(57)【要約】  本発明は、病原真菌に感染した植物を処置する組成物および方法に関し、感染した植物または感染の可能性がある植物を、オクタン酸銅もしくは水酸化銅などの銅化合物、または、ミクロブタニル、プロピコナゾール、テブコナゾールもしくはエポキシコナゾールなどのトリアゾール殺菌剤から選択される殺菌剤；アピラーゼ阻害剤、例えば、N-(m-トリル)-[1、1’-ビフェニル]-4-スルホンアミド、S-ヘプチル 2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボチオアート、3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド、または(E)-3-メチル-N’-(1-(ナフタレン-2-イル)エチリデン)ベンゾヒドラジドから選択される促進剤；および、任意で、植物学上許容される不活性担体を含む、殺菌性組成物に接触させることを特徴とする。
2018503676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
銅類またはトリアゾールから選択される殺菌剤、およびN-(m-トリル)-[1,1’-ビフェニル]-4-スルホンアミド、S-ヘプチル 2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボチオアート、3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド、または(E)-3-メチル-N’-(1-(ナフタレン-2-イル)エチリデン)から選択される促進剤を含む組成物。
【請求項２】
前記殺菌剤が、オクタン酸銅、ミクロブタニル、プロピコナゾール、テブコナゾール、またはエポキシコナゾールの少なくともひとつから選択される、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記組成物が植物学上許容される不活性担体をさらに含む、請求項１の組成物。
【請求項４】
前記殺菌剤の量が真菌を処理するための最適量以下である、請求項１の組成物。
【請求項５】
殺菌剤の量が真菌を処理するための最適量であって、殺菌剤-抵抗性真菌に適用するように適合されている、請求項１の組成物。
【請求項６】
促進剤が、促進剤対殺菌剤で0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、7.5、および10%重量対重量にて提供される、請求項１の組成物。
【請求項７】
促進剤が、促進剤対殺菌剤で0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、7.5、および10%体積対体積にて提供される、請求項１の組成物。
【請求項８】
前記組成物が相乗的であって、促進剤に対する殺菌剤の重量比が約500:1と5000:1との間にある、請求項１の組成物。
【請求項９】
植物病原真菌に感染し、または、感染のリスクにある植物または植物の種子を処理する方法であって、前記植物または植物の種子を、銅類またはトリアゾールから選択される殺菌剤、および、N-(m-トリル)-[1,1’-ビフェニル]-4-スルホンアミド、S-ヘプチル 2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボチオアート、3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド、または(E)-3-メチル-N’-(1-(ナフタレン-2-イル)エチリデン)ベンゾヒドラジドから選択される促進剤に接触させることを含む、方法。
【請求項１０】
前記殺菌剤が、オクタン酸銅、ミクロブタニル、プロピコナゾール、テブコナゾール、またはエポキシコナゾールの少なくともひとつから選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記植物病原真菌が、ボツリティス・シネレア、コレトトリカム・グラミニコラ、フザリウム・オキシスポルム、スクレロチアナ・スクレロチオルム、バーティシリウム・ダーリアエ、ミコスファエレラ・グラミニコラ、またはスファセロテカ・レリアナである、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記植物が、果物のなる植物、野菜のなる植物、ナッツのなる植物または穀物植物である、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記植物が、ストロベリー、バナナ、トウモロコシ、ダイズ、タバコ、コムギまたはワタである、請求項９の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、さらに希釈剤を含む、請求項９の方法。
【請求項１５】
前記殺菌剤の量が、真菌を処理するのに最適以下である、請求項９の方法。
【請求項１６】
前記殺菌剤の量が真菌を処理するのに最適であって、殺菌剤抵抗性真菌に適用するように適合されている、請求項９の方法。
【請求項１７】
前記促進剤が促進剤対殺菌剤で0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、7.5、および10%重量対重量にて提供される、請求項９の方法。
【請求項１８】
前記促進剤が、促進剤対殺菌剤0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、7.5、および10%体積対体積にて提供される、請求項９の方法。
【請求項１９】
前記組成物が相乗的であって、促進剤に対する殺菌剤の重量比が約500:1と5000:1との間にある、請求項９の方法。
【請求項２０】
殺菌剤であって、真菌を処理するのに十分量の、銅またはトリアゾール殺菌剤；およびアピラーゼ阻害剤を含む、殺菌剤。
【請求項２１】
前記アピラーゼ阻害剤が、N-(m-トリル)-[1,1’-ビフェニル]-4-スルホンアミド； S-ヘプチル 2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボチオアート；3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド；3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド；または(E)-3-メチル-N’-(1-(ナフタレン-2-イル)エチリデン)ベンゾヒドラジドの少なくともひとつから選択される、請求項２０の殺菌剤。
【請求項２２】
前記殺菌剤が、細胞を増殖させるための増殖培地に添加されている、請求項２０の殺菌剤。
【請求項２３】
前記細胞が、細菌、真菌、植物、動物、哺乳動物、酵母、両性動物、鳥、線虫または昆虫の細胞の少なくともひとつから選択される、請求項２０の殺菌剤。
【請求項２４】
前記組成物が相乗的であって、促進剤に対する殺菌剤の重量比が約500:1と5000:1との間にある、請求項２０の殺菌剤。
【請求項２５】
