(57)【要約】本開示は、少なくとも2つの抗体重鎖定常領域またはその断片を各々が含む少なくとも2つの二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含む、多量体B型肝炎ウイルス（HBV）タンパク質結合分子、例えば、二量体IgAまたは五量体もしくは六量体IgM結合分子を提供し、ここで、各重鎖定常領域またはその断片は、HBV抗原結合ドメインと連結されている。本開示はまた、多量体結合分子を含む組成物、多量体結合分子をコードするポリヌクレオチド、ならびに多量体結合分子を製造する方法および使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つの二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含む、多量体結合分子であって；
各結合ユニットが、抗原結合ドメインと各々連結されている少なくとも2つの抗体重鎖定常領域またはその断片を含み；
少なくとも1つの抗原結合ドメインが、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合し、かつ、
該結合分子が、該HBV抗原に特異的に結合する該抗原結合ドメインを含む参照用の単一の二価結合ユニットよりも効力がある、
前記多量体結合分子。
【請求項２】
前記参照用の単一の二価結合ユニットがIgG抗体である、請求項1記載の結合分子。
【請求項３】
2つの二価IgA結合ユニットまたはその断片とJ鎖またはその断片もしくはバリアントとを含む二量体結合分子であって、各結合ユニットが、抗原結合ドメインと各々連結されている2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含む、請求項1または請求項2記載の結合分子。
【請求項４】
分泌成分またはその断片もしくはバリアントをさらに含む、請求項3記載の結合分子。
【請求項５】
前記IgA重鎖定常領域またはその断片の各々が、Cα2ドメインまたはCα3-tpドメインを含む、請求項3または請求項4記載の結合分子。
【請求項６】
1つまたは複数のIgA重鎖定常領域またはその断片がCα1ドメインをさらに含む、請求項5記載の結合分子。
【請求項７】
前記IgA重鎖定常領域がヒトIgA定常領域である、請求項3〜6のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項８】
各結合ユニットが、IgA定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置付けられたVHを各々が含む2つのIgA重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置付けられたVLを各々が含む2つの免疫グロブリン軽鎖とを含む、請求項3〜7のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項９】
それぞれ5つまたは6つの二価IgM結合ユニットまたはその断片を含む五量体または六量体結合分子であって、各結合ユニットが、抗原結合ドメインと各々連結されている2つのIgM重鎖定常領域またはその断片を含む、請求項1または請求項2記載の結合分子。
【請求項１０】
前記IgM重鎖定常領域またはその断片の各々が、Cμ3ドメインおよびCμ4-tpドメインを含む、請求項9記載の結合分子。
【請求項１１】
1つまたは複数のIgM重鎖定常領域またはその断片が、Cμ2ドメイン、Cμ1ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項9または請求項10記載の結合分子。
【請求項１２】
五量体であり、かつ、J鎖またはその断片もしくはそのバリアントをさらに含む、請求項9〜11のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１３】
J鎖またはその断片が、アミノ酸配列SEQ ID NO:54またはその機能的断片を含む、請求項3または請求項12記載の結合分子。
【請求項１４】
J鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含む修飾J鎖であり、該異種ポリペプチドが、該J鎖またはその断片に直接的または間接的に融合されている、請求項3、請求項12、または請求項13記載の結合分子。
【請求項１５】
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記J鎖またはその断片に融合されている、請求項14記載の結合分子。
【請求項１６】
前記ペプチドリンカーが、5個以上25個以下のアミノ酸を含む、請求項15記載の結合分子。
【請求項１７】
前記ペプチドリンカーが、
2018513680.tif 000038
からなる、請求項16記載の結合分子。
【請求項１８】
前記異種ポリペプチドが、前記J鎖もしくはその断片のN末端、該J鎖もしくはその断片のC末端、または該J鎖もしくはその断片のN末端およびC末端の両方に融合されている、請求項14〜17のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項１９】
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、請求項15〜18のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項２０】
前記異種ポリペプチドの前記結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項19記載の結合分子。
【請求項２１】
前記抗原結合断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、単鎖Fv（scFv）断片、ジスルフィド結合Fv（sdFv）断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項20記載の結合分子。
【請求項２２】
前記抗原結合断片がscFv断片である、請求項21記載の結合分子。
【請求項２３】
前記異種ポリペプチドが、CD3εに特異的に結合することができる、請求項19〜22のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項２４】
前記修飾J鎖が、アミノ酸配列SEQ ID NO:68（V15J）またはSEQ ID NO:71（J15V）を含む、請求項23記載の結合分子。
【請求項２５】
前記修飾J鎖が、シグナルペプチドをさらに含む、請求項24記載の結合分子。
【請求項２６】
前記修飾J鎖が、アミノ酸配列SEQ ID NO:67（V15J）またはSEQ ID NO:70（J15V）を含む、請求項25記載の結合分子。
【請求項２７】
前記IgM重鎖定常領域がヒトIgM定常領域である、請求項9〜12のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項２８】
各結合ユニットが、前記定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置付けられたVHを各々が含む2つの重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置付けられたVLを各々が含む2つの免疫グロブリン軽鎖とを含む、請求項3〜27のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項２９】
少なくとも1つの結合ユニットが、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合する2つの抗原結合ドメインを含み、かつ、該少なくとも1つの結合ユニット内の2つの重鎖が同一である、請求項3〜28のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項３０】
前記少なくとも1つの結合ユニット内の2つの軽鎖が同一である、請求項29記載の結合分子。
【請求項３１】
2つの軽鎖定常領域が、ヒトλ定常領域またはヒトκ定常領域である、請求項29または請求項30記載の結合分子。
【請求項３２】
感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合する少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個の抗原結合ドメインを含む、請求項29〜31のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項３３】
少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個の抗原結合ドメインが同一である、請求項32記載の結合分子。
【請求項３４】
前記HBV抗原が、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて、該HBV抗原が非感染性サブウイルス粒子上に発現するよりも高い密度で発現する、請求項1〜33のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項３５】
前記HBV抗原が、B型肝炎表面抗原（HBsAg）、プレコア抗原、コア抗原、X-抗原、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項1〜34のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項３６】
前記HBV抗原がHBsAgであり、かつ、HBsAgが、S領域（S）；プレS2領域およびS領域；プレS1領域、プレS2領域、およびS領域；またはそれらの断片を含む、請求項35記載の結合分子。
【請求項３７】
HBsAgが、プレS1領域、プレS2領域、およびS領域、またはそれらの断片を含む、請求項36記載の結合分子。
【請求項３８】
それぞれVHおよびVLアミノ酸配列SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:21、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:22、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43およびSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45およびSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:76の、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域を含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項３９】
VHアミノ酸配列SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:13のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域を含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項４０】
前記少なくとも1つの抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変領域（VH）および抗体軽鎖可変領域（VL）を含み、該VHおよび該VLが、それぞれ、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:21、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:22、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43およびSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45およびSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:76と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項４１】
前記少なくとも1つの抗原結合ドメインが抗体VHを含み、該VHが、SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:13と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜37のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項４２】
アミノ酸配列SEQ ID NO:58を含むIgM重鎖およびアミノ酸配列SEQ ID NO:59を含む軽鎖を含む、請求項1〜41のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項４３】
アミノ酸配列SEQ ID NO:63を含むIgM重鎖およびアミノ酸配列SEQ ID NO:59を含む軽鎖を含む、請求項1〜41のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項４４】
HBV増殖の阻害、HBVクリアランスの増強、HBV感染力の制御、および／またはHBV成長の制御において、HBV結合抗原結合ドメインを含む参照単一結合ユニットよりも効力がある、請求項1〜42のいずれか一項記載の結合分子。
【請求項４５】
J鎖またはその機能的断片もしくはバリアントと、2つの重鎖および2つの軽鎖を各々が含む5つの結合ユニットとを含む、単離されたIgM抗体またはその断片であって、各重鎖またはその断片が、ヒトμ定常領域またはその断片、および重鎖可変領域アミノ酸配列SEQ ID NO:62を含み、かつ、各軽鎖が、ヒトκ定常領域および軽鎖可変領域アミノ酸配列SEQ ID NO:6を含み；前記抗体またはその断片が会合して、HBV表面抗原のプレS1領域に特異的に結合することができる五量体IgM抗体を形成することができる、前記単離されたIgM抗体またはその断片。
【請求項４６】
前記重鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO:63を含み、かつ、前記軽鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO:59を含む、請求項45記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項４７】
J鎖が、アミノ酸配列SEQ ID NO:54またはその機能的断片を含む、請求項45または請求項46記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項４８】
J鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含む修飾J鎖であり、該異種ポリペプチドが、該J鎖に直接的または間接的に融合されている、請求項45〜47のいずれか一項記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項４９】
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記J鎖またはその断片に融合されている、請求項48記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５０】
前記ペプチドリンカーが、5個以上25個以下のアミノ酸を含む、請求項49記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５１】
前記ペプチドリンカーが、
2018513680.tif 000039
からなる、請求項50記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５２】
前記異種ポリペプチドが、前記J鎖もしくはその断片のN末端、該J鎖もしくはその断片のC末端、または該J鎖もしくはその断片のN末端およびC末端の両方に融合されている、請求項49〜51のいずれか一項記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５３】
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、請求項48〜52のいずれか一項記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５４】
前記異種ポリペプチドの前記結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項53記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５５】
前記抗原結合断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、単鎖Fv（scFv）断片、ジスルフィド結合Fv（sdFv）断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項54記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５６】
前記抗原結合断片がscFv断片である、請求項55記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５７】
前記異種ポリペプチドが、CD3εに特異的に結合することができる、請求項53〜56のいずれか一項記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５８】
前記修飾J鎖が、アミノ酸配列SEQ ID NO:68（V15J）またはSEQ ID NO:71（J15V）を含む、請求項57記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項５９】
前記修飾J鎖が、シグナルペプチドをさらに含む、請求項58記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６０】
前記修飾J鎖が、アミノ酸配列SEQ ID NO:67（V15J）またはSEQ ID NO:70（J15V）を含む、請求項59記載のIgM抗体またはその断片。
【請求項６１】
請求項1〜44のいずれか一項記載の結合分子または請求項45〜60のいずれか一項記載のIgM抗体を含む、組成物。
【請求項６２】
請求項1〜44のいずれか一項記載の結合分子または請求項45〜60のいずれか一項記載のIgM抗体のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドサブユニットが、IgM重鎖定常領域と、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合する抗体の結合ドメインの少なくとも抗体VH部分とを含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項６３】
前記ポリペプチドサブユニットが、
（a）VHアミノ酸配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:73、またはSEQ ID NO:75の、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3ドメイン、または1つもしくは複数のHCDR中に1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3ドメイン；あるいは
（b）SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:73、またはSEQ ID NO:75と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列
を含むVHドメインのC末端に融合された、ヒトIgAもしくはIgM定常領域またはその断片
を含む、請求項62記載のポリヌクレオチド。
【請求項６４】
請求項1〜44のいずれか一項記載の結合分子または請求項45〜60のいずれか一項記載のIgM抗体のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドサブユニットが、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合する抗体の結合ドメインの抗体VL部分を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項６５】
前記ポリペプチドサブユニットが、
（a）VLアミノ酸配列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:76の、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3ドメイン、または1つもしくは複数のLCDRに1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3ドメイン；または
（b）SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:76と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列
を含むVLのC末端に融合された、ヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片
を含む、請求項64記載のポリヌクレオチド。
【請求項６６】
請求項62または請求項63記載のポリヌクレオチド、および請求項64または請求項65記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項６７】
前記ポリヌクレオチドが単一ベクター上に含有される、請求項66記載の組成物。
【請求項６８】
前記ポリヌクレオチドが別々のベクター上に位置付けられている、請求項66記載の組成物。
【請求項６９】
J鎖またはその断片もしくはそのバリアントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項66〜68のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７０】
前記ポリヌクレオチドが単一ベクター上に位置付けられている、請求項69記載の組成物。
【請求項７１】
前記ポリヌクレオチドが少なくとも2つの別々のベクター上に位置付けられている、請求項69記載の組成物。
【請求項７２】
請求項67または請求項70記載のベクター。
【請求項７３】
請求項68または請求項71記載のベクター。
【請求項７４】
請求項62〜65のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、請求項66〜71のいずれか一項記載の組成物、または請求項72もしくは請求項73記載のベクターを含む宿主細胞であって、請求項1〜44のいずれか一項記載の結合分子、またはそのサブユニットを発現することができる、前記宿主細胞。
【請求項７５】
請求項1〜44のいずれか一項記載の結合分子または請求項45〜60のいずれか一項記載のIgM抗体を産生する方法であって、請求項74記載の宿主細胞を培養する工程、および該結合分子を回収する工程を含む、前記方法。
【請求項７６】
慢性感染細胞内でのB型肝炎ウイルス（HBV）の増殖、潜伏、または維持を制御する方法であって、HBVとHBV感受性細胞との混合物を請求項1〜44のいずれか一項記載の結合分子と接触させる工程を含み、該結合分子が、HBV抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む参照単一結合ユニット抗体よりも効力がある、前記方法。
【請求項７７】
患者におけるB型肝炎ウイルス（HBV）感染によって引き起こされたまたは悪化した疾患または状態を治療する方法であって、HBVに感染したまたはHBVに感染しやすい患者に請求項1〜44のいずれか一項記載の結合分子を投与する工程を含み、該結合分子が、HBV抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む参照単一結合ユニット抗体よりも効力がある、前記方法。
【請求項７８】
前記疾患または状態が、急性肝炎、慢性肝炎、肝臓炎、肝硬変、肝不全、肝細胞癌（HCC）、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
前記患者がHBV疾患症状を示し、該症状が、増加したウイルス負荷、ウイルス排出、腹痛、暗色尿、発熱、関節痛、食欲の喪失、吐き気および嘔吐、虚弱および疲労、黄疸、またはそれらの組み合わせである、請求項77または請求項78記載の方法。
【請求項８０】
慢性感染細胞内でのB型肝炎ウイルス（HBV）の増殖、潜伏、または維持を制御する方法であって、HBVとHBV感受性細胞との混合物を請求項45〜60のいずれか一項記載のIgM抗体と接触させる工程を含み、該IgM抗体が、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む参照単一結合ユニット抗体よりも効力があり、各重鎖がVHアミノ酸配列SEQ ID NO:62を含み、各軽鎖がVLアミノ酸配列SEQ ID NO:6を含む、前記方法。
【請求項８１】
患者におけるB型肝炎ウイルス（HBV）感染によって引き起こされたまたは悪化した疾患または状態を治療する方法であって、HBVに感染したまたはHBVに感染しやすい患者に請求項45〜60のいずれか一項記載のIgM抗体を投与する工程を含み、該IgM抗体が、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む参照単一結合ユニット抗体よりも効力があり、各重鎖がVHアミノ酸配列SEQ ID NO:62を含み、各軽鎖がVLアミノ酸配列SEQ ID NO:6を含む、前記方法。
【請求項８２】
前記疾患または状態が、急性肝炎、慢性肝炎、肝臓炎、肝硬変、肝不全、肝細胞癌（HCC）、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項81記載の方法。
【請求項８３】
前記患者がHBV疾患症状を示し、該症状が、増加したウイルス負荷、ウイルス排出、腹痛、暗色尿、発熱、関節痛、食欲の喪失、吐き気および嘔吐、虚弱および疲労、黄疸、またはそれらの組み合わせである、請求項81または請求項82記載の方法。
【請求項８４】
以下の工程を含む、非感染性ウイルス粒子に対するよりも高い親和性、高いアビディティ、またはそれらの組み合わせで、感染性ウイルス粒子の表面、ウイルス感染細胞の表面、またはそれらの組み合わせに結合する結合分子を同定するための方法：
（a）試験結合分子を感染性ウイルス粒子と接触させて、該感染性ウイルス粒子に対する該試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；
（b）該試験結合分子を非感染性のウイルス粒子と接触させて、該非感染性粒子に対する該試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；
（c）工程（a）と工程（b）の結果を比較する工程；および
（d）工程（a）で測定された該親和性または該アビディティが工程（b）で測定された該親和性または該アビディティより高い試験化合物を同定する工程。
【請求項８５】
以下の工程を含む、ウイルスに感染していない細胞に対するよりも高い親和性、高いアビディティ、またはそれらの組み合わせで、関心対象のウイルスに感染した細胞の表面に結合する結合分子を同定するための方法：
（a）試験結合分子をウイルス感染細胞と接触させて、該ウイルス感染細胞に対する該試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；
（b）該試験結合分子をウイルスに感染していない細胞と接触させて、該非感染細胞に対する該試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程であって、該非感染細胞が、それが感染していないこと以外は該ウイルス感染細胞と同一である、工程；
（c）工程（a）と工程（b）の結果を比較する工程；および
（d）工程（a）で測定された該親和性または該アビディティが工程（b）で測定された該親和性または該アビディティより高い試験化合物を同定する工程。
【請求項８６】
以下の工程を含む、HBVサブウイルス粒子に対するよりも高い親和性、高いアビディティ、またはそれらの組み合わせで感染性B型肝炎ウイルス（HBV）ウイルス粒子の表面、HBV感染細胞の表面、またはそれらの組み合わせに結合する結合分子を同定するための方法：
（a）試験結合分子をHBVウイルス粒子と接触させて、該HBVウイルス粒子に対する該試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；
（b）該試験結合分子をHBVサブウイルス粒子と接触させて、HBVサブウイルス粒子に対する該試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；
（c）工程（a）と工程（b）の結果を比較する工程；および
（d）工程（a）で測定された該親和性または該アビディティが工程（b）で測定された該親和性または該アビディティより高い試験化合物を同定する工程。
【請求項８７】
以下の工程を含む、HBVに感染していない細胞に対するよりも高い親和性、高いアビディティ、またはそれらの組み合わせでB型肝炎ウイルス（HBV）に感染した細胞の表面に結合する結合分子を同定するための方法：
（a）試験結合分子をHBV感染細胞と接触させて、該HBV感染細胞に対する該試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；
（b）該試験結合分子をHBVに感染していない細胞と接触させて、HBVに感染していない細胞に対する該試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程であって、該非感染細胞が、それが感染していないこと以外は該HBV感染細胞と同一である、工程；
（c）工程（a）と工程（b）の結果を比較する工程；および
（d）工程（a）で測定された該親和性または該アビディティが工程（b）で測定された該親和性または該アビディティより高い試験化合物を同定する工程。
【請求項８８】
前記HBV感染細胞がヒト細胞である、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
前記試験結合分子が、請求項1〜44記載の結合分子のいずれかである、請求項87または88記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、2015年3月25日に出願された米国特許仮出願第62/137,881号の恩典を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
B型肝炎ウイルス（HBV）は、二本鎖DNAウイルスのクラスに属し、4種の主要な血清型（adr、adw、ayr、およびayw）および8種の主要な遺伝子型（A〜H）を含むことが現在公知である。血清型は、エンベロープタンパク質配列の違いに基づいており、一方で、8種の遺伝子型は、世界中にわたり特定の地理的領域に明確に分布している。遺伝子型の違いは、疾患の重症度および治療への応答の有効性と関係している（Kramvis et al., Vaccine, 23(19):2409-23, 2005（非特許文献1） および Magnius et al., Intervirology, 38(1-2):24-34, 1995（非特許文献2） を参照のこと）。
【０００３】
HBVゲノムは、部分的に二本鎖である環状DNAから構成される。すなわち、一本鎖であるゲノムの部分がある。HBVゲノムのより長い部分は3020〜3320ヌクレオチド長であり、より短い部分は1700〜2800ヌクレオチド長である。HBVゲノムのより長い部分は、ウイルスDNAポリメラーゼに連結されている。
【０００４】
HBV感染細胞は、感染性ウイルス粒子に加えて、核を欠く球状および線維状の非感染性粒子を産生することができる。これらの非感染性粒子は、HBV感染個体中、感染性粒子の1,000〜100,000倍であり得る（Chai et al. J. Virol. 82:7812-7817, 2005（非特許文献3） を参照のこと）。
【０００５】
以下を含む、HBVによって産生される5種のウイルスタンパク質がある：
1．エンベロープタンパク質（S遺伝子によってコードされる表面抗原HBsAgとしても公知）；
