(57)【要約】  本発明は、セグメント細菌株と真核宿主細胞とを共培養することを含んでなり、該培養が鉄を含む細菌培地成分を含有する富栄養組織培養液体培地において５％未満のO2レベルで行われる、セグメント細菌株のインビトロ培養法に関する。本発明はまた、セグメント細菌株をインビトロで培養する工程を含んでなる、セグメント細菌株を遺伝子改変する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セグメント細菌株と真核宿主細胞とを共培養することを含んでなり、該培養が鉄を含む細菌培地成分を含有する富栄養組織培養液体培地中５％未満のO2レベルで行われる、セグメント細菌株のインビトロ培養法。
【請求項２】
ａ)固相培養培地で真核宿主細胞を増殖させる工程；
ｂ)工程ａ)の増殖真核宿主細胞を真核宿主細胞-SFB液体培養培地に浸漬する工程；
ｃ)工程ｂ)の細胞培養物をSFB株、好ましくはSFB細胞内子孫でチャレンジする工程；
ｄ)生存真核宿主細胞とSFB株とを液体培養培地中５％未満のO2レベルで共培養する工程；及び任意に
ｅ)培養SFB株を回収する工程
を含んでなる、セグメント細菌株のインビトロ培養法。
【請求項３】
真核宿主細胞が上皮細胞又はガン細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
真核宿主細胞が胃腸管の細胞又はガン腫細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
真核宿主細胞がヒトCaco-2、TC7若しくはHeLa細胞株又はマウスmICcl2若しくはCMT93細胞株からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ)において、真核宿主細胞が０％〜５％、好ましくは0.5〜３％、より好ましくは１〜2.5％のO2レベルで増殖する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ)において、真核宿主細胞-SFB液体培養培地が鉄を含む細菌培地成分を含有する富栄養組織培養培地である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
液体培養培地がウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、脳・心臓滲出物、酵母/ペプトン/カゼインアミノ酸混合物及び鉄を補充したDMEM/F12アドバンスト培地を含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ)において、SFB株がフィラメント又は細胞内子孫の形態である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ)において、SFB株が真核宿主細胞に近接するか又は直接接触する、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
真核宿主細胞とSFBとの共培養が０％〜５％、好ましくは0.5〜３％、より好ましくは１〜2.5％のO2レベルで行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
鉄が0.015〜0.05mMの濃度である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
培養SFB株がフィラメント、細胞内子孫又は芽胞の形態で回収される、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ｉ)大腸菌(Escherichia coli)株を、SFB株に導入する興味対象のDNA配列を含み、大腸菌株及び遺伝子改変の標的のSFB株で複製可能である組換えシャトルベクターDNAで遺伝的に改変する工程；
ii)工程ｉ)で得られた遺伝子改変大腸菌株を、遺伝子改変の標的のSFB株と、請求項２〜１３のいずれか１項に記載のインビトロ培養法に従って共培養する工程であって、該培養法の工程ｃ)において、工程ｂ)の細胞培養物を遺伝子改変の標的のSFB株、好ましくはSFB細胞内子孫と、前記遺伝子改変大腸菌株との両方でチャレンジし；そして、該培養法の工程ｄ)において、生存真核宿主細胞とSFB株と遺伝子改変大腸菌株とを液体培養培地中５％未満のO2レベルで共培養する、工程；
iii)工程ii)の遺伝子改変SFB株を回収する工程
を含んでなる、セグメント細菌株を接合により遺伝子改変する方法。
【請求項１５】
ｉ)セグメント細菌株を、請求項２〜１３のいずれか１項に記載のインビトロ培養法に従って培養して回収する工程；
ii)工程ｉ)で回収したSFB株と形質転換されるべき精製プラスミドとを、好ましくはグリセロール/H2O中で、混合する工程；
iii)工程ii)で得られた混合物に電気パルスを印加する工程；
iv)遺伝子形質転換SFB株を回収する工程
を含んでなる、セグメント細菌株をエレクトロポレーションにより遺伝子改変する方法。
【請求項１６】
ｉ)セグメント細菌株を、請求項２〜１３のいずれか１項に記載のインビトロ培養法に従って培養して回収する工程；
ii)工程ｉ)で回収したSFB株と形質転換されるべき精製プラスミドとを、好ましくはグリセロール/塩化カルシウム中で、混合する工程；
iii)工程ii)で得られた混合物をインキュベートする工程；
iv)任意に、混合物に熱ショックを印加する工程；
ｖ)遺伝子形質転換SFB株を回収する工程
を含んでなる、セグメント細菌株を化学的形質転換により遺伝子改変する方法。
【請求項１７】
SFBとは異なる微生物又は細胞に由来する興味対象の抗原を発現する単離された遺伝子改変SFB株。
【請求項１８】
医薬として使用するため、好ましくは抗原が由来する微生物により引き起こされる疾患又はガンの予防又は治療に使用するための、SFBとは異なる微生物又は細胞に由来する興味対象の抗原を発現する生存遺伝子改変SFB株。
【請求項１９】
SFBとは異なる微生物又は細胞に由来する興味対象の抗原を発現する生存遺伝子改変SFB株を含んでなる治療用免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セグメント細菌(SFB)のインビトロ増殖法に関する。本発明はまた、SFB株の遺伝子改変方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セグメント細菌(SFB)又はCandidatus arthromitus又はCandidatus savagella又はArthromitus immunis又はArthromitus murisは、マウス、ラット、ウサギ、鳥類(例えば、ニワトリ)、魚類、両生類及び恐らくはヒトを含む多くの脊椎動物種の腸(遠位回腸)に見出されるグラム陽性、嫌気性、クロストリジウム関連、芽胞形成性の片利共生生物である(Klaasenら，1992；Yinら，2012)。フィラメントのサイズは長さが0.5〜1000μmの範囲である。SFBは細胞内子孫を生じる(Schnupfら，2013；概説についてはEricssonら，2014)。一旦形成された細胞内子孫は、フィラメント化し始めて二細胞性、その後三細胞性になるまでは、単細胞性である。
【０００３】
SFBは、腸免疫系を教育し、健常な生理学的炎症状態を誘導するその独特な能力のため、多くの関心を集めている(Schnupfら，2013；Ivanovら，2009)。SFBコロニー形成は、腸粘膜リンパ系組織の成熟を導き、強力で広範なIgA応答を誘導し、Ｔ細胞画分を刺激し、腸の先天性防御メディエータをアップレギュレートし、小腸Th17応答の顕著な増大を誘導する(Schnupfら，2013；Ivanovら，2009；Gaboriau-Routhiauら，2009)。加えて、SFBコロニー形成は、全身性応答に対してアジュバント効果を働かせ、よってマウス脳炎及び関節炎モデルにおいて病的状態を増悪することがある一方、遺伝的素因を有するマウスをＩ型糖尿病の発症から保護する(Leeら，2011；Wuら，2010；Chappertら，2013；Kriegelら，2011；Yurkovetskiyら，2013)。
【０００４】
他の片利共生生物とは異なり、セグメント細菌は、回腸の吸収上皮細胞及びパイエル板を覆う細胞に密接に付着している(Jepsonら，1993；Chaseら，1976)。このコロニー形成は病的状態をもたらさない；むしろ、宿主を病原因子から保護する(Ivanovら，2009)。
幾つかのSFB株のゲノムが当該分野で知られている。ラット及びマウスのSFBゲノムの最近の配列決定により、SFBが高度栄養要求性であることが明らかになり、SFBは偏性共生生物と通性共生生物との間とされた(Pampら，2012)。これら知見により、SFBが栄養必要量の少なくとも幾らかを宿主との相互作用から得ることが示唆される(Prakashら，2011；Sczesnakら，2011；Kuwaharaら，2011；Pampら，2012)。
SFBは50年以上もインビトロ培養ができなかったので、この細菌の重要な免疫刺激特性の基礎をなすセグメント細菌-宿主相互作用については依然として知見がほとんどない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、SFBをインビトロで培養する効果的な方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、マウスSFBを、宿主外で、セグメント細菌-宿主細胞共培養系で増殖させた。本発明者らは、この系において、単独コロニー形成マウスから単離した単細胞SFBが、フィラメント化、セグメント化及び分化を経て、(マウス内でコロニー形成して特徴的免疫応答(signature immune response)を誘導することができる)生存可能な感染性粒子(単細胞性細胞内子孫)を放出することを示した。本発明者らはまた、この共培養系においてSFB芽胞の形成を観察した。インビトロでは、細胞内子孫は、マウス及びヒト宿主細胞に付着し、アクチンを補充することができる。更に、SFBは、宿主の先天防御遺伝子、炎症性サイトカイン及びケモカインのアップレギュレーションを強力に刺激することができる。SFBのこれら免疫刺激特性は病原因子に対する宿主の抵抗性を増大させ、興味対象の特定の病原因子に対する直接免疫に利用され得る。
