(57)【要約】  本発明は、増幅技術、例えば次世代シークエンシング（ＮＧＳ）等で使用される品質保証法に関する。
2018536430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸テンプレートの複雑性を決定する方法であって、
核酸テンプレートの複雑性を決定するために、
ｉ）核酸テンプレートを提供することと、
ｉｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む複数のプライマーの対を提供することであって、第１のプライマーが、核酸テンプレートの一部分に対して相補的な配列を含み、第２のプライマーが、核酸テンプレートの相補体の一部分に対して相補的な配列を含み、
ｉｉｉ）第１のプライマーの５’末端、第２のプライマーの５’末端、もしくはその両方にコードワードを連結してコードワード−プライマー分子を形成すること、または核酸テンプレートにコードワードを連結してコードワード−テンプレート分子を形成することと、
ｉｖ）対をなすコードワード−プライマー分子と核酸テンプレートと共に、またはプライマーの対とコードワード−テンプレート分子と共に、規定のサイクル数、増幅反応を実施して、増幅反応生成物を取得することと、
ｖ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物の配列を取得することと、
ｖｉ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物中に存在する各コードワードの存在量を決定することと、
ｖｉｉ）各サイクルの実測コードワードエントロピーを決定することと、
ｖｉｉｉ）実測コードワードエントロピーを、推定コードワードエントロピーと比較すること
を含む前記方法。
【請求項２】
真正な配列変異体を識別する方法であって、
真正な配列変異体を識別するために、
ｉ）核酸テンプレートを提供することと、
ｉｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む複数のプライマーの対を提供することであって、第１のプライマーが、核酸テンプレートの一部分に対して相補的な配列を含み、第２のプライマーが、核酸テンプレートの相補体の一部分に対して相補的な配列を含み、
ｉｉｉ）第１のプライマーの５’末端、第２のプライマーの５’末端、もしくはその両方にコードワードを連結してコードワード−プライマー分子を形成すること、または核酸テンプレートにコードワードを連結してコードワード−テンプレート分子を形成することと、
ｉｖ）対をなすコードワード−プライマー分子と核酸テンプレートと共に、またはプライマーの対とコードワード−テンプレート分子と共に、規定のサイクル数、増幅反応を実施して、増幅反応生成物を取得することと、
ｖ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物の配列を取得することと、
ｖｉ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物中に存在する各コードワードの存在量を決定することと、
ｖｉｉ）各サイクルの実測コードワードエントロピーを決定することと、
ｖｉｉｉ）ステップｖｉ）およびｖｉｉ）の結果に基づき、管理された分類法を実施すること
を含む前記方法。
【請求項３】
真正な配列変異体が、低頻度の配列変異体である、請求項２に記載の方法
【請求項４】
核酸テンプレートが、ＤＮＡテンプレートである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
コードワード−プライマー分子またはプライマーが、アダプター配列とさらに連結している、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
異なるコードワードが、プライマーの対内の各プライマーと連結しており、または同一のコードワードが、プライマーの対内の各プライマーと連結している、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
コードワードが、核酸テンプレートとランダムに連結している、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
実測コードワードエントロピーが、シャノンエントロピー、シンプソンインデックス、または任意のその他の多様性インデックスにより計算される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
コードワードが、一様でないプール内に存在する、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
コードワードが、バランスのとれたプール内に存在する、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
コードワードのバランスのとれたプールを取得する方法であって、
ｉ）規定の長さの複数のコードワードを含む開始サンプルを提供することと、
ｉｉ）標的配列を提供することと、
ｉｉｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む複数のプライマーの対を提供することであって、第１のプライマーが、標的配列の一部分に対して相補的な配列を含み、第２のプライマーが、標的配列の相補体の一部分に対して相補的な配列を含み、ならびに各コードワードが、第１のプライマーの５’末端、第２のプライマーの５’末端、またはその両方と連結して、対をなすコードワード−プライマー分子を形成し、
ｉｖ）対をなすコードワード−プライマー分子と標的配列と共に、規定のサイクル数、増幅反応を実施して、増幅反応生成物を取得することと、
ｖ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物の配列を取得することと、
ｖｉ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物中に存在する各コードワードの存在量を決定すること、
ｖｉｉ）コードワード性能の測定後のパラメーターを、
ａ）ステップ（ｖｉ）から得られた存在量を予想される数字と比較すること、および／または
ｂ）各先行増幅サイクルに対する存在量の増加率を決定すること
により取得することと、
ステップ（ｖｉｉ）から得られた測定後のパラメーターを使用して、確率論的局所探索法を使用するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの探索を実施して、コードワードのバランスのとれたプールを取得すること
を含む、前記方法。
【請求項１２】
コードワード−プライマー分子が、アダプター分子とさらに連結している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
規定の長さが、約４単位〜約２１単位である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
開始サンプルが、少なくとも１０個のコードワードを含む、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
開始サンプルが、ランダムなサンプルであるか、又はコンビナトリアルな制約および／または熱力学的制約を受ける、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
開始サンプルが、コードワード配列のすべての組合せを含むか、またはコードワード配列の組合せのサブセットを含む、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
コードワードのより大きなプールまたは異なる長さのコードワードを使用して実施される、請求項１１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
単一の標的配列を使用して、または２以上の標的配列を使用して実施される、請求項１１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
単回または２回以上実施される、請求項１１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
サブシークエンスおよび場所の関数としての、コードワード性能の判定を含む、請求項１１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
増幅プロセス、汚染、サンプルの同一性ミスマッチ、またはコードワードプールのアンバランスを決定するための、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号１〜１４６に記載の配列のうちの１つまたは複数を含むプライマー。
【請求項２３】
第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマーの対のセットであって、第１のプライマーが、配列番号１〜７３の任意の１つに記載する配列を含み、第２のプライマーが、配列番号７４〜１４６の任意の１つに記載する配列を含む、前記セット。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載のプライマーまたはプライマーの対を含むキットであって、プライマーまたはプライマーの対を保管、輸送、送達、もしくは使用するのに適した試薬をさらに含み、使用説明書を含んでいてもよい、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、品質保証方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デジタル単一分子リプレゼンテーションシークエンシングは、しばしば次世代シークエンシング（ＮＧＳ）と呼ばれ、単一分子ＤＮＡシークエンシングに近い合成アプローチによるシークエンシングを使用する。ＮＧＳ法の特徴は、誘導された配列内に単一分子を提示することである。ＮＧＳは、ゲノミクスに基づくがん試験において、ゲノムプロファイリングするために使用される。
【０００３】
しかし、対立遺伝子コールにおける信頼性を立証する品質保証プロセスから利益を得ると予想されるＮＧＳのいくつかの態様が存在する。このような態様として、対立遺伝子増幅における生物学的および技術的偏りの検出、不良なテンプレートの検出またはシークエンシング時のテンプレート提示不足、外来アンプリコン汚染の検出、ならびにインプットＤＮＡプール内の真正な低頻度突然変異の検出が挙げられる。品質保証は、臨床試験の必要要素であり、また堅固な研究基盤も可能にする。
塩基の配列が、ワードまたはコード（バーコードまたは分子バーコードと呼ばれる）を表すＤＮＡ配列の確率論的連結と、それに後続する増幅の使用等、いくつかの戦略が、ＤＮＡ分子の計測で使用されてきた。
【０００４】
公知のＤＮＡコードワードアプローチの限界として、計測で使用されるコードワード分子のセットに偏りが生じた場合の結果について、また配列依存性であり得る連結時に効率が損なわれた時の結果についても、一般的に考慮されないことが挙げられる。さらに、方法は、ＮＧＳ配列内で対立遺伝子を検出するために、分子計測工程を確率論的手法に組み込むことが必要とされる（例えば、ベイジアングラフィカルモデルを使用する方法、例えばＳＮＶｍｉｘ(1)等、および配列変動の特性に基づく分類指標に組み込まれる方法、例えばｍｕｔａｔｉｏｎｓｅｑ(2)等）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様では、本開示は、核酸テンプレートの複雑性を決定するために、
ｉ）核酸テンプレートを提供することと、
ｉｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む複数のプライマーの対を提供することであって、第１のプライマーが、核酸テンプレートの一部分に対して相補的な配列を含み、第２のプライマーが、核酸テンプレートの相補体の一部分に対して相補的な配列を含み、
ｉｉｉ）第１のプライマーの５’末端、第２のプライマーの５’末端、もしくはその両方にコードワードを連結してコードワード−プライマー分子を形成すること、または核酸テンプレートにコードワードを連結してコードワード−テンプレート分子を形成することと、
ｉｖ）対をなすコードワード−プライマー分子と核酸テンプレートと共に、またはプライマーの対とコードワード−テンプレート分子と共に、規定のサイクル数、増幅反応を実施して、増幅反応生成物を取得することと、
ｖ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物の配列を取得することと、
ｖｉ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物中に存在する各コードワードの存在量を決定することと、
ｖｉｉ）各サイクルの実測コードワードエントロピーを決定することと、
ｖｉｉｉ）実測コードワードエントロピーを、推定コードワードエントロピーと比較することと
により、核酸テンプレートの複雑性を決定する方法を提供する。
【０００６】
代替的態様では、本開示は、真正な配列変異体を識別するために、
ｉ）核酸テンプレートを提供することと、
ｉｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む複数のプライマーの対を提供することであって、第１のプライマーが、核酸テンプレートの一部分に対して相補的な配列を含み、第２のプライマーが、核酸テンプレートの相補体の一部分に対して相補的な配列を含み、
ｉｉｉ）第１のプライマーの５’末端、第２のプライマーの５’末端、もしくはその両方にコードワードを連結してコードワード−プライマー分子を形成すること、または核酸テンプレートにコードワードを連結してコードワード−テンプレート分子を形成することと、
ｉｖ）対をなすコードワード−プライマー分子と核酸テンプレートと共に、またはプライマーの対とコードワード−テンプレート分子と共に、規定のサイクル数、増幅反応を実施して、増幅反応生成物を取得することと、
ｖ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物の配列を取得することと、
ｖｉ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物中に存在する各コードワードの存在量を決定することと、
ｖｉｉ）各サイクルの実測コードワードエントロピーを決定することと、
ｖｉｉｉ）ステップｖｉ）およびｖｉｉ）の結果に基づき、管理された分類法（supervised clasification）を実施することと
