(57)【要約】【課題】細胞内エネルギー代謝を改善するための環状トリペプチドの使用。【解決手段】本発明は、卵母細胞インテグリンへのフェルチリンベータの結合部位を再生させるトリペプチドを含む環状ペプチドの、細胞エネルギー代謝の改善のための使用に関する。より具体的には、本発明は、生殖補助医療（ＭＡＰ）プロトコルの関連で、配偶子または胚細胞のエネルギー代謝の刺激、具体的には、卵母細胞の体外成熟、受精率および出生率の向上のための、トリペプチドＦＥＥｃを含む環状ペプチドの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内エネルギー代謝の刺激が必要とされる医学的または非医学的用途におけるその使用のための、卵母細胞インテグリンへのフェルチリンベータの結合部位を再生させるトリペプチドを含む環状ペプチド。
【請求項２】
薬剤が、生殖補助医療（ＭＡＰ）プロトコルにおいて、精子の進行速度およびその受精能力を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のその使用のための請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
薬剤が、ＭＡＰプロトコルにおいて、超活性化精子の量を増加させる、請求項１に記載のその使用のための請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
子宮内授精（ＩＵＩ）プロトコルにおける、請求項１〜３のいずれか一項に記載のその使用のための請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
前記精子が、前記子宮内授精の前に、１〜１００μＭのペプチドの存在下で１分間〜３時間インキュベートされることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項に記載のその使用のための請求項２〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
薬剤が、卵母細胞の体外成熟を改善する、請求項１に記載のその使用のための請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
ヒト卵母細胞の体外成熟を改善するための、請求項６に記載のその使用のための請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
受精および卵母細胞活性化を改善するための、請求項６または７に記載のその使用のための請求項６または７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記卵母細胞が、１〜１００μＭのペプチドの存在下で１分間〜４日間の間の期間インキュベートされることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載のその使用のための請求項６〜８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記薬剤が、接合体発生の第１週の間に、割球の倍数性を改善することを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載のその使用のための請求項６〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
薬剤が、移植前胚発生を改善することを特徴とする、請求項１に記載のその使用のための請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記薬剤が、長期間にわたる培養条件下で使用されることを特徴とする、請求項１１に記載のその使用のための請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
配偶子および胚の低温保存を改善するためのその使用のための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
体外受精（ＩＶＦ）プロトコルにおける、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のその使用のための請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記薬剤が、妊娠可能性を増加させることを特徴とする、請求項１０に記載のその使用のための請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記薬剤が、流産リスクを低減することを特徴とする、請求項１０に記載のその使用のための請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記薬剤が、異数性、特に三倍体化のリスクを低減することを特徴とする、請求項１０に記載のその使用のための請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１８】
薬剤が、生体外での細胞培養の促進に使用されることを特徴とする、請求項１に記載のその使用のための請求項１に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記細胞がリンパ球であることを特徴とする、請求項１８に記載のその使用のための請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
薬剤が眼内に投与されることを特徴とする、請求項１に記載のその使用のための請求項１に記載のペプチド。
【請求項２１】
薬剤がベクター化されることを特徴とする、請求項１に記載のその使用のための請求項１に記載のペプチド。
【請求項２２】
局所適用を目的とする化粧用または治療用組成物におけるその使用のための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２３】
卵母細胞インテグリンへのフェルチリンベータの結合部位を再生させるトリペプチドを含む環状ペプチドを含む、化粧用または皮膚処置用組成物。
【請求項２４】
卵母細胞インテグリンへのフェルチリンベータの結合部位を再生させるトリペプチドを含む環状ペプチドを含む点眼薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生殖補助医療（ＭＡＰ）の分野に関し、より詳細には、特に生体外での細胞培養または細胞維持のステップを含むプロトコルの間に、細胞におけるミトコンドリア活性、またはより一般的にはエネルギー活性の刺激が必要となる全ての医学的、獣医学的またはその他の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１５％以上のカップルが、生殖可能期間内に生殖補助医療を受けている。精子に障害があるときには、受精のためにはマイクロインジェクション技術によることが一般的である。しかし、この技術は卵母細胞にとって非常に侵襲的である。更に、正常な精子による体外受精（ＩＶＦ）においても、通常では３〜５％の不可解な受精不成功が見られる。
