(57)【要約】本発明は、認知力低下のリスクを予測し、認知力低下の進行を監視し、患者の認知力低下を診断するための方法に関する。本発明はさらに、患者の脳内鉄レベルを低下させるか、または患者のCSFフェリチンレベルを低下させることによって、患者の認知力低下の進行速度を減少させる方法に関する。
2018513368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の認知力低下のリスクを予測する方法であって、
患者の脳内鉄の第１レベルを決定すること；
脳内鉄の第１レベルを脳内鉄の基準レベルと比較すること；
脳内鉄の第１レベルと基準レベルとの差を決定すること；および
その差から患者の認知力低下のリスクを推定すること；
を含む方法。
【請求項２】
脳内鉄レベルの差が、上昇であり、それによって認知力低下のリスクの増加が示される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者の認知力低下を診断する方法であって、
患者の脳内鉄の第１レベルを決定すること；
脳内鉄の第１レベルを脳内鉄の基準レベルと比較すること；
脳内鉄の第１レベルと基準レベルとの差を決定すること；および
その差から患者の認知力低下を推定すること；
を含む方法。
【請求項４】
脳内鉄レベルの差が、上昇であり、それによって認知力低下が診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
患者の認知力低下の進行をモニタリングする方法であって、
第１の時点で患者の脳内鉄のレベルを決定すること；
同じ患者の脳内鉄のレベルを、第１の時点の後の第２の時点で決定すること；
必要に応じて、第１および第２の時点の脳内鉄のレベルを基準レベルと比較すること；
第１および第２の時点のそれぞれにおける脳内鉄のレベルの差を決定すること；
第１および第２の時点の脳内鉄レベルの差から認知力低下の進行を推定すること；
を含む方法。
【請求項６】
脳内鉄レベルの差が、基準レベルに対して、第２の時点における鉄レベルが第１の時点よりも高くなるような第１および第２の時点の間の上昇であり、それによって認知力低下が進行したことが示される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脳内鉄のレベルが、セロプラスミン、アミロイド前駆体タンパク質、タウ、フェリチン、トランスフェリン、トランスフェリン結合タンパク質などから選ばれる鉄関連タンパク質レベルの測定値として、またはMRIもしくは超音波検査によって決定される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
脳内鉄が、皮質鉄である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
脳内鉄のレベルが、脳脊髄液（CSF）フェリチンの測定値として決定される、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
脳内鉄のレベルが、MRI、場合によっては超磁場7T MRIまたは臨床3T MRI画像によって決定される、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法であって、
さらに、
患者のアポリポタンパク質E（ApoE）のレベルを決定すること；
患者のApoEレベルをApoEの基準レベルと比較すること；
患者のApoEレベルおよび基準レベルと、患者の脳内鉄レベルおよび脳内鉄の基準レベルとの間の相関を決定すること；および
ApoEレベルと脳内鉄レベルとの間の相関から認知力低下のリスクを推定すること；
を含む方法。
【請求項１２】
相関が、正の相関であり、それによって認知力低下のリスクの増加が示される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
患者のApoE遺伝子型を決定することをさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ApoE遺伝子型が、Apoε4対立遺伝子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ApoEレベルが、CSF ApoEレベルの測定値によって決定される、請求項１１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
アミロイドβペプチド、タウ、ホスホタウ、シヌクレイン、Rab3a、Aβおよび神経糸タンパク質など、場合によっては、タウまたはAβから選ばれる認知障害のバイオマーカーのレベルを決定することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
基準レベルが、認知的に正常な固体から決定される、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
認知力低下が、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病（AD）へのMCIの変換、およびADを包含する、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
脳内鉄、フェリチンまたはCSFフェリチンを測定する前に、鉄関連タンパク質レベルのみが測定されるように、未結合の細胞性鉄を排除する、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
患者の認知力低下の進行速度を減少させる方法であって、患者の脳内鉄レベルを低下させることを含む方法。
【請求項２１】
患者の認知力低下の進行速度を減少させる方法であって、患者のCSFフェリチンレベルレベルを低下させることを含む方法。
【請求項２２】
患者の認知能力を高める方法であって、患者のCSFフェリチンレベルを低下させることを含む方法。
【請求項２３】
CSFフェリチンレベルが、有効量のデフェリプロンまたは鉄低下剤を投与することによって低下される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
患者が、ApoE遺伝子型を有し、場合によってε4対立遺伝子を保有する、請求項２０〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
患者が、CN患者である、請求項２０〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知症、認知障害および／または情動障害および／または行動機能障害、アルツハイマー病および関連する認知症の領域に関連する認知力低下のリスクを予測する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、遺伝的脆弱性、予後診断方法および治療方法に関する。本発明は、脳内鉄と認知力低下との相関関係に関する。好ましくは、本発明は、認知力低下の進行の診断、予後および／またはモニタリングのための方法における脳内鉄レベルの指標としてのフェリチン、より好ましくは、脳脊髄液（CSF）フェリチンに関し、さらに該認知力低下の診断または予後に応じて個体を1つ以上のクラスに階層化することに関する。より具体的には、本発明は、ADバイオマーカーとして遺伝子型と相関する脳内鉄レベルの決定による、被験者におけるアルツハイマー病（AD）の診断、予後およびモニタリング、または障害を有する個体の階層化に関する。
【背景技術】
【０００２】
オーストラリアへのアルツハイマー病（AD）というすでに大規模となっている重荷は、高齢化人口統計および有効な治療法がないことにより増加することが予測されている。ADに関与する既知の経路を標的とする薬物の最近の大規模な第III相臨床試験は、患者に有益ではなかった。アミロイドβ（Aβ）病変が蓄積し始めるにつれて、疾病の前臨床段階で疾患修飾治療が行われるべきであるという新たな合意が出ている。したがって、この疾患を効果的に治療するためには、ADの早期検出が必要である。ADよび認知力低下などのADをもたらす関連症状に対する臨床的に許容しうる予後バイオマーカーは現在のところ存在しない。
【０００３】
AD脳病変は、認知症状の発症の約20年前に発達を開始する。その結果、抗AD治療が、この前臨床期間に付与された場合に成功する可能性が最も高い。ADにおいて早期に認知力低下を予測するバイオマーカーを同定する必要がある。アミロイドPETイメージングは、高齢者の認知力低下の最も進んだバイオマーカーである。
PiB、フルテメタモール、またはフロルベタピル放射性リガンドによって同定される高いAβ負荷（Aβ+）は、高Aβ負荷（Aβ+）は、3年以上にわたる認知的に正常な（CN）被験者の記憶コンポジットスコアに対して〜0.5の平均効果サイズで認知低下を予測する。Aβイメージングは、認知力低下の敏感な予測因子（98％）であるが、研究では、60歳以上の認知障害のない人でも脳への高いAβ負荷（〜20-30％があることを繰り返し示している）。現在、アルツハイマー型認知症への認知力低下を引き起こすには他の因子が必要であることが明らかである。
【０００４】
死後の研究は、タウ沈着が認知障害を伴うAβ負荷よりも強く相関することを示した。認知症患者の脳脊髄液（CSF）におけるレベルが特異的に増加または減少するタウおよびAβなどの標的のレベルを測定することによって、ADを診断または特異的に診断する試みがなされている。
【０００５】
Aβおよびタウは、ADの脳アミロイドおよび絡み合ったプロテオパシー（proteopathy）を形成し、広範なバイオマーカー研究の対象となっている。皮質アミロイドおよび海馬タウの蓄積は、ADに特徴的であるが、臨床的に正常とみなされる人々においても実在しうる。
【０００６】
現在、Aβの予後的および診断的値は、それが生体液中で測定されるか陽電子放射断層撮影法（PET）イメージングによって測定されるかにかかわらず、それ自体、制限があることが理解されている。死後の研究では、正常な老化において脳のタウの蓄積が見出されており、上昇したCSFタウは最良の利用可能な予後バイオマーカーの1つであるが、臨床的にはまだ有用ではない。
【０００７】
上記に照らして、特にADなどの神経学的障害に至る認知力低下を同定する方法、または、疾患の進行を遅らせるのを助けることができる、特に疾患の発症時に認知力低下を提示する方法が必要とされている。ADを有することが疑われる被験者由来の生体サンプル中に存在するマーカーの信頼性のある測定によって前臨床または初期ステージの疾患を検出する能力は、また、疾患の治療および管理を早期に開始することも可能にする。現在の利用可能な診断方法および予後方法において、高価な装置、体験される不快感および副作用を必要とすることなく、低下の進行をモニターするために同じ試験を用いることができる。
【０００８】
検出可能な臨床的インジケーターの描画に先立って、臨床医が早期予後診断に到達するのを助けることができ、実際の確認脳画像検査の必要性を排除する試験が有用であろう。
【０００９】
臨床試験中であるAD用の疾患修飾療法では、リスクのある個体において可能な限り早期にその疾患の特徴を検出することができるバイオマーカーを同定するための社会的かつ経済的な要請があるので、抗AD治療は 疾患の負荷が軽度であり、機能的および不可逆的な認知喪失を予防または遅延させる可能性がある時点で実施されうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、認知力低下を有する患者の診断、予後診断またはモニタリングに使用することができ、患者の認知力低下と相関する、単純で効果的な尺度を提供することが望まれる。この早期発見は、早期に適切に治療されるとAD発症の遅延化を補佐しうるか、または認知力低下のために薬物治療を受けている患者の進行をモニタリングするのを補佐しうる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
ADの発症前に認知力低下を測定することにより、疾患の進行を遅らせる薬物による早期治療が可能となる可能性がある。
【００１２】
したがって、本発明の1つの態様では、患者の認知力低下のリスクを予測する方法であって、
患者の脳内鉄の第１レベルを決定すること；
脳内鉄の第１レベルを脳内鉄の基準レベルと比較すること；
脳内鉄の第１レベルと基準レベルとの差を決定すること；および
その差から患者の認知力低下のリスクを推定すること；
を含む方法が提供される。
【００１３】
出願人は、ADに至る認知能力低下の代替的/補助的な予後予測として脳内鉄の上昇を特定している。出願人は、脳の鉄負荷が、ADの長期的な転帰（認知症、脳萎縮）に、より確立された疾患のバイオマーカー（たとえば、CSFタウおよびAβ）と同様の影響を有することを示す。
【００１４】
