(57)【要約】  本開示は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、およびCD52抗原に対する抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現する操作された細胞を提供する。いくつかの実施例において、本開示は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、およびCD52抗原に関連する疾患を治療するための方法を提供する。
2018513692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチドであって、ポリペプチドはシグナルペプチド、CD2抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項２】
CD2抗原認識ドメインが、CD2に選択的なモノクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む、請求項1に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項３】
CD2抗原認識ドメインがCD2 scFvを含む、請求項1に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項４】
CD2抗原認識ドメインが、配列番号19に対して選択的なポリペプチドを含む、請求項1に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項５】
操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチドであって、ポリペプチドはシグナルペプチド、CD3抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項６】
CD3抗原認識ドメインが、CD3に選択的なモノクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む、請求項5に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項７】
CD3抗原認識ドメインがCD3 scFvを含む、請求項5に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項８】
CD3抗原認識ドメインが、配列番号20に対して選択的なポリペプチドを含む、請求項5に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項９】
操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド、ポリペプチドは、シグナルペプチド、CD4抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。
【請求項１０】
CD4抗原認識ドメインが、CD4に選択的なモノクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む、請求項9に記載の操作されたキメラ抗原受容体ポリペプチド 。
【請求項１１】
CD4抗原認識ドメインがCD4 scFvを含む、請求項9に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項１２】
CD4抗原認識ドメインが、配列番号21に対して選択的なポリペプチドを含む、請求項9に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項１３】
操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド、ポリペプチドはシグナルペプチド、CD5抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。
【請求項１４】
CD5抗原認識ドメインが、CD5に選択的なモノクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む、請求項13に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項１５】
CD5抗原認識ドメインがCD5 scFvを含む、請求項13に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項１６】
前記CD5抗原認識ドメインが、配列番号22に対して選択的なポリペプチドを含む、請求項13に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項１７】
操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド、ポリペプチドはシグナルペプチド、CD7抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。
【請求項１８】
CD7抗原認識ドメインが、CD7に選択的なモノクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む、請求項17に記載の操作されたキメラ抗原受容体ポリペプチド。
【請求項１９】
CD7抗原認識ドメインがCD7 scFvを含む、請求項17に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項２０】
CD7抗原認識ドメインが、配列番号23に対して選択的なポリペプチドを含む、請求項17に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項２１】
操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド、ポリペプチドはシグナルペプチド、CD8抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。
【請求項２２】
CD8抗原認識ドメインが、CD8に選択的なモノクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む、請求項21に記載の操作されたキメラ抗原受容体ポリペプチド。
【請求項２３】
CD8抗原認識ドメインがCD8 scFvを含む、請求項21に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項２４】
前記CD8抗原認識ドメインが、配列番号24あるいは配列番号25に対して選択的であるポリペプチドを含む、請求項21に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項２５】
操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド、ポリペプチドはシグナルペプチド、CD52抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。
【請求項２６】
CD52抗原認識ドメインが、CD52に選択的なモノクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む、請求項25に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項２７】
CD52抗原認識ドメインがCD52 scFvを含む、請求項25に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項２８】
前記CD52抗原認識ドメインが、配列番号26に対して選択的なポリペプチドを含む、請求項25に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項２９】
ヒンジ領域は、CD-8α、CD28、4-1BB、OX40、CD3-ゼータ、それらの機能的誘導体、およびそれらの組み合わせからなるグループから選択されるヒトタンパク質のヒンジ領域を含む、請求項1-28の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項３０】
膜貫通ドメインは、以下から選択されるヒトタンパク質の膜貫通領域を含む
CD-8α、CD28、4-1BB、OX40、CD3-ゼータ、それらの機能的誘導体、およびそれらの組み合わせからなるグループを含む、請求項1-28の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項３１】
シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ、共通FcRγ（FCER1G）、FcγRIIa、FcRβ（Fcイプシロンリボ）、CD3γ、CD3δ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12からなる群から選択されるシグナル伝達ドメインを含むその活性断片、およびそれらの組み合わせを含む、請求項1-28の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項３２】
共刺激ドメインは、OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、NKG2C、NKG2D、B7-H3 CD83に結合するリガンド、ICAM-1、LFA-1（CD11a / CD18）、ICOS、および4-1BB（CD137）、それらの活性断片、およびそれらの組み合わせを含む請求項1-28の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項３３】
すくなくとも配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17そして配列番号1８の一つが含まれた、請求項1-28の操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチド。
【請求項３４】
エンジニアリングされたキメラ抗原レセプターポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは請求項1~33のいずれか1つをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項３５】
すくなくとも配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8そして配列番号９を含む、請求項34に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリヌクレオチド。
【請求項３６】
ベクター中に存在するポリヌクレオチドを含む、請求項34〜35に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリヌクレオチド。
【請求項３７】
ベクターが含むプロモーターを含む 、請求項36に記載の操作されたキメラ抗原レセプターポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項1~33のポリペプチドを発現する操作された細胞。
【請求項３９】
請求項1~33に記載の少なくとも2つのポリペプチドを発現する、請求項38に記載の操作された細胞。
【請求項４０】
細胞が免疫調節細胞である、請求項38に記載の操作された細胞。
【請求項４１】
細胞がT細胞である、請求項38に記載の操作された細胞。
【請求項４２】
細胞がCD4 T細胞である、請求項38に記載の操作された細胞。
【請求項４３】
細胞がCD8 T細胞である、請求項38に記載の操作された細胞。
【請求項４４】
前記細胞がナチュラルキラー細胞である、請求項38に記載の操作された細胞。
【請求項４５】
細胞がNK-92細胞である、請求項38に記載の操作された細胞。
【請求項４６】
細胞がNKT細胞である、請求項38に記載の操作された細胞。
【請求項４７】
請求項34~35のポリヌクレオチドを発現する操作された細胞。
【請求項４８】
細胞が、請求項34~37に記載の少なくとも2つのポリヌクレオチドを発現する、請求項34~35に記載の操作された細胞。
【請求項４９】
細胞が免疫調節細胞である、請求項48に記載の操作された細胞。
【請求項５０】
細胞がT細胞である、請求項48に記載の操作された細胞。
【請求項５１】
細胞がCD4 T細胞である、請求項48に記載の操作された細胞。
【請求項５２】
細胞がCD8 T細胞である、請求項48に記載の操作された細胞。
【請求項５３】
細胞がナチュラルキラー細胞である、請求項48に記載の操作された細胞。
【請求項５４】
細胞がNK-92細胞である、請求項48に記載の操作された細胞。
【請求項５５】
細胞がNKT細胞である、請求項48に記載の操作された細胞。
【請求項５６】
以下の工程を含む、請求項38~55に記載の操作された細胞を作製する方法：
I.      末梢血細胞または臍帯血細胞を提供する工程;
II.     請求項34~37のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを工程（i）の細胞に導入する工程;
III.    工程（ii）の細胞を増殖させる工程; そして
IV.     工程（iii）の細胞を単離して、前記操作された細胞を提供する工程。
【請求項５７】
以下の工程を含む、請求項38~55に記載の操作された細胞を作製する方法：
I.      胎盤細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または造血幹細胞を提供する工程;
II.     請求項34~37のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを工程（i）の細胞に導入する工程;
III.    工程（ii）の細胞を増殖させる工程;  そして
IV.     工程（iii）の細胞を単離して、前記操作された細胞を提供する工程。
【請求項５８】
CD4陽性T細胞白血病またはCD4陽性T細胞リンパ腫に対する抗白血病または抗リンパ腫免疫として、それを必要とする患者に提供する方法であって、
I.      請求項9のポリペプチドを発現する操作された細胞の治療有効量をそれを必要とする患者に投与すること;そして
II.     必要に応じて、患者のT細胞白血病またはT細胞リンパ腫に対する免疫をアッセイすることを含む。
【請求項５９】
CD4陽性T細胞白血病細胞またはCD4陽性T細胞リンパ腫細胞の数を減少させる方法であって、
I.      CD4陽性T細胞白血病細胞またはCD4陽性T細胞リンパ腫細胞を請求項9のポリペプチドを発現する有効量の操作された細胞と接触させること;そして
II.     場合により、CD4陽性T白血病細胞またはCD4陽性リンパ腫細胞についてアッセイすることを含む。
【請求項６０】
CD4陽性白血病細胞またはCD4陽性リンパ腫細胞が患者に存在する、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
CD4陽性リンパ腫/白血病細胞が、未分化大細胞リンパ腫細胞またはT-ALL細胞である、請求項59に記載の方法。
【請求項６２】
CD4陽性T細胞白血病細胞またはT細胞リンパ腫細胞が、セザリー細胞または急性骨髄性白血病細胞である、請求項59に記載の方法。
【請求項６３】
CD2を有する免疫制御細胞の数を減少させる方法であって、
I.      免疫調節細胞を有効量の請求項1~4のポリペプチドを発現する操作された細胞;そして
II.     場合により、免疫調節細胞の減少をアッセイすることを含む方法。
【請求項６４】
操作された細胞がCD2を発現しない、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
免疫調節細胞を不活性化することをさらに含む、請求項63~64に記載の方法。
【請求項６６】
CD3を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法であって、
I.      請求項5~8に記載のポリペプチドを発現する操作された細胞の有効量と前記免疫調節細胞を接触させること; そして
II.     場合により、免疫調節細胞の数の減少をアッセイすることを含む方法。
【請求項６７】
CD4を有する免疫制御細胞の数を減少させる方法であって、
I.      請求項9〜12に記載のポリペプチドを発現する操作された細胞の有効量と免疫調節細胞を接触させること;そして
II.     場合により、免疫調節細胞の数の減少をアッセイすることを含む方法。
【請求項６８】
CD4を有する免疫調節細胞が記憶CD4 T細胞である、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
CD5を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法であって、
I.      前記免疫調節細胞を、請求項13~16のポリペプチドを発現する操作された細胞の有効量 と接触させる工程;そして
II.     場合により、免疫調節細胞の数の減少をアッセイすることを含む方法。
【請求項７０】
操作された細胞がCD5を発現しない、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
CD7を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法であって、
I.      請求項17~20のポリペプチドを発現する操作された細胞の有効量と前記免疫調節細胞を接触させること;そして
II.     場合により、免疫調節細胞の数の減少をアッセイすることを含む方法。
【請求項７２】
操作された細胞が、T細胞およびナチュラルキラー細胞の少なくとも1つを含む、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
操作された細胞が、CD7抗原を発現しない、請求項72に記載の方法。
【請求項７４】
CD8を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法であって
I.      前記免疫調節細胞を請求項21~24のポリペプチドを発現する有効量の操作された細胞と接触させる工程; そして
II.     場合により、免疫調節細胞の数の減少をアッセイすることを含む方法。
【請求項７５】
CD52を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法であって、
I.      前記免疫調節細胞を請求項25~28のポリペプチドを発現する有効量の操作された細胞と接触させる工程; そして
II.     場合により、免疫調節細胞の数の減少をアッセイすることを含む方法。
【請求項７６】
操作された細胞が、T細胞およびナチュラルキラー細胞の少なくとも1つを含む、請求項58~75に記載の方法。
【請求項７７】
免疫調節細胞が患者に存在する、請求項58〜75に記載の方法。
【請求項７８】
操作された細胞が、免疫調節細胞に対して自己、同系、同種異系または異種である、請求項58~75に記載の方法。
【請求項７９】
操作された細胞が前記免疫調節細胞に対して自己由来である、請求項58〜75に記載の方法。
【請求項８０】
請求項38~55に記載の操作された細胞の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、細胞増殖性疾患を治療する方法。         
【請求項８１】
操作された細胞が、CD2抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターポリペプチドを含む、請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
CD2関連細胞増殖性疾患が、急性骨髄性白血病、NK細胞白血病、NK細胞リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、T-ALL、NK細胞リンパ腫、NK細胞白血病、または肥満細胞疾患からなる群 を含む、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
操作された細胞が、CD3抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターポリペプチドを含む、請求項80に記載の方法。
【請求項８４】
操作された細胞が、CD4抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターを含む、請求項80に記載の方法。
【請求項８５】
増殖性疾患が、急性骨髄性白血病からなる群から選択されるCD4関連増殖性疾患を含む、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
急性骨髄性白血病が、急性骨髄性白血病M4および急性骨髄性白血病M5からなる群より選択される、請求項84に記載の方法。
【請求項８７】
操作された細胞が、CD5抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターを含む、請求項80に記載の方法。
【請求項８８】
CD5関連増殖性疾患、胸腺癌、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、T細胞新生物、末梢T細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、T細胞急性リンパ球性白血病（T-ALL）、および慢性リンパ性白血病（CLL）からなる群 を含む、請求項87に記載の方法。
【請求項８９】
操作された細胞が、CD7抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターを含む、請求項80に記載の方法。
【請求項９０】
CD7関連細胞増殖性疾患が、慢性骨髄性白血病（CML）および急性骨髄性白血病からなる群を含む、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
CD7関連白血病による細胞増殖性疾患が、急性骨髄性白血病、NK細胞白血病、T細胞急性リンパ球性白血病（T-ALL）、およびNK細胞リンパ腫からなる群を含む、請求項89に記載の方法。
【請求項９２】
前記操作された細胞が、CD8抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターを含む、請求項80に記載の方法。
【請求項９３】
前記操作された細胞が、CD52抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターを含む、請求項80に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞増殖性疾患が、T細胞白血病およびT細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項80に記載の方法。
【請求項９５】
T細胞白血病が、大粒状リンパ球性白血病、成人T細胞白血病、T細胞前リンパ球性白血病、およびT細胞急性リンパ球性白血病（T-ALL）を含む、請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
T細胞リンパ腫が、末梢T細胞リンパ腫、節節外T細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫を含む、請求項95に記載の方法。未分化大細胞リンパ腫および血管免疫芽球性T細胞リンパ腫が含まれる。
【請求項９７】
前記方法が、化学療法、放射線、免疫抑制剤、および抗ウイルス療法と組み合わせた投与をさらに含む、請求項80に記載の方法。
【請求項９８】
自己免疫疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項38~55に記載の治療された細胞の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項９９】
自己免疫疾患が、アジドーシス病、脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（1型）、ジストロフィー表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン橋本病、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、脈管炎、白斑、 、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【請求項１００】
前記抗原認識ドメインが、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、およびCD52の少なくとも1つに特異的である、請求項98に記載の方法。
【請求項１０１】
前記操作された細胞が不活性化される、請求項58〜100に記載の方法。
【請求項１０２】
前記操作された細胞が自殺系をさらに含む、請求項58〜100に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞増殖性疾患がT細胞リンパ腫またはT-ALLである、請求項83に記載の操作された細胞。
【請求項１０４】
放射線療法、ホルモン療法、化学療法、チェックポイント阻害剤、免疫療法、またはそれらの組み合わせとの同時投与をさらに含む、請求項58~100に記載の方法。
【請求項１０５】
前記操作された細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む、細胞増殖性疾患の治療における使用のための、請求項38~55に記載の操作された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、2015年2月27日に出願された米国仮特許出願第62/121,842号に基づく優先権を主張する国際PCT出願であり、その全体内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
リンパ球の一種であるT細胞は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。その他、リンパ球である、B細胞、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）と比較し細胞の表面にT細胞受容体(TCR)が存在している。ヘルパーT細胞（CD4+TあるいはCD4T細胞と呼ばれる）には細胞表面上にCD4糖蛋白質が発現している。ヘルパーT細胞は、MHC（主要組織適合性複合体）クラスII分子によって提示されるペプチド抗原で活性化される。一旦活性化されると、これらの細胞は急速に増殖し、免疫応答を調節するサイトカインを分泌する。細胞傷害性T細胞（CD8 + T細胞またはCD8 T細胞としても知られている）は、CD8細胞表面上のグリコプロテインを細胞表面中に発現している。CD8 + T細胞は、MHCクラスI分子によって提示される提示されるペプチド抗原で活性化される。T細胞のサブセットであるメモリーT細胞は、長期間生存し、それらの同種抗原に応答し、過去における感染および/あるいは腫瘍細胞に対する記憶に基づき、免疫反応を起こすことで身体を防御する。
【０００３】
T細胞は、その表面上にキメラ抗原受容体（CARs）とよばれる特別な受容体を産生するように 遺伝子操作することができる。CARsは、 腫瘍細胞上の特異的タンパク質（抗原）を認識するT細胞上のタンパク質である。これらの設計されたCAR T細胞は、実験室において数十億に達するまで増殖させ、次いで、増殖させたCAR T細胞は患者に注入される。
【０００４】
今日までのキメラ抗原受容体（CAR）T細胞を用いた臨床試験では、細胞標準的化学療法に耐性をもつ血液悪性腫瘍に対する治療方として非常に見込みがある。最も注目すべきことに、CD19-特異的CAR（CD19CAR）T細胞療法は、B細胞悪性腫瘍における長期間寛解を含め、著しく良好な結果をしめした。（参照文献: Kochenderfer、Wilsonら、2010、Kalos、Levineら、2011、Porter、Levineら、2011、Davila、Riviereら、2013、Grupp、Freyら、2013、Grupp、Kalosら、2013、Kalos、Nazimuddinら、2013、Kochenderfer、Dudleyら、2013、Kochenderfer、Dudleyら、2013、Lee、Shahら、2013、Park、Riviereら、2013、Maude、Freyら、2014）。
【０００５】
B細胞白血病およびリンパ腫におけるCAR療法の成功にもかかわらず、T細胞悪性腫瘍に対するCAR療法は、まだ十分には確立されていない。T細胞悪性腫瘍は、B細胞の悪性腫瘍と比較して予後不良である（Abramson、Feldman et al。2014）、この点においてCAR療法は臨床における大きな可能性を秘めている。
【０００６】
CD5は80％以上のT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）で発現している。1つの選択肢として、CD５を発現しているT細胞白血病またはT細胞リンパ腫に対し抗CD5抗体を用いて治療することである。しかしながら、この試みの成功は多くはない。
【０００７】
