(57)【要約】  分析物（１３２）を検出するための装置（１００）であって、基板（１１０）のポリマー材料（１１２）と、基板に熱的に結合した熱伝達要素（１１４）と、熱伝達要素から発する熱波（２０２）を生じさせる制御装置（１２１）と、ポリマー材料に液体（１２４）を通すように配設され、構成されたフローセル（１２２）と、ポリマー材料を通る液体の温度（Ｔ２）を検出するための温度センサ（１３４）と、熱伝達要素における熱波と液体中の減衰した熱波（２０４）との間の位相シフトに少なくとも部分的に基づいて、液体中の分析物（１３２）の濃度を計算するための処理装置（１２３）とを含む装置。このような装置を形成する関連する方法、および分析物を検出する関連する方法も開示される。
2018535436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物（１３２）を検出するための装置（１００）であって、
表面に形成されたポリマー材料（１１２）を有する基板（１１０）であって、該ポリマー材料が、前記分析物に結合するように調製され、前記ポリマー材料の熱伝達特性が、前記ポリマー材料に結合した前記分析物の量に基づいて変化するように調製された基板（１１０）と、
前記ポリマー材料の反対側の前記基板の表面に熱的に結合した熱伝達要素（１１４）と、
前記熱伝達要素に熱的に結合した温度調節装置（１１８）と、
前記温度調節装置に前記熱伝達要素から発する熱波（２０２）を生じさせるように構成された制御装置（１２１）と、
液体（１２４）を前記基板の前記ポリマー材料に通すように配設され、構成されたフローセル（１２２）と、
前記ポリマー材料を通る前記液体の温度（Ｔ２）を検出するように構成された温度センサ（１３４）と、
前記熱伝達要素と前記液体中の減衰した熱波（２０４）との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、前記液体中の分析物（１３２）の濃度を計算するように構成された処理装置（１２３）とを含むことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記処理装置は、前記熱伝達要素における前記熱波と、前記液体中の前記減衰した熱波との間の振幅の差の少なくとも一部に基づいて、前記分析物の前記濃度を計算するように構成されたことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記基板は、金属、または金属合金を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記熱伝達要素は、銅を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記制御装置は、可変周波数で前記熱伝達要素の温度を変化させるように構成されたことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記ポリマー材料は、分子インプリントポリマー、または表面インプリントポリマーなどのインプリントポリマーを含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記ポリマー材料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ならびにその一部および類似体からなる群から選択された材料を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記ポリマー材料は、第２細菌に対する前記ポリマー材料の第２親和性よりも高い第１親和性を有する第１細菌に結合するように調製されたことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記第１細菌は、生きている細菌を含み、前記第２細菌は、死んだ細菌を含み、前記生きている細菌と、前記死んだ細菌とは、同じ種に属することを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記第１細菌は、第１の種を含み、前記第２細菌は、第２の種を含み、該第２の種は、前記第１の種の類似体であることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
分析物を検出するための方法であって、
分析物（１３２）を含む液体（１２４）を基板（１１０）のポリマー材料（１１２）に通し、該ポリマー材料が、前記分析物に結合するように調製され、前記ポリマー材料の熱伝達特性が、前記ポリマー材料に結合した前記分析物の量に基づいて変化するように調製されることと、
前記分析物を前記ポリマー材料に結合させることと、
熱伝達要素（１１４）から前記基板を通って前記ポリマー材料に熱波（２０２）を供給することと、
前記液体の温度（Ｔ２）を検出することと、
前記熱伝達要素によって供給された前記熱波と、前記液体中の減衰した熱波（２０４）との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、前記液体中の前記分析物の濃度を計算することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記熱伝達要素に熱的に結合した温度調節装置（１１８）の温度（Ｔ１）を変化させるように構成された制御装置（１２１）によって前記熱波を生成することをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記液体中の前記分析物の濃度を計算することは、前記熱伝達要素における前記熱波と、前記液体中の前記減衰した熱波との間の振幅の差を測定することを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
熱伝達要素から前記基板を通って前記ポリマー材料まで熱波を供給することは、前記熱波の周波数を変えることを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記液体の温度を検出することは、時間の関数として前記液体の前記温度を検出することを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記液体中の前記分析物の濃度を計算することは、前記液体中の生物学的分析物の濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記液体中の生物学的分析物の濃度を計算することは、前記液体中のヒスタミンの濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
分析物を含む液体を基板のポリマー材料に通すことは、前記分析物を含む前記液体を分子インプリントポリマーに通すことを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
分析物を含む液体を基板のポリマー材料に通すことは、前記分析物を含む前記液体を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ならびにそれらの一部および類似体からなる群から選択された材料に通すことを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
熱伝達要素から前記基体を通って前記ポリマー材料に熱波を供給することは、前記熱伝達要素の温度（Ｔ１）を０．２℃未満だけ変化させることを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記液体中の前記分析物の濃度を計算することは、多数の種を含む混合物中の１種類の細菌濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記液体中の前記分析物の濃度を計算することは、同じ種の、生きている細菌と死んだ細菌とを含む混合物中の生きている細菌の濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分析物以外の材料を前記ポリマー材料から除去するために前記ポリマー材料を洗浄することをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
分析物（１３２）を検出するための装置（１００）を形成するための方法であって、
基板（１１０）の表面にポリマー材料（１１２）を形成し、該ポリマー材料は、前記分析物に結合するように調製され、前記ポリマー材料の熱伝達特性は、前記ポリマー材料に結合した前記分析物の量に基づいて変化するように調製されることと、
熱伝達要素（１１４）を前記ポリマー材料の反対側の前記基板の表面に熱的に結合させることと、
温度調節装置（１１８）を前記熱伝達要素に熱的に結合させることと、
前記温度調節装置に前記熱伝達要素から発する熱波（２０２）を生じさせるように制御装置（１２０）を構成することと、
液体（１２４）が前記基板の前記ポリマー材料を通るようにフローセル（１２２）を構成することと、
前記ポリマー材料を通る前記液体の温度（Ｔ２）を検出するように温度センサ（１３４）を構成することと、
前記熱伝達要素における前記熱波と、前記液体中の減衰した熱波（２０４）との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、前記液体中の分析物（１３２）の濃度を計算するように処理装置（１２３）を構成することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
基板の表面にポリマー材料を形成することは、前記基板の前記表面に前記ポリマー材料をスクリーンプリントすることを含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
基板の表面にポリマー材料を形成することは、前記基板の前記表面に分子インプリントポリマーを形成することを含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
細菌を特徴付けるための方法であって、
第１細菌と第２細菌とを含む分析物（１３２）を含む液体（１２４）を基板（１１０）のポリマー材料（１１２）に通して接触させ、前記第１細菌に結合するように該ポリマー材料を調製し、前記ポリマー材料の熱伝達特性は、前記ポリマー材料に結合した前記分析物の量に基づいて変化し、前記第１細菌は、前記第２細菌よりも高い親和性を有する前記ポリマー材料に結合することと、
前記分析物の、前記第１細菌および前記第２細菌の一部を前記ポリマー材料に結合させることと、
前記第２細菌の少なくとも一部を、前記ポリマー材料から除去することと、
前記基板の温度を検出することと、
前記基板の前記温度の少なくとも一部に基づいて、前記液体中の前記第１細菌の濃度を計算することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記第１細菌は、生きている細菌を含み、前記第２細菌は、死んだ細菌を含み、前記生きている細菌と、死んだ細菌とは同じ種に属することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１細菌は、第１の種を含み、前記第２細菌は、第２の種を含み、前記第２の種は、前記第１の種の類似体であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２細菌の少なくとも一部を除去することは、前記ポリマー材料を洗浄することを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリマー材料を洗浄することは、前記ポリマー材料をリン酸緩衝生理食塩水溶液ですすぐことを含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記分析物を含む前記液体を基板のポリマー材料に通すことは、前記分析物を含む前記液体を、分子インプリントポリマー、または表面インプリントポリマーなどのインプリントポリマーに通すことを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記分析物を含む液体を基板のポリマー材料に通すことは、前記分析物を含む前記液体を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ならびにそれらの一部および類似体からなる群から選択された材料に通すことを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリマー材料から前記第２細菌の少なくとも一部を除去する前に、前記基板の温度を検出することと、
