(57)【要約】眼および眼以外の組織に影響する障害、例えば角膜ジストロフィーおよびマイクロサテライト拡張疾患を治療するための方法が本明細書に記載される。本方法は、ゲノムＤＮＡを切断および／または修復するために、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などのヌクレアーゼ系を使用する。そのような方法は、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９開裂部位を標的化する非相同的末端連結（ＮＨＥＪ）または相同性誘導型修復（ＨＤＲ）と組み合わせて修復鋳型を含む、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復系をさらに含むことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において眼の組織に影響する障害を治療するための方法であって、前記被験体の眼の領域に、ゲノム標的化ヌクレアーゼと少なくとも１つの標的化ゲノム配列を含むガイドＤＮＡとを含むヌクレアーゼ系の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼが、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸を含む発現ベクターとして提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ガイドＤＮＡが、ＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）、ＤＮＡ分子または前記ｇＲＮＡをコードする核酸を含む発現ベクターとして提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼ系がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼ系が遺伝子変異を不活性化または切り出す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復系をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＳＢ修復系が、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９開裂部位に標的化される非相同的末端連結（ＮＨＥＪ）または相同性誘導型修復（ＨＤＲ）と組み合わせてまたはそれらなしに修復鋳型を含み、前記部位は遺伝子変異を補正または編集する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記障害が角膜ジストロフィーまたはマイクロサテライト拡張疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記眼の領域が角膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ガイドＤＮＡが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の標的化ゲノム配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的ゲノム配列が、配列番号１〜１７２および１７４〜３４２に示すヌクレオチド配列のいずれか１つまたはその任意の組合せから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記角膜ジストロフィーが、上皮基底膜ジストロフィー、上皮再発性びらんジストロフィー、上皮下粘液性角膜ジストロフィー、メースマン角膜ジストロフィー、リッシュ上皮角膜ジストロフィー、膠様滴状角膜ジストロフィー、ライス−ビュックラース角膜ジストロフィー、ティール−ベーンケ角膜ジストロフィー、格子状角膜ジストロフィー、１型（古典的）、格子状角膜ジストロフィー、２型、格子状角膜ジストロフィー、ＩＩＩ型、格子状角膜ジストロフィー、ＩＩＩＡ型、格子状角膜ジストロフィー、Ｉ／ＩＩＩＡ型、格子状角膜ジストロフィー、ＩＶ型、多形性（角膜）アミロイドーシス、顆粒状角膜ジストロフィー、１型、顆粒状角膜ジストロフィー、２型、斑状角膜変性症、シュナイダー角膜ジストロフィー、先天性間質角膜ジストロフィー、斑状角膜ジストロフィー、後部無定形角膜ジストロフィー、フランソワの中心部雲状ジストロフィー、デスメ膜前角膜ジストロフィー、フックス内皮角膜ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、先天性遺伝性内皮ジストロフィーおよびＸ連鎖内皮角膜ジストロフィーからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロサテライト拡張疾患が、瞼裂縮小、下垂および逆内眼角贅皮合指症、鎖骨頭蓋骨形成不全、先天性中心性低換気症候群、ハッダード症候群ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＦＲＡＸＡ（脆弱性Ｘ症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱性ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリートライヒ運動失調）、フックス内皮角膜ジストロフィー、ＦＸＴＡＳ（脆弱性Ｘ関連振戦／運動失調症候群）、手足生殖症候群、ＨＤ（ハンティングトン病）、全前脳症、成長ホルモン欠乏による精神遅滞、精神遅滞、てんかん、ウェスト症候群、パーチントン症候群、眼球咽頭筋ジストロフィー、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調１型）、ＳＣＡ１２（脊髄小脳失調１２型）、ＳＣＡ１７（脊髄小脳失調１７型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調３型またはマチャド−ジョセフ疾患）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調７型）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調８型）および合多指症からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレアーゼ系が目の表面に局所投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレアーゼ系が、角膜、強膜の上か外側に、眼内、結膜下、テノン嚢下もしくは眼球後の空間に、または眼瞼内もしくはその周囲に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレアーゼ系が移植、注射によって、またはウイルスで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