【０００７】
したがって、本発明は、セグメント細菌株と真核宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞、より好ましくはヒト宿主細胞とを共培養することを含んでなり、該培養が(好ましくは、0.015〜0.05mMの濃度の)鉄を含む細菌培地成分を含有する富栄養組織培養液体培地中にて、５％未満、好ましくは４％未満のO2レベルで行われる、セグメント細菌(SFB)株のインビトロ培養法を提供する。
本明細書で用いる場合、セグメント細菌株とは、Candidatus arthromitus又はCandidatus savagella又はArthromitus immunis又はArthromitus murisの株、好ましくはArthromitus muris株をいう。
有利には、本方法は、次の工程：
ａ)固相培養培地で真核宿主細胞を増殖させる工程；
ｂ)工程ａ)の増殖真核宿主細胞を真核宿主細胞-SFB液体培養培地に浸漬する工程；
ｃ)工程ｂ)の細胞培養物をSFB株、好ましくはSFB細胞内子孫でチャレンジする工程；
ｄ)生存真核宿主細胞とSFB株とを液体培養培地中５％未満、好ましくは４％未満のO2レベルで共培養する工程；及び任意に
ｅ)培養SFB株を回収する工程
を含んでなる。
【０００８】
工程ａ)に関して：
真核宿主細胞は、任意の脊椎動物細胞、好ましくは任意の哺乳動物細胞、より好ましくは任意のヒト又はネズミ細胞(例えば、マウス細胞)であることができる。
１つの好適な実施形態において、真核宿主細胞はインビトロで接着性の細胞である。有利には、この接着性細胞は、インビトロで、分化することができ、よってコンフルーエント条件下で長期間、上首尾に培養できる。
別の１つの好適な実施形態において、真核宿主細胞は上皮細胞である。有利には、真核宿主細胞は胃腸管(例えば、大腸又は小腸)の細胞である。
別の１つの実施形態において、真核宿主細胞は、ガン細胞、好ましくはガン腫(carcinoma)細胞、より好ましくは腺ガン腫(adenocarcinoma)細胞である。
１つの最も好適な実施形態において、真核宿主細胞は、哺乳動物の胃腸上皮接着性細胞又は接着性ガン細胞(特に、ヒト又はマウスの大腸上皮若しくは小腸細胞又は腺ガン腫細胞)である。
１つの特定の実施形態において、真核宿主細胞は、ヒトのCaco-2、TC7(Caco-2の１つのサブクローン)若しくはHeLa細胞株又はマウスのmICcl2若しくはCMT93細胞株からなる群より選択され、好ましくはヒトCaco-2又はTC7細胞株である。
【０００９】
有利には、真核宿主細胞は、０％(嫌気条件)〜５％(０〜37.1トル)、好ましくは0.5％〜３％(3.7〜22.3トル)、より好ましくは１〜2.5％(7.4〜18.6トル)のO2レベルで増殖させる。
真核宿主細胞の増殖のための湿度及び温度条件は、当業者がルーチン検査により決定することができる。温度は好ましくは36℃〜38℃、より好ましくは37℃である。
真核宿主細胞培養培地の組成は、当業者がルーチン検査により決定することができる。例えば、培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)又はダルベッコ改変イーグル培地：栄養因子混合物F-12(DMEM/F12)アドバンスト培地、不活化(又は補体不含[decomplemented])ウシ胎仔血清(FCS)及びアミノ酸を含んでなる。
有利には、真核宿主細胞は、少なくとも20％、好適性が増す順に、少なくとも25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、より好ましくは100％の細胞コンフルーエンスが得られるまで増殖させる。
【００１０】
１つの好適な実施形態において、真核宿主細胞は細胞単層が得られるまで増殖させる。
別の１つの好適な実施形態において、工程ａ)で増殖した真核宿主細胞は、工程ｂ)の前に、プレート(好ましくは組織培養ウェル又はトランスウェル(transwell)、より好ましくは組織培養トランスウェル)に播種する。
有利には、真核宿主細胞の播種密度は１×104〜６×104細胞/cm2である。例示として、真核宿主細胞の播種密度は、６×104〜12×104細胞/培養ウェル(すなわち、3.8cm2)又は３×104〜６×104細胞/培養トランスウェル(すなわち、1.12cm2)である。
有利には、工程ｃ)でSFBを添加するとき、真核宿主細胞の培養密度は0.5×105〜３×105細胞/cm2である。例示として、真核宿主細胞の培養密度は、３×105〜６×105細胞/培養ウェル(3.8cm2)又は１×105〜３×105細胞/培養トランスウェル(1.12cm2)である。
【００１１】
工程ｂ)に関して：
真核宿主細胞-SFB液体培養培地は、真核宿主細胞及びSFB株の両方の培養に適切な培地である。
有利には、液体培養培地は、鉄を含む細菌培地成分を含有する富栄養組織培養培地(例えば、DMEM/F12アドバンスト培地)である。
液体培養培地は、脳・心臓滲出物及び酵母/ペプトン/カゼインアミノ酸混合物を含んでなることができる。これら細菌培地補充物は当該分野において周知である。
鉄は、二価鉄形態(Fe2+状態)及び/又は三価鉄形態(Fe3+状態)であることができる。例示として、鉄は、Fe2+/Fe3+、３×Fe2+、３×Fe2+又はヘミン、好ましくはFe2+/Fe3+、３×Fe2+又は３×Fe2+の形態であることができる。
有利には、鉄の濃度は、0.015〜0.05mM、好ましくは0.02〜0.04mMである。
【００１２】
１つの好適な実施形態において、液体培養培地は、ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸(例えば、GlutamaxTM)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、脳・心臓滲出物、酵母/ペプトン/カゼインアミノ酸混合物及び鉄を補充した真核宿主細胞培養用培地(例えば、DMEM/F12アドバンスト培地)を含んでなる。
液体培養培地は、DMEM又はDMEM/F12アドバンスト培地を含んでなるときには特に、補体不含ウシ胎仔血清(FCS)を補充することができる。有利には、液体培地は、１％〜５％、好ましくは１％〜３％、より好ましくは２％の補体不含FCSを補充する。
有利には、液体培養培地は更に、糖、レチノイン酸及び/又はヌクレオチドを含んでなる。
【００１３】
工程ｃ)に関して：
SFB株は野生型株又は遺伝子改変株であることができる。遺伝子改変SFB株は、野生型SFB株から、形質転換、形質導入又は接合により取得することができる。
SFB株は、フィラメント又は細胞内子孫の形態であることができる。
SFB株は、対象動物、特に、ヒト又はマウスのような哺乳動物(例えば、SFB単独定着[monoassociated]マウス)から単離することができる。哺乳動物からSFB株を単離する方法は、当該分野において公知である(Lecuyerら，2014)。
個々のSFBフィラメントは、以下の方法により単離することができる：対象動物から回腸、盲腸及び/又は大腸の内容物を採集し、倒立顕微鏡及びマイクロマニピュレータに装着したマイクロピペットを用いて個々のフィラメントを捕集する。
【００１４】
SFB細胞内子孫は、無酸素又は低酸素条件(すなわち、０％〜２％酸素)下、以下の方法で単離することができる：対象動物から回腸、盲腸及び/又は大腸の内容物を採集し、100μmメッシュで濾過し、密度勾配カラムを用いてその他の糞便物質から分離し、５μmフィルターを通過させて、単細胞性の細胞内子孫(平均0.7μm)の純粋培養物を取得する。SFBフィラメントもまた、この方法に従い、５μmフィルター上に採集することができる。
本明細書で用いる場合、用語「チャレンジ(する)」とは、細菌が宿主細胞と相互作用する(宿主細胞に付着/侵入する)か否かに関わらず、真核宿主細胞への細菌の添加をいう。
１つの好適な実施形態において、SFB株は、真核宿主細胞と近接し、好ましくは真核宿主細胞と直接接触する。
本明細書で用いる場合、用語「近接(する)」とは、真核宿主細胞とSFB株との距離が２cm以下である真核宿主細胞とSFB株との共培養(物)をいう。
有利には、SFBの播種密度は0.2×104〜10×104細胞/cm2である。例示として、SFBの播種密度は、１×104〜10×104細菌/培養ウェル(すなわち、3.8cm2)又は１×104〜10×104細菌/培養トランスウェル(すなわち、1.12cm2)である
有利には、真核宿主細胞とSFBとの比は、0.1〜100、好ましくは0.3〜60である。
【００１５】
工程ｄ)に関して：
真核宿主細胞とSFBとの共培養は、０％(嫌気条件)〜５％、好ましくは0.5〜３％、より好ましくは１〜2.5％のO2レベルで行う。
生存真核宿主細胞とSFB株との共培養のための湿度及び温度条件は、当業者がルーチン検査により決定することができる。温度は、好ましくは36℃〜38℃、より好ましくは37℃である。
共培養は、１、２、３、４、５又は６日間行うことができる。
共培養はまた、SFB株がフィラメント化、セグメント化、分化を経て細胞内子孫又は芽胞を放出するまで行うことができる。
芽胞形成を誘導する条件は、有利には、ストレス(例えば、酸化ストレス又は短時間の抗生物質)を添加することを含む(Davis and Savage，1976)。
【００１６】
工程ｅ)に関して：
培養SFB株は、フィラメント、細胞内子孫又は芽胞の形態で回収することができる。
SFBフィラメントは、倒立顕微鏡及びマイクロマニピュレータに装着したマイクロピペットを用いて回収することができる。
