(57)【要約】  本開示は、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を懸濁バッファと混合し、懸濁を形成する工程；（ｂ）前記懸濁を溶解バッファと混合し、溶解物を形成する工程；（ｃ）前記溶解物を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；（ｄ）前記溶液を少なくとも１つの磁性粒子と混合し、前記少なくとも１つの核酸に可逆的に結合された少なくとも１つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程；（ｅ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、前記混合溶液から分離する工程；（ｆ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、第１の洗浄バッファ及び第２の洗浄バッファで洗浄する工程；及び（ｇ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、溶出バッファと混合する工程；を含む方法に関する。これらのバッファ及び磁性粒子を含むキットもまた、本明細書に開示される。
2018503366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸精製のための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程；
（ｂ）前記懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解物を形成する工程；
（ｃ）前記溶解物を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；
（ｄ）前記溶液を少なくとも１つの磁性粒子と混合し、少なくとも１つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程であって、前記少なくとも１つの改質された磁性粒子が前記少なくとも１つの核酸に可逆的に結合される、工程；
（ｅ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、前記混合溶液から分離する工程；
（ｆ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、第１の洗浄バッファ及び第２の洗浄バッファで洗浄する工程；及び
（ｇ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、溶出バッファと混合する工程；
を含み、
前記懸濁バッファが、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のイオンキレート剤、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のバッファ化合物を含み、
前記溶解バッファが、約１質量％〜約１０質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤、及び約０．２Ｍ以上の濃度で存在する少なくとも１つの第２のバッファ化合物を含み、
前記結合バッファが、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のカオトロピック剤、約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも１つの第１の塩、約１体積％〜約５体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のアルコール、及び約０．２５質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第３のバッファ化合物を含み、
前記第１の洗浄バッファが、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のカオトロピック剤、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のイオンキレート剤、約３０体積％〜約５０体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のアルコール、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第４のバッファ化合物を含み、
前記第２の洗浄バッファが、少なくとも１つの第３のアルコール、及び随意的な少なくとも１つの第２の塩を含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料が、プラスミドＤＮＡを含む少なくとも１つの細菌細胞物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの第１のイオンキレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のバッファ化合物が、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム（ＡＬＳ）、ドデシル硫酸カリウム（ＰＤＳ）、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のバッファ化合物が、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの第１のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第３のバッファ化合物が、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの第２のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のイオンキレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第４のバッファ化合物が、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
核酸精製のためのキットであって、
（ａ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のイオンキレート剤、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のバッファ化合物を含む懸濁バッファ；
（ｂ）約１質量％〜約１０質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤、及び約０．２Ｍ以上の濃度で存在する少なくとも１つの第２のバッファ化合物を含む溶解バッファ；
（ｃ）約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のカオトロピック剤、約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも１つの第１の塩、約１体積％〜約５体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のアルコール、及び約０．２５質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第３のバッファ化合物を含む結合バッファ；
（ｄ）約４．５Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のカオトロピック剤、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のイオンキレート剤、約３０体積％〜約５０体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のアルコール、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第４のバッファ化合物を含む第１の洗浄バッファ；
（ｅ）少なくとも１つの第３のアルコール、及び随意的な少なくとも１つの第２の塩を含む第２の洗浄バッファ；及び
（ｆ）少なくとも１つの磁性粒子、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項９】
前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料が、プラスミドＤＮＡを含む少なくとも１つの細菌細胞であることを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、請求項８又は９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって本願に援用される、２０１４年１２月９日出願の米国仮特許出願第６２／０８９３３３号の米国法典第３５編特許法第１１９条に基づく優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、概略的には、核酸精製のための方法及びキットに関し、より詳細には、トランスフェクショングレードのプラスミドＤＮＡを精製するための磁性粒子をベースとしたキット及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ又はＲＮＡの単離などの核酸精製は、さまざまな生化学的及び診断的手順における重要な工程でありうる。プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は、クローニングのためのベクターの調製から、転写又は共役転写／翻訳反応のためのテンプレートの生成まで、多くの用途に使用されうる。クローニング、トランスフェクション、シークエンシング、増幅、ハイブリダイゼーション、及び／又は合成等のような追加の処理が行われる前に、しばしばそれらが見い出される複合混合物（例えば、組織、細胞、体液など）から核酸を分離する必要があるかもしれない。例えば、タンパク質、脂質、及び／又は炭水化物などの汚染物質の存在により、これらの処理の多くが妨げられる又は抑制される。例えば、単離中に運ばれる不純物は、収率を低下させる及び／又は酵素系が所定の生成物を合成することを妨げるおそれがある。さらに、ＤＮＡはＲＮＡ用途を汚染し得、逆も同様である。したがって、さまざまの多様な開始物質から核酸を効果的に単離して所望の最終使用機能性を確保することが重要でありうる。
【０００４】
核酸を精製するために選択される方法は、幾つかの事例では、核酸試料の収率、品質、及び／又は純度を含む、単離された生成物のさまざまな特性に影響を与えうる。核酸精製のための多くの方法が開発されてきたが、これらの方法は、例えば、高コスト、高複雑性、低速度、低収率、低純度、汚染、毒性、及び／又は非効率性を含む、１つ以上の欠点を有しうる。従来、さまざまの精製方法において、核酸を結合及び分離するために、磁性粒子が使用されてきた。これらの方法は、遠心分離及び／又は真空処理工程をなくす、より高い純度の生成物を産出する、及び／又は操作者の安全性を改善するといったいくつかの利点を有しうる。しかしながら、磁性粒子を使用する方法は、今もなお、低速度、高複雑性、及び／又は全体の収率の乏しさなどのさまざまな不利点に悩まされうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、より速く、複雑性が低下した、より安価な、及び／又は生成物の純度及び／又は収率に関して改善されうる、核酸精製のための磁性粒子をベースとした方法及びキットを提供することが有益であろう。結果的に得られる精製された核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、クローニング、トランスフェクション、制限消化、及び臨床診断のような多種多様の生化学及び診断用途に使用されうる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、さまざまな実施形態において、核酸を精製するための方法に関し、該方法は、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を、懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程；（ｂ）懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解液を形成する工程；（ｃ）溶解液を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；（ｄ）溶液を少なくとも１つの磁性粒子と混合し、少なくとも１つの核酸に可逆的に結合された少なくとも１つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程；（ｅ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を混合溶液から分離する工程；（ｆ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を第１の洗浄バッファ及び第２の洗浄バッファで洗浄する工程；及び、（ｇ）改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程、を含む。
【０００７】
さまざまな実施形態によれば、懸濁バッファは、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのイオンキレート剤、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのバッファ化合物を含みうる。溶解バッファは、約１質量％〜約１０質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤、及び約０．２Ｍ以上の濃度で存在する少なくとも１つのバッファ化合物を含みうる。非限定的な実施形態において、結合バッファは、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのカオトロピック剤、約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも１つの塩、約１体積％〜約５体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つのアルコール、及び、約０．２５質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つのバッファ化合物を含みうる。さらなる実施形態によれば、第１の洗浄バッファは、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのカオトロピック剤、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのイオンキレート剤、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのバッファ、及び、約３０体積％〜約５０体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つのアルコールを含みうる。さらなる実施形態において、第２の洗浄バッファは、少なくとも１つのアルコール及び、必要に応じて、少なくとも１つの塩を含みうる。磁性粒子は、例えば、カルボキシルコーティングされた磁性粒子、シリカ系磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されうる。これらのバッファ及び磁性粒子を含む核酸精製キットもまた、本明細書に開示される。
【０００８】
本発明の追加の特徴及び利点は、以下の詳細な説明に記載されており、一部には、その説明から当業者にとって容易に明らかとなり、あるいは、以下の詳細な説明、特許請求の範囲、及び添付の図面を含む、本明細書に記載される本発明を実施することによって認識されよう。
【０００９】
前述の概要及び以下の詳細な説明は、両方とも本開示のさまざまな実施形態を提示しており、特許請求の範囲の本質及び特性を理解するための概観又は枠組みを提供することが意図されているものと解されたい。添付の図面は、本開示のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書内に取り込まれてその一部を構成する。図面は、本開示のさまざまな実施形態を例証しており、その説明とともに、本発明の原理及び動作を説明する役目をする。
【００１０】
以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号で示される、以下の図面と併せて読まれた場合に、最もよく理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示の一実施形態に従った核酸精製方法を示す流れ図
【図２】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのｐＤＮＡ収率を示すグラフ
【図３】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのトランスフェクション効率を示すグラフ
【図４】本開示のさまざまな実施形態に従った方法を使用して、及び、先行技術の方法を使用して精製されたｐＤＮＡ（ＥｃｏＲＩで切断された又はされない）のアガロースゲル電気泳動分析
【図５】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのｐＤＮＡ収率を示すグラフ
【図６】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのトランスフェクション効率を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１２】
方法
核酸精製のための方法が、本明細書に開示され、該方法は、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を、懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程；（ｂ）懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解液を形成する工程；（ｃ）溶解液を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；（ｄ）溶液を少なくとも１つの磁性粒子と混合し、少なくとも１つの核酸に可逆的に結合された少なくとも１つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程；（ｅ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を混合溶液から分離する工程；（ｆ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を第１の洗浄バッファ及び第２の洗浄バッファで洗浄する工程；及び、（ｇ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程、を含む。
【００１３】
本開示の実施形態は、本開示の非限定的な実施形態に従った核酸精製方法の流れ図を示す図１を参照して論じられる。以下の概要は、特許請求の範囲に記載される本方法の概観を提供することが意図されており、さまざまな態様は、非限定的な実施形態を参照して、本開示全体にわたってさらに詳細に論じられ、これらの実施形態は、以下に論じられる概略的な方法の文脈において互いに置き換え可能である。
【００１４】