本発明の1つの実施態様では、脳内鉄のレベルは、これらに限定されるものではないが、セロプラスミン、アミロイド前駆体タンパク質、タウ、フェリチン、トランスフェリン、およびトランスフェリン結合タンパク質などの鉄関連タンパク質レベルの測定値として決定されうる。脳内鉄を、フェリチンレベルによるか、またはMRIによるか、または当業者に利用可能な任意の方法によって決定するのが好ましい。好ましい実施態様において、脳内鉄のレベルは、脳脊髄液（CSF）フェリチンの測定値として決定される。
【００１５】
CSF中の主要な鉄結合タンパク質フェリチンを指標として、高い脳鉄負荷は、認知的に正常な被験者、軽度認知障害被験者およびAD被験者のコホートにおいて、6〜7年にわたる、より低い認知力および脳萎縮と関連付けられた。
【００１６】
本発明のもう1つの態様では、患者の認知力低下を診断する方法であって、
患者の脳内鉄の第１レベルを決定すること；
脳内鉄の第１レベルを脳内鉄の基準レベルと比較すること；
脳内鉄の第１レベルと基準レベルとの差を決定すること；および
その差から患者の認知力低下を推定すること；
を含む方法が提供される。
【００１７】
本発明のさらにもう1つの態様では、患者の認知力低下の進行をモニタリングする方法であって、
第１の時点で患者の脳内鉄のレベルを決定すること；
同じ患者の脳内鉄のレベルを、第１の時点の後の第２の時点で決定すること；
必要に応じて、第１および第２の時点の脳内鉄のレベルを基準レベルと比較すること；
第１および第２の時点のそれぞれにおける脳内鉄のレベルの差を決定すること；
第１および第２の時点の脳内鉄レベルの差から認知力低下の進行を推定すること；
を含む方法が提供される。
【００１８】
脳内鉄のレベルの変化は、さらに、患者の認知力低下の変化を評価することにおいて使用することができる。したがって、脳内鉄のレベルのモニタリングにおいて、一定期間にわたる認知力低下の存在をモニターすること、または患者の認知力低下進行を追跡することが可能である。
【００１９】
本発明のもう1つの実施態様では、認知力低下を決定するための方法は、さらに、
患者のアポリポタンパク質E（ApoE）のレベルを決定すること；
患者のApoEレベルをApoEの基準レベルと比較すること；
患者のApoEレベルおよび基準レベルと、患者の脳内鉄レベルおよび脳内鉄の基準レベルとの間の相関を決定すること；および
ApoEレベルと脳内鉄レベルとの間の相関から認知力低下のリスクを推定すること；
を含む。
【００２０】
出願人は、CSFフェリチンレベルがCSF ApoEレベルと顕著な関連を形成し、APOEε4アイソフォームを有する被験者が、ADリスク対立遺伝子なしの被験者と比較してCSFフェリチンの上昇を有することを見出した。
【００２１】
さらに別の実施態様では、本発明方法は、さらに、単独でまたは認知力低下を評価する方法と組み合わせて使用される、タウまたはAβ（これらに限定されるものではない）などの認知障害のバイオマーカーのレベルを測定することを含む。これらの追加のマーカーは、認知力低下のリスクを決定するための方法の精度を高めることができる。
【００２２】
本発明のもう1つの態様では、認知力低下の進行速度を減少させる方法であって、脳内鉄レベルを低下させることを含む方法が提供される。
【００２３】
本発明のもう1つの態様では、CSFフェリチンレベルを低下させることを含む、認知低下の進行速度を減少させる方法が提供される。
【００２４】
本発明のさらにもう1つの態様では、CSFフェリチンレベルを低下させることを含む、認知能力を高める方法が提供される。
【００２５】
脳内鉄またはCSFフェリチンレベルを低下させるために、デフェリプロンなどの鉄キレーターといったような化合物を使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ベースラインCSFバイオマーカーによって予測されるMCIから認知症への変換を示す。最小Cox比例ハザードモデル（第4表参照）に基づいて、変換は、（a）ApoE（フェリチン=6.5ng/mL、タウ/Aβ1-42= 0.69単位）および（b）タウ/Aβ1-42（フェリチン=6.5ng/mL、ApoE=7.2μg/mL）の各五分位値に対してプロットされる。グラフの右側の数字は、五分位の境界を示す。
【図２】ADへのMCIの変換のためのバイオマーカーとしてのCSFフェリチンの有用性を示す。ADへのMCIの変換のロジスティック回帰モデリングの受信者操作曲線（第4表参照）。（a）人口統計情報を含む基本モデル：年齢、性別、BMI、教育年数、APOEε4ステータス。（b）ベースモデル＋CSFフェリチン。（c）ベースモデル＋CSF ApoE。（d）ベースモデル＋tau/Aβ1-42。AUC-曲線下面積。
【図３】CSFフェリチンがApoEレベルと関連し、APOE遺伝子型に応じて変化することを示す。（a,b）モデリング CSF中のフェリチン。（補足の第１表のM3）。最小多重回帰は、CSF ApoEおよびAPOEε4を含んでいた。（a）APOEε4キャリアおよびε4ノンキャリアにおけるCSF ApoEおよびフェリチンレベルの散布図。遺伝子型は、ApoEとフェリチンとの関係に影響を与えなかった；しかしながら、遺伝子型はCSFフェリチンレベルと関連しており、したがって、ε4キャリアおよびε4ノンキャリアは別々にプロットされる。フルモデルの線形成分のR2は0.341であった（グラフ上に表示）。（b）APOE4キャリアおよびノンキャリアにおけるCSFフェリチンレベル（ANCOVA：P値=1.10x10-8）。（c）CSF ApoEの重回帰。APOEε4キャリアおよびノンキャリアにおけるApoEレベル（ANCOVA：P=2.50x10-09）。データは平均±標準誤差である。「n」はグラフのカラム中に示される。
【図４】CSFフェリチンレベルが認知状態を独立して予測することを示す。（a-c）。CSFの三分位として表されるベースラインADAS-Cog13スコアの重回帰（a）フェリチン （L＜5.5；H＞7.3 ng m-1）、（b） ApoE （L＜5.8；H＞7.8 mg ml-1）および（c）tau/Ab1-42 （L＜0.35；H＞0.76）。（d）CSFフェリチン三分位として表されるベースラインRVLTスコアの重回帰。最小限のモデルでは、ベースライン診断、性別、年齢およびAD CSFバイオマーカーについてデータが調整される。データは平均±標準誤差である。「n」はグラフのカラム中に示される。CN、認知正常；MCI、軽度認知障害。
【図５】ベースラインCSFバイオマーカーによって予測されるMCIから認知症への変換を示す。（a）最小コックス比例ハザードモデルに基づいたMCI生存率（第２表）、フェリチンの各五分位につき変換をプロットする（コホートの平均値を適用する：ApoE=7.27.2 mg ml-1、タウ/Ab1-42=0.69単位）。グラフの右側の数字は、五分位の境界を示す。この最小モデルは、CSFバイオマーカーのみを含んだ。（b）CSFバイオマーカーによる診断の平均年齢の変化。Coxモデルの各五分位境界のB50％生存期間のために用いられた月数を、その境界の単位値に対してグラフ化した。線形モデルの勾配を用いて、検体の各単位変化に対する変換年齢の変化を推定した（図5aおよび図1と比較）。（c-e）ADへのMCIの変換のロジスティック回帰モデリングの受信者操作曲線（第２表）。（c）年齢、性別、BMI、教育年数、APOEε4ステータスを管理する基本モデル。（d）ベースモデル＋ApoEおよびタウ/Ab1-42。（e））ベースモデル＋ApoE、タウ/Ab1-42およびフェリチン。AUC、曲線下面積。
【図６】CSFフェリチンレベルが独立して脳の構造変化を予測することを示す。（a-c）CSF（a）フェリチン （L＜5.5；H＞7.3 ng ml-1）、（b）ApoE （L＜5.8；H＞7.8 mg ml-1）および（c）タウ/Ab1-42 （L＜0.35；H＞0.76）の三分位に基づく縦方向の海馬の変化。（d-f） CSF（d）フェリチン、（e）ApoEおよび（f）タウ/Ab1-42 の三分位に基づく縦方向の側脳室の変化。これらの混合効果モデルは、年齢、性別、ベースライン診断、教育年数、APOEε4状態および頭蓋内容積について調整された。ベースラインでの三分位はすべてのモデルで有意に異ならなかったので、視覚的表示のためにベースライン値は各診断グループの調整された平均値で保持された。CN、認知的に正常；H、最高三分位；M、中間三分位；MCI、軽度認知障害；L、最低三分位。
【図７】フェリチンおよび他のバイオマーカーがAD提示に及ぼす影響の概略図を示す。（a）CSFフェリチンは、認知的に正常な被験者（点線）およびADを発症する被験者（実線）の経時認知能力において、CSFタウ/Ab1-42およびApoEに対して質的に異なる影響を有する。より高いCSFフェリチンレベルは、[α]ポイントによる、より低いベースライン認知状態（たとえば、RVLT）を伴い、ここで、[α]=Ln[フェリチン（ng ml-1）]*1 77である（第２表）。この効果は、[α]=[β,γ]であるように、経時的に一定である。その結果として、フェリチンは、ADへの変換の年齢において[δ]月数による、左へのシフトを引き起こし、ここで、[δ]=フェリチン（ng ml-1）*3である（図5b）。タウ/Ab1-42またはApoEのレベルは、ベースライン認知状態[ε]および[ε]＜[φ、γ]などの認知力低下率の両方と関連している。効果は、診断の年齢において、[η]月数による、シフトを引き起こし、ここで、[η]=ApoE （mg ml-1）*8またはtau/Ab1-42 （単位）*17である（図5b）。
【図８】APOE-ε4対立遺伝子の状態によって階層化されたベースラインCSF因子によって予測される認知的に正常な（CN）被験者における認知低下を示す。（A-B）ベースライン（A）CSFタウ/Aβ1-42比と、（B）CSFフェリチンとの関連性、7年以上にわたるAPOEε4キャリアおよびノンキャリアにおけるRAVLTスコアの年変化。（C-D）ベースライン（C）CSFタウ/Aβ1-42比と、（B）CSFフェリチンとの関連性、7年以上にわたるAPOEε4キャリアおよびノンキャリアにおけるADAS-Cog13スコアの年変化。（E）7以上にわたるCNε4被験者における安定または悪化（1年当たりRAVLT単位変化が≧1）認知を予測するためのベースラインCSFフェリチンのROC。曲線下面積（AUC）=0.96。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な記載
ADの発症前に認知力低下を測定することにより、早期治療介入を可能にして疾患の進行を遅らせることができる。前臨床期間に与えられた抗AD治療は、成功の可能性が最も高い。しかしながら、いくつかの場合、認知症やADは完全には発症せず、患者は、軽度認知障害（MCI）の症状を呈するか、または認知力低下を経験する認知的に正常な高齢者である。経時的に認知力低下を管理するには、進行を監視することが不可欠である。
【００２８】
したがって、本発明の1つの態様では、患者の認知力低下のリスクを予測する方法であって、
患者の脳内鉄の第１レベルを決定すること；
脳内鉄の第１レベルを脳内鉄の基準レベルと比較すること；
脳内鉄の第１レベルと基準レベルとの差を決定すること；および
その差から患者の認知力低下のリスクを推定すること；
を含む方法が提供される。
【００２９】
出願人は、ADに至る認知能力低下の代替的/補助的な予後予測として脳内鉄の上昇を特定している。この疾患中に、鉄が患部に蓄積するが、最近まで病因に及ぼすその影響についての議論があった。出願人は、ADの進行に対する脳内鉄の寄与を定量化している。出願人は、脳の鉄負荷が、ADの長期的な転帰（認知症、脳萎縮）に、より確立された疾患のバイオマーカー（たとえば、CSFタウおよびAβ）と同様の影響を有することを示す。これらの知見は、AD病因における鉄上昇を示唆する証拠が増えつつあることと合わせて、MRIおよび先進技術を用いたADのバイオマーカーとしての脳内鉄レベルの支持を提供している。
【００３０】
ADにおける鉄の上昇は、認知低下の未知の、推定的共決定因子である。近年まで、AD病因に対する鉄の寄与は不明であった。本出願人は、ここに、長期的なAD転帰における鉄の影響を明らかにする。
【００３１】
本発明は、認知能力の低下の程度として測定される認知力低下のリスクを評価することに関する。患者の認知能力が低下すると、忘却、焦点維持能力の低下、および問題解決能力の低下など、老化に関連する様々な症状を引き起こす変化が起こる。症状は、しばしば認知症やうつ病、さらにはアルツハイマー病などのより重篤な状態に進行する。
【００３２】
