(57)【要約】  本発明は、栄養所要量が特徴的な患者に関し示差的な栄養所要量を決定し、かかる患者に示差的な栄養所要量を充足する組成物を提供する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患に罹患している被検者における健常な被検者に対し示差的な栄養所要量により特徴づけられる疾患に罹患している被検者の、疾患関連性の示差的な栄養所要量を決定するための、インビトロ法であって、
ａ．疾患に罹患している被検者のサンプルにおいて、前記被検者の栄養プロファイルを示すマーカーのステータスのプロファイルを決定するステップと、
ｂ．健常な被検者のサンプルにおいて、前記ステップａにおいて決定されたものと同じマーカーのステータスのプロファイルを決定するステップと、
ｃ．ステップａ及びステップｂにおいて決定されたプロファイルを比較して、疾患に罹患している被検者における栄養に関して示差的な栄養所要量を決定するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記疾患が炎症性腸疾患である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項３】
栄養素が、タンパク質、アミノ酸、脂肪、又は炭水化物からなる群から選択され、微量栄養素が、ビタミン又は元素の群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ１ａ）において、前記マーカーの前記ステータスが被検者のコホートにおいて決定され、場合により、前記コホートにおける前記被検者が同じ重症度の疾患を示しており、場合により、前記コホートにおける前記被検者が再発しており、又は場合により、前記コホートにおける前記被検者が寛解している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ１ｂ）において、前記マーカーの前記ステータスが、健常な被検者のコホートにおいて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、全血、血漿、血清、赤血球細胞、尿、又は組織生検からなる群から選択されるサンプルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記マーカーの前記ステータスが、前記マーカーを直接定量することにより、又は前記最初のマーカーの前記ステータスを示す更なる１つのマーカー又は複数のマーカーを定量することにより間接的に、評価される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０個のマーカーの前記ステータスが決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記マーカーが、タンパク質ステータス及び又は異化のマーカーであり、場合により、前記タンパク質ステータスマーカーが、アルブミン、プレアルブミン、又は／及びホスホクレアチン及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、場合により、異化についての前記ステータス指標が、アンモニア、尿素、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記マーカーが、酸化的ストレスステータスについてのマーカーであり、場合により、前記酸化的ストレスのマーカーが、４−ヒドロキシノネナール、マロンアルデヒド、ニトロチロシン、カルボニル化タンパク質、トータルグルタチオン、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ活性、グルタチオン還元酵素活性、スーパーオキシドジスムターゼ活性、カタラーゼ活性、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記マーカーが、窒素合成酵素ステータスについてのマーカーであり、場合により、前記窒素合成酵素ステータスについてのマーカーが、ニトリト、ニトラート、尿素サイクルにおける中間体（オルニチン、シトルリン、アルギニノコハク酸（arginine succinic acid）、アルギニン）、モノメチルアルギニン、対称ジメチルアルギニン、非対称ジメチルアルギニン、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記マーカーがアミノ酸ステータスについてのマーカーであり、及び前記マーカーが、アミノアラニン、β−アラニン、サルコシン、アルギニン、モノメチルアルギニン、非対称−ジメチルアルギニン、対称ジメチルアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シトルリン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ヒドロキシプロリン、エタノールアミン、α−アミノ酪酸、β−アミノイソ酪酸、γ−アミノ酪酸、ホモシステイン、システイン、γ−グルタミル−システイン、システイニル−グリシン、ホモシスチン、システイン、シスタチオニン、メチオニン  スルホキシド、セレノメチオニン、メチオニンスルホキシミン、セレノシステイン、セレノシスチン、エルゴチオネイン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、又はＳ−アデノシルメチオニンアミン、α−ケト酪酸、２−アミノ酪酸、２−アミノ−３−ケト酪酸、α−ケト−β−メチル酪酸（又はα−ケトイソ甘草酸）、α−ケトイソカプロン酸、又はα−ケト−β−メチル甘草酸、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカーが、スレオニン、セリン、又はプロリンからなる群から選択され、好ましくはスレオニンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーがスレオニンマーカーであり、場合により、前記マーカーがスレオニン又はスレオニンの代謝産物であり、場合により、前記スレオニンの代謝産物が、プロピオン酸、２−アミノ酪酸、２−ケト酪酸、２−アミノ−３−ケト酪酸、アミノアセトン、アセチルＣｏＡ、グリシン、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーがイソロイシンマーカーであり、場合により、前記マーカーがイソロイシン又はイソロイシンの代謝産物であり、場合により、前記イソロイシンの代謝産物が２−ケト−３−メチル甘草酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記マーカーが脂肪酸マーカーであり、場合により、前記脂肪酸が、酪酸Ｃ４：０、カプロン酸Ｃ６：０、カプリル酸Ｃ８：０、カプリン酸Ｃ１０：０、ウンデカン酸Ｃ１１：０、ラウリン酸Ｃ１２：０、トリデカン酸Ｃ１３：０、ミリスチン酸Ｃ１４：０、ペンタデカン酸Ｃ１５：０、パルミチン酸Ｃ１６：０、ヘプタデカン酸Ｃ１７：０、ステアリン酸Ｃ１８：０、アラキジン酸Ｃ２０：０、ヘンイコサノン酸Ｃ２１：０、ベヘン酸Ｃ２２：０、リグノセリン酸Ｃ２４：０、ミリストレイン酸Ｃ１４：１  ｎ−５、ｃｉｓ−１０−ペンタデセン酸Ｃ１５：１  ｎ−５、パルミトレイン酸Ｃ１６：１  ｎ−７、ｃｉｓ−１０−ヘプタデセン酸Ｃ１７：１  ｎ−７、エライジン酸Ｃ１８：１  ｎ−９  ｔｒａｎｓ、オレイン酸Ｃ１８：１  ｎ−９  ｃｉｓ、ｃｉｓ−１１−エイコセン酸Ｃ２０：１  ｎ−９、エルカ酸Ｃ２２：１  ｎ−９、ネルボン酸Ｃ２４：１  ｎ−９、リノールエライジン酸Ｃ１８：２  ｎ−６  ｔｒａｎｓ、リノレン酸Ｃ１８：２  ｎ−６  ｃｉｓ、γ−リノレン酸Ｃ１８：３  ｎ−６、α−リノレン酸Ｃ１８：３  ｎ−３、ｃｉｓ−１１，１４−エイコサジエン酸Ｃ２０：２  ｎ−６、ｃｉｓ−８，１１，１４−エイコサトリエン酸Ｃ２０：３  ｎ−６、ｃｉｓ−１１，１４，１７−エイコサトリエン酸２０：３  ｎ−３、アラキドン酸Ｃ２０：４  ｎ−６、ｃｉｓ−１３，１６−ドコサジエン酸２２：２  ｎ−６、ｃｉｓ−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（eicosapentanoic）（ＥＰＡ）Ｃ２０：５  ｎ−３、ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）Ｃ２２：６  ｎ−３、リポ酸、又はリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及び／又はホスファチジルエタノールアミンを含む）からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記マーカーが元素マーカー（ミネラルマーカーを含む）であり、前記元素（ミネラルを含む）が、リチウム（Ｌｉ）、ボロン（Ｂ）、マグネシウム（Ｍｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、ケイ素（Ｓｉ）、リン（Ｐ）、硫黄（Ｓ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ヒ素（Ａｓ）、セレニウム（Ｓｅ）、臭素（Ｂｒ）、ルビジウム（Ｒｂ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、スズ（Ｓｎ）、ヨウ素（Ｉ）、バリウム（Ｂａ）、チタニウム（Ｔｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）からなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記マーカーがビタミンマーカーであり、場合により、前記ビタミンが、水溶性ビタミン又は脂溶性ビタミンからなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記水溶性ビタミンが、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ニコチン酸又はナイアシン）、ビタミンＢ３ニコチンアミド、ビタミンＢ３メチルニコチンアミド、ビタミンＢ３ニコチン尿酸、ビタミンＢ４（コリン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ビタミンＢ６ピリドキサール、ピリドキサミン）、ビタミンＢ６ピリドキサールホスフェート、ビタミンＢ６ピリドキサミン、ビタミンＢ６ピリドキシン酸、ビタミンＢ８（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ９メチルテトラヒドロ葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、メチルコバラミン）、又はビタミンＢ１２ヒドロキシコバラミン、アデノシルコバラミンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記脂溶性ビタミンが、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＫ２（メナキノン）、ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＥ（α−トコフェロール、δ−トコフェロール）、ビタミンＤ（２５−ＯＨビタミンＤ２、ビタミンＤ  ２５−ＯＨ  Ｄ３、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、１α−２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ３）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記マーカーがヌクレオチドマーカーであり、場合により、前記ヌクレオチドが、イノシン５’モノホスフェート、アデノシン５’モノホスフェート、シチジン５’モノホスフェート、グアノシン５’−モノホスフェート、イノシン５’モノホスフェート、ウリジン５’モノホスフェート、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記マーカーが浸透圧調節物質マーカーであり、場合により、前記浸透圧調節物質が、トリメチルアミンＮ−オキシド、ジメチルスルホニオプロピオナート、トリメチルグリシン、サルコシン、ベタイン、グリセロホスホリルコリン、ｍｙｏ−イノシトール、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記マーカーが植物栄養素マーカーであり、場合により、前記植物栄養素が、カロテノイド、エラグ酸、フラボノイド、クロロゲン酸、レスベラトロル、グルコシノレート、植物エストロゲン、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記マーカーがペプチドマーカーであり、場合により、前記ペプチドが、還元型グルタチオン又は酸化型グルタチオンからなる群から選択される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ａ．請求項１〜２４に記載の方法により、疾患に罹患している被検者に関し前記示差的な栄養所要量を決定するステップと、
