(57)【要約】術後感染の可能性を低減するために外科用包帯およびインプラントを表面処理する方法およびその方法で用いられる合成水分散性脂質構造物を開示する。第１態様において、本発明は、物体の表面を少なくとも１種の機能性脂質構造物の水性分散液と接触させる工程を含む抗微生物性表面処理方法を提供し、前記脂質は、ジ−アシルグリセロリン脂質、ジ−アルケニルグリセロリン脂質、またはジ−アルキルグリセロリン脂質であり、前記構造物の機能性部分は抗微生物活性を付与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物体の表面を少なくとも１種の機能性脂質構造物の水性分散液と接触させる工程を含む抗微生物性表面処理方法であって、前記脂質は、ジ−アシルグリセロリン脂質、ジ−アルケニルグリセロリン脂質、またはジ−アルキルグリセロリン脂質であり、前記構造物の機能性部分は抗微生物活性を付与する、方法。
【請求項２】
前記物体は外科用包帯または外科用インプラントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物体は外科用インプラントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記表面はステンレス鋼である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記水性分散液は洗剤および有機溶媒を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記水性分散液は、塩水または水と、前記少なくとも１種の機能性脂質構造物とからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記脂質はジ−アシルグリセロリン脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質はホスファチジルエタノールアミンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記脂質はジ−オレオイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能性部分は、セレニドおよびポリカチオンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記機能性部分は、シアノセレニドおよびポリアミンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記機能性部分はシアノセレニドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗微生物性表面処理は抗細菌性表面処理であり、より好ましくは、前記抗微生物性表面処理は殺細菌性表面処理である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記表面への接触は、抗微生物性表面処理を提供するのに十分な時間にわたって前記物体を前記分散液中に浸漬することによる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記時間は６０秒間未満である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記時間は３０秒間未満である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記時間は１０秒間未満である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記物体が浸漬されている間、前記分散液は超音波処理される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
下記構造のセレニド脂質構造物であって、
【化１】
2018500144.tif 000016
ｍは整数の１、２、３または４であり、好ましくは整数の１、２または４であり、最も好ましくは整数の２であり、
ｎは整数の３、４または５であり、最も好ましくは整数の４であり、
ｐは整数の１、２または３であり、最も好ましくは整数の２であり、
ｑは整数の１、２または３であり、最も好ましくは整数の１であり、
Ｍは一価の置換基であり、好ましくは一価の置換基ＣＨ３またはＨであり、最も好ましくは一価の置換基Ｈであり、
Ｍ’は一価のカチオンまたは置換基であり、好ましくは一価のカチオンＨ＋、Ｋ＋またはＮａ＋であり、最も好ましくは一価のカチオンＨ＋であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、脂肪族Ｃ１４−２０アシル、脂肪族Ｃ１４−２０アルケニルまたは脂肪族Ｃ１４−２０アルキル置換基であり、好ましくはミリスチル、パルミチル、ステアリル、アラキジル、パルミトレオイル、ペトロセレニル、オレオイル、エライジル、バクセニルおよびゴンドイルからなる群から選択される置換基であり、最も好ましくは脂肪族Ｃ１８アルケニル置換基のオレオイルである、セレニド脂質構造物。
【請求項２０】
下記構造のカチオン性脂質構造物であって、
【化２】
2018500144.tif 000017
Ｘは−ＣＨ２−であり、ｎは整数の３、４または５であり、Ｒ１およびＲ２は、非分枝で飽和またはモノ不飽和であるＣ１４−２０アシル基からなる群から独立して選択され、Ｒ３はＮ１−アシル化ポリアミンである、構造物。
【請求項２１】
Ｒ３は下記構造のものである、請求項２０に記載の構造物。
【化３】
2018500144.tif 000018
【請求項２２】
Ｓｐｍ−Ａｄ−ＤＯＰＥと称される下記構造のカチオン性脂質構造物。
【化４】
2018500144.tif 000019
【請求項２３】
請求項１９乃至２２のいずれか１項に記載のカチオン性脂質構造物の水中分散液から実質的になる殺細菌性表面処理調合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗微生物性表面処理方法、およびそのような方法に用いられる構造物に関する。本発明は特に、外科用包帯およびインプラントのための抗細菌性表面処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ギャロ（Gallo）らの２０１４年の刊行物（非特許文献１）に述べられているように、医学の分野における植え込み型装置の使用の予測される増大により、これらの場合に関連する感染数は当然上昇するであろうと思われる。感染予防に適した抗微生物性表面処理の現状知識を概説する。表面処理の手法としては、細菌の付着の最小限化、バイオフィルム形成の阻害、および殺細菌作用が挙げられる。
【０００３】
リード（Reid）らの刊行物（特許文献１〜９）は、セレン（Ｓｅ）化合物を含有する殺生物性製剤を開示している。前記セレン化合物は表面に堆積され、その表面と共有結合または非共有結合し得る。式ＲＳｅＸの化合物であって、Ｒは脂肪族またはフェノール基であり、Ｘは保護基である化合物を含む広範なセレン化合物が提案されている。
【０００４】
カチオン性脂質は、主にウイルスに基づいた遺伝子送達の代替としてリポソーム遺伝子送達に使用するために開発されてきたが、殺細菌力を有していることも確認されている。一般的なカチオン性脂質類としては、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）および３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が挙げられる。少なくともある程度はリポフェクションの効率が低いために、遺伝子療法の臨床試験の大部分は、遺伝子送達の別の手段を用いてきた。カチオン性脂質のさらなる開発は、リポフェクションの効率を改善しようとしてきた。
【０００５】
ベール（Behr）らの１９８９年の刊行物（非特許文献２）およびレーミ（Remy）らの１９９４年の刊行物（非特許文献３）は、脂質がホスファチジルエタノールアミンであるスペルミン脂質コンジュゲート（ＤＯＰＥＳおよびＤＰＰＥＳ）を開示している。コンジュゲーションは、官能化されたＬ−５−カルボキシスペルミン誘導体のカルボキシル官能基によって行われる。前記コンジュゲートは、凝縮リポポリアミン被覆プラスミドの調製に用いられる。前記被覆プラスミドはトランスフェクション手順に用いられる。
【０００６】
ビック（Byk）らの１９８９年の刊行物（非特許文献４）は、ＤＮＡ転移に使用するために開発された一連のカチオン性脂質間における構造活性相関を開示している。これらの調査で評価されたリポアミンの中で、ポリアミンの幾何構造はトランスフェクション効率に影響を有することが示された。
【０００７】
ランダッゾ（Randazzo）らの２００９年の刊行物（非特許文献５）は、遺伝子導入および殺細菌作用に関連したカチオン性脂質の二重機能の調査を開示している。これらの活性を有することが示されたカチオン性脂質は、脂質成分としてステロール部分を含んでいた。
【０００８】
本発明の目的は、術後感染の発生を低減するために有効である水分散性の抗微生物性脂質構造物を用いて外科用包帯およびインプラントの表面を処理する方法を提供することにある。本発明の目的は、この方法に使用するための抗微生物性脂質構造物を提供することにある。これらの目的は、少なくともそのような処理および構造物の選択において有用な選択肢を提供するという目的と択一的に読まれるべきである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／０２２４２７５号
【特許文献２】国際公開第２００７／００８２９３号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／０１５８９６６号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０／００２８８２３号
【特許文献５】国際公開第２０１０／０８００８６号
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１０／０１５８９６７号
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１２／０２８８８１３号
【特許文献８】米国特許第８，２３６，３３７号
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１３／０１６５５９５号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Gallo et al (2014) Antibacterial Surface Treatment for Orthopaedic Implants Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 13849-13880
【非特許文献２】Behr et al (1989) Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986
【非特許文献３】Remy et al (1994) Gene transfer with a series of lipophilic DNA-binding molecules Bioconjugate Chem. 5, 647-654
