(57)【要約】本発明は、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療における新規な投薬レジメンに関する。特に、本発明は、投薬レジメンにおいて潜伏ウイルスリザーバー駆逐剤とともに投与される、抗ＨＩＶ−１特異的抗体および／またはＨＩＶ特異的ワクチンペプチドなどのＨＩＶ特異的タンパク質治療剤の製剤の特定の新規な使用に関する。製剤は、さらに、少なくとも１つの免疫調節化合物、および／またはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤などの他のリザーバー駆逐剤と組み合わせて、１つ以上の他の治療剤とともに投与することができる。
2018515603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ）の病理学的影響を低減および／もしくは遅延させる、またはＨＩＶの症状を緩和、低減もしくは遅延させる、またはＨＩＶの臨床マーカーを改善する、あるいはＨＩＶに感染したヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症するリスクを低減させる、またはウイルス再活性化中にＨＩＶ粒子の循環（ＨＩＶウイルス血症）を予防、遅延もしくは減少させる方法であって、以下の工程：
ａ）有効量の１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドおよび／または抗ＨＩＶ−１特異的抗体などの任意の他のタンパク質治療剤を、１以上の用量で１〜１２週間の期間にわたって投与することを含むＨＩＶ−１治療免疫相；ならびに
ｂ）有効量のリザーバー駆逐剤を投与することを含む、その後のウイルス再活性化相
を含む、方法。
【請求項２】
１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドが、配列番号１８（Ｖａｃｃ−１０）、配列番号１１（Ｖａｃｃ−１１）、配列番号６（Ｖａｃｃ−１２）および配列番号３（Ｖａｃｃ−１３）に示されるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれからなるペプチドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ）などのアジュバントが、前記ＨＩＶ−１治療免疫と併用して、その前にまたはそれと同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リザーバー駆逐剤が、前記ＨＩＶ−１治療免疫相の少なくとも約１、２、３または４週間後に、連続して１、２、３または４週間の期間にわたって投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ウイルス再活性化相が、有効量のリザーバー駆逐剤を１〜１０用量、例えば２〜１０用量、例えば３〜１０、例えば４〜１０、例えば５〜１０、例えば６〜１０、例えば７〜１０、例えば８〜１０、例えば９〜１０、例えば１０用量、または１〜９用量、例えば１〜８用量、例えば１〜７、例えば１〜６、例えば１〜５、例えば１〜４、例えば１〜３、例えば３用量で投与することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）および／またはｂ）が、独立して、任意の順序で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
リザーバー駆逐剤が、ロミデプシンまたはパノビノスタットなどのＨＤＡＣ阻害剤である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
リザーバー駆逐剤が、最大１ｍｇ／ｍ２、例えば最大２ｍｇ／ｍ２、例えば最大２．５ｍｇ／ｍ２、例えば最大３ｍｇ／ｍ２、例えば最大４ｍｇ／ｍ２、例えば最大５ｍｇ／ｍ２、例えば最大７．５ｍｇ／ｍ２、例えば最大１０ｍｇ／ｍ２、例えば最大１２ｍｇ／ｍ２、例えば最大１２．５ｍｇ／ｍ２、例えば最大１４ｍｇ／ｍ２、例えば２．５ｍｇ／ｍ２〜７．５ｍｇ／ｍ２、例えば約５ｍｇ／ｍ２の用量での注入によりロミデプシン投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｃＡＲＴにおいて、ＨＩＶ−１の潜伏リザーバーに対する影響が、ＨＩＶ感染患者においてウイルス学的に抑制される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
各ペプチドが、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／投与、例えば０．１〜１０ｍｇ／投与、例えば０．１〜９ｍｇ／投与、例えば０．１〜８ｍｇ／投与、例えば０．１〜７ｍｇ／投与、例えば０．１〜６ｍｇ／投与、例えば０．１〜５ｍｇ／投与、例えば０．１〜４ｍｇ／投与、例えば０．１〜３ｍｇ／投与、例えば０．１〜２ｍｇ／投与、例えば０．１〜１．２ｍｇ／投与、例えば０．１〜０．９ｍｇ／投与、例えば０．１〜０．６ｍｇ／投与、例えば０．１〜０．４ｍｇ／投与の用量で与えられる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＩＶ−１治療免疫相が、１〜１２週間の期間にわたり、例えば２〜１２週間の期間にわたり、例えば３〜１２週間の期間にわたり、例えば４〜１２週間の期間にわたり、例えば５〜１２週間の期間にわたり、例えば６〜１２週間の期間にわたり、例えば７〜１２週間の期間にわたり、例えば８〜１２週間の期間にわたる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＩＶ−１治療免疫相が、１〜１０用量、例えば２〜１０用量、例えば３〜１０、例えば４〜１０、例えば５〜１０、例えば６〜１０、例えば７〜１０、例えば８〜１０、例えば９〜１０、例えば１０用量で投与することを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上のペプチドが酢酸塩の形態である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
塩の酢酸塩含量が、４％〜１８％、例えば５％〜１７％、例えば６％〜１６％、例えば７％〜１５％、例えば８％〜１４％、例えば９％〜１４％、例えば９％〜１３％、例えば１０％〜１４％、例えば１１％〜１４％、または５％〜１６％、例えば５％〜１５％、例えば５％〜１４％、例えば６％〜１４％、例えば６％〜１３％、例えば７％〜１２％、例えば７％〜１１％、例えば８％〜１１％、例えば９％〜１１％、または３％〜１８％、例えば３％〜１７％、例えば３％〜１６％、例えば３％〜１５％、例えば３％〜１４％、例えば３％〜１３％、例えば３％〜１１％、例えば３％〜１０％、例えば４％〜１０％、例えば４％〜９％、例えば４％〜８％、例えば４％〜７％、例えば４％〜６％、例えば４％〜５％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１つ、２つ、３つまたは４つのペプチドがＨＩＶ−１治療免疫相において使用される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
酢酸塩としての４つ全てのペプチドが、ＨＩＶ−１治療免疫相において使用される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ペプチドが、式−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２のアミドＣ末端またはその酢酸塩を有する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
４つ全てのペプチドが１：１：１：１の比（ｗ／ｗ）で使用される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ、２つ、３つまたは４つのペプチドが、溶解した液体状態である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記液体が水である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
免疫調節化合物および第２のリザーバー駆逐剤、例えばヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤から選択される少なくとも１つのさらなる治療活性剤を投与することをさらに含む、請求項１から２０いずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
免疫調節化合物が、抗ＰＤ１抗体、例えばＭＤＸ−１１０６（Ｍｅｒｃｋ）、ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標）（サリドマイド）、抗ＰＤ１抗体、シクロホスファミド、レバミゾール、レナリドマイド、ＣＣ−４０４７（ポマリドマイド）、ＣＣ−１１００６（Ｃｅｌｇｅｎｅ）およびＣＣ−１００１５（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ならびに国際公開第２００７／０２８０４７号、国際公開第２００２／０５９１０６号および国際公開第２００２／０９４１８０号のいずれか１つに記載されている免疫調節化合物から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
免疫調節化合物がレナリドマイドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
リザーバー駆逐剤が、Ｍ３４４（４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［７−（ヒドロキシアミノ）−７−オキソヘプチル］ベンズアミド）、キダミド（ＣＳ０５５／ＨＢＩ−８００）、４ＳＣ−２０２、（４ＳＣ）、レスミノスタット（４ＳＣ）、ヒドロキサム酸、例えばボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、トリコスタチンＡおよびパノビノスタット（ＬＢＨ５８９）；ベンズアミド、例えばエンチノスタット（ＭＳ−２７５）、ＣＩ９９４、およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、環状テトラペプチド（例えばトラポキシン、例えばトラポキシンＢ）、およびデプシペプチド、例えばロミデプシン（ＩＳＴＯＤＡＸ）、求電子性ケトン、および脂肪酸化合物、例えばフェニル酪酸塩、バルプロ酸、オキサムフラチン、ＩＴＦ２３５７（ジェネリックのギビノスタット）、アピシジン、ＭＣ１２９３、ＣＧ０５、およびＣＧ０６；転写因子を活性化する化合物、例えば、ＮＦ−カッパＢ、プロストラチン、オーラノフィン、ブリオスタチン、非腫瘍原性ホルボールエステル、ＤＰＰ（１２−デオキシホルボール−１３−フェニル酢酸塩）、ＰＭＡ、およびホルボール１２−ミリステート１３−酢酸塩（ＰＭＡ）；ＨＩＶ  ｍＲＮＡ伸長を活性化する化合物、例えば、Ｐ−ＴＥＦ−ｂキナーゼおよびヘキサメチルビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）；ＩＬ−７；Ｔ細胞刺激因子、例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８−Ｔ細胞刺激Ａｂ；キナーゼ阻害剤、例えば、チルホスチンＡ、チルホスチンＢおよびチルホスチンＣ；ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシンホモログ）遺伝子阻害剤、例えば、ＳＦ１６７０（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ジスルフィラム（ＤＳＦ）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの阻害剤、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）およびｂｐＶ（ｐｉｃ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体−９（ＴＬＲ９）アゴニストおよびＴｏｌｌ様受容体−７（ＴＬＲ９）アゴニスト、ケルセチン、リポ酸、酪酸ナトリウム、ＴＮＦ−アルファ、ＰＨＡおよびＴａｔから選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ロミデプシンなどのリザーバー駆逐剤が、１〜１２時間にわたって、例えば、１〜１１時間、１〜１０時間、１〜９時間、１〜８時間、１〜７時間、１〜６時間、１〜５時間、１〜４時間、２〜４時間、３〜４時間にわたって注入によって投与される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
抗ＨＩＶ抗体、類似体または誘導体などの、有効量のＨＩＶ特異的タンパク質治療剤を１回以上の用量で投与することを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ）の病理学的影響を低減および／もしくは遅延させる、またはＨＩＶに感染したヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症するリスクを低減させるためのキットであって、
ａ）１以上の用量の有効量の１つ以上のＨＩＶ類似体ペプチド；および
ｂ）リザーバー駆逐剤
を含み、適宜、
ｃ）１つ以上のさらなる治療的に活性な薬剤
を含むキット。
【請求項２８】
１つ以上のペプチドおよび／またはリザーバー駆逐剤および／または前記１つ以上のさらなる治療的に活性な薬剤が、請求項１から２６のいずれか一項に定義される通りである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ）の病理学的影響を低減および／もしくは遅延させる、またはＨＩＶに感染したヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症するリスクを低減させる方法において使用するための配列番号１８（Ｖａｃｃ−１０）、配列番号１１（Ｖａｃｃ−１１）、配列番号６（Ｖａｃｃ−１２）に示されるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれからなる１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチドであって、前記方法は、以下の工程：
ａ）１〜１２週の期間にわたって前記１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドの１つ以上の用量を投与することからなる治療的ＨＩＶ−１免疫化相；および
ｂ）有効量のリザーバー駆逐剤を投与することからなる、その後のウイルス再活性化相
を含む、ペプチド。
【請求項３０】
組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ）などのアジュバントが、前記ＨＩＶ−１治療免疫と併用して、その前にまたはそれと同時に投与される、請求項２９に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項３１】
リザーバー駆逐剤が、前記ＨＩＶ−１治療免疫相の少なくとも約１、２、３または４週間後に、連続して１、２、３または４週間の期間にわたって投与される、請求項２９または３０に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項３２】
ウイルス再活性化相が、１〜１０用量、例えば２〜１０用量、例えば３〜１０、例えば４〜１０、例えば５〜１０、例えば６〜１０、例えば７〜１０、例えば８〜１０、例えば９〜１０、例えば１０用量、または１〜９用量、例えば１〜８用量、例えば１〜７、例えば１〜６、例えば１〜５、例えば１〜４、例えば１〜３、例えば３用量の投与を含む、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項３３】
リザーバー駆逐剤が、ロミデプシンまたはパノビノスタットなどのＨＤＡＣ阻害剤である、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項３４】
リザーバー駆逐剤が、５ｍｇ／ｍ２の投薬量での注入によって投与されるロミデプシンである、請求項３３に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項３５】
ｃＡＲＴにおいて、ＨＩＶ−１の潜伏リザーバーに対する影響が、ＨＩＶ感染患者においてウイルス学的に抑制される、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項３６】
各ペプチドが、１回の投与あたり０．１ｍｇ〜１０ｍｇ用量、例えば０．２〜１０ｍｇ／投与、例えば０．２〜９ｍｇ／投与、例えば０．２〜８ｍｇ／投与、例えば０．２〜７ｍｇ／投与、例えば０．２〜６ｍｇ／投与、例えば０．２〜５ｍｇ／投与、例えば０．２〜４ｍｇ／投与、例えば０．２〜３ｍｇ／投与、例えば０．２〜２ｍｇ／投与、例えば０．２〜１ｍｇ／投与、例えば０．２〜０．８ｍｇ／投与、例えば０．２〜０．６ｍｇ／投与、例えば０．２〜０．４ｍｇ／投与の用量で与えられる、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項３７】
ＨＩＶ−１治療免疫相が、１〜１２週間の期間にわたる、例えば２〜１２週間の期間にわたる、例えば３〜１２週間の期間にわたる、例えば４〜１２週間の期間にわたる、例えば５〜１２週間の期間にわたる、例えば６〜１２週間の期間にわたる、例えば７〜１２週間の期間にわたる、例えば８〜１２週間の期間にわたる、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項３８】
ＨＩＶ−１治療免疫相が、１〜１０用量、例えば２〜１０用量、例えば３〜１０、例えば４〜１０、例えば５〜１０、例えば６〜１０、例えば７〜１０、例えば８〜１０、例えば９〜１０、例えば１０用量で投与することを含む、請求項２９から３７のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項３９】
前記１つ以上のペプチドが酢酸塩の形態である、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項４０】
塩の酢酸塩含量が、４％〜１８％、例えば５％〜１７％、例えば６％〜１６％、例えば７％〜１５％、例えば８％〜１４％、例えば９％〜１４％、例えば９％〜１３％、例えば１０％〜１４％、例えば１１％〜１４％、または５％〜１６％、例えば５％〜１５％、例えば５％〜１４％、例えば６％〜１４％、例えば６％〜１３％、例えば７％〜１２％、例えば７％〜１１％、例えば８％〜１１％、例えば９％〜１１％、または３％〜１８％、例えば３％〜１７％、例えば３％〜１６％、例えば３％〜１５％、例えば３％〜１４％、例えば３％〜１３％、例えば３％〜１１％、例えば３％〜１０％、例えば４％〜１０％、例えば４％〜９％、例えば４％〜８％、例えば４％〜７％、例えば４％〜６％、例えば４％〜５％である、請求項３９に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項４１】
１つ、２つ、３つまたは４つのペプチドがＨＩＶ−１治療免疫相において使用される、請求項２９から４０のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項４２】
酢酸塩としての４つ全てのペプチドが、ＨＩＶ−１治療免疫相において使用される、請求項２９から４１のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項４３】
ペプチドが、式−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２のアミドＣ末端またはその酢酸塩を有する、請求項２９から４２のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項４４】
４つ全てのペプチドが１：１：１：１の比（ｗ／ｗ）で使用される、請求項２９から４３のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項４５】
前記１つ、２つ、３つまたは４つのペプチド酢酸塩が、溶解した液体状態にある、請求項２９から４４のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項４６】
前記液体が水である、請求項４４に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項４７】
方法が、免疫調節化合物、および第２のリザーバー駆逐剤、例えばヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤から選択される１つ以上のさらなる治療活性剤を投与することをさらに含む、請求項２９から４６のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項４８】
免疫調節化合物が、抗ＰＤ１抗体、例えばＭＤＸ−１１０６（Ｍｅｒｃｋ）、ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標）（サリドマイド）、抗ＰＤ１抗体、シクロホスファミド、レバミゾール、レナリドマイド、ＣＣ−４０４７（ポマリドマイド）、ＣＣ−１１００６（Ｃｅｌｇｅｎｅ）およびＣＣ−１００１５（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ならびに国際公開第２００７／０２８０４７号、国際公開第２００２／０５９１０６号および国際公開第２００２／０９４１８０号のいずれか１つに記載されている免疫調節化合物から選択される、請求項４７に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項４９】
免疫調節化合物がレナリドマイドである、請求項４８に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項５０】
リザーバー駆逐剤が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えばＭ３４４（４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［７−（ヒドロキシアミノ）−７−オキソヘプチル］ベンズアミド）、キダミド（ＣＳ０５５／ＨＢＩ−８００）、４ＳＣ−２０２、（４ＳＣ）、レスミノスタット（４ＳＣ）、ヒドロキサム酸、例えばボリノスタット（ＳＡＨＡ）、スベロイルビス−ヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、トリコスタチンＡおよびパノビノスタット（ＬＢＨ５８９）；ベンズアミド、例えばエンチノスタット（ＭＳ−２７５）、ＣＩ９９４、およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、環状テトラペプチド（例えばトラポキシン、例えばトラポキシンＢ）、およびデプシペプチド、例えばロミデプシン［Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ）］、求電子性ケトン、および脂肪酸化合物、例えばフェニル酪酸塩、バルプロ酸、オキサムフラチン、ＩＴＦ２３５７（ジェネリックのギビノスタット）、アピシジン、ＭＣ１２９３、ＣＧ０５、およびＣＧ０６、メタセプト−１（ＭＣＴ−１）、メタセプト−３（ＭＣＴ−３）、スクリプタイド、ドロキシノスタット、ＨＣ毒素、ＣＡＹ１０３９８、ＭＣ１２９３、ＣＡＹ１０４３３、デプデシン、１−ナフトエ酸ナトリウム、ＭＲＫ１またはＭＲＫ−１１；ＮＣＨ−５１、ＨＤＡＣ３選択的阻害剤Ｔ２４７およびＴ３２６、およびSuzuki, T. et al. PLoS One 8, e68669 (2013)に記載されている他のもの；転写因子を活性化する化合物、例えばＮＦ−カッパＢ、プロストラチン（１２−デオキシホルボール−１３−酢酸塩）、プロストラチン類似体、オーラノフィン、ブリオスタチン、非腫瘍形成ホルボールエステル、ブリオスタチン類似体、ブリオスタチン−２、ブリオスタチン−２充填ナノ粒子、ＤＰＰ（１２−デオキシホルボール−１３−フェニル酢酸塩）、ＰＭＡ、およびホルボール１２−ミリステート１３−酢酸塩（ＰＭＡ）、ホルボール１３−モノエステル、ホルボール１３−ヘキサノエート、およびホルボール１３−ステアレート（Ｐ−１３Ｓ）；ＡＶ６（４−３’，４’−ジクロロアニリノ−６−メトキシキノリン化合物）；Ｐａｍ３ＣＳＫ４；キノリン−８−オールおよびその誘導体、５−クロロキノリン−８−オールおよび５−クロロキノリン−８−イル；ＨＩＶ  ｍＲＮＡ伸長を活性化する化合物、例えばＰ−ＴＥＦ−ｂキナーゼおよびヘキサメチルビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）；Ｐ−ＴＥＦ−ｂアゴニスト、例えばＪＱ１；ブロモドメイン阻害剤（ＢＥＴｉ）、例えばＴＥＮ−０１０（ＪＱ２）、ＧＳＫ５２５７６２、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ、Ｉ−ＢＥＴ１５１、ＭＳ４１７；タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性剤、例えばインゲノール−３−アンゲレート（ＰＥＰ００５、インゲノールメブテート）、ＩＮＧ−Ａ（インゲノール−３−トランス−シンナメート）、ＩＮＧ−Ｂ（インゲノール−３−ヘキサノエート）、ＩＮＧ−Ｃ（インゲノール−３−ドデカノエート）、インゲノール３，２０−ジベンゾエート、米国特許出願第２０１５／００３０６３８号に記載されているインゲノール誘導体、ＳＪ２３Ｂ（ジャトロファンジテルペン）、Hamer, D. H. et al. J. Virol. 77, 10227-10236 (2003)に記載されているジアシルグ��セロール（ＤＡＧ）類似体、ＤＡＧラクトン、インゴール７，８，１２−トリ酢酸塩３−フェニル酢酸塩、インゴール７，８，１２−トリ酢酸塩３−（４−メトキシフェニル）酢酸塩、８−メトキシインゴール７，１２−ジ酢酸塩３−フェニル酢酸塩、グニジマクリン、ブリオスタチン−１；ＩＬ−７、ＩＬ−１５；米国特許第８，８１６，１２２号に開示されているプロストラチンまたはブリスタチンの類似体およびそのプロドラッグ；米国特許第８，５３６，３７８号に開示されているプロストラチン類似体；サーチュイン阻害剤；Ｔ細胞刺激因子、例えば抗ＣＤ３／ＣＤ２８−Ｔ細胞刺激Ａｂ；キナーゼ阻害剤、例えば、チルホスチンＡ、チルホスチンＢおよびチルホスチンＣ；ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシンホモログ）遺伝子阻害剤、例えばＳＦ１６７０（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ジスルフィラム（ＤＳＦ）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの阻害剤、ダクチノマイシン、アクラルビシン、シタラビン、アフィジコリン；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えばｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）およびｂｐＶ（ｐｉｃ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、例えばＴｏｌｌ様受容体−９（ＴＬＲ９）アゴニストおよびＴｏｌｌ様受容体−７（ＴＬＲ７）アゴニスト；イミキモド、ＧＳ−９６２０、ケルセチン、リポ酸、酪酸ナトリウム、ＴＮＦ−アルファ、ＰＨＡ、Ｔａｔ、米国特許出願公開第２０１３／００７１３５４号、米国特許出願公開第２０１４／００８１０２２号、米国特許出願公開第２０１５／０２３９８８８号、米国特許出願公開第２００９／００４７２４９号、米国特許出願公開第２０１１／０２３６３４８号、米国特許出願公開第２０１４／０１３５４９２号、米国特許出願公開第２０１０／０１４３３０１号、米国特許出願公開第２０１４／０３１６１３２号、米国特許出願公開第２００９／０２０２４８４号、欧州特許出願公開第２１７０８８８号、カナダ特許出願公開第２６９１４４４号、欧州特許出願公開第２３６４３１４号、欧州特許出願公開第２８１８４６９号、カナダ特許出願公開第２７４５２９５号、欧州特許出願公開第２０３８２９０号、カナダ特許出願公開第２６５６４２７号、国際公開第２００９／００５６８７号、国際公開第２０１０／０７７６１３号または国際公開第２００８／００５５５５号に列挙されているＴＬＲ７アゴニスト；例えば米国特許出願公開第２００５／００５４５９０号（米国特許出願第１０／９３１，１３０号）および米国特許出願公開第２００６／０１６０８３０号（米国特許出願第１１／３０４，６９１号）に記載されている、当技術分野において公知であるＴＬＲ７アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストプロドラッグ、３，５−二置換−３Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２−オン、例えば５−アミノ−３−（２’−Ｏ−アセチル−３’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２−オン、イミキモド、イサトリビンおよびそれらのプロドラッグ変異体（例えばＡＮＡ−９７５およびＡＮＡ−９７１、ＡＮＡ７７３）、２，９置換８−ヒドロキシアデノシン誘導体（ＳＭ−３６０３２��）；アンホテリシンＢ；ＪＮＪ６１１；ＣＬ５７２；ユグロン（５ＨＮ、５−ヒドロキシナフタレン−１，４−ジオン）および国際公開第２０１０／０９９１６９号に開示されている化合物、ＴＬＲ−５アゴニスト、例えばフラジェリン、ＴＬＲ７／８アゴニスト、例えばＲ−８４８、ＴＬＲ−９アゴニスト、例えば合成ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＰＧ７９０９またはＭＧＮ１７０３、以下：５−アザシチジン［アザシチジン］、シネフンギン、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン、５−ＡｚａｄＣ）、１−３−ダラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）およびジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノンを含有するオリゴデオキシヌクレオチド二重鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガレート、ヒドララジン、プロカインおよびプロカインアミド；前述のいずれかの類似体を含む２種（非ヌクレオシドおよびヌクレオシド脱メチル化剤）から選択されるＤＮＡメチル化阻害剤から選択される、請求項４８または４９に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【請求項５１】
