(57)【要約】  本発明は、光子線照射連鎖球菌ワクチン調製物およびその使用方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の連鎖球菌による感染症を予防または治療する方法であって、前記対象に治療有効量の光子線照射連鎖球菌を投与して前記感染を予防または治療することを含む、方法。
【請求項２】
複数の異なる連鎖球菌種および／または連鎖球菌血清型によって感染症を予防または治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光子線照射連鎖球菌が、異なるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌種、連鎖球菌血清型および／または連鎖球菌派生株を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記連鎖球菌感染症が、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１つまたは複数の血清型による感染症を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記連鎖球菌による感染症が、気道感染症、肺炎、耳感染症、耳痛、中耳感染症、中耳炎、副鼻腔炎、髄膜炎、結膜炎、菌血症、敗血症、関節感染症、骨感染症、化膿性関節炎、敗血症、骨髄炎、軟部組織感染症、蜂巣炎、筋炎、眼窩周囲蜂巣炎、膿瘍、壊死性筋膜炎、膿痂疹、腹膜炎、心感染症、心内膜炎および／または心外膜炎のいずれか１つまたは複数のものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
対象に連鎖球菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記対象に治療有効量の光子線照射連鎖球菌を投与して前記免疫応答を誘導することを含む、方法。
【請求項７】
前記免疫応答が、前記対象に投与するものとは異なる連鎖球菌種および／または連鎖球菌血清型に対する異型免疫応答を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記治療有効量の光子線照射連鎖球菌が、異なるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌種、連鎖球菌血清型および／または連鎖球菌派生株を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記異なる連鎖球菌種および／または連鎖球菌血清型が肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫応答が、
（ｉｋｉ）Ｂリンパ球応答；
（ｉｉ）少なくとも部分的に前記光子線照射連鎖球菌の二本鎖ＲＮＡとＴｏｌｌ様受容体との相互作用によって誘導される自然免疫応答；
（ｉｉｉ）Ｔリンパ球応答
のいずれか１つまたは複数のものを含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記光子線照射連鎖球菌が、少なくとも１つの肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型または肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の少なくとも１つの非莢膜型派生株を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）１つまたは複数の欠陥ＤＮＡ修復タンパク質；および／または
（ｉｉ）ＤＮＡ修復能の欠陥を引き起こす遺伝子変異
を含む変異連鎖球菌を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記光子線照射変異連鎖球菌が、ＤＮＡ修復タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠陥を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記光子線照射変異連鎖球菌が、ＤＮＡアルキル化修復タンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡポリメラーゼ４をコードする遺伝子、ｈｅｘＡ、ｈｅｘＢ、ｍｕｔＳ、ｒａｄＣ、ｒｅｃＡ、ｒｅｃＦ、ｒｅｃＮ、ｒｅｃＯ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣまたはｕｖｒＤから選択される１つまたは複数の遺伝子の欠陥を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）変異株である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記欠陥ＤＮＡ修復タンパク質が、前記光子線照射変異連鎖球菌において変異しているか、短縮さているか、存在しない、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記光子線照射変異連鎖球菌が、
（ｉ）自己溶菌酵素、溶血素、ニューモリシンおよび／またはＰｓａＡタンパク質のいずれか１つまたは複数のものに欠陥があり；かつ／あるいは
（ｉｉ）自己溶菌酵素、溶血素および／またはＰｓａＡタンパク質のいずれか１つまたは複数のものが存在しない
連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株を含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記光子線照射連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株が、
（ｉ）欠陥自己溶菌酵素タンパク質をコードする遺伝子、欠陥溶血素をコードする遺伝子、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子および／または欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子のいずれか１つまたは複数のものを含むか；あるいは
（ｉｉ）自己溶菌酵素をコードする遺伝子、溶血素をコードする遺伝子および／またはＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子のいずれか１つまたは複数のものが存在しない派生株である、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記自己溶菌酵素がＬｙｔＡである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記光子線照射連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株が、
（ｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含むか；または
（ｉｉ）ｌｙｔＡ遺伝子を含まず、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子を含む、
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記光子線照射変異連鎖球菌の不活化に必要な光子線照射量が、対応する非変異連鎖球菌に必要な光子線照射量よりも少ない、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記光子線照射連鎖球菌の一部または全部が、ＲＮＡ転写産物をコードするＤＮＡの配列を含む改変連鎖球菌を含み、前記ＲＮＡ転写産物が、転写後に二本鎖部分を形成することが可能な自己相補性領域を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記二本鎖ＲＮＡ転写産物の部分が、少なくとも１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、３５塩基対、４０塩基対、４５塩基対、５０塩基対、５５塩基対、６０塩基対、６５塩基対または７０塩基対の長さである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記二本鎖ＲＮＡ転写産物が、前記対象にＴｏｌｌ様受容体活性化を含む自然免疫応答を惹起する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔｏｌｌ様受容体がＴｏｌｌ様受容体−３（ＴＬＲ−３）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記光子線照射連鎖球菌が栄養要求性変異連鎖球菌を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）前記細菌を不活化もしくは弱毒化し；かつ／または
（ｉｉ）前記対象の免疫応答を誘導または増強する
抗原またはその成分をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡ部分を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換えＤＮＡ部分が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの病原性、感染、増殖、成長またはその任意の組合せに必要な内在遺伝子と置き換わるか、これを破壊する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記光子線照射連鎖球菌が、完全に殺菌された連鎖球菌を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記光子線照射連鎖球菌を前記対象の粘膜または鼻腔内に投与する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記光子線照射連鎖球菌をアジュバントと組み合わせて前記対象に投与する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象に別個の１用量、２用量または３用量の前記光子線照射連鎖球菌を投与する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象がヒトである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
光子線照射の総線量が少なくとも８キログレイ（ｋＧｙ）、９ｋＧｙ、１０ｋＧｙ、１１ｋＧｙ、１２ｋＧｙ、１５ｋＧｙ、２０ｋＧｙ、２５ｋＧｙ、３０ｋＧｙ、４０ｋＧｙまたは５０ｋＧｙの前記光子線照射連鎖球菌を投与する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記光子線照射連鎖球菌が、γ線照射連鎖球菌、Ｘ線照射連鎖球菌またはその組合せを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記光子線照射連鎖球菌がＸ線照射連鎖球菌を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記光子線照射連鎖球菌が、γ線照射連鎖球菌とＸ線照射連鎖球菌の組合せを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記光子線照射がγ線照射である、請求項２０または３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記光子線照射がＸ線照射である、請求項２０または３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記光子線照射が、γ線照射とＸ線照射の組合せである、請求項２０または３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子と、欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子とを含むか；
（ｉｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含み、ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しないか；
（ｉｉｉ）欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含み、ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しないか；または
（ｉｖ）欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子を含み、ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子が存在せず、かつＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しない
連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株を含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
光子線照射連鎖球菌と、薬学的に許容される添加剤、賦形剤および／または担体とを含み、
（ｉ）前記光子線照射連鎖球菌が、１つもしくは複数の欠陥ＤＮＡ修復タンパク質を含む変異連鎖球菌および／または少なくとも１種類のＤＮＡ修復タンパク質が存在しない変異連鎖球菌を含み；かつ／あるいは
（ｉｉ）前記光子線照射連鎖球菌が、ＲＮＡ転写産物をコードするＤＮＡの配列を含む改変連鎖球菌を含み、前記ＲＮＡ転写産物が、転写後に二本鎖部分を形成することが可能な自己相補性領域を含む、
ワクチン組成物。
【請求項４２】
前記変異連鎖球菌が、ＤＮＡアルキル化修復タンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡポリメラーゼ４をコードする遺伝子、ｈｅｘＡ、ｈｅｘＢ、ｍｕｔＳ、ｒａｄＣ、ｒｅｃＡ、ｒｅｃＦ、ｒｅｃＮ、ｒｅｃＯ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣまたはｕｖｒＤから選択される１つまたは複数の遺伝子の欠陥を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）変異株である、請求項４１に記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
前記改変連鎖球菌が改変肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、前記二本鎖ＲＮＡ転写産物の部分が少なくとも１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、３５塩基対、４０塩基対、４５塩基対、５０塩基対、５５塩基対、６０塩基対、６５塩基対または７０塩基対の長さである、請求項４１または４２に記載のワクチン組成物。
【請求項４４】
前記光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）前記細菌を不活化もしくは弱毒化するか；または
（ｉｉ）前記対象の免疫応答を誘導もしくは増強する
抗原またはその成分をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡ部分を含む、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項４５】
前記組換えＤＮＡ部分が、病原性、感染、繁殖またはその任意の組合せに必要な内在遺伝子と置き換わるか、これを破壊する、請求項４４に記載のワクチン組成物。
【請求項４６】
前記光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）自己溶菌酵素、溶血素、ニューモリシンおよび／またはＰｓａＡタンパク質のいずれか１つまたは複数のものに欠陥があり；かつ／あるいは
（ｉｉ）自己溶菌酵素、溶血素および／またはＰｓａＡタンパク質のいずれか１つまたは複数のものが存在しない
連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株を含む、請求項４１〜４５のいずれか１つまたは複数の項に記載のワクチン。
【請求項４７】
前記光子線照射連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株が、
（ｉ）欠陥自己溶菌酵素タンパク質をコードする遺伝子、欠陥溶血素をコードする遺伝子、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子および／または欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子のいずれか１つまたは複数のものを含むか；あるいは
（ｉｉ）自己溶菌酵素をコードする遺伝子、溶血素をコードする遺伝子および／またはＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子のいずれか１つまたは複数のものが存在しない派生株である、
請求項４６に記載のワクチン。
【請求項４８】
前記光子線照射連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株が、
（ｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含むか；または
（ｉｉ）ｌｙｔＡ遺伝子を含まず、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子を含む、
請求項４１〜４７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項４９】
前記光子線照射変異連鎖球菌が、
（ｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子と、欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子とを含むか；
（ｉｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含み、ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しないか；
（ｉｉｉ）欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含み、ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しないか；または
（ｉｖ）欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子を含み、ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子が存在せず、かつＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しない
連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株を含む、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項５０】
前記光子線照射連鎖球菌が、完全に弱毒化された連鎖球菌または完全に殺菌された連鎖球菌を含む、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５１】
アジュバントをさらに含む、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５２】
経粘膜投与もしくは鼻腔内投与用に製剤化するか、筋肉内注射、皮下注射もしくは皮内注射用に製剤化した、請求項４１〜５１のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５３】
前記光子線照射連鎖球菌が、γ線照射変異連鎖球菌および／またはγ線照射改変連鎖球菌を含む、請求項４１〜５２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５４】
前記光子線照射連鎖球菌が、Ｘ線照射変異連鎖球菌および／またはＸ線照射改変連鎖球菌を含む、請求項４１〜５２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５５】
前記光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）γ線照射変異連鎖球菌とＸ線照射変異連鎖球菌の組合せ；および／または
（ｉｉ）γ線照射改変連鎖球菌とＸ線照射改変連鎖球菌の組合せ
を含む、請求項４１〜５２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５６】
請求項４１〜５５のいずれか１項に記載のワクチン組成物を調製する方法であって、
（ｉ）連鎖球菌の調製物に光子線照射して前記細菌を弱毒化または殺菌することと；
（ｉｉ）光子線照射した前記連鎖球菌と薬学的に許容される添加剤、賦形剤および／または担体とを組み合わせることと
を含む、方法。
【請求項５７】
