(57)【要約】  本発明は、組換え発現された抗体分子の組成物中の単量体のパーセンテージを増加させる方法であって、抗体分子が、１つのＶＨ及び１つのＶＬを含む目的の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つのＦｖを含み、前記ＶＨ及びＶＬが１つ又は複数のリンカーを介して直接的又は間接的に結合し、それらの間のジスルフィド結合によって安定化されていることを特徴とし、前記方法が、ａ）抗体分子を含む組成物を３０℃〜６０℃の範囲の温度で少なくとも１時間の期間保持する熱変換のステップを含み、ステップａ）が還元剤の存在下で、又は還元剤との処置後に実施される、上記方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え発現された抗体分子の組成物中の単量体のパーセンテージを増加させる方法であって、前記抗体分子が、１つのＶＨ及び１つのＶＬを含む目的の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つのＦｖを含み、前記ＶＨ及びＶＬが１つ又は複数のリンカーを介して直接的又は間接的に結合されており、それらの間のジスルフィド結合によって安定化されていることを特徴とし、
前記方法が、
ａ）抗体分子を含む組成物を３０℃〜６０℃の範囲の温度で少なくとも１時間の期間保持する熱変換のステップ
を含み、
ｂ）ステップａ）が還元剤の存在下で、又は還元剤による処置後に実施される、上記方法。
【請求項２】
温度が４５〜５５℃、例えば５０〜５５℃の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
温度が５０℃である、請求項３に記載の方法。
【請求項４】
還元剤がグルタチオン（ＧＳＨ）、亜硫酸エチル、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２−メルカプトエチルアミン（ＢＭＥＡ）、システイン−ＨＣｌ及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む群から選択される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
還元剤が２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）及び２−メルカプトエチルアミン（ＢＭＥＡ）、特に２−メルカプトエチルアミンから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
還元剤の濃度が１ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば３０〜９０ｍＭ、６０〜９０ｍＭ又は７０〜８０ｍＭの範囲である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
期間が１〜７０時間、例えば３〜１０時間、例えば４〜６時間の範囲であり、特に５時間である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップａ）が４５〜５５℃の温度の範囲で４〜６時間の期間実施され、ステップｂ）において、還元剤がＢＭＥＡ又はＢＭＥであり、６０〜９０ｍＭの範囲の濃度である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）が５０℃の温度で５時間の期間実施され、ステップｂ）において、還元剤がＢＭＥＡ又はＢＭＥであり、７０〜８０ｍＭの範囲の濃度、例えば７５ｍＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
還元剤がアミノ酸の存在下で使用される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アミノ酸がアルギニン、リシン及びプロリンから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アミノ酸の濃度が０．０１〜１．０Ｍの範囲であり、例えば０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９Ｍである、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が組成物中０．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ、例えば２〜３ｇ／Ｌの範囲の濃度である、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
熱ステップが同時撹拌の存在下で実施される、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
撹拌が１００〜１２００ｒｐｍの範囲である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
温度が４０〜６０℃の範囲に上昇する前に、還元剤が組換え抗体組成物に添加される、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
温度が４０〜６０℃の範囲となった後に、還元剤が組換え抗体組成物に添加される、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
下流精製のさらなるステップを含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
下流処理がクロマトグラフィーのステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
クロマトグラフィーが疎水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
クロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
１つ又は複数のリンカーを介して直接的又は間接的に連結され、それらの間のジスルフィド結合によって安定化されるＶＨ及びＶＬが、抗原結合部位を形成する相補的ＶＨ／ＶＬ対である、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＶＨ及びＶＬがリンカーを介して直接連結される、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
抗体がｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｓｄＡｂ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
各ＶＨ及びＶＬが、第２抗体を介してＶＨ及びＶＬを間接的に連結するリンカーを含む、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
抗体がＦａｂ−ｄｓＦｖである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
抗体が、
第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、ＣＨ１ドメイン及び第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）をＮ末端から順に含む重鎖、
第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、ＣＬドメイン及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）をＮ末端から順に含む軽鎖
を含む、ヒトＯＸ４０及びヒト血清アルブミンに結合する二重特異性抗体融合タンパク質であり、
前記重鎖及び軽鎖は、ＶＨ１及びＶＬ１が第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２及びＶＬ２が第２の抗原結合部位を形成するように整列されており、
第１の抗原結合部位によって結合される抗原はヒトＯＸ４０であり、第２の抗原結合部位によって結合される抗原はヒト血清アルブミンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
重鎖の第１の可変ドメイン（ＶＨ１）が、ＣＤＲ−Ｈ１に関する配列番号１に示した配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関する配列番号２に示した配列、及びＣＤＲ−Ｈ３に関する配列番号３に示した配列を含み、軽鎖の第１の可変ドメイン（ＶＬ１）が、ＣＤＲ−Ｌ１に関する配列番号４に示した配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関する配列番号５に示した配列、及びＣＤＲ−Ｌ３に関する配列番号６に示した配列を含み、
第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）が配列番号１１に示した配列を有し、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）が配列番号１２に示した配列を有し、
第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）がジスルフィド結合によって連結されている、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、組換え発現された抗体分子の組成物中の単量体の量を増加させる方法、及び本明細書に記載の方法から得られる又は得ることができる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用モノクローナル抗体は、治療剤の非常に重要なクラスとなっている。ＷＯ２０１０／０１９４９３に開示されているように、これらの抗体分子の精製及び製剤には課題が指摘されている。しかし、最高品質の物質だけを治療用途において使用することが極めて重要である。これは、新しく複雑な抗体構築物が、例えば、二重特異性フォーマットの治療剤として生成されていることから、より困難となっている。
【０００３】
新たな抗体フォーマットは、多くの場合、可変ドメインが自然状態ではＣ末端で定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）又は定常重鎖ドメイン（ＣＨ１）に連結されていない、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む少なくとも１つのＦｖ領域の存在を必要とする。天然に存在する完全抗体分子においては、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインの存在は、ＶＬ及びＶＨの対合を安定化させるように作用する。したがって、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインが存在しない状態においては、可変ドメインは、隣接する分子の可変ドメインと動的に交換される傾向がある。ｖ−領域対合をロックダウンし動的な交換を防止する、この動的過程を停止させる１つの方法は、ＶＨとＶＬの間へのジスルフィド結合の導入である。しかし、ジスルフィド結合が存在すると、望ましくない抗体の多量体を安定化させるようにも作用する可能性がある。
【０００４】
また新たな抗体フォーマットは、リンカーを含む場合が多い。しかし、リンカーが存在すると、１つの分子内の可変ドメインが別の分子内の可変ドメインと対合して、２つの分子が互いに連結する場合、望ましくない多量体を形成させる可能性がある。そして、Ｆｖ内のジスルフィド結合の存在は、多量体種を安定化させるように作用する。
【０００５】
公知の二重特異性抗体フォーマットの一例は、ＷＯ２０１０／０３５０１２及びＷＯ２０１１／０３６４６０に詳細に開示されているＦａｂ−ｄｓＦｖである。この抗体フォーマットは、図２７に示すように、２つ以上の単量体を含む多量体を形成する傾向がある。また同様の多量体種もジスルフィド結合ｓｃＦｖ分子を含む組成物に生じ、この場合、１つのｓｃＦｖ由来のＶＨが別のｓｃＦｖ由来のＶＬと対合し、２つのｓｃＦｖ分子が一緒に連結するジスルフィド安定化Ｆｖ対を形成し、２つのｓｃＦｖの二量体を生じる。別々の分子中の可変ドメインのさらなる対合によって、より大きな多量体種が生成され得る。
【０００６】
既知の精製方法、例えばクロマトグラフィーなどは、大きな多量体種を小さな単量体種から分離することができるが、これは、必然的に抗体の全収率を低下させる。したがって、二重特異性抗体フォーマットにおいては、抗体の組成物中の望ましくない多量体種の問題に対処する方法が強く求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示の方法は、抗体分子を含む組成物中の多量体の量を減少させることにより、上記の問題に対する解決策を提供する。本開示は、特に、ヒトにおける使用に適した単量体モノクローナル抗体分子の組成物を提供するのに有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、組換え発現された抗体分子の組成物中の単量体のパーセンテージを増加させる方法であって、抗体分子が、１つのＶＨ及び１つのＶＬを含む目的の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つのＦｖを含み、前記ＶＨ及びＶＬが１つ又は複数のリンカーを介して直接的又は間接的に結合されており、それらの間のジスルフィド結合によって安定化されていることを特徴とし、
前記方法が、
ａ）抗体分子を含む組成物を３０℃〜６０℃の範囲の温度で少なくとも１時間の期間保持する熱変換のステップ
を含み、
ｂ）ステップａ）が還元剤の存在下で、又は還元剤による処置後に実施される、上記方法を提供する。
【０００９】
組換え発現された抗体に本明細書に記載の方法を使用すると、組成物中の単量体の量が有利に増加する。有利には、本明細書の方法は、工業規模で容易に、しかもコスト効率良く使用することができる。
【００１０】
本発明の方法は、多量体種を単量体に変換し、それによって、単量体のパーセンテージを増加させることができる。変換のステップは、有利には、還元剤がＶＨ及びＶＬと多量体種との間のジスルフィド結合を還元して部分的に変性し、それによって、多量体を分解する。また本方法は、ＶＨドメインとＶＬドメインが単一抗体分子内でＦｖ対を形成させること、ＶＨとＶＬの間の安定性ジスルフィド結合の再形成を単量体内で生じさせることを可能にする。本発明者らは、驚いたことに、本変換ステップ及び還元剤を使用して、抗体を全く変性させることなく、抗体多量体を抗体単量体に変換させることができることを明らかにした。また本発明の方法は、有利には、適切なジスルフィド結合を再形成させ、所望の単量体を生成することができる。
【００１１】
一実施形態において、単量体の濃度の増加は、２倍、３倍、４倍又はそれ以上である。本発明の方法は、好ましくは、単量体形態で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は少なくとも９０％の抗体を含む、熱変換ステップ後の組換え抗体組成物を提供する。
【００１２】
一実施形態において、本開示は、本明細書に記載の方法から得られる又は得ることができる抗体又は結合断片に及ぶ。
【００１３】
また本発明は、処置で使用するための本明細書に記載の方法から得られる組成物の使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】５０℃で５０ｍＭのベータ−メルカプタンエタノールを用いて処理した、すなわち、処理がプロテインＡ精製後に実施された、プロテインＡ精製抗体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２】５０℃で５０ｍＭのベータ−メルカプタンエタノールで処理した、すなわち、処理がプロテインＡ精製後に実施された、プロテインＡ精製抗体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図３】３７〜６０℃の範囲の温度で５０ｍＭのベータ−メルカプタンエタノールで処理した抗体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖに対して得られた単量体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析のパーセンテージを示す図である。
【図４】処理後に得られた単量体の推定収率を、処理前の総初期標的タンパク質収率のパーセンテージとして示す図である。本明細書で使用される推定収率とは、処理前の出発収率を基準としたパーセンテージとしての単量体の収率である。
【図５】３７〜６０℃の範囲の温度において５０ｍＭのベータ−メルカプタンエタノールで処理した場合の抗体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの正味単量体回収の経時的なＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析を示す図である。
【図６】５０℃の温度で、１〜５０ｍＭの範囲のベータ−メルカプタンエタノール濃度で処理した場合の抗体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの正味単量体回収の経時的なＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析を示す図である。