方法が請求項１から２６のいずれか一項に定義されている通りである、請求項２９から５０のいずれか一項に記載の１つ以上の有効量のＨＩＶ特異的ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療における新規な投薬レジメンに関する。具体的には、本発明は、潜伏ウイルス駆逐剤（latent viral reservoir purging agent）とともに投薬レジメンにおいて投与される、ＨＩＶ特異的ワクチンペプチドおよび／または抗ＨＩＶ−１特異的抗体などの任意の他のタンパク質治療薬の製剤の具体的な新規な使用に関する。さらに、製剤は、１つ以上の他の治療薬とともに、例えば、少なくとも１つの免疫調節化合物および／または他のリザーバー駆逐剤、例えばヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を併用して投与され得る。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＨＩＶ−１感染は、今日、疾患を回避するためには生涯にわたる抗レトロウイルス組合せ療法（ｃＡＲＴ）が必要である、不治の慢性ウイルス感染として認識されている（Egger, Hirschel et al. 1997, Palella, Delaney et al. 1998）。急性ＨＩＶ感染の間の非常に初期に、潜伏リザーバー（latent reservoir）が確立され、有効なｃＡＲＴにもかかわらず、ＨＩＶ−１は潜伏感染細胞内で生き残る（Dai, Agosto et al. 2009, Carter, Onafuwa-Nuga et al. 2010, Wightman, Solomon et al. 2010）。治療中断に際して、このウイルスは急速に複製し、ウイルス血症が治療前レベルに回復する。不活性な静止状態期には、潜伏感染細胞は免疫系に認識されず、抗レトロウイルス薬に不応答である（Chun, Stuyver et al. 1997, Finzi, Hermankova et al. 1997）。リザーバーサイズは個体間で変化する場合があり、多数の異なる因子、限定されないが、例えば、宿主の免疫状態、診断から開始までの時間、持続する免疫活性化のレベル、用いられる抗レトロウイルス治療レジメンおよび治療に対する個々の応答により影響され得る。ウイルス増殖アッセイを用いた初期の研究により、複製−コンピテントなウイルスを有する潜伏ＣＤ４  Ｔ細胞の数は、１０６細胞あたり約１であることが示された。
【０００３】
広範な生体分析アッセイが、潜伏ウイルスリザーバーを定量する試みに用いられてきたが、根絶ストラテジーの臨床研究において、ＨＩＶ−１リザーバーをモニターするためにどのアッセイ（単数または複数）を用いるべきかは現時点で不明である（Eriksson, Graf et al. 2013）。活性化に際し、複製コンピテントな組み込まれたプロウイルスＤＮＡを有する静止状態Ｔ細胞は、ＨＩＶ転写を再開することができる（Chun, Finzi et al. 1995, Chun, Carruth et al. 1997, Eriksson, Graf et al. 2013）。提案されているＨＩＶ−１の治療方法の１つは、抗レトロウイルス療法の存在下で、潜伏感染細胞を活性化し、死滅させることである（Deeks 2012）。組み込まれたＨＩＶ  ＤＮＡの転写をブロックする分子機序のエピジェネティックな改変は、静止状態の感染メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞においてＨＩＶ−１発現を再活性化し、潜伏性を中断させることができる（Rasmussen, Schmeltz Sogaard et al. 2013, Rasmussen, Tolstrup et al. 2013）。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、ヒストンのリジン残基のアセチル化を促進することにより、遺伝子のスイッチを入れる（Van Lint, Emiliani et al. 1996, Tyagi, Pearson et al. 2010）。これは、クロマチン弛緩および転写活性化を誘導する。ＨＤＡＣｉロミデプシン［Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）、Ｃｅｌｇｅｎｅ］は、潜伏感染細胞株および初代Ｔ細胞においてＨＩＶ−１発現を強力に活性化する（Geleziunas 2013）。
【０００４】
Ｖａｃｃ−４ｘは、より緩徐な疾患進行および改善されたウイルス制御と関連付けられていることから、ｐ２４Ｇａｇに対する免疫応答を改善することを目的とするペプチドベースのＨＩＶ−１治療ワクチンである（Kiepiela 2007; Zuniga 2006）。Ｖａｃｃ−４ｘ免疫の主要な目的は、ＨＩＶ  ｐ２４に対する免疫系応答を強化することである。Ｖａｃｃ−４ｘによる免疫後に、ＨＩＶ−１に対する増強した免疫応答は、機能的なＨＩＶ治療ストラテジーの一部として宿主免疫系を改善し得る。
【０００５】
今日までに行われた最も大きな無作為化プラセボ制御のＨＩＶ治療ワクチン試験の１つ（研究ＣＴ−ＢＩ／Ｖａｃｃ−４ｘ／２００７／１）において、Ｖａｃｃ−４ｘおよびアジュバントとしてのｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）］は、プラセボと比較してＶａｃｃ−４ｘ群において設定値でウイルス量（ＶＬ）の有意な減少を示し、より高いプレＡＲＴ値がプラセボと比較してＶａｃｃ−４ｘ群に存在するにもかかわらず、設定値でＶＬのこれまでのプレＡＲＴ値からの有意な低下を示した。加えて、Ｖａｃｃ−４ｘは免疫原性であり、ＣＤ４とＣＤ８  Ｔ細胞の両方において増殖応答を誘導することが示された。
【０００６】
偽陽性および真性と診断されたＨＩＶ血清サンプル間を区別する方法に用いられる新たなＨＩＶ  ｐ２４ペプチドが国際公開第９１／１３３６０号に記載されている。Johnson R.P., et al., The Journal of Immunology, Vol.147, p.1512-1521, No.5, September 1, 1991は、３人のＨＩＶ−１血清陽性個体におけるｇａｇ特異的ＣＴＬ応答の繊細な特異性の分析を記載し、ｇａｇ特異的ＣＴＬ応答がＨＬＡクラスＩ制限されたＣＤ３＋ＣＤ８＋リンパ球により媒介されることが判明した。欧州特許出願公開第０３５６００７Ａ号は、抗原性決定基を開示する。具体的には、同文献は、ＨＩＶ−１に存在するタンパク質に関連し、ＡＩＤＳに対する潜在的なワクチンの基礎として用いることができる合成ポリペプチド配列に関する。Rosenberg E.S. et al., Science, Vol.278, 21 November 1997, p.1447-1450は、多数の慢性ウイルス感染において、ウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球が有効な免疫の維持に重要であるが、慢性ヒト免疫不全ウイルス−タイプ１（ＨＩＶ−１）感染においては特性上検出不能であることを記載する。ｐ２４に対するＨＩＶ−１−特異的増殖応答は、ウイルス量に反比例の関係にあった。著者らは、ＨＩＶ−１特異的ヘルパー細胞が、免疫療法的介入およびワクチン開発において重要である可能性が高いと結論付けている。国際特許出願公開第００／５２０４０号は、例えば、ＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ２４の保存領域に基づくＨＩＶ特異的ペプチドの投与によってＨＩＶ感染を治療する方法を開示する。
【０００７】
ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療に改善された治療法および投薬レジメンを提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の目的
ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療および／または予防に使用することができる有効な方法を提供することが本発明の実施形態の目的である。本発明は、ＨＩＶ特異的ワクチンペプチドが、特定のリザーバー駆逐剤とともに、特定の投薬レジメンにおいて用いられ得るという知見に基づき、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療および／または枯渇および根絶において有効な方法を提供する。このような特定の投薬レジメンは、特に、併用療法として製剤化された場合、抗ＨＩＶ抗体および／またはＨＩＶ特異的免疫原性（ワクチン）ペプチドなどのさらなるＨＩＶ特異的タンパク質治療薬を含む医薬組成物の特性に関して、他の有利な効果を提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
特異的なリザーバー駆逐剤を併用した特定の投与レジメンにおいて投与されるＨＩＶ特異的ワクチンペプチドは、ウイルス枯渇の改善およびウイルス量の減少をもたらし、したがって、ＨＩＶ治療方法の改善に有用であることが見出されている。第１の態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ）の病理学的影響を低減および／もしくは遅延させる、またはＨＩＶに感染したヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症するリスクを低減させる方法であって、以下の工程：
ａ）有効量の１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドを、１以上の用量で投与することを含むかまたは本質的にそれからなるＨＩＶ−１治療免疫相。特定の実施形態において、ＨＩＶ特異的ペプチドは、１〜１２週間の期間にわたって投与される、配列番号１８（Ｖａｃｃ−１０）、配列番号１１（Ｖａｃｃ−１１）、配列番号６（Ｖａｃｃ−１２）および配列番号３（Ｖａｃｃ−１３）に示されるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれからなるペプチドから選択される；ならびに
ｂ）リザーバー駆逐剤などの有効量の潜伏逆転剤を投与することを含むかまたは本質的にそれからなる、その後のウイルス再活性化相
を含む、方法を提供する。工程ａ）およびｂ）は、恩恵を大きくするために１回以上繰り返してもよい。
【００１０】
したがって、本発明は、免疫刺激性ＨＩＶ関連ペプチドを用いて前処置し、次に、１つ以上の潜伏逆転剤、例えばリザーバー駆逐剤を使用して、ウイルス発現を誘導することによって、ＨＩＶウイルス量、ウイルス潜在リザーバーの代わりを低減する方法を提供する。免疫刺激性ＨＩＶペプチドによる前処理は、例えば、ＨＩＶ感染細胞の免疫媒介性死滅によって、その後のウイルスの認識およびクリアランスを可能にする。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ）の病理学的影響を低減および／もしくは遅延させる、またはＨＩＶに感染したヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症するリスクを低減させるキットであって、以下。
ａ）特定の実施形態において、１〜１２週間の期間にわたって、配列番号１８（Ｖａｃｃ−１０）、配列番号１１（Ｖａｃｃ−１１）、配列番号６（Ｖａｃｃ−１２）および配列番号３（Ｖａｃｃ−１３）に示されるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれからなるペプチドである、有効量の１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチド；および
ｂ）リザーバー駆逐剤などの潜伏逆転剤；および適宜、
ｃ）少なくとも１つのさらなる治療活性剤
の１以上の用量を含む、キットを提供する。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ）の少なくとも１つの病理学的影響を低減および／もしくは遅延させる、またはＨＩＶに感染したヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症するリスクを低減させる方法であって、以下の工程：
ａ）特定の実施形態において、以下のアミノ酸配列：
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５  Ｘａａ６  Ａｌａ  Ｘａａ８  Ｘａａ９  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｘａａ１４  Ｘａａ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７  Ｘａａ１８  Ｖａｌ  Ｘａａ２０（配列番号１）
（式中、
１位のＸａａは、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
２位のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＡｒｇであり、
３位のＸａａは、ＬｅｕまたはＭｅｔであり、
４位のＸａａは、ＧｌｙまたはＡｒｇであり、
５位のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、ＧｌｎまたはＡｌａであり、
６位のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、
８位のＸａａは、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、
９位のＸａａは、ＬｅｕまたはＩｌｅであり、
１４位のＸａａは、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＶａｌであり、
１５位のＸａａは、ＡｌａまたはＳｅｒであり、
１６位のＸａａは、ＣｙｓまたはＳｅｒであり、
１７位のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｅｕであり、
１８位のＸａａは、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり、
２０位のＸａａは、ＧｌｙまたはＡｒｇである）；
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  ［Ｇｌｙ］ｎ  Ｘａａ１２  Ｘａａ１３  Ｔｙｒ  Ｘａａ１５  Ｐｒｏ  Ｘａａ１７  Ｘａａ１８  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｘａａ２１  Ｘａａ２２（配列番号４）
（式中、
１位のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐであるかまたは存在しない、
２位のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
３位のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＭｅｔであり、
４位のＸａａは、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕであり、
５位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｒｏであり、
１２位のＸａａは、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、
１３位のＸａａは、ＭｅｔまたはＬｅｕであり、
１５位のＸａａは、Ｓｅｒ、ＣｙｓまたはＧｌｎであり、
１７位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＡｌａであり、
１８位のＸａａは、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、
２１位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＣｙｓまたはＧｌｙであり、
２２位のＸａａは、Ｇｌｙであるかまたは存在しない、
ｎは、０、１、２または３である）；
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｘａａ９  Ｘａａ１０  Ｘａａ１１  Ｘａａ１２  ［Ｇｌｙ］ｎ  Ｘａａ１３  Ｘａａ１４  Ｘａａ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７  Ｘａａ１８  Ｘａａ１９  Ｘａａ２０  Ｘａａ２１  Ｘａａ２２  Ｘａａ２３  Ｘａａ２４（配列番号９）
（式中、
１位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ａｒｇであるかまたは存在しない、
２位のＸａａは、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＬｙｓであり、
３位のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＬｅｕであり、
７位のＸａａは、ＶａｌまたはＡｌａであり、
８位のＸａａは、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、
９位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ＰｈｅまたはＴｈｒであり、
１０位のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＬｅｕであり、
１１位のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｌｅｕであるかまたは存在しない、
１２位のＸａａは、Ｓｅｒであるかまたは存在しない、
１３位のＸａａは、Ａｒｇであるかまたは存在しない、
１４位のＸａａは、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ａｌａであるかまたは存在しない、
１５位のＸａａは、Ｉｌｅであるかまたは存在しない、
１６位のＸａａは、Ｔｙｒであるかまたは存在しない、
１７位のＸａａは、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
１８位のＸａａは、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＡｓｐであり、
１９位のＸａａは、ＴｒｐまたはＧｌｙであり、
２０位のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＧｌｎまたはＡｌａであり、
２１位のＸａａは、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｌａであり、
２２位のＸａａは、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌであり、
２３位のＸａａは、ＧｌｙまたはＣｙｓであり、
２４位のＸａａは、Ｌｅｕであるかまたは存在しない、
ｎは、１、２または３である）；および
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｘａａ５  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｘａａ９  Ｌｅｕ  Ｘａａ１１  ［Ｇｌｙ］ｎ  ［Ａｒｇ］ｍ  Ｘａａ１２  Ｘａａ１３  Ｘａａ１４  Ｘａａ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７  Ｘａａ１８  Ｘａａ１９  Ｘａａ２０  Ｘａａ２１  Ｘａａ２２  Ｘａａ２３  Ｘａａ２４  Ｘａａ２５（配列番号１５）
（式中、
１位のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇであるかまたは存在しない、
２位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり、
５位のＸａａは、ＰｒｏまたはＴｈｒであり、
６位のＸａａは、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＮｌｅｕであり、
７位のＸａａは、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、
８位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＭｅｔであり、
９位のＸａａは、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＬｅｕであり、
１１位のＸａａは、Ｓｅｒであるかまたは存在しない、
１２位のＸａａは、Ａｌａ、Ａｒｇであるかまたは存在しない、
１３位のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕであるかまたは存在しない、
１４位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕであるかまたは存在しない、
１５位のＸａａは、Ｔｙｒ、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
１６位のＸａａは、ＧｌｙまたはＡｓｐであり、
１７位のＸａａは、ＡｌａまたはＬｅｕであり、
１８位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｓｎであり、
１９位のＸａａは、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、
２０位のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｎｌｅｕ、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、
２１位のＸａａは、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＬｅｕまたはＡｌａであり、
２２位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｎであり、
２３位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＣｙｓまたはＧｌｙであり、
２４位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｖａｌであるかまたは存在しない、
２５位のＸａａは、Ｇｌｙであるかまたは存在しない、
互いに独立してｎは、１、２または３であり、ｍは、０、１、２または３である）
を含むかまたは本質的にそれからなる、有効量の１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドを１以上の用量で１〜１２週間の期間にわたって投与することを含むかまたは本質的にそれからなるＨＩＶ−１治療免疫相であって、
ここで、各ＨＩＶ特異的ペプチドの末端部は、遊離のカルボキシル基もしくはアミノ基、アミド、アシルまたはアセチルであってもよく；各ペプチドは、適宜、酢酸塩の形態であるＨＩＶ−１治療免疫相；ならびに
ｂ）リザーバー駆逐剤などの有効量の潜伏逆転剤を投与することを含むかまたは本質的にそれからなる、その後のウイルス再活性化相
を含む、方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、特定の実施形態において、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ）の病理学的影響を低減させおよび／もしくは遅延させる方法、またはＨＩＶに感染したヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症するリスクを低減させる方法に使用するための配列番号１８（Ｖａｃｃ−１０）、配列番号１１（Ｖａｃｃ−１１）、配列番号６（Ｖａｃｃ−１２）に示されるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれからなるペプチドである、有効量の１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドに関し、該方法は、以下の工程：
ａ）１〜１２週間の期間にわたって、上記１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドを１以上の用量で投与することを含むかまたは本質的にそれからなるＨＩＶ−１治療免疫相；および
ｂ）リザーバー駆逐剤などの有効量の潜伏逆転剤を投与することを含むかまたは本質的にそれからなる、その後のウイルス再活性化相
を含み；工程ａ）およびｂ）は、適宜、繰り返される。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、特定の実施形態において、潜伏リザーバーからＨＩＶウイルスを活性化する治療中に、ＨＩＶに感染したヒトにおけるヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ）の病理学的影響を予防、低減および／または遅延させる方法において使用するための配列番号１８（Ｖａｃｃ−１０）、配列番号１１（Ｖａｃｃ−１１）、または配列番号６（Ｖａｃｃ−１２）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドである、有効量の１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドの使用に関し、該方法は、以下の工程：
ａ）１〜１２週間の期間にわたって、上記１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドを１以上の用量で投与することを含むかまたは本質的にそれからなるＨＩＶ−１治療免疫相；および
ｂ）リザーバー駆逐剤などの有効量の潜伏逆転剤を投与することを含むかまたは本質的にそれからなる、その後のウイルス再活性化相
を含む。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、特定の実施形態において、潜伏リザーバーからＨＩＶウイルスを活性化する治療中に、ＨＩＶに感染したヒトにおけるヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ）粒子の循環もしくはＨＩＶウイルス血症を予防、低減および／または遅延させる方法において使用するための配列番号１８（Ｖａｃｃ−１０）、配列番号１１（Ｖａｃｃ−１１）または配列番号６（Ｖａｃｃ−１２）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドである、有効量の１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドの使用に関し、該方法は、以下の工程：
ａ）１〜１２週間の期間にわたって、上記１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドを１以上の用量で投与することを含むかまたは本質的にそれからなるＨＩＶ−１治療免疫相；および
ｂ）リザーバー駆逐剤などの有効量の潜伏逆転剤を投与することを含むかまたは本質的にそれからなる、その後のウイルス再活性化相
を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明にかかる方法は、本明細書において定義される１つ以上のＨＩＶ特異的なものと組み合わせてまたは単独で、有効量のさらなるＨＩＶ特異的タンパク質治療剤、例えば、抗ＨＩＶ−１特異的モノクローナル抗体などの抗ＨＩＶ抗体、類似体または誘導体などを１以上の用量で投与することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明のＨＩＶ特異的タンパク質治療剤は、ＨＩＶ−１中和抗体などの抗ＨＩＶ抗体である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明の特異的タンパク質治療剤は、広範な中和抗体（ｂＮＡｂ）であり、例えば、２Ｆ５、４Ｅ１０、Ｍ６６．６、ＣＡＰ２０６−ＣＨ１２、１０ｅ８、ＰＧ９、ＰＧ１６、ＣＨ０１−０４、ＰＧＴ１４１−１４５、２Ｇ１２、ＰＧＴ１２１−１２３、ＰＧＴ１２５−１３１、ＰＧＴ１３５−１３７、ｂ１２、ＨＪ１６、ＣＨ１０３−１０６、ＶＲＣ０１−０３、ＶＲＣ−ＰＧ０４、０４ｂ、ＶＲＣ−ＣＨ３０−３４、３ＢＮＣ１１７、３ＢＮＣ６０、ＮＩＨ４５−４６、１２Ａ１２、１２Ａ２１、８ＡＮＣ１３１、１３４、１ＮＣ９、１Ｂ２５３０、ＶＲＣ０７−５２３、ＰＧＴ１５１、３５０２２、ＰＧ６、ＰＧＴ１２８、１０−１０７４、ＰＧＶ０４、ＶＲＣ２６が挙げられる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明の特異的タンパク質治療剤は、ＣＤ４結合抗体であり、例えばイバリズマブ、ＣＣＲ５結合抗体、例えばＰＲＯ  １４０、二重特異性抗体、例えば二重親和性再標的化タンパク質（ＤＡＲＴ）またはＢ細胞特異的Ｔ細胞誘導因子（ＢＩＴＥ）が挙げられる。他のＨＩＶ−１特異的抗体および抗体断片、類似体または誘導体は利用可能であるかまたは利用可能であり得、代わりに本発明の組成物および方法において使用され得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＨＩＶ特異的ペプチドは、配列番号１、４、９および１５のアミノ酸配列の群から選択され；ここで、各ＨＩＶ特異的ペプチドの末端は、遊離のカルボキシル基もしくはアミノ基、アミド、アシルまたはアセチルであり得；各ペプチドは酢酸塩の形態である。いくつかの実施形態において、配列番号１８（Ｖａｃｃ−１０）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドは、酢酸塩の形態である。いくつかの実施形態において、配列番号１１（Ｖａｃｃ−１１）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドは、酢酸塩の形態である。いくつかの実施形態において、配列番号６（Ｖａｃｃ−１２）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドは、酢酸塩の形態である。いくつかの実施形態において、配列番号３（Ｖａｃｃ−１３）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドは、酢酸塩の形態である。
いくつかの実施形態において、１つ、２つ、３つまたは４つのペプチド酢酸塩は、本発明にかかる方法において使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、フローサイトメトリーによって測定された、リンパ球におけるＨ３アセチル化の平均（ＳＥＭ）レベルを示す。
【図２】図２は、１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞当たりの細胞結合した非スプライス（ＣＡ  ＵＳ）ＨＩＶ  ＲＮＡのコピー数を示す。ＣＡ  ＵＳ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡのレベルにおけるベースラインからの平均（ＳＥＭ）変化。
【図３】図３は、ＨＩＶウイルス量：ＨＩＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬ血漿：Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて決定された血漿ＨＩＶ−１  ＲＮＡの個々のレベルを示す（ＬＯＤ＝「検出不能」ＨＩＶ  ＲＮＡ、ＬＯＱ＝「検出可能」であるが定量的でないＨＩＶ  ＲＮＡ＜２０コピー／ｍＬ）。
【図４】図４は、ＴＭＡアッセイ、ＨＩＶ  ＲＮＡの存在を示す。６人全ての参加者の平均血漿ＨＩＶ−１  ＲＮＡデータは、転写媒介増幅アッセイを用いて決定された。
【図５】図５は、１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりの全ＨＩＶ−１  ＤＮＡの絶対レベルを示す。全ＨＩＶプロウイルスＤＮＡパートＡ（１０６のＣＤ４Ｔ細胞当たりの全ＨＩＶ  ＤＮＡコピー数）。
【図６】図６は、ＣＤ４（％）−平均および標準偏差−パートＡを示す。
【図７】図７は、ＣＤ８（％）−平均および標準偏差−パートＡを示す。
【図８】図８は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０９／Ｌ）を示す。
【図９】図９は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（１０９／Ｌ）を示す。
【図１０】図１０は、ＣＤ４／ＣＤ８比を示す。
【図１１】図１１は、全ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞当たりのコピー数）−ＦＡＳを示す。
【図１２】図１２は、全ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞当たりのコピー数）−ＦＡＳを示す。ボックスプロット：下限から上四分位までのボックス、外れ値を除く最小値から最大値までのバー。線は平均を結ぶ。
【図１３】図１３は、複製コンピテントなプロウイルスの変化（ＩＵＰＭ）（Ｎ＝６）を示す。
【図１４】図１４は、ｃＡＲＴの再開始までの時間−ＦＡＳを示す。