2．ポリメラーゼ（P遺伝子によってコードされるpol）；
3．B型肝炎X-タンパク質（X遺伝子によってコードされるX-抗原HBxAg）；
4．ヌクレオカプシドまたはコア抗原（C遺伝子によってコードされるHBcAg）；ならびに
5．プレコア（コアおよびプレC遺伝子によってコードされるHBeAg）。
【０００６】
HBsAgは、HBVゲノム中の3つの独立した開始コドンから3つのサイズで産生される。この遺伝子産物の小、中および大バージョンは、3つの指定ドメインのうちのうちの1つまたは複数の組み合わせ：（i）S単独（S）、（ii）プレS2およびS（M）、または（iii）プレS1およびプレS2およびS（L）である（図1A）。感染性粒子は、ほとんどの場合、この抗原の3つ全てのバージョンを保有し、かつ、プレS1タンパク質（図1B）とNTCP受容体（SLC10A1遺伝子によってコードされる、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド、または肝臓胆汁酸輸送体）との間の相互作用を介して肝細胞に侵入することができる。したがって、プレS1抗原は、感染と関連しており、かつ、感染性ウイルス粒子において優先的に発現する（Hong et al., Virology, 318:134-141, 2004（非特許文献4）; Park et al., Antiviral Res., 68:109-115, 2005（非特許文献5））。
【０００７】
HBeAgは、プレコアタンパク質であり、分泌される。プレコアタンパク質は、免疫調節的役割を果たすことが示されている。HBeAgは、コア抗原への免疫応答を調節することが見いだされている（Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:14913-14918, 2004（非特許文献6））。
【０００８】
カプシド、ポリメラーゼ、および表面抗原タンパク質の機能は明らかであるようだが、「X」遺伝子の機能は、それが肝細胞癌（HCC）の発生においてある役割を果たすことが知られているにもかかわらず、まだ完全には解明されていない（Tang et al., Cancer Sci., 97:977-983, 2006（非特許文献7）, Ng et al., J. Gastroent., 46:974-990, 2011（非特許文献8） および Kew, Michael C., J. Gastro. Hepat., 26 Suppl. 1:144-152, 2011（非特許文献9））。
【０００９】
B型肝炎ウイルスは、世界で20億を超える人が感染していると考えられている。世界で3億5千〜4億人の慢性または持続感染個体がいると考えられ、HBVまたはHBV感染による合併症は、世界で1年当たり780,000人の死亡をもたらす。HBVは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）よりも50〜100倍感染力が強い。HBVは、感染性血液または体液に曝露されることによって伝播される。感染の症状は、通常、食欲の喪失、疲労、微熱、黄疸、筋肉および関節の痛み、吐き気および嘔吐、黄色皮膚ならびに暗色尿を含む。幾人かの個体は、身体からウイルスを完全には除去できず、その結果、肝臓損傷および肝硬変をもたらす可能性がある慢性感染をもたらす。慢性HBV患者の約15〜40%は、肝硬変および／またはHCCを発症する（Xu et al., Canc. Lett., 345:216-222, 2014（非特許文献10））。HBVウイルスゲノムは、宿主のゲノム中で存続し、かつ、除去された後に再活性化されて、新たなHBV症状を導く可能性がある。肝臓癌の割合は、HBV感染を有する者がはるかに高い。
【００１０】
ウイルスのクリアランスおよび病原性は共に、適応または獲得免疫応答によって媒介される。これは、体液性（抗体媒介性）免疫成分および細胞媒介性免疫性成分の両方を含む。特に、感染は、ウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の応答をトリガーし、これが慢性感染において観察される肝臓組織への傷害の大部分を生じさせる。
【００１１】
HBV感染に対抗するための多くの予防戦略が開発されている。該ウイルスの組換え表面抗原に基づいてワクチンが開発されている（WO 2014/0489101（特許文献1） および Shouval, D., J. Hepatol. 39 (Suppl. l):70-76, 2003（非特許文献11） を参照のこと）。加えて、高力価個体由来のヒト血清からHBV免疫グロブリン（HBIG）が開発されている。HBIGは、典型的には、子供への伝播を予防するためにHBV感染母体の乳児に提供される。分かっている曝露の24時間以内にHBIGが投与されるならば、HBV感染を予防することができる。HBIGはまた、通常、HBV感染肝臓移植患者に、新たな組織の再感染を予防するために投与される。
【００１２】
慢性感染個体は、治療の候補である。しかしながら、現在のところ、慢性HBV感染を除去することが知られている承認済みの治療法はない。利用可能な治療法は、ウイルスが複製するのを妨害することによって、さらなる感染を遮断することができる。慢性HBV感染を含むHBV感染を治療および／または治癒するために、種々のモノクローナル抗体および併用療法が研究されているが、何一つとして商業化されていない。
【００１３】
慢性感染のための治療選択肢、例えば、インターフェロンおよびラミブジンは、あまり効果的ではなく、かつ、重度の副作用を引き起こすことが知られている。HBV感染の治療または予防のための治療法の開発に向けた努力にもかかわらず、HBV感染（例えば、慢性HBV感染）を標的とする新たな治療法を開発する継続的なニーズが依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】WO 2014/0489101
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Kramvis et al., Vaccine, 23(19):2409-23, 2005
【非特許文献２】Magnius et al., Intervirology, 38(1-2):24-34, 1995
【非特許文献３】Chai et al. J. Virol. 82:7812-7817, 2005
【非特許文献４】Hong et al., Virology, 318:134-141, 2004
【非特許文献５】Park et al., Antiviral Res., 68:109-115, 2005
【非特許文献６】Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:14913-14918, 2004
【非特許文献７】Tang et al., Cancer Sci., 97:977-983, 2006
【非特許文献８】Ng et al., J. Gastroent., 46:974-990, 2011
【非特許文献９】Kew, Michael C., J. Gastro. Hepat., 26 Suppl. 1:144-152, 2011
【非特許文献１０】Xu et al., Canc. Lett., 345:216-222, 2014
【非特許文献１１】Shouval, D., J. Hepatol. 39 (Suppl. l):70-76, 2003
【発明の概要】
【００１６】
概要
1つまたは複数のB型肝炎抗原に結合するための特異性を保有する多量体結合分子の種々の態様が開示される。本開示は、少なくとも2つの二価結合ユニットを含む多量体結合分子またはそのバリアントもしくは断片を提供し；ここで、各結合ユニットは、抗原結合ドメインと各々連結されている少なくとも2つの抗体重鎖定常領域またはその断片を含み；ここで、少なくとも1つの抗原結合ドメインは、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合し、該結合分子は、HBV抗原に特異的に結合する同じ抗原結合ドメインを含む参照用の単一の二価結合ユニットよりも効力がある。特定の局面において、参照用の単一の二価結合ユニットは、IgG抗体である。
【００１７】
特定の局面において、結合分子は、2つの二価IgA結合ユニットまたはその断片と、J鎖またはその断片もしくはバリアントとを含む、二量体結合分子であることができ、ここで、各結合ユニットは、抗原結合ドメインと各々連結されている2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の局面において、二量体結合分子は、分泌成分またはその断片もしくはバリアントをさらに含むことができる。特定の局面において、IgA重鎖定常領域またはその断片は各々、Cα2ドメインまたはCα3-tpドメインを含み、かつ、Cα1ドメインをさらに含むことができる。特定の局面において、IgA重鎖定常領域は、ヒトIgA定常領域である。特定の局面において、本明細書において提供されている二量体結合分子の各結合ユニットは、IgA定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置付けられたVHを各々が含む2つのIgA重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置付けられたVLを各々が含む2つの免疫グロブリン軽鎖とを含むことができる。
【００１８】
特定の局面において、結合分子は、それぞれ5つまたは6つの二価IgM結合ユニットを含む五量体または六量体結合分子であることができ、ここで、各結合ユニットは、抗原結合ドメインと各々連結されている2つのIgM重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の局面において、IgM重鎖定常領域またはその断片は各々、Cμ3ドメインおよびCμ4-tpドメインを含み、かつ、Cμ2ドメイン、Cμ1ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含むことができる。特定の局面において、J鎖またはその断片もしくはそのバリアントをさらに含む五量体結合分子が提供される。特定の局面において、本明細書において提供されている六量体または五量体結合分子の少なくとも1つの重鎖定常領域は、ヒトIgM定常領域である。特定の局面において、本明細書において提供されている六量体または五量体結合分子の各結合ユニットは、定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置付けられたVHを各々が含む2つの重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置付けられたVLを各々が含む2つの免疫グロブリン軽鎖とを含む。
【００１９】
特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）の少なくとも1つの結合ユニットは、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合する2つの抗原結合ドメインを含み、結合ユニット内の2つの重鎖は同一である。特定の局面において、結合ユニット内の2つの軽鎖は同一である。特定の局面において、結合ユニットの軽鎖定常領域は、ヒトλ定常領域またはヒトκ定常領域である。特定の局面において、結合分子は、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合する、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個の抗原結合ドメインを含む。特定の局面において、結合ドメインのうち少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個は、同一である。
【００２０】
結合分子が五量体である場合、結合分子は、J鎖、またはその断片、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントをさらに含むことができる。特定の局面において、J鎖またはその断片は、アミノ酸配列SEQ ID NO:54またはその機能的断片を含む。特定の局面において、J鎖またはその断片は、異種ポリペプチドをさらに含むことができる。異種ポリペプチドは、J鎖またはその断片に直接的または間接的に融合されることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して、J鎖またはその断片に間接的に融合されることができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは、例えば5以上25以下のアミノ酸を含むことができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは、
2018513680.tif 000002
からなる。異種ポリペプチドは、J鎖もしくはその断片のN末端もしくはその近傍に、J鎖もしくはその断片のC末端もしくはその近傍に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端およびC末端の両方もしくはその近傍に、融合されることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、結合ドメイン、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。抗原結合断片は、例えば、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、単鎖Fv（scFv）断片、ジスルフィド結合Fv（sdFv）断片、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、CD3εに特異的に結合することができる。例えば、特定の局面において、修飾J鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO:68（V15J）またはSEQ ID NO:71（J15V）を含むことができる。さらに、特定の局面において、これらの特定の修飾J鎖はシグナルペプチドをさらに含むことができ、その場合、当該修飾J鎖はアミノ酸配列SEQ ID NO:67（V15J）またはSEQ ID NO:70（J15V）を含む。
【００２１】
特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）によって結合されるHBV抗原は、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて、HBV抗原が非感染性サブウイルス粒子上に発現するよりも高い密度で発現する。特定の局面において、HBV抗原は、B型肝炎表面抗原（HBsAg）、プレコア抗原、コア抗原、X-抗原、またはそれらの任意の組み合わせである。結合分子がHBsAgに結合する特定の局面において、結合分子は、S領域（S）、プレS2およびS領域、またはプレS1、プレS2およびS領域、またはその断片を含むことができる。
【００２２】
特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、それぞれVHおよびVLアミノ酸配列SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:21、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:22、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43およびSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45およびSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:76に含有されるHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域を含む。
【００２３】
特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、VHアミノ酸配列SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:13のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域を含む。
【００２４】
特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域（VH）および抗体軽鎖可変領域（VL）を含み、ここで、VHおよびVLは、それぞれ、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:21、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:22、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43およびSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45およびSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:76と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）の少なくとも1つの抗原結合ドメインは抗体VHを含み、ここで、VHは、SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:13と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
特定の局面において、本明細書において提供されている結合分子は、アミノ酸配列SEQ ID NO:58を含むIgM重鎖とアミノ酸配列SEQ ID NO:59を含む軽鎖とを含む、六量体もしくは五量体IgM抗体またはその断片である。特定の局面において、本明細書において提供されている結合分子は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 63を含むIgM重鎖とアミノ酸配列SEQ ID NO:59を含む軽鎖とを含む、六量体もしくは五量体IgM抗体またはその断片である。
【００２７】
特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）は、ウイルス中和、感染細胞の殺傷、ウイルスクリアランスの増強、慢性感染細胞内でのHBVの増殖、潜伏、または維持の制御において、同じHBV結合抗原結合ドメインを含む参照単一結合ユニットよりも効力があることができる。
【００２８】
本開示は、J鎖またはその機能的断片もしくはバリアントと、2つの重鎖および2つの軽鎖を各々が含む5つの結合ユニットとを含む、単離されたIgM抗体またはその断片をさらに提供し、ここで、各重鎖またはその断片は、ヒトμ定常領域またはその断片および重鎖可変領域アミノ酸配列SEQ ID NO:62を含み、各軽鎖は、ヒトκ定常領域および軽鎖可変領域アミノ酸配列SEQ ID NO:6を含むことができ；ここで、抗体またはその断片は会合して、HBV表面抗原のプレS1領域に特異的に結合することができる五量体IgM抗体を形成できる。特定の局面において、IgM抗体またはその断片の重鎖はアミノ酸配列SEQ ID NO:63を含み、IgM抗体またはその断片の軽鎖はアミノ酸配列SEQ ID NO:59を含む。特定の局面において、J鎖またはその断片は、アミノ酸配列SEQ ID NO:54またはその機能的断片を含む。特定の局面において、J鎖またはその断片は、異種ポリペプチドをさらに含むことができる。異種ポリペプチドは、J鎖またはその断片に直接的または間接的に融合されることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して、J鎖またはその断片に間接的に融合されることができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは、例えば、少なくとも5以上25以下のアミノ酸を含むことができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは、
2018513680.tif 000003
からなる。異種ポリペプチドは、J鎖もしくはその断片のN末端もしくはその近傍に、J鎖もしくはその断片のC末端もしくはその近傍に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端およびC末端の両方もしくはその近傍に、融合されることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、結合ドメイン（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を含むことができる。抗原結合断片は、例えば、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、単鎖Fv（scFv）断片、ジスルフィド結合Fv（sdFv）断片、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、CD3εに特異的に結合することができる。例えば、特定の局面において、修飾J鎖はアミノ酸配列SEQ ID NO:68（V15J）またはSEQ ID NO:71（J15V）を含むことができる。さらに、特定の局面において、これらの特定の修飾J鎖はシグナルペプチドをさらに含むことができ、その場合、当該修飾J鎖はアミノ酸配列SEQ ID NO:67（V15J）またはSEQ ID NO:70（J15V）を含む。
【００２９】
本開示は、本明細書において提供されている二量体、五量体、もしくは六量体結合分子または本明細書において提供されている単離されたIgM抗体を含む、組成物をさらに提供する。
【００３０】
本開示はまた、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、ポリペプチドサブユニットは、IgM重鎖定常領域と、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合する抗体の結合ドメインの少なくとも抗体VH部分とを含む。特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、VHアミノ酸配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO:73、もしくはSEQ ID NO:75の；または、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO:73、もしくはSEQ ID NO:75と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは100%同一のアミノ酸配列の、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3ドメイン、または1つもしくは複数のHCDR中に1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3ドメイン、を含むVHのC末端に融合されたヒトIgAもしくはIgM定常領域またはその断片を含む。
【００３１】
本開示はまた、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、ポリペプチドサブユニットは、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合する抗体の結合ドメインの抗体VL部分を含む。特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、VLアミノ酸配列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO:74、もしくはSEQ ID NO:76の；または、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO:74、もしくはSEQ ID NO:76と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは100%同一のアミノ酸配列の、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3ドメイン、または1つもしくは複数のLCDRに1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3ドメイン、を含むVLのC末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含むことができる。
【００３２】
本開示は、重鎖をコードするヌクレオチドおよび軽鎖をコードするヌクレオチドを含む組成物をさらに提供する。組成物に含まれるポリヌクレオチドは、単一ベクター上に含有されてもよいし、別々のベクター上に位置付けられてもよい。特定の局面において、組成物は、J鎖またはその断片もしくはそのバリアントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含むことができ、そのポリヌクレオチドは、重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドのいずれかとして、完全に別々のベクター上または同じベクター上にあることができる。
【００３３】
また、上記の1、2、またはより多くのベクターも本開示によって提供される。
【００３４】
追加の局面において、本開示は、提供されるポリヌクレオチド、提供される組成物、または提供されるベクターを含む、宿主細胞を提供し、ここで、該宿主細胞は、本明細書において提供されている二量体、五量体、もしくは六量体結合分子（例えば、本明細書において提供されている単離されたIgM抗体）、またはそれらのサブユニットを発現することができる。本開示はまた、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、本明細書において提供されている単離されたIgM抗体）を産生する方法を提供し、ここで、該方法は、提供される宿主細胞を培養する工程、および結合分子を回収する工程を含む。
【００３５】
本開示は、慢性感染細胞内でのB型肝炎ウイルス（HBV）の増殖、潜伏、または維持を制御する、例えば、ウイルスの付着、感染力、複製、潜伏、放出などを制御する方法をさらに提供し、ここで、該方法は、HBVとHBV感受性細胞との混合物を、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、本明細書において提供されている単離されたIgM抗体）と接触させる工程を含み、ここで、HBVの複製は、結合分子と共通の少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG抗体よりも大きな効力で制御される。
【００３６】
本開示は、患者におけるB型肝炎ウイルス（HBV）感染によって引き起こされたまたは悪化した疾患または状態を治療する方法をさらに提供し、ここで、該方法は、HBVに感染したまたはHBVに感染しやすい患者に、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、本明細書において提供されている単離されたIgM抗体）を投与する工程を含む。特定の局面において、結合分子は、該結合分子またはIgM抗体と同じ、HBV抗原に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む参照単一結合ユニット抗体（例えば、IgG抗体）よりも効力があり得る。特定の局面において、疾患または状態は、例えば、急性肝炎、慢性肝炎、肝臓炎、肝硬変、肝不全、肝細胞癌（HCC）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。特定の局面において、患者は、非限定的に、増加したウイルス負荷、ウイルス排出、腹痛、暗色尿、発熱、関節痛、食欲の喪失、吐き気および嘔吐、虚弱および疲労、黄疸、またはそれらの組み合わせのような1つまたは複数のHBV疾患症状を示し得る。
【００３７】
本開示は、非感染性ウイルス粒子に対するよりも高い親和性、高いアビディティ、またはそれらの組み合わせで感染性ウイルス粒子の表面、ウイルス感染細胞の表面、またはそれらの組み合わせに結合する結合分子を同定するための方法をさらに提供し、ここで、該方法は、（a）試験結合分子を感染性ウイルス粒子と接触させて、感染性ウイルス粒子に対する試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；（b）試験結合分子を非感染性のウイルス粒子と接触させて、非感染性粒子に対する試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；（c）工程（a）と工程（b）の結果を比較する工程；ならびに（d）工程（a）で測定された親和性またはアビディティが工程（b）で測定された親和性またはアビディティより高い試験化合物を同定する工程を含む。
【００３８】
別の局面において、本開示は、ウイルスに感染していない細胞に対するよりも高い親和性、高いアビディティ、またはそれらの組み合わせで関心対象のウイルスに感染した細胞の表面に結合する結合分子を同定するための方法を提供し、ここで、該方法は、（a）試験結合分子をウイルス感染細胞と接触させて、ウイルス感染細胞に対する試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；（b）試験結合分子をウイルスに感染していない細胞と接触させて、非感染細胞に対する試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程（ここで、非感染細胞は、感染していないこと以外はウイルス感染細胞と同一である）；（c）工程（a）と工程（b）の結果を比較する工程；ならびに（d）工程（a）で測定された親和性またはアビディティが工程（b）で測定された親和性またはアビディティより高い試験化合物を同定する工程を含む。
【００３９】
別の局面において、本開示は、HBVサブウイルス粒子に対するよりも高い親和性、高いアビディティ、またはそれらの組み合わせで感染性B型肝炎ウイルス（HBV）ウイルス粒子の表面、HBV感染細胞の表面、またはそれらの組み合わせに結合する結合分子を同定するための方法を提供し、ここで、該方法は、（a）試験結合分子をHBVウイルス粒子と接触させて、HBVウイルス粒子に対する試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；（b）試験結合分子をHBVサブウイルス粒子と接触させて、HBVサブウイルス粒子に対する試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；（c）工程（a）と工程（b）の結果を比較する工程；ならびに（d）工程（a）で測定された親和性またはアビディティが工程（b）で測定された親和性またはアビディティより高い試験化合物を同定する工程を含む。
【００４０】
別の局面において、本開示は、HBVに感染していない細胞に対するよりも高い親和性、高いアビディティ、またはそれらの組み合わせでB型肝炎ウイルス（HBV）に感染した細胞の表面に結合する結合分子を同定するための方法を提供し、ここで、該方法は、（a）試験結合分子をHBV感染細胞と接触させて、HBV感染細胞に対する試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程；（b）試験結合分子をHBVに感染していない細胞と接触させて、HBVに感染していない細胞に対する試験結合分子の結合の親和性またはアビディティを測定する工程（ここで、非感染細胞は、感染していないこと以外はHBV感染細胞と同一である）；（c）工程（a）と工程（b）の結果を比較する工程；ならびに（d）工程（a）で測定された親和性またはアビディティが工程（b）で測定された親和性またはアビディティより高い試験化合物を同定する工程を含む。特定の局面において、HBV感染細胞は、ヒト細胞である。特定の局面において、試験結合分子は、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図1A：HBV表面タンパク質の線形構造。図1B：膜中のHBV表面タンパク質の立体配置。
【図２Ａ】種々のHBV24 IgM構築物からの発現産物を示すSDSポリアクリルアミドゲル。
【図２Ｂ】HBV23 IgGおよびIgM構築物からの発現産物を示すSDSポリアクリルアミドゲル。
【図２Ｃ】HBV19 IgGおよびIgM構築物からの発現産物を示すSDSポリアクリルアミドゲル。