により、真正な配列変異体を識別する方法を提供する。
【０００７】
真正な配列変異体は、低頻度の配列変異体であり得る。
核酸テンプレートは、ＤＮＡテンプレートであり得る。
コードワード−プライマー分子またはプライマーは、アダプター配列とさらに連結し得る。
異なるコードワードが、プライマーの対内の第１および第２のプライマーと連結し得るか、または同一のコードワードが、プライマーの対内の第１および第２のプライマーと連結し得る。
コードワードは、核酸テンプレートとランダムに連結し得る。
実測コードワードエントロピーは、多様性インデックス、例えばシャノンエントロピー、シンプソンインデックス、または任意のその他の多様性インデックス等により計算可能である。
コードワードは、一様でないプール内に存在し得る。
コードワードは、本明細書の記載に従い得られるバランスのとれたプール内に存在し得る。
本明細書に記載する方法は、真正な配列変異体、増幅プロセス汚染、サンプルの同一性ミスマッチ、またはコードワードプールのアンバランスを検出するのに利用可能である。
【０００８】
代替的態様では、本開示は、コードワードのバランスのとれたプールを取得する方法であって、
ｉ）規定の長さの複数のコードワードを含む開始サンプルを提供することと、
ｉｉ）標的配列を提供することと、
ｉｉｉ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む複数のプライマーの対を提供することであって、第１のプライマーが、標的配列の一部分に対して相補的な配列を含み、第２のプライマーが、標的配列の相補体の一部分に対して相補的な配列を含み、ならびに各コードワードが、第１のプライマーの５’末端、第２のプライマーの５’末端、またはその両方と連結して、対をなすコードワード−プライマー分子を形成し、
ｉｖ）対をなすコードワード−プライマー分子と標的配列と共に、規定のサイクル数、増幅反応を実施して、増幅反応生成物を取得することと、
ｖ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物の配列を取得することと、
ｖｉ）各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数において、増幅反応生成物中に存在する各コードワードの存在量を決定することと、
ｖｉｉ）コードワード性能の測定後のパラメーターを、
ａ）ステップ（ｖｉ）から得られた存在量を予想される数字と比較すること、および／または
ｂ）各先行増幅サイクルに対する存在量の増加率を決定すること
により取得することと、
ステップ（ｖｉｉ）から得られた測定後のパラメーターを使用して、確率論的局所探索法を使用するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの探索を実施して、コードワードのバランスのとれたプールを取得することと
を含む方法を提供する。
【０００９】
コードワード−プライマー分子は、アダプター配列にさらに連結し得る。
コードワードの長さは、約４単位〜約２１単位であり得る。
開始サンプルサイズは、少なくとも１０個のコードワードであり得る。
開始サンプルは、ランダムなサンプルであり得るか、又はコンビナトリアルな制約および／または熱力学的制約を受け得る。
開始サンプルは、コードワード配列のすべての組合せを含み得るか、またはコードワード配列の組合せのサブセットを含み得る。
方法は、コードワードのより大きなプールまたは異なる長さのコードワードを使用して実施され得る。
方法は、単一の標的配列を使用して、または２つもしくはそれ超の標的配列を使用して実施され得る。
方法は、単回または２回以上、実施され得る。
方法は、サブシークエンスおよび場所の関数としての、コードワード性能の判定を含み得る。
プライマーは、配列番号１〜１４６に記載する配列のうちの１つまたは複数を含み得る。
【００１０】
いくつかの態様では、本開示は、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマーの対のセットであって、第１のプライマーが、配列番号１〜７３の任意の１つに記載する配列を含み、第２のプライマーが、配列番号７４〜１４６の任意の１つに記載する配列を含む、プライマーの対のセットを提供する。
いくつかの実施形態では、プライマーまたはプライマーの対は、プライマーまたはプライマーの対を保管、輸送、送達、もしくは使用するための適する試薬と共に、キット内に提供され得るが、使用説明書も含み得る。
この本発明の概要は、必ずしも本発明のすべての特徴を記載しているわけではない。
本発明のこのようなおよびその他の特徴は、添付の図面を参照する下記の説明からより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】患者サンプルのワークフローを示すフロー図である。
【図２】配列分析のワークフローを示すフロー図である。
【図３】サブシークエンス組成および場所の関数としての、コードワード性能を示すマトリックスの図である。
【図４】コードワード性能において、強い影響を有するパラメーターを決定するアルゴリズムを示す図である。
【図５】ＮＧＳシークエンシング反応を行うためのＤＮＡテンプレートおよびプライマーの概略図である。
【図６】代表的なシークエンシング反応の最初から４回のＰＣＲサイクルにおいて認められた増幅された配列およびコードワードを示す概略図である。この図は、最初から３回のＰＣＲサイクルに組み込まれるすべてのコードワードを示す。ただし、４回目のＰＣＲサイクルでは、増幅された配列に由来するコードワードのみを示す。
【図７】増幅期間中にコードワードが付加される機構を示す概略図である。
【図８】ｉ〜Ｕ（１）の第４ＰＣＲサイクルにおけるコードワードエントロピー分布を示す箱ひげ図である。
【図９】ｉ〜Ｕ（１）およびｉ〜Ｕ（３）の第４ＰＣＲサイクルにおけるコードワードエントロピー分布の比較を示す箱ひげ図であり、ｘ軸の表示は、各分布を生成するのに使用したパラメーターに対応する（例えば、ｕ１_ｍ１は、ｉ〜Ｕ（１）およびｍ＝１に対応する）。
【図１０】コードワード多重度における変動のポアソン分布モデルを示すグラフの図であり、実線曲線は、（数１）および（数２）のときの、ランダムに生成したポアソン分布ｉ〜Ｐ（λ＝６）に対応し、また破線曲線は、数値が１だけシフトした同一の分布を有する（この場合、（数３）および（数４）である）。
【図１１】λ＝１、３、６、およびｍ＝１．．１０である、ｉ〜Ｕ（１）およびｉ〜Ｐ（λ）の第４ＰＣＲサイクルにおけるコードワードエントロピー分布の比較を示すグラフの図である。
【図１２】λ＝１、３、６、およびｍ＝３００、１０００、２０００、３０００である、ｉ〜Ｕ（１）およびｉ〜Ｐ（λ）の第４ＰＣＲサイクルにおけるコードワードエントロピー分布の比較を示すグラフの図である。
【図１３】ｉ〜Ｕ（１）のときに（数５）であり、およびｉ〜Ｐ（λ）のときに（数６）である、第４ＰＣＲサイクルにおける各コードワードｗjの発生確率を示すグラフの図である。
【図１４】コードワード多重度における変動の負の二項分布を示すグラフの図であり、実線曲線は、（数７）および（数８）である、ランダムに生成した負の二項式分布ｉ〜ＮＢ（ｒ＝６、ｐ＝０．５）に対応し、また破線曲線は、数値が１だけシフトした同一の分布を示す。この場合、（数９）および（数１０）である。
【図１５】ｉ〜Ｕ（１）およびｉ〜ＮＢ（ｒ、ｐ）のときに、ｍ＝３０００である第４ＰＣＲサイクルにおけるコードワードエントロピー分布の比較を示すグラフの図であり、ｘ軸の表示は各分布を生成するのに使用したパラメーターに対応する（例えば、ｎｂｉｎｏｍｉａｌ１＿ｐ．１は、シフト後の分布ｉ〜ＮＢ（ｒ、ｐ＝０．１）＋１、ただしμ＝１に対応する。すなわち（数１１）である。
【図１６】平均エントロピーと図１５に由来する負の二項分布の分散の間の関連性を示すグラフの図である。
【図１７Ａ】ｉ〜ＮＢ（ｒ、ｐ）およびｍ＝１のときの、コードワードエントロピー分布を示すグラフの図である。
【図１７Ｂ】ｉ〜ＮＢ（ｒ、ｐ）およびｍ＝５のときの、コードワードエントロピー分布を示すグラフの図である。
【図１７Ｃ】ｉ〜ＮＢ（ｒ、ｐ）およびｍ＝１０のときのコードワードエントロピー分布を示すグラフの図である。
【図１８Ａ】図１７Ａに示すエントロピー分布の平均に対する、負の二項多重度分布の分散の相関を示すグラフの図である。
【図１８Ｂ】図１７Ｂに示すエントロピー分布の平均に対する、負の二項式多重度分布の分散の相関を示すグラフの図である。
【図１８Ｃ】図１７Ｃに示すエントロピー分布の平均に対する、負の二項多重度分布の分散の相関を示すグラフの図である。
【図１９】ｉ〜Ｕ（１）および外れ値を含むｉ〜Ｕ（１）について、第４ＰＣＲサイクルにおけるコードワードエントロピー分布の比較を示すグラフの図である。外れ値の数は２〜７０の範囲であり、５〜７の間で変化するランダムな多重度を有する。いずれの場合においても、テンプレート分子の開始数はｍ＝５であり、またプール内の固有のコードワードの合計数は、１４＊ｍ＝７０である。
【図２０】２、３、および４ＰＣＲサイクル、およびテンプレート分子の開始数ｍが異なる場合のコードワードエントロピー分布を示すグラフの図である。
【図２１Ａ】増幅生成物のエントロピーが、対応する濃度の開始テンプレート分子において予想されるエントロピー分布内にある場合について示すグラフの図である。
【図２１Ｂ】増幅生成物のエントロピーが低めの数値を有し、ＰＣＲプロセスにおけるアーチファクトが示唆される場合について示すグラフである。
【図２２】増幅生成物の品質を評価するためのコードワードエントロピーの使用について示す概略図である。
【図２３Ａ】コードワード、ｍ＝５０００を用いた場合、用いない場合のアンプリコン性能を示すグラフの図である。
【図２３Ｂ】コードワード、ｍ＝１００００を用いた場合、用いない場合のアンプリコン性能を示すグラフの図である。
【図２４Ａ】８−ｍｅｒの開始テンプレートの数の関数としてエントロピーを示すグラフの図であり、エントロピーは、位置１３６６３３３３８に第５染色体内の所定の対立遺伝子を含むすべての読み取りに基づき計算される。
【図２４Ｂ】１０−ｍｅｒの開始テンプレートの数の関数としてエントロピーを示すグラフの図であり、エントロピーは、位置１３６６３３３３８に第５染色体内の所定の対立遺伝子を含むすべての読み取りに基づき計算される。
【図２５】いくつかの開始テンプレートについて、コードワードエントロピーの分布を示すグラフの図であり、エントロピーは、同一のアンプリコンに属する読み取りに由来するすべてのコードワードに基づき計算された。
【図２６】テンプレートの開始数の関数として、マイナーなＳＮＰ対立遺伝子に関するコードワードエントロピーを示すグラフの図である。
【図２７】テンプレートの開始数の関数として、アーチファクト対立遺伝子のコードワードエントロピーを示すグラフの図である。
【図２８】アーチファクトの変異体および真正突然変異のエントロピーを示すグラフの図であり、すべての真正突然変異の訓練および試験データ、ならびに％ＶＡＦを凡例に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図面の簡単な説明の欄に記載した（数１）から（数１１）は以下の通りである。
【数１】
2018536430.tif 000003
【数２】
2018536430.tif 000004
【数３】
2018536430.tif 000005
【数４】
2018536430.tif 000006
【数５】
2018536430.tif 000007
【数６】
2018536430.tif 000008
【数７】
2018536430.tif 000009
【数８】
2018536430.tif 000010
【数９】
2018536430.tif 000011
【数１０】
2018536430.tif 000012
【数１１】
2018536430.tif 000013
【００１３】
本開示は、バランスのとれた性能コードワードプールの関連する配列パラメーターを決定し、そしてより大きなバランスのとれたプールを初めから設計するために、測定後のパラメーターを利用する方法を一部提供する。
核酸コードワード（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ等）の分子計測プールは、開始時のテンプレートの数、品質の見積り、およびＰＣＲ／シークエンシング／ＤＮＡ合成エラーの検出／回避を提供するのに有用であり得る。ランダムに導入された核酸コードワードの計測は、例えば、テンプレート数およびエラー制御法を決定するためのエントロピーの指標、および関連する情報の理論的指標を使用して分析され得る。
【００１４】
１つの態様では、本開示は、標的配列またはテンプレート、例えば核酸テンプレート等に対してランダムに連結させるための適するコードワードプールを設計および選択するための方法を提供する。「核酸テンプレート」または「標的配列」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子、または相補的分子を意味する。核酸テンプレートまたは標的配列は、非限定的に、臨床試料、生物学的研究試料、もしくは法医学試料を含む試料から単離され得る、または人工的な配列、例えば合成もしくは組換え配列等であり得る。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートまたは標的配列は、非限定的に、臨床的または生物学的に興味深い配列、例えば患者固形腫瘍もしくは循環性細胞を含まないＤＮＡ試料内の体細胞突然変異ホットスポット等、または法医学的に興味深い配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートまたは標的配列は、非限定的に、突然変異を含有する配列（「真正な配列変異体」）を含む。真正な配列変異体は、低頻度の真正突然変異、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％未満の変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ；ｖａｒｉａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を有する突然変異等を含み得る。いくつかの実施形態では、低頻度の真正突然変異は、５％未満のＶＡＦを有し得る。
【００１５】