前記第２細菌の少なくとも一部を前記ポリマー材料から除去する前に、前記基板の前記温度の少なくとも一部に基づいて、前記液体中の前記分析物の総濃度を計算することとをさらに含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記液体の温度を検出することをさらに含み、前記液体中の前記第１細菌の濃度を計算することは、前記液体の前記温度の少なくとも一部に基づくことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリマー材料を通って、熱伝達要素から熱波を供給することをさらに含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記液体中の前記第１細菌の濃度を計算することは、前記熱伝達要素によって供給された前記熱波と、前記ポリマー材料を通って減衰した熱波との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、前記液体中の前記第１細菌の濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記熱伝達要素に熱的に結合した温度調節装置の温度を変化させるように構成された制御装置によって前記熱波を生成することをさらに含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記液体中の前記第１細菌の濃度を計算することは、前記熱伝達要素によって供給された熱波と前記ポリマー材料を通って減衰した熱波との間の振幅の差に少なくとも部分的に基づいて、前記液体中の前記第１細菌の濃度を計算することを含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリマー材料を通って熱伝達要素から熱波を供給することは、前記熱波の周波数を変化させることを含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリマー材料を通って熱伝達要素から熱波を供給することは、前記熱伝達要素の温度（Ｔ１）を０．２℃未満だけ変化させることを含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
細菌を含む液体を特徴付けるための方法であって、
第１株の細菌（１３２ａ）と、少なくとも第２株の細菌（１３２ｂ）とを含む液体（１２４）を、基板（１１０）のポリマー材料（１１２）に通して接触させ、該ポリマー材料は、前記第１株の細菌に結合するように調製され、前記ポリマー材料の熱伝達特性は、前記ポリマー材料に結合した材料の量に基づいて、前記ポリマー材料の熱伝達特性を変化させ、前記第１細菌が、前記少なくとも第２細菌よりも高い親和性を有する前記ポリマー材料に結合することと、
前記第１細菌の一部と、前記少なくとも第２細菌の一部とを前記ポリマー材料に結合させることと、
前記少なくとも第２細菌を前記ポリマー材料から除去するために前記ポリマー材料を洗浄することと、
前記ポリマー材料を洗浄した後、前記液体を前記ポリマー材料に通すことと、
前記少なくとも第２細菌を前記ポリマー材料から除去するために、前記ポリマー材料を少なくとも２回洗浄することと、
前記基板の温度を検出することと、
前記ポリマー材料の前記温度の少なくとも一部に基づいて、前記液体中の前記第１細菌の濃度を計算することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
前記ポリマー材料を洗浄することは、該ポリマー材料をリン酸緩衝生理食塩水溶液ですすぐことを含むことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも第２細菌を前記ポリマー材料から除去するために、前記ポリマー材料を洗浄することは、前記ポリマー材料から前記第１細菌を除去することなく、前記少なくとも第２細菌を前記ポリマー材料から除去することを含むことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリマー材料を洗浄後、前記液体を前記ポリマー材料に通すことは、前記ポリマー材料に結合した前記第１細菌の量を増加させることを含むことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の実施形態は、主に、熱波を生じるように構成されたヒートシンクを覆うようなポリマー材料を用いて分析物を検出する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）は、複合混合物中の化学物質を検出するために使用することができる。最近の研究では、これらのポリマーは、生物学的分析用途について関心が高まっている。これらのＭＩＰを使用する利点は、容易かつ安価な製造、機械的安定性、化学的安定性、熱的安定性、再利用性、および長い貯蔵期間である。近年、分子インプリントの概念は、タンパク質、糖タンパク質、植物ウイルス、ヒトウイルス、細菌、花粉、酵母細胞、および哺乳類の赤血球細胞の検出用の、いわゆる「表面インプリントポリマー」（ＳＩＰ）を作製するための、マイクロメートルサイズの細胞を用いる薄いポリマー膜の表面インプリンティングにまで拡大した。ＳＩＰは、所望の標的の一部に一致する形態および機能を有する表面のくぼみを有するポリマー性材料である。ＳＩＰは、ＭＩＰの孔を通って迅速には拡散しない大きな物体（たとえば、細胞、細菌など）に結合するために適している。インプリンティングは、ポリマーの軟化によって重合後に生じてもよい。文献に記載されたバイオセンサを用いる細胞の検出は、従来、重量検出、電気的出力プラットフォーム、またはマイクロフルイディクス技術によって行われる。しかしながら、これらの技術は、多くの場合、時間がかかり、難しい分析をもたらし、または高価な設備を必要とする。
【０００３】
たとえば、分析物の濃度に基づく、付着したＭＩＰを有する物質の温度抵抗は、２０１４年１月９日に公開された米国特許出願公開２０１４／００１１１９８号明細書「Heat-Transfer Resistance Based Analysis Bioparticles」に記載されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。表面における機能基の、形状、寸法、および機能性のわずかな違いを有する細胞を識別する性能を備える低価格のセンサプラットフォームは、最新の研究および産業のための貴重なツールであろう。
【発明の概要】
【０００４】
いくつかの実施形態において、分析物を検出するための装置は、表面に形成されたポリマー材料を有する基板と、ポリマー材料の反対側の基板表面に熱的に結合したヒートシンクと、ヒートシンクに熱的に結合した温度調節装置と、温度調節装置にヒートシンクから発する熱波を生じさせるように構成された制御装置と、基板のポリマー材料を液体が通るように配設および構成されたフローセルとを含む。装置は、ポリマー材料を通る液体の温度を検出するように配設および構成された温度センサと、ヒートシンクにおける熱波と液体中の減衰した熱波との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、液体中の分析物の濃度を計算するように構成された処理装置とをさらに含んでもよい。
【０００５】
分析物を検出するための方法は、分析物を含む液体を基板上のポリマー材料に通すことと、分析物をポリマー材料に結合させることと、基板を通ってヒートシンクからポリマー材料まで熱波を供給することと、液体の温度を検出することと、ヒートシンクによって生じた熱波と液体中の減衰した熱波との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、液体中の分析物の濃度を計算することとを含む。
【０００６】
分析物を検出するための装置を形成する方法は、ポリマー材料を基板の表面に形成することと、ヒートシンクをポリマー材料の反対側の基板表面に熱的に結合させることと、温度調節装置をヒートシンクに熱的に結合させることと、温度調節装置にヒートシンクから発する熱波を生じさせるように制御装置を構成することと、液体が基板のポリマー材料を通るようにフローセルを構成することと、ポリマー材料を通る液体の温度を検出するように温度センサを構成することと、ヒートシンクにおける熱波と液体中の減衰した熱波との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、液体中の分析物の濃度を計算するように処理装置を構成することとを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、細菌を特徴付ける方法は、第１細菌と第２細菌とを含む分析物を含む液体を、基板におけるポリマー材料に通して接触させることを含む。ポリマー材料は、第１細菌に結合するように調製され、第１細菌は、第２細菌よりも高い親和性を有するポリマー材料に結合する。ポリマー材料の熱伝達特性は、ポリマー材料に結合した分析物の量に基づいて変化する。本方法は、分析物の、第１細菌および第２細菌の一部をポリマー材料に結合させることと、第２細菌の少なくとも一部をポリマー材料から除去することと、基板の温度を検出することと、液体中の第１細菌の濃度を基板の温度の少なくとも一部に基づいて計算することとをさらに含む。
【０００８】
他の実施形態において、細菌を含む液体を特徴付ける方法は、細菌の第１株と少なくとも細菌の第２株とを含む液体を、基板上のポリマー材料に通して接触させることを含む。ポリマー材料は、細菌の第１株に結合するように調製され、第１細菌は、少なくとも第２細菌よりも高い親和性を有するポリマー材料に結合する。ポリマー材料の熱伝導特性は、ポリマー材料に結合した材料の量に基づいて変化する。本方法は、第１細菌の一部と、少なくとも第２細菌の一部とをポリマー材料に結合させることと、ポリマー材料を、少なくとも第２細菌をポリマー材料から除去するために洗浄することと、ポリマー材料の洗浄後、液体をポリマー材料に通すことと、ポリマー材料を、少なくとも第２細菌をポリマー材料から除去するために少なくとも２回洗浄することと、基板の温度を検出することと、ポリマー材料の温度の少なくとも一部に基づいて、液体中の第１細菌の濃度を計算することとをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】分析物を検出するための装置を示す簡略模式図である。
【図２】熱波が図１の装置内をどのように伝わるのかを示す簡略模式図である。
【図３】分析物を検出するための別の装置を示す簡略模式図である。
【図４】本開示の一実施形態に従って測定された、ドーパミンの結合等温線を示すグラフである。
【図５】本開示の一実施形態に従って測定された、ドーパミンの検量線を示すグラフである。
【図６】本開示の一実施形態に従って測定された、温度変化を示すグラフである。
【図７】本開示の一実施形態に従って測定された、熱抵抗の時間依存性の値を示すグラフである。
【図８】図７の熱抵抗データを用量作用曲線の形態で示すグラフである。
【図９】本開示の一実施形態に従って生じた熱波を示すグラフである。
【図１０】本開示の一実施形態に従って、基板を通った後に測定された熱波を示すグラフである。
【図１１】本開示の一実施形態に従って測定された、図１０に示される熱波の位相シフトを示すグラフである。
【図１２】本開示の一実施形態に従って、基板を通った後に測定された熱波を示すグラフである。
【図１３】本開示の一実施形態に従って測定された、図１２に示される熱波の位相シフトを示すグラフである。
【図１４】Ｅ．コリ（E. Coli）でインプリントされたポリマーの光学顕微鏡分析である。
【図１５】Ｓ．アウレウス（S. aureus）でインプリントされたポリマーの光学顕微鏡分析である。
【図１６】暴露間の洗浄とともに、死んだＥ．コリと生きているＥ．コリとに交互に暴露された装置の熱応答を示すグラフである。
【図１７】図５に示される熱応答を要約するボックスプロットである。
【図１８】暴露間の洗浄とともに、Ｓ．アウレウスとＥ．コリとに交互に暴露された装置の熱応答を示すグラフである。
【図１９】暴露間の洗浄とともに、Ｓ．アウレウスとＥ．コリとに交互に暴露された装置の熱応答を示すグラフである。
【図２０】図７および８に示された熱応答を要約するボックスプロットである。
【図２１】暴露間の洗浄とともに、徐々に増加する濃度のＥ．コリに暴露された装置の熱応答を示すグラフである。
【図２２】図１０に示された熱応答に由来する用量作用曲線である。
【図２３】暴露間の洗浄とともに、Ｅ．コリとＳ．アウレウスとの混合物に暴露された装置の熱応答を示すグラフ、および熱応答を要約するボックスプロットである。
【図２４】本開示の一実施形態に従って測定された、装置の温度変化を示すグラフである。
【図２５】本開示の一実施形態に従って測定された、装置の温度変化を示すグラフである。
【図２６】本開示の一実施形態に従って測定された、装置の温度変化を示すグラフである。
【図２７】本開示の一実施形態に従って測定された、装置の温度変化を示すグラフである。
【図２８】本開示の一実施形態に従って測定された、装置の温度変化を示すグラフである。
【図２９】本開示の一実施形態に従って測定された、装置の温度変化を示すグラフである。
【図３０】本開示の一実施形態に従って測定された、装置の温度変化を示すグラフである。
【図３１】本開示の一実施形態に従って、基板を通った後に測定された熱波を示すグラフである。
【図３２】本開示の一実施形態に従って、基板を通った後に測定された熱波を示すグラフである。
【図３３】本開示の一実施形態に従って、基板を通った後に測定された熱波を示すグラフである。
【図３４】本開示の一実施形態に従って、基板を通った後に測定された熱波を示すグラフである。
【図３５】本開示の一実施形態に従って、基板を通った後に測定された熱波を示すグラフである。
【図３６】本開示の一実施形態に従って、基板を通った後に測定された熱波を示すグラフである。
【図３７】本開示の一実施形態に従って、基板を通った後に測定された熱波を示すグラフである。
【図３８】本開示の実施形態に従って測定された、類似細菌と標的細菌とに暴露されたときの、装置の温度変化を示すグラフである。
【図３９】図３８に示されたデータについて、０．０３Ｈｚにおける位相シフトを示すグラフである。
【図４０】開示の一実施形態に従って測定された、類似細菌と標的細菌とに暴露されたときの、装置の温度変化を示すグラフである。
【図４１】図４０に示されたデータについて、０．０３Ｈｚにおける位相シフトを示すグラフである。
【図４２】本開示の実施形態に従って、細菌の混合物に繰り返し暴露される間に測定された装置の温度変化を示すグラフである。
【図４３】温度変化が図４２に示される装置の熱応答を示すグラフ、およびその熱応答を要約するボックスプロットである
