(57)【要約】  本発明は、ダブルクエンチアッセイにより、核酸混合物から少なくとも１個の標的核酸配列を検出するための方法に関する。方法のダブルクエンチアッセイは、複数標的核酸配列の融解温度媒介識別のための新規アプローチを活用する。本発明は、さらにパーツキットに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列の検出方法であって、
（ａ）前記標的核酸配列にＰＴＯ（プロービングおよびタギングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、前記ＰＴＯが、（ｉ）前記標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）前記標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む融解温度決定領域（ＭＴＤＲ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含むステップと、
（ｂ）前記ＰＴＯにＣＱＯ（キャプチャリングおよびクエンチングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、前記ＣＱＯが、（ｉ）前記ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、前記ＰＴＯのＭＴＤＲが前記ＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成するように構成されるステップと、
（ｃ）前記タグ二本鎖をヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップであって、前記タグ二本鎖が前記標的核酸配列にハイブリダイズする際に、前記ヌクレアーゼ活性を有する酵素が前記タグ二本鎖の開裂を誘導し、それにより、前記ＣＱＯのキャプチャリング部分にハイブリダイズした前記ＭＴＤＲおよび前記少なくとも１個のフルオロフォアを含むＰＴＯフラグメントを含む活性化タグ二本鎖フラグメントが放出されるステップと、
（ｄ）前記活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして前記少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得るステップと、
（ｅ）前記少なくとも１個のフルオロフォアからのシグナルを測定することにより前記活性化タグ二本鎖フラグメントを検出するステップであって、前記シグナルが前記標的核酸配列の存在を示すステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
以下の通り、ステップ（ｂ）がステップ（ａ）の前に実施される、請求項１に記載の方法；
（ｂ）ＰＴＯにＣＱＯをハイブリダイズするステップであって、前記ＰＴＯが、（ｉ）前記標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）前記標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む融解温度決定領域（ＭＴＤＲ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含み、前記ＣＱＯが、（ｉ）前記ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、前記ＰＴＯのＭＴＤＲが前記ＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成するように構成されるステップ、
（ａ）前記標的核酸配列に前記タグ二本鎖をハイブリダイズするステップ、
（ｃ）前記タグ二本鎖をヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップであって、前記タグ二本鎖が前記標的核酸配列にハイブリダイズする際に、前記ヌクレアーゼ活性を有する酵素が前記タグ二本鎖の開裂を誘導し、それにより、前記ＣＱＯのキャプチャリング部分にハイブリダイズした前記ＭＴＤＲおよび前記少なくとも１個のフルオロフォアを含むＰＴＯフラグメントを含む活性化タグ二本鎖フラグメントが放出されるステップ、
（ｄ）前記活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして前記少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得るステップ、ならびに
（ｅ）前記少なくとも１個のフルオロフォアからのシグナルを測定することにより前記活性化タグ二本鎖フラグメントを検出するステップであって、前記シグナルが前記標的核酸配列の存在を示すステップ。
【請求項３】
以下の通り、ステップ（ｂ）および（ｃ）が逆順に行われる、請求項１に記載の方法；
ステップ（ａ）標的核酸配列にＰＴＯ（プロービングおよびタギングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、前記ＰＴＯが、（ｉ）前記標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）前記標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む融解温度決定領域（ＭＴＤＲ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含むステップ、
ステップ（ｃ）前記ハイブリダイズされたＰＴＯをヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップであって、前記ＰＴＯが前記標的核酸配列にハイブリダイズする際に、前記ヌクレアーゼ活性を有する酵素が前記ＰＴＯの開裂を誘導し、それにより、前記ＭＴＤＲおよび前記少なくとも１個のフルオロフォアを含む活性化ＰＴＯフラグメントが放出されるステップ、
ステップ（ｂ）前記活性化ＰＴＯにＣＱＯ（キャプチャリングおよびクエンチングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、前記ＣＱＯが、（ｉ）前記ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、前記ＰＴＯのＭＴＤＲが前記ＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズして活性化タグ二本鎖を形成するように構成されるステップ、
ステップ（ｄ）前記活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして前記少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得るステップ、ならびに
ステップ（ｅ）前記少なくとも１個のフルオロフォアからのシグナルを測定することにより前記活性化タグ二本鎖フラグメントを検出するステップであって、前記シグナルが前記標的核酸配列の存在を示すステップ。
【請求項４】
前記方法のステップが繰り返される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１個のＣＱＯが、２個以上のＰＴＯなどのＰＴＯ群を検出するように構成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
単一ＣＱＯが、前記方法の全てのＰＴＯの検出に使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、オリゴヌクレオチドプライマー対の存在下で実施され、前記プライマー対が、前記標的核酸に相補的で、前記標的核酸に相補的な第１の伸長産物の合成を刺激する第１のプライマー、および前記第１の伸長産物に相補的で、第２の伸長産物の合成を刺激する第２のプライマーを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２個の標的核酸配列が、それらそれぞれの活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度の差異に基づいて相互に識別できる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＴＤＲによって、前記活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度が決まる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＭＴＤＲが、５０℃〜７５℃、例えば、５０℃〜７０℃の融解温度が得られるように構成される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度が、３０℃〜１００℃である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度が、５０℃〜７５℃である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＴＯのフルオロフォアおよび前記ＣＱＯの最近接クエンチャーが、１〜４０ヌクレオチドまたは塩基対、例えば、６〜３５、１０〜３０、１５〜２５、例えば、約１８ヌクレオチドの距離だけ離れている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ターゲティング部分および前記ＰＴＯのＭＴＤＲが、リンカー分子により分離され、前記リンカーが、１〜２００ヌクレオチド、例えば、１〜５０ヌクレオチド、例えば、１〜３０ヌクレオチド、例えば、２〜２０ヌクレオチド、例えば、６〜１３ヌクレオチド、例えば、８〜１２ヌクレオチド、例えば、９〜１２ヌクレオチド、例えば、１１ヌクレオチドを含む核酸リンカーである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ターゲティング部分および前記ＰＴＯのＭＴＤＲが、リンカー分子により分離され、前記リンカーが、非核酸リンカーである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ターゲティング部分および前記ＰＴＯのＭＴＤＲが、核酸および／または有機化合物などの非核酸を含むリンカー分子により分離される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＴＯの合計長さが、１０〜５００ヌクレオチドもしくは塩基対、例えば、２０〜１００、例えば、３０〜７０ヌクレオチドであり、および／または前記ＣＱＯの合計長さが、１０〜５００ヌクレオチドもしくは塩基対、例えば、１５〜１００、例えば、２０〜５０ヌクレオチドもしくは塩基対である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＴＯおよびＣＱＯが、ヘアピン構造をもたらすことができる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
多くても１個のＣＱＯを使って前記少なくとも１個、例えば、少なくとも２個、例えば、少なくとも３個、例えば、少なくとも４個の標的核酸配列が検出される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的核酸の上流に位置する核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を含む上流オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的核酸の下流に位置する核酸配列に実質的に逆相補的な核酸配列を含む下流オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ターゲティング部分が前記ＰＴＯの５’末端に位置する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＭＴＤＲが前記ＰＴＯの３’末端に位置する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＴＯおよび／またはＣＱＯが、３’末端にブロック基をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ブロック基が、ビオチン、標識、リン酸基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、および／もしくはアルカンジオールからなる群から選択され、かつ／または前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドなどの３’−ヒドロキシル基不含ヌクレオチドを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヌクレアーゼ活性がＦＥＮヌクレアーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヌクレアーゼ活性を有する酵素が、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼが、耐熱性である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＴＯの開裂が、上流にオリゴヌクレオチドを伸長する、前記テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼにより誘導され、前記ポリメラーゼが５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記一組の相互作用標識が、フルオロフォアおよびクエンチャーを含み、前記フルオロフォアからの蛍光発光が前記クエンチャーによりクエンチされる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも一組の相互作用標識が、１、２、３、４、５、６、７組またはそれを超える組の相互作用標識を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも一組の相互作用標識が、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベースである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップｂ）のフルオロフォアからの発光が、ステップｃ）の前記ＰＴＯクエンチャーおよび前記ＣＱＯクエンチャーによりクエンチされるように、前記ＰＴＯの相互作用標識の組み合わせが配置される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記活性化タグ二本鎖がステップ（ｄ）で融解される場合に、前記フルオロフォアからの発光がクエンチされない、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも２組のＰＴＯおよびＣＱＯが、少なくとも２個の標的核酸配列の検出に使用される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
活性化タグ二本鎖の存在が、融解曲線分析またはハイブリダイゼーション曲線分析により判定される、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記フルオロフォアが、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）を含む群から選択される、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
２個以上のフルオロフォア、例えば、２、３、４、５、６、７および／または８個のフルオロフォアが存在する、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＴＯおよび／またはＣＱＯクエンチャー（単一または複数）が、ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）１、ＢＨＱ２、およびＢＨＱ３、Ｃｏｓｍｉｃ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ製）、Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ  Ｂｉｏｎｅｅｒ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＥＢＱ）（例えば、Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ製）またはこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
２個以上のクエンチング分子、例えば、２、３、４、５、６、７および／または８個のクエンチング分子が存在する、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ＵＮＧ処理ステップおよび／または変性ステップが、ステップ（ａ）の前に使われる、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、ステップ（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｃ）、（ａ）〜（ｄ）および／または（ａ）〜（ｅ）を繰り返し、繰り返すサイクル間で変性を行うことをさらに含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ステップ（ａ）〜（ｅ）が１つの反応槽中で実施され、またはいくつかの前記ステップ（ａ）〜（ｅ）が１つもしくは複数の別の反応槽中で実施される、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＰＴＯおよび前記ＣＱＯが、懸濁液または溶液中に存在する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記標的核酸配列が、細菌、ウイルス、真菌、および／または原生動物などの病原性生物由来である、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記病原性生物が、クラミジア、淋病、ヘルペスなどの性行為感染症を引き起こす病原性生物である、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記病原性生物が、ＭＲＳＡである、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載のＣＱＯ。
【請求項５０】
核酸混合物から少なくとも１個の標的核酸配列を検出するためのパーツキットであって、
ｉ．必要に応じて、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の少なくとも１個のＰＴＯ、
ｉｉ．請求項１〜４９のいずれか１項に記載の少なくとも１個のＣＱＯ、および
ｉｉｉ．必要に応じて、標的核酸配列の検出方法に関するインストラクション、
を含む、キット。
【請求項５１】
前記キットの少なくとも１個のＣＱＯが、少なくとも１個のＰＴＯ、例えば、少なくとも２個のＰＴＯ、例えば、少なくとも３個のＰＴＯ、例えば、少なくとも４個のＰＴＯ、例えば、少なくとも５個のＰＴＯ、などの６、８、１０、１２、１５、２０、３０、２５、３５、４０、４５、５０またはそれを超えるＰＴＯを検出するように構成される、請求項４６に記載のキット。
【請求項５２】
前記少なくとも１個のＣＱＯが、１個または複数のＰＴＯ群を検出するように構成される、請求項１〜５１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５３】
少なくとも１個のプレハイブリダイズされたＰＴＯおよびＣＱＯを含む、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５４】