被験体において眼以外の組織に影響する障害を治療するための方法であって、前記被験体の眼以外の前記組織に、ゲノム標的化ヌクレアーゼと少なくとも１つの標的化ゲノム配列を含むガイドＤＮＡとを含むヌクレアーゼ系の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼが、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸を含む発現ベクターとして提供される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ガイドＤＮＡが、ＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）、ＤＮＡ分子または前記ｇＲＮＡをコードする核酸を含む発現ベクターとして提供される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレアーゼ系がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレアーゼ系が遺伝子変異を不活性化または切り出す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復系をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＳＢ修復系が、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９開裂部位に標的化される非相同的末端連結（ＮＨＥＪ）または相同性誘導型修復（ＨＤＲ）と組み合わせて修復鋳型を含み、前記部位はゲノム変異を補正または編集する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記障害がマイクロサテライト拡張疾患である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記ガイドＤＮＡが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の標的化ゲノム配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的ゲノム配列が、配列番号１〜１７２および１７４〜３４２に示すヌクレオチド配列のいずれか１つまたはその任意の組合せから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロサテライト拡張疾患が、瞼裂縮小、下垂および逆内眼角贅皮合指症、鎖骨頭蓋骨形成不全、先天性中心性低換気症候群、ハッダード症候群ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＦＲＡＸＡ（脆弱性Ｘ症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱性ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリートライヒ運動失調）、フックス内皮角膜ジストロフィー、ＦＸＴＡＳ（脆弱性Ｘ関連振戦／運動失調症候群）、手足生殖症候群、ＨＤ（ハンティングトン病）、全前脳症、成長ホルモン欠乏による精神遅滞、精神遅滞、てんかん、ウェスト症候群、パーチントン症候群、眼球咽頭筋ジストロフィー、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調１型）、ＳＣＡ１２（脊髄小脳失調１２型）、ＳＣＡ１７（脊髄小脳失調１７型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調３型またはマチャド−ジョセフ疾患）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調７型）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調８型）および合多指症からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヌクレアーゼ系が、局所的、血管内、皮内、経真皮的、非経口的、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、領域的、経皮的、気管内、腹腔内、動脈内、膀胱内、腫瘍内、吸入的、灌流的、洗浄的、注射を通して直接的、または投与および製剤を通して経口的に投与される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年７月２日に出願された米国仮出願第６２／１８８，０１３号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
角膜ジストロフィーは、一般的に遺伝性、両側性、対称性、徐々に進行性であり、環境や全身性因子に主に関連していない一群の障害である（１、２）。角膜ジストロフィーは任意の解剖学的層、細胞型または角膜の組織に影響することがあり、角膜透明度の喪失および視力の低減をもたらす（１、３）。群としての角膜ジストロフィーは、米国の人口の４％超に影響し、角膜移植は、かなりの視力喪失を引き起こすのに十分な重症度の角膜ジストロフィーのための決定的治療である。フックス内皮角膜ジストロフィー（ＦＥＣＤ）は、米国の人口の概ね４％に影響する最も一般的な角膜ジストロフィーである。ＦＥＣＤ症例の概ね７０％は、転写因子４（ＴＣＦ４）遺伝子でのマイクロサテライトトリヌクレオチド反復配列拡張によって引き起こされる（４）。追加のマイクロサテライト拡張疾患（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）が記載されている（５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｗｅｉｓｓ  ＪＳら、Ｃｏｒｎｅａ（２０１５）；３４：１１７〜１５９
【非特許文献２】Ｗｅｉｓｓ  ＪＳら、Ｃｏｒｎｅａ（２００８）；２７（補遺２）：Ｓ１〜Ｓ８３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、眼および眼以外の組織に影響する障害、例えば角膜ジストロフィーおよび目ならびに体全体の他の組織および器官に影響するマイクロサテライト拡張疾患を治療するための新規の改善された療法への大きな必要性がある。
眼および眼以外の組織に影響する障害、例えば角膜ジストロフィーおよびマイクロサテライト拡張疾患を治療するための方法が本明細書に記載される。本方法は、ゲノムＤＮＡを切断および／または修復するために、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などのヌクレアーゼ系を使用する。角膜ジストロフィーおよびマイクロサテライト拡張疾患を引き起こす遺伝子変異を不活性化または補正し、それによってこれらの群の疾患のために遺伝子療法アプローチを提供するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をベースとした遺伝子編集を使用することができる。
【０００５】
