(57)【要約】  本発明は、様々な眼の状態、特に、角膜の状態に使用できる眼科用組成物を包含する。また、これらの組成物およびこれらの組成物を含むキットを利用する方法も包含される。
2018513117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）角膜の菲薄化もしくは不整形に関連する状態を治療もしくは予防する、（ｉｉ）角膜の損傷もしくは傷害を治療もしくは予防する、または（ｉｉｉ）眼の屈折異常を治療もしくは予防する方法であって、前記角膜または前記眼をＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物と接触させ、それによって前記状態、損傷、傷害、または屈折異常を治療または予防することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＴＧＦβ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記デキサメタゾンは、デキサメタゾンホスフェートである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの前記ＴＧＦβ３ポリペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は、４０〜４０００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物は、点眼薬として製剤化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物は、ゲランガムを用いて製剤化される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物は、１日１回または１日２回投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物は、１つ以上の追加の眼用薬剤と同時投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の追加の眼用薬剤は、麻酔薬、抗炎症薬、抗菌剤、および潤滑剤からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物は、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングの使用と併せて投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、前記組成物を用いた治療の間および／または後に角膜の形状を成形するかまたは維持するように適合される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、前記組成物のための担体として、または組成物溶出デバイスとして作用するように適合される、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）または（ｉｉ）の場合、前記組成物は、角膜コラーゲン架橋と併せて投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物の前記投与は、架橋の前および／または後である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の場合、前記方法は、屈折矯正手術の前または後に行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記状態は、円錐角膜、近視、および乱視からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記角膜の前記損傷または傷害は、擦過傷、裂傷、潰瘍、熱傷、穿刺、または手術のうちの１つ以上に関連する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記眼の屈折異常は、近視、遠視、乱視、および老視のうちの１つ以上に関連する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物と、（ｉｉ）１つ以上のコンタクトレンズと、を含む、キット。
【請求項２１】
前記コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、前記組成物を用いた治療の間および／または後に角膜の形状を成形するかまたは維持するように適合される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、前記組成物のための担体として、または組成物溶出デバイスとして作用する、請求項２０または請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ＴＧＦβ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
前記デキサメタゾンは、デキサメタゾンホスフェートである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記組成物は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの前記ＴＧＦβ３ポリペプチドを含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記組成物は、４０〜４０００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンを含む、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
前記組成物は、点眼薬として製剤化される、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
前記組成物は、ゲランガムを用いて製剤化される、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記組成物は、１日１回または１日２回の投与のために製剤化される、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記組成物は、前記１つ以上の追加の眼用薬剤と共製剤化される、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記キットは、前記１つ以上の追加の眼用薬剤を含む、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記１つ以上の追加の眼用薬剤は、麻酔薬、抗炎症薬、抗菌剤、および潤滑剤からなる群から選択される、請求項３０または請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記キットは、コンタクトレンズ溶液を含む、請求項２０〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
前記キットは、使用説明書を含む、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
前記キットは、（ｉ）前記眼の屈折異常の前記治療もしくは予防、（ｉｉ）円錐角膜、近視、遠視、乱視、老視、および角膜実質ジストロフィからなる群から選択される角膜の状態の前記治療もしくは予防、または（ｉｉｉ）擦過傷、裂傷、潰瘍、熱傷、穿刺、角膜融解、および外科的傷害からなる群から選択される角膜の状態の前記治療のために使用される、請求項２０〜３４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３６】
角膜実質細胞におけるＩＩ型コラーゲンの発現を誘導する方法であって、前記角膜実質細胞を、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物に接触させ、それによって前記角膜実質細胞におけるＩＩ型コラーゲンの発現を誘導することを含む、方法。
【請求項３７】
前記ＴＧＦβ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記デキサメタゾンは、デキサメタゾンホスフェートである、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの前記ＴＧＦβ３ポリペプチドを含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物は、４０〜４０００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンを含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物は、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングを介した投与のために製剤化される、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物は、溶液、ゲル、クリーム、またはエマルジョンとしての投与のために製剤化される、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
（ｉ）角膜の菲薄化もしくは不整形に関連する状態を治療もしくは予防する、（ｉｉ）角膜の損傷もしくは傷害を治療もしくは予防する、または（ｉｉｉ）眼の屈折異常を治療もしくは予防する方法であって、前記角膜または前記眼に、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を含む組成物、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物を同時投与し、それによって前記状態、損傷、傷害、または屈折異常を治療または予防することを含む、方法。
【請求項４６】
角膜実質細胞におけるＩＩ型コラーゲンの発現を誘導する方法であって、前記角膜実質細胞に、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を含む組成物、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物を同時投与し、それによって前記角膜実質細胞におけるＩＩ型コラーゲンの発現を誘導することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年３月５日に出願されたニュージーランド仮特許出願第ＮＺ７０５７２７号の利益を主張するものであり、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本開示は、眼の状態の治療および／または予防に有用な組成物および方法に関する。特に、本開示は、角膜の強化および再生、ならびに眼の屈折異常の矯正に使用することができる組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
これまで、分化した細胞は、以前の状態に戻る能力を持たなくなると考えられていた。しかしながら、この見識は、多能性幹細胞（細胞リプログラミング）の誘導、および分化細胞が別の表現型に転換できることを示す証拠によって疑問視されてきている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ＆Ｙａｍａｎａｋａ  ２００６；Ｗｅｒｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｙａｍａｎａｋａ＆Ｂｌａｕ  ２０１０；Ｇｕｒｄｏｎ＆Ｍｅｌｔｏｎ  ２００８；Ｐｅｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。さらに、今では、周囲の細胞、細胞外マトリックス、ならびに増殖因子および分化因子を含む細胞の微小環境が、細胞分化の方向転換をもたらす上で重要な役割を果たすと考えられている（Ｈａｋｅｌｉｅｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌａｓ  ２００２）。この情報に基づいて、研究者は、細胞リプログラミングおよび幹細胞の技術を用いた治療法を開発し始めた。
【０００４】
眼の角膜は、眼の全屈折力（焦点を合わせる力）の２／３超を占めている。角膜の形状におけるたとえわずかな変化でも、網膜上で焦点が結ばれる像の鮮明度に劇的な影響を与え得る。角膜の実質層（眼の透明な前面）は、角膜組織の大半を占め、大部分がＩ型およびＶ型コラーゲンである密集したコラーゲン原線維から構成される、高度に組織化されたラメラからなる（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。均一に整列したコラーゲン原線維に起因する実質層の特有な構造は、角膜に靭性および透明性という特性を付与する（Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ  ２０００）。
【０００５】
角膜からストローマ細胞（角膜実質細胞）を除去し、単層で培養すると、それらは線維芽細胞の形態学的特徴を示し、星状の細胞から多核の紡錘状細胞に転換する（Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。一般的に観察される角膜実質細胞の別の表現型は、傷害後に角膜に見られる筋線維芽細胞の形態である（Ｊｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）。外因性増殖因子およびサイトカインにおける変化が、これらの表現型変化をもたらすと考えられる（Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【０００６】
増殖因子のＴＧＦβファミリーは、軟骨細胞（軟骨）分化の最も強力な誘導因子であることが分かっている（Ｈｅｎｇ，Ｃａｏ，＆Ｌｅｅ  ２００４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｍｅｎｅｔｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ＴＧＦβ１は、ニワトリ胚線維芽細胞によるコラーゲンおよびファイブロネクチンの合成を刺激する（Ｉｇｎｏｔｚ  ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ  １９８６）。角膜実質細胞に関して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２は、おそらくは角膜実質細胞の筋線維芽細胞表現型への変換に起因して、瘢痕に関連するＥＣＭの沈着を引き起こすことが分かっている（Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ，Ｍａｎｎ，Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ，Ｃｏｒｐｕｚ，＆Ｒｏｔｈ  ２００１）。対照的に、ＴＧＦβ３は、線維症または瘢痕を起こさずに、Ｉ型コラーゲンからなるＥＣＭの沈着を引き起こすように角膜の線維芽細胞を誘導することが示されている（Ｋａｒａｍｉｃｈｏｓ，Ｈｕｔｃｈｅｏｎ，＆Ｚｉｅｓｋｅ  ２０１１）。ある特定の非タンパク質性化合物、例えば、デキサメタゾン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｈｅｒｉｎｇ，Ｃａｐｌａｎ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，＆Ｙｏｏ  １９９８）、アスコルビン酸（Ｆａｒｑｕｈａｒｓｏｎ，Ｂｅｒｒｙ，Ｂａｒｂａｒａ  Ｍａｗｅｒ，Ｓｅａｗｒｉｇｈｔ，＆Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  １９９８）、およびエタノール（Ｋｕｌｙｋ＆Ｈｏｆｆｍａｎ  １９９６）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞分化を促進することも分かっている。
【０００７】
種々の欠陥、傷害、疾患、および変性疾患を含む、角膜に影響を与える数多くの状態が存在する。近視は、角膜の過度の湾曲によって生じ、眼に進入した光が網膜の手前で焦点を結ぶ。これは、世界中で最も多く見られる視力障害であり、いくつかのアジア諸国では７０〜９０％、欧米では３０〜４０％の人々の視力に影響を及ぼしている（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ２００２）。ほとんどの場合、近視は、最初に学齢児童に起こり、約２０歳まで進行する。これはまた、成人における黄斑変性症、網膜剥離、および緑内障の有病率にも関連している（Ｅｂｅｎｓｔｅｉｎ＆Ｐｒｕｉｔｔ  ２００６）。
【０００８】
近視は、処方眼鏡またはコンタクトレンズの使用によって最も一般的に矯正される。しかしながら、これらのデバイスは、該状態に対する恒久的な治療は提供せず、ある特定の活動の間の使用には適さない。コンタクトレンズはまた、眼感染症、ならびに角膜擦過傷および潰瘍を含むより深刻な状態にも関連している。ある特定の状況において、屈折矯正手術または角膜矯正治療は、近視に適応がある。それでもなお、これらの治療は、軽度から中程度の近視に一時的な矯正を提供するに過ぎない：これらは恒久的な治療ではなく、重度の症例には適さない。
【０００９】
円錐角膜は、角膜実質の菲薄化およびボーマン層として知られる角膜の一部分の破損に関連する、形状不正な角膜変性症である。角膜実質の進行性菲薄化は、典型的には数十年かけて起こり、その結果として角膜が円錐状になる。これは、不正乱視および近視による視力障害を引き起こす。円錐角膜の原因は未だに分かってはいないが、絶えず目をこすることおよびコンタクトレンズ着用等の要因に関連している（Ｋｒａｃｈｍｅｒ，Ｆｅｄｅｒ，＆Ｂｅｌｉｎ  １９８４；Ｓｈｅｒｗｉｎ＆Ｂｒｏｏｋｅｓ  ２００４）。早ければ思春期に現れ、２０代または３０代まで進行する。
【００１０】
円錐角膜の有病率は、世界の一般集団において約２０００人に１人と推定されており（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  １９９８）、性別による偏向は認められない。円錐角膜の発症は、典型的には早期成人期であり、働き盛りおよび子育て年齢にまで継続するため、生活の質の損失および円錐角膜の治療による経済的負担は、重大な公衆衛生上の懸念を意味する。円錐角膜は、西洋における角膜移植の主要な適応症であり、フランスの角膜移植の２８．８％（Ｌｅｇｅａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１）および米国の１１．４％〜１５．４％を占めることが研究者によって明らかにされている（Ｃｏｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｄｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ニュージーランドでは円錐角膜の有病率が異常に高く、パシフィカおよびマオリ集団においては不釣り合いに高い発生率が示されている（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｐａｔｅｌ＆ＭｃＧｈｅｅ  ２０１３）。ニュージーランドにおいて実行される全角膜移植の約５０％が、円錐角膜のためである（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
【００１１】
円錐角膜に関するいくつかの研究にもかかわらず、根底にある生化学的プロセスは十分に理解されていないままである。円錐角膜の家族性発症は、病因の１つが遺伝的であることを示唆している（Ｉｈａｌａｉｎｅｎ  １９８５）。この状態はまた、ある特定の生化学的要因および生体力学的要因と関連している。例えば、円錐角膜の角膜菲薄化は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分の喪失によるものであることが明らかになっている。しかしながら、これは、それらの破壊、それらの形成障害、またはそれらの組み合わせに起因する場合がある（Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ＆Ｄａｍｍｓ  １９９５；Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ  １９９９；Ｊｈａｎｊｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。角膜実質において、円錐角膜に関連する変化は、ラメラおよび角膜実質細胞数の減少（Ｋｕ，Ｎｉｅｄｅｒｅｒ，Ｐａｔｅｌ，Ｓｈｅｒｗｉｎ，＆ＭｃＧｈｅｅ  ２００８；Ｓｈｅｒｗｉｎ＆Ｂｒｏｏｋｅｓ  ２００４）、ならびにラメラ組織、およびコラーゲン原線維量の分布における変化を含む（Ｍｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【００１２】
実質層の分解は、異常なタンパク分解酵素活性に起因する可能性があると考えられる（Ｆｕｋｕｃｈｉ，Ｙｕｅ，Ｓｕｇａｒ，＆Ｌａｍ  １９９４）。円錐角膜の角膜は、低レベルの酵素阻害物質および高レベルの分解酵素を有することが分かっている（Ｋｅｎｎｅｙ＆Ｂｒｏｗｎ  ２００３）。生体力学的要因は、紫外線照射および機械的外傷によって引き起こされる酸化的損傷に起因する角膜の菲薄化および剛性の低下を含む（Ｋｅｎｎｅｙ＆Ｂｒｏｗｎ  ２００３）。生体力学的研究により、円錐角膜の角膜は、弾性および剛性の低下を示したが、その理由は未だに不明である（Ｅｄｍｕｎｄ  １９８８）。コラーゲン架橋の減少が原因であるかもしれないと提案されている（Ｗｏｌｌｅｎｓａｋ＆Ｂｕｄｄｅｃｋｅ  １９９０）。現在のところ、満足の行く円錐角膜の動物モデルは存在せず、研究は主としてｅｘ  ｖｉｖｏ環境に限定されている。
【００１３】
状態の重症度に応じて、円錐角膜の進行を遅らせるための試みは、特別な眼鏡およびコンタクトレンズの使用を含む。重度の症例では、角膜インプラント、角膜実質内リング、または角膜移植が必要となる（Ｊｈａｎｊｉ，Ｓｈａｒｍａ，＆Ｖａｊｐａｙｅｅ  ２０１１）。角膜の全層が除去されてドナー角膜組織と交換される手技である全層角膜移植は、円錐角膜の重症症例を治療するために最も一般的に用いられる外科的手技である（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  １９９８）。円錐角膜は、世界的に角膜移植手術の主な適応であり、円錐角膜に罹患する約１２〜２０％の人々が角膜移植を必要としている（Ｐｒａｍａｎｉｋ，Ｍｕｓｃｈ，Ｓｕｔｐｈｉｎ，＆Ｆａｒｊｏ  ２００６）。
【００１４】
円錐角膜の初期治療の選択肢、例えば、Ｒｏｓｅ  Ｋレンズとして知られる特別に作製されるガス透過性レンズは、視力の改善に重点を置いてきた。より新しい治療は、疾患の進行を遅らせることを目的としている。角膜コラーゲン架橋（ＣＸＬ）として知られる治療は、角膜の剛性および生体力学的安定性を高めることに着目している。この手技では、上皮が切除され、局所リボフラビン点眼薬が投与され、角膜が約３０分間３７０ｎｍの紫外線Ａ波に曝露される（Ａｓｈｗｉｎ＆ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  ２０１０；Ｇ．Ｗｏｌｌｅｎｓａｋ，Ｓｐｏｅｒｌ，＆Ｓｅｉｌｅｒ  ２００３）。ＵＶＡ光線がリボフラビンを活性化させ、それによって角膜実質内のコラーゲン分子間に共有結合の形成を誘導する活性酸素種を生成すると考えられる（Ｓｐｏｅｒｌ，Ｈｕｈｌｅ，＆Ｓｅｉｌｅｒ  １９９８；Ｇ．Ｗｏｌｌｅｎｓａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。しかしながら、この手技は、内皮細胞損傷の可能性があるため、４００μｍよりも薄い角膜の治療には不適切である。この治療はより剛性の高い角膜をもたらすが、角膜の菲薄化の問題には対応しない。
【００１５】
したがって、角膜に影響を及ぼす状態を含む眼の状態に対応するための治療用組成物および方法に対する継続的な必要性が存在する。特に、比較的低侵襲性であり、投与しやすい治療薬の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１６】
本発明者は、角膜組織におけるコラーゲンの発現および細胞外マトリックスの形成を変化させるように角膜細胞を改変するための組成物および方法を開発した。これらの組成物および方法は、角膜を再生および／または強化するのに有用であり、それによって角膜および眼の屈折異常の種々の状態を治療および／または予防する。
【００１７】
一態様において、本発明は、角膜を、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物と接触させ、それによって状態を治療または予防することを含む、角膜の菲薄化もしくは不整形形状異常に関連する状態を治療または予防する方法を含む。
【００１８】
種々の態様において、