請求項１〜５３のいずれか１項に記載の下流オリゴヌクレオチドおよび／または請求項１〜５３のいずれか１項に記載の上流オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜５３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５５】
請求項１〜５４のいずれか１項に記載のヌクレアーゼ活性を有する酵素さらに含む、請求項１〜５４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５６】
試料中の標的核酸配列の前記増幅および／または検出のためのプロセスに使用するための反応混合物であって、増幅の前に、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１個のＰＴＯおよび少なくとも１個のＣＱＯを含み、前記一対のプライマー、ＰＴＯおよびＣＱＯが、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマーが第１の前記標的核酸に相補的で、前記標的核酸に対して相補的な第１の伸長産物の合成を刺激する第１のプライマー、および前記第１の伸長産物に相補的で、第２の伸長産物の合成を刺激する第２のプライマーを含むことを特徴とし；前記ＰＴＯが前記標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列または前記標的核酸の相補配列にハイブリダイズし、前記領域が前記プライマー対の１つのメンバーと、前記プライマー対のもう一方のメンバーの相補配列との間にあり、前記ＰＴＯが少なくとも一組の相互作用標識、ＭＴＤＲ、および必要に応じて前記ターゲティング部分と前記ＭＴＤＲとの間のリンカーを含み；前記ＣＱＯが少なくとも１個のクエンチャーおよびキャプチャリング部分を有し、前記キャプチャリング部分が前記ＰＴＯにハイブリダイズするように構成される、反応混合物。
【請求項５７】
前記反応混合物中の全てのＰＴＯにハイブリダイズするように構成された単一ＣＱＯを含む、請求項５６に記載の反応混合物。
【請求項５８】
数個のオリゴヌクレオチドプライマー対および数個のＰＴＯを含む、請求項５６または５７に記載の反応混合物。
【請求項５９】
請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法で使用するための反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融解温度の測定に基づく複数標的ＤＮＡ配列の間接的検出のためのｑＰＣＲ法に関する。本発明は、さらにパーツキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲによるＤＮＡ試料中の特定配列の検出は標準的プロセスになっている。この技術は、遺伝子欠失解析から病原体特定およびテンプレート定量までの様々な異なる目的のために使用される。通常、異なる色のフルオロフォアが異なる標的を検出するために使用される。しかし、相互間で容易に識別可能なフルオロフォアの数に限りがあるために、この方法では、検出可能な特異的標的の数が限定される。
【０００３】
さらに、ＰＣＲ反応中のＤＮＡハイブリダイゼーションのステップは、イオン強度、塩基組成、核酸から切り詰められたフラグメントの長さ、ミスマッチの程度、および変性剤の存在により影響を受ける。ＤＮＡハイブリダイゼーションベースの技術は、核酸配列決定にとって、ならびに臨床診断、遺伝子研究、および法医学的検査室分析にとって極めて有用である。しかし、欠点として、ハイブリダイゼーションに依存する従来の方法は、プローブと非標的核酸配列との間の非特異的ハイブリダイゼーションに起因する擬陽性の結果を生ずる可能性がある。したがって、それらの信頼性を向上させるために解決すべき問題が残されている。
【０００４】
Ｓｅｅｇｅｎｅ（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）は、融解曲線分析によりマルチプレクシングにも適応できる技術を開発した。国際公開第２０１３１１５４４２Ａ１に記載のように、ＳｅｅｇｅｎｅのＴＯＣＥ技術は、加水分解時にプライマーフラグメントを放出するプローブに基づいている。次に、このフラグメントは、第２の人工標的に対しプライマーとして作用することが求められ、そこで、その特定のプローブに連結でき、特異的融解プロファイルを有する二本鎖標的が生成される。このシステムは、融解することにより高マルチプレクシングにも対応できるが、放出フラグメントが人工標的上で第２の伸長を開始および完了する必要があることにより、本質的に本発明より複雑である。本発明で生成されるフラグメントは、標識、融解フラグメントを直接提供する。
【０００５】
Ｐａｔｈｏｆｉｎｄｅｒ  ＢＶ（Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，Ｈｏｌｌａｎｄ）は、融解曲線分析によりマルチプレクシングにも適応できる技術を開発した。米国特許出願公開第２０１００２９７６３０Ａ１号に記載のように、このシステムは、２個の標的特異的プローブを提供することに基づくものであり、これらのプローブは、標的に隣接してハイブリッド形成した場合、リガーゼにより結合でき、特定の標的プローブに特異的な融解プロファイルを有する融解可能フラグメントを生成する。しかし、米国特許出願公開第２０１００２９７６３０Ａ１号で示されるように、このシステムは、本当のホモジニアスアッセイではなく、最初のＰＣＲ反応後に試験管を開けて、例えば、リガーゼ溶液を添加する必要がある。この余分のステップは、本発明の方法では必要でなく、このステップはＰＣＲ産物の混入のリスクがあるために極めて望ましくなく、また、追加の取り扱いステップも必要となる。
【０００６】
Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓは、融解曲線分析によりマルチプレクシングにも適応できる敗血症検出の方法およびアッセイを開発した。このシステムは、ＦＲＥＴプローブに依存しており、相互作用標識を有する２個のプローブが単一標的に隣接して結合されるように設計され、第１のプローブのフルオロフォアが第２のプローブと相互作用し、シグナルを生成する。２個のプローブは、温度勾配にさらされた場合、プローブが特異的融解曲線を生成することができるように設計できる。このシステムの欠点は、融解プロファイルが特定の標的配列の範囲内で設計される必要があることである。一方、本発明の方法は、一旦最適化されれば、任意の標的特異的プローブに結合できる融解タグを提供する。さらに、ＦＲＥＴプローブは２個の標識を必要とするので、このようなシステムは、１個のプローブ当たり１個のフルオロフォアを有する本発明に比べて、より低レベルの、例えば、５個のフルオロフォア検出チャネルを有するＰＣＲシステムに対するマルチプレクシングに適応できる。
【０００７】
マルチプレックスＤＮＡ標的検出のその他の方法は、例えば、チップベースプローブによる固体表面結合によるものである。これらのチップベースの方法は、多数の標的核酸配列を識別可能かもしれないが、チップアセンブリプロセスが厄介であり、多くの場合、複雑、高価かつ扱いの難しい機器を伴う。
【０００８】
したがって、簡便、高信頼性で再現可能な複数標的核酸配列の検出に対する必要性が依然としてある。さらに、蛍光標識の数により制限を受けない新規標的検出方法が必要とされている。さらに、マルチプレックス核酸配列解析における複雑さおよびステップの数を減らし、この結果として、さらに費用対効果が大きく、簡単な臨床的診断法、遺伝子研究プロトコル、および法医学的検査室分析を促進する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、単純、簡便、高信頼性で、再現可能な複数の標的ＤＮＡ配列の検出方法を提供する。本発明は、フルオロフォア毎の数個の標的配列を検出するために融解曲線測定を使用する。この方法により、単一のフルオロフォアを使って多数の標的が検出でき、かつ／または異なる融解温度および異なるフルオロフォアを用いることにより、多数の標的を検出できる。本発明者らは、異なるプロービングおよびタギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）を使った、標的ＤＮＡ配列のマルチプレックス検出のための、融解曲線測定と組み合わせたデュアルクエンチアッセイを開発した。該ＰＴＯはそれぞれ、単一キャプチャリングおよびクエンチングオリゴヌクレオチド（ＣＱＯ）と一緒に、異なる融解温度依存性領域（ＭＴＤＲ）を含む。本発明の数個のＣＱＯおよびＰＴＯを使用することにより、１回のアッセイで検出できる標的配列の数をさらに増やせる。メルトプレックス（ＭｅｌｔＰｌｅｘ）システムと名付けた本発明の概念を図１に示す。
【００１０】
本発明は、１）標的核酸配列に対する配列特異的ハイブリダイゼーションおよび２）標的シグナル検出に必要な活性化タグ二本鎖フラグメントの配列特異的酵素的放出、の組合せにより標的核酸配列の擬陽性検出を防止する（図１）。活性化タグ二本鎖フラグメントの存在を介したこの標的核酸配列の間接的測定は、優れた精度を確保し、擬陽性の結果に関する問題を完全に克服できないまでも減らすことができる。
【００１１】
メルトプレックスシステムの利点の１つは、数個の特有のＰＴＯにより特定された複数の標的配列を１個のＣＱＯが検出し得ることである。検出されるそれぞれの標的核酸配列に対し、同じフルオロフォアを有するＰＴＯ内で特有のＭＴＤＲ配列（融解温度依存性領域）を有するＰＴＯが設計される。したがって、単一蛍光標識のみを使って検出できる標的核酸配列の数が増やせる。同じＣＱＯと適合した類似のフルオロフォアを有する異なるＰＴＯは、類似の蛍光標識および／または同一の蛍光標識を含むのであるから、ＰＴＯ群と呼んでもよいであろう。それぞれのＰＴＯ群は、単一のＣＱＯにより検出され得、活性化タグ二本鎖を形成、この活性化タグ二本鎖フラグメントは、その群中のそれぞれのＰＴＯ上の特有のＭＴＤＲの結果として融解温度の差異に基づいて識別される。必要に応じて、２個以上のクエンチャーを含めて、同じＣＱＯにより多様なフルオロフォアのクエンチングを可能とすることにより、数個のＰＴＯ群を、単一のＣＱＯにより検出することも可能である。したがって、本発明は、それぞれの検出される核酸の標的核酸配列に対する異なるタイプの蛍光標識を必要とすることなくアッセイにより検出できる標的核酸配列の数を増やすことができる。本発明は、異なるＰＴＯ群に対し数個の蛍光標識を適用してよく、これにより、標準的検査室機器を使ったアッセイにより検出できる標的核酸配列の数をさらに増やせる。
【００１２】
さらに、本発明のＣＱＯは、標的配列に依存しない。したがって、いくつかのアッセイで信頼性の高い結果が得られることが証明されたＣＱＯは、その他のアッセイで再使用できる。このような再使用のプローブは、新しいアッセイを設計に際し、重要な資源を節約し得る。
【００１３】
汚染はＰＣＲベースの技術の主要な問題である。汚染のリスクを抑制する１つの選択肢は、アッセイの開始後、反応バイアルを再度開く必要のない技術を使用することである。本発明は、アッセイ開始後、反応バイアルを再度開く必要がなく、したがって、汚染される傾向が少ない。
【００１４】
本発明の主要態様は、標的核酸配列の検出方法に関し、前述の方法は、
（ａ）標的核酸配列にＰＴＯ（プロービングおよびタギングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む融解温度決定領域（ＭＴＤＲ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含み、ＰＴＯのターゲティング部分が、標的核酸配列とハイブリダイズでき、ＰＴＯのＭＴＤＲが標的核酸配列とハイブリダイズしないステップと、
（ｂ）前述のＰＴＯにＣＱＯ（キャプチャリングおよびクエンチングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、ＣＱＯが、（ｉ）ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、ＰＴＯのＭＴＤＲがＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成するように構成されるステップと、
（ｃ）タグ二本鎖をヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップであって、タグ二本鎖が標的核酸配列にハイブリダイズする際に、ヌクレアーゼ活性を有する酵素がタグ二本鎖の開裂を誘導し、それにより、ＣＱＯのキャプチャリング部分にハイブリダイズしたＭＴＤＲおよび少なくとも１個のフルオロフォアを含むＰＴＯフラグメントを含む活性化タグ二本鎖フラグメントが放出され、ＰＴＯフラグメントがＣＱＯのキャプチャリング部分にハイブリダイズされるステップと、
（ｄ）前述の活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得るステップと、
（ｅ）少なくとも１個のフルオロフォアからのシグナルを測定することにより活性化タグ二本鎖フラグメントを検出するステップであって、シグナルが標的核酸配列の存在を示すステップと、を含む。
【００１５】
方法のステップａ）およびｂ）は、任意の順序で起こってよく、すなわち、タグ二本鎖がＰＴＯ／タグ二本鎖の標的核酸への結合前に形成されてもよい。
【００１６】
別の実施形態では、ステップ（ｃ）および（ｂ）を交換して、それにより、方法が、（ａ）ＰＴＯおよび標的がハイブリダイズするステップ、（ｃ）ＰＴＯおよび標的をヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させて活性化ＰＴＯを放出させるステップ、および（ｂ）活性化ＰＴＯにＣＱＯをハイブリダイズすることにより、活性化タグ二本鎖を形成するステップ、ならびにその後に続けて上記で開示のステップ（ｄ）および（ｅ）を含む。
【００１７】
方法のステップは繰り返してよい。
【００１８】
活性化ＰＴＯまたは活性化タグ二本鎖の存在を記録する。
【００１９】
タグ二本鎖が融解する（ステップｄ）温度を記録する。
【００２０】
本発明のアッセイは、多数の用途を有する。非包括的な用途のリストには、以下が含まれる。
・ヒトおよび／または獣医学的診断
・食物および／または餌の品質および安全性
・環境監視
・科学研究
【００２１】
本発明のアッセイは、パーツキットとして販売されてよい。したがって、本発明の一態様は、本明細書に記載のような標的核酸配列の検出用のパーツキットに関し、キットは、
ｉ．必要に応じて、本明細書で記載の少なくとも１個のＰＴＯと、
ｉｉ．本明細書で記載の少なくとも１個のＣＱＯと、
ｉｉｉ．標的核酸配列の検出方法に関するインストラクションと、を含む。
【００２２】
したがって、本発明のある実施形態は、１個または複数の標的核酸配列の単一ＣＱＯによる検出である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施形態の非限定的図示である。
【図２】ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の融解曲線分析。ＤＥＣ４８６Ｐは、予測通りネガティブコントロールでは融解曲線を生成しないが、一方、その他の全ての設計は、ＮＴＣ反応において、融解曲線シグナルのレベルが高くなっている。（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）、○：ＤＥＣ４８６Ｐ、△：ＤＥＣ４８７Ｐ、ｘ：ＤＥＣ４８８Ｐ、□：ＤＥＣ４８９Ｐ、◇：ＤＥＣ４９０Ｐ。
【図３】テンプレートの有無の場合のタギングプローブＤＥＣ４８６Ｐに対するＰＣＲ反応産物の融解曲線分析。ＮＴＣ（ｘ）はネガティブコントロールでは融解曲線を生成しないが、テンプレートとの反応（◇）からは明確に識別可能なシグナルが存在する。また、クエンチングプローブがない反応（○）では、融解曲線が認められない。（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。
【図４】テンプレートの有無の場合のタギングプローブＤＥＣ４８７Ｐに対するＰＣＲ反応産物の融解曲線分析。ＮＴＣ（ｘ）はネガティブコントロールでは小さい融解曲線を生成するが、テンプレートとの反応（◇）からは明確に識別可能なシグナルが存在する。クエンチングプローブがない反応（○）では、融解曲線が認められない。（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。
【図５】テンプレートの有無の場合のタギングプローブＤＥＣ４８８Ｐに対するＰＣＲ反応産物の融解曲線分析。ＮＴＣ（ｘ）はネガティブコントロールではわずかな融解曲線を生成するが、テンプレートとの反応（◇）からは明確に識別可能なシグナルが存在する。クエンチングプローブがない反応（○）では、融解曲線が認められない。（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。
【図６】テンプレートの有無の場合のタギングプローブＤＥＣ４８９Ｐに対するＰＣＲ反応産物の融解曲線分析。ＮＴＣ（ｘ）はネガティブコントロールで明瞭な融解曲線を生成し、一方、テンプレートとの反応（◇）からは識別可能なシグナルが存在する。クエンチングプローブがない反応（○）では、融解曲線が認められない。（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。
【図７】テンプレートの有無の場合のタギングプローブＤＥＣ４９０Ｐに対するＰＣＲ反応産物の融解曲線分析。ＮＴＣ（ｘ）はネガティブコントロールでかなり大きな融解曲線を生成し、これは、テンプレートとの反応（◇）由来の曲線とは明確に識別できない。クエンチングプローブがない反応（○）では、融解曲線が認められない。（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。
【図８】ポジティブ試料に対するタギングプローブＤＥＣ４８６Ｐ−ＤＥＣ４９０ＰのＱ−ＰＣＲ増幅曲線、○：ＤＥＣ４８６Ｐ、△：ＤＥＣ４８７Ｐ、ｘ：ＤＥＣ４８８Ｐ、□：ＤＥＣ４８９Ｐ、◇：ＤＥＣ４９０Ｐ、実線：ＤＥＣ４６４。タギングプローブはＴａｑｍａｎタイプのプローブに比べてシグナル強度が低いが、全てのプローブは、１６〜２０のＣＴ値を有するポジティブシグナル読み取り値を明確に生成する。
【図８ａ】本発明の一実施形態の非限定的図示である。