図１に示されるように、少なくとも１つの核酸を含む試料（例えば細菌）１０５を、工程Ｓにおいて懸濁バッファ中に懸濁してもよい。次いで、工程Ｌにおいて試料を溶解させ、ｐＤＮＡ１２０、及び所望でない核酸１１５（例えばＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ）を含むさまざまな汚染物質１１０を含む溶解物を生成してもよい。溶解物をさらに結合／中和バッファと混合しインキュベートし、遠心分離により工程Ｃにおいて処理して任意の凝集体又は高分子１２５を分離してもよい。次いで、磁性粒子１３０を残存溶液に加えてもよい。試料（細菌）１０５から放出されたｐＤＮＡ１２０は、工程Ｂにおいて磁性粒子１３０の表面に可逆的に結合されうる。磁石１３５を使用して、磁性粒子１３０を引き寄せ、残存溶液からそれらを分離してもよい。結合していない汚染物質１１０は、工程Ｗにおいて１つ以上の洗浄バッファを使用して磁性粒子１３０を洗浄することによって除去されうる。次いで、ｐＤＮＡ１２０は、工程Ｅにおいて、溶出バッファを使用して、磁性粒子ら溶出かつ解放されうる。磁性粒子１３０は、例えば磁石を使用して、工程Ｐにおいて溶液から分離されて、次にさまざまな用途に使用されうる精製されたｐＤＮＡ生成物を生じうる。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、用語「少なくとも１つの核酸を含む試料」及びその変形物は、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子など、少なくとも１つの核酸を含みうる、生体又は環境サンプルから得られる試料又は培養物のような任意の材料を意味することが意図されている。少なくとも１つの核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、トータルＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及び／又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが挙げられうる。生体サンプルには、細胞、組織、及び例えば尿、全血、及び血清及び血漿のような血液由来の液体などの体液のようなヒト及び動物サンプルが含まれてもよい。環境サンプルには、２、３例を挙げると、アガロースのような植物組織、及び細菌サンプルが含まれてもよい。さまざまな実施形態において、試料は、細菌培養物を含みうる。例えば、細菌培養物は、１（８×１０８細胞／ｍｌ）におよそ等しいＯ．Ｄ．６００の濃度で一晩で調製できる。追加の実施形態によれば、精製される少なくとも１つの核酸は、例えばｐＤＮＡなどのＤＮＡでもよい。
【００１６】
少なくとも１つの核酸を含む試料を、懸濁バッファ（Ｓ１）中で混合、例えば懸濁してもよい（図１の工程Ｓ参照）。さまざまな実施形態において、懸濁バッファＳ１は、少なくとも１つのイオンキレート剤（ＩＣ１）及び少なくとも１つのバッファ化合物（Ｂ１）を含んでもよい。懸濁バッファＳ１はまた、約５０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌ〜約２５０μｇ／ｍｌなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０μｇ／ｍｌ〜約１，０００μｇ／ｍｌの範囲の濃度でＲＮアーゼをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、試料との混合の前に、ＲＮアーゼを懸濁バッファＳ１に加えてもよい。
【００１７】
少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ１は、約２ｍＭ〜約９ｍＭ、約３ｍＭ〜約８ｍＭ、約４ｍＭ〜約７ｍＭ、又は約５ｍＭ〜約６ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、例えば約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で懸濁バッファＳ１中に存在してもよい。例えば、ＩＣ１濃度は、約１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、５．５ｍＭ、６ｍＭ、６．５ｍＭ、７ｍＭ、７．５ｍＭ、８ｍＭ、８．５ｍＭ、９ｍＭ、９．５ｍＭ、又は１０ｍＭ、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲でもよい。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ１は、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及びその異性体、例えばエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ１は、ＥＤＴＡ及びその異性体から選択されてもよい。少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ１は、さまざまな実施形態において、プロテアーゼ阻害剤としても作用しうる。
【００１８】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ１は、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７０ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約６０ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、例えば約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で懸濁バッファＳ１中に存在しうる。例えば、Ｂ１濃度は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭ、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲でもよい。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ１は、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ１は、Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌから選択されてもよい。
【００１９】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ１は、さまざまな実施形態において、約２５℃において約７〜約９の範囲、例えば、約７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は９のｐＫａを有してもよい。少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ１は、約７．５〜約９．５、約８．５〜約９、又は約８〜約８．３など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約７〜約１０の範囲の値にｐＨを調整するのに十分な量で懸濁バッファＳ１中に含まれてもよい。例えば、Ｓ１は、約７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は１０、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲に等しいｐＨを有してもよい。
【００２０】
懸濁後、溶解バッファＳ２を加え、懸濁試料から溶解物を形成してもよい（例えば、図１の工程Ｌを参照）。溶解バッファＳ２は、さまざまな実施形態において、少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤（ＤＣ）及び少なくとも１つのバッファ化合物（Ｂ２）を含んでもよい。懸濁液及び溶解バッファＳ２を、当該技術において知られる任意の方法で混合してもよく、例えば、溶解バッファＳ２を懸濁液に加え、例えば反転によって混合してもよい。特定の実施形態において、混合物は、少なくとも５回、少なくとも１０回、又はそれ以上などの複数回、反転されうる。反転による混合により、最適な細胞溶解効率及び／又は最終的な核酸収率が確保できる。さらに、懸濁液を、試料を溶解するのに十分な所定の時間、溶解バッファＳ２中で必要に応じてインキュベートしてもよい。この時間は、約１分間〜約８分間、約２分間〜約５分間、又は約３分間〜約４分間など、これらの間のすべての範囲及び部部分的範囲を含む、例えば、約３０秒間〜約１０分間の範囲でありうる。
【００２１】
少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤ＤＣは、約２質量％〜約９質量％、約３質量％〜約８質量％、約４質量％〜約７質量％、又は約５質量％〜約６質量％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、例えば、約１質量％〜約１０質量％の範囲の濃度で溶解バッファＳ２中に存在してもよい。例えば、ＤＣ濃度は、約１質量％、１．２５質量％、１．５質量％、１．７５質量％、２質量％、２．２５質量％、２．５質量％、２．７５質量％、３質量％、３．２５質量％、３．５質量％、３．７５質量％、４質量％、４．２５質量％、４．５質量％、４．７５質量％、５質量％、５．２５質量％、５．５質量％、５．７５質量％、６質量％、６．２５質量％、６．５質量％、６．７５質量％、７質量％、７．２５質量％、７．５質量％、７．７５質量％、８質量％、８．２５質量％、８．５質量％、８．７５質量％、９質量％、９．２５質量％、９．５質量％、９．７５質量％、又は１０質量％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤ＤＣは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム（ＡＬＳ）、ドデシル硫酸カリウム（ＰＤＳ）、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００又はＸ−１１４）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０又は８０）、及びそれらの組合せのような、カチオン性、アニオン性、非イオン性、及び双性イオン性の洗浄剤又は界面活性剤から選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤ＤＣは、ＳＤＳ及びＳＤＢＳから選択されてもよい。少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤ＤＣは、さまざまな実施形態において、試料中で細胞膜を分散させる及び／又は脂質及び／又はタンパク質を変性させるために使用してもよい。
【００２２】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ２は、例えば、約０．２５Ｍ以上、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、１Ｍ又はそれより高くなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．２Ｍ以上の濃度で溶解バッファＳ２中に存在してもよい。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ２は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、及びそれらの組合せのような水酸化物から選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ２は、ＮａＯＨでもよい。
【００２３】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ２は、さまざまな実施形態において、約２５℃で、例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．１〜約２の範囲のｐＫｂを有してもよい。少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ２は、例えば、約１０．５〜約１２．５、又は約１１〜約１２など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０〜約１３の範囲の値にｐＨを調整するのに十分な量で溶解バッファＳ２中に含まれてもよい。例えば、Ｓ２は、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、又は１３、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲に等しいｐＨを有してもよい。
【００２４】
溶解後、結合（又は中和）バッファ（Ｓ３）を溶解物に加えて溶液を形成してもよい。結合バッファＳ３は、少なくとも１つのカオトロピック剤（Ｃ１）、少なくとも１つのアルコール（Ａ１）、随意的な少なくとも１つの塩（Ｚ１）、及び少なくとも１つのバッファ化合物（Ｂ３）を含んでもよい。溶解物及び結合バッファＳ３を、当該技術において知られる任意の方法で混合してもよく、例えば、結合バッファＳ３を溶解物に加え、例えば反転により混合してもよい。特定の実施形態において、混合物は、少なくとも５回、少なくとも１０回、又はそれ以上などの複数回、反転されうる。溶解物は、必要に応じて、試料を中和する及び／又は所望でない汚染物質（濁った粒子として見える）の凝集形成を促進するのに十分な時間、結合バッファＳ３中でインキュベートされてもよい。この時間は、例えば、約２分〜約２５分、約３分〜約２０分、約４分〜約１５分、又は約５分〜約１０分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１分〜約３０分の範囲でありうる。
【００２５】
少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ１は、例えば、約４．２Ｍ〜約５．８Ｍ、約４．４Ｍ〜約５．６Ｍ、約４．６Ｍ〜約５．４Ｍ、又は約４．８Ｍ〜約５．２Ｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で結合バッファＳ３中に存在しうる。例えば、Ｃ１の濃度は、約４Ｍ、４．１Ｍ、４．２Ｍ、４．３Ｍ、４．４Ｍ、４．５Ｍ、４．６Ｍ、４．７Ｍ、４．８Ｍ、４．９Ｍ、５Ｍ、５．１Ｍ、５．２Ｍ、５．３Ｍ、５．４Ｍ、５．５Ｍ、５．６Ｍ、５．７Ｍ、５．８Ｍ、５．９Ｍ、又は６Ｍであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ１は、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択されうる。特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ１は、ＧｕＨＣｌ及びＧｕＳＣＮから選択されうる。少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ１は、さまざまな実施形態において、試料中で細胞膜を分散させる及び／又は脂質及び／又はタンパク質を変性させるために使用してもよい。
【００２６】
少なくとも１つのアルコールＡ１は、例えば、約２体積％〜約４体積％、又は約２．５体積％〜約３体積％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１体積％〜約５体積％の範囲の濃度で結合バッファＳ３中に存在しうる。例えば、Ａ１の濃度は、約１体積％、１．５体積％、２体積％、３体積％、３．５体積％、４体積％、４．５体積％、又は５体積％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのアルコールＡ１は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択されうる。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのアルコールＡ１は、イソプロパノールでありうる。少なくとも１つのアルコールＡ１は、さまざまな実施形態において、カオトロピックであってよく、試料中で細胞膜を分散させる及び／又はタンパク質を変性させるために使用してもよい。
【００２７】
少なくとも１つの塩Ｚ１は、存在する場合には、例えば、約０．４Ｍ〜約１．８Ｍ、約０．６Ｍ〜約１．６Ｍ、約０．８Ｍ〜約１．４Ｍ、又は約１Ｍ〜約１．２Ｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．２Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で結合バッファＳ３中に存在しうる。例えば、Ｚ１の濃度は、約０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、又は２Ｍであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つの塩Ｚ１は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つの塩Ｚ１は、硫酸アンモニウムでもよい。少なくとも１つの塩Ｚ１は、さまざまな実施形態において、核酸精製を改良するために含まれてもよい、又は他の実施形態において除外されてもよいが、この場合には低い収率を生じうる。結合バッファＳ３中の塩濃度が増加すると、例えば、磁性粒子への核酸の結合及び／又は所望でない汚染物質凝集体の沈殿が促進されうる。
【００２８】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ３は、例えば、約０．５％〜約２．５％、又は約１％〜約１．５％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．２５質量％〜約３質量％の範囲の濃度で結合バッファＳ３中に存在しうる。例えば、Ｂ３濃度は、約０．２５質量％、０．５質量％、０．７５質量％、１質量％、１．２５質量％、１．５質量％、１．７５質量％、２質量％、２．２５質量％、２．５質量％、２．７５質量％、又は３質量％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ３は、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択されてもよい。
【００２９】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ３は、さまざまな実施形態において、約２５℃で、例えば、約４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５、６、６．２５、６．５、６．７５、又は７など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４〜約７の範囲のｐＫｂを有してもよい。少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ３は、約５〜約８、又は約６〜約７など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４〜約９の範囲の値にｐＨを調整するのに十分な量で結合バッファＳ３中に含まれてもよい。例えば、Ｓ３は、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は９、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲に等しいｐＨを有してもよい。
【００３０】
さまざまな実施形態によれば、例えば溶解バッファＳ２の添加により生じるアルカリ性条件（例えばｐＨ＞１０）を使用して、試料中のｐＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方を変性できる。結合バッファＳ３によるその後の中和は、さまざまな方法で、特にｐＤＮＡ精製について、開示される方法の全体的有効性に役立ちうる。例えば、中和により、ゲノムＤＮＡはストランド内の態様で塩基対となり得、したがって不溶性の凝集を形成し、これは溶液から沈殿しうる。対照的に、環状ｐＤＮＡの共有結合により閉鎖した性質により、ストランド間リハイブリダイゼーション（ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ  ｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が促進され、したがってｐＤＮＡが溶液中に残ると考えられる。さらに、結合バッファＳ３が、カリウム、ナトリウム、又はリチウム塩のような少なくとも１つの塩Ｚ１を含む場合、これらの塩は、溶液中の１つ以上の成分と反応して、追加の沈殿を形成しうる。例えば、ＳＤＳのカリウム塩は、不溶性である。したがって、タンパク質及び洗浄剤の両方の沈殿及び凝集によって、高分子量ゲノムＤＮＡの捕捉が補助されうる。次いで、これらの凝集体及び任意の高分子を、以下により詳細に説明されるように、例えば遠心分離、又は濾過のような他の既知の方法により（例えば図１の工程Ｃ参照）、溶液から除去してもよい。
