(57)【要約】新規のＴＤＰ−４３の病理学的形態、当該ＴＤＰ−４３の病理学的形態に対するモノクローナル抗体、及びその使用が本明細書に開示される。この新規のＴＤＰ−４３の病理学的形態は、直径約２〜４００ｎｍの球状粒子サイズを有することを特徴とする。本開示の第２の態様は、ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の予防又は処置のための医薬品又は医薬組成物を製造するための抗体の使用を提供することである。【選択図】図１１
2018503596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス活性化応答（ＴＡＲ）−ＤＮＡ−結合タンパク質４３ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）に特異的に結合する、抗体又はそのフラグメントであって、
配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号：５、配列番号：６及び配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】
前記重鎖可変領域が、配列番号：４のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号：８のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＴＤＰ−４３オリゴマーが、直径約２〜４００ｎｍの球状粒子サイズを有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記ＴＤＰ−４３オリゴマーが、直径約４０〜６０ｎｍの粒子サイズを有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の予防又は処置のための医薬組成物であって、有効量の請求項１に記載の抗体；及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項６】
前記ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患が、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムのＡＬＳ−パーキンソン痴呆症候群、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、封入体ミオパシー、封入体筋炎、海馬硬化症、又はパーキンソン病である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記重鎖可変領域が、配列番号：４のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号：８のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
被験体の生体試料からＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患を診断する方法であって、
前記生体試料を有効量の請求項１に記載の抗体と接触させることにより、前記生体試料中のＴＤＰ−４３オリゴマーの量を決定するステップ；及び
前記生体試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量を、健康な被験体から得られたコントロール試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量と比較するステップ；を含み、
前記生体試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量が、前記コントロール試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量よりも顕著に高い又は低いことが、前記被験体が前記ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患を患っていることを示す、方法。
【請求項９】
前記ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患が、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムのＡＬＳ−パーキンソン痴呆症候群、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、封入体ミオパシー、封入体筋炎、海馬硬化症、又はパーキンソン病である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料が、脳生検試料、脳脊髄液試料、全血試料、血清試料、血漿試料、尿試料、又は粘液試料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域が、配列番号：４のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号：８のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
１．本発明の分野
【０００２】
本開示は、トランス活性化応答（ＴＡＲ）−ＤＮＡ−結合タンパク質４３ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）の新規の病理学的形態、当該ＴＤＰ−４３の病理学的形態に対する抗体、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
【０００４】
神経変性疾患は、現代社会において重要な健康問題になってきている。ＷＨＯの報告によると、２０２５年には、世界の高齢者人口の７５％を超える人々が、いくつかの種類の神経変性疾患を患うだろうとされている。前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）は、米国の６５歳未満の人々において、認知症の２番目に一般的な形態であり、４３ｋＤａのトランス活性化応答（ＴＡＲ）−ＤＮＡ−結合タンパク質（ＴＤＰ−４３）が、散発性及び家族性ＦＴＬＤ症例の大部分、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）における主要な疾患タンパク質であることが同定された。加えて、ＴＤＰ−４３は、アルツハイマー病患者の最大５７％に存在していた。現在、これらの疾患の治癒法又は処置法は存在せず、ＴＤＰ−４３の病理学的形態の形成を調節し得る分子を同定するために、顕著な努力がなされてきた。
【０００５】
上記を考慮すると、関連技術において、ＴＤＰ−４３の病理学的形態を調節し得る分子を同定する必要があり、そのような分子は、ＴＤＰ−４３の病理学的形態の形成に起因する神経変性疾患の予防又は処置のための医薬品の製造のための潜在的な薬物候補となるだろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、トランス活性化応答（ＴＡＲ）−ＤＮＡ−結合タンパク質４３ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）オリゴマーが、アルツハイマーアミロイド−β（Ａβ）をクロスシーディングして、アミロイドオリゴマーを形成する能力を有し、インビトロ及びインビボで神経毒性であるという所見に基づく。したがって、当該ＴＤＰ−４３オリゴマーに結合する能力を有する分子（例えば、抗体）は、ＴＤＰ−４３タンパク質症を抑制する可能性があり、それ故に、ＴＤＰ−４３の病理学的形態の沈着に起因する神経変性疾患の診断、防止又は処置に適切な医薬品（すなわち、ワクチン及び受動免疫）の製造に有用である。
【０００７】
したがって、本開示は、ＴＤＰ−４３オリゴマーに特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを提供することを目的とする。この抗体は、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号：５、配列番号：６及び配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０００８】
ＴＤＰ−４３は、直径約２〜４００ｎｍの粒子サイズを特徴とする。好ましくは、ＴＤＰ−４３オリゴマーは、直径約４０〜６０ｎｍの球状粒子サイズを有する。
【０００９】
いくつかの好ましい実施形態によれば、本抗体の重鎖可変領域は、配列番号：４のアミノ酸配列を有し、本抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：８のアミノ酸配列を有する。
【００１０】
一つの例において、本抗体は、受託番号ＢＣＲＣ９６０４９４として、台湾（ＨｓｉｎＣｈｕ、Ｔａｉｗａｎ、Ｒ．Ｏ．Ｃ．）にある食品工業開発研究機関（ＦＩＤＲＩ）の生物資源収集センター（ＢＣＲＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞系統によって産生される。
【００１１】
別の例において、本抗体は、受託番号ＢＣＲＣ９６０４９５としてＢＣＲＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系統によって産生される。
【００１２】
さらに別の例において、本抗体は、受託番号ＢＣＲＣ９６０４９６としてＢＣＲＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系統によって産生される。
【００１３】
さらなる例において、本抗体は、受託番号ＢＣＲＣ９６０４９７としてＢＣＲＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系統によって産生される。
【００１４】
またさらなる例において、本抗体は、受託番号ＢＣＲＣ９６０４９８としてＢＣＲＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系統によって産生される。
【００１５】
したがって、本開示の第２の態様は、ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の予防又は処置のための医薬品又は医薬組成物を製造するための上述の抗体の使用を提供することである。この医薬品又は医薬組成物は、有効量の上述の抗体；及び治療的に許容される添加剤を含む。
【００１６】
本開示の好ましい実施形態によれば、本抗体は、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号：５、配列番号：６及び配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。１つの特定の例において、重鎖可変領域は、配列番号：４のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号：８のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
他の好ましい実施形態によれば、抗体は、受託番号ＢＣＲＣ９６０４９４、ＢＣＲＣ９６０４９５、ＢＣＲＣ９６０４９６、ＢＣＲＣ９６０４９７、又はＢＣＲＣ９６０４９８としてＢＣＲＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系統のいずれかによって産生されてよい。
【００１８】
本発明の抗体は、医薬組成物の全質量に基づき約０．１％〜９９質量％のレベルで存在する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、医薬組成物の全質量に基づき少なくとも１質量％のレベルで存在する。ある実施形態において、本発明の抗体は、医薬組成物の全質量に基づき少なくとも５質量％のレベルで存在する。さらに他の実施形態において、本発明の抗体は、医薬組成物の全質量に基づき少なくとも１０質量％のレベルで存在する。またさらに他の実施形態において、本発明の抗体は、医薬組成物の全質量に基づき少なくとも２５質量％のレベルで存在する。
【００１９】
本開示の医薬品又は医薬組成物によって処置可能なＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患は、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムのＡＬＳ−パーキンソン痴呆症候群、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、封入体ミオパシー、封入体筋炎、海馬硬化症、又はパーキンソン病のいずれかであってよい。
【００２０】
したがって、本開示の第３の態様は、被験体においてＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の予防又は処置のための方法を提供することである。この方法は、ＴＤＰ−４３タンパク質症を阻害又は抑制するように、治療的に有効量の本発明の抗体を被験体に投与するステップを含む。
【００２１】
いくつかの好ましい実施形態によれば、本抗体は、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号：５、配列番号：６及び配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。１つの特定の例において、重鎖可変領域は、配列番号：４のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号：８のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
他の好ましい実施形態によれば、抗体は、受託番号ＢＣＲＣ９６０４９４、ＢＣＲＣ９６０４９５、ＢＣＲＣ９６０４９６、ＢＣＲＣ９６０４９７、又はＢＣＲＣ９６０４９８としてＢＣＲＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系統によって産生されてよい。
【００２３】
本開示の方法によって処置され得るＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、嗜銀顆粒性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムのＡＬＳ−パーキンソン痴呆症候群、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、封入体ミオパシー、封入体筋炎、海馬硬化症、又はパーキンソン病（ＰＤ）である。
【００２４】
本開示の第４の態様は、被験体においてＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の診断のための方法を提供することである。この方法は、被験体から生体試料を採取するステップ；生体試料を有効量の本発明の抗体と接触させることにより、生体試料中のＴＤＰ−４３オリゴマーの量を決定するステップ；及び生体試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量を、健康な被験体から得られたコントロール試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量と比較するステップ；を含み、ここで、生体試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量が、コントロール試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量よりも顕著に高い又は低いことが、被験体が神経変性疾患を患っていることを示す。
【００２５】
本開示の好ましい実施形態によれば、生体試料は、脳生検試料、脳脊髄液試料、全血試料、血清試料、血漿試料、尿試料、又は粘液試料である。
【００２６】
いくつかの好ましい実施形態によれば、本抗体は、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号：５、配列番号：６及び配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。１つの特定の例において、重鎖可変領域は、配列番号：４のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号：８のアミノ酸配列を有する。
【００２７】
他の好ましい実施形態によれば、抗体は、受託番号ＢＣＲＣ９６０４９４、ＢＣＲＣ９６０４９５、ＢＣＲＣ９６０４９６、ＢＣＲＣ９６０４９７、又はＢＣＲＣ９６０４９８としてＢＣＲＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系統のいずれかによって産生されてよい。
【００２８】
したがって、本開示の第５の態様は、生体試料中のＴＤＰ−４３の病理学的形態の検出のためのキットを提供することである。検出結果は、その生体試料の被験体が、ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患を患っているかどうかを決定するための基準として使用してよい。キットは、少なくとも、容器、及び生体試料中のＴＤＰ−４３オリゴマーを検出するための試薬を含み、ここで、試薬が、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体、及び説明文であって、容器に関連付けられかつ生体試料中のＴＤＰ−４３の病理学的形態（すなわち、本明細書に記載のＴＤＰ−４３オリゴマー）を検出するための本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体の使い方を示す説明文、を含む。説明文は、パンフレット、テープ、ＣＤ、ＶＣＤ又はＤＶＤの形態であってよい。キットは、ＴＤＰ−４３オリゴマーの非存在又は健康な被験体におけるＴＤＰ−４３オリゴマーの正常レベルを示すネガティブコントロールをさらに含んでよい。
【００２９】
本発明の１又は複数の実施形態の詳細が、以下の添付の説明に記載されている。本発明の他の特徴及び利点が、詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本説明は、添付の図面に照らして読まれる以下の詳細な説明から、よりよく理解されるであろう。
【００３１】
図１は、全長ＴＤＰ−４３がアミロイド様オリゴマーを形成することを示す。
【図１Ａ】２８０ｎｍでの吸収によってモニターされたＥ．  ｃｏｌｉから精製された全長ＴＤＰ−４３の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（実線）又はスロットブロット法の強度により定量化されたヒトＨＥＫ２９３細胞から精製された全長ＴＤＰ−４３の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（破線）。分子量標準の保持時間を示している。
【図１Ｂ】抗アミロイドオリゴマー抗体、Ａ１１を用いる、ＴＤＰ−４３のドットブロット法。ＳＥＣ前（プレロードＴＤＰ−４３）及びＳＥＣ後（ボイド容量、ＴＤＰ−４３オリゴマー）の新鮮に精製されたＴＤＰ−４３及びバッファーをＡ１１で免疫染色した。