【非特許文献４】Byk et al (1998) Synthesis, activity, and structure-activity relationship studies of novel cationic lipids for DNA transfer J. Med. Chem. 1998, 41, 224-235
【非特許文献５】Randazzo et al (2009) A series of cationic sterol lipids with gene transfer and bactericidal activity Bioorganic & Medicinal Chemistry 17, 3257-3265
【発明の概要】
【００１１】
第１態様において、本発明は、物体の表面を少なくとも１種の機能性脂質構造物の水性分散液と接触させる工程を含む抗微生物性表面処理方法を提供する。前記脂質は、ジ−アシルグリセロリン脂質、ジ−アルケニルグリセロリン脂質、またはジ−アルキルグリセロリン脂質であり、前記構造物の機能性部分（functional moiety)は抗微生物活性を付与する。
【００１２】
好ましくは、前記物体は外科用包帯または外科用インプラントである。より好ましくは、前記物体は外科用インプラントである。最も好ましくは、前記表面はステンレス鋼である。
【００１３】
好ましくは、前記水性分散液は洗剤および有機溶媒を含まない。より好ましくは、前記水性分散液は、塩水または水と、前記少なくとも１種の機能性脂質構造物とからなる。
好ましくは、前記脂質はジ−アシルグリセロリン脂質である。より好ましくは、前記脂質はホスファチジルエタノールアミンである。最も好ましくは、前記脂質はジ−オレオイルホスファチジルエタノールアミンである。
【００１４】
好ましくは、前記機能性部分は、セレニドおよびポリカチオンからなる群から選択される。より好ましくは、前記機能性部分は、シアノセレニドおよびポリアミンからなる群から選択される。最も好ましくは、前記機能性部分はシアノセレニドである。
【００１５】
好ましくは、前記抗微生物性表面処理は抗細菌性表面処理である。より好ましくは、前記抗微生物性表面処理は殺細菌性表面処理である。
好ましくは、前記表面への接触は、抗微生物性表面処理を提供するのに十分な時間にわたって前記物体を前記分散液中に浸漬することによって行われる。より好ましくは、前記時間は６０秒間未満である。さらにより好ましくは、前記時間は３０秒間未満である。最も好ましくは、前記時間は１０秒間未満である。
【００１６】
好ましくは、前記物体が浸漬されている間、前記分散液は超音波処理される。
好ましくは、前記分散液中における前記構造物の濃度は、抗微生物性表面処理を提供するのに十分である。より好ましくは、前記濃度は１ｍｇ／ｍＬ未満の構造物である。
【００１７】
第１態様の第１実施形態において、本発明は、前記表面をセレニド−脂質構造物の水性分散液と接触させる工程を含む抗微生物性表面処理方法を提供する。前記脂質は、ジ−アシルグリセロリン脂質、ジ−アルケニルグリセロリン脂質、またはジ−アルキルグリセロリン脂質である。
【００１８】
第１態様の第２実施形態において、本発明は、前記表面をＦ−Ｓ−Ｌの構造のカチオン性脂質構造物の水性分散液と接触させる工程を含む外科用インプラントの表面を処理する方法を提供する。ここで、ＦはＮ１−アシル化ポリアミンであり、Ｓは水中に分散可能な構造物を提供するように選択されたスペーサーであり、Ｌはジアシル−またはジアルキルグリセロ脂質である。
【００１９】
好ましくは、Ｌはジアシルグリセロ脂質である。より好ましくは、Ｌはジアシルグリセロリン脂質である。最も好ましくは、Ｌはホスファチジルエタノールアミンである。
好ましくは、前記カチオン性脂質構造物は下記構造のものであり、
【００２０】
【化１】
2018500144.tif 000002
Ｍは一価のカチオンであり、Ｘが二価のメチレン基（−ＣＨ２−）である場合、ｎは整数の３、４または５であり、Ｒ１およびＲ２は、Ｃ１４−２０飽和、モノ−不飽和またはジ−不飽和の非分枝アシル基からなる群から独立して選択され、Ｒ３はＮ１−アシル化ポリアミンである。
【００２１】
好ましくは、前記水性分散液は、本発明の第１態様のこの第２実施形態では、塩水ではない。
第２態様において、本発明は、下記構造のセレニド脂質構造物を提供し、
【００２２】
【化２】
2018500144.tif 000003
ｍは整数の１、２、３または４であり、好ましくは整数の１、２または４であり、最も好ましくは整数の２であり、
ｎは整数の３、４または５であり、最も好ましくは整数の４であり、
ｐは整数の１、２または３であり、最も好ましくは整数の２であり、
ｑは整数の１、２または３であり、最も好ましくは整数の１であり、
Ｍは一価の置換基であり、好ましくは一価の置換基ＣＨ３またはＨであり、最も好ましくは一価の置換基Ｈであり、
Ｍ’は一価のカチオンまたは置換基であり、好ましくは一価のカチオンＨ＋、Ｋ＋またはＮａ＋であり、最も好ましくは一価のカチオンＨ＋であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、脂肪族Ｃ１４−２０アシル、脂肪族Ｃ１４−２０アルケニルまたは脂肪族Ｃ１４−２０アルキル置換基であり、好ましくはミリスチル、パルミチル、ステアリル、アラキジル、パルミトレオイル、ペトロセレニル（petroselenyl）、オレオイル、エライジル（elaidyl）、バクセニル（vaccenyl）およびゴンドイル（gondoyl）からなる群から選択される置換基であり、最も好ましくは脂肪族Ｃ１８アルケニル置換基オレオイルである。
【００２３】
第３態様において、本発明は、下記構造のカチオン性脂質構造物を提供し、
【００２４】
【化３】
2018500144.tif 000004
Ｘは−ＣＨ２−であり、ｎは整数の３、４または５であり、Ｒ１およびＲ２は、非分枝で飽和またはモノ不飽和であるＣ１４−２０アシル基のうちから独立して選択され、Ｒ３はＮ１−アシル化ポリアミンである。
【００２５】
好ましくは、Ｒ３は下記構造のものである。
【００２６】
【化４】
2018500144.tif 000005
本発明の第４態様は、本発明の第２態様または第３態様の少なくとも１種の構造物の水中分散液から実質的になる殺細菌性表面処理調合物を提供する。
【００２７】
この明細書の説明および特許請求の範囲において、以下の頭字語、用語および句は下記に提供する意味を有する。「脂環式」とは、環状脂肪族を意味する。「脂肪族」とは、アルカン、アルケン、もしくはアルキン、またはそれらの誘導体を意味し、芳香族の特別な安定性を有していない化合物に対する記述子として用いられる。「アルカン」とは、一般式ＣｎＨ２ｎ＋２の飽和炭化水素を意味する。「アルケン」とは、１つ以上の二重炭素−炭素結合を含む不飽和炭化水素を意味する。「アルキン」とは、１つ以上の三重炭素−炭素結合を含む不飽和炭化水素を意味する。「芳香族」とは、ベンゼン環を含むか、または同様の化学的性質を有することを意味する。「Ｂｏｃ」とは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを意味する。「Ｂｏｃ３Ｓｐｍ」とは、（Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９−トリ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，１２−ジアミノ−４，９−ジアザドデカンを意味する。「〜を備える（comprising）」とは、「〜を含む（including）」、「〜を含有する（containing）」、または「〜を特徴とする（characterized by）」ことを意味し、任意の付加的な要素、材料または工程を排除しない。「〜から実質的になる（consisting essentially of）」とは、実質的な限定（material limitation）である任意の要素、材料または工程を除外することを意味する。「〜からなる（consisting of）」とは、不純物および他の付随物を除いて、特定されていない任意の要素、材料または工程を除外することを意味する。「水中に分散可能な」とは、有機溶媒または界面活性剤の不在下で、２５℃の純粋な脱イオン水中に分散可能であり、少なくとも１μｍｏｌ／ｍＬの濃度の分散液を提供することを意味し、「水分散性」はそれに相当する意味を有する。「ＤＯＰＥ」とは、１，２−Ｏ−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンを意味する。「ＤＳＰＥ」とは、１，２−Ｏ−ジステレオイル（distereoyl）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンを意味する。「親水性の（hydrophilic）」とは、水と混合するか、水に溶解するか、または水によって濡らされる傾向を有することを意味し、「親水性（hydrophilicity）」とはそれに相当する意味を有する。「疎水性の（hydrophobic）」とは、水をはね返すか、または水と混合しない傾向を有することを意味し、「疎水性（hydrophobicity）」とはそれに対応する意味を有する。「一価のカチオン」とは、単一の正電荷を有するイオンを意味し、一価のカチオンＨ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋または（ＣＨ３ＣＨ２）３Ｎ＋を含む。「Ｎ１−アシル化」とは、分子の最も長い鎖の末端の第一アミンにおけるアシル基（ＲＣＯ−）の付加を意味し、「Ｎ１−アシル化された」とは、それに相当する意味を有する。「ポリアミン」とは、少なくとも２つの一級アミノ（ＮＨ２）官能基を含む３つ以上のアミン官能基を含む非分枝有機化合物を意味する。「Ｓｐｍ」（または「ｓｐｍ」）とは、スペルミンを意味する。
【００２８】
発明の提示（Statement of Invention）および特許請求の範囲において定義される主題の要素、特徴または整数を参照して用いられるか、または本発明の別の実施形態を参照して用いられる場合の「第１」、「第２」、「第３」などの用語は、選好順位を示唆するものではない。
【００２９】
試薬の濃度または比率が指定される場合、指定された濃度または比率は、その試薬の初期の濃度または比率である。値が１つ以上の小数位まで表される場合には、標準的な丸めが適用される。例えば、１．７は、１．６５０・・・（1.650 recurring）〜１．７４９・・・（1.749 recurring）の範囲を包含する。
【００３０】
さらなる制限がない場合には、化合物の構造の表現における単純な結合（plain bonds）の使用は、前記化合物のジアステレオマー、エナンチオマーおよびそれらの混合物を包含する。化合物の構造または部分構造の表現において、二価の基の繰り返しは、
【００３１】
【化５】
2018500144.tif 000006
によって表され、−Ｘ−は、ｎ回繰り返される二価の基である。前記二価の基がメチレン（−ＣＨ２−）である場合、この二価の基の繰り返しは、
【００３２】
【化６】