銅類またはトリアゾール殺菌剤に対して抵抗性である病原真菌による感染を処理する方法であって、前記病原真菌を、銅類またはトリアゾールを真菌アピラーゼ阻害剤と組み合わせて含む組成物に接触させることを含み、前記真菌アピラーゼ阻害剤は、前記真菌が前記殺菌剤を解毒することまたは前記殺菌剤を送出することのうち少なくともひとつを防止する、方法。
【請求項２６】
前記殺菌剤が、オクタン酸銅、ミクロブタニル、プロピコナゾール、テブコナゾール、またはエポキシコナゾールの少なくともひとつから選択される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記植物病原真菌が、ボツリティス・シネレア、コレトトリカム・グラミニコラ、フザリウム・オキシスポルム、スクレロチアナ・スクレロチオルム、バーティシリウム・ダーリアエ、ミコスファエレラ・グラミニコラ、またはスファセロテカ・レリアナの少なくともひとつから選択される、請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記植物が、果物のなる植物、野菜のなる植物、ナッツのなる植物または穀物植物である、請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記植物が、ストロベリー、バナナ、トウモロコシ、ダイズ、タバコ、コムギまたはワタである、請求項２５の方法。
【請求項３０】
前記組成物が相乗的であって、促進剤に対する殺菌剤の重量比が約500:1と5000:1との間にある、請求項２５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概略、殺菌剤の分野に関し、より詳しくは、病原真菌に感染した植物の処理用の促進した薬効の殺菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲に限定されず、この背景は、病原真菌に感染した植物を処理するのに有用な殺菌剤組成物に関連して記載される。
【０００３】
病原真菌は、世界的に、作物および収穫後果物の壊滅的な損失をもたらす (Chen et al., 2008)。多くの化学殺菌剤が、種々の真菌種を殺すことによってそれらの損失を防ぐために、高容量で、頻繁に使用されている。殺菌剤の世界市場は、2005年に74億を超えると算定され (Morton and Staub, 2008)、2017年までには200億ドル超まで上昇すると予測される (Israel, 2013)。作物病害のリスクを低減し、食物の安全を促進し、環境を保護するために、新たな有効な殺菌剤または現行の殺菌剤の薬効を増強する方策を開発しなければならない。
【０００４】
殺菌剤の薬効に対する一つの制限は、細胞膜を通してそれらを隔離するか、送出することによってそれらを即座に解毒する真菌の能力である。真菌は外因性化学物質を除去する多様なメカニズムを用い、これらのプロセスのいずれかの阻害が殺菌剤の薬効を増強することは明らかである。植物も、外因性化学物質を送出することによってそれらを解毒する。先行例は、ABCB1ホモログ (AtPgp1)またはアピラーゼ (apyrase) (NTPDase)酵素 (AtAPY1)のいずれかの過剰発現がシロイヌナズナ（エイ・タリアナ (A. thaliana)）植物に対する多除草剤抵抗性を付与することを証拠付けた (Windsor et al., 2003)。さらに、アピラーゼ酵素活性の阻害剤は除草剤を送出する植物の能力を抑制し、かくして、これらの毒物に対する感受性を増強した (Windsor et al., 2003)。ある種のアピラーゼの重要な機能は、植物および動物における多様な応答の公知のレギュレータである細胞外ATP (eATP) (Clark et al., 2014)の低定常状態の維持を支援することにある (Knowles, 2011; Lim et al., 2014)。まとめると、Windsor et al. (2003)のデータは、除草剤抵抗性におけるアピラーゼおよびABCトランスポータの二重の役割を支持し、アピラーゼ活性の崩壊またはATPの外来添加はABC輸送活性を阻害し、かくして、毒性化合物の継続的流出を遮断し得ることを示した。
【発明の概要】
【０００５】
アピラーゼ阻害剤AI.1 {N-(m-トリル)-[1,1’-ビフェニル]-4-スルホンアミド}、AI.10 {S-ヘプチル 2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボチオアート}、AI.13 {3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド}、およびAI.15 {(E)-3-メチル-N’-(1-(ナフタレン-2-イル)エチリデン)ベンゾヒドラジド}は、植物病原性真菌に対する銅およびトリアゾール殺菌剤の効果を別々に促進する。促進されやすい好ましい殺菌剤は、オクタン酸銅、水酸化銅、ミクロブタニル、プロピコナゾール、テブコナゾール、エポキシコナゾール、ジフェノコナゾール、トリチコナゾール、およびプロチオコナゾールである。選択された殺菌剤および促進剤の組合せが植物病原性真菌に対する相乗的殺真菌活性を付与する。
【０００６】
ひとつの具体例において、本発明は、病原真菌に感染した、または、感染するリスクにある植物または植物種子を処理するための組成物および方法を包含する。この発明の前記組成物は、殺菌剤および促進剤および植物学上許容される不活性担体の製剤を含む。前記殺菌剤は、オクタン酸銅、水酸化銅、ミクロブタニル、プロピコナゾール、テブコナゾール、エポキシコナゾール、ジフェノコナゾール、トリチコナゾール、またはプロチオコナゾールなどの銅化合物殺菌剤またはトリアゾール殺菌剤から選択される。促進剤として用いられるアピラーゼ阻害剤の例は、
AI.1:   N-(m-トリル)-[1,1’-ビフェニル]-4-スルホンアミド、
AI.10:  S-ヘプチル 2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボチオアート、
AI.13:  3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド、
または
AI.15:  (E)-3-メチル-N’-(1-(ナフタレン-2-イル)エチリデン)ベンゾヒドラジド
を含む。
【０００７】
この発明の前記組成物において、殺真菌効果が相乗的である、促進剤に対する前記殺菌剤の重量比は、約500:1と5000:1との間の範囲にある。
【０００８】