したがって、より効果的に、安全であり、効率的なT細胞関連悪性腫瘍を標的としたキメラ抗原レセプターに基づく治療方法を向上させる必要性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国仮特許出願第62/121,842号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kochenderfer、Wilsonら、2010
【非特許文献２】Kalos、Levineら、2011
【非特許文献３】Porter、Levineら、2011
【非特許文献４】Davila、Riviereら、2013
【非特許文献５】Grupp、Freyら、2013
【非特許文献６】Grupp、Kalosら、2013
【非特許文献７】Kalos、Nazimuddinら、2013
【非特許文献８】Kochenderfer、Dudleyら、2013
【非特許文献９】Kochenderfer、Dudleyら、2013
【非特許文献１０】Lee、Shahら、2013
【非特許文献１１】Park、Riviereら、2013
【非特許文献１２】Maude、Freyら、2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は血液悪性腫瘍に対するキメラ抗体受容体(CARs)の構成およびその使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この実施例では、本開示はシグナルペプチド、CD2抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００１２】
別の実施例では、本開示は、シグナルペプチド、CD3抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００１３】
別の実施例では、本開示は、シグナルペプチド、CD4抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００１４】
別の実施例では、本開示は、シグナルペプチド、CD5抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００１５】
別の実施例では、本開示は、シグナルペプチド、CD7抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００１６】
別の実施例では、本開示は、シグナルペプチド、CD8抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００１７】
別の実施例では、本開示は、シグナルペプチド、CD52抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００１８】
この実施例では、本開示はCD2を選択的に認識する抗原ドメインを有するキメラ抗体受容体ポリペプチドをコードする遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００１９】
別の実施例では、本開示は、CD3を選択的に認識する抗原ドメインを有するキメラ抗体受容体ポリペプチドをコードする遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００２０】
別の実施例では、本開示は、CD4を選択的に認識する抗原ドメインを有するキメラ抗体受容体ポリペプチドをコードする遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００２１】
別の実施例では、本開示は、CD5を選択的に認識する抗原ドメインを有するキメラ抗体受容体ポリペプチドをコードする遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００２２】
別の実施例では、本開示は、CD7を選択的に認識する抗原ドメインを有するキメラ抗体受容体ポリペプチドをコードする遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００２３】
別の実施例では、本開示は、CD8を選択的に認識する抗原ドメインを有するキメラ抗体受容体ポリペプチドをコードする遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００２４】
別の実施例では、本開示は、CD52を選択的に認識する抗原ドメインを有するキメラ抗体受容体ポリペプチドをコードする遺伝子改変されたキメラ抗体受容体ポリペプチドを提供する。
【００２５】
別の実施例では、本開示は、上記のいかなるキメラ抗原レセプターポリペプチドを発現するように操作された細胞を提供する。
【００２６】
別の実施例では、本開示は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、またはCD52に対して選択的な抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現する操作された細胞を作製する方法を提供する。以下の方法も含まれる、（i）末梢血細胞または臍帯血細胞の提供する方法、（ii）前述のポリヌクレオチドを前記の細胞に導入する方法、（iii）工程（ii）における細胞を増殖させる方法、また工程（iii）の細胞を単離して前述における操作された細胞を提供する方法。
【００２７】
別の実施例では、本開示は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、またはCD52に対して選択的な抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現する操作された細胞を作製する方法を提供する。以下の方法も含まれる、（i）胎盤細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または造血幹細胞を提供する方法、（ii）前述のポリヌクレオチドを前記の細胞に導入する方法、（iii）工程（ii）における細胞を増殖させる方法、また（iv）工程（iii）から細胞を単離して前述における操作された細胞を提供する方法。
【００２８】
この実施例では、本開示は、CD4陽性T細胞白血病またはCD4陽性T細胞リンパ腫に対し、抗白血病または抗リンパ腫免疫を付与する方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）この治療を必要とする患者に、効果的な量のCD4抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現させた細胞を投与すること、また（ii）場合により、患者におけるT細胞白血病またはT細胞リンパ腫に対する免疫性を測定すること。
【００２９】
別の実施例では、本開示は、CD4陽性T細胞白血病細胞またはCD4陽性T細胞リンパ腫細胞の数を減少させる方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）CD4陽性T細胞白血病細胞またはCD4陽性T細胞リンパ腫細胞を、効果的な量のCD4抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞と接触させること、また（ii）場合により、CD4陽性T細胞白血病細胞またはCD4陽性T細胞リンパ腫細胞を測定すること。
【００３０】
別の実施例では、本開示は、CD2抗原を有する免疫制御細胞の数を減少させる方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）前記免疫調節細胞を効果的な量のCD2抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞と接触させること、また（ii）場合により、免疫制御細胞の数の減少を測定する。
【００３１】
別の実施例では、本開示は、CD3抗原を有する免疫制御細胞の数を減少させる方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）前記免疫調節細胞を効果的な量のCD3抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞と接触させること、また（ii）場合により、免疫制御細胞の数の減少を測定する。
【００３２】
別の実施例では、本開示は、CD4抗原を有する免疫制御細胞の数を減少させる方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）前記免疫調節細胞を効果的な量のCD4抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞と接触させること、また（ii）場合により、免疫制御細胞の数の減少を測定する。
【００３３】
別の実施例では、本開示は、CD5抗原を有する免疫制御細胞の数を減少させる方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）前記免疫調節細胞を効果的な量のCD5抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞と接触させること、また（ii）場合により、免疫制御細胞の数の減少を測定する。
【００３４】
別の実施例では、本開示は、CD7抗原を有する免疫制御細胞の数を減少させる方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）前記免疫調節細胞を効果的な量のCD7抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞と接触させること、また（ii）場合により、免疫制御細胞の数の減少を測定する。
【００３５】
別の実施例では、本開示は、CD8抗原を有する免疫制御細胞の数を減少させる方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）前記免疫調節細胞を効果的な量のCD8抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞と接触させること、また（ii）場合により、免疫制御細胞の数の減少を測定する。
【００３６】
別の実施例では、本開示は、CD52抗原を有する免疫制御細胞の数を減少させる方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）前記免疫調節細胞を効果的な量のCD52抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞と接触させること、また（ii）場合により、免疫制御細胞の数の減少を測定する。
【００３７】
この実施例では、本開示は、細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）治療への効果的な量のCD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、またはCD52抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞を必要とする患者に投与する。
【００３８】
この実施例では、本開示は、自己免疫疾患を治療する方法を提供する。以下の方法等が含まれる、（i）治療への効果的な量のCD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、またはCD52抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞を必要とする患者に投与する。
【００３９】
この実施例では、本開示は、細胞増殖性疾患の治療に使用するために、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、またはCD52抗原認識ドメインを有するCARポリペプチドを発現する操作された細胞を提供する。この使用は、操作された細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【００４０】
いくつかの実施例では、一般的にCARは、細胞内シグナル伝達、ヒンジおよび/または膜貫通ドメインの少なくとも1つを含む。第1世代CARは、細胞内シグナル伝達ドメインとしてCD3zを含むが、一方、第2世代CARは、例えば、CD28または4-1BBのように特に限定されない単一の共刺激ドメインを持つ。第3世代CARには、CD28、4-1BB（CD137としても知られている）およびOX-40、そして他の共刺激分子など、特に限定されないなどの2つの共刺激ドメインを含む。
【００４１】
いくつかの実施例では、CARに発現されるCD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、またはCD52抗原認識ドメイン は、発現カセットの一部に存在する。好ましい実施例では、アクセサリー遺伝子またはタグまたはその一部を発現遺伝子またはカセットに含む。アクセサリー遺伝子は自殺誘導遺伝子あるいはカスパーゼ9遺伝子に限らずそれら一部であるかもしれない。「自殺遺伝子」のようなアブレーションアプローチは遺伝子療法の安静を向上させ、特定の化合物または分子によって活性化された場合にのみ細胞を死滅させる。いくつかの実施例では、c-mycタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（SBP）、短縮型EGFR遺伝子（EGFRt）またはその一部のようなあるいはそれらの組み合わせであるエピトープタグ である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】CD４CARの発現。（A）CD4CARをコードする組換えレンチウイルスベクターの模式図。CD4CAR発現は、SFFV（脾臓フォーカス形成ウイルス）プロモーターによって誘導される。第3世代のCD4 CARは、リーダー配列、CD4scFv、ヒンジドメイン（H）、膜貫通ドメイン（TM）および、次のような細胞内シグナル伝達ドメイン、CD28,  4-1BB（両方とも共刺激分子）およびCD3ゼータ (CD3zeta)を含む。（B）293FT細胞に、GFP（レーン1）およびCD4CAR（レーン2）のレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトし、その 48時間後にマウス抗ヒトCD3z抗体を用い、ウエスタンブロット分析を用い CD4CAR （レーン2）の発現を確認した。（C）CD4発現細胞を標的とする第3世代のキメラ抗原受容体発現T細胞の構成要素の図解。
【図２】CD4CAR T細胞の作製。（A）実験計画の略図。（B）UCB (umbilical cord blood) 軟膜細胞を抗CD3抗体およびIL-2で2日間活性化した。GFP（中）またはCD4CAR（右）レンチウイルス上清のいずれかで細胞を形質導入した。7日間のインキュベーション後、細胞を、ビオチンと結合したヤギ抗マウスFab2またはヤギIgG抗体を用い、その後ストレプトアビジン-PEで処理を用い、フローサイトメトリーによって分析した。（C）非形質導入CB細胞は左に示されている。CD4CAR T細胞は、T細胞増殖中にCD4 +細胞集団を枯渇させる。CB軟膜細胞を、抗CD3抗体およびIL-2を用い2日間活性化させた。CBバフィコート T細胞は、CD8 +細胞傷害性T細胞およびCD4 +ヘルパーT細胞の2つのサブセット（左）を含む。GFP（中）またはCD4CAR（右）レンチウイルス上清を用い、細胞を形質導入した。培養3日後、マウス抗ヒトCD4（FITC）およびCD8（APC）抗体を用い、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。非形質導入PMBCもまた抗体を用い標識した（左）。（D）ほとんどのCD4CAR T細胞は、セントラルメモリーのような表現型を有する。CB軟膜細胞を抗CD3抗体で2日間活性化した。細胞にCD4CARレンチウイルス上清を形質導入した。6日間の増殖後、CD62L、CD45ROおよびCD45RA表現型を解析するため、CD8 +細胞をフローサイトメトリー（N = 3）によって表現型について分析した。
【図３】CD4CAR T細胞は、共培養アッセイにおいてT細胞白血病細胞を除去する。（A）CD4CAR T細胞は、共培養においてKARPAS 299 T細胞白血病細胞を排除する。GFP（中央）またはCD4CAR（右）レンチウイルス上清のいずれかを用い形質導入を行った活性化したヒトCBバフィコート細胞とKARPAS 299細胞とを2：1の割合でインキュベートした。24時間の共培養後、細胞をマウス抗ヒトCD4（APC）およびCD8（PerCp）抗体で染色し、T細胞サブセット（N = 3）の割合をフローサイトメトリーで分析した。（B）および（C）CD4CAR T細胞は、共培養において初代T細胞白血病細胞を除去する。GFP（中央）またはCD4CAR（右）レンチウイルス上清のいずれかを用い形質導入を行った活性化したヒトCBバフィコート細胞とセザリー症候群(Sezary Syndrome)（B）およびPTCL（C）の原発性T細胞白血病細胞と2：1の割合でインキュベートした。共培養の24時間後、マウス抗ヒトCD4（FITC）およびCD8（APC）抗体（N = 3）を用いたフローサイトメトリーにより細胞を分析した。（左）はヒト初代細胞のみが標識されるのを示している。（D）CD4CAR T細胞は、CD4陰性リンパ腫細胞（SP53、B細胞リンパ腫細胞株）を溶解させることができなかった。GFP（中央）またはCD4CAR（右）レンチウイルス上清のいずれかで形質導入された活性化ヒトCBバフィコート細胞を、膜色素CMTMRを用いてプレ染色したSP53マントル細胞リンパ腫細胞と共に2：1の比でインキュベートした。24時間の共培養後、細胞をマウス抗ヒトCD3（PerCp）で染色し、次いでフローサイトメトリー（N = 2）で分析した。CMTMRで予備染色したSP53細胞のみを標識した（左）。
【図４】PBMCに由来するCD4CAR T細胞は、CD8 + T細胞の割合が高く、特異的にCD4発現白血病細胞株を死滅させる。（A）PBMCに由来するCD4CAR T細胞は、CD8 + T細胞の割合が非常に高い。PMBC軟膜細胞のT細胞はCD8 +およびCD4 +（左）細胞で構成され、抗CD3抗体およびIL-2で2日間活性化した後、次いでGFP（中央）またはCD4CAR（右）レンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。3日の培養後、細胞を標識し、フローサイトメトリーを用いることでT細胞サブセットの分析を行った。非形質導入PMBCもまた標識した（左）。（B）CD4CAR T細胞はKARPAS 299細胞を特異的に死滅させる。コントロールとしてのGFP またはCD4CARレンチウイルス上清のいずれかを形質導入したPMBC T細胞を、CFSEで染色したKARPAS 299とそれぞれ2：1、5：1および10：1の比でインキュベートした。37℃で一晩インキュベートした後、色素7AADを加え、細胞をフローサイトメトリーで分析した。標的細胞の死滅率は、ネガティブコントロール細胞（SP53細胞、CMTMRで染色したB細胞リンパ腫細胞株）の生存率に対する標的細胞の生存率を比較することによって測定した。
【図５】CD4CAR T細胞は、異なる形式のin vivoモデルで抗白血病効果を効果的に示す。NSGマウスは、2.5Gyの致死量以下の照射を受けた。照射の24時間後、マウスに、1×106（A）または0.5×106（BおよびC）細胞数のKARPAS 299細胞を皮下注射した。細胞を注射したマウスに対し、CD4CAR T細胞またはコントロールT細胞を用い異なるコースおよびスケジュールで処置を行った。N = 5 ずつ各グループのマウスに注射した。（A）では、低用量の2×106数のCD4CAR T細胞を、3日目に注射し、続いて、腫瘍増殖の加速が観察された後の、22日目に大量、8×106のCD4CAR T細胞を注射した。（B）２回に及んで、3日目に8×106および10日目に5.5×106の数の大量のCD4CAR T細胞を注射した。（C）低用量（2.5×106）のCD4CAR T細胞を5日ごとに合計4回投与した。（D）CD4CAR T細胞またはコントロールGFP T細胞で処置したマウスの全生存率マウスの生存率をされた。N = 10。
【図６】CD4CAR のHEK-293細胞の表面上での発現。HEK-293細胞にCD4CARまたはGFPコントロールウイルス上清を用い6時間にわたり形質導入をおこなった。その後、3日間のインキュベーションを行い、CD4CARの細胞上での発現をフローサイトメトリーによって解析した。
【図７】レンチ-GFPおよびCD4CARウイルスを用いて形質導入された活性化PMBCバフィコート細胞間の細胞増殖の比較。活性化されたPMBC軟膜細胞を用い、GFPコンタロールまたはCD4-CARレンチウイルス上清のいずれかで形質導入した（0日目）。その後、1日目に細胞を洗浄し、3および5日目に培地を加えた。
【図８】CD4CARの構成。（A）脾フォーカス形成ウイルス（SFFV）プロモーターによって発現させる第3世代CD4CARをコードするレンチウイルスベクターの模式図。この構成は、リーダー配列、抗CD4 scFv、ヒンジドメイン（H）、膜貫通（TM）およびシグナル伝達ドメインCD28,4-1BBおよびCD3ゼータ(CD3 zeta) を含む。（B）HEK293FT細胞に、GFPベクターコントロール（レーン1）およびCD4CAR（レーン2）レンチウイルスプラスミドをトランスフェクトさせた。トランスフェクション48時間後に細胞を回収し、続いてマウス抗ヒトCD3z抗体を用いたウエスタンブロット解析に使用した。（C）CD4発現細胞を標的とする第3世代CAR NK細胞の図解。
【図９】CD4CAR NK細胞の作製。（A、上部パネル）FACS（N = 3）によって選別される前のNK細胞上のCD4CAR発現レベル。（A、下のパネル）共培養実験（N = 3）の前に、選別および増殖後のNK細胞上のCD4CAR発現状態。
【図１０Ａ】CD4 CAR NK細胞は、共培養アッセイにおいてCD4 +白血病およびリンパ腫細胞を除去する。共培養実験がエフェクターと標的との割合が2：1で24時間実施され、CD56およびCD4をマーカーとし、フローサイトメトリーによって解析した（パネルAおよびB）。各アッセイは、標的細胞のみ（左）および標的細胞並びにベクターコントロール（中央）または標的細胞並びにCD4CAR（右）レンチウイルス上清で形質導入したNK細胞と共にインキュベートした結果からなる。上段、パネルA：Karpas 299（N = 3）。中段、パネルA：HL-60T細胞（N = 2）。下段、パネルA：CCRF-CEM細胞（N = 2）。CD4CAR NK細胞は、CD4 + T細胞リンパ腫/セザリー症候群（N = 2）およびCD4発現小児T細胞ALL（N = 2）の患者由来の初代T細胞白血病細胞を除去した。
【図１０Ｂ】CD4 CAR NK細胞は、共培養アッセイにおいてCD4 +白血病およびリンパ腫細胞を除去する。共培養実験がエフェクターと標的との割合が2：1で24時間実施され、CD56およびCD4をマーカーとし、フローサイトメトリーによって解析した（パネルAおよびB）。各アッセイは、標的細胞のみ（左）および標的細胞並びにベクターコントロール（中央）または標的細胞並びにCD4CAR（右）レンチウイルス上清で形質導入したNK細胞と共にインキュベートした結果からなる。
【図１０Ｃ】（C）棒グラフは上記の2：1および5：1 E：T比の共培養アッセイ結果をまとめたものである。
【図１１】共培養における特異性および用量依存的死滅曲線。CD4CAR NK細胞は、CD4発現白血病細胞株を用量依存的かつ特異的に溶解する。CD4CAR NKおよびベクターコントロールNK細胞を、CFSEで染色したオンターゲットである（Karpas 299またはCCRF-CEM）細胞およびCMTMRで染色したオフターゲットであるMOLT4細胞とエフェクター細胞対標的細胞比 (E/T比) 1：4、1：2そして1:1で共培養を行った。24時間後、7-AAD色素を添加し、残りの生細胞をフローサイトメトリーで分析した。CD4CAR NKによる標的細胞であるCD4 + Karpas299またはCCRF-CEMに対する 殺傷率はベクターコントロールNK細胞との共培養の結果と比較した結果導かれた。
【図１２】CD4CAR NK細胞は、エフェクター細胞対標的細胞比 (E/T比) 2：1でヒト臍帯血から単離されたCD4 + T細胞を排除するが、造血幹細胞/前駆細胞の分化には影響しない。（A）共培養アッセイを、エフェクター細胞対標的細胞比2：1で24時間行った後、細胞をマウス抗ヒトCD56およびCD4抗体で染色した。（左）は標的細胞を単独でインキュベートした結果を示す。ヒト臍帯血から得られたCD4 + T細胞をレンチウイルス上清により形質導入したコントロールNK細胞（中央）あるいはCD4CARを形質導入したNK細胞（右）とともにインキュベートした。（N = 2）（B）CD4CAR NK細胞を、IL-2を補充したNK細胞培地中で、CD34 +臍帯血細胞500個をそれぞれ2：1および5：1の共培養エフェクター：標的比で24時間インキュベートした。使用した実験対照は、CD34 +細胞単独であり、非形質導入NK細胞は、CD34 + CB細胞とそれぞれ2：1および5：1のエフェクター：標的比で共培養した。造血細胞分化は、16日目に赤血球バースト形成単位（BFU-E）および顆粒球/単球コロニー形成単位（CFU-GM）の数を介して評価した。CFU統計分析は、2-way ANOVA with alpha set at 0.05.を用いた。
【図１３】CD4CAR NK細胞はin vivoで抗白血病効果を示す。致死量以下の照射を受けたNSGマウスに、腫瘍形成を誘導するためにルシフェラーゼ発現Karpas 299細胞を皮下注射した（0日目）。1日目および各5日おきに合計6回におよび、5×106個のCD4CAR NK細胞またはベクターコントロールNK 細胞をマウスに静脈注射した。（A）7日目、14日目、および21日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングによる解析を行った。（B）CD4CAR NK並びベクターコントロールNK 細胞を注入したマウスの平均光強度の比較（C）1日目および1日おきにの腫瘍サイズの測定および2つのグループ間の平均腫瘍サイズを比較した。（D）2つのグループ間のマウスの生存率を比較した。
【図１４】CD4 CAR NK細胞は、共培養アッセイにおいてCD4陽性白血病およびリンパ腫細胞を除去する。すべての共培養アッセイはエフェクター細胞対標的細胞比 5：1で24時間行った、その後、細胞をマウス抗ヒトCD56およびCD4抗体で染色した。各アッセイは、ベクターコントロール（中心）またはCD4CAR（右）レンチウイルス上清のいずれかを形質導入したNK細胞で、標的細胞と共にインキュベートし、同様に対照群として標的細胞のみ単独でインキュベートした （左）データからなる。（A）CD4CAR NK細胞は、Karpas 299白血病T細胞、（B）HL-60 T細胞および（C）CCRF-CEM細胞を除去した。CD4CAR NK細胞は、CD4発現T細胞白血病/セザリー症候群（E）およびCD4発現小児T細胞急性リンパ芽球性白血病(TALL（F）を有する患者由来の初代T細胞白血病細胞 (T-cell ALL)を排除した。
【図１５】NK細胞を、ベクターコントロールまたはCDCARレンチウイルス上清のいずれかで形質導入した、または非形質導入コントロール細胞を培養した。7日間のインキュベーション後、細胞を回収し、ビオチン標識ヤギ抗マウスF（Ab'）2、および続いてストレプトアビジン-PEでを用いて標記し、フローサイトメトリーによって分析した。CD4CAR NK細胞はソーティング後に 85％以上がCD4CAR +細胞であった。
【図１６】CD4CAR NK細胞は、CD4-、CD5+のMOLT4細胞を溶解しなかった。（A）MOLT4細胞の免疫表現型は、ほぼすべてがCD4+およびCD5+であることが確認された。（B）CD4CAR NK細胞（下のパネル）は、ベクターコントロールのNK細胞（上パネル）と比較し、エフェクター細胞対標的細胞比5：1の条件で0時間、4時間、8時間、および24時間で違いが見られなかった。（C）抗CD4 CDCAR NK抗腫瘍活性は、CD4 + Karpas 299陽性対照を用いて5：1のE：T比、4時間の共培養実験で確認された。
【図１７Ａ】CD5CARの産生。A. CD5CARおよびAnchored CD5 scFvのDNA遺伝子構造 および翻訳されたタンパク質築構造、およびCD5CARの機能と創造を示す図案。第3世代のCD5CAR構築物のDNA構造は5 'から3'末端にかけ、リーダー配列、抗CD5細胞外一本鎖可変断片（抗CD5 ScFv）、ヒンジ領域 (Hinge)、膜貫通領域 (TM)、および第3世代CARと定義する3つの細胞内シグナル伝達ドメイン; CD28、4-1BBおよびCD3ζからなる。Anchored CD5 scFv抗体のDNA構造は、細胞内シグナル伝達ドメインを有さないCD5CAR構造と同様である。翻訳されたタンパク質構造は、標的であるCD5に結合する抗CD5 ScFv 領域 、抗CD5 ScFvが最適な 位置でターゲットとの結合を可能にするのに適切な位置付けを可能にするヒンジ領域 、および膜貫通領域を含む。完全なCD5CARタンパク質はまた、2つの共刺激ドメインおよび細胞内ドメインであるCD3ゼータ鎖も含む。この構造は、CD28、4-1BB、およびCD3ζをもつ第3世代のCARとみなされる。
