(57)【要約】  本発明は、眼用リポ酸コリンエステル組成物、および眼に好適な前記組成物の生体適合性製剤を生成するための特定のプロセスを記載する。
2018536018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．１〜１０重量％のリポ酸コリンエステルの薬学的に許容される塩、０．１〜２重量％の浸透圧調整剤、０．００３〜０．０１重量％ｍｐ防腐剤、０．０５％〜１．０重量％の生化学的エネルギー源、および水を含む、老視の治療のための薬学的組成物。
【請求項２】
前記リポ酸コリンエステルの薬学的に許容される塩が塩化物塩、臭化物塩、またはヨウ化物塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記浸透圧調整剤がグリセロールである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記防腐剤が塩化ベンザルコニウムである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記生化学的エネルギー源がアラニンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも９カ月、または少なくとも１年の貯蔵安定性を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
非刺激性点眼溶液である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の薬学的組成物を生成する方法であって、
前記リポ酸コリンエステルの薬学的に許容される塩を細かく粉砕することと、
５ｐｐｍ未満、好ましくは２ｐｐｍ未満の酸素を有する水に粉砕された前記塩を加えることと、
６〜８時間、好ましくは８時間室温で混合して、混合物を形成することと、
眼用ボトルに前記混合物を充填し、キャッピング前に不活性ガスのオーバーレイを加えることと、
充填およびキャッピングされた前記眼用ボトルをガス不透過性パウチにパッケージングすることと、
前記パッケージを２〜８℃で保管することと
を含む、方法。
【請求項９】
前記パウチが酸素捕捉剤を含有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リポ酸コリンエステルの薬学的に許容される塩が、５ｍｍ以下の平均粒径を有する粉末に粉砕される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
混合温度が２０〜２５℃の間である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記不活性ガスが窒素である、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記眼用ボトルが、低密度ポリプロピレン（ＬＤＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、またはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ボトルである、請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記眼用ボトルが、吹き込み−充填−密封ユニットである、請求項８から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれか一項に記載の方法によって調製された、貯蔵安定かつ／または非刺激性の点眼溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、眼用リポ酸コリンエステル組成物および生体適合性であり安定であり非刺激性である点眼製剤を生成するためのプロセスに関する。本明細書における組成物は、（限定されないが）老視、ドライアイ、白内障、および加齢性黄斑変性症などの眼障害のための治療薬として企図される。
【背景技術】
【０００２】
リポ酸コリンエステル（ＬＡＣＥ）は、Ｒ−α−リポ酸の化学的に合成された誘導体である。
【０００３】
チオクト酸としても知られるリポ酸は、ジスルフィド結合が６番炭素と８番炭素とを結合して１，２−ジチオラン環を形成している炭素数８の脂肪酸である。この酸は光学異性体を形成し、その中でも異性体Ｒ−α−リポ酸が最も生物学的に活性である。
【０００４】
リポ酸コリンエステル（ＬＡＣＥ、化学構造は図１を参照されたい）は、カチオン性コリン頭部基の組み込みによって生体膜を透過するように設計された。リポ酸は角膜を透過しないが、リポ酸のコリンエステル誘導体は角膜を透過し、角膜エステラーゼによって加水分解され、生物学的に活性なリポ酸に変換される。ＬＡＣＥは、老視を治療するための点眼薬として１日２回適用される眼用溶液に製剤化されている。
【０００５】
リポ酸およびコリンからなるプロドラッグであるＬＡＣＥは、老視を治療するための独特の分子である。リポ酸（ＬＡ）は活性成分であり、コリン頭部基は眼への透過性を助ける働きをする。ＬＡとコリンとの間の結合は、点眼薬が投与された後に涙膜および角膜のエステラーゼによって加水分解される。遊離リポ酸は眼に入り、最終的に水晶体に達する。水晶体において、リポ酸は、内在性の酸化還元酵素によりジヒドロリポ酸に還元され、これにより次に、表面の細長い水晶体細胞内における細胞質タンパク質の加水分解が起こる。このタンパク質切断により、サイトゾルの自由な流れ、および水晶体の加齢性硬化に関連する酸化的プロセスの逆転が可能になる。ＬＡＣＥから調製された眼用溶液は、遠近調節の加齢性損失である老視を有する人々の遠近調節を可能にし、近見視力の焦点を改善させることが期待されている。
【０００６】
老視とは、加齢に関連して近くの物体に焦点を合わせることができなくなることであり、この状態は、目に見える物体に焦点を合わせるための水晶体の焦点距離および湾曲の自動調整における柔軟性の損失をもたらす、水晶体の微細構造の生理学的変化によって引き起こされる。この状態は、補正レンズによって補正される。リポ酸コリンエステル（「ＬＡＣＥ」）（例えば、米国特許第８，４１０，４６２号を参照されたい）は、近見視力を回復させうると報告されている。
【０００７】
この主張の裏付けとなるのは、水晶体の軟化が、ヒトドナーの水晶体ではタンパク質ジスルフィド還元剤のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用し、またマウスの水晶体ではリポ酸を用いて、薬理学的に誘発されうることを実証したエクスビボ研究である。
【０００８】
この作用機序により、複数の眼疾患および眼障害の治療を企図することが可能になる。これらの障害は、限定されないが、老視、加齢性黄斑変性症、白内障、およびドライアイである。
【０００９】
ＬＡＣＥの製剤を問題のあるものにしている問題点は、分子の活性を損なう酸化種を形成するジチオラン結合の開環によって不安定化する傾向である。室温においてＬＡＣＥは急速に分解して酸化種になる（「HPLC Chromatogram of LACE Ophthalmic Solution with Degradation Products」参照、図２参照）。冷蔵温度で保管したときでさえ、早ければ１週間の保管で急速な酸化が起こり、薬品としての分子の有用性が損なわれる。ＬＡＣＥ眼用溶液（別称ＥＶ０６眼用溶液）を薬品としてのその可能性の限界まで利用するためには、水性製剤が保管および使用中に安定化されることが重要であった。
【００１０】
ＬＡＣＥ眼用溶液の薬学的発展を阻んだ別の問題点は、ウサギ刺激モデルにおいてインビボで観察された眼表面刺激の発生であった。本発明は、眼球刺激に寄与したかまたは眼球刺激を引き起こした予想外のパラメータ、およびこれらのパラメータを排除するかまたは最小限に抑えるためのプロセスを詳述する。これらのパラメータは、通常は眼球刺激に相関または起因する要因である原薬の製剤組成または特性に関連しなかった。
【００１１】
本明細書に記載される組成物および方法は、眼用ＬＡＣＥ製剤を長期間安定化させるための方法を説明する。また、特定のプロセス条件下で製剤化されたＬＡＣＥ製剤の刺激の原因に関する予期せぬ発見も説明する。最終の快適なＬＡＣＥの眼用溶液（ＥＶ０６眼用溶液）の作製における主要な要因として特定された重要なプロセスパラメータも非自明的である。
【００１２】