【０００３】
先行特許出願（特許文献１）において、本発明者らのチームは、２つの末端システイン間に環化結合を有する、式Ｃ−Ｓ−Ｆ−Ｅ−Ｅ−Ｃ（配列番号１）の環状トリペプチド（Ｐｈｅ、ＡｃＧｌｕ、ＡｃＧｌｕ）（ＦＥＥｃ）、およびヒト生殖子の受精能力を増加させるその作用を記載した。これに相当する分子が様々な動物の種にも存在し、それらは同じ性質を有し、また前記文献にも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５／０５１７９９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それらの研究を検討し、本発明者らは、ＦＥＥｃ分子が精子に影響を及ぼすことを見出した（下記の実施例１）。具体的には、それはＣＡＳＡ（コンピュータ支援精子分析）による分析によると、精子運動のパラメータを改善する。ゆえに、例えば、直線速度および頭部の側方移動の振幅は、それぞれ７％および８％（Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．００２）増加する（実施例１）。これは、超活性化精子のパーセンテージが約３０％増加することとなる（Ｐ＜０．００９）。これらの超活性化精子が、受精させる精子である。精子の運動が、ダイニン腕の軸糸付近の精細管への結合により生じるため、その進行速度を上昇させるためには、そのＡＴＰ消費を増加させるか、または少なくともそのエネルギー代謝を強化させることを考えるのが論理的である。ダイニンはＡＴＰアーゼである。ＦＥＥｃに曝露された精子のミトコンドリア代謝を研究することによって、本発明者らは、前記ＦＥＥｃがミトコンドリア膜電位の上昇を誘導し、それがミトコンドリアによるＡＴＰ合成の増加、または消費の減少のいずれかを証明する、という仮説を立てている。ゆえに、ＦＥＥｃは、ＡＴＰ産生の改善または細胞によるその使用の制御により、精子のミトコンドリアでのエネルギー代謝またはより一般的には細胞内エネルギー代謝を改善する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、広義には卵母細胞インテグリンへのフェルチリンベータの結合部位を再生させるトリペプチドを含む環状ペプチド、または式ＥＥＰ（配列番号２）のトリペプチドの、ミトコンドリア活性を改善するための、または、より広義には、細胞内エネルギー代謝を改善するための薬剤としてのその使用のための、使用に関する。本明細書では、２つの異なるタイプの細胞、すなわち精子および卵母細胞、ならびに、胚である多細胞生物の発生に対するかかるペプチドの適用が例示される。実験のセクションで示される結果は、細胞内エネルギー代謝の改善が必要とされる他の用途においてこのペプチドが使用可能であるという事実を裏付ける。特に、このペプチドは、細胞、特にリンパ球の培養の収率の改善に有用でありうる。特定の一実施形態では、ペプチドはベクター化（ｖｅｃｔｏｒｉｚｅｄ）され、すなわち、細胞へのその取り込みを促進する薬剤、分子、組成物または任意の他のタイプのベクターと組み合わせて投与される。より広義には、ベクター化は、有効成分をベクターと結合することにより、標的に対するその分布を調整し、制御するのに有用である。
【０００７】
前述において、「卵母細胞インテグリンへのフェルチリンベータの結合部位を再生させるトリペプチドを含む環状ペプチド」とは、上記の出願、国際公開第２００５／０５１７９９Ａ２号に記載のペプチドに対応する。この先行特許出願、特に表１に記載のように、トリペプチドは種ごとに異なる。それは当業者に公知の任意の手段によって、特にトリペプチドの両側に位置する２つのシステイン残基により、環化されうる。広義には、出願、国際公開第２００５／０５１７９９Ａ２号に記載の全てのバリエーションが、本発明の目的のための「卵母細胞インテグリンへのフェルチリンベータの結合部位を形成するトリペプチドを含む環状ペプチド」の定義に対応すると考えられる。本明細書を読みやすくするために、この環状ペプチド、およびまた、それを有効成分として含む薬剤を、本明細書では式「ＦＥＥｃ」により表記する。当業者は、この表記がまた、ヒト以外の種で使用できる形態も包含すること、例えばウシの場合にはＴＤＥ環状トリペプチドを使用すべきであることを完全に理解するであろう。
【０００８】
下記の本発明の詳細な説明、およびまた実施例を読むことにより、本発明の範囲が、生殖補助医療の用途に限定されず、多くの他の分野における実際の用途においても適用可能であることが理解されるであろう。ゆえに本発明はより広義には、細胞内エネルギー代謝の刺激が必要とされる医学的もしくは非医学的用途におけるＦＥＥｃの使用に関する。
【０００９】
精子の子宮内授精に及ぼす作用：
ＦＥＥｃはまた、精子運動パラメータを改善することにより、子宮内授精（ＩＵＩ）における妊娠率を改善することができる。本発明の第１の具体的態様によると、ＦＥＥｃは、生殖補助医療（ＭＡＰ）プロトコルにおいて精子の進行速度を上昇させるのに使用される。ＭＡＰの関連では更に、ＦＥＥｃは、精子運動パラメータの改善、および超活性化精子のレベルの増加に使用できる。ゆえに、ＦＥＥｃの使用は、ヒトにおける、また非ヒト哺乳類における子宮内授精（ＩＵＩ）プロトコルにおいて特に有利である。この態様における本発明の実施では、１０〜１００μＭのペプチドの存在下で精子を望ましくは１分〜３時間インキュベートし、次に子宮内授精前に洗浄する。
【００１０】
体外での卵母細胞の成熟に及ぼす作用：
分子は、卵母細胞に対しても効果的である。卵核胞で保護されたヒトの卵母細胞の体外成熟は、ＦＥＥｃの存在下では、３７．７１％から５９．３０％に上昇する（Ｐ＜５．７×１０−５）（実施例２）。３７歳以上の患者では、この率は３６．９６％から６８．２９％に上昇し（Ｐ＜０．００３）、これは分子がこの年齢層において特に効果的であることを示す。３７〜４０歳の女性の卵母細胞は、そのミトコンドリア活性の低下を理由として、少なくとも５０％、より通常では約８０％のケースにおいて異数体である。分子は、卵母細胞の倍数性を、発生能および移植能が受精した卵母細胞のミトコンドリア活性に依存する胚をそれと同じ理由で胚のも改善することができる。後述の「フェルチリン」の臨床試験の関連で、３７歳未満の女性における妊娠率の有意な増加はこの有利な効果が、いかなる卵母細胞に対して、また特にその受精期および初期の胚発生の期間において見られることを示す。これらの結果に従う仮説は、フェルチリンが卵母細胞の倍数性を改善できるということである。
【００１１】
したがって、分子を含む培養培地の、体外受精用培地、および胚インキュベーション用培地の添加により、（特に３０歳未満および３７歳以上の女性において）卵母細胞および胚の成熟の改善、ならびに、従来のＩＶＦによる、およびＩＣＳＩ（細胞質内精子注入）を伴うＩＶＦによる受精率の改善が可能となる。