本発明のもうひとつの具体例は、植物病原性真菌に感染した、または、感染するリスクにある植物または植物種子の処理に向けられる。処理は、前記植物を前記殺菌剤および促進剤の製剤に接触させることを要件とし、ここに、前記殺菌剤は、オクタン酸銅、水酸化銅、ミクロブタニル (myclobutanil)、プロピコナゾール (propiconazole)、テブコナゾール (tebuconazole)、エポキシコナゾール (epoxiconazole)、ジフェノコナゾール(difenoconazole)、トリチコナゾール (triticonazole)、またはプロチオコナゾール (prothioconazole)であって、前記促進剤は、AI.1、AI.10、AI.13またはAI.15である。本発明の製剤は、特に、前記植物病原真菌ボツリティス・シネレア (Botrytis cinerea)、コレトトリカム・グラミニコラ (Colletotrichum graminicola)、フザリウム・オキシスポルム (Fusarium oxysporum)、スクレロチアナ・スクレロチオルム (Sclerotiana sclerotiorum)、バーティシリウム・ダーリアエ (Verticillium dahliae)、ミコスファエレラ・グラミニコラ (Mycospharella graminicola)およびスファセロテカ・レリアナ (Sphacelotheca reliana)に対して有効である。
【０００９】
もう一つの具体例において、本発明は、真菌を処理するのに十分な量にて、銅またはトリアゾール殺菌剤；およびアピラーゼ阻害剤を含む殺菌剤を包含する。ひとつの局面において、アピラーゼ阻害剤は、N-(m-トリル)-[1,1’-ビフェニル]-4-スルホンアミド； S-ヘプチル 2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボチオアート；3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド；3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド；または(E)-3-メチル-N’-(1-(ナフタレン-2-イル)エチリデン)ベンゾヒドラジドの少なくともひとつから選択される。もうひとつの局面において、前記殺菌剤は、細胞を増殖するための増殖培地に添加される。もうひとつの局面において、前記細胞は、細菌、真菌、植物、動物、哺乳動物、酵母、両性動物、鳥、線虫または昆虫の細胞の少なくともひとつから選択される。
【００１０】
もうひとつの局面において、前記組成物は相乗的であって、促進剤に対する前記殺菌剤の重量比は、約500:1と5000:1との間の範囲にある。
【００１１】
なおもうひとつの具体例において、本発明は、銅類またはトリアゾール殺菌剤に対して抵抗性である病原真菌による感染を処理する方法を包含し、前記方法は、前記病原真菌を、銅類またはトリアゾールを真菌アピラーゼ阻害剤と共に含む組成物に接触させることを含み、ここに、前記真菌アピラーゼ阻害剤は、前記真菌が前記殺菌剤を解毒することまたは前記殺菌剤を送出することの少なくともひとつから防止する。ひとつの局面において、前記殺菌剤は、オクタン酸銅、プロピコナゾール、テブコナゾール、またはエポキシコナゾールの少なくともひとつから選択される。もうひとつの局面において、前記病原真菌は、ボツリティス・シネレア、コレトトリカム・グラミニコラ、フザリウム・オキシスポルム、スクレロチアナ・スクレロチオルム、バーティシリウム・ダーリアエ、ミコスファエレラ・グラミニコラ、またはスファセロテカ・レリアナの少なくともひとつから選択される植物病原である。もうひとつの局面において、前記病原真菌が植物病原であって、処理される植物が、果物のなる植物、野菜のなる植物、ナッツのなる植物または穀物植物である。もうひとつの局面において、前記病原真菌が植物病原であって、処理される植物がストロベリー、バナナ、トウモロコシ、ダイズ、タバコ、コムギまたはワタである。もうひとつの局面において、前記組成物が相乗的であって、アピラーゼ阻害剤に対する前記殺菌剤の重量比が約500:1と5000:1との間にある。
【００１２】
本発明の特徴および利点をより完全に理解するため、本発明の詳細な説明を付随する図面とともに参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は異なる植物に由来して特徴付けられるアピラーゼと真菌種との間の系統発生学上の関係を示す系統樹である。この樹は、種々の植物および真菌：アラビドプシス・タリアナ (Arabidopsis thaliana) アピラーゼ１（受託番号 NP_187058）、アラビドプシス・タリアナ アピラーゼ２ （受託番号 NP_001154717）、ピサム・サチバム (Pisum sativum) （受託番号 BAA75506）、ボツリティス・シネレア （受託番号 XP_001558134）、コレトトリカム・グラミニコラ （受託番号 EFQ33146）、フザリウム・オキシスポルム （受託番号 ENH75262）、スクレロチアナ・スクレロチオルム （受託番号 XP_001590729）およびバーティシリウム・ダーリアエ （受託番号 EGY20804）由来で報告されたアピラーゼ遺伝子配列から推測されたアミノ酸配列に基づいて構築された。
【図２】図2Aないし2Cは、アピラーゼ阻害剤が、病原性真菌ボツリティス・シネレアに対する３つの異なる殺菌剤：2A. オクタン酸銅、2B. プロピコナゾール、および2C. ミクロブタニルの薬効を異なって促進することを示すグラフである。植物病原性真菌株（ボツリティス・シネレア）は、65 μMのアピラーゼ阻害剤 (AI # 1、10、13および15)の存在下、30℃にて１２日間、YPD培地ペトリ皿で増殖した。等量のジメチルスルホキシド (DMSO)を対照として添加した。実験を２回繰り返して、同じ結果であった。エラーバーは標準偏差を示す (n=5)。殺菌剤の薬効の有意性は、*** (スチューデントｔ−テスト、P < 0. 001); **(スチューデントｔ−テスト、P < 0.01)または*(スチューデントｔ−テスト、P < 0.05)で表示する。
【図３】図3Aないし3Cは、アピラーゼ阻害剤が、病原性真菌コレトトリカム・グラミニコラに対する３つの異なる殺菌剤：3A. オクタン酸銅、3B. プロピコナゾール、および3C. ミクロブタニルの薬効を異なって促進することを示すグラフである。植物病原性真菌株（コレトトリカム・グラミニコラ）は、65 μMのアピラーゼ阻害剤 (AI # 1、10、13および15)の存在下、30℃にて１２日間、YPD培地ペトリ皿で増殖した。等量のジメチルスルホキシド (DMSO)を対照として添加した。実験を２回繰り返して、同じ結果であった。エラーバーは標準偏差を示す (n=5)。殺菌剤の薬効の有意性は、*** (スチューデントｔ−テスト、P < 0. 001); **(スチューデントｔ−テスト、P < 0.01)または*(スチューデントｔ−テスト、P < 0.05)で表示する。
【図４】図4Aないし4Cは、アピラーゼ阻害剤が、病原性真菌フザリウム・オキシスポルムに対する３つの異なる殺菌剤： 4A. オクタン酸銅、4B. プロピコナゾール、および4C. ミクロブタニルの薬効を異なって促進することを示すグラフである。植物病原性真菌株（フザリウム・オキシスポルム）は、65 μMのアピラーゼ阻害剤 (AI # 1、10、13および15)の存在下、30℃にて１２日間、YPD培地ペトリ皿で増殖した。等量のジメチルスルホキシド (DMSO)を対照として添加した。実験を２回繰り返して、同じ結果であった。エラーバーは標準偏差を示す (n=5)。殺菌剤の薬効の有意性は、*** (スチューデントｔ−テスト、P < 0. 001); **(スチューデントｔ−テスト、P < 0.01)または*(スチューデントｔ−テスト、P < 0.05)で表示する。