前記連鎖球菌の調製物に光子線照射することが、前記細菌をγ線に曝露することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記連鎖球菌の調製物に光子線照射することが、前記細菌をＸ線に曝露することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記連鎖球菌の調製物に光子線照射することが、前記細菌をγ線およびＸ線に曝露することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の方法によって調製される、ワクチン組成物。
【請求項６１】
連鎖球菌による感染症の予防または治療に使用する、請求項４１〜５５または６０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項６２】
連鎖球菌による感染症の予防または治療のための薬物の調製への光子線照射連鎖球菌の使用であって、前記薬物が、請求項４１〜５５または６０のいずれか１項に記載のワクチン組成物である、使用。
【請求項６３】
前記連鎖球菌による感染症が、気道感染症、肺炎、耳感染症、耳痛、中耳感染症、中耳炎、副鼻腔炎、髄膜炎、結膜炎、菌血症、敗血症、関節感染症、骨感染症、化膿性関節炎、骨髄炎、軟部組織感染症、蜂巣炎、筋炎、眼窩周囲蜂巣炎、膿瘍、腹膜炎、心感染症、心内膜炎および心外膜炎のいずれか１つまたは複数のものである、請求項６１に記載のワクチン組成物または請求項６２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照による組込み）
本願は、２０１５年３月２６日に出願された「Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ」と題するオーストラリア仮特許出願第２０１５９０１０９８号の優先権を主張するものであり、上記出願の内容全体が相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、全般的にはワクチンの分野に関する。より具体的には、本発明は連鎖球菌ワクチン調製物およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
連鎖球菌は連鎖球菌科に属する球菌の一属である。連鎖球菌には多数の様々な種が存在し、その一部のものはヒトおよび動物に疾患を引き起こす。このほか、様々な発酵製品の製造に重要なものもある。
【０００４】
個々の連鎖球菌種は、その溶血特性（α溶血性およびβ溶血性）に基づいて２つの主要なグループに分けられる。α溶血性連鎖球菌には肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および緑色連鎖球菌が含まれる。β溶血性のグループはＡ群連鎖球菌とＢ群連鎖球菌とからなる。Ｂ群連鎖球菌は通常、消化器系および女性の膣に生息し、有害作用はみられない。新生児には重篤な感染症を引き起こすことがあるが、ほとんどの人はＢ群連鎖球菌に対する自然免疫を急速に発達させる。Ａ群連鎖球菌は通常、咽喉部および皮膚表面に生息し、成人および小児の感染症の一般的な原因の１つである。Ａ群感染症は通常、健康に重大な脅威をもたらさないもの（例えば、咽喉感染症、蜂巣炎、膿痂疹、副鼻腔炎、中耳感染症）であるが、Ａ群連鎖球菌が身体の組織および器官のさらに深部まで侵入することによって、より重篤な侵襲性感染（例えば、肺炎、敗血症、髄膜炎、壊死性筋膜炎）を確立することがあるほか、急性連鎖球菌感染後糸球体腎炎および急性リウマチ熱を含めた重篤な続発症を誘発することもある。
【０００５】
さらに、腸には連鎖球菌性（糞便性）連鎖球菌種が多数みられ、心内膜炎および尿路感染症を引き起こすことがある。
【０００６】
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌とも呼ばれる）は、ヒトおよび動物の集団の罹病率および死亡率の相当数を占める重要なヒト病原菌であり、肺炎、髄膜炎、副鼻腔炎および中耳炎を含めた重篤な病態を引き起こす。世界で毎年１６０万人が侵襲性肺炎球菌性疾患で死亡すると推定されており、そのうち約１００万人が小児である。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）には、莢膜の化学構造および免疫原性に基づいて区別される血清型が多数（９０超）存在する。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）には非侵襲性肺炎球菌性疾患の原因となる非莢膜型の菌株がほとんど事実上存在しないことから、莢膜多糖体が肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の根本的な病原性因子であると考えられている。このため、現在用いられている肺炎球菌ワクチンには、ワクチン抗原として莢膜多糖体が使用されている。
【０００７】
現在用いられている肺炎球菌コンジュゲートワクチンがカバーする範囲は、選択された血清型のセット（例えば、ＰＣＶ７（血清型７）、ＰＣＶ１０（血清型１０）およびＰＣＶ１３（血清型１３））に限られている。多くの集団では、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆを標的とするＰＣＶ７ワクチンの導入により、肺炎球菌性疾患の病苦が大幅に軽減されている。ただし、標的とするワクチン血清型が引き起こす疾患に対しては効果がみられるものの、血清型置換によってワクチンの正味の効果が低下することが多い。例えば、米国、イギリス、ドイツ、ウェールズおよびオランダを含めたいくつかの地域では、ＰＣＶ７導入後に血清型１９Ａが非ワクチン血清型として頻繁に出現することが報告されている。このため、肺炎球菌コンジュゲートワクチンの実施による非ワクチン血清型の出現が問題となっている。
【０００８】
肺炎球菌コンジュゲートワクチンによる非ワクチン血清型の出現を考えれば、さらに広い範囲の血清型に対して免疫を誘導することが可能な新規な連鎖球菌ワクチンが必要とされる。
【０００９】
上気道のコロニー形成は、肺炎球菌性疾患の病理発生に不可欠な最初の段階であり、したがって、侵襲性肺炎球菌性疾患の最も重要な危険因子であると考えられる。上気道のコロニー形成は市中での肺炎球菌の水平伝播の土台でもあり、予防手段の重要な標的となる。
【００１０】
したがって、広範囲の肺炎球菌血清型に対して免疫を誘導することが可能であり、上気道投与に適したワクチンが必要とされる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、既存の連鎖球菌ワクチンの欠点を少なくとも１つ軽減または緩和する改善された連鎖球菌ワクチンに関する。
【００１２】
したがって、本発明は、少なくとも以下に挙げる実施形態に関する：
【００１３】
実施形態１．対象の連鎖球菌による感染症を予防または治療する方法であって、対象に治療有効量の光子線照射連鎖球菌を投与して感染を予防または治療することを含む、方法。
【００１４】
実施形態２．複数の異なる連鎖球菌種および／または連鎖球菌血清型によって感染症を予防または治療する、実施形態１に記載の方法。
【００１５】
実施形態３．光子線照射連鎖球菌が、異なるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌種、連鎖球菌血清型および／または連鎖球菌派生株を含む、実施形態２に記載の方法。
【００１６】
実施形態４．連鎖球菌感染症が、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１つまたは複数の血清型による感染症を含む、実施形態１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【００１７】
実施形態５．連鎖球菌による感染症が、気道感染症、肺炎、耳感染症、耳痛、中耳感染症、中耳炎、副鼻腔炎、髄膜炎、結膜炎、菌血症、敗血症、関節感染症、骨感染症、化膿性関節炎、敗血症、骨髄炎、軟部組織感染症、蜂巣炎、筋炎、眼窩周囲蜂巣炎、膿瘍、壊死性筋膜炎、膿痂疹、腹膜炎、心感染症、心内膜炎および／または心外膜炎のいずれか１つまたは複数のものである、実施形態１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【００１８】
実施形態６．対象に連鎖球菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に治療有効量の光子線照射連鎖球菌を投与して免疫応答を誘導することを含む、方法。
【００１９】
実施形態７．免疫応答が、対象に投与するものとは異なる連鎖球菌種および／または連鎖球菌血清型に対する異型免疫応答を含む、実施形態６に記載の方法。
【００２０】
実施形態８．治療有効量の光子線照射連鎖球菌が、異なるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌種、連鎖球菌血清型および／または連鎖球菌派生株を含む、実施形態６または実施形態７に記載の方法。
【００２１】
実施形態９．異なる連鎖球菌種および／または連鎖球菌血清型が肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型である、実施形態７または実施形態８に記載の方法。
【００２２】
実施形態１０．免疫応答が、
（ｉ）Ｂリンパ球応答；
（ｉｉ）少なくとも部分的に光子線照射連鎖球菌の二本鎖ＲＮＡとＴｏｌｌ様受容体との相互作用によって誘導される自然免疫応答；
（ｉｉｉ）Ｔリンパ球応答
のいずれか１つまたは複数のものを含む、実施形態６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【００２３】
実施形態１１．光子線照射連鎖球菌が、少なくとも１つの肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型または肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の少なくとも１つの非莢膜型派生株を含む、実施形態１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【００２４】
実施形態１２．光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）１つまたは複数の欠陥ＤＮＡ修復タンパク質；および／または
（ｉｉ）ＤＮＡ修復能の欠陥を引き起こす遺伝子変異
を含む変異連鎖球菌を含む、実施形態１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【００２５】
実施形態１３．光子線照射変異連鎖球菌が、ＤＮＡ修復タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠陥を含む、実施形態１２に記載の方法。
【００２６】
実施形態１４．光子線照射変異連鎖球菌が、ＤＮＡアルキル化修復タンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡポリメラーゼ４をコードする遺伝子、ｈｅｘＡ、ｈｅｘＢ、ｍｕｔＳ、ｒａｄＣ、ｒｅｃＡ、ｒｅｃＦ、ｒｅｃＮ、ｒｅｃＯ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣまたはｕｖｒＤから選択される１つまたは複数の遺伝子の欠陥を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）変異株である、実施形態１３に記載の方法。
【００２７】
実施形態１５．欠陥ＤＮＡ修復タンパク質が、光子線照射変異連鎖球菌において変異しているか、短縮さているか、存在しない、実施形態１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【００２８】
実施形態１６．光子線照射変異連鎖球菌が、
（ｉ）自己溶菌酵素、溶血素、ニューモリシンおよび／またはＰｓａＡタンパク質のいずれか１つまたは複数のものに欠陥があり；かつ／あるいは
（ｉｉ）自己溶菌酵素、溶血素および／またはＰｓａＡタンパク質のいずれか１つまたは複数のものが存在しない
連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株を含む、実施形態１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【００２９】
実施形態１７．光子線照射連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株が、
（ｉ）欠陥自己溶菌酵素タンパク質をコードする遺伝子、欠陥溶血素をコードする遺伝子、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子および／または欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子のいずれか１つまたは複数のものを含むか；あるいは
（ｉｉ）自己溶菌酵素をコードする遺伝子、溶血素をコードする遺伝子および／またはＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子のいずれか１つまたは複数のものが存在しない派生株である、
実施形態１６に記載の方法。
【００３０】
実施形態１８．自己溶菌酵素がＬｙｔＡである、実施形態１６または実施形態１７に記載の方法。
【００３１】
実施形態１９．光子線照射連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株が、
（ｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含むか；または
（ｉｉ）ｌｙｔＡ遺伝子を含まず、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子を含む、
実施形態１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【００３２】
実施形態２０．光子線照射変異連鎖球菌の不活化に必要な光子線照射量が、対応する非変異連鎖球菌に必要な光子線照射量よりも少ない、実施形態１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【００３３】
実施形態２１．光子線照射連鎖球菌の一部または全部が、ＲＮＡ転写産物をコードするＤＮＡの配列を含む改変連鎖球菌を含み、ＲＮＡ転写産物が、転写後に二本鎖部分を形成することが可能な自己相補性領域を含む、実施形態１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００３４】
実施形態２２．二本鎖ＲＮＡ転写産物の部分が、少なくとも１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、３５塩基対、４０塩基対、４５塩基対、５０塩基対、５５塩基対、６０塩基対、６５塩基対または７０塩基対の長さである、実施形態２１に記載の方法。
【００３５】
実施形態２３．二本鎖ＲＮＡ転写産物が、対象にＴｏｌｌ様受容体活性化を含む自然免疫応答を惹起する、実施形態２１または実施形態２２に記載の方法。
【００３６】
実施形態２４．Ｔｏｌｌ様受容体がＴｏｌｌ様受容体−３（ＴＬＲ−３）である、実施形態２３に記載の方法。
【００３７】
実施形態２５．光子線照射連鎖球菌が栄養要求性変異連鎖球菌を含む、実施形態１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【００３８】
実施形態２６．光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）細菌を不活化もしくは弱毒化し；かつ／または
（ｉｉ）対象の免疫応答を誘導または増強する
抗原またはその成分をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡ部分を含む、実施形態１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【００３９】
実施形態２７．組換えＤＮＡ部分が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの病原性、感染、増殖、成長またはその任意の組合せに必要な内在遺伝子と置き換わるか、これを破壊する、実施形態２６に記載の方法。
【００４０】
実施形態２８．光子線照射連鎖球菌が、完全に殺菌された連鎖球菌を含む、実施形態１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【００４１】
実施形態２９．光子線照射連鎖球菌を対象の粘膜または鼻腔内に投与する、実施形態１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【００４２】
実施形態３０．光子線照射連鎖球菌をアジュバントと組み合わせて対象に投与する、実施形態１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【００４３】
実施形態３１．対象に別個の１用量、２用量または３用量の光子線照射連鎖球菌を投与する、実施形態１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【００４４】
実施形態３２．対象がヒトである、実施形態１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【００４５】
実施形態３３．光子線照射の総線量が少なくとも８キログレイ（ｋＧｙ）、９ｋＧｙ、１０ｋＧｙ、１１ｋＧｙ、１２ｋＧｙ、１５ｋＧｙ、２０ｋＧｙ、２５ｋＧｙ、３０ｋＧｙ、４０ｋＧｙまたは５０ｋＧｙの光子線照射連鎖球菌を投与する、実施形態１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【００４６】
実施形態３４．光子線照射連鎖球菌が、γ線照射連鎖球菌、Ｘ線照射連鎖球菌またはその組合せを含む、実施形態１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【００４７】
実施形態３５．光子線照射連鎖球菌がＸ線照射連鎖球菌を含む、実施形態１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【００４８】
実施形態３６．光子線照射連鎖球菌が、γ線照射連鎖球菌とＸ線照射連鎖球菌の組合せを含む、実施形態１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【００４９】
実施形態３７．光子線照射がγ線照射である、実施形態２０または実施形態３３に記載の方法。
【００５０】
実施形態３８．光子線照射がＸ線照射である、実施形態２０または実施形態３３に記載の方法。
【００５１】
実施形態３９．光子線照射が、γ線照射とＸ線照射の組合せである、実施形態２０または実施形態３３に記載の方法。
【００５２】
実施形態４０．光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子と、欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子とを含むか；
（ｉｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含み、ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しないか；
（ｉｉｉ）欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含み、ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しないか；または
（ｉｖ）欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子を含み、ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子が存在せず、かつＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しない
連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株を含む、実施形態１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【００５３】
実施形態４１．光子線照射連鎖球菌と、薬学的に許容される添加剤、賦形剤および／または担体とを含み、
（ｉ）光子線照射連鎖球菌が、１つもしくは複数の欠陥ＤＮＡ修復タンパク質を含む変異連鎖球菌および／または少なくとも１種類のＤＮＡ修復タンパク質が存在しない変異連鎖球菌を含み；かつ／あるいは
（ｉｉ）光子線照射連鎖球菌が、ＲＮＡ転写産物をコードするＤＮＡの配列を含む改変連鎖球菌を含み、ＲＮＡ転写産物が、転写後に二本鎖部分を形成することが可能な自己相補性領域を含む、
ワクチン組成物。
【００５４】
実施形態４２．変異連鎖球菌が、ＤＮＡアルキル化修復タンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡポリメラーゼ４をコードする遺伝子、ｈｅｘＡ、ｈｅｘＢ、ｍｕｔＳ、ｒａｄＣ、ｒｅｃＡ、ｒｅｃＦ、ｒｅｃＮ、ｒｅｃＯ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣまたはｕｖｒＤから選択される１つまたは複数の遺伝子の欠陥を含む肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）変異株である、実施形態４１に記載のワクチン組成物。