【図１Ｃ】バッファー、又は９Ｍ  尿素、７．２Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ、若しくは２％  ＳＤＳを含有するバッファー中で、９０℃１時間の加熱を行って又は行わずに、新鮮に精製されたＴＤＰ−４３をドットした。３つのレプリカを作製し、Ａ１１抗体、抗Ｎ−末端ＴＤＰ−４３抗体（残基１−２６０）、及び抗Ｃ−末端ＴＤＰ−４３抗体（残基２５０−４１４）によって別々にプロービングした。
【図１Ｄ】ＴＤＰ−４３オリゴマーのＴＥＭ画像（スケールバー、５００ｎｍ）。単一のオリゴマーのズームイン画像が左上に示されている（スケールバー、５０ｎｍ）。
【図１Ｅ】ＴＤＰ−４３オリゴマーのＡＦＭ画像（スケールバー、５００ｎｍ）。単一のオリゴマーのズームイン画像が左上に示されている（スケールバー、５０ｎｍ）。
【図１Ｆ】ＳＥＣから得られたＴＤＰ−４３のオリゴマー画分のＤＬＳ分析。粒子直径が、散乱光強度及び粒子数に対してプロットされている。
【図１Ｇ】ＳＥＣから得られたＴＤＰ−４３のオリゴマー画分のＤＬＳ分析。粒子直径が、散乱光強度及び粒子数に対してプロットされている。
【００３２】
図２は、ＴＤＰ−４３のコンホメーション、ＴｈＴ蛍光、及びＤＮＡ結合を示す。
【図２Ａ】全長ＴＤＰ−４３（実線）及び短い形態のＴＤＰ−４３（破線）の遠ＵＶ  ＣＤスペクトル。２５０〜１９０ｎｍのスペクトルが示されている。
【図２Ｂ】全長ＴＤＰ−４３（実線）及び短い形態のＴＤＰ−４３（破線）のＢｉｓ−ＡＮＳ蛍光スペクトル。バッファーシグナルが示されている（点線）。
【図２Ｃ】Ａβ線維と比較した、ＴＤＰ−４３のＴｈＴ結合。全長ＴＤＰ−４３（■、実線）、短い形態のＴＤＰ−４３（●、破線）、及びＡβ線維（▲、点線）のＴｈＴ蛍光発光スペクトル。Ａβ線維のみがＴｈＴ結合シグナルを示した。
【図２Ｄ】蛍光滴定によってモニターされたＴＤＰ−４３のＴＡＲ  ＤＮＡ結合。ＴＤＰ−４３の全長（四角）及び短い形態（丸）を、一本鎖ＴＡＲ  ＤＮＡ−Ａ部位（塗りつぶされたシンボル）及び−Ｂ部位（空白のシンボル）で滴定した。２８０ｎｍで励起しながら、３５０ｎｍでのＴＤＰ−４３又はＴＤＰ−４３ｓの発光最大値をモニターした。示されたデータは開始点に正規化されたものであり、示された線は適合線である。
【００３３】
図３は、Ａβに対するＴＤＰ−４３のクロスシーディングを示す。
【図３Ａ】ＴＤＰ−４３を用いない及び０．４〜４％の範囲の濃度のＴＤＰ−４３を用いる、Ａβ線維化のＴｈＴアッセイ。シーディングされたＴＤＰ−４３のモル比のパーセンテージが示されている。
【図３Ｂ】０時間での、ＴＤＰ−４３を含む及び含まない、Ａβの光誘導性架橋（ＰＩＣＵＰ）アッセイ。シーディングされたＴＤＰ−４３のモル比のパーセンテージが示されている。
【図３Ｃ】４％  ＴＤＰ−４３を含む及び含まない、Ａβの終点生成物のＴＥＭ画像（スケールバー、１００ｎｍ）。
【００３４】
図４は、ＴＤＰ−４３オリゴマーが神経突起変性を誘導し、インビトロ及びインビボで神経毒性であることを示す。
【図４Ａ】ＭＴＴアッセイ（図４Ａ）及びＬＤＨアッセイ（図４Ｂ）によって実施された、ヒトＢＥ（２）−Ｃ細胞に対するＴＤＰ−４３の細胞毒性（ｎ＝３、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。
【図４Ｂ】ＭＴＴアッセイ（図４Ａ）及びＬＤＨアッセイ（図４Ｂ）によって実施された、ヒトＢＥ（２）−Ｃ細胞に対するＴＤＰ−４３の細胞毒性（ｎ＝３、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。
【図４Ｃ】ＭＴＴアッセイを用いる、１次ニューロン培養物に対するＴＤＰ−４３の細胞毒性。ＭＴＴアッセイにおける細胞生存能力はバッファーコントロールに対して正規化される（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。統計値は、図４Ａ及び図４Ｃについてはチューキーの事後検定を伴う一元配置分散分析によって、図４Ｂについては両側の対応のないスチューデントのｔ検定によって、分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図４Ｄ】コントロール又はＴＤＰ−４３、０．４４μＭで処置した１次ニューロンの免疫細胞化学。試料を、ＭＡＰ−２免疫染色、ＧＦＡＰ免疫染色、及びＤＡＰＩ染色に供した。
【図４Ｅ】海馬内ＴＤＰ−４３注射は、マウス海馬のＣＡ領域において、ニューロン喪失を示した。バッファーコントロール及びＴＤＰ−４３の海馬注射（各群ｎ＝３）を実施した。ニューロン特異性マーカーＮｅｕＮ及び核特異性色素ＤＡＰＩによる海馬領域の免疫組織化学が示されている。病変部は矢印によって示されている（スケールバー、５０μｍ）。
【００３５】
図５は、ＴＤＰ−Ｏ抗体がＴＤＰ−４３オリゴマーを特異的に認識することを示す。
【図５Ａ】ネイティブバッファー、又は９Ｍ  尿素、７．２Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ、若しくは２％  ＳＤＳを含有するバッファー中で、９０℃１時間の加熱を行って又は行わずに、新鮮に精製されたＴＤＰ−４３を、ＴＤＰ−４３オリゴマーを免疫原として使用して新しく作製されたポリクローナル抗体、ＴＤＰ−Ｏによってプロービングされるドットブロット法に供した。ＴＤＰ−ＯによるＴＤＰ−４３コンホメーションの免疫反応性は、図１Ｃに示されるＡ１１によるものと同様であった。
【図５Ｂ】Ａβオリゴマーを、Ａ１１及びＴＤＰ−Ｏ抗体によってプロービングされるドットブロット法に供した。Ａ１１はＡβオリゴマーを認識することができたが、ＴＤＰ−Ｏはできなかった。
【図５Ｃ】３倍濃縮されたＴＤＰ−４３（実線）及び３倍濃縮されていないＴＤＰ−４３（点線）をＳＥＣに供した。ＴＤＰ−４３オリゴマー（★）、ＴＤＰ−４３モノマー（☆）、及び分子量標準の溶出体積が示されている。
【図５Ｄ】１ｍｌのＳＥＣ画分を回収し、ＴＤＰ−Ｏ（上のブロット）及びＮ１−２６０抗体（下のブロット）によるドットブロット法に供した。
【図５Ｅ】ＳＥＣからの精製されたＴＤＰ−４３オリゴマー及びモノマーをＥＬＩＳＡにより特徴付けた。ＴＤＰ−４３試料をＥＬＩＳＡプレート上に用量依存的にコーティングした。ＴＤＰ−４３オリゴマーをＴＤＰ−Ｏ（■）及びＮ１−２６０（□）抗体によりプロービングし、ＴＤＰ−４３モノマーをＴＤＰ−Ｏ（●）及びＮ１−２６０（○）抗体によりプロービングした。ＴＤＰ−Ｏ抗体は、ＴＤＰ−４３オリゴマーに対して顕著な高い特異性を有する。
【００３６】
図６は、ＦＴＬＤ−ＴＤＰのトランスジェニックマウスモデルにおいて、ＴＤＰ−４３オリゴマーが存在し、年齢と共に増加することを示す。
【図６Ａ】野生型並びに６月齢及び１２月齢のＴＤＰ−４３Ｔｇ＋／＋トランスジェニックマウスの脳スライスにおける、ヒトＴＤＰ−４３及びＴＤＰ−４３オリゴマーの免疫蛍光染色。抗ＴＤＰオリゴマー染色、ＴＤＰ−４３染色、及びＤＡＰＩ染色をした細胞が示されている（スケールバー、１００μｍ）。ブロッキングされた領域が、最後の列において、より高い倍率で提示された（スケールバー、２５μｍ）。
【図６Ｂ】定量化された結果は、サイトゾルにおいてＴＤＰ−Ｏ及びＴＤＰ−４３の沈着を有する細胞の比率が年齢依存性であったことを示した。（１群あたりｎ＝３、各マウスにつきランダムな５つの視野を計算した。データを平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表す。統計値は、テューキーの事後検定を伴う一元配置分散分析によって分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。）
【００３７】
【図７】図７は、ＴＤＰ−４３オリゴマーがＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者に存在することを示す。合計で、３のＦＴＬＤ−ＴＤＰ症例、３の神経学的及び病理学的に正常な、年齢が合致したコントロール、及び３のＴＤＰ−４３封入体を有しないアルツハイマー病症例（「神経変性疾患コントロール」として）を調べた。代表的な画像が示されている。（Ａ）、（Ｃ）、及び（Ｅ）  ＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者の海馬（Ｃ）及び前頭皮質切片（Ａ、Ｅ）における、ＴＤＰ−Ｏ抗体によるＴＤＰ−４３の免疫組織化学的染色。ＴＤＰ−Ｏは、濃く染色された、卵形又は不規則な形状であるが目立たない細胞質封入体（矢印）及び変性神経突起（矢頭）を表すニューロピルにおけるコンマ形のプロファイルを同定した。（Ｅ）に示されるようないくつかの皮質領域において、神経細胞質は粗い粒状免疫反応性を示した。（Ｂ）、（Ｄ）、及び（Ｆ）  ＴＤＰ−Ｏは、コントロール被験体の脳を染色しなかった。ＴＤＰ−Ｏ抗体は、モノマーＴＤＰ−４３の抗体とは対照的に、核を染色しなかった。これは、ミスフォールドＴＤＰ−４３に対する特異性を実証する。全てのパネルのスケールバーは２０μｍである。
【００３８】
図８は、罹患海馬から免疫沈降されたＴＤＰ−４３オリゴマーの免疫金標識を示す。ＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者の海馬を摘出し、ＴＤＰ−Ｏ抗体によって免疫沈降させた。溶出液を、Ｎ−末端ＴＤＰ−４３抗体で免疫金標識するＥＭに供した（スケールバー、５０ｎｍ）。
【図８Ａ】ＦＴＬＤ−ＴＤＰにおけるＴＤＰ−４３オリゴマー（スケールバー、１００ｎｍ）。
【図８Ｂ】ＴＤＰ−４３オリゴマーのズームイン画像（スケールバー、５０ｎｍ）。
【００３９】
【図９】図９は、ＴＤＰ−Ｏ  ｍＡｂｓがＴＤＰ−４３オリゴマーに対してより高い特異性を示すことを示す。それぞれＴＤＰ−Ｏ−３、−５、−８、−９、及び−１０ハイブリドーマ細胞によって産生される、様々な濃度のＴＤＰ−Ｏ  ｍＡｂｓ（１−２ｘ１０−５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡアッセイに使用して、ＳＤＳ変性又は非変性ＴＤＰ−４３を検出した。
【００４０】
図１０は、ＴＤＰ−Ｏ  ｍＡｂｓが、精製されたＴＤＰ−４３オリゴマーに対してより高い特異性を示すことを示す。ＴＤＰ−Ｏハイブリドーマ細胞の条件培地を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーからの精製されたＴＤＰ−４３オリゴマー及びモノマーをＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。
【図１０Ａ】ＴＤＰ−４３オリゴマー及びモノマーをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬカラムによって分離及び回収した。
【図１０Ｂ】ＴＤＰ−Ｏ−３、−５、−８、−９、及び−１０ハイブリドーマ細胞系統の条件培地を使用して、ＴＤＰ−４３オリゴマー及びモノマーをＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。
【００４１】
【図１１】図１１は、５の単離されたＴＤＰ−Ｏモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のコンセンサスアミノ酸配列を示す。Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、ＣＤＲは相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）の略語である。
【００４２】
【図１２】図１２は、ＴＤＰ−Ｏモノクローナル抗体がＴＤＰ−４３オリゴマー誘導細胞毒性を救済することを示す。ＭＴＴアッセイを実施して、ＢＥ（２）−Ｃ細胞の細胞生存能力を調べた。データは平均値±標準偏差として示される。統計的分析を、一元配置分散分析によって、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１で実施した。この結果は、ＴＤＰ−４３オリゴマーによって誘導された毒性が、ＴＤＰ−Ｏ抗体の処置によって有意に救済されたことを示した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
説明
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本例の説明として意図されており、本例が構築又は利用され得る唯一の形態を示すことを意図するものではない。この説明は、本例の機能及び本例を構築及び動作させるための一連のステップを示す。しかしながら、同一又は同等の機能及び一連のステップは、異なる例によって達成され得る。
【００４４】
Ｉ．定義
【００４５】
本明細書で使用される用語「ＴＤＰ−４３タンパク質症」は、４３ｋＤａのトランス活性化応答（ＴＡＲ）−ＤＮＡ−結合タンパク質（ＴＤＰ−４３）と特に結びついた疾患を指す。ＴＤＰ−４３は、ユビキチン陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−Ｕ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と結びついていることが知られる疾患タンパク質である。それ故に、ＴＤＰ−４３タンパク質症は、アルツハイマー病（ＡＤ）、嗜銀顆粒性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムのＡＬＳ−パーキンソン痴呆症候群、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、封入体ミオパシー、封入体筋炎、海馬硬化症、又はパーキンソン病（ＰＤ）を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用される用語「有効量」は、投与時及び必要な時間、ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の処置に関して所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。
【００４７】
フレーズ「医薬的に許容される」は、ヒトに投与されたときに、「一般に安全とみなされる」、例えば、生理的に耐容され、典型的には、胃の不調、目まいなどのアレルギー性又は同様の有害反応を生じない、分子実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用される、用語「医薬的に許容される」は、連邦又は州政府の規制当局によって承認されていること、又は動物における、及びより具体的にはヒトにおける使用についての、米国薬局方又は他の一般に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。
【００４８】
用語「投与された（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」又は「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、本明細書において交換可能に使用され、本開示の二重特異性抗体又は組成物を直接に投与することを意味する。
【００４９】
用語「被験体」又は「患者」は、本開示の組成物及び／又は方法で処置可能な、ヒト種を含む動物を指す。用語「被験体」又は「患者」は、１つの性別が特定されていない限り、オスとメスの両方の性別を指すことが意図される。したがって、用語「被験体」又は「患者」は、がんの処置から恩恵を受け得る任意のほ乳類を含む。「被験体」又は「患者」の例は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及びニワトリを含むがこれらに限定されない。例示的な実施形態において、患者はヒトである。
【００５０】
本明細書で使用される用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、所望の薬理的及び／又は生理的効果を得ること、例えば、ＴＤＰ−４３の病理学的形態の存在を検出すること、器官萎縮を防止若しくは救済すること、又は認知症若しくは筋肉の衰弱及び硬直の発症を阻害することを意味することが意図される。この効果は、疾患又はその症候を完全に又は部分的に防止するという点において予防的、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害効果の部分的な又は完全な治癒という点において治療的であり得る。本明細書で使用される「処置」は、ほ乳類、特にヒトにおける疾患の防止的（例えば、予防的）、治癒的又は緩和的処置を含み；かつ（１）疾患になりやすい可能性があるが、まだそれを有するとは診断されていない個体における、疾患又は状態（例えば、がん又は心不全）の発症の防止的（例えば、予防的）、治癒的又は緩和的処置；（２）疾患の（例えば、その発症を阻止することによる）阻害；又は（３）疾患の軽減（例えば、疾患に関連する症候の低減）を含む。
【００５１】
用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、最も広い意味で使用され、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを、それらが所望の生物学的活性を示す限り、すなわち、それがタンパク質及び／又は他の分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識するときに、抗原に特異的に結合する生物学的活性を示す限り、包含する。本願の一つの実施形態によれば、本発明の抗体は、ＴＤＰ−４３オリゴマーを特異的に認識するポリクローナル抗体である。
【００５２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように構築されるべきものではない。様々なエピトープに対する様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基（すなわち、エピトープ）に対するものである。本開示のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法又は組換えＤＮＡ法によって作製してよい。本明細書のモノクローナル抗体は、特に、「キメラ」又は「組換え」抗体を含み、ここで、それらが所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体又はある抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である一方で、鎖の残りが、別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であり、当該抗体のフラグメントも同様である。