【図４４】図４２に示されたデータについて、０．０３Ｈｚにおける位相シフトを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書に示される図は、特定の装置または方法の実際の図ではなく、本開示の例示的な実施形態を記載するために採用された理想化された図にすぎない。図面の間の共通の要素は、同じ参照符号を保持してもよい。
【００１１】
本明細書において使用されるように、用語「テンプレート分子」および「テンプレート細菌」は、それぞれ、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）または表面インプリントポリマー（ＳＩＰ）を形成するために使用される、分子または細菌を表す。そのようなＭＩＰまたはＳＩＰは、続いて、ＭＩＰまたはＳＩＰを形成するために使用されたテンプレート分子に対応する機能性を有する「標的分子」または「結合パートナー」を検出することができる。
【００１２】
本明細書において使用されるように、文脈に応じて、用語「してもよい（ｍａｙ）」は、用語「できる（ｃａｎ）」を含み、用語「であってもよい（ｍａｙ  ｂｅ）」は、用語「である（ｉｓまたはａｒｅ）」を含む。さらに、用語「してもよい（ｍａｙ）」の存在は、限定されないが、本開示の実施形態を実行するまたは実施するための選択肢を示すことを意図する。
【００１３】
図１は、分析物を検出するための装置１００を示す簡略模式図である。いくつかの実施形態において、装置１００は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡなどの核酸、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡにおける一塩基多型（ＳＮＰｓ）、小分子、タンパク質、細菌などの標的分子を検出するために構成されてもよい。
【００１４】
装置１００は、表面に位置したポリマー材料１１２を有する基板１１０を含んでもよい。たとえば、ポリマー材料１１２は、基板１１０の概して平面状の表面一面に、形成、または配設されてもよく、基板１１０の反対側の別の平面状表面は、ポリマー材料１１２を有さなくてもよい。いくつかの実施形態において、基板１１０は、金属（たとえばアルミニウム）、合金、半導体（たとえば、シリコン、ドープダイヤモンドなど）、電気的絶縁材料（たとえば、非ドープダイヤモンド）を含んでもよい。ポリマー材料１１２は、結合した分析物の量に基づいて熱伝達特性が変化する任意の材料を含んでもよい。たとえば、ポリマー材料１１２の、熱導電率、熱拡散率、熱容量、または他の特性は、表面における分析物の濃度によって変化してもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ポリマー材料１１２は、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）、または表面インプリントポリマー（ＳＩＰ）などのインプリントポリマーを含んでもよい。ＭＩＰおよびＳＩＰは、当該分野において「プラスチック」抗体と表わされてもよい。ＭＩＰは、典型的には、特定の結合パートナーについて高い親和性を有するので、そのような結合パートナーがＭＩＰに接触したとき、分子はＭＩＰに結合する。ＭＩＰは、それらの各標的分子について高い親和性を有するナノキャビティを含む合成受容体である。インプリンティング（たとえば、ナノキャビティの形成）は、多くの場合、重合工程の一部である。ＭＩＰは、細菌、小さなイオンから複合マトリクス中の大きな細胞などの標的に特異的に結合することができる。ＭＩＰへの分子の結合は、熱的特性、機械的特性、電気的特性などのＭＩＰのいくつかの特性を変えてもよい。ＭＩＰの変化した特性は、したがって、比較的低濃度において、そのような分子の存在を検出するために使用されてもよい。ＭＩＰは、たとえば２００９年１１月１２日に公開された米国特許出願公開第２００９／０２８１２７２号明細書「Monodisperse Molecularly Imprinted Polymer Beads」に記載されており、その全ての開示が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１６】
同様に、ＳＩＰは、典型的には、特定の結合パートナーについて高い親和性を有するが、典型的には、ＭＩＰの孔を通って迅速には拡散しない比較的大きな物体（たとえば、細胞、細菌など）に結合することができる。ＳＩＰは、表面一面に形成され、続いてポリマーを軟化させることによって重合後にインプリントされたポリマー材料であってもよい。
【００１７】
ある実施形態において、ポリマー材料１１２は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部もしくは類似体を含んでもよい。たとえば、装置１００は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、核酸ポリマー、プローブ、またはそれらの一部もしくは類似体（たとえば、相補的ＤＮＡ、抗体）などのポリマー材料１１２で機能化された基板１１０（たとえば、ダイヤモンド表面）を含んでもよい。ポリマー材料１１２は、特定の結合パートナーについて高い親和性を有するように調製されるので、そのような結合パートナーが基板１１０の表面に接触したとき、分子がポリマー材料１１２に結合する。ポリマー材料１１２は、結合パートナーの類似体（たとえば、結合パートナーと同様の機能性を有する材料）に結合してもよいが、結合パートナー自体との結合と同じ親和性を有する必要はない。いくつかの実施形態において、ポリマー材料１１２は、１０以上の繰り返しユニットなどの、少なくとも約７の繰り返しユニットを含んでもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ポリマー材料１１２は、基板１１０にスクリーンプリントされた材料を含んでもよい。スクリーンプリントされた材料は、他の材料と比較して比較的高い均一性で、効率的に大量に製造されてもよい。
【００１９】
装置１００は、ポリマー材料１１２の反対側の表面などの、基板１１０の表面に熱的に結合したヒートシンク１１４をさらに含んでもよい。簡略化のためにヒート「シンク」と表わされるが、ヒートシンク１１４は、基板１１０に熱を供給するか、当該基板１１０から熱を除去するように構成されてもよいので、熱伝達要素１１４として特徴付けられてもよい。ヒートシンク、または熱伝達要素１１４は、遷移金属（たとえば、銅、銀など）、もしくは合金、またはそれらの混合物などの、高い熱伝導率を有する材料であってもよい。いくつかの実施形態において、ポリマー材料１１２は、ヒートシンク１１４自体に塗布されてもよい。ヒートシンク１１４は、ヒートシンク１１４の温度を検出するように構成された温度センサ１１６（たとえば、熱電対、または別の装置）と、ヒートシンク１１４の温度を維持するように構成された温度調節装置１１８とに熱的に結合してもよい。温度調節装置１１８は、たとえば、熱電素子、熱交換機、ファン、抵抗ヒータなどを含んでもよい。温度センサ１１６は、温度を変える抵抗を有する抵抗器であってもよい。ヒートシンク１１４の特性が公知である場合（たとえば、調節装置１１８のコントロール信号とヒートシンク１１４の温度との間の関係が十分に特徴付けられている場合）、温度センサ１１６は、省略されてもよい。いくつかの実施形態において、温度センサ１１６は、温度調節装置１１８と統合されてもよい。たとえば、温度調節装置１１８自体の内部抵抗は、その温度を決定するために測定されてもよい。
【００２０】
温度センサ１１６と温度調節装置１１８とは、ヒートシンク１１４に、当該ヒートシンク１１４から発し基板１１０（その上にポリマー材料１１２を含む）を通る熱波を生じさせるように温度調節装置１１８を制御するように構成された（すなわちプログラムされた）制御装置１２１に結合されてもよい。たとえば、制御装置１２１と処理装置１２３とは、コンピュータ１２０に組み込まれてもよい（たとえば、制御装置１２１は、電気信号を受信し提供するように構成された入出力カードであってもよく、処理装置１２３から信号を受信するように構成されてもよい）。いくつかの実施形態において、制御装置１２１は、比較的短い時間でわずかにヒートシンク１１４の温度を変化させることができる比例・積分・微分（ＰＩＤ）制御装置であってもよい。たとえば、制御装置１２１は、約０．５℃以下、約０．２℃以下、または０．０５℃以下だけヒートシンク１１４の温度を変化させてもよい。したがって、熱波は、約１．０℃以下、約０．４℃以下、または約０．１０℃以下の振幅を有してもよい。制御装置１２１は、約０．００５〜約０．１Ｈｚ、または約０．０１〜約０．０５Ｈｚなどの、約０．００１〜約０．５Ｈｚの周波数を有する熱波を形成するために、温度調節装置１１８を介してヒートシンク１１４の温度を一の設定点から他の設定点に、そしてその逆に変化させることが可能であってもよい。いくつかの実施形態において、制御装置１２１、温度調節装置１１８、およびヒートシンク１１４は、可変周波数を有する熱波を共に生じてもよい。（存在するならば）温度センサ１１６からの測定値、温度調節装置１１８への既知の入力、または他の手段に基づいて、熱波の特性は、既知であってもよい（たとえば、位相、振幅、特定時間の周波数、周波数変化の速度など）。
【００２１】
他の実施形態において、制御装置１２１は、一定の温度でヒートシンク１１４を維持するように構成されてもよい。一定の温度でヒートシンクを用いる分析物の検出は、２０１５年８月６日に公開された米国特許出願公開第２０１５／０２１９５８４号明細書「Biosensor Using Impedimentric Real-Time Monitoring」に記載されており、その全ての開示が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２２】
装置１００は、液体１２４を基板１１０のポリマー材料１１２に通すように構成されたフローセル１２２をさらに含んでもよい。フローセル１２２は、基板１１０のポリマー材料１１２に隣接した空隙１２６と、液体１２４が流れる、注入口１２８および排出口１３０とを規定してもよい。Ｏリング１３１、または別の適切な密封機構は、基板１１０のポリマー材料１１２に隣接してフローセル１２２内に液体１２４を保持してもよい。
【００２３】
液体１２４は、上述のように、ポリマー材料１１２に特異的に結合し、その熱特性を変える分析物１３２を含んでもよい。たとえば、分析物１３２は、１以上の細菌株を含んでもよい。分析物１３２（複数の分析物１３２ａおよび１３２ｂを含んでもよい）は、上述のように、ポリマー材料１１２に特異的に結合してもよく、その熱特性を変えてもよい。複数の分析物１３２ａおよび１３２ｂが液体１２４中に存在する場合、分析物１３２ａ、１３２ｂは、各分析物１３２ａ、１３２ｂがポリマー材料１１２に結合するように同様の機能性を有してもよい。分析物１３２ａ、１３２ｂは、異なる親和性を有するポリマー材料１１２に結合してもよい。いくつかの実施形態において、第１分析物１３２ａは、生きている細菌を含んでもよく、第２分析物１３２ｂは、同じ種類の死んだ細菌を含んでもよい。他の実施形態において、第１分析物１３２ａは、細菌を含んでもよく、第２分析物１３２ｂは、類似細菌を含んでもよい。
【００２４】
温度センサ１３４（たとえば、熱電対または別の装置）は、フローセル１２２内の（たとえば、流れる）液体１２４の温度を検出するように構成されてもよい。コンピュータ１２０は、たとえば、制御装置１２１および／または処理装置１２３を介して温度センサ１３４の抵抗を測定し、その抵抗を温度に関連付けることによって、液体１２４の温度を記録することができる。液体１２４の温度は、ヒートシンク１１４の温度とは異なってもよく、分析物１３２の有無と液体１２４中のその濃度との少なくとも一部に基づいて変化してもよい。たとえば、分析物の濃度に基づく基板の温度抵抗は、２０１４年１月９日に公開された米国特許出願公開第２０１４／００１１１９８号明細書「Heat-Transfer Resistance Based Analysis Bioparticles」に記載されており、その全ての開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、処理装置１２３は、熱波が基板１１０とポリマー材料１１２とを通った後、ヒートシンク１１４によって生じた熱波と、液体１２４中の減衰した熱波との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、液体１２４中の分析物１３２の濃度を計算するように構成されてもよい。
【００２６】
図２は、熱波が、図１の装置１００をどのように伝わるかを示す簡略模式図である。図２は、図１に示されるいくつかの構成要素を含むが、構成要素を通り、その間を伝わる熱波を表現するためにそれらを分離して示している。特に、図２は、コンピュータ１２０に結合された、温度調節装置１１８に熱的に結合したヒートシンク１１４と温度センサ１１６とを示す。分析物１３２の濃度は、別の測定工程なしに、ヒートシンク１１４における熱波と、液体１２４中の熱波との間の差に基づいて測定されてもよい。
【００２７】
ヒートシンク１１４は、熱波２０２を生じ、基板１１０とその上のポリマー材料１１２とに熱波２０２を伝達してもよい。たとえば、ヒートシンク１１４が、３７℃の一定の温度で初期に維持される場合、熱波２０２は、ヒートシンク１１４を３７．１℃に加熱し、続いてヒートシンク１１４を３６．９℃に冷却することによって生成されてもよい。温度調節装置１１８によるヒートシンク１１４の加熱および冷却よって、対応する方法で、基板１１０とポリマー材料１１２とが加熱および冷却されてもよい。熱波２０２は、振幅α１および周波数φ１を有してもよい。振幅α１および／または周波数φ１は、時が経てば変化してもよい。たとえば、熱波２０２は、継続的に変化する周波数φ１を有してもよい。