【００５５】
実施形態４３．改変連鎖球菌が改変肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、二本鎖ＲＮＡ転写産物の部分が少なくとも１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、３５塩基対、４０塩基対、４５塩基対、５０塩基対、５５塩基対、６０塩基対、６５塩基対または７０塩基対の長さである、実施形態４１または実施形態４２に記載のワクチン組成物。
【００５６】
実施形態４４．光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）細菌を不活化もしくは弱毒化するか；または
（ｉｉ）対象の免疫応答を誘導もしくは増強する
抗原またはその成分をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡ部分を含む、実施形態４１〜４３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【００５７】
実施形態４５．組換えＤＮＡ部分が、病原性、感染、繁殖またはその任意の組合せに必要な内在遺伝子と置き換わるか、これを破壊する、実施形態４４に記載のワクチン組成物。
【００５８】
実施形態４６．光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）自己溶菌酵素、溶血素、ニューモリシンおよび／またはＰｓａＡタンパク質のいずれか１つまたは複数のものに欠陥があり；かつ／あるいは
（ｉｉ）自己溶菌酵素、溶血素および／またはＰｓａＡタンパク質のいずれか１つまたは複数のものが存在しない
連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株を含む、実施形態４１〜４５のいずれか１つまたは複数に記載のワクチン。
【００５９】
実施形態４７．光子線照射連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株が、
（ｉ）欠陥自己溶菌酵素タンパク質をコードする遺伝子、欠陥溶血素をコードする遺伝子、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子および／または欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子のいずれか１つまたは複数のものを含むか；あるいは
（ｉｉ）自己溶菌酵素をコードする遺伝子、溶血素をコードする遺伝子および／またはＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子のいずれか１つまたは複数のものが存在しない派生株である、
実施形態４６に記載のワクチン。
【００６０】
実施形態４８．光子線照射連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株が、
（ｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含むか；または
（ｉｉ）ｌｙｔＡ遺伝子を含まず、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子を含む、
実施形態４１〜４７のいずれか１項に記載のワクチン。
【００６１】
実施形態４９．光子線照射変異連鎖球菌が、
（ｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と、欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子と、欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子とを含むか；
（ｉｉ）欠陥ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含み、ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しないか；
（ｉｉｉ）欠陥ＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子と欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子とを含み、ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しないか；または
（ｉｖ）欠陥ニューモリシンをコードする遺伝子を含み、ＬｙｔＡタンパク質をコードする遺伝子が存在せず、かつＰｓａＡタンパク質をコードする遺伝子が存在しない
連鎖球菌Ｒｘ１株の派生株を含む、実施形態４１〜４８のいずれか１項に記載のワクチン。
【００６２】
実施形態５０．光子線照射連鎖球菌が、完全に弱毒化された連鎖球菌または完全に殺菌された連鎖球菌を含む、実施形態４１〜４９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【００６３】
実施形態５１．アジュバントをさらに含む、実施形態４１〜５０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【００６４】
実施形態５２．経粘膜投与もしくは鼻腔内投与用に製剤化するか、筋肉内注射、皮下注射もしくは皮内注射用に製剤化した、実施形態４１〜５１のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【００６５】
実施形態５３．光子線照射連鎖球菌が、γ線照射変異連鎖球菌および／またはγ線照射改変連鎖球菌を含む、実施形態４１〜５２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【００６６】
実施形態５４．光子線照射連鎖球菌が、Ｘ線照射変異連鎖球菌および／またはＸ線照射改変連鎖球菌を含む、実施形態４１〜５２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【００６７】
実施形態５５．光子線照射連鎖球菌が、
（ｉ）γ線照射変異連鎖球菌とＸ線照射変異連鎖球菌の組合せ；および／または
（ｉｉ）γ線照射改変連鎖球菌とＸ線照射改変連鎖球菌の組合せ
を含む、実施形態４１〜５２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【００６８】
実施形態５６．実施形態４１〜５５のいずれか１項に記載のワクチン組成物を調製する方法であって、
（ｉ）連鎖球菌の調製物に光子線照射して細菌を弱毒化または殺菌することと；
（ｉｉ）光子線照射した連鎖球菌と薬学的に許容される添加剤、賦形剤および／または担体とを組み合わせることと
を含む、方法。
【００６９】
実施形態５７．前記連鎖球菌の調製物に光子線照射することが、細菌をγ線に曝露することを含む、実施形態５６に記載の方法。
【００７０】
実施形態５８．前記連鎖球菌の調製物に光子線照射することが、細菌をＸ線に曝露することを含む、実施形態５６に記載の方法。
【００７１】
実施形態５９．前記連鎖球菌の調製物に光子線照射することが、細菌をγ線およびＸ線に曝露することを含む、実施形態５６に記載の方法。
【００７２】
実施形態６０．実施形態５６〜５９のいずれか１項に記載の方法によって調製される、ワクチン組成物。
【００７３】
実施形態６１．連鎖球菌による感染症の予防または治療に使用する、実施形態４１〜５５または６０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【００７４】
実施形態６２．連鎖球菌による感染症の予防または治療のための薬物の調製への光子線照射連鎖球菌の使用であって、薬物が、実施形態４１〜５５または６０のいずれか１項に記載のワクチン組成物である、使用。
【００７５】
実施形態６３．連鎖球菌による感染症が、気道感染症、肺炎、耳感染症、耳痛、中耳感染症、中耳炎、副鼻腔炎、髄膜炎、結膜炎、菌血症、敗血症、関節感染症、骨感染症、化膿性関節炎、骨髄炎、軟部組織感染症、蜂巣炎、筋炎、眼窩周囲蜂巣炎、膿瘍、腹膜炎、心感染症、心内膜炎および心外膜炎のいずれか１つまたは複数のものである、実施形態６１に記載のワクチン組成物または実施形態６２に記載の使用。
【００７６】
これより、添付の図面を参照しながら、単なる非限定的な例として本発明の好ましい実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】抗ＬｙｔＡ抗血清および抗ＰｄＴ抗血清を用いて肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９および様々な派生株のＰｄＴおよびＬｙｔＡを検出したウエスタンブロット分析の結果を示す図である。これにより、ｌｙｔＡ遺伝子の欠失が成功し、ｐｌｙがＰｄＴをコードする変異遺伝子に置換され、ｌｙｔＡヌル変異株（自己溶菌酵素欠損）であり肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）と命名されるニューモリシン変異派生（ＰｄＴ）Ｒｘ１株が作製されたことが確認される。レーン：１．対照の精製Ｐｌｙおよび精製ＬｙｔＡ（それぞれ５ｎｇ）；２．肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９；３．肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１；４．Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）ワクチン株（照射前）。組換え精製Ｐｌｙおよび組換え精製ＬｙｔＡタンパク質は、Ｈｉｓ６−タグの存在によりサイズが大きくなっている。
【図２】ＰｄＴ変異型のニューモリシンを有する派生Ｒｘ１株の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）に溶血活性が認められないことを確認するため実施した溶血アッセイの結果を示す図である。
【図３】ΔｌｙｔＡ遺伝子がコードするｍＲＮＡ転写産物の予測二次構造を示す図である。
【図４】肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）を氷上（図４Ａ）またはドライアイス上（図４Ｂ）で様々な線量のγ線照射に曝露した後の生存率を示すグラフである。
【図５】γ線照射が物理的形態に及ぼす影響を示すグラム染色した肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）の画像である。ＤＩ：ドライアイス；ＫＧＹ：キログレイ。
【図６】γ線照射が物理的形態に及ぼす影響を示す肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）の走査型電子顕微鏡像である。
【図７】生きた肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株Ｄ３９（血清型２）による鼻腔内抗原刺激に対してγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウスの（Ａ）生存期間中央値および（Ｂ）生存率のパーセントを示すグラフである。＊Ｐ＝＜０．０５；γ−ＰＮ＝γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）。
【図８−１】γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウスのＥＦ３０３０（血清型１９Ｆ）（図８Ａおよび図８Ｂ）またはＰ９（血清型６Ａ）（図８Ｃ）による異型抗原刺激に対する免疫を示す一連のグラフである。抗原刺激から９６時間後に肺（図８Ａ）および鼻咽頭部（図８Ｂ）のＥＦ３０３０細菌数を求めた。図８Ｃは、Ｐ９による抗原刺激後２１日間のマウスの生存期間を示す。γ−ＰＮ＝γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）。
【図８−２】同上。
【図９】鼻腔内にγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウスの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）特異的抗体応答を測定したＥＬＩＳＡの結果を示す一連のグラフである。個々のグラフは、血清の抗原Ｐｌｙ、ＣｂｐＡ、ＧｌｐＯおよびＮａｎＡに特異的なＩｇＧ応答；ならびにＰｓｐＡおよび未照射Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）細菌全細胞に対するＩｇＧ抗体応答およびＩｇＡ抗体応答を示す。マウスは、γ−ＰＮ（γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ））をワクチン接種したものまたはワクチン接種しなかったもの（ＰＢＳ対照）である。
【図１０】腹腔内にγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウスの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）特異的抗体応答を測定したＥＬＩＳＡの結果を示す一連のグラフである。個々のグラフは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）細胞の全細胞溶解物（ＷＣ）（図１０Ａ）ならびに精製抗原であるＰｌｙ（図１０Ｂ）およびＣｂｐＡ（図１０Ｃ）に特異的な血清ＩｇＧ力価を示す。γ−ＰＮ＝γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）。
【図１１】鼻腔内にγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種し、致死量の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株Ｄ３９による抗原刺激を実施した野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスおよびＢ細胞欠損Ｃ５７／ＢＬ６（μＭＴ）マウスの生存率のパーセントを示すグラフである。＊＊Ｐ＝＜０．０１；γ−ＰＮ＝γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）。
【図１２−１】鼻腔内に肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウスに由来する培養脾細胞の上清で実施したサイトカイン分析の結果を示す図である。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原ＭａｌＸ、ＣｏｎＡまたは全γ線照射Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）ワクチンで刺激した後の脾細胞の上清中のインターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）（図１２Ａ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）（図１２Ｂ）のレベルが示されている。図１２Ｃおよび１２Ｄは、ＭａｌＸまたはワクチンの存在下で培養した脾細胞に細胞内サイトカイン染色を実施して、７２時間の刺激後に誘導されたＴｈ１細胞（ＩＦＮ−γ＋を使用）、Ｔｈ２細胞（ＩＬ−４＋）、Ｔｈ１７細胞（ＩＬ−１７＋）およびＴ−ｒｅｇ細胞（Ｆｏｘｐ３＋）の割合を測定した結果を示す。γ−ＰＮ＝γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１３】インフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ８による抗原刺激の３週間前に（ｉ）対照としてＰＢＳを投与したマウス（図１３Ａ）および（ｉｉ）鼻腔内に肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウス（図１３Ｂ）のＡ／ＰＲ８による抗原刺激後の体重変化のパーセントを示す図である。γ−ＰＮ＝γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）。
【図１４】鼻腔内にコレラ毒素（ＣＴ）単独（対照）または肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）＋コレラ毒素をワクチン接種したマウスに肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＥＦ３０３０株（血清型１９Ｆ）による抗原刺激を実施した後の肺（図１４Ａ）および鼻咽頭部（図１４Ｂ）の細菌数を示す図である。図１４Ｃおよび図１４Ｄは、鼻腔内にＣＴ単独（対照）または肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）＋ＣＴをワクチン接種した後、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９株（血清型２）または肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｐ９株（血清型６Ａ）による抗原刺激を実施したマウスそれぞれの生存期間を示す。＊ｐ＝＜０．０５；＊＊ｐ＝＜０．０１；γ−ＰＮ＝γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）。
【図１５−１】細胞内サイトカイン染色を実施して、鼻腔内にコレラ毒素（ＣＴ）単独（対照）または肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）＋ＣＴをワクチン接種したマウスの脾細胞をγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）ワクチンまたはＭａｌＸ抗原で７２時間刺激した後に誘導されたＴｈ１細胞（ＩＦＮ−γ＋を使用）、Ｔｈ２細胞（ＩＬ−４＋）、Ｔｈ１７細胞（ＩＬ−１７＋）およびＴ−ｒｅｇ細胞（Ｆｏｘｐ３＋）の割合を測定した結果を示す図である（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。このほか、培養脾細胞の上清にサイトカイン分析を実施した。ＭａｌＸまたはγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）ワクチンで刺激した後の脾細胞の上清中のインターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）のレベルが示されている（図１５Ｃ）。γ−ＰＮ＝γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）。
【図１５−２】同上。
【図１５−３】同上。
【図１６】コレラ毒素アジュバントが存在するγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）または存在しない同菌株を鼻腔内にワクチン接種したマウスの血清の未照射Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）細菌全細胞に対する肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）特異的抗体応答を測定したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。γ−ＰＮ＝γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）。
【図１７】鼻腔内にγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種し、致死量の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９株による抗原刺激を実施した野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスの生存率のパーセントを示すグラフである。抗原刺激の２４時間前、抗原刺激の６時間後および抗原刺激の４８時間後、マウスにＩＦＮ−γもしくはＩＬ−１７に対する中和抗体または関連するアイソタイプ対照抗体を注射した。＊Ｐ＝＜０．０５、＊＊Ｐ＝＜０．０１；γ−ＰＮ＝γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）。
【図１８】生きた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９による抗原刺激の２４時間後および４８時間後に誘導された肺のＴエフェクター細胞（Ｔｈ１およびＴｈ１７）、γδＴ細胞（γδＴ１およびγδＴ１７）および貪食細胞（マクロファージおよび好中球）の総数を、γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウスと未ワクチン接種マウスとで比較した図である。
