうした方法により、関心のある１または複数の遺伝子が細胞中に挿入されるように、その細胞を組換え改変することができる。関心のある１または複数の遺伝子とは例えば、単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子（特に、ウィルスまたは他の病原体などの微生物に対して有効な抗体）についてコードする遺伝子であり、他の病原体には、細菌、真菌、および寄生虫などの呼吸器官の微生物が含まれる。このような方法はまた、他の抗体、特に様々な種類の眼の疾患の治療に役立つ抗体の送達によって他の疾患に対しても役立つ。次いで、このような細胞、例えば筋および呼吸器の細胞を、レシピエント患者の所与の器官の組織に挿入することができ、ここで、それらの細胞は外来性ＤＮＡを発現させ、血流または局所組織に送達するために、その抗体タンパク質を合成して細胞を取り巻く腔内に分泌し、これは、その抗体がその臨床効果を実現する箇所によって決まる。このような投与の手段は、商業コストの問題なく、かつ大量の抗体を生産し次いで使用するまで保管しなければならないという問題なく、挿入された遺伝子操作細胞が、恒常的なレベル、場合によりさらに誘発性のレベルの抗体タンパク質を産生することを可能にする。加えて、この細胞は、必要に応じて様々な量の抗体タンパク質を産生する点で患者のニーズに対応するように操作することができる。
【００９９】
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、分泌型で使用することができる一方で、本発明のこのジスルフィドを含まない抗体は、細胞内で発現させて治療目的のために関心のある生化学過程を調節することもできる。
【０１００】
第１１の態様において、本発明は、本発明の核酸分子またはベクターを含む、宿主細胞を提供する。
用語「宿主細胞」とは、発現ベクターが導入されている細胞を指す。宿主細胞には、細菌、微生物、植物または動物の細胞、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣系）、またはＮＳＯ細胞が挙げられる。
【０１０１】
第１２の態様において、本発明は、単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子を産生する方法であって、本発明の単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子をコードする核酸を、その核酸の発現を可能にする条件下で発現させるステップを含む、方法を提供する。
【０１０２】
様々な実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体またはマルチモジュール型抗体分子は、宿主細胞または無細胞系中で発現される。
本発明の抗体分子は、任意の既知の確立された発現系および組換え細胞培養技術を使用して、例えば細菌宿主（原核生物系）または酵母菌、真菌、昆虫細胞、もしくは哺乳動物細胞などの真核生物系中で発現させることによって産生することができる。本発明の抗体分子は、ヤギ、植物、またはゼノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ）トランスジェニックマウスなどのトランスジェニック生物中で、またはヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きいフラグメントを有し、かつマウス抗体の産生に欠損のある改変マウス細胞株中で産生することができる。抗体は化学合成によって生産することもできる。
【０１０３】
本発明の抗体分子の組換え生産の場合、一般にその抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニング（増幅）または発現のためのプラスミドなどの複製可能なベクター中に挿入する。好適な発現系の実例は、グルタミン酸シンテターゼ系（例えば、ロンザ・バイオロジーズ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）によって販売されている）であり、この宿主細胞は、例えばＣＨＯまたはＮＳＯである。この抗体をコードするポリヌクレオチドは、通常の手順を使用して容易に単離され、配列決定される。使用することができるベクターには、プラスミド、ウィルス、ファージ、トランスポゾン、微小染色
体（このプラスミドは典型的な実施の形態である）が挙げられる。一般には、このようなベクターはさらに、シグナル配列、複製開始点、１または複数のマーカ遺伝子、エンハンサー要素、プロモータ、および発現を容易にするように単一ドメイン抗体ポリヌクレオチドに操作可能に結合した転写終結配列を含む。
【０１０４】