【００１２】
したがって、体外受精期間におけるＦＥＥｃ分子を含む培養培地の添加により、顕微操作の有無にかかわらず、使用する実験条件下で、特に３７歳未満の女性における妊娠率および乳児の出生率を改善することが可能となる。
【００１３】
卵母細胞の体外成熟（ＩＶＭ）プロトコルにおける作用：
ＦＥＥｃ分子はまた、受胎能を維持するための卵母細胞の体外成熟（ＩＶＭ）プロトコルにも効果的であり得る。
【００１４】
体外受精プロトコルにおいて、卵母細胞の成熟は通常、卵母細胞の回収時に完了している。しかしながら、卵母細胞の中には、時にはいまだ未成熟のものも存在する。更に、卵巣の機能異常または刺激を困難にする臨床症状を呈する女性も一部存在する。したがって、体外成熟に際して、未成熟の段階での穿刺を随時行った。ペプチドにより、この成熟（受胎能維持のための体外成熟）を効果的に補助できた。
【００１５】
全ての未成熟卵母細胞は、胚胞（ＧＶ）と呼ばれる大きな核を有する。成熟した卵母細胞は、囲卵腔（卵母細胞の表面と透明帯との間）に第１の極体（ＰＧ）が存在することを特徴とする。成熟した卵母細胞のみが受精できる。
【００１６】
本発明者らは、ＦＥＥｃにより体外での卵母細胞の成熟の改善が可能になることを示した。これは、卵母細胞のミトコンドリア活性に対する、またはエネルギー代謝に対する前記トリペプチドの効果によって説明される。実際、ミトコンドリア活性、またはより広義にはエネルギー代謝は、年齢と共に減少し、また卵母細胞の成熟では、以下のように幾つかの高度にエネルギーを消費するステップが存在する：
・胚胞の破裂
・染色体凝縮
・中期板の形成
・スピンドルの形成
・チェックポイントタンパク質の合成
・終期
・ＰＧの放出。
【００１７】
実際は、年齢と共に悪化するこれらの卵細胞の成熟の問題は、若い細胞（若いドナーまたは卵原幹細胞から得た卵母細胞）に由来するミトコンドリアのマイクロインジェクションにより修正される。これは、ミトコンドリア機能不全またはより広義にはエネルギーの不足を伴う細胞の異常をＦＥＥｃが実際に修正する確率を高めるものである。
【００１８】
したがって、その態様の別のものによると、本発明は、卵母細胞の体外成熟を改善するための、ＦＥＥｃの使用に関する。減数分裂の質の改善により、おそらく、若い女性においても観察される流産の率を減少させると考えられ、ゆえに、本発明のこの態様はまた、３７歳未満、または３０歳未満の女性においても、卵母細胞の体外成熟の改善に有効である。本発明のこの態様の実施の際には、卵母細胞を１時間〜４日間の間の期間、具体的には最長３日または２４時間、１０〜１００μＭのペプチドの存在下でインキュベートする。
【００１９】
受精した卵母細胞の活性化に及ぼす作用：
本発明者らは、受精後の精子頭部の脱凝縮が増加することも示している。これは、受精時の卵母細胞活性化が改善されたことを反映する。これは更に、卵母細胞のミトコンドリア活性と関連する。
【００２０】
割球形成に及ぼす作用：
本発明者らは、ＦＥＥｃにより割球形成の改善も可能になることも（マウスにおいて）示している。これもまた、ミトコンドリア活性に対する、または、より広義には細胞の代謝に対するトリペプチドの効果に起因するともいえる。実際、ミトコンドリアＤＮＡの複製が移植前胚形成の間には起こらないことが知られている。発生第１週の間、接合体（または卵子）は、２細胞および次の４細胞から始まる連続的な有糸分裂により分裂し、更に桑実期を経て胚盤胞期に達するが、その際、卵母細胞に最初から存在するミトコンドリアが優先的に使用される。したがって、ミトコンドリア不足（数または産生量に関する）は、減数分裂および有糸分裂の間に割球中の染色体不安定の原因となりえ、またそれは接合体もしくは胚の発生、または妊娠の進行さえも抑制しうる。これは、天然受精後の、またはＩＶＦの際の胚移植後の自然流産の一般的原因である。したがって、本発明はまた、接合体発生第１週の間において割球の倍数性を改善するためのＦＥＥｃの使用に関する。結果として、本発明は、流産の数を減少させるためのＦＥＥｃの使用に関する。本発明はまた、異数性、特に三倍体化（ｔｒｉｓｏｍｙ）のリスクを低下させるためのＦＥＥｃの使用に関する。本発明のこの態様では、胚を２４時間〜６または７日間の間の期間、１０〜１００μＭのペプチドの存在下でインキュベートする。
【００２１】
上記の使用は、特に体外受精（ＩＶＦ）プロトコルに有用である。それらにより、ヒトにおいては、あらゆる年齢の女性が、文献に記載のミトコンドリア注入（現在まで多くの文献で高い効果が記載）に依ることなく、自分自身の卵母細胞で、ＭＡＰにより子を授かることができる。
【００２２】
流産リスクの低減：
本発明はまた、流産リスクの低減へのＦＥＥｃの使用に関し、この点は前述のとおりであり、下記の実験のセクションにおいて例示されるとおりである。
【００２３】
三倍体化のリスクの低減：
本発明はまた、全ての女性、特に３５、３６、３７、３８、３９または４０歳およびそれ以上の女性における、ＩＶＦの際の、三倍体化、またはより広義には、異数性のリスクを低減するための、ＦＥＥｃの使用に関する。
【００２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胚発生の動態の改善：
本発明はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの移植前胚発生を改善するための、ＦＥＥｃの使用に関する。特定の一実施形態では、当該移植前の発生は、長期間にわたる培養条件下で得られる。胚発生の動力学の改善により、出生率の向上が可能となる。
【００２５】
天然繁殖における作用：
ＩＶＦの関連で卵母細胞および接合体に対するＦＥＥｃの効果が、本発明者により示されたが、これらの効果は、天然受精の際にも、例えば、トリペプチドが卵母細胞へのベクター化に適する手段と組み合わされたＦＥＥｃの、排卵時の経膣的な投与により、得られることが明らかである。
【００２６】
配偶子および胚の低温保存の際の作用：
また、低温保存された卵母細胞の生存率が、とりわけそのミトコンドリア活性に依存することが示されている。胚についても同様であると考えられる。したがって、ＦＥＥｃペプチドにより、低温保存された配偶子および胚の解凍の際の、生存率および／または品質が改善されうる。
【００２７】
他のタイプの細胞に対する作用：
環状トリペプチドは、卵母細胞上のα６β１インテグリンと結合させるために調製される。このインテグリンは、その高い遍在性により、様々な他のタイプの細胞の細胞質膜と結合できる。したがって、この分子はおそらく、多くのタイプの細胞のエネルギー活性を増加させることができると考えられる。したがって、ＩＶＦ以外の多くの用途に使用できる。
【００２８】
分子の作用形式は、おそらくα６β１インテグリンを介して生じるため、ＦＥＥｃは、多くの他のタイプの細胞に対して効果を発揮しうる。この分子は、いかなる細胞培養の収率改善にも使用できるであろう。