【図３Ａ】精製HBV24M2V15J（三角）、精製HBV24G（四角）、およびHBV24G上清（円）のHBsAg-Lへの結合を示すELISA結果。
【図３Ｂ】精製HBV23MJ（三角）、精製HBV24G（四角）のHBsAg-Lへの結合を示すELISA結果。
【図４】PLC肝細胞癌細胞へ結合するHBV抗体のFACS分析。上の列：抗S抗体（HBV23抗HBsAg）、IgGおよびIgM＋ヒトJ鎖；下の列：抗プレS1抗体（HBV24GおよびHBV24M2V15J）、IgGおよびIgM＋V15J。各パネル中の未標識ヒストグラムは、未染色PLC細胞および適切なヒト抗体アイソタイプ対照（IgGまたはIgM）で染色されたPLC細胞を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
詳細な説明
定義
用語「a」または「an」エンティティは、そのエンティティの1つまたは複数を指す；例えば、「結合分子（a binding molecule）」は、1つまたは複数の結合分子を表すと理解される。そのようにして、用語「a」（または「an」）、「1つまたは複数の」および「少なくとも1つの」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００４３】
さらに、「および／または」は、本明細書において使用される場合、他の具体的な開示の有無にかかわらず、2つの具体的な特徴または構成要素の各々の具体的な開示として考慮されるべきである。したがって、用語「および／または」は、本明細書において「Aおよび／またはB」などの語句において使用されるとおり、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」（単独）、および「B」（単独）を含むことを意図する。同様に、用語「および／または」は、「A、B、および／またはC」などの語句において使用されるとおり、以下の態様の各々を包含することを意図する：A、B、およびC；A、B、またはC；AまたはC；AまたはB；BまたはC；AおよびC；AおよびB；BおよびC；A（単独）；B（単独）；ならびにC（単独）。
【００４４】
別段の定義のない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; および the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press は、本開示において使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する。
【００４５】
単位、接頭辞、および記号は、その国際単位系（Systeme International de Unites）（SI）によって許容される形態で示される。数値範囲は、その範囲を規定する数を含む。別段の指定がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの向きで左から右へと書かれる。本明細書において提供されている見出しは、本明細書を全体として参照することによって得ることができる、種々の局面または本開示の局面を限定するものではない。したがって、直ぐ下に定義される用語は、本明細書をその全体で参照することによってより完全に定義される。
【００４６】
本明細書において使用されるとおり、用語「天然に存在しない」物質、組成物、エンティティ、および／または物質、組成物、もしくはエンティティの任意の組み合わせ、またはそれらの任意の文法上の変形は、条件付きの用語であり、該条件付きの用語は、当業者によって「天然に存在する」と十分に理解されているか、または、審査員もしくは行政機関もしくは裁定機関によって「天然に存在する」と決定または解釈されている（もしくは任意の時点でその可能性がある）物質、組成物、エンティティ、および／または物質、組成物、もしくはエンティティの任意の組み合わせのそのような形態を明示的に除外するが、単にそれらを除外するにすぎない。
【００４７】
本明細書において使用されるとおり、用語「ポリペプチド」は、単数形の「ポリペプチド」だけでなく複数形の「ポリペプチド」も包含すると意図され、かつ、アミド結合（ペプチド結合としても公知）によって直線的に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、2つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、かつ、その産物の特定の長さを指すわけではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または2つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたはそれと互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」はまた、公知の保護／遮断基、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾によるグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、および誘導体化を非限定的に含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことを意図する。ポリペプチドは、生物学的供給源に由来するかまたは組換え技術によって産生することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。ポリペプチドは、化学合成によることを含む任意の様式で生成することができる。
【００４８】
本明細書に開示されるポリペプチドは、約3以上、5以上、10以上、20以上、25以上、50以上、75以上、100以上、200以上、500以上、1,000以上、または2,000以上のアミノ酸のサイズのポリペプチドであることができる。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することができるが、これらは必ずしもこのような構造を有する必要はない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは折り畳み型と称され、規定された三次元構造を保有しないポリペプチドは、むしろ多数の異なる立体配置を採用することができ、これは非折り畳み型と称される。本明細書において使用されるとおり、糖タンパク質という用語は、アミノ酸、例えばセリンまたはアスパラギンの酸素含有または窒素含有側鎖を介してタンパク質に付着された少なくとも1つの炭水化物部分にカップリングされたタンパク質を指す。
【００４９】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体とは、その天然環境にないポリペプチドを意図する。精製のレベルは特に必要ではない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術によって分離された、分画された、または部分的にもしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドであるのと同様に、本明細書に開示されるとおり「単離された」と見なされる。
【００５０】
本明細書において使用されるとおり、用語「天然に存在しない」ポリペプチド、またはその任意の文法上の変形は、条件付きの用語であり、該条件付きの用語は、当業者によって「天然に存在する」と十分に理解されているか、または、審査員もしくは行政機関もしくは裁定機関によって「天然に存在する」と決定または解釈されているか、もしくは任意の時点でその可能性があるポリペプチドのそのような形態を明示的に除外するが、単にそれらを除外するにすぎない。
【００５１】
本明細書に開示される他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、またはバリアント、およびそれらの任意の組み合わせである。用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」は、本明細書に開示されるとおり、対応する天然抗体またはポリペプチドの特性（例えば、抗原への特異的結合）の少なくとも幾つかを保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、例えば、本明細書の他の箇所で考察される特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片ならびに欠失断片を含む。例えば、ポリペプチドのバリアントは、上記の断片を含み、そしてまた、アミノ酸置換、欠失、または挿入が原因で変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。特定の局面において、バリアントは、天然に存在することができない。天然に存在しないバリアントは、当技術分野において公知の変異誘発技術を使用して産生することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。誘導体は、元のポリペプチドにおいては見いだされない追加の特徴を示すように変化したポリペプチドである。例は、融合タンパク質を含む。バリアントポリペプチドはまた、本明細書において「ポリペプチド類似体」と称することができる。本明細書において使用されるとおり、ポリペプチドの「誘導体」はまた、官能性側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された1つまたは複数のアミノ酸を有する対象のポリペプチドを指すことができる。また、20種の標準的なアミノ酸のうちの1つまたは複数の誘導体を含有するペプチドも「誘導体」として含まれる。例えば、プロリンを4-ヒドロキシプロリンに置換することができ；リシンを5-ヒドロキシリシンに置換することができ；ヒスチジンを3-メチルヒスチジンに置換することができ；セリンをホモセリンに置換することができ；リシンをオルニチンに置換することができる。
【００５２】
「保存的アミノ酸置換」は、1つのアミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基に置き換わるものである。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、当技術分野において定義されている。例えば、チロシンをフェニルアラニンに置換することは、保存的置換である。特定の態様において、本明細書において提供されているポリペプチドおよび抗体の配列中の保存的置換は、該アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の、結合分子が結合する抗原への結合を無効にしない。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180-1 187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); および Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997) を参照のこと）。
【００５３】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形の核酸だけでなく複数形の核酸も包含することを意図し、かつ、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNA（mRNA）、cDNA、またはプラスミドDNA（pDNA）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来的な結合（例えば、ペプチド核酸（PNA）において見いだされるようなアミド結合）を含むことができる。用語「核酸」または「核酸配列」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えば、DNAまたはRNA断片を指す。
【００５４】
「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然環境から分離された核酸またはポリヌクレオチドの任意の形態を意図する。例えば、ゲル精製されたポリヌクレオチド、またはベクター中に含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、「単離された」と見なされる。また、クローニング用の制限部位を有するように改変されたポリヌクレオチドセグメント、例えば、PCR産物も「単離された」と見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞中に維持された組換えポリヌクレオチド、または緩衝液もしくは食塩水のような非天然溶液中の精製された（部分的にまたは実質的に）ポリヌクレオチドを含む。単離されたRNA分子は、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロRNA転写物を含み、ここで、該転写物は、天然に見いだされるであろう転写物ではない。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成によって産生されたこのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、もしくは転写ターミネーターのような調節エレメントであるか、または該調節エレメントを含むことができる。
【００５５】
本明細書において使用されるとおり、「天然に存在しない」ポリヌクレオチド、またはその任意の文法上の変形は、条件付きの用語であり、該条件付きの用語は当業者によって「天然に存在する」と十分に理解されているか、または、審査員もしくは行政機関もしくは裁定機関によって「天然に存在する」と決定または解釈されている（もしくは任意の時点でその可能性がある）ポリペプチドのそのような形態を明示的に除外するが、単にそれらを除外するにすぎない。
【００５６】
本明細書において使用されるとおり、「コーディング領域」は、アミノ酸へと翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「終止コドン」（TAG、TGA、またはTAA）は、アミノ酸へと翻訳されないが、コーディング領域の一部であると見なすことができ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコーディング領域の一部ではない。2つ以上のコーディング領域は、単一ポリヌクレオチド構築物中、例えば、単一ベクター上に、または別々のポリヌクレオチド構築物中、例えば、別々の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコーディング領域を含有してもよいし複数のコーディング領域を含んでもよく、例えば、単一ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別個にコードすることができる。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、別のコーディング領域に融合されたまたは融合されていないいずれかの異種コーディング領域を含むことができる。異種コーディング領域は、非限定的に、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインのような特化したエレメントまたはモチーフをコードするものを含む。
【００５７】
特定の態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸は、DNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、1つまたは複数のコーディング領域と作動可能に連結されているプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含むことができる。作動可能な連結は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドに対するコーディング領域が、調節配列の影響下または制御下で遺伝子産物の発現が行われるように、1つまたは複数の調節配列と連結されている場合である。2つのDNA断片（たとえば、ポリペプチドコーディング領域およびそれと連結されているプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、および、2つのDNA断片間の連結の性質が遺伝子産物の発現を誘導する発現調節配列の能力と干渉しないまたは転写されるべきDNA鋳型の能力と干渉しない場合、「作動可能に連結されている」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を引き起こすことができた場合に、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結されている。プロモーターは、所定の細胞中でDNAの大幅な転写を誘導する細胞特異的プロモーターであることができる。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルが、ポリヌクレオチドと作動可能に連結されて、細胞特異的転写を誘導することができる。
【００５８】
様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらは、非限定的に、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、非限定的に、サイトメガロウイルス（最前期プロモーター、イントロン-Aと連結）、シミアンウイルス40（前期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントを含む。他の転写制御領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ-グロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するものだけでなく、真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列も含む。追加の好適な転写制御領域は、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーだけでなく、リンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）も含む。
【００５９】
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらは、非限定的に、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特定すると、内部リボソーム進入部位、またはIRES、これはまたCITE配列とも称される）を含む。
【００６０】
他の態様において、ポリヌクレオチドは、RNA、例えば、メッセンジャーRNA（mRNA）、転移RNA、またはリボソームRNAの形態のRNAであることができる。
【００６１】
ポリヌクレオチドおよび核酸コーディング領域は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコーディング領域と連結されることができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横断する成長中のタンパク質鎖の搬出が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、完全なまたは「全長」ポリペプチドから切断されて分泌されたまたは「成熟」形態のポリペプチドを産生する、ポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドを有することができることを認識している。特定の態様において、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、またはそれに作動可能に連結されているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能性誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列と置換することができる。
【００６２】
特定の結合分子、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体が本明細書に開示される。フルサイズ抗体について具体的に言及しない限り、用語「結合分子」は、フルサイズ抗体だけでなく、このような抗体の抗原結合サブユニット、断片、バリアント、類似体、または誘導体、例えば、抗体分子と同様な方法で抗原に結合するが異なるスキャフォールドを使用する、改変抗体分子または断片を包含する。
【００６３】
本明細書において使用されるとおり、用語「結合分子」は、その最も広い意味で、受容体（例えば、エピトープまたは抗原決定基）に特異的に結合する分子を指す。本明細書においてさらに記載されるとおり、結合分子は、本明細書に記載される1つまたは複数の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。結合分子の非限定例は、抗原特異的結合を保持する抗体またはその断片である。
【００６４】
用語「結合ドメイン」および「抗原結合ドメイン」は、本明細書において互換的に使用され、エピトープに特異的に結合するのに必要かつ十分な結合分子の領域を指す。例えば、「Fv」、例えば、抗体の可変重鎖および可変軽鎖（2つの別々のポリペプチドサブユニットまたは単鎖のいずれかとしての）は、「結合ドメイン」と見なされる。
【００６５】
他の抗原結合ドメインは、非限定的に、ラクダ種に由来する抗体の可変重鎖（VHH）、またはフィブロネクチンスキャフォールドにおいて発現する6つの免疫グロブリン相補性決定領域（CDR）を含む。本明細書に記載される「結合分子」は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個またはそれ以上の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。
【００６６】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書において互換的に使用することができる。抗体（または本明細書に開示されるその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、少なくとも重鎖の可変領域（ラクダ種の場合）または少なくとも重鎖および軽鎖の可変領域を含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988）を参照されたい。別段の記載のない限り、用語「抗体」は、抗体の小さい抗原結合断片から、フルサイズ抗体、例えば、2つの完全な重鎖および2つの完全な軽鎖を含むIgG抗体、4つの完全な重鎖および4つの完全な軽鎖を含みかつJ鎖および／もしくは分泌成分を含むことができるIgA抗体、または10もしくは12の完全な重鎖および10もしくは12の完全な軽鎖を含みかつJ鎖を含むことができるIgM抗体までのあらゆる範囲を包含する。
【００６７】
以下にさらに詳細に考察されるとおり、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖が、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それらには幾つかのサブクラス（例えば、γ1〜γ4またはα1〜α2）があることを認識する。抗体の「クラス」をそれぞれIgG、IgM、IgA、IgG、またはIgEと決定するのがこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2などは、よく特徴付けられており、機能的特殊化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の修飾バージョンは、本開示に照らして当業者に容易に識別可能であり、したがって、これらは本開示の範囲内である。
【００６８】
軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合され、2つの重鎖の「尾」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞、または遺伝子改変された宿主細胞のいずれかによって生成される場合に、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合される。重鎖では、アミノ酸配列は、Y立体配置のフォーク端のN末端から各鎖の最後のC末端まで伸びている。特定の抗体（例えば、IgG抗体）の基本的な構造は、本明細書において「H2L2」構造、または「結合ユニット」とも称される「Y」構造を形成する、ジスルフィド結合を介して共有結合している2つの重鎖サブユニットおよび2つの軽鎖サブユニットを含む。
【００６９】
用語「結合ユニット」は、本明細書において、結合分子の一部、例えば、標準的な免疫グロブリン構造、すなわち、2つの重鎖もしくはその断片および2つの軽鎖もしくはその断片、または2つの重鎖もしくはその断片（例えば、ラクダまたは軟質類（condricthoid）抗体に由来する）に対応する、抗体またはその抗原結合断片を指すように使用される。特定の局面において、例えば、結合分子が単一結合ユニットIgG抗体またはその抗原結合断片である場合、用語「結合分子」および「結合ユニット」は、等価である。他の局面において、例えば、結合分子がIgA二量体、IgM五量体、またはIgM六量体である場合、結合分子は「多量体」でありかつ2つ以上の「結合ユニット」を含み、IgA二量体の場合は2つの「結合ユニット」を、またはIgM五量体もしくは六量体の場合は5もしくは6つの「結合ユニット」をそれぞれ含む。結合ユニットは、全長抗体重鎖および軽鎖を含む必要はないが、典型的には二価であり、すなわち、以下に定義される2つの「抗原結合ドメイン」を含む。本開示において提供されている特定の結合分子は、五量体または六量体であり、IgM定常領域またはその断片を含む5つまたは6つの二価結合ユニットを含む。
【００７０】
本明細書において使用されるとおり、2つ以上の結合ユニット、例えば、2つ、5つ、または6つの結合ユニットを含む結合分子は、「多量体」と称することができる。用語「多量体」は、複数のユニットを保有することを意味する。したがって、例えば、「多量体結合分子」は、複数の結合ユニットを保有する。多量体結合分子は、2、3、4、5またはさらに6つまたはそれ以上もの結合ユニットを保有することもできる。
【００７１】
本明細書において使用される用語「天然配列J鎖」または「天然J鎖」は、任意の動物種の天然配列IgMまたはIgA抗体のJ鎖（そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:54として提示される成熟ヒトJ鎖を含む）を指す。
【００７２】
用語「修飾J鎖」は、本明細書において、異種部分、例えば、異種ポリペプチド、例えば、天然配列に導入された外来結合ドメインを含む、天然配列J鎖ポリペプチドのバリアントを指すために使用される。導入は、異種ポリペプチドもしくは他の部分の直接的もしくは間接的な融合またはペプチドもしくは化学リンカーを介した付着によることを含む、任意の手段によって達成することができる。用語「修飾ヒトJ鎖」は、非限定的に、SEQ ID NO:54のアミノ酸配列の天然配列ヒトJ鎖、または、異種部分、例えば、異種ポリペプチド、例えば、外来結合ドメインの導入によって修飾されたその機能的断片を包含する。特定の局面において、異種部分は、IgMの五量体へのまたはIgAの二量体への効率的な多量体化およびそのような多量体の標的への結合に干渉しない。例示的な修飾J鎖は、例えば、PCT公開公報 WO 2015/153912号（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）に見いだすことができる。
【００７３】
用語「結合価」、「二価」、「多価」および文法上の等価体は、所与の結合分子または結合ユニット中の抗原結合ドメインの数を指す。そのようにして、用語「二価」、「四価」、および「六価」は、所与の結合分子に関して、それぞれ、2つの抗原結合ドメイン、4つの抗原結合ドメイン、および6つの抗原結合ドメインの存在を表す。典型的なIgM由来結合分子では、各結合ユニットは二価であるが、一方、結合分子それ自体は、10または12の結合価を有することができる。二価または多価結合分子は、単一特異性（すなわち、抗原結合ドメインの全てが同じ）であるか、または二重特異性もしくは多重特異性（例えば、2つ以上の抗原結合ドメインが異なる場合、例えば、同じ抗原上の異なるエピトープに結合するか、または完全に異なる抗原に結合する）であることができる。
【００７４】
用語「エピトープ」は、抗体への特異的結合を可能にする任意の分子決定基を含む。特定の局面において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルのような分子の化学的に活性な表面基（surface grouping）を含むことができ、特定の局面において、三次元構造の特徴、および／または特有の電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体によって結合される標的の領域である。
【００７５】
「多重特異性結合分子もしくは抗体」または「二重特異性結合分子もしくは抗体」は、同じまたは異なる標的上の2つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を有する、結合分子、抗体、またはその抗原結合断片を指す。「単一特異性」は、1つのエピトープにのみ結合する能力を指す。
【００７６】
用語「標的」は、結合分子に結合され得る物質を含むようにその最も広い意味で使用される。標的は、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または他の分子であってもよい。さらに、「標的」は、例えば、結合分子に結合され得る結合エピトープを含む、細胞、臓器、または生体であってもよい。
【００７７】
抗体軽鎖および重鎖は、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。この事に関して、可変軽鎖（VL）部分および可変重鎖（VH）部分の両方の可変領域（本明細書において「可変ドメイン」と互換的に呼ぶことができる）が抗原の認識および特異性を決定することが理解されるであろう。反対に、軽鎖の定常ドメイン（CL）および重鎖の定常ドメイン（例えば、CH1、CH2またはCH3）は、分泌、経胎盤運動性、Fc受容体結合、補体結合などのような生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、これらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。N末端部分は可変領域であり、C末端部分は定常領域であり；CH3（またはIgMの場合CH4）ドメインおよびCLドメインはそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端にある。
【００７８】
「全長IgM抗体重鎖」は、N末端側からC末端側の方向に、抗体重鎖可変領域（VH）、抗体重鎖定常ドメイン1（CM1またはCμ1）、抗体重鎖定常ドメイン2（CM2またはCμ2）、抗体重鎖定常ドメイン3（CM3またはCμ3）、および抗体重鎖定常ドメイン4（CM4またはCμ4）を含む、ポリペプチドであり、尾部も含むことができる。
【００７９】
「全長IgA抗体重鎖」は、N末端側からC末端側の方向に、抗体重鎖可変領域（VH）、抗体重鎖定常ドメイン1（CA1またはCα1）、抗体重鎖定常ドメイン2（CA2またはCα2）、抗体重鎖定常ドメイン3（CA3またはCα3）、および尾部を含む、ポリペプチドである。単量体および分泌IgAの構造は、例えば、Woof, JM and Russell, MW, Mucosal Immunology 4:590-597 (2011) に記載されている。
【００８０】
上に示したとおり、可変領域、すなわち、「抗原結合ドメイン」は、結合分子が、抗原上のエピトープを選択的に認識して、該エピトープに特異的に結合することを可能にする。すなわち、結合分子（例えば、抗体）のVLドメインおよびVHドメイン、または相補性決定領域（CDR）のサブセットは、一体となって、三次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、VHおよびVL鎖の各々にある3つのCDRによって規定される。ある抗体は、より大きな構造を形成する。例えば、IgAは、（全てジスルフィド結合を介して共有結合している）2つのH2L2ユニットおよびJ鎖を含む分子を形成することができ、IgMは、5つまたは6つのH2L2ユニットと、幾つかの態様においては、ジスルフィド結合を介して共有結合しているJ鎖とを含む、五量体または六量体分子を形成することができる。特定の態様において、多量体IgAおよびIgM分子もまた、同じくジスルフィド結合を介して共有結合することができる分泌成分を含有することができる。