【図１５】図１５は、ｃＡＲＴ休止中にＨＩＶ  ＲＮＡが＜＞５０コピー／ｍＬに達するまでの時間−ＦＡＳを示す。
【図１６】図１６は、血漿ＨＩＶ−１  ＲＮＡ（コピー／ｍＬ）−ベースラインから通院１３まで−ＦＡＳを示す。１７人中６人（３５％）の対象が、ロミデプシン投薬後、ＬＬｏＱを超える、少なくとも１回の血漿ＨＩＶ−ＲＮＡ測定値を有した。血漿ＨＩＶ−１  ＲＮＡ（コピー／ｍＬ）−ベースラインから通院１３−ＦＡＳ。
【図１７】図１７は、細胞結合した非スプライスＨＩＶ−１  ＲＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞当たりのコピー数）−ＦＡＳを示す。
【図１８】図１８は、ヒストンＨ３アセチル化（蛍光強度中央値）−ＦＡＳを示す。
【図１９】図１９は、組み込まれたＨＩＶ  ＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋当たりのコピー数）を示す。
【図２０】図２０は、ＣＤ４（１０９／Ｌ）数を示す。
【図２１】図２１は、ＣＤ８（１０９／Ｌ）数を示す。
【図２２】図２２は、ＣＤ４パーセントを示す。
【図２３】図２３は、ＣＤ８パーセントを示す。
【図２４】図２４は、ＣＤ４／ＣＤ８比を示す。
【図２５】図２５は、ＩＣＳ：ＨＩＶ−１  ｇａｇプールを示す。
【図２６】図２６は、ＩＣＳ：Ｖａｃｃ−４ｘペプチドプールを示す。
【図２７】図２７は、ウイルス阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤などの強力なウイルスリザーバー駆逐剤の治療的使用が、組み込まれたＨＩＶプロウイルスからのＨＩＶ−１転写における短時間の増加をもたらし、１つ以上の抗ＨＩＶ特異的抗体および／またはＶａｃｃ−４ｘなどの本発明のＨＩＶ特異的免疫原性ペプチドによる、ＨＩＶ感染個体の前処置との併用において、ＨＩＶペプチドにより免疫された対象におけるＨＩＶ−１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のレベルおよび応答性の増加に起因して、ウイルス量および／またはＨＩＶ−１リザーバーサイズにおける長期の低減をもたらすという知見に基づく。
【００２３】
定義
「１つの（ｏｎｅ）」、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」などの用語を本開示において使用する場合、別段の指示がない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。さらに、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味することが意図され、よって、明示されたもの以外の他の構成要素、特徴、条件または工程の存在を許容する。
【００２４】
「ＨＩＶ」は、別段の指示がない限り、一般的に、ヒト免疫不全ウイルス１を表す。
【００２５】
「ＨＩＶ疾患」は、しばしばインフルエンザ様感染として顕在化する急性ＨＩＶ感染並びに初期および中間期ステージの症候性疾患（皮疹、疲労、寝汗、若干の体重減少、口の潰瘍並びに皮膚および爪の真菌感染などのいくつかの非特徴的症状を有する）を含むいくつかのステージから構成される。ほとんどのＨＩＶ感染個体は、これらなどの軽度の症状を、より重篤な病気を発症する前に経験する。一般的に、最初の軽度な症状が現れるには５〜７年かかると考えられている。ＨＩＶ疾患が進行するにつれ、未だＡＩＤＳと診断されなくともかなり不健康になる個体もある（下記参照；ＨＩＶ疾患の後期ステージ）。典型的な問題として、口または膣の慢性鵞口瘡（真菌発疹または斑）、口（口唇ヘルペス）または生殖器の再発性ヘルペス水疱、持続的発熱、持続性下痢および顕著な体重減少が挙げられる。「ＡＩＤＳ」は、後期ステージのＨＩＶ疾患であり、免疫系の効果を進行的に低下させ、個体を日和見感染および腫瘍に罹患し易くする状態である。
【００２６】
「ＨＩＶの病理学的影響を低減および／または遅延させること」は、本文脈に関して、本発明の方法の使用が、本発明に従って治療されるＨＩＶ感染個体において観察されるＨＩＶ感染の病理学的症状発現、および最終的には罹患率の統計学的に有意な低減および／または遅延をもたらすことをいうことを意味する。すなわち、ＡＩＤＳを特徴付ける明らかな疾患症状の発現時期が、非治療対照と比較してより遅く、および／または病理学的症状発現の数が、本発明の治療を受けない対照に対して低減する。
【００２７】
「ＨＩＶの症状を緩和、低減もしくは遅延すること、またはＨＩＶの臨床マーカーを改善すること」は、本文脈に関して、本発明の方法の使用が、本発明に従って治療される、ＨＩＶに感染した個体においてみられる低下したウイルス量の設定値などの、ＨＩＶに関連した症状の統計学的に有意な低減および／もしくは遅延、または臨床マーカーの改善を提供することをいうことを意味する。
【００２８】
用語「ＨＩＶ特異的ペプチド」とは、本明細書で使用するとき、ｇａｇ  ｐ２４などのＨＩＶの保存領域に基づくペプチドであって、遊離または担体に結合した形態の抗原を意味し、このペプチドは良好な抗原として作用し、治療用途に適している。
【００２９】
本発明によるいくつかの態様において、投与レジメンはまた、抗ＨＩＶ抗体などのさらなるＨＩＶ特異的タンパク質治療剤の医薬組成物およびその投与を含み得る。特定の実施形態において、タンパク質治療剤は、抗ＨＩＶ−１特異的モノクローナル抗体などの抗ＨＩＶ抗体である。いくつかの実施形態において、本発明に従って使用される抗ＨＩＶ抗体は中和性であり、すなわち、例えばＨＩＶの生物活性の少なくとも４０％を選択的に中和する抗体（例えば、限定されないが、モノクローナル抗体）である。
【００３０】
用語「抗体」は、本明細書において最も広義に使用され、具体的には、全長のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）および抗体断片を、それらが所望の生物学的活性を示す（すなわち上記の薬剤として機能するように）限りにおいて含む。抗体産生に関する種々の技術は、例えば、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)に提供されている。
【００３１】
「抗体断片または抗体類似体」は、全長抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片／類似体の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一腕のＶＬおよびＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（典型的には、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン）およびｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨおよびＶ−ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびカッパボディ（例えば、Ill et al., Protein Eng 1997;10: 949-57参照）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；および抗体断片と１つ以上の単離されたＣＤＲまたは機能的パラトープから形成される多特異性抗体断片、この場合、機能的抗体断片を形成するように、単離されたＣＤＲまたは抗原結合性の残基もしくはポリペプチドが結合または連結され得る、が挙げられる。種々のタイプの抗体断片は、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23, 1126-1136；国際公開第２００５／０４０２１９号、並びに公開された米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号および同第２００２／０１６１２０１号に記載または概説されている。
【００３２】
用語「抗体誘導体」は、本明細書で使用するとき、例えば、抗体を第２の分子に連結するために、１つ以上のアミノ酸が化学的に、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成またはアミド形成などにより修飾されている、全長抗体または抗体の断片、好ましくは抗体の少なくとも抗原結合領域または可変領域を含むものを含む。これには、限定されないが、ＰＥＧ化抗体、システイン−ＰＥＧ化抗体およびそれらの変異体が含まれる。
【００３３】
「接合体」は、本明細書で使用するとき、細胞傷害剤、検出可能な薬剤などの第２の薬剤に結合または連結された、抗体誘導体などの本発明に従って使用される薬剤を含む。接合体は、共有結合的に連結されたペプチドからから構成され得る（接合体の例は、ペプチド結合を介して連結された２つのペプチドを含む融合ペプチドであり、そのため、この場合の接合体は核酸断片からの発現産物であり得る）が、接合体はまた、化学的接合を介して共有結合したペプチドの組合せであり得る（従来の例は、グルタルアルデヒドを用いる接合である）。より複雑な接合の別の例は、本発明の薬剤もしくはペプチド多量体または他の化学物質が担体分子に連結し、この担体分子が更に本発明の他の薬剤、ペプチド多量体または他の化学物質とカップリングしている例（例えば、化学物質がポリ−リジン担体（リジン「ツリー」）に結合している場合）である。
【００３４】
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するヒト／非ヒトキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類）種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これら改変は、抗体の性能を更に洗練するためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、この可変ドメインでは超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ残基の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、適宜、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含んでもよい。さらなる詳細については、例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、国際公開第９２／０２１９０号、米国特許出願公開第２００６／００７３１３７号、米国特許第６，７５０，３２５号、同第６，６３２，９２７号、同第６，６３９，０５５号、同第６，５４８，６４０号、同第６，４０７，２１３号、同第６，１８０，３７０号、同第６，０５４，２９７号、同第５，９２９，２１２号、同第５，８９５，２０５号、同第５，８８６，１５２号、同第５，８７７，２９３号、同第５，８６９，６１９号、同第５，８２１，３３７号、同第５，８２１，１２３号、同第５，７７０，１９６号、同第５，７７７，０８５号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号および同第５，２２５，５３９号を参照されたい。
【００３５】
参照抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体と区別する参照抗体の生物学的特徴の１つ以上を有するものである。
【００３６】
用語「ペプチド」は、本文脈において、２〜１０個のアミノ酸残基の短いペプチド、１１〜１００個のアミノ酸残基のオリゴペプチドおよび１００個を超えるアミノ酸残基のポリペプチドのいずれも意味することが意図される。ペプチド中のアミノ酸に言及する場合、アミノ酸は、他の情報が提供されていなければＬ−アミノ酸であることが意図される。
【００３７】
「タンパク質」は、少なくとも１つのペプチドを含む機能的生体分子を表すことが意図される；少なくとも２つのペプチドを含む場合、これらは、複合体を形成していてもよいし、共有結合していてもよいし、または非共有結合的に連結していてもよい。タンパク質中のポリペプチド（単数または複数）は、グリコシル化および／または脂質化することができ、および／または補欠分子基を含むことができる。
【００３８】
ペプチドの「変異体」または「類似体」とは、参照ペプチド、典型的には天然のまたは「親の」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。ペプチド変異体は、天然のアミノ酸配列内にある特定位置に１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。
【００３９】
「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様な物理化学的性質の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。同様な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において公知であり、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。保存的アミノ酸置換の特定の形態は、遺伝子コードによってコードされる通常の２０アミノ酸ではないアミノ酸での置換を含む。本発明の好適な実施形態は、合成ペプチドの使用を包含するため、本明細書に開示されたペプチドにおいてこのような「天然に存在しない」アミノ酸残基を提供することに問題はなく、よって、アミノ酸残基の側鎖中の天然の飽和炭素鎖を、より短いまたはより長い飽和炭素鎖と交換することが可能である−例えば、リジンは、側鎖−（ＣＨ２）ｎＮＨ３（式中、ｎは４ではない）を有するアミノ酸で置換され得、アルギニンは、側鎖−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝ＮＨ２）ＮＨ２（式中、ｎは３ではない）を有するアミノ酸で置換され得る、などである。同様に、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸は、側鎖−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（式中、ｎ＞２）を有するアミノ酸残基で置換し得る。
【００４０】
ペプチドの「レトロ形態」は、Ｎ末端からＣ末端方向のアミノ酸の順序が逆転しているペプチドの形態である。例えば、ＡＬＤＦＲのレトロ形態は、ペプチドＲＦＤＬＡである。
【００４１】
２つのアミノ酸配列に関して、用語「実質的に同一」とは、両配列が、最適に整列されたとき（例えば、デフォルトのギャップウェイトを用いるプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより）、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約９８または少なくとも約９９パーセントの配列同一性を有することを意味する。一実施形態において、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、種々の置換、欠失およびその他の改変（保存的アミノ酸置換を含む）に割り当てられた類似性の尺度を使用して同様な配列を適合させる。例えば、公衆に利用可能なＧＣＧソフトウェアは、デフォルトのパラメータで使用して、密接に関連するポリペプチド（例えば、異なる生物種からの相同ポリペプチド）間または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定することができる「Ｇａｐ」および「ＢｅｓｔＦｉｔ」などのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨されるパラメータを適用して、ＦＡＳＴＡまたはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて比較することができる。ＧＣＧバージョン６．１．中のプログラムであるＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列とサーチ配列の間で最良のオーバーラップ領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219）。配列を種々の生物からの多数の配列を含むデータベースと比較するときまたは核酸配列の配列関係性または同一性を推論するときに好適な別のアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いるコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐである。例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990;215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997)を参照されたい；各々、参照により本明細書に組み込まれる。２つの実質的に同一のアミノ酸配列中の「対応する」アミノ酸位置は、本明細書において言及されるタンパク質解析ソフトウェアのいずれかにより、典型的にはデフォルトパラメータを用いて整列させたときの位置である。
【００４２】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置されている場合、「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響する場合、該コード配列に作動可能に連結している；または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合、コード配列に作動可能に連結している。一般的に、「作動可能に連結している」とは、連結しているＤＮＡ配列が連続していること、分泌リーダーの場合には連続しおよびリーディングフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の実施に従って用いられる。
【００４３】
「単離された」分子は、それが見出される組成物中で、それが属する分子クラスに関して優勢な種である（すなわち、該組成物中で該分子タイプの少なくとも約５０％を構成し、典型的には、該組成物中の該分子種、例えばペプチドの少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上を構成する）分子である。通常、分子（例えば、ペプチドまたは抗体など）の組成物は、該組成物中に存在する全てのペプチド種または抗体種との関連ではペプチド分子または抗体分子に関して、または提案される使用との関連では少なくとも実質的に活性なペプチド種に関して、５０％超、または５５％超、または６０％超、または６５％超、または７０％超、または７５％超、または８０％超、または８５％超、または９０％超、または９５％超、または９６％超、または９７％超、または９８％超、または９９％超、または９９．５％超、または９９．９％超、あるいは５０％〜５５％の範囲、または５５％〜６０％の範囲、または６０％〜６５％の範囲、または６５％〜７０％の範囲、または７５％〜８０％の範囲、または８０％〜８５％の範囲、または８５％〜９０％の範囲、または９０％〜９５％の範囲、または９５％〜９９％の範囲、または９６％〜９９％の範囲、または９７％〜９９％の範囲、または９８％〜９９％の範囲の均質性を示す。
【００４４】
本発明の文脈に関して、「治療」または「治療すること」とは、文脈と矛盾しない限り、疾患または障害の１つ以上の症状または臨床的に関連する症状発現を予防し、緩和させ、管理し、治癒させまたは低減させることを意味する。例えば、疾患または障害の症状も臨床的に関連する症状発現も同定されていない患者の「治療」は、予防的または防止的治療であり、一方、疾患または障害の症状または臨床的に関連する症状発現が同定されている患者の「治療」は、一般的には、予防的または防止的治療を構成しない。
【００４５】
用語「抗原」は、免疫系の特異的認識成分（抗体、Ｔ細胞）によって認識される物質（substance of matter）を表す。
【００４６】
用語「免疫原」は、本文脈では、個体において免疫原を標的する適応免疫応答を誘導し得る物質を表すものとする。換言すれば、免疫原は、免疫を誘導し得る抗原である。
【００４７】
用語「エピトープ」、「抗原決定基」および「抗原部位」は、本明細書において互換可能に使用され、抗原または免疫原中の、抗体が認識する領域（抗体結合エピトープの場合には、「Ｂ細胞エピトープ」としても知られる）またはエピトープがＭＨＣ分子と複合体化している場合にはＴ細胞受容体が認識する領域（Ｔ細胞受容体結合エピトープの場合には、すなわち「Ｔ細胞エピトープ」）を表す。
【００４８】
用語「免疫原的有効量」は、当技術分野における通常の意味を有する。すなわち、免疫原と１つ以上の免疫学的特徴を共有する病原因子と顕著に戦う免疫応答を誘導し得る該免疫原の量を意味する。
【００４９】
用語「ワクチン」は、免疫原を含む組成物であって、病的状態の発症リスクを低減することができ、または病的状態の治癒において支援し得る（もしくはその１つ以上の症状を少なくとも緩和し得る）治療的に有効な免疫応答を誘導することができる、免疫応答を誘導することができる組成物について用いられる。
【００５０】
用語「医薬として許容される」は、当技術分野における通常の意味を有する。すなわち、この用語は、問題の疾患の治療時にヒトに使用される医薬品または成分の一部として受容され得る物質について使用される。したがって、この用語は、事実上、治療対象の状態を改善するというよりはむしろ悪化させる毒性物質の使用を排除する。
【００５１】
「Ｔヘルパーリンパ球エピトープ」（ＴＨエピトープ）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、該ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示され得るペプチドである。「免疫学的担体」は、一般的に、１つ以上のＴＨエピトープを含み、それとカップリングされる抗原に対する免疫応答を、Ｔヘルパーリンパ球を確実に活性化し、増殖させることによって増大させる物質（substance）または物質（matter）の組合せである。公知の免疫学的担体の例としては、破傷風およびジフテリア毒素並びにキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。
【００５２】
用語「アジュバント」は、ワクチン技術の分野における通常の意味を有する。すなわち、１）それ自体はワクチンの免疫原に対する特異的免疫応答を開始させ得ないが、２）それにもかかわらず、免疫原に対する免疫応答を増強し得る物質または組成物である。または、換言すれば、アジュバント単独でのワクチン接種は、免疫原に対する免疫応答を提供せず、免疫原でのワクチン接種は、免疫原に対する免疫応答を生じさせても生じさせなくてもよいが、免疫原とアジュバントの組合せのワクチン接種は、免疫原単独で誘導されるものより強力な免疫原に対する免疫応答を誘導する。
【００５３】
本発明の具体的な態様および実施形態
本発明の１つの態様は、１つ以上のＨＩＶ−特異的治療剤、例えば、上記される抗ＨＩＶ抗体および／またはＨＩＶ特異的免疫原性ペプチドの使用に関する。
【００５４】
特定の実施形態において、ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端改変、例えば、アミド化、アシル化またはアセチル化を含む。ペプチドのＣ末端がアミドである場合、適切なアミドは、式−Ｃ（Ｏ）−ＮＲｘＲｙ（式中、ＲｘおよびＲｙは、独立して、水素およびＣ１〜６アルキルから選択され、そのアルキル基は、１つ以上のフッ素原子で置換されてもよく、例えば、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３および−ＣＦ３であり得る）を有するものを含んだ。言及し得る具体的なアミド基は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。ペプチドのＮ末端がアセチル化されている場合、適切なアセチル化Ｎ末端は、式−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｒｚ［式中、Ｒｚは、水素、Ｃ１〜６アルキル（そのアルキル基は、１つ以上のフッ素原子で置換されてもよく、例えば、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３および−ＣＦ３であり得る）またはフェニルである］のものを含む。
【００５５】
ペプチドは、ワクチン剤として企図されるため、特定の実施形態において、免疫原性担体などの担体分子とカップリングされる。よって、ペプチドは、他の分子に、組換え融合体として（例えば、ＣＬＩＰ技術を介して）または化学結合により配向様式（例えば、へテロ二官能性架橋剤を用いて）もしくは非配向様式で連結され得る。例えば、ジフテリア毒素、ポリリジンコンストラクトなどの担体分子への連結は全て、当技術分野において周知である技術を用いて、本発明に従って可能である。
【００５６】
免疫原性担体（単数または複数）は、好都合には、当技術分野において従来使用されているもの（例えば、ジフテリアまたは破傷風毒素、ＫＬＨなど）などの担体タンパク質から選択されるが、集団の多くの比率でＴ細胞免疫を誘導することができる短いペプチド（Ｔヘルパーエピトープ）を使用することも可能である。このようなＴヘルパーエピトープについての詳細は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第００／２００２７号に見出すことができる−そこで検討されている全ての免疫学的担体および「無差別な」（すなわち普遍的な）Ｔヘルパーエピトープは、本発明における免疫原性担体として有用であり得る。
【００５７】
特定の実施形態において、担体は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、すなわちビリオンの性質を有するが感染性のない粒子である。このようなウイルス様粒子は、化学的に（例えば、Jennings and Bachmann Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2009. 49:303-26 Immunodrugs: Therapeutic VLP-based vaccines for chronic diseases）または融合タンパク質を作製するクローニング技術（例えば、Peabody et al. J. Mol. Biol. 2008; 380: 252-63. Immunogenic display of diverse peptides on virus-like particles of RNA phage MS2）を用いて提供され得る。別の例は、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって最初に作製された、放射線照射でウイルスゲノムを破壊したホルマリン不活化ＨＩＶからなるＨＩＶワクチンたる「Ｒｅｍｕｎｅ」である。この会社は、同一技術を用いて、今日広く用いられている死滅ポリオワクチンを作製したＪｏｎａｓ  Ｓａｌｋによって設立された。
【００５８】
本発明の１つの態様は、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドの組成物をリザーバー駆逐剤などの有効量の潜伏逆転剤と組み合わせて、適宜、医薬として許容される希釈剤または媒体および適宜、１つ以上の免疫学的アジュバントとともに含む免疫原性組成物（例えばワクチン組成物）の使用に関する。
【００５９】
本発明の特定の態様に共通して、全て、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドが上記の通り、配列番号１、４、９および１５の群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはからなる実施形態；各ＨＩＶ特異的ペプチドの末端部が、遊離のカルボキシル基またはアミノ基、アミド、アシルまたはアセチルであってもよい実施形態；および酢酸塩の形態である実施形態を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、上記ＨＩＶ特異的ペプチドの２つ以上のＣｙｓ残基は、鎖内もしくは鎖間のジスルフィド結合、−Ｓ−（ＣＨ２）ｐ−Ｓ−または−（ＣＨ２）ｐ−架橋（式中、ｐ＝１〜８であり、適宜、１つ以上のヘテロ原子、例えばＯ、ＮおよびＳが介在していてもよい）の一部を形成していてもよく、および／または上記ペプチド配列は固体支持体に固定化されている。
【００６１】
いくつかの実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号２および配列番号３の群から選択される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８の群から選択される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、配列番号９のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４の群から選択される。
【００６４】
いくつかの実施形態において、配列番号１５のアミノ酸配列は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０の群から選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドは、配列番号１、配列番号４、配列番号９および配列番号１５の群の各々から選択される少なくとも２つ、３つまたは４つのペプチドからなるかまたはそれを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドは、配列番号３、配列番号６、配列番号１１および配列番号１８のペプチドからなるかまたはそれを含む。
【００６７】
免疫原性組成物の調製には、免疫学的アジュバントなどの従来技術の構成要素の使用が含まれる。下記で例として詳述するこれらアジュバントとは別に、免疫原性組成物は当技術分野において一般に教示されるように調製される。
【００６８】
有効成分としてペプチド配列を含むワクチンの調製は、全てが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６０８，２５１号；同第４，６０１，９０３号；同第４，５９９，２３１号；同第４，５９９，２３０号；同第４，５９６，７９２号；および同第４，５７８，７７０号に例示されるように、当技術分野において広く十分に理解されている。典型的には、このようなワクチンは、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射可能剤として調製される；注射前の液体への溶解または懸濁に適切な固体形態もまた調製し得る。調製物はまた乳化され得る。活性な免疫原性成分は、しばしば、医薬として許容されおよび有効成分と相溶性である賦形剤とともに混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せである。加えて、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤またはワクチンの効力を増強するアジュバントなどの少量の補助物質を含み得る；アジュバントについては下記で詳述する。
【００６９】
ワクチンは、従来のように、例えば、皮下、皮内、真皮内、真皮下または筋肉内に、注射により非経口投与される。他の投与態様に適切なさらなる製剤として、坐剤、いくつかの場合には、経口、経鼻、口腔内、舌下、腹腔内、膣内、肛門、硬膜外、脊髄および頭蓋内製剤が挙げられる。坐剤については、従来の結合剤および担体として、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを挙げ得る；このような坐剤は、有効成分を０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは１〜２％（ｗ／ｗ）の範囲で含む混合物から形成し得る。経口製剤としては、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤が挙げられる。これら組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤または粉剤の形態をとり、１０〜９５％（ｗ／ｗ）、好ましくは２５〜７０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含有し得る。