2018500144.tif 000007
によって表される。
【００３３】
さらなる制限がない場合には、化合物の構造の表現における単純な結合の使用は、前記化合物のジアステレオマー、エナンチオマーおよびそれらの混合物を包含する。
前記構造物の調製および使用の説明を容易にするために、以下の呼称を用いる。
【００３４】
「−ＣＭＧ（ｍ）−」とは下記の部分構造を示し、
【００３５】
【化７】
2018500144.tif 000008
ｍは整数の１、２、３または４であり、Ｍは一価の置換基である。
【００３６】
「−Ａｄ−」とは下記の部分構造を示し、
【００３７】
【化８】
2018500144.tif 000009
ｎは整数の４である。
【００３８】
「−ＤＯＰＥ」とは下記構造の置換基を示し、
【００３９】
【化９】
2018500144.tif 000010
Ｍ’は一価のカチオン（典型的にはＨ＋）である。
【００４０】
本発明について、今度は実施形態または実施例および添付図面の頁の図を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＮＣＳｅＣＨ２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称されるシアノセレニド脂質構造物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル。
【図２】黄色ブドウ球菌の生育可能な培養物（viable cultures）の存在下におけるインキュベーション後の、未処理（Ａ）および処理済み（Ｂ）クーポンの表面の蛍光顕微鏡画像。
【図３】表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermis）の生育可能な培養物の存在下におけるインキュベーション後の、未処理（Ａ）および処理済み（Ｂ）クーポンの表面の蛍光顕微鏡画像。
【図４】未処理（Ａ）および処理済み（Ｂ）クーポンに曝露された黄色ブドウ球菌の培養物を接種した後のインキュベートされた血液寒天培地プレートの写真。
【図５】未処理（Ａ）および処理済み（Ｂ）クーポンに曝露された表皮ブドウ球菌の培養物を接種した後のインキュベートされた血液寒天培地プレートの写真。
【図６】未処理（Ａ）の外科用包帯およびＮＣＳｅＣＨ２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称される構造物を処理に用いた処理済み（Ｂ）外科用包帯の試料の走査型電子顕微鏡写真（３５０倍）。
【図７】未処理（Ａ）の外科用包帯およびＮＣＳｅＣＨ２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称される構造物を処理に用いた処理済み（Ｂ）外科用包帯の試料の走査型電子顕微鏡写真（３，５００倍）。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の方法は、臨床医および外科医により使用場所および使用時において外科用包帯およびインプラントを処理する好都合な生体適合性手段を提供する。
機能性部分としてのシアノセレニド
Ｍａｌ−（ＣＨ２）２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥおよびＨ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称される構造物の調製は、ボヴィン（Bovin）らの２００８年の刊行物に開示されており、完全を期すために本願において再述する。アセトン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、トルエンおよびｏ−キシレンは、チメッド（Chimmed）（ロシア連邦）から入手した。アセトニトリルはクリオクロム（Cryochrom）（ロシア連邦）から入手した。ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＣＦ３ＣＯＯＨ、Ｅｔ３Ｎ、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドは、メルク（Merck）（ドイツ）から入手した。イミノ二酢酸ジメチルエステル塩酸塩はリーキン（Reakhim）（ロシア連邦）から入手した。ダウエックス（Dowex）５０Ｘ４−４００およびセファデックス（Sephadex）ＬＨ−２０はアマシャム・バイオサイエンス・アクチボラーグ（Amersham Biosciences AB）（スウェーデン）から入手した。シリカゲル６０はメルク（Merck）（ドイツ）から入手した。テトラアミン（Ｈ２Ｎ−ＣＨ２）４Ｃ  ｘ  ２Ｈ２ＳＯ４は、リザーランド（Litherland）ら（１９３８年）によって記載されている通りに合成した。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル６０  Ｆ２５４アルミニウムシート（メルク（Ｍｅｒｋ）、１．０５５５４）を用いて実施し、７％のＨ３ＰＯ４に浸漬した後にチャーリング（charring）することにより検出した。
【００４３】
｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸メチルエステルの調製
（メトキシカルボニルメチル−アミノ）−酢酸メチルエステル塩酸塩（９８８ｍｇ、５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５ｍＬ）撹拌溶液に、Ｂｏｃ−ＧｌｙＧｌｙＮｏｓ（３２９３ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）および（ＣＨ３ＣＨ２）３Ｎ（３４７５μＬ、２５ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を室温で一晩撹拌し、次いでｏ−キシレン（７０ｍＬ）で希釈し、蒸発濃縮した。シリカゲル上におけるフラッシュカラムクロマトグラフィー（トルエン中に充填、酢酸エチルで溶離）により、粗製生成物を生じた。前記粗製生成物をクロロホルム中に溶解させ、水、０．５ＭのＮａＨＣＯ３、および飽和ＫＣｌで順次洗浄した。そのクロロホルム抽出物を蒸発濃縮し、生成物をシリカゲルカラム（クロロホルム中に充填、１５：１（ｖ／ｖ）のクロロホルム／メタノールで溶離）において精製した。それらの画分を蒸発濃縮し、残留物を真空乾燥すると、無色の濃密なシロップが得られた。収量１７８５ｍｇ（９５％）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４９（７：１（ｖ／ｖ）のクロロホルム／メタノール）。
【００４４】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、［Ｄ６］ＤＭＳＯ、３０℃）δ、ｐｐｍ：７．８２６（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯ）、６．９７９（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯＯ）、４．３４８および４．０９５（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯ）、３．９６９（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨ）、３．６８９および３．６２１（ｓ、３Ｈ；  ＯＣＨ３）、３．５５９（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ；ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯＯ）および１．３８０（ｓ、９Ｈ；  Ｃ（ＣＨ３）３）。
【００４５】
｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸の調製
｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸メチルエステル（１７６０ｍｇ、４．６９ｍｍｏｌ）のメタノール（２５ｍＬ）撹拌溶液に、０．２ＭのＮａＯＨ水溶液（２３．５ｍＬ）を添加し、その溶液を室温で５分間維持した。次に、前記溶液を酢酸（０．６ｍＬ）で酸性化し、蒸発乾燥させた。その残留物のシリカゲル上におけるカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル中に充填、２：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）のｉ−ＰｒＯＨ／酢酸エチル／水で溶離）により、回収された｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸メチルエステル（６３ｍｇ、３．４％）と、目標化合物（１３２０ｍｇ）とが生じた。その中間物質を次にメタノール／水／ピリジン混合物（２０：１０：１、３０ｍＬ）中に溶解させ、残留ナトリウムカチオンを除去するためにイオン交換カラム（ダウエックス（Dowex）５０Ｘ４−４００、ピリジン型、５ｍＬ）に通した。次に前記カラムを同一の混合溶媒で洗浄し、溶離液を蒸発させて、残留物をクロロホルム／ベンゼン混合物（１：１、５０ｍＬ）に溶解し、次いで蒸発濃縮し、真空下で乾燥させた。１０の収量は１２５０ｍｇ（７４％）で白色固体であった。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４７（４：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）のｉ−ＰｒＯＨ／酢酸エチル／水）。
【００４６】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、［Ｄ６］ＤＭＳＯ、３０℃）、Ｎ−カルボキシメチルグリシンユニットのシス−配座異性体およびトランス−配座異性体の混合物、ｃ．３：２．主要配座異性体；δ、ｐｐｍ：７．７１７（ｔ、Ｊ＝５Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯ）、７．０２４（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯＯ）、４．０５１（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＣＨ３）、３．９２８（ｄ、Ｊ＝５Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨ）、３．７８６（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．６１６（ｓ、３Ｈ；  ＯＣＨ３）、３．５６３（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯＯ）、１．３８１（ｓ、９Ｈ；  Ｃ（ＣＨ３）３）ｐｐｍ；副配座異性体、δ＝７．７６６（ｔ、Ｊ＝（５Ｈｚ）、１Ｈ；  ＮＨＣＯ）、７．０１５（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯＯ）、４．２８８（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＣＨ３）、３．９２８（ｄ、Ｊ＝５Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨ）、３．８５８（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．６７６（ｓ、３Ｈ；  ＯＣＨ３）、３．５６３（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯＯ）、１．３８１（ｓ、９Ｈ；  Ｃ（ＣＨ３）３）。