【００２８】
上述のように、基板１１０上の分析物１３２の有無は、ポリマー材料１１２の、導電性、熱分散性、熱容量、または他の特性を変化させてもよい。図２は、ポリマー材料１１２が、その内のキャビティ１３６であって、分析物１３２の少なくとも一部と相互作用するように適応されたキャビティ１３６を規定することができることを概念的に示す。どのような特定の理論にも拘束されないが、キャビティ１３６は、分析物１３２に特異的に結合するように作用するように構成されてもよい。したがって、ポリマー材料１１２は、液体１２４中の分析物１３２の濃度に基づいて、いくつかのキャビティ１３６中の液体１２４から分析物１３２の、粒子または分子を受けてもよい。液体１２４とポリマー材料１１２とは、分析物１３２が、ポリマー材料１１２に結合し、等しい速度でポリマー材料１１２から離れるように、所定の温度において平衡に達してもよい。ポリマー材料１１２の熱特性は、分析物１３２の、粒子または分子に結合したキャビティ１３６の画分の一部に依存してもよい。
【００２９】
基板１１０および／またはその上のポリマー材料１１２は、減衰した熱波２０４を形成するために、基板１１０および／またはその上のポリマー材料１１２を通る熱波２０２を変化させてもよい。減衰した熱波２０４は、温度センサ１３４によって検出されてもよく、コンピュータ１２０によって記録されてもよい。減衰した熱波２０４は、振幅α２と周波数φ2とを有してもよく、振幅α２と周波数φ2とは熱波２０２の振幅α１と周波数φ１とは異なってもよい。振幅α１、α２、および／または周波数φ１、φ2の差は、ポリマー材料１１２に結合した分析物１３２の量に相関してもよく、したがって、液体１２４中の分析物１３２の濃度に相関してもよい。振幅α１、α２、および／または周波数φ１、φ2の差の測定は、定常状態において液体１２４の温度を測定する従来法に比べて、ポリマー材料１１２に結合した比較的少ない量の分析物１３２（液体１２４中の低濃度の分析物１３２に対応する）を検出することを可能にする。
【００３０】
他の実施形態において、処理装置１２３は、ヒートシンク１１４と、液体１２４との間の定常状態の温度の差に基づいて、分析物１３２の濃度を計算するように構成されてもよい。
【００３１】
ある実施形態において、分析物１３２は、平坦でない表面に結合してもよい。たとえば、図３は、分析物１３２を検出するための別の装置２００を示す、簡略模式図である。装置２００は、その表面に形成された基材２１２を有する熱電対２１０を含んでもよい。たとえば、基材２１２は、熱電対２１０の全端部が含まれるように、熱電対２１０の一般的な円筒状表面にわたって形成されてもよい。熱電対２１０は、電気接点２１６，２１８の間に温度依存性電圧を提供するように調製された２つの材料の間の接合部を含んでもよい。いくつかの実施形態において、熱電対２１０は、１以上の金属（たとえば、白金、金、イリジウム、パラジウムなど）、または合金（たとえば、ニッケル合金、銅合金、ロジウム合金、レニウム合金、鉄合金、モリブデン合金など）を含んでもよい。
【００３２】
基材２１２は、当該分野においてＰＬＬＡと表わされるポリ−（Ｌ）−乳酸などのポリマー材料であってもよい。ＰＬＬＡは、透明で、環境的に再利用可能な源（たとえば、デンプン、または糖含有農産物）から作製する費用がかからず、生分解性で生体親和性である。さらに、ＰＬＬＡは、クロロホルムに溶解可能であり、熱電対２１０に塗布することが可能である。ＰＬＬＡの他の材料は、所望の特性に基づいて、基材２１２として選択されてもよい。いくつかの実施形態において、基材２１２は、ポリウレタン、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸共重合体、Ｄ，Ｌラクチド／グリコール酸共重合体、または他の選択されたポリマーを含んでもよい。基材２１２は、薄く、滑らかに、均一に熱電対２１０の外部を覆う形態であってもよい。基材２１２による被覆の均一性は、装置２００に再現可能な結果を生じさせることを可能にする。基材２１２の厚さは、熱電対２１０に向かって、または熱電対２１０から離れて流れる熱の速度に影響を与えるために、基材２１２の熱抵抗を考慮して選択されてもよい。したがって、薄い基材２１２は、速い応答が望まれるか、または温度の差異が小さい用途に有益であってもよい。
【００３３】
基材２１２は、当該基材２１２を破壊することなく、熱電対２１０を曲げることができるように装置２００が柔軟であるように、少なくともいくらかの弾性を示すように選択されてもよい。このことは、装置２００を、厳しいクリアランス、または屈曲性を必要とする用途（たとえば、カテーテルのｉｎ  ｖｉｖｏ用途）に使用することを可能にする。
【００３４】
アッセイポリマー２１４は、基材２１２の表面であってもよい。いくつかの実施形態において、アッセイポリマー２１４は、熱電対２１０の表面に直接に結合してもよく、基材２１２は、省略されてもよい。アッセイポリマー２１４は、当該アッセイポリマーに結合した分析物の量に応じて熱伝達特性が変化する材料を含んでもよい。たとえば、アッセイポリマー２１４の、熱伝導性、熱拡散率、熱容量、または他の特性は、その表面の分析物の濃度によって変化してもよい。
【００３５】
いくつかの実施形態において、アッセイポリマー２１４はインプリントポリマー（ＭＩＰまたはＳＩＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部もしくは類似体（たとえば、抗体）を含んでもよい。アッセイポリマー２１４は、特異的結合パートナーに対する高い親和性を有し、そのような結合パートナーが、熱電対２１０の表面と接触したとき、その分子がアッセイポリマー２１４に結合するように構成されてもよい。いくつかの実施形態において、アッセイポリマー２１４は、１０以上の繰り返しユニットなどの少なくとも約７の繰り返しユニットを含んでもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態において、装置２００は、アッセイポリマー２１４に結合した分析物の量を計算するようにプログラムされた処理装置２２３を含んでもよい。処理装置２２３は、アッセイポリマー２１４に結合した分析物の量の少なくとも一部に基づいて装置２００に接触した液体中の分析物の濃度を計算してもよい。たとえば、処理装置２２３は、２０１４年１月９日に公開された米国特許出願公開第２０１４／００１１１９８号明細書「Heat-Transfer Resistance Based Analysis Bioparticles」、または２０１４年８月２８日に公開された米国特許出願公開第２０１４／０２４２６０５号明細書「Heat-Transfer Resistance Based Analysis of Bioparticles」に開示された方法によって分析物の量を計算してもよく、全ての開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、処理装置２２３は、熱電対２１０における減衰した熱波と、ヒートシンクにおける、またはヒートシンクから発する熱波との間の位相シフトを検出するために使用されてもよい。処理装置２２３は、したがって、ヒートシンクにおける熱波と、熱電対２１０における減衰した熱波との間の振幅の差の少なくとも一部に基づいて、液体中の分析物の濃度を計算してもよい。
【００３７】
図１に戻ると、ポリマー材料１１２は、基板１１０一面に、形成されるか、または提供されてもよい。たとえば、ポリマー材料１１２は、金属基板１１０にスクリーンプリントされてもよい。スクリーンプリンティングは、他の方法に比べて比較的高い均一性で、効率的に実施されてもよく、大量生産に規模を拡大されてもよい。基板のスクリーンプリンティングは、たとえば、２０１２年７月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１２／０１８６９９９号明細書「Electrochemical Sensor」に記載されており、その全ての開示が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３８】
ヒートシンク１１４は、ポリマー材料１１２の反対側の表面において基板１１０に熱的に結合してもよい。たとえば、ヒートシンク１１４は、熱がヒートシンク１１４から基板１１０に伝導によって流れることができるように、直接、物理的に基板１１０に接触するように設置されてもよい。いくつかの実施形態において、熱伝導性材料（たとえば、熱伝導性フィラーを有する重合可能な液体マトリクス）は、ヒートシンク１１４と基板１１０との間のエアギャップを除去するために、ヒートシンク１１４と基板１１０とに物理的に接触して設置されてもよい。同様に、温度調節装置１１８は、熱伝導性材料を通して直接の物理的接触によって、または他の適切な手段によってヒートシンク１１４に熱的に結合してもよい。
【００３９】
制御装置１２１（たとえば、ＰＩＤ制御装置）は、ヒートシンク１１４の温度を調節するために十分な電力を供給し、温度調節装置１１８にヒートシンク１１４の温度を変化させて熱波２０２を生じさせるように温度調節装置１１８に電気的に接続されてもよい（図２）。
【００４０】
フローセル１２２は、液体１２４が、注入口１２８を通ってフローセル１２２に入り、ポリマー材料１１２に接触し、続いて排出口１３０を通ってフローセル１２２から出るように基板１１０に隣接して固定されてもよい。いくつかの実施形態において、フローセル１２２は、１以上の留め具１３８（たとえば、ねじ）によってヒートシンク１１４に接続されてもよい。他の実施形態において、フローセル１２２は、統合糸によって、またはスリップ・フィット接合によって、ヒートシンク１１４に接続されてもよい。Ｏリング１３１、または他の密封機構は、ヒートシンク１１４、温度調節装置１１８、または基板１１０の背面に液体１２４を直接接触させないように構成されてもよい。
【００４１】
温度センサ１３４は、フローセル１２２を通って流れる液体１２４の温度を測定するために、フローセル１２２の空隙１２６内に配設されてもよい。温度センサ１３４は、接着剤、または他の適切な手段によって、フローセル１２２に固定されてもよい。温度センサ１３４は、抵抗計を含み得る処理装置１２３に電気的に接続してもよい。処理装置１２３は、ヒートシンク１１４によって生じた熱波２０２（図２）と、液体１２４中の減衰した熱波２０４（図２）との間の位相シフトの少なくとも一部に基づいて、液体１２４中の分析物１３２の濃度を計算するために、温度センサ１３４における温度を継続して検出するように構成されてもよい。
【００４２】
図１に示され、上述された装置１００は、細菌などの、任意の選択された分析物１３２を検出するために使用されてもよい。たとえば、装置１００は、液体１２４中の、生物学的分析物、または他の化学物質を検出、感知、および定量化するために使用されてもよい。装置１００は、特定の細菌株を検出、感知、および定量化するために、細菌が生きているか否かのために、または複合混合物中の細菌の種類を判別するために使用することができる。分析物１３２は、液体１２４に溶解されたか、または混合された、気体、液体、または固体であってもよい。たとえば、装置１００は、特定の配列（たとえば、ＳＮＰ）を有する核酸、タンパク質、小分子（たとえば、ドーパミン、ヒスタミンなど）、または他の物質などの、分析物、抗体、抗原、核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を検出、感知、定量化するために使用することができる。いくつかの実施形態において、装置１００は、ヒスタミン、ドーパミン、セロトニン、アドレナリン、メチルフェニデートなどを検出するために使用されてもよい。
【００４３】
本明細書に開示されたような分子インプリント法の多くの魅力的な特徴のうちの１つは、多様な分析物に適用可能であることである。小さな有機分子（たとえば、薬剤、殺菌剤、アミノ酸、およびペプチド、核酸塩基、ステロイド、糖など）のインプリンティングは、たとえば、K. HauptおよびK. Mosbachの「Molecularly Imprinted Polymers and Their Use in Biomimetic Sensors」Chem. Rev. 100, 2495-2504 (2000)、およびG. MustafaおよびP. Lieberzeitの「MIP Sensors on the Way to Real-World Applications」Springer Series on Chemical Sensors and Biosensors, vol. 12, pp. 167-187 (Springer, 2012)に記載されている。いくらか大きな有機化合物（たとえば、ペプチド）も同様の手法によってインプリントすることができる。タンパク質、細胞、および無機結晶などの大きな構造体をインプリントするための手順は、たとえば、M. Kempe、M. Glad、およびK. Mosbachの「An Approach Towards Surface Imprinting Using the Enzyme Ribonuclease A」J. Molecular Recognition, 8, 35-39 (1995)、S. Hjertenらの「Gels Mimicking Antibodies in Their Selective Recognition of Proteins」Chromatographia 44, 227-234 (1997)、H. Shiらの「Template-Imprinted Nanostructured Surfaces for Protein Recognition」Nature 398, 593-597 (1999)、A. Aherneらの「Bacteria-Mediated Lithography of Polymer Surfaces」J. Am. Chem. Soc. 118, 8771-8772 (1996)、およびS. M. D’Souzaらの「Directed Nucleation of Calcite at a Crystal-Imprinted Polymer Surface」Nature 398, 312-316 (1999)において提案された。先進薬剤送達への架け橋としての分子インプリンティングは、B. SellergrenおよびC. Allenderの「Molecularly Imprinted Polymers: A Bridge to Advanced Drug Delivery」Advanced Drug Delivery Reviews 57, 1733-1741 (2005)に記載されている。本段落において引用された各文献の全ての開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４４】