軽度認知障害（MCI）は、正常な老化の予想される認知力低下と、認知症のより重大な低下との中間段階である。MCIには、年齢に関連した通常の変化よりも大きい記憶、言語、思考、判断の問題が包含されうる。軽度の認知障害は、それらを経験する個人または他の人々に気づかれる程度の深刻な認知力の変化を引き起こすが、その変化は日常生活または独立した機能を妨げるほど深刻ではない。
【００３３】
現在、認知症、認知障害および/または情動障害および/または行動機能障害、アルツハイマー病および関連する認知症の領域における臨床診断は、一般に、記憶および/または心理検査を含む神経学的、神経心理学的および精神医学的評価を含む病歴および身体検査の評価、言語失調症および/または他の巣症状認知障害（たとえば、失行症、計算不能症および左右障害）の評価、障害のある判断および一般的な問題解決の困難性の評価、進行性の消極性から顕著な激越にわたる人格変化の評価、ならびに関連する脳領域の磁気共鳴イメージング（MRI）または陽電子放射断層撮影（PET）などの神経イメージングモダリティに由来する脳容積または活動測定値の測定などのさまざまな生物学的、放射線学的および電気生理学的試験を必要とする。
【００３４】
本明細書で使用される認知力低下の言及は、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病（AD）へのMCIの変換、およびADを含む。しかしながら、本発明は、認知症、認知障害および/または情動障害および/または行動機能障害、アルツハイマー病および関連する認知症の領域にも広く関係する。「認知力低下（cognitive deterioration）」という用語は、「認知力低下（cognitive decline）」と互換的に使用されうる。
【００３５】
本明細書で使用される用語「認知的に正常な（CN）患者」は、有意な認知障害または日常生活の障害のない対象を意味する。認知力低下の疑いがある、または認知力低下の危険性がある患者を、CN患者と比較することができる。これは、認知的に正常であるが、脳におけるアミロイド負荷（好ましくはPETイメージングによって決定される）などの神経学的疾患を示すマーカーの変化したレベルを示す患者を含む。CN患者の特徴は、正常からの劣化を判定できる基準レベルまたは基準値を提供するのを補佐する。CN患者が、Apoε4対立遺伝子を保有しないのが好ましい。
【００３６】
認知力低下のリスクは、基準レベルを提供するCN患者と比較して評価されうる。認知力低下および/またはアルツハイマー病の危険性がある患者には、家族歴、遺伝的脆弱性および欠損対立遺伝子を有する患者が含まれる。彼らは脆弱であり、認知症およびADに至るより迅速な認知力低下に罹りやすい遺伝子を有する。
【００３７】
本発明方法のいずれかに従って試験および/または治療することができる患者として、うつ病の病歴を有する認知機能障害、うつ病の病歴を有する認知機能障害、双極性疾患または統合失調性感情障害を伴う認知機能障害、全般性不安障害を伴う認知機能障害、注意欠陥を伴う認知機能障害、ADHD障害または注意欠陥障害およびADHD障害の両方を伴う認知機能障害、失読症、発達遅延、学校調整反応（school adjustment reaction）、アルツハイマー病、健忘性軽度認知障害、非健忘性軽度認知障害、神経イメージングまたは臨床検査による白質病を有する認知障害、前頭側頭型認知症、65歳未満の認知障害、10nmol/l未満の血清ホモシステインレベルを有する患者、および高血清トランスフェリンレベルを有する患者（最上位集団四分位）が挙げられる。
【００３８】
本明細書中で使用される用語「個体」、「被験者」および「患者」は、たとえば、インビボモデル（たとえば、薬物毒性を試験するための）において有用な、一般にマウス、サル、イヌ、ネコ、有蹄動物など（たとえば、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、霊長類など）を示す非ヒト動物との関連において、他に示されない限り、一般に、ヒト被験者を示す。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「決定する（determining）」、「測定する（measuring）」、「評価する（evaluating）」、「評価する（assessing）」および「アッセイする」は、一般に、任意の形態の測定を示し、生物試料中に要素が存在するか否かを決定することを含む。これらの用語は、生物試料の試料処理および形質転換工程を必要とする定量的および/または定性的決定の両方を含む。評価は、相対的であっても絶対的であってもよい。「のレベルを決定する」という語句は、存在するものの量を決定すること、および存在するか不在であるかを決定することを含むことができる。
【００４０】
脳内鉄のレベルは、認知力低下が疑われる患者または別の期間の同じ患者から決定されてもよい。あるいは、基準値または基準レベルまたは対照レベルを提供する認知力低下を有さないことが知られている患者から、脳内鉄のレベルを決定することができる。これは、健常対照または認知的に正常な個体（CN）由来であるのが好ましい。
【００４１】
本明細書中で使用される「基準値」または「基準レベル」は、互換的に使用されてもよく、絶対値；相対値；上限および/または下限を有する値；値の範囲；平均値（average value）；中央値、平均値（mean value）、縮小した重心値、または特定の対照値またはベースライン値と比較した値を含む群から選択されてもよい。それが、問題の生物試料または試験試料と並行して調製された既知の試料から得られる所定の基準値であるのが好ましい。基準値を決定する際に他の統計的変数を使用してもよいことを理解されたい。基準値は、個々のサンプル値、たとえば、認知力低下を伴うが、より早い時点で個体からのサンプルから得られた値、または患者もしくは試験される個体以外の障害を有する別の患者由来の試料から得られた値、または「正常」または「健常」個体、すなわち認知力低下であると診断されない個体か、そうでなければCN個体から得られた値などに基づくことができる。基準値は、AD患者または認知力低下患者、正常個体などの多数の基準試料に基づくか、または試験される試料を含むか、または含まない試料のプールに基づくことができる。
【００４２】
診断および予後の方法については、「基準レベル」は、典型的には、認知力低下に悩まされている集団から得られたレベルの平均などの所定の基準レベルである。場合によっては、所定の基準レベルは、年齢を適合させた集団から得られたレベル（たとえば、平均値または中央値）に由来する。本明細書に開示されるいくつかの例では、年齢を適合させた母集団は、非ADまたは神経変性疾患個体を有する個体を含む。
【００４３】
認知力低下の予後または認知力低下のリスクを提供する方法については、基準レベルは、同時に決定される基準レベル（たとえば、試験される試料を含む試料のプールに由来する基準値）も企図されるが、特定の診断について「正常」であると一般に決定されたレベル（たとえば、認知力低下と診断されなかった年齢を適合させた個体の平均レベル、またはAD以外の認知力低下と診断された年齢を適合させた個体の平均レベル、および/または健康な年齢を適合させた個体の平均レベル）と見なされうる。
【００４４】
基準レベルはまた、試験間の変動性を減少させるために、第１のレベルおよび基準レベルの測定値を標準化するための一定の内部対照の尺度であってもよい。内部対照は、赤十字などの血液バンクの標本であってもよい。
【００４５】
したがって、本発明方法を実施する際に、認知力低下個体から一組の試料を得ることができ、認知力低下を有さない個体から一組の試料を得ることができる。
【００４６】
脳内鉄の測定されたレベルは、脳内の結合または非結合の鉄のレベルの一次測定値であってもよく、または鉄の二次測定値（鉄の量が決定されうるが、必ずしも推定されるとは限らない測定値（質的データ））、たとえば、フェリチンなどの鉄関連タンパク質レベルの測定値であってもよい。したがって、フェリチンレベルなどの鉄関連タンパク質レベルを測定する場合、未結合の細胞性鉄を排除するために試料を加工してもよい。
【００４７】
本発明の1つの実施態様では、脳内鉄のレベルは、セロプラスミン、アミロイド前駆体タンパク質、タウ、フェリチン、トランスフェリン、トランスフェリン結合タンパク質などの鉄関連タンパク質レベルの測定値として決定することができる。脳内鉄が、フェリチンレベルによって、またはMRIもしくは超音波検査によって、または当業者に利用可能な任意の方法によって決定されるのが好ましい。
【００４８】
したがって、本発明は、MCIを有する正常な人々および個人における認知低下率を予測するための、APOE遺伝子型、CSFタウ、AβおよびApoEレベルに関する情報と併用した、鉄関連タンパク質レベル（たとえば、セルロプラスミン、アミロイド前駆体タンパク質、タウ、フェリチン、トランスフェリン、トランスフェリン結合タンパク質など）の使用を提供する。
【００４９】
フェリチンは、身体の鉄貯蔵タンパク質であり、AD脳組織で上昇する。培養系において、グリアによるフェリチンの発現および分泌は、細胞の鉄レベルに依存する。CSF中のフェリチンレベルは、おそらく脳内の鉄レベルを反映し、臨床的有用性を有する可能性がある。
【００５０】
したがって、好ましい実施態様において、脳内鉄のレベルは、脳脊髄液（CSF）フェリチンの測定値として決定される。したがって、本発明は、好ましくは軽度の認知障害（MCI）の症状を示す個体における認知力低下率を予測するための、（APOE遺伝子型、CSFタウ、AβおよびApoEレベルに関する情報と併用した）CSFフェリチン濃度の測定値の使用を提供する。
【００５１】
もう1つの実施態様において、本発明は、症状を提示しない個体（正常）における認知力低下率を予測するための、（好ましくは、APOE遺伝子型、CSFタウ、AβおよびApoEレベルに関する情報と併用した）CSFフェリチン濃度の測定値の使用を提供する。
【００５２】
CSF中の主要な鉄結合タンパク質フェリチンを指標として用いて、高脳内鉄負荷は、認知的に正常な被験者（n=91）、軽度の認知障害の被験者（n=144）およびADの被験者（n=67）のコホートで6〜7年にわたる、認知力の低下（たとえば、ADAS-Cog；図5a）および脳萎縮（たとえば、側脳室-構造MRI；図5b）と関連していた。これらおよび他のAD転帰に対するCSFフェリチンの影響の大きさは、タウ/Aβ42比（ADのためのゴールドスタンダードCSFバイオマーカー）に匹敵する。CSFフェリチンは、研究期間にわたって、ADへの進行を独立して予測し（図5c）、タウ/Aβの予測可能性を改善した。フェリチンの各1 ng/mlの増加は、3ヶ月までの前向き診断（forward diagnosis）をもたらした。このように、本出願人は、ADにおける脳内鉄の役割を実証し、AD予後の標的として脳内鉄を提示している。
【００５３】
本発明方法の実施において、脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルが、同定されるのが好ましい。当業者には理解されるように、脳内鉄、好ましくはフェリチンまたはより好ましくはCSFフェリチンのレベル（たとえば、濃度、発現および/または活性）は、定性または定量されうる。好ましくは、脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルは、DNA、RNA、脂質、炭水化物、タンパク質、金属またはタンパク質発現のレベルとして定量される。
【００５４】
脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルを同定するために、多数の定性的および定量的技術を使用することができることは明らかであろう。これらの技術として、2D DGE、多重反応モニタリング質量分析（MRM-MS）などの質量分析（MS）、リアルタイム（RT）-PCR、核酸アレイ；ELISA、酵素アッセイによるか、さまざまな免疫学的方法によるか、またはキャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、超拡散クロマトグラフィー、二次元の液相電気泳動（2-D-LPE）などの生化学的方法によるか、あるいはゲル電気泳動もしくはMRIにおけるそれらの移動パターンによる、機能分析が挙げられる。
【００５５】
しかしながら、脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルを同定するために使用される適切な技術が、分子の特性に依存することは当業者には明らかであろう。たとえば、分子が鉄である場合、MRIが、分子のレベルを定量化するために使用されうる。
【００５６】