【００７０】
ペプチドは、中性または塩形態としてワクチンに製剤化され得る。医薬として許容される塩としては、（ペプチドの遊離アミノ基とともに形成される）、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基などに由来し得る。
【００７１】
ワクチンは、投薬の処方に適合する様式で、治療上有効であり免疫原性であるような量で投与される。投与すべき量は、治療すべき対象に依存し、例えば、個体の免疫系が免疫応答を開始する能力および所望する免疫の程度などに依存する。適切な投薬量の範囲は、ワクチン接種あたり数百マイクログラムオーダーの有効成分であり、好ましい範囲は、約０．５μｇ〜１，８００μｇの範囲、好ましくは１μｇ〜１，５００μｇの範囲、特に約１００μｇ〜１２００μｇの範囲などの約０．１μｇ〜２，０００μｇである（ただし、より高い１〜１０ｍｇ範囲の量も企図されている）。また、初回投与およびブースター注射の適切なレジメンは変更可能であるが、初回投与の後に複数回の接種または他の投与が続くのが典型的である。
【００７２】
ペプチドのいくつかはワクチン中で十分に免疫原性であるが、他のいくつかについては、ワクチンがさらにアジュバント物質を含む場合に免疫応答が増強される。したがって、本明細書に記載される免疫原性分子は、アジュバントとともに製剤化することができる。
【００７３】
組み合わせるべきアジュバントは、体液性応答を誘導することが公知であり、以下を含む：ｉ）塩懸濁物（例えば、アルミニウムイオンまたはカルシウムイオンを含有する種々の塩）、ｉｉ）水中油エマルジョン（例えば、種々のスクアラン系またはスクアレン系のエマルジョン）、ｉｉｉ）油中水エマルジョン（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１またはＩＳＡ７２０）、ｉｖ）中性リポソーム、ｖ）カチオン性リポソーム、ｖｉ）マイクロスフェア、ｖｉｉ）免疫刺激性複合体（例えば、ＩＳＣＯＭまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｖｉｉｉ）パターン認識受容体アゴニスト（例えば、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ様ヘリカーゼ（ＲＬＨ）、骨髄様細胞で発現するトリガリング受容体（triggering receptor）（ＴＲＥＭ）およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニスト）、ｉｘ）サポニン（すなわち、シャボンノキ（Quillaja saponaria）またはキキョウ（Platycodon grandiflorum）に由来する任意のサポニン）、ｘ）ビロゾーム／ウイルス様粒子、ｘｉ）エンテロトキシン（すなわち、コレラ毒素、ＣＴＡ１−ＤＤまたはエシェリキア・コリ（Esherichia coli）易熱性エンテロトキシン）並びにそれらの組合せ。
【００７４】
ワクチンの抗原性特性のさらなる増強のために、周知のアジュバントを、経口免疫調整剤またはアジュバント、例えばＣｏｘ−２阻害剤または別の種類もしくはクラスの免疫調整化合物と組み合わせ得る。他の適切なアジュバントには、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、例えばＮｅｕｐｏｇｅｎまたはＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ；一般名、サルグラモスチム）、Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標）（Ｓａｎｄｏｚ／Ｓｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）が含まれる。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、アジュバントおよび１つ以上のさらなる治療剤、例えば、免疫調整剤および／または第１および第２の潜伏逆転剤、例えばリザーバー駆逐剤と組み合わせたワクチンの使用である。特定の実施形態において、これらの薬剤の各々は、独立して、経口投与用に選択され得る。
【００７６】
したがって、本発明の方法および組成物において、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドおよびリザーバー駆逐剤は、１つ以上のさらなる治療的に活性な薬剤、例えば、ＨＩＶおよび／またはＡＩＤＳを治療および／または予防するための薬剤と組み合わせて投与されてもよい。このような薬剤の例としては、限定されないが、抗ＰＤ−１抗体またはＩｇ融合タンパク質、例えば、ペンブロリズマブ／ＭＫ３４７５／キートルーダ、ＭＤＸ１１０６／ＢＭＳ９３６５５８、ＭＫ３４７５、ＣＴ−００１、ＡＭＰ−２２４またはＭＤＸ−１１０５、抗ＰＤ−１リガンド抗体またはＩｇ融合タンパク質、例えば、ＭＤＸ−１１０５、抗ＬＡＧ−３抗体またはＩｇ融合タンパク質、例えば、ＩＭＰ−３２１、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）またはトレメリムマブ、広範囲の中和する抗体（ｂＮＡｂ）、Ｔｏｌｌ様受容体９アゴニスト、例えば、ＭＧＨ１７０３、Ｔｏｌｌ様受容体３アゴニスト、例えば、ポリ−ＩＣＬＣ、インターロイキン１５（ＡＬＴ８０３）、インターフェロンアルファ、ＴＬＲ−４アゴニスト、例えば、ＡＳ０４（Ｃｅｒｖａｒｉｘ）、ＣＤ４結合抗体、例えば、イバリズマブ、ＣＣＲ５結合抗体、例えば、ＰＲＯ１４０、二重特異性抗体、例えば、二重親和性再標的化タンパク質（ＤＡＲＴ）またはＢ細胞特異的Ｔ細胞誘導因子（ＢＩＴＥ）が挙げられる。
【００７７】
用語「治療剤」、例えば「免疫調整剤」もしくは潜伏逆転剤、またはウイルスリザーバー駆逐剤は、本明細書で使用するとき、限定されないが、サイトカイン、例えばインターフェロン、モノクローナル抗体、例えば抗ＰＤ１抗体、ならびに他のチェックポイント阻害剤、シクロホスファミド、サリドマイド、レバミゾールおよびレナリドミドを含む。特定の広範囲の中和する抗体を含む、受動免疫または能動免疫のための他の抗体および他のワクチンが、本発明による治療剤として有用であり得ることが想定される。
【００７８】
用語「ウイルスリザーバー駆逐剤」は、本明細書で使用するとき、例えば、組み込まれたプロウイルス由来の以前にサイレントなＨＩＶ核酸の発現を増加させるかまたは誘導する。典型的なウイルスリザーバー駆逐剤には、限定されないが、オーラノフィン、ＩＬ−７、プロストラチン、ブリオスタチン、ＨＤＡＣ阻害剤、例えばボリノスタット、ジスルフィラム並びに国際公開第２０１３／０５０４２２号、国際公開第２０１２／０５１４９２Ａ３号、およびBarton et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics (2013); 93 1, 46-56l、またはXing and Silciano in Drug Discov Today. 2013 Jun; 18(0): 541-551に開示の任意の適切な薬剤を含み、限定されないが、ＰＭＡ、プロストラチン、ブリオスタチンおよびＴＮＦ−αを含む群から選択されるＮＦ−カッパ−Ｂ誘導剤、および／またはｂ）ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサメート、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、パノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサメートの桂皮ヒドロキサム酸類似体、ＩＦ２３５７、アリールオキシアルカン酸ヒドロキサミド、デプシペプチド（例えばロミデプシン）、アピシジン、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド分子群、ＦＫ−２２８、ｒｅｄ  ＦＫ、ヒドロキサム酸に脂肪族鎖により連結した環状ペプチド模擬体、酪酸塩、フェニル酪酸塩、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、酪酸ピバロイルオキシメチル、５ＮＯＸ−２７５およびＭＧＣＤ０１０３を含む異なるファミリー（ヒドロキサメート、環状ペプチド、脂肪族酸およびベンズアミド）から選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む。上記ウイルスリザーバー駆逐剤のいずれも単独でまたはいずれかの他の適切な潜伏逆転剤、例えば別のクラスのＨＩＶ誘導剤との組合せによる別のウイルスリザーバー駆逐剤と組み合わせて用いることができる。
【００７９】
また、ＤＮＡメチル化は、おそらくは抑制的ヒストン改変とともに、プロウイルスのサイレント状態での「固定」に寄与し得、活性状態への復帰を困難とする。これらの観察は、有効なｃＡＲＴとともにＨＤＡＣまたはＨＭＴまたはＤＮＡメチル化阻害剤が、ウイルス潜伏リザーバーのプールを、宿主免疫系が耐え得るレベルまで低減させ／排除することを目的とする良好な抗潜伏薬の候補を構成することを示唆する。
【００８０】
したがって、適切な免疫調節化合物または駆逐剤は、２つのクラス（非ヌクレオシドおよびヌクレオシド脱メチル化剤）から選択されるＤＮＡメチル化阻害剤であり得、５−アザシチジン（アザシチジン）、シネフンギン、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン、５−ＡｚａｄＣ）、１−３−ダラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）およびジヒドロ−５−アゼシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノン含有オリゴデオキシヌクレオチド二重鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガレート、ヒドララジン、プロカインおよびプロカインアミドを含む。
【００８１】
本発明に従って使用されるべき他の適切な免疫調節化合物または駆逐剤は、異なるファミリーのＨＤＡＣＩ（ヒドロキサメート、環状ペプチド、脂肪酸およびベンズアミド）、例えば、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサメート、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、パノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサメートの桂皮ヒドロキサム酸類似体、ＩＦ２３５７、アリールオキシアルカン酸ヒドロキサミド、デプシペプチド（例えば、ロミデプシン）、アピシジン、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド分子群、ＦＫ−２２８、ｒｅｄ  ＦＫ、ヒドロキサム酸に脂肪族鎖により連結した環状ペプチド模擬体、酪酸塩、フェニルブチレート、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、ピバロイルオキシメチルブチレート、５ＮＯＸ−２７５およびＭＧＣＤ０１０３から選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む。
【００８２】
本発明に従って使用されるべき他の適切な免疫調節化合物または駆逐剤には、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ケトシンおよびＢＩＸ−０１２９４）；Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｚｅｓｔｅ  ２（ＥＺＨ２）阻害剤−例えば、単独でまたは他のクラスの免疫調節化合物または駆逐剤と組み合わせて用いられる３−デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）が挙げられる。
【００８３】
他の適切なアジュバントとしては、応答選択的Ｃ５ａアゴニスト、例えば、Hung CY et al.  An agonist of human complement fragment C5a enhances vaccine immunity against Coccidioides infection.  Vaccine (2012) およびKollessery G et al. Tumor-specific peptide based vaccines containing the conformationally biased, response-selective C5a agonists EP54 and EP67 protect against aggressive large B cell lymphoma in a syngeneic murine model.  Vaccine (2011) 29: 5904-10に記載されるＥＰ５４およびＥＰ６７が含まれる。
【００８４】
したがって、ワクチンについてのアジュバント効果を達成するための様々な方法は公知である。一般的な原理および方法は、“The Theory and Practical Application of Adjuvants”, 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6、さらに“Vaccines: New Generationn Immunological Adjuvants”, 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9（両者は、参照により本明細書に組み込まれる）に詳述されているが、いくつかの後の刊行物もまたアジュバントを組み込む技術を扱っている：Roestenberg M et al., PLoS One. 2008;3(12):e3960. Epub 2008 Dec 18; Relyveld E and Chermann JC, Biomed Pharmacother. 1994;48(2):79-83; Hsu FJ et al., Blood. 1997 May 1;89(9):3129-35; Galli G et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 May 12;106(19):7962-7. Epub 2009 Apr 27; Bojang KA et al., Lancet. 2001 Dec 8;358(9297):1927-34; Odunsi K et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jul 31;104(31):12837-42. Epub 2007 Jul 25; Patel GB and Sprott GD; Crit Rev Biotechnol. 1999;19(4):317-57. Review; Agger EM et al., PLoS One. 2008 Sep 8;3(9):e3116; Kirby DJ et al. J Drug Target. 2008 May;16(4):282-93; Florindo HF et al., Vaccine. 2008 Aug 5;26(33):4168-77. Epub 2008 Jun 17; Sun HX et al., Vaccine. 2009 May 28; Guy B, Nat Rev Microbiol. 2007 Jul;5(7):505-17. Review.; Vandepapeliere P et al., Vaccine. 2008 Mar 4;26(10):1375-86. Epub 2008 Jan 14; Ghochikyan A et al. Vaccine. 2006 Mar 20;24(13):2275-82. Epub 2005 Dec 5; Xie Y et al., Vaccine. 2008 Jun 25;26(27-28):3452-60. Epub 2008 May 1; Chung YC et al., Vaccine. 2008 Mar 28;26(15):1855-62. Epub 2008 Feb 25; Maier M et al., Vaccine. 2005 Oct 25;23(44):5149-59; Sundling C et al., J Gen Virol. 2008 Dec;89(Pt 12):2954-64。
【００８５】
抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）がＨＩＶ−１感染を根絶できないのは、ＨＩＶ−１が潜伏リザーバーで休止状態にあるという事実にある。潜伏感染した静止状態のＣＤ４＋細胞（ナイーブまたは長寿のメモリー細胞）は、転写がサイレント状態であるＨＩＶ−１を保有し、ＨＩＶ−１感染の優勢なリザーバーを示す。また、他の細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞およびアストロサイト（これらでは、ＨＩＶ−１感染はＣＤ４非依存的機序を介して起こる）は、リザーバーとして働き得る（Alexaki et al., 2008, Curr. HIV Res. 6:388-400に概説されている）。ＨＩＶ−１感染根絶に向けた主要なチャレンジを示すのはこれら潜伏リザーバーである。根絶に向けたアプローチには、放出されたウイルスが近隣細胞に感染し、複製しないように、ＡＲＴ存在下で潜伏感染細胞（例えばメモリー細胞）を選択的に活性化してリザーバーを駆逐する試みが含まれる（Richman et al., 2009, Science 323:1304-1307）。リザーバー駆逐剤としては、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−７、並びにブリオスタチン、プロテインキナーゼＣアクチベータが挙げられる（Kovochich et al., 2011, PLoS ONE 6 (4):e18270）。
【００８６】
ＴＮＦ−αの異常産生に関連する疾患の治療に安全で効果的に用いることができる化合物を提供することを目的とする多数の研究が行われている。例えば、Marriott, J.B., et al, Expert Opin. Biol. Ther. (4): 1-8 (2001); G.W. Muller, et al, Journal of Medicinal Chemistry, 39(17): 3238-3240 (1996);およびG.W. Muller, et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 8: 2669-2674 (1998)を参照されたい。いくつかの研究は、ＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣによるＴＮＦ−α産生を強力に阻害する能力について選択された化合物群に着目している。L.G. Corral, et al, Ann. Rheum. Dis., 58 (suppl I): 1107-1113 (1999)。これら化合物は、しばしば免疫調節化合物とも呼ばれ、ＴＮＦ−αの強力な阻害を示すだけでなく、ＬＰＳによって誘導される単球ＩＬ１ＢおよびＩＬ１２産生の顕著な阻害も示す。ＬＰＳによって誘導されるＩＬ６はまた、部分的ではあるが、免疫調節化合物により阻害される。これら化合物は、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ１０の強力な刺激因子である。具体例としては、限定されないが、米国特許第６，２８１，２３０号および同第６，３１６，４７１号に記載される置換２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）フタルイミドおよび置換２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイソインドールが挙げられる。単球／マクロファージの機能は、感染に対する防御の第一線として働く先天免疫系の一部である。宿主の単球およびマクロファージを調節することにより、免疫調節化合物は、ウイルス感染、例えばインフルエンザ感染に対する応答の動力学を変化させることができる。
【００８７】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ヒストンタンパク質上のＮ−アセチル化リジンアミノ酸からアセチル基を除去する酵素のクラスである。現在、哺乳動物では１８個のＨＤＡＣが同定されている。それらは、細胞内局在、機能および配列類似性に基づいて４つのクラスに分けられている。クラスＩには、主に核に見出されるＨＤＡＣ１、２、３および８が含まれる。クラスＩＩのＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ４、５、６、７、９および１０）は、主に細胞質に見出されるが、核と細胞質の間を行き来できる可能性がある；クラスＩＩａは４つのＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ４、５、７および９）を含み、クラスＩＩｂは細胞質でのみ発現される２つのＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ６および１０）を含む。ＨＤＡＣ１１は、普遍的に発現され、クラスＩとクラスＩＩの両方のＨＤＡＣと配列類似性を有し、クラスＩＶを示す。クラスＩＩＩ（「サーチュインファミリー」とも呼ばれる）は、原則としてヒストンに作用しないＮＡＤ＋依存性タンパク質の一員である。
【００８８】
治療ペプチドワクチンは、ＡＲＴがアクセスし難い避難部位、例えばウイルスが残存する領域を示すリンパ系組織（Pantaleo et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9838-42; Fox et al., 1991, J. Infect. Dis. 164:1051-57）および中枢神経系（Alexaki et al., 2008, Curr. HIV Res. 6:388-400）に浸透することができるという利点を有する。このことは、ウイルス自体とＨＩＶ関連免疫活性化の両方を標的する治療的介入に関する。本発明の方法において、少なくとも１つのＨＩＶ特異的ペプチドは、リザーバー駆逐剤とともに、適宜、別の免疫調節化合物および／または第２のリザーバー駆逐剤、例えば、別のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤とともに、特定の投薬レジメンで投与される。
【００８９】
免疫調節化合物は、抗ＰＤ１抗体、例えば、ＭＤＸ−１１０６（Ｍｅｒｃｋ）／ＢＭＳ−９３６５５８、ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標）（サリドマイド）、抗ＰＤＬ１抗体、シクロホスファミド、シロリムス、レバミゾール、レナリドミド、ＣＣ−４０４７（ポマリドミド）、ＣＣ−１１００６（Ｃｅｌｇｅｎｅ）およびＣＣ−１００１５（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ならびに国際公開第２００７／０２８０４７号、国際公開第２００２／０５９１０６号および国際公開第２００２／０９４１８０号のいずれか１つに記載されている免疫調節化合物のいずれかから選択され得る。免疫調節化合物は、例えば、４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオンおよび３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペリジン−２，６−ジオンから選択され得る。具体的な実施形態において、免疫調節化合物はレナリドミドである。免疫調節化合物は鏡像異性的に純粋であり得る。
【００９０】
第１または適宜第２のリザーバー駆逐剤、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤は、Ｍ３４４（４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［７−（ヒドロキシアミノ）−７−オキソヘプチル］ベンズアミド）、キダマイド（ＣＳ０５５／ＨＢＩ−８００）、４ＳＣ−２０２、（４ＳＣ）、レスミノスタット（４ＳＣ）、ヒドロキサム酸、例えばボリノスタット（ＳＡＨＡ）、スベロイルビス−ヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、トリコスタチンＡおよびパノビノスタット（ＬＢＨ５８９）；ベンズアミド、例えばエンチノスタット（ＭＳ−２７５）、ＣＩ９９４およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、環状テトラペプチド（例えばトラポキシン、例えばトラポキシンＢ）、およびデプシペプチド、例えばロミデプシン［Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ）］、求電子性ケトン、および脂肪酸化合物、例えばフェニルブチレート、バルプロ酸、オキサムフラチン、ＩＴＦ２３５７（ジェネリックのジビノスタット）、アピシジン、ＭＣ１２９３、ＣＧ０５、およびＣＧ０６、メタセプト−１（ＭＣＴ−１）、メタセプト−３（ＭＣＴ−３）、スクリプタイド、ドロキシノスタット、ＨＣ毒素、ＣＡＹ１０３９８、ＭＣ１２９３、ＣＡＹ１０４３３、デプデシン、１−ナフトエ酸ナトリウム、ＭＲＫ  １またはＭＲＫ−１１；ＮＣＨ−５１（Victoriano et al. FEBS Lett. 585, 1103-11 (2011)）、ＨＤＡＣ３選択的阻害剤Ｔ２４７およびＴ３２６、ならびにSuzuki, T. et al. PLoS One 8, e68669 (2013)に記載されている他のものから選択され得る。ＮＦ−カッパＢ、プロストラチン（１２−デオキシホルボール−１３−アセテート）、プロストラチン類似体、オーラノフィン、ブリオスタチン、非腫瘍形成性ホルボールエステル、ブリオスタチン類似体、ブリオスタチン−２、ブリオスタチン−２充填ナノ粒子、ＤＰＰ（１２−デオキシホルボール−１３−フェニルラセテート）、ＰＭＡ、およびホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、ホルボール１３−モノエステル、ホルボール１３−ヘキサノエート、およびホルボール１３−ステアレート（Ｐ−１３Ｓ）を含む転写因子を活性化する化合物；ＡＶ６（４−３’，４’−ジクロロアニリノ−６−メトキシキノリン化合物）；Ｐａｍ３ＣＳＫ４；キノリン−８−オールおよびその誘導体、５−クロロキノリン−８−オールおよび５−クロロキノリン−８−イル；Ｐ−ＴＥＦ−ｂキナーゼおよびヘキサメチルビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）を含むＨＩＶ  ｍＲＮＡ伸長を活性化する化合物；ＪＱ１を含むＰ−ＴＥＦ−ｂアゴニスト；ＴＥＮ−０１０（ＪＱ２）、ＧＳＫ５２５７６２、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ、Ｉ−ＢＥＴ１５１、ＭＳ４１７を含むブロモドーマイン阻害剤（ＢＥＴｉ）；プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化剤、例えばインゲノール−３−アンゲラート（ＰＥＰ００５、インゲノールメブテート）、ＩＮＧ−Ａ（インゲノール−３−トランス−シンナメート）、ＩＮＧ−Ｂ（インゲノール−３−ヘキサノエート）、ＩＮＧ−Ｃ（インゲノール−３−ドデカノエート）、インゲノール３，２０−ジベンゾエート、米国特許出願公開第２０１５／００３０６３８号に記載されるインゲノール誘導体、ＳＪ２３Ｂ���ジャトロファンジテルペン）、Hamer, D. H. et al. J. Virol. 77, 10227-10236 (2003).に記載されるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）類似体；ＤＡＧラクトン、インゴール７，８，１２−トリアセテート３−フェニルアセテート、インゴール７，８，１２−トリアセテート３−（４−メトキシフェニル）アセテート、８−メトキシインゴール７，１２−ジアセテート３−フェニルラセテート、グニジマクリン、ブリオスタチン−１；ＩＬ−７、ＩＬ−１５；米国特許第８，８１６，１２２号に開示されるプロストラチンまたはブリスタチンの類似体およびそのプロドラッグ；米国特許出願公開第０８／５３６３７８号に開示されるプロスタラチン類似体；サーチュイン阻害剤；抗ＣＤ３／ＣＤ２８−Ｔ細胞刺激Ａｂを含むＴ細胞刺激因子；キナーゼ阻害剤、例えば、チロホスチンＡ、チロホスチンＢおよびチロホスチンＣ；ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシンホモログ）遺伝子阻害剤、例えば、ＳＦ１６７０（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ジスルフィラム（ＤＳＦ）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの阻害剤；ダクチノマイシン、アクラルビシンシタラビン、アフィジコリン；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）およびｂｐＶ（ｐｉｃ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストおよびＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニスト；イミキモド、ＧＳ−９６２０、ケルセチン、リポ酸、酪酸ナトリウム、ＴＮＦ−アルファ、ＰＨＡ、Ｔａｔ、米国特許出願公開第２０１３／００７１３５４号、同第２０１４／００８１０２２号、同第２０１５／０２３９８８８号、同第２００９／００４７２４９号、同第２０１１／０２３６３４８号、同第２０１４／０１３５４９２号、同第２０１０／０１４３３０１号、同第２０１４／０３１６１３２号、同第２００９／０２０２４８４号、欧州特許出願公開第２１７０８８８号、カナダ特許出願公開第２６９１４４４号、欧州特許出願公開第２３６４３１４号、同第２８１８４６９号、カナダ特許出願公開第２７４５２９５号、欧州特許出願公開第２０３８２９０号、カナダ特許出願公開第２６５６４２７号、国際公開第２００９／００５６８７号、同第２０１０／０７７６１３号または同第２００８／００５５５５号に列挙されるＴＬＲ７アゴニスト；当技術分野において公知であるＴＬＲ７アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストプロドラッグ、例えば、米国特許出願公開第２００５／００５４５９０号（米国仮特許出願第１０／９３１，１３０号）および米国特許出願公開第２００６／０１６０８３０号（米国仮特許出願第１１／３０４，６９１号）（両者は参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されるもの。例えば、ＴＬＲ７アゴニストまたはＴＬＲ７アゴニストプロドラッグは、化合物Ｉ（３，５−ジ置換−３Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２−オン、例えば、５−アミノ−３−（２’−Ｏ−アセチル−３’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２−オン）であり得る。Ｔｏｌｌ様受容体７アゴニストまたはプロドラッグには、限定さ��ないが、以下が含まれる：イミキモド、イサトリビンおよびそのプロドラッグ変異体（例えば、ＡＮＡ−９７５およびＡＮＡ−９７１、ＡＮＡ７７３）、２，９、置換された８−ヒドロキシアデノシン誘導体（ＳＭ−３６０３２０）；アンホテリシンＢ；ＪＮＪ６１１；ＣＬ５７２；ユグロン（５ＨＮ、５−ヒドロキシナフタレン−１，４−ジオン）および国際公開第２０１０／０９９１６９号に開示される化合物；ＴＬＲ−５アゴニスト、例えば、フラジェリン、ＴＬＲ７／８アゴニスト、Ｒ−８４８、ＴＬＲ−９アゴニスト、例えば、合成ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＰＧ７９０９またはＭＧＮ１７０３。適切な駆逐剤は、５−アザシチジン（アザシチジン）、シネフンギン、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン、５−ＡｚａｄＣ）、１−３−ダラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）およびジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチド二重鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガレート、ヒドララジン、プロカインおよびプロカインアミド；または上記のいずれかの類似体を含む２つのクラス（非ヌクレオシドおよびヌクレオシド脱メチル化剤）から選択されるＤＮＡメチル化阻害剤であり得る。
