(57)【要約】本発明は治療用免疫療法送達ベクターをはじめとする疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法組成物を提供および作成する系、および１つ以上のネオエピトープと関連するペプチド、または対象の癌もしくは非健常に特異的な突然変異を含むペプチドを発現する遺伝子発現コンストラクトを含む同組成物の作製方法を提供する。本発明の送達ベクターにはリステリア細菌ベクターをはじめとする細菌ベクター、またはウイルスベクター、ペプチド免疫療法ベクター、またはＤＮＡ免疫療法ベクターが含まれ、そのベクターは対象より獲得された疾患担持生体試料に存在する１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含む１つ以上の融合タンパク質を備える。本発明は、腫瘍もしくは癌、または感染症、または自己免疫疾患もしくは臓器移植拒絶反応をはじめとする前記対象における疾患または症状に対する免疫応答を誘導するための同組成物の使用方法も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
（ａ）  前記対象の疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
（ｂ）  ステップ（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、および
（ｃ）  二者択一的に、（ｉ）所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換えリステリア株を保存するか、あるいは（ｉｉ）前記弱毒化組換えリステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与によって前記疾患または症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップを含む前記方法。
【請求項２】
をさらに含む請求項１に記載の方法。
（ｄ）  ステップ（ｃ）の前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析すること、
（ｅ）  ステップ（ｄ）において特定された前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択すること、
（ｆ）  前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を含むベクターで第２弱毒化組換えリステリア株を形質転換すること、および
（ｇ）  二者択一的に、（ｉ）所定の時点で前記対象に投与するために第２弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは（ｉｉ）前記第２弱毒化組換え型リステリア株を含む第２組成物を前記対象に投与すること
【請求項３】
ステップ（ｄ）において前記対象より第２生体試料を獲得する工程が、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む前記組成物の投与の後に増殖するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む生体試料の獲得を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｄ）の前記特徴分析過程が
（ｉ）  前記疾患に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および
（ｉｉ）  前記Ｔ細胞上のＴ細胞受容体が結合する特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｉ）の前記スクリーニングおよび特定がＴ細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
それぞれが異なるセットの１つ以上のネオエピトープを含む複数の弱毒化組換えリステリア株を作成するために前記方法が繰り返される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の弱毒化組換えリステリア株が５〜１０株、１０〜１５株、１５〜２０株、１０〜２０株、２０〜３０株、３０〜４０株、または４０〜５０株の弱毒化組換えリステリア株を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の弱毒化組換えリステリア株の混合株が約５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、または１００〜２００個のネオエピトープを含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記弱毒化組換え型リステリア株が前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを分泌する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）が、前記１つ以上のペプチドの発現および分泌を確認するために前記弱毒化組換えリステリア株を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
プラスミドベクターまたはファージベクターを使用してステップ（ｂ）の前記形質転換が行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ミニ遺伝子核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターを使用してステップ（ｂ）の前記形質転換が行われ、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含み、前記キメラタンパク質が
（ａ）  細菌分泌シグナル配列、
（ｂ）  ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、および
（ｃ）  前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを含み、
前記細菌分泌シグナル配列、前記ユビキチンタンパク質、および前記１つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プラスミドが組込み型プラスミドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
抗生物質選択が無い状態で前記プラスミドが前記組換え型リステリア株内で安定的に維持される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記弱毒化組換え型リステリア株が１つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記突然変異がａｃｔＡ遺伝子突然変異、ｐｒｆＡ突然変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重突然変異、ｄａｌ／ｄａｌ遺伝子二重突然変異、ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択され、且つ、前記突然変異が前記１つ以上の内在性遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ベクターが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームをさらに備える、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
（ａ）  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
（ｂ）  ステップ（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、またはステップ（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してＤＮＡ免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製するステップ、および
（ｃ）  二者択一的に、（ｉ）所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記ＤＮＡ免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは（ｉｉ）前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与によって前記疾患または症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップを含む前記方法。
【請求項２３】
をさらに含む請求項２２に記載の方法。
（ｄ）  ステップ（ｃ）の前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析すること、
（ｅ）  ステップ（ｄ）において特定された前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択すること、
（ｆ）  ステップ（ｄ）において特定された前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする前記１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第２ベクターを形質転換するか、または前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用して第２ＤＮＡ免疫療法ベクターまたは第２ペプチド免疫療法ベクターを作製すること、および
（ｇ）  二者択一的に、（ｉ）所定の時点で前記対象に投与するために前記第２ベクターまたは前記第２ＤＮＡ免疫療法または前記第２ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記第２ベクター、前記第２ＤＮＡ免疫療法、または前記第２ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与すること
【請求項２４】
ステップ（ｄ）における前記対象より第２生体試料を獲得する工程が、前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む前記組成物の投与の後に増殖するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む第２生体試料の獲得を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｄ）の前記特徴分析過程が
（ｉ）  前記疾患に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および
（ｉｉ）  前記Ｔ細胞上のＴ細胞受容体が結合する特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｉｉ）の前記スクリーニングおよび特定がＴ細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
それぞれ異なるセットの１つ以上のネオエピトープを含む複数のベクター、ＤＮＡ免疫療法、またはペプチド免疫療法を作製するために前記方法が繰り返される、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数のベクター、ＤＮＡ免疫療法、またはペプチド免疫療法が５〜１０種類、１０〜１５種類、１５〜２０種類、１０〜２０種類、２０〜３０種類、３０〜４０種類、または４０〜５０種類のベクター、ＤＮＡ免疫療法、またはペプチド免疫療法を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数のベクター、ＤＮＡ免疫療法、またはペプチド免疫療法の混合物が約５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、または１００〜２００個のネオエピトープを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ベクターがワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子である、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）が、前記１つ以上のペプチドの発現を確認するために前記ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡ免疫療法が前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを含む前記核酸配列を含む、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸配列がプラスミドの形態である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記プラスミドが組込み型プラスミドまたは染色体外マルチコピープラスミドである、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチド免疫療法が前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを含み、各ペプチドが免疫原性ポリペプチドまたはその断片と融合しているか、または混合されている、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドのそれぞれが約５〜５０アミノ酸長である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドのそれぞれが約８〜２７アミノ酸長である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上のネオエピトープが５〜１００個のネオエピトープを含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上のネオエピトープが１５〜３５個のネオエピトープ、８〜１１個のネオエピトープまたは１１〜１６個のネオエピトープを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ以上のネオエピトープが複数のネオエピトープを含み、ステップ（ｂ）の前記核酸配列内の前記複数のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドの順序のランダム化を１回以上繰り返すことがステップ（ｂ）に含まれる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ａ）における前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記１つ以上のＯＲＦを前記健常生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記１つ以上のＯＲＦと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記ＯＲＦ中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患担持生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患または症状が感染症、腫瘍、または癌である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患または症状が感染症であり、前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患または症状が前記腫瘍または癌であり、前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列と前記健常生体試料より抽出された前記核酸配列がエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記１つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記１つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記１つ以上のネオエピトープがＴ細胞エピトープを含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫原性ポリペプチドが配列番号３で表されるｔＬＬＯタンパク質である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫原性ポリペプチドが配列番号１２〜１３および配列番号１５〜１８のいずれか１つで表される短縮化ＡｃｔＡタンパク質である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記免疫原性ポリペプチドが配列番号５〜１０のいずれか１つで表されるＰＥＳＴアミノ酸配列である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記免疫原性ポリペプチドが前記変異型ＬＬＯタンパク質であり、前記変異型ＬＬＯタンパク質がコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）内に突然変異を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記突然変異が、（ｉ）配列番号２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、またはＷ４９２の置換、またはそれらのあらゆる組合せ、配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドによる置換であって、前記非ＬＬＯペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む前記置換、または配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の欠失を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記１つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原を含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、キメラＨｅｒ２抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、二価ＰＳＡ、ＥＲＧ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＰＡＫ６、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原Ｅ（ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、インターロイキン１３受容体α（ＩＬ１３−Ｒ  α）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、血管新生抗原、ｒａｓタンパク質、ｐ５３タンパク質、ｐ９７黒色腫抗原、ＫＬＨ抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１抗原、ＴＲＰ−２、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはテスティシンを含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つ以上のネオエピトープが感染症関連エピトープ、感染性ウイルス病関連エピトープ、または感染性細菌病関連エピトープを含む、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記感染症が以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス，クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ），ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ），ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス，サイトメガロウイルス，鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記アジュバントが顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピッドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ステップ（ｃ）（ｉｉ）の投与により前記対象における個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じ、前記対象における抗癌免疫応答または抗腫瘍免疫応答が生じ、前記対象における抗感染症免疫応答が生じ、前記対象におけるウイルス感染症を含む感染症に対する抗感染症免疫応答が生じ、または前記対象における細菌感染症を含む感染症に対する抗感染症免疫応答が生じる、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
請求項１〜２１および請求項３７〜７０のいずれか一項に記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
【請求項７２】
請求項２２〜７０のいずれか一項に記載の方法によって作製されるＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法。
【請求項７３】
請求項１〜２１および請求項３７〜７０のいずれか一項に記載の方法により作製された１つ以上の弱毒化組換えリステリア株を含む組成物の免疫原性混合物。
【請求項７４】
各弱毒化組換えリステリア株が疾患または症状を有する対象の疾患担持生体試料に存在する１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を含んでいる１つ以上の弱毒化組換えリステリア株を含む組成物の免疫原性混合物。
【請求項７５】
前記１つ以上の弱毒化組換えリステリア株が複数の弱毒化組換えリステリア株を含み、各弱毒化組換えリステリア株の前記核酸配列が異なるセットの１つ以上のネオエピトープをコードする、請求項７３または７４に記載の免疫原性混合物。
【請求項７６】
前記複数の弱毒化組換えリステリア株が５〜１０株、１０〜１５株、１５〜２０株、１０〜２０株、２０〜３０株、３０〜４０株、または４０〜５０株の弱毒化組換えリステリア株を含む、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の免疫原性混合物。
【請求項７７】
前記複数の弱毒化組換えリステリア株の混合株が約５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、または１００〜２００個のネオエピトープを含む、請求項７３〜７６のいずれか一項に記載の免疫原性混合物。
【請求項７８】
前記混合物中の前記弱毒化組換えリステリア株の各々が１つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項７７に記載の免疫原性混合物。
【請求項７９】
前記混合物中の前記組換えリステリア株の各々が１〜２０個のネオエピトープを発現する、請求項７８に記載の組成物の免疫原性混合物。
【請求項８０】
対象において個別化抗腫瘍応答を誘発する方法、または対象において腫瘍を予防または治療する方法であって、請求項７３〜７９のいずれか一項に記載の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法。
【請求項８１】
次の要素、すなわち、免疫原性ポリペプチドが融合している第１ネオエピトープアミノ酸配列、第１リンカー配列を介して機能的であるように前記第１ネオエピトープアミノ酸配列が連結している第２ネオエピトープアミノ酸配列、および第２リンカー配列を介して機能的であるように前記第２ネオエピトープアミノ酸配列が連結している少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクト。
【請求項８２】
前記免疫原性ポリペプチドがＮ末端短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）であり、且つ、最後のネオエピトープが第３リンカー配列を介して機能的であるようにＣ末端タグに連結している、請求項８１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項８３】
前記核酸コンストラクトが前記タグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む、請求項８１または８２に記載の核酸コンストラクト。
【請求項８４】
前記ヒスチジンタグが、機能的であるようにＮ末端でＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに連結されている６×ヒスチジンタグである、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項８５】
前記第１リンカー配列、前記第２リンカー配列、および前記第３リンカー配列のうちの１つ以上が４×グリシンリンカーである、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項８６】
前記第１ネオエピトープアミノ酸配列、前記第２ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ約５〜５０アミノ酸である、請求項８１〜８５のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項８７】
前記第１ネオエピトープアミノ酸配列、前記第２ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ約８〜２７アミノ酸、８〜１１アミノ酸、または１１〜１６アミノ酸である、請求項８６に記載の核酸コンストラクト。
【請求項８８】
前記第１ネオエピトープアミノ酸配列、前記第２ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ２１アミノ酸である、請求項８７に記載の核酸コンストラクト。
【請求項８９】
前記核酸コンストラクトが５〜１００個のネオエピトープをコードする、請求項８１〜８８のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項９０】
前記核酸コンストラクトが１５〜３５個のネオエピトープをコードする、請求項８９に記載の核酸コンストラクト。
【請求項９１】
前記キメラタンパク質の前記要素がＮ末端からＣ末端へと配置されているか、または機能的であるように連結されている、請求項８１〜９０のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項９２】
前記ｔＬＬＯが機能的であるようにプロモーター配列に連結されている、請求項９１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項９３】
前記プロモーター配列がｈｌｙプロモーター配列である、請求項９２に記載の核酸コンストラクト。
【請求項９４】
前記コンストラクトが次の構成成分、すなわち、ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−［第一２１ｍｅｒ］−［４×グリシンリンカーＧ１］−［第二２１ｍｅｒ］−［４×グリシンリンカーＧ２］−…−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−［６×Ｈｉｓタグ］−［２×終止コドン］を含む、請求項８１〜９３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項９５】
請求項８１〜９４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトによってコードされるキメラタンパク質。
【請求項９６】
請求項８１〜９４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、または請求項９５に記載のキメラタンパク質を発現する組換えリステリア株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月２６日に出願された米国特許出願番号第６２／１６６５９１号、２０１５年６月１２日に出願された米国特許出願番号第６２／１７４６９２号、および２０１５年９月１５日に出願された米国特許出願番号第６２／２１８９３６号の利益を請求し、それらの特許出願のそれぞれの全体が全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
【０００２】
ＥＦＳウェッブを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイルＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔに書かれている配列表は４８８ｋｂであり、２０１６年５月２５日に作成され、ここに参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は治療用免疫療法送達ベクターをはじめとする疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法組成物、および１つ以上のネオエピトープと関連するペプチド、または対象の癌もしくは非健常に特異的な突然変異を含むペプチドを発現する遺伝子発現コンストラクトを含む同組成物の作製方法を提供する。本発明の送達ベクターには細菌ベクター、またはウイルスベクター、ペプチド免疫療法ベクター、またはＤＮＡ免疫療法ベクターが含まれ、対象より獲得された疾患担持生体試料に存在する１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含む１つ以上の融合タンパク質を備えるリステリア細菌ベクターが含まれる。本発明は、腫瘍もしくは癌、または感染症、または自己免疫疾患もしくは臓器移植拒絶反応をはじめとする前記対象における疾患または症状に対する免疫応答を誘導するための同組成物の使用方法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
個別化医療の前には特定のタイプおよびステージの癌を有する大半の患者が同じ治療を受けた。しかしながら、ある特定の患者にはよく効くが、他の患者には同様には効かない治療があることが医師と患者に明らかになってきた。したがって、特定の腫瘍に効果がある有効な個別免疫治療を開発する必要が存在する。個別化治療戦略は、標準的な治療で予期されるものよりも個体にとって有効であり、且つ、副作用を起こすことが少ないものであり得る。
【０００５】
腫瘍は人のＤＮＡの突然変異に起因して発生し、その突然変異は、宿主によって産生される対応する正常タンパク質には存在しない潜在的なネオエピトープを含む変異型タンパク質または異常型タンパク質を産生する原因となり得る。これらのネオエピトープの中にはＴ細胞応答を刺激し、且つ、免疫系による初期の癌細胞の破壊を仲介して癌の臨床エビデンスを発生させないことができるものもある。しかしながら定着癌の場合ではその免疫応答は不充分である。癌における天然配列腫瘍関連バイオマーカー、過剰発現バイオマーカー、または不適切発現バイオマーカーを標的とする治療的免疫療法の開発に関する大量のデータが生成されている。しかしながら、これらの治療法に関連する明らかな臨床上の利益を実証することは極めて難しいことが示されており、本出願を作文している時点ではＦＤＡによって認可された治療的免疫療法はたった１件である。このことの主な理由は、全ての個体に生じる中枢性トレランスの一部として、天然配列ペプチドに対して高い結合親和性を有するあらゆるＴ細胞が自己抗原として認識され、自己免疫を防ぐためにこれらの自己反応性クローンが幼児期に胸腺によって除去されるか、または他には寛容機構を介して不活化されることである。
【０００６】
ネオエピトープは、晩年に生じるＤＮＡの変異、例えば、獲得突然変異、またはある特定の細胞のＤＮＡ内の変異によって起こるゲノム変異により生じる疾患に関連するタンパク質内に存在する潜在的に免疫原性のエピトープである。例えば癌では特定の「ネオエピトープ」が獲得ＤＮＡ異常を保持しない（同じ個体の）細胞に関連する対応する正常タンパク質内には存在せず、そのＤＮＡ異常によりそのネオエピトープが病気になっていない、または中に疾患担持組織を含んでいない対象細胞において発現される。ネオエピトープを特定することは困難であり得るが、しかしながらネオエピトープを特定し、それらを標的とする治療法を開発することは個別化治療戦略内で使用するために有利になる。特定の獲得ＤＮＡ異常は患者の特定の疾患細胞ならびにそれらの免疫系が認識する可能性がある特定のエピトープの両方にとって非常に個別的である。これらの因子は人毎に異なるので、前癌状態のような疾患を持つ人に生じる数千になり得る複数のネオエピトープを標的とするために個別化アプローチを用いることが必要である。
【０００７】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、リステリア症の原因となるグラム陽性の通性細胞内病原体である。その細胞内生活環においてＬｍは食作用によって、または非食細胞の能動的侵入によって宿主細胞に侵入する。内在化に続いてＬｍは膜結合ファゴソーム／液胞からのその脱出を幾つかの細菌病原性因子、主に宿主細胞の細胞質へのその細菌の侵入を可能にする孔形成性タンパク質であるリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）の分泌によって媒介することができる。細胞質中でＬｍは複製し、細菌性アクチン重合タンパク質（ＡｃｔＡ）と他の病原性因子によって促進される移動性に基づいて隣接する細胞に広がる。細胞質内でＬｍ分泌タンパク質、および最終的にはＬｍ構造タンパク質はプロテアソームによって分解され、そして小胞体内のＭＨＣクラスＩ分子結合し得るペプチドへとプロセッシングを受ける。これらのＭＨＣペプチド複合体は細胞表面に輸送され、そして標的特異的Ｔ細胞に提示され、且つ、標的特異的Ｔ細胞によって認識され得る。この特有の特徴により、腫瘍抗原がＭＨＣクラスＩ分子によって提示されて腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化することができるという点でＬｍは大変魅力的なＴ細胞生成ベクターとされる。ＣＴＬは、癌細胞または細胞内感染を有する細胞のような体内の他の細胞を殺す主標的特異的エフェクター細胞である。
【０００８】
加えて、Ｌｍは一度内在化されるとファゴリソソーム区画においてもプロセッシングを受け、ＭＨＣクラスＩＩ上のそのペプチドによって癌細胞または感染細胞の標的指向型殺滅についてＣＴＬを支援し得る抗原特異的ＣＤ４−Ｔ細胞応答が生成され得る。
【０００９】
加えて、そのベクターは生きた細菌であるのでその組成物は、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰＳ、およびＴＬＲをはじめとする幾つかの細胞外分子パターン受容体、細胞内分子パターン受容体、および細胞質分子パターン受容体を含む、自然免疫の多数のトリガーを刺激し得る。例えば、核オリゴマー化ドメイン様受容体によるペプチドグリカンの認識、およびＤＮＡであるＡＩＭ２およびＳＴＩＮＧによるＬｍ  ＤＮＡの認識により炎症カスケードおよび免疫調節カスケードが活性化される。この炎症性応答とＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ経路への抗原の効率的な送達との組合せがＬｍを腫瘍の治療、腫瘍に対する保護、および腫瘍に対する免疫応答の誘導における強力な免疫療法的ベクターとしている。
【００１０】
Ｔ細胞応答を追加的に刺激し、そして他の治療法と併用されてもよいリステリアベースの免疫療法ベクターの一構成要素として対象の癌に特異的なネオエピトープをターゲティングすることにより、対象の癌に対して個別化されており、且つ、その癌の治療に有効でもある免疫療法が提供され得る。免疫原性の高いペプチド抗原の標的ペプチドへの融合によりその標的抗原の免疫原性、または寛容機構を逃れていたＴ細胞を刺激する免疫療法の能力を著しく高めることができ、それは免疫療法として特定の可能性を有し得る。
【００１１】
本発明は個別免疫療法組成物、および対象の異常または非健常組織内の潜在的なネオエピトープをターゲティングするためのその使用法を提供し、その免疫療法は、これらのネオエピトープを標的とする免疫応答を増強するために前記ネオエピトープを含むペプチドおよび／または融合ポリペプチドを発現するための送達および免疫療法ベクターとしての組換え型リステリア免疫療法の使用を含む。作成されるそれらの個別免疫療法は対象における疾患、例えば癌を効果的に治療し、予防し、寿命を延ばし、またはその疾患の発生率を低下させることができる。さらに、本発明の組換え型リステリアは他の抗疾患療法または抗癌療法と効果的に併用され得る。
【発明の概要】
【００１２】
１つの態様では本発明は、疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
a.  弱毒化リステリア株送達ベクター、および
b.  前記リステリア株を形質転換するためのプラスミドベクターであって、１つ以上のネオエピトープまたは潜在的なネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含み、
前記ベクターで前記リステリア株を形質転換することにより前記対象の疾患または症状を標的とした個別免疫療法系が作成される前記系に関する。
【００１３】
１つの態様では本発明は、疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
a.  送達ベクター、および所望により  
b.  前記送達ベクターを形質転換するためのプラスミドベクターであって、１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含む前記系に関する。
【００１４】
関連の態様では前記送達ベクターは細菌性送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはウイルスベクター送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはペプチド免疫療法送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはＤＮＡプラスミド免疫療法送達ベクターを含む。
【００１５】
関連の態様では前記疾患または症状は感染症、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、または腫瘍、または癌、または異型細胞もしくは組織を含む。別の態様では治療としての生きた弱毒化免疫療法薬品の人への投与により惹起される自然免疫応答によって適応免疫応答が促進および増強される。別の関連の態様ではその免疫応答は適応免疫応答である。さらに別の関連の  態様ではその  免疫応答  はＴ細胞  免疫応答である。別の関連の態様では弱毒化組換え型リステリアが培養され、凍結保存され、所望により凍結乾燥およびスプレー乾燥され、そして前記対象に対する治療形態として単独で投与されるか、またはそれらの疾患に対して有益な可能性がある他の治療法と併用投与される。その治療には反復投与が含まれ得る。
【００１６】
別の態様では本発明は、疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
a.  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の前記１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを前記比較により特定するステップ、
b.  免疫原性応答向けの前記１つ以上のネオエピトープを含むペプチドをスクリーニングするステップ、
c.  前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、
d.  および二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を前記対象に投与し、免疫原性組成物の一部として前記弱毒化組換え型リステリア株を投与するステップを含む前記方法に関する。
【００１７】
関連の態様では本発明は次のもの、すなわち、
a.  本明細書において提供される１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドに融合された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子、または  
b.  キメラタンパク質をコードする第１オープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質が
i.    細菌分泌シグナル配列、
ii.    ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、
iii.    本明細書において提供される１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含み、且つ、
（ｉ）〜（ｉｉｉ）の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記１つ以上のペプチドが機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている前記核酸コンストラクトを含む組換え弱毒化リステリア株に関する。
【００１８】
関連の態様では前記細菌性配列はリステリア配列であり、幾つかの実施形態では前記リステリア配列はｈｌｙシグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列である。
【００１９】
別の関連の態様では本発明は、本明細書において提供される弱毒化組換え型リステリア株、および薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物に関する。
【００２０】
別の関連の態様では前記組成物は１つ以上の弱毒化リステリア株を含み、各弱毒化リステリア株が１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上の異なるペプチドを発現する。別の態様では各弱毒化リステリアは一連のネオエピトープを発現する。
【００２１】
関連の態様では本明細書において提供される前記方法により疾患または症状を有する前記対象における個別化増強抗疾患免疫応答、すなわち、抗感染症免疫応答、抗自己免疫疾患免疫応答、抗臓器移植拒絶反応免疫応答、または抗腫瘍もしくは抗癌免疫応答の生成が可能になる。
【００２２】
別の関連の態様では本明細書において提供される前記方法により対象における前記疾患、すなわち、前記感染症、前記自己免疫疾患、前記臓器移植拒絶反応、または前記腫瘍もしくは癌の個別化治療または予防が可能になる。
【００２３】
別の関連の態様では本明細書において提供される前記方法により前記疾患または症状、すなわち、前記感染症、または前記自己免疫疾患、または前記臓器移植拒絶反応、または前記腫瘍もしくは癌を有する前記対象の生存時間が増加する。
【００２４】
１つの態様では本発明は、１つ以上の個別化ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列を備える組換え型弱毒化リステリア株であって、前記ネオエピトープが疾患または症状を有する対象の前記疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記リステリア株に関する。
【００２５】
１つの態様では本発明は、疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって  （ａ）  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の前記１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、（ｂ）（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップ、所望により、（ｃ）前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である前記１つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、（ｄ）（ｃ）において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および（ｅ）前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第２弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記第２弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記第２弱毒化組換え型リステリア株を含む第２組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法に関する。
【００２６】
疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、（ａ）疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の前記１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、（ｂ）  （ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、または（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してＤＮＡ免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記ＤＮＡ免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、（ｃ）前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、（ｄ）（ｃ）において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および（ｅ）前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第２ベクターを形質転換するか、または（ｃ）において特定された前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してＤＮＡ免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記ＤＮＡ免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法。
【００２７】
１つの態様では本発明は、（ａ）本明細書において提供される１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドに融合された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子、または（ｂ）キメラタンパク質をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質が  （ｉ）細菌分泌シグナル配列、（ｉｉ）ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、（ｉｉｉ）本明細書において提供される１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含み、且つ、（ａ）〜（ｃ）の前記シグナル配列、前記ユビキチンおよび１つ以上のペプチドが機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている前記コンストラクトを含む組換え型弱毒化リステリア株であって、
前記ネオエピトープが疾患または症状を有する対象の前記疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記リステリア株に関する。
【００２８】
関連の態様では前記疾患または症状を有する対象への前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした免疫応答が生じる。
【００２９】
関連の態様では前記株は前記対象の疾患または症状を標的とした前記対象向けの個別免疫療法ベクターである。
【００３０】
関連の態様では前記ネオエピトープ配列は腫瘍特異的、転移癌特異的、細菌感染症特異的、ウイルス感染症特異的、およびそれらのあらゆる組合せである。
【００３１】
関連の態様では１つ以上のネオエピトープが約５個から５０個の間のアミノ酸を含む。
【００３２】
関連の態様では前記疾患担持組織または細胞のエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて前記ネオエピトープが決定される。
【００３３】
関連の態様では免疫抑制性エピトープについて１つ以上のネオエピトープがスクリーニングされ、免疫抑制性エピトープが前記核酸分子から除外される。
【００３４】
関連の態様では１つ以上のネオエピトープが前記リステリア株に応じて発現および分泌に関してコドンを最適化される。
【００３５】
関連の態様では１つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している。
【００３６】
関連の態様では前記免疫原性ポリペプチドは変異型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、ＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２（ＬＡ−２４２）融合体、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である。
【００３７】
関連の態様では前記疾患または症状は感染症、自己免疫疾患、または、腫瘍もしくは癌、または異形成症である。
【００３８】
関連の態様では前記感染症はウイルス感染症または細菌感染症を含む。
【００３９】
関連の態様では１つ以上のネオエピトープは感染症関連特異的エピトープを含む。
【００４０】
関連の態様では前記弱毒化リステリアは１つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む。
【００４１】
関連の態様では前記リステリア株は１つ以上の免疫調節性分子をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトをさらに備える。
【００４２】
関連の態様では個別免疫療法組成物は上記のいずれかにおいて開示される１つ以上のリステリア株を含む。
【００４３】
関連の態様では個別免疫療法組成物により１つ以上のネオエピトープを標的とする免疫応答が誘発される。
【００４４】
関連の態様では前記組成物は前記リステリア株の混合物を含み、その混合物は同日に投与される複数の前記ネオエピトープを含む。
【００４５】
関連の態様では前記混合物は異なる日に投与される、または交互の順序で投与される複数の前記リステリア株を含み、異なる日に投与される前記混合物は複数の前記ネオエピトープを含む。
【００４６】
関連の態様では前記組成物は前記リステリア株の混合物を含み、その混合物は同日に投与される複数の前記ネオエピトープを含む。
【００４７】
関連の態様では前記混合物は本系において発現し得る前記患者において特定された全ての前記ネオエピトープを含む。
【００４８】
関連の態様では前記混合物はクローン性と記載される全て、または複数の前記ネオエピトープを含む。
【００４９】
関連の態様では前記混合物はＲＮＡシーケンシングに基づくトランスクリプトームにおいても示される全て、または複数の前記ネオエピトープを含む。
【００５０】
関連の態様では前記組成物は、各株が少なくとも１つの特有の前記ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む前記核酸コンストラクトを備える複数の前記リステリア株の混合物を含む。
【００５１】
関連の態様では前記組成物は前記リステリア株の混合物を含み、前記混合物は複数の前記ネオエピトープを含む。
【００５２】
関連の態様では前記混合物は最大で約５００個のネオエピトープを含む。
【００５３】
関連の態様では前記混合物は、１つ以上のエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備える１つ以上の組換え型弱毒化リステリア株送達ベクターをさらに含み、前記エピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含み、前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした免疫療法が発生する。
【００５４】
関連の態様では上記のいずれかにおいて開示される組成物はアジュバントをさらに含む。
【００５５】
関連の態様では前記対象への前記組成物の投与により前記対象における個別化増強抗疾患または抗症状免疫応答が生じる。
【００５６】
本発明の関連の態様ではＤＮＡ免疫療法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物を含む。
【００５７】
本発明の関連の態様ではペプチド免疫療法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物を含む。
【００５８】
本発明の関連の態様では本発明の医薬組成物は上記のいずれかにおいて開示される免疫療法または個別免疫療法組成物と医薬担体を含む。
【００５９】
本発明の関連の態様では前記疾患または症状を有する対象の疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する少なくとも１つのネオエピトープに対する免疫応答の誘導方法は、上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
【００６０】
本発明の関連の態様では疾患または症状を有する対象における標的とされる免疫応答の誘導方法は上記のいずれかにおいて記載される免疫原性組成物または免疫療法を前記対象に投与することを含み、前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした個別免疫療法が発生する。
【００６１】
本発明の関連の態様では対象において疾患または症状を治療、抑止、または抑制する方法は、前記疾患または症状を標的とするために上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を投与するステップを含む。
【００６２】
さらに別の実施形態では前記疾患または症状は感染症、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、腫瘍、または癌である。
【００６３】
本発明の関連の態様では対象のリンパ組織または体循環、および腫瘍、または疾患もしくは異型組織内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比率であって、対象の疾患または症状を担持する組織内に存在するネオエピトープを標的としている前記Ｔエフェクター細胞の比率を上げる方法は、上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
【００６４】
本発明の関連の態様では、抗原またはそのペプチド断片が１つ以上のネオエピトープを含む、その抗原に特異的なＴ細胞を対象において増加させるための方法は、上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
【００６５】
本発明の関連の態様では腫瘍を有するか、または癌を患う対象、または感染症を患う対象の生存時間の増加方法は、上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
【００６６】
本発明の関連の態様では対象の癌からの予防方法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
【００６７】
本発明の関連の態様では対象における癌発症の抑制または遅延化方法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
【００６８】
本発明の関連の態様では対象における腫瘍または転位の減少化方法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
【００６９】
本発明の関連の態様では対象の感染症からの予防方法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
【００７０】
本発明の別の実施形態によると、上記の方法であって、前記個別免疫療法組成物を作製するステップを追加として含み、前記作製が、
(a)  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b)  （ａ）において特定された１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答の生成を生じさせるステップ、所望により、
(c)  前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である１つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d)  （ｃ）において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e)  １つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第２弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するためにその第２弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいはその第２弱毒化組換え型リステリア株を含む第２組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が開示される。
【００７１】
１つの実施形態では本発明は、本明細書において開示される方法により作製された１つ以上の組換え型リステリア株を含む組成物の免疫原性混合物に関する。別の実施形態では前記混合物中の前記リステリアの各々が１つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む。別の実施形態では前記混合物中の各リステリアは１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、または１００〜２００個のネオエピトープを発現する。別の実施形態では各混合物は１〜５株、５〜１０株、１０〜１５株、１５〜２０株、１０〜２０株、２０〜３０株、３０〜４０株、または４０〜５０株の組換え型リステリア株を含む。
【００７２】
１つの実施形態では本発明は、対象における抗腫瘍応答の誘発方法であって、本明細書において開示される免疫原性混合物組成物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法に関する。別の実施形態では対象において腫瘍を予防または治療する方法であって、本明細書において開示される組成物の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法が本明細書において開示される。１つの実施形態では本発明は次の要素、すなわち、Ｎ末端短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）が融合している第１ネオエピトープアミノ酸配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第１ネオエピトープＡＡ配列に連結されている第２ネオエピトープＡＡ配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第２ネオエピトープＡＡ配列に連結されている少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列、およびリンカー配列を介して機能的であるようにＣ末端ヒスチジンタグに連結している最後のネオエピトープを含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクトに関する。
【００７３】
別の実施形態では本発明は、対象向けの個別免疫療法を作成するための系であって、少なくとも１つの処理装置、および前記処理装置により実行されるプログラム命令を含む少なくとも１つの記憶媒体を含み、前記プログラム命令によって前記処理装置が次のこと、すなわち、
a.  全ての新抗原および前記対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイプを含む出力データを受信すること、
b.  各エピトープの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるエピトープを除外すること、
c.  対象ＨＬＡに結合する残りの新抗原の能力、およびそれらの新抗原の予想ＭＨＣ結合スコアに基づいてそれらの新抗原を数値により評価すること、
d.  各エピトープのアミノ酸配列をプラスミドに挿入すること、
e.  各コンストラクトの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるあらゆるコンストラクトを除外すること、
f.  最も高いスコアになったコンストラクトから開始して、各コンストラクトのアミノ酸配列を対応するＤＮＡ配列に翻訳すること、
g.  所定の上限に達するまでランク順に前記プラスミドコンストラクトに追加のエピトープを挿入すること、
h.  対象における免疫治療応答を測定するために前記コンストラクトの末端にＤＮＡ配列タグを付加すること、および
i.  リステリア・モノサイトゲネスにおける発現および分泌のために前記エピトープおよびＤＮＡ配列タグを最適化すること、を含むステップを実行することになる前記系に関する。
【００７４】
以下の発明を実施するための形態、実施例、および図面から本発明の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、この発明を実施するための形態より本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が当業者に明らかとなるので、この発明を実施するための形態および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示として提示されていることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
本発明に関する主題は、本明細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本発明の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点と共に、添付図面と共に読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良好に理解され得る。
【００７６】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂ  Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（ＡＤＸＳ１１−００１）は異なる発現系を使用してＥ７を発現および分泌する。Ｌｍ−Ｅ７は、Ｌ．モノサイトゲネスゲノムのｏｒｆＺドメインの中へと遺伝子カセットを導入することによって作製された（図１Ａ）。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙシグナル配列、およびＨＰＶ−１６  Ｅ７が後に続くＬＬＯの最初の５つのアミノ酸（ＡＡ）の発現を引き起こす。（図１B）、ｐｒｆＡ−株ＸＦＬ−７をプラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することによってＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を作製した。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７の非溶血性融合体の発現を引き起こすｈｌｙプロモーターを有する。ｐＧＧ−５５は、インビボでのＸＦＬ−７によるプラスミドの保持について選択するためのｐｒｆＡ遺伝子も含有する。
【００７７】
【図２】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はＥ７を分泌する。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）をルリア−ベルターニ培地中、３７℃で一晩増殖させた。６００ｎｍのＯＤ吸光度によって決定される同等数の細菌をペレット化し、そして各上清１８ｍＬをＴＣＡ沈殿した。Ｅ７発現をウエスタンブロットによって分析した。ブロットを抗Ｅ７  ｍＡｂで調査し、それに続いてＨＲＰ結合抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で調査し、次いでＥＣＬ検出試薬を使用して発色させた。
【００７８】
【図３】ＬＬＯ−Ｅ７融合体の腫瘍免疫療法有効性  腫瘍接種の７日、１４日、２１日、２８日、および５６日後におけるマウス内の腫瘍サイズがミリメートルで示されている。未感作マウス：白丸、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７：黒丸、Ｌｍ−Ｅ７：正方形、Ｌｍ−Ｇａｇ：白ひし形、そしてＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ：黒三角。
【００７９】
【図４】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７−免疫されたマウスに由来する脾細胞はＴＣ−１細胞に曝露されると増殖する。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７株、Ｌｍ−Ｅ７株、または対照ｒＬｍ株を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫および追加免疫した。追加免疫の６日後に脾細胞を採取し、そして放射線照射したＴＣ−１細胞と共に表示されている比で培養皿に蒔いた。細胞を３Ｈチミジンでパルスラベルし、採取した。ｃｐｍは、（実験的ｃｐｍ）−（非ＴＣ−１対照）と定義される。
【００８０】
【図５】図５Ａおよび図５Ｂ  （図５Ａ）Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＥ７を分泌することを実証するウエスタンブロット。レーン１：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、レーン２：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７．００１、レーン３：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．３、レーン４：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．４。（図５Ｂ）Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（長方形）、Ｌｍ−Ｅ７（楕円）、およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（×）を投与されたマウス、ならびに未感作マウス（非ワクチン接種、黒三角形）内の腫瘍サイズ。
【００８１】
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｃ  （図６Ａ）４つのＬＭ免疫療法を作製するために使用されるプラスミド挿入断片の概略図。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７挿入断片は使用される全てのリステリア遺伝子を含有する。これはｈｌｙプロモーター、ｈｌｙ遺伝子の最初の１．３ｋｂ（タンパク質ＬＬＯをコードする）、およびＨＰＶ−１６  Ｅ７遺伝子を含有する。ｈｌｙの最初の１．３ｋｂはシグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７はｈｌｙプロモーター、シグナル配列、ならびにＰＥＳＴ配列およびＥ７配列を含むが、短縮型ＬＬＯ遺伝子の残りの部分を除外する。Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７はＰＥＳＴ領域を除外するが、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、Ｅ７、および短縮型ＬＬＯの残りの部分を含有する。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉはｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。（図６Ｂ）上のパネル：腫瘍退行を誘導するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構成体。下のパネル：２つの別個の実験での腫瘍移植後２８日目における平均腫瘍サイズ。（図６Ｃ）ＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構成体により脾臓においてＥ７特異的リンパ球のより高いパーセンテージが誘導された。３回の実験からのデータの平均およびＳＥが図示されている。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【００８２】
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂ  （図７Ａ）ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、これに続いてＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、もしくはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与したマウス、または免疫療法を投与しなかった（未感作）マウスにおける脾臓内でのＥ７特異的なＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に浸潤する数。（図７Ｂ）図７Ａに記述したマウスの脾臓および腫瘍でのＥ７特異的ＣＤ８＋細胞の誘導および浸潤。
【図７Ｂ】同上。
【００８３】
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂ  腫瘍の中のＥ７特異的リンパ球のより高いパーセンテージを誘導するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構成体。（図８Ａ）１つの実験からの代表的データ。（図８Ｂ）３回の全ての実験からのデータの平均およびＳＥ。
【図８Ｂ】同上。
【００８４】
【図９】実施例6で提示された臨床試験で患者に観察された有効性を示すコホート１およびコホート２からのデータ。
【００８５】
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂ  （図１０Ａ）ｋｌｋ３の組込みおよびＡｃｔＡの欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（図１０Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に組み込まれている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した、それぞれのコンストラクトからの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲにより、野生型タンパク質の分泌シグナル配列を欠失しているｋｌｋ３遺伝子に対応する７１４ｂｐのバンドが増幅される。
【００８６】
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｄ  （図１１Ａ）ｐＡＤＶ１３４プラスミドのマップである。（図１１Ｂ）ＬｍｄｄＡ−１３４培養上清からのタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＬＬＯ−Ｅ７タンパク質が抗Ｅ７モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロットにより検出された。抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーター、短縮型ＬＬＯのためのＯＲＦおよびヒトＰＳＡ遺伝子（ｋｌｋ３）からなる。（図１１Ｃ）ｐＡＤＶ１４２プラスミドのマップである。（図１１Ｄ）抗ＰＳＡおよび抗ＬＬＯ抗体を使用してＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現を示したウエスタンブロットである。
【００８７】
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂ  （図１２Ａ）選択圧（Ｄ−アラニン）のある場合とない場合とで培養した場合の、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビトロでのプラスミド安定性を示す。株および培養条件が先に挙げられており、ＣＦＵ決定に使用されたプレートが後に挙げられている。（図１２B）インビボでのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのクリアランス、およびこの間の潜在的なプラスミド損失を評価したものである。細菌が静脈内注入され、示された時点で脾臓から単離された。ＣＦＵは、ＢＨＩプレートおよびＢＨＩ＋Ｄ−アラニンプレート上で決定された。
【００８８】
【図１３】図１３Ａおよび図１３Ｂ  （図１３Ａ）１０８ＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した後での株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビボでのクリアランスを示す。ＣＦＵの数は、ＢＨＩ／ｓｔｒプレート上でのプレーティングにより決定された。この方法での検出限界は１００ＣＦＵであった。（図１３Ｂ）１０４０３Ｓ株、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株およびＸＦＬ７株を用いたＪ７７４細胞の細胞感染アッセイ。
【００８９】
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｅ  （図１４Ａ）ブースター投与後６日目における無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞におけるＰＳＡ四量体特異的な細胞を示す図である。（図１４Ｂ）未感作マウスおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスの脾細胞におけるＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色がＰＳＡペプチドで５時間にわたり刺激された。カスパーゼ・ベースアッセイ（図１４Ｃ）およびユーロピウム・ベースアッセイ（図１４Ｄ）を使用した、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスおよび未感作マウスに由来するインビトロ刺激エフェクターＴ細胞を様々なエフェクター／標的比率で使用する、ＰＳＡペプチドを瞬間適用されたＥＬ４細胞の特異的溶解を示す図である。（図１４Ｅ）ＰＳＡペプチドの存在下またはペプチド無しで２４時間にわたり刺激した後に取得した未感作脾細胞および免疫脾細胞におけるＩＦＮγスポット数。
【００９０】
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｃ  ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫がＴｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）腫瘍の退行を誘導する。マウスを未処置のままにするか（ｎ＝８）（図１５Ａ）、または７日目、１４日目および２１日目にＬｍｄｄＡ−１４２（１×１０８ＣＦＵ／マウス）（ｎ＝８）（図１５Ｂ）またはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ｎ＝８）（図１５Ｃ）で腹腔内に免疫した。腫瘍のサイズが個別の各腫瘍について測定され、それらの値がミリメートル単位での平均直径として表されている。それぞれの線は個別のマウスを示す。
【００９１】
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂ  （図１６Ａ）無処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ−１４２）のいずれかで免疫されたマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内のＰＳＡ−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析を示す。（図１６Ｂ）無処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのいずれかで免疫されたマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内の、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋として定義されたＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の分析。
【００９２】
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂ  （図１７Ａ）ｋｌｋ３の組込みおよびａｃｔＡの欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（図１７Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に組み込まれている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した各コンストラクトからの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲにより、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７６０ｂｐのバンドが増幅される。
【００９３】
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｃ（（図１８Ａ））Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質を分泌することを示す。細菌培養上清からのタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用してウエスタンブロットによりＬＬＯおよびＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質を検出した。（図１８Ｂ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３により作製されたＬＬＯでは溶血活性が保持された。細菌培養上清の段階希釈物と共にヒツジ赤血球をインキュベートし、５９０ｎｍでの吸光度により溶血活性を測定した。（図１８C）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がマクロファージ様のＪ７７４細胞内部で増殖した。細菌と共にＪ７４４細胞を１時間にわたって培養し、続いてゲンタマイシン処理を行って細胞外の細菌を殺菌した。表示した時点で獲得したＪ７７４溶菌液の段階希釈物のプレーティングにより細胞内増殖を測定した。これらの実験でＬｍ  １０４０３Ｓが対照として使用された。
【００９４】
【図１９】Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３でのマウスの免疫がＰＳＡ特異的な免疫応答を誘導する。１×１０８ＣＦＵのＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３、またはＬｍｄｄＡ−１４２を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを１週間間隔で２回免疫し、７日後に脾臓を採取した。モネンシンの存在下で脾細胞を１μＭのＰＳＡ６５−７４ペプチドで５時間にわたり刺激した。ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌおよび細胞内ＩＦＮ−γについて細胞を染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒサイトメーター内で分析した。
【００９５】
【図２０】図２０Ａおよび図２０Ｂ  ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。（図２０Ａ）ＬｍｄｄＡ株における染色体のｄａｌ−ｄａｔ欠失を相補させるための構成的リス照りパｐ６０プロモーターの制御下にある枯草菌ｄａｌ遺伝子を保持するＰＡｄｖ１６４のプラスミドマップを示す図である。このプラスミドは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片であるＥＣ１（ａａ  ４０〜１７０）、ＥＣ２（ａａ  ３５９〜５１８）およびＩＣＩ（ａａ  ６７９〜８０８）の直接融合によって構築されたキメラヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への短縮型ＬＬＯ（１−４４１）の融合体も含有する。（図２０Ｂ）抗ＬＬＯ抗体でブロットしたＴＣＡ沈殿細胞培養上清のウエスタンブロット分析によって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）内でｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現と分泌が検出された。約１０４ＫＤの差次的なバンドがｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内在性ＬＬＯは５８ＫＤのバンドとして検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。
【００９６】
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｃ  （図２１Ａ）ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性を示す図である。免疫されたマウスに由来する脾細胞におけるＨｅｒ２／ｎｅｕリステリアベースの免疫療法により誘発された細胞傷害性Ｔ細胞応答が、刺激因子としてのＮＴ−２細胞および標的としての３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を使用して試験された。Ｌｍ対照は、無関連の抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）を発現することを除いて全ての点で同一であるＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づいた。（図２１Ｂ）マイトマイシンＣ処理ＮＴ−２細胞を用いた２４時間のインビトロ刺激の後にＥＬＩＳＡによって測定された、免疫されたＦＶＢ／Ｎマウスに由来する脾細胞によって細胞培地中へと分泌されたＩＦＮ−γを示す図である。（図２１Ｃ）前記タンパク質の異なる領域に由来するペプチドとのインビトロでのインキュベーションに応答した、キメラ免疫療法で免疫されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに由来する脾細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す図である。図の凡例にリスト表示したように、組換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質が正の対照として使用され、無関連ペプチド群またはペプチドを含まない群が負の対照を構成した。７２時間のコインキュベーションの後に採取された細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌が検出された。各データ点は３回のデータの平均値±標準誤差であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【００９７】
【図２２】リステリア−ＣｈＨｅｒ２／ｎｅｕ免疫療法の腫瘍防止試験  Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに各組換え型リステリア−ＣｈＨｅｒ２免疫療法または対照リステリア免疫療法を６回注射した。６週齢で免疫を開始し、２１週目まで３週ごとに免疫を継続した。腫瘍の外観を毎週観察し、腫瘍を有しないマウスのパーセンテージとしてそれを表現した。＊ｐ＜０．０５、グループ当たりＮ＝９。
【００９８】
【図２３】脾臓中のＴｒｅｇのパーセンテージに対するＡＤＸＳ３１−１６４を用いる免疫の効果を示す図である。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６細胞のＮＴ−２細胞を皮下接種し、１週間の間隔で各免疫療法を３回免疫した。２回目の免疫の７日後に脾臓を採取した。免疫細胞の単離後、Ｔｒｅｇの検出のために抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、および抗ＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群の間での全ＣＤ３＋細胞または全ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表されるＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【００９９】
【図２４】図２４Ａおよび図２４Ｂ  ＮＴ−２腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇのパーセンテージに対するＡＤＸＳ３１−１６４を用いる免疫の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６細胞のＮＴ−２細胞を皮下接種し、１週間の間隔で各免疫療法を３回免疫した。２回目の免疫の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の単離後、Ｔｒｅｇの検出のために抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、および抗ＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。（図２４Ａ）  代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットを示す図である。（図２４Ｂ）  異なる投与群の間での全ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表され（左のパネル）、且つ、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）として表される、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す図である。データは２つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭとして示される。
【０１００】
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｃ  ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は乳癌細胞株の脳内での増殖を遅延することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＡＤＸＳ３１−１６４または対照リステリア株で３回免疫した。麻酔をかけたマウスの頭蓋内にＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００細胞）を注射した。（図２５Ａ）Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００  ＣＣＤカメラを使用して示されている日にマウスのエクスビボ撮像を遂行した。（図２５Ｂ）１秒当たり表面積１平方ｃｍ当たりの光子数としてピクセル輝度がグラフにされた。これは平均放射輝度として提示されている。（図２５Ｃ）ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞株、およびＮＴ−２細胞株によるＨｅｒ２／ｎｅｕの発現が、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体を使用してウエスタンブロットにより検出された。マウスのマクロファージ様細胞株のＪ７７４．Ａ２細胞を負の対照として使用した。
【０１０１】
【図２６】図２６Ａ〜図２６Ｃは、組換え型リステリアタンパク質ミニ遺伝子コンストラクトの概略的なマップを表す。（図２６Ａ）オボアルブミン由来ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを産生するコンストラクトを表す図である。（図２６Ｂ）ＰＣＲクローニングによってＳＩＩＮＦＥＫＬの代わりにＧＢＭ由来ペプチドが導入された同等の組換えタンパク質を表す図である。（図２６Ｃ）リステリアの株由来の4つの別個のペプチド抗原を発現するように設計されたコンストラクトを表す図である。
【０１０２】
【図２７】図２７に示されるプラスミドｐＡｄｖ２１１、ｐＡｄｖ２２３およびｐＡｄｖ２２４を作製するためのプラスミド骨格ｐＡｄｖ１４２内の異なるＡｃｔＡ  ＰＥＳＴ領域（図１１Ｃ参照）のクローニングを示す概略図である。この模式図は、異なるＡｃｔＡコード領域がＸｂａＩおよびＸｈｏＩで制限処理されて骨格プラスミドｐＡｄｖ１４２内にリステリオリジンＯシグナル配列とインフレームでクローニングされたことを示している。
【０１０３】
【図２８】図２８Ａ〜図２８Ｂ（図２８Ａ）移植可能腫瘍モデルとしてＴＰＳＡ２３を使用する腫瘍退行試験。８匹のマウスからなる３群に１×１０６細胞の腫瘍細胞を０日目に移植し、１０８ＣＦＵの様々な治療法、すなわち、ＬｍｄｄＡ１４２、ＬｍｄｄＡ２１１、ＬｍｄｄＡ２２３、およびＬｍｄｄＡ２２４を６日目、１３日目、および２０日目に処置した。未感作マウスはどの処置も受けなかった。腫瘍を毎週モニターし、平均腫瘍径が１４〜１８ｍｍであった場合にマウスを殺処理した。グラフ中の各シンボルは個別のマウスの腫瘍サイズを表す  実験を二回繰り返し、同様の結果を得た。（図２８Ｂ）実験の様々な日における未感作マウスと免疫されたマウスの生存率を示す図である。
【０１０４】
【図２９】図２９Ａ〜図２９ＢＰＳＡ特異的免疫応答を四量体染色（図２９Ａ）およびＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色（図２９Ｂ）により調査した。１０８ＣＦＵのさまざまな療法、すなわちＬｍｄｄＡ１４２（ＡＤＸＳ３１−１４２）、ＬｍｄｄＡ２１１、ＬｍｄｄＡ２２３、およびＬｍｄｄＡ２２４でマウスを１週間の間隔で３回免疫した。免疫アッセイのため、２回目の追加免疫後の６日目に脾臓を採取した。この実験のために群当たり２匹のマウスの脾臓をプールした。（Ａ）ＰＳＡエピトープ特異的四量体染色を用いて未感作マウス、ＬｍｄｄＡ１４２を免疫されたマウス、ＬｍｄｄＡ２１１を免疫されたマウス、  ＬｍｄｄＡ２２３を免疫されたマウス、およびＬｍｄｄＡ２２４を免疫されたマウスの脾臓内のＰＳＡ特異的Ｔ細胞を検出した。細胞をマウス抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ３（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５）、抗ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ）、およびＰＳＡ四量体−ＰＥで染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒにより分析した。（図２９Ｂ）５時間にわたる１μＭのＰＳＡ特異的Ｈ−２Ｄｂペプチド（ＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬ）を用いる刺激後の未感作マウスと免疫されたマウスにおいてＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ８＋  ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞のパーセンテージを検出するための細胞内サイトカイン染色を示す図である。
【０１０５】
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｃ.ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２（ＬＡ２２９）融合ＰＳＡおよびｔＬＬＯ融合ＰＳＡを使用することによるＣ５７ＢＬ６マウスにおける免疫応答の生成を検討するために腫瘍モデルであるＴＰＳＡ２３を使用した。５匹のマウスからなる４群に１×１０６細胞の腫瘍細胞を０日目に移植し、１０８ＣＦＵの様々な治療法、すなわち、ＬｍｄｄＡ２７４、ＬｍｄｄＡ１４２（ＡＤＸＳ３１−１４２）、およびＬｍｄｄＡ２１１を６日目と１４日目に処置した。未感作マウスはどの処置も受けなかった。最後の免疫後の６日目に各マウスから脾臓と腫瘍を採取した。（図３０Ａ）表は免疫後１３日目の腫瘍体積を示している。脾臓（図３０Ｂ）および腫瘍（図３０Ｃ）における五量体染色によりＰＳＡ特異的免疫応答を調査した。免疫アッセイのために群当たり２匹のマウスまたは群当たり３匹のマウスの脾臓をプールし、群あたり５匹のマウスの腫瘍をプールした。細胞をマウス抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ３（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５）、抗ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ）、およびＰＳＡ五量体−ＰＥで染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒにより分析した。
【０１０６】
【図３１Ａ】図３１Ａ〜図３１Ｃ  ＳＯＥ突然変異形成戦略。ＬＬＯの第４ドメインに突然変異を形成することによってＬＬＯの病原性の減少／低下が達成された。（図３１Ａ〜図３１Ｂ）  このドメインは、それがオリゴマー形成して孔を形成する場所である膜に結合できるようにするコレステロール結合部位を含有する。図３１Ｃは全長型ＬＬＯ（ｒＬＬＯ５２９）を示している。組換え型ＬＬＯであるｒＬＬＯ４９３はアミノ酸１〜４９３（シグナル配列を含む）にわたるＬＬＯのＮ末端断片を表す。組換え型ＬＬＯであるｒＬＬＯ４８２はアミノ酸１〜４８２（シグナル配列を含む）にわたるＮ末端ＬＬＯ断片（アミノ酸４８３〜４９３のコレステロール結合ドメインの欠失を含む）を表す。組換え型ＬＬＯであるｒＬＬＯ４１５はアミノ酸１〜４１５（シグナル配列を含む）にわたるＮ末端ＬＬＯ断片（アミノ酸４８３〜４９３のコレステロール結合ドメインの欠失を含む）を表す。組換え型ＬＬＯであるｒＬＬＯ５９−４１５はアミノ酸５９〜４１５にわたるＮ末端ＬＬＯ断片（コレステロール結合ドメインを含まない）を表す。組換え型ＬＬＯであるｒＬＬＯ４１６−５２９はアミノ酸４１６〜５２９にわたり、且つ、コレステロール結合ドメインを含むＮ末端ＬＬＯ断片を表す。
【図３１Ｂ】同上。
【図３１Ｃ】同上。
【０１０７】
【図３２】図３２Ａおよび図３２Ｂ  クマシー染色による突然変異型ＬＬＯタンパク質の発現が図３２Ａに示されており、ウエスタンブロットによるものが図３２Ｂに示されている。
【０１０８】
【図３３】図３３Ａおよび図３３Ｂ  突然変異型ＬＬＯ（ｍｕｔＬＬＯおよびｃｔＬＬＯ）タンパク質の溶血活性をｐＨ５．５（図３３Ａ）およびｐＨ７．４（図３３Ｂ）において示すデータがヒストグラムにより提示されている。
【０１０９】
【図３４】ＰＡＫ６をｔＬＬＯとの融合タンパク質として発現するＰＡＫ６コンストラクト（７６０５ｂｐ）のプラスミドマップを示す図である。ＰＡＫ６のプラスミドの模式的マップ。そのプラスミドはリステリアの複製起点（Ｒｅｐ  Ｒ）と大腸菌の複製起点（ｐ１５）の両方を含有する。黒の矢印は転写方向を表す。枯草菌ｄａｌ遺伝子はＤ−アラニン合成を相補する。抗原発現カセットはｈｌｙプロモーター、短縮型ＬＬＯのＯＲＦ、およびヒトＰＡＫ６遺伝子からなる。
【０１１０】
【図３５】配列番号１０２で表されるＰＡＫ６の核酸配列を示す図である。
【０１１１】
【図３６】配列番号１０３で表されるＰＡＫ６のアミノ酸配列を示す図である。
【０１１２】
【図３７】図３７Ａは腫瘍シーケンシングおよびＤＮＡ生成のワークストリームの概略を示す図である。  図３７Ｂは  ＤＮＡクローニングおよび免疫療法製造のワークストリームの概略を示す図である。
【０１１３】
【図３８】個別免疫療法組成物の並行製造のための完全包括型単回使用細胞培養システムのクラスターの図である。
【０１１４】
【図３９】完全包括型単回使用細胞培養システムの接種部分と発酵部分の詳細図である。
【０１１５】
【図４０】完全包括型単回使用細胞培養システムの濃縮部分の詳細図である。
【０１１６】
【図４１】完全包括型単回使用細胞培養システムの透析濾過部分の詳細図である。
【０１１７】
【図４２】完全包括型単回使用細胞培養システムの製品分配部分の詳細図である。
【０１１８】
【図４３】図４３Ａは免疫療法の効率を改善するためにネオエピトープの段階選択を用いる過程の図である。  図４３Ｂは複数のネオエピトープの並行選択を用いる過程の図である。
【０１１９】
【図４４】全ての新抗原および患者ＨＬＡタイプを含む出力データを使用する、送達ベクター、例えばリステリア・モノサイトゲネスに使用される１つ以上のネオエピトープを含む個別化プラスミドベクターのＤＮＡ配列を生成する（手動または自動化）過程のフローチャートを示す図である。
【０１２０】
【図４５】２５Ｄ検出に対するＳＩＩＮＦＥＫＬタグの移動の効果を示す図である。ＳＩＩＮＦＥＫＬタグは、そのタグがＣ末端に位置するにしても、Ｎ末端に位置するにしても、またはそれらの間に位置するにしても分泌されたネオエピトープを特定する。
【０１２１】
【図４６】図４６ＡはＬｍ  Ｎｅｏコンストラクトを使用する処置を含むＢ１６Ｆ１０腫瘍実験のタイムラインを示す図である。  図４６ＢはＬｍｄｄＡ２７４、Ｌｍ−Ｎｅｏ−１２、およびＬｍ−Ｎｅｏ−２０による腫瘍退行、および陰性対照としたＰＢＳによる腫瘍退行を示す図である。
【０１２２】
図４６ＣはＬｍｄｄＡ２７４、Ｌｍ−Ｎｅｏ−１２、またはＬｍ−Ｎｅｏ−２０での処置後のＢ１６Ｆ１０腫瘍を含むマウスの生存を陰性対照として使用されるＰＢＳでの処置後のものと比較する図である。
【０１２３】
【図４７】図４７Ａ〜図４７ＣはＰＳＡ−サバイビン−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図４７Ａ）、ＳＩＩＮＦＥＫＬを含まないＰＳＡ−サバイビン（図４７Ｂ）、およびＮｅｏ２０−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図４７Ｃ）の発現と分泌のレベルを示す。
【０１２４】
【図４８】Ｎｅｏ２０抗原（Ｃ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬタグを含む）または陰性対照に対するＣＤ８  Ｔ細胞応答を示す図である。各条件についてのＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答のパーセントがグラフにより示されている。
【０１２５】
【図４９】図４９ＡはＬｍｄｄＡ２７４、Ｌｍ−Ｎｅｏ−１２、Ｌｍ−Ｎｅｏ−２０、およびＬｍ−Ｎｅｏ３０による腫瘍退行、および陰性対照としたＰＢＳによる腫瘍退行を示す図である。  図４９ＢはＬｍｄｄＡ２７４、Ｌｍ−Ｎｅｏ−１２、Ｌｍ−Ｎｅｏ−２０、およびＬｍ−Ｎｅｏ３０での処置後のＢ１６Ｆ１０腫瘍を含むマウスの生存を陰性対照として使用されるＰＢＳでの処置後のものと比較する図である。
【０１２６】
【図５０】分泌を改変するためのコンストラクト内のネオエピトープの順序のランダム化の効果、またはネオエピトープの部分組合せへのネオエピトープの組合せの分割とそれらの部分組合せのランダム化の効果を示す図である。
【０１２７】
【図５１】肺ネオエピトープコンストラクトで免疫されたマウスにおける相対的ＣＤ８細胞応答を示す図である。
【０１２８】
例示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも正確な縮尺率で描かれているわけではないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、対応する要素または類似の要素を示すために図の間で参照番号が繰り返される場合がある。
【発明を実施するための形態】
【０１２９】
以下の発明を実施するための形態では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示されている。しかしながら、本発明は本明細書において実際に示されるこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者によって理解される。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
【０１３０】
１つの実施形態では、疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
a.  弱毒化リステリア株送達ベクター、および
b.  前記リステリア株を形質転換するためのプラスミドベクターであって、１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを備える前記プラスミドベクター、
を含み、前記プラスミドで前記リステリア株を形質転換することにより前記被検者の疾患または症状を対象とする個別免疫療法系が作成作製される前記系が提供される。
【０１３１】
１つの実施形態では本発明は、疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
a.  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の前記１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを前記比較により特定するステップ、
b.  免疫原性応答向けの前記１つ以上のネオエピトープを含むペプチドをスクリーニングするステップ、
c.  前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるプラスミドベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、および
d.  二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を前記対象に投与し、免疫原性組成物の一部として前記弱毒化組換え型リステリア株を投与するステップを含む前記方法を提供する。
【０１３２】
別の実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を提供するための系であって、次の構成要素、すなわち、