最終的なプロセス条件は分解種の形成を最小限に抑え、眼球刺激に起因する種の形成を最小限に抑えた。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】リポ酸コリンエステルの化学構造を示す図である。
【図２】１、３、および４時間混合した製剤ＫＷ−ＬＡＣＥ−０１−８６−２の８．１分でのＬＡＣＥミセル種を示す図である。
【図３】６、８、および２４時間混合した製剤ＫＷ−ＬＡＣＥ−０１−８６−２の８．１分でのＬＡＣＥミセル種を示す図である。
【図４】ミセルＬＡＣＥ種（矢印により表されるピーク）は冷蔵温度で混合したときに最も高いことを示す図である。
【図５Ａ】高いミセルＬＡＣＥ濃度（ＨＰＬＣで７．９〜８．５分の間の大きなピークによって表される）が「集塊のある（clumped）」ＬＡＣＥ塩化物のＡＰＩと相関することを示す図である。
【図５Ｂ】低いミセルＬＡＣＥ（矢印により表されるピーク）が集塊のないＬＡＣＥ  ＡＰＩと相関することを示す図である。
【図６】アラニンおよびｐＨの効果を示す図である。
【図７】次の可変要素を比較する製剤のプロットである：（ａ）対照（原物）と、対照＋０．２５％塩化ナトリウム、グリセリンを含まない対照＋０．２５％塩化ナトリウムとの対比、（ｂ）対照（原物）と塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）を含まない対照との対比、（ｃ）対照（原物）とグリセリンを含まない原物の製剤との対比。
【図８】５７℃におけるＬＡＣＥ安定性に対する亜硫酸塩の効果を示す図である。亜硫酸塩含有製剤は、ｐＨ４および４．５において、亜硫酸塩０．０５％（黒四角■、黒三角▲）および亜硫酸塩０．１％（ｘ）の濃度で調製した。亜硫酸塩の添加は、原物の製剤（黒菱形◆）を安定化させなかった。
【図９】塩化ベンザルコニウムを排除することによる安定化効果の可能性をさらに探索する図である。塩化ベンザルコニウムを含まない製剤変化形態は全て、対照の原物の製剤（ｐＨ４．５）よりも優れていた。製剤変化形態は、ｐＨ４、４．５（黒三角▲、黒四角■）のＢＡＣ不含組成物、グリセリンなし／ＢＡＣなし＋０．９％塩化ナトリウム（ｘ）、ｐＨ４および４．５のＢＡＣなし＋０．０５％亜硫酸塩（黒丸●、黒四角■）であった。
【図１０】グリセリンの排除がＬＡＣＥ安定性に与える効果を示す図である。
【図１１】緩衝組成物がＬＡＣＥ安定性に与える効果を示す図である。
【図１２Ａ】ＨＰＬＣ−ＵＶにより測定されたＬＡＣＥミセル種％と刺激スコア（ウサギ刺激モデルにおける）の相関性を示す図である。
【図１２Ｂ】ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤにより測定されたＬＡＣＥミセル種％と刺激スコア（ウサギ刺激モデルにおける）の相関性を示す図である。
【図１３】グリセロールオスモル濃度標準曲線を示す図である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、２つの主な目的、すなわち（ａ）２〜５℃の冷蔵保管温度で少なくとも１年間安定であるＬＡＣＥの眼用溶液を作製すること、および（ｂ）眼に対して非刺激性であるＬＡＣＥの眼用溶液を調製するためのプロセスパラメータを作製し最適化することを達成する。
【００１５】
ＬＡＣＥの化学構造は、２つの分解点を示す。１つはジチオラン環の開環であり、もう１つは酸化的および加水分解的な分解である。先に言及したように、ＬＡＣＥは酸素と相互作用して酸化種を急速に発生させる。水中では、ＬＡＣＥはまた、リポ酸およびコリンを発生させるエステル結合の加水分解を受けやすい。加水分解が起こる速度は温度に相関し、加水分解は低い温度およびｐＨにおいて少ない。
【００１６】
ガス透過性である透過性低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）点眼器ボトルに保管された、ＥＶ０６眼用溶液とも呼ばれるＬＡＣＥ眼用溶液誘導体に関する研究が行われた。本明細書には、調合されたＬＡＣＥ溶液の保管中の酸化を最小限に抑えるために本発明者らが開発した方法が記載される。
【００１７】
さらに、ＬＡＣＥを含む賦形剤混合物の広範な適合性研究は、安定化因子としての特定の賦形剤の重要性、水中でのＬＡＣＥの加水分解の安定化におけるｐＨの役割、ならびに塩化ナトリウムおよびグリセロールなどのオスモル濃度調整剤の効果を証明した。最も重要なことには、クエン酸塩、リン酸塩、およびホウ酸塩に対立するものとして、ＬＡＣＥに対するアラニンの安定化効果が本発明において説明された。
【００１８】
刺激の原因を探求している間に、ＬＡＣＥが水に溶解すると、本質的に両親媒性である化合物に一般的なミセルおよびミセル凝集体が生じることが発見された。定義として、ミセル形成化合物の例は、ホスファチジルコリン、ペグ化ホスファチジルコリン、ステアリン酸ＰＥＧ、ソルビトールなどである。この分子には両親媒性の性質があるため、ＬＡＣＥのミセル形成現象は予想外ではないが、より低い温度でのこれらの凝集体の形成は意外であった。凝集体の存在は、組織内で開発されたＲＰ−ＨＰＬＣ法によって測定された。この測定は、ＨＰＬＣ−ＵＶ（図３Ａ）およびＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ（図３Ｂ）の両方で行うことができた。
【００１９】
ＬＡＣＥ水溶液は、冷蔵温度（２〜５℃）でゲル様の構造を形成した。また、ミセル形成薬物の濃度の上昇とともに、これらのミセル集合体の数および凝集が増加することが予想される。本発明者らは、ＬＡＣＥのミセル凝集の程度と眼表面の刺激との相関性を示した。ミセルビヒクルは不溶性化合物のための薬物送達系として企図されることが多いため、これは予想外であり驚くべき結果である。したがって、ミセル凝集体との刺激の相関を報告する記述はこれが初めてである。この現象は、発見された以上、快適さと相関する調合方法によって最小限に抑える必要があった。
【００２０】
ミセル凝集体の形成は、調合温度と相関しているようであった（図４）。自己集合体の形成は、最小化されたエネルギー状態を達成するための表面自由エネルギーの効率的な低下と相関する熱力学的現象である。ＬＡＣＥをより低い温度（５℃）の水中で調合すると、ゲル様の稠度を有した凝集体が形成された。冷蔵温度で製剤化した組成物は、眼に対して極度に刺激性であった。凝集の状態は、ＲＰ−ＨＰＬＣ法によって定量化することができた（図３Ａ〜３Ｂに示されるクロマトグラムを参照されたい）。一連の調査実験は、広範なサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって測定したとき、ポリマーまたはオリゴマーの存在を示さなかった。他の調査では、周囲空気の存在下または窒素の存在下で実施されたプロセスに応じた眼球刺激を試験した。空気または窒素との刺激の相関性は存在しなかった。分解生成物は空気の存在下でより高かったものの、室温で製剤化したとき、両者は等しく快適であった。ＬＡＣＥを室温で調合したとき、ＨＰＬＣ法で定量化するとミセル凝集はより低かった。室温で調合したＬＡＣＥは、快適であり非刺激性の溶液を作製した。
【００２１】
ミセル凝集体の「ほぐれ（disentangling）」も予期せぬものであった。ＬＡＣＥ水性組成物中に生じた凝集体は、ＨＰＬＣによって測定した場合に、溶液を室温で卓上に放置して平衡化させると「ほぐれる」ことができた。さらなる実験は、勢いよい混合が脱凝集を達成したことを示した。したがって、これらの種は共有結合を有する恒久的な種ではないことが証明され、むしろ、ＬＡＣＥ凝集体の自己集合は５℃と比較して室温でより低い濃度を有するようであった。ＬＡＣＥ水溶液は、凍結すると粘質の稠度を生じた。これらの溶液は、室温まで上昇させてこの温度で保管したとき、再び均質な溶液のように見え、自己集合の温度依存性の概念の信憑性がさらに高まった。
【００２２】
しかしながら、凝集体を含まないＬＡＣＥ溶液は、ひとたび調合されれば、冷蔵条件で保管して酸化的および加水分解的な分解を最小限に抑えることができた。安定性研究を通じて、分解事象を最小限に抑えるのに理想的なＬＡＣＥの保管温度は２〜５℃であることが証明された。
【００２３】
刺激が最も少ない溶液をもたらすために理想的な調合条件は室温（２２〜２５℃）であると決定され、老視のための安定で快適なＬＡＣＥの眼用溶液を得るために理想的な保管条件は２〜５℃の間であると決定された。
【００２４】
ＬＡＣＥから調製された眼用溶液の安定化をさらに助けるため、酸素捕捉剤パケットをＬＤＰＥ眼用ボトルとともにマイラー製の不透過性パウチに入れて酸化誘発性分解を防止した。広範な安定性研究は、ＥＶ０６眼用溶液の１年間の安定性の達成を実証した。