ｂ．前記疾患に罹患している前記被検者において、前記栄養素及び主要栄養素の前記栄養プロファイルを、請求項１のステップｂにおいて決定された健常な被検者の栄養プロファイルに対して、又は該プロファイルへと、回復させる量で栄養素を含む組成物を製造するステップと、を含む、疾患に罹患している被検者に投与するのに好適な栄養組成物の製造方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法により製造された組成物。
【請求項２７】
液体又は粉末の形態の請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記疾患に罹患している被検者における健常な被検者に対し示差的な栄養所要量により特徴づけられる疾患の治療に使用し、場合により前記疾患はＩＢＤである、請求項２６又は２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が、前記少なくとも１つの栄養素を、前記疾患に罹患している被検者の１日所要量を充足する量で含む、請求項２８に記載の使用のための組成物。
【請求項３０】
ａ）請求項２６又は２７に記載の組成物を準備するステップと、
ｂ）前記疾患に罹患している被検者における健常な被検者に対し示差的な栄養所要量により特徴づけられる疾患に罹患している被検者に、前記組成物を投与するステップと、を含み、場合により前記疾患はＩＢＤである、疾患に罹患しているヒト被検者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、栄養必要量が特徴的（specific）である患者の示差的（distinctive）な栄養所要量を決定し、かかる患者の示差的な栄養所要量を充足する組成物を提供する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
被検者の栄養ステータスは、様々なパラメーター又は化合物により定義される。例えば、被検者の体液又は組織中には、栄養素、微量栄養素、及びその他の化合物が特定濃度で見られる。多くの疾患では、患者の疾患、代謝の変動、及び／又は最適ではない食事管理に対応するためにこれらの化合物の利用が増大することから、これらの化合物濃度又はこれらのパラメーター値が変化している。結果として、関係するパラメーター及び化合物が、健常な被検者において見られる範囲から外れてしまい、体組成成分の供給不十分、エネルギーの供給不足、又は機能成分の不足などといった栄養不足が生じるため、かかる疾患に罹患している被検者は栄養不良である。したがって、栄養ステータスに作用する疾患に罹患している被検者は、かかる被検者の示差的栄養所要量に対応する栄養学的介入により効果を得られ得る。そのため、かかる被検者に、健常な被検者の栄養ステータスの代謝的、生理的、及び機能的等価性を回復する量で栄養素及び微量栄養素を含む栄養組成物を投与することが必要とされる。
【０００３】
被検者が示差的な栄養所要量を示すこのような疾患の特定例には、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）がある。
【０００４】
ＩＢＤにおける栄養素の役割は、特に、経腸栄養のみ（exclusiveenteral nutrition：ＥＥＮ）で軽度〜中等度の疾患においてコルチコステロイドと同等の寛解が誘導され得ることが報告されている、小児クローン病（ＣＤ）において高い関心を集めている。したがって、標準治療（ＳｏＣ）に提示される栄養学的介入を加えることは、安全な長期疾病管理に関し魅力的なオプションとなる。栄養不良はＩＢＤ、特にＣＤの小児及び成人患者で一般的であり、典型的には、体重の減少をもたらすタンパク質−エネルギー不足、及び／又はビタミン／ミネラル欠乏として顕在化する。概して、食後の腹痛及び下痢に伴う食事摂取不足がＩＢＤにおける栄養不良の最も一般的な原因である。栄養不良の程度は、疾患の持続期間、重症度、及び疾患の伸展（extend）、並びに腸切除又は線維症に起因した機能喪失によって異なる。ＩＢＤ患者では脂肪量及び筋肉量が減少していることが報告されており、更には微量栄養素の欠乏によっても軽度疾患が生じ、あるいは寛解期に微量栄養素の欠乏が生じることも報告されている。
【０００５】
栄養素はまた、栄養素の欠乏に伴う栄養不良以上に寛解期を維持するのに、特に粘膜の健康を維持するのに有効なアプローチとしても考えられる。粘液ゲルを形成して腸上皮を保護する腸内ムチンは、ＩＢＤにおける粘膜損傷後の上皮の健康回復に極めて重要であることが示唆されてきた。適切なムチン合成を維持する身体容量は、いくつかの特定のアミノ酸の生物学的利用能に直接関係している。腸炎では、経腸栄養を施したミニブタにおいて、胃腸管におけるスレオニンの取り込みと、ムチン合成と、が増大することは既知である。そのため、ＩＢＤ同様の炎症条件下では、特定の栄養素に富んでいるために、ムチン合成を維持するにあたって特定のアミノ酸が必須条件となっている可能性がある。
【０００６】
したがって、健常な被検者の栄養ステータスとは異なる栄養ステータスをもつ疾患（複数可）又は病態に罹患している患者に示差的な規定食ニーズを特定する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、健常な被検者の栄養ステータスとは異なる栄養ステータスの患者の示差的な栄養所要量を決定する新しい方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明は：ａ）第１に、疾患に罹患している被検者のサンプルにおいて、マーカー（栄養素、微量栄養素、及び／又はそれらの代謝産物、及び／又はバイオマーカー、あるいはこれらの任意の組み合わせを含む）のステータスのプロファイル、すなわち「栄養プロファイル」を決定するステップと、ｂ）第２に、健常な被検者由来のサンプル又は疾患の重症度若しくは段階の異なる患者由来のサンプルにおいて、ステップａ）において決定されたものと同じマーカー（例えば、同じ栄養素、微量栄養素及び／又はそれらの代謝産物、及び／又はバイオマーカー）のステータスについての同様の栄養プロファイルを決定するステップと、ｃ）第３に、ステップａ）及びステップｂ）において決定された栄養プロファイルを比較して、疾患に罹患している患者の示差的な栄養所要量を決定するステップと、によって、疾患に罹患している被検者の疾患関連性の示差的な栄養所要量をインビトロで決定する方法に関する。
【０００９】
本方法により、特定の疾患に罹患している患者及び同じ疾患で重症度又は段階の異なる患者の栄養プロファイル及び特徴的な栄養所要量を決定することが可能になる。特定されたこれらの栄養所要量をもとに、疾患に罹患している患者の栄養プロファイルを健常な被検者の栄養プロファイルへと回復又は改善し得る量で栄養素及び微量栄養素を含む栄養組成物を製造することができる。
【００１０】
疾患に罹患している患者の栄養プロファイルを、健常な被検者又は状態の改善された（すなわち、疾患の重症度がより低い）患者の栄養プロファイルへと回復させ得る量で栄養素及び微量栄養素を含む栄養組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】示差的な栄養所要量を決定する方法論的アプローチを示すダイアグラムである。特定の疾患に関連付けられる示差的な栄養（nutritional／nutrient）所要量の定量には、栄養プロファイル又は栄養ステータスを使用する。栄養プロファイルは総合的な栄養ステータスの指標となり、一通りの栄養素及び微量栄養素の値、並びに／又は患者及び健常者集団間で測定されたそれらに関連するステータスマーカーを以て評価される。栄養プロファイルは、疾患の状態（再発、寛解、重症度）に関連する臨床情報（臨床マーカーを含む）と相関するものであり得る。栄養プロファイルは患者群と健常者群との間で比較され、及び／又は疾患の活動性、重症度、又は段階に関し相対的に定義された患者群内で比較される。患者と健常者対照との間で栄養プロファイルに違いが認められた場合、示差的な栄養学的／栄養所要量（ＤＮＲ）が決定される。図１中、「ＮＰ」は栄養プロファイルを意味する；「Ｄａ」は、疾患活動性若しくは重症度が高いこと、又は疾患が最終ステージであることを意味する；「Ｄｂ」は、疾患活動性若しくは重症度が低いこと、又は疾患が初期ステージであることを意味する；「Ｄｃ」は、疾患を有しないこと、又は健常な状態であることを意味する；「≠」は、栄養プロファイルが異なることを意味する；「ＮＰ（Ｄａ）」、「ＮＰ（Ｄｂ）」、「ＮＰＤｃ」は、それぞれＤａ、Ｄｂ、及びＤｃの栄養プロファイルを意味する。
【図２】臨床で証明された有効性で以て、症状を緩和する、寛解を維持する、及び患者のクオリティ・オブ・ライフを向上させるのに適するよう栄養レベルを回復させる目的で、製品の栄養組成にＤＮＲを使用する例を比喩的に示すダイアグラムである。図１中、「ＮＰ」は栄養プロファイルを意味する；「Ｄａ」は、疾患活動性若しくは重症度が高いこと、又は疾患が最終ステージであることを意味する；「Ｄｂ」は、疾患活動性若しくは重症度が低いこと、又は疾患が初期ステージであることを意味する；「Ｄｃ」は、疾患を有しないこと、又は健常な状態であることを意味する；「≠」は、栄養プロファイルが異なることを意味する；「ＮＰ（Ｄａ）」、「ＮＰ（Ｄｂ）」、「ＮＰＤｃ」は、それぞれＤａ、Ｄｂ、及びＤｃの栄養プロファイルを意味する。
【図３】スレオニン及びイソロイシンの代謝産物
【図４】スレオニン及びその他のアミノ酸酸化指数の比較分析による、ＩＢＤにおけるスレオニンの特徴的所要量の決定。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［定義］
「栄養ステータス」は、個人又は集団群（コホート）について定量可能な身体ステータスに関する。栄養ステータスは、対象らの栄養ステータス（栄養素の消費及び利用）に関する。本発明では、栄養ステータスは、かかる栄養ステータスの指標となるマーカー、特に、生物学的、生化学的、生理学的マーカー、又は被検者のサンプルにおいて決定されるその他のマーカーを使用して定量化される。
【００１３】
「栄養プロファイル」は、栄養素及び微量栄養素についての一揃いの定量的測定値、又はサンプル（赤血球細胞、血漿、血清、尿、組織などの体液）において評価される、それらの一揃いの関連するステータスマーカーに関し、したがって、幾種類かの、少なくとも２種類の栄養素、微量栄養素、又は関連するステータスマーカーの測定値が決定される必要がある。
【００１４】
「マーカー」は、１つのプロファイル又は一揃いのマーカー群において、ある種のパラメーター／マーカーを表す、定量可能なパラメーターである。かかるマーカーの定量化が、かかるマーカーのステータスとなる。このパラメーターは、栄養素（例えば、タンパク質、アミノ酸など）又は微量栄養素（ビタミン、ミネラルなどの元素）などのある種の化合物の量に直接関連し得る。しかしながら、マーカーは、栄養素濃度及び微量栄養素濃度及び／又はサンプルのステータスマーカーの数学的組み合わせから導かれる値にも関係し得る。マーカーは機能性マーカーであってもよく、特に、ある種の生理活性（例えば、酵素活性）又は生理学的ステータス（酸化的ストレスのステータス）に関連するマーカーであってもよい。