【図７】処理後に得られた単量体の推定収率を、処理前の総初期標的タンパク質収率のパーセンテージとして示す図である。
【図８】ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ｇ３０００）によるプロセス分析において、所定のｂＭＥＡ濃度の５０℃での変換中のＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ正味単量体回収率を決定することを示す図である。
【図９】本開示の方法を使用する処理に供されていない、組換え抗体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの発現由来上清のプロテインＡ精製を表すＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図１０】５０℃で５０ｍＭのベータ−メルカプタンエタノールで処理した、組換え抗体Ａ２６  Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの発現由来上清のプロテインＡ精製を表すＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図１１】プロテインＡ精製前に清澄化した上清を５０℃で５０ｍＭのｂＭＥＡで処理したＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図１２】清澄化した上清を５０℃で５０ｍＭのｂＭＥＡで処理した後にプロテインＡ精製を行ったＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図１３】本明細書に開示した方法の有無にかかわらず、調製した下流処理後の抗体物質に対するＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析を示す図である。図は、２つの方法を使用して得られた物質が同等の物質を提供することを示唆している。
【図１４】本明細書に開示した方法の有無にかかわらず、調製した下流処理後の抗体物質に対するＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析を示す図である。図は、２つの方法を使用して得られた材料が同等の物質を提供することを示唆している。
【図１５】様々な賦形剤で処理したＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ抗体の非還元ＳＤＳページを示す図である。
【図１６ａ】異なる条件下で処理した後のＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖに対するサイズ排除クロマトグラフィーデータを示す図である。
【図１６ｂ】異なる条件下で処理した後のＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖに対するサイズ排除クロマトグラフィーデータを示す図である。
【図１７ａ】室温において還元剤で処理した後の単量体のパーセンテージを示す図である。
【図１７ｂ】５０℃において２時間還元剤で処理した後の単量体のパーセンテージを示す図である。
【図１８ａ】室温において還元剤で処理した後のＳＥ−ＨＰＬＣにより解析した単量体のパーセンテージを示す図である。
【図１８ｂ】５０℃において２時間還元剤で処理した後のＳＥ−ＨＰＬＣにより解析した単量体のパーセンテージを示す図である。
【図１９】抗体分子配列及びそれらの構成要素を示す図である。
【図２０】抗体分子配列及びそれらの構成要素を示す図である。
【図２１】抗体分子配列及びそれらの構成要素を示す図である。
【図２２】抗体分子配列及びそれらの構成要素を示す図である。
【図２３】抗体分子配列及びそれらの構成要素を示す図である。
【図２４】抗体分子配列及びそれらの構成要素を示す図である。
【図２５】抗体分子配列及びそれらの構成要素を示す図である。
【図２６】抗体分子配列及びそれらの構成要素を示す図である。
【図２７】単量体Ｆａｂ−ｄｓＦｖ及びＦａｂ−ｄｓＦｖ多量体バージョンを示す図である。
【図２８】抗体フォーマットの例を示す図である。
【図２９】抗体フォーマットの例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で使用される用語の多量体又は多量体形態とは、ドメインの全部が適切にフォールドされ対になっている２つ以上の抗体単量体由来のドメインからなる抗体形態を意味する。例えば、図２７のＦａｂ−ｄｓＦｖについて示したように、多量体は、各ＶＨドメインがＶＬドメインと対になり相補的Ｆｖ領域を形成する、２つ以上の抗体単量体から形成され得る。
【００１６】
一実施形態において、本明細書で使用される単量体のパーセンテージを増加させるとは、本開示の方法が適用される前に得られる単量体抗体分子のパーセンテージに比べて総標的タンパク質収率のパーセンテージがより高い単量体抗体分子の数値を得ることを意味する。例えば、単量体のパーセンテージは、抗体分子の初期収率の３０％であり得、本方法を適用した後、単量体のパーセンテージは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％であり得る。一実施形態において、単離された単量体の絶対数値、すなわち収率は、本開示の方法を実施した後では高い。
【００１７】
本明細書で使用される収率又は総タンパク質とは、文脈が別段の指示をしない限り、組成物中の抗体分子種の合計値を意味する。一実施形態において、使用される収率の値は、本開示による処理過程前の値である。
【００１８】
一実施形態において、使用される収率の値は、本開示による方法を実施した後に回収される総タンパク質（抗体分子種）の量である。
【００１９】
本開示の方法を実施した後に回収される総タンパク質（抗体分子種）は、処理過程が必然的にいくらかの喪失をもたらすので、減少する。
【００２０】
標的タンパク質とは、発現される組換え抗体分子を意味する。
【００２１】
組換えタンパク質は、組換え技術を使用して発現される抗体分子などのタンパク質である。
【００２２】
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書で使用の抗体濃度は、供給濃度とも呼ばれ、標的タンパク質及びそれらの多量体を含む物質における単量体及び多量体を含むすべての抗体種の濃度を意味する。一実施形態において、抗体濃度は、組成物から不純物を除去するプロテインＡ精製のステップ後の組成物中の抗体濃度である。
【００２３】
本発明の方法のステップａ）において、熱変換は３０〜６０℃の範囲の温度で行われる。一実施形態において、温度は、３５〜６０℃、４０〜６０℃、４５〜５５℃、４５〜５０℃、５０〜５５℃、４８〜５２℃、４９〜５１℃の範囲であり、例えば、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５０．５℃、５１℃、５１．５℃、５２℃、５２．５℃、５３℃、５３．５℃、５４℃、５４．５℃、及び５５℃である。一実施形態において、ステップａ）における温度は、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４又は５５℃、例えば約５０℃で実施される。
【００２４】
本明細書で使用される範囲内の温度は、本方法の間、組成物が同じ温度で保持されることを必ずしも意味するものではないが、組成物は、一般に、本方法の関連ステップが実施される期間中、所定の範囲内の１つ又は複数の温度で保持される。処理中に温度が範囲外にずれるかシフトする場合、コントローラーは、所望の範囲内に組成物を誘導するステップを取る。
【００２５】
抗体組成物が本開示による範囲内の温度で保持される期間は、一実施形態において、１〜７０時間の範囲であり、例えば２〜６０時間、例えば３〜５０時間、３〜１０時間、４〜６時間、４．５〜５．５時間、特に４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５時間である。一実施形態において、期間は約５時間である。
【００２６】
本明細書で使用される還元剤は、抗体などの当該分子中のジスルフィド結合を還元することができる還元剤を意味する。１つ又は複数のジスルフィド結合を含む抗体の存在下における還元剤は、適切な条件下で、ジスルフィド結合を、例えば−ＳＨの形態に還元する能力を有する。一実施形態において、還元剤それ自体は、単一のチオール基、２個のチオール基又は３個以上のチオール基を含む。或いは、還元剤は、それ自体チオール基を含まない。
【００２７】
本明細書で使用されるチオールは、物体−ＳＨを含む基を意味する。
【００２８】
一実施形態において、還元剤は、グルタチオン（ＧＳＨ）、亜硫酸エチレン、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、塩酸塩などのその塩を含む２−メルカプトエチルアミン（ＢＭＥＡ、ｂＭＥＡ又はＢ−ｍｅａ、β−ｍｅａ又はβｍｅａとも呼ばれる）、システイン、例えばシステイン−ＨＣｌ、亜リン酸及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、ＴＨＰ（トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィンを含む群から選択される。
【００２９】
一実施形態において、還元剤は単一のチオール基を含む。有利には、単一のチオールを含む還元剤が使用される場合、単量体の可変領域間の所望のジスルフィド結合が、必然的に、すなわち、特定の酸化ステップを実施する必要性を伴って形成される。単一のチオール基を含む還元剤の例としては、限定するものではないが、グルタチオン、メルカプトエタノール（例えば２−メルカプトエタノール）、メルカプトエチルアミン（例えば２−メルカプトエチルアミン）及びシステイン（例えばシステイン−ＨＣｌ）が挙げられる。
【００３０】
一実施形態において、チオール還元剤は、メルカプトエタノール（例えば２−メルカプトエタノール）、メルカプトエチルアミン（例えば２−メルカプトエチルアミン）、特に、２−メルカプトエチルアミン（ＢＭＥＡ、ｂＭＥＡ又はＢ−ｍｅａ、β−ｍｅａ又はβｍｅａとも呼ばれる）である。
【００３１】
一実施形態において、還元剤は、抗体組成物が本開示の温度範囲内にある前に添加される。一実施形態において、ステップａ）は、還元剤で処理した後に実施され、特に還元剤は加熱前に除去される。還元剤が強力であるほど、前処理ステップにおける使用に適していると思われ、ステップａ）の前に除去される。したがって、還元剤が亜リン酸、ＤＤＴ、ＴＣＥＰ及びＴＨＰから選択される一実施形態において、還元剤はステップａ）の前に除去される。必要に応じて、還元剤は、ダイアフィルトレーション等を含む常用の技術によって、加熱前に除去することができる。ＴＣＥＰを使用の際、最終抗体分子中に所望のジスルフィド結合を再導入する酸化ステップを必要とする場合がある。
【００３２】
一実施形態において、還元剤は、温度が３０〜６０℃の範囲になる前に除去されない。還元剤がステップａ）における加熱中、組成物中に留まる実施形態は、特に、還元剤がグルタチオン、メルカプトエタノール（例えば２−メルカプトエタノール）、メルカプトエチルアミン（例えば２−メルカプトエチルアミン）、及びシステイン（例えばシステイン−ＨＣｌ）から選択されるような単一のチオール基を含有する還元剤に対して有益である。
【００３３】
還元剤が、強度が中程度であって、熱変換ステップａ）の間保持されるＤＴＴ又は亜リン酸である場合、その範囲の下限の温度、例えば３０〜４５℃の範囲の温度を使用することができる。さらに、これらの試薬をいくつかの分子における温度と組み合わせて使用する場合、抗体モノマー分子中の所望のジスルフィド結合の一部又は全部を改良する酸化ステップが必要となり得る。
【００３４】
一実施形態において、還元剤は、抗体組成物が本開示の温度範囲にあった後に添加される。一実施形態において、還元剤は、抗体組成物が本開示の温度範囲に入っている時に添加される。一実施形態において、還元剤は、抗体組成物が本開示の温度範囲にあった後に添加される。一実施形態において、還元剤は、複数回、例えば、温度が所望の範囲内にある前、及び／又は組成物が所定の温度範囲にあった後に添加される。一実施形態において、還元剤は、本方法中、２回以上添加される。
【００３５】
上記の実施形態において、還元剤がステップａ）の加熱前に添加され、ステップａ）の加熱中、組成物中に留まるか、又は、抗体組成物が温度範囲に入っている時、若しくは抗体組成物が本開示の温度範囲にあった後に添加される場合、還元剤は、ダイアフィルトレーション等を含む常用の技術によって、加熱ステップ中又は加熱ステップ後に除去することができる。
【００３６】
一実施形態において、本方法は、抗体中に１つ又は複数のジスルフィド結合を再形成させるため、ステップａ）の後、酸化条件に本組成物を供するさらなるステップを含む。この実施形態は、亜リン酸、ＤＤＴ、ＴＣＥＰ又はＴＨＰなどの還元剤が使用される場合に有効となり得る。或いは、本方法は、ステップａ）の後、酸化条件に本組成物を供するステップを含まない。酸化ステップは、単一のチオール基を含む還元剤、例えば、グルタチオン、メルカプトエタノール（例えば２−メルカプトエタノール）、メルカプトエチルアミン（例えば２−メルカプトエチルアミン）、及びシステイン（例えばシステイン−ＨＣｌ）が使用される場合、特に必要ではない。
【００３７】
本開示に記載の方法のさらなる利点は、抗体分子が使用する条件によって完全にアンフォールドされないことである。それはすなわち、アンフォールディングに起因する非活性化が最小限に抑えられ、抗体をリフォールディングする必要がなくなるということである。抗体が複数のジスルフィド結合を含む一実施形態において、抗体中のすべてのジスルフィド結合が還元されるとは限らない。したがって、いわゆるＦａｂ−ｄｓＦｖなどの分子においては、抗体分子のＦａｂ断片及びＦｖ中の鎖内ジスルフィド結合は、本発明の方法によって還元されない。β−ｍｅａは、特にＦａｂ−ｄｓＦｖ分子において有利である。
【００３８】
還元剤の濃度は、一般に、１ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば１０〜９０ｍＭ、例えば３０〜９０ｍＭ、６０〜９０ｍＭ、７０〜９０ｍＭ、７０〜８０ｍＭ、８０〜９０ｍＭ、３０〜５０ｍＭ、又は２０〜５０ｍＭの範囲である。一実施形態において、還元剤の濃度は、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８３ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ及び１００ｍＭから選択される。
【００３９】
一実施形態において、還元剤は、アミノ酸、例えば、疎水性アミノ酸、極性アミノ酸、荷電アミノ酸の存在下で使用される。理論によって束縛されることは望まないが、アミノ酸の存在は、熱変換ステップ中、組換え抗体分子の分子構造を安定させるように作用して、熱変性に対して保護する結果、全収率を改善すると考えられる。一実施形態において、アミノ酸は、アルギニン、リシン、アラニン、プロリン、セリン及びグリシンから選択される。一実施形態において、アミノ酸の濃度は、０．０１〜１．０Ｍ、例えば、０．０１〜０．８Ｍ、０．２〜０．８Ｍ、又は０．７〜０．８Ｍの範囲である。一実施形態において、アミノ酸の濃度は、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８又は０．９Ｍから選択される。
【００４０】
一実施形態において、アミノ酸はプロリン、アラニン又はリシンである。一実施形態において、使用されるプロリン、アラニン又はリシンの濃度は、１０ｍＭ〜８００ｍＭの範囲であり、例えば、２０、５５、１１０、２８０、５５５又は７７７ｍＭである。
【００４１】
アミノ酸は、温度が適合範囲、例えば３０〜６０℃、特に本明細書に記載の範囲又は特定温度である前又は後に、組換え抗体組成物に添加することができる。一実施形態において、温度が３０〜６０℃の範囲に上昇する前に、アミノ酸を組成物に添加する。
【００４２】
一実施形態において、塩基性塩、例えば、クエン酸塩、硫酸塩又は炭酸塩、例えば、クエン酸塩又は硫酸塩を添加する。
【００４３】
一実施形態において、所望の範囲の温度を維持する期間は、約１〜７０時間、例えば２〜６０時間、例えば３〜５０時間、３〜１０時間、４〜６時間、特に４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５時間である。一実施形態において、この熱ステップは、例えば、攪拌が１００〜１２００ｒｐｍの範囲、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００又は１２００ｒｐｍの同時撹拌下で実施される。
【００４４】
一実施形態において、本組成物中の抗体の濃度は、１．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ、例えば２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌ、例えば２ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌの範囲である。