【００２５】
また、本発明では、薬物を安定化させることを主な目的として調合されたリポソーム、エマルションといった他の種類の水性調製物を含む、ＬＡＣＥを安定化させる様々な組成物の実施形態が記載される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
Ａ．用語の定義
「ＥＶ０６」、「ＬＡＣＥ」、または「リポ酸コリンエステル」という用語は、図１に示される化学構造を有するものと理解される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、ＬＡＣＥ製剤とは、リポ酸コリンエステル製剤を指す。例えば、ＬＡＣＥ１．５％製剤とは、製剤の１．５重量％のリポ酸コリンエステルを有する製剤を指す。あるいは、ＥＶ０６眼用溶液、１．５％とは、１．５％のリポ酸コリンエステルを含む製剤を指す。
【００２８】
本明細書で使用される場合、リポ酸コリンエステルの「誘導体」とは、リポ酸コリンエステルを非水性の薬学的賦形剤と反応させることにより形成される、リポ酸およびコリンを除く任意の化合物または化合物の混合物として理解される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「自己集合」という用語は、最も安定なエネルギー状態を達成するための分子の熱力学的集合を表す。自己集合の一例は、典型的には疎水性構成成分および親水性構成成分を含む分子により形成される、水中で形成されるミセルである。分子の親水性構成成分がミセルの表面にあり、一方で内部は疎水性部分を含有する。ＬＡＣＥでは、コリン頭部基がミセルの表面にある。
【００３０】
明確に記述される場合または文脈から明らかである場合を除いて、本明細書で使用される場合「賦形剤」という用語は、薬学的に許容される賦形剤を指す。
【００３１】
「治療する」という用語は、疾患もしくは障害に関連する状態、症状、またはパラメータを改善させるために有効な量、様式、または形態で治療薬を投与することを指す。
【００３２】
「防止する」という用語は、統計的に有意な程度または当業者にとって検出可能な程度のいずれかまで、患者が障害に罹ることを防ぐこと、患者により長い期間障害のない状態を維持させること、または障害の進行を停止することを指す。
【００３３】
「治療有効量」という用語は、対象の眼疾患または眼障害（例えば老視）の発症の防止もしくは遅延またはその症状の寛解、あるいは遠近調節の幅もしくは病態を示す別の好適なパラメータの改善といった所望の生物学的成果の実現をもたらす、活性成分（例えばＬＡＣＥまたはその誘導体）の量を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「貯蔵安定性」または「貯蔵安定の」という用語は、保管の際に実質的に変化しない組成物もしくは活性成分（例えばＬＡＣＥまたはその誘導体）の特徴として、またはそれを特徴付けるものとして理解される。かかる貯蔵安定性を決定するための方法は公知であり、例えば、貯蔵安定性をＨＰＬＣによって測定して、製剤を特定の期間保管した後に残る、または製剤中で分解した、組成物もしくは活性成分（例えばリポ酸コリンエステル）の百分率を決定することができる。例えば、貯蔵安定の薬学的組成物とは、医薬品規格（ＩＣＨ）に従って保管した後、ＨＰＬＣによって測定した場合に少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超）の活性成分（例えばリポ酸コリンエステル）が組成物中に存在する組成物を指しうる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、化合物の「相対保持時間」または「ＲＲＴ」という用語は、「ＲＲＴ＝（ｔ2−ｔ0）／（ｔ1−ｔ0）」の方程式を使用して計算することができ、式中、ｔ0はボイド時間であり、ｔ1は、ＨＰＬＣによって測定した場合のリポ酸コリンエステルの保持時間であり、ｔ2は化合物の保持時間である。
【００３６】
本明細書で使用される「対象」という用語は、一般に、動物（例えばペット）あるいは健常なヒトまたは特定の疾患もしくは障害（例えば老視）を有する患者を含むヒトを指す。
【００３７】
ＶＩ．ＬＡＣＥ組成物および実施形態
本明細書に記載されるように、提案される本発明は、治療有効量のリポ酸コリンエステル、賦形剤、緩衝液、および適合性の条件を含む薬学的組成物、ならびに眼用点眼薬として好適である生体適合性（非刺激性）で安定な溶液をもたらす方法およびプロセスの実施形態を提示する。
【００３８】
本薬学的組成物中のリポ酸コリンエステルまたはその誘導体の濃度は、組成物の０．０１〜０．１重量％、０．１重量％〜１０重量％（例えば０．１重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、またはこれらの指定数値に基づく任意の範囲）の任意の濃度とすることができる。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物中のリポ酸コリンエステルの濃度は１％である。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物中のリポ酸コリンエステルの濃度は３％である。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物中のリポ酸コリンエステルの濃度は４％である。本組成物中のＬＡＣＥの好ましい範囲は１〜３％である。この範囲において、好ましい組成範囲は１．５〜４％である。
【００３９】
別の実施形態では、提案される本発明の有効な組成物は、ＬＡＣＥおよびアラニンを含有する水性製剤であり、アラニンは、０．１〜０．５％、０．５％〜１％、１％〜１．５％、１．５％〜３％の間の濃度である。この範囲において、好ましい組成は、アラニン０．５％およびＬＡＣＥ１．５％である。
【００４０】
好ましい実施形態では、有効なＬＡＣＥおよびアラニンを含有する組成物は、防腐剤として塩化ベンザルコニウムを３０〜１５０ｐｐｍの間の濃度で含有する。
【００４１】
別の実施形態では、ポリクオタニウム、ＳｏｆＺｉａといった他の防腐剤が、ヒトへの使用のためにＦＤＡにより認可されている濃度で防腐剤としてＬＡＣＥ水性製剤中に含まれる。他の防腐剤は、２−フェニルエタノール、ホウ酸、エデト酸二ナトリウムであってもよい。
【００４２】
別の実施形態では、ＬＡＣＥ含有眼用溶液は、防腐剤を含まない単回用量の無菌生成物である。
【００４３】
高い濃度で水中に溶解したＬＡＣＥの自己集合ミセル溶液はいくらかの刺激を示しうるため、生体適合性溶液をもたらすための一方法は、リポソームでの被包でありうる。この場合、ＬＡＣＥはリポソームの内部に含まれる。リポソームは一般に、眼表面との生体適合性がある。
【００４４】
別の実施形態では、本薬学的組成物は、０．１％〜１０％の濃度のグリセロールを有する。好ましい実施形態では、本組成物は、０．１〜５％のグリセロール濃度を有する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、防腐剤は塩化ベンザルコニウムであり、生化学的エネルギー源はアラニンである。いくつかの実施形態では、リポ酸コリンエステルは、塩素イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、メタンスルホン酸イオン、硝酸イオン、マレイン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、フマル酸イオン、フマル酸水素イオン、酒石酸イオン（例えば、（＋）−タートレート、（−）−タートレート、またはそれらの混合物）、酒石酸水素イオン、コハク酸イオン、安息香酸イオン、およびグルタミン酸などのアミノ酸のアニオンからなる群から選択される対イオンを有する。
【００４６】
