(57)【要約】  本発明は、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）によってコードされるタンパク質に結合する、単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドに関する。本発明は、先述の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを含むＬＡＧ−３結合剤を提供する。本発明はまた、がん又は感染症のような、ＬＡＧ−３阻害に応答する病気又は疾患を治療するために、関連するベクター、組成物及びＬＡＧ−３結合剤を使用する方法を提供する。【選択図】図１Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドであって、アミノ酸配列Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｘａａ１  Ｉｌｅ  Ｘａａ２  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｘａａ３  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｘａａ４  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｘａａ５  Ｘａａ６  Ａｓｎ  Ｘａａ７  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｘａａ８  Ｔｙｒ  Ｘａａ９  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｘａａ１０  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｘａａ１１  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｘａａ１２  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（配列番号１８１）を含み、
（ａ）Ｘａａ１はアスパラギン（Ａｓｎ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はリシン（Ｌｙｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はリシン（Ｌｙｓ）又はグルタミン（Ｇｌｎ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はイソロイシン（Ｉｌｅ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はアラニン（Ａｌａ）又はプロリン（Ｐｒｏ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はグルタミン酸（Ｇｌｕ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、
（ｇ）Ｘａａ７はグリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、
（ｈ）Ｘａａ８はグルタミン酸（Ｇｌｕ）又はグルタミン（Ｇｌｎ）であり、
（ｉ）Ｘａａ９はアラニン（Ａｌａ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｊ）Ｘａａ１０はグルタミン（Ｇｌｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であり、
（ｋ）Ｘａａ１１はアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、及び
（ｌ）Ｘａａ１２はグルタミン酸（Ｇｌｕ）又はリシン（Ｌｙｓ）である、
ポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｘａａ１  Ｉｌｅ  Ｘａａ２  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｘａａ３  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｘａａ４  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｘａａ５  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｘａａ６  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｘａａ７  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｘａａ８  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｘａａ９  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（配列番号１）を含み、
（ａ）Ｘａａ１はアスパラギン（Ａｓｎ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はリシン（Ｌｙｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はリシン（Ｌｙｓ）又はグルタミン（Ｇｌｎ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はイソロイシン（Ｉｌｅ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はアラニン（Ａｌａ）又はプロリン（Ｐｒｏ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はグリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、
（ｇ）Ｘａａ７はアラニン（Ａｌａ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｈ）Ｘａａ８はグルタミン（Ｇｌｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であり、及び
（ｉ）Ｘａａ９はアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）である、
請求項１に記載の単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２〜配列番号３４又は配列番号１８２〜１８６のいずれか１のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド。
【請求項４】
単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドであって、アミノ酸配列Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｘａａ１  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｘａａ２  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｘａａ４  Ｐｈｅ  Ｘａａ５  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｘａａ６  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｘａａ７  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｘａａ８  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｘａａ９  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｘａａ１０  Ｘａａ１１  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｘａａ１２  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｘａａ１３  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（配列番号３５）を含み、
（ａ）Ｘａａ１はアルギニン（Ａｒｇ）又はグリシン（Ｇｌｙ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はスレオニン（Ｔｈｒ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はスレオニン（Ｔｈｒ）又はアラニン（Ａｌａ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はセリン（Ｓｅｒ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はセリン（Ｓｅｒ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はセリン（Ｓｅｒ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｇ）Ｘａａ７はグリシン（Ｇｌｙ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であり、
（ｈ）Ｘａａ８はセリン（Ｓｅｒ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、
（ｉ）Ｘａａ９はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）又はロイシン（Ｌｅｕ）であり、
（ｊ）Ｘａａ１０はアスパラギン（Ａｓｎ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｋ）Ｘａａ１１はセリン（Ｓｅｒ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、
（ｌ）Ｘａａ１２はアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）であり、及び
（ｍ）Ｘａａ１３はアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）である、
ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号３６〜配列番号５６のいずれか１のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド。
【請求項６】
単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドであって、アミノ酸配列Ａｓｐ  Ｘａａ１  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｘａａ２  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ（配列番号５７）を含み、
（ａ）Ｘａａ１はバリン（Ｖａｌ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はシステイン（Ｃｙｓ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はグリシン（Ｇｌｙ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はアスパラギン（Ａｓｎ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はリシン（Ｌｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）又はロイシン（Ｌｅｕ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はバリン（Ｖａｌ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｇ）Ｘａａ７はセリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）又はグリシン（Ｇｌｙ）であり、及び
（ｈ）Ｘａａ８はヒスチジン（Ｈｉｓ）又はチロシン（Ｔｙｒ）である、
ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号５８〜配列番号８８又は１８７〜１８９のいずれか１のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド。
【請求項８】
単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドであって、アミノ酸配列Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｘａａ６  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ（配列番号８９）を含み、
（ａ）部分配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５が欠失しているか、又はＴｙｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎであり、及び
（ｂ）Ｘａａ６はスレオニン（Ｔｈｒ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）である、
ポリペプチド。
【請求項９】
部分配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５がＴｙｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎである、請求項８に記載の単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号９０のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド。
【請求項１１】
部分配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５が欠失している、請求項８に記載の単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号９１又は配列番号９２のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１９０又は１９１を含む、単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号１９２〜１９５のいずれか１を含む、請求項１３に記載の単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号１９６又は１９７を含む、単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号１９８〜２００のいずれか１を含む、請求項１５に記載の単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜５、１３又は１４のいずれか１項に記載の免疫グロブリン重鎖ポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
【請求項１８】
請求項６〜１２、１５又は１６のいずれか１項に記載の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
【請求項１９】
請求項１７又は請求項１８に記載の単離された核酸配列を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１〜５、１３又は１４のいずれか１項に記載の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、及び／又は請求項６〜１２、１５又は１６のいずれか１項に記載の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを含む、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）結合剤。
【請求項２１】
請求項１〜５、１３又は１４のいずれか１項に記載の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、及び請求項６〜１２、１５又は１６のいずれか１項に記載の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを含む、請求項２０に記載のＬＡＧ−３結合剤。
【請求項２２】
請求項１〜５、１３又は１４のいずれか１項に記載の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、又は請求項６〜１２、１５又は１６のいずれか１項に記載の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを含む、請求項２０に記載のＬＡＧ−３結合剤。
【請求項２３】
（ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、及び請求項６又は７に記載の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド；
（ｂ）請求項４又は５に記載の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、及び請求項８〜１２のいずれかに記載の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド；又は
（ｃ）請求項１３又は１４に記載の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、及び請求項１５又は１６に記載の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、
を含む、
請求項２０に記載のＬＡＧ−３結合剤。
【請求項２４】
抗体、抗体コンジュゲート又はそれらの抗原結合断片である、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のＬＡＧ−３結合剤。
【請求項２５】
Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、ｄＡｂ断片、又は一本鎖結合ポリペプチドである、請求項２４に記載のＬＡＧ−３結合剤。
【請求項２６】
ＬＡＧ−３タンパク質の細胞外ドメイン１（Ｄ１）及び／又は細胞外ドメイン２（Ｄ２）に結合する、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載のＬＡＧ−３結合剤。
【請求項２７】
ＬＡＧ−３結合剤が、エフェクター機能が低下したか、又は無効にされたＦｃ領域を含む、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載のＬＡＧ−３結合剤。
【請求項２８】
請求項２０〜２７のいずれか１項に記載のＬＡＧ−３結合剤をコードする単離された核酸配列。
【請求項２９】
請求項２８に記載の単離された核酸配列を含むベクター。
【請求項３０】
請求項２９に記載のベクターを含む単離された細胞。
【請求項３１】
（ａ）請求項２０〜２７のいずれか１項に記載のＬＡＧ−３結合剤又は請求項２９に記載のベクター、及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３２】
ＬＡＧ−３阻害に応答する、哺乳動物における病気を治療する方法であって、前記方法がＬＡＧ−３阻害に応答する病気を有する哺乳動物に、請求項３１に記載の組成物を有効量投与することを含み、そうすると、哺乳動物における前記病気が治療される方法。
【請求項３３】
前記病気が、がんである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記がんが、メラノーマ、腎臓細胞がん、肺がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、胆嚢がん、喉頭がん、肝臓がん、甲状腺がん、胃がん、唾液腺がん、前立腺がん、膵臓がん、又はメルケル細胞がんである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記病気が、感染症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記感染症が、ウイルス又は細菌によって引き起こされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、呼吸器合胞体｛こきゅうき ごうほうたい｝ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物におけるＬＡＧ−３結合剤の半減期が３０分〜４５日の間である、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＬＡＧ−３結合剤が、約１ピコモーラー（ｐＭ）〜約１００マイクロモーラー（μＭ）の間のＫＤでＬＡＧ−３に結合する、請求項３２〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