ＴＧＦβ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
デキサメタゾンは、デキサメタゾンホスフェートである。
【００１９】
組成物は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３ポリペプチドを含む。
組成物は、４０〜４０００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンを含む。
組成物は、点眼薬として製剤化される。
【００２０】
組成物は、ゲランガムを用いて製剤化される。
組成物は、１日１回または１日２回投与される。
組成物は、１つ以上の追加の眼用薬剤と同時投与される。
【００２１】
１つ以上の追加の眼用薬剤は、麻酔薬、抗炎症薬、抗菌剤、および潤滑剤からなる群から選択される。
組成物は、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングの使用と併せて投与される。
【００２２】
コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、組成物を用いた治療の間および／または後に角膜の形状を成形するかまたは維持するように適合される。
【００２３】
コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、組成物のための担体として、または組成物溶出デバイスとして作用するように適合される。
組成物は、角膜コラーゲン架橋と併せて投与される。
【００２４】
組成物の投与は、架橋の前および／または後である。
状態は、円錐角膜、近視、および乱視からなる群から選択される。
代替の態様において、方法は、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を含む組成物、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物の同時投与を含む。
【００２５】
さらなる一態様において、本発明は、角膜を、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物と接触させ、それによって角膜の損傷または傷害を治療または予防することを含む、角膜の損傷または傷害を治療または予防する方法を含む。
【００２６】
種々の態様において、
ＴＧＦβ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
デキサメタゾンは、デキサメタゾンホスフェートである。
【００２７】
組成物は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３ポリペプチドを含む。
組成物は、４０〜４０００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンを含む。
組成物は、点眼薬として製剤化される。
【００２８】
組成物は、ゲランガムを用いて製剤化される。
組成物は、１日１回または１日２回投与される。
組成物は、１つ以上の追加の眼用薬剤と同時投与される。
【００２９】
１つ以上の追加の眼用薬剤は、麻酔薬、抗炎症薬、抗菌剤、および潤滑剤からなる群から選択される。
組成物は、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングの使用と併せて投与される。
【００３０】
コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、組成物を用いた治療の間および／または後に角膜の形状を成形するかまたは維持するように適合される。
【００３１】
コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、組成物のための担体として、または組成物溶出デバイスとして作用するように適合される。
角膜の損傷または傷害は、擦過傷、裂傷、潰瘍、熱傷、穿刺、または手術のうちの１つ以上に関連する。
【００３２】
代替の態様において、方法は、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を含む組成物、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物の同時投与を含む。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、眼を、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物と接触させ、それによって眼の屈折異常を治療または予防することを含む、眼の屈折異常を治療または予防する方法を含む。
【００３４】
種々の態様において、：
ＴＧＦβ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
デキサメタゾンは、デキサメタゾンホスフェートである。
【００３５】
組成物は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３ポリペプチドを含む。
組成物は、４０〜４０００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンを含む。
組成物は、点眼薬として製剤化される。
【００３６】
組成物は、ゲランガムを用いて製剤化される。
組成物は、１日１回または１日２回投与される。
組成物は、１つ以上の追加の眼用薬剤と同時投与される。
【００３７】
１つ以上の追加の眼用薬剤は、麻酔薬、抗炎症薬、抗菌剤、および潤滑剤からなる群から選択される。
組成物は、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングと併せた使用のために投与される。
【００３８】
コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、組成物を用いた治療の間および／または後に角膜の形状を成形するかまたは維持するように適合される。
【００３９】
コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、組成物のための担体として、または組成物溶出デバイスとして作用するように適合される。
方法は、屈折矯正手術の前または後に行われる。
【００４０】
眼の屈折異常は、近視、遠視、乱視、および老視のうちの１つ以上に関連する。
代替の態様において、方法は、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を含む組成物、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物の同時投与を含む。
【００４１】
なおもさらなる態様において、本発明は、
ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物と、
１つ以上のコンタクトレンズと、を含むキットを包含する。
【００４２】
種々の態様において、
コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、組成物を用いた治療の間および／または後に角膜の形状を成形するかまたは維持するように適合される。
【００４３】
コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、組成物のための担体として、または組成物溶出デバイスとして作用する。
ＴＧＦβ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００４４】
デキサメタゾンは、デキサメタゾンホスフェートである。
組成物は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３ポリペプチドを含む。
組成物は、４０〜４０００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンを含む。
【００４５】
組成物は、点眼薬として製剤化される。
組成物は、ゲランガムを用いて製剤化される。
組成物は、１日１回または１日２回の投与のために製剤化される。
【００４６】
組成物は、１つ以上の追加の眼用薬剤と共製剤化される。
キットは、１つ以上の追加の眼用薬剤を含む。
１つ以上の追加の眼用薬剤は、麻酔薬、抗炎症薬、抗菌剤、および潤滑剤からなる群から選択される。
【００４７】
キットは、コンタクトレンズ溶液を含む。
キットは、使用説明書を含む。
キットは、眼の屈折異常の治療または予防のために使用される。
【００４８】
キットは、円錐角膜、近視、遠視、乱視、老視、および角膜実質ジストロフィからなる群から選択される角膜の状態の治療または予防のために使用される。
キットは、擦過傷、裂傷、潰瘍、熱傷、穿刺、角膜融解、および外科的傷害からなる群から選択される角膜の状態の治療のために使用される。
【００４９】
代替の態様において、キットは、別個の構成要素として、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を含む組成物、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物を含む。
【００５０】
さらなる態様において、本発明は、角膜実質細胞におけるＩＩ型コラーゲンの発現を誘導する方法であって、角膜実質細胞を、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物に接触させ、それによって角膜実質細胞におけるＩＩ型コラーゲンの発現を誘導することを含む方法を含む。
【００５１】
種々の態様において、
ＴＧＦβ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
デキサメタゾンは、デキサメタゾンホスフェートである。
【００５２】
組成物は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３ポリペプチドを含む。
組成物は、４０〜４０００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンを含む。
組成物は、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングを介した投与のために製剤化される。
【００５３】
組成物は、溶液、ゲル、クリーム、またはエマルジョンとしての投与のために製剤化される。
方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【００５４】
方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。
代替の態様において、方法は、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を含む組成物、およびデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含む組成物の同時投与を含む。
【００５５】
上記概要は、本発明のある特定の実施形態の特徴および技術的利点を広義に説明している。さらなる技術的利点は、以下の本発明の詳細な説明および実施例に詳細に記載される。
【００５６】
本発明の特徴であると考えられる新規の特徴は、添付の図面および実施例と関連付けて考慮すると、本発明の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。しかしながら、本明細書に提供される図面および実施例は、本発明を説明するのに役立つか、または本発明の理解を深める助けとなることを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】角膜の曲率増加によって引き起こされる近視のために、眼に進入する光が網膜上で焦点を結ばないことを示す概略図である。
【図１Ｂ】それぞれ、正常な角膜（Ａ）および円錐角膜の角膜（Ｂ）の図である。（Ｃ）重度の円錐角膜のシャインプルーフ画像。中央角膜に有意な角膜の菲薄化が認められる。
【図２】器官型切片培養の設定。
【図３】成獣雄ウィスターラットの眼に増殖因子点眼薬が点眼される。
【図４】ラットの眼を撮像するために特別に設定されたＰｈｏｅｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶ  ｉｎ  ｖｉｖｏ眼球撮像システム。
【図５】（Ａ）ナノインデンターシステム、（Ｂ）角膜の弾性およびヒステリシスを算出するために用いられる、インデンテーションプロセスの間に得られた典型的な荷重変位曲線の概略図である。Ｐｍａｘ＝印加される最大荷重、ｈｍａｘ＝押し込み深さ、ｈｃ＝接触深さ（先端部と試料との間の接触高さ）、ｈｆ＝最終深さ、Ｓ＝除荷剛性。
【図６】ヒト角膜ボタン（Ａ）およびラット眼球（Ｂ）を保持するように設計されたナノインデンテーションの装備。顕微鏡を使用することによって角膜の中央部分の位置出しを行い（Ｃ）、位置出ししてからインデンタープローブを使用する（Ｄ）。
【図７】軟骨形成分化培地に播種された角膜実質細胞。ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンを含有する軟骨形成分化培地で３週間培養した角膜実質細胞は球を形成し、それを（Ａ）球の周辺部はネスチン、（Ｂ）コア内はＩＩ型コラーゲンを用いて標識した。次いで、培養培地を、線維芽細胞増殖培地を含有する血清と１週間交換し、球から細胞を広がらせ、皿に集合させた（Ｃ）。単層中の細胞がＩＩ型コラーゲンに陰性であったのに対し、細胞クラスターはＩＩ型コラーゲンには陽性のままであった（Ｄ）。
【図８】線維芽細胞増殖培地を含有する血清に播種された角膜実質細胞。対照線維芽細胞増殖培地で３週間培養した角膜実質細胞は、ネスチン（Ａ）およびＩＩ型コラーゲン（Ｂ）に陰性であった。コンフルエントな線維芽細胞を、次いで、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンを含有する軟骨形成分化培地で３週間培養した（Ｃ）。細胞は、ＩＩ型コラーゲンに陰性のままであった（Ｄ）。（Ｅ）軟骨形成分化培地中のコンフルエントな線維芽細胞のペレット培養物。３週間培養した後、細胞ペレットを切片化したところ、角膜実質細胞マーカーであるケラトカンに陽性に標識され（Ｆ）、軟骨細胞特異的ＩＩ型コラーゲンには陰性であった（Ｇ）。
【図９】対照培地（Ａ）および（Ｄ）で２週間培養したヒト角膜切片は、それぞれ、ＩＩ型コラーゲンには陰性であり、Ｉ型コラーゲンには陽性であった。１週間（Ｂ）および（Ｅ）ならびに２週間（Ｃ）および（Ｆ）、軟骨形成分化培地中で培養したヒト角膜切片を、ＩＩ型コラーゲン（Ｂ）および（Ｃ）ならびにＩ型（Ｅ）および（Ｆ）について標識した。２週間処理した角膜切片においてＩＩ型コラーゲンに対する強い標識が見られたのに対し、１週間のみ処理した切片は、ＩＩ型コラーゲンに陰性であった。軟骨形成分化培地中で両方の期間培養した切片は、対照処理切片と比較するとあまり強くは標識されなかったが、未処理角膜のＩ型コラーゲンには陽性であった。
【図１０】ヒト角膜切片を（Ａ）対照培地および（Ｂ）軟骨形成分化培地で２週間培養し、ＩＩ型コラーゲンについて標識した。図９によって示されるように同様の結果が得られた。（Ｃ）未処理の角膜と、（Ｄ）および（Ｅ）ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンで処理したラットの角膜においてＩＩ型コラーゲンが広く標識されている処理した角膜とを示すＩｎ  ｖｉｖｏ実験。角膜の前（上）部により強い標識が見られた（Ｄ）。ＩＩ型コラーゲンは繊維状に見え、ＥＣＭ全体に均一に分布されていた。
【図１１】対照培地（Ａ）、（Ｃ）、および（Ｅ）、ならびに軟骨形成分化培地（Ｂ）、（Ｄ）、および（Ｆ）中で２週間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養し、ＩＩ型コラーゲン（Ａ）および（Ｂ）、ならびにビメンチン（Ｃ）〜（Ｆ）についてそれぞれ標識された円錐角膜の角膜ボタンである。正常なヒト角膜における標識と比較して、処理した円錐角膜の角膜（Ｂ）におけるＩＩ型コラーゲンの標識は弱かった。しかしながら、ＩＩ型コラーゲンの沈着は、以前に正常なヒトおよびラットの角膜のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ処理後に見られたパターンと類似していた。円錐角膜の角膜の未処理の半分である（Ｃ）および（Ｅ）と比較して、円錐角膜のボタン（Ｄ）および（Ｆ）の処理した半分における線維芽細胞集団は数が増加し、角膜実質細胞は、多数の長い細胞突起を有し、より健康かつ無傷に見えた（Ｆ）。
【図１２】Ｅｘ  ｖｉｖｏ培養したヒト円錐角膜の角膜を、対照培地（Ａ）および（Ｃ）、ならびに軟骨形成分化培地（Ｂ）および（Ｄ）中で３週間培養し、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）（Ａ）および（Ｂ）、ならびにＩＩＩ型コラーゲン（Ｃ）および（Ｄ）について標識した。軟骨形成分化培地中で培養した角膜と比較して、対照培地（Ａ）中で培養した角膜の実質層におけるαＳＭＡにより強い標識が認められた。２つの培地のうちのいずれかで培養した角膜は、ＩＩＩ型コラーゲンには陽性に標識されなかった。
【図１３】ｉｎ  ｖｉｖｏ処理した角膜の角膜透明性。処理した角膜（Ａ）および（Ｃ）、ならびに未処理の角膜（Ｂ）および（Ｄ）。３週間後、処理および未処理の角膜は互いに区別することができなかった。角膜（Ａ）および（Ｂ）の正面図から、光が容易に通過して眼の裏側の血管が非常に鮮明に見える、透明な角膜が明らかにされている。８週目の角膜断面のｉｎ  ｖｉｖｏ画像から、光が容易に通過する、透明な、透き通った角膜が明らかにされている。角膜の混濁または瘢痕の徴候は認められなかった。
【図１４】ｉｎ  ｖｉｖｏで処理した角膜におけるＩＩ型コラーゲン（Ａ）およびＩ型コラーゲン（Ｂ）の定量的遺伝子発現。１週間の処理後、ＩＩ型コラーゲンの発現には初期の増加が見られた。処理を中止すると、ＩＩ型コラーゲンの発現に著しい低下が見られた（Ａ）。天然の角膜Ｉ型コラーゲンの発現も、最初は上方制御されたが、長期処理したところ（最長７週間）、その発現は、未処理の対照角膜に相当するものであった（Ｂ）。
【図１５】１週間ｉｎ  ｖｉｖｏで処理した角膜と未処理の角膜との比較は、硬度（Ｈ）、および弾性率（Ｅｒ）の低下に有意差を示さなかった。
【図１６】２匹のラットからの３週間ｉｎ  ｖｉｖｏで処理した角膜および未処理の角膜について得られた荷重変形曲線。プロットした値を含む対応するグラフは、処理した角膜における弾性率（Ｅｒ）および硬度（Ｈ）の増加を明らかに示している。
【図１７】８週間処理したおよび対照ヒト円錐角膜の角膜との弾性率および硬度の比較は、処理した角膜の両方におけるパラメータの著しい増加を明らかにしている。
【図１８】ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞リプログラミングと、治療中に所望の角膜形状を保持するための剛性コンタクトレンズとを組み合わせることによってヒツジの眼の角膜を再形成する。
【図１９】（Ａ）Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶ眼撮像システム。この撮像システムは、角膜の厚さ、曲率、および透明性の測定を可能にする。（Ｂ）ＯＣＴアタッチメントは、本明細書に示される画像と同様に、前眼部の可視化、ならびに角膜の厚さおよび完全性の測定を可能にする。ヒツジにおける角膜の生体力学をｅｘ  ｖｉｖｏで評価するために使用される（Ｃ）ナノインデンター、および（Ｄ）その設定の概略図。出力は、荷重変位曲線として示され、弾性ヤング率を得るため、および硬度の尺度を得るために分析され得る。ヒツジのような大動物では、角膜の厚さ（Ｅ）はミクロンで示され、角膜の曲率測定値（Ｆ）は、携帯用Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）を使用して得られる。角膜の曲率（Ｆ）の場合、広く間隔の開いた色輪郭は大きな曲率半径を意味し、より狭い輪郭は、急な曲率の領域を意味する。数字は、各点の曲率半径を示す。
【図２０】デキサメタゾンと組み合わせたＴＧＦβ３のみが、ＩＩ型コラーゲンの沈着をもたらした。ヒツジ角膜組織を、（Ａ）ＢＭＰ６、（Ｂ）ＢＭＰ６＋ヒドロコルチゾン、（Ｃ）ＴＧＦβ３＋ヒドロコルチゾン、（Ｄ）ＢＭＰ６＋デキサメタゾン、（Ｅ）ＴＧＦβ３＋プレドニゾン、（Ｆ）ＴＧＦβ３＋Ｔｒｉｅｓｅｎｓｅ（登録商標）、（Ｇ）および（Ｈ）それぞれ２０×および６０×の倍率のＴＧＦβ３＋デキサメタゾン中で培養し、軟骨特異的ＩＩ型コラーゲンについて標識した。
【図２１】ＴＧＦβ３デキサメタゾンとの組み合わせに関する用量反応試験。ヒツジ角膜を３週間培養し、ＩＩ型コラーゲンについて標識した。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下の説明は、多数の例示的な構成、パラメータ等を記載する。しかしながら、そのような説明は、本発明の範囲に対する制限であることを意図するものではなく、代わりに、例示的な実施形態の説明として提供されるということを認識されたい。
【００５９】
定義
本発明の説明、態様、実施形態、および実施例における本明細書の例の各々において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の用語は、制限なく、包括的に理解されるものとする。したがって、文脈上、明らかに別段の要求がない限り、本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む」、「含んでいる」等の語は、排他的な意味ではなく、包括的な意味で、すなわち、「限定されないが、〜を含む」の意味に解釈されるべきである。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「強化」は、角膜組織（例えば、実質層）を含む角膜の厚さ、硬度、弾性率、引張強度、および規則性のうちの１つ以上を増加させる方法を指す。強化は、角膜に特定の形状、すなわち、角膜の曲率を付与するために用いられ得る。強化方法は、眼または角膜の特定の条件の存在下または非存在下で行われ得る。強化は、角膜の細胞外マトリックス中の構成成分（例えば、ＩＩ型コラーゲン）の増加を含み得る。強化はまた、角膜の細胞（例えば、角膜実質細胞）の数を増加させることも含み得る。細胞の数は、例えば、そのような細胞の増殖状態を静止状態から活動状態に変化させることによって増加させてもよい。
【００６１】
「同時投与」または「同時投与する」は、薬剤、例えば、眼の治療薬の併用を指し、共製剤（すなわち、複合製剤）の投与、および別々の製剤の同時投与または連続投与を含む。同様に、「〜と併せて」は、治療用組成物と治療デバイス／手順との併用を指す。これは、デバイス／手順の使用に先行する、デバイス／手順と同時の、および／またはデバイス／手順の使用後の、組成物の使用を含むことができる。
【００６２】
角膜の「状態」は、角膜の疾患、欠陥、損傷、傷害、変性、または機能不全の状況を指す。状態は、角膜組織（例えば、実質層）または角膜細胞（例えば、角膜実質細胞）に影響を及ぼし得る。状態は、急性の状態、例えば、擦過傷もしくは潰瘍症であり得るか、または慢性の状態、例えば、円錐角膜もしくは近視であり得る。
【００６３】
本明細書で使用される「角膜」は、虹彩、瞳孔、および前眼房を覆う眼の透明な前の部分を指す。これは、角膜上皮、ボーマン層、角膜実質、デスメ膜、および角膜上皮を含む。特に興味深いのは、角膜の実質層（固有質とも称される）であり、角膜実質細胞とともに規則的に配置されたコラーゲン線維の細胞外マトリックスを含む。
【００６４】
化学誘導体に関連する「誘導体」は、化学的に修飾されている化合物を指す。本開示は、本明細書に記載の化合物の各々だけでなく、元の化合物の塩、水素化物、エステル、および他の修飾等の化学修飾形態を含む、それらの任意の誘導体も包含する。
【００６５】
ポリペプチドに特に関連して本明細書で使用される「単離された」は、その天然の環境から分離された分子を指す。単離された分子は、生化学的技術、組換え技術、および合成技術を含む、当該技術分野で既知であり使用されている任意の方法または方法の組み合わせによって得ることができる。単離された構成成分を得るために、ポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップまたは濃縮ステップによって調製されてもよい。特に興味深いのは、人工的な手段、すなわち、非自然的な手段によって得られるポリペプチドおよびペプチドである。これは、限定されないが、合成化学、組換え技術、精製プロトコル等を含む。天然、組換え、または合成の源から単離されたポリペプチドが含まれる。また、化学合成によって、またはプラスミド、ベクター、もしくは細胞翻訳系または無細胞翻訳系に導入され得る他の発現構築物によって産生されるポリペプチドも含まれる。そのようなポリペプチドは、ヒトの介在なしで、天然に存在するポリペプチドとは明らかに区別される。
【００６６】