好適な緩衝剤は、本薬学的組成物のために所望のｐＨを達成することのできる当該技術分野で知られるもののうちのいずれか（例えば本明細書に記載のもの）でありうる。非限定的な例としては、リン酸緩衝液（例えば、リン酸一ナトリウム一水和物、リン酸二ナトリウム（無水））、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、およびＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）が挙げられる。緩衝剤の好適な量は、所望のｐＨに基づいて容易に計算することができる。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、緩衝剤は、眼用生成物として許容される量におけるものである。しかしながら、いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は緩衝剤を含まない。いくつかの実施形態では、水溶液または最終的な薬学的組成物のｐＨは、酸（例えば塩酸）または塩基（例えば水酸化ナトリウム）によって所望のｐＨ範囲（例えば本明細書に記載のもの）に調整される。
【００４７】
他の実施形態では、緩衝系は、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、カルシウム緩衝液、ならびにそれらの組合せおよび混合物から選択されうる。好ましい実施形態では、緩衝液はアミノ酸緩衝液である。別の好ましい実施形態では、アミノ酸緩衝液はアラニンを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、リポ酸コリンエステルは、塩素イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、メタンスルホン酸イオン、硝酸イオン、マレイン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、フマル酸イオン、フマル酸水素イオン、酒石酸イオン（例えば、（＋）−タートレート、（−）−タートレート、またはそれらの混合物）、コハク酸イオン、安息香酸イオン、およびグルタミン酸などのアミノ酸のアニオンからなる群から選択される対イオンを有する。他の対イオンは、ステアリン酸イオン、プロピオン酸イオン、およびフロ酸イオンである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本眼用製剤は、４〜８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本眼用製剤は、４．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本眼用製剤は、生化学的に許容されるエネルギー源、防腐剤、緩衝剤、等張化剤、界面活性剤、粘度調節剤、および抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、抗酸化剤を含有する。いくつかの好ましい実施形態では、抗酸化剤は、アスコルビン酸を含む。別の好ましい実施形態では、抗酸化剤は、グルタチオンを含有する。好適な抗酸化剤は、当該技術分野で知られるもののうちのいずれでもよい。非限定的な例としては、アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、アルファチオグリセリン、エチレンジアミン四酢酸、エリトルビン酸、システイン塩酸塩、Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−カルニチン、クエン酸、酢酸トコフェロール、二塩化イソシアヌル酸カリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、ダイズレシチン、チオグリコール酸ナトリウム、チオリンゴ酸ナトリウム、天然ビタミンＥ、トコフェロール、アスコルビルパスチミネート（ascorbyl pasthyminate）、ピロ亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、１，３−ブチレングリコール、ペンタエリスリチルテトラキス［３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）］プロピオネート、没食子酸プロピル、２−メルカプトベンズイミダゾール、および硫酸オキシキノリンが挙げられる。抗酸化剤の好適な量は、組成物の０．１重量％〜５重量％の範囲（例えば０．１重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、またはこれらの指定数値に基づく任意の範囲）とすることができる。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、抗酸化剤は、眼科的に許容される量におけるものである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、高純度の窒素またはアルゴンなどの不活性環境下で調合することによって調製される。好ましい実施形態では、本薬学的組成物は、２ｐｐｍ未満の酸素を含む窒素環境下で調合される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、２０〜２５℃の間の温度で調合することによって調製される。
【００５３】
好ましい実施形態では、固体ＬＡＣＥ分子は、微粉末状に粉砕される。好ましくは、固体ＬＡＣＥ分子は、集塊のない粉末状に粉砕される。ある実施形態では、粒径は、５００ミクロン未満である。別の好ましい実施形態では、粒径は、１００ミクロン未満である。
【００５４】
好ましい実施形態では、本薬学的組成物は、室温（２０〜２５℃）に維持した水溶液をまず脱気し、次にこの溶液中に賦形剤を溶解させ、続いて、低速の窒素スパージ下で勢いよく溶解させながら固体ＬＡＣＥを分けてゆっくりと添加することによって調製される。
【００５５】
一実施形態において、本薬学的組成物は、４時間〜２４時間勢いよく撹拌される。好ましい実施形態では、本薬学的組成物は、４時間〜８時間勢いよく撹拌される。別の好ましい実施形態では、本薬学的組成物は、８時間勢いよく撹拌される。
【００５６】
いずれの方法によって調製された薬学的組成物も、少なくとも３カ月（例えば３カ月、６カ月、９カ月、１年、または１年超）の貯蔵安定性を有しうる。
【００５７】
本薬学的組成物はまた、５℃で特定の期間保管した後に、薬物関連分解物の好ましいプロファイル（例えば全薬物関連不純物、または特定の薬物関連不純物の量）を有しうる。製剤中の薬物関連分解物の量を測定するための分析ツール（例えばＨＰＬＣ）は公知である。
【００５８】
好適な生化学的に許容されるエネルギー源は、当該技術分野で知られるもののうちのいずれでもよい。例えば、生化学的に許容されるエネルギー源は、エネルギー代謝経路、特にグルコース代謝経路の中間体として関与することにより還元を促進することのできるもののうちのいずれでもよい。好適な生化学的に許容されるエネルギー源の非限定的な例としては、アミノ酸またはその誘導体（例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、２−オキソグルタル酸、グルタミン酸、およびグルタミンなど）、糖またはその代謝物（例えばグルコース、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ））、ピルビン酸エステル（例えばピルビン酸エチル）、ラクトース、乳酸塩、またはそれらの誘導体）、脂質（例えば脂肪酸またはその誘導体、例えばモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、ならびにリン脂質）、および他のもの（例えばＮＡＤＨ）が挙げられる。生化学的に許容されるエネルギー源の好適な量は、組成物の０．０１重量％〜５重量％の範囲（例えば０．０５重量％、０．１重量％、０．２重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、またはこれらの指定数値に基づく任意の範囲）とすることができる。いくつかの実施形態では、生化学的エネルギー源はピルビン酸エチルである。いくつかの実施形態では、生化学的エネルギー源はアラニンである。いくつかの実施形態では、ピルビン酸エチルまたはアラニンの量は、組成物の０．０５重量％〜５重量％の範囲（例えば０．０５重量％、０．１重量％、０．２重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、またはこれらの指定数値に基づく任意の範囲）である。いくつかの実施形態では、アラニンの量は、組成物の０．５重量％である。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、生化学的に許容されるエネルギー源は、眼科的に許容される量におけるものである。
【００５９】
