(57)【要約】  本発明は、ラクトバチルス・プランタルムによって生成されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むプレバイオティック組成物に関し、ここで、該ＧＯＳは、選択されたラクトバチルス・プランタルムプロバイオティクス細菌株の選択増殖培地としての役割を果たし、およびここで、該ＧＯＳは、形態が選択されたプロバイオティクス細菌株の逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成される形態と実質的に同じである。本発明はまた、ＧＯＳを生成する方法にも関し、およびＧＯＳを組み込む成分に関する。
2018500048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタルムによって生成されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むプレバイオティック組成物であって、ここで、該ＧＯＳは、選択されたラクトバチルス・プランタルムプロバイオティクス細菌株の選択増殖培地としての役割を果たし、かつ、該ＧＯＳは、選択されたプロバイオティクス細菌株における逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成される形態と実質的に同じである、組成物。
【請求項２】
前記ＧＯＳが、以下の菌株：ラクトバチルス・プランタルム２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）；ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）；ラクトバチルス・プランタルム２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはその突然変異株の１もしくは複数によって生成される、および／またはそれらに対して選択性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がカプセル化されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、身体の胃腸環境を通過し、かつ、その機能特性を維持できるようにするための賦形剤または担体化合物をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、飲むことができる液体の形態であり、そして／または固体もしくは液体食料品と混合できる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
薬品として使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
栄養補助食品として使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
コレステロールの管理または高コレステロールの処置に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
メタボリック症候群の管理または処置に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
体重管理に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
糖尿病の管理または処置に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生成する方法であって、嫌気条件下、最高５５℃の温度にて最長１６時間、最高５０％のラクトースを含む増殖培地中で１若しくは複数のラクトバチルス・プランタルムを培養し、そして、ラクトバチルス・プランタルム細胞からＧＯＳを採取するステップを含む方法。
【請求項１３】
前記１若しくは複数のラクトバチルス・プランタルム菌株を、最高５０℃の温度にて最長１４時間、最高４０％のラクトースを含む増殖培地中で培養する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記増殖培地が、ＭＲＳ培地またはその改変バージョンを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＲＳ培地が：約１０ｇ／Ｌの細菌学的ペプトン；約８ｇ／Ｌの肉エキス；約４ｇ／Ｌの酵母抽出物；約２ｇ／Ｌのリン酸一ナトリウム；約５ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム；約２ｇ／Ｌのクエン酸三アンモニウム；約０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ4；約０．０５ｇ／ＬのＭｎＳＯ4；１ｍｌ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；約０．５ｇ／ＬのＬシステインＨＣＬ；約４ｍｌ／Ｌのレザスリン；および最高約５０％のラクトース、を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＧＯＳが、溶解によってラクトバチルス・プランタルム細胞から採取される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶解が、１若しくは複数の凍結−融解ステップを伴う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ラクトバチルス・プランタルム菌株は、次の：ラクトバチルス・プランタルム２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）；ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）；ラクトバチルス・プランタルム２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはその突然変異株のうちの１もしくは複数から選択される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＯＳの収率が、最高約３５％である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＧＯＳの収率が、最高約３１％である、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ラクトースの変換が、最高約７０％である、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ラクトースの変換が、最高約６６％である、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物に使用するためのＧＯＳを生成するのに使用される、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望のラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）プロバイオティクス細菌株の増殖に特異的なプレバイオティクス組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスは、宿主に健康上の利益を付与する細菌である。典型的に、腸内に天然に存在する細菌集団を補給するために、プロバイオティクス細菌株の培養物が個体によって消費され、または個体に投与される。数例を挙げると、がん、下痢症および過敏性腸症候群の発生の低減を含むいくつかの健康上の利益が、プロバイオティクスに関連するとされている。また予備研究では、プロバイオティクスが、コレステロールの血清レベルおよび血圧の低下に有用であり、糖尿病をモジュレートする一助になり得ることが示されている。
【０００３】
乳酸桿菌（Lactobacilli）は、乳製品に共通のプロバイオティクスであり、現在販売されているプロバイオティクスの約７５％を構成している。しかし、腸内で有用となるのに、乳酸桿菌用量の２％しか生存しないと推定されている。
【０００４】
プレバイオティクスは、乳酸桿菌またはビフィドバクテリウム属などの有益な常在性腸内微生物叢を選択的に増強することができる食事性成分であり、食品部門への適用がかなり増大することが見出されている。プレバイオティクスは、非消化性食品成分であり、大腸細菌によって選択的に代謝され、それによって健康の改善に寄与する。従ってプレバイオティクスを使用すると、常在性腸微生物の環境内の有益な変化を促進することができ、従ってプロバイオティクスの生存を助けることができる。プレバイオティクスは、腸内で選択的に代謝されないペクチン、セルロース、キシランなどのほとんどの食物繊維とは明確に異なる。プレバイオティクスとしての分類基準は、胃酸性度、哺乳動物の酵素による加水分解および胃腸管による吸収に抵抗しなければならないこと、腸管ミクロフローラによって発酵されること、ならびに健康および良好な状態と関連する腸管細菌の増殖および／または活性を選択的に刺激することである。
【０００５】
フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ、イヌリンおよびオリゴフルクトース）およびガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、プレバイオティクス分類基準を満たすことがヒト介入研究で繰り返し実証されている。現在、乳酸桿菌に対する選択性プレバイオティクスは、存在していない。
【０００６】