【００１５】
「示差的な栄養所要量」（ＤＮＲ）は、疾患に罹患している被検者と健常な被検者との間で異なる栄養所要量である。例えば、疾患に罹患している被検者のサンプルにおいて、栄養プロファイル、又は栄養素のプロファイルの定量分析は、健常な被検者の栄養プロファイルと比較して異なるものであり得る。このような状況下で栄養プロファイルにおいて観察された違いは、疾患に特徴的な栄養所要量の特定及び定量に使用できる。
【００１６】
「遊離形態のアミノ酸」は、遊離型のアミノ酸として組成物に含まれており、他のアミノ酸などの他の化合物には結合しておらず、したがって、ペプチド又はタンパク質の一部となっていないアミノ酸である。
【００１７】
そのため、「結合型のアミノ酸」は、ペプチド若しくはタンパク質の一部となっている、又はその他の化合物に結合しているアミノ酸である。
【００１８】
「タンパク質アミノ酸」は、タンパク質を生産するための翻訳機構により使用されるもの、並びに翻訳後のタンパク質において改質を受けるものなどといった、天然に生産されるタンパク質で見られるアミノ酸である。
【００１９】
「非タンパク質アミノ酸」は、天然に生産されるタンパク質には見られないものの、細胞及び生物における代謝産物又は構成成分であるアミノ酸である。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
節の見出しは、主題を明確にするためのものであり、主題を限定すると解釈されるべきではない。
【００２１】
本発明の概念を図１に示す。
【００２２】
疾患に罹患している被検者（疾患に罹患している被検者、患者）、例えば、患者のコホートにおける栄養プロファイルが決定され、健常な被検者（健常者対照）コホートの栄養ステータスと比較される。栄養プロファイルは、栄養素、微量栄養素、及び／又は栄養／微量栄養素ステータスマーカーのプロファイル（少なくとも２つの測定値に関する）を決定するステップを含む。健常な被検者及び疾患に罹患している患者のサンプルにおいて、特定のマーカーのステータス（かかるマーカーの定量）を決定する。患者の栄養プロファイルと健常な被検者の栄養プロファイルとの比較により、疾患に罹患している被検者と健常者対照との間の違いが特定され、疾患集団において示差的な栄養所要量を特定及び定量化するのに使用される。更に、疾患の重症度又は段階をもとに相対的に階層化した患者集団内で栄養プロファイルを比較すると、疾患活動性又は重症度若しくは段階を抑え、患者の病態を改善することに関連付けられる、一揃いの栄養素及び微量栄養素を特定することが可能になる。
【００２３】
次のステップにおいて、それぞれの示差的な栄養所要量を考慮して栄養組成物（製品）を配合することができる。更に、疾患活動性又は重症度の高い患者の栄養プロファイルを、疾患活動性又は重症度の低い患者の栄養プロファイルへと回復させることを目的とした栄養組成物（製品）の決定には、疾患の重症度若しくは段階に関し階層化された、疾患に罹患している患者集団内での栄養プロファイルの変動も使用される。
【００２４】
例えばある患者において、健常な被検者におけるスレオニン、及び／又はその酸化代謝産物（複数可）の値と比較してアミノ酸のスレオニンの血中濃度の低下が観察された場合、及び／又はその１種以上の酸化代謝物（複数可）濃度の低下が観察された場合（図３）、栄養組成物には、食品からのスレオニン、又はスレオニンの遊離アミノ酸それ自体の摂取を調節することを目的として、タンパク質若しくはペプチドのいずれかを含有させることになる（図２）。かかる組成物は、かかる患者のスレオニンについての特徴的所要量を満たすことを目的として、患者に投与される。この方法では、疾患に罹患している被検者のスレオニン要求の増大が満たされ、その結果、スレオニンの欠乏が補正される。
【００２５】
いくつかの疾患では、異なる栄養所要量に関連する異なる重症度が示される。このような場合では、栄養ステータスが決定される患者コホートは、疾患重症度が同じ又は同様である患者コホートであり得る。この方法では、特定の重症度の疾患に罹患している患者の示差的な栄養所要量を特定し、重症度に合わせた製品を提供することができる。この方法について、以下により詳細に記載する。
【００２６】
疾患に罹患している被検者に関し、示差的な栄養所要量を決定する方法：
本発明は、疾患に罹患している被検者における健常な被検者に対し示差的な栄養所要量により特徴づけられる疾患に罹患している被検者の、疾患関連性の示差的な栄養所要量を決定するための、インビトロ法であって、
ａ．疾患に罹患している被検者のサンプルにおいて、かかる被検者の栄養プロファイルを示すマーカー（栄養素、微量栄養素及び／又はそれらの代謝産物及び／又はバイオマーカーを含む）のステータスのプロファイルを決定するステップと、
ｂ．健常な被検者のサンプルにおいて、健常な被検者の栄養プロファイルを示すマーカーであって、ステップａで決定されたものと同じマーカーのステータスのプロファイルを決定するステップと、
ｃ．ステップａ及びステップｂにおいて決定されたプロファイルを比較して、疾患に罹患している被検者における栄養に関して示差的な栄養所要量を決定するステップと、を含む、方法に関する。
【００２７】
ステータスマーカーの様々な栄養素、微量栄養素、及びそれらに関係する代謝産物を決定（定量化）できる。それぞれのマーカーに関し、そのステータス、すなわち、かかるマーカーの有無又はその値が決定される。総合的な解析及び解釈にあたり、代謝において互いに関係している栄養素、微量栄養素又は関連マーカーをグループ化することができる。
【００２８】
決定した栄養プロファイルをもとに、疾患に罹患している被検者における特定の栄養素及び微量栄養素の欠乏を特定できる。これらの欠乏が特定されることにより、かかる欠乏を補填するよう適切にレベルを調節された、一揃いの適切な栄養素又は微量栄養素を栄養組成物に提供することが可能となる。疾患に罹患している被検者へのこの一揃いの栄養素の投与は、疾患に罹患している被検者の栄養プロファイルを健常な被検者の栄養プロファイルへと回復させる効果を有し得る。
【００２９】
栄養素に関する栄養ステータスを示すマーカーは、直接的マーカーでも間接的マーカーでもよい。直接的マーカーは、例えば、栄養素又は微量栄養素の量を示す。間接的マーカーは、直接決定されたマーカー、例えば、その組み合わせをもとにしたものであってよく、あるいは栄養素若しくは微量栄養素の代謝産物若しくは異化生成物、及び／又は栄養素若しくは微量栄養素のバイオマーカー若しくは異化生成物であってよく；あるいは、身体における特定の生理状態に関し得る。
【００３０】
間接的マーカーは、栄養素及び微量栄養素の相対的ステータスを決定すること、すなわち、特定の栄養素の他の栄養素に対する比、特定の栄養素の微量栄養素に対する比、特定の微量栄養素の特定の微量栄養素に対する比、又は上記の組み合わせ、を決定することに関連し得る。
【００３１】
更に、間接的マーカーは、疾患に罹患している被検者において機能マーカーを決定することにも関し得る。機能マーカーは、被検者の健康ステータスを示す生理学的又は生化学的パラメーターに関するマーカーである。例えば、機能マーカーは、赤血球トランスケトラーゼ活性、赤血球グルタチオン還元酵素活性、酸化的ストレスステータス、又は酸化窒素合成酵素活性などの測定値とすることができる。これらの機能マーカーは、健常な被検者では特定（参照）のステータスを示す。疾患に罹患している被検者ではこれらのマーカーの値が異なるため、健常な被検者と比較して栄養素又は微量栄養素が不適当であることが示され得る。栄養組成物において組み合わせ及びレベルが適切な栄養素及び微量栄養素により、疾患に罹患している被検者に適切な措置を行うことで、これらの機能マーカーのレベルは、健常な被検者において測定されるレベルへと回復され得る。
【００３２】
サンプル：
被検者より採取したサンプルに対し栄養プロファイルの決定を行う。
【００３３】
サンプルは、全血、血漿、血清、赤血球細胞、尿、又は組織生検からなる群から選択されたサンプルとすることができる。決定方法に応じ、異なるサンプルが同じ被検者から得られることになる。同じ被検者由来のサンプルを組み合わせて使用することもできる。第１の時点で被検者から１つのサンプル又は一揃いのサンプルを得て、第２又は更なる時点で追加のサンプル又は一揃いのサンプルを得ることも想到される。この方法では、被検者における栄養プロファイルの経時的な変化を測定できる。
【００３４】
サンプルは、以降の解析に関係する技術要件にしたがい加工される。
【００３５】
例えば、生体サンプルは、ミネラル及び微量元素の分析（ミネラルの解析を含む元素解析）のため、希釈後に誘導結合質量分析装置（inductively coupled mass spectrometer）に直接注入され得る。生体サンプルは、様々なタンパク質沈殿工程、抽出工程、洗浄工程、誘導体化工程にかけた後に、脂肪酸分析の場合には炎イオン化検出器に連結した気−液クロマトグラフィー装置に、あるいはアミノ酸又は水溶性ビタミンの分析の場合には質量分析計に連結した高圧液体クロマトグラフィーに注入されてもよい。生体サンプルを加工して、比色分析、蛍光分析、又は免疫アッセイ分析にかけることもできる。
【００３６】
決定される栄養プロファイル及びマーカー：
栄養プロファイルは、直接的マーカー及び間接的マーカーを包含する。マーカーは、生化学的マーカー、生物学的マーカー、若しくは機能マーカー、又はこれらの組み合わせであってよい。これらのマーカーは被検者の栄養ステータスに関し、したがって栄養素を考慮した栄養所要量を示す。これらのマーカーは、被検者が摂取した栄養によって影響を受け得る。これらのマーカーは、下記の様々な方法により決定できる。
【００３７】
これらのマーカーの定量分析により、栄養素についての栄養所要量が示される。栄養素は、主要栄養素及び微量栄養素であってよい。主要栄養素は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂肪、脂肪酸、炭水化物、又はコリンであってよい。微量栄養素は、ミネラル、ビタミン、カロテノイド、植物栄養素であってよい。栄養素はまた、構造類似性には依らずにその機能（機能栄養素）をもとにグループ化することができる。例えば、抗酸化物質は、そのものの構造には依らず抗酸化作用を提供する。抗酸化物質は、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、又はペプチドであってよい。
【００３８】
少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０個のマーカーのステータスが決定され得る。決定されるマーカーの最大数に特段の要件はないものの、上限は２５、５０、１００、２５０、又は１０００個になり得る。
【００３９】
タンパク質マーカー：
タンパク質マーカーは、タンパク質ステータスのマーカー、又はタンパク質異化のマーカーにより決定され、したがってタンパク質又はアミノ酸、あるいは特定のタンパク質及びアミノ酸を提供する栄養素の栄養所要量が決定され得る。タンパク質ステータスマーカーは、アルブミン、プレアルブミン、又は／及びホスホクレアチン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。異化のマーカーは、アンモニア、尿素、改質アミノ酸（モノメチル、及びジメチルアルギニン）、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００４０】
アミノ酸マーカー：
アミノ酸マーカーは、サンプル中の代謝産物／異化生成物を含むアミノ酸又はその誘導体の量をステータスの指標として決定するステップにより決定でき、ひいては、タンパク質若しくはアミノ酸、又は特定のタンパク質及びアミノ酸を提供する栄養素についての栄養所要量を決定できる。