【００５３】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、所望の特異性又は親和性を有する、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種からの超可変領域残基によって、超可変領域残基が置き換えられているヒト免疫グロブリンである。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。一般に、ヒト化抗体は、全ての又は実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１、及び典型的には２の可変ドメインの、実質的に全てを含むだろう。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を任意選択的に含んでよい。
【００５４】
単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むものとして本明細書で使用される。
【００５５】
ＩＩ．本発明の説明
【００５６】
４３ｋＤａのトランス活性化応答（ＴＡＲ）−ＤＮＡ−結合タンパク質（ＴＤＰ−４３）は、散発性のユビキチン陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−Ｕ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の全てのサブタイプのユビキチン化ミスフォールド凝集体における疾患タンパク質として同定されている。本研究において、発明者は、全長ＴＤＰ−４３が、アルツハイマーアミロイド−β（Ａβ）をクロスシーディングしてアミロイドオリゴマーを形成する、構造的に安定な球状オリゴマーを形成することを予期せず発見した。それ故に、薬剤（例えば、抗体）が当該ＴＤＰ−４３オリゴマーに結合することができる場合、当該薬剤は、ＴＤＰ−４３のタンパク質症及び／又はＡβオリゴマー化（ただしこれに限定されない）などの後続の事象に対するＴＤＰ−４３の効果を抑制又は阻害し得る。したがって、当該薬剤は、ＴＤＰ−４３の病理学的形態の沈着及び／又は凝集に起因する神経変性疾患を防止又は処置するのに適切な医薬品（例えば、ワクチン又は受動免疫）の製造に有用である。
【００５７】
したがって、本開示の第１の態様は、抗体、特に、本発明の実施例で同定されたＴＤＰ−４３オリゴマーを認識し、それにより、タンパク質、特に、ＴＤＰ−４３の、疾患に関連する凝集を阻害する抗体を提供することである。一般に、タンパク質凝集プロセスは、いったん開始すると自己伝播様式で進み、さらなるタンパク質分子のコンホメーション変化及び／又は重合が誘導される凝集カスケードが起こり、これがタンパク質分解に耐性のある有毒な生成物の形成を引き起こす。このように形成されたタンパク質凝集は、アルツハイマー病（ＡＤ）、嗜銀顆粒性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムのＡＬＳ−パーキンソン痴呆症候群、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、封入体ミオパシー、封入体筋炎、海馬硬化症、又はパーキンソン病（ＰＤ）などの神経変性疾患の近位の原因であると考えられている。
【００５８】
本開示の好ましい実施形態によれば、ＴＤＰ−４３オリゴマーは、直径約２〜４００ｎｍの粒子サイズを有することを特徴とする。好ましくは、ＴＤＰ−４３オリゴマーは、直径約２０〜４００ｎｍの、例えば直径２０〜３０ｎｍ、３０〜４０ｎｍ、４０〜５０ｎｍ、５０〜６０ｎｍ、６０〜７０ｎｍ、７０〜８０ｎｍ、８０〜９０ｎｍ、９０〜１００ｎｍ、１００〜１２０ｎｍ、１２０〜１４０ｎｍ、１４０〜１６０ｎｍ、１６０〜１８０ｎｍ、１８０〜２００ｎｍ、２００〜２２０ｎｍ、２２０〜２４０ｎｍ、２４０〜２６０ｎｍ、２６０〜２８０ｎｍ、２８０〜３００ｎｍ、３００〜３２０ｎｍ、３２０〜３４０ｎｍ、３４０〜３６０ｎｍ、３６０〜３８０ｎｍ、及び３８０〜４００ｎｍの粒子サイズを有する。より好ましくは、ＴＤＰ−４３オリゴマーは、直径約４０〜６０ｎｍの球状粒子サイズを有する。
【００５９】
本発明の抗体は、上述のＴＤＰ−４３オリゴマー、そのエピトープ、並びにその様々なコンホメーション及びエピトープに、特異的に結合する。好ましい実施形態において、本明細書に開示される抗体は、病理学的ＴＤＰ−４３、特に、直径約２〜４００ｎｍの球状粒子サイズを有することを特徴とする全長ＴＤＰ−４３オリゴマーに優先的に結合する。
【００６０】
所望のモノクローナル抗体を産生するために、最初に、マウス、ラット又はウサギなどの動物を、適切な用量のＴＤＰ−４３オリゴマーで免疫化する。一般に、動物をＴＤＰ−４３オリゴマーで免疫化する際に、アジュバントとＴＤＰ−４３オリゴマー溶液が一緒に混合される。本発明に有用なアジュバントの例は、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、及び水酸化アルミニウムアジュバントを含む。免疫化は一般に、抗原の静脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射によって主に行われる。免疫化間隔は特に限定されない。免疫化は、数日間〜数週間、好ましくは２〜３週間の間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回行ってよい。免疫化の結果、抗体価が吸光度レベルにおいて２以上になると、動物は約１ヶ月間放置される。次いで、再免疫化が少なくとも１回行われる。最終免疫化の数日後、好ましくは３〜５日後に、脾細胞及び所属リンパ節を除去する。免疫化後に血液試料を定期的に採取し、遠心分離に共して血清を分離する。次いで、得られた血清を、任意の適切な方法による抗体価の測定に供する。この任意の適切な方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含むがこれらに限定されない、一つの好ましい例において、抗体価はＥＬＩＳＡによって測定される。次いで、ＴＤＰ−４３オリゴマーに対して高い抗体価を示す動物に最終免疫化を行う。
【００６１】
抗体産生細胞は、免疫化動物の脾細胞及び所属リンパ節などから調製される。抗体産生細胞の調製において、組織破片及び赤血球を可能な限り除去することが好ましい。市販の赤血球除去剤をこの目的のために使用してよい。代替的に、塩化アンモニウム及びトリスのバッファーを調製及び使用してよい。このように調製された抗体産生細胞は、骨髄腫細胞などの不死細胞と直ちに融合されて、抗体を産生しながら半永久的に増殖し続けるハイブリドーマ細胞を生じる。マウスなどの動物に由来する一般的に入手可能な細胞株を使用してよい。本発明において使用するのに好ましい細胞株は、効率的に融合し、抗体の安定で高いレベルの産生を支持し、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含有するＨＡＴ選択培地に対して感受性である細胞株であるべきであり、抗体産生細胞と融合された場合にのみそこに生存するべきである。骨髄腫細胞の例は、マウス骨髄腫細胞系統（骨髄腫ＦＯ細胞など）及びヒト骨髄腫細胞系統（Ｋａｒｐａｓ  ７０７Ｈなど）を含むがこれらに限定されない。
【００６２】
細胞融合は通常、約２００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧなどの細胞融合プロモーターの存在下で、脾細胞又はリンパ節細胞を市販の入手可能な骨髄腫細胞と混合することにより行われる。代替的に、細胞融合は、電気融合などの電気的刺激を利用した市販の細胞融合装置で行ってよい。融合の後、得られた細胞をＨＡＴ培地で希釈し培養する。
【００６３】
次いで、目的のハイブリドーマを、融合された細胞から選択する。ＨＡＴ培地中で培養された、生存する融合された細胞は、コロニーを形成するだろう。次いで、各培養ウェルの上清を回収し、ＴＤＰ−４３オリゴマーに対する抗体価の有無について調べる。確認の方法としては、ＴＤＰ−４３オリゴマー又はＴＤＰ−４３モノマーがプレート上にコーティングされ、スクリーニング判定基準として使用される、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又はＲＩＡを使用してよい。抗体陽性ウェルが同定されると、次いで細胞を、アミノプテリンを含有しないＨＴ培地中で培養する。しばらく培養した後、培養上清中の抗体価を再び確認する。次いで、最終的に選択された細胞をクローニングに供し、単一細胞を得る。ＴＤＰ−４３オリゴマーに対して高い特異性を示すクローンを選択し、ある程度増殖させてハイブリドーマを樹立する。
【００６４】
本開示の好ましい実施形態によれば、５のハイブリドーマ、ＴＤＰ−Ｏ−３、ＴＤＰ−Ｏ−５、ＴＤＰ−Ｏ−８、ＴＤＰ−Ｏ−９及びＴＤＰ−Ｏ−１０を選択した。モノクローナル抗体は、任意の既知の方法によって単離又は調製してよい。例えば、抗体は、血清濃度の低い培地中でハイブリドーマを培養することによって得られた培養上清から調製してよい。代替的に、ハイブリドーマを動物の腹腔内に注射し、得られた腹水を回収して抗体を調製してよい。抗体は、親和性カラム、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどを用いる方法によって精製又は単離してよい。これらの既知の方法はいずれも、適宜選択してよく、又は組み合わせて使用してよい。
【００６５】
特定の実施形態によれば、本開示のモノクローナル抗体は、受託番号ＢＣＲＣ９６０４９４、ＢＣＲＣ９６０４９５、ＢＣＲＣ９６０４９６、ＢＣＲＣ９６０４９７、又はＢＣＲＣ９６０４９８として、食品工業開発研究機関（ＦＩＤＲＩ）（ＨｓｉｎＣｈｕ、Ｔａｉｗａｎ、Ｒ．Ｏ．Ｃ．）の生物資源収集研究センター（ＢＣＲＣ）に寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＴＤＰ−Ｏ−３、ＴＤＰ−Ｏ−５、ＴＤＰ−Ｏ−８、ＴＤＰ−Ｏ−９及びＴＤＰ−Ｏ−１０によってそれぞれ産生される。
【００６６】
好ましい実施形態によれば、本明細書に開示されるモノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖可変領域にそれぞれ位置するコンセンサス配列を含む。したがって、本明細書に記載のモノクローナル抗体は、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号：５、配列番号：６及び配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をそれぞれ含む。好ましくは、ヒト化モノクローナル抗体は、配列番号：４の重鎖可変領域、及び配列番号：８の軽鎖可変領域を含む。本開示に記載のアミノ酸配列、特に配列番号：１〜６、及び８のなかでも、Ｘａａは、本技術分野において知られている任意のＬ体又はＤ体アミノ酸残基を表す。一つの例において、Ｘａａは酸性アミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）である。別の例において、Ｘａａは塩基性アミノ酸残基（例えば、リシン、アルギニン、又はヒスチジン）である。さらなる例において、Ｘａａは非極性アミノ酸残基（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、又はトリプトファン）である。さらに別の例において、Ｘａａは非電荷極性アミノ酸残基（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、又はチロシン）である。
【００６７】
代替的に、抗ＴＤＰ−４３オリゴマーモノクローナル抗体は、ＤＮＡクローニング又はＤＮＡ合成によって産生されてよい。抗ＴＤＰ−４３オリゴマーｍＡｂｓをコードするＤＮＡは、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの、従来の手順の使用によって、容易に単離及び配列決定されてよい。ハイブリドーマ細胞（例えば、ＴＤＰ−Ｏ−３、ＴＤＰ−Ｏ−５、ＴＤＰ−Ｏ−８、ＴＤＰ−Ｏ−９又はＴＤＰ−Ｏ−１０ハイブリドーマ）は、当該ＤＮＡの好ましい源の役割を果たす。ＤＮＡが単離されると、このＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いでこの発現ベクターを、免疫グロブリンタンパク質を産生しない、Ｅ．  Ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞に遺伝子導入して、組換え宿主細胞中で所望のモノクローナル抗体を合成する。
【００６８】
次いで、このように産生されたモノクローナル抗体及び当該抗体をコードするＤＮＡを使用して、キメラ抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体及び／又はそれらに由来する抗体フラグメントを産生することができる。
【００６９】
非ヒト起源モノクローナル抗体の主要な関心事は、レシピエントに対するその免疫原性であり、これは場合によっては危険なアレルギー性反応を引き起こす。ほとんどのモノクローナル抗体はマウス起源のものであり、ヒトに注射すると免疫原性であることが判明している。本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマーｍＡｂｓの免疫原性を低減するために、マウス抗ＴＤＰ−４３オリゴマーＡｂｓの重鎖及び軽鎖の可変ドメインを、ヒト抗体の定常領域に取り付けることによって、ヒト化抗体が産生される。
【００７０】
ヒト化抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体を作り出すために、当該抗体をコードするＤＮＡを単離及び配列決定し、次いでヒト化構築物を作り出すのに使用した。
【００７１】
本開示の好ましい実施形態によれば、ＣＤＲ（相補性決定領域）グラフト化が用いられ、ここで、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬ遺伝子中のＣＤＲ領域が、適当なＣＤＲコードセグメント（例えば、ＴＤＰ−４３オリゴマーの結合に関与するアミノ酸セグメントをコードする抗ＴＤＰ−４３オリゴマーＡｂｓ中のＤＮＡセグメントなど）で置き換えられる。したがって、得られる抗体は、ＣＤＲのみが元のマウス抗体からのものである一方、ＶＨ及びＶＬ遺伝子中のフレームワーク領域及び定常領域遺伝子（すなわち、ＣＫ又はＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）がヒトＩｇＧのものである、可変領域を有する。
【００７２】
好ましい実施形態において、ヒト化抗ＴＤＰ−４３オリゴマーｍＡｂは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。産生された後、ヒト化抗ＴＤＰ−４３オリゴマーｍＡｂｓは、クロスフローろ過、親和性カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過などを含む本技術分野の標準手順にしたがって精製してよい。ヒト化抗体は、マウス抗ＴＤＰ−４３オリゴマーＡｂｓと同一又は実質的に同様の様式で機能するものであるということが理解されるべきである。好ましくは、ヒト化抗ＴＤＰ−４３オリゴマーＡｂｓ（Ｆａｂ又は全長ＩｇＧのいずれかの形態）は、マウスバージョンと比較して、ヒト被験体における使用においてより有利であるものである。いくつかの実施形態において、ヒト化抗ＴＤＰ−４３オリゴマーＡｂｓは、本開示の二重特異性抗体の産生において使用される。
【００７３】
本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、ＴＤＰ−４３タンパク質症の任意のインビボ又はインビトロモデルの使用によって特徴付けることができる。当業者は、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体が、例７に記載の動物モデルのような、マウスモデルにおいて特徴付けることができることを容易に理解する。代替的に、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、例８に記載のヒトＡＤ試料によって特徴付けることができる。
【００７４】
一つの例において記載されるインビトロデータによれば、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、ＴＤＰ−４３オリゴマーによって誘導された細胞毒性に対し阻害効果を有する。この例によれば、ＴＤＰ−４３オリゴマー誘導細胞毒性を阻害するのに十分な本抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体の濃度は、約０．００１−５．０ｍｇ／ｍｌであり、例えば、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、又は５．０ｍｇ／ｍｌである。好ましくは、濃度は約０．０１−１．０ｍｇ／ｍｌである。より好ましくは、濃度は約０．０２−０．０８ｍｇ／ｍｌである。
【００７５】
当業者は、ＴＤＰ−４３タンパク質症の実験モデルを防止的設定又は治療的設定において使用することができることを理解する。防止的設定において、動物の投与は、ＴＤＰ−４３タンパク質症又はその症候の発症の前に開始し、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、ＴＤＰ−４３タンパク質症又はその症候の発症を防止、低減又は遅延させるその能力について評価される。治療的設定において、動物の投与は、ＴＤＰ−４３タンパク質症又はその症候の発症の後に開始し、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、ＴＤＰ−４３タンパク質症又はその症候の発症を処置、低減又は緩和させるその能力について評価される。ＴＤＰ−４３タンパク質症の症候は、試験被験体の脳、脊髄、脳脊髄液又は血清における病理学的ＴＤＰ−４３沈着の蓄積を含むがこれらに限定されない。
【００７６】
したがって、本開示は、Ａβの凝集に関連する神経変性疾患を処置するための医薬組成物又は医薬品を提供する。組成物は、有効量の本明細書に記載の本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体；及び医薬的に許容される添加剤を含む。本開示の医薬組成物又は医薬品によって処置可能なＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患は、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムのＡＬＳ−パーキンソン痴呆症候群、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、封入体ミオパシー、封入体筋炎、海馬硬化症、又はパーキンソン病を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