本発明の一目的は、所与のプロバイオティクス細菌の特異的な増殖を可能にするプレバイオティクス組成物を提供することである。プレバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルムなどの、産業に一般的に使用されるプレバイオティクスの有益な種または株を標的にできれば、やはり望ましいと思われる。本発明のまたさらなる一目的は、ある特定のプロバイオティクス細菌株に対して選択性があるプレバイオティクス組成物を識別し、生成するためのスクリーニング方法を提供することである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、ラクトバチルス・プランタルムによって生成されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むプレバイオティック組成物であって、ここで、該ＧＯＳは、選択されたラクトバチルス・プランタルムプロバイオティクス細菌株の選択増殖培地としての役割を果たし、およびここで、ＧＯＳは、形態が選択されたプロバイオティクス細菌株の逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成される形態と実質的に同じである、プレバイオティック組成物を提供する。
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、均質のオリゴ糖を含んでも、または異種のオリゴ糖を含んでもよい。
【０００８】
好ましくは、ＧＯＳは、以下の菌株：ラクトバチルス・プランタルム２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）；ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）；ラクトバチルス・プランタルム２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはその突然変異株の１もしくは複数によって生成される、および／またはそれらに対して選択性がある。
【０００９】
プレバイオティクス組成物は、好ましくは望ましい常在性腸内微生物叢、特に、好ましいプロバイオティクス細菌株の割合の変化を誘発するために、組成物中に有効量で存在する。微生物叢の変化が急速に必要である場合、または現在存在していない新しい細菌株を腸に播種する助けにするために組成物が使用される場合、より多くの量を利用してもよい。
【００１０】
プレバイオティクス組成物は、カプセル化されていてもよい。多くのカプセル化技術が、当業者には明らかであり、用いられるカプセル化技術は、消化通過中にプロバイオティクス増殖培地に必要な安定性に合わせて調整される。
【００１１】
プレバイオティクス組成物は、身体の胃腸管環境を通過し、腸の下部に効率的に送達され放出されるようにするための賦形剤または担体化合物をさらに含むことができる。プレバイオティクスは、濃縮され、かつ／またはフリーズドライされ得る。組成物は、いくつかの型式、例えば飲むことのできる液体および／または固体もしくは液体食料品と混合できる粉末であってもよい。
【００１２】
プレバイオティクス組成物は、１つまたは複数の活性成分、例えばビタミン、ミネラル、植物性化学物質、抗酸化剤、およびそれらの組合せと組み合わせることができる。
【００１３】
ビタミンには、脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミン、ならびにそれらの組合せが含まれ得る。一部の実施形態では、ビタミンには、水溶性ビタミン、例えばビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＢ（チアミンまたはＢ１、リボフラビン（riboflavoin）またはＢ２５ナイアシンまたはＢ３、ピリドキシンまたはＢ６、葉酸またはＢ９、シアノコバラミン（cyanocobalimin）またはＢ１２、パントテン酸、ビオチン）、およびそれらの組合せが含まれ得る。
【００１４】
ミネラルには、ナトリウム、マグネシウム、クロム、ヨウ素、鉄、マンガン、カルシウム、銅、フッ化物、カリウム、亜リン酸、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００１５】
抗酸化剤には、アスコルビン酸、クエン酸、ローズマリー油、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＥリン酸塩、トコフェロール、ジ−アルファ−トコフェリルリン酸塩、トコトリエノール、アルファリポ酸、ジヒドロリポ酸、キサントフィル、ベータクリプトキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ベータ−カロテン、カロテン、混合カロテノイド、ポリフェノール、フラボノイド（fiavonoid）、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００１６】
植物性化学物質には、カロテノイド（cartotenoid）、葉緑素、クロロフィリン、繊維、フラバノイド、アントシアニン（anthocyamn）、シアニジン（cyaniding）、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、フラバノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン（epigailocatechingallate）、テアフラビン、テラルビシン（thearubigin）、プロアントシアニン、フラボノール、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチン、フラバノンスヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、タンゲレチン、フラボン、アピゲニン、ルテオリン、リグナン、フィトエストロゲン、レスベラトロール、イソフラボン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、ダイズイソフラボン、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００１７】
本発明のさらなる一態様によれば、コレステロールの管理または高コレステロールの処置に使用するためのプレバイオティクス組成物が提供される。あるいはまたはさらには、組成物は、メタボリック症候群、体重管理もしくは肥満、または糖尿病の管理または処置に使用するためのものであってもよい。ラクトバチルス・プランタルムによって生成されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む組成物であって、ここで、該ＧＯＳは、選択されたラクトバチルス・プランタルムプロバイオティクス細菌株の選択増殖培地としての役割を果たし、およびここで、該ＧＯＳは、本明細書中で先に記載した選択されたプロバイオティクス細菌株の逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成される形態と実質的に同じである、組成物は、薬品または医薬品、および／または栄養補助食品として使用されてもよい。
【００１８】
本発明のさらなる態様において、高コレステロール、メタボリック症候群、肥満または糖尿病の処置のための、ラクトバチルス・プランタルムによって生成されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むプレバイオティック組成物であって、ここで、該ＧＯＳは、選択されたラクトバチルス・プランタルムプロバイオティクス細菌株の選択増殖培地としての役割を果たし、およびここで、該ＧＯＳは、形態が選択されたプロバイオティクス細菌株の逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成される形態と実質的に同じである、プレバイオティック組成物が提供される。
【００１９】
本発明のより一層さらなる態様において、高コレステロール、メタボリック症候群、肥満または糖尿病のための薬品の製造における、微生物によって生成されたオリゴ糖を含むプレバイオティック組成物の使用であって、ここで、該組成物は、ラクトバチルス・プランタルムによって生成されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含み、ここで、該ＧＯＳは、選択されたラクトバチルス・プランタルムプロバイオティクス細菌株の選択増殖培地としての役割を果たし、およびここで、該ＧＯＳは、形態が選択されたプロバイオティクス細菌株の逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成される形態と実質的に同じである、使用が提供される。
【００２０】
本発明の第１の態様に記載のプレバイオティクスの特徴は、コレステロール管理のための組成物に適用することができ、交換可能であることも、当業者に明らかとなろう。
【００２１】
組成物は、医薬品または薬品の代わりに（またはそれに加えて）、栄養補助食品、健康補助食品または機能性食品として使用することができる。本発明のより一層さらなる一態様は、栄養補助食品、栄養補給食品または機能性食品のための、ラクトバチルス・プランタルムによって生成されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むプレバイオティック組成物であって、ここで、該ＧＯＳは、選択されたラクトバチルス・プランタルムプロバイオティクス細菌株の選択増殖培地としての役割を果たし、およびここで、該ＧＯＳは、形態が選択されたプロバイオティクス細菌株の逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成される形態と実質的に同じである、組成物であってもよい。
【００２２】
本発明の第１の態様に関連するプレバイオティクスの特徴は、栄養補助食品、健康補助食品または機能性食品のための組成物に適用することができ、交換可能であることも、やはり当業者に明らかとなろう。
【００２３】
さらに組成物は、既存の食料品、例えばヨーグルトに組み込むことができ、または食料品と容易にブレンドすることができ、もしくは液体飲料に作製することができる粉末として組み込むことができる。
【００２４】
本発明の別の態様において、嫌気条件下、最高約５５℃の温度にて最長１６時間、最高約５０％のラクトースを含む増殖培地中で１若しくは複数のラクトバチルス・プランタルムを培養し、そして、ラクトバチルス・プランタルム細胞からＧＯＳを採取するステップを含む、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生成する方法が提供される。