分析物１３２を検出するために、分析物１３２を含む液体１２４は、基板１１０を覆うポリマー材料１１２に隣接して接触したフローセル１２２を通ってもよい。分析物１３２（たとえば、粒子、分子、または細菌）は、ポリマー材料１１２に結合し、ポリマー材料１１２の１以上の熱特性を変化させる。液体１２４は、検出の間にフローセル１２２を継続的に通って流れてもよく、またはその流れは検出が始まる前に止められてもよい。熱波２０２（図２）と減衰した熱波２０４とは、液体１２４が流れていようと、停滞していようと液体１２４を通って伝わってもよい。液体１２４の熱特性は、流れている液体１２４と、停滞した液体１２４とで異なってもよいが、流れ特性に基づいて決定することができる。いくつかの実施形態において、フローセル１２２と、その中の液体１２４とは、分析物１３２の検出前に試験温度に至ってもよい。上述のように、ポリマー材料１１２は、目的の特定分析物１３２に結合するように調製された分子インプリントポリマーであってもよい。
【００４５】
熱波２０２（図２）は、基板１１０を通ってヒートシンク１１４からポリマー材料１１２に提供されてもよい。制御装置１２１（たとえば、ＰＩＤ制御装置）は、予め選択された量だけ予め選択された周波数において、ヒートシンク１１４の温度を上昇させ、温度を低下させることなどによって、温度調節装置１１８を介してヒートシンク１１４の温度を変化させてもよい。ヒートシンク１１４の温度変化は、当該変化が、同時に生じる他の測定値に顕著に影響を与えないように十分に小さくてもよい。たとえば、フローセル１２２中の液体１２４の平均温度は、平均温度測定値の時間間隔が周波数の変化よりも長く、および／または温度変化量がポリマー材料１１２を有する分析物１３２の相互作用によって誘導される温度変化と比較して小さい場合に限り、ヒートシンク１１４の温度が変化していても測定することができる。いくつかの実施形態において、ヒートシンク１１４は、約０．００５〜約０．１Ｈｚ、または約０．０１〜約０．０５Ｈｚなどの約０．００１〜約０．５Ｈｚの周波数を有する熱波２０２を供給してもよい。さらに、熱波２０２の周波数は、試験中変化してもよい（たとえば、周波数は、低周波数から高周波数まで、またはその逆に継続して変化してもよい）。熱波２０２は、約１．０℃以下、約０．４℃以下、または約０．１０℃以下の振幅を有してもよい。
【００４６】
フローセル１２２中の液体１２４の温度が測定されてもよく、その結果は、ヒートシンク１１４の温度と比較されてもよい。
【００４７】
液体１２４中の分析物１３２の濃度は、ヒートシンク１１４によって生じた熱波２０２と、液体１２４中の減衰した熱波２０４との間の位相シフトの少なくとも一部において計算されてもよい。熱波２０２と減衰した熱波２０４との比較は、既知濃度の液体の反応に基づいて処理装置１２３によって実施されてもよい。いくつかの実施形態において、熱波２０２と減衰した熱波２０４との比較は、振幅、位相シフト、または他の特性の少なくとも一部に基づいてもよい。
【００４８】
熱波の測定は、ポリマー材料１１２の全ての温度を顕著に変化させることなく、熱抵抗の測定を可能にする。特定の理論になんら拘束されないが、そのような測定は、電子工学分野におけるキャパシタンスまたはインダクタンスの測定に熱的に類似していると考えられる。たとえば、抵抗の測定は、電子装置、または材料についていくらかの情報を明らかにするが、キャパシタンスまたはインピーダンスの測定は、装置または材料が負荷にどのように応答するかなどの追加の情報を明らかにする。同様に、本明細書に開示された方法による熱抵抗の測定は、定常状態の温度の差を測定することでは可能ではない、さらなる情報を明らかにすることができる。
【００４９】
たとえば、熱波を提供するとき、受容体に対する標的の結合によって、液体中の減衰した熱波の、振幅、周波数、および／または位相の変化の形態で、異なる種類の情報が、利用可能である。位相シフトは、入力の周波数に基づいて変化してもよい。熱波によって提供された情報量は、定常分析よりも非常に大きく、情報は、材料の様々な検出、または識別を可能にしてもよい。
【００５０】
さらに、なんらの特定の理論にも拘束されないが、ポリマー材料１１２の熱量は、その受容体（すなわち、キャビティ１３６）への分析物１３２の結合によって生じてもよい。分析物１３２の結合前に、キャビティ１３６は、液体で満たされてもよい。その受容体への分析物１３２の結合後、液体は、分析物１３２によって置換されてもよいので、変換器システム全体の熱量が増加する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、第１分析物１３２ａは、第２分析物１３２ｂをポリマー材料１１２から取り除くことによって、第２分析物１３２ｂと区別されてもよい。たとえば、第１分析物１３２ａが生きている細菌であり、第２分析物１３２ｂが死んだ細菌である場合、死んだ細菌は、生きている細菌を残したままポリマー材料１１２から（たとえば、緩衝液で）洗浄され、またはすすがれてもよい。第１分析物１３２ａと、第２分析物１３２ｂとの間の親和性の差は、そのような識別を促進してもよい。いくつかの実施形態において、第１分析物１３２ａは、ポリマー材料１１２を形成するために使用されたテンプレート分子であってもよく、第２分析物１３２ｂは、いくつか同様の機能を有する、分子または細菌であってもよい。したがって、第２分析物１３２ｂは、ポリマー材料１１２に少なくとも弱く結合してもよい。
【００５２】
実施例
実施例１〜５は、２０１４年１月９日に公開された米国特許出願公開第２０１４／００１１１９８号明細書「Heat-Transfer Resistance Based Analysis Bioparticles」に一般的に記載されたバイオセンサ装置の態様を利用する。
【００５３】
実施例１：ドーパミンを検出するためのテンプレートを有するＭＩＰの作製
エチルグリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）、ドーパミン塩酸塩（９９％）、およびメタノールは、Acros Organics社（ラフバラ、イギリス）から購入された。重合前に、ＭＡＡ中の安定剤とＥＧＤＭとは、アルミナを通る濾過によって取り除かれた。４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）と、セロトニンクレアチニン硫酸塩一水和物（９８％）とは、Sigma-Aldrich社（ジリンガム、イギリス）から購入された。熱伝達測定のために、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液は、Oxoid Limited社（ベイジングストーン、イギリス）から入手したダルベッコタブレットによって作製された。
【００５４】
ＭＡＡ（０．５４ｇ、６．６ｍｍｏｌ）、ＥＧＤＭ（２．９６ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）、および４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（６５ｍｇ）の混合物は、ドーパミン（０．０６３ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、テンプレート分子とともに、メタノール（３．６７ｍｌ）および水（０．５７ｍｌ）中に溶解された。この混合物は、Ｎ２で脱ガスされ、重合を開始するために加熱された。反応を完全に終了させるために、混合物は、１２時間にわたって６５℃で保たれた。重合後、大きいポリマーは、１０μｍよりも小さな直径を有する微粒子を得るために、砕かれ、篩分けされた。ドーパミンは、メタノールおよび水の５０／５０混合物を用いる継続的抽出によってＭＩＰ粉末から取り除かれた。６時間後、ＭＩＰは、Thermo Scientific社（ラフバラ、イギリス）のＮＩＣＯＬＥＴ（商標）３８０ＦＴ−ＩＲ装置を備えるＡＴ−ＩＲ分光器によって確かめられたように、ドーパミンを実質的に含まなかった。その後、ＭＩＰ粉末は、１００℃で１２時間にわたってオーブン中で乾燥させられた。非インプリントポリマー（ＮＩＰ）は、ドーパミンの存在なしに、同じ方法に従ってコントロールとして合成された。
【００５５】
実施例２：ドーパミンを検出するためのＭＩＰの試験
ＭＩＰおよびＮＩＰ粒子の、特異性および結合等温線は、Agilent８４５３分光器（ストックポート、イギリス）を用いる光学バッチ再結合実験によって測定された。再結合実験について、２０ｍｇの、ＭＩＰまたはＮＩＰ粉末は、０．３〜１．０ｍＭの濃度の、５ｍｌのドーパミン水溶液に添加された。得られた懸濁液は、室温においてロッキングテーブル上で１２時間にわたって振とうされた。その後、懸濁液は、濾過され、ドーパミンの遊離濃度（Ｃｆ）は、ＵＶ−ｖｉｓ分光器によって測定された。ドーパミンの結合濃度（Ｓｂ）は、ＭＩＰおよびＮＩＰの１グラムごとに計算され、結合等温線は、図４に示される。結合等温線を調節することによって、テンプレートドーパミンに対するＭＩＰの特異性が測定された。選択性を試験するために、競合分子セロトニンが使用された。なぜなら、その構造は、ドーパミンに非常に類似しているからである。これらの実験のために、２０ｍｇのＭＩＰ粉末が、５ｍｌのセロトニン水溶液に添加され、結合等温線は、懸濁液の濾過の後に測定された。
【００５６】
図４は、ＭＩＰと、そのリファレンスであるＮＩＰとの間の結合の顕著な差を示す。特異性を測定するために、選択された濃度におけるリファレンスＮＩＰに結合した量に分割されたＭＩＰに結合した量であるインプリントファクター（ＩＦ）が使用された。結合等温線は、特定濃度におけるインプリントファクターを分析するために以下の種類の２パラメータ調節によって調節された（数式１）。
【数式１】
【００５７】
2018535436.tif 000003
【００５８】
数式１は、フリントリッヒ結合等温線に対応し、結合部位と、親和性定数との分布が異質であると評価される場合、ＭＩＰ結合等温度線の調節のために使用されてもよい。Ｃｆ＝０．３ｍＭにおいて、ＩＦは、３．１±０．１であったが、より高い濃度は、結合部位の飽和によって、わずかに低いＩＦ値（〜２．５）を生じさせた。結果は、文献における他のドーパミンＭＩＰと比較された。競合するセロトニンに対するＭＩＰの応答は、リファレンスと有意に異ならなかった。このことは、システムの選択性を示す。
【００５９】
実施例３  ＭＩＰ被覆されたスクリーンプリント電極（ＳＰＥ）の作製
以下の実施例を通して実施された実験は、３ｍｍのグラファイト作業電極、グラファイト対電極、およびＡｇ／ＡｇＣｌリファレンス電極を有する３電極構造を備えるスクリーンプリント電極（ＳＰＥ）（４１ｍｍ×７ｍｍ）を利用する。
【００６０】
ＳＰＥは、スクリーンプリント機器（MicroDEK 1760RS、DEK社、ウェイマス、イギリスから入手可能）を用いて、３ｍｍ径の作業電極を形成するようにステンシルデザインで作製された。まず、カーボングラファイトインク製剤（C2000802P2、Gwent Electronic Material社、イギリスから入手可能）が、２５０μｍの厚さを有するポリエステル基板上にプリントされた。カーボングラファイトインクは、３０分間にわたって６０℃で乾熱滅菌器で硬化された。誘電性ペースト（D2070423D5、Gwent Electronic Materials社から入手可能）は、連結部を覆うためにポリエステル基板上にプリントされた。誘電性ペーストは、３０分間にわたって６０℃で硬化された。センサのこのバッチの再現性は、エッジコネクタを用いてレドックスプローブ、[Ｒｕ（ＮＨ３）]２＋/３＋／０．１Ｍ  ＫＣｌに対して４％ＲＳＤ未満に対応することが見出された。
【００６１】
ここで、ＭＩＰは、ＭＰおよびＭＩの重量％に基づいて、ＳＰＥのインクに組み込まれた。ＭＰは、微粒子の重量であり、ＭＩは、プリント工程において使用されたインク製剤の重量である。これらの例として、ＭＰの重量パーセントは、３０％であり、ＭＩの重量パーセントは、７０％であった。
【００６２】
実施例４  ＳＰＥのサイクリックボルタンメトリー測定