【図５】図5Aないし5Cは、アピラーゼ阻害剤が、病原性真菌スクレロチアナ・スクレロチオルムに対する３つの異なる殺菌剤： 5A. オクタン酸銅、5B. プロピコナゾール、および5C. ミクロブタニルの薬効を異なって促進することを示すグラフである。植物病原性真菌株（スクレロチアナ・スクレロチオルム）は、65 μMのアピラーゼ阻害剤 (AI # 1、10、13および15)の存在下、30℃にて１２日間、YPD培地ペトリ皿で増殖した。等量のジメチルスルホキシド (DMSO)を対照として添加した。実験を２回繰り返して、同じ結果であった。エラーバーは標準偏差を示す (n=5)。殺菌剤の薬効の有意性は、*** (スチューデントｔ−テスト、P < 0. 001); **(スチューデントｔ−テスト、P < 0.01)または*(スチューデントｔ−テスト、P < 0.05)で表示する。
【図６】図6Aないし6Cは、アピラーゼ阻害剤が、病原性真菌バーティシリウム・ダーリアエに対する３つの異なる殺菌剤： 6A. オクタン酸銅、6B. プロピコナゾール、および6C. ミクロブタニルの薬効を異なって促進することを示すグラフである。植物病原性真菌株（バーティシリウム・ダーリアエ）は、65 μMのアピラーゼ阻害剤 (AI # 1、10、13および15)の存在下、30℃にて１２日間、YPD培地ペトリ皿で増殖した。等量のジメチルスルホキシド (DMSO)を対照として添加した。実験を２回繰り返して、同じ結果であった。エラーバーは標準偏差を示す (n=5)。殺菌剤の薬効の有意性は、*** (スチューデントｔ−テスト、P < 0. 001); **(スチューデントｔ−テスト、P < 0.01)または*(スチューデントｔ−テスト、P < 0.05)で表示する。
【図７】図7は、実験したアピラーゼ阻害剤 (AI)の例示的な化学構造および系統的な名称を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の様々な具体例の作成および使用が以下詳細に説明されるが、本発明は、広汎な特別の文脈において具体化できる多くの適用可能な発明概念を提供するものと理解されるべきである。ここで議論される特定の具体例は、本発明を作成し使用するための特定のやり方の単なる例示であって、本発明の範囲を限定しない。
【００１５】
ここで用いるとき、用語「促進剤 (enhancer)」、「増進剤 (potentiator)」は、酵素的アピラーゼ活性を阻害するひとつの化合物または複数の化合物（「アピラーゼ阻害剤」、「AI」または「ai」）を意味し、殺菌剤の促進、亢進または増進をもたらす。例えば、前記促進剤または増進剤を殺菌剤とともに用いる場合、増進剤の活性の結果、増進剤および前記殺菌剤の組合せが、前記殺菌剤の殺真菌効果を促進し、および／または前記殺菌剤に対して抵抗性になった真菌を、前記殺菌剤に感受性にする。最も頻繁には、これらの促進剤または増進剤は、前記真菌自体または真菌に感染した（または感染したであろう）生きた生物への不都合な活性を有しない。本発明の増進剤は、殺菌剤に対して標的真菌抵抗性であるアピラーゼ阻害剤である。本発明の増進剤の非制限的な例は、N-(m-トリル)-[1,1’-ビフェニル]-4-スルホンアミド（アピラーゼ阻害剤1もしくは(AI.1)）； S-ヘプチル 2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボチオアート；3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド (AI.10)；3-(N-(4-ブロモフェニル)スルファモイル)-N-(3-ニトロフェニル)ベンズアミド (AI.13)；および／または(E)-3-メチル-N’-(1-(ナフタレン-2-イル)エチリデン)ベンゾヒドラジド (AI.15)を包含する。図7は、実験したアピラーゼ阻害剤 (AI)の例示的な化学構造および系統的な名称を示す。ある種の具体例において、前記殺菌剤促進剤または増進剤は、前記真菌の処理に最適となるように最適量以下の前記殺菌剤を生じ、それにより、前記真菌を処理するのに必要な殺菌剤の量を低減する。殺菌剤の濫用による殺真菌剤に対する真菌の増強した抵抗性を考慮すると、本発明は、抵抗性真菌を再び感受性にするのみならず、定用量投与計画を用いる結果、真菌が殺菌剤に対して抵抗性になる機会を低減することも期待される。
【００１６】
アピラーゼは、その統一的な特徴がATPのガンマリン酸塩を加水分解し、ADPのベータリン酸塩をより少ない度合いで加水分解する能力である、酵素である。ほとんどのアピラーゼは、前記細胞外マトリクスに向かう加水分解活性を持つ細胞膜関連たんぱく質として表現される。細胞外アピラーゼは、しばしば、エクト-アピラーゼと呼ばれる。エクト-アピラーゼは、しばしば、細胞外ATPを加水分解する。
【００１７】
殺菌剤に対する真菌抵抗性は、しばしば、細胞膜を通してそれらを隔離するか、送出することによってそれらを即座に解毒する真菌の能力を開発した前記真菌によってもたらされる。真菌は、これらの外因性化学物質を除去するための多様なメカニズムを用い、それで、この効果に対抗するのは困難であった。外因性化学物質解毒に対する真菌抵抗性の阻害は、殺菌剤の薬効を増強し、および／または、殺菌剤に対して抵抗性になった真菌を再び感受性にするであろう。
【００１８】
この発明の化合物は、殺菌剤、本発明のアピラーゼ阻害剤を、例えば、任意の植物学上許容される担体または希釈剤とともに含む組成物の形態で適用されることができる。これらの組成物は、しばしば、適用するために、水その他の液体で希釈し得る濃縮製剤であリ得る。ある種の具体例において、前記組成物は、さらなる処理なくスプレーまたは塗布される粒子または顆粒製剤でもあり得る。
【００１９】
ここで用いるとき、用語「植物学上許容される」は、限定されないが、種子、実生、植物細胞、植物、または花を含む、そのライフサイクルのいずれかの期間の植物のいずれかの部分との使用に適用可能な組成物、希釈剤、賦形剤、および／または担体をいう。前記組成物は、農業技術において従来的な手順、方法および配合に従って調製することができる。本発明の教示に従えば、農業および／または化学の当業者は、所望の組成物を用意に調製し得る。最も一般的には、本発明の化合物は、前記組成物のそのままないし濃縮製剤から調製された水性または非水性の懸濁剤または乳剤として、貯蔵、および／または適用するために調剤し得る。水溶性、水懸濁性または乳化可能製剤は、固形製剤（例えば、水和剤）に転換するか、または、それとして調剤することもできる。ある種の製剤において、本発明の組成物は、増殖培地、例えば、植物その他の細胞のタイプの増殖用のイン・ビトロ培地、土壌に供給され、または、種子、実生、根、幹、茎、葉、花もしくは植物全体にスプレーされ得る。
【００２０】