【００２９】
上記のように、ＦＥＥｃはおそらく、多くのタイプの細胞表面に存在するα６β１インテグリンまたは別の受容体に対して作用する。したがって、それはこのインテグリンまたはその他の受容体を有する任意の細胞のミトコンドリア活性またはエネルギー代謝の改善に使用できる。この性質を直接適用したのが、あらゆる細胞培養の収率の改善である。したがって本発明はまた、目的の細胞をＦＥＥｃと接触させるステップを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ミトコンドリア活性、またはより広義には、細胞のエネルギー活性を改善する方法に関する。この方法は、生体外で、細胞療法の関連で患者に投与する目的で培養される初期細胞に対して有効に実施することができる。この方法から利益を得られる細胞培養の非限定的な例として、皮膚移植用の観点での皮膚細胞培養、細胞免疫治療用の観点でのリンパ球培養などが挙げられる。
【００３０】
本発明は、医療用途（例えば細胞療法）または非医療用途（例えば実験目的またはタンパク質製造のための細胞の維持、）において、ＦＥＥｃ受容体を発現するあらゆるタイプの細胞の生体外での培養を促進するための、ＦＥＥｃペプチドの使用に関する。
【００３１】
哺乳動物界に対する作用：
分子は、種特異性を示す。そのアイソフォームは、全ての家畜化もしくは農耕用家畜を含む非家畜化動物（その幾つかの種は繁殖が困難な種（競走馬、ホルスタイン）である）用に調製することができる。
【００３２】
ミトコンドリアの病態および老化に対する作用
ミトコンドリア活性、またはより広義には、エネルギー代謝を刺激する分子としてのＦＥＥｃの性質は、ミトコンドリア活性の不全に関連するいかなるタイプの病態に対しても、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用できる。これに関して、広義には老化病態が挙げられうる。ミトコンドリア機能不全と神経変性疾患との関係は、例えば、幾つかのチームにより確立されている。ゆえに、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病を治療するための薬剤としてＦＥＥｃを使用できると考えられる。染色体テロメア長と細胞内ミトコンドリア活性との関係も示されている。実際、テロメアの短縮化は老化過程と関連している。したがって、細胞のミトコンドリアまたはエネルギー活性を刺激することにより、老化効果を遅延させることが可能である。
【００３３】
ミトコンドリア病は、様々な様相を示すが、網膜色素変性型または眼筋麻痺型などの眼の徴候を頻繁に合併する。後者の病態に対しては、ＦＥＥｃの眼内への局所投与、例えば点眼薬により、ミトコンドリアまたはエネルギー不足に関連する症状を改善できると考えられる。したがって、本発明の別の目的は、卵母細胞インテグリンへのフェルチリンベータの結合部位を形成できるトリペプチドを含む環状ペプチドを含む目薬である。かかる点眼薬は、ＦＥＥｃに加え、増粘剤、消毒剤、抗菌剤またはこのタイプの製品に使用できる任意の他の化合物などの、別の薬剤を含んでもよい。出願、国際公開第２００５／０５１７９９Ａ２号に記載の培地は、当然ながら、本発明の目的の「点眼薬」という用語の定義から除外される。
【００３４】
化粧料における作用
本発明はまた、局所適用を意図する美容用または治療用組成物への、ＦＥＥｃの使用に関する。例として、コラーゲン産生のために線維芽細胞を刺激するための、または、発毛促進、例えば脱毛症の防止もしくは遅延を目的として毛包を刺激するための、ＦＥＥｃの使用が挙げられうる。したがって、本発明はまた、有効成分としてＦＥＥｃを含む化粧用または皮膚処置用組成物に関する。「化粧用または皮膚処置用組成物」という用語は、本明細書では、ＦＥＥｃに加えて、美容分野で通常使用される成分を含む組成物を意味すると意図される。本発明によれば、化粧用または皮膚処置用組成物は、当業者に公知のいかなる形態とすることもできる。例えば、水中油型、油中水型もしくは水中シリコーン型エマルジョン、多層エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、固形エマルジョン、水性もしくは水性アルコールゲル、クリーム、乳液、ローション、軟膏、油剤、バルサム剤、塗剤、マスク、粉、含浸担体、例えば経皮パッチ、水性もしくは水性アルコールローションおよび／もしくはワックス、メイクアップ用製品、例えばファンデーション、シャンプー、コンディショナー、局所適用用のセラム（ｓｅｒｕｍ）、またはヘアローションが挙げられる。国際公開第２００５／０５１７９９Ａ２号に記載の培地は、当然ながら、本発明の目的の化粧用または皮膚処置用組成物の定義から除外される。
【００３５】
本発明によれば、化粧用または皮膚処置用組成物は、例えば顔用、身体用またはヘアケア用組成物、例えば顔用および／または身体用および／または毛髪用組成物であってもよい。
【００３６】
以下の実施例において本発明を例示するが、その範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＦＥＥｃ（右）対「スクランブル」対照ペプチド（左）の存在下での、ミトコンドリア膜電位の変動。大部分の患者における、曝露された精子中での膜電位の増加に注目すべきである。
【図２】１００μＭのＦＥＥｃの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）でインキュベートした、透明帯を除去したヒト卵母細胞と融合したヒトの精子の、ＵＶ励起後のカウント。融合した精子の数の増加、およびそれらの頭部の迅速な脱凝縮に注目すべきである。
【図３】体外成熟（ＩＶＭ）の際の、Ｄ１における成熟した卵母細胞の割合。対照培地または１００μＭのＦＥＥｃを添加した培地中でのＩＶＭ後、ＧＶ期から始まり減数分裂中期ＩＩ（ＭＩＩ）のヒト卵母細胞の割合を表すダイアグラム。＊ｐ＝０．０２。＊＊ｐ＝０．００３。Ｄ１＝２４時間のＩＶＭ。
【図４】体外成熟（ＩＶＭ）の際の、Ｄ１における閉鎖した卵母細胞の割合。閉鎖したヒト卵母細胞の割合を表すダイアグラム。対照培地または１００μＭのＦＥＥｃを添加した培地中での体外成熟（ＩＶＭ）後、ＧＶ期から始まりＤ１において観察した結果。Ｄ１＝２４時間のＩＶＭ。
【図５】標準培地中でのＩＶＭ（２４時間）後の、ＭＩＩのヒト卵母細胞で得られた減数分裂のスピンドルの標識。抗α−チューブリン抗体によるスピンドル標識、およびＤＡＰＩによる染色体の標識。共焦点顕微鏡で得られた画像。Ａ：全卵母細胞。Ｂ：中期板の拡大図。
【図６】ＱＤＥｃペプチドに対応するフェルチリンの存在下または非存在下における、若齢および老齢マウス間の、Ｄ１における受精率の比較。若齢：７週齢のＢ６ＣＢＡＦ１マウス、老齢：７月齢のＢ６ＣＢＡＦ１マウス。