【００２５】
好ましくは、１若しくは複数のラクトバチルス・プランタルム菌株は、最高約５０℃の温度にて最長約１４時間、最高約４０％のラクトースを含む増殖培地中で培養される。１若しくは複数のラクトバチルス・プランタルム菌株は、約４０〜約５０℃の範囲内の温度にて約１０〜約１４時間、約２０〜約４０％の範囲内のラクトースを含む増殖培地中で培養されてもよい。
増殖培地は、ＭＲＳ培地またはその改変バージョンを含む。
ＭＲＳ培地は：好ましくは、約８〜約１２ｇ／Ｌの細菌学的ペプトン；約７〜約９ｇ／Ｌの肉エキス；約３〜約５ｇ／Ｌの酵母抽出物；約１〜約３ｇ／Ｌのリン酸一ナトリウム；約４〜約６ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム；約１〜約２ｇ／Ｌのクエン酸三アンモニウム；約０．１〜約０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ4；約０．０２〜約０．１５ｇ／ＬのＭｎＳＯ4；約１〜約３ｍｌ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；約０．２５〜約０．７５ｇ／ＬのＬシステインＨＣＬ；約２〜約６ｍｌ／Ｌのレザスリン（rezasurin）；および約２０〜約５５％のラクトース、を含む。
【００２６】
より好ましくは、ＭＲＳ培地は、最高約１０ｇ／Ｌの細菌学的ペプトン；最高約８ｇ／Ｌの肉エキス；最高約４ｇ／Ｌの酵母抽出物；最高約２ｇ／Ｌのリン酸一ナトリウム；最高約５ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム；最高約２ｇ／Ｌのクエン酸三アンモニウム；最高約０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ4；最高約０．０５ｇ／ＬのＭｎＳＯ4；最高約１．５のｍｌ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；最高約０．５ｇ／ＬのＬシステインＨＣＬ；最高約４ｍｌ／Ｌのレザスリン；および最高約５０％のラクトース、を含む。
【００２７】
最も好ましくは、ＭＲＳ培地は、約１０ｇ／Ｌの細菌学的ペプトン；約８ｇ／Ｌの肉エキス；約４ｇ／Ｌの酵母抽出物；約２ｇ／Ｌのリン酸一ナトリウム；約５ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム；約２ｇ／Ｌのクエン酸三アンモニウム；約０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ4；約０．０５ｇ／ＬのＭｎＳＯ4；約１ｍｌ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；約０．５ｇ／ＬのＬシステインＨＣＬ；約４ｍｌ／Ｌのレザスリン；および最高約５０％のラクトース、を含む。
【００２８】
β−ガラクトシダーゼは、多くの方法によって採取され得るが、溶解によってラクトバチルス・プランタルム細胞から採取されるのが好ましい。斯かる溶解は、１若しくは複数の凍結融解ステップを伴ってもよい。
【００２９】
ラクトバチルス・プランタルム菌株は、次の：ラクトバチルス・プランタルム２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）；ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）；ラクトバチルス・プランタルム２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはその突然変異株のうちの１もしくは複数から選択され得る。
【００３０】
好ましくは、ＧＯＳの収率は、最高約３５％である。より好ましくは、ＧＯＳの収率は、最高約３１％である。最も好ましくは、ＧＯＳの収率は、最高約３０．５％である。
好ましくは、ラクトースの変換は、最高約７０％である。より好ましくはラクトースの変換は、最高約６８％である。最も好ましくは、ラクトースの変換は、最高約６６％である。
本明細書中で先に記載した方法は、本発明の組成に関する態様において使用するためのＧＯＳを生成するのに使用されてもよい。
【００３１】
本発明の詳細な説明
ここで、本発明の実施形態を、以下の図面の詳細な説明を単なる例として用いて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】Ｌ．プランタルムのための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図１Ｂ】Ｌ．カゼイ（casei）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図１Ｃ】Ｌ．サリバリウス（salivarius）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図１Ｄ】Ｌ．ファーメンタム（fermentum）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図１Ｅ】Ｌ．ラムノサス（rhanmosus）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図１Ｆ】Ｌ．デルブリュッキ（delbrueckii）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図２Ａ】Ｌ．プランタルムのための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図２Ｂ】Ｌ．カゼイのための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図２Ｃ】Ｌ．サリバリウスのための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図２Ｄ】Ｌ．デルブリュッキのための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図２Ｅ】Ｌ．ラムノサスのための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図２Ｆ】Ｌ．アシドフィルス（acidophilus）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図２Ｇ】Ｌ．ヘルベティカス（helveticus）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。
【図３】ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、１４時間にわたる異なる細菌株の結果を示すグラフである（ＯＤ600を毎時間測定した）。
【図４】ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、試験前２日間にわたる異なる細菌株の結果を示すグラフである（ＯＤ600を毎時間測定した）。
【図５Ａ】Ａ ＭＲＳブロス、Ｂ １％ラクトース基本培地およびＣ ５％ラクトース基本培地中、ＯＤ420で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリーニングした、様々な乳酸桿菌種の結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】Ａ ＭＲＳブロス、Ｂ １％ラクトース基本培地およびＣ ５％ラクトース基本培地中、ＯＤ420で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリーニングした、様々な乳酸桿菌種の結果を示すグラフである。
【図５Ｃ】Ａ ＭＲＳブロス、Ｂ １％ラクトース基本培地およびＣ ５％ラクトース基本培地中、ＯＤ420で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリーニングした、様々な乳酸桿菌種の結果を示すグラフである。
【図６Ａ】Ａ ＭＲＳブロス、Ｂ １％ラクトース基本培地およびＣ ５％ラクトース基本培地中、ｏ−ＮＰ（ｕＭ）で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリーニングした、様々な乳酸桿菌種の結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】Ａ ＭＲＳブロス、Ｂ １％ラクトース基本培地およびＣ ５％ラクトース基本培地中、ｏ−ＮＰ（ｕＭ）で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリーニングした、様々な乳酸桿菌種の結果を示すグラフである。
【図６Ｃ】Ａ ＭＲＳブロス、Ｂ １％ラクトース基本培地およびＣ ５％ラクトース基本培地中、ｏ−ＮＰ（ｕＭ）で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリーニングした、様々な乳酸桿菌種の結果を示すグラフである。
【図７】Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６による１６８時間にわたるＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の収率を示すグラフである。
【図８】Ｌ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６による１６８時間にわたるＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の収率を示すグラフである。
【図９】Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。
【図１０】Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。
【図１１】Ｌ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。