哺乳動物に対して、ＰＤ−１結合剤及び／又はＴＩＭ−３結合剤を投与することを更に含む、請求項３２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＤ−１結合剤及び／又はＴＩＭ−３結合剤が抗体、抗体コンジュゲート又はそれらの抗原結合断片である、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された資料の参照による援用
本明細書と同時に提出され、コンピューターで読み取り可能な、以下の通り識別されるヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、その全体が本明細書に参照により援用される：２０１６年２月２日付けの「723163_ST25.TXT」という名前の182,600バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２２３としても知られるリンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）は、免疫グロブリン・スーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、構造的・遺伝子的にＣＤ４に関連している。ＬＡＧ−３はＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣｓ）で発現する。ＣＤ４のように、ＬＡＧ−３はＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用することが実証されているが（Baixerasら、J. Exp. Med., 176: 327-337 (1992)）、異なった部位で結合する（Huardら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(11): 5744-5749 (1997)）。特に、例えばＬＡＧ−３免疫グロブリン融合タンパク質（ｓＬＡＧ−３Ｉｇ）は、ＬＡＧ−３を介して直接的・特異的に細胞表面のＭＨＣクラスＩＩに結合する（Huardら、Eur. J. Immunol., 26: 1180-1186 (1996)）。
【０００３】
ＬＡＧ−３はＴ細胞の活性化に続いて、上方調節され、Ｔ細胞の恒常性と同様に、Ｔ細胞の機能を調節する（Sierroら、Expert Opin. Ther. Targets, 15(1):91-101 (2011))。抗ＬＡＧ−３抗体を添加することによって、Ｔ細胞の増殖が高まり、ＣＤ２５のような活性化抗原の発現がより高くなり、インターフェロンγ及びインターロイキン４のようなサイトカインの濃度がより高くなるという、抗原特異的なＴ細胞の応答に関するin vitro研究において実証されたように（Huardら、Eur. J. Immunol., 24: 3216-3221 (1994)）、ＬＡＧ−３／ＭＨＣクラスＩＩの相互作用は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の抗原依存的な刺激を下方調節することにおいて役割を果たしてもよい。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はまた、活性化時にＬＡＧ−３を発現することが示されており、抗ＬＡＧ−３抗体はin vitro及びin vivoの両方において、誘導されたＴｒｅｇ細胞による抑制を阻害する。このことは、ＬＡＧ−３は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性に貢献することを示唆している（Huangら、Immunity, 21: 503-513 (2004))。更には、ＬＡＧ−３は、Ｔ細胞依存的及び非依存的な機構の両方において、調節性Ｔ細胞によってＴ細胞恒常性をネガティブに調節することが示されている（Workman, C. J. and Vignali, D. A., J. Immunol., 174: 688-695 (2005)）。
【０００４】
アネルギーであるか、又は機能障害を呈する従来型Ｔ細胞のサブセットはＬＡＧ−３を発現し、ＬＡＧ−３＋Ｔ細胞は、腫瘍部位において、及び慢性的なウイルス感染の間、濃縮される（enriched）。しかし、ＬＡＧ−３ノックアウトマウスは、通常のウイルス特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を開始することが示されている。このことは、ＬＡＧ−３の役割が不可欠でないことを示唆している。一方で、ＬＡＧ−３阻害（blockade）と組み合わされたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の阻害は、単独でのＰＤ−Ｌ１阻害と比べて、ウイルス制御を改善した（Blackburnら、Nat. Immunol., 10: 29-37 (2009)、及びRichterら、Int. Immunol., 22: 13-2 (2010)）。
【０００５】
in vivoにおいて、トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞が非反応性又はアネルギー状態である、自己免疫寛容／腫瘍マウスモデルにおいては、ＬＡＧ−３阻害又はＣＤ８＋Ｔ細胞の不足が、Ｔ細胞の増殖、腫瘍部位におけるＴ細胞の補充及びエフェクター機能を促進した（Grossoら、J. Clin. Invest., 117: 3383-92 (2007)）。
【０００６】
モノクローナル抗体の使用による等のＬＡＧ−３活性の阻害は、臨床前研究に基づいて、ウイルス感染及びメラノーマを治療するための治療的アプローチとして現在調査されている。例えば、Ｆｃ領域に融合させた可溶性ｈｕＬＡＧ−３の添加は、健常又はがん患者のＰＢＭＣにおいては、Ｔ細胞によって認識される、インフルエンザ・マトリクス・タンパク質又はメラノーマ抗原（ＭＡＲＴ−１）のような、ウイルス及び腫瘍抗原に対する、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を促進した（Casatiら、J. Immunol, 180: 3782-3788 (2008)）。
【０００７】
ＬＡＧ−３と高い親和性をもって結合し、効果的にＬＡＧ−３活性を中和するＬＡＧ−３の追加的なアンタゴニスト(例えば、抗体)に対するニーズがある。本発明はそのようなＬＡＧ−３結合剤を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、アミノ酸配列Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｘａａ１  Ｉｌｅ  Ｘａａ２  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｘａａ３  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｘａａ４  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｘａａ５  Ｘａａ６  Ａｓｎ  Ｘａａ７  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｘａａ８  Ｔｙｒ  Ｘａａ９  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｘａａ１０  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｘａａ１１  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｘａａ１２  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（配列番号１８１）を含み、
（ａ）Ｘａａ１はアスパラギン（Ａｓｎ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はリシン（Ｌｙｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はリシン（Ｌｙｓ）又はグルタミン（Ｇｌｎ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はイソロイシン（Ｉｌｅ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はアラニン（Ａｌａ）又はプロリン（Ｐｒｏ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はグルタミン酸（Ｇｌｕ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、
（ｇ）Ｘａａ６はグリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、
（ｈ）Ｘａａ８はグルタミン酸（Ｇｌｕ）又はグルタミン（Ｑ）であり、
（ｉ）Ｘａａ９はアラニン（Ａｌａ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｊ）Ｘａａ１０はグルタミン（Ｇｌｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であり、
（ｋ）Ｘａａ１１はアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、及び
（ｌ）Ｘａａ１２はグルタミン（Ｇｌｎ）又はリシン（Ｌｙｓ）である、
単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明は、アミノ酸配列Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｘａａ１  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｘａａ２  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｘａａ４  Ｐｈｅ  Ｘａａ５  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｘａａ６  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｘａａ７  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｘａａ８  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｘａａ９  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｘａａ１０  Ｘａａ１１  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｘａａ１２  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｘａａ１３  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（配列番号３５）を含み、
（ａ）Ｘａａ１はアルギニン（Ａｒｇ）又はグリシン（Ｇｌｙ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はスレオニン（Ｔｈｒ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はスレオニン（Ｔｈｒ）又はアラニン（Ａｌａ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はセリン（Ｓｅｒ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はセリン（Ｓｅｒ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はセリン（Ｓｅｒ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｇ）Ｘａａ７はグリシン（Ｇｌｙ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であり、
（ｈ）Ｘａａ８はセリン（Ｓｅｒ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、
（ｉ）Ｘａａ９はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）又はロイシン（Ｌｅｕ）であり、
（ｊ）Ｘａａ１０はアスパラギン（Ａｓｎ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｋ）Ｘａａ１１はセリン（Ｓｅｒ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、
（ｌ）Ｘａａ１２はアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）であり、及び
（ｍ）Ｘａａ１３はアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）である、
単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。
【００１０】
本発明は更に、配列番号１９０又は１９１を含む単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。
【００１１】
本発明は、アミノ酸配列Ａｓｐ  Ｘａａ１  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｘａａ２  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ（配列番号５７）を含み、
（ａ）Ｘａａ１はバリン（Ｖａｌ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はシステイン（Ｃｙｓ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はグリシン（Ｇｌｙ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はアスパラギン（Ａｓｎ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はリシン（Ｌｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）又はロイシン（Ｌｅｕ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はバリン（Ｖａｌ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｇ）Ｘａａ７はセリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）又はグリシン（Ｇｌｙ）であり、及び
（ｈ）Ｘａａ８はヒスチジン（Ｈｉｓ）又はチロシン（Ｔｙｒ）である、
単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明は、アミノ酸配列Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｘａａ６  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ（配列番号８９）を含み、
（ａ）部分配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５は欠失しているか、又はＴｙｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎであり、
（ｂ）Ｘａａ６はスレオニン（Ｔｈｒ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）である、
単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明は、配列番号１９６又は１９７を含む単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドもまた提供する。
【００１４】
更に、本発明は、単離又は精製された、前記免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸配列、そのような核酸配列を含むベクター、前記免疫グロブリンポリペプチドを含むＬＡＧ−３結合剤、そのようなＬＡＧ−３結合剤をコードする核酸配列、そのような核酸配列を含むベクター、そのようなベクターを含む単離細胞、そのようなＬＡＧ−３結合剤又はそのようなベクターと医薬的に許容される担体を共に含む組成物、及びそのような組成物を哺乳動物に有効量投与することによって、哺乳動物のがん又は感染症を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｃｏｌｏｎ２６結腸腺がん細胞を移植し、表示された抗体を注入したマウスにおける、経時的な平均腫瘍体積のグラフである。図中の各データプロットは、表示された治療群を指す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｃｏｌｏｎ２６結腸腺がん細胞を移植し、表示された抗体を注入した、３つの治療群のマウスにおける、個々の動物の経時的な腫瘍体積のグラフである。図中の各データプロットは、治療群の各動物を指す。
【図２Ａ】図２Ａは、様々な濃度の抗ＰＤ−１抗体又は抗ＬＡＧ−３抗体での、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞によって分泌されたＩＬ−２を表わす。
【図２Ｂ】図２Ｂは、樹状細胞に曝露前（ナイーブ：naive）又は曝露後（２４、４８及び７２時間）のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＬＡＧ−３及びＰＤ−１の発現を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、又はそれらの断片(例えば、抗原結合断片)を提供する。本明細書で使用される用語「免疫グロブリン」又は「抗体」は、脊椎動物の血液又はその他の体液においてみられるタンパク質を指し、それは、細菌及びウイルスのような外来の異物を見つけ出し、中和する免疫システムによって用いられる。該ポリペプチドは、天然環境から取り出されることにおいて、「単離」される。好ましい実施形態においては、免疫グロブリン又は抗体は、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むタンパク質である。該ＣＤＲは、抗体の抗原結合を担う「超可変領域」を形成する（更に以下において検討する）。免疫グロブリン全体は、典型的には４本のポリペプチド：２コピーの同一な重（Ｈ）鎖ポリペプチド及び２コピーの同一な軽（Ｌ）鎖ポリペプチドからなる。各重鎖は１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域及び３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）領域を含み、各軽鎖は１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域及び１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む。抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの異なる型のカッパ（κ）又はラムダ（λ）のいずれか一方に割り当てられ得る。典型的な免疫グロブリンにおいては、各軽鎖は重鎖とジスルフィド結合によって結びつき、２本の該重鎖は互いにジスルフィド結合によって結びついている。軽鎖の可変領域は、該重鎖の可変領域と整列し（aligned）、軽鎖の定常領域は、重鎖の最初の定常領域と整列する。重鎖の残りの定常領域は互いに整列する。
【００１７】
軽鎖及び重鎖の各組の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。ＶＨ及びＶＬ領域は、４つのフレームワーク（ＦＷ又はＦＲ）領域を含む各領域と、同じ一般的構造を有する。本明細書において用いられる場合、用語「フレームワーク領域」は、超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の間に位置する、可変領域内部の比較的保存されたアミノ酸配列を指す。各可変ドメインには４つのフレームワーク領域があり、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と指名されている（designated）。フレームワーク領域は、可変領域の構造フレームワークを提供するβシートを形成する（例えば、C.A. Janewayら編、Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)参照）。
【００１８】
フレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）によって接続している。上述のように、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として知られる３つのＣＤＲは、抗体の「超可変領域」を形成し、抗原結合を担う。ＣＤＲは、フレームワーク領域によって形成されるβシート構造を接続し、いくつかの例においては、その一部を含むループを形成する。軽鎖及び重鎖の定常領域が、抗原に対する抗体の結合に直接関与しない一方で、定常領域は可変領域の配置に影響を与え得る。定常領域はまた、エフェクター分子や細胞との相互作用を介した、抗体依存性補体媒介性溶解（antibody-dependent complement-mediated lysis）又は抗体依存性細胞毒性（antibody-dependent cellular toxicity）に関与するというような、様々なエフェクター機能を示す。
【００１９】
本発明の単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドは、望ましくは、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）によってコードされるタンパク質（本明細書ではまた「ＬＡＧ−３タンパク質」として参照する）に結合する。上述したように、ＬＡＧ−３は、Ｔ細胞機能及びホメオスタシスをネガティブに調節する、４９８アミノ酸のタンパク質である（Triebelら、J. Exp. Med., 171(5): 1393-1405 (1990)；及びTriebel F., Trends Immunol., 24(12): 619-22 (2003)）。ＬＡＧ−３は免疫グロブリン・スーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、構造的に及び遺伝子的にＣＤ４と関連している。ＬＡＧ−３の細胞質内領域は、ＣＤ３／ＴＣＲ活性化経路の下方調節に関わるシグナル伝達分子と考えられる、ＬＡＰと表記されるタンパク質と相互作用することが示されている（Iouzalenら、Eur. J. Immunol., 31: 2885-2891 (2001)）。更に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は活性化時にＬＡＧ−３を発現することが示されており、in vitro及びin vivoの両方において、抗ＬＡＧ−３抗体は、誘導されたＴｒｅｇ細胞による抑制を阻害する。このことは、ＬＡＧ−３はＴｒｅｇ細胞の抑制活性に寄与することを示唆している（Huangら、Immunity, 21: 503-513 (2004)）。しかしながら、最近の研究では、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＬＡＧ−３の発現は、Ｔｒｅｇをより抑制的にするというよりむしろ、それらをＴｒｅｇによる抑制に対してより感受的な状態にすることを示唆している（Durhamら、PLoS ONE, 9(11): e109080 (2014)参照）。ある環境においては、ＬＡＧ−３はまた免疫刺激効果を有することが示されている（例えば、Prigentら、Eur. J. Immunol., 29: 3867-3876 (1999)、El Mir and Triebel, J. Immunol., 164: 5583-5589 (2000) 、及びCasatiら、Cancer Res., 66: 4450-4460 (2006)参照）。本発明の単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び本発明の単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドは、ＬＡＧ−３と他の抗原に結合する剤を形成することができ、結果として、「二重反応性」結合剤（例えば、二重反応性抗体）となる。例えば、該剤はＬＡＧ−３、及び、例えば、プログラムド・デス１（programmed death 1：ＰＤ−１）及び／又はＴ細胞免疫グロブリン・ドメイン及びムチン・ドメイン３タンパク質（ＴＩＭ−３）のような、免疫システムの他のネガティブ調節因子に結合し得る。
【００２０】
ＬＡＧ−３に結合する抗体及びその要素（components）は、当該技術分野において公知である（例えば、米国特許出願公開第2010/0233183号、第2011/0150892号及び第2014/0093511号を参照）。抗ＬＡＧ−３抗体はまた、例えば、アブカム（Cambridge, MA）及びＲ＆Ｄシステムズ社（Minneapolis, MN）のような販売元から市販されている。
【００２１】
本発明はアミノ酸配列Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｘａａ１  Ｉｌｅ  Ｘａａ２  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｘａａ３  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｘａａ４  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｘａａ５  Ｘａａ６  Ａｓｎ  Ｘａａ７  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｘａａ８  Ｔｙｒ  Ｘａａ９  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｘａａ１０  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｘａａ１１  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｘａａ１２  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（配列番号１８１）を含み、
（ａ）Ｘａａ１はアスパラギン（Ａｓｎ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はリシン（Ｌｙｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はリシン（Ｌｙｓ）又はグルタミン（Ｇｌｎ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はイソロイシン（Ｉｌｅ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はアラニン（Ａｌａ）又はプロリン（Ｐｒｏ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はグルタミン酸（Ｇｌｕ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、
（ｇ）Ｘａａ６はグリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、
（ｈ）Ｘａａ８はグルタミン酸（Ｇｌｕ）又はグルタミン（Ｑ）であり、
（ｉ）Ｘａａ９はアラニン（Ａｌａ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｊ）Ｘａａ１０はグルタミン（Ｇｌｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であり、
（ｋ）Ｘａａ１１はアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、及び
（ｌ）Ｘａａ１２はグルタミン（Ｇｌｎ）又はリシン（Ｌｙｓ）である、
単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。
【００２２】
別の実施形態においては、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドはアミノ酸配列Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｘａａ１  Ｉｌｅ  Ｘａａ２  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｘａａ３  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｘａａ４  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｘａａ５  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｘａａ６  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｘａａ７  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｘａａ８  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｘａａ９  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（配列番号１）を含み、からなり又はから本質的になり、
（ａ）Ｘａａ１はアスパラギン（Ａｓｎ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はリシン（Ｌｙｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はリシン（Ｌｙｓ）又はグルタミン（Ｇｌｎ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はイソロイシン（Ｉｌｅ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はアラニン（Ａｌａ）又はプロリン（Ｐｒｏ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はグリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、
（ｇ）Ｘａａ７はアラニン（Ａｌａ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｈ）Ｘａａ８はグルタミン（Ｇｌｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であり、及び
（ｉ）Ｘａａ９はアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）である。
【００２３】
一実施形態においては、単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５又は配列番号１８６のいずれか１のアミノ酸配列を含む、からなる又はから本質的になる。
【００２４】
本発明はまたアミノ酸配列Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｘａａ１  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｘａａ２  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｘａａ４  Ｐｈｅ  Ｘａａ５  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｘａａ６  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｘａａ７  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｘａａ８  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｘａａ９  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｘａａ１０  Ｘａａ１１  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｘａａ１２  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｘａａ１３  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（配列番号３５）を含み、からなり又はから本質的になり、
（ａ）Ｘａａ１はアルギニン（Ａｒｇ）又はグリシン（Ｇｌｙ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はスレオニン（Ｔｈｒ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はスレオニン（Ｔｈｒ）又はアラニン（Ａｌａ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はセリン（Ｓｅｒ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はセリン（Ｓｅｒ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はセリン（Ｓｅｒ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｇ）Ｘａａ７はグリシン（Ｇｌｙ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であり、
（ｈ）Ｘａａ８はセリン（Ｓｅｒ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、
（ｉ）Ｘａａ９はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）又はロイシン（Ｌｅｕ）であり、
（ｊ）Ｘａａ１０はアスパラギン（Ａｓｎ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｋ）Ｘａａ１１はセリン（Ｓｅｒ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、
（ｌ）Ｘａａ１２はアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）であり、及び
（ｍ）Ｘａａ１３はアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）である、
免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。
【００２５】
一実施形態においては、単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５又は配列番号５６のいずれか１のアミノ酸配列を含む、からなる、又はから本質的になる。
【００２６】
別の実施形態においては、配列番号１９０又は１９１を含む単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドの例としては、配列番号１９２〜１９５のいずれか１を含むものが挙げられる。
【００２７】
本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチドが配列番号１〜配列番号５６、配列番号１８２〜１８６又は配列番号１９０〜１９５のいずれか１のアミノ酸配列から本質的になるとき、ポリペプチドに実質的に影響しない追加的な構成要素(例えば、精製や単離を手助けするビオチンのようなタンパク質部分)が、ポリペプチドに含められ得る。本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチドが、配列番号１〜配列番号５６のいずれか１のアミノ酸配列からなるとき、該ポリペプチドはいずれの追加的な成分（即ち、本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチドに内在しない構成要素）も含まない。
【００２８】
本発明は、配列番号１〜５６のいずれか１と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一）のアミノ酸配列を含む、単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。本明細書において記載されている、核酸配列又はアミノ酸配列の「同一性」は、所望の（interest）核酸配列又はアミノ酸配列を、比較対照となる核酸配列又はアミノ酸配列と比較することによって決定し得る。同一性の割合は、所望の配列と比較対照の配列との間で同じである（即ち、同一である）ヌクレオチド又はアミノ酸の残基数を、最も長い配列長(即ち、所望の配列と比較対照の配列のどちらかの長い方の配列長)で割ったものである。２以上の配列の間で、最適なアライメント（alignment）を得るため及び同一性を計算するために、多くの数学的アルゴリズムが知られており、多くの利用可能なソフトウェア・プログラムに取り込まれている。そのようなプログラムの例としては、ＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗ、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ及びＡＬＩＧＮ（核酸配列及びアミノ酸配列のアライメント用）、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ２．１、ＢＬ２ＳＥＱ及びそれらの以降のバージョンのもの）及びＦＡＳＴＡプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ３ｘ、ＦＡＳＴＭ及びＳＳＥＡＲＣＨ）（配列アライメント及び配列類似性探索用）が挙げられる。配列アライメント・アルゴリズムはまた、例えば、Altschulら、J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990)、Beigert ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009) 、Durbinら編、Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009) 、Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005) 、Altschulら、Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997) 、及びGusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997)に開示されている。
【００２９】
別の実施形態においては、本発明はアミノ酸配列Ａｓｐ  Ｘａａ１  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｘａａ２  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ（配列番号５７）を含む単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを含み、からなり又はから本質的になり、
（ａ）Ｘａａ１はバリン（Ｖａｌ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｂ）Ｘａａ２はシステイン（Ｃｙｓ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｃ）Ｘａａ３はグリシン（Ｇｌｙ）又はセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｄ）Ｘａａ４はアスパラギン（Ａｓｎ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、
（ｅ）Ｘａａ５はリシン（Ｌｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）又はロイシン（Ｌｅｕ）であり、
（ｆ）Ｘａａ６はバリン（Ｖａｌ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、
（ｇ）Ｘａａ７はセリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）又はグリシン（Ｇｌｙ）であり、及び
（ｈ）Ｘａａ８はヒスチジン（Ｈｉｓ）又はチロシン（Ｔｙｒ）である、
免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。
【００３０】
一実施形態においては、単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号１８７、配列番号１８８、又は配列番号１８９のいずれか１のアミノ酸配列を含む、からなる、又はから本質的になる。
【００３１】
本発明は、アミノ酸配列Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｘａａ６  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ（配列番号８９）を含み、からなり又はから本質的になり、
（ａ）部分配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５は欠失しているか、又はＴｙｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎであり、及び