本発明の一態様は、被験体において眼の組織に影響する障害を治療するための方法であって、前記被験体の眼の領域に、ゲノム標的化ヌクレアーゼと少なくとも１つの標的化ゲノム配列を含むガイドＤＮＡとを含むヌクレアーゼ系の治療的有効量を投与することを含む、方法に関する。
【０００６】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸を含む発現ベクターとして提供され得る。
【０００７】
ある特定の実施形態では、ガイドＤＮＡは、ＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）、ＤＮＡ分子または前記ｇＲＮＡをコードする核酸を含む発現ベクターとして提供され得る。
【０００８】
ある特定の実施形態では、ガイドＤＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）、ＤＮＡ分子、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む発現ベクター、またはその任意の組合せとして提供することができる。
【０００９】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ系は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９であってよい。
【００１０】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ系は、遺伝子変異を不活性化または切り出す。
【００１１】
ある特定の実施形態では、この系は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復系をさらに含む。
【００１２】
ある特定の実施形態では、ＤＳＢ修復系は、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９開裂部位に標的化される非相同的末端連結（ＮＨＥＪ）または相同性誘導型修復（ＨＤＲ）と組み合わせてまたはそれらなしに修復鋳型を含み、前記部位は遺伝子変異を補正または編集する。
【００１３】
ある特定の実施形態では、ＤＳＢ修復系は、宿主細胞機構によって提供される。
【００１４】
ある特定の実施形態では、ゲノムに標的化されたヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であってよい。
【００１５】
ある特定の実施形態では、障害は角膜ジストロフィーまたはマイクロサテライト拡張疾患であり得る。
【００１６】
ある特定の実施形態では、眼の領域は角膜であり得る。
【００１７】
ある特定の実施形態では、ガイドＤＮＡは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の標的化ゲノム配列を含む。
【００１８】
ある特定の実施形態では、標的ゲノム配列は、配列番号１〜１７２および１７４〜３４２に示すヌクレオチド配列のいずれか１つまたはその任意の組合せから選択される。
【００１９】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ系は目の表面に局所投与され得る。
【００２０】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ系は、角膜、強膜の上か外側に、眼内、結膜下、テノン嚢下もしくは眼球後の空間に、または眼瞼内もしくはその周囲に投与され得る。
【００２１】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ系は移植、注射によって、またはウイルスで投与され得る。
【００２２】
本発明の一態様は、被験体において眼以外の組織に影響する障害を治療するための方法であって、前記被験体の眼以外の前記組織に、ゲノム標的化ヌクレアーゼと少なくとも１つの標的化ゲノム配列を含むガイドＤＮＡとを含むヌクレアーゼ系の治療的有効量を投与することを含む、方法に関する。
【００２３】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは前記ヌクレアーゼをコードする核酸を含む発現ベクターとして提供され得る。
【００２４】
ある特定の実施形態では、ガイドＤＮＡは、ＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）、ＤＮＡ分子または前記ｇＲＮＡをコードする核酸を含む発現ベクターとして提供され得る。
【００２５】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ系はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９であり得る。
【００２６】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ系は遺伝子変異を不活性化または切り出す。
【００２７】
ある特定の実施形態では、方法は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復系をさらに含む。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ＤＳＢ修復系は、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９開裂部位に標的化される非相同的末端連結（ＮＨＥＪ）または相同性誘導型修復（ＨＤＲ）と組み合わせて修復鋳型を含み、前記部位はゲノム変異を補正または編集する。
【００２９】
ある特定の実施形態では、ゲノム標的化ヌクレアーゼはＣａｓ９であり得る。
【００３０】
ある特定の実施形態では、障害はマイクロサテライト拡張疾患であり得る。
【００３１】
ある特定の実施形態では、ガイドＤＮＡは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の標的化ゲノム配列を含む。
【００３２】
ある特定の実施形態では、標的ゲノム配列は、配列番号１〜１７２および１７４〜３４２に示すヌクレオチド配列のいずれか１つまたはその任意の組合せから選択される。
【００３３】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ系は、局所的、血管内、皮内、経真皮的、非経口的、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、領域的、経皮的、気管内、腹腔内、動脈内、膀胱内、腫瘍内、吸入的、灌流的、洗浄的、注射を通して直接的、または投与および製剤を通して経口的に投与される。