【図７】Ｄ２およびＤ４における、ＱＤＥｃペプチドの存在下または非存在下における、若齢および老齢マウス間の分裂胚の平均パーセンテージの比較。若齢：７週齢のＢ６ＣＢＡＦ１マウス（ｎ＝１０８個の卵母細胞のうち、対照５６個、ＱＤＥｃ５２個）、老齢：７月齢のＢ６ＣＢＡＦ１マウス（ｎ＝１２８個の卵母細胞のうち、対照６５個、ＱＤＥｃ６３個）、＊ｐ＝０．０２、＊＊ｐ＝０．００８、＊＊＊ｐ＝０．０１。
【図８】Ｄ２における、ＱＤＥｃペプチドの存在下または非存在下における、若齢および老齢マウス間の閉鎖（ＡＴＲ）の平均パーセンテージの比較。若齢：７週齢のＢ６ＣＢＡＦ１マウス（ｎ＝１０８個の卵母細胞のうち、対照５６個、ＱＤＥｃ５２個）、老齢：７月齢のＢ６ＣＢＡＦ１マウス（ｎ＝１２８個の卵母細胞のうち、対照６５個、ＱＤＥ６３個）。
【図９】実施例５で実施された臨床試験の方法を表すダイアグラム。
【図１０】臨床試験の関連での、主要および副次的判断基準に関する予備的結果。移植による新鮮なまたは凍結した胚による妊娠率（対照群：ｎ＝１７移植／ＦＥＥｃ群：ｎ＝１３移植）。「トップ胚」（ｔｏｐ  ｅｍｂｒｙｏ）のパーセンテージ（対照群：ｎ＝７５分裂胚／ＦＥＥｃ群、ｎ＝７２）。受精率（対照群：ｎ＝２５９  ＭＩＩ／ＦＥＥｃ群、ｎ＝２４６  ＭＩＩ）。
【図１１】臨床試験の関連で得られた妊娠率。
【図１２】ＦＥＥｃの存在下でのインキュベート後の、ＧＶで保護された卵母細胞の成熟率の改善。この試験は、女性あたり１個の卵母細胞を考慮し、ＦＥＥｃまたは対照ペプチドの存在下で前記卵母細胞をインキュベートすることにより行った。
【図１３】年齢層毎の、ＧＶで保護されたヒト卵母細胞の成熟に対する、ＦＥＥｃの効果。
【図１４】ＱＤＥｃによる、若齢マウスにおける移植前胚発生の刺激（＊Ｐ＜０．００５３２、＊＊Ｐ＜０．００３７４、＊＊＊Ｐ＜０．００９１３、＊＊＊＊Ｐ＜０．０６８、（  ）内は胚数）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３８】
材料および方法：
下記に示す実験例は、以下の材料および方法を使用して得られた。
【００３９】
精子運動パラメータの観察：
試験する精子を各々等分し、一方はＦＥＥｃでインキュベートし、他方は、同じであるがランダムな順のアミノ酸を含有する「スクランブル」ペプチドでインキュベートした。本発明者らは、３７℃で３時間、１００μＭのＦＥＥｃペプチドまたはスクランブルペプチドの存在下でヒトから得た精子をインキュベートし、次に、自動分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｓｐｅｒｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＣＡＳＡ）により精子運動パラメータを観察した。
【００４０】
試験した精子パラメータは、平滑化したＶＡＰ、ＶＳＬ、ＶＣＬおよびＡＬＨである。それらは各々、平均速度、直線速度、曲線速度および頭部振幅に該当する。この試験では、超活性化精子のパーセンテージが有意な増加を示した（Ｍｏｒｔｉｍｅｒらの基準に従う）。これにより、ペプチドの存在下で観察される受精率の増加の説明が可能となる。
【００４１】
ミトコンドリア膜電位の測定：
本発明者らは、３７℃で３時間、ＦＥＥｃペプチド、または同じアミノ酸をランダムな順で含み、ゆえに対照群を構成する「スクランブル」ペプチドの存在下で、ヒトから得た精子をインキュベートした。洗浄後、精子を親油性蛍光色素、ＤＩＯＣ６を使用して標識した。
【００４２】
次にミトコンドリア膜電位（ミトコンドリア内膜のレベルにおけるプロトン勾配）をフローサイトメトリーにより測定した。ＦＥＥｃへの曝露後、精子が増加していることがわかる。
【００４３】
受精インデックスの測定
透明帯を除去したヒト卵母細胞を、１００μＭのＦＥＥｃの存在下または非存在下において、ヒト精子とインキュベートした。ＵＶ励起の後、融合した精子をカウントした。核がヘキスト３３３４２で標識されているとき、精子が融合したものとみなした。更に、ＦＥＥｃペプチドの存在下で卵母細胞を貫通した精子頭部は、数が増加するのみならず、それらの精子頭部の脱凝縮を証明するぼやけた外見を有する。この脱凝縮は、精子の貫通後の卵母細胞活性化の第１段階の１つである。したがって、このことから、ＦＥＥｃは精子の受精能力を改善するのみならず、受精した卵母細胞を活性化すると結論付けることができる。
【００４４】
体外成熟（ＩＶＭ）を目的とするヒト卵母細胞の回収
研究に供する未成熟ヒト卵母細胞は、コーチン病院（パリ、フランス）の生殖補助医療（Ｍｅｄｉｃａｌｌｙ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｃｒｅａｔｉｏｎ、ＭＡＰ）センターの体外受精（ＩＶＦ）研究室から回収した。卵母細胞穿刺の２時間後、マイクロインジェクションしようとする卵母細胞をヒアルロニダーゼ（Ｏｒｉｇｉｏ社、Ｌｉｍｏｎｅｓｔ、フランス）により、それらの放射冠（ｃｏｒｏｎａ）を除去した。倒立顕微鏡（Ｈｏｆｆｍａｎ社）での観察後、胚胞（ＧＶ）期の未成熟卵母細胞を以降の実験のために維持した。
【００４５】
未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟（ＩＶＭ）
ＧＶ期の未成熟ヒト卵母細胞を、対照培養培地（グローバル、ＪＣＤ社、Ｌａ  Ｍｕｌａｔｉｅｒｅ、フランス）（ｎ＝２０３）、または１００μＭのＦＥＥｃを添加した同じ培地（ｎ＝１９３）にランダム化した。未成熟ヒト卵母細胞を、３７歳未満の女性に属するもの、および３７歳以上の女性に属するものの２つの群に分類した。小胞穿刺の日、ＧＶ期の卵母細胞の２つの群を、油膜で覆った２０μｌの液滴中でインキュベートし、５％のＣＯ２下、３７℃に維持して、倒立顕微鏡（Ｈｏｆｆｍａｎ社）を用いてＤ１（インキュベート２４時間）およびＤ２（インキュベート４８時間）において観察した。卵母細胞を、中期ＩＩ（囲卵腔に第１極体）、胚胞期（ＧＶ）、中期Ｉ（極体放出を伴わない胚胞の破裂）または閉鎖卵細胞に分類した。
【００４６】
体外成熟（ＩＶＭ）を目的とするマウス卵母細胞の回収
チャールズリバー・ラボラトリー社（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランス）により供給されたＢ６ＣＢＡＦ１メス（５〜８週齢の間）に対し、排卵誘発を生じさせずに、ＰＭＳＧ（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）を１０ＩＵでの注射して刺激した。未成熟卵母細胞を注射の４８時間後に卵巣から回収し、次にそれらの卵丘細胞をヒアルロニダーゼにより除去し、Ｍ２培養培地で３回洗浄した。ＧＶ期に分類される卵母細胞のみを、以降の実験のために維持した。
【００４７】
未成熟マウス卵母細胞の体外成熟（ＩＶＭ）
マウス卵母細胞を、一方は標準培地、他方は１００μＭのＱＤＥｃを添加した培地間でランダム化して、インキュベートした。培養皿は前日に調製し、５％のＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。Ｄ０（安楽死後８時間）およびＤ１（２４時間）において卵母細胞を観察した。