組み換え技術を使用する場合、その抗体分子は細胞内で産生させることも、ペリプラズム中で産生させることも、直接的に培地中に分泌させることもできる。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれかの粒子状デブリが、例えば遠心分離または限外濾過によって除去される。カータ（Ｃａｒｔｅｒ）ら著、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９２年、第１０巻、ｐ．１６３〜１６７は、大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）のペリプラズムへ分泌される抗体を単離するための手順について記述している。ポリペプチドは、可溶性の折りたたまれた状態で直接的に得るか、封入体の形態で回収し、続いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで再生することができる。分子内ジスルフィド架橋を有する抗体の場合、さらなる選択肢は、酸化性細胞内環境を有する特定の宿主細胞株を使用し、こうして細胞質ゾル中でのジスルフィド結合の形成を可能にすることができる（ベンチュリ  Ｍ．（Ｖｅｎｔｕｒｉ  Ｍ．）、セイファート  Ｃ．（Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｃ．）、およびフンテ  Ｃ．（Ｈｕｎｔｅ  Ｃ．）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）、２００２年、第３１５巻、ｐ．１〜８）。
【０１０５】
細胞によって産生された抗体分子は、任意の通常の精製技術、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィは１つの好ましい精製手法である。本発明の特定の抗体分子に対して使用される精製法の選択肢は、平均的な当業者の知識の範囲内にある。
【０１０６】
最後の態様において、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体、マルチモジュール型抗体分子、抗体結合体、核酸分子、または医薬組成物の、障害または疾患を診断または治療するための方法における使用に関する。
【０１０７】
本発明は、下記の実施例によってさらに例示される。しかしながら、本発明は、これらの例示された実施形態に限定されないことを理解されたい。
（実施例）
方法
安定性向上用ライブラリーの作製。ランダム変異誘発ライブラリーが、ジーンモルフＩＩミュータゲネシスキット（Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用するエラープローンＰＣＲによって作製された。クローン化された野生型遺伝子（最初のライブラリーの場合）または改良されたバリアント（後続のライブラリーの場合）が鋳型として使用され、反応は製造業者のプロトコルに従って行われた。使用されたプライマーは、変異されるべきオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）に隣接する配列にアニールした。平均５０ｎｇのインサート鋳型が、リン酸化プライマーによる３０サイクルのＰＣＲ反応で使用され、最終のプラスミドライブラリーにおいて遺伝子当たり平均約２〜３個のアミノ酸変異を生じた。このエラープローンＰＣＲ産物はゲル精製された（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）ゲル精製キット）。
【０１０８】
プラスミドライブラリーは、本明細書で述べる最適化プロトコルを使用してホールプラスミドのメガプライマーＰＣＲ（ＭＥＧＡＷＨＯＰ）反応（ミヤザキ（Ｍｉｙａｚａｋｉ）著、メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）、２００３年、第２３１巻、ｐ．２３）によって作製された。典型的には、ＫＯＤエ
クストリーム（ＫＯＤ  Ｘｔｒｅｍｅ）ポリメラーゼ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））を用いたＰＣＲ反応において、野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）遺伝子を含有する１〜１０ｎｇのプラスミドが、鋳型として使用され、かつ精製されたｅｐＰＣＲインサートのインサート長の１ｂｐ当たり約１ｎｇのインサート（例えば、５００ｂｐのインサートに対して５００ｎｇ）をメガプライマーとして使用して、増幅された。緩衝組成物は、１ｍＭ  ＮＡＤ＋および４０ＵのＴａｑＤＮＡリガーゼを添加し、０．５ＵのＫＯＤエクストリーム（ＫＯＤ  Ｘｔｒｅｍｅ）ポリメラーゼを使用する、製造業者によって推奨された標準的なものであった。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分、（９８℃で１０秒、６５℃で３０秒、６８℃で６分）で３０サイクル、４℃での保留であった。ＰＣＲ後、そのＰＣＲ反応物に２０ＵのＤｐｎＩ（ＮＥＢ）が加えられ、３７℃で３時間インキュベートされた。
【０１０９】