【図１２】Ｌ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。
【図１３】１８Ｕ．のＬ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。
【図１４】１８Ｕ．のＬ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。
【図１５】３０Ｕ．のＬ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。
【図１６】３０Ｕ．のＬ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。
【図１７】Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６から生成されたＧＯＳ混合物上で増殖した様々な細菌の相対的増殖プロファイルを示すグラフである。
【図１８】Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６から生成されたＧＯＳ混合物上で増殖したより小さい範囲の細菌の相対的増殖プロファイルを示す第２のグラフである。
【図１９】β−ｇａｌ活性を評価するためのラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）のＯＤ420計測グラフのグラフを示す。
【図２０】β−ｇａｌ活性を評価するためのラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６のＯＤ420計測グラフを示す。
【図２１】β−ｇａｌ活性を評価するためのラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６のＯＤ420計測グラフを示す。
【図２２】初期のＧＯＳ産生を評価するために使用したラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）に関するクロマトグラムを示す（ＧＯＳ％＝５．２およびラクトース％＝８９）。
【図２３】初期のＧＯＳ産生を評価するために使用したラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６に関するクロマトグラムを示す（ＧＯＳ％＝５．５およびラクトース％＝８２）。
【図２４】初期のＧＯＳ産生を評価するために使用したラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６に関するクロマトグラムを示す（ＧＯＳ％＝６およびラクトース％＝７５）。
【図２５】ラクトバチルス・デルブリュッキの対照株に関するクロマトグラムを示す（ＧＯＳ％＝１７およびラクトース％＝３２）。
【図２６】６単位の酵素／ｍｌを用いた５０℃にて４０％のラクトース中での１４時間の培養時点のラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）に関するクロマトグラムを示す。
【図２７】６単位の酵素／ｍｌを用いた５０℃にて４０％のラクトース中での２４時間の培養時点のラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）に関するクロマトグラムを示す。
【図２８】ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）に関する１２および２４時間におけるＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の収率のグラフを示す。
【図２９】５０℃にて４０％のラクトース中での２４時間培養を通じたラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６に関する糖のパーセンテージを示すグラフである。
【図３０】５０℃にて４０％のラクトース中での２４時間にわたるラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６に関する糖のパーセンテージを示すグラフである。
【図３１Ａ】４０℃にて１５％のラクトース中で培養したときのラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６（図３１Ａ）とラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６（図３１Ｂ）との間の糖のパーセンテージ（およびＧＯＳ収率）の比較上の相違を示す。
【図３１Ｂ】４０℃にて１５％のラクトース中で培養したときのラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６（図３１Ａ）とラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６（図３１Ｂ）との間の糖のパーセンテージ（およびＧＯＳ収率）の比較上の相違を示す。
【図３２Ａ】４０℃にて４０％のラクトース中で培養したときのラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６（図３２Ａ）とラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６（図３２Ｂ）との間の糖のパーセンテージ（およびＧＯＳ収率）の比較上の相違を示す。
【図３２Ｂ】４０℃にて４０％のラクトース中で培養したときのラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６（図３２Ａ）とラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６（図３２Ｂ）との間の糖のパーセンテージ（およびＧＯＳ収率）の比較上の相違を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
機構的に、グリコシダーゼは、それらの好ましいアクセプター分子として水を使用するすべてのトランスフェラーゼである。しかし、これらの酵素は、高濃度の基質炭水化物などの適切な状況下では、単糖部分を、基質（グリコシルドナーとして作用する）から他の基質または非基質炭水化物（グリコシルアクセプターとして作用する）に転移させる。典型的に、これらの反応の生成物は、すべての可能なグリコシド連結を異なる量で含有する複合体混合物である。反応は動力学的に制御されるので、合成された連結プロファイルは、生成する酵素による連結の加水分解の速度定数に対してマッピングすべきである。結果的にオリゴ糖は、胃腸管の生態系において、生成する生物によって他の生物よりも容易に代謝され得る。この手法は、実験室での試験で見込みがあることが示されている。
【００３４】
しかし、多くの酵素合成反応では、ラクトースに加えてアクセプターとして作用する他の炭水化物を含むことが可能である。このように、新規な構造を含有する新規な混合物を構築することができた。
【００３５】
乳酸桿菌およびビフィドバクテリウム属などのプロバイオティクス種は、高度に糖分解性であり、しばしば様々なグリコシダーゼ酵素を生成する。これらの酵素は、転移活性を有することができ、オリゴ糖を合成することができる。この活性は、β−ガラクトシダーゼについては広く報告されているが、α−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、またはβ−キシロシダーゼなどの他の酵素については集中的に研究されていない。スクロース依存性グリコシルトランスフェラーゼを使用して、オリゴ糖を合成することも可能である。これらは、フルクトースまたはグルコース部分のいずれかを、スクロースからスクロースアクセプターに転移し、多糖体の長鎖を構築する。しかしこれらは、適切なアクセプターが存在する状態では、しばしばヘテロ−オリゴ糖を合成する。これは、デキストランスクラーゼおよびアルテルナンスクラーゼ（alternansucrase）と共に生じることが示されており、レバンスクラーゼ（laevansucrase）と共に生じる場合もある。
【００３６】
ある合成反応の生成物を、その後の反応においてアクセプターとして使用する戦略を探求するための実験が求められている。プロバイオティクスがβ−ガラクトシダーゼおよびレバンスクラーゼを生成する場合、例えば酵素抽出物は、ガラクトオリゴ糖を合成するために使用することができた。次に、この生成物混合物を、同じ抽出物およびグリコシルドナーとしてのスクロースと併用すると、フルクタンを合成することができた。これらのフルクタンの多くは、アクセプターとして作用し得るガラクトオリゴ糖上に構築され得る。このようにして、生成する生物によって発酵が高度に調整されるはずである、新規な複合体混合物を生成することができた。
【００３７】
本実験の基礎は、新規なＧＯＳを生成するために、微生物においてβ−ガラクトシダーゼを可逆的に使用することであった。β−ガラクトシダーゼは、普通はラクトースを消化するはずである。しかし、基質および温度に関して反応条件を変化させることによって、酵素は可逆的に作用し、ラクトース（ＧＯＳ）のオリゴ糖版を産生する。
【００３８】
乳酸桿菌は、ビフィドバクテリウム属であるプロバイオティクスとしてより頻繁に使用されているが、乳酸桿菌に対して選択性があるプレバイオティクスは存在していない。またこれらのプロバイオティクスは、β−ガラクトシダーゼ活性を備えているので、実験によって、これらのプロバイオティクスに特異的なＧＯＳの生成を誘発した。ＧＯＳなどのプレバイオティクスの代謝作用は、種に特異的であり（バイ−イムノ（Bi-Immuno）細菌およびビフィド（Bifido）細菌によって証明される通り）、従って乳酸桿菌のＧＯＳは、乳酸桿菌の増殖、生存性、および健康上の利益を潜在的に増強する。
【実施例】
【００３９】
実施した実験は、以下の通りであった。
１．様々なプロバイオティクスの乳酸桿菌を集め、ＧＯＳを産生するそれらの能力について試験し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定すること、
２．逆酵素手順を使用してプレバイオティクスＧＯＳを産生すること、