【００４７】
｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸Ｎ−オキシスクシンイミドエステル（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ２（ＭＣＭＧｌｙ）Ｎｏｓ）の調製
｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸（１２００ｍｇ、３．３２ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４２０ｍｇ、３．６５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）氷冷撹拌溶液に、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７５４ｍｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を０℃で３０分間、次いで室温で２時間にわたって撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素の沈澱物を濾別し、ＤＭＦ（５ｍＬ）で洗浄し、濾液を最小体積に蒸発濃縮した。次にその残留物を（ＣＨ３ＣＨ２）２Ｏ（５０ｍＬ）とともに１時間撹拌し、デカンテーションによってエーテル抽出物を除去した。残留物を真空下で乾燥させると、白色泡沫として活性エステル（１４００ｍｇ、９２％）が得られた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７１（４０：１（ｖ／ｖ）のアセトン／酢酸）。
【００４８】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、［Ｄ６］ＤＭＳＯ、３０℃）、Ｎ−カルボキシメチルグリシンユニットのシス−配座異性体およびトランス−配座異性体の混合物、Ｃ．３：２。
主要配座異性体；δ、ｐｐｍ：７．８９６（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯ）、６．９７２（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯＯ）、４．５３３（ｓ、２Ｈ；ＮＣＨ２ＣＯＯＮ）、４．３９９（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＣＨ３）、３．９９７（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨ）、３．６９５（ｓ、３Ｈ；  ＮＨＣＯ）、３．５６６（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ；ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯＯ）、１．３８０（ｓ、９Ｈ；Ｃ（ＣＨ３）３。
【００４９】
副配座異性体；δ、ｐｐｍ：７．８８２（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯ）、６．９６３（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯＯ）、４．９２４（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＮ）、４．１３３（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＣＨ３）、４．０３４（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ；ＣＯＣＨ２ＮＨ）、３．６３２（ｓ、３Ｈ；ＯＣＨ３）、３．５７２（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ；ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯＯ）、１．３８０（ｓ、９Ｈ；Ｃ（ＣＨ３）３。
【００５０】
活性エステル（１３８０ｍｇ）を６ｍＬの体積となるようにＤＭＳＯ中に溶解させ、０．５Ｍ溶液として用いた（−１８℃で保管）。
｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸メチルエステルの調製
（メトキシカルボニルメチル−アミノ）−酢酸メチルエステル塩酸塩（９８８ｍｇ、５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５ｍＬ）撹拌溶液に、Ｂｏｃ−ＧｌｙＧｌｙＮｏｓ（３２９３ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３４７５μＬ、２５ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を室温（ｒ．ｔ．）で一晩撹拌し、次いでｏ−キシレン（７０ｍＬ）で希釈し、蒸発濃縮した。シリカゲル上におけるフラッシュカラムクロマトグラフィー（トルエン中に充填、酢酸エチルで溶離）により、粗製生成物を生じた。前記粗製生成物をクロロホルム中に溶解させ、水、０．５ＭのＮａＨＣＯ３、および飽和ＫＣｌで順次洗浄した。そのクロロホルム抽出物を蒸発濃縮して、生成物をシリカゲルカラム（クロロホルム中に充填、クロロホルム／メタノール１５：１で溶離）上で精製した。画分を蒸発濃縮して、その残留物を真空乾燥することにより、（３）の無色の濃密なシロップを生じた（１７８５ｍｇ、９５％）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４９（クロロホルム／メタノール７：１）。
【００５１】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、［Ｄ６］ＤＭＳＯ、３０℃）  δ＝７．８２６（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯ、６．９７９（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ；ＮＨＣＯＯ）、４．３４８および４．０９５（ｓ、２Ｈ；ＮＣＨ２ＣＯＯ）、３．９６９（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨ）、３．６８９および３．６２１（ｓ、３Ｈ；  ＯＣＨ３）、３．５５９（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ；ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯＯ）、１．３８０（ｓ、９Ｈ；ＣＭｅ３）ｐｐｍ。
【００５２】
｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸の調製
｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸メチルエステル（１７６０ｍｇ、４．６９ｍｍｏｌ）のメタノール（２５ｍＬ）撹拌溶液に、０．２ＭのＮａＯＨ水溶液（２３．５ｍＬ）を添加した。その溶液を室温で５分間維持し、次いで酢酸（０．６ｍＬ）で酸性化し、蒸発乾燥させた。その残留物のシリカゲル上におけるカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル中に充填、ｉＰｒＯＨ／酢酸エチル／水（２：３：１）で溶離）により、回収された（３）（６３ｍｇ、３．４％）と粗製目標化合物（１３２０ｍｇ）とを生じた。前記粗製目標化合物をメタノール／水／ピリジン混合物（２０：１０：１、３０ｍＬ）中に溶解させ、残留Ｎａカチオンを除去するためにイオン交換カラム（ダウエックス（Dowex）５０Ｘ４−４００、ピリジン型、５ｍＬ）に通した。前記カラムを同一の混合物で洗浄し、溶離液を蒸発させ、クロロホルム／ベンゼン混合物（１：１、５０ｍＬ）中に溶解させ、次いで蒸発濃縮し、真空下で乾燥させて、１２５０ｍｇ（７４％）であった白色固体の純粋な（１０）の収量を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４７（ｉＰｒＯＨ／酢酸エチル／水（４：３：１））。
【００５３】
Ｎ−カルボキシメチル−グリシンユニットのシス−配座異性体およびトランス−配座異性体の混合物  ｃ．３：１の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、［Ｄ６］ＤＭＳＯ、３０℃）。
【００５４】
主要配座異性体：δ＝７．７１７（ｔ、Ｊ＝５Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯ）、７．０２４（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ；ＮＨＣＯＯ）、４．０５１（ｓ、２Ｈ；ＮＣＨ２ＣＯＯＭｅ）、３．９２８（ｄ、Ｊ＝５Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨ）、３．７８６（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．６１６（ｓ、３Ｈ；ＯＣＨ３）、３．５６３（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯＯ）、１．３８１（ｓ、９Ｈ；ＣＭｅ３）  ｐｐｍ。
【００５５】
副配座異性体：δ＝７．７６６（ｔ、Ｊ＝５Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯ）、７．０１５（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯＯ）、４．２８８（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＭｅ）、３．９２８（ｄ、Ｊ＝５Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨ）、３．８５８（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．６７６（ｓ、３Ｈ；  ＯＣＨ３）、３．５６３（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯＯ）、１．３８１（ｓ、９Ｈ；ＣＭｅ３）  ｐｐｍ。
【００５６】
｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸Ｎ−オキシスクシンイミドエステルＢｏｃ−Ｇｌｙ２（ＭＣＭＧｌｙ）Ｎｏｓの調製
［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸（１２００ｍｇ、３．３２ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４２０ｍｇ、３．６５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）氷冷撹拌溶液に、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７５４ｍｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を０℃で３０分間、次いで室温で２時間にわたって撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素の沈澱物を濾別し、ＤＭＦ（５ｍＬ）で洗浄して、濾液を最小体積に蒸発濃縮した。残留物をＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）とともに１時間にわたって撹拌した。デカンテーションによってエーテル抽出物を除去し、残留物を真空中で乾燥させ、白色泡沫として目標化合物（１４００ｍｇ、９２％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７１（アセトン／酢酸  ４０：１）。
【００５７】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、［Ｄ６］ＤＭＳＯ、３０℃）、Ｎ−カルボキシメチル−グリシンユニットのシス−配座異性体およびトランス−配座異性体の混合物  ｃ．３：２。
【００５８】
主要配座異性体：δ＝７．８９６（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯ）、６．９７２（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯＯ）、４．５３３（ｓ、２Ｈ；ＮＣＨ２ＣＯＯＮ）、４．３９９（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＭｅ）、３．９９７（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨ）、３．６９５（ｓ、３Ｈ；ＯＣＨ３）、３．５６６（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯＯ）、１．３８０（ｓ、９Ｈ；ＣＭｅ３）  ｐｐｍ。
【００５９】
副配座異性体：δ＝７．８８２（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯ）、６．９６３（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ；  ＮＨＣＯＯ）、４．９２４（ｓ、２Ｈ；ＮＣＨ２ＣＯＯＮ）、４．１３３（ｓ、２Ｈ；  ＮＣＨ２ＣＯＯＭｅ）、４．０３４（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ；  ＣＯＣＨ２ＮＨ）、３．６３２（ｓ、３Ｈ；  ＯＣＨ３）、３．５７２（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ；ＣＯＣＨ２ＮＨＣＯＯ）、１．３８０（ｓ、９Ｈ；ＣＭｅ３）  ｐｐｍ。
【００６０】
【化１０】
2018500144.tif 000011
【００６１】
【化１１】
2018500144.tif 000012
【００６２】
【化１２】
2018500144.tif 000013
Ｍａｌ−（ＣＨ２）２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥおよびＨ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称される構造物の調製
Ｈ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称される構造物は、｛［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ）−アセチル］−メトキシカルボニルメチル−アミノ｝−酢酸Ｎ−オキシスクシンイミドエステルＢｏｃ−Ｇｌｙ２（ＭＣＭＧｌｙ）Ｎｏｓから、ボヴィン（Bovin）らの２００８年の刊行物のスキームＩＩＩに従って調製した。Ｍａｌ−（ＣＨ２）２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称される構造物は、ボヴィン（Bovin）らの２００８年の刊行物のスキームＩＶの第１工程に従って調製した。手短に述べると、Ｈ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称される構造物を、５倍過剰量の、ｉ−ＰｒＯＨ−水中の３−マレイミドプロピオン酸オキシベンズトリアゾルエステルで処理した。セファデックス（Sephadex）ＬＨ−２０上におけるゲル透過クロマトグラフィー（ｉ−ＰｒＯＨ−水、１：２）後、マレイミド脂質構造物を４０％の収率で単離した。
【００６３】
ＮＣＳｅＣＨ２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥの調製
Ｍａｌ−（ＣＨ２）２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称されるマレイミド脂質構造物と、セレノ亜硫酸カリウム（potassium selenosulfite）（Ｋ２ＳｅＳＯ３）との間の付加反応［スキームＡ］、セレノフェノール（ＰｈＳｅＨ）との間の付加反応［スキームＢ］、およびセレン化水素（Ｈ２Ｓｅ）との間の付加反応［スキームＣ］によってシアノセレニド脂質構造物を調製する試みは失敗であった。後から考えると、スキームＡに従って安定したセレノ−ブンテ塩（Bunte salt）を得ることが出来ないことは、ディストラー（Distler）の１９６７年の刊行物におけるそれらの硫黄類似体の化学的挙動の開示から少なくともある程度は予測可能である。スキームＢおよびスキームＣにそれぞれ従ったプロトン性媒体中におけるフェニルセレニドおよびセレン化水素の試行されたマイケル付加物は双方とも、所望のセレニルスクシンイミドとは対照的に、減少したマレイミド二重結合を有する生成物を生じた。定量的収量でのセレニルスクシンイミドの形成は、ニュメオ（Numeo）らの１９８１年の刊行物中に開示されている。しかしながら、開示されている無水エーテルの使用は、Ｍａｌ−（ＣＨ２）２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称されるポリアニオン性マレイミド脂質構造物の使用には不適合である。
【００６４】
ＮＣＳｅＣＨ２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称されるシアノセレニド脂質構造物は、活性化された２−セレノシアナト酢酸（2-selenocyanatoacetic acid）（ＮＣ−Ｓｅ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）を通じで成功裡に調製できることをその後に発見した。活性化されたＮＣ−Ｓｅ−ＣＨ２ＣＯＯＨをスキームＤ（ａ）またはスキームＤ（ｂ）に従って脂質構造物Ｈ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと反応させた。調製した構造物は、不活性雰囲気下の暗所で保管した。セレノシアン酸カリウムは、スキームＤ（ａ）または（ｂ）に従ってＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとして、またはスキームＤ（ｃ）に従って混合無水物として、容易に活性化され得るので、セレノシアン酸カリウムを最適な試薬として選択した。セレノシアノ酢酸カリウム（Potassium selenocyanoacetate）（ＮＣＳｅＣＨ２ＣＯＯＫ）は、クラウス（Klauss）の１９７０年の刊行物中に開示された手順に従って、セレノシアン酸カリウム（ＫＳｅＣＮ）およびブロモ酢酸カリウム（ＢｒＣＨ２ＣＯＯＫ）の新たに調製した溶液から合成した。合成したＮＣＳｅＣＨ２ＣＯＯＫは、活性化前に、暗所で真空デシケーター中の水酸化カリウム（ＫＯＨ）ペレット剤上に保管した。活性化のために、前記セレノシアノ酢酸カリウム（１５６ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウランヘキサフルオロホスファート（ＨＳＴＵ）（アイリス（IRIS）、ドイツ）（２１２ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ＰＴＦＥ毛細管を介した緩やかな乾燥アルゴン流でバブリングしながら添加した。こうして得られたスラリーをこの方法では３０分間にわたって撹拌し、その間に初期の固形物はより稠密な結晶性沈澱（ＫＰＦ６）に変化した。反応混合物を１〜２分間にわたって超音波処理し、１ｍＬの２０％ＩＰＡおよび次いで１００μＬの１ＮのＫＨＣＯ３に溶解したＨ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥ（１１０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）と称される構造物と混ぜ合わせた。直ちに沈殿した粘着性固形物（おそらくＮＣＳｅＣＨ２ＣＯＯＳｕ）を超音波処理しながら３０％のＩＰＡ（約１．６ｍＬ）を滴下して加えることによって溶解させ、その反応混合物を、ｐＨを８．０〜８．５の範囲で維持しながら、室温で３時間にわたって磁気的に撹拌した（ＴＬＣ対照：  溶媒を真空中で蒸発させ、乾燥残留物を３ｍＬのアセトニトリルとともに、微細なスラリー形成するまで超音波処理によって粉砕し、次にエッペンドルフチューブ（２×２．２ｍＬ）に移して遠心分離し、固形物を純粋なＩＰＡおよびＭｅＣＮで連続して４回洗浄した（各２ｍＬ、簡単な超音波処理した後に遠心分離）。湿った固形物を３．５ｍＬの３０％ＩＰＡ−水中に溶解し、恒量まで凍結乾燥させた。１１１ｍｇ（９２％）のＮＣＳｅＣＨ２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称されるシアノセレニド−脂質構造物が、赤味がかった非晶質粉末として得られた。Ｒｆ〜０．５、２：６：１（ｖ／ｖ）のＣＨＣｌ３／メタノール／水；ＴＬＣアルミニウムシートシリカゲル６０  Ｆ２５４（メルク１．０５５５４）。質量分光法はこの構造物のキャラクタリゼーションに適しているとは思われないことに留意されたい。Ｓｅを含まないフラグメントのピークのみが検出され得る。前記構造物について測定された１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図１に提供する。
【００６５】
機能性部分としてのシアノセレニド