「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語（例えば、配列番号１）、および他のそのような用語は、簡潔にするために、本明細書に記載される分子を指す。そのような用語は、これらの分子の完全な特徴を提供することを意味するものではない。したがって、タンパク質またはポリペプチドは、特定のアミノ酸配列、特定の二次元的表現の構造を有するものとして本明細書において特徴付けられてもよいが、請求される実際の分子は、三次元構造、ある特定の結合についての移動度、および全体として分子の他の特性を含む他の特徴を有することを理解されたい。本開示に包含されるのは、分子自体および全体としてのそれらの特性である。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【００６７】
ＴＧＦβ３「ポリペプチド」は、任意の源から得られたポリペプチド、例えば、単離された天然に存在するポリペプチド、組換えポリペプチド、および合成ポリペプチドを指し、天然に存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドだけではなく、本明細書に詳述されるように、変異アミノ酸配列およびそのような配列の断片を有するポリペプチドも含む。ＴＧＦβ３はまた、当該技術分野において、形質転換増殖因子−β３、ＴＧＦＢ３、ＡＲＶＤ、およびＦＬＪ１６５７１とも称され得る。
【００６８】
アミノ酸の「配列同一性」は、２つ以上のポリペプチドのアミノ酸対アミノ酸の比較を指す。試験配列は、基準配列（すなわち、１００％の同一性を共有する）に対して同一であり得るか、または１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。好ましい態様において、アミノ酸置換は、基準アミノ酸と比較して、電荷または疎水性等の類似する化学特性および／または物理特性を有し得る。配列同一性は、典型的には、最も高い相同性の領域における配列アライメントによって決定され得る。配列アライメントアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）配列アライメントプログラムは、当該技術分野において周知であり、広く使用されている。配列アライメントに基づいて、比較されたポリペプチド配列間のパーセント同一性を決定することができる。
【００６９】
本明細書で使用される「屈折異常」は、眼による光の集束における欠陥を指す。屈折異常は、球面異常および円柱異常を含み得る。低次収差および高次収差の両方が含まれる。特に屈折異常として含まれるのは、近視、遠視、乱視、不同視、および老視として知られる眼の状態である。
【００７０】
角膜に関連する「再生」は、角膜（角膜組織（例えば、実質層）を含む）の形状、厚さ、規則性、硬度、弾性率、および引張強度のうちの１つ以上の復元を指す。再生の方法は、角膜に特定の形状、すなわち、角膜の曲率を付与するために用いられ得る。再生方法は、眼または角膜の特定の条件の治療において行われ得る。再生は、角膜の細胞外マトリックス中の構成成分（例えば、ＩＩ型コラーゲン）の増加を含み得る。再生はまた、角膜の細胞（例えば、角膜実質細胞）の数を増加させることも含み得る。細胞の数は、例えば、そのような細胞の増殖状態を静止状態から活動状態に変化させることによって増加させてもよい。
【００７１】
例えば、角膜細胞（例えば、角膜実質細胞）に関して、細胞の「リプログラミング」は、分化の状態における変化を指す。リプログラミングは、細胞形態、細胞の遺伝子発現（例えば、Ｉ型コラーゲンおよび／もしくはＩＩ型コラーゲンの発現を含むコラーゲンの発現）、または細胞増殖状況（例えば、静止状態もしくは活動状態）における１つ以上の変化に関連する。
【００７２】
「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物を指す。
「予防すること」は、ある状態、例えば、眼の状態、または具体的には角膜の障害もしくは他の欠陥等の角膜の状態の発症を停止することまたは遅延させることを指す。予防措置は、状態の１つ以上の症状の停止もしくは遅延をもたらすか、またはそのような症状が生じた場合はそれを軽減する。角膜の状態の予防は、本明細書に詳述されるように、角膜の強化を含み得る。
【００７３】
「治療すること」は、ある状態、例えば、眼の状態、または具体的には角膜の障害もしくは他の欠陥等の角膜の状態を軽減する、改善する、または解消することを指す。治療は、状態の１つ以上の症状の軽減、改善、または排除をもたらす。角膜の状態の治療は、本明細書に詳述されるように、角膜の再生を含み得る。本発明の組成物および方法は、本明細書に詳述されるように、種々の状態を治療するため、種々の状態を予防するため、または種々の状態を治療および予防するために使用され得る。
【００７４】
細胞および組織の再生
細胞および組織の再生技術は、治療処置における大きな期待が見込める。本明細書に開示されるように、本発明者は、角膜組織におけるＩＩ型コラーゲンの発現および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の沈着に影響を及ぼすために、ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞リプログラミングを用いて細胞を改変するための組成物および方法を開発した。これは、今度は眼の角膜を強くするおよび／または強化するために使用される。本発明者は、そうすることにより、角膜実質マトリックスのｉｎ  ｓｉｔｕ／ｉｎ  ｖｉｖｏでの再生および強化のための特有のアプローチを提供する。
【００７５】
したがって、開示される方法は、近視および円錐角膜を含む種々の角膜の状態のためのｉｎ  ｖｉｖｏ組織工学治療に用いられ得る。前述のように、近視は、角膜の過度な曲率によって特徴付けられ（図１Ａ）、円錐角膜は、角膜の菲薄化という特徴的パターンに至る進行性の拡張性角膜ジストロフィである（図１Ｂ；Ｒｏｍｅｒｏ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｓａｎｔｏｄｏｍｉｎｇｏ−Ｒｕｂｉｄｏ，＆Ｗｏｌｆｆｓｏｈｎ  ２０１０より出典の画像）。
【００７６】
角膜実質細胞は、比較的静止状態にあり、通常は線維芽細胞または筋線維芽細胞表現型に転換したときに、大量の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を産生するのみである。これらの表現型に関連するＥＣＭの沈着は、通常、角膜線維症および透明性の喪失を引き起こす（Ｋａｄｌｅｒ，Ｂａｌｄｏｃｋ，Ｂｅｌｌａ，＆Ｂｏｏｔ−Ｈａｎｄｆｏｒｄ  ２００７）。軟骨を構成する細胞である軟骨細胞は、角膜に見出されるＩ型に類似する線維性コラーゲンであるＩＩ型コラーゲンを分泌する。ＩＩ型コラーゲンはまた、ニワトリ角膜の発生中に角膜実質細胞によっても発現されるが、これは後に成熟ニワトリ角膜実質内のＩ型によって置き換えられる（Ｌｉｎｓｅｎｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。
【００７７】
本発明者は、成人ヒトおよびラットの角膜からのストローマ細胞を、増殖因子を特定する神経細胞系統で処理したときにニューロン特異的タンパク質を産生するようにリプログラミングすることができることを以前に示した（Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。このデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で増殖因子環境を調節するだけで、成人細胞集団をリプログラミングすることができることを示している。
【００７８】
次に、本明細書において実証されるように、本発明者は、形質転換増殖因子β３（ＴＧＦβ３）およびデキサメタゾンで細胞を処理することにより軟骨特異的線維性コラーゲンであるＩＩ型コラーゲンを産生するように、角膜実質の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで誘導することができることを示す（実施例８および９）。具体的には、本発明者は、ヒト円錐角膜の角膜生検において、角膜実質細胞がこれら２つの化合物で処理されたときに、ＩＩ型コラーゲンを発現することを実証した（実施例８）。さらに、動物試験を用いて、本発明者は、ＩＩ型コラーゲンの沈着を刺激するために、点眼薬を使用してＴＧＦβ３およびデキサメタゾンの２つの化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで送達できることを実証した（実施例９）。特に、ＩＩ型コラーゲンの沈着は均一であり、線維症または瘢痕を伴わず、かつ角膜の透明性に影響を及ぼすことなく、角膜の生体力学を改善した（実施例１１および１３）。
【００７９】
理論に拘束されることを望むものではないが、コラーゲン沈着は、角膜実質内の細胞を軟骨細胞表現型にリプログラミングすることによってもたらされると仮説が立てられる。軟骨細胞は、角膜に見出されるＩ型に類似する線維性コラーゲンであるだけではなく、ニワトリ角膜の発生中にも発現されるＩＩ型コラーゲンを分泌することが分かっている（Ｌｉｎｓｅｎｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。これは後に成熟した角膜実質内のＩ型コラーゲンによって置き換えられる（Ｌｉｎｓｅｎｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。
【００８０】
本明細書に記載される結果において、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンで角膜実質細胞を処理したところ、Ｉ型コラーゲンの発現における初期の増加が観察された（実施例１２）。しかしながら、本発明者は、観察されたレベルのＩ型コラーゲンの沈着は、角膜を硬化／再形成するには不十分であると考える。さらに、ＩＩ型コラーゲンの沈着は、治療戦略としてより実現可能であると見なされる。ＩＩ型コラーゲンは、例えば、円錐角膜の角膜に存在する酵素による酵素分解の影響を受けにくいことに留意されたい。
【００８１】
本発明者の結果によれば、角膜実質細胞のリプログラミングを用いて、角膜の生体力学的特徴を改善するための有効な処置として新しいＥＣＭ分子を産生することが可能である。このアプローチは、前述のような角膜の酵素による分解に対する感受性を低下させるため、有利であると考えられる。開示される治療モジュールは、角膜を安定させることのみを目的とするのではなく、種々の角膜の状態および眼の屈折異常を含む眼の状態に対する治療補助を提供することも目的としている。したがって、本発明の方法は、例えば、拡張性角膜における円錐角膜の角膜実質細胞の治療のために使用され得る。さらに、本発明の方法は、本明細書に詳述されるように、近視および種々の他の角膜の状態の治療に使用され得る。
【００８２】
眼および角膜に影響を及ぼす状態
本明細書に記載の組成物は、角膜（例えば、実質層）および角膜細胞（例えば、角膜実質細胞）の再生または強化において特に有用である。組成物は、角膜の菲薄化、脆弱化、細胞喪失、組織喪失、マトリックス喪失、コラーゲン喪失、および／または不整形に対応するために使用され得る。このように、本明細書に記載の組成物は、角膜の欠陥、疾患、損傷、傷害、および／または変性、ならびに眼の屈折異常に関与する状態を含む、眼に影響を及ぼす種々の状態に用いることができる。
【００８３】
具体的な態様において、本発明は、角膜の欠陥を治療するための方法を包含する。ある特定の状況において、本発明の方法は、角膜の欠陥を予防するためにも使用され得る。欠陥は、特定の角膜の状態に関連している場合がある。例示的な状態は、本明細書に詳述されるような円錐角膜、ならびに球状角膜、ペルーシド角膜辺縁変性、および後部円錐角膜等の角膜拡張症を含む関連する状態を含む（例えば、Ａｒｆｆａ  １９９７；Ｋｒａｃｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８４；Ｒａｂｏｎｉｔｚ  ２００４；Ｊｉｎａｂｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０を参照）。近視、老視、ならびに正乱視および不正乱視を包含する乱視も、欠陥として特に含まれる。角膜の先天性欠陥もまた含まれる。その中には、扁平角膜および小角膜が含まれ、後者は、胎児性アルコール症候群、ターナー症候群、エーラース・ダンロス症候群、ヴァイユ・マルケザーニ症候群、ワールデンブルグ症候群、ナンス・ホーラン症候群、およびコルネリア・デ・ランゲ症候群に関連し得る。エーラース・ダンロス症候群ＩＶ型に関連し得る球状角膜（前述）もまた含まれる。
【００８４】
さらなる態様において、本発明は、角膜の損傷または変性を治療するための方法を包含する。ある特定の状況において、本発明の方法は、角膜の損傷を予防するために使用され得る。損傷または変性は、角膜の特定の状態に関連し得る。特に含まれるのは、角膜融解、例えば、関節リウマチ等の炎症性疾患に関連する角膜融解である。他の例示的な状態は、角膜炎、例えば、辺縁角膜炎、角膜実質角膜炎、兎眼性角膜炎、神経栄養性角膜炎、糸状角膜炎、酒さ性角膜炎、ウイルス性角膜炎（ヘルペス角膜炎を含む）、真菌性角膜炎、原虫性角膜炎、ならびに他の感染性角膜炎、例えば、梅毒性角膜実質炎、微胞子虫による角膜炎、タイゲソン角膜炎、および感染性結晶状角膜症を含む。末梢潰瘍性角膜炎（ＰＵＫ）とも称される潰瘍性角膜炎も含まれ、これは、関節リウマチ、ウェゲナー肉芽腫症、全身性エリテマトーデス、再発性多発軟骨炎、および結節性多発動脈炎等の全身性疾患に関連する潰瘍性角膜炎を含む。眼内炎も含まれる。また、慢性角膜浮腫、モーレン潰瘍、角膜縁凹窩、フリクテン症、テリエン周辺変性症、ザルツマン変性症、球状変性症、およびフックスジストロフィも含まれる。そのような状態は、当該技術分野において周知であり、十分に特徴付けられている。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ２００８；Ｄｅｎｎｉｓｔｏｎ  ２００９；およびＷｉｌｌｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．２０００を参照されたい。さらには、角膜実質ジストロフィ、例えば、格子状角膜実質ジストロフィ（例えば、１型および２型）、顆粒状角膜ジストロフィ（例えば、１型および２型）、斑状角膜ジストロフィ、シュナイダー角膜ジストロフィ、先天性角膜実質ジストロフィ、および斑点状角膜ジストロフィが含まれる。
【００８５】
さらなる態様において、本発明は、角膜に対する傷害を治療するための方法を包含する。物理的損傷、化学的損傷、照射損傷、および／または特定の薬物による損傷による傷害が含まれる。傷害は、角膜擦過傷、角膜びらん、角膜穿刺、膜破裂、角膜瘢痕、または角膜潰瘍（融解性潰瘍、無痛潰瘍、および表在性潰瘍を含む）に関連し得る。手術創、放射状角膜切開後の角膜損傷、および遷延性上皮欠損を含む角膜形成術後の急性期の問題を含む、眼の手術に関連する傷害および他の損傷もまた含まれる。さらに、角膜融解、例えば、眼の手術または他の治療（例えば、局所ＮＳＡＩＤ投与）後の角膜融解に関連する傷害が含まれる。角膜融解は、感染性、炎症性、または栄養性の原因に起因し得る。加齢に関連する角膜の傷害および損傷もまた含まれる。
【００８６】
さらなる態様において、本発明は、眼の屈折異常を治療または予防するための方法を包含する。そのような屈折異常は、近視、遠視、老視、不同視、高次収差、および種々の乱視を含む特定の状態に関連し得る。高次収差は、限定されないが、昏睡、トレフォイル、クアドラフォイル（ｑｕａｄｒａｆｏｉｌ）、球面収差、および数学的表現（例えば、ゼルニケ多項式）によって特定される収差を含む。
【００８７】
角膜の状態は、フルオレセイン染色を含む種々の方法によって診断され得、該染色は、ザイデル試験、鏡面反射顕微鏡、角膜トポグラフィー、等尺性断層撮影（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、角膜厚測定、超音波、細隙灯、角膜擦過細胞診、および生検を含み得る。診断は、視力および／または混濁の評価も含み得る。角膜の状態は、疼痛、羞明、異物感、視力低下、浮腫、白血球浸潤、フルオレセイン取り込み、血管新生、充血、ならびに頭痛、悪心、および疲労等の全身症状のうちの１つ以上の症状に関連し得る。同様に、屈折異常の症状は、限定されないが、視力低下、ならびに霧視、複視、かすみ目、眼精疲労、異物感、問題のあるグレアまたはハロ、飛蚊症、ゴースト像、夜間視力障害、斜視、過度の凝視、瞬き過多、頭痛、眼をこすること、眼の疲れ、眼の表面の乾燥、眼刺激、充血、および眼の痙攣を含んでもよい。
【００８８】
治療用組成物
前述のように、本明細書に記載の組成物は、角膜に影響を及ぼす状態および眼の屈折異常を含む、種々の眼の状態を治療および／または予防するために用いられ得る。組成物は、デキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤とともに、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を含んでもよい。
【００８９】
種々の態様において、組成物は、記載される構成成分（ＴＧＦβ３ポリペプチド（またはその変異体もしくは断片）とデキサメタゾン（またはその誘導体もしくは関連ステロイド剤））との組み合わせを含むように製剤化されてもよいか、あるいは、第１の構成成分（ＴＧＦβ３ポリペプチド（またはその変異体もしくは断片）または代替としてデキサメタゾン（またはその誘導体もしくは関連ステロイド剤））と、投与前に加えられる第２の構成成分とを含むように製剤化されてもよい。代替として、組成物は、第２の構成成分を含む製剤との同時投与または連続投与において使用される、第１の構成成分（ＴＧＦβ３ポリペプチド（またはその変異体もしくは断片）または代替としてデキサメタゾン（またはその誘導体もしくは関連ステロイド剤））を含むように製剤化されてもよい。
【００９０】
一態様において、ＴＧＦβ３ポリペプチドは、少なくとも下記のアミノ酸配列を含んでもよい：ＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮ  ＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬ  ＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷ  ＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹ  ＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹ  ＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴ  ＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰ  ＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰ  ＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹ  ＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱ  ＬＳＮＭＶＶＫＳＣＫ  ＣＳ（配列番号１）（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＣＡＲ７００８８．１）。ＴＧＦβ３ポリペプチドは、少なくとも上に示す１１２個のアミノ酸を含むことができ、２５．５ｋＤａの分子量を有してもよい。代替として、ＴＧＦβ３ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＣＡＡ３３０２４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３３０２４、またはＮＣＢＩ基準配列ＮＰ＿００３２３０．１中に特定される前駆体ポリペプチド配列のアミノ酸６４４〜８５０（２０７個のアミノ酸）に由来してもよい。
【００９１】
他の態様において、ＴＧＦβ３の変異体または断片が用いられてもよい。例えば、変異体または断片は、配列番号１に対して少なくとも７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは、本明細書に記載される配列番号１に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％の配列同一性を示し得る。ＴＧＦβ３の変異体が、生物学的活性、例えば、非変異ポリペプチドと比較して同様であるかまたは改善された活性を示す場合に特に興味深い。
【００９２】
さらなる態様において、特定の断片が用いられてもよい。例えば、ＴＧＦβ３断片は、配列番号１の少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも８５個のアミノ酸、より好ましくは、配列番号１の少なくとも９０個のアミノ酸、少なくとも９１個のアミノ酸、少なくとも９２個のアミノ酸、少なくとも９３個のアミノ酸、少なくとも９４個のアミノ酸、少なくとも９５個のアミノ酸、少なくとも９６個のアミノ酸、少なくとも９７個のアミノ酸、少なくとも９８個のアミノ酸、少なくとも９９個のアミノ酸、最も好ましくは、配列番号１の１００個のアミノ酸、少なくとも１０１個のアミノ酸、少なくとも１０２個のアミノ酸、少なくとも１０３個のアミノ酸、少なくとも１０４個のアミノ酸、少なくとも１０５個のアミノ酸、少なくとも１０６個のアミノ酸、１０７個のアミノ酸、１０８個のアミノ酸、１０９個のアミノ酸、１１０個のアミノ酸、または１１１個のアミノ酸を含んでもよい。特に興味深いのは、ＴＧＦβ３の機能的断片であり、例えば、生物学的活性、例えば、基準ポリペプチドと比較して同様であるかまたは改善された活性を示す断片である。
【００９３】
特定の態様において、ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片は、組換えポリペプチドとして提供されてもよい。例えば、当該技術分野において広く知られかつ使用されているように、ポリペプチドは、細胞または細胞不含発現系において発現させてもよい。これらには、細菌、真菌、植物、および哺乳動物発現系が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、およびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ細胞を用いた発現系は、特に含まれる。ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片は、ヒトまたは非ヒト発現系において発現されるヒト組換えポリペプチドとして提供されてもよい。ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片は、既知の方法に従って、ジスルフィド結合したホモ二量体の非グリコシル化ポリペプチド鎖として提供されてもよい。
【００９４】
ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片は、周知のクロマトグラフィー技術を含む標準的な方法によって組換え発現系から単離されてもよい。ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片は、ポリペプチドの切断、単離、および／または局在化を促進するための配列タグを含んでもよい。本発明によれば、ＴＧＦβ３ポリペプチドは、種々の商業的供給源から得られてもよい。例えば、組換えヒトＴＧＦβ３は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号２４３−Ｂ３−００２；２４３−Ｂ３−０１０）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．（カタログ番号４３４４−５００；４３４４−５０；４３４４−５）、またはＰｒｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ（カタログ番号ＣＹＴ−１１３；ＣＹＴ−３１９）から得られてもよい。
【００９５】
ＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片の生物学的活性は、広く知られかつ使用されている方法に従って測定されてもよい。例えば、生物学的活性は、ポリペプチドがミンク肺上皮細胞（Ｍｖ１Ｌｕ）の増殖を阻害する能力によって培養中に測定されてもよい（例えば、Ｐｒｅｍａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．２００６を参照）。この測定による例示的な活性は、≦５０ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０によって示される。代替として、生物学的活性は、マウスＨＴ−２細胞のＩＬ−４誘導性の増殖（ＩＬ−２の存在下でヒツジ赤血球によって活性化されるＢＡＬＢ／ｃ脾臓）の用量依存性阻害によって測定されてもよい（例えば、Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９５を参照）。この測定による例示的な活性は、典型的には０．１〜０．５ｎｇ／ｍｌである。代替として、本明細書に記載の薬剤の組み合わせを含む組成物は、以下に記載される方法を用いて生物学的活性について測定されてもよい。例えば、角膜実質細胞におけるＩＩ型コラーゲン（例えば、ＩＩ型コラーゲン、α１）の誘導は、免疫組織化学アッセイ、タンパク質アッセイ、ウェスタンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析、および定量的ＰＣＲ技術のうちの１つ以上によって評価され得る。