a.  前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される疾患担持生体試料、
b.  前記疾患または症状を有する前記対象、または別の健常ヒト対象より獲得される健常生体試料、
c.  前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記核酸配列によりコードされる前記ＯＲＦ中の突然変異であって、１つ以上のネオエピトープを構成する前記突然変異を特定するためのスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールと関連のデジタルソフトウェアであって、
i.  Ｔ細胞エピトープまたは免疫原性またはそれらのあらゆる組合せの特定のために前記ＯＲＦ中の前記突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む関連デジタルソフトウェア、
d.  前記疾患担持試料に由来する前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸をクローニングし、且つ、発現させるための核酸クローニングおよび発現キット、
e.  １つ以上のネオエピトープを含む候補ペプチドのＴ細胞免疫原性を検査するための免疫原性アッセイ、
f.  ステップ（ｅ）の１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記特定済み免疫原性ペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターで形質転換するための弱毒化リステリア送達ベクターを含み、
一度形質転換されると前記リステリアが保存されるか、または免疫原性組成物の一部として（ａ）の前記ヒト対象に投与される、前記系が提供される。
【０１３３】
別の実施形態では感染症、臓器移植拒絶反応、または腫瘍もしくは癌。
【０１３４】
１つの実施形態では本発明は、疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
c.  送達ベクター、および所望により  
d.  前記送達ベクターを形質転換するためのプラスミドベクターであって、１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含む前記系に関する。
【０１３５】
１つの実施形態では、１つ以上の個別化ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列を備える組換え型弱毒化リステリア株であって、前記ネオエピトープが疾患または症状を有する対象の前記疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記リステリア株が提供される。
【０１３６】
１つの実施形態では、（ａ）本明細書において提供される１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドに融合された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子、または（ｂ）キメラタンパク質をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質が  （ｉ）細菌分泌シグナル配列、（ｉｉ）ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、および（ｉｉｉ）本明細書において提供される１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含み、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記１つ以上のペプチドが機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている前記核酸コンストラクトを含む組換え型弱毒化リステリア株であって、前記ネオエピトープが疾患または症状を有する対象の前記疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記リステリア株が提供される。
【０１３７】
別の実施形態では前記疾患または症状を有する対象への前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした免疫応答が生じる。
【０１３８】
別の実施形態では前記株は前記対象の疾患または症状を標的とした前記対象向けの個別免疫療法ベクターである。
【０１３９】
別の実施形態では前記ペプチドは少なくとも２つの異なるネオエピトープアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
別の実施形態では前記ペプチドは同じアミノ酸配列の１回以上のネオエピトープの繰返しを含む。
【０１４１】
別の実施形態では前記リステリア株は１つのネオエピトープを含む。
【０１４２】
別の実施形態では前記リステリア株は約１〜１００個の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は約１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、５〜１５個、５〜２０個、５〜２５個、１５〜２０個、１５〜２５個、１５〜３０個、１５〜３５個、２０〜２５個、２０〜３５個、２０〜４５個、３０〜４５個、３０〜５５個、４０〜５５個、４０〜６５個、５０〜６５個、５０〜７５個、６０〜７５個、６０〜８５個、７０〜８５個、７０〜９５個、８０〜９５個、８０〜１０５個、または９５〜１０５個の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は約５０〜１００個の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は最大で約１００個のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は約１〜１００個、５〜１００個、５〜７５個、５〜５０個、５〜４０個、５〜３０個、５〜２０個、５〜１５個、または５〜１０個の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は約１〜１００個、１〜７５個、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、または１〜１０個の範囲のネオエピトープを含む。
【０１４３】
別の実施形態では前記リステリア株は約１００個を超えるネオエピトープを含む。別の実施形態では前記リステリア株は最大で１０個のネオエピトープを含む。別の実施形態では前記リステリア株は最大で２０個のネオエピトープを含む。別の実施形態では前記リステリア株は最大で３０個のネオエピトープを含む。別の実施形態では前記リステリア株は最大で４０個のネオエピトープを含む。別の実施形態では前記リステリア株は最大で５０個のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は約２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、または１００個のネオエピトープを含む。
【０１４４】
本明細書に記載される１つの実施形態ではネオエピトープ内の検出される突然変異の両側に約５〜３０アミノ酸の範囲のアミノ酸が組み込まれる。加えて、または代わりに約８〜２７アミノ酸長の範囲の様々なサイズのネオエピトープ挿入断片が挿入される。加えて、または代わりに約５〜５０アミノ酸長の範囲の様々なサイズのネオエピトープ挿入断片が挿入される。加えて、または代わりに１０〜３０アミノ酸長、１０〜４０アミノ酸長、１５〜３０アミノ酸長、１５〜４０アミノ酸長、または１５〜２５アミノ酸長の範囲の様々なサイズのネオエピトープ挿入断片（すなわち、ネオエピトープをコードするペプチド）が挿入される。別の実施形態では各ネオエピトープ挿入断片は１〜１０アミノ酸長、１０〜２０アミノ酸長、２０〜３０アミノ酸長、または３０〜４０アミノ酸長である。別の実施形態では前記ネオエピトープ挿入断片は１〜１００アミノ酸長、５〜１００アミノ酸長、５〜７５アミノ酸長、５〜５０アミノ酸長、５〜４０アミノ酸長、５〜３０アミノ酸長、５〜２０アミノ酸長、５〜１５アミノ酸長、または５〜１０アミノ酸長である。さらに別の実施形態では前記ネオエピトープアミノ酸配列は１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５または１〜１０である。別の実施形態では各ネオエピトープ挿入断片は２１アミノ酸長であるか、または「２１−ｍｅｒ」ネオエピトープ配列である。さらに別の実施形態では前記ネオエピトープアミノ酸挿入断片は約８〜１１アミノ酸長または１１〜１６アミノ酸長である。
【０１４５】
別の実施形態では前記ネオエピトープ配列は腫瘍特異的、転移癌特異的、細菌感染症特異的、ウイルス感染症特異的、およびそれらのあらゆる組合せである。加えて、または代わりに前記ネオエピトープ配列は炎症特異的、免疫調節分子エピトープ特異的、Ｔ細胞特異的、自己免疫疾患特異的、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）特異的、およびそれらのあらゆる組合せである。
【０１４６】
別の実施形態では１つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む。加えて、または代わりに１つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む。別の実施形態では１つ以上のネオエピトープが立体構造ネオエピトープを含む。
【０１４７】
別の実施形態では１つ以上のネオエピトープがＴ細胞エピトープを含む。
【０１４８】
１つの実施形態では、次の要素、すなわち、免疫原性ポリペプチドが融合している第１ネオエピトープアミノ酸（ＡＡ）配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第１ネオエピトープＡＡ配列に連結されている第２ネオエピトープＡＡ配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第２ネオエピトープＡＡ配列に連結されている少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクトが本明細書において開示される。所望により、前記免疫原性ポリペプチドはＮ末端短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）であってよい。所望により、前記最後のネオエピトープはリンカー配列を介して機能的であるようにＣ末端のヒスチジンタグなどのタグに連結されていてよい。所望により、前記核酸コンストラクトは前記タグをコードする配列の後に少なくとも１つの終止コドン（例えば２つの終止コドン）を含んでよい。１つの実施形態では、次の要素、すなわち、Ｎ末端短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）が融合している第１ネオエピトープアミノ酸（ＡＡ）配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第１ネオエピトープＡＡ配列に連結されている第２ネオエピトープＡＡ配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第２ネオエピトープＡＡ配列に連結されている少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列、およびリンカー配列を介して機能的であるようにＣ末端ヒスチジンタグに連結している最後のネオエピトープを含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクトが本明細書において開示される。所望により、前記ヒスチジンタグは６×ヒスチジンタグであってよい。別の実施形態では前記要素はＮ末端からＣ末端へと配置されているか、または機能的であるように連結されている。別の実施形態では各核酸コンストラクトは前記６×ヒスチジン（ＨＩＳ）タグをコードする配列の後に少なくとも１つの終止コドンを含む。別の実施形態では各核酸コンストラクトは前記６×ヒスチジン（ＨＩＳ）タグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む。別の実施形態では前記６×ヒスチジンタグは機能的であるようにＮ末端でＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに連結されている。別の実施形態では前記リンカーは４×グリシンリンカーである。
【０１４９】
別の実施形態では前記核酸コンストラクトは少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列を含む。別の実施形態では前記核酸コンストラクトは２〜１０個の追加ネオエピトープ、１０〜１５個の追加ネオエピトープ、１０〜２５個の追加ネオエピトープ、２５〜４０個の追加ネオエピトープ、または４０〜６０個の追加ネオエピトープを含む。別の実施形態では前記核酸コンストラクトは約１〜１０個、約１０〜３０個、約３０〜５０個、約５０〜７０個、約７０〜９０個、または最大で約１００個のネオエピトープを含む。例えば、前記核酸コンストラクトは約５〜１００個のネオエピトープ、または約１５〜３５個のネオエピトープを含み得る。
【０１５０】
別の実施形態では各ネオエピトープアミノ酸配列は１〜１０アミノ酸長、１０〜２０アミノ酸長、２０〜３０アミノ酸長、または３０〜４０アミノ酸長である。別の実施形態では前記ネオエピトープアミノ酸配列は１〜１００アミノ酸長、５〜１００アミノ酸長、５〜７５アミノ酸長、５〜５０アミノ酸長、５〜４０アミノ酸長、５〜３０アミノ酸長、５〜２０アミノ酸長、５〜１５アミノ酸長、または５〜１０アミノ酸長である。さらに別の実施形態では前記ネオエピトープアミノ酸配列は１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５または１〜１０である。別の実施形態では各ネオエピトープアミノ酸配列は２１アミノ酸長であるか、または「２１−ｍｅｒ」ネオエピトープ配列である。さらに別の実施形態では前記ネオエピトープアミノ酸配列は約８〜１１アミノ酸長または１１〜１６アミノ酸長である。
【０１５１】
別の実施形態では前記核酸コンストラクトは、Ｎ末端短縮型ＬＬＯが融合している２１アミノ酸配列のネオエピトープとそれに隣接するリンカー配列およびその後に続く少なくとも１つの第２ネオエピトープとそれに隣接する別のリンカーを含み、且つ、そのオープン・リーディング・フレームを終えるＳＩＩＮＦＥＫＬ−６ｘＨｉｓタグ−２×終止コドンによって終わる組換えポリペプチド、キメラタンパク質、または融合ポリペプチド、すなわち、ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−第一２１ｍｅｒ−４×グリシンリンカーＧ１−第二２１ｍｅｒ−４×グリシンリンカーＧ２−…−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６ｘＨｉｓｔａｇ−２×終止コドンをコードする。別の実施形態では上記のコンストラクトの発現はｈｌｙプロモーターによって引き起こされる。
【０１５２】
別の実施形態では前記核酸配列は少なくとも１つの第１ネオエピトープと少なくとも１つの第２ネオエピトープとの間に組み込まれている１つ以上のリンカー配列を含む。別の実施形態では前記核酸配列は少なくとも１つの第１ネオエピトープと少なくとも１つの第２ネオエピトープと少なくとも１つの第３エピトープとの間に組み込まれている少なくとも２つの異なるリンカー配列を含む。別の実施形態では１つ以上のリンカーは配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、および配列番号８６で表されるヌクレオチド配列を含む群より選択される４×グリシンリンカーである。
【０１５３】
別の実施形態では前記核酸配列は前記のコードされるペプチドに融合しているタグをコードする少なくとも１つの配列を含む。別の実施形態ではそのタグは配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
別の実施形態では前記１つ以上のネオエピトープはそれぞれ約８個〜２７個の間のアミノ酸を含む。あるいは、前記１つ以上のネオエピトープはそれぞれ約５個〜５０個の間のアミノ酸を含む。別の実施形態では前記１つ以上のネオエピトープはそれぞれ約２１個のアミノ酸を含む。
【０１５５】
別の実施形態では前記疾患担持組織または細胞のエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて前記ネオエピトープが決定される。
【０１５６】
別の実施形態では前記ネオエピトープはマッチする生体試料アミノ酸配列と比較して選択されたアミノ酸突然変異をコードする核酸配列とそのＮ末端側に隣接する約１０アミノ酸とそのＣ末端側の約１０アミノ酸を含む。
【０１５７】
別の実施形態では１つ以上のネオエピトープ、前記免疫原性エピトープを含むペプチド、またはそれらの両方が親水性である。
【０１５８】
別の実施形態では１つ以上のネオエピトープ、前記免疫原性エピトープを含むペプチド、またはそれらの両方がカイト・ドゥーリトル・プロット上で最大でも１．６である。
【０１５９】
別の実施形態では免疫抑制性エピトープについて１つ以上のネオエピトープがスクリーニングされ、免疫抑制性エピトープが前記核酸分子から除外される。
【０１６０】
別の実施形態では１つ以上のネオエピトープが前記リステリア株に応じて発現および分泌に関してコドンを最適化される。
【０１６１】
１つの実施形態ではネオエピトープ、治療用ポリペプチド、または治療用核酸をコードする前記核酸配列は１つ以上のネオエピトープまたは核酸の発現レベル上昇のために最適化され、別の実施形態では１つ以上のネオエピトープを含む治療用ポリペプチドまたは核酸の発現期間の増加のために最適化され、別の実施形態ではそれらの組合せのために最適化される。加えて、または代わりに、ネオエピトープ、治療用ポリペプチド、または治療用核酸をコードする前記核酸配列は翻訳、分泌、転写、およびそれらのあらゆる組合せのレベル上昇のために最適化される。
【０１６２】
加えて、または代わりに、ネオエピトープ、治療用ポリペプチド、または治療用核酸をコードする前記核酸配列はそのオリゴヌクレオチド配列において形成される可能性がある二次構造の可能性のレベルを低下させるために最適化され、あるいはその配列を修飾し得るあらゆる酵素の結合を防止するために最適化される。
【０１６３】
１つの実施形態では「最適化される」という用語は所望の変化を指し、１つの実施形態ではそれは本発明において記載される１つ以上のネオエピトープを含む人工的遺伝子発現の変化であり、別の実施形態ではそれはタンパク質発現の変化である。１つの実施形態では最適化された遺伝子発現は遺伝子発現の最適化された調節である。別の実施形態では最適化された遺伝子発現は遺伝子発現の増加である。本態様によると、および１つの実施形態では野生型と比較した遺伝子発現の２倍から１０００倍の増加が企図されている。別の実施形態では遺伝子発現の２倍から５００倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の２倍から１００倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の２倍から５０倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の２倍から２０倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の２倍から１０倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の３倍から５倍の増加が企図されている。
【０１６４】
別の実施形態では最適化された遺伝子発現は特定の環境条件下での遺伝子発現の増加であり得る。別の実施形態では最適化された遺伝子発現は遺伝子発現の減少を含んでよく、１つの実施形態ではそれは特定の環境条件下だけでのことであってよい。
【０１６５】
別の実施形態では最適化された人工的遺伝子発現は遺伝子発現期間の増加である。本態様によると、および１つの実施形態では野生型と比較した遺伝子発現期間の２倍から１０００倍の増加が企図されている。別の実施形態では遺伝子発現期間の２倍から５００倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現期間の２倍から１００倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現期間の２倍から５０倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現期間の２倍から２０倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現期間の２倍から１０倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現期間の３倍から５倍の増加が企図されている。別の実施形態ではその遺伝子発現期間の増加は非ベクター発現対照における遺伝子発現に対して比較されるか、あるいは野生型ベクター発現対照における遺伝子発現に対して比較される。
【０１６６】
１つの実施形態では細菌細胞における発現は転写サイレンシング、短いｍＲＮＡ半減期、二次構造形成、抑制因子または阻害因子などのオリゴヌクレオチド結合分子の結合部位、および希少ｔＲＮＡプールの利用可能性によって妨げられる。細菌における  発現の多くの問題の原因は大元の配列内に見出される。ＲＮＡの最適化にはｃｉｓ作用性要素の改変、そのＧＣ含量の適合、その細菌細胞の非限定性ｔＲＮＡプールに関するコドンバイアスの改変、および内部相同性領域の無効化が含まれ得る。
【０１６７】
したがって、１つの実施形態では注意深く設計された合成配列によると半減期が延長した安定的なメッセージ、つまり、宿主細胞内での高レベルのタンパク質産生を期待することができる。
【０１６８】
したがって、１つの実施形態では配列の最適化は宿主遺伝子のコドンバイアス、１つの実施形態ではリステリア・モノサイトゲネス遺伝子のコドンバイアスへのコドン使用頻度の適合、非常に高い（８０％超）または非常に低い（３０％未満）ＧＣ含量を有する領域の調節、次のｃｉｓ作用性配列モチーフ、すなわち内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、およびリボソーム進入部位のうちの１つ以上の回避、ＡＴリッチ配列ストレッチまたはＧＣリッチ配列ストレッチの回避、反復配列およびＲＮＡ二次構造の回避、（潜在的な）スプライシングのドナー部位およびアクセプター部位、分岐部位の回避、またはそれらの組合せを伴う。１つの実施形態では遺伝子がヒト細胞での発現のために最適化される。さらに別の実施形態では発現の最適かは遺伝子の隣接領域および／または発現ベクター内の他の部分への配列要素の付加を伴う。
【０１６９】
１つの実施形態では本発明の製剤および方法は、前記核酸によりコードされる１つ以上のネオエピトープを含む治療用ポリペプチドの発現レベルの上昇、発現期間の増加、またはそれらの組合せのために最適化された核酸を提供する。
【０１７０】
別の実施形態では１つ以上のネオエピトープによりＭＨＣクラスＩＩのエピトープ提示が可能になる。
【０１７１】
別の実施形態では前記リステリア株は１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを発現および分泌する。
【０１７２】
別の実施形態では前記リステリア株は前記対象の感染時に１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを発現および分泌する。
【０１７３】
別の実施形態では前記リステリア株は複数の前記核酸配列分子を含む。
【０１７４】
１つの実施形態では本明細書において開示される融合ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトはプラスミド挿入断片である。別の実施形態ではその挿入断片は前記融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む。別の実施形態では前記融合ポリペプチドは本明細書において開示される１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドに融合した免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む。一実施形態ではこの挿入断片はプラスミド上にあってよく、またはゲノム中に少なくとも部分的に組み込まれてよい。別の実施形態ではその挿入断片はキメラタンパク質をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトとして設計されてよく、そのキメラタンパク質は細菌分泌シグナル配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、および本明細書において提供される１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含む。別の実施形態ではそのシグナル配列、ユビキチン、および１つ以上のペプチドは機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている。
【０１７５】
別の実施形態では前記リステリア株はキメラタンパク質をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクト中の核酸配列を含み、前記キメラタンパク質は  （ａ）細菌分泌シグナル配列、（ｂ）ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、（ｃ）本明細書において提供される１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含み、（ａ）〜（ｃ）のシグナル配列、ユビキチン、および１つ以上のペプチドが機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている。
【０１７６】
別の実施形態では前記核酸分子は前記組換え型リステリア株内の細菌人工染色体中に存在する。
【０１７７】
別の実施形態では前記核酸分子は前記組換え型リステリアワクチン株内のプラスミドの中に存在する。
【０１７８】
別の実施形態ではそのプラスミドは組込み型プラスミドである。
【０１７９】
別の実施形態ではそのプラスミドは染色体外マルチコピープラスミドである。
【０１８０】
別の実施形態ではそのプラスミドは抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において安定的に維持される。
【０１８１】
別の実施形態ではそのプラスミドは前記リステリア株に対して抗生物質耐性を付与しない。
【０１８２】
別の実施形態では前記１つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している。例えば、それらの１つ以上のペプチドの各々が異なる免疫原性ポリペプチドまたはそれらの断片に融合していてよく、またはそれらの１つ以上のペプチドの組合せが免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合していてよい（例えば、免疫原性ポリペプチドが第１ネオエピトープに連結されており、それが第２ネオエピトープに連結されており、それが第３ネオエピトープに連結されている等々）。
【０１８３】
別の実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含むそれらの１つ以上のペプチドが免疫原性ポリペプチドまたはその断片に同時に融合している。
【０１８４】
別の実施形態ではその免疫原性ポリペプチドは変異型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、ＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２融合体、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である。
【０１８５】
別の実施形態ではそのＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２融合タンパク質は配列番号１６で表される。
【０１８６】
別の実施形態ではそのｔＬＬＯタンパク質は配列番号３で表される。
【０１８７】
別の実施形態ではそのａｃｔＡは配列番号１２〜１３および配列番号１５〜１８で表される。
【０１８８】
別の実施形態ではそのＰＥＳＴアミノ酸配列は配列番号５〜１０で表される配列から選択される。
【０１８９】
別の実施形態ではその変異型ＬＬＯはコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を含む。
【０１９０】
別の実施形態ではその突然変異は配列番号２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、またはＷ４９２の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１９１】
別の実施形態ではその突然変異は配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドによる置換を含み、その非ＬＬＯペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む。
【０１９２】
別の実施形態ではその突然変異は配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の欠失を含む。
【０１９３】
別の実施形態では前記１つ以上のペプチドは前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原を含む。別の実施形態ではその異種抗原または自己抗原は腫瘍関連抗原またはその断片である。
【０１９４】
別の実施形態では前記ネオエピトープまたはその断片はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、キメラＨｅｒ２抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、二価ＰＳＡ、ＥＲＧ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＰＡＫ６、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原Ｅ（ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、インターロイキン１３受容体α（ＩＬ１３−Ｒ  α）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、血管新生抗原、ｒａｓタンパク質、ｐ５３タンパク質、ｐ９７黒色腫抗原、ＫＬＨ抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１抗原、ＴＲＰ−２、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはテスティシンを含む。
【０１９５】
別の実施形態ではその腫瘍または癌は乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺性腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む。
【０１９６】
別の実施形態ではその腫瘍または癌はその腫瘍または癌の転移癌を含む。
【０１９７】
別の実施形態では前記疾患または症状は感染症、自己免疫疾患、または、腫瘍もしくは癌である。
【０１９８】
別の実施形態では前記感染症はウイルス感染症または細菌感染症を含む。
【０１９９】
別の実施形態では１つ以上のネオエピトープは感染症関連特異的エピトープを含む。
【０２００】
別の実施形態ではその感染症は感染性ウイルス病である。
【０２０１】
別の実施形態ではその感染症は感染性細菌病である。
【０２０２】
別の実施形態ではその感染症は以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる。
【０２０３】
別の実施形態では前記弱毒化リステリアは１つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む。
【０２０４】
別の実施形態ではその内在性遺伝子突然変異はａｃｔＡ遺伝子突然変異、ｐｒｆＡ突然変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重突然変異、ｄａｌ／ｄａｌ遺伝子二重突然変異、またはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される。
【０２０５】
別の実施形態ではその突然変異は前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む。
【０２０６】
別の実施形態では前記ベクターは代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレーム、または代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第２核酸配列をさらに備える。
【０２０７】
別の実施形態ではそのオープン・リーディング・フレームによってコードされる代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
【０２０８】
別の実施形態では前記リステリアはリステリア・モノサイトゲネスである。
【０２０９】
別の実施形態では前記リステリア株は１つ以上の免疫調節性分子をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトをさらに備える。
【０２１０】
別の実施形態ではその免疫調節性分子はインターフェロンγ、サイトカイン、ケモカイン、Ｔ細胞刺激因子、およびそれらのあらゆる組合せを含む群より選択され、前記分子が前記リステリア株から発現および分泌される。
【０２１１】
１つの実施形態では本明細書において開示される個別免疫療法組成物は本明細書において開示される１つ以上の送達ベクターを含む。１つの実施形態では本明細書において開示される個別免疫療法組成物は上記のいずれかにおいて開示される１つ以上のリステリア株を含む。別の実施形態では個別免疫療法組成物は１つ以上のネオエピトープをそれぞれ発現する１〜２種類、１〜５種類、１〜１０種類、１〜２０種類、または１〜４０種類の組換え送達ベクターの混合物を含む。別の実施形態ではその混合物は１〜５種類、５〜１０種類、１０〜１５種類、１５〜２０種類、１０〜２０種類、２０〜３０種類、３０〜４０種類、または４０〜５０種類の送達ベクターを含む。別の実施形態では個別免疫療法組成物は短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列との融合タンパク質という背景の中で１つ以上のネオエピトープをそれぞれ発現する１〜２種類、１〜５種類、１〜１０種類、１〜２０種類、または１〜４０種類の組換え送達ベクターの混合物を含む。１つの実施形態ではその送達ベクター混合物中に存在する個々の送達ベクターが治療の一部として対象に同時投与される。別の実施形態ではその送達ベクター混合物中に存在する個々の送達ベクターが治療の一部として対象に順次投与される。
【０２１２】
１つの実施形態では、本明細書において開示される方法によって作製される１つ以上の組換え送達ベクターを含む組成物の免疫原性混合物が本明細書において開示される。別の実施形態では前記混合物中の前記送達ベクターの各々が１つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む。別の実施形態では前記混合物中の各送達ベクターは１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、または１００〜２００個のネオエピトープを発現する。別の実施形態では各混合物は１〜５種類、５〜１０種類、１０〜１５種類、１５〜２０種類、１０〜２０種類、２０〜３０種類、３０〜４０種類、または４０〜５０種類の送達ベクターを含む。別の実施形態ではその混合物は異なるセットの１つ以上のネオエピトープをそれぞれ含む複数の送達ベクターを含む。ネオエピトープの第１セットは第２セットが含んでいない１つのネオエピトープを含む場合にその第２セットとは異なり得る。同様に、ネオエピトープの第１セットは第２セットが含んでいるネオエピトープを含んでいない場合にその第２セットとは異なり得る。例えば、ネオエピトープの第１セットと第２セットは同じネオエピトープのうちの１つ以上を含むことができ、それでいてなお異なるセットであり得、または第１セットは同じネオエピトープのうちのいずれかを含んでいないことでネオエピトープの第２セットと異なり得る。
【０２１３】
１つの実施形態では、本明細書において開示される方法により作製された１つ以上の組換え型リステリア株を含む組成物の免疫原性混合物が本明細書において開示される。別の実施形態では前記混合物中の前記リステリアの各々が１つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む。別の実施形態では前記混合物中の各リステリアは１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、または１００〜２００個のネオエピトープを発現する。別の実施形態では各混合物は１〜５株、５〜１０株、１０〜１５株、１５〜２０株、１０〜２０株、２０〜３０株、３０〜４０株、または４０〜５０株の組換え型リステリア株を含む。別の実施形態ではその混合物は異なるセットの１つ以上のネオエピトープをそれぞれ含む複数の組換え型リステリア株を含む。ネオエピトープの第１セットは第２セットが含んでいない１つのネオエピトープを含む場合にその第２セットとは異なり得る。同様に、ネオエピトープの第１セットは第２セットが含んでいるネオエピトープを含んでいない場合にその第２セットとは異なり得る。例えば、ネオエピトープの第１セットと第２セットは同じネオエピトープのうちの１つ以上を含むことができ、それでいてなお異なるセットであり得、または第１セットは同じネオエピトープのうちのいずれかを含んでいないことでネオエピトープの第２セットと異なり得る。
【０２１４】
１つの実施形態では、対象における抗腫瘍応答の誘発方法であって、本明細書において開示される免疫原性混合物組成物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法が本明細書において開示される。別の実施形態では対象において腫瘍を予防または治療する方法であって、本明細書において開示される組成物の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法が本明細書において開示される。１つの実施形態では前記組成物混合物から選択される少なくとも１つの組換え型リステリア株を含む組成物は前記組成物混合物から選択される少なくとも別の組換え型リステリア株と同時に（すなわち、同じ医薬として）投与されてよく、並行して（すなわち、あらゆる順序で次々に投与される別個の医薬として）投与されてよく、またはあらゆる順序で順次投与されてよい。順次投与は本明細書において開示される組換え型リステリア株を含む原薬が異なる剤形である（１つの薬剤が錠剤またはカプセル剤であり、別の薬剤が滅菌液剤である）とき、および／または異なる投与スケジュールで投与されるとき、例えば、１つのリステリア株を含む前記組成物混合物の１つの組成物が少なくとも毎日投与され、別の組成物が週に一回、２週に一回、または３週に一回など、より低い頻度で投与されるときに特に有用である。
【０２１５】
別の実施形態ではその個別免疫療法組成物により１つ以上のネオエピトープを標的とする免疫応答が誘発される。
【０２１６】
別の実施形態では前記組成物は、各株が少なくとも１つの特有の前記ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む前記核酸コンストラクトを備える複数の前記リステリア株の混合物を含む。
【０２１７】
別の実施形態では前記組成物は前記リステリア株の混合物を含み、前記混合物は複数の前記ネオエピトープを含む。
【０２１８】
当業者は「複数」という用語は１より上の整数を包含し得ることを理解する。１つの実施形態ではその用語は１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００の範囲を指す。
【０２１９】
別の実施形態では前記混合物は最大で約３００個のネオエピトープを含む。
【０２２０】
別の実施形態では前記混合物は約１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、または１００〜２００個の範囲のネオエピトープを含む。
【０２２１】
１つの実施形態では前記混合物はベクター当たり約８〜２７個の範囲のエピトープを含む。別の実施形態では前記混合物はベクター当たり約２１個のエピトープの範囲を含む。別の実施形態では前記混合物はベクター当たり約１〜５個、１〜１０個、１〜２０個、１〜３０個、１〜５０個、１〜６０個、１〜７０個、１〜８０個、１〜９０個、１〜１００個、１〜１１０個、１〜１５０個、１〜２００個、１〜２５０個、１〜３００個、または１〜５００個の範囲エピトープを含む。
【０２２２】
１つの実施形態では全てのエピトープがネオエピトープである。別の実施形態ではベクター当たり少なくとも１つのエピトープがネオエピトープである。
【０２２３】
１つの実施形態ではネオエピトープの発現と分泌の効率を決定するために送達ベクター内の突然変異数に対するコンストラクトの数が決定される。別の実施形態ではベクター当たり約５０個のエピトープから開始して一連の直鎖状ネオエピトープが検査される。別の実施形態ではベクター当たり約１〜５個、５〜１０個、１０〜２０個、２０〜５０個、５０〜７０個、７０〜９０個、９０〜１１０個、１１０〜１５０個、１５０〜２００個、２００〜２５０個、３００〜３５０個、または４００〜５００個のエピトープから開始して一連の直鎖状ネオエピトープが検査される。１つの実施形態ではベクター当たり少なくとも１つのネオエピトープがコンストラクトに含まれる。
【０２２４】
１つの実施形態では使用されるベクターの数は単一のベクターに由来する複数のエピトープの翻訳と分泌の効率および特定のネオエピトープを保持する各Ｌｍベクターに必要とされる感染多重度（ＭＯＩ）を考慮して、またはネオエピトープ数を参照して決定される。
【０２２５】
１つの実施形態では使用されるベクター（例えばリステリアベクター）の数は、循環腫瘍細胞に見出される公知の腫瘍関連突然変異、公知の癌「ドライバー」突然変異、および／または公知の化学療法耐性突然変異からなる所定の群を考慮に入れ、２１アミノ酸配列ペプチドの選択においてこれらを優先することにより決定される（実施例３０参照）。別の実施形態ではこの決定は、特定された変異遺伝子をＣＯＳＭＩＣ（癌体細胞突然変異カタログ、ｃａｎｃｅｒ．Ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）またはキャンサーゲノムアナリシスまたは他の類似の癌関連遺伝子データベースに対してスクリーニングすることにより行われ得る。さらに、および別の実施形態では免疫抑制性エピトープ（Ｔｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導性Ｔヘルパーエピトープ、等）のスクリーニングを利用して脱選択する、またはベクターに対する免疫抑制的影響を回避する。別の実施形態では選択されるコドンは特定の送達ベクター（例えばリステリア株）に応じて効率的な翻訳および分泌について最適化されたコドンである。当技術分野において知られているＬ．モノサイトゲネスについて最適化されたコドンの例は本明細書中の表８に提示されている。
【０２２６】
別の実施形態では前記混合物は少なくとも2つの異なるネオエピトープアミノ酸配列を含む。
【０２２７】
別の実施形態では前記混合物は約１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、または９０〜１００個の範囲のネオエピトープを含む。
【０２２８】
別の実施形態では前記混合物は約５０〜１００個の範囲のネオエピトープを含む。
【０２２９】
別の実施形態では前記混合物は最大で約１００個のネオエピトープを含む。
【０２３０】
別の実施形態では前記混合物は約１００個より多くのネオエピトープを含む。
【０２３１】
別の実施形態では前記混合物は最大で約１０個のネオエピトープを含む。
【０２３２】
別の実施形態では前記混合物は最大で約２０個のネオエピトープを含む。
【０２３３】
別の実施形態では前記混合物は最大で約５０個のネオエピトープを含む。
【０２３４】
別の実施形態では前記混合物は約２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個のネオエピトープを含む。
【０２３５】
別の実施形態では前記混合物は約５〜１５個、５〜２０個、５〜２５個、１５〜２０個、１５〜２５個、１５〜３０個、１５〜３５個、２０〜２５個、２０〜３５個、２０〜４５個、３０〜４５個、３０〜５５個、４０〜５５個、４０〜６５個、５０〜６５個、５０〜７５個、６０〜７５個、６０〜８５個、７０〜８５個、７０〜９５個、８０〜９５個、８０〜１０５個、または９５〜１０５個の範囲のネオエピトープを含む。
【０２３６】
別の実施形態では前記混合物は約５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、または１００個のネオエピトープを含む。
【０２３７】
別の実施形態では前記混合物は１つ以上の１つ以上の免疫調節性分子をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備える１つ以上の組換え型弱毒化リステリア株送達ベクターをさらに含む。
【０２３８】
別の実施形態ではその免疫調節性分子はインターフェロンγ、サイトカイン、ケモカイン、Ｔ細胞刺激因子、およびそれらのあらゆる組合せを含む群より選択され、前記分子が前記リステリア株から発現および分泌される。
【０２３９】
別の実施形態では前記混合物は、１つ以上のエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備える１つ以上の組換え型弱毒化リステリア株送達ベクターをさらに含み、前記エピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含み、前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした免疫療法が発生する。
【０２４０】
別の実施形態では上記のいずれかにおいて開示される組成物はアジュバントをさらに含む。
【０２４１】
別の実施形態ではそのアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピッドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。
【０２４２】
別の実施形態では前記対象への前記組成物の投与により前記対象における個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる。
【０２４３】
別の実施形態ではその免疫応答は抗癌応答または抗腫瘍応答を含む。
【０２４４】
別の実施形態ではその免疫応答は抗感染症応答を含む。
【０２４５】
別の実施形態では前記感染症はウイルス感染症を含む。
【０２４６】
別の実施形態では前記感染症は細菌感染症を含む。
【０２４７】
別の実施形態ではその個別免疫療法により前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が増加する。
【０２４８】
別の実施形態ではその個別免疫療法は前記疾患または症状を有する前記対象における腫瘍サイズまたは転移癌サイズを減少させる。
【０２４９】
別の実施形態ではその個別免疫療法は前記疾患または症状を有する前記対象において転移癌を予防する。
【０２５０】
本発明の別の実施形態ではＤＮＡ免疫療法は上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物を含む。
【０２５１】
本発明の別の実施形態ではペプチド免疫療法は上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物を含む。
【０２５２】
別の実施形態ではその免疫療法はアジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組合せをさらに含む。
【０２５３】
本発明の別の実施形態では本発明の医薬組成物は上記のいずれかにおいて開示される免疫療法または個別免疫療法組成物と医薬担体を含む。
【０２５４】
本発明の別の実施形態では前記疾患または症状を有する対象の疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する少なくとも１つのネオエピトープに対する免疫応答の誘導方法は、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
【０２５５】
本発明の関連の態様では疾患または症状を有する対象における標的とされる免疫応答の誘導方法は上記のいずれかにおいて開示される免疫原性組成物または免疫療法を前記対象に投与することを含み、前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした個別免疫療法が発生する。
【０２５６】
本発明の別の実施形態では対象において疾患または症状を治療、抑止、または抑制する方法は、前記疾患または症状を標的とするために上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を投与するステップを含む。
【０２５７】
本発明の別の実施形態によると前記組成物または免疫療法を経口投与または非経口投与するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
【０２５８】
別の実施形態では非経口投与は静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む。
【０２５９】
さらに別の実施形態では前記疾患または症状は感染症、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、腫瘍、または癌である。
【０２６０】
別の実施形態ではその腫瘍または癌は乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺性腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む。
【０２６１】
別の実施形態では前記感染症はウイルス感染症または細菌感染症を含む。
【０２６２】
別の実施形態ではその感染症は以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる。
【０２６３】
本発明の別の実施形態では、対象の脾臓および腫瘍内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比率であって、対象の疾患または症状を担持する組織内に存在するネオエピトープを標的としている前記Ｔエフェクター細胞の比率を上げる方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０２６４】
本発明の別の実施形態では、抗原またはそのペプチド断片が１つ以上のネオエピトープを含む、その抗原に特異的なＴ細胞を対象において増加させるための方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０２６５】
本発明の別の実施形態では、腫瘍を有するか、または癌を患う対象、または感染症を患う対象の生存時間の増加方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０２６６】
本発明の別の実施形態では、対象の癌からの予防方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０２６７】
本発明の別の実施形態では、対象における癌発症の抑制または遅延化方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０２６８】
本発明の別の実施形態では、対象における腫瘍サイズまたは転移癌サイズの減少方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０２６９】
本発明の別の実施形態によるとその腫瘍または癌は乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺性腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む。
【０２７０】
本発明の別の実施形態では、対象の感染症からの予防方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０２７１】
本発明の別の実施形態では前記感染症はウイルス感染症または細菌感染症を含む。
【０２７２】
本発明の別の実施形態ではその感染症は以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる。
【０２７３】
別の実施形態では前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答が生じる。
【０２７４】
本発明の別の実施形態によると、上記の方法であって、前記個別免疫療法組成物を作製するステップを追加として含み、前記作製が、
(a)  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b)  （ａ）において特定された１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答の生成を生じさせるステップ、所望により、
(c)  前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である１つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d)  （ｃ）において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e)  １つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第２弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するためにその第２弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいはその第２弱毒化組換え型リステリア株を含む第２組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が開示される。
【０２７５】
１つの実施形態では前記１つ以上のネオエピトープは複数のネオエピトープを含む。所望により、ステップ（ｂ）はステップ（ｂ）の前記核酸配列内の前記複数のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドの順序のランダム化を１回以上繰り返すことをさらに含んでもよい。そのようなランダム化は、例えば、複数のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドのセット全体の順序のランダム化を含むことができ、または複数のネオエピトープの部分セットを含む１つ以上のペプチドの部分セットの順序のランダム化を含むことができる。例えば、前記核酸配列が２０個のネオエピトープを含む（１番〜２０番まで番号を付けられた）２０個のペプチドを含む場合、ランダム化は２０個全てのペプチドの順序のランダム化を含むことができ、またはそれらのペプチドの部分セット（例えば、ペプチド１〜５またはペプチド６〜１０）だけの順序のランダム化を含むことができる。そのような順序のランダム化はそれらのネオエピトープの分泌および提示、ならびにそれぞれ個々の領域の分泌および提示を容易にし得る。
【０２７６】
別の実施形態では疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較するステップは、スクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦを前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用をさらに含み、前記関連デジタルソフトウェアは、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列内の前記ＯＲＦ中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む。
【０２７７】
本発明の別の実施形態では上記のいずれかにおいて開示される方法は、１つ以上のネオエピトープ、１つ以上のネオエピトープを含むペプチド、またはそれらの両方を疎水性および親水性についてスクリーニングするステップを追加的に含む。
【０２７８】
本発明の別の実施形態によると親水性である１つ以上のネオエピトープ、１つ以上のネオエピトープを含むペプチド、またはそれらの両方を選択するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
【０２７９】
本発明の別の実施形態によるとカイト・ドゥーリトル・プロットにおいて最大で１．６である１つ以上のネオエピトープ、１つ以上のネオエピトープを含むペプチド、またはそれらの両方を選択するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
【０２８０】
本発明の別の実施形態によると特定のリステリア株に応じて発現および分泌について１つ以上のネオエピトープまたは１つ以上のネオエピトープを含むペプチドのコドンを最適化するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
【０２８１】
本発明の別の実施形態によると免疫抑制性エピトープ向けの１つ以上のネオエピトープをスクリーニングするステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
【０２８２】
本発明の別の実施形態によると前記生体試料は組織、細胞、血液、または血清である。
【０２８３】
本発明の別の実施形態によると前記疾患または症状を有する前記対象より疾患担持生体試料を獲得するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
【０２８４】
別の実施形態によると本明細書において開示される本発明は、前記疾患または症状を有する前記対象より健常生体試料を獲得するステップを追加的に含む。
【０２８５】
別の実施形態によると前記対象から第２生体試料を獲得するステップは、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む第２組成物の投与の後に増殖するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む生体試料を獲得することを含む。
【０２８６】
本発明の別の実施形態によると  （ａ）前記疾患に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および（ｂ）前記Ｔ細胞上のＴ細胞受容体が結合する特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
【０２８７】
別の実施形態では前記スクリーニングおよび特定ステップはＴ細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む。
【０２８８】
別の実施形態ではそのシーケンシングは関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む。
【０２８９】
本発明の別の実施形態によるとエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて前記核酸配列のシーケンシングを決定するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
【０２９０】
１つの実施形態では本明細書において開示される融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質は本明細書において開示される組換え型リステリアによって発現および分泌される。別の実施形態では本明細書において開示されるその融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質はＣ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグを含む。別の実施形態では本明細書において開示されるその融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質は本明細書において開示される組換え型リステリアによって発現および分泌される。別の実施形態ではポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグに特異的に結合するタンパク質、分子、または抗体（またはその断片）を使用して本明細書において開示される抗原またはポリペプチド（融合またはキメラ）の分泌が検出される。別の実施形態では本明細書において開示されるその融合ポリペプチド、またはキメラタンパク質は本明細書において開示される組換え型リステリアによって発現および分泌される。別の実施形態ではＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグに結合する抗体、タンパク質、または分子を使用して本明細書において開示される抗原またはポリペプチド（融合またはキメラ）の分泌が検出される。別の実施形態では本明細書において開示されるキメラタンパク質の融合ポリペプチドは、限定されないが、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）およびポリ（ＮＡＮＰ）をはじめとする当技術分野において知られている他のあらゆるタグを含む。
【０２９１】
１つの実施形態では各ネオエピトープはリンカー配列によって同じベクター上にコードされる後続のネオエピトープに接続される。１つの実施形態ではそのリンカーは４×グリシンＤＮＡ配列である。当業者は、本明細書において開示される方法および組成物に当技術分野において知られている他のリンカー配列を使用することができることを理解する（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＲｅｄｄｙ  Ｃｈｉｃｈｉｌｉ，  Ｖ．  Ｐ．，  Ｋｕｍａｒ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｓｉｖａｒａｍａｎ，  Ｊ．  （２０１３），  Ｌｉｎｋｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２：  １５３−１６７を参照されたい）。さらに別の実施形態では前記リンカーは配列番号  １〜１１、それに応じて配列番号７６〜８６、およびそれらのあらゆる組合せを含む群より選択される。
【０２９２】
１つの実施形態では挿入断片中の最後のネオエピトープはタグ配列とそれに続く終止コドンに融合している。当業者は、例えばＬｍベクターからの分泌時に、または特定のＴ細胞への親和性、または抗原提示細胞による提示についてコンストラクトを検査するときにタグによって融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質の簡単な検出が可能なり得ることを理解する。
【０２９３】
１つの実施形態では様々なＨＬＡ  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）リーディングフレームのうちの少なくとも幾つかを提供するために検出された突然変異の両側に約１０個の隣接アミノ酸を組み込んでクラス１ＭＨＣ−１提示を提供する。
【０２９４】
本明細書中の表７は、各突然変異がアミノ酸を表す太字の文字によって表示されており、各突然変異の両側に１０アミノ酸が隣接して２１アミノ酸ペプチドネオエピトープを提供している５０個のネオエピトープペプチドの試料リストを示している。１つの実施形態では、単一のプラスミド中に適合し得るものよりも使用しやすい２１アミノ酸ペプチドが存在する場合、異なる２１アミノ酸ペプチドを必要に応じて／要望に応じて優先順位によって第１コンストラクト、第２コンストラクト等と呼ぶ。別の実施形態では所望のネオエピトープのセット全体を含む複数のベクターのうちの１つに対する優先度の割り当てが、相対的サイズ、転写優先度、および／または翻訳されたポリペプチドの全体的疎水性のような因子に基づいて決定される。
【０２９５】
１つの実施形態では反復度を最小限にするためにネオエピトープ間に異なるリンカー配列が配置される。別の実施形態ではネオエピトープ間に異なるリンカー配列を配置することにより二次構造が低減され、それによりＬｍ組換えベクター株集団内の挿入断片を含むプラスミドの効率的な転写、翻訳、分泌、維持、または安定化が可能になる。
【０２９６】
１つの実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
a.  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
b.  （ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップ、所望により、
c.  前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である前記１つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
d.  （ｃ）において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
e.  前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第２弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記第２弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記第２弱毒化組換え型リステリア株を含む第２組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が本明細書において開示される。
【０２９７】
１つの実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
（ａ）  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の前記１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
（ｂ）  （ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、または（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してＤＮＡ免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記ＤＮＡ免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、
（ｃ）  前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
（ｄ）  （ｃ）において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
（ｅ）  （ｃ）において特定された前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第２ベクターを形質転換するか、または前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してＤＮＡ免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記ＤＮＡ免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が本明細書において開示される。
【０２９８】
１つの実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
a.  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
b.  （ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換し、または（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のＯＲＦを含む前記核酸配列を使用してＤＮＡ免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記ＤＮＡ免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、
c.  Ｔ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞または血液または組織標本を含む前記対象の第２生体試料であって、潜在的なネオエピトープペプチドに対する応答の特定および選択をＴ細胞免疫応答の増加または変化に基づいて可能にする前記第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドとの反応により、またはＴ細胞受容体特異性についてのＰＣＲベースのディープシーケンシングおよびネオエピトープと関連する増加したＴ細胞応答の評価により特徴分析するステップ、
d.  （ｃ）において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
e.  （ｃ）において特定された前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列で第２ベクターを形質転換するか、または前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してＤＮＡ免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記ＤＮＡ免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が本明細書において開示される。
【０２９９】
別の実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を提供するための系であって、次の構成要素、すなわち、
g.  前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される疾患担持生体試料、
h.  前記疾患または症状を有する前記対象、または別の健常ヒト対象より獲得される健常生体試料、
i.  前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記核酸配列によりコードされる前記ＯＲＦ中の突然変異であって、１つ以上のネオエピトープを構成する前記突然変異を特定するためのスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールと関連のデジタルソフトウェアであって、
i.  Ｔ細胞エピトープまたは免疫原性またはそれらのあらゆる組合せの特定のために前記ＯＲＦ中の前記突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む関連デジタルソフトウェア、
j.  前記疾患担持試料に由来する前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸をクローニングし、且つ、発現させるための核酸クローニングおよび発現キット、
k.  Ｔ細胞の免疫原性および／または１つ以上のネオエピトープを含む候補ペプチドの結合を検査するための免疫原性アッセイ、
l.  核酸配列、ペプチド  アミノ酸配列、および  Ｔ細胞  受容体  アミノ酸配列をシーケンシングし、分析するための分析装置および関連のソフトウェア、
m.  ステップ（ｅ）の１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記特定済み免疫原性ペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターで形質転換するための弱毒化リステリア送達ベクターであって、
i.  一度形質転換されると前記リステリアが保存されるか、または免疫原性組成物の一部として（ａ）の前記ヒト対象に投与される前記弱毒化リステリア送達ベクター、または
n.  送達ベクター、および所望により  
o.  前記送達ベクターを形質転換するためのベクターであって、１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記ベクターを含む前記系が提供される。
【０３００】
別の実施形態では前記１つ以上のペプチドは前記核酸配列中の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）によってコードされる。
【０３０１】
別の実施形態では疾患は感染症、または腫瘍もしくは癌である。
【０３０２】
別の実施形態では前記送達ベクターは細菌性送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはウイルスベクター送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはペプチド免疫療法送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはＤＮＡ免疫療法送達ベクターを含む。
【０３０３】
１つの実施形態では個別免疫療法を作成するための方法であって、
a.  前記疾患または症状を有する対象より疾患担持生体試料を獲得するステップ、
b.  前記疾患担持試料より核酸を抽出するステップ、
c.  ステップ（ａ）の前記対象または同じ種の異なる個体より健常生体試料を獲得するステップ、
d.  前記健常試料より核酸を抽出するステップ、
e.  ステップ（ｂ）とステップ（ｄ）の抽出された核酸をシーケンシングするステップ、
f.    前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記ＯＲＦであって、１つ以上のネオエピトープを含むペプチドをコードする前記ＯＲＦ内の変異核酸配列を特定するステップ、
g.  前記疾患担持試料の前記ＯＲＦであって、１つ以上のネオエピトープを含むペプチドをコードする前記ＯＲＦ内の変異配列を特定するステップであって、
a.  限定されないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シーケンシング、またはホールエクソームシーケンシングを含む当技術分野においてよく知られている方法を用いて前記ネオエピトープが特定される前記ステップ、
h.  前記特定済み変異核酸配列を含む前記１つ以上のペプチドを発現させるステップ、
i.  免疫原性Ｔ細胞応答の存在がＴ細胞エピトープを含む１つ以上のネオエピトープの存在と相関する、その免疫原性Ｔ細胞応答について前記１つ以上のネオエピトープを含む各ペプチドをスクリーニングするステップ、
j.  Ｔ細胞エピトープである１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上の免疫原性ペプチドをコードする核酸配列を特定および選択し、前記配列を備えるプラスミドベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、
k.  前記１つ以上の免疫原性ペプチドの発現と分泌を確認するために前記弱毒化リステリア株を培養し、その特徴を分析するステップ、および
l.  所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化リステリアを保存するか、または免疫原性組成物の一部として投与される前記弱毒化リステリア株を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０３０４】
別の実施形態では前記対象より第２生体試料を獲得する工程は、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む前記第２組成物の投与の後に増殖するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む生体試料を獲得することを含む。
【０３０５】
別の実施形態では前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析する工程は、
a.    前記疾患に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、
b.  前記Ｔ細胞上のＴ細胞受容体が結合する特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む。
【０３０６】
別の実施形態では特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップは、前記Ｔ細胞を前記１つ以上のペプチドと接触させることを含む。別の実施形態では前記スクリーニングおよび特定ステップは、Ｔ細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを実施してペプチド特異性を決定することを含む。当業者は、Ｔ細胞受容体に結合するペプチドを決定する方法が当技術分野においてよく知られていることを充分に理解する。
【０３０７】
１つの実施形態では本明細書において提供される個別免疫療法を作成する系または方法における比較ステップは、スクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記ＯＲＦであって、１つ以上のネオエピトープを含むペプチドをコードする、またはそれらのペプチド内に構成される前記ＯＲＦ内の変異核酸配列を特定するための関連デジタルソフトウェアの使用を含む。別の実施形態ではその関連デジタルソフトウェアは、Ｔ細胞エピトープまたは免疫原性またはそれらのあらゆる組合せの特定のために前記ＯＲＦ内の前記疾患担持核酸配列のスクリーニング、または１つ以上のネオエピトープを含む前記ペプチドをコードするデジタル式で翻訳された対応するアミノ酸配列のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む。
【０３０８】
１つの実施形態では、提供される個別免疫療法を作成するための前記系または方法における免疫原性Ｔ細胞応答のスクリーニングステップは、例えばＴ細胞増殖アッセイ、前記ネオエピトープで活性化されたＴ細胞を使用し、且つ、腫瘍細胞と共培養され、５１Ｃｒ放出アッセイまたは３Ｈチミジンアッセイを用いる腫瘍退行アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ、およびＦＡＣＳ分析をはじめとする当技術分野においてよく知られている免疫応答アッセイの使用を含む。（例えば、全体が本明細書に援用される米国特許第８７７１７０２号明細書を参照されたい）。
【０３０９】
別の実施形態では前記細菌性配列はリステリア配列であり、幾つかの実施形態では前記リステリア配列はｈｌｙシグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列である。
【０３１０】
別の実施形態では前記疾患は局所性疾患である。別の実施形態では前記疾患は腫瘍または癌である。別の実施形態ではその腫瘍または癌は固形腫瘍または固形癌である。別の実施形態ではその腫瘍または癌は液性腫瘍または液性癌である。別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は腫瘍、または癌、またはそれらの一部分を含む。
【０３１１】
１つの実施形態では前記疾患は感染症である。別の実施形態ではその感染症は感染性ウイルス病または感染性細菌病である。別の実施形態では本明細書において提供される前記方法により特定されるネオエピトープは感染症関連特異的エピトープである。
【０３１２】
別の実施形態ではネオエピトープは特有の腫瘍または癌ネオエピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは免疫原性である。別の実施形態ではネオエピトープはＴ細胞によって認識される。別の実施形態では１つ以上のネオエピトープを含むペプチドは、腫瘍または癌に対するＴ細胞応答であって、前記対象に対して個別化されている前記応答を活性化する。
【０３１３】
別の実施形態ではネオエピトープは特有の腫瘍または癌ネオエピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは感染症に関連する特有のエピトープを含む。１つの実施形態ではその感染症エピトープは前記疾患と直接的に相関する。交互の実施形態ではその感染症エピトープは前記感染症と関連する。
【０３１４】
別の実施形態では本明細書において提供される前記方法によりが疾患を有する前記対象における個別化増強抗疾患免疫応答、すなわち、抗感染症免疫応答、または抗感染症免疫応答、または抗腫瘍免疫応答の生成可能になる。別の実施形態では本明細書において提供される前記方法により対象における前記疾患、すなわち、前記感染または感染症、または前記腫瘍もしくは癌の個別化治療または予防が可能になる。別の実施形態では本明細書において提供される前記方法により前記疾患、すなわち、前記感染または感染症、または前記腫瘍もしくは癌を有する前記対象の生存時間が増加する。
【０３１５】
１つの実施形態では本発明は本明細書において提供される組換え型リステリア株と薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では１つ以上の異なるネオエピトープを含む１つ以上の異なるペプチドをそれぞれ発現する１つ以上の組換え型リステリア株を含む１つ以上の免疫原性組成物が本明細書において提供される。別の実施形態では各リステリアは一連のネオエピトープを発現する。別の実施形態では各ペプチドはＴ細胞エピトープである１つ以上のネオエピトープを含む。１つの実施形態では対象において標的とされる個別化抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法であって、本明細書において提供される組換え型リステリア株であって、１つ以上のネオエピトープを含む前記リステリア株を含む免疫原性組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。別の実施形態ではリステリア株は次のもののうちの１つ、すなわち、癌疾患に関連する１つ以上のネオエピトープを含むペプチドに融合している免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子、またはキメラタンパク質をコードする第１オープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質がリステリア分泌シグナル配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、および腫瘍または癌に関連する１つ以上のネオエピトープをそれぞれ含む１つ以上のペプチドを含み、前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記１つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配置されているか、または機能的であるように連結されている前記核酸コンストラクトを含む。
【０３１６】
別の実施形態では前記融合ペプチドはＨＩＳタグまたはＳＩＩＮＦＥＫＬタグにさらに連結されている。別の実施形態ではそのタグ配列はＣ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬおよび６Ｈｉｓアミノ酸を含む。別の実施形態ではそのタグ配列はネオエピトープの簡単な検出を可能にするアミノ酸配列または核酸配列である。別の実施形態ではそのタグ配列は本明細書において開示されるネオエピトープの分泌を確認するためのアミノ酸配列または核酸配列である。当業者は、それらのタグの配列が前記プラスミドベクターまたはファージベクター上の融合ペプチド配列に組み込まれる場合があることを理解する。これらのタグが発現し、臨床医がこれらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することにより、分泌されたペプチドの免疫原性を追跡することを可能にする抗原性エピトープが提示される場合がある。そのような免疫応答は、限定されないが、これらのタグに対して特異的なモノクローナル抗体およびＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブをはじめとする多数の試薬を使用してモニターされ得る。
【０３１７】
別の実施形態では本発明の方法は、対象の脾臓および腫瘍内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比率であって、対象の異常組織または非健常組織、例えば腫瘍組織または癌の内部に存在するネオエピトープを標的とする前記Ｔエフェクター細胞の比率を上げることであり、本明細書において提供される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法である。
【０３１８】
別の実施形態では本発明の方法は、対象において抗原特異的Ｔ細胞を増加させるためのものであって、前記抗原またはそのペプチド断片が１つ以上のネオエピトープを含み、本明細書において提供される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法である。
【０３１９】
別の実施形態では本発明の方法は、腫瘍を有するか、または癌を患う対象、または感染症を患う対象の生存時間を増加させるためのものであって、本明細書において提供される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法である。
【０３２０】
別の実施形態では本発明の方法は、対象における腫瘍または癌または感染症または感染症を治療することであって、本明細書において提供される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法である。
Ｉ．免疫療法の個別化
【０３２１】
１つの実施形態では本発明の方法により個別免疫療法が作成される。別の実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法の作成方法は、前記患者の疾患に特異的である変異および異型抗原（新抗原）内のネオエピトープを特定および選択することを含む。別の実施形態では対象向けの個別免疫療法の作成方法は前記対象への治療を提供するためにある。別の実施形態では個別免疫療法は、癌、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、細菌感染症、ウイルス感染症、およびＨＩＶなどの慢性ウイルス病のような疾患を治療するために用いられ得る。
【０３２２】
１つの実施形態では個別免疫療法の作成方法の一ステップは疾患または症状を有する対象より異常生体試料または非健常生体試料を獲得することである。本明細書において使用される場合、「異常生体試料または非健常生体試料」という用語は「疾患担持生体試料」または「疾患担持試料」と互換的に使用され、全て同じ意味と質を有する。１つの実施形態では生体試料は組織、細胞、血液、リンパ球を含む対象から得られるあらゆる試料、疾患担持細胞を含む対象から得られるあらゆる試料、または対象から得られる健常であるが、同じ対象もしくは類似の個体から得られる疾患担持試料にも匹敵するあらゆる試料である。
【０３２３】
１つの実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は腫瘍組織または癌組織またはそれらの一部分を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は固形腫瘍であり得る。別の実施形態では腫瘍または癌は固形腫瘍または固形癌、例えば血液癌または腫瘍が生じない乳癌ではない。
【０３２４】
別の実施形態では腫瘍試料は、腫瘍細胞または癌細胞を含有する患者、または腫瘍細胞または癌細胞を含有することが疑われる患者に由来する生体試料などのあらゆる試料に関する。その生体試料は血液、原発腫瘍から得られる組織試料、または腫瘍転移癌、もしくは腫瘍細胞もしくは癌細胞を含有する他のあらゆる試料から得られる組織試料などのあらゆる組織試料であり得る。さらに別の実施形態では生体試料は血液、唾液に由来する細胞、または脳脊髄液に由来する細胞である。別の実施形態では腫瘍試料は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの１つ以上の単離腫瘍細胞または癌細胞、または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの１つ以上の単離腫瘍細胞もしくは癌細胞を含む試料に関する。別の実施形態では腫瘍または癌は乳癌または乳房腫瘍を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍を含む。別の実施形態では腫瘍または癌はＨｅｒ２含有腫瘍またはＨｅｒ２含有癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は黒色腫の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は膵臓腫瘍または膵臓癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は卵巣腫瘍または卵巣癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は胃腫瘍または胃癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は膵臓の癌病巣を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺性腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は多形神経膠芽腫の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は大腸腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺扁平腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は胃腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は卵巣表面上皮性新生物（例えばその良性、増殖性、または悪性の変種）の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は口腔扁平上皮癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺非小細胞癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は子宮内膜癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は膀胱腫瘍または膀胱癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は頭頚部腫瘍または頭頚部癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は前立腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は胃腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は口腔咽頭腫瘍または口腔咽頭癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺腫瘍または肺癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肛門腫瘍または肛門癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は大腸腫瘍または大腸癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は食道腫瘍または食道癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は中皮腫の腫瘍または癌を含む。
【０３２５】
別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は非腫瘍組織または癌組織を含む。別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は血液試料から単離された細胞、唾液に由来する細胞、または脳脊髄液に由来する細胞を含む。別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は異常または非健常であると考えられるあらゆる組織またはその部分の試料を含む。
【０３２６】
１つの実施形態では、本明細書において提供される前記方法に従って分析のために疾患担持生体試料を獲得することができる感染症をはじめとする他の非腫瘍疾患または非癌疾患が本発明によって包含される。別の実施形態では感染症はウイルス感染症を含む。別の実施形態では感染症は慢性ウイルス感染症を含む。別の実施形態では感染症はＨＩＶなどの慢性ウイルス病を含む。別の実施形態では感染症は細菌感染症を含む。別の実施形態では前記感染症は寄生虫感染症である。
【０３２７】
１つの実施形態ではその感染症は、限定されないが、以下の病原体のうちのいずれか１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、膣トリコモナス、または本明細書において挙げられていない当技術分野において知られている他のいずれかの感染症によって引き起こされる感染症である。
【０３２８】
１つの実施形態では病原性原生動物および蠕虫による感染症にアメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、ニューモシスティス・カリニ、バベシア症、ランブル鞭毛虫症、旋毛虫病、フィラリア症、住血吸虫症、線虫症、吸虫症、または肝蛭症、および条虫（サナダムシ）症が挙げられる。
【０３２９】
別の実施形態では前記感染症は家畜の感染症である。別の実施形態では家畜の疾患は、人間に伝染する可能性があり、「人獣共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態ではこれらの疾患に口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、仮性狂犬病、ブタコレラ（ＣＳＦ）、牛の１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）感染によって生じるＩＢＲ、および豚の仮性狂犬病（オーエスキー病）、トキソプラズマ症、炭疽病、水疱性口内炎ウイルス、ロドコッカス・エクイ、野兎病、ペスト（エルシニア・ペスチス）、トリコモナスが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３３０】
１つの実施形態では、本明細書において提供される前記方法に従って分析のために疾患担持生体試料を獲得することができる自己免疫疾患をはじめとする他の非腫瘍疾患または非癌疾患が本発明によって包含される。当業者は、「自己免疫疾患」という用語が個体自身の組織、器官に対する免疫反応、またはその出現より生じる疾患または症状、またはその結果の状態を指すことを理解する。本明細書において使用される場合、「自己免疫疾患」という用語には診断学において自己組織を指向する抗体が必ずしも癌および他の疾患の状態に関与していないが、それでもなお重要であるその疾患の状態が含まれる。さらに、１つの実施形態ではその用語は、正常身体組織および正常な抗原と反応する抗体に関わるＢ細胞による自己抗体の産生により生じる、またはその自己抗体の産生により悪化する症状を指す。他の実施形態では自己免疫疾患は、自己抗原（例えば核抗原）に由来するエピトープに特異的である自己抗体の分泌を伴う疾患である。
【０３３１】
１つの実施形態では、自己免疫疾患を有する対象を治療しようとする努力の中で本発明は、自己反応性ネオエピトープを特定する系および方法であって、抗体または免疫抑制細胞、例えばＴｒｅｇまたはＭＤＳＣが介在する寛容を誘導するためにこれらの自己反応性ネオエピトープに対して自己免疫疾患を有する対象を免疫する方法を含む前記系または方法を含む。
【０３３２】
１つの実施形態では自己免疫疾患は全身性自己免疫疾患を含む。「全身性自己免疫疾患」という用語は１つより多くの器官に影響する自己免疫反応が原因の疾患、障害、または一群の症状を指す。別の実施形態では全身性自己免疫疾患には抗ＧＢＭ腎炎（グッドパスチャー病）、多発性血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、顕微鏡的多発性血管炎（ＭＰＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性筋炎（ＰＭ）またはセリアック病が含まれるがこれらに限定されない。
【０３３３】
１つの実施形態では自己免疫疾患は結合組織疾患を含む。「結合組織疾患」という用語は身体の結合組織に影響する自己免疫反応が原因の疾患、病気、または一群の症状を指す。別の実施形態では結合組織疾患には全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性筋炎（ＰＭ）、全身性硬化症または混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０３３４】
１つの実施形態では、本明細書において提供される前記方法に従って分析のために疾患担持生体試料を獲得することができる臓器移植拒絶反応をはじめとする他の非腫瘍疾患または非癌疾患が本発明によって包含される。別の実施形態では拒絶される器官は、限定されないが、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、腸、胃、精巣、角膜、皮膚、心臓弁、血管、または骨をはじめとする固形器官である。別の実施形態では拒絶される器官には血液組織、骨髄、またはランゲルハンス島細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【０３３５】
１つの実施形態では、移植された器官の拒絶を有する移植対象、または移植片宿主病（ＧＶｈＤ）を経験している移植対象を治療しようとする努力の中で本発明は、自己反応性ネオエピトープを特定する系および方法であって、抗体または免疫抑制細胞、例えばＴｒｅｇまたはＭＤＳＣが介在する寛容を誘導するためにこれらの自己反応性ネオエピトープに対して自己免疫疾患を有する対象を免疫する方法を含む前記系または方法を含む。
【０３３６】
試料は当技術分野においてよく知られている日常的な生検技法を用いて獲得され得る。生検は医療専門家、例えば病理医による対象からの細胞または組織の摘出を含み得る。多種多様なタイプの生検技法がある。最も一般的なタイプには  （１）組織試料だけが摘出される切開生検、（２）一塊の領域または疑わしい領域が摘出される切除生検、および（３）組織試料または液体試料が針で摘出される針生検が含まれる。太い針を使用するとき、その技法はコア生検と呼ばれる。細い針を使用するとき、その技法は細針生検と呼ばれる。
【０３３７】
１つの実施形態では本発明の試料は切開生検によって獲得される。別の実施形態では試料は切除生検によって獲得される。別の実施形態では試料は針生検を用いて獲得される。別の実施形態では針生検はコア生検である。別の実施形態では生検は細針吸引生検である。別の実施形態では試料は血液試料の一部から獲得される。別の実施形態では試料は頬スワブの一部として獲得される。別の実施形態では試料は唾液試料採取の一部として獲得される。別の実施形態では生体試料は組織生検材料の全部または一部を含む。別の実施形態では組織生検材料が採取され、その組織試料に由来する細胞であって、本発明の生体試料を含む前記細胞が収集される。別の実施形態では本発明の試料は細胞生検材料の一部として獲得される。別の実施形態では同じ対象から複数の生検材料が採取され得る。別の実施形態では同じ組織または細胞から同じ対象に由来する複数の生検材料が収集され得る。別の実施形態では前記対象内の異なる組織の細胞源から同じ対象に由来する複数の生検材料が収集され得る。
【０３３８】
１つの実施形態では生検材料は骨髄組織を含む。別の実施形態では生検材料は血液試料を含む。別の実施形態では生検材料は胃腸組織、例えば食道、胃、十二指腸、直腸、結腸、および末端回腸の生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は肺組織を含む。別の実施形態では生検材料は前立腺組織を含む。別の実施形態では生検材料は肝臓組織を含む。別の実施形態では生検材料は神経系組織、例えば脳生検材料、神経生検材料、または髄膜生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は泌尿生殖器組織、例えば腎臓生検材料、子宮内膜生検材料、または子宮頸部錐体生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は乳房生検材料を含む。別の実施形態では生検材料はリンパ節生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は筋肉生検材料を含む。さらに別の実施形態では生検材料は皮膚生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は骨生検材料を含む。別の実施形態では疾患組織の診断を確認するために各試料についての疾患担持試料病理検査が行われる。別の実施形態では健常組織の診断を確認するために健常試料が検査される。
【０３３９】
１つの実施形態では正常生体試料または健常生体試料が前記対象から獲得される。別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は、対象に由来する生体試料などのあらゆる試料に関連する非腫瘍試料である。その試料は本明細書において提供される生体試料から獲得される健常細胞などのあらゆる組織試料であり得る。別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は、１つの実施形態では関連の個体である別の個体から獲得される。別の実施形態では別の個体は前記対象と同じ種の個体である。別の実施形態では別の個体は、疾患担持生体試料を含有していない、または疾患担持生体試料を含有することが疑われていない健康な個体である。別の実施形態では別の個体は、腫瘍細胞または癌細胞を含有しない、または腫瘍細胞もしくは癌細胞を含有することが疑われていない健康な個体である。当業者は、その個体が健康であることを判定するために疾患の存在についての当技術分野において知られている方法を用いてその健康な個体がスクリーニングされ得ることを理解する。疾患担持生体試料と健常生体試料は両方とも同じ組織（例えば、腫瘍組織とその周りの正常組織の両方を含む組織部分）から獲得することができる。好ましくは、健常生体試料は基本的に、または完全に正常健常細胞から構成され、疾患担持生体試料（例えば、癌細胞または特定の種類の癌細胞を含むと考えられる試料）との比較に使用することができる。それらの試料は同じタイプのもの（例えば、両方とも血液、または両方とも血清）であることが好ましい。例えば、疾患担持生体試料が細胞を含む場合、健常生体試料中の細胞がその疾患担持生体試料中の疾患担持細胞と同じ組織起源（例えば、肺または脳）を持ち、且つ、同じ細胞種（例えば、神経性、上皮性、間質性、造血性）から生じることが好ましい。
【０３４０】