好適な防腐剤は、当該技術分野で知られるもののうちのいずれでもよい。非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、セトリモニウム、クロロブタノール、エデト酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ポリクオタニウム−１（Ｐｏｌｙｑｕａｄ（登録商標））、ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）、安定化オキシクロロ複合体（ＰＵＲＩＴＥ（登録商標））、過ホウ酸ナトリウム、およびＳｏｆＺｉａ（登録商標）が挙げられる。本薬学的組成物中の防腐剤の好適な量は、組成物の０．００５重量％〜０．１重量％の範囲（例えば０．００５、０．０１、０．０２重量％、０．０５重量％、０．１重量％、またはこれらの指定数値に基づく任意の範囲）とすることができる。いくつかの実施形態では、防腐剤は塩化ベンザルコニウムである。いくつかの実施形態では、塩化ベンザルコニウムは、組成物の０．００３重量％〜０．１重量％（例えば０．００３、０．０１、０．０２重量％、０．０５重量％、０．１重量％、またはこれらの指定数値に基づく任意の範囲）の量におけるものである。いくつかの実施形態では、塩化ベンザルコニウムは、組成物の０．０１重量％の量におけるものである。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、防腐剤は、眼科的に許容される量におけるものである。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、防腐剤を含まない。
【００６０】
好適な等張化剤は、当該技術分野で知られるもののうちのいずれでもよい。非限定的な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトール、デキストロース、グリセリン、プロピレングリコール、およびそれらの混合物が挙げられる。本薬学的組成物中の等張化剤の好適な量は、２００〜４６０ｍＯｓｍ（例えば、２６０〜３６０ｍＯｓｍまたは２６０〜３２０ｍＯｓｍ）のオスモル濃度を達成することのできる任意の量である。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、等張性組成物である。いくつかの実施形態では、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）の量は、組成物の０．１重量％〜５重量％（例えば、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、またはこれらの指定数値に基づく任意の範囲）である。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、等張化剤は、眼科的に許容される量におけるものである。
【００６１】
好適な界面活性剤は、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤を含め、当該技術分野で知られるもののうちのいずれでもよい。有用な非イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、ポリオキシエチレン脂肪エステル（例えば、ポリソルベート８０［ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレエート］、ポリソルベート６０［ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノステアレート］、ポリソルベート４０［ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノパルミテート］、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレート、ポリ（オキシエチレン）ソルビタントリオレエート、またはポリソルベート６５［ポリ（オキシエチレン）ソルビタントリステアレート］）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（例えば、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８１］、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１２３］、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５］、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７１］、またはポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４１］）、ポリオキシル４０ステアレート、スクロース脂肪エステル、およびそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。本薬学的組成物中の界面活性剤の好適な量は、組成物の０．０１重量％〜５重量％の範囲（例えば、０．０５、０．１、０．２重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、またはこれらの指定数値に基づく任意の範囲）とすることができる。いくつかの実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０であり、ポリソルベート８０の量は、組成物の０．０５重量％〜５重量％の範囲（例えば、０．０５、０．１、０．２重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、またはこれらの指定数値に基づく任意の範囲）である。いくつかの実施形態では、ポリソルベート８０の量は、組成物の０．５重量％である。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、界面活性剤は、眼科的に許容される量におけるものである。しかしながら、いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、界面活性剤を含まない。
【００６２】
好適な粘度調節剤は、当該技術分野で知られるもののうちのいずれでもよい。非限定的な例としては、カルボポールゲル、セルロース系薬剤（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ポリカルボフィル、ポリビニルアルコール、デキストラン、ゼラチングリセリン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー４０７、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドン、ならびにそれらの混合物が挙げられる。粘度調節剤の好適な量は、組成物の０．１重量％〜５重量％の範囲（例えば０．１重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、またはこれらの指定数値に基づく任意の範囲）とすることができる。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、粘度調節剤は、眼科的に許容される量におけるものである。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、粘度調節剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのポリマー粘度調節剤）を含まない。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、以下：
（ａ）組成物の０．１重量％〜１０重量％（例えば０．１重量％、１．０重量％、１．５重量％、３重量％、４重量％、５重量％、または指定数値間の任意の範囲）のリポ酸コリンエステル濃度を有すること、
（ｂ）組成物の０．００３重量％〜０．１重量％（例えば０．０１重量％）の防腐剤（例えば塩化ベンザルコニウム）濃度を有すること、
（ｃ）組成物の０．１重量％〜５重量％（例えば０．５重量％）の生化学的エネルギー源（例えばアラニン）濃度を有すること、および
（ｄ）組成物の０．５重量％〜５重量％（例えば２．７重量％）のグリセロール濃度を有すること