（ｂ）Ｘａａ６はスレオニン（Ｔｈｒ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）である、
単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドは、Ｘａａ６がスレオニン（Ｔｈｒ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ）であるとき、配列番号８９の４９〜５３番目の部位において部分配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５を含み得るか、又はそれを欠き得る。本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドが部分配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５を含むとき、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４及びＸａａ５はそれぞれ任意の適したアミノ酸残基であり得る。好ましくは、Ｘａａ１はチロシン（Ｔｙｒ）であり、Ｘａａ２はアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、Ｘａａ３はアラニン（Ａｌａ）であり、Ｘａａ４はセリン（Ｓｅｒ）であり、及びＸａａ５はアスパラギン（Ａｓｎ）である。部分配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５を含む免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドの好ましいアミノ酸配列は、配列番号９０を含む。免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドが、部分配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５を欠くとき、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドは、好ましくは、配列番号９１又は配列番号９２のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
別の実施形態においては、配列番号１９６又は１９７を含む、単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドが提供される。そのようなポリペプチドの例としては、配列番号１９８〜２００のいずれか１を含むポリペプチドを含むものが挙げられる。
【００３４】
本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドが、配列番号５７〜配列番号９２、配列番号１８７〜１８９又は配列番号１９６〜２００のいずれか１のアミノ酸配列から本質的になるとき、ポリペプチドに実質的に影響しない追加的な構成要素（例えば、精製又は単離を手助けするビオチンのようなタンパク質の一部）が、ポリペプチドに含められ得る。本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドが、配列番号５７〜配列番号９２のいずれか１のアミノ酸配列からなるとき、ポリペプチドはいずれの追加的な構成要素（即ち、本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドに内在しない構成要素）も含まない。
【００３５】
本発明は、配列番号５７〜配列番号９２のいずれか１と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一）のアミノ酸配列を含む、単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。核酸配列又はアミノ酸配列の「同一性」は、本明細書記載の方法によって決定し得る。
【００３６】
上述の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は軽鎖ポリペプチドの１以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸で置き換え得るか（replaced）又は置換（substituted）し得る。アミノ酸の「置き換え」又は「置換」は、ある部位又は残基の１アミノ酸の、ポリペプチド配列内部の同じ部位、又は残基での別のアミノ酸残基による置き換えを指す。
【００３７】
アミノ酸は大きく、「芳香族」又は「脂肪族」にグループ分けされる。芳香族アミノ酸は、芳香環を含む。「芳香族」アミノ酸の例としては、ヒスチジン（Ｈ又はＨｉｓ）、フェニルアラニン（Ｆ又はＰｈｅ）、チロシン（Ｙ又はＴｙｒ）及びトリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ）が挙げられる。非芳香族アミノ酸は大きく、「脂肪族」としてグループ分けされる。「脂肪族」アミノ酸の例としては、グリシン（Ｇ又はＧｌｙ）、アラニン（Ａ又はＡｌａ）、バリン（Ｖ又はＶａｌ）、ロイシン（Ｌ又はＬｅｕ）、イソロイシン（Ｉ又はＩｌｅ）、メチオニン（Ｍ又はＭｅｔ）、セリン（Ｓ又はＳｅｒ）、スレオニン（Ｔ又はＴｈｒ）、システイン（Ｃ又はＣｙｓ）、プロリン（Ｐ又はＰｒｏ）、グルタミン酸（Ｅ又はＧｌｕ）、アスパラギン酸（Ａ又はＡｓｐ）、アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）、グルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）、リシン（Ｋ又はＬｙｓ）及びアルギニン（Ｒ又はＡｒｇ）が挙げられる。
【００３８】
脂肪族アミノ酸は、４つのサブグループに細分類してもよい。「非極性の大きい脂肪族サブグループ」はバリン、ロイシン及びイソロイシンからなる。「弱い極性の脂肪族サブグループ」はメチオニン、セリン、スレオニン及びシステインからなる。「極性／帯電した脂肪族サブグループ」はグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン及びアルギニンからなる。「小さい残基サブグループ」はグリシン及びアラニンからなる。帯電した／極性アミノ酸のグループは、３つのサブグループ：リシン及びアルギニンからなる「正電荷を有するサブグループ」、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる「負電荷を有するサブグループ」並びにアスパラギン及びグルタミンからなる「極性サブグループ」に細分類してもよい。
【００３９】
芳香族アミノ酸は、２つのサブグループ：ヒスチジン及びトリプトファンからなる「窒素環サブグループ」並びにフェニルアラニン及びチロシンからなる「フェニルサブグループ」に細分類してもよい。
【００４０】
アミノ酸の置き換え（replacement）又は置換（substitution）は、保存的なもの、準保存的なもの、又は非保存的なものであり得る。「保存的なアミノ酸置換」又は「保存的な変異」という表現は、性質の共通する別のアミノ酸で、１つのアミノ酸を置き換えることを指す。個々のアミノ酸の間で共通する性質を定義する機能的な方法は、同種生物の対応するタンパク質の間での、アミノ酸変化の標準化された頻度（normalized frequencies）を分析することである（Schulz and Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)）。そのような分析によれば、アミノ酸のグループは、グループ内のアミノ酸が互いに、優先的に交換され、それゆえ、タンパク質構造全体に与える影響が互いに最も似ているものとして定義しても良い（Schulz and Schirmer、上記を参照）。
【００４１】
保存的なアミノ酸置換の例としては、例えば、正電荷が維持され得るようにアルギニンをリシンに、及びその逆に、負電荷が維持され得るようにアスパラギン酸をグルタミン酸に、及びその逆に、自由な−ＯＨ基が維持され得るようにスレオニンをセリンに、自由な−ＮＨ２基が維持され得るようにアスパラギンをグルタミンに、というように、上述したサブグループ内でのアミノ酸の置換が挙げられる。
【００４２】
「準保存的な変異」は、上で列記した同じグループ内でのアミノ酸のアミノ酸置換を含むが、同じサブグループ内での置換を含まない。例えば、アスパラギンをアスパラギン酸に、又はリシンをアスパラギンに置換することは、同じグループ内であるが、異なるサブグループ内のアミノ酸を含む。「非保存的な変異」は異なるグループ間、例えば、トリプトファンをリシンに、又はセリンをフェニルアラニンに、等のアミノ酸置換を含む。
【００４３】
更に、上述の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は軽鎖ポリペプチドに、１以上のアミノ酸を挿入し得る。任意の適したアミノ酸を、任意の数で、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列に挿入し得る。この点、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、２以上、５以上、又は１０以上のアミノ酸）であるが、２０を超えないアミノ酸（例えば、１８以下、１５以下、又は１２以下のアミノ酸）を、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列に挿入し得る。好ましくは、１〜１０のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸）を、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列に挿入する。この点、該アミノ酸（複数可）は、任意の適した部位において、上述の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は軽鎖ポリペプチドのいずれか１つに挿入し得る。好ましくは、該アミノ酸（複数可）は、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３）に挿入される。
【００４４】
本発明の単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、本明細書に記載された具体的なアミノ酸配列を含むポリペプチドに限定されない。実際に、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドは、ＬＡＧ−３への結合に関して、本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドと競合する、任意の重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドであり得る。この点、例えば、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドは、本明細書に記載の重鎖及び軽鎖ポリペプチドによって認識される、ＬＡＧ−３の同じエピトープに結合する、任意の重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドであり得る。抗体の競合は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット又は免疫組織化学法（例えば、米国特許第4,828,981号及び第8,568,992号；及びBraitbardら、Proteome Sci., 4: 12 (2006)を参照）を利用する、通常のペプチド競合アッセイを用いて、分析し得る。
【００４５】
本発明は、本明細書に記載された、１以上の本発明の単離されたアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる、単離されたＬＡＧ−３結合剤を提供する。「ＬＡＧ−３結合剤」は、ＬＡＧ−３タンパク質に特異的に結合する分子、好ましくはタンパク質分子を意味する。好ましくは、該ＬＡＧ−３結合剤は抗体又はその断片（例えば、免疫原性の断片）である。本発明のＬＡＧ−３結合剤は、本発明の単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は本発明の単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる。一実施形態においては、ＬＡＧ−３結合剤は、本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド又は本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる。別の実施形態においては、ＬＡＧ−３結合剤は、本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを含むか、から本質的になるか、又はからなる。
【００４６】
本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドの任意のアミノ酸残基は、アミノ酸の置き換え、挿入及び／若しくは欠失の結果、ＬＡＧ−３結合剤の生物学的活性が促進又は改善される限り、任意の組合せで、異なるアミノ酸残基で置き換え得るか、又は欠失若しくは挿入し得る。ＬＡＧ−３結合剤の「生物学的活性」は、例えば、特定のＬＡＧ−３エピトープへの結合親和性、その受容体（複数可）へのＬＡＧ−３結合の中和又は阻害、in vivoにおけるＬＡＧ−３活性の中和又は阻害(例えば、ＩＣ５０)、薬物動態、及び交差反応性（例えば、ＬＡＧ−３タンパク質の非ヒト・ホモログ又はオルソログとの、又は、他のタンパク質若しくは組織との交差反応性)を指す。当該技術分野において認識される抗原結合剤の他の生物学的特性又は特徴は、例えば、アビディティ（avidity）、選択性、溶解性、フォールディング（folding）、免疫毒性、発現及び製剤化を含む。上述の特性又は特徴は、ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分析（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）又はＫＩＮＥＸＡＴＭ、in vitro又はin vivoでの中和アッセイ、受容体−リガンド結合アッセイ、サイトカイン又は成長因子の産生及び／又は分泌アッセイ、及びシグナル伝達及び免疫組織化学アッセイを含む、標準的な技術を用いて観察、測定及び／又は評価することができるが、これらに限定されない。
【００４７】
用語「阻害」又は「中和」は、ＬＡＧ−３結合剤の活性に関して、本明細書において使用される場合、例えば、ＬＡＧ−３の生物学的活性又はＬＡＧ−３と関連した疾患又は状態の進行又は重篤度を、実質的に拮抗し（antagonize）、妨げ（prohibit）、阻み（prevent）、抑制し（restrain）、遅くらせ（slow）、中断し（disrupt）、変更し（alter）、削除し（eliminate）、停止し（stop）又は反転する（reverse）能力を指す。本発明の単離されたＬＡＧ−３結合剤は、好ましくは、ＬＡＧ−３活性を、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約１００％又は前記値の任意の２つによって定義される範囲で、阻害するか又は中和する。
【００４８】
本発明の単離されたＬＡＧ−３結合剤は、本明細書に記載されたように、抗体そのもの又は抗体断片であり得る。用語「抗体の断片」、「抗体断片」及び「抗体の機能的な断片」は、抗原に特異的に結合する能力を維持している抗体の１以上の断片を意味するよう、本明細書において相互に交換可能なものとして用いられる（一般には、Holligerら、Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)を参照）。単離されたＬＡＧ−３結合剤は、任意のＬＡＧ−３結合抗体断片を含有し得る。該抗体断片は、望ましくは、例えば１以上のＣＤＲ、可変領域（若しくはその部分）、定常領域（若しくはその部分）又はそれらの組合せを含む。抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結びついた２つのＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）抗体のシングルアーム（single arm）のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）温和な還元条件を用いてＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を破壊して得られるＦａｂ’断片、（ｖ）ジスルフィドで安定化したＦｖ断片（ｄｓＦｖ）及び（ｖｉ）抗原に特異的に結合する抗体の単一な可変領域ドメイン（ＶＨ若しくはＶＬ）ポリペプチドであるドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
単離されたＬＡＧ−３結合剤が免疫グロブリン重鎖又は軽鎖ポリペプチドの断片を含む実施形態においては、該断片はＬＡＧ−３に結合し、好ましくはＬＡＧ−３の活性を阻害する限り、任意のサイズであり得る。この点、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドの断片は、望ましくは約５と１８の間（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は前記値の任意の２つで定義される範囲）のアミノ酸を含む。同様に、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドの断片は望ましくは、約５と１８の間（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は前記値の任意の２つで定義される範囲）のアミノ酸を含む。
【００５０】
ＬＡＧ−３結合剤が抗体又は抗体断片であるとき、抗体又は抗体断片は、望ましくは、任意の適したクラス（class）の重鎖定常領域（Ｆｃ）を含む。好ましくは、抗体又は抗体断片は、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４の抗体又はそれらの変異体に基づく重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態においては、ＬＡＧ−３結合剤は、抗体のエフェクター機能を低減又は削除するように操作されたＦｃ領域を含む。エフェクター機能を低減又は削除するようにＦｃ領域を操作する技術と同じく、エフェクター機能が低減したか又は無効にされた、操作がなされたＦｃ領域は、当該技術分野において公知であり、市販されており、これらのいずれも本発明と一緒に用いることができる。
【００５１】
ＬＡＧ−３結合剤はまた、一本鎖抗体断片であり得る。一本鎖抗体断片の例としては、（ｉ）２つのドメインをポリペプチド一本鎖として合成できるようにする、合成リンカーによって接合されたＦｖ断片（即ちＶＬ及びＶＨ）の２つのドメインからなる一価の分子である一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Birdら、Science, 242: 423-426 (1988)、Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988) 、及びOsbournら、Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)を参照）、及び（ｉｉ）各ポリペプチド鎖が、同じポリペプチド鎖上でＶＨ及びＶＬ間のペアリングができないほど短いペプチドリンカーによってＶＬに接続したＶＨを含み、それによって、２つの機能的な抗原結合部位を有する二量体分子を生成するために、異なるＶＨ−ＶＬポリペプチド鎖において、相補的なドメイン間でペアリングを促進する、二量体ポリペプチド鎖であるダイアボディ（diabody）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体断片は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許出願公開第2009/0093024 A1号においてより詳細に記載されている。
【００５２】
単離されたＬＡＧ−３結合剤はまた、細胞内発現抗体（intrabody）又はその断片であり得る。細胞内発現抗体は、細胞内において発現し機能する抗体である。細胞内発現抗体は、典型的にはジスルフィド結合を欠き、その特異的な結合活性によって標的遺伝子の発現又は活性を調節することができる。細胞内発現抗体は、単離されたＶＨ及びＶＬドメイン並びにｓｃＦｖｓのような単一ドメイン断片を含む。細胞内発現抗体は、標的タンパク質が位置する細胞内区画において高い濃度で発現することができるよう、細胞内発現抗体のＮ又はＣ末端に付加した細胞内情報輸送シグナル（sub-cellular trafficking signals）を含み得る。標的遺伝子との相互作用において、細胞内発現抗体は、標的タンパク質機能を調節し、及び／又は標的タンパク質の分解を促進し、標的タンパク質を細胞内の生理的でない区画に隔離するような機構によって、表現型／機能的ノックアウトを達成する。細胞内発現抗体によって媒介される遺伝子の不活性化のその他の機構は、標的タンパク質上の触媒活性部位に結合する、又はタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用若しくはタンパク質−ＲＮＡ相互作用に関与するエピトープに結合するように、細胞内発現抗体が標的とする（directed）エピトープに依存し得る。