カチオン性脂質構造物９ａをそのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩（スキームＥ）として調製および単離した。手短に述べると、ポリアミンスペルミン［ＣＡＳ＃  ７１−４４−３］（２）の脱対称化（desymmetritisation）は、保護基としてＢｏｃを用いたゲール（Geall）およびブラグブロー（Blagbrough）の２０００年の刊行物中に開示されている方法の修正版に従って実施した。前記方法はまた、スペルミジン［ＣＡＳ＃  １２４−２０−９］（１）、テトラエチレンペンタミン［ＣＡＳ＃  １１２−５７−２］（３）、ペンタエチレンヘキサミン［ＣＡＳ＃  ４０６７−１６−７］（４）、およびヘキサエチレンヘプタミン［４４０３−３２−１］（５）、のような他の非分枝ポリアミンの脱対称化に適用可能であることが分かるであろう。従って、一連のカチオン性脂質構造物はスキームＥに従ってアクセスされてもよい。
【００６６】
スキームＥに従って、Ｂｏｃ保護された脱対称化中間体Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９−トリ−ｔｅｒ−ブトキシカルボニル）−１，１２−ジアミノ−４，９−ジアザドデカン（６）は、ホモ二官能性架橋剤アジピン酸ジスクシンイミジルを用いて、ジアシルグリセロリン脂質１，２−Ｏ−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジル−エタノールアミン［ＣＡＳ＃  ４００４−０５−１］（ＤＯＰＥ）にコンジュゲートされる。他のジスクシンイミジル化合物がホモ二官能性架橋剤として用いられてもよいことが認識されるであろう。これらは含む。
【００６７】
活性化された脂質（７ａ）は、Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９−トリ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，１２−ジアミノ−４，９−ジアザドデカン（６）の末端の一級アミノ基をアシル化して、脂質付加された（lipidated）Ｂｏｃ保護ポリアミン中間体（８ａ）を提供する。また、スキームＩに従って、１，２−Ｏ−ジステレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン［ＣＡＳ＃］（ＤＳＰＥ）のような他のジアシルグリセロリン脂質がＤＯＰＥの代わりに用いられてもよいことが認識されるであろう。
【００６８】
スキームＥの最終工程において、脂質付加されたポリアミン中間体（８ａ）は脱保護され、カチオン性脂質構造物（９ａ）がそのトリフルオロ酢酸塩として分離される。
材料および方法
クロロホルム、ジクロロエタン、ジクロロメタン、メタノールおよびトルエンはチメッド（Chimmed）（ロシア連邦）から入手した。トリフルオロ酢酸、トリエチルアミン、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナートメチルトリフルオロアセタートはメルク（Merck）（ドイツ）から入手した。スペルミンはシグマ−オールドリッチ（Sigma-Aldrich）（米国）から入手した。セファデックスＬＨ−２０はアマシャム  バイオサイエンス  アクチボラーグ（Amersham Biosciences AB）（スウェーデン）から入手した。シリカゲル６０はメルク（Merck）（ドイツ）から入手した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析はシリカゲル６０  Ｆ２５４プレート（メルク）上で実施した。アミノ含有化合物はニンヒドリン試薬を用いて検出した。ＤＯＰＥ含有化合物は、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）の水溶液を用いて、または８％（ｗ／ｖ）のリン酸水溶液中に浸漬した後に２００℃超で加熱することによって、検出した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、３０℃で、ブルカー  バイオスピン  ゲーエムベーハー（Bruker BioSpin GmbH）の７００ＭＨｚの測定器によって、対照標準として溶媒の残留プロトンのシグナル（［Ｄ］ＣＨＣｌ３、７．２７０ｐｐｍ；  ［Ｄ２］Ｈ２０、４．７５０ｐｐｍ）を用いて記録した。質量スペクトルはアジレント（Agilent）ＥＳＩ−ＴＯＦ  ６２２４  ＬＣ／ＭＳ分光計によって記録した。
【００６９】
Ｂｏｃ３Ｓｐｍ（６）の調製
窒素下で−８０℃においてスペルミン（２）（１当量、１．３４ｇ、６．６ｍｍｏｌ）のメタノール（９０ｍＬ）撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸メチル（１．１当量、０．７３０ｍＬ、７．２６ｍｍｏｌ）のメタノール（１．５ｍＬ）溶液を３０分間にわたって滴下して添加した。−８０℃でさらに３０分間にわたって撹拌を続け、次いで温度を０℃に上昇させた。該反応は主にモノトリフルオロアセトアミドを与えた。分離せずに、残りのアミノ官能基を、過剰なジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（４当量、５．７６ｇ、２６．４ｍｍｏｌ）のメタノール溶液を３分間にわたって滴下して添加することによって定量的に保護した。次に、その反応を２５℃に加熱し、さらに１５時間撹拌して、完全に保護されたスペルミン（Ｒｆ  ０．３３（９５：５（ｖ／ｖ）のＣＨＣｌ３−ｉ−ＰｒＯＨ））を提供した。次に、濃アンモニア水（conc. aq. NH3）によって溶液のｐＨを１１ｐＨ単位を超えるまで増大させ、次いで２５℃で１５時間にわたって撹拌することによって、トリフルオロ酢酸保護基（trifluoroacetate protecting group）をインサイチューで除去した。前記溶液を真空中で濃縮し、その残留物をシリカゲル（９５：５：１〜９０：１０：１（ｖ／ｖ／ｖ）のＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ｃｏｎｃ．ａｑ．ＮＨ３）上で精製して、無色の均質なオイルとして表題化合物（６）（１．５ｇ、４５％）を得た（Ｒｆ  ０．３２（８３：１６：１（ｖ／ｖ／ｖ）のＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ｃｏｎｃ．ａｑ．ＮＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：実測値  ５０２．３７２５（Ｍ＋＋１）、Ｃ２５Ｈ５０Ｎ４Ｏ６  要求されるＭ＋  ５０１．３６５２。
【００７０】
１Ｈ−ＮＭＲ（７００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、３０３°Ｋ）、δ、ｐｐｍ：３．４（ｍ、２Ｈ、１−ＣＨ２）、３．０５−３．３０（ｍ、８Ｈ、３、４、７、８−ＣＨ２）、３．０１（ｍ、２Ｈ、１０−ＣＨ２）、２．０３（ｍ、２Ｈ、９−ＣＨ２）、１．６７（ｍ、２Ｈ、２−ＣＨ２）、１．５０（ｍ、４Ｈ、５，６−ＣＨ２）、１．４４、１．４５、１．４６（３  ｓ、重複、２７  Ｈ、３  Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３）。
【００７１】
ＳｕＯ−Ａｄ−ＤＯＰＥ（７ａ）およびＳｕＯ−Ａｄ−ＤＳＰＥ（７ｂ）の調製
アジピン酸ジスクシンイミジル（７０ｍｇ、２０５μｍｏｌ）の乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）溶液に、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＥ（４０μｍｏｌ）のクロロホルム（１．５ｍＬ）溶液を添加し、続いてトリエチルアミン（７μＬ）を添加した。その混合物を室温で２時間維持し、次いで酢酸で中和し、真空中である程度濃縮した。残留物のカラムクロマトグラフィー（セファデックス  ＬＨ−２０、１：１（ｖ／ｖ）のクロロホルム−メタノール、０．２％（ｗ／ｖ）の酢酸水溶液）により、無色のシロップとしてＳｕＯ−Ａｄ−ＤＯＰＥ（７ａ）（３７ｍｇ、９５％）を生じた。ＴＬＣ（６：３：０．５（ｖ／ｖ／ｖ）のクロロホルム−メタノール−水）  Ｒｆ  ０．５（ＳｕＯ−Ａｄ−ＤＯＰＥ（７ａ））およびＲｆ  ０．５５（ＳｕＯ−Ａｄ−ＤＯＰＥ（７ｂ））。
【００７２】
１Ｈ  ＮＭＲ（２：１（ｖ／ｖ）のＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）δ：
ＳｕＯ−Ａｄ−ＤＯＰＥ（７ａ）−５．５（ｍ、４Ｈ、２×（−ＣＨ＝ＣＨ−）、５．３９（ｍ、１Ｈ、−ＯＣＨ２−ＣＨＯ−ＣＨ２Ｏ−）、４．５８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６７、Ｊ＝１１．９８、−ＣＣＯＯＨＣＨ−ＣＨＯ−ＣＨ２Ｏ−）、４．３４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．６１、Ｊ＝１１．９８、−ＣＣＯＯＨＣＨ−ＣＨＯ−ＣＨ２Ｏ−）、４．２６（ｍ、２Ｈ、ＰＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、４．１８（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＯＰ）、３、６２（ｍ、２Ｈ、ＰＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）、３．００（ｓ、４Ｈ、ＯＮＳｕｃ）、２．８（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ（Ａｄ）、２．５０（ｍ、４Ｈ、２ｘ（−ＣＨ２−ＣＯ）、２．４２（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ（Ａｄ）、２．１７（ｍ、８Ｈ、２×（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−）、１．９３（ｍ、４Ｈ、ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ）、１．７８（ｍ、４Ｈ、２×（ＣＯＣＨ２ＣＨ２−）、１，４３、１．４７（２  ｂｓ、４０Ｈ、２０  ＣＨ２）、１．０４（ｍ、６Ｈ、２  ＣＨ３）。
【００７３】