一般に、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、医薬組成物の全質量に基づき約０．１％〜９９質量％のレベルで存在する。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、医薬組成物の全質量に基づき少なくとも１質量％のレベルで存在する。ある実施形態において、抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、医薬組成物の全質量に基づき少なくとも５質量％のレベルで存在する。さらに他の実施形態において、抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、医薬組成物の全質量に基づき少なくとも１０質量％のレベルで存在する。またさらに他の実施形態において、抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、医薬組成物の全質量に基づき少なくとも２５質量％のレベルで存在する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明の医薬品又は前記医薬組成物は、神経変性疾患の症候を改善させることが知られている薬剤をさらに含む。このような薬剤の例は、ＡＣｈＥＩ、Ａβ阻害剤、又はムスカリンレセプターアゴニストなどを含むが、これらに限定されない。
【００７９】
医薬品又は前記医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｅｄ．  Ａｌｆｏｎｏｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ（１９８５）に記載されるような、許容される医薬手順にしたがい調製される。医薬的に許容される添加剤は、製剤中の他の成分と適合性であり、生物学的に許容されるものである。
【００８０】
本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、経口投与、腹腔内投与、頭蓋内投与、髄腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、直腸投与又は吸入による投与などの本技術分野において知られている任意の手段によって、単独又は従来の医薬的に許容される添加剤と組み合わせて投与してよい。一つの好ましい実施形態において、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、被験体に静脈内投与される。別の好ましい実施形態において、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、被験体に髄腔内投与される。
【００８１】
適用可能な固体添加剤は、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、フィラー、滑剤、圧縮助剤、バインダー又は錠剤崩壊剤又はカプセル化材料としても作用し得る１又は複数の物質を含んでよい。粉末において、添加剤は、微細に分割された活性成分と混合されている、微細に分割された固体である。錠剤において、活性成分は、必要な圧縮特性を有する添加剤と適切な割合で混合され、所望の形状及びサイズに圧縮されている。粉末及び錠剤は、好ましくは、最大９９％の活性成分を含有する。適切な固体添加剤は、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジンなどを含む。
【００８２】
本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、腹腔内、又は小脳内注射によって投与することのできる滅菌溶液又は懸濁液である、液体医薬組成物に処方してもよい。経口投与は、液体又は固体の組成物形態であってよい。
【００８３】
本発明の医薬品又は前記医薬組成物はまた、口腔粘膜を介する薬物送達のための、頬及び／又は舌下薬物投与単位などの、粘膜適用のための様々な投与形態に処方されてもよい。医薬的に許容され、適切な付着の程度及び所望の薬物放出プロファイルの両方を提供し、投与される活性薬剤及び頬及び／又は舌下薬物投与単位中に存在し得る任意の他の成分と適合性である、幅広い生分解性ポリマーの添加剤を使用してよい。一般に、ポリマーの添加剤は、口腔粘膜の湿った表面に付着する親水性のポリマーを含む。ポリマーの添加剤の例は、アクリル酸ポリマー及びコポリマー；加水分解ポリビニルアルコール；ポリエチレンオキシド；ポリアクリレート；ビニルポリマー及びコポリマー；ポリビニルピロリドン；デキストラン；グアーガム；ペクチン；デンプン；並びにセルロース系ポリマーを含むがこれらに限定されない。
【００８４】
したがって、本発明は、ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患のほ乳類、好ましくはヒトを処置する方法も提供し、この方法は、本明細書に記載の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体を含有する本発明の医薬品又は前記医薬組成物の投与を含む。当該医薬品又は組成物は、組成物の１又は複数の活性成分を適当な又は所望の作用部位に有効に輸送し得る任意の経路、例えば、口、鼻、肺、受動的又はイオントフォレーシス送達などの経皮、又は非経口、例えば、直腸、デポー、皮下、静脈内、髄腔内、筋肉内、鼻腔内、小脳内、点眼液又は軟膏の経路など、によって、ほ乳類、好ましくはヒトに投与される。さらに、本発明の化合物と他の活性成分は併用投与又は同時投与されてよい。
【００８５】
いくつかの実施形態において、被験体に投与される有効な用量は、約１〜１００ｍｇ／Ｋｇ被験体体重、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／Ｋｇ被験体体重であり、好ましくは約５０〜７０ｍｇ／Ｋｇ被験体体重、例えば５０、６０又は７０ｍｇ／Ｋｇ被験体体重であり、最も好ましくは約５０ｍｇ／Ｋｇ被験体体重である。用量は、単一のアリコートで、又は代替的に１より多いアリコートで、投与することができる。
【００８６】
本開示の任意選択の実施形態によれば、本方法は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣｈＥＩ）、Ａβ阻害剤、又はムスカリンレセプターアゴニストを、上述の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体と同時に又は逐次的に、被験体に投与するステップをさらに含んでよい。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＡＣｈＥＩは、アランタミン、シムセリン、ドネペジル、ＥＲ  １２７５２８、ガランタミン、ガンスチグミン、ヒューペルジンＡ、フェンセリン、フェネチルノルシムセリン、リバスチグミン、ＲＳ  １２５９、ＳＰＨ  １３７１、タクリン、チアシムセリン、又はザナペジルのいずれかである。他の実施態様において、Ａβ阻害剤は、バピネオズマブ、ＰＴＢ２、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール、ＰＰＩ  １０１９、ＲＳ  ０４０６、ＳＰ  ２３３、ＥＧＣＧ、Ｅｘｂｅｒｙｌ−１、又はＳＥＮ  ６０６のいずれかである。ムスカリンレセプターアゴニストは、オキソトレモリン又はキサノメリンである。
【００８８】
本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体はまた、被験体におけるＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の検出又は診断のためのツールとして使用してもよい。したがって、本発明は、ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患を有する又は有すると疑われる被験体を検出又は診断するための方法を提供する。この方法は、被験体から生体試料を採取するステップ；生体試料を有効量の本抗体と接触させることにより、生体試料中のＴＤＰ−４３オリゴマーの量を決定するステップ；及び生体試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量を、健康な被験体から得られたコントロール試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量と比較するステップを含み、生体試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量が、コントロール試料中で検出されたＴＤＰ−４３オリゴマーの量よりも顕著に高い又は低いことが、被験体がＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患を患っていることを示す。
【００８９】
本明細書に記載の生体試料は、脳生検試料、脳脊髄液試料、全血試料、血清試料、血漿試料、尿試料、粘液試料及びそれらの精製された又はろ過された形態を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
抗体結合は、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、（例えば、コロイド金、酵素又は放射性同位元素標識を用いる）インシトゥイムノアッセイ、ウエスタンブロット、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、及び免疫電気泳動アッセイなどの、本技術分野において知られている技術によって検出してよい。一つの実施形態において、抗体結合は、ＥＬＩＳＡの使用によって検出される。いくつかの実施形態において、自己抗体は、体液中に検出され、この体液は、脳脊髄液、全血、血清、血漿、粘液、及びそれらの精製された又はろ過された形態を含むがこれらに限定されない。一つの好ましい例において、抗体は脳脊髄液試料から検出された。他の実施態様において、抗体は脳生検試料から検出される。
【００９１】
当業者に本発明を使用するためのツールを提供するために、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体は、神経変性疾患の診断、検出又は確認のためのキットに組み立てられる。好ましい実施形態において、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体に反応性であるＴＤＰ−４３の病理学的形態の存在を使用して、被験体に予後診断を提供する。例えば、コントロール（健康な被験体に由来する）と比較して、生体試料中に、顕著に異なるレベルの、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体に反応性であるＴＤＰ−４３の病理学的形態が検出されることは、ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の発生を示すものである。提供される情報はまた、処置過程を指図するためにも使用される。例えば、ある被験体がＴＤＰ−４３の病理学的形態を有することが判明した場合、ＡＤ、ＡＬＳ及びＰＤなどのＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の処置のための療法は、それらが有効である可能性がより高い、より早い時期に開始され得る。
【００９２】
一つの実施形態において、本発明は、本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体の使用によるＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の診断のためのキットを提供する。キットに含まれる部品は、容器、生体試料中のＴＤＰ−４３オリゴマーを検出するための試薬であって、本発明の一つの例において記載の手順にしたがって調製された本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体を含む試薬、及び説明文であって、容器に関連付けられかつ生体試料中のＴＤＰ−４３の病理学的形態（又は本明細書に記載のＴＤＰ−４３オリゴマー）を検出するための本発明の抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体の使い方を示す説明文である。説明文は、パンフレット、テープ、ＣＤ、ＶＣＤ又はＤＶＤの形態であってよい。キットは、抗ＴＤＰ−４３オリゴマー抗体と複合体を形成するＴＤＰ−４３オリゴマーの、健康な被験体における正常レベルを示すネガティブコントロールをさらに含んでよい。
【００９３】
以下、本発明を、限定ではなく実証の目的のために提供されている以下の実施形態を参照して、より具体的に説明する。
【実施例】
【００９４】
実施例
【００９５】
材料及び方法
【００９６】
材料
ＨＥＫ細胞から単離されたヒトＴＤＰ−４３は、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から得た。生成物の説明に基づき、ＴＤＰ−４３を、ＴｒｕｅＯＲＦクローン、ＲＣ２１０６３９で一過的に遺伝子導入されたヒトＨＥＫ２９３細胞から得た。組換えＴＤＰ−４３は、Ｃ−末端Ｍｙｃ−ＤＤＫタグを有した。過剰発現した組換えＴＤＰ−４３タンパク質を、抗ＤＤＫ親和性カラムを用いて精製した。短い形態のＴＤＰ−４３（残基１０１−２８５）を、Ｋｕｏら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００９）３７、１７９９−１８０８）によって記載された手順にしたがって調製する。ドットブロット法のための抗Ｎ−末端残基１−２６０ＴＤＰ−４３抗体（Ｎ１−２６０として表示される）及び免疫組織化学のための抗ＴＤＰ−４３抗体は、両方共Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した。抗Ｃ−末端残基３５０−４１４ＴＤＰ−４３抗体（Ｃ３５０−４１４として表示される）はＮｏｖｕｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＵＳＡ）製であり、抗アミロイドオリゴマー抗体Ａ１１はＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）製であった。抗ＤＤＫモノクローナル抗体はＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ製であった。Ａβペプチドは、ゲノミクス研究センター、アカデミアシニカのペプチド合成施設によって合成した。他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）又はＡｍｒｅｓｃｏ（Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）から購入した。全ての細胞培養試薬は、さらに表示するものを除いては、Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。
【００９７】
ＴＤＰ−４３の精製
Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグＴＤＰ−４３を、全長ＴＤＰ−４３をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｑ２Ｂからクローニングした。増幅産物をＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで二重消化し、ｐＥＴ１４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にサブクローニングして、Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグを作製した。Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグ化ＴＤＰ−４３をＥ．  ｃｏｌｉ株Ｒｏｓｅｔｔａ２（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で形質転換及び過剰発現させた。細胞を採取し、氷上の、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％  ＲＮａｓｅ  Ａ、２％  ＤＮａｓｅ  Ｉ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（完全、ＥＤＴＡフリー、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する３０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ  ８中で、マイクロフルイダイザーにより溶解した。溶解物を２７，０００×ｇ、４℃で遠心分離した。上清を、３０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ８、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ  イミダゾール、及び１０％  グリセロールを含有するバッファー中で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ親和性カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）にロードした。同一のランニングバッファー中でイミダゾールステップグラジエントを実施した。ＴＤＰ−４３は、およそ２００ｍＭ  のイミダゾールで溶出した。精製されたｈｉｓ−タグ化ＴＤＰ−４３タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、クーマシーブルー染色によって同定した。組換えＴＤＰ−４３は、余分のＮ−末端残基ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＬＥを有した。計算される分子質量は４７，１４７Ｄａである。示されるように、タンパク質をさらに透析した。タンパク質濃度を、Ｎｉｃｋ  Ｐａｃｅ（Ｐａｃｅら、（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ４、２４１１−２４２３）により記載された等式にしたがう、４４，９２０ｃｍ−１Ｍ−１の消衰係数の２８０ｎｍでの吸収により、バックグラウンド差し引き後に定量化した。短い形態のＴＤＰ−４３については、１５，４７０ｃｍ−１Ｍ−１の消衰係数を使用した。
【００９８】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００  １０／３００  ＧＬ分析用ゲルろ過カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、３０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するランニングバッファー中の分子量マーカー、フェリチン（４４０ｋＤａ）、β−アミラーゼ（２００ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、チトクロームＣ（１２．４ｋＤａ）により標準化した。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。０．２μｍフィルター膜によりろ過した、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来の、３００μｌの体積の組換えＴＤＰ−４３を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムにインジェクションした。１ｍｌの画分をフラクションコレクターによって自動的に回収した。プレロード試料及びオリゴマー画分を回収し、オリゴマー画分からのシグナルが非常に希釈されていることに起因して、異なる暴露時間でＡ１１（１：１０００）によってプロービングされる、ドットブロット法に供した。オリゴマー画分は、動的光散乱で特徴づけた。２μＭのＨＥＫ細胞から得られた１００μｌの体積のＴＤＰ−４３もまた、同一の手順で調べた。画分をスロットブロット法により分析した。