SFB細胞内子孫は、フィラメントから、５μmフィルターでのろ過により回収することができる。SFBフィラメントは５μmフィルター上に集めることができる。
SFB芽胞(細菌胞子)は、当該分野において周知の方法(例えば国際出願WO 2014/121298に開示された方法)により回収することができる。
【００１７】
本発明はまた、本出願人がブダペスト条約に従いCNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，Paris)へ2014年12月23日に寄託したArthromitus muris株(受託番号CNCM I4932)を提供する。
本発明はまた、セグメント細菌株を接合により遺伝子改変する方法であって、
ｉ)大腸菌(Escherichia coli)株を、SFB株に導入する興味対象のDNA配列を含み、大腸菌株及び遺伝子改変の標的のSFB株で複製可能である組換えシャトルベクターDNAで遺伝的に改変する工程；
ii)工程ｉ)で得られた遺伝子改変大腸菌株を、遺伝子改変の標的のSFB株と、本発明のインビトロ培養法に従って共培養する工程であって、該培養法の工程ｃ)において、工程ｂ)の細胞培養物を遺伝子改変の標的のSFB株、好ましくはSFB細胞内子孫と、前記遺伝子改変大腸菌株との両方でチャレンジし；そして、該培養法の工程ｄ)において、生存真核宿主細胞とSFB株と遺伝子改変大腸菌株とを液体培養培地中５％未満のO2レベルで共培養する、工程；
iii)工程ii)の遺伝子改変SFB株を回収する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００１８】
組換えシャトルベクターDNAは、興味対象のDNA配列を含んでなり、大腸菌株及びクロストリジウム株の両方で複製可能である組換えクロストリジウムシャトルベクターDNAであることができる。このようなベクターの構築は当該分野で公知である(Heapら，2009)。
有利には、興味対象のDNA配列は、細胞質発現のためには構成的SFB(例えば、リボソーム)プロモーターの制御下にあることができ、表面発現のためには分泌リポタンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合することができる。例示として、SFBで機能する強力なプロモーターは、Yangら(2014)により記載されたSFB SFBNYU_003340遺伝子のプロモーターである。
組換えシャトルベクターDNAは、１つ又は異なる複数の抗生物質選択マーカー(すなわち、抗生物質耐性カセット)を含んでなることができる。任意の抗生物質選択マーカー(例えば、リンコマイシン、スペクチノマイシン、チアンフェニコール、クロラムフェニコール及びテトラサイクリン、好ましくはリンコマイシン)を用いることができる。インビトロでのSFB増殖阻害試験において、SFBは、0.1μg/mlのリンコマイシン、４μg/mlのスペクチノマイシン、１μg/mlのチアンフェニコール、５μg/mlのクロラムフェニコール及び0,6μg/mlのテトラサイクリンに感受性である。有利には、組換えシャトルベクターDNAは、ERM/リンコマイシン耐性カセットを含んでなる。
【００１９】
興味対象のDNA配列は、興味対象の抗原をコードするDNA配列であることができる。興味対象の抗原をコードするDNA配列は、有利には、例えばSczesnakら(2011)が記載した方法に従って、SFBでの発現についてコドン最適化される。例示として、興味対象の抗原は、Shigella flexneriのIpaB又はIpaD、EPECのインチミン及び熱不安定性トキシン並びにETECのコロニー形成因子抗原Ｉ(Cfa/I)付着因子CfaEであることができる。
コドン最適化したSFB SFBNYU_003340遺伝子のプロモーターの制御下にある興味対象のDNA配列の例は、配列番号17に示される。この配列は、緑色蛍光タンパク質(GFP)-オボアルブミン(Ova)ペプチド融合タンパク質をコードする。
大腸菌株は、ネガティブ選択性栄養要求性大腸菌株(Danchin，1977)であることができる。
有利には、大腸菌株は増殖にジアミノピメリン酸を必要とする。このような株は、富栄養培養培地においてジアミノピメリン酸に対して選択することができる。
大腸菌株の遺伝子改変は、エレクトロポレーション、形質導入、熱ショック形質転換又はプロトプラスト融合により行うことができる。
工程ii)の共培養により、シャトルベクターDNAの大腸菌株からSFBへの接合による移入が可能になる。
有利には、工程ｂ)の細胞培養物を、先ず遺伝子改変の標的のSFB株でチャレンジし、次いでSFB株の増殖が見られた後に遺伝子改変大腸菌株でチャレンジする。
【００２０】
本発明はまた、セグメント細菌株をエレクトロポレーションにより遺伝子改変する方法であって、
ｉ)セグメント細菌株を、本発明のインビトロ培養法に従って培養して回収する工程；
ii)工程ｉ)で回収したSFB株と形質転換されるべき精製プラスミドとを、好ましくはグリセロール/H2O中、例えば10％グリセロール/H2O中で、混合する工程；
iii)工程ii)で得られた混合物に電気パルスを印加する工程；
iv)遺伝子形質転換SFB株を回収する工程
を含んでなる、方法を提供する。
【００２１】
本方法の工程ｉ)において、SFB株は、TC7細胞で２〜４日間培養することができる。
本方法の工程ｉ)において、SFB株は、SFB細胞を集めて０％(嫌気条件)〜５％、好ましくは0.5〜３％、より好ましくは１〜2.5％のO2レベル下で氷上に置くことにより回収することができる。
本方法の工程ii)において、電界は、有利には、６kV/cm〜30kV/cm、好ましくは6.5kV/cm〜25kV/cmである。
工程ii)において、精製プラスミドは、クロストリジウム種で用いるために設計することができる(Heapら，2009)。例示として、プラスミドpMTL80110、pMTLP82254、pMTL83353、pMTL84422、pMTL85141、pMTL82151、pMTL83151、pMTL84151又はpMTL85151(全てHeapら[2009]により記載)(GENBANKデータベースでもこれらアクセッション番号で言及される)を用いることができる。有利には、プラスミドは、そのマルチクローニング部位のFseI部位とPmeI部位との間にクローニングされたERM/リンコマイシン耐性カセットを更に含んでなるpMTL82151、pMTL83151、pMTL84151及びpMTL85151からなる群より選択する。これらプラスミドを、pMTL82151-ERM、pMTL83151-ERM、pMTL84151-ERM及びpMTL85151-ERMと呼び、それぞれ配列番号18、19、20及び21に記載する。
プラスミドは、標準法により、ほとんどの場合には例えば市販のキット(例えば、Qiagen(登録商標)プラスミド精製キット)を用いて、精製することができる。
工程iv)において、プラスミドが抗生物質耐性カセットを含んでなる場合、プラスミドで形質転換されたSFBは、対応する抗生物質マーカーを用いてインビトロで選択する。
【００２２】
本発明はまた、セグメント細菌株を化学的形質転換により遺伝子改変する方法であって、
ｉ)セグメント細菌株を、本発明のインビトロ培養法に従って培養して回収する工程；
ii)工程ｉ)で回収したSFB株と形質転換されるべき精製プラスミドとを、好ましくはグリセロール/塩化カルシウム中、例えば10％グリセロール/0.1Ｍ塩化カルシウム中で、混合する工程；
iii)工程ii)で得られた混合物をインキュベートする工程；
iv)任意に、混合物に熱ショックを印加する工程；
ｖ)遺伝子形質転換SFB株を回収する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００２３】
本方法の工程ｉ)において、SFB株は、TC7細胞で２〜４日間培養することができる。
本方法の工程ｉ)において、SFB株は、SFB細胞を集めて０％(嫌気条件)〜５％、好ましくは0.5〜３％、より好ましくは１〜2.5％のO2レベル下で氷上に置くことにより回収することができる。
工程iii)において、SFB株及び精製プラスミドは、15〜45分間、好ましくは30分間インキュベートすることができる。
工程iv)において、熱ショックは、有利には、41〜43℃、好ましくは42℃で、15〜45秒間、好ましくは30秒間印加する。
工程ｖ)において、プラスミドが抗生物質耐性カセットを含んでなる場合、プラスミドで形質転換されたSFBは、対応する抗生物質マーカーを用いてインビトロで選択する。
【００２４】
本発明に従うセグメント細菌株の遺伝子改変法は、形質転換SFB株をインビボで選択する工程を更に含んでなることができる。このインビボ選択工程は、、インビトロで選択した(抗生物質耐性カセットを含むプラスミドで形質転換した)SFBをマウスの腸に投与(例えば経口投与)し、次いで対応する抗生物質マーカーを該マウスに投与し、その後、生存する遺伝子形質転換SFB株を該マウスから回収することを含んでなる。抗生物質マーカー(例えば、リンコマイシン)は、マウスの飲用水に添加することができる。例示として、リンコマイシンは、低希釈率、好ましくは50〜500μg/Lで飲用水に用いることができる。
生存遺伝子改変SFB株は、対象動物(好ましくは、哺乳動物)への経口摂取又は非経口投与後の抗原送達ビヒクルとして、フィラメント、細胞内子孫又は芽胞のいずれかで、好ましくは芽胞で、用いることができる。
【００２５】
したがって、本発明はまた、興味対象の抗原(例えば、Shigella flexneriのIpaB又はIpaD、EPECのインチミン及び熱不安定性トキシン並びにETECのコロニー形成因子抗原Ｉ(Cfa/I)付着因子CfaE)を発現する、好ましくは該抗原を分泌するか又は細菌表面に露出する単離した遺伝子改変SFB株を提供する。