【００５３】
単離されたＬＡＧ−３結合剤はまた、抗体コンジュゲート（conjugate）であり得る。この点、単離されたＬＡＧ−３結合剤は、（１）抗体、代替となる足場又はそれらの断片のコンジュゲート、及び（２）ＬＡＧ−３結合剤を含むタンパク質部分又は非タンパク質部分のコンジュゲートであり得る。例えば、ＬＡＧ−３結合剤は、ペプチド、蛍光分子又は化学療法剤にコンジュゲートした抗体の全部又は一部であり得る。
【００５４】
単離されたＬＡＧ−３結合剤は、ヒト抗体、非ヒト抗体又はキメラ抗体であり得るか、又はそれらから獲得し得る。「キメラ」は、ヒト領域及び非ヒト領域の両方を含む抗体又はその断片を意味する。好ましくは、単離されたＬＡＧ−３結合剤はヒト化抗体である。「ヒト化」抗体は、ヒト抗体の足場及び非ヒト抗体から得られたか、又はそれに由来する少なくとも１つのＣＤＲを含むモノクローナル抗体である。非ヒト抗体は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）のような任意の非ヒト動物から単離された抗体を含む。ヒト化抗体は、非ヒト抗体から得られたか、又はそれに由来する１、２又は３のＣＤＲを含み得る。本発明の一実施形態において、本発明のＬＡＧ−３結合剤のＣＤＲＨ３は、マウスモノクローナル抗体から得られるか、又はそれに由来する。一方で、本発明のＬＡＧ−３結合剤の残りの可変領域及び定常領域は、ヒト・モノクローナル抗体から得られるか、又はそれに由来する。
【００５５】
ヒト抗体、非ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体は、in vitroの供給源（例えば、ハイブリドーマ又は組換で抗体を産生する細胞株）及びin vivoの供給源（例えば、げっ歯類）を含む、任意の方法で獲得し得る。抗体を産生する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976)、Harlow and Lane編、Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988)、及びJanewayら編、Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)に記載されている。ある実施形態においては、ヒト抗体又はキメラ抗体は、１以上の内在免疫グロブリン遺伝子が、１以上のヒト免疫グロブリン遺伝子で置き換えられた、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を用いて産生し得る。内在抗体遺伝子が効果的にヒト抗体遺伝子に置き換えられたトランスジェニックマウスの例としては、Ｍｅｄａｒｅｘ  ＨＵＭＡＢ−ＭＯＵＳＥＴＭ、Ｋｉｒｉｎ  ＴＣ  ＭＯＵＳＥＴＭ及びＫｙｏｗａ  Ｋｉｒｉｎ  ＫＭ−ＭＯＵＳＥＴＭ（例えば、Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005)及びLonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008)を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト化抗体は、例えば、ヒト抗体の足場への非ヒトＣＤＲの移植（例えば、Kashmiriら、Methods, 36(1): 25-34 (2005)、及びHouら、J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008)を参照）を含む、当該技術分野において公知である、任意の適した方法（例えば、An, Z. (ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey (2009)を参照）を用いて生成し得る。一実施形態においては、ヒト化抗体は、例えば、米国特許出願公開第2011/0287485 A1号に記載されている方法を用いて生産し得る。
【００５６】
一実施形態においては、本明細書に記載された、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３）又は可変領域は、タンパク質化学又は組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いて、抗体又は非抗体ポリペプチドのような別の分子に移植（transplanted）（即ち、移植（grafted））し得る。この点、本発明は、本明細書に記載されている免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドの少なくとも１つのＣＤＲを含む、単離されたＬＡＧ−３結合剤を提供する。単離されたＬＡＧ−３結合剤は、本明細書に記載されている免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖可変領域の１、２又は３つのＣＤＲを含み得る。
【００５７】
好ましい実施形態においては、ＬＡＧ−３結合剤は、ＬＡＧ−３エピトープに結合し、ＭＨＣクラスＩＩ分子へのＬＡＧ−３の結合をブロック（blocks）し、ＬＡＧ−３介在性シグナル伝達を阻害する。例えば、ＬＡＧ−３結合剤は、ＬＡＧ−３タンパク質の４つのＩｇ様細胞外ドメイン（Ｄ１−Ｄ４）の１以上に結合し得る（例えば、Triebelら、J. Exp. Med., 171(5): 1393-1405 (1990)、及びBruniquelら、Immunogenetics, 47: 96-98 (1997)を参照)。好ましくは、ＬＡＧ−３結合剤は、ＬＡＧ−３タンパク質のドメイン１（Ｄ１）及び／又はドメイン２（Ｄ２）に結合する。本発明はまた、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を、間接的な又はアロステリックな様式でブロックする（blocks）単離又は精製されたＬＡＧ−３エピトープを提供する。
【００５８】
本発明はまた、本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド及び本発明のＬＡＧ−３結合剤をコードする、１以上の単離された又は精製された核酸配列を提供する。
【００５９】
用語「核酸配列」はＤＮＡ又はＲＮＡのポリマー、即ち、一本鎖又は二本鎖であり得、非天然又は改変したヌクレオチドを含有し得るポリヌクレオチドを含むことを意図する。本明細書において使用される場合、用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかである。これらの用語は、分子の一次構造を指し、そのため、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡを含み、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。これらの用語は、均等物として、メチル化された及び／又はキャップ化されたポリヌクレオチド等であるが、これらに限定されない、ヌクレオチド類似体及び修飾ポリヌクレオチドから作製されたＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの類似体を含む。核酸は典型的には、核酸配列又はポリヌクレオチドを形成するために、リン酸結合を介して結びついているが、多くの他の結びつきが当該技術分野において公知である（例えば、ホスホチオエート、ボラノホスフェートなど）。
【００６０】
本発明は更に、本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド及び／又は本発明のＬＡＧ−３結合剤をコードする、１以上の核酸配列を含むベクターを提供する。該ベクターは、例えば、プラスミド、エピソーム、コスミド、ウイルス・ベクター（例えば、レトロウイルス又はアデノウイルス）又はファージであり得る。適したベクター及びベクター調製の方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)、及びAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)を参照）。
【００６１】
本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド（heavy）、本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド及び／又は本発明のＬＡＧ−３結合剤をコードする核酸配列に加えて、該ベクターは、好ましくは宿主細胞におけるコードされた配列の発現を提供する（provide for）プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、シグナルペプチド（例えば、オステオネクチン・シグナルペプチド）、配列内リボソーム進入部位（internal ribosome entry sites (IRES)）等の発現調節配列を含む。典型的な発現調節配列は、当該技術分野において公知であり、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。
【００６２】
多様な異なる供給源に由来する構成的（constitutive）、誘導性及び抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターは、当該技術分野において周知である。プロモーターの代表的な供給源としては、例えば、ウイルス、哺乳類、昆虫、植物、酵母菌及び細菌が挙げられ、これらの供給源に由来する、適したプロモーターは容易に利用可能であるか、又は公に利用できる、例えば、他の商業的若しくは個人的な供給源と同様、ＡＴＣＣのような寄託機関に由来する配列に基づいて、合成によって産生し得る。プロモーターは１方向性（即ち、１方向に転写を開始する）又は２方向性（即ち、３’又は５’方向のいずれにも転写を開始する）であり得る。プロモーターの限定されない例としては、例えば、Ｔ７細菌発現システム、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）細菌発現システム、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、Ｔｅｔシステム（米国特許第5,464,758号及び第5,814,618号）、エクジソン誘導システム（Noら、Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351 (1996)）、Ｔ−ＲＥＸＴＭシステム（インビトロジェン, Carlsbad, CA）、ＬＡＣＳＷＩＴＣＨＴＭシステム（ストラタジーン、San Diego, CA）及びＣｒｅ−ＥＲＴタモキシフェン誘導性リコンビナーゼ・システム（Indraら、Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999) 、Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000) 、米国特許第7,112,715号、及びKramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144 (2005)）が挙げられる。
【００６３】
本明細書において用いられる場合、用語「エンハンサー」は、例えば、作動可能に結び付けられた核酸配列の転写を増加する、ＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から何キロベースも離れて位置することができ、調節性因子の結合、ＤＮＡメチル化のパターン又はＤＮＡ構造の変化を仲介し得る。多様な異なる供給源に由来する多数のエンハンサーは、当該技術分野において周知であり、クローン化されたポリヌクレオチド（例えば、他の商業的又は個人的供給源と同様、ＡＴＣＣのような寄託機関に由来）としてか、又はそれに含まれるものとして利用できる。プロモーター（例えば、一般に用いられているＣＭＶプロモーターなど）を含む、多くのポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列を含む。エンハンサーはコード配列の上流、内部又は下流に位置し得る。
【００６４】
ベクターはまた、「選択マーカー遺伝子」を含み得る。本明細書において用いられる場合、用語「選択マーカー遺伝子」は、対応する選択試薬の存在下において、該核酸配列を発現する細胞が、特異的に、正又は負に選択されることを可能にする核酸配列を指す。適した選択マーカー遺伝子は、当該技術分野において公知であり、例えば、国際特許出願公開第1992/008796号及び第1994/028143号、Wiglerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567-3570 (1980)、O'Hareら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527-1531 (1981)、Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076 (1981)、Colberre-Garapinら、J. Mol. Biol., 150: 1-14 (1981)、Santerreら、Gene, 30: 147-156 (1984) 、Kentら、Science, 237: 901-903 (1987)、Wiglerら、Cell, 11: 223-232 (1977)、Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026-2034 (1962)、Lowyら、Cell, 22: 817-823 (1980)、及び米国特許第5,122,464号及び第5,770,359号に記載されている。
【００６５】
いくつかの実施形態においては、ベクターは宿主細胞において複製することができる「エピソーマル発現ベクター」又は「エピソーム」であり、適切な選択圧の存在下で、宿主細胞内でＤＮＡの染色体外部分（segment）として存続する（例えば、Coneseら、Gene Therapy, 11: 1735-1742 (2004)を参照）。市販されているエピソーマル発現ベクターの代表例としては、エプステイン・バー（Epstein Barr）核抗原１（ＥＢＮＡ１）及びエプステイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を利用するエピソーマル・プラスミドが挙げられるが、これに限定されない。インビトロジェン（Carlsbad, CA）のベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７及びｐｃＤＮＡ３．１、及びストラタジーン（La Jolla, CA）のベクターｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１及びｏｒｉＰのかわりに、Ｔ抗原及びＳＶ４０複製起点を使用するエピソーマル・ベクターの限定されない例である。
【００６６】
他の適したベクターとしては、宿主細胞のＤＮＡにランダムに取り込まれ（integrate into）てもよく、発現ベクターと宿主細胞の染色体の間の特異的組換えを可能にする組換部位を含んでもよい、インテグレーティング（integrating）発現ベクターが挙げられる。そのようなインテグレーティング発現ベクターは、所望のタンパク質の発現をもたらすために、宿主細胞の染色体の内在発現調節配列を利用しても良い。部位特異的な様式で取り込まれるベクターの例としては、例えば、インビトロジェン（Carlsbad, CA）のｆｌｐ−ｉｎシステムの構成物(例えば、ｐｃＤＮＡＴＭ５／ＦＲＴ）又はストラタジーン（La Jolla, CA）のｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６  Ｃｏｒｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓにおいて見出し得るようなｃｒｅ−ｌｏｘシステムが挙げられる。宿主細胞の染色体にランダムに取り込まれるベクターの例としては、例えば、ライフテクノロジーズ（Carlsbad, CA）のｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の非存在下で導入されるとき）、ミリポア（Billerica, MA）のＵＣＯＥ及びプロメガ（Madison, WI）のｐＣＩ又はｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）ＦＬＥＸＩＴＭが挙げられる。
【００６７】
ウイルス・ベクターもまた使用し得る。市販されているウイルス発現ベクターの代表例としては、クルーセル社（Leiden, The Netherlands）から市販されているアデノウイルス・ベースのＰｅｒ．Ｃ６システム、インビトロジェン（Carlsbad, CA）のレンチウイルス・ベースのｐＬＰ１、及びストラタジーン（La Jolla, CA）のレトロウイルス・ベクターｐＦＢ−ＥＲＶとｐＣＦＢ−ＥＧＳＨが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、同じベクター上（即ち、in cis）で、細胞に提供され得る。一方向性のプロモーターが、各々の核酸配列の発現を調節するために使用され得る。別の実施形態においては、二方向性と一方向性のプロモーターの組合せが、複数の核酸配列の発現を調節するために使用され得る。本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、別のベクターに載せて（即ち、in trans）、細胞集団に、代替的に提供され得る。それぞれの別のベクターにおいて、各々の核酸配列は、同じか又は異なる発現調節配列を含み得る。別のベクターは、同時に又は順番に細胞に提供され得る。
【００６９】
本発明のアミノ酸配列をコードする核酸（複数可）を含むベクター（複数可）は、コードされるポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、任意の適した原核細胞又は真核細胞を含む、宿主細胞に導入され得る。そういうものとして、本発明は、本発明のベクターを含む単離された細胞を提供する。好ましい宿主細胞は、容易に、かつ確実に増殖し得る細胞であり、合理的な速い増殖速度を有し、良く特性が明らかにされている発現システムを有し、そして容易にかつ効率的に形質転換又はトランスフェクトし得るものである。
【００７０】
適した原核細胞の例としては、バチラス属（例えば、バチラス・サチリス（Bacillus subtilis）及びバチラス・ブレビス（Bacillus brevis））、エシェリヒア属（例えば、大腸菌（E. coli））、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、サルモネラ属、及びエルウィニア属が挙げられるが、これらに限定されない。特に有用な原核細胞は、大腸菌（例えば、Ｋ１２、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号：33694）、ＤＨ５α、ＤＨ１０、ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号：53338）及びＣＣ１０２）の様々な株を含む。
【００７１】
好ましくは、該ベクターは真核細胞に導入される。適した真核細胞は、当該技術分野において公知であり、例えば、酵母菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む。適した酵母菌細胞の例としては、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、ピキア属、リノ−スポリジウム属（Rhino-sporidium）、サッカロマイセス属、及びシゾサッカロマイセス属に由来するものが挙げられる。好ましくは、酵母菌細胞は、サッカロマイセス・セレビシー（Saccharomyces cerivisae）、及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）が挙げられる。
【００７２】
適した昆虫細胞は、例えば、Kittsら、Biotechniques, 14: 810-817 (1993) 、Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 (1993) 、及びLucklowら、J. Virol., 67: 4566-4579 (1993)に記載されている。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９及びＨＩ５（インビトロジェン、Carlsbad, CA）を含む。
【００７３】