【図９】標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の融解曲線分析。ＤＥＣ５００Ｐは、ポジティブ試料では融解曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。□：ＤＥＣ５００Ｐ、−：ＤＥＣ５００Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図１０】標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の増幅曲線。ＤＥＣ５００Ｐは、ポジティブ試料では増幅曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。□：ＤＥＣ５００Ｐ、−：ＤＥＣ５００Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図１１】標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の融解曲線分析。ＤＥＣ５０２Ｐは、ポジティブ試料では融解曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。□：ＤＥＣ５００Ｐ、◇：ＤＥＣ５０２Ｐ、−：ＤＥＣ５０２Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図１２】標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の増幅曲線。ＤＥＣ５０２Ｐは、ポジティブ試料では増幅曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。□：ＤＥＣ５００Ｐ、◇：ＤＥＣ５０２Ｐ、−：ＤＥＣ５０２Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図１３】標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の融解曲線分析。ＤＥＣ５０３Ｐは、ポジティブ試料では融解曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。ｘ：ＤＥＣ５０３Ｐ、−：ＤＥＣ５０３Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図１４】標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の増幅曲線。ＤＥＣ５０３Ｐは、ポジティブ試料では増幅曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。ｘ：ＤＥＣ５０３Ｐ、−：ＤＥＣ５０３Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図１５】ＤＥＣ５００ＰおよびＤＥＣ５０２Ｐを使った標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応の融解曲線分析は、ポジティブ試料では、２個の個別に識別可能な融解曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。○：ＤＥＣ５００Ｐ＋ＤＥＣ５０２Ｐ、−：ＤＥＣ５００Ｐ＋ＤＥＣ５０２Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図１６】ＤＥＣ５００ＰおよびＤＥＣ５０２Ｐを使った標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の増幅曲線は、ポジティブ試料では増幅曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。○：ＤＥＣ５００Ｐ＋ＤＥＣ５０２Ｐ、−：ＤＥＣ５００Ｐ＋ＤＥＣ５０２Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図１７】ＤＥＣ５００ＰおよびＤＥＣ５０３Ｐを使った標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）反応の融解曲線分析は、ポジティブ試料では個別に識別可能な２つ融解曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。△：ＤＥＣ５００Ｐ＋ＤＥＣ５０３Ｐ、−：ＤＥＣ５００Ｐ＋ＤＥＣ５０３Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図１８】ＤＥＣ５００ＰおよびＤＥＣ５０３Ｐを使った標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の増幅曲線は、ポジティブ試料では増幅曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。△：ＤＥＣ５００Ｐ＋ＤＥＣ５０３Ｐ、−：ＤＥＣ５００Ｐ＋ＤＥＣ５０３Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図１９】標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の融解曲線分析：ＲＭＤ７Ｐは、ポジティブ試料では、融解曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。○：ＲＭＤ７Ｐ、−：ＲＭＤ７Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図２０】標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の増幅曲線：ＲＭＤ７Ｐは、ポジティブ試料では、増幅曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。○：ＲＭＤ７Ｐ、−：ＲＭＤ７Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図２１】標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の融解曲線分析：ＲＭＤ８Ｐは、ポジティブ試料では、融解曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。ｘ：ＲＭＤ８Ｐ、−：ＲＭＤ８Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図２２】標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の増幅曲線：ＲＭＤ８Ｐは、ポジティブ試料では、増幅曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。ｘ：ＲＭＤ８Ｐ、−：ＲＭＤ８Ｐ  ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【図２３】ポリメラーゼ濃度の関数としてプロットしたＲＭＤアッセイの平均Ｃｑ値。Ｘ軸：任意単位。
【図２４】ポリメラーゼ濃度の関数としてプロットしたｍＶａｌｉｄＰｒｉｍｅアッセイの平均Ｃｑ値。Ｘ軸：任意単位で、１は、製造業者による推奨濃度である。
【図２５】ステップ２（９５℃）でのポリメラーゼ濃度の関数としてのＲＭＤ増幅曲線の振幅。Ｘ軸：任意単位で、１は、製造業者による推奨濃度である。
【図２６】ステップ２（９５℃）でのポリメラーゼ濃度の関数としてのｍＶａｌｉｄＰｒｉｍｅ増幅曲線の振幅。Ｘ軸：任意単位で、１は、製造業者による推奨濃度である。
【図２７】ポリメラーゼ濃度の関数としてＲＭＤプローブ／クエンチャー二本鎖の融解温度。Ｘ軸：任意単位で、１は、製造業者による推奨濃度である。
【図２８】（Ａ）標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の増幅曲線：ＤＥＣ４８６Ｐは、標的濃度に対応するポジティブ試料ではＣｑ値を有する増幅曲線を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。△：５ｘ希釈、ｘ：２５ｘ希釈、□：１２５ｘ希釈、◇：６２５ｘ希釈、○：３１２５ｘ希釈、−：１５６２５ｘ希釈、ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。（Ｂ）標的ポジティブコントロールおよびＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）ＰＣＲ反応産物の融解曲線分析：ＤＥＣ４８６Ｐは、標的濃度に対応するポジティブ試料では融解曲線振幅を生成するが、予測通りネガティブコントロールでは生成しない（シングルプレックスで３回繰り返した結果を示す）。△：５ｘ希釈、ｘ：２５ｘ希釈、□：１２５ｘ希釈、◇：６２５ｘ希釈、○：３１２５ｘ希釈、−：１５６２５ｘ希釈、ＮＴＣ（ノンテンプレートコントロール）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
マルチプレックスＰＣＲの主要な課題は、単純で簡便かつ信頼性の高い方法を使った複数標的ＤＮＡ配列の容易な検出である。本発明者らは、標識当たり、すなわち、フルオロフォア当たり数個の標的ＤＮＡ配列を検出するために、融解曲線測定と組み合わせたデュアルクエンチアッセイを開発した。本発明の非限定的概念を図１に示す。
【００２５】
定義
本明細書で使用される場合、用語の「ダブルクエンチアッセイ」は、少なくとも１個のフルオロフォア当たり少なくとも２個のクエンチャーの使用を意味する。ある実施形態では、１個のクエンチャーがＣＱＯ上に位置し、別のクエンチャーがＰＴＯ上に位置する。ある実施形態では、クエンチャーがＰＴＯ上に位置する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「相互作用標識」または「１組の相互作用標識」は、それらが隣接して位置する場合に相互作用する少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを意味する。相互作用する標識が隣接して位置する場合、クエンチャーは、フルオロフォアシグナルをクエンチできる。相互作用は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により媒介され得る。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、用語の「隣接して位置する」は、２個の対象物間の物理的距離を意味する。フルオロフォアおよびクエンチャーが隣接して位置する場合は、クエンチャーはフルオロフォアシグナルを部分的にまたは完全にクエンチできる。ＦＲＥＴクエンチングは通常、約１００Åまでの距離で発生し得る。本明細書で使用される場合、「隣接して位置する」は、１００Å未満および／または約１００Åの距離を意味する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語の「プロービングおよびタギングオリゴヌクレオチド」または「ＰＴＯ」は、少なくとも一組の相互作用標識を含むオリゴヌクレオチドを意味する。本発明のＰＴＯは、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成される。ＰＴＯは、ターゲティング部分、「融解温度決定領域」または「ＭＴＤＲ」（以下の定義を参照）、および必要に応じて、ターゲティング部分とＭＴＤＲとの間のリンカーを含む。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語の「ＰＴＯ群」は、同じ組み合わせの相互作用標識を有する多数のＰＴＯを意味し、群中のそれぞれのＰＴＯは、特有のターゲティング配列およびＭＴＤＲ領域を有する。群中のそれぞれのＰＴＯは、異なる標的核酸配列を検出するように構成されてよく、また、特有のＭＴＤＲは、本明細書に記載の融解温度により、群中のそれぞれのＰＴＯの区別を容易にする。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語の「キャプチャリングおよびクエンチングオリゴヌクレオチド」または「ＣＱＯ」は、少なくとも１個のクエンチャーおよびキャプチャリング部分を含むオリゴヌクレオチドを意味する。ＣＱＯのキャプチャリング部分は、本発明のＰＴＯにハイブリダイズするように構成される。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語の「タグ二本鎖」は、ハイブリダイズしたＰＴＯとＣＱＯを意味する。ＰＴＯは、さらに標的核酸配列にハイブリダイズし得る。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語の「タグ二本鎖フラグメント」または「活性化タグ二本鎖フラグメント」または活性化タグ二本鎖は、ハイブリダイズしたＰＴＯフラグメントとＣＱＯを意味し、この場合、ＰＴＯのクエンチャーは存在しない。タグ二本鎖開裂を誘発し、ＰＴＯクエンチャーを放出するヌクレアーゼ活性を有する酵素の結果として、ＰＴＯのクエンチャーは放出されている。「活性化ＰＴＯ」は、クエンチャーが取り除かれたＰＴＯを意味する。活性化ＰＴＯの存在は、ｑＰＣＲおよび／またはリアルタイムＰＣＲを使って測定し得る。本明細書で開示される方法のステップの順序に応じて、活性化ＰＴＯまたは活性化タグ二本鎖の存在が測定される。好ましい実施態様では、活性化タグ二本鎖のみがリアルタイムＰＣＲにより検出できる。最も好ましい実施形態実施態様では、ＣＱＯクエンチャーによるＰＴＯフルオロフォアの完全なクエンチングにより、活性化タグ二本鎖のみがリアルタイムＰＣＲにより検出できる。他の実施形態では、任意のシグナル検出後に、アッセイが活性化ＰＴＯにより較正される。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語の「蛍光標識」または「フルオロフォア」は、光励起時に光を再放射できる蛍光性化学的化合物を意味する。フルオロフォアは特異的波長の光エネルギーを吸収し、より長い波長の光を再放射する。励起状態にある分子は、周囲分子と相互作用するので、吸収された波長、エネルギー伝達効率、および発光前の時間は、フルオロフォア構造およびその化学的環境の両方に依存する。最大吸収（〜励起）および発光の波長（例えば、吸収／発光＝４８５ｎｍ／５１７ｎｍ）は、所定のフルオロフォアに言及するのに使用される典型的な用語であるが、全体のスペクトルを考慮することが重要となる場合もある。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語の「クエンチ」または「クエンチング」は、フルオロフォアなどの所定の物質の蛍光強度を低下させる何らかのプロセスを意味する。クエンチングは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により媒介され得る。ＦＲＥＴは、ドナー（例えば、フルオロフォア）とアクセプター（例えば、クエンチャー）の遷移双極子間の古典的な双極子−双極子相互作用に基づいており、ドナー−アクセプター距離に依存する。ＦＲＥＴは、典型的には、１００Åまでの距離で発生できる。ＦＲＥＴはまた、ドナー−アクセプタースペクトル重なりおよびドナーおよびアクセプター遷移双極子モーメントの相対的配向に依存する。フルオロフォアのクエンチングはまた、フルオロフォアと別のフルオロフォアまたは非蛍光分子との間の非蛍光錯体の形成の結果として、起こることがある。この機構は、「接触クエンチング」、「静的クエンチング」または「基底状態錯体形成」として知られる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語の「クエンチャー」は、フルオロフォアなどの所定の物質をクエンチできる化学化合物を意味する。
【００３６】
マルチプレックスＰＣＲでは、２個以上の標的核酸配列を検出し得る。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語の「融解温度決定領域」または「ＭＴＤＲ」は、ＰＴＯの５’末端に位置するポリヌクレオチド領域を意味する。ＭＴＤＲ中のポリヌクレオチドの性質および／または数によって、例えば、ＰＴＯフラグメントおよびＣＱＯを含む活性化タグ二本鎖の融解温度が決まる。同様に、ＭＴＤＲによって、例えば、ＰＴＯフラグメントおよびＣＱＯを含む活性化タグ二本鎖のハイブリダイゼーション温度が決まる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語の「融解温度」または「Ｔｍ」は、ＤＮＡ二本鎖の片方が解離して、単鎖になる温度を意味し、従って二本鎖の安定性を示す。Ｔｍに影響を与える主因子は、塩濃度、ＤＮＡ濃度、ｐＨおよび変性剤（フォルムアミドまたはＤＭＳＯなど）の存在である。配列、長さ、およびハイブリダイゼーション状態などのその他の影響も同様に重要な場合がある。配列のＧＣ含量および塩濃度は、プライマーＴｍのある程度の目安となる。本発明で参照する融解温度は、Ｋｉｂｂｅらにより２００７年に記載された最近接熱力学理論を使って計算される。対応するＴｍ計算機は、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ＯｌｉｇｏＣａｌｃ．ｈｔｍｌで入手可能である。本発明で示されるＴｍ値は、８００ｎｍのＣＱＯ（「プライマー」）および５０ｎｍの（Ｎａ＋）を基準にして計算されている。アデニン、チミン、シトシンおよび／またはグアニン類似体を含むオリゴの融解温度計算では、類似体はその対応する核酸により置き換えられる。融解温度を計算する場合には、オリゴ上のフルオロフォアおよびクエンチャーは、考慮する必要がない。融解温度の決定は、ＤＮＡ二本鎖を加熱することにより、または実質的に相補的である２個の単鎖化ＤＮＡ鎖を冷却する（ハイブリダイズする）ことにより、行い得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語の「変性」は、ＤＮＡの相補的塩基間の水素結合を破壊し、単鎖になることによる解離である。それはまた、ＰＣＲ反応サイクルイベントも意味し、例えば、反応系を９０〜１００℃で３〜２４０秒間加熱することを含んでよい。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語の「すぐに使用できるペレット」は、本発明の少なくとも１個のＰＴＯおよび／または少なくとも１個のＣＱＯを含む実質的に水不含組成物を意味する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語の「バックグラウンド融解曲線生成」は、融解曲線分析中のバックグラウンドシグナルを意味する。バックグラウンドシグナルは、ＰＴＯ上の少なくとも１個のフルオロフォアのシグナルが、少なくとも１個のＰＴＯのクエンチャーにより完全にクエンチされない場合に、発生する可能性がある。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語の「ＴＩＮＡ」は、ねじれたインターカレーティング核酸を意味し、米国特許第９，１０２，９３７号に記載のような一群の核酸インターカレーティング分子である。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語の「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は、修飾ＲＮＡヌクレオチドを意味する。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分が２’酸素および４’炭素を連結する追加のブリッジで修飾される。ブリッジは、３’内部（Ｎｏｒｔｈ）配座中のリボースを「固定」し、これは、Ａ型二本鎖中でよく認められる。ＬＮＡヌクレオチドは、必要に応じ、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合し、ＤＮＡまたはＲＮＡにワトソン−クリック塩基対合則に従って、ハイブリダイズできる。このようなオリゴマーは化学的に合成され、市販品として入手される。ロックドリボース配座は、塩基スタッキングおよび主鎖の予備組織化を強化する。これにより、二本鎖の熱安定性が高められ、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性が著しく高められる。ＬＮＡおよびその合成方法は、当業者には既知であり、また、例えば、欧州特許第１０１５４６９号および同第１０１５４６９号に記載されている。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語の「逆相補的な」は、それの逆相補配列である別の核酸配列にハイブリダイズできる核酸配列を意味する。例えば、配列５’−Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４．．．Ｎｘ−３’の逆相補配列は、５’−Ｎｘ’．．．Ｎ４’Ｎ３’Ｎ２’Ｎ１’−３’であり、ここで、Ｎｘ’、Ｎ４’、Ｎ３’、Ｎ２’、Ｎ１’は、それぞれＮｘ、Ｎ４、Ｎ３、Ｎ２、Ｎ１に対する相補的なヌクレオチドを示す。
【００４５】
標的の検出