本発明者らは、アピラーゼ阻害剤がABCB輸送活性を阻害することによって植物細胞から除草剤の送出を抑制する能力が、自体が病原性真菌からの殺菌剤の送出を抑制し得る能力を高めることを認識した。ABCトランスポータは、殺菌剤を送出することによる殺菌剤に対する病原性真菌の抵抗性を支援することにおいて重要な役割を演じる (Kretschmer et al., 2009)。植物アピラーゼ阻害剤が真菌ABCトランスポータに対して有効であること（それらは植物ABCBトランスポータに対抗するから）、または、除草剤の除草薬効を促進するだけなのでそれらが殺真菌殺菌剤の薬効を促進することを予期することはできなかった。
【００２１】
アピラーゼは、動物細胞および植物細胞においてよく研究されているが、植物病原性真菌においてはあまりよく特性が明らかにされていない (Knowles et al., 2011; Clark et al., 2014)。真菌エクトフォスファターゼは、もっと特性が明らかにされており、基質に対するそれらのKmがアピラーゼのものよりもずっと高いにもかかわらず、ATPおよびADPも加水分解する。エクトフォスファターゼは、栄養摂取、増殖、分化、接着、増悪および感染のプロセスにおいて重要な役割を演じることが示されているので、それらは、他のやり方で、殺菌剤に対する真菌耐性に影響を与え得る。宿主細胞への接着が真菌感染を確立する最初のステップであり、エクトフォスファターゼは、宿主細胞と接触する最初の寄生たんぱく質のひとつであろう。いくつかの結果が、エクトフォスファターゼ活性が、宿主細胞に接着する真菌の薬効を増進することを示す (Freitas-Mesquita AL et al., 2014)。
【００２２】
本発明は、特定のアピラーゼ阻害剤が普通に入手可能な殺菌剤のいくつかの植物病原性真菌種の増殖をより効果的に制限する薬効を促進することを、初めて実証する。ある種の非制限的具体例において、アピラーゼ阻害剤は、最終組成物中0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、7.5、および10%重量対重量にて提供できる。液体形態で提供される場合、アピラーゼ阻害剤は、最終希釈組成物中0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、7.5、および10%体積対体積にて提供できる。当業者は、前記殺菌剤および前記アピラーゼ阻害剤の製剤が、使用前に希釈可能である濃縮物で提供され得、または、処理用に準備された希釈形態で提供され得ることを認識するであろう。
【００２３】
試験目的で、本発明とともに用いられる種々の殺菌剤および阻害剤はある濃度で用いられた。当業者は、種々の組成物が変化する濃度および組成で商業的の用いられることを認識するであろう。例えば、殺菌剤が、例えば、環境規制により、14-30%濃度にて商業的に適用されることはあたりまえである。本発明は、真菌抵抗性が上昇してあまり有効でなくなったことが知られている種々の殺菌剤、例えば、銅およびトリアゾール殺菌剤との特別な使用を見出した。
【００２４】
例えば、プロピコナゾールはトリアゾール類の殺菌剤の一員であり、市場占有率で最大群の殺菌剤である。プロピコナゾールを果物、野菜、条播作物および芝草に使用して、種々の真菌病を制御する。ミクロブタニルもトリアゾール類の殺菌剤の一員である。ミクロブタニルを果物、野菜、条播作物および芝草に使用して、種々の真菌病を制御する。
【００２５】
オクタン酸銅は銅化合物類の殺菌剤の一員であり、それは、米国で使用され、市場占有率で２番目に大きな類の殺菌剤である。オクタン酸銅を主に果物および野菜に使用して、種々の真菌病を制御する。
【００２６】
本発明は、前記植物病原真菌、例えば、ボツリティス・シネレア、コレトトリカム・グラミニコラ、フザリウム・オキシスポルム、スクレロチアナ・スクレロチオルム、バーティシリウム・ダーリアエ、ミコスファエレラ・グラミニコラおよびスファセロテカ・レリアナに対して特に有効な殺菌剤製剤を提供することを模索する。
【００２７】
ボツリティス・シネレアは世界中で200を超える作物宿主にネクロトロフ・ライフスタイル攻撃性を持つ空気伝染性植物病原である。重要なタンパク質、油料、繊維および園芸作物、ブドウおよびイチゴを包含する双子葉植物種を主に攻撃する。多くの類の殺菌剤が、遺伝的可変性のためにボツリティス・シネレアの制御に失敗している (Williamson et al., 2007)。ボツリティスは、貯蔵、輸送の間に、および市場で、果物および野菜の二次軟腐も引き起こす (Gonzalez et al., 2006)。
【００２８】
コレトトリカム属は、3,200種を超える単子葉および双子葉植物を攻撃する~600種を含む。コレトトリカム・グラミニコラは、主に、トウモロコシ (Zea mays)に感染し、米国だけで、およそ１０億ドルの年間損失を引き起こしている (Connell et al., 2012)。
【００２９】
土壌伝染性真菌フザリウム・オキシスポルム属クベンセ (Fusarium oxysporum f.sp. cubense)により引き起こされるバナナのパナマ病 (Fusarium wilt)は、１８７４年、オーストラリアで初めて報告された。バナナの萎ちょう病は、世界中のバナナ生産への主たる脅威である。いったん植物が感染されたら、この病気を有効に制御するために現在入手可能な殺菌剤はない (Peng J et al., 2014)。
【００３０】
白かび菌（スクレロチアナ・スクレロチオルム）は、400を超える宿主種を攻撃することが知られ、最も広範囲にわたる植物病原であると考えられている。これらの種の大部分が双子葉植物ならびに多数の農業的に重要な単子葉植物である (Bolton et al., 2006)。S. スクレロチオルム (S. sclerotiorum)に影響されるいくつかの重要な作物は、マメ類（ダイズ）、ほとんどの野菜、核果およびタバコを含む。
【００３１】
子嚢菌類バーティシリウム・ダーリアエは、広汎な双子葉宿主種において維管束萎ちょう病 (vascular wilt disease)を引き起こす土壌伝染性真菌植物病原である (Klosterman et al., 2009)。V. ダーリアエ (V. dahliae)は、ワタその他、野菜、繊維、果物、ナッツ樹木、森林樹および鑑賞植物のような重要な作物に重大な収穫および品質の損失をもたらし得る (Bhat and Subbarao, 1999; Pegg and Brady, 2002)。
【００３２】
子嚢菌類ミコスファエレラ・グラミニコラ（無性：セプトリア・トリチシ (Septoria tritici)）は、コムギが成長する限り発生するコムギ葉の最も深刻な歯病害のひとつである。この病気による収穫損失は25%-50%の範囲であり、特に、ヨーロッパ、地中海領域および東アフリカで高い。エム・グラミンコラ (M. gramincola)による感染は、昨年期の作物の残りに産生される空気伝染性子嚢胞子である。最初の感染は、通常、春または秋に実生が出回った後に発生する。成体病は、感染植物の葉および幹上の壊疽病斑に特徴がある。
【００３３】