別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は同時に獲得される。「正常生体試料または健常生体試料」および「基準試料」または「基準組織」という用語は全体を通して互換的に使用され、全て同じ意味と質を有する。別の実施形態では「基準」は、腫瘍標本より得られた結果との相互関係を示し、且つ、腫瘍標本より得られた結果を比較するために使用され得る。別の実施形態では「基準」は、同じ種の充分に多数の正常標本を検査することにより経験的に決定され得る。別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は、異常試料または健常試料を獲得する前、またはその後にその正常試料または健常試料が獲得されるような時間であり得る異なる時点で獲得される。獲得方法は生検または採血について当技術分野において日常的に用いられている方法を含む。別の実施形態では試料は凍結試料である。別の実施形態では試料は組織パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックとして構成される。
【０３４１】
１つの実施形態では前記正常生体試料または健常生体試料の獲得の後に前記試料は、当技術分野においてよく知られている技術および方法を用いて核酸抽出のために加工される。別の実施形態では抽出された核酸はＤＮＡを含む。別の実施形態では抽出された核酸はＲＮＡを含む。別の実施形態ではＲＮＡはｍＲＮＡである。別の実施形態では次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリーが調製される。次世代シーケンシングライブラリーが構築されてよく、次世代シーケンシングライブラリーがエクソームキャプチャまたは標的遺伝子キャプチャを行ってよい。別の実施形態では当技術分野において知られている技術を用いてｃＤＮＡ発現ライブラリーが作製される。例えば、ここに完全に援用される米国特許出願公開第２０１４０１４１９９２号明細書を参照されたい。
【０３４２】
個別免疫療法を作成するための本発明の方法は、正常または健常試料と比べて異常試料または非健常試料に存在する体細胞突然変異または配列差異であって、発現されるアミノ酸をコードするこれらの配列にある前記体細胞突然変異または前記差異を特定するためにその異常試料または非健常試料に由来する抽出核酸とその正常試料または健常基準試料に由来する抽出核酸の使用を含み得る。１つの実施形態では前記体細胞突然変異または配列差異を発現するペプチドは、ある特定の実施形態では全体を通して「ネオエピトープ」と呼ばれ得る。
【０３４３】
当業者は、「ネオエピトープ」という用語が基準試料、例えば正常非癌性細胞もしくは組織または生殖系列細胞もしくは組織などには存在しないが疾患担持組織、例えば癌細胞には見つかるエピトープも意味し得ることを理解する。別の実施形態では、これには正常非癌細胞または生殖系列細胞において対応するエピトープが見つかるが、しかしながら癌細胞では１つ以上の突然変異に起因してそのエピトープの配列がネオエピトープになるように変化している状況が含まれる。別の実施形態ではネオエピトープは変異型エピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープはそのエピトープの両側に非変異配列を有する。１つの実施形態ではネオエピトープは直鎖状エピトープである。別の実施形態ではネオエピトープは溶媒曝露されると考えられており、したがってＴ細胞抗原受容体にアクセス可能であると考えらえる。
【０３４４】
別の実施形態では本明細書において提供される１つ以上のペプチドは１つ以上の免疫抑制性Ｔ調節性ネオエピトープを含まない。別の実施形態では本明細書において提供される前記方法により特定され、且つ、使用されるネオエピトープは免疫抑制性エピトープを含まない。別の実施形態では本明細書において提供される前記方法により特定され、且つ、使用されるネオエピトープはＴ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞を活性化しない。
【０３４５】
別の実施形態ではネオエピトープは免疫原性である。別の実施形態ではネオエピトープはＴ細胞エピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは適応免疫応答エピトープを含む。
【０３４６】
別の実施形態ではネオエピトープは単一の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも２か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも２か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも３か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも４か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも５か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも６か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも７か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも８か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも９か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも１０か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも２０か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは１〜１０か所、１１〜２０か所、２０〜３０か所、および３１〜４０か所の突然変異を含む。
【０３４７】
別の実施形態ではネオエピトープは前記対象の前記疾患または症状と関連する。別の実施形態ではネオエピトープは前記対象の前記疾患または症状を引き起こす。別の実施形態ではネオエピトープは前記疾患担持生体試料内に存在する。別の実施形態ではネオエピトープは前記疾患担持生体組織内に存在するが、前記疾患または症状を引き起こさず、または前記疾患もしくは症状と関係ない。
【０３４８】
別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは１個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは２個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは３個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは４個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは５個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは６個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは７個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは８個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは９個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは１０個またはそれより多くのネオエピトープを含む。
【０３４９】
１つの実施形態ではネオエピトープの特定ステップは、異常生体試料または非健常生体試料より得られた抽出核酸をシーケンシングすること、および正常生体基準試料または健常生体基準試料より得られた抽出核酸をシーケンシングすることを含む。別の実施形態では全ゲノムがシーケンシングされる。別の実施形態ではエクソームがシーケンシングされる。さらに別の実施形態ではトランスクリプトームがシーケンシングされる。別の実施形態ではＴ細胞受容体シーケンシングを用いてネオエピトープが特定される。
【０３５０】
別の実施形態ではネオエピトープは以下、すなわち、Ｐａｖｌｅｎｋｏ  Ｍ，  Ｌｅｄｅｒ  Ｃ，  Ｒｏｏｓ  ＡＫ，  Ｌｅｖｉｔｓｋｙ  Ｖ，  Ｐｉｓａ  Ｐ．  （２００５）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｈ−２Ｄ（ｂ）−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＴＬ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＰＳＡ．    Ｐｒｏｓｔａｔｅ．    １５；６４（１）：５０−９  （ＰＳＡネオエピトープ）、Ｍａｃｉａｇ  ＰＣ，  Ｓｅａｖｅｙ  ＭＭ，  Ｐａｎ  ＺＫ，  Ｆｅｒｒｏｎｅ  Ｓ，  Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ｙ．  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａ  ｂｒｏａｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．    Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １；６８（１９）：８０６６−７５  （ＨＬＡ−Ａ２マウスのＨＭＷ−ＭＡＡエピトープ）、Ｚｈａｎｇ  ＫＱ，  Ｙａｎｇ  Ｆ，  Ｙｅ  Ｊ，  Ｊｉａｎｇ  Ｍ，  Ｌｉｕ  Ｙ，  Ｊｉｎ  ＦＳ，  Ｗｕ  ＹＺ．    （２０１２）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ／ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＰＳＣＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．    Ｕｒｏｌｏｇｙ．；７９（６）：１４１０．ｅ７−１３．  ｄｏｉ：    １０．１０１６／ｊ．ｕｒｏｌｏｇｙ．２０１２．０２．０１１．    Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ａｐｒ  １７  （ＨＬＡ−Ａ２エピトープＰＳＣＡ）、Ｋｏｕｉａｖｓｋａｉａ  ＤＶ，  Ｂｅｒａｒｄ  ＣＡ，  Ｄａｔｅｎａ  Ｅ，  Ｈｕｓｓａｉｎ  Ａ，  Ｄａｗｓｏｎ  Ｎ，  Ｋｌｙｕｓｈｎｅｎｋｏｖａ  ＥＮ，  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ．    （２００９）Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＰＳＡ：    １５４−１６３  （１５５Ｌ）  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＤ８  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＰＳＡ：    １５４−１６３  ｂｕｔ  ｆａｉｌｅｄ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｔｈｅ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＰＳＡ：  ａ  ｐｈａｓｅ  ２  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．；３２（６）：６５５−６６  （ＨＬＡ−Ａ２エピトープＰＳＡ）において開示される、当技術分野において知られているネオエピトープを含む。
【０３５１】
「ゲノム」という用語は生物の染色体中の遺伝情報の総量を指す。「エクソーム」という用語はゲノムのコード領域を指す。「トランスクリプトーム」という用語は全てのＲＮＡ分子からなるセットを指す。
【０３５２】
１つの実施形態によると核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり、より好ましくはＲＮＡであり、最も好ましくはインビトロ転写されたＲＮＡ（ΓνＲＮＡ）または合成ＲＮＡである。本発明によると核酸にはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え技術により生産された分子、および化学合成された分子が含まれる。別の実施形態では核酸は一本鎖または二本鎖の直鎖状または共有結合により閉環した分子として存在し得る。別の実施形態では核酸は単離されたものでよい。本発明によると「単離核酸」という用語は、その核酸が（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され、（ｉｉ）クローニングにより組換え技術で生産され、（ｉｉｉ）例えば、切断とゲル電気泳動による分離により精製され、または（ｉｖ）例えば、化学合成により合成されたことを意味する。核酸は、特に鋳型ＤＮＡからのインビトロ  転写により調製することができるＲＮＡの形態で  細胞への導入、すなわち、細胞の形質移入に使用され得る。また、ＲＮＡは使用前に配列の安定化、キャッピング、およびポリアデニル化により修飾され得る。
【０３５３】
当業者は、「突然変異」という用語は基準配列と比較した前記核酸配列の変化または差異（ヌクレオチド置換、付加、または欠失、早期終止または停止）を包含し得ることを理解することになる。例えば、異常試料中に存在する変化または差異は正常試料には見られない。「体細胞突然変異」は生殖細胞（精子および卵）を除く体の細胞のいずれにおいても起こる可能性があり、したがって子供には受け渡されない。これらの変化は（常にというわけではないが）癌または他の疾患の原因となり得る。１つの実施形態では突然変異は非同義突然変異である。「非同義突然変異」という用語は翻訳産物中のアミノ酸置換などのアミノ酸変化を引き起こす突然変異、好ましくはヌクレオチド置換を指す。
【０３５４】
異常試料が腫瘍または癌組織である場合、１つの実施形態では突然変異は「癌突然変異シグネチャ」を含むことがあり得る。「癌突然変異シグネチャ」という用語は、非癌性基準細胞と比較すると癌細胞中に存在する突然変異のセットを指す。前癌組織または異型組織、および同組織の体細胞突然変異が含まれる。
【０３５５】
デジタル核型分析は遺伝病の原因となり得るあらゆる大きな染色体異常を見つけるために染色体分析に用いられる技術である。１つの実施形態ではデジタル核型分析を用いてシーケンシングおよび比較分析される染色体領域に焦点を合わせることができる。別の実施形態ではデジタル核型分析は、ゲノム全体の特定の座位に由来する、単離され、且つ、列挙されている短いＤＮＡ配列を分析して仮想的に実施される。
【０３５６】
あらゆる適切なシーケンシング法を本発明に従って用いることができる。１つの実施形態では次世代シーケンシング（ＮＧＳ）テクノロジーが用いられる。本方法のシーケンシングステップにかかる時間を短くするために将来的に第三世代のシーケンシング法がＮＧＳテクノロジーの代わりになる可能性がある。明確化を目的として説明すると、本発明の背景における「次世代シーケンシング」または「ＮＧＳ」という用語は、サンガー化学として知られる「コンベンショナル」シーケンシング法と対照的に、ゲノム全ゲノムを小断片に切断することにより全ゲノムに沿ってランダムに鋳型核酸を並行して読む全ての新規ハイスループットシーケンシング技術を意味する。そのようなＮＧＳ技術（大規模並行シーケンシング技術としても知られる）はゲノム全体、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムの全転写配列）またはメチローム（ゲノムの全メチル化配列）の核酸配列情報を非常に短い時間で、例えば、１〜２週間以内、好ましくは１〜７日以内、または最も好ましくは２４時間未満以内に配信することができ、且つ、原理的には一細胞シーケンシングアプローチを可能にする。商業的に利用可能である、または文献中で言及されている複数のＮＧＳプラットフォーム、例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．    ２０１１：    Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．    Ｊ．  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３８  （３），  ９５−１０９、またはＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．    ２００９：    Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：    Ｆｒｏｍ  ｂａｓｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．    Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５，  ６４１−６５８に詳しく記載されているプラットフォームを本発明の背景で使用することができる。そのようなＮＧＳテクノロジー／プラットフォームの非限定的な例には以下のものが含まれる。
【０３５７】
１）例えば最初にＲｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８：  Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ''．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１  （５３７５），  ３６３−３６５において記載されたＲｏｃｈｅの関連会社である４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（コネチカット州ブランフォード）のＧＳ−ＦＬＸ  ４５４ゲノムシーケンサー（商標）において実施されたパイロシーケンシングとして知られるシーケンシング・バイ・シンセシステクノロジー。この技術は、一本鎖ＤＮＡ結合ビーズが激しいボルテックス混合により油によって周囲を覆われたＰＣＲ反応物を含有するエマルジョンＰＣＲ増幅用の水性ミセルに封入されているエマルジョンＰＣＲを用いる。パイロシーケンシング工程の時、ポリメラーゼがＤＮＡ鎖を合成するときのヌクレオチドの取り込み時にリン酸分子から発せられる光が記録される。
【０３５８】
２）可逆的ダイターミネーターに基づき、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｏｌｅｘａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）およびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）において実施されるＳｏｌｅｘａ（現在ではカリフォルニア州サンディエゴのＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．の一部）により開発されたシーケンシング・バイ・シンセシスアプローチ。この技術では４種類全てのヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼと共にフローセルチャネル中のオリゴプライマーがアニールされたクラスター断片に同時に加えられる。ブリッジ増幅によりシーケンシング用の４種類全ての蛍光標識ヌクレオチドでクラスター鎖が伸長する。
【０３５９】
３）例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（現在ではＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）のＳＯＬｉｄ（商標）プラットフォームにおいて実施されるシーケンシング・バイ・ライゲーションアプローチ。この技術では固定された長さの一群の全ての可能なオリゴヌクレオチドがシーケンシングされる位置に応じて標識される。オリゴヌクレオチドがアニールされ、且つ、ライゲーションされる。マッチする配列に対してのＤＮＡリガーゼによる優先的なライゲーションによりその位置のヌクレオチド情報を知らせるシグナルが生じる。シーケンシングの前にＤＮＡはエマルジョンＰＣＲにより増幅される。同一のＤＮＡ分子のコピーだけをそれぞれ含有するそれにより生じたビーズがスライドグラス上に配置される。二つ目の例として、Ｄｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ニューハンプシャー州セイラム）のＰｏｌｏｎａｔｏｒ（商標）Ｇ．００７プラットフォームも、並行シーケンシング用にＤＮＡ断片を増幅するためにランダムアレイ化ビーズベースエマルジョンＰＣＲを用いることによるシーケンシング・バイ・ライゲーションアプローチを用いている。
【０３６０】
４）例えばＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州メンロパーク）のＰａｃＢｉｏ  ＲＳシステムまたは  Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）のＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）プラットフォームにおいて実施されるものなどの一分子シーケンシング技術。この技術のはっきりとした特徴は、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシーケンシングとして定義される、増幅することなく単一のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をシーケンシングするその能力である。例えば、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅは合成するときに各ヌクレオチドを直接的に検出するために非常に高感度の蛍光検出システムを使用している。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく類似アプローチがＶｉｓｉｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（テキサス州ヒューストン）により開発されている。他の蛍光ベースの一分子技術はＵ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓの技術（ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ（商標））とＧｅｎｏｖｏｘｘの技術（ＡｎｙＧｅｎｅ（商標））である。
【０３６１】
５）複製時の一本鎖上のポリメラーゼ分子の移動をモニターするためにチップ上に配置されている様々なナノ構造体を使用する一分子シーケンシング用ナノテクノロジー。ナノテクノロジーに基づくアプローチの非限定的な例はＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国オックスフォード）のＧｒｉｄＯＮ（商標）プラットフォーム、Ｎａｂｓｙｓ（ロードアイランド州プロビデンス）により開発されたハイブリダイゼーション支援ナノポアシーケンシングプラットフォーム（ＨＡＮＳ（商標））、およびコンビナトリアル・プローブアンカーライゲーション（ｃＰＡＬ（商標））と呼ばれる特許権で保護されたＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）テクノロジーを使用するリガーゼベースＤＮＡシーケンシングプラットフォームである。
【０３６２】
６）一分子シーケンシング向け電子顕微鏡法ベースの技術、例えばＬｉｇｈｔＳｐｅｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（カリフォルニア州サニーベール）およびＨａｌｃｙｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（カリフォルニア州レッドウッドシティ）により開発された一分子シーケンシング向け電子顕微鏡法ベースの技術。
【０３６３】
７）ＤＮＡの重合時に放出される水素イオンの検出に基づくイオンセミコンダクターシーケンシング。例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州サンフランシスコ）は．大規模並行的にこの生化学過程を実施するために微細加工ウェルの高密度アレイを使用する。各ウェルは異なる鋳型ＤＮＡを保持する。それらのウェルの下にイオン感受性層があり、その下に特許権で保護されたイオンセンサーがある。
【０３６４】
幾つかの実施形態ではＤＮＡ調製物とＲＮＡ調製物がＮＧＳの出発物質として働く。そのような核酸は生体材料などの試料から、例えば新鮮な瞬時凍結腫瘍組織またはホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織（ＦＦＰＥ）から、または新たに単離された細胞から、または患者の末梢血液に存在するＣＴＣから容易に入手され得る。正常非変異型ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを正常、体細胞組織から抽出することができるが、しかしながら本発明の背景では生殖系列細胞が好ましい。生殖細胞系列ＤＮＡまたはＲＮＡは非血液系悪性腫瘍を有している患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出される。ＦＦＰＥ組織または新規単離単一細胞より抽出された核酸は非常によく断片化されているが、それらはＮＧＳ用途には適切である。
【０３６５】
エクソームシーケンシング向けの幾つかの標的化ＮＧＳ方法が文献中に記載されており（レビューには、例えばＴｅｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｋｉｎ  ２０１０：  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９  （２），  Ｒ１４５−５１参照）、それらの全てを本発明と併用することができる。これらの方法（例えばゲノムキャプチャ、ゲノムパーティショニング、ゲノムエンリッチメント等として記載される）の多くがハイブリダイゼーション技術を使用し、それらにはアレイベースハイブリダイゼーションアプローチ（例えばＨｏｄｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７：  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３９，  １５２２−１５２７）およびリキッドベースハイブリダイゼーションアプローチ（例えばＣｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９：  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６，  １９０９６−１９１０１）が含まれる。ＤＮＡ試料調製とその後のエクソームキャプチャ用の市販のキットも利用可能であり、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）はＴｒｕＳｅｑ（商標）ＤＮＡ試料調製キットとＥｘｏｍｅ濃縮キットＴｒｕＳｅｑ（商標）Ｅｘｏｍｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔを提供している。
【０３６６】
本発明の背景では、「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全または実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子を指す。「リボヌクレオチド」はβ−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡなどの単離ＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、および１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化により天然ＲＮＡとは異なる改変型ＲＮＡなどの組換え技術により生成されたＲＮＡを含む。そのような変化はＲＮＡの末端または内部への非ヌクレオチド材料の付加など、非ヌクレオチド材料の付加、例えば、ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド材料の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは非天然ヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドなどの非標準的ヌクレオチドを含むこともできる。これらの改変型ＲＮＡを類似体または天然ＲＮＡ類似体と呼ぶことができる。
【０３６７】
本発明によると、「ＲＮＡ」という用語は「ｍＲＮＡ」を含み、且つ、好ましくは「ｍＲＮＡ」に関する。「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、そして鋳型ＤＮＡを使用して生成され、且つ、ペプチドまたはポリペプチドをコードする「転写物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは５’−ＵＴＲ、タンパク質コード領域、および３’−ＵＴＲを含む。細胞中およびインビトロではｍＲＮＡは限られた半減期しか持たない。本発明の背景ではｍＲＮＡは鋳型ＤＮＡからのインビトロ転写によって生成されてもよい。そのインビトロ転写法は当業者に知られている。例えば、市販されている様々なインビトロ転写キットがある。
【０３６８】
１つの実施形態ではヒト組織（またはあらゆる非ヒト動物）より得られる生体試料（疾患および／または正常）に由来するＤＮＡおよびＲＮＡは三組抽出される。別の実施形態では疾患試料は腫瘍試料であり、前記試料新抗原／ネオエピトープの供給源を提供する。別の実施形態では新抗原の供給源は順次生じる転移癌または循環腫瘍細胞に由来する。当業者は、これらが、最初の生検材料には存在しないが、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＣ）を特異的に標的とするベクター、またはシーケンシングされた最初の生検材料とは異なるように変異形成した転移癌には含まれ得る追加の突然変異を含む場合があり得ることを理解する。
【０３６９】
１つの実施形態では本明細書の開示に従って得られた三組の各試料がＤＮＡエクソームシーケンシングによってシーケンシングされる。ホールエクソームシーケンシングの後にＶＣＦファイル出力データまたは他の適切なファイルが得られ、ＦＡＳＴＡ形式または当技術分野において知られている他のあらゆる適切な形式で表示される。１つの実施形態では「ＶＣＦ」またはバリアントコール形式という用語はＳＮＰおよび他の構造的遺伝子変異をコードするための１０００ゲノムプロジェクトにより使用されるファイル形式である。その形式は１０００ゲノムプロジェクトのウェッブサイト（ｗｗｗ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ａｎａｌｙｓｉｓ／Ｖａｒｉａｎｔ％２０Ｃａｌｌ％２０Ｆｏｒｍａｔ／ＶＣＦ％２０％２８Ｖａｒｉａｎｔ％２０Ｃａｌｌ％２０Ｆｏｒｍａｔ％２９％２０ｖｅｒｓｉｏｎ％２０４．０／ｅｎｃｏｄｉｎｇ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ−ｖａｒｉａｎｔｓ）でさらに説明されている。ＶＣＦコールはＥＢＩ／ＮＣＢＩにおいて利用可能である。１つの実施形態ではその表示は非同義突然変異を中央に置き、その突然変異がコードするアミノ酸の両側の１０〜１５アミノ酸を示している。フレームシフト突然変異は終止コドンまでコードされる変異型ペプチドの全配列を周囲の１０〜１５アミノ酸と共に示す。１つの実施形態ではＶＣＦファイルまたは他の適切なファイルから関係する情報を抽出し、それをＦＡＳＴＡ形式または他の適切な形式にすることによりハイドロパシー検査スクリプトとＭＨＣ結合親和性スクリプトの両方にそれらの２１ｍｅｒネオエピトープ配列を直接的に入力することが可能になる。
【０３７０】
１つの実施形態では疎水性は、カイト・ドゥーリトル（Ｋｙｔｅ  Ｊ，  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ  （Ｍａｙ  １９８２）．  “Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ”．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７  （１）：  １０５−３２）、または他の適切なハイドロパシープロット、または、限定されないが、全ての文献の全体が参照により本明細書に援用されるＲｏｓｅら（Ｒｏｓｅ，  Ｇ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，  Ｒ．  （１９９３）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．，  ２２，  ３８１−４１５．）、Ｋａｌｌｏｌ  Ｍ．  Ｂｉｓｗａｓ，  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．  ＤｅＶｉｄｏ，  Ｊｏｈｎ  Ｇ．  Ｄｏｒｓｅｙ（２００３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１０００，  ６３７−６５５、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｄ  （Ｊｕｌｙ  １９８４）．    Ａｎｎ．    Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．    ５３：    ５９５−６２３．）、Ａｂｒａｈａｍ  Ｄ．Ｊ．，  Ｌｅｏ  Ａ．Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：    Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１３０−１５２（１９８７）、Ｓｗｅｅｔ  Ｒ．Ｍ．，  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．    Ｂｉｏｌ．    １７１：４７９−４８８（１９８３）、Ｂｕｌｌ  Ｈ．Ｂ．，  Ｂｒｅｅｓｅ  Ｋ．  Ａｒｃｈ．    Ｂｉｏｃｈｅｍ．    Ｂｉｏｐｈｙｓ．    １６１：６６５−６７０（１９７４）、Ｇｕｙ  Ｈ．Ｒ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．  ４７：６１−７０（１９８５）、Ｍｉｙａｚａｗａ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １８：５３４−５５２（１９８５）、Ｒｏｓｅｍａｎ  Ｍ．Ａ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．    Ｂｉｏｌ．    ２００：５１３−５２２（１９８８）、Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ  Ｒ．Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．    Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：８４９−８５５（１９８１）、Ｗｉｌｓｏｎ  Ｋ．Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．    Ｊ．  １９９：３１−４１（１９８１）、Ｃｏｗａｎ  Ｒ．，  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｒ．Ｇ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０（１９９０）、Ａｂｏｄｅｒｉｎ  Ａ．Ａ．  Ｉｎｔ．    Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．    ２：５３７−５４４（１９７１）、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．    Ｂｉｏｌ．    １７９：１２５−１４２（１９８４）、Ｈｏｐｐ  Ｔ．Ｐ．，  Ｗｏｏｄｓ  Ｋ．Ｒ．  Ｐｒｏｃ．    Ｎａｔｌ．    Ａｃａｄ．    Ｓｃｉ．    Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：３８２４−３８２８（１９８１）、Ｍａｎａｖａｌａｎ  Ｐ．，  Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  Ｐ．Ｋ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６７３−６７４（１９７８）、Ｂｌａｃｋ  Ｓ．Ｄ．，  Ｍｏｕｌｄ  Ｄ．Ｒ．    Ａｎａｌ．    Ｂｉｏｃｈｅｍ．    １９３：７２−８２（１９９１）、Ｆａｕｃｈｅｒｅ  Ｊ．−Ｌ．，  Ｐｌｉｓｋａ  Ｖ．Ｅ．  Ｅｕｒ．    Ｊ．  Ｍｅｄ．    Ｃｈｅｍ．    １８：３６９−３７５（１９８３）、Ｊａｎｉｎ  Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２（１９７９）、Ｒａｏ  Ｍ．Ｊ．Ｋ．，  Ａｒｇｏｓ  Ｐ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．    Ｂｉｏｐｈｙｓ．    Ａｃｔａ  ８６９：１９７−２１４（１９８６）、Ｔａｎｆｏｒｄ  Ｃ．  Ｊ．  Ａ��．    Ｃｈｅｍ．    Ｓｏｃ．    ８４：４２４０−４２７４（１９６２）、Ｗｅｌｌｉｎｇ  Ｇ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．    １８８：２１５−２１８（１９８５）、Ｐａｒｋｅｒ  Ｊ．Ｍ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５４２５−５４３１（１９８６）、Ｃｏｗａｎ  Ｒ．，  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｒ．Ｇ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０（１９９０）により開示される定量法をはじめとする他の適切な定量法を用いて定量される。別の実施形態では効率的な分泌には不満足なほど高レベルの疎水性を持つスコアがその定量関連の尺度で付いた全てのエピトープがリストから除かれるか、または選択から除かれる。別の実施形態では効率的な分泌には不満足なほど高レベルの疎水性を持つ１．６以上などのスコアがカイト・ドゥーリトル・プロットで付いた全てのエピトープがリストから除かれるか、または選択から除かれる。別の実施形態では対象ＨＬＡに結合する各新抗原の能力が、ｎｅｔＭＨＣｐａｎ、ＡＮＮ、ＳＭＭＰＭＢＥＣ、ＳＭＭ、ＣｏｍｂＬｉｂ＿Ｓｉｄｎｅｙ２００８、ＰｉｃｋＰｏｃｋｅｔ、ｎｅｔＭＨＣｃｏｎｓをはじめとする免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）分析資源を用いて評価される。他の情報源にはＴＥｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｐｒｅｄｉｃｔ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）または当技術分野において利用可能な代替的ＭＨＣ結合測定スケールが含まれる。
【０３７１】
別の実施形態では、対象向けの個別免疫療法を作成するための系であって、少なくとも１つの処理装置、および前記処理装置により実行されるプログラム命令を含む少なくとも１つの記憶媒体、前記プログラム命令によって前記処理装置が次のこと、すなわち、
a.  全ての新抗原／ネオエピトープおよび対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイプを含む出力データを受信すること、
b.  各エピトープの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるエピトープを除外すること、
c.  対象ＨＬＡに結合する残りの新抗原の能力、およびそれらの新抗原の予想ＭＨＣ結合スコアに基づいてそれらの新抗原を数値により評価すること、
d.  各エピトープのアミノ酸配列をプラスミドに挿入すること、
e.  各コンストラクトの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるあらゆるコンストラクトを除外すること、
f.  最も高いスコアになったコンストラクトから開始して、各コンストラクトのアミノ酸配列を対応するＤＮＡ配列に翻訳すること、
g.  所定の上限に達するまでランク順に前記プラスミドコンストラクトに追加のエピトープを挿入すること、
h.  対象における免疫治療応答を測定するために前記コンストラクトの末端にＤＮＡ配列タグを付加すること、および
i.  リステリア・モノサイトゲネスにおける発現および分泌のために前記エピトープおよびＤＮＡ配列タグを最適化すること、を含むステップを実行することになる前記系が本明細書において開示される。
【０３７２】
１つの実施形態では一度ネオエピトープが特定されるとカイト・ドゥーリトル・ハイドロパシーインデックス２１アミノ酸ウィンドウによってそのネオエピトープにスコアが付けられ、別の実施形態では特定のカットオフ値（約１．６）より上のスコアになるネオエピトープはリステリア・モノサイトゲネスによって分泌されない可能性があるので除外される。別の実施形態ではそのカットオフ値は次の範囲、１．２〜１．４、１．４〜１．６、１．６〜１．８、１．８〜２．０、２．０〜２．２  ２．２〜２．５、２．５〜３．０、３．０〜３．５、３．５〜４．０、または４．０〜４．５から選択される。１つの実施形態では実施形態エピトープをリストから除外する、または選択除外するために使用されるカットオフ値スコアは１．６である。別の実施形態ではそのカットオフ値は１．４、１．５、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．３、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、または４．５である。別の実施形態ではそのカットオフ値は使用されている送達ベクターの属に応じて変化する。別の実施形態ではそのカットオフ値は使用されている送達ベクターの種に応じて変化する。
【０３７３】
１つの実施形態ではカイト・ドゥーリトル・ハイドロパシーインデックス２１アミノ酸スライディングウィンドウによってネオエピトープにスコアがつけられる。別の実施形態ではそのスライディングウィンドウサイズは９アミノ酸、１１アミノ酸、１３アミノ酸、１５アミノ酸、１７アミノ酸、１９アミノ酸、および２１アミノ酸を含む群より選択される。別の実施形態ではそのスライディングウィンドウサイズは９〜１１アミノ酸、１１〜１３アミノ酸、１３〜１５アミノ酸、１５〜１７アミノ酸、１７〜１９アミノ酸、または１９〜２１アミノ酸である。
【０３７４】
別の実施形態ではステップ（ｈ）のＤＮＡ配列タグはＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓまたは当技術分野において利用可能な代用タグ配列である。別の実施形態では免疫抑制特性を有することが知られている新抗原が上のステップ（ａ）の前に考慮対象外とされる。１つの実施形態ではこれらの免疫抑制性エピトープは配列中に提示されるとおりであるか、またはエピトープ配列およびリンカーのスプライシングの結果として人工的に作製される。
【０３７５】
１つの実施形態では本明細書において開示される方法によって得られる出力ＦＡＳＴＡファイル（例えば、本明細書の実施例３０参照）を使用して患者特異的コンストラクトが手作業かプログラムされたスクリプトのどちらかにより設計される。別の実施形態ではそのプログラムされたスクリプトは一連のプロトコルを使用して各対象向けの１つ以上のネオエピトープを含有する個別化血漿コンストラクトの作製を自動化する（図４４）。その出力ＦＡＳＴＡファイルを入力し、それらのプロトコルが実行された後に１つ以上のネオエピトープを含むＬＭベクターのＤＮＡ配列が出力される。そのソフトウェアプログラムは各対象向けの個別免疫療法の作成に有用である。
【０３７６】
１つの実施形態ではネオエピトープを特定するために疾患担持試料と健常試料に由来する核酸配列が比較される。ネオエピトープはＯＲＦ配列内にアミノ酸変化を含む。本明細書において使用される場合、ペプチドまたはタンパク質に関しての「配列変化」という用語はアミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体、およびアミノ酸置換変異体を指し、好ましくはアミノ酸置換変異体を指す。本発明によるとこれらの全ての配列変化が新しいエピトープを作製する可能性がある。
【０３７７】
１つの実施形態ではアミノ酸挿入変異体は特定のアミノ酸配列中に単一の、または２個、またはそれより多くのアミノ酸の挿入を含む。別の実施形態ではアミノ酸付加変異体は１個以上のアミノ酸、例えば１個、２個、３個、４個、または５個、またはそれより多くのアミノ酸のアミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合を含む。別の実施形態ではアミノ酸欠失変異体は配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１個、２個、３個、４個、または５個、またはそれより多くのアミノ酸の除去を特徴とする。別の実施形態ではアミノ酸置換変異体は配列中の少なくとも１つの残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されることを特徴とする。
【０３７８】
全ての試料がＯＲＦ内の新規遺伝子シーケンシングについて分析される。前記疾患担持生体試料と健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を比較するための方法は、スクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールおよび関連のデジタルソフトウェアの使用を含む。バイオインフォマティクス分析を実施するための方法が当技術分野において知られており、例えば、各々が完全に本出願に援用される米国特許出願公開第２０１３／０２１０６４５号明細書、同第２０１４／００４５８８１号明細書、および国際公開ＷＯ２０１４／０５２７０７号パンフレットを参照されたい。
【０３７９】
ヒト腫瘍は顕著な数の体細胞突然変異を保持することが典型的である。しかしそれでも腫瘍を通してどの特定の遺伝子でも同一の突然変異が見つかることはまれである（最も一般的なドライバー突然変異についても低い頻度である）。したがって、１つの実施形態では患者特異的腫瘍突然変異を包括的に特定する本発明の方法により個別免疫療法の標的が提供される。
【０３８０】
１つの実施形態では疾患担持試料から特定される突然変異が主要組織適合複合体クラスＩ分子（ＭＨＣＩ）上に提示される場合があり得る。１つの実施形態ではネオエピトープ突然変異を含有するペプチドは免疫原性であり、適応免疫系により「非自己」新抗原として認識される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では前記疾患または症状に対するＴ細胞免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では疾患または症状に対する適応免疫応答を治療的に活性化し得る。
【０３８１】
別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗腫瘍または抗癌Ｔ細胞免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では抗腫瘍適応免疫応答または抗癌適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗自己免疫疾患Ｔ細胞免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では抗自己免疫疾患適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗感染症Ｔ細胞免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では抗感染症適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗臓器移植拒絶反応Ｔ細胞免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では疾患または症状に対する抗臓器移植拒絶反応適応免疫応答を治療的に活性化し得る。
【０３８２】
別の実施形態では免疫原性応答の存在が１つ以上の免疫原性ネオエピトープの存在と相関する。別の実施形態では組換えリステリアがＴ細胞エピトープ、または適応免疫応答エピトープ、またはそれらのあらゆる組合せを含むネオエピトープをコードする核酸を含む。
【０３８３】
１つの実施形態では本方法は１つ以上のネオエピトープを含む各アミノ酸配列を免疫原性応答についてスクリーニングすることを含み、免疫原性応答の存在が免疫原性エピトープを含む１つ以上のネオエピトープと相関する。別の実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープがペプチドに含まれる。別の実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープがポリペプチドに含まれる。別の実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープが融合ポリペプチドに含まれる。別の実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープがユビキチンポリペプチドに融合して含まれる。
【０３８４】
別の実施形態では本方法は１つ以上のネオエピトープを含む各アミノ酸配列を免疫原性Ｔ細胞応答についてスクリーニングすることを含み、免疫原性Ｔ細胞応答の存在がＴ細胞エピトープを含む１つ以上のネオエピトープと相関する。別の実施形態では本方法は１つ以上のネオエピトープを含む各アミノ酸配列を適応免疫応答についてスクリーニングすることを含み、適応免疫応答の存在が適応免疫応答エピトープを含む１つ以上のネオエピトープと相関する。
【０３８５】
１つの実施形態では、提供される個別免疫療法を作成するための前記系または方法における免疫原性Ｔ細胞応答のスクリーニングステップは、例えばＴ細胞増殖アッセイ、前記ネオエピトープで活性化されたＴ細胞を使用し、且つ、腫瘍細胞と共培養され、５１Ｃｒ放出アッセイまたは３Ｈチミジンアッセイを用いる腫瘍退行アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ、およびＦＡＣＳ分析をはじめとする当技術分野においてよく知られている免疫応答アッセイの使用を含む。（例えば、全体が本明細書に援用される米国特許第８７７１７０２号明細書、および欧州特許第１７７４３３２（Ｂ１）号明細書を参照されたい）。別の実施形態では免疫原性応答についてのスクリーニングステップは非Ｔ細胞応答を調査する。別の実施形態では提供される個別免疫療法の作成系または作成方法における非Ｔ細胞応答についてのスクリーニングステップは、サイトカイン産生の調査が異なる部分集合のサイトカイン、すなわち、ＩＬ−１０およびＩＬ−１βに焦点を当てていることを除いて上記のＴ細胞についてのアッセイと類似のアッセイをはじめとする当技術分野においてよく知られている免疫応答アッセイの使用を含む。（例えば、両方とも全体が本明細書に援用される米国特許第８９６２３１９号明細書および欧州特許第１７７４３２号明細書を参照されたい。例えば、５１Ｃｒ放出アッセイによってＴ細胞免疫応答をアッセイしてよく、そのアッセイは１つ以上のネオエピトープを含む免疫療法でマウスを免疫するステップを含み、免疫後約１０日に脾臓の採取が続き、その後でフィーダー細胞としての放射線照射したＴＣ−１細胞（１００：１、脾細胞：ＴＣ−１）と培養して脾細胞を確立し、インビトロで５日間にわたって刺激し、その後で標的として１つ以上のネオエピトープを含むペプチド／ポリペプチドを使用して標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて使用することができる。
【０３８６】
別の実施形態では免疫応答についてのスクリーニングステップは、例えば全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０１２９４９９号明細書に開示されるようにＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの使用を含む。
【０３８７】
１つの実施形態では本方法は、特定されたＴ細胞ネオエピトープをコードする核酸配列、または前記特定されたＴ細胞ネオエピトープを含むペプチドを選択し、前記配列で組換え弱毒化リステリア株を形質転換することを含む。１つの実施形態では本方法は、特定された適応免疫応答ネオエピトープをコードする核酸配列、または前記特定された適応免疫応答ネオエピトープを含むペプチドを選択し、前記配列で組換え弱毒化リステリア株を形質転換することを含む。
【０３８８】
１つの実施形態では本明細書に記載される系または方法は前記Ｔ細胞ネオエピトープの発現と分泌を確認するために前記リステリア株を培養し、その特徴を分析することを含む。１つの実施形態では本明細書に記載される系または方法は前記適応免疫応答ネオエピトープの発現と分泌を確認するために前記リステリア株を培養し、その特徴を分析することを含む。１つの実施形態では本明細書に記載される系または方法は前記１つ以上のペプチドの発現と分泌を確認するために前記リステリア株を培養し、その特徴を分析することを含む。
【０３８９】
１つの実施形態では本発明の系または方法は所定の時点で前記対象に投与するために前記リステリアを保存すること、または前記リステリアを前記対象に投与し、前記リステリア株を免疫原性組成物の一部として投与することを含む。
ＩＩ  組換え型リステリア株
【０３９０】
１つの実施形態では本発明の組換え型リステリア株は核酸分子を含み、その核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含み、その融合ポリペプチドは１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドに融合している短縮型リステリオリジンＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。当業者は、１つ以上のエピトープを含む本明細書において提供される１つ以上のペプチドがまず免疫原性であってよく、それらの免疫原性がｔＬＬＯ、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列などの免疫原性ポリペプチドと融合されるか、または混合されることにより増強されてよいことを理解する。別の実施形態では本発明の組換え型リステリア株は核酸分子を含み、その核酸分子は短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む。１つの実施形態ではその組換え型リステリア株は弱毒化されている。
【０３９１】
１つの実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む本明細書において提供される１つ以上のペプチドはそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している。
【０３９２】
別の実施形態では短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列は異種抗原またはその断片に融合していない。別の実施形態では短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列は本明細書において提供される１つ以上のペプチドに融合していない。
【０３９３】
別の実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む本明細書において提供される１つ以上のペプチドは免疫原性組成物の一部として免疫原性ポリペプチドまたはその断片と混合される。
【０３９４】
１つの実施形態では短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質は推定上のＰＥＳＴ配列を含む。１つの実施形態では短縮型ａｃｔＡタンパク質はＰＥＳＴ含有アミノ酸配列を含む。別の実施形態では短縮型ａｃｔＡタンパク質は推定上のＰＥＳＴ含有アミノ酸配列を含む。
【０３９５】
１つの実施形態ではＰＥＳＴアミノ酸（ＡＡ）配列は短縮型ＬＬＯ配列を含む。別の実施形態ではＰＥＳＴアミノ酸配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号１）である。別の実施形態ではリステリアに由来する他のＬＭ  ＰＥＳＴ  ＡＡ配列への抗原の融合によってもその抗原の免疫原性が増強される。
【０３９６】
別の実施形態では本発明の方法および組成物のＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は配列番号３を含む。別の実施形態ではその断片はＬＬＯシグナルペプチドを含む。別の実施形態ではその断片は配列番号４を含む。別の実施形態ではその断片はほぼ配列番号４から構成される。別の実施形態ではその断片は配列番号４から本質的に構成される。別の実施形態ではその断片は配列番号４に対応する。別の実施形態ではその断片は配列番号４と相同である。別の実施形態ではその断片は配列番号４の断片と相同である。１つの実施形態では使用される短縮型ＬＬＯは前記シグナル配列を含まない。別の実施形態ではその短縮型ＬＬＯはシグナル配列を含む。活性化ドメインを有さず、且つ、特にシステイン４８４を有しないあらゆる短縮型ＬＬＯが本発明の方法および組成物に適切であることが当業者に明らかになる。別の実施形態では配列番号１のＰＥＳＴ  ＡＡ配列を含むあらゆる短縮型ＬＬＯへの異種抗原の融合によりその抗原の細胞介在性免疫および抗腫瘍免疫が増強される。
【０３９７】
本発明の免疫治療を構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は別の実施形態では以下の配列を有する：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１３１２８；配列番号２；核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１５１２７で表される）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、それらは細菌によってＬＬＯが分泌されるときにそれから切断される。したがって、この実施形態では全長活性型ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では上記のＬＬＯ断片は本発明の免疫療法に組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。
【０３９８】
別の実施形態では本発明の組成物および方法において利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、以下の配列を有する：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD  （配列番号３）。
【０３９９】
別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は本明細書において利用されるＬＬＯタンパク質のおよそＡＡ２０〜４４２に対応する。
【０４００】
別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は以下の配列を有する：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD  （配列番号４）。
【０４０１】
別の実施形態では「Ｎ末端短縮型ＬＬＯタンパク質」、「Ｎ末端ＬＬＯ断片」、「短縮型ＬＬＯタンパク質」、「ΔＬＬＯ」という用語、またはそれらの文法的に同等の用語は本明細書において互換的に使用され、非溶血性であるＬＬＯ断片を指す。別の実施形態ではこれらの用語は推定上のＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片を指す。
【０４０２】
別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は、システイン４８４を含む領域の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態ではＬＬＯは、参照により本明細書に援用される米国特許第８７７１７０２号明細書に詳細に述べられるように、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
【０４０３】
１つの実施形態では本発明はリステリオシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質を含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供し、前記ＬＬＯタンパク質は前記ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、またはこれらの組み合わせの突然変異を含む。１つの実施形態では前記Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２の残基は配列番号２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２であるが、別の実施形態ではそれらの残基は、当業者に知られているように配列アラインメント使用して推測することができるような対応する残基である。１つの実施形態では残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２に突然変異が形成されている。１つの実施形態では突然変異は置換であり、別の実施形態では欠失である。１つの実施形態ではＣＢＤ全体に突然変異が形成されており、一方で別の実施形態ではＣＢＤの部分に突然変異が形成されており、一方で別の実施形態ではＣＢＤ内の特定の残基だけに突然変異が形成されている。
【０４０４】
１つの実施形態では本発明は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片を含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供し、その変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片の突然変異領域に対する非ＬＬＯペプチドの置換を含み、突然変異領域はＣ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２から選択される残基を含む。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はＮ末端ＬＬＯ断片である。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は少なくとも４９２アミノ酸（ＡＡ）長である。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は４９２〜５２８ＡＡ長である。別の実施形態では前記非ＬＬＯペプチドは１〜５０アミノ酸長である。別の実施形態では前記突然変異領域は１〜５０アミノ酸長である。別の実施形態ではその非ＬＬＯペプチドはその突然変異領域と同一の長さである。別の実施形態ではその非ＬＬＯペプチドはその突然変異領域と異なる長さを有する。別の実施形態では前記置換は溶血活性に関する不活化突然変異である。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯと比べた溶血活性の低下を呈する。別の実施形態ではその組換え型のタンパク質またはポリペプチドは非溶血性である。
【０４０５】
本明細書において提示されるように、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２がアラニン残基で置換された突然変異型ＬＬＯタンパク質を作製した（実施例２５）。その変異型ＬＬＯタンパク質、すなわち、ｍｕｔＬＬＯは大腸菌発現系で発現および精製され（実施例２７）、野生型ＬＬＯと比べて実質的に低下した溶血活性を呈する（実施例２８）ことができた。
【０４０６】
別の実施形態では本発明は、（ａ）変異型ＬＬＯタンパク質であって、その変異型ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインに含まれる内部欠失を含有する前記変異型ＬＬＯタンパク質、および（ｂ）目的の異種ペプチドを含む組換え型のタンパク質またはポリペプチドを提供する。別の実施形態ではそのコレステロール結合ドメインの配列は配列番号１０１で表される。別の実施形態ではその内部欠失は１１〜５０アミノ酸内部欠失である。別の実施形態ではその内部欠失はその組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血活性を不活性化する。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに比べた溶血活性の低下を呈する。
【０４０７】
別の実施形態では本発明は、（ａ）変異型ＬＬＯタンパク質であって、その変異型ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインの断片に含まれる内部欠失を含有する前記変異型ＬＬＯタンパク質、および（ｂ）目的の異種ペプチドを含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供する。別の実施形態ではその内部欠失は１〜１１アミノ酸内部欠失である。別の実施形態ではそのコレステロール結合ドメインの配列は配列番号１０１で表される。別の実施形態ではその内部欠失はその組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血活性を不活性化する。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに比べた溶血活性の低下を呈する。
【０４０８】
別の実施形態では本発明の方法および組成物の突然変異領域は配列番号２の残基Ｃ４８４を含む  別の実施形態ではその突然変異領域は相同ＬＬＯタンパク質の対応するシステイン残基を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は配列番号２の残基Ｗ４９１を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は配列番号２の残基Ｗ４９２を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。相同タンパク質の対応する残基を特定するための方法は当技術分野において周知であり、例えば配列アライメントがその方法に挙げられる。
【０４０９】
別の実施形態ではその突然変異領域は残基Ｃ４８４およびＷ４９１を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は残基Ｃ４８４およびＷ４９２を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は残基Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は残基Ｃ４８４、Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。
【０４１０】
別の実施形態では本発明の方法および組成物の突然変異領域は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のコレステロール結合ドメインを含む。例えば、配列番号２の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００から構成される突然変異領域がそのＣＢＤ（残基４８３〜４９３）を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は変異型ＬＬＯタンパク質のＣＢＤ断片、またはその断片である。例えば、本明細書において提示されるように、それぞれがＣＢＤ断片である残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２がアラニン残基に変更された（実施例２５）。さらに、本明細書において提示されるように、残基４８４〜４９２のＣＢＤ断片がＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する異種配列で置き換えられた（実施例２６）。別の実施形態ではその突然変異領域は変異型ＬＬＯタンパク質のＣＢＤまたはその断片と重なる。例えば、配列番号２の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０から構成される突然変異領域がそのＣＢＤを含む。別の実施形態では単一のペプチドがシグナル配列に欠失を、ＣＢＤに突然変異または置換を有してよい。本発明の別個の実施形態により各可能性が表される。
【０４１１】
別の実施形態ではその突然変異領域の長さは１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは６〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは７〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは８〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは９〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１０〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜２ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１２〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１５０ＡＡである。本発明の別の実施形態により各可能性が表される。
【０４１２】
別の実施形態では本発明の方法および組成物の置換突然変異はＬＬＯタンパク質またはその断片の突然変異領域が同数の異種ＡＡで置き換えられている突然変異である。別の実施形態ではその突然変異領域のサイズよりも大きい数の異種ＡＡが導入される。別の実施形態ではその突然変異領域のサイズよりも小さい数の異種ＡＡが導入される。本発明の別の実施形態により各可能性が表される。
【０４１３】
別の実施形態ではその置換突然変異は単一の残基の点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は２残基の点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は３残基の点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は３残基より多くの点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は数残基の点突然変異である。別の実施形態では点突然変異に含まれる複数の残基が連続している。別の実施形態ではそれらの複数の残基は連続していない。
【０４１４】
別の実施形態では本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドの突然変異領域を置き換える非ＬＬＯペプチドの長さは１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは６〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは７〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは８〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは９〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１０〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜２ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１２〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１５０ＡＡである。
【０４１５】
別の実施形態では本発明の方法および組成物のＬＬＯ断片の長さは少なくとも４８４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４８４ＡＡを超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも４８９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４８９を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも４９３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４９３を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５００を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５０５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５０５を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５１０を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５１５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５１５を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５２０を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５２０を超える。本明細書においてＬＬＯ断片の長さに言及するとき、シグナル配列が含まれる。したがって、ＣＢＤ内の第１システインの番号は４８４であり、ＡＡ残基の総数は５２９である。
【０４１６】
別の実施形態では本発明は、（ａ）変異型ＬＬＯタンパク質であって、その変異型ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインに含まれる内部欠失を含有する前記変異型ＬＬＯタンパク質、および（ｂ）本明細書において提供される１つ以上のエピトープを含むペプチドを含む組換えタンパク質またはポリペプチド、または同タンパク質もしくはポリペプチドを備える本明細書において提供される弱毒化リステリア株を提供する。別の実施形態ではそのコレステロール結合ドメインの配列は配列番号１０１で表される。別の実施形態ではその内部欠失は１〜１１アミノ酸内部欠失、１〜５０アミノ酸内部欠失、または１１〜５０アミノ酸内部欠失である。別の実施形態ではその内部欠失はその組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血活性を不活性化する。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに比べた溶血活性の低下を呈する。
【０４１７】
別の実施形態では本発明のペプチドは融合ペプチドである。別の実施形態では「融合ペプチド」はペプチド結合または他の化学結合によって互いに連結した２つ以上のタンパク質を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。別の実施形態では前記タンパク質はペプチド結合または他の化学結合によって直接的に互いに連結されている。別の実施形態では前記タンパク質はそれらの２つ以上のタンパク質の間の１個以上のＡＡ（例えば、「スペーサー」）によって互いに連結されている。
【０４１８】
本明細書において提示されるように、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２が抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＣＴＬエピトープで置換された突然変異型ＬＬＯタンパク質を作製した（実施例２６）。その変異型ＬＬＯタンパク質、すなわち、ｍｕｔＬＬＯは大腸菌発現系で発現および精製され（実施例２７）、野生型ＬＬＯと比べて実質的に低下した溶血活性を呈する（実施例２８）ことができた。当業者は、本明細書において提供される方法または過程により特定されるあらゆるネオエピトープをＬＬＯのＣＢＤの置換または置き換えに使用することができることを理解する。
【０４１９】
別の実施形態では本発明の方法および組成物の内部欠失の長さは１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは６〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは７〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは８〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは９〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１０〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜２ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１２〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１５０ＡＡである。
【０４２０】
別の実施形態では内部欠失を含む本発明の変異型ＬＬＯタンパク質はその内部欠失を除いて完全長である。別の実施形態ではその変異型ＬＬＯタンパク質は追加的な内部欠失を含む。別の実施形態ではその変異型ＬＬＯタンパク質は１つより多くの追加的な内部欠失を含む。別の実施形態ではその変異型ＬＬＯタンパク質はＣ末端から短縮されている。
【０４２１】
別の実施形態では本発明の方法および組成物の内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤを含む。例えば、配列番号２の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００から構成される内部欠失はそのＣＢＤ（残基４８３〜４９３）を含む。別の実施形態ではその内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤ断片である。例えば、残基４８４〜４９２、４８５〜４９０、および４８６〜４８８は全て配列番号２のＣＢＤの断片である。別の実施形態ではその内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤと重なる。例えば、配列番号２の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０から構成される内部欠失はそのＣＢＤを含む。
【０４２２】
別の実施形態では短縮型ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の最初の４４１ＡＡを含む。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はＬＬＯの最初の４２０ＡＡを含む。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は野生型ＬＬＯタンパク質の非溶血性形態である。
【０４２３】
別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。
【０４２４】
別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態ではそれらの残基番号は上に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書において利用されるＬＬＯタンパク質と比べて挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は当技術分野において知られている他のあらゆるＬＬＯ断片である。
【０４２５】
相同タンパク質の対応する残基を特定するための方法は当技術分野において周知であり、例えば配列アライメントがその方法に挙げられる。１つの実施形態では相同ＬＬＯは、ＬＬＯ配列（例えば、配列番号２〜４のうちの１つ）に対する７０％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同ＬＬＯは配列番号  ２〜４のうちの１つに対する７２％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する７５％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する７８％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する８０％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する８２％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する８３％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する８５％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する８７％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する８８％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する９０％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する９２％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する９３％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する９５％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する９６％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する９７％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する９８％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する９９％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  ２〜４のうちの１つに対する１００％の同一性を指す。
【０４２６】
「ＰＥＳＴアミノ酸配列」、「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴ配列ペプチド」、「ＰＥＳＴペプチド」、または「ＰＥＳＴ配列含有タンパク質またはペプチド」という用語は本明細書において互換的に使用される。当業者は、これらの用語に短縮型ＬＬＯタンパク質が包含される場合があり、それは１つの実施形態ではＮ末端ＬＬＯであり、または別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質であることを理解する。ＰＥＳＴ配列ペプチドは当技術分野において知られており、米国特許第７６３５４７９号明細書、および米国特許出願公開第２０１４／０１８６３８７号明細書に記載されており、これらの両方の全体が本明細書に援用される。
【０４２７】
別の実施形態では、Ｌ．モノサイトゲネスについてＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ（ＴＢＳ  ２１：２６７−２７１，  １９９６）によって記載されるものなどの方法に従って原核生物のＰＥＳＴ配列を日常的に特定することができる。あるいは、この方法に基づいて他の原核生物由来のＰＥＳＴアミノ酸配列を特定することもできる。ＰＥＳＴアミノ酸配列が期待される他の原核生物には他のリステリア属の種が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｌ．モノサイトゲネスのタンパク質ＡｃｔＡは４つのそのような配列を含有する。これらは、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号５）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号６）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号７）、およびＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号８）である。また、ストレプトコッカス属の種に由来するストレプトリジンＯもＰＥＳＴ配列を含有する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスのストレプトリジンＯはアミノ酸３５〜５１にＰＥＳＴ配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号９）を含み、ストレプトコッカス・エクイシミリスのストレプトリジンＯはアミノ酸３８〜５４にＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１０）を含む。さらに、ＰＥＳＴ配列を抗原タンパク質の中に埋め込むことができると考えられる。したがって、本発明の目的のため、ＰＥＳＴ配列融合に関するときは「融合」という言葉によって、抗原タンパク質が抗原と、その抗原の一端に連結されているか、またはその抗原の中に埋め込まれるかのいずれかのＰＥＳＴアミノ酸配列の両方を含むことを意味する。他の実施形態ではＰＥＳＴ配列またはＰＥＳＴ含有ポリペプチドは融合タンパク質の一部でもなく、そのポリペプチドが異種抗原を含むこともない。
【０４２８】
「核酸配列」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸コンストラクト」という用語は本明細書において互換的に使用され、それらの用語はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指してよく、それらの分子には原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および甚だしくは合成ＤＮＡ配列も含まれるがこれらに限定されない。この用語はＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。この用語は少なくとも２つの塩基/糖/リン酸化合物からなる鎖を指す場合もある。この用語は一量体単位の核酸重合体を指す場合もある。１つの実施形態ではＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態であってよい。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記述されている（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびそれに引用された参照文献）。ＤＮＡはプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡの形態であってよく、またはこれらの群の誘導体であってよい。加えて、これらの形態のＤＮＡおよびＲＮＡは一本鎖、二本鎖、三重鎖、または四重鎖であってもよい。別の実施形態ではこれらの用語は他の種類の骨格を含むが、同じ塩基を含む人工核酸も含み得る。１つの実施形態ではこの人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチド骨格およびヌクレオチド塩基を含有し、１つの実施形態ではＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の実施形態ではヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態ではヌクレオチドは、１つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では人工核酸は当技術分野において知られている天然核酸のリン酸骨格の他のあらゆる変異形を含有する。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は当業者に知られており、例えばＮｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７、およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記載される。核酸の生産および使用が当業者に知られており、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  （２００１），  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ編、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  （２００３）  Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｃ．  Ｆａｒｅｅｄに記載される。
【０４２９】
別の実施形態では本明細書において提供される核酸分子はエピソームベクターまたはプラスミドベクターから発現する。別の実施形態ではそのプラスミドは抗生物質選択が無い状態で組換え型リステリア株において安定的に維持される。別の実施形態ではそのプラスミドは組換え型リステリアに対して抗生物質耐性を付与しない。
【０４３０】
１つの実施形態では本明細書において提供される免疫原性ポリペプチドまたはその断片はＡｃｔＡタンパク質またはその断片である。１つの実施形態ではＡｃｔＡタンパク質は配列番号１１で表される配列を含む：
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGPNNNNNNGEQTGNVAINEEASGVDRPTLQVERRHPGLSSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKANKRKVAKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLKANQKPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPTPSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIMRETAPSLDSSFTSGDLASLRSAINRHSENFSDFPLIPTEEELNGRGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDRLADLRDRGTGKHSRNAGFLPLNPFISSPVPSLTPKVPKISAPALISDITKKAPFKNPSQPLNVFNKKTTTKTVTKKPTPVKTAPKLAELPATKPQETVLRENKTPFIEKQAETNKQSINMPSLPVIQKEATESDKEEMKPQTEEKMVEESESANNANGKNRSAGIEEGKLIAKSAEDEKAKEEPGNHTTLILAMLAIGVFSLGAFIKIIQLRKNN  （配列番号１１）。
【０４３１】
この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から切断される。１つの実施形態ではＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは上記配列番号１１のＡＡ１〜２９のシグナル配列を含む。別の実施形態ではＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは上記配列番号１１のＡＡ１〜２９のシグナル配列を含まない。
【０４３２】
１つの実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片を含む。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片である。１つの実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１２で表される配列を含む：
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP  （配列番号１２）。
【０４３３】
別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片は配列番号１２で表される配列を含む。
【０４３４】
別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１３で表される配列を含む：
MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKG  （配列番号１３）。
【０４３５】
別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片は当技術分野において知られている他のあらゆるＡｃｔＡ断片である。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片は免疫原性断片である。
【０４３６】
別の実施形態ではＡｃｔＡタンパク質は配列番号１４で表される配列を含む：
M  G  L  N  R  F  M  R  A  M  M  V  V  F  I  T  A  N  C  I  T  I  N  P  D  I  I  F  A  A  T  D  S  E  D  S  S  L  N  T  D  E  W  E  E  E  K  T  E  E  Q  P  S  E  V  N  T  G  P  R  Y  E  T  A  R  E  V  S  S  R  D  I  E  E  L  E  K  S  N  K  V  K  N  T  N  K  A  D  L  I  A  M  L  K  A  K  A  E  K  G  P  N  N  N  N  N  N  G  E  Q  T  G  N  V  A  I  N  E  E  A  S  G  V  D  R  P  T  L  Q  V  E  R  R  H  P  G  L  S  S  D  S  A  A  E  I  K  K  R  R  K  A  I  A  S  S  D  S  E  L  E  S  L  T  Y  P  D  K  P  T  K  A  N  K  R  K  V  A  K  E  S  V  V  D  A  S  E  S  D  L  D  S  S  M  Q  S  A  D  E  S  T  P  Q  P  L  K  A  N  Q  K  P  F  F  P  K  V  F  K  K  I  K  D  A  G  K  W  V  R  D  K  I  D  E  N  P  E  V  K  K  A  I  V  D  K  S  A  G  L  I  D  Q  L  L  T  K  K  K  S  E  E  V  N  A  S  D  F  P  P  P  P  T  D  E  E  L  R  L  A  L  P  E  T  P  M  L  L  G  F  N  A  P  T  P  S  E  P  S  S  F  E  F  P  P  P  P  T  D  E  E  L  R  L  A  L  P  E  T  P  M  L  L  G  F  N  A  P  A  T  S  E  P  S  S  F  E  F  P  P  P  P  T  E  D  E  L  E  I  M  R  E  T  A  P  S  L  D  S  S  F  T  S  G  D  L  A  S  L  R  S  A  I  N  R  H  S  E  N  F  S  D  F  P  L  I  P  T  E  E  E  L  N  G  R  G  G  R  P  T  S  E  E  F  S  S  L  N  S  G  D  F  T  D  D  E  N  S  E  T  T  E  E  E  I  D  R  L  A  D  L  R  D  R  G  T  G  K  H  S  R  N  A  G  F  L  P  L  N  P  F  I  S  S  P  V  P  S  L  T  P  K  V  P  K  I  S  A  P  A  L  I  S  D  I  T  K  K  A  P  F  K  N  P  S  Q  P  L  N  V  F  N  K  K  T  T  T  K  T  V  T  K  K  P  T  P  V  K  T  A  P  K  L  A  E  L  P  A  T  K  P  Q  E  T  V  L  R  E  N  K  T  P  F  I  E  K  Q  A  E  T  N  K  Q  S  I  N  M  P  S  L  P  V  I  Q  K  E  A  T  E  S  D  K  E  E  M  K  P  Q  T  E  E  K  M  V  E  E  S  E  S  A  N  N  A  N  G  K  N  R  S  A  G  I  E  E  G  K  L  I  A  K  S  A  E  D  E  K  A  K  E  E  P  G  N  H  T  T  L  I  L  A  M  L  A  I  G  V  F  S  L  G  A  F  I  K  I  I  Q  L  R  K  N  N（配列番号１４）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から切断される。１つの実施形態ではＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは配列番号１５４のＡＡ１〜２９のシグナル配列を含む。別の実施形態ではＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは配列番号１４のＡＡ１〜２９のシグナル配列を含まない。
【０４３７】
別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１５で表される配列を含む：
A  T  D  S  E  D  S  S  L  N  T  D  E  W  E  E  E  K  T  E  E  Q  P  S  E  V  N  T  G  P  R  Y  E  T  A  R  E  V  S  S  R  D  I  E  E  L  E  K  S  N  K  V  K  N  T  N  K  A  D  L  I  A  M  L  K  A  K  A  E  K  G  P  N  N  N  N  N  N  G  E  Q  T  G  N  V  A  I  N  E  E  A  S  G（配列番号１５）。別の実施形態では配列番号１５で表される短縮型ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれる。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では配列番号１５は全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは配列番号１４の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では配列番号１５は配列番号１４の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸１２２までを含む。
【０４３８】
別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１６で表される配列を含む：
A  T  D  S  E  D  S  S  L  N  T  D  E  W  E  E  E  K  T  E  E  Q  P  S  E  V  N  T  G  P  R  Y  E  T  A  R  E  V  S  S  R  D  I  E  E  L  E  K  S  N  K  V  K  N  T  N  K  A  D  L  I  A  M  L  K  A  K  A  E  K  G  P  N  N  N  N  N  N  G  E  Q  T  G  N  V  A  I  N  E  E  A  S  G  V  D  R  P  T  L  Q  V  E  R  R  H  P  G  L  S  S  D  S  A  A  E  I  K  K  R  R  K  A  I  A  S  S  D  S  E  L  E  S  L  T  Y  P  D  K  P  T  K  A  N  K  R  K  V  A  K  E  S  V  V  D  A  S  E  S  D  L  D  S  S  M  Q  S  A  D  E  S  T  P  Q  P  L  K  A  N  Q  K  P  F  F  P  K  V  F  K  K  I  K  D  A  G  K  W  V  R  D  K（配列番号１６）。別の実施形態では配列番号１６で表される短縮型ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２と呼ばれる。別の実施形態では配列番号１６で表される短縮型ＡｃｔＡはＬＡ２２９と呼ばれる。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは完全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。別の実施形態では配列番号１６は完全長ＡｃｔＡ配列の約アミノ酸３０から約アミノ酸２２９までを含む。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは配列番号１４の約アミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。別の実施形態では配列番号１６は配列番号１４のアミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。
【０４３９】
別の実施形態では本明細書に開示される短縮型ＡｃｔＡ配列はＮ末端においてｈｌｙシグナルペプチドにさらに融合している。別の実施形態ではｈｌｙシグナルペプチドに融合しているその短縮型ＡｃｔＡは配列番号１３８を含む：
M  K  K  I  M  L  V  F  I  T  L  I  L  V  S  L  P  I  A  Q  Q  T  E  A  S  R  A  T  D  S  E  D  S  S  L  N  T  D  E  W  E  E  E  K  T  E  E  Q  P  S  E  V  N  T  G  P  R  Y  E  T  A  R  E  V  S  S  R  D  I  E  E  L  E  K  S  N  K  V  K  N  T  N  K  A  D  L  I  A  M  L  K  A  K  A  E  K  G  P  N  N  N  N  N  N  G  E  Q  T  G  N  V  A  I  N  E  E  A  S  G  V  D  R  P  T  L  Q  V  E  R  R  H  P  G  L  S  S  D  S  A  A  E  I  K  K  R  R  K  A  I  A  S  S  D  S  E  L  E  S  L  T  Y  P  D  K  P  T  K  A  N  K  R  K  V  A  K  E  S  V  V  D  A  S  E  S  D  L  D  S  S  M  Q  S  A  D  E  S  T  P  Q  P  L  K  A  N  Q  K  P  F  F  P  K  V  F  K  K  I  K  D  A  G  K  W  V  R  D  K.