【００３１】
結合バッファの添加後、溶液を少なくとも１つの磁性粒子と混合し、混合溶液を生成してもよい（例えば、図１の工程Ｂ参照）。本明細書で用いられる場合、用語「磁性粒子」及びその変形物は、例えば、核酸が可逆的に結合可能な表面を有する少なくとも１つの材料でコーティングされた、常磁性又は超常磁性などの磁性コアを有する粒子を意味することが意図されている。適切な磁性粒子としては、例えば、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子などが挙げられうる。シリカ系磁性粒子は、幾つかの実施形態では、ケイ質酸化物（siliceous oxide）でコーティングされ、したがって核酸が結合可能な水和したケイ質酸化物吸着性表面（例えば、シラノール基を含む表面）を提供する、常磁性のコアを含みうる。磁性粒子は、追加的な実施形態において、２、３例を挙げると、弱く又は強く正に荷電した表面、弱く又は強く負に荷電した表面、若しくは疎水性の表面などの機能化された表面を生成するように表面改質されうる。
【００３２】
市販の磁性粒子の非限定的な例としては、ＭａｇＱｕ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．社製のＱｂｅａｄｓ、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．社製のＧｒａｃｅビーズなどが挙げられる。磁性粒子は、例えば、直径約０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０μｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、直径約０．３μｍ〜約１０μｍの範囲の直径などの市販の寸法を含む、核酸を結合するのに適した任意の寸法を有しうる。Ｑｂｅａｄｓは、例えば、約４μｍ〜約５μｍの範囲の平均直径を有してもよく、Ｇｒａｃｅビーズは約５μｍ〜約１０μｍの範囲の平均直径を有してもよい。
【００３３】
幾つかの実施形態において、磁性粒子を、少なくとも１つの媒質中の懸濁として溶液に加えてもよい。媒質は、例えば、水及び／又はカオトロピック剤から選択されてもよい。特定の実施形態において、磁性粒子は、水中に懸濁されたＱｂｅａｄｓ又はＧｕＳＣＮのようなカオトロピック剤中に懸濁されたＧｒａｃｅビーズでもよい。懸濁液中のビーズの濃度は、所望に変化してもよく、例えば、約２０μｇ／ｍｌ〜約９０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ〜約８０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌ、又は約５０μｇ／ｍｌ〜約６０μｇ／ｍｌなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの範囲でもよい。使用される場合、懸濁液中のカオトロピック剤の濃度もまた、所望に変化してもよく、例えば、約２Ｍ〜約６Ｍ、又は約４Ｍ〜約５Ｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１Ｍ〜約８Ｍの範囲でもよい。磁性ビーズを含む溶液のｐＨは、例えば、約５〜約８、又は約６〜約７など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４〜約９の範囲でもよい。
【００３４】
理論に縛られることは望まないが、結合バッファＳ３によって取り込まれた、比較的高濃度のカオトロピック剤及び／又は塩は、ｐＤＮＡなどの核酸が、シリカ表面などの磁性粒子の表面に可逆的に（例えば、非共有的に）結合する能力を高めることができると考えられる。よって、例えば可逆的に結合された核酸を含む、改質された磁性粒子は、次に、結合していない汚染物質から分離されうる。例えば、磁石が、改質された磁性粒子に近接して配置され、粒子を引き寄せて、例えば、凝集体又はペレットを形成しうる。ある特定の実施形態では、改質された磁性粒子を含む混合溶液を含有する管のような容器が、残留溶液が除去される間に粒子を寄せ集めいくらか固定することが可能な磁気スタンド上に、配置されうる。
【００３５】
核酸を磁性粒子に結合した後、及び、例えば磁石を用いて改質された磁性粒子を分離した後、粒子が混合され、濯がれ、又は、１つ以上の洗浄バッファで洗浄されうる（例えば、図１の工程Ｗを参照）。第１の洗浄バッファ（Ｗ１）は、例えば、少なくとも１つのカオトロピック剤（Ｃ２）、少なくとも１つのイオンキレート剤（ＩＣ２）、少なくとも１つのアルコール（Ａ２）、及び少なくとも１つのバッファ化合物（Ｂ４）を含みうる。
【００３６】
少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ２は、例えば、約４．２Ｍ〜約５．８Ｍ、約４．４Ｍ〜約５．６Ｍ、約４．６Ｍ〜約５．４Ｍ、又は約４．８Ｍ〜約５Ｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で第１の洗浄バッファＷ１中に存在してもよい。例えば、Ｃ２の濃度は、約４Ｍ、４．１Ｍ、４．２Ｍ、４．３Ｍ、４．４Ｍ、４．５Ｍ、４．６Ｍ、４．７Ｍ、４．８Ｍ、４．９Ｍ、５Ｍ、５．１Ｍ、５．２Ｍ、５．３Ｍ、５．４Ｍ、５．５Ｍ、５．６Ｍ、５．７Ｍ、５．８Ｍ、５．９Ｍ、又は６Ｍであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ２は、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ２は、ＧｕＨＣｌ及びＧｕＳＣＮから選択されうる。少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ２は、さまざまな実施形態において、磁性粒子表面への核酸の結合を促進するために使用してもよい。
【００３７】
少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ２は、例えば、約２ｍＭ〜約９ｍＭ、約３ｍＭ〜約８ｍＭ、約４ｍＭ〜約７ｍＭ、又は約５ｍＭ〜約６ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で第１の洗浄バッファＷ１中に存在してもよい。例えば、ＩＣ２の濃度は、約１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、５．５ｍＭ、６ｍＭ、６．５ｍＭ、７ｍＭ、７．５ｍＭ、８ｍＭ、８．５ｍＭ、９ｍＭ、９．５ｍＭ、又は１０ｍＭであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ２は、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及びその異性体、例えばエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ２は、ＥＤＴＡ及びその異性体から選択されてもよい。少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ２は、さまざまな実施形態において、酸化損傷及び／又は汚染ヌクレアーゼ活性を減少する及び／又はマグネシウムのような金属イオンをキレートする作用をしうる。
【００３８】
少なくとも１つのアルコールＡ２は、例えば、約３５体積％〜約４５体積％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約３０体積％〜約５０体積％の範囲の濃度で第１の洗浄バッファＷ１中に存在しうる。例えば、Ａ２の濃度は、約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、又は５０％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのアルコールＡ２は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つのアルコールＡ２は、イソプロパノールでありうる。
【００３９】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ４は、例えば、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７０ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約６０ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で第１の洗浄バッファＷ１中に存在しうる。例えば、Ｂ４の濃度は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ４は、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ４は、Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌから選択されてもよい。
【００４０】
さまざまな実施形態において、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ４は、約２５℃において、例えば、約７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は９など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約７〜約９の範囲のｐＫａを有してもよい。少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ４は、例えば、約６．５〜約７．５、又は約６．８〜約７．２など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約６〜約８の範囲の値にｐＨを調整するのに十分な量で第１の洗浄バッファＷ１中に含まれてもよい。例えば、Ｗ１は、約６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲に等しいｐＨを有してもよい。
【００４１】
改質された磁性粒子は、さらに混合され、濯がれ、少なくとも１つのアルコール（Ａ３）及び随意的な少なくとも１つの塩（Ｚ２）を含みうる第２の洗浄バッファ（Ｗ２）で洗浄されてもよい。少なくともの１つのアルコールＡ３は、例えば、約７５体積％〜約９５体積％、又は約８０体積％〜約９０体積％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約７０体積％〜約１００体積％の範囲の濃度で第２の洗浄バッファＷ２中に存在しうる。例えば、Ａ３の濃度は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのアルコールＡ３は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つのアルコールＡ３は、エタノールでありうる。
【００４２】
少なくとも１つの塩Ｚ２は、存在する場合には、例えば、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７０ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約６０ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で第２の洗浄バッファＷ２中に存在しうる。例えば、Ｚ２の濃度は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つの塩Ｚ２は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つの塩Ｚ２は、ＮａＡＣ及びＮＨ４ＡＣから選択されうる。
【００４３】
さまざまな実施形態によれば、第２の洗浄バッファＷ２のｐＨは、例えば、約６．２〜約７．５、約６．５〜約７、又は約６．４〜約６．８など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約６〜約８の範囲でありうる。第２の洗浄バッファＷ２のｐＨは、アルコール及び／又は塩の量を変化させることによって調整されてよく、あるいは、本明細書に開示されるように、１つ以上のバッファ化合物、例えば氷酢酸又はＮａＯＨを使用して調整されてもよい。
【００４４】
洗浄バッファＷ１及びＷ２の添加及び除去の後に、細胞残屑、脂質、タンパク質、及び／又は所望でない核酸等の汚染物質を含まない、又は実質的に含まない、表面に可逆的に結合された核酸を有する、改質された磁性粒子がもたらされうる。さまざまな実施形態によれば、このように生成された、改質された磁性粒子は、次に、溶出バッファ（Ｅ１）と混合され、結合した核酸を放出し、磁性粒子から分離することができる（例えば、図１の工程Ｅを参照）。改質された磁性粒子は、例えば、約４５秒〜約９分、約１分〜約８分、約２分〜約７分、約３分〜約６分、又は約４分〜約５分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約３０秒〜約１０分などの核酸を放出するのに十分な時間、溶出バッファＥ１中でインキュベートされうる。
【００４５】
溶出バッファＥ１は、例えば、水、若しくは、例えば、少なくとも１つのバッファ化合物（例えばＴｒｉｓなど）、少なくとも１つの塩、及び／又は少なくとも１つのイオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）を含む、比較的低塩の溶液を含みうる。特定の実施形態において、溶出バッファＥ１は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの少なくとも１つのバッファ化合物及び約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの少なくとも１つのイオンキレート剤を含みうる。ある非限定的な実施形態によれば、溶出バッファＥ１は、１０ｍＭのＴｒｉｓ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含みうる。
【００４６】
磁性粒子（もはや核酸には付着していない）は、その後、例えば、磁石を使用して分離され、溶液から除去されてよく、最終生成物として溶液中の精製された核酸を生じうる（例えば、図１の工程Ｐを参照）。例えば、本明細書に開示される方法及びキットは、精製されたｐＤＮＡ生成物を提供するために用いられうる。さまざまな実施形態によれば、本明細書に開示される方法及びキットは、トランスフェクショングレードのｐＤＮＡを短時間で効率的に生成するために用いられうる。例えば、非限定的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、約３０分未満、例えば約２０分未満の時間で行われうる。本明細書に開示される方法は、ある特定の実施形態では、およそ２０分間で１ｍｌの一晩細菌培養（Ｏ．Ｄ．６００≒１）から平均で１０μｇのｐＤＮＡを生じうる。
【００４７】
さまざまなバッファ溶液の成分は、幾つかの実施形態では、例えば、互いに同一であっても異なっていてもよいなど、互いに置換可能に用いられうるものと解されたい。例えば、カオトロピック剤Ｃ１及びＣ２は、同一であっても異なっていてもよい。同様に、イオンキレート剤ＩＣ１及びＩＣ２；塩Ｚ１及びＺ２；アルコールＡ１、Ａ２、及びＡ３；及びバッファＢ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４は、それぞれ、同一であっても異なっていてもよい。同様に、これらの成分の濃度は可変であり、幾つかの事例では、所望の用途に応じて、同一であるか又は類似していてもよい。
【００４８】
本明細書に開示される方法はさらに、遠心分離、濾過など、当技術分野で知られている追加の工程を含みうるものと解されたい。非限定的な例として、結合バッファＳ３の添加後、生じた溶液を遠心分離又は濾過して、所望でない凝集体又は高分子を除去してもよい。さまざまな実施形態により、試料及び／又は磁性粒子の遠心分離もまた必要に応じて行ってもよい。そのような場合、遠心分離は、約１２，０００ｇ〜約１６，０００ｇ、又は約１４，０００ｇ〜約１５，０００ｇなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０，０００ｇ〜約１８，０００ｇの範囲の加速度で行ってもよい。遠心分離は、さまざまな実施形態において、例えば、約１分〜約１４分、約２分〜約１３分、約３分〜約１２分、約４分〜約１１分、約５分〜約１０分、約６分〜約９分、又は約７分〜約８分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約３０秒〜約１５分の範囲の時間、行ってもよい。
【００４９】
他の非限定的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、遠心分離工程を含まず、したがって、処理を自動化する能力が高まりうる。他の必要に応じた工程は、空気乾燥を含んでもよく、例えば、改質された磁性粒子を洗浄バッファＷ１及びＷ２で濯いだ後に、粒子は、約２分〜約９分、約３分〜約８分、約４分〜約７分、又は約５分〜約６分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１分〜約１０分の範囲の時間、空気乾燥されうる。さまざまな試料、溶液、若しくは、試料又は溶液の一部を管などの新しい容器へと除去又は移動することもまた、所望されるように又は必要に応じて、本明細書に開示される方法の間に行われうる。
【００５０】
キット
本開示はまた、核酸精製のためのキットにも関し、該キットは、懸濁バッファ、溶解バッファ、結合／中和バッファ、少なくとも１つの磁性粒子、第１の洗浄バッファ、第２の洗浄バッファ、及び必要に応じて溶出バッファを含む。バッファは、さまざまな実施形態において、精製方法に関して先に開示されたバッファＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｂ１、Ｗ１、Ｗ２及びＥ１に対応しうる。各バッファに関して上述したさまざまな実施形態は、本明細書に開示されるキットを形成するために、限定されることなく、任意の方式で組み合わせることができるものと解されたい。
【００５１】
さまざまな実施形態によれば、即時使用可能な、各成分について所定の濃度を有する各バッファが、キットに供給されうる。あるいは、末端利用者によって、適切な種類及び量の溶媒で希釈されて、即時使用可能なバッファを生成するために、１つ以上の濃縮溶液が提供されてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、使用者によってエタノールなどのアルコールで、例えば、エタノールの７０体積％以上の最終濃度まで希釈可能な、濃縮された洗浄バッファＷ２が提供されてもよい。
【００５２】
キットは、幾つかの実施形態では、末端利用者への精製プロトコルに関する指示書及び／又は希釈指示書をさらに含みうる。他の実施形態によれば、キットはさらに、磁気スタンド、管、遠心分離機、細菌培養のための培地及び／又は抗生物質、溶媒、及び／又はＲＮアーゼなどのさまざまな追加の構成要素又は設備を含みうる。
【００５３】
さまざまな開示される実施形態は、その特定の実施形態に関して説明される特定の特徴、要素又は工程を包含しうるものと認識されよう。特定の特徴、要素又は工程は、１つの特定の実施形態に関して説明されるが、さまざまな例証されていない組合せ又は置換における代替的な実施形態と差し替える又は組み合わせることができることもまた認識されよう。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、用語「ｔｈｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を意味し、そうでないことが明確に示されない限り、「１つのみ」に限定されるべきではないこともまた理解されたい。よって、例えば、「１つの（ａ）バッファ」についての言及は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、このような「バッファ」を２つ以上有する例を含む。
【００５５】