担子菌類スファセロテカ・レリアナは、トウモロコシ (Zea mays)全体に感染して、糸黒穂病 (Head Smut)を引き起こす。この病気による収穫損失は変化し、この病気の発生に直接依存する。前記真菌は作物破片または土壌中で、二倍体冬胞子として越冬する。花状構造は、一般黒穂病の成熟した瘤に似た、大量の粉状冬胞子を含有する胞子嚢に変換される。
【００３４】
前記植物病原性真菌株ボツリティス・シネレア、コレトトリカム・グラミニコラ、フザリウム・オキシスポルム、スクレロチアナ・スクレロチオルムおよびバーティシリウム・ダーリアエは、米国テキサスＡ＆Ｍ大学、植物ゲノミクス＆バイオテクノロジー研究所 (the Institute for Plant Genomics & Biotechnology, Texas A & M University, USA)から入手した。ジャガイモデキストロース寒天 (PDA, Sigma-Aldrich)を様々な病原性真菌株の増殖に規定通りに使用した。
【００３５】
エクトフォスファターゼ阻害剤NGXT191 (AI.1)、AI.10、NGXT1913 (AI.13)、およびAI.15をこの実験に用いた。前記殺菌剤オクタン酸銅 (C16H30CuO4)、ミクロブタニル (C15H17ClN4)およびプロピコナゾール (C15H17Cl2N3O2)を用いた。用いたこれらの化合物の濃度は、オクタン酸銅 (285 mM)、ミクロブタニル (53.6 mM)およびプロピコナゾール (418 mM)であった。
【００３６】
真菌増殖試験：
標準抗真菌感受性ディスク試験を行って、病原性真菌の増殖に対するエクトフォスファターゼ阻害剤のいかなる増進効果をも測定した。病原性真菌野生型株をPDA培地上に播き、殺菌剤を含有するペーパーディスクをプレートの中心に置いた。プレートは、エクトフォスファターゼ阻害剤 (65 μM)または、単独で適用しても病原性真菌の増殖に影響しない等量のDMSO溶媒（対照として機能する）のいずれかを含有する。プレートは、前記真菌の増殖速度に依存して、30℃にて７日間（C. グラミニコラおよびS. スクレロチオルム)または１２日間（B. シネレア、F. オキシスポルムおよびV. ダーリアエ）インキュベートした。プレートの写真を撮り、IMAGE JTMソフトウェア (NIH, USA)を用いて、真菌増殖阻害の区域を測定した。全ての試験を５回繰り替えした。実験は２回行った。結果は、スチューデントＴ−テストを用いて有意性を分析した。
【００３７】
アピラーゼの配列および系統発生解析：
種々の植物および病原性真菌由来のアピラーゼの推定アミノ酸配列（ヌクレオシド三リン酸−ジホスホヒドロラーゼ）の比較。アラビドプシス・タリアナ (Arabidopsis thaliana) アピラーゼ１ （受託番号 NP_187058）、アラビドプシス・タリアナ (Arabidopsis thaliana) アピラーゼ２ （受託番号 NP_001154717）、ピサム・サチバム （受託番号 BAA75506）、ボツリティス・シネレア （受託番号 XP_001558134）、コレトトリカム・グラミニコラ （受託番号 EFQ33146）、フザリウム・オキシスポルム （受託番号 ENH75262）、スクレロチアナ・スクレロチオルム （受託番号 XP_001590729）およびバーティシリウム・ダーリアエ （受託番号 EGY20804）を作成した。推定アミノ酸配列の多重整列は、種々の病原性真菌由来のアピラーゼの一次構造が、他の既知の植物アピラーゼから、Ｃ末端のサイズで相違するが、機能的に重要な保存GDA1/CD39（ヌクレオシドリン酸）スーパーファミリードメインを維持する。実験された５つの真菌のうち、B. シネレアは、糖キナーゼ/HSP70/アクチンスーパーファミリードメインのヌクレオチド結合領域を持たないが、この領域はC. グラミニコラ、F. オキシスポルム、S. スクレオチオルムおよびV. ダーリアエには存在する。系統樹は、C. グラミニコラとV. ダーリアエとは互いに近く同一の枝に位置し、一方、B. シネレア、F. オキシスポルムおよびS. スクレロチオルムは異なる枝に位置することを示す（図１）。
【００３８】
アピラーゼ阻害剤は植物病原真菌の増殖を阻害する：
この研究では、以下のエクトフォスファターゼ（アピラーゼ）阻害剤の例を用いた。
【００３９】
【化１】
2018503676.tif 000003
【００４０】
【化２】
2018503676.tif 000004
【００４１】
【化３】
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【００４２】
【化４】
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【００４３】
これらのアピラーゼ阻害剤は、(Wang et al., 2012)で用いられ、以下の節に詳細に説明するプレートアッセイにより判断すると、前記植物病原性真菌に対する銅化合物およびトリアゾール殺菌剤（オクタン酸銅、ミクロブタニル、プロピコナゾール、テブコナゾールまたはエポキシコナゾール）の効果を異なって促進する。
【００４４】
化合物の各々は、それぞれ、便宜上、AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15（上述）と略すが、単独で真菌プレートアッセイを試験すると、殺真菌活性は検出されなかった。真菌増殖に対する効果は示さなかった。
【００４５】
実施例１：ボツリティス・シネレア
病原性真菌B. シネレアを、アピラーゼ阻害剤AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15で補充した殺菌剤（オクタン酸銅、ミクロブタニルおよびプロピコナゾール）の存在下、増殖した。阻害剤AI.1と組み合わせたオクタン酸銅は、B. シネレアの増殖（22%）に対して、オクタン酸銅単独と比較して著しく大きな阻害効果を有した（図2A）。また、阻害剤AI.1、AI.13およびAI.15と組み合わせたミクロブタニルは、B. シネレアの増殖に対して、ミクロブタニル単独のものと比較して著しく大きな阻害効果を有した（図2B）。阻害剤AI.1、AI.10およびAI.15と組み合わせた前記殺菌剤プロピコナゾールは、B. シネレアの増殖に対して、プロピコナゾール単独と比較して大きな阻害効果を有した（図2C）。
【００４６】
実施例２：コレトトリカム・グラミニコラ
病原性真菌C. グラミニコラを、アピラーゼ阻害剤AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15で補充した殺菌剤（オクタン酸銅、ミクロブタニルおよびプロピコナゾール）の存在下、増殖した。阻害剤AI.1およびAI.13と組み合わせたオクタン酸銅は、C. グラミニコラの増殖に対して、オクタン酸銅単独のものと比較して著しく大きな阻害効果を有した（図3A）。阻害剤AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15の存在下、殺菌剤ミクロブタニルは、C. グラミニコラの増殖に対して、ミクロブタニル単独のものと比較して著しく大きな阻害効果を有した（図3B）。プロピコナゾールに加えて４つの阻害剤はいずれも、真菌の増殖に対して、単独で用いたプロピコナゾールよりもより著しかったものはなかった（図3C）。