のうちの１つまたは複数を特徴とする。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、１〜３重量％のグリセリン、０．５重量％のアラニン、０．００５〜０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、１〜３重量％のリポ酸コリンエステル、および水から本質的になり、本薬学的組成物のｐＨは４．３〜４．７である。
【００６５】
一実施形態において、本眼用組成物は、対象の各眼に１日１回、１日２回、１日３回、および１日４回投薬される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明は、水溶液中で加水分解を受けやすい活性成分（例えばリポ酸コリンエステルまたはその誘導体）を含む薬学的組成物を水溶液中に保管するためのシステムも提供する。好ましい実施形態では、本薬学的組成物は、ＬＤＰＥ眼用点眼器ボトルに保管され、充填プロセス中に窒素でオーバーレイされ、キャッピングされてから、酸素吸収剤を含む二次的なマイラー製のガス不透過性パウチに詰められる。
【００６７】
別の実施形態では、点眼器ボトルまたはユニットは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）である。別の実施形態では、点眼器ボトルは、低いガス透過性を有する材料で作られたものである。
【００６８】
他の実施形態では、点眼器ボトルは、低いガス透過性を有する任意の材料で作られていてよい。別の実施形態では、点眼器ボトルは、吹き込み、充填、密封技術によって充填される単位用量でありうる。
【００６９】
一実施形態において、本薬学的組成物は、３カ月〜２年の期間２〜５℃で保管される。
【００７０】
ＶＩＩ．治療の方法
リポ酸コリンエステルまたはその誘導体を含む薬学的組成物（例えば本明細書に記載のもの）は、酸化的損傷に関連した疾患または障害を治療または防止するための方法に用いることができる。酸化的損傷に関連した疾患または障害は公知である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される薬学的組成物のいずれかを治療有効量で対象の眼に投与することを含む、眼疾患の治療を必要とする対象の眼疾患を治療する方法を提供する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、眼疾患は、老視、ドライアイ、白内障、黄斑変性症（加齢性黄斑変性症を含む）、網膜症（糖尿病性網膜症を含む）、緑内障、または眼炎症である。いくつかの実施形態では、眼疾患は老視である。
【００７３】
本明細書における眼疾患を治療または防止する方法のための薬学的組成物の好適な量は、任意の治療有効量とすることができる。いくつかの実施形態では、本方法は、水晶体の遠近調節の幅を少なくとも０．１ジオプター（Ｄ）（例えば０．１、０．２、０．５、１、１．２、１．５、１．８、２、２．５、３、または５ジオプター）増加させるために有効な量の薬学的組成物を対象の眼に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１〜５滴（１滴当たり約４０ｕＬ）の薬学的組成物を対象の眼に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象の眼は、１日１回、２回、３回、４回、５回、または５回よりも多く、各回につき１〜５滴（１滴当たり約４０μＬ）の薬学的組成物で治療される。いくつかの実施形態では、対象の水晶体または眼は、各回につき１滴、２滴、３滴、４滴、５滴、または５滴超の薬学的組成物で治療される。いくつかの実施形態では、対象の眼は、１日当たり２回または３回、各回につき１滴または２滴（１滴当たり約４０ｕＬ）の、本明細書の薬学的組成物で治療される。
【００７４】
本方法は、任意の年齢の患者に行うことのできる予防法を含む。本方法は、任意の年齢の患者、特に２０〜７５歳の間の患者に行うことのできる治療法も含む。
【００７５】
以下の実施例は例示であり、特許請求される実施形態の範囲を限定するものではない。
実施例
【実施例１】
【００７６】
【表１】
2018536018.tif 000003
【実施例２】
【００７７】
ＬＡＣＥ処理溶液の混合時間と相関したミセル種の動態
本節に記載される実験は、ＬＡＣＥミセル種が２５℃における長期の混合時間にわたり安定化し減少することを実証する。その結果は、ミセルおよびミセル凝集体などの自己集合系に特徴的なこれらの種の可逆的性質を示した。
【００７８】
分子の自発的な自己集合によって形成されるミセル種は、平衡系の全自由エネルギーによって推進される。この実験は、より長い混合期間でのこの平衡状態の達成の動態を示した。
【００７９】
目的：
・成長するミセル種が安定化したかを証明することによって処理時間の階層区分を確立すること。
・「保持時間」を確立すること。
【００８０】
手順：
・通気した窒素でビヒクルを脱酸素した後、２５℃にて１．５％のＬＡＣＥ  ２００ｇを２バッチ調製した。窒素は、ＬＡＣＥの溶解の間、連続的に通気した。
・一方のバッチは、相当の集塊を含むＧＭＰバッチ２番（Ｇ２−１４ＬＡＣ）をそのまま使用して調製し、他方は、乳鉢および乳棒を使用して微粉末状に粉砕されたＧ２−１４ＬＡＣの試料を使用して調製した。
・ＬＡＣＥの溶解およびｐＨ調整の後、一定の窒素オーバーレイを用い、溶解酸素を（８．２ｐｐｍの飽和溶解度に対して）約１．６ｐｐｍに維持しながら、これらのバッチを２４時間撹拌した。１ｈ、３ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、９ｈ、および２４ｈの時点で、約５〜１５ｍＬをシリンジにより取り出し、ボトルに窒素オーバーレイがない状態で点眼器ボトルに滅菌濾過した（５ｍＬ／ボトル）（装置はバルクバッチのために使用中であった）。
・全ての時点における試料を１０ｍｇ／ｇに希釈し、次に、バルク溶液から取り出した３０分以内にＥＬＳＤ検出を用いたＲＰ−ＨＰＬＣ分析のために注入した。
・２４時間時点の後、バルク溶液を滅菌濾過し、それぞれを２つの約５０ｍＬ分量に分割した。一方は５℃に保ち、他方の５０ｍＬ分量は２５℃に保った。全ての分量は、容器に吹き込んだ窒素でオーバーレイした。
・さらなる２４時間の保持時間の終わりに、ボトルに窒素オーバーレイがある状態で点眼器ボトルに各分量を充填した。
【００８１】
溶解の所見
・集塊のあるＧ２−１４ＬＡＣの分量を約５分間にわたって製剤ＫＷ−ＬＡＣＥ−０１−８６−１に加えたところ、集塊の一部は溶解するのにさらに２０分間必要であった。
・粉末状のＧ２−１４ＬＡＣは約１５分間にわたって製剤ＫＷ−ＬＡＣＥ−０１−８６−２に加えた。これは、各スパチュラ１杯分が、表面に浮遊する材料の薄いラフト状に凝集し、直ちに分散しなかったためである。したがって、前の分量が渦に引き込まれるまで別の分量は加えなかった。いずれか１つの分量が溶解するのにかかる推定時間は約１０分間であり、プロセス全体はおよそ２５分間かかった。
【００８２】
結果
・ＲＴ＝８分におけるピーク（ミセル種と相関している）は、測定した第１の時点の両製剤で明白であった。
・２つのバッチ間で８分ピーク（ミセル種）の面積％に一貫した差はなかったが、粉末状ＬＡＣＥを用いて作った第２のバッチは、いくつかの時点でより高いレベルのミセル種を有した。
・８分ピークの面積％は、以下の表に示されるように、２４時間で著しく低減していた。
・最終的なｐＨは両バッチで４．５４であった。
【００８３】
【表２】
2018536018.tif 000004
【００８４】
この結果は、８．１分でのＬＡＣＥミセル種が長期の混合時間で最小限に抑えられることを示す。８．１分におけるピークは、より長い混合時間で劇的に減少する。
【００８５】
溶液のそれぞれで、リポ酸コリンエステルの分解物も測定した。先に述べたように、ＬＡＣＥの分解機序は酸化的および加水分解的であり、酸化種および加水分解種をもたらす。
【００８６】
【表３】
2018536018.tif 000005
【００８７】
このデータは、ＬＡＣＥの分解生成物が長期の混合時間とともに増加することを示す。したがって、ＥＶ０６眼用溶液の調合のための最終的なプロセス条件は、分解物が最小限に抑えられた非刺激性溶液を達成するために最大で８時間を必要とした。
【実施例３】
【００８８】
ミセルＬＡＣＥ種の存在と混合温度の相関性
図４に示されるデータは、アルゴン下および冷蔵条件下で製剤化されたＬＡＣＥ塩化物の溶液のものである。この溶液は、眼表面に対して極めて刺激性であった。パーセントミセル種は主なＬＡＣＥ  ＡＰＩピークの８〜１０％であり（ミセル種は７．９〜８．１分の保持時間において矢印で表されている）、これは室温で混合された溶液では通常観察されない濃度である。