ＶＨ３６のジスルフィドを含まないバージョンの同定を可能にするライブラリーを作製するために、最初に、ｓｔＩＩシグナル配列を部位特異的変異誘発によって除去し、クローンＶＨ３６ｉを作製する。次に、残基位置Ｃ２２、Ａ２４、およびＣ９６がランダム化された部位特異的変異誘発ライブラリーが、ＭＥＧＡＷＨＯＰによって作製された。リン酸化された順方向（５’−ＧＧＣＴＣＡＣＴＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＮＮＫＧＣＡＮＮＫＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣ−３’）および逆方向（５’−ＣＣＴＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＭＮＮＡＴＡＡＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＴＧ−３’）プライマーを使用するＰＣＲが、鋳型としてのＶＨ３６ｉと、ＫＯＤホットスタート（ＫＯＤ  ＨｏｔＳｔａｒｔ）ポリメラーゼ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））とを使用して製造業者のプロトコルに従って行われた。このＰＣＲ産物はゲル精製され、ＭＥＧＡＷＨＯＰ反応がこれまでと同様に行われ、その後にＤｐｎＩ処理が行われた。ＤＨ１０Ｂ細胞は、ＤｐｎＩ処理し、精製されたＭＥＧＡＷＷＨＯＰ産物で電気穿孔され、約１０５個のユニークメンバーのライブラリーを生じた。
【０１１０】
溶解性および安定性のスクリーニング。ロゼッタ２（Ｒｏｓｅｔｔａ２）細胞が、変異誘発ライブラリーで形質転換され、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補った２４．５ｃｍ直径平方のＬＢ寒天プレート上に塗布された。これらはマスタープレートとみなされる。コロニーはデュラポア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）の０．４５μｍフィルタ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移され、抗生物質および３０μＭイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を補ったＬＢ寒天プレート上に（コロニーを上に向けて）置かれた。タンパク質の発現のために誘発が室温（ＲＴ：ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で一晩行われた。
【０１１１】
タンパク質の産生後、誘発プレートは、所望の温度（溶解性のスクリーニングについてはＲＴ、または安定性のスクリーニングについてはより高い温度）下に３０分間置かれた。このデュラポア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）膜は、ＣｏＦｉ溶解バッファー［２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１１．２Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））、およびＥＤＴＡを含まない１：１０００希釈のプロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩＩ）（メルク（Ｍｅｒｃｋ））］に浸漬したワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）紙と、ニトロセルロース膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））とからなる溶解サンドイッチに移され、このスクリーニング温度でもう一度３０分間インキュベートされた。
【０１１２】
細胞溶解液はさらに、それぞれ−８０℃およびＲＴでの３回の凍結−解凍サイクル（それぞれ３０分）によって改良された。デュラポア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）膜およびワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）紙が廃棄され、ニトロセルロース膜が、ブロッキングバッファー［ＴＢＳ−Ｔバッファー（２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トゥイーン２０）、および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］
中でＲＴにおいて１時間インキュベートされた。
【０１１３】
ブロッキング後、ニトロセルロース膜は、７０回転／分（ｒｐｍ）で振とうしながらＴＢＳ−Ｔ中でＲＴにおいて３回、１０分間洗浄された。可溶性タンパク質の存在は、その膜を１：５，０００希釈のヒスプローブ−ＨＲＰ（ＨｉｓＰｒｏｂｅ−ＨＲＰ）（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を含有するＴＢＳ−Ｔ中でインキュベートすることにより、または１％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ中で１：１０，０００希釈のプロテインＡ−ＨＲＰプローブ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））と共に３０ｒｐｍで振とうしながらＲＴにおいて１時間インキュベートすることによって検出された。先に述べられたのと同様に行われる３回の洗浄のステップが続いた。
【０１１４】
ニトロセルロース膜は、ＣＣＤカメラ（富士フイルムＬＡＳ−４０００）を使用するスーパーシグナルウェストデュラケミルミネセンスキット（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｋｉｔ）（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用して現像された。