本発明は、蛍光標識当たり複数の標的核酸の同時検出を可能とする新規デュアルクエンチングアッセイに関する。試料中の複数の標的核酸配列の存在は、複数のタグ二本鎖の形成をもたらし、これらは、タグ二本鎖フラグメント融解温度および／またはハイブリダイゼーション温度の差異に基づいて識別することができる。タグ二本鎖は、ハイブリダイズしたＰＴＯおよびＣＱＯを含む。それぞれの活性化タグ二本鎖フラグメントが溶解すると、ＰＴＯの標識からシグナルが得られる。したがって、特定の温度でのシグナルは、ＰＴＯに特異的な標的配列の存在を示す。それぞれの活性化タグ二本鎖フラグメントがハイブリダイズすると、ＰＴＯの標識からシグナルがクエンチされる。したがって、特定の温度でのクエンチされたシグナルは、ＰＴＯに特異的な標的配列の存在を示す。本発明の一般的概念を図１に示す。本発明は、１）ＰＴＯターゲティング部分による、標的核酸配列に対する配列特異的ハイブリダイゼーションおよび２）標的配列の上流へのオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ伸長のヌクレアーゼ活性による、標的シグナル検出に必要な活性化タグ二本鎖フラグメントの配列特異的酵素的放出、の組合せにより擬陽性シグナルを防止する。活性化タグ二本鎖フラグメントの存在を介したこの標的核酸配列の間接的測定は、優れた精度を確保し、擬陽性の問題を克服する。単一ＣＱＯが、多くのＰＴＯおよび／または多くのＰＴＯ群にハイブリダイズしてよい。したがって、本発明は、単一ＣＱＯを利用した、１個以上の、このような複数の、核酸の検出に関する。
【００４６】
融解温度は、複数の標的核酸配列の特定を仲介した。
特有のＭＴＤＲを有する数個のＰＴＯの検出のための１個のＣＱＯの使用により、より簡単なアッセイ装置が得られ、これにより、フルオロフォア当たり（例えば、ＰＴＯ群当たり）数個の標的核酸配列が検出できる。１個のフルオロフォアを使って識別可能なＰＴＯ群中のＰＴＯの数は、活性化タグ二本鎖フラグメントの融解時に蛍光タグのシグナルの検出に使用される分析機器の感度に依存する。例として提供された簡単な装置で、１個のＣＱＯを使ってＰＴＯ群の内の少なくとも３個のＰＴＯを特定し得る。したがって、２個の異なるフルオロフォアを有する２個のＰＴＯ群を使って、１回の反応で少なくとも６個のＰＴＯの検出を促進し得る。それぞれのＰＴＯは、標的核酸配列の存在を示す。特定される標的の数は、異なる蛍光タグを有する３個以上のＰＴＯ群を使うことにより、さらに増やし得る。単一ＣＱＯは言うまでもなく、３個以上、例えば、３個、４個またはそれを超えるＰＴＯにハイブリダイズ可能である。ＰＴＯ群が、２、３、４、５、６、７またはそれを超えるＰＴＯを含んでもよく、単一ＣＱＯを使って、これらのＰＴＯのそれぞれを検出してもよい。同時にその他のＰＴＯ群（異なるフルオロフォアを有するＰＴＯ）を同じＣＱＯで同様に検出し得る。このようにして、単一ＣＱＯを使って複数の標的を検出し得る。ある実施形態では、単一ＣＱＯは、このように、２、４、６、８、１０、１５、２０、３０、４０、５０、またはそれを超えるＰＴＯを検出可能であり、したがって、このアッセイにより対応する数の標的核酸を検出できる。
【００４７】
本発明のデュアルクエンチングアッセイの装置は、標的核酸のマルチプレックス検出のための簡単で信頼性の高いアッセイをもたらす。本発明の簡単なアッセイは、多くの用途を有する。本発明のアッセイの非包括的用途リストは、下記であってよい。
・ヒトおよび／または獣医学的診断のための本発明の方法の使用。対象由来の身体試料中の、例えば、病原体、または癌遺伝子もしくはミクロサテライトなどの少なくとも１種の微生物からの標的核酸の臨床的識別および／または定量化。
・環境監視のための本発明の方法の使用。例えば、任意の試料、例えば、水試料中の少なくとも１種の（微）生物からの標的核酸の識別および／または定量化。
・食物および／または餌の品質および安全性判定、例えば、餌および／または飲料試料などの食品の任意の試料中の少なくとも１種の生物由来の標的核酸の識別および／または定量化のための本発明の方法の使用。
・科学研究のための本発明の方法の使用。
【００４８】
本発明の主要態様は、標的核酸配列の検出方法に関し、該方法は、
ステップ（ａ）標的核酸配列にＰＴＯ（プロービングおよびタギングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む融解温度決定領域（ＭＴＤＲ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含むステップと、
ステップ（ｂ）前述のＰＴＯにＣＱＯ（キャプチャリングおよびクエンチングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、ＣＱＯが、（ｉ）ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、ＰＴＯのＭＴＤＲがＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成するように構成されるステップと、
ステップ（ｃ）タグ二本鎖をヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップであって、タグ二本鎖が標的核酸配列にハイブリダイズする際に、ヌクレアーゼ活性を有する酵素がタグ二本鎖の開裂を誘導し、それにより、ＣＱＯのキャプチャリング部分にハイブリダイズしたＭＴＤＲおよび少なくとも１個のフルオロフォアを含むＰＴＯフラグメントを含む活性化タグ二本鎖フラグメントが放出されるステップと、
ステップ（ｄ）前述の活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得るステップと、
ステップ（ｅ）少なくとも１個のフルオロフォアからのシグナルを測定することにより活性化タグ二本鎖フラグメントを検出するステップであって、シグナルが標的核酸配列の存在を示すステップと、を含む。
【００４９】
本明細書のいずれかの実施形態の方法のステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、ＰＣＲ反応の一部を形成してよい。標的配列を増幅する一組のオリゴヌクレオチドプライマーが添加される。エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが存在するために、この増幅により、活性化ＰＴＯまたは活性化タグ二本鎖の放出が起こる。用語の活性化は、ＰＴＯ上にクエンチャーが存在しないことに関する。活性化ＰＴＯまたは活性化タグ二本鎖の全ての存在は、記録され／検出され得る。ＰＣＲ反応がｑＰＣＲ反応の場合には、活性化ＰＴＯまたは活性化タグ二本鎖の量が定量され得る。オリゴヌクレオチドプライマー対は、前述の標的核酸に相補的で、前述の標的核酸に相補的な第１の伸長産物の合成を刺激する第１のプライマー、および前述の第１の伸長産物に相補的で、第２の伸長産物の合成を刺激する第２のプライマーを含む。ＰＴＯは、標的ヌクレオチド配列、特に増幅産物にハイブリダイズし得る。
【００５０】
ある実施形態では、活性化ＰＴＯおよび／または活性化タグ二本鎖の存在が検出される。別の実施形態では、活性化ＰＴＯおよび／または活性化タグ二本鎖の量が定量される。活性化ＰＴＯおよび／または活性化タグ二本鎖の存在の検出および／または定量化は、活性化ＰＴＯおよび／または活性化タグ二本鎖が形成された後で組み込まれる任意のステップであってよい。
【００５１】
ステップ（ｄ）および（ｅ）は、融解アッセイの一部を形成し、標的の存在および／または非存在が、活性化タグ二本鎖のＴｍに基づいて判定される。融解アッセイは、ＰＣＲ装置中で実行してよい。
【００５２】
ステップ（ａ）および（ｂ）は、任意の順序で行ってよい。したがって、本発明のある実施形態では、本明細書で記載の方法は、
ステップ（ｂ）ＰＴＯ（プロービングおよびタギングオリゴヌクレオチド）にＣＱＯ（キャプチャリングおよびクエンチングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む融解温度決定領域（ＭＴＤＲ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含み、ＣＱＯが、（ｉ）ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、ＰＴＯのＭＴＤＲがＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成するように構成されるステップと、
ステップ（ａ）標的核酸配列にタグ二本鎖のＰＴＯをハイブリダイズするステップと、
ステップ（ｃ）タグ二本鎖をヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップであって、タグ二本鎖が標的核酸配列にハイブリダイズする際に、ヌクレアーゼ活性を有する酵素がタグ二本鎖の開裂を誘導し、それにより、ＣＱＯのキャプチャリング部分にハイブリダイズしたＭＴＤＲおよび少なくとも１個のフルオロフォアを含むＰＴＯフラグメントを含む活性化タグ二本鎖フラグメントが放出されるステップと、
ステップ（ｄ）前述の活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得るステップと、
ステップ（ｅ）少なくとも１個のフルオロフォアからのシグナルを測定することにより活性化タグ二本鎖フラグメントを検出するステップであって、シグナルが標的核酸配列の存在を示すステップと、を含む。
【００５３】
またある実施形態では、ステップ（ｂ）および（ｃ）は、逆順で行われる。したがって、本発明のある実施形態では、本明細書で記載の方法は、
ステップ（ａ）標的核酸配列にＰＴＯ（プロービングおよびタギングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む融解温度決定領域（ＭＴＤＲ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含むステップと、
ステップ（ｃ）ハイブリダイズされたＰＴＯをヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップであって、ＰＴＯが標的核酸配列にハイブリダイズする際に、ヌクレアーゼ活性を有する酵素がＰＴＯの開裂を誘導し、それにより、ＭＴＤＲおよび少なくとも１個のフルオロフォアを含む活性化ＰＴＯフラグメントが放出されるステップと、
ステップ（ｂ）前述の活性化ＰＴＯにＣＱＯ（キャプチャリングおよびクエンチングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、ＣＱＯが、（ｉ）ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、ＰＴＯのＭＴＤＲがＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズして活性化タグ二本鎖を形成するように構成されるステップと、
ステップ（ｄ）前述の活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得るステップと、
ステップ（ｅ）少なくとも１個のフルオロフォアからのシグナルを測定することにより活性化タグ二本鎖フラグメントを検出するステップであって、シグナルが標的核酸配列の存在を示すステップと、を含む。
【００５４】
全てのアッセイでは、ステップは繰り返されてもよい。特に、種々のアッセイに対し上記で示した順序のステップ（ａ）および（ｃ）は、１回または複数回繰り返してよい。繰り返しの数は、ＰＣＲ反応で通常実施される通りであってよい。
【００５５】
タグ二本鎖がこの方法のステップ（ｄ）で融解する温度は記録される。したがって、本発明のある実施形態では、ステップ（ｄ）は、
ステップ（ｄ）前述の活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得て、活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度を記録するステップを含む。
【００５６】
ある実施形態では、上記方法は、ステップ（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｃ）、（ａ）〜（ｄ）および／または（ａ）〜（ｅ）を繰り返し、繰り返すサイクル間で変性を行うことをさらに含む。したがって、ある実施形態では、ステップ（ｂ）から始め、ステップ（ｂ）〜（ａ）、（ｂ）〜（ｃ）、および／または（ｂ）から（ｅ）を繰り返し、繰り返しサイクル間で変性を行うということになる。別の実施形態では、ステップが１個の反応槽内で実施される、または（ａ）〜（ｅ）または（ｂ）〜（ｅ）のいくつかのステップが１つまたは複数の別の反応槽中で実施される。ある実施形態では、ステップ（ａ）、（ｃ）および（ｂ）から初め、ステップ（ａ）〜（ｃ）、（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｄ）および／または（ａ）〜（ｅ）を繰り返し、繰り返しサイクル間で変性を行うことにより、ステップを繰り返し得る。
【００５７】
全ての方法のさらなる実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が同時に、またはほぼ同時に行われ、および／またはステップ（ｄ）および（ｅ）が同時に、またはほぼ同時に行われる。
【００５８】
２個の標的配列の検出を示す非限定的例は、
１）ターゲティング部分＃１、および融解温度が５０℃になるように構成されたＭＴＤＲ＃１を含むＰＴＯ＃１であって、標的核酸配列＃１にハイブリダイズできるＰＴＯ＃１と、
２）ターゲティング部分＃２、および融解温度が６０℃になるように構成されているＭＴＤＲ＃２を含むＰＴＯ＃２であって、標的核酸配列＃２にハイブリダイズできるＰＴＯ＃２と、
３）上記で本明細書に記載のように、ＭＴＤＲ＃１およびＭＴＤＲ＃２にハイブリダイズするように構成されているＣＱＯと、を含む混合物であってよい。
【００５９】
標的核酸配列＃１および配列＃２の存在下で、本発明の方法は、ＣＱＯがＰＴＯ＃１のＭＴＤＲ＃１にハイブリダイズする活性化タグ二本鎖フラグメント＃１、およびＣＱＯがＰＴＯ＃２のＭＴＤＲ＃２にハイブリダイズする活性化タグ二本鎖フラグメント＃２をもたらす。一定の温度範囲にわたり、活性化タグ二本鎖フラグメント＃１およびタグ二本鎖フラグメント＃２を含む混合物を融解する場合、温度が５０℃に到達すると第１のシグナルが生成され、温度が６０℃に到達すると第２のシグナルが生成される。この単純化した例では、第１のシグナル（５０℃での）は、標的核酸配列＃１の存在を示し、第２のシグナルは、標的核酸配列＃２の存在を示す。したがって、１個のフルオロフォアを使って、少なくとも２個の異なる標的を検出することが可能である。当業者なら、本発明の方法により、どのようにして多数の標的を特定し得るかを容易に理解することができる。
【００６０】
本発明は、少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも一組の相互作用標識を含む少なくとも１個のタグ二本鎖またはＤＮＡ二本鎖をさらに含んでよい。これは、例えば、分析機器のＴｍを較正するためのコントロール試料として使用してよい。オリゴヌクレオチドのＴｍは、例えば、塩濃度、ＤＮＡ濃度、ｐＨおよび変性剤（フォルムアミドまたはＤＭＳＯなど）の存在に応じて変化してよい。分析される試料が、変化する、すなわち、複数の塩濃度を含む場合、コントロール試料を含めるのが望ましいであろう。ある実施形態では、本明細書で記載の方法は、コントロール試料および／またはコントロールタグ二本鎖を分析することをさらに含む。別の実施形態では、本明細書で記載の方法は、コントロール試料および／またはコントロールタグ二本鎖を分析し、分析機器のＴｍ出力を較正することをさらに含む。したがって、標的配列の非存在下では、本方法は、ＰＴＯ上のクエンチャーの除去による活性化がなされていないＰＴＯおよびタグ二本鎖の存在を検出するということになる。当業者ならわかるように、本明細書で開示のようにアッセイを実施している場合、ネガティブコントロール（標的が存在しない）およびポジティブコントロール（標的の存在）を含めてよい。コントロールを使ってアッセイを較正してよい。ゲノムＤＮＡの存在のための市販のコントロールの例は、ＶａｌｉｄＰｒｉｍｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｔａａ．ｃｏｍ／ｗｐ−ｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１２／１０／ＴＡＴＡＡ−Ｍａｎｕａｌ  ＶａｌｉｄＰｒｉｍｅ  Ｐｒｏｂｅ  ｖ０１  １．ｐｄｆである。
【００６１】
当業者に知られているように、二本鎖の融解温度は通常、配列の性質には依存せず、むしろ、個々のヌクレオチドの相対量に依存する。当業者はまた、反応を妨害する可能性のある二次または三次構造を生成し得る特定の配列を避けることを知っている。実施例に示すように、本方法は異なる配列を有するＭＴＤＲを取り扱う。
【００６２】
ＭＴＤＲは、標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む。このような文脈における用語の「非相補的」は、当業者により、通常のＰＣＲ条件および／またはストリンジェントな条件下で、本質的に非相補的な、すなわち、本質的に標的核酸配列にハイブリダイズできない配列を意味すると理解されよう。
【００６３】
同様に、用語の「実質的に標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列」は、ポリメラーゼによる伸長が効率的である、あるいは実施可能であるように、標的核酸配列にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を意味する。当業者には明らかであるように、ポリメラーゼによる伸長が可能ではないような程度にまで標的核酸配列に対するヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを妨げないという条件下であれば、いくつかのミスマッチがあってもよい。
【００６４】
ＰＴＯ
特定されるべきそれぞれの標的核酸配列に対して、それぞれの標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたＰＴＯが得られる。それぞれのＰＴＯは、同じまたは類似のフルオロフォアを共有するＰＴＯ中で特有のＭＴＤＲを有する。ＰＴＯのＭＴＤＲは、その活性化タグ二本鎖フラグメント融解温度に対して決め手となるものである。それぞれのタグ二本鎖フラグメントは、特有のＭＴＤＲを有するＰＴＯフラグメントおよび少なくとも１個のフルオロフォアを含み、ＰＴＯフラグメントのＭＴＤＲが、ＣＱＯのキャプチャリング部分にハイブリダイズされる。特有のＭＴＤＲとは、タグ二本鎖および／またはタグ二本鎖フラグメントに付与する融解温度が特有であるＭＴＤＲを意味する。特有のＭＴＤＲは、したがって、ＰＴＯの群内で特有である。したがって、特有のＭＴＤＲを、それぞれ異なる標識／フルオロフォアを有する数個のＰＴＯで使用してよい。
【００６５】
ある実施形態では、ターゲティング部分は、ＰＴＯの５’末端に位置する。別の実施形態では、ＭＴＤＲはＰＴＯの３’末端に位置する。
【００６６】
別の実施形態では、ＰＴＯは非核酸分子および／または核酸類似体を含む。
【００６７】
融解温度決定領域（ＭＴＤＲ）
活性化タグ二本鎖フラグメントを形成するＰＴＯのＭＴＤＲの長さによって、前述のタグ二本鎖フラグメントの融解温度が変化する。短いＭＴＤＲ領域（例えば、１０個の核酸より短い）の使用により、低融解温度が得られるであろう。発明者らは、種々の長さ、例えば、約１６個〜約４０個の核酸のＭＴＤＲを使用した。しかし、本発明のＭＴＤＲ領域は、５〜１００個の核酸および／または核酸類似体、例えば、１０〜８０個、例えば、１５〜７０個、好ましくは、例えば、１３〜６０個、より好ましくは、例えば、１６〜３９個の核酸および／または核酸類似体を含んでよい。したがって、本発明のある実施形態では、ＭＴＤＲは、５〜５０個の核酸および／または核酸類似体、例えば、１０〜４０個、例えば、１３〜３０個の核酸および／または核酸類似体を含む。長いＭＴＤＲ領域（例えば、５０個より多い核酸）を使う場合には、ＭＴＤＲそれ自体内の二次構造形成を避けるように注意する必要がある。好ましい実施形態では、本発明のＭＴＤＲ領域は、ロックド核酸（ＬＮＡ）などの１３〜２５個の核酸および／または核酸類似体を含む。核酸類似体の具体例としては、塩基対の組み合わせとして次の塩基：ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ、ｉｓｏ−ｄＣ／ｉｓｏ−ｄＧが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