【００４７】
実施例３：フザリウム・オキシスポルム属クベンセ
病原性真菌F. オキシスポルムを、アピラーゼ阻害剤AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15で補充した殺菌剤（オクタン酸銅、ミクロブタニルおよびプロピコナゾール）の存在下、増殖した。阻害剤AI.1およびAI.13と組み合わせたオクタン酸銅は、F. オキシスポルムの増殖に対して、オクタン酸銅単独よりも著しく大きな阻害効果を有した（図4A）。殺菌剤ミクロブタニルは、阻害剤AI.10の存在下、F. オキシスポルムの増殖に対して、ミクロブタニル単独よりも著しく大きな阻害効果を有した（図4B）。AI.10の存在下、殺菌剤プロピコナゾールは、F. オキシスポルムの増殖に対して、プロピコナゾール単独よりも著しく大きな阻害効果を有した（図4C）。
【００４８】
実施例４：スクレロチアナ・スクレロチオルム
病原性真菌スクレロチアナ・スクレロチオルム、アピラーゼ阻害剤AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15で補充した殺菌剤（オクタン酸銅、ミクロブタニルおよびプロピコナゾール）の存在下、増殖した。阻害剤AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15と組み合わせたオクタン酸銅は、スクレロチアナ・スクレロチオルムの増殖に対して、オクタン酸銅単独よりも著しく大きな阻害効果を有した（図5A）。ミクロブタニルは、阻害剤AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15の存在下、スクレロチアナ・スクレロチオルムの増殖に対して、ミクロブタニル単独よりも著しく大きな阻害効果を有した（図5B）。阻害剤AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15と組み合わせた前記殺菌剤プロピコナゾールは、スクレロチアナ・スクレロチオルムの増殖に対して、プロピコナゾール単独よりも著しく大きな阻害効果を有した（5C図）。
【００４９】
実施例５：バーティシリウム・ダーリアエ
病原性真菌V. ダーリアエ、アピラーゼ阻害剤AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15で補充した殺菌剤（オクタン酸銅、ミクロブタニルおよびプロピコナゾール）の存在下、増殖した。阻害剤AI.1、AI.10、AI.13およびAI.15と組み合わせたオクタン酸銅は、真菌V. ダーリアエの増殖に対して、オクタン酸銅単独よりも著しく大きな阻害効果を有した（図6A）。阻害剤AI.15と組み合わせたミクロブタニルは、V. ダーリアエの増殖に対して、ミクロブタニル単独よりも著しく大きな阻害効果を有した（図6B）。プロピコナゾールは、阻害剤AI.10およびAI.15の存在下、V. ダーリアエの増殖に対して、プロピコナゾール単独よりも著しく大きな阻害効果を有した（図6C）。
【００５０】
実施例６：テブコナゾールおよびAI
前記化合物は、コムギ種子に対する低比率のメタラキシル (metalaxyl)に加えて、RAXIL(R)殺菌剤（テブコナゾール）との組み合わせにおける病気効率 (disease efficacy)につき試験した。促進剤AI.1と組み合わせて試験したテブコナゾール、0.15および0.25 gm ai/100 kgの比率は、1.5 gm ai/100 kgの商業アプリケーション比率より７．５および１０倍下であった。病気スクリーンを、低減した比率のテブコナゾールおよびメタラキシルで予備実験を行って、それらの低比率では効果がないことを確認した。トリアゾールは、標準比率の1.5 gm ai/100 kgにて研究対照として含ませた。生成物は、テブコナゾール + メタラキシルで予備処理した種子への過剰処理としておよび２種類の殺菌剤入りの単一水性スラリーとしての双方に適用した。２つの比率2.5および10 gm ai/100kgの促進剤AI.1を評価した。
【００５１】
種子伝染性バイオアッセイ
種子伝染性バイオアッセイは、種子伝染性病原真菌を検出できるようにした滅菌封入ボックス内で行った。プラスチック製靴箱を表面滅菌し、滅菌吸い取り紙を各容器の下に置いた。単子葉評価は、種子を殺すのに用いる方法に基づく双子葉評価とは異なる。単子葉は、滅菌水で湿らせた吸い取り紙上に置き、25℃にて１日間インキュベートした後、0℃にて２４時間置いて、種子胚を殺した。双子葉種子は、胚を殺すのに用いる2,4-D除草剤の緩和溶液を吸収した吸い取り紙上に置いた。バイオアッセイボックスを、次いで、25℃にて７日間置いた。真菌増殖は、各種子の顕微鏡評価により観察し記録した。50種の各種子につき２つの複製を通常行う。結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
2018503676.tif 000007
【００５３】
NSL+試験.  天然砂質ロームスクリーン (A natural sandy loam screen (NSL))は砂対土壌の1:1混合物から構成され、前記ロームは、自然にピシウム種 (Pythium spp.)および土壌特有の他の微生物に寄生されている。NSL+試験は、同一土壌混合物およびさらなる成分のフザリウム・グラミネアルム (Fusarium graminearum)を維持する。F. グラミネアルムの適当な単離物を種子区域に接種した。植え付けた種子を10℃雰囲気に置いて、ピシウム圧 (Pythium pressure)にとって最適環境にした。上記の条件下１０日間後、種子は、実生発生および生存評価のために温室 (27℃)に移した。NSL+試験は、典型的な野生条件に類似する、同一アッセイでピシウムおよびフザリウム活性の双方につき化合物の評価を可能にする。全ての処理を５回繰り返し、温室内の場所は無秩序であった。実生の発生および生存を評価した。滅菌対照をすべてのスクリーニングに含ませた。滅菌対照は、滅菌NSL混合物に置かれた未処理種子から構成された。結果を表２および３に示す。
【００５４】
【表２】
2018503676.tif 000008
【００５５】
【表３】
2018503676.tif 000009
【００５６】
実施例７：エポキシコナゾール活性に対する種々のアピラーゼ阻害剤の比較
単離物を酵母ジャガイモデキストロース寒天上で増殖させた。OD測定に基づく殺菌剤感受性試験を、ウェル毎におよそ10,000胚珠（顕微鏡胚珠計数）を用いる96ウェルプレートで行った。促進剤の試験濃度は、0、0.003、0.016、0.08、0.4、2、10および50 μgml-1であった。試験した殺菌剤濃度は、0、0.00128、0.0064、0.016、0.032、0.08、0.16、0.8、4、10、20および50 μgml-1であった。結果を表４および５に示す。