【００８１】
抗体抗原結合ドメイン中に存在する6つの「相補性決定領域」または「CDR」は、抗体が水性環境中でその三次元立体配置を取る場合に抗原結合ドメインを形成するように特定の配置をとる、アミノ酸の短い不連続配列である。「フレームワーク」領域と称される抗原結合ドメイン中の残りのアミノ酸は、分子間の多様性がより低い。フレームワーク領域は主にβシート立体配置を採用し、CDRは、当該βシート構造を接続する、幾つかの場合には当該βシート構造の一部を形成する、ループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間非共有相互作用によって正確な方向にCDRの配置を提供するスキャフォールドを形成するように機能する。配置されたCDRによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、そのコグネイトエピトープへの抗体の非共有結合を促進する。CDRおよびフレームワーク領域を作るアミノ酸は、それぞれ、種々の異なる方法で規定されているので、当業者は任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定することができる（“Sequences of Proteins of of Immunological Interest,” Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); and Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)（参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。
【００８２】
当技術分野の範囲内で使用および／または許容される用語の定義が2つ以上ある場合、本明細書において使用される用語の定義は、明示的に反対のことを述べない限り、全てのそのような意味を含むことを意図する。具体例は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見られる非連続抗原結合部位を記載するための用語「相補性決定領域」（「CDR」）の使用である。これらの特定の領域は、例えば、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of of Immunological Interest” (1983) および Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)（参照によって本明細書に組み入れられる）によって記載されている。KabatおよびChothiaの定義は、互いに比較したときのアミノ酸の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体のCDRまたはそのバリアントのCDRを指すためのいずれかの定義（または当業者に公知の他の定義）の適用は、別段の指定がない限り、本明細書中で定義および使用される用語の範囲内であることを意図する。上の引用文献の各々によって定義されるCDRを包含する適切なアミノ酸は、比較として以下の表1に示される。特定のCDRを包含する正確なアミノ酸の数は、CDRの配列およびサイズに応じて変化するであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮してどのアミノ酸が特定のCDRを含むかをルーチンに決定することができる。
【００８３】
（表１）CDR定義*
2018513680.tif 000004
* 表1中の全てのCDR定義のナンバリングは、Kabatらによって示されるナンバリング規則によるものである（以下を参照のこと）
【００８４】
免疫グロブリン可変ドメインはまた、例えば、IMGT情報システム（www://imgt.cines.fr/）（IMGT（登録商標）/V-Quest）を使用して分析することで、CDRを含む可変領域セグメントを同定することができる（例えば、Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36:W503-508, 2008 を参照のこと）。
【００８５】
Kabatらはまた、任意の抗体に適用可能である可変ドメイン配列についてのナンバリングシステムを定義した。当業者は、配列それ自体を超える任意の実験データに頼ることなく、この「Kabatナンバリング」のシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書において使用されるとおり、「Kabatナンバリング」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) によって示されるナンバリングシステムを指す。しかしながら、Kabatナンバリングシステムの使用が明示的に言及されない限り、本開示における全てのアミノ酸配列について連続的なナンバリングが使用される。
【００８６】
結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体）は、非限定的に、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab'およびF(ab')2、Fd、Fv、単鎖Fv（scFv）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、VLまたはVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリーによって産生される断片を含む。scFv分子は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号に記載されている。本開示によって包含される免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の種類（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）またはサブクラスの免疫グロブリン分子であることができる。また、二価でありかつIgNAR可変ドメイン（VNAR）を含む単鎖を含む、免疫グロブリン新規抗原受容体（IgNAR）アイソタイプも企図される（Walsh et al., Virol., 411:132-141, 2011 を参照のこと）。
【００８７】
「〜に特異的に結合する」とは、一般に、結合分子（例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および、その結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間でいくらかの相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、結合分子は、その抗原結合ドメインを介してランダムな関係のないエピトープに結合するよりも容易にそのエピトープに結合するときに、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書において、ある結合分子があるエピトープに結合する相対親和性を特定するために使用される。例えば、結合分子「A」は、所与のエピトープに対して結合分子「B」よりも高い特異性を有すると見なすことができ、または、結合分子「A」は、それが関係するエピトープ「D」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「C」に結合すると言うことができる。
【００８８】
本明細書に開示される結合分子（例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、5×10-2 sec-1、10-2 sec-1、5×10-3 sec-1、10-3 sec-1、5×10-4 sec-1、10-4 sec-1、5×10-5 sec-1、または10-5 sec-1  5×10-6 sec-1、10-6 sec-1、5×10-7 sec-1または10-7 sec-1以下の解離速度（k(off)）で標的抗原に結合すると言うことができる。
【００８９】
本明細書に開示される結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、103 M-1 sec-1、5×103 M-1 sec-1、104 M-1 sec-1、5×104 M-1 sec-1、105 M-1 sec-1、5×105 M-1 sec-1、106 M-1 sec-1、または5×106 M-1 sec-1または107 M-1 sec-1以上の結合速度（k(on)）で標的抗原に結合すると言うことができる。
【００９０】
結合分子（例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、当該結合分子が、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合をある程度まで遮断する程度に、当該結合分子が当該エピトープに優先的に結合する場合、当該エピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を競合阻害すると言われる。競合阻害は、当技術分野において公知の任意の方法（例えば、競合ELISAアッセイ）によって測定することができる。結合分子は、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、または少なくとも50%競合阻害すると言うことができる。
【００９１】
本明細書において使用されるとおり、用語「親和性」は、個々のエピトープと、例えば免疫グロブリン分子の1つまたは複数の抗原結合ドメインとの結合の強さの尺度を指す。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)の27〜28ページを参照されたい。本明細書において使用されるとおり、用語「アビディティ」は、抗原結合ドメインの集団と抗原との複合体の総合的な安定性を指す。例えば、Harlowの29〜34ページを参照されたい。アビディティは、集団内の個々の抗原結合ドメインと特異的エピトープとの親和性、ならびに免疫グロブリンおよび抗原の結合価の両方に関連する。例えば、二価モノクローナル抗体と、高度に反復するエピトープ構造を有する抗原（例えば多量体）との間の相互作用は、アビディティの高い相互作用であろう。また、二価モノクローナル抗体と、細胞表面に高密度で存在する受容体との間の相互作用も、アビディティの高い相互作用であろう。
【００９２】
本明細書に開示される結合分子またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体はまた、それらの交差反応性に関して記載または特定することができる。本明細書において使用されるとおり、用語「交差反応性」は、1つの抗原に特異的な結合分子（例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）が第二の抗原と反応する能力；2つの異なる抗原性物質間の関連性の尺度を指す。したがって、結合分子が、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、その結合分子は交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘導エピトープと同じ相補的な構造的特徴の多くを含有し、幾つかの場合では、実際には元のエピトープよりも良好にフィットし得る。
【００９３】
結合分子（例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）はまた、抗原に対するその結合親和性に関して記載または特定することができる。例えば、結合分子は、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数またはKDで抗原に結合することができる。
【００９４】
単鎖抗体または他の抗原結合ドメインを含む抗体断片は、単独でまたは以下のうちの1つまたは複数との組み合わせで存在することができる：ヒンジ領域、CH1、CH2、CH3、もしくはCH4ドメイン、J鎖、または分泌成分。また、可変領域とヒンジ領域、CH1、CH2、CH3、もしくはCH4ドメイン、J鎖、または分泌成分のうちの1つまたは複数の任意の組み合わせを含むことができる抗原結合断片も含まれる。結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片は、トリおよび哺乳動物を含む任意の動物起源に由来することができる。抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体であることができる。別の態様において、可変領域は、軟質類起源（例えば、サメ由来）であることができる。本明細書において使用されるとおり、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、かつ、ヒト免疫グロブリンライブラリーからまたは1つまたは複数のヒト免疫グロブリンにトランスジェニックな動物から単離された抗体を含み、ある場合には内因性免疫グロブリンを発現することができ、ある場合、以下に、および例えば、Kucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号に記載されるとおり発現することができない。
【００９５】
本明細書において使用されるとおり、用語「重鎖サブユニット」または「重鎖ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含み、結合分子、例えば、重鎖サブユニットを含む抗体は、以下の少なくとも1つを含むことができる：VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、またはそのバリアントもしくは断片。例えば、結合分子（例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、VHドメインに加えて、CH1ドメイン；CH1ドメイン、ヒンジ、およびCH2ドメイン；CH1ドメインおよびCH3ドメイン；CH1ドメイン、ヒンジ、およびCH3ドメイン；またはCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、ならびにCH3ドメインを含むことができる。特定の局面において、結合分子（例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、VHドメインに加えて、CH3ドメインおよびCH4ドメイン；またはCH3ドメイン、CH4ドメイン、およびJ鎖を含むことができる。さらに、本開示における使用のための結合分子は、特定の定常領域部分、例えば、CH2ドメインの全てまたは一部を欠くことができる。これらのドメイン（例えば、重鎖サブユニット）を元の免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列の点で異なるように修飾できることが当業者によって理解されよう。
【００９６】
結合分子（例えば、抗体またはその断片）の重鎖サブユニットは、異なる免疫グロブリン分子に由来するドメインを含むことができる。例えば、ポリペプチドの重鎖サブユニットは、IgG1分子に由来するCH1ドメインおよびIgG3分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖サブユニットは、IgG1分子に一部由来しかつIgG3分子に一部由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖サブユニットは、IgG1分子に一部由来しかつIgG4分子に一部由来するキメラヒンジを含むことができる。
【００９７】
本明細書において使用されるとおり、用語「軽鎖サブユニット」または「軽鎖ドメイン」は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、VLまたはCL（例えば、CκまたはCλ）ドメインの少なくとも1つを含む。
【００９８】
結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体）は、これらが認識または特異的に結合する抗原のエピトープまたは部分に関して記載または特定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の一部は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープまたは少なくとも2つのエピトープを含むことができ、かつ、抗原のサイズ、立体配置、および種類に応じて任意の数のエピトープを含むことができる。
【００９９】
先に示したとおり、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。本明細書において使用されるとおり、用語「VH領域」または「VHドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端側の可変ドメインを含み、用語「CH1ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第一の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインを含む。CH1ドメインは、VHドメインに隣接しており、典型的なIgG重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側にある。
【０１００】
本明細書において使用されるとおり、用語「CH2ドメイン」は、例えば、従来のナンバリングスキーム（244番目〜360番目のアミノ酸、Kabatナンバリングシステム；および231番目〜340番目のアミノ酸、EUナンバリングシステム；（Kabat EA et al.（前掲書中）を参照のこと）を使用して、IgG抗体の約244番目のアミノ酸〜360番目のアミノ酸まで伸びる重鎖分子の一部を含む。CH3ドメインは、IgG分子のCH2ドメインからC末端側へと伸び、およそ108アミノ酸を含む。特定の免疫グロブリンクラス、例えば、IgMは、CH4領域をさらに含む。
【０１０１】
本明細書において使用されるとおり、用語「ヒンジ領域」は、IgG、IgA、およびIgD重鎖中、CH1ドメインをCH2ドメインにつなぐ重鎖分子の一部を含む。このヒンジ領域は、およそ25アミノ酸を含み、かつ可撓性であり、したがって2つのN末端側の抗原結合領域が独立に動くことを可能にする。
【０１０２】
本明細書において使用されるとおり、用語「ジスルフィド結合」は、2つの硫黄原子間で形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第二のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。あるIgG分子では、CH1およびCL領域は、ジスルフィド結合によって連結され、2つの重鎖は、Kabatナンバリングシステムを使用して239および242に相当する位置（226または229位、EUナンバリングシステム）で2つのジスルフィド結合によって連結される。
【０１０３】
本明細書において使用されるとおり、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第一の種から得られるかまたはそれに由来し、定常領域（インタクトであるか、部分的であるか、または修飾されていることができる）が第二の種から得られる、抗体を指す。幾つかの態様においては、標的結合領域または部位は非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域はヒトのものである。
【０１０４】
用語「多重特異性抗体」、または「二重特異性抗体」は、単一の抗体分子（または「結合ユニット」）内の2つ以上の異なるエピトープに特異的な抗原結合ドメインを有する抗体を指す。他の結合分子は、カノニカルな抗体構造に加えて、2つの異なる結合特異性で構築することができる。二重特異性または多重特異性抗体によるエピトープ結合は、同時または連続的であることができる。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌することができる細胞株の2つの例である。二重特異性抗体はまた、組換え手段によって構築することができる（Strohlein and Heiss, Future Oncol. 6:1387-94 (2010); Mabry and Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)）。二重特異性抗体はまた、ダイアボディであることができる。したがって、多量体である二重特異性結合分子は、各々異なる特異性を有する幾つかの異なる抗原結合ドメインを潜在的に保有することもできる。例えば、IgM結合分子は、5つまたは6つの結合ユニットを含有する多量体と見なされ、各結合ユニットは、おそらく2つの抗原結合ドメインを保有する。このようなIgM結合分子では、各抗原結合ドメインは異なる識別可能なエピトープに結合することができるので、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、またはさらに12もの異なる特異性もあり得る。
【０１０５】
本明細書において使用されるとおり、用語「改変（された）抗体」は、重鎖および軽鎖または両方のいずれかにおける可変ドメインがCDRまたはフレームワーク領域のいずれかにおける1つまたは複数のアミノ酸の少なくとも部分的な置換によって変更された、抗体を指す。特定の局面において、公知の特異性の抗体由来のCDR全体を、異種抗体のフレームワーク領域中に移植することができる。代替CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにサブクラスの抗体に由来することができるが、CDRが異なるクラスの抗体、例えば異なる種からの抗体に由来することもできる。公知の特異性の非ヒト抗体由来の1つまたは複数の「ドナー」CDRがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に移植された改変抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と称される。特定の局面において、CDRの全てをドナー可変領域由来の完全なCDRに置換する必要はなく、なお依然としてドナーの抗原結合能をレシピエント可変ドメインへ移行することができる。例えば、米国特許第号5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号、および第6,180,370号に示される説明を考慮すれば、通例の実験を行うかまたは試行錯誤による実験のいずれかによって機能的な改変抗体またはヒト化抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。
【０１０６】
本明細書において使用されるとおり、用語「改変」は、合成手段（例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素もしくは化学カップリング、またはこれらの技術の幾つかの組み合わせ）による核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
【０１０７】
本明細書において使用されるとおり、用語「連結された」、「融合された」または「融合」または他の文法上の等価体は、互換的に使用することができる。これらの用語は、化学コンジュゲーションまたは組換え手段を含むあらゆる手段によって、2つ以上のエレメントまたは構成成分を一緒に接合することを指す。「インフレーム融合」は、元のORFの翻訳リーディングフレームを維持するように、連続的なより長いオープンリーディングフレーム（ORF）を形成する2つ以上のポリヌクレオチドORFの接合を指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のORFによってコードされるポリペプチドに相当する2つ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である（そのセグメントは、通常、天然ではそのように接合されていない）。したがって、リーディングフレームは、融合されたセグメント全体にわたり連続にされるが、そのセグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に分離されることができる。例えば、免疫グロブリン可変領域のCDRをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合できるが、「融合された」CDRが連続的なポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも1つの免疫グロブリンフレームワーク領域または追加のCDR領域をコードするポリヌクレオチドによって分離されることができる。
【０１０８】
ポリペプチドの文脈において、「直鎖状配列」または「配列」は、配列中の互いに隣接するアミノ酸がポリペプチドの一次構造において連続する、ポリペプチドにおけるアミノ末端側からカルボキシル末端側への方向のアミノ酸の順序である。
【０１０９】
ポリペプチドの、該ポリペプチドの別の部分に対して「アミノ末端側」または「N末端側」にある部分は、一連のポリペプチド鎖における前側の部分である。同様に、ポリペプチドの、該ポリペプチドの別の部分に対して「カルボキシ末端側」または「C末端側」にある部分は、一連のポリペプチド鎖における後側の部分である。例えば、典型的な抗体では、可変ドメインは定常領域に対して「N末端側」にあり、定常領域は可変ドメインに対して「C末端側」にある。
【０１１０】
用語「発現」は、本明細書において使用されるとおり、遺伝子が、生化学物質、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスは、遺伝子ノックダウンだけでなく一過性発現および安定発現の両方を非限定的に含む、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の出現を含む。プロセスは、非限定的に、メッセンジャーRNA（mRNA）への遺伝子の転写およびこのようなmRNAのポリペプチドへの翻訳を含む。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質および任意の前駆体の生成を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書において使用されるとおり、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーRNA、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであることができる。本明細書に記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を受けた核酸、または、翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの相互作用、タンパク質分解切断などを受けたポリペプチドをさらに含む。
【０１１１】
「〜を治療する」または「治療」または「〜を治療すること」または「〜を緩和する」または「〜を緩和すること」のような用語は、既存の診断された病的状態または障害の症状を治癒する、遅延させる、減少させる、および／またはその進行を停止するもしくは遅らせる治療的手段を指す。「〜を予防する」、「予防」、「〜を回避する」、「〜を阻止する」などのような用語は、未診断の標的の病的状態または障害の発生を予防する防止的または予防的手段を指す。したがって、「治療を必要とするもの」は、既に障害を有するもの；障害を有する傾向のあるもの；および障害が予防されるべきであるものを含むことができる。
【０１１２】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後、または治療が望まれる任意の対象、特定すると哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒト、家庭内動物、家畜、および動物園動物、スポーツ用動物、またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなどを含む。
【０１１３】
本明細書において使用されるとおり、「治療から恩恵を受けるであろう対象」および「治療を必要とする動物」などの語句は、1つまたは複数の抗原結合ドメインを含む抗体のような結合分子の投与から恩恵を受けるであろう哺乳動物対象のような対象を含む。このような結合分子、例えば、抗体は、例えば、診断手順のためにおよび／または疾患の治療もしくは予防のために使用することができる。
【０１１４】
本明細書において使用されるとおり、B型肝炎表面抗原または「HBsAg」は、HBVの表面糖タンパク質を指す。HBsAgは、HBVゲノム中の3つの独立した開始コドンから3つのサイズで産生される。この遺伝子産物の小、中および大バージョンは、3つの指定ドメインのうちの1つまたは複数の組み合わせ：（i）S単独（S）、（ii）プレS2およびS（M）、または（iii）プレS1およびプレS2およびS（L）である（図1A）。HBsAgは、血清型および系統間で異なるが、HBsAgの例示的な「L」バージョンは、アミノ酸配列：
2018513680.tif 000005
を含む。
【０１１５】
プレS1領域に下線を引いており、プレS2領域に二重下線を引いている。シグナルペプチドを含む前駆体HBsAgは、以下に提示されている。
2018513680.tif 000006
【０１１６】
本明細書において使用されるとおり、HBsAgの「プレS1領域」は、アミノ酸配列：
2018513680.tif 000007
と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列を含む、HBsAgの108アミノ酸N末端を指す。
【０１１７】
SEQ ID NO:60は、HBVのad血清型に由来するが、HBsAgのこの領域は、全てのHBV血清型で保存されている。中和モノクローナル抗体は、20〜47番目のアミノ酸（下線を引いている）に及ぶ領域に結合することが示されている。例えば、マウス抗体KR127に関連する抗体（例えば、米国特許第7,115,723号、米国特許第8,420,353号、Hong et al., Virol., 318:131-141, 2004、および Kim, J.H., et al. FEBS Letters 589:193-200 (2015) を参照のこと）は、SEQ ID NO:60の37〜47番目のアミノ酸内のエピトープに結合する。モノクローナル抗体2D028（WO 2011/045079A1）は、SEQ ID NO:60の38〜47アミノ酸内のエピトープに結合する。別のプレS1抗体F35.25（Petit, et al., Mol Immunol. 1989 Jun;26(6):531-7）は、SEQ ID NO:60の32〜53番目のアミノ酸内のエピトープに結合する。別のプレS1抗体5a19（Pizarro, et al., FEBS Letters 509:463-468 (2001)）は、プレS1のay血清型の37〜43番目のアミノ酸内のエピトープ（NTANPDW、SEQ ID NO:77）に結合する。プレS1領域は、肝細胞受容体結合に関与する（図1Aおよび図1B）。
【０１１８】
本明細書において使用されるとおり、B型肝炎Xタンパク質またはX抗原（HBxAg）は、B型肝炎ウイルスによって産生される154アミノ酸Ｘタンパク質を指す。HBxAgは、アミノ酸配列：
2018513680.tif 000008
と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
該タンパク質は、肝細胞癌（HCC）の発生に関与し得る（Seifer, M., et al., J Hepatology; 13 (suppl. 4): S61-S65）。HBxAgに対する抗体は、HCC腫瘍を有するマウスの腫瘍サイズを低減させ、生存を改善することが示されている（Li et al. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 1996 Apr;76(4):271-4）。
【０１２０】