【実施例４】
【００８９】
ミセルＬＡＣＥ種の形成と集塊の相関性
図５Ａは、固体の「集塊」を有したＬＡＣＥバッチから調製されたＥＶ０６眼用溶液のＲＰ−ＨＰＬＣ塩化物のクロマトグラムである。このロットのＡＰＩ（有効活性成分、固体ＬＡＣＥ原薬）から調製された溶液は、粉状のＡＰＩのロットから調製された溶液（図５Ｂ）よりも高い百分率（１０〜１５％）のミセルＬＡＣＥ種（矢印で示されている）を示した。したがって、両方の溶液が完全に溶解したように見えたものの、集塊のないＡＰＩから製剤化された溶液は、より低い濃度のミセルＬＡＣＥ種を有した。眼球刺激と相関させると、図５Ａに示される溶液は、ウサギモデルにおいてより高い刺激スコアを有した。このため、調合前に粉末状材料にするための脱集塊形成手順を組み込んだ。
【実施例５】
【００９０】
ＬＡＣＥとの賦形剤の適合性研究
要旨
これらの実験の目的は、製剤組成および微小環境（例えばｐＨ）の系統的変動を通じて、製剤を不安定化させる可能性のある可変要素を導き出すことであった。リポ酸、およびリポ酸のあらゆる誘導体は、熱、光、および酸素中で分解および重合を受け、ジチオラン環の開環をもたらすことになる。したがって、酸化的なフリーラジカルの切断を誘発することのできる賦形剤の存在が不安定化因子となりうる。製剤グリッド１および２では、製剤中に既に存在する賦形剤の効果を可能性のある不安定化因子として系統的に調査した。
【００９１】
これらの実験におけるＬＡＣＥの製剤化は、精製水中に原薬、アラニン、グリセリン、塩化ベンザルコニウムを含み、４．４〜４．６の間のｐＨおよび２９０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を達成するために、１Ｎ水酸化ナトリウムまたは１Ｎ塩酸を添加した。本文書に記載された実験は、ＬＡＣＥ眼用溶液を安定化させることのできる賦形剤を特定するための適合性研究であった。
【００９２】
製剤グリッド１番では、以下の（ａ）〜（ｅ）に提示する可変要素を試験した。製剤は、窒素フラッシュしたグローブボックス内で調製し、滅菌濾過した。全ての製剤は５７℃の促進条件下で試験し、Ｔ＝０日、３．５日、および７日におけるアッセイおよび不純物をＨＰＬＣによって試験した。グリッド１番では、合計１９個の製剤を試験した。
（ａ）ｐＨの効果：ｐＨ３．５、４、および５で製剤を調製し、ｐＨ４．５の対照製剤と比較した。図６に示されるように、ＬＡＣＥの分解速度は、３．５〜５の範囲の全てのｐＨレベルで同等であった。
（ｂ）アラニンの効果：分解速度を原物の製剤（対照）と比較することにより、製剤中のアラニンの役割を推論した。図６に示されるように、アラニンの非存在は、ＬＡＣＥの分解速度を加速させるようであった。したがって、アラニンはＥＶ０６眼用製剤において重要な賦形剤である。
（ｃ）塩化ベンザルコニウムおよびグリセリンの効果：グリセリンに含まれる過酸化物は酸化を触媒しうると仮定した。同様に、ＢＡＣは、フリーラジカルの切断およびその後の酸化が理由で原薬を不安定化させうると仮定した。図７に見られるように、塩化ベンザルコニウム不含製剤は、対照よりも実質的に安定性があった。グリセリン不含のプロトタイプも、対照よりも安定性があった。さらに、（オスモル濃度を調整するためにグリセロールの代わりに）製剤に加えた塩化ナトリウムは、不安定化効果を有するようであった（これもまた図７に示されている）。グリセリン、塩化ナトリウム、亜硫酸塩、およびｐＨの様々な組合せを用い、全ての変化形態で塩化ベンザルコニウム不含であった別の実験において、塩化ベンザルコニウム不含製剤の全てが対照よりも安定性があったことは注目に値した（図５）。図７および９の実験は、ＬＡＣＥの塩化ベンザルコニウムを排除することが製剤を安定化させうることを示す。ＥＶ０６眼用組成物では、塩化ベンザルコニウム含有量を５０ｐｐｍに最小化することが、主な安定化因子を有しうる。塩化ナトリウムは不安定化効果を示したため、最終的なＥＶ０６組成物中の等張化剤としてはグリセロールがより好適であるとみなされた。
（ｄ）亜硫酸塩の効果：様々なレベルの亜硫酸塩を組み合わせ、亜硫酸塩を用いた様々な実験を行った（図８）。亜硫酸塩を様々なｐＨレベル（４、４．５）および濃度で抗酸化剤として製剤に加えた（図８）。亜硫酸塩の存在は、ＬＡＣＥの安定性を実質的に改善させないようであった。製剤中０．１％の亜硫酸塩は対照と同等であったため、有害作用が存在したかどうかは明らかでなかった。
（ｅ）グリセリンの効果：グリセリンを系統的に排除することにより、グリセリンの効果を様々な製剤の組合せで調査した。図７および１０に示されるように、グリセリン不含の組合せは、対照よりも安定性があるようであった。しかしながら、塩化ナトリウムの不安定化効果が高いため、浸透圧調整のための重要な賦形剤としてグリセリンを選択した。
（ｆ）緩衝液の効果：様々な緩衝組成物を試験した。酢酸緩衝液および酢酸＋ホウ酸は、製剤を安定化させるようであった。
【００９３】
実験
ａ）ＨＰＬＣ法の設定：ＨＰＬＣアッセイは、（Ａ）リン酸でｐＨ４．５に調整した０．０５Ｍのリン酸一ナトリウム、０．００５Ｍの１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム塩、０．２％ｖ／ｖのトリエチルアミン、および（Ｂ）アセトニトリルで構成された５０分の移動相勾配からなった。使用した分析カラムは、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  ＡＱ（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、１２０Å）、Ｐ／Ｎ  ＡＱ１２５０５２５４６ＷＴであり、分析の検出波長は２２５ｎｍである。
ｂ）製剤
ＬＡＣＥのＡＰＩが酸素または熱に曝露されないことを確実にするよう細心の注意を払って製剤を調製した。ＡＰＩの一定分量をグローブバッグ内の不活性Ｎ2雰囲気下で清潔なガラスバイアルにとり、アルミ箔に包んで使用まで−２０℃の冷凍庫で保管した。これらの製剤は、高純度の賦形剤および無菌のガラス製品を用いて調製した。全ての賦形剤は保存液中で予め調製し、ＡＰＩの添加および最終的なｐＨ調整の前に一緒に混合した。これらの製剤は付録Ａで一覧になっている。
【００９４】
ＩＩ．結果および詳解
図６は、ｐＨ３．５、４、４．５（原物）、５で調製した製剤、およびアラニンを含まない対照を系統的に比較する、５７℃における日数に対する（Ｔ＝０日、３．５日、および７日にわたる）ＬＡＣＥのＡＰＩの％のプロットである。Ｔ＝０においてでさえ、アラニンを含まない製剤は、ＡＰＩ含有量がかなり劣化した。図６に見られるように、製剤は、ｐＨ３．５〜５のこれらの条件下で同等であった。図７は、製剤の次の可変要素を比較するプロットである：（ａ）対照（原物）と、対照＋０．２５％塩化ナトリウム、グリセリンを含まない対照＋０．２５％塩化ナトリウムとの対比、（ｂ）対照（原物）と塩化ベンザルコニウムを含まない対照との対比、（ｃ）対照（原物）とグリセリンを含まない原物の製剤との対比。
【００９５】
図７に見られるように、原物の製剤への塩化ナトリウムの添加は、製剤を安定化させなかった。
【００９６】
図８は、５７℃におけるＬＡＣＥ安定性に対する亜硫酸塩の効果を示す。亜硫酸塩含有製剤は、ｐＨ４および４．５において、亜硫酸塩０．０５％（黒四角■、黒三角▲）および亜硫酸塩０．１％（ｘ）の濃度で調製した。亜硫酸塩の添加は、原物の製剤（黒菱形◆）を安定化させなかった。
【００９７】
図９は、塩化ベンザルコニウムを排除することによる安定化効果の可能性をさらに探索するものである。塩化ベンザルコニウムを含まない製剤変化形態は全て、対照の原物の製剤（ｐＨ４．５）よりも優れていた。製剤変化形態は、ｐＨ４、４．５（黒三角▲、黒四角■）のＢＡＣ不含組成物、グリセリンなし／ＢＡＣなし＋０．９％塩化ナトリウム（ｘ）、ｐＨ４および４．５のＢＡＣなし＋０．０５％亜硫酸塩（黒丸●、黒四角■）であった。
【００９８】
図７および１０は、ｐＨ、亜硫酸塩、および塩化ナトリウムに応じた様々な組成物におけるグリセリンの排除の効果を比較する。塩化ナトリウムおよび亜硫酸塩の存在下におけるグリセリンなし、ＢＡＣなしの製剤（＋）、およびグリセリンなし、ＢＡＣありの製剤（＊）は、原物の製剤（黒菱形◆）よりも優れていた。
【００９９】