用語「興味対象の抗原を発現する遺伝子改変SFB株」及び「興味対象の抗原を発現するように遺伝子改変したSFB株」は本明細書で互換可能に用いる。
本明細書で用いる場合、興味対象の抗原とは、SFBとは異なる微生物又は細胞(例えば、腫瘍細胞)に由来する(外来)抗原であって、これに対する免疫応答が対象動物で惹起されるように意図された抗原をいう。微生物は、細菌、ウイルス又は真菌生物であることができる。細胞は、好ましくは、哺乳動物起源のもの、好ましくはヒト起源のものである。
Ｂ細胞応答及びＴ細胞応答(Th1細胞応答及び(特に)Th17細胞応答の両方を含む)の両方を誘導するSFBの強力な能力を考えれば、抗原は、有利には、Th17応答を惹起するように選択する。
【００２６】
抗原の特定の実施形態としては、下痢性病原因子Shigella、腸管毒素性大腸菌(ETEC)又は接着/破壊(attaching and effacing)(A/E)病変誘導性腸管毒素性大腸菌(EPEC)の主に表面タンパク質に由来する抗原が挙げられる。Shigella抗原については、宿主細胞侵入に必要であるIII型分泌装置tipタンパク質IpaB及びIpaDを選択することができる(Parsot 2009)。IpaB及びIpaDは、種々のShigellaセロタイプ間で保存されており、二重変異熱不安定性トキシンと複合体化した組換えタンパク質として、Shigellaの致死性肺チャレンジに対して、鼻内免疫後には90％の保護効力を、経口投与時には40％の保護効力をもたらす(Heineら，2013)。加えて、IpaB指向性抗体は、インビトロでShigella斑形成を阻害することが示されている(Millsら，1988)。ETEC抗原については、線毛先端に位置し、非ヒト霊長類Aotus nancymaaeモデルで皮内投与後にETECからの保護をもたらすコロニー形成因子抗原Ｉ(Cfa/I)付着因子CfaEを選択することができる(Fleckensteinら，2014)。Cfa/IはEPEC株のサブセットに存在するので、熱不安定性トキシン(LT)を挙げることができる。熱不安定性トキシンは高度に免疫原性であり、このトキシンの二重変異体は、ワクチン研究において粘膜アジュバントとして用いられる(Martinez-Becerraら，2012)。しかし、SFBは既に強力な免疫刺激能を有するので、Bacillus subtilisが表面に存在させるとき又は細胞質発現させるときにそれ自体が当該トキシンに対する保護抗体応答を惹起することができるLTの非毒性Ｂサブユニット(LTB)のみを選択することができる(Paccezら，2007)。EPEC抗原については、付着因子インチミンを選択することができる。インチミンは、転位レセプターTirへの結合により特徴的な接着/破壊(A/E)病変形成を媒介し(Kaperら，2004)、腸管出血性大腸菌及びマウスEPEC様株C. rodentiumにおいて定型及び非定型EPECの両方に見出される。保護免疫原としてのインチミンは、ウサギEPEC、EHEC及びC. rodentium感染の幾つかの動物モデルで検証されている(Ferreiraら，2011)。具体的には、ヒトEPEC下痢症例で最も高頻度なEPECインチミンサブタイプでありC. rodentiumに存在するサブタイプである94kDaのβ-インチミン抗原のアミノ酸363〜808をコードするフラグメントを選択することができる。このフラグメントは、皮下サブユニットワクチンとして投与されたとき、又はインチミンフラグメント発現Lactobacillus株により経口若しくは舌下で送達されたときに保護免疫をもたらすことができ、インチミンタイプ非依存性免疫の誘導における有望性を示す(Ferreiraら，2008及び2011、Ghaem-Maghami，M.ら，2001)。
【００２７】
遺伝子改変SFB株は、上記のように、形質転換、形質導入又は接合により、好ましくは本発明に従うセグメント細菌株の遺伝子改変法により、取得することができる。
本発明はまた、医薬として使用するための、特に抗原が由来する微生物により引き起こされる疾患又はガンの予防又は治療に使用するための上記の興味対象の抗原を発現する生存遺伝子改変SFB株を提供する。
SFB株は、フィラメント、細胞内子孫又は芽胞、好ましくは芽胞の形態であることができる。
本発明はまた、上記の興味対象の抗原を発現する生存遺伝子改変SFB株を含んでなる治療用免疫原性(又はワクチン)組成物を提供する。
SFB株は、フィラメント、細胞内子孫又は芽胞、好ましくは芽胞の形態であることができる。
用語「免疫原性組成物」及び「ワクチン組成物」は本明細書で互換可能に用いる。
【００２８】
本発明はまた、抗原が由来する微生物により引き起こされる疾患又はガンの予防又は治療に用いるための、上記の免疫原性組成物を提供する。
本発明に従う、興味対象の抗原を発現する遺伝子改変SFB株及び該遺伝子改変SFB株を含んでなる免疫原性組成物は、対象動物において、該抗原を指向する抗体の惹起に特に適切である。
有利には、免疫原性組成物は、医薬的に許容され得るキャリアを含んでなる。
本明細書で用いる場合、「医薬的に許容され得るキャリア」には、医薬投与に適合性のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌性及び抗真菌性物質、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。適切なキャリアは、当該分野の標準的な教科書であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。
本発明に従う、興味対象の抗原を発現する遺伝子改変SFB株及び該遺伝子改変SFB株を含んでなる免疫原性組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに、抗原が由来する微生物による感染又はガンを予防するか又はその重篤度、持続期間の程度を低減するに十分な量で投与する。
治療有効量は、とりわけ、治療対象動物、その年齢及び全身状態、抗体を産生する免疫応答の能力、所望する保護の程度、治療すべき病状の重篤度並びに投与形態に依存して変化する。適切な有効量は当業者が容易に決定することができる。治療有効量は、ルーチン試験により決定することができる比較的広範囲内に含まれる。
対象動物には、初回免疫後、当業者が決定する適切な間隔で１回又は２回の追加免疫注射を施してもよい。
代表的には、免疫原性組成物は、注射可能形態(溶液又は懸濁液)又は注射前の液体キャリアへの溶解若しくは懸濁に適切な固体形態として調製する。
免疫原性組成物は、製剤化し、非経口で又は粘膜経路で、好ましくは経口で投与してもよい。
【００２９】
本発明はまた、医薬、好ましくは抗原が由来する微生物又はガンに対する予防又は治療ワクチンの製造のための、上記の興味対象の抗原を発現する遺伝子改変SFB株又は免疫原性組成物の使用を提供する。
本発明はまた、抗原が由来する微生物により引き起こされる感染又はガンを予防及び/又は治療する方法であって、その必要がある対象動物に、上記の興味対象の抗原を発現する遺伝子改変SFB株又は免疫原性組成物を、感受性細胞の微生物感染を阻害し、結果として感染を予防又は治療するか、又はガン細胞の増殖を阻害し、結果としてガンを予防又は治療するに有効な量で投与することを含んでなる方法を提供する。
用語「治療」には、感染及び/若しくは感染の症状又はガンを治癒し、緩和し、軽減し、変化させ、寛解し、前記感染等から回復させ、修復させ、改善させ又は前記感染等に影響を及ぼすことを目的として、感染、感染の症状又はガンを有する患者へ、上記の興味対象の抗原を発現する遺伝子改変SFB株又は免疫原性組成物を投与することが含まれる。
用語「予防」は、感染の進行を低下及び/若しくは消失させること、又は感染若しくはガンの発症を遅延又は抑止することを意味する。
【００３０】
本発明はまた、本発明のインビトロ培養法により取得可能なSFB株のプロバイオティクスとしての使用を提供する。
SFB株は生存していることも死滅していることもでき、好ましくは生存している。
SFB株は、フィラメント、細胞内子孫又は芽胞、好ましくは芽胞の形態であることができる。
本発明はまた、本発明のインビトロ培養法により取得可能なSFB株を含んでなる食品(例えば乳製品)を提供する。
SFB株は生存していることも死滅していることもでき、好ましくは生存している。
SFB株は、フィラメント、細胞内子孫又は芽胞、好ましくは芽胞の形態であることができる。
前述の特徴に加えて、本発明は、本発明を説明する実施例及び添付図面に言及する以下の説明から理解される他の特徴を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】SFBのインビトロ増殖及び増殖要件。ａ：５μm濾過前後のSFBのグラム染色及び長さ；ｂ：示した条件による宿主細胞でのSFB増殖のqPCR；ｃ：トランスウェルにおいてTC7細胞で嫌気増殖した４日齢SFBフィラメントのSEM画像；ｄ〜ｉ：低酸素濃度下、トランスウェルに播種した(示した)細胞株での(ｄ)、示した細胞コンフルーエンスのTC7細胞での(ｅ)、種々の条件下での(ｆ，ｇ，ｈ，ｉ)SFB増殖；ｂ，ｉ，ｈ：両側ｔ検定による統計分析(* ｐ≦0.05，** ｐ≦0.01，*** ｐ≦0.001)。
【図２】インビトロ増殖の間のフィラメントから細胞内子孫へのSFBの分化。Ａ：増殖及び分化ステージを強調したSFBフィラメントの概略図。示した条件でインキュベートしたTC7細胞(Ｂ)及び低酸素でトランスウェルで増殖させたTC7細胞(ｃ)での４日間の増殖後のSFBのグラム染色。トランスウェルにおいて１〜2.5％のO2にて、mICcl2細胞(Ｄ〜Ｇ)及びTC7細胞(Ｈ)で増殖させたSFBの分析。代表的な２日齢SFBフィラメントのqPCR定量(３値の平均±s.d.)(Ｄ)、個々のSFBの長さ(Ｅ)、グラム染色(Ｆ)及びセグメント長分析(Ｇ)。Ｈ：４日間の増殖後のSFBのSEM。Ｂ〜Ｈ，３つ組で行った３実験の１つからの代表的な画像及び値(Ｄ：平均±s.d.)