【００３４】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかとなる。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更および改変がこの詳細な記載から当業者に明らかになるので、詳細な記載および具体例は本発明の好ましい実施形態を表しているものの、例示としてだけ与えられることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１−１】図１は、それぞれの変異と重なるｇＲＮＡ配列および角膜ジストロフィーの原因となることが公知である遺伝子の優性変異を破壊するそれらの能力を使用してＣａｓ９によって標的化可能であると同定された２つの部位を記載する、４つのパネル（Ａ）〜（Ｄ）を含む。パネル（Ａ）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を使用したＨＥＫ２９３細胞でのＴＧＦＢＩエクソン１２４の標的化を表す。非相同的末端連結による％遺伝子改変（％インデル）を下に示す。パネル（Ｂ）は、定量化のために使用されるピークを示しているゲルの画像トレースを表す。パネル（Ｃ）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を使用したＨＥＫ２９３細胞でのＴＧＦＢＩエクソン５５５の標的化を表す。非相同的末端連結による％遺伝子改変（％インデル）を下に示す。パネル（Ｄ）は、定量化のために使用されるピークを示しているゲルの画像トレースを表す。
【図１−２】同上
【００３６】
【図２−１】図２は、ＴＣＦ４遺伝子のエクソン２とエクソン３の間のイントロン内の標的配列に対応するｇＲＮＡ配列を使用してＣａｓ９によって標的化可能であると同定された部位を記載する、３つのパネル（Ａ）〜（Ｃ）を含む。パネル（Ａ）は、フックス角膜ジストロフィーを引き起こすトリヌクレオチド反復配列拡張の下流のイントロン配列を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系６ｇＲＮＡ（表４）を使用したＨＥＫ２９３細胞を表す。分子量ラダーは、左端および右端のレーンに示す。対照レーンは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９トランスフェクションを示さない。Ｃａｓ９レーンは、Ｃａｓ９によるトランスフェクションを示すがｇＲＮＡは示さない。矢印は非相同的末端連結によって生成された主要な開裂生成物を示し、非相同的末端連結による％遺伝子改変は下に示す。パネル（Ｂ）は、定量化のために使用されるピークを示しているゲルの画像トレースを表す。パネル（Ｃ）は、各ｇＲＮＡの予想された消化物サイズを表す。
【図２−２】同上
【図２−３】同上
【図２−４】同上
【００３７】
【図３−１】図３は、ＴＣＦ４遺伝子のエクソン２とエクソン３の間のイントロン内の標的配列に対応するｇＲＮＡ配列を使用してＣａｓ９によって標的化可能であると同定された部位を記載する、３つのパネル（Ａ）〜（Ｃ）を含む。パネル（Ａ）は、フックス角膜ジストロフィーを引き起こすトリヌクレオチド反復配列拡張の上流のイントロン配列を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系６ｇＲＮＡ（表３）を使用したＨＥＫ２９３細胞を表す。分子量ラダーは、右のレーンに示す。対照レーンは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９トランスフェクションを示さない。矢印は非相同的末端連結によって生成された主要な開裂生成物を示し、非相同的末端連結による％遺伝子改変は下に示す。パネル（Ｂ）は、定量化のために使用されるピークを示しているゲルの画像トレースを表す。パネル（Ｃ）は、各ｇＲＮＡの予想された消化物サイズを表す。
【図３−２】同上
【図３−３】同上
【図３−４】同上
【発明を実施するための形態】
【００３８】
目の障害、例えば角膜ジストロフィーおよびマイクロサテライト拡張疾患を治療するための方法が本明細書に記載される。本方法は、ゲノムＤＮＡを切断、ニックを入れるおよび／または修復するために、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などのヌクレアーゼ系を使用する。
【００３９】
本明細書で用いるように、用語「目疾患」は、角膜ジストロフィーおよびマイクロサテライト拡張疾患を限定されずに含む、目の障害を包含することができる。
【００４０】
本明細書で用いるように、用語「角膜ジストロフィー」または「複数の角膜ジストロフィー」は、一般的に遺伝性、両側性、対称性、徐々に進行性であり、環境や全身性因子に主に関連していない一群の障害を言う（１、２）。角膜ジストロフィーには、以下のものが（限定されずに）含まれる：上皮基底膜ジストロフィー（別名、地図状点状指紋状ジストロフィー、コーガン小嚢胞性角膜上皮ジストロフィー、前部基底膜ジストロフィー（Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ））；上皮再発性びらんジストロフィー（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｒｏｓｉｏｎ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（別名、Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｅｔｔｉ角膜ジストロフィー、Ｓｍｏｌａｎｄｉｅｎｓｉｓジストロフィー（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ  Ｓｍｏｌａｎｄｉｅｎｓｉｓ）、Ｈｅｌｓｉｎｇｌａｎｄｉｃａジストロフィー（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ  Ｈｅｌｓｉｎｇｌａｎｄｉｃａ））；上皮下粘液性角膜ジストロフィー（Ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｕｃｉｎｏｕｓ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）；メースマン角膜ジストロフィー（別名、若年性遺伝性上皮ジストロフィー、Ｓｔｏｃｋｅｒ  Ｈｏｌｔジストロフィー）；リッシュ上皮角膜ジストロフィー（Ｌｉｓｃｈ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（別名、バンド状（Ｂａｎｄ−Ｓｈａｐｅｄ）および渦巻状（Ｗｈｏｒｌｅｄ）の小嚢腫ジストロフィー）；膠様滴状角膜ジストロフィー（別名、上皮下アミロイドーシス、原発性家族性アミロイドーシス（Ｇｒａｙｓｏｎ））；ライス−ビュックラース角膜ジストロフィー（別名、ボウマン層の角膜ジストロフィー、Ｉ型（ＣＤＢ  Ｉ）、地図上角膜ジストロフィー（Ｗｅｉｄｌｅ）、非定型的顆粒状角膜ジストロフィー、顆粒状角膜ジストロフィー、３型、前部制限膜ジストロフィー（Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｌｉｍｉｔｉｎｇ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、１型、表在性顆粒状角膜ジストロフィー（Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  