範囲は、ここでは、「約」１つの特定の値から、及び／又は、「約」別の特定の値までとして表されうる。このような範囲が表される場合、例には、１つの特定の値から、及び／又は、他の特定の値までが含まれる。同様に、値が先行詞「約」を使用して近似的に表される場合、その特定の値は、別の態様を形成するものと解されたい。範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び、他の端点とは独立して、の両方の意味を表すこともさらに理解されよう。
【００５６】
実施例以外において、本明細書に表されるすべての数値は、他に明確に示されない限り、そのように記載されているかどうかにかかわらず、「約」を含むものと解釈されるべきである。しかしながら、列挙される各数値は、「約」その値として表されているかどうかにかかわらず、正確を予定されているものとも解されたい。よって、「２Ｍより大きい濃度」及び「約２Ｍより大きい濃度」は、両方とも、「約２Ｍより大きい濃度」と「２Ｍより大きい濃度」の実施形態を含む。
【００５７】
他に明記されない限り、本明細書に記載されるいずれの方法も、その工程が特定の順番で行われる必要があると解釈されることは決して意図されていない。したがって、方法の請求項が、その工程が従うべき順番について実際に記述していない場合、又はその工程がある特定の順番に限定されるべきであることが、特許請求の範囲又は説明において他に明示されていない場合、任意の特定の順番が推測されることは、決して意図されていない。
【００５８】
特定の実施形態のさまざまな特徴、要素又は工程は、移行句「含む（comprising）」を使用して開示されうると同時に、移行句「〜からなる（consisting）」又は「〜から本質的になる（consisting essentially of）」を使用して記載されうるものを含む、代替的な実施形態が含蓄されるものと解されたい。よって、例えば、Ａ＋Ｂ＋Ｃを含むバッファに含蓄される代替的な実施形態は、バッファがＡ＋Ｂ＋Ｃからなる実施形態と、バッファがＡ＋Ｂ＋Ｃから本質的になる実施形態を含む。
【００５９】
本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、さまざまな修正及び変形が本開示になされうることは、当業者にとって明白であろう。本開示の精神および実体を取り込む開示される実施形態の修正、組合せ、部分的組合せ及び変形は、当業者に想起されうることから、本開示は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内にあるすべてを含むものと解釈されたい。
【００６０】
以下の実施例は、非限定的かつ単なる例証であることが意図されており、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって定められる。
【実施例】
【００６１】
例示的な精製プロトコル
単なる論述の目的で、細菌培養からｐＤＮＡを精製するための例となるプロトコルが、以下に提供される。当然ながら、このプロトコルは、限定することを意図されておらず、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６２】
ａ）細菌培養試料の調製：適切な媒質及び抗生物質を用いて、５ｍｌの一晩細菌培養、Ｏ．Ｄ．６００≒１を調整する；
ｂ）懸濁バッファの調製：１００μｇ／ｍｌの最終濃度まで、懸濁バッファＳ１にＲＮアーゼを加える；
ｃ）試料の懸濁：１ｍｌの一晩細菌培養を１．５マイクロ遠心分離管に移し、１分間１２，０００ｇにおける遠心分離により細胞を採取し、その後、培養培地を除去し、２５０μｌの調製Ｓ１バッファにより再懸濁する；
ｄ）試料の溶解：２５０μｌの溶解バッファＳ２を懸濁液に加え、最低１０回の反転により混合する；
ｅ）結合のための調製：３５０μｌの結合バッファＳ３を細胞溶解物に加え、最低１０回、又は濁った微粒子が見えるまで、反転により混合する；
ｆ）細胞溶解物のクリアリング：溶液を１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、透明な溶解物を新しいマイクロ遠心分離管に移す；
ｇ）磁性粒子の調製：使用前に少なくとも１分間、水又はカオトロピック剤中で磁性粒子の懸濁液をボルテックスする；
ｈ）ｐＤＮＡの結合：透明な溶解物に５０μｌの磁性粒子溶液を加え、反転により混合し、その後、室温で５分間インキュベートする；
ｉ）ｐＤＮＡ結合磁性粒子の分離：１分間磁気スタンドを使用して可逆的に結合したｐＤＮＡを有する磁性粒子を磁気によって分離し、残存する溶解物を除去する；
ｊ）ｐＤＮＡ−結合磁性粒子の洗浄：可逆的に結合したｐＤＮＡを含む磁性粒子を、５００μｌの洗浄バッファＷ１で一度及び７００μｌの洗浄バッファＷ２で一度洗浄する；
ｋ）洗浄バッファの除去：洗浄バッファＷ１及びＷ２を除去し、可逆的に結合したｐＤＮＡを有する磁性粒子を磁気スタンド上で５分間、上下を逆にして空気乾燥させる；
ｌ）ｐＤＮＡの溶出：磁気スタンドから管を取り外し１００μｌ（又はより濃縮した試料の生成のために５０μｌ）の水を加え、室温で１分間インキュベートする；
ｍ）ｐＤＮＡの精製：管を磁気スタンド上に１分間置き、磁性粒子を除去し、溶出したｐＤＮＡを新しいマイクロ遠心分離管に移す。
【００６３】
比較実施例１
ｐＤＮＡを、１０００μｇのＱｂｅａｄｓ又は５０００μｇのＧｒａｃｅビーズを用いる上記プロトコルを使用して細菌培養物から精製した。同じ細菌培養物をまた、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＷｉｚａｒｄ  ＭａｇｎｅＳｉｌ  Ｔｆｘ（登録商標）を使用して精製した。各方法について平均全ｐＤＮＡ収率を定量し、図２に示した。Ｑｂｅａｄｓを使用する本発明の方法についての平均全ｐＤＮＡ収率は、１ｍｌの細菌培養（Ｏ．Ｄ．６００≒１）の試料から１０．０μｇであった。Ｇｒａｃｅビーズを使用する本発明の方法についての平均ｐＤＮＡ収率は、９．２μｇであるのに対し、比較例のＰｒｏｍｅｇａ法は１０．７μｇのｐＤＮＡを生じた。
【００６４】
次いで、各ｐＤＮＡ試料についてのトランスフェクション効率を、ｅＧＦＰ−コード化プラスミドであるｐＥＧＦＰ−Ｃ１をＨｅｌａ細胞中にトランスフェクションすることにより特定した。トランスフェクションされた細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、核の可視化のためにＤＡＰＩで染色した。ＧＦＰ及び核について適切なフィルタを用いて蛍光画像を取り、その後、まず２値画像（白黒）を変換しＧＦＰ陽性細胞及び総細胞（核）を計数するために定められる特徴を計数することにより、ＩｍａｇｅＪ画像分析を行った。ＧＦＰ陽性細胞を視野中の細胞の総数で割ることにより、トランスフェクション効率を特定した。各方法についてのトランスフェクション効率が図３に示され、エラーバーは少なくとも８画像の標準偏差を示す。トランスフェクション効率は、Ｑｂｅａｄｓ、Ｇｒａｃｅビーズ、及びＰｒｏｍｅｇａキットを使用する方法についてそれぞれ、３９．０％、３９．６％、及び４０．４％であった。
【００６５】
したがって、図２〜３は、約２０分で行われた本発明の方法が、ベンチマーク比較例の「Ｐｒｏｍｅｇａ」キットのものに匹敵するｐＤＮＡ収率及び品質を提供することを実証している。
【００６６】
比較実施例２
ＳＤＳ又はＳＤＢＳを含む溶解バッファＳ２を用いる上記プロトコルを使用して、細菌培養物からｐＤＮＡを精製した。同じ細胞培養物をまた、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＷｉｚａｒｄ  ＭａｇｎｅＳｉｌ  Ｔｆｘ（登録商標）を使用して精製した。各方法について平均全ｐＤＮＡ収率を定量し、図４に示した。溶解バッファＳ２中でＳＤＳを使用する本発明の方法についての平均全ｐＤＮＡ収率は、１ｍｌの細胞培養物（Ｏ．Ｄ．６００≒１）の試料から７．３μｇであった。溶解バッファＳ２中でＳＤＢＳを使用する本発明の方法についての平均ｐＤＮＡ収率は、９．８μｇであるのに対し、比較例のＰｒｏｍｅｇａ法は６．４μｇのｐＤＮＡを生じた。
【００６７】
制限消化及びトランスフェクションのような下流用途を行い、各方法により生じる精製ｐＤＮＡの質を特定した。制限消化について、制限酵素ＥｃｏＲＩを使用して、ｐＤＮＡを線形化した。図５は、３つの異なる方法についてのｐＤＮＡ試料（非切断Ａ又はＥｃｏＲＩで切断したＢ）のアガロースゲル電気泳動分析を示す。図５により示されるように、各方法により生じたｐＤＮＡは、制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化できた。
【００６８】
次いで、各ｐＤＮＡ試料についてのトランスフェクション効率を、ｅＧＦＰ−コード化プラスミドであるｐＥＧＦＰ−Ｃ１をＨｅｌａ細胞中にトランスフェクションすることにより特定した。トランスフェクションされた細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、核の可視化のためにＤＡＰＩで染色した。ＧＦＰ及び核について適切なフィルタを用いて蛍光画像を取り、その後、まず２値画像（白黒）を変換しＧＦＰ陽性細胞及び総細胞（核）を計数するために定められる特徴を計数することにより、ＩｍａｇｅＪ画像分析を行った。ＧＦＰ陽性細胞を視野中の細胞の総数で割ることにより、トランスフェクション効率を特定した。各方法についてのトランスフェクション効率が図６に示され、エラーバーは少なくとも８画像の標準偏差を示す。トランスフェクション効率は、ＳＤＳ溶解バッファ、ＳＤＢＳ溶解バッファ、及びＰｒｏｍｅｇａキットを使用する方法についてそれぞれ、３８．０％、４５．４％、及び５２．９％であった。
【００６９】
したがって、図４〜６は、約２０分で行われた本発明の方法が、ベンチマーク比較例の「Ｐｒｏｍｅｇａ」キットのものを超えて改良される又はそれに匹敵するｐＤＮＡ収率及び／又は品質を提供することを実証している。
【００７０】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００７１】
実施形態１
核酸精製のための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程；
（ｂ）前記懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解物を形成する工程；
（ｃ）前記溶解物を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；
（ｄ）前記溶液を少なくとも１つの磁性粒子と混合し、少なくとも１つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程であって、前記少なくとも１つの改質された磁性粒子が前記少なくとも１つの核酸に可逆的に結合される、工程；
（ｅ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、前記混合溶液から分離する工程；
（ｆ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、第１の洗浄バッファ及び第２の洗浄バッファで洗浄する工程；及び
（ｇ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、溶出バッファと混合する工程；
を含み、
前記懸濁バッファが、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のイオンキレート剤、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のバッファ化合物を含み、
前記溶解バッファが、約１質量％〜約１０質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤、及び約０．２Ｍ以上の濃度で存在する少なくとも１つの第２のバッファ化合物を含み、
前記結合バッファが、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のカオトロピック剤、約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも１つの第１の塩、約１体積％〜約５体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のアルコール、及び約０．２５質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第３のバッファ化合物を含み、
前記第１の洗浄バッファが、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のカオトロピック剤、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のイオンキレート剤、約３０体積％〜約５０体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のアルコール、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第４のバッファ化合物を含み、
前記第２の洗浄バッファが、少なくとも１つの第３のアルコール、及び随意的な少なくとも１つの第２の塩を含む、
ことを特徴とする方法。
【００７２】
実施形態２
前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料が、プラスミドＤＮＡを含む少なくとも１つの細菌細胞物であることを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
【００７３】
実施形態３
前記少なくとも１つの第１のイオンキレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のバッファ化合物が、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１又は２に記載の方法。
【００７４】
実施形態４
前記少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム（ＡＬＳ）、ドデシル硫酸カリウム（ＰＤＳ）、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のバッファ化合物が、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【００７５】
実施形態５
前記少なくとも１つの第１のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第３のバッファ化合物が、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
【００７６】
実施形態６
前記少なくとも１つの第２のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のイオンキレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第４のバッファ化合物が、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。
【００７７】
実施形態７
前記少なくとも１つの第３のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
【００７８】
実施形態８
前記少なくとも１つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
【００７９】
実施形態９
前記溶液を前記少なくとも１つの磁性粒子と混合する工程（ｄ）の前に、前記溶液を遠心分離し、少なくとも１つの凝集体又は高分子を除去する工程をさらに含むことを特徴とする、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。
【００８０】
実施形態１０
前記少なくとも１つの改質された磁性粒子から前記少なくとも１つの核酸を放出するのに十分な時間、前記溶出バッファと共に前記少なくとも１つの改質された磁性粒子をインキュベートする工程をさらに含み、前記溶出バッファが、水、及び少なくとも１つのバッファ化合物及び／又は少なくとも１つのイオンキレート剤を含む溶液から選択されることを特徴とする、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
【００８１】
実施形態１１
核酸精製のためのキットであって、
（ａ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のイオンキレート剤、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のバッファ化合物を含む懸濁バッファ；
（ｂ）約１質量％〜約１０質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤、及び約０．２Ｍ以上の濃度で存在する少なくとも１つの第２のバッファ化合物を含む溶解バッファ；
（ｃ）約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のカオトロピック剤、約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも１つの第１の塩、約１体積％〜約５体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のアルコール、及び約０．２５質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第３のバッファ化合物を含む結合バッファ；
（ｄ）約４．５Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のカオトロピック剤、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のイオンキレート剤、約３０体積％〜約５０体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のアルコール、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第４のバッファ化合物を含む第１の洗浄バッファ；
（ｅ）少なくとも１つの第３のアルコール、及び随意的な少なくとも１つの第２の塩を含む第２の洗浄バッファ；及び
（ｆ）少なくとも１つの磁性粒子、
を含むことを特徴とするキット。
【００８２】
実施形態１２
前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料が、プラスミドＤＮＡを含む少なくとも１つの細菌細胞であることを特徴とする、実施形態１１に記載のキット。
【００８３】
実施形態１３
前記少なくとも１つの第１のイオンキレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のバッファ化合物が、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１１又は１２に記載のキット。
【００８４】
実施形態１４
前記少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム（ＡＬＳ）、ドデシル硫酸カリウム（ＰＤＳ）、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のバッファ化合物が、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１１〜１３のいずれかに記載のキット。
【００８５】
実施形態１５
前記少なくとも１つの第１のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第３のバッファ化合物が、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１１〜１４のいずれかに記載のキット。
【００８６】
実施形態１６
前記少なくとも１つの第２のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のイオンキレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第４のバッファ化合物が、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１１〜１５のいずれかに記載のキット。