【００４１】
アミノ酸マーカーは、アラニン、β−アラニン、サルコシン、アルギニン、モノメチルアルギニン、非対称−ジメチルアルギニン、対称ジメチルアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シトルリン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ヒドロキシプロリン、エタノールアミン、α−アミノ酪酸、β−アミノイソ酪酸、γ−アミノ酪酸、ホモシステイン、システイン、γ−グルタミル−システイン、システイニル−グリシン、ホモシスチン、システイン、シスタチオニン、メチオニンスルホキシド、セレノメチオニン、メチオニンスルホキシミン、セレノシステイン、セレノシスチン、エルゴチオネイン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、Ｓ−アデノシルメチオニンアミン、α−ケト酪酸、２−アミノ酪酸、２−アミノ−３−ケト酪酸、α−ケト−β−メチル酪酸（又はα−ケトイソ甘草酸）、α−ケトイソカプロン酸、又はα−ケト−β−メチル甘草酸からなる群から選択され得る。
【００４２】
好ましい実施形態によると、スレオニン、セリン、又はプロリン、好ましくはスレオニンのステータス、及びしたがってそれらの所要量が決定される。
【００４３】
好ましくは、スレオニンのステータスの指標は、スレオニン及び／又はスレオニンの１つ又は複数の異化生成物である。スレオニンの異化生成物（複数可）は、プロピオン酸、２−アミノ酪酸、２−ケト酪酸、２−アミノ−３−ケト酪酸、アミノアセトン、アセチルＣｏＡ、グリシン、又はこれらの組み合わせ（図３）からなる群から選択される。
【００４４】
好ましくは、イソロイシンのステータスの指標は、イソロイシン又はイソロイシンの異化生成物である。決定されるイソロイシン異化生成物は、好ましくは２−ケト−３−メチル甘草酸（図３）である。
【００４５】
脂肪酸マーカー：
脂肪酸マーカーは、関連ステータスを示す脂肪酸の定量分析をもとに決定でき、したがって、脂肪、リン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンなど）、又は特定の脂肪酸を提供する栄養素についての栄養所要量が決定され得る。
【００４６】
脂肪酸マーカーは、酪酸Ｃ４：０、カプロン酸Ｃ６：０、カプリル酸Ｃ８：０、カプリン酸Ｃ１０：０、ウンデカン酸Ｃ１１：０、ラウリン酸Ｃ１２：０、トリデカン酸Ｃ１３：０、ミリスチン酸Ｃ１４：０、ペンタデカン酸Ｃ１５：０、パルミチン酸Ｃ１６：０、ヘプタデカン酸Ｃ１７：０、ステアリン酸Ｃ１８：０、アラキジン酸Ｃ２０：０、ヘンイコサノン酸Ｃ２１：０、ベヘン酸Ｃ２２：０、リグノセリン酸Ｃ２４：０、ミリストレイン酸Ｃ１４：１  ｎ−５、ｃｉｓ−１０−ペンタデセン酸Ｃ１５：１  ｎ−５、パルミトレイン酸Ｃ１６：１  ｎ−７、ｃｉｓ−１０−ヘプタデセン酸Ｃ１７：１  ｎ−７、エライジン酸Ｃ１８：１  ｎ−９  ｔｒａｎｓ、オレイン酸Ｃ１８：１  ｎ−９  ｃｉｓ、ｃｉｓ−１１−エイコセン酸Ｃ２０：１  ｎ−９、エルカ酸Ｃ２２：１  ｎ−９、ネルボン酸Ｃ２４：１  ｎ−９、リノールエライジン酸（linoelaidic）Ｃ１８：２  ｎ−６  ｔｒａｎｓ、リノレン酸Ｃ１８：２  ｎ−６  ｃｉｓ、γ−リノレン酸Ｃ１８：３  ｎ−６、α−リノレン酸Ｃ１８：３  ｎ−３、ｃｉｓ−１１，１４−エイコサジエン酸Ｃ２０：２  ｎ−６、ｃｉｓ−８，１１，１４−エイコサトリエン酸Ｃ２０：３  ｎ−６、ｃｉｓ−１１，１４，１７−エイコサトリエン酸２０：３  ｎ−３、アラキドン酸Ｃ２０：４  ｎ−６、ｃｉｓ−１３，１６−ドコサジエン酸２２：２  ｎ−６、ｃｉｓ−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタン酸（eicosapentanoic）（ＥＰＡ）Ｃ２０：５  ｎ−３、ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）Ｃ２２：６  ｎ−３、又はリポ酸からなる群から選択され得る。
【００４７】
元素マーカー（ミネラルマーカーを含む）：
元素分析による定量、及び／又は鉄のステータスに関してはフェリチン、銅のステータスに関してはセルロプラスミンなどといった、それらの関連するタンパク質若しくは代謝産物の定量により、サンプル中の直接的元素（ミネラルを含む）マーカーが測定される。
【００４８】
元素マーカー（ミネラルマーカーを含む）は、リチウム（Ｌｉ）、ボロン（Ｂ）、マグネシウム（Ｍｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、ケイ素（Ｓｉ）、リン（Ｐ）、硫黄（Ｓ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ヒ素（Ａｓ）、セレニウム（Ｓｅ）、臭素（Ｂｒ）、ルビジウム（Ｒｂ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、スズ（Ｓｎ）、ヨウ素（Ｉ）、バリウム（Ｂａ）、チタニウム（Ｔｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）からなる群から選択され得る。
【００４９】
間接的元素マーカー（ミネラルマーカーを含む）は、１つ若しくは複数の元素及び／又はそれらの関連するタンパク質若しくは代謝産物の組み合わせを包含する。
【００５０】
直接的及び間接的マーカーは、元素（ミネラルを含む）の食事所要量を決定するのに使用できる。
【００５１】
ビタミンマーカー：
ビタミンマーカーは、直接的マーカー又は間接的マーカーのいずれかであり得る。直接的マーカーは、サンプル中のビタミン及び／又はそれらの代謝生成物の定量化を包含する。間接的マーカーは、１つ若しくは複数のビタミン及び／又はそれらの代謝生成物の組み合わせ、並びにビタミンのステータスを示す機能マーカー、例えば、それぞれビタミンＢ１（チアミン）のステータスに関しては赤血球トランスケトラーゼ活性、及びビタミンＢ２（リボフラビン）に関しては赤血球グルタチオン還元酵素活性などを包含する。
【００５２】
ビタミンマーカーは、ビタミンの食事所要量を決定するのに使用できる。ビタミンマーカーは、水溶性ビタミン又は脂溶性ビタミンからなる群から選択され得る。
【００５３】
水溶性ビタミン及びそれらの代謝産物は、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ニコチン酸、又はナイアシン）、ニコチンアミド、メチルニコチンアミド、ニコチン尿酸、コリン、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン）、ピリドキサールホスフェート、ピリドキシン酸、ビタミンＢ８（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、メチルテトラヒドロ葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、メチルコバラミン）、ヒドロキシコバラミン、アデノシルコバラミンからなる群から選択され得る。
【００５４】
脂溶性ビタミンは、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＫ２（メナキノン）、ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＥ（α−トコフェロール、δ−トコフェロール）、ビタミンＤ（２５−ＯＨ  ビタミンＤ２、ビタミンＤ  ２５−ＯＨ  Ｄ３、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、１α−２５−（ＯＨ）２  ビタミンＤ３）からなる群から選択され得る。
【００５５】
ヌクレオチドマーカー：
ヌクレオチドマーカー、及びしたがってヌクレオチドを提供する栄養素の必要所要量が決定され得る。
【００５６】
ヌクレオチドは、イノシン５’モノホスフェート、アデノシン５’モノホスフェート、シチジン５’モノホスフェート、グアノシン５’−モノホスフェート、イノシン５’モノホスフェート、ウリジン５’モノホスフェート、又はこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００５７】
植物栄養素マーカー：
植物栄養素マーカー、及びしたがって植物栄養素を提供する栄養素の必要所要量が決定され得る。
【００５８】
一実施形態では、植物栄養素は、カロテノイド（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン）、エラグ酸、フラボノイド（カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン）、クロロゲン酸、レスベラトロル、グルコシノレート、フィトエストロゲン（ゲニステイン、ダイゼインなど）、又はこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００５９】
ペプチドマーカー：
ペプチドマーカー、及びしたがってペプチドを提供する栄養素の必要所要量が決定され得る。
【００６０】
ペプチドは、還元型グルタチオン又は酸化型グルタチオンからなる群から選択され得る。
【００６１】
酸化的ストレスマーカー：
酸化的ストレスマーカー、及びしたがって酸化的ストレスのステータスを改善する栄養素の必要所要量が決定され得る。
【００６２】
一実施形態では、酸化的ストレスマーカーは、４−ヒドロキシノネナール、マロンアルデヒド、ニトロチロシン、カルボニル化タンパク質、トータルグルタチオン（total glutathione）、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、グルタチオン過酸化酵素活性、グルタチオン還元酵素活性、スーパーオキシドジスムターゼ活性、カタラーゼ活性、又はこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００６３】
酸化的ストレスのステータスに影響する栄養素は、食物性酸化剤であり得る。食物性酸化剤は、ビタミン、ミネラル（例えば、セレニウム）、植物化学物質、アミノ酸（例えば、システイン）、又はペプチド（例えば、グルタチオン）であり得る。これらの栄養素は、酸化的ストレスレベルを健常な被検者のものと同様のレベルに回復させる。
【００６４】
酸化窒素合成酵素活性：
窒素合成酵素活性マーカー、及びしたがって酸化窒素合成酵素活性に影響する栄養素の必要所要量が決定され得る。
【００６５】
一実施形態では、窒素合成酵素活性のマーカーは、ニトリト、ニトラート、モノメチルアルギニン、非対称ジメチルアルギニン、対称ジメチルアルギニン、アルギニン、シトルリン、オルニチン、アルギニノコハク酸、又はこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００６６】
浸透圧調節物質マーカー：
浸透圧調節物質のマーカー、及びしたがって浸透圧調節物質のステータスに影響する栄養素の必要所要量が決定され得る。これらのマーカーは機能マーカーである。
【００６７】
一実施形態では、浸透圧調節物質マーカーは、トリメチルアミンＮ−オキシド、ジメチルスルホニオプロピオナート、トリメチルグリシン、サルコシン、ベタイン、グリセロホスホリルコリン、ｍｙｏ−イノシトール、又はこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００６８】
マーカーの定量化方法：
栄養ステータスに関係する、サンプル中の上記のマーカーを決定するにあたり、多様な方法が知られている。マーカーの定量化を行う様々な非限定的な方法例について以下に記載する。当該技術分野で既知のその他の方法も、追加的に／代替的に使用され得る。
【００６９】
本発明の観点において、栄養ステータスは、栄養素及び微量栄養素のステータスを示すことができ、生化学的マーカー、生物学的マーカー、機能的マーカー、又はその他のマーカーであり得る、直接的又は間接的マーカーのステータスのプロファイルに関する。