もう1つの例では、フェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンの存在を決定する場合、フェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルは、フェリチンに特異的なタグ付き抗体などの二次検出試薬を利用するELISA技術によって決定されうる。精度を高めるために、患者から採取したCSFサンプルを、鉄レベルを検出する前に、他の非鉄結合分子、またはフェリチン以外の他の鉄結合分子を除去するための前処理をしてもよい。したがって、サンプルは、評価前に処理されてもよい。
【００５７】
鉄結合分子がタンパク質である非限定的な例において、タンパク質のレベルは、イムノアッセイによっても検出されうる。イムノアッセイは、抗原（すなわち、タンパク質）に特異的に結合する抗体を使用するアッセイとして、当業者によって注目されるであろう。したがって、イムノアッセイは、抗体に対するタンパク質の特異的結合の検出によって特徴付けられる。タンパク質を検出するためのイムノアッセイは、競合的または非競合的のいずれであってもよい。非競合イムノアッセイは、捕捉された検体（すなわちタンパク質）の量を直接測定するアッセイである。競合アッセイにおいて、試料中に存在する検体（すなわち、タンパク質）の量は、試料中に存在する検体（すなわち、タンパク質）によって捕捉剤（すなわち抗体）から置換された（または競合された）添加された（外因性の）検体の量を測定することによって、間接的に測定される。
【００５８】
競合アッセイの一例では、既知の量の（外因性の）タンパク質を試料に加え、次いで、試料を抗体と接触させる。抗体に結合した（外因性の）タンパク質の添加量は、外因性タンパク質を添加する前の試料中のタンパク質の濃度に反比例する。もう1つのアッセイでは、たとえば、抗体は、それらが固定される固体基板に直接結合されうる。次いで、これらの固定化された抗体は、試験試料中に存在する目的のタンパク質を捕捉する。他の免疫学的方法として、流体またはゲル沈殿反応、免疫拡散（一重または二重）、凝集アッセイ、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、リポソームイムノアッセイ、補体固定アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイまたは免疫PCRが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
フェリチンは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）または当業者に利用可能な任意の方法によって簡便に測定されうる。
【００６０】
したがって、ADなどの障害をもたらす認知力低下を有するか、または発症する可能性のある個体の指標を提供することができる脳内鉄レベルは、当業者が利用可能な任意の方法によって、フェリチン、最も好ましくはCSFフェリチンを測定することによって、測定されうる。
【００６１】
CSFフェリチンは、通常、腰椎穿刺（脊髄タップ）によって脳脊髄液から得られるCSFサンプル中で測定される。一例として、CSFはポリプロピレンチューブまたはシリンジに集められ、その後、遠心分離ステップを経ずにポリプロピレン移送チューブに移され、次いで、収集後1時間以内にドライアイス上で凍結される。それらは、直ちに分析されてもよく、あるいは、-80℃で凍結させてもよい。CSFフェリチンタンパク質レベルは、Myriad Rules Based Medicineプラットフォーム（Human Discovery MAP、v1.0）を用いて決定された。
【００６２】
脳内鉄レベルは、試験される被験者または個体からの脳内鉄のレベルを特異的に決定することができる任意の利用可能な測定技術を用いて測定することができる。測定は、脳内鉄のレベルが基準試料の基準値を上回るか下回っているかを示すことができさえすれば、定量的であっても定性的であってもよい。
【００６３】
もう1つの好ましい実施態様では、脳内鉄のレベルは、MRI、場合によっては超磁場7T MRIまたは臨床3T MRI画像によって決定される。
【００６４】
鉄をMRIでインビボで定量化する3つの主な方法が存在する。1）T2*マップ：鉄の存在は、プロトンのコヒーレントスピンを局部的に乱し、T2*を短縮するが、これは、T2*マッピング（複数の勾配エコー、GREを用いて）で画像化されうる。2）QSM：鉄の存在は、勾配エコーイメージングを用いてもマッピングされうる組織の感受性に影響を及ぼす。3）磁場依存緩和速度増加（FDRI）：2つの異なる磁場強度（3Tおよび7T）で収集されたT2wを用いることにより、鉄レベルを推定することができる。
【００６５】
3T以下のMRIを用いたAD（以下参照）および他の疾患における皮質鉄の断面増加を報告する多数の文献があるが、鉄蓄積を他の組織変化と区別するMRIの能力に関する警告があるので、7Tは鉄含有量を推測するために3Tよりも大きな利点を有する。1つは、より高い信号対雑音比であり、これは、空間分解能を高め、および/または走査時間を短縮するために使用されうる。7Tは、磁化率に対する感度を高めるというさらなる利点を有する。磁場強度が増加すると、鉄感受性画像のコントラストが増強される。これは、グラディエントエコー位相画像において実証されている。分解能の向上と、感受性-感度とを組み合わせることが、AD40-42パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患において鉄を定量するための7Tの使用をもたらしている。研究は、7Tの鉄感度の増加に起因する海馬および皮質層の視覚化の向上を示している。7Tでの鉄に対する予想される増加した感度は、分散を減少させ、統計的検出力を改善しうる。3Tを超える、7Tのより高い空間分解能は、相における皮質層形成の可視化を可能にし、皮質層間の鉄沈着の調査を容易にする。
【００６６】
ここ20年の間に、MRIが脳内鉄の含有量を測定するために使用され、高齢化脳における鉄の上昇を明らかにしているが、それはADにおいて誇張されている。横断的研究では、自覚障害者およびAD患者の脳内鉄濃度と記憶機能との間に逆相関が存在するが、AD転帰におけるMRIによって測定された鉄の影響における長期的研究では存在しなかった。出願人は、高い脳内鉄含有量が、より早期の年齢での発症につながることを明らかにする。
【００６７】
好ましくはCSFフェリチンを介して測定されるように、基準レベルと比較して脳内鉄含有量が高いことが認知力低下につながるという知見に基づいて、本発明においては、脳内鉄およびCSFフェリチンの増加が、患者と基準レベルとの間の差につながると考えられる。この差は、認知力低下のリスクを推測するのに役立つ。
【００６８】
脳内鉄レベルにおける患者と基準レベルとの間の差が上昇であることは、認知力低下のリスクが高いことを示す。上昇の程度は、認知力低下のリスクの診断または評価が存在するかどうかの指標を提供する。上昇が小さいことはリスクを示し、上昇が大きいことは認知力低下を示す可能性がある。患者と基準レベルとの間の上昇が増加は、認知力低下のリスクが増加することを示す。
【００６９】
簡潔にするために、本明細書に含まれる説明のいくつかは、ADに関連して行われる。しかしながら、当業者であれば、本発明が予後または診断として、または、これらに限定されるものではないが、多発性硬化症、脳性麻痺、パーキンソン病、神経障害（末梢神経に影響を与える状態）、認知症、レビー小体型認知症（DLB）、多発性梗塞性認知症（MID）、血管性認知症（VD）、統合失調症および/またはうつ病、認知障害および前頭側頭型認知症などの他の神経障害の進行の診断/予後および/またはモニタリングの支援として使用されうることを理解することができると考えられる。
【００７０】
本発明のもう1つの態様では、患者の認知力低下を診断する方法であって、
患者の脳内鉄の第１レベルを決定すること；
脳内鉄の第１レベルを脳内鉄の基準レベルと比較すること；
脳内鉄の第１レベルと基準レベルとの差を決定すること；および
その差から患者の認知力低下を推定すること；
を含む方法が提供される。
【００７１】
高脳内鉄負荷が、より低い認知に関連するという出願人の知見は、認知力低下を診断するために使用することができる。患者のレベルと基準レベルとの間の上昇である脳内鉄レベルの差は、認知力低下の診断を示す。上昇の程度は、認知力低下の重症度の指標となる。上昇が小さいことは、リスクを示す可能性があり、上昇が高いことは、認知力低下の診断を示す可能性が高い。患者のレベルと基準レベルとの間の上昇の増加は、認知力低下の増加を示す。
【００７２】
診断が、可能性のある疾患または障害を決定または同定しようとする方法、およびこの方法によって到達された意見を示すということは、当業者であれば理解するであろう。
【００７３】
さらに、アミロイド負荷またはアミロイドレベルを決定して、高い新皮質アミロイドの存在を確認するなど、患者の認知力低下の肯定的な診断を正当であるかどうかを、検証または確認することができる。互換的に使用されることが多い用語であるアミロイド負荷またはアミロイドレベル、またはアミロイドおよびアミロイドフラグメントの存在は、脳に沈着した脳アミロイドベータ（Aβまたはアミロイド-β）の濃度またはレベルを示し、アミロイドβペプチドは、（老人性）プラークの主要構成成分である。
【００７４】
患者は、また、PETおよびMRIなどのイメージング技術を使用して、またはPET（他には、PiB-PETと呼ばれる）と共に使用される場合にはPiBなどの診断ツールの助けを借りて、認知力低下に対して陽性であると確認されうる。認知力低下陽性の患者が、PiB陽性であるのが好ましい。患者が、高い新皮質アミロイド負荷（PiB陽性）に対応する標準的な取り込み値比（SUVR）を有するのがより好ましい。たとえば、現行では、SUVRが1.5で脳内で高レベルを反映することができ、1.5未満で脳内の新皮質アミロイド負荷の低レベルを反映する可能性があると考えられている。当業者は、高レベルまたは低レベルの新皮質アミロイド負荷とみなされるものを決定することができるであろう。当業者には理解されるように、患者は、また、CSFからアミロイドβおよびタウを測定することによって、神経学的疾患について陽性であることを確認されうる。
【００７５】
さらに、脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンの診断能力を特徴付ける際に、当業者はこれらのバイオマーカーの診断カットオフを計算し得る。このカットオフは、値、レベルまたは範囲である。診断カットオフは、認知力低下を判定または特定しようとする過程を支援する価値レベルまたは範囲を提供するべきである。
【００７６】
たとえば、脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルは、レベルが診断カットオフを上回っている場合、認知力低下の診断でありうる。あるいは、当業者には理解されるように、脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルは、レベルが診断カットオフを下回る場合、認知力低下の診断でありうる。
【００７７】
脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンの診断カットオフは、当業者に知られている多くの統計分析ソフトウェアプログラムを用いて導き出すことができる。一つの例として、診断カットオフを決定する一般的な技術は、正常な個体の平均を決定すること、および、たとえば、規定された感度および特異度値を用いる±SDおよび/またはROC分析を用いることを含む。典型的には、80％を超える感度および特異度が許容されうるが、これは各疾患の状況に依存する。診断カットオフの定義は、テストが開発された臨床設定とは異なる臨床設定で使用される場合には再導入が必要となる場合がある。このコントロールを達成するために、個体を測定して平均+/-SDを決定する。当業者には理解されるように、対照個体から得られた測定値の外側であるか、または測定値から離れて+/-2 SDを用いて、正常範囲外の個体を同定することができる。正常範囲外の個体は、疾患に対して陽性とみなすことができる。次いで、統計的試験によって古い診断基準がまだ適用可能であると判定されるかどうかを決定するために、新しい臨床設定で得られた値を歴史的値と比較する。疾患状態を有することがわかっている個体も分析に包含されるであろう。疾患状態および対照状態サンプルの両方が利用可能な状況において、選択された感度および特異度を有するROC分析方法が、認知力低下を示す診断値を決定するために、典型的には80％、選択されうる。診断カットオフの決定を、また、当業者に知られている統計モデルを使用して決定することもできる。
【００７８】
本発明方法における脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンの使用は、当該技術分野において神経学的疾患の存在の予後評価を提供することにおいて知られている神経学的疾患の臨床評価の他の方法と組み合わせて使用することもできると考えられる。