【００５７】
【表４】
2018503676.tif 000010
【００５８】
【表５】
2018503676.tif 000011
【００５９】
この発明の組成物は、分散剤、液剤、懸濁剤、エアロゾルおよび粉剤の形態で植物に適用され、それは前記殺菌剤およびこの発明の促進剤および植物学上許容される不活性担体を含む。最も広汎に用いられる担体は水である。前記組成物は、適用のため水に分さされた濃縮製剤またはさらなる処理なく適用される粉剤もしくは顆粒剤のいずれかである。前記組成物は、農業化学技術で当たり前の手順および組成にしたがって調製されるが、この発明の化合物がそこに含まれているので、新規かつ重要である。
【００６０】
植物に適用する前記組成物の実量は重要ではなく、当業者によって容易に決定できる。一般に、活性化合物の重量に対して10 ppmから5000 ppmの濃度が良好な制御を与えると予測される。多くの化合物で、100から1500 ppmの濃度で十分であろう。
【００６１】
植物真菌病は、有効量の本発明の組成物を、前記植物病原または前記植物病原が生息する場所または前記植物病原が生息しているであろう場所（植物もしくは土壌）に適用することによって制御し得る。植物病は、有効量の前記組成物を植物または植物が成長することを許される場所に適用することによって制御できる。特に、適用は、前記植物の茎および葉、前記植物の種子、鱗茎、根茎、塊茎、塊根および担根体を含む前記植物の球根類になされる。
【００６２】
本発明の制御方法における土壌の処理として、例えば、土壌への噴霧、土壌との混合、土壌への液剤の灌流（液剤の灌漑、土壌への注入、液剤の滴下）が含まれる。当該処理は、散布前、散布時、散布直後、実生の生育期中、定植前、定植時、定植後の成長時に実行できる。
【００６３】
この明細書で議論されたいかなる具体例も、いかなる方法、キット、試薬、または本発明の組成物について実行することができ、その逆も同様であると考えられる。さらに、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成できる。
【００６４】
ここに記載された特定の具体例は例示といて示されたものであり、本発明の限定ではないことを理解されるべきである。この発明の本質的な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な具体例で採用され得る。当業者は、ただの規定実験、ここに記載される特別の手順の多数の等価物を用いることを、理解し、または、解明することができる。そのような等価物はこの発明の範囲内であるとみなされ、特許請求の範囲に保護される。
【００６５】
本明細書で言及された全ての刊行物および特許出願は、この発明が属する当業者の技術水準を示している。全ての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が出典明示して特別にかつ個別に示されているかのような同じ限度まで、出典明示してここに含まれる。
【００６６】
語句「不定冠詞 (a)」または「不定冠詞 (an)」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書中、用語「を含む (comprising)」と併せて用いられるとき、「ひとつ (one)」を意味するが、「一以上 (one or more)」、「少なくともひとつ (at least one)」、および「１または１を超える (one or more than one)」の意味と整合する。特許請求の範囲における用語「または (or)」の使用は、代替物のみを参照すると明示的に表記するか、代替物が互いに排他的である場合を除き、「および／または (and/or)」を意味するために用いられるが、開示は、代替物のみを参照する定義および「および／または」を支持する。
【００６７】
本明細書および特許請求の範囲に用いるとき、語句「含む（現在進行形） (comprising)」（ならびに「含む（原型） (comprise)」および「含む（三人称単数現在） (comprises)」のような「含む（現在進行形） (comprising)」のいかなる形態）、「有する（現在進行形）()having」（ならびに「有する（原型） (have)」および「有する（三人称単数現在） (has)」のような「有する（現在進行形） (having)」のいかなる形態）、「包含する（現在進行形） (including)」（ならびに「包含する（三人称単数現在） (includes)」および「包含する（原型） (include)」のような「包含する（現在進行形） (including)」のいかなる形態）または「含有する（現在進行形） (containing)」（ならびに「含有する（三人称単数現在） (contains)」および「含有する（原型） (contain)」のような「含有する（現在進行形） (containing)」のいかなる形態）は包含的またはオープンエンドであり、付随的、未記載のエレメントまたは方法ステップを排除しない。
【００６８】
ここで用いるとき、用語「またはそれらの組合せ (or combinations thereof)」は、その用語の前に列挙された項目のすべての配列および組合せをいう。例えば、「A、B、C、またはそれらの組合せ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCの少なくともひとつ、および、特別な文脈で順序が重要ならば、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、またはCABも包含することを意図する。この例で先を続けると、BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどの一以上の項目または用語の繰り返しを含有する組合せが明らかに包含される。典型的に、文脈からそうでなければ、いずれの組合せにおいても、項目または用語の数には制限がないことを、当業者は理解するであろう。
【００６９】
本明細書に開示され、特許請求される前記組成物および／または方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験なく、なし得る。この発明の前記組成物および方法は、好ましい具体例の観点から記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された、前記組成物ならびに／または方法および前記方法のステップまたは一連のステップに変形を施すことができることは当業者には明らかである。
当業者に明らかなそのような類似の代替および修飾の全ては、付随する特許請求の範囲に規定されるように、本発明の精神、範囲および概念から逸脱しないとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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