【図１９−１】菌株Ｄ３９、Ｒｘ１、Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）およびＲｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）のＰＣＲおよびウエスタンブロット分析の結果を示す図である。このほか、Ｒｘ１、Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）およびＲｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）の増殖が示されている。ＰＣＲでは、ｐｌｙ遺伝子、ｌｙｔＡ遺伝子およびｐｓａＡ遺伝子の遺伝子座を増幅した（図１９Ａ）。ウエスタンブロットには、Ｐｌｙ、ＬｙｔＡおよびＰｓａＡに対する抗血清を用いた（図１９Ｂ）。増殖には、細菌をＳＩＬＡＣ  ＲＰＭＩ１６４０  Ｆｌｅｘ培地（グルコース添加）に０．０５のＡ６００で播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で静的に培養した（図１９Ｃ）。これにより、Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）からｐｓａＡ遺伝子を欠失させてＲｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）を作製することに成功したことが確認されるほか、Ｍｎ２＋を添加していない培地ではＲｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）株が増殖欠陥を示すことがわかる。
【図１９−２】同上。
【図１９−３】同上。
【図２０】ΔｐｓａＡ遺伝子がコードするｍＲＮＡ転写産物の予測二次構造を示す図である。
【図２１−１】ドライアイス上で様々な線量のγ線照射に曝露した肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）の生存能を示すグラフである（図２１Ａ）。照射していない肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）（図２１Ｂ）または２５ｋＧｙで照射した同菌株（図２１Ｃ）の物理的形態の走査型電子顕微鏡画像が示されている。
【図２１−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
定義
本願で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、複数の指示対象を包含する。例えば、「タンパク質」という語句は複数のタンパク質も包含する。
【００７９】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という語の変化形、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などは、それに対応する変化した意味を有する。したがって、例えば、γ線照射連鎖球菌株Ａを「含む」ワクチンは、γ線照射連鎖球菌株Ａのみからなるものであっても、１つまたは複数の追加の成分（例えば、γ線照射連鎖球菌株Ｂ）含むものであってもよい。
【００８０】
本明細書で使用される「複数」という用語は、２以上を意味する。ある特定の態様または実施形態では、複数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１またはそれ以上およびそこに導かれる任意の整数ならびにそこに導かれる任意の範囲を意味し得る。
【００８１】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語の意味には、無毒性であるが、本発明に用いて所望の治療効果を得るのに十分な量の薬剤または組成物が包含される。必要とされる正確な量は、治療する種、対象の年齢および全般的健康状態、治療する病態の重症度、投与する具体的な薬剤、投与様式などの諸因子に応じて対象ごとに異なるものとなる。したがって、全実施形態に適用される正確な「有効量」を明記することは不可能である。しかし、所与の場合に対して、当業者が慣例的な実験のみを用いてしかるべき「有効量」を決定し得る。
【００８２】
本明細書で使用される「光子線」という用語は、γ線およびＸ線の両方を包含することが理解されよう。したがって、「光子線照射（された）」材料は、γ線に曝露され、それにより「γ線照射（された）」状態になった材料、Ｘ線に曝露され、それにより「Ｘ線照射（された）」状態になった材料またはその両方であり得る。単なる非限定的な例として、ある材料を光子線照射（された）状態にするため、材料に少なくとも０．０１ＭｅＶ、少なくとも０．１ＭｅＶ、少なくとも０．５ＭｅＶ、０．０１ＭｅＶ〜０．５ＭｅＶの間、０．０１ＭｅＶ〜１ＭｅＶの間、０．０１ＭｅＶ〜１０ＭｅＶの間、０．５ＭｅＶ〜２０ＭｅＶの間、０．５ＭｅＶ〜１５ＭｅＶの間、０．５ＭｅＶ〜１０ＭｅＶの間、０．５ＭｅＶ〜５ＭｅＶの間、０．５ＭｅＶ〜２ＭｅＶの間または１ＭｅＶ〜２ＭｅＶの間（例えば１．２５ＭｅＶ）のエネルギーの光子線に照射し得る。
【００８３】
本明細書で細菌に関連して使用される「弱毒化」という用語は、その細菌が、投与対象の宿主に免疫応答を誘導するのに十分な期間の間、その宿主で非病原性感染のみを確立することが可能であることを意味することが理解されよう。しかし、その細菌は、長期感染を確立することも、その弱毒化された細菌を投与する非易感染性宿主に有害な病原性感染を確立することもできない。
【００８４】
本明細書で免疫または免疫応答に関連して使用される「誘導する」、「誘導」、「増強する」および「増強」という用語は、存在しないか測定可能であるかを問わない既存のレベルを上回る免疫または免疫応答の増大を指す。
【００８５】
本明細書で使用される「対象」という用語は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類およびげっ歯類の種を含めた経済、社会または研究に重要な任意の動物を包含する。したがって、「対象」は哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ブタ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマまたはヒツジ）などであり得る。この用語の範囲にはほかにも、実験動物（例えば、げっ歯類、ウサギなど）、鳥類（例えば、家禽）、魚類および甲殻類が包含される。
【００８６】
本明細書で所与の感染症および／または感染によって生じる疾患もしくは病態に関連して使用される「予防する」、「予防」および「予防すること」という用語は、対象が、感染症、疾患または病態の原因となる病原性生物に曝露されても、その感染症および／または疾患もしくは病態を発現する傾向が小さいことを意味することが理解されよう。感染症および／または疾患もしくは病態を発現する傾向が小さいことは、傾向の減少および傾向の欠如の両方を包含することが理解されよう。
【００８７】
本明細書で所与の感染症および／または感染によって生じる疾患もしくは病態に関連して使用される「治療する」および「治療すること」という用語は、対象に感染している病原性生物の数を減少させることならびに／あるいは感染症の任意の症状および／または感染によって生じる疾患もしくは病態の症状を軽減することを包含することが理解されよう。
【００８８】
本明細書で記載される数値に関して「約」という用語を使用する場合、その記載される数値およびその記載される値の±１０％以内の数値がこれに包含されることが理解されよう。
【００８９】
ある範囲の数値に言及する際に「〜の間」という用語を使用する場合、範囲の各終点の数値がこれに包含されることが理解されよう。例えば、長さ１０残基〜２０残基の間のポリペプチドには、長さ１０残基のポリペプチドおよび長さ２０残基のポリペプチドが包含される。
【００９０】
本明細書の先行技術に関する資料の任意の記載または本明細書でその資料から導かれるかその資料に基づく意見は、その資料またはそこから導かれる意見が関連技術分野の一般的な知識の一部であることを認めるものではない。
【００９１】
説明を目的として本明細書で言及される資料はいずれも、特に明記されない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９２】
（詳細な説明）
以下の詳細な説明は、当業者が本発明を実施することが可能な程度に詳細に本発明の例示的実施形態を伝えるものである。記載される様々な実施形態の特徴も制約も、必ずしも本発明の他の実施形態または本発明全体を限定するものではない。したがって、以下の詳細な説明は、請求項によって定められる本発明の範囲を限定するものではない。
【００９３】
連鎖球菌感染症に対して現在用いられているワクチンは一般に、複数の血清型由来の精製莢膜多糖体を含有する（最新のＰＣＶ２３ワクチンは２３の血清型由来の多糖体を含有する）多糖体ワクチンまたはジフテリアトキソイドをはじめとする非連鎖球菌起源のタンパク質抗原とコンジュゲートした莢膜多糖体を含有するコンジュゲートワクチンである。多糖体ワクチンに付随する重要な問題として血清型置換があるほか、コンジュゲートワクチンは多糖体ワクチンによってカバーされる一部の血清型に対してのみ免疫を誘導する。例えば、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）には９０を超える血清型が認められており、そのほとんどが疾患の原因となることがわかっている。したがって、特定の病原性菌種に含まれる連鎖球菌種および／または連鎖球菌血清型の大部分に対する幅広い免疫を確立するには、現在入手可能な連鎖球菌ワクチンによって誘導される免疫では不十分である。ウイルスとは対照的に、安全な弱毒化生細菌ワクチンの作製は困難である。遺伝子数を比較すると細菌の方がはるかに多く、このため、ワクチン受容者に投与した後に変異細菌／弱毒化細菌が病原型に復帰変異しないようにするのがより困難である。このほか、生細菌ワクチンは、易感染性患者、例えば悪性腫瘍に対する化学療法を受けている患者、ＨＩＶ患者および若年または高齢の対象などに投与するのには適さない。このような患者は、様々な形態の連鎖球菌感染症に感染しやすいが、いかなる形態の弱毒化生連鎖球菌ワクチンの投与からも事実上除外される。
【００９４】
本発明は、異なる連鎖球菌種および／または異なる連鎖球菌血清型に対して異型免疫を誘導することが可能なワクチン（本明細書では「本発明のワクチン」とも呼ばれる）を提供する。このワクチンは殺菌した連鎖球菌を含有するため、弱毒生ワクチンによって生じる可能性のある問題点を緩和する。このワクチンはほかにも、広範囲の連鎖球菌種および／または連鎖球菌血清型に対して免疫を誘導することが可能であるため、血清型置換が及ぼす可能性のある影響を軽減する。
【００９５】
本明細書にはこのほか、本発明のワクチンならびにこのワクチンを含む薬物および医薬組成物を製造する方法が提供される。
【００９６】
本発明はこのほか、対象の連鎖球菌感染症を予防または治療する方法に関する。この方法は、対象に本発明のワクチンを投与することを含む。このワクチンは予防目的で投与しても治療目的で投与してもよい。この方法は、対象に複数の異なる連鎖球菌種および／または連鎖球菌サブタイプに対する異型免疫を誘導し得る。
【００９７】
必要とされる限定ではないが、本発明のワクチンは、粘膜表面用に製剤化し、粘膜表面から投与するのが好ましい。例えば、ワクチンを鼻腔内に投与してもよく、ある特定の実施形態では、これにより、標的とする特定の疾患または病態に応じて、より効果的な免疫応答が刺激され得る。
【００９８】
連鎖球菌ワクチン調製物
−連鎖球菌株
本発明のワクチンは、弱毒化または完全に殺菌された連鎖球菌およびγ線照射への曝露によって弱毒化または完全に殺菌されたその派生株を土台とするものである。連鎖球菌は、宿主生物に有害な感染を確立することが可能な病原性細菌であり得る。本発明のワクチンは、光子線（例えば、γ線および／またはＸ線）への曝露によって弱毒化または殺菌した異なる連鎖球菌の組合せ、例えば異なる連鎖球菌種の組合せおよび／または同じ連鎖球菌種内の異なる連鎖球菌血清型の組合せを含めた組合せを含み得る。
【００９９】
連鎖球菌は、例えば、十分に特徴が明らかにされている溶血特性またはγ溶血性連鎖球菌の場合はその欠如に従って分類されるα溶血性、β溶血性またはγ溶血性の連鎖球菌であり得る。
【０１００】
適切なα溶血性連鎖球菌の非限定的な例としては、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および緑色連鎖球菌（例えば、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、Ｓ．ミティス（Ｓ．ｍｉｔｉｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．ソブリナス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、Ｓ．ミレリ（Ｓ．ミレリ（Ｓ．ｍｉｌｌｅｒｉ）））が挙げられる。本発明の範囲内に含まれるものとしてほかにも、上記の連鎖球菌種の個々の血清型がある。
【０１０１】
適切なβ溶血性連鎖球菌の非限定的な例としては、細胞壁の細菌抗原（多糖）の炭水化物組成に基づくランスフィールド分類法で分類されるもの（Ａ〜Ｈ群、Ｌ群、Ｎ群およびＲ／Ｓ群）が挙げられる。例えば、β溶血性細菌としては、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群）、Ｓ．エクイシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）（Ｃ群）、Ｓ．エクイ（Ｓ．ｅｑｕｉ）（Ｃ群）、Ｓ．ズーエピデミカス（Ｓ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）（Ｃ群）、Ｓ．ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｃ群）、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ｄ群）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（Ｄ群）、Ｓ．ミレリ（Ｓ．ミレリ（Ｓ．ｍｉｌｌｅｒｉ））（Ｅ群）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（Ｅ群）、Ｓ．アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（Ｆ群）、Ｓ．カニス（Ｓ．ｃａｎｉｓ）（Ｇ群）、Ｓ．ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｇ群）、Ｓ．サングイス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）（Ｈ群）、Ｓ．ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｌ群）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（Ｎ群）およびＳ．スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）（Ｒ／Ｓ群）のいずれか１つまたは複数のものが挙げられる。本発明の範囲内に含まれるものとしてほかにも、上記の連鎖球菌種の個々の血清型がある。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１つまたは複数の血清型を含む。したがって、ワクチンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆおよび／または４８のいずれか１つまたは複数のものを含み得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆのいずれか１つまたは複数のものを含み得る。
【０１０４】
−連鎖球菌派生株
本発明のワクチンは、光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）連鎖球菌派生株を含み得る。連鎖球菌派生株は、人為的遺伝子操作によって生じた組換え型の連鎖球菌または天然変異型の連鎖球菌であり得る。特定のものに限定されるわけではないが、連鎖球菌派生株は、病原性を低下させる１つまたは複数の遺伝子改変を含み得る。
【０１０５】
単なる非限定的な例として、連鎖球菌派生株は、莢膜遺伝子座（ｃｐｓ）を破壊または除去する遺伝子変異を含み得る。例えば、莢膜産生を阻害、破壊または修正するたに（例えば、組換えなどによって）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のｃｐｓＡ遺伝子，ｃｐｓＢ遺伝子，ｃｐｓＣ遺伝子，ｃｐｓＤ遺伝子および／またはｃｐｓＥ遺伝子あるいは他の連鎖球菌種の相同遺伝子のいずれか１つまたは複数のものを改変し得る。あるいは、連鎖球菌派生株は、上記のものをはじめとする遺伝子に、天然の非莢膜型連鎖球菌が生じる自然発生的変異があるものであり得る。連鎖球菌派生株は、莢膜遺伝子座の全部または少なくとも一部を欠くものであり得る。いくつかの実施形態では、莢膜を欠く連鎖球菌派生株は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１株またはＲｘ１派生株である。
【０１０６】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、連鎖球菌派生株は、他の標的タンパク質の産生または活性を低下させるか阻害する遺伝子変異を含み得る。単なる非限定的な例として、コリン結合タンパク質をコードする１つもしくは複数の遺伝子；自己溶菌酵素をコードする１つもしくは複数の遺伝子（例えば、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のｌｙｔＡ、ｌｙｔＢ、ｌｙｔＣもしくは他の連鎖球菌の相同遺伝子）；成長のための栄養素／補因子（例えば、金属イオン）要求性を付与する１つもしくは複数の遺伝子（例えば、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のｐｓａＡもしくは他の連鎖球菌の相同遺伝子；防御抗原をコードする１つもしくは複数の遺伝子（例えば、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のｐｓｐＡもしくは他の連鎖球菌の相同遺伝子）；および／または毒性決定因子もしくは毒性調節因子をコードする１つもしくは複数の遺伝子（例えば、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のｃｏｄＹ、ｃｏｍＣ、ｃｏｍＤ、ｃｐｓ２Ａ、ｃｓｐ４Ａ、ｇｌｐＯ、ｍｇｒＡ、ｎａｎＡ、ｎａｎＢ、ｐａｖＡ、ｐｃｐＡ、ｐｈｔＡ、ｐｈｔＢ、ｐｈｔＤ、ｐｈｔＥ、ｐｉｕＡ、ｐｉａＡ、ｐｌｙ、ｐｒｔＡ、ｐｓａＡ、ｐｓｒＰ、ｒｒｇＡ、ｒｒｇＢ、ｓｐｘＢおよび他の連鎖球菌の上記遺伝子のホモログ）に遺伝子変異が存在し得る。
【０１０７】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、連鎖球菌派生株は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの病原性および／または成長が低下した栄養要求株を生じる遺伝子変異を含み得る。単なる非限定的な例として、チミジル酸合成酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子に遺伝子変異が存在し得る。
【０１０８】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、連鎖球菌派生株は、同じ種であるが血清型が異なる連鎖球菌；異なる種の連鎖球菌；非連鎖球菌；あるいはヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ブタ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマまたはヒツジ）；実験動物（例えば、げっ歯類またはウサギ）；鳥類；および／または組換え連鎖球菌を投与する対象の１つまたは複数の（外部）遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外部遺伝子は、１つまたは複数の内在遺伝子（例えば、直前の段落に記載したいずれか１つまたは複数の遺伝子）を破壊するか、他の方法で不活性化する。他の実施形態では、１つまたは複数の外部遺伝子は、内在遺伝子を破壊も不活性化もしない。単なる非限定的な例として、１つまたは複数の外部遺伝子は、連鎖球菌派生株を投与する対象の免疫応答を誘導または増強するタンパク質をコードする。免疫応答は、自然免疫応答、適応免疫応答またはその両方であり得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外部遺伝子は、免疫調節因子（例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗体、融合タンパク質、ペプチド、タンパク質および／またはホルモン）をコードする。他の実施形態では、１つまたは複数の外部遺伝子は、別の異なる科の細菌の抗原（例えば、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）抗原、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）抗原、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）抗原）、ウイルス抗原（例えば、アデノウイルス抗原、コロナウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、ライノウイルス抗原、呼吸合包体ウイルスウィルス抗原、ＨＩＶ抗原、肝炎ウイルス抗原またはヘルペスウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、パピローマウイルスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原）、真菌／酵母抗原、蠕虫抗原および／または原生動物抗原を含み得る。