【００４５】
一実施形態において、本方法はアミノ酸を使用せず、１．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの範囲の抗体分子濃度を使用し、約５０℃の温度で、５０〜９０ｍＭの還元剤、例えばＢＭＥＡ又はＢＭＥ、特にＢＭＥＡの存在下において、約５時間実施される。有利には、収率は９０％の高収率であり得、その場合、それらの６０％以上が単量体である。
【００４６】
本発明の方法の一実施形態において、以下の反応条件を使用する：還元剤はＢＭＥＡであり、アミノ酸はリシンであり、温度は５０℃であり、期間は約５時間である。
【００４７】
一実施形態において、熱変換ステップは、４５〜５５℃の範囲の温度、例えば５０℃で、５０〜９０ｍＭ、例えば５０ｍＭ又は７５ｍＭの還元剤、例えばＢＭＥＡ又はＢＭＥ、特にＢＭＥＡの存在下において、４〜６時間の間、例えば５時間実施する。この実施形態において、抗体濃度は、好ましくは２〜３ｇ／Ｌの範囲である。一実施形態において、ステップａ）は、５０℃の温度で５時間実施され、ステップｂ）において、還元剤はＢＭＥＡ又はＢＭＥであり、濃度は７０〜８０ｍＭ、例えば７５ｍＭである。この実施形態において、熱変換ステップは、好ましくは、０．０１〜０．８Ｍ、例えば０．７〜０．８Ｍの範囲の濃度のプロリン、アラニン又はリシンから選択されるアミノ酸の存在下で行われる。
【００４８】
本開示の方法のさらなる実施形態において、以下の反応条件を熱変換ステップで使用する：還元剤は７５ｍＭ濃度のＢＭＥＡであり、アミノ酸は０．７〜０．８Ｍ濃度のリシンであり、温度は５０℃であり、期間は約５時間であり、抗体濃度は２〜３ｇ／Ｌ、例えば２．７５ｇ／Ｌである。有利には、収率は８２％以下であり得、それらの７９％以上が単量体である。
【００４９】
本明細書で使用される抗体分子は、抗体（すなわち、完全抗体）又はそれらの結合断片を意味する。
【００５０】
用語の「抗体」とは、すなわち、２本重鎖及び２本の軽鎖のエレメントを含む無傷の（完全）抗体、完全抗体又はそれらの結合断片を含む分子を意味する。本明細書で使用される結合断片は、１、２又は３つ以上の結合部位を含む抗体様分子を意味し、ここで、この分子は「完全抗体」の完全長重鎖又は軽鎖を含有していない。一実施形態において、結合断片は、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン（単数又は複数）を含まない。抗体の結合断片としては、単鎖抗体（すなわち、完全長重鎖及び軽鎖）；Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又は、ＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価若しくは四価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217を参照）、例えば、ＷＯ２００９／０４０５６２に開示されているＦａｂＦｖフォーマット及びＷＯ２０１０／０３５０１２に開示されているそのジスルフィド安定化バージョンを挙げることができる。本明細書で使用される用語「Ｆａｂ断片」とは、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン及び軽鎖（ＣＬ）の定常ドメインを含む軽鎖断片、並びに重鎖のＶＨ（可変重鎖）ドメイン及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を意味する。
【００５１】
抗体断片を作製及び製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181を参照）。本開示で使用するための他の抗体断片は、ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に開示されているＦａｂ及びＦａｂ’断片を含む。
【００５２】
典型的なＦａｂ’分子は、重鎖が可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及びヒンジ領域を含み、軽鎖が可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む、重鎖及び軽鎖の対を含む。一実施形態において、Ｆａｂ’の二量体が提供され、例えば、二量体形成はヒンジを介し得る。
【００５３】
一実施形態において、組換え発現された抗体分子は、多重特異性抗体分子、例えば、二重特異性抗体又は三重特異性抗体である。本明細書で使用される「二重特異性分子」とは、２つの抗原結合部位を有する分子を意味し、これは同一抗原又は異なる抗原に結合し得る。本明細書で使用される「三重特異性分子」とは、３つの抗原結合部位を有する分子を意味し、これは同一抗原又は異なる抗原に結合し得る。本明細書で使用される「多重特異性抗体」は、２つ以上の結合ドメイン、例えば２つ又は３つの結合ドメインを有する本明細書に記載の抗体分子を意味する。一実施形態において、ドメインは全部、抗原上の同一エピトープに結合すること、又は抗原上の異なるエピトープに結合することを含め、同一抗原に結合する。
【００５４】
本明細書で使用される「抗原結合部位」とは、１対の可変領域、特に、標的抗原と特異的に相互作用する同族対を含む、分子の一部を意味する。結合部位、抗原結合部位、結合ドメイン、抗原結合ドメインは、文脈が別段の指示をしない限り、本明細書では同義的に使用される。
【００５５】
したがって、一実施形態において、抗体分子は結合ドメインを含む。結合ドメインは、一般に、重鎖由来の３つ及び軽鎖由来の３つの６つのＣＤＲを含む。一実施形態において、各鎖由来の３つのＣＤＲはフレームワークにあり、そのフレームワークと一緒に可変領域を形成する。したがって、一実施形態において、抗体分子は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、抗原に特異的な結合ドメインを含む。本明細書で使用される活性断片は、結合断片と同義である。
【００５６】
本明細書で使用される「特異的に」とは、特異的である抗原のみを認識する抗原結合部位、又は、非特異的である抗原に対する親和性と比較した場合に特異的である抗原に対して有意に高い結合親和性、例えば、５、６、７、８、９、１０倍の高い結合親和性を有する結合部位を意味するものとする。結合親和性は、標準的なアッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴によって測定することができる。
【００５７】
抗体可変ドメインにおける残基は、慣例通り、Ｋａｂａｔらによって考案された方式によって番号付与される。この方式は、Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA（これ以降、「Ｋａｂａｔら」（上掲）という）に記載されている。別段の指示のない限り、この番号方式を本明細書において使用する。
【００５８】
Ｋａｂａｔ残基の呼称は、アミノ酸残基の直鎖状番号付与と必ずしも直接一致するとは限らない。実際の直鎖状アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであっても相補性決定領域（ＣＤＲ）であっても、構造成分の短縮又は構造成分への挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付与よりも少数のアミノ酸又は追加のアミノ酸を含有し得る。残基の正確なＫａｂａｔ番号付与は、抗体の配列における相同性残基を「標準」Ｋａｂａｔ番号付与配列とアラインメントすることによって、所与の抗体について決定することができる。
【００５９】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付与方式によれば、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)）によれば、ＣＤＲ−Ｈ１と同等のループは残基２６から残基３２に及んでいる。したがって、別段の指示のない限り、本明細書で使用される「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付与方式とＣｈｏｔｈｉａのトポロジーループ定義との組合せによる記載のとおり、残基２６から３５を意味するものとする。
【００６０】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付与方式によれば、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。本発明の方法において、抗体は、目的の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つのＦｖ（ＶＨ／ＶＬ対）を含み、前記ＶＨ及びＶＬは、１つ又は複数のリンカーを介して直接的又は間接的に連結され、それらの間のジスルフィド結合によって安定化される。
【００６１】
一実施形態において、抗体又はその結合断片は、例えば、ジスルフィドが重鎖と軽鎖の間のような鎖間ジスルフィド結合である場合、及び／又は２つの重鎖間のヒンジ領域にある結合である場合、さらなるジスルフィド結合を含む。
【００６２】
一実施形態において、組換え発現された抗体分子は、１つ又は複数の、例えば、１、２、３、４、５又は６つのジスルフィド結合を含む。一実施形態において、ジスルフィドは天然に存在する。一実施形態において、１つ又は複数のジスルフィドは、特定の位置にあるように操作される。一実施形態において、少なくとも１つの天然に存在するジスルフィド結合及び少なくとも１つの操作されたジスルフィド結合が存在する。本明細書で使用される操作されたジスルフィド結合は、ジスルフィド結合中の１つ又は両方の硫黄が組換え遺伝子工学技術によって導入されたものを意味する。
【００６３】
ＶＨとＶＬの間のジスルフィド結合の位置は限定されない。可変ドメイン中のジスルフィド結合に関する位置の例としては、以下を含む群から選択される位置が挙げられるが、これらに限定するものではない：
・  ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ、例えば、Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)を参照；
・  ＶＨ４４＋ＶＬ１００、例えば、Biochemistry 33 5451-5459 Reiter et al (1994)；又はJournal of Biological Chemistry Vol. 269 No. 28 pp.18327-18331 Reiter et al (1994)；又はProtein Engineering, vol.10 no.12 pp.1453-1459 Rajagopal et al (1997)を参照;
・  ＶＨ４４＋ＶＬ１０５、例えば、J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995)を参照；
・  ＶＨ４５＋ＶＬ８７、例えば、Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)を参照；
・  ＶＨ５５＋ＶＬ１０１、例えば、FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)を参照；
・  ＶＨ１００＋ＶＬ５０、例えば、Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990)を参照；
・  ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；
・  ＶＨ９８＋ＶＬ４６、例えば、Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)を参照；
・  ＶＨ１０１＋ＶＬ４６；
・  ＶＨ１０５＋ＶＬ４３、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993)；又はProteins 19, 35-47 Jung et al (1994)を参照；
・  ＶＨ１０６＋ＶＬ５７、例えば、FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)を参照、
及び分子中に位置する可変領域対におけるそれらに対応する位置（単数及び複数）。
【００６４】
したがって、一実施形態において、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、１つがＶＨ内にあり、１つがＶＬ内にある、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されていてもよく、対のシステイン残基の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３、並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。一実施形態において、ジスルフィド結合は、位置ＶＨ４４及びＶＬ１００の間で形成される。
【００６５】
上記で列挙したアミノ酸対は、ジスルフィド結合が形成され得るように、システインによる置き換えに寄与する位置にある。システインは、公知の技術によって、これらの所望する位置へ操作することができる。したがって、一実施形態において、本開示による操作されたシステインとは、所与のアミノ酸位置の天然残基がシステイン残基と置き換えられた場合のものを意味する。
【００６６】
操作されたシステインの導入は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施することができる。これらの方法としては、限定するものではないが、ＰＣＲ伸長オーバーラップ突然変異誘発、部位特異的変異誘発又はカセット変異誘発（一般に、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993を参照）が挙げられる。部位特異的変異誘発キットは市販されており、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）がある。カセット変異誘発は、Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323に基づいて実施することができる。或いは、変異体は、アニーリング、連結及びＰＣＲ増幅、並びに重複オリゴヌクレオチドのクローニングによる全遺伝子合成によって作製することができる。
【００６７】
一般に、ＶＨ及びＶＬが１つ又は複数のリンカーを介して直接的又は間接的に連結されており、それらの間のジスルフィド結合によって安定化されているＶＨ／ＶＬ対は、抗原結合部位を形成し、協同作用的に抗原に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対であり、すなわち、同一抗原に対する親和性を有し、協同作用的に抗原に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である。典型的には、それらは、同一抗体、例えば、宿主によってインビボで生成される抗体に由来するＶＨ／ＶＬ対である。本明細書で使用されるような協同作用的に抗原を結合するとは、可変領域が共に標的抗原に特異的に結合することを意味する。
【００６８】
一実施形態において、抗体は、ＶＨが重鎖定常ドメインＣＨ１にＣ末端で融合されておらず、ＶＬが軽鎖定常領域ＣＬにＣ末端で融合されていない、少なくとも１つのＦｖを含む（Ｃカッパ又はＣラムダ）。
【００６９】
ＶＨドメイン及びＶＬドメインは相互作用を形成することが可能であり、他の抗体分子中のＶＨドメイン又はＶＬドメインとの相互作用を介して多量体が形成される。
【００７０】
Ｆｖにおいて、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、リンカーを介して互いに直接的に連結されていてもよく、又はリンカーを介して１つ若しくは複数のさらなる分子に間接的に連結していてもよい。ＶＨとＶＬの間の連結は、所与のＶＨ及びＶＬ対の関係を「固定」又は決定し、その結果、オリジナルのＶＨとＶＬの関係は連結の存在によって維持されるので、前記ＶＨ対と別の分子中のＶＬとが対になる場合、多量体が形成される。
【００７１】
反対に、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが１つ又は複数のリンカーによって連結されていないＦｖにおいては、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは「ばらばらになること」（ブリーシング（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）とも呼ばれる）が可能であり、これらが修復される場合、可変ドメインの１つが（置き換わるオリジナルの可変領域と同じ配列を有するが）オリジナル対合由来でないならば、そのとき分子は単に単量体として変性する。
【００７２】
本発明において言及したリンカーは、好ましくは、ジスルフィド結合ではない。抗体での使用に適したリンカーは、当技術分野において周知である。リンカーは、１つ又は複数のアミノ酸を含み得る。さらなる実施形態において、リンカーは、２〜４０個のアミノ酸、例えば、２〜３０個、２〜２０個又は２〜１０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの例は、下記に開示したものが挙げられる。