サイクリックボルタンメトリー測定は、３つの電極を用いる電位調整機（Autolab  PG-STAT、Metrohm社、ユトレヒト、オランダから入手可能）を用いて実施された。実施例３に記載されたような、グラファイトスクリーンプリント電極とＭＩＰ被覆されたＳＰＥとは、規定された作業電極として使用された。白金対電極とリファレンス電極としての飽和カロメル電極（ＳＣＥ）とは、回路を完成させる。この電気分析手順は、窒素脱ガスされたｐＨ７．４リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で、５μＭごとに０〜５０μＭの範囲のドーパミン濃度にわたって調べられた。＋０．２０Ｖにおける酸化ピークは、分析パラメータとして使用された。この実験手順は、５０ｍＶ／ｓｅｃのスキャン速度で、−０．２Ｖ〜＋０．８Ｖの電位範囲にわたって実施された。得られた検量線は、図５に示される。ドーパミン濃度に対する酸化ピーク高さの分析は、両方の電極の応答がおおよそ線形であることを示す。
【００６３】
ドーパミンに対する両方の電極の応答は、線形フィット（Ｒ２＝０．９７）で表わすことができ、センサプラットフォームの高感度形態を示す。非被覆ＳＰＥについて、勾配は、０．０２３μＡ／μＭドーパミンであったが、ＭＩＰ修飾されたＳＰＥについて、勾配は、０．０２５μＡ／μＭドーパミンであった。検出限界は、信号が標準偏差の３倍である濃度として規定された。検出限界は、ＭＩＰ被覆されたＳＰＥについて４．７±０．０５μＭであり、非被覆ＳＰＥについて４．０±０．０６μＭであった。
【００６４】
実施例５：熱伝達方法（ＨＴＭ）
１１０μｌの全内部体積を有する、６ｍｍの内径、４ｍｍの高さのフローセルが、アクリルで作製された（Lucite International社、ランカシア、イギリスから商標ＰＥＲＳＰＥＸ（登録商標）として利用可能である）。フローセルは、実施例４に記載された電位調整機システムに結合され、Ｏリングで密閉された。フローセルと、電位調整機システムとの間の接触面積は、２８ｍｍ２であった。ＭＩＰ被覆されたＳＰＥ（実施例３に記載）は、水平に取り付けられ、ヒートシンクとして機能する銅ブロック上に機械的に押し付けられた。銅ブロックの温度Ｔ１は、コントロールパラメータＰ＝８、Ｉ＝１、およびＤ＝０を有する、比例・積分・微分（ＰＩＤ）コントローラによって積極的にコントロールされ、熱電対によって測定された。銅ブロックの温度Ｔ１は、３７．００℃で維持された。
【００６５】
第２熱電対は、液体中の温度Ｔ２が測定されたＭＩＰ被覆されたＳＰＥの表面上に配設された。熱抵抗は、Ｒｔｈ（℃／Ｗ）と省略され、温度の差異（Ｔ１−Ｔ２）を、３７．００℃における温度定数を維持する間に消費された供給電力Ｐ（ワット）で除算することによって決定された（数式２）。
【数式２】
【００６６】
2018535436.tif 000004
【００６７】
ＭＩＰ被覆されたＳＰＥは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で安定化され、続いて溶液中のドーパミン濃度が徐々に増加する（０〜９００ｎＭ）がフローセルに加えられた。信号の安定後、各濃度においてＲｔｈ値が測定された。対応する用量作用曲線が構築され、図４に示される。
【００６８】
フローセルは、２０．００±０．０２℃の安定な環境温度で環境中に設置された。銅ブロックの温度Ｔ１は、ＰＩＤ制御装置によって３７．００±０．０２℃で正確に制御された。フローセルは、純粋なＰＢＳ溶液で満たされ、Ｔ２の安定化後、徐々に増加する濃度のドーパミンＰＢＳ溶液が添加された（０〜１０００ｎＭ）。図６に示されるように、フローセルに流れる溶液の濃度変化は、Ｔ２への迅速な低下をもたらす。安定なプラトーレベルに到達後、センサーセルは、少なくとも１５分間にわたって安定化されたままである。Ｔ２の減少は、続いてＭＩＰ層への標的分子の結合に単独で寄与可能である。図７は、時間依存性熱抵抗値を示し、図８は、用量作用曲線の形態で対応するＲｔｈデータを示す。図８に示される正規化値は、ベースライン信号への各添加後に観察されたＲｔｈの徐算によって計算された。
【００６９】
図７は、熱抵抗Ｒｔｈが、ＰＢＳ中においてドーパミン濃度が９００ｎＭまで徐々に増加するにつれて、６．８０±０．１０℃／Ｗ〜７．９２±０．０９℃／Ｗから段階的に増加したことを示す。これは、１６．５％の割合増加に対応し、信号のノイズ（１．１％）よりも顕著に高く、このことは、この効果が、ＭＩＰのナノキャビティへの標的の結合によるものであることを示す。リファレンスＮＩＰ電極において同じ試験が行われたとき、熱抵抗は、ドーパミンの濃度が増加するにつれて顕著に変化しなかった。したがって、ＭＩＰは、ドーパミンに特異的であると考えられる。
【００７０】
図８における計算された用量作用曲線に示されるように、８００ｎＭまでの濃度において、結合効果は、濃度に直線的に増加した。より高い濃度において、飽和に向かう傾向が示され、このことは、結合部位の増加した占有率に寄与してもよい。線形フィットによって、検出限界は、３５０±３０ｎＭに定められ、サイクリックボルタンメトリー（４７００±５０ｎＭの検出限界を有する、実施例４を参照）に比べて顕著に向上している。
【００７１】
実施例６：熱波伝達分析（ＴＷＴＡ）
機能化チップを通る熱伝達の分析に加えて、ヒートシンクに対応する位相シフトは、ＨＴＭ（実施例５）が行われたのと同じ試料において同時に調べられた。
【００７２】
ＰＢＳ中における４種類の選択されたドーパミン濃度（０、３００ｎＭ、４００ｎＭ、および８００ｎＭ）において、ＰＩＤ制御装置は、熱導電性シリコンペースト（SILCOTHERM SG502、ACC Silicones社、サマセット、イギリスから入手可能）を通って、２２Ωラジアルリード型高電力抵抗器（Type MPR Series、TE Connectivity社、シャフハウゼン、スイスから入手可能）によってヒートシンクを通って熱波を伝えた。熱波は、図９に示されるように、０．１℃の振幅と０．０１Ｈｚ〜０．０５Ｈｚの可変周波数とを有した。ドーパミンがＭＩＰ粒子に結合したとき、位相中の遅れ（φ1 ≠ φ2）と、熱波出力の振幅（α1 ≠ α2）の減少とは、図１０に示されるように、Ｔ２において測定された。なぜなら、熱波は、０．１℃のみの振幅を有し、別個の４つの時点までに加えられたので、熱波は、システムの安定性、または計算された熱抵抗値に影響を与えない。
【００７３】
図１０において、入力熱波（Ｔ１）と、純粋なＰＢＳ緩衝液に暴露されたＭＩＰ被覆ＳＰＥを通って得られる波との間で観察された位相シフトは、 ヒートシンクから液体コンパートメントの中央に熱を伝えるために必要な時間に依存する。ＭＩＰ被覆されたＳＰＥが、３００ｎＭのドーパミンＰＢＳ溶液に暴露されたとき、信号の振幅の低下に付随した位相シフトのわずかな増加が観察された。ドーパミンの濃度が高くなるにつれて、測定された位相シフトは大きくなり、振幅は減少した。なんら特定の理論に拘束されるものではないが、ＭＩＰ層への神経伝達物質の結合が、固液界面における熱伝達抵抗の上昇をもたらしたと考えられる。このことは、ヒートシンクから液体コンパートメントへのゆっくりとした熱の消失をもたらし、図１０において観察された結果を説明すると考えられる。
【００７４】
図１１は、加えられた熱波の周波数の関数として観察された位相を示す。図１１に示されるように、０．０２Ｈｚと０．０３Ｈｚとの間に位相シフトの大きな変化が現れ、０Ｈｚと０．０２Ｈｚとの間、および０．０３Ｈｚと０．０５Ｈｚとの間に小さな変化が現れる。したがって、０．０３Ｈｚの周波数が、後の実施例において標的受容体の動態を測定するために選択された。３００ｎＭを超える濃度において、熱波出力における顕著な効果は、０．０３Ｈｚにおいて測定された。この周波数において、５７°±１°の位相シフトがＰＢＳ中で観察されたが、８００ｎＭにおけるこの増加は、７５°±２°に増加し、これは３１％±２％の増加に対応する。
【００７５】
図８に示されるように、熱伝達法（ＨＴＭ、実施例５）によるドーパミンの検出限界は、約３５０ｍＮであった。しかしながら、実施例６に記載されたように位相応答を測定すると、ドーパミンは、３００ｎＭにおいて連続的に測定された。８００ｎＭの高濃度において、熱伝達法は、１６±１％の効果を生じ、これは、位相シフト応答よりほぼ２倍低い。したがって、熱波伝達分析（ＴＷＴＡ、実施例６）は、ドーパミンの検出を向上させることができる。
【００７６】
実施例７  バナナにおけるドーパミンの検出
バナナは、蒸し器および混合器（Avent model SCF870/20、Royal Philips社、アイントホーフェン、オランダから入手可能）を組み合わせて４分間粉砕され、続いて５分間にわたって３２００ｒｐｍで遠心された。上清は、透明な液体を得るために濾過され、徐々に増加する濃度のドーパミン（６２．５、１２５、５００、１０００、２０００ｎＭ）を添加された。５００ｎＭ以上の濃度において、熱抵抗における顕著な効果が観察された。
【００７７】
実施例６に記載された試験は、ドーパミンを添加されたバナナ由来の液体を用いて繰り返された。熱波出力の結果は、３７．００℃の初期温度に正規化され、対応する位相シフトは、図１２に示される。５００ｎＭ以上の結果のみが提供される。なぜなら、より低い濃度において有意な差が観察されなかったからである。中程度のフィルタ（１０ポイント中央値）は、粘度効果を補正するためにデータに適用された。図１３は、加えられた熱波の周波数の関数として観察された位相を示す。５００ｎＭの添加濃度において、５５±３Ｈｚの位相シフトが、純粋な無添加溶液中の３７±２Ｈｚに比べて測定された。増加率において、４６％±２％の差が測定され、これは、添加された濃度のドーパミンの効果と、バナナに存在する初期ドーパミンの効果との組み合わせである。５００ｎＭは、依然としてドーパミンが生物学的試料中に存在する濃度範囲であるので、この実施例７は、熱波伝達分析（ＴＷＴＡ）技術が、生物学的に適切なドーパミン濃度を測定するために使用されてもよい。
【００７８】
従来法は、高い粘度と、大きなタンパク質などの、食品試料中の他の干渉する化合物の存在とが原因で、食品関連試料を測定するために実施することは困難である。たとえば、特定化合物の検出限界は、（緩衝液中で３００ｎＭの濃度が検出可能であった実施例６と、添加されたバナナ流体において５００ｎＭの濃度が検出可能であった実施例７とを比べて）非特定結合レベルおよび高いノイズレベルが原因で増加してもよい。
【００７９】
以下の表１は、緩衝液中、および食品試料中のドーパミンのＭＩＰ修飾されたＳＰＥの検出限界を比較する。表１は、熱的方法が、従来の電気化学的方法を超える利点を提供可能であることを示す。なぜなら、緩衝液における検出限界は、約一桁低いからである。さらに、熱的方法は、複雑な食品試料の測定を可能にする。ＨＴＭに比べて、熱波の伝達の分析は、顕著に高い効果量（８００ｎＭのドーパミン緩衝液において３１％対１６％）を有し、厳格な温度制御をあまり必要とすることなく検出限界を向上させた。
【表１】
2018535436.tif 000005
【００８０】
ＭＩＰ粒子とスクリーンプリンティングインクとの直接混合は、電極作製のいくつかの工程を除き、機能化された電極の大量生産を可能にしてもよい。熱波伝達分析（ＴＷＴＡ）は、緩衝液だけではなく、関連する食品試料についてのナノモル範囲のドーパミンの検出限界をもたらしてもよい。さらなる利点は、この技術が、熱伝達方法と同時に実行可能であり、結果の直接の確認を可能にすることである。記載された方法論は、生物医学研究および臨床研究の分野において使用される神経伝達物質の、迅速かつ費用高率の高い検出のための新たなアプローチを提供する。
【００８１】
実施例８  微生物の培養、および試料作製
エシュリヒア・コリ（Escherichia coli）（ＡＴＣＣ（登録商標）８７３９（商標））と、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（ＡＴＣＣ（登録商標）６５３８（商標））との特徴付けられた株は、Leibniz Institute DSMZ社、ブラウンシュヴァイク、ドイツから入手した。２０ｍｌの普通ブイヨン（商品番号x929.1、Carl Roth社、カールスルーエ、ドイツ）が、Ｅ．コリ（E.Coli、大腸菌）の単一コロニーに播種され、２０ｍｌのCaso broth（品番x938.1、Carl Roth社）がＳ．アウレウス（S. aureus）の単一コロニーに播種された。両方のコロニーは、攪拌しながら、３７℃で一晩増殖された。
【００８２】
１ｍｌの一晩培養物は、それぞれ２０ｍｌの普通ブイヨンに希釈され、３７℃で３時間、またはＯＤ６００値（すなわち、６００ｎｍの波長において測定された光学密度、細菌の濃度に相関する測定値）が１になるまで増殖させられた。その後、細胞は、ペレットを形成するために遠心分離によって回収され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一回洗浄され、続いて所望の濃度になるようにＰＢＳ中に再懸濁された。
【００８３】
実施例９  細菌をインプリントされたポリウレタン層の作製
スピンコーティング溶液は、１２２ｍｇの４，４’−ジイソシアノジフェニルメタン、２２２ｍｇのビスフェノールＡ、および２５ｍｇのフロログルシノールを５００μＬの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させることによって作製された。全ての試薬は、少なくとも９９．９％の純度を有し、ディーゲム、ベルギーのSigma-Aldrich社から受け取ったように使用された。溶液は、穏やかに撹拌しながら６５℃で２００分間にわたってそのゲル化点まで重合された。溶液は、１：５の比率で無水ＴＨＦに希釈された。１．２±０．１μｍの平均厚さを有するポリウレタン層（Dektak 3ST、Sloan Instruments社、サンタバーバラ、カルフォルニア、アメリカ）は、溶液を２０００ｒｐｍで６０秒間にわたってスピンコートすることによって、１ｃｍ２の表面積を有する各アルミナ基板上に形成された。