好ましくは、哺乳動物細胞が、本発明において利用される。多くの適した哺乳動物宿主細胞は、当該技術分野において公知であり、多くはアメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Manassas, VA）から入手可能である。適した哺乳動物細胞の例としては、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号：CCL61）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞（Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220 (1980))、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号：CRL1573）及び３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号：CCL92）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適した哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号：CRL1650）及びＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ番号：CRL1651）及びＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号：CCL70）である。更なる哺乳動物宿主細胞の例としては、形質転換された細胞株が挙げられ、霊長類細胞株及びげっ歯類細胞株が挙げられる。通常の２倍体細胞、in vitroでの組織及び移植片の初代培養に由来する細胞株もまた適している。他の適した哺乳動物細胞株は、いずれもＡＴＣＣから入手可能であるマウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、及びＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。適した哺乳動物宿主細胞を選択する方法、及び細胞を形質転換、培養、増幅（amplification）、スクリーニング及び精製する方法は、当該技術分野において公知である。
【００７４】
一実施形態においては、哺乳動物細胞はヒト細胞である。例えば、哺乳動物細胞は、Ｂリンパ球前駆細胞（pre-B lymphocyte origin）株のような、ヒトのリンパ細胞又はリンパ細胞に由来する細胞株であり得る。ヒトのリンパ細胞株の例としては、制限がなく、ＲＡＭＯＳ（ＣＲＬ−１５９６）、Ｄａｕｄｉ（ＣＣＬ−２１３）、ＥＢ−３（ＣＣＬ−８５）、ＤＴ４０（ＣＲＬ−２１１１）、１８−８１（Jackら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1581-1585 (1988)）、Ｒａｊｉ細胞（ＣＣＬ−８６）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Crucell Holland B.V., Leiden, The Netherlands）及びその派生細胞が挙げられる。
【００７５】
本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、「トランスフェクション」、「形質転換」又は「形質導入」によって細胞に導入しても良い。本明細書で用いられる場合、「トランスフェクション」、「形質転換」又は「形質導入」は、物理的又は化学的方法を用いることによって、宿主細胞に１以上の外来のポリヌクレオチドを導入することを指す。多くのトランスフェクション技術は、当該技術分野において公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿法（例えば、Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)を参照)、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、カチオン性リポソーム媒介性（cationic liposome-mediated）トランスフェクション法、タングステン粒子促進微小粒子衝撃法（tungsten particle-facilitated microparticle bombardment）（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)）、及びリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿法（Brashら、Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）を含む。ファージ又はウイルス・ベクターは、多くが市販されている、適したパッケージ細胞において感染性粒子を増殖後、宿主細胞に導入し得る。
【００７６】
本発明は、本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、本発明のＬＡＧ−３結合剤、上述した任意の物をコードする本発明の核酸配列、又は本発明の核酸配列を含む本発明のベクターを、有効量含む組成物を提供する。好ましくは、該組成物は医薬的に許容される（例えば、生理学的に許容される）組成物であり、それは担体、好ましくは医薬的に許容される（例えば、生理学的に許容される）担体、及び本発明のアミノ酸配列、抗原結合剤、又はベクターを含む。任意の適した担体は、本発明の文脈において使用され得ると共に、そのような担体は当該技術分野において周知である。担体の選択は、該組成物が投与され得る特定の部位、及び該組成物を投与するために用いられる特定の方法によってある程度決定される。該組成物は、任意で滅菌され得る。該組成物は、保管のために凍結又は凍結乾燥され得ると共に、使用の前に適した滅菌担体に再構成し得る。該組成物は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001)に記載されている従来技術に従って、産生し得る。
【００７７】
本発明は更に、ＬＡＧ−３の阻害又は中和に応答する哺乳動物において病気（disorder）を治療する方法を提供する。該方法は、ＬＡＧ−３の阻害又は中和に応答する、病気を有する哺乳動物に上述した組成物を投与することを含み、それによって哺乳動物における病気が治療される。「ＬＡＧ−３の阻害に応答する」又は「ＬＡＧ−３の中和に応答する」病気は、ＬＡＧ−３の水準若しくは活性を低下させることが、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて治療上のメリットを有する、又は、ＬＡＧ−３の不適切な発現（例えば、過剰発現）若しくはＬＡＧ−３の上昇した活性が、疾患（disease）又は病気の病的な影響を引き起こす又はそれに貢献する、任意の疾患又は病気を指す。ＬＡＧ−３の阻害に応答する病気は、例えば、がん及び感染症を含む。本発明の方法は、当該技術分野において公知である任意の型のがん、例えば、メラノーマ、腎臓細胞がん、肺がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、胆嚢がん、喉頭がん、肝臓がん、甲状腺がん、胃がん、唾液腺がん、前立腺がん、膵臓がん、又はメルケル細胞がんなど（例えば、Bhatiaら、Curr. Oncol. Rep., 13(6):488-497(2011)を参照）を治療するために使用され得る。本発明の方法は、任意の型の感染症（即ち、細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫によって引き起こされる疾患又は病気）を治療するために使用され得る。本発明の方法によって治療され得る感染症の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によって引き起こされる疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、本発明のＬＡＧ−３結合剤、上述した任意の物をコードする本発明の核酸配列、又は本発明の核酸配列を含む本発明のベクターを含む組成物の投与は、哺乳動物における、がん又は感染症に対する免疫応答を誘導する。「免疫応答」は、例えば、抗体産生及び／又は免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化を伴い得る。
【００７８】
本明細書において用いられる場合、用語「治療」、「治療する」等は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。好ましくは、該効果は、治療、即ち、該効果が疾患及び／又は該疾患に起因する有害症状を、部分的又は完全に治す。この目的を達成するために、本発明の方法は、ＬＡＧ−３結合剤の「治療有効量」を投与することを含む。「治療有効量」は、必要な投与量及び投与期間において、所望の治療結果を達成するのに、効果的である量を指す。個人の病気の状態、年齢、性別、及び体重、並びに個人において所望の応答を誘発するためのＬＡＧ−３結合剤の能力のような要因によって、治療有効量は変化しても良い。例えば、本発明のＬＡＧ−３結合剤の治療有効量は、ヒトにおけるＬＡＧ−３の生物活性を低減する量である。
【００７９】
或いは、薬理学的及び／又は生理学的効果は予防的、即ち、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防する効果であっても良い。この点、本発明の方法は、ＬＡＧ−３結合剤の「予防有効量」を投与すること含む。「予防有効量」は、必要な投与量及び投与期間において、所望の予防結果（例えば、疾患発症の予防）を達成するのに、効果的である量を指す。
【００８０】
典型的な投与量は、例えば、動物又はヒトの体重で１ｐｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る；但し、この例示する範囲よりも小さい又はそれを超える投与量は、本発明の範囲内にある。毎日の非経口投与量は、総体重の約０．００００１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．００１μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ又はこれらの数値の任意の２つによって定義される範囲）であり得る。好ましくは、総体重の約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ又はこれらの数値の任意の２つによって定義される範囲）であり得る。より好ましくは、総体重の１μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約３μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約７５μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ又はこれらの数値の任意の２つによって定義される範囲）であり得る。より更に好ましくは、１日当たり約０．５〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ又は数値の任意の２つによって定義される範囲）であり得る。治療した患者を定期的に評価することにより、治療又は予防効果を観察し得る。数日以上にわたる反復投与のために、状態に依存して、疾患の症状が所望の程度抑制されるまで治療を繰り返し得る。しかし、他の投与計画が有用であり得、それらは本発明の範囲内にある。所望の投与量は、組成物の１回の急速静注によって、組成物の複数回の急速静注によって、又は組成物の連続注入投与によって、送達され（delivered）得る。
【００８１】
本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、本発明の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、本発明のＬＡＧ−３結合剤、上述した任意の物をコードする本発明の核酸配列又は本発明の核酸配列を含む本発明のベクターを有効量含む組成物は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、経肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔、舌下又は坐剤投与を含む標準的な投与技術を用いて、哺乳動物に投与し得る。該組成物は、好ましくは、非経口投与に適している。本明細書において用いられる場合、用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内及び腹腔内投与を含む。より好ましくは、該組成物は、静脈内、腹腔内、皮下注射による末梢全身送達（peripheral systemic delivery）によって哺乳動物に投与される。
【００８２】
一旦、哺乳動物（例えば、交差反応性のヒト）に投与されると、本発明のＬＡＧ−３結合剤の生物学的活性は、当該技術分野において公知の適した任意の方法で測定し得る。例えば、該生物学的活性は、特定のＬＡＧ−３結合剤の安定性を決定することにより、評価し得る。本発明の一実施形態においては、ＬＡＧ−３結合剤（例えば、抗体）のin vivoにおける半減期は、約３０分〜４５日の間（例えば、約３０分、約４５分、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約１０時間、約１２時間、約１日、約５日、約１０日、約１５日、約２５日、約３５日、約４０日、約４５日又はこれらの数値の任意の２つによって定義される範囲）である。別の実施形態においては、ＬＡＧ−３結合剤のin vivoにおける半減期は、約２時間〜２０日の間（例えば、約５時間、約１０時間、約１５時間、約２０時間、約２日、約３日、約７日、約１２日、約１４日、約１７日、約１９日又はこれらの数値の任意の２つによって定義される範囲）である。別の実施形態においては、ＬＡＧ−３結合剤のin vivoにおける半減期は、約１０日〜約４０日の間（例えば、約１０日、約１３日、約１６日、約１８日、約２０日、約２３日、約２６日、約２９日、約３０日、約３３日、約３７日、約３８日、約３９日、約４０日又はこれらの数値の任意の２つによって定義される範囲）である。
【００８３】
特定のＬＡＧ−３結合剤の生物学的活性は、ＬＡＧ−３又はそのエピトープへの結合親和性を決定することによってもまた評価し得る。用語「親和性」は、２つの試薬の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（ＫＤ）として表される。エピトープに対する抗体の親和性のように、リガンドに結合する試薬の親和性は、例えば、約１ピコモーラー（ｐＭ）〜約１００マイクロモーラー（μＭ）（例えば、約１ｐＭ〜約１ｎＭ、約１ｎＭ〜約１μＭ又は約１μＭ〜約１００μＭ）であり得る。一実施形態においては、ＬＡＧ−３結合剤は１ｎＭよりも小さいか又はそれと同等（例えば、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０２５ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００１ｎＭ又はこれらの数値の任意の２つによって定義される範囲）のＫＤでＬＡＧ−３タンパク質に結合し得る。別の実施形態においては、ＬＡＧ−３結合剤は２００ｐＭよりも小さいか又はそれと同等（例えば、１９０ｐＭ、１７５ｐＭ、１５０ｐＭ、１２５ｐＭ、１１０ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７５ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ又はこれらの数値の任意の２つによって定義される範囲）のＫＤでＬＡＧ−３タンパク質に結合し得る。目的の抗原又はエピトープに対する免疫グロブリンの親和性は、任意の当該技術分野で認められたアッセイを用いて測定し得る。そのような方法としては、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、分離可能ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、溶液相競合（ＫＩＮＥＸＡＴＭ）、抗原パニング（panning）、及び／又はＥＬＩＳＡが挙げられる（例えば、Janewayら編、Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing, New York, NY, 2001を参照)。 
【００８４】
本発明のＬＡＧ−３結合剤は、単独で、又は他の薬剤と組合せて（例えば、アジュバントとして）投与しても良い。例えば、ＬＡＧ−３結合剤は、本明細書において開示された疾患の治療又は予防のための、他の剤と組み合わせて投与し得る。この点、ＬＡＧ−３結合剤は、例えば、当該技術分野において公知である任意の化学療法剤を含む少なくとも１つの他の抗がん剤、電離放射線、小分子抗がん剤、がんワクチン、生物療法（例えば、他のモノクローナル抗体、がん死滅（cancer-killing）ウイルス、遺伝子治療、及び養子Ｔ細胞移植）及び／又は手術との組合せで使用し得る。本発明の方法が感染症を治療するとき、ＬＡＧ−３結合剤は、少なくとも１つの抗細菌剤又は少なくとも１つの抗ウイルス剤との組合せで投与し得る。この点、該抗細菌剤は当該技術分野において公知である、任意の適した抗生物質であり得る。抗ウイルス剤は、特定のウイルスを特異的な標的とする、任意の適した型の、任意のワクチン（例えば、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、組換えベクターワクチン、及び小分子抗ウイルス療法（例えば、ウイルス複製阻害剤およびヌクレオシド類似体））であり得る。
【００８５】
別の実施形態においては、本発明のＬＡＧ−３結合剤は、免疫チェックポイント経路を阻害する、他の剤との組合せで投与し得る。例えば、本発明のＬＡＧ−３結合剤は、プログラムド・デス１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞免疫グロブリン・ドメイン及びムチン・ドメイン３タンパク質（ＴＩＭ−３）及び細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）経路を、阻害するか又は拮抗する（antagonize）剤との組合せで投与し得る。これらの免疫チェックポイント経路の２以上を同時に標的とする組合せ治療は、改善された潜在的に相乗的な抗腫瘍活性を実証している（例えば、Sakuishiら、J. Exp. Med., 207: 2187-2194 (2010) 、Ngiowら、Cancer Res., 71: 3540-3551 (2011) 、及びWooら、Cancer Res., 72: 917-927 (2012)を参照)。一実施形態においては、本発明のＬＡＧ−３結合剤は、ＴＩＭ−３に結合する抗体及び／又はＰＤ−１に結合する抗体との組合せで投与される。この点、哺乳動物における、がん又は感染症を治療する本発明の方法は更に、（ｉ）ＴＩＭ−３タンパク質に結合する抗体及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含む組成物か、又は（ｉ）ＰＤ−１タンパク質に結合する抗体及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含む組成物、を哺乳動物に投与することを含み得る。
【００８６】
治療用途に加え、本明細書に記載のＬＡＧ−３結合剤は、診断又は研究用途として使用し得る。この点、ＬＡＧ−３結合剤は、ＬＡＧ−３の不適切な発現（例えば、過剰発現）又は、上昇したＬＡＧ−３活性が、疾患又は病気の病理学的効果を引き起こすか、又はそれに貢献する病気又は疾患を診断するための方法において使用し得る。同様にして、ＬＡＧ−３結合剤は、ＬＡＧ−３阻害に反応する疾患又は病気について試験された患者における、ＬＡＧ−３タンパク質レベルを観察するためのアッセイにおいて使用され得る。研究用途としては、例えば、ＬＡＧ−３結合剤を利用する方法、及び試料中、例えば、ヒト体液又は細胞若しくは組織抽出物中で、ＬＡＧ−３タンパク質を検出するための標識を利用する方法が挙げられる。ＬＡＧ−３結合剤は、検出可能な部分による共有又は非共有標識のような修飾と共に、又は修飾なしで使用し得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ）、蛍光若しくは化学発光化合物（例えば、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又は西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ）又は補欠分子族であり得る。検出可能な部分に対して抗原結合剤（例えば、抗体）を別々に結合する（conjugating）ために、当該技術分野で公知の任意の方法を、本発明の文脈において採用しても良い（例えば、Hunterら、Nature, 194: 495-496 (1962) 、Davidら、Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974) 、Painら、J. Immunol. Meth., 40: 219-230 (1981) 、及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)を参照）。
【００８７】