【００７０】
直接的生化学的マーカーは、特定の栄養素の濃度であり得る。栄養素は、主要栄養素（例えば、タンパク質及び誘導されるアミノ酸、炭水化物、脂質）又は微量栄養素（ビタミン及び元素（ミネラルを含む））であり得る。
【００７１】
間接的生化学的マーカーは、主要栄養素、若しくは微量栄養素、又はこれらの組み合わせのいずれかに関係する栄養ステータスの指標となり得る。
【００７２】
栄養ステータスの指標は、ある栄養素そのものがなくともその濃度がかかる栄養素のステータスを示す、バイオマーカーであってもよい。例えば、鉄についてはフェリチン、又はビタミンＤについては２５−ヒドロキシ−ビタミンＤビタミン。
【００７３】
その他の栄養素のステータスマーカーは、単一の栄養素又はその代謝産物の濃度、又は栄養素及びそれらの代謝産物の濃度の組み合わせ（比）、又は栄養素の濃度とその他の生化学的マーカー（例えば、栄養素／微量栄養素の輸送タンパク質）及び／又は生物学的及び／又は機能マーカー（例えば、トランスケトラーゼ活性、赤血球グルタチオン還元酵素活性などの比酵素活性）の濃度との組み合わせから誘導され得る。
【００７４】
様々な方法が、直接的又は間接的生化学的マーカーのステータスの決定に関係する。以下、かかるマーカーの様々な定量化法を議論する。しかしながら、それぞれの定量化の方法は、特定の栄養素又は一揃いの栄養素についての栄養所要量を導き出すものであれば、本発明の方法に関し決定的なものではないことは理解されたい。
【００７５】
指標アミノ酸酸化（Indicator of aminoacid oxidation：ＩＡＡＯ）の方法論：
一例として、必須アミノ酸の特徴的な所要量は、指標アミノ酸酸化（ＩＡＡＯ）法を用い定量できる（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＳＡ，Ｔｈｏｒｐｅ  ＪＭ，Ｂａｌｌ  ＲＯ，Ｐｅｎｃｈａｒｚ  ＰＢ．；Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．２００１  Ｆｅｂ，７３（２）：２７６〜８２．；Ｅｌａｎｇｏ  Ｒ，Ｂａｌｌ  ＲＯ，Ｐｅｎｃｈａｒｚ  ＰＢ．，Ｊ  Ｎｕｔｒ．２００８  Ｆｅｂ；１３８（２）：２４３〜６．Ｒｅｖｉｅｗ）。窒素バランスに制限があることから、ヒトにおける必須アミノ酸の必要所要量の評価にあたり、安定な同位体の炭素酸化をベースとした方法が開発された（Ｐｅｎｃｈａｒｚ  ＰＢ，Ｂａｌｌ  ＲＯ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．２００３；２３：１０１〜１６）。ＩＡＡＯ法は、アミノ酸の必要所要量の評価に関して、極わずかな事前調節（minimal prior adaptation）を以てその正当性が確認されている（Ｂｒｏｓｓ  Ｒ，Ｂａｌｌ  ＲＯ，Ｐｅｎｃｈａｒｚ  ＰＢ．，Ｊ  Ｎｕｔｒ．１９９８  Ｎｏｖ；１２８（１１）：１９１３〜９；Ｔｈｏｒｐｅ  ＪＭ，Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＳＡ，Ｂａｌｌ  ＲＯ，Ｐｅｎｃｈａｒｚ  ＰＢ．，Ｊ  Ｎｕｔｒ．１９９９  Ｆｅｂ；１２９（２）：３４３〜８）。ＩＡＡＯ法−は、タンパク質の合成の際に、ある必須アミノ酸が欠乏していると、いわゆる指標アミノ酸（通常、Ｌ−［１−１３Ｃ］フェニルアラニン）を含むその他の全てのアミノ酸が使用されなくなるために過剰になり、したがって酸化されることになるという概念に基づく（Ｐｅｎｃｈａｒｚ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ  ２００３）。これは主に、過剰なアミノ酸の貯蔵は不可能であり、したがって必ずタンパク質への組み込み又は酸化のいずれかが行われることを理由とする。制限アミノ酸の摂取が増加するに伴い、タンパク質への組み込みが増加することを反映して指標アミノ酸の酸化は減少することになる。制限アミノ酸の必要所要量が充足されると、被検アミノ酸の摂取を増加させても指標アミノ酸の酸化はそれ以上変化しなくなる。指標アミノ酸の酸化の減少が止まり、プラトーに達する変曲点は、「ブレイクポイント」と呼ばれる。二相（bi-phase）線形回帰分析により特定されるブレイクポイントは、制限（被検）アミノ酸に関し推定される平均必要所要量を示す。ＩＡＡＯモデルの具体的な強度は、酸化の絶対レベルを問題とせず、むしろ同じブレークポイント（所要量推定）を生じる、広範な摂取レベルにわたる相対的な酸化を問題とするものである。この方法は、広く受け入れられているアプローチであるものの、重大な制限を示す。必須アミノ酸のみに適用可能であることに加えて、各臨床検査ごとに評価可能な必須アミノ酸は１種のみであり、臨床検査は患者にとって侵襲的であり（トレーサーの動態検査及び経時的な複数回の食事変更）、更には時間もかかってしまう。
【００７６】
栄養学的プロファイル（又は栄養素プロファイル）：
栄養素の必要所要量は、栄養素及びその代謝産物の定量的分析、すなわち生物学的サンプルにおける栄養素プロファイルを用い決定できる。高性能液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分析、分光測定、又は免疫アッセイなどの分析法をベースとして、分析法を組み合わせて使用することで栄養素プロファイルが得られる。栄養素プロファイルは、幅広い栄養素及び微量栄養素並びにそれらの代謝生成物（代謝産物）に加え、関連するタンパク質である栄養素／微量栄養素輸送体、あるいは栄養素／微量栄養素に特異的な酵素活性などの機能バイオマーカーの濃度を決定するステップを包含する。この栄養素プロファイルによるアプローチは、広範囲の栄養素及び微量栄養素をカバーし、したがって栄養素間の相互作用の評価を可能にするのに加え、動態検査が必要とされないことから、より迅速であり、かつ患者にとって比較的低侵襲性なものとなり得るという利点を有する。
【００７７】
アミノ酸の必要所要量の決定に関し、アミノ酸及びその特徴的な代謝生成物の濃度の並行分析（concomitant analysis）を用い、特徴的なアミノ酸の酸化を決定することができる。タンパク質酸化の結果として生じる特徴的なアミノ酸の酸化測定を用い、タンパク質へのそれらの相対的な組み込み、及びタンパク質合成にあたっての代謝要求を充足する特異的な必要所要量を推察できる。例えば、スレオニンは、２−ケト酪酸、２−アミノ酪酸、及び２−アミノ−３−ケト酪酸（図３）へと酸化される。
【００７８】
例えば、スレオニン及びその代謝産物の濃度の並行分析を行って、スレオニンの酸化を評価できる（図３の左側を参照のこと）。次に、スレオニンの酸化をベンチマークとして用い、例えば、イソロイシンなどのそれぞれ必須アミノ酸と比較する（図３の右側を参照のこと）。イソロイシンの場合には、イソロイシン、及びその酸化生成物である２−ケト３−メチル−甘草酸の濃度を決定して酸化を測定する（図２の右側を参照のこと）。酸化は、スレオニン及びその代謝産物（複数可）の濃度を組み合わせた計算結果として定義される［例えば、
Ｌ−スレオニン濃度／２−ケト酪酸濃度比
Ｌ−スレオニン濃度／（２−ケト酪酸濃度＋２−アミノ酪酸濃度）比
Ｌ−スレオニン濃度／（２−ケト酪酸濃度＋２−アミノ酪酸濃度＋２−アミノ３−ケト酪酸濃度）比
又はこれらの任意の数学的な組み合わせ
又はこれらと、その他のマーカー若しくはタンパク質異化生成物（例えば、循環アンモニア濃度、尿素サイクル中中間体濃度（オルニチン、シトルリン、アルギニン、コハク酸、アルギニン）、対称ジメチルアルギニン濃度、対称ジメチルアルギニン濃度）との任意の数学的な組み合わせ
これらと、酸化的ストレスマーカーである、酸化窒素代謝産物（血漿／血清中酸化窒素レベル、尿中ニトラートレベル）のマーカーとの任意の組み合わせ
これらと、モニターに使用される臨床マーカー、例えば、ＩＢＤ活動性：ＣＲＰ、血球数の違い、糞便中カルプロテクチン、鉄ステータス、血液沈降速度、タンパク質の電気泳動、糞便中好中球、及びビタミンＢ１２ステータスなどとの任意の組み合わせ］。
【００７９】
例えば、スレオニン及びイソロイシンの酸化を、図４で行った通り疾患に罹患している被検者及び健常な被検者との間で比較できる（図中、実施例はＩＢＤを対象の疾患としている）。図４に見ることができる通り、スレオニン酸化が健常な被検者と比較して低い場合にのみ、ＩＢＤにおけるスレオニンの栄養必要所要量が増大していることが特定され得る。
【００８０】
そのため、本発明は、疾患に罹患している被検者及び健常な被検者のスレオニン酸化及び／又はイソロイシン参加を比較することを含む、スレオニン及び／又はイソロイシンの栄養必要所要量を決定する方法にも関する。
【００８１】
タンデム質量分析と連結した超性能液体クロマトグラフィーによるアミノ酸の定量化：
アミノ酸も、被検者から得られたサンプルにおいて直接測定できる。
【００８２】
サンプルの準備
５０μＬの血漿又は血清に、１０μＬの標識内部標準と、タンパク質沈殿用に１４０μＬの冷メタノール（０．１％ギ酸）とを加える。次に、サンプルをボルテックスにより撹拌（５分間）した後、４℃にて１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。次に上清を回収して誘導体化を行う。
【００８３】
アミノ酸誘導体化
製造元による手順にしたがって、ＡｃｃＱ−Ｔａｇ  Ｕｌｔｒａ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用して誘導体化を実施する：１０μＬの標準アミノ酸混合溶液又はサンプルの上清を７０μＬのＡｃｃＱ−Ｔａｇ  Ｕｌｔｒａボレート緩衝液（ｐＨ＝８．８）と混合する。緩衝化した混合物に２０μＬの再構成したＡｃｃＱ−Ｔａｇ  Ｕｌｔｒａ試薬（３ｍｇ／ｍＬの、アセトニトリル中６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバマート、すなわちＡＱＣ）を加え、誘導体化を実施する。次に、サンプルを直接ボルテックスにかけた後、５５℃で１５分間インキュベートする。
【００８４】
タンデム質量分析に連結した超性能液体クロマトグラフィーを用いたアミノ酸分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）プローブによりＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＴＱ質量分析計とオンラインで連結させたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムでＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。クロマトグラフ分離は、溶離液Ａ及びＢの二相システムを使用してＷａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ−Ｔａｇ  Ｕｌｔｒａカラム（２．１ｍｍ内径×１００ｍｍ、粒子径１．７μｍ）を用い実施する。溶離液Ａは、市販のＡｃｃＱ−Ｔａｇ  Ｕｌｔｒａ溶離液Ａ濃縮液（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）１０％と、水９０％とを含有する。溶離液Ｂは、市販のＡｃｃＱ−Ｔａｇ  Ｕｌｔｒａ溶離液Ｂ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）とする。使用する分離勾配は、０〜０．５４分間（９９．９％  Ａ）、５．７４分間（９０．９％  Ａ）、７．７４分間（７８．８％  Ａ）、８．０４（４０．４％  Ａ）、８．０５〜８．６４（１０％  Ａ）、８．７３〜１０．０（９９．９％  Ａ）とする。オートサンプラー温度は２０℃に設定し、カラム温度は５５℃に設定する。サンプルの注入容量は２μＬとする。Ｗａｔｅｒｓ  ＩｎｔｅｌｌｉＳｔａｒｔルーチンを使用して、測定する各アミノ酸に対し、コーン電圧及び衝突エネルギーの値を決定する。衝突により全てのＡＱＣ付加体から解離される、共通の主要な生成物（common main product）を表すイオンｍ／ｚ  １７１を各アミノ酸の定量化に使用した。アミノ酸の保持時間は、標準アミノ酸溶液をＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入することにより決定する。イオン源の設定には以下を使用した：キャピラリー電圧２．５ｋＶ（ＥＳＩ＋）；脱溶媒温度６００℃；脱溶媒ガス流量１０００  Ｌ／ｈ；イオン源温度１５０℃。