【０１１５】
実施例１：指向性進化およびＨｏｔ−ＣｏＦｉによる安定なＶＨドメインの作製
４Ｄ５  ＶＨドメインが、本発明者らの安定化のための元となる（ｐａｒｅｎｔａｌ）骨格として選択された。その理由は、その元となるＩｇＧトラスツズマブが、好ましい免疫原性プロフィールを有する承認されたＦＤＡ薬物であり、かつその安定性が広範囲に研究されているためである（バーセレミー（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ）ら著、生化学学会誌（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、２００８年、第２８３巻、ｐ．３６３９〜３６５４）。４Ｄ５  ＶＨのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のランダム変異誘発ライブラリーが作られ、およそ４０，０００個のクローンがホットコロニーフィルトレーション（Ｈｏｔ−ＣｏＦｉ）によって８０℃においてスクリーニングされ、２２種類のユニーク陽性クローンの同定につながった。
【０１１６】
これらのバリアントが集められ、新しいランダム変異誘発ライブラリーのための鋳型として使用された。スクリーニングの第２ラウンドは９０℃で行われ、これは３１種類の追加のユニーク陽性クローンの同定につながり、それらがさらに特徴付けされた。これらのクローンの生物物理学的特徴付けは、改変バージョンにおいて細胞凝集の温度（Ｔｃａｇｇ）を決定することによって行われた（アシアル（Ａｓｉａｌ）ら著、ネイチャー・コミュニケーションズ（Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、２０１３年、第４巻、ｐ．２９０１）。この場合、熱応力は、ＰＣＲ装置中で全長タンパク質ライゼートに対して４０℃から９５℃までの勾配を使用して行われ、続いて凝集塊を除去するために遠心分離され濾過された。次いでその可溶性画分をニトロセルロース膜上に点在させ、成長させた。ＷＴの推定されるＴｃａｇｇが約５０℃であるのに対し、最良の変異細胞株ＶＨ３６は約７３℃のＴｃａｇｇを有する。これは、ＷＴに比べて２３℃の凝集温度の向上に相当する。
【０１１７】
この作業によって同定された最良の２種の変異細胞株ＶＨ３３およびＶＨ３６は、それぞれ変異Ｒ５０Ｓ、Ａ７８Ｖ、Ｓ９３Ｇ、Ａ１００ｂＰ、およびＨ３５Ｄ、Ｓ９３Ｇ、Ａ１００ｂＰ、Ｗ１０３Ｒを含有する。興味深いことに、Ｒ５０およびＨ３５Ｒの変異は、選択されたすべてのクローンにおいて相互に排他的である。
【０１１８】
実施例２：ＶＨ分子内ジスルフィド結合の除去のためのさらなる進化
ＶＨ３６が、ジスルフィドを含まないバージョンの進化のための熱安定性開始鋳型として選択された。ＶＨ３６をペリプラズムの方へ向けるシグナルペプチドｓｒＩＩが除去され、鋳型ＶＨ３６ｉを作り、これは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質中に凝集した。ＮＮ
Ｋコドンを使用して３つの位置、Ｃ２２、Ａ２４、およびＣ９２が、クンケル法による変異誘発によってすべての２０種類のアミノ酸に関してランダム化された。このライブラリーからのおよそ約２０，０００個のクローンをＣｏＦｉブロットによってスクリーニングし、そのニトロセルロース膜をプロテインＡ−ＨＲＰプローブによって成長させて可溶性の折りたたまれたＶＨ３６ｉバリアントを同定した。５種類の異なるバリアントが同定され、ＶＨ３６ｉ．１が最も安定であり、Ｔｍ＝５８℃であった。このクローンは、変異Ｃ２２Ｓ、Ａ２４Ｃ、およびＣ９６Ｔを含有する。
【０１１９】
ＶＨ３６ｉ．１がバインダーの作製に役立つために、その安定性がそのＣＤＲ、特にＣＤＲ−Ｈ３に左右されるべきでない。さらに変異Ａ１００ｂＰは、ＣＤＲ−Ｈ３中で下向きのキンクを発生させ、それはＣＤＲ−Ｈ３の柔軟性、したがってＣＤＲ−Ｈ３の可塑性を減少させる。この理由でＣＤＲ−Ｈ３を除去し、位置Ｗ９５からＰ１００ｂまでを配列ＳＳＳＡによって置き換え、構築物ＶＨ３７ｉを作る。ＶＨ３７ｉは安定性が低く、Ｔｍ＝４６℃である。ＶＨ３７ｉをさらに安定化するために新しいランダム変異誘発ライブラリーをＣｏＦｉによってスクリーニングし、プロテインＡ−ＨＲＰプローブによって成長させた。これはＲＴでのスクリーニングのステップおよび５０℃での陽性のより厳密な確証を伴う。４種類の安定化されたクローンが同定され、ＶＨ３７ｉ．１およびＶＨ３７ｉ．２が、Ｔｍ＝約５６℃の安定性を有する最も安定なものであった。ＶＨ３７ｉ．１は、コア領域変異Ａ７８Ｖを含有し、一方、ＶＨ３７ｉ．２は、ＣＤＲ−Ｈ３に近い所に位置する変異Ｇ９３Ｖを含有する。これら両方のクローン由来の変異を組合せて、Ｔｍ＝約５７℃の安定性を有する最終クローンＶＨ３８ｉを作製した。このバリアントは、その分子の唯一のシステインである位置Ｃ２４、すなわち元の野生型のＡｌａに対する幾種類かの置換と、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｒｙ、Ｓｅｒ、およびＴｒｐへの変異とを受け入れる。Ｃ２４ＩおよびＣ２４Ｌは、Ｔｍ＝約５８℃を有する最も安定なバリアントである。この研究を通じて得られたすべての知識の組合せは、ジスルフィド架橋の存在または不在下でのＶＨドメインのより高い安定性を可能にする変異の同定につながった。これらの好ましい変異は、図１Ａおよび１Ｂ中で強調されており、本発明の最終的な骨格、すなわちそれぞれＶＨ−ＮＴＵ（＋）およびＶＨ−ＮＴＵ（−）に対応する。