ＬＡＧ−３タンパク質レベルは、当該技術分野で公知の任意の適した方法によって、本発明のＬＡＧ−３結合剤を用いて測定し得る。そのような方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及びＦＡＣＳが挙げられる。ＬＡＧ−３の通常又は標準的な発現値は、任意の適した技術を用いて、例えば抗原・抗体複合体を形成するのに適した条件下で、ＬＡＧ−３を含むか、又は含むと疑われる試料と抗ＬＡＧ−３抗体とを混合することによって設定し得る。抗体は、結合した又は結合していない抗体の検出を容易にするために、検出可能な物質で直接又は間接的に標識される。適した検出可能な物質としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、及び放射性物質が挙げられる（例えば、Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)を参照）。次に、試料において発現しているＬＡＧ−３ポリペプチドの量は、基準値と比較される。
【００８８】
ＬＡＧ−３結合剤は、キット、即ち、所定量の試薬と診断アッセイを行うための説明書とが、組み合わされたパッケージで提供され得る。ＬＡＧ−３結合剤が酵素で標識されている場合、該キットは望ましくは、酵素によって必要とされる基質及び補因子（例えば、検出可能な発色団又はフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含む。加えて、他の添加物をキットに含んでいても良い。例えば、安定化剤、緩衝剤（例えば、ブロッキング・バッファー又は溶解バッファー）等である。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する、試薬の溶液中の濃度を提供するために変更し得る。該試薬は、溶解により適切な濃度の試薬溶液が得られる賦形剤を含む、乾燥粉末（典型的には、凍結乾燥したもの）として提供しても良い。
【００８９】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、当然のことながら、決して、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９０】
実施例１
本実施例は、抗ヒトＬＡＧ−３モノクローナル抗体を作製する方法を実証する。
【００９１】
マウスへの免疫及びハイブリドーマ・スクリーニングに用いるための抗原を産生するため、マウスＩｇＧ２ａ（ヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ）又は不活性型ワサビ蛍光タンパク質（ｄＷＦＰヒトＬＡＧ−３）のいずれかに、ヒトＬＡＧ−３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードする遺伝子を融合させた。具体的には、雌のスイス・ウェブスター（ＳＷＲ）マウスを、ハーラン・ラボラトリーズ社（Indianapolis, IN）から購入し、２つの群に分けた。６日間の順応後、動物の１つの群を、完全フロインドアジュバント（complete Freund’s adjuvant：ＣＦＡ）又は不完全フロインドアジュバント（incomplete Freunds adjuvant：ＩＦＡ）を用いて、３〜４週間の間隔で、マウス１尾あたり、５０μｇの精製されたヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃを、４〜６回、投与（doses）して免疫した。動物の２つ目の群は、３〜４週間の間隔で、ヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ又はｄＷＦＰヒトＬＡＧ−３ＥＣＤを交互に、４〜６回の投与で注入した。２つ目の群においても、ＣＦＡ又はＩＦＡをアジュバントとして用いた。細胞表面のヒトＬＡＧ−３に対する結合によって評価するような、ヒトＬＡＧ−３に対する血清力価の測定のために、動物から採血した。ＣＨＯ−Ｓ細胞を、Ｈ−２Ｋｋ膜貫通ドメインに融合させた完全長ヒトＬＡＧ−３細胞外ドメインで、トランスフェクトした（ＣＨＯ−Ｓ  ｈｕＬＡＧ−３  ＥＣＤ細胞）。血清は、１：１，０００〜１：１，０００，０００に希釈し、４℃で３０分間、ＣＨＯ−Ｓ  ｈｕＬＡＧ−３  ＥＣＤ細胞と共にインキュベートした。細胞を遠心分離し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄し、ＰＥをコンジュゲート（Southern Biotech, Birmingham, Alabama）したか、又はＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲＴＭ６４７（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と共に、４℃で３０分間、インキュベートした。細胞は、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳＡＲＲＡＹＴＭバイオアナライザー（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）で分析した。力価の測定値に基づいて、各群由来の１尾の動物について、脾臓を採取する３日前、追加免疫を行った。脾臓組織から単一細胞の懸濁液を調製し、標準的な技術を用いて、細胞融合によるハイブリドーマの作製に用いた。２つの異なるミエローマ細胞株Ｆ０（de St. Groth and Scheidegger, J. Immunol. Methods, 35: 1-21 (1980)に記載）及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Kearneyら、J. Immunol., 123: 1548-1550 (1979)に記載）を融合に用いた。
【００９２】
ハイブリドーマの上清を、ＣＨＯ−Ｓ  ｈｕＬＡＧ−３  ＥＣＤ細胞に対する結合でスクリーニングし、上記のような、トランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｓに対する結合と比較した。ＣＨＯ−Ｓ  ｈｕＬＡＧ−３  ＥＣＤ細胞に対する結合に基づいて、ハイブリドーマを４８穴プレートに移し、増幅した。
【００９３】
次いで、ＭＨＣＩＩ（ＬＡＧ−３受容体）を内生的に高いレベルで発現するＢ細胞株である、Ｄａｕｄｉ細胞に対する、ＤｙＬ６５０で標識したヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ（ヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ  ＤｙＬ６５０）の結合をブロックする能力で、上清を試験した。簡易には、ヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ  ＤｙＬ６５０を、Ｄａｕｄｉ細胞に添加する前に、対照ＩｇＧ抗体又は候補の抗ヒトＬＡＧ−３モノクローナル抗体と共にプレインキュベートした。ブロッキングは、ＢＤ  ＦＡＣＳＡＲＲＡＹＴＭバイオアナライザーを用いて、Ｄａｕｄｉ細胞に対する蛍光の減少によって測定した。次いで、これらのハイブリドーマは、エキゾースト（exhaust）上清の作製の為に、サブクローニングし（subcloned）、プレートへと増幅した。続いて、抗体を精製し、ＣＨＯ-Ｓ ｈｕＬＡＧ-３ ＥＣＤ細胞に対する結合と、Ｄａｕｄｉアッセイにおけるブロッキング能力の両方を再試験して、確かめた。
【００９４】
本実施例の結果は、ハイブリドーマ細胞技術を用いた、抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の産生を確認するものである。
【００９５】
実施例２
本実施例は、ＣＤＲ移植及びキメラ抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の設計及び作製について記載する。
【００９６】
実施例１に記載のハイブリドーマに由来する抗体は、アイソタイプ決定し（isotyped）、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）をクローニングするために、ＲＴ−ＰＣＲに供し、シーケンスを行った。具体的には、ＲＮＥＡＳＹＴＭキット（キアゲン、Venlo, Netherlands）を用いてハイブリドーマ・クローンの細胞ペレット（ペレット当たり、１ｘ１０６細胞）からＲＮＡを単離し、オリゴｄＴ−ｐｒｉｍｅｄ  ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ合成システム（ライフテクノロジーズ、Carlsbad, CA）を用いてｃＤＮＡを調製した。ＶＬのＰＣＲ増幅は、ディジェネレートした（degenerate）マウスＶＬフォワード・プライマーのプール（pool）（Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer-Verlag, Berlin (2001)を参照）及びマウスκ定常領域リバース・プライマーを利用した。ＶＨのＰＣＲ増幅は、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ合成システム（ライフテクノロジーズ、Carlsbad, CA）の推奨するプロトコールとともに、ディジェネレートしたマウスＶＨフォワード・プライマーのプール（Kontermann and Dubel、上記と同じ）及びマウスγ１又はγ２ａ定常領域リバース・プライマー(各クローンに由来する精製された抗体のアイソタイピングに基づく)を利用した。ＰＣＲ産物は、精製し、ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ（ライフテクノロジーズ、Carlsbad, CA）にクローニングした。
【００９７】
各細胞ペレットに由来する個々のコロニーを選択し、標準的なサンガー・シーケンス法（Genewiz, Inc., South Plainfield, NJ）で配列を解析した。可変領域の配列を調べ、最も近縁なヒト生殖細胞系列の重鎖又は軽鎖のＶ領域配列と整列させた。ＣＤＲ移植のために３つの抗体を選択した（（１）５．Ｂ１１、（２）５．Ｄ７及び（３）１．Ｅ１０と表示する）。
【００９８】
ＣＤＲ移植抗体の配列は、上記の各々のマウス抗体に由来するＣＤＲ残基を、最も近縁なヒト生殖細胞系列ホモログにクローニングすることによって設計した。ＣＤＲ移植抗体の可変領域を合成し、分析するためにヒトＩｇＧ１／κ定常領域と共に発現させた。加えて、マウスとヒトのキメラ抗体を、ヒトＩｇＧ１／κ定常領域に結びつけられた上記のマウス抗体の可変領域を用いて構築した。キメラ及びＣＤＲ移植抗体は、ＣＨＯ−Ｓ  ｈｕＬＡＧ−３  ＥＣＤ細胞への結合、及び上記のヒトＬＡＧ−３  ＥＣＤ／Ｄａｕｄｉブロッキング・アッセイでの活性についての特性を調べた。
【００９９】
抗ＬＡＧ−３抗体存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を、ＩＬ−２分泌を測定することで評価する、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞：樹状細胞混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、キメラ及びＣＤＲ移植抗体の機能的な拮抗活性についても試験した。ＬＡＧ−３はＴ細胞機能のネガティブ調節因子であるので、ＬＡＧ−３の拮抗作用は、ＩＬ−２産生の増加によって測定されるような、Ｔ細胞活性化の増強をもたらすことが期待された。ＭＬＲアッセイにおいて、ＩＬ−２活性の増加によって測定されるような、５．Ｂ１１、５．Ｄ７及び１．Ｅ１０のＣＤＲ移植抗体の拮抗活性が実証された。
【０１００】
本実施例の結果は、ＬＡＧ−３に特異的に結合し、ＬＡＧ−３を阻害するキメラ及びＣＤＲ移植モノクローナル抗体の作製方法について実証するものである。
【０１０１】
実施例３
本実施例は、抗ヒトＬＡＧ−３ヒト化モノクローナル抗体の親和性成熟について実証する。
【０１０２】
実施例２に記載したオリジナルのネズミ（murine）モノクローナル抗体の２つ（５．Ｄ７及び１．Ｅ１０）に由来するＣＤＲ移植抗体を、in silico体細胞超変異（in silico somatic hypermutation (iSHM)）により親和性成熟に供した。本方法は、ＮＣＢＩからダウンロードした、in vivoで成熟した抗体配列を比較し、それらをヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ、ＩＧＫＶ及びＩＧＬＶ配列及びそれらの対立遺伝子形態と比較する、コンピューター分析によって予測された変異を取り入れる（Bowersら、J. Biol. Chem., 288(11):7688-7696 (2013)に記載の通り）。既報の通り、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、結果として得られた抗体のＬＡＧ−３結合特性及びＣＨＯ−Ｓ  ｈｕＬＡＧ−３  ＥＣＤ細胞に対する結合能力を評価した。ＫＩＮＥＸＡＴＭ３０００アッセイ（Sapidyne Instruments, Boise, Idaho）を用いて、溶液ベースの親和性分析も行い、結果をＫＩＮＥＸＡＴＭＰｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．２．６を用いて分析した。０．８と１．２Ｖの間で抗体単独での最大シグナルに達するよう実験パラメーターを選択し、一方で最大シグナルの１０％より小さくなるよう、バッファーのみでの非特異的結合シグナルを制限した。５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３中のヒト又はカニクイザルＷＦＰ−ＬＡＧ−３（１ｍＬ中、５０μｇ／ｍＬ）溶液において希釈することによって、アズラクトンビーズ（５０ｍｇ）を抗原でコーティングした。該溶液を室温で２時間、回転させて、ビーズをピコフュージ（picofuge）においてペレット化し、ブロッキング溶液（１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。ビーズをブロッキング溶液（１ｍＬ）に再懸濁し、室温で１時間回転させて、２５倍容量のＰＢＳ／０．０２％ＮａＮ３で希釈した。親和性を測定するための、二次抗体はＡＬＥＸＦＬＵＯＲＴＭ６４７ｄｙｅ−抗ヒトＩｇＧ（５００ｎｇ／ｍＬ）であった。抗体サンプルの濃度は、一定(５０ｐＭ又は７５ｐＭ)を維持した一方で、ヒト又はカニクイザルＷＦＰ−ＬＡＧ−３抗原を１μＭ〜１７ｐＭまでの、３倍希釈シリーズを用いて滴定した。全てのサンプルは、ＰＢＳ（０．２％ＮａＮ３、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）（PBS, 0.2% NaN3, 1 mg/mL BSA）で希釈し、室温で３０時間平衡化した。加えて、最大シグナル及び非特異的結合シグナルを決定するために、抗体のみを含むサンプル及びバッファーのみを含むサンプルを、それぞれ試験した。
【０１０３】
McConnellら、Protein Eng. Des. Sel., 26: 151 (2013)に記載されている、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイを用いて、選択した抗体の熱安定性を評価した。このアッセイでは、タンパク質アンフォールド（unfolds）として露出する、タンパク質表面に存在する疎水性のパッチ（hydrophobic patches）に、疎水性の蛍光色素が結合する能力によって、安定性を評価する。熱安定性を測定するため、タンパク質アンフォールドが５０％となる温度（Ｔｍ）を決定した。このアッセイでは、５．Ｄ７モノクローナル抗体変異体が、薬剤開発に適した許容される融点（Ｔｍ）（即ち、７０℃より高いこと）を有していることを実証した。
【０１０４】
試験した抗体のin vivoにおける薬物動態に関する、潜在的な問題点のリスク排除は、標的の陰性細胞に対する非特異的結合を評価することによって行われた（例えば、Hotzelら、mAbs, 4: 753-760 (2012)を参照）。フローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて、ＨＥＫ２９３ｆ細胞への結合に関して抗体を試験した。その結果、非特異的結合は５．Ｄ７について低く、更に２段階の精製によって取り除かれ得ることが示された。
【０１０５】
本実施例の結果は、抗ＬＡＧ−３ヒト化モノクローナル抗体の親和性成熟の方法を確認するものである。
【０１０６】
実施例４
本実施例は、進化可能なライブラリーから、抗ヒトＬＡＧ−３抗体を同定する方法について実証する。
【０１０７】
ヒト・ドナーに由来する組換え（Ｄ）Ｊ領域に接合した生殖細胞系列のＶ遺伝子断片配列に基づき、Bowersら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108(51): 20455-20460 (2011)に記載されているように、ＩｇＧの進化可能なライブラリーを構築した。ＩｇＧ重鎖 （ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を、各ベクターが異なる抗生物質選択マーカーをコードする、別々のエピソーマル・ベクターにクローニングした（Horlickら、Gene, 243(1-2): 187-194 (2000)）。抗体が組織培養培地に分泌されると共に、細胞表面にも提示されるように、ＨＣベクターを整えた（Horlickら、J. Biol. Chem., 288(27): 19861-19869 (2013)）。ＨＣ及びＬＣの多様なセットを、ＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトし、約１０９細胞まで増幅した。次に、ストレプトアビジン（ＳＡ）結合磁気ビーズのみ（カタログ番号：11047、ライフテクノロジーズ, Carlsbad, CA）及びＳＡ結合磁気ビーズでコーティングした無関係なビオチン化抗原に対して、該細胞ライブラリーを２回ずつのネガティブ選択に供した。次いで、ヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃで直接コートした磁気ビーズ又はビオチン化ＬＡＧ−３  ＥＣＤ  ｍＩｇＧ１  ＦｃでコートしたＳＡ結合磁気ビーズのいずれかを用いて、１回のポジティブ選択を行った。ポジティブ選択細胞を希釈し、１ウェル当たりおよそ１〜１０細胞の密度で９６ウェル・フォーマット（format）に播種した。生じたコロニーは娘プレートへと増幅した、ＦＡＣＳＡＲＲＡＹＴＭ分析によって、各群の一部についてＬＡＧ−３  ＥＣＤ  ｍＩｇＧ１  Ｆｃ  ＤｙＬ６５０に対する結合について試験した。上清に分泌された抗体もまた、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭでＬＡＧ−３  ＥＣＤ  ｍＩｇＧ１  Ｆｃに対する結合能力を試験した。
【０１０８】
ＦＡＣＳＡＲＲＡＹＴＭ分析によって、ヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ  ＤｙＬ６５０に対して特異的染色を示した細胞及び／又はＢＩＡＣＯＲＥＴＭで特異的に結合した細胞は、ヒトＬＡＧ−３に結合できる特異的なＨＣ／ＬＣの組合せを回復させるため、選抜のために増幅し及びシーケンスに供した。細胞集団で見られた抗体のＨＣ及びＬＣをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＰＣＲによってレスキューした（rescued）。一般的に、シーケンス分析によって、ＨＣ／ＬＣ配列は多重に見出される。幾つかのケースにおいては、所望のＨＣ／ＬＣの組合せは、ヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ  ＤｙＬ６５０を用いた最初のＦＡＣＳ選抜によって、目的のモノクローナル抗体を発現する細胞を濃縮することによって同定された。高い抗体発現を呈し及びヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ  ＤｙＬ６５０への結合に対して陽性である細胞集団を単離し、引き続いてシーケンス分析に供した。全体として、更に性状を調べるために適した、潜在的に特異的な抗ＬＡＧ−３抗体の候補（hits）として、１２の異なるＨＣ／ＬＣペアを同定した。これらのストラテジーズ（strategies）は、Ａ１／Ａ１４、Ａ２、Ａ３／Ａ１７、Ａ４／Ａ１９、Ａ５／Ａ１６、Ａ６、Ａ８／Ａ２０、Ａ９、Ａ１０／Ａ１５、Ａ１１、Ａ１２及びＡ１３と表記した。
【０１０９】
抗体はまた、カニクイザルＬＡＧ−３タンパク質（ｃｙｎｏＬＡＧ−３）に対する結合能力について調べた。ライブラリーから同定された、これらの生殖細胞系列の抗体は、細胞表面に発現した抗原に対して結合するには弱すぎたので、ヒト抗原に類似する可溶性抗原をＤｙＬ６５０（ｃｙｎｏＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ  ＤｙＬ６５０）で標識し、次いで、細胞表面に抗体のストラテジーズ（strategies）を提示するＨＥＫ２９３細胞と共にインキュベートした。進化可能なライブラリーから同定した８つの抗体のストラテジーズ（strategies）を試験し、ｃｙｎｏＬＡＧ−３  ＥＣＤ  ｍＩｇＧ１  Ｆｃに結合する能力を実証した。
【０１１０】
本実施例の結果は、ヒト及び非ヒトＬＡＧ−３に対するモノクローナル抗体を、進化可能なライブラリーを用いて、同定し得ることを確認するものである。
【０１１１】
実施例５