【図３】インビトロ増殖SFBの生存能、コロニー形成及び免疫刺激能。ａ：トランスウェルにおいてTC7細胞で増殖させた後のSFB長；５μm濾液の３日間の継代培養前後に、トランスウェルにおいてTC7細胞で増殖させたSFBの定量(ｂ)及びグラム染色(ｃ)；ｄ〜ｋ：フィラメント/細胞内子孫のミックス、細胞内子孫又はSFB単独定着マウスの糞便(SFBVivo)のいずれかを強制摂取させた無菌C57BL/6マウスの分析；ｄ：回腸定着SFBの定量；ｅ，ｋ：回腸固有層における宿主遺伝子発現；示したマーカーのB220+ Ｂ細胞頻度(ｆ，ｇ)及びCD45+CD3+CD4+ Ｔ細胞頻度(ｉ，ｊ)の代表的なフローサイトメトリプロット及び定量；ｈ：糞便分泌IgAのELISAによる定量。ａ〜ｋ：画像及び値は２つ組で行った２実験(ａ〜ｃ)又は群あたり４〜６匹のマウスを用いて行った実験(ｄ〜ｋ)の１つからの代表的な画像及び値(平均±s.d.)である。両側ｔ検定による統計分析(*** ｐ≦0.001)。
【図４】SFB-宿主細胞相互作用及び宿主応答。２日間の細胞内子孫チャレンジ後の、サブコンフルーエント(Ａ)及びコンフルーエント(Ｂ)のmICcl2細胞に付着したSFBのSEM。Ｃ：細胞内子孫で２日間チャレンジしたmICcl2細胞の4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色(Ｄ)及びアクチン染色(Ａ)の合成(Ｍ)。共焦点スライス(s)及びZ-投影を示す。Ｄ：TC7細胞に付着した３日齢SFBフィラメントのSEM。SFB(Ｅ〜Ｇ)又は種々のMAMP(Ｈ)でのチャレンジの３日後の、mICcl2細胞(Ｅ，Ｆ，Ｈ)及びTC7細胞(Ｇ)のqPCR分析による宿主応答。NS：有意差無し；BDL：検出限界未満。画像及び値は、３つ組で行った２２実験の１つからの代表的なもの(Ａ〜Ｄ)又は３つ組で行った４実験からの累積値である。最小/最大ウィスカーを有する25〜75％百分位数のボックスプロット(Ｅ〜Ｇ)又は平均±s.e.m.；(Ｈ)両側ｔ検定による統計分析(* ｐ≦0.05，** ｐ≦0.01，*** ｐ≦0.001)。
【図５】インビトロ増殖SFBの腸コロニー形成及び宿主応答。ａ，ｂ：強制摂取に用いたインビトロ増殖SFBのqPCR定量(ａ)及びSEM(ｂ)。ｃ：糞便サンプル中のSFBのqPCR定量。ｄ：SFBVivo又はSFBVitroをC57BL/6マウスに強制摂取させた25日後のインビボでのSFB付着のSEM。ｅ：21日目のSFBコロニー形成無菌C3H/HeNマウス回腸のSEM。空の付着部位を示す。ｆ：SFB又は大腸菌を21日間コロニー形成させた通常又は無菌マウスにおける回腸固有層での宿主遺伝子発現。画像及び値は、２実験の１つからの代表なもの(ａ〜ｅ)又は合計で７匹の無菌マウス、４匹のSFBコロニー形成マウス、５匹の大腸菌コロニー形成マウス及び４匹の通常マウスを用いて行った２実験の累積値(ｆ)である。メジアン及び最小/最大ウィスカーを有する25〜75％百分位数のプロットを示す。ｃ，ｆ：両側ｔ検定による統計学的分析(* ｐ≦0.05，** ｐ≦0.01)。
【実施例】
【００３２】
実施例１：マウスセグメント細菌のインビトロでの増殖及び宿主相互作用
材料及び方法
細胞培養物及びSFB特異的培養培地
TC7、CMT93及びHeLa細胞を、10％不活化ウシ胎仔血清(FCS；AbCys CVFSVF00-0U)及び非必須アミノ酸(Invitrogen 11140-035)を含むDMEM(Gibco 31885)で培養した。mICcl2は、２％不活化FCS及びGlutamax(Gibco 35050)を含み、10nM hEGF(Sigma E9644)、50nMデキサメタゾン(Sigma D4902)及び１nMトリヨードサイロニン(Sigma T5516)を補充したDMEM/F12アドバンスト培地(Gibco 12634)で維持した。HeLa細胞はATCCから入手した。全ての細胞株は２週間ごとにマイコプラズマについて検査し、常に陰性であることが判明した。細胞は、実験開始時に単層が存在するように、実験の１〜３日前に、定型の12ウェル組織培養プレート又は0.4μmフィルターを備えるCostarトランスウェルプレートのいずれかに播種し(Sigma CLS3460及びFisher Scientific W2127P)、培地中の酸素濃度を徐々に低下させるために低酸素チャンバに一晩供した。SFB培養の開始時、SFBの(TC7細胞への直接)添加前に先ず、TC7、CMT93、HeLa及びmICcl2培地を(１％酸素平衡化)培地に交換する。
【００３３】
SFB培地を次のとおり作製した：２％ FCS、Glutamax及び12.5mM HEPES(Sigma H0887)を含み、以下の補充物を補充したDMEM/F12アドバンスト培地：1/100希釈率の(１)５×濃縮の脳・心臓滲出物(BD Difco 237500)、(２)10％のペプトン/酵母(BBL Biosafe 211862)及び５％のカゼインアミノ酸(DIFCO 0320-01-1)、(３)200mMのリボース/セロリボース/マンノース(Sigma：R9629，C7252，M6020)；1/1,000希釈率の(１)10mMの硫酸鉄(Merck 3965)、(２)12.5mMのクエン酸第二鉄アンモニウム(LabGuard 0658)、(３)1.4Ｎ NH4OHを含む50％エタノール中1.5mMのヘミン(Sigma 51280)、(４)10mg/mlのアスコルビン酸ナトリウム及び500mMのアスコルビン酸１-リン酸(Sigma：A4034，49752)；1/10,000希釈率のDMSO中30mg/mlのレチノイン酸(Sigma R2625)；1/500希釈率の(１)10μlのDNaseI(Roche 04 716 728 001)で37℃にて１時間消化し、75℃にて30分間熱不活化した10mg/mlの精子DNA(Life Technologies 15632-011)、(２)未消化の10mg/mlのRNA(Sigma R6750)。SFB培地に特異的な培地補充物(ヌクレオチド及びヘミンを除く)は２週間ごとに新たに調製し、他のものは４℃で、レチノイン酸及びヌクレオチドについては−20℃で保存した。mICcl2細胞を用いる場合、SFB培地にはhEGF、デキサメタゾン及びトリヨードサイロニンを更に補充した。特に、0.2％酵母抽出物(BD 212750；20％のものから1/100)の追加補充により、SFB増殖が更に改善され、アスコルベートもホスホアスコルベートもヘミンも添加する必要がない。
【００３４】
SFB単独定着マウスからの細胞内子孫の精製及び感染プロトコル
細胞内子孫の単離に用いた全ての液体は、０％酸素に設定した無酸素チャンバ内で一晩予め平衡化した。SFB単独定着JH-/-マウスを組織培養フード内で無菌的に死亡させた後、解剖のために嫌気キャビネット内に置いた。回腸、盲腸及び結腸の内容物を50mlのPBS中に再懸濁し、ボルテックスによりホモジナイズした。ホモジネートを100μmメッシュに通して、大きな糞便残渣を除去した。濾過物を8,000ｇにて５分間遠心して細菌及び不溶物をペレット化し、ペレットをマウスあたり３mlのPBS中に再懸濁し、15mlのFalconチューブ内で、PBSを用いて作製した３mlの50％及び２mlの30％ Nycodenz(AbCYS 1002424)溶液上に積層し、4,000ｇにて10分間遠心した。30％画分内のSFBを採集し、PBSに希釈し、細菌を8,500ｇにて10分間ペレット化した。ペレットを15mlの予め平衡化したPBS中にピペッティング/ボルテックスにより再懸濁し、５μmフィルター(Sigma Z612502)により濾過した。濾過物を8,000ｇにて５分間遠心分離し、ペレットを適切な量の予め平衡化した培養培地に再懸濁した。通常、用いた４つの12ウェルプレートごとに１匹のマウスを用い、50μlの細菌懸濁物を各ウェルに加えた。接着を促進するため、SFBでチャレンジした細胞を嫌気キャビネット内でziplockバッグに封入し、キャビネットから取り出して、300ｇにて10分間遠心した。
【００３５】
SFBを真核細胞の存在下で３日間増殖させ、その間、酸素濃度を０日目の１％から１日目に1.5％、２日目に２％、３日目に2.5％へ徐々に増加させる。３日目に、培養上清のアリコートを採取して、これを新たに調製した真核細胞(トランスウェルフィルターにおいて低酸素条件で上記のとおり調製)のチャレンジに用いることにより継代培養物を作製することができる。
【００３６】
SFBの回収並びにSFB増殖の定量及び分析