【図１７ＢＣ】CD5CARの産生。B. HEK293細胞におけるCD5CAR発現はウエスタンブロット解析により示す。CD5CAR発現を確認するため、GFP（ネガティブコントロール）またはCD5CARレンチウイルスをHEK293細胞に48時間におよび形質導入し、CD3z抗体を用いてウエスタンブロット解析をした。左レーンはGFPを用いたネガティブコントロールで、期待されるバンドは存在しない。右のレーンは約50kDaのバンドを示し、分子量はCD5CAR構造に基づいて予測されたものである。C. フローサイトメトリー によるレンチウイルス形質導入CD5CAR T細胞のT細胞表面上でのCD5CAR発現の解析 。この分析は、２度の形質導入を行い、2回目のレンチウイルス形質導入後8日目のCD5CAR T細胞に対して行った。左：アイソタイプコントロールのT細胞集団（ネガティブコントロール）、右：ヤギ抗マウスF（AB'）2-PEを用いたフローサイトメトリーにより20.53％を示すCD5 CARがT細胞上に発現するしていることを示す。
【図１８ＡＢ】CD5CAR T細胞の形質導入の研究概要。A. １度の形質導入によるCD5 CAR T細胞の生成。B. ２度の形質導入によるCD5 CAR T細胞の生成。
【図１８Ｃ】C. CD5 CARレンチウイルスを用いた、１度あるいは２度の形質導入によるT細胞上の表面に発現しているCD5 のダウンレギュレーションの比較。GFP T細胞と比較した、レンチウイルス形質導入後8日にわたる細胞外CD5タンパク質のダウンレギュレーションの分析。一度の形質導入によるCD5CAR T細胞は、8日目までの期間には細胞表面からのCD5の完全なダウンレギュレーションを示さず、6日目にCD5タンパク質発現がもっとも低下していた。２度の形質導入 では、私たちは、0日目の24.44％から４日目の完全に近いCD5 +、CD3 +二重陽性CD5CAR T細胞の減少に気づいた。 対照的に、GFP T細胞対照は、CD5 +、CD3 +二重陽性集団を2日目から8日目まで95％を上回って維持している。
【図１９】anchored CD5 scFv抗体のレンチウイルス形質導入後の7日後でのT細胞におけるCD5発現のダウンレギュレーション。A.一度の形質導入法による、anchored CD5 scFvレンチウイルスの形質導入。B. anchored CD5 scFvは、T細胞上の表面CD5発現の量を下方制御または減少させる。フローサイトメトリーによる解析で一度のCD5 scFvの 形質導入および、その後7日間のインキュベーションを行うことでCD5タンパク質発現量の（〜32％）の有意な減少を示した。CD5発現の消失が観察されるが、7日後では完全には無くならず、現在、２度におけるanchored CD5 scFv抗体の形質導入による追跡実験が現在完了中である。
【図２０】CD5CAR細胞は、CD5を発現するT-ALL細胞株を効果的に溶解し、CD5を発現しないT白血病細胞株を溶解しない。A. フローサイトメトリーによる、T-ALL細胞株の単独培養（左欄）、GFPベクター形質導入T細胞とT-ALL細胞株との共培養（中段）およびCD5CAR形質導入T細胞とT-ALL細胞株との共培養（右列）での分析。各列にはそれぞれの細胞株名が書かれ、CD5 + T-ALL細胞系統が上段と中段（CCRF-CEMとMolt-4）にCD5陰性細胞株が下段に（KARPAS 299）が見られる。KAEPAS 299は、CD5陰性T細胞リンパ腫である。すべての共培養のインキュベーションタイムは24時間であり、エフェクター：標的細胞比は5：1であった。GFPコントロール細胞と比較して、CD5 T ALL白血病細胞株の両方について細胞溶解度は両法とも78％を超えていた。B.この棒グラフは、図20Aで示されるGFP T細胞との共培養と比較した場合のCD5CAR T細胞によるT細胞溶解度を示す。図20 CD5陰性であるKARPAS 299細胞とのCD5 CAR T細胞共培養では溶解はみられなかった（n = 3回の独立した重複実験を行った）。
【図２１ＡＢ】CD5CAR細胞は、CD5を発現する患者サンプル由来のT細胞急性リンパ芽球性白血病細胞を効果的に溶解する。A. フローサイトメトリーによるT-ALL細胞のみ（左カラム）、GFP T細胞とT-ALL細胞との共培養（中段）およびCD5CAR T細胞とT-ALL細胞とのの共培養（右列）における分析結果。各患者の細胞ごと列が与えられ、患者の機密性を維持するために番号が付けられている。すべての共培養のインキュベーションタイムは24時間であり、エフェクター：標的細胞比は5：1であった。GFPコントロールと比較した細胞溶解度はT-ALL -1について71.3％以上であった。残りの細胞株も同様にCD5陽性細胞溶解を示したが、より低い程度で33-47％であった。この結果は、後述する各白血病サンプルのCD5発現に関連している可能性がある。B. この棒グラフは、図2１Aで示されるGFP T細胞との共培養と比較した場合のCD5CAR T細胞によるT細胞溶解度を示す。全ての実験は重複実験を行った。
【図２１Ｃ】C. フローサイトメトリーにより、図21Aで用いられた患者からのT cell ALLのCD3およびCD5発現レベルを分析。我々は、T-ALL-1およびT-ALL-3についてCD5陽性違いをを観察する。
【図２１Ｄ】D. フローサイトメトリーによる4人の患者サンプルT-ALL細胞集団のCD5発現レベルの分析。フローサイトメトリー解析によって平均蛍光強度（MFI）の差を決定した（図21C）。
【図２２】患者T-ALL細胞（T-ALL-8）のCD5CAR T細胞殺傷能力の詳細な分析。フローサイトメトリー解析による、CD5CAR T細胞での患者由来のT-ALL細胞に対する死滅能力の実証。コントロールGFP-T細胞とT-ALL-8細胞の共培養結果が左側で、T-ALL-8とのCD5CAR共培養による結果が右側に見られる。すべてのCD5陽性細胞でありCD34陽性（（赤色で囲んだもの）あるいはCD34陰性（緑色で囲んだもの、T細胞）の両方を溶解し、CD5陰性細胞については溶解が見られなかったことを我々は認める。GFPコントロールと比較した場合、CD5CAR T細胞は、CD5陽性T-ALL-8細胞の最低でも93.1％を溶解する。実験は二重に行った。さらに、CD5CAR T細胞は本質的にT細胞集団（緑色で囲まれたCD5 + CD34-）をも排除する。
【図２３】CD5CAR T細胞は、正常なGFP標識T細胞を効果的に除去する。A、CD5CAR T細胞は、量依存的に正常T細胞を死滅させる。CD5CAR T細胞またはCD123CAR T細胞（コントロール）を、0.25：1、0.5：1、および1：1エフェクター：標的細胞比でGFP標識T細胞と共培養した。24時間後、残りの生存GFP T細胞をフローサイトメトリーにより解析した。T細胞はCD123を発現しないので、コントロールであるCD123CAR T細胞と比較して、CD5 CAR T細胞との共培養におけるGFP T細胞生存を比較することにより、標的細胞に対する死滅能力（パーセント）を測定した。B、Aからのデータに基づくCD5 CAR T細胞による殺傷曲線。
【図２４Ａ】CD5CARまたはanchored CD5 scFv T細胞とT細胞を共培養した場合、T細胞はCD5発現を維持した。A、CD5CAR T細胞またはanchored CD5 scFv T細胞およびコントロールCD123 CAR T細胞の作製方法。
【図２４Ｂ】B、異なるCAR形質導入後のT細胞上のCD5発現レベル（2度の形質導入後の3日目）。活性化T細胞にCD5CARまたはanchored CD5 scFvおよびCD123CARを発現するレンチウイルスをそれぞれ形質導入した。形質導入の後3日後に、CD5発現をフローサイトメトリーにより分析した。
【図２５ＡＢ】正常なT細胞と、CD5CARまたはanchored CD5 scFv T細胞またはCD123CAR（コントロール）と2日間（図25A）または4日間（図25Ｂ）共培養したときに、正常なT細胞がCD5発現を維持するかどうかを決定するために、1：1の比で共培養した。CD5CAR T細胞またはanchored CD5 scFv T細胞またはCD123CAR T（対照）細胞をGFP標識T細胞と共にインキュベートし、次いで共培養したGFP標識T細胞をフローサイトメトリーによりCD5発現状態および細胞の生存について分析した。
【図２５Ｃ】C（図25C）、CD5CAR-またはanchored CD5 scFvを形質導入させたCCRF-CEMまたはMolt-4T ALL細胞は、CD5発現のダウンレギュレーションを示した。CCRF-CEMまたはMolt-4 T ALL細胞に、CD5CARまたはanchored CD5 scFvを発現するレンチウイルスを形質導入した。2回目の形質導入後、形質導入された白血病細胞をフローサイトメトリーによりCD5発現について分析した。
【図２６Ａ】CD5CAR T細胞は、in vivoで大きな抗白血病効果を示す。致死量以下の照射を受けたNSGマウスに、24時間後、測定可能な腫瘍形成を誘導するため、1×106個のルシフェラーゼ発現CCRF-CEM細胞（0日目）を静脈から注射した。3日目および4日目に、5×106 CD5CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞をマウスに静脈注射した。これらの注射を6日目と7日目に繰り返し、1マウスあたり合計2.0×107細胞を注入した。A、5日目、8日目、10日目および13日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングで解析した。
【図２６Ｂ】B、CD5CAR Tを注射マウス及びベクターコントロールT細胞を注入したマウスでの平均光強度を比較した。
【図２６Ｃ】C、コントロールと比較してCD5CAR T細胞で処置したマウスでの腫瘍細胞の殺傷率の比較。
【図２６Ｄ】D、15日目にベクターコントロールまたはCD5CAR T細胞を注射したマウスから末梢血を採取し、それぞれの白血病細胞の残存率を決定比較した。
【図２７Ａ】CD5 CAR NK細胞（NK-92）は、in vitroでCCRF-CEM T-ALL細胞を効果的に除去する。AおよびB、CD5を発現するTリンパ芽球細胞株CCRF-CEMを以下のE：T（エフェクター：標的）細胞比でCD5 CAR NK細胞と24時間共培養した。標的集団をフローサイトメトリーで定量化するため、CD56およびCD5抗体を用い、NK-CARおよび標的細胞集団をそれぞれ分離、定量化した。各棒グラフは形質導入されたベクターコントロールNK細胞と比較した標的細胞の細胞溶解率を示し、N = 2回の重複実験の平均統計を示す。
【図２７Ｂ】AおよびB、CD5を発現するTリンパ芽球細胞株CCRF-CEMを以下のE：T（エフェクター：標的）細胞比でCD5 CAR NK細胞と24時間共培養した。標的集団をフローサイトメトリーで定量化するため、CD56およびCD5抗体を用い、NK-CARおよび標的細胞集団をそれぞれ分離、定量化した。各棒グラフは形質導入されたベクターコントロールNK細胞と比較した標的細胞の細胞溶解率を示し、N = 2回の重複実験の平均統計を示す。
【図２７Ｃ】C、CD5CAR NK細胞は、CCRF-CEM細胞を用量依存的に除去する。CD5を発現するCCRF-CEMを、示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比でCD5CAR NK細胞と共培養しさせた。2：1のE：T比で溶解率は飽和され、より少ない比率で共培養すると、用量依存的にCD5を発現するCCRF-CEMが排除される。CCRF-CEMの完全な除去は5：1比で達成された。
【図２８Ａ】CD5CAR NK細胞は、2つのCD5 + T-ALL系統、MOLT-4およびJurkatを効果的に溶解する。A、CD5CAR NK細胞を、示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比で24時間、MOLT-4細胞と共培養した。標的細胞生存率は、形質導入されたベクターコントロールNK細胞と比較して表され、各棒グラフは、N = 2回の重複実験の平均統計を示す。
【図２８Ｂ】B、CD5CAR NK細胞を、示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比で24時間Jurkat細胞と共培養する。標的細胞生存率は、形質導入されたベクターコントロールNK細胞と比較して表され、各棒グラフは、N = 2回の重複実験の平均統計を示す。
【図２９Ａ】CD5CAR NK細胞は、ヒト患者ゆらいの高悪性度のCD5 + T-ALL細胞を効果的に除去する。A、患者からのT-ALL細胞（T-ALL＃1）を、指示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比でCD5CAR NK細胞と共に24時間共培養した。
【図２９Ｂ】B、患者からのT-ALL細胞（T-ALL＃２）、指示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比でCD5CAR NK細胞と24時間共培養した。T-ALL患者サンプルをスクリーニングするために細胞サイトトラッカー色素（CMTMR）を用いたフローサイトメトリーで標的集団を仕分けし、定量した。データは重複実験の平均統計値を表す。標的CD5 + CD34 +細胞の割合をコントロールに対してゲーティングした。標的細胞生存率は、形質導入されたベクターコントロールNK細胞と比較して表され、各棒グラフとして示す。左から右へかけ、棒グラフは、それぞれの比率の左側にCD34 + CD5 +および右側にCD5 + cd34-のデータを示す。CD5CAR NKは、低CD5 + CD34 +発現腫瘍幹細胞集団と比較し、高度にCD5 +発現する標的集団に対するほぼ完全な溶解を示す。2：1の比でほほ溶解率の飽和が達成され、これはE：T比の希釈の必要性を意味する。
【図２９Ｃ】図29Cにおいて、患者＃3（PTCL）および患者＃4（セザリー症候群、Sezary Syndrom）からの白血病細胞を、示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比でそれぞれ24時間、CD5CAR NK細胞と共培養した。
【図２９Ｄ】図29Dにおいて、患者＃3（PTCL）および患者＃4（セザリー症候群、Sezary Syndrom）からの白血病細胞を、示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比でそれぞれ24時間、CD5CAR NK細胞と共培養した。
【図３０】CD5NK-CARは、臍帯血T細胞を特異的に除去する。T細胞を臍帯血（UCB）T細胞から単離し、示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比で24時間CD5CAR NK細胞と共培養する。CD56およびCD5抗体を用いたフローサイトメトリー解析で、標的T細胞集団とNK-CARを分離、定量化した。細胞生存率は、形質導入されたベクターコントロールNK細胞に相対して表され、各棒グラフは、重複実験による平均統計値を表す。
【図３１Ａ】CD5CAR NK細胞は、CD5 +マントル細胞リンパ腫および慢性リンパ球性白血病を効果的に排除する。CD5CAR NK細胞を、Jeko細胞（図31A）と共培養した。
【図３１Ｂ】CD5CAR NK細胞を、マントル細胞リンパ腫患者の白血病細胞（図31B）と共培養した。
【図３１Ｃ】CD5CAR NK細胞を、慢性リンパ性白血病患者の白血病細胞（図31C）と共培養した。CD5の主要サブセットを発現するマントル細胞系リンパ腫由来細胞系JeKoを示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比でCD5CAR NK細胞と6時間共培養した。マントル細胞リンパ腫またはCLLについては、共培養を24時間行った。標的集団をゲートし、図に示すようにフローサイトメトリーで定量した。CD5CAR NK細胞は、CD5 + CD19 +白血病集団およびCD5 + CD19-T細胞集団を特異的に標的とする。細胞生存率は、形質導入されたベクターコントロールNK細胞との相対値として表され、各棒グラフは、重複実験の平均統計値を表す。
【図３２】CD5CAR NK細胞共培養実験の結果をまとめた棒グラフ。
【図３３Ａ】CD5CAR NK細胞は、In vivoで強力な抗白血病効果を示す。致死量以下の照射を受けたNSGマウスに、24時間後、1×106個のルシフェラーゼ発現CCRF-CEM細胞（0日目）を静脈注射して、測定可能な腫瘍形成を誘導した。3日目および4日目に、5×106個のCD5CAR NK細胞またはベクター対照NK細胞をマウスに静脈注射した。これらの注射を6日目と7日目にも繰り返し、1マウスあたり合計2.0×107細胞を注入した。A. 5日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングにて解析した。
【図３３Ｂ】B、コントロールと比較したCD5CAR NK細胞で処置したマウスでの死滅させた腫瘍細胞の割合。
【図３４】CD3CARの構成とその発現。A、レンチウイルスベクターにおけるCD3CARの構成の模式図。CARの発現は、SFFV（脾臓フォーカス形成ウイルス）プロモーターによって誘導され、第3世代の構成として、リーダー配列、ヒンジドメイン（H）、膜貫通ドメイン（TM）、CD28および4-BBの2つの共刺激ドメインおよびCD3ゼータ(CD3zeta)の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。B、HEK-293FT細胞に形質導入の48時間後にウエスタンブロット解析のためのGFP（レーン1）およびCD3CAR（レーン2）のレンチウイルスプラスミドを形質導入させ、マウス抗ヒトCD3zeta抗体でプローブした。
【図３５Ａ】CD3CAR NK細胞は、in vitroでCD3発現T-ALL細胞株を除去する。約80％のCD3を発現するTリンパ芽球細胞株Jurkatを、示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比で6時間、CD3CAR NK細胞と共培養した。
【図３５Ｂ】B、ソート（CCRF-CD3）細胞またソートされていないCCRF-CEM（CCRF-CEM）細胞をCD3CAR NK細胞と共に24時間共培養した。標的細胞集団を、NK-CARおよび標的細胞集団からそれぞれ分離させるためCD56およびCD3抗体を用いてフローサイトメトリーで定量した。細胞生存率は、形質導入されたベクターコントロールNK細胞と比較して表され、各棒グラフは、n = ２回の独立した、重複実験の平均統計値を表す。
【図３６Ａ】CD3CAR NK細胞は、患者サンプル由来の原発性CD3 +白血病細胞に対する強力な殺傷能力を示す。A、SPT-1（セザリー症候群）患者の細胞はCD3陽性であり、指示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比でCD3CAR NK細胞と24時間共培養した。標的集団を、NK-CARおよび標的細胞集団からそれぞれ分離するためにCD56およびCD3を用いたフローサイトメトリーで定量した。一方、SPT-1は異種細胞集団であるが、広範におけるCD3 +発現集団はCD3NK-CARによって排除される。
【図３６Ｂ】B、PT4（未分類のPTCL）患者細胞はCD3 + CD7-であり、示されたE：T（エフェクター：標的）細胞比で24時間CD3CAR NK細胞と共培養した。標的集団をゲーティングし、図に示すように定量化した。PT4白血病細胞は、CD3 + CD7-型であり、CD3CAR NK細胞によって効果的に削除される。また、広範におけるCD3 +集団はCD3CAR NK細胞によって影響を受ける。
【図３７】CD3CAR NK細胞は正常なT細胞を予想どおりに溶解することができる。臍帯血から単離した正常なT細胞に、GFPを発現するレンチウイルスで形質導入した。形質導入したGFP T細胞を用いてCD3CAR NK細胞とともに共培養した。2.5％血清を含むNK細胞用培地で共培養実験を実施した。共培養物を24時間インキュベートし、フローサイトメトリー分析のために標識した。CD3CAR NK細胞による標的T細胞を溶解する能力を、共培養後の残留CD3 + GFP T細胞の量を比較することによって評価した。重要なことに、インキュベーション時間の増加に伴い、標的であるCD3 + GFP T細胞は、標的細胞比の5：1の割合の用量で80％を超える効率で溶解されることが示された。
【図３８Ａ】CD3CAR NK細胞は、in vivoで著しい抗白血病効果を示す。A、致死量以下の照射を受けたNSGマウスに、24時間後に、1×106個のルシフェラーゼ発現Jurkat細胞（0日目）を静脈注射して、測定可能な腫瘍形成を誘導した。3日目および4日目に、各 5×106個のCD3CAR NK細胞またはベクターコントロールNK細胞を静脈注射した。これらの注射を6日目および7日目に、そして再び10日目に繰り返し、マウスあたり合計2.5×107個の細胞を注入した。（A）4、7、9および13日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングにて解析した。
【図３８Ｂ】B, CD3CAR NKを注入したマウスとベクターコントロールNK細胞注入マウスにおける測定した平均光強度の比較。
【図３８Ｃ】C、コントロールと比較してCD3CAR NK細胞で処置したマウスでの腫瘍細胞の殺傷率のパーセンテージ。
【図３９】T細胞リンパ腫またはT細胞白血病を標的とするCAR TまたはNK細胞の作製のためのステップ。
【図４０】図40. CD2、CD3、CD5およびCD7を標的とするために、1遺伝子あたり3対のsgRNAをCHOPCHOPで設計する。目的の遺伝子を標的とするために、3対のsgRNAをCHOPCHOPで設計した。次いで、遺伝子特異的sgRNAを、ヒトCas9およびE2A自己切断リンカーと連結したピューロマイシン耐性遺伝子を発現するレンチウイルスベクター（Lenti U6-sgRNA-SFFV-Cas9-puro-wpre）にクローニングした。U6-sgRNAカセットはCas9エレメントの前にある。sgRNAおよびCas9puroの発現は、それぞれU6プロモーターおよびSFFVプロモーターによって誘導される。
【図４１】CRISPR / Cas9レンチウイルスシステムを用いた安定なCD5欠損CCRF-CEMおよびMOLT-4 T細胞の作製。A. ２つの異なるCRISPR/Cas9 KDであるLenti-U6-sgCD5a-SFFV-Cas9puro（sgCD5A）およびLenti-U6-sgCD5b-SFFV-Cas9puro（sgCD5B）をCCRF-CEMT細胞に使用し、その後のピューロマイシン選択実施におけるCD5発現の消失をフローサイトメトリー分析の結果が示す。野生型のコントロールは、最も左側の散布図に見られる。sgRNA CD5Aを用いたCRISPR / Cas9 KD法はCD5タンパク質ダウンレギュレーションをより成功させたので、この集団（青色の円と矢印で示す）をソーティングし、精製した結果を図41Bに示す。B. フローサイトメトリー解析データは、scCD5A CRISPR / Cas9技術を用いて形質導入された純粋に選別された安定なCD5陰性CCRF-CEM細胞のパーセンテージを示す。我々は、CD45陽性CD5陰性CCRF sgCD5A CCRF-CEM T細胞が99％純度以上であることを指摘する。C. ピューロマイシン処理後の2つの異なるsgRNA配列（配列CD5AおよびCD5B、中央および右のカラム）を用いたCRISPR / Cas9 KDを用いたMOLT-4 T細胞におけるCD5発現の消失を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。野生型のコントロールには、最も左側の散布図が見られます。プライマーCD5Aを用いたCRISPR / Cas9 KD法はCD5タンパク質ダウンレギュレーションでを成功させたので、この集団（青色の円と矢印で示す）の選別、精製および図41Dで示すように分析。フローサイトメトリー分析データでは、scCD5A CRISPR / Cas9技術を用いて形質導入され、純粋に選別された安定なCD5陰性MOLT-4細胞のパーセンテージを示す。我々はCD45陽性、CD5陰性MOLT-4 sgCD5A T細胞が99％純度以上の細胞が精製されたことを指摘する。
【図４２】CRISPR / Cas9レンチウイルス系を用いたCCRF-CEM細胞またはNK-92細胞における安定したCD7欠損細胞の作製および細胞選別。sgCD7A（Lenti-U6-sgCD7a-SFFV-Cas9-puro）およびsgCD7B（Lenti-U6-sgCD7b-SFFV-Cas9-puro）を用いたCCRF-CEM（図42AおよびB）またはNK-92（図42CおよびD）における、ピューロマイシン処理後のCD７欠損の割合をCD45およびCD7抗体によるフローサイトメトリー分析によって決定した。図中の挿入の値は、分析中の陽性および陰性発現CD45またはCD7の割合を示した。右のパネルは、sgCD7AまたはsgCD7D CRISPレンチウイルスを用いて形質導入されたCD7陰性細胞から調製されたCCRF-CEM（B）またはNK-92細胞（D）における選別された安定なCD7陰性細胞の百分率純度を示した。
【図４３】CD7CAR NK7--92細胞は、CD7を発現するT細胞ALL細胞株T細胞を効果的に溶解する。自己殺傷を避けるために、CD7欠損NK-92（NK7--92）細胞を作製し、CD7CARを形質導入した。＃Aおよび＃Bの2つ異なるの形質導入されたCD7CAR NK7--92細胞を用いてそれらの殺傷能力をテストした。A、CCRF-CEM細胞単独培養（左カラム）、GFP NK7--92細胞とCCRF-CEM細胞の共培養（中央カラム）および異なるCD7CAR- NK7--92細胞とCCRF-CEM細胞の共培養でのフローサイトメトリー分析#AおよびB＃（右の列）。B、Aから得られたデータに基づく棒グラフである。
【図４４】CD3多量体タンパク質複合体。CD3はタンパク質複合体を含み、上の図に記載されているように4つの異なる鎖から構成される。この複合体は、CD3δ鎖、CD3γ鎖、および2つのCD3ε鎖を含む。これらの鎖は、αβ鎖を構成するT細胞受容体（TCR）と会合する。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本開示は、キメラ抗原受容体（CAR）の構成、方法およびその作製、ならびにCAR構成における使用方法を提供する。
【００４４】
構成
キメラ抗原受容体ポリペプチド
この実施例では、本開示は、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを有するキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドを提供する。
【００４５】
ここで使用される、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は同様な意味で使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基を有する化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むこれら名称に対してアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合された2つ以上のアミノ酸を有する任意のペプチドまたはタンパク質をも含む。本明細書中で使用される、この用語は、短鎖および長鎖ともに言及されており、業界では短鎖はペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと言及され、例えば長鎖はタンパク質として一般に言及されている多くの種類がある。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの改変体、改変ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質含め他様々なものがある。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００４６】
シグナルペプチドは、輸送および局在化を指向するペプチド配列、細胞での任意のいかなる付着ポリペプチド、例えば細胞のある種のオルガネラ（小胞体のような）そしてあるいは細胞表面状に対しての、ペプチド配列を含む。
【００４７】
シグナルペプチドは、本開示においての、細胞膜や細胞表面や正確な曲在地を指示する、いかなる分泌タンパク質または膜貫通タンパク質のペプチドである。特に本開示のシグナルペプチドは、本開示での細胞膜あるいは細胞表面、原形質膜に及ぶ膜貫通部分、細胞質部分または細胞の内部にある活性ドメイン。
【００４８】
この実施例では、シグナルペプチドは、小胞体（ER）を通過した後に切断され、すなわち切断可能なシグナルペプチドである。実施例では、シグナルペプチドは、I型、II型、III型またはIV型のヒトタンパク質である。実施形態では、シグナルペプチドは、免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドを含む。
【００４９】
「抗原認識ドメイン」には、標的の抗原、受容体、ペプチドリガンド、またはタンパク質リガンドに対して選択的なポリペプチドまたは標的のポリペプチドが含まれる。
【００５０】