【００７９】
決定的な診断は、PETやMRIなどのイメージング技術を介して、PETとともに用いる場合PiBなどの診断ツールの支援とともに（PiB-PETとも呼ばれる）、正当であるかどうかを検証または確認されうる。
【００８０】
本発明方法を適用する際には、患者における認知力低下の存在に関する臨床的または近臨床的（near clinical）決定を下すことができ、それは最終的な診断に関して決定的であってもなくてもよいとみなされる。
【００８１】
同様に、本発明方法は、認知力低下の予後の支援を提供する際に使用することができ、認知力低下の存在または性質に関する前臨床判定の評価を支援すると考えられる。これは、哺乳動物が認知力低下を発症する可能性が有意に増強されているという知見を得ることを示すとみなされるであろう。
【００８２】
脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチン（APOE遺伝子型、CSFタウ、AβおよびApoEレベルに関する情報と併せて）のレベルの評価と組み合わせての認知力低下の存在についての臨床的決定が、記憶および/または心理テスト、言語障害および/または他の巣症状認知障害（たとえば、失行症、計算不能症および左右障害）の評価、判断力の低下および一般的な問題解決の困難性の評価、漸進的な受動性から顕著な興奮までの人格変化の評価などの評価（必ずしもこれらに限定されない）に関連すると考えられることが、当業者には理解されるであろう。本発明方法は、また、神経学的疾患の存在の予後評価を提供する際に、当技術分野で公知の神経学的疾患の臨床評価の他の方法と組み合わせて使用されうることが企図されるであろう。
【００８３】
認知力低下の疑いのある患者の認知力低下の決定的な診断は、PETやMRIなどのイメージング技術を用いて、あるいは、たとえばPETと併用した場合のPiBなどの診断ツールの支援を受けて（PiB-PETとも呼ばれる）、正当であるかどうかを検証または確認されうる。したがって、本発明方法は、事前スクリーニングまたは予後様式で患者の認知力低下を評価するために使用することができ、正当なものであれば、たとえば、PiB-PETを用いてさらなる確定診断を行うことができる。
【００８４】
本発明のさらにもう1つの態様では、患者の認知力低下の進行をモニタリングする方法であって、
第１の時点で患者の脳内鉄のレベルを決定すること；
同じ患者の脳内鉄のレベルを、第１の時点の後の第２の時点で決定すること；
必要に応じて、第１および第２の時点の脳内鉄のレベルを基準レベルと比較すること；
第１および第２の時点のそれぞれにおける脳内鉄のレベルの差を決定すること；
第１および第２の時点の脳内鉄レベルの差から認知力低下の進行を推定すること；
を含む方法が提供される。
【００８５】
脳内鉄のレベルの変化は、さらに、患者の認知力低下の変化を評価することにおいて使用することができる。したがって、脳内鉄のレベルのモニタリングにおいて、一定期間にわたる認知力低下の存在をモニターすること、または患者の認知力低下進行を追跡することが可能である。
【００８６】
したがって、患者の脳内鉄のレベルの変化を用いて認知機能および認知力低下を評価し、認知力低下の予後または診断を診断または支援し、および/または患者におけるADへの進行をモニターする（たとえば、患者における進行を追跡する、および/または患者における医療または外科的治療の効果を追跡する）ことができる。
【００８７】
同じ哺乳動物についての、以前に採取されたサンプルと比較して変化したレベルに関連することも企図される。したがって、CNサンプルなどの基準レベルと比較する必要はないかもしれない。これに関して、基準レベルは、より早い時点における脳内鉄のレベルであってもよい。
【００８８】
鉄内脳のためのレベルは、また、複数の時点で患者から得られうることも企図される。このような連続的なサンプリングは、患者の認知力低下の進行を監視することに関する本発明方法を介して実現可能であると考えられる。連続的なサンプリングは、毎月、年4回（すなわち、3ヶ月毎）、半年毎、毎年、2年毎、またはそれほど頻繁でない任意の所望のタイムライン上で実行されうる。測定されたレベルと既定レベルとの間の比較は、新しいサンプルが測定されるごとに実行されてもよく、またはレベルに関するデータがより頻繁でない分析のために保持されてもよい。
【００８９】
もう1つの実施態様では、脳内鉄レベルの差は、基準レベルに対して、第２の時点における鉄レベルが第１の時点よりも高くなるような第１および第２の時点の間の上昇であり、認知力低下の進行が進んだことを示す。出願人は、比較的低いフェリチン（＜6.6ng/ml）を有する患者は、近い将来に悪化しないことを明らかにしている。このことは、ε4+ve被験者の30％がADを発症しない理由を説明する可能性がある。逆に、この閾値を超えるフェリチンの各単位増加から、より急速な劣化が予測された。
【００９０】
本発明方法は、哺乳動物に投与される治療の効果をモニタリングするために追加的に使用されることが可能であり、治療モニタリングおよび患者管理とも呼ばれる。脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルの変化を用いて、薬物治療に対する患者の応答を評価することができる。このようにして、治療の開始後に患者の脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルを調べることにより、新しい治療計画を開発することもできる。
【００９１】
未結合の鉄を除去するためにフェリチンレベルの評価に先立って、CSFサンプルを前処理してもよい。
【００９２】
したがって、本発明方法は、たとえば、神経学的疾患の特定の治療の評価のための臨床研究のモニタリングを支援することができる。たとえば、化合物は、対照またはCN患者に認められるレベルに対して、認知力低下を有する患者における脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルを正常化する能力について試験されうる。治療された患者において、化合物は、脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルを、対照またはCN患者に見られるレベルまたはその近くのレベルで維持するその能力について試験されうる。
【００９３】
本発明のもう1つの実施態様では、認知力低下を決定するための方法は、さらに、
患者のアポリポタンパク質E（ApoE）のレベルを決定すること；
患者のApoEレベルをApoEの基準レベルと比較すること；
患者のApoEレベルおよび基準レベルと、患者の脳内鉄レベルおよび脳内鉄の基準レベルとの間の相関を決定すること；および
ApoEレベルと脳内鉄レベルとの間の相関から認知力低下のリスクを推定すること；
を含む。
【００９４】
出願人は、CSFフェリチンレベルがCSF ApoEレベルと顕著な関連を形成し（図3a）、APOEε4アイソフォームを有する被験者が、ADリスク対立遺伝子なしの被験者と比較してCSFフェリチンの上昇を有することを見出した（図3b）。死後前頭前野皮質におけるApoEおよびフェリチンmRNAレベルの分析は、このCSFタンパク質研究（年齢に対して修正された、遺伝子型未知）と類似の強度および方向の関連を確認する。APOEε3およびε4ノックインマウスの脳内鉄含量の測定は、また、ε4ノックインマウスは、WT（+32％; 3ヶ月齢マウス）と比較して鉄が上昇していることを明らかにした。
【００９５】
特に、HFE（ヘモクロマトーシスを引き起こす）の鉄蓄積変異は、APOEε4とのエピスタチック相互作用を有し、ADリスクを増大させ、病状発症を5.5年早める。出願人は、APOEε4が、CSFフェリチンと認知提示との関連に影響を与えることを明らかにする。長期的記憶能力の混合効果モデル（RAVLT；7年間）では、上昇したCSFフェリチンから、APOEε4キャリアでは認知低下の加速が予測されたが（p=0.003）、非キャリアでは予測されなかった（図5）。したがって、APOEε4対立遺伝子を有することは、脳内鉄状態のレポーターとしてCSFフェリチンを用いて測定されるように、脳内鉄への上昇を引き起こし、鉄媒介損傷に対する脆弱性を増加させる。
【００９６】
また、出願人は、正常な人々の認知低下を7年以上予測するに際し、CSFフェリチンを確立されたADリスク変数であるAPOE-ε4、CSFタウ/Aβ1-42およびApoEと組み合わせることを示す。
【００９７】
したがって、出願人によるこれらの知見は、認知力低下を評価するための方法を改善するために適用されうる。好ましい実施態様において、認知力低下は、CSFフェリチンを用いて脳内鉄を測定することによって決定される。これらの知見から、APOEε4対立遺伝子および高い鉄含量を保有する患者は、認知力低下の傾向がある。
【００９８】
さらなる実施態様において、脳内鉄またはCSFフェリチンレベルは、正常人における認知低下を予測する際に、APOE-ε4、CSFタウ/Aβ1-42 およびApoEなどの確立されたADリスク変数と組み合わせられうるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
したがって、脳内鉄とAPOEε4対立遺伝子との間の正の相関は、認知力低下または衰退のリスクの増加を示しうる。
【０１００】
さらにもう1つの実施態様では、本発明方法は、アミロイドβペプチド、タウ、ホスホタウ、シヌクレイン、Rab3a、Aβおよび神経糸タンパク質などの認知障害のバイオマーカーのレベルを決定することをさらに含む。これらの追加のバイオマーカーは、単独で、または認知力低下を評価するための方法と組み合わせて使用されうる。本発明方法は、認知力低下を決定するための脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのみを評価することに限定される必要はない。これらの追加のマーカーは、認知力低下の危険性を判定し、評価における偽陽性を減少させる方法の精度を高めることができる。
【０１０１】
本発明のもう1つの態様において、本発明は、認知力低下の進行速度を減少させる方法であって、脳内鉄レベルを低下させることを含む方法を提供する。
【０１０２】
この方法は、正常な人々が、より高いCSFフェリチンレベルを有する場合に、より悪い認知能力を有するという知見に基づいている。出願人は、CSFフェリチンレベルを測定することによって、脳内鉄の測定値と認知力低下と相関させた。理論に縛られることなく、脳内鉄を低下させることは、認知力低下に関連するCSFフェリチンレベルを低下させる。
【０１０３】
本発明のもう1つの態様において、CSFフェリチンレベルを低下させることを含む、認知力低下の進行速度を減少させる方法が提供される。
【０１０４】
本発明のさらにもう1つの態様において、CSFフェリチンレベルを低下させることを含む、認知能力を高める方法が提供される。
【０１０５】
脳内鉄またはCSFフェリチンレベルを低下させるために、デフェリプロンなどの鉄キレーターなどの化合物を使用することができる。しかしながら、同様に脳内鉄またはCSFフェリチンを低下させる他の化合物も本発明の範囲に含まれる。
【０１０６】
患者への鉄キレート化剤の投与は、脳またはCSF中の鉄のレベルをCSFフェリチンの形態で低下させることができる。これは、認知力低下を示す患者に特に有効である。高いCSFフェリチンレベルは高い脳内鉄と相関するので、Apoε4対立遺伝子を有する患者にもこの治療の恩恵を受けるであろう。しかしながら、アポE4を保有していないCN患者もまた、CSFフェリチンレベルの脳内鉄を低下させることから恩恵を受けることができる。
【０１０７】
鉄キレート剤または鉄低下剤の投与は、静脈内、皮下、非経口、経口または局所的などの、薬物が治療される領域にアクセスして鉄レベルを低下させることができる任意の適切な経路によって行うことができる。
【０１０８】
改善は、本明細書に記載の認知力低下を評価する方法によって決定されうる。
【０１０９】
さらなる態様において、本発明は、認知力低下について患者における診断および/または予後のために、または認知力低下の危険性がある患者を同定するために使用されうるキットを提供する。
【０１１０】
したがって、本発明は、認知力低下についての患者の診断または予後のため、または認知力低下のリスクがある患者を同定するため、あるいは認知力低下を有する患者に投与される療法の効果をモニタリングするために、本発明の方法で用いることができるキットを提供する。
【０１１１】