３．新規な分子をスケールアップして、インビトロ試験を行うこと、
４．プロバイオティクスおよびシンバイオティクスを試験する一連の「腸モデル」実験において、プレバイオティクスが存在しない状態および存在する状態で、乳酸桿菌の生存および増殖を比較すること、
５．乳酸桿菌のためのカプセル化材料としてＧＯＳを使用できる可能性を評価すること、ならびに
６．カプセル化材料の送達特性を試験すること。
【００４０】
実験の第１段階中に最初に調査した細菌株を、以下の表１に示す。
【００４１】
【表１】
2018500048.tif 000003
【００４２】
細菌増殖曲線の決定を、ＰＢＳ９００μＬ中、培養物の希釈系列１００μＬを使用して、０時間、３時間、５時間、８時間および２４時間間隔で培養物をサンプリングすることによって行った。各系列２０μＬを、陰性対照と共に瓶上に広げ、増殖を評価した。
【００４３】
株のいくつかの細菌計数を、０．１％ラクトースを増殖培地として使用することによって評価した。図１Ａ〜１Ｆは、Ｌ．プランタルム、Ｌ．カゼイ、Ｌ．サリバリウス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ラムノサス、およびＬ．デルブリュッキのための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した経時的な細菌計数が、すべておよそ６．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌから、約１３時間目には９．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌをわずかに超える定常増殖曲線をもたらし、増殖が、２５時間目までには増大しなくなった通り漸減したことを示している。
【００４４】
株のいくつかの細菌計数を、５％ラクトースを増殖培地として使用することによって評価した。図２Ａ〜２Ｇは、Ｌ．プランタルム、Ｌ．カゼイ、Ｌ．サリバリウス、Ｌ．デルブリュッキ、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．アシドフィルスおよびＬ．ヘルベティカスのための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数を示している。ここでもすべてが、およそ６．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌから、約１３時間目には９．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌをわずかに超える定常増殖曲線をもたらし、次に、増殖は、２５時間目までには増大しなくなった通り平坦になった。
【００４５】
次に、コレステロールを細菌株の培養培地に含め、各株をインキュベーション後にコレステロールの量について試験した。
【００４６】
使用したコレステロールアッセイは、次式によるものである。
コレステロール％×乾燥重量（ｇ）-1＝（Ｂ−Ｔ／Ｂ×１００）／Ｗ
式中、Ｂ＝接種されなかった対照中のコレステロール含量（ｍｇ／ｌ-1）、Ｔ＝培養培地中のコレステロール（ｍｇ／ｌ-1）およびＷ＝細胞（１２時間のインキュベーション後の乾燥重量（ｇ））。
【００４７】
培養物のペレット重量を、上清（supernanent）とは独立に測定し、消費されたブロス（蒸発した残留物）も測定した。コレステロールアッセイを数回実施して、三連で実施した。
【００４８】
図３は、ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、１４時間にわたる異なる細菌株の増殖を示しており（ＯＤ600を毎時間測定した）、いくつかの細胞株が、この培地において増殖するのにはるかにより有効であったことを示している。Ｌ．プランタルム（Planatarum）は、最良の増殖プロファイルを示し、その後にＬ．デルブリュッキ、Ｌ．カゼイおよびＬ．ファーメンタムが続いた。図３は、ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、１２時間にわたる異なる細菌株の増殖を示しており（ＯＤ600を毎時間測定した）、いくつかの細胞株が、この培地において増殖するのにはるかにより有効であったことを示している。Ｌ．プランタルム（planatarum）は、最良の増殖プロファイルを示し、その後にＬ．デルブリュッキ、Ｌ．カゼイおよびＬ．ファーメンタムが続いた。
【００４９】
図４は、ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、試験前２日間にわたる異なる細菌株の結果を示すグラフである（ＯＤ600を毎時間測定した）。Ｌ．ファーメンタムは、最良の増殖プロファイルを示し、その後にＬ．ラムノサス、Ｌ．ヘルベティカス（halveticus）、Ｌ．ヘルベティカス（halveticus）およびＬ．サリバリウスが続いた。
【００５０】
次に、コレステロール活性をさらに測定するために、直接的なプレートアッセイ試験を株に対して実施した。静止細胞の胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）活性を測定して、コンジュゲートした胆汁酸の加水分解からのアミノ酸の放出を評価した。胆汁酸塩の脱コンジュゲーション（遊離コール酸の放出に基づく）を測定し、最後に、脱コンジュゲーションした胆汁とコレステロールの共沈殿を評価した。以下の表２は、直接的なプレートアッセイの結果を示す。
【００５１】
【表２】
2018500048.tif 000004
【００５２】
Ｌ．カゼイ、Ｌ．デルブリュッキおよびＬ．アシドフィルスは、すべて信頼できるＢＳＨ活性を有していたことが分かった。
【００５３】
コレステロールを含有する培地で増殖できる株およびＢＳＨ活性を有する株の結果を比較することによって、Ｌ．カゼイおよびＬ．デルブリュッキ、は、特定のプレバイオティクスＧＯＳを生成し、識別するのに適した候補であると思われる。
【００５４】
特定の株によって産生されたＧＯＳプレバイオティクスは、ＧＯＳを生成するだけでなく代謝する、最適化された代謝作用を有する（逆酵素手順から産生される通り）。従ってＧＯＳは、プロバイオティクスにとって非常に選択的な環境を作り出すことができるシンバイオティクスに、プロバイオティクスと共に組み込むことができる。プロバイオティクスは、健康上の特定の利益を有することができるので、健康上の特定の利益に合わせて調整されるシンバイオティクス配合物を産生することができる。
【００５５】
本発明の一態様によるシンバイオティクス組成物を識別し、配合するためのスクリーニング方法は、以下のステップに従う。
（ａ）健康上の必要性を識別するステップ、
（ｂ）プロバイオティクス作用、例えばＢＳＨ活性、コレステロール同化および心疾患にとって非常に重要な交差（interjection）点を識別するステップ、
（ｃ）ハイスループットスクリーニング方法を使用するプロバイオティクスライブラリーをスクリーニングするステップ、
（ｄ）潜在的な活性および健康上の利益を有する株を識別するステップ、
（ｅ）発酵過程を使用して活性の発現を最適化するステップ、
（ｆ）ベータガラクトシダーゼ活性について株をスクリーニングするステップ、
（ｇ）新規なＧＯＳを産生するステップ、
（ｈ）インビトロ試験を可能にするためにスケールアップするステップ、
（ｉ）プレバイオティクスが存在しない状態および存在する状態で、インビトロプレートアッセイおよび腸モデルを使用して、プロバイオティクスの生存および増殖を比較するステップ（株が特徴付けられたら、集団変化を経時的に研究するための分子方法論を使用する。このことは、数の増大または活性の増大に起因して影響を受ける場合にわかる）、ならびに
（ｊ）プレバイオティクスおよびプロバイオティクスを組み合わせて、組み合わされたプレバイオティクスおよびプロバイオティクスの効果を調査するステップ。
【００５６】
新規なＬ．ロイテリ（reuteri）ＧＯＳの嫌気的利用の評価
これらの実験では、嫌気性培養物を試験して、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を使用して２４時間目の腸内細菌群の集団をモニタすることによって、新規なラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のガラクトオリゴ糖のインビトロ利用を評価した。フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、メリビオースおよびラフィノースを、参照炭水化物として使用した。以下の表３は、これらの実験結果を示している。
【００５７】
【表３】
2018500048.tif 000005
【００５８】
結果は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuterri）のＧＯＳが、ビフィドバクテリウム属および乳酸桿菌の集団数において有意な増大を示し、プレバイオティクス効果（affect）を呈することを示している。さらにＧＯＳは、いかなる他の糖よりも乳酸桿菌の増殖速度を１０８％も増大し、属の特異性を示唆した。ラクトバチルス・ロイテリの株を添加すると、プレバイオティクス効果が増大し、ビフィドバクテリウム集団が１２０％増大した。
【００５９】
このことは、ＧＯＳを生成する生物を、その生物によって生成されたＧＯＳに添加すると、ＧＯＳ単独よりも腸ミクロフローラ集団に対する効果が大きかったことを示唆している。
【００６０】
乳酸桿菌β−ガラクトシダーゼのスクリーニングアッセイ
これらの実験では、１０種類の乳酸桿菌種を、β−ガラクトシダーゼ活性について、標準酵素アッセイを使用してｏ−ＮＰＧを基質として用いて三連でスクリーニングした。実験は、ＭＲＳ、基本培地中１％および５％ラクトースの３種類の異なる培地で実施した。ラクトースは、β−ガラクトシダーゼのための一次基質なので、最高活性を呈すると予測された。活性を０〜２４時間の間の時点で測定し、最高活性は、２４時間後に示された。図５〜６に示されている通り、一般に、５％ラクトースは、最高酵素活性を呈し、ＭＲＳブロス（炭素源としてグルコースだけを含有する）よりも高い傾向がある。高い酵素活性は、ＧＯＳを産生するために必須であり、全体的に高い活性を示す３種類の生物は、両方のＬ．ファーメンタム株およびＬ．カゼイを含む。