標的特異的抗原認識ドメインは、好ましくは、標的の抗原に対する抗体、または標的の抗原に結合するペプチド、または標的の抗原に結合する抗体に結合するペプチドもしくはタンパク質に由来する抗原結合ドメインを含むか、または標的上の受容体に結合するペプチドまたはタンパク質リガンド（成長因子、サイトカイン、またはホルモンを含むが、これらに限定されない）、または受容体に由来するドメイン（成長因子受容体、サイトカイン受容体またはホルモン受容体）を標的とすることができる。標的には、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、およびCD52が含まれる。別の実施例では、標的は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8およびCD52のいかなるの部分をも含む。この実施例では、標的は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、およびCD52ポリペプチドの表面露出部分をも含む。
【００５１】
別の実施例では、標的はCD2の細胞外ドメイン（配列番号19）である。別の実施例では、標的はCD3イプシロン鎖細胞外ドメイン（配列番号20）である。別の実施例では、標的はCD4細胞外ドメイン（配列番号21）である。別の実施例では、標的はCD5細胞外ドメイン（配列番号22）である。別の実施例では、標的はCD7細胞外ドメイン（配列番号23）である。別の実施例では、標的はCD8α鎖細胞外ドメイン（配列番号24）である。別の実施例では、標的はCD8ベータ鎖細胞外ドメイン（配列番号25）である。別の実施例では、標的はCD52 CAMPATH-1抗原（配列番号26）である。
【００５２】
この実施例では、抗原認識ドメインは、標的に対して向けられる（選択的な）モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む。
【００５３】
この実施例では、抗原認識ドメインは、フラグメント抗原結合フラグメント（Fab）を含む。別の実施例では、抗原認識ドメインは、一本鎖可変フラグメント（scFV）を含む。scFVは、短いリンカーペプチドと結合した免疫グロブリンの重鎖（VH）および軽鎖（VL）の可変領域の融合タンパク質である。
【００５４】
別の実施例では、抗原認識ドメインは、ラクダ科単一ドメイン抗体またはその一部を含む。この実施例では、ラクダ科単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物に見出された重鎖抗体、またはVHH抗体を含む。ラクダのVHH抗体（例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマおよびアルパカ）は、ラクダ科単鎖抗体の可変断片を指し（Nguyenら、2001; Muyldermans、2001参照）、また、ラクダ科動物、ラクダの単離されたVHH組換え抗体、またはラクダ科動物の合成VHH抗体もまた含まれる。
【００５５】
別の実施例では、抗原認識ドメインは、それらの同族受容体に関与するリガンドを含む。別の実施例では、抗原認識ドメインはヒト化される。
【００５６】
抗原認識ドメインは、その配列内にいくつかの可変性を含み、依然としてここに開示される標的に対して選択的であり得ることが理解される。したがって、抗原認識ドメインのポリペプチドは、本明細書中に開示される抗原認識ドメインポリペプチドと少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも80％、または少なくとも70％同一でありえる考えられ、依然として本明細書に記載され、本開示の範囲内である。
【００５７】
別の実施例では、抗原認識ドメインは配列番号19、配列番号 20、配列番号 21、配列番号22、配列番号 23、配列番号24、または配列番号25あるいは配列番号に選択的である。
【００５８】
ヒンジ領域は、例えば、キメラ抗原受容体、および少なくとも1つの共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない配列の間に位置する。ヒンジ配列は、例えば、ヒトまたはその一部を含むいかなる属からの任意の適切な配列から得ることができる。そのようなヒンジ領域は、業界分野で知られている。この実施例では、ヒンジ領域は、人のタンパクの領域を含む、CD-8アルファ、CD28,4-1BB、OX40、CD3-ゼータ、T細胞レセプターαまたはβ鎖、CD3ゼータ鎖、CD28、CD3ε、 CD45、CD5, CD8, CD9, CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、それらの機能的誘導体や複合体を含む。
【００５９】
この実施例では、ヒンジ領域はCD8ヒンジ領域を含む。
【００６０】
いくつかの実施例では、ヒンジ領域は、免疫グロブリン（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、およびIgD）から選択されるものを含む、しかし限定はされない。
【００６１】
膜貫通ドメインは、細胞膜に及ぶ疎水性ポリペプチドを含む。特に、膜貫通ドメインは、細胞膜の一方の側（細胞外）から細胞膜の他方の側（細胞内または細胞質）に及ぶ。
【００６２】
膜貫通ドメインは、αヘリックスまたはベータバレルの形態、またはそれらの組み合わせであるかもしれない。膜透過ドメインは、多くの膜貫通セグメント、各α-ヘリックス、βシート、またはそれらの組み合わせを有するポリトピックタンパク質含むかもしれない。
【００６３】
この施形例では、膜貫通ドメインはCARのドメインの1つとして自然に関与しているものが使われる。別の実施例では、膜貫通ドメインは、アミノ酸置換によって選択または修飾されて、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にする。
【００６４】
例えば、膜貫通ドメインは、T細胞レセプターαまたはβ鎖の膜貫通ドメイン、CD3ゼータ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、 CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、それらの機能的誘導体、およびそれらの組み合わせの膜貫通ドメインが含まれる。
【００６５】
人工的に設計された膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性残基を含むポリペプチドである。この実施例では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組み合わせが合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。
【００６６】
この実施例では、膜貫通ドメインはCD8膜貫通ドメインである。別の実施例では、膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインである。そのような膜貫通ドメインは当該分野で公知である。
【００６７】
シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインは、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの局面を刺激または活性化するために免疫細胞の活性化を提供するポリペプチドを含む。
【００６８】
この実施例では、シグナル伝達ドメインは、機能的シグナル伝達ドメインのポリペプチドを含む、CD3ゼータ、共通FcRガンマ（FCER1G）、Fcガンマ、FcRベータ（Fcイプシロンリボ）、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79bのDNAX活性化タンパク質10（DAP10）、DNAX活性化タンパク質12（DAP12）、それらの活性断片、それらの機能的誘導体、およびそれらの組み合わせを含む。そのようなシグナル伝達ドメインは当該分野で公知である。
【００６９】
この実施例では、CARポリペプチドは、1つあるいは1つ以上の共刺激ドメインをさらに含む。この実施例では、共刺激ドメインは、OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、ナチュラルキラーグループ2メンバーC（NKG2C）、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）、B7-H3、CD83、ICAM-1、LFA-1（CD11a / CD18）、ICOSおよび4-1BB（CD137）に結合するリガンド、それら活性フラグメント、機能性誘導体およびそれらの組み合わせ。
【００７０】
この実施形態では、CARポリペプチドはCD2CARであり、配列番号10あるいは配列番号11を含む。この実施例では、CARポリペプチドはCD3CARであり、そして配列番号12を含む。この実施例では、CARポリペプチドはCD4CARであり、そして配列番号13または配列番号14を含む。この実施例では、CARポリペプチドはCD5CARであり、そして配列番号15を含む。この実施形態では、CARポリペプチドはCD7CARであり、そして配列番号17を含む。この実施形態では、CARポリペプチドはCD52CARであり、そして配列番号18を含む。
【００７１】
キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド
本開示は、上記のキメラ抗原レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。CARをコードするポリヌクレオチドは、特定のCARのアミノ酸配列から、いかなる従来の方法によっても 容易に調製される。アミノ酸配列をコードする塩基配列は、各ドメインのアミノ酸配列について、前述のNCBI RefSeq IDまたはGenBenkのアクセッション番号から取得することができ、本発明の核酸は、標準的な分子生物学および/または化学的手順で調整できる。例えば、塩基配列に基づいてポリヌクレオチドを合成することができ、本発明のポリヌクレオチドはcDNAライブラリーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりDNA断片を合成することにより調製することができる。
【００７２】
この実施例では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子の 、または発現またはクローニングカセットの一部である。
【００７３】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。ポリヌクレオチドは、DNAおよびRNAを含む。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される場合、核酸およびポリヌクレオチドは同様の意味でもある。当業界では、核酸がポリヌクレオチドであり、これを加水分解してモノマー「ヌクレオチド」にすることができるという一般的な知識を有する。モノマーヌクレオチドを加水分解してヌクレオシドにすることができる。本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドには核酸配列を含め、組換え手段、すなわち組換えライブラリーまたは細胞からの通常のクローニング技術およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などを用いたゲノム、似た技術および合成手段による核酸配列のクローニングが含まれるが、これらは限定されない。
【００７４】
この実施例では、ポリヌクレオチドは、配列番号1または配列番号2のCD2CARポリヌクレオチドを含む。この実施例では、ポリヌクレオチドは、配列番号3のCD3CARポリヌクレオチドを含む。この実施例では、ポリヌクレオチドは、配列番号4または配列番号5のCD4CARポリヌクレオチドを含む。この実施例では、ポリヌクレオチドは、配列番号6のCD5CARポリヌクレオチドを含む。この実施例では、ポリヌクレオチドは、配列番号8のCD7CARポリヌクレオチドを含む。この実施例では、ポリヌクレオチドは、配列番号9のCD52CARポリヌクレオチドを含む。
【００７５】
ポリヌクレオチドベクター
上記のポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングすることができる。「ベクター」は、単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドを細胞の内部に送達するために使用される構築物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、ファージミド、コスミドおよびウイルスを含むが、これらだけに限定されない多数のベクターが当該分野で公知である。ウイルスには、ファージ、ファージ誘導体が含まれる。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどの核酸の細胞への移動を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなど他にも似たものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
この実施例では、ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、組込みベクター、および配列決定ベクターが含まれる。
【００７７】
この実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。一実施形態では、操作された細胞は、ポリヌクレオチド配列を発現するためにウイルスに形質導入される。
【００７８】
哺乳動物細胞への遺伝子導入のための多くのウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクターに挿入され、当該分野で公知の技術を用いてレトロウイルス粒子中にパッケージングされる。次いで組換えウイルスを単離し、in vivoまたはex vivoのいずれかで対象の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系が当該分野で公知である。いくつかの実施例では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当該分野で公知である。この実施例では、レンチウイルスベクターが使用される。
【００７９】
ウイルスベクター技術は当該分野で周知であり、例えばSambrookら（2001、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York）および他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物体において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ位、および1つあるいは1つ以上の選択マーカー（例えば、WO 01/96584; WO 01/29058;およびUS、米国特許第6,326,193号）。
【００８０】
キメラ抗原レセプターポリヌクレオチドの発現は、例えば、限定されないが、SFFVまたはヒト伸長因子11α（EF）プロモーター、CAG（CMVエンハンサーを有するチキンベータアクチンプロモーター）プロモーターヒト伸長因子1α（EF）プロモーター。利用される弱い/弱い発現プロモーターの例としては、限定されないが、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーター、ユビキチンC（UBC）プロモーター、およびホスホグリセレートキナーゼ1（PGK）プロモーター、またはその一部を含む。キメラ抗原受容体の誘導性発現は、例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、限定されないが、TRE3GV（全ての世代および好ましくは第3世代を含むTet応答エレメント）、誘導性プロモーター（Clontech Laboratories, Mountains View, CA）を含むあるいは、またはその一部、またはそれらの組み合わせである。
【００８１】
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに 連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を誘導することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子-1a（EF-1a）である。しかし、限定はされないが、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）長末端反復（LTR）プロモーター、MoMuLVエプスタイン - バーウイルス即時型早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、同様にヒト遺伝子プロモーター限定はされないが以下のような、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーターなどが挙げられる。さらに、本開示は構成的プロモーターの使用に限定されるべきではなく、誘導性プロモーターも本開示の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が所望される場合に 連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができる分子スイッチ、または発現が望ましくない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に 連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含む。発現のための他の要素は、宿主細胞によってまたはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などのその当該分野でよく知られている。
【００８３】
さらなるプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の上流30〜100bpの領域に位置するが、開始部位の下流に機能的エレメントを同様に含むことが最近示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であり、その結果、チミジンキナーゼ（tk）プロモーターにおいて、エレメントが反転または移動されるときにプロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が始まる前に50bp離れて増加し得る減少する。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために協同的にまたは独立して機能することができる。
【００８４】
CARポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含むこともできるウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする場合、その他として、選択マーカーをDNAの別個の断片に担持させ、同時トランスフェクション手順に用いることもできる。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞における発現を可能にするために適切な調節配列に隣接していてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば、ネオなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００８５】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないか、またはレシピエント生物または組織によって発現されない遺伝子であり、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点で測定される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光をコードする遺伝子（例えば、Ui-Teiら、2000 FEBS Letters 479：79-82）など含まれる。適切な発現系は周知であり、公知の技術を用いて調製するか、または商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小5 'フランキング領域を有する構造がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーターによる転写を調節する能力を 評価するために使用される。
【００８６】
遺伝子を細胞に導入し発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターの枠組みとして、ベクターは宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に当該分野の任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。
【００８７】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクターおよび/または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrookら（2001、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York）。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【００８８】
DNAおよびRNAベクターの使用をめ、含目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法 。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳類、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなど他に由来し得る。例えば、米国特許第5,350,674号および第5,585,362号を参照されたい。
【００８９】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質系システムなどのコロイド分散系が含まれる。インビトロおよびインビボでの送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。非ウイルス送達システムが利用される場合、送達ビヒクルの例はリポソームである。核酸の宿主細胞への導入（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）のために、脂質製剤の使用が考えられる。別の側面では、核酸は脂質と会合している。脂質と会合した核酸は、リポソームの脂質二重層内に点在するリポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合した連結分子を介してリポソームに結合され、リポソームに閉じ込められるリポソームと複合体化し、脂質を含む溶液中に分散させ、脂質と混合し、脂質と混合し、脂質中の懸濁液として含有し、ミセルに含有または複合化した、またはそうでなければ脂質と会合する。脂質、脂質/ DNAまたは脂質/発現ベクター関連組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二層構造、ミセル、または「崩壊」構造で存在し得る。それらは単に溶液中に散在していてもよく、サイズまたは形状が一様でない凝集物を形成する可能性がある。脂質は、天然または合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質には、細胞質に天然に存在する脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。
【００９０】
使用に適した脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）は、Sigma、St. Louis、MOから得ることができる。ジエチルリン酸（「DCP」）は、K＆K Laboratories（Plainview、NY）から得ることができる。コレステロール（「Choi」）は、Calbiochem-Behringから得ることができる。ジミリスチルホスファチジルグリセロール（DMPG）および他の脂質は、Avanti Polar Lipids、Inc.（Birmingham、AL）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質のストック溶液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。
【００９１】
「リポソーム」は、密閉された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される多様な単一および多重層脂質媒体を包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有するものとして特徴付けることができる。マルチラメラリポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。リン脂質を過剰の水溶液に懸濁させると、それらは自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再構成を受け、脂質二重層間に水および溶質を閉じ込める（Ghoshら、19 1 Glycobiology 5; 505-10）。しかし、通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造を、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在することができる。また、リポフェクタミン - 核酸複合体も考えられる。
【００９２】
外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するか、または本開示のポリヌクレオチドに細胞をさらす方法を使用するのにかかわらず、宿主細胞における組換えDNA配列の存在を確認するために、様々な方法が実施されえる。このような検定法、例えば、Southernそして Northern blotting、RT-PCRおよびPCRのような当該分野で周知の「分子生物学的」測定法; 特定のペプチドの存在または非存在を検出するなど、免疫学的手段（ELISAおよびウェスタンブロット）または本開示の範囲内にある物質を同定するための本明細書に記載の検定法などの「生化学的」測定法が含まれる。
【００９３】
エンジニアリングセル
別の実施例では、本開示は、上記に記載された、またはそれをコードするポリヌクレオチド、そして上記で述べられたキメラ抗原レセプターポリペプチド発現する操作された細胞を提供する。
【００９４】
「操作された細胞」は、遺伝子、DNAまたはRNA配列、またはタンパク質またはポリペプチドの付加または修飾によって修飾、形質転換、または操作される、いかなる生物のいかなる細胞をも意味する。本開示では単離された細胞、宿主細胞、および遺伝子操作された細胞、NK細胞およびT細胞などの単離された免疫細胞を含み、キメラ抗原レセプターまたはキメラ抗原レセプター複合体、キメラ受容体を細胞表面で発現させるDNAまたはRNA配列をコードするものも含める。単離された宿主細胞および操作された細胞は、例えば、NK細胞活性またはTリンパ球活性を高め、癌の治療および感染性疾患の治療のために使用されえる。
【００９５】
本明細書に開示されているように、キメラ抗原レセプターポリペプチドをその膜に発現および/または一体化することができるいかなる細胞も使用することができる。
【００９６】
この実施形例では、免疫調節細胞を含む操作された細胞。免疫調節細胞には、CD4 T細胞（ヘルパーT細胞）、CD8 T細胞（細胞傷害性T細胞、CTL）、およびメモリーT細胞または記憶幹細胞T細胞などのT細胞が含まれる。別の実施形例では、T細胞にはナチュラルキラーT細胞（NK T細胞）が含まれる。
【００９７】
この実施例では、操作された細胞はナチュラルキラー細胞を含む。ナチュラルキラー細胞は当該分野でよく知られている。この実施例では、ナチュラルキラー細胞には、NK-92細胞などの細胞株が含まれる。さらなるNK細胞株の例には、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS細胞、およびNKL細胞も含まれる。
【００９８】
NK細胞は、GvHDのリスクなしに抗腫瘍効果を媒介し、T細胞と比較して短命である。したがって、NK細胞は、癌細胞を破壊した直後に枯渇する、改変された細胞を除去するため、CAR構成上に誘導性自殺遺伝子の導入の必要性を減少させるであろう。
【００９９】
この実施形例において、本明細書に記載されている操作された細胞は、１つ以上のタイプのキメラ抗原レセプターポリペプチドを含み得る。操作された細胞がCD2CAR、CD3CAR、CD4CAR、CD5CAR、CD7CAR、CD8CAR、およびCD52CARの少なくとも2つを含む実施例が考えられる。例えば、操作された細胞は、CD4キメラ抗原レセプターポリペプチド（CD4CAR）およびCD5キメラ抗原レセプターポリペプチド（CD5CAR）を含み得る。
【０１００】
本明細書中で、CDXCARは、CDX抗原認識ドメインを有するキメラ抗原受容体を指す。本明細書中で、CDXは、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8およびCD52のいずれか1つであり得る。