【０４４０】
別の実施形態ではｈｌｙシグナルペプチドに融合している短縮型ＡｃｔＡは、配列番号１３９を含む配列によってコードされる：
【化１】
2018515588.tif 000003
（配列番号１３９）。別の実施形態では配列番号１３９は、ＸｂａＩ用の特有の制限酵素部位を作製するために使用されるリンカー領域（太字、斜字体のテキストを参照のこと）をコードし、それにより様々なポリペプチド、異種抗原等をシグナル配列の後にクローニングすることができる配列を含む。よって、当業者は、シグナルペプチダーゼがそのリンカー領域の前にある配列に作用してシグナルペプチドを切断することを理解する。
【０４４１】
別の実施形態では、短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１７で表される配列を含む：
A  T  D  S  E  D  S  S  L  N  T  D  E  W  E  E  E  K  T  E  E  Q  P  S  E  V  N  T  G  P  R  Y  E  T  A  R  E  V  S  S  R  D  I  E  E  L  E  K  S  N  K  V  K  N  T  N  K  A  D  L  I  A  M  L  K  A  K  A  E  K  G  P  N  N  N  N  N  N  G  E  Q  T  G  N  V  A  I  N  E  E  A  S  G  V  D  R  P  T  L  Q  V  E  R  R  H  P  G  L  S  S  D  S  A  A  E  I  K  K  R  R  K  A  I  A  S  S  D  S  E  L  E  S  L  T  Y  P  D  K  P  T  K  A  N  K  R  K  V  A  K  E  S  V  V  D  A  S  E  S  D  L  D  S  S  M  Q  S  A  D  E  S  T  P  Q  P  L  K  A  N  Q  K  P  F  F  P  K  V  F  K  K  I  K  D  A  G  K  W  V  R  D  K  I  D  E  N  P  E  V  K  K  A  I  V  D  K  S  A  G  L  I  D  Q  L  L  T  K  K  K  S  E  E  V  N  A  S  D  F  P  P  P  P  T  D  E  E  L  R  L  A  L  P  E  T  P  M  L  L  G  F  N  A  P  T  P  S  E  P  S  S  F  E  F  P  P  P  P  T  D  E  E  L  R  L  A  L  P  E  T  P  M  L  L  G  F  N  A  P  A  T  S  E  P  S  S（配列番号１７）。別の実施形態では配列番号１７で表される短縮型ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３と呼ばれる。別の実施形態ではこの短縮型ＡｃｔＡは全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では配列番号１７は全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは配列番号１４の最初の約３０個目のアミノ酸からアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では配列番号１７は配列番号１４の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３３２までを含む。
【０４４２】
別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１８で表される配列を含む：
A  T  D  S  E  D  S  S  L  N  T  D  E  W  E  E  E  K  T  E  E  Q  P  S  E  V  N  T  G  P  R  Y  E  T  A  R  E  V  S  S  R  D  I  E  E  L  E  K  S  N  K  V  K  N  T  N  K  A  D  L  I  A  M  L  K  A  K  A  E  K  G  P  N  N  N  N  N  N  G  E  Q  T  G  N  V  A  I  N  E  E  A  S  G  V  D  R  P  T  L  Q  V  E  R  R  H  P  G  L  S  S  D  S  A  A  E  I  K  K  R  R  K  A  I  A  S  S  D  S  E  L  E  S  L  T  Y  P  D  K  P  T  K  A  N  K  R  K  V  A  K  E  S  V  V  D  A  S  E  S  D  L  D  S  S  M  Q  S  A  D  E  S  T  P  Q  P  L  K  A  N  Q  K  P  F  F  P  K  V  F  K  K  I  K  D  A  G  K  W  V  R  D  K  I  D  E  N  P  E  V  K  K  A  I  V  D  K  S  A  G  L  I  D  Q  L  L  T  K  K  K  S  E  E  V  N  A  S  D  F  P  P  P  P  T  D  E  E  L  R  L  A  L  P  E  T  P  M  L  L  G  F  N  A  P  T  P  S  E  P  S  S  F  E  F  P  P  P  P  T  D  E  E  L  R  L  A  L  P  E  T  P  M  L  L  G  F  N  A  P  A  T  S  E  P  S  S  F  E  F  P  P  P  P  T  E  D  E  L  E  I  M  R  E  T  A  P  S  L  D  S  S  F  T  S  G  D  L  A  S  L  R  S  A  I  N  R  H  S  E  N  F  S  D  F  P  L  I  P  T  E  E  E  L  N  G  R  G  G  R  P  T  S  E（配列番号１８）。別の実施形態では配列番号１８で表される短縮型ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ４と呼ばれる。別の実施形態ではこの短縮型ＡｃｔＡは全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では配列番号１８は全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは配列番号１４の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では配列番号１８は配列番号１４の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３９９までを含む。
【０４４３】
別の実施形態では「短縮型ＡｃｔＡ」または「ΔＡｃｔＡ」はＰＥＳＴドメインを含むＡｃｔＡ断片を指す。別の実施形態ではこれらの用語はＰＥＳＴ配列を含むＡｃｔＡ断片を指す。
別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質をコードする組換え型ヌクレオチドは配列番号１９で表される配列を含む：
atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca.
【０４４４】
別の実施形態ではその組換え型ヌクレオチドは配列番号１９で表される配列を有する。別の実施形態ではその組換え型ヌクレオチドはＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする他のあらゆる配列を含む。
【０４４５】
別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡタンパク質の最初の約１００ＡＡから構成される。
【０４４６】
別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３３８から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜４５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６３９から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３３８から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜４００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜４５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜５００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜５５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜６０４から構成される。
【０４４７】
別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有する。別の実施形態ではそれらの残基番号は上に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が本明細書において利用されるＡｃｔＡタンパク質と比べて挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片は当技術分野において知られている他のあらゆるＡｃｔＡ断片である。
【０４４８】
別の実施形態では相同ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ配列（例えば、配列番号１１〜１８のうちの１つ）に対する７０％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する７２％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する７５％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する７８％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する８０％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する８２％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する８３％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する８５％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する８７％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する８８％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する９０％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する９２％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する９３％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する９５％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する９６％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する９７％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する９８％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する９９％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号  １１〜１８のうちの１つに対する１００％の同一性を指す。
【０４４９】
当業者は、本明細書において提供されるあらゆる核酸配列に対して参照されるときの「相同性」という用語は、対応する天然核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチドのパーセンテージを包含し得ることを理解する。
【０４５０】
１つの実施形態では相同性は当技術分野において充分に記述される方法によって、配列アライメントについてのコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム分析は、例えば、ＢＬＡＳＴパッケージ、ＤＯＭＡＩＮパッケージ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）パッケージ、ＧＥＮＰＥＰＴパッケージ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどの利用可能なあらゆる数のソフトウェアパッケージの利用を含み得る。
【０４５１】
別の実施形態では「相同性」は、本明細書において提供される配列から選択される配列に対する６８％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では「相同性」は、本明細書において提供される配列から選択される配列に対する７０％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では「相同性」は、本明細書において提供される配列から選択される配列に対する７２％よりも高い同一性を指す。別の実施形態ではその同一性は７５％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は７８％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８０％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８２％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８３％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８５％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８７％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８８％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９０％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９２％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９３％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９５％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９６％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９７％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９８％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９９％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は１００％である。
【０４５２】
別の実施形態では相同性は候補配列のハイブリダイゼーションの測定を介して決定され、そのハイブリダイゼーションの方法は当技術分野において充分に記述されている（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．編、（１９８５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙを参照されたい）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、天然カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの相補物に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行され得る。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの断片化変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中における４２℃で一晩のインキュベーションである。
【０４５３】
１つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は抗生物質耐性遺伝子を持っていない。
【０４５４】
１つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリアはファゴリソソームを回避する能力を有する。
【０４５５】
１つの実施形態ではリステリアゲノムは内因性ａｃｔＡ遺伝子の欠失を含み、この遺伝子は１つの実施形態では病原性因子である。１つの実施形態では異種抗原または抗原性ポリペプチドがリステリア染色体中にＬＬＯとインフレームで組み込まれる。別の実施形態ではその組み込まれた核酸分子は、ＡｃｔＡとインフレームでａｃｔＡ座位に組み込まれている。別の実施形態ではＡｃｔＡをコードする染色体核酸は、抗原をコードする核酸分子によって置き換えられる。
【０４５６】
１つの実施形態では本明細書において提供されるペプチドは１つ以上のネオエピトープを含む。１つの実施形態では本明細書において提供されるペプチドは抗原によって構成される。別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドは抗原断片である。１つの実施形態では本明細書において提供される抗原は１つ以上のネオエピトープを含む。別の実施形態ではその抗原は異種抗原または自己抗原である。１つの実施形態では本明細書において提供される異種抗原または自己抗原は腫瘍関連抗原である。当業者は、「異種」という用語が、細菌が天然または通常では発現しない抗原またはその一部を指すことを理解する。１つの実施形態では異種抗原は、リステリア株が天然または通常では発現しない抗原を含む。別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は天然の腫瘍関連抗原である。別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は合成腫瘍関連抗原である。別の実施形態ではその腫瘍関連抗原はキメラ腫瘍関連抗原である。さらに別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は１つ以上のネオエピトープを含む。さらに別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は新抗原である。
【０４５７】
１つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリアは１つ以上のペプチドを含む組換えポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含み、前記１つ以上のペプチドが１つ以上のネオエピトープを含む。別の実施形態ではその組換えポリペプチドは、本明細書において提供されるペプチドに融合した短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列をさらに含む。
【０４５８】
別の実施形態では本明細書において提供される核酸分子は短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列を含む組換えポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含み、その短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列ペプチドは異種抗原に融合していない。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは短縮型ＬＬＯタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは短縮型ＡｃｔＡタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは短縮型ＬＬＯタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは短縮型ＡｃｔＡタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは短縮型ＬＬＯタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質またはその断片からなる短縮型ＡｃｔＡタンパク質をコードする。
【０４５９】
当業者は、「抗原」、「抗原断片」、「抗原部分」、「異種タンパク質」、「異種抗原」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」、「抗原性ポリペプチド」という用語、またはそれらの文法的に同等の用語が本明細書において互換的に使用され、その用語は、宿主内に存在すると、または別の実施形態では宿主によって検出されるとプロセッシングを受け、且つ、対象の細胞内に存在するＭＨＣクラスＩ分子および／またはクラスＩＩ分子上に提示され、その提示が免疫応答の開始につながる本明細書に記載されるポリペプチド、ペプチドまたは組換えペプチドを指すことを理解する。１つの実施形態ではその抗原は宿主に対して外来のものであり得る。別の実施形態ではその抗原は宿主内に存在してもよいが、免疫寛容のために宿主によってこの抗原に対する免疫応答が誘発されない。別の実施形態ではその抗原は１つ以上の  ネオエピトープを含む新抗原であり、１つ以上のネオエピトープがＴ細胞エピトープである。別の実施形態ではその抗原またはそのペプチド断片はＴ細胞エピトープである１つ以上のネオエピトープを含む。
【０４６０】
別の実施形態では抗原は少なくとも１つのネオエピトープを含む。１つの実施形態では抗原は少なくとも１つのネオエピトープを含む新抗原である。１つの実施形態ではネオエピトープは免疫系によって以前に認識されていないエピトープである。新抗原は腫瘍抗原と関連することが多く、癌原細胞中に見出される。新抗原および、拡大すると、新抗原決定基（ネオエピトープ）は、タンパク質がグリコシル化、リン酸化、またはタンパク質分解などの生化学経路内でさらに修飾されると形成される場合がある。これはそのタンパク質の構造変化により新または「ネオ」エピトープを産生することができる。
【０４６１】
１つの実施形態では本明細書において提供されるリステリアは、キメラタンパク質をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質が
a.  細菌分泌シグナル配列、
b.  ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、
c.  前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含み、且つ、
（ａ）〜（ｃ）の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記１つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されているか、または機能的であるように連結されている前記コンストラクトを含む。
【０４６２】
別の実施形態では本明細書において提供される細菌性シグナル配列はリステリアのシグナル配列であり、それは別の実施形態ではｈｌｙシグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列である。別の実施形態ではその細菌性シグナル  配列は当技術分野において知られている他のあらゆるシグナル配列である。別の実施形態ではミニ遺伝子核酸コンストラクトを含む組換え型リステリアは、各オープン・リーディング・フレーム間のシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つ以上のオープン・リーディング・フレームをさらに含む。別の実施形態ではミニ遺伝子核酸コンストラクトを含む組換え型リステリアは、各オープン・リーディング・フレーム間のシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された１〜４つのオープン・リーディング・フレームをさらに含む。別の実施形態では各オープン・リーディング・フレームが異なるペプチドをコードする。
【０４６３】
別の実施形態では細菌分泌シグナル配列（ＳＳ）、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、およびペプチド配列をコードするオープン・リーディング・フレームを含む組換え型核酸コンストラクトを含む組換え型弱毒化リステリア株が本明細書において提供される。別の実施形態ではその核酸コンストラクトは、細菌分泌シグナル配列、ユビキチンタンパク質、およびペプチド配列を含むキメラタンパク質をコードする。１つの実施形態ではそのキメラタンパク質は次（ＳＳ−Ｕｂ−ペプチド）のように配置される。
【０４６４】
１つの実施形態ではその核酸コンストラクトは２つの終止コドンが続くペプチド部分のカルボキシ末端に対応するコドンを含んでタンパク質合成の終了を確実にする。
【０４６５】
１つの実施形態では本明細書に記載される組成物および方法において提供されるミニ遺伝子核酸コンストラクトは、カルボキシ末端に別個のペプチド部分を含有する多数の組換えタンパク質を促進するように設計されている発現系を含む。これは、１つの実施形態では、それらの細菌分泌シグナル配列-ユビキチン-ペプチド（ＳＳ−Ｕｂ−ペプチド）コンストラクトのうちの１つをコードする配列をテンプレートとして利用するＰＣＲ反応により達成される。１つの実施形態では、Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域にまで延びるプライマーを使用し、且つ、そのプライマーの３’端に所望のペプチド配列のためのコドンを導入すると、一度のＰＣＲ反応で新しいＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列を生成することができる（本明細書の実施例を参照のこと）。細菌プロモーターと細菌分泌シグナル配列の最初の数ヌクレオチドをコードする５’プライマーは、全てのコンストラクトに対して同一であってもよい。このコンストラクトの概略図が本明細書の図２６Ａ〜Ｃに提示されている。
【０４６６】
１つの実施形態では、本明細書において提供される組換えポリペプチドをコードする核酸はシグナルペプチドまたは配列も含む。１つの実施形態では、本明細書において提供される核酸コンストラクトまたは核酸分子によってコードされる細菌分泌シグナル配列はリステリア分泌シグナル配列である。別の実施形態では本発明の方法および組成物の融合タンパク質はリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）由来のＬＬＯシグナル配列を含む。当業者は、本明細書において提供される１つ以上のネオエピトープを含む抗原またはペプチドが例えばヘモリジン（ｈｌｙ）シグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列のようなシグナル配列の使用により発現し得ることを理解する。あるいは、外来遺伝子は、例えば、融合タンパク質を作製することなくＬ．モノサイトゲネスプロモーターの下流で発現可能である。別の実施形態ではそのシグナルペプチドは細菌性（リステリア性または非リステリア性）である。１つの実施形態ではそのシグナルペプチドはその細菌に固有のものである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはその細菌にとって外来のものである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはリステリア・モノサイトゲネス由来のシグナルペプチド、例えばｓｅｃＡ１シグナルペプチドである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはラクトコッカス・ラクティス由来のＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはバチルス・アントラシス由来の保護抗原シグナルペプチドである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはリステリア・モノサイトゲネス由来のｓｅｃＡ２シグナルペプチド、例えばｐ６０シグナルペプチドである。加えて、その組換え型核酸分子はｐ６０をコードする第３のポリヌクレオチド配列またはその断片を所望により含む。別の実施形態ではそのシグナルペプチドは、バチルス・サブチリスＴａｔシグナルペプチドなどのＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）である。１つの実施形態ではそのシグナルペプチドは前記組換えポリペプチドをコードする同じ翻訳リーディングフレーム内にある。
【０４６７】
別の実施形態では前記分泌シグナル配列はリステリアタンパク質由来である。別の実施形態ではその分泌シグナルはＡｃｔＡ３００分泌シグナルである。別の実施形態ではその分泌シグナルはＡｃｔＡ１００分泌シグナルである。
【０４６８】
１つの実施形態では前記核酸コンストラクトはユビキチンタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む。１つの実施形態ではそのユビキチンは全長タンパク質である。当業者は、本明細書において提供される発現コンストラクト内のユビキチン（本明細書において提供される核酸コンストラクトより発現されたユビキチン）は宿主細胞の細胞質に侵入すると加水分解酵素の作用によりカルボキシ末端でその核酸コンストラクトより発現されたその組換えキメラタンパク質の残りの部分から切断されることを理解する。これによりそのペプチド部分のアミノ末端が遊離し、宿主細胞の細胞質中にペプチド（長さはその特定のペプチドに依存する）を産生する。
【０４６９】
１つの実施形態では本明細書において提供される核酸コンストラクトによってコードされるペプチドは、長さが８〜１０アミノ酸（ＡＡ）である。別の実施形態ではそのペプチドは１０〜２０ＡＡ長である。別の実施形態ではそのペプチドは２１〜３０ＡＡ長である。別の実施形態ではそのペプチドは３１〜５０ＡＡ長である。別の実施形態ではそのペプチドは５１〜１００ＡＡ長である。
【０４７０】
１つの実施形態では本明細書において提供される核酸分子は代謝酵素をコードする第２オープン・リーディング・フレームをさらに含む。別の実施形態ではその代謝酵素は、前記組換え型リステリア株の染色体の中で失われている内在性遺伝子を相補する。別の実施形態ではその代謝酵素は、前記組換え型リステリア株の染色体内で突然変異が形成されている内在性遺伝子を相補する。別の実施形態ではその第２オープン・リーディング・フレームによってコードされる代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。別の実施形態ではその第２オープン・リーディング・フレームによってコードされる代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）である。別の実施形態では本明細書において提供されるリステリア株は内在性ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子内に突然変異を含む。別の実施形態ではそのリステリアはｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を欠いている。
【０４７１】
別の実施形態では本発明の方法および組成物の核酸分子は機能可能であるようにプロモーター／調節性配列に連結されている。別の実施形態では本発明の方法および組成物の第１オープン・リーディング・フレームは機能可能であるようにプロモーター／調節性配列に連結されている。別の実施形態では本発明の方法および組成物の第２オープン・リーディング・フレームは機能可能であるようにプロモーター／調節性配列に連結されている。別の実施形態ではそれらのオープン・リーディング・フレームの各々が機能可能であるようにプロモーター／調節性配列に連結されている。
【０４７２】
別の実施形態では「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌の持続的増殖のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの酵素は栄養素の合成に要求される。
【０４７３】
別の実施形態では前記組換え型リステリアは弱毒化栄養要求性株である。別の実施形態ではその組換え型リステリアは、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８１１４４１４号明細書に記載されるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７株である。
【０４７４】
１つの実施形態では前記弱毒化株はＬｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、リステリア免疫療法ベクターに基づき、病原性遺伝子であるａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化されており、且つ、ｄａｌ遺伝子の相補によってインビボおよびインビトロでの望ましい異種抗原または短縮型ＬＬＯ発現のためのプラスミドを保持する。
【０４７５】
別の実施形態では前記弱毒化株はＬｍｄｄＡである。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍΔａｃｔＡである。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍΔＰｒｆＡである。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍΔＰｒｆＡ＊である。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＢである。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＡである。別の実施形態ではその株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態ではこの株は、リステリアベースの免疫療法の固有の特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態ではこの株はＥＧＤリステリアバックボーンから作られる。別の実施形態では本発明で使用される株は非溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株である。
【０４７６】
別の実施形態では前記リステリア株は栄養要求性突然変異体である。別の実施形態ではそのリステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
【０４７７】
１つの実施形態ではＤ−アラニン欠損ＡＡ株を、例えば、当業者に周知の多数の方法で作製することができ、それらの方法には欠失突然変異形成、挿入突然変異形成、およびフレームシフト突然変異、タンパク質の早期終止を引き起こす突然変異、または遺伝子発現に影響する調節性配列の突然変異を生成することになる突然変異形成が含まれる。別の実施形態では、組換えＤＮＡ技術を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射線照射を用い、その後で突然変異体を選択する伝統的な突然変異形成技術を使用して突然変異形成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰に伴われる低い可能性のため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンについての変異体は、単純な実験室培養アッセイにおいてＤ−アラニンの非存在下で増殖する能力について試験される場合がある。別の実施形態では、この化合物の非存在下で増殖することができない変異体がさらなる研究のために選択される。
【０４７８】
別の実施形態では、本明細書において提示されるように、前述のＤ−アラニン関連遺伝子に加えて代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子がリステリアの突然変異形成の標的として使用されてもよい。
【０４７９】
別の実施形態ではその代謝酵素は、前記組換え型細菌株の染色体の残りの部分に欠けている内在性代謝遺伝子を相補する。１つの実施形態ではその内在性代謝遺伝子は染色体内で突然変異が形成される。別の実施形態ではその内在性代謝遺伝子は染色体から欠失している。別の実施形態ではその代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態ではその代謝酵素はその組換え型リステリア株内で細胞壁合成に使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態ではその代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態ではその代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。本明細書において提供される方法および組成物の別々の実施形態により各可能性が表される。
【０４８０】
１つの実施形態では前記栄養要求性リステリア株は、その栄養要求性リステリア株の栄養要求性を相補する代謝酵素を含むエピソーム性発現ベクターを含む。別の実施形態では、そのコンストラクトはエピソーム様式でそのリステリア株内に含有される。別の実施形態ではその外来抗原はその組換え型リステリア株が保持するプラスミドベクターから発現される。別の実施形態ではそのエピソーム性発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。１つの実施形態では本明細書において提供される方法および組成物の抗原はＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドに融合している。
【０４８１】
別の実施形態では前記リステリア株はアミノ酸（ＡＡ）代謝酵素が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はＤグルタミン酸シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はｄａｔ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はｄａｌ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はｄｇａ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はジアミノピメリン酸合成に関与する遺伝子が欠損している。ＣｙｓＫ。別の実施形態ではその遺伝子はビタミンＢ１２非依存的メチオニンシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態ではその遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態ではその遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｈｒＣである。別の実施形態ではそのリステリア株は上述の遺伝子のうちの１つ以上が欠損している。
【０４８２】
別の実施形態ではそのリステリア株はシンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではその遺伝子はＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態ではその遺伝子はｆｏｌＰである。別の実施形態ではその遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態ではその遺伝子はｉｓｐＦである。別の実施形態ではその遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態ではその遺伝子はｈｉｓＨである。別の実施形態ではその遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態ではその遺伝子はリボソームラージサブユニット・シュードウリジンシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態ではその遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はｃｏｂＳである。別の実施形態ではその遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｃｂｉＤである。別の実施形態ではその遺伝子はウロポルフィリン−ＩＩＩ  Ｃ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノゲン−ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｃｏｂＱである。別の実施形態ではその遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｒｕＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態ではその遺伝子はｍｖａＳである。別の実施形態ではその遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態ではその遺伝子はｉｓｐＧである。別の実施形態ではその遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態ではその遺伝子はクエン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｇＪである。別の実施形態ではその遺伝子は３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はインドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成要素である。別の実施形態ではその遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態ではその遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態ではその遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｃａｒＡである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態ではその遺伝子はｍｇｓＡである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｈｅｐＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｒｌｕＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態ではその遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態ではその遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態ではその遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態ではその遺伝子はシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態ではその遺伝子���ｔｒｕＡである。別の実施形態ではその遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態ではその遺伝子はａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２、等々）である。
【０４８３】
別の実施形態ではその遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｏＡである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｏＤである。別の実施形態ではその遺伝子はｐｌｃＢである。
【０４８４】
別の実施形態ではそのリステリア株はペプチドトランスポーターが欠損している。別の実施形態ではその遺伝子はＡＢＣトランスポーター／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣトランスポーター／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣトランスポーター／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子は亜鉛ＡＢＣトランスポーター／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子は糖ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はリン酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はＺＩＰ亜鉛トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は硫酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチドトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はマグネシウムトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は蟻酸／亜硝酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はスペルミジン／プトレシンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はＮａ／Ｐｉコトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は糖リン酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はグルタミンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はメジャーファシリテイターファミリートランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はモリブデンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はテイコ酸ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はコバルトＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はアンモニウムトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はアミノ酸ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は細胞分裂ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はマンガンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は鉄化合物ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はマルトース／マルトデキストリンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は上記のタンパク質のうちの１つのサブユニットである。
【０４８５】
１つの実施形態では、組換え型リステリアを得るため、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書において提供される。別の実施形態ではリステリアを形質転換するために使用される本明細書において提供されるその核酸は、病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその核酸分子はリステリアゲノムの中に組み込まれ、非機能性病原性遺伝子を担持する。別の実施形態ではその病原性遺伝子はその組換え型リステリア内で突然変異が形成される。さらに別の実施形態ではその核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内在性遺伝子を不活性化するために使用される。さらに別の実施形態ではその病原性遺伝子はａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、ならびにｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、またはｐｒｆＡ遺伝子である。当業者は、病原性遺伝子は組換え型リステリア内の病原性と関連付けられる当技術分野において知られているあらゆる遺伝子であり得ることを理解すべきである。
【０４８６】
さらに別の実施形態ではそのリステリア株はｉｎｌＡ突然変異体、ｉｎｌＢ突然変異体、ｉｎｌＣ突然変異体、ｉｎｌＪ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ａｃｔＡ突然変異体、ｄａｌ／ｄａｔ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、またはｐｌｃＡとｐｌｃＢの両方を欠いている二重変異体、またはａｃｔＡとｉｎｌＢの両方を欠いている二重変異体である。別の実施形態ではそのリステリアはこれらの遺伝子の欠失または突然変異を個別に、または組み合わせて含む。別の実施形態では本明細書において提供されるリステリアは遺伝子のそれぞれ１つずつを欠いている。別の実施形態では本明細書において提供されるリステリアは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む本明細書において提供されるいずれかの遺伝子のうちの少なくとも１遺伝子、最高で１０遺伝子を欠いている。別の実施形態ではｐｒｆＡ突然変異体はＤ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異体である。
【０４８７】
１つの実施形態では前記弱毒化生リステリアは組換え型リステリアである。別の実施形態ではその組換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態ではその組換え型リステリアは、ゲノムａｃｔＡ遺伝子およびゲノムインターナリンＣ遺伝子の突然変異または欠失を含む。１つの実施形態では隣接する細胞へのリステリアの移行はその過程に関与するａｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、それにより免疫療法のバックボーンとしての高い免疫原性と有用性を伴う予想外に高レベルの弱毒化が生じる。
【０４８８】
１つの実施形態ではその代謝遺伝子、病原性遺伝子などはそのリステリア株の染色体内で欠けている。別の実施形態ではその代謝遺伝子、病原性遺伝子などはそのリステリア株の染色体内および何らかのエピソーム性遺伝要素内で欠けている。別の実施形態ではその代謝遺伝子、病原性遺伝子などはその病原性株のゲノム内で欠けている。１つの実施形態ではその病原性遺伝子は染色体内で突然変異が形成される。別の実施形態ではその病原性遺伝子は染色体から欠失している。
【０４８９】
１つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は弱毒化されている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはａｃｔＡ病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはｐｒｆＡ病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはｉｎｌＢ遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはａｃｔＡ遺伝子とｉｎｌＢ遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性ｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性ｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡ遺伝子とｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡ遺伝子とｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＢ遺伝子、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＢ遺伝子、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＢ遺伝子、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は以下の遺伝子、すなわち、ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢのうちのいずれか一遺伝子または遺伝子の組合せの不活性化突然変異を含む。
【０４９０】
当業者は、「突然変異」という用語およびその文法的に同等の用語が配列（核酸配列またはアミノ酸配列）に対するあらゆるタイプの突然変異または修飾を含み、これには欠失突然変異、短縮化、不活性化、分断、または転座が含まれることを理解する。これらのタイプの突然変異は当技術分野においてよく知られている。
【０４９１】
１つの実施形態では、本明細書において提供される代謝酵素または相補性遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するため、形質転換された栄養要求性細菌はそのアミノ酸代謝遺伝子またはその相補性遺伝子の発現について選別を行う培地上で培養される。別の実施形態ではＤ−グルタミン酸合成について栄養要求性の細菌がＤ−グルタミン酸合成遺伝子を含むプラスミドで形質転換され、Ｄ−グルタミン酸が無い状態でその栄養要求性細菌が増殖し、一方でそのプラスミドで形質転換されなかった栄養要求性細菌、またはＤ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は増殖しない。別の実施形態ではＤ−グルタミン酸合成について栄養要求性の細菌が形質転換され、本発明のプラスミドを発現すると、そのプラスミドがＤ−アラニン合成のアミノ酸代謝酵素をコードする核酸を含む場合、Ｄ−アラニンが無い状態でその細菌が増殖する。必要な増殖因子、添加物、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含んでいる、または欠いている適切な培地を作製するためのそのような方法は当技術分野においてよく知られており、また市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）。本発明の別個の実施形態によって各方法が表される。
【０４９２】
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が一度適切な培地上で選択されると、この細菌は選択圧の存在下で繁殖する。そのような繁殖は栄養要求性因子を有しない培地でのその細菌の増殖を含む。その栄養要求性細菌内にアミノ酸代謝酵素を発現するそのプラスミドが存在することにより、そのプラスミドがその細菌と共に複製し、そうしてそのプラスミドを保持する細菌が継続的に選択されることが確実になる。当業者は本開示および本明細書の方法を教授されると、そのプラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによってそのリステリア免疫療法ベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
【０４９３】
当業者は、別の実施形態では他の栄養要求性株および相補系を本発明に関して使用するためにそれらが適合されることを理解する。
【０４９４】
１つの実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は相互に直接融合している。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片をコードする遺伝子および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は機能可能であるようにリンカーペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は異種抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は単独で、すなわち融合されていない形態で発現および使用される。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は融合タンパク質の最Ｎ末端部分である。別の実施形態では短縮型ＬＬＯは、Ｎ末端ＬＬＯを得るためにＣ末端側において切断される。別の実施形態では短縮型ＬＬＯは非溶血性ＬＬＯである。
【０４９５】
１つの実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は相互に直接融合している。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片をコードする遺伝子および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は機能可能であるようにリンカーペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は異種抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は単独で、すなわち融合されていない形態で発現および使用される。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は融合タンパク質の最Ｎ末端部分である。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは、Ｎ末端ＡｃｔＡを得るためにＣ末端側において切断される。
【０４９６】
１つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は組換えポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型核酸は、本明細書において提供される組換え型リステリア株のプラスミド中にある。別の実施形態ではそのプラスミドはその組換え型リステリア株の染色体中に組み込まれないエピソーム性プラスミドである。別の実施形態ではそのプラスミドはそのリステリア株の染色体中に組み込まれる組み込みプラスミドである。別の実施形態ではそのプラスミドはマルチコピープラスミドである。
【０４９７】
１つの実施形態では前記異種抗原は腫瘍関連抗原である。１つの実施形態では本明細書において提供される組成物および方法の組換え型リステリア株は、腫瘍細胞が発現する異種抗原性ポリペプチドを発現する。１つの実施形態では腫瘍関連抗原は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である。別の実施形態では腫瘍関連抗原はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である。さらに別の実施形態では腫瘍関連抗原は、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０１４２７９号明細書に記載されるＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原である。さらに別の実施形態では腫瘍関連抗原は血管新生抗原である。
【０４９８】
１つの実施形態では本明細書において提供されるペプチドは抗原性ペプチドである。別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドは腫瘍抗原に由来する。別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドは感染症抗原に由来する。別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドは自己抗原に由来する。別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドは血管新生抗原に由来する。
【０４９９】
１つの実施形態では本明細書において提供されるペプチドが由来する抗原は、真菌病原体、細菌、寄生生物、蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態では本明細書のペプチドが由来する抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インスリンペプチドＢ、ばれいしょ粉状そうか病菌抗原、ビブリオース抗原、サルモネラ抗原、ニューモコッカス抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、黒色腫関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５または−４５ヒトパピローマウイルス由来のヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、変異型かそうではないｒａｓタンパク質、変異型かそうではないｐ５３タンパク質、Ｍｕｃ１、メソテリン、ＥＧＦＲ  ＶＩＩＩまたはｐＳＡから選択される。
【０５００】
他の実施形態ではそのペプチドは、以下の疾患、すなわち、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来の免疫原および抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形腫瘍および血液担持腫瘍を含む癌、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓移植、心臓移植、膵臓移植、肺移植、骨移植、および肝臓移植などの移植拒絶反応、グレーブス病、多腺性自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性関節炎、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ウェゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、尋常性白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ぶどう膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じん麻疹、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、アミロイドーシス、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアスポロゾイト周囲タンパク質、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症のうちの１つに関連する抗原に由来する。
【０５０１】
別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドが由来する抗原は腫瘍関連抗原であり、これは１つの実施形態では以下の腫瘍抗原のうちの１つ、すなわち、ＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ）タンパク質、例えばＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、チロシナーゼ、変異型ｒａｓタンパク質、変異型ｐ５３タンパク質、ｐ９７黒色腫抗原、進行性癌に関連するｒａｓペプチドまたはｐ５３ペプチド、子宮頚部癌に関連するＨＰＶ１６／１８抗原、乳癌に関連するＫＬＨ抗原、大腸癌に関連するＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ｇｐ１００、黒色腫に関連するＭＡＲＴ１抗原、または前立腺癌に関連するＰＳＡ抗原である。別の実施形態では本明細書において提供される組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これらは１つの実施形態ではＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組み合せである。当技術分野において知られている他の腫瘍関連抗原も本発明において考慮されている。
【０５０２】
１つの実施形態では前記ペプチドは、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願番号１２／９４５３８６号明細書に記載されるキメラＨｅｒ２抗原に由来する。
【０５０３】
別の実施形態ではそのペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ７（ＨＰＶ１６株またはＨＰＶ１８株のどちらかに由来）、ＨＰＶ−Ｅ６（ＨＰＶ１６株またはＨＰＶ１８株のどちらかに由来）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ、ＳＣＣＥ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、サバイビン、バキュロウイルスアポトーシス阻害性反復配列含有タンパク質５（ＢＩＲＣ５）、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、またはこれらの組み合せから選択される抗原に由来する。
【０５０４】
１つの実施形態では本発明のリステリアによって発現されるポリペプチドは神経ペプチド成長因子アンタゴニストでもよく、１つの実施形態ではこれは［Ｄ−Ａｒｇ１、Ｄ−Ｐｈｅ５、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、Ｌｅｕ１１］サブスタンスＰ、［Ａｒｇ６、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、ＮｍｅＰｈｅ８］サブスタンスＰ（６−１１）である。これらの実施形態および関連する実施形態は当業者に理解される。
【０５０５】
１つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含み、その抗原はＨＰＶ−Ｅ７タンパク質を含む。１つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株はＨＰＶ−Ｅ７タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０５０６】
１つの実施形態ではＥ７タンパク質全体またはその断片のどちらかがＬＬＯタンパク質またはその短縮化物またはそのペプチド、ＡｃｔＡタンパク質またはその短縮化物またはそのペプチド、またはＰＥＳＴ様配列含有ペプチドに融合されて本発明の組成物および方法の組換えポリペプチドまたはペプチドを生成する。別の実施形態では、（全体で、または断片の供与源としてのどちらかで）利用されるＥ７タンパク質は、次の配列
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号２０）を有する。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の相同体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の変異体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の異性体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の相同体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の変異体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の異性体の断片である。
【０５０７】
別の実施形態ではそのＥ７タンパク質の配列は、
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ（配列番号２１）である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の相同体である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の変異体である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の異性体である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の断片である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の相同体の断片である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の変異体の断片である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の異性体の断片である。
【０５０８】
別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は以下のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つ、すなわち、Ｍ２４２１５、ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、またはＭ１４１１９で表される配列を有する。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の相同体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の変異体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の異性体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の相同体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の変異体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の異性体の断片である。
【０５０９】
１つの実施形態ではＨＰＶ抗原はＨＰＶ１６である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から選択される。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態ではＨＰＶは高リスクＨＰＶタイプである。別の実施形態ではＨＰＶは粘膜ＨＰＶタイプである。
【０５１０】
１つの実施形態ではＨＰＶ  Ｅ６はＨＰＶ−１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ７はＨＰＶ−１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ６はＨＰＶ−１８由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ−１８由来である。別の実施形態ではＨＰＶ  Ｅ６抗原は、本発明の組成物または方法においてＥ７抗原の代わりに、またはＥ７抗原に加えて、ＨＰＶ媒介性の疾患、障害、または症状を治療もしくは改善するために利用される。別の実施形態ではＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７は、ＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７の代わりに、またはこれと組み合せて利用される。そのような実施形態ではその組換え型リステリアはＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７を染色体から発現し、且つ、ＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７をプラスミドから発現してよく、またはその逆で発現してもよい。別の実施形態ではＨＰＶ−１６  Ｅ６抗原およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６抗原およびＥ７抗原は、本明細書において提供される組換え型リステリア内に存在するプラスミドから発現する。別の実施形態ではＨＰＶ−１６  Ｅ６抗原およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６抗原およびＥ７抗原は、本明細書において提供される組換え型リステリアの染色体から発現する。別の実施形態ではＨＰＶ−１６  Ｅ６抗原およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６抗原およびＥ７抗原は、各ＨＰＶ株のＥ６抗原とＥ７抗原のそれぞれがプラスミドまたは染色体のどちらかより発現される実施形態をはじめとする上記の実施形態のあらゆる組合せで発現する。
【０５１１】
１つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含み、その腫瘍関連抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドを含む。１つの実施形態では腫瘍関連抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原を含む。１つの実施形態ではＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドはキメラＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原（cHer-2）を含む。
【０５１２】
１つの実施形態では弱毒化栄養要求性リステリア免疫療法株はリステリア免疫療法ベクターに基づき、病原性遺伝子ＡｃｔＡの欠失に起因して弱毒化されており、且つ、ｄａｌ遺伝子の相補によってインビボおよびインビトロでのＨｅｒ２／ｎｅｕ発現のためのプラスミドを保持する。１つの実施形態ではそのリステリア株はリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の最初の４４１アミノ酸に融合しているキメラ型Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現および分泌する。別の実施形態ではそのリステリアは、ｄａｌ、ｄａｔおよびａｃｔＡの内在性遺伝子内に突然変異を有するｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡリステリアである。別の実施形態ではその突然変異はそれらの変異形成された遺伝子の欠失、短縮化、または不活性化である。別の実施形態ではそのリステリア株は、トランスジェニック動物内のＨＥＲ２／ｎｅｕに対する寛容を破壊する能力を有する強力で抗原特異的な抗腫瘍応答を発揮する。別の実施形態では、ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ株は免疫されたマウスの脾臓からより迅速に除去されるので、それは高度に弱毒化されており、且つ、以前のリステリア免疫治療世代よりも良好な安全性プロファイルを有する。別の実施形態では、このリステリア株により、抗生物質耐性でより病原性のバージョンのこの免疫療法であるＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも長い腫瘍発症の遅延がトランスジェニック動物において生じる。全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願番号１２／９４５３８６号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１４２７９１号明細書を参照されたい。別の実施形態ではそのリステリア株は腫瘍内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の著しい減少を生じる。別の実施形態では、ＬｍｄｄＡ免疫療法で処理した腫瘍内のＴｒｅｇの頻度がより低くなることで腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率が上昇し、ＬｍｄｄＡ免疫療法を用いた免疫後により好ましい腫瘍微小環境を得ることができることが示唆される。１つの実施形態では本発明は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質またはその断片に融合しているＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。１つの実施形態では本発明は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質またはその断片に融合しているＬＬＯタンパク質のＮ末端断片から構成される組換えポリペプチドを提供する。その実施形態では前記異種抗原はＨｅｒ−２キメラタンパク質またはその断片である。
【０５１３】
別の実施形態では本発明の方法および組成物のＨｅｒ−２キメラタンパク質はヒトＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質はマウスＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質はラットＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質は霊長類Ｈｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質はヒトまたは他のあらゆる動物種のＨｅｒ−２キメラタンパク質または当技術分野において知られているその組合せである。
【０５１４】
別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質は「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」、または「ｃＮｅｕ」と称されるタンパク質である。
【０５１５】
１つの実施形態では前記Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、癌遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外断片と１つの細胞内断片を保持し、別の実施形態ではそのキメラタンパク質は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２ＤｑおよびマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１７エピトープ（断片ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１）を保持する（図２０Ａ）。別の実施形態ではそのキメラタンパク質はマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１３エピトープ（断片ＥＣ２およびＩＣ１）を保持する。別の実施形態ではそのキメラタンパク質はマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１４エピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ１）を保持する。別の実施形態ではそのキメラタンパク質はマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも９エピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ２）を保持する。別の実施形態ではそのＨｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は非溶血性リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）に融合している。別の実施形態ではそのＨｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質はリステリア・モノサイトゲネスのリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の最初の４４１アミノ酸に融合しており、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化栄養要求性株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌される。別の実施形態ではキメラ型Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原／ＬＬＯ融合タンパク質を発現する本明細書において提供される弱毒化栄養要求性株からのその融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現と分泌は、インビトロで８時間培養した後のＴＣＡ沈殿した細胞培養上清内のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のものと同等である（図２０Ｂ参照）。
【０５１６】
１つの実施形態ではＣＴＬ活性が無感作の動物または関連のリステリア免疫療法を注射されたマウスにおいて検出されなかった（図２１Ａ）。一方で別の実施形態では本明細書において提供される弱毒化栄養要求性株は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスに由来する脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することができる（図２１Ｂおよび２１Ｃ）。
【０５１７】
別の実施形態ではそのＨｅｒ−２キメラタンパク質は配列番号２２に示される以下の核酸配列によってコードされる：
gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaa  （配列番号２２）。
【０５１８】
別の実施形態ではそのＨｅｒ−２キメラタンパク質は以下の配列を持つ：
E  T  H  L  D  M  L  R  H  L  Y  Q  G  C  Q  V  V  Q  G  N  L  E  L  T  Y  L  P  T  N  A  S  L  S  F  L  Q  D  I  Q  E  V  Q  G  Y  V  L  I  A  H  N  Q  V  R  Q  V  P  L  Q  R  L  R  I  V  R  G  T  Q  L  F  E  D  N  Y  A  L  A  V  L  D  N  G  D  P  L  N  N  T  T  P  V  T  G  A  S  P  G  G  L  R  E  L  Q  L  R  S  L  T  E  I  L  K  G  G  V  L  I  Q  R  N  P  Q  L  C  Y  Q  D  T  I  L  W  K  N  I  Q  E  F  A  G  C  K  K  I  F  G  S  L  A  F  L  P  E  S  F  D  G  D  P  A  S  N  T  A  P  L  Q  P  E  Q  L  Q  V  F  E  T  L  E  E  I  T  G  Y  L  Y  I  S  A  W  P  D  S  L  P  D  L  S  V  F  Q  N  L  Q  V  I  R  G  R  I  L  H  N  G  A  Y  S  L  T  L  Q  G  L  G  I  S  W  L  G  L  R  S  L  R  E  L  G  S  G  L  A  L  I  H  H  N  T  H  L  C  F  V  H  T  V  P  W  D  Q  L  F  R  N  P  H  Q  A  L  L  H  T  A  N  R  P  E  D  E  C  V  G  E  G  L  A  C  H  Q  L  C  A  R  G  Q  Q  K  I  R  K  Y  T  M  R  R  L  L  Q  E  T  E  L  V  E  P  L  T  P  S  G  A  M  P  N  Q  A  Q  M  R  I  L  K  E  T  E  L  R  K  V  K  V  L  G  S  G  A  F  G  T  V  Y  K  G  I  W  I  P  D  G  E  N  V  K  I  P  V  A  I  K  V  L  R  E  N  T  S  P  K  A  N  K  E  I  L  D  E  A  Y  V  M  A  G  V  G  S  P  Y  V  S  R  L  L  G  I  C  L  T  S  T  V  Q  L  V  T  Q  L  M  P  Y  G  C  L  L  D  （配列番号２３）。
【０５１９】
１つの実施形態では本明細書において提供される方法および組成物のＨｅｒ２キメラタンパク質またはその断片はそのシグナル配列を含まない。別の実施形態では、そのシグナル配列の疎水性が高いため、そのシグナル配列の削除によりそのＨｅｒ２断片がリステリア内で順調に発現できるようになる。
【０５２０】
別の実施形態では本発明の方法および組成物のＨｅｒ２キメラタンパク質の断片はその膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含まない。１つの実施形態では、そのＴＭの疎水性が高いため、そのＴＭの削除によりそのＨｅｒ−２断片がリステリア内で順調に発現できるようになる。
【０５２１】
耐性腫瘍が小断片性リステリアベース免疫治療またはトランスツズマブ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外領域に位置するエピトープに対するモノクローナル抗体）の標的とされているとき、癌原性タンパク質であるＨｅｒ２／ｎｅｕ内の点突然変異またはアミノ酸欠失が耐性腫瘍細胞の治療に介在することが報告されている。その癌遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外断片と１つの細胞内断片を保持するキメラ型Ｈｅｒ２／ｎｅｕベースの組成物が本明細書に記載される。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２ＤｑおよびマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１７エピトープを保持するこのキメラタンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスのリステリオリシンＯタンパク質の最初の４４１アミノ酸に融合され、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌された。  
【０５２２】
別の実施形態では前記腫瘍関連抗原は血管新生抗原である。別の実施形態ではその血管新生抗原は活性化周皮細胞と腫瘍新生血管内の周皮細胞との両方の上に発現し、別の実施形態ではその抗原はインビボでの新血管形成と関連する。別の実施形態ではその血管新生抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態ではその血管新生抗原は当技術分野において知られているものであり、参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１０／１０２１４０号パンフレット内において提供される。
【０５２３】
１つの実施形態では本明細書において列挙されるあらゆるアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチドの相同性は、免疫ブロット分析を含む当技術分野において充分に記述される方法によって、または確立された方法を介する利用可能な多数のソフトウェアパッケージのうちのどれかを利用するアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム分析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかにはＦＡＳＴＡパッケージ、ＢＬＡＳＴパッケージ、ＭＰｓｒｃｈパッケージ、またはＳｃａｎｐｓパッケージが含まれてよく、それらは例えばスミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または分析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用してもよい。
【０５２４】
１つの実施形態では本明細書において提供されるミニ遺伝子核酸コンストラクトまたは本明細書において提供される１つ以上のペプチドに融合している免疫原性ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸分子を備えるプラスミドが、相同組換えを用いてリステリア染色体に組み込まれる。相同組換えの技術は当技術分野において周知であり、例えばＢａｌｏｇｌｕ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  ＳＭらの著作  （Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５，  １０９（１−２）：１１−７）、およびＪｉａｎｇ  ＬＬ，  Ｓｏｎｇ  ＨＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ２００５，  ３７（１）：１９−２４）に記載されている。別の実施形態では相同組換えは米国特許第６８５５３２０号に記載されるように実施される。この場合、Ｅ７を発現する組換え型Ｌｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下にあり、且つ、遺伝子産物の分泌を確実にするためにｈｌｙシグナル配列を含むＥ７遺伝子の染色体への組み込みによって作製され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組換え体を得た。別の実施形態では温度感受性プラスミドが組換え体を選択するために使用される。本発明の別個の実施形態により各技術が表される。
【０５２５】
別の実施形態では前記コンストラクトまたは核酸分子は、トランスポゾン挿入を用いてリステリア染色体に組み込まれる。トランスポゾン挿入の技術は当技術分野において周知であり、とりわけＤＰ−Ｌ９６７の構築についてのＳｕｎらの著作  （Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，  ５８：  ３７７０−３７７８）に記載される。別の実施形態ではトランスポゾン突然変異形成は安定なゲノム挿入変異体を形成することができるという利点を有するが、外来遺伝子が挿入されるゲノム内の位置がわからないという欠点を有する。
【０５２６】
１つの実施形態では本明細書において提供されるベクターは、プラスミドベクターまたはファージベクターを含む当技術分野において知られているベクターである。別の実施形態では前記コンストラクトまたは核酸分子は、ファージ組込み部位を含むファージベクターを用いてリステリア染色体に組み込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法のある特定の実施形態ではバクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグレース遺伝子と付着部位を使用してゲノム内のあらゆる適切な部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３’端）であり得るその対応する付着部位にその異種遺伝子が挿入される。別の実施形態ではそのコンストラクトまたは異種遺伝子の組込みの前に利用される付着部位から内在性プロファージが除去される。別の実施形態ではこの方法により一コピー組込み体が生じる。別の実施形態では本発明は、ｄ−アラニンラセマーゼを含むがこれに限定されない必須酵素について栄養要求性である宿主株、例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）を使用することができる臨床用途向けのファージベースの染色体組込み系をさらに含む。別の実施形態では「ファージ除去工程」を避けるためにＰＳＡに基づくファージ組込み系を使用する。別の実施形態ではこれは組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による継続的な選択を必要とする。したがって、別の実施形態では本発明は、抗生物質を用いた選択を必要としないファージベースの染色体組込み系の確立を可能にする。代わりに、栄養要求性宿主株を相補することができる。
【０５２７】
別の実施形態では本明細書において提供されるベクターは、細菌性送達ベクター、ウイルスベクター送達ベクター、ペプチド免疫療法送達ベクター、およびＤＮＡ免疫療法送達ベクターを含む当技術分野において知られている送達ベクターである。当業者は、「送達ベクター」という用語が１つ以上のネオエピトープまたは１つ以上のネオエピトープを含むペプチドを宿主細胞内に送達することができ、ある特定の実施形態ではそれを宿主細胞内で発現することができるコンストラクトを指すことを理解する。そのようなベクターの代表例にはウイルスベクター、核酸発現ベクター、裸ＤＮＡ、およびある特定の真核細胞（例えば、プロデューサー細胞）が含まれる。１つの実施形態では送達ベクターはプラスミドベクターまたはファージベクターと異なる。別の実施形態では本発明の送達ベクターと本発明のプラスミドベクターまたはファージベクターは同じである。別の実施形態では本明細書において開示される方法および組成物において使用される送達ベクターはリステリア・モノサイトゲネス株である。
【０５２８】
本明細書において提供される方法および組成物の１つの実施形態では、「組換え部位」または「部位特異的組換え部位」という用語は、その組換え部位に隣接する核酸部分の交換または切除を媒介するリコンビナーゼによって（いくつかの事例では、関連タンパク質と共に）認識される核酸分子内の塩基配列を指す。それらのリコンビナーゼと関連タンパク質は「組換えタンパク質」と総称される（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）３：６９９−７０７；１９９３）を参照のこと）。
【０５２９】
「ファージ発現ベクター」、「ファージベクター」、または「ファージミド」は、本明細書において提供される方法および組成物の核酸配列をインビトロまたはインビボで、原核生物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞を含むあらゆる細胞の中で構成的または誘導的に発現することを目的としたあらゆるファージベースの組換え発現系を指す。典型的にはファージ発現ベクターは細菌細胞内で複製することも適切な条件下でファージ粒子を生成することも可能である。この用語は直鎖状または環状の発現系を含み、且つ、エピソームのままであるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれる両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
【０５３０】
１つの実施形態では本明細書において使用される「機能可能であるように連結される」という用語は、転写が開始されるように転写および翻訳の調節性核酸があらゆるコード配列に対して配置されることを意味する。一般的に、これはプロモーターおよび転写開始または始動配列がコ−ド領域の５’側に配置されることを意味する。
【０５３１】
１つの実施形態では「オープン・リーディング・フレーム」または「ＯＲＦ」は、タンパク質をコードする可能性がある塩基配列を含有する生物のゲノムの部分である。別の実施形態ではＯＲＦの開始末端および終止末端はｍＲＮＡの末端と同等ではなく、それらの末端は通常ｍＲＮＡ内に含まれる。１つの実施形態ではＯＲＦは遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置する。したがって、１つの実施形態では内在性ポリペプチドとのオープン・リーディング・フレームとして機能可能であるようにゲノムに組み込まれた核酸分子は、内在性ポリペプチドと同一のオープン・リーディング・フレームとしてゲノムに組み込まれた核酸分子である。
【０５３２】
１つの実施形態では本発明はリンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。１つの実施形態では「リンカー配列」は２つの異種ポリペプチドまたはそれらの断片もしくはドメインを接続するアミノ酸配列を指す。一般的に、本明細書において使用される場合、リンカーはポリペプチドを共有結合で連結して融合ポリペプチドを形成するアミノ酸配列である。典型的には、リンカーは、オープン・リーディング・フレームがコードするアミノ酸配列およびディスプレイタンパク質を含む融合タンパク質を作製するためのディスプレイプラスミドベクターからレポーター遺伝子を除去した後に残る組換えシグナルから翻訳されるアミノ酸を含む。当業者によって理解されるように、そのリンカーはグリシンおよび他の小さい中性アミノ酸などの追加的なアミノ酸を含むことができる。
【０５３３】
１つの実施形態では、本明細書において使用される場合、「内在性」は基準生物内で発生もしくは創出された、または基準生物内の原因により生じたものを説明する。別の実施形態では内在性は天然であることを指す。
【０５３４】
別の実施形態では「安定的に維持される」は、選択（例えば、抗生物質選択）が無い状態での検出可能な損失を伴わない核酸分子またはプラスミドの１０世代にわたる維持を指す。別の実施形態ではその期間は１５世代である。別の実施形態ではその期間は２０世代である。別の実施形態ではその期間は２５世代である。別の実施形態ではその期間は３０世代である。別の実施形態ではその期間は４０世代である。別の実施形態ではその期間は５０世代である。別の実施形態ではその期間は６０世代である。別の実施形態ではその期間は８０世代である。別の実施形態ではその期間は１００世代である。別の実施形態ではその期間は１５０世代である。別の実施形態ではその期間は２００世代である。別の実施形態ではその期間は３００世代である。別の実施形態ではその期間は５００世代である。別の実施形態ではその期間はより多くの世代である。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養されて）安定的に維持される。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定的に維持される。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定的に維持される。
【０５３５】
別の実施形態では内在性ＡｃｔＡ配列とのオープン・リーディング・フレームとして機能可能であるようにリステリアゲノムに組み込まれた核酸分子を含む組換え型リステリア株が本明細書において提供される。別の実施形態では本明細書において提供される方法および組成物の組換え型リステリア株は、ＡｃｔＡまたは短縮型ＡｃｔＡに融合された抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性発現プラスミドベクターを含む。１つの実施形態ではその抗原の発現と分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびａｃｔＡシグナル配列の制御下にあり、その抗原はＡｃｔＡの１〜２３３アミノ酸（短縮型ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）への融合として発現される。別の実施形態ではその短縮型ＡｃｔＡは、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７６５５２３８号明細書に記載されるように、野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０のアミノ酸から成る。別の実施形態ではその短縮型ＡｃｔＡは、米国特許出願公開第２０１４／０１８６３８７号明細書に記載されるように、ＰＥＳＴモチーフが欠失しており、非保存的ＱＤＮＫＲ置換を含有するＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修正版（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）である。
【０５３６】
１つの実施形態では本明細書において提供される断片は機能的断片である。別の実施形態では「機能的断片」は、単独で、または本明細書において提供される免疫療法組成物として対象に投与されると免疫応答を誘発することができる免疫原性断片である。別の実施形態では機能的断片は、当業者によって理解され、且つ、本明細書においてさらに提示されるように、生物活性を有する。
【０５３７】
１つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は弱毒化株である。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は組換え株である。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は生きた弱毒化組換え型リステリア株である。
【０５３８】
別の実施形態では本発明の方法および組成物の組換え型リステリア株は、組換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・シーリゲリ}株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は、当技術分野において知られている他のあらゆるリステリア種の組換え株である。
【０５３９】
別の実施形態では本発明の組換え型リステリア株は動物宿主を通して継代されている。別の実施形態ではその継代はその株の免疫療法ベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の病原性を安定化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の病原性を増加する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の不安定な亜系の普及を低下させる。別の実施形態ではそのリステリア株は抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入物を含む。別の実施形態ではそのリステリア株は抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態ではその継代は本明細書に記載されるように実施される。別の実施形態では当技術分野において知られている他のあらゆる方法によってその継代が実施される。
【０５４０】