【００８７】
実施形態１７
前記少なくとも１つの第３のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１１〜１６のいずれかに記載のキット。
【００８８】
実施形態１８
前記少なくとも１つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、実施形態１１〜１７のいずれかに記載のキット。
【００８９】
実施形態１９
（ｇ）水、及び少なくとも１つのバッファ化合物及び／又は少なくとも１つのイオンキレート剤を含む溶液から選択される溶出バッファ、
をさらに含むことを特徴とする、実施形態１１〜１８のいずれかに記載のキット。
【００９０】
実施形態２０
核酸精製のためのキットであって、
（ａ）約８ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する、ＥＤＴＡ、その異性体、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第１のイオンキレート剤、及び約１０ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲の濃度で存在する、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第１のバッファ化合物を含む、懸濁バッファ；
（ｂ）約１質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する、ＳＤＳ、ＳＤＢＳ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤、及び約０．２Ｍ以上の濃度で存在する、アルカリ水酸化物及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第２のバッファ化合物、を含む溶解バッファ；
（ｃ）約４Ｍ〜約４．５Ｍの範囲の濃度で存在する、ＧｕＨＣｌ、ＧｕＳＣＮ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第１のカオトロピック剤、約０．３Ｍ〜約１．５Ｍの範囲の濃度で存在する、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第１の塩、約１体積％〜約２体積％のイソプロパノール、及び約１質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第３のバッファ化合物、を含む結合バッファ；
（ｄ）約４．５Ｍ〜約５Ｍの範囲の濃度で存在する、ＧｕＨＣｌ、ＧｕＳＣＮ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第２のカオトロピック剤、約１ｍＭ〜約３ｍＭの範囲の濃度で存在する、ＥＤＴＡ、その異性体、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第２のイオンキレート剤、約３０体積％〜約４０体積％のイソプロパノール、及び約２０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第４のバッファ化合物、を含む第１の洗浄バッファ；
（ｅ）少なくとも約７０体積％のエタノール、及び約８０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第２の塩、を含む第２の洗浄バッファ；及び
（ｆ）少なくとも１つのシリカ系磁性粒子、
を含むことを特徴とするキット。
【符号の説明】
【００９１】
１０５  試料
１１０  汚染物質
１１５  核酸
１２０  ｐＤＮＡ
１３０  磁性粒子
１３５  磁石
【図１】
2018503366.tif 000003
【図２】
2018503366.tif 000004
【図３】
2018503366.tif 000005
【図４】
2018503366.tif 000006
【図５】
2018503366.tif 000007
【図６】
2018503366.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成29年8月9日(2017.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって本願に援用される、２０１４年１２月９日出願の米国仮特許出願第６２／０８９３３３号の米国法典第３５編第１１９条に基づく優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、概略的には、核酸精製のための方法及びキットに関し、より詳細には、トランスフェクショングレードのプラスミドＤＮＡを精製するための磁性粒子をベースとしたキット及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ又はＲＮＡの単離などの核酸精製は、さまざまな生化学的及び診断的手順における重要な工程でありうる。プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は、クローニングのためのベクターの調製から、転写又は共役転写／翻訳反応のためのテンプレートの生成まで、多くの用途に使用されうる。クローニング、トランスフェクション、シークエンシング、増幅、ハイブリダイゼーション、及び／又は合成等のような追加の処理が行われる前に、しばしばそれらが見出される複合混合物（例えば、組織、細胞、体液など）から核酸を分離する必要があるかもしれない。例えば、タンパク質、脂質、及び／又は炭水化物などの汚染物質の存在により、これらの処理の多くが妨げられる又は抑制される。例えば、単離中に運ばれる不純物は、収量を低下させる及び／又は酵素系が所定の生成物を合成することを妨げるおそれがある。さらに、ＤＮＡはＲＮＡ用途を汚染し得、逆も同様である。したがって、さまざまの多様な開始物質から核酸を効果的に単離して所望の最終使用機能性を確保することが重要でありうる。
【０００４】
核酸を精製するために選択される方法は、幾つかの事例では、核酸試料の収量、品質、及び／又は純度を含む、単離された生成物のさまざまな特性に影響を与えうる。核酸精製のための多くの方法が開発されてきたが、これらの方法は、例えば、高コスト、高複雑性、低速度、低収量、低純度、汚染、毒性、及び／又は非効率性を含む、１つ以上の欠点を有しうる。従来、さまざまの精製方法において、核酸を結合及び分離するために、磁性粒子が使用されてきた。これらの方法は、遠心分離及び／又は真空処理工程をなくす、より高い純度の生成物を産出する、及び／又は操作者の安全性を改善するといったいくつかの利点を有しうる。しかしながら、磁性粒子を使用する方法は、今もなお、低速度、高複雑性、及び／又は全体の収量の乏しさなどのさまざまな不利点に悩まされうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、より速く、複雑性が低下した、より安価な、及び／又は生成物の純度及び／又は収量に関して改善されうる、核酸精製のための磁性粒子をベースとした方法及びキットを提供することが有益であろう。結果的に得られる精製された核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、クローニング、トランスフェクション、制限消化、及び臨床診断のような多種多様の生化学及び診断用途に使用されうる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、さまざまな実施形態において、核酸を精製するための方法に関し、該方法は、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を、懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程；（ｂ）懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解液を形成する工程；（ｃ）溶解液を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；（ｄ）溶液を少なくとも１つの磁性粒子と混合し、少なくとも１つの核酸に可逆的に結合された少なくとも１つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程；（ｅ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を混合溶液から分離する工程；（ｆ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を第１の洗浄バッファ及び第２の洗浄バッファで洗浄する工程；及び、（ｇ）改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程、を含む。
【０００７】
さまざまな実施形態によれば、懸濁バッファは、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのイオンキレート剤、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのバッファ化合物を含みうる。溶解バッファは、約１質量％〜約１０質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤、及び約０．２Ｍ以上の濃度で存在する少なくとも１つのバッファ化合物を含みうる。非限定的な実施形態において、結合バッファは、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのカオトロピック剤、約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも１つの塩、約１体積％〜約５体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つのアルコール、及び、約０．２５質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つのバッファ化合物を含みうる。さらなる実施形態によれば、第１の洗浄バッファは、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのカオトロピック剤、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのイオンキレート剤、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのバッファ、及び、約３０体積％〜約５０体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つのアルコールを含みうる。さらなる実施形態において、第２の洗浄バッファは、少なくとも１つのアルコール及び、必要に応じて、少なくとも１つの塩を含みうる。磁性粒子は、例えば、カルボキシルコーティングされた磁性粒子、シリカ系磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されうる。これらのバッファ及び磁性粒子を含む核酸精製キットもまた、本明細書に開示される。
【０００８】
本発明の追加の特徴及び利点は、以下の詳細な説明に記載されており、一部には、その説明から当業者にとって容易に明らかとなり、あるいは、以下の詳細な説明、特許請求の範囲、及び添付の図面を含む、本明細書に記載される本発明を実施することによって認識されよう。
【０００９】
前述の概要及び以下の詳細な説明は、両方とも本開示のさまざまな実施形態を提示しており、特許請求の範囲の本質及び特性を理解するための概観又は枠組みを提供することが意図されているものと解されたい。添付の図面は、本開示のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書内に取り込まれてその一部を構成する。図面は、本開示のさまざまな実施形態を例証しており、その説明とともに、本発明の原理及び動作を説明する役目をする。
【００１０】
以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号で示される、以下の図面と併せて読まれた場合に、最もよく理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示の一実施形態に従った核酸精製方法を示す流れ図
【図２】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのｐＤＮＡ収量を示すグラフ
【図３】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのトランスフェクション効率を示すグラフ
【図４】本開示のさまざまな実施形態に従った方法を使用して、及び、先行技術の方法を使用して精製されたｐＤＮＡ（ＥｃｏＲＩで切断された又はされない）のアガロースゲル電気泳動分析
【図５】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのｐＤＮＡ収量を示すグラフ
【図６】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのトランスフェクション効率を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１２】
方法
核酸精製のための方法が、本明細書に開示され、該方法は、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を、懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程；（ｂ）懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解液を形成する工程；（ｃ）溶解液を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；（ｄ）溶液を少なくとも１つの磁性粒子と混合し、少なくとも１つの核酸に可逆的に結合された少なくとも１つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程；（ｅ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を混合溶液から分離する工程；（ｆ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を第１の洗浄バッファ及び第２の洗浄バッファで洗浄する工程；及び、（ｇ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程、を含む。
【００１３】
本開示の実施形態は、本開示の非限定的な実施形態に従った核酸精製方法の流れ図を示す図１を参照して論じられる。以下の概要は、特許請求の範囲に記載される本方法の概観を提供することが意図されており、さまざまな態様は、非限定的な実施形態を参照して、本開示全体にわたってさらに詳細に論じられ、これらの実施形態は、以下に論じられる概略的な方法の文脈において互いに置き換え可能である。
【００１４】
図１に示されるように、少なくとも１つの核酸を含む試料（例えば細菌）１０５を、工程Ｓにおいて懸濁バッファ中に懸濁してもよい。次いで、工程Ｌにおいて試料を溶解させ、ｐＤＮＡ１２０、及び所望でない核酸１１５（例えばＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ）を含むさまざまな汚染物質１１０を含む溶解物を生成してもよい。溶解物をさらに結合／中和バッファと混合しインキュベートし、遠心分離により工程Ｃにおいて処理して任意の凝集体又は高分子１２５を分離してもよい。次いで、磁性粒子１３０を残存溶液に加えてもよい。試料（細菌）１０５から放出されたｐＤＮＡ１２０は、工程Ｂにおいて磁性粒子１３０の表面に可逆的に結合されうる。磁石１３５を使用して、磁性粒子１３０を引き寄せ、残存溶液からそれらを分離してもよい。結合していない汚染物質１１０は、工程Ｗにおいて１つ以上の洗浄バッファを使用して磁性粒子１３０を洗浄することによって除去されうる。次いで、ｐＤＮＡ１２０は、工程Ｅにおいて、溶出バッファを使用して、磁性粒子ら溶出かつ解放されうる。磁性粒子１３０は、例えば磁石を使用して、工程Ｐにおいて溶液から分離されて、次にさまざまな用途に使用されうる精製されたｐＤＮＡ生成物を生じうる。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、用語「少なくとも１つの核酸を含む試料」及びその変形物は、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子など、少なくとも１つの核酸を含みうる、生体又は環境サンプルから得られる試料又は培養物のような任意の材料を意味することが意図されている。少なくとも１つの核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、トータルＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及び／又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが挙げられうる。生体サンプルには、細胞、組織、及び例えば尿、全血、及び血清及び血漿のような血液由来の液体などの体液のようなヒト及び動物サンプルが含まれてもよい。環境サンプルには、２、３例を挙げると、アガロースのような植物組織、及び細菌サンプルが含まれてもよい。さまざまな実施形態において、試料は、細菌培養物を含みうる。例えば、細菌培養物は、１（８×１０８細胞／ｍｌ）におよそ等しいＯ．Ｄ．６００の濃度で一晩で調製できる。追加の実施形態によれば、精製される少なくとも１つの核酸は、例えばｐＤＮＡなどのＤＮＡでもよい。
【００１６】
少なくとも１つの核酸を含む試料を、懸濁バッファ（Ｓ１）中で混合、例えば懸濁してもよい（図１の工程Ｓ参照）。さまざまな実施形態において、懸濁バッファＳ１は、少なくとも１つのイオンキレート剤（ＩＣ１）及び少なくとも１つのバッファ化合物（Ｂ１）を含んでもよい。懸濁バッファＳ１はまた、約５０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌ〜約２５０μｇ／ｍｌなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０μｇ／ｍｌ〜約１，０００μｇ／ｍｌの範囲の濃度でＲＮアーゼをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、試料との混合の前に、ＲＮアーゼを懸濁バッファＳ１に加えてもよい。
【００１７】
少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ１は、約２ｍＭ〜約９ｍＭ、約３ｍＭ〜約８ｍＭ、約４ｍＭ〜約７ｍＭ、又は約５ｍＭ〜約６ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、例えば約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で懸濁バッファＳ１中に存在してもよい。例えば、ＩＣ１濃度は、約１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、５．５ｍＭ、６ｍＭ、６．５ｍＭ、７ｍＭ、７．５ｍＭ、８ｍＭ、８．５ｍＭ、９ｍＭ、９．５ｍＭ、又は１０ｍＭ、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲でもよい。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ１は、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及びその異性体、例えばエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ１は、ＥＤＴＡ及びその異性体から選択されてもよい。少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ１は、さまざまな実施形態において、プロテアーゼ阻害剤としても作用しうる。