【００９１】
本発明の方法において、少なくとも１つのＨＩＶ特異的タンパク質治療剤、例えば、抗体および／またはＨＩＶワクチンペプチド、および／または１つ以上のさらなる治療活性剤の成分は、同時に、逐次的にまたは別々に任意の順序で投与され得る。
【００９２】
したがって、本発明は、少なくとも１つのＨＩＶ特異的タンパク質治療剤、例えば、ペプチドおよび／または１つ以上のさらなる治療活性剤の１つ、２つまたはそれ以上の成分を、適宜１つ以上の医薬として許容されるアジュバント、希釈剤または担体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【００９３】
同様に、本発明はまた、各成分が医薬として許容されるアジュバント、希釈剤または担体と混合して製剤化される、少なくとも１つのＨＩＶ特異的タンパク質治療剤、例えば、ペプチドおよび／または１つ以上のさらなる治療活性剤（例えば、１つ以上のリザーバー駆逐剤および／または１つ以上の免疫調節化合物）を含む組合せ製品を提供する。本発明のこの態様において、組合せ製品は、単一（組合せ）医薬製剤またはパーツキットのいずれかであってもよい。パーツキットにおいて、成分のいくつかまたは全ては、別々に製剤化されてもよく、各々が他のもの（単数または複数）と組み合わせた投与に適切な形態で提供されてもよい。
【００９４】
また、成分（単数または複数）は、上記の１つ以上のさらなる成分と組み合わせて使用するために、例えば使用説明書とともに提供されてもよい。
【００９５】
本発明において使用するためのタンパク質およびペプチドは、当技術分野で認識されている方法を用いて合成生産されてもよい。このようなペプチドの合成生産についてのさらなる詳細は、当技術分野において周知である；実施例もまた参照されたい。あるいは、ペプチドは、当技術分野において周知である材料および方法を用いて、組み換え的に生成されてもよい。本発明において使用するためのペプチドを形質転換細胞により組換え生成する場合、必須ではないが、発現産物を培養培地から取り出しもしくは培養培地中に分泌させ、または形質転換細胞の表面に保有させることが好都合である。
【００９６】
効果的な産生細胞が同定されている場合、その細胞を基にして、本発明のベクターを有し、本発明の核酸フラグメントを発現する安定な細胞株を樹立することが好ましい。好ましくは、この安定細胞株は、ペプチド発現産物を分泌しまたは保有することによりその精製を容易とする。
【００９７】
一般的には、レプリコン、および宿主細胞と適合性である種に由来する制御配列を含有するプラスミドベクターは、宿主と組み合わせて用いられる。ベクターは、通常、複製部位、および形質転換細胞中で表現型選択を提供し得るマーキング配列を保有する。例えば、エシェリキア・コリ（E. coli）は、典型的には、エシェリキア・コリ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される（例えば、Bolivar et al., 1977を参照されたい）。ｐＢＲ３２２プラスミドは、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有し、したがって、形質転換細胞の容易な同定手段を提供する。ｐＢＲプラスミドまたは他の微生物プラスミドもしくはファージはまた、発現用原核微生物が使用することができるプロモーターを含有しまたは含有するように修飾されていなければならない。
【００９８】
組換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されるそれらのプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（(Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979）並びにトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al., 1979;欧州特許出願公開第００３６７７６号）が挙げられる。これらが最も一般的に用いられるが、他の微生物プロモーターが見出されており、利用されている。それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開され、当技術分野において容易に利用可能である（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Online ISBN: 9780471142720, DOI: 10.1002/0471142727, Print ISSN: 1934-3639, Online ISSN: 1934-3647;およびその添付物を参照されたい）。
【００９９】
原核生物に加えて、酵母培養物などの真核微生物もまた用いることができ、さらに、この場合、プロモーターは発現を駆動し得るべきものである。サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiase）または一般的なパン酵母は、真核微生物の中で最も一般的に用いられるが、多数の他の菌株が広く入手可能である。サッカロミセス属における発現に関して、例えば、プラスミドＹＲｐ７が一般的に用いられる（Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980; Current Protocols in Molecular Biology, Online ISBN: 9780471142720, DOI: 10.1002/0471142727, Print ISSN: 1934-3639, Online ISSN: 1934-3647およびそれらの添付物）。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ）は、他の一般的に使用される酵母（糸状菌）の発現系である。
【０１００】
酵母ベクター中の適切なプロモーター配列としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzman et al., 1980）または他の糖分解酵素（Hess et al., 1968; Holland et al., 1978）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。適切な発現プラスミドの構築において、これら遺伝子に関連する終止配列はまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止を提供するために、発現ベクター中、発現が望まれる配列の３’側に組み込まれる。
【０１０１】
転写が生育条件により制御されるというさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素および上記のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母適合性プロモーター、複製起点および終止配列を含有する任意のプラスミドベクターが適切である。
【０１０２】
微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞培養物はまた、宿主として用いることができる。原理上、かかる任意の細胞培養物は、脊椎動物または無脊椎動物の培養物に由来するかにかかわらず機能する。このような有用な宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯ細胞およびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｗ１３８、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７  ２９３、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（ＳＦ）細胞、キイロショウジョウバエ（ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster））細胞株［例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２（Ｓ２）］およびＭＤＣＫ細胞株である。
【０１０３】
このような細胞用の発現ベクターは、通常、（必要であれば）複製起点、任意の必要なリボソーム結合部位とともに、発現すべき遺伝子の前に位置するプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終止配列（当技術分野において周知である他の制御配列のうち）を含む。
【０１０４】
哺乳動物細胞における使用に関して、発現ベクターにおける制御機能は、しばしば、ウイルス材料により提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、最も頻繁にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ともに、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有する断片としてウイルスから容易に得られるため、特に有用である（Fiers et al., 1978）。ウイルスの複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に向かって伸長する約２５０ｂｐ配列を含んでいれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた用いることができる。さらに、所望の遺伝子配列と通常関連しているプロモーターまたは制御配列を用いることも可能であり、望ましいことが多い。ただし、このような制御配列は、宿主細胞系と適合性である必要がある。
【０１０５】
複製起点は、外来の起点、例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、他のポリオーマウイルス、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）に由来してもよい起点を含むようにベクターを構築することによって提供されてもよく、または宿主細胞の染色体複製機序によって提供されてもよい。ベクターが宿主細胞の染色体内に組み込まれる場合、後者で十分であることが多い。
【０１０６】
上記で詳述したポリペプチドベースのワクチンの投与経路および投与スキームについて、これらは本発明の核酸ワクチンにも適用可能であり、ポリペプチドの投与経路および投与スキームに関して上記した全ての検討は核酸にも必要な変更を行った上であてはまる。これに、核酸ワクチンが静脈内および動脈内に投与することもできることが加えられるべきである。さらに、核酸ワクチンが、いわゆる遺伝子銃の使用によりおよび／またはエレクトロポレーションの使用により投与可能であることは当技術分野において周知である。よって、これらおよび等価な投与様式もまた本発明の一部と見なされる。
【０１０７】
通常の状況下で、核酸断片は、発現がウイルスプロモーターの制御下にあるベクターの形態で導入される。本発明によるベクターのより詳細な検討については、上記を参照されたい。また、核酸ワクチンの製剤化および使用に関する詳細な開示が利用可能である。Donnelly JJ et al, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648およびDonnelly JJ et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172を参照されたい。これらの参考文献はともに参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
ペプチド免疫原または核酸免疫原の使用に代替するものは、生免疫原技術の使用である。これは、本発明の核酸断片またはベクターを用いて形質転換された非病原性微生物の投与を含む。非病原性微生物は、任意の適切な弱毒化細菌株（継代により、または組換えＤＮＡ技術による病原性発現産物の除去により弱毒化される）、例えば、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）ＢＣＧ．、非病原性ストレプトコッカス属種（Streptococcus spp.）、エシェリキア・コリ、サルモネラ属種（Salmonella spp.）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）、シゲラ属（Shigella）などであることができる。従来技術の生ワクチンの製造を扱う概説は、例えば、Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492 1496およびWalker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990（両者は、参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。このような生ワクチンに用いられる核酸断片およびベクターについての詳細は、下記を参照されたい。
【０１０９】
細菌性生免疫原の代替物として、本発明の核酸断片は、ワクシニア系統または任意の他の適切なポックスウイルスなどの非毒性ウイルスワクチンベクターに組み込むことができる。
【０１１０】
通常、非病原性微生物またはウイルスは、対象に１回のみ投与されるが、特定の場合、保護免疫を維持するために、微生物／ウイルスを生涯において１回を超えて投与する必要があり得る。生ワクチンまたはウイルスワクチンを用いる場合、ポリペプチドワクチン接種について上記した免疫化スキームが有用であることも企図されている。
【０１１１】
あるいは、生またはウイルス免疫化は、事前または事後のポリペプチドおよび／または核酸免疫化と組み合わされる。例えば、生またはウイルスワクチンによる初回免疫、続くポリペプチドまたは核酸アプローチを用いるその後のブースター免疫化を行うことができる。
【０１１２】
本発明による使用のためのＨＩＶ特異的ペプチド
本発明は、ＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ２４の保存領域に基づくＨＩＶ特異的ペプチドの使用に関し、遊離形態または担体結合形態の抗原は、少なくとも１つの該ペプチドを含む。
【０１１３】
本発明を例示するための本明細書に記載されるＨＩＶ特異的ペプチドは、ＨＩＶ−１コアタンパク質ｐ２４の４つの異なる保存領域に起源を有し、これらは、ＨＩＶ−１エピトープの独自性（感受性および特異性）を維持するという特性を有する。さらに、これらペプチドは、認識される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）拮抗効果を有さず、少なくとも１つの可能なＣＴＬエピトープを有する。
【０１１４】
上記の基準を満たす本発明による使用のためのＨＩＶ特異的ペプチドは、上記に定義されるとおり、配列番号１、４、９および１５のアミノ酸配列の群を含むかまたはそれらの配列の群から本質的になるペプチドから選択される；ここで、各ＨＩＶ特異的ペプチドの末端部は遊離のカルボキシル基もしくはアミノ基、アミド、アシルまたはアセチルであってもよい；あるいは、ＨＩＶ特異的ペプチドのいずれかの酢酸塩であってもよい。
【０１１５】
ＨＩＶ特異的ペプチド配列は、配列番号１、配列番号４、配列番号９または配列番号１５の配列の群より選択される少なくとも１つのペプチドを含むかまたは本質的にそれからなる、特に良好な抗原として機能する能力を有する。抗原性は、異なるペプチドの比もしくは濃度、または例えば二量体化もしくは多量体化によりペプチドサイズを調節することによって、および／または固相への固定化によって適合させ得る。抗原は、架橋、例えば鎖のＣｙｓ残基間のジスルフィド架橋、またはＣ１〜Ｃ８アルキレンのような架橋（Ｏ、ＳまたはＮのような１つ以上のヘテロ原子が介在していてもよい）により連結された２つ以上のポリペプチド配列を含んでもよく、または好ましくは、ポリペプチド配列は連結されていない。鎖は、固相に、単量体、二量体またはオリゴマー形態で固定化され得る。固定化を容易にする「腕」を得るために、さらなるアミノ酸を末端に付加してもよい。
【０１１６】
本発明のＨＩＶ特異的ペプチドの全てのアミノ酸は、Ｄ型またはＬ型であることができるが、天然に存在するＬ型が一般的に好ましい。ＨＩＶ特異的ペプチド配列のＣ末端およびＮ末端は、末端のＮＨ２基および／またはＣＯＯＨ基の改変により天然配列から逸脱し得、例えば、アシル化され、アセチル化され、アミド化され、もしくはその塩であってもよく；または担体もしくは別の分子用の結合部位を提供するように改変されていてもよい。ペプチドのＣ末端がアミドであるとき、適切なアミドとしては、式−Ｃ（Ｏ）−ＮＲｘＲｙ（式中、ＲｘおよびＲｙは、独立して、水素およびＣ１〜６アルキルから選択され、そのアルキル基は、１つ以上のフッ素原子で置換されてもよく、例えば−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３および−ＣＦ３であり得る）を有するものが挙げられ、言及し得る具体的なアミド基は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。ペプチドのＮ末端がアセチル化されているとき、適切なアセチル化Ｎ末端としては、式−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｒｚ［式中、Ｒｚは、水素、Ｃ１〜６アルキル（そのアルキル基は、１つ以上のフッ素原子で置換されてもよく、例えば−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３および−ＣＦ３であり得る）またはフェニルである］のものが挙げられる。
【０１１７】
本発明による使用のためのＨＩＶ特異的ペプチドは、６〜５０個のアミノ酸、好ましくは１０〜３０個のアミノ酸からなる。これらは、特定位置での天然のアミノ酸変動の全てをカバーする。それらは、このような置換を機能的に可能にする位置に１つ以上の非天然アミノ酸残基をさらに含み得る。
【０１１８】
本発明による使用のためのポリペプチド抗原は、遊離形態または担体結合形態のいずれかである。ペプチドが適宜結合していてもよい担体または固相は、広範な公知の担体から選択することができる。それは、ワクチン中の免疫成分としての固定化されたポリペプチドの意図する用途に関して選択されるべきである。
【０１１９】
特定の好ましい実施態様において、本発明による使用のためのＨＩＶ特異的ペプチドは、配列番号１、４、９および１５のアミノ酸配列を含有する抗原を含み、特定の好ましい実施形態において、ペプチドは１：１：１：１の比（ｗ／ｗ）で生じる。
【０１２０】
１つのさらなる好ましい実施態様において、本発明による使用のためのＨＩＶ特異的ペプチドは、以下のアミノ酸残基：
RALGPAATLQTPWTASLGVG（配列番号３）
RWLLLGLNPLVGGGRLYSPTSILG（配列番号６）
RAIPIPAGTLLSGGGRAIYKRWAILG（配列番号１１）
および
RFIIPNlFTALSGGRRALLYGATPYAIG（配列番号１８）（６位のＮｌはノルロイシンである）
を含むかまたは本質的にそれからなるペプチド、またはそれらの塩、特に酢酸塩を含む。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、本発明による使用のためのＨＩＶ特異的ペプチドは、Ｃ末端で以下：
RALGPAATLQTPWTASLGVG-NH2（配列番号３）
RWLLLGLNPLVGGGRLYSPTSILG-NH2（配列番号６）
RAIPIPAGTLLSGGGRAIYKRWAILG-NH2（配列番号１１）
および
RFIIPNlFTALSGGRRALLYGATPYAIG-NH2（配列番号１８）
またはそれらの塩、特に酢酸塩のように改変される。（本願において、「Ｖａｃｃ−４ｘ」とも呼ばれる）。
【０１２２】
ペプチド生成の説明
本発明のペプチドは、直鎖アミノ酸配列を生成する任意の公知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術により生成することができる。本発明のペプチドまたは該ペプチドの多量体をコードする核酸配列を発現ベクターに導入する。適切な発現ベクターは、例えば、複製および発現に必要な制御領域を含むプラスミド、コスミド、ウイルスおよびＢＡＣまたはＹＡＣ（細菌または酵母の人工染色体）である。発現ベクターは、宿主細胞において発現を達成するように刺激されてもよい。適切な宿主細胞は、例えば、細菌、酵母細胞、ならびに他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞である。このような技術は、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989に記載される。他の周知な技術は、液相または好ましくは固相（樹脂）で、例えば、いわゆるメリフィールド合成により、アミノ酸残基を次のアミノ酸残基に１つずつカップリングすることによる分解または合成である。例えば、Barany and Merrifield in the Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol.2, E. Gross and Meinhofer, Ed. (Acad.Press, N.Y., 1980), Kneib-Coronier and Mullen Int. J. Peptide Protein Res.,30, p.705-739 (1987)およびFields and Noble Int.J.Peptide Protein Res., 35, p.161-214 (1990)を参照されたい。
【０１２３】
連結ペプチドまたは環状ペプチドが所望である場合、適切な直鎖アミノ酸配列を合成し、アミノ酸配列を化学的酸化工程に供して、１つのペプチド配列内または２つのペプチド配列間の２つのシステイン残基を環化または連結する。Akaji et al., Tetrahedron Letter, 33, 8, p.1073-1076, 1992を参照。
【０１２４】
合成の一般的説明
アミノ酸誘導体は、Bachem AG, Switzerlandより供給を受けた。
【０１２５】
本明細書に記載されるペプチドは、好ましくは、Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、Ｃ末端がアミド化されている。本明細書に記載される全てのペプチドの対イオンは、荷電官能基（すなわち、グアニジノ側鎖、アルギニンおよびリジンのε−アミノ基［Ｖａｃｃ−１１］、およびアルギニンの側鎖［Ｖａｃｃ−１０、Ｖａｃｃ−１２およびＶａｃｃ−１３］）にイオン形態で結合する酢酸塩である。アキラルなグリシンを除く全てのアミノ酸残基はＬ型である。
【０１２６】
本明細書に記載されるペプチドは、三環式アミドリンカー樹脂上で、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ストラテジーを利用してアセンブルした。
【０１２７】
簡潔には、三環式アミドリンカー樹脂を固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）反応器に撹拌器で移す。次に、下記に示される一般的説明に従って、樹脂の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−脱保護により合成を開始し、続いて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いたカップリング手順を行う。この工程に続けて、再び、Ｆｍｏｃ−脱保護の後、配列に応じたアミノ酸誘導体、ペプチドまたはジペプチドのカップリングを行う。最後のカップリング工程は、側鎖を保護したＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨを用いて行う。最後のＦｍｏｃ−脱保護後、デシケータ内で減圧下にペプチド樹脂を乾燥させる。
Ｆｍｏｃ−脱保護手順：
工程１：洗浄；
工程２：Ｆｍｏｃ−脱保護；
工程３〜９：洗浄。
【０１２８】
各工程は、溶媒／試薬の添加、室温での撹拌および濾過からなる。
【０１２９】
ペプチド樹脂は、脱イオン水および１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）（Ｖａｃｃ−１０およびＶａｃｃ−１３）またはトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）（Ｖａｃｃ−１１およびＶａｃｃ−１２）の存在下で、冷ＴＦＡを用いて約２〜３時間、室温にて処理される。樹脂の濾取およびＴＦＡでの洗浄後、ペプチドをジイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）中で沈降させる。次に、ペプチドを濾取し、ＩＰＥで洗浄し、デシケータ内で減圧下に乾燥させる。
【０１３０】
前の段階で得られた物質は、アセトニトリル（ＡＣＮ）グラジエント溶出を用いる逆相カラムでの分取ＨＰＬＣにより精製され、ＴＥＡＰおよび／またはＴＦＡ系を用いてλ＝２２０ナノメートル（ｎｍ）で紫外線（ＵＶ）検出する。Ｖａｃｃ−１０のみＴＦＡ系で精製する。
【０１３１】
Ｖａｃｃ−１３について、ＴＥＡＰおよびＴＦＡ系を用いる前に、分取ＨＰＬＣ精製用のパークロレート系を導入した。原材料として過塩素酸ナトリウムを挙げる。
【０１３２】
Ｖａｃｃ−４ｘ酢酸塩の製造の最終段階は、イオン交換による、第３段階で得られるＴＦＡ塩から酢酸塩への交換である。１回のまたは数回の組み合わせた分取ＨＰＬＣ実行の凍結乾燥材料は、個々のペプチドの性質に応じて種々の濃度の酢酸または精製水に溶解される。溶解したペプチドをイオン交換樹脂（酢酸塩形態）に装填し、５％酢酸（またはＶａｃｃ−１３については２０％精製水）で平衡化させる。５％酢酸（またはＶａｃｃ−１３については精製水）で溶出を行い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により検証し、０．２μｍメンブレンフィルターにより濾過し、凍結乾燥して、白色〜オフホワイトの粉体として最終生成物を得る。
【０１３３】
Ｖａｃｃ−４ｘ製剤はいずれのイオン性賦形剤も含有しないが、ペプチドおよびそれらの対イオン（酢酸塩）が特定の浸透圧の原因である。１０〜１００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲は、技術的試料について得られた結果に基づいて規定した。４つのペプチドに起因する可能な変動性を考慮する。医薬品について、４つのＶａｃｃ−４ｘペプチドの各々を約１ｍｇ用いた。凍結乾燥物を０．３０ｍＬのＷＦＩで再構成する。表１に列挙したペプチドの酢酸含量を考慮すれば、Ｖａｃｃ−４ｘの酢酸含量は、０．３０ｍＬの溶液中約０．４０ｍｇである。理論上の浸透圧は、計算によれば約２３ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、これはＶａｃｃ−４ｘバッチで決定した値（２０〜２３ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）と良好に相関する。
【表１】
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【実施例】
【０１３４】
実施例は、単に本発明を説明する目的のために提供され、限定することは意図されない。当業者は、特許請求の範囲に記載された本発明の概念および範囲から逸脱することなく本明細書に記載されるペプチド、抗原およびワクチンを改変できることが理解されるはずである。
【０１３５】
本発明のポリペプチドは、抗原を形成するための配列番号１、４、９および１５の各群から選択される配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つのペプチドとヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）に対する保護の提供を意図する防止もしくは治療ワクチンの活性成の組合せにおいて用いることができる。ワクチンは、宿主の免疫系（ヒトまたは脊椎動物）の保護または刺激において、例えば、インターロイキン、インターフェロン、顆粒球−マクロファージ増殖因子、造血性増殖因子または類似の免疫調節因子の刺激において有益な効果を有する化合物を含み得る。特定の実施形態において、ワクチン組成物は、アジュバントまたは媒体をさらに含み、その場合、アジュバントまたは媒体は、特定の実施形態において、場合によりミョウバン、フロイントアジュバント（完全もしくは不完全）または水酸化アルミニウムと組み合わされたモノホスホリルリピドＡ［ＭＰＬ（登録商標）］である。アジュバント／媒体の最適量は、選ばれるタイプ（単数または複数）、当業者によって理解される選択に依存する。
本発明のペプチドまたはワクチン製剤は、保存前に凍結乾燥することができる。ワクチンは、好ましくは低温にて、使用可能な状態である１つ以上の投薬単位を含むアンプル中で保存し得る。当業者は、適切な用量が患者の体重、疾患のタイプ、状態の重症度、投与経路および他のいくつかの因子に依存し得ることを理解する。ワクチンは、最大１２回、注射により投与され得、典型的には約６回投与される。注射液の調製において、ペプチドを滅菌水または塩化ナトリウム溶液に、ペプチドあたり１〜３ｍｇ／ｍｌの最終濃度および０〜０．９％塩化ナトリウムで溶解する。典型的には、注射容量は、１００μｌ〜２００μｌ（２×１００μｌ）である。ペプチドは、特定の実施形態において、適切なアジュバントおよび／または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、例えば、ＮｅｕｐｏｇｅｎまたはＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ；ジェネリックの名称、サルグラモスチン）、Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標）＜＜Ｓａｎｄｏｚ／Ｓｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｕｇｈ＞＞とともに同時に投与される。適切な投与は、皮内、皮下、静脈内、経口、筋肉内、鼻内、粘膜または他の任意の適切な経路であり得る。保護を達成および／もしくは維持し、ＨＩＶの症状を緩和、低減もしくは遅延させる、またはＨＩＶの臨床マーカーを改善するために、ブースター投与が必要とされ得る。
【０１３６】
実施例１：ペプチドの生成
ＫＡＬＧＰＧＡＴＬＱＴＰＷＴＡＣＱＧＶＧ−ＮＨ２（配列番号２）の生成
このペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成された。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造をアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認した。
【０１３７】
ＲＡＬＧＰＡＡＴＬＱＴＰＷＴＡＳＬＧＶＧ（配列番号３）の生成
このペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成された。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認した。
分子式：Ｃ８８Ｈ１４４Ｏ２５Ｎ２６
【０１３８】
ＷＩＩＰＧＬＮＰＬＶＧＧＧＫＬＹＳＰＴＳＩＬＣＧ−ＮＨ２（配列番号５）の生成
このペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成された。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認した。
質量分析：理論分子量：２４５４．９
実験的分子量：２４５４．８  ＥＳ＋
【０１３９】
ＲＷＬＬＬＧＬＮＰＬＶＧＧＧＲＬＹＳＰＴＳＩＬＧ（配列番号６）の生成
このペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成された。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認した。
分子量（遊離塩基）：２５５２
分子式：Ｃ１１９Ｈ１９５Ｏ２９Ｎ３３
【０１４０】
ＫＩＬＬＧＬＮＰＬＶＧＧＧＲＬＹＳＰＴＳＩＬＧ（配列番号７）、ＲＬＬＬＧＬＮＰＬＶＧＧＧＲＬＹＳＰＴＴＩＬＧ（配列番号８）およびＮＩＰＩＰＶＧＤＩＹＧＧＧＤＩＹＫＲＷＱＡＬＣＬ（配列番号２１）の生成
これらペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成される。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認する。
【０１４１】
ＲＮＩＰＩＰＶＧＤＩＹＧＧＧＤＩＹＫＲＷＱＡＬＣＬ（配列番号１０）の生成
このペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成された。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認した。
質量分析：理論分子量：２８１７．３
実験的分子量：２８１３．７  ＥＳ＋
【０１４２】
ＲＡＩＰＩＰＡＧＴＬＬＳＧＧＧＲＡＩＹＫＲＷＡＩＬＧ（配列番号１１）の生成
このペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成された。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認した。
分子量（遊離塩基）：２７０７
分子式：Ｃ１２５Ｈ２０８Ｏ２９Ｎ３８
【０１４３】
ＡＬＰＩＰＡＧＦＩＹＧＧＧＲＩＹＫＲＷＱＡＬＧ（配列番号１２）、ＫＩＰＩＰＶＧＦＩＧＧＧＷＩＹＫＲＷＡＩＬＧ（配列番号１３）およびＫＩＰＩＰＶＧＴＬＬＳＧＧＧＲＩＹＫＲＷＡＩＬＧ（配列番号１４）の生成
これらペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成される。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認する。
【０１４４】
ＫＦＩＩＰＮｌＦＳＡＬＧＧＡＩＳＹＤＬＮＴＮｌＬＮＣＩ（配列番号１６）の生成
このペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成された。配列中のＮｌはノルロイシンである。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認した。
質量分析：理論分子量：２７８３．３
実験的分子量：２７８３．３  ＥＳ＋
【０１４５】
ＫＦＩＩＰＮｌＦＳＡＬＳＧＧＧＡＩＳＹＤＬＮＴＦＬＮＣＩＧ（配列番号１７）の生成
このペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成された。配列中のＮｌはノルロイシンである。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認した。
質量分析：理論分子量：２９３２．４
実験的分子量：２９３１．８  ＥＳ＋
【０１４６】
ＲＦＩＩＰＮｌＦＴＡＬＳＧＧＲＲＡＬＬＹＧＡＴＰＹＡＩＧ（配列番号１８）の生成
このペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成された。配列中のＮｌはノルロイシンである。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認した。
分子量（遊離塩基）：２８９４
分子式：Ｃ１３７Ｈ２１７Ｏ３２Ｎ３７
【０１４７】
ＫＩＩＰＮｌＦＳＡＬＧＧＧＲＬＬＹＧＡＴＰＹＡＩＧ（配列番号１９）、ＲＩＩＰＮｌＦＴＡＬＳＧＧＧＲＬＬＹＧＡＴＰＹＡＩＧ（配列番号２０）およびＷＩＩＰＮｌＦＳＡＬＧＧＡＩＳＹＤＬＮＴＮｌＬＮＣＩ（配列番号２２）の生成
これらペプチドは、合成の一般的説明に従い、対応する出発物質からアミド形態で合成される。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、構造はアミノ酸分析および質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）により確認した。
【０１４８】
実施例２
配列番号３、６、１１および１８のペプチドを含むワクチンを調製した（本明細書においてＶａｃｃ−４ｘとも呼ばれる）。凍結乾燥ペプチドを滅菌水に最終濃度４ｍｇ／ｍｌで溶解した。最終塩濃度は０．９％であった。顆粒細胞−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の調製はまた、製造業者の使用指示書に従って、最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌに調製した。この２つの溶液を皮内投与する。典型的な注射用量は１００μｌである。
【０１４９】
実施例３
抗原溶液または懸濁液を等量部の完全または不完全フロイントアジュバントのＢｅｈｒｉｎｇと混合し、次に、注射シリンジに吸引して激しく押出すことによりまたはホモジナイザーを用いて微細乳化する。エマルジョンは、少なくとも３０分間は安定な状態でなければならない。抗原−アジュバントエマルジョンは、最良には、デポーとして皮下注射される。
【０１５０】
実施例４
毒性試験を実施例２におけるワクチンのペプチド組成物についてマウスおよびラットで行った。２番目に一般的に用いられるげっ歯動物種から比較データを提供するための試験についてマウスを選択した。試験物質は４つのペプチドの混合物であり、生理食塩水を用いて再構成する凍結乾燥物質を含む１バイアルとして供給され、用量レベルを総ペプチド量の観点から表した。個々のペプチドは、各ペプチドの用量レベルが０．００７５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０７５ｍｇ／ｋｇ体重および０．７５ｍｇ／ｋｇ体重（意図するヒト用量の最大５００倍である）となるように、１：１：１：１の比（ｗ／ｗ）で存在した。試験動物を各１０匹の動物（雄５匹および雌５匹）の４群に分けた；生理食塩水の対照群、ならびに低用量、中用量および高用量の群。試験組成物は、投与速度３ｍｌ／分で尾静脈内注入により１回投与された。１５日目および１６日目に、ペントバルビトンナトリウムの腹腔内注射により動物を屠殺した。
【０１５１】
これらの試験結果は、マウスおよびラットに投与した用量レベルは有害反応を誘発せず、影響のないレベルは３ｍｇ／ｋｇを超えることを示した。
【０１５２】
実施例５：ＨＩＶ−１により誘導される抗体を検出するイムノアッセイ
磁性粒子試薬を製造業者が推奨するプロトコルに従って調製する。用いられるＤｙｎａｂｅａｄｓはＤｙｎａｌ  ＡＳが製造したものである。リガンドを用いてコーティングされた磁性粒子を試薬１と呼ぶ。本発明によるペプチドは、予め活性化させた磁性粒子表面に共有結合的にカップリングさせる。また、磁性粒子表面にペプチドを物理的に吸収させることが可能である。試薬１の粒子濃度は、１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲内である。粒子サイズは０．２μｍ〜１５μｍの間で変化する。ペプチド濃度は０．０１ｍｇ／ｍｇ粒子〜１ｍｇ／ｍｇ粒子の範囲内である。
【０１５３】
抗ヒトＩｇアルカリホスファターゼ（ＡＰ）接合された抗体試薬をＤａｋｏ  ＡＳの推奨プロトコルに従って調製する。このプロトコルは当技術分野において標準的な手順である。この試薬を試薬２と呼ぶ。
【０１５４】
フェノールフタレイン一リン酸基質溶液をＦｌｕｋａ  ＡＧの推奨プロトコルに従って調製する。このプロトコルは当技術分野で標標準的な手順である。この基質溶液を試薬３と呼ぶ。
【０１５５】
使用される洗浄緩衝液およびインキュベーション緩衝液は、次のさらなる化合物を含む標準的な０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩基緩衝液である；Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０１％〜０．１％）、グリセロール（０．１％〜１０％）および塩化ナトリウム（０．２％〜０．１％）。
【０１５６】
アッセイ手順は、各ウェルにおいて、１滴の試薬１を２滴の洗浄緩衝液と混合するインキュベーション工程を含む。混合後、３０μｌの試料を加え、溶液を５分間インキュベートする。磁性粒子は磁石により捕捉可能であり、液体の除去後に磁石を分離する。次に、ウェルを４滴の洗浄溶液で２回洗浄した後に、試薬２とともにインキュベートする。１滴の試薬２を２滴の洗浄緩衝液に加え、溶液を５分間インキュベートする。磁性粒子は磁石により捕捉可能であり、液体の除去後に磁石を分離する。次に、洗浄工程を繰り返した後、試薬３とともにインキュベートする。２滴の試薬３を各ウェルに加え、溶液を３分間インキュベートする。結果は、白色背景に対して読み取り可能である。陽性結果は赤色（３＋＝強い赤色）であり、一方、陰性結果は、陰性対照において得られる透明な淡黄／褐色の溶液である。
【０１５７】
ＨＩＶウイルスまたはＨＩＶ特異的ペプチドもしくはタンパク質、例えば、本発明のペプチドにより誘導された抗体の検出には、イムノアッセイキットを用いることができる。
【０１５８】
実施例６
Ｖａｃｃ−４ｘ免疫により生じる抗ＨＩＶ  ｐ２４免疫応答は、ＡＲＴと組み合わせて、健常ＣＤ４レベル（＞６００×１０６／Ｌ）に十分に復帰していない患者において免疫再構成を改善し得る。免疫再構成が不完全な対象におけるＶａｃｃ−４ｘの可能性のある利益としては、ｐ２４およびＨＩＶに対する免疫応答における持続的な改善が可能であることを含む。
【０１５９】
可能性のあるリスクとしては、免疫に関連する不快感および不便ならびにＶａｃｃ−４ｘおよびＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（ｒｈｕ−ＧＭ−ＣＳＦ）への曝露に対する既知または未知の副作用リスク（最も一般的には注射部位での局所反応および疲労感を含む）が挙げられる（この可能性は未だ決定されていない）。
【０１６０】
マウスおよびラットにおける非臨床的単回用量研究の結果は、静脈内Ｖａｃｃ−４ｘの用量レベルが有害反応を誘発せず、影響のないレベルが３ｍｇ／ｋｇを超える（安全限界が計画したヒト用量レベルの５００倍を超える）ことを示す。
【０１６１】
ウサギ研究において、Ｖａｃｃ−４ｘの影響は、臨床プログラムで用いたアジュバントであるＧＭ−ＣＳＦの同時存在下で評価された。局所皮内反応、例えば紅斑および浮腫が見出されたが、しかしながら、同様な影響は対照動物において肉眼観察と組織的観察の両方で見出された。これら局所反応は、Ｖａｃｃ−４ｘ処置された動物において僅かに顕著であった。この研究において全身反応はなかった。これらデータは、Ｖａｃｃ−４ｘが、提案される臨床試験に関連するモデルにおいて毒性学的に制限されないことを示す。
【０１６２】
治療ワクチン候補のＶａｃｃ−４ｘは、１回の第Ｉ相臨床試験および３回の第ＩＩ相臨床試験において研究された。第Ｉ相研究には、ＡＲＴを受けている９人の対象を含む１１人のＨＩＶ陽性対象が参加した。（ＡＲＴが開始されている場合）対象はＡＲＴを維持した；全対象に２６週間の期間にわたって０．４ｍｇ／注射の用量で１２回のＶａｃｃ−４ｘ免疫を行った。免疫は、アジュバントとしてｒｈｕ−ＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標）［モルグラモスチム］］の注射後に行われた。全対象が１つ以上の有害事象（ＡＥ）を経験した；９人の対象は処置に関連すると判断された事象を経験した。報告された有害反応の重症度は、１人の対象が重症の局所反応を示したことを除き、軽度または中程度であった。対象は、処置に関連したＡＥまたは毒性反応に起因して脱落しなかった；重症な有害事象（ＳＡＥ）は生じなかった。１人を超える対象において観察された処置に関連した事象には、注射の痛み（７人の対象）、倦怠感−めまい（４人の対象）、インフルエンザ様症状（２人の対象）および注射部位の皮膚刺激（２人の対象）が挙げられた。
【０１６３】
全対象は、遅延型過敏症（ＤＴＨ）皮膚反応により測定される細胞媒介免疫応答を経験した。４５％の対象について、酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を用いるγＩＦＮ放出により測定されるいくらかの細胞媒介免疫応答が報告された；Ｖａｃｃ−４ｘペプチドに対する抗体応答は観察されなかった。
【０１６４】
第ＩＩ相用量決定研究（ＣＴＮ  Ｂ−ＨＩＶ  ２／２００１）には、４０人のＨＩＶ陽性対象が参加し、そのうち３８人が試験を完了した。対象はＡＲＴを維持し、２６週間の期間にわたって、Ｖａｃｃ−４ｘ注射あたり０．４ｍｇ（２０人の対象）または１．２ｍｇ（２０人の対象）の用量で１０回の免疫処置を受けた。Ｖａｃｃ  ４ｘによる免疫は、局所アジュバントとしてのｒｈｕ−ＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標）［モルグラモスチム］］の注射後に行われた。ＡＲＴを第２６週から第３０週まで中断し、対象自身のウイルスへの曝露（自家免疫）を可能とした。ＡＲＴを第３０週から第３８週まで再開し、Ｖａｃｃ  ４ｘペプチドおよび対象自身のウイルスに対する免疫応答を成熟させた。ＡＲＴを第３８週から（この試験を正式に終了した）第５２週まで中断した。２０人の対象（０．４ｍｇ群の８人の対象および１．２ｍｇ群の１２人の対象）において、処置に関連したＡＥが観察された。免疫期間中、ＳＡＥは報告されなかった。１人の対象が、第２６週および第３８週の免疫およびＤＴＨ検査に関連して一過性の血管迷走神経反応を経験した。２人目の対象は、第５２週のＤＴＨ検査に関連して血管迷走神経反応を経験した。検査パラメータ、バイタルサインおよび一般状態について、免疫に帰せられる変化は観察されなかった。ＨＩＶ  ＲＮＡ、ＣＤ４細胞数およびＣＤ８細胞数の変化は、免疫に関連する安全上の懸念がないことを示した。
【０１６５】
全対象について、ＤＴＨ陽性反応として報告された免疫学的応答が観察された。全体として、硬結と紅斑の両方の陽性応答は、低用量（ＬＤ、０．４ｍｇ  Ｖａｃｃ−４ｘ）群と比較して、高用量（ＨＤ、１．２ｍｇ  Ｖａｃｃ−４ｘ）群において統計学的に有意に高かった。ＤＴＨ反応の用量依存的な差は本研究を通して維持された。Ｔ細胞増殖は、第１２週後に安定したようであり、ＤＴＨの結果と一致して、ＨＤが有利であることが実証された。ＡＲＴを第３８週で中断し、ＣＤ４数が２００／μＬ未満に低下したときまたはＡＩＤＳもしくはＨＩＶに関連する事象が観察されたとき（すなわち臨床実務）に再開する計画とした。Ｖａｃｃ−４ｘに対するＤＴＨ応答（第３８週に決定された高応答対低応答）は、本研究の終了時（第５２週）のウイルス量の減少および対応するＣＤ４数の改善に関連付けられた。
【０１６６】
免疫期間中、ＣＤ４数は、安定であるかまたは増加した。ＡＲＴの中断は、ＣＤ４数の減少をもたらした。しかしながら、最後のＡＲＴ中断の１４週間後（第５２週）には、平均ＣＤ４数は、依然として２００×１０６細胞／Ｌを上回っていた。ＬＤ群とＨＤ群の間に差は観察されなかった。過半数の対象は、本研究の完了（第５２週）後もＡＲＴが中断された状態であった；ＡＲＴの再開まで対象を追跡する許可を得た。治療中断の期間は、ペプチドに対する免疫応答性に関係した。対象をオランダにおいてＶａｃｃ−４ｘの投与なしで治療が停止された類似した対象と比較した場合、Ｖａｃｃ−４ｘ対象でＣＤ４細胞の緩徐であるが有意な減少が見出された。Ｖａｃｃ−４ｘ第ＩＩ相臨床研究に参加した全対象について達成された中央値の治療中断は３１カ月であった。
【０１６７】
ＣＴＮ  ＢＩ  Ｖａｃｃ−４ｘ／２００９／１は、ＣＴＮ  Ｂ−ＨＩＶ−２／２００１の非盲検フォローアップ研究であり、Ｖａｃｃ−４ｘを用いる再ブースター免疫がＣＴＮ  Ｂ−ＨＩＶ−２／２００１研究で行われた免疫期間中に得られた免疫応答を再活性化または増強することができるかどうかを決定するための試験であった。副次的な目的は、ＤＴＨの評価およびＤＴＨ応答と初期研究におけるＤＴＨとの比較により、Ｖａｃｃ−４ｘのインビボ（in vivo）免疫原性を評価すること；ＣＤ４数、ＣＤ８数およびＨＩＶウイルスＲＮＡにおけるＶａｃｃ−４ｘの影響を評価すること；ならびに、Ｖａｃｃ−４ｘの安全性および忍容性を評価することであった。この研究に参加した２６人の対象の全員が２回のＶａｃｃ−４ｘブースター投与を受けた。
【０１６８】
合計７４のＡＥが２３人の対象によって報告された。ほとんどの有害事象（ｎ＝６０）は、研究処置に多分／おそらくは関連していると判定された。関連する有害事象の大部分（９８％）は軽度であった。研究処置に関連する２つの有害事象、一方は頭痛、一方は注射部位の硬結が中程度と判定された。痒み（注射部位の掻痒感）は、本研究処置に関連して最も頻繁に報告された有害事象であった。１９人の患者（７３％）がこの有害事象を少なくとも１回報告した。これらのうち１０人の患者が、両方の免疫に関連する痒みを報告し、一方、他の９人の患者については１回だけ報告があった。５人の患者は免疫に関連する膨潤を報告した。これらの患者うち３人については、２回の免疫後とも膨潤を報告した。本研究中に死亡した患者はいなかった。重篤な有害事象を報告した患者はおらず、臨床的に関連する変化も記録されなかった。
【０１６９】
この研究により、Ｖａｃｃ−４ｘペプチドが最大７年間持続するＴ細胞応答を誘導することが実証された。再ブースター免疫により、殺傷マーカーを増加させることが可能であった。このことから、Ｔ細胞のＨＩＶ感染細胞を殺傷する能力が増大したことが再び示される。再ブースター免疫の前に、全患者が、主たる研究においてＡＲＴを停止する前のレベルと類似するＣＤ４、ＣＤ８およびウイルス量のレベルに復帰していた。再ブースター免疫は、患者のＣＤ４、ＣＤ８およびウイルス量において負の作用を示さなかった。これら患者の再ブースター免疫の結果として安全上の懸念は報告されなかった。
【０１７０】
第ＩＩ相研究ＣＴ−ＢＩ  Ｖａｃｃ−４ｘ  ２００７／１（ＥｕｄｒａＣＴ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２００７−００６３０２−１３）は、米国および欧州（英国、ドイツ、スペインおよびイタリア）で行われた。本研究は、ＡＲＴに対する妥当な応答を維持したＨＩＶ−１に感染した患者におけるＶａｃｃ−４ｘ対プラセボの多施設無作為化二重盲検での免疫原性研究であった。主目的は、ＣＤ４数、Ｔ細胞機能（ＥＬＩＳＰＯＴ、Ｔ細胞増殖応答および細胞内サイトカイン染色）およびＡＲＴ中断の応答におけるＶａｃｃ−４ｘ免疫対プラセボの影響の評価であった。ＣＤ４数の減少またはウイルス量増加に起因する、第２８週のＡＲＴ中断と第５２週の研究終了の間でＡＲＴを再開する必要性を主要な効力指標の１つとしてモニターした。
【０１７１】
ＩＴＴ分析集団において、Ｖａｃｃ−４ｘは、プラセボとの比較において、第２８週のＡＲＴ休止後にＡＲＴ再開が必要となった対象の割合を減少させないと結論付けられた。プラセボとの比較で、第２８週とＡＲＴ再開前の最後のＣＤ４評価時の間でＣＤ４数のパーセンテージ変化に対する影響はなかった。ＡＲＴの再開時は、Ｖａｃｃ−４ｘおよびプラセボ処置対象において同様であった。
【０１７２】
ＡＲＴ休止後のウイルス量は対象間で異なり、Ｖａｃｃ−４ｘ免疫がプラセボを上回る好都合な効果を明らかにした。データに、ＡＲＴを受けていたかまたは受けていなかったかにかかわらず、全ての評価可能な対象を含ませた場合、第４週〜第５２週にわたるウイルス量の反復測定ＡＮＯＶＡに有意差はなかった。第５２週までＡＲＴを休止した状態の対象のサブグループにおいて、平均ウイルス量は、Ｖａｃｃ−４ｘ処置対象においてプラセボ群より低かった。事後分析は、第５２週（最終観察値補完法：Ｌａｓｔ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｃａｒｒｉｅｄ  Ｆｏｒｗａｒｄ［ＬＯＣＦ］）のウイルス量は、Ｖａｃｃ−４ｘ群においてプラセボ群より統計学的に有意に低いことを示した。
【０１７３】
第２８週から第５２週までのＨＩＶ−１  ＲＮＡ変化の分析から、群間にＶａｃｃ−４ｘに有利な統計学的有意差が明らかになった。第５２週でＡＲＴを休止した状態の対象のＡＵＣは、Ｖａｃｃ−４ｘ群においてプラセボ群より低かった。事後分析は、このＡＵＣの差が統計学的に有意であることを示した。
【０１７４】
本研究中に安全上の懸念は生じなかった。本研究は、Ｄａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）の監督を受けた。
【０１７５】
実施例７
増殖、多機能性、ＩＬ−２分泌およびＩＦＮ−γ産生の増加に関するＩＭｉＤを伴うペプチドの試験
【０１７６】
本発明に従って用いられるペプチドと予めインキュベートした樹状細胞を用いた刺激による多機能性ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の拡大は、Keersmaeckerら(J. Virol., 2012 86:9351-9360)によって記載された方法およびそこで参照された方法により調べることができ、ＨＩＶタンパク質ＧａｇまたはＮｅｆは、本発明に従って用いられるペプチドとのインキュベーション後、共培養でＴ細胞を刺激するために用いられる。
【０１７７】
Keersmaeckerらは、ＧａｇまたはＮｅｆ特異的ペプチドを提示する樹状細胞を用いたＴ細胞のインビトロ（in vitro）刺激中のＩＭｉＤ［レナリドミド（ＩＭｉＤ３；ＣＣ−５０１３）およびポマリドミド（ＩＭｉＤ１；ＣＣ−４０４７）］の存在が多数のＴ細胞機能改善をもたらすことを見出した。とりわけ、抗原刺激後の、溶菌能が増大し、より多くのＧａｇ抗原エピトープを認識し、より低い抗原ペプチド濃度で多機能性ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加を伴うＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の減少、ＣＤ８  Ｔ細胞によるＩＬ−２産生の増大、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞による検出可能なＩＦＮ−γ産生であった。“Expansion of Polyfunctional HIV-Specific T Cells upon Stimulation with mRNA Electroporated Dendritic Cells in the Presence of Immunomodulatory Drugs” Brenda De Keersmaecker, Sabine D. Allard, Patrick Lacor, Rik Schots, Kris ThielemansおよびJoeri L. Aerts, J. Virol. September 2012 86:9351-9360；印刷に先立って2012年6月20日に公開(doi:10.1128/JVI.00472-12)を参照されたい。
【０１７８】
実施例８
レナリドミドおよびＨＤＡＣ阻害剤の組合せによる４つのペプチドを含むペプチド組成物の試験のために示唆される臨床研究プロトコル
【０１７９】
下記：
１）ペプチド組成物ならびにアジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦおよびレナリドミド（ＣＣ−５０１３）、
２）ペプチド組成物ならびにアジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦおよびレナリドミド（ＣＣ−５０１３）のプラセボ、または
３）プラセボ
のいずれかによる、第１週、第２週、第３週および第４週での免疫ならびに第１２週および第１３週でのブースター免疫（４回の初回免疫および２回のブースター免疫）。ペプチド組成物：０．６、０．９、１．２および１．５ｍｇ（等モル量の各ペプチド）；ならびにレナリドミド：５、１０および２５ｍｇ。
【０１８０】
レナリドミド（ＣＣ−５０１３）アームに無作為化された対象に、ペプチド組成物による免疫前の２日間、毎日および各免疫当日にレナリドミド（ＣＣ−５０１３）の単回経口投与をする。
【０１８１】
この臨床試験設定に従って用いられるペプチド組成物は、配列番号３、配列番号６、配列番号１１および配列番号１８からなる。
【０１８２】
第２０週で、全ての研究アームの対象にバックグラウンドＡＲＴを続けながら、８週間の間（第２８週まで）、一週間おきに１、３および５日目に（すなわち、週に３回）、２０ｍｇのパノビノスタット（ＬＢＨ５８９）の経口投与をする。その後、２４週間のフォローアップ期間（第５２週まで）を設ける。研究完了の際に、ＡＲＴを中断してウイルス制御における研究処置の効果を評価するさらなる観察試験への参加を対象に勧めてもよい。この部分の研究への参加は任意であり、潜伏ＨＩＶ−１リザーバーにおける研究処置の効果によって決定される（最大治療中断期間：１６週）。まとめると
研究アーム１：ペプチド組成物＋ＩＭｉＤ＋ＨＤＡＣ（パノビノスタット）
研究アーム２：ペプチド組成物＋ＨＤＡＣ（パノビノスタット）
研究アーム３：ＨＤＡＣ（パノビノスタット）
【０１８３】
本発明による組合せ治療の結果としてのウイルスリザーバーの涸渇は、例えば、Lehrmanら（The Lancet (366), 2005, pp. 549-555）およびそこで参照された文献に記載される手順に従って定量し得る。簡潔には、これは、治療前、治療中および治療後に得られた患者血液の試料において、刺激された潜伏感染細胞からのｐ２４発現、血漿ＨＩＶ  ＲＮＡ濃度（ウイルス量）およびリアルタイムＰＣＲ分析による組み込まれたＨＩＶ  ＤＮＡを測定することを含む。
【０１８４】
実施例９：ＤＣ／Ｔ細胞増殖アッセイ
樹状細胞（ＤＣ）は、健常血液ドナーのバフィコート調製物から単離された単球から作製された。簡潔には、末梢血単核細胞を密度勾配遠心分離により分離し、次に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造業者の指示書に従って用いて、単球を陰性選択により単離した。Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｅｒｌａｎｄ）においてＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ，Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ；Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）とともに単球を５〜６日間培養して未成熟ＤＣを生じさせた。サイトカインを２〜３日毎に補充した。ＩＦＮ−γ（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−α（３０００ＩＵ／ｍｌ）を用いて２４時間、細胞を成熟させた。成熟後、１０μｇ／ｍｌのペプチドを用いて２時間３７℃にてＤＣをパルスし、次に、徹底的に洗浄し、蛍光色素（ＶＰＤ４５０，ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｍ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で標識した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共培養した。種々のＤＣ：Ｔ細胞比を適切な対照とともに試験した。共培養開始時に、ＩＭｉＤを含むかまたは含まないウェルにＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（５０ｎｇ／ｍＬ）（ともにＩｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）を添加した。６〜１０日目に、フローサイトメトリーによりＴ細胞増殖レベルを分析した。共培養ウェルの上清をＬｕｍｉｎｅｘ技術を用いて調べ、サプレッサー活性を確かめた。
【０１８５】
実施例１０：細胞浸透アッセイ
下記実施例において使用される本発明によるペプチドは、Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎが、Sheppard, (1978) J.Chem.Soc., Chem. Commun., 539のＦｍｏｃ−ストラテジーを用いて、Ｃ末端アミドとして合成した。
【０１８６】
ビオチン化ペプチドの細胞内染色
９６ウェルＵ底ポリスチレンプレート（ＮＵＮＣ、カタログ番号：１６３３２０）をヒトＰＢＭＣの染色に用いた。簡潔には、８μｌのＮ末端またはＣ末端ビオチン化した本発明によるペプチド（すなわち、各ペプチドについて５ｍＭ、２．５ｍＭおよび１．２５ｍＭを試験）を、血液ドナーからの４０μｌのＰＢＭＣ（１２．５×１０６細胞／ｍｌ）とともに３７℃にて２時間インキュベートした。次に、１５０μｌのＣｅｌｌｗａｓｈ（ＢＤ、カタログ番号：３４９５２４）で細胞を３回洗浄し、続いて、１００μｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｔ４４２４）で各細胞ペレットを再懸濁し、その後、３７℃にて５分間インキュベートした。次に、トリプシン処理された細胞を１５０μｌのＣｅｌｌｗａｓｈ（ＢＤ，カタログ番号：３４９５２４）を用いて３回洗浄し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）プラス（ＢＤ，カタログ番号：５５４７１５）で再懸濁し、続いて、製造業者の指示に従って４℃にて２０分間インキュベートした。次に、細胞を１５０μｌのＰｅｒｍＷａｓｈ（ＢＤ，カタログ番号：５５４７１５）で２回洗浄した。次に、ビオチン化ペプチドおよび樹状細胞を可視化するため、細胞を、それぞれストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＢＤ，カタログ番号：５５４０６７）および抗ｈＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号：１２−０１１６）を製造業者の指示に従って用いて４℃にて３０分間染色した。次に、細胞を１５０μｌのＰｅｒｍＷａｓｈで３回洗浄し、続いて染色緩衝液（ＢＤ，カタログ番号：５５４６５６）に再懸濁した後、フローサイトメトリーを行った。樹状細胞は、リンパ球領域外のＣＤ１１ｃ＋事象（すなわち、リンパ球より高いＦＳＣおよびＳＳＣシグナル）としてゲートを通過させた。ＨＴＳローダーを備えるＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで計２０００００細胞を取得し、全細胞と樹状細胞の両方について、ペプチド−蛍光に関するヒストグラムを作成した（すなわちＧｅｏＭｅａｎ）。
【０１８７】
ビオチン化ペプチドの細胞外染色
９６ウェルＵ底ポリスチレンプレート（ＮＵＮＣ，カタログ番号：１６３３２０）をヒトＰＢＭＣの染色に用いた。簡潔には、８μｌのＮ末端またはＣ末端ビオチン化した、本発明によるペプチド（すなわち、各ペプチドについて５ｍＭ、２．５ｍＭおよび１．２５ｍＭを試験；全ペプチドを供給業者が固相合成により製造した）を、血液ドナーからの４０μｌのＰＢＭＣ（１２．５×１０６細胞／ｍｌ）とともに３７℃にて２時間インキュベートした。次に、１５０μｌのＣｅｌｌｗａｓｈ（ＢＤ，カタログ番号：３４９５２４）を用いて細胞を３回洗浄した後、ビオチン化ペプチドおよび樹状細胞を可視化するため、細胞を、それぞれストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＢＤ，カタログ番号：５５４０６７）および抗ｈＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号：１２−０１１６）を製造業者の指示に従って用いて４℃にて３０分間染色した。次に、細胞を１５０μｌのＣｅｌｌｗａｓｈ（ＢＤ，カタログ番号：３４９５２４）を用いて３回洗浄し、続いて染色緩衝液（ＢＤ，カタログ番号：５５４６５６）に再懸濁した後、フローサイトメトリーを行った。樹状細胞は、リンパ球領域外のＣＤ１１ｃ＋事象（すなわち、リンパ球より高いＦＳＣおよびＳＳＣシグナル）としてゲートを通過させた。ＨＴＳローダーを備えるＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで計２０００００細胞を取得し、全細胞と樹状細胞の両方について、ペプチド−蛍光に関するヒストグラムを作成した（すなわちＧｅｏＭｅａｎ）。