図１１は、ＬＡＣＥ安定性に対する様々な緩衝組成物の使用を探索したものである。原物の製剤（ｐＨ４．５）を、酢酸緩衝液組成物（黒四角■、ｘ、＊、黒丸●）およびｐＨ７．５のホウ酸塩と比較した。抗酸化剤として加えたエデト酸ナトリウムは、製剤を安定化させなかった。酢酸緩衝液および酢酸緩衝液＋ホウ酸は、対照製剤よりも優れているようであった。
【０１００】
まとめると、塩化ベンザルコニウムの排除は、安定性を一貫して向上させるようであった。グリセロールの排除は、プラスのステップでもありうる。グリセロールは、場合によりＡＰＩの分解につながる残留したホルムアルデヒドが存在することで知られる。興味深いことに、エデト酸塩または亜硫酸塩の添加は、プラスの効果を有しなかった。アスコルビン酸ナトリウムなどの別の抗酸化剤もプラスの効果を有しうる。
【０１０１】
【表４−１】
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【０１０２】
【表４−２】
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【０１０３】
【表４−３】
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【０１０４】
【表４−４】
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【０１０５】
【表４−５】
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【実施例６】
【０１０６】
パーセントミセルＬＡＣＥ種と眼球刺激の相関性
図１２Ａおよび１２Ｂは、一般に、調合したいくつかのバッチでのミセルＬＡＣＥ種と刺激の相関性の寸評を提示する。
【実施例７】
【０１０７】
グリセロールを用いたオスモル濃度の調整方法
薬物含有製剤およびプラセボに必須のオスモル濃度の範囲は、２８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇである。好ましくは、全てのＬＡＣＥ製剤は、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／Ｋｇの範囲内である必要がある。
【０１０８】
ＬＡＣＥはオスモル濃度に寄与するため、各製剤は、必須のオスモル濃度を達成するために様々な濃度のグリセロールを有することになる。
【０１０９】
Ｉ．要旨：最終的な調整された組成物
【０１１０】
【表５】
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【０１１１】
ＩＩ．実験詳細：
Ａ．グリセロール含有プラセボ
一連のプラセボを調製した。全てのプラセボ、およびその後に調製したＬＡＣＥ含有溶液は、様々な量のグリセロールとともに次のものを含有した。
・アラニン０．５％（５ｍｇ／ｇ）
・塩化ベンザルコニウム０．００５％（０．０５ｍｇ／ｇ）
・ｐＨを４．５に調整するための１Ｎ水酸化ナトリウム、１Ｎ塩酸、少量
・注射用水（最終的な重量に合わせて添加）。
【０１１２】
【表６】
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【０１１３】
Ｂ．ＬＡＣＥ含有製剤
上記のグリセロールオスモル濃度標準曲線（表６参照）、およびＬＡＣＥ  １％毎にさらに４４〜５５ｍＯｓｍ／ｋｇ（平均４８ｍＯｓｍ／ｋｇ）を示した出願人らの観察に基づき、ＬＡＣＥの浸透圧への実際の寄与を確認するために一連の溶液を調製した。全オスモル濃度の標的は３００ｍＯｓｍ／ｋｇであった。
【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
これらのデータは、オスモル濃度に対するＬＡＣＥの効果が１％毎に約５７〜６０ｍＯｓｍ／ｋｇと、予想をいくらか超えることを示す。したがって、十分な一連の溶液を、ＬＡＣＥを含まない溶液のためにわずかに変更された標的オスモル濃度、ひいては異なる標的グリセロール含有量で調製した。全ての溶液は、プラセボに使用したものと同じアラニン／塩化ベンザルコニウム、ｐＨ４．５の保存液を使用して調製し、最終組成が一貫して次の通りになるようにした。
アラニン０．５％（５ｍｇ／ｇ）
塩化ベンザルコニウム０．００５％（０．０５ｍｇ／ｇ）
ｐＨを４．５に調整するための１Ｎ水酸化ナトリウム、１Ｎ塩酸、少量
注射用水（最終的な重量が製剤当たり５．０ｇとなるように添加）
【０１１６】
【表８】
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【０１１７】
Ｃ．無菌調製物
これらの実験結果に基づき、以下の組成を標的として、滅菌濾過した各製剤の１０．０ｇのバッチを調製し、滅菌点眼器ボトルにパッケージングした（ボトル当たり２ｍＬ）。
【０１１８】
【表９】
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【実施例８】
【０１１９】
ＬＡＣＥ薬学的組成物の調製方法
ＬＡＣＥ薬学的組成物の調製方法は次の通りである。
・室温にて、バッチ重量の８０％の注射用水（ＷＦＩ）をガラス調合容器に加える。この水を窒素でパージして酸素を≦１０ｐｐｍにする。
・段階的に、アラニン、グリセリン、およびＢＡＣを添加し、溶解するまで混合する。
・ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを４．４〜４．６に調整する。
・窒素下で乳鉢および乳棒でＬＡＣＥを粉砕して脱集塊形成し、混合しながらゆっくりと添加する。
・脱酸素した注射用水を加えて、最終的なバッチの標的重量を達成する。
・バッチを合計８時間混合して、完全な分散および溶解を確実にする。
・必要であれば、ＮａＯＨまたはＨＣｌでｐＨを４．４〜４．６に調整してもよい。
・必要であれば、グリセロールでオスモル濃度を２９０〜３１０に調整してもよい。
・８時間の混合後、ＥＶ０６バルク薬品溶液をカプセル型ＳＨＣ０．５／０．２μｍ滅菌フィルタに通して保持バッグに無菌的に濾過する。
・保持バッグ内のバルク生成物溶液を冷蔵または氷浴によって５℃に保つ。
・フィルタの完全性を確実にするために、フィルタ泡立ち点試験を行う。
・滅菌濾過されたバルク溶液をクラス１００の部屋に無菌的に移し、予め滅菌したボトルに充填する。
・窒素オーバーレイ下でボトルに無菌のチップおよびキャップを適用する。
・密封したボトルをトレイに移し、窒素パージとともにバッグに入れ、５℃の保管場所に直ちに移す。
【実施例９】
【０１２０】
ＬＡＣＥ製剤の安定性研究
初期の製剤プロトタイプは、エデト酸ナトリウムおよび０．０１％の塩化ベンザルコニウムを含有した。これらの賦形剤ありおよびなしの安全性研究は、エデト酸ナトリウムがＬＡＣＥを安定化させなかったことを実証した。過剰の塩化ベンザルコニウムの存在は、薬物をわずかに不安定化させた。したがって、最終的な製剤はエデト酸ナトリウムを含まず、０．００５％の塩化ベンザルコニウムを含む。微生物学的試験により、現在の製剤組成中０．００４％の塩化ベンザルコニウムが、薬品中の防腐剤として効果的であることが示された。
【０１２１】
薬物製剤をさらに安定化させる試みで、中規模のＲ＆Ｄバッチの系統的安定性研究（５℃、２５℃、および４０℃）を、ジップロック、蒸気不透過性箔のパウチに含まれた酸素捕捉パケットの存在下および非存在下で、ボトルに入ったＥＶ０６眼用溶液に行った。再密封可能な箔パウチに密封された酸素捕捉パケットの存在下で５℃にて保管された生成物のボトルは、１２カ月の安定性を示した。
【０１２２】
開発プロセス全体を通して、周囲の酸素への曝露および非冷蔵条件に起因する分解に対して最終的な製剤を安定化させるため、さらなる予防措置をとった。窒素下での原薬の取扱（酸素の排除、および水分の最小化）、および窒素ブランケット下での調合を行って、酸素への曝露を最小限に抑えた。調合後、生成物を蒸気不透過性の保持バッグに充填し、ボトリングが行われるまで冷蔵条件下で保管する。バルク溶液を含む保持バッグは充填中低温に保つ。窒素ブランケットを各ボトル内の薬物溶液上に配し、酸素曝露を最小限に抑える。
【０１２３】
【表１０−１】
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【０１２４】
【表１０−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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