【００９６】
本明細書に記載されるように、組成物はまた、デキサメタゾン、その誘導体、および／または関連ステロイド剤も含んでもよい。デキサメタゾンは、以下の化学構造を有するとして特徴付けられる。
【００９７】
【化１】
2018513117.tif 000003
【００９８】
デキサメタゾンの商品名は、例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）、Ｄｅｘａｓｏｎｅ（登録商標）、Ｄｉｏｄｅｘ（登録商標）、Ｈｅｘａｄｒｏｌ（登録商標）、Ｍａｘｉｄｅｘ（登録商標）、およびＭｉｎｉｍｓ（登録商標）を含む。
【００９９】
種々の態様において、その任意のエステルおよび塩を含むデキサメタゾンの誘導体が使用されてもよい。例示的な誘導体は、限定されないが、デキサメタゾン−１７−アセテート（ＣＡＳ参照番号：１１７７−８７−３）、リン酸デキサメタゾン二ナトリウム（ＣＡＳ参照番号：２３９２−３９−４）、デキサメタゾン吉草酸エステル（ＣＡＳ参照番号：１４８９９−３６−６）、デキサメタゾン−２１−イソニコチン酸エステル（ＣＡＳ参照番号：２２６５−６４−７）、デキサメタゾンパルミチン酸エステル（ＣＡＳ参照番号：３３７５５−４６−３）、デキサメタゾンプロピオン酸塩（ＣＡＳ参照番号：５５５４１−３０−５）、デキサメタゾンアセフラート（ＣＡＳ参照番号：８３８８０−７０−０）、デキサメタゾン−２１−ガラクトシド（ＣＡＳ参照番号：９２９０１−２３−０）、デキサメタゾン２１−チオピバレート、デキサメタゾン２１−チオペンタノエート、デキサメタゾン２１−チオール−２−メチル−ブタノエート、デキサメタゾン２１−チオール−３−メチル−ブタノエート、デキサメタゾン２１−チオヘキサノエート、デキサメタゾン２１−チオール−４−メチル−ペンタノエート、デキサメタゾン２１−チオール−３，３−ジメチル−ブタノエート、デキサメタゾン２１−チオール−２−エチル−ブタノエート、デキサメタゾン２１−チオオクタノエート、デキサメタゾン２１−チオール−２−エチル−ヘキサノエート、デキサメタゾン２１−チオノナノエート、デキサメタゾン２１−チオデカノエート、デキサメタゾン２１−ｐ−フルオロチオベンゾエートまたはそれらの組み合わせを含む。特に含まれるのは、デキサメタゾンアルコールおよびリン酸デキサメタゾンナトリウムである。ＵＳ４１７７２６８に記載されるように、デキサメタゾン誘導体もまた含まれる。
【０１００】
組成物は、デキサメタゾンの代わりにまたはそれに加えて、関連ステロイド剤を含んでもよい。例えば、他のコルチコイドステロイドが、デキサメタゾンの代わりにまたはそれとともに用いられてもよい。関連ステロイドとしての使用に好ましいのは、Ｃｏｏｐｍａｎ分類によるグループＣのステロイドであり、ベタメタゾン型ステロイド、例えば、デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、ベタメタゾン、リン酸ベタメタゾンナトリウム、およびフルオコルトロンを含む。他の関連ステロイド剤は、限定されないが、フルオロメタロン、ロトプレンドール、メドリゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、リメキソロン、ヒドロコルチゾン、ロドキサミド、またはそれらの任意の誘導体もしくは組み合わせを含む。特に含まれるのは、フルオロメタロンアセテート、フルオロメタロンアルコール、プレドニゾロンアセテート、リン酸プレドニゾロンナトリウム、ロトプレンドールエタボン酸塩、ヒドロコルチゾンアセテート、およびロドキサミドトロメタミンである。本開示の化学物質のいずれに関しても、化学物質は、アセテート形態およびリン酸ナトリウム形態、ナトリウム塩等の種々の修飾形態であり得ることを理解されたい。
【０１０１】
組成物は、例えば、０．０４ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、もしくは０．０４ｎｇ／ｍｌ〜０．４ｎｇ／ｍｌ、もしくは０．４ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、もしくは４〜４０ｎｇ／ｍｌ、もしくは４０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌ、もしくは４０ｎｇ／ｍｌ〜４０００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤、あるいは、約０．０４ｎｇ／ｍｌ、約０．０８ｎｇ／ｍｌ、約０．１２ｎｇ／ｍｌ、約０．４ｎｇ／ｍｌ、約０．８ｎｇ／ｍｌ、約１．２ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ、約１２ｎｇ／ｍｌ、約２４ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約１２０ｎｇ／ｍｌ、約２４０ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約１０００ｎｇ／ｍｌ、約１６００ｎｇ／ｍｌ、約２０００ｎｇ／ｍｌ、約２４００ｎｇ／ｍｌ、約３２００ｎｇ／ｍｌ、もしくは約４０００ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含んでもよい。
【０１０２】
さらなる例として、組成物は、０．４μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌ、もしくは０．４μｇ／ｍｌ〜４μｇ／ｍｌ、もしくは４μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤、あるいは約０．４μｇ／ｍｌ、約０．８μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約１．２μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、もしくは約４０μｇ／ｍｌのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含んでもよい。
【０１０３】
さらなる例として、組成物は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、もしくは０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、もしくは１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤、あるいは約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１０ｍｇ／ｍｌのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含んでもよい。
【０１０４】
組成物は、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、もしくは１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、もしくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、もしくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌのＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、あるいは約１ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、もしくは約１μｇ／ｍｌのＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を含んでもよい。特定の態様において、組成物は、少なくとも４ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片とともに、少なくとも４０ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含んでもよい。
【０１０５】
組成物はまた、１つ以上の抗炎症薬を含んでもよい。例示的な抗炎症薬は、少なくとも、ケトチフェンフマル酸塩、ジクロフェナクナトリウム、フルルビプロフェンナトリウム、ケトルラクトロメタミン、スプロフェン、セレコキシブ、ナプロキセン、ロフェコキシブ、またはそれらの任意の誘導体もしくは組み合わせを含む。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が特に含まれる。組成物は、さらに、１つ以上の麻酔薬を含んでもよい。例示的な麻酔薬は、少なくとも、局所麻酔薬、例えば、プロパラカイン、リドカイン、およびテトラカイン、ならびにそれらの任意の誘導体または組み合わせ等を含む。他の眼用薬剤が組成物に含まれるように選択されてもよい：これらは、治療を受ける対象の状態および必要性に基づいて当業者によって選択され得る。
【０１０６】
本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載されるように、また既知の方法に従って、局所投与のために製剤化され得る。ある特定の状況において、眼内投与が望ましい場合がある。組成物は、眼への投与に適した任意の形態で提供され得る。例示的な製剤は、少なくとも、適切な眼科用ビヒクル中の、溶液、懸濁液、エマルジョン（分散系）、ゲル、クリーム、または軟膏を含む。例えば、組成物は、点眼薬、半固体ゲル、またはスプレーの形態で提供されてもよい。ある特定の態様において、成形コンタクトレンズまたは他の挿入物／インプラントに、本発明の組成物を含浸させることができる。このようにして、対象がコンタクトレンズを着用すると、組成物を連続的に、かつ持続放出様式で角膜に送達することができる。
【０１０７】
眼への局所投与の場合、組成物は、５．０〜８．０のｐＨ範囲で製剤化されてもよい。このｐＨ範囲は、溶液への緩衝液の添加によって達成され得る。製剤は、緩衝溶液中で安定であることが好ましい。すなわち、緩衝液と活性薬剤との間には、例えば、沈殿または凝集による、組成物を不安定にするであろう有害な相互作用は存在しない。組成物は、対象の必要性（例えば、作業上の必要性、休息時間、睡眠等）に応じて、高張性（５％〜４０％、好ましくは約１０、２０、３０、もしくは４０％）または低張性（０％〜５％、好ましくは約１、２、３、もしくは４％）であり得る。高張性組成物（例えば、４０％）は、本明細書に詳述されるように、成形コンタクトレンズと組み合わされる場合に使用され得る。
【０１０８】
組成物は、任意選択的な成分として１つ以上の適切な保存剤を含んでもよい。適切な保存剤は、汚染、例えば、細菌汚染を防止するために加えられてもよい。そのような薬剤は、限定されないが、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、ＥＤＴＡ、ソルビン酸、Ｏｎａｍｅｒ（登録商標）Ｍ、および当業者に既知の他の薬剤、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。そのような保存剤は、典型的には組成物の０．００１重量％〜１．０重量％のレベルで用いられ得る。
【０１０９】
組成物は、任意選択的な共溶媒を含有してもよい。本発明の組成物の構成成分の溶解性は、組成物中の界面活性剤または他の適切な共溶媒によって高めることができる。そのような共溶媒／界面活性剤は、例えば、ポリソルベート２０、６０、および８０、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８、Ｆ−８４、およびＰ−１０３）、シクロデキストリン、チロキサポール、および当業者に既知の他の薬剤、ならびにそれらのあらゆる組み合わせを含む。そのような共溶媒は、典型的には組成物の０．０１重量％〜２重量％のレベルで用いられ得る。
【０１１０】
眼の中への組成物の取り込みを増加するために浸透促進剤が使用されてもよい。例示的な薬剤は、少なくとも、塩化セチルピリジニウム、ラサロシド等のイオノフォア、塩化ベンザルコニウム、パラベン、Ｔｗｅｅｎ  ２０、サポニン、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｂｒｉｊ  ７８、Ｂｒｉｊ  ９８、エチレンジアミン四酢酸、胆汁酸塩および胆汁酸（コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸、およびウルソデオキシコール酸等）、カプリン酸、アゾン、フシジン酸ヘキサメチレンラウリン酸アミド、サポニン、ヘキサメチレンオクタンアミド、およびデシルメチルスルホキシドを含む。
【０１１１】
加えて、組成物と眼との接触を延長するために、眼を覆うムチン膜に接着するための生体接着ポリマーが使用されてもよい。生体接着ポリマーは、多数の親水性官能基を有する巨大分子親水コロイド、例えば、静電相互作用を確立することができるカルボキシ−、ヒドロキシ−、アミド、および硫酸であってもよい。例示的な薬剤は、少なくとも、ポリアクリル酸（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ、Ｃａｒｂｏｐｈｉｌ、およびポリカルボフィル）およびカルボキシメチルセルロースを含む。
【０１１２】
制御放出系もまた使用され得る：そのような系は、ｉｎ  ｓｉｔｕゲル、コロイド粒子、ナノ粒子、および／またはニオソームを含んでもよい。他の薬物送達系は、限定されないが、耐食性眼用挿入物、浸食性眼用挿入物、ハイドロゲル、コラーゲンシールド、リポソーム、薬物充填フィルム（例えば、ＮＯＤ（登録商標））、およびイオン導入法を含む。
【０１１３】
組成物はまた、粘度を増加させるための任意選択的な薬剤も含み得る。活性化合物の眼内吸収を高めるために、製剤を調剤する際の変動を減少させるために、製剤の懸濁液もしくはエマルジョンの構成成分の物理的分離を減少させるために、および／または別様に眼科用製剤を改善するために、単純水溶液の粘度を超えて増加される粘度が望ましい場合がある。そのような粘度上昇剤は、例として、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、当業者に既知の他の薬剤、またはそれらの組み合わせを含む。そのような薬剤は、典型的には組成物の０．０１重量％〜２％重量％のレベルで用いられ得る。
【０１１４】
特定の態様において、組成物は、ゲル化剤、例えば、ゲランガム等の水溶性高分子多糖類を含む。ゲランガムは、種々の商業的供給源から得ることができ、例えば、Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）の商品名で販売されている。特に、Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）ＬＴ１００は、柔らかく弾性のある非脆性ゲルを形成する、細目メッシュの高アシルゲランとして使用され得る。具体的な態様において、ゲランガムに基づく組成物は、０．５％点眼薬として製剤化される。
【０１１５】
他の薬剤が、組成物をさらに安定化するためまたは別様に強化するために使用されてもよい。例えば、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、チロキサポール、硫酸ナトリウム、および／またはヒドロキシエチルセルロースのうちの１つ以上が、組成物をさらに安定化するさらなる有益な効果を有し得る。
【０１１６】
治療方法
上で述べたように、本明細書に記載の組成物は、角膜（例えば、実質層）および角膜細胞（例えば、角膜実質細胞）の再生または強化において特に有用である。具体的には、組成物は、角膜の形状、厚さ、規則性、硬度、弾性率、引張強度、または機能（例えば、屈折）を向上させるために使用され得る。したがって、本明細書に記載の組成物は、種々の角膜の状態および眼の屈折異常に対応するように使用されてもよく、また他の眼の治療の補助治療として使用されてもよい。
【０１１７】
前述のように、組成物は、眼に投与するための任意の適切な手段で製剤化され得る。製剤として含まれるのは、点眼液、クリーム、エマルジョン、軟膏、およびゲルである。点眼薬として作製される製剤には特に留意されたい。特定の態様において、組成物は、多くの種類の市販の点眼薬ディスペンサーのいずれかを使用して点眼薬として投与されてもよい。例示として、本発明の組成物のための容器は、透明、半透明、および不透明であってもよく、ガラス内張り、異物混入防止、１回分または数回分の用量アリコートに梱包されている、およびそれらの任意の組み合わせ等の、他の特性または特性の組み合わせを含み得る。
【０１１８】
組成物は、所望の医学的転帰を達成するために、治療有効量で対象に投与され得る。具体的には、組成物は、本明細書に記載される眼の状態に対応するため、またはそのような状態の１つ以上の症状を少なくとも軽減するための量で投与されてもよい。組成物の正確な投与量（すなわち、量および計画）は、対象および提示される状態に基づいて臨床医によって決定され得る。例示的な製剤（例えば、点眼薬）は、１〜２４回／日、または１〜１２回／日、または１〜６回／日、または１〜４回／日、または１〜３回／日、または１〜２回／日、または１、２、３、４、６、８、１２、１８、もしくは２４回／日投与されてもよい。組成物は、治療される各眼に１滴を入れることによって点眼薬として局所的に適用されてもよい。代替として、２〜３滴が各眼に適用されてもよい。
【０１１９】
記載される組成物の場合、投与量範囲は、例えば、１回の用量につき片目当たり、０．２ｐｇ〜２．４ｎｇ、もしくは２ｐｇ〜２．４ｎｇのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤、あるいは約０．２ｐｇ、約０．４ｐｇ、約０．６ｐｇ、約０．８ｐｇ、約１．２ｐｇ、約２．４ｐｇ、約２ｐｇ、約４ｐｇ、約６ｐｇ、約８ｐｇ、約１２ｐｇ、約１８ｐｇ、約２４ｐｇ、約０．２ｎｇ、約０．２６ｎｇ、約０．４ｎｇ、約０．６ｎｇ、約０．８ｎｇ、約１．２ｎｇ、約１．８ｎｇ、もしくは約２．４ｎｇのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤であってもよい。
【０１２０】
別の例として、投与量範囲は、１回の用量につき片目当たり、１２ｎｇ〜１．３μｇ、または６ｎｇ〜６００ｎｇのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤、あるいは６ｎｇ、約８ｎｇ、約１２ｎｇ、約１６ｎｇ、約１８ｎｇ、約２４ｎｇ、約２６ｎｇ、約３０ｎｇ、約３６ｎｇ、約４０ｎｇ、約４８ｎｇ、約５２ｎｇ、約５４ｎｇ、約６０ｎｇ、約７２ｎｇ、約７８ｎｇ、約８０ｎｇ、約９０ｎｇ、約１２０ｎｇ、約１３０ｎｇ、約１６０ｎｇ、約１８０ｎｇ、約２４０ｎｇ、約２６０ｎｇ、約３００ｎｇ、約３６０ｎｇ、約４００ｎｇ、約４８０ｎｇ、約５２０ｎｇ、約５４０ｎｇ、約６００ｎｇ、約７２０ｎｇ、約７８０ｎｇ、約９００ｎｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤であってもよい。
【０１２１】
さらに他の例として、投与量範囲は、１回の用量につき片目当たり、１．５μｇ〜１５０μｇ、２．６μｇ〜２６０μｇ、もしくは６．５μｇ〜６５０μｇのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤、あるいは約１．５μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４．５μｇ、約６μｇ、約６．５μｇ、約７．５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２２．５μｇ、約３２．５μｇ、約２０μｇ、約２６μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約１２０μｇ、約１３０μｇ、約１５０μｇ、約１８０μｇ、約２２５μｇ、約２４０μｇ、約２６０μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、約３２５μｇ、約４５０μｇ、約６００μｇ、もしくは約６５０μｇのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤であってもよい。特定のデキサメタゾンの製剤は市販されており、それらは許容される投与量および投与計画に従って用いられてもよいことを認識されたい。
【０１２２】
上記デキサメタゾンの投与量のいずれも、例えば、１回の用量につき片目当たり、５ｐｇ〜６５ｎｇ、または０．５ｎｇ〜６５ｎｇのＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、あるいは約５ｐｇ、約１０ｐｇ、約１５ｐｇ、約２０ｐｇ、約３０ｐｇ、約４５ｐｇ、約６０ｐｇ、約０．０５ｎｇ、約０．１ｎｇ、約０．１５ｎｇ、約０．２ｎｇ、約０．３ｎｇ、約０．４５ｎｇ、約０．５ｎｇ、約０．６ｎｇ、約０．６５ｎｇ、約１ｎｇ、約１．５ｎｇ、約２ｎｇ、約３ｎｇ、約４ｎｇ、約４．５ｎｇ、約６ｎｇ、約６．５ｎｇ、約７．５ｎｇ、約９ｎｇ、約１０ｎｇ、約１２ｎｇ、約１３ｎｇ、約１５ｎｇ、約１６ｎｇ、約２０ｎｇ、約２２．５ｎｇ、約２４ｎｇ、約３０ｎｇ、約３２．５ｎｇ、約３６ｎｇ、約４０ｎｇ、約４５ｎｇ、約４８ｎｇ、約５０ｎｇ、約５２ｎｇ、約６０ｎｇ、もしくは約６５ｎｇのＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片の投与量範囲と同時投与されてもよい。
【０１２３】
片目の投与量は、開示される組成物の約１滴であってもよい。１滴の組成物は、１０μｌ〜２００μｌ、２０μｌ〜１２０μｌ、もしくは５０μｌ〜８０μｌ、またはその間の任意の値であってもよい。例えば、ピペッター等のディスペンサーは、１μｌ〜３００μｌおよびその間の任意の値の液滴を分注することができる。好ましくは、ディスペンサーは、開示される組成物１滴当たり、約１５μｌ、約２０μｌ、約３０μｌ、約４５μｌ、約６０μｌ、または約６５μｌを計量する。
【０１２４】
組成物がコンタクトレンズまたは別の挿入物／インプラントデバイスを介して投与される場合、コンタクトレンズまたは挿入物／インプラントは、例えば、０．０１ｍｇ〜１０ｍｇのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤、あるいは約０．０１ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．７ｍｇ、約１ｍｇ、約５ｍｇ、または約１０ｍｇのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含んでもよい。代替として、コンタクトレンズまたは挿入物／インプラントは、１０ｎｇ〜１００ｎｇのデキサメタゾンまたはその誘導体もしくは関連ステロイド剤、あるいは約１ｎｇ、約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約２０ｎｇ、約５０ｎｇ、約８０ｎｇ、または約１００ｎｇのデキサメタゾン，またはその誘導体もしくは関連ステロイド剤を含んでもよい。さらなる例として、コンタクトレンズまたは挿入物／インプラントは、約１０ｎｇ〜１μｇのＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片、あるいは約１０ｎｇ、約５０ｎｇ、約１００ｎｇ、約２００ｎｇ、約５００ｎｇ、約８００ｎｇ、または約１μｇのＴＧＦβ３ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を含んでもよい。
【０１２５】
本明細書に記載の組成物は、種々の外科的手技または他の治療と併せて使用されてもよい。例えば、組成物は、眼の屈折矯正のための外科的方法および非外科的方法とともに使用することができる。例示的な方法は、限定されないが、ミニ非対称放射状角膜切開術（ＭＡＲＫ）を含む放射状角膜切開術（ＲＫ）、六角形角膜切開術（ＨＫ）、レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）、角膜曲率形成術、レーザーｉｎ  ｓｉｔｕ角膜曲率形成術（ＬＡＳＩＫ）、例えば、ｉｎｔｒａＬＡＳＩＫ（登録商標）、レーザー上皮細胞屈折矯正術（ＬＡＳＥＫ）、例えば、Ｅｐｉ−ＬＡＳＥＫ、自動角膜層状切除（ＡＬＫ）、レーザー熱角膜形成術（ＬＴＫ）、伝導式角膜形成術（ＣＫ）、角膜輪部減張切開術（ＬＲＩ）、乱視矯正角膜切開術（ＡＫ）、エピケラトファキア、前毛様体強膜切開術（ＡＣＳ）、強膜補強術、老視の回復、老視のレーザー回復術（ＬＲＰ）、角膜内リング（ＩＣＲ）、角膜実質内リング（例えば、ＩＮＴＡＣＴＳ（登録商標））、移植可能なコンタクトレンズ、強膜拡張バンド（ＳＥＢ）、およびＫａｍｒａ（商標）インレーを含む。加熱角膜形成術、角膜矯正治療、酵素角膜矯正治療、および化学的角膜矯正治療もまた含まれる。