「相補的」とは、ワトソン−クリック塩基対を形成して２つの核酸の間で二本鎖領域を生成する能力を有するヌクレオチドを十分な数含む２つの核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。したがって、ＤＮＡまたはＲＮＡの一方のストランド内のアデニンは、反対側の相補的ＤＮＡストランド内のチミン、または反対側の相補的ＲＮＡストランドのウラシルと対をなす。核酸分子内の各ヌクレオチドは、二本鎖を形成するのに、反対側の相補的ストランド内のヌクレオチドと一致したワトソン−クリック塩基対を形成する必要ないと理解される。核酸テンプレートまたは標的配列は、任意の長さまたはヌクレオチド組成を有し得る、例えば天然もしくは非天然のヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体もしくは誘導体を含む、２つまたはそれ超の共有結合したヌクレオチドからなる任意の鎖等であり得る。
【００１６】
ランダムに生成させたコードワードのプールは、エントロピーを推定するのに十分であり得るが、コードワードのランダムに生成させたセットは、ＰＣＲシークエンシング反応において十分な性能を発揮しない核酸配列を含む可能性があり、したがってテンプレート分子を計測するのに使用される情報内容の減少または偏りを生じさせるおそれがある。したがって、いくつかの実施形態では、増幅された開始時のテンプレート間のエントロピーの相違を測定することが、最適な性能を得るのに有益であり得る。
１つの態様では、本開示は、コードワードのバランスのとれたプールを取得する方法を提供する。
「コードワード」とは、一義的に決定され得る配列を有する直鎖状ポリマー性分子、例えば、非限定的に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または増幅能力を有するその他の高分子等を意味する。一方、本明細書で例示する方法は、ＤＮＡ分子について参照するが、該方法は、増幅能力を有するその他の分子に一般的に適用されるものと理解される。
コードワードは、長さ「ｋ」であり得る。長さｋは、任意の規定の長さ、例えば少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１単位（例えば、ヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基）等であり得る、またはそれより長い場合もあるが、大幅に長い長さになると、コストアップとなり、効率も損なわれるおそれもある。いくつかの実施形態では、長さｋは１０であり得る。
【００１７】
コードワードの「バランスのとれたプール」とは、コードワードの偏った増幅または組込みを回避するために、バランスのとれた熱力学的設計を可能にする、および／またはコードワードの同一性の判定において、シークエンシングエラーが許容されるように、十分に異なるコードワードのプールを意味する。コードワードの好適なバランスのとれたプールは、｜Ｗ｜≒ｍ＊（２C−２）コードワード（ｍはテンプレートの開始数であり、またｃはＰＣＲサイクル数である）のオーダーであり得、例えば、本明細書に記載するようなエントロピーの見積りを可能にする。一般的に、および特定の理論のいずれにも拘束されずに、コードワードのバランスのとれたプールは、平準性能を提供し、また増幅性能が類似したケースでも区別することができる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、規定の長さｋを有する複数のコードワードの開始サンプルが提供される。コードワードの開始サンプルは、配列またはそのサブセットのすべての組合せ、例えば、１０を超える、または１００を超える異なるコードワードを代表し得るが、プールのサイズは、考え得る組合せを制限するものと理解される。いくつかの実施形態では、コードワードの開始サンプルは、試験されるプールのサイズと同一のサイズを有し得る。長さｋのコードワード配列の組合せは、コードワード配列内で一連のＮ（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵ）を組み入れることにより規定されるランダムな塩基の組み込み、もしくはオリゴヌクレオチド合成装置に提供される、長さｋのすべてのコードワードサブシークエンスのコンビナトリアル的明示規定等により、またはその組合せにより、任意の適する技術を使用して生成可能である。そのような技術は、当業者によく知られている。いくつかの実施形態では、例えば、チオまたはその他の塩基修飾を組み込んだ修飾塩基が利用可能である。特定の理論のいずれにも拘束されずに、修飾塩基は、コードワードの熱力学的プロパティーを変化させ得る、または物理的方法、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン捕捉用のビオチン部分を組み込むことにより、コードワードを検索する方法を提供し得る。
【００１９】
コードワード性能に関連する配列特性パラメーター
いくつかの実施形態では、下記のコンビナトリアルおよび／または熱力学的な制約のうちの１つまたは複数が、コードワードに適用され得る。
本明細書に記載する方法では、Ｗは、長さｋのヌクレオチド塩基の直鎖状配列として定義されるコードワードｗのセットである。すなわちＷ＝
｛ｗ＝ｗ1ｗ2．．．ｗk｜ｗi∈｛Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ｝∀ｉ∈１．．、ｋ｝である。
【００２０】
物理的実体においては、各バーコードＤＮＡ配列またはコードワードは、配列をエンコードする複数の同一の分子を含み得る。オリゴヌクレオチドの物理的プール内に存在する多重集合のコードワード分子は、したがってＭ＝｛ｗ：ｉ｜ｗ∈Ｗおよびｉ＝１、２、．．｝として定義可能であり、式中、ｗはルート要素であり、またｉ＝ｉ（ｗ）はｗの多重度である。すなわち、ｗの多重度は、多重集合Ｍ内に認められるｗの事例数である。ルート集合（固有のコードワード）の濃度は、｜Ｗ｜＝ｐであり、多重集合Ｍの濃度はΣw∈Wｉ（ｗ）である。
高品質プールＭの設計は、コンビナトリアルおよび熱力学的な制約を導入することによりモデル化され得る。高品質コードワードは、増幅されるＤＮＡテンプレート配列の数を減少させない。下記のコンビナトリアル制約のうちの１つまたは複数を、ルート要素ｗに対して課すことができるが、ただしＨは、長さｗiおよびｗjが同一の２つのコードワードの完全なアライメント内のミスマッチ数として定義される、コードワードの対（ｗi，ｗj）のハミング距離である。
Ｃ１：コードワードミスマッチ（ＨＤ＿ｗ）。ｗi，ｗj∈Ｗのときに、Ｈ（ｗi，ｗj）≧ｄｗである。プール内の考え得るすべてのコードワードの対の間で、多数のミスマッチを強制する。
Ｃ２：コードワードゲノムミスマッチ（ＨＤ＿ｇ）。ｗi∈Ｗかつｋ−ｍｅｒ  ｗgである、Ｈ（ｗi，ｗg）≧ｄｇが、ヒトゲノムに見出される。コードワードが、ＰＣＲプロセス期間中に、ヒトｋ−ｍｅｒと相互作用するのを回避するために、各コードワードおよび全ヒトｋ−ｍｅｒ間のｄg個のミスマッチが、モデルに導入される。
【００２１】
Ｃ３：タグ化プライマーゲノムミスマッチ（ＨＤ＿ｇｐ）。プライマーｐと結びついたｗipとして定義される、ｗipの全ｋ−ｍｅｒサブシークエンスｗsは、ｗip∈ＷのときにＨ（ｗs，ｗip）≧ｄpを有さなければならない。この制約は、コンテナープライマー配列を有するコードワードの境界が、ゲノム内で偶発的なホモロジーを生成させないことを確実にする。
Ｃ４：タグ化プライマーの対のミスマッチ（ＨＤ＿ｐｐ）。Ｈ（ｗip(i)，ｗjp(j)）≧ｄpp∀ｗip(i)，ｗjp(j)コードワードタグ化プライマー。この制約は、コードワードタグ化プライマーが、互いに相互作用しないことを確実にする。
Ｃ５．ＧＣ含有量。ｗj∈Ｗのそれぞれは、ＧＣ含有量ｃを、４５≦ｃ≦６０であるように有する。コードワードの安定性および一様性は、同一のコードワード内の特異的塩基ＧおよびＣを計測することによりモデル化され得る。
下記の熱力学的な制約のうちの１つまたは複数も、望ましくない相互作用を防止するために課すことができる。
【００２２】
Ｔ１．ヘアピン融解温度。プライマーＷipと結びついたコードワードそれぞれについて、配列ｗipを含み形成し得る可能性のある、考え得るすべてのヘアピンに由来する最高融解温度は、ｔｅｍｐ＿ｈａｉｒｐｉｎよりも低くなければならない。ヘアピンが形成されると、ＰＣＲ期間中にバーコードタグ化プライマーがＤＮＡテンプレートにアニーリングするのが阻止される。
Ｔ２．セルフダイマー自由エネルギー。プライマーｗipと結びついた各コードワードの二次構造の自由エネルギーΔＧ（ｗip）は、閾値ΔＧdimerより大きくなければならない。ｗipの二次構造は、バーコードタグ化プライマーがＤＮＡテンプレートにアニーリングするのを阻止するが、この制約はその形成を禁止する。
Ｔ３．ヘテロ二量体自由エネルギー。２つのバーコードタグ化プライマーｗip(i)およびｗjp(j)の相互作用により形成されるヘテロ二量体の自由エネルギーΔＧ（ｗip(i)，ｗjp(j)）は、すべてのｗip(i)およびｗjp(j)について、閾値ΔＧheterodimerより大きくなければならない。バーコードタグ化プライマーの対の間で二次構造が形成されると、ＤＮＡテンプレートとのアニーリングが阻止されるが、この制約はその形成を禁止する。
【００２３】
規定のコードワード長さに関して、ルート集合Ｗのサイズは、制約数と共に減少する。しかし、必要とされる固有のコードワードの数は、ＰＣＲサイクル数と共に、およびＤＮＡ標的テンプレートの質量と共に増加する。例えば、反応内のテンプレート分子の絶対数は、約３．４ｐｇ（すなわち、３×１０-12ｇ）であるハプロイドヒトゲノムの質量を使用して推定可能である。代表的な標的を定めたＰＣＲシークエンシング反応は、１ｎｇ〜１０ｎｇのテンプレート分子質量、すなわちハプロイド標的遺伝子座１個当たり約３００〜約３０００コピー、または二倍体遺伝子座１個当たり、その数の２倍、すなわち、約６００〜約６０００コピーを使用する。しかし、本明細書に記載する方法は、単一のテンプレート分子まで減少したエントロピーの決定を可能にする。４回のＰＣＲサイクルでは、これまでに開示した設計上の制約Ｃ１〜Ｃ５およびＴ１〜Ｔ３を組み込む場合、３００＊１４〜３０００＊１４のコードワードが、１つの標的遺伝子座の各末端に必要とされる。しかし、プールは、各標的遺伝子座および各末端が、異なるセットのコードワードを有するように設計される。すなわち、ＭL1R∩ＭL1F∩．．．∩ＭLnR∩ＭLnF＝φ、式中ＬｉRおよびＬｉFは、リバースおよびフォアワードエンドに対応する標的遺伝子座Ｌｉである。したがって、ｘ標的遺伝子座を用いた実験では、必要とされる異なるコードワードの数は、３００＊１４＊２＊ｃ＝８，４００＊ｃ〜３０００＊１４＊２＊ｃ＝８４，０００＊ｃである。
【００２４】
したがって、大型で多様なセットのコードワードが有用である。より長いおよびより短いコードワード長さが、Ｃ１〜５およびＴ１〜３に示すような所望の制約に応じて利用可能である。ただし、コードワードに課される制約は、望ましくない相互作用を回避し、また同時に固有のコードワードの数が、４回またはそれ超のＰＣＲサイクルにおいて、高いコードワードエントロピーを取得するのに十分大きいことを保証するのに必要とされる最低限度であるべきである。
コードワードのサブサンプルを対象とするコードワード性能パラメーターの測定
いくつかの実施形態では、増幅効率により強い影響を有するコードワードプロパティー（例えば、Ｃ１〜５および／またはＴ１〜３のうちの１つまたは複数）を決定するために、網羅的な方法が、長さが固定されたコードワードのすべてを物理的に試験し、また様々な用途で最適なＰＣＲ増幅を生成するコードワードを選択するのに利用可能である。
【００２５】
代替的実施形態では、例えば、塩基４〜２１個、例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個等の長さのコードワードの場合、特性選択スペースを低減する方法が利用可能である。特性選択用のＬａｓｓｏ（最小絶対選択およびシュリンケージオペレーター）法が、類似したコードワード性能を生成する特性を決定するのに使用される。この方法は、回帰式により判明した重みがＬ１ノルム（
【数１２】
2018536430.tif 000014
）にペナルティーを課すことにより線形モデルを当てはめる。係数は、
【００２６】
【数１３】
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として見積もられ、式中、ｙjは、応答変数またはコードワード性能であり、Ｘjは説明変数または特性であり、およびλは各コードワードプロパティーβjに割り振られた重みである。チューニングパラメーターλは、ペナルティーの強度を制御する。すなわち、
【数１４】
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は、λ＝０および
【数１５】
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であり、λ→∞のときの直線回帰の推定である。交差検証は、最良の数値λを選択するのに利用可能である。
任意のその他の特性選択法、またはＡｄａＢｏｏｓｔ等の分類法が、増幅効率により大きな影響を有するコードワードプロパティーを決定するのに利用可能であるものと理解される。
【００２７】
１つの例では、規定の長さｋを有する、考え得るすべての配列の組合せ、またはそのサブセットを代表するコードワードの開始サンプルが生成される。いくつかの実施形態では、コードワードの開始サンプルは、少なくとも１０個の異なるコードワードを含む。代替的実施形態では、コードワードの開始サンプルは、１００個を超える異なるコードワードを含む。いくつかの実施形態では、長さがｋのコードワードのフルセットが測定される場合、これは、長さがｋ＋１、ｋ＋２等のコードワードのサブセットとみなすことができる。いくつかの実施形態では、ｋが１０の場合、コードワードの考え得る全配列の組合せが生成され得る。一般的に、コードワードの開始サンプルは、コードワードの代表的なセットを取得するために、長さｋに比例すべきである。
【００２８】
コードワードの開始サンプル内に存在する異なるコードワードのそれぞれは、単一の標的配列プライマーまたはプライマーの対の５’末端に連結して、コードワード−プライマー分子を形成し得る。「プライマーの対」とは、２つの最適に設計されたオリゴヌクレオチド配列（「第１のプライマー」および「第２のプライマー」）、例えばポリメラーゼ連鎖反応を惹起するように機能し得るフォアワードおよびリバースプライマー等を意味し、第１のプライマーおよび第２のプライマーは、標的配列のいずれか一方のストランド上の相補的配列にアニールする。プライマーの対内のプライマーは、任意の適する長さ、例えば少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、またはそれより長いヌクレオチド塩基等であり得るが、ただし長さが大幅に長くなると、コストアップとなり、合成上のエラーが増加し、効率も損なわれるおそれもある。いくつかの実施形態では、プライマーの対内のプライマーは、１５個のヌクレオチド塩基であり得る。いくつかの実施形態では、同一のコードワードは、プライマーの対内の第１のプライマーおよび第２のプライマーと連結可能である。代替的な実施形態では、異なるコードワードが、プライマーの対内の第１のプライマーおよび第２のプライマーと連結可能である。いくつかの実施形態では、コードワードは、プライマーの対の一方のプライマーのみと連結可能である。代替的な実施形態では、コードワードは、プライマーの対の両方のプライマーと連結可能である。