別の実施形態では本発明の組換え型核酸は、前記リステリア株内のそのコードされたペプチドの発現を引き起こすプロモーター／調節性配列に機能可能であるように連結されている。遺伝子の構成的発現を引き起こすために有用なプロモーター／調節性配列は当技術分野において周知であり、これらには、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰＡｃｔＡプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバチルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４１】
別の実施形態では本発明のペプチドをコードする核酸の誘導性で組織特異的な発現が、そのペプチドをコードする核酸を誘導性または組織特異的プロモーター／調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘導性プロモーター／調節性配列の例としてはＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘導性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では金属、グルココルチコイドなどのような誘導剤に応答して誘導されるプロモーターが利用される。したがって、本発明は、既知または未知のどちらかであるプロモーター／調節性配列であって、その配列に機能可能であるように連結されている所望のタンパク質の発現を引き起こすことができるあらゆるプロモーター／調節性配列の使用を含むことが理解される。当業者は、「異種」という用語が基準種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を包含することを理解する。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は１つの実施形態ではそのリステリア株にとって固有または内在性のものではないペプチドを発現することになり、または別の実施形態ではそのリステリア株によって通常発現されないポリペプチドを発現することになり、または別の実施形態ではそのリステリア株以外の供給源に由来するポリペプチドを発現することになる。別の実施形態では異種という用語は同一の種の中の異なる生物に由来するものを説明するために使用される。別の実施形態では前記異種抗原は、リステリアの組換え株によって発現され、その組換え株が哺乳類細胞に感染するとプロセッシングを受け、且つ、細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。別の実施形態ではリステリア種によって発現されるその異種抗原は、その哺乳類内で自然に発現する対応する未修飾の抗原またはタンパク質を認識するＴ細胞応答が生じる限り、腫瘍細胞または感染性因子の中のその未修飾の抗原またはタンパク質と厳密に一致する必要がない。「異種抗原」という用語は本明細書において「抗原性ポリペプチド」、「異種タンパク質」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」などと呼ばれる場合がある。
【０５４２】
当業者は、「エピソーム性発現ベクター」という用語が、直鎖状または環状であり得、且つ、通常二本鎖の形態であり、細菌または細胞のゲノムに組み込まれるのと反対に宿主細菌または宿主細胞の細胞質内に存在するという点で染色体外にある核酸プラスミドベクターを包含することを理解する。１つの実施形態ではエピソーム性発現ベクターは目的の遺伝子を含む。別の実施形態ではエピソーム性ベクターは細菌の細胞質中において複数コピーで存続し、それにより目的の遺伝子の増幅をもたらし、別の実施形態では必要なときにウイルス性トランス作用因子が供給される。別の実施形態ではそのエピソーム性発現ベクターは本明細書においてプラスミドと称される場合がある。別の実施形態では「組込み型プラスミド」は宿主ゲノムへのそのプラスミドの挿入または担持される目的の遺伝子の挿入を目的とする配列を含む。別の実施形態では目的の挿入遺伝子は分断されず、または細胞ＤＮＡへの組込みによりしばしば生じる調節上の制約を受けない。別の実施形態ではその挿入異種遺伝子の存在は、その細胞自身の重要な領域の再構成または分断につながらない。別の実施形態において、安定な形質移入法ではエピソーム性ベクターを使用することで染色体組込み型プラスミドを使用するよりも高い形質移入効率が生じることが多い（Ｂｅｌｔ，Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨＰＲＴ２）ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４８６１−４８６６；Ｍａｚｄａ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４，  １４３−１５１）。１つの実施形態では本明細書において提供される方法および組成物のエピソーム性発現ベクターは、ＤＮＡ分子を細胞に送達するために用いられる様々な方法のいずれかによってインビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達され得る。また、それらのベクターは単独でも対象の細胞への送達を強化する医薬組成物の形態でも送達され得る。
【０５４３】
１つの実施形態では「融合される」という用語は共有結合による機能可能な連結を指す。１つの実施形態ではこの用語は（核酸配列またはそのオープン・リーディング・フレームの）組換え技術による融合を含む。別の実施形態ではこの用語は化学的結合を含む。
【０５４４】
１つの実施形態では「形質転換」という用語は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り込むように細菌細胞を操作することを指す。別の実施形態では「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現させるために細菌細胞を操作することを指す。本明細書において提供される方法および組成物の別個の実施形態により各可能性が表される。
【０５４５】
別の実施形態では遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へ導入するために接合が用いられる。接合の方法は当技術分野において周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊ．ら（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭら（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記載されている。本明細書において提供される方法および組成物の別個の実施形態により各方法が表される。
【０５４６】
１つの実施形態では「弱毒化」という用語は細菌が動物において疾患の原因となる能力の減退を意味する。つまり、その弱毒化リステリアは培養状態で増殖し、且つ、維持され得るが、その弱毒化リステリア株の病原特性は野生型リステリアと比較すると減少している。例として弱毒化リステリアを用いるＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内接種を用いると、接種された動物の５０％が生存する致死量（ＬＤ５０）が野生型リステリアのＬＤ５０より少なくとも約１０倍増加するのが好ましく、少なくとも約１００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１，０００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１０，０００倍増加するのがなおより好ましく、および少なくとも約１００，０００倍増加するのが最も好ましい。したがって、リステリアの弱毒化株は、それが投与された動物を殺さない株であるか、または投与された細菌の数が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときのみ動物を殺す株である。弱毒化細菌は、一般的な環境中ではその細菌の成長のために必要な栄養素が中に存在しないために複製する能力を有しない細菌を意味するとも解釈されるべきである。したがって、その細菌の複製は必要な栄養素が提供される制御環境中での複製に限定される。したがって、本発明の弱毒化株は非制御的複製の能力がないという点で環境的に安全である。
組成物
【０５４７】
１つの実施形態では本発明の組成物は免疫原性組成物である。１つの実施形態では本発明の組成物はインターフェロンガンマの強い特異的刺激を誘導し、１つの実施形態ではこれは抗血管新生特性を有する。１つの実施形態では本発明のリステリアはインターフェロンガンマの強い特異的刺激を誘導し、１つの実施形態ではこれは抗血管新生特性を有する（全体が参照により本明細書に援用されるＤｏｍｉｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  Ｍａｙ；５４（５）：４７７−８８．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｏｃｔ  ６、全体が参照により本明細書に援用されるＢｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｆｅｂ  １５；１６６（４）：２２７６−８２）。１つの実施形態ではリステリアの抗血管新生特性はＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  ２００１）。別の実施形態ではリステリアの抗血管新生特性はＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態ではリステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−ガンマ分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＣ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組み合せによって媒介される。
【０５４８】
別の実施形態では本発明の組成物の投与は１つ以上の抗血管新生タンパク質または因子の生産を誘導する。１つの実施形態ではその抗血管新生タンパク質はＩＦＮ−γである。別の実施形態ではその抗血管新生タンパク質は色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１、または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。１つの実施形態では本発明のリステリアは抗血管新生因子の放出に関与し、したがって１つの実施形態では抗原を対象に導入するためのプラスミドベクターとしての役割に加えて治療的な役割を有する。本発明の別個の実施形態により各リステリア株およびその株のタイプが表される。
【０５４９】
別の実施形態では本明細書において提供される方法および組成物によって誘導される免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態ではその免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態ではその応答はＣＤ８＋  Ｔ細胞応答である。別の実施形態ではその応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。本明細書において提供される別個の実施形態により各可能性が表される。
【０５５０】
別の実施形態では本発明の組成物の投与により抗原特異的Ｔ細胞の数が増加する。別の実施形態では組成物の投与によりＴ細胞上の共刺激受容体が活性化される。別の実施形態では組成物の投与によりメモリーＴ細胞および／またはエフェクターＴ細胞の増殖が誘導される。別の実施形態では組成物の投与によりＴ細胞の増殖が増加する。本明細書において提供される別個の実施形態により各可能性が表される。
【０５５１】
全体を通して使用される場合、「組成物」および「免疫原性組成物」という用語は交換可能であり、すべて同一の意味と質を有する。１つの実施形態では組換え型リステリア株を含み、且つ、各構成要素の同時投与または順次投与のために抗体をさらに含む本明細書において提供される免疫原性組成物は、「併用療法」とも呼ばれる。当業者は、併用療法が追加的な構成要素、抗体、療法などを含んでもよいことを理解する。幾つかの実施形態では「医薬組成物」という用語は医療用途に適切な組成物、例えば、必要な対象に投与するための組成物を指す。１つの実施形態では本発明は本明細書において提供される弱毒化リステリア株と薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では本発明は本明細書において提供されるＤＮＡ免疫療法と薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では本発明は本明細書において提供されるワクシニアウイルス株またはウイルス様粒子と薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では本発明は本明細書において提供されるペプチド免疫療法と薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【０５５２】
別の実施形態では本発明は本発明のヌクレオチド分子を含む組換え免疫療法ベクターを提供する。別の実施形態ではそのベクターは発現ベクターである。別の実施形態ではその発現ベクターはプラスミドである。別の実施形態では本発明は本発明のヌクレオチド分子を細胞に導入するための方法を提供する。組換えベクターを構築および利用するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの著作  （２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＢｒｅｎｔらの著作  （２００３，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。別の実施形態ではそのベクターは細菌ベクターである。別の実施形態ではそのベクターはサルモネラ属の種、シゲラ属の種、ＢＣＧ、Ｌ．モノサイトゲネス、大腸菌、およびＳ．ゴルドニから選択される。別の実施形態ではファゴリソソーム融合を回避し、且つ、細胞の細胞質内で生きるように改変された組換え細菌ベクターによって１つ以上のペプチドが送達される。別の実施形態ではそのベクターはウイルスベクターである。他の実施形態ではそのベクターはワクシニア、アビポックス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ、変異ワクシニア株アンカラ（ＭＶＡ）、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスから選択される。別の実施形態ではそのベクターは裸ＤＮＡベクターである。別の実施形態ではそのベクターは当技術分野において知られている他のあらゆるベクターである。本発明の別個の実施形態により各可能性が表される。
【０５５３】
対象において増強抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発するため、対象において腫瘍介在性免疫抑制を阻害するため、または対象の脾臓および腫瘍におけるＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比率を増加させるため、またはこれらのあらゆる組合せの目的で本発明の組成物が本発明の方法で使用され得る。
【０５５４】
別の実施形態では本発明のリステリア株を含む組成物はアジュバントをさらに含む。１つの実施形態では本発明の組成物はアジュバントをさらに含む。別の実施形態では本発明の方法および組成物において使用されるアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態ではそのアジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態ではそのアジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態ではそのアジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはモノホスホリルリピドＡである。別の実施形態ではそのアジュバントはモノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態ではそのアジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態ではそのアジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態ではそのアジュバントは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態ではそのアジュバントは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは当技術分野において知られている他のあらゆるアジュバントであるか、またはこれを含む。
【０５５５】
１つの実施形態では本発明の免疫原性組成物は、核酸分子を含む組換え型リステリア株であって、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含み、前記融合ポリペプチドが異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む前記組換え型リステリア株を含む。別の実施形態では本発明の免疫原性組成物は、核酸分子を含む組換え型リステリア株であって、前記核酸分子が短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第１オープン・リーディング・フレームを含む前記組換え型リステリア株を含む。
【０５５６】
１つの実施形態では本発明の免疫原性組成物は、核酸分子を含む組換え型リステリア株であって、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含み、前記融合ポリペプチドが異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む前記組換え型リステリア株を含み、前記組成物は抗体またはその断片をさらに含む。別の実施形態では前記抗体またはその断片はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０５５７】
１つの実施形態では本発明の免疫原性組成物は本明細書において提供される組換え型リステリア株を含み、前記組成物は抗体またはその断片をさらに含む。別の実施形態では前記抗体またはその断片はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０５５８】
別の実施形態では本発明の免疫原性組成物は組換え型リステリア株を含み、前記組成物は抗体またはその断片をさらに含む。別の実施形態では前記抗体またはその断片はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０５５９】
幾つかの実施形態では「抗体」という用語は、所望の標的と特異的に相互作用可能であり、例えば、チェックポイント阻害薬の結合を妨害することができる完全な分子ならびに「抗原結合断片」とも呼ばれるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなどのその機能性断片を指す。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストを含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体またはその断片を含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗ＰＤ−１抗体またはその断片を含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片を含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗Ｂ７−Ｈ４抗体またはその断片を含む。
【０５６０】
幾つかの実施形態ではそれらの抗体断片は  （１）抗体分子の一価抗原結合断片を含有し、一つの完全な軽鎖と一本の重鎖の一部を得るためにパパイン酵素で抗体全体を消化することで作製され得る断片であるＦａｂ、（２）一つの完全な軽鎖と重鎖の一部を得るためにペプシンで抗体全体を処理し、続いて還元することにより得ることができる抗体分子の断片であって、抗体当たり２本の断片が得られるＦａｂ’、（３）ペプシンで抗体全体を処理し、後続の還元を行わないことにより得ることができる抗体の断片であって、２本のＦａｂ’断片が２本のジスルフィド結合によって結合した二量体である（Ｆａｂ’）２、（４）２本の鎖として発現した軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝的に改変された断片であるＦｖ、または（５）遺伝的に融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝的に改変された断片である単鎖抗体（「ＳＣＡ」）を含む。本発明の別個の実施形態により各可能性が表される。
【０５６１】
これらの断片の作製方法は当技術分野において知られている。（例えば、参照により本明細書に援用されるＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８を参照されたい）。
【０５６２】
幾つかの実施形態では前記抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解、またはその断片をコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）内での発現によって調製され得る。
【０５６３】
幾つかの実施形態では抗体断片は従来の方法による抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化によって獲得され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓ断片を提供するためにペプシンを用いる抗体の酵素的切断によって抗体断片を作製することができる。チオール還元剤を使用し、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の保護基を所望により使用してこの断片をさらに切断して３．５ＳのＦａｂ’一価断片を作製することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的切断により２本の一価Ｆａｂ’断片と１本のＦｃ断片が直接的に作製される。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許  第４０３６９４５号明細書および同第４３３１６４７号明細書、およびその中に含有される参照文献によって説明されており、それらの特許の全体を参照により本明細書に援用する。Ｐｏｒｔｅｒ，  Ｒ．  Ｒ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．    Ｊ．，  ７３：１１９〜１２６，  １９５９も参照されたい。一価軽鎖重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝的技術などの抗体を切断する他の方法は、完全抗体によって認識される抗原にそれらの断片が結合する限り、用いられてもよい。
【０５６４】
Ｆｖ断片はＶＨ鎖およびＶＬ鎖の結合を含む。この結合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．    Ｎａｔ．’ｌ    Ａｃａｄ．    Ｓｃｉ．    ＵＳＡ  ６９：２６５９〜６２，  １９７２に記載されるように非共有結合性である場合がある。あるいは、それらの可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結する、またはグルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋することができる。Ｆｖ断片はペプチドリンカーによって接続されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含むことが好ましい。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されるＶＨドメインとＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。その構造的遺伝子は発現ベクターに挿入され、これはその後大腸菌などの宿主細胞の中に導入される。その組換え型宿主細胞はそれらの２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを作製するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｆｉｌｐｕｌａ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２：    ９７−１０５，  １９９１、Ｂｉｒｄ    ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：  ４２３−４２６，  １９８８、Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：  １２７１−７７，  １９９３、および全体が参照により本明細書に援用されるＬａｄｎｅｒらの米国特許  第４９４６７７８号明細書によって説明されている。
【０５６５】
抗体断片の別の形態は単一相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって、ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）を得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して抗体生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２：    １０６−１０，  １９９１を参照のこと。
【０５６６】
幾つかの実施形態では本明細書に記載される抗体または断片は「ヒト化形態」の抗体を含む場合がある。幾つかの実施形態では「ヒト化形態の抗体」という用語は、非ヒト（例えば、マウスの）抗体であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）のキメラ分子である前記非ヒト抗体を指す。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見られない残基を含む場合もある。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである少なくとも１つの、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。最適にはヒト化抗体は免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分も含むことになる［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２９  （１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．    Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，  ２：５９３−５９６  （１９９２）］。
【０５６７】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は移入残基と呼ばれることが多く、これらは典型的には移入可変ドメインから取られる。ヒト化は、ウィンターおよびその協力者の方法［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７  （１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）］に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列に置き換えることによって基本的実施可能である。したがって、こうしたヒト化抗体はキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）であり、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種の対応する配列によって置き換えられている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基および場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類の抗体の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。
【０５６８】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野において知られている様々な技法を使用しても生産され得る［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．    Ｂｉｏｌ．，  ２２７：３８１  （１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．    Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１  （１９９１）］。Ｃｏｌｅらの技法およびＢｏｅｒｎｅｒらの技法もヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  ｐ．７７  （１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えば、マウスの中にヒト免疫グロブリン座位を導入することによってヒトを作製することができる。それを挑戦すると、遺伝子再構成、組立、および抗体レパートリーを含む全ての点に関してヒトの中で見られるものと非常に似ているヒト抗体の生産が観察される。この取り組みは、例えば、米国特許  第５５４５８０７号明細書、同第５５４５８０６号明細書、同第５５６９８２５号明細書、同第５６２５１２６号明細書、同第５６３３４２５号明細書、同第５６６１０１６号明細書、および以下の科学出版物、すなわち、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，  ７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８４５−５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８２６（１９９６）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．    Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．    １３  ６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０５６９】
１つの実施形態では本明細書において提供される疾患は癌または腫瘍である。１つの実施形態では本発明の方法で治療される癌は乳癌である。別の実施形態ではこの癌は子宮頚部癌である。別の実施形態ではこの癌はＨｅｒ２含有性癌である。別の実施形態ではこの癌は黒色腫である。別の実施形態ではこの癌は膵臓癌である。別の実施形態ではこの癌は卵巣癌である。別の実施形態ではこの癌は胃癌である。別の実施形態ではこの癌は膵臓の癌病巣である。別の実施形態ではこの癌は肺腺癌である。別の実施形態ではこの癌は肺腺癌である。別の実施形態では、これは多形神経膠芽腫である。別の実施形態ではこの癌は大腸腺癌である。別の実施形態ではこの癌は肺扁平腺癌である。別の実施形態ではこの癌は胃腺癌である。別の実施形態ではこの癌は卵巣表面上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態ではこの癌は口腔扁平上皮癌である。別の実施形態ではこの癌は肺非小細胞癌である。別の実施形態ではこの癌は子宮内膜癌である。別の実施形態ではこの癌は膀胱癌である。別の実施形態ではこの癌は頭頸部癌である。別の実施形態ではこの癌は前立腺癌である。別の実施形態ではこの癌は口腔咽頭癌である。別の実施形態ではこの癌は肺癌である。別の実施形態ではこの癌は肛門癌である。別の実施形態ではこの癌は大腸癌である。別の実施形態ではこの癌は食道癌である。別の実施形態ではこの癌は中皮腫である。
【０５７０】
１つの実施形態では本明細書において提供される異種抗原はＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態ではその抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態ではそのＨＰＶ-Ｅ７はＨＰＶ株１６由来である。別の実施形態ではそのＨＰＶ-Ｅ７はＨＰＶ株１８由来である。別の実施形態ではそのＨＰＶ-Ｅ６はＨＰＶ株１６由来である。別の実施形態ではそのＨＰＶ-Ｅ７はＨＰＶ株１８由来である。別の実施形態では本明細書において提供される異種抗原の断片も本発明に包含される。
【０５７１】
別の実施形態ではその抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕである。別の実施形態ではその抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態ではその抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態ではその抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態ではその抗原はＣＥＡである。別の実施形態ではその抗原はＬＭＰ−１である。別の実施形態ではその抗原はｐ５３である。別の実施形態ではその抗原は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態ではその抗原はＰＳＭＡである。別の実施形態ではその抗原は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）である。別の実施形態ではその抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態ではその抗原はＷＴ−１である。別の実施形態ではその抗原はＨＩＶ−１  Ｇａｇである。別の実施形態ではその抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態ではその抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態ではその抗原はＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。別の実施形態ではその抗原は二価ＰＳＡである。別の実施形態ではその抗原はＥＲＧである。別の実施形態ではその抗原はＥＲＧコンストラクトＩＩＩ型である。別の実施形態ではその抗原はＥＲＧコンストラクトＶＩ型である。別の実施形態ではその抗原はアンドロゲン受容体（ＡＲ）である。別の実施形態ではその抗原はＰＡＫ６である。別の実施形態ではその抗原はＰＡＫ６の高エピトープ領域を含む。別の実施形態ではその抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、ＳＣＣＥ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、サバイビン、バキュロウイルスアポトーシス阻害性反復配列含有タンパク質５（ＢＩＲＣ５）、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、またはこれらの組合せから選択される。別の実施形態では抗原はその抗原の野生型を含む。別の実施形態では抗原はその抗原の突然変異型を含む。
【０５７２】
１つの実施形態ではＰＡＫ６の核酸配列は配列番号１０２で示される。別の実施形態ではＰＡＫ６のアミノ酸配列は配列番号１０３で示される。（全体が本明細書に援用される、２０１２年９月５日にオンライン出版されたＫｗｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌを参照されたい。)
【０５７３】
別の実施形態では「免疫原性断片」は、単独で、または本明細書において提供される免疫療法組成物として対象に投与されると免疫応答を誘発する断片である。別の実施形態ではそのような断片は、液性免疫応答および／または適応免疫応答のどちらかを誘発するために必要なエピトープを含有する。
【０５７４】
１つの実施形態では本発明の組成物は抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物は少なくとも１つの抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では組成物は2つの抗体、3つの抗体、４つの抗体、または４つを超える抗体を含みうる。別の実施形態では本発明の組成物はＬｍ株および抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物はＬｍ株および少なくとも１つの抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本明細書の組成物はＬｍ株および2つの抗体、3つの抗体、４つの抗体、または４つを超える抗体を含む。別の実施形態では本発明の組成物は抗体またはその機能性断片を含み、その組成物は本明細書において提供されるリステリア株を含まない。同じ組成物または異なる組成物に存在する様々な抗体は同一の形態を有する必要はなく、例えば、１つの抗体はモノクローナル抗体であってよく、別の抗体はＦＡｂ断片であってよい。本発明の異なる実施形態により各可能性が表される。
【０５７５】
１つの実施形態では本発明の組成物は、特異的にＧＩＴＲまたはその部分に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物は、特異的にＯＸ４０またはその部分に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では組成物は、ＧＩＴＲまたはその部分に特異的に結合する抗体とＯＸ４０に特異的に結合する抗体を含む。別の実施形態では本発明の組成物はＬｍ株、およびＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物はＬｍ株、およびＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物はＬｍ株、およびＧＩＴＲまたはその部分に特異的に結合する抗体、およびＯＸ４０またはその部分に特異的に結合する抗体を含む。別の実施形態では本発明の組成物はＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその機能性断片を含み、その組成物は本明細書において提供されるリステリア株を含まない。別の実施形態では本発明の組成物はＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその機能性断片を含み、その組成物は本明細書において提供されるリステリア株を含まない。別の実施形態では本発明の組成物はＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその機能性断片とＧＩＴＲに特異的に結合する抗体を含み、その組成物は本明細書において提供されるリステリア株を含まない。同じ組成物または異なる組成物に存在する様々な抗体は同一の形態を有する必要はなく、例えば、１つの抗体はモノクローナル抗体であってよく、別の抗体はＦＡｂ断片であってよい。本発明の異なる実施形態により各可能性が表される。
【０５７６】
「抗体機能性断片」という用語は、特異的に抗原に結合して本発明で意図されている生物学的効果を引き起こすことが可能である完全抗体の部分を指す。抗体断片の例としてはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるがこれに限定されない。
【０５７７】
本明細書において使用される場合、「抗体重鎖」は全ての抗体分子の天然の立体構造でそれらの分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうち長い方を指す。
【０５７８】
本明細書において使用される場合、「抗体軽鎖」は全ての抗体分子の天然の立体構造でそれらの分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうち短い方を指し、κ軽鎖およびλ軽鎖は２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０５７９】
本明細書において使用される「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書において記載されるバクテリオファージによる抗体発現など、組換えＤＮＡ技術を使用して作製された抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子を合成し、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現することにより生成されたその抗体、またはその抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、そのＤＮＡまたはアミノ酸配列は当技術分野において利用可能であり、且つ、よく知られている合成ＤＮＡ技術またはアミノ酸配列技術用いて獲得されている。
【０５８０】
１つの実施形態では抗体またはその機能性断片は抗原結合領域を含む。１つの実施形態では抗原結合領域は抗体またはその抗原結合ドメインである。１つの実施形態ではその抗原結合ドメインはＦａｂまたはｓｃＦｖである。
【０５８１】
当業者は、抗体に関する「結合する」または「特異的に結合する」という用語が特異的な抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合することがない抗体またはその機能性断片を包含することを理解する。例えば、１つの種の抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の種のその抗原にも結合する場合があるが、そのような種間交差反応性はそれ自体で特異的なものとしての抗体の分類を変更することはない。別の実施例では抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原の異なるアレル型に結合する場合もある。しかしながら、そのような交差反応はそれ自体で特異的なものとしての抗体の分類を変更することはない。幾つかの事例では、第２化学種と抗体、タンパク質、またはペプチドの相互作用に関連して、その相互作用がその化学種上での特定の構造（例えば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存すること、例えば、抗体は特定のアミノ酸配列というよりも特定のタンパク質構造を認識して結合することを意味するために「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を使用することができる。
【０５８２】
１つの実施形態では本発明の組成物は、組換え型リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）株を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるように、本発明の組成物は抗体またはその機能性断片を含む。
【０５８３】
１つの実施形態では免疫原性組成物は、本明細書において提供される抗体またはその機能性断片、および本明細書において提供される組換え型弱毒化リステリアを含む。別の実施形態では本明細書において提供される免疫原性組成物の各構成成分は、本明細書において提供されるその免疫原性組成物の別の構成成分の前に、別の構成成分と同時に、または別の構成成分の後に投与される。１つの実施形態では、同時に投与されるときでさえも、Ｌｍ組成物と抗体またはその機能性断片は２つの別個の組成物として投与されてよい。あるいは、別の実施形態ではＬｍ組成物は抗体またはその機能性断片を含んでよい。
【０５８４】
別の実施形態では本発明の組成物は、非経口的に、癌近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内に投与されるなど、当業者に知られているあらゆる方法によって対象に投与される。
【０５８５】
別の実施形態では前記組成物は経口投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物として製剤される。好適な固形経口製剤としては錠剤、カプセル、丸薬、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられる。好適な液状経口製剤としては液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、オイルなどが挙げられる。本発明の別の実施形態では前記活性成分はカプセルに製剤される。この実施形態によると、本発明の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて硬質ゼラチンカプセルを含む。
【０５８６】
別の実施形態では組成物は液状調製物の静脈内注射、動脈内注射、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体製剤としては液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、オイルなどが挙げられる。１つの実施形態ではそれらの医薬組成物は静脈内投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で製剤される。別の実施形態ではそれらの医薬組成物は動脈内投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で製剤される。別の実施形態ではそれらの医薬組成物は筋肉内投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で製剤される。
【０５８７】
幾つかの実施形態では、抗体またはその機能性断片が組換え型Ｌｍ株を含む組成物と別個に投与されるとき、その抗体は静脈内に、皮下に、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてよい。１つの実施形態では抗体を含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。
【０５８８】
１つの実施形態では「免疫原性組成物」という用語は本明細書において提供される組換え型リステリア、およびアジュバントおよび抗体もしくはその機能性断片、またはこれらのあらゆる組合せを包含する場合がある。別の実施形態では免疫原性組成物は本明細書において提供される組換え型リステリアを含む。別の実施形態では免疫原性組成物は当技術分野において知られている、または本明細書において提供されるアジュバントを含む。本明細書にさらに提供されるように、そのような組成物の投与が免疫応答を強化する、または制御性Ｔ細胞に対するＴエフェクター細胞の比率を増加する、または抗腫瘍免疫応答を誘発することも理解されるべきである。
【０５８９】
１つの実施形態では本発明は、前記リステリア株を含み、且つ、抗体またはその機能性断片をさらに含む組成物の投与を含む使用方法を提供する。別の実施形態では、同じ組成物または異なる組成物に存在し得る、且つ、そのリステリアと同じ組成物内か、または別個の組成物内に存在し得る本明細書において提供される１つより多くの抗体の投与が使用方法に含まれる。本発明の異なる実施形態により各可能性が表される。
【０５９０】
１つの実施形態では「医薬組成物」という用語は、前記リステリア株および少なくとも１つの抗体またはその機能性断片をはじめとする活性成分または複数の活性成分の治療的有効量を医薬的に許容される担体または希釈剤と共に包含する。「治療的有効量」という用語が所与の病状および投与レジメンに対して治療効果をもたらす量を指すことが理解されるべきである。
【０５９１】
当業者は、「投与する」という用語が対象を本発明の組成物と接触させることを包含することを理解する。１つの実施形態ではインビトロで、すなわち試験管内で、またはインビボで、すなわち生物、例えば、ヒトの細胞または組織の中で投与を行うことができる。１つの実施形態では本発明は、本発明のリステリア株およびその組成物を対象に投与することを包含する。
【０５９２】
本明細書において使用される「約」という用語は数量的にプラスマイナス５％を意味し、または別の実施形態ではプラスマイナス１０％を意味し、または別の実施形態ではプラスマイナス１５％を意味し、または別の実施形態ではプラスマイナス２０％を意味する。当業者は、「対象」という用語が、病気またはその後遺症に対する治療を必要とする、またはその病気もしくはその後遺症になりやすい成人または子供のヒト、ティーンエージャーまたは青年のヒトを含む哺乳類を包含することができ、その用語がイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどのヒト以外の哺乳類も含み得ることを理解するべきである。この用語が家畜を包含してもよいことも理解される。「対象」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
【０５９３】
本明細書において提供される免疫原性組成物の投与に続き、腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の存在を増大することになる末梢リンパ器官内でのＴエフェクター細胞の増殖が本明細書において提供される方法によって誘導される。別の実施形態では、末梢におけるＴエフェクター細胞の存在を増大することになる末梢リンパ器官におけるＴエフェクター細胞の増殖が本明細書において提供される方法によって誘導される。Ｔエフェクター細胞のそのような増殖は、Ｔｒｅｇ数に影響を与えずに末梢内および腫瘍部位における制御性Ｔ細胞に対するＴエフェクター細胞の比率の増加をもたらす。当業者は、末梢リンパ器官には脾臓、パイエル板、リンパ節、アデノイド等が挙げられるがこれに限定されないことを理解する。１つの実施形態では制御性Ｔ細胞に対するＴエフェクター細胞の比率の増加がＴｒｅｇの数に影響を与えずに末梢で起こる。別の実施形態では、制御性Ｔ細胞に対するＴエフェクター細胞の比率の増加が末梢内、リンパ器官内、および腫瘍部位においてこれらの部位でのＴｒｅｇ数に影響を与えずに起こる。別の実施形態ではＴエフェクター細胞の比率の増加によりＴｒｅｇの頻度が低下するが、これらの部位におけるＴｒｅｇの総数は減少しない。
併用療法およびその使用方法
【０５９４】
１つの実施形態では本発明は、対象において増強抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法であって、異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含む組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含む方法であり、免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストを含む組成物の有効量を投与するステップをさらに含む前記方法を提供する。
【０５９５】
１つの実施形態では免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストは抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体またはその断片、抗ＰＤ−１抗体またはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片である。
【０５９６】
別の実施形態では本発明は、対象において増強抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法であって、短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含む組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含む方法であり、抗体またはその断片を含む組成物の有効量を前記対象に投与するステップをさらに含む前記方法を提供する。別の実施形態ではその抗体はアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態ではその抗体は抗ＴＮＦ受容体抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態ではその抗体は抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態ではその抗体は抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態では前記方法は、前記組換え型リステリア株を含む組成物内に含まれ得るか、または別個の組成物内に含まれ得る追加的な抗体の投与をさらに含む。
【０５９７】
１つの実施形態では本明細書において記載されるリステリア株を含むあらゆる組成物が本発明の方法の中で使用され得る。１つの実施形態では、本明細書に記載されるように、リステリア株と抗体またはその断片を含むあらゆる組成物、例えばＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗体、またはＴ細胞受容体共刺激分子に結合する抗体、または共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体に結合する抗体を含む組成物が本発明の方法の中で使用され得る。１つの実施形態では本明細書に記載される抗体またはその機能性断片を含むあらゆる組成物が本発明の方法の中で使用され得る。リステリア株を含む組成物であって、抗体を含むものと含まないものをこれまでに詳細に説明してきた。抗体を含む組成物についてもこれまでに詳細に説明してきた。一部の実施形態では本発明の方法において、抗体またはその断片、例えばＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗体、またはＴ細胞受容体共刺激分子に結合する抗体、または共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体に結合する抗体を含む組成物が、リステリア株を含む組成物の投与の前に、その投与と同時に、またはその投与の後に投与され得る。
【０５９８】
１つの実施形態では腫瘍の退行を達成するため、初回の治療過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、もしくは数か月の間隔の後、本発明の組成物の反復投与（投薬）を行ってよい。別の実施形態では腫瘍増殖の抑制を達成するため、初回の治療過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、反復投薬を行ってよい。撮像技法、血清腫瘍マーカーの分析、生検、または腫瘍に伴う症状の存在、その不在、またはその寛解などの診断方法を含む当技術分野において知られているあらゆる技法のいずれかによって評価を決定してよい。
【０５９９】
１つの実施形態では、異種抗原を発現する腫瘍の予防、治療、およびそれに対するワクチン接種のための、およびその異種抗原の準優占エピトープに対する免疫応答を誘導しつつ、その腫瘍のエスケープ変異を防止するための方法および組成物が本明細書において提供される。
【０６００】
１つの実施形態では異種抗原を発現する腫瘍の予防、治療、およびそれに対するワクチン接種のための方法および組成物は、短縮型リステリオリシン（ｔＬＬＯ）タンパク質の使用を含む。別の実施形態では本明細書において提供される方法および組成物は、ｔＬＬＯを過剰発現する組換え型リステリアを含む。別の実施形態ではそのｔＬＬＯはリステリア内のプラスミドから発現する。
【０６０１】
別の実施形態では、対象において腫瘍増殖または癌を予防または治療するための方法であって、本明細書に記載されるような抗体またはその機能性断片、および異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む組換え型リステリア免疫療法株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。別の実施形態では、対象において腫瘍増殖または癌を予防または治療するための方法であって、本明細書に記載されるような抗体またはその機能性断片、および短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含む組換え型リステリア免疫療法株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０６０２】
１つの実施形態では「治療する」という用語は疾患を治癒することを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患を防止することを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の発生率を減少させることを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の症状を改善することを指す。別の実施形態では「治療する」とは患者の無成績生存率または全体的生存率を増加させることを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の進行を安定させることを指す。別の実施形態では「治療する」とは寛解を誘導することを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の進行を減速させることを指す。別の実施形態では「減少させる」、「抑制する」、および「阻害する」という用語はより少なくすること、または減らすことを指す。
【０６０３】
１つの実施形態では、対象の脾臓および腫瘍微小環境内で制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比率を増加させる方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物を投与することを含む前記方法が本明細書において提供される。別の実施形態では対象内の脾臓および腫瘍微小環境内で調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比率を増加させることにより、対象内でのより顕著な抗腫瘍応答が可能になる。
【０６０４】
別の実施形態ではＴエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−  Ｔ細胞を含む。別の実施形態ではＴエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−  Ｔ細胞である。別の実施形態ではＴエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。別の実施形態ではＴエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞である。別の実施形態では制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ細胞である。
【０６０５】
１つの実施形態では本発明は、腫瘍または癌を治療する、腫瘍または癌から保護する、および腫瘍または癌に対する免疫応答を誘導する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。
【０６０６】
１つの実施形態では本発明は、ヒト対象において腫瘍または癌を予防または治療する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物株であるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片と腫瘍関連抗原を含む組換えポリペプチドを含む前記組換え型リステリア株を前記対象に投与するステップを含み、それによりその腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導し、これによって前記組換え型リステリア株がヒト対象における腫瘍または癌を治療する前記方法を提供する。別の実施形態ではその免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態ではそのＴ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−  Ｔ細胞応答である。別の実施形態ではそのＴ細胞応答はＣＤ８＋  Ｔ細胞応答である。別の実施形態ではそのＴ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答である。別の実施形態では本発明は、腫瘍または癌から対象を保護する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物をその対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。別の実施形態では本発明は、対象において腫瘍退行を誘導する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物をその対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。別の実施形態では本発明は、腫瘍または癌の発生または再発を減少させる方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物をその対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。別の実施形態では本発明は、対象において腫瘍の形成を抑制する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物をその対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。別の実施形態では本発明は、対象において癌の寛解を誘導する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物をその対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。１つの実施形態では融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子がリステリアゲノムに組み込まれる。別の実施形態ではその核酸分子はその組換え型リステリア免疫療法株内のプラスミドの中にある。別の実施形態ではその核酸分子はその組換え型リステリア免疫療法株内の細菌人工染色体の中にある。
【０６０７】
１つの実施形態では本方法は組換え型リステリアを追加的な療法と共に同時投与するステップを含む。別の実施形態ではその追加的な療法は外科手術、化学療法、免疫療法、放射線療法、抗体ベースの免疫療法、またはこれらの組合せである。別の実施形態ではその追加的な療法はその組換え型リステリアの投与に先行する。別の実施形態ではその追加的な療法はその組換え型リステリアの投与の後に続く。別の実施形態ではその追加的療法は抗体療法である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を増加させ、且つ、より強力な抗腫瘍免疫応答を生成するため、その組換え型リステリアが漸増用量で投与される。当業者は、細胞の免疫応答を強化するために腫瘍を有する対象に、限定されないが、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および当技術分野において知られている他のサイトカインをはじめとするサイトカインであって、それらのうちの幾つかが参照により本明細書に援用される米国特許第６９９１７８５号明細書に記載されているサイトカインを提供することによって抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることを理解する。
【０６０８】
１つの実施形態では本明細書において提供される方法は、前記対象内で抗腫瘍免疫応答を強化する抗体またはその機能性断片と本明細書において提供される免疫原性組成物を同時投与するステップをさらに含む。
【０６０９】
１つの実施形態では本明細書において提供される方法は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤と本明細書において提供される免疫原性組成物を同時投与するステップをさらに含む。本発明で使用されるＩＤＯ経路阻害剤としては、限定されないが、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキシアルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体、または小分子ＩＤＯ阻害剤をはじめとする当技術分野において知られているあらゆるＩＤＯ経路阻害剤が含まれる。別の実施形態では本明細書において提供される組成物および方法は、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンとも併せて、その前に、またはそれに続いて使用される。別の実施形態ではＩＤＯ阻害は化学療法剤の効率を強化する。
【０６１０】
別の実施形態では、癌を患うか、または腫瘍を有する対象の生存率を増加させる方法であって、本明細書に記載されるような抗体またはその機能性断片、および異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む組換え型リステリア免疫療法株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０６１１】
別の実施形態では、癌を患うか、または腫瘍を有する対象において抗原特異的Ｔ細胞を増加させる方法であって、本明細書に記載されるような抗体またはその機能性断片、および異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む組換え型リステリア免疫療法株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。別の実施形態では、癌を患うか、または腫瘍を有する対象においてＴ細胞を増加させる方法であって、本明細書に記載されるような抗体またはその機能性断片、および短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含む組換え型リステリア免疫療法株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
【０６１２】
別の実施形態では本発明の方法は、本明細書において提供されるような組換え型リステリア株または抗体もしくはその機能性断片を用いて対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態では追加免疫接種で使用されるその組換え型リステリア株は、最初の「準備刺激」接種で使用される株と同一である。別の実施形態ではその追加免疫株は準備刺激株と異なる。別の実施形態ではその追加免疫接種で使用される抗体は、最初の「準備刺激」接種で使用される抗体と同じ抗原に結合する。別の実施形態ではその追加免疫抗体は準備刺激抗体と異なる。別の実施形態では準備刺激接種と追加免疫接種において同一の用量が使用される。別の実施形態ではより大きい用量が追加免疫に使用される。別の実施形態ではより小さい用量が追加免疫に使用される。別の実施形態では本発明の方法は対象に追加免疫ワクチン接種を実施するステップをさらに含む。１つの実施形態ではその追加免疫ワクチン接種は一回の準備刺激ワクチン接種に続いて行われる。別の実施形態では準備刺激ワクチン接種の後に一回の追加免疫ワクチン接種が実施される。別の実施形態では準備刺激ワクチン接種の後に２回の追加免疫ワクチン接種が実施される。別の実施形態では準備刺激ワクチン接種の後に３回の追加免疫ワクチン接種が実施される。１つの実施形態では準備刺激株と追加免疫株との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では準備刺激株と追加免疫株との間の期間は１週間であり、別の実施形態ではそれは２週間であり、別の実施形態ではそれは３週間であり、別の実施形態ではそれは４週間であり、別の実施形態ではそれは５週間であり、別の実施形態ではそれは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では追加免疫株は準備刺激株の８〜１０週間後に投与される。
【０６１３】
別の実施形態では本発明の方法は、本明細書において提供される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物で対象を追加免疫することをさらに含む。別の実施形態では本発明の方法は、本明細書において提供される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物の追加免疫用量を投与するステップを含む。別の実施形態ではその追加免疫用量は前記免疫原性組成物の代替的形態である。別の実施形態では本発明の方法は対象に追加免疫用免疫原性組成物を投与するステップをさらに含む。１つの実施形態ではその追加免疫用量は前記免疫原性組成物の単回準備刺激用量の後に続く。別の実施形態では準備刺激用量の後に単回追加免疫用量が投与される。別の実施形態では準備刺激用量の後に２回の追加免疫用量が投与される。別の実施形態では準備刺激用量の後に３回の追加免疫用量が投与される。１つの実施形態では、本明細書において提供される弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物の準備刺激用量と追加免疫用量との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態ではこの用量は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では準備刺激用量と追加免疫用量との間の期間は１週間であり、別の実施形態ではそれは２週間であり、別の実施形態ではそれは３週間であり、別の実施形態ではそれは４週間であり、別の実施形態ではそれは５週間であり、別の実施形態ではそれは６〜８週間であり、さらに別の実施形態ではその追加免疫用量は免疫原性組成物の準備刺激用量の８〜１０週間後に投与される。
【０６１４】
多数の病原体に対する免疫応答とそれらに対する保護の強化にとって非相同的「準備刺激追加免疫」戦略が有効であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．    Ｒｅｖ．  １７０：２９−３８（１９９９）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｈ．Ｌ．，  Ｎａｔ．    Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．    ２：２３９−５０（２００２）、Ｇｏｎｚａｌｏ，  Ｒ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒａｉｎ  ２０：１２２６−３１（２００２）、Ｔａｎｇｈｅ，  Ａ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．    Ｉｍｍｕｎ．    ６９：３０４１−７（２００１）。準備刺激注射と追加免疫注射において異なる形態の抗原を提供することがその抗原に対する免疫応答を最大化するようである。ＤＮＡ株での準備刺激とそれに続くアジュバント中のタンパク質を用いた追加免疫、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達による追加免疫が、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋  Ｔ細胞応答をそれぞれ改善する最も効果的な方法のようである。Ｓｈｉｖｅｒ  Ｊ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）、Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｓ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒａｉｎ  ２０：１０３９−４５（２００２）、Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒａｉｎ  １９：９５−１０２（２０００）、Ｓｉｎ，  Ｊ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．    １８：７７１−９（１９９９）。サルのワクチン接種研究の最近のデータより、サルがＨＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡで準備刺激ワクチン接種され、続いてＨＩＶ  ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）で追加免疫ワクチン接種されるときにＨＩＶ  ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡにＣＲＬ１００５ポロキサマー（１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）を添加することでＴ細胞応答が増強されることが示唆されている。ＤＮＡ／ポロキサマーでの準備刺激とそれに続くＡｄ５−ｇａｇ追加免疫についての細胞免疫応答は、（ポロキサマーを含まない）ＤＮＡ準備刺激とそれに続くＡｄ５−ｇａｇ追加免疫についての細胞免疫応答、またはＡｄ５−ｇａｇのみについての細胞免疫応答よりも大きかった。Ｓｈｉｖｅｒ，  Ｊ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．    Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）。米国特許出願公開第２００２／０１６５１７２（Ａ１）号明細書は、免疫応答が生成されるように抗原の免疫原性部分をコードするベクターコンストラクトと抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質を同時投与することについて記載している。その文書はＢ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限られている。さらに、米国特許第６５００４３２号明細書は、目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は同一の免疫応答時の、好ましくは互いに０〜１０日以内、または３〜７日間以内のそのポリヌクレオチドとそのポリペプチドの投与を意味する。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（全ての形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例えば、プラスモジウム属のもの）、および病原性細菌（結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲ���、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げられるがこれに限定されない）が挙げられる。上記の参照文献の全ては全体が参照により本明細書に援用される。
【０６１５】
１つの実施形態では本発明の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態ではそのプロトコルは予防的である。別の実施形態では本発明の組成物は、家族性遺伝学、または当業者によって理解されるようなこれらの種類の病気にかかりやすくする他の環境のために乳癌または他の種類の腫瘍などの癌のリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では本免疫療法は、外科手術、従来の化学療法、または放射線治療による腫瘍増殖の縮小術の後の癌免疫療法として使用される。そのような処置に続いて本発明の免疫療法が投与され、これによってその免疫療法の腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答により残っている転移癌が破壊され、癌からの寛解が長期化される。別の実施形態では本発明の免疫療法は、以前に定着した腫瘍の成長に作用し、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。
【０６１６】
幾つかの実施形態では「含む」という用語またはその文法的な形態は、表示された活性薬剤、例えば、本発明のＬｍ菌株を含むと共に他の活性薬剤、例えば、抗体またはその機能性断片、および製薬業界で知られているような医薬的に許容される担体、賦形剤、軟化薬、安定剤などを含むことを指す。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、唯一の活性成分が示された活性成分である組成物を意味するが、製剤の安定、保存などのためであって、指示された活性成分の治療効果には直接的に関与しないその他の化合物も含まれることがある。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、指示された活性成分の機序とは別個の機序によって治療効果を発揮する構成要素を意味することがある。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、治療効果を発揮し、且つ、表示された活性成分のクラスとは別個の化合物クラスに属する構成要素に関連し得る。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、例えば、異なる作用機序により作用することにより治療効果を発揮し、表示された活性成分の治療効果とは異なり得る構成要素に関連し得る。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は活性成分の放出を促進する構成要素に関連し得る。幾つかの実施形態では「から成る」という用語は、活性成分および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物に関連する。
【０６１７】
本明細書において使用される時、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」で表される単数形は、文脈から明確に別段の指示が無い限り、複数の参照物を含む。例えば、「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、これらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【０６１８】
本出願全体を通して本発明の様々な実施形態が範囲形式で提示される場合がある。範囲形式の記載は単に利便性および簡潔性のためにすぎず、本発明の範囲の一定不動の限定として解釈されるべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記載はその範囲内の全ての可能な部分的範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、１〜６までなどのような範囲の記載は、１〜３まで、１〜４まで、１〜５まで、２〜４まで、２〜６まで、３〜６まで、等々などの部分的範囲、ならびにこの範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したと考えられるべきである。これは範囲の程度と無関係に適用される。
【０６１９】
本明細書において数値的範囲が示されるときはいつも、表示された範囲内のあらゆる引用される数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１表示数と第２表示数と「の間にわたる／の間の範囲」という句、および第１表示数「から」第２表示数「までにわたる／までの範囲」という句は本明細書において互換的に使用され、第１表示数および第２表示数ならびにそれらの間の全ての分数および整数を含むことを意味する。
【０６２０】
本明細書において使用される場合、「方法」という用語は、限定されないが、化学技術分野、薬理学技術分野、生物学技術分野、生化学技術分野、および医学技術分野などの専門家によって知られているか、またはそれらの専門家によって既知の方式、手段、技術、および手法から容易に開発される方式、手段、技術、および手法をはじめとする、所与の課題を実線するための方式、手段、技術、および手法を指す。
【０６２１】
１つの実施形態では「約」という用語は表示された数、または数値範囲からの０．０００１〜５％の間の逸脱を指す。１つの実施形態では「約」という用語は表示された数、または数値範囲からの１〜１０％の間の逸脱を指す。１つの実施形態では「約」という用語は表示された数、または数値範囲からの最大で２５％の逸脱を指す。
【０６２２】
本明細書において開示される対象には次の実施形態が含まれるがこれらに限定されない。
実施形態１  疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系であって、
（ａ）  弱毒化リステリア株送達ベクター、および
（ｂ）  前記リステリア株を形質転換するためのプラスミドベクターであって、１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを備える前記プラスミドベクター、
を含み、前記プラスミドで前記リステリア株を形質転換することにより前記被検者の疾患または症状を対象とする個別免疫療法系が作成作製される、前記系。
実施形態２  前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌を含む、実施形態１に記載の系。
実施形態３  前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態２に記載の系。
実施形態４  前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態２に記載の系。
実施形態５  前記１つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープ、または立体構造ネオエピトープ、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の系。
実施形態６  前記１つ以上のネオエピトープが溶媒曝露ネオエピトープを含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の系。
実施形態７  Ｔ細胞を前記１つ以上のペプチドと接触させてＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９、またはそれらのあらゆる組合せのうちの少なくとも１つの分泌増加、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、およびＩＬ−２を含む群より選択されるサイトカインの分泌増加を分析し、前記増加により前記ペプチドが１つ以上のＴ細胞ネオエピトープを含むと特定される免疫原性アッセイを用いて前記ネオエピトープの免疫原性が決定された、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の系。
実施形態８  前記プラスミドで形質転換された前記弱毒化リステリアが前記１つ以上の免疫原性のペプチドを分泌する、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の系。
実施形態９  前記１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合した１つ以上のネオエピトープを含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の系。
実施形態１０  前記１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がミニ遺伝子核酸コンストラクトを含み、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを備え、前記キメラタンパク質が
（ａ）  細菌分泌シグナル配列、
（ｂ）  ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、
（ｃ）  １つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを含み、
（ａ）〜（ｃ）の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記１つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の系。
実施形態１１  前記プラスミドベクターが組込み型プラスミドである、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の系。
実施形態１２  前記プラスミドベクターが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の系。
実施形態１３  形質転換の後に抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、実施形態１２に記載の系。
実施形態１４  前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、実施形態９に記載の系。
実施形態１５  前記ｔＬＬＯタンパク質が配列番号３で表される、実施形態１４に記載の系。
実施形態１６  前記ＡｃｔＡが配列番号１２〜１３および配列番号１５〜１８で表される、実施形態１４に記載の系。
実施形態１７  前記ＰＥＳＴアミノ酸配列が配列番号５〜１０で表される配列から選択される、実施形態１４に記載の系。
実施形態１８  前記変異型ＬＬＯがコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を含む、実施形態１４に記載の系。
実施形態１９  前記突然変異が配列番号２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、またはＷ４９２の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態１８に記載の系。
実施形態２０  前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドによる置換を含み、前記非ＬＬＯペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態１８に記載の系。
実施形態２１  前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の欠失を含む、実施形態１８に記載の系。
実施形態２２  前記免疫原性の１つ以上のネオエピトープが前記疾患または症状と関連する、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の系。
実施形態２３  １つ以上のネオエピトープを含む前記免疫原性のペプチドが異種抗原または自己抗原、またはそれらの断片から構成される、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の系。
実施形態２４  前記異種抗原または自己抗原が腫瘍関連抗原である、実施形態２３に記載の系。
実施形態２５  前記１つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の系。
実施形態２６  前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、キメラＨｅｒ２抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＥＲＧ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＰＡＫ６、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原Ｅ（ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、インターロイキン１３受容体α（ＩＬ１３−Ｒ  α）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、血管新生抗原、ｒａｓタンパク質、ｐ５３タンパク質、ｐ９７黒色腫抗原、ＫＬＨ抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１抗原、ＴＲＰ−２、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはテスティシンを含む、実施形態２５に記載の系。
実施形態２７  前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態２または２５のいずれかに記載の系。
実施形態２８  前記１つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の系。
実施形態２９  前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態２８に記載の系。
実施形態３０  前記感染症が感染性細菌病である、実施形態２８に記載の系。
実施形態３１  前記感染症が以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態２８に記載の系。
実施形態３２  前記弱毒化リステリアが１つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の系。
実施形態３３  前記内在性遺伝子突然変異がａｃｔＡ遺伝子突然変異、ｐｒｆＡ突然変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重突然変異、ｄａｌ／ｄａｌ遺伝子二重突然変異、またはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、実施形態３２に記載の系。
実施形態３４  Ｄ１３３Ｖ突然変異を含むＰｒｆＡをコードする核酸配列を備えるプラスミドで前記リステリアを形質転換することにより前記ｐｒｆＡ突然変異が相補される、実施形態３３に記載の系。
実施形態３５  前記突然変異が前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、実施形態３２〜３４のいずれか１つに記載の系。
実施形態３６  前記プラスミドが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第２核酸配列をさらに備える、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載の系。
実施形態３７  前記オープン・リーディング・フレームによってコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態３６に記載の系。
実施形態３８  前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の系。
実施形態３９  前記組換え型リステリアが培養または凍結保存されるか、またはそれらのあらゆる組合せで処理され、且つ、前記対象に対してある形態の治療法として単独で、または前記疾患にとって有益な可能性がある他の治療法と併用して投与される、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載の系。
実施形態４０  前記対象に対する前記弱毒化組換え型リステリアとアジュバントを含む免疫原性組成物の一部として前記プラスミドで形質転換された前記弱毒化リステリアが投与される、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載の系。
実施形態４１    前記免疫原性組成物の投与が、１つ以上のネオエピトープを含む異なるペプチドを発現する弱毒化リステリアとアジュバントを含む１つ以上の免疫原性組成物を同時または順次投与するステップをさらに含む、実施形態４０に記載の系。
実施形態４２  前記アジュバントが顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピッドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態４０〜４１のいずれか１つに記載の系。
実施形態４３  疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
（ａ）  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の前記１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを前記比較により特定するステップ、
（ｂ）  免疫原性応答向けの前記１つ以上のネオエピトープを含むペプチドをスクリーニングするステップ、
（ｃ）  前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるプラスミドベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を前記対象に投与し、免疫原性組成物の一部として前記弱毒化組換え型リステリア株を投与するステップを含む前記方法。
実施形態４４  前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌である、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５  前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４６  前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４７  前記疾患担持生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態４３〜４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８  前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象、または同じ種の異なる個体より獲得される、実施形態４３〜４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４９  前記疾患担持生体試料または健常生体試料が組織、血液から単離された細胞、痰から単離された細胞、唾液から単離された細胞、または脳脊髄液から単離された細胞を含む、実施形態４３〜４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０  前記核酸配列がエクソームシーケンシングを用いて決定される、実施形態４３〜４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５１  前記核酸配列がトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、実施形態４３〜５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５２  前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
（ｉ）  前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記ＯＲＦ中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、実施形態４３〜５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５３  免疫原性応答についての前記スクリーニングが次のステップ、すなわち、
（ａ）  １つ以上のネオエピトープを含む前記ペプチドとＴ細胞または複数のＴ細胞を接触させるステップ、
（ｂ）  前記細胞において免疫原性Ｔ細胞応答について分析し、免疫原性Ｔ細胞応答の存在により前記ペプチドを免疫原性ペプチドとして特定するステップを含む、実施形態４３〜５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４  前記１つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープまたは立体構造ネオエピトープを含む、実施形態４３〜５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５  前記１つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、実施形態４３〜５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６  前記弱毒化組換え型リステリアがＴ細胞エピトープを含む１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上の免疫原性のペプチドを分泌する、実施形態４３〜５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５７  それぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合した１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上の免疫原性のペプチドをコードする核酸配列を備えるプラスミドベクターを使用して前記形質転換が行われる、実施形態４３〜５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８  ミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、キメラタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む前記コンストラクトを備えるプラスミドベクターを用いて前記形質転換が行われ、前記キメラタンパク質が
（ａ）  細菌分泌シグナル配列、
（ｂ）  ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、
（ｃ）  前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上の免疫原性のペプチドを含み、
（ａ）〜（ｃ）の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態４３〜５６のいずれか１つに記載の系。
実施形態５９  前記１つ以上の免疫原性のペプチドの発現を確認するために前記弱毒化組換え型リステリア株を培養し、その特徴を分析することをさらに含む実施形態４３〜５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０  前記プラスミドが組込み型プラスミドである、実施形態４３〜５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１  前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態４３〜５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２  抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３  前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、実施形態５７に記載の方法。
実施形態６４  前記ｔＬＬＯタンパク質が配列番号３で表される、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５  前記ａｃｔＡが配列番号１２〜１３および配列番号１５〜１８で表される、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６６  前記ＰＥＳＴアミノ酸配列が配列番号５〜１０で表される配列から選択される、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６７  前記変異型ＬＬＯがコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を含む、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６８  前記突然変異が配列番号２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、またはＷ４９２の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態６７に記載の方法。
実施形態６９  前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドによる置換を含み、前記非ＬＬＯペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態６７に記載の方法。
実施形態７０  前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の欠失を含む、実施形態６７に記載の方法。
実施形態７１  前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原から構成される、実施形態４３〜７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２  前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３  前記１つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態４３〜７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７４  前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、キメラＨｅｒ２抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、二価ＰＳＡ、ＥＲＧ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＰＡＫ６、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原Ｅ（ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、インターロイキン１３受容体α（ＩＬ１３−Ｒ  α）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、血管新生抗原、ｒａｓタンパク質、ｐ５３タンパク質、ｐ９７黒色腫抗原、ＫＬＨ抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１抗原、ＴＲＰ−２、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはテスティシンを含む、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７５  前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態４４および７３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６  前記１つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態４３〜７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７７  前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８  前記感染症が感染性細菌病である、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７９  前記感染症が以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態７６に記載の方法。