【０１０９】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、連鎖球菌派生株は、細菌に１つまたは複数の標的遺伝子を過剰発現させる遺伝子変異を含み得る。この文脈での「過剰発現」は、同じ生物学的条件下で対応する連鎖球菌に遺伝子改変のない同じ遺伝子を発現させた場合よりも高い発現レベルを意味することが理解されよう。所与の標的遺伝子の過剰発現は、例えば、投与する連鎖球菌派生株の親株である連鎖球菌株および／またはその連鎖球菌派生株そのものに対して対象の免疫応答を誘導または増強し得る。単なる非限定的な例として、遺伝子変異は、補体系を活性化することが可能なタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子（例えば、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のｃｂｐＡ、ｐｓｐＡ、ｐｌｙまたは他の連鎖球菌の上記遺伝子のホモログ）の連鎖球菌派生株での産生を増大させ得る。
【０１１０】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、連鎖球菌派生株は、ＤＮＡ修復能の欠陥を引き起こす遺伝子変異を含み得る。光子線照射（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射）され、光子線照射によってＤＮＡ損傷の修復能が低下した連鎖球菌派生株を含むワクチンの使用は、弱毒化または不活化に必要な光子線照射量を抑えることができると同時に、逆にワクチンの有効性および安全性が増大させることができる限りにおいて有利であり得る。いくつかの実施形態では、連鎖球菌派生株は、ミスマッチ修復系のタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子（例えば、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のｈｅｘＡ遺伝子座または他の連鎖球菌のこの遺伝子座のホモログ）の発現を妨害または不活性化する遺伝子変異を含む。他の実施形態では、連鎖球菌派生株は、ＤＮＡアルキル化修復タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子（例えば、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＤＮＡポリメラーゼ４、ｈｅｘＡ、ｈｅｘＢ、ｍｕｔＳ、ｒａｄＣ、ｒｅｃＡ、ｒｅｃＦ、ｒｅｃＮ、ｒｅｃＯ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤまたは他の連鎖球菌の上記遺伝子のホモログ）の発現を妨害または不活性化する遺伝子変異を含む。
【０１１１】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、連鎖球菌派生株は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生を促進する遺伝子変異を含み得る。ｄｓＲＮＡはｍＲＮＡまたはｔＲＮＡであり得る。特に限定されるわけではないが、ｄｓＲＮＡの長さは、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、３５塩基対、４０塩基対、４５塩基対、５０塩基対、５５塩基対、６５塩基対または７０塩基対を上回るものであり得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、ｄｓＲＮＡの長さは、約１０〜約７０塩基対（ｂｐ）の間；約１０〜約５０塩基対（ｂｐ）の間；約１０〜約３０塩基対（ｂｐ）の間；約２０〜約７０塩基対（ｂｐ）の間；約２０〜約６０塩基対（ｂｐ）の間；約２０〜約５０塩基対（ｂｐ）の間；約２０〜約４０塩基対（ｂｐ）の間；約２０〜約３０塩基対（ｂｐ）の間；約３０〜約７０塩基対（ｂｐ）の間；約４０〜約７０塩基対（ｂｐ）の間；約５０〜約７０塩基対（ｂｐ）の間；約６０〜約７０塩基対（ｂｐ）の間；約３０〜約６０塩基対（ｂｐ）の間；約３０〜約５０塩基対（ｂｐ）の間；または約３０〜約４０塩基対（ｂｐ）の間であり得る。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、別の状態では一本鎖であるさらに大きいＲＮＡ分子の構成要素である。さらに大きいＲＮＡ分子は、複数のｄｓＲＮＡを構成要素として含み得る。ｄｓＲＮＡは、さらに大きいＲＮＡ分子の内部構成要素または末端構成要素であり得る。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、終止ステムループ配列を含み得る。ｄｓＲＮＡは、さらに大きいＲＮＡ分子内の自己相補性領域から生じるものであり得る。１つまたは複数の自己相補性領域を含み、それにより転写時にｄｓＲＮＡ部分が生じるように、連鎖球菌派生株の所与の遺伝子内のコード領域（１つまたは複数）／エキソン（１つまたは複数）を設計することができる。
【０１１２】
ｄｓＲＮＡは、連鎖球菌派生株を投与する対象の細胞に発現するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）タンパク質が認識することが可能なものであり得る。ＴＬＲタンパク質は、細胞の小胞体および／またはエンドソーム区画内に位置し得る。ＴＬＲタンパク質はＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）タンパク質であり得る。特に限定されないが、細胞は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞および／または樹状細胞のいずれか１つまたは複数のものであり得る。ｄｓＲＮＡがＴＬＲ３タンパク質に認識されることによって、対象に免疫応答が誘導され得る。免疫応答は自然免疫応答であり得る。免疫応答は、１型インターフェロン応答であり、かつ／または炎症性サイトカインの放出を含むものであり得る。
【０１１３】
本発明のワクチンに使用する連鎖球菌派生株は一般に、それが由来する親菌株との遺伝的類似性が極めて高い。非限定的な例として、本明細書で言及される「連鎖球菌派生株」は、それが由来する親連鎖球菌株との配列相同性が７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を上回るものであり得る。さらなる非限定的な例として、本明細書で言及される「連鎖球菌派生株」は、その対応する親菌株と比較したとき、１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ以上の遺伝子または上記の遺伝子の発現に必要な制御配列に遺伝子変異を含み得る。遺伝子変異は、問題の１つまたは複数の遺伝子の発現を増大させるか、減少させるか、阻害し得る。
【０１１４】
非限定的な一実施形態では、連鎖球菌派生株はＲｘ１株であり得る。Ｒｘ１派生株の自己溶菌酵素遺伝子（ｌｙｔＡ）を欠失させるか、非機能性にし得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、Ｒｘ１派生株のニューモリシン遺伝子（ｐｌｙ）を欠失させるか、非機能性にし得る。例えば、ｐｌｙ遺伝子をトキソイド型のｐｌｙなどの別の遺伝子に置換し得る。
【０１１５】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、肺炎球菌表面抗原Ａ遺伝子（ｐｓａＡ）を欠失させるか、別の方法で非機能性にし得る。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のｐｓａＡ遺伝子は、Ｍｎ２＋輸送および酸化ストレス耐性に関与する肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓａＡ）をコードする。本明細書に記載されるｐｓａＡ欠失変異株は、低Ｍｎ２＋環境中での成長および／または肺炎球菌コンピテンスに欠陥のあるものであり得る。非限定的な実施形態では、Ｒｘ１のｐｓａＡ欠失変異株（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）を用いて、毒性、コンピテンスおよび／または低Ｍｎ２＋環境中での成長が低下したワクチン候補Ｒｘ１株（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）を作製し得る。上記の特徴によって、Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）にバイオセキュリティーおよびバイオセーフティーがさらに加わり、γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ワクチンの調製に適したワクチン候補となり得る。さらに、Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）をＭｎ２＋ストレス条件下、発酵槽で成長させると、遺伝子発現に変化が誘発されて防御抗原の産生レベルが増大し得る。このように、防御抗原の発現レベルを高めたワクチン製品を使用することによって防御レベルの改善がもたらされ得る。
【０１１６】
細菌の遺伝子操作の技術は当業者に周知である（例えば、Ｖｅｎｎｉｓｏｎ  「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，ＰＨＩ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．，２０１０；ＺｙｓｋｉｎｄおよびＢｅｒｎｓｔｅｉｎ，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１４；Ｂｏｓｅ，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」の「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第１１０６巻，ｐ．１０１−１１１，２０１４；ＨａｋｅｎｂｅｃｋおよびＣｈｈａｔｗａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ」，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００７；Ｍｏｒｏｎａら，「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｔｈａｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇｅｎｅｓ  ｃｐｓＡ，ｃｐｓＢ  ａｎｄ  ｃｐｓＤ  ｈａｖｅ  ｏｎ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８９：１９０５−１９１３，２００４；Ｍｏｒｏｎａら，「Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ［ＹＧＸ］４  ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＣｐｓＤ，ａｎ  ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｎｇ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ」，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：３００９−３０１９，２００３；ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｓａ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：８８９−９０１，２００４；Ｍａｈｄｉら，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２２：２２０８−２２２０，２０１２を参照されたい）。
【０１１７】
光子線照射
本発明のワクチン中の連鎖球菌およびその派生株は、光子線に曝露されたものであり得る。上記のように、「光子線」という用語はγ線およびＸ線の両方を包含すると理解される。したがって、「光子線照射された」連鎖球菌またはその派生株は、γ線への曝露によって「γ線照射された」もの、Ｘ線への曝露によって「Ｘ線照射された」ものまたはその両方であり得る。当業者に公知のように、Ｘ線は、放射性崩壊時に核そのものから放射されるのではなく、電子が核の電場を通過することによって放射される点を除けば、γ線と同じものである。単なる非限定的な例を挙げれば、ある材料を光子線照射された状態するため、その材料に少なくとも０．０１ＭｅＶ、少なくとも０．１ＭｅＶ、少なくとも０．５ＭｅＶ、０．０１ＭｅＶ〜０．５ＭｅＶ、０．０１ＭｅＶ〜１ＭｅＶ、０．０１ＭｅＶ〜１０ＭｅＶ、０．５ＭｅＶ〜２０ＭｅＶ、０．５ＭｅＶ〜１５ＭｅＶ、０．５ＭｅＶ〜１０ＭｅＶ、０．５ＭｅＶ〜５ＭｅＶ、０．５ＭｅＶ〜２ＭｅＶまたは１ＭｅＶ〜２ＭｅＶ（例えば、１．２５ＭｅＶ）の間のエネルギーの光子線を照射し得る。
【０１１８】
本発明のワクチン中の連鎖球菌およびその派生株は、γ線照射されたものであり得る。任意の適切なγ線源を使用し得る。適切なγ放射体としては、特に限定されないが、Ｂａ１３７、Ｃｏ６０、Ｃｓ１３７、Ｉｒ１９２、Ｕ２３５、Ｓｅ７５およびＹｂ１６９が挙げられる。
【０１１９】
連鎖球菌およびその派生株のγ線照射は、市販の装置、例えば、Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ社（カナダ）製のＧａｍｍａｃｅｌｌ照射装置（例えば、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ４０照射装置、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ２２０照射装置、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  １０００照射装置，Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ３０００照射装置）、Ｊ．Ｌ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（サンフェルナンド、カリフォルニア州、米国）社製のγ線照射装置またはＮｏｒｄｉｏｎ社（カナタ、オンタリオ州、カナダ）製のＮｏｒｄｉｏｎ  Ｇａｍｍａ  Ｃｅｌｌ−１０００照射装置を用いて実施し得る。その他の適切な装置については、例えば、米国特許第３，５５７，３７０号および米国特許第３，５６７，９３８号に記載されている。
【０１２０】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、本発明のワクチン中の連鎖球菌およびその派生株は、Ｘ線照射されたものであり得る。任意の適切なＸ線源を使用し得る。適切なＸ線源としては、特に限定されないが、ＩＢＡ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ社（ルーヴァン・ラ・ヌーヴ、ベルギー）製のｅＸｅｌｉｓ（登録商標）殺菌Ｘ線機器が挙げられる。その他の適切な装置としては、例えば、Ｒａｄ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（スワニー、ジョージア州、米国）社製のＲＳ２４００（登録商標）およびＲＳ３４００（登録商標）が挙げられる。
【０１２１】
連鎖球菌およびその派生株は一般に、細菌／派生株を弱毒化または不活化するのに十分な線量の光子線（例えば、γ線および／またはＸ線）に曝露する。光子線照射の線量は、実質的に抗原（例えば、表面抗原）の構造を破壊せずに細菌およびその派生株を弱毒化または不活化するのに十分なものでるのが好ましい。したがって、光子線照射された細菌およびその派生株によって抗原決定基の免疫原性が保持され得る。処理する全細菌／派生株を抗原決定基の構造的完全性に悪影響を及ぼさずに曝露できるよう十分な時間にわたって、十分なレベルの線量で光子線を照射するのが好ましい。
【０１２２】
当業者に公知のように、吸収線量の尺度の１つにグレイ（Ｇｙ）があり、これは、質量１キログラムに蓄積された１ジュールのエネルギーと定義される。この尺度の古い単位の１つに「放射線吸収線量」を表すｒａｄがあり、１Ｇｙ＝１００ｒａｄである。
【０１２３】
本発明に従って使用する連鎖球菌およびその派生株を約１×１０３ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ（または約１０Ｇｙ〜約２×１０４ｋＧｙ）の範囲の総線量の光子線（例えば、γ線および／またはＸ線）に曝露し得る。本発明のある特定の実施形態では、連鎖球菌またはその派生株を総線量約１×１０３ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０９ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０８ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０７ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０６ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０５ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０４ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０４ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０５ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０６ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０７ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０８ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄまたは約１×１０９ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄの間のＸ線および／またはγ線に曝露する。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施形態では、連鎖球菌またはその派生株を約６．５×１０４ｒａｄ〜２×１０７ｒａｄ（０．６５ＫＧｙ〜２００ｋＧｙ）の間の総線量の光子線（例えば、Ｘ線および／またはγ線）に曝露する。本発明の他の実施形態では、連鎖球菌またはその派生株を総光子線量約１０ｋＧｙ〜１２ｋＧｙ、約１２ｋＧｙ〜１４ｋＧｙ、約１４ｋＧｙ〜１６ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜２０ｋＧｙ、約１４ｋＧｙ〜２０ｋＧｙ超、１０超約１２ｋＧｙ〜１４ｋＧｙ、１２ｋＧｙ超、１４ｋＧｙ超、１６ｋＧｙ超、１８ｋＧｙ超、２０ｋＧｙ超、１．２６×１０６ｒａｄ（１２．６ｋＧｙ）、総光子線量約１×１０６ｒａｄ（約１０ｋＧｙ）の光子線または総光子線量１×１０５ｒａｄ（１ＫＧｙ）に曝露する。
【０１２５】
光子線（例えば、γ線および／またはＸ線）の至適線量は、連鎖球菌またはその派生株が存在する培地、処理する細菌／派生株の量および／または処理するサブタイプもしくは菌株などの因子の影響を受け得る。したがって、処理の効果を増大させるよう光子線の総線量、曝露時間および／または曝露時間にわたって照射する光子線のレベルを至適化し得る。
【０１２６】
光子線（例えば、γ線および／またはＸ線）の総線量を一定時間にわたって連鎖球菌またはその派生株に累積的に照射し得る。例えば、総線量よりも低いレベルの光子線を必要な光子線の総線量に達するのに十分な時間にわたって細菌／派生株に照射し得る。
【０１２７】
一実施形態では、連鎖球菌またはその派生株の調製物を光子線（例えば、γ線および／またはＸ線）に曝露する間、これを凍結状態および／または凍結乾燥状態で維持する。これにより、抗原の生物学的完全性の保存が促進され、抗原の不必要な損傷が回避され、それにより、光子線照射された細菌調製物の免疫原性、特に、例えば異種サブタイプに対する交差反応性／交差防御免疫性を誘発する能力が増大し得る。凍結および／または凍結乾燥した連鎖球菌またはその派生株の調製物の処理には一般に、１０〜２０ｋＧｙ（例えば、１０ｋＧｙ超、１２Ｇｙ超、１４Ｇｙ超、１６Ｇｙ超または１８ｋＧｙ超）の光子線が効果的であり得る。
【０１２８】
上記のように、光子線処理は、実質的に細菌抗原の構造を破壊せずに細菌／派生株を不活化するのに十分なものであるのが好ましい。連鎖球菌またはその派生株の弱毒化および／または不活化は、当該技術分野で一般に知られている方法を用いて評価し得る。
【０１２９】