IgM結合分子
IgMは、抗原による刺激に応答してB細胞によって産生される最初の免疫グロブリンであり、血清中に1.5 mg/ml前後で存在し、半減期は5日である。IgMは、典型的には、多量体、例えば、五量体または六量体分子である。したがって、IgM分子は、「多量体」結合分子である。5つまたは6つのIgM結合ユニットの各々は、2つの軽鎖および2つの重鎖を含む。IgGは、3つの重鎖定常ドメイン（CH1、CH2およびCH3）を含有するが、上に説明したとおり、IgMの重鎖（μ）は、C末端「尾部」を含む第四の定常ドメイン（CH4）をさらに含有する。ヒトIgM定常領域は、典型的には、アミノ酸配列SEQ ID NO:53を含む。ヒトCμ1領域は、SEQ ID NO:53の約5番目のアミノ酸〜約102番目のアミノ酸の範囲であり；ヒトCμ2領域は、SEQ ID NO:53の約114番目のアミノ酸〜約205番目のアミノ酸の範囲であり、ヒトCμ3領域は、SEQ ID NO:53の約224番目のアミノ酸〜約319番目のアミノ酸の範囲であり、Cμ4領域は、SEQ ID NO:53の約329番目のアミノ酸〜約430番目のアミノ酸の範囲であり、そして、尾部は、SEQ ID NO:53の約431番目のアミノ酸〜約453番目のアミノ酸の範囲である。ヒトIgM定常領域のアミノ酸配列（SEQ ID NO:53）は、以下に提供されている。
2018513680.tif 000009
【０１２１】
IgM結合分子は、追加の小さいポリペプチド鎖（J鎖）と複合体を形成して五量体IgM結合分子を形成することができる、5つの結合ユニット（各々「IgM結合ユニット」）を含むことができる。ヒトJ鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO:54を含む。IgM結合ユニットは、J鎖なしで会合し、典型的には六量体IgM結合分子を形成する。理論に束縛されるものではないが、IgM結合ユニットが会合して六量体または五量体結合分子を形成する際に、Cμ3およびCμ4ドメインを伴うと考えられる。したがって、本開示において提供されている六量体または五量体IgM結合分子は、典型的には、少なくともCμ3およびCμ4ドメインを含むIgM定常領域を含む。ヒトJ鎖のアミノ酸配列（SEQ ID NO:54）は、以下に提供されている。
2018513680.tif 000010
【０１２２】
IgM重鎖定常領域は、Cμ2ドメインもしくはその断片、Cμ1ドメインもしくはその断片、および／または他のIgM重鎖ドメインをさらに含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供されている結合分子は、完全なIgM重鎖（μ）定常ドメイン、例えば、SEQ ID NO:53、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体を含むことができる。
【０１２３】
五量体または六量体IgM HBV結合分子
本開示は、五量体または六量体HBV結合分子、すなわち、本明細書に定義される5つまたは6つの「結合ユニット」を保有する結合分子を提供し、これは、HBV抗原（例えば、HBsAg、例えば、HBsAgのプレS1領域）に特異的に結合することができる。本明細書において提供されている結合分子は、単一の結合ユニットから構成される結合分子（例えば、IgG抗体）と比較して改善された結合特性または生物活性を保有することができる。言い換えれば、本明細書において提供されている五量体または六量体IgM結合分子は、幾つかの態様において、例えば、わずか2つのHBV特異的抗原結合ドメインを含む参照単一結合ユニットと比較して、ウイルスクリアランスを増強することができ、かつより効力があることができる。用語「改善された結合特性」は、以下のとおりにさらに分類される。本明細書において提供されている五量体または六量体IgM結合分子は、それを必要とする個体に投与されたとき、本明細書において提供されている五量体または六量体IgM結合分子の抗原結合ドメインと配列が同一である抗原結合ドメインを保有するわずか1つの結合ユニットを含む単一の結合分子（すなわち、非多量体結合分子）と比較して、より強く、より効力があると実験的に決定される活性を示すことができるか、または、（i）感染性HBVビリオンの感染力を中和する、例えば、低減する、（ii）HBV感染細胞（HCC細胞、潜伏感染細胞、および慢性感染細胞を含む）の数を低減する、（iii）HBV感染を予防する、（iv）ウイルスクリアランスを、例えば増強された感染細胞の殺傷を通して増強する、ならびに／または（v）HBV感染の徴候および症状を改善するために、必要な結合分子の質量またはモル当量がより少なくて済むことができる。
【０１２４】
本明細書において提供されている結合分子は、同様に、合成またはキメラ構造から構成される多価結合分子と比較して独特の特徴を保有することができる。例えば、ヒトIgM定常領域の使用は、キメラ定常領域または合成構造を含有する結合分子と比べて低減された免疫原性、ひいては増加された安全を与えることができる。さらに、IgMベースの結合分子は、より均質な発現産物をもたらす六量体または五量体オリゴマーを一貫して形成することができる。優れた補体結合もまた、IgMベースの結合分子の有利なエフェクター機能であることができる。
【０１２５】
上に言及した参照単一結合ユニットは、IgG結合ユニットであることができる。参照IgG結合ユニットは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4などのような任意のアイソタイプであることができる。参照結合ユニットは、典型的には、同じ動物に由来する。したがって、多量体結合分子がヒトのものである場合、参照単一結合ユニットもヒトのものであるが、必ずしもヒトのものである必要はない。すなわち、参照単一結合ユニットは、IgGタイプのヒト化抗体であることができる。反対に、多量体結合分子がウサギ結合分子である場合、参照単一結合ユニットもウサギ結合ユニットであろう。さらに、多量体結合分子が1つまたは複数の結合ユニット断片から構成される場合、参照単一結合ユニットも等価な単一結合ユニット断片であろう。言い換えれば、参照単一結合ユニットは、参照単一結合ユニットが等価な単一結合ユニットである以外は、多量体結合分子中に含有される結合ユニットと他の配列および構造の点では同一である。
【０１２６】
特定の局面において、本開示は、それぞれ5つまたは6つの結合ユニットを含む五量体または六量体結合分子を提供し、ここで、各結合ユニットは、2つのIgM重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の局面において、2つのIgM重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。幾つかの態様において、IgM結合分子中の抗原結合ドメインは、起源がヒトであるか、またはヒト化されているか、またはそれらの組み合わせである。
【０１２７】
本明細書において提供されている多量体結合分子が五量体である場合、結合分子は、J鎖、またはその機能的断片、またはそのバリアントをさらに含むことができる。五量体IgM結合分子がJ鎖を含有する場合、該J鎖は、IgM結合分子と同じ種のJ鎖であることができる。すなわち、五量体IgM結合分子がヒトのものである場合、J鎖もヒトのものであることができる。特定の局面において、J鎖は、異種部分または1つまたは複数の異種部分、例えば、異種ポリペプチド配列、例えば、天然配列に導入された外来結合ドメインを含む、修飾J鎖である。特定の局面において、外来結合ドメインは、CD3（例えば、CD3ε）に特異的に結合する。特定の局面において、成熟修飾J鎖は、V15J（SEQ ID NO:68）またはJ15V（SEQ ID NO:71）を含む。
【０１２８】
IgM重鎖定常領域は、Cμ1ドメイン、Cμ2ドメイン、Cμ3ドメイン、および／またはCμ4ドメインのうちの1つまたは複数を含むことができるが、ただし、定常領域は、結合分子において所望の機能を果たすことができ、例えば、第二のIgM定常領域と連結されて抗原結合ドメインを形成するか、または他の結合ユニットと連結されて六量体もしくは五量体を形成することができる。特定の局面において、個々の結合ユニット内の2つのIgM重鎖定常領域またはその断片は各々、Cμ3ドメインもしくはその断片、Cμ4ドメインもしくはその断片、尾部（TP）もしくはその断片、またはCμ3ドメイン、Cμドメイン、およびTPもしくはその断片の任意の組み合わせを含む。特定の局面において、個々の結合ユニット内の2つのIgM重鎖定常領域またはその断片は各々、Cμ2ドメインもしくはその断片、Cμ1ドメインもしくはその断片、またはCμ1ドメインもしくはその断片およびCμ2ドメインもしくはその断片をさらに含む。
【０１２９】
特定の局面において、結合ユニット中の2つのIgM重鎖定常領域の各々は、抗原結合ドメイン（例えば、抗体のFv部分、例えば、ヒトまたはマウス抗体のVHおよびVL）と連結されている。特定の局面において、本明細書において提供されている結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、交差反応性HBV抗原結合ドメイン、例えば、2、3、4、またはそれ以上のHBVサブタイプに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである。他の態様において、本明細書において提供されているIgM結合分子は、結合ユニットを含むことができ、ここで、各結合ユニットは、異なるおよび識別可能な特異性を保有する。したがって、五量体IgM結合分子は、5個もの異なる特異性を保有することもでき、それによって、現在公知である全ての異なるHBVサブタイプに結合することができる。さらに、五量体IgM結合分子の各結合ユニットが2つの抗原結合ドメインを保有するため、かつ、これらの2つの抗原結合ドメインの各々が、独立して、異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに結合することができるため、五量体IgM結合分子は、異なるHBVサブタイプにわたって、2、3、4、5、6、7、8、9またはさらに10個もの異なる抗原またはエピトープに結合することができる。同様に、六量体IgM結合分子は、結合ユニットを含むことができ、ここで、各結合ユニットは、異なるおよび識別可能な特異性を保有する。したがって、六量体IgM結合分子は、12個もの異なる特異性を保有することもでき、それによって、現在公知である全ての異なるHBVサブタイプに結合することができる。さらに、六量体IgM結合分子の各結合ユニットが2つの抗原結合ドメインを保有するため、かつ、これらの2つの抗原結合ドメインの各々が、独立して、異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに結合することができるため、本明細書に開示される六量体IgM結合分子は、異なるHBVサブタイプにわたって、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11またはさらに12個もの異なる抗原またはエピトープに結合することができる。
【０１３０】
特定の局面において、少なくとも1つの抗原結合ドメインは、HBVビリオン表面エンベロープタンパク質（HBsAg）のS領域、プレS2領域、および／もしくはプレS1領域、またはHBV Xタンパク質に結合する。特定の態様において、少なくとも1つの抗原結合ドメインは、プレS1領域に特異的に結合する。幾つかの局面において、多量体結合分子は、プレS1、プレS2、およびSを含むHBV抗原に結合する。幾つかの態様において、HBV抗原は、プレS1およびプレS2、またはプレS1およびS、またはプレS2およびSである。プレS1抗原に結合する結合ユニットは、プレS1抗原に対して1つまたは複数の異なる特異性を保有することができる。すなわち、本明細書において提供されている多量体結合分子の少なくとも1つの結合ユニットは、HBVエンベロープタンパク質のプレS1タンパク質に特異的であり、そして、各結合ユニットが2つもの抗原結合ドメインを保有することができるため、各抗原結合ドメインは、プレS1タンパク質上の異なるおよび識別可能なエピトープに結合することができる。他の態様において、多量体結合分子が複数の結合ユニットを含むとき、各結合ユニットは独立して異なるHBV抗原に特異的であることができる。したがって、少なくとも2つの結合ユニットを含む多量体結合分子において、一方の結合ユニットはプレS1抗原に対して特異性を保有することができ、もう一方の結合ユニットはS抗原などに対して特異性を保有することができる。あるいは、結合ユニットの全ては、例えば、プレS1に対して同一の特異性を保有することができる。したがって、各結合ユニットが異なる抗原結合ドメインから構成できるのと同じように、多量体結合分子は、異なるHBV抗原に対して1つまたは複数の特異性を保有することができる。幾つかの局面において、多量体結合分子の全ての結合ユニットは、プレS1抗原に対して特異性を保有する。
【０１３１】
本明細書において提供されている多量体結合分子の結合ユニットに対するHBV抗原標的は、感染性HBVビリオンの表面、HBV感染細胞の表面、またはそれらの組み合わせにおいて、HBV抗原が非感染性サブウイルス粒子上に発現するよりも高い密度で発現することができる。例えば、プレS1が、感染性HBVビリオン粒子上に、非感染性の球状および線維状のHBVビリオン粒子上よりも高い密度で、すなわち、より多い数で発現することが公知である（Hong et al., Virology, 318:134-141, 2004; Heerman et al., J. Virol., 52(2):396-402, 1984; および Park et al., Antiviral Res., 68:109-115, 2005）。特定の態様において、本明細書において提供されている多量体結合分子の結合ユニットの少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個の抗原結合ドメインは、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合することができる。理論に束縛されるものではないが、感染性HBVビリオン中でより高度に発現するHBV抗原に対して特異性を保有する多量体結合分子は、上に考察したとおり、参照単一結合ユニットよりも、より効果的であり、より高い活性を保有し、より効力があることができるか、または、例えば感染細胞の殺傷を通したウイルスクリアランスの増強、例えばウイルス中和を通した感染力の抑制、および／または、感染個体、例えば、急性、慢性、もしくは潜伏感染個体中のHBVウイルスの成長もしくは維持の抑制の所望の活性を達成するために必要な分子がより少なくて済むことができる。
【０１３２】
あるいは、HBV抗原は、エンベロープタンパク質（S、Mおよび／またはL）、プレコア抗原（例えば、HBeAg）、コア抗原（例えば、HBcAg）、およびX-抗原（例えば、HBx）を含む、HBVタンパク質の任意の1つまたは複数であることができる。さらに、本明細書において提供されている多量体結合分子は、結合ユニットを保有することができ、その各々は、独立して、これらのHBV抗原の任意の1つまたは複数に対して特異性を保有する。したがって、単一の多量体結合分子は、例えば、エンベロープタンパク質(S、Mおよび／またはL）、プレコア抗原、コア抗原およびX-抗原を含む、HBV抗原の1つまたは複数に対して特異性を保有することができる。
【０１３３】
IgA結合分子
IgAは、粘膜免疫において重要な役割を果たしており、産生される総免疫グロブリンの約15%を構成する。IgAは、単量体または二量体分子である。本明細書において提供されている二量体結合分子は、5つまたは6つの結合ユニットを含む結合分子（例えば、六量体または五量体IgM抗体）と区別することができる結合特性または生物活性を保有することができる。例えば、二量体結合分子は、より小さいであろうし、より良好な組織透過性を達成することもできる。IgA結合分子は、2つのIgA単量体およびJ鎖を含むようにインビトロ発現によって製造することができる。次いで、IgA分子を、例えば静脈内注入を通して、個体に投与することができ、粘膜または粘膜組織に移動するIgA分子は、上皮細胞によって産生される分泌成分に結合して複合体を形成することができ、それによってsIgAが形成される。オリゴマーsIgAは上皮細胞を横断して移動し、sIgAは最終的に粘膜表面に送達される（Kaetzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(19):8796-8800）。それゆえ、血流へのIgAの送達は、粘膜組織の標的化を提供することができる。
【０１３４】
IgA結合ユニットは、2つの軽鎖および2つの重鎖を含む。IgAは、3つの重鎖定常ドメイン（Cα1、Cα2およびCα3）を含有し、かつ、C末端「尾部」を含む。ヒトIgAは、2つのサブタイプ、IgA1およびIgA2を有する。ヒトIgA1定常領域は、典型的には、アミノ酸配列SEQ ID NO:55：
2018513680.tif 000011
を含む。
【０１３５】
ヒトCα1領域は、SEQ ID NO:55の約6番目のアミノ酸〜約98番目のアミノ酸の範囲であり；ヒトCα2領域は、SEQ ID NO:55の約125番目のアミノ酸〜約220番目のアミノ酸の範囲であり、ヒトCα3領域は、SEQ ID NO:55の約228番目のアミノ酸〜約330番目のアミノ酸の範囲であり、尾部は、SEQ ID NO:55の約331番目のアミノ酸〜約352番目のアミノ酸の範囲である。ヒトIgA2定常領域は、典型的には、アミノ酸配列SEQ ID NO:56：
2018513680.tif 000012
を含む。
【０１３６】
ヒトCα1領域は、SEQ ID NO:56の約6番目のアミノ酸〜約98番目のアミノ酸の範囲であり；ヒトCα2領域は、SEQ ID NO:56の約112番目のアミノ酸〜約207番目のアミノ酸の範囲であり、ヒトCα3領域は、SEQ ID NO:56の約215番目のアミノ酸〜約317番目のアミノ酸の範囲であり、尾部は、SEQ ID NO:56の約318番目のアミノ酸〜約340番目のアミノ酸の範囲である。
【０１３７】
2つのIgA結合ユニットは、2つの追加のポリペプチド鎖、J鎖（SEQ ID NO:54）および分泌成分（SEQ ID NO:57）と複合体を形成して、分泌IgA（sIgA）抗体を形成することができる。理論に束縛されるものではないが、IgA結合ユニットが会合して二量体sIgA結合分子を形成する際に、Cα3および尾部ドメインを伴うと考えられる。したがって、本開示において提供されている二量体IgA結合分子は、典型的には、少なくともCα3および尾部ドメインを含むIgA定常領域を含む。分泌成分のアミノ酸配列（SEQ ID NO:57）は、以下に提供されている。
2018513680.tif 000013
【０１３８】
IgA重鎖定常領域は、Cα2ドメインもしくはその断片、Cα1ドメインもしくはその断片、および／または他のIgA重鎖ドメインをさらに含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供されている結合分子は、完全なIgA重鎖（α）定常ドメイン、例えば、SEQ ID NO:55もしくはSEQ ID NO:56、またはその断片を含むことができる。
【０１３９】
二量体HBV結合分子
本開示は、多量体結合分子、例えば、2つ以上のIgA分子を含む多量体結合分子を提供し、ここで、各IgA分子は、HBV抗原（例えば、HBsAg、例えば、HBsAgのプレS1領域）に特異的に結合することができる、本明細書に定義される1または2つの「結合ユニット」を含むことができる。上に説明したとおり、IgM多量体結合分子の文脈において、本明細書において提供されているIgA多量体結合分子は、参照用の単一の結合ユニットから構成される結合分子（例えば、単一結合ユニットIgG抗体）と比較して改善された結合特性または生物活性を保有することができる。言い換えれば、本明細書において提供されているIgA結合分子は、幾つかの態様において、わずか2つのHBV特異的抗原結合ドメインを含む参照単一結合ユニットと比較して、ウイルスクリアランスを増強することができ、かつ／または、例えば、例えば感染細胞の殺傷を通したウイルスクリアランスの増強、例えばウイルス中和を通した感染力の抑制、および／または、感染個体（例えば、急性、慢性、もしくは潜伏感染個体）中のHBVウイルスの成長もしくは維持の抑制において、より効力があることができる。用語「改善された結合特性」は、以下のとおりにさらに分類することができる。本明細書において提供されているIgA結合分子は、それを必要とする個体に投与されたとき、本明細書において提供されているIgA結合分子の抗原結合ドメインと配列が同一である抗原結合ドメインを保有するわずか1つの結合ユニットを含む単一の結合分子（すなわち、非多量体結合分子）と比較して、より強く、より効力があると実験的に決定される活性を示すことができるか、または、ウイルスクリアランスを増強する、感染性HBVビリオンの感染力を低減する、および／または感染個体中の感染性HBVビリオンの成長を低減するために必要な結合分子の質量もしくはモル当量がより少なくて済むことができる。
【０１４０】
上に言及した参照単一結合ユニットは、IgG結合ユニットであることができる。参照IgG結合ユニットは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4などのような任意のアイソタイプであることができる。参照結合ユニットは、典型的には、同じ動物に由来する。したがって、多量体結合分子がヒトのものである場合、参照単一結合ユニットもヒトのものであるが、必ずしもヒトのものではない。すなわち、参照単一結合ユニットは、IgGタイプのヒト化抗体であることができる。反対に、多量体結合分子がウサギ結合分子である場合、参照単一結合ユニットもウサギ結合ユニットであろう。さらに、多量体結合分子が1つまたは複数の結合ユニット断片から構成される場合、参照単一結合ユニットも等価な単一結合ユニット断片であろう。言い換えれば、参照単一結合ユニットは、参照単一結合ユニットが等価な単一結合ユニットである以外は、多量体結合分子中に含有される結合ユニットと他の配列および構造の点では同一である。
【０１４１】
特定の局面において、本開示は、2つの二価結合ユニットを含む多量体結合分子を提供し、ここで、各結合ユニットは、2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の局面において、2つのIgA重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。IgA結合ユニットは、ヒトの結合ユニット、もしくはヒト化された結合ユニット、またはそれらの組み合わせであることができる。あるいは、IgM結合ユニットは、単一のIgM結合分子中の混合種のIgM結合ユニットであることができる。
【０１４２】
本明細書において提供されている多量体（例えば、二量体）IgA結合分子は、J鎖またはその機能的断片もしくはそのバリアントをさらに含むことができる。特定の局面において、J鎖は、1つの異種部分または1つもしくは複数の異種部分（例えば、異種ポリペプチド配列、例えば、天然配列に導入された外来結合ドメイン）を含む、修飾J鎖である。特定の局面において、外来結合ドメインは、CD3（例えば、CD3ε）に特異的に結合する。特定の局面において、成熟修飾J鎖は、V15J（SEQ ID NO:68）またはJ15V（SEQ ID NO:71）を含む。本明細書において提供されている多量体IgA結合分子は、分泌成分またはその断片もしくはそのバリアントをさらに含むことができる。
【０１４３】
IgA重鎖定常領域は、Cα1ドメイン、Cα2ドメイン、および／またはCα3ドメインのうちの1つまたは複数を含むことができるが、ただし、定常領域は、結合分子において所望の機能を果たすことができ、例えば、第二のIgA定常領域と連結されて抗原結合ドメインを形成するか、または別のIgA結合ユニットと連結されて二量体結合分子を形成することができる。特定の局面において、個々の結合ユニット内の2つのIgA重鎖定常領域またはその断片は各々、Cα3ドメインもしくはその断片、尾部（TP）もしくはその断片、またはCα3ドメイン、TP、もしくはその断片の任意の組み合わせを含む。特定の局面において、個々の結合ユニット内の2つのIgA重鎖定常領域またはその断片の各々は、Cα2ドメインもしくはその断片、Cα1ドメインもしくはその断片、またはCα1ドメインもしくはその断片およびCα2ドメインもしくはその断片をさらに含む。
【０１４４】
特定の局面において、所与の抗原結合ドメインにおいて、2つのIgA重鎖定常領域の各々は、抗原結合ドメイン（例えば、抗体のFv部分、例えば、ヒトまたはマウス抗体のVHおよびVL）と連結されている。特定の局面において、本明細書において提供されている結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、交差反応性HBV抗原結合ドメイン、例えば、2、3、4、またはそれ以上のHBVサブタイプに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである。特定の局面において、少なくとも1つの抗原結合ドメインは、HBVビリオンのプレS1またはX抗原に結合する。
【０１４５】
他の態様において、本明細書において提供されているIgA結合分子は、結合ユニットを含むことができ、ここで、各結合ユニットは、異なるおよび識別可能な特異性を各々が有する2つの抗原結合ドメインを保有することができる。したがって、二量体IgA結合分子は、4つもの異なる特異性を保有することもできる。
【０１４６】
特定の局面において、少なくとも1つの抗原結合ドメインは、HBVビリオンエンベロープタンパク質（HBsAg）のS領域、プレS2領域、および／またはプレS1領域に結合する。特定の態様において、少なくとも1つの抗原結合ドメインは、プレS1タンパク質に特異的に結合する。幾つかの局面において、多量体結合分子は、プレS1、プレS2、およびSを含むHBV抗原に結合する。幾つかの態様において、HBV抗原は、プレS1およびプレS2、またはプレS1およびS、またはプレS2およびSである。プレS1抗原に結合する結合ユニットは、プレS1抗原に対して1つまたは複数の異なる特異性を保有することができる。すなわち、本明細書において提供されている多量体結合分子の少なくとも1つの結合ユニットは、HBVエンベロープタンパク質のプレS1タンパク質に特異的であり、そして、各結合ユニットが2つもの抗原結合ドメインを保有することができるため、各抗原結合ドメインは、プレS1タンパク質上の異なるおよび識別可能なエピトープに結合することができる。他の態様において、多量体結合分子が複数の結合ユニットを含むとき、各結合ユニットは独立して異なるHBV抗原に特異的であることができる。したがって、少なくとも2つの二価結合ユニットを含む多量体結合分子において、一方の結合ユニットはプレS1抗原に対して特異性を保有することができ、もう一方の結合ユニットはS抗原などに対して特異性を保有することができる。あるいは、結合ユニットの全ては、例えば、プレS1に対して同一の特異性を保有することができる。したがって、各結合ユニットが異なる抗原結合ドメインから構成できるのと同じように、多量体結合分子は、異なるHBV抗原に対して1つまたは複数の特異性を保有することができる。本開示のある局面において、多量体結合分子の全ての結合ユニットは、プレS1抗原に対して特異性を保有する。特定の局面において、少なくとも1つの抗原結合ドメインは、HBV X抗原（HBxAg）に結合する。
【０１４７】
提供される多量体結合分子の結合ユニットが特異性を保有するHBV抗原は、感染性HBVビリオンの表面、HBV感染細胞の表面、またはそれらの組み合わせにおいて、HBV抗原が非感染性サブウイルス粒子上に発現するよりも高い密度で発現することができる。例えば、プレS1が、感染性HBVビリオン粒子上に、非感染性の球状および線維状のHBVビリオン粒子上よりも高い密度で、すなわち、より多い数で発現することが公知である（Hong et al., Virology, 318:134-141, 2004; Park et al., Antiviral Res., 68:109-115, 2005）。特定の態様において、本明細書において提供されている多量体結合分子の少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つの抗原結合ドメインは、感染性ウイルス粒子の表面上、HBV感染細胞の表面上、またはそれらの組み合わせにおいて発現するB型肝炎ウイルス（HBV）抗原に特異的に結合する。感染細胞の表面上に発現しているとき、感染細胞の表面上に発現しているMHC分子との関連で、より高密度のHBV抗原を見いだすことができる。理論に束縛されるものではないが、感染性HBVビリオン中でより高度に発現するHBV抗原に対して特異性を保有する多量体結合分子は、上に考察したとおり、参照単一結合ユニットよりも、より効果的であり、より高い活性を保有し、より効力があることができるか、または、ウイルスクリアランスの増強、感染力の抑制、および／または感染個体中のHBVウイルスの成長の抑制の所望の活性を達成するために必要な分子がより少なくて済むことができる。
【０１４８】
あるいは、HBV抗原は、HBsAgエンベロープタンパク質（S、Mおよび／またはL）、プレコア抗原（例えば、HBeAg）、コア抗原（例えば、HBcAg）およびX-抗原（例えば、HBx）を含む、HBVタンパク質の任意の1つまたは複数であることができる。さらに、本明細書において提供されている多量体結合分子は、結合ユニットを保有することができ、その各々は独立して、これらのHBV抗原の任意の1つまたは複数に対して特異性を保有する。したがって、単一の多量体結合分子は、例えば、エンベロープタンパク質（S、Mおよび／またはL）、プレコア抗原、コア抗原およびX-抗原を含むHBV抗原の1つまたは複数に対して特異性を保有することができる。
【０１４９】
修飾J鎖
特定の局面において、本明細書において提供されているHBV結合分子は、修飾J鎖を組み込む二重特異性であることができる。本明細書およびPCT公開公報 WO2015/153912号において提供されている、修飾J鎖は、例えば、標的に特異的に結合することが可能なポリペプチド結合ドメインを含むことができる、異種部分、例えば、異種ポリペプチド、例えば、外来結合ドメインを含むことができる。結合ドメインは、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、抗体−薬物コンジュゲートもしくはその抗原結合断片、または抗体様分子であることができる。ポリペプチド結合ドメインは、付加の位置および種類（例えば、直接的または間接的融合、化学係留など）を適切に選択することによってJ鎖に導入することができる。
【０１５０】
特定の局面において、結合ドメインは、単一特異性、二重特異性、および多重特異性抗体ならびに抗体断片を含む、抗体または抗体の抗原結合断片であることができる。抗体断片は、非限定的に、抗体断片から形成される、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、scFv、(scFv)2断片、単鎖抗体分子、ミニボディ、または多重特異性抗体であることができる。特定の局面において、抗体断片は、scFvである。
【０１５１】
他の局面において、結合ドメインは、抗体様分子、例えば、ヒトドメイン抗体（dAb）、二重親和性再標的化（DART）分子、ダイアボディ、ジ−ダイアボディ、二重可変ドメイン抗体、積層型可変ドメイン抗体、Small Modular Immuno Pharmaceutical（SMIP）、サロボディ、鎖交換改変ドメイン（SEED）-ボディ、またはTandAbであることができる。
【０１５２】
結合ドメインは、レシピエントIgMもしくはIgA分子のその結合標的への結合に、またはIgA二量体もしくはIgM五量体へ効率的に組み込むJ鎖の能力に干渉することなく、結合ドメインのその結合標的への結合を可能にする任意の位置で、天然J鎖配列に導入することができる。特定の局面において、結合ドメインは、C末端もしくはその近傍に、成熟N末端（すなわち、シグナルペプチドの切断後のものであり、SEQ ID NO:54のアミノ酸番号23）もしくはその近傍に、またはJ鎖の三次元構造が許容可能であるかに基づいた内部位置に、挿入することができる。特定の局面において、SEQ ID NO:54のヒトJ鎖のC末端から約10残基を欠くかまたは成熟N末端から約10アミノ酸残基を欠く天然配列J鎖に結合ドメインを導入することができる。別の局面において、結合ドメインは、SEQ ID NO:54の天然配列ヒトJ鎖に、SEQ ID NO:54のシステイン残基114と123との間に、または別の天然配列J鎖の等価な位置に導入することができる。さらなる局面において、結合ドメインは、SEQ ID NO:54のJ鎖のような天然配列J鎖に、グリコシル化部位またはその近傍に導入することができる。特定の局面において、結合ドメインは、SEQ ID NO:54の天然配列ヒトJ鎖に、C末端から約10アミノ酸残基内に導入することができる。