【００４８】
免疫蛍光法
ＩＶＭから得られたヒト卵母細胞を、周囲温度で１時間、２％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、次に０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。０．５％のＢＳＡ、０．１％のトリトンＸ−１００、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０および５％の正常ヤギ血清を含有する溶液中で卵母細胞をインキュベートすることによって、透過化処理を行った。次に卵母細胞をＰＢＳ−０．５％  ＢＳＡ中で洗浄した後、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中の抗ヒトαチュービュリン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）の１／２００希釈液中で一晩インキュベートした。次に卵母細胞をＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒがコンジュゲートしたＩｇＧ二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ａｌｆｏｒｔｖｉｌｌｅ、フランス）の存在下で、１時間インキュベートした。洗浄ステップの後、卵母細胞をＤＡＰＩ（１／１０００希釈）中で１０分間インキュベートした後、スライドに載せ、暗所で共焦点顕微鏡により観察した。スピンドルの解析の際には、独立にかつ良好に構成された微小管繊維が中期板のレベルで完全に配置された染色体と連結された卵母細胞を、正常なものとした。
【００４９】
マウスの刺激および交配
７週齢の「若齢」および７月齢の「老齢」Ｂ６ＣＢＡＦ１メスに、１０ＩＵのＰＭＳＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を注射し、続いて１０ＩＵのｈＣＧ（ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を４６〜４８時間後に投与して排卵を誘発することで構成される過剰排卵の後、Ｃ５７Ｎオスと交尾させた。
【００５０】
交尾の翌日、膣栓を示すマウスを安楽死させた。ｈＣＧの注入の１５〜１６時間後に輸卵管から卵母細胞を回収し、囲卵腔中の第２極体の存在によって受精率を評価した。
【００５１】
受精したマウス卵母細胞のインキュベート
交尾後に受精し、回収されたマウス卵母細胞を、４群（環状ＱＤＥペプチド（ＱＤＥｃ）に曝露された若齢、若齢対照、ＱＤＥｃに曝露された老齢、老齢対照）にランダム化し、対照では２０μｌの培養培地（ＫＳＯＭ）の滴中に、曝露されたものでは１００μＭのＱＤＥｃを添加してインキュベートした。ｉｎ  ｖｉｖｏでの交尾（Ｄ０）の後、Ｄ１からＤ４まで曝露を継続させた。ＱＤＥｃはヒトＦＥＥｃに対応する。培養皿を５％のＣＯ２下、３７℃でインキュベートし、それらを鉱油で被覆した。
【００５２】
卵母細胞を、双眼拡大顕微鏡で毎日観察し、胚発生の徴候を評価した。正常な発生動態では、最短で、Ｄ２までに胚の２細胞への分裂が起こり、Ｄ５までに桑実胚期または胚盤胞期を迎える。
【００５３】
ヒトＩＶＦのランダム化プロスペクティブ試験
平均年齢は、女性が３４．３±４．２歳、およびそのパートナーが３７．０±５．２歳である６６カップルに対し、２０１４年９月８日、コーチンＭＡＰセンターのＩＶＦ研究室で臨床試験を開始した。この試験は、ＦＥＥｃの存在下または非存在下において実施される体外受精（ＩＶＦ）の、ランダム化による、単一施設でのプロスペクティブ試験である。その卵丘から回収された卵母細胞を、その回収した順に従い、１つずつ交替に２つの群に分けた。全ての卵母細胞を回収したとき、卵丘からの回収に関与しなかった技術者に、２つの群のうちのいずれをＦＥＥｃ存在下で受精させ、またいずれを対照として用いるかについて、ランダムに決定させた。卵母細胞の一方を標準培養培地（グローバル、ＪＣＤ社）でインキュベートし、他方を、１００μＭのＦＥＥｃを添加した同じ培地でインキュベートした。
【００５４】
図９にダイアグラムとして表すこの試験の方法を以下に示す。産婦人科医による、ホルモンの刺激後の卵巣穿刺により、１８〜４３歳の女性に由来するヒト卵母細胞を回収した。卵母細胞を、ランダム化して２つの群に分け、すなわち卵母細胞を、１００μＭのＦＥＥｃを添加した標準培養培地、または標準培養培地（グローバル、ＪＣＤ社）の存在下でインキュベートし、次に、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベーターに置いた。パートナーの精子を研究室で回収し、ＭＡＰセンターの標準調製法により最も動きの良いものを選択した。ＩＶＦは、油下、２０μｌの滴中、選択された精子１０５／ｍｌの濃度の授精培地中で、精子を卵母細胞と接触させることで構成される。５％のＣＯ２下、３７℃で、インキュベーター内で１８時間、授精を行う。授精の１８時間後（Ｄ１）、卵母細胞から放射冠を除去する。受精した卵母細胞を洗浄し、別の培地の滴に移し、更に２４時間培養する。子宮内への移植時、それらを３回洗浄し、次に移植培地中に移し、子宮腔に注入する。由来の群に何ら注意を払うことなく、その見かけの品質に従い、胚を移植する。年齢、ＩＶＦの徴候、可能性のランク（ａｔｔｅｍｐｔ  ｒａｎｋ）および得られた胚の品質、ならびにカップルの合意に従い、１個または複数の胚を移植する。幾つかの胚は、直ちに、またはＤ２での胚の移植後に、５日間（胚盤胞期）にわたる長時間の培養を行う場合もある。
【００５５】
主要評価基準は、新鮮なまたは冷凍された胚の移植による臨床妊娠率であり、均一移植群（対照群および処理群）ならびに混合移植群（２つの混合群）の３つの群について流産率を評価した。
【００５６】
副次的基準は以下の通りである：
−  授精率、すなわち、コホートの中期２の卵母細胞数に対する、受精１８時間後の、細胞質内に２つの前核を有する接合体数の比率。
−  良質の胚、すなわち分裂の順序が理想的な順序に対応する胚、つまり、Ｄ２において４〜５細胞、およびＤ３において８〜９細胞、ならびに割球断片化がＡ型（断片により占められる割合が胚体積の１０％未満のとき）またはＢ型（断片により占められる割合が胚総体積の１０％〜３０％の間のとき）のパーセンテージ。ゆえに、これらの「トップ」胚は、各群の胚総数に対する各タイプの胚数の比率に対応する。
【００５７】
このプロトコルは、２０１２年１２月１３日にＷｅｓｔ  ＶＩ倫理委員会によって承認された。試験は、２０１３年７月８日にフランス生物医薬局（Ａｇｅｎｃｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｂｉｏｍｅｄｅｃｉｎｅ）から許可を得た。ＩＶＦは、適切な臨床診療への厳格な順守に基づき実施される。試験への参加に同意した各カップルは、自由意思によりインフォームドコンセント文書に署名した。