【０１０１】
TCR欠損T細胞のCARへの応用
この実施例では、操作された細胞、特にドナーから得られた同種異型T細胞は、MHC認識に関与するTCR（T細胞受容体）の成分を不活性化するように修飾することができる。その結果、TCR欠損T細胞は移植片対宿主病（GVHD）を引き起こさないであろう。
【０１０２】
T抗原欠損TおよびNK細胞
T細胞リンパ腫またはT細胞白血病は、これらの疾患の有用な標的であり得る特異的抗原を発現する。例えば、T細胞リンパ腫または白血病はCD7、CD2、CD3およびCD5を発現する。しかしながら、CD7、CD2、CD3およびCD5は、CAR TまたはNK細胞（CD3およびCD5を除く）においても発現され、これらの抗原を標的とする能力を相殺する。自己殺傷は、これらの抗原のいずれかを標的とするCARで武装したT細胞またはNK細胞で起こり得る。これは、これらの抗原を標的とするCARの産生を困難にする。したがって、T細胞またはNK細胞をCARで武装した細胞として使用する場合、内在性抗原を不活性化する必要があり得る。
【０１０３】
別の実施形例では、操作された細胞が他の操作された細胞に作用するのを防ぐのに細胞表面ポリペプチドを不活性化するため、改変された細胞がさらに改変される。例えば、操作された細胞の内因性CD2、CD3、CD4、CD5、およびCD7遺伝子の1つまたは複数を、ノックアウトまたは不活性化させる。好ましい実施例では、改変された細胞は、内因性CD2およびCD7遺伝子の少なくとも1つがノックアウトまたは不活性化されたナチュラルキラー細胞である。
【０１０４】
別の好ましい実施例では、操作された細胞は、内在性CD2、CD3、CD4、CD5、CD7およびCD8遺伝子の少なくとも1つがノックアウトまたは不活性化されたT細胞である。別の好ましい実施例では、操作された細胞は、ノックアウトまたは不活性化された内因性CD2およびCD7遺伝子の少なくとも1つを有するNK細胞である。
【０１０５】
この実施例では、特定の抗原認識ドメインを有するCARを発現する遺伝子操作された細胞は、その抗原を発現する遺伝子を不活性化またはノックアウトされている。例えば、CD2 CARを有するT細胞は、CD2抗原遺伝子が不活性化またはノックアウトされているであろう。別の実施例において、CD4抗原認識ドメインを有するCARを発現している操作された細胞（例えば、NK細胞またはT細胞）は、CD4抗原がその細胞表面上に発現されないように改変される。別の実施例において、CD2抗原認識ドメインを有する1つのCARまたはCD7抗原認識ドメインを有するべつのCARを有する操作された細胞（例えば、NK細胞またはT細胞）は、CD2抗原遺伝子およびCD7抗原遺伝子の両方がノックアウトまたは不活性化されている。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
遺伝子をノックアウトまたは不活性化する方法は、当技術分野において一般的に知られている。例えば、操作された細胞のCD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、およびCD52遺伝子をノックアウトまたは不活性化するために、CRISPR / Cas9システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）およびTALEヌクレアーゼ（TALEN）およびメガヌクレアーゼを使用することができる。
【０１０８】
元となる細胞
改変された細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄、腫瘍浸潤リンパ球、リンパ節組織、または胸腺組織から得ることができる。宿主細胞は、胎盤細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または造血幹細胞を含む。細胞は、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種から得ることができる。細胞は、確立された細胞株から得ることができる。
【０１０９】
上記細胞は、いかなる既知の手段によって得ることができる。操作された細胞のレシピエントに対して、細胞は、自己、同系、同種、または異種でありえる。
【０１１０】
「自己」という用語は、それが後に個体に再導入される同じ個体に由来するいかなるの物質をも指す。
【０１１１】
「同種異系」という用語は、その物質が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来するいかなる物質をも言及する。1つまたは複数の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、2つまたはそれ以上の個体が互いに同種異系であると言われる。いくつかの側面では、同じ種の個体に由来する同種異系物質は、抗原的に相互作用するために遺伝子的に十分に相違している可能性がある。
【０１１２】
「異種」という用語は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【０１１３】
「同系」という用語は、特に抗原または免疫学的反応に関して、極めて近い遺伝的類似性または同一性を指す。同系系は、例えば、器官および細胞（例えば、癌細胞およびその非癌性対応物）が同じ個体に由来するモデル、および/または器官および細胞が、同系交配 種の異なる個々の動物に由来するモデル。
【０１１４】
自殺システム
本開示の操作された細胞はまた、自殺システムをも含み得る。自殺システムは、上述したように、操作された細胞が不活性化または破壊されるメカニズムを提供する。このような特徴は、操作された細胞が使用されるいかなる処置の正確な治療制御を可能にする。本明細書で使用される場合、自殺システムは、自殺システムを有する細胞が失活または破壊され得るメカニズムを提供する。自殺システムは当該技術分野において周知である。
【０１１５】
この実施例では、自殺システムは、薬理学的に活性化されて、必要に応じて含有細胞を排除することができる遺伝子を含む。特定の局面において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を保有する宿主に対して免疫原性ではない。一例では、自殺システムは、CD20を操作された細胞の細胞表面上に発現させる遺伝子を含む。したがって、リツキシマブの投与は、遺伝子を含む操作された細胞を破壊するために使用される。
【０１１６】
いくつかの実施例では、自殺システムはエピトープタグを含む。エピトープタグの例には、c-mycタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（SBP）、およびtruncated EGFR遺伝子（EGFRt）が含まれる。この実施例において、エピトープタグは、操作された細胞において発現される。したがって、エピトープタグに対する抗体の投与を用いて、これら遺伝子を含む操作された細胞を破壊することができる。
【０１１７】
別の実施例では、自殺システムは、切断された表皮成長因子受容体を遺伝子操作された細胞の表面上に発現させる遺伝子を含む。したがって、セツキシマブの投与は、遺伝子を含む操作された細胞を破壊するために使用される。
【０１１８】
別の実施例において、自殺遺伝子は、カスペース8遺伝子、カスパーゼ9遺伝子、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ（CD）、またはシトクロムP450をも含む。
【０１１９】
Jonesら（Jones BS、Lamb LS、Goldman F and Di Stasi A（2014）、自殺遺伝子伝達による細胞療法製品の安全性の改善、Front.Pharmacol.5：254、doi：10.3389 / fphar.2014.00254）の著書を含め、さらなる自殺システムの例は全体としてこの中に記載されている。
【０１２０】
CD2CAR
CD2接着分子は、すべての末梢血T細胞およびナチュラルキラー細胞に発現されている細胞表面抗原であるが、Bリンパ球では発現されない 。CD2の細胞外ドメインは、ホモ二量体化を媒介することができる免疫グロブリン様ドメインを含む。CD58（LFA-3）またはCD48によるCD2のライゲーションは、T細胞が抗原提示細胞に接着するのを助け、抗原に対するT細胞受容体を介したシグナル伝達を増強するシグナル伝達経路を誘発する。CD2ノックアウトマウスは正常な免疫機能を示し、CD2は他のT細胞共刺激受容体、例えばCD28と機能的に類似していると考えられる。
【０１２１】
CD2は、T-ALL、T細胞リンパ腫/白血病、急性前骨髄球性白血病（微小顆粒変異体）、全身性肥満細胞症、マスト細胞病、胸腺腫および急性骨髄性リンパ腫（M0）およびNK細胞白血病で発現する。
【０１２２】
この実施例では、本開示は、CD2抗原に特異的な抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターポリペプチド、およびそれを発現する操作された細胞を提供する。
【０１２３】
別の実施例では、本開示は、CD2抗原に特異的な抗原認識ドメインの配列の変異体、およびそれを発現する操作された細胞を有するキメラ抗原レセプターポリペプチドを提供する。
【０１２４】
この実施例では、CD2 CARは、少なくとも1つの共刺激ドメインを含む。別の実施例において、CD2CARは、少なくとも2つの共刺激ドメインを含む。
【０１２５】
この実施例では、CD2CARは配列番号10または配列番号11を含む。
【０１２６】
CD3CAR
CD3はタンパク質複合体からなり、上の図に示すように4つの異なる鎖で構成されている。この複合体は、CD3δ鎖、CD3γ鎖、および2つのCD3ε鎖を含有する。これらの鎖は、αβ鎖を構成するT細胞受容体（TCR）と会合する。
【０１２７】
TCR / CD3複合体はT系統細胞の独特のマーカーである。この複合体に対する開発された種々のモノクローナル抗体が存在する。そのようなモノクローナル抗体の1つは、表面CD3に対するマウスモノクローナル抗体OKT3である。CD3は、T細胞およびT細胞悪性腫瘍の一般的なマーカーである。CD3イプシロンに対するOKT3は、T細胞を同定するために使用される一般的な抗体である。抗CD3モノクローナル抗体は、（1）急性腎臓、心臓または肝臓同種移植拒絶反応; （2）移植前のドナー骨髄からのT細胞の枯渇; （3）I型糖尿病の新たな発症の処置としても使われる。CD3イプシロン鎖に対するCD3は、良性および悪性疾患におけるT細胞を同定するために使用される最も特異的なT細胞抗体である。CD3は末梢T細胞リンパ腫の86％に認められる。
【０１２８】
いくつかの実施例において、本開示は、CD3CARの製造方法を含む。さらなる実施例では、CD3CARは、CD3の表面タンパク質に特異的に結合するscFv抗体を含む。
【０１２９】
いくつかの実施例では、CD3CARは、TCR/CD3複合体に特異的に結合するscFv分子を含む。
【０１３０】
いくつかの実施例では、CAR中のscFvは、CD3に関連するαβTCRの細胞外ドメインに特異的に結合する分子である。
【０１３１】
CD4CAR
この実施例では、本開示はCD4CAR CD4抗原認識ドメインを含むキメラ抗原レセプター示す。
【０１３２】
この実施例では、CD4 CARは、少なくとも1つの共刺激ドメインを含む。別の実施例において、CD4CARは、少なくとも2つの共刺激ドメインを含む。
【０１３３】
この実施例において、CD4CARは、配列番号13および配列番号14を含む。
【０１３４】
CD5CAR
別の実施例において、本開示は、CD5に特異的な抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターポリペプチド、およびそれを発現する操作された細胞を提供する。
【０１３５】
この実施例では、CD5CARは、少なくとも1つの共刺激ドメインを含む。別の実施例において、CD5CARは、少なくとも2つの共刺激ドメインを含む。
CD7CAR
【０１３６】
CD7は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである膜貫通タンパク質である。このタンパク質は、成熟T細胞の表面上に発現される。それは、T細胞系統細胞上で発現される表面抗原である。
【０１３７】
CD7はT-ALLの非常に良いマーカーであり、T-ALLの90％以上がCD7を発現する。CD7はまた、NKリンパ腫、T細胞リンパ腫/白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、およびリンパ球に富む胸腺腫においても発現される。
【０１３８】
この実施例では、本開示は、CD7抗原に特異的な抗原認識ドメインを有するキメラ抗原受容体ポリペプチド、およびそれを発現する操作された細胞を提供する。
【０１３９】
この実施例では、CD7CARは、少なくとも1つの共刺激ドメインを含む。別の実施例では、CD7CARは、少なくとも2つの共刺激ドメインを含む。
【０１４０】
方法
操作された細胞の作製方法
この実施例では、本開示はまた、上記に記載された操作された細胞を作製する方法を提供する。
【０１４１】
この実施例では、上記の細胞が得られ、あるいは単離される。細胞は、あらゆる既知の手段によって単離されえる。細胞は末梢血細胞または臍帯血細胞を含む。別の実施例において、細胞は、胎盤細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または造血幹細胞である。
【０１４２】
上記のキメラ抗原レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、あらゆる既知の手段によって末梢血細胞または臍帯血細胞に導入される。一例において、上記のキメラ抗原レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを介して細胞に導入される。
【０１４３】
上記のキメラ抗原レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、あらゆる既知の手段によって、胎盤細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または造血幹細胞に導入される。一例において、上記のキメラ抗原レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを介して細胞に導入される。
【０１４４】
他の実施例では、キメラ抗原レセプターポリヌクレオチドは、一過性RNA修飾、いわゆる「生分解性誘導体」として構築することができる。RNA修飾誘導体は、T細胞またはNK細胞にエレクトロポレーションで導入される。さらなる実施例では、本明細書に記載のキメラ抗原レセプターは、キメラ抗原レセプターポリヌクレオチドをウイルスベクターなしで宿主ゲノムに組み込む「Sleeping Beauty」とも呼ばれるトランスポゾンシステムで構築することができる。
【０１４５】
操作された細胞を提供するため、上記のポリヌクレオチドが細胞に導入され、操作された細胞が増殖される。上記のポリヌクレオチドを含む操作された細胞は、あらゆる既知の手段によって増殖される。
【０１４６】
本開示では増殖させた細胞を、あらゆる既知の手段によって精製し、 単離した操作された 細胞提示する。
【０１４７】
使用方法
本開示は、免疫調節細胞を死滅させるか、免疫抑制細胞の数を減少させるか、または枯渇させる方法を提供する。別の実施例では、本開示は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8およびCD52の少なくとも1つを有する細胞を死滅させる、数を減らす、または減少させる方法を提供する。
【０１４８】
本明細書中でで述べる「減少する」とは、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも99％、または100％である。
【０１４９】
本明細書中で述べる、「枯渇」は、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも99％、または100％の減少を含む。
【０１５０】
この実施例では、本開示は、CD2抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターペプチドを発現する上記の操作された細胞の有効量と免疫調節細胞とを接触させることにより、CD2を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法を含む。場合により、CD2を有する免疫調節細胞の数の減少は、当該分野では既知で、あらゆる細胞死測定法によって決定されえる。
【０１５１】
本明細書中で述べる、免疫調節細胞は、患者内、細胞培養中、または単離たものを含む。
【０１５２】
本明細書中で述べる、「患者」には、哺乳動物が含まれる。本明細書で言及される哺乳動物は、あらゆる哺乳動物でありえる。本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、マウスおよびハムスターなどのげっ歯類の哺乳類、ウサギなどのラゴモルフの哺乳類を含むが、これらに限定されない、あらゆる哺乳動物を意味する。哺乳動物は、Felines（ネコ）およびCanines（イヌ）を含む、Carnivora であってもよい。哺乳動物は、ウシ（ウシ）およびブタ（ブタ）またはウマ（ウマ）を含むペルソダクチラ（Perssodactyla）の 偶蹄目目の哺乳類であってもよい。哺乳動物は、霊長類、Ceboids、またはSimoids（サル）、またはAnthropoids（ヒトおよび類人猿）の順であってもよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１５３】
特定の実施例では、患者は、0-6ヶ月齢、6~12ヶ月齢、1~5歳齢、5~10歳齢、5~12歳齢、10-15歳、15-20歳のヒトである、13〜19歳、20〜25歳、25〜30歳、20〜65歳、30〜35歳、35〜40歳、40〜45歳、45〜50歳、50歳55〜60歳、60〜65歳、65〜70歳、70〜75歳、75〜80歳、80〜85歳、85〜90歳、90〜95歳年齢は95歳から100歳までである。
【０１５４】
本明細書で述べられるように、操作された細胞の「有効量」および「治療有効量」という用語は、所望の治療または生理学的または効果または結果を提供するのに十分な量の操作細胞を意味する。そのような効果または結果には、細胞性疾患の症状の軽減または改善が含まれる。望ましくない効果、例えば、副作用は、時に所望の治療効果と共に現れる。それゆえ、従事者は潜在的な効果と潜在的なリスクとのバランスを取って、適宜な「有効量」が何であるかを判断する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢および一般的な状態、投与様式などに依存して、対象によって異なるであろう。したがって、正確な「有効量」を指定することは不可能かもしれない。しかし、いかなる個人の場合でも、適切な「効果的な量」という用語は、該当業界による通常の技術を用いて決定されえる。一般的に、特定の操作された細胞または操作された細胞群は、標的細胞の増殖を減少させるのに十分な量および条件下で与えられる。
【０１５５】
この実施例では、本開示は、CD2抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターペプチドを発現する上記の操作された細胞の有効量と免疫調節細胞とを接触させることにより、CD2を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法を含む。場合により、CD2を有する免疫調節細胞の数の減少は、当該分野で知られるいかなる細胞死検定法によって決定されえる。
【０１５６】
この実施例では、本開示は、CD3抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターペプチドを発現する上記の操作された細胞の有効量と免疫調節細胞とを接触させることにより、CD3を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法を含む。場合により、CD3を有する免疫調節細胞の数の減少は、当該分野で知られるいかなる細胞死検定法によって決定されえる。         
【０１５７】
この実施例では、本開示は、CD4抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターペプチドを発現する上記の操作された細胞の有効量と免疫調節細胞とを接触させることにより、CD4を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法を含む。場合により、CD4を有する免疫調節細胞の数の減少は、当該分野で知られるいかなる細胞死検定法によって決定されえる。
【０１５８】
この実施例では、本開示は、CD5抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターペプチドを発現する上記の操作された細胞の有効量と免疫調節細胞とを接触させることにより、CD5を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法を含む。場合により、CD5を有する免疫調節細胞の数の減少は、当該分野で知られるいかなる細胞死検定法によって決定されえる。
【０１５９】
この実施例では、本開示は、CD7抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターペプチドを発現する上記の操作された細胞の有効量と免疫調節細胞とを接触させることにより、CD7を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法を含む。場合により、CD7を有する免疫調節細胞の数の減少は、当該分野で知られるいかなる細胞死検定法によって決定されえる。
【０１６０】
この実施例では、本開示は、CD8抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターペプチドを発現する上記の操作された細胞の有効量と免疫調節細胞とを接触させることにより、CD8を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法を含む。場合により、CD8を有する免疫調節細胞の数の減少は、当該分野で知られるいかなる細胞死検定法によって決定されえる。
【０１６１】
この実施例では、本開示は、CD52抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターペプチドを発現する上記の操作された細胞の有効量と免疫調節細胞とを接触させることにより、CD52を有する免疫調節細胞の数を減少させる方法を含む。場合により、CD52を有する免疫調節細胞の数の減少は、当該分野で知られるいかなる細胞死検定法によって決定されえる。
【０１６２】
治療の方法
別の実施例において、本開示は、細胞増殖性疾患の治療方法を提供する。該方法は、上記で述べられた操作された細胞での治療上の有効な量を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【０１６３】
細胞増殖性疾患は、いかなる癌、腫瘍性疾患の一つ、またはこれらの細胞が、特殊化そして異なる細胞へのいかなる分化を伴わない、制御されない細胞増殖（例えば、細胞塊の形成）であるいかなる疾患を含む。
【０１６４】
細胞増殖性疾患としては、悪性腫瘍、または骨髄異形成症候群または前骨髄腫または前リンパ腫などの前癌状態も含まれる。
【０１６５】
開示される方法に関して、癌は、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、膀胱癌（例えば、膀胱癌腫）、骨癌、脳腫瘍（例えば、髄芽腫）、乳癌、肛門癌、肛門管または肛門直腸癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部の癌、胆嚢または胸膜の癌、鼻の癌、鼻腔または中耳線維肉腫、胃腸カルチノイド腫瘍、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、膵臓癌、膵臓癌、膵臓癌、膵臓癌、膵臓癌、膵臓癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液体腫瘍、肝臓癌、肺癌（非小細胞肺癌）、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭B細胞性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、T細胞急性リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、結節外NK / T細胞リンパ腫、NK細胞白血病/リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、前立腺癌、前立腺癌、膵臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、および尿毒症が含まれる。好ましくは、癌は血液悪性腫瘍（例えば、限定されないが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、B-慢性リンパ球性白血病、毛状細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病（ALL）およびバーキットリンパ腫）、胸腺癌、びまん性大細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、および慢性リンパ性白血病（CLL）、T細胞リンパ腫および末梢T細胞リンパ腫などいかなる癌も含まれる。
【０１６６】
本開示は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、およびCD52に関与するT細胞およびNK細胞の枯渇による急性臓器拒絶の治療方法を提供する。
【０１６７】
この実施例では、本開示は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8およびCD52の少なくとも1つに関連するT細胞およびNK細胞の枯渇による急性または慢性移植片対宿主病（GVHD）の治療方法を含む。
【０１６８】
この実施例では、本開示は、臓器移植を受けた患者に、または臓器移植を受ける患者に、CD3CARを有する操作された細胞の有効量を投与することによって臓器拒絶反応を防止する方法を提供する。
【０１６９】
別の実施例において、本開示は、CD3CARを有する操作された細胞の有効量を、それを必要とする患者に投与することによって、GVHDを予防または治療する方法を提供する。
【０１７０】
この実施例において、本開示は、幹細胞移植のためにin vivoでCAR TまたはNK細胞を使用して、ドナーおよび宿主TまたはNK細胞を枯渇または減少させる方法を含む。これは、骨髄幹細胞移植の注入の直前に患者にCAR TまたはNK細胞を投与することによって達成される。
【０１７１】
本開示は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、およびCD52の少なくとも1つに関連する細胞増殖性疾患の治療のためのコンディショニングまたは移植ブリッジストラテジーまたはスタンドアローンとしての免疫療法の方法を提供する。
【０１７２】
本開示は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8およびCD52の少なくとも1つに関連する細胞増殖性疾患の治療方法を提供する。
【０１７３】
別の実施例において、本開示は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8およびCD52の少なくとも1つの発現に関連する非癌関連疾患の治療方法を提供する。
【０１７４】
いくつかの実施例では、細胞増殖性疾患の治療のためのCD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、またはCD52抗原認識ドメインを有するCARは、CTLA-4およびPD1/PDL-1などのチェックポイント遮断薬と併用する。腫瘍撲滅の強化につながる可能性がある。
【０１７５】
免疫抑制微小環境の存在は、CAR T / NK細胞の全機能を制限し得る。いくつかの実施例において、CD4CARとCTLA-4およびPD1 / PD-L1などのチェックポイント遮断薬との組み合わせは、腫瘍撲滅の強化につながる可能性がある。現在、チェックポイントの遮断薬は、CAR T細胞と組み合わせた臨床試験において試験されている。
【０１７６】
いくつかの実施例では、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、またはCD52抗原認識ドメインを有するCARは、初期化学療法に対する反応を深める、除去する、減少させる、抵抗する、そして、あるいは長期における、または他の補助療法と組み合わせたとき使用される。
【０１７７】
疾患状態を治療または予防するために利用可能すべての補助療法は、本開示の一部であると考えられ、一部あるいは本開示の範囲内である
【０１７８】
いくつかの実施例において、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、またはCD52抗原認識ドメインを有するNK細胞CARは、癌および/または自己免疫疾患を有するいかなる哺乳類に「既製品」として投与される。