ある実施形態では、ステップ（ａ）は、標的核酸配列にＰＴＯをハイブリダイズすることを含み、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含むＭＴＤＲであって、５〜５０核酸および／または核酸類似体、例えば、１０〜４０、例えば、１３〜３０核酸および／または核酸類似体を含むＭＴＤＲ、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含み、ＰＴＯのターゲティング部分が、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成され、ＰＴＯのＭＴＤＲが標的核酸配列とハイブリダイズするようには構成されない。
【００６９】
本発明の１つの利点は、１個のＣＱＯが特有のＰＴＯにより複数の標的配列を検出し得ることである。検出されるそれぞれの標的核酸配列に対し、同じまたは類似の蛍光標識を有するＰＴＯに対して特有のＭＴＤＲ配列を有するＰＴＯが設計され、これらの異なるＰＴＯは、それらが類似のおよび／または同一の蛍光標識を含む場合、ＰＴＯ群と呼んでよい。それぞれのＰＴＯ群は、単一のＣＱＯにより検出し得、活性化タグ二本鎖フラグメントを形成、この活性化タグ二本鎖フラグメントは、その群中のそれぞれのＰＴＯ上の特有のＭＴＤＲの結果として融解温度の差異に基づいて識別される。したがって、単一蛍光標識のみを使って検出できる標的核酸配列の数が増やせる。
【００７０】
別の実施形態では、それぞれの識別可能な蛍光標識に対し、本明細書で記載の方法は、少なくとも１個の、例えば、少なくとも２個の、例えば、少なくとも３個の、例えば、少なくとも４個の、例えば、少なくとも５個の、例えば、少なくとも１０個の標的核酸配列を相互から、それらそれぞれのタグ二本鎖フラグメントの融解温度の差異に基づいて識別でき、それぞれのタグ二本鎖フラグメントの融解温度は、ＭＴＤＲの長さと組成により決まる。別の実施形態では、本明細書に記載のＭＴＤＲの長さおよび／または組成により、本明細書で上記の活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度が決まる。活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度は、任意の温度であってよいが、室温を超える温度が好ましい。ＰＣＲ反応は、通常、１００℃近傍の沸点を有する緩衝水溶液中で行われる。したがって、ある実施形態では、本明細書で記載の活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度は、３０℃〜１００℃、例えば、３５℃〜９０℃、例えば、４０℃〜７５℃、例えば、４５℃〜７５℃である。好ましい実施形態では、活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度は、３５℃〜９０℃、例えば、５０℃〜８５℃である。さらなる実施形態では、タグ二本鎖フラグメントを形成するＰＴＯのＭＴＤＲは、３０℃〜１００℃、例えば、３５℃〜８０℃、例えば、４０℃〜７５℃、例えば、４５℃〜７５℃の活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度が得られるように構成される。好ましい実施形態では、タグ二本鎖フラグメントを形成するＰＴＯのＭＴＤＲは、５０℃〜７５℃、例えば、５０℃〜７０℃の融解温度が得られるように構成される。ＰＴＯ群のＭＴＤＲは、それらそれぞれの融解温度が容易に検出され、記録されるように選択されるのが好ましい。したがって、ＰＴＯ群のＭＴＤＲは、それぞれの融解温度が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０℃、またはそれを超える温度だけ異なってよい。
【００７１】
ある実施形態では、ステップ（ａ）は、標的核酸配列にＰＴＯをハイブリダイズすることを含み、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含むＭＴＤＲであって、５０℃〜７５℃、例えば、５０℃〜７０℃の融解温度が得られるように構成されたＭＴＤＲ、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含み、ＰＴＯのターゲティング部分が、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成され、ＰＴＯのＭＴＤＲが標的核酸配列とハイブリダイズするようには構成されない。
【００７２】
リンカー分子
ＰＴＯは、ターゲティング部分とＰＴＯのＭＴＤＲとの間にリンカー分子をさらに含んでよく、これは、標的核酸配列およびＣＱＯに非相補的である。したがって、ある実施形態では、本明細書に記載のＰＴＯは、ターゲティング部分とＰＴＯのＭＴＤＲとの間にリンカー分子をさらに含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、リンカーは、標的核酸配列およびＣＱＯに非相補的なリンカーであり、リンカー分子は、１〜２００ヌクレオチド、例えば、１〜５０ヌクレオチド、例えば、１〜３０ヌクレオチド、例えば、２〜２０ヌクレオチド、例えば、４〜１４ヌクレオチド、例えば、６〜１３ヌクレオチド、例えば、８〜１２ヌクレオチド、例えば、９〜１２ヌクレオチド、例えば、１１ヌクレオチドを含む。リンカー分子は、非核酸、例えば、非天然またはその他の有機化合物、例えば、Ｃ１〜Ｃ４０アルカン、例えば、Ｃ６炭素鎖などの炭素鎖を含んでもよく、またはこれらから構成されてもよい。ある実施形態では、リンカーは、核酸および非核酸の混合物を含む。別の実施形態では、リンカーは任意の有機化合物を含む。リンカーはグリコールリンカー、または当業者に既知の任意のリンカーであってよい。非核酸の利点は、このようなリンカーがＰＴＯに沿ったポリメラーゼの進行を停止させることであろう。
【００７４】
ブロック基
ＰＴＯおよび／またはＣＱＯの３’末端を、「ブロック」して、ＰＣＲ反応中にその伸長を防止するのが好ましい。ブロッキングは、従来の方法により実現してよい。例えば、ブロッキングは、ヌクレオチドの最後の３’−ヒドロキシル基に、ビオチン、リン酸基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエートおよび／またはアルカンジオールなどの化学部分を付加することにより実施してよい。あるいは、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去することにより、または３’−ヒドロキシル基を含まないヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチドを使用することにより、実施してもよい。したがって、ある実施形態では、ＰＴＯおよび／またはＣＱＯは、３’末端にブロック基をさらに含む。別の実施形態では、前述のブロック基は、ビオチン、リン酸基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、および／またはアルカンジオールからなる群から選択される。別の実施形態では、ＰＴＯおよび／またはＣＱＯの３’末端の伸長は、ＰＴＯおよび／またはＣＱＯの最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去することにより、または３’−ヒドロキシル基を含まないヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチドを使うことにより、防止される。ＣＱＯ上のクエンチャーは、ブロック基として機能し得る。ある実施形態では、ＣＱＯ上の前述のブロック基はクエンチャーである。別の実施形態では、ＣＱＯ上の前述のブロック基はＣＱＯの３’末端に位置するクエンチャーである。
【００７５】
ＰＴＯはクリックケミストリーにより合成してもよい。特異的ＭＴＤＲは複数のアッセイに使用してよいが、ＰＴＯのターゲティング部分は、測定される標的に応じて変わる。これらの２個の成分および任意のリンカーは、したがって、当業者に知られているように、クリックケミストリーにより連結されてよい。また、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ（２００８）５２（１）：４７−４８、も参照されたい。
【００７６】
ＣＱＯ
本発明のある実施形態では、それぞれのＣＱＯは、少なくとも１個の、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８または９個、例えば、少なくとも１０個の標的核酸配列、例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または５０個を超える標的核酸の特定に、本方法で使われる。さらなる実施形態では、２個のＣＱＯが多数の標的配列を特定するために使用され、それぞれのＣＱＯは、少なくとも１個の、例えば、少なくとも２、３、４、５個の、例えば、少なくとも１０個またはそれを超える標的核酸配列を特定するために使用される。さらなる実施形態では、３個のＣＱＯ、例えば、少なくとも４、５、６、７個、例えば、少なくとも８個が多数の標的配列を特定するために使用され、それぞれのＣＱＯは、少なくとも１個の、例えば、少なくとも２、３、４、５個の、例えば、少なくとも１０個の標的核酸配列を特定するために使用される。
【００７７】
ある実施形態では、ＣＱＯおよび必要に応じてヌクレアーゼ活性を有する酵素が、懸濁液または溶液として存在する。ある実施形態では、少なくとも１個のＣＱＯおよび必要に応じてヌクレアーゼ活性を有する酵素が、すぐに使用できる懸濁液または溶液として存在する。すぐに使用できることは、ＰＣＲ反応を行うための全ての条件が満たされている、すなわち、必要とする塩、ｐＨなどが存在することを意味する。ある実施形態では、少なくとも１個のＣＱＯおよび必要に応じてヌクレアーゼ活性を有する酵素が、すぐに使用できるペレットとして存在する。ある実施形態では、少なくとも１個のＰＴＯおよび少なくとも１個のＣＱＯならびに必要に応じて本発明のヌクレアーゼ活性を有する酵素が、懸濁液または溶液として存在する。ある実施形態では、少なくとも１個のＰＴＯおよび少なくとも１個のＣＱＯならびに必要に応じて本発明のヌクレアーゼ活性を有する酵素が、すぐに使用できる懸濁液または溶液として存在する。さらなる実施形態では、少なくとも１個のＰＴＯおよび少なくとも１個のＣＱＯならびに必要に応じてヌクレアーゼ活性を有する酵素が、すぐに使用できるペレットとして存在する。ある実施形態では、すぐに使用できるペレットは、例えば、ＰＣＲ反応を行うための塩および／またはヌクレオチドを含む実質的に水不含組成物を含む。
【００７８】
別の実施形態では、ＣＱＯは非核酸分子を含む。
【００７９】
ある実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチド、すなわち、少なくとも１個のクエンチャーおよびキャプチャリング部分を含むＣＱＯに関し、ＣＱＯのキャプチャリング部分は、少なくとも１個、例えば、２個またはそれを超える本発明のＰＴＯにハイブリダイズするように構成され、単一ＣＱＯが多数の標的核酸配列の検出に使用され得る。ＣＱＯは、ＰＴＯのＭＴＤＲ領域にハイブリダイズする。ある実施形態では、ＣＱＯは、ＰＴＯのターゲティング部分におよび／またはＰＴＯの任意のリンカーにハイブリダイズしない。
【００８０】
ＣＱＯは、本アッセイにしたがって使用するためのものである。
【００８１】
ＰＴＯおよびＣＱＯ融合
ＰＴＯおよびＣＱＯは、連結されてよく、また、ヘアピン構造を可逆的に形成するように構成されてよく、ＰＴＯのＭＴＤＲおよびＣＱＯのキャプチャリング部分がハイブリダイズし、それにより、ヘアピン構造が得られる。図８ａは、ＰＴＯおよびＣＱＯがどのようにしてヘアピン構造を生じ得るかの例を示す。ある実施形態では、ＰＴＯおよびＣＱＯは同じオリゴヌクレオチド上に存在する。ある実施形態では、ＰＴＯおよびＣＱＯは連結されている。別の実施形態では、ＰＴＯおよびＣＱＯは、同じオリゴヌクレオチド上に位置し、ＰＴＯのＭＴＤＲおよびＣＱＯのキャプチャリング部分はヘアピン構造を可逆的に形成するように構成される。
【００８２】
それぞれのＰＴＯおよび／またはＣＱＯの合計長さは、変わってもよい。一実施形態では、ＰＴＯの合計長さは、１０〜５００ヌクレオチド、例えば、２０〜１００、例えば、３０〜７０ヌクレオチドである。別の実施形態では、ＣＱＯの合計長さは、１０〜５００ヌクレオチドまたは塩基対、例えば、１５〜１００、例えば、２０〜５０ヌクレオチドまたは塩基対である。ＰＴＯおよびＣＱＯが融合または連結されている場合には、融合産物の合計長さは、２０〜６００ヌクレオチドであってよい。別の実施形態では、ＰＴＯおよび／またはＣＱＯは非天然塩基を含む。人工核酸（またはゼノ核酸、ＸＮＡ）の例には、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡおよびＴＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物類およびそれらの使用は、当業者には既知である。非天然塩基の具体例としては、塩基対の組み合わせとして次の塩基：ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ、ｉｓｏ−ｄＣ／ｉｓｏ−ｄＧが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、ＰＴＯおよび／またはＣＱＯは非核酸分子を含む。
【００８３】
フルオロフォアおよびクエンチャー
発明者らは、ＰＴＯ上に位置するフルオロフォア（単一または複数）とＣＱＯ上に位置するクエンチャー（単一または複数）との距離が、バックグラウンド融解曲線生成に影響を与えることを示した。一実施形態では、ＰＴＯフルオロフォア分子とＣＱＯクエンチャー分子との距離は、６〜６０塩基対、例えば、１０〜３５塩基対、例えば、１５〜２５塩基対である。別の実施形態では、ＰＴＯのフルオロフォアおよびＣＱＯのクエンチャー（最近接クエンチャー）は、１〜４０ヌクレオチドまたは塩基対、例えば、６〜３５、１０〜３０、１５〜２５、例えば、約１８ヌクレオチドの距離で離れている。
【００８４】
ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアと、ＣＱＯの少なくとも１個の最近接クエンチャーとの間の距離は、ＰＴＯおよびＣＱＯがハイブリダイズされておらず、シグナルがクエンチされていない場合に、クエンチングによる活性化タグ二本鎖と融解タグ二本鎖との間のシグナルの識別を可能とするのに十分であるのが好ましい。したがって、バックグラウンドシグナルが真のポジティブシグナルより低く、バックグラウンドシグナルとポジティブシグナルとの間の識別が可能となる限りにおいて、ある程度のバックグラウンドシグナルが発生してよい。同様に、当業者ならわかっているように、フルオロフォアおよびクエンチャーの選択も同様に、バックグラウンドシグナルおよびポジティブシグナルが識別できるようにすべきである。
【００８５】
ある実施形態では、本発明のステップ（ｂ）は、ＰＴＯおよびＣＱＯをハイブリダイズすることを含み、ＣＱＯが、（ｉ）ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、ＰＴＯのＭＴＤＲがＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成するように構成され、ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアおよびＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーが、１〜４０ヌクレオチドまたは塩基対、例えば、６〜３５、１０〜３０、１５〜２５、例えば、約２０ヌクレオチドの距離だけ離れている。
【００８６】
ある実施形態では、本発明の少なくとも一組の相互作用標識が、フルオロフォアおよびクエンチャーを含み、前述のフルオロフォアからの蛍光発光が前述のクエンチャーによりクエンチされる。一組の相互作用標識が適合性のあるフルオロフォアおよびクエンチャーを有するように構成される。別の実施形態では、少なくとも一組の相互作用標識が、１、２、３、４、５、６、７組またはそれを超える組み合わせの相互作用標識を含む。さらなる実施形態では、少なくとも２群のＰＴＯおよびＣＱＯが、少なくとも２個の標的核酸配列の検出に使用され、それぞれのＰＴＯ群およびＣＱＯ群が、適合性のあるフルオロフォアおよびクエンチャーを有するように構成される。別の実施形態では、少なくとも一組の相互作用標識間の主要相互作用が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により媒介される。
【００８７】
発明者らはまた、少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含むＰＴＯの相互作用標識の組み合わせが、望ましくないバックグラウンド融解曲線生成に影響を与えることも示した。ある実施形態では、ＰＴＯの相互作用標識の組み合わせは、１〜４０ヌクレオチドまたは塩基対、例えば、６〜３５、１０〜３０、１５〜２５、例えば、約２０ヌクレオチドの距離だけ離れている。ある実施形態では、本明細書で記載の方法のステップ（ａ）は、標的核酸配列にＰＴＯをハイブリダイズすることを含み、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含むＭＴＤＲ、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含み、少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーが、３．４Å〜１３６Å、例えば、２０．４Å〜１１９Å、３４Å〜１０２Å、５１Å〜８５Å、例えば、約６１．２Åの距離だけ離れており、ＰＴＯのターゲティング部分が、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成され、ＰＴＯのＭＴＤＲが標的核酸配列とハイブリダイズするようには構成されない。ある実施形態では、本明細書で記載の方法のステップ（ａ）は、標的核酸配列にＰＴＯをハイブリダイズすることを含み、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含むＭＴＤＲ、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含み、少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーが、１〜４０ヌクレオチドまたは塩基対、例えば、６〜３５、１０〜３０、１５〜２５、例えば、約１８ヌクレオチドの距離だけ離れており、ＰＴＯのターゲティング部分が、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成され、ＰＴＯのＭＴＤＲが標的核酸配列とハイブリダイズするようには構成されない。
【００８８】