【００７３】
一実施形態において、リンカーは、配列３９〜９０に示した配列から選択される。
【表１】
2018515453.tif 000002
【表２−１】
2018515453.tif 000003
【表２−２】
2018515453.tif 000004
（Ｓ）は、配列５０〜５４において任意選択である。
【００７４】
リジッドなリンカーの例としては、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号８９）、ＰＰＰＰ（配列番号９０）及びＰＰＰが挙げられる。
【００７５】
本発明の一態様において、Ｆｖは、単一のリンカーによって直接連結されているＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。ＶＨドメイン及びＶＬドメインを直接連結するのに適したリンカーは、上記に記載されている。
【００７６】
一実施形態において、ＶＨ及びＶＬは、ｄｓｓｃＦｖとも呼ばれる、ジスルフィド安定化単鎖可変断片を形成し、これはＶＨ及びＶＬ可変ドメイン間のペプチドリンカーと前記ＶＨ及びＶＬ間のドメイン間のジスルフィド結合を有する単鎖可変断片である分子である。
【００７７】
この実施形態において、ｄｓｓｃＦｖ分子は、１つ又は複数のさらなる分子、好ましくは第２の抗体又はその結合断片に融合され、二価、三価又は四価抗体を形成し得る。ｄｓｓｃＦｖは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＶＨ及びＶＬの両方に位置し得る１つ又は複数のリンカーを介して１つ又は複数のさらなる分子に融合される。例えば、１つ又は複数のｄｓｓｃＦｖ分子は、完全抗体又はその結合断片の１つ又は複数の鎖のＣ末端又はＮ末端に融合され得る。例えば、２つ以上のｄｓｓｃＦｖ分子を互いに融合させて、ダイアボディ、タンデムｓｃＦＶ（ビス−ｄｓｓｃＦｖ）又はミニボディを形成することができる。
【００７８】
Ｆｖ領域を介して多量体化する傾向を有し得る抗体フォーマットとしては、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ｓｃダイアボディＣＨ３、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ツーインワン（ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ）ＩｇＧ、デュアルＶドメインＩｇＧ、ＩｇＧ−Ｖ及びＶ−Ｉｇが挙げられる。ジスルフィド結合がこれらの構築物を安定化させるためにＦｖ又はｓｃＦｖにおいて使用される場合、得られる単量体の収率を改善するために本方法を使用することは有益であり得る。
【００７９】
本発明のさらなる態様において、各ＶＨ及びＶＬは、第２の分子を介してＶＨ及びＶＬを間接的に連結するリンカーを含む。この態様において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、別々のリンカーを介して第２の分子に連結される。各可変ドメインを第２の分子に連結するのに適したリンカーは、上記に記載されている。第２の分子は、ＶＨとＶＬの間の間接的連結を提供する。各ＶＬ及びＶＨは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを標的抗原に協同作用的に結合させるために、適切な位置で第２の分子に連結される。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ペプチド結合又はペプチドリンカーにより互いに直接的に連結されない。
【００８０】
この態様において、第２の分子は、好ましくは、二価、三価又は四価の抗体を形成するための第２抗体又はその結合断片である。一実施形態において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、完全抗体又はＦａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２を介して間接的に連結される。例えば、第２抗体がＦａｂである場合、ＶＨドメインは、第２抗体のＣＨ１などの重鎖定常領域のＣ末端に融合されていてもよく、ＶＬ単一ドメイン抗体は、第２抗体の軽鎖定常領域のＣ末端（Ｃカッパ又はＣラムダ）に融合されていてもよく、それによりＦａｂ−ｄｓＦｖが形成される。Ｆａｂ−ｄｓＦｖ抗体は、参照によって本明細書に援用されるＷＯ２０１０／０３５０１２及びＷＯ２０１１／０３６４６０に詳細に開示されている。
【００８１】
抗体は、さらなる結合ドメイン、例えば、ＷＯ２０１１／１１７６５３に開示されているジスルフィド安定化ＤＶＤ−Ｉｇ分子、又はＷＯ２０１１／０３０１０７に開示されている、いわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃなどを含んでいてもよい。なお、前記の各文献は参照により本明細書に援用される。したがって、本明細書で使用される抗体には、二価、三価又は四価の抗体が含まれる。
【００８２】
本発明の方法において使用され得る他の適切な抗体フォーマットは、それぞれ参照により本明細書に援用される、ＦａｂＦｖＦｃ及び（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃ抗体を開示するＷＯ２０１１／０３０１０７、ＰＥＧにコンジュゲートされているＦａｂ−ｄｓＦｖ抗体を開示するＷＯ２０１１／０６１４９２、及びＦａｂ−ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖを開示するＷＯ２０１１／０８６０９１に開示されており、この場合、ジスルフィド結合がＦｖ又はｓｃＦｖに用いられている。
【００８３】
単量体収率を改善するために本発明の方法で使用され得る他の適切な抗体フォーマットは、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１５／１９７７７２に開示されており、これは、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖；及び、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖；
（式中、
ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表し；
Ｘは、結合又はリンカーを表し；
Ｙは、結合又はリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣカッパを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し、
ここで、Ｖ１及びＶ２の少なくとも１つはｄｓｓｃＦｖである）
を含むか、又はこれらからなる多重特異性抗体分子を開示している。
【００８４】
本明細書で使用される「単鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」とは、ＶＨ可変ドメイン及びＶＬ可変ドメイン間のペプチドリンカーによって安定化される、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むか、又はこれらからなる単鎖可変断片を意味する。ＶＨ可変ドメイン及びＶＬ可変ドメインは、任意の適切な配向性であり得る。例えば、ＶＨのＣ末端は、ＶＬのＮ末端に連結されてもよく、又は、ＶＬのＣ末端はＶＨのＮ末端に連結されてもよい。
【００８５】
本明細書で使用される「ジスルフィド安定化単鎖可変断片」又は「ｄｓｓｃＦｖ」とは、ＶＨ可変ドメイン及びＶＬ可変ドメイン間のペプチドリンカーによって安定化され、またＶＨとＶＬの間のドメイン間ジスルフィド結合を含む単鎖可変断片を意味する。本明細書で使用される「ジスルフィド安定化可変断片」又は「ｄｓＦｖ」とは、ＶＨ可変ドメインとＶＬ可変ドメインの間のペプチドリンカーは含まず、その代りに、ＶＨとＶＬの間のドメイン間ジスルフィド結合によって安定化される、単鎖可変断片を意味する。
【００８６】
本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」とは、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨなどの単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を意味する。
【００８７】
抗体フォーマットの例を図２８に示す。一実施形態において、Ｖ１及びＶ２は両方ともｄｓｓｃＦｖであり、この抗体フォーマットは、本明細書ではＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖとも呼ばれる。ＶＨ可変ドメイン及びＶＬ可変ドメインは、任意の適切な配向性であり得る。例えば、ＶＨのＣ末端は、ＶＬのＮ末端に連結されてもよく、又は、ＶＬのＣ末端はＶＨのＮ末端に連結されてもよい。
【００８８】
単量体収率を改善するための本発明の方法で使用され得る他の適切な抗体フォーマットは、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１３／０６８５７１の実施例４に開示されており、これはＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ抗体フォーマットを開示している。抗体フォーマットの例を図２９に示す。
【００８９】
一実施形態において、抗体はＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含まない。
【００９０】
一実施形態において、抗体断片は、例えば、それぞれ参照によって本明細書に援用されるＷＯ２０１０／０３５０１２及びＷＯ２０１１／０３６４６０に開示されている、いわゆるＦａｂ−ｄｓＦｖフォーマットである。
【００９１】
一実施形態において、抗体は、ＷＯ２０１１／１１７６４８に開示されているジスルフィド安定化Ｆａｂである。一実施形態において、抗体は、ＷＯ２０１１／１１７６４８に開示されているジスルフィド安定化Ｆａｂではない。
【００９２】
一実施形態において、抗体は、ＯＸ４０に特異的な結合ドメインを含む。
【００９３】
一実施形態において、抗体は、血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む。
【００９４】
一実施形態において、抗体は、ＯＸ４０に特異的な結合ドメイン及び血清アルブミンに特異的な結合ドメイン、特に、例えば血清アルブミン結合ドメインがＦｖ部分である、Ｆａｂ−ｄｓＦｖフォーマットを含み、特に、参照によって本明細書に援用されるＷ０２０１３／０６８５６３に開示されているＯＸ４０及びヒト血清アルブミンに特異的な二重特異性構築物である。
【００９５】
本開示は、
第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、ＣＨ１ドメイン及び第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）をＮ末端から順に含む重鎖、
第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、ＣＬドメイン及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）をＮ末端から順に含む軽鎖
を含む、ヒトＯＸ４０及びヒト血清アルブミンに結合する二重特異性抗体融合タンパク質であって、
前記重鎖及び軽鎖は、ＶＨ１及びＶＬ１が第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２及びＶＬ２が第２の抗原結合部位を形成するように整列されており、
第１の抗原結合部位によって結合される抗原はヒトＯＸ４０であり、第２の抗原結合部位によって結合される抗原はヒト血清アルブミンであり、特に、
重鎖の第１の可変ドメイン（ＶＨ１）は、ＣＤＲ−Ｈ１に関する配列番号１に示した配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関する配列番号２に示した配列、及びＣＤＲ−Ｈ３に関する配列番号３に示した配列を含み、軽鎖の第１の可変ドメイン（ＶＬ１）は、ＣＤＲ−Ｌ１に関する配列番号４に示した配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関する配列番号５に示した配列、及びＣＤＲ−Ｌ３に関する配列番号６に示した配列を含み、
第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）は、配列番号１１に示した配列を有し、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、配列番号１２に示した配列を有し、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、ジスルフィド結合によって連結されている、上記二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
【００９６】
一実施形態において、ＣＨ１ドメインと第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の間にペプチドリンカーが存在する。一実施形態において、ＣＬドメインと第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の間にペプチドリンカーが存在する。一実施形態において、第１重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）は、配列番号８に示した配列を含む。一実施形態において第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）は、配列番号７に示した配列を含む。一実施形態において、重鎖は、配列番号１５に示した配列に含むか、又はこれらからなる。一実施形態において、軽鎖は、配列番号１６に示した配列を含むか、又はこれらかなる。
【００９７】
一実施形態において、抗体分子は、血清アルブミン結合ドメイン、例えば、配列番号２９又は３０に示した可変領域由来の１、２又は３つの重鎖ＣＤＲ、及び配列番号３１又は３２に示した可変領域由来の１、２又は３つの軽鎖ＣＤＲ、特に、ＣＤＲＨ１に対するＣＤＲＨ１、ＣＤＨ２に対するＣＤＲＨ２、ＣＤＨ３に対するＣＤＲＨ３などの配列番号２９又は３０に示した可変領域由来の３つの重鎖ＣＤＲ、及びＣＤＲＬ１に対するＣＤＲＬ１、ＣＤＬ２に対するＣＤＲＬ２、ＣＤＬ３に対するＣＤＲＬ３などの配列番号３１又は３２に示した可変領域由来の３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【００９８】
一実施形態において、抗体分子は、配列番号３０に示した重鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗体分子は、配列番号３２に示した軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗体分子は、配列番号３０に示した重鎖可変領域、及び配列番号３２に示した軽鎖可変領域を含む。
【００９９】
一実施形態において、重鎖は、配列番号１５又は１９を含むか、又はこれらからなる。一実施形態において、軽鎖は、配列番号１６又は２０を含むか、又はこれらからなる。一実施形態において、結合断片抗体分子は、配列番号１５及び１６、１５及び２０、１６及び１９、又は１９及び２０を含む。したがって、一実施形態において、配列番号１５に示した配列を含む重鎖、及び配列番号１６に示した配列を含む軽鎖を有する、ヒトＯＸ４０及びヒト血清アルブミンに結合する二重特異性抗体融合タンパク質が提供される。
【０１００】
一実施形態において、Ｆａｂ−ｄｓＦｖフォーマットなどの抗体分子は、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１４／０１９７２７に開示されているものである。
【０１０１】
一実施形態において、抗体分子は、特に、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１３／０６８５７１に開示されているＣＤＲ又は可変領域を有する、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む。
【０１０２】
一実施形態において、本開示による抗体又は断片は、モノクローナルである。モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ハイブリドーマ技術（Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985）などによって調製することができる。
【０１０３】
本開示の方法で使用される抗体分子はまた、例えば、Babcook, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93(15), 7843-7848、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７に開示されている方法によって、特異的抗体を産生するために選択された単一リンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし発現させることによる単一リンパ球抗体法を使用して産生することができる。