【０１７９】
CD3CAR
いくつかの実施例において、CD3 CARを有するNK細胞は、抗腫瘍免疫を示し、CD3を発現する白血病/リンパ腫を死滅させる効力を発揮する。
【０１８０】
この開示は、CD3CAR NK細胞を用いて、骨髄、血液および器官における異常または悪性T細胞を除去または減少させるための方法を提供する。いくつかの実施例において、CD3陽性悪性疾患には、前駆Tリンパ芽球性白血病/リンパ腫、成熟T細胞リンパ腫/白血病、EBV陽性T細胞リンパ増殖性障害、成人T細胞白血病/リンパ腫、菌状息肉腫/セザリー症候群、原発性皮膚CD30陽性T細胞リンパ増殖性疾患、末梢T細胞リンパ腫（特に明記されていない）、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫および未分化大細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されない。
【０１８１】
いくつかの実施例において、CD3CAR NK細胞は、幹細胞療法に適格でないT-白血病/リンパ腫を有する患者を治療するために使用されるか、または多くの集中化学療法レジメンにもかかわらず寛解を達成しない患者に使用される。さらなる実施例では、CD3CAR NK細胞は、骨髄移植または骨髄移植へのブリッジのためのコンディショニングレジメンの構成要素として使用されえる。
【０１８２】
CD4CAR
この実施例では、CARの抗原認識ドメインがその対応する抗原に結合すると、CD4CARを有する操作された細胞は抗腫瘍免疫を示す。好ましい実施例では、CARをもつCD8 T細胞は、CD4を発現する白血病/リンパ腫細胞を死滅させる効力を発揮する。
【０１８３】
本開示は、限定されないが、骨髄、血液および/または器官に見出される異常または悪性T細胞を欠失、減少、治療、予防または排除するための方法を含む。いくつかの実施例において、悪性CD4発現細胞は、前駆Tリンパ芽球性白血病/リンパ腫、成熟T細胞リンパ腫/白血病細胞、例えばT細胞前リンパ球性白血病、EBV陽性T細胞リンパ増殖性障害、成人T血管腫、リンパ腫、菌状息肉腫/セザリー症候群、原発性皮膚CD30陽性T細胞リンパ増殖性疾患、末梢性T細胞リンパ腫（特に明記されていない）、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫および未分化大細胞リンパ腫を含む。
【０１８４】
いくつかの実施例において、CD4CAR細胞は、幹細胞療法に適格でない患者のT-白血病/リンパ腫細胞または多くの化学療法レジメンにもかかわらず寛解を達成したことのない患者を治療するために使用される。
【０１８５】
いくつかの実施例において、CD4CAR細胞は、CD4発現急性骨髄単球性白血病、急性単芽球性白血病、単球性白血病および慢性骨髄単球性白血病を治療するために使用される。
【０１８６】
いくつかの実施例では、CD4CAR T細胞をT細胞培養培地中で増殖させることができ、そのようなセントラルメモリーT細胞またはナイーブT細胞の亜集団を単離して、移植の改善に使用することができる。これらの細胞はメモリーT細胞機能を持続し、支持することができ、癌の長期制御に理想的な候補となる。
【０１８７】
免疫抑制微小環境の存在は、CAR T / NK細胞の完全な機能を制限しえる。いくつかの実施例において、CD4CARとCTLA-4およびPD1 / PD-L1などのチェックポイント遮断薬との組み合わせは、腫瘍撲滅の強化につながる可能性がある。
【０１８８】
いくつかの実施例において、CD4CAR細胞は、最初の化学療法に対する応答を深く、除去し、減少させ、抵抗しおよび/または延長するための戦略として、または他の補助療法と組み合わせて使用される。疾患状態を治療または予防するために利用可能なすべての補助療法は、本開示の一部であると考えられ、本開示の範囲内である。化学療法には、CHOP（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチッド、プレドニゾン）、EPOCH（エトポシド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、プレドニゾン）、または他の多剤耐性レジメンが含まれるが、これらは限定されない。好ましい実施例において、CD4CAR細胞は、幹細胞移植および/または化学療法後の残存疾患を治療または予防するために利用される。
【０１８９】
この実施例では、CD4CARを含む細胞は、CARの抗原認識ドメインがその対応する抗原に結合すると、免疫制御細胞の減少を示す。例えば、CD4CARを含む細胞には、CD8 T細胞、NK細胞、またはNK-92細胞のこれらに限定されないが少なくとも1つが含まれる。
【０１９０】
CD4CARを有する他の適切な細胞はCD4ヘルパー細胞に遭遇したとき、CD4ヘルパー細胞に高い削除効力を示した、そして/または発揮した、それにより臓器移植拒絶を予防するあるいは自己免疫疾患をコントロールまたは緩和することができる、これらは本開示の一部であると考えられ、本開示の範囲に含まれる。
【０１９１】
CAR T細胞で観察されるCAR関連副作用の持続に関する懸念はない。いくつかの実施例では、急性の、または致命的な臨床的環境における自己免疫疾患を有する患者にCD4CAR NK細胞を投与することでCD4ヘルパーT細胞のような免疫調節細胞を急速に減少させ、それにより新規または非記憶のCD4ヘルパーT細胞を再生することを可能にする。
【０１９２】
この開示は、CD4CARを作製する方法を含む。いくつかの実施例では、T細胞を用いてCD4CARが作製される。他の実施例において、CD4CARは、NK細胞またはNK-92細胞を用いて産生され、癌および/または自己免疫疾患を有するいかなる哺乳類に「既成品」として投与される。いくつかの実施例では、CD4CAR NK-92またはNK細胞は、特定のCD4 + T細胞またはCD4を発現する癌細胞を殺し、減少させ、枯渇させ、および/または予防することができる。
【０１９３】
いくつかの実施例では、ヤギ抗マウスFab抗体またはその一部を用い、フローサイトメトリーによってCD4CARの高レベルの発現を有するCD4CAR NK-92細胞を生成することができる。いかなる他の属を使用して生成された、いかなる他のタイプの抗体は、本開示の一部であると考えられ、本開示の範囲内である。
【０１９４】
いくつかの実施例では、CD4CAR NK-92細胞は、幹細胞移植または化学療法後に最小限の残存疾患があるときに1回の治療に利用することができる。
【０１９５】
いくつかの実施例において、CD4CARは、発現遺伝子またはカセットの一部である。好ましい実施例では、発現遺伝子またはカセットは、CD4CARに加えて、アクセサリー遺伝子またはエピトープタグまたはその一部を含みえる。アクセサリー遺伝子は、誘導性自殺遺伝子またはその一部であり、カスパーゼ9遺伝子、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ（CD）またはシトクロムP45029を含むが、これらに限定されない。「自殺遺伝子」での削除方法は、遺伝子治療の安全性を向上させ、特定の化合物または分子によって活性化された場合にのみ特定の細胞を殺す。いくつかの実施例では、自殺遺伝子は誘導性であり、二量体化（CID）の特定の化学誘導剤を用いて活性化される。
【０１９６】
いくつかの実施例では、付属タグは、c-mycタグ、trancated EGFR遺伝子（EGFRt）またはその一部またはそれらの組み合わせである。アクセサリータグは、非免疫原性選択ツールとして、またはマーカーを追跡するために使用される。
【０１９７】
いくつかの実施例では、CD4CARを発現する宿主細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト）に1つあるいはそれ以上のさらなる治療剤とともに投与することができる。これに関して、宿主細胞またはCD4CARを含むベクターを含む組成物を最初に投与し、1つまたは複数のさらなる治療剤を2番目に投与することができ、またはその逆に投与することができる。
【０１９８】
本開示は、CD4CARを発現する宿主細胞の典型的な量を哺乳動物に投与することをその範囲内に含み、例えば、約50万〜約10億細胞が範囲であり得る。上記の範囲外のすべての部分範囲および範囲は、開示の一部であると考えられ、本開示の範囲内である。
【０１９９】
好ましい実施例では、SFFVプロモーターを用いて、CD8 T細胞をリダイレクトし、CD4CAR発現させ、CD4発現細胞をターゲットにする。いくつかの実施例では、CARは、scFvの細胞外発現およびCD4発現細胞と遭遇した場合の強い免疫応答の促進などの機能的特徴を含む。
【０２００】
この実施例では、CD4CARを含む細胞は、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）およびナチュラルキラー（NK）細胞を含む群から選択される。好ましい実施例では、CARを有する細胞には、CD8 T細胞、NK細胞、およびNK-92細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０１】
いくつかの実施例では、CD4CARは、DNA /核酸コンジュゲート、ペプチド、化学物質および/または低分子を含む薬物コンジュゲートと共に使用して、有効性および安全性を高めることができる。
【０２０２】
HIV-1感染の制御は、抗レトロウイルス療法の組み合わせを用いてHIV患者において達成されえるが、中断後にウイルス負荷が増加する。再発性HIV-1の供給源または貯蔵庫は、記憶CD4 T細胞である。この実施例において、本開示のCD4CARは、記憶CD4 T細胞を減少させるために使用され、それによって、HIV感染について滅菌効果が達成される。別の実施形態では、CD4CARはHIVウイルスの侵入を阻止するのを助けるが、CD4CARはHIV侵入に必須のタンパク質であるCD4タンパク質に結合する。
【０２０３】
したがって、本開示は、CD4 T細胞を枯渇させることによって臓器移植拒絶反応を防止する方法を提供する。該方法は、それを必要とする患者に、CD4抗原認識ドメインを有するキメラ抗原受容体ポリペプチドを有する治療有効量の操作された細胞を投与することを含む。
【０２０４】
CD5CAR
別の実施例において、CD5抗原認識ドメイン（CD5CAR）を有するCARポリペプチドの投与は、関節リウマチを治療するために使用される。別の実施例では、CD5CARは、骨髄移植療法（BMT）療法後の移植片対宿主病の予防として使用することができる。別の実施例において、CD5CARは、自己免疫疾患および悪性腫瘍の治療におけるCD5発現の改変に使用されえる。
【０２０５】
いくつかの実施例では、CD5に選択的なキメラ抗原受容体を有する操作された細胞の開示は、化学療法にもはや反応しないか、または最小残存疾患、骨髄移植が適格ではない患者の骨髄移植のためへの橋渡しとして機能し得るかもしれない。さらなる実施例では、CD5CARは、CD5陽性白血病細胞を除去した後、続けて骨髄幹レスキューを行い、リンパ球減少を支持することができる。
【０２０６】
特定の実施例において、CD5CARαTまたはNK細胞は、CD5を発現する細胞を標的とする。標的細胞は、T細胞リンパ腫またはT細胞白血病などの癌細胞、前駆細胞急性T細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫、B細胞慢性リンパ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、CD5陽性びまん性大B細胞リンパ腫、および胸腺癌が含まれるが限定されない。
【０２０７】
この実施例では、CD5CARは、リウマチ性関節炎、移植片対宿主病および自己免疫疾患を含むが、これらに限定されない非血液疾患を治療するために使用される。         
【０２０８】
操作されたまたは改変されたT細胞は、IL-2および/またはIL-7およびIL-15の両方の存在下で、または他の分子を用いることで増殖するかもしれない。
【０２０９】
患者への投与前にin vitroで操作されたT細胞を増殖させることによって、CD5の不活性化の前または後にCARの導入は実現可能である。
【０２１０】
特定の実施例において、CD5の不活性化は、以下の手段の1つによって達成することができる：
（1）ヒンジ領域を介して膜貫通ドメインに連結されたT細胞表面上に抗CD5 scFvを発現させる。これは、CD5陰性T細胞のCD5陰性T細胞への変化をもたらすかもしれない。
（２）CD5タンパク質に特異的に結合する抗CD5 scFvまたはそのCD5のネガティブモジュレーター、またはその断片もしくはドメインを発現させる。
【０２１１】
いくつかの実施例では、CD5に対するscFv（一本鎖抗体）は、細胞内CD5に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に由来し、CD5タンパク質の細胞表面への輸送をブロックする。好ましい実施例では、抗CD5 scFvには、ER（小胞体）移行配列KDELが含まれる。それが細胞内で発現され、ERまたはゴルジに保持される場合、抗CD5 scFvは分泌経路内にCD5を閉じ込め、T細胞におけるCD5の適切な細胞表面位置への移動防止をもたらす。
【０２１２】
いくつかの実施例では、CD5CAR T細胞は、CTLA-4およびPD-1 / PD-L1遮断薬などのまたはIL-2およびIL12などのサイトカイン、またはコロニー刺激第1因子受容体（CSF1R）の阻害剤（FPA008）のような、しかし限定されないであり、免疫調節薬と共に投与することでより良好な治療成果をもたらす。
【０２１３】
別の実施例では、本開示は、抗白血病または抗リンパ腫免疫を付与、補助、増加または増強する方法を提供する。
【０２１４】
有効成分としてCARを発現する操作された細胞を含む治療剤は、非経口的に、例えば注射または注入によって、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、腫瘍内、または求心性リンパ管に投与することができるがもちろん投与経路は限定されない。
【０２１５】
本開示のいかなる方法は、手術、放射線、ホルモン療法、化学療法、免疫療法、またはそれらの組み合わせなどのさらなる癌療法での個体に送達するステップをさらに含む。
【０２１６】
化学療法には、CHOP（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチッド、プレドニゾン）、EPOCH（エトポシド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、プレドニゾン）、または他の多剤耐性レジメンが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施例において、CD54CAR細胞は、幹細胞移植および/または化学療法後の残存疾患を治療または予防するために利用される。
【０２１７】
別の実施例では、本開示のいずれかの方法は、MS患者のための抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン-2、シタラビン（ARA-Cとしても知られる）またはナタリズマブ治療、または乾癬患者のためのエファリズマブ治療またはPML患者のための他の治療をさらに含む。さらなる側面として、本開示のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸、およびFK506などの免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATHなどの他の免疫抑制剤と組み合わせて、抗CD3抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカインおよび照射が含まれる。カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリンおよびFK506）のいずれかを阻害するか、または成長因子誘発シグナル伝達（ラパマイシン）に重要なp70S6キナーゼを阻害する薬物 （Liuら、Cell 66：807-815,1991; Hendersonら、Immun. 73：316-321,1991; Biererら、Curr. Opin. Immun. 5：763-773, 1993）もまた使用される。さらなる側面では、本開示の細胞組成物は、（例えば、前、同時または後に）骨髄移植療法、T細胞アブレーション治療など以下のような処置を組み合わせた、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射（XRT）、シクロホスファミド、またはOKT3またはCAMPATHのような抗体療法を使用する方法と組み合わせて使える。一つの側面において、本開示の細胞組成物は、B細胞アブレーション療法、例えばCD20、例えばリツキサン（Rituxan）と反応する薬剤の後に投与される。例えば、この実施例では、被験体は、高用量の化学療法およびその後の末梢血幹細胞移植による標準治療を受けることができる。特定の実施例では、移植に続いて、被験体は、本開示の増殖された免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施例において、増殖された細胞は手術の前または後に投与される。
【０２１８】
本明細書で使用される用語「自己免疫疾患」は、自己免疫応答から生じる疾患として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例には、アジドーシス病、脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（1型）、ジストロフィー表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン - リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液浮腫、悪性貧血、および潰瘍性大腸炎など、これだけに限定されないが、これらのことが含まれる。
【０２１９】
本開示は、以下に示す実施例を参照してよりよく理解される。以下の実施例は、本明細書で請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび/または方法がどのようになされ、評価されるかについての完全な開示および記載を当業者に提供するために提示され、例示であり、本開示を限定するものではない。
【０２２０】
癌の治療、阻害、または予防のための送達系での投与後、医者に周知の様々な方法で治療用操作細胞の有効性を評価することができる。例えば、化学療法アジュバントと共に送達される治療的に操作された細胞が、治療的に操作された細胞が癌細胞の負荷を軽減するか、またはさらなる増殖を予防することを観察することによって、対象の癌の治療または阻害するのに有効であることを当業者は理解するであろう。癌細胞の負荷は、例えば、特定の癌細胞核酸の存在を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応アッセイを用いて、または血液中の特定の癌細胞マーカーの同定、たとえば抗体を用いて被験体または患者からのサンプル（例えば、血液に限定されないが）、または、患者の循環する癌細胞抗体レベルのレベルを測定することによる、当該分野で既知の方法によって測定することができる。
【０２２１】
使用例
CD4特異的キメラ抗原受容体（CAR）改変T細胞を用いたヒトT細胞悪性腫瘍の標的化
材料および方法
血液ドナー、原発性腫瘍細胞および細胞系
ヒトリンパ腫細胞および末梢血単核細胞を、残留試料から得た。臍帯血細胞は、Stony Brook University Hospitalのドナーから入手した。SP53およびKARPAS 299リンパ腫細胞株は、ATCC（Manassas、VA）から入手した。
レンチウイルスの産生およびT細胞への形質導入
【０２２２】
ウイルス上清を産生するために、293FT細胞を、製造者のプロトコールに従って、Lipofectamine 2000（Life Technologies、Carlsbad、CA）を用いて、pMD2GおよびpSPAXウイルスパッケージングプラスミド、ならびにpRSC.CD4.3GまたはGFPレンチウイルスベクターのいずれかを用い、コトランスフェクトした。レンチウイルス形質導入の前に、300IU / mLのIL-2および1μg/ mLの抗ヒトCD3（Miltenyi Biotec、Germany）の存在下で、臍帯または末梢血単核バフィコート細胞を2日間活性化した。
【０２２３】
Ｔ細胞の増殖
IL-2を加えたT細胞培地（50％AIM-V、40％RPMI1640,10％FBSおよび1×ペニシリン/ストレプトマイシン;すべてGibco製品）中でCAR形質導入T細胞を7日間増殖させた。細胞数を毎日測定し、T細胞数を2×10 6細胞/ mL未満に維持するために、培地を2〜3日毎に添加した。
【０２２４】
CAR免疫表現型
7日間の増殖後のCAR細胞免疫表現型の分析のため、CD4CAR T細胞およびGFPコントロール細胞をCD45RO、CD45RA、CD62LおよびCD8（すべてBD Biosciences製）で染色し、フローサイトメトリー分析する。
【０２２５】
共培養―標的細胞アブレーションアッセイ
CD4CAR T細胞またはGFP T細胞（コントロール）を、1mLのIL-2の含まれないT細胞培養液中で2：1,5：1および10：1の比率（それぞれ200,000,500,000または100万個のエフェクター細胞〜100,000個の標的細胞）の比で標的細胞とともに24時間インキュベート。標的細胞は、KARPAS 299細胞（CD4を発現する未分化大T細胞リンパ腫）、CD4 + T細胞白血病 - セザリー症候群の患者由来の白血病細胞、およびCD4 + PTCLリンパ腫患者由来であった。ネガティブコントロールとして、CD4CAR T細胞およびGFP T細胞を、CD4を発現しないSP53（マントル細胞リンパ腫）細胞とともに、同じ比率で1mLの培地中、個別実験を行った。24時間の共培養の後、細胞をマウス抗ヒトCD8およびCD4抗体で染色した。SP53細胞を用いた実験では、SP53細胞をT細胞と共培養する前にCMTMR（Life Technologies）で標識し、T細胞を共培養インキュベーション後にマウス抗ヒトCD3（PerCp）で標識した。
【０２２６】
In vivoマウス異種モデル 
Jackson Laboratory由来のNSGマウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1 / SzJ）を、Stony Brook University IACUC承認プロトコールの下で使用した。マウスはすべて雄で、8〜12週齢であった。3組のin vivo実験を盲検なしで行った。各セットについて、10匹のマウスに致死量以下の（2.5Gy）用量のガンマ線照射を照射し、無作為に処置またはコントロール群に割り当てた。24時間後、7日以内に測定可能な皮下腫瘍を形成するために、マウスに0.5×106または1.0×106個のKARPAS 299細胞を1度、皮下注射した。腫瘍の大きさの面積を1日おきに測定した。最初のセットでは、100万個のKARPAS 299細胞の注射の3日後に、200万個のCD4CAR T（5匹のマウス）または200万個のGFPコントロールT細胞（5匹のマウス）をマウスに静脈内（尾静脈注射によって）投与した。２２日後に800万個の細胞が投与された。第2のセットでは、10匹のNSGマウスに照射し、0.5×106個のKARPAS 299細胞を注射した。2回目に、800万個のCD4CAR T細胞（5匹）および800万個のGFPコントロールT細胞（5匹）の1コースをマウスに静脈注射した。２回目は550万個の細胞用量を、10日目に静脈注射した。第3セットでは、10匹のNSGマウスに照射し、0.5×10 6個のKARPAS 299細胞を注射した。1日目に、マウスに、2.5×106個のCD4CAR T細胞またはGFPコントロールT細胞（1群あたり5匹のマウス）を静脈注射した。静脈注射を5日毎に合計4コースの処置を繰り返した。
【０２２７】
結果
第3世代のCD4CARの生成
抗CD4分子のscFv（一本鎖可変断片）ヌクレオチド配列は、ヒト化モノクローナルibalizumab（Hu5A8またはTNX-355としても知られる）に由来している。このモノクローナル抗体は、すでに様々な第I相または第II相臨床試験において使用されている。CD4CARによるシグナル伝達を改善するために、CD28および4-1BB共刺激分子の細胞内ドメインをCD3ゼータシグナル伝達ドメインに融合させた。さらに、細胞表面上のCD4CAR分子の効率的な発現のために、CD8のリーダー配列が導入された。実際、抗CD4 scFv(Anti-CD4 scFv)は、CD8由来のヒンジ（H）および膜貫通（TM）領域（図1A）によって細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。CD4CAR DNA分子をレンチウイルスプラスミドにサブクローニングした。2つの共刺激ドメイン（CD28および4-1BB）が存在するため、CD4CARは第3世代CARであると考えられている。CD4CAR発現は、強力なSFFV（脾臓フォーカス形成ウイルス）プロモーターのもとで制御され、血液学的応用に適している。
【０２２８】
CD4CARの特徴
CD4CAR構造を検証するために、トランスフェクトされた293-FT細胞をウエスタンブロット解析にて分析した。抗CD3ゼータモノクローナル抗体によるイムノブロッティングは、CD4CAR CD3ゼータ (CD3zeta) 融合タンパク質の予測されるサイズのバンドを示した（図1B）。予想通り、GFPコントロールベクター（図1B）ではCD3zeta発現は観察されなかった。作製されたCD4CARレンチウイルスもまた、scFvを対象としたフローサイトメトリー解析を介してHEK293細胞における形質導入効率について試験した（図6）。したがって、本発明者らは、本発明者らの作製した第3世代のCD4CARが、細胞内末端にCD3zeta細胞内ドメインおよび細胞外末端にscFvを含有することを確認した、そのことが、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメインならびにCD28および4-1BB共役ドメインを含有することをも意味する（図1C）。T細胞におけるCD4CAR発現および機能の前臨床試験の特徴付けのために、ヒトT細胞を抗CD3抗体およびIL-2で活性化し、次いでCD4CARおよびGFPコントロールレンチウイルス上清でそれぞれ形質導入した。それおぞれのT細胞を形質導入後7日間増殖させた。
【０２２９】
臍帯血由来のCD4CAR T細胞は、CD8 + T細胞が豊富に含まれ、それらのほとんどはセントラルメモリーT細胞ような免疫表現型を生じる。
【０２３０】
ヒト臍帯血（CB）は、同種異系T細胞療法の代替として使える。ヒトCB軟膜細胞を活性化し、CD4CARまたはコントロール（GFP）レンチウイルスのいずれかで形質導入した。形質導入後、CD4CAR T細胞およびGFP T細胞を7日間増殖させ、CD4CARおよびGFP T細胞の両方について 細胞数が20倍増加したことが観察された（図7）。7日目に、T細胞サブセットについてフローサイトメトリーにより細胞を分析した（図2A）。フローサイトメトリー分析は、T細胞の〜54％がCD4CARを発現することを示した（図2B）。さらに、我々は、CD4CAR形質導入後のT細胞の増殖経過中にCD4およびCD8サブセットを分析した。以前の知見と一致して、抗CD3および共刺激分子によるT細胞活性化の間に、小サブセットCD8細胞はCD4を誘導発現した（図2C）。予想通り、約33％の細胞がCD4 +のままであるGFP対照と比較して、CD4 + TサブセットはCD4CAR形質導入後3または4日以内にほぼ完全に消耗した（図2C）。これらのデータは、CD4CAR T細胞が細胞増殖の間にin vitroで強力な抗CD4活性を示すことを示している。
【０２３１】
我々はまた、各培養の最後にCD4CAR T細胞の免疫表現型を評価した。刺激後、ナイーブT細胞はCD45RAを失い、CD45ROを獲得してセントラルメモリーT細胞になる。3回に及ぶフローサイトメトリー分析実験からは、増殖したT細胞の約96％がCD45RO +であり、約83％がCD62L +であり、約80％がCD8 + CD45RO + CD62L +であり、4％未満がCD45RA +であった（図2D）。CD8 + CD45RO + CD62L +免疫表現型は、セントラルメモリーの様な表現型の獲得と一致し、低CD45RA +発現は、ナイーブT細胞状態の喪失を意味する。臍帯血に由来するCD4CAR T細胞は、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群および未分類のPTCLリンパ腫を含むCD4発現白血病/リンパ腫を特異的に殺す。
【０２３２】
CD8 + T細胞が豊富に含まれるCD4CAR T細胞が産生された（図2C）。次いで、これらの細胞はKARPAS 299細胞株を用いて、抗白血病機能についてin vitroで試験された。KARPAS 299細胞株は、CD4を発現する未分化大型T細胞リンパ腫を有する患者の末梢血から最初に確立された。細胞遺伝学的分析は、以前にKARPAS 299細胞が多くの細胞遺伝学的異常を有することを示した。共培養実験の間、CD4CAR細胞は、著明な白血病細胞殺傷能力を示した（図3A）。最初に、CB由来CD4CAR T細胞をKARPAS 299細胞をアブレーションする能力について試験した。実際に、24時間のインキュベーションおよび2：1の低いE：T（エフェクター：標的）比で、CD4CAR細胞はKARPAS299細胞を首尾よく除去した。コントロールとして、CD4CAR T細胞もCD4陰性リンパ腫細胞をアブレーションする能力について試験した。SP53マントル細胞リンパ腫細胞株は、CD4を発現しないヒトB細胞リンパ腫細胞株である。フローサイトメトリー分析は、CD4CAR T細胞がSP53マントル細胞リンパ腫を溶解または除去できなかったことを示した（図3D）。