考慮されるキットは、これらに必ずしも限定されるものではないが、脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルを決定するために特異的なポリペプチド、タンパク質および/またはオリゴヌクレオチドを含むことができる試薬のパネルを含むことができる。したがって、被験者が認知力低下を有することを示すために、脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルを決定するために使用されうるキットの試薬は、これらに限定されるものではないが、2D DGE、多重反応モニタリング質量分析（MRM-MS）などの質量分析（MS）、リアルタイム（RT）-PCR、核酸アレイ；ELISA、機能アッセイ、酵素アッセイ、さまざまな免疫学的方法、またはキャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、ハイパー拡散クロマトグラフィー、二次元液相電気泳動（2-D-LPE）またはゲル電気泳動におけるそれらの移動パターンなどの生化学的方法などの脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンを検出する方法のいずれかにおいて使用することができる。たとえば、脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンを認識する任意の抗体が使用されうることが想定される。
【０１１２】
好ましい実施態様では、本発明は、認知力低下に対する患者のスクリーニング、診断または予後のための方法で使用するための試薬キットであって、少なくとも脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルを定量するための試薬のパネルを提供するキットを提供する。
【０１１３】
さらなる実施態様では、キットはさらに、哺乳動物のサンプル中の脳内鉄、好ましくはフェリチン、またはより好ましくはCSFフェリチンのレベルを定量するための試薬のパネルとの組み合わせにおける使用のための、これらに限定されるものではないが、APOE-ε4、CSFタウ/Aβ1-42およびApoEなどの他のADリスク変数を決定するための手段を提供する。ADリスク変数は、アミロイドβペプチド、タウ、ホスホタウ、シヌクレイン、Rab3a、Aβおよび神経糸タンパク質を定量することによって決定されうる。したがって、これらのリスク変数を決定するのに適した試薬をキットに含めることができる。
【０１１４】
当業者は、ADリスク変数であるAPOE-ε4、CSFタウ/Aβ1-42およびApoE、より好ましくはアミロイドβペプチド、タウ、ホスホタウ、シヌクレイン、Rab3a、Aβおよび神経糸タンパク質の存在を決定および定量するために、任意の適当な試薬を用いることができた。
【０１１５】
本発明の他の態様は、本発明の特定の実施態様の以下の説明を検討することにより、当業者には明らかになるであろう。
【０１１６】
本明細書（特許請求の範囲を含む）において、用語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含む（comprised）」または「含む（comprising）」が用いられる場合、それらは、記載された特徴、整数、ステップまたは構成要素の存在を特定するものとして解釈されるべきであるが、1つまたは複数の他の特徴、整数、ステップまたは構成要素、またはそれらのグループの存在を排除するものではない。
【０１１７】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より完全に記載される。
実施例
【実施例１】
【０１１８】
脳脊髄液中のフェリチンレベルは、アルツハイマー病の転帰を予測し、APOEによって調節される。
フェリチンは身体の主要鉄貯蔵タンパク質である；指標として脳脊髄液（CSF）レベルのフェリチンを用いることによって、長期的な転帰における脳内鉄状態の影響が、アルツハイマー病神経イメージングイニシアティブ（ADNI）コホートで研究された。
【０１１９】
この実施例は、アルツハイマー病神経イメージングイニシアティブ（ADNI）の前向き臨床コホートにおける、7年にわたるベースラインCSF-フェリチンデータと、バイオマーカー、認知、解剖学的および診断結果との関連を示す。CSFフェリチンレベルは、ADのさまざまな転帰を予測する上で、より確立されたAD CSFバイオマーカーであるタウ/Ab1-42比およびアポリポタンパク質E（ApoE）レベルと同様の有用性を有することが明らかにされる。
【０１２０】
（i）方法
ADNI解説
データは、2014年7月15日に、アルツハイマー病神経イメージングイニシアティブ（Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative （ADNI））データベース（adni.loni.usc.edu）からダウンロードされた。ADNI研究は、以前に詳細に記載されている（Ali-Rahmaniら（2014））。
【０１２１】
ADNI1の選択基準および除外基準
選択基準は、以下の通りである：
（1）Hachinskiの虚血スコア≦4；（2）スクリーニング前の4週間の安定した許容薬物療法；（3）高齢者抑うつ尺度スコア（Geriatric Depression Scale score）＜6；（4）神経心理学的検査に適した視覚および聴力；登録を妨げる病気のない良好な一般的健康；（5）学歴または職歴相当物の6つの等級；（6）英語またはスペイン語を流暢に話す能力；（7）外来受診時に参加者に同行できる、直接または電話のいずれかで1週間当たり10時間接触する研究パートナー。
【０１２２】
異なる診断グループの基準を、第1表に要約する。グループの年齢は一致したものであった。認知的に正常な（CN）被験者は、有意な認知障害または日常生活の活動の障害があってはならない。臨床診断されたAD患者は、軽度のADを有さなければならず、推定AD（probable AD）39のための国立神経疾患・伝達障害研究所及び脳卒中／アルツハイマー疾患・関連疾病協会（National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer's Disease and Related Disorders Association）基準を満たさなければならなかったが、軽度認知障害患者（MCI）はこれらの基準を満たすことができず、ほとんど完全な一般的認知ならびに機能的遂行を有するが、MCIのための定義された基準を満たす。
【０１２３】
CSFバイオマーカーの収集および分析
CSFは、ベースライン時にADNI参加者のサブセットにおいて1回収集された。CSF中のAb1-42およびタウレベルは、Luminexプラットフォームを用いて測定された。ApoEおよびフェリチンタンパク質レベルは、Myriad Rules Based Medicineプラットフォーム（Human Discovery MAP、v1.0；ADNI 材料および方法を参照）を用いて測定された。CSFのH因子（FH）レベルは、わずかな変更を加えた製造業者のオーバーナイトプロトコルに従い、マルチプレックスヒト神経変性キット（HNDG1-36K；Millipore、ビルリカ、マサチューセッツ）を用いて測定された。
【０１２４】
CSFを、各部位に提供されたポリプロピレンチューブまたはシリンジに収集し、次いで、遠心分離工程なしでポリプロピレン移送管に移し、次いで、ドライアイス上でペンシルバニア大学メディカルセンターのADNI バイオマーカー・コア研究所に一夜輸送するために、収集後1時間以内にドライアイス上で凍結した。室温にて解凍し（1時間）、穏やかに混合した後、これらのサンプルからアリコート（0.5ml）を調製した。アリコートを、バーコードラベルを貼ったポリプロピレンバイアル中に-80℃にて保存した。ラン・ツー・ランおよび試薬キット・ロット源の変動を最小限にするために、この研究のための同じ分析ランで、解凍されていない新鮮な各被験体の縦軸時点のセットの0.5mlアリコートを同じ96ウェルプレート上で分析した。2回の繰り返しサンプルについてのラン変動係数（CV％）内では、Ab1-42については2.5〜5.9％、タウについては2.2〜6.2％の範囲であり、CSFプールサンプルにつてのラン間CV％は、Ab1-42については5.1〜14％、タウについては2.7〜11.2％の範囲であった。
【０１２５】
アポリポタンパク質E（ApoE）およびフェリチンタンパク質レベルは、Rules Based Medicine（Human Discovery MAP、v1.0）を用いて決定された。手順および標準的操作手順に関するさらなる情報は、以前の刊行物（Shaw、L.M.ら（2011）およびMcKhann、G.ら（1984））およびオンライン（http：//www.adni-info.org/）に見出されうる。
【０１２６】
構造的MRIの取得および処理
1.5-T MRIおよび標的の周りに同位体的可変分解能1.2mmを有するサジタルボリューメトリック3D MPRAGEを有する被験者を分析に含めた。「www.loni.ucla.edu/ADNI」、詳細については「Shaw、L.M.ら（2009）」を参照。使用された海馬および腹部容積は、2014年7月15日にダウンロードされたADNIMERGE Rパッケージの一部としてのADNIMERGEプライマリテーブルのものであった。CN被験者およびMCI被験者のみが、MRI分析に包含された。MRIスキャンは、ベースライン、6ヶ月、1年およびその後毎年6年間にわたって実施された。
【０１２７】
統計的分析
すべての統計的作業は、packages ggplot2 （Team、R.C. R：（2014））、nlme （Wickham、H. （2009））、car （Pinheiro、J.、Bates、D.、DebRoy、S.、Sarkar、D. & Team、R.C. （2014））およびDeducer （Fox、J. & Weisberg、S. （2011））を用い、R（バージョン3.1.0）（Jack、C.R.、Jr.ら（2008））で行なわれた。回帰モデルを適用するのに必要な条件、残差の正規分布、および多重共線性の不在をテストした。すべてのモデルがこれらの条件を満たした。最小モデルは、赤池情報量基準（AIC）およびベイジアン情報量基準（BIC）を用いるステップダウン回帰によって得られ、中心的仮説が維持されたことが確認された。1つ以上の共変量がない場合、被験者は分析から除外された。被験者が研究を途中で放置した場合、彼らのデータは、放置された時点でモデリングに含められた。正規性を保つために、変数：CSFフェリチン、H因子、タウおよびヘモグロビンは、自然対数変換されが、ADAS-cog13は、平方根変換された
【０１２８】
診断群にわたる各CSFバイオマーカーの差を評価するANCOVAモデルには、最初に、年齢、性別、BMI、APOE遺伝子型、およびCSFヘモグロビン（Hb）およびH因子のレベルが包含された。CSFサンプルに血漿フェリチンを導入する外傷性タップの可能性を制御するために、CSF Hbが血液汚染の代理として包含された。フェリチンレベルは特定の炎症状態において上昇することが知られているので、FHを用いて炎症を制御した。
【０１２９】
CSFフェリチンおよびApoEの重回帰モデルは、年齢、性別、BMI、APOE遺伝子型、およびCSFヘモグロビン（Hb）およびH因子のレベルに加えて、CSFタウ、Ab1-42およびフェリチンまたはApoEのいずれかのさまざまな包含を含んだ。最小モデルは、第5表の表凡例に記載される。
【０１３０】
CSFフェリチン、CSFタウ/Ab1-42比およびCSF ApoEを用いたベースラインアルツハイマー病評価尺度認識（ADAS-cog13）スコアおよびRey言語学習テスト（RVLT）スコア間の関連性を、各認知尺度についての共変量調整重回帰で試験した。これらの分析では、年齢、性別、BMI、教育年数、APOE-ε4対立遺伝子およびベースライン診断が、最初に共変量として包含された。ベースラインCSFフェリチンレベルと長期的臨床転帰（ADAS-cog13および7年にわたるRVLTスコア）との関連性を評価するために、線形混合効果モデルを用いた。これらのモデルは、認知のベースラインモデルと同じ変数のために調整され、さらに、CSFバイオマーカーの各々との相互作用変数としての時間も含んだ。これらの相互作用項のいずれかの有意な値は、変数が認知変化の割合に影響を与えたことを示す。ADAS-cog13の縦断的分析では、最小モデルは、教育年数、性別、APOE-ε4対立遺伝子を含んだ。RVLTを用いた縦断的分析では、最小モデルは、教育年数および性別を含んだ。
【０１３１】