【０１２６】
組成物は、非屈折性状態の外科的矯正、例えば、角膜裂傷の外科的矯正と併せて使用されてもよい。特定の態様において、本明細書に記載の組成物は、角膜に対して行われる特定の外科的方法と併せて使用されてもよい。例示的な方法は、限定されないが、角膜の移植手術、全層角膜移植（ＰＫ）、治療的表層角膜切除術（ＰＴＫ）、翼状片切除、角膜染色、人工角膜挿入（例えば、ＫＰｒｏまたはＤｏｈｌｍａｎ−Ｄｏａｎｅ）、および歯根部利用人工角膜挿入（ＯＯＫＰ）を含む。
【０１２７】
組成物は、角膜コラーゲン架橋と併せて使用されてもよい。角膜架橋は、典型的には、ＵＶＡ光線への曝露によって活性化されたリボフラビン溶液の使用を伴う。知られている架橋方法は、限定されないが、上皮が除去される角膜架橋（ドレスデンプロトコル、またはエピオフ）、経上皮架橋（エピオン）、および加速架橋を含む。架橋手順は、一般的に入手可能であり、とりわけ、ＣＸＬ、Ｃ３−Ｒ（登録商標）ＣＣＬ（登録商標）、およびＫＸＬ（登録商標）角膜架橋として販売されている。組成物の投与は、架橋手順の前および／または後であってもよい。開示される組成物は、角膜実質の濁りおよび細胞喪失（後により詳細に記載される）等の架橋手順の有害な影響を回避するかまたはそれに対抗するために使用することができると提唱されている。さらに、開示される組成物を用いた角膜の再生は、以前はそのような手順に不適応であった対象、例えば、角膜の厚さが４００μｍ未満の対象に対して架橋を行うことを可能にすることができる。さらに、開示される組成物は、架橋のみの使用によっては対応されない進行性の角膜の菲薄化を遅延または停止するために使用することができる。
【０１２８】
本明細書に記載の組成物は、１つ以上の追加の眼用薬剤と同時投与されてもよい。種々の態様において、同時投与は、そのような薬剤との同時投与もしくは後続投与によるか、またはそのような薬剤との共製剤化によるものであり得る。治療されるまたは予防される状態に応じて、本明細書に記載の組成物は、限定されないが、抗ヒスタミン薬、感神経模倣薬、β受容体遮断薬、副交感神経刺激薬、副交感神経遮断薬、プロスタグランジン、栄養剤、血管収縮剤、潤滑剤、抗菌剤、および麻酔薬を含む、１つ以上の薬剤と同時投与されてもよい。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む種々の抗炎症薬が特に含まれる。組成物はまた、眼潤滑液および人工涙液と同時投与されてもよい。
【０１２９】
麻酔薬の非限定的な例は、ベンゾカイン、ブピバカイン、コカイン、エチドカイン、リドカイン、メピバカイン、プラモキシン、プリロカイン、クロロプロカイン、プロカイン、プロパラカイン、ロピカイン、およびテトラカインを含む。抗炎症薬の非限定的な例は、アスピリン、アセトアミノフェン、インドメタシン、スルファサラジン、オルサラジン、サリチル酸ナトリウム、トリサルチル酸コリンマグネシウム、サルサレート、ジフルニサル、サリチルサリチル酸、スリンダク、エトドラク、トルメチン、ジクロフェナク、ケトロラク、イブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、スプロフェン、オキサプロキシン、メフェナム酸、メクロフェナム酸、オキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、ピラゾリジンジオン、フェニルブタゾン、オキシフェンタトラゾン、フェニラミン、アンタゾリン、ナブメトン、ＣＯＸ−２阻害剤（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））、アパゾン、ニメスリド、および、ジレウトンを含む。ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、フルオロメトロン、および、デキサメタゾン等のグルココルチコイドもまた、抗炎症薬として使用され得る。
【０１３０】
例示的な抗菌剤は、限定されないが、亜鉛バシトラシン、クロラムフェニコール、クロロテトラサイクリン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、ノルフロキサシン、スルファセタミド、スルフイソキサゾール、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン、トブラマイシン、イドクスウリジン、トリフルリジン、ビダラビン、アシクロビル、フォスカネット、ガンシクロビル、ナタマイシン、アンフォテリシンＢ、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、フルシトシン、クリンダマイシン、ピリメタミン、フォリン酸、スルファジアジン、および、トリメトプリム・スルファメトキサゾールを含む。例示的な血管収縮剤は、限定されないが、ジピベフリン（Ｐｒｏｐｉｎｅ（登録商標））、エピネフリン、フェニレフリン、アプラクロニジン、コカイン、ヒドロキシアンフェタミン、ナファゾリン、テトラヒドロゾリン、ダピプラゾール、ベタキソロール、カルテオロール、レボブノロール、メチプラノロール、およびチモロールを含む。栄養素は、ビタミン、ミネラル、および他の有益な物質、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＥ、ビタミンＫ、および亜鉛を含む。
【０１３１】
具体的な態様において、本明細書に記載の組成物は、点眼薬として製剤化され、そのような点眼薬は、他の点眼薬製剤と併せて使用される。そのような他の点眼薬は、限定されないが、洗浄／潤滑点眼薬、ドライアイ治療薬、ステロイドおよび抗生物質点眼薬、緑内障点眼薬、アレルギー／抗炎症点眼薬、ならびに結膜炎点眼薬を含む。
【０１３２】
組成物は、対象の角膜の支持または再形成を補助するために、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングと併せて使用されてもよい。角膜挿入物には、角膜インレーおよび角膜アンレーデバイスが含まれる。例えば、コンタクトレンズ、角膜実質内リング、または他の挿入物／インプラントは、組成物を用いた治療の前、間、および／または後に角膜の形状を成形するかまたは維持するために使用されてもよい。角膜の「挿入物」は、典型的には、角膜の中に一時的に挿入されるデバイスを指すのに対し、角膜の「インプラント」は、典型的には、より恒久的なデバイスを指すことに留意されたい。しかしながら、当該技術分野において、多くの周知のデバイスはインプラント／挿入物として交換可能に記載されている。したがって、本明細書で使用される「挿入物／インプラント」という用語は、使用される時間に基づいて厳密に限定的であると見なされるべきではない。
【０１３３】
コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、角膜の欠陥、疾患、損傷、傷害、および／または変性、ならびに眼の屈折異常の治療のために、開示される組成物とともに使用されてもよい。種々の態様において、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングは、組成物のための担体として、または組成物溶出デバイスとして作用し得る。他の態様において、コンタクトレンズ、角膜実質内リング、または他の角膜挿入物／インプラントは、本明細書において詳述されるように、眼への投与に適した組成物、例えば、点眼薬とともに用いられてもよい。ある特定の態様において、対象に最も適したコンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、もしくは角膜実質内リングを決定するために、かつ／または組成物の配合を決定するために、コンピュータソフトウェアが使用されてもよい。特定の態様において、本明細書に記載の組成物とともに、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングを用いた治療は、眼の手術、例えば、屈折矯正手術または移植手術の前または後に使用される。
【０１３４】
治療は、対象を評価すること（例えば、対象の年齢、作業上の必要性、眼球異常または障害等）、角膜の前面の曲率半径に必要な変化の助けとなるように、成形コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングの使用を処方すること、およびコンタクトレンズまたはインプラント／挿入物と併せて使用されるように本明細書に記載の組成物を処方することを含む。処方され、対象によって用いられるコンタクトレンズまたはインプラント／挿入物は、角膜に機械的力を及ぼし、それによって形状の変化、すなわち、角膜の屈折力を誘導するように使用することができる。
【０１３５】
ある特定の好ましい態様において、角膜は、開示される組成物と併せた角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングの使用によって支持または形成され得る。市販のデバイスの例は、ＩＮＴＡＣＳ（登録商標）およびＫｅｒａＲｉｎｇ角膜実質内リングを含む。別の態様において、成形コンタクトレンズが、開示される組成物と併せて使用されてもよい。コンタクトレンズは、ハードまたは硬質であり得るか、またはソフトレンズであり得る。代替として、コンタクトレンズは、硬い部分と柔らかい部分の両方を備えてもよい。ソフトコンタクトレンズが使用される場合、角膜により大きな正または負の曲率が誘導され得、対象の眼における不快感は、その対象がコンタクトレンズに順応するにつれて減少するであろう。ハードコンタクトレンズが使用される場合、より大きな機械的圧力が角膜に及ぼされる可能性がある。コンタクトレンズは、気体透過性であってもよい。成形コンタクトレンズは、商業的供給源から得られてもよい。市販のレンズの例として、少なくとも、ＤｒｅａｍＬｉｔｅ、ＯＫ  Ｌｅｎｓ、ＥｙｅＤｒｅａｍ、ＭｉｒａｃＬｅｎｓ、ＤｒｅａｍＬｅｎｓ、ｉ−ＧＯ  ＯＶＣ、ＧＯＶ、Ｗａｋｅ  ａｎｄ  Ｓｅｅ、ＣＲＴ、Ｆａｒｇｏ／ｉＳｅｅ、Ｅｍｅｒａｌｄ、およびＷａｖｅ  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｌｅｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍのレンズが挙げられる。
【０１３６】
一旦、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングが対象の眼の上／中に配置されると、本明細書に記載の組成物（例えば、点眼薬）が眼に投与されてもよい。ある特定の状況において、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングの配置前に、組成物を前投与することが望ましい場合がある。有利には、コンタクトレンズ、角膜実質内リング、または他の挿入物／インプラントと組成物とは、角膜の形状に変化をもたらし、それによって屈折力を生じさせるように、併せて使用されてもよい。組成物は、角膜が所望の形状変化を受け入れることができるように、より頻繁に投与されてもよい。ある特定の態様において、組成物は、少なくとも２４、１２、または８時間毎に投与される。他の態様において、組成物は、６時間毎に投与される。ある特定の他の態様において、組成物は、約３時間毎に投与される。さらに他の態様において、組成物は、約２時間毎に投与される。さらに他の態様において、組成物は、１時間毎に投与される。
【０１３７】
いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、コンタクトレンズ、角膜挿入物、角膜インプラント、または角膜実質内リングと、本明細書に記載の組成物との併用は、角膜の分子構造における変化を含んでもよく、角膜実質に見出される細胞およびコラーゲン（例えば、ＩＩ型コラーゲン）等のタンパク質の変化を誘導し得る。そうすることで、角膜の表面がより均一になる。角膜の表面の不規則性を低減することにより、全ての像の質および透明さ（すなわち、視力）が改善される。
【０１３８】
成形コンタクトレンズの計算には、最も平坦な角膜曲率測定が用いられる。当業者はまた、より傾斜した角膜曲率測定または両方の平均を使用することができ、この角膜の曲率に基づいて、角膜の前面の曲率半径を平坦にするかまたは傾斜させるのに必要な計算を行い、ひいては眼の屈折欠陥を矯正する。成形コンタクトレンズのベースカーブは、それぞれの眼の屈折力の変化に基づいて別々に計算され得る。特定の態様において、成形コンタクトレンズのベースカーブは、要求される屈折異常に応じて、１〜４つのより平坦なまたはより傾斜したジオプタ、より好ましくは１〜３つのより平坦なまたはより傾斜したジオプタ、さらにより好ましくは１〜２つのより平坦なまたはより傾斜したジオプタで計算され始めることができる。周辺ベースカーブは、成形コンタクトレンズの順応に依存し、中心ゾーンより大きい０．５ｍｍの直径となるように計算されるが、設計に応じて異なり得る。
【０１３９】
本発明に従って使用される成形コンタクトレンズの直径は、８．０ｍｍ〜１８．０ｍｍであり得る。市販のレンズはそのような直径で製造される。ある特定の態様において、成形コンタクトレンズは、８．０ｍｍ〜１２．０ｍｍの範囲の直径を有するハードコンタクトレンズであってもよい。他の態様において、成形コンタクトレンズは、１３．０ｍｍ〜１５．０ｍｍの範囲の直径を有するソフトコンタクトレンズであってもよい。ソフトコンタクトレンズは、角膜全体を覆い、強膜から強膜に及んでもよい。さらにほかの態様において、成形コンタクトレンズは、硬い材料と柔らかい材料からなってもよい。コンタクトレンズは、中心部が硬く、約１２．０ｍｍ、１３．０ｍｍ、１４．０ｍｍ、または１５．０ｍｍまでであってもよく、周辺部は柔らかく、１６．０ｍｍ、１７．０ｍｍ、および１８．０ｍｍまでであってもよい。より大きなコンタクトレンズ、好ましくはソフトコンタクトレンズが、成形コンタクトレンズとして夜に使用されてもよい。
【０１４０】
成形コンタクトレンズの度数は、対象が快適に見るために必要な屈折力にできるだけ近くなるよう決定され得る。成形コンタクトレンズの順応プロセスの間、視力が対象の必要性を満たすのに十分でない場合、その対象は、治療を受ける間に眼鏡を処方される。角膜が再形成されているかまたは再形成された場合、治療が計画通りに進んでおり、かつ適切であることを確認するために、種々の検眼測定が繰り返される。そのような測定は、近見視力および遠見視力に関する視力、オルソタイプ、角膜曲率測定、客観的および主観的な網膜検影法、成形コンタクトレンズの順応図、成形コンタクトレンズの動き、ならびに成形コンタクトレンズの快適性が挙げられ得る。
【０１４１】
測定が行われた後、これらの測定に基づいて治療プログラムに変更が行われてもよい。評価ごとに、同じ成形コンタクトレンズを続けるかどうか、または新しいコンタクトレンズを使用するべきかの決定が行われ得る。さらに、成形コンタクトレンズとともに使用される組成物に関しても同じ決定を行うことができる。成形コンタクトレンズおよび／または組成物の変更は、数週間にわたって角膜の所望の再形成を誘導するために行われ得る。ある特定の態様において、毎週の定期的な補正は、治療が開始されてから最初の８週間の間に行われる。
【０１４２】
本明細書に記載の組成物は、角膜のコラーゲン含有量（例えば、ＩＩ型コラーゲン）に変化をもたらす。角膜の解剖学的形態、組織像、および生理機能の他の態様も、組成物によって影響を受け得る。ある特定の態様において、組成物は、角膜の水和に変化をもたらすために、高張性または低張性であり得る。他の態様において、組成物は、角膜の分子構造（例えば、細胞外マトリックス）を変更し、このようにして、角膜を強化もしくは修復するか、または所望の曲率になるように角膜を再形成するために使用されてもよい。
【０１４３】
角膜を再形成する場合、角膜を軟化するための１つ以上の酵素を同時投与することが望ましい場合がある。例示的な酵素は、限定されないが、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、ケラタンゼ、およびストロメライシンを含み、これらは、角膜の種々のプロテオグリカン成分に作用することが示されている。酵素コラゲナーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ１（間質コラゲナーゼ）、およびマトリックスメタロプロテアーゼ２（ゼラチナーゼ）もまた含まれる。組成物がそのような酵素と同時投与される場合、そのような酵素の作用を高めるために、ポリマー等のビヒクル（例えば、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、セルロース等）を組成物中に含むことが望ましい場合がある。メタロプロテアーゼ酵素を活性化するために、さらなる薬剤、例えば、インターロイキン−１α、腫瘍壊死因子α／βおよびその任意の亜型、尿酸ナトリウム１水和物、酢酸４−アミノフェニル水銀、ヒト血清アミロイドＡ、ヒトＢ２ミクログロブリン、および塩化銅が含まれてもよい。カルバミド（尿素）もまた含まれ得る。また、これらの薬剤の任意の組み合わせも使用され得る。
【０１４４】
組成物はまた、角膜に見出される他の糖類またはタンパク質を分解する１つ以上酵素と同時投与されてもよい。組成物は、成形コンタクトレンズまたは任意の角膜挿入物／角膜インプラントの刺激を軽減するために使用される１つ以上の麻酔薬と同時投与されてもよい。組成物は、治療中の対象の快適性を向上させるために１つ以上の潤滑剤と同時投与されてもよい。他の態様において、組成物は、抗細菌剤、抗ウイルス剤、および／または抗真菌剤等の１つ以上の抗菌剤と同時投与されてもよい。組成物はまた、１つ以上の血管収縮剤と同時投与されてもよい。当業者は、治療される状態に基づいて、対象への同時投与に適切な薬剤を決定することができる。
【０１４５】
ある特定の態様において、組成物は、キット内に提供されてもよい。キットは、成形コンタクトレンズ、潤滑点眼薬、コンタクトレンズ用洗浄液または他の溶液、コンタクトレンズ携帯ケース、予備のコンタクトレンズ一対、ならびにコンタクトレンズ着用および組成物使用に関する指示書のうちの１つ以上を含んでもよい。キットとともに提供される組成物は、構成成分（ＴＧＦβ３ポリペプチド（またはその変異体もしくは断片）とデキサメタゾン（またはその誘導体もしくは関連ステロイド剤））との組み合わせを含むように製剤化されてもよいか、またはキットは、投与前に一緒に混合されるかまたは一緒に投与される、すなわち、同時投与または連続投与による、別々の製剤として、構成成分を含んでもよい。
【実施例】
【０１４６】
本明細書に記載される実施例は、特定の実施形態および態様を例示する目的で提供されるのであって、決して本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本明細書に記載される開示および教示を用いて、過度な実験を行うことなく、他の実施形態、態様、および変形例を作り出すことができる。そのような全ての実施形態、態様、および変形例は、本発明の一部であると見なされる。
【０１４７】
実施例１：実験の概要
以前の実験において、本発明者は、角膜実質細胞を神経細胞系統に分化するように誘導することが可能であることを示した。本明細書に記載の実験は、角膜実質細胞が軟骨特異的ＩＩ型コラーゲンを分泌する軟骨細胞様細胞に転換する可能性を調査することを目的としていた。この種類の軟骨は、発生中に発現されると考えられる（Ｌｉｎｓｅｎｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。さらなる目的は、生きたラットの角膜においてｉｎ  ｖｉｖｏでＩＩ型コラーゲンの沈着を誘導することができるかどうか、およびこの処置が角膜の光学的特性に好ましい影響を与えたかどうかを確認することであった。さらなる目的は、円錐角膜の組織中の角膜実質細胞が、この細胞リプログラミングの方法および後続のＩＩ型コラーゲンに富んだＥＣＭの産生に適用可能であり得るかどうかを決定することであった。最後に、この実験は、ＩＩ型コラーゲンの沈着がｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで処理した角膜の生体力学的特性に及ぼす影響を、硬度および弾性率の分析を可能にする生物工学的アプローチであるナノインデンテーション試験を使用して評価することを目標としていた。
【０１４８】
実施例２：組織試料
ヒト組織
死体の全ヒト角膜、移植手術時に得られた円錐角膜の角膜、ヒト角膜縁周縁部、および外科医が切除したＤＳＥＫキャップ（角膜内皮移植からの余分な角膜実質組織）は、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ（Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）から供給されたドナーから得られた。角膜縁接合部から２ｍｍの角膜縁を残して角膜移植手術のために中央角膜ボタンが除去された後、ヒト角膜縁周縁部を採取した。組織を使用する前に、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｘ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから研究倫理承認書および同意書が得られた。全ての組織は、使用するまでＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ培地（イーグルＭＥＭ培地中に２％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ）に保存し、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ輸送培地（５％デキストランを添加したＥｙｅ  Ｂａｎｋ培地）中で輸送された。
【０１４９】
動物組織
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから動物試験に関する倫理承認書が得られた（承認番号Ｒ８５６）。二酸化炭素室を使用した安楽死後に、６〜８週齢の成獣雄ウィスターラットから眼および軟骨を得た。動物から全眼を除去し、解剖顕微鏡下で外科用ハサミを使用して、角膜を慎重に切除した。剣状突起は、その端部に薄くて広い軟骨板を含む頬骨の一部であるが、メスの刃を使用してこれを切除した。動物組織をポビドンヨード（ＰＶＰ−Ｉ）およびチオ硫酸ナトリウムで洗浄した。軟骨を覆う余分な脂肪および組織は、刃で掻爬した。新たに回収した眼および軟骨は、使用するまでの最小限の時間、リン酸緩衝食塩水に保存した。
【０１５０】
実施例３：組織学的解析
組織の調製および凍結切片化
角膜片および軟骨片（２ｍｍ×２ｍｍ）を、液体窒素中で瞬間凍結する前に、Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、Ｓａｋｕｒａ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に包埋した。厚さ１０〜１５μｍの切片を、Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ５５０  Ｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して切断し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（商標）Ｐｌｕｓ静電式スライド（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌｅｎｓｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に載せた。凍結切片は、次に使用するまで−２０℃で保存した。
【０１５１】
細胞および組織の培養
ヒトおよびラット角膜からの組織消化および細胞調製
角膜縁周縁部を切除して、クラスＩＩ層流フード内で強膜から角膜実質を単離した。この後、角膜上皮および内皮を角膜切開刀で穏やかに掻爬し、廃棄した。ＤＳＥＫキャップにも、角膜切開刀を用いた穏やかな掻爬を行って上皮を除去した。次いで、残りの角膜実質組織を、回転式振盪機上で穏やかに混合しながら、３７℃のハンクス平衡塩類溶液（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中０．４％のＩＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で消化した。様々な消化時間を用いたが、最適な組織消化および細胞生存率には５時間が必要であった。
【０１５２】