【０１２０】
実施例３：ジスルフィド架橋の不在下での発現および安定性についてのＶＨ−ＮＴＵ（−）とジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）とのＶＨ  １Ｂ１の比較
ジスルフィド架橋の不在下での安定性についてＶＨ骨格の挙動をジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のＶＨ骨格１Ｂ１と比較するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質中で発現することができる２種類のタンパク質構築物が作製された（図２）。
【０１２１】
ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の骨格（ＧＮＥ）と、アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＳＡＩＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＴＧＲＳＳＳＡＭＤＹＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）を有する骨格ＶＨ−ＮＴＵ（−）とが、ｐＥＴ系発現ベクター中にクローン化され、それらプラスミドがロゼッタ２（Ｒｏｓｅｔｔａ２）発現細胞株に形質転換された。発現は、８００ｍＬのＴＢ培地中で１８℃において一晩行われた。本明細書中で述べるＶＨ−ＮＴＵ（−）抗体は、４Ｄ５ＶＨドメインをベースにしており、そのＣＤＲ−Ｈ３は、多様な標的に対して異なるバインダーを作製する場合にこのＣＤＲ中の予想される変動を補償するために９５〜１００ａ位でフレキシブル配列ＳＳＳに置き換えられた。
【０１２２】
ＧＮＥおよびＶＨ−ＮＴＵ（−）について得られた細胞ペレットは、それぞれ１８ｇおよび２０ｇであった。これらは３０ｍＬの溶解バッファー中に再懸濁され、超音波処理によって溶解された。
【０１２３】
ライゼートは、４℃において３５，０００ｇで１５分間遠心分離され、上清（可溶性画分）が保管された。ＧＮＥおよびＶＨ−ＮＴＵ（−）の可溶性画分からのアリコートが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せられた。電気泳動後、それらのタンパク質をニトロセルロース膜上に移し、抗ｍｙｃ抗体でプローブして、ＧＮＥおよびＶＨ−ＮＴＵ（−）の可溶性発現の相対的レベルを比較した。
【０１２４】
融解温度（Ｔｍ）は、示差走査蛍光分析（エリクソン（Ｅｒｉｃｓｓｏｎ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２００６年、第３５７巻、ｐ．２８９〜２９８）によって決定された（図４）。ＧＮＥおよびＶＨ−ＮＴＵ（−）は、それぞれ融解温度Ｔｍ＝４０．６℃およびＴｍ＝５６．１℃を有する。したがって、骨格ＶＨ−ＮＴＵ（−）は、ジスルフィド架橋の不在下のジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の骨格よりも１６℃安定である。
【０１２５】
データは、骨格ＶＨ−ＮＴＵ（−）が、ジスルフィド架橋の不在下のジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の１Ｂ１よりも優れていることを示す。ＶＨ−ＮＴＵ（−）については、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのその可溶性発現収率が１２８倍であり、また安定性は１６℃優れている。これらの利点は、本発明の骨格を、細胞内標的に対して抗体を生成させるための理想的な選択肢にする。これは、治療だけでなく研究および画像化の目的のために細胞内分子を標的にする明白な用途を有する。このより高い発現収率は、生産および精製工程を単純化し、かつ速めることができる。
【０１２６】
実施例４：骨格ＶＨ−ＮＴＵを使用した多様な標的に対するバインダーの作製
本発明者らの骨格の有用性を立証するために、図２Ａに記載されている配列がファージディスプレイ抗体のライブラリーを作製するための鋳型として使用された。このライブラリー１は、３種類のＣＤＲ、すなわちＨ１、Ｈ２、およびＨ３すべてに変異を含有し、ＴｙｒおよびＳｅｒに偏ったアミノ酸組成を有する（図５）。
【０１２７】
ライブラリー１を使用して、３種類の多様な標的、すなわちヒト増殖因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）、ヒトＳＨ２ドメイン含有タンパク質３Ｃ（ＳＨＥＰ１）、および熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の二官能性ジヒドロ葉酸還元酵素−チミジル酸合成酵素（ＤＨＦＲ−ＴＳ）に対するバインダーが同定された。得られた親和性は１８０ｎＭ〜１７ｎＭの範囲にある（図６）。