【００９９】
スロットブロット法
ＨＥＫ２９３細胞から単離されたＴＤＰ−４３のサイズ排除クロマトグラフィーの画分は、それらが低い濃度であるため、スロットブロット法によって調べた。１ｍｌの画分毎に２００μｌのアリコートを、自家真空システムを備えるＢｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦ精密ろ過装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）にロードした。抗ＤＤＫモノクローナル抗体（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を、検出のための一次抗体として使用した。強度をＩｍａｇｅ  Ｊ  １．４２（国立衛生研究所、ＭＤ、ＵＳＡ）によって定量化した。
【０１００】
ドットブロット法
精製されたＴＤＰ−４３を、変性剤を含む又は含まない、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ  ８に１０倍希釈した。様々な状態の各試料は、変性剤なしであるか、９Ｍ  尿素、７．２Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ、又は２％  ＳＤＳのいずれかを含有する。最終ＴＤＰ−４３濃度は０．４μＭであった。試料を、１時間、室温又は９０℃でインキュベートした。ＴＤＰ−４３試料２μｌをニトロセルロース膜上にドットし、ドットブロット法に供した。簡単に言うと、ブロッキング及び０．００２％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を含有するトリス緩衝生理食塩水での洗浄後、膜を、ＴＢＳＴを含む５％  ミルク中の抗Ｎ−末端残基１−２６０ＴＤＰ−４３抗体（１：２，０００）、抗Ｃ−末端残基３５０−４１４ＴＤＰ−４３抗体（１：２，０００）、及び抗アミロイドオリゴマー抗体、Ａ１１（１：１，０００）に供し、続いて対応するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体抗ウサギ又は抗マウスＩｇＧ（１：５，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）に供した。膜をＥＣＬ化学発光試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で可視化した。ss
【０１０１】
透過型電子顕微鏡法
新鮮に精製されたＴＤＰ−４３を、１０ｍＭ  トリス含有バッファー、ｐＨ  ８中で、４℃で一晩透析した。試料を、１７，０００×ｇ、４℃で、３０分間遠心分離して沈殿物を除去し、上清を定量化してＴＥＭイメージングに供した。ＴＤＰ−４３試料を、グロー放電された、４００メッシュＦｏｒｍｖａｒ炭素被覆銅グリッド（ＥＭＳ  Ｉｎｃ．、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ、ＵＳＡ）上に５分間置き、リンスし、２％  酢酸ウラニルで陰性染色した。試料は、Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＴＷＩＮ  ＴＥＭ（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ、ＵＳＡ）又はＨｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７０００  ＴＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｉｎｃ．、Ｊａｐａｎ）で、７５ｋＶの加速電圧で調べた。
【０１０２】
原子間力顕微鏡法
新鮮に精製されたＴＤＰ−４３を、１０ｍＭ  トリス含有バッファー、ｐＨ  ８中で、４℃で一晩透析した。試料を、１７，０００×ｇ、４℃で、３０分間遠心分離して沈殿物を除去し、上清を定量化してＡＦＭイメージングに供した。１０μＬの体積のＴＤＰ−４３を新鮮にスライスされた雲母（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）上に滴下し、試料付着のために５分間インキュベートした。試料を、１ｍｌのｄｄＨ２Ｏによって洗浄し、傾斜した雲母の最上部から穏やかに除去した。試料を室温で乾燥させ、タッピングモードを用いるＡＦＭイメージング（Ｎａｎｏｎｉｃｓ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）に供した。ばね定数が１．６Ｎ／ｍ及び先端半径が＜１０ｎｍのＡＦＭチップ、ＰＰＰ−ＺＥＩＬＲ（Ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒｓ、Ｎｅｕｃｈａｔｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を実験に用いた。
【０１０３】
動的光散乱
ＳＥＣからの溶出オリゴマー画分を動的光散乱に使用した。試料は、３０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．４、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー中にあった。データは、５０ｍＷレーザファイバーを備えるＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ動的光散乱装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で取得した。粘度及び屈折率の適当なパラメーターを各溶液について設定し、温度を２５℃に保った。
【０１０４】
円二色性
新鮮に精製されたＴＤＰ−４３を、１０ｍＭ  トリス含有バッファー、ｐＨ  ８中で、４℃で一晩透析した。試料を、１７，０００×ｇ、４℃で、３０分間遠心分離して沈殿物を除去し、上清を定量化してＣＤ測定に供した。遠ＵＶ  ＣＤスペクトルを、円形石英セル（Ｈｅｌｌｍａ、Ｆｏｒｅｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）中で、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１５分光旋光計（Ｊａｓｃｏ  Ｉｎｃ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）によって、１ｍｍの経路長で、室温で測定した。スペクトルを２５０〜１９０ｎｍで収集し、バッファーバックグラウンドで補正した。
【０１０５】
内部及びＢｉｓ−ＡＮＳ蛍光分光法
新鮮に精製されたＴＤＰ−４３を、１０ｍＭ  トリス含有バッファー、ｐＨ  ８中で、４℃で一晩透析した。試料を、１７，０００×ｇ、４℃で、３０分間遠心分離して沈殿物を除去し、上清を定量化した。１．５μＭでのＴＤＰ−４３の内部蛍光を、２８０又は２９５ｎｍで励起しながら３０５〜４００ｎｍで収集した。ＴＤＰ−４３、ＴＤＰ−４３ｓ、及びバッファーコントロールのＢｉｓ−ＡＮＳスペクトルを、４００ｎｍで励起して４５０〜６００ｎｍで収集した。試料は、０．８μＭのＴＤＰ−４３及び５μＭのＢｉｓ−ＡＮＳを含有する。全ての実験は、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−３分光蛍光光度計（Ｈｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて、循環水浴を用い２５℃で行った。
【０１０６】
チオフラビンＴ結合
新鮮に精製されたＴＤＰ−４３を、１０ｍＭ  トリス含有バッファー、ｐＨ  ８中で、４℃で一晩透析した。試料を、１７，０００×ｇ、４℃で、３０分間遠心分離して沈殿物を除去し、上清を定量化した。ＴＤＰ−４３試料及びＡβ４０線維を使用して、チオフラビンＴ結合を検出した。１μＭの試料を、等モルチオフラビンＴと混合し、４４２ｎｍで励起し、４５５〜５０５ｎｍの発光スペクトルを収集した。２５μＭのＡβ４０線維ストックを、以前に記載されたように（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｇｌａｂｅ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（２００６）２８１、２４４１４−２４４２２）調製した。簡単に言うと、合成Ａβを６Ｍ  ＧｄｎＨＣｌに溶解し、１０ｍＭ  リン酸バッファー、ｐＨ  ７．４にリフォールディングした。次いで、２５μＭのＡβを、２５℃で、静止状態で、１０日間より長くインキュベートした。次いで、実験前に成熟線維を１μＭに希釈した。スペクトルをバッファーバックグラウンドから差し引いた。
【０１０７】
コンゴーレッド分光法
透析されたＴＤＰ−４３及び成熟Ａβ線維、０．５μＭの吸光度を、４００ｎｍ〜６００ｎｍで、１０μＭ  コンゴーレッドの存在下で、ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計ＤＵ８００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣＡ）によって測定した。
【０１０８】
ＯＣ抗体によるドットブロット法
透析されたＴＤＰ−４３及びＡβ線維（２μｌ、０．５μＭ）をニトロセルロース膜上にドットし、標準ドットブロット手順を実施した。ＯＣ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：１０，０００）及びＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（１：１０，０００）を用いた。
【０１０９】
ＤＮＡ結合の蛍光滴定
蛍光滴定を用いて、ＤＮＡ結合の際のタンパク質コンホメーション変化をモニターした。３０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ８中、１．５μＭの、新鮮に精製され透析された全長ＴＤＰ−４３及び短い形態のＴＤＰ−４３（残基１０１−２８５）を、ＴＡＲ  ＤＮＡ  Ａ−部位（配列番号：９）及びＢ−部位（配列番号：１０）を含む一本鎖ＴＡＲ  ＤＮＡで滴定した。内部タンパク質蛍光を２８０ｎｍで励起して、ＴＤＰ−４３のコンホメーション変化をモニターした。発光スペクトルをＦｌｕｏｒｏＭａｘ−３分光蛍光光度計（Ｈｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって収集した。全長又は短い形態のＴＤＰ−４３についての３５０ｎｍでの発光最大値を収集し、ＤＮＡコントロールで差し引き、希釈因子で補正した。次いで、データを開始強度に正規化し、さらに、以下の単一のタンパク質及びリガンド結合等式（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ（２００４）１３、２１９６−２２０６）に当てはめた。
【数１】
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式中、γは、結合したタンパク質比を表す観察されたシグナル変化の比であり、Ｐｔは総ＴＤＰ−４３濃度であり、Ｌｔは総リガンド濃度であり、Ｋｄは解離定数である。データ及び当てはめは、ＤＮＡ及びＴＤＰ−４３の比率に対してプロットされている。
【０１１０】
オリゴマークロスシーディング及びＴｈＴアッセイ
Ａβは、我々の以前のプロトコル（Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（２０１１）２８６、９６４６−９６５６；Ｎｉら、ＦＡＳＥＢ（２０１１）２５、１３９０−１４０１）にしたがい調製した。Ａβ４０を、８Ｍ  ＧｄｎＨＣｌを含有するバッファーＡ（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．４）に溶解し、リフォールディングし、２８０ｎｍでの吸収（ε＝１，２８０ｃｍ−１Ｍ−１）を用いて定量化した。２５μＭ  Ａβ、５０μＭ  ＴｈＴ、及び０〜１μＭ（０−４％）の範囲の様々な濃度の新鮮に透析されたＴＤＰ−４３を含有する実験試料を、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ８、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に調製した。次いで、試料を、９６穴ＥＬＩＳＡプレート中で、静止状態で、透明フィルムで密封してインキュベートし、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって、２５℃で様々な時間でモニターした。ＴｈＴ発光は、４４２ｎｍで励起しながら４８５ｎｍで測定した。
【０１１１】
光誘導性架橋（ＰＩＣＵＰ）
この実験は、以前に記載されたように（Ｂｉｔａｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６、３５１７６−３５１８４）実施した。簡単に言うと、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの泳動を容易にするために、Ａβストックを、８Ｍ  尿素及び１０ｍＭ  リン酸ナトリウム含有バッファー、ｐＨ  ７．４を使用することにより調製した。２５μＭのＡβ試料を、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ８、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有し、ＴＤＰ−４３を示される様々な濃度で含む又は含まないバッファー中に調製した。試料を直ちにＰＩＣＵＰアッセイに供した。９０％のＡβ溶液を、５％の３ｍＭ  Ｒｕ（Ｂｐｙ）及び５％の２０ｍＭ  ＡＰＳと混合した。混合後、試料を、密閉チャンバー内で、手動スイッチを用いて、３０秒間、青色光ＬＥＤに暴露した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーを添加することによって架橋反応を停止させ、試料を１６％  トリス−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。すべての活動は遅延なく実施された。このゲルを、Ａβ残基１−１７を認識する抗Ａβ抗体６Ｅ１０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）及び抗Ｎ−末端ＴＤＰ−４３  １−２６０抗体を用いるウエスタンブロッティングに供した。
【０１１２】
ヒト神経芽細胞腫を用いるＴＤＰ−４３の細胞毒性試験
ＴＤＰ−４３の細胞毒性試験を実施するために、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、アメリカ合衆国）アッセイを、ヒト神経芽細胞腫ＢＥ（２）−Ｃ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２６８）を使用して最初に用いた。この細胞を、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）を含むＲＰＭＩ増殖培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃で、５％  ＣＯ２及び加湿雰囲気下で培養した。１ウェルあたり合計６０，０００細胞を、透明９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）に播種し、一晩インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、４０μｌの血清フリーＲＰＭＩ培地によって置き換え、続いて透析バッファーで連続的に希釈された１０μｌのＴＤＰ−４３試料を添加した。ＴＤＰ−４３試料は、新鮮に透析し遠心分離した。この上清を用い、透析バッファーはバッファーコントロールの役割を果たした。細胞を２４時間さらにインキュベートし、標準プロトコルにしたがいＭＴＴアッセイを実施した。短く述べると、７μｌの体積の５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴを各ウェルに添加し、細胞を３時間インキュベートした。次いで、培地を捨て、紫色ホルマザン結晶が完全に溶解するまでＤＭＳＯを添加して、細胞を溶解させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）によって５７０及び６９０ｎｍでの吸光度を測定し、５７０ｎｍでのシグナルを６９０ｎｍのシグナルから差し引いた。５つのレプリカから得られたデータを平均し、細胞を含まない試料バックグラウンドで補正した。細胞生存能力を、バッファーで処置した細胞を１００％として用いるデータの正規化の後に示した。ＬＤＨアッセイを製造者のプロトコルにしたがい実施した。簡単に言うと、２０，０００個の細胞を増殖培地に播種し、２４時間インキュベートした。試料を、ＭＴＴアッセイに記載されるように処置した。ＬＤＨ基質をアッセイバッファーと混合し、室温に保った。基質添加前に、細胞を室温に３０分間冷却した。暗所で１時間インキュベートした後、基質蛍光を５６０ｎｍで励起し、５９０ｎｍでの発光をＥＬＩＳＡプレートリーダーによって測定した。データを３つのレプリカから取得し、平均し、細胞を含まない試料バックグラウンドによって補正した。ＭＴＴ及びＬＤＨアッセイのｐ−値は、対応のないスチューデントのｔ検定を用いて計算した。
【０１１３】
マウス１次皮質ニューロンを用いるＴＤＰ−４３の細胞毒性試験
妊娠Ｃ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｙａｎｇ  Ｍｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔａｉｐｅｉ、台湾の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）の承認を得て、国立実験動物センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＮＬＡＣ、台湾）から購入した。１次皮質ニューロン培養物は、胚生１９日目のマウスから作製し、２μＭ  ＦｄＵを含有するｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（２１１０３０４９、ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）を含む９６穴プレート（２ｘ１０５細胞／ウェル）に播種した。８日間インビトロで増殖させた後、１次ニューロン培養物を、新鮮に透析された可溶性ＴＤＰ−４３で２４時間処置し、次いで０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴと共に３時間インキュベートした。透析バッファーはバッファーコントロールの役割を果たした次いで、ＭＴＴホルマザン結晶を、１０％  ＳＤＳ及び２０ｍＭ  ＨＣｌを含有する等しい体積の溶解バッファーによって一晩溶解した。各ウェルの波長５７０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。データを３つのレプリカから取得し、平均し、細胞を含まない試料バックグラウンドによって補正した。ＭＴＴアッセイのｐ−値は、対応のないスチューデントのｔ検定を用いて計算した。