例えば、光子線（例えば、γ線および／またはＸ線）で処理した後に寒天培地上にコロニーを形成する生存細菌の数（すなわち、コロニー形成単位）を求めることによって細菌の弱毒化および／または不活化を評価することができる。
【０１３０】
抗原決定基の完全性は、例えば、表面成分のウエスタンブロット、ＦＡＣＳ解析または酵素アッセイを用いて、精製した未変性抗原成分に対する単一特異性抗血清のパネルとの反応性によって評価することができる。
【０１３１】
予防法および利用法
本発明は、対象の連鎖球菌感染症を予防する予防法を提供する。このほか、対象の連鎖球菌感染症を治療する治療法が提供される。この方法は、光子線照射された連鎖球菌および／またはその派生株を、例えば本発明のワクチンの形態で、対象に投与することを含む。光子線照射された連鎖球菌および／またはその派生株は、γ線、Ｘ線またはその両方を照射されたものであり得る。
【０１３２】
この方法は、対象の連鎖球菌に対する免疫応答を誘導または増強する。免疫応答は、複数の血清型の連鎖球菌に対する免疫応答を誘導または増強し得る限り、交差反応性／異種性であってよい。この方法はほかにも、複数の異なる光子線照射された（例えば、γ線照射、Ｘ線照射またはその両方を照射された）連鎖球菌種またはその派生株を投与して、複数の種の連鎖球菌およびその様々な血清型に対する免疫を生じさせることを含み得る。
【０１３３】
この方法は、以下に挙げる連鎖球菌種のいずれか１つまたは複数のものに対する免疫応答を誘導または増強し得る：ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・カニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）、Ｓ．ミレリ（Ｓ．ｍｉｌｌｅｒｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）およびストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、この方法は、所与の連鎖球菌種を原因とする連鎖球菌感染症を、対象に光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）同じ連鎖球菌種の調製物を投与することによって予防または治療することを含む。感染症の原因となる連鎖球菌種の血清型は、投与する光子線照射連鎖球菌種の血清型と異なるものであり得る。
【０１３５】
単なる非限定的な例を挙げれば、この方法を用いて以下のものを予防または治療し得る：
（ｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｉｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）血清型（１つまたは複数）と投与することによって、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｉｉｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・カニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・カニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・カニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｉｖ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・ディスガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・ディスガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・ディスガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｖ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｖｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｖｉｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｖｉｉｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｉｘ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のフェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたフェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｘ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のフェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたフェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｘｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｘｉｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・ミレリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｌｌｅｒｉ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・ミレリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｌｌｅｒｉ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・ミレリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｌｌｅｒｉ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｘｉｉｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｘｉｖ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射された肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｘｖ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数の化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射された化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｘｖｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｘｖｉｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；
（ｘｖｉｉｉ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る；ならびに／あるいは
（ｘｉｘ）光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数のストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）の血清型（１つまたは複数）を投与することによって、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）のいずれか１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療し得る。投与する光子線照射されたストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、この方法を用いて、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療する。この方法は、光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）１つまたは複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型を対象に投与することによって、対象に複数の異なる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型に対する免疫応答を誘導することを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）単一の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型を投与することを含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、この方法は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１つまたは複数の血清型を原因とする感染症、疾患または病態を予防または治療することを含む。この方法は、光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）少なくとも１つの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型を対象に投与することを含み、対象に肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆおよび／または４８のいずれか１つまたは複数のものに対する免疫応答を誘導し得る。いくつかの実施形態では、この方法は、対象に肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆのいずれか１つまたは複数のものに対する免疫応答を誘導し得る。投与する光子線照射された肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型（１つまたは複数）は、感染症、疾患または病態の原因となる血清型（１つまたは複数）と異なるものであり得る。
【０１３８】
疾患または病態は、連鎖球菌の特定の種または血清型の感染を原因とする任意の疾患または病態であり得る。単なる非限定的な例を挙げれば、疾患または病態は、肺炎、耳感染症、耳痛、中耳感染症、中耳炎、副鼻腔炎、髄膜炎、結膜炎、菌血症、敗血症、関節感染症、骨感染症、化膿性関節炎、骨髄炎、軟部組織感染症、蜂巣炎、筋炎、眼窩周囲蜂巣炎、膿瘍、腹膜炎、心感染症、心内膜炎および心外膜炎のいずれか１つまたは複数のものであり得る。
【０１３９】
対象は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類およびげっ歯類の種を含めた経済、社会または研究に重要な任意の動物であり得る。したがって、対象は、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ブタ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマまたはヒツジ）などの哺乳動物であり得る。対象は、実験動物（例えば、マウス、ラットまたはモルモットなどのげっ歯類；ウサギなど）、鳥類（例えば、家禽）、魚類または甲殻類であり得る。
【０１４０】
光子線照射された（例えば、γ線照射および／またはＸ線照射された）連鎖球菌および／またはその光子線照射された派生株は、例えば非経口経路（例えば、真皮内，静脈内，脊髄内，腹腔内，皮下または筋肉内），経口経路，局所経路または粘膜経路（例えば、鼻腔内）を含めた任意の適切な経路によって対象に投与し得る。いくつかの実施形態では、投与は粘膜経路によるものである。例えば、投与は鼻腔内投与であり得る。
【０１４１】
特定の作用機序（１つまたは複数）に限定されるわけではないが、この方法は、
（ｉ）感染症、疾患または病態の原因となる連鎖球菌の抗原（１つまたは複数）と特異的に結合する抗体の産生；
（ｉｉ）感染症、疾患または病態の原因となる連鎖球菌の抗原（１つまたは複数）に特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球応答；
（ｉｉｉ）感染症、疾患または病態の原因となる連鎖球菌の抗原（１つまたは複数）に特異的なＣＤ８＋Ｔリンパ球応答
のうち１つまたは複数のものを含む免疫応答を対象に誘導し得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、この方法は、対象にインターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）依存性であり得る免疫応答、ＩＬ−１７Ａ非依存性であり得る免疫応答ならびに／あるいはサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）の産生および／またはＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ−３）の活性化を含めた自然免疫系の活性化を含む免疫応答を誘導し得る。このことは、Ｂ細胞の活性化閾値を低下させ、かつ／または目的の抗原に対する抗体応答の質または量を増強するのを補助し得る。
【０１４３】
単なる非限定的な例を挙げれば、この方法によって誘導または増強される対象の免疫応答は、適切な対照と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍または少なくとも約１００倍増大し得る。適切な対象は、例えば、ほかの点では同じ条件下、実質的に同一の条件下または同一条件下で、この方法を実施する前に得た同じ免疫応答の測定結果であり得る。
【０１４４】
免疫応答を検出および定量化する方法は当業者に周知であり、例えば、固相不均一法（例えば、酵素結合免疫測定法）、液相法（例えば、電気化学発光法）、増幅発光近接均一法（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色、機能的Ｔ細胞アッセイ、機能的Ｂ細胞アッセイ、機能的単球−マクロファージアッセイ、樹状細胞および細網内皮細胞アッセイ、ＮＫ細胞応答の測定、酸化バーストアッセイ、細胞傷害性特異的細胞溶解アッセイ、五量体結合アッセイならびに食作用およびアポトーシスの評価がこれに含まれる。
【０１４５】
ワクチン製剤
本明細書に記載される連鎖球菌およびその派生株を医薬組成物に組み込み得る。この組成物は、宿主に疾患または病態に至り得る感染を確立することが可能な病原性生物に対する免疫応答を刺激することができる。したがって、この組成物は、予防ワクチン（すなわち、感染症および／または疾患／病態の予防を目的に投与するワクチン）および治療ワクチン（すなわち、感染症および／または疾患／病態の治療を目的に投与するワクチン）を含めたワクチンとなり得る。したがって、本発明のワクチンは、予防、改善、緩和または治療を目的に受容者に投与され得る。このようなワクチンはいずれも、本明細書で「本発明のワクチン」と呼ばれるものにまとめて包含されることが理解されよう。本発明のワクチンに組み込むのに適した連鎖球菌およびその派生株の非限定的な例が上の「連鎖球菌株」および「連鎖球菌派生株」と題するサブセクションに記載されている。ワクチンの連鎖球菌およびその派生株は、光子線（例えば、γ線および／またはＸ線）によって弱毒化または不活化されている。光子線は、細菌／派生株とほかの試薬（１つまたは複数）とを組み合わせてワクチン製剤にする前、ワクチン製剤にするとき、またはワクチン製剤にした後に細菌／派生株に照射し得る。
【０１４６】
−製剤
本発明のワクチンは、当業者に公知の方法を用いて調製し得る。適切な方法の非限定的な例はＧｅｎｎａｒｏら（編）（１９９０），「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（イーストン、ペンシルベニア州、米国）に記載されており、ワクチンの調製方法はＶｏｌｌｅｒら（１９７８），「Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ（ボルチモア、メリーランド州、米国）に概説されている。
【０１４７】
ワクチンは、薬学的に許容される担体、添加剤、賦形剤および／またはアジュバントを含み得る。本明細書で企図される「薬学的に許容される」担体、添加剤、賦形剤および／またはアジュバントとは、ヒトまたは非ヒト動物などの特定の受容者に投与しても有害反応（１つまたは複数）を引き起こさない物質のことである。薬学的に許容される担体、添加剤、賦形剤およびアジュバントは一般に、ワクチンのほかの成分との適合性もある。適切な添加剤、賦形剤および担体の例は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｅｐｉｅｎｔｓ」第４版（２００３），Ｒｏｗｅら（編），Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎに記載されている。
【０１４８】
薬学的に許容される担体、添加剤または賦形剤の非限定的な例としては、脱塩水または蒸留水；生理食塩水；植物ベースの油、例えばラッカセイ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油またはヤシ油など；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリソルポキサン（ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ  ｐｏｌｙｓｏｌｐｏｘａｎｅ）などのポリシロキサンを含めたシリコーン油；揮発性シリコーン；流動パラフィン、軟パラフィンまたはスクアランなどの鉱油；セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど；低級アルカノール、例えばエタノールまたはイソプロパノール；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールまたはグリセリン；脂肪酸エステル、例えばパルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチルなど；ポリビニルピリドン；寒天；カラゲナン；トラガントゴムまたはアラビアゴムおよび石油ゼリーが挙げられる。担体（１つまたは複数）は通常、組成物の１０重量％〜９９．９重量％を占める。
【０１４９】
本発明のワクチンは、注射による投与に適した形態、経口摂取に適した製剤の形態（例えばカプセル剤、錠剤、カプレット剤、エリキシル剤など）、局所投与に適した軟膏、クリームもしくはローションの形態、点眼剤として送達するのに適した形態、鼻腔内吸入もしくは経口吸入などの吸入による投与に適したエアゾールの形態または非経口投与、すなわち真皮内、皮下、筋肉内もしくは静脈内への注射に適した形態であり得る。
【０１５０】
経口投与用の固体形態のワクチンは、ヒトおよび獣医学の薬務に許容される結合剤、甘味剤、崩壊剤、賦形剤、香味剤、コーティング剤、保存剤、滑沢剤および／または時間遅延剤を含有し得る。適切な結合剤としては、アラビアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールが挙げられる。適切な甘味剤としては、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンが挙げられる。適切な崩壊剤としては、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天が挙げられる。適切な賦形剤としては、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたは第二リン酸カルシウムが挙げられる。適切な香味剤としては、ハッカ油、ウインターグリーン油、チェリー香味剤、オレンジ香味剤またはラズベリー香味剤が挙げられる。適切なコーティング剤としては、アクリル酸および／またはメタクリル酸のポリマーまたはコポリマーおよび／またはそのエステル、ロウ、脂肪アルコール、ゼイン、セラックまたはグルテンが挙げられる。適切な保存剤としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、αトコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは亜硫酸水素ナトリウムが挙げられる。適切な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが挙げられる。適切な時間遅延剤としては、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【０１５１】
経口投与用の液体形態のワクチンは、上記の物質に加えて液体担体を含有し得る。適切な液体担体としては、水、油、例えばオリーブ油、ラッカセイ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、ラッカセイ油、ヤシ油など、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリドまたはその混合物が挙げられる。
【０１５２】