【００６１】
Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６から長時間かけて生成されたＧＯＳ
これらの実験では、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６を、それらのＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の生成（および消費）に関して１６８時間かけて評価した。
【００６２】
Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６のＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の収率を、以下および表４に示す。
【００６３】
【表４】
2018500048.tif 000006
【００６４】
Ｌ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６のＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の収率を、以下および表５に示す。
【００６５】
【表５】
2018500048.tif 000007
【００６６】
２０％ラクトース培地中、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６から２４時間かけて生成されたＧＯＳ
この実験では、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６のβ−ガラクトシダーゼからのＧＯＳの合成を調査した。溶解した後、粗製抽出物を、２０％ラクトース中、２４時間かけてインキュベートし、サンプルを０時間目および２４時間目に得た。
【００６７】
以下の表６は、Ｔ０において存在している糖を示す。
【００６８】
【表６】
2018500048.tif 000008
【００６９】
以下の表７は、Ｔ２４において存在している糖を示す。
【００７０】
【表７】
2018500048.tif 000009
【００７１】
Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６から短時間に生成されたＧＯＳ
この実験では、ＧＯＳを、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６から生成し、糖の酵素活性対ＧＯＳ％を、先の実験中にほとんどの活性が生じたとき、そのままの状態で５０時間にわたって評価した。
【００７２】
プロトコル
ＧＯＳを、以下のプロトコルを使用して生成した。
１．Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６のために、２％ラクトースを補充した改変ＭＲＳブロス中、一晩培養物５０ｍｌをセットアップする。
２．２％ラクトースを含有するｍＭＲＳブロス１Ｌに、一晩培養物５０ｍｌを懸濁させる。
３．嫌気性キャビネット中で３７℃においてインキュベートする。
４．Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６については１４時間。
５．Ｌ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６については８時間。
６．ＯＤ６６０を測定する。
７．培養物を１００００ｇ×１０分で遠心分離処理する。
８．リン酸ナトリウム緩衝液中、４０％ラクトースを作製する。４００ｇ／Ｌ。
９．上清を捨てる。
１０．ペレットをリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁させる（５０ｍＭ、ｐＨ６．８）。
１１．ｆａｌｃｏｎ５０ｍｌにペレットをプールする。
１２．液体窒素で３回凍結融解させる。
１３．フレンチプレスする。３０，０００ＰＳＩ、１回通過、５滴／分。
１４．溶菌液を遠沈させる−１５，０００ｇ×４５分。
１５．上清を新しいｆａｌｃｏｎに注ぐ。
１６．β−ｇａｌ活性アッセイを実施して、酵素濃縮を行う。
１７．遊離細胞抽出物を、４０％ラクトース／リン酸ナトリウム緩衝液と共にインキュベートする。
１８．２００μｌを５０時間にわたって２時間ごとにサンプリングする。
１９．サンプルを凍結させる。
２０．０．２μｍフィルタを介してすべてのサンプルを滅菌濾過する。
２１．ＨＰＬＣで分析する。
【００７３】
結果−ＧＯＳの生成
図９〜１２に示されている通り、ラクトース変換は３０〜４５％であり、ＧＯＳ収率は１０％であった。
【００７４】
酵素活性
Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６から生成されたＧＯＳの酵素活性（従って効率）を確認するために、さらなる実験を実施した。
【００７５】
培養物を、１Ｌ中でＦは８時間増殖させ、Ｆ＊については１４時間増殖させ、１２，０００ｇ×１０分で収集した。細胞を溶解し、細胞抽出物を１５，０００ｇ×４５分で遠心沈殿させた。次にこれを、４０％ラクトースリン酸ナトリウム緩衝液＋ＭｇＣｌ２中、同じＵの酵素／反応と共に４０℃でインキュベートし、活性を、ＨＰＬＣにより３６時間かけて２時間の時点で分析した。
【００７６】
酵素単位の算出は、以下の表８にある通りであった。
【００７７】
【表８】
2018500048.tif 000010
【００７８】
結果
図１３〜１６に示されている通り、ラクトース変換は４０〜５０％であり、ＧＯＳ収率は１５〜２０％であった。
【００７９】
乳酸桿菌の特異性とＧＯＳ純度
この実験では、この種に特異的なＧＯＳが任意の増殖特異性を提供するかどうかを知るために、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６から生成されたＧＯＳを、様々な細菌の増殖培地の一部として使用した。
【００８０】
ＧＯＳの合成
Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６を、２％ラクトースを補充した改変ＭＲＳ中、培養物１Ｌにおいて１４時間増殖させた。培養物を遠心沈殿させ、リン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁させた。細胞を、液体窒素およびフレンチプレスを使用して溶解し、溶菌液をスピンして、遊離細胞抽出物を得た。遊離細胞抽出物を、４０％ラクトースと共にインキュベートし、サンプルを５０時間にわたって２時間ごとに得た。サンプルを、分析のためにすべての時点後にＨＰＬＣに搭載した。
【００８１】
２０％ＧＯＳ混合物の増殖曲線
初期に生成された不純ＧＯＳの１％を、ｍＭＲＳ ｈｕｎｇａｔｅ９ｍｌに添加した。この混合物上で、以下の様々な生物の増殖を分析した。クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）およびラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueccki）。実験を、列挙したものを用いて、０、３、６、８、１６および２４時間において３回の反復し三連で実施した。
【００８２】
図１７および１８に示されている通り、Ｃ．ディフィシレ（difficile）には増殖はほとんど見出されなかったが、最良の増殖が、Ｌ．ラムノサス（rhamnosus）に見出された。２０％ＧＯＳ混合物は、一般に、乳酸桿菌に対してより選択性であった。
【００８３】
ＧＯＳ合成の最適化
次に、最適化試験を、ラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６、ラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６、およびラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）に関して実施した。
以下の成分：細菌学的ペプトン１０ｇ／Ｌ；肉エキス８ｇ／Ｌ；酵母抽出物４ｇ／Ｌ；リン酸一ナトリウム２ｇ／Ｌ；酢酸ナトリウム５ｇ／Ｌ；クエン酸三アンモニウム２ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ4 ０．２ｇ／Ｌ；ＭｎＳＯ4 ０．０５ｇ／Ｌ；Ｔｗｅｅｎ８０ １ｍｌ／Ｌ；ＬシステインＨＣＬ０．５ｇ／Ｌ；レザスリン４ｍｌ／Ｌを有し；および２％のラクトースを補充した、改変ＭＲＳ培地を増殖培地として使用した。
【００８４】
初期段階
増殖期中のβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）発現に関する最適期間を確立するために初期段階を調べた。方法は以下の通りであった。最初に、細胞を、３７℃にて大きなチューブ内で嫌気的に、１０ｍｌの改変ＭＲＳ（ｍＭＲＳ）（先に詳述）中で培養した。次に、０、２、４、６、８、１２、１６、および２４時間の間隔でサンプルを採取し、そして、酵素発現の最適期間を確立するために各時点でβ−ｇａｌ活性分析を実施した。
【００８５】
β−Ｇａｌ活性アッセイ
以下の試薬：リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．８）；塩化マグネシウム（５０ｍＭ）；炭酸ナトリウム（１Ｍ）；Ｏ−ＮＰＧ（０．２Ｍ）；および（検量線用に）ｏ−ＮＰ（１０ｍＭ）、を使用した。２５０μｌのｏ−ＮＰＧ、２０μｌのＭｇＣｌ2、２００μｌの緩衝液、および４０μｌの酵素サンプルを、３７℃、１２０ｒｐｍにて８分間インキュベートした。次に、５００μｌの炭酸ナトリウムを加え、そして、サンプルをＯＤ420で計測して、ｏ−ニトロフェノールの量を算定し、その結果として、検量線に対して結果を比較することによってβ−ｇａｌ活性を確立した。図１９は、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）のＯＤ420計測を示し、図２０は、ラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６のＯＤ420計測を示し、それに対し、図２１は、ラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６のＯＤ420計測を示す。β−ｇａｌ活性は、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）では約１２時間にてピークに達し、ラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６では約１０時間にてピークに達し、およびラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）では約１６時間にてピークに達する。