【０２３３】
患者サンプルを用いても研究を行った。患者1は、侵略的なCD4 + T細胞白血病、標準化学療法に反応しなかったセザリー症候群である。患者2は、不特定のCD4 + PTCLリンパ腫である。両方の患者サンプルのフローサイトメトリー分析は、CD4を発現するほとんどすべての白血病細胞で、強く均一なCD4発現を示した（図3BおよびC）。患者サンプルとCD4CARとを24時間共培養の結果をフローサイトメトリー分析によって視覚化すると 、CD4 +悪性腫瘍の急速かつ最終的なアブレーションが生じ、Sezary症候群およびPTCL共培養の両方で約98%の削除が観察され、これは以前示したKARPASのアブレーションと一致する（図3Bおよび3C）。したがって、共培養アッセイにおいて、CD4CAR T細胞は、異なる２種類の攻撃的CD4 +リンパ腫/白血病細胞を効率的に患者サンプルから排除することを示す、それが例え2：1の低いE：T比（図3Bおよび3C）であってもである。これらのデータは、抗CD19 CARを介したB細胞悪性腫瘍の標的化におけるCD19の役割に類似した、CD4がCD4陽性T細胞白血病およびリンパ腫の有望な治療標的であることを支持しています。したがって、我々の患者サンプルおよびCD4CAR共培養アッセイは、CD4陽性悪性腫瘍を標的とするためにCARを使用する概念を示している。
【０２３４】
PBMCに由来するCD4CAR T細胞は、CD4発現する腫瘍細胞株を特異的に死滅させる  autologous adoptive CAR T療法が診療所で一般的に使用されるので、PBMC（末梢血単核細胞）に由来するCD4CAR T細胞でテスト した。PBMCを活性化し、CD4CARレンチウイルスで形質導入した。CD4およびCD8セットは、細胞増殖中のフローサイトメトリーによってモニターし、コントロールGFPで形質導入した細胞のものと比較した。CD4CAR T細胞由来のPBMCは、CB由来のCD4CAR T細胞で観察されるように、CD8 + T細胞が豊富に含まれる（図4A）これはCD4 +枯渇がCD4CAR T細胞 によることを示す。続いてPBMC由来のCD4CAR細胞を、KARPAS 299細胞株を用いて、CD4陽性白血病/リンパ腫細胞をアブレーションする能力において試験した。アブレーションアッセイは、CD4CAR T細胞またはGFP T細胞、KARPAS 299細胞、およびSP53マントル細胞リンパ腫細胞株をネガティブコントロールとした共培養を含めた。24時間後に反応を停止させ、死んだ細胞を7-AAD（7-アミノアクチノマイシンD）で染色し、生存細胞をフローサイトメトリーで分析した。CD4CAR T細胞は一晩インキュベートしたKARPAS 299細胞を、それぞれ2：1,5：1および10：1のE：T比でそれぞれ38％、62％および85％の速度で排除した（図4B）。これらのデータを合わせると、強い量依存的関係が示されます。標的細胞をGFPコントロールT細胞とともにインキュベートすると、KARPAS 299細胞の死滅は観察されなかった。これらの結果は、CD4CAR T細胞アブレーションがCD4 +を標的とした特異的反応であることを実証する。
【０２３５】
CD4CAR T細胞はin vivoで 有意な抗腫瘍活性を示す
In vivo抗腫瘍活性を評価するために、KARPAS 299細胞株を用いて異種マウスモデルを開発した。複数の異なる設定を使用して、In vivoでのCD4CAR T細胞の有効性を試験した。最初に、一度の 低用量の投与でNSGマウスにおける白血病の出現を遅延させるCD4CAR T細胞の能力を試験した。注入前に、改変されたT細胞は、フローサイトメトリー分析によって示されるように、約40〜50％のCD4CARを発現する細胞を提示した。マウスにKARPAS 299細胞の皮内注射を受けさせた後、低用量（200万）のCD4CAR T細胞の一度の注射（静脈内投与）を行った。白血病を有するマウスへの全身性CD4CART細胞の低用量の単一投与は、一時的な退縮のみを引き起こすか、または白血病性腫瘤の出現を遅延させた（図5A）。白血病の増殖が加速し始めたとき、8×106個のCD4CAR T細胞の追加投与により白血病の増殖を著しく阻止した（図5A）。
【０２３６】
CD4CAR抗白血病活性の有効性をさらに試験するために、比較的大量のCD4CAR T細胞の2度の投与を行った。同様に、2回で合計13.5x106のCD4CAR T細胞を注射すると、より低いCD4CAR用量と比較してより顕著な白血病増殖停止が引き起こされたが、最終的には白血病細胞集団が増殖した（図5B）。最終的に、本発明者らは、低用量のCD4CAR T細胞（2.5×106細胞）の多回投与の有効性を見つけた。我々は、皮下の白血病を有するマウスに CD4CAR T細胞の静脈内投与を4日または5日に1回、合計4回くりかえした。4コースのCD4CAR T細胞投与後、4匹の処置されたマウスの1匹は腫瘍がなく、毒性 を示さなかった。複数回投与のCD4CAR T細胞処置マウスは、単回投与と比較してより有意な抗白血病効果を示した（図5Cおよび5A）。さらに、CD4CAR T細胞での処理は、GFP形質導入コントロールT細胞での処置と比較して、KARPAS 299リンパ腫を有するマウスの生存を有意に延長した（図5D）。
【０２３７】
抗CD4キメラ抗原受容体（CD4CAR）NK細胞は、前臨床モデルにおけるT細胞悪性腫瘍を効率的に標的とする
方法材料
原発性腫瘍細胞および細胞系
ヒト白血病細胞は、Stony Brook UniversityのInstitutional Review Boardによって承認されたプロトコールで、残留サンプルから得られた。臍帯血細胞もまた、Stony Brook University Hospitalのドナーからのプロトコールの下で得られた。書面によるインフォームドコンセントがすべてのドナーから得られた。Karpas 299、HL-60、CCRF-CEM、MOLT4およびNK-92細胞株は、ATCC（Manassas、VA）から入手した。NK-92細胞は 特に指定されない限り、リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まないα-MEMおよび2mMのL-グルタミン、1.5g/L重炭酸ナトリウム、12.5％の熱不活性化ウマ血清、12.5％の熱不活性化FBS、1X Pen/Strep、0.2％イノシトール、0.02％葉酸および50μMβ-メルカプトエタノールとIL-2（300IU / mL）の組成の濾過したNK細胞培地で培養した。Karpas 299、CCRF-CEM、およびMOLT4細胞株をRPMI、10％FBS、1×Pen / Strep（Gibco、Waltham、MA、USA）の培地で培養した。HL-60細胞をIMDM、10％FBS、1×Pen / Strep（Gibco、Waltham、MA、USA）の培地で培養した。
【０２３８】
CAR構築世代
CD4特異的CAR（pRSC.SFFV.CD4.3G）は、4-1BBおよびCD3ゼータドメインの上流の細胞内CD28ドメインを含むように設計され、それによってこの構造を第3世代のCARとした。
【０２３９】
レンチウイルスの生産と形質導入
ウイルス上清を産生するために、293FT細胞に、製造者のプロトコールに従ってLipofectamine 2000（Life Technologies、Carlsbad、CA）を用い、pRSC.SFFV.CD4.3GまたはGFPレンチウイルスベクターコントロールを含むpMD2GおよびpSPAXウイルスパッケージングプラスミドでコトランスフェクトした。ウイルス上清での形質導入の前に、300 IU / mL IL-2の存在下でNK細胞を最低2日間培養した。トランスフェクションおよび形質導入手順は、補足データにさらに記載されている。
【０２４０】
形質導入されたNK細胞のCAR検出
CARの発現を測定するために、形質導入の3日後にNK細胞を洗浄し、FACs緩衝液（0.2％BSAを含DPBS）に懸濁させた。非特異的結合をブロックするために、Normal goat IgG（Jackson Immunoresearch、West Grove、PA）を使用した。各NK細胞サンプルを、4℃で30分間、ビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスF（Ab '）2（1：250、Jackson Immunoresearch、West Grove、PA）でプローブした。細胞を1回洗浄し、FACs緩衝液に再懸濁した。次いで細胞をPE標識ストレプトアビジン（1：250、Jackson Immuno Research、West Grove、PA）を用い30分間4℃で染色した。細胞をFAC緩衝液で洗浄し、2％ホルマリン液中に再懸濁させた。FACS Calibur装置（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ）を用いてフローサイトメトリーを行い、結果をKaluzaソフトウェア（Beckman Coulter、Brea、CA）を用いて分析した。
【０２４１】
共培養アッセイ
CD4CARまたはベクターコントロールNK細胞を、Karpas 299細胞（未分化大型T細胞リンパ腫）、HL-60細胞（急性前骨髄球性白血病）、CCRF-CEM細胞（T細胞急性リンパ芽球性白血病：T-ALL）ヒト臍帯血から単離されたCD4 + T細胞または初代ヒト白血病細胞（成人セザリー症候群および小児T-ALL）を2：1および5：1の比でそれぞれCD4発現細胞（200,000および500,000のエフェクター細胞から100,000の標的細胞）を IL-2を含まない1mLのNK細胞培養培地中で培養した。共培養の24時間後、残った生細胞を採取し、マウス抗ヒトCD56およびCD4抗体で染色し、4℃で30分間インキュベートした。CD56 +単一陽性NK細胞、およびCD4 +単一陽性示された標的細胞。全ての細胞をFACs緩衝液で洗浄し、2％ホルマリンに懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２４２】
細胞毒性アッセイ
CD4CARまたはベクターコントロールNK細胞を、標的細胞（CFSE染色したKarpas 299細胞およびCMTMR染色CCRF-CEM細胞）の50:50混合物およびオフターゲットCMTR標識MOLT4細胞とエフェクター：標的比でインキュベートしたIL-2を含まない1mLのNK細胞培養培地中で、1：1,1：2および1：4の比でインキュベートした。24時間後、細胞を7-AAD（BioLegend、San Diego、CA）で染色し、FACS緩衝液で洗浄し、生存7-AAD陰性細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【０２４３】
コロニー形成単位（CFU）アッセイ
CD4CAR NK細胞を、IL-2を補充したNK細胞培地中で、500個のCD34 + CB細胞とそれぞれ24時間、共培養エフェクター：標的比2：1および5：1でインキュベートした。使用したコントロールとして、CD34 +細胞のみ、およびCD34 + CB細胞と2：1および5：1エフェクター：標的比で共培養した非形質導入NK細胞であった。造血細胞の分化は、16日目に赤血球バースト形成単位（BFU-E）および顆粒球/単球コロニー形成単位（CFU-GM）の数を介して評価した。CFU統計分析は、2-way ANOVA with alpha set at 0.05を用いた。
【０２４４】
異種マウスモデル
雄の12週齢のNSGマウス（NOD.Cg-Prkdcsid Il2rgtm1Wj1 / SzJ）をJackson Laboratory（Bar Harbor、ME）から購入し、Stony Brook University IACUC承認プロトコールの下で使用した。NSGマウスに致死量以下（21.5Gy）のガンマ線照射を照射した。24時間後、測定可能な皮下腫瘍を形成させるために、ルシフェラーゼを発現するように安定に形質導入された0.5×106のKarpas 299細胞をマウスに皮内注射した。Karpas 299細胞注射の24時間後の1日目に、マウスに、5×106個のCD4CAR NK細胞またはベクターコントロールNK細胞（1グループ当たりN = 4）を尾静脈から静脈注射した。静脈内注射を5日間毎に6コース合計で繰り返した。腫瘍の大きさの面積を1日おきに測定した。Karpas 299細胞注射後の7、14および21日目に、100μLのRediJect D-ルシフェリン（Perkin Elmer、Waltham、MA）をマウスに皮下注射し、IVISイメージング（PerkinElmer、Waltham、MA）にて解析した。Caliper Life Sciencesソフトウェア（PerkinElmer、Waltham、MA）を用いて画像を分析した。
【０２４５】
統計
異種モデルのサンプルサイズは、2-sample, 2-sided equality power analysis (90% power and <5% significance)を使用して推定した。腫瘍の大きさの面積および光度の有意差をUnpaired Student T tests決定した。Kaplan-Meier法を用いて生存曲線を構築し、a log-rank  (Mantel-Cox) test with P <0.05 considered significantを用いて生存の統計分析を行った。統計分析は、GraphPad Prism 6ソフトウェアを用いて行った。差異は、処置群と対照群の間で同様であると判定された。
【０２４６】
結果
第3世代のCD4CARの生成
抗CD4分子の一本鎖可変断片（scFv）ヌクレオチド配列は、ヒト化モノクローナル抗体イバイザズマブ（Hu5A8またはTNX-355）由来であり、その安全性および有効性はHIVの臨床試験において十分に研究されている。シグナル伝達を改善するために、CD4CARは、CD3zetaシグナル伝達ドメインに融合したCD28および4-1BBドメインを用いて設計され、第3世代のCARとなった。CD19を標的とした第3世代のCAR T細胞は、これまでにも臨床試験で大きな効力を発揮しています。NK細胞表面上のCD4CAR分子の効率的な発現のために、強力な脾臓焦点形成ウイルスプロモーター（SFFV）を使用し、CD8のリーダー配列を構築物に組み込んだ。抗CD4 scFvは、CD8由来ヒンジ（H）および膜貫通（TM）領域によって細胞内シグナル伝達ドメインから離れている（図8Aおよび8C）。続いて、CD4CAR DNA分子をレンチウイルスプラスミドにサブクローン化した。
【０２４７】
CD4CARの特性評価
CD4CAR構造を検証するために、HEK293-FT細胞をCD4CARレンチウィルスプラスミドまたはベクターコントロールプラスミドでトランスフェクトし、48時間後にウエスタンブロット分析のために回収した。抗CD3ゼータ（CD3zeta）モノクローナル抗体によるイムノブロッティングは、CD4CAR-CD3ゼータ（CD3zeta）融合タンパク質の予測されるサイズのバンドを示した（図8B）。予想通り、GFPベクターコントロールタンパク質においてCD3zeta発現は観察されなかった（図8B）。
【０２４８】
CD4CAR NKの作製
CD4CAR NK形質導入効率は、フローサイトメトリー（図9Aの上のパネル）によって決定されるように、15.9％であると測定された。次に、蛍光活性化細胞選別（FACS）をCD4CAR + NK細胞の割合をさらに高めるために使用した。選別後、回収されたCD4CARhigh NK細胞は、85％を超えるCD4CAR陽性であることが確認された（図15）。CD4CARhigh細胞のFACS収集後、CD4CAR発現レベルは、最大10継代の培養、および凍結保存後のNK細胞上で75〜90％で一貫して安定したままであった。実際、共培養実験の開始時に、CD4CARhigh NK細胞はCARを85％発現していた（図9A下部パネル）。
【０２４９】
CD4CAR NK細胞は、未分化大型T細胞リンパ腫（Karpas 299）、急性骨髄性白血病（HL-60）およびT細胞急性リンパ芽球性白血病（CCRF-CEM）を含むCD4 +血液癌細胞を特異的に溶解する。
【０２５０】
CD4CAR NK細胞を、以下のCD4 +細胞株：Karpas 299、HL-60、およびCCRF-CEMを用いてin vitroで抗リンパ腫活性について試験した。Karpas 299細胞株は、未分化大型T細胞リンパ腫を有する25歳の患者の末梢血から樹立された。HL-60細胞株は、36歳の急性前骨髄球性白血病患者の末梢血から樹立された。CCRF-CEM細胞株は、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）を有する4歳の患者の末梢血から樹立された。
【０２５１】
24時間共培養実験の間、CD4CAR NK細胞は、エフェクター細胞対標的細胞比（E：T）低い2：1の割合（図10A）および標準的な5：1の比率で、CD4陽性白血病/リンパ腫細胞に対する著しい殺傷能力を示した（図10C）。共培養での細胞毒性アッセイにおいて、標的腫瘍細胞は、CD4 +、CD56-免疫表現型（フローサイトメトリーチャート上では青色で標識されている）によって同定された。予想どおり、ベクターコントロールNK細胞は、NK細胞に先天性の非特異的な腫瘍細胞殺傷能力を示したが、予想通り、CD4CAR NK細胞と比較してCD4 +腫瘍細胞に対してははるかに効果的ではなかった。Karpas 299細胞の分析だけで99.1％のCD4 +発現が確認された（図1Aの上部パネル）。際立って、 2：1のE：T比で、コントロール対照（N = 2）と比較して、CD4CAR NK細胞は100％のKarpas 299細胞を完全に切除した（図10A上部パネルおよび10C）。同様に、HL-60およびCCRF-CEM細胞の分析では、それぞれ99.9％および92.1％になるCD4の高発現が確認された（図10A中および下部パネル）。同様に、2：1のE：T比では、ベクターコントロール（図10Aおよび10C）と比較して、CD4CAR NK細胞は75％のHL-60細胞および97％のCCRF-CEM細胞を強く溶解した。これらのデータを合わせると、CD4CAR NK細胞は、NK細胞に固有の非特異的抗腫瘍細胞活性を保持することに加えて、CD4 +細胞を特異的かつ強力に標的とすることが示される。
【０２５２】
患者試料を用いて共培養実験 を行った（図10Bおよび10C）。患者1は、標準的な化学療法に反応しなかった侵襲的なCD4 +皮膚T細胞リンパ腫 であるセザリー症候群を示した。セザリー症候群は、PTCLのサブセットである。患者1の白血病細胞は、フローサイトメトリーにより78.1％CD4 +であると評価された（図10B）。患者2は、CD4 +小児T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）を示した。同様に、患者2の細胞は、フローサイトメトリーを介して43.7％のCD4 +であると評価された（図10B）。2：1の低いE：T比率で24時間共培養した後、CD4CAR NK細胞は、患者1由来のCD4 +セザリー症候群細胞58％および患者2由来のCD4 + T-ALL細胞78％を溶解した（N = 2 ）。さらに、E：T比率を5：1に上げることで、CD4CAR NK細胞は、患者1由来のセザリー症候群細胞の82％および患者2由来のT-ALL細胞の82％を溶解した（N =  2）（図10Cおよび図14）。これらのデータは、成人および小児のCD4 + T細胞白血病およびリンパ腫の両方に対する患者サンプルおよび細胞株 における用量依存性応答および強力なCD4CAR NK細胞抗腫瘍活性を強く示唆する。
【０２５３】
CD4CAR NK細胞は、CD4発現腫瘍細胞株を用量依存的に特異的に溶解する
CD4CAR NK細胞は、エフェクター細胞対標的細胞比 1：4、1：2および1：1の用量依存的にin vitroでCD4 + Karpas 299およびCCRF-CEM白血病細胞株を特異的に溶解する（図11）。各共培養E：T比について、CD4CAR NKエフェクター細胞またはベクターコントロールNKエフェクター細胞を、同数のオンターゲットCD4 +細胞、CFSE染色Karpas 299またはCFSE染色CCRF-CEMで構成された腫瘍細胞と「オフターゲット」であるCMTMR染色したCD4-、CD5 + MOLT4急性リンパ芽球性白血病細胞とインキュベートした。MOLT4細胞を、開始細胞数の変動および自発的標的細胞死の変動を説明するために含めた。24時間後、生存細胞をフローサイトメトリーにより分析した。CD4CAR NK共培養におけるCD4 +標的細胞生存をベクターコントロールNK共培養と比較することにより、標的細胞の溶解パーセントを測定した。Karpas 299細胞は、それぞれ1：4、1：2および1：1のエフェクター対標的比で67％、95％および100％の割合で排除された（図11）。そして、同じE：T比で、それぞれ39％、58％、および69％の割合でCCRF-CEM細胞が排除された（図11）。予想通り、CD4CAR NK細胞は、フローサイトメトリー分析（図16A）によりCMTMR標識された<5％CD4 +であるMOLT4細胞を溶解しなかった 。さらなる共培養実験により、CD4CAR NK細胞は、0時間、4時間、8時間および24時間でMOLT4細胞を溶解しなかったことが確認された（図16B）、一方、CD4CAR NK細胞がKarpas 299細胞を4時間で溶解することがフローサイトメトリーによって検出された（図16C） 。これらのデータを合わせると、CD4CAR NK細胞の抗腫瘍細胞傷害性は用量依存性であり、迅速 であり、CD4 +細胞に対して高度に特異的であることが示される。
【０２５４】
臍帯血から単離されたCD4 + T細胞を用いて、さらなる共培養研究を行った。これらの実験において、CD4CAR NK細胞は、共培養の24時間後に2：1のエフェクター：標的比でCD4 + T細胞を完全に枯渇させ、残りのCD4 +細胞は0.0％であった。予想通り、対応するベクターコントロールNK細胞（CD56 +、CD4-）とのCD4 +臍帯血細胞共培養後、CD4 +集団の割合ははほとんど変化しておらず（図12A）、CD4CAR NK細胞は健康な組織で特異的かつ強固にCD4 +集団排除する。
【０２５５】
CD4CAR NK細胞は、造血コンパートメントにおける幹細胞の分化に影響を与えない
CFU（Colony-Forming-Unit）アッセイ分析は、CD4CAR NK細胞が造血コンパートメントのCD34 +臍帯血幹細胞産生に有意に影響しないことを明らかにした。造血コンパートメントの分化を0日目の赤血球前駆体および顆粒球/マクロファージ前駆体の存在と、16日目の赤血球形成数（BFU-E）および顆粒球/単球コロニー形成単位（CFU-GM）の数によって決定した（図12B）。この知見は、成熟T細胞マーカーであるCD4への特異的な標的化であり、造血幹細胞および早期前駆細胞への影響が限定され、治療の安全性の指標である系統のスキューイングの証拠にはならない。
【０２５６】
CD4CAR NK細胞は、in vivoで有意な抗腫瘍活性を示す
CD4CAR NK細胞のin vivo抗腫瘍活性を評価するために、我々は、致死量以下の照射を受けたNSGマウスにルシフェラーゼ発現Karpas 299細胞を皮内注射して、測定可能な腫瘍形成を誘導する異種マウスモデルを開発した。１日目である、２４時間後にKarpas 299細胞を注射、後に5日ごとに合計6コースほど、マウスに5x10 6個のCD4CAR NK細胞またはベクターコントロールNK細胞を静脈注射で投与した。7、14および21日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、腫瘍負荷を測定するためにIVISイメージングを行った（図13A）。CD4CAR NK注射マウスについて測定された平均光強度を、ベクターコントロールNK注射マウスの平均光強度と比較した（図13B）。21日目までに、CD4CAR NKを注射したマウスは、光度が有意に低く、すなわち、ベクターコントロールと比較して腫瘍負荷が少なかった（p <0.01）。1日目およびその後の1日おきに、腫瘍サイズ面積を測定し、2つのグループ間の平均腫瘍サイズを比較した（図13C）。Unpaired student T test 統計解析により、CD4CAR NK注射マウスの平均腫瘍サイズは、17日目（p <0.05）および19〜25日目（p <0.01）に続くベクターコントロールNK注射マウスの平均腫瘍サイズよりも有意に小さいことが明らかとなった。次に、我々は2つのグループにわたってマウスの生存を比較した（図13D）。すべてのCD4CAR NK注射マウスは、30日以降も生存した。しかしながら、コントロールNK処理のマウスは１７日以降死に始め、２３日までにすべてマウスは死んだ。要約すると、これらのin vivoのデータは、CD4CAR NK細胞がKarpas 299注射NSGマウスの腫瘍を有意に減少させることを示し、生存期間の延長を促した。
【０２５７】
抗CD5キメラ抗原受容体（CD5CAR）T細胞は、CD5陽性血液学的悪性腫瘍を効率的に標的とする。
【０２５８】
例
結果
第3世代のCD5CARの作製
CD5CARおよびanchored CD5 scFv抗体の構造は、CD5発現細胞の標的化および溶解の両方の点及び、CD5CAR T細胞がそれら自身のCD5CAR T細胞集団のCD5発現を下方制御する能力の点でCD5CAR T細胞の機能および機序を試験するために設計され、（図17A）。CD5CAR構造を確認するために、作製したCD5CARレンチウイルスをHEK293細胞に形質導入した。CD5CARまたはGFP-レンチウイルスで48時間処理した後、HEK293細胞におけるCD5CARの発現を、CD5CARタンパク質のC末端領域を認識するCD3ゼータ (CD3ζ) 抗体を用いたウエスタンブロット分析によって確認した（図17B）。得られたバンドは、CD5CAR形質導入HEK293細胞におけるCD5CARタンパク質の予測されたサイズであり、GFP形質導入HEK293細胞は、ウエスタンブロット分析によって特定のバンドを示さなかった。その後の実験でCD5CARタンパク質の機能を評価するために、CD5CARレンチウイルスを活性化ヒトT細胞に形質導入した。T細胞表面上のCD5CARの発現を、CD5CARタンパク質のscFv領域を認識するヤギ抗マウスF（ab'）抗体を用いたフローサイトメトリー分析によって評価した。フローサイトメトリー分析は、CD5CAR発現の約20％がアイソタイプコントロール (Isotype control) 比較してCD5CAR形質導入T細胞で観察されたことを示した（図17C）。これらの結果は、今後の実験のためにCD5CAR発現T細胞を首尾よく作製したことを示した。
【０２５９】
CAR療法におけるCD5発現のダウンレギュレーション
CD5CAR T細胞共培養および動物試験に先立って、CD5CAR T集団内の自己殺傷を避けるために、CD5CAR T細胞の表面上のCD5の発現がダウンレギュレーションされる。CD5のダウンレギュレーションは、CAR T細胞集団内のCAR T細胞の自己殺傷を防止し、CD5のダウンレギュレーションは、T細胞の死滅能力の増加と関連する。CD5発現を有さないT細胞内で産生されるCARは、CAR自身の構造にもかかわらず、超機能的CARである。CD5 CAR T細胞の作製およびCD5 CARレンチウイルスの単回または２回の形質導入を用いたCD5ダウンレギュレーションの比較の方法を図18Ａお呼び図18Ｂに示す。非濃縮CD5 CARレンチウイルスを有する単一形質導入でCD5CAR T細胞は、8日目までに細胞表面からのCD5タンパク質の完全なダウンレギュレーションを示さず、6日目に最大CD5陰性集団が46％まで上昇した（図18C）。２度の形質導入集団では、形質導入されたT細胞の約90％が4日間のインキュベーションでCD5陰性となった。対照的に、GFP T細胞コントロールは、2日目から8日目まで95％を超えるCD5 +、CD3 +両陽性集団を維持する（図18C）。
【０２６０】
T細胞上のCD5発現のダウンレギュレーションは、anchored CD5CAR scFvレンチウイルスの形質導入によって達成することができる
CD5CARがT細胞上のCD5発現をダウンレギュレーションする機構をさらに解明するために、anchored CD5 scFv（配列番号7（図17A））と命名された新規構造を作製した。この構造は CD5 scFvがT細胞表面上につなぎとめることを可能にするため、anti-CD5 scFvがヒンジ領域を介して膜貫通ドメインにつながる。anchored CD5 scFvポリペプチド（配列番号16）は、CD5CARの機能としで観察されるようにCD5標的に結合するが標的細胞の溶解はしない。1度の形質導入による並びにフローデータ分析結果を図19Aおよび19Bに示すが、インキュベーション7日目のT細胞でCD5発現の部分的ダウンレギュレーションが見られる。これは1度の形質導入でのCD5CAR T細胞で見られるCD5発現の部分的ダウンレギュレーションの結果と一致する。
【０２６１】
CD5CAR T細胞は、T-cell ALL細胞株を効果的に溶解する