経口投与用のワクチンを含む懸濁剤は、分散剤および／または懸濁化剤をさらに含み得る。適切な懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ポリ−ビニル−ピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはアセチルアルコールが挙げられる。適切な分散剤としては、レシチン、ステアリン酸などの脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、ジオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、ステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、ラウリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ジオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタンまたはラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどが挙げられる。
【０１５３】
ワクチンを注射用液剤または懸濁剤として調製するには、無毒性の非経口的に許容される賦形剤または担体、例えばリンガー溶液、等張食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノールおよび１，２プロピレングリコールなどを使用し得る。
【０１５４】
経口投与用のワクチン乳剤は、１つまたは複数の乳化剤をさらに含み得る。適切な乳化剤としては、上に例示した分散剤または天然ゴム、例えばグアーガム、アラビアゴムもしくはトラガントゴムなどが挙げられる。
【０１５５】
ワクチンの局所製剤は、有効成分（１つまたは複数）（例えば、光子線照射された連鎖球菌および／またはその誘導体）を１つまたは複数の許容される担体および任意選択でほかの任意の治療成分とともに含む。局所投与に適した製剤としては、皮膚から治療が必要な部位への浸透に適した液体または半液体の製剤、例えばリニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤またはパスタ剤のほか、眼球、耳または鼻への投与に適した滴剤が挙げられる。
【０１５６】
滴剤として製剤化する場合、ワクチンは、無菌で水性または油性の液剤または懸濁剤を含み得る。これらは、任意選択で界面活性剤を含む殺菌剤、殺真菌剤および／またはほかの任意の適切な保存剤の水溶液に有効成分を溶かすことによって調製し得る。次いで、得られた溶液をろ過によって清澄化し、適切な容器に移して滅菌する。例えば、ろ過によって滅菌を実施した後、吸引技術によって容器に移し得る。滴剤に含ませるのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例には、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）がある。油性溶液の調製に適した溶媒としては、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。
【０１５７】
ローション剤として製剤化する場合、ワクチンは、皮膚または眼球への適用に適したものを含む。眼球用ローション剤は、任意選択で殺菌剤を含有する無菌水溶液を含んでよく、滴剤の調製に関して上に記載したものと同じ方法によって調製され得る。皮膚に適用するローション剤またはリニメント剤はほかにも、乾燥を促進し皮膚に冷却感を与える物質、例えばアルコールまたはアセトンなどならびに／あるいは保湿剤、例えばグリセロールまたはヒマシ油もしくはラッカセイ油などの油などを含み得る。
【０１５８】
クリーム剤、軟膏剤またはパスタ剤として製剤化する場合、ワクチンは、外用の有効成分の半固形製剤であり得る。これらは、微粉化形態または粉末化形態の有効成分を単独で、または水性液もしくは非水性液の溶液もしくは懸濁液の形で、油脂性基剤または非油脂性基剤と混合することによって作製し得る。基材は、炭化水素、例えば軟パラフィン、硬パラフィン、流動パラフィン、グリセロール、ミツロウ、金属石鹸など；粘質物；天然由来の油、例えばアーモンド油、コーン油、ラッカセイ油、ヒマシ油もしくはオリーブ油など；羊毛脂もしくはその誘導体またはステアリン酸もしくはオレイン酸などの脂肪酸とプロピレングリコールもしくはマクロゴールなどのアルコールを含み得る。
【０１５９】
ワクチンは、任意の適切な界面活性剤、例えば陰イオン性、陽イオン性または非イオン性の界面活性剤、例えばソルビタンエステルもしくはそのポリオキシエチレン誘導体などを含み得る。このほか、懸濁化剤、例えば天然ゴム、セルロース誘導体または無機物質、例えばケイ素質シリカなどおよびほかの成分、例えばラノリンなどを含み得る。
【０１６０】
ワクチンをリポソームの形態で投与してもよい。リポソームは一般に、リン脂質をはじめとする脂質物質に由来し、水性媒体に分散した単層または他重層の水和液晶によって形成される。リポソームを形成することが可能であり、毒性がなく、生理的に許容される代謝可能な任意の脂質を使用することができる。リポソーム形態のワクチンは、安定剤、保存剤、添加剤などを含有し得る。好ましい脂質としてリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）があり、ともに天然および合成のものである。リポソームを形成する方法は当該技術分野で公知であり、これに関連して特にＰｒｅｓｃｏｔｔ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第ＸＩＶ巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６），ｐ．３３以降が参照される。
【０１６１】
−アジュバント
本発明のワクチンにアジュバント（１つまたは複数）が含まれていてもよいが、本明細書に記載する実験データから、光子線照射された連鎖球菌およびその派生株はそのようなアジュバントを必要とせずに免疫を誘導し得ることがわかっている。したがって、本発明のワクチンは、アジュバントを含んでも含まなくてもよい。
【０１６２】
一般に、ワクチン組成物に関連するアジュバント活性には、特に限定されないが、ワクチン中の免疫原成分（例えば、光子線照射された連鎖球菌および／またはその誘導体）によって誘導される免疫応答を（定量的または定性的に）増強する能力が含まれる。この活性により、免疫応答を引き起こすのに必要な免疫原成分の量もしくはレベルが抑えられ、かつ／または所望の免疫応答を引き起こすのに必要な免疫処置の回数もしくは頻度が抑えられ得る。
【０１６３】
好ましくは、アジュバントによって、ワクチンの成分（１つまたは複数）によって誘導および／または増強される免疫応答が増強され、防御効果が向上する。好ましくは、アジュバントによって、ほかの活性成分（１つまたは複数）（例えば、光子線照射された連鎖球菌および／またはその誘導体）の使用量を減らして防御免疫を誘導することが可能になる。
【０１６４】
本発明のワクチンに含めるのに適したアジュバントの非限定的な例およびその調製方法が「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，（２０００），Ｏｈａｇａｎ（編），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．に記載されている。本発明のワクチンには任意の適切なアジュバントを含ませ得る。
【０１６５】
このようなアジュバントの具体例としては、特に限定されないが、水酸化アルミニウム；インターフェロン、インターロイキンをはじめとするサイトカインを含めたポリペプチドアジュバント；ＡＭＰＨＩＧＥＮ、水中油型乳剤および油中水型乳剤；ならびにＱｕｉｌＡなどのサポニンが挙げられる。
【０１６６】
例えば、アルミニウム系アジュバントを使用し得る。適切なアルミニウム系アジュバントとしては、特に限定されないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびその組合せが挙げられる。使用し得るアルミニウム系アジュバントのその他の具体例が欧州特許第１２１６０５３号および米国特許第６，３７２，２２３号記載されている。
【０１６７】
本発明のワクチンのアジュバントとして水中油型乳剤を使用してもよい。水中油型乳剤は当該技術分野で周知である。水中油型乳剤は一般に、代謝可能な油、例えば魚油、植物油または合成油を含む。適切な水中油型乳剤の例としては、欧州特許第０３９９８４３号、米国特許第７，０２９，６７８号および国際公開第２００７／００６９３９号に記載されているものが挙げられる。水中油型乳剤をほかのアジュバントおよび／または免疫刺激剤と組み合わせて使用してもよい。
【０１６８】
その他の適切なアジュバントの非限定的な例としては、免疫刺激物質、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、コレラ毒素（ＣＴ）またはその構成サブユニット、易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）またはその構成サブユニット、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドアジュバント（リポ多糖（ＬＰＳ）およびその誘導体（例えば、モノホスホリルリピドＡおよび３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）など）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト（例えば、ＴＬＲ−２アゴニスト、ＴＬＲ−３アゴニスト）ならびに呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質などが挙げられる。
【０１６９】
本発明のワクチン中のアジュバントは通常、皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、保存剤、殺菌剤および緩衝剤を含み得る。免疫原性ペプチドと脂質とのコンジュゲーションによって、水溶性リポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓまたはそのジパルミトイル誘導体Ｐａｍ２Ｃｙｓなどの別の種類の「自己アジュバント」が得られる。このようなアジュバントには、免疫原性成分を伴って抗原提示細胞（樹状細胞など）の中に入り、それにより抗原提示の増強および細胞の活性化を同時に生じさせるという利点がある（例えば、ＢｒｏｗｎおよびＪａｃｋｓｏｎ，（２００５），「Ｌｉｐｉｄ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｌｆ  ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２３：８３を参照されたい）。
【０１７０】
適切なアジュバントには、例えばフロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、デトロイト、ミシガン州）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、ローウェー、ニュージャージー州）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ社、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；陽イオン誘導体化多糖または陰イオン誘導体化多糖；ポリホスファゼン；生分解性マイクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ  Ａなど市販されているものがある。このほか、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン２、インターロイキン７またはインターロイキン１２などのサイトカインをアジュバントとして使用してもよい。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、本発明のワクチンに含まれるアジュバントは、ＴＨ１型が優勢の免疫応答を誘導し得る。ＴＨ１型優性の応答の誘起に使用するのに適したアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組合せが挙げられる。例えば、組成物またはワクチンを、Ｔｈｏｅｌｅｎら（２００１），「Ａ  ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ」，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：２４００−２４０３に記載されているような水酸化アルミニウム（ミョウバン）と３−Ｏ−デアシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）とを含有するアジュバントＡＳ０４とともに製剤化し得る。ＴＨ１型免疫応答を優先的に誘導するほかの既知のアジュバントとしては、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが挙げられる。このオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないのが特徴である。このようなオリゴヌクレオチドは当業者に公知であり、例えば、国際公開第１９９６／０２５５５号に記載されている。ほかにも例えば、Ｓａｔｏら，（１９９６），「Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｇｅｎｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：３５２−３５４には免疫刺激ＤＮＡ配列が記載されている。
【０１７２】
アジュバントのまた別の例としてサポニン、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、フレイミングハム、マサチューセッツ州）があり、これを単独で、またはほかのアジュバントと組み合わせて使用し得る。例えば、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組合せ、例えば国際公開第１９９４／００１５３号に記載されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組合せなど、または国際公開第１９９６／３３７３９号に記載されているように、コレステロールでＱＳ２１の反応性を抑制した反応原性の低い組成物を含めた増強アジュバント系を用い得る。また別の製剤は水中油型乳剤とトコフェロールとを含む。国際公開第１９９５／１７２１０号には、水中油型乳剤にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含むアジュバント製剤が記載されている。本発明の組成物に含まれるアジュバントは、国際公開第１９９５／１７２１０号に記載されているように、水中油型乳剤にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む製剤を含み得る。一実施形態では、本発明の組成物は、天然の代謝可能な油をベースとするアジュバントであるアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７２０（Ｍ−ＩＳＡ−７２０；Ｓｅｐｐｉｃ社、フェアフィールド、ニュージャージー州）を含む。
【０１７３】
アジュバントは、粘膜経路から投与した免疫原性成分に対する粘膜免疫および／または全身免疫を増強する効果のある粘膜アジュバントであるのが好ましい。粘膜アジュバントは、ワクチン送達を促進しワクチンのほかの免疫原性成分によって誘導される防御免疫の誘導を増強するもの（例えば、リポソーム、渦巻形構造物（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、弱毒化生ベクター、ポリＤ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリドまたはＰＬＧＡ、キタン（ｃｈｉｔａｎ）、ＤＮＡワクチン、粘膜付着性物質）と、免疫を刺激する役割を果たすもの（例えば、自然免疫関連毒素系、サイトカイン系など）とに大別される。特定の機序に限定されるわけではないが、粘膜アジュバントの有利な効果の一部は、ワクチンの免疫原性成分が粘膜バリアを通過するのを助ける能力に由来すると考えられる。粘膜バリアを横断する際、粘膜アジュバントが、例えば補体活性化、サイトカインの誘導、抗体産生または抗体タイプの切替えの刺激、抗原提示細胞の刺激ならびに／あるいはＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩの発現への影響によって免疫を増強する可能性が考えられる。
【０１７４】
投与経路
本発明のワクチンは、特に限定されないが、非経口（例えば、真皮内、静脈内、脊髄内、腹腔内、皮下または筋肉内）経路、経口経路、局所経路または粘膜経路（例えば、鼻腔内）を含めた標準的な経路によって受容者に投与し得る。
【０１７５】
例えば、ワクチンを粘膜経路によって投与し得る。鼻腔内、眼内、バッカル、生殖器内（膣内）、直腸内、気管内、皮膚および消化管を含めた許容される粘膜ワクチン投与経路の非限定的な例。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本発明のワクチンを鼻腔内経路によって投与する。理論または特定の作用様式（１つまたは複数）に限定されるわけではないが、ワクチンの鼻腔内投与は、細菌が上気道および／または下気道の粘膜表面から宿主に感染する特定の連鎖球菌感染症に対して免疫を増強するのに有利であり得る。さらに、粘膜ワクチン接種（例えば、鼻腔内ワクチン接種）は、気道のみならず、生殖器粘膜を含めた離れた位置にある粘膜部位にも粘膜免疫を誘導し得る。
【０１７７】
本発明の鼻腔内ワクチンは、例えば、点鼻剤、スプレーもしくは吸入に適したものとして液体形態で、粉末として、クリームとして、または乳剤として製剤化することができる。このほか、噴霧化またはエアゾール化した鼻腔内ワクチンを用いてもよい。ほかにも、ミスト剤、粉末剤もしくはスプレー剤の吸入または点鼻剤、塗布剤、粉末剤、スプレー剤、ミスト剤、噴霧剤の鼻腔内投与などによる上気道および／または下気道の粘膜へのワクチン投与が企図される。
【０１７８】
一実施形態では、使用直前に再構成することが可能な凍結乾燥粉末の形態で鼻腔内投与用のワクチンを提供する。本発明のワクチンおよび組成物の粉末ワクチン製剤は、液体ベースのワクチンの安定性および送達に付随する冷蔵状態での保管および分配の必要性を克服する１つの手段となる。乾燥粉末製剤には、安定性が増大するほか、微生物の増殖を抑えるという利点がある。
【０１７９】
凍結乾燥ワクチンは、非凍結乾燥ワクチンと同等のレベルのヘテロサブタイプ免疫を誘導し得る。ワクチンは、当該技術分野で公知の任意の適切な技術を用いて凍結乾燥させ得る。例えば、光子線照射された連鎖球菌および／またはその誘導体の液体調製物をドライアイス−イソプロパノールスラリー中で凍結させ、凍結乾燥機（例えば、Ｖｉｒｔｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  １０−３２４  Ｂｅｎｃｈ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ社，ニューヨーク州）で適切な時間（例えば、２４時間）の間、凍結乾燥させ得る。
【０１８０】
一実施形態では、噴霧凍結乾燥（ＳＦＤ）粒子を作製することによって本発明の乾燥粉末経鼻ワクチンを製造する（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（２００２），「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｒａｙ  ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ．２．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ」，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，９１：３８８−３９５；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ，ら（２０００），「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｒａｙ−ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ」，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，１７：１３７４−１３８３；Ｍａａら（１９９９），「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｐｏｗｄｅｒｓ：ｓｐｒａｙ  ｄｒｙｉｎｇ  ｖｓ  ｓｐｒａｙ  ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ」，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１６：２４９−２５４；Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏ  ら（２００１）；「Ｎｏｎ−ａｑｕｅｏｕｓ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｐｒａｙ−ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｉｅｄ  ＢＳＡ  ｉｎｔｏ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，７６：１９９−２０８；Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏら（２００１），「Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｙ  ｎｏｎ−ａｑｕｅｏｕｓ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ」，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５３：１１５−１２０；および米国特許第６，５６９，４５８号を参照されたい）。