【００８５】
分析器の設定は、次の通りの一般値を使用する各較正中に決定する：第１四重極２．９５（低質量分解能（low mass resolution））、１４．３５（高質量分解能（high massresolution））、イオンエネルギー１：０．１；第２四重極２．９５（低質量分解能）及び１４．４０（高質量分解能）、イオンエネルギー２：０．３。アルゴンを衝突ガスとして、０．１５ｍＬ／分の流量で使用した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＭａｓｓＬｙｎｘＴＭソフトウェアによりＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムの管理及びデータ取得を実施した。ＴａｒｇｅｔＬｙｎｘＴＭソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によりデータ分析を実施した。
【００８６】
ガス−液体クロマトグラフィーによる脂肪酸の定量化：
薄層クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーなどの任意の好適な方法により脂肪酸の濃度を決定できる。
【００８７】
以下、ガスクロマトグラフィー法を例示する。
【００８８】
サンプルの準備
酸性条件下で血漿及び赤血球細胞（ＲＢＣ）脂肪酸の誘導体化を行う。簡潔に、ネジ蓋付きガラスチューブ内で、２００μＬのサンプルを、メタノール、塩酸メタノール、ヘキサン、及び内部標準液と混合する。チューブに蓋をして、血漿については１００℃で６０分間、ＲＢＣについては９０分間加熱した後、室温への冷却を行い、水を加えて反応を停止する。次に、チューブを１２００ｇで５分間遠心分離して、上側の有機相を回収し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析する。
【００８９】
気−液クロマトグラフィーによる脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の高速分析
全てのＦＡＭＥ分析を、フューズドシリカＢＰＸ−７０キャピラリーカラム（１０ｍ×０．１ｍｍ内径、膜厚０．２ｍ；ＳＧＥ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を取り付けた７８９０  Ａｇｉｌｅｎｔガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で実施する。分割インジェクタ（３５：１）及び炎イオン化検出（ＦＩＤ）システムをそれぞれ２５０℃及び３００℃で操作した。オーブンの容量は、Ａｇｉｌｅｎｔから市販の装置を使用しておよそ５４００ｃｍ３に低減した。オーブン温度のプログラム設定は、４５℃で０．５分間等温、１００℃／分で１８０℃に上昇、この温度で０．５分間等温、９℃／分で２２０℃まで上昇させ、この温度で０．５分間等温の後、５０℃／分で２５０℃に上昇させた（合計操作時間７．９分）。キャリアガス（Ｈ２）流を０．７ｍＬ／分で一定に維持し、ＦＩＤシグナルを５０Ｈｚで取得した。
【００９０】
ＦＡＭＥの識別
標準ＦＡＭＥの混合物を使用して、脂肪酸の識別を確認した。この混合物は、次のメチルエステルを含有する：酪酸（４：０）、カプロン酸（６：０）、カプリル酸（８：０）、カプリン酸（１０：０）、ウンデカン酸（１１：０）、ラウリン酸（１２：０）、トリデカン酸（１３：０）、ミリスチン酸（１４：０）、ミリストレイン酸（１４：１  ｎ−５）、ペンタデカン酸（１５：０）、ペンタデセン酸（１５：１  ｎ−５）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１  ｎ−７）、ヘプタデカン酸（１７：０）、ヘプタデセン酸（１７：１  ｎ−７）、ステアリン酸（１８：０）、エライジン酸（ｔｒａｎｓ−１８：１  ｎ−９）、オレイン酸（１８：１  ｎ−９）、リノールエライジン酸（ａｌｌ  ｔｒａｎｓ−１８：２  ｎ−６）、リノレン酸（１８：２  ｎ−６）、アラキジン酸（２０：０）、γ−リノレン酸（１８：３  ｎ−６）、エイコセン酸（２０：１  ｎ−９）、リノレン酸（１８：３  ｎ−３）、ヘンイコサノン酸（２１：０）、エイコサジエン酸（２０：２  ｎ−６）、ベヘン酸（２２：０）、エイコサトリエン酸（２０：３  ｎ−６）、エルカ酸（２２：１  ｎ−９）、エイコサトリエン酸（２０：３  ｎ−３）、アラキドン酸（２０：４  ｎ−６）、ドコサジエン酸（２２：２  ｎ−６）、リグノセリン酸（２４：０）、エイコサペンタン酸（eicosapentanoic acid）（２０：５  ｎ−３）、ネルボン酸（２４：１  ｎ−９）、及びドコサヘキサエン酸（２２：６  ｎ−３）。
【００９１】
硫黄含有分子の定量化：
硫黄含有分子は、アミノ、及び誘導体（ホモシステイン、システイン、γ−グルタミル−システイン、システイニル−グリシン、ホモシスチン、システイン、シスタチオニン、メチオニンスルホキシド、セレノメチオニン、メチオニンスルホキシミン、セレノシステイン、セレノシスチン、エルゴチオネイン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、Ｓ−アデノシルメチオニンアミン）、ペプチド（還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオン）、及びリポ酸を含有する。
【００９２】
サンプルの準備
血漿、血清又は赤血球細胞サンプル（５０μＬ）を、５０μＬの内部標準グルタチオンエチルエステル（ＧＳＨｅｅ）と混合した後、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム及びアンモニアの水溶液（０．５％ｖ／ｖ、ｐＨ９．５）中に１０ｍＭヨード酢酸を含む１００μＬの誘導体化溶液で処理する。この混合物を室温で１５分間保管する。反応を停止させ、５０μＬの冷スルホサリチル酸溶液（１０％ｗ／ｖ）を加えてタンパク質を沈殿させる。次に、この混合物を４℃にて１６０００  ｘ  ｇで１５分間遠心分離する。上清（２００μＬ）をガラス製バイアルに写し、及び２μＬを注入した。
【００９３】
タンデム質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）に連結した超性能液体クロマトグラフィーによる、誘導体化した硫黄含有分子の分析
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）プローブによりＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＴＱ質量分析計とオンラインで連結させたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムでＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施する。Ｗａｔｅｒｓ  ＨＳＳ  Ｔ３  ２．１ｍｍ  ＋  １００ｍｍ、１．７μｍカラムを使用して、クロマトグラフ分離を実施する。溶媒Ａ（０．１％ギ酸水溶液）及び溶媒Ｂ（０．１％ギ酸を添加したアセトニトリル／水２０：８０、ｖ／ｖ）から構成された勾配を使用して０．２５ｍＬ／分の流量で溶出を行う。勾配は次の通りとした：１００％溶媒Ａ  ０〜２分間、１％溶媒Ａ  ２〜７分間、９９％溶媒Ａ  ７．１〜１０分間。質量分析計は、次の条件下で操作する：キャピラリー電圧：２．５ＫＶ；イオン源温度：１５０℃；脱溶媒温度：６００℃；脱溶媒ガス流速：１０００Ｌ／Ｈｒ。第１四重極に関しては、低質量分解能及び高質量分解能は、イオンエネルギーを０．１とすると、それぞれ２．９５及び１４．３５になる。第２四重極に関しては、低質量分解能及び高質量分解能は、イオンエネルギーを０．３とすると、それぞれ２．９５及び１４．４０になる。アルゴンを衝突ガスとして、０．１５ｍＬ／分の流量で使用した。それぞれコーン電圧及び衝突エネルギー値を最適化して、Ｗａｔｅｒｓ  ＩｎｔｅｌｌｉＳｔａｒｔソフトウェアを使用して各代謝産物についてＭＲＭ遷移を決定した。これらの条件を使用して、各硫黄含有分子をＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入して保持時間を決定する。１つの遷移チャネルのみを監視するため、ＭＲＭ関数（function）ごとにＭＲＭ−ＭＳ法を構築する。Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＭａｓｓＬｙｎｘＴＭソフトウェアによりＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムの管理及びデータ取得を実施した。ＴａｒｇｅｔＬｙｎｘＴＭソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によりデータ分析を実施した。
【００９４】
元素（ミネラルを含む）の定量化：
当該技術分野で既知の任意の好適な方法により元素（ミネラルを含む）を定量化できる。実施例を以下に提供する。
【００９５】
サンプルの準備
５％１−ブタノール、０．０５％ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００、及び１％水酸化アンモニウムを含有する希釈液で容量１５０μＬの生体液（血漿、血清、尿など）を１：１０希釈する。
【００９６】
誘導結合プラズマ三連四重極質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ／ＭＳ）を用いる元素分析
８８００  ＩＣＰ−ＭＳ／ＭＳ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を低マトリックスプラズマモードで動作させて元素分析を実施する。ＩＣＰ−ＭＳシステムには、サンプルを直接導入するため一体化型オートサンプラーを取り付ける。同軸型ネブライザー及びＳｃｏｔｔ型のダブルパススプレーチャンバから構成されたサンプル導入部に、一体型ぜん動式ポンプにより０．３５ｍＬ／分の流量でサンプルを送り込む。プラズマによるイオン化後、分析種のイオンを質量分析計に送り込む。ＩＣＰ−ＭＳシステムには、ＭＳ／ＭＳ分析モードの適用を可能にする三連四重極プラズマ質量分析計を取り付けた。外部較正法により各ミネラルの定量化を行った。プラズマ揺動及びマトリックス効果を補正又は低減するため、オンライン希釈を適用してサンプルを多元素混合内部標準液と混合した。品質管理に関し、各分析試行中に、ヒトの認証標準物質（Ｓｅｒｏ，ＮｏｒｗａｙのＳｅｒｏｎｏｒｍ  Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌ−１）を分析した。測定した元素を別表１に掲載する。
【００９７】
誘導結合プラズマ三連四重極質量分析に連結した高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ／ＭＳ）を使用する元素種分析