【０１１４】
免疫細胞化学
１２ｍｍガラスカバースリップを備える２４穴プレートで１次ニューロン細胞を培養し（３×１０５細胞／ウェル）、各ウェルをポリ−Ｄ−リシンでコーティングした。細胞は、ＴＤＰ−４３（０．６μＭ）又はバッファーコントロールで、２４時間、３７℃で、５％  ＣＯ２の加湿雰囲気中で処置し、４％  パラホルムアルデヒドによって、２０分間、室温で固定した。次いで、細胞を、ＰＢＳで１０分間、３回洗浄し、ブロッキングバッファー（０．３％  トリトンｘ−１００及び１０％  ＦＢＳを含有するＰＢＳ）で、１時間、室温でブロッキングした。ブロッキング後、微小管結合タンパク質−２（ＭＡＰ−２）（ＭＡＢ３７８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）及びポリクローナルウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（Ｚ０３３４、ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の一次抗体によって、２時間、室温で、細胞を最初にハイブリダイズし、次いで、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＵＫ）又はＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）の蛍光色素結合二次抗体によって、１時間、室温で、ハイブリダイズした。最終的に、ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）＋ＤＡＰＩ、Ｈ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．）を含有するゲルをマウントすることによって細胞をマウントし、Ｏｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡（ＢＸ−６１、Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって観察した。
【０１１５】
ＴＤＰ−４３の海馬内注射
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｎｇ  Ｋｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＣＫＵ）（Ｔａｉｎａｎ、台湾）の動物センターにおいて、ＮＣＫＵのＩＡＣＵＣのガイドラインにしたがって、購入及び繁殖させた２月齢のオスＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスを、海馬内注射に適用した。動物は、ノーズチューブを介するイソフルラン吸入（酸素中１．２％）で麻酔した。各動物は、組換え全長ＴＤＰ−４３の両側海馬内注射を受けた。定位固定座標は、ブレグマに関して以下の通りであった：前後方向（ＡＰ）、−２ｍｍ；内外側方向（ＭＬ）、±１ｍｍ；背腹方向（ＤＶ）、−２ｍｍ。注射針を所望の深さにゆっくりと接近させ、マイクロシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＶ、ＵＳＡ）に連結されたステンレス鋼シリンジ針（３３ゲージ）を用いて、１μｌ／ｍｉｎの注射速度で、２μｌのＴＤＰ−４３、２．２μＭを注射した。針をさらに５分間そのままにし、注射されたＴＤＰ−４３の拡散を制限した。
【０１１６】
マウス脳の免疫蛍光染色
１２月齢のオスの野生型マウス、並びに６月齢の及び１２月齢のＴＤＰ−４３Ｔｇ＋／＋トランスジェニックマウスを免疫蛍光染色に採用した。全てのマウスもまた、ＮＣＫＵのＩＡＣＵＣのガイドラインにしたがって、ＮＣＫＵの動物センターにおいて飼養した。ＴＤＰ−４３注射の２週間後に、成体マウスを深く麻酔し、４％  パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／０．０１Ｍ  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ  ７．４で経心腔的に灌流した。脳を除去し、次いで３０％  スクロース／４％  ＰＦＡ溶液中に一晩保存した。１０μｍ厚の切片を、０．０１Ｍ  ＰＢＳ中に０．２％  トリトンＸ−１００及び５％  正常ロバ血清を含有するブロッキング溶液で、室温で１時間処置した。海馬内注射の実験のために、切片を、マウスモノクローナル抗ＮｅｕＮ（１：３００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）中で、４℃で一晩インキュベートし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５結合ロバ抗マウス抗体（１：３００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）中で、室温で１時間インキュベートした。次いで、切片をＤＡＰＩで対比染色し、蛍光マウント培地（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）でマウントした。全ての切片を、正立蛍光顕微鏡（ＢＸ５１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）下で調べた。トランスジェニックマウスにおける共局在研究のために、切片を抗ＴＤＰ−４３抗体（１：１０００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１０４２２３）、ＴＤＰＯ（１：１０００、ＬＴＫ  ＢｉｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、台湾）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合ヤギ抗ウサギ抗体及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５結合ロバ抗マウス抗体（１：３００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。次いで、切片をＤＡＰＩと共にインキュベートし、蛍光マウント培地（蛍光マウント培地；Ｄａｋｏ）でカバースリップをかけた。全ての切片を、レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００ＥＰＦＳ−Ｃ１−Ｓｉ）で調べた。
【０１１７】
ＴＤＰ−４３オリゴマー特異性ポリクローナル抗体の産生及び特徴付け
精製された全長ＴＤＰ−４３を、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０中で、４℃で透析し、およそ０．２ｍｇ／ｍｌに濃縮して免疫原とした。ポリクローナル抗体産生のための標準プロトコル（ＬＴＫ  ＢｉｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、台湾）にしたがって、ニュージーランド白色ウサギをこの免疫原で免疫化した。簡単に言うと、０．５ｍｌの免疫原を２週間間隔でウサギに注射した。６回の注射後、ウサギを屠殺し、使用のために血清を得た。ドットブロット法及びＥＬＩＳＡによるＴＤＰ−Ｏの特徴付けのために、全長ＴＤＰ−４３を、３０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー中のＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００  １０／３００  ＧＬ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に、０．３ｍｌ／ｍｉｎの流速で供した。１ｍｌの画分を回収し、ＴＤＰ−Ｏ及びＮ１−２６０抗体によってプロービングされるドットブロット法に供した。ＴＤＰ−４３オリゴマー及びモノマー画分を、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によってさらに定量化し、連続的に希釈してＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。標準プロトコルにしたがうＥＬＩＳＡを実施した。簡単に言うと、コーティングされた試料を、一晩４℃でインキュベートし、次いで、２時間室温で、ＴＢＳＴ中１０％  スキムミルクでブロッキングした。プレートを洗浄し、ＴＤＰ−Ｏ（ＴＢＳＴ中の３％  スキムミルク中、１：１２，５００）又は抗Ｎ−末端残基１−２６０ＴＤＰ−４３抗体（ＴＢＳＴ中の３％  スキムミルク中、１：１，０００希釈）によって、２時間室温でプロービングした。洗浄後、プレートを抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（１：１，０００；Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）に、２時間室温で供し、洗浄し、次いで、１００μｌの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）によって可視化した。１００μｌの２５０ｍＭ  ＨＣｌを添加することによって反応を停止し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【０１１８】
β５線維の作製
ＴＤＰ−４３フラグメントのＲＲＭ２ドメイン内のβ５ペプチドを化学的に合成した（ＭＤＢｉｏ，  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）。このペプチドをアセトニトリルによって可溶化し、ＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）で１０倍に、５ｍｇ／ｍｌに希釈した。１７，０００×ｇで３０分間の遠心分離の後に上清を回収し、０．２μｍフィルター膜（Ｐａｌｌ、ＵＳＡ）を通してろ過した。次いで、試料を、静止状態で、室温で７日間インキュベートした。β５線維が形成され、形態をＴＥＭによって観察した。試料を、上述の手順にしたがい、ＴＤＰ−Ｏ抗体によりプロービングされるドットブロット法に供した。
【０１１９】
ＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者の脳組織のＴＤＰ−Ｏ染色
パラフィン包埋組織切片をキシレンで３回洗浄して脱ワックスした。次いで、組織をアルコールグラジエントを介して水和させ、続いて１ｘ  ＴＢＳで５分間洗浄した。１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ  ６）を使用して、１５分間フルパワー（１，５００ワット）でマイクロウェーブを作動させることによって、抗原回復を実施した。組織を１ｘ  ＴＢＳ中の３％  過酸化水素中で２０分間インキュベートすることにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングし、続いて１ｘ  ＴＢＳで５分間洗浄した。組織を、１０％  正常ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１時間、周囲温度でインキュベートすることにより、非特異的結合をブロッキングした。抗体バッファー（５％  ウシ血清アルブミン及び０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を補充した１ｘ  ＴＢＳ）中に、一次抗体を１：１０００に希釈し、一晩４℃で組織に適用した。スライドを洗浄バッファー（１ｘ  ＴＢＳ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で３回洗浄した。ビオチン化二次抗体を、抗体バッファー中１：５００希釈で、１時間、周囲温度で適用した。組織を洗浄バッファー中で３回洗浄し、次いでＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣペルオキシダーゼ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＰＫ−６１００）と共に３０分間インキュベートし、続いて１ｘ  ＴＢＳ中で１回洗浄した。次いで、ＤＡＢペルオキシダーゼ基質試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＳＫ−４１００）に、２−１０分間組織を暴露して、最適な染色を達成した。Ｍａｙｅｒｓヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で組織を対比染色し、次いでアルコールグラジエントを介して脱水し、続いてキシレン洗浄した。組織スライドをＰｅｒｍｏｕｎｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してマウントした。３のコントロール、３のＦＴＬＤ−ＴＤＰ、及び３のＡＤ患者からの死後の脳試料が、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｄａｖｉｓのアルツハイマー病センターから提供された。この研究は、施設内治験審査委員会によって承認された。死後に研究組織を共有するためのインフォームドコンセントを、全ての患者から得た。
【０１２０】
ＦＴＬＤ−ＴＤＰ脳における、ＴＤＰ−４３オリゴマーのＩＰ及び免疫標識
２のコントロール及び１のＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者の凍結脳組織を、５０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  トリトンＸ−１００、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有する溶解バッファーで、〜０．０５ｇ／ｍｌに溶解した。溶解させた試料を、組織粉砕器（Ｗｈｅａｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって、氷上でホモジナイズした。ホモジナイズ後、１７，０００ｘｇで、１０分間、４℃での遠心分離後に可溶性画分を回収し、ＩＰ分析のために保存した。組織分画の前に、製造者の手順にしたがい、ＩＰビーズ上にＴＤＰ−Ｏ抗体が架橋されたものを調製した。簡単に言うと、合計４０μｇのＴＤＰ−Ｏ抗体を、１０μｌのタンパク質Ａ及びＧ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｘｔｒａ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のそれぞれと共に、結合バッファー（５０ｍＭ  トリスｐＨ  ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で、室温で１時間インキュベートした。ビーズ上に抗体を結合させた後、架橋試薬（５０ｍＭ  ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩及び２００ｍＭ  トリエタノールアミン、ｐＨ  ８．９）によって、室温で１時間、架橋を実施し、１００ｍＭ  エタノールアミン、ｐＨ  ８．９を、室温で３０分間添加することによって、反応を停止した。次に、海馬の可溶性画分を、ＴＤＰ−Ｏ抗体架橋ＩＰビーズと共に、室温で１時間インキュベートした。非結合種は、結合バッファーでの少なくとも６回の洗浄によって除去した。Ｇｅｎｔｌｅ  Ａｇ／Ａｂ溶出バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）、ｐＨ  ６．６によって標的タンパク質を溶出し、溶出液をＥＭイメージング及び免疫金標識のために保存した。免疫金標識のために、１０μｌの溶出液を、４００メッシュＦｏｒｍｖａｒ炭素被覆銅グリッド（ＥＭＳ  Ｉｎｃ．、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ、ＵＳＡ）上に５分間置き、ＰＢＳによって洗浄し、次いでＰＢＳ溶液中１％  ＢＳＡによって、室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、０．１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液中のＮ１−２６０抗体（１：５，０００、ａｂ５７１０５、Ａｂｃａｍ）によって、室温で１時間、グリッドを標識し、高塩濃度ｔｗｅｅｎ（ＨＳＴ）バッファー（５０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）及びＰＢＳによって洗浄した。洗浄後、グリッドを、６ｎｍ金結合２次抗マウスＩｇＧ抗体（１：４０、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に、室温で１時間インキュベートした。ＨＳＴ洗浄及びＰＢＳ洗浄によって非結合抗体を除去した。次いで、１％  グルタルアルデヒド含有ＰＢＳによって、室温で１０分間グリッドを固定し、ｄｄＨ２Ｏによって６回洗浄した。最終的に、グリッドをリンスし、２％  酢酸ウラニルで陰性染色し、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  Ｆ２０  Ｓ−ＴＷＩＮ  ＴＥＭでのＴＥＭイメージングに供した。
【０１２１】
モノクローナルＴＤＰ−Ｏ抗体の精製
製造者の手順にしたがい、タンパク質Ｇアガロースキット（ＫＰＬ）によって、モノクローナルＴＤＰ−Ｏ抗体を精製した。簡単に言うと、２０％  エタノール中に供給されたタンパク質Ｇアガロース（１．５ｍｌ）を使い捨てカラムに注いだ。１０ｍｌの洗浄バッファー（０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で樹脂を洗浄した。ＴＤＰ−Ｏハイブリドーマ細胞の条件培地（５ｍｌ）を５ｍｌの結合バッファーで希釈した。次いで、混合された試料溶液をカラムにロードし、混合のためにカラムを反転させた。次いで、カラムを、ＯＤ２８０ｎｍが０に近づくまで、５ｍｌの洗浄バッファーによって４回洗浄した。次いで、１ｍｌの溶出バッファー（０．２Ｍ  グリシン、ｐＨ  ２．８５）を添加することによって抗体を穏やかに溶出し、２４０μｌの５Ｘ洗浄バッファーを含む回収チューブに回収した。抗体を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  ３０ｋＤａカットオフ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、バッファーを洗浄バッファーに交換した。２８０ｎｍでの吸光度によって抗体の濃度を定量化した（１ｍｇ抗体の吸光度＝１．３４）。