Cox比例ハザードモデルを使用して、AD変換の時間に対するCSF検体の影響を評価した。最初のモデルは、CSF ApoE、tau/Ab1-42およびフェリチンとともに交絡変数としてベースラインにおける年齢、性別、教育年数およびAPOE-ε4遺伝子型を含んだ。CSFバイオマーカーのみを含有する最小モデルを、BICステップダウン手順および対数尤度検定を介して同定した。ロジスティック回帰分析を用いて、ADへの変換のリスクにおけるCSF検体の影響を評価した。CSFフェリチン、ApoEおよびタウ/Ab1-42検体の組み合わせは、ベースラインにおける年齢、性別、教育年数、APOE遺伝子型およびBMIについて調整されたADへのMCIの変換のロジスティック回帰モデルに包含された。これらのモデルは、102ヶ月まで診断がADに変化したMCI参加者から安定したMCI参加者を同定することにおける、これらの検体の予測性能を決定した。受信者-操作曲線および曲線下面積は、ロジスティック回帰モデルの予測確率から導かれた。
【０１３２】
年齢、教育年数、BMI、性別およびAPOE遺伝子型および頭蓋内容積を調整した線形混合モデルを用いて、CSFフェリチン、ApoE、タウ/Ab1-42と、海馬および側脳室に対する縦断的構造（MRI）変化との関係を分析した。すべてのモデルにおいて、CSFフェリチン、ApoE、タウ/Ab1-42およびベースライン診断は、固定効果として含まれ、最小限のモデルから除去されなかった。2つのランダムな効果、切片および勾配（時間）も包含された。時間と診断、時間とCSFフェリチン、時間とCSF ApoE、ならびに時間とCSFタウ/Ab1-42との間の相互作用も、すべてのモデルに包含された。
【０１３３】
AD被験者は、数が少なく、追跡期間が短いため、MRI分析からすべて除外された。ADNIからのPET画像データは、CSFフェリチンが測定された患者数が少なく、ベースライン時にPETイメージングを受けた患者が少なかったため、分析に含まれなかった。
【０１３４】
（ii）結果
結果
CSFフェリチンとADのバイオマーカーとの関係
他の報告書と一致して、ADNIコホートでは、認知的正常（CN；n=91）、軽度認知障害（MCI；n=144）およびAD（n=67）の被験者（ANCOVA：P=0.591；第4表）の間で、CSFフェリチンレベルに差異はなかった。
【０１３５】
【表１】
2018513368.tif 000003
【０１３６】
第4表
この研究で使用されたADNIコホートからの被験者のベースライン特性は、診断によって階層化された。
CN-認知的に正常；MCI-軽度認知障害；AD-アルツハイマー病。未調整の単位値が表に示される。性別、年齢、教育年数、BMI、APOE遺伝子型、CSFヘモグロビンおよびCSF H因子について、CSF検体およびMRI脳構造のANCOVAモデルのp値を調整した。頭蓋内容積は、脳構造のANCOAモデルにも包含された。
【０１３７】
コホートがCSF Ab1-42レベル（192 ng l-1 カットオフ；Mattsson、N.ら（2014）において以前に提案された）に従って分離されて、おそらくは脳アミロイド負荷を反映する場合（ANCOVA：P = 0.946）、フェリチンレベルの変化はなかった。しかしながら、AD17の確立されたCSFバイオマーカー（タウ、p-タウ、Ab1-42）を含むフェリチンの多重回帰モデリングにおいて、CSFフェリチンレベルは、p-tauではなく、Ab1-42（部分R2=0.013、P=0.029）およびタウ（部分R2=0.086、P＜0.001；モデル1、第1表）によって予測された。
【０１３８】
第1表
アルツハイマー病のCSFフェリチンとCSFバイオマーカーとの間の関係のモデリング
CSFフェリチンレベルと2つの確立されたCSFバイオマーカーであるAβ1-42およびタウとの関連性（M1およびM2）、ならびにCSFフェリチンレベルとより新しい候補CSFバイオマーカーであるApoEタンパク質レベルとの関連性（M2＆M3）を調査するための3つのモデルが提供される。すべてのモデルは、変数：年齢、性別、BMI、APOE遺伝子型、ベースライン診断、およびCSFタウ、p-タウ、Aβ1-42、HbおよびFHのレベルを最初に包含した。M2 & M3はさらに、ApoE CSFレベルを包含した。M1最小モデルは、APOE遺伝子型、タウ、BMI、性別、およびFHを包含した。M2最小モデルは、APOE遺伝子型およびApoEレベルを包含し、そしてタウおよびAβ1-42が保持された。M3最小モデルは、M2と同じものを包含したが、タウおよびAβ1-42は除外された。AIC-赤池情報量基準、BIC-ベイジアン情報量基準。
【０１３９】
【表２】
2018513368.tif 000004
【０１４０】
アポリポタンパク質E遺伝子（APOE）対立遺伝子は、AD（Corder、E.H. ら（1993））およびCSFアポリポタンパク質Eタンパク質（ApoE）の主要な遺伝的リスクであり、CSFアポリポタンパク質Eタンパク質（ApoE）レベルは、Ab1-42（Cruchaga、C. ら（2012）、Martinez-Morillo、E. ら（2014））およびタウ（Toledo、JBら（2014）：Martinez-Morillo、E.ら（2014））に関連するので、モデルは、CSF ApoEレベルを含むように再構築された。これにより、フェリチンと他のバイオマーカー（Ab1-42：R2＜0.001、P=0.904；タウ：R2=0.003、P=0.219；モデル2、第1表）との関係は廃止された。これは、ApoEとフェリチンとの間の驚くほど強い関係を検出することをもたらし（線形項部分 R2=0.243、P=7.69x10-22）、それは、モデルからAb1-42およびタウ（有意でない項）が除かれた場合に改善された（線形項部分 R2=0.341、P=1.52；モデル3、第1表、図3a）。
【０１４１】
モデル3では、APOE遺伝子型は、CSFフェリチン（P=1.10x10-8）に強く影響し、主要なADリスク対立遺伝子ε4は、非ε4キャリアよりも22％高いレベルを誘導した（図3b）。相反的に、CSF ApoEの多重回帰モデルでは、APOEε4陽性被験者は非ε4キャリアと比較してApoEレベルが低かった（-16%；P=2.50x10-09）（図3c）。血漿フェリチンレベルは、血漿ApoEレベルまたはAPOEε4対立遺伝子状態に関連しなかったが、血漿フェリチンレベルとCSFフェリチンレベルとの間には適度の関連があった（β=0.075、P=0.0002）。
【０１４２】
フェリチンと精神神経学的評価との関連
ADにおけるCSFフェリチンと認知能力との関係を検討した。ベースラインADAS-Cog13（アルツハイマー病評価尺度）スコアは、ADバイオマーカーおよび他の臨床変数を含む重回帰モデルにおいて、独立して、CSFフェリチン、ApoEレベル（P=0.0003）およびタウ/Ab1-42比（P=0.025）と関連していた。三分位分析では、高いレベル（47.2 ng m-1）のフェリチンは、低いレベルのフェリチン（＜5.4 ng ml-1）と比較して、〜3ポイント不良なADAS-cog13スコアと関連していた（図4a）。同様に、三分位では、以前に報告されたように（Toledo、J.B.ら（2014）：Kester、M.I.ら（2009））、低レベルのApoEは、〜4ポイント不良なADAS-Cog13と関連し（図4b）、高タウ/Ab1-42比は、〜2ポイント不良なADAS-Cog13と関連していた（図4c）。
【０１４３】
CSFフェリチンのベースライン値が長期的認知結果を予測するかどうかを決定するために、以前に報告されたように（Toledo、J.B.ら（2014）：Kester、M.I.ら（2009））、7年間にわたる年間ADAS-Cog13スコアの混合効果モデルが構築され（統計に関する第5表、患者数に関する第2表）、ApoE（P=0.006）およびタウ/Ab1-42比（P=2.7x10-7）の両方の比が依然として認知変化率と関連していることが観察された（時間と相互作用する）。しかしながら、フェリチンは、ADAS-Cog13に一定の横断的減少によって影響を与えた（P=4.93x10-4 主要効果のみ；第5表）。
【０１４４】
第2表
縦断的認知評価の患者数
Bl：ベースライン。CN：認知正常。MCI：軽度認知障害。AD：アルツハイマー病。
【表３】
2018513368.tif 000005
【表４】
2018513368.tif 000006
第5表
AD転帰におけるCSFバイオマーカーの関連のモデル化
すべてのモデルは、最初に、以下の変数を包含した：年齢、性別、BMI、APOE遺伝子型、ベースライン診断；MRIモデルはさらに頭蓋内容積を包含した。認知モデルの最小モデルは、ベースライン診断、性別、教育年数、AD CSFバイオマーカーを包含した。Cox比例ハザードモデル（Cox）の最小モデルは、AD CSFバイオマーカーのみを包含した。MRIモデルの最小モデルは、年齢、性別、ベースライン診断、教育年数、APOEε4状態、および頭蓋内容積を包含した。利用可能なデータを有するすべての被験者は、認知モデルに包含された。ベースライン時にMCIとして分類された被験者のみがMCIの変換モデルに包含された。MRIモデルは、ベースライン時に認知的に正常またはMCIと分類された被験者が包含された。ベースラインにおけるAD被験者は、数が少なく、追跡がないために包含されなかった（第3表）。*変換モデルの統計は、各検体の1四分位範囲の変化に基づいた（フェリチン：3.3 ng/ml、tau/Aβ1-42：0.67単位；ApoE：3.1μg/ml）。（ダガー）非パラメトリックなCoxおよびLRモデルを除いて、フェリチン値は対数変換された。^β係数は、ADAS-Cog13の平方根に対するものである。#側心室の場合、β係数は、心室容積の自然対数である。MR：重回帰、MELM：混合効果線形モデル。Cox：コックス比例ハザードモデル。LR：ロジスティック回帰。NS：有意ではない。
【０１４５】
認知は、対照およびMCI患者の区別において、より感度が高い、Rey言語学習テスト（RVLT）を用いてモデル化された。このモデルでは、フェリチンレベルのみが横断的な認知能力と関連していたが（P=0.0017；第5表、図4d）、CSFフェリチンは縦断的モデルにおける劣化の速度と関連しなかった（P=0.817；第5表）。ベースラインのタウ/Ab1-42比（P=4.85x10-5）は、RVLTの認知低下率と関連していたが、ApoEについては傾向のみであった（P=0.066）。したがって、両方の認知スケールにおいて、CSFフェリチンは病状にかかわらず一定の量で性能に影響を与えた。
【０１４６】
もし高いフェリチンレベルが時間とともに一定の値で認知能力を悪化させたならば、高いフェリチンレベルを有するMCI個体は、比較的早期の間隔でAD診断の基準を満たすであろう。これを調査するために、CSFフェリチン、ApoEおよびタウ/Ab1-42を測定した144人のMCI被験者に対して、Cox比例ハザードモデルを用いた。7年間にわたるMCIの変換の最小モデル（これらのCSFバイオマーカーのみを包含する；第5表）では、フェリチン（P=0.03；図5a）、ApoE（P=0.008；補足的図6a）およびタウ/Ab1-42（P=0.037；補足的図6b）がそれぞれ有意な予測変数であった。
【０１４７】
このモデルを使用して、各バイオマーカーの各五分位数に対して50％の生存期間のために何ヶ月が必要であるかが推定された。これらの値の線形モデルを、各検体（指定された単位; x軸）の五分位境界の値に対して構築した（月; y軸）。これらの関数の勾配は、ベースラインCSF検体における1単位の変化に関連する平均変換年齢（月）の変化を推定する。バイオマーカー間の比較のために、変化を、検体値に対するs.d.変化に関連する変換の平均年齢で表す。フェリチンに対する1つのs.d.変化は、変換年齢におけるApoEおよびタウ/Ab1-42についての18.2ヶ月および8.6ヶ月と比較して、9.5ヶ月のシフトと関連していた（図5b）。
【０１４８】
別々に調整されたロジスティック回帰モデルでは、四分位範囲による各バイオマーカーのベースライン濃度の増加は、フェリチン（OR：1.36、95%CI：1.17-1.58）およびタウ/Ab1-42比（OR：1.13、CI：0.95-1.35）についてADへの変換の確率を増加させ、ApoE（OR：0.72、CI：0.61-0.85）の確率を減少させた。1つのモデルに3つの検体すべてを包含させると、各検体の予測値が増加された（OR （CI）:フェリチン=2.32 （1.86-2.9]、タウ/Ab1-42=1.45[1.16-1.8]、ApoE=0.38[0.3-0.48]；第5表）。
【０１４９】