全てのクロマトグラフ実験に関し、１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ｄｕａｌ−ｐｉｓｔｏｎ  ＵＨＰＬＣポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｏｋｉｏ，Ｊａｐａｎ）を使用する。アイソクラティック溶出モードで、移動相として５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．４）を適用し、ＩＣＰ−ＭＳに連結したサイズ排除クロマトグラフィーにより、生体分子に弱く結合しているミネラル種の分析を行う。安定種の分析に関し、０．４ｍＬ／分の流量で勾配溶出を適用し、逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳを使用する。移動相Ａは２％アセトニトリル（ＡＣＮ）、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）から構成され、移動相Ｂは９８％ＡＣＮ、０．０５％ＴＦＡから構成される。典型的な勾配は、３０分間のうちにアセトニトリルを５％から８０％に線形増加させることから構成される。生体液の分析に関し、注入容量３〜２０μＬを適用する。検出したクロマトグラフピークに対応する画分を回収することにより、ミネラル種の識別を達成する。最後に、回収した画分を予備濃縮し、脱塩し、生体分子の識別のため分子ＭＳにより分析する。ポストカラム同位体希釈分析により定量化を行う。ここに、同位体濃縮した元素を２％硝酸に溶解し、０．２ｍＬ／分の一定流量を維持しながらぜん動ポンプにより注入した。
【００９８】
水溶性ビタミン：
水溶性ビタミンは、被検者から得られたサンプル中で直接定量化できる。
【００９９】
化学物質
ビタミン標準、ギ酸、酢酸をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水はＷａｔｅｒ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入し、アセトニトリルはＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）から購入した。標識されたビタミン標準は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）から購入する。
【０１００】
サンプルの準備
血漿／血清は−８０℃で保存し、解凍してすぐ氷上に置いた。血漿／血清には標識した内部標準混合物を添加し、１０分間置く。１００μＬの血漿／血清を１００μＬの１０％ＴＣＡ酸と混合して、タンパク質を沈殿させる。ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、及び代謝産物の分析のため、サンプルを１０分間氷上で抽出し、４℃にて１７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ビタミンＢ９の分析に際しては、１００μＬの血清／血漿を、酢酸及びアスコルビン酸を含有している２００μＬ９０％メタノール／水溶液と混合する。サンプルを２０分間撹拌し、遠心分離し、上清を窒素流下で乾燥させる。サンプルを水に再懸濁し、上述のＵＰＬＣ条件を用いて注入した。
【０１０１】
タンデム質量分析に連結した超性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、及びビタミンＢ９、及び代謝産物の分析
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）プローブによりＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＴＱ質量分析計とオンラインで連結させたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムに１０μＬの上清を注入した。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＨＳＳ  Ｔ３  ２．１×１００ｍｍカラム、０．６ｍＬ流速、溶媒Ａ−０．１％ギ酸水溶液、溶媒Ｂ−０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液を使用して、クロマトグラフ分離を達成した。勾配のプログラム設定は、９分間のうちに１００％のＡから１００％のＢへと勾配させるものとする。ビタミンごとに２遷移についてＭＲＭモードを設定して、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＥＶＯ  ＴＱＳ質量分析計でビタミンの検出を実施した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＭａｓｓＬｙｎｘＴＭソフトウェアによりＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムの管理及びデータ取得を実施した。ＴａｒｇｅｔＬｙｎｘＴＭソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によりデータ分析を実施した。
【０１０２】
脂溶性ビタミン：
脂溶性ビタミンは、被検者から得たサンプル中で直接定量化できる。
【０１０３】
化学物質
ヘキサン、メタノール、エタノール、脱イオン水及びアセトニトリルはＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＥ）ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入する。ビタミンの標準はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入する。分析用カラム（ＨＳＳ  Ｃ１８，１．７□ｍ  ３ｘ１００ｍｍ）及び固相抽出（ＳＰＥ）プレートは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入する。
【０１０４】
サンプルの準備
ビタミンを光による分解から保護するため、研究室に適切に設置されたフィルターを利用した紫外線（ＵＶ）保護下でサンプルの調製工程を実施した。液−液抽出法と組み合わせてタンパク質沈殿を用い、脂溶性ビタミンを抽出する。簡潔に、２００□Ｌのブチル化ヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）のエタノール溶液に２００□Ｌのヒト血清を加えてタンパク質沈殿を実施し、サンプルを酸化から保護した。次にサンプルを２．５ｍＬのｎ−ヘキサンで抽出し、超音波処理し、遠心分離するのを３回繰り返した。回収した上清を併せて窒素流下で乾燥させて、最終的に、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール９：１で再構成する。
【０１０５】
２つの２５−ヒドロキシビタミンＤ代謝産物を異なる抽出プロトコルにかける。簡潔に、１５０□Ｌのヒト血清に、タンパク質の沈殿用に１５０□□Ｌのメタノールを加える。遠心分離（４℃にて４０００ｒｐｍで１５分間）により回収された上清画分を収集し、メタノール及び水で予調整したＯａｓｉｓ  ＨＬＢ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）カートリッジを使用してＳＰＥクリーンアップ工程にかけた。カートリッジにサンプルを充填し、水及び５％メタノール溶液で洗浄する。分析種の溶出にはメタノールを使用する。次に、サンプルを乾燥させ、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール９：１で再構成する。
【０１０６】
超性能コンバージェンスクロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＵＰＣ２−ＭＳ／ＭＳ）による脂溶性ビタミン及び代謝産物の分析
Ｘｅｖｏ  ＴＱＳ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を取り付けたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ超性能コンバージェンスクロマトグラフィー（ＵＰＣ２）システムでＵＰＣ２−ＭＳ／ＭＳ分析を行う。ＨＳＳ  Ｃ１８分析カラムを使用して、ポンプＡ（移動相、ＣＯ２）及びポンプＢ（移動相、１０ｍＭ酢酸アンモニウムメタノール溶液）を接続してクロマトグラフ分離を実施する。適用する勾配は、２％有機溶媒から開始し、１４分間の合計実施時間のうち４０％までの間、流量１．２ｍＬで用いた。ＭＳ分析は以下の通りとする：キャピラリー電圧：２．６ｋＶ、脱溶媒温度：５００℃、コーンガス流量：１５０Ｌ／ｈｒ、脱溶媒ガス流量：５００Ｌ／ｈｒ。この分析を実施するにあたり、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を適用する。Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＭａｓｓＬｙｎｘＴＭソフトウェアによりＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムの管理及びデータ取得を実施した。データ分析はＴａｒｇｅｔＬｙｎｘＴＭソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で実施した。
【０１０７】
例えば、ビタミンＤのステータスを決定するべく、ある程度の量で２５−ヒドロキシ−ビタミンＤビタミンを使用してもよい。
【０１０８】
更なる微量栄養素分析：
ビタミン又はミネラル／微量元素ステータスは、以下の方法例を用い実施できる。
【０１０９】
ビタミンＢ１２及びビタミンＢ９（葉酸）ステータスは、競合作用を利用して測定することもできる。
【０１１０】
ビタミンＢ１２ステータスについては、血漿／血清メチルマロン酸及び全ホモシステイン、並びに血漿濃度ホロトランス（holotrans）コバラミンＩＩの定量化を実施できる。
【０１１１】
鉄のステータスのついては、フェリチン、可溶性トランスフェリン輸送体、又はヘプシジンの定量化を実施できる。
【０１１２】
ヨウ素ステータスに関し、チロキシンＴ４及びＴ３の定量化を実施することができる。
【０１１３】
銅のステータスに関しては、セルロプラスミン及び銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの定量化を行うことができる。
【０１１４】
代謝産物の更なる分析：
アンモニア及び尿素の定量化のため、血漿／血清にはＣｏｂａｓ（登録商標）Ｃ１１１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して更なる分析を行う。測定は分光測定法により実施する。アンモニア濃度は、３４０ｎｍ（波長Ａ）及び６２９ｎｍ（波長Ｂ）で計算されたエンドポイント低下である。尿素濃度は、３４０ｎｍ（波長Ａ）及び４０９ｎｍ（波長Ｂ）での速度論的低下に依る計算モードを使用して決定する。
【０１１５】
組成物：
本発明の組成物は、疾患に罹患しているヒトにおいて、健常なヒト又は健常なコホートの栄養プロファイル又はステータスとの代謝的、生理的及び機能的等価性を回復する量で栄養素を含む。
【０１１６】
第１に、疾患に罹患しているヒト、又は同じ疾患に罹患している若しくは同じ重症度の疾患に罹患している患者コホートに関し示差的な栄養所要量を決定する。
【０１１７】
この方法では、疾患に罹患している患者に最適な量で提供されていない、ひいては提供されている量が少なすぎる又は多すぎる栄養素を識別でき、一般的には提供されている量が少なすぎる栄養素を識別できる。
【０１１８】
次に、疾患に罹患しているヒトの栄養プロファイルを健常なヒトの栄養プロファイルへと回復させる量で栄養素を含有するよう栄養組成物を調整してもよい。最適には、疾患に罹患している被検者の栄養プロファイルは、疾患に罹患している被検者用に調整された栄養組成物の摂取後に同じ又はほとんど同一の栄養ステータスを有することになる。
【０１１９】
例えば、ＩＡＡＯ方法論により決定される、スレオニンの欠乏を示す疾患に罹患している被検者のための栄養組成物は、スレオニンの欠乏を軽減又は解消する量で、遊離スレオニン又は／及びタンパク質結合型スレオニンのいずれかの形態のスレオニンを含む。
【０１２０】
したがって、栄養組成物は、通常食よりも少量でこれらの栄養素のみを含む栄養補助食品であってよい。
【０１２１】