SFBを回収するため、培養上清を集めて、8,000ｇにて４分間遠心分離し、ペレットを100μlのPBS中に再懸濁した。このうち、20μlをグラム染色用にスライドグラスに滴下し、30μlを等量の50％グリセロールと混合して−80℃で凍結し、残る50μlをDNA抽出に用いた。DNAは、Qiagen糞便キット(51504；阻害剤錠は使用せず)を用いて単離し、1/20に希釈した。SFB増殖は、次のプライマー対を用いる16S rRNA遺伝子のqPCR分析により定量した：SFB特異的Ｆ：5'-AGGAGGAGTCTGCGGCACATTAGC-3'(配列番号１)；及び汎用Ｒ：5'-TCCCCACTGCTGCCTCCCGTAG-3'(配列番号２)。qPCRのために、６μlの希釈SFB DNAを1.5μlの４mMプライマーミックス及び7.5μlのPower SybrGreen Masterミックス(Applied 4368708)と混合し、ABI 7900HT装置で384ウェルプレート中でPCRを行った。統計分析には両側スチューデントｔ検定を用いた(* ｐ≦0.05，** ｐ≦0.01，*** ｐ≦0.001)。SFBセグメント長分析にはImageJを用いた。SEM分析のために、SFB含有上清をPBSで洗浄し、0.1μmフィルター(Watman 110405)上に吸引し、2.5％グルタルアルデヒドを含む0.1Ｍカコジル酸塩緩衝液で固定した後、処理した。SEM用の細胞を、４％スクロース及び2.5％グルタルアルデヒドを含むPHEM緩衝液(１リットルあたり18.14ｇのPIPES、6.5ｇのHEPES、3.8ｇのEGTA、0.99ｇのMgSO4。10Ｍ KOHでpH7.0に調整)で固定し、SEM用に処理した。蛍光には、細胞を、PBS/3.7％ PFAで固定し、PBS/0.1％ Triton X-100で予め透過化し、DAPI及びA568-ファロイジンで染色し、0.4μm切片をLeica SP5共焦点顕微鏡で採取した。
【００３７】
インビトロ増殖SFBの無菌マウスでのコロニー形成
本実験は独立して２回行い、同様な結果を得た；１つの実験を示す。トランスウェルにおいてTC7及びmICcl2細胞で３日間インビトロ増殖させたSFBを等分し、一方の半分を５μmフィルターにより濾過して細胞内子孫のみを含む画分を得た。細菌を遠心分離により濃縮して、マウスあたり0.25mlの細菌をPBS中に得た。用いた動物の数は動物の入手可能性、隔離飼育器及び投入数に従った。無作為化又は盲検化は行わなかった。無菌施設で飼育した４匹の11週齢C57BL/6雄性及び雌性マウスからなる２群を、一晩絶食させ、これらに0.25mlの400mM炭酸水素ナトリウム、続いて0.25mlのインビトロ増殖SFBを強制摂取させた。年齢適合コントロールマウスにインビボ由来SFBを下記のとおりコロニー形成させた。糞便サンプルを各マウスについて３週間の種々の時点で集め、SFB DNAを、Qiagen糞便キットを用いて抽出し、16S rDNAのqPCR分析及びSFBゲノム濃度が既知のSFB DNAサンプルとの比較(Illuminaシーケンシングにより決定)に基いて定量した。回腸に定着したSFBをモニターするため、DNAをGodonら(1997)の方法により凍結回腸生検から抽出した。
【００３８】
C57BL/6マウスからの固有層リンパ球の単離及び染色
年齢適合無菌B6マウス及びインビトロ又はインビボ増殖SFBを３週間コロニー形成させたマウスを、Ivanovら(2009)に記載のように先天性及び養子免疫応答について分析した。簡潔には、RNA抽出、相補DNA(cDNA)合成並びにSYBR又はTaqman技術(Applied Biosystems)及びQuantStudio7 qPCR装置を用いるqPCR分析のため、パイエル板の切出し後、マウス小腸をPBSで洗浄し、回腸サンプルをRNAlater内に置いた。値はTfrCに対して規格化した。
固有層リンパ球(LPL)を、Gaboriau-Routhiauら(2009)が記載したように調製した。残る小腸を、60mlのPBS-３mM EDTA(Sigma)中で10分間37℃にて４回インキュベートし、20％ FCS(Gibco)、100U/mlコラゲナーゼ(Sigma)及び175U/ml DNase I(Sigma)を含む60mlのRPMI 1640で40分間37℃にて消化した。次いで、LPLを40〜80％パーコールグラジエントで15分間2,000ｇにて精製し、8％ FCS、１mM HEPES、0.02mM葉酸、0.67mM L-アルギニン及び0.27mM L-アスパラギンを含むDMEMGlutamax(全てSigma)に再懸濁した。
表面抗原並びにIL-17及びIL-10の細胞内発現についてのLPLの分析を、(５)に記載のようにフローサイトメトリにより行った。簡潔には、LPLを、ブレフェルジンＡ(10μg/ml)の存在下、100ng/mlホルボール12-ミリステート13-アセテート及び１μg/mlイオノマイシンで４時間刺激した(全てSigma)。表面分析に用いた細胞は刺激しなかった。表面染色には、LPLを、次の抗体のカクテルで20分間４℃にて標識した：FITC-抗GL7(クローンGL7)、PerCP-抗CD8a(クローン53-6.7)、APC-H7-抗CD4(クローンGK1.5)、AF647-抗B220(クローンRA3-6B/2)(全てBD Pharmingen)、PE-抗IgA(Southern Biotech)並びにFluor450-抗CD45(クローン30-F11)及びPECy7-抗CD3(クローン145-2C11)(共にeBioscience)。
【００３９】
細胞内サイトカイン染色には、細胞を更に、２％ PFAで20分間室温(〜24℃)にて固定し、洗浄し、PBS-１％ FCS-0.5％サポニン(Sigma)中に希釈したPE-抗IL-17(クローンTC11-18H10)及びAPC-抗IL-10(クローンJES5-16E3)(BD Pharmingen)で一晩４℃にて染色した。標識細胞をFACSCanto II及びFACSDivaソフトウェア(BD Biosciences)で分析した。ゲートは、Aqua生存/死亡色素排除(Invitrogen)後の生存細胞について設定した。
qPCR分析には、無菌マウスのメジアン値を算出し、参照値「１」として、検査サンプルのメジアン値との比較に用いた。
【００４０】
無菌マウスでの糞便由来SFB及び大腸菌のコロニー形成
無菌雄性及び雌性C3H/HeNマウスをINRA(ANAXEM platform)無菌施設から入手した。８〜９週齢無菌マウスに、0.5mlの新鮮な大腸菌MG1655嫌気培養物又はSFB単独定着マウス由来の糞便ホモジネートを強制摂取させた(Ivanovら，2009)。SFBのコロニー形成を糞便中で、細菌DNAの抽出及びSFBに特異的なプライマー対を用いるqPCRによる16S rDNA増幅によってモニターした。値はCcl25(構成的に発現される上皮細胞マーカー)に対して規格化し、無菌コントロールマウスのメジアン値と比較した。無菌マウス及び純粋隔離(gnotobiotic)マウスをプラスチック製隔離装置内で飼育し、これらに、γ照射(40kGy)により滅菌した市販飼料を自由摂取させた。用いた動物の数は、動物及び隔離装置の入手可能性に従い、２つの独立実験から得た。無作為化又は盲検化は行わなかった。純粋隔離マウスを、年齢適合無菌コントロールと並行して、コロニー形成後21日目に死亡させた。全ての動物実験手順は、実験動物の飼育及び使用に関するフランス国及びEECの法規に従い、地元の倫理委員会の承認及びフランス研究省の認可を得て行った。
【００４１】
SFB増殖及びMAMP刺激に対するインビトロでの宿主応答
SFB及びMAMPに対する宿主応答には、３つの技術サンプルを用いた４つの独立実験からプールした結果が含まれた。一般には、最小の三組の生物学的複製を用い、傾向は明らかであるが有意性がない場合に増やした。SFBをトランスウェルにおいてヘミン及びアスコルビン酸ナトリウムを欠くSFB培地中１〜2.5％酸素にてmICcl2又はTC7細胞で３日間インビトロ増殖させた後、細胞を溶解させ、RNAを、Nucleospin RNAキット(Macherey-Nagel)を用いて抽出した。cDNAを、RNA superscript II、オリゴdT、RNaseout及びdNTP(Invitrogen)を用いて合成し、pPCRを、ABI 7900HT及びQuantStudio7(Life Technologies)qPCR装置でSchnupfら(2012)により記載されたプロトコルを用いて行った。TaqManアッセイを供給業者が示唆するように行った。値をB2Mに対して規格化し、Reg3γ、Tnfα及びFabp2についてのCt値を、転写物検出の欠如に起因して、コントロール細胞において、41に設定した。MAMP刺激には供給業者(Invivogen)が推奨する最高濃度の次のアゴニストを用いた：100ng/mlのPam2CSK4(tlrlpm2 s-1)、300ng/mlのPam3CSK4(tlrl-pms)、10μg/mlの大腸菌K12のペプチドグリカン(Tlr-ksspgn)、10μg/mlのMDP(tlrl-mdp)、３μg/mlのCpG(tlr-1584)、100ng/mlのフラジェリン(tlrl-pstfla-5)。フラジェリンについては過剰(10×)も試験し、同様であることが判明した。
【００４２】
用いたマウス及びヒトqPCRプライマー
マウスTaqman(登録商標)アッセイ：
B2M Mm00437762_m1、TfrC Mm00441941_m1、Ccl25 Mm00436443_m1、Fabp2 Mm00433188_m1、Reg3g Mm01181783_g1、Fut2 Mm00490152_S1、Aqp3 Mm01208559_m1、Pigr Mm00465049_m1、Ltf Mm00434787_m1、Tff3 Mm00495590_m1、Tnfa Mm00443258_m1、IL1a Mm00439620_m1、IL1b Mm00434228_m1、IL6 Mm00446190_m1、IL15 Mm00434210_m1、IL18 Mm00434225_m1、Cxcl2 Mm00436450_m1、Ccl2 Mm00436450_m1、Ccl5 Mm01302428_m1、Ccl7 Mm01308393_g1、Ccl20 Mm01268754_m1、Ccl28 Mm00445039_m1、Csf2 Mm01290062_m1