【０１５３】
導入は、直接的または間接的融合によって達成することができ、すなわち、ペプチドリンカー有りでまたはペプチドリンカー無しで、それらのコーディングヌクレオチド配列をインフレームで連結することにより、1つのポリペプチド鎖においてJ鎖と結合ドメインとを連結することによって、達成することができる。ペプチドリンカー（間接的融合）は、使用される場合、約1〜50、または約1〜40、または約1〜30、または約1〜20、または約1〜10、または約1〜5、または約10〜20アミノ酸長であることができ、J鎖配列に導入されるべき結合ドメインの一端または両端に存在することができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは、約1〜5、約10〜20、または約10〜15アミノ酸長である。特定の局面において、ペプチドリンカーは15アミノ酸長である。特定の局面において、ペプチドリンカーは、（GGGGS）3（SEQ ID NO:72）である。
【０１５４】
また、複数の異種ポリペプチド、例えば、複数の結合ドメインをJ鎖に導入することも可能である。
【０１５５】
修飾J鎖は、修飾J鎖をコードする核酸を好適な原核または真核宿主生物中で発現させることによる、組換えDNA技術の周知の技術によって産生することができる。
【０１５６】
修飾J鎖はまた、本明細書の他の箇所に記載されるレシピエントIgMまたはIgA結合分子の重鎖および軽鎖と共に共発現させることができる。修飾J鎖の組み込みの前の、レシピエント結合分子は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であることができ、例えば、単一特異性、二重特異性、または多重特異性のIgAまたはIgM抗体であることができる。抗体を含む二重特異性および多重特異性のIgMおよびIgA結合分子は、例えば、米国特許出願第61/874,277号および第61/937,984号（その全体の内容は、参照によって明示的に組み入れられる）に記載されている。
【０１５７】
特定の局面において、本明細書に記載される抗HBV IgMまたはIgA結合分子は、T細胞、NK細胞、マクロファージ、または好中球等の免疫エフェクター細胞に対して結合特異性を有する修飾J鎖を含んでもよい。特定の局面において、エフェクター細胞はT細胞であり、結合標的は（以下に考察される）CD3である。HBV抗原（例えば、HBsAg）を表面に発現する感染細胞を標的として、エフェクター細胞（例えばエフェクターT細胞）を活性化または再誘導する（T細胞依存性殺傷またはTDCC）ことによって、本明細書において提供されている二重特異性抗HBVx抗CD3 IgMまたはIgA結合分子は、標的に対して増強された免疫応答、例えば補体媒介性細胞傷害性、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）、TDCC、および／またはNK細胞媒介性殺傷を含む応答を生じさせ、それによって、さらに効力および有効性を増加させることができる。特定の局面において、修飾J鎖を含む本明細書において提供されている二重特異性抗HBVx抗CD3 IgMまたはIgA結合分子は、B型肝炎ウイルスによる感染によって引き起こされたまたは悪化した疾患または状態の治療に使用することができる。
【０１５８】
T細胞の場合、cluster of differentiation 3（CD3）は、歴史的にT3複合体として公知の多量体タンパク質複合体であり、会合して3対の二量体（εγ、εδ、ζζ）として機能する4種の別個のポリペプチド鎖（ε、γ、δ、ζ）から構成される。CD3複合体は、T細胞受容体（TCR）と非共有結合するT細胞共受容体として役立つ。このCD3複合体の構成成分、とりわけCD3εは、本明細書において提供されている二重特異性IgMまたはIgA結合分子の修飾J鎖の標的であることができる。
【０１５９】
特定の局面において、二重特異性抗HBVx抗CD3 IgMまたはIgA結合分子は、抗体の結合ドメインを介してHBV感染細胞またはHBVウイルス粒子に結合するが、一方で、J鎖は、CD3εに結合するように修飾されている。
【０１６０】
特定の局面において、本明細書において提供されている修飾J鎖の抗CD3ε結合ドメインは、scFvである。抗CD3ε scFvは、J鎖のN末端もしくはその近傍で、またはJ鎖のC末端もしくはその近傍で、直接的または間接的のいずれかで、scFvとJ鎖配列との間に導入された合成リンカー、例えば、（GGGGS）3リンカー（SEQ ID NO:72）と融合させることができる。特定の局面において、scFvは、ビジリズマブ（Nuvion）のVHおよびVL領域を含む。特定の局面において、修飾J鎖は、ビジリズマブのVH、（GGGGS）3リンカー、およびビジリズマブのVLを含む、scFvを含む。
【０１６１】
特定の局面において、修飾J鎖は、15アミノ酸（GGGGS）3リンカーを介してヒトJ鎖のN末端に融合されたビジリズマブのscFvを含み、これは、本明細書においてV15Jと称される修飾J鎖である。V15Jはシグナルペプチドをさらに含んでもよく、それにより、輸送され、会合してIgMまたはIgA結合分子を形成するのが容易になる。成熟V15Jタンパク質は、SEQ ID NO:68として提示され、19アミノ酸からなる免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドを含む前駆体バージョンは、SEQ ID NO:67として提示されている。特定の局面において、修飾J鎖は、15アミノ酸（GGGGS）3リンカーを介してヒトJ鎖のC末端に融合されたビジリズマブのscFvを含み、これは、本明細書においてJ15Vと称される修飾J鎖である。J15Vはシグナルペプチドをさらに含んでもよく、それにより、輸送され、会合してIgMまたはIgA結合分子を形成するのが容易になる。成熟J15Vタンパク質は、SEQ ID NO:71として提示され、22アミノ酸からなるヒトJ鎖シグナルペプチドを含む前駆体バージョンは、SEQ ID NO:70として提示されている。特定の局面において、他のシグナルペプチドを使用することができる。修飾J鎖の発現、分泌、および本明細書において提供されている抗HBV IgMまたはIgA結合分子への組み込みを容易にする好適なシグナルペプチドの選択および包含は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６２】
改変HBV抗原結合ドメイン
特定の局面において、本明細書において提供されているHBV抗原結合ドメインは、6つもの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むことができ、ここで、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのCDRが、以下の表2に示されているHBV mAbの対応するCDRに関連しているか、または幾つかの態様においては同一である。特定の局面において、本明細書において提供されているHBV抗原結合ドメインは、6つもの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むことができ、ここで、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのCDRが、米国特許第7,115,723号に開示されているHBV mAb KR127の対応するCDRに関連しているか、または幾つかの態様においては同一である。KR127抗体およびその誘導体は、HBsAgプレS1エピトープに特異的である。特定の局面において、本明細書において提供されているHBV抗原結合ドメインは、KR127のヒト化バージョン、例えば、共に米国特許第7,115,723号に開示されているKR127I（ここで、VHおよびVL領域は、それぞれアミノ酸配列SEQ ID NO:1および3を含む）、KR127III（ここで、VHおよびVL領域は、それぞれアミノ酸配列SEQ ID NO:1および3を含む）であることができる。別の局面において、本明細書において提供されているHBV抗原結合ドメインは、米国特許第8,420,353号（VHおよびVL それぞれSEQ ID NO:5および6）、Hong et al., Virol., 318:131-141, 2004（VHおよびVL それぞれSEQ ID NO:4および3）、またはKim, J.H., et al. FEBS Letters 589:193-20, 2015（VHおよびVL それぞれSEQ ID NO:47および48）において提供されているKR127のヒト化親和性成熟バージョンであることができる。
【０１６３】
クローニングした可変領域を免疫グロブリンドメインへ遺伝子改変して、このような構築物を発現および精製するための方法は、当技術分野において公開されており、当業者の能力の範囲内である（例えば、Wu et al., MAbs, 1:339-47, 2009, and Wu et al., Nat. Biotechnol., 25:1290-7, 2007 を参照のこと）。
【０１６４】
表2は、本明細書において提供されている多量体結合分子において使用することができる例示的な非限定的なHBV結合ドメインのVHおよびVLアミノ酸配列、ならびに結合ドメインが結合する同定されたエピトープを提供する。これらの配列、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を、標準的な五量体または六量体IgMまたはIgA構造へと改変することができる。
【０１６５】
（表２）HBVに特異的なモノクローナル抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列
2018513680.tif 000014
2018513680.tif 000015
2018513680.tif 000016
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2018513680.tif 000019
【０１６６】
特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、六量体、または五量体結合分子のHBV抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域（VH）および抗体軽鎖可変領域（VL）を含み、ここで、VH領域、VL領域、またはVH領域およびVL領域の両方は、上記の表2に示されている参考文献に開示されているHBVモノクローナル抗体の対応するVHおよびVLに関連する。特定の局面において、本明細書において提供されている結合分子は、表2に列挙されている抗体のVHおよびVLを含むIgG抗体よりも大きな効力を示す。抗HBVのIgAまたはIgM形態の増加したアビディティは、非常に低密度のHBV表面タンパク質を伴う感染細胞に結合することができる、より効力の大きい治療抗体をもたらすことができ、これは、感染患者由来のHBVをより効果的にクリアランスすることをを可能にする。特定の局面において、VHは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:73、またはSEQ ID NO:75のうちの任意の1つまたは複数と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。特定の局面において、VLは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:76のうちの任意の1つまたは複数と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。特定の局面において、VH／VL配列は、それぞれ、以下の配列対のうちの任意の1つまたは複数を含む：SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:21、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:22、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43およびSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45およびSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:76。
【０１６７】
本開示に基づいて当業者は様々な異なる二量体、六量体、および五量体結合分子を検討することができ、それら自体が本開示に含まれるが、特定の局面において、IgM定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置付けられたVHを各々が含む2つのIgM重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置付けられたVLを各々が含む2つの免疫グロブリン軽鎖とを各結合ユニットが含む、上記の結合分子が提供される。特定の局面において、IgA定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置付けられたVHを各々が含む2つのIgA重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置付けられたVLを各々が含む2つの免疫グロブリン軽鎖とを各結合ユニットが含む、上記の結合分子が提供される。
【０１６８】
さらに、特定の局面において、結合分子の少なくとも1つの結合ユニット、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合ユニットは、上記のHBV抗原結合ドメインのうち2つを含む。特定の局面において、結合分子の1つの結合ユニット、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合ユニット内の2つのHBV抗原結合ドメインは、互いに異なっていてもよいし、同一であってもよい。
【０１６９】
特定の局面において、結合分子の1つの結合ユニット、または結合分子の2つの結合ユニット内の2つのIgA重鎖は、同一である。特定の局面において、結合分子の1つの結合ユニット、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合ユニット内の2つのIgM重鎖は、同一である。
【０１７０】
特定の局面において、結合分子の1つの結合ユニット、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの結合ユニット内の2つの軽鎖は、同一である。特定の局面において、結合分子の少なくとも1つの結合ユニット内の、または少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、もしくは少なくとも6つの結合ユニット内の2つの同一の軽鎖は、κ軽鎖（例えば、ヒトκ軽鎖）またはλ軽鎖（例えば、ヒトλ軽鎖）である。
【０１７１】
特定の局面において、本開示によって提供される二量体、五量体、または六量体結合分子の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの結合ユニット（またはそれらの各々）は、2つの同一のIgAまたはIgM重鎖、および2つの同一の軽鎖を含む。この局面によれば、結合分子の1つの結合ユニット、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つもしくは6つの結合ユニット中のHBV抗原結合ドメインは、同一であることができる。さらにこの局面によれば、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子は、上記のHBV抗原結合ドメインを少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12コピー含むことができる。特定の局面において、結合ユニットの少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つは、同一であることができ、そして、特定の局面において、結合ユニットは、同一の抗原結合ドメイン、例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個の同一であることができるHBV抗原結合ドメインを含むことができる。
【０１７２】
特定の局面において、二量体、六量体、または五量体結合分子は、VHおよびVLを含む少なくとも1つのHBV抗原結合ドメインを含み、ここで、VH領域、VL領域、またはVH領域およびVL領域の両方は、それぞれアミノ酸配列SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:21、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:22、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43およびSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45およびSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:76を含む対応するVHおよびVL領域に関連する。特定の局面において、二量体、六量体、または五量体結合分子は、VHを含む少なくとも1つのHBV抗原結合ドメインを含み、ここで、VH領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:13を含む対応するVH領域に関連する。
【０１７３】
特定の局面において、二量体、六量体、または五量体結合分子は、それぞれVHおよびVLアミノ酸配列SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:21、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:22、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43およびSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45およびSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:76の、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域を含むVHを含み、かつLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、少なくとも1つのHBV抗原結合ドメインを含む。特定の局面において、二量体、六量体、または五量体結合分子は、VHアミノ酸配列SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:13のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域を含むVHを含む、少なくとも1つのHBV抗原結合ドメインを含む。
【０１７４】
特定の局面において、二量体、六量体、または五量体結合分子は、VHおよびVLを含む少なくとも1つのHBV抗原結合ドメインを含み、ここで、VH領域、VL領域、またはVH領域およびVL領域の両方は、それぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:21、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:22、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43およびSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45およびSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:76と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列を含む。特定の局面において、二量体、六量体、または五量体結合分子は、VHを含む少なくとも1つのHBV抗原結合ドメインを含み、ここで、VH領域は、SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:13と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列を含む。
【０１７５】
特定の局面において、VHおよびVLは、米国特許第7,115,723号に記載されているHBV プレS1 mAbに由来することができる。例えば、HBV抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のVHアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:3と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のVLアミノ酸配列を含むことができる。
【０１７６】
特定の局面において、VHおよびVLは、Hong et al., Virol., 318:131-141, 2004 に記載されているHBV プレS1 mAbに由来することができる。例えば、HBV抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:4と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のVHアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:3と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のVLアミノ酸配列を含むことができる。
【０１７７】
特定の局面において、VHおよびVLは、米国特許第8,420,353号に記載されているHBV mAbに由来することができる。例えば、HBV抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:5と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のVHアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:6と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のVLアミノ酸配列を含むことができる。
【０１７８】
特定の局面において、HBV抗原結合ドメインは、それぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:21、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:22、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43およびSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45およびSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:76を含むVHおよびVLアミノ酸配列を含むことができる。特定の局面において、HBV抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:13を含むVHアミノ酸配列を含むことができる。
【０１７９】
特定の局面において、アミノ酸配列SEQ ID NO:58を含むIgM重鎖およびアミノ酸配列SEQ ID NO:59を含むκ軽鎖を含む、本明細書においてHBV24Mとして指定される六量体または五量体抗体が提供される。SEQ ID NO:58および59は以下に提供されている。
＞HBV24 IgM重鎖（SEQ ID NO:58）
2018513680.tif 000020
＞HBV24κ軽鎖（SEQ ID NO:59）
2018513680.tif 000021
【０１８０】
特定の局面において、アミノ酸配列SEQ ID NO:62を含むヒト化重鎖可変領域（VH）が提供される。
＞HBV24M2 IgM重鎖（SEQ ID NO:62）
2018513680.tif 000022
【０１８１】
特定の局面において、アミノ酸配列SEQ ID NO:63を含むIgM重鎖およびアミノ酸配列SEQ ID NO:59を含むκ軽鎖を含む、本明細書においてHBV24M2として指定される六量体または五量体抗体が提供される。SEQ ID NO:63および59は以下に提供されている。
＞HBV24M2 IgM重鎖（SEQ ID NO:63）
2018513680.tif 000023
＞HBV24κ軽鎖（SEQ ID NO:59）
2018513680.tif 000024
【０１８２】
特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体HBV結合分子は、同じ抗原結合ドメインを含む参照単一結合ユニットのような他の結合分子と比較して、有利な構造的および／もしくは機能的特性、または「改善された結合特性」を保有することができる。例えば、二量体、五量体、または六量体HBV結合分子は、対応する参照単一結合ユニット、例えば、上記の多量体結合分子中に存在するものと同じVHおよびVL領域配列を含むIgG1結合分子と比べて、インビトロまたはインビボのいずれかの生物学的アッセイにおいて改善された活性または効力を保有することができる。生物学的アッセイは、非限定的に、ウイルス中和アッセイ、細胞付着アッセイ、ウイルス放出アッセイ、免疫組織化学アッセイ、直接細胞傷害性アッセイ、補体媒介性細胞傷害性（CDC）アッセイ、T細胞媒介性殺傷（TDCC）アッセイ、NK細胞媒介性殺傷アッセイなどを含む。特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）は、そのHBV抗原結合ドメインと同じHBVエピトープに特異的に結合する等価な量の単一特異性の単一結合ユニットIgG1抗体またはその断片よりも高い効力で、HBVの中和またはHBV感染細胞の殺傷を誘導することができる。
【０１８３】
「効力」または「改善された結合特性」とは、所与の生物学的結果、例えば、所与のアッセイにおけるウイルス接種物の20%、50%、または90%の中和（EC20、EC50、またはEC90）を達成するのに必要な所与の結合分子の最少量を意味する。効力は、例えば、ウイルス中和%、感染細胞の殺傷%、または他の測定可能なパラメーターがY軸上にあり、そして、結合分子濃度（例えば、μg/mlまたはnM単位）がX軸上にある曲線として表すことができる。
【０１８４】
特定の局面において、TDCCは、T細胞活性化アッセイを通して、例えば、本明細書において提供されている二重特異性抗HBsAgｘ抗CD3 IgM結合分子の存在下で、HBsAg発現細胞と改変CD3発現T細胞とを共培養し、そして、サイトカイン放出、標的細胞溶解、または他の検出方法を通してT細胞活性化を測定することによってインビトロで測定することができる。特定の局面において、TDCCは、T細胞指向性標的細胞殺傷を通して測定することができる。
【０１８５】
特定の局面において、HBsAg発現細胞は、不死化細胞株、例えば、肝細胞癌（HCC）細胞株、例えば、PLC/PRF/5細胞、または細胞株、例えば、HEK293、CHO、HepG2、もしくはHepaRG細胞（HBV抗原、例えば、HBsAgもしくはHBsAg-Lをトランスフェクトさせて、前記抗原を発現する）、またはHBV感染細胞、例えば、HBV感染HepaRG細胞、またはHBV産生細胞、例えば、HepG2.2.15細胞であることができる。類似の細胞株は、公知であり、かつ当業者によって容易に得られる。特定の局面において、HBV抗原発現細胞株は、HBV感染、HCC、または関連癌を患う患者に由来することができる。
【０１８６】
特定の局面において、HBV抗原発現細胞の殺傷（例えば、CDC、TDCC、ADCCによる）の全体、および他の殺傷様式、例えば、アポトーシスは、単離されたT細胞および／または補体もしくは全血（T細胞および補体の両方を含む）を使用したアッセイでインビトロ試験することができる。
【０１８７】
特定の局面において、例えば、結合分子が、本明細書において提供されている2つの同一の抗HBsAg結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合ユニットを含む五量体結合分子である場合、例えば、HBsAg発現PLC/PRF/5細胞株またはHepG2.2.15細胞を使用したCDCアッセイで試験すると、結合分子は、例えばμg/ml単位またはnM単位で測定したときに、同一の抗HBsAg結合ドメインを有する1当量（重量またはモル濃度当量）の抗HBsAg単一特異性IgG1抗体のIC50よりも、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍またはそれ以上低いIC50で、補体媒介性殺傷を誘導することができる。特定の局面において、HBsAg発現細胞がPLC/PRF/5細胞株またはHBsAgトランスフェクト細胞である場合、結合分子は、例えばモルまたは分子量当量で測定したときに、同一の抗HBsAg結合ドメインを有する1当量の抗HBsAg単一特異性IgG1抗体のIC50よりも、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、または少なくとも100倍低いIC50で、補体媒介性殺傷を誘導することができる。
【０１８８】
特定の局面において、本明細書において提供されている2つの同一の抗HBsAg結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合ユニットを含む五量体結合分子＋本明細書において提供されている野生型または修飾J鎖は、より低いHBV抗原発現レベルを示す細胞で実施されたCDCアッセイにおいて、増加した効力を示すことができる。例えば、HBV発現PLC/PRF/5細胞またはHepG2.2.15細胞を使用したCDCアッセイで試験すると、本明細書において提供されている野生型または修飾J鎖を有する五量体抗HBsAg結合分子は、例えばモルまたは分子量当量で測定したときに、同一の抗HBsAg結合ドメインを有する1当量の抗HBsAg単一特異性IgG1抗体のIC50よりも、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍またはそれ以上低いIC50で、補体媒介性殺傷を誘導することができる。
【０１８９】
特定の局面において、本明細書において提供されている2つの同一の抗HBV結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合ユニットを含む二重特異性五量体結合分子＋本明細書において提供されているヒトCD3に結合することが可能な修飾J鎖（例えば、V15JまたはJ15V）は、TDCCアッセイにおいて増加した効力を示すことができる。例えば、本明細書において提供されているヒトCD3に結合することが可能な修飾J鎖（例えば、V15JまたはJ15V）を有する五量体抗HBsAg結合分子は、例えば、改変Jurkat T細胞と共培養したHBsAg発現PLC/PRF/5細胞またはHepG2.2.15細胞を使用したT細胞活性化アッセイで試験すると、例えばモルまたは分子量当量で測定したときに、HBV抗原発現細胞およびT細胞に結合する同一の抗HBsAg結合ドメインを有する1当量の二重特異性抗HBsAg IgG1抗体（例えば、単一結合ユニット二重特異性抗HBsAgx抗CD3分子）のIC50よりも、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍またはそれ以上低いIC50で、T細胞媒介性殺傷を刺激することができる。
【０１９０】