【００２９】
コードワードは、任意の適する技術、例えばオリゴヌクレオチド合成またはライゲーションまたはその他の適する方法等を使用してプライマーと連結可能である。例えば、長さがｋの考え得るすべてのコードワードの開始サンプルは、単一の標的配列プライマー（例えば、本明細書に記載するＣＧ００１ｖ２パネル配列に開示されるような遺伝子座プライマーの対等、表１５を参照）の５’末端において合成される。いくつかの実施形態では、アダプター配列が、ＰＣＲ生成物のライブラリー構築のために、例えば、図５で、および本明細書に記載するＣＧ００１ｖ２アッセイで概説するように、合成の一部としてコードワードの５’に付加可能である。アダプター配列は、ＮＧＳプラットフォーム上でシークエンシング化学反応を可能にするように特に設計された核酸配列、例えばＤＮＡ配列等であり得るが、その場合、シークエンシングライブラリー分子は、ガラスフローセル表面またはビーズに繋留され、そして分子のいずれか一方の端部から行われるヌクレオチド塩基同定の連続的なサイクルの対象とされる。アダプター配列は、当技術分野において公知であり、また多くのそのような配列が市販されている。
【００３０】
標的配列は、標的配列プライマーの対のそれぞれの配列に対して相補的な配列を含め、任意の適する増幅反応によって、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはコードワード配列を含む増幅反応生成物を提供するために連続して適用される、核酸の鎖を増幅可能な任意のポリメラーゼ、例えば非限定的にＴ４ポリメラーゼ、φ２９ポリメラーゼ、または逆転写酵素（ＲＮＡの場合）等を使用する任意の適する線形増幅技術によって、コードワード−プライマー分子の対を使用しながら増幅可能である。
増幅反応生成物の配列は、非限定的に、ガラスフローセル上での逐次合成シークエンシング、ビーズ上でのパイロシークエンシング、または光学的シグナルもしくはイオンｐＨ変化として得られるヌクレオチド塩基読み取りと連動するプロトン半導体技術を利用した次世代ＤＮＡシークエンシングケミストリーを含む、任意の適する技術を駆使して取得され得る。採用される追加の技術として、ナノウェルおよびナノポアを利用する真正な単一分子リアルタイムシークエンシングが挙げられる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、コードワードの増幅性能は、以下のように決定することができる。ＰＣＲ標的反応は、例えば、本明細書に記載のＣＧ００１ｖ２アッセイについて記載するプロセスを使用して実施され得るが、ただし反応は、コードワードの存在量の増加率を決定するために、事前に決定された増幅サイクル数（規定のサイクル数）の後に中止され得る。したがって、コードワード−標的ＰＣＲ反応のサンプルは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５サイクル、またはそれ超のサイクルにおいて、またはこれらサイクルのサブセットの任意の組合せ（中間のサイクル数）において取得され得る。いくつかの実施形態では、追加の増幅サイクルが、ネスト化されたＰＣＲ技術を使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、制限ｃ*は、ＰＣＲ反応のサイクル数により決定され得るが、ｃ*サイクルに必要とされるコードワードの予想される数は、最大でコードワードプールのサイズであるべきである。
【００３２】
各サイクルの終了時、規定のサイクル数の終了時、または中間のサイクル数におけるＰＣＲ反応は、次に任意の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）デバイス上、もしくは、例えばＣＧ００１ｖ２アッセイで記載されるような、核酸テンプレート配列のデジタルカウントを提供することができる任意のデバイス上で、または当業者公知のよく知られた任意のＰＣＲ−ＮＧＳシークエンシング法によって、指標化および配列決定され得る。
各サイクルの終了時に、増幅反応生成物中に存在するコードワードの存在量は、例えば、ＣＧ００１ｖ２アッセイに概説するのと同様に、次に例えば、ＤＮＡ配列アラインメントおよびコードワード事例の計測により決定され得る（図２）。コードワードは、異なる戦略を使用して抽出され得る。例えば、アンプリコンシークエンシングデータに対してプライマーのセットをマッチングさせること、およびプライマーと５’末端との間に生ずるｋ−ｍｅｒをトリミングすることによる。このユーティリティーは、プライマー配列をマッチングさせる際に、ハミング距離閾値の設定を支援する。高品質データを取得するために、一致した読み取りの両方が、検討されるフィルターを通過しなければならない。さらに、低品質の読み取り、例えばプライマー−二量体等は、追加のメトリック、例えば一致した読み取りのペアワイズ配列アラインメントの相補的塩基の数として計算される編集距離等を使用することによりフィルター除去され得る。アンプリコン内の全読み取りのモード編集距離に対して設定された閾値よりも大きい編集距離を有する読み取りに由来するコードワードが、フィルター除去され得る。これは、４〜３５のＰＣＲサイクルのそれぞれに現れる、長さｋのコードワードの数を明らかにする。
【００３３】
コードワード配列の性能は、次に、（ｉ）この方法を１回または複数回、反復したときの実際のコードワード存在量と予想されるコードワード存在量との間の関連性、および／または（ｉｉ）ＰＣＲサイクルを増加させたときの存在量の増加率により計算され得る。異なるアプローチとして、（ｉｉｉ）コードワード頻度の実際の分布を分析することを挙げることができる。
（ｉ）に関して、予想エントロピー分布が正規分布に従う、という仮説の下で、予想エントロピー分布のパラメーターを使用して、実測エントロピーのｚスコア値が算出可能であれば、予想エントロピー分布に基づき、実測エントロピーの確率が得られる。実測エントロピーを予想エントロピー分布と比較する、当業者によく知られていると予想されるその他の統計的アプローチが利用可能である。
【００３４】
（ｉｉ）のコードワード増幅係数は、直接的に、または線形モデリングにより計算され得るが、その場合、例えば、所定のワードＹwの存在量は、関数β０＋β１＊Ｘとしてモデル化され、式中、ＸはＰＣＲサイクル数、およびβ１の推定値は増幅の係数である。β0の値は、コードワードｗが最初に認められるサイクルと関連する。ＰＣＲにおける配列増幅は指数関数的であるが、コードワード増幅は直線的である（図６および表１）。
【表１】
2018536430.tif 000018
したがって、完全なＰＣＲ反応では、コードワードは１ＰＣＲサイクル当たり１だけ増加するものと期待されるので、Ｙw＝β0＋Ｘである。
【００３５】
（ｉｉｉ）の場合、増幅性能が不良なコードワード、または選好的に増幅されるコードワードを識別するのに、実際のコードワード頻度分布が利用可能である。実測頻度値は、［ａ、ｂ］の範囲内にあるべきであり、その場合コードワード増幅は直線的であり、またより多くのコードワードがＰＣＲ反応の後期サイクルにおいて導入されるので、ａ≦ｉ≦ｊ≦ｂのとき、頻度ｉのコードワードの数は、頻度ｊのコードワードの数に等しいかそれ以上と予想される。過剰増幅の例として、ａ＜ｋ＜ｂのとき、［ｋ，ｂ−１］の範囲内の頻度を有するコードワードが存在しないが、残りの実測頻度よりもかなり高い頻度ｂで、コードワードが認められる場合が挙げられる。すなわち、ｋ≪ｂである。このアプローチでは、数１０億もの増幅された読み取りの一部のみがアッセイにおいて配列決定されるので、所定のコードワードを含む読み取りの全母集団のうちの小さいサンプルのみが観察可能である。
【００３６】
性能指標を精緻化するための反復手順
上記例において、好ましいおよび好ましくないコードワードプロパティーが、規定の長さのコードワードについて決定される。いくつかの実施形態では、より短いまたはより長い長さ（例えば、１、２、３、４、またはそれ超の連続したコードワード長さ）のコードワードが、性能の追加指標を提供するために生成され得るが、また増幅および分析ステップが、異なる長さのコードワードを使用して反復され得る。図４は、ＰＣＲ増幅においてより強い影響を有する熱力学的パラメーターおよび配列パラメーターを調査する反復手順を示す。
いくつかの実施形態では、増幅および分析ステップは、単一の標的遺伝子座上で実施され得る。代替的実施形態では、個々の標的遺伝子座配列と連結したコードワード−プライマー分子の性能から、標的遺伝子座特異的配列の独立性を評価するために、増幅および分析ステップが、２つまたはそれ超の遺伝子座上で実施され得る。
いくつかの実施形態では、全プロセス（コードワードの生成、増幅、および分析）が、コードワード長さおよび／または標的遺伝子座毎に１回、実施され得る。代替的実施形態では、全プロセス（コードワードの生成、増幅、および分析）が、コードワード長さおよび／または標的遺伝子座毎に２回またはそれ超の回数、反復され得る。いくつかの実施形態では、反復測定間の分散が決定される場合があり、そして分散が１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％等の所望の数値未満の場合、反復測定は中止される。当業者は、任意の特定の数値周辺で測定が安定化しているポイントを容易に認識し、そのポイント後にさらなる反復を中止するものと理解される。
【００３７】
配列組成の関数としてのコードワード性能の測定
規定の標的遺伝子座において、規定の長さのコードワードの性能測定が済んだら、性能と関連した配列パラメーターが、以下のように決定され得る。
いくつかの実施形態では、コードワード性能は、サブシークエンス組成および場所の関数として分類され得る。好ましいおよび好ましくないサブシークエンス組成および場所に関係する情報が、良好なＰＣＲ増幅を示す可能性がより高いと考えられる、より長いコードワードを設計するのに利用可能である。
いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅に影響を及ぼすコードワード内のサブシークエンスは、以下のように検出可能である。
【００３８】
Ｗkを長さｋのコードワードのセットとする。すなわち、Ｗk＝｛ｗ＝ｗ1ｗ2．．．ｗk｜ｗｉ∈｛Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ｝∀ｉ∈１．．，ｋ｝であり、Ｗkのサイズは｜Ｗk｜＝４kである。各コードワードまたはコードワードのサブセットｗj∈Ｗkの性能ｙjは、ＰＣＲ反応内で測定される。次に、サブシークエンスの組成を列、およびサブシークエンスの場所を行として行列が生成される。行列の要素は、特定のサブシークエンスの組成および場所を有するコードワードのメジアン性能である。例えば、図３に示す行列Ｙでは、第１の行は、サブシークエンスＡＡを有するコードワードに対応し、また第１の列はコードワードの第１および第２の位置に見出されるホモポリマーに対応する。したがってｙ11は、すべてのコードワードｗ＝ＡＡｗ3．．ｗkのメジアン増幅であり、ただしｗi∈｛Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ｝ｉ＝３．．ｋである。
【００３９】
行列内のサブシークエンスは、固定された長さを有し、したがって考え得るサブシークエンスの長さｌ＝２．．．ｋ−１のそれぞれについて１つの行列が生成される。ただし、すべての行列が同じ量の情報を提供するわけではない。例えば、所定の長さのサブシークエンスの数は、サブシークエンスの長さと共に減少し、したがってサブシークエンスが長いほど、提供される情報は少ない。さらに、長いコードワードの場合、長さ２のサブシークエンスは、ＰＣＲ増幅に影響を与えないと考えられる。適するサブシークエンスの長さは、したがってコードワード長さの２５％、すなわちｌ＝０．２５＊ｋに最も近い整数である。
ｋが固定の場合、不良および優良な性能を有するサブシークエンスを推測するために、行列Ｙからヒートマップが生成され得る。さらに、Ｙの要素も、類似した増幅性能を生み出すサブシークエンスの組成および場所を識別するためにクラスター化され得る。
【００４０】
この方法は、本明細書に記載するがんホットスポットマルチプレックスＰＣＲアッセイにおいて、標的アンプリコンの１つのフォアワードおよびリバースプライマーの両方に合成的に組み込まれたランダムな８−ｍｅｒを含む、市販されている正常女性ＤＮＡテンプレート上で、いくつかのサンプルの実験データを使用して例示される。シングルプレックスＰＣＲを行う際に、コードワードプライマーを、プライマー混合物の一部およびプライマー単独として、その両方で使用した。インプットＤＮＡは、ｍ＝５００、１０００、５０００、１００００、５００００、および１０００００個のハプロイドゲノムであるように異なった。別のマルチプレックスＰＣＲ反応を、１５および２５サイクル行った。すべての実験を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑプラットフォームを使用して実施した。表２は、いずれのサンプルにも認められるコードワードに由来する考え得るすべての２−ｍｅｒについて、そのソート後の頻度を示す。最も好ましい２−ｍｅｒは、「ＡＡ」である一方、最も好ましくない２−ｍｅｒは、ＧＣ含有量が高い２−ｍｅｒ、例えば「ＧＧ」または「ＣＧ」等である。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
最も影響力のある配列および熱力学的プロパティーを決定するために、Ｌａｓｓｏ法において配列と熱力学的プロパティーを組合せることができる。この方法は、本明細書に記載する、本発明者らのがんホットスポットマルチプレックスＰＣＲアッセイで用いられる標的遺伝子座のうちの１つのフォアワードおよびリバースプライマーの両方に合成的に組み込まれた８−ｍｅｒを含む、市販されている正常女性ＤＮＡテンプレート上で例示される。異なるＰＣＲサイクル（ｃ＝１５、１０、２５、および３０）、およびインプットの量（ｍ＝７，５７５、０、５００、１Ｋ、５Ｋ、１０Ｋ、１００Ｋ）を用いたいくつかの実験から得たデータを使用した。すべての実験を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑプラットフォームを使用して実施した。検討される配列プロパティーは、サブシークエンスの長さが３であるサブシークエンスの場所および組成である。ＧＣ含有量は、熱力学的プロパティーとして含まれる。３フォールド交差検証を、チューニングパラメーターλについて最適な数値を決定するのに用いた。このチューニングパラメーターを使用したＬａｓｓｏ法の結果を表３に列挙する。この表は、ＧＣ含有量は、コードワード性能に対して、３−ｍｅｒのサブシークエンスの場所および組成よりも大きな影響を有することを示唆する。