【００８４】
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スタンプは、スキール、ベルギーのMalvom社から購入されたDow Corning SYLGARD（登録商標）１８４シリコンエラストマーキットを用いて作製された。細菌で被覆されたＰＤＭＳスタンプは、４００μＬの細菌ＰＢＳ懸濁液を各スタンプに加えることによって形成された。細菌は、６０秒間にわたってスタンプの表面に留められた。過剰の流体は、スタンプ表面に細菌の緻密な単一層を作製するために、６０秒間にわたって３０００ｒｐｍでスタンプをスピンコートすることによって除去された。
【００８５】
細菌で被覆されたスタンプは、１つのアルミニウム基板上のポリウレタン層に７０Ｐａの圧力で押圧された。ポリウレタンは、スタンプが基板の表面から除去された後、６５℃で１８時間にわたって不活性雰囲気下において硬化された。テンプレート細菌は、エタノールおよびＰＢＳで洗浄され、基板の表面のキャビティに選択的に結合したまま残される。したがって、表面インプリントポリマー（ＳＩＰ）は、Ｅ．コリおよびＳ．アウレウスのそれぞれに選択的に作製された。
【００８６】
実施例１０  熱伝達法（ＨＴＭ）
６ｍｍの内径と、４ｍｍの高さとを有し、１１０μｌの内部総体積を有するフローセルは、アクリル（ランカスター、イギリスのLucite International社から商標ＰＥＲＳＰＥＸ（登録商標）として利用可能）で作製された。フローセルは、電位調整器に結合され、Ｏリングで密閉された。フローセルと電位調整システムとの間の接触面積は、２８ｍｍ２であった。ＳＩＰ被覆された基板（実施例９に記載された）は、ヒートシンクとして機能する銅ブロックに、水平に取り付けられ、機械的に押し付けられた。銅ブロックの温度Ｔ１は、コントロールパラメータＰ＝８、Ｉ＝１、およびＤ＝０で比例・積分・微分（ＰＩＤ）制御装置によって積極的に制御され、熱電対によって測定された。銅ブロックの温度Ｔ１は、３７．００℃に維持された。
【００８７】
第２熱電対は、液体中の温度Ｔ２を測定されたＳＩＰ被覆基板の表面上に配設された。熱抵抗は、Ｒｔｈ（℃／Ｗ）と省略され、数式２で示されるように、温度を３７．００℃で一定に保持している間に消費された入力電力Ｐ（ワット）によって温度の差（Ｔ１−Ｔ２）を除算することによって決定された（実施例５を参照）。
【００８８】
ＳＩＰ被覆基板は、各実験の開始時点においてＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中で安定化された。細菌は、２．５ｍＬ／分の制御された流速で３ｍｌの細菌溶液（１×１０７  ＣＦＵ／ｍｌ  ＰＢＳ）を注入することによってシステムに導入された。ＳＩＰ被覆基板は、１２分間にわたって０．２５ｍＬ／分の流速（総体積３ｍＬ）で、ＰＢＳで洗浄された後、ＳＩＰ層から任意の未結合細菌を取り除くために安定化された。ＨＴＭ機構は、毎秒１回測定の速度で、固液界面における熱抵抗（Ｒｔｈ）を監視する。
【００８９】
実施例１１  顕微鏡イメージング
ＳＩＰ被覆された基板の顕微鏡イメージングは、ディーゲム、ベルギーのLeica Microsystems社から入手可能なＤＭ７５０光学顕微鏡で実施された。ＳＩＰ被覆された基板は、６４０ｘおよび１０００ｘの倍率で画像化された。ソフトウェア（ImageJ version 1.44p、ベセズダ、メリーランド、アメリカ、国立衛生研究所から入手可能）は、ＳＩＰ被覆された基板の顕微鏡画像における単位面積毎の細胞インプリントの数を決定するために使用された。細胞インプリントの平均表面範囲は、ＳＩＰ被覆された基板の各種類について、各ＳＩＰ被覆された基板上の５つの位置において、３つの異なる試料の細胞インプリント数に基づいて計算された。
【００９０】
Ｅ．コリでインプリントされたＳＩＰ表面の光学顕微鏡分析（図１１）は、細菌の寸法に対応する、１．５〜３μｍに変化する長さと０．５〜１．５μｍの幅とを有する、桿状インプリントを明確に示す。１．１１×１０６±６．６２×１０５インプリント／ｃｍ２の計算された表面割合は、６．０２±１．６％の総表面割合に対応する。Ｓ．アウレウスＳＩＰの光学顕微鏡分析（図１５）は、±５００ｎｍ〜８００ｎｍの直径を有する球状インプリントの不均質な分布を示す。２．９１×１０６±８．７３×１０５インプリント／ｃｍ２のインプリント表面割合は、９．１２±２．１％の総表面割合に対応する。
【００９１】
実施例１２  生きている細菌と死んだ細菌との識別
ＳＩＰ被覆された基板は、実施例８および実施例９に記載されたように、ＰＢＳ中の生きているＥ．コリ細胞（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度）で形成され、インプリントされた。ＳＩＰ被覆された基板は、ＳＩＰ被覆された基板と銅ブロックとの間の熱的接触を確実にするために、その被覆されていない、研磨された背面を銅ブロックに機械的に押圧された。ＳＩＰ被覆された基板は、ＰＢＳで満たされたフローセル中に配設された。ＳＩＰ被覆された基板のＲｔｈ信号は、６０分間にわたって安定化された。死んだ細菌は、２．５ｍＬ／分の流速で、７２秒間にわたってフローセルに導入された。流れが止められ、Ｒｔｈ信号は６０分間にわたって安定化され、細菌はＳＩＰ表面に沈殿させられた。任意の未結合細菌は、０．２５ｍＬ／分の流速で１２分間にわたってＰＢＳでフローセルを洗浄することによって除去された。６０分間の安定期間後、実験は、生きているＥ．コリ細胞で繰り返された。この実験の結果は、図１６および図１７に示される。
【００９２】
図１６は、両方の暴露（すなわち、生きているＥ．コリ細胞および死んだＥ．コリ細胞への暴露）が、ＳＩＰ被覆された基板の固液界面における熱抵抗の増加をもたらすことを示している。死んだ細菌の添加に付随する増加は、ＰＢＳで洗浄することによって部分的に可逆性であってもよいが、生きているＥ．コリ細胞を添加することによって生じた増加は、不可逆的であると考えられる。図１７は、データを要約するボックスプロットである。エラーバーは、信号におけるノイズの標準偏差を示す。
【００９３】
図１６および図１７は、信号（Ｒｔｈ）が、死んだ細菌のＰＢＳ溶液の添加後に０．６７±０．１５℃／Ｗだけ増加することを示す。ＰＢＳでチャンバを洗浄した後、信号は、ベースライン上の０．３６±０．１６℃／Ｗの値に再度低下する。生きている細菌を測定チャンバに注入した後、信号は、０．９１±０．２１℃／Ｗの値に再度上昇する。緩衝液を用いる洗浄は、Ｒｔｈの測定可能な減少を生じず、信号は、ベースラインを超える０．９３±０．１９℃／Ｗで留まる。
【００９４】
Ｒｔｈの増加は、死んだ細胞についていくらか低いけれども、実施例１２、ならびに図１６および図１７に記載された熱抵抗試験は、死んだ細菌および生きている細菌への最初の暴露後、同等の応答を示す。死んだ細菌細胞の形態は、インプリントポリマー表面上のマイクロキャビティの寸法に一致すると考えられる。また、死んだ細菌は、それらの外膜上にいくつかの細菌特異的な機能基を発現し、死んだ細菌とインプリントされた表面との間の部分的な機能的一致を提供してもよい。生きている細胞と死んだ細胞との両方は、ポリマーのマイクロキャビティを通る熱流動特性を変え、典型的には、固液界面において熱抵抗を増加させる。インプリント表面をすすぐと、インプリント表面上のマイクロキャビティから死んだ細菌を除去するために十分なせん断力を提供することができる。一方、生きているＥ．コリへのインプリント表面の暴露は、一回の洗浄によって反転できない熱抵抗の増加を生じ得る。インプリントと生きている細菌との間の結合は、インプリントと死んだ細菌との間の結合よりも安定であると考えられる。同じ種類の死んだ細菌と生きている細菌との間の違いは、インプリンティングの間にマイクロキャビティ内に生じる化学的機能化に基づいてもよい。
【００９５】
実施例１３  Ｅ．コリとＳ．アウレウスとの間の選択性
ＳＩＰ被覆された基板は、実施例８および実施例９に記載されたように、Ｓ．アウレウス細胞（グラム陽性細菌）およびＥ．コリ細胞（グラム陰性細菌）で形成され、インプリントされた。ＳＩＰ被覆された基板は、ＳＩＰ被覆された基板と銅ブロックとの間の熱的接触を確保するために、被覆されていない研磨された背面を銅ブロックに機械的に押し付けられた。ＳＩＰ被覆された基板は、ＰＢＳで満たされたフローセル内に配設された。時間依存性Ｒｔｈデータは、ＳＩＰ被覆された基板を、類似体の非標的細菌、および標的細菌に連続的に暴露することによって得られた。フローセルは、両方の暴露の間に、制御された速度で洗浄された。
【００９６】
図１８は、Ｅ．コリ  インプリントＳＩＰをＳ．アウレウス細胞のＰＢＳ懸濁液（濃度  １×１０７  ＣＦＵ／ｍＬ）に暴露することが、固液界面における熱抵抗を０．６２±０．１４℃／Ｗだけ増加させたことを示す。ＰＢＳでフローセルをすすぐと、信号はベースラインに戻った（ΔＲｔｈ＝０．０７±０．２１℃／Ｗ）。同一の濃度を有するＥ．コリ溶液を用いるサイクルの繰り返しは、０．９６±０．１６℃／Ｗ（洗浄後のΔＲｔｈ＝０．９４±０．１２℃／Ｗ）のＲｔｈの不可逆的増加を生じた。図１９に示されるように、Ｓ．アウレウス  インプリントＳＩＰを、Ｅ．コリに、続いてＳ．アウレウスに暴露したとき、同様の傾向が観察された。Ｅ．コリ細胞溶液への暴露は、Ｒｔｈ信号を０．７６±０．０９℃／Ｗ増加させたが、ＰＢＳでフローセルをすすぐと、熱抵抗は、ベースラインを超える０．１２±０．１１℃／Ｗの値で安定化した。ＳＩＰを標的細胞溶液に暴露すると、０．９１±０．１７℃／Ｗの熱抵抗の増加がもたらされた。ＰＢＳを用いる細胞の洗浄は、信号を顕著に変化させなかった（０．８７±０．１９℃／Ｗ）。
【００９７】
したがって、図１８および図１９は、類似非標的細菌、および最終的には標的細菌への連続的な細菌暴露の間に、Ｅ．コリ（図１８）、またはＳ．アウレウス（図１９）でインプリントされたＳＩＰの時間依存性Ｒｔｈ測定を示す。両方の場合、非標的細菌の添加は、熱抵抗の増加をもたらすが、緩衝液によるフローセルの洗浄後、信号は、ベースライン付近まで戻った。ＳＩＰへの標的細菌の結合は、Ｒｔｈの不可逆性上昇をもたらした。これらの実験結果は、図２０のボックスプロットにまとめられている。
【００９８】
実施例１４  選択性試験および用量反応曲線
１×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度を有するＥ．コリ細胞のＰＢＳストック溶液の一部は、１００、５０、２０、および１０倍に希釈され、ＳＩＰ被覆された基板（実施例８および実施例９に記載されたように、Ｅ．コリでインプリントされた）は、フローセル内の増加した濃度の標的Ｅ．コリ細胞に連続的に暴露された。各暴露工程の間において、フローセルは、０．２５ｍＬ／分の速度で１２分間にわたってエタノールですすがれ、続いて０．２５ｍＬ／分の速度で１２分間にわたってＰＢＳですすがれた。この実験結果は、図２１に示される。結果は、ＳＩＰ被覆された基板の検出限界（ＬｏＤ）を特定する。
【００９９】
Ｅ．コリ細胞が添加されたとき、熱抵抗が増加し、この増加は、濃度依存性であると考えられる。図２１に示される時間依存性の熱抵抗データは、ＳＩＰ被覆された基板の１×１０５ＣＦＵ／ｍＬの濃度への暴露は、Ｒｔｈの測定可能な増加をもたらさなかった。２×１０５ＣＦＵ／ｍＬの添加後、信号は増加し始めた。信号は、５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの濃度において飽和し始めるようである。以前の実験からの結果に組み合わされたこれらの結果は、添加された標的細菌濃度の関数として対数目盛でＲｔｈの応答を示す図２２に示される用量作用曲線を確立するために使用された。
【０１００】
用量反応曲線は、以下の式に係る、経験的な指数フィット関数に従う。
【数式３】
【０１０１】
2018535436.tif 000006
ここで、ｃは、Ｅ．コリの濃度であり、Ａ，ＢおよびＣは、定数である。図２２において得られたデータを通して描かれた指数フィットは、０．９９０１のＲ２値を有する。
【０１０２】
実施例１４と、図２１および図２２とに記載された感度試験は、本明細書に記載されたようなセンサが、試料中の標的細菌の濃度上昇に定性的に応答し、その応答を定量化することができることを示す。比較的低い濃度において、センサの応答は、ノイズレベル内に留まるであろう。しかし、閾値濃度（実施例１４における約２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）から始まり、Ｒｔｈ信号は、統計的に識別可能であるベースラインを超えて十分に高い値に増加する（十分な量の細胞が、インプリントポリマーにおけるマイクロキャビティに相互作用し、結合することを示し、ポリマーを流れる熱を防ぎ、それによって熱伝達抵抗を増加させる）。この効果は濃度が増加するにつれて示され始めるが、ポリマーは飽和するようである（実施例１４では５×１０５ＣＦＵ／ｍＬを超える濃度において）。データへの指数フィットを用い、信号対ノイズ比が３よりも大きい濃度として検出限界を定義すると、実施例１４における試料についての検出限界（ＬｏＤ）は、１．５×１０５ＣＦＵ／ｍＬであった。ＬｏＤは、たとえば、沈降時間、スピンコート速度および加速度、テンプレート濃度、ならびにスタンプ表面の表面機能化などの細菌性インプリンティングについての合成手順によって影響され得る。また、信号のノイズは、電子ノイズの低減、遮蔽、遮断などによって向上させることができる。
【０１０３】
実施例１５  半複合マトリクスにおけるＥ．コリの検出
溶液は、１：９９の比率で、Ｅ．コリ細胞およびＳ．アウレウス細胞の両方を含んで作製された。細菌の総濃度は、１×１０７ＣＦＵ／ｍＬであった。この混合物は、連続的な濃縮実験において使用された。