【０１０４】
ヒト化抗体分子は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び非ヒト種由来の１つ又は複数のドナー残基を任意選択的に含むヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。一実施形態において、本開示の方法に供される抗体又は結合断片は、ヒト化される。
【０１０５】
本発明の方法で使用される抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して産生することができ、Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182, 41-50;Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184, 177-186;Kettleborough et al. Eur. J. Immunol., 1994, 24, 952-958;Persic et al., Gene, 1997 187, 9-18；及びBurton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；及びＷＯ９５／２０４０１；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第５，４０３，４８４号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，７５０，７５３号；米国特許第５，８２１，０４７号；米国特許第５，５７１，６９８号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，５１６，６３７号；米国特許第５，７８０，２２５号；米国特許第５，６５８，７２７号；米国特許第５，７３３，７４３号；及び米国特許第５，９６９，１０８号によって開示されているものが挙げられる。
【０１０６】
トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物を含む他の生物も、例えばファージ技術を使用してヒト化抗体を産生するために使用することができる。
【０１０７】
完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、すべてヒト起源である、又は必ずしも同一抗体由来ではないヒト起源の配列に実質的に同一であるそれらの抗体である。完全ヒト化抗体の例としては、例えば、上記のファージディスプレイ法により産生される抗体、並びに、例えば、欧州特許第０５４６０７３号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、欧州特許第０４３８４７４号、及び欧州特許第０４６３１５１号において一般用語で記載されているように、マウス免疫グロブリン可変領域遺伝子及び／又は定常領域遺伝子がそのヒト相当物によって置き換えられているマウスにより産生される抗体が挙げられる。
【０１０８】
本発明の方法で使用するための抗体物質は、抗体可変領域及び定常領域（単数又は複数）をコードするＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技術を使用することによって調製することができる。標準的な分子生物学技術を使用して、所望のアミノ酸又はドメインを修飾、付加又は欠失させることができる。可変領域又は定常領域への任意の改変は、本明細書で使用される用語「可変」領域及び「定常」領域によりさらに包含される。
【０１０９】
抗体出発物質は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含む任意の種から得ることができる。抗体の一部は、２つ以上の種から得ることができ、例えば、抗体はキメラであってもよい。一例において、定常領域は１つの種に由来し、可変領域は別の種に由来する。また抗体出発物質は、改変されていてもよい。別の例において、抗体の可変領域は、組換えＤＮＡ操作技術を使用して作製された。このような操作されたバージョンは、例えば、天然抗体のアミノ酸配列における挿入、欠失又は変化によって、天然抗体可変領域から作製されたものを含む。このタイプの特定の例は、少なくとも１つのＣＤＲを含有し、任意選択的に、１つの抗体に由来する１つ又は複数のフレームワークアミノ酸、及び第２抗体由来の可変領域ドメインの残りを含有する操作された可変領域ドメインを含む。これらの抗体を作製し製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Bossら、米国特許第４，８１６，３９７号；Cabillyら、米国特許第６，３３１，４１５号；Shraderら、ＷＯ９２／０２５５１；Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, 3833； Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323;Bird et al, 1988, Science, 242, 423； Queenら、米国特許第５，５８５，０８９号；Adair、ＷＯ９１／０９９６７； Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142；Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181を参照）。
【０１１０】
一実施形態において、抗体は、同族対である結合ドメインを形成する可変ドメイン対を含む。本明細書で使用される同族対は、可変ドメインの天然の対、すなわち、単一抗体又は抗体発現細胞から単離されたものを意味するものとする。可変ドメインは、最適化及び／又はヒト化されていてもよい。同族対に由来する最適化／ヒト化可変ドメインは、最適化／ヒト化後も依然として同族対と考えられる。
【０１１１】
したがって、本開示は、ヒト抗体分子、ヒト化抗体分子又はキメラ抗体分子を本明細書に開示の方法に供することにまで及ぶ。
【０１１２】
抗体は、任意の標的抗原に特異的であり得る。抗原は、細胞関連タンパク質、例えば細胞上、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質であってもよく、又は、可溶性タンパク質であってもよい。また目的の抗原は、任意の医学上の関連タンパク質、例えば疾患又は感染中にアップレギュレートされるタンパク質、例えば、受容体及び／又はそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面タンパク質の特定の例としては、接着分子、例えばβ１インテグリンなどのインテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１、又はＣＳＦ１−受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ｄｕｄｕｌｉｎ２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ抗原及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、ＰＤ−１、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＴＬ１Ａ、ＤＲ３、ＩＬ−７受容体Ａ、並びに必要に応じて、それらの受容体が挙げられる。
【０１１３】
可溶性抗原としては、インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７、例えばＩＬ１７Ａ及び／又はＩＬ１７Ｆ、ウイルス抗原、例えば呼吸器系合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えばＩｇＥ、インターフェロン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγ、腫瘍壊死要因ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子−αとして知られていたもの、本明細書ではＴＮＦ又はＴＮＦαとも呼ばれる）、腫瘍壊死因子−β、コロニー刺激因子、例えばＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ、及び血小板由来増殖因子、例えばＰＤＧＦ−α、及びＰＤＧＦ−β、ＷＩＳＰ−１、並びに必要に応じて、それらの受容体が挙げられる。他の抗原としては、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、ウイルス、例えばインフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、ＨｅｐＢ及びＨｅｐＣ、バイオテロ剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ毒及びクモ毒及び毒素が挙げられる。
【０１１４】
一実施形態において、本方法は、ヒトへの投与に適した基準まで抗体分子を精製し、次いで、それを製剤化するさらなるステップを含む。
【０１１５】
本明細書に記載の方法を使用して精製した抗体分子は、高い結合親和性、特にナノモル又はピコモルを有する。
【０１１６】
親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して測定することができる。一実施形態において、抗体又は結合断片は、約１００ｐＭ以上、例えば約５０ｐＭ以上、例えば約４０ｐＭ以上、特に３０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態において、抗体又は結合断片は完全にヒトであるかヒト化されており、約１００ｐＭ以上の結合親和性を有する。
【０１１７】
本明細書で使用される天然に存在するドメインの誘導体は、天然に存在する配列中の１、２、３、４又は５個のアミノ酸が、例えば、望ましくない特性を排除するが、ドメインを特徴付ける機能（単数及び複数）は保持されるように置換又は欠失され、ドメインの特性を最適化することを意味するものとする。
【０１１８】
抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることも、当業者には理解されよう。これらの修飾の種類及び程度は、多くの場合、分子を発現するために使用される宿主細胞系、並びに培養条件に依存する。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化におけるバリエーション変異体を含み得る。最も一般的な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（例えばリシン又はアルギニンなど）の欠失である（Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995に開示されている）。これらの翻訳後の変化は、分子の特性に影響を及ぼし、したがって下流プロセシングに影響を与える可能性がある。
【０１１９】
一実施形態において、本開示の方法で使用される抗体組成物は、酢酸ナトリウムを例えば２５ｍＭの濃度で含まない。一実施形態において、本開示の方法で使用される抗体組成物は、塩化ナトリウムを例えば２５ｍＭの濃度で含まない。
【０１２０】
疎水性アミノ酸の例としては、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン、例えばアラニン、プロリン又はグリシンが挙げられる。極性アミノ酸の例としては、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン及びトリプトファン、例えばセリンが挙げられる。荷電アミノ酸の例としては、アルギニン、リシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸、例えばアルギニン又はリシン、特にリシンが挙げられる。
【０１２１】
クエン酸塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウム、例えばナトリウム又はカリウム、特にナトリウムが挙げられる。硫酸塩の例としては、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウム、例えばアンモニウムが挙げられる。炭酸塩（重炭酸塩を含む）の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及び対応するそれら重炭酸塩形態が挙げられる。
【０１２２】
一実施形態において、塩は０．５〜５ｍＭの濃度、例えば、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５又は５ｍＭである。一実施形態において、硫酸アンモニウムは、４ｍＭの濃度である。一実施形態において、クエン酸ナトリウムは、１．５ｍＭの濃度である。
【０１２３】
一実施形態において、本開示による熱変換ステップは、清澄化された上清に対して行われる。上清は、任意の適切な手段、例えば、遠心分離、濾過等によっても清澄化することができる。一実施形態において、上清は０．２２ミクロンの濾過を使用して清澄化される。
【０１２４】
一実施形態において、プロテインＡクロマトグラフィーのステップは、熱変換ステップ前に、上清に対して行われる。プロテインＡ精製は、この技術が多量体を単量体から分離させることができるので、本明細書に開示の抗体分子のタイプ（特にＣＨ２ＣＨ３ドメインを含まないもの）の論旨において特に有利である。
【０１２５】
プロテインＡクロマトグラフィーの使用は、単量体形態にＦｃ領域を含まないヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収するために使用することができる。結合活性効果がヒトＶＨ３ドメインとプロテインＡとの結合間で観察されている。Ｆｃ領域とプロテインＡの間の相互作用については開示されておらず、抗体の単量体形態及び多量体形態を含有する混合物から単量体ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収することができることを示したこの知見は驚くべきことである。
【０１２６】
したがって、プロテインＡ精製のステップは、ａ）単量体形態及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を、ドメインＤ及び／又はドメインＥを含むプロテインＡクロマトグラフィー材料に、前記抗体をプロテインＡに結合させる条件下で供するステップと、ｂ）ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体がＦｃ領域を含有していない、単量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収するステップとを含み得る。或いは、プロテインＡ精製のステップは、ａ）単量体形態及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を、ドメインＤ及び／又はドメインＥを含む前記プロテインＡクロマトグラフィー材料に供するステップと、ｂ）前記抗体をプロテインＡに結合させるステップと、ｃ）単量体形態の抗体の結合を選択的に破壊する溶出バッファーを適用するステップと、ｄ）得られた溶出液を回収するステップと、任意選択的で、ｅ）多量体形態の抗体の結合を破壊する第２の溶出バッファーを適用し、この第２の溶出液を回収するステップとを含み、ここで、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体はＦｃ領域を含有しない。抗体がＯＸ４０に特異的な抗体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ及びＷ０２０１３／０６８５６３に開示されているヒト血清アルブミンである一実施形態において、プロテインＡ精製が上記のように実施されるが、その場合、ステップｃ）では、単量体の結合を破壊するための溶出バッファーがｐＨ３．５〜ｐＨ４．２、好ましくはｐＨ３．６〜ｐＨ４．１、ｐＨ３．７〜ｐＨ４．０、好ましくはｐＨ３．８〜ｐＨ３．９又はｐＨ３を有し、任意選択のステップｅ）では、多量体形態の抗体の結合を破壊する溶出バッファーが３．５未満のｐＨ、好ましくは３．４未満のｐＨ、好ましくはｐＨ２．８〜ｐＨ３．２、好ましくはｐＨ２．９〜ｐＨ３．１、好ましくはｐＨ３．０を有する。
【０１２７】
或いは、プロテインＡ精製のステップは、ａ）単量体形態及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物を、ドメインＤ及び／又はドメインＥを含む前記プロテインＡクロマトグラフィー材料に供するステップと、ｂ）多量体形態の抗体を結合させるステップと、ｃ）流出液中の単量体形態の抗体を回収するステップと、任意選択的で、ｄ）多量体形態の抗体の結合を選択的に破壊する溶出バッファーを適用するステップと、ｅ）ｄ）によって得られた溶出液を回収するステップとを含み、ここで、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体はＦｃ領域を含有しない。
【０１２８】
別の実施形態において、プロテインＡクロマトグラフィーは、熱変換ステップ前に実施されない。
【０１２９】