【０１８８】
本発明によるＣＭＩペプチドは、天然型対応物と比べ、細胞に進入する能力が改善していることが明確に見られた。
【０１８９】
データは、製造業者の指示書に従って、ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡ（ＢＤ）ソフトウェアにより算出される、各試験ペプチドのｇｅｏｍ．ｍｅａｎ値である。
【０１９０】
実施例１１：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってアッセイした陽性ＣＴＬ応答
陽性ＣＴＬ応答は、代替的に、ヒトＩＦＮ−ガンマ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）についてＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりアッセイされてもよい。簡潔には、１日目に、単球を付着させるために、ＨＣＶ患者由来のＰＢＭＣ試料をフラスコにおいて（４３０  ０００  ＰＢＭＣ／ｃｍ２）、被覆量の培養培地［Ｌ−グルタミン（ＭｅｄＰｒｏｂｅ  カタログ番号１３Ｅ１７−６０５Ｅ）、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号Ａ１５−１０１）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号Ｐ１１−０１０）を補足したＲＰＭＩ  １６４０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号ＰＡＡＥ１５−０３９）］中に２時間、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。非接着細胞を単離し、洗浄し、さらなる使用までＦＢＳ中１０％Ｖ／Ｖ  ＤＭＳＯで凍結させた。接着細胞を培養培地を用いて注意深く洗浄し、続いて、３日目まで、最終濃度２  ｇ／ｍｌのｈｒＧＭ−ＣＳＦ（Ｘｉａｍｅｎ  ａｍｏｙｔｏｐ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ｃｏ．，カタログ番号：３００４．９０９０．９０）および１  ｇ／ｍｌのｈｒＩＬ−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号：ＰＨＣ００４３）および適宜、免疫調節剤（ＩＭｉＤ）を含む培養培地中で３７℃にてインキュベートした。次に、この手順を６日目に繰り返した。７日目に、０．５  ｇ／ウェルの抗ヒトインターフェロンをコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＨＴＳ）に、培養樹状細胞（５０００〜１００００／ウェル）を、融解した自家非接着細胞（２０００００／ウェル）、抗原試料［ペプチド抗原の最終濃度１〜８μｇ／ｍｌ；コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｃ７２７５）またはＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｌ２７６９）の最終濃度５μｇ／ｍｌ］、抗アネルギー抗体［抗ＰＤ−１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号：１６−９９８９−８２）と抗ＰＤ−Ｌ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号：１６−５９８３−８２）の両方の最終濃度０．０３〜０．０５μｇ／ｍｌ］とともに添加した。プレートを一晩インキュベートし、製造業者の指示に従ってスポットを発色させた。ＥＬＩＳＰＯＴリーダー［ＣＴＬ−ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ５  ＵＶアナライザー］上でスポットを読み取った。
【０１９１】
実施例１２：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
１日目に、血液ドナー由来のＰＢＭＣ試料を融解し、温培地で洗浄し、融解後の細胞を回復させるため、フラスコにおいて（２５００００ＰＢＭＣ／ｃｍ２）、被覆量の培養培地［ウルトラ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ，ＢＥ１２−７０２Ｆ７０１）；１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号Ａ１５−１０１）；ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号Ｐ１１−０１０）を含むＲＰＭＩ  １６４０］中で２４時間、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。２日目に、細胞を、９６ウェル平底Ｆａｌｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ組織培養プレートに、容量２００μｌの全培地中５０００００細胞／ウェルで添加した。並列するウェルに、示した刺激および適宜、免疫調節剤（ＩＭｉＤ）を２重に加え、または対照として培地のままで６日間３７℃にて５％ＣＯ２で放置した。６日間のインキュベーション後、１００μｌの細胞懸濁液を、１μｇ／ｍｌの天然型インフルエンザＭ２ｅタンパク質をコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＨＴＳ）に移した。２４時間のインキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回、ＰＢＳで５回洗浄した（２００μｌ／ウェル）。マウス抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭビオチン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ９０４０−０８および９０２０−０８）を０．５％ＦＢＳを含むＰＢＳに希釈し、９０分間３７℃にてインキュベートした。洗浄を上記のとおり繰り返した後、８０μｌのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ２８９）を各ウェルに添加し、暗所で室温にて６０分間インキュベートした。次に、ウェルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回、ＰＢＳで４回洗浄した後（２００μｌ／ウェル）、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ  ＩＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ，ＳＫ−５３００）の基質を添加し、７分間室温で発色させた。反応を流水で停止させ、プレートを乾燥させ、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー［ＣＴＬ−ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ５  ＵＶ  Ａｎａｌｙｚｅｒ］によりスポットを数えた。
【０１９２】
ＥＬＩＳＡ：抗原（１００μｌ）［８μｇ／ｍｌを、冷コーティング緩衝液（０．０５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３  ｐＨ９．６）（ＣＢと呼ぶ）中で１〜３日間予めインキュベートした］またはＣＢ単独（バックグラウンド対照）を示されたように用いて、マイクロタイタープレートのウェルを４℃でコーティングした。マイクロタイタープレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋１％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００；ＷＢと呼ぶ）で３回洗浄し、続いて２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ｗ／ｖ  ＢＳＡ）で２時間室温（ＲＴ）にてブロックした。次に、プレートをＷＢで３回洗浄し、続いて、添加した５０〜７０μｌ／ウェルのヒト（またはウサギもしくはヒツジ）血清［希釈緩衝液（ＰＢＳ＋１％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００＋１％ｗ／ｖ  ＢＳＡ；ＤＢと呼ぶ）中、１：５〜１：２５０の系列希釈物］と３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートをＷＢで６回洗浄し、続いて７０μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ接合プロテインＧ（ＤＢ中３μｇ／ｍｌ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ５３９３０５）またはヤギ抗マウスＩｇＧビオチン（１μｇ／ｍｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１０３０−０８）とともにＲＴで１時間インキュベートした。ヤギ抗マウスＩｇＧビオチンの場合、プレートを余分の一工程で上記のとおり洗浄した後、１００μｌのストレプトアビジン−アルカリ−ホスファターゼ（１μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ２８９）を添加し、１時間ＲＴでインキュベートした。次に、プレートをＷＢで６回洗浄し、続いて、１００μｌ／ウェルの０．３％ｗ／ｖフェノールフタレイン一リン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−５７５８）とともに室温で１０〜６０分間インキュベートした。最後に、プレートを１００μｌ／ウェルのクエンチ溶液（０．１Ｍ  ＴＲＩＳ＋０．１Ｍ  ＥＤＴＡ＋０．５Ｍ  ＮａＯＨ＋０．０１％ｗ／ｖ  ＮａＮ３；ｐＨ１４）の添加によりクエンチし、続いて、ＥＬＩＳＡリーダー（ＡＳＹＳ  ＵＶＭ  ３４０）で５５０ｎｍにて測定した。次に、血清の強度、すなわち液性免疫応答の大きさを、記載の光学密度（ＯＤ）値を生じる血清希釈率または示した血清希釈率でのＯＤ値として記録する。
【０１９３】
実施例１３：臨床試験プロトコル−ｃＡＲＴにおいてウイルス学的に抑制されたＨＩＶ−１感染成人のウイルスリザーバーにおける、Ｖａｃｃ−４ｘ＋ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦを用いるＨＩＶ−１治療免疫およびロミデプシンを用いるＨＩＶ−１再活性化の影響を評価する第Ｉ／ＩＩａ相研究
主目的は、ｃＡＲＴにおいてウイルス学的に抑制されたＨＩＶ感染患者のＨＩＶ−１潜伏リザーバーにおけるＶａｃｃ−４ｘ＋ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦを用いた治療および環状ロミデプシン治療の影響を測定することである。
一次評価項目：
１）有害事象（ＡＥ）、有害反応（ＡＲ）、重篤な有害事象（ＳＡＥ）、重篤な有害反応（ＳＡＲ）、重篤な予想外の有害反応（ＳＵＳＡＲ）により評価される安全性および忍容性の評価
２）下記によりＣＤ４＋Ｔ細胞において測定される潜伏リザーバーサイズ：
ａ）ＨＩＶ−１ウイルス増殖アッセイ［１０６の静止メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞中のＨＩＶ−１  ＲＮＡ（ＲＵＰＭ）］
ｂ）組み込まれたＨＩＶ−１  ＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）
ｃ）総ＨＩＶ−１  ＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）
二次評価項目  パートＢ
１）ｃＡＲＴ再開までの時間
２）ｃＡＲＴ休止中にウイルス血漿が検出されるまでの時間
３）細胞結合した非スプライスＨＩＶ−１  ＲＮＡとして測定されるＨＩＶ転写（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）
４）ＥＬＩＳｐｏｔ、増殖および／または細胞内サイトカイン染色により測定されるＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答
５）血漿ＨＩＶ−１ウイルス量
６）リンパ球において測定されるヒストンＨ３アセチル化
７）Ｔ細胞数および表現型
８）ＥＬＩＳＡによって測定されるＶａｃｃ−４ｘペプチドおよびｐ２４に対する抗体力価。
【０１９４】
ｃＡＲＴにおいてウイルス学的に抑制されたＨＩＶ−１感染成人のウイルスリザーバーにおけるＶａｃｃ−４ｘ＋ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦを用いたＨＩＶ−１治療免疫およびロミデプシンを用いたＨＩＶ−１再活性化の影響を評価する第Ｉ／ＩＩａ相オープン研究。本研究は、Ｖａｃｃ−４ｘ＋ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦの、ロミデプシンに対するアジュバント療法としての安全性／忍容性を評価するため、ならびに潜伏ＨＩＶリザーバーにおける影響、および分析的治療中断中にウイルス量を抑制する能力を査定するために行われる（ｎ＝２０、すなわち２０人の患者）。標的集団：ｃＡＲＴにおいて現時点でウイルス学的に抑制されたＨＩＶ−１感染成人（ｐＶＬ＜５０コピー／ｍＬ）。
研究手順／頻度：
１．潜伏ＨＩＶ−１リザーバーの安定性を確認し、ベースラインのＨＩＶ−１  Ｔリンパ球特異的免疫を決定する４週間の前治療相（通院１〜通院２）。
２．通院２、３、４、５、６および７にＶａｃｃ−４ｘをｒｈｕＧＭ−ＣＳＦとともに投与する１２週間のＨＩＶ−１治療免疫相（通院２〜通院７）、続く２週間のフォローアップ期（通院８〜通院９）。
３．１サイクルのロミデプシン注入（用量５ｍｇ／ｍ２）からなる３週間のウイルス再活性化相（通院１０〜通院１２）。
４．潜伏ＨＩＶ−１リザーバーサイズにおける試験対象処置の効果を査定する約８週間の治療後観察相（通院１３〜通院１４）。
５．１６週間の分析的治療中断相（通院１５〜３４）。
【０１９５】
試験対象医薬品：
Ｖａｃｃ−４ｘ：１．２ｍｇを０、７、１４、２１、７７および８４日目（通院２、３、４、５、６および７）に皮内投与する、ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ：Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ）０．０６ｍｇを０、７、１４、２１、７７および８４日目（通院２、３、４、５、６および７）に、Ｖａｃｃ−４ｘ投与の１０分前に皮内投与する、
ロミデプシン：Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ）５ｍｇ／ｍ２を、連続３週間（１０５、１１２および１１９日目）（通院１０、１１ｂおよび１２）に３回の静脈内注入により投与する（２８日間の１サイクルに対応する）。
【０１９６】
試験計画：
１．潜伏ＨＩＶ−１リザーバーの安定性を確認し、ベースラインのＨＩＶ−１  Ｔリンパ球特異的免疫を決定する４週間の前治療相（通院１〜通院２）。
２．通院２、３、４、５、６および７にＶａｃｃ−４ｘをｒｈｕＧＭ−ＣＳＦとともに投与する１２週間のＨＩＶ−１治療免疫相（通院２〜通院７）、続く２週間のフォローアップ期（通院８〜通院９）。
３．１サイクルのロミデプシン注入（用量５ｍｇ／ｍ２）からなる３週間のウイルス再活性化相（通院１０〜通院１２）。
４．潜伏ＨＩＶ−１リザーバーサイズにおけるロミデプシンの効果を査定する約８週間の治療後観察相（通院１３〜通院１４）。
５．１６週間の分析的治療中断相（通院１５〜３４）。
【０１９７】
処置
Ｖａｃｃ−４ｘ
Ｖａｃｃ−４ｘは、４つの合成ペプチド（Ｖａｃｃ−１０酢酸塩、Ｖａｃｃ−１１酢酸塩、Ｖａｃｃ−１２酢酸塩およびＶａｃｃ−１３酢酸塩）からなり、各々は、それぞれ残基１６６〜１８５、残基２５２〜２６９、残基２６４〜２８４および残基３３５〜３５４を有する天然型Ｇａｇ領域を表す、ＨＩＶ−１  ｐ２４キャプシドタンパク質の保存ドメインに対応する。
【０１９８】
Ｖａｃｃ−４ｘは、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って製造され、凍結乾燥した白色粉体の滅菌バイアルとして供給される。本品には追加成分は存在しない。
【０１９９】
ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ［サルグラモスチム、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ］
Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）は、Ｓａｎｏｆｉが製造し、Ｇｅｎｚｙｍｅが供給する。それは、分子量１９，５００、１６，８００および１５，５００ダルトンの３つの主要な分子種によって特徴付けられる１２７アミノ酸の糖タンパク質である。液体Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）製剤は、バイアルに滅菌保存状態（１．１％ベンジルアルコール）の注射用溶液（５００ｍｃｇ／ｍＬ）として製剤化されている。凍結乾燥したＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）は、１ｍＬの滅菌注射水（ＵＳＰ）または１ｍＬの静菌注射水（ＵＳＰ）による再構成を必要とする、保存剤不含の滅菌白色粉体（２５０ｍｃｇ）である。液体のＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）は、ｐＨ範囲が６．７〜７．７であり、凍結乾燥したＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）のｐＨ範囲は７．１〜７．７である。
【０２００】
さらなる情報については、ＩＢ［Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）を規定する情報］を参照されたい。
【０２０１】
ロミデプシン［Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）、Ｃｅｌｇｅｎｅ］
【０２０２】
Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）は、Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た。このヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤は、二環式デプシペプチドである。室温では、ロミデプシンは白色粉体であり、化学的には、（１Ｓ，４Ｓ，７Ｚ，１０Ｓ，１６Ｅ，２１Ｒ）−７−エチリデン−４，２１−ビス（１−メチルエチル）−２−オキサ−１２，１３−ジチア−５，８，２０，２３−テトラアザビシクロ［８．７．６］トリコス−１６−エン−３，６，９，１９，２２−ペントンとして記載される。実験式はＣ２４Ｈ３６Ｎ４Ｏ６Ｓ２である。Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）は、２つのバイアルを含むキットとして供給される。注射用Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）（ロミデプシン）は、滅菌凍結乾燥した白色粉体であり、１０ｍｇのロミデプシンおよび２０ｍｇのポビドン（ＵＳＰ）を含む単回使用バイアルで供給される。Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）の希釈剤は滅菌透明溶液であり、２ｍＬ送達容量を含む単回使用バイアルにおいて供給される。Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）用希釈剤は、８０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコール（ＵＳＰ）および２０％（ｖ／ｖ）脱水アルコール（ＵＳＰ）を含む。
【０２０３】
さらなる情報については、ロミデプシンのＩＢを参照されたい。
【０２０４】
Ｖａｃｃ−４ｘ
Ｖａｃｃ−４ｘの各用量（１２ｍｇ／ｍＬ溶液の０．１ｍＬ）を、アジュバントとしてのｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）］の皮内投与後に、皮内注射により投与する。ＨＩＶ−１治療ワクチン接種相で計６回のＶａｃｃ−４ｘ／ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ免疫を計画する（通院３、４、５、６、７および８）。
【０２０５】
Ｖａｃｃ−４ｘの各投与の約１０分前に、ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦをアジュバントとして皮内投与した。Ｖａｃｃ−４ｘは、この研究の過程中、同じ腕の三角筋表層でｒｈｕＧＭ−ＣＳＦと同じ部位に皮内投与された。
【０２０６】
皮内注射を投与する場合、皮下に注射することのないように最大限の注意を払われた。正確に注射できた場合には、皮膚穿刺後に少量を注射することにより小さな水疱が出現するはずである。表面に近すぎる注射は、注射中または抜針後に注射部位から試料漏れを生じるため、回避しなければならない。
【０２０７】
ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ
ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦの各用量（０．６０ｍｇ／ｍＬ溶液の０．１ｍＬ）を、ＨＩＶ−１治療ワクチン接種相の間、アジュバントとして、皮内投与によるＶａｃｃ−４ｘ免疫の１０分前に皮内注射により投与した（通院３、４、５、６、７および８）。ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦは、この研究の過程中、同じ腕の三角筋表層でＶａｃｃ−４ｘと同じ部位に皮内投与された。
【０２０８】
皮内注射を投与する場合、皮下に注射することのないように最大限の注意を払われた。正確に注射できた場合には、皮膚穿刺後に少量を注射することにより小さな水疱が出現するはずである。表面に近すぎる注射は、注射中または抜針後に注射部位から試料漏れを生じるため、回避しなければならない。
【０２０９】
ロミデプシン
用量は５ｍｇ／ｍ２であり、２８日サイクルの１、８および１５日目（通院１０、１１および１２）に４時間にわたって静脈内投与された。
【０２１０】
試験評価：
臨床検査評価
生化学的検査：
ルーチンの生化学的検査には、血液学的パラメータ（ヘモグロビン、白血球数の総数および変化量、血小板数）、ＡＬＡＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、リン、マグネシウム、カルシウム、尿素、アルブミンおよびＣＲＰが含まれる。
【０２１１】
ＨＩＶウイルス学：
ＨＩＶ−１ウイルス増殖［１０６の静止メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのＨＩＶ−１  ＲＮＡ（ＲＵＰＭ）］：潜伏しているが複製コンピテントなウイルスを保有する静止ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を測定するために用いられる代表的な標準アッセイは、患者から高度精製した静止ＣＤ４＋Ｔ細胞とＨＩＶ陰性ドナー由来のＰＢＭＣとの共培養に基づき、百万細胞あたりの感染単位（ＩＵＰＭ）として測定される［Finzi 1999, Chun 2007］。
【０２１２】
組み込まれたＨＩＶ−１  ＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）：感染細胞内で、ＨＩＶ  ＤＮＡは、直鎖状の非組込み形態、環状形態および組込みプロウイルスとして存在することができる。有効なｃＡＲＴを受けている患者において、ＨＩＶ  ＤＮＡの多くは静止状態の潜伏感染ＣＤ４＋Ｔ細胞に組み込まれる。組み込まれたウイルスを含む細胞の数を定量するために最も広く用いられている技術は、Ａｌｕ−ＬＴＲ  ＰＣＲアッセイ［Sonza 1996］である。
【０２１３】
総ＨＩＶ−１  ＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）：総ＨＩＶ  ＤＮＡは、組込みおよび非組込みＤＮＡならびに潜伏および欠損ウイルスを定量する。ｃＡＲＴを受けている患者において総ＨＩＶ  ＤＮＡと組み込まれたＨＩＶ  ＤＮＡの間に強い相関が存在し、したがって、細胞関連ＨＩＶ  ＤＮＡは、潜伏感染細胞総数の良好な代替マーカーである可能性が高い［Koelsch 2008］。
【０２１４】
非スプライスＨＩＶ−１  ＲＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）：ＨＩＶ転写は、デジタルドロップレットＰＣＲを用いて細胞結合した１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞当たりの非スプライスＨＩＶ−１  ＲＮＡのコピー数として測定された。
【０２１５】
ＮＡＴスクリーニングによる血漿ＨＩＶ−１  ＲＮＡ検出：転写媒介増幅（ＴＭＡ）ベースの方法（通常、核酸試験（ＮＡＴ）スクリーニングと呼ばれる）により測定される（ＰＲＯＣＬＥＩＸ  ＵＬＴＲＩＯ  Ｐｌｕｓ，Ｇｅｎｐｒｏｂｅ）。
【０２１６】
血漿ＨＩＶ  ＲＮＡ、定量的ウイルス量：Ｒｏｃｈｅ  ＶＬ（ルーチンの臨床アッセイ）により測定される。
【０２１７】
ヒストンＨ３アセチル化：新鮮な単離ＰＢＭＣについて細胞内サイトカイン染色によるフローサイトメトリーを用いてリンパ球において測定される。
【０２１８】
Ｔ細胞数（ＣＤ４およびＣＤ８）
【０２１９】
系統発生学的分析
【０２２０】
免疫学：
ＥＬＩＳｐｏｔ、増殖および／または細胞内サイトカイン染色によって測定されるＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答。
【０２２１】
実施例１４
以下は、臨床試験「潜伏ＨＩＶ−１リザーバー（ＲＥＤＵＣ）の低減のためのヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるロミデプシンおよび治療用ワクチンＶａｃｃ−４ｘの安全性および有効性」のパートＡからのウイルス再活性化データおよびパートＢからのウイルス再活性化が提供される（clinicaltrials.govの臨床試験ＮＴＣ０２０９２１１６を参照されたい）。本研究の試験対象患者基準は、以下の通りであった：年齢＞１８歳；現在、ｃＡＲＴを受けており、最低１年間はｃＡＲＴを受けている；少なくとも１年間はＨＩＶ−１血漿ＲＮＡ＜５０コピー／ｍＬである（ウイルス量の誤差を除く）；およびＣＤ４  Ｔ細胞数≧５００細胞／ｍｍ３。
【０２２２】
研究の除外基準は、以下の通りであった：ＣＤ４  Ｔ細胞数の最低＜２００細胞／ｍｍ３；過去６カ月以内にＨＤＡＣｉ（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）を用いた前回の治療；活動性ＡＩＤＳ指標日和見感染、活性型ＨＢＶもしくはＨＣＶ同時感染、重大な心疾患、悪性腫瘍、移植、インスリン依存性真性糖尿病または他のプロトコルにより定義される除外された医学的状態の任意の証拠；任意のプロトコルにより定義される禁忌薬物またはワクチン接種の使用；ならびにプロトコルに定義される血液学的および臨床化学的パラメータの容認できない値。また、プロトコルにより定義される避妊方法の使用を希望しないまたは使用できない男性または女性は除外される。
【０２２３】
臨床研究のパートＡには、３つの相が含まれた。第１に、潜伏ＨＩＶ−１リザーバーの安定性を確認し、ベースラインＨＩＶ−１  Ｔリンパ球特異的免疫を決定するための２〜４週間の前処理相（通院１〜通院２ａ）。第２に、４時間の期間にわたって静脈内投与される、５ｍｇ／ｍ２の用量のロミデプシン注入の１サイクルからなる３週間のウイルス再活性化相（通院２〜通院７）。用量制限毒性が観察された場合において、２．５ｍｇ／ｍ２までの脱エスカレーションが計画された。ロミデプシンは、０日目、７日目および１４日目に注入された。第３に、ロミデプシンの潜伏ＨＩＶ−１ｌリザーバーのサイズにおける影響を評価するための約９週間の活性化後相（通院８〜通院１１）。
【０２２４】
臨床研究のパートＢは５つの相が含まれた。第１に、潜伏ＨＩＶ−１リザーバーの安定性を確認し、ベースラインＨＩＶ−１  Ｔリンパ球特異的免疫を決定するための２〜４週間の前処理相（通院１〜通院２）。第２に、通院２、３、４、５、６および７でＶａｃｃ−４ｘをｒｈｕＧＭ−ＣＳＦと一緒に投与した１２週間の治療的ＨＩＶ−１免疫化相（通院２〜通院７）、続く２週間のフォローアップ期間（通院８）。第３に、５ｍｇ／ｍ２の用量のロミデプシン注入の１サイクルからなる３週間のウイルス再活性化相（通院９〜通院１１）。第４に、潜伏ＨＩＶ−１リザーバーのサイズにおける試験対象処置の効果を評価するための約９週間の後処理観察相（通院１２〜通院１３）。第５に、１６週間の分析的治療中断相（通院１４〜通院３３）。
【０２２５】
研究のこのパートの主目的は、ＨＩＶ感染患者において、５ｍｇ／ｍ２の減量でのロミデプシンの安全性および認容性を評価することであった。副次目的は、ｃＡＲＴにおいてウイルス学的に抑制されたＨＩＶ感染患者におけるロミデプシン処理のＨＩＶ−１転写における影響を決定することであった。
【０２２６】
パートＡの主要評価項目は、安全性と認容性であった；有害事象（ＡＥ）、有害反応（ＡＲ）、重篤な有害事象（ＳＡＥ）、重篤な有害反応（ＳＡＲ）、重篤な予期しない有害反応（ＳＵＳＡＲ）によって測定される評価。
【０２２７】
パートＢの主要評価項目は、第１に、有害事象（ＡＥ）、有害反応（ＡＲ）、重篤な有害事象（ＳＡＥ）、重篤な有害反応（ＳＡＲ）、重篤な予期しない有害反応（ＳＵＳＡＲ）および用量制限毒性によって測定される安全性および認容性であった。第二に、以下によって測定されるＣＤ４＋Ｔ細胞における潜伏ＨＩＶ−１リザーバーのサイズ：
ａ）ＨＩＶ−１ウイルス増殖アッセイ［静止メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＲＵＰＭ）における１０６あたりＨＩＶ−１  ＲＮＡ］
ｂ）組み込まれたＨＩＶ−１  ＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）
ｃ）総ＨＩＶ−１  ＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）
【０２２８】
臨床研究のパートＡの副次的評価項目は、以下の通りであった：
１）細胞結合した非スプライスＨＩＶ−１  ＲＮＡとして測定されるＨＩＶ転写（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）
２）血漿ＨＩＶ  ＲＮＡとして測定されるＨＩＶ転写（ＮＡＴスクリーニングおよび標準的なＨＩＶ  ＲＮＡによる）
３）リンパ球におけるヒストンＨ３アセチル化
４）以下によって測定されるＣＤ４＋Ｔ細胞における潜伏ＨＩＶ−１リザーバーのサイズ：
ａ）ＨＩＶ−１ウイルス増殖アッセイ［静止メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞における１０６あたりのＨＩＶ−１  ＲＮＡ（ＲＵＰＭ）］
ｂ）組み込まれたＨＩＶ−１  ＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）
ｃ）総ＨＩＶ−１  ＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）。
【０２２９】