【０１２２】
間接ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ９６穴プレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ）を、ＴＢＳ（５０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中２００μｌに溶解した２０ｎｇの全長ＴＤＰ−４３オリゴマータンパク質で、４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を除去した後、０．２％  ＳＤＳを含む及び含まないＴＢＳバッファーをコーティングされたウェルに室温で１時間添加した。ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで処置したＴＤＰ−４３オリゴマーは変性する一方で、ＳＤＳを含まないＴＢＳバッファーで処置したＴＤＰ−４３オリゴマーはオリゴマーコンホメーションを維持することとなる。処置後、バッファーを除去し、２００μｌのＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．６、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中１０％  スキムミルクで、２時間室温で、ウェルをブロッキングした。ＰＢＳＴ（３００μｌ／ウェル）で３回洗浄した後、５％  スキムミルクを含有するＴＢＳＴ中に希釈されたｍＴＤＰ−Ｏ抗体（０．００００１〜２μｇ／ｍｌ）１００μｌを添加し、１時間室温でインキュベートした。３００μｌのＰＢＳで２回洗浄した後、ＴＢＳＴ中の５％  スキムミルク中に希釈された、１００μｌのＨＲＰ結合抗マウス抗体（１：１，０００）を続いて用いることによって、結合した抗体を検出した。１時間室温でインキュベートし、３００μｌのＰＢＳによって２回洗浄した後、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＫＰＬ  ＳｕｒｅＢｌｕｅ）（１００μｌ）を各ウェルに添加し、混合物を１０分間室温でインキュベートした。１００μｌの２５０ｍＭ  ＨＣｌを混合物に添加することによって反応を停止し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって、４５０ｎｍでの光学的密度を測定した。
【０１２３】
間接ＥＬＩＳＡアッセイのためのＴＤＰ−４３オリゴマー及びモノマーの調製
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  ３０ｋＤａカットオフを使用することによって、ＴＤＰ−４３タンパク質（１８０μｇ／ｍｌ）を３から１ｍｌに濃縮した。濃縮されたＴＤＰ−４３タンパク質溶液、５００μｌを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラムにロードし、３０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌで、０．３ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。画分（５００μｌ毎画分）を回収し、ＴＤＰ−４３オリゴマー又はモノマーを含有する画分を別々にプールした。ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ）によってタンパク質濃度を定量化した。ＴＤＰ−４３モノマー又はオリゴマー（３００ｎｇ）を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ）上にコーティングした。ＴＤＰ−Ｏハイブリドーマ細胞の条件培地（１００μｌ）（１：１，０００）を使用して、上述の間接ＥＬＩＳＡアッセイによりＴＤＰ−４３オリゴマーを検出した。
【０１２４】
抗体アイソタイプの決定
ｍＴＤＰ−Ｏ抗体のアイソタイピングを、ＥＬＩＳＡマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）アイソタイピングキット（Ｔｈｅｒｍｏ）によって、製造者の手順にしたがい実施した。このアッセイにおいて、個々のウェルが抗マウス重鎖補足抗体（抗ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ及びＩｇＭ）又は抗マウス軽鎖補足抗体（カッパ又はラムダ）でプレコーティングされているＥＬＩＳＡストリップウェルプレートを使用した。簡単に言うと、ＴＤＰ−Ｏハイブリドーマ細胞系統の条件培地をＴＢＳ中で５０倍に希釈し、試料を８ウェルストリップの各ウェルに添加した。次いで、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（５０μｌ）を８ウェルストリップの各ウェルに添加し、反応物を１時間室温でインキュベートした。３回洗浄した後、ＴＭＢ基質（７５μｌ）を各ウェルに添加し、プレートを、室温で、暗所で１０分間インキュベートした。次に、７５μｌの０．１８Ｍ  硫酸を添加することにより反応を停止した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【０１２５】
Ｉｇ可変（Ｖ）遺伝子のクローニング及び配列決定
ＧｅｎｅＪＥＴ  ＲＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、全ＲＮＡを２×１０６ハイブリドーマ細胞から調製した。Ｍａｘｉｍａ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用することにより、ｃＤＮＡ合成を行った。次いで、マウスＩｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇ２  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｉｇ重鎖及びカッパ遺伝子を増幅した。ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＰＣＲ産物をクローニングした。最終的に、ＤＮＡ配列決定を、Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈによって実施した。
【０１２６】
細胞毒性アッセイ
ＭＴＴアッセイを用いて、ＴＤＰ−４３オリゴマー誘導細胞毒性に対するモノクローナルＴＤＰ−Ｏ抗体の阻害効果を調べた。ヒト神経芽細胞腫ＢＥ（２）−Ｃ細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−２２６８）を、３７℃で、５％  ＣＯ２下でインキュベートし、１０％  ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ培地中で培養した。細胞を、９６穴プレートのＲＰＭＩ培地中に、１ウェルあたり４０，０００細胞で播種し、２４時間インキュベートした。ダルベッコのＰＢＳでさらに希釈することなく、又は２倍若しくは４倍希釈して、モノクローナルＴＤＰ−Ｏ−３（５ｍｇ／ｍｌ）を調製した。培地を捨て、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ培地によって細胞を１回洗浄した。ＲＰＭＩ培地（４０μｌ）を各ウェルに添加し、続いて２０μｌの１．５μＭ  ＴＤＰ−４３オリゴマー及び１μｌの５、２．５、又は１．２５ｍｇ／ｍｌ  ＴＤＰ−Ｏ抗体溶液を添加した。さらに２４時間細胞をインキュベートした。その後、７μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液を添加し、３時間インキュベートした。培地を捨て、ＤＭＳＯを使用してホルマザン結晶を溶解した。５７０及び６９０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって測定した。５７０ｎｍと６９０ｎｍとの間の吸光度差を計算し、平均し（ｎ＝３）、細胞を含まないバックグラウンドを差し引いた。バッファーコントロールを使用して各データセットを正規化した。一元配置分散分析によって統計的分析を実施した。
【０１２７】
例１  全長ＴＤＰ−４３は凝集体を容易に形成する
【０１２８】
この例において、ＴＤＰ−４３病理のメカニズムを調査した。Ｅ．  ｃｏｌｉの組換え全長ヒトＴＤＰ−４３（Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグを有するＴＤＰ−４３、ＭＷ  ４７，１４５Ｄａ）及びＨＥＫ２９３細胞から精製されたＴＤＰ−４３タンパク質を、「材料及び方法」に記載の手順にしたがい、それぞれ得た。次いで、このようにして得られたＴＤＰ−４３タンパク質をＳＥＣ分析に供した。結果を図１Ａに示す。図１Ａに明示されるように、８６％超のＴＤＰ−４３がボイド容量に溶出した。そしてスロットブロット法は、２の異なる源からの組換え全長ＴＤＰ−４３タンパク質の大部分が、大きな凝集体を容易に形成することを確認した。ＴＤＰタンパク質症が封入体（ＩＢ）形成を特徴とし、高分子量凝集体が組換え全長ＴＤＰ−４３において見出されたため、我々は、ＴＤＰ−４３が、アミロイドーシスにおけるアミロイドオリゴマーに似たオリゴマーを形成する可能性があると推測した。したがって、Ａβオリゴマー模倣体に対して作製された、コンホメーション依存性抗アミロイドオリゴマー特異性抗体、Ａ１１を使用して、ＴＤＰ−４３オリゴマーを調べたところ、我々は、両方のＴＤＰ−４３試料がＡ１１と免疫反応性であり、対応するバッファーはＡ１１と免疫反応性でなかったことを見出した（図１Ｂ）。希釈されたＴＤＰ−４３を含有するオリゴマー画分は、より弱い強度を示した。
【０１２９】
認識がコンホメーション依存性であるかどうかを確認するために、様々な変性方法を用いて、Ａ１１並びに抗Ｎ−末端及びＣ−末端ＴＤＰ−４３抗体によるドットブロット法にＴＤＰ−４３オリゴマーを供する前に、ＴＤＰ−４３オリゴマーを破壊した（図１Ｃ）。タンパク質を、様々なバッファー、すなわち、９Ｍ  尿素、７．２Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ、又は２％  ＳＤＳを含む又は含まないバッファー中でインキュベートし、９０℃で１時間さらに処置した。Ａ１１の検出について、加熱は、ネイティブバッファーにおける検出シグナルを顕著に変化させなかった。しかしながら、シグナルは高い濃度の尿素又はＧｄｎＨＣｌの存在下で弱められ、追加の加熱処置によってほぼ無くなった。シグナルは、２％  ＳＤＳの存在下で、加熱に関係なく、検出されなかった。対照的に、抗Ｎ−末端抗体は、すべての条件にわたって一貫して、ＴＤＰ−４３を認識した。これは、等しい量のタンパク質がドットされたことを確認するものである。試料が尿素及び加熱で変性された場合又は試料がＧｄｎＨＣｌで、加熱して又は加熱せずに変性された場合には、抗Ｃ−末端抗体による認識は、少なくなった又は完全に喪失した。これらの所見は、抗Ｃ−末端ＴＤＰ−４３抗体によって認識されるエピトープが、これらの変性条件下で変化することを示す。
【０１３０】
まとめると、これらの結果は、組換え全長ＴＤＰ−４３が、アミロイドオリゴマーと共通のエピトープを共有する高分子量種を容易に形成することを示した。これらの種は、化学的変性下では安定性が高いが、ＳＤＳ感受性である。
【０１３１】
例２  全長ＴＤＰ−４３は不均一球状オリゴマーを形成する
【０１３２】
この例において、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）（図１Ｄ）及び原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）（図１Ｅ）によって、凝集体の形態を観察した。ＴＥＭは、いくつかのスフェロイド状及びリング状の特徴を有する不均一球状種を明らかにしたが、一方で、ＡＦＭは、ほとんどがスフェロイドであり、リング状構造はほとんどないことを明らかにした（図１Ｅ、挿入図）。粒子サイズ分布は、ＴＥＭ画像に基づき計算した。球状粒子の大部分は、直径が約４０〜６０ｎｍであった（データは示されず）。ＡＦＭによって調べられたリング状オリゴマーは、高さが６ｎｍであった（データは示されず）。加えて、ＳＥＣから溶出されたオリゴマー画分の動的光散乱（ＤＬＳ）もまた、粒子サイズが直径４０〜４００ｎｍの範囲の不均一分布を示した（図１Ｆ）。これらの粒子の最も大きい集団は、約５０〜６０ｎｍの直径を有した（図１Ｇ）。これは、ＴＥＭ研究からの結果と一致する。イメージング及びサイズ分布の所見を組み合わせて、我々の結果は、全長ＴＤＰ−４３が、球状超微細構造を有する不均一粒子を形成したことを示した。この結果は、野生型ＴＤＰ−４３及びＡＬＳ結合ＴＤＰ−４３変異体がオリゴマーを形成したことを示唆する以前の報告と一致する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ（２００９）２８４、２０３２９−２０３３９）。まとめると、我々は、構造的に及び免疫学的に、これらのＴＤＰ−４３種が、いくつかの神経変性疾患において神経毒性であると幅広く考えられている球状アミロイドオリゴマーに、非常に似ていたことを見出した。
【０１３３】
例３  ＴＤＰ−４３オリゴマーは、コンホメーション的及び機能的に区別できる
【０１３４】
ＴＤＰ−４３オリゴマーをさらに調べるために、ＴＤＰ−４３オリゴマーの２次構造を遠ＵＶ円二色性（ＣＤ）によって特徴付けた。結果を図２Ａに示す。２つの二重最小値が、２１０及び２２２ｎｍ付近にそれぞれ観察された。これはおそらくα−らせん構造を表す。このスペクトルは、その結晶構造中のほとんどがβ−ストランドである２つのＲＲＭを含む、短い形態のマウスＴＤＰ−４３（残基１０１−２６５、プロットではＴＤＰ−４３ｓとして表示される）のものとは異なる（Ｋｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００９）３７、１７９９−１８０８）。内部芳香族残基の励起から得られる蛍光スペクトルは、およそ３４０ｎｍで発光最大値を示した。これは、ＴＤＰ−４３のチロシン及びトリプトファン残基が溶媒暴露されたことを示す（データは示されず）。さらに、暴露された疎水性のタンパク質表面を検出するために、タンパク質フォールディング時の部分的にフォールディングされていない中間体を通常プロービングする外部蛍光色素Ｂｉｓ−ＡＮＳを用いた。結果を図２Ｂに示す。図２Ｂに示されるように、全長ＴＤＰ−４３は、短い形態のＴＤＰ−４３よりも大きい程度に、Ｂｉｓ−ＡＮＳと反応した。これは、全長ＴＤＰ−４３オリゴマーが短い形態のＴＤＰ−４３とは異なる疎水性暴露表面積を有することを、さらに示唆する。
【０１３５】
加えて、古典的なアミロイド色素チオフラビンＴ（ＴｈＴ）もまた使用して、全長ＴＤＰ−４３がＴｈＴに結合するかどうかを調べた。結果を図２Ｃに示す。ＴｈＴ結合から生じる全長又は短い形態のＴＤＰ−４３のいずれについても、蛍光発光ピークは見られなかった。対照的に、同一のタンパク質濃度、１μＭのＡβ線維は、強い蛍光発光を示した（図２Ｃ）。これは、チオフラビンを用いる病理学的調査結果と一致する。同様に、コンゴーレッドとのＴＤＰ−４３オリゴマー結合及び抗線維抗体ＯＣとのその免疫反応性は、全て陰性であった（データは示されず）。これらの結果及びＣＤデータは、ＴＤＰ−４３オリゴマーがクロスβシート構造を採用していそうにないことを示唆する。しかしながら、さらなる特徴付けのための原子レベルの構造研究が必要である。
【０１３６】
正常な、機能的ＴＤＰ−４３が特定の核酸配列に結合すると仮定して、次いで我々は、ＴＤＰ−４３オリゴマーがＤＮＡ結合能力を妨げるかどうかを調査した。蛍光滴定を採用して、ＤＮＡ結合の際のタンパク質コンホメーション変化をモニターした。結果を図２Ｄに示す。簡単に言うと、ＴＤＰ−４３オリゴマーを一本鎖ＴＡＲ  ＤＮＡ−Ａ部位又は−Ｂ部位で滴定し、これらのｓｓＤＮＡとミクロモル以下の親和性で結合すると報告されている（Ｋｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００９）３７、１７９９−１８０８）短い形態のＴＤＰ−４３と比較した。図２Ｄに明示されるように、ＴＡＲ  ＤＮＡ−Ａ部位及び−Ｂ部位の両方は、低いｓｓＤＮＡ濃度で短い形態のＴＤＰ−４３蛍光を消光し、一方で、消光のレベルは、全長ＴＤＰ−４３において顕著に低減した。データは、ＴＤＰ−４３及びｓｓＤＮＡの１：１化学量論を示す「材料及び方法」セクションにおいて記載した単一のタンパク質及びリガンド結合等式によく当てはまった。当てはめから得られた解離定数、Ｋｄは、ＴＡＲ−Ａで滴定した全長ＴＤＰ−４３、ＴＡＲ−Ｂで滴定した全長ＴＤＰ−４３、ＴＡＲ−Ａで滴定した短い形態のＴＤＰ−４３、及びＴＡＲ−Ｂで滴定した短い形態のＴＤＰ−４３についてそれぞれ、７．０５±０．８２、６．２７±０．６８、０．２０±０．０９、及び０．３８±０．１０μＭである。この結果は、短い形態についてのｓｓＤＮＡ結合が、ＴＡＲ−Ａ部位及び−Ｂ部位がＴＤＰ−４３に対する同様の親和性を有する、全長ＴＤＰ−４３についてのｓｓＤＮＡ結合の１５倍よりも強いことを示した。この所見は、全長ＴＤＰ−４３オリゴマーのＲＲＭが、結合領域のマスキングのために、ＤＮＡ結合から妨害されるか、又はＤＮＡ結合能力が低下した異常コンホメーションを有することを示す。全長ＴＤＰ−４３内に残った発光変化は、試料におけるＴＤＰ−４３モノマーの小さい集団の存在に起因する可能性がある。まとめると、これらの結果は、ＴＤＰ−４３オリゴマーが、短い形態のＴＤＰ−４３とは異なる生物物理学的及び生化学的特性を有することを実証した。これは、それらのコンホメーションが区別できることを示す。
【０１３７】
例４  ＴＤＰ−４３オリゴマーは、Ａβをアミロイドオリゴマーに変換する
【０１３８】
この例において、クロスシーディング実験によって、ＴＤＰ−４３がＡβ線維化経路に影響を与え得るかどうかを調査した。
【０１３９】
最初に、ＴＤＰ−４３オリゴマーの非存在下、及び０．４〜４％の範囲のＴＤＰ−４３オリゴマーの存在下でのＴｈＴアッセイによって、Ａβ４０線維化を調べた。結果を図３Ａに示す。ＴＤＰ−４３がＡβ線維化を用量依存的に強く阻害したことが見出された（図３Ａ）。４％  ＴＤＰ−４３の存在は、およそ１８０時間の実験時間全体の間に、Ａβ線維化を完全に抑制した。次いで、光誘導性架橋（ＰＩＣＵＰ）を実施して、開始時点で現れた一過性Ａβ種を調べた。この結果は、Ａβ単独は、架橋後に、主にモノマー、ダイマー、トリマー、及びテトラマーを形成した一方で、ＴＤＰ−４３オリゴマーはより高分子量のＡβ種をシーディングする働きをしたことを示した（図３Ｂ）。Ａβペンタマーが、ＴＤＰ−４３添加下で用量依存的に観察された。また、〜５５ｋＤａに移動するものと、〜１０５から＞２１０ｋＤａまででスメアになっているものとの、２つのより大きな集合体が観察された。ＳＤＳ−非耐性ＴＤＰ−４３モノマーに加えて、〜５５ｋＤａの種及び〜８０から＞２１０ｋＤａまでのスメアを引き起こすいくつかの種が見出された。ＴＥＭイメージングを用いたさらなる分析は、Ａβが線維形成を受けずに、４％  ＴＤＰ−４３オリゴマーの存在下で直径が＜１０ｎｍの球状オリゴマーに変換され、一方で、予想通り、Ａβ単独は依然として成熟アミロイド線維を形成したことを示した（図３Ｃ）。ＴＤＰ−４３オリゴマーシードは、Ａβオリゴマーの直径よりも大きい、＞５０ｎｍの直径を保持した（データは示されず）。これらの結果は、ＴＤＰ−４３オリゴマーがＡβオリゴマー形成を誘導することができることを支持した。これは、ＴＤＰ−４３がアミロイドと共通の特性を共有することを再び示す。