【００１８】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ１は、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７０ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約６０ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、例えば約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で懸濁バッファＳ１中に存在しうる。例えば、Ｂ１濃度は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭ、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲でもよい。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ１は、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ１は、Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌから選択されてもよい。
【００１９】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ１は、さまざまな実施形態において、約２５℃において約７〜約９の範囲、例えば、約７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は９のｐＫａを有してもよい。少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ１は、約７．５〜約９．５、約８．５〜約９、又は約８〜約８．３など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約７〜約１０の範囲の値にｐＨを調整するのに十分な量で懸濁バッファＳ１中に含まれてもよい。例えば、Ｓ１は、約７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は１０、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲に等しいｐＨを有してもよい。
【００２０】
懸濁後、溶解バッファＳ２を加え、懸濁試料から溶解物を形成してもよい（例えば、図１の工程Ｌを参照）。溶解バッファＳ２は、さまざまな実施形態において、少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤（ＤＣ）及び少なくとも１つのバッファ化合物（Ｂ２）を含んでもよい。懸濁液及び溶解バッファＳ２を、当該技術において知られる任意の方法で混合してもよく、例えば、溶解バッファＳ２を懸濁液に加え、例えば反転によって混合してもよい。特定の実施形態において、混合物は、少なくとも５回、少なくとも１０回、又はそれ以上などの複数回、反転されうる。反転による混合により、最適な細胞溶解効率及び／又は最終的な核酸収量が確保できる。さらに、懸濁液を、試料を溶解するのに十分な所定の時間、溶解バッファＳ２中で必要に応じてインキュベートしてもよい。この時間は、約１分間〜約８分間、約２分間〜約５分間、又は約３分間〜約４分間など、これらの間のすべての範囲及び部部分的範囲を含む、例えば、約３０秒間〜約１０分間の範囲でありうる。
【００２１】
少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤ＤＣは、約２質量％〜約９質量％、約３質量％〜約８質量％、約４質量％〜約７質量％、又は約５質量％〜約６質量％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、例えば、約１質量％〜約１０質量％の範囲の濃度で溶解バッファＳ２中に存在してもよい。例えば、ＤＣ濃度は、約１質量％、１．２５質量％、１．５質量％、１．７５質量％、２質量％、２．２５質量％、２．５質量％、２．７５質量％、３質量％、３．２５質量％、３．５質量％、３．７５質量％、４質量％、４．２５質量％、４．５質量％、４．７５質量％、５質量％、５．２５質量％、５．５質量％、５．７５質量％、６質量％、６．２５質量％、６．５質量％、６．７５質量％、７質量％、７．２５質量％、７．５質量％、７．７５質量％、８質量％、８．２５質量％、８．５質量％、８．７５質量％、９質量％、９．２５質量％、９．５質量％、９．７５質量％、又は１０質量％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤ＤＣは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム（ＡＬＳ）、ドデシル硫酸カリウム（ＰＤＳ）、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００又はＸ−１１４）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０又は８０）、及びそれらの組合せのような、カチオン性、アニオン性、非イオン性、及び双性イオン性の洗浄剤又は界面活性剤から選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤ＤＣは、ＳＤＳ及びＳＤＢＳから選択されてもよい。少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤ＤＣは、さまざまな実施形態において、試料中で細胞膜を分散させる及び／又は脂質及び／又はタンパク質を変性させるために使用してもよい。
【００２２】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ２は、例えば、約０．２５Ｍ以上、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、１Ｍ又はそれより高くなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．２Ｍ以上の濃度で溶解バッファＳ２中に存在してもよい。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ２は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、及びそれらの組合せのような水酸化物から選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ２は、ＮａＯＨでもよい。
【００２３】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ２は、さまざまな実施形態において、約２５℃で、例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．１〜約２の範囲のｐＫｂを有してもよい。少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ２は、例えば、約１０．５〜約１２．５、又は約１１〜約１２など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０〜約１３の範囲の値にｐＨを調整するのに十分な量で溶解バッファＳ２中に含まれてもよい。例えば、Ｓ２は、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、又は１３、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲に等しいｐＨを有してもよい。
【００２４】
溶解後、結合（又は中和）バッファ（Ｓ３）を溶解物に加えて溶液を形成してもよい。結合バッファＳ３は、少なくとも１つのカオトロピック剤（Ｃ１）、少なくとも１つのアルコール（Ａ１）、随意的な少なくとも１つの塩（Ｚ１）、及び少なくとも１つのバッファ化合物（Ｂ３）を含んでもよい。溶解物及び結合バッファＳ３を、当該技術において知られる任意の方法で混合してもよく、例えば、結合バッファＳ３を溶解物に加え、例えば反転により混合してもよい。特定の実施形態において、混合物は、少なくとも５回、少なくとも１０回、又はそれ以上などの複数回、反転されうる。溶解物は、必要に応じて、試料を中和する及び／又は所望でない汚染物質（濁った粒子として見える）の凝集形成を促進するのに十分な時間、結合バッファＳ３中でインキュベートされてもよい。この時間は、例えば、約２分〜約２５分、約３分〜約２０分、約４分〜約１５分、又は約５分〜約１０分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１分〜約３０分の範囲でありうる。
【００２５】
少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ１は、例えば、約４．２Ｍ〜約５．８Ｍ、約４．４Ｍ〜約５．６Ｍ、約４．６Ｍ〜約５．４Ｍ、又は約４．８Ｍ〜約５．２Ｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で結合バッファＳ３中に存在しうる。例えば、Ｃ１の濃度は、約４Ｍ、４．１Ｍ、４．２Ｍ、４．３Ｍ、４．４Ｍ、４．５Ｍ、４．６Ｍ、４．７Ｍ、４．８Ｍ、４．９Ｍ、５Ｍ、５．１Ｍ、５．２Ｍ、５．３Ｍ、５．４Ｍ、５．５Ｍ、５．６Ｍ、５．７Ｍ、５．８Ｍ、５．９Ｍ、又は６Ｍであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ１は、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択されうる。特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ１は、ＧｕＨＣｌ及びＧｕＳＣＮから選択されうる。少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ１は、さまざまな実施形態において、試料中で細胞膜を分散させる及び／又は脂質及び／又はタンパク質を変性させるために使用してもよい。
【００２６】
少なくとも１つのアルコールＡ１は、例えば、約２体積％〜約４体積％、又は約２．５体積％〜約３体積％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１体積％〜約５体積％の範囲の濃度で結合バッファＳ３中に存在しうる。例えば、Ａ１の濃度は、約１体積％、１．５体積％、２体積％、３体積％、３．５体積％、４体積％、４．５体積％、又は５体積％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのアルコールＡ１は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択されうる。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのアルコールＡ１は、イソプロパノールでありうる。少なくとも１つのアルコールＡ１は、さまざまな実施形態において、カオトロピックであってよく、試料中で細胞膜を分散させる及び／又はタンパク質を変性させるために使用してもよい。
【００２７】
少なくとも１つの塩Ｚ１は、存在する場合には、例えば、約０．４Ｍ〜約１．８Ｍ、約０．６Ｍ〜約１．６Ｍ、約０．８Ｍ〜約１．４Ｍ、又は約１Ｍ〜約１．２Ｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．２Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で結合バッファＳ３中に存在しうる。例えば、Ｚ１の濃度は、約０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、又は２Ｍであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つの塩Ｚ１は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つの塩Ｚ１は、硫酸アンモニウムでもよい。少なくとも１つの塩Ｚ１は、さまざまな実施形態において、核酸精製を改良するために含まれてもよい、又は他の実施形態において除外されてもよいが、この場合には低い収量を生じうる。結合バッファＳ３中の塩濃度が増加すると、例えば、磁性粒子への核酸の結合及び／又は所望でない汚染物質凝集体の沈殿が促進されうる。
【００２８】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ３は、例えば、約０．５％〜約２．５％、又は約１％〜約１．５％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．２５質量％〜約３質量％の範囲の濃度で結合バッファＳ３中に存在しうる。例えば、Ｂ３濃度は、約０．２５質量％、０．５質量％、０．７５質量％、１質量％、１．２５質量％、１．５質量％、１．７５質量％、２質量％、２．２５質量％、２．５質量％、２．７５質量％、又は３質量％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ３は、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択されてもよい。
【００２９】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ３は、さまざまな実施形態において、約２５℃で、例えば、約４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５、６、６．２５、６．５、６．７５、又は７など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４〜約７の範囲のｐＫｂを有してもよい。少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ３は、約５〜約８、又は約６〜約７など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４〜約９の範囲の値にｐＨを調整するのに十分な量で結合バッファＳ３中に含まれてもよい。例えば、Ｓ３は、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は９、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲に等しいｐＨを有してもよい。
【００３０】
さまざまな実施形態によれば、例えば溶解バッファＳ２の添加により生じるアルカリ性条件（例えばｐＨ＞１０）を使用して、試料中のｐＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方を変性できる。結合バッファＳ３によるその後の中和は、さまざまな方法で、特にｐＤＮＡ精製について、開示される方法の全体的有効性に役立ちうる。例えば、中和により、ゲノムＤＮＡはストランド内の態様で塩基対となり得、したがって不溶性の凝集を形成し、これは溶液から沈殿しうる。対照的に、環状ｐＤＮＡの共有結合により閉鎖した性質により、ストランド間リハイブリダイゼーション（ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ  ｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が促進され、したがってｐＤＮＡが溶液中に残ると考えられる。さらに、結合バッファＳ３が、カリウム、ナトリウム、又はリチウム塩のような少なくとも１つの塩Ｚ１を含む場合、これらの塩は、溶液中の１つ以上の成分と反応して、追加の沈殿を形成しうる。例えば、ＳＤＳのカリウム塩は、不溶性である。したがって、タンパク質及び洗浄剤の両方の沈殿及び凝集によって、高分子量ゲノムＤＮＡの捕捉が補助されうる。次いで、これらの凝集体及び任意の高分子を、以下により詳細に説明されるように、例えば遠心分離、又は濾過のような他の既知の方法により（例えば図１の工程Ｃ参照）、溶液から除去してもよい。
【００３１】
結合バッファの添加後、溶液を少なくとも１つの磁性粒子と混合し、混合溶液を生成してもよい（例えば、図１の工程Ｂ参照）。本明細書で用いられる場合、用語「磁性粒子」及びその変形物は、例えば、核酸が可逆的に結合可能な表面を有する少なくとも１つの材料でコーティングされた、常磁性又は超常磁性などの磁性コアを有する粒子を意味することが意図されている。適切な磁性粒子としては、例えば、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子などが挙げられうる。シリカ系磁性粒子は、幾つかの実施形態では、ケイ質酸化物（siliceous oxide）でコーティングされ、したがって核酸が結合可能な水和したケイ質酸化物吸着性表面（例えば、シラノール基を含む表面）を提供する、常磁性のコアを含みうる。磁性粒子は、追加的な実施形態において、２、３例を挙げると、弱く又は強く正に荷電した表面、弱く又は強く負に荷電した表面、若しくは疎水性の表面などの機能化された表面を生成するように表面改質されうる。
【００３２】
市販の磁性粒子の非限定的な例としては、ＭａｇＱｕ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．社製のＱｂｅａｄｓ、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．社製のＧｒａｃｅビーズなどが挙げられる。磁性粒子は、例えば、直径約０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０μｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、直径約０．３μｍ〜約１０μｍの範囲の直径などの市販の寸法を含む、核酸を結合するのに適した任意の寸法を有しうる。Ｑｂｅａｄｓは、例えば、約４μｍ〜約５μｍの範囲の平均直径を有してもよく、Ｇｒａｃｅビーズは約５μｍ〜約１０μｍの範囲の平均直径を有してもよい。
【００３３】
幾つかの実施形態において、磁性粒子を、少なくとも１つの媒質中の懸濁として溶液に加えてもよい。媒質は、例えば、水及び／又はカオトロピック剤から選択されてもよい。特定の実施形態において、磁性粒子は、水中に懸濁されたＱｂｅａｄｓ又はＧｕＳＣＮのようなカオトロピック剤中に懸濁されたＧｒａｃｅビーズでもよい。懸濁液中のビーズの濃度は、所望に変化してもよく、例えば、約２０μｇ／ｍｌ〜約９０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ〜約８０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌ、又は約５０μｇ／ｍｌ〜約６０μｇ／ｍｌなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの範囲でもよい。使用される場合、懸濁液中のカオトロピック剤の濃度もまた、所望に変化してもよく、例えば、約２Ｍ〜約６Ｍ、又は約４Ｍ〜約５Ｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１Ｍ〜約８Ｍの範囲でもよい。磁性ビーズを含む溶液のｐＨは、例えば、約５〜約８、又は約６〜約７など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４〜約９の範囲でもよい。
【００３４】
理論に縛られることは望まないが、結合バッファＳ３によって取り込まれた、比較的高濃度のカオトロピック剤及び／又は塩は、ｐＤＮＡなどの核酸が、シリカ表面などの磁性粒子の表面に可逆的に（例えば、非共有的に）結合する能力を高めることができると考えられる。よって、例えば可逆的に結合された核酸を含む、改質された磁性粒子は、次に、結合していない汚染物質から分離されうる。例えば、磁石が、改質された磁性粒子に近接して配置され、粒子を引き寄せて、例えば、凝集体又はペレットを形成しうる。ある特定の実施形態では、改質された磁性粒子を含む混合溶液を含有する管のような容器が、残留溶液が除去される間に粒子を寄せ集めいくらか固定することが可能な磁気スタンド上に、配置されうる。
【００３５】