ある実施形態では、ＰＴＯの相互作用標識の組み合わせは、ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアからの発光が、ＰＴＯの少なくとも１個のクエンチャーにより、およびＰＴＯおよびＣＱＯがハイブリダイズする場合、ＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーによりクエンチされるように配置される。別の実施形態では、ＰＴＯの相互作用標識の組み合わせは、ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアからの発光が、ＰＴＯの少なくとも１個のクエンチャーにより、およびＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーによりクエンチされるように配置され、ＰＴＯおよびＣＱＯがハイブリダイズした場合に、ＰＴＯの少なくとも１個のクエンチャーおよびＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーによるＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアのクエンチングのレベルが、実質的に類似している。好ましい実施形態では、ＰＴＯの相互作用標識の組み合わせは、ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアからの発光が、ＰＴＯの少なくとも１個のクエンチャーにより、およびＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーによりクエンチされるように配置され、ＰＴＯおよびＣＱＯがハイブリダイズする場合に、ＰＴＯの少なくとも１個のクエンチャーとＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアの距離と、ＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーとＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアの距離とが、実質的に類似している。さらなる実施形態では、ＰＴＯの相互作用標識の組み合わせは、ＰＴＯおよびＣＱＯがハイブリダイズする場合、ＰＴＯの少なくとも１個のクエンチャーによるＰＴＯの少なくとも１個のクエンチングのレベルが、ＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーによるクエンチングのレベルと実質的に類似している、かつ／またはそれより高くなるように配置される。別の実施形態では、ＰＴＯの相互作用標識の組み合わせは、ＰＴＯおよびＣＱＯがハイブリダイズする場合、ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアからＰＴＯの少なくとも１個のクエンチャーまでの距離が、ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアからＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーまでの距離と実質的に類似している、かつ／またはそれより短くなるように配置される。
【００８９】
オリゴヌクレオチドに結合可能な種々のフルオロフォアを本発明で使用してよい。ある実施形態では、本明細書で記載のＰＴＯは、少なくとも１個のフルオロフォアを含む。別の実施形態では、ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアは、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）またはこれらの組み合わせを含む群から選択される。別の実施形態では、本発明のＰＴＯは、２個以上のフルオロフォア、例えば、２、３、４、５、６、７個、および／または、例えば、８個のフルオロフォアを含む。ある実施形態では、本発明のＰＴＯは、２個以上の同じフルオロフォア、例えば、３、４、５、６、７個、および／または、例えば、８個の同じフルオロフォアを含む。別の実施形態では、本発明のＰＴＯは、２個以上の異なるフルオロフォア、例えば、３、４、５、６、７個、および／または、例えば、８個の異なるフルオロフォアを含む。
【００９０】
本明細書に記載のＰＴＯ上の少なくとも１個のフルオロフォアのクエンチングを促進にするために、ＰＴＯは少なくとも１個のクエンチャー分子を含む。オリゴヌクレオチドに結合可能な複数のクエンチャーを本発明で使用してよい。ＰＴＯの少なくとも１個のクエンチャーおよび少なくとも１個のフルオロフォアは、少なくとも一組の相互作用標識となるように構成される。ある実施形態では、本明細書で記載のＰＴＯは、少なくとも１個のクエンチャーを含む。別の実施形態では、ＰＴＯの少なくとも１個のクエンチャーは、ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアをクエンチするように構成される。別の実施形態では、ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアは、ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）１、ＢＨＱ２、およびＢＨＱ３、Ｃｏｓｍｉｃ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＵＳＡ製）、Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ  Ｂｉｏｎｅｅｒ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＥＢＱ）（例えば、Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ製）またはこれらの組み合わせを含む群から選択される。さらなる実施形態では、本発明のＰＴＯは、２個以上のクエンチャー、例えば、２、３、４、５、６、７個、および／または、例えば、８個のクエンチャーを含む。ある実施形態では、本発明のＰＴＯは、２個以上の同じクエンチャー、例えば、３、４、５、６、７個、および／または、例えば、８個の同じクエンチャーを含む。別の実施形態では、本発明のＰＴＯは、２個以上の異なるクエンチャー、例えば、３、４、５、６、７個、および／または、例えば、８個の異なるフルオロフォアを含む。
【００９１】
本明細書に記載のＰＴＯ上の少なくとも１個のフルオロフォアのクエンチングを促進にするために、ＣＱＯは少なくとも１個のクエンチャー分子を含む。オリゴヌクレオチドに結合可能なほとんどのクエンチャーを本発明で使用してよい。しかし、ＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーおよびＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアは、少なくとも一組の相互作用標識となるように構成されてよい。ある実施形態では、本明細書で記載のＣＱＯは、少なくとも１個のクエンチャーを含む。別の実施形態では、ＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーは、本明細書に記載のＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアをクエンチするように構成される。別の実施形態では、ＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーは、ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）１、ＢＨＱ２、およびＢＨＱ３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＵＳＡ製）を含む群から選択される。さらなる実施形態では、本発明のＣＱＯは、２個以上のクエンチャー、例えば、２、３、４、５、６、７個、および／または、例えば、８個のクエンチャーを含む。ある実施形態では、本発明のＣＱＯは、２個以上の同じクエンチャー、例えば、３、４、５、６、７個、および／または、例えば、８個のクエンチャーを含む。別の実施形態では、本発明のＣＱＯは、２個以上の異なるクエンチャー、例えば、３、４、５、６、７個、および／または、例えば、８個のフルオロフォアを含む。
【００９２】
本発明に有用なフルオロフォアには、当該技術分野において既知のいずれかの蛍光分子を含めてよい。フルオロフォアの例は、Ｃｙ２（商標）Ｃｆｆｌｆｉ、ＹＯ−ＰＲｎ（商標）−１（５０９）、ＹＤＹＯ（商標）−１（５０９）、Ｃａｌｒｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸ（商標）（５１９）、Ａｌｅｘａ（商標）（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１１０（５２０）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（商標）（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（商標）（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（商標）（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯ（商標）−ｌ（５３３）、ＴＯＴＯＩ（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３（商標）（５７０）、Ａｌｅｘａ（商標）５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ（商標）（５９０）、Ｃｙ３．５（ＴＭ）（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｒｉｍｓｏｎ（商標）（６１５）、Ａｌｅｘａ（商標）５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯ（商標）−３（６３１）、ＹＯＹＯ（商標）−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯ（商標）−３（６６０）、ＴＯＴ０３（６６０）、ＤｉＤＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５（商標）（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ５４０（５４４）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ５６０（５５９）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ５９０（５９１）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ６１０（６１０）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ６７０（７０５）およびＱｕａｓａｒ７０５（６１０）である。括弧中の数字は、ナノメートル単位の最大発光波長である。好ましい実施形態では、フルオロフォアは、ＦＡＭおよび／またはＴＥＴからなる群から選択される。広範囲の波長または特定の波長の蛍光をクエンチングできる非蛍光のｂｌａｃｋ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ分子を本発明で使用してよいことは、注目に値する。好ましい実施形態では、一組の相互作用標識は、ＦＡＭ／ＢＨＱである。その他の好適なフルオロフォア／クエンチャー対が、当技術分野において既知である。
【００９３】
ステップ（ａ）ＰＴＯの標的配列へのハイブリダイジング
本発明のステップ（ａ）は、本発明のＰＴＯの標的核酸へのハイブリダイゼーションに関する。ある実施形態では、本明細書で記載の方法のステップ（ａ）は、標的核酸配列へのＰＴＯのハイブリダイジングに関し、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含むＭＴＤＲ、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含み、ＰＴＯのターゲティング部分が、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成され、ＰＴＯのＭＴＤＲが標的核酸配列とハイブリダイズするようには構成されない。
【００９４】
ある実施形態では、ステップ（ａ）は、標的核酸配列へのＰＴＯのハイブリダイジングを含み、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含むＭＴＤＲ、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含み、ＰＴＯのターゲティング部分が、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成され、ＰＴＯのＭＴＤＲが標的核酸配列とハイブリダイズするようには構成されず、ＰＴＯは、１０〜５００ヌクレオチド、例えば、２０〜１００、例えば、３０〜７０ヌクレオチドまたは塩基対である。
【００９５】
本発明のＰＴＯおよびＣＱＯは、本発明の標的配列の添加の前に予混合されてよい。したがって、本発明のステップ（ｂ）のタグ二本鎖形成は、ＰＴＯの標的配列へのハイブリダイゼーションの前に形成されてよい。ある実施形態では、以下の通り、ステップ（ｂ）はステップ（ａ）の前に実施される；
（ｂ）ＰＴＯにＣＱＯ（キャプチャリングおよびクエンチングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む融解温度決定領域（ＭＴＤＲ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含み、ＰＴＯのターゲティング部分が、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成され、ＰＴＯのＭＴＤＲが標的核酸配列とハイブリダイズするようには構成されず、ＣＱＯが、（ｉ）ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、ＰＴＯのＭＴＤＲがＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成するように構成されるステップ、および
（ａ）標的核酸配列に前述のタグ二本鎖をハイブリダイズするステップ、
（ｃ）タグ二本鎖をヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップであって、タグ二本鎖が標的核酸配列にハイブリダイズする際に、ヌクレアーゼ活性を有する酵素がタグ二本鎖の開裂を誘導し、それにより、ＣＱＯのキャプチャリング部分にハイブリダイズしたＭＴＤＲおよび少なくとも１個のフルオロフォアを含むＰＴＯフラグメントを含む活性化タグ二本鎖フラグメントが放出されるステップ、
（ｄ）前述の活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得るステップ、および
（ｅ）少なくとも１個のフルオロフォアからのシグナルを測定することにより活性化タグ二本鎖フラグメントを検出するステップであって、シグナルが核酸混合物中の標的核酸配列の存在を示すステップ。
【００９６】
少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得るために、前述の活性化タグ二本鎖フラグメントは、ＭＴＤＲの少なくとも一組の相互作用標識中に含まれる少なくとも１個のクエンチャーを含まない。換言すれば、少なくとも一組の相互作用標識の少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーが、もはや相互作用しない場合にシグナルが得られる。
【００９７】
本発明のＰＴＯ、ＣＱＯおよび標的配列は、同時に混合されてもよい。ある実施形態では、本発明のステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、任意の順序で実施しても、または同時に実施してもよい。
【００９８】
上流および下流のオリゴヌクレオチド
標的核酸配列に対しＰＴＯの結合部位の上流および下流に位置する１対のＰＣＲプライマーの添加により、ＰＣＲアッセイの特異性が高められ、擬陽性ハイブリダイゼーションシグナルの回避が促進される。したがって、本発明は、標的核酸に相補的な上流プライマーおよび標的核酸上のＰＴＯ結合部位の下流にハイブリダイズし得る下流プライマーをさらに含んでよい。上流および下流のオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列のＰＴＯ結合部位と重なり合わないように構成される。上流および下流のプライマーは、標的核酸配列の２０００塩基対以内に位置してよい。一実施形態では、上流オリゴヌクレオチドおよび下流オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列のＰＴＯ結合部位から少なくとも１塩基対の位置に配置される。別の実施形態では、上流および／または下流オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列のＰＴＯ結合部位から１〜２０００塩基対の位置に配置される。上流および／または下流オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列から２０００塩基対（２ｋｂ）を超える位置に、標的核酸配列から、例えば、２．５ｋｂ、例えば、３ｋｂ、例えば、３．５ｋｂ、例えば、４ｋｂ、例えば、５ｋｂ、例えば、１０ｋｂ、例えば、２０ｋｂの位置に、配置されてよい。
【００９９】
汚染除去
反応槽の汚染除去をステップ（ａ）の前に行ってよい。したがって、ある実施形態では、ＵＮＧ処理ステップ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３８：５６９−５７５（２００５年４月））および／または変性ステップがステップ（ａ）に先立って使用される。当業者に既知のＲＮＡ汚染除去処理を適用してよい。ある実施形態では、汚染除去処理ステップおよび／または変性ステップがステップ（ａ）の前に行われる。
【０１００】
ステップ（ｂ）ＣＱＯのＰＴＯへのハイブリダイズによるタグ二本鎖の形成
本方法のステップ（ｂ）は、タグ二本鎖を形成する、ＰＴＯおよびＣＱＯのハイブリダイゼーションに関する。ある実施形態では、本方法のステップ（ｂ）は、前述のＰＴＯにＣＱＯをハイブリダイズすることを含み、ＣＱＯが、（ｉ）ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、ＰＴＯのＭＴＤＲがＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成するように構成される。
【０１０１】
以前記載したように、発明者らは、ＰＴＯ上に位置するフルオロフォア（単一または複数）とＣＱＯ上に位置するクエンチャー（単一または複数）との距離が、バックグラウンド融解曲線生成に影響を与えることを示した。
【０１０２】
ある実施形態では、本方法のステップ（ｂ）は、ＰＴＯおよびＣＱＯをハイブリダイズすることを含み、ＣＱＯが、（ｉ）ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、ＰＴＯのＭＴＤＲがＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成するように構成され、ＰＴＯ上の少なくとも１個のフルオロフォアとＣＱＯクエンチャー分子上の少なくとも１個のクエンチング分子との間の距離が、１〜６０塩基対、例えば、１０〜３５塩基対、例えば、１５〜２５塩基対、例えば、約１８塩基対である。
【０１０３】
ある実施形態では、本方法のステップ（ｂ）は、前述のＰＴＯにＣＱＯをハイブリダイズすることを含み、ＣＱＯが、（ｉ）ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアのクエンチングをするように構成された少なくとも１個のクエンチング分子を含み、ＰＴＯのＭＴＤＲがＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成する。
【０１０４】
ステップ（ｃ）活性化タグ二本鎖フラグメントの放出
本発明のステップ（ｃ）は、放出されたタグ二本鎖フラグメントを形成する、タグ二本鎖のヌクレアーゼ媒介開裂に関する。ある実施形態では、本発明のステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）からのタグ二本鎖をヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させることを含み、タグ二本鎖が標的核酸配列にハイブリダイズする際に、ヌクレアーゼ活性を有する酵素がタグ二本鎖の開裂を誘導し、それにより、ＣＱＯのキャプチャリング部分にハイブリダイズしたＭＴＤＲおよび少なくとも１個のフルオロフォアを含むＰＴＯフラグメントを含む活性化タグ二本鎖フラグメントが放出される。