ＳｕＯ−Ａｄ−ＤＳＰＥ（７ｂ）−  ５．３９（ｍ、１Ｈ、−ＯＣＨ２−ＣＨＯ−ＣＨ２Ｏ−）、４．５３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．４２、Ｊ＝１１．９８、−ＣＣＯＯＨＣＨ−ＣＨＯ−ＣＨ２Ｏ−）、４．３３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．８７、Ｊ＝１１．９８、−ＣＣＯＯＨＣＨ−ＣＨＯ−ＣＨ２Ｏ−）、４．２３（ｍ、２Ｈ、ＰＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）、４．１５（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＯＰ）、３、６１（ｍ、２Ｈ、ＰＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）、３．００（ｓ、４Ｈ、ＯＮＳｕｃ）、２．８１（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ（Ａｄ）、２．４８（ｍ、４Ｈ、２×（−ＣＨ２−ＣＯ）、２．４２（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ（Ａｄ）、１．９３（ｍ、４Ｈ、ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ）、１．７８（ｍ、４Ｈ、２×（ＣＯＣＨ２ＣＨ２−）、１，４３、１．４７（２  ｂｓ、４０Ｈ、２０  ＣＨ２）、１．０４（ｍ、６Ｈ、２  ＣＨ３）。
【００７４】
Ｂｏｃ３Ｓｐｍ−Ａｄ−ＤＯＰＥ（８ａ）の調製
Ｂｏｃ３Ｓｐｍ（６）（５５２ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（２５ｍＬ）撹拌溶液に、トリメチルアミン（１ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＳｕＯ−Ａｄ−ＤＯＰＥ（１０６６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（２５ｍＬ）溶液を添加した。その反応混合物を２時間撹拌し、次いで３７℃の減圧下で溶媒を除去した。粗製生成物を９７：３〜８５：１５（ｖ／ｖ）のＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨを用いた溶離によるシリカゲル上におけるクロマトグラフィーによって精製し、粘着性オイルとして表題化合物（８ａ）（１．１６ｇ、７８％）を得た。ＴＬＣ（１０：６：０．８（ｖ／ｖ／ｖ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＨ−Ｈ２Ｏ）  Ｒｆ  ０．３６。
【００７５】
１Ｈ  ＮＭＲ（７００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ  １：１、１０ｍｇ／ｍＬ、３０３°Ｋ）δ、ｐｐｍ：５．３４（ｍ、４Ｈ；２  ＣＨ＝ＣＨ）、５．１９（ｍ、１Ｈ；ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２Ｏ）、４．３７（ｄｄ、Ｊｇｅｍ〜１１．１Ｈｚ、１Ｈ、ＰＯＣＨ２−ＣＨ−ＣＨａ−Ｏ（ＣＯ））、４．１３（ｄｄ、Ｊ〜７．２Ｈｚ、１Ｈ、ＰＯＣＨ２−ＣＨ−ＣＨｂ−Ｏ（ＣＯ））、３．９４（ｍ、４Ｈ）、３．４８（ｍ、２Ｈ）、３．０５−３．３０（ｍ、１２Ｈ、１，３，４，７，８，１０−ＣＨ２）、２．７１（ｍ、２Ｈ）、２．２０−２．４２（ｍ、８Ｈ）、１．９８−２．０４（ｍ、８Ｈ）、１．６４（ｍ、８Ｈ）、１．５８（ｍ、４Ｈ）、１．４９（ｍ、４Ｈ、５，６−ＣＨ２）、１．４４、１．４５、１．４６（３ｓ、２７Ｈ、３  Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３）、１．２２−１．３７（ｍ、４０Ｈ、２０  ＣＨ２）、０．８８および０．８９（２ｄ、Ｊ≒７Ｈｚ、６Ｈ、２  ＣＨ３）．
Ｓｐｍ−Ａｄ−ＤＯＰＥ（９ａ）の調製
２５℃の８ａ（１．１６ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）撹拌溶液にＴＦＡ（５ｍＬ、９５％）を添加した。２０分後、前記溶液を３５℃の真空中で濃縮し、その残留物をトルエン（１０  ｍＬで５回）とともに同時蒸発（co-evaporated）させて、微量のＴＦＡを除去した。任意の低分子量不純物を除去するために、前記残留物を１：１（ｖ／ｖ）のＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中に溶解させ、２回に分けてセファデックスＬＨ−２０カラム（容積３３０ｍＬ、溶離液は１：１（ｖ／ｖ）のＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ）に通した。純粋な９ａ（ジ−ＴＦＡ塩）を含有する画分を合わせて、蒸発乾燥させ、その残留物を水（〜１００ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥した。９７５ｍｇ（８９％）の収量を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：実測値  １０５６．８０６３（Ｍ＋＋１）、Ｃ５７Ｈ１１０Ｎ５Ｏ１０Ｐ  要求されるＭ＋  １０５５．７７９。
【００７６】
１Ｈ  ＮＭＲ（７００ＭＨｚ、１：１（ｖ／ｖ）のＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＯＤ、１０ｍｇ／ｍＬ、３０３°Ｋ）δ、ｐｐｍ：５．５１（ｍ、４Ｈ；２  ＣＨ＝ＣＨ）、５．４２（ｍ、１Ｈ；ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２Ｏ）、４．６（ｄｄ、Ｊｇｅｍ＝１２．１Ｈｚ、Ｊ＝２．８１Ｈｚ、１Ｈ、ＰＯＣＨ２−ＣＨ−ＣＨａ−Ｏ（ＣＯ））、４．３４（ｄｄ、Ｊ＝７．０９Ｈｚ、１Ｈ、ＰＯＣＨ２−ＣＨ−ＣＨｂ−Ｏ（ＣＯ））、４．１４（ｍ、２Ｈ、ＰＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ）、４．０６（ｍ、２Ｈ、ＰＯＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２）、３．５９（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ）、３．４９（ｍ、２Ｈ、１−ＣＨ２）、３．１１−３．２８（ｍ、１０Ｈ、３，４，７，８，１０−ＣＨ２）、２．４２および２．５１（２ｍ、８Ｈ、４  ＣＯＣＨ２）、２．２６（ｍ、２Ｈ、２−ＣＨ２）、２．１９（ｍ、８Ｈ、２  ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）、２．０７（ｍ、２Ｈ、９−ＣＨ２）、１．９９（ｍ、４Ｈ、５，６−ＣＨ２）、１．７９（ｍ、８Ｈ、４  ＣＯＣＨ２ＣＨ２）、１．４０−１．５４（ｍ、４０Ｈ、２０  ＣＨ２）、１．０５および１．０６（２ｔ、Ｊ≒７Ｈｚ、６Ｈ、２  ＣＨ３）。
【００７７】
【化１３】
2018500144.tif 000014
抗微生物性表面処理
ＮＣＳｅＣＨ２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称されるシアノセレニド脂質構造物のステンレス鋼表面における細菌の増殖を防止する能力を評価した。使用したステンレス鋼（３１６  ＳＳ）クーポン（カタログ番号ＲＤ１２３−３１６、バイオサーフェス  テクノロジーズ（Biosurface Technologies））を市販の消毒洗浄剤（TRIGENE（商標））の１％（ｖ／ｖ）水溶液中に浸漬し、続いて市販アルカリ洗浄剤（PYRONEG（商標））の０．１％（ｖ／ｖ）水溶液に浸漬した後、脱イオン水で濯いだ。濯いだクーポンから、９５％（ｖ／ｖ）のエタノール中に浸漬し、続いて同一の溶媒中で濯ぎ、次いでメタノール中で３０分間にわたって超音波で処理することによって、有機残留物および金属屑を除去した。最後に、前記クーポンを沸騰したメタノール中に１０分間浸漬した後に９０℃で乾燥させ、包装して１２１℃で２０分間にわたって高圧滅菌した。殺菌したクーポンをＮＣＳｅＣＨ２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称されるシアノセレニド脂質構造物の脱気した５０μｇ／ｍＬ水性分散液中に浸漬することによって、処理済みクーポンを調製した。前記水性分散液は、滅菌蒸留水中において１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製された前記構造物の脱気ストック溶液から調製した。対照として、殺菌したクーポンを滅菌蒸留水中に浸漬することによって、未処理クーポンを調製した。処理済みクーポンおよび未処理クーポンをラミナーフローキャビネット内で乾燥させた。黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌の凍結ストック溶液を解凍し、それを用いて血液寒天培地プレートに画線接種（streak inoculate）した後、３７℃で一晩インキュベートした。１×１０８ｃ．ｆ．ｕ／ｍＬの懸濁液中のおおよその細胞密度を提供するように、分離したコロニーを１０ｍＬの滅菌水中に懸濁し、血液寒天培地プレート上の各懸濁液の生存率測定（viability counts）によって確認した（黄色ブドウ球菌、１．１５×１０８ｃ．ｆ．ｕ／ｍＬ；  表皮ブドウ球菌、１．２７×１０７ｃ．ｆ．ｕ／ｍＬ）。個々の乾燥したクーポンを滅菌したマイクロプレートのウェルに移し、各クーポンの表面を１０μＬのブドウ球菌種の細胞の懸濁液と接触させ、その懸濁液を乾かした（およそ２０分間）。次に、１ｍＬの量の３ｇ／Ｌトリプチックソイブロスを、前記クーポンを被覆するようにウェル内に導入して、前記マイクロプレートを覆い、１５０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で２１時間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、クーポンを取り出して、水で洗浄し、乾燥させた。
【００７８】
次に、前記クーポンの各々の表面上に３滴の染色剤を２分間にわたって配置した後に滅菌水で濯いで風乾することにより、乾燥したクーポンの表面をアクリジンオレンジで染色した。１，０００×倍率の蛍光顕微鏡による観察結果を図２（黄色ブドウ球菌）および図３（表皮ブドウ球菌）に示す。双方のブドウ球菌の種は、未処理クーポンの表面上においてバイオフィルムを確立することができた。前記種のどちらも、処理済みクーポン上ではバイオフィルムを確立することができなかった。前記クーポンへの曝露後の細菌の生存能力を評価するために、１００μＬの量のインキュベーション後の前記ブロスを血液寒天培地プレートの表面上に塗布した。次に、前記プレートを３７℃で一晩インキュベートした。インキュベートしたプレートの写真を図４（黄色ブドウ球菌）および図５（表皮ブドウ球菌）に示す。処理済みクーポンの表面への曝露は、細菌細胞増殖を著しく阻害した。
【００７９】