一実施形態において、本方法は、さらなる下流処理ステップを含む。一実施形態において、本方法は、下流精製のさらなるステップを含み、例えば、下流処理はクロマトグラフィーステップ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーなどを含む。
【０１３０】
本明細書で使用される下流処理ステップは、抗体をさらに精製するためのステップａ）に続いて使用される少なくとも１つのステップを意味する。下流処理の例としては、１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムなど）が挙げられる。ポリペプチド及びタンパク質の下流処理において使用される技術は、当業者には周知である。
【０１３１】
一実施形態において、下流処理は、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップ、特にイオン交換クロマトグラフィーを含む。一実施形態において、本方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーステップ、続いて陽イオン交換クロマトグラフィーステップを含み、又はその逆も含む。一実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーが使用される。一実施形態において、混合モードクロマトグラフィーが使用される。一実施形態において、複数のクロマトグラフィーステップが使用される。
【０１３２】
一実施形態において、本方法は、ウイルスの不活性化ステップ、例えば定義した期間、定義したｐＨで、例えば低いｐＨでタンパク質含有組成物を保持することを含む。
【０１３３】
一実施形態において、最終の下流処理ステップは、タンパク質に対する最終保存バッファー及び濃度を得るためのダイアフィルトレーションステップ及びバッファー交換である。
【０１３４】
一実施形態において、熱変換ステップに続く下流処理は、熱変換ステップ前に、上述したようなプロテインＡ（例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム）精製を含む。
【０１３５】
一実施形態において、下流処理は、ウイルス不活性化ステップ、続いて限外濾過及びバッファー交換、次に続いて陰イオン交換クロマトグラフィー及びその後の陽イオン交換クロマトグラフィー、及びウイルス濾過ステップをさらに含む。
【０１３６】
一実施形態において、熱変換ステップに続く下流処理は、ウイルス不活性化ステップ、続いて限外濾過及びバッファー交換、次に続いて陰イオン交換クロマトグラフィー及びその後の陽イオン交換クロマトグラフィー、及びウイルス濾過ステップを含む。
【０１３７】
一実施形態において、下流処理は、ウイルス不活性化ステップ、続いて限外濾過及びバッファー交換、次に続いて陽イオン交換クロマトグラフィー及びその後の陰イオン交換クロマトグラフィー、及びウイルス濾過ステップをさらに含む。
【０１３８】
一実施形態において、熱変換ステップに続く下流処理は、ウイルス不活性化ステップ、続いて限外濾過及びバッファー交換、次に続いて陽イオン交換クロマトグラフィー及びその後の陰イオン交換クロマトグラフィー、及びウイルス濾過ステップを含む。
【０１３９】
他の下流処理ステップとしては、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は混合モードクロマトグラフィーが挙げられる。
【０１４０】
一実施形態において、最終の下流処理ステップは、タンパク質に対する最終保存バッファー及び濃度を得るためのダイアフィルトレーションステップ及びバッファー交換である。
【０１４１】
一実施形態において、本明細書に開示された方法は、精製された単量体抗体分子を１つ又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートさせる、さらなるステップを提供した。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子又は抗体分子に結合させることができる単一の部分を形成するように連結された２つ以上のこのような分子を含み得る。
【０１４２】
エフェクター分子に連結された抗体を得ることが望ましい場合、これは、抗体が直接的に又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結される標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順によって調製することができる。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせる技術は、当技術分野で周知である（Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53； Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62:119-58、及びDubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123を参照）。特定の化学的手順は、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１に開示されているものが挙げられる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に開示されている組換えＤＮＡ手順を使用して達成することができる。
【０１４３】
本明細書で使用される用語のエフェクター分子としては、例えば、抗腫瘍剤、薬物、毒素、生物学的に活性のあるタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成の若しくは天然の高分子、核酸及びそれらの断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート金属、ナノ粒子及びレポーター基、例えば蛍光性化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物が挙げられる。
【０１４４】
エフェクター分子の例はとしては、細胞に有害な（例えば、死滅させる）薬剤を含む、細胞毒又は細胞傷害性剤を挙げることができる。例としては、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎｓ）、ドラスチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。
【０１４５】
またエフェクター分子としては、限定するものではないが、抗代謝剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルマスティン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトチン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アンスラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、並びに抗有系分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられる。
【０１４６】
他のエフェクター分子としては、キレート放射性核種、例えば１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カルホルニウム２５２、イリジウム１９２並びにタングステン１８８／レニウム１８８；又は、限定するものではないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を挙げることができる。
【０１４７】
他のエフェクター分子としては、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。目的の酵素としては、限定するものではないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられる。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、限定するものではないが、免疫グロブリン、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素、タンパク質、例えばインスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓症薬又は抗血管新生薬、例えばアンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又は生体応答調整物質、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）又は他の成長因子及び免疫グロブリンが挙げられる。
【０１４８】
他のエフェクター分子としては、例えば、診断に有用な検出可能物質を挙げることができる。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、ポジトロン放出金属（ポジトロン放出断層撮影で使用するためのもの）、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断として使用するための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、一般的に、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられる；適切な発光物質としては、ルミノールが挙げられる；適切な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられる；適切な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが挙げられる。
【０１４９】
別の例においては、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期を延長し、及び／又は抗体の免疫原性を低下させ、及び／又は上皮関門を横切る免疫系までの抗体の送達を増強し得る。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はＷＯ０５／１１７９８４に開示されているようなアルブミン結合化合物が挙げられる。
【０１５０】
エフェクター分子がポリマーである場合、それは一般に、合成ポリマー若しくは天然ポリマー、例えば、任意に置換されている直鎖又は分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分枝若しくは非分枝状ポリサッカライド、例えば、ホモ−若しくはヘテロ−ポリサッカライドであり得る。
【０１５１】
上記合成ポリマー上に存在し得る特定の任意の置換基としては、１つ又は複数個のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基が挙げられる。
【０１５２】
合成ポリマーの特定の例としては、任意に置換されている直鎖又は分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）、又はそれらの誘導体、特に、任意に置換されているポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はそれらの誘導体などが挙げられる。特定の天然ポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体が挙げられる。
【０１５３】
本明細書で使用される「誘導体」には、例えば、マレイミド等のチオール選択性反応基等の反応性誘導体を含むものとする。反応基は、直接的に、又はリンカーセグメントを介してポリマーに連結され得る。このような基の残基は、ある場合には、開示の抗体とポリマーの間の連結基として生成物の一部を形成することは理解されよう。
【０１５４】
ポリマーのサイズは、所望に応じて変えることができるが、一般に、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば５０００〜４００００Ｄａ、例えば２００００〜４００００Ｄａなどの平均分子量の範囲である。ポリマーのサイズは、特に、生成物の意図した使用、例えば、腫瘍等のある種の組織へと局在化する能力、又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択することができる（総説については、Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545を参照）。例えば、したがって、生成物が、例えば腫瘍の処置において使用するために循環を離れ、組織に透過することを意図する場合、例えば約５０００Ｄａの分子量を有する低分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が循環中に留まる適用においては、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する、高分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。
【０１５５】
適切なポリマーとしては、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）、とりわけ、メトキシポリ（エチレングリコール）若しくはそれらの誘導体が挙げられ、とりわけ、約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリアルキレンポリマーが挙げられる。
【０１５６】
一例において、本発明で使用される抗体は、ポリ（エチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合される。特定の一例において、ＰＥＧ分子は、抗体内に配置されている任意の結合可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を介して結合させることができる。このようなアミノ酸は、抗体中に天然で存在していてもよく、又は組換えＤＮＡ法を使用して抗体へと操作されてもよい（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号；米国特許第５，６６７，４２５号；ＷＯ９８／２５９７１を参照）。一例において、本発明の分子は、改変が、エフェクター分子を結合させるためのその重鎖のＣ末端への１つ又は複数のアミノ酸の付加である、改変抗体である。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を結合させることができる。一実施形態において、ＰＥＧ分子は、軽鎖中のシステイン１７１に連結されるが、例えば、参照によって本明細書に援用されるＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい。
【０１５７】
適切には、ＰＥＧ分子は、抗体内に配置されている少なくとも１個のシステイン残基のチオール基によって共有結合で連結される。改変抗体に結合される高分子はそれぞれ、抗体内に配置されているシステイン残基の硫黄原子に共有結合で連結され得る。共有結合による連結は、一般に、ジスルフィド結合、特に硫黄−炭素結合である。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばチオール選択性誘導体、例えばマレイミド及びシステイン誘導体を使用することができる。活性化ポリマーは、上記に記載したポリマー改変抗体の調製において出発材料として使用することができる。活性化ポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステルなどのチオール反応基を含有する任意のポリマー、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドであってもよい。このような出発材料は購入することができ（例えば、Ｎｅｋｔａｒ，元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．，  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  ＡＬ，  ＵＳＡから）、又は、従来の化学的手順を使用して、市販の出発材料から調製することができる。特定のＰＥＧ分子としては、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）、並びにＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が挙げられる。
【０１５８】
一実施形態において、本方法は、ヒトにおける使用に適した医薬製剤として、そのコンジュゲートされたバージョンを含む、抗体又は結合断片を製剤化するさらなるステップを含む。
【０１５９】
したがって、本開示はまた、本開示の方法から得られた抗体分子を、１つ又は複数の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体と共に添加及び混合するステップを含む、医薬用組成物又は診断用組成物を調製するための方法ステップを提供する。
【０１６０】