【００５８】
統計分析
定量的変数は、それらの数値、平均および標準偏差によって分析した。定量的変数に対する適切な検定方法（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ検定またはＷｉｌｃｏｘｏｎ検定）を使用して、データを曝露群および非曝露群間で比較した。パーセンテージの比較は、カイ二乗（χ２）検定またはフィッシャー正確検定を使用して行った。ｐ値（有意な閾値）が０．０５未満であったとき、比較データ間の相違を統計的有意であるとみなした。
【００５９】
実施例１
精子運動パラメータ、および男性における超活性化精子のパーセンテージの改善
予備実験では、ＦＥＥペプチドの存在下でインキュベートした精子の１８時間生存試験において、生存が、１００μＭの濃度のＦＥＥで処理した群において、対照群と比較して有意に改善されることが示された。
【００６０】
実施例１ａ
ＦＥＥｃの、および対照であるスクランブルペプチドの存在下、インキュベート後の、精子運動パラメータの自動分析：
下記の表１に示す結果は、平滑化したＶＡＰ（ｐ＝０．００８）、ＶＳＬ（ｐ＝０．０４８）、ＶＣＬ（ｐ＜０．０００１）およびＡＬＨ（ｐ＝０．００２）の増加を示し、超活性化精子では対照群と比較し２９％の増加が得られた（ｐ＝０．００９）ことを示す。超活性化精子のパーセンテージのこの改善は、それらの融合能力の改善、およびインタクトの卵母細胞−卵丘複合体に対するマウスにおいて記録された受精率の上昇を説明するものである
【００６１】
【表１】
2018536013.tif 000002
【００６２】
実施例１ｂ
ミトコンドリア膜電位の測定
「スクランブル」ペプチドと比較して、ＦＥＥｃペプチドの存在下では、ミトコンドリア膜電位が２１％上昇することがわかる（ｐ＜０．００１）（図１）。
【００６３】
したがって、ＦＥＥｃは、精子ミトコンドリア膜電位を上昇させることにより精子運動パラメータを改善する。
【００６４】
実施例１ｃ
受精インデックスの試験
図２に示す結果は、ＦＥＥｃペプチドの存在下では、透明帯を除去した卵母細胞と融合する精子の数が多いのみならず、対照群と異なり、前記精子が脱凝縮されることも示す。
【００６５】
平均１９．０±４．６個の精子が、対照卵母細胞の原形質でカウントされる一方、１００μＭのＦＥＥｃでインキュベートした後では、３６．９±１１．７個の精子が卵母細胞と融合することが報告される（ｐ＜０．００１）。この現象は、ＦＥＥｃペプチドにより媒介される精子の受精能力の増加および卵母細胞の活性化を示唆する。
【００６６】
３７名の患者の精子運動パラメータについて、ＦＥＥｃ（３時間のインキュベート）の存在下または非存在下において分析した。Ｍｏｒｔｉｍｅｒの基準に従う超活性化精子のパーセンテージの有意な増加が見られ、それらの受精能力の向上を説明するものである（上記の表１を参照）。
【００６７】
実施例２
未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟に対する改善のパーセンテージ
試験した全てのヒト卵母細胞において、Ｄ１でのＦＥＥｃによる卵成熟の有意な増加が示された。得られた結果は、ＦＥＥｃを用いた中期ＩＩ（ＭＩＩ）の卵母細胞では４２．３％（６９／１６３）、対して、対照群では３０．０％（５２／１７３）である（ｐ＝０．０２）（図３）。成熟の増加は、３７歳以上の女性から得た卵母細胞で、Ｄ１と同時期においてなおより顕著である。得られた結果は、ＦＥＥｃを用いたＭＩＩの卵母細胞では４７．９％（２３／４８）、対して、対照群では２０．４％（１１／５４）である（ｐ＝０．００３）。
【００６８】
若齢女性の卵母細胞に関しては同等の成熟率が得られたため（ＦＥＥｃの存在下の中期ＩＩの卵母細胞では４７．９％、対して、対照群では２０．４％、ｐ＝０．００３）、ヒトの卵母細胞におけるＩＶＭの改善は、３７歳未満の女性から得た卵母細胞では低いが、より年配の女性の卵母細胞では非常に顕著である。
【００６９】
ＧＶ期の３３６個のヒト卵母細胞を、ＦＥＥｃペプチドの存在下または非存在下においてランダム化してインキュベートして得られた結果は、ＦＥＥｃの存在下でヒト卵母細胞の成熟率が改善されることを示す。
【００７０】
２つの群間の卵母細胞の閉鎖率については、有意差は検出されなかった（ペプチド存在下では１６．５％、対して、対照群では１６．８％）（図４）。３７歳以上の女性のサンプルでは、対照培地（２４．１％、１３／５４）と比較して、ＦＥＥｃペプチドの存在下（１６．７％、８／４８）では、閉鎖率の有意でないが閉鎖率の低下傾向（ｐ＞０．０５）が注目される。
【００７１】
試験を継続し、追加の結果が得られた。これらの結果は上記の結果を確認するものであり、後述するＦＥＥｃペプチドの他の効果を示す。
【００７２】
合計６００個の卵母細胞を体外で成熟させた。分析の際、女性一人あたり１個の卵母細胞のみを試験に含め、全ての事象の独立性を担保した。培地中のフェルチリンの存在により、成熟率は３８．３％から５９．０％に増加した（Ｐ＜１．６×１０−４）（図１２）。ＧＶ期由来の卵母細胞の提供元の女性の年齢とのとの関数として解析すると、成熟の改善は、３７歳未満の女性では比較的低い（４２．６％〜５１．８％、Ｐ＜０．２）が、３７歳以上の女性から得た卵母細胞では非常に高い（３５．１％〜６５．９％、Ｐ＜３．９１×１０−５）ことがわかる。したがって、フェルチリンは、放射冠を除去した卵母細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成熟、および第１極体の放出を刺激することができる。明らかに、加齢に伴う卵母細胞のエネルギー不足がより大きい程、フェルチリンは、この刺激をより良好に行う。この試験はまた、３７歳以上および３０歳未満の女性のＧＶ期の卵母細胞の成熟率の増加を示すことができるものといえる（図１３）。
【００７３】
実施例３
体外で成熟させたヒト卵母細胞の減数分裂スピンドルの形成
図５は、染色体が並んでいない中期板における、染色体の配列の不完全なおよび異常な形成を示す。対照培地の存在下、ＩＶＭの２４時間後のＭＩＩ期のヒト卵母細胞から得た画像である。
【００７４】
実施例４
マウスにおける受精率の改善および初期の胚発生
Ｄ１では、受精率は、若齢マウスでは変化がないが、老齢マウスでは３９％から５１％に増加する（ｐ＜０．０３）（図６）。
【００７５】
Ｄ２では、若齢マウスのうち、卵母細胞の５０．０％（２６／５２）が、対照群における３２．４％（１８／５６）と比較して、ＱＤＥｃ群においては分裂している（Ｐ＝０．０２）（図７）。老齢マウスに関しては、Ｄ２では、対照（３５．４％、２３／６５）と比較して、ＱＤＥｃ（５８．７％、３７／６３）の存在下では有意に分裂胚が多い（ｐ＝０．００８）。Ｄ４では、若齢マウスから得た桑実胚期または胚盤胞胚期の分裂胚の比率は、対照ＱＤＥｃを添加した培地の６３．０％（１７／２６）と比較して、対照群では３４．６％（７／１６）である（ｐ＜０．０３）。この割合は、老齢マウスでは、対照培地の２８．３％（１５／５３）と比較して、ペプチドの存在下では８６．３％（６３／７３）に達する（ｐ＝０．００１）。