組織消化が完了した後、１２００ｒｐｍで７分間遠心分離することにより細胞をペレット化した。次いで、最小量の適切な細胞培養培地中に細胞を再懸濁し、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＬ卓上倒立顕微鏡およびＮｅｕｂａｕｅｒ血球計数器を使用してカウントした。１：１の比でトリパンブルー溶液（ＰＢＳ中０．０４％のトリパンブルーストック）に加えた細胞懸濁液を、試料当たり最低３カウントで使用し、平均値を取った。
【０１５３】
角膜実質細胞の細胞培養
細胞操作は、クラスＩＩ層流フード内で無菌技術を用いて行った。単離した角膜実質細胞を、２〜３ｍｌの細胞培養培地中のプラスチックまたはガラス製カバースリップ上の１２ウェルまたは２４ウェルクラスタープレート（Ｆａｌｃｏｎ）内で培養した。細胞は、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター内に維持した。培養培地を２４時間後に交換し、その後は２日おきにまたは必要があればより頻繁に交換した。細胞は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＬ卓上倒立顕微鏡を用いて毎日観察した。細胞ペレット培養のために、プラスチック製の円錐管内で、３００ｇで７分間２０℃にて遠心分離することにより組織をペレット化した後、細胞を新たに得た。適切な培養培地を試験管に加えた。３７℃で２４時間のインキュベーション後、細胞が収縮し、管の壁に接着しないペレットが形成された。３７℃の５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、２ｍｌの培地中でペレットを３週間培養した。培地は１日おきに交換した。
【０１５４】
器官型切片培養
ヒトおよびラットの角膜組織および軟骨組織を、刃を用いて前後平面に切片化し（１〜２ｍｍ）、切片を器官型の空気／液体界面培養系に配置した（図２）。端的に述べると、正常組織の外植片を、０．４μｍ孔径の細胞培養インサート（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ、Ｆｒａｎｃｅ）上で、培養培地とＣＯ２富化環境との界面で培養した。角膜切片は、上皮側を上にして３ｍｌの培養培地を含む細胞培養プレート上に配置した。培養培地は１日おきに交換した。
【０１５５】
実施例３：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏリプログラミング
培養培地
下の表に記載されるように、いくつかのカスタムメイド培地を使用した。
【０１５６】
【表１−１】
2018513117.tif 000004
【０１５７】
【表１−２】
2018513117.tif 000005
【０１５８】
角膜実質細胞の軟骨形成リプログラミング
軟骨形成分化培地中で組織片を様々な時間間隔で培養し、増殖因子処理に必要とされる最適な時間を決定した。各時点で試料を回収した（表２）。細胞の単層を得るために、ガラスカバースリップ上に１５×１０４／ｃｍ２の密度で角膜実質細胞を播種した。細胞を２４時間カバースリップに付着させ、１日おきに培養培地を交換した。細胞は、最長３週間維持した。
【０１５９】
【表２】
2018513117.tif 000006
【０１６０】
実施例４：Ｉｎ  ｖｉｖｏリプログラミング
増殖因子送達のためのゲル点眼薬製剤
細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａによって産生される水溶性多糖類であるゲランガムを使用して、点眼薬を製剤化した。ゲルベース製剤の使用は、角膜滞留時間の延長、および治療薬の眼アベイラビリティの増加を可能にする。高分子ゲランガムはアニオン性ポリマーであるため、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、およびＮａ＋等の一価および二価のカチオンの存在下ではｉｎ  ｓｉｔｕゲル化を経験する（Ｂａｋｌｉｗａｌ，＆Ｐａｗａｒ  ２０１０）。涙液中に存在する電解質は、点眼されるとポリマーのゲル化を引き起こし、次により長い滞留時間および薬物のバイオアベイラビリティの増大をもたらす（Ｌｕｄｗｉｇ  ２００５）。以前の製剤化試験に基づいて、ポリマー製剤は、無刺激性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に安全である（Ｒｕｐｅｎｔｈａｌ，Ｇｒｅｅｎ，＆Ａｌａｎｙ  ２０１１）。
【０１６１】
最初に蒸留水を８０℃に加熱し、その後、ゲランガム（Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（商標）ＵＳＡ）を絶えず撹拌しながら加えることによって０．５％溶液を調製した。粉末が完全に溶解してから、溶液を冷却し、４℃で保存する。適切な量の増殖因子を絶えず撹拌しながら流動性ゲルに加える。培養培地中で使用されるよりも１０倍高い濃度の増殖因子を用いて、鼻涙の排出および瞬きによって失われる薬物を補完した。点眼薬ゲルは、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３および約４μｇ／ｍｌのデキサメタゾンを含んでいた。
【０１６２】
神経原性因子および軟骨形成因子を用いた処理
動物を手で保定し、約１５μＬの点眼薬を右眼に点眼した（図３）。反対側の眼を対照眼として用いた。１日３回の点眼薬を、神経細胞の特異化には最長５日間投与し、軟骨形成細胞の特異化には最長８週間投与した。
【０１６３】
実施例５：免疫組織化学（ＩＨＣ）解析
組織の回収および処理
処理終了時に、二酸化炭素室を使用して動物を安楽死させた。眼を採取してリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。次いで、角膜を慎重に切除し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１時間固定し、凍結および切片化の前に組織を凍結保護するためにスクロース溶液で処理した。凍結保護としてのスクロースは、凍結組織片における氷晶アーチファクトの形成を防止する脱水剤である。組織の緩慢凍結の場合、凍結保護が特に重要である。
【０１６４】
端的に述べると、４℃の２０％スクロース溶液に角膜を５時間浸漬し、次いで、３０％スクロース溶液に移し、組織が沈むまで４℃に維持した（通常は一晩）。次いで、角膜をＯＣＴ化合物中に包埋し、液体窒素に浸漬して急速凍結を引き起こした。凍結した組織ブロックは、次に使用するまで−８０℃で保存した。約１０〜１５μｍの厚さのクリオスタット切片をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（商標）Ｐｌｕｓスライドに載せ、必要とされるまでスライドを−８０℃で保存した。細胞培養の場合、カバースリップ上で培養した細胞をＰＢＳですすぎ、４％ＰＦＡで１５分間固定した。カバースリップを次に使用するまでＰＢＳに浸漬した。
【０１６５】
免疫組織化学
凍結組織切片に関して、免疫組織化学を行う前に、スライドを１５〜２０分間室温で維持した。ＰＢＳを使用してＯＣＴを洗い流し、組織の周辺ゾーンを、ワックスペンを使用して境界を画定した。組織片は、最初に１０％正常ヤギ血清のブロッキング溶液を用いて１時間インキュベートした後、適切な希釈率の一次抗体を用いて４℃で一晩インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳ中で３回すすいだ後、適切な希釈率の二次抗体を用いてインキュベーションした。二次抗体を室温で２時間静置した。核マーカー４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて切片を対比染色し、Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ退色防止剤（ＰｒｏＳｃｉＴｅｃｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に埋め込んだ。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ（商標）ＦＶ−１０００共焦点レーザー走査型顕微鏡（４０５ｎｍ、４７３ｎｍ、および５５９ｎｍ波長レーザー）およびＬｅｉｃａ  ＤＭＲＡ蛍光顕微鏡を使用して撮像した。
【０１６６】
【表３】
2018513117.tif 000007
【０１６７】
実施例６：遺伝子発現解析
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成
試料からのｍＲＮＡ抽出は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ  ＭｉｃｒｏＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。端的に述べると、組織試料を０．７５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）および担体ＲＮＡと混合し、手持ち式ホモジナイザー（ＰＲＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用してホモジナイズした。次いで、０．２ｍｌのクロロホルムを用いて試料をインキュベートした後、１２０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離した。上相を分離し、エタノールと混合し、次いで回収カラムチューブに移した。
【０１６８】
１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによりＲＮＡを回収した。フロースルーを廃棄し、抽出したＲＮＡをデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）で処理した。提供された緩衝液で数回カラムを洗浄し、最後にＲＮＡを、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を含まない水に分散した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して濃度を決定し、ｍＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０１６９】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｃＤＮＡを調製した。端的に述べると、１００ｎｇのＲＮＡを、ＶＩＬＯ（商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ、およびＲＮＡｓｅ不含水とともに２５℃で１０分間インキュベートした。次いで、試料を４２℃で１２０分間インキュベートした後、８５℃で５分間インキュベーションした。ｃＤＮＡを−２０℃で保存した。
【０１７０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを使用した定量的ＰＣＲ
対象とする遺伝子のためにＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを得た。ＰＣＲステップにおいて、１０μＬのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩを１μＬのアッセイ試料、約２５ｎｇのｃＤＮＡ、および９μＬの水と合わせて体積を２０μＬとした。試験管をボルテックスし、短時間遠心分離して内容物を沈殿させた。各ｃＤＮＡ試料を３通り調製し、３８４ウェルプレートにピペットで注入した。各反応混合物２０μＬをＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｏｐｔｉｃａｌ  ３８４−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルに充填した。次いで、プレートをＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｆｉｌｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で覆い、プレートを短時間遠心分離して気泡を除去した。プレートを７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍに移し、以下の熱サイクルパラメータを使用して実行した：５０℃で２分、９５℃で１０分、その後９５℃で１５秒および６０℃で１分を４０サイクル。結果は、前の項に記載されるように分析した。
【０１７１】
【表４】
2018513117.tif 000008
【０１７２】
実施例７：ｉｎ  ｓｉｔｕでの角膜実質ＥＣＭタンパク質沈着後の生体力学的特性および光学的特性の試験
げっ歯類の眼球前部分（前部構造）の実験
角膜の生体力学は、種々の角膜疾患の診断および治療において関連性があることが示されており、角膜の構造、および角膜の生理的機能との関係に関する洞察を提供する。透明性の低下は望ましくないため、ＥＣＭタンパク質の沈着を引き起こすための処理を受けた角膜は、角膜混濁についても検査する必要がある。
【０１７３】
Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶげっ歯類眼撮像システム（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）を使用して、処理したラットの角膜を調べた。最初に、ケタミンおよびＤｏｍｉｔｏｒ（登録商標）（３：２）の腹腔内注射を用いてラットを鎮静化した。Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶ撮像システムの細隙灯アタッチメントを使用して、角膜の層を詳細に調べ、角膜の完全性および透明性を確認した。角膜の透明性を確認するために網膜像の撮像も行った。撮像後、鎮静の回復のために、ラットにＡｎｔｉｓｅｄａｎ（登録商標）（ａｔｉｐａｍｅｚｏｌｅ）を投与した。
【０１７４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ処理した角膜のナノインデンテーション測定
ナノインデンテーションは、対象とする試料面に垂直な微弱な力を印加し、結果として得られた試料の圧痕の測定を通して、対象とする材料の機械的測定を提供する（Ｄｉａｓ＆Ｚｉｅｂａｒｔｈ  ２０１３）。ナノインデンテーションは、組織および他の生体材料におけるナノスケールおよびミクロスケールの機械特性を測定するための強力なツールとして最近出現した（Ｅｂｅｎｓｔｅｉｎ＆Ｐｒｕｉｔｔ  ２００６）。さらに最近のｉｎ  ｓｉｔｕ  走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）画像処理の発展では、ナノインデンター先端部が、ナノインデンテーションと組み合わされた３Ｄ画像処理デバイスとして同時に使用され、新規材料研究の新しい波をもたらした（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｓｃｈｉｒｅｒ  ２００９）。ナノインデンテーション先端部が制御荷重下で角膜組織に押し込まれる間に、力、変位、および時間が同時に記録される。ナノインデンテーションの間に印加される力は、数ナノニュートンほど小さくてもよいか、または数ニュートンほど大きくてもよく、広範なサイズスケールでの試験を可能にする。ナノインデンテーション試験は、荷重変位曲線として出力され、角膜の剛性、完全性、および弾性に関連する機械的特性を算出するための明確に定義された方程式を用いて分析することができる。
【０１７５】
ヒト円錐角膜の角膜を、対照培地中、またはリプログラミング因子を誘導する特定のＥＣＭタンパク質を含有する培地中の器官型培養液に入れた。次いで、処理期間の終了時に、ナノインデンテーション測定を行った。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、動物を手で保定し、リプログラミング因子を含有する約１５μＬのゲル点眼薬製剤を各ウィスターラットの右眼に点眼した。反対側の眼を対照眼として用いた。点眼薬を１日３回、最長７週間投与した。単離した眼に対する処理期間の１週目、３週目、または７週目の後に、ナノインデンテーションの測定値を記録した。
【０１７６】
ナノインデンテーション試験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＡｕｃｋｌａｎｄのＣｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｌａｂで行われた。角膜をその自然な位置で検査するために、ナノインデンテーションには型が必要であった。以前の試験では、角膜を所定の位置に保持するためにポリスチレンおよびブルータックを使用していた。荷重下で型が変形することの影響は潜在的な誤差の源であるため、試験のために硬い型が決定された。型を作製するために使用された最初の材料は、従来の粘土であった。これをヒト角膜試料の正確な形状および曲率に形成した（図６（Ａ））。次いで、粘土を試験に使用するまでの２日間放置して硬化させた。ラット眼の試験は、眼球全体が用いられるため若干異なるものであった。眼球を所定の場所に保持するために、樹脂で充填された、眼球を保持するための小さな窪みを有するペトリ皿が使用された（図６（Ｂ））。試料を乾燥させないためにＰＢＳを使用した。
【０１７７】
試料は非常に柔らかい生体試料なので、全てのナノインデンテーション試験には円錐球状の流体先端部を使用した。ヒト試料に用いられた押し込み荷重は５０μＮであった。ラット眼球には、３〜５μＮの荷重範囲が用いられた。光ファイバーライトを点灯し、顕微鏡からの光線の下で試料を直接配置した。角膜の中央部をできる限り正確に光線の下に直接配置した（図６（Ｃ））。角膜の表面が良好な解像度で観察できるまでＺ軸スライダーを調節することにより試料に焦点を合わせた。角膜試料中央の最も高い点に確実に焦点が合うように、Ｘ軸およびＹ軸方向に視野を移動させて、焦点がどのように変化するかを観察した。
【０１７８】
一旦、データ収集ポイントの焦点を角膜の中央に合わせてから、試料の境界を定義し、迅速なアプローチを取った。押し込み前に、荷重の機能を正確に設定しなければならなかった。実際のインデンテーションプロセスは、Ｈｙｓｉｔｒｏｎ  Ｔｒｉｂｏｉｎｄｅｎｔｅｒ（登録商標）によって自動化されている（図６（Ｄ））。定義された限度に達するまで試料に貫通するインデンター先端部に、予め定義された荷重を配置した。次いで、先端部を１０秒間保持した後、試料から先端部を外した。先端部を外した後の圧痕の面積（Ａｒ）によって試料の硬度を決定した。
【０１７９】
【数１】
2018513117.tif 000009
【０１８０】
Ｐｍａｘが最大インデンテーション荷重である場合、面積は、円錐球状先端部と試料との接触面積である。以下の方程式によって示されるように、低い弾性率は、試料およびインデンター先端部の両方の弾性率を表したものである。
【０１８１】
【数２】
2018513117.tif 000010
【０１８２】
式中、ｉはインデンターを意味し、ｍは試料材料を意味する。低い弾性率から、試料がいかに弾性であるかが分かる。同じインデンター先端部が各試験に使用されるため、低い弾性率を用いて、試験される各試料の弾性を比較することができる。
【０１８３】
実施例８：ヒト成人角膜実質細胞を外因性ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンで処理すると軟骨特異的ＩＩ型コラーゲンを産生する
１つの増殖因子がいくつかの細胞の種類に同じかまたは異なる効果で作用し得る一方で、１つより多くの増殖因子が同様の生物学的機能を共有し得ることが分かっている。角膜実質においてコラーゲン沈着を引き起こし得る増殖因子、サイトカイン、および化学物質を選択する場合、ある特定の外因性因子の既知の影響を考慮することが重要であった。本発明の実験において、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンの併用処理が用いられた。
【０１８４】
ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンの効果に関する証拠のほとんどは、それらの幹細胞／前駆細胞に対する影響に関して行われてきた試験から得られた（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ，Ｙａｎｕｋａ，Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，Ｍｅｌｔｏｎ，＆Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ２０００；Ｗｏｒｓｔｅｒ，Ｎｉｘｏｎ，Ｂｒｏｗｅｒ−Ｔｏｌａｎｄ，＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ２０００）。ＴＧＦβとデキサメタゾンとの組み合わせは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前駆細胞を軟骨細胞に分化させるように誘導するために以前に使用されている（Ｄｉｅｋｍａｎ，Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｌｅｎｎｏｎ，Ｃａｐｌａｎ，＆Ｇｕｉｌａｋ  ２００９；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｋｏｌａｍｂｋａｒ，Ｐｅｉｓｔｅｒ，Ｓｏｋｅｒ，Ａｔａｌａ，＆Ｇｕｌｄｂｅｒｇ  ２００７；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。さらに、合成ステロイド薬であるデキサメタゾンは、炎症性眼疾患を治療するために使用されてきた。したがって、ＴＧＦβ３とデキサメタゾンとの組み合わせが、軟骨細胞表現型に向けて角膜実質細胞の分化を促進するために軟骨形成分化培地に使用された。
【０１８５】
本発明の実験において、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンの発現は特筆に値する。Ｉ型およびＩＩ型等の線維状コラーゲンは、自己組織化および架橋して、非常に高い剛性、低い伸展性、および弾性エネルギー貯蔵能力を示す、高結晶性の線維を形成することが分かっている（Ｗｅｌｌｓ  ２００３）。線維の剛性および引張強度に寄与するのは架橋である。
【０１８６】
角膜実質の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、大部分がＩ型およびＶ型コラーゲンで構成された、密集したヘテロタイプのコラーゲン原線維からなる。角膜の原線維と同様に、軟骨原線維はヘテロタイプ（ＩＩ型およびＸＩ型から構成される）であり、２５ｎｍの均一な直径（角膜の原線維よりもやや小さい）を有する（Ｍｅｎｄｌｅｒ，Ｅｉｃｈ−Ｂｅｎｄｅｒ，Ｖａｕｇｈａｎ，Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ，＆Ｂｒｕｃｋｎｅｒ  １９８９）。ＩＩ型コラーゲンは、コラーゲンの主要な原線維成分であり、その分子が、長さ３００ｎｍの、単一の途切れのないヘリカルドメインから本質的になるという点において、Ｉ型コラーゲンに類似している。それらの類似性に起因して、ＩＩ型およびＸＩ型コラーゲンは、他の組織におけるＩ型およびＶ型コラーゲンの軟骨類似体であると見なされる（角膜実質コラーゲン）。
【０１８７】
本発明の実験において、成熟した角膜からの角膜実質細胞を、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンを含有する軟骨形成分化培地、または標準的な線維芽細胞増殖培地のいずれかに播種した。２〜３日以内に、軟骨形成分化培地に播種した角膜実質細胞は、直径約５０〜１００μｍの細胞凝集／球を形成した（図７（Ａ））。球の中心部は軟骨細胞特異的ＩＩ型コラーゲンで、周辺部はネスチンについて標識した（図７（Ｂ））。さらに、一旦、球が線維芽細胞増殖培地に配置されると、球からの細胞が外向きに広がり始め（図７（Ｃ））、培養皿に集合し、細胞の単層を形成した。細胞が一度凝集した領域はＩＩ型コラーゲンについて標識されたのに対し、単層中の細胞は標識されなかった（図７（Ｄ））。
【０１８８】
線維芽細胞増殖培地に播種した角膜実質細胞は、線維芽細胞様細胞の均一な単層を形成したが（図８（Ａ））、ネスチンまたはＩＩ型コラーゲンのいずれについても標識されなかった（図８（Ｂ））。培地を軟骨形成分化培地に交換したとき、培養物の外観に変化は認められず、細胞はＩＩ型コラーゲン陰性のままであった。これらの結果は、軟骨様ＥＣＭの産生には細胞凝集が重要であると考えられることを示唆している。線維芽細胞増殖培地に播種した角膜実質細胞は、必要とされる細胞凝集を形成することができなかった。したがって、線維芽細胞のクラスターを形成するために、コンフルエントな線維芽細胞を培養皿から解離させ、ペレット化し、軟骨形成分化培地中でペレット培養物としてさらに３週間増殖させた。細胞ペレットは、角膜実質特異的ＥＣＭタンパク質ケラトカンに陽性に標識されたが、軟骨特異的ＥＣＭタンパク質ＩＩ型コラーゲンには陰性であった（図８（Ｆ）および（Ｇ））。
【０１８９】
実施例９：成人ヒト角膜および成獣ラット角膜の角膜実質細胞をＴＧＦβ３およびデキサメタゾンで処理すると、ＥＣＭを含有するＩＩ型コラーゲンを分泌する