パートＢの副次的評価項目は、以下の通りであった：
１）ｃＡＲＴの再開始までの時間
２）ｃＡＲＴの休止中の検出可能なウイルス血症までの時間
３）細胞結合した非スプライスＨＩＶ−１  ＲＮＡとして測定されるＨＩＶ転写（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのコピー）
４）ＥＬＩＳｐｏｔ、増殖および／または細胞内サイトカイン染色によって測定されるＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答
５）血漿ＨＩＶ−１ウイルス量
６）リンパ球において測定されるヒストンＨ３アセチル化
７）Ｔ細胞数および表現型
８）ＥＬＩＳＡによって測定されるＶａｃｃ−４ｘペプチドおよびｐ２４に対する抗体力価。
【０２３０】
ヒストンＨ３アセチル化は、新鮮に単離されたＰＢＭＣ上の細胞内サイトカイン染色によるフローサイトメトリーを用いてリンパ球において測定された。新鮮に単離されたＰＢＭＣを固定し、透過性にし、アセチル化特異的抗体を用いて染色し、ヒストン上のエピジェネティックな修飾を評価する可能性を提供した（Rigby L, Muscat A, Ashley D, Algar E. Epigenetics 2012;7(8):875-882）。簡単には、ＰＢＭＣ（１×１０６）を３ｍｌの氷冷ＰＢＳ／１％ＦＢＳに再懸濁し、遠心分離し、ボルテックスし、ペレットを溶解し、固定剤を添加し、１００μｌの２％ＰＦＡ（氷冷）を加えて、短時間ボルテックスし、氷上で１５分間インキュベートした。次に、細胞を４ｍｌのＰＢＳ中で洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、染色するまで４℃で保存した。試料を３ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ボルテックスし、細胞ペレットを溶解させ、１００μｌの０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、短時間ボルテックスし、１０分間、室温（ＲＴ）にてインキュベートした。次に、試料をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、６００μｌのブロック（ＰＢＳ／１０％ＦＢＳ）を添加し、ボルテックスし、細胞ペレットを再懸濁し、室温で２０分間インキュベートした。３ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、２００μｇ／ｍｌの一次抗体である抗アセチルヒストンＨ３（ウサギ）（５μｌ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または２００μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照（正常ウサギ血清、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）を添加し、試料をボルテックスし、細胞ペレットを再懸濁し、１時間、室温にてインキュベートした。この後、試料をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、５μｌの２次抗体（ＡＦ−４８８接合したロバ抗ウサギＩｇＧ、濃１２０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし、ボルテックスし、細胞ペレットを再懸濁し、１時間、暗所（室温）にてインキュベートした。最後に、試料をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、８０μｌのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ（５００００事象、抗アセチルヒストンＨ３蛍光強度中央値、ＭＦＩ、アイソタイプ対照からバックグラウンドＭＦＩを差し引いて算出される）により分析した。
【０２３１】
ＨＩＶ転写は、デジタル液滴ＰＣＲを用いて、細胞結合した非スプライスＨＩＶ−１  ＲＮＡ／１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞のコピーとして測定した。ＬＤ分離カラムにより、記載されるようにＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ陰性ビーズ分離キット（ＣＤ４  Ｔ細胞単離、＃１３０−０９６−５３３）を用いて、ＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、溶解し（Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出キットの溶解緩衝液）、ＲＮＡおよびＤＮＡを抽出するまで−８０℃で保存した（Ａｌｌｐｒｅｐ単離キット、Ｑｉａｇｅｎ）。ＨＩＶ患者からの細胞結合した非スプライスＨＩＶ  ＲＮＡの逆転写、増幅および定量を以下のように行った。要約すると、ＨＩＶ非スプライスＲＮＡは、定義されたプライマー／プローブセットを用いたＢｉｏＲａｄ  ＱＸ１００液滴デジタルプラットフォーム上で検出され、ＩＰＯ８（Ｉｍｐｏｒｔｉｎ  ８）およびＴＢＰ（Ｔａｔａ結合タンパク質）遺伝子転写の定量によって総細胞入力に関連付けられる。ヌクレアーゼを含まないｄＨ中の１１．５μｌの患者抽出ｍＲＮＡ、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｕ１２４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５μｌの３μｇ／μｌランダムヘキサマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および０．５μｌの０．５μｇ／μｌオリゴ（ｄＴ）１２−１８  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物を調製し、６５℃で５分間インキュベートし、次に、直ちに氷上で５分間インキュベートした。第１鎖ｃＤＮＡ産生は、２０μｌの総反応容量に対して、４．０μｌの５×第１鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．０μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５μｌのＲＮＡｓｅＯＵＴ  ＲＮＡｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．０μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物を添加することによって行われ、ＰＣＲ装置において４２℃で４５分間、次に８０℃で１５分間インキュベートされた。反応物は、下流アッセイを行うまで４℃または氷上で保持された。ｕｓＲＮＡについて、３μｌのプライマー／プローブミックスＳＬ３０Ｍ（プライマーＳＬ１９／２０  最終濃度１０００ｎＭおよびＭＧＢプローブＳＬ３０ＭＩＤＤＬＥ  ５’−ＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧＣ−３  最終濃度２５０ｎＭ）［Lewin, Journal of Virology 1999;73(7):6099-6103 Saleh, Retrovirology 2011;8:80］、１１μｌの２×ｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）、５μｌの水、および患者試料由来の３μｌのｃＤＮＡ（総容量２２μｌ）を含有するｄｄＰＣＲ混合物を作製した。各試料における総細胞入力を調整するために、相対コピー数を２つのヒト内在性対照遺伝子ＴＢＰ  ＰＬ（ＶＩＣ）アッセイＩＤ：Ｈｓ００１８３５３３＿ｍ１およびＩＰＯ８（ＦＡＭ）アッセイＩＤ：Ｈｓ００４２７６２０＿ｍ１（ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に標準化した。全てのＨＩＶ  ＲＴ試料を６回反復し、参照遺伝子を２回反復してアッセイした。ＰＣＲ反応混合物をＢｉｏＲａｄ  ＱＸ−１００乳化装置に装填し、製造者の指示に従って各試料を２０，０００ナノリットルのサイズにした液滴に分画した。ＰＣＲサイクル条件は、以下の通りであった：９���℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒の変性後、５９℃で６０秒間の伸長および９８℃で最後の１０分間の４０サイクル。サイクル後、続いて液滴をＱＸ１００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）によって自動的に読み取って、データをＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（商標）分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析した。平均して、６つのＨＩＶ複製物が、８０，０００〜９８，０００個の液滴を生成し、時間点ごとに分析された。
【０２３２】
血漿ＨＩＶ  ＲＮＡ、定量的ウイルス量は、製造者の指示に従って、Ｃｏｂａｓ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＨＩＶ−１試験、ｖ２．０（Ｒｏｃｈｅ）によって測定された（ルーチンの臨床アッセイ）。このアッセイの定量下限は２０コピーのＨＩＶ−１  ＲＮＡ／ｍＬであるが、これを下回る定性的評価を与える。血漿ＨＩＶ−１  ＲＮＡはまた、製造者の指示に従って、通常、核酸試験（ＮＡＴ）スクリーニング（ＰＲＯＣＬＥＩＸ  ＵＬＴＲＩＯ  Ｐｌｕｓ、Ｇｅｎｐｒｏｂｅ）と呼ばれる転写媒介増幅（ＴＭＡ）に基づく方法によって測定された。
【０２３３】
細胞結合したＨＩＶ−１  ＤＮＡの定量化
ＨＩＶ−１  ＤＮＡ定量について、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）上のＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９６−５３３）を使用してＣＤ４  Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４  Ｔ単離後、細胞を溶解緩衝液に再懸濁し、以前に記載されているように消化した［Chomont, 2009 Nat Med, 15(8): 893-900］。１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞あたりの総ＨＩＶ−１  ＤＮＡの絶対レベルを決定するために、ＱＸ１００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたＨＩＶ−１  ＤＮＡ定量のために細胞溶解物を直接使用した［Strain et al 2013 PLOS One］。
【０２３４】
ＨＩＶ−１ウイルス増殖アッセイは、本質的にSogaard et al. (2015) PLoS Pathog 11(9)に記載されている通りに行われた。
【０２３５】
ＨＩＶ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞
凍結保存されたＰＢＭＣは、以前に公表された［Rasmussen, Lancet. HIV 1, e13-21 (2014), Sogaard, PLoS Pathog. 11, e1005142 (2015)］細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を用いて分析された。簡単には、融解したＰＢＭＣを一晩放置し、ＨＩＶ−１  Ｇａｇペプチドプール（１５０ペプチド混合物、ＰｅｐＭｉｘ（商標）ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａ）を用いて６時間刺激した。刺激されていない陽性対照試料［ブドウ球菌エンテロトキシンｂ(staphyloccocal enterotoxin b)、ＳＥＢ］を各時点で含めた。刺激後、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍプロトコルを使用して、近赤外線アミノ反応性染料（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、続いて表面染色（ＣＤ８＋（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＢＤ）および細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮγ（Ｂ２７）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて細胞を染色した。ＨＩＶ特異的応答は、非刺激対照におけるバックグラウンド応答を差し引いたＧａｇ−ペプチドプールを用いて刺激された試料において検出された応答として定義された。全ての試料をＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅサイトメーター上で分析し、データをＦｌｏｗＪｏバージョン１０．０．７を用いて分析した。
【０２３６】
ウイルス阻害アッセイ
以前に報告された設定［Chen, J. Virol. 83, 3138-49 (2009), Slichter, J. Immunol. Methods 404, 71-80 (2014), Xu, AIDS 16, 1849-57 (2002)］から適合されたエクスビボでのウイルス阻害アッセイを使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞がウイルス複製を阻害する能力の変化を調べた。このアッセイにおいて使用するためのＨＸＢ２ウイルスは、ＨＥＫ２９３ＴのトランスフェクションおよびＴＺＭ−ｂｌ細胞へのウイルスの滴定によって産生された。
【０２３７】
ウイルス阻害アッセイは、３つの異なる時点、ベースライン、免疫後および活性化後から、凍結保存されたＰＢＭＣ（３０×１０６）を用いて実施された。急速に融解して計数したした後（Ｃａｓｙ  ｍｏｄｅｌ  ＴＴ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、得られたＰＢＭＣの半分を完全培地［１０％Ｈｉ−ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）および１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０ｗ．安定グルタミン（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）］中に再懸濁し、２４ウェルプレート中で３日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。残りの半分から、製造業者のプロトコル（Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、分離カラム上の磁気マイクロビーズを用いた陰性選択によってＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。次に、精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を完全培地（２×１０６／ｍＬ）に再懸濁し、フィトヘマグルチニン形態［１％ＰＨＡ（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）およびＩＬ２（２０Ｕ／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）］とともに３日間、２４ウェルプレート中で活性化した。４日目に、ＰＢＭＣとＣＤ４＋Ｔ細胞をともに洗浄し、ＩＬ２を補充したＣＤ４＋Ｔ細胞に再懸濁した。翌日（５日目）に、ＣＤ４＋Ｔ細胞（４×１０６／ｍＬ）をウェルあたり１×１０６細胞の密度で播種し、ＨＸＢ２ウイルス（ＭＯＩ  ０．０１）で感染させた。ウイルス添加後、細胞を２４ウェルプレート中で４時間インキュベートし、続いて３回の連続洗浄工程を行い、非融合ウイルスを除去した。最後の洗浄後、上清を回収し、細胞を再懸濁し（０．６６×１０６／ｍＬ）、９６ウェル丸底プレートに播種した（１００，０００細胞／１５０μＬ／ウェル）。６日目に、磁性マイクロビーズ（ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた陰性選択により、残りのＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、１：０（ＣＤ４／ＣＤ８）、１：１および２：１の比率で感染ＣＤ４＋Ｔ細胞に添加した。各比率について、ウェルあたり最終容量２５０μＬを三連で作製した。８日目に、各ウェルから上清（７５μＬ）を採取し、ＩＬ２含有培地と交換した。最後に、１１日目に、最終上清を回収し、続いて抗ＨＩＶ−１−ｐ２４  ｇａｇ（Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏ試薬、Ｉｒｅｌａｎｄ）および抗ＨＩＶ−１−ｐ２４  ＭＡｂのビオチン化接合体（Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏ試薬、Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用した社内ＥＬＩＳＡによってｐ２４抗原測定を行った。ウイルス複製を阻害するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力は、式：ＣＤ８＋Ｔ細胞のＨＩＶ抑制能（ｌｏｇ  ｐ２４低下）＝（Ｌｏｇ１０  ｐ２４  ＣＤ４＋Ｔ細胞／ｐ２４  ＣＤ８＋Ｔ細胞２：１）［Saez-Cirion, Nat. Protoc. 5, 1033-41(2010)］を用いて算出された。
【０２３８】
結果パートＡ
この研究のパートＡの目的は、ＨＩＶ再活性化における安全性および効果に基づいて、ＨＤＡＣｉ  Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）（ロミデプシン）の最適用量を確立することであった。５ｍｇ／ｍ２のロミデプシンによる処置は、従来のＨＩＶ薬剤ｃＡＲＴを受けている６人の患者においてＨＩＶを再活性化することが首尾よくできた。ロミデプシン注入の結果として、細胞結合した非スプライスＨＩＶ  ＲＮＡと細胞外ＨＩＶ  ＲＮＡの両方が有意に増加した。治療は安全であり、ほとんどの有害事象（ＡＥ）はグレード１であった。１人の個体における２つのグレードＩＩ  ＡＥが観察された。重篤な有害事象は観察されなかった。
【０２３９】
ロミデプシンに対する薬力学的応答の細胞尺度であるリンパ球ヒストンＨ３アセチル化は、各ロミデプシン投与後に急速に増加した（最大倍数範囲：ベースラインに対して３．７〜７．７）。同時に、ＨＩＶ−１転写（細胞結合した非スプライスＨＩＶ−１  ＲＮＡ）は、ベースラインから有意に増加した（倍数範囲：３回目の注入後、２．４〜５．０；ｐ＝０．０３、ウィルコクソン）。注目すべきことに、血漿ＨＩＶ−１  ＲＮＡは、６人のうちの５人の患者において、複数回の注入後の時点でベースラインの２０コピー／ｍＬ未満から容易に定量可能なレベル（標準的な臨床アッセイを用いる）まで増加した（２回目の注入後、範囲４６〜１０３コピー／ｍＬ）。血漿ＨＩＶ−１  ＲＮＡはまた、ベースラインと比較して、注入後の時点で転写媒介増幅アッセイによってより頻繁に検出された。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０２４０】
結果パートＢ
主目的パートＢ
【０２４１】
主目的は、ｃＡＲＴにおいてウイルス学的に抑制されたＨＩＶ感染患者のＨＩＶ−１潜伏リザーバーにおけるＶａｃｃ−４ｘ＋ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦおよび環状ロミデプシン処理による治療の影響を測定することであった。主な仮説は、強力なＨＤＡＣｉの治療的使用が、Ｖａｃｃ−４ｘ免疫化された対象において、ＨＩＶ−１特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球のレベルおよび応答性の増加に起因して、ＨＩＶ−１転写の短期間の増加およびＨＩＶ−１リザーバーサイズの長期的低減をもたらすということである。
【０２４２】
複数の主要評価項目パートＢ−以下によって測定されるＣＤ４＋Ｔ細胞における潜伏ＨＩＶ−１リザーバーのサイズ：
・ＨＩＶ−１ウイルス増殖アッセイで測定される複製コンピテントプロウイルス［感染単位／１０６の休止中のＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＵＰＭ）］
・組み込まれたＨＩＶ−１  ＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞当たりのコピー数）（データはここに示されていない）
・総ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞当たりのコピー数）
副次目的パートＢ
・ロミデプシンおよびＧＭ−ＣＳＦを組み込まれたＶａｃｃ−４ｘの安全性および認容性の評価
・抗レトロウイルスの休止を監視した後のＨＩＶ感染のウイルス学的制御における治療誘導効果の評価（ＭＡＰ）。
・ｃＡＲＴにおいてウイルス学的に抑制されたＨＩＶ感染患者のＨＩＶ−１転写におけるＶａｃｃ−４ｘおよびロミデプシン治療の効果の決定
副次的評価項目パートＢ
・有害事象（ＡＥ）、有害反応（ＡＲ）、重篤なＡＥ、重篤なＡＲ、ＳＵＳＡＲおよび用量制限毒性
・ｃＡＲＴの再開始までの時間（ＭＡＰ中）
・ｃＡＲＴ休止中に血漿ＨＩＶ  ＲＮＡ＞５０コピー／ｍＬに達するまでの時間
・細胞結合した非スプライスＨＩＶ−１  ＲＮＡ（１０６のＣＤ４＋Ｔ細胞当たりのコピー数）として測定されるＨＩＶ転写
・血漿ＨＩＶ−１ウイルス量（ＮＡＴスクリーニングおよび標準ＨＩＶ  ＲＮＡ）
・リンパ球において測定されるヒストンＨ３アセチル化
・ＥＬＩＳｐｏｔ、Ｔ細胞増殖、またおそらくは細胞内サイトカイン染色によって測定されるＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答
・Ｔ細胞数および表現型
・ＥＬＩＳＡによって測定されるＶａｃｃ−４ｘペプチドおよびｐ２４に対する抗体力価
・ＥＬＩＳＡによって測定されるＣ５に対する抗体力価の変化
【０２４３】
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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総ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡを対数変換し、因子として通院と共分散としてベースライン値を伴うＡＮＣＯＶＡモデルを用いて分析した。
複製コンピテントプロウイルス（ＩＵＰＭ）
分析された合計５１人の試料において、１７人の対象における３回の通院、５１人のうちの３１人（６１％）が検出限界（ＬｏＤ）を下回り、１７人の対象のうちの９人（５３％）がＬｏＤを上回る１つ以上の結果を示した。データは、１００万個のＣＤ４  Ｔ細胞あたりの感染単位（ＩＵＰＭ）として提供され、すなわち、アッセイに使用される細胞数の違いを考慮して結果が算出され、したがって、ＬｏＤを上回る結果は対象内および対象間で同等である。定量的ウイルス増殖アッセイは、ＣＤ４＋Ｔ細胞における複製コンピテントリザーバーを過小評価し得る。
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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１７人中の６人（３５％）の対象は、ロミデプシン投薬後、少なくとも１回の血漿ＨＩＶ−ＲＮＡ測定値がＬＬｏＱを上回った。
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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ヒストンＨ３アセチル化（蛍光強度中央値）−ＦＡＳ
【表２０】
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【表２１】
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組み込まれたＨＩＶ  ＤＮＡ
【表２２】
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【表２３】
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ＣＤ４数
【表２４】
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【表２５】
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ＣＤ８数
【表２６】
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【表２７】
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ＣＤ４パーセント
【表２８】
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ＣＤ８パーセント
【表２９】
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ＣＤ４／ＣＤ８比
【表３０−１】
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【表３０−２】
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【０２４４】
概要
ＲＥＤＵＣ試験において、Ｖａｃｃ−４ｘおよび潜伏逆転剤であるロミデプシン［Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標）、Ｃｅｌｇｅｎｅ］の組合せは、再活性化されたＨＩＶの制御および潜伏ウイルリザーバーの減少をもたらし、ＲＥＤＵＣパートＢは２０人の患者を登録した。ウイルス量に関するデータは１７人の患者から得られ、１６人の患者は試験を完了した。
【０２４５】
見出しの結果は、以下の通りであった：
・潜伏ＨＩＶリザーバーは、４０％（総ＨＩＶ  ＤＮＡとｑＶＯＡ）大幅に低減された。組み込まれたＤＮＡは、統計学的有意性に達しなかったが、ベースラインからフォローアップまで減少傾向を示した（減少中央値１３％、９５％［ＣＩ］：−３２．５〜１２．２、ＡＮＣＯＶＡ  ｐ＝０．２７１）
・リザーバーの再活性化にもかかわらず、併用抗レトロウイルス療法（ｃＡＲＴ）の１７人の患者のうち１１人でウイルス量が検出レベルを下回った。４人の患者は、測定可能であるがウイルス量が低く、３回のロミデプシン注入のうちの１つだけであった。
・ロミデプシンの薬力学的効果、すなわち潜伏ＨＩＶリザーバーの再活性化は、ヒストンアセチル化レベルおよびウイルス発現の増加によって確認された。
・Ｖａｃｃ−４ｘおよびロミデプシンの組合せは、安全であり十分に許容された。
【０２４６】
潜伏リザーバーサイズ
３つの異なるアッセイを選択して、リザーバーの真のサイズおよび治療の効果を最もよく評価する方法について、科学的なＨＩＶ共同体における進行中の検討のため、潜伏リザーバーサイズへの影響を測定した。
【０２４７】
潜伏リザーバーの減少における一貫した結果が観察された。総ＨＩＶ  ＤＮＡにより測定すると、４０％（ｐ＝０．０１２）の有意な減少が達成され、同様に、潜伏ＨＩＶリザーバーサイズの４０％（ｐ＝０．０１９）の減少がｑＶＯＡによって測定された。総ＨＩＶ−１  ＤＮＡに類似して、組み込まれたＤＮＡは、統計学的有意性に達しなかったが、ベースラインからフォローアップまで減少傾向を示した（減少中央値１３％、９５％［ＣＩ］：−３２．５〜１２．２、ＡＮＣＯＶＡ  ｐ＝０．２７１）。ＲＥＤＵＣパートＡにおいて、患者は、先行するＶａｃｃ−４ｘを用いたワクチン接種なしにロミデプシン注入を受けたが、潜伏リザーバーのサイズは影響を受けなかった。総ＨＩＶ  ＤＮＡは、リザーバーサイズを推定するために最も広く使用されているアッセイである［Rouzioux, C & Richman, D (2013) ‘How to best measure HIV reservoirs?’ Current Opinion in HIV and AIDS 8, 170-175］。臨床試験設定におけるｑＶＯＡの適用はチャレンジであり、この研究において、６人の患者について検出限界を超えるデータが達成された。
【０２４８】
ウイルス量
ロミデプシン注入後のＣＤ４＋Ｔ細胞においてウイルス再活性化が確認されているにも関わらず、ウイルス量（血漿ＨＩＶ−１  ＲＮＡ）は、ｃＡＲＴ中の試験を通じて１７人の患者のうち１１人において検出限界（２０コピー／ｍｌ）未満の状態であった。検出可能なウイルス量を有する６人の患者のうち、４人の患者は、３回のロミデプシン注入のうちの１回の後に、血液中に測定可能であるが低ＨＩＶを有し、わずか２１〜５９コピー／ｍｌであった。重要なことに、３回のロミデプシン注入のそれぞれの後に、１７人の患者のうち２人だけが検出可能なウイルス量を有した。
【０２４９】
ＲＥＤＵＣパートＡにおいて、ロミデプシンはＨＩＶ−１転写を誘導し、６人の患者のうち５人において容易に検出されたウイルス量の有意な増加をもたらした。ＲＥＤＵＣパートＡおよびＲＥＤＵＣパートＢの結果を比較すると、Ｖａｃｃ−４ｘによるワクチン接種は、再活性化ウイルスの制御を可能にしたことを示す。
【０２５０】
リバウンドまでの時間
処置中断後のｃＡＲＴの再開始までの時間中央値は２４．５日であり、これは、介入なしで予想されるものと同様である。この結果は、ＨＩＶ科学界の多数の人々による現在の信念と整合しており、ｃＡＲＴがない場合には、２つを超える異なる化合物クラスの組合せが長期にわたるウイルス制御を達成する必要があると考えられる。
【０２５１】
特定の理論に拘束されるものではないが、免疫反応性をさらに強化することができる第３の薬剤が、Ｖａｃｃ−４ｘおよび潜伏逆転剤に加えて、組合せ治療の一部として有効であることが予想され得る。
【０２５２】
安全性と認容性
Ｖａｃｃ−４ｘおよびロミデプシンの治療は安全であり十分に許容された。全ての有害反応は、ロミデプシン（すなわち、疲労、吐き気および便秘）またはＧＭ−ＣＳＦとともに投与されたＶａｃｃ−４ｘ（局所皮膚反応、疲労および頭痛）のいずれかの既知の副作用と一致した。
【０２５３】
合計して、１４１件の有害事象が登録され、そのうちの４３件の有害事象は、ＧＭ−ＣＳＦとともに投与されたＶａｃｃ−４ｘに関連し、および５７件がロミデプシンに関連するものと考えられた。４１件の有害事象は無関係であり、１３３件の有害事象は軽度（グレード１）であり、数日以内に自発的に解決された。いくつかのグレード２の有害事象があり、薬物関連グレード３の有害事象は観察されなかった。
【０２５４】
本明細書および下記の特許請求の範囲を通して、文脈が他に要求しない限り、用語「含む（comprise）」、ならびに変形「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」は、記述された整数、工程、整数の群または工程の群を含むことが理解されるが、任意の他の整数、工程、整数の群および工程の群を除外するものではない。
【０２５５】
本明細書において言及される全ての特許および特許出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０２５６】
本明細書および特許請求の範囲がその一部を構成する本願は、いずれもの後の出願において優先権の基礎として使用され得る。後の出願の特許請求の範囲は、本明細書に記載されたいずれもの特徴および特徴の組合せに関するものであり得る。それらは、物、組成物、方法または使用クレームの形態であり得、例としてであって、限定するものではないが、特許請求の範囲を含み得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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