【００４３】
【表３】
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設計基準に基づき、適するコードワードについて配列スペースを探索するためのランダム反復式改善
ＤＮＡコードワードのより大きな最適性能プールを設計するために、測定後または計算後のパラメーターが、設計制約と共に利用可能である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、確率論的局所探索アルゴリズム（ＳＬＳ）が利用可能である。例えば、Tulpanらが記載するＳＬＳアルゴリズム(10)は、所定の制約に違反するサイズ固定のコードワードセットのスペース内で局所探索を実施する。制約は、本明細書に記載するように決定されるコードワードプロパティー、ならびにプール内のその他のコードワードとの相互作用と関係する制約、例えばコードワードミスマッチ等（Ｃ１）を含み得る。探索は、ＤＮＡ鎖のランダムに選択されたセットを用いて初期化される。次に、反復的に、コンフリクト、すなわち、制約に違反するコードワードの対が選択され、そして以下のように各コードワードの１つを修正することにより解決される。
【００４５】
インプットパラメーター
制約パラメーターＣのリスト、例えば：
ｎ  プールサイズ
ｋ  ワードの長さ
ｄw  プール内のワードの対間のハミング距離
ΔＧheterodimer  ヘテロ二量体形成に関する自由エネルギー閾値
ｃ  ＧＣ含有量
アルゴリズムのパラメーターは：
ｍａｘ＿ｔｒｉｅｓ  プールが初期化される最大回数
ｍａｘ＿ｓｔｅｐｓ  最大反復数
ｎｈｏｏｄ＿ｓｉｚｅ  近傍のサイズ
【００４６】
初期化
ワードＳの開始セットは、ＧＣ含有量の制約が満たされるようにランダムに選択される。［４０％、６０％］のＧＣ含有量が、増幅率が高いおよび低いコードワードを回避するのに利用可能である。アルゴリズムの性能を改善するために、ＧＣ含有量の制約を満たすコードワードのスペース上で探索を実施する。ＧＣ含有量がｃであり、４０％＜ｃ＜６０％であるときの長さｋのコードワードの合計数は、２k＊Σj=[k*0.40]..[k*0.6]Ｃ（ｋ，ｊ）であり、ただしＣは長さｋのコードワード内のｊ位置の組合せであることに留意されたい。しかし、開始セットは、ＧＣ含有量の制約を満たすコードワードのより小型のセットｎを一般的に含有する。セットサイズは、アルゴリズム全体を通じて一定のままであり、また各反復において、制約を満たすセット内のコードワード数が増加するように工夫される。
【００４７】
近傍
各反復において、制約に違反するワードの対ｗ1，ｗ2∈Ｓが、一様にランダム選択される。次にｗ1およびｗ2の近傍Ｍが構築される、すなわち、Ｍ＝Ｎ（ｗ1）ＵＮ（ｗ2）であり、ただしＮは、１−突然変異近傍およびランダムな近傍により構成されるハイブリッドランダム化近傍である。
所定のコードワードｗの１−突然変異近傍は、１つの塩基を修飾することにより、ｗから取得可能であるすべてのコードワードから構成される。長さがｋの、所定のコードワードｗ1およびｗ2の対では、ＧＣ含有量の制約を満たす１−突然変異近傍が、２＊ｋ存在する。
【００４８】
ランダムな近傍が、長さがｋおよびＧＣ含有量がｃである、固定された数のランダムコードワードを選択することにより構築される。生成されるランダムコードワードの数は、ｎｈｏｏｄ＿ｓｉｚｅ−２＊ｋであることに留意されたい。ランダムな近傍は、探索スペース内での局所極小回避に役立つ。
選択基準
近傍Ｍ＝Ｎ（ｗ1）ＵＮ（ｗ2）内のワードｗ’が、プール
【数１６】
2018536430.tif 000029
内の制約違反の数が最大限抑えられるように選択される。プールＳ＾は、プールＳにおいてｗ’∈Ｎ（ｗ1）のとき、ｗ1をｗ’に置き換えることにより、またはｗ’∈Ｎ（ｗ2）のとき、ｗ2をｗ’に置き換えることにより形成される。プールＳと
【数１７】
2018536430.tif 000030
は１ワード異なることに留意されたい。
【００４９】
中止基準
アルゴリズムの各反復において、プールＳは、１つのワードを置き換えることにより修正される。このプロセスは、最大ｍａｘ＿ｓｔｅｐｓ回実施される。ｍａｘ＿ｓｔｅｐｓの反復後でも解決しない場合、プールＳはランダムに初期化され、プロセスが繰り返される。プールＳは、最大ｍａｘ＿ｔｒｉｅｓ回、初期化される。プールＳ内のすべてのワードが制約を満たすとき、または最大ｍａｘ＿ｔｒｉｅｓ回、実施されるとき、ＳＬＳは中止する。
図４、ステップ（５）のアルゴリズムに関する擬似コードは以下の通り：
【００５０】
ＤＮＡコード設計のための確率論的局所探索手順
インプット：ワードの数（ｎ）、ワードの長さ（ｋ）、制約のセット（Ｃ）
アウトプット：Ｃを部分的または完全に満たすｍワードのセットＳ
ｉ：＝１からｍａｘ＿ｔｒｉｅｓまで実行
Ｓ：＝ワードの開始セット
Ｓbest＝Ｓ
ｊ：＝１からｍａｘ＿ｓｔｅｐｓまで実行
Ｓがすべての制約を満たす場合
リターンＳ
そうでなければ
制約の１つに違反するワードｗ1，ｗ2∈Ｓをランダムに選択する
Ｍ：＝Ｎ（ｗ1）ＵＮ（ｗ2）、すなわちｗ1およびｗ2の近傍に由来するすべてのワード
Ｓ内の制約違反数が最大限減少するように、Ｍからワードｗ’を選択する
ｗ’∈Ｎ（ｗ1）の場合
ｗ1をｗ’に置き換える
そうでなければ
ｗ2をｗ’に置き換える
ｅｎｄｉｆ
Ｓが、Ｓbestよりも多くの制約違反を有さなければ
Ｓbest：＝Ｓ；
ｅｎｄｉｆ
ｅｎｄｉｆ
ｅｎｄｆｏｒ
ｅｎｄｆｏｒ
リターンＳbest
ＤＮＡコード設計のための確率論的局所探索  終了
【００５１】
各反復において、見出された最良のプールＳbest、すなわち、違反した制約の数が最小のプールがストアされることに留意されたい。ＳＬＳは、Ｓbestを返す。また、アルゴリズムは、２つのｆｏｒ  ｌｏｏｐも有することにも留意されたい。外側のｆｏｒ  ｌｏｏｐでは、プールは初期化され、したがってコードの実施は、ｍａｘ＿ｔｒｉｅｓ回のＳＬＳの独立した実行と並存可能である。
本明細書に記載するＳＬＳの修正バージョン、または別の最適化法が、制約のリストを満たすプールを見つけるのに利用可能であると理解される。
コードワードエントロピーによるテンプレート多様性分析
いくつかの態様では、本開示は、品質管理、突然変異コーリング、およびＮＧＳシークエンシングに対するその他の用途において、テンプレート分子のプールに由来する増幅された配列内のコードワードエントロピーについて、その情報の理論的測定を使用する方法を提供する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、コードワードが連結される（例えば、標的プライマー配列、例えばＣＧ００１．ｖ２のプライマー配列に関する本明細書に記載する配列等と共にライゲーションされる、または合成される）。テンプレート分子とのライゲーションに起因する無効性および予測不可能性は、アーカイブ試料、例えば患者組織診断のルーチン法であるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプル等から取り出されたＤＮＡテンプレートにとって特に問題であるが、コードワードがプライマーに連結すれば、その問題を一般的に回避し得る。代替的実施形態では、コードワードは、標的分子と連結し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、テンプレート−コードワード連結型のテンプレートに適用され得る。
【００５３】
ペアエンドシークエンシングアプローチ（pair-end sequencing approach）がＮＧＳプロセスで使用されるので、２つの異なるプライマーが、ＮＧＳシークエンシング反応において、分子バーコード、およびプライマーをプライミングしている；図５を参照。いくつかの実施形態では、アダプターが、各末端に対して設計されたサンプルを識別するのに利用可能である。さらに、コーディング効率を高めるために、異なるバーコードが各標的プライマーに連結される（例えば、ライゲーションまたは合成される）。得られた修飾プライマーは、例えば、サンプルが追加のＤＮＡインデックスを通じてコード化される追加のＰＣＲ反応による、デマルチプレクシングステップにおける連結を目的とした共通アダプター配列をさらに含み得る。しかし、テンプレート多様性分析は、アダプターの使用を必要としない。
いくつかの実施形態では、単一のコードワードまたは分子バーコードが、プライマーの対内の２つのプライマーの一方と連結する。代替的実施形態では、同一のもしくは異なるコードワードまたは分子バーコードが、プライマーの対内で使用される。
【００５４】
代替的実施形態では、アダプター配列が連結した、または連結していないコードワードまたは分子バーコードが、コードワード−テンプレート分子を形成するために、核酸テンプレート分子、例えばＤＮＡテンプレート分子等に直接ライゲーションされ得るが、また後続するキメラテンプル−コードワード［−アダプター］分子が、共通プライマーを使用して増幅され得る。特定の理論のいずれにも拘束されずに、このアプローチは、全ゲノムから得られたＤＮＡ断片からなるプールのシークエンシングに有用であり得る、またはゲノムＤＮＡ断片の濃縮捕捉ハイブリダイゼーション（enrichment capture hybridization）から取得され得る。当業者は、この状況において、本明細書に開示するエントロピー法を適用することができる。
【００５５】
一般的に、コードワードエントロピーによるテンプレート多様性分析は、
・バランスのとれた、またはバランスが偏った性能のコードワードのプールを使用して、コードワードを増幅生成物またはテンプレートとランダムに連結すること；
・例えば、ＣＧ００１ｖ２として記載されるアッセイにおいて概説される方法を使用して、標的遺伝子座のＰＣＲ−ＮＧＳシークエンシングすること；
・コードワードのアライメントおよび存在量の計測を行うこと；および
・真の分散をアーチファクトから区別するための決定手順と連携して、実測エントロピーと予想エントロピーを比較すること、およびテンプレートプールサイズを見積もること
により実施され得る。
性能が理想化されたコードワードプールを用いた、ＰＣＲシークエンシング期間中のＤＮＡコードワード内の期待されるエントロピーの見積り
コードワードの異なる性能特性に基づく、エントロピーの予想される指標は、以下のように決定され得る。予想される指標は、実際の性能の決定、および突然変異コーリングに関する後続するステップで利用可能である。
いくつかの実施形態では、コードワードＭからなる高多様性プールのセットが生成され、そして例えば、合成またはライゲーションにより標的プライマーと連結される。代替的実施形態では、ＤＮＡコードワードは、例えばライゲーションにより、テンプレート分子と確率論的に連結する。いくつかの実施形態では、実際のコードワード多様性は、シャノンエントロピーを使用して決定され得る。しかし、任意のその他の適する多様性メトリック、例えばシンプソンインデックス等も利用可能であると理解される。
【００５６】
ＰＣＲ反応は、開始数がｍのテンプレート分子から開始し、同テンプレート分子は、コードワード注解付きプライマーのプールと相互作用する。サイクル数がｃのＰＣＲプロセスの増幅生成物に認められる、所定のコードワードセットの多様性（Ａc）は、Ｈ（Ａc）＝−Σwj∈WＰ（ｗj）ｌｏｇ2（ｗj）、ただしＰ（ｗj）＝０の場合、Ｐ（ｗj）ｌｏｇ2（ｗj）＝０、として定義されるシャノンエントロピーＨを使用して計算される。
所定のＰＣＲサイクルで認められるコードワードのエントロピーは、したがっていくつかの要因、例えばプールサイズ｜Ｍ｜、プールＭ内の各コードワードｗjの多様性ｉ（ｗj）、およびテンプレート分子の開始数ｍ等に依存する。
【００５７】
所定のＰＣＲサイクルのコードワードエントロピーは、以下のように推定可能である。第１に、増幅された配列の数、および各ＰＣＲサイクルで必要とされる固有のコードワードの最低数を見積もる。２つの異なるコードワードプールが、フォワードプライマーＭFについて１つ、およびリバースプライマーＭRについて異なる１つ生成される。したがって、増幅生成物と関連する２セットのコードワードが、所定のＰＣＲサイクルの終了時に認められる：フォワードプライマーについて１セット、およびリバースプライマーについて第２のセット。例えば、図６は、最初から４回のＰＣＲサイクルに関する増幅された配列、ならびに増幅された各配列と関連したフォアワードおよびリバースプライマーのコードワードを示す。表４は、完全なＰＣＲプロセスの各サイクルに見出されるコードワードのリスト、ならびに対応するエントロピーを含む。例えば、４番目のＰＣＲサイクルでは、２２個の増幅された配列、各末端に１４個の固有のコードワードが存在し、またコードワードエントロピーは３．６６である。
【表４】
2018536430.tif 000031
【００５８】
増幅される配列の数および固有のコードワードの数は、一般的に推測可能である。所定のＰＣＲサイクルにおいて出現し得る３タイプの配列が存在する：（１）オリジナルのＤＮＡテンプレート、（２）１つの端部に１つのコードワードを有する、オリジナルのテンプレートに由来するプライマー延長部、および（３）各端部に１つずつ２つのコードワードを有するプライマー延長生成物に由来するプライマー延長生成物。表５は、所定のＰＣＲサイクルで認められた各タイプの配列の数を含む。また、所定のＰＣＲサイクルｃのいずれかにおいて、各タイプについて認められる配列の数を取得するための一般式も含む。
【００５９】
【表５】
2018536430.tif 000032
【００６０】
１ＰＣＲサイクル当たりの固有のコードワードの数を取得するためには、オリジナルのＤＮＡテンプレートに由来する各プライマー延長生成物は、１つのコードワードｗ1を含むことに留意されたい。ただし、増幅される場合、生成物は、コードワードｗ1および他方の端部に新規のコードワードｗ2を含む。同様に、プライマー延長生成物に由来するプライマー延長生成物は、２つのコードワードｗ1およびｗ2を含む。このような配列は、一方向で増幅され、また新しい生成物は、１つの新しいコードワードｗ3を含む。したがって、配列が増幅される毎に、新しいコードワードが導入される（図７）。