Ｇｒａｎｕｌａｒ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ））；ティール−ベーンケ角膜ジストロフィー（Ｔｈｉｅｌ−Ｂｅｈｎｋｅ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（別名、ボウマン層の角膜ジストロフィー、ＩＩ型（ＣＤＢ２）、ハニカム形角膜ジストロフィー（Ｈｏｎｅｙｃｏｍｂ−Ｓｈａｐｅｄ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、前部制限膜ジストロフィー、ＩＩ型、カール状線維角膜ジストロフィー（Ｃｕｒｌｙ  Ｆｉｂｅｒｓ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ−Ｊｏｎｋｅｒｓ角膜ジストロフィー）；格子状角膜ジストロフィー、１型（古典的）（別名、Ｂｉｂｅｒ−Ｈａａｂ−Ｄｉｍｍｅｒジストロフィー）；格子状角膜ジストロフィー、２型（別名、家族性アミロイドーシス（フィンランド型またはゲルソリン型）、Ｍｅｒｅｔｏｊａ症候群）；格子状角膜ジストロフィー、ＩＩＩ型；格子状角膜ジストロフィー、ＩＩＩＡ型；格子状角膜ジストロフィー、Ｉ／ＩＩＩＡ型；格子状角膜ジストロフィー、ＩＶ型；多形性（角膜）アミロイドーシス；顆粒状角膜ジストロフィー、１型（別名、角膜ジストロフィーグレーノーＩ型）；顆粒状角膜ジストロフ��ー、２型（別名、Ａｖｅｌｌｉｎｏジストロフィー、複合顆粒状−格子状ジストロフィー）；斑状角膜変性症（別名、グレーノー角膜ジストロフィーＩＩ型、Ｆｅｈｒ斑紋状ジストロフィー）；シュナイダー角膜ジストロフィー（別名、シュナイダー結晶状角膜ジストロフィー（ＳＣＣＤ）、シュナイダー結晶状ジストロフィーサイン結晶（Ｓｃｈｎｙｄｅｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  Ｓｉｎｅ  Ｃｒｙｓｔａｌ）、シュナイダーの遺伝性結晶状間質ジストロフィー、結晶状間質ジストロフィー（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、中心間質結晶状角膜ジストロフィー、シュナイダーの角膜結晶状ジストロフィー、シュナイダー角膜結晶状ジストロフィー）；先天性間質角膜ジストロフィー（別名、先天性遺伝性間質ジストロフィー）；斑状角膜ジストロフィー（別名、フランソワ−ニーテンス斑点状（Ｍｏｕｃｈｅｔｅｅ）角膜ジストロフィー）；後部無定形角膜ジストロフィー（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（別名、後部無定形間質ジストロフィー（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ））；フランソワの中心部雲状ジストロフィー；デスメ膜前角膜ジストロフィー；フックス内皮角膜ジストロフィー（別名、上皮内角膜ジストロフィー）；後部多形性角膜ジストロフィー（別名、後部多形性ジストロフィー、Ｓｃｈｌｉｃｈｔｉｎｇジストロフィー）；先天性遺伝性内皮ジストロフィー（別名、Ｍａｕｍｅｎｅｅ角膜ジストロフィー）；Ｘ連鎖内皮角膜ジストロフィー。
【００４１】
上記の障害の全ては、公知のまたは推定上の遺伝子変異によって引き起こされる。まだ記載されていない角膜ジストロフィーは、公知のまたは推定上の遺伝子変異によって引き起こされる。したがって、全ての遺伝的角膜ジストロフィーは、変異体対立遺伝子の補正または不活性化を含む遺伝子療法のために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のようなヌクレアーゼ系に対して感受性であり得る。
【００４２】
本明細書で用いるように、ショートタンデムリピートとも呼ばれる「マイクロサテライト配列」は、一般的に５〜５０回の範囲内で繰り返される短いＤＮＡ配列（通常２〜５ヌクレオチド）である。これらの配列はヒトゲノム全体に存在し、変異を起こすことおよび／または反復配列の数が増加することができる。一部のマイクロサテライト配列は、それらがある特定の長さを越えて拡張するならば、マイクロサテライト拡張疾患をもたらすことができる。全ての公知のまたはまだ記載されていないマイクロサテライト拡張疾患は、公知のまたは推定上の遺伝子の拡張によって引き起こされる。したがって、全てのマイクロサテライト拡張疾患は、変異体対立遺伝子の補正または不活性化を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子療法に対して感受性であり得る。
【００４３】
本明細書で用いるように、マイクロサテライト拡張疾患は、以下の障害を含む（しかし、限定されなくてもよい）眼および眼以外の組織に影響する疾患を包含することができる：瞼裂縮小、下垂および逆内眼角贅皮合指症（ｅｐｉｃａｎｔｈｕｓ  ｉｎｖｅｒｓｕｓ  ｓｙｎｄａｃｔｙｌｙ）；鎖骨頭蓋骨形成不全；先天性中心性低換気症候群（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｈｙｐｏｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハッダード症候群
【００４４】
ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＦＲＡＸＡ（脆弱性Ｘ症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱性ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリートライヒ運動失調）、フックス内皮角膜ジストロフィー、ＦＸＴＡＳ（脆弱性Ｘ関連振戦／運動失調症候群）、手足生殖症候群、ＨＤ（ハンティングトン病）、全前脳症、成長ホルモン欠乏による精神遅滞、精神遅滞、てんかん、ウェスト症候群、パーチントン症候群、眼球咽頭筋ジストロフィー、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調１型）、ＳＣＡ１２（脊髄小脳失調１２型）、ＳＣＡ１７（脊髄小脳失調１７型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調３型またはマチャド−ジョセフ疾患）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調７型）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調８型）、合多指症。
【００４５】
本明細書で用いるように、被験体の「目」、「目領域」または「眼の領域」という用語は、角膜、結膜、強膜、窩、黄斑、視神経、網膜、水晶体、虹彩、瞳孔から、眼内、結膜下、テノン嚢下もしくは眼球後の空間、または眼瞼および目の他の解剖学的特徴の中もしくはその周囲を包含する。
【００４６】