抗体分子は、医薬用組成物若しくは診断用組成物中の唯一の活性成分であってもよく、又は他の抗体成分を含む他の活性成分、例えば、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮ若しくは抗ＬＰＳ抗体、又はキサンチンなどの非抗体成分を伴っていてもよい。他の適切な活性成分としては、耐性を誘導することができる抗体、例えば抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ４抗体が挙げられる。
【０１６１】
さらなる実施形態において、本開示に記載の抗体分子又は組成物は、さらなる医薬的に活性な薬剤、例えば、コルチコステロイド（例えばプロピオン酸フルチカゾン）及び／若しくはベータ−２−アゴニスト（例えばサルブタモール、サルメテロール、若しくはフォルモテロール）、又は細胞成長及び細胞増殖の阻害剤（例えばラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート）、又は、代替的なＣＤ２８及び／若しくはＣＤ４０阻害剤と組み合わせて使用される。一実施形態において、阻害剤は低分子である。別の実施形態において、阻害剤は標的に特異的な抗体である。
【０１６２】
本医薬組成物は、治療有効量の抗体分子を適切に含む。本明細書で使用される用語「治療有効量」とは、標的とされる疾患又は症状を処置、改善若しくは予防するために必要とされる治療剤の量、又は検出可能な治療効果若しくは予防効果を示すのに必要とされる治療剤の量を意味する。治療有効量はまず、細胞培養アッセイ、又は動物モデル、通常、齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類において推測することができる。また動物モデルを用いて、適切な濃度範囲及び投与経路を決定することができる。次いで、このような情報を使用し、ヒトにおいて投与するための有用な用量及び経路を決定することができる。
【０１６３】
ヒト対象に対する正確な治療有効量は、病態の重症度、対象の一般的健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ（単数又は複数）、反応感受性及び治療に対する耐性／応答に依存する。この量は、日常的な実験によって決定することができ、臨床医の判断内である。一般に、治療有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。医薬組成物は、用量当たり所定量の本発明の活性剤を含有する単位投与用量の形態で都合よく提示することができる。
【０１６４】
組成物は、患者に個別に投与することができ、又は、他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次的に又は別々に）投与することができる。
【０１６５】
抗体分子が投与される用量は、処置しようとする病状の性質、例えば、存在する疾患／炎症の程度に依存し、また分子が予防的に使用されるのか、現にある病状を処置するのかに依存する。
【０１６６】
投与の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の期間に依存する。抗体が短い半減期を有する場合（例えば２〜１０時間）、１日当たり１回又は複数回の投与を行う必要があり得る。或いは、抗体が長い半減期を有する場合（例えば２〜１５日）、投与は１日当たり１回、週当たり１回、又は１若しくは２か月毎に１回だけが必要であり得る。
【０１６７】
医薬として許容可能な担体は、それ自体、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導すべきでなく、また毒性であってはならない。適切な担体は、大型でゆっくりと代謝される高分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子などであってよい。
【０１６８】
医薬として許容可能な塩は、例えば、鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩、又は有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩等を使用することができる。
【０１６９】
治療用組成物中の医薬として許容可能な担体は、液体、例えば、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール等をさらに含有していてもよい。加えて、補助物質、例えば、浸潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝物質等をこのような組成物中に存在させることができる。このような担体は、患者による服用のため、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル剤、シロップ剤、スラリー及び懸濁液として医薬組成物を製剤化することができる。
【０１７０】
投与に適した形態としては、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は持続注入による非経口投与に適した形態を挙げることができる。生成物が注射用又は注入用である場合、それは、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形態をとることができ、また製剤化剤、例えば、懸濁剤、保存剤、安定化剤、及び／又は分散剤を含有していてもよい。或いは、本開示の分子は、適切な滅菌液体を用いる使用前の再構成向けの乾燥形態であってもよい。
【０１７１】
製剤化されたならば、本発明の組成物は、対象に直接投与することができる。処置される対象は、動物であり得る。しかし、１つ又は複数の実施形態において、本組成物はヒト対象への投与に適している。
【０１７２】
適切には、本開示に記載の製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体の等電点の値と同じではない。例えば、製剤のｐＨが７である場合、８〜９又はそれ以上のｐＩが適切であり得る。理論に束縛されることは望まないが、これは最終製剤に改善された安定性を付与することができると考えられ、例えば、抗体が溶液中に留まる。
【０１７３】
本開示の医薬組成物は、限定するものではないが、経口経路、静注経路、筋肉内経路、動脈内経路、髄内経路、髄腔内経路、脳室内経路、経皮的経路（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｒｏｕｔｅ）、経皮経路（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｒｏｕｔｅ）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照）、皮下経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、経腸経路、局所経路、舌下経路、膣内経路又は直腸内経路を含む任意の数の経路によって投与することができる。またハイポスプレーも、本発明の医薬組成物の投与に使用することができる。典型的には、治療用組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかの注射可能物質として調製することができる。また、注射前に液状ビヒクル中の溶液又は懸濁液に適した固体形態も調製することができる。
【０１７４】
本組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射若しくは筋内注射によって達成されるか、又は組織の間質腔に送達される。また、本組成物は病変へ投与することもできる。投与処置は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであってよい。
【０１７５】
本組成物中の活性成分が抗体分子であることは理解されよう。このような場合、それは消化管内で分解を受けやすい。したがって、本組成物が消化管を使用する経路によって投与される場合、本組成物は、抗体分子を分解から保護するが、消化管から吸収されたら抗体を放出する薬剤を含有する必要がある。
【０１７６】
医薬として許容可能な担体の完全な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, N.J. 1991)において参照することができる。
【０１７７】
一実施形態において、製剤は、吸入を含む局所投与用製剤として提供される。
【０１７８】
適切な吸入可能な調製物は、吸入可能な粉末、噴射ガスを含有する定量型エアロゾル又は噴射ガスを含まない吸入用溶液を含む。活性物質を含有する本開示に記載の吸入可能な粉末は、単独の上述の活性物質、又は上述の活性物質と生理学的に許容可能な賦形剤の混合物からなり得る。
【０１７９】
これらの吸入可能な粉末としては、単糖類（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖類（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えばデキストラン）、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれらの相互の混合物が挙げられる。単糖類又は二糖類は適切に使用され、ラクトース又はグルコースは、特に、しかし排他するものではないが、それらの水和物の形で使用される。
【０１８０】
肺内に沈着させるための粒子は、１０ミクロン未満、例えば１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍ等の粒子サイズが必要である。活性成分（例えば抗体）の粒子サイズは、極めて重要である。
【０１８１】
吸入可能なエアロゾルの調製に使用することができる噴射ガスは、当技術分野で公知である。適切な噴射ガスは、炭化水素、例えばｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタン、及びハロ炭化水素、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体の中から選択される。上述の噴射ガスは、それ単独で使用することができ、又はそれらの混合物で使用することができる。
【０１８２】
特に適切な噴射ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）、並びにそれらの混合物が特に適切である。
【０１８３】
噴射ガス含有の吸入可能エアロゾルはまた、他の成分、例えば共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、滑沢剤及びｐＨ調整手段などを含有していてもよい。これらの成分はすべて、当技術分野で公知である。
【０１８４】
本発明による噴射ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、最高５重量％の活性物質を含有し得る。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【０１８５】
或いは、肺への局所投与はまた、例えば、ネブライザー等の装置、例えば、圧縮器に接続されたネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  Ｖａ製のＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮器に接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）ネブライザー）を使用する、液体溶液製剤又は懸濁液製剤の投与によってなされ得る。
【０１８６】
本明細書の方法からに得られる抗体又は結合断片は、溶媒中に、例えば、溶液又は懸濁液の形態中に分散させて送達することができる。これは適切な生理学的溶液、例えば生理食塩水、又は他の医薬として許容可能な溶媒若しくはバッファー中に懸濁させることができる。当技術分野で公知のバッファーは、水１ｍｌ当たり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含むことができ、それにより約４．０〜５．０のｐＨが達成される。懸濁液は、例えば、凍結乾燥された分子を使用することができる。
【０１８７】
治療用懸濁液又は溶液製剤はまた、１つ又は複数の賦形剤を含有し得る。賦形剤は当技術分野で周知であり、バッファー（例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー及び重炭酸バッファー）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが挙げられる。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生物分解性ミクロスフェアに封入することができる。製剤は、一般的に、滅菌製造方法を使用して実質的に滅菌の形態で提供される。
【０１８８】
これには、製剤に使用される緩衝溶媒／溶液の濾過による生成物及び滅菌物、滅菌緩衝化溶剤溶液中の分子の無菌懸濁液、及び当業者によく知られている方法による滅菌容器への製剤分配が含まれ得る。
【０１８９】
本開示に記載の噴霧可能な製剤は、例えば、箔製薬袋中にパックされた単回用量単位（例えば、密閉プラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。各バイアルは、溶媒／溶液バッファーの体積、例えば２ｍＬ中に単位投与用量を含有する。
【０１９０】
本明細書の文脈に含まれることは、包含することを意味するものとする。技術的に適切な場合、本発明の実施形態は組み合わせることができる。本明細書において明確に列挙された任意の実施形態は、否定的な免責事項の根拠として使用することができる。 
【０１９１】
本発明をここで以下の実施例を参照して説明するが、これらは単なる例示であって、決して本発明の範囲の限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１９２】
（例１）
プロテインＡ精製Ｆａｂ−ｄｓＦｖ多量体種の熱変換
Ａ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖのＣＨＯ発現及び清澄化
ヒトＯＸ４０と軽鎖配列Ａ２６  Ｆａｂ軽鎖−（３ｘＧ４Ｓ）−６４５ｄｓＦｖ（ｇＬ４）（配列番号１６）及び重鎖配列Ａ２６  Ｆａｂ重鎖−（Ｇ４Ｓ，Ｇ４Ｔ，Ｇ４Ｓ）−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５）（配列番号１５）を有する血清アルブミンを結合する構築物を、安定なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）において発現させた。これは、選択可能マーカーとしてのＤＨＦＲに関する遺伝子及び生成物をコードする遺伝子の両方を含有するプラスミドベクターを用いて、メーカーの使用説明書に従いＮｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用するトランスフェクションにより生成した。トランスフェクト細胞は、ヒポキサンチン及びチミジン欠失培地で、ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートの存在下において選択した。
【０１９３】
細胞系は、接種段階を通じて、２０ｎＭメトトレキサートを含有する培地で培養した。次いで、細胞をメトトレキサートの非存在下で培養する。最終培養ステップについては、細胞を、メトトレキサートの非存在下の培地中で１４日間、８０Ｌのステンレス鋼バイオリアクターにおいて培養した。上清の清澄化は遠心分離によって行い（４０００×ｇ、室温で６０分）、続いて深層及び濾過滅菌法を行った。
【０１９４】
哺乳動物発現されたＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ精製
清澄化したＣＨＯ上清を、Ｄｅｌｂｅｃｃｏｓリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で平衡化した９．４ｍｌのＨｉＳｃｒｅｅｎ（系列中２カラム）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにアプライした。カラムをＰＢＳで洗浄し、結合物質を０．１Ｍのクエン酸塩ｐＨ３．５で溶出させた。回収した溶出ピークを、２ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５を用いて〜ｐＨ７に調整した。ｐＨ調整した溶出液を、１０ｋＤａ分子量カットオフ遠心分離機を使用してＰＢＳ  ｐＨ７．４にバッファー交換した。
【０１９５】
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いる一般的方法
試料を、５０μｌの最終容量で必要とされる１．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いで、１００ｍＭのＮＥＭ  ５μｌを添加した。次いで、試料をＮｏｖｅｘトリス−グリシンＳＤＳサンプルバッファー５０μｌで希釈し（２×）、ボルテックス処理してから、３分間９５℃でインキュベートした。調製した試料を、４〜２０％のアクリルアミントリス／グリシンＳＤＳゲル上に１ウェル当たり５μｇでロードし、１５０Ｖの定電圧で１２０分間、泳動させた。
【０１９６】