各配列タイプは、次のサイクルにおいて１つの新しいコードワードを生成するので、サイクルｃ毎の固有のコードワードの合計数は、２c−２に等しい（表６）。
【表６】
2018536430.tif 000033
【００６１】
サイクルｃ内の所定のコードワードｗjの頻度ｆi,cも、完全なＰＣＲプロセスにおいて、ｆj,c＝ｆj,c-1＋１、ただしｆi,c0＝１、およびｃ0はｗjが最初に認められるサイクルとして算出可能である。すなわち、コードワード頻度は、各ＰＣＲサイクルにおいて１だけ増加するものと期待される。表１は、図６の第１および第２のサイクルにおいて出現するコードワードの頻度を示す。
理想的な状況下では、プール内の各コードワードは、多重度１で一様に分布している、すなわち、ｉ（ｗj）＝ｉ〜Ｕｎｉｆｏｒｍ（１）、ただしＵｎｉｆｏｒｍは一様な統計分布を意味する。しかし、実際には、実測される多重度分布は、オリゴヌクレオチド合成のエラー、配列に固有の熱力学的制約に起因するいくつかの配列のオリゴヌクレオチド合成における無効性、類似した問題に起因するコードワードの非効率的なＰＣＲ増幅およびシークエンシングに起因して、一様とは異なる可能性がある。実際、任意のコーディング法が、非一様な特性の問題を抱えている可能性がある。コードの一様でない分布の影響は、ＰＣＲシークエンシング期間中のエントロピー特性の見積りを前提として、以下のように取り扱われ得る。
【００６２】
第１のステップは、実験に基づいたコードワード多重度分布を識別することである。理想的な分布は、一様であるが、ただしその他の分布、例えばある期間に認められるイベントの数をモデル化するのに使用されるポアソン分布等も、実際観察され得る。分布の平均および分散が異なる場合、負の二項分布も観察され得る。第１ステップとして、探査分析およびＱ−Ｑプロットが、実験に基づいた分布を公知の分布と比較するのに利用可能である。次に最大尤度の推定が、選択した確率分布モデルを前提として、実際のコードワード多重度分布の確率を取得するのに利用可能である。さらに、近似試験の良否も、ランダムなサンプルが特定の分布に由来すると仮定することが合理的かどうか示すために利用可能である。
次のステップは、特定のコードワード多重度分布の特徴づけがすでに行われていることを前提として、予想されるコードワードエントロピー分布を決定することである。所定のＰＣＲサイクルで認められるコードワードは、コードワードプール｜Ｍ｜内での交換による統計的サンプリングによりモデル化され得るが、その場合、サンプルのサイズは、増幅される配列の数に依存する。ルート要素ｗjは１より大きい多重度を有し得るので、交換を含むサンプリングが使用される。さらに、ＰＣＲ反応期間中のエラーは、コードワードのエントロピーに影響を及ぼす可能性があり、例えば、プライマーは、分離および再プライムする可能性がある。
【００６３】
以下のセクションでは、異なる多重度のコードワード分布が存在するときの、第４ＰＣＲサイクルにおけるコードワードエントロピーの挙動について説明する。いずれのケースでも、エントロピー分布は、ルート要素の多重度分布が決定されている固定化されたプールの交換を含む、１０００個の独立したサンプルを生成させることにより取得された。ｍ＝１のテンプレート（テンプレートの数はｍとして定義）とｍの倍数との間のコードワードエントロピーの挙動は以下のように表され、開示されるエントロピー法が、ＰＣＲシークエンシングプロセスの後期サイクルにおいて取り込まれたエラー、またはランダムに分布した単一テンプレートの分散を、真の対立遺伝子からどのように区別し得るか説明する。
【００６４】
（ｉ）一様な多重度分布
好ましい実施形態では、４サイクルによる完全なＰＣＲ反応は、１４個の異なるコードワードを有する（図６、表４を参照）。ｉ（ｗj）＝ｉ〜Ｕｎｉｆｏｒｍ（１）の場合、ｍ個のテンプレート分子の増幅に必要とされるプールサイズは、｜Ｍ｜＝ｍ＊Σj∈|W|ｉ（ｗj）＝ｍ＊１４である。交換を含むサンプルが採取される場合、これは母集団サイズに対応する。各テンプレート分子は、４ＰＣＲサイクル後に、２２個の増幅された配列を有するので、サンプルのサイズは、ｎ＝２２＊ｍである。この場合、プール内で所定のコードワードを認める確率は、Ｐ（ｗj）＝ｉ（ｗj）／｜Ｍ｜＝１／（ｍ＊１４）である。
【００６５】
図８は、開始テンプレートの数ｍが異なる場合の実測エントロピー分布を示す。このような分布は、パラメーターが１である一様なコードワード多重度分布から、交換を含む１０００個の独立したサンプルのエントロピーを計算することにより生成された。開始テンプレート分子の数ｍが増加すると、より高いエントロピーが認められる。しかし、エントロピーの分散は、ｍが増加するにつれて減少する。この図は、異なる数値ｍについて水平線で示す予想エントロピーも含む。予想エントロピーは、実測エントロピーよりも常に高い。コードワードの多重度が一様に分布しているとき、エントロピーの分布は、コードワードの多重度ｉ（ｗj）から独立している。これを、ｉ〜Ｕｎｉｆｏｒｍ（１）およびｉ〜Ｕｎｉｆｏｒｍ（３）について図９に例示する。
理想的な状況では、コードワードの多重度は、一様に分布している。しかし、オリゴヌクレオチド合成のエラーに起因して、多重度のばらつきが生じ得る。本明細書に記載するエントロピー法は、しかし、プール内に、バランスの偏ったコードワードの提示が存在する場合、後期ＰＣＲサイクルにおいて取り込まれたエラーを区別するのになおも使用される。
【００６６】
（ｉｉ）ポアソン多重度分布
コードワード多重度のばらつきは、パラメーターがλであるポアソン分布、すなわちｉ〜Ｐ（λ）を使用してモデル化され得る。ポアソン分布が、ある期間に認められたイベントの数をモデル化するのに使用される。この場合、イベントは、オリゴヌクレオチド合成期間中に生成されるコードワードｗjである。ｉ〜Ｐ（λ）の場合、すべてのコードワードが、同一の多重度を有するわけではないが、ただし平均と分散はλに等しい。ポアソン分布の密度関数は、
【数１８】
2018536430.tif 000034
として定義されるが、ただしｋ∈｛０，１．．．｝のときμ［ｉ］＝λ＝σ2［ｉ］である。
【００６７】
このケースをモデル化するのに、ポアソンサンプルを生成させ、そしてコードワード多重度ｉはゼロより大きいはずなので、数値を１だけシフトさせた。図１０は、ランダムに生成させたポアソン分布、ならびにすべての数値が１だけシフトした修正後の分布を示す。シフトした分布において、平均値は１単位増加しているが、分散は同じままであることに留意されたい。
サイクル数が１よりも大きい場合、ＰＣＲプロセスの品質はより良好に評価される。理由として、ｃ回目のＰＣＲサイクル終了時に、テンプレートが十分に増幅されない場合、増幅生成物のコードワードエントロピーは、より少ないＰＣＲサイクルｃ’（ただしｃ’＜ｃ）と関連する予想エントロピーとして識別され得ることが挙げられる。
【００６８】
一様でない性能のコードワードプールを用いたＰＣＲシークエンシング期間中のＤＮＡコードワードにおける予想エントロピーの推定
図１１および図１２は、多重度が一様な分布、およびλ値が異なるポアソン分布に従うときのエントロピー分布を示す。エントロピー分布を、固定されたコードワード多重度分布に由来する１０００個の独立したサンプルのエントロピーを計算することにより取得した。多重度がポアソン分布に従うとき、エントロピーは減少する。理由として、いくつかのコードワードはより高い発生確率を有し、したがってサンプルの多様性は、すべてのコードワードが同一の発生確率を有するときに得られるサンプルと比較して低下することが挙げられる。図１３は、多重度が一様であり、またポアソン分布のパラメーターλ＝ｉ＝１のときに、プール内で各コードワードをサンプリングする確率を示す。多重度がポアソン分布に従うとき、λの値が大きくなるに従いプール内のコードワードの発生数はより一様となるので、エントロピーは増加する。さらに、開始テンプレート分子の数ｍが増加すると共に、エントロピーは増加し、分散は減少する。
【００６９】
（ｉｉｉ）負の二項多重度分布
ポアソン分布は、分布の平均および分散が同一であると仮定する。しかし、多重度の分散が平均を上回るとき、過剰な散布が実際には観察され得る。このケースは、負の二項分布、すなわち、ｉ〜ＮＢ（ｒ；ｐ）を用いてモデル化され得る。分布は、所定数の不奏功ｒが生ずる前の一連の独立したベルヌーイ試行における奏功数の確率をモデル化する。各ベルヌーイ試行の奏功確率はｐである。密度関数は、Ｐ（ｉ＝ｋ）＝Ｃ（ｋ＋ｒ−１，ｋ）ｐk（１−ｐ）rとして定義され、ただしｋ＝０，１，２，．．．であり、Ｃは、ｋ＋ｒ−１回のベルヌーイ試行におけるｋ個の奏功の組合せである。平均および分散は、それぞれμ［ｉ］＝ｐｒ／（１−ｐ）、およびσ2［ｉ］＝ｐｒ／（１−ｐ）２である。
【００７０】
このケースをモデル化するために、負の二項サンプルを生成させたが、コードワード多重度ｉは０より大きいはずなので、数値は１だけシフトさせている。図１４は、パラメーターｒ＝６およびｐ＝０．５で、ランダムに生成した負の二項分布、ならびにすべての数値を１だけシフトさせた修正後の分布を示す。シフトした分布では、平均は１単位増加しているが、分散は同じままであることに留意されたい。
エントロピーにおいて、分散が有する効果を調査するために、負の二項分布の異なる複数のパラメーターを用いて、いくつかのサンプルを生成させた。表７は、生成した各サンプルの平均と分散を含む。パラメーターｐおよびｒは、サンプルの平均
【数１９】
2018536430.tif 000035
が固定されるように変化させた。例えば、
【数２０】
2018536430.tif 000036
のとき、分散
【数２１】
2018536430.tif 000037
の数値は２．０８〜１０．３の範囲である。奏功の確率ｐが増加するに従い、サンプルの分散
【数２２】
2018536430.tif 000038
は減少することに留意されたい。さらに、ｐが固定の場合、サンプルの平均
【数２３】
2018536430.tif 000039
が増加するに従い、サンプルの分散は増加する。
【００７１】
【表７】
2018536430.tif 000040
【００７２】
第４ＰＣＲサイクルおよび開始数３，０００のＤＮＡテンプレートをモデル化するために、各サンプルのサイズを４２，０００に固定した。図１５は、多重度が、パラメーターが１の一様分布、およびμ＝１、３、６であり、ｐ＝０．１、０．２、．．．、０．９である負の二項分布に従うときのエントロピー分布を示す。エントロピー分布を、所定のコードワード多重度分布に由来する１０００個の独立したサンプルのエントロピーを計算することにより取得した。コードワード多重度が負の二項分布に従うときに認められたエントロピーは、コードワード多重度が一様であるときに認められたエントロピーよりも低い。ｐが固定の場合、μが増加すると、すなわちサンプルの分散が増加すると、エントロピーは減少する。さらに、μが固定の場合、パラメーターｐが減少すると、したがって分散が増加すると、エントロピーは減少する。各分布の平均エントロピーと分散の間の関係を図１６に示す。サンプルの平均が固定の場合、多重度分布の分散が増加するに従い、エントロピーは減少する。
【００７３】
図１７Ａ〜Ｃおよび１８Ａ〜Ｃは、テンプレート分子の開始数が、ｍ＝１、５、および１０のときのコードワードエントロピーを示す。一般的に、分散が増加するとエントロピーは低下する。この傾向は、ｍが増加するに従いより明確となる。
【００７４】
（ｉｖ）外れ値を含む一様な多重度分布
実際に生ずる可能性のある別のシナリオでは、ほとんどのコードワードが、そのうちのいくつかがより高いまたは低い発生数を有する場合を除き、同一の多重度を有する。このケースでは、多重度はいくつかの外れ値を含む一様な分布としてモデル化される。４サイクルおよびｍ個の開始テンプレートコピーによるＰＣＲプロセスでは、プールサイズは、各コードワードをサンプリングする確率が
【数２４】
2018536430.tif 000041
のとき、
【数２５】
2018536430.tif 000042
として算出される。
【００７５】
このケースをシミュレートするために、異なる数の外れ値を含め、また５〜７の範囲にあるランダムな多重度を用いて、パラメーターが１の一様な分布を生成させた。図１９は、ｍ＝５、および｜Ｗ｜＝１４＊５＝７０のときの、１０００個の独立したサンプルから得られた対応するエントロピー分布を示す。外れ値を導入すると、エントロピーは減少する。しかし、外れ値の数が小さい場合、エントロピーではより低い数値が認められる。したがって、外れ値の数が増加するに従い、エントロピーは増加する。外れ値の数が７０、すなわちすべてのコードワードに外れ値が導入されると、エントロピーは、外れ値を含めずに得られたエントロピーに匹敵する。
【００７６】
（ｖ）一様な多重度分布および異なる数のＰＣＲサイクル
実際には、すべての配列が期待通りに増幅されるわけではない。例えば、配列によっては、ＰＣＲプロセスの初期のサイクルにおいてのみ増幅される。この状況をモデル化するために、多重度が一様に分布しているときに、異なるＰＣＲサイクルにおいて増幅される配列のコードワードエントロピーを比較した。各ケースをシミュレートするのに必要とされるパラメーターは、母集団サイズ、サンプルサイズ、および異なるＰＣＲサイクルにおいてコードワードをサンプリングする確率である。これらのパラメーターを表８に挙げる。
【表８】
2018536430.tif 000043
【００７７】
図２０は、ｉ〜Ｕ（１）のときの異なるＰＣＲサイクルにおけるエントロピー分布を示す。エントロピー分布は、異なるＰＣＲサイクルにおいて、表８に示すパラメーターを使用して、交換を含む１，０００個のサンプルを生成させることにより取得した。シミュレーションで認められたエントロピーは、ＰＣＲサイクルが少ないほど低い。サイクル数が少ないほど、固有のコードワードの数も少ないので、これは予想される通りである。
【００７８】
アンプリコン性能におけるコードワード組込みの効果
アンプリコン性能についても、本発明者らのがんホットスポットマルチプレックスＰＣＲアッセイの全７３標的遺伝子座において、そのフォアワードおよびリバースプライマーの両方に合成的に組み込まれた１０−ｍｅｒを含む市販の正常女性ＤＮＡテンプレートを使用して試験した。２５ＰＣＲサイクルおよび異なる量のインプットＤＮＡ（ｍ）を使用した。ｍ＝５，０００および１０，０００のときに、この実験から得られたアンプリコン１個当たりの読み取り数を、市販の正常女性ＤＮＡテンプレート、およびコードワードを有さないプライマーを用いた４つの異なる実験について比較した。この実験は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑプラットフォームを使用して実施した。これら４つの実験において、３０ＰＣＲサイクルおよびｍ＝７，５７５のハプロイドゲノムを使用した。図２３Ａおよび２３Ｂは、ＰＣＲサイクルの数がより小さくても、コードワードを有するときの性能は、コードワードを有さないときの性能に匹敵することを示す。プール内に選好的に増幅されたコードワードが存在すると結果に偏りが生ずるおそれがあるが、それが存在しないことを確認した後に、アンプリコンの性能を分析したことに留意されたい。