【０１０４】
ＳＩＰ被覆された基板は、実施例９において記載されたように、Ｅ．コリでインプリントされた。基板は、混合物に３回連続して暴露され、基板は、各暴露の間に緩衝液で洗浄された。図２３に示される結果は、信号（Ｒｔｈ）が、第１暴露の後、ベースラインに比べて顕著には増加しないことを示す。Ｒｔｈは、第２暴露工程および第３暴露工程の後に増加する。細菌混合物に暴露した後、Ｒｔｈ信号は、最初に飽和まで増加する。
【０１０５】
各工程における飽和レベル（図２３の右のスケールを用いて示された）は、それぞれ、混合物に暴露した後、および緩衝液で洗浄した後、ΔＲｔｈの比率として決定された。ＬｏＤは、破線として示され、３回の信号の標準偏差として規定され、２６．４％に相当する。最初の２回のサイクル後、信号は、検出限界よりも非常に低い０．８±８．１％および１１．８±７．８％に到達するのみであった。第３回暴露後、信号は、３２．１±８．０％の飽和レベルにおいて検出限界を超える。
【０１０６】
特定の理論に何ら拘束されるものではないが、標的細胞および類似細胞は、第１暴露において、ＳＩＰ被覆された基板に結合すると考えられる。洗浄後、信号は、ベースライン値とは顕著には異ならない値に低下した。混合物中の標的細胞（Ｅ．コリ）の総濃度は、実施例１４において決定されたＬｏＤ以下の１×１０５ＣＦＵ／ｍＬにすぎなかった。さらに、Ｅ．コリ細胞は、ＳＩＰ被覆された基板におけるマイクロキャビティに結合する類似細菌であるＳ．アウレウス細胞を９９：１で上回った。Ｅ．コリ細胞は、Ｓ．アウレウス細胞によって既に占有されているマイクロキャビティに結合することができない。また、類似細菌は、立体障害が原因で、標的細菌が、ＳＩＰ被覆された基板と相互作用することを防ぐことができる。
【０１０７】
これらの問題は、暴露サイクルの数を増やすことによって少なくとも部分的に克服することができる。各サイクルによって、信号は、飽和し、最終的にＬｏＤに達すると考えられ、このことは、濃縮が、ＳＩＰ被覆された基板の感受性を向上させることができ、複合混合物の増加に伴って低濃度の細菌を検出することができることを示す。
【０１０８】
実施例１６  細菌を検出するための熱波分析
７種類の細菌でインプリントされたポリウレタン層であって、Ｅ．コリ、Ｓ．アウレウス、Ｋ．ニューモニエ（K. pneumoniae）、Ｐ．アエルギノーサ（P. aeruginosa）、Ｓ．エピデルミディス（S. epidermidis）、Ａ．バウマンニイ（A. baumannii）、およびＥ．コリ  Ｋ−１２に感受性を有するポリウレタン層は、実施例９に記載されたように形成された。ポリウレタン層は、実施例１０に記載されたようにフローセル中においてアルミニウム基質上に配設された。フローセルは、それぞれ時間の関数、銅ブロックの温度Ｔ１を変化させるように構成された。
【０１０９】
各基板は、緩衝溶液における標的細菌の濃度上昇にさらされた。標的細菌の各濃度について、温度Ｔ１は、一定期間にわたって一定に保たれ、続いて熱波を加えるために変えられた。基板の下の温度は、電力Ｐを加えることによって３７℃で一定に保たれた。液体フローセルの温度Ｔ２は、経時的に観察された。また、熱抵抗（すなわち、Ｒｔｈ＝（Ｔ１−Ｔ２）／Ｐ）も、経時的に観察された。結果は、図２４〜図３０に示される。
【０１１０】
これらの結果は、フローセル中の標的細菌の量が増加すると、フローセル中の液体の温度（Ｔ２）が、低下することを示す。このことは、細菌が、基板上のポリウレタンに結合しており、同様にＴ２を低下させる固液界面における熱抵抗（Ｒｔｈ）を増加させることを示すと考えられる。
【０１１１】
各濃度における熱波が分析され、図３１〜図３７に示される。Ｔ２における相対変化は、各波について測定され、その結果は、入力波に関して、時間でプロットされた。
【０１１２】
図３１〜図３７におけるデータは、フローセルにおける標的細菌の濃度上昇が、基板を通って伝わる熱波の位相シフトと、熱波の振幅の低下とをもたらすことを示す。任意の特定の論理に拘束されないが、細菌が基板上のポリウレタンに結合するので、界面における熱抵抗を増加し、熱エネルギーを液体に伝達することを抑制すると考えられる。このことは、波の振幅変化から分かる。また、熱波は、観察された位相シフトをもたらすチップにわたってゆっくりと消散する。位相シフトおよび／または振幅変化は、試料中の細菌濃度に関連付けることができ、試料の特性を明らかにするために使用することができる。
【０１１３】
実施例１７  細菌に対するインプリントＳＩＰの選択性
細菌に感受性を有する７種類の細菌インプリントポリウレタン層、実施例１６において試験されたものと同一のものは、交差選択性試験について使用された。また、他のＳＩＰは、９枚全ての基板を試験することができるように、Ｃ．ディフィシル（C. difficile）と、Ｅ．セコルム（E. cecorum）とでインプリントされた。
【０１１４】
基板の選択性を決定するために、各ＳＩＰは、８種類の類似細菌に連続的に暴露され、最後に、実施例１０に記載されたようなフローセルにおける標的（すなわち、インプリントされた細菌）に暴露された。各暴露工程において、細菌のＰＢＳ懸濁液（ｐＨ７．４、１×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）が、フローセルに注入された。各細菌について、温度Ｔ１は、一定の期間にわたって一定に保持され、続いて熱波を適用するために変更された。基板の下の温度は、電力Ｐを加えることによって３７℃で一定に保たれた。液体フローセルの温度Ｔ２は、経時的に観察された。熱抵抗（すなわち、Ｒｔｈ＝（Ｔ１−Ｔ２）／Ｐ）も、経時的に観察された。信号の安定化後、ＳＩＰは、任意の非結合材料を除去するために緩衝溶液で洗浄された。処理は、各細菌が、８種類の類似細菌が試験され、最後に標的が試験されるまで繰り返された。
【０１１５】
Ｅ．コリ  ＳＩＰについての、時間依存性温度プロファイルと、ＴＷＴＡ分析とは、図３８に示される。これらの結果は、フローセル中の標的細菌量が増加すると、液体フローセルの温度（Ｔ２）が、低下することを示す。このことは、細菌が、基板上のポリウレタンに結合し、固液界面における熱抵抗（Ｒｔｈ）を増加させ、同様にＴ２を低下させることを示すと考えられる。基板がＰＢＳで洗浄されたとき、標的以外の細菌は、洗い流される傾向がある。
【０１１６】
フローセルへの類似細胞の添加は、Ｔ２の減少をもたらし、この減少は、緩衝液で洗浄することによって容易に反転可能であり、実施例１３の結果に対応する。しかしながら、Ｅ．コリ  Ｋ−１２細胞の添加後、信号は、ベースラインには完全に戻らず、中間値で安定する。標的Ｅ．コリ細胞の添加は、信号を最小値までさらに低下させ、その後信号は、緩衝液を用いる洗浄によって一定に留まる。これらの知見は、ＴＷＴＡによって確認される。図３９は、Ｅ．コリ  インプリントされたＳＩＰ上の各細菌についてのＴＷＴＡ試験について０．０３Ｈｚにおける位相シフトを示す。最初の７種類の類似細菌は、入力波と比べて伝達波における位相シフトを生じないが、類似体Ｅ．コリ  Ｋ−１２と、標的Ｅ．コリ細胞との両方への暴露は、Ｅ．コリ細胞について観察される測定可能な最大の位相シフトをもたらす。
【０１１７】
Ｅ．コリ  Ｋ−１２インプリントＳＩＰにおける同様の実験は、図４０および図４１に示されるように、これらの結果を裏付ける。これらの実験に加えて、ＳＩＰは、試験において各細菌についてインプリントされ、標的細菌、および類似細菌に継続的に暴露された。データは、交差選択性が、これらのＳＩＰを用いる同様の実験において観察されなかったことを示している。これらの実験の結果は、表２にまとめられる。
【表２】
2018535436.tif 000007
実施例１７に記載された結果は、１以上のインプリントＳＩＰを有するセンサプラットフォームが、定量的な方法で、緩衝液中の様々な種類の細菌を選択的に識別することができることを示している。
【０１１８】
実施例１８  複合混応物に暴露されたときのインプリントＳＩＰの選択性
現場での細菌検出および同定中に遭遇する試料は、微量の標的に加えて、過剰の競合分子および細胞を含むことが予測され得る。この条件を刺激するために、実施例９に記載されたような、Ｓ．アウレウスを用いるインプリントＳＩＰは、ＳＩＰを細菌の混合物に暴露する進行性濃縮実験について選択された。Ｓ．アウレウスと過剰の８種類の非標的細菌とを含む、実施例１９において試験された９種類の細菌の混合物が作製された。各非標的細菌に対するＳ．アウレウスの比率は、１：９９であり、細菌の総濃度は、１×１０７ＣＦＵ／ｍＬであった。ＳＩＰは、混合物に５回連続して暴露され、各暴露の間に緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄された。
【０１１９】
時間依存性の温度プロファイルは、図４２に示される。ＳＩＰに基づく細菌検出のための測定技術としてＴＷＴＡを評価するために、ＨＴＭは、参照技術として使用された。したがって、熱抵抗Ｒｔｈは、式２に従って温度プロファイルから計算された（実施例５を参照）。
【０１２０】
熱抵抗データは、図４３に示され、中程度フィルタを目へのガイドとして利用することによって単純化された。漸進的濃縮の効果をより明確に視覚化するために、Ｒｔｈ応答の飽和レベルは、フローセルへの混合物の添加による最大効果量での洗浄後、正味効果量を除算することによって、（細胞の暴露に続く洗浄からなる）各暴露サイクルについて計算された。これらの結果は、４〜５の暴露サイクル後、検出限界に達するまで、各暴露サイクル正味信号が徐々に増加することを示している。検出限界値は、図４３において破線として示され、測定（すなわち、３σ法）を通じてＲｔｈ信号の３倍最大誤差として規定された。
【０１２１】
図４４に示されたＴＷＴＡデータは、同様の傾向を示す。各暴露サイクル後、伝達された波において観察された正味位相シフトは、徐々に増加し、第３の暴露サイクル後、信号は、検出限界に到達する。
【０１２２】
混合物中の過剰な競合細菌が原因で、少量の標的細菌のみしかＳＩＰに結合することができないと考えられる。したがって、熱抵抗Ｒｔｈ（図４３）と位相シフト（図４４）とにおける応答は、標的細菌のみに暴露されたときよりも明確ではないであろう。暴露の数が増加すると、応答は、徐々に増加し、最後に検出限界レベルに達する。なぜなら、非標的細菌は、ＳＩＰから洗い流され、次のサイクルにおいて標的細菌を受け入れ可能な結合部位を暴露するからである。ＨＴＭについての信号のノイズが顕著に高いので、ＨＴＭについてのＬｏＤは、４、または５の連続的サイクル後にのみ到達されるが、一方、側定法としてＴＷＴＡを用いると、有意であるとみなすことが可能な測定可能な信号は、２〜３のサイクル後、既に明らかである。熱波のノイズ量が少ないので、ＴＷＴＡ原理の開発は、熱的細菌特定の価値ある進歩と考えることができる。
【０１２３】
本明細書に記載された方法および装置は、同様の細菌株だけではなく、同一株の、生きている細菌と死んだ細菌とを識別するために使用されてもよいことが思いがけなく見出された。任意の特定の理論に拘束されないが、生きているＥ．コリと、死んだＥ．コリとの間の界面化学の相違は、それらの形態学的同一性にも関わらず、それらを識別するために十分であるようである。
【０１２４】
さらに、非標的分析物（たとえば、標的分析物細菌に似ているが、同一ではない細菌）のすすぎは、他の結合部位から標的分析物を除去することなく、非標的分析物の結合部位を解放することによって、ポリマー材料の検出能力を増加させることができることが予期せず見出された。したがって、標的分析物によって最初に占有された結合部位は、占有されたままであってもよく、非標的（類似体）分析物によって最初に占有された結合部位は、別の分析物との（特に、標的分析物との）再結合のために排除されてもよい。おそらく、インプリント内部のいくつかの機能基に互換可能である細胞膜上の細菌特異的な機能基の存在によって、類似細菌は、いくらかインプリントに結合してもよい。しかしながら、その結合は、洗浄によって提供されるせん断力に耐えるとは考えられない。標的細菌は、一方、熱抵抗が洗浄後に高いレベルで留まるように、ポリマーに固く結合したままであると考えられる。そのような排除および再結合は、同様の、または関連した分析物の複合混合物を特徴付けるために有用であるであろう。なぜなら、関連した分析物は、お互いにインプリントされた部位に弱く結合する傾向があるからである。分析物を排除および再結合することによって、低濃度の標的分析物を検出することができる。
【０１２５】
本明細書に記載された方法および装置は、定常状態分析法、または熱波分析法と組み合わせて使用されてもよい。様々な形状の基板が使用されてもよく、データ（たとえば、温度）は、ポリマー材料で被覆された基板において、または被覆された熱電対において、分析されるべき液体中などの様々な点で収集されてもよい。
【０１２６】
本明細書において記載された方法は、従来、複雑な設備と高度に訓練された人員とを有する実験室において実施される、リアルタイム、またはほぼリアルタイムで細菌を特徴付けるために使用されてもよい。したがって、方法および装置は、より早く、安価なデータ収集を可能にし、たとえば、住民に発生した細菌を特定することによって、転帰を向上させることができる。そのような方法は、ヘルスケア、環境安全性、食品安全（たとえば、水中細菌、空中細菌、および食品媒介細菌）、およびテロリズム対策（たとえば、炭そ菌などの検出によって）において有益であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【国際調査報告】
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