実施形態８０  前記弱毒化リステリアが１つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、実施形態４３〜７９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８１  前記内在性遺伝子突然変異がａｃｔＡ遺伝子突然変異、ｐｒｆＡ突然変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重突然変異、ｄａｌ／ｄａｌ遺伝子二重突然変異、またはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２  Ｄ１３３Ｖ突然変異を含むＰｒｆＡをコードする核酸配列を備えるプラスミドで前記リステリアを形質転換することにより前記ｐｒｆＡ突然変異が相補される、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８３  前記突然変異が前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、実施形態８０〜８２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８４  前記プラスミドが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第２核酸配列をさらに備える、実施形態４３〜８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５  前記オープン・リーディング・フレームによってコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態８４に記載の方法。
実施形態８６  前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、実施形態４3〜85のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８７  １つ以上の異なるネオエピトープを含む異なるペプチドを発現する組換え型リステリアとアジュバントを含む１つ以上の免疫原性組成物を前記対象に投与することをさらに含む実施形態４３〜８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８８    同時投与または順次投与が投与に含まれる、実施形態８７に記載の方法。
実施形態８９  前記アジュバントが顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピッドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態８７〜８８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９０  免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む実施形態４３〜８９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９１  前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片である、実施形態９０に記載の方法。
実施形態９２  前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、実施形態４３〜９１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９３  前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９４  前記免疫応答が抗感染症応答を含む、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９５  前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態９４に記載の方法。
実施形態９６  前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態９４に記載の方法。
実施形態９７  前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、実施形態４３〜９６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９８  前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が前記投与により増加する、実施形態４３〜９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９９  実施形態４３〜８６のいずれか１つに記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
実施形態１００  疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
（ａ）  送達ベクターまたは他のベクター、および所望により
（ｂ）  前記送達ベクターを形質転換するためのプラスミドベクターであって、１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含む前記系。
実施形態１０１  前記送達ベクターが細菌送達ベクターを含む、実施形態１００に記載の系。
実施形態１０２  前記送達ベクターがウイルスベクター送達ベクターを含む、実施形態１００に記載の系。
実施形態１０３  前記送達ベクターがペプチド免疫療法送達ベクターを含む、実施形態１００に記載の系。
実施形態１０４  前記ペプチド免疫療法送達ベクターが１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む、実施形態１０３に記載の系。
実施形態１０５  前記送達ベクターがＤＮＡプラスミド免疫療法ベクターを含む、実施形態１００に記載の系。
実施形態１０６  前記ＤＮＡプラスミド免疫療法ベクター送達ベクターが１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む、実施形態１０５に記載の系。
実施形態１０７  前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌を含む、実施形態１００に記載の系。
実施形態１０８  前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態１０７に記載の系。
実施形態１０９  前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態１０７に記載の系。
実施形態１１０  前記１つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープ、または立体構造ネオエピトープ、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態１００〜１０９のいずれか１つに記載の系。
実施形態１１１  前記１つ以上のネオエピトープが溶媒曝露ネオエピトープを含む、実施形態１００〜１１０のいずれか１つに記載の系。
実施形態１１２  Ｔ細胞を前記１つ以上のペプチドと接触させてＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９、またはそれらのあらゆる組合せのうちの少なくとも１つの分泌増加、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、およびＩＬ−２を含む群より選択されるサイトカインの分泌増加を分析し、前記増加により前記ペプチドが１つ以上のＴ細胞ネオエピトープを含むと特定される免疫原性アッセイを用いて前記ネオエピトープの免疫原性が決定された、実施形態１００〜１１１のいずれか１つに記載の系。
実施形態１１３    前記プラスミドで形質転換された前記送達ベクターが前記１つ以上の免疫原性のペプチドを分泌する、実施形態１００〜１１２のいずれか１つに記載の系。
実施形態１１４  前記１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合した１つ以上のネオエピトープを含む、実施形態１００〜１１３のいずれか１つに記載の系。
実施形態１１５  前記１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がミニ遺伝子核酸コンストラクトを含み、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを備え、前記キメラタンパク質が
（ａ）  細菌分泌シグナル配列、
（ｂ）  ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、
（ｃ）  １つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを含み、
（ａ）〜（ｃ）の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記１つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態１００〜１１３のいずれか１つに記載の系。
実施形態１１６  前記プラスミドベクターが組込み型プラスミドである、実施形態１００〜１１５のいずれか１つに記載の系。
実施形態１１７  前記プラスミドベクターが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態１００〜１１５のいずれか１つに記載の系。
実施形態１１８  前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、実施形態１１４に記載の系。
実施形態１１９  前記ｔＬＬＯタンパク質が配列番号３で表される、実施形態１１８に記載の系。
実施形態１２０  前記ＡｃｔＡが配列番号１２〜１３および配列番号１５〜１８で表される、実施形態１１８に記載の系。
実施形態１２１  前記ＰＥＳＴアミノ酸配列が配列番号５〜１０で表される配列から選択される、実施形態１１８に記載の系。
実施形態１２２  前記変異型ＬＬＯがコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を含む、実施形態１１８に記載の系。
実施形態１２３  前記突然変異が配列番号２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、またはＷ４９２の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態１１８に記載の系。
実施形態１２４  前記突然変異が配列番号６８で表さる前記ＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドによる置換を含み、前記非ＬＬＯペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態１１８に記載の系。
実施形態１２５  前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の欠失を含む、実施形態１１８に記載の系。
実施形態１２６  前記免疫原性の１つ以上のネオエピトープが前記疾患または症状と関連する、実施形態１００〜１２５のいずれか１つに記載の系。
実施形態１２７  １つ以上のネオエピトープを含む前記免疫原性のペプチドが異種抗原または自己抗原、またはそれらの断片から構成される、実施形態１００〜１２５のいずれか１つに記載の系。
実施形態１２８  前記異種抗原または自己抗原が腫瘍関連抗原である、実施形態１２７に記載の系。
実施形態１２９  前記１つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態１００〜１２８のいずれか１つに記載の系。
実施形態１３０  前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、キメラＨｅｒ２抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＥＲＧ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＰＡＫ６、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原Ｅ（ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、インターロイキン１３受容体α（ＩＬ１３−Ｒ  α）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、血管新生抗原、ｒａｓタンパク質、ｐ５３タンパク質、ｐ９７黒色腫抗原、ＫＬＨ抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１抗原、ＴＲＰ−２、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはテスティシンを含む、実施形態１２８に記載の系。
実施形態１３１  前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態１０７または１２８のいずれかに記載の系。
実施形態１３２  前記１つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態１００〜１３１のいずれか１つに記載の系。
実施形態１３３  前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態１３２に記載の系。
実施形態１３４  前記感染症が感染性細菌病である、実施形態１３２に記載の系。
実施形態１３５  前記感染症が以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態１３２に記載の系。
実施形態１３６  前記送達ベクターが培養または凍結保存されるか、またはそれらのあらゆる組合せで処理され、且つ、前記対象に対してある形態の治療法として単独で、または前記疾患にとって有益な可能性がある他の治療法と併用して投与される、実施形態１００〜１３５のいずれか１つに記載の系。
実施形態１３７  前記対象に対する前記組換え送達ベクターとアジュバントを含む免疫原性組成物の一部として前記プラスミドで形質転換されてもよい前記送達ベクターの投与が行われる、実施形態１００〜１３６のいずれか１つに記載の系。
実施形態１３８    前記免疫原性組成物の投与が１つ以上のネオエピトープを含む異なるペプチドを発現する送達ベクターとアジュバントを含む１つ以上の免疫原性組成物の投与をさらに含む、実施形態１３７に記載の系。
実施形態１３９  前記アジュバントが顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピッドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態１３７〜１３８のいずれか１つに記載の系。
実施形態１４０  疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
（ａ）  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の前記１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
（ｂ）  （ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップ、所望により、
（ｃ）  前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である前記１つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
（ｄ）  （ｃ）において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
（ｅ）  前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第２弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記第２弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記第２弱毒化組換え型リステリア株を含む第２組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法。
実施形態１４１    前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦを前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
（ｉ）  前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列内のＯＲＦ中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、実施形態１４０に記載の方法。
実施形態１４２  前記対象より第２生体試料を獲得する工程が、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む前記第２組成物の投与の後に増殖するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む生体試料の獲得を含む、実施形態１４０〜１４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４３  前記生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、実施形態１４０〜１４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４４  前記特徴分析過程が  
（ｉ）  前記疾患に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、
（ｉｉ）  前記Ｔ細胞上のＴ細胞受容体が結合する特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、実施形態１４０〜１４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４５  前記スクリーニングおよび特定がＴ細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４６  前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、実施形態１４５に記載の方法。
実施形態１４７  前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌である、実施形態１４０〜１４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４８  前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、実施形態１４７に記載の方法。
実施形態１４９  前記疾患担持生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態１４０〜１４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５０  前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態１４０〜１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５１  前記核酸配列の前記シーケンシングがエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、実施形態１４０〜１５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５２  前記１つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、実施形態１４０〜１５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５３  前記１つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、実施形態１４０〜１５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５４  前記弱毒化組換え型リステリアが１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを分泌する、実施形態１４０〜１５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５５  前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープがＴ細胞エピトープを含む、請求項１４０〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１５６  プラスミドベクターまたはファージベクターを使用して前記形質転換が行われる、実施形態１４０〜１５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５７  １つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、実施形態１４０〜１５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５８  ミニ遺伝子核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターを使用して前記形質転換が行われ、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含み、前記キメラタンパク質が
（ａ）  細菌分泌シグナル配列、
（ｂ）  ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、
（ｃ）  前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを含み、
（ａ）〜（ｃ）の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記１つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態１４０〜１５７のいずれか１つに記載の系。
実施形態１５９  前記１つ以上のペプチドの発現と分泌を確認するために前記弱毒化組換え型リステリア株を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む実施形態１４０〜１５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６０  前記プラスミドが組込み型プラスミドである、実施形態１５６〜１５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６１  前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態１５６〜１５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６２  抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、実施形態１５６〜１５８に記載の方法。
実施形態１６３  前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、実施形態１５７に記載の方法。
実施形態１６４  前記ｔＬＬＯタンパク質が配列番号３で表される、実施形態１６３に記載の方法。
実施形態１６５  前記ａｃｔＡが配列番号１２〜１３および配列番号１５〜１８で表される、実施形態１６３に記載の方法。
実施形態１６６  前記ＰＥＳＴアミノ酸配列が配列番号５〜１０で表される配列から選択される、実施形態１６３に記載の方法。
実施形態１６７  前記変異型ＬＬＯがコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を含む、実施形態１６３に記載の方法。
実施形態１６８  前記突然変異が配列番号２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、またはＷ４９２の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１６９  前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドによる置換を含み、前記非ＬＬＯペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１７０  前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の欠失を含む、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１７１  前記１つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原から構成される、実施形態１４０〜１７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７２  前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、実施形態１７１に記載の方法。
実施形態１７３  前記１つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態１４０〜１７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７４  前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、キメラＨｅｒ２抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、二価ＰＳＡ、ＥＲＧ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＰＡＫ６、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原Ｅ（ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、インターロイキン１３受容体α（ＩＬ１３−Ｒ  α）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、血管新生抗原、ｒａｓタンパク質、ｐ５３タンパク質、ｐ９７黒色腫抗原、ＫＬＨ抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１抗原、ＴＲＰ−２、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはテスティシンを含む、実施形態１７１〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７５  前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態１４７および１７３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７６  前記１つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態１４０〜１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７７  前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態１７６に記載の方法。
実施形態１７８  前記感染症が感染性細菌病である、実施形態１７６に記載の方法。
実施形態１７９  前記感染症が以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態１７６に記載の方法。
実施形態１８０  前記弱毒化リステリアが１つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、実施形態１４０〜１７９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８１  前記内在性遺伝子突然変異がａｃｔＡ遺伝子突然変異、ｐｒｆＡ突然変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重突然変異、ｄａｌ／ｄａｌ遺伝子二重突然変異、またはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、実施形態１８０に記載の方法。
実施形態１８２  前記突然変異が前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、実施形態１８０〜１８１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８３  前記ベクターが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレーム、または代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第２核酸配列をさらに備える、実施形態１４０〜１８２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８４  前記オープン・リーディング・フレームによってコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態１８３に記載の方法。
実施形態１８５  前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、実施形態１４０〜１８４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８６  前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む実施形態１４０〜１８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８７  前記アジュバントが顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピッドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態１７６に記載の方法。
実施形態１８８  免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む実施形態１４０〜１８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８９  前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片である、実施形態１８８に記載の方法。
実施形態１９０  前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、実施形態１４０〜１８９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９１  前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、実施形態１９０に記載の方法。
実施形態１９２  前記免疫応答が抗感染症応答を含む、実施形態１９０に記載の方法。
実施形態１９３  前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態１９２に記載の方法。
実施形態１９４  前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態１９２に記載の方法。
実施形態１９５  前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、実施形態１４０〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９６  前記個別免疫療法により前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が増加する、実施形態１４０〜１９１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９７  実施形態１４０〜１８５のいずれか１つに記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
実施形態１９８  疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
（ａ）  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の前記１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
（ｂ）  （ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、または（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してＤＮＡ免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記ＤＮＡ免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、
（ｃ）  前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
（ｄ）  （ｃ）において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
（ｅ）  （ｃ）において特定された前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第２ベクターを形質転換するか、または前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してＤＮＡ免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記ＤＮＡ免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法。
実施形態１９９    前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦを前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
（ｉｉ）  前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列内のＯＲＦ中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、実施形態１９８に記載の方法。
実施形態２００  前記対象より第２生体試料を獲得する工程が、前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む前記第２組成物の投与の後に増殖するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む第２生体試料の獲得を含む、実施形態１９８〜１９９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０１  前記生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、実施形態１９８〜２００のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０２  前記特徴分析過程が  
（ｉ）  前記疾患に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、
（ｉｉ）  前記Ｔ細胞上のＴ細胞受容体が結合する特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、実施形態１９８〜２０１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０３  前記スクリーニングおよび特定がＴ細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、実施形態２０２に記載の方法。
実施形態２０４  前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、実施形態２０３に記載の方法。
実施形態２０５  前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌である、実施形態１９８〜２０４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０６  前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、実施形態２０５に記載の方法。
実施形態２０７  前記疾患担持生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態１９８〜２０６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０８  前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態１９８〜２０７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０９  前記核酸配列の前記シーケンシングがエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、実施形態１９８〜２０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１０  前記１つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、実施形態１９８〜２０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１１  前記１つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、実施形態１９８〜２１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１２  前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープがＴ細胞エピトープを含む、実施形態１９８〜２１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１３  前記ベクターがワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子である、実施形態１９８〜２１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１４  前記１つ以上のペプチドの発現を確認するために前記ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む実施形態１９８〜２１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１５  前記ＤＮＡ免疫療法が１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のＯＲＦを含む核酸配列を含む、実施形態１９８〜２１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１６  前記核酸配列がプラスミドの形態である、実施形態２１５に記載の方法。
実施形態２１７  前記プラスミドが組込み型プラスミドまたは染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態２１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１８  １つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、実施形態５９〜７８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１９  前記ペプチド免疫療法が１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含み、各ペプチドが免疫原性ポリペプチドまたはその断片と融合しているか、または混合されている、実施形態１９８〜２１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２０  前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、実施形態２１８〜２１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２１  前記ｔＬＬＯタンパク質が配列番号３で表される、実施形態２２０に記載の方法。
実施形態２２２  前記ａｃｔＡが配列番号１２〜１３および配列番号１５〜１８で表される、実施形態２２０に記載の方法。
実施形態２２３  前記ＰＥＳＴアミノ酸配列が配列番号５〜１０で表される配列から選択される、実施形態２２０に記載の方法。
実施形態２２４  前記変異型ＬＬＯがコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を含む、実施形態２２０に記載の方法。
実施形態２２５  前記突然変異が配列番号２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、またはＷ４９２の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態２２４に記載の方法。
実施形態２２６  前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドによる置換を含み、前記非ＬＬＯペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態２２４に記載の方法。
実施形態２２７  前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の欠失を含む、実施形態２２４に記載の方法。
実施形態２２８  前記１つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原から構成される、実施形態１９８〜２２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２９  前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、実施形態２２８に記載の方法。
実施形態２３０  前記１つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態１９８〜２２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３１  前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、キメラＨｅｒ２抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、二価ＰＳＡ、ＥＲＧ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＰＡＫ６、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原Ｅ（ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、インターロイキン１３受容体α（ＩＬ１３−Ｒ  α）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、血管新生抗原、ｒａｓタンパク質、ｐ５３タンパク質、ｐ９７黒色腫抗原、ＫＬＨ抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１抗原、ＴＲＰ−２、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはテスティシンを含む、実施形態２２９〜２３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３２  前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態２０５および２３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３３  前記１つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態１９８〜２３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３４  前記感染症が感染性ウイルス病または感染性細菌病である、実施形態２３３に記載の方法。
実施形態２３５  前記感染症が以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態２３４に記載の方法。
実施形態２３６  前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む実施形態１９８〜２３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３７  前記アジュバントが顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピッドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態２３６に記載の方法。
実施形態２３８  免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む実施形態１９８〜２３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３９  前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片である、実施形態２３８に記載の方法。
実施形態２４０  前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、実施形態１９８〜２３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４１  前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、実施形態２４０に記載の方法。
実施形態２４２  前記免疫応答が抗感染症応答を含む、実施形態２４０に記載の方法。
実施形態２４３  前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、実施形態２４２に記載の方法。
実施形態２４４  前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、実施形態１９８〜２４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４５  前記個別免疫療法により前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が増加する、実施形態１９８〜２４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４６  実施形態１９８〜２１４、２１８、および２２０〜２３５のいずれか１つに記載の方法により作製されるウイルス様粒子。
実施形態２４７  実施形態１９８〜２１４、２１８、および２２０〜２３５のいずれか１つに記載の方法により作製されるワクシニアウイルス株。
実施形態２４８  実施形態１９８〜２１２、２１５〜２１８、および２２０〜２３５のいずれか１つに記載の方法により作製されるＤＮＡ免疫療法。
実施形態２４９  実施形態１９８〜２１２、２１９、および２２０〜２３５のいずれか１つに記載の方法により作製されるペプチド免疫療法。
実施形態２５０  実施形態１９７に記載のリステリアを含む医薬組成物。
実施形態２５１  実施形態２４６に記載のウイルス様粒子を含む医薬組成物。
実施形態２５２  実施形態２４７に記載のワクシニアウイルス株を含む医薬組成物。
実施形態２５３  実施形態２４８に記載のＤＮＡ免疫療法を含む医薬組成物。
実施形態２５４  実施形態２４９に記載のペプチド免疫療法を含む医薬組成物。
実施形態２５５  対象向けの個別免疫療法を作成するための系であって、少なくとも１つの処理装置および前記処理装置により実行されるプログラム命令を含む少なくとも１つの記憶媒体を含み、前記プログラム命令によって前記処理装置が次のこと、すなわち、
（ａ）  全てのネオエピトープおよび前記対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイプを含む出力データを受信すること、
（ｂ）  各ネオエピトープの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるエピトープを除外すること、
（ｃ）  対象ＨＬＡに結合する残りのネオエピトープの能力、およびそれらのネオエピトープの予想ＭＨＣ結合スコアに基づいてそれらのネオエピトープを数値により評価すること、
（ｄ）  各ネオエピトープのアミノ酸配列をプラスミドに挿入すること、
（ｅ）  各コンストラクトの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるあらゆるコンストラクトを除外すること、
（ｆ）  最も高いスコアになったコンストラクトから開始して、各コンストラクトのアミノ酸配列を対応するＤＮＡ配列に逆翻訳すること、
（ｇ）  所定の上限に達するまでランク順に前記プラスミドコンストラクトに追加のネオエピトープを挿入すること、
（ｈ）  前記対象における免疫治療応答を測定するために前記コンストラクトの末端にＤＮＡ配列タグを付加すること、および
（ｉ）  リステリア・モノサイトゲネスにおける発現および分泌のために前記ネオエピトープをコードする前記ＤＮＡ配列および前記ＤＮＡ配列タグを最適化すること、を含むステップを実行することになる前記系。
実施形態２５６  好ましい出力データがＦＡＳＴＡ形式のものである、実施形態２５５に記載の系。
実施形態２５７  カイト・ドゥーリトル・ハイドロパシープロットを用いて疎水性が測定される、実施形態２５５〜２５６のいずれかに記載の系。
実施形態２５８  カイト・ドゥーリトル・プロット上で１．６より上のスコアになる全てのネオエピトープが除外または選択除外される、実施形態２５５〜２５７のいずれかに記載の系。
実施形態２５９  免疫エピトープデータベース（ＩＥＤ）を用いて対象ＨＬＡに結合する各ネオエピトープの能力が評価される、実施形態２５５〜２５８のいずれかに記載の系。
実施形態２６０  各ネオエピトープのサイズが２１アミノ酸（２１ｍｅｒ）である、実施形態２５５〜２５９のいずれかに記載の系。
実施形態２６１  前記ＤＮＡタグがリンカーを介して前記ネオエピトープに連結される、実施形態２５５〜２６０のいずれかに記載の系。
実施形態２６２  前記リンカーが４×グリシンリンカーである、実施形態２５５〜２６１のいずれかに記載の系。
実施形態２６３  ステップ（ｈ）の前記ＤＮＡ配列タグがＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓである、実施形態２５５〜２６２のいずれかに記載の系。
実施形態２６４  免疫抑制特性を有することが知られているネオエピトープがステップ（ａ）の前に考慮から除外される、実施形態２５５〜２６３のいずれかに記載の系。
【０６２３】
以下の実施例では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本発明はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者によって理解される。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記載されていない。
【実施例】
【０６２４】
材料および実験方法（実施例１〜２）
細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ−１腫瘍をＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換した。Ｔ．Ｃ．Ｗｕ（ジョンズ・ホプキンズ大学医学部、米国メリーランド州ボルチモア）によって提供されたＴＣ−１は、低レベルのＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７を発現し、且つ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換された腫瘍形成性の高い肺上皮細胞である。ＴＣ−１を、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃＭ）の２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍＬのＧ４１８、および１０％のナショナルコレクションタイプカルチャー−１０９培地中、３７°で１０％のＣＯ２を用いて培養した。Ｃ３は、ＨＰＶ  １６の完全ゲノムで不死化され、且つ、ｐＥＪ−ｒａｓで形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウス胚細胞である。ＥＬ−４／Ｅ７は、レトロウイルスによってＥ７を形質導入された胸腺腫ＥＬ−４である。
Ｌ．モノサイトゲネス株および増殖  
【０６２５】
使用されたリステリア株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソーム発現系内のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子、図１Ａ）、Ｌｍ−Ｅ７（ＡＤＸＳ１１−００１とも呼ばれる）（リステリアゲノムへと組み込まれる単一コピーＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」、エピソーム発現系内のｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８」、染色体へと組み込まれる単一コピーＨＩＶ−１Ｇａｇ遺伝子カセット）であった。プライマー５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２４、ＸｈｏＩ部位は下線付き）および５’−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（配列番号２５、ＳｐｅＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲによってＥ７を増幅し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカリフォルニア州サンディエゴ）にライゲーションした。ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化によってＥ７をｐＣＲ２．１から切り出し、ｐＧＧ−５５にライゲーションした。このｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性転写因子ｐｒｆＡをマルチコピーシャトルプラスミド（Ｗｉｒｔｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ、  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、  １６５：８３１，  １９８６）であるｐＡＭ４０１にクローニングし、ｐＧＧ−５５を作製した。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙ遺伝子産物の最初の４４１個のＡＡの発現を引き起こし（溶血性Ｃ末端を欠いており、以下では「ΔＬＬＯ」と呼ばれ、配列番号３に示す配列を有する）、これはＸｈｏＩ部位によってＥ７遺伝子に結合されてｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を生じ、それはＬＬＯ−Ｅ７として転写され、分泌される。リステリアのｐｒｆＡ陰性株であるＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学のＤｒ．Ｈａｏ  Ｓｈｅｎによって提供された）のｐＧＧ−５５を用いた形質転換が、インビボでのプラスミドの保持に対して選択された（図１Ａ〜図１Ｂ）。プライマー５’−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号２６、ＮｈｅＩ部位は下線付き）、および５’−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号２７、ＸｈｏＩ部位は下線付き）を用いてｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片を作成した。プライマー５’−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（配列番号２８、ＸｂａＩ部位は下線付き）、および５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号２９、ＳａｌＩ部位は下線付き）を用いてｐｒｆＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。ｈｌｙプロモーターとＥ７の発現と分泌を引き起こすシグナル配列とを含有する発現カセットをＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインへと導入することによってＬｍ−Ｅ７を作製した。プライマー５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号３０、ＢａｍＨＩ部位は下線付き）および５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号３１、ＸｂａＩ部位は下線付き）を使用してＥ７をＰＣＲ増幅した。次いでＥ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターにライゲーションした。結果として得られるプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ７でＬＭ株１０４０３Ｓを形質転換したが、このプラスミドはＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む。その相同性ドメインが相同組換えによるＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入を可能にする。Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組込みについてクローンをスクリーニングした。クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を含むブレインハートインフュージョン培地中で細菌を培養し（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）、またはクロラムフェニコールを含まない同培地中で細菌を培養した（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）。細菌をアリコットにして−８０℃で凍結した。ウエスタンブロット法によって発現を検証した（図２）。
ウエスタンブロット法
【０６２６】
リステリア株をルリア−ベルターニ培地中に３７℃で培養し、６００ｎｍで測定された同一の光学密度で採取した。上清をＴＣＡ沈殿し、０．１ＮのＮａＯＨを補充した１×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一量の各細胞ペレットまたは各ＴＣＡ沈殿上清を４〜２０％のトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ、カリフォルニア州サンディエゴ）上に負荷した。それらのゲルを二フッ化ポリビニリデンに転写し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ）で調査し、次いでＨＲＰ−結合抗マウス二次Ａｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国リトル・チャルフォント）とインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ検出試薬で発色させ、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に露光させた。
腫瘍増殖の測定
【０６２７】
１日おきに表面の最短径及び最長径にキャリパーをわたして腫瘍を測定した。これら２つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートルの単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が２０ｍｍに達したとき、マウスを殺処理した。各時点に対する腫瘍の測定値は生きているマウスに対してのみ示されている。
定着した腫瘍増殖に対するリステリア組換え体の効果
【０６２８】
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）が左脇腹の皮下に２×１０５ＴＣ−１細胞を受容した。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径４〜５ｍｍの触知可能なサイズに達した。次いで８匹のマウスからなる群を７日目および１４日目に０．１ＬＤ５０の  Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０７ＣＦＵ）、またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０５ＣＦＵ）で腹腔内処置した。
５１Ｃｒリリースアッセイ
【０６２９】
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇで腹腔内免疫した。免疫の１０日後に脾臓を採取した。脾細胞をフィーダー細胞としての放射線照射ＴＣ−１細胞と培養して（１００：１、脾細胞：ＴＣ−１）確立し、インビトロで５日間刺激し、次いで以下の標的を使用して標準的５１Ｃｒリリースアッセイに使用した。ＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥ７  Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）でパルスしたＥＬ−４。Ｅ：Ｔ細胞比は、３回繰り返して、８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１であった。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、５０μｌの上清を各ウェルから取り出した。Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンター（米国メリーランド州ゲイザースバーグ）を用いてサンプルをアッセイした。特異的溶解率は、［（実験による一分当たりのカウント（ｃｐｍ）−自然発生ｃｐｍ）／（総ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）］×１００として決定された。
ＴＣ−１特異的増殖
【０６３０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇを用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０で免疫し、２０日後に１ＬＤ５０で腹腔内注射により追加免疫した。追加免疫の６日後、免疫したマウスおよび未感作マウスから脾臓を採取した。Ｅ７  Ａｇ源としてのウェル当たり２．５×１０４細胞、１．２５×１０４細胞、６×１０３細胞、または３×１０３細胞の放射線照射ＴＣ−１細胞と共に、またはＴＣ−１細胞を含まずに、または１０μｇ／ｍｌのＣｏｎ  Ａと共に平底９６ウェルプレート中に５×１０５細胞／ウェルの密度で培養して脾細胞を確立した。４５時間後に０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジン／ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはＴｏｍｔｅｃハーベスター９６（米国コネチカット州オレンジ）を使用して１８時間後に回収され、Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。ｃｐｍの変化は、実験的ｃｐｍ−Ａｇを含まないｃｐｍとして計算された。
フローサイトメトリー分析
【０６３１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０．１  ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７を用いて静脈内（ｉ．ｖ．）免疫し、３０日後に追加免疫した。ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ結合）、ＣＤ６２リ癌ド（ＣＤ６２Ｌ、ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ結合）、およびＥ７  Ｈ−２Ｄｂ四量体に対する３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターとＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用して実施した。追加免疫の５日後に採取した脾細胞を、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）または対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドを負荷したＨ−２Ｄｂ四量体を用いて、室温（ｒｔ）で染色した。四量体を１／２００に希釈して使用した。これらの四量体は、Ｄｒ．Ｌａｒｒｙ  Ｒ．  Ｐｅａｓｅ（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、米国ミネソタ州ロチェスター）およびＮＩＡＩＤ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙおよびＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈならびに標準試薬プログラムによって提供された。四量体＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を分析した。
Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ実験
【０６３２】
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５細胞のＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ細胞を接種した。３日目、１０日目、および１７日目に０．１ＬＤ５０のＬｍ−ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０８ｃｆｕ）を用いて８匹のマウスの群を免疫し、８匹のマウスを処置しないままにした。
統計
【０６３３】
腫瘍径の比較のため、各群の腫瘍サイズの平均値とＳＤを決定し、スチューデントのｔ−検定によって統計的有意性を決定した。ｐ≦０．０５を有意と見なした。
実施例１：ＬＬＯ−抗原融合体は抗腫瘍免疫性を誘導する
結果
【０６３４】
Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７をＴＣ−１の増殖に影響を与える能力に関して比較した。皮下腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスの左の脇腹に確立した。７日後、腫瘍は触診可能なサイズ（４〜５ｍｍ）に達した。７日目および１４日目に０．１ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、または対照としてのＬｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰをマウスにワクチン接種した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は定着したＴＣ−１腫瘍のうちの７５％の完全な退行を誘導し、一方でこの群の中の他の２匹のマウスでは腫瘍増殖が抑制された（図３）。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−Ｇａｇを用いた免疫は腫瘍退行を誘導しなかった。この実験は複数回繰返され、常に非常に類似した結果であった。加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７については異なる免疫プロトコル下でも類似の結果が達成された。別の実験では、定着した５ｍｍのＴＣ−１腫瘍を有するマウスを単回の免疫で治癒することができた。
【０６３５】
他の実験では２つの他のＥ７発現腫瘍細胞株であるＣ３とＥＬ−４／Ｅ７を使用して類似の結果が得られた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたワクチン接種の有効性を確認するため、腫瘍を除去した動物にＴＣ−１腫瘍細胞またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞をそれぞれ６０日目または４０日目に再負荷した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫された動物は実験終了まで腫瘍が無いままであった（ＴＣ−１の場合１２４日目、ＥＬ−４／Ｅ７については５４日目）。
【０６３６】
したがってΔＬＬＯとの融合タンパク質としての抗原の発現によりその抗原の免疫原性が強化される。
実施例２：ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７処理によりＴＣ−１特異的脾細胞増殖が誘発される
【０６３７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を有するＬｍ−Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するため、抗原特異的免疫能の尺度であるＴＣ−1特異的増殖性応答を免疫されたマウスにおいて測定した。２０：１、４０：１、８０：１、および１６０：１の脾細胞：ＴＣ−１比でＥ７の供給源としての放射線照射ＴＣ−１細胞に曝露されるとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫されたマウス由来の脾細胞が増殖した（図４）。反対に、Ｌｍ−Ｅ７およびｒＬｍ対照で免疫されたマウスに由来する脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖を示しただけであった。
実施例３：ＡｃｔＡ−Ｅ７融合およびＰＥＳＴ−Ｅ７融合体は抗腫瘍免疫性を付与する
材料および方法
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の構築
【０６３８】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、短縮型のａｃｔＡタンパク質に融合されたＥ７タンパク質を発現するプラスミドを含むＬＭの組換え株である。Ｌｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７は、ｐＤＰ−２０２８を修飾することにより構成されたプラスミドベクターｐＤＤ−１をリステリアに導入することにより作製された。ｐＤＤ−１は、ＡｃｔＡ−Ｅ７の発現と分泌を引き起こす１コピーの３１０ｂｐのｈｌｙプロモーターとｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）を発現する発現カセット、４つのＰＥＳＴ配列（配列番号１９）を含む１１７０ｂｐのａｃｔＡ遺伝子（短縮型ＡｃｔＡポリペプチドはその分子の最初の３９０個のＡＡから成る。配列番号１１）、３００ｂｐのＨＰＶＥ７遺伝子、１０１９ｂｐのｐｒｆＡ遺伝子（病原性遺伝子の発現を制御）、および形質転換細菌クローンの選択のためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）を含む（Ｓｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ａｒｃｈ．  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．，  １３０：９２−９７）。
【０６３９】
ｈｌｙプロモーター（ｐＨｌｙ）および遺伝子断片は、ｐＧＧ５５（実施例１）からプライマー５’−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（Ｘｂａ  Ｉ部位は下線付き；配列番号３２）およびプライマー５’−ＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＧＣ−’３（Ｎｏｔ  Ｉ部位は下線付き。最初の１８ヌクレオチドはＡｃｔＡ遺伝子と重複；配列番号３３）を使用してＰＣＲ増幅された。ａｃｔＡ遺伝子は、Ｌｍ  １０４０３Ｓ野生型ゲノムからプライマー５’−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴ−３’（ＮｏｔＩ部位は下線付き；配列番号３４）およびプライマー５’−ＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣ−３’（ＸｈｏＩ部位は下線付き；配列番号３５）を使用してＰＣＲ増幅された。Ｅ７遺伝子は、ｐＧＧ５５（ｐＬＬＯ−Ｅ７）からプライマー５’−ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡ−３’（ＸｈｏＩ部位は下線付き；配列番号３６）およびプライマー５’−ＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（ＸｍａＩ部位は下線付き；配列番号３７）を使用してＰＣＲ増幅された。ｐｒｆＡ遺伝子は、Ｌｍ  １０４０３Ｓ野生型ゲノムからプライマー５’−ＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（ＸｍａＩ部位は下線付き；配列番号３８）およびプライマー５’−ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（ＳａｌＩ部位は下線付き；配列番号３９）を使用してＰＣＲ増幅された。ｈｌｙプロモーター−ａｃｔＡ遺伝子融合（ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ）は、精製したｐＨｌｙ  ＤＮＡおよび精製したａｃｔＡ  ＤＮＡから、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３２）および下流ａｃｔＡプライマー（配列番号３５）を使用してＰＣＲ生成および増幅された。
【０６４０】
ｐｒｆＡ遺伝子（Ｅ７−ｐｒｆＡ）に融合されたＥ７遺伝子は、精製したＥ７  ＤＮＡおよび精製したｐｒｆＡ  ＤＮＡから、上流Ｅ７プライマー（配列番号３６）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号３９）を使用してＰＣＲ生成および増幅された。
【０６４１】
Ｅ７−ｐｒｆＡ融合生成物に融合されたｐＨｌｙ−ａｃｔＡ融合生成物は、精製した融合ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ  ＤＮＡ生成物および精製した融合Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡ生成物から、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３２）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号３９）を使用してＰＣＲで生成および増幅され、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホヤ）にライゲーションされた。コンピテント大腸菌（ＴＯＰ１０’Ｆ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホヤ）をｐＣＲＩＩ-ＡｃｔＡＥ７で形質転換した。溶解および分離の後、ＢａｍＨＩを使用する制限分析（７７０ｂｐと６４００ｂｐの期待断片サイズ（または挿入断片をベクターに転じると：２５００ｂｐと４１００ｂｐ））およびＢｓｔＸＩを使用する制限分析（２８００ｂｐと３９００ｂｐの期待断片サイズ）によりプラスミドをスクリーニングし、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３２）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号３９）を使用するＰＣＲ分析でもプラスミドをスクリーニングした。
【０６４２】
ＸｂａＩとＳａｌＩを使用する二重消化によりｐＣＲＩＩからｐＨｌｙ−ａｃｔＡ−Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡ挿入断片を切り出し、同様にＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化されたｐＤＰ−２０２８にライゲーションした。ｐＡｃｔＡＥ７発現系でＴＯＰ１０’Ｆコンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホヤ）を形質転換した後に上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３２）および下流ＰｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号３９）を使用するＰＣＲ分析によりクロラムフェニコール耐性クローンをスクリーニングした。ｐＡｃｔＡＥ７を含むクローンをブレインハートインフュージョン培地（クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍｌ（ミリリットル）、Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州デトロイトを含む）中に培養し、ミディプレップＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を使用してｐＡｃｔＡＥ７を細菌細胞から単離した。Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０：  ２２０９−２２１８）に記載されるようにペニシリン処理したリステリア（ＸＦＬ−７株）のｐｒｆＡ陰性株をｐＡｃｔＡＥ７発現系で形質転換し、インビボでのそのプラスミドの保持についてクローンを選抜した。クローンをクロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍＬ）入りのブレインハートインフュージョン中に３７℃で培養した。細菌をアリコットにして−８０℃で凍結した。
抗原発現のイムノブロット検証
【０６４３】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＡｃｔＡ−Ｅ７（約６４ｋＤ）を分泌することを検証するため、リステリア株をルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中に３７℃で培養した。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて培養上清からタンパク質を沈殿させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを含む１×サンプルバッファー中にそれを再懸濁した。同一の量の各ＴＣＡ沈殿上清を４％〜２０％のトリスグリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ、カリフォルニア州サンディエゴ）に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜に転写し、１：２５００の抗Ｅ７モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ）で調査し、次いで１：５０００のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国、リトル・チャルフォント）で調査した。Ａｍｅｒｓｈａｍ増強化学発光検出試薬を用いてブロットを発色させ、オートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に対して露光させた（図５Ａ）。
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉの構築（図６Ａ）
【０６４４】
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがプロモーターおよびｈｌｙ遺伝子のＰＥＳＴ配列のみ、特にＬＬＯの最初の５０個のＡＡを含有すること以外はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を構築するため、ＳＯＥ（ジーンスプライシング・バイ・オーバーラップエクステンション）ＰＣＲ技法を使用して、ｈｌｙプロモーターおよびＰＥＳＴ領域を全長のＥ７遺伝子に融合した。従来のＰＣＲ技法によってＥ７遺伝子およびｈｌｙ−ＰＥＳＴ遺伝子断片をＬＬＯの最初の４４１個のＡＡを含有するプラスミドｐＧＧ−５５から増幅し、まとめてスプライシングした。最終的なプラスミドｐＶＳ１６．５を作製するため、インビトロ選択用のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ４０１にｈｌｙ−ＰＥＳＴ−Ｅ７断片およびｐｒｆＡ遺伝子をサブクローニングし、得られたプラスミドを使用してＸＦＬ−７を形質転換した。
【０６４５】
Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがＰＥＳＴ配列を欠いていること以外は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である組換え型リステリア株である。これは、ＰＥＳＴ含有領域（３３３〜３８７ｂｐ）をｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子から除去するために設計されたプライマーを使用してエピソーム発現系を構築したこと以外は、基本的にＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７について記載されたように作製された。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯを含まないＥ７を分泌する組換え株である。この株を形質転換するのに用いるプラスミドはＥ７遺伝子に融合したｈｌｙプロモーターの遺伝子断片およびシグナル配列を含有する。このコンストラクトは、染色体の中へと組み込まれた単一コピーのＥ７遺伝子を発現した大元のＬｍ−Ｅ７とは異なる。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、発現されるＥ７抗原の形態を除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７と完全に同系である。
結果
【０６４６】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７によって誘導される抗腫瘍免疫をＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によって誘導される抗腫瘍免疫性に対して比較するため、２×１０５細胞のＴＣ−１腫瘍細胞をマウスに皮下移植し、触知可能サイズ（およそ５ミリメートル［ｍｍ］）まで増殖させた。７日目および１４日目に１ＬＤ５０のＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（５×１０８ＣＦＵ）（十字）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０８ＣＦＵ）（四角）、またはＬｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）（丸）のいずれかでマウスを腹腔内免疫した。２６日目までに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の全ての動物は腫瘍が無いままであったが、一方で未感作動物（三角）およびＬｍ−Ｅ７で免疫された動物の全てが大きい腫瘍を成長させた（図５Ｂ）。したがって、ＡｃｔＡ−Ｅ７融合体でのワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
【０６４７】
加えて、Ｅ７発現腫瘍の退行を生じさせるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉの能力についてそれらを比較した。４０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮下ＴＣ−１腫瘍を確立した。腫瘍が４〜５ｍｍに達した後、８匹のマウスからなる５つの群にマウスを分けた。各群を４つの組換え型ＬＭ免疫療法のうちの１つで処置し、１つの群は未処置のままにした。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７はそれぞれ５／８事例および３／８の事例で定着した腫瘍の退行を誘導した。いずれの時点においてもＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で処置されたマウスの平均腫瘍サイズの間に統計的な差はなかった。しかしながら、ＰＥＳＴ配列を含まないＥ７であるＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを発現する免疫療法は、１匹を除いて全てのマウスで腫瘍退行を引き起こすことができなかった（図６Ｂ、上のパネル）。これは２回の実験を表したものであり、２８日目における平均腫瘍サイズの統計的に有意な差がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７で処置した腫瘍とＬｍ−Ｅ７ｅｐｉまたはＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７で処置した腫瘍との間で観察された（Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定；図６Ｂ、下のパネル）。加えて、ＰＥＳＴ含有免疫療法をワクチン接種されたマウスの脾臓における３回の実験にわたって四量体陽性脾細胞のパーセンテージの増加に再現性が見られた（図６Ｃ）。したがって、ＰＥＳＴ−Ｅ７融合体を用いたワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
実施例４：ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列へのＥ７の融合がＥ７特異的免疫を強化し、腫瘍浸潤性Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞を発生させる
材料および実験方法
【０６４８】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｃｌ（マイクロリットル）の２×１０５細胞のＴＣ−１腫瘍細胞に加えて４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）を含む５００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮下移植した（ｎ＝３）。マウスを７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内免疫し、脾臓および腫瘍を２８日目に採取した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上で、２ミリリットル（ｍＬ）のＲＰ  １０培地を含有する試験管内において４℃で一晩インキュベートした。鉗子を用いて腫瘍を細かく切り刻み、２ｍｍのブロックに切断し、３ｍｌの酵素混合物（ＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ−１）と共に３７℃で１時間インキュベートした。四量体およびＩＦＮ−γ染色のため、組織懸濁液をナイロンメッシュに通して濾過し、ＰＢＳ中の５％胎児ウシ血清＋０．０５％ＮａＮ３で洗浄した。
【０６４９】
ブレフェルジンＡの存在下で１０７細胞／ｍＬの脾細胞および腫瘍細胞を１マイクロモル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドと共に５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４  Ｇ２）中、４℃で１時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌについて染色し、透過処理し、透過処理キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して固定し、ＩＦＮ−γについて染色した。２レーザーフローサイトメーター、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して５００，０００イベントを取得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）を使用して分析した。活性化（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＦＮ−γ分泌細胞のパーセンテージを計算した。
【０６５０】
四量体染色のため、Ｈ−２Ｄｂ四量体にフィコエリスリン（ＰＥ）結合Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号４０）を負荷し、室温で１時間染色し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ−結合抗ＣＤ８＋で４℃において３０分間染色した。脾臓および腫瘍内の四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を比較して細胞を分析した。
結果
【０６５１】
抗原特異的免疫を強化するＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の能力を分析するため、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかで免疫するか、または無処置（未感作）とした。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７群およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群のマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７または未感作マウスにおけるものよりも高いパーセンテージのＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ａ）および四量体特異的ＣＤ８＋細胞（図７Ｂ）を含有した。
【０６５２】
別の実験では、腫瘍担持マウスにＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、またはＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍中のＥ７特異的リンパ球のレベルを測定した。０．１ＬＤ５０の４つの免疫療法を用いて７日目および１４日目にマウスを処置した。腫瘍を２１日目に採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体を用いて、およびＥ７／Ｄｂ四量体を用いて染色した。腫瘍内の四量体陽性リンパ球のパーセンテージの増加が、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を用いてワクチン接種されたマウスで見られた（図８Ａ）。この結果は３つの実験にわたって再現性があった（図８Ｂ）。
【０６５３】
したがって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７、およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。
実施例５：ＬＬＯおよびＡｃｔＡの融合体はＥ６/Ｅ７トランスジェニックマウスにおいて自発性（自然発生）腫瘍を減少させる
【０６５４】
Ｅ６/Ｅ７トランスジェニックマウスにおける自発性腫瘍に対するＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫療法およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７免疫療法の影響を判断するため、６〜８週齢のマウスを１×１０８  単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７または２．５×１０８単位の  Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７で毎月一回８か月にわたり免疫した。最後の免疫から２０日後にマウスを殺処理し、甲状腺を摘出し、重量測定した。この実験を二回実施した（表１）。
【０６５５】
表１．    ８か月齢のワクチン未接種のトランスジェニックマウスとワクチン接種済みのトランスジェニックマウスにおける甲状腺重量（ｍｇ）＊。
【表１】
2018515588.tif 000004
【０６５６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７処置マウスと無処置マウスの間の甲状腺重量の差、およびＬｍ−ＬＬＯ−ＡｃｔＡ処置マウスと無処置マウスの間の甲状腺重量の差は両方の実験において有意（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０５）であったが、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ処置マウス（無関係の抗原対照）と無処置マウスの間の差は有意ではなく（スチューデントのｔ−検定）、このことはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７が自然発生腫瘍増殖を抑制したことを示している。よって、本発明の免疫療法は新しいＥ７発現腫瘍の形成を防止する。
【０６５７】
上記実施例における所見を要約すると、ＬＬＯ抗原およびＡｃｔＡ抗原の融合体は、（ａ）腫瘍浸潤性抗原特異的Ｔ細胞を含み、且つ、腫瘍退行を誘導して通常の腫瘍および特に侵襲性の強い腫瘍の両方の腫瘍増殖を抑制することが可能である腫瘍特異的免疫応答を誘導し、（ｂ）自己抗原に対する寛容を克服し、そして（ｃ）自然発生腫瘍増殖を防止する。これらの所見は、多種多様な抗原、ＰＥＳＴ様配列、および腫瘍タイプについて首尾よく実施されたことによって証明されるように、大多数の抗原、ＰＥＳＴ様配列、および腫瘍タイプに一般化される。
実施例６：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫療法は安全であり子宮頚部癌患者の臨床指標を改善する
材料および実験方法
【０６５８】
選択基準。治験の全ての患者は「進展子宮頸部癌、進行性子宮頸部癌、または再発性子宮頚部癌」と診断されており、登録時の評価で全員がステージＩＶＢの疾患を有する段階であることが示された。全ての患者がカンジジン、おたふく風邪、破傷風、またはツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）から選択される３つのメモリー抗原を含むアネルギーパネルに対して陽性の免疫応答を示し、妊娠中でもＨＩＶ陽性でもなく、４週間以内に治験薬を服用しておらず、ステロイドを受容していなかった。
【０６５９】
プロトコル：患者は、入院患者への２５０ｍｌの通常生理食塩水の３０分間にわたる静脈内（ＩＶ）注入として３週間の間隔で２回のワクチン接種を実施された。５日後、患者は単回のＩＶアンピシリンコースを受け、さらに１０日間の経口アンピシリンを受けた上で解放された。食欲、日常的作業を完了する能力、安らかな睡眠など、全般的な生命力および生活の質の尺度であるカルノフスキーパフォーマンス指標を使用して全般的な健康状態を判断した。さらに、安全性および全体的な健康状態についての以下の指標、すなわち、アルカリホスファターゼ、直接ビリルビンと総ビリルビンの両方、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ｇｇｔ）、コレステロール、収縮期、拡張期、および心拍数、カルノフスキー様の生活の質の指標である疾患進行評価用の米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）基準、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板レベル、リンパ球レベル、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、およびＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）が決定された。患者は２回目の投与後の３週間目および３か月目に追跡調査を受け、その時点でそれらの患者の固形腫瘍治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）スコアを決定し、スキャンを実施して腫瘍サイズを決定し、治験終了時に免疫学的分析用に血液標本を採取し、その免疫学的分析にはＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＣＤ４+細胞集団、およびＣＤ８+細胞母集団の評価が含まれた。
【０６６０】
リステリア株：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の作製は実施例１に説明されている。
結果
【０６６１】
治験の前に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内（ｉ．ｖ．）投与と腹腔内（ｉ．ｐ．）投与の間で抗腫瘍有効性を判断するために前臨床実験を実施した。１×１０４細胞のＴＣ−１細胞を含む腫瘍を皮下に確立した。７日目および１４日目に１０８単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の腹腔内投与か、または１０８単位、１０７単位、１０６単位、もしくは１０５単位の用量でのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与のいずれかでマウスを免疫した。３５日目に両方の経路で１０８単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を受けたか、または１０７単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与を受けたマウスの５／８、および１０６単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与を受けたマウスの４／８が治癒した。それに対して、１０７単位未満の用量、または幾つかの事例では腹腔内投与された１０８単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は腫瘍増殖の抑制に効果的ではなかった。よって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与は腹腔内投与よりも効果的である。
治験
【０６６２】
進展子宮頸部癌、進行性子宮頸部癌、または再発性子宮頚部癌の患者におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫療法の安全性と有効性を評価するために第Ｉ相／第ＩＩ相の治験を実施した。それぞれ５人の患者をコホート１〜２に割り当て、それぞれ１×１０９ＣＦＵまたは3.3×１０９ＣＦＵを受けた。さらに５人の患者をそれぞれコホート３〜４に割り当て、それぞれ１×１０１０ＣＦＵまたは３．３１×１０１０ＣＦＵを受ける。
安全性データ
第１コホート
【０６６３】
第１コホートの患者全員が注入の開始後１〜２時間以内に軽度から中程度の発熱および悪寒の発症を報告した。一部の患者には吐き気を伴う嘔吐、または伴わない嘔吐があった。１例を除いて（後述）パラセタモールなどの非ステロイド系薬剤の単回投与がこれらの症状の解消に充分であった。発熱と呼応して、その時間経過に合わせて幾分かの一時的な心血管系の効果が観察された。その他の有害効果は報告されなかった。
【０６６４】
子宮頚部癌のこの後期段階では１年生存率は患者の１０〜１５％であることが典型的であり、有効であった腫瘍療法はこれまでに無い。実際に、患者２は非常に侵襲性の強い疾患を有する若年の患者であり、治験完了後まもなくに亡くなった。
【０６６５】
投与後２日目、３日目、および５日目に定量的血液培養物を評価した。このコホートで評価可能な５人の患者のうち、４人はどの時点でも血清中リステリアを示さず、１人は２日目に非常に少量（３５ＣＦＵ）の循環リステリアを有したが、３日目または５日目には検出可能なリステリアはなかった。
【０６６６】
患者５は最初のワクチン接種に反応し、投与後４８時間にわたって軽度の発熱があり、抗炎症剤で治療を受けた。１例で発熱が中程度の重篤度になる（どの時点でも３８．４℃を超えない）まで上昇したが、その後その患者にはアンピシリンコースが提供され、これによって発熱が解消した。抗生物質投与中、この患者は軽度のじんましんを発症し、これは抗生物質投与後に解消した。血液培養物は全て無菌であり、心血管データはその他の患者で観察された範囲内にあり、血清化学値は正常で、この患者にはリステリア症がないことが示された。さらに、アネルギーパネルは、１／３のメモリー抗原に対する強い反応を示し、（他の患者と類似する）機能性免疫の存在を示した。患者５はその後、追加免疫を受けると他の全員の患者と類似した反応を示した。
第２コホートおよび全般的安全性の観察  
【０６６７】
両方のコホートで注入後に肝臓機能試験において軽度で一時的な変化が観察された。これらの変化は治験をモニタリングする主治医によって臨床的有意性を持たないと判断され、体循環から肝臓および脾臓まで急速に除去される細菌の短命の感染であると予期された。概して、上記の方法の節に記載された全ての安全性指標が正味の変化をほとんど、または全く示さず、優れた安全性プロフィールを示した。このコホートにおける副作用プロファイルは最初のコホートで見られたプロファイルと実質的に同一であり、それは医原性感染の誘導の結果として発生するサイトカインおよび類似の因子の結果に関連する用量依存的シリーズの症状のようであった。どの時点でも血清中リステリアが観察されず、どちらのコホートでも用量制限毒性が観察されなかった。
有効性−第１コホート  
【０６６８】
治験を終了した第１コホートの３人の患者で以下の有効性指標を観察した：（図９）。
【０６６９】