ロジスティック回帰モデルに基づく受信者-操作曲線は、これらの検体の正確性を決定してADへの変換を予測した。ベースモデル（年齢、性別、教育年数、BMI、APOEε4遺伝子型）（図5c）の曲線下面積（AUC）は0.6079であり、これは、フェリチン（AUC：0.6321；図2b）、ApoE（0.6311；図2c）、またはわずかにタウ/Ab1-42（0.6177；図2d）のいずれかの単一の包含によって増加した。タウ/Ab1-42がApoEを含むモデルに含まれる場合、AUCはわずかに増加した（0.6311から0.6483へ；図5d）。この能力は、AD用に確立されたCSFバイオマーカーを組み合わせたものであり、フェリチン値を加えることによって顕著に改善された（0.6483から0.6937へ；図5e）。
【０１５０】
フェリチンと脳萎縮のと関連
CNおよびMCI被験者について、6年間にわたり、フェリチンレベルが、海馬および側室心室領域に対する神経解剖学的変化と関連しているかどうかを調査した（第3表；患者数 ）。
【０１５１】
第3表
縦断的MRI評価の患者数
Bl：ベースライン。CN：認知正常。MCI：軽度認知障害。AD：アルツハイマー病。
【表５】
2018513368.tif 000007
【０１５２】
CSFフェリチンはこれまで、単独で考慮された場合にさまざまな脳構造の萎縮を予測することが示されていたが、他のバイオマーカーもモデリングに包含された場合のCSFフェリチンの影響を調べた。ベースラインApoE、フェリチンおよびタウ/Ab1-42値は、調節された縦断的モデルにおいて、それぞれ独立して海馬の体積を予測した（第5表）。海馬の萎縮率は、高いCSFフェリチンを有する個体において、より大きかった（P=0.02；図6a）。低いCSF ApoE（P=0.008；図6b）または高いタウ/Ab1-42（P=6.80x10-6；図6c）同様に、萎縮を予測した。側脳室拡張も同様に、高CSFフェリチン（P=0.008；図6d）、低CSF ApoE（P=0.0002；図6e）、または高Q5タウ/Ab1-42（P=4.19x10-8；図6f）と独立して関連していた。
【０１５３】
（iii）考察
これらの分析は、CSFフェリチンレベルが、ADNIコホートにおける認知能力と独立して関連し、ADへのMCIの変換を予測したことを明らかにする。これらの転帰におけるフェリチンの影響の大きさは、確立されたバイオマーカーであるApoEおよびタウ/Ab1-42に匹敵した；しかしながら、フェリチンの効果の性質は同じではなかった。フェリチンは、試験期間において認知能力の一定した変化に関連していたが（図7a）、他のバイオマーカーに関連する減少は、時間とともに悪化した（図7b）。高いフェリチンレベル（1 ng ml-1フェリチン当たり1.77 RVLTポイント；第5表）に応答した下方シフト（より貧しい認知的提示）は、より早期の診断年齢をもたらす（1 ng ml-1フェリチン当たり3ヶ月；図5b）。これは、早発性AD患者が、遅発性
患者よりも大きな新皮質鉄負荷を有するという知見と一致する。集合的に、これらのデータは、アルツハイマー病およびパーキンソン病の第2相試験における有益な結果を報告している、脳内鉄を低下させるという治療戦略の検討を支持する。CSFデフェリプロンのような薬物から予想されるように、フェリチンを低下させることは、おそらく3年間まで、ADへのMCIの変換を遅延させる可能性がある。
【０１５４】
このデータは、ADの疾病原因における鉄への探索的洞察を提供し、ApoEとフェリチンとの予想外の相互作用を同定する。そのフェリチンレベルは、APOE-ε4対立遺伝子によって増加される。対立遺伝子は、逆よりむしろ、ApoEがフェリチンレベルに影響を及ぼすと主張する。これらの知見は、APOE遺伝子型が構成的な脳内負荷に影響を及ぼすことを示唆している。
【０１５５】
これらのデータは、フェリチンレベルを増加させることにより、APOEε4状態がADに対する罹患性を付与するという概念を支持する。
【０１５６】
本実施例は、7年間にわたって、認知的に正常な91例、軽度認知障害（MCI）144例およびAD患者67例において、ベースラインCSFフェリチンレベルが認知機能と負の関連があり、ADへのMCIの変換を予測したことを示す。フェリチンは、CSFアポリポタンパク質Eレベルと強く関連し、アルツハイマー病リスク対立遺伝子であるAPOE-ε4によって上昇した。これらの知見は、脳内鉄の上昇がADの進行に悪影響を及ぼし、ADの主要な遺伝的危険因子であるAPOE-ε4の起こりうるメカニズムとして脳内鉄上昇を導入することを明らかにしている。
【実施例２】
【０１５７】
脊髄性フェリチンは、前臨床APOE-ε4キャリアにおける認知低下のリスクを決定する。
ε4を保持することが脳脊髄中の鉄を上昇させるので、アポリポタンパク質E（APOE）のε4対立遺伝子は、アルツハイマー病（AD）へのい最大のリスクを付与し、最近のデータはリスクベクターとして脳鉄負荷を巻き込んでいる（CSF）フェリチン≒20% （Ayton Sら（2015））。CSFフェリチンレベルは、ADに移行する軽度認知障害（MCI）被験者の縦断的認知能力およびリスクを予測する。本実施例は、7年にわたって正常な人々の認知低下を予測するために、CSFフェリチンを、確立されたADリスク変数であるAPOE-ε4、CSFタウ/Aβ1-42およびApoEと組み合わせることを示す。
【０１５８】
（i）方法
本実施例では、アルツハイマー病神経イメージングイニシアティブ（ADNI）データベース（adni.loni.usc.edu；15 July 2014）から得られたデータを使用した。
【０１５９】
Aβ1-42、タウ（Luminex）、アポE、フェリチン（Myriad Rules Based Medicine）および縦断的Ray聴覚-視覚学習課題（RAVLT；早期変化に対する感度）およびAD評価スケール認知サブセット（ADAS-Cog13）スコアのベースラインCSFレベルを、R（バージョン3.2.1）を用いた線形混合効果モデルを用いて分析した。正常および多共線性の欠如が確認された。時期尚早に退去した被験者からのデータは、退去時点まで包含された。
【０１６０】
（ii）結果
前認知症の被験者の初期モデリング（第6表）は、タウ/Aβ1-42比と認知能力の時間との間の双方向の相互作用を明らかにし、この指標が認知力低下の速度を予測することを確認した（RAVLT：P=0.011；ADAS-Cog13：P=0.0011）。タウ/Aβ1-42は、他のADリスク因子：APOE-ε4状態、診断、フェリチン、またはApoEレベルと相互作用しなかった（別々に、またはより高次項において組み合わせてのいずれかで）。対照的に、CSFフェリチンは、時間、APOEε4および診断との4方向相互作用におけいて認知を予測した（RAVLT：P=0.0169；ADAS-Cog13 P=0.0297）。
【０１６１】
認知的に正常な（CN）被験者とMCI被験者を別々にモデリングした場合、タウ/Aβ1-42は、MCI（RAVLT：P=0.072；ADAS-Cog13；P=0.019）およびCN（RAVLT：P=0.039；ADAS-Cog13：P=0.006；図8A,B）被験者の認知力低下を予測し、この指標は他の包含された変数と相互作用しなかった。
【０１６２】
フェリチンとのすべての相互作用項は、MCI被験者にとって有意ではなかったが、認知能力に有意な大きな影響があった（RAVLT：P=0.019；ADAS-Cog13：P=0.042；Ayton Sら（2015）に記載されている従来の単純化されたモデリングと一致）。しかし、CN被験者については、フェリチンは、時間とε4との3者間の相互作用で認知力低下を予測した（RAVLT：P=0.0035；ADAS-Cog13：P=0.010；図8C、D）。ε4状態によるCN被験者の分類は、フェリチンがε4+ve被験者における認知低下を強く予測することを明らかにした（RAVLT：P=0.0008；ADAS-Cog13：P=0.016）。ε4-ve被験者については、より低いフェリチンレベルは、ADAS-Cog13における認知の中程度の悪化を予測した（P=0.016）but not in RAVLT （P=0.477）。
【０１６３】
最後に、ベースラインCSFフェリチンが、低下しているCNε4+ve被験者（RAVLTにおける、≧1ポイント/年の悪化）から安定しているCNε4+ve被験者を区別するために使用できるかどうかを決定しするために試験した。受信者操作特性（ROC）曲線下面積は、0.96であり、閾値予測値は6.6ngフェリチン/mlであった（図8E）。
【０１６４】
【表６】
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【０１６５】
第6表
患者の人口統計および統計モデル
CNおよびMCI被験者における縦断的（7年間）認知能力（RAVLT、ADAS-Cog13）の別々の共変量調整線形混合効果線形モデル（ADの被験者は、追跡率が低いため縦断的分析から除外した）。赤池情報量基準とベイジアン情報量基準を用いて最小限のモデルを得る前に、モデル化に最初に含まれた変数は、年齢、性別、BMI、教育年数、APOE-ε4対立遺伝子、ベースライン診断、CSFタウ/Aβ、CSF ApoE、CSFフェリチンであった。NA：該当なし。@：ADAS-Cog13変数は、平方根変換された。＃：CSFフェリチンは、自然対数変換された。*：この相互作用変数は、コホートが列のタイトルに従って制限されている場合、より低い次項に簡略化された。CN-認知的に正常；MCI-軽度認知障害；RAVLT-レイ聴覚視覚学習試験；ADAS-Cog13-アルツハイマー病評価尺度-認知。
【０１６６】
（iii）考察
これらのデータは、比較的低いフェリチン（＜6.6ng/ml）を有するCNε4+ve被験者は、近い将来に悪化しないことを示し、なぜε4+ve被験者の30％がADを発症しないのかを説明する可能性がある。逆に、この閾値を超えるフェリチンの単位増加は、より急速な悪化を予測した。
【０１６７】
これらの知見は、CSFフェリチンのε4キャリアおよび非キャリアにおける顕著な相違する影響を明らかにする。ε4キャリア中のCSFフェリチンレベルはすべて≧4.5ng/mlであるが、非ε4被験者では、その値の半分の範囲であり、被験者はわずかな認知力低下を示す（図8C、D）。
【実施例３】
【０１６８】
患者の認知力低下のリスクを評価する
本発明方法を実施するには、患者が認知能力のレベルについて評価されることが企図される。このレベルは、時間の経過とともに悪化するかどうかを判断するための基礎を設定する。それらの患者は、評価された後に、認知障害の徴候を示す可能性がある。
【０１６９】
CSFサンプルを得ることができ、イムノアッセイなどの方法によってCSFフェリチンレベルを決定することができる。次いで、このサンプルを、同じ方法で処理されたCN患者からの既定のサンプルと比較することができる。
【０１７０】
患者のCSFフェリチンレベルとCN患者のCSFフェリチンレベルの差が決定される。差の程度に応じて、認知力低下の程度を判定することができる。その差が大きく、患者のCSFフェリチンレベルがCN患者レベルに対して高い場合、評価を提示している患者は、認知力低下のリスクがより高い可能性がある。CN患者レベルとの差が小さい場合、評価を提示している患者は、認知力低下のリスクがより低い可能性がある。
【０１７１】
この試験は、患者の遺伝子型を決定することと並行して行なわれうる。患者がApoε4対立遺伝子を保有する場合、認知力低下のリスクはより高くなる。
【実施例４】
【０１７２】
患者の認知力低下のモニタリング
患者は、第1の時点で実施例３にしたがって試験される。第2の試験は、第1の時点の後の別の時点で行われる。患者のCSFフェリチンとCN患者の基準レベルとの間の差異を評価する。
【０１７３】
次いで、この差を、第1の時点からの差と比較することができる。
【０１７４】
差が大きい場合、劣化が進行するであろう。
【０１７５】
患者は、増加するCSFフェリチンレベルに基づいて、認知力が低下していると診断されうる。
【実施例５】
【０１７６】
患者の認知力低下の進行速度の減少
患者は、CSFフェリチンレベルに基づいて、認知力低下のレベルについて実施例３のように評価される。デフェリプロンは、患者のサイズ、年齢および体重によって計算される時間および用量で患者に投与される。
【０１７７】
認知力低下が減少したかどうかを評価するために、患者の認知能力を再評価する。
【０１７８】
本発明の前述の説明は、当業者が現在最良の態様であると考えられるものを製造し使用することを可能にするが、当業者は、本明細書中の特定の実施態様、方法、および実施例の変形、組み合わせ、および均等物の存在を理解することができる。したがって、本発明は、上述の実施態様、方法、および実施例によって限定されるものではなく、本明細書に広く記載された本発明の範囲および真の趣旨内のすべての実施態様および方法によって限定されるべきである。
【０１７９】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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