【０１２８】
第２世代のライブラリー（ライブラリー２）は、以前の設計に改良（ＣＤＲ−Ｈ３についてより広範囲の長さ、ＣＤＲ−Ｈ１では好ましい残基Ｔ３２、また同じＣＤＲ−Ｈ１中の残基Ｉ２９およびＣＤＲ−Ｈ３中の残基Ｍ１００ｃを置換するための疎水性残基）を加えて作製された（図５）。真核細胞翻訳開始因子４Ｅ（ＥＩＦ４Ｅ）および受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−３（Ｈｅｒ３）に対するバインダーが、このライブラリーから同定された。ライブラリー２を使用して得られる親和性は４８ｎＭ〜８ｎＭの範囲にある（図６）。
【０１２９】
実施例５：ヒト癌細胞中でのバインダーの発現
これらのＶＨドメインがヒト細胞内で安定であることを実証するために、このＶＨを高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に融合させた融合構築物が作製された。これはＶＨが可溶型で産生された場合に緑色蛍光発光の読出しを与える。図７は、抗Ｇｒｂ２  ＶＨ−ＥＧＦＰまたは対照のＶＨ−ＥＧＦＰのいずれかをトランスフェクトされたヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７の結果を示す。トランスフェクトされた細胞からの蛍光シグナルは、これらＶＨが細胞内で発現し、ヒト細胞中で安定性を維持し得ることを裏付けている（これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質中での発現について実施例３で述べたように本発明のＶＨ−ＮＴＵ
とジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のＧＮＥとの比較の間にすでに証明されている）。
【０１３０】
本明細書において、本発明を広範かつ一般的に述べてきた。この一般的な開示の範囲内にある、より狭い種および亜属の系列のそれぞれも本発明の一部を形成する。それには、削除される材料が本明細書中に具体的に列挙されているかどうかに関係なく、その属から任意の対象物を排除する条件または否定的限定付きで本発明のこの一般的記述が含まれる。他の実施形態は、以降の特許請求の範囲内にある。加えて、本発明の特徴および態様がマーカッシュ群によって記述される場合、当業者は、それにより、そのマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたは亜属のメンバーに関しても本発明が記述されることを認識する。
【０１３１】
当業者は、本発明が、その目的を遂行するように、かつ言及された目的および利点と、それに内在するものとを得るように良好に適合されることを容易に理解するであろう。さらに本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書中で開示された本発明に対する様々な置換形態および修正形態がなされ得ることは、当業者に容易に明らかになる。本明細書に記載される組成物、方法、手順、処理、分子、および特定の化合物は、好ましい実施形態を現在代表するものであり、具体例であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の趣旨の範囲内に包含され、また別添の特許請求の範囲によって規定されるその中の変更形態および他の使用が当業者に想到される。本明細書中の以前に公開された文献の列挙または考察は、必ずしもその文献が従来技術の一部であるか、または普通の一般的な知識であるという承認と受け取られるべきではない。
【０１３２】
本明細書中で例示的に記述される本発明は、本明細書中で具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限が存在しなくても適切に実施することができる。したがって、例えば用語「含む」、「包含する」、「含有する」などは、拡張的に限定なしに読まれるものとする。したがって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、指定された整数または整数群を含むことを意味し、任意の他の整数または整数群を排除することを意味しないことが理解される。加えて、本明細書中で使用される用語および表現は、説明の用語として使用されており、限定の用語としてではない。また、示されかつ記述された特徴の任意の均等物またはその部分を排除するそのような用語または表現の使用には何らの意図もないが、様々な修正形態が特許請求される本発明の範囲内にあり得ることが分かる。したがって、本発明は、例示的な実施形態および任意選択的な特徴によって具体的に開示されているが、その中で具現化され、本明細書中で開示されている修正形態および変形形態は当業者が依拠し得ること、およびそのような修正形態および変形形態は本発明の範囲内にあると考えられることを理解されたい。
【０１３３】
本明細書中で引用されるすべての文献および特許文献の内容は、それらの全体が参照により援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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