【００４３】
マウスSybr(登録商標)プライマー
B2M：F:tcagtcgtcagcatggctcgc(配列番号３)；R:tccggtgggtggcgtgagtatac(配列番号４)
iNos：F:cagctgggctgtacaaacctt(配列番号５)；R:cattggaagtgaagcgtttcg(配列番号６)
Saa1：F:catttgttcacgaggctttcc(配列番号７)；R:gtttttccagttagcttccttcatgt(配列番号８)
Saa2：F:tgtgtatcccacaaggtttcaga(配列番号９)；R:ttattaccctctcctcctcaagca(配列番号10)
Saa3：F:cgcagcacgagcaggat(配列番号11)；R:ccaggatcaagatgcaaagaatg(配列番号12)
Cxcl1：F:tggctgggattcacctcaag(配列番号13)；R:caagcctcgcgaccattct(配列番号14)
Cxcl10：F:gccgtcattttctgcctcat(配列番号15)；R:gcttccctatgcccctcatt(配列番号16)
【００４４】
ヒトTaqman(登録商標)アッセイ:
B2M Hs00984230_m1、Saa1 Hs00761940_s1、Saa2 Hs01667582_m1、IL6 Hs00985639_m1、IL8 Hs99999034_m1、Ccl20 Hs01011368_m1、Reg3g Hs00417999_m1、iNos Hs01075529_m1、Cxcl10 Hs00171042_m1、Fut2 Hs00382834_m1、IL15 Hs01003716_m1、IL18 Hs01038788_m1、Ccl5 Hs00982282_m1
【００４５】
結果
SFB-宿主細胞共培養系
単独定着マウスから単離したSFB株(Bolotinら，2014)をCNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，Paris)に2014年12月23日に寄託した(受託番号CNCM I4932；SFB-マウス-NLと呼ばれるArthromitus muris株)。SFBを、細菌培地成分及び追加の補充物を含有する富栄養組織培養培地において、低いが生理学的な酸素条件(Heら，1999)下で増殖させた真核細胞と培養した。単独定着マウスからのSFBを集め、100μmメッシュで濾過し、Nycodenzカラムを用いてその他のほとんどの糞便物質から分離し、５μmフィルターを通過させて、単細胞性の細胞内子孫(平均0.7μm)の純粋培養物を得た(図1a)。組織培養ウェル又はトランスウェルで増殖させた真核細胞を、湿潤嫌気キャビネット内に置き、細胞内子孫でチャレンジし、シールドボックス内で厳格な無酸素条件に維持したか、又は酸素濃度を低レベル(0.5〜1.4％ O2)に維持した嫌気キャビネット内に放置した。４日後、培養上清中の細菌増殖を、SFB特異的16S rDNAプライマーを用いる定量的PCR(qPCR)により定量し(図1b)、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて確証した(図1c)。SFB増殖は、アッセイしたほとんどの細胞株について全ての条件で観察されたが、増殖は、通常、組織培養ウェルと比較してトランスウェルにおいて増強しており、増殖は酸素の存在下で有意に良好であった。このことから、SFBが比較的耐気性の嫌気生物であることが明らかとなった。ヒト細胞株(TC7/HeLa)及びマウス細胞株(mICcl2/CMT93)の両方が増殖を支持したが、TC7は、一般にSFB増殖を最も堅牢に支持する、SFBにとって最も適切な(resilient)細胞株であった。経時的分析に基いて、最高の対数増殖期は１日目〜３日目に生じ、平均の最大倍増時間は5.0時間であった(図1d)。
【００４６】
SFBの増殖要件
SFB増殖は宿主細胞数に強い依存性を有し、数が減ると、細胞密度が低下した(図1e)。加えて、培地単独、細胞溶解物を補充した培地、又はSFBチャレンジ前に細胞を固定したときには、生じた増殖はごく僅かであった(図1f)。このことから、SFBの増殖には生存宿主細胞が必要であることが示される。SFBはまた、効率的な増殖には宿主細胞との近接を必要とした。なぜならば、細胞内子孫をトランスウェルの下方チャンバに加えたとき又は細菌をトランスウェル内に組織培養ウェル中のTC7細胞より上方に置いたときには増殖はほとんど生じなかったからである(０〜６％)(図1f，g)。また、宿主細胞との接触は絶対的な要件ではなかったので、宿主細胞はSFB増殖を促進する可溶性因子を放出する可能性があることが示唆される。培地補充の要件を調べるため、SFBを完全培地又は個々の添加物を含まない培地においてTC7細胞で増殖させた。脳・心臓滲出物、酵母/ペプトン/カゼインアミノ酸混合物及び特に鉄の補充は、SFB増殖に重要であった(図1h，i)。
【００４７】
1970年代に、マウス腸に存在するSFBの透過型電子顕微鏡観察研究により、或るライフサイクルが提案された：細胞内子孫の先端での堅固な保持による上皮細胞への付着によってフィラメント成長が導かれ、続いて(遠位先端で開始され、最終的に細胞内子孫の形成及び放出を導く)複雑な発生が進行する(図2A)(Chaseら，1976；Fergusonら，1979)。このモデルによれば、フィラメントが長さ50μmを超えて成長すると、大きな一次フィラメントセグメントは、対称分割を受けて、より小さな二次セグメントを形成し始める。これらは、非対称分割により分化して母/娘細胞を形成する。娘細胞は巻き囲まれた後、分割して周囲の母細胞セグメント内に２つの細胞内子孫を形成する。次いで、細胞内子孫は、フィラメント隔壁及び細胞壁の崩壊によりフィラメントから放出され、宿主に再付着する。
【００４８】
インビトロで、TC7細胞でのSFBの増殖は、相当量の(裸眼で容易に観察される毛玉様表現型に凝集していることがある)長いフィラメントを生じることが多かった(図2B)。これらフィラメントのほとんどは、４日後には分化しておらず、幾つかのフィラメントのみが分化中のフィラメントに特徴的な不均一な染色を示した(図2B，左カラム、下２つのパネル)。細胞内子孫は、SFB単独定着マウスから回収したフィラメント(データは示さず)と同様に、フィラメント先端に又は場合によりフィラメント中心部に位置して観察することができた(図2C)。SFBの分化は試験した４つ全ての細胞株で生じたが、より高い酸素濃度(１〜2.5％)を用いたときに分化がより明白であることに気付いた。このより高い酸素濃度での時間経過分析では(図2D)、チャレンジの１日後には短い細菌のみが検出された(図2E，F)。２日後には、長いフィラメントのみが存在し(図2E，F)、細菌隔壁はグラム染色を用いて明確に同定することができた(図2F)。３つのタイプのフィラメントが見出された(図2F，G)：2.6μm程度の長い細胞内セグメントを有する短いフィラメント；1.2μm程度のより短い細胞内セグメントを有する中間サイズのフィラメント；及びセグメント長がより不均一に分布する(非常に小さいセグメント(図2F，G)及び母細胞による娘細胞の巻き込みに似る半円状構造を有する稀なセグメント(図2F，２〜３日目，矢印)を含む)中間〜長いフィラメント。３日間の増殖後、ほとんどのフィラメントは最終の細胞内子孫ステージに少なくとも部分的に分化した。細胞内子孫は、フィラメント先端で(ここでは、フィラメント細胞壁が構造を喪失しているように見える)、特徴的な二重配向で観察することができた(図2F，最左側カラム)。種々の長さの多くの細胞内子孫は、もはや、フィラメントと結合していなかった。SEMにより、細胞内子孫及びフィラメント先端に針様堅固保持構造の存在が確証され(図2H，b〜g)、未分化の薄く平滑なフィラメント(図2H，a，e〜g)と、分化中のフィラメントに対応する不均一で球茎状の形態を有するより幅広いフィラメント(図2H，a，g，h)とを明確に区別することができた(Chaseら，1976；Fergusonら，1979)。加えて、分化中のフィラメントの遠位先端(ここから細胞内子孫が放出された)で、細胞壁残遺物を検出することができた(図2H，h及び追加データ図1b)(Chaseら，1976)。まとめると、これらデータにより、SFBのインビトロ培養は、インビトロ増殖SFBフィラメントの細胞内子孫ステージへの完全な分化を支持することが証明され、インビボ観察から推測されたSFBのライフサイクルが確証される。
【００４９】
インビトロ形成細胞内子孫の生存能及び感染性