【００７９】
開始テンプレートとエントロピーの関係
エントロピーは、テンプレートの開始数の関数として増加するものと期待される。この関係は、本発明者らのカスタムＣＧ００１がんホットスポットマルチプレックスＰＣＲアッセイの標的アンプリコンにおいて、その１つのフォアワードおよびリバースプライマーの両方に合成的に組み込まれたランダムな８−ｍｅｒおよび１０−ｍｅｒを含む、市販の正常女性ＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ社）テンプレート上で例示される。ＭｉＳｅｑプラットフォームを、読み取りをサンプリングするのに用いた。８−ｍｅｒについて検討された実験条件は、２０ＰＣＲサイクル、およびインプットＤＮＡ量、ｍ＝１０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００、１０００００である。１０−ｍｅｒについて検討された条件は、２５ＰＣＲサイクル、およびｍ＝１、２、３、４、５、１０、２５、５０、７５、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、２５０００である。
【００８０】
図２４Ａおよび２４Ｂは、位置１３６６３３３３８の、第５染色体由来のＳＮＰ  ｒｓ１３１８２８８３における１対立遺伝子当たりのコードワードエントロピーを、８−ｍｅｒおよび１０−ｍｅｒそれぞれについて示す。このプロットは、テンプレートの開始数ｍの関数としてエントロピーを示す。ＳＮＰの対立遺伝子ＡおよびＧの場合、一般的な傾向として、インプットＤＮＡがおよそｍ∈［１０，４０００］の範囲内であるときに、コードワードエントロピーが増加することが挙げられる。
１アンプリコン当たりのコードワードエントロピーを、次にインプットＤＮＡの関数として分析した。図２５は、コードワードエントロピーの分布を、いくつかの開始時テンプレートの数について示す。エントロピーは、同一のアンプリコンに属する読み取りに由来するすべてのコードワードについて計算した。図２５は、５０≦ｍ≦４０００のときの望ましい傾向を示し、その場合、開始テンプレート数と共にメジアンエントロピーが増加する。
【００８１】
品質保証に対するＤＮＡバーコードの適用
診断的ＤＮＡシークエンシングにおける品質保証では、患者の治療および管理において、誤った情報が提供されるのを防止するのが望ましい。ＮＧＳ法では、プロセスの汚染、サンプルの同一性の検出から、結果の分析的妥当性の精密な定義に及ぶ、品質保証の異なる態様を可能にする方法が組み込まれることがきわめて望ましい。バックグラウンドに導入される標的を定めたシークエンシング事例において、その目的毎に、増幅生成物の異なる態様を評価するのに、ＤＮＡコードワードが以下のように使用される。
【００８２】
（１）サンプルまたはプロセスの汚染検出
例えば、本明細書に記載するように生成された、非重複性のメンバーシップを含む公知のコードワードプールの異なるセットが、異なる日に、または例えば、ＣＧ００１ｖ２のプライマー配列への組込みによるサンプルの異なるプロセシングバッチと共に使用するために選択されるが、ゲノムのある領域を標的とする任意のその他のプライマー配列も利用可能である。したがって、各実験では、異なるコードワードセットがいつでも使用される状態にある。いくつかの実施形態では、コードワードは、ヒトゲノム内で、公知の多型性単一ヌクレオチド変異体を標的とするプライマーと連結している。好適には、検出された多型変異体の組合せによって、異なるヒト個人の識別が可能となるように、多数の個別生殖細胞多型が使用される。多型変異体は、反復配列内に一塩基変異、欠損、または変化を含み得る。選択される多型の数は、重複して発生する機会の尤度が許容される閾値よりも低く抑えられるように、母集団に含まれる所定の多型の頻度および遺伝子座の数の関数として求めることができる。許容される閾値は、１／１００００００であり得るが、１／１０００〜１／１００００００の間のいずれも、または１／１０００００００未満でも利用可能である。適する一塩基多型の数は、１６であり得るが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれより大きな数も利用可能である。生殖細胞多型とＤＮＡバーコードを併用すれば、複数のシークエンシングおよび情報学的ラボステップ期間中に個々のＤＮＡテンプレートの個別識別が可能となり、またコードワードの規定のセットが存在すれば、ラボワークフローにおけるプレート間、またはアッセイ間、または日間の相互汚染の検出が可能となる。
【００８３】
（２）ＰＣＲにおける不適切なテンプレート多様性を検出するためのコードワード多様性
コードワードエントロピー分布の実際の性能は、例えば、本明細書に記載するように、独立したＤＮＡテンプレートコントロールを対象とするいくつかの連続稀釈実験から、約３０００個のコピーを段階的に減らして単一のコピーになるまでテンプレートを稀釈し、そして公知テンプレートの異なる稀釈の異なる標的遺伝子座において測定後のエントロピーを立証することにより取得され得る。いくつかの数実施形態では、数個、すなわち４個ほどの分子が利用可能である。代替的実施形態では、３０００個を上回るコピーが利用可能である。代替的実施形態では、４〜３０００のコピー、または、例えば１０、５０、１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００等の間の任意の数が利用可能である。連続稀釈すれば、異なる濃度の開始テンプレート分子が得られる。当業者は、測定範囲全体にわたりアッセイ性能を標準化するのに、規定のインプットが用いられる任意のアッセイと類似した方式で、インプットとして開始時のテンプレート、およびアウトプットとして方法の測定対象特性であるエントロピーについて、両者間の関連性を取得するための連続稀釈実験を実施する方法を理解している。開始テンプレート分子の濃度が高いほど、コードワードエントロピーは高くなると予想される。これを、対立遺伝子ＳＮＰのエントロピーと共に、図２６に例示する。濃度が固定の場合、コードワードエントロピー分布を取得するために、実験は少なくとも１回実施されるが、好ましくは２回またはそれ超の回数、反復される。次に、目的とするＤＮＡテンプレートについて、増幅生成物のエントロピーが、開始テンプレート分子の濃度が同一の対応する予想エントロピー分布と比較される。関連するエントロピーの測定値が期待を満たさない場合には、反応は、したがって不適切として棄却され得る。この情報は、全体的なサンプル取扱いプロセスに組み込まれる。品質保証には、ＰＣＲ反応内の年齢と性能が異なるテンプレートを対象とした参照測定も組み込まれ、全体的なプロセス保証の一環として異なる日に反復される。
【００８４】
増幅生成物が、予想を下回る場合、実測エントロピーは、予想エントロピー分布よりも低い、図２１Ａおよび２１Ｂを参照。その結果として、実験に基づいたエントロピー分布における実測Ｈ（増幅生成物）の確率はほぼゼロである。実験に基づいた予想エントロピー分布が、パラメーターμおよびσ2を有する正規分布である場合には、Ｚスコア検定を利用して、増幅生成物のエントロピーｘ＝Ｈ（増幅生成物）が、予想分布の尾部内にあるか決定することができる。所与の数値に対するＺスコアは、
【数２６】
2018536430.tif 000044
として定義され、また平均からの標準偏差の指標である。Ｚスコア検定では、帰無仮説が、Ｈ0：ｘ＝μとして定義される。帰無仮説は、ｐ値が有意水準αよりも小さい場合に棄却される。ｐ値が非常に小さいと、それに関連して非常に高いまたは非常に低い（負の）Ｚスコアが正規分布の尾部に見出される。これは、実測値ｘは予想分布Ｎ（μ，σ2）に属するということがきわめて起こり得ないことを示唆する。
【００８５】
Ｚスコア法以外の方法も適用可能である。例えば、実測エントロピーが予想エントロピー分布に属するという仮説に基づき、実測エントロピーの分位点を決定することが可能である。実測エントロピーが外れ値である場合、これは、ＰＣＲプロセス内のアーチファクトを示唆し、そしてシークエンシング／品質管理期間中にサンプルの棄却を可能にする。
【００８６】
ＰＣＲ／シークエンシングエラーまたはテンプレート分子内のランダムに分布した個々の塩基の変化との対比による真正突然変異の検出
本明細書に記載する方法のうちの１つまたは複数は、例えば、悪性細胞の部分集団が、大部分（クローンと呼ぶ）には存在しない変異体を含み得るがん診断に適用される。追加の適用例として、稀な細菌ゲノムまたはウイルスゲノムが母集団において検出される感染性病原体シークエンシングの分野が挙げられる。本明細書に記載する方法のうちの１つまたは複数は、稀なＤＮＡ変異体（「低頻度真正突然変異」）が、母集団バックグラウンドにおいてＮＧＳシークエンシングにより分析／検出される任意の状況で一般的に使用され得る。本明細書に記載する方法は、あらゆる変異体対立遺伝子頻度を有するいかなる配列においても用途を見出すものと理解され、変異体が稀な変異体である必要はない。
【００８７】
本方法は、変異体対立遺伝子およびバックグラウンドのコードワードエントロピーの分布は異なるという仮説に基づき機能する。これは、ＳＮＰと関連した対立遺伝子のコードワードエントロピーとシークエンシングエラーまたはアーチファクトに起因して頻度が低い対立遺伝子とを比較することにより例示される。正常女性サンプルに見出されるＳＮＰを、表９に記載する。この分析において検討されるアーチファクト位置（シークエンシングエラーの位置）は、表１０に記載されているＳＮＰの近傍領域、［ＳＮＰ−５，ＳＮＰ−３］および［ＳＮＰ＋３，ＳＮＰ＋５］内にある。コードワードエントロピーを、マイナーなＳＮＰ対立遺伝子およびアーチファクトクラス内のすべての低頻度対立遺伝子について計算した、図２６および２７を参照。アーチファクト対立遺伝子のメジアンエントロピーは一定のままであるが、一方、ＳＮＰ対立遺伝子では、２５≦ｍ≦４０００のとき増加する。
【００８８】
表９は、正常女性の各連続稀釈サンプルにおいて識別されたＳＮＰを示す。ＳＮＰおよび対立遺伝子ＳＮＰが、本明細書に記載するがんホットスポットマルチプレックスＰＣＲアッセイ上で行われた、以下の実験条件：３０ＰＣＲサイクル、ｍ＝７５７５、およびコードワードを有さないプライマーによる、市販の正常女性テンプレートを用いたいくつかの実験において確認された。この表で報告するマイナー対立遺伝子、および％ＶＡＦは、複数のコードワード、２５ＰＣＲサイクル、および異なる開始テンプル数を用いた実験に対応する。
【表９】
2018536430.tif 000045
2018536430.tif 000046
2018536430.tif 000047
2018536430.tif 000048
【００８９】
表１０は、アーチファクトクラスについて検討された位置は、この表に記載されているＳＮＰ位置の近傍領域［ＳＮＰ−５，ＳＮＰ−３］および［ＳＮＰ＋３，ＳＮＰ＋５］であることを示す。
【００９０】
【表１０】
2018536430.tif 000049
【００９１】
真正な低頻度変異体は、教師付きまたは教師なし分類法を使用することによりシークエンシングエラーとは区別され得る。管理された分類法は、当業者公知であり、同法として、訓練セットの使用を含む方法が、非限定的に挙げられる。
【００９２】
検討されるクラスは、（１）真正突然変異、および（２）アーチファクトとして表示されるシークエンシングおよび／またはポリメラーゼエラーである。分類法の性能は、選択された特性に依存する。変異体を分類するための２つの特性：（１）低頻度変異体を含む増幅後の読み取りのコードワードエントロピー、および（２）変異位置での増幅後の読み取りの数として定義される被覆率を使用して、いくつかの教師付きの方法の性能を実証する。規定しない限り、デフォルトパラメーターを用いたこのようなアルゴリズムの稼働には、ｐｙｔｈｏｎ由来のｓｃｉｐｙライブラリーを使用した。
−  クラスと関連した重みがクラスの頻度と逆比例する、重みのバランスがとれている線形サポートベクターマシン（ＳＶＭ；Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ）。すなわち、
【数２７】
2018536430.tif 000050
、ただしｙ∈｛ａｒｔｉｆａｃｔ，ｍｕｔａｔｉｏｎ｝。
−  重みのバランスがとれている動径基底関数（ＲＢＦ）ＳＶＭ。
−  最近傍法。試験ポイントは、ｋ＝３として、クエリーポイントに最も近いｋ個の訓練サンプルの中で最も頻度が高いラベルを割り振ることにより分類される。
−  重みのバランスがとれているロジスティック回帰分析
−  ＡｄａＢｏｏｓｔ
−  線形判別分析
−  ツリーの最大深度ｍａｘ＿ｄｅｐｔｈ＝５であり、最良のスプリットを考慮するときの、検討する特性の数ｍａｘ＿ｆｅａｔｕｒｅｓ＝１であり、そして重みのバランスがとれているランダムフォレスト。
−  二次判別分析
−  ツリーの最大深度ｍａｘ＿ｄｅｐｔｈ＝５であり、重みのバランスがとれているデシジョンツリー
−  ガウシアンナイーブベイズ。
【００９３】
これらの方法を、全７３ＣＧ００１標的遺伝子座のフォアワードおよびリバースプライマーの両方に合成的に組み込んだランダム１０−ｍｅｒを含む、正常女性ゲノムＤＮＡおよびＨｏｒｉｚｏｎ  ＱＭＲＳマルチプレックス参照ＤＮＡ（ＦＦＰＥスクロールから社内調製した）の混合物を使用して試験した。ＰＣＲ反応を２５サイクル実施した。２種類の混合物：（１）１００％ＱＭＲＳおよび（２）１０％ＱＭＲＳ＋９０％正常女性を用い、反応毎の混合したインプットＤＮＡを、５０００ハプロイドコピーに維持した。
【００９４】
表１１は、真正突然変異クラスにおいて検討された突然変異のリスト（正常女性（ＮＦ）と組み合わせたＱＭＲＳに見出される突然変異のリスト）を示す。
【表１１】
2018536430.tif 000051
【００９５】
真正突然変異クラスの実際の変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）の割合（％）は、０．８６％〜２５．６２％で変化する。すべての低頻度対立遺伝子を対象として、真正突然変異位置とは異なるいくつかの位置において、アーチファクトクラスのデータをこの実験から取得した。検討した位置は、表１０に記載するＳＮＰの近傍領域、［ＳＮＰ−１０，ＳＮＰ−５］および［ＳＮＰ＋５，ＳＮＰ＋１０］、ならびに表１２に記載するエクソン領域内にある。正常女性サンプルの連続稀釈に由来するアーチファクト位置［ＳＮＰ−５，ＳＮＰ−３］および［ＳＮＰ＋３，ＳＮＰ＋５］も含まれた。