特定の局面において、本明細書において提供されている2つの同一の抗HBsAg結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合ユニットを含む単一特異性または二重特異性五量体結合分子＋本明細書において提供されているヒトCD3に結合することが可能な野生型J鎖または修飾J鎖（例えば、V15JまたはJ15V）は、全血インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて増加した効力を示すことができる。例えば、ヒルジン抗凝固ヒト血液と共培養したHBsAg発現PLC/PRF/5細胞株を使用した適切なインビトロ細胞傷害性アッセイで試験すると、本明細書において提供されている五量体抗HBV結合分子＋ヒトCD3に結合することが可能な野生型または修飾J鎖（例えば、V15JまたはJ15V）は、例えばモルまたは分子量当量で測定したときに、同一の抗HBsAg結合ドメインを有する1当量の抗HBsAg単一特異性IgG1抗体の、または、例えばモルまたは分子量当量で測定したときに、HBV抗原発現細胞およびT細胞に結合する同一の抗HBsAg結合ドメインを有する1当量の二重特異性抗HBsAg IgG1抗体（例えば、二重特異性の単一結合ユニット抗HBsAgx抗CD3分子）のIC50よりも、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも５倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍またはそれ以上低いIC50で、PLC/PRF/5細胞またはHepG2.2.15細胞の殺傷を達成することができる。
【０１９１】
特定の局面において、本明細書において提供されている2つの同一の抗HBsAg結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合ユニットを含む単一特異性または二重特異性五量体結合分子＋本明細書において提供されているヒトCD3に結合することが可能な野生型J鎖または修飾J鎖（例えば、V15JまたはJ15V）は、例えば本明細書の他の箇所に記載されているヒト化マウスモデルにおいて、インビボで増加したHBsAg発現細胞またはHBV感染細胞殺傷を示すことができる。
【０１９２】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本開示は、上記の二量体、六量体、または五量体結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、例えば、単離された、組換え、および／または天然に存在しないポリヌクレオチドをさらに提供する。「ポリペプチドサブユニット」とは、独立して翻訳されることができる、結合分子、結合ユニット、または抗原結合ドメインの一部を意味する。例は、非限定的に、抗体可変ドメイン、例えば、VHまたはVL、単鎖Fv、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、および／またはそれらの任意の断片を含む。
【０１９３】
特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、IgMもしくはIgA重鎖定常領域またはその断片、およびHBV抗原結合ドメインのVH部分を含むことができる。特定の局面において、ポリヌクレオチドは、VHのC末端に融合されたヒトIgMもしくはIgA定常領域またはその断片を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができ、ここで、VHは、アミノ酸配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:73、またはSEQ ID NO:75を含むVHのHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3領域を含む。
【０１９４】
特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、上記のHBV抗原結合ドメインの抗体VL部分を含むことができる。特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、VLのC末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含むことができ、ここで、VLは、アミノ酸配列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:76を含むVLのLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域、または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を含有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3領域を含む。
【０１９５】
特定の局面において、ポリヌクレオチドは、VHのC末端に融合されたヒトIgMもしくはIgA定常領域またはその断片を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができ、ここで、VHは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:73、またはSEQ ID NO:75のアミノ酸配列のうちの任意の1つまたは複数と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列を含む。
【０１９６】
特定の局面において、ポリヌクレオチドは、VLのC末端に融合されたヒト軽鎖定常領域またはその断片を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができ、ここで、VLは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:76のうちの任意の1つまたは複数と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のアミノ酸配列を含む。
【０１９７】
したがって、抗原結合ドメインを形成するために、B型肝炎抗原に特異的に結合する抗体の可変領域をIgMおよび／またはIgA構造のための発現ベクター鋳型に挿入することによって、少なくとも2つの二価結合ユニットを有する多量体結合分子を作製することができる。手短に言えば、重鎖および軽鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列を、既存の分子から合成または増幅させ、発現時にベクターが全長重鎖または軽鎖を生成するような適切な配向およびインフレームでベクターに挿入することができる。これらの目的に有用なベクターは、当技術分野において公知である。このようなベクターはまた、所望の鎖の発現を達成するために必要とされるエンハンサーおよび他の配列を含むことができる。複合ベクターまたは単一ベクターを使用することができる。これらのベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、次いで、その鎖を発現および精製する。発現時に、その鎖は、文献に報告されているとおり、完全に機能的な多量体結合分子を形成する。次いで、完全に会合し形成された多量体結合分子を標準的な方法によって精製することができる。必要であれば、発現および精製プロセスを商業スケールで実施することができる。
【０１９８】
本開示は、2つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物をさらに提供し、ここで、2つ以上のポリヌクレオチドは合わせて、上記の二量体、六量体、または五量体結合分子をコードすることができる。特定の局面において、組成物は、IgMおよび／またはIgA重鎖またはその断片、例えば、上記のヒトIgMおよび／またはIgA重鎖をコードするポリヌクレオチド（ここで、IgMおよび／またはIgA重鎖は、少なくともHBV抗原結合ドメインのVHを含む）と、軽鎖またはその断片、例えば、HBV抗原結合ドメインのVLを少なくとも含むヒトκまたはλ軽鎖をコードするポリヌクレオチドとを含むことができる。提供されるポリヌクレオチド組成物は、J鎖、例えば、ヒトJ鎖、またはその断片もしくはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供されている組成物を作るポリヌクレオチドは、2または3つの別々のベクター（例えば、発現ベクター）上に配置されることができる。このようなベクターは、本開示によって提供される。特定の局面において、本明細書において提供されている組成物を作るポリヌクレオチドの2つ以上は、単一ベクター（例えば、発現ベクター）上に配置されることができる。このようなベクターは、本開示によって提供される。
【０１９９】
本開示は、本明細書において提供されている二量体、五量体、もしくは六量体HBV結合分子をコードする1つのポリヌクレオチドもしくは2つ以上のポリヌクレオチド、またはそれらの任意のサブユニット、本明細書において提供されているポリヌクレオチド組成物、あるいは、本明細書において提供されている二量体、五量体、もしくは六量体HBV結合分子を合わせてコードする1つのベクターもしくは2、3もしくはそれ以上のベクター、またはそれらの任意のサブユニットを含む、宿主細胞、例えば、原核または真核宿主細胞をさらに提供する。特定の局面において、本開示によって提供される宿主細胞は、本開示によって提供される二量体、五量体、もしくは六量体HBV結合分子、またはそのサブユニットを発現することができる。
【０２００】
関連する局面において、本開示は、本開示によって提供される二量体、五量体、または六量体HBV結合分子を産生する方法を提供し、ここで、該方法は、上記の宿主細胞を培養する工程、および結合分子を回収する工程を含む。
【０２０１】
使用方法
本開示は、二量体IgAベースのHBV結合分子、または五量体もしくは六量体IgMベースのHBV結合分子を使用した、例えば、2つ以上のサブタイプにわたる、慢性感染細胞内でのB型肝炎ウイルス（HBV）の増殖、潜伏、または維持を制御する、例えば、ウイルスの付着、感染力、複製、潜伏、放出などを制御するための改善された方法を提供する。下記の方法は、表2に示されている参考文献に開示されている抗体ならびに対応するVHおよびVL配列、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体を非限定的に含む任意の新たなまたは既存のHBV抗体に由来するHBV抗原結合ドメインを含む、多量体結合分子を利用することができ、ここで、二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）は、上に開示および説明したとおり、対応する単一結合ユニット抗体、断片、バリアント、誘導体、または類似体と比較して改善された効力を提供することができる。本開示に基づいて、関心対象の任意のHBV特異的抗原結合ドメインを含む二量体IgA結合分子または五量体もしくは六量体IgM結合分子の構築は、十分に当業者の能力の範囲内である。抗HBV抗体のIgAまたはIgM形態の増加したアビディティは、非常に低密度のHBV表面タンパク質を伴うHBV感染細胞に結合することができる、より効力の大きい治療抗体をもたらすことができ、これは、改善されたウイルス中和、改善されたHBV感染細胞殺傷（例えば、補体またはT細胞媒介性細胞傷害性を通した）、HBVによる感染によって引き起こされたまたは悪化した疾患または状態（急性肝炎、慢性肝炎、肝臓炎、肝硬変、肝不全、肝細胞癌（HCC）、またはそれらの任意の組み合わせを非限定的に含む）の予防、ならびに感染患者由来のHBVのより効果的なクリアランスを可能にする。このような組成物の改善された結合特性は、例えば、使用されるべき用量の低減を可能にするか、または、対応する単一結合ユニット抗体に耐性のウイルスもしくはウイルス感染細胞のより効果的な中和および／もしくはクリアランスをもたらすことができる。「耐性」とは、HBVの中和、HBVまたはHBV感染細胞のクリアランス、感染力・複製・放出の制御などに対するHBV抗体の活性の任意の低下の程度を意味する。
【０２０２】
特定の局面において、本開示は、患者におけるB型肝炎ウイルス（HBV）感染によって引き起こされたまたは悪化した疾患または状態を治療する方法であって、HBVに感染したまたはHBVに感染しやすい患者に、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）を投与する工程を含む方法を提供する。本明細書の他の箇所に記載されるとおり、提供される結合分子は、例えばアミノ酸配列SEQ ID NO:62を有するVHおよびアミノ酸配列SEQ ID NO:6を有するVLを含む抗原結合ドメインと同じHBVエピトープ、例えば、HBV表面抗原のプレS1領域上のエピトープに特異的に結合する等価または同一の抗原結合ドメイン、例えば、単一特異性の単一結合ユニットIgG抗体またはその断片を含む参照単一結合ユニット抗体と比べて、増加した効力を示すことができる。特定の局面において、疾患または状態は、急性肝炎、慢性肝炎、肝臓炎、肝硬変、肝不全、肝細胞癌（HCC）、またはそれらの任意の組み合わせである。特定の局面において、本明細書において提供されている結合分子（例えば、IgM抗体）で処置（治療）されるべき患者は、特定の疾患症状、例えば、非限定的に、増加したウイルス負荷、ウイルス排出、腹痛、暗色尿、発熱、関節痛、食欲の喪失、吐き気および嘔吐、虚弱および疲労、黄疸、またはそれらの組み合わせを示すことができる。特定の局面において、疾患症状は、本明細書において提供されている結合分子によって、等価な単一結合ユニット抗体によるよりも高度に緩和または低減することができる。
【０２０３】
特定の局面において、本開示は、HBVの改善された中和を誘導するための方法を提供し、ここで、該方法は、HBV、またはHBV感染細胞を、本明細書に記載される二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）と接触させる工程を含み、ここで、結合分子は、例えばアミノ酸配列SEQ ID NO:62を有するVHおよびアミノ酸配列SEQ ID NO:6を有するVLを含む抗原結合ドメインと同じHBVエピトープ、例えば、HBV表面抗原のプレS1領域上のエピトープに特異的に結合する1当量の参照単一結合ユニット結合分子、例えば、単一特異性の単一結合ユニットIgG抗体またはその断片よりも高い効力でウイルス中和を誘導することができる。例えば、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のVHアミノ酸配列と、SEQ ID NO:3と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のVLアミノ酸配列とを含むことができる。別の局面において、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:62と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のVHアミノ酸配列と、SEQ ID NO:6と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%同一のVLアミノ酸配列とを含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）は、1当量の単一特異性の単一結合ユニットHBVモノクローナル抗体、例えば、対応するIgG抗体またはその断片よりも高い効力で2つ以上のHBVサブタイプのウイルス中和を誘導することができ、ここで、該抗体は、例えば、表2に示されるVHおよびVL配列と同じVHおよびVL領域であるかまたは該領域を含む。特定の局面において、六量体または五量体結合分子（例えば、IgM抗体）またはその断片は、アミノ酸配列SEQ ID NO:58を含む重鎖とアミノ酸配列SEQ ID NO:59を含む軽鎖とを含む。特定の局面において、六量体または五量体結合分子（例えば、IgM抗体）またはその断片は、アミノ酸配列SEQ ID NO:63を含む重鎖とアミノ酸配列SEQ ID NO:59を含む軽鎖とを含む。
【０２０４】
例えば、方法は、感染性HBVウイルス粒子、または他の感染性ウイルス粒子に対する親和性および／またはアビディティが決定されていない種々の結合分子のスクリーニングを含む。本明細書において提供されている方法を用いて、HBVサブウイルス粒子に結合するよりも高い親和性、高いアビディティ、またはそれらの組み合わせで感染性B型肝炎ウイルス（HBV）ウイルス粒子の表面、HBV感染細胞の表面、またはそれらの組み合わせに結合する結合分子を同定することができる。抗HBVのIgAまたはIgM形態の増加したアビディティは、非常に低密度のHBV表面タンパク質を伴う感染細胞に結合することができる、より効力が大きい治療抗体をもたらすことができ、これは、感染患者由来のHBVのより効果的なクリアランスを可能にする。同様に、本明細書において提供されている方法を用いて、同じウイルスの非感染性バージョンに結合するよりも高い親和性、高いアビディティ、または両方で他の感染性ウイルス粒子またはウイルス感染細胞の表面に結合する、結合分子を同定することができる。したがって、上に考察された有利な特性を保有する本明細書において提供されている結合分子を、感染性HBVまたは他のウイルス粒子に結合するための方法に使用することができる。本明細書において提供されている多量体結合分子の有利な特性に起因して、サブウイルス（非感染性）HBVウイルス粒子または他の非感染性ウイルス粒子に結合するよりも高いアビディティまたは親和性、またはそれらの組み合わせで感染性HBV粒子または他の感染性ウイルス粒子に結合する結合分子を同定することができる。したがって、感染性および非感染性ウイルス粒子への結合を検出し、結合親和性および／またはアビディティを比較することによってこのような特性を有するこのような結合分子を同定して、有利な特性を保有する追加の結合分子を同定することができる方法が開示される。この方法によって、サブウイルス（非感染性）ウイルス粒子に結合するよりも高いアビディティまたは親和性、またはそれらの組み合わせで感染性粒子に結合する結合分子を選択することができる。
【０２０５】
このような方法は、一般に、試験結合分子を感染性ウイルス粒子と接触させて、感染性ウイルス粒子に対する試験結合分子の結合の親和性および／またはアビディティを測定することによって実施することができる。同じ試験結合分子をまた、非感染性HBVサブウイルス粒子または他の非感染性ウイルス粒子と接触させて、HBVサブウイルス粒子または他の非感染性粒子に対する試験結合分子の結合の親和性および／またはアビディティを検出することができる。これらの2つの試験の結果を比較することによって、感染性HBV粒子または他の感染性ウイルス粒子に結合するための測定された親和性および／またはアビディティが非感染性HBVサブウイルス粒子または他の非感染性粒子に結合するための親和性および／またはよりも高い試験化合物（結合分子）が同定される。
【０２０６】
このようにして、本明細書において提供されている方法において有用な追加の結合分子を同定および利用することができる。
【０２０７】
同様に、HBV感染細胞または他のウイルス感染細胞についての親和性および／またはアビディティが決定されている種々の試験化合物（結合分子）の方法が開示される。本明細書において提供されている方法を用いて、ウイルスに感染していない同一の細胞に結合する、または非感染性ウイルス粒子に結合するよりも高い親和性、高いアビディティ、またはそれらの組み合わせでHBV感染細胞または他のウイルス感染細胞の表面に結合する結合分子を同定することができる。したがって、上に考察された有利な特性を保有する結合分子を、HBV感染細胞または他のウイルス感染細胞への優先的な結合のための方法において使用することができる。本明細書において提供されている多量体結合分子の有利な特性に起因して、結合分子は、類似の非感染細胞、または非感染性ウイルス粒子に結合するよりも高いアビディティおよび／または親和性でHBV感染細胞または他のウイルス感染細胞に結合することができる。したがって、ウイルス感染および非感染細胞および非感染性ウイルス粒子、ならびに結合親和性および／またはアビディティを比較して、結合の相違を同定する方法が開示される。この方法によって、HBVもしくは他のウイルス、または非感染性ウイルス粒子に感染していない類似の細胞に結合するよりも高いアビディティおよび／または親和性でHBV感染細胞または他のウイルス感染細胞に結合する結合分子を選択することができる。
【０２０８】
このスクリーニング法は、試験結合分子をHBV感染細胞（または他のウイルス感染細胞）と接触させる工程、およびHBVまたはウイルス感染細胞に対する試験結合分子の結合の親和性および／またはアビディティを測定する工程、ならびに、同じ試験の同じ結合分子をHBVもしくは他のウイルスに感染していない細胞、または非感染性ウイルス粒子と接触させる工程、およびHBVもしくは他のウイルスに感染していない細胞、または非感染性ウイルス粒子に対する試験結合分子の結合の親和性および／またはアビディティを測定する工程によって達成することができ、ここで、非感染細胞は、感染していないこと以外はHBV感染細胞と同一である。次いで、この試験化合物（または任意の数の試験化合物）についての結合結果を比較することによって、親和性および／またはアビディティが非感染細胞または非感染性ウイルス粒子よりも感染細胞に対してより高い試験化合物を同定することができる。
【０２０９】
このような方法における細胞は、HBVまたは他のウイルスが感染することが可能な任意の細胞、例えばヒト細胞であることができる。
【０２１０】
特定の局面において、二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）のHBV抗原結合ドメインは、6つの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、ここで、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのCDRは、表2に示されるHBV抗体のいずれか1つの対応するCDR、例えば、B型肝炎エピトープHBsAg、例えば、プレS1領域に親和性を保有するものに関連する。
【０２１１】
本明細書において提供されている方法における使用のための二量体、六量体、または五量体結合分子は、2つ以上のHBVサブタイプ、例えば、A、B、C、D、E、F、Gおよび/またはHに特異的に結合することができる、本明細書に定義される2つ、5つ、または6つの「結合ユニット」を有する結合分子である。特定の局面において、本明細書において提供されている方法における使用のための二量体、五量体、または六量体結合分子は、それぞれ、2つ、5つ、または6つの二価結合ユニットを含み、ここで、各結合ユニットは、2つのIgA重鎖定常領域もしくはその断片（IgAベースの結合分子の場合）、または2つのIgM重鎖定常領域もしくはその断片（IgMベースの分子の場合）を含む。特定の局面において、2つのIgAまたはIgM重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。
【０２１２】
本明細書において提供されている方法における使用のための二量体、五量体、または六量体HBV結合分子は、他の結合分子と比較して有利な構造的または機能的特性を保有することができる。例えば、本明細書において提供されている方法における使用のための二量体、五量体、または六量体結合分子は、上記のインビトロまたはインビボのいずれかの生物学的アッセイにおいて、これもまた上記の対応する参照単一結合ユニット、例えば、IgGまたはそのバリアント、類似体、もしくは誘導体よりも改善された結合特性を保有することができる。生物学的アッセイは、非限定的に、インビトロ中和アッセイ、血球凝集阻害アッセイ、細胞付着アッセイ、ウイルス放出アッセイ、免疫組織化学アッセイ、直接細胞傷害性アッセイ、補体媒介性細胞傷害性アッセイなどを含む。インビボ有効性モデルは、非限定的に、内因性肝臓能が低下したおよびヒト肝細胞で再構成された免疫欠陥マウスモデルを含む。あるいは、二量体、五量体、または六量体結合分子を、HBV感染の非ヒト霊長類モデルを使用してインビボで試験し、HBVクリアランスを評価することができる（以下の実施例7を参照のこと）。
【０２１３】
薬学的組成物および投与方法
本明細書において提供されている多量体、例えば、二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）を調製し、それを必要とする対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、または本開示に照らして当業者によって容易に決定される。多量体結合分子の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によってまたは局所であることができる。本明細書において使用される非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣内投与を含む。これらの投与形態が好適な形態として検討されるが、別の投与形態の例は、注射用、特に静脈内または動脈内の注射または点滴用の液剤であろう。好適な薬学的組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、および幾つかの態様において、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができる。
【０２１４】
本明細書において考察されるとおり、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体HBV結合分子を、B細胞を枯渇させることが望まれる疾患または障害のインビボ処置のために薬学的に有効な量で投与することができる。この事に関して、開示される多量体結合分子を、投与を容易にするためおよび活性剤の安定性を促進するために製剤化することができることが理解されるであろう。したがって、薬学的組成物は、生理食塩水、無毒の緩衝剤、防腐剤などのような薬学的に許容し得る無毒の滅菌担体を含むことができる。本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体HBV結合分子の薬学的に有効な量は、標的への効果的な結合を達成するのにおよび治療上の恩恵を達成するのに十分な量を意味する。好適な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980) に記載されている。
【０２１５】
本明細書において提供されている特定の薬学的組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤を含む、許容し得る剤形で経口投与することができる。特定の薬学的組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。このような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを増強する吸収促進剤、および／または他の従来の可溶化もしくは分散剤を用いて、食塩水中の溶液として調製することができる。
【０２１６】
単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる二量体、五量体、または六量体HBV結合分子の量は、例えば、処置（治療）される対象および特定の投与様式に応じて変化する。該組成物を、単回用量、多回用量として、または注入では確立された期間にわたって投与することができる。また、投与計画も最適の所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）をもたらすように調整することができる。
【０２１７】
本開示の範囲に沿って、本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体HBV結合分子を、治療を必要とする対象に、治療効果をもたらすのに十分な量で投与することができる。本明細書において提供されている多量体結合分子を、本開示の抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体と従来の薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを公知の技術に従って組み合わせることによって調製される従来の剤形で、対象に投与することができる。薬学的に許容し得る担体または希釈剤の形態および特徴を、組み合わせられるべき活性成分の量、投与経路および他の周知の変数によって決定することができる。
【０２１８】
「治療的に有効な用量または量」または「有効量」とは、投与されたときに、治療されるべき疾患または状態を有する患者の治療に関して正の治療応答をもたらす、二量体、五量体、または六量体HBV結合分子の量を意図する。
【０２１９】
B型肝炎ウイルスによる感染によって引き起こされたまたは悪化した疾患または状態の治療のための本明細書に開示される組成物の治療的に有効な用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の医薬、および処置（治療）が予防的であるか治療的であるかを含む多くの異なる要因に応じて変化することができる。特定の局面において、対象または患者は、ヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。当業者に公知の通常の方法を使用して治療投与量を決定して、安全性および有効性を最適化することができる。
【０２２０】
投与されるべき二量体、五量体、または六量体結合分子（例えば、IgM抗体）の量は、本開示を考慮して、過度の実験なしに当業者によって容易に決定される。多量体結合分子の投与様式およびそれぞれの量に影響を与える要因は、非限定的に、治療を受ける個体の疾患重症度、病歴、ならびに年齢、身長、体重、健康、および身体状態を含む。同様に、投与されるべき二量体、五量体、または六量体HBV結合分子の量は、投与様式および対象が単回用量の薬剤を受けるか多回用量の薬剤を受けるかに依存する。
【０２２１】
本開示はまた、B型肝炎ウイルスによる感染によって引き起こされたまたは悪化した疾患または状態を治療、予防、または管理するための医薬の製造における二量体、五量体、または六量体HBV結合分子の使用を提供する。
【０２２２】
本開示は、別段の指定がない限り、当分野における技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を採用する。このような技術は、文献において十分に説明されている（例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. 米国特許第4,683,195号; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md. を参照のこと）。
【０２２３】
抗体改変の一般的な原理は、Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press) に示されている。タンパク質改変の一般的な原理は、Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.) に示されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般的な原理は、Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); および Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.) に示されている。さらに、当技術分野において公知であるが具体的に記載されていない免疫学の標準的な方法は、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) および Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)に従うことができる。
【０２２４】
免疫学の一般原理を説明する標準的な参考文献は、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) “Monoclonal Antibody Technology” in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevier, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4th ed.; W.H. Freeman & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall, 2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press) を含む。
【０２２５】
上で引用されている参考文献の全て、ならびに本明細書で引用されている参考文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２２６】