CD5CAR T細胞の殺傷能力は、図20Aおよび20Bに示されるように、T-cell ALL 樹立細胞株であるCCRF-CEMおよびMOLT-4、および未分化大細胞白血病細胞株KARPAS 299に対して最初にためされた。GFPコントロールと比較した場合、2つのCD5 +細胞株について強い殺傷能力がみられ、両方の細胞株で75％を超えた細胞溶解を示した。CD5陰性である未分化大細胞白血病細胞株系KARPAS 299では0％の溶解が観察された。
【０２６２】
CD5CAR T細胞は、ヒト試料由来のT-cell ALL細胞を効果的に溶解する
複数の患者サンプルを用いて、CD5CARによるT-ALL患者サンプルの細胞溶解能力を調べ、CD5CAR細胞による共培養の結果を図21および図22に示した。T-ALL-1患者の細胞では強い細胞殺傷が認められ、これはCD5CAR細胞がT-cell ALL細胞株を標的とした場合に見られるCD5標的による細胞溶解と同様であったが、他の3つの患者白血病細胞に対しては比較的弱い溶解を示した（図21Aおよび図21B）。
【０２６３】
患者の白血病細胞に対するCD5CARの殺傷能力は、図21A、21Bおよび21Dに示すようにCD5発現の強度と相関していた。図21Cおよび21Dに示すように、フローサイトメトリー分析によりT-ALL-1、T-ALL3、T-ALL6およびT-ALL7のCD5発現を観察した。CD5発現は、T-ALL-1サンプルを除いて、T-ALL患者サンプルについて有意に低かった。
【０２６４】
CD5CAR T細胞は、標的細胞への特異性および強力な死滅を示す
コントロールとして、CD5CAR T細胞によるCD5陰性白血病T細胞を除去する能力について試験した。未分化大型T細胞リンパ腫株は、CD5を発現しない細胞株である。図20A、下のパネルに示すように、フローサイトメトリー分析は、CD5CAR T細胞がKARPAS 299細胞を溶解または除去することができないことを示した。
【０２６５】
T-ALLの最小限の疾患を有する患者から、高レベルのCD5発現を有する患者サンプル（T-ALL-8）を得た。CD5CARで共培養を行い、図22に示すように詳細に分析した。CD5 +正常T細胞、CD5 + CD34 + T-ALL細胞およびCD5-CD34 + T-ALL細胞を含む3つの集団細胞を、共培養後にフローサイトメトリーによって評価した。CD5CARは、GFPコントロールと比較した場合、CD5 +細胞集団全体でCD5陽性細胞への特異的および93％を超える強力な標的細胞溶解能力を示した。CD5CARは白血病細胞をCD5正常T細胞と同じくらい効率的に死滅させた。殺傷はCD5陰性集団で観察されなかった。CD5CAR T細胞は本質的にT細胞集団（CD5 + CD34-）を排除した。
【０２６６】
CD5CAR T細胞は正常なT細胞を効果的に排除する
CD5CAR T細胞は、0.25：1、0.5：1および1：1（エフェクター：標的）の低い比率での共培養アッセイにおいて用量依存的に正常T細胞を効果的に排除することを実証した（図23）。CD5CAR T またはCD123CAR T（コントロール）エフェクター細胞をGFP標識T細胞とともにインキュベートした。CD5CAR T共培養におけるGFP T細胞生存率をCD123CAR Tをコントロールとして共培養で比較することにより、標的細胞の死滅率を測定した。正常なGFP T細胞はCD5CAR T細胞により用量依存的に排除した。CD5CAR T細胞は、エフェクター対標的比1：1で全てのGFP T細胞を効果的に排除した（図23）。CD5CAR T細胞はすべての正常T細胞を効果的に排除するので、CD5CAR T療法の実現可能性は、永続的ではなく一時的なものを提供する能力に よるものである。CD5CAR T細胞は、造血細胞移植のための新規のコンディショニングレジメンまたは「ブリッジ」として使用することができる。
【０２６７】
T細胞は、CD5CARまたはanchored CD5 scFv T細胞と共培養したとき、CD5発現を維持した
CD5特性の1つは、抗体による結合後の内在化である。その結果、標的細胞は標的抗原を失い、antigen escape を引き起こす可能性がある。この現象は、CAR T細胞に基づく治療法を用いた臨床研究の失敗の原因として報告されている。次に、CD5 CARまたはanchored CD5 scFv T細胞が、共培養アッセイによりCD5陽性T細胞または白血病細胞上のCD5発現に影響を及ぼす場合 を調査する。CD5CAR T細胞またはanchored CD5 scFv T細胞およびCD123 CAR T細胞（コントロール）の作製のためのステップを図24Aに示した。CD5CARまたはanchored CD5 scFvおよびCD123CARレンチウイルスによる2回のT細胞形質導入後の3日目に、それぞれの形質導入T細胞をフローサイトメトリーによりCD5の発現を分析した。CD5CARまたはanchored CD5 scFvレンチウイルスのいずれかを形質導入したT細胞は、表面CD5タンパク質の 完全なダウンレギュレーションを示した（図24B）。対照的に、CD123 CAR形質導入-T細胞コントロールはCD5発現を維持した。
【０２６８】
次いで、形質導入されたCD5CARまたはCD5anchored scFvおよびCD123CAR T細胞を、GFP標識T細胞と1：1（E：T）の比率で2または4日間共培養した。図25AおよびBに示すように、CD5CAR T細胞は、効果的にすべてのGFP-T細胞を除去した。予想通り、形質導入されたCD5 anchored scFvまたはCD123CAR T細胞は、GFP T細胞を溶解することができなかった。さらに、形質導入されたCD5anchored scFvまたはCD123CAR T細胞と共に共培養すると、GFP T細胞は依然としてCD5を発現した。これらの研究は、免疫療法のためにCD5CARを用いる場合、CD5抗原の逃避が起こりにくいことを示している。
【０２６９】
T ALL細胞がCD5CARまたはCD5anchored scFvレンチウイルスで形質導入されたときのCD5発現のダウンレギュレーション
次に、 CD5CARまたはanchored CD5CARレンチウイルスの形質導入がT ALL細胞上のCD5発現のダウンレギュレーションをもたらすかどうかをテストした。CD5CARまたはanchored CD5 scFvレンチウイルスでCCRF-CEMおよびMOLT-4 T-ALL細胞に形質導入された。CD5CARまたはanchored CD5 scFvは、これらの白血病細胞上の表面CD5発現の量を有意にダウンレギュレートまたは減少させた（図25C）。対照的に、T細胞は、これらの細胞を形質導入したanchored CD5 scFv T細胞と共培養するために使用した場合、CD5発現を維持した（図24AおよびB）。
【０２７０】
CD5CAR T細胞はin vivoで著しい抗腫瘍活性を示す
患者の治療有効性の予測因子としてCD5CAR T細胞のin vivo抗腫瘍活性を評価するため、NSGマウスを致死量以下で照射し（2.0Gy）、1.0×10 6個のホタルルシフェラーゼ発現- CCRF-CEM細胞（CD5 +）を 測定可能な腫瘍形成を誘導する為、静脈注射した。CCRF-CEM-Luc +細胞注射 3日後に、5×10 6 CD5CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞をマウスに静脈注射した。これらの注射はさらに4日目、6日目、および7日目に繰り返した、マウスあたり合計20×10 6個のT細胞を注入した。5日目、8日目、10日目および13日目に、マウスにRediJect D-Luciferin（Perkin-Elmer）を皮下注射し、IVIS画像法（Caliper LifeSciences）にて腫瘍負荷を測定した（図26A）。CD5CAR T細胞を注射したマウスと、ベクターコントロールT細胞を注射したマウスの平均光強度を測定し、それらを比較した（図26B）。1対1のT検定分析は、コントロールと比較して、13日目までにCD5CAR T注射群において、光強度がより低く、腫瘍負荷がより少ない非常に有意な差を明らかにした（p <0.0012）。さらなる解析により、5日目までにCD5CAR T細胞で処置したマウスはコントロールマウスと比較して53％低い腫瘍量を有し、その割合は8日目までに95％に改善したことが示された（図26C）。腫瘍量は、13日目まで、処置されたマウスのバックグラウンドレベルに近いままであった。15日目に、治療を施したマウスおよび、CCRF-CEMまたはT細胞を注射しなかった2匹のマウス（バックグラウンドコントロールとして利用）を含む各マウスから少量の末梢血を採取し、移植されたCCRF-CEM細胞（CD5 +）の存在についてのフローサイトメトリーで解析した。コントロールT細胞を与えられたマウスは28〜43％のCCRF-CEM腫瘍細胞を有したが（図26D）、CD5CAR T細胞処理マウスの腫瘍細胞のパーセンテージがバックグラウンドレベル（<1％）に近かった。要約すると、これらのin vivoデータは、CD5CAR T細胞が、ベクターコントロールT細胞と比較して、CCRF-CEM注射NSGマウスにおける腫瘍量を強く低減し、生存を延長することを示している。
【０２７１】
抗CD5キメラ抗原受容体（CD5CAR）NK細胞は、CD5陽性血液悪性腫瘍を効率的に排除する
例
結果
CD5NK-CARの作製
抗CD5分子は、シグナル伝達を改善するためにCD3ゼータシグナル伝達ドメインに融合されたCD28および4-1BBドメインと連携した一本鎖可変フラグメント（scFv）を含むモジュラー設計で、それを第3世代のCARとする。NK細胞表面上のCD5CAR分子の効率的な発現のために、強力な脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター（SFFV）を使用し、CD8リーダー配列を構造に組み込んだ。抗CD5 scFvは、CD8由来ヒンジ（H）および膜貫通（TM）領域を介して細胞内シグナル伝達ドメインに結合する。次いで、このCD5CAR構成をレンチウイルスプラスミドにクローニングした。
【０２７２】
CD5CAR NK細胞の作製
フローサイトメトリー分析によってCD5CARの形質導入効率を決定した。CD5CAR + NK細胞を増やすために、 発現量の高いNK細胞を、フローサイトメトリーを用いて回収した。選別後、CD5CARhigh NK をin vitroおよびin vivoでの有効性試験のために増殖させた。
【０２７３】
CD5CAR NK細胞は、ヒトT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）細胞系を効果的に排除する
CD5CAR NK細胞の、抗T-ALL活性についてCCRF-CEM、MOLT-4およびJurkat細胞株を用いてin vitroで 試験した。これらの全てのT-ALL細胞系はCD5を高度に発現した。
【０２７４】
共培養実験で、CD5CAR NK細胞は、低エフェクター細胞対標的細胞比（E：T）が2：1および5：1でCCRF-CEMへの著しい殺傷能力を示した。これらの比で、CD5CAR NK細胞は事実上CCRF-CEM細胞を排除した（図27A）。CD5CAR NK細胞は、0.25：1、0.5：1、1：1、2：1および5：1のエフェクター：標的比でのin vitroでCCRF-CEM白血病細胞を用量依存的に溶解した（図27Bおよび27C）。追加の2つのT-ALL細胞、MOLT-4およびJurkatを用いて、CD5NK細胞の抗白血病活性を検討した。これらの2つの細胞株の共培養研究を、CD5CAR NK細胞を用いて行った。CD5CAR NK細胞は、2：1の低いエフェクター：標的比でMOLT-4およびJurkat細胞を事実上排除した（図28AおよびB）。
【０２７５】
CD5CAR NK細胞は、ヒト試料由来の攻撃的CD5 + T-ALL細胞を効果的に排除する
患者試料を用いて共培養実験も行った（図29A、B）。患者1および2は、いずれも標準化学療法に反応しなかったT-ALLであった。患者1（T-ALL＃1）は、CD5陽性のT-ALL細胞の小さなサブセットを有していた。この患者の白血病細胞をCD5CAR NK細胞と共培養した。Cell cytotracker dye（CMTMR）で患者の細胞を標識し、フローサイトメトリーにより、標的細胞をゲートおよび定量化した。標的CD5 + CD34 +細胞集団をアイソタイプコントロールに対してゲーティングした。CD5CAR NK細胞は、CD34 + CD5 +白血病細胞の約60％を5：1のE：T比で溶解した。重要なことに、CD5CAR NK細胞は、標的抗原エピトープに対して（選択的に）特異的かつ方向づけられた活性を示唆し、CD5-細胞集団に対して何ら活性を示さなかった。患者2（T-ALL＃2）はT-ALL集団を有し、これはCD5に対して事実上陽性であり、CD5CAR NK細胞と共培養した。CD5CAR NK細胞は、高度に発現するCD5 +標的集団のほぼ完全な溶解を示し、dim CD5 + CD34 +集団に対する強力な活性を示した（図29B）。
【０２７６】
CD5CAR NK細胞は、ヒト試料を用いて高悪性度のCD5 +末梢T細胞リンパ腫（PTCL）細胞を効果的に排除する
患者3は、CD4 + PTCL（分類されていないタイプ）を示し、患者4は、標準的な化学療法に応答しなかった高悪性度のPTCLであるセザリー症候群を示した。
【０２７７】
患者3由来のリンパ腫細胞をCD5CAR NK細胞と共に24時間共培養した。白血病細胞はCD5 + CD7陽性であり、CD5 + CD7-集団はフローサイトメトリーによってゲートされ、定量された。標的CD5 + CD7-集団を分析し、形質導入ベクターコントロールNK細胞と比較して細胞生存率をしらべた。CD5CAR NKは、白血病CD5 + CD7-標的集団のほぼ完全な溶解を示し、CD5を発現する正常なT細胞を含むCD5 +集団全体にわたって完全な溶解を示した（図29C）。
【０２７８】
セザリー症候群の患者＃4由来の白血病細胞を、2：1および5：1のE：T比でCD5CAR NK細胞と24時間共培養した。CD5CAR NK細胞は、セザリー症候群細胞の90％以上の溶解を伴う強力な抗白血病活性を示した（図29D）。2：1のE：T比で白血病細胞が事実上排除された。
【０２７９】
CD5CAR NK細胞は、正常なT細胞を効果的に枯渇させる
T細胞を臍帯血から単離し、CD5CAR NK細胞との共培養に使用した。図30に示すように、 CD5CAR NK細胞は、共培養24時間後に2：1の低いエフェクター：標的比でT細胞を完全に枯渇させた（図30）。GFPコントロールのものと比較して、T細胞集団はほとんど損なわれなかった。
【０２８０】
CD5CAR NK細胞は、マントル細胞リンパ腫（MCL）および慢性リンパ球性リンパ腫（CLL）を含むCD5 + B細胞悪性腫瘍を効果的に溶解する
さらなる共培養研究を、CD5 + Jekoリンパ腫細胞株や患者由来のマントル細胞リンパ腫（MCL）およびCLLで行った。JeKo-1 MCL細胞株は、MCLの大きな細胞変異体を有する患者の末梢血単核細胞から樹立された。2：1の低いE：Tでの共培養研究において、CD5CAR NK細胞は、Jeko細胞の約80％を効果的に溶解した（図31A）。MCLを有する患者サンプルから単離された細胞も、CD5CAR NK細胞と共培養した。標的集団をゲーティングし、生存細胞をフローサイトメトリーによって定量した。CD5CAR NK細胞は、実質的に、CD5 + CD19 +白血病集団およびCD5 + CD19-T細胞集団の両方の集団を排除した（図31B）。B細胞CLLを有する患者由来の細胞も、CD5CAR NK細胞と共培養した。フローサイトメトリーで白血病集団をゲートするためにCD19を使用した。CD5 + CD19 + CLL細胞は、CD5CAR NK細胞によって実質的に排除された（図31C）。これらの研究は、CD5CAR NK細胞が、白血病細胞系および患者白血病試料（図32）において、CD5を発現するT-ALL、PTCLおよびB細胞リンパ腫を含む深刻な抗腫瘍活性を有する生物学的特性を含むことを強く示唆する。
【０２８１】
CD5CAR NK細胞は、in vivoで強力な抗白血病活性を示す
CD5CAR T細胞を用いた同様の戦略で、CD5CAR NK細胞のin vivoでの抗腫瘍活性を、動物を用いて決定した。致死量以下の照射されたNSGマウスに、1.0×10 6個のホタルルシフェラーゼ発現CCRF-CEM細胞を静脈注射し、測定可能な腫瘍形成を誘導した。CCRF-CEM-Luc +細胞注射の3日後、マウスに、5×10 6個のCD5CAR NK細胞またはベクターコントロールNK細胞を静脈注射した。これらの注射を4日目にマウスあたり合計10×10 6個のNK細胞について繰り返した。5日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、腫瘍負荷を測定するためにIVISイメージングを利用した（図33A）。測定した平均光強度をCD5CAR NK細胞を注射したマウスとベクターコントロールNK細胞を注射したマウスのそれと比較した（図33B）。腫瘍の注入後5日目に処置したマウスの腫瘍負荷は3分の2であった。ペアT検定分析は、2つの群の間に非常に有意な差（P = 0.0302）を示した。これらのin vivoデータは、CD5CAR NK細胞が、ベクターコントロールNK細胞と比較して迅速にCCRF-CEM注射NSGマウスにおける腫瘍重量を有意に減少させることを示している。
【０２８２】
抗CD3キメラ抗原受容体（CD3CAR）NK細胞は、CD3陽性血液悪性腫瘍を効率的に溶解する
例
結果
CD3CARの作製
抗CD3分子は、シグナル伝達を改善するためにCD3ゼータ (CD3zeta) シグナル伝達ドメインに融合したCD28および4-1BBドメインと組み合わせた一本鎖可変フラグメント（scFv）を含むモジュール設計であり、それを第3世代のCARとしている。NK細胞（NK-92）表面上のCD3CAR分子の効率的な発現のために、強力な脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター（SFFV）を使用し、CD8リーダー配列を構造に組み込んだ。抗CD3 scFv (α-CD3scFV)は、CD8由来ヒンジ（H）および膜貫通（TM）領域を介して細胞内シグナル伝達ドメインに結合する（図34A）。次いで、このCD3CAR構造をレンチウイルスプラスミドにクローニングした。
【０２８３】
CD3CARの特性評価
ウエスタンブロット分析を、CD3CARレンチウイルスプラスミドおよびベクターコントロールプラスミドでトランスフェクトしたHEK293-FT細胞で行った。抗CD3ゼータモノクローナル抗体を用いたイムノブロットは、CD3CAR-CD3ゼータ融合タンパク質の予測されるサイズのバンドを示した、（図34B）その一方、ベクターコントロールタンパク質ではバンドが見られなかった。
【０２８４】
NK-92細胞を用いたCD3CAR NK細胞の作製
フローサイトメトリー分析によってCD3CARの形質導入効率を決定した。CD3CAR NK細胞を増やすために、高発現のNK細胞を、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて回収した。ソーティング後、CD3CARの発現が比較的高いNK細胞が得られた。フローサイトメトリーソーティング後のCD3CARの発現は、その後のNK細胞の増殖および凍結保存を含め、約30％で安定であった。
【０２８５】
CD3CAR NK細胞は、ヒトT-ALL細胞株を効果的に溶解する
CD3CAR NK細胞の有効性を決定するために、CD3 + T-ALL細胞株、Jurkat、およびCCRF-CEMを用いた共培養アッセイを行った。JurkatおよびCCRF-CEM細胞におけるCD3陽性細胞の割合は、それぞれ 約80％および10％陽性であり、次いで、CCRF-CEM細胞株由来のCD3 +細胞を高度に発現したCD3細胞について選別し、選別したCCRF-CEM細胞におけるCD3発現は約50％であった。JurkatおよびCCRF-CEM細胞との共培養の間、CD3CAR NK細胞は、著しい白血病細胞殺傷能力を示した（図35）。6時間のインキュベーションおよび2：1の低いE：T比で、CD3CAR NK細胞は、Jurkat細胞の60％を効果的に溶解した（図35A）。次に、相対的に高度にCD３が発現されたCCRF-CEM細胞（選別された）および未選別のCCRF-CEM細胞への殺傷能力を比較した。CD3 CAR NK細胞は、分類されていない低いCD3発現のCCRF-CEM（図35B）集団より よりも、選別された高いCD3発現集団のCCRF-CEMにおいてより効果的であるようであった。
【０２８６】
CD3CAR NK細胞は、ヒト試料からのCD3 +白血病細胞を効果的に排除する
患者試料を用いてCD3CAR NK細胞の殺傷能力をも試験した。両方の患者サンプルのフローサイトメトリー分析では、強く均一なCD3発現を示した。フローサイトメトリーで分析したところ、セザリー症候群の患者サンプルとCD3CAR NK細胞の共培養は 2：1の低いE：T比で約80％の白血病細胞の効果的な溶解をもたらした（図36A）。未分類のPTCLとCD3CAR NK細胞とを24時間共培養すると、CD3 +悪性細胞が事実上除去された（図36B）。CD3CAR NK細胞も広範なCD3 +集団に影響を与えた。
【０２８７】
CD3CAR NK細胞は、正常なT細胞を枯渇させることができる
GFP形質導入正常T細胞を用いてCD3CAR NK細胞を共培養した。図37に示すように、CD3CAR NK細胞は、4時間または24時間のインキュベーション後に正常なT細胞のかなりの部分を枯渇させた。
【０２８８】
CD3CAR NK細胞はin vivoで著しい抗白血病活性を示す
CD3CAR NK細胞のインビボでの抗腫瘍効果を決定するために、致死量以下の照射したNSGマウスにCD3陽性（約80％）である1.0×10 6個のホタルルシフェラーゼ発現Jurkat細胞を静脈注射し、Day 3またはDay4までに測定可能な腫瘍形成を認められた。
【０２８９】
Jurkat-Luc +細胞注射の3日後、マウス1匹当たり5×106個のCD3CAR NK細胞またはベクターコントロールNK細胞を各グループ6匹ずつに静脈注射した。これらの注射を3日目、6日目、7日目および10日目に繰り返し、マウスあたり合計25×10 6個のNK細胞量となった。4日目、7日目、9日目および13日目にIVISで画像化を行い、腫瘍重量を測定した（図38A）。１３日目の２匹のCD3CARを処置したマウスは処置中に亡くなった。測定した平均光強度をCD3CAR NK細胞を注射したマウスおよびベクターコントロールNKを注射したマウスと比較した（図38B）。最初の遅延期間の後、腫瘍重量は、処置したマウスについては第9日までに約3分の1に低下し、第13日にはわずか13％に低下した（図38C）。Paired T test analysisにより、2つの群の間に非常に有意な差（P = 0.0137）を示した。これらのin vivoデータは、CD3CAR NK細胞が、ベクターコントロールNK細胞と比較して、Jurkat注射NSGマウスにおいて腫瘍量を有意に減少させ、生存を延長することを実証すると結論する。
【０２９０】
CRISPR / Casヌクレアーゼは、T細胞またはNK細胞上に発現されるCD2、CD3、CD5およびCD7を標的とする
T細胞またはNK細胞は、CD2、CD3、CD5およびCD7のような表面抗原のいくつかを白血病またはリンパ腫と共有するようである。CD2、CD3、CD5、およびCD7は、それらがT細胞白血病/リンパ腫の大部分において発現されるので、TおよびNK細胞にとって良好な標的であり得る。
【０２９１】
したがって、表面抗原の一つであるCD2、CD3、CD5及びCD7を標的とする場合、この抗原を共有する場合にはCARを作製するために使用されるT細胞又はNK細胞内においての殺傷行為をさけるため、この抗原がT細胞又はNK細胞において欠損又はダウンレギュレートされる必要がある。
【０２９２】
T細胞リンパ腫またはT細胞白血病を標的とするCAR TまたはNK細胞の作製のための工程を図39に記載する。CD2、CD3、CD5およびCD7を標的とするために、3対のsgRNAをCHOPCHOPで設計した。次いで、遺伝子特異的sgRNA（図40）を、ヒトCas9を発現するレンチウイルスベクター（Lenti U6-sgRNA-SFFV-Cas9-puro-wpre）およびE2A自己切断リンカーと連結したピューロマイシン耐性遺伝子にクローニングした。U6-sgRNAカセットはCas9エレメントの前にある。sgRNAおよびCas9puroの発現は、それぞれU6プロモーターおよびSFFVプロモーターによって誘導される。
【０２９３】
例
結果
CRISPR / CasヌクレアーゼはT細胞系でCD5を標的とする。
レンチウイルスに保持された遺伝子特異的sgRNAを用いてCCRF-CEMおよびMOLT細胞へ形質導入した。最初に、 2つの異なる2つのCDISPR / Cas9sgRNA配列（図41Aおよび41C）を用いてCD5発現の喪失はがこれらのT細胞系の両方で観察された。CD5発現の消失に関して最も成功した集団を各細胞株から選択し、これらの細胞のソーティングを行い 、正常に増殖させ、> 99％純度のCD45 +およびCD5-であることが判明した（図41Bおよび41D）。
【０２９４】
CRISPR / Casヌクレアーゼは、T細胞系およびNK細胞上のCD7を標的とする
レンチウイルスに保持された遺伝子特異的sgRNAを用いてCCRF-CEM、MOLT細胞およびNK細胞を形質導入した（図42）。フローサイトメトリー分析は、2つの異なるsgRNAを用いたCRISPR / Cas9アプローチによるCCRF-CEMおよびNK-92細胞におけるCD7発現の消失を証明した（図42Aおよび42B）。集団（青色の円と矢印で示される）はソーティングに利用され、その後増殖して分析の結果を示した（図42B）。フローサイトメトリー分析によるCD7発現の喪失は、CD7を標的とするCRISPR / Casヌクレアーゼ（図42Cおよび42D）を用いた上記と同様のアプローチを用いてNK-92細胞でも見られた。選別したCD7陰性NK-92細胞（図42D）を増殖させ、CD7陽性白血病細胞を削除するためにCD7CAR NK細胞を生成するために使用した。
【０２９５】
CD7CAR NK7--92細胞は、強力な抗白血病活性を有する
CD7は、NKおよびT-ALL白血病細胞の両方で発現される。CD7CAR NK-92集団内での自己殺傷を避けるためには、まずCD7発現を不活性化する必要がある。CD7欠損NK-92細胞（NK7--92細胞）を、（図42D）に記載されているように作製し、増殖させた。増殖したNK7--92細胞に、CD7CARを発現するレンチウイルスを形質導入した。CD7CARは、CD3ゼータシグナルドメインに融合したCD28および4-BBドメインと併せた抗CD7 scFVを含み、これを第3世代のCARとした。CD7CAR NK7--92細胞を用いて、CD7を発現する白血病細胞の溶解能力を試験した。図43に示すように、CD7CAR NK7--92細胞は、T-ALL細胞株CCRF-CEMに対して強力な抗白血病活性を示した。フローサイトメトリーによって分析したところ、CCRF-CEM細胞の共培養は5：1のE：T比で約50％の白血病細胞の効果的な溶解をもたらした（図43Aおよび43B）。
【０２９６】
CD3多量体タンパク質複合体が図44に明らかにされている。この複合体は、CD3δ鎖、CD3γ鎖、および2つのCD3ε鎖を含む。これらの鎖は、αβ鎖を構成するT細胞受容体（TCR）と会合する。
【０２９７】
CD3CARは、移植片対宿主病（GvHD）に使用される
CD3CARは、幹細胞移植の前または後に患者に投与される。患者は、白血球の上昇したレベルについて試験される。
【０２９８】
CD3CARは、骨髄移植の前または後に患者に投与される。患者は、白血球の上昇したレベルについて試験される。
【０２９９】
CD3CARは、組織移植片の前または後に患者に投与される。患者は、白血球の上昇したレベルについて試験される。
【０３００】
臓器移植
CD3CARは、臓器移植手術の前に臓器移植患者に投与される。患者は臓器拒絶反応を検査される。以下のような組織学的所見がみられる、（1）T細胞の浸潤、幾つかのケースでは、好酸球、形質細胞および好中球を伴う浸潤、特に隠せない指示比で、（2）移植された組織型によって異なる組織解剖学的構造の妥協、および3）血管への損傷。
【０３０１】
CD3CARは、臓器移植手術後に臓器移植患者に投与される。患者は臓器拒絶反応を検査される。以下のような組織学的賢所がみられる、（1）T細胞の浸潤、幾つかのケースでは、 好酸球、形質細胞および好中球を伴う浸潤、特に隠せない指示比で、（2）移植された組織型によって異なる組織解剖学的構造の妥協、および3）血管への損傷。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７ＢＣ】
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【図１８ＡＢ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１ＡＢ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５ＡＢ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
2018513692000001.app
【国際調査報告】
2018513692.tif 000072
2018513692.tif 000073
2018513692.tif 000074