成人ヒト角膜の切片を、対照培地中または軟骨形成分化培地中の器官型切片培養液に２週間配置した。次いで、組織片を軟骨細胞特異的ＥＣＭタンパク質ＩＩ型コラーゲンおよび天然角膜のＩ型コラーゲンについて標識した。陽性の標識は、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンで処理した角膜にのみ見られた（図９（Ｃ）および１０（Ｂ））。２週間の処理期間によって、処理した角膜の角膜実質ＥＣＭ内にＩＩ型コラーゲンの沈着がもたらされたことが分かった（図９（Ｃ））。１週間の処理では、角膜実質ＥＣＭにおけるＩＩ型コラーゲンの眼に見える沈着はもたらされなかった（図９（Ｂ））。
【０１９０】
天然Ｉ型コラーゲンの量およびパターンは、処理した角膜において若干変化したと考えられた。一般に、標識の強度は類似していたが、分布はより広範であり、標識の量は未処理の角膜のほうがより高かった（図９（Ｄ））。さらに、新たに産生されたＩＩ型コラーゲンは、いずれの大きな塊または凝集体を形成するもことなく、ＥＣＭに均一にかつ規則正しく沈着した。標識は、角膜実質の既存のコラーゲン構造に沿って明らかに見られ、実質層の全厚さにわたって分布していた。
【０１９１】
次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト角膜組織実験をｉｎ  ｖｉｖｏげっ歯類試験に拡張し、１５μｌのゲランガムに基づくＴＧＦβ３およびデキサメタゾンの点眼薬製剤の１日３回投与により、雄ウィスターラットの右角膜を２週間処理した。２週間後、ラットを安楽死させ、角膜を免疫組織化学のために処理した。処理した角膜のみが、ＩＩ型コラーゲンに陽性に標識され、より高いレベルの沈着が角膜の前部に観察された（図１０（Ｄ）および（Ｅ））。したがって、軟骨形成分化培地中で培養した角膜切片のみがＩＩ型コラーゲンに陽性であった。さらに、ＩＩ型コラーゲンは、角膜実質の既存のコラーゲン構造に沿って均一な層として沈着した。
【０１９２】
実施例１０：円錐角膜の角膜におけるＩＩ型コラーゲン沈着の誘導
本発明者は、次に、彼らの試験において観察されたｉｎ  ｖｉｖｏ  リプログラミングが円錐角膜の治療に利用できることを確認しようと試みた。円錐角膜の角膜中の角膜実質細胞が、ＩＩ型コラーゲン沈着の誘導に適用可能であることを確認するために実験を行った。角膜の移植手術後に得られた円錐角膜の角膜ボタンを、それらば得られたらすぐに培養液中に配置した。各ボタンの半分を対照培地に入れ、残りの半分を軟骨形成分化培地中に配置し、２週間維持した。２週間後、免疫組織化学またはｍＲＮＡ抽出のいずれかのために組織を処理した。処理した角膜の半分のみの角膜実質ＥＣＭがＩＩ型コラーゲンに陽性であった（図１１（Ｂ））。正常な角膜組織と比較して、標識の強度は円錐角膜組織においてより低かったが、標識パターンは類似しており、既存のコラーゲンラメラ構造に沿った規則正しい配置に従っていた。
【０１９３】
ビメンチン標識により、円錐角膜の角膜の角膜実質細胞において、未処理のものと処理したものとの間ではっきりとした違いが明らかになった。一般に、角膜実質細胞の密度は、未処理の角膜においてより低く、角膜の後部には細胞が少ない（図１１（Ｃ））。また、処理した角膜における角膜実質細胞は、より糸状に見え、未処理の角膜における角膜実質細胞と比較すると形態が完成している（図１１（Ｅ）および（Ｆ））。未処理の角膜における角膜実質細胞と比較して、処理した角膜における角膜実質細胞は、より長く、またビメンチンについて強く標識されたより多くの細胞突起を有していた。
【０１９４】
実施例１１：ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンによる処理は、線維化タンパク質の沈着を誘導せず、角膜混濁を引き起こす
軟骨形成分化培地中で最長３週間培養したヒト角膜を、線維症および瘢痕に関連するＩＩＩ型コラーゲンおよびαＳＭＡについて標識した（Ｇａｂｂｉａｎｉ  ２００３；Ｋａｒａｍｉｃｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。線維化マトリックス沈着のいずれの証拠も存在しなかったが、その一方で、対照組織においてより高い程度のαＳＭＡ標識が認められた（図１２）。これらの結果は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２とは異なり、ＴＧＦβ３は角膜実質細胞の筋線維芽細胞への分化を誘導しないという以前の知見を裏付けるものである。
【０１９５】
試験期間を通して生きたラットに対して灯細隙灯試験を行った。試験時には、処理した角膜と未処理の角膜には瘢痕または混濁の徴候がなく、それらを区別することができなかった。血管を見せるための眼の裏側の画像は、光の通過を遮断しない鮮明な角膜を示しており（図１３（Ａ）および（Ｂ））、Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶレンズを使用したラット角膜のｉｎ  ｖｉｖｏ断面画像により、光が容易に透過する透明な角膜が明らかになった（図１３（Ｃ）および（Ｄ））。角膜を通る光の透過の妨害につながるいずれの角膜混濁または濁りの徴候も認められなかった。
【０１９６】
実施例１２：ｉｎ  ｖｉｖｏ処理時のＩＩ型およびＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現における変化
１週間、７週間、および３週間ｉｎ  ｖｉｖｏで処理した後、４週間の未処理期間を設けたラットの角膜を、定量的遺伝子発現解析に供した。増殖因子処理を中止した後、ＩＩ型コラーゲンの発現が再び低下するかどうか、および／または永久的に停止するかどうかを決定することが目的であった。天然角膜のＩＩ型コラーゲンに対する処理の影響も調べた。
【０１９７】
７週間処理した角膜と比較して、１週間処理した角膜は、非常に高いレベルのＩＩ型コラーゲンを発現した。図３５の最初のグラフによって示されるように、処理を中止すると、発現レベルは著しく低下した。Ｉ型コラーゲンの発現の場合、１週間および７週間処理した角膜を、各々、それらの未処理の角膜と比較した。１週間の処理後に、Ｉ型コラーゲンの発現には初期スパイクが認められたが、７週目には、Ｉ型コラーゲンの発現は有意に低く、未処理角膜におけるその発現に相当するものであったことが明らかになった（図１４（Ｂ））。
【０１９８】
実施例１３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで処理した角膜の生体力学的特性における変化
ＩＩ型コラーゲンの沈着が角膜の剛性および弾性に影響を及ぼすという仮説を立てた。これらの変化を評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏラット角膜およびｅｘ  ｖｉｖｏ処理したヒト角膜、ならびにそれらの対応する対照を、ナノインデンテーション試験に供した。
【０１９９】
未処理対照と比較して、１週間ｉｎ  ｖｉｖｏで処理したラット角膜は、硬度または弾性のいずれにおいても有意な増加を示さなかった（図１５）。３週間ｉｎ  ｖｉｖｏで処理した角膜において、処理眼と対照眼との間に明らかな違いが認められた。各角膜を最大で８回試験し、その結果得られた荷重変形グラフは良好な再現性を示した（図１６）。増殖因子処理に曝露した右眼において、硬度と、弾性率の低下の両方が著しく高かった。対照培地または軟骨形成分化培地中のいずれかで６週間ｅｘ  ｖｉｖｏ培養した対応する球状角膜の角膜対も、同じ生体力学的試験に供した。この場合も同様に、試験により、処理した角膜の硬度および弾性率における有意な増加が明らかになった（図１７）。
【０２００】
実施例１４：増殖因子およびステロイドの比較組み合わせ
角膜実質細胞の軟骨細胞分化における他の増殖因子とステロイドとの組み合わせの有効性を調べるためにヒツジ角膜に対するｅｘ  ｖｉｖｏ試験を行った。
【０２０１】
Ａｕｃｋｌａｎｄ  Ｍｅａｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓから新鮮なヒツジの眼を得た。直ちに角膜を切除し、ポビドンヨード（ＰＶＰ−Ｉ）およびチオ硫酸ナトリウム溶液で洗浄した。次いで、穿孔器を使用してヒツジ角膜組織の８ｍｍの円板を切除した。角膜円板を各培養条件（表５に概説される）に３週間配置した。次いで、角膜円板を器官型の空気／液体界面培養系に配置した。
【０２０２】
端的に述べると、正常組織の外植片を、０．４μｍ孔径の細胞培養インサート（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ、Ｆｒａｎｃｅ）上で、培養培地とＣＯ２富化環境との界面で培養した。角膜切片は、上皮側を上にして３ｍｌの培養培地を含む細胞培養プレート上に配置した。培養培地は１日おきに交換した。使用した基本培地は、１％Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ（抗生物質−抗真菌剤溶液）および１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＧＩＢＣＯ（登録商標））を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）であった。３週間の終了時に、各角膜円板を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１時間固定し、凍結および切片化の前に組織を凍結保護するためにスクロース溶液で処理した。
【０２０３】
簡潔に述べると、４℃の２０％スクロース溶液に角膜を５時間浸漬し、次いで、３０％スクロース溶液に移し、組織が沈むまで４℃に維持した（通常は一晩）。次いで、角膜をＯＣＴ（最適切削温度）化合物中に包埋し、液体窒素に浸漬して急速凍結を引き起こした。凍結した組織ブロックは、次に使用するまで−８０℃で保存した。約４〜６個の４０μｍの厚さのクリオスタット切片をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（商標）Ｐｌｕｓスライドに載せ、必要とされるまでスライドを−８０℃で保存した。次いで、角膜切片をＩＩ型コラーゲンについて標識した。
【０２０４】
免疫組織化学のために、スライドを１５〜２０分間室温で維持した。ＰＢＳを使用してＯＣＴを洗い流し、組織の周辺ゾーンを、ワックスペンを使用して境界を画定した。組織片は、最初に１０％正常ヤギ血清のブロッキング溶液を用いて１時間インキュベートした後、マウス抗ＩＩ型コラーゲン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／ＭＡＢ８８８７）を用いて４℃で一晩インキュベートした。適切な希釈率のヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）／Ａ−１１００１）を用いてインキュベーションした。二次抗体を室温で２時間静置した。核マーカー４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて切片を対比染色し、Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ退色防止剤（ＰｒｏＳｃｉＴｅｃｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に埋め込んだ。Ａｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ（商標）ＦＶ−１０００共焦点レーザー走査型顕微鏡（４０５ｎｍ、４７３ｎｍ、および５５９ｎｍ波長レーザー）およびＬｅｉｃａ  ＤＭＲＡ蛍光顕微鏡を使用して標識を可視化した。
【０２０５】
表５は、本試験からの知見を表している。図２０は、各条件の角膜切片におけるＩＩ型コラーゲン標識の代表的な画像を示す。
【０２０６】
【表５】
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【０２０７】
この結果により、ＴＧＦβ３とデキサメタゾンとの組み合わせが、標的細胞から所望の反応を誘発した唯一の試験組み合わせであることが確認された（図２０、パネルＧ〜Ｈ）。他の増殖因子−ステロイドの組み合わせは、角膜実質細胞中のＩＩ型コラーゲンに所望の変化をもたらすことはできなかった（図２０、パネルＡ〜Ｆ）。またこの結果により、ヒツジ角膜の角膜実質細胞のリプログラミングも確認された（図２０、パネルＧ〜Ｈ）。
【０２０８】
以前の試験では、他の増殖因子および他のステロイド化合物が角膜の治療および修復には不適切であることが示された。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２はどちらも線維化した瘢痕を生じさせる（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ａｌｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅ，Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｊｅｓｔｅｒ，Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｃｏｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。ＥＧＦは、軟骨形成を負に制御する（Ｙｏｏｎ  ２０００）。エストロゲンもまた、軟骨形成を負に制御する（Ｋａｔｏ＆Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ  １９８５）。ヒドロコルチゾンは、軟骨細胞分化よりもむしろ脂肪生成を促進することが示されている（Ｇｈｏｎｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｌｅｅ，Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。これらの初期の研究は、一緒に作用して角膜実質細胞の軟骨細胞分化および瘢痕のない角膜の治癒を促進するＴＧＦβ３およびデキサメタゾンに関する本発明の知見の有意性を示す。
【０２０９】
実施例１５：ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンの比較投与量
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験前に、ｅｘ  ｖｉｖｏ処理のための種々の有効投与量を特定するための実験を行った。ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンを種々の濃度で含有する培養培地でヒツジ角膜を培養することにより、これら２つの因子に関する用量範囲試験を行った。
【０２１０】
新鮮なヒツジの眼を得、実施例１４に記載されるように角膜を切除および処理した。１つのヒツジ角膜円板を１６個の培養条件の各々に３週間配置した（図２１）。角膜円板を培養し、次いで、実施例１４に記載されるように免疫組織化学解析および顕微鏡解析に供した。図２１は、各条件の角膜切片におけるＩＩ型コラーゲン標識の代表的な画像を示す。
【０２１１】
本試験から、より低い濃度のＴＧＦβ３（２〜４ｎｇ／ｍＬ）およびデキサメタゾン（１〜１０ｎＭ）は、より低いｅｘ  ｖｉｖｏ有効性を有することが明らかになった（図２１、１行目および２行目）。より高い用量、すなわち、８〜１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３および１００〜１０００ｎＭのデキサメタゾンが、ＩＩ型コラーゲンの沈着を誘導するのに効率的であった（図２１、３行目および４行目）。
【０２１２】
これらの結果は、１００ｎＭのデキサメタゾンおよび１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３の使用を有効濃度として裏付けた（図２１、３行目）。より高い濃度のデキサメタゾン（１０００ｎＭ、すなわち、４００ｎｇ／ｍＬ）もまた有効であることが示された（図２１、４行目）。本試験で試験したデキサメタゾン濃度は、市販の点眼薬に使用される濃度（すなわち、１ｍｇ／ｍＬのデキサメタゾン）よりも著しく低いことに留意されたい。
【０２１３】
実施例１６：実験的観察および結果の概要
ＴＧＦβ１とデキサメタゾンとの組み合わせは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前駆細胞を軟骨細胞に分化させるように誘導するために以前に使用されている（Ｄｉｅｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｋｏｌａｍｂｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。他の試験では、角膜実質細胞のサイドポピュレーションが、類似する軟骨細胞分化条件下で軟骨特異的ＩＩ型コラーゲンから構成されるマトリックスを産生することが示されている（Ｄｕ，Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ，Ｍａｎｎ，ＳｕｎｄａｒＲａｊ，＆Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ  ２００５）。また、強膜細胞が、ＴＧＦβ１およびＢＭＰ２を含有する軟骨形成分化培地で４週間後にアグリカンを含む軟骨特異的マーカーとＩＩ型コラーゲンを発現したことが報告されている。さらに、ヒト強膜細胞は、軟骨欠損ラットに移植された後、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける軟骨形成の可能性を保持することが示されている（Ｓｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。強膜の線維芽細胞と角膜実質とは、共通の発生起源を共有することが分かっている。
【０２１４】
本明細書に示されるように、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンを含有するが血清が存在しない培養培地に播種した角膜実質細胞は、細胞凝集によって２〜３日以内に細胞スフェロイドを自然に形成し、３週目には、これらの細胞クラスターは、軟骨特異的ＩＩ型コラーゲンに陽性に標識された。最初にＴＧＦβ３およびデキサメタゾンで処理したとき、Ｉ型コラーゲンの発現も増加された。培地をウシ胎仔血清を含有する対照培地に交換すると、細胞クラスターは、単層の細胞に分散した。単層で増殖中の細胞は、もはやＩＩ型コラーゲンを発現しなかった。これらの結果から、細胞の凝集および環境が、ＩＩ型コラーゲンの誘導において重要である可能性が示唆される。
【０２１５】
特に、血清を含有する培地中で線維芽細胞として最初に増殖させた角膜実質細胞は、培地をＴＧＦβ３およびデキサメタゾンを含有する軟骨形成分化培地に交換したときにＩＩ型コラーゲンを分泌しなかった。このことは、一旦、線維芽細胞として増殖すると、細胞は軟骨形成経路に沿って分化する能力を喪失することを示唆している。これに加えて、ペレットとして軟骨形成分化培地中の三次元培養で成長させた線維芽細胞も、軟骨特異的ＩＩ型コラーゲンを発現することができなかった。これらの結果から、静止状態にある角膜実質細胞の表現型および細胞の凝集が軟骨細胞分化にとって重要であることが示唆される。
【０２１６】
軟骨形成分化培地における正常な角膜および円錐角膜の角膜のｅｘ  ｖｉｖｏ培養により、角膜実質のラメラに沿ったＩＩ型コラーゲンの均一な沈着が明らかになったことが本明細書に示される。角膜実質内のあらゆる角膜実質細胞は、ＩＩ型コラーゲン標識に関連しており、ここでも同様に、軟骨形成表現型へのリプログラミングが確率論的であることが示唆され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養から得られた結果が前駆細胞のサイドポピュレーションの増殖の結果ではなかったことが裏付けられた。さらに、ラットにおける角膜のｉｎ  ｖｉｖｏ処理も、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養で見られたのと同様の様式でＩＩ型コラーゲンの沈着を引き起こした。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏで処理したときには角膜の前部にＩＩ型コラーゲンのより強い免疫標識が見られたことから、おそらくは、眼表面からの角膜実質の前層への増殖因子のより容易な拡散を反映している可能性が最も高い。
【０２１７】
円錐角膜の角膜実質細胞においての密度の違いを調べる研究によって、細胞密度における全体的な低下が報告されている。本明細書における結果も、これを裏付けている。しかしながら、角膜実質の前部における細胞密度の著しい低下を報告している他の研究とは異なり（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ｅｆｒｏｎ，＆Ｔｕｌｌｏ  ２００５；Ｋｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｍｅｎｃｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｎｉｅｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）、本明細書における結果は、未処理の円錐角膜の角膜の角膜実質の後部における角膜実質細胞密度の著しい低下も示している。円錐角膜には、角膜の全体的な菲薄化が認められる。しかしながら、これが、角膜実質細胞のアポトーシスおよび後続のＥＣＭの産生低下によるものであるかどうか、または角膜実質細胞アポトーシスが角膜の菲薄化プロセスに続発するかどうかは分かっていない。
【０２１８】
本明細書に示されるように、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンを含有する軟骨形成培地中で培養した円錐角膜の角膜のうち処理した半分は、対照と比較して角膜実質細胞密度の増加を示した。さらに、角膜実質の後部には、角膜実質細胞が再集合したと考えられた。処理した半分における角膜実質細胞も、大きな突出した核およびいくつかの細胞突起を伴って、より健康に見えると考えられた。このことは、２つの因子を用いた処理が、角膜実質細胞を増殖させ、角膜実質細胞を欠いた特定の後部に角膜実質を再集合させた可能性を示唆している。
【０２１９】
現在の円錐角膜の治療の１つであるコラーゲン架橋は、角膜実質の前部において初期の角膜実質細胞アポトーシスをもたらした。次いで、この後に角膜実質細胞による角膜実質の再集合の期間が続く。角膜実質細胞の細胞死は、通常、傷害への反応として見られ、架橋の場合、ＵＶＡ誘導性の細胞損傷の結果であると理解されている。このアポトーシス応答は、さらなる炎症から角膜を保護するために発生したと考えられる（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎｅｔｔｏ，＆Ａｍｂｒｏｓｉｏ  ２００３）。
【０２２０】
架橋処理後には、最長で数ヶ月持続し得る角膜実質の濁りも観察された。これは、角膜の微細構造の変化をもたらすコラーゲンの直径およびコラーゲン原線維間の空間における増加に起因している。ほとんどの研究が、処理後６〜１２ヶ月には角膜の曇りの低減を報告している（Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｆｒｙ，Ｂｈａｔｔ，＆Ｈｅｒｓｈ  ２０１０；Ｍａｚｚｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。架橋処理後に角膜の臨床観察は何回か行われているが、角膜の曇りおよび他の考えられる処理の下流効果の原因に関しては曖昧さが存在する。角膜が再集合して透明になるには数ヶ月を要するという事実から、架橋が角膜実質内の創傷治癒反応を誘発している可能性が示唆される。
【０２２１】
本試験では、たとえ長期（最長８週間）のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ処理時であっても、角膜混濁の証拠は認められなかった。これは、おそらく、既存のコラーゲンラメラに沿った均一な層状のＩＩ型コラーゲンの沈着によるものである。ＩＩＩ型コラーゲン（線維症に関連する）およびα平滑筋アクチン（筋線維芽細胞の形成中）の沈着は、混濁および瘢痕につながる。これらはどちらも、角膜創傷中に見られる。これらのタンパク質のいずれも処理した角膜には発現されなかったことから、瘢痕をもたらし得る創傷治癒カスケードが誘発されなかったことが示唆される。
【０２２２】
本明細書に記載されるように、ＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現の定量的測定は、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンを中止するとその発現が有意に低下したことを示した。これは、角膜実質細胞のリプログラミングは不可逆的ではなく、後続のＥＣＭにおけるＩＩ型コラーゲンの沈着は潜在的に制御され得るということを示唆している。不可逆的なＥＣＭの沈着を誘導することは望ましくないため、これは治療方法の開発にとって重要である。