以下の実施例は、例示を目的として提供されるものであって、限定を目的に提供されるものではない。
【実施例】
【０２２７】
実施例1：表面抗原の調製
過去に報告されているとおりに、表面抗原を調製することができる（例えば、Short et al., J. Mol. Biol. (2009) 390, 135-141 を参照のこと）。1つの方法では、HBVキャリアの血液からHBsAgを単離する。HBVを含有する凍結血清を、例えば、Diagnostics, Development and Research Division, National Blood Service, Colindale Centre, London, UK から得ることができる。次いで、個別パックを融解し、遠心分離し（3700×gで20分間）、その上清をTBS中の20%スクロース0.5ml上に層として載せ（5.1mlチューブ中）、遠心分離する（266,000×gで30分間）。ペレットを（4℃で一晩湿らして軟らかくした後で）20mMトリス塩化物（Tris chloride）（pH 7.4）および140mM NaCl（トリス緩衝生理食塩水、TBS）に再懸濁し、プールし、CsCl（初期濃度0.22g/ml）を用いた平衡遠心（266,000×gで72時間）に供する。勾配から画分（250μl）を取り、電子顕微鏡法によって、ならびにDNA抽出および分析によって、B型肝炎DNAをモニタリングする。最も好適なHBsAg粒子を含有する画分（B型肝炎DNA（ひいてはウイルス）フリーでもある）を取り、使用のためにTBSで透析する。複数の形態の表面抗原HBsAg（長型、プレS1-プレS2-S；中型、プレS2-S；短型、S）（天然型および組換え型の両方ならびにペプチド断片）は、他のHBVタンパク質の形態と同様に市販されていた。
【０２２８】
実施例2：HBVカプシドおよびビリオンの単離
カプシドおよびビリオンを単離する方法は、当技術分野で周知であり、多数の公知の手段によって実行することができる（例えば、Dryden, Molecular Cell, 22:843-850, June 23, 2006, suppl. を参照のこと）。カプシド単離の1つの方法では、解剖したばかりの全肝臓を生理食塩水で灌流する。次いで、肝臓を、溶解緩衝液（例えば、0.25 Mスクロース、1mM MgCl2、5mMトリス（pH 7.4））中でホモジナイズし、そこに完全プロテアーゼ阻害剤（Roche Applied Science, Indianapolis,IN）を補充する。各ホモジナートの上清を、SW40ローター中4℃および11,000rpmで15分間の遠心分離によって得る。HBV特異的サザンブロット分析を実施するために、上清のアリコートを取り出す。次いで、残りを30%スクロースクッション（リン酸緩衝化食塩水（PBS）中0.73 Mスクロース）上に層として載せ、ウイルス粒子を、SW40ローター中4℃および40,000rpmで5時間の遠心分離によってペレット化する。次いで、ペレットを、CsCl溶液［3.3 gのCsClをPBS溶液（1×PBS、20mM EDTA、および1×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）10mlに溶解した］1mlに再懸濁する。次いで、再懸濁した材料をクイックシールチューブ（Beckman Instruments, Palo Alto, CA）に移す。チューブに、CsCl溶液を充填し、密閉し、そして、TI80ローター中11℃および60,000rpmで18時間の遠心分離によってHBV粒子をバンド状にする。
【０２２９】
チューブの底に穴を開けて、画分を収集する。カプシドを含有する画分をプールし、PBSで希釈し、次いで濃縮する。濾液を合わせて、さらに30分間かけてペレット化する。次いで、試料を分割し、前もって作られたCsCl勾配（ρ 1.2〜1.4）上にロードする。4℃および38,000rpmで3時間の遠心分離後、画分（各200μl）をピペットによって収集し、それらの屈折率を測定して同等の画分をプールする。
【０２３０】
CsClを除去しかつプールした画分を濃縮するために、試料をペレット化してPBS中に再懸濁することを3回行うが、2回は、例えばTLA100.4ローターを使用して、最後は、例えばTLA100.2を使用して行う（各々、45,000rpmおよび4℃で1時間）。
【０２３１】
ビリオン単離の1つの方法では、1つまたは複数のHBV陽性個体から得られた複数の血漿交換ユニットをプールし、滅菌チーズクロスに通して濾過し、そして、ビリオンを以下に記載のとおりに精製する（Kaplan 1973; J. Virol. 12,995-1005）。簡潔に述べると、ポリカーボネートチューブに血漿プール65mlをロードし、これをSW30ローター中21,000rpmおよび5℃で3時間の遠心分離に供する。上清を廃棄して、チューブに別の血漿プール65mlを再ロードし、遠心分離を繰り返す。各々出発物質130mlからの2つのペレットを各々、PBS約7mlに再懸濁し、プールし、そして、PBS中20%（w/w）スクロースのクッション7mlに通すSW30ローター中30,000rpmおよび5℃の遠心分離に4時間供する。ペレットを、元の出発物質と比較して50×の終濃度までPBSに再懸濁し、アリコート50μlに分割し、-80℃で凍結する。
【０２３２】
あるいは、Kimによって概説されている方法に従ってHBVビリオンを産生することができる（FEBS Letters 2015; 589, 193-200）。簡潔に述べると、ウイルス粒子を、全長HBVゲノムを含有するベクターを用いたHepG2細胞（ATCC HB-8065）の一過性トランスフェクションによって産生する（例えば、pHBVEcoR1-; Gripon 1995; Virol. 213(2), 292-299）。次いで、PEG沈殿によってウイルス粒子を50倍に濃縮する（Le Seyed 1999; J. Virol. 73(3), 2052-2057）。HBVウイルスの遺伝子型は、使用するベクターに依存する。
【０２３３】
実施例3：HBVに特異的な改変IgM結合分子
本明細書において提供されている種々のHBV抗体のVHおよびVL領域を、標準的な方法によってまたは受託業者によって、IgGおよびIgMバックグラウンドにクローニングすることができる。
【０２３４】
HBV24：米国特許第8,420,353号において提供されているプレS1抗原に特異的なヒト化抗体のVHおよびVL（それぞれ、本明細書においてSEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6として提示される）を、アミノ酸配列SEQ ID NO:84およびSEQ ID NO:58をそれぞれ含むヒトIgGおよびIgM重鎖と、SEQ ID NO:59を含むκ軽鎖とをコードする適切なベクターにクローニングした。SEQ ID NO:58および58は上に列挙している。当該ベクターを（必要に応じて、下記のヒト野生型または修飾J鎖をコードするベクターを用いて）HEK293細胞にトランスフェクトして発現を可能にし、IgG分子HBV24GおよびIgM分子HBV24Mを産生させた。
【０２３５】
SEQ ID NO:84 HBV24G重鎖
2018513680.tif 000025
【０２３６】
HBV23：Cerino, et al., (2015) PLOS one 10(4):e0125704. doi: 10.1371 において提供されているHBsAgのS領域に特異的なヒト抗体のVHおよびVL（それぞれ、本明細書においてSEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:74として提示される）を、アミノ酸配列SEQ ID NO:85およびSEQ ID NO:80をそれぞれ含むヒトIgGおよびIgM重鎖と、SEQ ID NO:81を含むλ軽鎖とをコードする適切なベクターにクローニングした。当該ベクターを（必要に応じて、下記のヒト野生型または修飾J鎖をコードするベクターを用いて）HEK293細胞にトランスフェクトして発現を可能にし、IgG分子HBV23GおよびIgM分子HBV23Mを産生させた。
【０２３７】
SEQ ID NO:85 HBV23G重鎖
2018513680.tif 000026
【０２３８】
SEQ ID 80 HBV23M重鎖
2018513680.tif 000027
【０２３９】
SEQ ID 81 HBV23M軽鎖
2018513680.tif 000028
【０２４０】
HBV19：Pizarro, et al., FEBS Letters 509:463-468 (2001) において提供されているHBsAg血清型ayのプレS1領域に特異的なヒト抗体のVHおよびVL（それぞれ、本明細書においてSEQ ID NO:75、およびSEQ ID NO:76として提示される）を、アミノ酸配列SEQ ID NO:86およびSEQ ID NO:82をそれぞれ含むヒトIgGおよびIgM重鎖と、SEQ ID NO:83を含むκ軽鎖とをコードする適切なベクターにクローニングした。当該ベクターを（必要に応じて、下記のヒト野生型または修飾J鎖をコードするベクターを用いて）HEK293細胞にトランスフェクトして発現を可能にし、IgG分子HBV19GおよびIgM分子HBV19Mを産生させた。
【０２４１】
SEQ ID NO:86 HBV19G重鎖
2018513680.tif 000029
【０２４２】
SEQ ID 82 HBV19M重鎖
2018513680.tif 000030
【０２４３】
SEQ ID 83 HBV19M軽鎖
2018513680.tif 000031
【０２４４】
抗CD3抗体ビジリズマブ（Nuvion）由来の可変領域を組み込んだ別個の融合部位を伴う2つの異なるJ鎖バリアントを構築した。2つの異なる位置関係（V15JおよびJ15V）で、15アミノ酸を含有する（GGGGS）3リンカー（SEQ ID NO:72、下線を引いている）を介して、J鎖（イタリック体）に融合されている、ビジリズマブに対応するscFv（V）（VH-(GGGGS)3-VL、二重下線を引いている）を伴う、2つのJ鎖の配列を以下に示す。各配列は、下線もイタリック体もなしで示されているN末端シグナルペプチドを含有する。特定の局面においては、ここに示されているシグナルペプチドを他のシグナルペプチド配列に置き換えてもよい。
【０２４５】
SEQ ID NO:67：V15Jについての前駆体修飾J鎖配列（DNA配列：SEQ ID NO:66）：
2018513680.tif 000032
【０２４６】
SEQ ID NO:68：V15Jについての成熟修飾J鎖配列：
2018513680.tif 000033
【０２４７】
SEQ ID NO:66：
2018513680.tif 000034
【０２４８】
SEQ ID NO:70：J15Vについての前駆体修飾J鎖配列（DNA配列：SEQ ID NO:69）：
2018513680.tif 000035
【０２４９】
SEQ ID NO:71：J15Vについての成熟修飾J鎖配列：
2018513680.tif 000036
【０２５０】
SEQ ID NO:69：
2018513680.tif 000037
【０２５１】
成熟構築物は各々、約45kDの分子量を有し、かつ、CD3の可溶性ε鎖（Sino Biological）またはT細胞に結合することができる（データ示さず）。
【０２５２】
種々の抗HBsAg重鎖および軽鎖に対応するDNA構築物と、野生型（wt）J鎖、V15J J鎖、またはJ15V J鎖の配列のいずれかに対応するDNA構築物とを、HEK293細胞へ共トランスフェクトし、標準的な方法に従ってタンパク質を発現させて精製した。例えば、PCT公開公報 WO 2015/153912号（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）を参照されたい。HBV19、HBV23、およびHBV24抗体のIgGまたはIgM＋JバージョンをトランスフェクトしたHEK293細胞は、標準的な方法による精製を可能にするのに十分なタンパク質を産生した。
【０２５３】
アガロース−アクリルアミドハイブリッドゲル。IgM構築物を、過去に記載された方法（Chugai Seiyaki Kabushiki Kaisha, 2010, Pub. No.: US 2010/0172899 A1）から改変された非還元SDS-PAGEによって分離した。簡潔に述べると、40% Acrylamide/Bis-Acrylamide 37.5:1（Sigma-Aldrich）およびUltrapure Agarose（Invitrogen）を、終濃度がそれぞれ3.6%および0.5%になるように混合し、0.375 Mトリス緩衝液（pH 8.8）および15%グリセロール中のハイブリッドゲルとした。得られた混合物を50℃に加熱して、0.08% TEMEDおよび0.08%過硫酸アンモニウムの添加によって重合を開始させた。得られた溶液を2つのプレート間に注いで、アクリルアミドを37℃で1時間重合させ、次いで、完全な重合を確実にするために室温で30分間静置した。得られたハイブリッドゲルにタンパク質試料をロードし、当該ゲルをTris-Acetate SDS Running Buffer（Novex）中、800Vhで泳動した。次いで、ゲルを40%メタノール、10%酢酸中で10分間固定し、Colloidal Blue Staining Kit（Novex）を使用して少なくとも3時間染色し、その後、水中で脱染した。
【０２５４】
非還元SDS−非変性PAGE。Native PAGE 3〜12% Bis-Trisゲル（Novex）中にタンパク質試料をロードした。Tris-Acetate SDS Running Buffer（Novex）を加えて、ゲルを40Vで15分間、次いで、90Vで2時間泳動した。次いで、ゲルを40%メタノール、10%酢酸中で10分間固定し、Colloidal Blue Staining Kit（Novex）を使用して少なくとも3時間染色し、その後、水中で脱染した。
【０２５５】
非還元SDS−非変性PAGEによって測定したHBV24の発現および会合（アセンブリ）を図2Aに示す。HBV23の発現および会合（アセンブリ）を図2Bに示す。HBV19の発現および会合（アセンブリ）を図2Cに示す。各IgGの重鎖および軽鎖が十分に発現し、会合してIgG抗体を形成していた（HBV24、図示せず；HBV23、図2B、ライン2；HBV19、図2C、ライン2）。
【０２５６】
HBV24Mの重鎖および軽鎖は十分に発現していたが、ヒトJ鎖と共発現させた場合はIgM五量体を形成するように適切には会合していなかった（図2A、「Hu/Hu」）。一方で、SEQ ID NO:59を含む軽鎖は、マウスIgM重鎖定常領域を有するキメラHBV24と組み合わせた場合に適切に会合していた（図2A、「Ch/Hu」）。
【０２５７】
SEQ ID NO:5に関連するIgM重鎖可変領域を、特定のアミノ酸の部位特異的変異誘発を介して構築し、アミノ酸配列SEQ ID NO:62を含む重鎖可変領域を得た。SEQ ID 62を、上記の方法に従って、アミノ酸配列SEQ ID NO:63を含むIgM重鎖をコードする適切なベクターにクローニングした。当該ベクターを、アミノ酸配列SEQ ID NO:59を含むκ軽鎖を含むベクターおよびヒトJ鎖（SEQ ID NO:54）をコードするベクターまたは修飾J鎖V15J（SEQ ID NO:68）をコードするベクターと共にHEK293細胞にトランスフェクトして発現を可能にし、IgM分子HBV24M2JおよびHBV24M2V15Jを産生させた。両方の発現産物は適切に会合して五量体IgM分子を形成した。二重特異性結合分子HBV24M2V15Jを図2Aに示す（「M2/Hu」）。
【０２５８】
実施例4：結合アッセイ
HBV24M2V15JおよびHBV23MJを、ELISAアッセイによって全長HBsAg-L（プレS1、プレS2、およびS）への結合について評価した。HBV24M2V15Jについて、結合を、米国特許第8,420,353号において提供されているプレS1抗原に特異的なヒト化IgG抗体と比較し、HBV23MJについて、結合を、Cerino et al. (2015) PLOS one 10(4):e0125704. doi: 10.1371 において提供されているヒトIgG抗体と比較した。
【０２５９】
アッセイを以下の方法によって行った。HBV24については、96ウェルポリスチレンMaxiSorp ELISAプレート（Nunc）を、コーティング緩衝液（100mM 重炭酸塩、pH 9.5）100μL中、1μg/mL HBsAg-L抗原（Beacle, BCL-AG-001）で4℃で一晩コートした。HBV23については、プレートをHBsAg（Prospec HBS-872)でコートした。次いで、プレートを0.05% PBS-Tweenで洗浄し、2% BSA-PBSでブロッキングした。ブロッキング後、段階希釈した試料（精製タンパク質または細胞培養上清）100μLをウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、HBV24抗体についてはHRPコンジュゲートマウス抗ヒトκ抗体（Southern Biotech, 9230-05；2% BSA-PBSで1:6000希釈）と、HBV23抗体についてはHRPコンジュゲートマウス抗ヒトλ（Southern Biotech, Cat 9180-05；2% BSA-PBSで1:6000希釈）と1時間インキュベートした。0.05% PBS-Tweenを使用した5回の最終洗浄後、TMB基質（BD Biosciences, 555214）100μLを各ウェルに加え、暗所で15分間インキュベートした。次いで、1ウェル当たり2N HClを50μL加えることによって反応を停止させた。次いで、A450データを収集し、4パラメーターロジスティックモデルを使用してGraphPad Prismで分析した。
【０２６０】
HBV24についてのIgM 対 IgGをモル濃度で比較した結果を図3Aに示す。HBV24M2V15Jは、57 pM（IgG上清の場合）および61 pM（精製IgGの場合）に対して26 pMのEC50を示し、IgG対応物（HBV24G）よりも効果的な結合を示した。
【０２６１】
HBV23についてのIgM 対 IgGを重量濃度で比較した結果を図3Bに示す。HBV23MJは、30 ng/ml（IgGの場合）に対して64 ng/mlのEC50を示し、IgG対応物（HBV23G）よりも効果的な結合を示した。また、最大A450によって測定したところ、HBV23MJの結合能は、HBV23Gよりもはるかに高かった。
【０２６２】
HBV24M2V15J、HBV24G、HBV23MJ、およびHBV23Gを、以下の方法によって、PLC細胞（細胞表面にHBsAgを発現する肝細胞癌細胞株）への結合についてさらに評価した。
【０２６３】
Alexanderヘパトーマ細胞（PLC/PRF/5; ATCC CRL-8024）を、10% HI FBS（Gibco, cat#10082-147）を含有するDMEM（Gibco, cat#11965-084）中で培養し、染色の前日に細胞に新鮮培地を補充した。染色当日に、Cell Dissociation Buffer（Gibco, cat#131510-14）を使用して細胞を剥がした。培地の全てを吸引除去した後、カルシウムまたはマグネシウム不含PBS 10mLで細胞をすすいだ。PBSを吸引除去した後、細胞をCell Dissociation Buffer 10mlと37℃で20〜30分間インキュベートした。次いで、フラスコを軽く叩くことによって細胞を剥がして、単一細胞懸濁液を生成した。等量の培地を加えることによってCell Dissociation Bufferを中和して、トリパンブルー色素排除法を使用して細胞計数盤（BioRad TC20）で生細胞数を決定した。細胞の密度を1.5×104個の細胞／FACS 2% FBS緩衝液（BD Pharmingen, cat# 554656）60μLに調整し、60μLを「v」底96ウェルプレートに加えた。全ての抗体を、30μg/mL、10μg/mL、3μg/mL、および1μg/mLの終濃度で試験し；各抗体の50μLをそれぞれのウェルに加えた。次いで、プレートを4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACS 2% FBS緩衝液150μLで洗浄した後、プレートを1200rpmで5分間遠心分離し（Sorvall Legend XIR遠心分離機）、細胞ペレットを崩すことなく上清を穏やかに吸引した。細胞を適切なAlexaFluor-647標識二次抗体、抗ヒトκ軽鎖（BioLegend, cat#316514）またはAF647抗ヒトλ軽鎖（BioLegend, cat#316614）と4℃で30分間インキュベートすることによって、抗体結合を検出した。洗浄工程を上記のとおり繰り返して、細胞を1:100 7_AAD（BD Pharm, cat#51-68981E）と共にFACS 2% FBS 60μLに再懸濁した。FACSCalibur（商標）（Becton Dickinson）で試料毎に1000事象を獲得し、データ分析をFlowJo LLC製のFlowJoによって行った。試験毎に、抗体結合を、未染色細胞と、適切なヒトアイソタイプ対照抗体で染色した細胞とで比較した。
【０２６４】
HBV24GおよびHBV23Gの結合は、FACS分析によって検出できなかった。一方で、HBV23MJおよび二重特異性HBV24M2V15Jは、検出可能な結合を示した（図4）。
【０２６５】
実施例5：感染性ビリオンおよび／またはHBV感染細胞に優先的に結合する抗体のスクリーニング
この実施例では、関心対象のウイルスに感染した細胞、または感染性の当該ウイルスに、より大きな程度（例えば、親和性、アビディティ、または他の特徴）で結合する結合分子について、ライブラリーをスクリーニングする。結合分子ライブラリー、例えば、抗体ライブラリー（ファージ／ハイブリドーマ／など）、例えば、ウイルス感染哺乳動物（例えば、HBV感染哺乳動物）のB細胞に由来するVH領域およびVL領域のライブラリーを作製する。次いで、このライブラリーを、固体支持体上の（例えば、96ウェルプレートまたはビーズに付着している）ウイルス感染細胞（例えば、HBV感染細胞、例えば、肝細胞癌（HCC）細胞株）または感染性ウイルス粒子（例えば、HBV粒子）と接触させて、感染細胞に結合する抗体（このような抗体が非感染性粒子にも結合するか否かにかかわらず、このような抗体を全て含む）を富化させる。感染細胞に結合する抗体を収集および増幅させる。次いで、回収した抗体を、プレート、ビーズ、カラム等の固体支持体に付着している、非感染性ウイルス粒子（例えば、HBVサブウイルス粒子）および／または先に使用したウイルス感染細胞と同じタイプの非感染細胞と接触させる。非感染性ウイルス粒子または非感染細胞に結合しない抗体を、回収および増幅させる。この工程を1回以上繰り返して、ウイルス感染細胞または感染性ウイルス粒子に優先的に結合する抗体を富化させる。富化した／選択的に枯渇されたライブラリーを再度回収し、増幅させる。最後に、関心対象の抗体を回収し、クローン精製し、さらに特徴付ける。
【０２６６】
実施例6：ウイルス中和アッセイ
インビトロHBVウイルス中和アッセイを、Maeng et al., Virology 270:9-16, 2000 によって記載されている技術のような様々な標準技術を使用して実行することができる。簡潔に述べると、ヒト肝細胞（非癌性肝臓断片の酵素的解離によって調製される）を、通常の成長培地2mlを含有する1ウェル当たり106個の細胞密度で播種し、3日後にHBV粒子（約3×107個のウイルスゲノム当量）を感染させる。
【０２６７】
中和アッセイのために、ウイルス粒子を種々の濃度の抗体（ならびに適切な対照）と室温で1時間プレインキュベートし、培養した肝細胞上に接種する。肝細胞を、4%ポリエチレングリコール（PEG）を含有する無血清培養培地1mlで被覆する。感染細胞を成長培地で洗浄し、2日毎に培地を新しくしながらさらに17日間インキュベートする。
【０２６８】
感染後17日目に、培養培地のアリコートを取り出して10倍希釈して、HBV抗原（例えば、HBsAg）の濃度を、例えば、HBsAg用の適切なアッセイキット、放射免疫アッセイキット（Abbott Laboratories, Chicago, IL）を使用して決定する。
【０２６９】
あるいは、HBVウイルス中和試験を、Kim（FEBS Letters 2015; 589,193-200）によって記載されているとおり実行することができる。簡潔に述べると、HepaRG細胞（例えば、ThermoFisher HPRGC10）を1ウェル（培養培地100μLを含有する）当たり6×104個の細胞の密度で播種し、6日間培養する。次いで、ウイルス粒子（5μL）を種々の濃度の抗体5μLと室温で30分間プレインキュベートし、次いで、4%PEG 8000の非存在下または存在下で、培養したHepaRG細胞と24時間インキュベートする。感染細胞を培地で洗浄し、2日毎に培地を交換しながらさらに10日間インキュベートする。感染後10日目に、アッセイの定量範囲に留まるように培養上清を希釈し、ELISAキット（Bio-Rad）でHBsAg濃度を決定する。
【０２７０】
実施例7：インビボモデル
本明細書において提供されている二量体、五量体、または六量体結合分子を、uPA/RAG-2マウス（Dandri Hepatology 2001; 33 (4): 981-988）、すなわち免疫不全ウロキナーゼ型プラス ミノーゲン活性化因子（uPA）／組換え活性化遺伝子-2（RAG-2）マウスを非限定的に含む、マウスモデルでインビボ試験することができる。マウスを、ヒト肝細胞により再増殖させ、HBVに感染させて、インビボ有効性について結合分子を試験することができる。トリメラ（trimera）マウスモデル（llan Hepatology 1999; 29: 553-562）は、SCIDマウス骨髄細胞で放射線保護された致死的な放射線を浴びたマウスを含む。Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-モデル（Grompe Nat Biotech 2007; 25 (8): 903-910; Verma PNAS 2007; 104 (51):20507-20511）は、ヒト肝細胞により肝臓を再増殖させるための調節可能システムを有する、免疫不全フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ欠損（fah(-/-)）マウスを含む。TK-NOGベースのヒト化マウスモデル（Kosaka Biochem Biophys Res Commun. 2013 Nov 8;441(1):230-5）は、肝臓に限定されたアルブミンプロモーターの制御下でのチミジンキナーゼのトランスジェニック発現を伴う、超免疫不全NOGマウスを含む。MUP-uPA/SCID/Bgモデル（Tesfave PLoS ONE 2013; 8(10):e77298）は、SCID/Beigeバックグラウンドの主要な尿タンパク質プロモーターによって駆動されるuPA遺伝子を保有するマウスを含む。二量体、五量体、または六量体結合分子を非ヒト霊長類でインビボ試験することができる。As/HSG-hu HSC/Hepマウスモデル（Bility PLoS ONE 2014; 10(3):e1004032）は、ヒト免疫および肝細胞の両方により再増殖されたマウスを含み、持続性HBV感染を支持する。
【０２７１】
実施例8：HBV抗体の補体依存性細胞傷害性
IgM表現型の抗体は、標的細胞の補体依存性細胞傷害性（CDC）活性への作用に補体タンパク質C1qの効率的な結合を使用することに、とりわけよく適している。CDCを測定するために、HBsAgを発現する肝細胞癌細胞（例えば、Alexanderヘパトーマ細胞（PLC/PRF/5; ATCC CRL-8024））またはHBsAg-Lを発現する組換え細胞を使用する。標的細胞を洗浄し、CDCアッセイ培地（RPMI 1640、10%熱不活化FBS）に1.0×106個の細胞/mLの密度で再懸濁し、Nunc 384ウェル組織培養処理白色ポリスチレンプレートに10μL／ウェルを加える。試験抗体の3倍の段階希釈物をアッセイ培地中に調製し、アッセイプレートに10μL／ウェルを加え、プレートを、5% CO2インキュベーター内37℃で2時間インキュベートして、オプソニン化を起こさせる。正常なヒト血清補体（Quidel）をアッセイ培地中30%に希釈し、アッセイプレートに10μL／ウェルを加える。プレートを、5% CO2インキュベーター内37℃で4時間インキュベートする。Cell Titer-Glo 試薬（Promega）を使用のために融解し、アッセイプレートに15μL／ウェルを加える。細胞を溶解するために、プレートをプレートシェーカー上で2分間、次いで室温でさらに10分間優しく混合した後、EnVisionプレートリーダー（Perkin-Elmer）で発光を測定する。バックグラウンドシグナルを減算した後、生存率を抗体濃度に対してプロットし、GraphPad Prismを使用してEC50値を決定する。
【０２７２】
実施例9：HBVXCD3二重特異性抗体によるT細胞活性化
二重特異性抗HBsAg/抗CD3抗体がHBsAg標的に結合することによってT細胞を活性化できるか否かを実証するために、以下のアッセイを実施する。改変Jurkat T細胞（Promega CS176403）およびHBsAgを発現する肝細胞癌細胞（例えば、Alexanderヘパトーマ細胞（PLC/PRF/5; ATCC CRL-8024））またはHBsAg-Lを発現する組換え細胞のいずれかを、10%ウシ胎児血清（Invitrogen）を補充したRPMI（Invitrogen）中で培養する。精製した二重特異性および単一特異性抗HBV抗体の段階希釈物を、HBsAg発現細胞と、白色384ウェルアッセイプレート中20μLで、5% CO2にて37℃で2時間インキュベートする。改変Jurkat細胞（25000）を混合物に40μLの最終容量まで加える。混合物を、5% CO2にて37℃で5時間インキュベートする。次いで、細胞混合物をルシフェリン含有溶解緩衝液（Promega, Cell Titer Glo）20μLと混合して、ルシフェラーゼレポーター活性を測定する。EnVisionプレートリーダーによって発光出力を測定する。Prismソフトウェアを使用した4パラメーター曲線適合によってEC50を決定する。
【０２７３】
実施例10：T細胞指向性B細胞殺傷−LDH放出アッセイ
二重特異性HBV x CD3 IgM結合分子が、CD8+T細胞急性リンパ芽球性白血病（TALL）細胞の存在下で標的細胞を殺傷することができるか否かを実証するために、共培養実験を実施することができる。HBsAg発現細胞（約6×103個の細胞）、例えば、肝細胞癌細胞、例えばAlexanderヘパトーマ細胞（PLC/PRF/5; ATCC CRL-8024）またはHBsAg-Lを発現する組換え細胞を、384ウェル黒色組織培養プレート上、1ウェル当たり10%熱不活化FBSを補充したRPMI 1640培地45μLの総容量で、異なる濃度の試験化合物の存在下、3×104個のTALL細胞（ATCC CRL-11386）と共培養する。5% CO2インキュベーター内37℃で24時間インキュベーションの後、CytoTox-ONE基質試薬（Promega, G7891）15μLを各ウェルに加え、死細胞から放出されたLDHのレベルを測定する。プレートを簡単に振盪させて試薬を混合し、次いで、室温で90分間インキュベートした後にEnVisionプレートリーダー（Perkin-Elmer）で蛍光シグナル（励起485 nmおよび発光615 nm）を測定する。次いで、データをGraphPad Prismで分析して、EC50を決定する。
【０２７４】
本開示の幅および範囲は、上記の例示的な態様のいずれにも限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの等価物に従って定義されるべきである。
【図１】
2018513680.tif 000040
【図２Ａ】
2018513680.tif 000041
【図２Ｂ】
2018513680.tif 000042
【図２Ｃ】
2018513680.tif 000043
【図３Ａ】
2018513680.tif 000044
【図３Ｂ】
2018513680.tif 000045
【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月24日(2017.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018513680000001.app
【国際調査報告】
2018513680.tif 000047
2018513680.tif 000048
2018513680.tif 000049