先ず、SFBをTC7細胞で好気条件下にて、多くの細胞内子孫が現れるまで増殖させた(図3a)。更に１日後、細胞内子孫はもはや存在せず、平均細菌長は顕著により長くなった。このことから、細胞内子孫のフィラメントへの成長が示される。同様に、５μmフィルターでの濾過により、インビトロ増殖させた細胞内子孫をフィラメントと分離し、新たに播種した細胞に加えると、SFBの数が増え、新たに形成したフィラメントがフィラメント先端で細胞内子孫に分化した(図3b，c)。このことから、インビトロで形成した細胞内子孫のフィラメント化及び分化が証明される。インビトロで増殖したSFBがマウスでコロニー形成し、特徴的な先天性及び後天性免疫応答を刺激する能力を保持するかどうかを評価するため、インビトロで３日間増殖させたSFBをフィラメント/細胞内子孫画分及び純粋細胞内子孫画分に分割し(図5a，b)、無菌マウスに強制摂取させた。コロニー形成は、いずれの画分でも強制接種の５日後に確立されたが(図5c)、フィラメント/細胞内子孫画分及び細胞内子孫画分について140倍の投与量の差があった。しかし、糞便サンプルに由来するSFB(SFBVivo)を強制摂取させたマウス(概して、回腸で良好なコロニー形成を示した)とは異なり、インビトロ増殖させたSFB(SFBVitro)を強制摂取させたマウスは、回腸でコロニー形成したSFBの数が遥かに少なく(図3d及び追加データ図1d)；代わりに、盲腸で濃密なコロニー形成を示した(図5d)。よって、SFBVitroは明らかに回腸に付着することができるが、これら結果から、糞便中に見出される芽胞から放出される細胞内子孫による回腸コロニー形成がより効率的であり得、このことはおそらくライフサイクルのこの特定のステージでの鞭毛の発現に起因するであろうことが示唆される(Pampら，2012)。特に、先天性宿主応答の大きさ(図3e)は、回腸のコロニー形成レベルに比例したが(図3e)、SFB糞便全量には比例しなかった(追加データ図1c)。SFBの回腸付着の要件は先天性宿主応答を誘導することであることが明らかとなった。SFBVivoと同様に、SFBVitroもまた、効力は弱いものの、パイエル板においてＢ細胞コンパートメントを刺激し(図3f，g)、糞便中のIgA分泌を亢進させ(図3h)、小腸固有層におけるTh17細胞の数及びIL-17AメッセンジャーRNAのレベルを増大させることができた(図3i〜k)。
【００５０】
SFB-宿主相互作用及びSFB増殖に対する宿主応答
宿主細胞とSFBとの間の近接という効率的増殖の外観上明白な要件にもかかわらず、強固な相互作用は容易に観察されなかった。しかし、細胞に対して細胞内子孫を穏やかに遠心することにより相互作用を促進すると、SFBフィラメントはmICcl2細胞に付着することが判明した(図4A〜C)。この安定な相互作用は、フィラメント先端の周囲でのアクチン蓄積を伴い(図4C)、マウス回腸で観察されるもの(図5e)と同様な、構造的にインタクトな空の付着部位を残すことができた(図4A，c)。付着したフィラメントは、未分化のもの及び最終細胞内子孫ステージに達したものの両方を含んでいた。インビボでの結果(Tannockら，1984)に反して、インビトロでの付着は、種特異的ではなかった(図4D)。インビトロ及びインビボでのSFBに対する宿主応答の類似性を評価するために、SFBコロニー形成により調節されることが知られている上皮由来宿主因子(Ivanovら，2009；Gaboriau-Routhiauら，2009；Gotoら，2014；Shimaら，2008；Lecuyerら，2014)の遺伝子発現プロフィールを分析した。インビトロでの遺伝子調節は、インビボでの遺伝子調節に近似していることが判明した(図4E)。このことはこのインビトロモデル系を更に支持する。以前に示された上皮因子の範囲を超えて、幾つかの追加のサイトカイン、ケモカイン及び宿主防御遺伝子を調べた(図4F)。データは、SFB増殖が、多面発現性炎症メディエータ(例えば、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、インターロイキン-１-α(IL1-α)及び血清アミロイドA1〜A3(Saa1〜Saa3))の誘導、幾つかの先天性宿主防御機構(Reg3γ、iNos及びラクトフェリン)の誘導、並びに、Ｂ細胞の動員、IgAの遊出、Ｔ細胞の動員及び活性化、好中球、樹状細胞及び単球の動員を招く免疫学的環境を伴う強力な炎症性宿主応答をもたらすことを示す。これと一致して、mICcl2細胞とのインビトロ共培養の間にアップレギュレートされるほとんどの免疫遺伝子の転写物レベルもまた、インビボコロニー形成実験の間に、SFBにより増大したが、大腸菌(Escherichia coli)では増大しないことが観察された(図5f)。反対に、ヒトTC7細胞株における転写応答は、mICcl2細胞において観察されたものと相違し、インビボでの結果との一致点は少なかった(図4g)。最後に、一連の微生物関連分子パターン(MAMP)を用いて、インビトロでのSFBに対する炎症性応答がおそらくはTLR2の活性化により形成されることが証明された(図4h)。
【００５１】
結論
これらデータより、SFBのインビトロ培養の成功が証明され、SFB増殖要件及びSFBチャレンジに対する宿主応答に関する新たな洞察がもたらされる。これらデータより、インビボでは、回腸表面へのSFBの付着が上皮細胞応答の惹起の重要な特徴である一方、付着が稀であるインビトロでは、概して、SFBと細胞との近接が、刺激シグナルの送達についての付着の必要性を迂回するようであることが示唆される。これら知見から、SFBの刺激能力の媒介という点での、SFBの複製適所としての回腸上皮表面の重要性が強調される。
【００５２】
実施例２：SFB株を遺伝子改変する方法
クロストリジウム種で用いるために設計した一連のモジュール型シャトルベクター(Heapら，2009)を、インビトロ増殖の間のSFBに、接合及び形質転換の両方を用いて安定的に導入される能力について試験する。各プラスミドは、抗生物質耐性カセット、マルチクローニング部位及びプロモーターの選択により、異なる複製起点を含有する。接合及び形質転換はSFBのインビトロ増殖の間に行う。
【００５３】
接合
増殖培地へのジアミノピメリン酸の添加を要求する栄養要求性大腸菌株を、ドナー株として用いる。なぜならば、この株は、ジアミノピメリン酸を含まない富栄養培地において、容易に選択することができるからである。
SFB株を、単独定着マウスから上記のように精製し、細胞内子孫(IO)を、組織培養プレート又はトランスウェルプレートで増殖させた宿主細胞(TC7細胞)に、SFB増殖について上述した条件下に加える。
実質的な増殖が生じた後(２〜４日後)、ジアミノピメリン酸(100μg/ml)及びドナー大腸菌株(増殖にdap添加を要求し、プラスミドを有する)を加え、細胞及びSFBと共に遠心分離し、所与の時間(例えば、４〜８時間)維持する。
或いは、インビトロで増殖させた(培養した)SFBを採集し、上記大腸菌株と混合してペレット化し(全て低酸素下)、種々の時間(例えば、４〜８時間)ペレット状態で維持する。
細菌を採集し、ジアミノピメリン酸を欠く通常のSFB増殖培地で２回洗浄した後、適切な抗生物質(用いたプラスミドによりこの抗生物質に対する耐性がSFBに付与される)が補充された通常のSFB培地において新鮮な真核細胞(常に低酸素下)に接触させる。
所与の時間後(０〜24時間後)、SFVを採集し、無菌マウスに強制摂取させる。
飲用水の抗生物質処理により組換えSFBを選択して維持する。SFB単独定着マウスの処置に必要となる飲用水中の抗生物質使用の最適で最小のレジメを事前に決定し、組換えSFBの選択に用いる。
【００５４】
エレクトロポレーションによる形質転換
上記のように、SFBをインビトロにてTC7細胞で２〜４日間増殖させる(培養する)。
SFBを採集して氷上に置く。低酸素条件下で、氷上に置いた溶液を用いて、SFBを、10％グリセロール/予め平衡化した水で６回洗浄した後、10％グリセロール/H2Oで再懸濁して遠心分離する。
精製プラスミドDNAを加え、SFBをエレクトロポレートする(6.5kV/cm〜25kV/cm)。
SFBを再び通常のSFB培地中に置き、新鮮な細胞と遠心する。SFBを３〜24時間回復させた後、選択抗生物質を一晩加える。
SFBを無菌マウスに強制摂取させる。
飲用水の抗生物質処理のより組換えSFBを選択して維持する。
【００５５】
化学的方法による形質転換：塩化カルシウム及び熱ショック
上記のように、SFBをインビトロにてTC7細胞で２〜４日間増殖させる。
SFBを採集して氷上に置く。低酸素条件下で、氷上に置いた溶液を用いて、SFBを、0.1Ｍ塩化カルシウムで５回洗浄した後、10％グリセロール/0.1Ｍ塩化カルシウムで再懸濁して遠心分離する。
精製プラスミドDNAをSFBに加え、30分間インキュベートする。
SFBに42℃にて30秒間の熱ショックを与えた後、通常のSFB培地中に再び入れて、新鮮な細胞と遠心する。SFBを３〜24時間回復させた後、選択抗生物質を一晩加える。
SFBをGFマウスに強制摂取させる。
或いは、上記手順を、熱ショックを与えずに室温にて行なってもよい。
飲用水の抗生物質処理により組換えSFBを選択して維持する。
【００５６】
参考文献
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【図１−１】
2018505666.tif 000002
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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