【００７６】
有利なことに、マウスにおける割球形成は、ＱＤＥｃペプチドの存在下で改善される。
【００７７】
閉鎖した胚のパーセンテージは、２つの若齢マウスの群間で有意差がなく、ＱＤＥｃの存在下では１７．３％（９／５２）、および対照では３０．４％（１７／５６）である（ｐ＝０．１）。若齢マウスと比較して、閉鎖のパーセンテージは、ＱＤＥｃ（３８．１％、２４／６３）および対照群（４９．２％、３２／６５）間で同程度の率であり、老齢マウス群で高い（ｐ＝０．２）（図８）。
【００７８】
より詳細に移植前胚発生を研究するため、以下のプロトコルを実施した。すなわち、マウスをＤ０で交尾させた。Ｄ１で、卵管を裂傷により卵母細胞を回収した。次にそれらをランダム化様式で２つの群に分け、ＱＤＥｃ有りまたは無しで培地中に置き、受精させた。
【００７９】
Ｄ３では桑実胚の、Ｄ４では胚盤胞の増加を示し、中でも、拡張胚盤胞の場合、卵母細胞をＱＤＥｃの存在下でインキュベートしたときに増加するという結果である（３１．１％対４５．９％、Ｐ＜０．００９）（図１４）。更に、偽妊娠のメスへのこれらの胚盤胞の移植後、特に若齢マウス由来の胚では、移植された胚によって得られる子孫数の有意な増加が見られる（下記の表２）
【００８０】
【表２】
2018536013.tif 000003
【００８１】
実施例５
体外受精による臨床妊娠率の増加
以下に示す結果は、「フェルチリン」試験の関連で得られた。
【００８２】
第１ステップで、５６のカップルを含めた。平均年齢は、女性が３３．９±４．１歳、パートナーが３６．７±５．３歳である。２つの群、ＦＥＥｃ対対照の、受精率間またはトップ品質胚のパーセンテージ間の有意差は示されなかった。対照および混合群と比較して、ペプチドの存在下において、移植により妊娠率が増加する有意な傾向は示されない（それぞれ、２９．４％（５／１７）および４０％（２／５）と比較して、４６．１％（６／１３））（図１０および下記の表２）。対照群から得た胚の移植後、流産が１例報告された。副作用は現在まで報告されていない。
【００８３】
現在まで、６６のカップルを試験に含めた。５４の移植を行い、そのうち、対照胚が２６例、ＦＥＥ群の胚が２２例、２つの群の胚（混合移植）が６例であった。累積妊娠率は、３つの群でそれぞれ３４．６％、４５．５％および３３．３％であった。自然流産率は、それぞれ３３．３％、１０％および０％であった。したがって、臨床妊娠率は、それぞれ２３％、４１％および３３．３％である。臨床妊娠率が患者年齢に相関するという基本的事実は、若齢の患者において、成長的（ｅｖｏｌｕｔｉｖｅ）臨床妊娠（つまり妊娠〜出産予定日）の率が２０％から５７．１％に有意に増加する（Ｐ＜０．０３）ことがわかるということである。
【００８４】
【表３】
2018536013.tif 000004
【００８５】
結果はまた、ＦＥＥｃ群から得た胚の移植後の臨床妊娠において２１％の増加を示す（対照群の３３．３％（８／２４）と比較して、４０．０％（８／２０））（ｐ＞０．０５）。受精率は、ＦＥＥｃに曝露された群の６７．６％と比較して、対照では６６．２％である（ｐ＞０．０５）。初期の自然流産率は、胚がＦＥＥｃに曝露されたときの１１．１％（１／９）と比較して、対照群では３７．５％（３／８）に達する（ｐ＞０．０５）（図１１）。
【００８６】
３７歳未満の女性では、受精率は、対照群の６８．３％と比較して、ＦＥＥｃへの曝露後では７０．９％である。卵母細胞がＦＥＥｃに曝露された場合、妊娠率は、対照群の２０．０％と比較して、５７．１％に達する（下記の表４）。
【００８７】
【表４】
2018536013.tif 000005
【００８８】
現在までの試験に含まれる最初の６６カップルのうち、５１例で移植を行い、その他は先延ばしし、これらの５１例の移植の結果は以下のとおりである：
−  ２１例は、対照群の胚を使用して実施
−  １８例は、ＦＥＥｃの存在下の群を使用して実施
−  １２例は、２つの群の胚を使用して実施。
【００８９】
他の群（ＦＥＥｃの存在下の胚の９％と比較して、３３％の流産率）と比較して、ＦＥＥｃの存在下の群では、妊娠率が高く、流産率が低い（下記の表５および６）。
【００９０】
若齢女性の妊娠率は、対照と比較して、ＦＥＥｃの存在下では２０％から５７．１％に増加する（ｐ＜０．０３）。
【００９１】
【表５】
2018536013.tif 000006
【００９２】
【表６】
2018536013.tif 000007
【００９３】
フェルチリン試験を継続することにより、更なる結果が得ることが可能になった。合計６６のカップルを試験に含めた。結果を以下の表に報告する。
【００９４】
試験の全体的なデータを表７に報告する。全体的な受精率は、実質的に変化しなかった。しかしながら、ＦＥＥｃの存在下では、低頻度の受精（２０％未満の受精率）を示す試験のパーセンテージが３７．９％から２７．３％まで減少しており、フェルチリンの存在下での生殖子の良好な受精能力が示唆される。同様に、フェルチリン群における多精受精が対照群と同程度であったため（４．０％対５．２％）、多精受精をブロックする正常な機構が変更されなかったことを示している
【００９５】
【表７】
2018536013.tif 000008
【００９６】
胚移植を行った全てのカップルの結果を、表８に報告する。この表では、フェルチリンの有無での、２つの群の卵母細胞における、不可解な受精障害を呈したカップル（ｎ＝６）を除外している。
【００９７】
【表８】
2018536013.tif 000009
【００９８】
表８に示すように、胚移植を行った患者では、受精率は６９．５％から７８．６％まで増加し、これは１３％の改善であるが、本コホートでは有意水準には達していない。胚盤胞期までの胚発生は変化せず、子宮への胚の着床率も同様である。一方、フェルチリン群の流産率は約５０％減少する（１５．４％対３０．５％）。
【００９９】
胚移植を行い、女性が３７歳未満であるカップルの結果を表９に報告する。
【０１００】
女性が３７歳未満であるカップル（ｎ＝４７）であり、処理された患者の７０％に対応するカップルのみを考慮すると、受精率が７０．９％から８３．３％まで有意に改善されることがわかる（Ｐ＜０．０５）。流産率は、対照群の胚を移植した患者での３６．３％から９．１％に減少し、つまり、フェルチリン群の胚を移植した患者では４分の１である。実際に小児を出生する成長的（ｅｖｏｌｕｔｉｖｅ）妊娠率は、対照胚の群の２８．６％から、フェルチリン群の胚の４１．６％に増加する
【０１０１】
【表９】
2018536013.tif 000010
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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