【００８６】
ＧＯＳ合成
β−ｇａｌ活性の研究に基づいて、次に、ピーク活性の時点で細胞を採取することによって、ＧＯＳを各種／菌株で合成した。５０ｍｌの予備一晩培養物を、改変ＭＲＳ培地を使って３７℃にて嫌気的に調製した。３Ｌバッチで一晩培養物を、改変ＭＲＳ培地を使って嫌気的に３７℃にて調製した。ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）では１２時間にて、ラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６では１０時間にて、およびラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６では１６時間にて、細胞を採取した。
【００８７】
次に、採取した細胞を１０，０００ｇにて１５分間遠心分離した。次に、細胞を、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．８）で洗浄し、更に１０，０００ｇにて５分間遠心分離し、次に、１０ｍｌの緩衝液中に再懸濁した。次に、細胞を、３サイクルにわたって液体窒素凍結融解を使用して溶解し、そして、細胞破砕器を２回の通過にわたり４５０００ＰＳＩにて作動させた。次に、溶解物を、１５，０００ｇにて４０分間遠心分離し、さらなる分析の前に−８０℃にて保存した。
【００８８】
最適化の分析
潜在的な最適化条件の範囲を、３種類の生物体それぞれで評価した：１、２、および４Ｕの酵素活性／ｍｌ；１５、２０、３０、４０、５０％のラクトースを含む増殖培地；４０、５０、５５、６０、６５、７５℃の培養温度；および０、４、８、１２、２４、３０時間の間隔でサンプリングをおこなう。インキュベーション後に、サンプルを、９５℃にて５分間加熱して、酵素を変性させ、次に、濾過し、そして、さらなる分析の前に−２０℃にて保存した。
【００８９】
この分析に使用した基準は、ＢｉＭｕｎｏ（登録商標）（ガラクトオリゴ糖を含んでいるClasado Ltdによって市販された製品）、ラクトース、グルコースおよびガラクトースであった。糖のパーセンテージを、曲線下面積分析を使用して評価した。
６０、６５および７５℃にて無ＧＯＳ産生が確立された（しかし、β−ｇａｌ活性アッセイをこれらの温度にて実施すると、活性を示した）。概して、１０％未満の低いＧＯＳ収率が見出され、これは、濃縮されていない酵素による可能性が高く、高レベルの水反応が加水分解を促進する。ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）からのＧＯＳ産生の根拠があった。図２２〜２５は、２０％のラクトース、２単位の酵素において、５０℃にて培養し、そして、６時間にてサンプル抽出した、選択された生物体および対照としてのラクトバチルス・デルブリュッキのＧＯＳ産生の証拠を例示するクロマトグラムを示す。図２２は、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）（ＧＯＳ％＝５．２およびラクトース％＝８９）の結果を示し；図２３は、ラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６（ＧＯＳ％＝５．５およびラクトース％＝８２）の結果を示し；図２４は、ラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６（ＧＯＳ％＝６およびラクトース％＝７５）の結果を示し；および図２５は、ラクトバチルス・デルブリュッキ（ＧＯＳ％＝１７およびラクトース％＝３２）の対照株の結果を示して、反応が作動していたことを証明している。
【００９０】
対照としてＢ．ビフィダムを使用したさらなる合成反応を試みた。Ｂ．ビフィダム粗細胞抽出物をＢｉｍｕｎｏ（登録商標）と同様にＧＯＳ生成物の合成に使用して、アッセイが適切に動作したかどうか評価した。選択された生物体の成長は、５０℃および６単位の酵素／ｍｌにて４０％のラクトースにおいて存在した。プレーティングアウトプロトコールを使用して、予備一晩培養後、かつ、得られた３Ｌ培養物を採取する前に純粋培養物を提供した。図２６が、１４時間のラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）に関するクロマトグラムを示す一方で、図２７が、２４時間のラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）に関するクロマトグラムを示す。図２８は、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）に関する１２および２４時間におけるＧＯＳ、ラクトース、および単糖の収率のグラフを示し、そして、その結果はまた、以下の表９にも示される：
【００９１】
【表９】
2018500048.tif 000011
【００９２】
結果は、トランスガラクトシル化反応が起こっていて、ラクトース（基質）が消費され、かつ、単糖（生成物）が増加していることを示す。ＧＯＳはβ−ｇａｌによって合成されるが、その後、β−ｇａｌによって加水分解される。最適化の観点から、１４時間において６６％のラクトース変換にて３０．５％の最高ＧＯＳが好ましいことが確立された。
【００９３】
ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）の最適化されたＧＯＳ産生は、コレステロール、心臓病、糖尿病または肥満の管理に関して調査中であった２種類の他の菌株、ラクトバチルス・プランタルム２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）およびラクトバチルス・プランタルム２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ならびにラクトバチルス・プランタルムの他の菌株と同様であり得る。
【００９４】
同様の実験を、ラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６およびラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６の両方に関する両合成反応について実施した。酵素単位が制御されていなかったので、データが変動した。図２９は、４０％のラクトース中で５０℃にて２４時間の培養にわたるラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６に関する糖のパーセンテージを示すグラフであり、さらに、以下の表１０でもより詳細に示される：
【００９５】
【表１０】
2018500048.tif 000012
【００９６】
結果は、明確なトランスガラクトシル化反応が起こっていて、１２時間において６６．５％のラクトース変換にて最適な３１％のＧＯＳ収率が確立されたことを示す。
４０％のラクトース中、５０℃にて２４時間にわたるラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６に関する糖のパーセンテージの結果を、以下の図３０および表１１に示す：
【００９７】
【表１１】
2018500048.tif 000013
【００９８】
結果は、ＧＯＳが産生され、そして、２２時間において６４％のラクトース変換にて最適な２３％のＧＯＳ収率が確立されたことを示す。
図３１Ａおよび３１Ｂは、１５％のラクトース中、４０℃にて培養したときのラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６とラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６との間の糖（およびＧＯＳ収率）のパーセンテージの比較上の違いを示し、そして、両方とも同様の時点にて同様のＧＯＳ収率を示す。結果はまた、わずかなトランスガラクトシル化が低いラクトース濃度（１５％）に起因すると予想されることも実証する。それが（加水分解）であり、そして、これらの条件下で高い単糖産生も示す、反応を実施して、酵素が活性であることを確実にした。
【００９９】
図３２Ａおよび３２Ｂは、４０％のラクトース中、４０℃にて培養したときのラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６とラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６との間の糖（およびＧＯＳ収率）のパーセンテージの比較上の違いを示す。ラクトバチルス・ファーメンタムＮＣＩＭＢ３０２２６は、その後急激に次第に小さくなった１８時間におけるＧＯＳ産生のピーク（５１．０８％）を示した。ラクトバチルス・ファーメンタムＡＴＣＣ１１９７６は、２時間にＧＯＳ産生のピーク（４０．４７％）を示し、その後時折、比較的高い％（２６〜３４％の間）のＧＯＳを維持した。
前述の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護範囲を制限するものではなく、本発明を実施することができる実施例を例示する。
【０１００】
生物材料の寄託
当該出願は、寄託された生物材料に関する以下の表示に関係し、および主張する。
名称：欧州細胞培養物保存機関
住所：英国公衆衛生培養物保存施設、ポートンダウン、ソールズベリー、ＳＰ４ ０ＪＧ、英国
日付：２０１３年１１月４日
受入番号：１３１１０４０１
−および−
名称：欧州細胞培養物保存機関