【０１０５】
擬陽性シグナルを回避するために、活性化タグ二本鎖フラグメントがハイブリダイズされる場合に、ＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーが、ＰＴＯの少なくとも１個のフルオロフォアを可逆的にクエンチするように構成される。本方法のある実施形態では、ＣＱＯの少なくとも１個のクエンチャーが、活性化タグ二本鎖フラグメントの少なくとも１個のフルオロフォアを可逆的にクエンチするように構成される。上記で説明したように、ＣＱＯのクエンチャーおよびＰＴＯのフルオロフォアは、バックグラウンドシグナルおよびポジティブシグナルが識別できるように選択されるべきである。同様に、ＣＱＯのクエンチャーと、ＰＴＯのフルオロフォアの間の距離は、所望のシグナル識別が得られるように最適化される必要があろう。
【０１０６】
ヌクレアーゼ活性を有するいずれの酵素も、図１に示すタグ二本鎖の放出を誘導し得る。ある実施形態では、上記ヌクレアーゼ活性は、ＦＥＮヌクレアーゼ（フラップエンドヌクレアーゼ）の５’ヌクレアーゼ活性である。別の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、耐熱性テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼおよび／またはＳｓｏ７ｄ−融合ポリメラーゼまたはこれらの混合物である。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、Ｓｓｏ７ｄ−融合ポリメラーゼである。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ＧｏＴａｑポリメラーゼである。別の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を有するテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼである。したがって、ある実施形態では、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【０１０７】
当業者なら、ポリメラーゼの濃度がその活性に影響を与える場合があることを知っている。最適濃度はまた、標的の濃度、テンプレートまたは反応中に存在する核酸の配列などのさらなるパラメータに依存し得る。当業者なら、良好な結果を得るためにポリメラーゼ濃度を最適化する方法を知っている。
【０１０８】
活性化タグ二本鎖フラグメントをもたらすタグ二本鎖の放出は、本明細書で記載の上流オリゴヌクレオチドの伸長時にヌクレアーゼ活性を有する酵素により媒介される。ある実施形態では、タグ二本鎖のＰＴＯ部分の開裂は、上流オリゴヌクレオチドを伸長する前述のテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼにより誘導される。この場合、前述のポリメラーゼは５’ヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態では、タグ二本鎖のＰＴＯ部分の開裂は、上流オリゴヌクレオチドの伸長時に、前述のテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼにより誘導される。この場合、前述のポリメラーゼは５’ヌクレアーゼ活性を有する。
【０１０９】
ＰＴＯの５’ターゲティング部分が開裂される場合、タグ二本鎖フラグメントが放出される。開裂は、ＰＴＯのターゲティング部分と標的核酸配列との間の親和性を低減させ、その結果、標的核酸配列およびタグ二本鎖の開裂が生じ、それにより、活性化タグ二本鎖フラグメントが形成される。ある実施形態では、本明細書で記載のＰＴＯ上の少なくとも１個のクエンチャーが、ヌクレアーゼ活性を有する酵素によりＰＴＯから放出される。別の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、活性化タグ二本鎖フラグメントのＰＴＯ部の少なくとも１個のクエンチャーを取り除く。別の実施形態では、活性化タグ二本鎖フラグメントは、ＰＴＯの少なくとも１個のクエンチャーが存在しないＰＴＯフラグメントを含む。本明細書に記載のようにおよび図１に示すように、ヌクレアーゼ活性を有する酵素のヌクレアーゼ活性の結果として、少なくとも１個のクエンチャーが活性化タグ二本鎖フラグメント上に存在しなくてよい。
【０１１０】
活性化タグ二本鎖および／または活性化ＰＴＯの存在は、ｑＰＣＲおよび／またはリアルタイムＰＣＲにより検出し得る。活性化タグ二本鎖のみがリアルタイムＰＣＲにより検出できるのが好ましい。
【０１１１】
ステップ（ｄ）活性化タグ二本鎖フラグメントの融解
本発明のステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）からの活性化タグ二本鎖フラグメントの融解に関する。ある実施形態では、本発明のステップ（ｄ）は、前述の活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして、少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得ることを含む。融解が起こる温度は記録される。
【０１１２】
融解は、限定されないが、加熱、アルカリ、フォルムアミド、尿素およびグリオキサール処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ作用）、および結合タンパク質を含む従来の技術により実施し得る。例えば、融解は、３０℃〜１００℃の範囲の温度で加熱することにより達成できる。
【０１１３】
活性化タグ二本鎖フラグメントが一定の温度範囲にわたり加熱されると、本発明のＣＱＯからＰＴＯのＭＴＤＲが解離する。活性化タグ二本鎖フラグメントの二本鎖の片方が解離して単鎖になる温度は、融解温度領域（ＭＴＤＲ）により決定されるタグ二本鎖の安定性により決定される。したがって、ある実施形態では、活性化タグ二本鎖フラグメントは、一定の温度範囲にわたり加熱される。別の実施形態では、活性化タグ二本鎖フラグメントは、３０℃〜１００℃、例えば、３５℃〜１００℃、例えば、４０℃〜７５℃、例えば、４５℃〜７５℃に加熱される。好ましい実施形態では、活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度は、４５℃〜７０℃である。別の実施形態では、活性化タグ二本鎖フラグメントは、所定の温度で融解する。
【０１１４】
活性化タグ二本鎖フラグメントが二本鎖である限り、ＰＴＯ上の少なくとも１個のフルオロフォアからの発光は、ＣＱＯ上の少なくとも１個のクエンチャーにより実質的にクエンチされる。活性化タグ二本鎖フラグメントが解離し、単鎖になる場合、ＰＴＯ上の少なくとも１個のフルオロフォアの発光は、ＣＱＯ上の少なくとも１個のクエンチャーによりクエンチされなくてよい。したがって、ある実施形態では、ステップ（ｄ）でタグ二本鎖が融解される場合、少なくとも１個のフルオロフォアからの発光がクエンチされない。ある実施形態では、ステップ（ｄ）でタグ二本鎖が解離し、単鎖になる場合、少なくとも１個のフルオロフォアからの発光がクエンチされない。別の実施形態では、活性化タグ二本鎖フラグメントの存在は、融解曲線分析および／またはハイブリダイゼーション曲線分析により判定される。さらなる実施形態では、活性化タグ二本鎖フラグメントの存在は、融解曲線分析および／またはハイブリダイゼーション曲線分析により判定され、活性化タグ二本鎖フラグメントの融解温度の特定は、本明細書で記載のＰＴＯのＭＴＤＲによってなされる。
【０１１５】
ステップ（ｅ）融解タグ二本鎖フラグメントからのシグナルの検出
本発明のステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）のタグ二本鎖融解の結果としてのシグナルの検出に関する。本発明のある実施形態では、ステップ（ｅ）は、少なくとも１個のフルオロフォアからのシグナルを測定することにより活性化タグ二本鎖フラグメントを検出することを含み、シグナルが核酸混合物中の標的核酸配列の存在を示す。
【０１１６】
測定されるシグナルの性質は、ＰＴＯ上の少なくとも１個のフルオロフォアに依存し、様々な分析方法、例えば、リアルタイムＰＣＲ検出システムにより決定し得る。
【０１１７】
融解曲線またはハイブリダイゼーション曲線は、従来の技術により得てよい。例えば、融解曲線またはハイブリダイゼーション曲線は、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーのパラメータに伴う出力シグナルの変動のグラフプロットまたはディスプレイを含んでよい。出力シグナルを、ハイブリダイゼーションパラメータに対し直接にプロットしてよい。通常、融解曲線またはハイブリダイゼーション曲線は、出力シグナル、例えば、蛍光を有し、これは、Ｙ軸上にプロットされた二本鎖構造の程度（すなわち、ハイブリダイゼーションの程度）およびＸ軸上にハイブリダイゼーションパラメータ（すなわち、温度）を示す。
【０１１８】
蛍光による融解曲線を記録するために、通常、各温度での０〜３６０秒の設定された平衡時間を使って、全体的試料温度を段階的に上昇または下降させることができる。通常、０．５℃〜２℃のステップ幅が使用されるが、所望の精度に応じて、０．１℃まで小さくしてもよい。それぞれの温度で、当該波長に対し、蛍光の読み値が記録される。融解曲線に基づいて、適用した条件下でのＤＮＡ二本鎖のＴｍを測定できる。
【０１１９】
分子生物学全領域において核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）定量化のために選択される方法は、リアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使ったＤＮＡの増幅がリアルタイムでモニターされる（ｑＰＣＲサイクラーは、常にｑＰＣＲプレートをスキャンする）ことから、このように呼ばれる。
【０１２０】
蛍光レポータープローブ（Ｔａｑｍａｎまたはデュアル標識プローブ）は、プローブに相補的な配列を含むＤＮＡのみを検出する。したがって、レポータープローブの使用は、特異性を顕著に高め、その他のｄｓＤＮＡの存在下であっても、この技術の実施を可能とする。同じチューブ中の数個の標的配列をモニターするために、異なる色の標識、蛍光プローブをマルチプレックスアッセイに使用できる。この方法は、プローブの一端に蛍光レポーターおよび反対側末端に蛍光のクエンチャーを有するＤＮＡベースプローブに依存する。クエンチャーに対してレポーター近接していることにより、蛍光の検出が妨げられ、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの破壊は、レポータークエンチャー近接を分断し、したがって、クエンチされない蛍光の発光を可能とし、これを、レーザーによる励起後に検出できる。したがって、それぞれのＰＣＲサイクルでのレポータープローブによる標的化産物の増加は、プローブの破壊およびレポーターの放出に起因して、蛍光の比例的増加を引き起こす。ＰＣＲは、通常通り準備され、レポータープローブが添加される。反応が開始されるに伴い、ＰＣＲのアニーリング段階中に、プローブおよびプライマーの両方がＤＮＡ標的にアニールする。新規ＤＮＡ鎖の重合がプライマーから開始され、ポリメラーゼがプローブに到達すると、その５’−３’エキソヌクレアーゼがプローブを分解し、蛍光レポーターをクエンチャーから物理的に分離し、蛍光の増加を生じる。蛍光はリアルタイムＰＣＲ装置で検出および測定され、産物の指数関数的増加に対応するその幾何学的増加を使って、それぞれの反応における定量サイクル値（Ｃｑ）が決定される。
【０１２１】
反応中に存在する二本鎖のアニーリング温度または変性温度でシグナルを測定できる。したがって、シグナルは、５５〜６５℃の温度で、例えば、５６〜６４℃、例えば、５７〜６３℃、例えば、５８〜６２℃、例えば、５９〜６１℃、例えば、６０℃で測定できる。他の実施形態では、シグナルは、９０〜１００℃の温度で、例えば、９１〜９９℃、例えば、９２〜９８℃、例えば、９４〜９７℃、例えば、９５〜９６℃、例えば、９５℃で測定できる。当業者なら、いずれの温度が最良の読み値シグナルを与えるかを判定する方法をわかっている。
【０１２２】
実施例５に示すように、標的の濃度は、検出されるシグナルの強度に影響を与える。したがって、標的濃度は、必要に応じ、シグナルを改善するように調節してよい。
【０１２３】
標的核酸配列
本明細書で使用される場合、標的核酸配列は、核酸配列の混合物中で特定するのが望ましい任意の核酸を意味する。本発明の簡単なアッセイは、多くの用途を有する。本発明のアッセイの非包括的用途リストは、下記であってよい。
・ヒトおよび／または獣医学的診断
・食物および／または餌の品質および安全性
・環境監視
・科学研究
【０１２４】
したがって、ある実施形態では、本発明の標的核酸配列は、細菌、ウイルス、真菌、および／または原生動物などの病原性生物由来である。別の実施形態では、本発明の標的核酸配列は、雌ウシ、ニワトリ、ブタ、ウマ、ヒツジ、および／またはヤギなどの家畜に感染することができる病原性生物由来である。好ましい実施形態では、本発明の標的核酸配列は、ヒト、雌ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、および／またはヤギなどの哺乳動物に感染することができる病原性生物由来である。より好ましい実施形態では、本発明の標的核酸配列は、ヒトに感染することができる病原性生物由来である。
【０１２５】
本発明のある実施形態では、本発明の標的核酸配列は、ヒトに感染することができるウイルス由来である。本発明のさらなる実施形態では、本発明の標的核酸配列は、ヒトに感染することができる、１０％より高い死亡率を引き起こすウイルス由来である。ある実施形態では、ウイルスはエボラウイルスである。
【０１２６】
本発明のある実施形態では、本発明の標的核酸配列は、ヒトに感染することができる細菌由来である。本発明のさらなる実施形態では、本発明の標的核酸配列は、ヒトに感染することができる、１０％より高い死亡率を引き起こす細菌由来である。
【０１２７】
本発明のある実施形態では、本発明の標的核酸配列は、クラミジア、淋病、およびヘルペスからなる群より選択される性行為感染症を引き起こす病原性生物由来である。
【０１２８】
本発明のある実施形態では、本発明の標的核酸配列は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む群から選択される病原性生物由来である。
【０１２９】
標的核酸配列の検出キット
本発明の構成要素は、パーツキット内に含めてよい。
したがって、本発明の態様は、標的核酸配列の検出用パーツキットに関し、該キットは、
ｉ．必要に応じて、本明細書で記載の少なくとも１個のＰＴＯと、
ｉｉ．本明細書で記載の少なくとも１個のＣＱＯと、
ｉｉｉ．必要に応じて、ヌクレアーゼ活性を有する酵素と、
ｉｖ．必要に応じて、標的核酸配列の検出方法に関するインストラクションと、を含む。
【０１３０】
キットは、２個以上の標的核酸配列の検出のために使用し得る。ある実施形態では、本明細書で記載のキットは、
ｉ．必要に応じて、少なくとも２個の異なるＰＴＯ群からの少なくとも２個のＰＴＯ、および
ｉｉ．少なくとも２個のＣＱＯ、をさらに含む。
【０１３１】
キットはまた、少なくとも１個の、本明細書に記載の下流および／または上流オリゴヌクレオチドも含んでよい。ある実施形態では、キットは、本明細書に記載の、下流オリゴヌクレオチドおよび／または上流オリゴヌクレオチドをさらに含む。
【０１３２】
さらに、キットは、ヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含んでよい。したがって、ある実施形態では、キットは、本明細書に記載のヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む。
【０１３３】
ある実施形態では、本明細書で記載のキットは、懸濁液または溶液である。ある実施形態では、本明細書で記載のキットは、すぐに使用できる懸濁液または溶液である。さらなる実施形態では、記載キットは、すぐに使用できるペレットの状態である。ある実施形態では、すぐに使用できるペレットは、前述のキットのｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）を含む、実質的に水不含組成物を含む。
【０１３４】
ある実施形態では、本明細書で記載のキットは、部分的におよび／または完全にハイブリダイズしたＰＴＯおよびＣＱＯを含む。
【０１３５】
キットはまた、コントロールとして、および、例えば、適用した分析機器のＴｍの較正のために使い得る、少なくとも１個のタグ二本鎖を含んでよい。オリゴヌクレオチドのＴｍは、例えば、塩濃度、ＤＮＡ濃度、ｐＨおよび変性剤（フォルムアミドまたはＤＭＳＯなど）の存在に応じて変化してよい。分析される試料が変化する、すなわち、塩濃度を含む場合、このようなコントロールが望ましいであろう。ある実施形態では、本明細書で記載のキットは、コントロール試料および／またはコントロールタグ二本鎖をさらに含む。
【０１３６】
診断
本方法は、診断および／または処置を必要としている個人の診断および／または処置に使用し得る。
【０１３７】
したがって、本発明のある実施形態は、標的核酸配列の存在を特徴とする疾患または障害を有するとして個人を診断する方法に関し、前述の方法は、他に示したアッセイステップを含み、前述の標的核酸配列の検出をもたらす。
【０１３８】
その非限定的例は下記である。標的核酸配列の存在を特徴とする疾患または障害を有するとして個人を診断する方法であって、前述の方法は、
ステップ（ａ）標的核酸配列にＰＴＯ（プロービングおよびタギングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、ＰＴＯが、（ｉ）標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲティング部分、（ｉｉ）標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む融解温度決定領域（ＭＴＤＲ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のフルオロフォアおよび少なくとも１個のクエンチャーを含む少なくとも１組の相互作用標識を含むステップと、
ステップ（ｂ）前述のＰＴＯにＣＱＯ（キャプチャリングおよびクエンチングオリゴヌクレオチド）をハイブリダイズするステップであって、ＣＱＯが、（ｉ）ＰＴＯのＭＴＤＲに逆相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部分および（ｉｉ）少なくとも１個のクエンチング分子を含み、ＰＴＯのＭＴＤＲがＣＱＯのキャプチャリング部分とハイブリダイズしてタグ二本鎖を形成するように構成されるステップと、
ステップ（ｃ）タグ二本鎖をヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップであって、タグ二本鎖が標的核酸配列にハイブリダイズする際に、ヌクレアーゼ活性を有する酵素がタグ二本鎖の開裂を誘導し、それにより、ＣＱＯのキャプチャリング部分にハイブリダイズしたＭＴＤＲおよび少なくとも１個のフルオロフォアを含むＰＴＯフラグメントを含む活性化タグ二本鎖フラグメントが放出されるステップと、
ステップ（ｄ）前述の活性化タグ二本鎖フラグメントを融解および／またはハイブリダイズして少なくとも１個のフルオロフォアからシグナルを得るステップと、
ステップ（ｅ）少なくとも１個のフルオロフォアからのシグナルを測定することにより活性化タグ二本鎖フラグメントを検出するステップであって、シグナルが標的核酸配列の存在、したがって、前述の個人の疾患または障害の存在を示すステップと、を含む。
【０１３９】