本明細書で用いるように、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９ヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡの切断および／または修復のための極めて多用途で正確なアプローチである（６）。角膜ジストロフィーおよびマイクロサテライト拡張疾患を引き起こす遺伝子変異を不活性化または補正し、それによってこれらの群の疾患のために遺伝子療法アプローチを提供するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をベースとした遺伝子編集を使用することができる。２０ヌクレオチド（ｎｔ）標的配列およびＣａｓ９二重鎖ヌクレアーゼに結合する追加の構造的ＲＮＡ部分からなる単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を利用するために、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの天然に存在するＣＲＩＳＰＲ系を改変した（６、７）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、５’−ＮＧＧ−３’プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接している、任意の２０ｎｔ配列で切断する能力を有する、または、代替のＰＡＭ配列および生命情報科学は標的部位をマッピングするツールを提供する（８、１０）。Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断は、非相同的末端連結（ＮＨＥＪ）を含む内因性細胞性機構によって修復され、これにより、元の変異体対立遺伝子を不活性化することができる挿入欠失変異が生じる。したがって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、フレームシフトを通してそれを不活性化するためにタンパク質コード変異に十分近く近接してＤＮＡを切断することによって、疾患を引き起こす遺伝子変異を補正することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、それを切り出すために変異の両側でＤＮＡを切断することによって、または、その距離が約２００ｂｐ未満であるならば変異もしくは反復配列を挟む異なる鎖の上にニックを入れることによって、または、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９開裂部位に標的化される修復鋳型および相同性誘導型修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）の使用を通して、疾患を引き起こすコードもしくは非コード遺伝子変異を補正することができる。したがって、特異的変異体配列は、遺伝子編集して、修復することができる。
【００４７】
角膜細胞に適用されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、角膜ジストロフィーを引き起こす遺伝子欠損を補正することができ、したがって、これらの障害を治療するために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９治療は、インプラントまたは注射を通して目の表面に局所的に投与されてもよい。インプラントまたは注射は、角膜、強膜に、眼内、結膜下、テノン嚢下もしくは眼球後の空間に、または眼瞼内もしくはその周囲に投与されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、フックス内皮角膜ジストロフィーに加えて他のマイクロサテライト拡張疾患を治療するために、角膜または目の外側に適用されてもよい。角膜ジストロフィーおよびマイクロサテライト拡張疾患を治療するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９アプローチは、遺伝子変異を不活性化もしくは切り出すために単一のもしくは複数のガイドＲＮＡを利用することも、または遺伝子変異を補正するために修復鋳型の使用を利用することもできる。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９治療は、マイクロサテライト拡張疾患を引き起こす遺伝子欠損を補正するために眼以外の組織に適用されてもよい。
【００４８】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９治療の投与経路は、接触する細胞または組織の位置および性質によって異なることができ、例えば、血管内、皮内、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、領域性（ｒｅｇｉｏｎａｌ）、経皮、気管内、腹腔内、動脈内、膀胱内、腫瘍内、吸入、灌流、洗浄、直接注入および経口投与および製剤、または以下の投与経路のいずれかを含む。用語「全身投与」は、被験体の循環系への組成物の導入をもたらすか、またはさもなければ体全体へのその拡散を許容する方法での投与を指す。「領域性」投与は、特異的および幾分より限定された解剖学的空間、例えば腹腔内、髄腔内、硬膜下、または特異的器官への投与を指す。「局所投与」は、限定されたまたは限局性の解剖学的空間への組成物または薬物の投与、例えば腫瘍塊への腫瘍内注射、皮下注射、皮内または筋肉内注射を指す。局所投与または領域性投与は、循環系への組成物の浸入をもたらすこと、すなわち、それをある程度は全身性にする可能性もあることを当業者は理解する。例えば、用語「血管内」は、全身性、領域性および／または局所の投与であるかどうかにかかわらず患者の１本または複数本の血管の中、内側または内部に、を意味する、患者の血管系への送達を指すものと理解される。ある特定の実施形態では、投与は静脈と考えられる血管内に（静脈内）であってよく、他では、投与は動脈と考えられる血管内にであってよい。静脈には、限定されずに、内頸静脈、末梢静脈、冠状静脈、肝臓静脈、門脈、大伏在静脈、肺静脈、上大静脈、下大静脈、胃静脈、脾臓静脈、下腸間膜静脈、上腸間膜静脈、橈側皮静脈および／または大腿静脈が含まれる。動脈には、限定されずに、冠状動脈、肺動脈、上腕動脈、内頸動脈、大動脈弓、大腿動脈、末梢動脈および／または毛様体動脈（ｃｉｌｉａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ）が含まれる。送達は、細動脈または毛細管を介してかまたはそれらに対するものであってよいと考えられる。
【００４９】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を含む真核生物の細胞で標的化ゲノム編集を促進するために使用することができる。ゲノム編集を促進するために、改変する細胞は、ガイドＲＮＡ分子自体またはガイドＲＮＡ分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターとともにＣａｓ９をコードする発現ベクターまたはＣａｓ９タンパク質、ＤＮＡもしくはＲＮＡ自体を共トランスフェクトされる。例えば、ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９の導入は、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＣａｓ９をコードする核酸を含む発現ベクターとしてＣａｓ９をトランスフェクトすることによって実行することができる。ある特定の実施形態では、ガイドＤＮＡは、ＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）、ＤＮＡ分子として、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む発現ベクターとして、直接的にそれ自体投与することができる。