患者１はそれぞれ２０ｍｍの２個の腫瘍がある状態で治験に登録し、これらの腫瘍は治験期間にわたり１８ｍｍおよび１４ｍｍに縮小し、免疫療法の治療有効性を示した。さらに、患者１はカルノフスキーパフォーマンス指標が７０で治験登録し、その指標は投与後には９０に上昇した。安全性審査パネルの会合で、セルビア国ベオグラード市の腫瘍学および放射線学研究所腫瘍学部門の部門長であるＳｉｎｉsａ  Ｒａｄｕｌｏｖｉｃが、それらの治験の実施機関の代表者、その機関のコンサルタントとして働く独立癌医であるＭｉｃｈａｅｌ  Ｋｕｒｍａｎ、Ｍｅｒｃｋ社のためにガーダシルの第ＩＩＩ相治験を実施し、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ社のためにサーバリックスの治験を実施したエモリー大学の婦人科腫瘍学者であるＫｅｖｉｎ  Ａｕｌｔ、およびＮＣＩの婦人科腫瘍学グループの創設者であり、ミシシッピ大学の婦人科腫瘍学の教授であるＴａｔｅ  Ｔｈｉｇｐｅｎに結果を発表した。Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ博士の意見では、患者１は免疫療法の治療による臨床的利益を示した。
【０６７０】
亡くなる前の患者２は混在した反応を示しており、１／２の腫瘍が縮小した。
【０６７１】
患者３は腫瘍随伴性疾患（患者の全体的な衰弱状態によって癌にとって二次的な他の続発症が生じるその癌の付帯現象）がある状態で登録したが、それには血小板数の９３６×１０９／ｍｌまでの上昇が含まれた。最初の投与の後、この数値はほぼ正常なレベルである４０５×１０９／ｍｌに減少した。
【０６７２】
患者４はそれぞれ２０ｍｍの２個の腫瘍がある状態で治験に登録し、これらの腫瘍は治験期間にわたり１８ｍｍおよび１４  ｍｍに縮小し、免疫療法の治療有効性を示した。患者４は１．６Ｋｇの体重増加を示し、１回目と２回目の投与の間でおよそ１０％のヘモグロビン数増加を示した。
有効性  -  第２コホートおよび一般的観察
【０６７３】
最低用量のコホートでは２人の患者で腫瘍の縮小が見られた。この効果のタイミングは、その効果が免疫応答の経時的発生に従っていたという点で免疫学的応答に関して観察された内容と一致した。これまでに腫瘍細胞量が評価された第２コホートの２人の患者のうち１人がワクチン接種後の時点で劇的な腫瘍細胞量の減少を示した。治験開始時、この患者には１３ｍｍ、１３ｍｍ、および１４ｍｍの３個の腫瘍があった。２回の免疫療法投与後、２個の腫瘍が９．４ｍｍおよび１２ｍｍに縮小し、３個目の腫瘍はもはや検出できなかった。
【０６７４】
２つのコホートの腫瘍細胞量を図１３Ｂに示す。要約すると、準備刺激注入と単回の追加免疫を含む治療レジメンで投与された比較的に低用量のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によっても、データが収集された６人の患者のうち３人で客観的奏功が達成された。
考察
【０６７５】
子宮頚部癌のこの後期段階では１年生存率は患者の１０〜１５％であることが典型的であり、有効であった腫瘍療法はこれまでに無い。ステージＩＶＢの子宮頚部癌を回復に向かわせることに有効であることを示した治療は無かった。この段階での子宮頚部癌の治療の困難さにもかかわらず、２／６の患者において抗腫瘍効果が観察された。さらに、本明細書において上述したようにその他の有効性指標が治験を終了した患者で観察された。
【０６７６】
よって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はヒト対象において安全であり、比較的低い用量で投与されても子宮頚部癌患者の臨床的指標を向上させる。追加免疫ワクチン接種の用量と回数を増やすと、および／または抗生物質を少量の用量で、もしくは注入後の後期の時点で投与すると、追加の肯定的な結果が観察される可能性がある。前臨床研究により、一桁台の倍率での用量の増加が奏効率に劇的な変化（例えば、０％の奏効率から５０〜１００％の完全寛解率）を起こし得ることが示された。また、追加的な追加免疫投与によって得られる免疫応答がさらに増強される高い可能性がある。さらに、観察された治療的免疫応答の肯定的効果は、免疫系が引き続き癌を攻撃することから、追加の時間経過にわたり継続する可能性がある。
実施例７：弱毒化リステリア株ＬｍｄｄΔａｃｔＡの構築、およびＬｍｄｄ株およびＬｍｄｄａ株内のｈｌｙ遺伝子へのフレーム内でのヒトｋｌｋ３遺伝子の挿入。
材料および方法
【０６７７】
前立腺癌のマウスモデルにおいて腫瘍の退行に関連する強力なＰＳＡ特異的免疫応答を誘発するｔＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌する組換え型Ｌｍであって、ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現がそのベクターに抗生物質耐性を付与するｐＧＧ５５ベースのプラスミド（表２）に由来する前記組換え型Ｌｍ（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）を開発した。最近、我々はｐＡＤＶ１４２プラスミドに基づくＰＳＡ免疫療法用の新株であって、抗生物質耐性マーカーを持たず、ＬｍｄｄＡ−１４２（表３）と呼ばれる株を開発した。この新株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも１０倍弱毒化されている。加えて、ＬｍｄｄＡ−１４２はＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも免疫原性がわずかに高く、且つ、ＰＳＡを発現する腫瘍の退行に関して著しく有効であった。
【０６７８】
表２．    プラスミドおよび株
【表２】
2018515588.tif 000005
【０６７９】
プラスミドｐＡｄｖ１４２（６５２３ｂｐ）の配列は次のとおりであった：cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgttatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaaccccTAAcccgggccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagccaacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaaaagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgatatactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagttaaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaagtcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatctgtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaatcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagcttctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgtagaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctcaatcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagcatgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagatacatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgttcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgattttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctattgatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatattttgttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagccaaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacgtgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatcccaattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataagggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagatgaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagtagggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatcgaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaaaaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagggaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagatttatttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcatttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaagccttatttagcgacgaccaaaaaagagattagagaagtgctaggcattcctgaacggacattagataaattgctgaaggtactgaaggcgaatcaggaaattttctttaagattaaaccaggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcatta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 このプラスミドは２００８年２月２０日にＧｅｎｅｗｉｚ試験施設にて大腸株から配列決定された。
【０６８０】
Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株を病毒性因子ＡｃｔＡの不可逆的な欠失によって弱毒化した。下流遺伝子の発現に対するあらゆる極性効果を避けるようにａｃｔＡのフレーム内欠失をＬｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンドで構築した。そのＬｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ΔａｃｔＡはＡｃｔＡの５９１アミノ酸の欠失によってＮ末端の最初の１９アミノ酸とＣ末端の２８アミノ酸残基を含有する。
【０６８１】
そのａｃｔＡ欠失突然変異体は、ＰＣＲによってａｃｔＡの上流部分（６５７ｂｐ、オリゴＡｄｖ２７１／２７２）および下流部分（６２５ｂｐ、オリゴＡｄｖ２７３／２７４）に対応する染色体領域を増幅し、且つ、結合することにより作製された。この増幅に使用されたプライマーの配列が表３に提示されている。ａｃｔＡの上流ＤＮＡ領域と下流ＤＮＡ領域をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限部位においてｐＮＥＢ１９３内にクローニングし、このプラスミドからＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩを温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７内にさらにクローニングしてΔａｃｔＡ／ｐＫＳＶ７（ｐＡｄｖ１２０）を得た。
【０６８２】
表３：ａｃｔＡの上流および下流のＤＮＡ配列の増幅に使用されたプライマーの配列
【表３】
2018515588.tif 000006
【０６８３】
その遺伝子の染色体上の位置からの欠失を、そのａｃｔＡ欠失領域の外側に結合するプライマーであって、プライマー３（Ａｄｖ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ、配列番号：４６）およびプライマー４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ、配列番号４７）として図１０Ａおよび図１０Ｂに示されているプライマーを使用して確認した。ＬｍｄｄおよびＬｍｄｄΔａｃｔＡから単離された染色体ＤＮＡに対してＰＣＲ分析を実施した。Ｌｍｄｄの染色体ＤＮＡ内でのプライマー対１／２および３／４の２つの異なるセットによる増幅後のＤＮＡ断片のサイズは３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂであると予期された。一方で、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ用のプライマー対１／２および３／４を使用するＰＣＲの期待サイズは１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂであった。したがって、図１０Ａおよび図１０Ｂ中のＰＣＲ分析によりａｃｔＡの１．８ｋｂ領域がＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内で欠失していることが確認される。ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内のａｃｔＡ含有領域の欠失を確認するためにＰＣＲ産物に対してＤＮＡシーケンシングも実施した。
実施例８：Ｌｍベクターによる抗原送達のための抗生物質非依存的エピソーム発現系の構築。
【０６８４】
Ｌｍベクター（ｐＡｄｖ１４２）による抗原送達のための抗生物質非依存的なエピソーム発現系は、次世代の抗生物質を含まないプラスミドｐＴＶ３である（Ｖｅｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、２００４．  ７２（１１）：６４１８−２５、参照により本明細書に援用される）。リステリア株Ｌｍｄｄは染色体中に病原性遺伝子転写活性化因子の遺伝子である１コピーのｐｒｆＡ遺伝子を含むため、ｐｒｆＡをｐＴＶ３から欠失した。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位でのｐ６０−リステリアｄａｌのカセットをｐ６０−枯草菌ｄａｌにより置換してプラスミドｐＡｄｖ１３４を得た（図１１Ａ）。リステリアとバチルスのｄａｌ遺伝子の類似性は約３０％であり、Ｌｍｄｄ染色体内のｄａｌ遺伝子の残りの断片とそのプラスミドとの間で組換えが起こる可能性が実質的に排除される。プラスミドｐＡｄｖ１３４は抗原発現カセットｔＬＬＯ−Ｅ７を含んだ。ＬｍｄｄＡ株をｐＡｄｖ１３４プラスミドで形質転換し、選択したクローンからのＬＬＯ−Ｅ７タンパク質の発現をウエスタンブロットによって確認した（図１１Ｂ）。１０４０３Ｓ野生型株に由来するＬｍｄｄ系は、Ｌｍｄｄストレプトマイシン耐性を除き、抗生物質耐性マーカーを持っていない。
【０６８５】
さらに、ｐＡｄｖ１３４をＸｈｏＩ／ＸｍａＩで制限処理してヒトＰＳＡであるｋｌｋ３をクローニングしてプラスミドｐＡｄｖ１４２を得た。新しいプラスミドであるｐＡｄｖ１４２（図１１Ｃ、表２）はリステリアｐ６０プロモーターの制御下にあるバチルスｄａｌ（Ｂ−Ｄａｌ）を含む。そのシャトルプラスミドｐＡｄｖ１４２は外因性Ｄ−アラニンの非存在下で大腸菌ａｌａ  ｄｒｘ  ＭＢ２１５９ならびにリステリア・モノサイトゲネス株Ｌｍｄｄの両方の増殖を相補した。プラスミドｐＡｄｖ１４２内の抗原発現カセットはｈｌｙプロモータープロモーターおよびＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質から構成される（図１１Ｃ）。
【０６８６】
プラスミドｐＡｄｖ１４２でリステリアのバックグラウンド株であるＬｍｄｄａｃｔＡ株を形質転換してＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡを得た。そのＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現と分泌を、抗ＬＬＯ抗体および抗ＰＳＡ抗体を使用するウエスタンブロットにより確認した（図１１Ｄ）。インビボでの２継代後にＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現および分泌が存在した。
実施例９：ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株のインビトロおよびインビボでの安定性
【０６８７】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡリステリア株を選択圧の存在下または非存在下で８日間にわたり培養することによりプラスミドのインビトロでの安定性を検査した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株用の選択圧はＤ−アラニンである。したがって、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地およびＢＨＩ＋１００μｇ／ｍｌ  Ｄ−アラニン培地中でＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株を継代培養した。選択培地（ＢＨＩ）および非選択培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）培地上にプレーティングした後に毎日ＣＦＵを決定した。プラスミドの喪失が非選択培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）上へのプレーティング後のより高いＣＦＵにつながることが予期された。図１２Ａに示されるとおり、選択培地と非選択培地の間でＣＦＵ数に差が無かった。このことは、実験が終了するときである少なくとも５０世代にわたってプラスミドｐＡｄｖ１４２が安定であったことを示唆する。
【０６８８】
５×１０７ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡをＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注入することによりインビボでのプラスミド維持を測定した。２４時間および４８時間の時点でＰＢＳ中に均質化した脾臓から生存可能な細菌を分離した。ＢＨＩプレートおよびＢＨＩ＋１００ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−アラニン上で各時点について各試料のＣＦＵを決定した。選択培地および非選択培地への脾細胞のプレーティングの後、２４時間後にコロニーを回収した。この株は非常に弱毒化されているため、インビボにおいて２４時間で細菌負荷量が除去された。選択的プレートおよび非選択的プレートで有意なＣＦＵの差は検出されず、単離された全ての細菌内での前記組換えプラスミドの安定した存在を示した（図１２Ｂ）。
実施例１０：ＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）株のインビボでの継代、病毒性およびクリアランス
【０６８９】
ＬｍｄｄＡ−１４２は、エピソーム的に発現されたｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質を分泌する組換え型リステリア株である。安全な用量を決定するために様々な用量のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡでマウスを免疫化し、毒性効果を決定した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、最小限の毒性効果しか引き起こさなかった（データ非表示）。それらの結果より、１０８ＣＦＵの用量のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡはマウスによって充分に忍容されることが示唆された。病毒性研究によりＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株が非常に弱毒化されたことが示されている。
【０６９０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに安全な用量１０８ＣＦＵを腹腔内投与した後での、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビボクリアランスを決定した。２日後、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスの肝臓および脾臓内には検出可能なコロニーが存在しなかった。この株は高度に弱毒化されているため、インビボで４８時間の時点で完全に除去された（図１３Ａ）。
【０６９１】
マクロファージに感染して細胞内で成長するＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株の能力がＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの弱毒化により低下するか決定するため、細胞感染アッセイを実施した。Ｊ７７４Ａ．１などのマウスのマクロファージ様細胞株にリステリア構成体をインビトロで感染させ、細胞内増殖を定量した。陽性対照株である野生型リステリア株１０４０３Ｓは細胞内で増殖し、ｐｒｆＡ変異体である陰性対照ＸＦＬ７は、ファゴリソソームを回避することができず、したがってＪ７７４細胞内で増殖しない。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの細胞質内増殖は、細胞から細胞へと伝播するこの株の能力が失われているため、１０４０３Ｓよりも遅かった（図１３Ｂ）。それらの結果は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡがマクロファージに感染し、細胞質内で増殖する能力を持っていることを示す。
実施例１１：Ｃ５７ＢＬ／６  マウスにおけるＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株の免疫原性
【０６９２】
Ｃ５７ＢＬ／６  マウス内でＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡコンストラクトにより誘発されたＰＳＡ特異的免疫応答を、ＰＳＡ四量体染色を用いて決定した。１週間の間隔でマウスをＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで２回免疫し、追加免疫から６日後にＰＳＡ四量体について脾細胞を染色した。ＰＳＡ特異的四量体についての脾細胞の染色により、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡがＰＳＡ四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の２３％を誘発することが示された（図１４Ａ）。ＰＳＡペプチドでの５時間にわたる刺激後にＩＦＮ−γを分泌するＰＳＡ特異的Ｔ細胞の機能的能力を、細胞内サイトカイン染色を使用して検査した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ群ではＰＳＡペプチドで刺激されたＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＩＦＮ−γ分泌細胞のパーセンテージの、未感作マウスと比較して２００倍の増加があり（図１４Ｂ）、これはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株が非常に免疫原性であり、且つ、脾臓内でＰＳＡに対して高レベルの機能的に活性的なＰＳＡ  ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き起こすことを示している。
【０６９３】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡでマウスを免疫した後でＰＳＡに対して生成された細胞傷害性Ｔ細胞の機能的活性を決定するため、我々は瞬間的にＨ−２Ｄｂペプチドで処理されたＥＬ４細胞を溶解するＰＳＡ特異的ＣＴＬの能力をインビトロアッセイで試験した。ＦＡＣＳベースのカスパーゼアッセイ（図１４Ｃ）およびユーロピウム放出（図１４Ｄ）を用いて細胞溶解を測定した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスの脾細胞は、ＰＳＡペプチドを標的抗原として提示する細胞に対して高い細胞溶解活性を持つＣＴＬを含んだ。
【０６９４】
抗原で２４時間にわたって刺激した後、ＩＦＮ−γを分泌するエフェクターＴ細胞の機能的能力を決定するためにＥＬＩＳｐｏｔを実施した。ＥＬＩＳｐｏｔを用いると、特異的ペプチドで刺激されたＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスに由来する脾細胞におけるＩＦＮ−γのスポット数の２０倍の増加が、未感作マウスの脾細胞と比較すると観察された（図１４Ｅ）。
実施例１２：ＬｍｄｄＡ−１４２株での免疫によりＰＳＡを発現する腫瘍の退行およびＰＳＡ特異的ＣＴＬによる腫瘍の浸潤が誘導される。
【０６９５】
ＰＳＡを発現するように改変された前立腺腺癌細胞株（Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）；Ｓｈａｈａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）を使用してＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）コンストラクトの治療効力を決定した。マウスに２×１０６のＴＰＳＡ細胞を皮下移植した。腫瘍接種後６日目に腫瘍が４〜６ｍｍの触知可能なサイズに達したとき、１週間の間隔でマウスを３回にわたって１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−１４２で免疫するか、１０７ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（陽性対照）で免疫するか、または未処置のままとした。未感作マウスは腫瘍を徐々に増殖させた（図１５Ａ）。ＬｍｄｄＡ−１４２で免疫されたマウスでは全てに３５日目まで腫瘍が無く、８匹のうち３匹のマウスが腫瘍を徐々に増殖させたが、それらの腫瘍は未感作マウスと比較してずっと遅い速度で増殖した（図１５Ｂ）。８匹のうち５匹のマウスが７０日目まで腫瘍が無いままであった。予期されたとおり、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチン接種マウスには未感作対照よりも腫瘍が少なく、対照におけるものよりも遅く腫瘍が増殖した（図１５Ｃ）。したがって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡコンストラクトは、ＴＰＳＡ細胞株によって確立された腫瘍の６０％を退行させ、且つ、他のマウスでは腫瘍の増殖を遅らせることができた。腫瘍が無いまま治癒したマウスは６８日目にＴＰＳＡ腫瘍に再曝露された。
【０６９６】
無処置群（図１５Ａ）で起こらなかったことと比べると、ＬｍｄｄＡ−１４２によるマウスの免疫により実験動物の６０％超（図１５Ｂ）において、ＰＳＡを発現するよう改変されて７日間で確立されたＴｒａｍｐ−Ｃ１腫瘍の増殖を抑制し、それらの腫瘍の退行を誘導することができる。非常に弱毒化されたベクター（ＬｍｄｄＡ）およびｐＡＤＶ１４２プラスミド（表２）を使用してＬｍｄｄＡ−１４２を構築した。
【０６９７】
さらに、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡコンストラクトによって生成されたＰＳＡ特異的ＣＤ８リンパ球の腫瘍浸潤能力を調査した。マウスに腫瘍およびマトリゲルの混合物を皮下移植した後、７日間の間隔でマウスを未感作にするか、または対照（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）リステリアもしくはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで２回免疫した。２１日目に腫瘍を切除し、それらの腫瘍に浸潤しているＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ四量体＋とＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋の制御性Ｔ細胞集団についてそれらの腫瘍を分析した。
【０６９８】
未感作マウスおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７対照で免疫されたマウスの両方に存在する非常に少数のＰＳＡ特異的ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ四量体＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）が観察された。ところが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスではＰＳＡ特異的ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ四量体＋ＴＩＬのパーセンテージに１０〜３０倍の増加があった（図７Ａ）。興味深いことに、脾臓内のＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ四量体＋細胞集団は腫瘍内よりも７．５倍少なかった（図１６Ａ）。
【０６９９】
加えて、無処置マウスおよびリステリアで免疫されたマウスの腫瘍内でのＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の存在が決定された。興味深いことに、リステリアでの免疫によって脾臓内ではなく腫瘍内のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの数にかなりの減少が生じた（図１６Ｂ）。ところが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡコンストラクトは、未感作群およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫群と比較されると腫瘍内でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの頻度の減少に強力な影響を有した（図１６Ｂ）。
【０７００】
よって、ＬｍｄｄＡ−１４２免疫療法は、腫瘍部位を浸潤することができるＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導できる（図１６Ａ）。興味深いことに、ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫は、腫瘍内での制御性Ｔ細胞数の減少に関連し（図１６Ｂ）、おそらく、効率的な抗腫瘍ＣＴＬ活性にとってより好ましい環境がその免疫により創出される。
実施例１３：Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ＰＳＡ融合にもかかわらず機能的なＬＬＯを分泌する。
【０７０１】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、相同組換えにより染色体中のｈｌｙ遺伝子の下流にインフレームで挿入されたＰＳＡタンパク質をコードする全長型ヒトｋｌｋ３遺伝子を含む。これらのコンストラクトは、温度感受性レプリコンを有し、ｈｌｙ−ｋｌｋ３−ｍｐｌ組換えカセットを保有するｐＫＳＶ７プラスミド（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇｍａｎ，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．  １９９２；  ７４（７−８）  ｐ７０５−７１１）を使用する相同組換えにより作製された。その第２の組換え事象後のプラスミドの切除のため、組込みの選択に使用される抗生物質耐性マーカーが失われている。さらに、ＬｍｄｄＡ−１４３株ではａｃｔＡ遺伝子が欠失している（図１７Ａ）。両方のコンストラクトにおいてｈｌｙとインフレームのｋｌｋ３の染色体への挿入をＰＣＲ（図１７Ｂ）とシーケンシング（データ非表示）により確認した。
【０７０２】
これらの染色体コンストラクトの一つの重要な面は、ＬＬＯ−ＰＳＡが生成されてもファゴソームからのリステリアの回避、細胞質侵入、およびＬ．モノサイトゲネスによって生じる効率的な免疫に必要とされるＬＬＯの機能が完全には消滅しないことである。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の培養上清由来の分泌タンパク質のウエスタンブロット分析によりＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質に対応する約８１ｋＤａのバンドおよびＬＬＯの期待サイズである約６０ｋＤａのバンド（図１８Ａ）が明らかになり、ＬＬＯがＬ．モノサイトゲネスによってＬＬＯ−ＰＳＡ融合体から切断されるか、または染色体中での融合遺伝子にもかかわらずなおも単一のタンパク質として産生されるかのどちらかであることがこれにより示された。野生型Ｌ．モノサイトゲネス１０４０３Ｓと比較して、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によって分泌されたＬＬＯは５０％の溶血活性を保持した（図１８Ｂ）。これらの結果と一致して、Ｌｍｄｄ−１４３とＬｍｄｄＡ−１４３の両方がマクロファージ様Ｊ７７４細胞株において細胞内で複製可能であった（図１８Ｃ）。
実施例１４：Ｌｍｄｄ−１４３とＬｍｄｄＡ−１４３の両方がＰＳＡ抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発する。
【０７０３】
Ｌｍｄｄ−１４３とＬｍｄｄＡ−１４３の両方がＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌できることを示した後、これらの株がＰＳＡ特異的免疫応答をインビボで誘導できるかという問題を調査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを未処置のままにするか、またはＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３、もしくはＬｍｄｄＡ−１４２で２回免疫した  ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答をＰＳＡ６５〜７４ペプチドでの脾細胞の刺激、およびＩＦＮ−γについての細胞内染色により測定した。図１９に示されるとおり、染色体ベクターおよびプラスミドベースのベクターにより誘導された免疫応答は同様である。
材料および方法（実施例１５〜２０）
【０７０４】
オリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）によって合成され、ＤＮＡ配列決定はＧｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ（米国ニュージャージー州サウスプレインフィールド）によって行われた。フローサイトメトリー試薬をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ、カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。細胞培養培地、添加物、および他の全ての試薬は、表示されない限り、Ｓｉｇｍａ（米国ミズーリ州セントルイス）のものである。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＨＬＡ−Ａ２ペプチドはＥＺｂｉｏｌａｂｓ（米国インディアナ州ウェストフィールド）によって合成された。完全ＲＰＭＩ１６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は２ｍＭのグルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％のウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含有した。ポリクローナル抗ＬＬＯ抗体は以前に記載があるものであり、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体はＳｉｇｍａから購入されたものである。
マウスおよび細胞株
【０７０５】
全ての動物実験はペンシルバニア大学またはラトガース大学のＩＡＣＵＣによって認可されたプロトコルに従って実施された。ＦＶＢ／ＮマウスはＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州バーハーバー）から購入された。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ癌タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスはペンシルバニア大学の実験動物コア施設で収容および飼育された。ＮＴ−２腫瘍細胞株は高レベルのラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、前述されたように培養された。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞はＡＴＣＣから入手され、ＡＴＣＣの推奨に従って培養された。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株はＪｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（ミネソタ大学、ミネソタ州）からの寛大な供与物であり、完全Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で培養された。生物発光作業はペンシルバニア大学（米国ペンシルバニア州フィラデルフィア）の小動物撮像施設（ＳＡＩＦ）による指導の下で実行された。
リステリア構成体および抗原発現
【０７０６】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは親切にもペンシルバニア大学のＭａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅ博士によって供与され、これはｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）にクローニングされた全長のヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んだ。ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表４に示されるオリゴを使用するＰＣＲによってｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３つの部分、すなわちＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１を増幅するためのテンプレートとしてこのプラスミドを使用した。
【０７０７】
表４：ヒトＨｅｒ−２−キメラのクローニング用のプライマー
【表４】
2018515588.tif 000007
【０７０８】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラコンストラクトは、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法およびテンプレートとしてそれぞれ分かれているｈＨｅｒ−２／ｎｅｕ部分による直接融合によって作製された。プライマーが表５に示されている。
【０７０９】
表５
【表５】
2018515588.tif 000008
【０７１０】
異なる部分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列
【０７１１】
ＣｈＨｅｒ２遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８から切り出し、ＬｍｄｄシャトルベクターであるｐＡｄｖ１３４中にＬＬＯの短縮型非溶血性断片とインフレームでクローニングした。挿入断片、ＬＬＯ、およびｈｌｙプロモーターの配列をＤＮＡシークエンシング分析によって確認した。エレクトロコンピテントａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、すなわちＬｍｄｄＡにこのプラスミドを電気穿孔により導入し、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）寒天プレート上で陽性クローンを選択した。幾つかの実験ではｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）断片を発現する類似のリステリア株を比較目的で使用した。全ての試験研究において、免疫系に対するリステリアの抗原非依存的効果を説明するために無関連のリステリア構成体（Ｌｍ対照）を含めた。Ｌｍ対照はＡＤＸＳ３１−１６４（ＬｍｄｄＡ−ＣｈＨｅｒ２）と同一のリステリアプラットフォームに基づいているが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現した。融合タンパク質のリステリアからの発現と分泌を試験した。各構成体をインビボで２回継代した。
細胞傷害性アッセイ
【０７１２】
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウスからなる群を、１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２  ＩＣＩ、またはＬｍ対照（無関連抗原を発現する）を用いて１週間の間隔で３回免疫するか、または未感作のままとした。ＮＴ−２細胞をインビトロで培養し、トリプシンにより剥離し、マイトマイシンＣ（無血清Ｃ−ＲＰＭＩ培地中に２５０μｇ／ｍＬ）で３７℃において４５分間にわたって処置した。これらの細胞を５回洗浄した後、免疫した動物または未感作動物から採取された脾細胞と１：５の比率（スティミュレーター：レスポンダー）で５日間にわたり３７℃および５％ＣＯ２で共培養した。以前に記載された方法に従い、標的としてのユーロピウム標識３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞を使用して標準的な細胞傷害性アッセイを実施した。分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ２）を５９０ｎｍにて使用して、４時間の培養の後に死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。比溶解率を（実験群での溶解−自然発生的溶解）／（最大溶解−自然発生的溶解）として定義した。
免疫されたマウスに由来する脾細胞によるインターフェロン−γの分泌
【０７１３】
３〜５匹のＦＶＢ／ＮマウスまたはＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからなる群を、１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、陰性リステリア対照（無関連抗原を発現する）を用いて１週間の間隔で３回免疫するか、または未感作のままとした。最後の免疫の１週間後、ＦＶＢ／Ｎマウスに由来する脾細胞を単離し、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中にマイトマイシンＣで処置されたＮＴ−２細胞が存在する状態で５×１０６細胞／ウェルの割合で２４ウェルプレートにおいて共培養した。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに由来する脾細胞は、１μＭのＨＬＡ−Ａ２特異的なペプチド、または大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された１μｇ／ｍＬの組換え型Ｈｉｓタグ付きＣｈＨｅｒ２タンパク質が存在する状態で培養された。上清のサンプルを２４時間後または７２時間後に取得し、製造業者の推奨に従ってマウスＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用してインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在について試験した。
Ｈｅｒ２トランスジェニック動物での腫瘍研究  
【０７１４】
６週齢のＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４匹／群）を５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、またはＬｍ対照で６回免疫した。これらのマウスを自然発生的乳腺腫瘍の出現について週に２回観察し、最高５２週間まで電子カリパスを使用してそれらの腫瘍を測定した。平均直径が１ｃｍ２のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を摘出し、ＲＮＡｌａｔｅｒ中に−２０℃で保存した。これらの腫瘍のエスケープに対するＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質内の突然変異の効果を決定するため、ゲノムＤＮＡ単離キットを使用してゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定した。
脾臓および腫瘍内の制御性Ｔ細胞に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果
【０７１５】
マウスに１×１０６細胞のＮＴ−２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）移植した。７日目、１４日目、および２１日目にこれらのマウスを１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４またはＬｍｄｄＡ対照で免疫するか、または未感作のままにした。２８日目に腫瘍および脾臓を摘出し、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在について検査した。簡潔に述べると、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で２枚のスライドグラスの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を単離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、ＰＢＳ中にＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍＬ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有するバッファーを用いてそれらを消化した。室温にて撹拌しながら６０分間インキュベーションした後、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をＲＢＣ溶解バッファーによって溶解し、続いて１０％ＦＢＳを含有する完全ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通す濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）中に再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗体、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体、抗ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体で染色し、続いて透過処理し、そして抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥで染色した。４カラーＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー分析を実施し、ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを分析した。
統計分析
【０７１６】
生存データについてログランクχ二乗検定を使用し、三回行われたＣＴＬアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイについてスチューデントのｔ検定を使用した。これらの分析では０．０５未満のｐ値（＊印をつけた）を統計的に有意であると考えた。Ｐｒｉｓｍソフトウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００６）のどちらかを用いて全ての統計分析を行った。別段の記載がない限り、我々は全てのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック試験研究のために群あたり８〜１４匹のマウスを使用し、全ての野生型ＦＶＢ／Ｎ研究のために群あたり少なくとも８匹のマウスを使用した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍試験研究を除き、全ての研究を少なくとも１回は繰り返した。
実施例１５：Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネス株の生成：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築
【０７１７】
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築は以下の通りであった。簡潔に述べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法によるＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）と１つの細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）の直接融合によって作製された。そのキメラタンパク質はそのタンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープの大半を有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子をｐＡｄｖ１３８プラスミド（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の構築に使用された）から切り出し、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドにクローニングし、それによりプラスミドｐＡｄｖ１６４を得た（図２０Ａ）。これらの２つのプラスミド骨格の間には２つの大きい違いがある。１）ｐＡｄｖ１３８が組換え型細菌のインビトロ選別のためにクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用するのに対し、ｐＡｄｖ１６４は枯草菌由来のＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を保持し、その遺伝子がｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を持たないＬｍｄｄＡ株でのインビトロ選別とインビボプラスミド保持のために代謝経路の相補を利用する。この免疫療法プラットフォームは、改変リステリア株の抗生物質耐性についてのＦＤＡの憂慮に対処するために設計および開発された。２）ｐｒｆＡ遺伝子はＬｍｄｄ株のインビボでの相補に必要ではないので、ｐＡｄｖ１３８とは異なりｐＡｄｖ１６４はそのプラスミド中にこの遺伝子のコピーを保持しない（以下の配列および図２０Ａを参照されたい）。ＬｍｄｄＡ免疫療法株はａｃｔＡ遺伝子（リステリアの細胞内運動および細胞から細胞への伝播に関係する）も欠いており、そのためにこのバックボーンに由来する組換え型免疫療法株はその親株であるＬｍｄｄに由来する株よりも病原性が１００倍弱い。ＬｍｄｄＡベースの免疫療法はまた、免疫されたマウスの脾臓に由来するＬｍｄｄベースの免疫療法よりもずっと速く（４８時間未満の間に）除去される。この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現と分泌は、ウエスタンブロット分析を用いて約１０４ＫＤのバンドが抗ＬＬＯ抗体によって検出されたように、インビトロで８時間培養した後のＴＣＡ沈殿した細胞培養上清の中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のもの（図２０Ｂ）と同等であった。陰性対照としてｔＬＬＯのみを発現するリステリアバックボーン株を使用した。
【０７１８】
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図２０Ａおよび図２０Ｂを参照されたい）：
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 （配列番号８７）
実施例１６：ＡＤＸＳ３１−１６４はＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同じく免疫原性である
【０７１９】
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の生成に関するＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性を標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２免疫療法のものと比較した。両方の免疫療法により、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に対する強力であるが同等の細胞傷害性Ｔ細胞応答が誘発された。したがって、ＬＬＯに融合されたＨｅｒ２細胞内断片のみを発現するリステリアで免疫されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラよりも低い溶解活性を示した。未感作動物、または無関連のリステリアを注射されたマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図２１Ａ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は野生型ＦＶＢ／Ｎマウスに由来する脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することもできた（図２１Ｂ）。これは、高レベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原を発現するマイトマイシンＣで処理されたＮＴ−２細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清の中に検出された（図２１Ｃ）。
【０７２０】
ＡＤＸＳ３１−１６４での免疫後のヒトＭＨＣクラスＩエピトープの適切なプロセッシングと提示をＨＬＡ−Ａ２マウスで検査した。免疫されたＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入体に由来する脾細胞を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ分子の細胞外ドメイン（配列番号５９のＨＬＹＱＧＣＱＶＶまたは配列番号６０のＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）または細胞内ドメイン（配列番号６１のＲＬＬＱＥＴＥＬＶ）に位置するマップされたＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに対応するペプチドと共に７２時間にわたって共培養した（図２１Ｃ）。組換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質を陽性対照として使用し、無関連のペプチドまたはペプチド無しを陰性対照として使用した。この実験のデータは、標的とされた抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープに対する抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的免疫応答がＡＤＸＳ３１−１６４により誘発され得ることを示している。
実施例１７：ＡＤＸＳ３１−１６４は自然発生的乳腺腫瘍の発症防止に関してＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２よりも有効である
【０７２１】
２０〜２５週齢でゆっくりと増殖する自然発生的乳腺腫瘍を発生するＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物においてＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果をＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の抗腫瘍効果と比較した。無関連のリステリア対照免疫療法で免疫された全ての動物が２１〜２５週目の内に乳房腫瘍を発生し、３３週目の前に殺処理された。対照的に、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組換え型免疫療法によって乳腺腫瘍形成の著しい遅延が生じた。４５週目では、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２で免疫されたマウスの２５％と対照的に、ＡＤＸＳ３１−１６４ワクチン接種マウスの５０％超（９匹のうち５匹）に未だに腫瘍が無かった。５２週目では、ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫された８匹のうち２匹のマウスがまだ腫瘍を有しないままであったが、一方で他の実験群の全てのマウスが既に病気のために死んでいた（図２２）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４は、より弱毒化されているにもかかわらず、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物の自然発生的乳腺腫瘍の発症の防止に関してＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも有効であることを示している。
実施例１８：ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫時のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子内の突然変異
【０７２２】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープ内の突然変異は、小断片免疫療法で、またはＨｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメイン内のエピトープを標的化するモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン）で免疫されたときの腫瘍エスケープに関係すると考えられている。これを評価するため、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム物質を抽出し、キメラ免疫療法または対照免疫療法で免疫された腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片を配列決定した。どのワクチン接種されたた腫瘍試料のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子内にも突然変異が観察されなかった。これは代替的なエスケープ機構を示唆している（データを示さず）。
実施例１９：ＡＤＸＳ３１−１６４は腫瘍内制御性Ｔ細胞の著しい減少を引き起こす
【０７２３】
脾臓および腫瘍内での制御性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するため、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫の後、脾細胞および腫瘍内リンパ球を単離し、Ｔｒｅｇを染色し、これらがＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞として明らかにされたが、別々に分析したときにＦｏｘＰ３マーカーまたはＣＤ２５マーカーのどちらかを用いて同等の結果が得られた。それらの結果は、無関連のリステリア免疫療法または未感作動物と比較すると、ＡＤＸＳ３１−１６４での免疫は、脾臓内のＴｒｅｇの頻度に対して効果を有しないことを示した（図２３）。対照的に、リステリア免疫療法での免疫は腫瘍内のＴｒｅｇの存在に少なからぬ影響を引き起こした（図２４Ａ）。無処置の腫瘍内の全ＣＤ３＋Ｔ細胞の平均で１９．０％がＴｒｅｇであったが、この頻度は無関連免疫療法については４．２％に減少し、ＡＤＸＳ３１−１６４ついては３．４％に減少し、これは腫瘍内Ｔｒｅｇ頻度の５倍の減少であった（図２４Ｂ）。ＬｍｄｄＡ免疫療法のいずれかで処置されたマウスにおける腫瘍内Ｔｒｅｇ頻度の減少を腫瘍サイズの差の原因とすることはできなかった。代表的実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫されたマウスの腫瘍（平均直径（ｍｍ）±ＳＤ：６．７１±０．４３、ｎ＝５）は、無処置マウスの腫瘍（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）または無関連の免疫療法で処置されたマウスの腫瘍（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）よりも有意に小さかったが、一方で後者のこれら２群の比較は腫瘍サイズの統計的有意差を示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡ免疫療法で処置された腫瘍内のＴｒｅｇの頻度が低いほど腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率が上昇した。これは、ＬｍｄｄＡ免疫療法での免疫後により好ましい腫瘍微小環境が得られることを示唆する。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現する免疫療法だけが腫瘍増殖を低下させることができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示した。
実施例２０：ＡＤＸＳ３１−１６４での末梢免疫は転移性乳癌細胞株の脳内での増殖を遅延させることができる
【０７２４】
ＡＤＸＳ３１−１６４免疫療法または無関連のＬｍ対照免疫療法でマウスを腹腔内免疫し、次いでルシフェラーゼおよび低レベルのＨｅｒ２／ｎｅｕを発現する５，０００細胞のＥＭＴ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞を頭蓋内に移植した（図２５Ａ）。麻酔されたマウスの生体外撮像によって接種後の様々な時点で腫瘍をモニターした。腫瘍接種後８日目に全ての対照動物で腫瘍が検出されたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスではどんな検出可能な腫瘍も示すマウスが無かった（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。腫瘍接種後１１日目には陰性対照群の全てのマウスが既に腫瘍のために死んでいたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群の全てのマウスがまだ生存しており、腫瘍増殖の小さい兆候を示すのみであったので、ＡＤＸＳ３１−１６４はこれらの腫瘍の発症を明らかに遅延させることができた。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与で得られた免疫応答が中枢神経系に到達し得る可能性があること、およびＬｍｄｄＡベースの免疫療法がＣＮＳ腫瘍の治療のために使用される可能性があり得ることを強く示唆する。
実施例２１：ペプチド「ミニ遺伝子」発現系
材料および方法
【０７２５】
この発現系は、カルボキシ末端において独特のペプチド部分を含有する組換えタンパク質群のクローニングを促進するように設計されている。これは、テンプレートとしてＳＳ−Ｕｂ−ペプチドコンストラクトのうちの１つをコードする配列を利用する単純なＰＣＲ反応によって達成される。Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域にまで延びるプライマーを使用し、且つ、そのプライマーの３’端に所望のペプチド配列のためのコドンを導入することにより、一回のＰＣＲ反応で新しいＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列を生成することができる。細菌プロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の最初の数ヌクレオチドをコードする５’プライマーは、全てのコンストラクトに対して同一である。この戦略を使用して作製されたコンストラクトを図２６Ａ〜２６Ｃに概略的に表す。この実施例では２つのコンストラクトを説明する。１つのコンストラクトはマウスＭＨＣクラスＩ上に提示されるモデルペプチド抗原を含有し、第２のコンストラクトは、ヒト膠芽腫（ＧＢＭ）ＴＡＡに由来するものなどの治療的に適切なペプチドが置換されることになる場所を示している。明確にするため、図２６Ａ〜Ｃで図示されているコンストラクトをＡｃｔＡ１〜１００分泌シグナルを含有するものとして指定した。しかしながら、同等の効果によってＬＬＯベースの分泌シグナルが置き換わってもよい。
【０７２６】
提案されている系の利点のうちの１つは、単一のリステリアベクターコンストラクトを使用して複数のペプチドを細胞に負荷することが可能になることである。複数のペプチドは、上述の単一ペプチド発現系の改造を用いて組換え型弱毒化リステリア（例えば、ｐｒｆＡ突然変異リステリアまたはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ突然変異リステリア）の中に導入されることになる。１つの挿入断片の中にコードされる連続的なＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列に由来する複数の別個のペプチドをコードするキメラタンパク質。シャイン・ダルガノリボソーム結合部位が各ＳＳ−Ｕｂ−ペプチドコード配列の前に導入されてそれらのペプチドコンストラクトの各々の別々の翻訳が可能になる。図２６Ｃは、組換え型リステリアの１つの株から４つの別個のペプチド抗原を発現するように設計されたコンストラクトの概略図を示している。これは厳密には一般的な発現戦略を表したものであるので、公知のマウスまたはヒトの腫瘍関連抗原または感染症抗原に由来する４つの独特のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドが含まれている。
材料および方法（実施例２２〜２４）
【０７２７】
実施例７にｐＡｄｖ１４２プラスミドおよびＬｍｄｄＡ１４２株のことが記載されている。その他の詳細を以下に提供する。
ｐＡｄｖ１４２プラスミドおよびＬｍｄｄＡ１４２株の構築  
【０７２８】
このプラスミドはＶｅｒｃｈらによって以前に構築された次世代の抗生物質を含まないプラスミドであるｐＴＶ３である。Ｌｍ−ｄｄＡは染色体中に１コピーのｐｒｆＡ遺伝子を含むので、病原性遺伝子転写活性化因子ｐｒｆＡの不必要なコピーをｐＴＶ３プラスミドから欠失した。したがって、そのｄａｌ含有プラスミド中にｐｒｆＡ遺伝子が存在することは必須ではなかった。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位でのｐ６０−リステリアｄａｌのカセットをｐ６０−枯草菌ｄａｌ（ｄａｌＢｓ）により置換してプラスミドｐＡｄｖ１３４を得た。さらに、ｐＡｄｖ１３４をＸｈｏＩ／ＸｍａＩで制限処理してヒトＰＳＡであるｋｌｋ３をクローニングしてプラスミドｐＡｄｖ１４２を得た。その新しいプラスミドであるｐＡｄｖ１４２（図１１Ｃ）はｄａｌＢｓを含んでおり、その発現はＬｍ  ｐ６０プロモーターの制御下にあった。そのシャトルプラスミドｐＡｄｖ１４２は外因性Ｄ−アラニンの非存在下で大腸菌ａｌａ  ｄｒｘ  ＭＢ２１５９とＬｍｄｄの両方の増殖を相補することができた。プラスミドｐＡｄｖ１４２内の抗原発現カセットはｈｌｙプロモータープロモーターおよびｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質から構成される（図２７）。
【０７２９】
プラスミドｐＡｄｖ１４２でリステリアのバックグラウンド株であるＬｍｄｄＡ株を形質転換してＬｍｄｄＡ１４２またはＡＤＸＳ３１−１４２を得た。ＡＤＸＳ３１−１４２株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現と分泌を、抗ＬＬＯ抗体および抗ＰＳＡ抗体を使用するウエスタンブロットにより確認した。それらは図１１Ｄに示されている。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのインビボでの２継代後にＡＤＸＳ３１−１４２株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現および分泌が存在した。
ＬｍｄｄＡ２１１株、ＬｍｄｄＡ２２３株、およびＬｍｄｄＡ２２４株の構築
【０７３０】
ＡｃｔＡタンパク質の異なる短縮断片を含む３種類の異なるプラスミドｐＡｄｖ２１１、ｐＡｄｖ２２３、およびｐＡｄｖ２２４を作製するために異なるＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ領域をプラスミドｐＡｄｖ１４２中にクローニングした。
ＬＬＯシグナル配列（ＬＬＯｓｓ）−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２（ｐＡｄｖ２１１）／ＬｍｄｄＡ２１１
【０７３１】
２５塩基の重複を用いるＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法を用いて最初に２つの断片であるＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ（８１７ｂｐのサイズ）とＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ−ＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２（６０２ｂｐのサイズ）を増幅し、次に一つに融合した。このＰＣＲ産物はこの時点で７６２ｂｐのサイズの断片であるＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＸｈｏＩを含んでいる。その新しいＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＸｈｏＩ  ＰＣＲ産物およびｐＡｄｖ１４２（ＬｍｄｄＡ−ＰＳＡ）プラスミドをＰｓｉＩ／ＸｈｏＩ制限酵素で消化し、そして精製した。ライゲーションを行い、ＭＢ２１５９エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、そしてＬＢ寒天プレート上に播種した。ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２／ｐＡｄｖ１４２（ＰＳＡ）クローンを挿入断片特異的ＰＣＲ反応により選択およびスクリーニングし、ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２／ｐＡｄｖ１４２（ＰＳＡ）クローンの９番、１０番が陽性であり、そのプラスミドをミニプレップ精製した。ＰＣＲスクリーニングによるそれらのクローンのスクリーニングの後、陽性クローンの挿入断片を配列決定した。ｐＡｄｖ２１１．１０と呼ばれるプラスミドＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２／ｐＡｄｖ１４２（ＰＳＡ）でリステリアＬｍｄｄＡ突然変異体エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、ＢＨＩ／ストレプトマイシン寒天プレート上に播種した。生じたＬｍｄｄＡ２１１株をコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。幾つかのリステリアコロニーを内在性ＬＬＯタンパク質とＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡ（ＬＡ２２９−ＰＳＡ）タンパク質の発現と分泌について選択およびスクリーニングした。マウスのインビボでの２継代後にＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現が存在した。
ＬＬＯｓｓ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ３およびＰＥＳＴ４：
【０７３２】
ＡｃｔＡＰＥＳＴ３断片とＡｃｔＡＰＥＳＴ４断片をＰＣＲ法により作製した。ＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＸｈｏＩ断片（８３９ｂｐのサイズ）とＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＸｈｏＩ断片（１１４６ｂｐのサイズ）を含むＰＣＲ産物をｐＡｄｖ１４２中にクローニングした。生じたプラスミドｐＡｄｖ２２３（ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＸｈｏＩ／ｐＡｄｖ１４２）クローンおよびｐＡｄｖ２２４（ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ４／ｐＡｄｖ１４２）クローンを挿入断片特異的ＰＣＲ反応により選択およびスクリーニングした。それらのｐＡｄｖ２２３およびｐＡｄｖ２２４プラスミドでＬｍｄｄＡバックボーンを形質転換してそれぞれＬｍｄｄＡ２２３およびＬｍｄｄＡ２２４が生じた。幾つかのリステリアコロニーを内在性ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２３）タンパク質、またはＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２４）タンパク質の発現と分泌について選択およびスクリーニングした。マウスのインビボでの２継代後に融合タンパク質ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２３）またはＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２４）の安定した発現と分泌が存在した。
実験プラン１
【０７３３】
ＴＰＳＡ２３（ＰＳＡ発現性腫瘍モデル）を使用するＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ−ＰＳＡ（ＰＥＳＴ３配列、ＰＥＳＴ２配列、およびＰＥＳＴ４配列）およびｔＬＬＯ−ＰＳＡの治療効力を評価および比較した。無処置マウスを対照群として使用した。インターフェロンγの細胞内サイトカイン染色およびＰＳＡ四量体染色も用いて免疫応答を並行して評価した。
腫瘍退行試験のために
【０７３４】
８匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢のオス）からなる１０群に１×１０６細胞のＴＰＳＡ２３細胞を０日目に皮下移植した。６日目にそれらのマウスは免疫を受け、それに続いて１週間離れている２回の追加用量を受けた。腫瘍が平均直径で１．２ｃｍのサイズに到達するまで毎週腫瘍増殖をモニターした。
免疫原性試験  
【０７３５】
２群のＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢のオス）を下の表に記載される免疫療法で１週間の間隔で３回にわたり免疫した。最後の追加免疫注射から６日後、マウスを殺処理し、脾臓を採取し、四量体染色および細胞内サイトカイン染色によるＩＦＮ−γ分泌に関して免疫応答を検査した。
実験プラン２  
【０７３６】
この実験は実験プラン１の繰返しであるが、未感作群、ｔＬＬＯ群、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２−ＰＳＡ群、およびｔＬＬＯ−ＰＳＡ群だけが含まれた。実験プラン１と同様に、ＴＰＳＡ２３（ＰＳＡ発現性腫瘍モデル）を使用して治療効力を評価した。群当たり５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに１×１０６細胞のＴＰＳＡ２３細胞を０日目に皮下移植した。６日目にそれらのマウスは免疫（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を受け、それに続いて１週間後に追加免疫を受けた。最後の処置から６日目に脾臓と腫瘍を採取した。脾臓と腫瘍の両方においてＰＳＡ五量体染色を用いて免疫応答をモニターした。
材料および方法：
【０７３７】
ＴＰＳＡ２３細胞を完全培地中で培養する。マウスに腫瘍細胞を移植する２日前にＴＰＳＡ２３細胞を完全培地中に継代培養した。実験当日（０日目）に細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで二回洗浄した。細胞を計数し、注射用にマウス当たり２００ｕｌのＰＢＳ中に１×１０６細胞の濃度で再懸濁した。各マウスの脇腹に腫瘍細胞を皮下注射した。
ＴＰＳＡ２３細胞用の完全培地
【０７３８】
４３０ｍｌのグルコース含有ＤＭＥＭ、４５ｍｌのウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２５ｍｌのヌー・セラムＩＶ、５ｍｌの１００×Ｌ−グルタミン、５ｍｌの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍｌの１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを混合することによりＴＰＳＡ２３細胞用の完全培地を調製した。細胞を分割する間に０．００５ｍｇ／ｍｌのウシインスリンおよび１０ｎＭのデヒドロイソアンドロステロンをフラスコに添加した。
脾細胞用の完全培地（ｃ−ＲＰＭＩ）
【０７３９】
４５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、５０ｍｌのウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、５ｍｌの１００×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、５ｍｌの１００×Ｌ−グルタミン、５ｍｌの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍｌの１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１２９ｕｌの１４．６Ｍの２−メルカプトエタノールを混合することにより完全培地を調製した。
単離された脾細胞の調製
【０７４０】
生物安全フード内で作業を行った。滅菌したピンセットとハサミを使用して実験マウス群と対照マウス群から脾臓を採取した。１０ｍｌのＰＢＳを含む１５ｍｌのチューブに入れてそれらの脾臓を実験室に運んだ。各マウスの脾臓を別々に処理した。脾臓を無菌ペトリ皿に取り、３ｍＬの注射筒のピストン棒の後端を使用してすりつぶした。１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を含む１５ｍｌのチューブに脾臓細胞を移した。４℃で５分間にわたる１，０００ＲＰＭでの遠心分離により細胞を沈殿させた。１０％の漂白剤中に上清を捨てた。タッピングで細胞ペレットを穏やかに壊した。脾臓当たり２ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝液をその細胞ペレットに添加することによりＲＢＣを溶解した。ＲＢＣは２分間で溶解された。すぐに１０ｍｌのｃ−ＲＰＭＩ培地をその細胞懸濁液に添加してＲＢＣ溶解緩衝液を不活化した。４℃で５分間にわたる１，０００ＲＰＭでの遠心分離により細胞を沈殿させた。上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍｌのｃ−ＲＰＭＩ中に再懸濁し、セルストレーナーに通した。血球計算盤を使用して細胞を計数し、１０ｕｌの細胞懸濁液を９０ｕｌのトリパンブルー染色液と混合して生存度をチェックした。約２×１０６細胞を五量体染色に使用した。（注記：各脾臓は１〜２×１０８細胞を産するはずである）。
ミルテニー・マウス腫瘍解離キットを使用する腫瘍からの単細胞懸濁液の調製
【０７４１】
２．３５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、１００μＬの酵素Ｄ、５０μＬの酵素Ｒ、および１２．５μＬの酵素ＡをｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃチューブに加えることにより酵素ミックスを調製した。腫瘍（０．０４〜１ｇ）を２〜４ｍｍの小片に切断し、酵素ミックスを含むｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃチューブに移した。そのチューブの上端を下にしてｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーターの筒状ケースに取り付け、プログラムｍ＿ｉｍｐＴｕｍｏｒ＿０２を実行した。プログラムの終了後、ＣチューブをｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーターから取り外した。ＭＡＣＳｍｉｘチューブローテーターを使用して連続的に回転させながら試料を３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。インキュベーションの完了後に再びＣチューブの上端を下にしてｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーターの筒状ケースに取り付け、プログラムｍ＿ｉｍｐＴｕｍｏｒ＿０３を２回実行した。１５ｍＬのチューブ上に置かれた７０μｍフィルターにその細胞懸濁液を通した。そのフィルターも１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。細胞を３００×ｇで７分間にわたって遠心分離した。上清を捨て、細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した。この時点でそれらの細胞を五量体染色のために分割することができる。
脾細胞の五量体染色
【０７４２】
ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社の市販のＰＳＡ−Ｈ−２Ｄｂ五量体を使用して製造業者が推奨するプロトコルを用いてＰＳＡ特異的Ｔ細胞を検出した。ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３、および五量体について脾細胞を染色した。一方でＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５、および五量体について腫瘍細胞を染色した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞をゲーティングで絞り込んでＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ五量体＋細胞の頻度を決定した。Ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用してＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ上で染色細胞を取得および分析した。
五量体染色に必要な材料
【０７４３】
脾細胞（上記の調製物）、Ｐｒｏ５（登録商標）ＰＥ結合組換えＭＨＣ  ＰＳＡ五量体  （注記：蓋をきつく締め、暗所に４℃で一貫して五量体ストックが保存されることを確実にされたい）、ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５結合抗ＣＤ３抗体、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８抗体およびＡＰＣ結合抗ＣＤ６２Ｌ抗体、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ）および固定溶液（ＰＢＳ中の１％熱不活化ウシ胎児血清（ＨＩ−ＦＣＢＳ）、２．５％ホルムアルデヒド）
標準的染色プロトコル
【０７４４】
Ｐｒｏ５（登録商標）ＰＳＡ五量体を冷却済みマイクロ遠心分離機中で５〜１０分間にわたって１４，０００×ｇで遠心分離してその溶液中に存在するあらゆるタンパク質凝集物を除去した。これらの凝集物は、検査容量中に含まれていると非特異的染色の原因となる場合がある。染色条件当たり２×１０６脾細胞を割り当て、チューブ当たり１ｍｌの洗浄緩衝液を加えた。細胞を４℃の冷却済み遠心分離機中で５分間にわたって５００×ｇで遠心分離した。細胞ペレットを残留量（約５０μｌ）中に再懸濁した。別段の表示がある場合を除き、その後の全てのステップについて全てのチューブを氷上で冷やした。１０μＬの標識済み五量体を細胞に添加し、ピペット操作により混合した。それらの細胞を光から遮断して室温（２２℃）で１０分間にわたってインキュベートした。細胞をチューブ当たり２ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄し、残留液（約５０μｌ）中に再懸濁した。最適量の抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、および抗ＣＤ６２Ｌ抗体（１：１００希釈）を添加し、ピペット操作により混合した。単染色対照試料もこの時点で作製した。試料を光から遮断して２０分間にわたって氷上に放置した。細胞をチューブ当たり２ｍｌの洗浄緩衝液で二回洗浄した。細胞ペレットを残留量（約５０μｌ）中に再懸濁した。２００μＬの固定溶液を各チューブに添加し、ボルテックス混合した。データ取得の準備ができるまでそれらのチューブを冷蔵庫内に暗くして保存した。（注記：細胞の形態が固定後に変化するので、データ取得に進む前に３時間にわたって試料を放置することが得策である。試料は最大で２日間にわたって保存可能である）。
細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮ−γ）プロトコル：
【０７４５】
２×１０７細胞／ｍｌ脾細胞をＦＡＣＳチューブ中に取り、１００μＬのブレフェルジンＡ（ＢＤ  Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ）をそのチューブに添加した。刺激のために２μＭのペプチドをそのチューブに添加し、細胞を室温で１０〜１５分間にわたってインキュベートした。陽性対照試料についてはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）（２×）とイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）（２×）を対応するチューブに添加した。各処理に由来する１００μＬの培地をＵ字底９６ウェルプレートの対応するウェルに添加した。１００μＬの細胞を対応するウェルに添加した（培地＋細胞で２００μｌの終体積）。そのプレートを２分間にわたって６００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ２で５時間にわたってインキュベートした。そのプレートの内容物をＦＡＣＳチューブに移した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加し、５分間にわたって１２００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨てた。２００μＬの２．４Ｇ２上清および１０μＬのウサギ血清をそれらの細胞に添加し、室温で１０分間にわたってインキュベートした。それらの細胞を１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。それらの細胞を１２００ｒｐｍで５分間にわたる遠心分離により収集した。フルオロクローム結合モノクローナル抗体（ＣＤ８  ＦＩＴＣ、ＣＤ３  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ６２Ｌ  ＡＰＣ）を含む５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に細胞を懸濁し、暗所で３０分間にわたって４℃でインキュベートした。細胞を１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、２００μＬの４％ホルマリン溶液中に再懸濁し、２０分間にわたって４℃でインキュベートした。それらの細胞を１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、ＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（０．２５ｍｌ／チューブ）中に１５分間にわたって再懸濁した。細胞を遠心分離により収集し、目的のサイトカインに対するフルオロクローム結合モノクローナル抗体（ＩＦＮｇ−ＰＥ）を含む５０μＬのＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液中に再懸濁した。それらの細胞を暗所で３０分間にわたって４℃でインキュベートした。ＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（チューブ当たり１ｍｌ）を使用して細胞を二回洗浄し、分析前に２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。
結果
実施例２２：組換え型リステリア構成体を用いるワクチン接種により腫瘍退行が生じる
【０７４６】
１週目までに全ての群が２〜３ｍｍの平均サイズを有する腫瘍を発生させたことがデータにより示された。３週目（２０日目）にＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２（「ＬＡ２２９」としても知られる）−ＰＳＡ、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３−ＰＳＡおよびＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３−ＰＳＡ、およびＰＳＡに融合されたｔＬＬＯを発現するＬｍｄｄＡ−１４２（ＡＤＸＳ３１−１４２）で免疫されたマウスが腫瘍退行および腫瘍増殖の遅延を示した。６週目までに未感作群の全てのマウスとＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＰＳＡ処置群の大半が大きな腫瘍を有し、安楽死させられねばならなかった（図２８Ａ）。ところが、ＬｍｄｄＡ−１４２マウス群、ＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２マウス群、およびＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ３マウス群はより良好な腫瘍退行と生存率を示した（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。
実施例２３：組換え型リステリアを用いるワクチン接種により高レベルの抗原特異的Ｔ細胞が生じる
【０７４７】
ＬｍｄｄＡ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡ免疫療法により、ＬｍｄｄＡ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ（３または４）−ＰＳＡまたはＬｍｄｄＡ−１４２と比較して高レベルのＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答が生じた（図２９Ａ）。ＰＳＡ特異的免疫療法におけるＰＳＡ四量体特異的Ｔ細胞の規模は未感作マウスよりも３０倍大きかった。同様に、ＰＳＡ特異的抗原での刺激に応答した高レベルのＩＦＮ−γ分泌がＬｍｄｄＡ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡ免疫療法について観察された（図２９Ｂ）。
実施例２４：ＡＣＴＡ／ＰＥＳＴ２（ＬＡ２２９）を用いるワクチン接種により脾臓に多数の抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞が生じる
【０７４８】
ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２融合ＰＳＡを発現するＬｍは、ｔＬＬＯ融合ＰＳＡを発現するＬｍ、またはｔＬＬＯ処置群と比較して、より多数のＰＳＡ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を脾臓中に生成することができた。腫瘍に浸潤するＰＳＡ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数はＬｍ−ｔＬＬＯ−ＰＳＡ免疫マウスとＬｍ−ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２−ＰＳＡ免疫マウスの両方について同様であった（図３０Ｂおよび３０Ｃ）。また、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２−ＰＳＡを発現するＬｍの腫瘍退行能力は、ｔＬＬＯ−ＰＳＡを発現するＬｍｄｄＡ−１４２について見られるものと同様であった（図３０Ａ）。
実施例２５：ＬＬＯコレステロール結合ドメインの部位特異的突然変異形成
【０７４９】
ＣＢＤ内に不活性化点突然変異を導入するため、以下の戦略を使用して部位特異的突然変異形成をＬＬＯに対して実施した。結果として得られるタンパク質は、「ｍｕｔＬＬＯ」と称される。
ＬＬＯのｐＥＴ２９ｂへのサブクローニング
【０７５０】
野生型ＬＬＯのアミノ酸配列は、
【化２】
2018515588.tif 000009
（配列番号２）である。シグナルペプチドおよびコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）は下線付きであり、ＣＢＤ内の３つの重要な残基（Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２）は太字の斜字体である。
【０７５１】
６×Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）をＬＬＯのＣ末端領域に付加した。Ｈｉｓタグ付きＬＬＯのアミノ酸配列は、
【化３】
2018515588.tif 000010
（配列番号６２）である。
【０７５２】
Ｈｉｓタグ付きＬＬＯタンパク質をコードする遺伝子をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、そのＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩをＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間で発現ベクターｐＥＴ２９ｂにサブクローニングした。ＬＬＯタンパク質をコードする遺伝子の配列は、
【化４】
2018515588.tif 000011
（配列番号６３）である。下線付き配列は、配列の最初から順に、ＮｄｅＩ部位、ＮｈｅＩ部位、ＣＢＧコード領域、６×Ｈｉｓタグ、およびＢａｍＨＩ部位である。次のステップにおいて突然変異形成されるＣＢＤ残基が太字の斜字体である。
スプライシング・バイ・オーバーラップエクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲ
【０７５３】
ステップ１：第１と第２のＰＣＲ反応をｐＥＴ２９ｂ−ＬＬＯテンプレートに対して実施した。第１プライマーと第２プライマーを利用する第１ＰＣＲ反応はＮｈｅＩ部位とＣＢＤとの間の断片を増幅し、ＣＢＤへの突然変異の導入を含んだ。第３プライマーと第４プライマーを利用する第２ＰＣＲ反応は、ＣＢＤとＢａｍＨＩ部位との間の断片を増幅し、ＣＢＤへの同じ突然変異の導入を含んだ（図３１Ａ）。
【０７５４】
ＰＣＲ反応第１サイクル：Ａ）９４℃で２分３０秒、Ｂ）９４℃で３０秒、Ｃ）５５℃で３０秒、Ｄ）７２℃で１分、ステップＢ〜Ｄを２９回繰り返す（合計３０サイクル）、Ｅ）７２℃で１０分。
【０７５５】
ＰＣＲ反応第２サイクル：Ａ）９４℃で２分３０秒、Ｂ）９４℃で３０秒、Ｃ）６０℃で３０秒、Ｄ）７２℃で１分、ステップＢ〜Ｄを２９回繰り返す（合計３０サイクル）、Ｅ）７２℃で１０分。
【０７５６】
ステップ２：第１と第２のＰＣＲ反応の産物を混合し、（突然変異形成されたＣＢＤをコードする領域において）アニールさせ、第１プライマーと第４プライマーを用いてＰＣＲをさらに２５サイクル実施した（図３１Ｂ）。ＰＣＲ反応サイクル：Ａ）９４℃で２分３０秒、Ｂ）９４℃で３０秒、Ｃ）７２℃で１分、ステップＢ〜Ｃを９回繰り返す（合計１０サイクル）、第１プライマーと第４プライマーを添加する、Ｄ）９４℃で３０秒、Ｅ）５５℃で３０秒、Ｆ）７２℃で１分、ステップＤ〜Ｆを２４回繰り返す（合計２５サイクル）、Ｇ）７２℃で１０分。
プライマー配列：
【０７５７】
プライマー１：GCTAGCTCATTTCACATCGT  （配列番号６４；ＮｈｅＩ配列は下線付き）。
【０７５８】
プライマー２：
【化５】
2018515588.tif 000012
（配列番号６５；ＣＢＤコード配列は下線付き、突然変異形成されたコドンは太字の斜字体）。
【０７５９】
プライマー３：
【化６】
2018515588.tif 000013
（配列番号６６；ＣＢＤコード配列は下線付き、突然変異形成されたコドンは太字の斜字体）。
【０７６０】
プライマー４：GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG（配列番号６７；ＢａｍＨＩ配列は下線付き）。
【０７６１】
野生型ＣＢＤ配列はＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ（配列番号６８）である
【０７６２】
突然変異形成されたＣＢＤ配列はＥＡＴＧＬＡＷＥＡＡＲ（配列番号６９）である
【０７６３】
突然変異形成されたＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片の配列は、
【化７】
2018515588.tif 000014
（配列番号７０）である。
実施例２６：ＬＬＯ  ＣＢＤの一部のＣＴＬエピトープとの置換
【０７６４】
ＣＢＤの９アミノ酸（ＡＡ）をＮＹ−ＥＳＯ−１抗原由来のＣＴＬエピトープで置換するため、部位特異的突然変異形成をＬＬＯに対して実施した。ＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する「ｃｔＬＬＯ」という名称のＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープ１５７〜１６５を含む配列ＥＳＬＬＭＷＩＴＱＣＲ（配列番号７１；突然変異形成された残基は下線付き）でＣＢＤの配列（配列番号６８）を置き換えた。
【０７６５】
使用されるサブクローニング戦略は前出の実施例と同様であった。
【０７６６】
使用されるプライマーは以下のとおりであった。
【０７６７】
プライマー１：GCTAGCTCATTTCACATCGT（配列番号６４；ＮｈｅＩ配列は下線付き）。
【０７６８】
プライマー２：
【化８】
2018515588.tif 000015
（配列番号７２；ＣＢＤコード配列は下線付き、突然変異形成された（ＮＹ−ＥＳＯ−１）コドンは太字の斜字体）。
【０７６９】
プライマー３：
【化９】
2018515588.tif 000016
（配列番号７３；ＣＢＤコード配列は下線付き、突然変異形成された（ＮＹ−ＥＳＯ−１）コドンは太字の斜字体）。
【０７７０】
プライマー４：GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG（配列番号６７；ＢａｍＨＩ配列は下線付き）。
【０７７１】
結果として得られるＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ断片の配列は以下のとおりである：
【化１０】
2018515588.tif 000017
（配列番号７４）。
実施例２７：ｍｕｔＬＬＯとｃｔＬＬＯは大腸菌発現系において発現および精製可能である
【０７７２】
ｍｕｔＬＬＯとｃｔＬＬＯは大腸菌中で発現し得ることを示すため、ｐＥＴ２９ｂで大腸菌を形質転換し、且つ、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、次いで４時間後に細胞溶菌液を回収し、総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離し、そしてクマシー染色（図３２Ａ）とモノクローナル抗体Ｂ３−１９を使用する抗ＬＬＯウエスタンブロットの対象とした（図３２Ｂ）。このように、ＣＢＤ内に点突然変異または置換を含むＬＬＯタンパク質が大腸菌発現系において発現および精製可能である。
実施例２８：ｍｕｔＬＬＯとｃｔＬＬＯは溶血活性の著しい低下を示す
材料および実験方法
溶血アッセイ
【０７７３】
１．野生型および変異型のＬＬＯを図３３Ａ〜Ｂに表示される希釈度で９００μＬの１×ＰＢＳ−システイン（ＰＢＳを０．５Ｍシステイン塩酸でｐＨ５．５に調節するか、または７．４に調節した）中に希釈した。２．ＬＬＯを３７℃で３０分間にわたってインキュベートすることにより活性化した。３．ヒツジ赤血球（２００μｌ／試料）をＰＢＳ−システインで二回洗浄し、上清が比較的に明るくなるまで１×ＰＢＳで３〜５回洗浄した。４．ヒツジ赤血球の最終ペレットをＰＢＳ−システインに再懸濁し、１００μＬのその細胞懸濁液を９００μＬのＬＬＯ溶液に添加した（１０％の終濃度）。５．５０μＬのヒツジ赤血球を９５０μＬの水＋１０％ツイーン２０に添加した（溶解についての陽性対照。他のチューブに加えられる細胞の総量としての溶解細胞の５０％の量を含むことになるので「５０％対照」）。６．全てのチューブを穏やかに混合し、３７℃で４５分間にわたってインキュベートした。７．赤血球をマイクロ遠心分離機中で１０分間にわたって１５００ｒｐｍで遠心分離した。８．その上清の２００μｌのアリコットを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移し、５７０ｎｍで読んで溶血後に放出されたヘモグロビンの濃度を測定し、そして５０％対照に対して試料を用量決定した。
結果
【０７７４】
ヒツジ赤血球アッセイを用いてｍｕｔＬＬＯとｃｔＬＬＯの溶血活性を決定した。ｍｕｔＬＬＯはｐＨ５．５において著しく減少した（１００倍と１０００倍の間）溶血タイターを示し、且つ、ｐＨ７．４において検出不可能な溶血活性を示した。ｃｔＬＬＯはどちらのｐＨでも検出不可能な溶血活性を示した（図３３Ａ〜Ｂ）。
【０７７５】
したがって、Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２を含むＬＬＯ  ＣＢＤ残基、の点突然変異（ｍｕｔＬＬＯ）または置換突然変異（ｃｔＬＬＯ）により溶血活性が消失するか、または大きく低下する。さらに、異種抗原ペプチドでのＣＢＤの置換は、野生型ＬＬＯと比べて著しく低下した溶血活性を持つ異種エピトープの免疫原性担体を作製する効果的な手段である。
実施例２９：完全閉鎖単回使用細胞増殖系
【０７７６】
その革新的システムは、独特な構成で配置されている容易に利用可能なバイオプロセッシング要素および技術を活用することで単一完全閉鎖系を使用して改変型Ｌｍ細菌を培養し、その発酵ブロスを濃縮し、それらの細胞を洗浄および精製し、発酵培地を製剤緩衝液に交換し、且つ、患者特異的用量をすぐに使用可能なＩＶバッグに分配する。このタイプの系はそれぞれの患者の免疫療法の隔離と管理を提供する。この系は、免疫療法を標的とする個別化ネオエピトープの特定と臨床使用についての全体的なワークストリームに組み込むのに特によく適している（図３７Ａ〜Ｂ）。