【００９６】
【表１２】
2018536430.tif 000052
【００９７】
図２８は、すべてのデータに関するエントロピーおよび被覆率を示し、アーチファクトクラスならびに真正突然変異クラスが、対応する変異対立遺伝子頻度の割合（％）と共に特定されている。さらに、訓練および試験データも同じ図の中で表示されている。
【００９８】
試験セット内の真正突然変異の予測されるクラスを表１３に示す。図２８の試験セット内の突然変異データならびに各分類指標からの予測されるクラスが含まれる。この試験セットに対する性能メトリックとして、マシューズ相関係数を示す。マシューズ相関係数は、この表に示す突然変異試験データに限らず、すべての試験データを考慮することに留意されたい。各分類法の性能を、２０フォールド交差検証により取得した。交差検証するための階層化された戦略を、各フォールドがほぼ同じ割合の２つのクラスを含むことを保証するのに用いた。アーチファクトクラスのサイズは、真正突然変異クラスよりもかなり大きいので、ＭＣＣ＝（ＴＰ＊ＴＮ−ＦＰ＊ＦＮ）／［（ＴＰ＋ＦＰ）（ＴＰ＋ＦＮ）（ＴＮ＋ＦＰ）（ＴＮ＋ＦＮ）］1/2として定義されるマシューズ相関係数を性能メトリックとして用いた。
【００９９】
【表１３】
2018536430.tif 000053
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2018536430.tif 000055
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【０１００】
表１４は、非確率論的方法であるＳＶＭおよび最近傍法、ならびにロジスティック回帰分析による確率論的方法は、この試験において最高性能を示すことを表している。階層化された交差検証を２０回実施したときのマシューズ相関係数の平均を性能メトリックとして示す。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法で使用される管理された分類法には、少なくとも０．７のマシューズ相関係数を示す方法が含まれる。そのような方法として、非限定的に、ＳＶＭ、最近傍法、およびロジスティック回帰分析による確率論的方法が挙げられる。
【０１０１】
【表１４】
2018536430.tif 000057
【０１０２】
ＮＧＳシークエンシングにおけるテンプレートの複雑性およびヌクレオチドの変化に関するエントロピーに基づく測定法の組込み
図２２に概説するプロセスは、実測コードワードエントロピーが、増幅生成物の品質を検出するために、実際にどのように使用されるか、その方法を示す。プロセスは、観察されるすべてのコードワードを特徴づけるステップから開始する。汚染を検出するのに使用された、これまでの実験に由来するコードワードが存在すれば、それは汚染の兆候である。汚染が無ければ、プロセスは、シークエンシングにおけるテンプレートの提示不足を検出する方法と共に継続する。配列が予想通りに増幅された場合には、最終ステップは、真の変異体の検出である。
図２２の手順は、コードワード多重度の分布が一様であるという最初の仮説に基づき、機能する。技術的問題に起因するコードワードエントロピーの非一様性は、本明細書に記載するように検出可能であり、したがって予想されるバックグラウンドエントロピーの計算に組み込まれる。
【０１０３】
ＮＧＳシークエンシングパネルを用いた患者腫瘍組織のシークエンシングに関するサンプルワークフロー
依頼する側の医師は、安全が確保された外部ウェブのポータルにアクセスして、患者サンプル依頼書を提出する。サンプルは、次に受け入れ時に、会社の検査情報マネジメントシステム（ＬＩＭＳ）に登録され、そしてヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）スライドが、ホルマリン固定パラフィン包埋患者組織の腫瘍細胞充実度について評価される。患者サンプルが、十分な腫瘍含有量を有さない場合には、新規サンプルが要求される。抽出後にサンプルから１００ｎｇを上回るＤＮＡが得られない場合にも、新規サンプルが必要とされる。また、サンプルは、ライブラリー構築およびデータ分析後に、すべてのＱＣ要件を満たす必要もある。すべてのＱＣメトリクスに合格したら、患者報告書が作成され、依頼する側のヘルスケア提供者に回付される。図１は、患者サンプルワークフローを示す。
【０１０４】
ＤＮＡ抽出
ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の切片４×１０ミクロンから抽出した。抽出プロトコールを修正して、脱パラフィンが、サンプルを鉱物油内、９０℃に加熱することから構成されるようにした。要するに、分子グレードの鉱物油３００μｌを、ＦＦＰＥスクロールに添加し、そして９０℃で２０分間加熱した。次に、ＡＴＬバッファーおよびプロテイナーゼＫの添加後、Ｑｉａｇｅｎ社の説明書を正確に順守してサンプルを処理した。溶融パラフィンか水層らを分離するのに役立つように、サンプルを、液体をスピンカラムに移す直前に、氷上で４分間冷却した。溶出したＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量した。
【０１０５】
ライブラリーの構築
ＦＦＰＥ  ＤＮＡ、５０ｎｇを、ＱｉａｇｅｎマルチプレックスＰＣＲキットを使用してアンプリコンを生成するのに使用した。アンプリコンを２つのプール内で生成させた；９０個のホットスポットおよび７個のエクソン（表１６）をカバーする合計７３個のアンプリコン（表１５に記載されているプライマー）に対応したプールＡおよびプールＢ。
【表１５】
2018536430.tif 000058
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【０１０６】
【表１６】
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【０１０７】
ＰＣＲ後に、ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズクリーンアップライブラリーが、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴバーコードキットを使用して構築されるように、遺伝子座特異的プライマーには、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）共通配列が含まれた。インデックス化したアダプターを、８サイクルのＰＣＲを通じて増幅された配列にライゲートした。ライブラリー構築後、ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズを使用してサンプルを再度精製し、Ｑｕｂｉｔで定量し、そしてＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して分析した。サンプルをプールし、そして１２．５ｐＭに稀釈した後、ペアドエンド１５０ｂｐ読み取りについて、３００サイクルｖ２キットを使用して、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）上でシークエンシングした。患者２０例、ならびに陽性および陰性対照が測定毎に含まれるような戦略でプーリングした。
【０１０８】
がん内で体細胞異常の標的を定めた増幅を行うためのプライマーパネルＣＧ００１．２
ヒトゲノム（ｈｇ１９）内の標的ゲノム領域を増幅するために、７３個のＰＣＲプライマーの対からなる、標的対象となるオリゴヌクレオチドＤＮＡ配列プライマーパネルＣＧ００１．ｖ２、（表１５）を、プライマー３(3)を使用して設計した。プライマー設計で使用されるゲノム領域は、標的領域の２００ｂｐ上流および下流にあるゲノム領域を含む。パネルで使用されるプライマーの対を選択する際には、下記のプライマー３設定を使用して、標的領域毎に最低４５個のプライマーの対からなるプライマーの群の設計が含まれた；最低サイズ：１８、最適サイズ：２０、最大サイズ：２７、生成物のサイズ範囲：１００〜２４９、最低テンプレート数：５７、最適なテンプレート数：６０、最大テンプレート数：６３。下記の基準のいずれかを満たすプライマーの対を、設計群から除外した：フォアワードまたはリバースプライマー配列のいずれかにおいて連続３個超のグアニンが存在する、１０００ゲノム対立遺伝子頻度が＞０．００５であるｓｎｐを有するゲノムの標的領域とアライメントするプライマー、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔを使用して決定された標的でないゲノム領域を増幅するプライマーの対(4)。
【０１０９】
プライマー群のそれぞれに含まれるプライマーの対を、２つプールのうちの一方に含まれる既存するプライマーの対との適合性について連続的に試験した。既存するプライマーの対とのプライマーの二量化を、一致する塩基が＞８０％であり、４個超の塩基がアライメントすることとして定義し、その二量化について、各プライマーの対を試験した。適合性を有するプライマーの対が識別されたら、該プライマーの対をプールに添加し、そしてプライマーの群に対するプライマーの対の試験を終了した。次のプライマーの群内で、プライマーの対の試験を開始する。２つのプールにわたり分散するプライマーの群のそれぞれに由来する１つの選択された適合性のあるプライマーの対から構成されるこのプロセスを使用して、最終的なプライマーパネルが策定された。各パネル内の各プライマーの対のＰＣＲ増幅性能を評価し、そしてゲノム配列を増幅することができなかったプライマーの対を、プライマー３を使用して再設計し、そして既存するプールとの適合性について試験した。
【０１１０】
ＣＧ００１．ｖ２を実施して得られた配列の情報分析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑにより生み出された標的アンプリコンに由来する対をなす読み取りを、ＢＷＡ−ｍｅｍアルゴリズム(5)と共にｂｗａを使用して、参照ゲノムｈｇ１９にアライメントした。アライメントした読み取りのさらなるプロセシングおよびフィルター処理を、ＳＡＭｔｏｏｌｓ(6)およびｂａｍＵｔｉｌｓ(7)を使用して実施した。下記の基準を満たすアライメントした読み取りのみを、さらなる分析で使用した；予想される読み取りの長さに一致する、ミスマッチが５個未満の読み取り、およびソフトクリッピングが７ｂｐ未満である読み取り。次にＭｕｔａｔｉｏｎＳｅｑ(2)（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｐｂｉｏ．ｂｃｃｒｃ．ｃａ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｍｕｔａｔｉｏｎｓｅｑ／）およびｓｔｒｅｌｋａ(8)ツールをそれぞれ使用するＳＮＶおよび挿入欠失の識別のために、フィルター処理後のアライメントを使用した。ＭｕｔａｔｉｏｎＳｅｑは、任意の所定の位置における体細胞突然変異の確率を評価するために、特性に基づく分類指標を使用し、また一致した腫瘍−正常の対に由来する配列データを必要とする。Ｓｔｒｅｌｋａは、ベイジアンアプローチに基づき、やはり腫瘍−正常の対を必要とする。一致した正常サンプルは入手不能なので、女性健常者の正常Ｂリンパ球に由来する細胞系を正常参照（ＮＡ０１９５３、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ社）として使用して変異体検出を実施した。信頼度の高いＳＮＶの検出は、目標最低深度１０００×、およびＭｕｔａｔｉｏｎＳｅｑ確率スコア≧０．９を必要とした。挿入欠失の検出は、最低目標深度１０００×、および品質スコアとして少なくとも３０を必要とした。定量的マルチプレックスＤＮＡ参照標準（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を、幅広い範囲の対立遺伝子頻度（１〜３３．５％）においてＳＮＶおよび挿入欠失を検出するための陽性対照として使用した。陽性対照に関する予測された対立遺伝子頻度と報告された対立遺伝子頻度との間のピアソンの相関において、相関係数が少なくとも０．９であれば、変異体検出の奏功を示唆する。ＳＮＶおよび挿入欠失が高い信頼度で検出されたときの効果は、ＳｎｐＥｆｆ(9)およびＵＣＳＣの公知の遺伝子データベースを使用して詳解された。図２２のワークフローでは、コードワード分析に関する開示の方法が突然変異コーリングに組み込まれているが、そのワークフローを含む拡張部分と共に、分析ワークフローを図２に示す。
【０１１１】
参考文献
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すべての引用は、本明細書により参照として組み込まれる。
【０１１２】
本発明は、１つまたは複数の実施形態に関して記載されている。ただし、特許請求の範囲に規定する本発明の範囲から逸脱せずに、いくつかの変更および修正を加えることができることは、当業者にとって明白である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018536430.tif 000080
【図１１】
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【図１２】
2018536430.tif 000082
【図１３】
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【図１４】
2018536430.tif 000084
【図１５】
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【図１６】
2018536430.tif 000086
【図１７Ａ】
2018536430.tif 000087
【図１７Ｂ】
2018536430.tif 000088
【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
2018536430.tif 000090
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
2018536430.tif 000092
【図１９】
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【図２０】
2018536430.tif 000094
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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