疾患または障害は、引き起こされる、すなわち、病原体による感染症または遺伝性障害または疾患であってよい。
【０１４０】
反応混合物
さらなる実施形態では、本発明は反応混合物を含む。したがって、本発明のある実施形態は、試料中の標的核酸配列の増幅および／または検出のためのプロセスに使用するための反応混合物を提供し、反応混合物は、増幅の前に、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１個のＰＴＯおよび少なくとも１個のＣＱＯを含み、前述の一対のプライマー、ＰＴＯおよびＣＱＯは、前述の一対のオリゴヌクレオチドプライマーが前述の標的核酸に相補的で、前述の標的核酸に対して相補的な第１の伸長産物の合成を刺激する第１のプライマー、および前述の第１の伸長産物に相補的で、第２の伸長産物の合成を刺激する第２のプライマーを含むことを特徴とし；前述のＰＴＯが標的核酸配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列または前述の標的核酸の相補配列にハイブリダイズし、前述の領域が前述のプライマー対の１個のメンバーと、前述のプライマー対のもう一方のメンバーの相補配列との間にあり、ＰＴＯが少なくとも一組の相互作用標識、ＭＴＤＲ、および必要に応じてターゲティング部分とＭＴＤＲとの間のリンカーを含み；ＣＱＯが少なくとも１個のクエンチャーおよびキャプチャリング部分を有し、前述のキャプチャリング部分がＰＴＯにハイブリダイズするように構成される。反応混合物は、数個のオリゴヌクレオチドプライマー対、数個のＰＴＯおよび単一ＣＱＯを含んでよい。反応混合物は、反応混合物中の全てのＰＴＯにハイブリダイズするように構成された単一ＣＱＯを含んでよい。
【０１４１】
コンピュータ実装方法
本発明の別の態様は、少なくとも１個の標的配列を特定するためのコンピュータ実装方法に関し、該方法は、１）ＰＴＯ、ＣＱＯ、標的配列に関する情報を与えるステップと、２）少なくとも１個の融解タグ二本鎖フラグメントからシグナルを得るステップと、３）前述の与えられた情報および取得したシグナルに基づいて、少なくとも１個の標的配列を特定するステップと、を含む。
【０１４２】
実施例
実施例１  フルオロフォアとＣＱＯクエンチャーとの間の距離
次の実施例は、５種の異なる設計のタギングプローブおよびｉｐａＨ遺伝子に特異的なＴａｑＭａｎプローブを含むＰＣＲ反応の結果を示す。全ての反応は、２個のコモンプライマー（ＤＥＣ２２９ＦおよびＤＥＣ２３０Ｒ）を用いて実施される。タギングプローブは、ＦＡＭがＤＥＣ４８６Ｐ中のＰＴＯのハイブリダイズされたターゲティング部分のクエンチャーの位置から最遠位および、ＤＥＣ４９０ＰのＰＴＯのハイブリダイズされたターゲティング部分のクエンチャーの位置に最近接の位置に挿入される。単一ＣＱＯ設計（ＤＥＣ４８１ｒＰ）と組み合わせて、５種の異なるタギングプローブ設計を試験した。結果は、ＦＡＭと、ハイブリダイズされたＰＴＯのターゲティング部分のクエンチャーの位置との間の距離が増えることにより、バックグラウンド融解曲線生成が減少することを示している。結果は、好ましいＰＴＯ設計（ＤＥＣ４８６Ｐ）は、特異的標的の存在下のみでＰＣＲ増幅曲線を生成し、また、増幅された標的の存在下でのみ融解曲線シグナルを生成することをさらに示す。（ＤＥＣ４８７Ｐ〜４９０Ｐ）を含むその他の設計は、ＮＴＣ反応において、全てバックグラウンド融解曲線を示し、擬陽性結果を示す。ＴａｑＭａｎプローブＤＥＣ４６４は、ＰＣＲ反応用のポジティブコントロールとして含められる。
【表１】
2018500932.tif 000003
【０１４３】
ＰＣＲ反応：
１ｘＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（製造番号＃１７２−５２８０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２００ｎＭの順方向および逆方向プライマー、４００ｎＭのタギングプローブ、８００ｎＭのクエンチングプローブ、１：２００希釈の標的、０．２５ＵウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（１Ｕ／μＬ）（＃ＥＮ０３６１  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む１０μＬの反応液を調製した。標的を、単一コロニーの大腸菌を２００μｌの水中に混合し、９５℃で１５分間煮沸することにより調製した。その後、２５μＬの煮沸標的を１００μＬの滅菌水に加えて、標的ストック溶液とし、最終のＰＣＲ反応では、これを５ｘに希釈した。ＡＢ  ｇｅｎｅ  ＳｕｐｅｒＰｌａｔｅ９６ウエルＰＣＲプレート（カタログ番号ＡＢ２８００）中で反応系を構築し、光学的に透明な粘着性Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ  Ｂフィルム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号ＭＢＳ１００１）で密封した。
【０１４４】
ＰＣＲ反応混合物を次のＰＣＲサイクルおよび融解曲線プログラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）に供した。
【表２】
2018500932.tif 000004
【０１４５】
実施例２  マルチプレックスＰＣＲ反応
次の実施例は、ｉｐａＨ遺伝子に特異的な、増加する長さのＭＴＤＲ領域を保持する３種の異なる設計のＰＴＯ（タギングプローブ）を含むＰＣＲ反応の結果を示し、ＤＥＣ５００Ｐが最も短いＭＴＤＲ領域およびそれによる最低のＴｍを有し、ＤＥＣ５０３Ｐが最も長いＭＴＤＲ領域およびそれによる最高のＴｍを有する。全ての反応は、２個のコモンプライマー（ＤＥＣ２２９ＦおよびＤＥＣ２３０Ｒ）を用いて実施された。単一ＣＱＯ（クエンチングプローブ）設計（ＤＥＣ４８１ｒＰ）と組み合わせて、３種の異なるタギングプローブを試験した。３種のＰＴＯ設計は、単独で（図９〜１４）、プローブＤＥＣ５００ＰとＤＥＣ５０２Ｐとを組み合わせて（図１５〜１６）、およびプローブＤＥＣ５００ＰとＤＥＣ５０３Ｐとを組み合わせて（図１７〜１８）試験された。結果は、それぞれのＰＴＯがＰＣＲ単独でおよび組み合わせて、良好に機能することを示している。特に、結果から、ＤＥＣ５００ＰとＤＥＣ５０２Ｐとを組み合わせたプローブは、２種の個別に識別可能な融解曲線を与え、両方のプローブが特異的シグナルを検出することを示すことがさらに明らかになる。結果から、ＤＥＣ５００ＰとＤＥＣ５０３Ｐとを組み合わせたプローブはまた、２種の個別に識別可能な、さらに広い間隔を隔てて、ＤＥＣ５００ＰとＤＥＣ５０３ＰとのＭＴＤＲの間の、より大きいＴｍの差異に応じた融解曲線を与え、同時に、両方のプローブが特異的シグナルを検出することを示すことがさらに明らかになる。結果から、ＮＴＣ反応において、全てのプローブが非常に低いバックグラウンド融解曲線をもたらし、ＰＴＯプローブは、特異的標的の存在がなければ、シグナルをもたらさないことを示すことがさらに明らかになる。
【表３】
2018500932.tif 000005
【０１４６】
ＰＣＲ反応：
１ｘ  ＧｏＴａｑ  プローブ  ｑＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（製造番号＃Ｐｒｏｍｅｇａ  Ａ６１０１）、２００ｎＭの順方向および逆方向プライマー、４００ｎＭのタギングプローブ、８００ｎＭのクエンチングプローブ、１：２００希釈の標的、０．２５ＵウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（１Ｕ／μＬ）（＃ＥＮ０３６１  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む１０μＬの反応液を調製した。標的を、ｉｐａＨ遺伝子を保持する単一コロニーの大腸菌を２００μｌの水中に混合し、９５℃で１５分間煮沸することにより調製した。その後、２５μｌの煮沸標的を１００μｌの滅菌水に加えて、標的ストック溶液とし、最終のＰＣＲ反応では、これを５ｘに希釈した。ＡＢ  ｇｅｎｅ  ＳｕｐｅｒＰｌａｔｅ９６ウエルＰＣＲプレート（カタログ番号ＡＢ２８００）中で反応系を構築し、光学的に透明な粘着性Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ  Ｂフィルム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号ＭＢＳ１００１）で密封した。
【０１４７】
ＰＣＲ反応混合物を次のＰＣＲサイクルおよび融解曲線プログラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）に供した。
【表４】
2018500932.tif 000006
【０１４８】
実施例３  ループプローブ設計
次の実施例は、ｉｐａＨ遺伝子に特異的な、ＭＴＤＲ領域としてループ設計を保持する２種の異なる設計のＰＴＯ（タギングプローブ）を含むＰＣＲ反応の結果を示し、ＰＴＯ（タギングプローブ）の最後の部分が、ループ領域によりＭＴＤＲ領域から分離された、ターゲティング部分（クエンチングプローブ部分）を含む。全ての反応は、２個のコモンプライマー（ＤＥＣ２２９ＦおよびＤＥＣ２３０Ｒ）を用いて実施される。２種の異なるＰＴＯ（タギングプローブ）を単独で試験した（ＲＭＤ７Ｐ、図１９〜２０およびＲＭＤ８Ｐ、図２１〜２２）。結果は、それぞれのプローブがＰＣＲにおいて良好に機能し、特異的標的の存在下のみで増幅曲線をもたらすことを示す。さらに、結果は、両方のプローブが、適切な標的の存在下では融解曲線をもたらすが、ＮＴＣの場合はそうではないことを示している。
【表５】
2018500932.tif 000007
【０１４９】
ＰＣＲ反応：
１ｘ  ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（製造番号＃１７２−５２８０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２００ｎＭの順方向および逆方向プライマー、４００ｎＭのタギングプローブ、１：２００希釈の標的、０．２５ＵウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（１Ｕ／μＬ）（＃ＥＮ０３６１  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む１０μｌの反応液を調製した。標的を、単一コロニーの大腸菌を２００μｌの水中に混合し、９５℃で１５分間煮沸することにより調製した。その後、２５μｌの煮沸標的を１００μｌの滅菌水に加えて、標的ストック溶液とし、最終のＰＣＲ反応では、これを５ｘに希釈した。ＡＢ  ｇｅｎｅ  ＳｕｐｅｒＰｌａｔｅ９６ウエルＰＣＲプレート（カタログ番号ＡＢ２８００）中で反応系を構築し、光学的に透明な粘着性Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ  Ｂフィルム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号ＭＢＳ１００１）で密封した。
【０１５０】
ＰＣＲ反応混合物を次のＰＣＲサイクルおよび融解曲線プログラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）に供した。
【表６】
2018500932.tif 000008
【０１５１】
実施例４：異なるＭＴＤＲの試験
この実験では、我々は、前の実施例（ＲＭＤ）とは異なる配列を有するいくつかのＰＴＯプローブおよび対応するクエンチャープローブ（ＣＱＯ）を試験し、異なる配列がポリメラーゼにより低い効率で結合するように作用する可能性があるかどうかを明らかにした。プライマーおよびプローブ標的はＩｐａＨプローブに対するものと同じとした。ＩｐａＨプローブ測定に対して行ったように、ＲＭＤ  ＰＴＯプローブおよびクエンチャーも試料中に存在する通常の加水分解プローブアッセイ、ｍＶａｌｉｄＰｒｉｍｅ、を試験した。この試験で、我々は、このアッセイのｑＰＣＲ反応も、ポリメラーゼの制限されたアクセスにより抑制されるかどうかを評価したいと思っている。
【０１５２】
方法
ｑＰＣＲ
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０機器（Ｒｏｃｈｅ）により実験を行った。ＲＭＤアッセイ用におよびｍＶａｌｉｄＰｒｉｍｅアッセイ用にテンプレートとして使用したｇＢｌｏｃｋｓ（表５）をＩＤＴに注文した。マスターミックスは、ＴＡＴＡＡ  Ｐｒｏｂｅ  ＧｒａｎｄＭａｓｔｅｒミックスとした。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをマスターミックスに加え、ポリメラーゼ規定濃度の１、２．５、５および１０倍のマスターミックス中の濃度のポリメラーゼを生成する。規定濃度は、反応を実施するのに最適濃度として製造業者により示された濃度と定義される。ｑＰＣＲ測定をＲＭＤアッセイ用の５個のプローブで実施した（表６）。表７に示すように、それぞれのプローブを１０種の異なる混合物で試験した。４種を異なる濃度のポリメラーゼおよび１種をＮＴＣとした、５種一組の混合物をＲＭＤシステムのみを使って作製した。
【０１５３】
一組の５種のその他の混合物を、ＩｐａＨプライマーおよびテンプレートは含まないが、マウス用のＶａｌｉｄＰｒｉｍｅアッセイのプライマー、プローブおよびテンプレートを含めて作製した。試薬を表８に示す濃度に混合した。全ての試料を２回実験した。温度プログラムを表９に示す。この場合、蛍光をプログラムのステップ２（６０℃）およびステップ３（９５℃）の両方で測定した。蛍光は、通常６０℃ステップでのみ測定される。プローブがクエンチング（ＣＱＯ）プローブにハイブリダイズされ、蛍光が６０℃でクエンチされるかもしれないので、我々は、全ての二本鎖ＤＮＡが融解される９５℃でも測定した。
【表７】
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【表８】
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2018500932.tif 000011
【表９】
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【表１０】
2018500932.tif 000013
【表１１】
2018500932.tif 000014
【０１５４】
結果
Ｃｑ値
ＲＭＤ試料（Ａ〜Ｄ）の反復実験の平均Ｃｑ値を計算した。それらをポリメラーゼ濃度の関数として図２３にプロットしている。増幅は通常、ポリメラーゼの濃度の増加と共に増加する。
【０１５５】
図２４は、ｍＶａｌｉｄＰｒｉｍｅプローブを含む試料のＣｑ値を示す。試料は種々ＲＭＤプローブも含むが、これらのプローブに対してはプライマーまたはテンプレートが試料中にないので、ｍＶａｌｉｄＰｒｉｍｅ標的のみが増幅され、蛍光は、主にｍＶａｌｉｄＰｒｉｍｅプローブに由来する。増幅は通常、ポリメラーゼの濃度の増加と共に増加する。
【０１５６】
増幅曲線
図２５に示すように、増幅曲線の振幅は、プローブの長さおよびポリメラーゼ濃度を変えることにより調節できる。この図は、９５℃での変性ステップの最後の増幅サイクルで測定した蛍光振幅を示す。全体としては、全てのプローブについて、より高いポリメラーゼ濃度では、より高い振幅に到達した。
【０１５７】
図２６のｍＶａｌｉｄＰｒｉｍｅプローブの振幅は、試験範囲のポリメラーゼ濃度で基本的に安定であった。
【０１５８】
融解温度
ＲＭＤプローブの測定された融解温度を図２７に示す。融解曲線は、ＲＭＤテンプレートを含む試料、混合物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対してのみ観察された。融解温度はプローブ長さと共に高くなり、増加するポリメラーゼ濃度と共にわずかに低下した。
【０１５９】
実施例５：標的濃度
次の実施例は、ｉｐａＨ遺伝子に特異的なプロービングおよびタギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＤＥＣ４８６Ｐにより検出された６種の異なる標的濃度の５ｘ希釈曲線を含むＰＣＲ反応の結果を示す。反応は、２個のコモンプライマー（ＤＥＣ２２９ＦおよびＤＥＣ２３０Ｒ）を用いて実施された。単一のキャプチャーおよびクエンチングプローブ設計（ＤＥＣ４８１ｒＰ）と組み合わせて、プロービングおよびタギングオリゴヌクレオチドを試験した。結果は、プロービングおよびタギングプローブは、標的希釈に対応した増幅曲線および融解曲線をもたらすことにより、有効に機能することを示す。ＮＴＣ反応からわかるように、ＤＥＣ４８６Ｐプローブは極めてわずかなバックグラウンドを示した。
【表１２】
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【０１６０】
ＰＣＲ反応：１ｘＳｓｏ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（製造番号＃Ｐｒｏｍｅｇａ  Ａ６１０１）、２００ｎＭの順方向および逆方向プライマー、４００ｎＭのプロービングおよびタギングプローブ、８００ｎＭのキャプチャリングおよびクエンチングプローブ、１：２００希釈の標的、０．２５ＵウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（１Ｕ／μＬ）（＃ＥＮ０３６１  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む１０μｌの反応液を調製した。標的を、ｉｐａＨ遺伝子を保持する単一コロニーの大腸菌を２００μｌの水中に混合し、９５℃で１５分間煮沸することにより調製した。その後、２５μｌの煮沸標的を１００μｌの滅菌水に加えて、標的ストック溶液とし、最終のＰＣＲ反応では、これを５ｘ〜１５６２５ｘに希釈した。ＡＢ  ｇｅｎｅ  ＳｕｐｅｒＰｌａｔｅ９６ウエルＰＣＲプレート（カタログ番号ＡＢ２８００）中で反応系を構築し、光学的に透明な粘着性Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ  Ｂフィルム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号ＭＢＳ１００１）で密封した。
【０１６１】
ＰＣＲ反応混合物を次のＰＣＲサイクルおよび融解曲線プログラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）に供した。
【表１３】
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【０１６２】
参考文献
Ｋｉｂｂｅ  ＷＡ．’ＯｌｉｇｏＣａｌｃ：ａｎ  ｏｎｌｉｎｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ’．（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５（ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｍａｙ  ２５．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３８：５６９−５７５（Ａｐｒｉｌ  ２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ（２００８）５２（１）：４７−４８．
【図１】
2018500932.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８ａ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月24日(2017.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2018500932.tif 000046
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