【００５０】
標的化ゲノム改変を促進するために、多くの異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を改変することもできるが、標的化ゲノム改変で最も一般的に使用されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系である。ガイドＲＮＡ分子によって標的化される部位で二本鎖ＤＮＡ切断を触媒するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、単一タンパク質Ｃａｓ９だけを必要とする。
【００５１】
細胞のゲノム内で複数の部位の同時編集を促進するために、複数のガイドＲＮＡ配列を単一のＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることができる。例えば、介在配列の欠失を促進するために、一対のガイドＲＮＡが近位位置の配列を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９はコドン最適化配列によってコードされる。コドン最適化プラスミドおよび操作されたＣａｓ９ニッカーゼをコードするプラスミドを含むＣａｓ９をコードするプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ＣＲＩＳＰＲ／）から公開されている。
【００５２】
標的化ゲノム工学へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の適用に関する追加の情報は、以下に見出すことができる：Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１（２０１２）；Ｃｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：２３０−２３２（２０１３）；Ｃｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３（２０１３）；Ｊｉｎｅｋら、ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００４７１（２０１３）；Ｍａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６（２０１３）；Ｑｉら、Ｃｅｌｌ  １５２：１１７３−１１８３（２０１３）；Ｆｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：８２２−８２６（２０１３）；Ｆｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：８２２−８２６（２０１３）；Ｈｓｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：８２７−８３２（２０１３）；Ｍａｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：８３３−８３８（２０１３）；Ｐａｔｔａｎａｙａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：８３９−８４３（２０１３）およびＷＯ／２０１３／１４２５７８（これらはそれぞれその全体亜が参考として本明細書に援用される）。
【００５３】
本明細書で提供される方法の一部の実施形態では、標的核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して改変される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系である。一部の実施形態では、被験体は、Ｃａｓ９をコードする核酸、および目の標的核酸配列に特異的であるガイドＲＮＡをコードする核酸が投与される。
【００５４】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的特異的ガイド配列（例えば、標的ＤＮＡ配列の配列に相補的である配列）およびガイドＲＮＡ足場配列を含む。一部の実施形態では、標的特異的ガイド配列は、配列番号１〜１７２および１７４〜３４２のいずれか１つまたはその任意の組合せから選択される核酸配列である。標的特異的ガイド配列は、配列番号１〜１７２および１７４〜３４２に示すヌクレオチド配列から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の核酸配列を含むことができる。
【００５５】
これで本発明を完全に記載したが、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、かつ過度の実験を行うことなく、本発明を広範囲の同等のパラメータ、濃度および条件で実行することができることを認める。
【００５６】
本記載は以下の実施例でさらに例示されるが、それらは限定するものと決して解釈されてはならない。
【実施例】
【００５７】
角膜ジストロフィーを引き起こす公知の変異を標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が同定された（表１ａ〜１ｃ）。表１のｇＲＮＡ  ＩＤに対応するヒトゲノム配列を、表２に列挙する。
【００５８】
トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）遺伝子での変異は、ライス−ビュックラース角膜ジストロフィー、ティール−ベーンケ角膜ジストロフィー、格子状角膜ジストロフィー、顆粒状角膜ジストロフィー１型、および顆粒状角膜ジストロフィー２型を含む角膜ジストロフィーのいくつかの形態を引き起こすことが知られている（１）。２つのホットスポットＲ１２４およびＲ５５５のミスセンス変異は、ＴＧＦＢＩ関連の角膜ジストロフィーのほぼ５０％を占める（９）。
【００５９】
角膜ジストロフィーのためのＣＲＩＳＰＲに基づく治療の実現可能性を実証するために、それぞれエクソン４および１２に位置するＴＧＦＢＩのＲ１２４およびＲ５５５の両方をコードするゲノム配列：５’−ＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＧＧＡＣＣＧＣＡＣＧＧ−３’（配列番号１４５）および５’−ＡＧＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＣＴＴＧＧＧ−３’（配列番号１７１）と重複する、２つのＣａｓ９標的化部位を同定した。これらの残基の特異的アミノ酸置換は、臨床的に異なる角膜ジストロフィーをもたらす：Ｒ１２４Ｃ−格子状角膜ジストロフィー、Ｉ型；Ｒ１２４Ｈ−顆粒状角膜ジストロフィー、２型；Ｒ５５５Ｗ−顆粒状角膜ジストロフィー、１型；およびＲ５５５Ｑ−ライス−ビュックラース角膜ジストロフィー。