【０２２３】
ナノインデンテーションは、円錐角膜（角膜ジストロフィー）、およびＬＡＳＩＫ後の眼の拡張症等のための架橋等の、術後療法の評価に用いられてきた。ヒト死体角膜に対して行われたある研究において、コラーゲンの架橋が、前部前角膜実質における弾性率に２倍増加を引き起こしたのに対し、後部角膜実質は処理による影響を受けなかったことが明らかになった（Ｄｉａｓ，Ｄｉａｋｏｎｉｓ，Ｋａｎｋａｒｉｙａ，Ｙｏｏ，＆Ｚｉｅｂａｒｔｈ  ２０１３）。本試験において、前部角膜の弾性を測定した。さらに、本試験の結果は、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンで処理した角膜において後部角膜実質の角膜実質細胞密度が変化したことを示している。
【０２２４】
ナノインデンテーションは、個々のコラーゲン原線維の特性を測定しないが、ＩＩ型コラーゲンの沈着で変化し、コラーゲン架橋において後に増加する、角膜の固有の弾性特性における変化を測定することができる。角膜実質内の構造の違いは、対応する生体力学的特性における違いに反映される。本明細書における結果は、増殖因子で処理したラット角膜の弾性率および硬度においてほぼ３倍増加が認められたことを示している。これらの結果は、処理によって、より高い弾性を有する、より剛性の高い角膜が得られることを示唆している。弾性率は、弾性的に変形される物質の抵抗性の尺度であり、したがって、より高い弾性率は、材料を変形させることがより困難であることを意味する。本試験において、１週間処理した角膜と比較して、３週間処理した角膜における硬度および弾性率の有意な増加は、検出可能なＩＩ型コラーゲンの層を沈着させるには少なくとも２〜３週間の処理が必要であることを示す免疫組織化学標識の結果と一致している。
【０２２５】
免疫組織化学標識の結果は、遺伝子発現試験および生体力学的試験と相まって、無傷の角膜内の角膜実質細胞が、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンを用いた処理によって軟骨形成経路に沿ったリプログラミングに適用可能であることを示している。ＴＧＦβ３とデキサメタゾンとを組み合わせた処理によるリプログラミングは、確率論的であり、より剛性の高い、より弾性の角膜をもたらすための増殖因子処理期間の調節によって制御され得る。特に、両方の薬剤の投与が必要である：ＴＧＦβ３とデキサメタゾンとが別々に試験される場合、角膜実質細胞においてＩＩ型コラーゲンの産生は観察されない。新規治療は、したがって、円錐角膜および他の眼疾患のために、本明細書に記載されるような、ＴＧＦβ３およびデキサメタゾンの投与によるｉｎ  ｖｉｖｏ組織工学を用いた新規治療が提案される。
【０２２６】
実施例１７：角膜の再形成を調べるための大動物モデル
ヒツジモデルにおいて最適な治療計画を実現しながら角膜を再形成する
角膜の再形成を実証するために、大動物モデルを使用するためのさらなる実験を行う。これらの実験では、処方コンタクトレンズの留置を可能にするために大動物モデルを使用した。ヒツジの眼は、大きさおよび生理機能がヒトの眼と同程度であるため、モデル動物としてヒツジを用いた。さらに、飼育設備はＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈのＬｉｎｃｏｌｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで入手可能であった。ヒツジは、穏やかな気質を有し、取り扱いに適していることに留意されたい。
【０２２７】
飼育設備内で標準的な操作手順に従ってヒツジを鎮静化した。げっ歯類の用量最適化試験に基づいて最適なＴＧＦβ３およびデキサメタゾン濃度を有する点眼薬製剤（体積目盛り付き）を右眼に点眼した後、コラーゲン沈着の間に所望の角膜の曲率を保持するために角膜ＩＮＴＡＣＳ（登録商標）（または類似の強膜リング）を留置した（図１８）。点眼薬は、３週間の期間にわたり、（げっ歯類の最適化試験で決定されたように）１日１回または１日２回のいずれかで継続的に投与した。次いで、ＩＮＴＡＣＳ（登録商標）を除去し、さらに３週間または６ヶ月間飼育を続けた。
【０２２８】
処理前および処理終了時（ＩＮＴＡＣＳ（登録商標）を除去したとき）に、角膜の厚さおよび曲率の測定を行った。携帯用角膜厚度計を使用して、処理した角膜対反対側の対照角膜の角膜の厚さにおける変化をｉｎ  ｖｉｖｏで検出した。携帯用Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）を使用して、処理前および処理後にヒツジの眼の角膜の曲率および角膜の厚さを測定した（図１９（Ｅ）および（Ｆ））。最終的な（最も正確な）Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）の測定値を用いて、レンズ除去から３週間後に角膜測定が繰り返される。げっ歯類の角膜について前述したように、これらは、動物を死に至らしめた後ではあるが、免疫組織学的解析および生体力学的解析のために眼を除去する前に行われる。万が一、ヒツジがハードコンタクトレンズに耐えられない場合（感染症、炎症、または被刺激性の徴候）、試験はレンズなしで継続され、ＩＩ型コラーゲンの沈着および分布、ならびに生体力学的特性等の主要パラメータの完了を可能にする。
【０２２９】
この結果を考慮すると、角膜を恒久的に再形成かつ安定化し、近視を含む一般的な角膜の欠陥に治療を提供するために、ガス透過性の剛性ＯｒｔｈｏＫコンタクトレンズ（または類似物）と組み合わせて、本明細書に詳述されるｉｎ  ｖｉｖｏ組織工学を用いることが提案される。
【０２３０】
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Ｍａｚｚｏｔｔａ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓｉ，Ｃ．，Ｂａｉｏｃｃｈｉ，Ｓ．，Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ，Ｏ．，Ｂｏｖｏｎｅ，Ｃ．，Ｓｐａｒａｎｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ，Ａ．（２００８）．Ｃｏｒｎｅａｌ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ−Ａ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１４６（４），５２７−５３３．ｅ５２１．
Ｍｅｅｋ，Ｋ．Ｍ．，Ｔｕｆｔ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｇｉｌｌ，Ｐ．Ｓ．，Ｈａｙｅｓ，Ｓ．，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．，＆Ｂｒｏｎ，Ａ．Ｊ．（２００５）．Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ  ｃｏｒｎｅａｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４６（６），１９４８−１９５６．
Ｍｅｎｃｕｃｃｉ，Ｒ．，Ｍａｒｉｎｉ，Ｍ．，Ｐａｌａｄｉｎｉ，Ｉ．，Ｓａｒｃｈｉｅｌｌｉ，Ｅ．，Ｓｇａｍｂａｔｉ，Ｅ．，Ｍｅｎｃｈｉｎｉ，Ｕ．，＆Ｖａｎｎｅｌｌｉ，Ｇ．Ｂ．（２０１０）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ／ＵＶＡ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｎ  ｋｅｒａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｎｅａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，３８（１），４９−５６．
Ｍｅｎｄｌｅｒ，Ｍ．，Ｅｉｃｈ−Ｂｅｎｄｅｒ，Ｓ．Ｇ．，Ｖａｕｇｈａｎ，Ｌ．，Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ，Ｋ．Ｈ．，＆Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｐ．（１９８９）．Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｍｉｘｅｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅｓ  ＩＩ，ＩＸ，ａｎｄ  ＸＩ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０８（１），１９１−１９７．
Ｍｅｎｅｔｒｅｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ＆Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｖｏｌｕｍｅ，８２（１），１３１−１３７．
Ｎｉｅｄｅｒｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｐｅｒｕｍａｌ，Ｄ．，Ｓｈｅｒｗｉｎ，Ｔ．，＆ＭｃＧｈｅｅ，Ｃ．Ｎ．Ｊ．（２００８）．Ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  ａｌｌ  ｌａｙｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｉｃ  ｃｏｒｎｅａ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４９（７），２９６４−２９７０．
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Ｐａｔｅｌ，Ｈ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ  ｓｔｕｄｙ  １９９１−２００３：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｕｒｃｅ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｃｏｒｎｅａ，２４（５），５７６−５８２．
Ｐａｔｅｌ，Ｄ．，Ｃ．ＭｃＧｈｅｅ  （２０１３）．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ：ｗｈａｔ  ｈａｖｅ  ｗｅ  ｌｅａｒｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ？  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｐｔｏｍｅｔｒｙ，９６（２），１８３−１８７．
Ｐｅｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ｗｈｙ  ａｎｄ  ｈｏｗ？  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，３５（４），３７３−３７９．
Ｐｒａｍａｎｉｋ，Ｓ．，Ｍｕｓｃｈ，Ｄ．Ｃ．，Ｓｕｔｐｈｉｎ，Ｊ．Ｅ．，＆Ｆａｒｊｏ，Ａ．Ａ．（２００６）．Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ  ｆｏｒ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１１３（９），１６３３−１６３８．
Ｐｒｅｍａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｅｎｓｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．５１（４），３２５−３３．
Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．（１９９８）．Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ．Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，４２（４），２９７−３１９．
Ｒａｂｏｎｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．（２００４）．Ｅｃｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｒｎｅａ．Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｃｏｒｎｅａ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．
Ｒｏｍｅｒｏ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｍ．，Ｓａｎｔｏｄｏｍｉｎｇｏ−Ｒｕｂｉｄｏ，Ｊ．，＆Ｗｏｌｆｆｓｏｈｎ，Ｊ．Ｓ．（２０１０）．Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｅｙｅ，３３（４），１５７−１６６．
Ｒｕｐｅｎｔｈａｌ，Ｉ．Ｄ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｃ．Ｒ．，＆Ａｌａｎｙ，Ｒ．Ｇ．（２０１１）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｇｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｏｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐａｒｔ  ２：Ｐｒｅｃｏｒｎｅａｌ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．
Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ，Ｍ．，Ｙａｎｕｋａ，Ｏ．，Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，Ｊ．，Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．，＆Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．（２０００）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｉｇｈｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９７（２１），１１３０７−１１３１２．
Ｓｈａｈ，Ｍ．，Ｆｏｒｅｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，＆Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｍ．Ｗ．（１９９５）．Ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  １  ａｎｄ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ２  ｏｒ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ３  ｔｏ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｒａｔ  ｗｏｕｎｄｓ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｓｃａｒｒｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０８（３），９８５−１００２．
Ｓｈｅｒｗｉｎ，Ｔ．，＆Ｂｒｏｏｋｅｓ，Ｎ．Ｈ．（２００４）．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ：ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，３２（２），２１１−２１７．
Ｓｐｏｅｒｌ，Ｅ．，Ｈｕｈｌｅ，Ｍ．，＆Ｓｅｉｌｅｒ，Ｔ．（１９９８）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｓ  ｉｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６６（１），９７−１０３．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ．（２００６）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ，１２６（４），６６３−６７６．
Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  （ｒｈＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓＲＩＩ）．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，７（５），３８９−９７．
Ｗｅｌｌｓ，Ｓ．Ｍ．（２００３）．Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｅｌａｓｔｉｃ  ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｉｎ  Ｃａｎａｄａ，５９（２），６７−７４．
Ｗｅｒｎｉｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ＥＳ−ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ｓｔａｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ，４４８（７１５１），３１８−３２４．
Ｗｉｌｌｓｈａｗ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．Ｐｅｎｓｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ：Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ．
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｎｅｔｔｏ，Ｍ．，＆Ａｍｂｒｏｓｉｏ，Ｒ．（２００３）．Ｃｏｒｎｅａｌ  ｃｅｌｌｓ：ｃｈａｔｔｙ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ，ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１３６（３），５３０−５３６．
Ｗｉｎｔｅｒ，Ａ．，Ｂｒｅｉｔ，Ｓ．，Ｐａｒｓｃｈ，Ｄ．，Ｂｅｎｚ，Ｋ．，Ｓｔｅｃｋ，Ｅ．，Ｈａｕｎｅｒ，Ｈ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｗ．（２００３）．Ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ：Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｄ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４８（２），４１８−４２９．
Ｗｏｌｌｅｎｓａｋ，Ｇ．，Ｓｐｏｅｒｌ，Ｅ．，＆Ｓｅｉｌｅｒ，Ｔ．（２００３）．Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ／ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ−Ａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１３５（５），６２０−６２７．
Ｗｏｌｌｅｎｓａｋ，Ｊ．，＆Ｂｕｄｄｅｃｋｅ，Ｅ．（１９９０）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ−ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｉｃ  ｅｙｅｓ．Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，２２８（６），５１７−５２３．
Ｗｏｒｓｔｅｒ，Ａ．Ａ．，Ｎｉｘｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｅｒ−Ｔｏｌａｎｄ，Ｂ．Ｄ．，＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．（２０００）．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β１  ｏｎ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｅｑｕｉｎｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１（９），１００３−１０１０．
Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ．（２０１０）．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｔｏ  ａ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｂｙ  ｔｈｒｅｅ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４６５（７２９９），７０４−７１２．
Ｙｏｏｎ  Ｙ．Ｍ．，Ｏｈ  Ｃ．Ｄ．，Ｋｉｍ  Ｄ．Ｙ．，Ｌｅｅ  ＹＳ，Ｐａｒｋ  Ｊ．Ｗ．，Ｈｕｈ  Ｔ．Ｌ．，Ｋａｎｇ  Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｕｎ  Ｊ．Ｓ．（２０００）．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ−ａｌｐｈａ，Ｅｒｋ−１，ａｎｄ  ｐ３８  ＭＡＰＫ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７５（１６）：１２３５３−９．
当業者は、本明細書に記載される実施形態または態様と実質的に同じ機能を行うかまたは実質的に同じ結果を達成する修正例、代替例、および／または変更例が、そのような関連する本発明の実施形態または態様に従って後に用いられ得ることを本開示から容易に理解するであろう。したがって、本発明は、その範囲内に、本明細書に開示されるプロセス、製品、組成物、化合物、手段、方法、および／またはステップに対する修正例、代替例、および変更例を包含することが意図される。
【０２３１】
本明細書に引用される、特許および特許出願を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。いずれかの参考文献が従来技術を構成することは認められない。また、いずれかの参考文献の議論も、ニュージーランドまたは他の任意の国における当該技術分野の共通の一般知識の一部を形成することを認めるものではない。
【図１Ａ】
2018513117.tif 000012
【図１Ｂ】
2018513117.tif 000013
【図２】
2018513117.tif 000014
【図３】
2018513117.tif 000015
【図４】
2018513117.tif 000016
【図５Ａ】
2018513117.tif 000017
【図５Ｂ】
2018513117.tif 000018
【図６Ａ】
2018513117.tif 000019
【図６Ｂ】
2018513117.tif 000020
【図６Ｃ】
2018513117.tif 000021
【図６Ｄ】
2018513117.tif 000022
【図７Ａ】
2018513117.tif 000023
【図７Ｂ】
2018513117.tif 000024
【図７Ｃ】
2018513117.tif 000025
【図７Ｄ】
2018513117.tif 000026
【図８】
2018513117.tif 000027
【図９Ａ】
2018513117.tif 000028
【図９Ｂ】
2018513117.tif 000029
【図９Ｃ】
2018513117.tif 000030
【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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