核酸を磁性粒子に結合した後、及び、例えば磁石を用いて改質された磁性粒子を分離した後、粒子が混合され、濯がれ、又は、１つ以上の洗浄バッファで洗浄されうる（例えば、図１の工程Ｗを参照）。第１の洗浄バッファ（Ｗ１）は、例えば、少なくとも１つのカオトロピック剤（Ｃ２）、少なくとも１つのイオンキレート剤（ＩＣ２）、少なくとも１つのアルコール（Ａ２）、及び少なくとも１つのバッファ化合物（Ｂ４）を含みうる。
【００３６】
少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ２は、例えば、約４．２Ｍ〜約５．８Ｍ、約４．４Ｍ〜約５．６Ｍ、約４．６Ｍ〜約５．４Ｍ、又は約４．８Ｍ〜約５Ｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で第１の洗浄バッファＷ１中に存在してもよい。例えば、Ｃ２の濃度は、約４Ｍ、４．１Ｍ、４．２Ｍ、４．３Ｍ、４．４Ｍ、４．５Ｍ、４．６Ｍ、４．７Ｍ、４．８Ｍ、４．９Ｍ、５Ｍ、５．１Ｍ、５．２Ｍ、５．３Ｍ、５．４Ｍ、５．５Ｍ、５．６Ｍ、５．７Ｍ、５．８Ｍ、５．９Ｍ、又は６Ｍであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ２は、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ２は、ＧｕＨＣｌ及びＧｕＳＣＮから選択されうる。少なくとも１つのカオトロピック剤Ｃ２は、さまざまな実施形態において、磁性粒子表面への核酸の結合を促進するために使用してもよい。
【００３７】
少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ２は、例えば、約２ｍＭ〜約９ｍＭ、約３ｍＭ〜約８ｍＭ、約４ｍＭ〜約７ｍＭ、又は約５ｍＭ〜約６ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で第１の洗浄バッファＷ１中に存在してもよい。例えば、ＩＣ２の濃度は、約１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、５．５ｍＭ、６ｍＭ、６．５ｍＭ、７ｍＭ、７．５ｍＭ、８ｍＭ、８．５ｍＭ、９ｍＭ、９．５ｍＭ、又は１０ｍＭであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ２は、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及びその異性体、例えばエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ２は、ＥＤＴＡ及びその異性体から選択されてもよい。少なくとも１つのイオンキレート剤ＩＣ２は、さまざまな実施形態において、酸化損傷及び／又は汚染ヌクレアーゼ活性を減少する及び／又はマグネシウムのような金属イオンをキレートする作用をしうる。
【００３８】
少なくとも１つのアルコールＡ２は、例えば、約３５体積％〜約４５体積％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約３０体積％〜約５０体積％の範囲の濃度で第１の洗浄バッファＷ１中に存在しうる。例えば、Ａ２の濃度は、約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、又は５０％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのアルコールＡ２は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つのアルコールＡ２は、イソプロパノールでありうる。
【００３９】
少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ４は、例えば、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７０ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約６０ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で第１の洗浄バッファＷ１中に存在しうる。例えば、Ｂ４の濃度は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ４は、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択されてもよい。特定の非限定的な実施形態において、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ４は、Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌから選択されてもよい。
【００４０】
さまざまな実施形態において、少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ４は、約２５℃において、例えば、約７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は９など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約７〜約９の範囲のｐＫａを有してもよい。少なくとも１つのバッファ化合物Ｂ４は、例えば、約６．５〜約７．５、又は約６．８〜約７．２など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約６〜約８の範囲の値にｐＨを調整するのに十分な量で第１の洗浄バッファＷ１中に含まれてもよい。例えば、Ｗ１は、約６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８、及びこれらの間のすべての範囲及び部分的範囲に等しいｐＨを有してもよい。
【００４１】
改質された磁性粒子は、さらに混合され、濯がれ、少なくとも１つのアルコール（Ａ３）及び随意的な少なくとも１つの塩（Ｚ２）を含みうる第２の洗浄バッファ（Ｗ２）で洗浄されてもよい。少なくともの１つのアルコールＡ３は、例えば、約７５体積％〜約９５体積％、又は約８０体積％〜約９０体積％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約７０体積％〜約１００体積％の範囲の濃度で第２の洗浄バッファＷ２中に存在しうる。例えば、Ａ３の濃度は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのアルコールＡ３は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つのアルコールＡ３は、エタノールでありうる。
【００４２】
少なくとも１つの塩Ｚ２は、存在する場合には、例えば、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７０ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約６０ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で第２の洗浄バッファＷ２中に存在しうる。例えば、Ｚ２の濃度は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つの塩Ｚ２は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つの塩Ｚ２は、ＮａＡＣ及びＮＨ４ＡＣから選択されうる。
【００４３】
さまざまな実施形態によれば、第２の洗浄バッファＷ２のｐＨは、例えば、約６．２〜約７．５、約６．５〜約７、又は約６．４〜約６．８など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約６〜約８の範囲でありうる。第２の洗浄バッファＷ２のｐＨは、アルコール及び／又は塩の量を変化させることによって調整されてよく、あるいは、本明細書に開示されるように、１つ以上のバッファ化合物、例えば氷酢酸又はＮａＯＨを使用して調整されてもよい。
【００４４】
洗浄バッファＷ１及びＷ２の添加及び除去の後に、細胞残屑、脂質、タンパク質、及び／又は所望でない核酸等の汚染物質を含まない、又は実質的に含まない、表面に可逆的に結合された核酸を有する、改質された磁性粒子がもたらされうる。さまざまな実施形態によれば、このように生成された、改質された磁性粒子は、次に、溶出バッファ（Ｅ１）と混合され、結合した核酸を放出し、磁性粒子から分離することができる（例えば、図１の工程Ｅを参照）。改質された磁性粒子は、例えば、約４５秒〜約９分、約１分〜約８分、約２分〜約７分、約３分〜約６分、又は約４分〜約５分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約３０秒〜約１０分などの核酸を放出するのに十分な時間、溶出バッファＥ１中でインキュベートされうる。
【００４５】
溶出バッファＥ１は、例えば、水、若しくは、例えば、少なくとも１つのバッファ化合物（例えばＴｒｉｓなど）、少なくとも１つの塩、及び／又は少なくとも１つのイオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）を含む、比較的低塩の溶液を含みうる。特定の実施形態において、溶出バッファＥ１は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの少なくとも１つのバッファ化合物及び約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの少なくとも１つのイオンキレート剤を含みうる。ある非限定的な実施形態によれば、溶出バッファＥ１は、１０ｍＭのＴｒｉｓ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含みうる。
【００４６】
磁性粒子（もはや核酸には付着していない）は、その後、例えば、磁石を使用して分離され、溶液から除去されてよく、最終生成物として溶液中の精製された核酸を生じうる（例えば、図１の工程Ｐを参照）。例えば、本明細書に開示される方法及びキットは、精製されたｐＤＮＡ生成物を提供するために用いられうる。さまざまな実施形態によれば、本明細書に開示される方法及びキットは、トランスフェクショングレードのｐＤＮＡを短時間で効率的に生成するために用いられうる。例えば、非限定的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、約３０分未満、例えば約２０分未満の時間で行われうる。本明細書に開示される方法は、ある特定の実施形態では、およそ２０分間で１ｍｌの一晩細菌培養（Ｏ．Ｄ．６００≒１）から平均で１０μｇのｐＤＮＡを生じうる。
【００４７】
さまざまなバッファ溶液の成分は、幾つかの実施形態では、例えば、互いに同一であっても異なっていてもよいなど、互いに置換可能に用いられうるものと解されたい。例えば、カオトロピック剤Ｃ１及びＣ２は、同一であっても異なっていてもよい。同様に、イオンキレート剤ＩＣ１及びＩＣ２；塩Ｚ１及びＺ２；アルコールＡ１、Ａ２、及びＡ３；及びバッファＢ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４は、それぞれ、同一であっても異なっていてもよい。同様に、これらの成分の濃度は可変であり、幾つかの事例では、所望の用途に応じて、同一であるか又は類似していてもよい。
【００４８】
本明細書に開示される方法はさらに、遠心分離、濾過など、当技術分野で知られている追加の工程を含みうるものと解されたい。非限定的な例として、結合バッファＳ３の添加後、生じた溶液を遠心分離又は濾過して、所望でない凝集体又は高分子を除去してもよい。さまざまな実施形態により、試料及び／又は磁性粒子の遠心分離もまた必要に応じて行ってもよい。そのような場合、遠心分離は、約１２，０００ｇ〜約１６，０００ｇ、又は約１４，０００ｇ〜約１５，０００ｇなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０，０００ｇ〜約１８，０００ｇの範囲の加速度で行ってもよい。遠心分離は、さまざまな実施形態において、例えば、約１分〜約１４分、約２分〜約１３分、約３分〜約１２分、約４分〜約１１分、約５分〜約１０分、約６分〜約９分、又は約７分〜約８分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約３０秒〜約１５分の範囲の時間、行ってもよい。
【００４９】
他の非限定的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、遠心分離工程を含まず、したがって、処理を自動化する能力が高まりうる。他の必要に応じた工程は、空気乾燥を含んでもよく、例えば、改質された磁性粒子を洗浄バッファＷ１及びＷ２で濯いだ後に、粒子は、約２分〜約９分、約３分〜約８分、約４分〜約７分、又は約５分〜約６分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１分〜約１０分の範囲の時間、空気乾燥されうる。さまざまな試料、溶液、若しくは、試料又は溶液の一部を管などの新しい容器へと除去又は移動することもまた、所望されるように又は必要に応じて、本明細書に開示される方法の間に行われうる。
【００５０】
キット
本開示はまた、核酸精製のためのキットにも関し、該キットは、懸濁バッファ、溶解バッファ、結合／中和バッファ、少なくとも１つの磁性粒子、第１の洗浄バッファ、第２の洗浄バッファ、及び必要に応じて溶出バッファを含む。バッファは、さまざまな実施形態において、精製方法に関して先に開示されたバッファＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｂ１、Ｗ１、Ｗ２及びＥ１に対応しうる。各バッファに関して上述したさまざまな実施形態は、本明細書に開示されるキットを形成するために、限定されることなく、任意の方式で組み合わせることができるものと解されたい。
【００５１】
さまざまな実施形態によれば、即時使用可能な、各成分について所定の濃度を有する各バッファが、キットに供給されうる。あるいは、末端利用者によって、適切な種類及び量の溶媒で希釈されて、即時使用可能なバッファを生成するために、１つ以上の濃縮溶液が提供されてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、使用者によってエタノールなどのアルコールで、例えば、エタノールの７０体積％以上の最終濃度まで希釈可能な、濃縮された洗浄バッファＷ２が提供されてもよい。
【００５２】
キットは、幾つかの実施形態では、末端利用者への精製プロトコルに関する指示書及び／又は希釈指示書をさらに含みうる。他の実施形態によれば、キットはさらに、磁気スタンド、管、遠心分離機、細菌培養のための培地及び／又は抗生物質、溶媒、及び／又はＲＮアーゼなどのさまざまな追加の構成要素又は設備を含みうる。
【００５３】
さまざまな開示される実施形態は、その特定の実施形態に関して説明される特定の特徴、要素又は工程を包含しうるものと認識されよう。特定の特徴、要素又は工程は、１つの特定の実施形態に関して説明されるが、さまざまな例証されていない組合せ又は置換における代替的な実施形態と差し替える又は組み合わせることができることもまた認識されよう。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、名詞は、「少なくとも１つ」の対象を指し、そうでないことが明確に示されない限り、「１つのみ」の対象に限定されるべきではないこともまた理解されたい。よって、例えば、「バッファ」についての言及は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、このような「バッファ」を２つ以上有する例を含む。
【００５５】
範囲は、ここでは、「約」１つの特定の値から、及び／又は、「約」別の特定の値までとして表されうる。このような範囲が表される場合、例には、１つの特定の値から、及び／又は、他の特定の値までが含まれる。同様に、値が先行詞「約」を使用して近似的に表される場合、その特定の値は、別の態様を形成するものと解されたい。範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び、他の端点とは独立して、の両方の意味を表すこともさらに理解されよう。
【００５６】
実施例以外において、本明細書に表されるすべての数値は、他に明確に示されない限り、そのように記載されているかどうかにかかわらず、「約」を含むものと解釈されるべきである。しかしながら、列挙される各数値は、「約」その値として表されているかどうかにかかわらず、正確を予定されているものとも解されたい。よって、「２Ｍより大きい濃度」及び「約２Ｍより大きい濃度」は、両方とも、「約２Ｍより大きい濃度」と「２Ｍより大きい濃度」の実施形態を含む。
【００５７】
他に明記されない限り、本明細書に記載されるいずれの方法も、その工程が特定の順番で行われる必要があると解釈されることは決して意図されていない。したがって、方法の請求項が、その工程が従うべき順番について実際に記述していない場合、又はその工程がある特定の順番に限定されるべきであることが、特許請求の範囲又は説明において他に明示されていない場合、任意の特定の順番が推測されることは、決して意図されていない。
【００５８】
特定の実施形態のさまざまな特徴、要素又は工程は、移行句「含む（comprising）」を使用して開示されうると同時に、移行句「〜からなる（consisting）」又は「〜から実質的になる（consisting essentially of）」を使用して記載されうるものを含む、代替的な実施形態が含蓄されるものと解されたい。よって、例えば、Ａ＋Ｂ＋Ｃを含むバッファに含蓄される代替的な実施形態は、バッファがＡ＋Ｂ＋Ｃからなる実施形態と、バッファがＡ＋Ｂ＋Ｃから実質的になる実施形態を含む。
【００５９】
本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、さまざまな修正及び変形が本開示になされうることは、当業者にとって明白であろう。本開示の精神および実体を取り込む開示される実施形態の修正、組合せ、部分的組合せ及び変形は、当業者に想起されうることから、本開示は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内にあるすべてを含むものと解釈されたい。
【００６０】
以下の実施例は、非限定的かつ単なる例証であることが意図されており、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって定められる。
【実施例】
【００６１】
例示的な精製プロトコル
単なる論述の目的で、細菌培養からｐＤＮＡを精製するための例となるプロトコルが、以下に提供される。当然ながら、このプロトコルは、限定することを意図されておらず、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６２】
ａ）細菌培養試料の調製：適切な媒質及び抗生物質を用いて、５ｍｌの一晩細菌培養、Ｏ．Ｄ．６００≒１を調整する；
ｂ）懸濁バッファの調製：１００μｇ／ｍｌの最終濃度まで、懸濁バッファＳ１にＲＮアーゼを加える；
ｃ）試料の懸濁：１ｍｌの一晩細菌培養を１．５マイクロ遠心分離管に移し、１分間１２，０００ｇにおける遠心分離により細胞を採取し、その後、培養培地を除去し、２５０μｌの調製Ｓ１バッファにより再懸濁する；
ｄ）試料の溶解：２５０μｌの溶解バッファＳ２を懸濁液に加え、最低１０回の反転により混合する；
ｅ）結合のための調製：３５０μｌの結合バッファＳ３を細胞溶解物に加え、最低１０回、又は濁った微粒子が見えるまで、反転により混合する；
ｆ）細胞溶解物のクリアリング：溶液を１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、透明な溶解物を新しいマイクロ遠心分離管に移す；
ｇ）磁性粒子の調製：使用前に少なくとも１分間、水又はカオトロピック剤中で磁性粒子の懸濁液をボルテックスする；
ｈ）ｐＤＮＡの結合：透明な溶解物に５０μｌの磁性粒子溶液を加え、反転により混合し、その後、室温で５分間インキュベートする；
ｉ）ｐＤＮＡ結合磁性粒子の分離：１分間磁気スタンドを使用して可逆的に結合したｐＤＮＡを有する磁性粒子を磁気によって分離し、残存する溶解物を除去する；