あるいは、栄養組成物を、疾患患者が正常な栄養ステータスのため必要としている全栄養素を提供する、したがって、被検者の栄養所要量が健常な被検者と比較して示差的である栄養素と、被検者の栄養所要量が健常な被検者と同じである栄養素と、の両方を提供する、完全食の形態とすることもできる。完全食は、疾患患者において、健常な被検者と比較して必要性が低い栄養素については少量でこれらの栄養素を含有し得る。
【０１２２】
配合：
上記の組成物は、液体又は固体形態で製剤化することができる。
【０１２３】
組成物は、本開示を読めば当業者が特定することができる少なくとも１種の更なる活性作用物質、担体、ビヒクル、賦形剤、又は補助剤を更に含むことができる。
【０１２４】
組成物は、栄養組成物又は医薬品の形態とすることができる。栄養組成物又は医薬品は、本発明の組成物を含み得る。
【０１２５】
栄養組成物：
本明細書で使用するとき、用語「栄養組成物」には、完全栄養組成物、部分的な又は不完全な栄養組成物、及び疾患又は状態に合わせた栄養組成物が含まれ得るがこれらに限定されない。完全栄養組成物（すなわち、要求される必須主要栄養素及び必須微量栄養素を全て含有する組成物）を患者の唯一の栄養源として使用できる。患者は、その栄養所要量の１００％をそのような完全栄養組成物から得ることができる。部分的又は不完全栄養組成物は、必須の主要及び微量栄養素を全て含有するわけではなく、患者のための唯一の栄養供給源として使用することはできない。部分又は不完全栄養組成物は、栄養補給剤として使用することができ、すなわち、患者の食事に追加して使用することができる。経口補給用栄養組成物は、本発明の方法により識別される通り、健常なヒトと比較して疾患に罹患しているヒトにおいて要求性が増大しているこれらの栄養素を含有する。
【０１２６】
完全栄養組成物のカロリー密度は、典型的には、０．７〜２．０ｋｃａｌ／ｍＬ（２．９〜８．４ｋＪ／ｍｌ）である。
【０１２７】
栄養組成物は、次の主要栄養素及び微量栄養素を含み得る：タンパク質源、脂質源、炭水化物源、ビタミン、及び元素（ミネラル含む）。
【０１２８】
タンパク質源は、動物性タンパク質、乳タンパク質、又は植物性タンパク質であってよい。
【０１２９】
栄養組成物は、１種以上の遊離アミノ酸を更に含む。アミノ酸の非限定例としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、シトルリン、システイン、グルタマート、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシセリン、ヒドロキシチロシン、ヒドロキシリジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが挙げられる。非タンパク質アミノ酸の例には、シトルリン、ＨＩＣＡ（α−ヒドロキシイソカプロン酸）、ＨＩＶＡ（α−ヒドロキシイソ甘草酸）、ＨＩＭＶＡ（α−ヒドロキシメチル甘草酸）、又はこれらの組み合わせがある。
【０１３０】
遊離アミノ酸が組成物中の唯一のタンパク質源となってもよく、あるいは他のタンパク質源と組み合わされてもよい。各アミノ酸は、全アミノ酸の０．５％〜２５％の量で存在する。
【０１３１】
脂肪源は、動物性油脂又は植物性油脂のいずれであってもよく、あるいは両方であってもよい。動物性油脂は本質的にカロリー価及び栄養価が等価であり互換的に使用可能であるものの、本発明の実施には、入手が用意であり、配合しやすく、飽和脂肪酸濃度が低いことから植物性油脂が好ましい。使用する脂肪源には、魚油、卵油、藻類油、トウモロコシ油、ひまわり油、サフラワー油、菜種油、ココナツ油、及び／又は大豆油、又はこれらの組み合わせが含まれる。
【０１３２】
栄養組成物は、ホウ素、カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、塩化物、クロム、塩化クロム、ピコリン酸クロム、銅、硫酸銅、グルコン酸銅、硫酸銅（ＩＩ）、フルオリド、鉄、カルボニル鉄、第２鉄、フマル酸鉄、リン酸鉄（ＩＩＩ）、鉄粉（iron trituration）、多糖類鉄、ヨージド、ヨウ素、マグネシウム、炭酸マグネシウム、マグネシウムヒドロキシド、マグネシウムオキシド、ステアリン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、リン酸カリウム、カリウムヨージド、塩化カリウム、酢酸カリウム、セレニウム、硫黄、ナトリウム、ドキュセートナトリウム、塩化ナトリウム、セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜鉛、亜鉛オキシド、硫酸亜鉛、及びこれらの混合物などの元素及びミネラルを含み得る。ミネラル化合物の非限定的な誘導体の例としては、上掲の任意のミネラル化合物の塩、アルカリ塩、エステル、及びキレートが挙げられる。
【０１３３】
栄養組成物は、ビタミンＢ１（チアミン、チアミンピロリン酸、ＴＰＰ、チアミン三リン酸、ＴＴＰ、チアミン塩酸塩、チアミンモノニトラート）、ビタミンＢ２（リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮ、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＦＡＤ、ラクトフラビン、オボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ニコチン酸、ニコチンアミド、ナイアシンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤ、ニコチン酸モノヌクレオチド、ＮｉｃＭＮ、ピリジン−３−カルボン酸）、ビタミンＢ３−前駆体トリプトファン、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン塩酸塩）、パントテン酸（パントテン酸塩、パンテノール）、葉酸（葉酸、フォラシン、プテロイルグルタミン酸）、ビタミンＢ１２（コバラミン、メチルコバラミン、デオキシアデノシルコバラミン、シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、アデノシルコバラミン）、ビオチン、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＡ（レチノール、酢酸レチニル、レチニルパルミタート、その他の長鎖脂肪酸をもつレチニルエステル、レチナール、レチノイン酸、レチノールエステル）、ビタミンＤ（カルシフェロール、コレカルシフェロール、ビタミンＤ３、１，２５，−ジヒドロキシビタミンＤ）、ビタミンＥ（α−トコフェロール、α−トコフェロールアセタート、α−トコフェロールスクシナート、α−トコフェロールニコチナート、α−トコフェロール）、ビタミンＫ（ビタミンＫ１、フィロキノン、ナフトキノン、ビタミンＫ２、メナキノン−７、ビタミンＫ３、メナキノン−４、メナジオン、メナキノン−８、メナキノン−８Ｈ、メナキノン−９、メナキノン−９Ｈ、メナキノン−１０、メナキノン−１１、メナキノン−１２、メナキノン−１３）、コリン、イノシトール、６−カロテン、及びこれらの任意の組み合わせなどのビタミン類を更に含み得る。
【０１３４】
完全栄養組成物は、典型的には、１０〜４０ｅｎ％タンパク質、１０〜６０ｅｎ％炭水化物、及び２０〜８０ｅｎ％脂肪を含む。「ｅｎ％」は、栄養組成物の全エネルギーのうちに占めるエネルギー量である。
【０１３５】
組成物はまた、抗酸化剤、安定剤（固体形態で提供されるとき）又は乳化剤（液体形態で提供されるとき）も含有し得る。
【０１３６】
栄養組成物の形態：
一実施形態では、栄養組成物は、栄養補給組成物、完全栄養組成物、ヨーグルト製品、発酵乳、フルーツジュース、サシェに入った形態の乾燥粉末、又はシリアルバーからなる群から選択される。
【０１３７】
栄養組成物は、特別医療用食品とも呼ばれるメディカルフードであってもよい。メディカルフード製品は、特別に配合される製品であり、疾患又は医学的状態（例えば、疾患又は望ましくない医学的状態の予防又は治療）の食事による管理を目的とする。メディカルフード製品は、臨床栄養を提供し、例えば、医学的状態を有する患者又はその他の特徴的栄養的必要性を有するヒトの特徴的栄養的必要性を満足することができる。
【０１３８】
メディカルフードは、経口栄養用のヘルスケア栄養組成物及び／又は経腸若しくは経管栄養補給用の栄養製品の形態であってよい。経管栄養用製品の場合では、かかる製品は、経管栄養補給に適した原材料のみを含むことになる。経管栄養補給に好適な原材料は、当業者に公知である。
【０１３９】
一実施形態では、メディカルフードは、栄養学的に完全な製品、飲料、栄養補助食品、中食、食品添加物（food additive）、食品製品への補給剤、溶解用粉末、経腸栄養組成物、乳児用調製粉乳、及びこれらの組み合わせの形態であり得る。
【０１４０】
一実施形態では、栄養組成物は、発酵乳、ヨーグルト、フレッシュチーズ、レンネット処理したミルク、菓子バー、朝食用シリアルフレーク、朝食用シリアルバー、飲料、粉ミルク、大豆ベース製品、ミルク以外の発酵製品、又は臨床栄養用栄養補給剤の形態であってよい。一実施形態では、組成物は粉末の形態であってよく、特に液体で再構成する粉末であってよい。一実施形態では、組成物は、液体の形態であってよく、例えば、レディ・トゥ・ドリンク液体経口栄養補給剤の形態であってよい。
【０１４１】
一実施形態では、栄養組成物は、錠剤、カプセル、液体、チュアブル、ソフトゲル、サシェ、粉末、シロップ、液体懸濁物、エマルジョン、溶液、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される形態である。一実施形態では、栄養組成物は、経口栄養補給剤である。あるいは、栄養組成物は経管栄養であってもよい。
【０１４２】
粘度：
栄養組成物が液体である場合、かかる液体の粘度は１５０ｍＰａ・ｓ未満、好ましくは１００ｍＰａ・ｓ未満、より好ましくは８０ｍＰａ・ｓ未満、更により好ましくは７０ｍＰａ・ｓ未満である。この粘度は、コーンプレート構造を使用して、２０℃にて５０  １／ｓの剪断速度で回転レオメーターで測定される。
【０１４３】
組成物がスプーンで食べられるよう用意された組織化製品（プディングなど）として提供される場合、粘度を、少なくとも３５０ｍＰａ・ｓ、好ましくは７５０ｍＰａ・ｓ超、より好ましくは１０００〜４０００ｍＰａ・ｓとすることが好ましい。
【０１４４】
治療用途及び方法：
本発明の組成物は、疾患の治療又は予防に使用でき、あるいは疾患に罹患している被検者における、健常な被検者の栄養ステータスとは異なる栄養ステータスと関連付けられる疾患の治療方法又は予防方法に使用できる。
【０１４５】
好ましい実施形態では、疾患は炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、コラーゲン大腸炎、リンパ球性大腸炎、空置大腸炎（diversion colitis）ベーチェット病、不確定大腸炎（indeterminatecolitis））である。本発明の方法及び組成物が適するその他の疾患又は臨床的状態としては、過敏性腸症候群、２型糖尿病、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知低下／認知機能障害、鬱、重篤ケア状態が挙げられる。
【０１４６】
製造方法：
上記の組成物の製造方法が提供され、かかる方法は、上記の栄養素のうち少なくとも１つを準備するステップと、場合により、例えば、１種以上のアミノ酸、脂肪、又は炭水化物からなる群から選択される少なくとも１つの更なる栄養素を加えるステップと、場合により、キャリア又は／及び水を加えるステップと、を含む。
【０１４７】
当業者であれば、本明細書に開示される本発明の特徴の全てが自由に組み合わせ可能であることを理解されるであろう。特に、本発明の異なる実施形態について記述されている特徴を組み合わせることができる。本発明の更なる利点及び特徴は、図面から明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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