住所：英国公衆衛生培養物保存施設、ポートンダウン、ソールズベリー、ＳＰ４ ０ＪＧ、英国
日付：２０１３年１１月４日
受入番号：１３１１０４０２
−および−
名称：欧州細胞培養物保存機関
住所：英国公衆衛生培養物保存施設、ポートンダウン、ソールズベリー、ＳＰ４ ０ＪＧ、英国
日付：２０１３年１１月４日
受入番号：１３１１０４０３
【図１Ａ】
2018500048.tif 000014
【図１Ｂ】
2018500048.tif 000015
【図１Ｃ】
2018500048.tif 000016
【図１Ｄ】
2018500048.tif 000017
【図１Ｅ】
2018500048.tif 000018
【図１Ｆ】
2018500048.tif 000019
【図２Ａ】
2018500048.tif 000020
【図２Ｂ】
2018500048.tif 000021
【図２Ｃ】
2018500048.tif 000022
【図２Ｄ】
2018500048.tif 000023
【図２Ｅ】
2018500048.tif 000024
【図２Ｆ】
2018500048.tif 000025
【図２Ｇ】
2018500048.tif 000026
【図３】
2018500048.tif 000027
【図４】
2018500048.tif 000028
【図５Ａ】
2018500048.tif 000029
【図５Ｂ】
2018500048.tif 000030
【図５Ｃ】
2018500048.tif 000031
【図６Ａ】
2018500048.tif 000032
【図６Ｂ】
2018500048.tif 000033
【図６Ｃ】
2018500048.tif 000034
【図７】
2018500048.tif 000035
【図８】
2018500048.tif 000036
【図９】
2018500048.tif 000037
【図１０】
2018500048.tif 000038
【図１１】
2018500048.tif 000039
【図１２】
2018500048.tif 000040
【図１３】
2018500048.tif 000041
【図１４】
2018500048.tif 000042
【図１５】
2018500048.tif 000043
【図１６】
2018500048.tif 000044
【図１７】
2018500048.tif 000045
【図１８】
2018500048.tif 000046
【図１９】
2018500048.tif 000047
【図２０】
2018500048.tif 000048
【図２１】
2018500048.tif 000049
【図２２】
2018500048.tif 000050
【図２３】
2018500048.tif 000051
【図２４】
2018500048.tif 000052
【図２５】
2018500048.tif 000053
【図２６】
2018500048.tif 000054
【図２７】
2018500048.tif 000055
【図２８】
2018500048.tif 000056
【図２９】
2018500048.tif 000057
【図３０】
2018500048.tif 000058
【図３１Ａ】
2018500048.tif 000059
【図３１Ｂ】
2018500048.tif 000060
【図３２Ａ】
2018500048.tif 000061
【図３２Ｂ】
2018500048.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月30日(2016.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタルムによって生成されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むラクトバチルス選択性プレバイオティック組成物であって、ここで、該ＧＯＳは、選択されたラクトバチルス・プランタルムプロバイオティクス細菌株の選択増殖培地としての役割を果たし、かつ、該ＧＯＳは、選択されたプロバイオティクス細菌株における逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成される形態と実質的に同じである、組成物。
【請求項２】
前記ＧＯＳが、以下の菌株：ラクトバチルス・プランタルム２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）；ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）；ラクトバチルス・プランタルム２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはその突然変異株の１もしくは複数によって生成され、および／またはそれらに対して選択性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がカプセル化されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、身体の胃腸環境を通過し、かつ、その機能特性を維持できるようにするための賦形剤または担体化合物をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、飲むことができる液体の形態であり、および／または固体もしくは液体食料品と混合できる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
薬品として使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
栄養補助食品として使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
コレステロールの管理または高コレステロールの処置に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
メタボリック症候群の管理または処置に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
体重管理に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
糖尿病の管理または処置に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ラクトバチルス選択性ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生成する方法であって、嫌気条件下、最高５５℃の温度にて最長１６時間、最高５０％のラクトースを含む増殖培地中で１若しくは複数のラクトバチルス・プランタルムを培養し、そして、ラクトバチルス・プランタルム細胞からＧＯＳを採取するステップを含む方法。
【請求項１３】
前記１若しくは複数のラクトバチルス・プランタルム菌株を、最高５０℃の温度にて最長１４時間、最高４０％のラクトースを含む増殖培地中で培養する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記増殖培地が、ＭＲＳ培地またはその改変バージョンを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＲＳ培地が：約１０ｇ／Ｌの細菌学的ペプトン；約８ｇ／Ｌの肉エキス；約４ｇ／Ｌの酵母抽出物；約２ｇ／Ｌのリン酸一ナトリウム；約５ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム；約２ｇ／Ｌのクエン酸三アンモニウム；約０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ4；約０．０５ｇ／ＬのＭｎＳＯ4；１ｍｌ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；約０．５ｇ／ＬのＬシステインＨＣＬ；約４ｍｌ／Ｌのレザスリン；および最高約５０％のラクトース、を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＧＯＳが、溶解によってラクトバチルス・プランタルム細胞から採取される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶解が、１若しくは複数の凍結−融解ステップを伴う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ラクトバチルス・プランタルム菌株は、次の：ラクトバチルス・プランタルム２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）；ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）；ラクトバチルス・プランタルム２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはその突然変異株のうちの１もしくは複数から選択される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＯＳの収率が、最高約３５％である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＧＯＳの収率が、最高約３１％である、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ラクトースの変換が、最高約７０％である、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ラクトースの変換が、最高約６６％である、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物に使用するためのＧＯＳを生成するのに使用される、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2018500048.tif 000063
2018500048.tif 000064
2018500048.tif 000065