ｊ）ｐＤＮＡ−結合磁性粒子の洗浄：可逆的に結合したｐＤＮＡを含む磁性粒子を、５００μｌの洗浄バッファＷ１で一度及び７００μｌの洗浄バッファＷ２で一度洗浄する；
ｋ）洗浄バッファの除去：洗浄バッファＷ１及びＷ２を除去し、可逆的に結合したｐＤＮＡを有する磁性粒子を磁気スタンド上で５分間、上下を逆にして空気乾燥させる；
ｌ）ｐＤＮＡの溶出：磁気スタンドから管を取り外し１００μｌ（又はより濃縮した試料の生成のために５０μｌ）の水を加え、室温で１分間インキュベートする；
ｍ）ｐＤＮＡの精製：管を磁気スタンド上に１分間置き、磁性粒子を除去し、溶出したｐＤＮＡを新しいマイクロ遠心分離管に移す。
【００６３】
比較実施例１
ｐＤＮＡを、１０００μｇのＱｂｅａｄｓ又は５０００μｇのＧｒａｃｅビーズを用いる上記プロトコルを使用して細菌培養物から精製した。同じ細菌培養物をまた、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＷｉｚａｒｄ  ＭａｇｎｅＳｉｌ  Ｔｆｘ（登録商標）を使用して精製した。各方法について平均全ｐＤＮＡ収量を定量し、図２に示した。Ｑｂｅａｄｓを使用する本発明の方法についての平均全ｐＤＮＡ収量は、１ｍｌの細菌培養（Ｏ．Ｄ．６００≒１）の試料から１０．０μｇであった。Ｇｒａｃｅビーズを使用する本発明の方法についての平均ｐＤＮＡ収量は、９．２μｇであるのに対し、比較例のＰｒｏｍｅｇａ法は１０．７μｇのｐＤＮＡを生じた。
【００６４】
次いで、各ｐＤＮＡ試料についてのトランスフェクション効率を、ｅＧＦＰ−コード化プラスミドであるｐＥＧＦＰ−Ｃ１をＨｅｌａ細胞中にトランスフェクションすることにより特定した。トランスフェクションされた細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、核の可視化のためにＤＡＰＩで染色した。ＧＦＰ及び核について適切なフィルタを用いて蛍光画像を取り、その後、まず２値画像（白黒）を変換しＧＦＰ陽性細胞及び総細胞（核）を計数するために定められる特徴を計数することにより、ＩｍａｇｅＪ画像分析を行った。ＧＦＰ陽性細胞を視野中の細胞の総数で割ることにより、トランスフェクション効率を特定した。各方法についてのトランスフェクション効率が図３に示され、エラーバーは少なくとも８画像の標準偏差を示す。トランスフェクション効率は、Ｑｂｅａｄｓ、Ｇｒａｃｅビーズ、及びＰｒｏｍｅｇａキットを使用する方法についてそれぞれ、３９．０％、３９．６％、及び４０．４％であった。
【００６５】
したがって、図２〜３は、約２０分で行われた本発明の方法が、ベンチマーク比較例の「Ｐｒｏｍｅｇａ」キットのものに匹敵するｐＤＮＡ収量及び品質を提供することを実証している。
【００６６】
比較実施例２
ＳＤＳ又はＳＤＢＳを含む溶解バッファＳ２を用いる上記プロトコルを使用して、細菌培養物からｐＤＮＡを精製した。同じ細胞培養物をまた、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＷｉｚａｒｄ  ＭａｇｎｅＳｉｌ  Ｔｆｘ（登録商標）を使用して精製した。各方法について平均全ｐＤＮＡ収量を定量し、図４に示した。溶解バッファＳ２中でＳＤＳを使用する本発明の方法についての平均全ｐＤＮＡ収量は、１ｍｌの細胞培養物（Ｏ．Ｄ．６００≒１）の試料から７．３μｇであった。溶解バッファＳ２中でＳＤＢＳを使用する本発明の方法についての平均ｐＤＮＡ収量は、９．８μｇであるのに対し、比較例のＰｒｏｍｅｇａ法は６．４μｇのｐＤＮＡを生じた。
【００６７】
制限消化及びトランスフェクションのような下流用途を行い、各方法により生じる精製ｐＤＮＡの質を特定した。制限消化について、制限酵素ＥｃｏＲＩを使用して、ｐＤＮＡを線形化した。図５は、３つの異なる方法についてのｐＤＮＡ試料（非切断Ａ又はＥｃｏＲＩで切断したＢ）のアガロースゲル電気泳動分析を示す。図５により示されるように、各方法により生じたｐＤＮＡは、制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化できた。
【００６８】
次いで、各ｐＤＮＡ試料についてのトランスフェクション効率を、ｅＧＦＰ−コード化プラスミドであるｐＥＧＦＰ−Ｃ１をＨｅｌａ細胞中にトランスフェクションすることにより特定した。トランスフェクションされた細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、核の可視化のためにＤＡＰＩで染色した。ＧＦＰ及び核について適切なフィルタを用いて蛍光画像を取り、その後、まず２値画像（白黒）を変換しＧＦＰ陽性細胞及び総細胞（核）を計数するために定められる特徴を計数することにより、ＩｍａｇｅＪ画像分析を行った。ＧＦＰ陽性細胞を視野中の細胞の総数で割ることにより、トランスフェクション効率を特定した。各方法についてのトランスフェクション効率が図６に示され、エラーバーは少なくとも８画像の標準偏差を示す。トランスフェクション効率は、ＳＤＳ溶解バッファ、ＳＤＢＳ溶解バッファ、及びＰｒｏｍｅｇａキットを使用する方法についてそれぞれ、３８．０％、４５．４％、及び５２．９％であった。
【００６９】
したがって、図４〜６は、約２０分で行われた本発明の方法が、ベンチマーク比較例の「Ｐｒｏｍｅｇａ」キットのものを超えて改良される又はそれに匹敵するｐＤＮＡ収量及び／又は品質を提供することを実証している。
【００７０】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００７１】
実施形態１
核酸精製のための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程；
（ｂ）前記懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解物を形成する工程；
（ｃ）前記溶解物を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；
（ｄ）前記溶液を少なくとも１つの磁性粒子と混合し、少なくとも１つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程であって、前記少なくとも１つの改質された磁性粒子が前記少なくとも１つの核酸に可逆的に結合される、工程；
（ｅ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、前記混合溶液から分離する工程；
（ｆ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、第１の洗浄バッファ及び第２の洗浄バッファで洗浄する工程；及び
（ｇ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、溶出バッファと混合する工程；
を含み、
前記懸濁バッファが、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のイオンキレート剤、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のバッファ化合物を含み、
前記溶解バッファが、約１質量％〜約１０質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤、及び約０．２Ｍ以上の濃度で存在する少なくとも１つの第２のバッファ化合物を含み、
前記結合バッファが、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のカオトロピック剤、約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも１つの第１の塩、約１体積％〜約５体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のアルコール、及び約０．２５質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第３のバッファ化合物を含み、
前記第１の洗浄バッファが、約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のカオトロピック剤、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のイオンキレート剤、約３０体積％〜約５０体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のアルコール、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第４のバッファ化合物を含み、
前記第２の洗浄バッファが、少なくとも１つの第３のアルコール、及び随意的な少なくとも１つの第２の塩を含む、
ことを特徴とする方法。
【００７２】
実施形態２
前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料が、プラスミドＤＮＡを含む少なくとも１つの細菌細胞物であることを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
【００７３】
実施形態３
前記少なくとも１つの第１のイオンキレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のバッファ化合物が、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１又は２に記載の方法。
【００７４】
実施形態４
前記少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム（ＡＬＳ）、ドデシル硫酸カリウム（ＰＤＳ）、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のバッファ化合物が、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【００７５】
実施形態５
前記少なくとも１つの第１のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第３のバッファ化合物が、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
【００７６】
実施形態６
前記少なくとも１つの第２のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のイオンキレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第４のバッファ化合物が、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。
【００７７】
実施形態７
前記少なくとも１つの第３のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
【００７８】
実施形態８
前記少なくとも１つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
【００７９】
実施形態９
前記溶液を前記少なくとも１つの磁性粒子と混合する工程（ｄ）の前に、前記溶液を遠心分離し、少なくとも１つの凝集体又は高分子を除去する工程をさらに含むことを特徴とする、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。
【００８０】
実施形態１０
前記少なくとも１つの改質された磁性粒子から前記少なくとも１つの核酸を放出するのに十分な時間、前記溶出バッファと共に前記少なくとも１つの改質された磁性粒子をインキュベートする工程をさらに含み、前記溶出バッファが、水、及び少なくとも１つのバッファ化合物及び／又は少なくとも１つのイオンキレート剤を含む溶液から選択されることを特徴とする、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
【００８１】
実施形態１１
核酸精製のためのキットであって、
（ａ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のイオンキレート剤、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のバッファ化合物を含む懸濁バッファ；
（ｂ）約１質量％〜約１０質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤、及び約０．２Ｍ以上の濃度で存在する少なくとも１つの第２のバッファ化合物を含む溶解バッファ；
（ｃ）約４Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のカオトロピック剤、約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも１つの第１の塩、約１体積％〜約５体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のアルコール、及び約０．２５質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第３のバッファ化合物を含む結合バッファ；
（ｄ）約４．５Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のカオトロピック剤、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のイオンキレート剤、約３０体積％〜約５０体積％の範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第２のアルコール、及び約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第４のバッファ化合物を含む第１の洗浄バッファ；
（ｅ）少なくとも１つの第３のアルコール、及び随意的な少なくとも１つの第２の塩を含む第２の洗浄バッファ；及び
（ｆ）少なくとも１つの磁性粒子、
を含むことを特徴とするキット。
【００８２】
実施形態１２
前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料が、プラスミドＤＮＡを含む少なくとも１つの細菌細胞であることを特徴とする、実施形態１１に記載のキット。
【００８３】
実施形態１３
前記少なくとも１つの第１のイオンキレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のバッファ化合物が、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１１又は１２に記載のキット。
【００８４】
実施形態１４
前記少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム（ＡＬＳ）、ドデシル硫酸カリウム（ＰＤＳ）、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のバッファ化合物が、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１１〜１３のいずれかに記載のキット。
【００８５】
実施形態１５
前記少なくとも１つの第１のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第３のバッファ化合物が、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１１〜１４のいずれかに記載のキット。
【００８６】
実施形態１６
前記少なくとも１つの第２のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のイオンキレート剤が、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）；イミノジコハク酸（ＩＤＳ）；ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；Ｌ−グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸・四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第４のバッファ化合物が、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１１〜１５のいずれかに記載のキット。
【００８７】
実施形態１７
前記少なくとも１つの第３のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態１１〜１６のいずれかに記載のキット。
【００８８】
実施形態１８
前記少なくとも１つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、実施形態１１〜１７のいずれかに記載のキット。
【００８９】
実施形態１９
（ｇ）水、及び少なくとも１つのバッファ化合物及び／又は少なくとも１つのイオンキレート剤を含む溶液から選択される溶出バッファ、
をさらに含むことを特徴とする、実施形態１１〜１８のいずれかに記載のキット。
【００９０】
実施形態２０
核酸精製のためのキットであって、
（ａ）約８ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する、ＥＤＴＡ、その異性体、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第１のイオンキレート剤、及び約１０ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲の濃度で存在する、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第１のバッファ化合物を含む、懸濁バッファ；
（ｂ）約１質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する、ＳＤＳ、ＳＤＢＳ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの洗浄カオトロピック剤、及び約０．２Ｍ以上の濃度で存在する、アルカリ水酸化物及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第２のバッファ化合物、を含む溶解バッファ；
（ｃ）約４Ｍ〜約４．５Ｍの範囲の濃度で存在する、ＧｕＨＣｌ、ＧｕＳＣＮ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第１のカオトロピック剤、約０．３Ｍ〜約１．５Ｍの範囲の濃度で存在する、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第１の塩、約１体積％〜約２体積％のイソプロパノール、及び約１質量％〜約３質量％の範囲の濃度で存在する、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第３のバッファ化合物、を含む結合バッファ；
（ｄ）約４．５Ｍ〜約５Ｍの範囲の濃度で存在する、ＧｕＨＣｌ、ＧｕＳＣＮ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第２のカオトロピック剤、約１ｍＭ〜約３ｍＭの範囲の濃度で存在する、ＥＤＴＡ、その異性体、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第２のイオンキレート剤、約３０体積％〜約４０体積％のイソプロパノール、及び約２０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第４のバッファ化合物、を含む第１の洗浄バッファ；
（ｅ）少なくとも約７０体積％のエタノール、及び約８０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つの第２の塩、を含む第２の洗浄バッファ；及び
（ｆ）少なくとも１つのシリカ系磁性粒子、
を含むことを特徴とするキット。
【符号の説明】
【００９１】
１０５  試料
１１０  汚染物質
１１５  核酸
１２０  ｐＤＮＡ
１３０  磁性粒子
１３５  磁石
【国際調査報告】
2018503366.tif 000009
2018503366.tif 000010
2018503366.tif 000011