【００６０】
記載のように（８）２つの標的部位をｐＨ１ｖ１（Ａｄｄｇｅｎｅ６０２４４）にクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）構築物で共トランスフェクトした。トランスフェクションから４８または６０時間の後に、ゲノムＤＮＡを収集し、付録Ａに列挙されるプライマーによって標的切断部位を囲む配列を増幅した（下を参照する）。ＰＣＲ生成物を次に精製、定量化し、その後Ｔ７  Ｅｎｄｏ  Ｉアッセイを実行した。
【００６１】
簡潔には、２００ｎｇのＰＣＲ生成物を変性させ、次にゆっくりと再アニールさせてヘテロ二本鎖の形成を可能にし、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩをＰＣＲ生成物に加え、３７℃で２５／３０分の間インキュベートしてヘテロ二本鎖を切断した。ＰＣＲ生成物を氷上に置くことによって反応を停止し、精製し、最後に６％ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲルに流して生成物を分解した。ＰｒｏｍｅｇａからのＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄ／Ｄｉａｍｏｎｄ核酸色素でゲルを染色し、可視化し、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。非相同的末端連結（ＮＨＥＪ）頻度を、二項式由来の式で計算した：％遺伝子改変＝
【数１】
2018520149.tif 000002
式中、「ａ」および「ｂ」の値はバックグラウンド減算の後の切断された断片の積分面積と等しく、「ｃ」は、バックグラウンド減算の後の非切断ＰＣＲ生成物の積分面積と等しい。
【００６２】
結果（図１）は、それぞれの変異（ＴＧＦＢ１）と重複するかまたは反復配列領域（ＴＣＦ４）の５’または３’を標的化するｇＲＮＡ配列を使用して、全ての同定された部位がＣａｓ９によって標的化可能であったことを示す。これらの結果は、角膜ジストロフィーの原因となることが公知である遺伝子での優性変異を破壊する能力を実証する。
【００６３】
角膜ジストロフィーおよびマイクロサテライト拡張疾患を治療するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９アプローチは、遺伝子変異を不活性化もしくは切り出すために単一のもしくは複数のガイドＲＮＡを利用することも、または遺伝子変異を補正するために修復鋳型および相同性誘導型修復の使用を利用することもできる。ＦＥＣＤを引き起こすＴＣＦ４マイクロサテライト拡張の場合、マイクロサテライト拡張の片側の領域またはマイクロサテライト拡張の両側の領域を標的化する１つまたは複数のｇＲＮＡが使用されてもよい。表３は、ＦＥＣＤを引き起こすＴＣＦ４マイクロサテライト拡張の上流のｇＲＮＡ標的配列のＩＤおよび対応するヒトゲノム配列を示す。表４は、同じＴＣＦ４マイクロサテライト拡張の下流のｇＲＮＡ標的配列のＩＤおよび対応するヒトゲノム配列を示す。ＦＥＣＤを引き起こすマイクロサテライト拡張を補正するために、ＴＣＦ４遺伝子中のこれらのｇＲＮＡまたは他のものを、任意の組合せで使用してもよい。表５に列挙のものを限定されずに含む他のマイクロサテライト拡張疾患のために、マイクロサテライト拡張の片側の領域またはマイクロサテライト拡張の両側の領域を標的化する１つまたは複数のｇＲＮＡを使用する類似のアプローチを使用してもよい。
【００６４】
付録Ａ
【化１】
2018520149.tif 000003
【化２】
2018520149.tif 000004
【化３】
2018520149.tif 000005
【化４】
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【化５】
2018520149.tif 000007
【００６５】
【化６】
2018520149.tif 000008
【化７】
2018520149.tif 000009
【００６６】
【表１Ａ−１】
2018520149.tif 000010
【表１Ａ−２】
2018520149.tif 000011
【００６７】
【表１Ｂ−１】
2018520149.tif 000012
【表１Ｂ−２】
2018520149.tif 000013
【表１Ｂ−３】
2018520149.tif 000014
【００６８】
【表１Ｃ−１】
2018520149.tif 000015
【表１Ｃ−２】
2018520149.tif 000016
【表１Ｃ−３】
2018520149.tif 000017
【表１Ｃ−４】
2018520149.tif 000018
【００６９】
【表２−１】
2018520149.tif 000019
【表２−２】
2018520149.tif 000020
【表２−３】
2018520149.tif 000021
【表２−４】
2018520149.tif 000022
【表２−５】
2018520149.tif 000023
【００７０】
【表３−１】
2018520149.tif 000024
【表３−２】
2018520149.tif 000025
【表３−３】
2018520149.tif 000026
【００７１】
【表４−１】
2018520149.tif 000027
【表４−２】
2018520149.tif 000028
【００７２】
【表５】
2018520149.tif 000029
【００７３】
【数２−１】
2018520149.tif 000030
【数２−２】
2018520149.tif 000031
【００７４】
均等物
当業者は、単にルーチンの実験操作を使用して、本明細書に記載された発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、または確認することができる。対象発明の具体的な実施形態が考察されたが、上の明細書は例示的であって制限的でない。この明細書を精査することにより、本発明の多くの変形が当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲とそれらの均等物の全範囲、および明細書とそのような変形を参考にして、判定されるべきである。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものである。
【図１−１】
2018520149.tif 000032
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【配列表】
2018520149000001.app
【国際調査報告】
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