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いる一般的方法
試料を、還元剤５０μｌの最終容量で必要とされる１．０ｍｇ／ｍｌに希釈した。次いで、試料をＮｏｖｅｘトリス−グリシンＳＤＳサンプルバッファー５０μｌで希釈し（２×）、ボルテックス処理してから、３分間９５℃でインキュベートした。調製した試料を、４〜２０％のアクリルアミントリス／グリシンＳＤＳゲル上に１ウェル当たりタンパク質５μｇでロードし、１５０Ｖの定電圧で１２０分間、泳動させた。ゲルは、クーマシーブルータンパク質染色液で染色した。図２及び図１２を参照されたい。
【０１９７】
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのＧ３０００  ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析の一般的方法
試料５０μｇをＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ）上に注入し、１ｍｌ／分で２００ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０を均一濃度勾配で展開した。シグナル検出は、２８０ｎｍの吸光度で行った。図９、図１０、図１３及び図１４を参照されたい。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析を使用して、単量体％（Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ単量体は約９分の保持時間を有する）、並びに変換プロセスの収率の推定方法の両方を決定した。変換プロセスに関する推定収率は、任意の特定の時点での全ピーク面積をＴ＝０での全ピーク面積のパーセンテージとして表すことにより計算した。
【０１９８】
一定の還元剤濃度でのプロテインＡ精製Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの熱変換
〜５ｍｇ／ｍｌのプロテインＡ精製Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖを、ＰＢＳ／１００ｍＭ  ｂＭＥＡ（β−メルカプトエチルアミン）の変換バッファー中で１：１希釈し、５０ｍＭの最終ｂＭＥＡ濃度を得た。希釈後、試料を所定の温度でインキュベートした。時間経過中に得た試料を氷上に置いて温度を下げ、変換プロセスを停止させた後、分析した。分析はＳＥＣ−ＨＰＬＣにより行い、単量体のレベル及び推定収率を決定した。
【０１９９】
単量体のレベルは、評価したすべての温度で増加が見られたが、変換速度は高い温度で有意に速かった。反対に、温度の上昇に伴い、推定収率は減少することが確認された。単量体の全収率（正味回収率）を計算するには、単量体レベルのパーセンテージを１００で割り、推定収率を掛けた。データを図３、図４及び図５、及び表１〜表３にまとめる。
【０２００】
インキュベーション温度≧５５℃では、正味回収率は、比較的短いインキュベーション時間後に減少する。≦５０℃では、正味回収率は、評価したすべての時間経過にわたって増加し続ける。正味回収率は４５〜５０℃で有意に高く、５０ｍＭ  ｂＭＥＡでは５０℃が最適と思われる。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０２０１】
一定温度でのプロテインＡ精製Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの熱変換
〜５ｍｇ／ｍｌのプロテインＡ精製Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖを、ＰＢＳ中の所定ｂＭＥＡ濃度（１、５、１０、２０及び５０ｍＭ）の２×ストックである変換バッファー中で、１：１希釈した。希釈後、試料を５０℃でインキュベートした。時間経過中に得た試料を氷上に置いて温度を下げ、変換プロセスを停止させた後、分析した。分析はＳＥＣ−ＨＰＬＣにより行い、単量体のレベル及び推定収率を決定した。データを図６、図７及び図８、並びに表４、表５及び表６にまとめる。
【０２０２】
変換の速度はｂＭＥＡ濃度の増加とともに増大した。正味回収率は、≧２０時間で、〜６５％単量体の安定水準に達した。ｂＭＥＡの濃度が低下すると、単量体のレベルは穏やかに増加するのが確認され、１ｍＭ  ｂＭＥＡでは時間経過に伴う増加はほとんど又は全く確認されなかった。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０２０３】
（例２）
清澄化した哺乳動物細胞培養上清中のＦａｂ−ｄｓＦｖ多量体種の熱変換
哺乳動物細胞培養上清中のＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの熱変換
清澄化した細胞培養上清は、１０ｋＤａ分子量カットオフ遠心分離機を使用し、原容量の半分まで濃縮した。次いで、濃縮上清を、ＰＢＳ／１００ｍＭ  ｂＭＥＡを使用して原容量に希釈し、５０ｍＭの最終ｂＭＥＡ濃度を得た。次いで、上清を５０℃で一晩（１４．５時間）インキュベートした。インキュベーション後、上清を氷上に置き、温度を低下させ、変換プロセスを停止させた。
【０２０４】
熱変換後の哺乳動物細胞培養上清由来Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ精製
熱変換したＣＨＯ上清を、Ｄｅｌｂｅｃｃｏｓリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で平衡化した９．４ｍｌのＨｉＳｃｒｅｅｎ（系列中２カラム）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにアプライした。カラムをＰＢＳで洗浄し、結合物質を０．１Ｍのクエン酸塩ｐＨ３．５で溶出させた。溶出ピークを回収し、２ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５を用いて〜ｐＨ７に調整した。精製は、無変換ＣＨＯを使用した対照で繰り返した。ｐＨを中和したプロテインＡ溶出液は、Ｇ３０００  ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（表７）、並びに非還元条件及び還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１１及び図１２）により解析した。多量体種のカラムへの結合が保持されている間、ＦａｂＦｖ単量体を溶出させる溶出ｐＨが確認された。上清の変換プロセスを繰り返し、９．４ｍｌのＨｉＳｃｒｅｅｎカラムにアプライし、溶出条件（０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ３．８）を用いて溶出させた。同一のローティング能力でロードした無変換上清の対照実験も行った。溶出ピークを回収し、２ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５を用いて〜ｐＨ７にｐＨを調整した。ｐＨを中和したプロテインＡ溶出液は、Ｇ３０００  ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図１３及び図１４）解析、並びにＡ２８０（表８）により解析した。ｐＨ３．５で溶出した場合、有意に高い単量体レベルが、同等の回収率で、変換物質から観察された。ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより解析した場合、変換の有無にかかわらず両上清からの生成物の品質は、ｐＨ３．８溶出液に匹敵したが、変換後にタンパク質量の有意な増加が確認された。
【表９】
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【表１０】
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【０２０５】
（例３）
様々なパラメーターの効果についての試験
この実験に使用した供給抗体は、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖであった。すべての実験は、プロテインＡ精製物質に対して実施した。Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ細胞培養液は、プロテインＡカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ，ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。物質をｐＨ７．４でロードしたところ、標的分子は結合されていたが、ほとんどの不純物はカラムを通って流出した。次いで、カラムは、クエン酸ナトリウムバッファーを使用して、ｐＨ３．４で溶出させた。これにより、単量体種が多量体種と共に溶出した。溶出プールを１３ｇ／Ｌまで濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーにダイアフィルトレーションした。供給抗体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖは、変換前に約１５％の単量体を含有していた。抗体の濃度（供給濃度ｇ／Ｌ）、ｐＨ、ｂＭＥＡ還元剤濃度、変換ステップの温度、及び混合速度について、以下の表９に示したようにすべて評価した。単量体、二量体、三量体、四量体及びＨＭＷＳ％は、ＢＥＨ２００  ＳＥＣ  １．７μｍカラムを使用し、Ｗａｌｔｅｒｓ製の装置を使用してＳＥ−ＵＰＬＣにより０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７及び２３時間で測定した。５時間について表１０に示す。
【表１１】
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【表１２】
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【０２０６】
変換ステップの目的は、単量体のパーセンテージ（％）を最大にすることである。調査した範囲にわたり、単量体％のモデルにおける最も重要な因子は還元剤濃度及び温度である。高い還元剤濃度、及び高い温度で、単量体％が増加した。
【０２０７】
温度の上昇と沈降の程度の間に相関がある傾向が確認された。
【０２０８】
（例４）
様々な賦形剤の効果についての試験
実験で試験した賦形剤及び濃度を下記の表１１に記載する：
【表１３】
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【０２０９】
濃度は、ｖ／ｖのパーセンテージとして示すポリソルベート２０及びポリソルベート８０を除き、ｍＭで表示している。実験は２ｍＬのディープウェルプレートで実施し、二連で行った。使用した条件は、０．５ｇ／Ｌ  Ａ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、１００ｍＭ  β−ｍｅａ、表１１に記載した賦形剤、及び温度５５℃であった。０．５ｇ／Ｌ  Ａ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、１００ｍＭ  β−ｍｅａ、５５℃を使用し、賦形剤を使用しない１０対照試料も実施した。Ａ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖ  ０．５ｇ／Ｌ、温度５５℃を使用し、還元剤及び賦形剤を使用しない６対照もさらに実施した。
【０２１０】
時間経過による試料は等間隔で得た。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して収率をモニターした。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイは、溶液中のタンパク質濃度を測定するために使用される分析手順である。β−ｍｅａは５９５ｎｍで吸収しなかったことが分かった。したがって、この方法を使用して総タンパク質濃度を測定し、それによりステップ収率を決定した。総タンパク質濃度は、Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ  ２００（Ｔｅｃａｎ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）液体ハンドリングロボットを使用して実施する液体移動を行う９６ウェルフォーマットのＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキットを使用することにより決定した。アッセイは、精製Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ物質を用いて較正し、Ａ２８０ｎｍにより直交的に試験した。試料を調製し、メーカーの使用説明書に従って解析した。次いで、未知の濃度は、直線回帰によって曲線から補間により決定した。
【０２１１】
引き続き、高収率の任意の実験をＳＥ−ＵＰＬＣ及びＳＤＳ  ＰＡＧＥによって解析した。アミノ酸は、対照に比べ収率を増加させるので、沈降を低下させるように見えた。ポリソルベートについては、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによるさらなる分析を実施してそれらの効果を解析した（図１５）。試料は、供給０．５ｇ／Ｌ、５５℃での１００ｍＭ  βＭＥＡ、５時間後の第２のスクリーニングから得た。図１６ａ及び図１６ｂは、異なる条件下における様々な賦形剤に関するサイズ排除データを示す。
【０２１２】
（例５）
リシンと組み合わせたパラメーターの試験
抗体供給濃度ｇ／Ｌ、ｂＭＥＡ濃度及び温度パラメーターを、０．７Ｍリシンの存在下及びリシンの非存在下において試験した。実験は２ｍＬのディープウェルプレートにおいて実施し、二連で行った。２ｍＬのエッペンドルフチューブを使用し、各変換ステップを水浴中で５時間実施した。
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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０．７Ｍのリシンが存在する場合、温度は単量体％に対して最も顕著な効果を有し、高い温度ほどより効果が認められた。
【０２１３】
（例６）
異なる還元剤の試験
最初の還元剤スクリーニング実験については、本発明者らは５０℃の温度を使用し、分子をオープンアップした。供給は、精製Ａ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、濃度１ｇ／Ｌ及び１５％単量体であった。実験は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｓで供給量１ｍＬにて実施した。スクリーニングした還元剤濃度は、１０、５０及び１００ｍＭであった（表１５）。試料を加熱し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＶｏｒｔｅｍｐ装置を使用して混合した。サンプリングは、加熱前の還元剤を添加した後、及び５０℃で２時間加熱した後に実施した。この実験の対照還元剤としてはβ−ｍｅａを使用した。
【表１７】
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【０２１４】
収率は、ＳＥ  ＵＰＬＣアッセイでのピーク面積を使用して計算した。試料の総ピーク面積を供給物質の総ピーク面積で割った。単量体収率は、単量体のパーセンテージに全収率を掛けることにより計算した。図１７ａは、処理を室温で実施した場合の単量体％を示し、図１７ｂは、５０℃で実施した対応実験に関する２時間後の結果を示す。
【０２１５】
図１８ａ及び図１８ｂは、ＳＥ−ＨＰＬＣによって実施した対応分析の結果を示す。
【０２１６】
（例７）
２Ｌスケールでの変換
２Ｌスケール実験に対する供給としての清澄化培養液を提供するため、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのＣＨＯ発現及び清澄化を実施例１と同様に実施した。熱変換実験は、２Ｌの変換量を使用し、２Ｌの発酵容器中で実施した。実験の供給は清澄化した細胞培養液（ＣＣＦ）であり、生成物の濃度は２．２ｇ／Ｌで、その３０％が単量体であった。実験条件を表１６に示す。変換ステップは、すべての実験において１７時間実施した。試料はＳＥ  ＵＰＬＣによって分析した。
【表１８】
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【表１９】
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【０２１７】
製造規模で使用されるものの代表的な容器において、変換ステップを２Ｌスケールにスケールアップすることが可能であった。ステップにわたって単量体の量を有意に増加させることが可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
2018515453.tif 000050
【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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