Ｓｐｍ−Ａｄ−ＤＯＰＥ（９ａ）と称されるカチオン性脂質構造物のステンレス鋼表面における細菌の増殖を防止する能力を評価した。前記構造物の分散液を滅菌脱イオン水中において１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。（前記構造物を塩水中に分散させようとすると前記構造物の沈殿を生じるであろうことに留意されたい。）１００μＬの量の前記分散液を１×１ｃｍのステンレス鋼（ＳＳ  ３０４）四角片の表面上に分与した。同量の滅菌した脱イオン水を第二ステンレス鋼四角片の表面上に分与することにより、対照を調製した。次に、双方の試料（試験および対照）を６０℃で２時間にわたって乾燥させた。前記試料は使用前に室温で保管した。２１ｇ／Ｌのミュラー＝ヒントンブロス（ＭＨＢ）中における大腸菌（ＡＴＣＣ  ２５９２２）の活発に増殖している（対数増殖期）培養物の１ｍＬ量を、１００μＬあたり８〜１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を提供するように、連続的に希釈した（１０−６）。前記ステンレス鋼四角片の個々の試料を滅菌した１２−ウェル培養プレートの各ウェルに配置し、１００ｍＬの連続的に希釈した培養物を各試料の表面上に分与した。前記培養物を室温で２０分間にわたって前記表面と接触させた後に、各試料をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄して、前記細菌の非癒着性細胞を除去した。次に、洗浄した各試料を、１０ｍＬの量のＭＨＢ中に浸漬して、３７℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、各試料を前述のように洗浄し、９ｍＬの量のＭＨＢ中に浸漬した。攪拌および超音波処理を交互に用いて、前記試料表面から細菌を除去した。次に、結果として生じたブロスの連続希釈物（１０−４）の一定量を血液寒天培地プレート上に塗布して、３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。一晩培養物の細胞密度を計算し、それを表１に示す。
【００８０】
【表１】
2018500144.tif 000015
表にした結果は、Ｓｐｍ−Ａｄ−ＤＯＰＥ（９ａ）と称されるカチオン性脂質構造物によって処理された試料の殺生物作用を示している。
【００８１】
ＮＣＳｅＣＨ２ＣＯ−ＣＭＧ（２）−Ａｄ−ＤＯＰＥと称されるシアノセレニド脂質構造物の外科用包帯における細菌の増殖を防止する能力も評価した。滅菌した外科用包帯（Propax（登録商標））を前記構造物の水性分散液に１秒間浸漬し、乾燥させ、次に細菌（表皮ブドウ球菌の臨床分離株）で汚染した。３０分後、次に細菌で汚染された包帯を増殖培地に２４時間配置して、前記培地内における増殖（コロニー形成単位の計数により判定）および前記包帯上における増殖を観察した（１０箇所の無作為の１０００×走査電子顕微鏡視野において細菌を見つけ出す）。培地における細菌の増殖は、未処理の試料については、１ｍＬ当たり２．６〜３．０×１０７コロニー形成単位（ｃｆｕ）に相当した。培地における細菌の増殖は、処理済み試料については、１ｍＬ当たり５〜１．３×１０４コロニー形成単位（ｃｆｕ）に相当した。未処理試料に対して、細菌増殖は１００％（１０のうち１０）の視野において観察された。処理済み試料に対して、細菌増殖は１０％（１０のうちの１）の視野において観察された。外科用包帯の処理済み試料および未処理試料の電子顕微鏡写真を図６および図７に提供する。反復試験区を複数回実施したところ、再現可能な結果をもたらした。
【００８２】
本発明について実施形態または実施例を参照しながら説明してきたが、当然のことながら、本発明の範囲から逸脱することなく、これらの実施形態または実施例に対して変更および修正がなされてもよい。特定の要素、特徴、または整数に対して既知の均等物が存在する場合、そのような均等物は、あたかもこの明細書において特に言及されるかのように組み込まれる。具体的には、参照した刊行物に開示されており、それらから選択された要素、特徴、または整数を含む実施形態または実施例に対する変更および修正は、特に放棄されない限り、本発明の範囲内にある。本発明によって提供され、説明中で検討した利点は、本発明のこれらの異なる実施形態において択一的に、または組み合わされて提供されてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
外科的処置具を表面処理する方法は、合成水分散性カチオン性脂質構造物を用いて生体外で実施される。
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【図１】
2018500144.tif 000020
【図２Ａ】
2018500144.tif 000021
【図２Ｂ】
2018500144.tif 000022
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2018500144.tif 000025
【図４Ｂ】
2018500144.tif 000026
【図５Ａ】
2018500144.tif 000027
【図５Ｂ】
2018500144.tif 000028
【図６Ａ】
2018500144.tif 000029
【図６Ｂ】
2018500144.tif 000030
【図７Ａ】
2018500144.tif 000031
【図７Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月5日(2016.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物体の表面を少なくとも１種の機能性脂質構造物の水性分散液と接触させる工程を含む抗微生物性表面処理方法であって、前記脂質は、ジ−アシルグリセロリン脂質、ジ−アルケニルグリセロリン脂質、またはジ−アルキルグリセロリン脂質であり、前記構造物の機能性部分はセレニドおよびポリカチオンからなる群から選択される、方法。
【請求項２】
前記物体は外科用包帯または外科用インプラントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物体は外科用インプラントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記表面はステンレス鋼である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記水性分散液は洗剤および有機溶媒を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記水性分散液は、塩水または水と、前記少なくとも１種の機能性脂質構造物とからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記脂質はジ−アシルグリセロリン脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質はホスファチジルエタノールアミンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記脂質はジ−オレオイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能性部分は、シアノセレニドおよびポリアミンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記機能性部分はシアノセレニドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗微生物性表面処理は抗細菌性表面処理である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗微生物性表面処理は殺細菌性表面処理である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記表面への接触は、抗微生物性表面処理を提供するのに十分な時間にわたって前記物体を前記分散液中に浸漬することによる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記時間は６０秒間未満である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記時間は３０秒間未満である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記時間は１０秒間未満である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記物体が浸漬されている間、前記分散液は超音波処理される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
下記構造のセレニド脂質構造物であって、
【化１】
2018500144.tif 000033
ｍは整数の１、２、３または４であり、好ましくは整数の１、２または４であり、最も好ましくは整数の２であり、
ｎは整数の３、４または５であり、最も好ましくは整数の４であり、
ｐは整数の１、２または３であり、最も好ましくは整数の２であり、
ｑは整数の１、２または３であり、最も好ましくは整数の１であり、
Ｍは一価の置換基であり、好ましくは一価の置換基ＣＨ３またはＨであり、最も好ましくは一価の置換基Ｈであり、
Ｍ’は一価のカチオンまたは置換基であり、好ましくは一価のカチオンＨ＋、Ｋ＋またはＮａ＋であり、最も好ましくは一価のカチオンＨ＋であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、脂肪族Ｃ１４−２０アシル、脂肪族Ｃ１４−２０アルケニルまたは脂肪族Ｃ１４−２０アルキル置換基であり、好ましくはミリスチル、パルミチル、ステアリル、アラキジル、パルミトレオイル、ペトロセレニル、オレオイル、エライジル、バクセニルおよびゴンドイルからなる群から選択される置換基であり、最も好ましくは脂肪族Ｃ１８アルケニル置換基のオレオイルである、セレニド脂質構造物。
【請求項２０】
下記構造のカチオン性脂質構造物であって、
【化２】
2018500144.tif 000034
Ｘは−ＣＨ２−であり、ｎは整数の３、４または５であり、Ｒ１およびＲ２は、非分枝で飽和またはモノ不飽和であるＣ１４−２０アシル基からなる群から独立して選択され、Ｒ３はＮ１−アシル化ポリアミンである、構造物。
【請求項２１】
Ｒ３は下記構造のものである、請求項２０に記載の構造物。
【化３】
2018500144.tif 000035
【請求項２２】
Ｓｐｍ−Ａｄ−ＤＯＰＥと称される下記構造のカチオン性脂質構造物。
【化４】
2018500144.tif 000036
【請求項２３】
請求項１９乃至２２のいずれか１項に記載のカチオン性脂質構造物の水中分散液から実質的になる殺細菌性表面処理調合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
第１態様において、本発明は、物体の表面を少なくとも１種の機能性脂質構造物の水性分散液と接触させる工程を含む抗微生物性表面処理方法を提供する。前記脂質は、ジ−アシルグリセロリン脂質、ジ−アルケニルグリセロリン脂質、またはジ−アルキルグリセロリン脂質であり、前記構造物の機能性部分（functional moiety)はセレニドおよびポリカチオンからなる群から選択される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
好ましくは、前記機能性部分は、シアノセレニドおよびポリアミンからなる群から選択される。最も好ましくは、前記機能性部分はシアノセレニドである。
【国際調査報告】
2018500144.tif 000037
2018500144.tif 000038
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