【０７７７】
そのカスタム設計の系は、単回使用バイオプロセッシングバッグ、患者ＩＶバッグ、サンプリングバッグ、チューブ類、フィルター、クイックコネクター、およびセンサーを使用して組み立てられる。その系が省スペースであることで個々の患者向けに製造することが可能になるが、それを増やして複数の患者向けの製品を並行して製造することができる（図３８）。その組立品全体は４つの区画、すなわち、１）接種と発酵、２）濃縮、３）透析濾過、および４）医薬製品充填から構成される。その系は完全閉鎖液体流路を有し、且つ、使用前に滅菌されるので、最終製剤免疫療法は直接的にＩＶバッグに分配され、凍結され、そして医療センターに発送される。したがって、バイアル瓶または事前充填注射筒に分配するときに伴われる典型的な充填／仕上げおよび包装の必要性がこれにより排除される。このことは、期待される患者への短時間での納品と送達に対処する。
【０７７８】
その組立品の接種および発酵区画（図３９）は増殖培地で充填され、且つ、指定温度まで温められる。次に細胞バンクを単回使用揺動式バッグ型発酵機か単回使用撹拌式バイオリアクター容器のどちらかに接種する。細菌が特定の密度まで増殖したところでその組立品の濃縮区画（図４０）を使用することで中空繊維フィルターを使用して発酵培地を除去し、且つ、そのバッチを濃縮する  洗浄／製剤緩衝液バッグがその組立品の透析濾過区画（図４１）に接続されており、細菌細胞が洗浄／精製され、残っている培地が中空繊維フィルター中でのクロスフロー濾過を介して製剤緩衝液と交換され、そして製品が終濃度まで希釈される。最後にそのバッチがその組立品の医薬製品充填区画（図４２）を使用して無菌単回使用ＩＶバッグおよびＱＣ検査用のサンプリングバッグに分割される。患者特異的免疫療法は、生きた弱毒化改変型Ｌｍ細菌の純粋な培養株を指定の濃度で含む少量非経口のＩＶバッグの中で凍結されて供給される。患者へ投与する前にそのＩＶバッグが融解され、細胞が再懸濁され、そして必要な用量が注射筒を用いて取り出され、且つ、より大きな注入用ＩＶバッグに添加される。
【０７７９】
数個の完全閉鎖組立品を並行使用して数人の患者または一人の患者のどちらかのために個別免疫療法組成物を製造する（図４３）。スループットを増やすため、追加の揺動式バイオリアクターシステムまたは撹拌容器バイオリアクターシステムが必要に応じて処理列に加えられる（例えば図３８参照）。
【０７８０】
その培養系の完全閉鎖設計により、製造過程において追加的に時間節約になると共に免疫療法組成物の完全な品質管理が可能になる。完全分析管理行動計画をリステリア送達ベクターの培養と並行して実施する（表６）。したがって、分配された製品は、追加の検査を必要とせずに患者に即時に送達されるように準備できている。
【０７８１】
表６．    分析管理行動計画
【表６】
2018515588.tif 000018
実施例３０：ネオエピトープ発現ベクターの構築
【０７８２】
以下に詳細が記載されるステップを用いて１つ以上のネオエピトープを含むＬｍベクターの構築を実施する。
ホールゲノムシーケンシング
【０７８３】
まず、腫瘍細胞の約２０％超に存在する非同義突然変異の位置を突き止めることを含む比較的ホールゲノムシーケンシングを実施し、ＦＡＳＴＡ形式で結果を提供する。全エクソームに由来する一致した正常試料／腫瘍試料は外部供給業者により配列決定されており、出力データは、２１アミノ酸配列ペプチドとしての全ての新抗原、例えば変異アミノ酸の両側に１０非変異アミノ酸を有するペプチドを記載する好ましいＦＡＳＴＡ形式で提供される。患者ＨＬＡタイプも含まれる。
【０７８４】
ヒト組織（またはあらゆる非ヒト動物）から得られた生体試料に由来するＤＮＡとＲＮＡは三組抽出される。新抗原の別の供給源は順次生じる転移癌または循環腫瘍細胞に由来する可能性がある。それらの新抗原は最初の生検材料には存在しないが、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＣ）を特異的に標的とするベクター、  または  シーケンシングされた最初の生検材料とは異なるように変異形成した転移癌には含まれる可能性がある追加の突然変異を含む場合があり得る。三組の各試料をＤＮＡエクソームシーケンシングにより配列決定する。簡潔に述べると、超音波装置を使用して３μｇの精製ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を約１５０〜２００ｂｐに断片化する。断片を末端修復し、５’末端リン酸化し、３’末端アデニル化し、その次に製造業者の指示に従ってイルミナ・ペアードエンドアダプターをそれらのｇＤＮＡ断片にライゲーションする。イルミナ・ＰＥ  ＰＣＲプライマーを使用してキャプチャ前増幅フローセル特異的配列を付加する。約５００ｎｇのアダプターライゲーション済みＰＣＲ増幅ｇＤＮＡ断片をビオチン化エクソーム（ヒトエクソームまたは他のあらゆる非ヒト動物、例えば、マウス、モルモット、ラット、イヌ、ヒツジのエクソーム）にハイブリダイズする。ＲＮＡライブラリーが６５℃で２４時間にわたってベイトになる。次にストレプトアビジン被覆磁性ビーズを使用してハイブリダイズしたｇＤＮＡ／ＲＮＡベイト複合体を取り出し、洗浄し、そしてＲＮＡベイトを切り出す。これらの溶出ｇＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、その後でイルミナ・シーケンシング装置上で配列決定する。
ＲＮＡ遺伝子発現プロファイリング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）
【０７８５】
総計で約５μｇの全ＲＮＡよりバーコードｍＲＮＡ−ｓｅｑ  ｃＤＮＡライブラリーを調製する。その次に、簡潔に述べると、ｍＲＮＡを単離および断片化する。その後、標準的イルミン・プロトコルに従ってｍＲＮＡ断片をｃＤＮＡに変換し、特定のイルミナ・アダプターに結合し、クラスター化し、そして配列決定する。出力配列リードを参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）に対して整列させる。ゲノムアラインメントおよびトランスクリプトームアラインメントを作成する。エクソン間接合部に対してもリードを整列させる。ＲｅｆＳｅｑ転写物の座標でリード座標を分割し、重なり合うエクソン間接合部リードを計数し、そしてＲＰＫＭ発現単位（転写物のキロベース当たりとマップ済み１００万リード当たりの転写物キロベース当たりでマップするリード）などの標準的正規化単位に正規化することにより発現値を決定する。
突然変異の検出
【０７８６】
疾患または症状を担持する組織試料に由来する単離ｇＤＮＡの断片を供給業者が用意したソフトウェア、例えばＳａｍｔｏｏｌｓ、ＧＡＴＫ、およびＳｏｍａｔｉｃ  Ｓｎｉｐｅｒにより健常組織の参照一致ｇＤＮＡに対して整列させる。
【０７８７】
異なるＨＬＡ  ＴＣＲリーディングフレームのうちの少なくとも幾つかを提供するため、検出される突然変異の両側にある約１０隣接アミノ酸を組み入れてクラス１ＭＨＣ−１提示を構成する。
【０７８８】
表７は、各突然変異が太字のアミノ酸を表す文字によって表示されており、且つ、両側に１０アミノ酸を隣接させて２１アミノ酸ペプチドネオエピトープを提供する５０種類のネオエピトープペプチドの試料リストを示している。
【０７８９】
表７．  
【表７−１】
2018515588.tif 000019
【表７−２】
2018515588.tif 000020
【０７９０】
出力ＦＡＳＴＡファイルを使用して以下に詳細が記載される基準のうちの１つ以上に従って手作業か、またはプログラムされたスクリプトのどちらかによって患者特異的コンストラクトを設計する。そのプログラムされたスクリプトは一連のプロトコルを使用して各対象向けの１つ以上のネオエピトープを含有する個別化血漿コンストラクトの作製を自動化する（図４５）。その出力ＦＡＳＴＡファイルを入力し、それらのプロトコルが実行された後に１つ以上のネオエピトープを含むＬＭベクターのＤＮＡ配列が出力される。そのソフトウェアプログラムは各対象向けの個別免疫療法の作成に有用である。
コンストラクトに組み込むためのネオエピトープの優先順位付け  
【０７９１】
カイト・ドゥーリトル・ハイドロパシーインデックス２１アミノ酸ウィンドウによりネオエピトープにスコアを付け、カットオフ（１．６付近）よりも上の全てのスコアを取ったものをリステリア・モノサイトゲネスによって分泌可能である可能性が無いとして除外する。次に患者ＨＬＡに結合する残りの２１アミノ酸長のペプチドの能力について（例えばＩＥＤＢ、免疫エピトープデータベースおよび分析ソース、ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／を使用することにより）それらにスコアを付け、各２１アミノ酸配列ペプチドの最良のＭＨＣ結合スコアによってそれらのペプチドの順位を決定する。サルモネラなどの異なる発現ベクターについてはカットオフが異なっていてよい。
【０７９２】
ネオエピトープの発現と分泌の効率を決定するために突然変異数に対するコンストラクト数を決定する。ベクター当たり約５０エピトープから開始して、直鎖状ネオエピトープの範囲を検査する。ある特定の事例ではコンストラクトはベクター当たり少なくとも１つのネオエピトープを含む。使用されるベクターの数は、単一のベクターに由来する複数のエピトープの翻訳と分泌の効率および特定のネオエピトープを保持する各Ｌｍベクターに必要とされるＭＯＩを考慮して、またはネオエピトープ数を参照して決定される。別の考慮事項は、循環腫瘍細胞に見出される公知の腫瘍関連突然変異、公知の癌「ドライバー」突然変異、公知の化学療法耐性突然変異からなる群を事前に定義し、且つ、２１アミノ酸配列ペプチド選択においてこれらを優先することによるものであり得る。これは、特定された変異遺伝子をＣＯＳＭＩＣ（癌体細胞突然変異カタログ、ｃａｎｃｅｒ．Ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）またはキャンサーゲノムアナリシスまたは他の類似の癌関連遺伝子データベースに対してスクリーニングすることにより行われ得る。さらに、免疫抑制性エピトープ（Ｔｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導性Ｔヘルパーエピトープ、等）のスクリーニングを利用して脱選択する、またはベクターに対する免疫抑制的影響を回避する。選択されたコドンは、特定のリステリア株に応じて効率的な翻訳および分泌になるようにコドン最適化される。当技術分野において知られているＬ．モノサイトゲネスについて最適化されたコドンの例が表８に提示されている。
【０７９３】
表８．    予備段階のリステリア・モノサイトゲネスにとり好ましい（最も一般的な）コドンの表
【表８】
2018515588.tif 000021
【０７９４】
残りの２１アミノ酸ペプチドネオエピトープをｐＡｄｖ１３４−ＭＣＳ（配列番号１３８）プラスミドに、または所望により上の実施例８において示されているようにＬＬＯ−Ｅ７カセットを交換してｔＬＬＯ−ネオエピトープ−タグ融合ポリペプチドを作製するｐＡｄｖ１３４に組み入れる。アミノ酸配列としてのその適合可能な挿入断片および全挿入断片をカイト・ドゥーリトル・テストにより再チェックしてコンストラクト全体にわたって何のハイドロパシーの問題も無いことを確認する。必要な場合は、挿入断片の順序を再構成するか、または問題の２１アミノ酸配列ペプチドをコンストラクトから除去する。
【０７９５】
ＤＮＡ合成／ｐＡｄｖ１３４−ＭＣＳ配列番号１３８、すなわち、へのクローニングのためにコンストラクトのアミノ酸配列を対応するＤＮＡ配列に逆翻訳する。cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatCTCGAGGAGCTCCTGCAGTCTAGAGTCGACACTAGTGGATCCAGATCTCCCGGGccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagccaacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaaaagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgatatactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagttaaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaagtcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatctgtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaatcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagcttctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgtagaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctcaatcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagcatgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagatacatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgttcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgattttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctattgatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatattttgttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagccaaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacgtgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatcccaattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataagggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagatgaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagtagggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatcgaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaaaaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagggaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagatttatttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcatttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaagccttatttagcgacgaccaaaaaagagattagagaagtgctaggcattcctgaacggacattagataaattgctgaaggtactgaaggcgaatcaggaaattttctttaagattaaaccaggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcattaaattaaaaaaagaagaacgagaaagctatataaaggcgctgacagcttcgtttaatttagaacgtacatttattcaagaaactctaaacaaattggcagaacgccccaaaacggacccacaactcgatttgtttagctacgatacaggctgaaaataaaacccgcactatgccattacatttatatctatgatacgtgtttgtttttctttgctggctagcttaattgcttatatttacctgcaataaaggatttcttacttccattatactcccattttccaaaaacatacggggaacacgggaacttattgtacaggccacctcatagttaatggtttcgagccttcctgcaatctcatccatggaaatatattcatccccctgccggcctattaatgtgacttttgtgcccggcggatattcctgatccagctccaccataaattggtccatgcaaattcggccggcaattttcaggcgttttcccttcacaaggatgtcggtccctttcaattttcggagccagccgtccgcatagcctacaggcaccgtcccgatccatgtgtctttttccgctgtgtactcggctccgtagctgacgctctcgccttttctgatcagtttgacatgtgacagtgtcgaatgcagggtaaatgccggacgcagctgaaacggtatctcgtccgacatgtcagcagacgggcgaaggccatacatgccgatgccgaatctgactgcattaaaaaagccttttttcagccggagtccagcggcgctgttcgcgcagtggaccattagattctttaacggcagcggagcaatcagctctttaaagcgctcaaactgcattaagaaatagcctctttctttttcatccgctgtcgcaaaatgggtaaatacccctttgcactttaaacgagggttgcggtcaagaattgccatcacgttctgaacttcttcctctgtttttacaccaagtctgttcatccccgtatcgaccttcagatgaaaatgaagagaaccttttttcgtgtggcgggctgcctcctgaagccattcaacagaataacctgttaaggtcacgtcatactcagcagcgattgccacatactccgggggaaccgcgccaagcaccaatataggcgccttcaatccctttttgcgcagtgaaatcgcttcatccaaaatggccacggccaagcatgaagcacctgcgtcaagagcagcctttgctgtttctgcatcaccatgcccgtaggcgtttgctttcacaactgccatcaagtggacatgttcaccgatatgttttttcatattgctgacattttcctttatcacggacaagtcaatttccgcccacgtatctctgtaaaaaggttttgtgctcatggaaaactcctctcttttttcagaaaatcccagtacgtaattaagtatttgagaattaattttatattgattaatactaagtttacccagttttcacctaaaaaacaaatgatgagataatagctccaaaggctaaagaggactataccaactatttgttaattaa大文字は外部供給業者によるマルチクローニング部位を指す。個々の２１アミノ酸ペプチド配列およびＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×ＨｉｓタグＤＮＡ配列（例えば配列番号８７）をＬ．モノサイトゲネス内での発現と分泌について最適化し、一方で４×グリシンリンカー配列は１１種類の事前決定ＤＮＡ配列（Ｇ１〜Ｇ１１、配列番号７６〜８６）のうちの１つである。より良好なＤＮＡ合成を可能にするためにリンカー配列コドンを変更して過剰な反復を回避する。４×グリシンリンカーの異なる配列コドンの例（Ｇ１〜Ｇ１１、配列番号７６〜８６）が表９に提示されている。
【０７９６】
表９．    ４×グリシンリンカーＤＮＡ配列および終末タグ配列
【表９】
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【０７９７】
各ネオエピトープをリンカー配列によって同じベクター上にコードされる次のネオエピトープに結合する。挿入断片中の最後のネオエピトープをタグ配列とそれに続く終止コドンに融合する。融合されるタグ、すなわち、Ｃ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬおよび６×Ｈｉｓアミノ酸配列が配列番号８７で表される。例えばＬｍベクターからの分泌時に、または特定のＴ細胞への親和性、または抗原提示細胞による提示についてコンストラクトを検査するときにそのタグによってｔＬＬＯ−ネオエピトープの簡単な検出が可能になる。そのリンカーは、Ｇ１〜Ｇ１１（配列番号７６〜８６）を含む群より選択される４×グリシンＤＮＡ配列であり、したがって、またはそれらのあらゆる組合せである。
【０７９８】
単一のプラスミド中に適合し得る（最大積載量は現在検査中である）ものよりも使用しやすい２１アミノ酸ペプチドが存在する場合、それらの異なる２１アミノ酸ペプチドを必要に応じて／要望に応じて優先順位によって第１コンストラクト、第２コンストラクト等と呼ぶ。所望のネオエピトープのセット全体を含む複数のベクターのうちの１つに対する優先度の割り当てが、相対的サイズ、転写優先度、および翻訳されたポリペプチドの全体的疎水性のような因子に基づいて決定される。
【０７９９】
１つの実施形態では本明細書において開示されるコンストラクトの構造は、Ｎ末端短縮型ＬＬＯが融合している１つ以上の２１ｍｅｒネオエピトープアミノ酸配列とそれに隣接するリンカー配列、および別のリンカーが隣接し、且つ、そのオープン・リーディング・フレームを終えるＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンによって終わる後続の少なくとも１つの第２ネオエピトープをコードする核酸配列、すなわち、ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−第一２１ｍｅｒ−４×グリシンリンカーＧ１−第二２１ｍｅｒ−４×グリシンリンカーＧ２−…−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む。別の実施形態では上のコンストラクトの発現は、ｈｌｙ遺伝子プロモーター配列または当技術分野において知られており、且つ、本明細書においてさらに開示される他の適切なプロモーター配列によって引き起こされる。当業者は、各２１ｍｅｒネオエピトープ配列が本明細書において開示されるｔＬＬＯ、短縮型ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴアミノ酸配列などの免疫原性ポリペプチドに融合されてもよいことを理解する。
【０８００】
反復を最小限にするためにネオエピトープ間に異なるリンカー配列を配置する。これにより可能性がある二次構造が低減され、それによりＬｍ組換えベクター株集団内の挿入断片を含むプラスミドの効率的な転写、翻訳、分泌、維持、または安定化が可能になる。
【０８０１】
少なくとも１つのネオエピトープに融合されたｔＬＬＯまたはｔＡｃｔＡまたはＡｃｔＡまたはＰＥＳＴアミノ酸配列を備えるオープン・リーディング・フレームを含むコンストラクトを含む供給業者由来のヌクレオチド配列を注文することによりＤＮＡ合成を行う。加えて、または代わりに、複数のネオエピトープを１つ以上のリンカー４×グリシン配列によって分ける。加えて、または代わりに、分子生物学技法により、例えば：特定の重複性プライマーおよび特定のプライマーを使用するソーイングＰＣＲにより、または適切な酵素（例えば、ライゲース）によって異なるヌクレオチド配列をライゲーションし、所望により続いて制限酵素によって切断することにより、およびそれらのあらゆる組合せにより所望の配列を含むように挿入断片を構築する。
【０８０２】
一実施形態では反復を最小限にするためにネオエピトープ間に異なるリンカー配列を配置する。これにより可能性がある二次構造が低減され、それによりＬｍ組換えベクター株集団内の挿入断片を含むプラスミドの効率的な転写、翻訳、分泌、維持、または安定化が可能になる。
【０８０３】
選択されたＤＮＡ挿入断片を当技術分野において標準的な技法（例えば、ＰＣＲ、ＤＮＡ複製・生物複製、オリゴヌクレオチド化学合成）により合成し、プラスミド、例えば実施例８において提示されるプラスミドにクローニングする。次にＬｍベクターをそのプラスミドで形質転換するか、または接合でそのプラスミドを導入する。加えて、または代わりに、その挿入断片をファージベクターに組み込み、そしてファージ感染によりＬｍベクターに挿入する。当技術分野において知られている技法、例えば挿入断片特異的プライマーを用いる細菌コロニーＰＣＲを利用して、または前記プラスミドを精製し、その挿入断片を含む少なくとも一部分をシーケンシングしてそのコンストラクトの確認を実施する。
実施例３１：ネオエピトープ発現ベクターからのネオエピトープの発現
【０８０４】
癌は突然変異によって引き起こされるので、個々の腫瘍における体細胞突然変異の包括的マップを提供する能力は、癌をより良好に理解し、且つ、癌に対して介入するための強力なツールを提供する。ヒトの癌は数十から数百の非同義突然変異を担持する。例えば、全ての目的のために全体が参照により本明細書に援用されるＣａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．    （２０１２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７２（５）：１０８１−１０９１を参照されたい。ところが、患者の間で共有される突然変異はまれであり、且つ、突然変異の大多数は患者特異的であり、そのことが．広範囲に適用可能な薬品の開発向けのミュータノームの開発を妨げている。
【０８０５】
この実施例では、健常肺組織には存在しない肺非小細胞癌組織において特定された約２００の非同義突然変異に基づいて実施例３０のようにネオエピトープ発現ベクターを構築した。組織はマサチューセッツ大学医学部癌中核的研究拠点組織バンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｍａｓｓｍｅｄ．ｅｄｕ／ｃｃｏｅ／ｃｏｒｅ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｔｉｓｓｕｅ−ａｎｄ−ｔｕｍｏｒ−ｂａｎｋ／ｂａｎｋｅｄ−ｔｕｍｏｒ−ｂｙ−ｏｒｇａｎ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ）より取り寄せた。他のものは典型的にはエピトープの免疫原性についての予測アルゴリズムに基づいてスクリーニングする。これらのアルゴリズムは、どのペプチドがＴ細胞応答を生成するか予測することに関して最良でも２０％正確なだけである。それらのアルゴリズムは２００突然変異全てを含むことができないのでこれを行う。ここでは全ての突然変異を含めることができたので、スクリーニング／予測アルゴリズムを使用しなかった。Ｌｍ株は何を分泌できそうか（すなわち、あまり疎水性ではなさそうか）判断するために疎水性についてスクリーニングを実施した。下の表に非同義突然変異（ネオエピトープ）が提示されている。
【表２３−１】
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【表２３−２】
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【表２３−３】
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【表２３−４】
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【表２３−５】
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【表２３−６】
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試薬
【０８０６】
肺パーミューテーションコンストラクトを試験するために次の試薬を使用した。
・  細菌：ＢＨＩ中で終夜培養したタグ付きＬｍｄｄａコンストラクト
・  細胞株：ＤＣ２．４
・  ＨＢＳＳ中の２％トリプシン  
・  ＲＰＭＩ  １０％ＦＢＳ  グルタマックス
・  ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ  ２％ＦＢＳ）
・  細胞計数溶液
・  ゲンタマイシン抗生物質
・  ２５Ｄ−ＡＰＣ結合抗体、１００倍
抗原提示細胞の回収
【０８０７】
幾つかの実験ではマウス樹状ＤＣ２．４細胞を２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＩＦＮγで４８時間にわたって刺激した。培地を除去し、フラスコ当たり２本の５０ｍＬコニカルチューブに収集した。１０ｍｌの体積の２％トリプシンＨＢＳＳ溶液をフラスコに加えて残っているＦＢＳを除去し、２本の５０ｍＬの収集用チューブに等しく移した（５ｍＬずつ）。１０ｍＬの体積の２％トリプシンＨＢＳＳ溶液をフラスコに添加して被覆し、顕微鏡下で固着性をチェックし、そして３７℃で５分間のインキュベーションが続いた。その懸濁液を２本の５０ｍＬの収集用チューブに収集し（５ｍＬずつ）、そして１２００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離した。上清を捨て、２５ｍＬのＲＰＭＩ  １０％ＦＢＳ  グルタマックス溶液を含むチューブ１中でペレットを再懸濁した。次にこれを２本目の収集用チューブに移してそれらの２本のチューブを１本にまとめた。
【０８０８】
その後、計数するためにチューブ（１．５ｍＬ）にラベルを付けた。１３５ｕＬの体積の計数溶液および１５ｕＬの体積の細胞を加え、細胞を室温で２分間にわたってインキュベートした。その後、２４ウェルプレート中で感染させるためにそれらのＤＣ２．４細胞を準備した。それらの２４ウェルプレートを３７℃（５％ＣＯ２）で一晩インキュベートした。その後、それらのプレートを２０００ｒｐｍで５秒間にわたって遠心分離し、上清を除去し、そして１ｍＬの新しいｃ−ＲＰＭＩを各ウェルに添加した。
感染
【０８０９】
その後、それらの細胞にＬｍｄｄａ−ＰＳＡ−サバイビン−タグ発現ベクター（３７度で終夜培養）を感染させた。合計のＬｍｄｄａ−ネオ・コンストラクトｃｆｕは１×１０９／ｍＬであった。そのＬｍｄｄａを１．５ｍＬ中で遠心分離し、室温で１ｍＬのＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ培地中に再懸濁した。ある体積のそのＬｍｄｄａを、２×１０６細胞に対する正しいＭＯＩに達するようにＤＣ２．４ウェルに添加した（ＭＯＩ：１０＝２０ｕＬのＬｍｄｄａ）。その後、そのプレートを１２００ｒｐｍで１５分間にわたって遠心分離し、そして５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターの中に４時間の感染のために配置した。それらの細胞のＬｍｄｄａ殺滅を停止するため、そのインキュベーションの１時間後に１０ｕｇ／ｍＬのゲンタマイシンを添加した。
２５Ｄ−ＡＰＣ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を用いる染色とフローサイトメトリー
【０８１０】
４時間の感染後、そのプレートを２０００ｒｐｍで３０秒間にわたって遠心分離し、上清を捨てた。ブロックするためにそれらの細胞を２００ｕＬの２．４Ｇ２中に再懸濁し、氷上で１０分間にわたって９６ウェルプレートに移した。それらの細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で洗浄した。その後、染色マスターミックスを添加し、それらの細胞をボルテックス混合し、そして氷上に２０分間にわたって放置した。その後、それらの細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、約３００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液（ペレットのサイズ／細胞数による）中に再懸濁した。その後、２５Ｄ−ＡＰＣの検出のためにフローサイトメーターにそれらの試料を流した。
実験１
【０８１１】
表１０．  ２５Ｄ−ＡＰＣの検出のために検査された試料
【表１０−１】
2018515588.tif 000029
【表１０−２】
2018515588.tif 000030
【０８１２】
コンストラクトの末尾の「Ｈ」（例えば「１２１−１４０Ｈ」）は、そのペプチド配列がそのＨを持っていないコンストラクトと同一であるが、同じペプチド配列を生じるその基底となるヌクレオチド配列が改変されたことを表す。
【０８１３】
表１１．  ２５Ｄ−ＡＰＣの検出
【表１１】
2018515588.tif 000031
【０８１４】
２５Ｄ−ＡＰＣ結合抗体を用いるＣ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬタグの検出が表１１に示されている。表１１に示されているように、ＳＶＮ−タグ陽性対照とＰＳＭＡ−タグ陽性対照は高レベルの陽性染色を示し、一方でＳＶＮ−ｎｏタグ陰性対照、無感染陰性対照、および未染色陰性対照は検出限界未満であった。同様に、試料４〜７、１０、１２、１６、２０〜２３、２５、および２７〜２９は高レベルの陽性染色を示した。これにより、感染すると抗原提示細胞において新抗原が発現および分泌することの確証が示される。
実験２
【０８１５】
表１２に示される追加の肺ネオエピトープコンストラクトを用いる第２の実験において上記のことを反復した。この実験では肺コンストラクトの様々な位置にタグを移動した。
【０８１６】
表１２．  ２５Ｄ−ＡＰＣの検出のために検査された試料
【表１２】
2018515588.tif 000032
【０８１７】
表１３．  ２５Ｄ−ＡＰＣの検出
【表１３】
2018515588.tif 000033
【０８１８】
２５Ｄ−ＡＰＣ結合抗体を用いるＣ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬタグの検出が表１３に示されている。表１３に示されているように、ＳＶＮ−タグ陽性対照は高レベルの陽性染色を示し、一方でタグ無し陰性対照、無感染陰性対照、および未染色陰性対照は検出限界未満であった。同様に、試料３、７、および８は高レベルの陽性染色を示した。これにより、感染すると抗原提示細胞において新抗原が発現および分泌することの確証が示される。
実験３
【０８１９】
表１４に示される追加の肺ネオエピトープコンストラクトを用いる第３の実験において上記のことを反復した。これらの肺コンストラクトではコンストラクトの様々な位置にタグを移動した。
【０８２０】
表１４．  ２５Ｄ−ＡＰＣの検出のために検査された試料
【表１４】
2018515588.tif 000034
【０８２１】
表１５．      ２５Ｄ−ＡＰＣの検出
【表１５】
2018515588.tif 000035
【０８２２】
２５Ｄ−ＡＰＣ結合抗体を用いるＣ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬタグの検出が表１５に示されている。表１５に示されているように、ＰＳＡ  サバイビン陽性対照とミニ遺伝子陽性対照は高レベルの陽性染色を示し、一方でタグ無し陰性対照と無感染陰性対照は検出限界未満であった。同様に、試料４、および５〜１２は高レベルの陽性染色を示した。これにより、感染すると抗原提示細胞において新抗原が発現および分泌することの確証が示される。
【０８２３】
図４５は、様々な位置にＳＩＩＮＦＥＫＬを含むＬｍコンストラクトに感染したＤＣ２．４細胞上の表面Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬを示している。そのグラフは、ＳＩＩＮＦＥＫＬがＣ末端、Ｎ末端、または内部に位置する場合に分泌されたネオエピトープがＳＩＩＮＦＥＫＬにより特定されることを示す、生２５Ｄデータの要約を示している。最後の５本のバーは次のコンストラクトに対応する：それぞれ、２７１２  ＳＩＩＮＦＥＫＬ−１２１−１４０−６ｘＨＩＳ、２７１２  １２１−１２５−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−１２６−１４０−６ｘＨＩＳ、２７１２  １２１−１３０−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−１３１−１４０−６ｘＨＩＳ、２７１２  １２１−１３５−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−１３６−１４０−６ｘＨＩＳ、および２７１２  １２１−１４０−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６ｘＨＩＳ。
実験４
【０８２４】
表１６に示される追加のＬｍｄｄａコンストラクトを用いる第４の実験において上記のことを反復した。
【０８２５】
表１６．  ２５Ｄ−ＡＰＣの検出のために検査された試料
【表１６−１】
2018515588.tif 000036
【表１６−２】
2018515588.tif 000037
【０８２６】
表１７．  ２５Ｄ−ＡＰＣの検出
【表１７】
2018515588.tif 000038
【０８２７】
２５Ｄ−ＡＰＣ結合抗体を用いるＣ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬタグの検出が表１７に示されている。表１７に示されているように、ＳＶＮ陽性対照は高レベルの陽性染色を示し、一方でタグ無し陰性対照は低レベルの染色を示した。同様に、試料４３〜１２、１５、１８、１９、２１、２２、２４、および２７〜３０は高レベルの陽性染色を示した。これにより、感染すると抗原提示細胞において新抗原が発現および分泌することの確証が示される。図５０は、ネオエピトープの提示および分泌に対するそれらのネオエピトープの順序のランダム化の効果を示している。１から２０まで順に並べたものは分泌しない。ところが、順序全体をランダム化する、または個々の断片に分解する、またはそれらの断片をランダム化することにより分泌がうまくいくことになる。同様に、２１から４０まで順に並べたものは分泌しない。その２０ｍｅｒ（１〜５、６〜１０）の個々の領域が作用せず、他の領域（１６〜２０）が作用する。ところが、個々の領域をランダム化することによりそれぞれ個々の領域の分泌がうまくいくことになる。
実施例３２：Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおけるＬｍ新抗原コンストラクトの治療効果
【０８２８】
癌細胞にあって対応する健常細胞には存在しない非同義突然変異を特定した後、それらの突然変異の機能上の影響、例えば、癌パッセンジャー状態と比べた癌ドライバー状態などを決定して治療標的選択の基礎を形成することに大きな努力が払われることが典型的である。ところが、これらの突然変異の免疫原性を明らかにすることにも、それらが誘発する免疫応答の特徴を分析することにもほとんど注意が払われていなかった。免疫学的見地より、突然変異により中枢性免疫寛容の対象ではない新抗原が創出され得るので、突然変異は特に強力なワクチン接種標的である。これらの突然変異の免疫原性を明らかにすること、またはそれらが誘発する免疫応答の特徴を分析することに注意が払われているとき、免疫のためにペプチド内に含まれるべき単一の突然変異にそれらの非同義突然変異を絞り込むことに努力が向けられることが典型的である。例えば、Ｃａｓｔｌｅらの著作では、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞において９６２非同義点突然変異が特定され、それらの突然変異のうちの５６３突然変異が発現遺伝子内にあった。これらの突然変異のうちの５０突然変異が、低い偽陽性率（ＦＤＲ）信頼値、発現遺伝子内の位置、および予測される免疫原性をはじめとする選択基準に基づいて選択された。これらの５０突然変異のうち１６突然変異だけが免疫されたマウスにおいて面機応答を誘発することがわかり、それらの１６突然変異の内の１１突然変異だけが変異型エピトープを優先的に認識する免疫応答を誘導した。次にそれらの突然変異のうちの２突然変異が腫瘍増殖阻害を誘導することがわかった。例えば、全ての目的のために全体が参照により本明細書に援用されるＣａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．    （２０１２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７２（５）：１０８１−１０９１を参照されたい。ところが、以下の実験において記述されるコンストラクトでは、腫瘍増殖の抑制に関してＮｅｏ２０およびＮｅｏ３０の方が良好であることが我々のデータより示唆される。我々のコンストラクトでは、Ｎｅｏ１２は１２種類の最も免疫原性のエピトープを含む。Ｎｅｏ１２は両方の腫瘍抑制エピトープ（表７において既に開示されたＭｕｔ３０およびＭｕｔ４４）を含む。Ｎｅｏ２０はＭｕｔ３０−Ｍｕｔ２−Ｍｕｔ３−Ｍｕｔ３−Ｍｕｔ４…Ｍｕｔ１９）を含む。Ｎｅｏ３０はＭｕｔ３０−Ｍｕｔ２−Ｍｕｔ３…Ｍｕｔ−２９）を含む。Ｎｅｏ２０およびＮｅｏ３０だけがＣａｓｔｌｅによって特定された腫瘍抑制エピトープのうちの１つ（Ｍｕｔ３０）を含み、次にそれらは免疫原性エピトープと非免疫原性エピトープの両方を含む。複数の腫瘍抑制エピトープを持たず、且つ、多数の非腫瘍抑制エピトープおよび非免疫原性エピトープさえも含むにもかかわらず。
実験１
【０８２９】
Ｌｍ新抗原コンストラクトによって生じる治療応答を決定するため、Ｂ１６Ｆ１０  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス黒色腫モデルにおける腫瘍増殖に対するそのようなコンストラクトの治療効果を調査するように腫瘍退行試験を設計した。具体的には、Ｃａｓｔｌｅらによって特定された１２種類の新抗原（Ｍｕｔ３０、Ｍｕｔ５、Ｍｕｔ１７、Ｍｕｔ２０、Ｍｕｔ２２、Ｍｕｔ２４、Ｍｕｔ２５、Ｍｕｔ４４、Ｍｕｔ４６、Ｍｕｔ４８、およびＭｕｔ５０を含むＬｍ−Ｃａｓｔｌｅ１２）または２０種類の新抗原（Ｍｕｔ３０、Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ３、Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ５、Ｍｕｔ６、Ｍｕｔ７、Ｍｕｔ８、Ｍｕｔ９、Ｍｕｔ１０、Ｍｕｔ１１、Ｍｕｔ１２、Ｍｕｔ１３、Ｍｕｔ１４、Ｍｕｔ１５、Ｍｕｔ１６、Ｍｕｔ１７、Ｍｕｔ１８、Ｍｕｔ１９、およびＭｕｔ２０を含むＬｍ−Ｃａｓｔｌｅ２０）を用いてＬｍ新抗原ベクターを設計した。例えば、全ての目的のために全体が参照により本明細書に援用されるＣａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．    （２０１２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７２（５）：１０８１−１０９１を参照されたい。
【０８３０】
腫瘍細胞株の増殖    １０％ＦＢＳ（５０ｍＬ）および１×グルタマックス（５ｍＬ）を含むｃ−ＲＰＭＩ中でＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞株を培養した。ｃ−ＲＰＭＩ培地は次の成分を含む：
ＲＰＭＩ１６４０  ４５０ｍＬ
ＦＣＳ  ５０ｍＬ
ＨＥＰＥＳ  ５ｍＬ
ＮＥＡＡ  ５ｍｌ
Ｌ−グルタミン  ５ｍＬ
ピルビン酸ナトリウム  ５ｍＬ
ペニシリン／ストレプトマイシン  ５ｍＬ
２−ＭＥ（１４．６Ｍ）  １２９μＬ
【０８３１】
腫瘍接種    ０日目にＢ１６Ｆ１０細胞をトリプシン処理し、培地で二回洗浄した。細胞を計数し、注射用に２００ｕｌのＰＢＳ当たり１×１０５細胞の濃度で再懸濁した。その後、各マウスの右脇腹にＢ１６Ｆ１０細胞を皮下移植した。試験３日目にマウスにワクチン接種を行った。直径が１２ｍｍの大きさに達するまで腫瘍を週に二回測定し、記録した。殺処理基準に腫瘍が合致したところでマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出して測定した。
【０８３２】
免疫療法処置    ３日目に免疫療法および処置が始まった。群をＬｍで処置し（ＩＰ）、追加免疫を二回行った。表１８に詳細が記載されている。
【０８３３】
表１８．治療スケジュール
【表１８】
2018515588.tif 000039
【０８３４】
免疫療法処置の調製    
1.  ＰＢＳのみ  −  ２００ｕＬ／マウスＩＰ
2.  ＬｍｄｄＡ−２７４（タイター：１．５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）
a.  −８０℃の１バイアルを３７℃の水槽内で融かす。
b.  １４，０００ｒｐｍで２分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c.  １ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを捨てる。
d.  ５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの終濃度になるようにＰＢＳ中に再懸濁する。
3.  Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ１２（タイター：１．５９×１０９ＣＦＵ／ｍＬとＬｍ−Ｃａｓｔｌｅ２０（タイター：１．６×１０９ＣＦＵ／ｍＬ)
a.  −８０℃の１バイアルを３７℃の水槽内で融かす。
b.  １４，０００ｒｐｍで２分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c.  １ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを捨てる。
d.  ５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの終濃度になるようにＰＢＳ中に再懸濁する。
【０８３５】
図４６Ｂに示されているように、腫瘍増殖は、対照群（ＰＢＳとＬｍｄｄＡ２７４）と比較すると、Ｌｍ−Ｎｅｏ１２およびＬｍ−Ｎｅｏ２０によって抑制された。ＬｍｄｄＡ２７４はリステリア対照であり、且つ、空ベクターである。それは短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）を含むが、しかしながら付随するネオエピトープは無い。加えて、２０種類の新抗体を含有するＬｍ−Ｎｅｏ２０は、１２種類の新抗体を含有するＬｍ−Ｎｅｏ１２よりも大幅に腫瘍増殖を抑制した。同様にＬｍ−Ｎｅｏ２０およびＬｍ−Ｎｅｏ１２は対照群と比較するとそれぞれ生存時間を増加させ、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０は最も大きな防護効果をもたらす（図４６Ｃ）。これらのデータは、ネオエピトープを担持するＬｍを用いるワクチン接種により抗腫瘍効果を付与することが可能であること、およびネオエピトープ数の増加により抗腫瘍効果が増大することを示している。
実験２
【０８３６】
様々なＬｍ新抗原コンストラクトにより生じる治療応答をさらに比較するため、Ｂ１６Ｆ１０  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス黒色腫モデルにおける腫瘍増殖に対するそのようなコンストラクトの治療効果を調査するように腫瘍退行試験を設計した。具体的には、Ｃａｓｔｌｅらによって特定された１２種類の新抗原（Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ１２）、２０種類の新抗原（Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ２０）、または３９種類の新抗原（Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ３９；リンカー無し、２０〜２９無し（Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ３０））を用いてＬｍ新抗原ベクターを設計した。例えば、全ての目的のために全体が参照により本明細書に援用されるＣａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．    （２０１２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７２（５）：１０８１−１０９１を参照されたい。
【０８３７】
腫瘍細胞株の増殖    １０％ＦＢＳ（５０ｍＬ）および１×グルタマックス（５ｍＬ）を含むｃ−ＲＰＭＩ中でＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞株を培養した。
【０８３８】
腫瘍接種    ０日目にＢ１６Ｆ１０細胞をトリプシン処理し、培地で二回洗浄した。細胞を計数し、注射用に２００ｕｌのＰＢＳ当たり１×１０５細胞の濃度で再懸濁した。その後、各マウスの右脇腹にＢ１６Ｆ１０細胞を皮下移植した。試験４日目にマウスにワクチン接種を行った。体積が１５００ｍｍ３の大きさに達するまで腫瘍を週に二回測定し、記録した。殺処理基準に腫瘍が合致したところでマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出して測定した。
【０８３９】
免疫療法処置    ４日目に免疫療法および処置が始まった。試験終了まで７日毎に一度動物を処置した。表１９に詳細が記載されるように群をＰＢＳ、ＬｍｄｄＡ２７４、Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ１２、Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ２０、Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ３９リンカー無し２０〜２９無しのいずれかで処置した。
【０８４０】
表１９．      治療スケジュール
【表１９】
2018515588.tif 000040
【０８４１】
免疫療法処置の調製    
1.  ＰＢＳのみ  −  ２００ｕＬ／マウスＩＰ
2.  ＬｍｄｄＡ−２７４（タイター：１．７×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）
a.  −８０℃の１バイアルを３７℃の水槽内で融かす。
b.  １４，０００ｒｐｍで２分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c.  １ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを捨てる。
d.  ５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの終濃度になるようにＰＢＳ中に再懸濁する。
3.  Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ１２（タイター：１．５９×１０９ＣＦＵ／ｍＬとＬｍ−Ｃａｓｔｌｅ２０（タイター：１．６×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）とＬｍ−Ｃａｓｔｌｅ３９（タイター：１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ)
a.  −８０℃の１バイアルを３７℃の水槽内で融かす。
b.  １４，０００ｒｐｍで２分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c.  １ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを捨てる。
d.  ５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの終濃度になるようにＰＢＳ中に再懸濁する。
【０８４２】
採取の詳細.  ５ｍｌのｃ−ＲＰＭＩ培地を含む個々のチューブに各マウスの脾臓を収集した。以下に詳述したステップを記載する。試験終了時に全ての腫瘍を摘出し、測定した。
1.  滅菌したピンセットとハサミを使用して脾臓を採取する。
2.  ２枚のスライドグラスまたは３ｍＬの注射筒のピストン棒の後端を使用して洗浄培地（ＲＰＭＩのみ）中で各脾臓をすりつぶす。
3.  その培地中の細胞を１５ｍＬのチューブに移す。
4.  細胞を室温で５分間にわたって１，０００ｒｐｍで沈殿させる。
5.  上清を捨て、残っている洗浄緩衝液中に細胞を穏やかに再懸濁し、そして脾臓当たり２ｍＬのＲＢＣ溶解緩衝液をその細胞ペレットに添加する。そのチューブを叩くことにより溶解緩衝液で細胞を穏やかに混合し、そして１分間待機する。
6.  直ちに１０ｍｌのｃ−ＲＰＭＩ培地をその細胞懸濁液に添加して溶解緩衝液を不活化する。
7.  細胞を室温で５分間にわたって１，０００で遠心分離する。
8.  それらの細胞をセルストレーナーに通し、１０ｍＬのｃ−ＲＰＭＩでもう１回それらの細胞を洗浄する。
9.  血球計算盤／Ｍｏｘｉ  Ｆｌｏｗを使用して細胞を計数し、トリパンブルー染色により生存度をチェックする。脾臓はそれぞれ約１〜２×１０８細胞を産するはずである。
10.  染色用にそれらの細胞を分ける。
11.  染色緩衝液の代わりに細胞表面抗体（ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ）を２．４Ｇ２中に添加することを例外として、イムデックス社のデキストラマー染色プロトコルに従う（ｗｗｗ．ｉｍｍｕｄｅｘ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ／１２１３５／ｔｆ１００３．０３＿ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｔａｉｎｉｎｇ＿ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ＿ｍｈｃ＿ｄｅｘｔｒａｍｅｒ．ｐｄｆ）。
【０８４３】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答    抗原提示細胞におけるＬｍ−Ｎｅｏ２０コンストラクトの発現と分泌を測定するために上で説明されたように２５Ｄアッセイを行った。図４７Ａは陽性対照（ＰＳＡ−サバイビン−ＳＩＩＮＦＥＫＬ）であり、図４７Ｂは陰性対照（ＳＩＩＮＦＥＫＬを含まないＰＳＡ−サバイビン）であり、そして図４７ＣはＬｍ−Ｎｅｏ２０（Ｃ末端にＳＩＩＮＦＥＫＬタグを有する）である。図４７に示されているように、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０が発現し、分泌されるが、陽性対照と比較すると低レベルでしかない。ところが、これらの低い分泌レベルにもかかわらず、ＳＩＩＮＦＥＫＬに対する特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が観察された。図４８は「低分泌」Ｌｍ−Ｎｅｏ２０コンストラクトに対するＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。図４８に示されているように、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の約２０％がＬｍ  Ｎｅｏ２０コンストラクト内の抗原に対して特異的である。
【０８４４】
抗腫瘍効果  図４９Ａに示されているように、腫瘍増殖は、対照群（ＰＢＳとＬｍｄｄＡ２７４）と比較すると、Ｌｍ−Ｎｅｏ１２、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０、およびＬｍ−Ｎｅｏ３０によって抑制された。加えて、３０種類の新抗原を含むＬｍ−Ｎｅｏ３０は、２０種類の新抗原を含むＬｍ−Ｎｅｏ２０よりも大幅に腫瘍増殖を抑制し、それは１２種類の新抗原を含むＬｍ−Ｎｅｏ１２よりも大幅に腫瘍増殖を抑制した。同様に、Ｌｍ−Ｎｅｏ３０、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０、およびＬｍ−Ｎｅｏ１２は対照群と比較するとそれぞれ生存時間を増加させ、Ｌｍ−Ｎｅｏ３０は最も大きな防護効果をもたらし、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０は次に最も大きな防護効果をもたらす（図４６Ｃ）。これらのデータは、ネオエピトープを担持するＬｍを用いるワクチン接種により抗腫瘍効果を付与することが可能であること、およびネオエピトープ数の増加により抗腫瘍効果が増大することを示している。
実施例３３：Ｌｍ新抗原コンストラクトで免疫されたマウスにおけるネオエピトープ特異的免疫質
【０８４５】
ｒ  Ｍ２、１−２０、８１−１００、１０１−１２０、１２１−１４０、Ｌｍ２７１２＃１、およびＬｍ２７１２＃３ネオエピトープコンストラクトを用いる免疫後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるネオエピトープおよびシグナルペプチド特異的応答を評価するために実験を設計した。公知のＴ細胞Ｈ−２Ｄｂ  ＰＳＡ６５〜７３（ＨＣＩＲＮＫＳＶＩ）、ＶｖＢ８Ｒ（ＴＳＹＫＦＥＳＶ）、ＩＡＶ  ＰＡ（ＳＳＬＥＮＦＲＡＹＶ）を用いる五量体染色、ならびにＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色により評価されるネオエピトープペプチド特異的応答によってネオエピトープおよびシグナルペプチド特異的免疫応答を検出する。免疫スケジュールおよび株の詳細が表２０に提示されている。
【０８４６】
表２０．  免疫スケジュール
【表２０】
2018515588.tif 000041
【０８４７】
これらのコンストラクトの各々は、肺コンストラクト実験の全てにおいて使用された同一の２７１２肺試料に由来する突然変異を標的とする。ｒＭ２は、２００非同義突然変異プールに由来する２０種類の２１ｍｅｒの無作為順序である。１−２０はその順序で最初の２０非同義突然変異を含む。同じことが８１−１００、１０１−１２０、および１２１−１４０に付いて当てはまる。２７１２＃１は５０種類の２１ｍｅｒ（１〜５０）を含む。２７１２＃３は５０種類の２１ｍｅｒ（１０１〜１５０）を含む。
【０８４８】
免疫療法の調製.  
1.  −８０℃の１バイアルを３７℃の水槽内で融かす。
2.  １４，０００ｒｐｍで２分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
3.  １ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを捨てる。
4.  適切な終濃度までＰＢＳ中に再懸濁する。
【０８４９】
単離された脾細胞の調製
1.  滅菌したピンセットとハサミを使用して脾臓を採取する。
2.  ２枚のスライドグラスまたは３ｍＬの注射筒のピストン棒の後端を使用して洗浄培地（ＲＰＭＩのみ）中で各脾臓をすりつぶす。
3.  その培地中の細胞を１５ｍＬのチューブに移す。
4.  細胞を室温で５分間にわたって１，０００ｒｐｍで沈殿させる。
5.  上清を捨て、残っている洗浄緩衝液中に細胞を穏やかに再懸濁し、そして脾臓当たり２ｍＬのＲＢＣ溶解緩衝液をその細胞ペレットに添加する。そのチューブを叩くことにより溶解緩衝液で細胞を穏やかに混合し、そして１分間待機する。
6.  直ちに１０ｍｌのｃ−ＲＰＭＩ培地をその細胞懸濁液に添加して溶解緩衝液を不活化する。
7.  細胞を室温で５分間にわたって１，０００で遠心分離する。
8.  それらの細胞をセルストレーナーに通し、１０ｍＬのｃ−ＲＰＭＩでもう１回それらの細胞を洗浄する。
9.  血球計算盤／Ｍｏｘｉ  Ｆｌｏｗを使用して細胞を計数し、トリパンブルー染色により生存度をチェックする。脾臓はそれぞれ約１〜２×１０８細胞を産するはずである。
10.  五量体染色とＥＬＩＳｐｏｔ用にそれらの細胞を分ける。
ＩＦＮγ向けのＥＬＩＳｐｏｔ
【０８５０】
１日目  チューブの調製：ＰＭＡ（完全培地中に１：１０００に希釈）    下で述べられるように細胞を調製した（各マウスについて５×１０６／ｍｌ）  。
1)  完全培地（ＢＭＥを含む）を調製する          １００ｍＬ
2)  第１群／第１マウス細胞（５×１０６／ｍＬのＢＭＥ含有完全培地）    ２ｍＬ
3)  第２群／第１マウス細胞（５×１０６／ｍＬのＢＭＥ含有完全培地）    ２ｍＬ
4)  第３群／第１マウス細胞（５×１０６／ｍＬのＢＭＥ含有完全培地）    ２ｍＬ
5)  第１群／第１マウス細胞（５×１０４／ｍＬのＢＭＥ含有完全培地）    ２ｍＬ
6)  第２群／第１マウス細胞（５×１０４／ｍＬのＢＭＥ含有完全培地）    ２ｍＬ
7)  第３群／第１マウス細胞（５×１０４／ｍＬのＢＭＥ含有完全培地）    ２ｍＬ
8)  エピトープ無し（チューブ１の培地）            ３ｍＬ
9)  Ｅ７ペプチド（チューブ１の培地ｍＬ当たり１ｍＭのペプチドの２ｕｌを添加する）‐  １６ｍＬ
10)  ＰＭＡ（チューブ１の培地ｍＬ当たり１ｕｇ／ｍＬのストックの１０ｕｌを添加する）＋イオノマイシン（チューブ１の培地ｍＬ当たり１ｍｇ／ｍＬのストックの１μＬを添加する）        ５ｍＬ
【０８５１】
ペプチドを用いる刺激：
a)  無菌ＰＢＳ（２００ｕＬ／ウェル）でプレートを４回洗浄する。
b)  ２００ｕＬ／ウェルの完全培地を添加する。室温で少なくとも３０分間にわたってインキュベートする。
c)  培地を除去し、表において計画されているように細胞懸濁液（１００ｕＬ／ウェル）と刺激因子（１００ｕＬ／ウェル）を添加する。
d)  アルミホイルでプレートを包み、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間にわたってインキュベートする。
【０８５２】
２日目    スポットの検出
a)  プレートを空にして細胞に対して除去処理を施し、ＰＢＳ（２００ｕＬ／ウェル）で５回洗浄する。
b)  １００ｕＬ／ウェルの希釈Ｒ４−６Ａ２−ビオチンを添加し、室温で２時間にわたってインキュベートする。
c)  ＰＢＳ（２００ｕＬ／ウェル）で５回洗浄する。
d)  １００ｕＬ／ウェルの希釈ストレプトアビジン−ＡＬＰを添加し、室温で１時間にわたってインキュベートする。
e)  ＰＢＳ（２００ｕＬ／ウェル）で５回洗浄する。
f)  フィルター（０．４５μｍフィルター）濾過したすぐに使用可能な１００ｕＬ／ウェルの基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を添加し、明確なスポットが現れるまで現像する。
g)  水道水中で徹底的に洗浄することによりカラー現像を停止する。
h)  プレートを放置して乾燥させ、次の日にスポットを数える。
【表２４】
2018515588.tif 000042
【０８５３】
結果    
【０８５４】
表２１は、２５Ｄアッセイを介して２１ｍｅｒの分泌を検出できたのか詳細に示している。
【０８５５】
表２１  肺免疫原性のまとめ
【表２１】
2018515588.tif 000043
【０８５６】
図５１は様々なコンストラクトで免疫されたマウスにおけるＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答をまとめている。２７１２＃１  ５０−２１−ｍｅｒコンストラクトを除く全てのコンストラクトにおいてＳＩＩＮＦＥＫＬに対する免疫応答が検出された（例えば、ネオエピトープ２１ｍｅｒアミノ酸鎖の代用タグが宿主に分泌し、その宿主はその２１ｍｅｒアミノ酸鎖に対する免疫応答を生成する）。
【０８５７】
重要なことに、２５Ｄアッセイを介して陽性選別体としてスクリーニングされなかった３種類のコンストラクト（ｒＭ２、１−２０、および２７１２＃３）は実際にはインビボ免疫応答を生成した（その応答は、２５Ｄによって陽性とスクリーニングされるコンストラクトよりもかなり小さいが）。さらに、最大で５０種類の２１ｍｅｒを含むコンストラクトに対する免疫応答を生成することができた。
【０８５８】
実施例３４：２７ｍｅｒの試験
【０８５９】
２７アミノ酸から構成されるネオエピトープコンストラクト、すなわち「２７ｍｅｒ」を使用して上記のように２５Ｄアッセイを実施した。結果が下の表２２に示されており、それらの結果はそれらのコンストラクトが２１ｍｅｒ以外のオリゴマーから構成され得ることを示している。
【０８６０】
表２２：２５Ｄ−ＡＰＣの検出（２７ｍｅｒを使用するアッセイ）
【表２２】
2018515588.tif 000044
【０８６１】
上または下で引用されている全ての特許提出物、ウェッブサイト、他の刊行物、受託番号などは、それぞれ個々のものが参照により援用されると具体的および個別に示された場合と同じ程度で全ての目的のために全体が参照により援用される。異なるバージョンの配列がある受託番号と異なる時点で関連する場合、本出願の有効な提出日におけるその受託番号と関連するバージョンとする。有効な提出日は、実際の提出日、または該当する場合はその受託番号について言及している優先出願の提出日のうちの早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェッブサイトなどが異なる時点で公開されている場合、別段の指示が無い限り、本出願の有効提出日の時点で最も細菌に公開されたバージョンとする。本発明のあらゆる特徴、工程、要素、実施形態、または態様は、別途具体的な指示が無い限り、他のあらゆるものと併用され得る。本発明のある特定の特徴が本明細書に例示され記述されてきたが、この時点で当業者には数多くの改変、置換、変更、および均等物が思い浮かぶだろう。したがって、本発明の真の趣旨内に含まれるかかるすべての改変および変更が添付の特許請求の範囲により網羅されるものされることを理解すべきである。
（項目１）
疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
（ａ）  前記対象の疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
（ｂ）  ステップ（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、および
（ｃ）  二者択一的に、（ｉ）所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリア株を保存するか、あるいは（ｉｉ）前記弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与によって前記疾患または症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップを含む前記方法。
（項目２）
をさらに含む項目１に記載の方法。
（ｄ）  ステップ（ｃ）の前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析すること、
（ｅ）  ステップ（ｄ）において特定された前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択すること、
（ｆ）  前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を含むベクターで第２弱毒化組換え型リステリア株を形質転換すること、および
（ｇ）  二者択一的に、（ｉ）所定の時点で前記対象に投与するために第２弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは（ｉｉ）前記第２弱毒化組換え型リステリア株を含む第２組成物を前記対象に投与すること
（項目３）
前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドのそれぞれが約５〜５０アミノ酸長である、項目１〜２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドのそれぞれが約８〜２７アミノ酸長である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記１つ以上のネオエピトープが５〜１００個のネオエピトープを含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記１つ以上のネオエピトープが１５〜３５個のネオエピトープ、８〜１１個のネオエピトープまたは１１〜１６個のネオエピトープを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記１つ以上のネオエピトープが複数のネオエピトープを含み、ステップ（ｂ）の前記核酸配列内の前記複数のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドの順序のランダム化を１回以上繰り返すことがステップ（ｂ）に含まれる、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
それぞれが異なるセットの１つ以上のネオエピトープを含む複数の弱毒化組換え型リステリア株を作成するために前記方法が繰り返される、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株が５〜１０株、１０〜１５株、１５〜２０株、１０〜２０株、２０〜３０株、３０〜４０株、または４０〜５０株の弱毒化組換え型リステリア株を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株の混合物が約５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、または１００〜２００個のネオエピトープを含む、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ａ）における前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記１つ以上のＯＲＦを前記健常生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記１つ以上のＯＲＦと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記ＯＲＦ中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
ステップ（ｄ）において前記対象より第２生体試料を獲得する工程が、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む前記組成物の投与の後に増殖するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む生体試料の獲得を含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記疾患担持生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ｄ）の前記特徴分析過程が  
（ｉ）  前記疾患に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および
（ｉｉ）  前記Ｔ細胞上のＴ細胞受容体が結合する特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
ステップ（ｉｉ）の前記スクリーニングおよび特定がＴ細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記疾患または症状が感染症、腫瘍、または癌である、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列と前記健常生体試料より抽出された前記核酸配列がエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記１つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記１つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記弱毒化組換え型リステリアが前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを分泌する、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記１つ以上のネオエピトープがＴ細胞エピトープを含む、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
プラスミドベクターまたはファージベクターを使用してステップ（ｂ）の前記形質転換が行われる、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
ミニ遺伝子核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターを使用してステップ（ｂ）の前記形質転換が行われ、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含み、前記キメラタンパク質が
（ａ）  細菌分泌シグナル配列、
（ｂ）  ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、および
（ｃ）  前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを含み、
前記細菌分泌シグナル配列、前記ユビキチンタンパク質、および前記１つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
ステップ（ｂ）が、前記１つ以上のペプチドの発現および分泌を確認するために前記弱毒化組換え型リステリア株を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記プラスミドが組込み型プラスミドである、あらゆる前記の項目２５に記載の方法。
（項目３０）
前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、項目２６に記載の方法。
（項目３３）
前記ｔＬＬＯタンパク質が配列番号３で表される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ａｃｔＡが配列番号１２〜１３および配列番号１５〜１８で表される、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記ＰＥＳＴアミノ酸配列が配列番号５〜１０で表される配列から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記変異型ＬＬＯがコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
前記突然変異が配列番号２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、またはＷ４９２の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドによる置換を含み、前記非ＬＬＯペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の欠失を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記１つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原を含む、項目１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記１つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、項目１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、キメラＨｅｒ２抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、二価ＰＳＡ、ＥＲＧ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＰＡＫ６、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原Ｅ（ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、インターロイキン１３受容体α（ＩＬ１３−Ｒ  α）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、血管新生抗原、ｒａｓタンパク質、ｐ５３タンパク質、ｐ９７黒色腫抗原、ＫＬＨ抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１抗原、ＴＲＰ−２、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはテスティシンを含む、項目１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、項目１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記１つ以上のネオエピトープが感染症関連エピトープを含む、項目１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記感染症が感染性ウイルス病である、項目１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記感染症が感染性細菌病である、項目１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記感染症が以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記弱毒化リステリアが１つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、項目１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記突然変異がａｃｔＡ遺伝子突然変異、ｐｒｆＡ突然変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重突然変異、ｄａｌ／ｄａｌ遺伝子二重突然変異、ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、項目１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記突然変異が前記１つ以上の内在性遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、項目１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記ベクターが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームをさらに備える、項目１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、項目１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む、項目１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記アジュバントが顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピッドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む、項目１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
ステップ（ｃ）（ｉｉ）の前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、項目１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記免疫応答が抗感染症応答を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記感染症がウイルス感染症を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記感染症が細菌感染症を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６５）
前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、項目１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が前記個別免疫療法により増加する、項目１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
項目１〜６６のいずれか一項に記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
（項目６８）
疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
（ａ）  疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前記疾患担持試料の１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
（ｂ）  ステップ（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、またはステップ（ａ）において特定された前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してＤＮＡ免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製するステップ、および
（ｃ）  二者択一的に、（ｉ）所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記ＤＮＡ免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは（ｉｉ）前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与によって前記疾患または症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせるステップを含む前記方法。
（項目６９）
をさらに含む項目６８に記載の方法。
（ｄ）  ステップ（ｃ）の前記Ｔ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前記対象の第２生体試料を獲得し、前記Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析すること、
（ｅ）  ステップ（ｄ）において特定された前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択すること、
（ｆ）  ステップ（ｄ）において特定された前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする前記１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第２ベクターを形質転換するか、または前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用して第２ＤＮＡ免疫療法ベクターまたは第２ペプチド免疫療法ベクターを作製するステップ、および
（ｇ）  二者択一的に、（ｉ）所定の時点で前記対象に投与するために前記第２ベクターまたは前記第２ＤＮＡ免疫療法または前記第２ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記第２ベクター、前記第２ＤＮＡ免疫療法、または前記第２ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップ  
（項目７０）
前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドのそれぞれが約５〜５０アミノ酸長である、項目６８または６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドのそれぞれが約８〜２７アミノ酸長である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記１つ以上のネオエピトープが５〜１００個のネオエピトープを含む、項目６８または６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記１つ以上のネオエピトープが１５〜３５個のネオエピトープ、８〜１１個のネオエピトープまたは１１〜１６個のネオエピトープを含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記１つ以上のネオエピトープが複数のネオエピトープを含み、ステップ（ｂ）の前記核酸配列内の前記複数のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドの順序のランダム化を１回以上繰り返すことがステップ（ｂ）に含まれる、項目６８〜７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
それぞれ異なるセットの１つ以上のネオエピトープを含む複数のベクター、ＤＮＡ免疫療法、またはペプチド免疫療法を作製するために前記方法が繰り返される、項目６８〜７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記複数のベクター、ＤＮＡ免疫療法、またはペプチド免疫療法が５〜１０株、１０〜１５株、１５〜２０株、１０〜２０株、２０〜３０株、３０〜４０株、または４０〜５０株の弱毒化組換え型リステリア株を含む、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記複数のベクター、ＤＮＡ免疫療法、またはペプチド免疫療法の混合物が約５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、または１００〜２００個のネオエピトープを含む、項目７５または７６に記載の方法。
（項目７８）
ステップ（ａ）における前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記１つ以上のＯＲＦを前記健常生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記１つ以上のＯＲＦと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記ＯＲＦ中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
ステップ（ｄ）における前記対象より第２生体試料を獲得する工程が、前記ベクター、前記ＤＮＡ免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む前記組成物の投与の後に増殖するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む第２生体試料の獲得を含む、項目６９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記疾患担持生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、項目６８〜７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
ステップ（ｄ）の前記特徴分析過程が  
（ｉ）  前記疾患に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および
（ｉｉ）  前記Ｔ細胞上のＴ細胞受容体が結合する特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、項目６９〜８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
ステップ（ｉｉ）の前記スクリーニングおよび特定がＴ細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記疾患または症状が感染症、腫瘍、または癌である、項目６８〜８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、項目６８〜８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列と前記健常生体試料より抽出された前記核酸配列がエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、項目６８〜８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記１つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、項目６８〜８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記１つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、項目６８〜８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記１つ以上のネオエピトープがＴ細胞エピトープを含む、項目６８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記ベクターがワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子である、項目６８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
ステップ（ｂ）が、前記１つ以上のペプチドの発現を確認するために前記ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記ＤＮＡ免疫療法が前記１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを含む前記核酸配列を含む、項目６８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記核酸配列がプラスミドの形態である、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記プラスミドが組込み型プラスミドまたは染色体外マルチコピープラスミドである、項目６８〜９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、項目６８〜９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記ペプチド免疫療法が前記１つ以上のネオエピトープを含む前記１つ以上のペプチドを含み、各ペプチドが免疫原性ポリペプチドまたはその断片と融合しているか、または混合されている、項目６８〜９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、項目９７〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記ｔＬＬＯタンパク質が配列番号３で表される、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記ａｃｔＡが配列番号１２〜１３および配列番号１５〜１８で表される、項目９９に記載の方法。
（項目１０２）
前記ＰＥＳＴアミノ酸配列が配列番号５〜１０で表される配列から選択される、項目９９に記載の方法。
（項目１０３）
前記変異型ＬＬＯがコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０４）
前記突然変異が配列番号２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、またはＷ４９２の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドによる置換を含み、前記非ＬＬＯペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０６）
前記突然変異が配列番号６８で表されるＣＢＤ内の１〜１１アミノ酸の欠失を含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０７）
前記１つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原を含む、項目６８〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記１つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、項目６８〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、キメラＨｅｒ２抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、二価ＰＳＡ、ＥＲＧ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＰＡＫ６、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原Ｅ（ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、インターロイキン１３受容体α（ＩＬ１３−Ｒ  α）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、血管新生抗原、ｒａｓタンパク質、ｐ５３タンパク質、ｐ９７黒色腫抗原、ＫＬＨ抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１抗原、ＴＲＰ−２、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはテスティシンを含む、項目１０８〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Ｈｅｒ２発現性癌またはＨｅｒ２発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、項目８４に記載の方法。
（項目１１２）
前記１つ以上のネオエピトープが感染症関連エピトープを含む、項目６８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記感染症が感染性ウイルス病または感染性細菌病である、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
前記感染症が以下の病原体のうちの１つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ（Ｑ熱）、ブルセラ属の種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、リシン毒素（トウゴマ由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む、項目６８〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記アジュバントが顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピッドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む、項目６８〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記免疫チェックポイント阻害薬が抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片である、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
ステップ（ｃ）（ｉｉ）の前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、項目６８〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記免疫応答が抗感染症応答を含む、項目１１９に記載の方法。
（項目１２２）
前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、項目６８〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
項目６８〜１２３のいずれか一項に記載の方法により作製された１つ以上の弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物の免疫原性混合物。
（項目１２５）
各弱毒化組換え型リステリア株が疾患または症状を有する対象の疾患担持生体試料に存在する１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を含んでいる１つ以上の弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物の免疫原性混合物。
（項目１２６）
前記１つ以上の弱毒化組換え型リステリア株が複数の弱毒化組換え型リステリア株を含み、各弱毒化組換え型リステリア株の前記核酸配列が異なるセットの１つ以上のネオエピトープをコードする、項目１２５に記載の免疫原性混合物。
（項目１２７）
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株が５〜１０株、１０〜１５株、１５〜２０株、１０〜２０株、２０〜３０株、３０〜４０株、または４０〜５０株の弱毒化組換え型リステリア株を含む、項目１２５〜１２６のいずれか一項に記載の免疫原性混合物。
（項目１２８）
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株の混合物が約５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、または１００〜２００個のネオエピトープを含む、項目１２５〜１２７のいずれか一項に記載の免疫原性混合物。
（項目１２９）
前記混合物中の前記弱毒化組換え型リステリア株の各々が１つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む、項目１２８に記載の免疫原性混合物。
（項目１３０）
前記混合物中の前記組換え型リステリア株の各々が１〜２０個のネオエピトープを発現する、項目１２９に記載の組成物の免疫原性混合物。
（項目１３１）
対象において個別化抗腫瘍応答を誘発する方法であって、項目１２８〜１３１のいずれか一項に記載の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法。
（項目１３２）
対象において腫瘍を予防または治療する方法であって、項目１２５〜１３０のいずれか一項に記載の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与することを含む前記方法。
（項目１３２）
次の要素、すなわち、免疫原性ポリペプチドが融合している第１ネオエピトープアミノ酸配列、第１リンカー配列を介して機能的であるように前記第１ネオエピトープアミノ酸配列が連結している第２ネオエピトープアミノ酸配列、および第２リンカー配列を介して機能的であるように前記第２ネオエピトープアミノ酸配列が連結している少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクト。
（項目１３３）
次の要素、すなわち、Ｎ末端短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）が融合している第１ネオエピトープアミノ酸配列、第１リンカー配列を介して機能的であるように前記第１ネオエピトープアミノ酸配列が連結している第２ネオエピトープアミノ酸配列、第２リンカー配列を介して機能的であるように前記第２ネオエピトープアミノ酸配列が連結している少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列、および第３リンカー配列を介して機能的であるようにＣ末端ヒスチジンタグに連結している最後のネオエピトープを含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクト。
（項目１３４）
前記第１ネオエピトープアミノ酸配列、前記第２ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ約５〜５０アミノ酸である、項目１３３に記載の核酸コンストラクト。
（項目１３５）
前記第１ネオエピトープアミノ酸配列、前記第２ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ約８〜２７アミノ酸、８〜１１アミノ酸、または１１〜１６アミノ酸である、項目１３４に記載の核酸コンストラクト。
（項目１３６）
前記第１ネオエピトープアミノ酸配列、前記第２ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ２１アミノ酸を含む、項目１３５に記載の核酸コンストラクト。
（項目１３７）
前記核酸コンストラクトが５〜１００個のネオエピトープをコードする、項目１３２〜１３６のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
（項目１３８）
前記核酸コンストラクトが１５〜３５個のネオエピトープをコードする、項目１３７に記載の核酸コンストラクト。
（項目１３９）
前記要素がＮ末端からＣ末端へと配置されているか、または機能的であるように連結されている、項目１３２〜１３８のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
（項目１４０）
前記ｔＬＬＯが機能的であるようにプロモーター配列に連結されている、項目１３７〜１３９のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
（項目１４１）
前記プロモーター配列がｈｌｙプロモーター配列である、項目１４０に記載の核酸コンストラクト。
（項目１４２）
前記核酸コンストラクトが前記ヒスチジンタグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む、項目１３２〜１４１のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
（項目１４３）
前記ヒスチジンタグが、機能的であるようにＮ末端でＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに連結されている６×ヒスチジンタグである、項目１３２〜１４２のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
（項目１４４）
前記第１リンカー配列、前記第２リンカー配列、および前記第３リンカー配列のうちの１つ以上が４×グリシンリンカーである、項目１３２〜１４３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
（項目１４５）
前記コンストラクトが次の構成成分、すなわち、ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−第一２１ｍｅｒ−４×グリシンリンカーＧ１−第二２１ｍｅｒ−４×グリシンリンカーＧ２−…−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む、項目１３２〜１４４のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
（項目１４６）
項目１３２〜１４５のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトによってコードされるキメラタンパク質。
（項目１４７）
項目１３２〜１４５のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、または項目１４６に記載のキメラタンパク質を発現する組換え型リステリア株。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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