本実施例は、進化可能なライブラリーを用いて同定した、抗ヒトＬＡＧ−３抗体の親和性成熟について実証する。
【０１１２】
実施例４に記載した進化可能なライブラリーから同定した、各抗体のＨＣ及びＬＣを共発現する安定な細胞株を、in vitroでのＳＨＭを開始するために、活性化誘導シチジン・デアミナーゼ（ＡＩＤ）でトランスフェクションした。ＡＩＤはまた、ライブラリーのスクリーンから増幅したオリジナルの混合細胞集団に、直接トランスフェクトした。全てのケースにおいて、細胞集団は、ＩｇＧ発現と抗原に対する結合の両方について染色し、混合集団としてフローサイトメトリーで回収し、次いで、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって配列を分析するために、増幅した。各ストラテジーズ（strategies）について、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域、並びにそれらの変異体における、ＳＨＭに由来する変異を集積するために、本過程を繰り返し行った。親和性における改良は、（１）ＳＰＲ、（２）ＣＨＯ−Ｓ  ｈｕＬＡＧ−３  ＥＣＤ細胞に対する結合能力、及び（３）ＭＬＲアッセイにおける活性によって測定した。各抗体の親和性が改良されるにつれて、親和性のゴールが、新規変異の同定及び再組合せを通して達成されるまで、選択の厳密性を引き上げた。
【０１１３】
選択された抗体の熱安定性は、上記のようにＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイを用いて、評価した。このアッセイでは、Ａ１７のストラテジー（strategy）に由来する厳選したモノクローナル抗体が、薬剤開発に適した許容されるＴｍを有することを実証した。抗体はまた、フローサイトメトリーベースのアッセイにより、ＨＥＫ２９３ｆ細胞への結合について試験した。本結果は、厳選したＡ１７候補への非特異的結合が小さいことを示した。
【０１１４】
選択された抗体は、上記のようにＤａｕｄｉ細胞に対するＤｙＬ６５０で標識した、ヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ（ヒトＬＡＧ−３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ  ＤｙＬ６５０)の結合をブロックする能力について試験した。中和抗体の用量範囲は、可溶性ＬＡＧ−３でプレインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。ある親和性成熟後の抗ＬＡＧ−３抗体は、可溶性ＬＡＧ−３とＭＨＣＩＩとの相互作用を完全に阻害した。
【０１１５】
本実施例の結果は、進化可能なライブラリーを用いて同定した、抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の親和性成熟の方法を確認するものである。
【０１１６】
実施例６
本実施例は、本発明の抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体が、ＬＡＧ−３シグナル伝達を阻害し得ること、並びに単独で及び抗ＰＤ−１抗体又は抗ＴＩＭ−３抗体との組合せで、in vitroでのＴ細胞活性化を促進し得ることを実証する。
【０１１７】
抗ＬＡＧ−３抗体及び抗ＰＤ−１抗体の組合せ研究についてのパラメーターを設定するために、抗ＰＤ−１抗体APE02058を、上記のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞ＭＬＲアッセイにおける用量反応で滴定した。複数のＭＬＲアッセイにおいて抗ＰＤ−１抗体を滴定した結果に基づいて、１３３ｐＭ（およそのＥＣ５０）及び１３ｐＭ（およそのＥＣ１０）を、抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体での、アンタゴニスト研究についての組合せで試験するために選択した。１３３ｐＭ又は１３．３ｐＭの抗ＰＤ−１抗体との組合せで、抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体のＥＣ５０は、６９０ｐＭ（抗ＬＡＧ−３抗体単独）から、４０ｐＭ（１３３ｐＭの抗ＰＤ−１抗体との組合せ）又は２００ｐＭ（１３．３ｐＭの抗ＰＤ−１抗体との組合せ）にまで低下し、それぞれ力価においては１７倍及び３倍の増加であった。
【０１１８】
抗ＬＡＧ−３抗体及び抗ＴＩＭ−３抗体の組合せ研究のパラメーターを設定するために、抗ＬＡＧ−３抗体APE05505を、上記のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞ＭＬＲアッセイにおける用量反応で滴定した。複数のＭＬＲアッセイにおいて、抗ＬＡＧ−３抗体を滴定した結果に基づいて、２ｎＭ（およそのＥＣ５０）及び０．２ｎＭ（およそのＥＣ１０）を、抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体での、アンタゴニスト研究についての組合せで試験するために選択した。２ｎＭ又は０．２ｎＭの抗ＬＡＧ−３抗体との組合せで、抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体のＥＣ５０は、１１ｎＭ（抗ＬＡＧ−３抗体単独）から、６ｎＭ（０．２ｎＭの抗ＴＩＭ−３抗体との組合せ）又は３ｎＭ（２ｎＭの抗ＴＩＭ−３抗体との組合せ）にまで低下し、それぞれ力価においては１．８倍及び３．６倍の増加であった。
【０１１９】
本実施例の結果は、本発明のＬＡＧ−３結合剤は、単独でも、免疫系の他のネガティブ調節因子のアンタゴニストとの組合せでも、ＬＡＧ−３の生物学的活性を阻害し得ることを実証するものである。
【０１２０】
実施例７
本実施例は、本発明の抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体が、抗ＰＤ−１抗体との組合せが、in vivoにおいて、ＬＡＧ−３シグナル伝達を阻害し得ること、及びＴ細胞活性化を促進し得ることを実証する。
【０１２１】
ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいて、抗マウスＬＡＧ−３サロゲート（surrogate）モノクローナル抗体（mAb C9B7W, BioXcell, West Lebanon, New Hampshire）の活性を、単独で、又は抗マウスＰＤ−１サロゲート・モノクローナル抗体（mAb RMP1-14, BioXcell, West Lebanon, New Hampshire）との組合せで試験した。１０尾の動物群に、１ｘ１０６のＭＣ３８細胞を皮下注射した。接種後１０日で、腫瘍サイズについて無作為に、動物を抽出した。マウスは５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体及び／又は１０ｍｇ／ｋｇの抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体で、１、４、８及び１１日目に治療し、各抗体又は各抗体の組合せで、合計４用量分投与した。治療に対する反応を評価するために、１週間に２回、腫瘍を測定した。抗ＰＤ−１＋抗ＬＡＧ−３の組合せは、それぞれの単剤単独よりも、腫瘍の増殖をより効果的に弱めた。ＰＤ−１単独（PD-1-only）群では７尾の動物、及び抗ＬＡＧ−３単独群における０尾の動物と比べ、これらの組合せでの治療群では１０尾の動物の全てにおいて完全な反応が観察された。次いで、組合せ群由来の完全な反応を示した９尾の動物は、再度、４ｘ１０６のＭＣ３８細胞を皮下接種した。再接種群においては、いずれの動物においても、測定可能な程度に腫瘍の発達がみられなかった一方で、同じ量の細胞を注射した全ての対照ナイーブ（naive）マウスでは触診可能な程度に腫瘍が増殖した。
【０１２２】
上記のサロゲート・モノクローナル抗体の活性もまた、Ｃｏｌｏｎ２６同系の腫瘍モデルにおいて、単独で、又は組合せで試験した。１２尾の動物群に、５ｘ１０５のＣｏｌｏｎ２６細胞を皮下注射した。マウスは、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体及び／又は１０ｍｇ／ｋｇの抗ＬＡＧ−３抗体で、４、７、１１及び１４日目に治療し、各抗体又は組合せ抗体について合計４回の投与を行った。治療への反応を評価するために、腫瘍を１週間に２回測定した。抗ＰＤ−１及び抗ＬＡＧ−３の組合せは、各単剤単独よりも、腫瘍の増殖について有効であった。組合せ投与群においては、１２尾の動物のうち１０尾において、完全な反応が観察されたのと比べ、ＰＤ−１単独群においては３尾、抗ＬＡＧ−３単独群においては１尾において、完全な反応が観察された。組合せ群に由来する、完全な反応を示した９尾の動物については、次いで５ｘ１０５のＣｏｌｏｎ２６細胞を再度接種した。再接種群においては、いずれの動物においても、計測可能な程度の腫瘍の発達がみられなかった一方で、同量の細胞を注射した対照のナイーブマウスにおいては、全て、触診可能な程度に腫瘍が増殖した。
【０１２３】
本実施例の結果は、免疫系の他のネガティブ調節因子のアンタゴニストとの組合せで、本発明のＬＡＧ−３結合剤は、in vivoにおいてＬＡＧ−３の生物学的活性を阻害し得ることを実証するものである。
【０１２４】
実施例８
本実施例は、同系マウス腫瘍モデルにおいて、抗ＬＡＧ−３抗体単独で、又は、抗ＰＤ−１抗体との組合せで、抗腫瘍活性における抗体のアイソタイプの影響を実証する。
【０１２５】
ラット・ハイブリドーマ細胞株由来の抗マウスＬＡＧ−３中和抗体（mAb C9B7W, BioXcell, West Lebanon, NH）の可変領域の配列を解析し、クローニングした後、ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）及びＩｇＧ２ａアイソタイプのマウスＬＡＧ−３を認識するサロゲート抗体を作製し、マウスＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａ発現ベクターにクローニングした。次いで、これらの抗体は、単独で、及びＢｉｏＸｃｅｌから購入したラット抗体（mAb RMP1-14, West Lebanon, NH）から、同様にして作製したマウスＰＤ−１を認識するマウスＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）サロゲート抗体との組合せで、有効性を試験した。具体的には、Ｃｏｌｏｎ２６結腸腺がん細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに移植し(５ｘ１０５細胞、皮下)、３日間増殖させた。マウスは、１群１２尾の動物の７群に無作為で分け、表１に記載のように４、７、１１及び１４日目に各抗体又は抗体の組合せを投与した。対照として、一致するアイソタイプ抗体を投与したマウスを用意した。研究終了まで、腫瘍体積を１週間に２回測定した。
【０１２６】
【表１】
2018505674.tif 000002
【０１２７】
本実験の結果は、図１Ａ及び１Ｂに示す。図１Ａ及び１Ｂは、腫瘍増殖に明らかな効果を示さないエフェクター機能を有する抗マウスＬＡＧ−３抗体(即ち、ＩｇＧ２ａ)と比べ、最小のエフェクター機能を有する単剤の抗マウスＬＡＧ−３抗体(即ち、ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）)は、抗腫瘍の効能を有することを示す。
【０１２８】
更に、図１Ａは、最小のエフェクター機能を有する抗マウスＬＡＧ−３抗体（即ち、ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ））は、抗マウスＰＤ−１  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）抗体の投薬計画との組合せで、抗マウスＰＤ−１  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）抗体単独と比べて、増強された抗腫瘍活性を示したことを示す。しかしながら、エフェクター機能が完全な抗マウスＬＡＧ−３抗体（ＩｇＧ２ａ）と、抗マウスＰＤ−１抗体との組合せは、抗マウスＰＤ−１  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）単独と比べ、効能が劣っていた。このことは、抗体のエフェクター機能は、抗マウスＰＤ−１を介する効能と干渉した可能性があることを示唆する。
【０１２９】
図１Ｂは、治療群３（抗マウスＰＤ−１  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）抗体で治療した動物）、群７（抗マウスＰＤ−１  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）抗体と抗マウスＬＡＧ−３  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）抗体の組合せ）、及び群６（抗マウスＰＤ−１  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）抗体と抗マウスＬＡＧ−３  ＩｇＧ２抗体の組合せで）に由来する個々の動物についての、経時的な腫瘍体積のグラフを提供する。群７（抗マウスＰＤ−１  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）抗体と抗マウスＬＡＧ−３  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ））では、１２尾の動物中８尾で、研究の終了までに、観察し得る腫瘍の増殖がなかった。それに対して、群６（抗マウスＰＤ−１  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）抗体と抗マウスＬＡＧ−３  ＩｇＧ２抗体）では、１２尾の動物中わずか３尾で、研究の終了までに、観察し得る腫瘍の増殖がなかった。群３（抗マウスＰＤ−１  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）単独）では、１２尾の動物中６尾で、研究の終了までに、腫瘍がなかった。このことは、抗マウスＰＤ−１  ＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）抗体との組合せで投与したときの、抗マウスＬＡＧ−３  ＩｇＧ２抗体のエフェクター機能による、干渉の可能性を示唆している。
【０１３０】
本実施例の結果は、エフェクター機能を有さない、抗マウスＬＡＧ−３抗体及び抗マウスＰＤ−１抗体は、単独で、及び組合せで、マウス同系腫瘍モデルにおいて、腫瘍の増殖を阻害し得ることを実証するものである。効能は、エフェクター機能を有する抗マウスＬＡＧ−３抗体を用いるとみられず、更に、抗ＰＤ−１による効能と干渉する場合がある。
【０１３１】
実施例９
本実施例は、本発明の抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の阻害活性が、回収時期に基づいて、混合リンパ球反応における、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の阻害活性と区別し得ること、ＰＤ−１及びＬＡＧ−３発現と相関することを実証する。
【０１３２】
抗ＬＡＧ−３抗体存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を、ＩＬ−２分泌を測定することによって評価する、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、機能的なＬＡＧ−３アンタゴニスト抗体を試験した。抗ＬＡＧ−３抗体は、アンタゴニスト的な抗ＰＤ−１抗体と一緒に試験し、そこでは、抗体を異なる時点において添加及び／又は回収した。具体的には、ヒト・ドナーに由来する単離された末梢血単球を樹状細胞（ＤＣｓ）に分化させ、次いで、２人目のドナーから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞と混合した。共培養の開始時点、又は共培養の開始から２４時間の時点のいずれかにおいて、阻害抗体を添加した。抗体添加後、２４時間及び４８時間の時点で、ＩＬ−２レベルを測定した。
【０１３３】
ＬＡＧ−３及びＰＤ−１の拮抗作用は、ＩＬ−２産生の増加によって測定されるような、Ｔ細胞活性化の増強をもたらすことが期待された。アッセイの開始時点で添加した時、抗ＰＤ−１抗体は、抗体添加後２４時間及び４８時間の両方の時点で、ＩＬ−２分泌を増加させた。一方で、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＭＬＲアッセイにおいて、４８時間の時点で測定したときは、ＩＬ−２分泌を増加させたが、２４時間の時点では増加させなかった。共培養の開始から２４時間の時点で、阻害的な抗ＬＡＧ−３抗体又は抗ＰＤ−１抗体を添加し、７２時間の時点で回収したとき、両方の抗体は活性があり、ＥＣ５０は同等のようであった（図２Ａ）。２４〜７２時間の時点でＰＤ−１発現の増加が観察されるように、これは発現と相関する。一方で、ＬＡＧ−３は４８時間及び７２時間の時点でのアッセイにおいて、遅れて発現するようである（図２Ｂ）。
【０１３４】
本実施例の結果は、ＬＡＧ−３阻害の効果が、標的の発現と相関することを実証し、ＬＡＧ−３の発現がＰＤ−１よりも一時的に遅れて生じることを実証する。
【０１３５】
本明細書において引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別に、具体的に、参照によって取り込まれることが示されるように、かつ全体が明細書に記載されているように、それと同程度の事項が、文献を参照することによって本明細書に取り込まれる。
【０１３６】
本発明を記載する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「a」及び「an」及び「the」及び「少なくとも１つ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数及び複数形の両方を含むものとして解釈されるべきである。１以上の項目の列記が続く、用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）は、明細書に別段の記載がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、列記された項目（Ａ又はＢ）から選択された１つの項目、又は列記された項目（Ａ及びＢ）の２以上の任意の組合せを意味するものとして解釈されるべきである。「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含有する(containing)」という用語は、別段の記載がない限り、制限のない用語（open-ended terms）（すなわち、「含むが、これに限定されない（including, but not limited to）」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、単に範囲内の各別個の値を個別に指す簡略方法として役立つことを意図しており、本明細書において個々の値はそれぞれ個別に列挙されているかのように、個々の値は明細書に取り込まれる。本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施し得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば「など（such as）」）の使用は、単に本発明をよりよく示すことを意図しており、特に断らない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であるとして、特許請求されていない任意の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０１３７】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するために、本発明者らに知られている最良の形態を含め、本明細書に記載する。これらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の記載を読めば、当業者にとって明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用することを予期しており、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付した特許請求の範囲に列挙された主題の全ての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、それらの全ての可能な変形例における上記要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【図１Ａ】
2018505674.tif 000003
【図１Ｂ】
2018505674.tif 000004
【図２Ａ】
2018505674.tif 000005
【図２Ｂ】
2018505674.tif 000006
【配列表】
2018505674000001.app
【国際調査報告】
2018505674.tif 000007
2018505674.tif 000008
2018505674.tif 000009