【０１４０】
例５  ＴＤＰ−４３オリゴマーは、神経突起変性及び毒性を誘導する
【０１４１】
この例において、ＴＤＰ−４３オリゴマーが神経毒性及び神経突起変性を引き起こし得るかどうかを調査した。
【０１４２】
簡単に言うと、ヒト神経芽細胞腫ＢＥ（２）−Ｃ細胞を、連続的に希釈された、圧倒的にオリゴマーを含有するＴＤＰ−４３試料で処置し、ＭＴＴ及びＬＤＨアッセイによって細胞毒性効果を調べた。結果を図４Ａ〜４Ｃに示す。ＭＴＴアッセイは、０．４４μＭ  ＴＤＰ−４３の存在下で、バッファーコントロールと比較して、細胞生存能力のおよそ２０％の低下を示した（図４Ａ）。組換えＴＤＰ−４３の乏しい溶解性のために、より高いＴＤＰ−４３濃度での毒性実験は不可能であった。同様の結果がＬＤＨアッセイにおいて見出され、０．４４μＭ  ＴＤＰ−４３が有意なレベルの細胞死を誘導した（図４Ｂ）。ＴＤＰ−４３は、マウスの１次皮質ニューロンにおいて用量依存性神経毒性を生じ、ここで０．６μＭのＴＤＰ−４３は、細胞生存能力のおよそ２０％の低下を引き起こした（図４Ｃ）。
【０１４３】
加えて、マウスの皮質ニューロンからの免疫組織化学研究は、０．６μＭ  ＴＤＰ−４３が、神経突起の収縮を誘導し、ニューロンの密度及び数を低下させたことを明らかにした（図４Ｄ）。インビボでのＴＤＰ−４３オリゴマーの神経毒性効果をさらに試験するために、２μｌの２．２μＭ  ＴＤＰ−４３をマウスの海馬領域に注射し、免疫蛍光染色によって神経細胞の生存を調べた。ニューロンマーカーＮｅｕＮ免疫反応性及びＤＡＰＩ染色によって決定されたように、ＴＤＰ−４３を注射したマウスのＣＡ１層において、かなりの量の神経細胞が失われた（図４Ｅ）が、バッファーを注射したマウスにおいては失われなかったことが見出された。この結果は、組換え全長ＴＤＰ−４３オリゴマーの海馬における注射が毒性を誘導することを示した。
【０１４４】
例６  ＴＤＰ−４３オリゴマー特異性ポリクローナル抗体の産生及び特徴付け
【０１４５】
抗アミロイドオリゴマー抗体（すなわち、Ａ１１）が異なるアミロイドと交差反応したため、ＴＤＰ−４３オリゴマーがこの疾患に存在するかどうかを検証するために、「材料及び方法」セクションに記載の手順にしたがい、ウサギにおいて組換えＴＤＰ−４３オリゴマーを免疫原として使用して、ポリクローナル抗体を作製した。このようにして得られたポリクローナル抗体をＴＤＰ−Ｏと命名する。
【０１４６】
全長ＴＤＰ−４３オリゴマーのコンホメーションに対するＴＤＰ−Ｏ抗体の特異性を、「材料及び方法」セクションに記載のような様々な変性条件下で、ドットブロット法によって調べた。結果を図５Ａに示す。１：１２５，０００希釈のＴＤＰ−Ｏは、ネイティブバッファー中で、加熱（９０℃、１時間）に関係なく、全長ＴＤＰ−４３と反応することができた。しかしながら、２％  ＳＤＳが存在し、加熱をした場合又はしなかった場合には、抗体とＴＤＰ−４３オリゴマーとの間の反応性は消失した。さらに、全長ＴＤＰ−４３が７．２Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ又は９Ｍ  尿素で、室温で１時間より長く処置された場合には、反応性は低下しなかった。これは、このタンパク質が高い濃度の化学的変性剤の下で安定性であったことを示した。しかしながら、反応性シグナルは、追加の加熱を用いると減少し始めた。これは、ＴＤＰ−Ｏがコンホメーション依存性抗体であることを示す。まとめると、ＴＤＰ−Ｏからのドットブロット法の結果は、Ａ１１のものと定性的に同一であった（図５Ａ対図１Ｃ）。
【０１４７】
ＴＤＰ−ＯがＡ１１のような一般的なアミロイドオリゴマー抗体よりもＴＤＰ−４３特異性であるかどうかを試験するために、Ａ１１及び／又はＴＤＰ−Ｏを使用して、Ａβオリゴマーに対する抗体特異性を調べた。図５Ｂに示されるように、ＴＤＰ−Ｏは、Ａβオリゴマーを認識することができなかった。このことは、それがＴＤＰ−４３オリゴマーに対して特異性であることを実証している。ＥＬＩＳＡも実施して、ＴＤＰ−ＯとＴＤＰ−４３オリゴマー及びモノマーとの間の反応性を定量的に特徴付けた。比較目的のために、Ｎ−末端残基１−２６０（Ｎ１−２６０）を認識するＴＤＰ−４３抗体を用いた。全長ＴＤＰ−４３のオリゴマー及びモノマー画分を調製するために、およそ１μＭの全長ＴＤＰ−４３又は３倍以上に濃縮されたＴＤＰ−４３試料をＳＥＣにロードし、１ｍｌの溶出画分を回収した（図５Ｃ）。次いで、画分１〜１８からの濃縮されたＴＤＰ−４３のＳＥＣ画分を、ＴＤＰ−Ｏ又はＮ１−２６０抗体によるドットブロット法に供した。結果を図５Ｄに示す。ＴＤＰ−Ｏが、ボイド容量に溶出されたＴＤＰ−４３オリゴマーに対応する、画分番号５〜７と強く反応したことが見出された。対照的に、Ｎ１−２６０は、画分６、及び画分１５〜１８と強い反応性を示した。これは、この抗体がＴＤＰ−４３のオリゴマー形態及びモノマー形態の両方を認識し得ることを示す。
【０１４８】
さらに、ＴＤＰ−Ｏに対するＴＤＰ−４３オリゴマーの特異性を、Ｎ１−２６０抗体をコントロールとして使用したＥＬＩＳＡによって定量化した。ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡアッセイによるタンパク質定量化後、ＴＤＰ−４３オリゴマー及びモノマー画分を連続的に希釈してＥＬＩＳＡプレート上にそれぞれコーティングした。標準ＥＬＩＳＡプロトコルにしたがい、ＴＤＰ−Ｏ及びＮ１−２６０を適用及び可視化した。図５Ｅに示される結果は、ＴＤＰ−Ｏ抗体が、ＴＤＰ−４３モノマーよりもＴＤＰ−４３オリゴマーに対して強い反応性を示し（ＥＣ５０＜０．５μｇ／ｍｌ）、一方で、Ｎ１−２６０抗体がＴＤＰ−４３オリゴマー又はモノマーに対して同様の反応性を示したことを示した（図５Ｅ）。さらに、以前に報告されたように（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０１３）２８８、９０４９−９０５７）、ＴＤＰ−ＯがＴＤＰ−４３の線維の形態ではなくオリゴマーの形態を認識することを保証するために、ＴＤＰ−４３のＲＲＭ２ドメイン内の５番目のβ−ストランドから作製されたβ５線維をドットした（データは示されず）。結果は、ＴＤＰ−ＯがＴＤＰ−４３オリゴマーのみを認識し、β５線維を認識しないことを明確に示した。まとめると、本出願のポリクローナルＴＤＰ−Ｏ抗体は、Ａβ種と交差反応することなく、ＴＤＰ−４３オリゴマーのコンホメーションを特異的に認識し得る。
【０１４９】
例７  ＴＤＰ−４３オリゴマーはトランスジェニックマウス脳に存在する
【０１５０】
インビボでのＴＤＰ−４３オリゴマーの存在を調べるために、野生型マウス及び６月齢及び１２月齢のＦＴＬＤ−ＴＤＰ−４３トランスジェニックマウスの脳切片に免疫組織化学的染色を実施した。結果を図６Ａ及び６Ｂに示す。前脳において全長ＴＤＰ−４３を発現するＦＴＬＤ−ＴＤＰ−４３トランスジェニックマウスは、それらが年をとるにつれて起こる学習／記憶能力及び運動機能におけるそれらの不全について、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ様病理を再現することが報告されている（Ｔｓａｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２０１０）２０７、１６６１−１６７３）。この例において、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ−４３トランスジェニックマウスの脳切片を、抗ＴＤＰ−４３及びＴＤＰ−Ｏで免疫蛍光染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。予想通り、野生型マウスにおいては、ＴＤＰ−４３が圧倒的に核に見出された。対照的に、ＦＴＬＤ−ＴＤＰトランスジェニックマウスにおいて、ＴＤＰ−４３が主にサイトゾルに見出され、ＴＤＰ−Ｏシグナルもまた検出された。顕著な量のＴＤＰ−４３及びＴＤＰ−Ｏシグナルが細胞において共局在することが見出され、二重陽性シグナルを有する細胞の数は年齢とともに増加した。シグナルの出現及び共局在は、アミロイド様ＴＤＰ−４３オリゴマーがＦＴＬＤ−ＴＤＰトランスジェニックマウス脳に存在し、その量が年齢とともに増加することを示唆した。
【０１５１】
例８  ＴＤＰ−４３オリゴマーはＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者の脳に存在する
【０１５２】
ヒト疾患におけるＴＤＰ−４３オリゴマーの関連性を評価するために、ＴＤＰ−４３免疫反応性封入体を有するＦＴＬＤ患者のサブグループを使用して、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者におけるＴＤＰ−４３オリゴマーの存在を調査した。ＴＤＰ−Ｏポリクローナル抗体を使用して、病理学的に確認されたＦＴＬＤ−ＴＤＰの３症例、年齢が合致した非認知症コントロールの３症例、及び「疾患コントロール」として、ＴＤＰ−４３病理のない、病理学的に確認されたＡＤの３症例の、海馬及び前頭皮質切片を免疫染色した。ＴＤＰ−Ｏ抗体は、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者のＴＤＰ−４３封入体と類似しているように見える、様々な神経細胞質封入体（図７、パネルＡ及びＣ）及び変性神経突起（図７、パネルＡ）を同定した。いくつかの領域において、神経細胞質が、粒状パターンに強く染色された（図７、パネルＥ）。対照的に、ニューロンリポフスチンからの非特異的反応性を除いて、ＴＤＰ−Ｏは、コントロール脳に対しても（図７、パネルＢ、Ｄ、及びＦ）、ＴＤＰ−４３病理を欠くＡＤ脳に対しても（データは示されず）、顕著な免疫反応性を示さなかった。ＴＤＰ−Ｏポリクローナル抗体は、正常組織中の核を染色することができなかった。このことは、それが、核に通常存在するＴＤＰ−４３モノマーと反応しないという我々の生化学的観察と一致する。加えて、ＴＤＰ−Ｏポリクローナル抗体によって認識されるＴＤＰ−４３の形態を検証するために、我々は、コントロール及び罹患ヒト海馬を用いたＴＤＰ−Ｏによる免疫沈降（ＩＰ）を実施した。海馬のトリトン可溶性画分を調製し、架橋ＴＤＰ−Ｏポリクローナル抗体を用いたＩＰに供した。溶出液を、Ｎ−末端ＴＤＰ−４３抗体（Ｎ１−２６０）で免疫標識するＥＭに供した（図８Ａ及び８Ｂ）。我々は、直径がおよそ５０ｎｍの、丸い、球状ＴＤＰ−４３凝集体を、罹患試料において観察することに成功したが、コントロール試料においては観察できず、この種はＮ１−２６０抗体によって認識された。これは、それらがＮ−末端を切断されていないことを示す。全体として、我々のＴＤＰ−Ｏポリクローナル抗体を使用することにより、我々は、ＴＤＰ−４３オリゴマーがＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者の脳に存在することを実証した。
【０１５３】
例９  ＴＤＰ−４３オリゴマー特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生及び特徴付け
【０１５４】
この例において、ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、ＴＤＰ−Ｏ−３、−５、−８、−９、及び−１０ハイブリドーマ細胞から産生された各ｍＡｂｓの、ＳＤＳ変性した又はしていないＴＤＰ−４３オリゴマーに対する特異性を調べた。結果を図９に示す。５つのハイブリドーマ細胞系統から産生されたモノクローナル抗体は全て、変性ＴＤＰ−４３タンパク質よりも非変性ＴＤＰ−４３オリゴマーに対して、高い結合活性を示した。この結果は、これらのｍＡｂｓが、ＴＤＰ−４３オリゴマーに対して特異性を有し、それらがコンホメーション依存性抗体であることを示した。
【０１５５】
単離されたｍＡｂｓの結合特異性を確認するために、ＴＤＰ−４３オリゴマー及びモノマーをゲルろ過により精製し（図１０Ａ）、次いでＥＬＩＳＡ用のプレート上にそれぞれコーティングして、各ｍＡｂｓの特異性を確認した。図１０Ｂに示される結果は、ＴＤＰ−Ｏ−３、−５、−８、−９、及び−１０ハイブリドーマ細胞系統から産生されたｍＡｂｓのそれぞれが、ＴＤＰ−４３オリゴマーを特異的に認識し得ることを確認した。
【０１５６】
ＥＬＩＳＡマウスｍＡｂアイソタイピングキット（Ｔｈｅｒｍｏ）も使用して、ＴＤＰ−Ｏ  ｍＡｂｓのアイソタイプを決定した。結果を表１に要約する。
【０１５７】
【表１】
2018503596.tif 000004
【０１５８】
表１に示される結果によれば、ＴＤＰ−Ｏ−３、−５、−８、−９、及び−１０ハイブリドーマ細胞系統によって産生されるｍＡｂｓは、ＩｇＧ２ａ及びカッパ軽鎖に対して、より反応性が高い。したがって、これらのｍＡｂｓは、ＩｇＧ２ａ及びカッパ軽鎖サブクラスに属する。
【０１５９】
このように単離された５つのｍＡｂｓを配列分析に供し、コンセンサス配列を決定して図１１に示した。
【０１６０】
例１０  ＴＤＰ−４３オリゴマー特異性ｍＡｂは、ＴＤＰ−４３オリゴマー誘導細胞毒性を阻害する
【０１６１】
ＴＤＰ−Ｏ抗体が、ＴＤＰ−４３オリゴマーによって誘導された細胞毒性を阻害することができるかどうかを調べるために、「材料及び方法」に記載のように、示された投与量で、モノクローナルＴＤＰ−Ｏ抗体（すなわち、ＴＤＰ−Ｏ−３）と共に又は無しで、ＴＤＰ−４３オリゴマーによって、ヒト神経芽細胞腫ＢＥ（２）−Ｃ細胞をそれぞれ処置した。次いで、細胞生存能力をＭＴＴアッセイにより測定した。この結果は、ＴＤＰ−４３オリゴマーが、ＢＥ（２）−Ｃ細胞に対する有意な毒性を誘導し、当該細胞毒性現象が、ＴＤＰ−Ｏ抗体の投与によって首尾よく回復したことを示した（図１２）。
【０１６２】
結論として、本開示は、Ａβをクロスシーディングしてアミロイドオリゴマーを形成し、神経変性疾患と関連している、ＴＤＰ−４３の病理学的形態を予期せず発見するものである。したがって、本開示は、ＴＤＰ−４３タンパク質症を抑制するのに有用な抗体を提供することを目的とする。前述の実施例の結果は、本抗ＴＤＰ−４３抗体がＴＤＰ−４３の病理学的形態に特異的に結合し、ＴＤＰ−４３誘導細胞毒性を抑制し、それ故に、それらがＴＤＰ−４３関連神経変性疾患を防止及び／又は処置する潜在的な手段として作用し得ることを、確認及び支持する。
【０１６３】
実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は１又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。
【図１Ａ】
2018503596.tif 000005
【図１Ｂ】
2018503596.tif 000006
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年5月17日(2017.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス活性化応答（ＴＡＲ）−ＤＮＡ−結合タンパク質４３ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）オリゴマーに特異的に結合する、抗体又はそのフラグメントであって、
配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号：５、配列番号：６及び配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】
前記重鎖可変領域が、配列番号：４のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号：８のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＴＤＰ−４３オリゴマーが、直径約２〜４００ｎｍの球状粒子サイズを有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記ＴＤＰ−４３オリゴマーが、直径約４０〜６０ｎｍの粒子サイズを有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患の予防又は処置のための医薬組成物であって、有効量の請求項１に記載の抗体；及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項６】
前記ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患が、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムのＡＬＳ−パーキンソン痴呆症候群、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、封入体ミオパシー、封入体筋炎、海馬硬化症、又はパーキンソン病である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記重鎖可変領域が、配列番号：４のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号：８のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
被験体の生体試料からＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患を診断するための医薬品の製造における請求項１に記載の抗体の使用。
【請求項９】
前記ＴＤＰ−４３オリゴマー関連疾患が、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムのＡＬＳ−パーキンソン痴呆症候群、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、封入体ミオパシー、封入体筋炎、海馬硬化症、又はパーキンソン病である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記生体試料が、脳生検試料、脳脊髄液試料、全血試料、血清試料、血漿試料、尿試料、又は粘液試料である、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域が、配列番号：４のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号：８のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の使用。
【国際調査報告】
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