【０１８１】
ワクチンの鼻腔内投与に好ましい装置には経鼻スプレー装置（例えば、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ社、Ｖａｌｏｉｓ社およびＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社から市販されている装置）がある。適切な装置の非限定的な例が、例えばＢｏｍｍｅｒ（１９９９），「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎａｓａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ，ｐ２６−３３に記載されている。鼻腔内装置は１〜５００μｍの範囲の小滴を生じさせ得る。１０μｍ未満の小滴の割合をごくわずか（例えば、５％未満）に抑えて吸入の可能性を最小限にするのが好ましい。鼻腔内装置は、２用量の送達、すなわち、単一のワクチン接種用量を２つのサブ用量で各鼻孔に１サブ用量ずつ送達することが可能なものであり得る。
【０１８２】
本発明のワクチンは、単独でとうよしても、ほかの追加の治療剤（１つまたは複数）と組み合わせて投与してもよい。ワクチンと治療剤（１つまたは複数）とともに投与する実施形態では、投与は同時であっても逐次的（すなわち、ワクチン投与後に薬剤（１つまたは複数）を投与するか、またはその逆）であってもよい。したがって、本発明のワクチンを別の薬剤とともに対象に投与する場合、両者を単一の組成物で同時に投与しても、別個の組成物で同時に投与しても、または異なる時間に別個に投与してもよい。
【０１８３】
用量
本発明のワクチンは一般に、投与経路および受容者の身体的特徴（健常状態を含む）に適合する方法で、所望の効果（１つまたは複数）（すなわち、治療効果、免疫原性効果および／または防御効果）が誘発されるように投与する。
【０１８４】
例えば、所与のワクチンのしかるべき用量は、特に限定されないが、対象の身体的特徴（例えば、年齢、体重、性別）、化合物を単一の薬剤として使用するのか補助治療剤として使用するのか、所与の連鎖球菌感染症の進行度（すなわち、病理学的状態）をはじめとする当業者に認識され得るものを含めた様々な因子に左右され得る。本発明の所与のワクチンのしかるべき用量を決定する際に考慮され得る様々な一般的考慮事項が、例えばＧｅｎｎａｒｏら（編）（１９９０），「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（イーストン、ペンシルベニア州、米国）；およびＧｉｌｍａｎら（編）（１９９０），「Ｇｏｏｄｍａｎ  Ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０１８５】
本発明のワクチンは一般に、有効成分（１つまたは複数）（すなわち、光子線照射された連鎖球菌および／またはその誘導体）約５０マイクログラム〜約５ｍｇの量で患者に投与し得る。約５０マイクログラム〜約５００マイクログラムの量の用量が特に好ましい。
【０１８６】
当業者であれば、慣例的な実験によって、所望の治療転帰を得るために本発明のワクチンに含ませる光子線照射された連鎖球菌またはその誘導体の有効で毒性のない量を決定することが可能であろう。
【０１８７】
有効量は一般に、有効成分（１つまたは複数）（すなわち、光子線照射された連鎖球菌またはその誘導体）が２４時間当たり約０．０００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重；通常、２４時間当たり約０．００１ｍｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ体重；２４時間当たり約０．０ｌｍｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重；２４時間当たり約０．ｌｍｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重；２４時間当たり約０．ｌｍｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重；２４時間当たり約１．０ｍｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内になると予想される。より通常には、有効量の範囲は、約１．０ｍｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重；２４時間当たり約１．０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重；２４時間当たり約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重；２４時間当たり約ｌ．０ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重；２４時間当たり約５．０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重；２４時間当たり約５．０ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重；２４時間当たり約５．０ｍｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内になると予想される。
【０１８８】
あるいは、有効量は有効成分（１つまたは複数）（すなわち、光子線照射された連鎖球菌またはその誘導体）が最大約５００ｍｇ／ｍ２であり得る。有効量は一般に、約２５〜約５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約２５〜約３５０ｍｇ／ｍ２、より好ましくは約２５〜約３００ｍｇ／ｍ２、さらにより好ましくは約２５〜約２５０ｍｇ／ｍ２、さらにより好ましくは約５０〜約２５０ｍｇ／ｍ２、さらにより好ましくは約７５〜約１５０ｍｇ／ｍ２の範囲内になると予想される。
【０１８９】
治療適用では通常、治療は感染症、病的状態または病態の持続期間にわたるものとなる。さらに当業者には、治療する感染症、病的状態または病態の性状および程度、投与する形態、経路および部位ならびに治療を受ける具体的な個体の性質によって、個々の投与の至適な量および間隔が決まることは明らかであろう。このような至適条件も従来の技術によって求めることができる。
【０１９０】
多くの場合、本発明のワクチンを数回または多数回投与するのが望ましい。例えば、本発明のワクチンを１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上投与し得る。投与は、約１週間〜約１２週間間隔、ある特定の実施形態では約１週間〜約４週間間隔であり得る。本発明のワクチンが標的とする特定の病原菌に反復して曝露される場合、定期的に再投与するのが望ましいこともある。
【０１９１】
当業者にはほかにも、治療過程を決定する従来の検査法を用いて至適な治療過程を確認することが可能であることが明らかであろう。
【０１９２】
本明細書に記載される方法は、予備刺激量の本発明のワクチンを投与することを含み得る。予備刺激量の後に追加免疫量を投与し得る。追加免疫は再接種を目的とするものであり得る。種々の実施形態では、ワクチンを少なくとも１回、２回、３回またはそれ以上投与する。本発明のワクチンは、連鎖球菌の特定の標的菌株（１つまたは複数）に対して血清陰性者である無感作受容者に投与し得る。あるいは、連鎖球菌の特定の標的菌株（１つまたは複数）に対して血清陽性者である初回刺激済みの受容者にワクチンを投与してもよい。
【０１９３】
当業者には、特定の実施形態の形で開示される本発明に、広い意味で記載される本発明の趣旨も範囲も逸脱せずに多数の変形および／または修正を施すことが可能であることが理解されよう。したがって、本発明の諸実施形態はあらゆる点で、例示的なものであって限定的なものではないものと見なされるべきである。
【実施例】
【０１９４】
これより、特定の実施例（１つまたは複数）を参照しながら本発明を説明するが、これらの実施例は決して限定的なものではないと解釈されるべきである。
【０１９５】
実施例１：汎用ワクチンとして検査に適した肺炎球菌株の作製。
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１株は血清型２（Ｄ３９）の派生株であり、菌体の外側に莢膜がない。下の流れ図に示すように、この菌株の遺伝子を改変して自己溶菌酵素遺伝子（ｌｙｔＡ）を除去した。得られたＲｘ１（ΔＬｙｔＡ）株を、下の流れ図に示すようにニューモリシン遺伝子（ｐｌｙ）をＰｄＴと命名されるトキソイド型Ｐｌｙで置換することによってさらに改変した。
【０１９６】
各形質転換段階の後、ＰＣＲおよびウエスタンブロットを実施して形質転換の成功を確認し、シークエンシングによってｌｙｔＡ欠失ニューモリシン変異（ＰｄＴ）Ｒｘ１株の作製の成功を確認し、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）と命名した（図１）。
【０１９７】
各派生株に溶血アッセイを実施して、ＰｄＴ変異型のニューモリシンを有する派生株に溶血活性がないことを確認した（図２）。
【０１９８】
流れ図：Ｒｘ１株を改変して、自己溶菌酵素をコードするｌｙｔＡ遺伝子を除去し、ニューモリシンをコードするｐｌｙ遺伝子をニューモリシン発現の変異誘導体ＰｄＴに置換するのに採用した手順。
【化１】
2018513877.tif 000002
【０１９９】
このようにウエスタンブロット、ＰＣＲおよびシーケンシングにより肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株である肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）の作製の成功を確認した。
【０２００】
実施例２：ΔｌｙｔＡ遺伝子由来のｍＲＮＡ転写産物の二次構造解析。
ΔｌｙｔＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の二次構造を予測する解析を実施した。
【０２０１】
欠失前のＲｘ１株のｌｙｔＡ遺伝子のＤＮＡ配列を隣接領域を含めて配列番号１に示す（下を参照されたい）。ｌｙｔＡ遺伝子のＡＴＧ（開始コドン）からＴＡＡ（停止コドン）までのコード領域全体をスプライス−オーバーラップ・エクステンションＰＣＲによりインフレームで欠失させた。得られたΔｌｙｔＡ遺伝子の配列を配列番号２に示す（下を参照されたい）。ΔｌｙｔＡ遺伝子配列がコードするｍＲＮＡ転写産物を配列番号３に示す（下を参照されたい）。
【０２０２】
ＲＮＡｆｏｌｄ（ＲＮＡｆｏｌｄ  ＷｅｂＳｅｒｖｅｒ（［ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ］）を用いてｍＲＮＡ転写産物の二次構造を予測し、図３に示した。図３に示されるｍＲＮＡ転写産物の予測二次構造は、自由エネルギーの最小値が−５２．８０ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予想される。配列番号３の黒い下線を施した太字で示される予測二本鎖末端ステムループ配列は、自由エネルギーの最小値が−１８．１０ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【０２０３】
配列番号１
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の隣接領域を含めたＬｙｔＡ遺伝子の配列
【化２−１】
2018513877.tif 000003
【化２−２】
2018513877.tif 000004
【０２０４】
自己溶菌酵素（ＬｙｔＡ）のｌｙｔＡコード配列をイタリック体／下線で示し、ＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ停止コドンを太字／イタリック体で強調した。−３５および−１０ならびにシグマ７０プロモーター認識配列にはそれぞれ、淡灰色および濃灰色で影を付けた。四角で囲まれた太字でないヌクレオチドは、ＲｐｏＤの転写結合部位（１つまたは複数）（ＴＦＢ）である可能性があることを表す。ＴＦＢの中央にある太字のＡは、ｌｙｔＡ  ｍＲＮＡの予測転写開始部位（ＴＳＳ）を表す。ＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ停止コドンに隣接する上流および下流のヌクレオチドを四角／太字で表した。
【０２０５】
ｌｙｔＡの配列番号１の上流と下流の四角／太字のヌクレオチド配列が互いに融合するように、ｌｙｔＡ遺伝子のコード領域全体をスプライス−オーバーラップ・エクステンションＰＣＲによってインフレームで欠失させた。
【０２０６】
配列番号２
ｌｙｔＡ遺伝子欠失後の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１株ΔＬｙｔＡ（および派生株）の遺伝子配列
【化３】
2018513877.tif 000005
【０２０７】
ΔｌｙｔＡ遺伝子がコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物を配列番号３に示す。黒い太字と下線で示されるリボヌクレオチドは、Ｒｈｏ依存性の停止を可能にする典型的な二本鎖（ｄｓ）ステムループ構造を形成するものと予測される。
【０２０８】
配列番号３
ΔｌｙｔＡ遺伝子がコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物
【化４】
2018513877.tif 000006
【０２０９】
実施例３：γ線照射の線量および条件が肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）の生存能および形態に及ぼす影響。
様々な照射線量および条件でγ線照射が濃縮ワクチン試料の生存能および形態に及ぼす影響を検討した。
【０２１０】
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をＴＨＹブロスで培養して、細胞密度を１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌにした。遠心分離により細菌を濃縮し、ＰＢＳで洗浄し、再び遠心分離し、最終濃度１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌの濃度でＰＢＳ−１０％グリエロール（ｇｌｙｅｒｏｌ）に再懸濁させた。氷上またはドライアイス（ＤＩ）上、様々な照射線量（０．５〜２５ｋＧｙ）および温度条件でストック肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌ）にγ線照射した。γ線照射後、ワクチンの試料を血液寒天プレート上に播き、生存能を評価し、不活化を確認した（図４Ａおよび図４Ｂ）。グラム染色および走査型電子顕微鏡観察を実施して、細菌の物理的形態に対するγ線照射の影響を明らかにした（それぞれ図５および図６）。
【０２１１】
γ線照射が細菌の形態に影響を及ぼすことはなかった。左側の画像は未照射対照細菌を示しているのに対し、右側の画像は、ドライアイス上で照射する試料を完全に不活化するのに必要な最小線量である１２ｋＧｙで照射した後の細菌の形態を示している。
【０２１２】
実施例４：γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウスを生きた肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９株で抗原刺激した場合の生存期間。
γ線照射Ｒｘ１（ＤＩ上で１２ＫＧＹのγ線照射を用いて調製したΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）によって生きたステプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９株（血清型２）による致死的抗原刺激に対する防御をもたらすことが可能であるかどうかを明らかにするため実験を実施した。
【０２１３】
マウスの鼻腔内に２用量のγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）を２週間間隔でワクチン接種した。２用量目のワクチン接種から２週間後、１×１０６ＣＦＵのステプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９でマウスを抗原刺激し、２１日の期間にわたって生存期間およびパーセント生存率をモニターした（図７Ａおよび図７Ｂ）。
【０２１４】
ワクチンによって、ステプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９による致死的抗原刺激に対する有意な防御をもたらすことができた。このように、γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）が生きた肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９株による鼻腔内抗原刺激に対する防御をもたらすことが認められた。
【０２１５】
実施例５：肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウスを肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＥＦ３０３０株（血清型１９Ｆ）またはＰ９株（血清型６Ａ）のいずれかで異型抗原刺激した場合の免疫。
γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）によってＥＦ３０３０（血清型１９Ｆ）またはＰ９（血清型６Ａ）による異型抗原刺激に対する防御をもたらすことが可能であるかどうかを明らかにするため、マウスの鼻腔内に２用量の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）をワクチン接種した。２用量目のワクチン接種から２週間後、マウスに１×１０７ＣＦＵのＥＦ３０３０または５×１０６ＣＦＵのＰ９を感染させた。ＥＦ３０３０による抗原刺激では、感染から９６時間後、肺および鼻咽頭部を採取して細菌数を求めた（それぞれ図８Ａおよび図８Ｂを参照されたい）。Ｐ９による抗原刺激では、その後２１日間にわたってマウスの生存率をモニターした（図８Ｃ）。
【０２１６】
肺の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＥＦ３０３０数の有意な減少および肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｐ９抗原刺激後の平均生存期間の有意差からわかるように、ワクチンによって異型抗原刺激に対する防御をもたらすことができた。
【０２１７】
実施例６：肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）を鼻腔内にワクチン接種したマウスでの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）特異的血清抗体応答の誘導。
【０２１８】
γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）によって鼻腔内ワクチン接種後に肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）特異的抗体応答を誘導することが可能であるかどうかを明らかにするため解析を実施した。
【０２１９】
マウスの鼻腔内に２用量のγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）をワクチン接種し、２用量目のワクチン接種から２週間後に血液を採取した。ＥＬＩＳＡを実施して、抗原であるＰｌｙ、ＮａｎＡ、ＣｂｐＡおよびＧｌｐＯに対する血清中の抗原特異的ＩｇＧ応答を判定した。さらに、ＥＬＩＳＡを用いて、ＰｓｐＡおよび未照射Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）細菌全細胞に対するＩｇＧ抗体応答およびＩｇＡ抗体応答を判定した。
【０２２０】
γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）による鼻腔内ワクチン接種後、ＣｂｐＡ、ＧｌｐＯ、ＰｓｐＡおよび全肺炎球菌体に対する検出可能な抗体応答がみられた（図９）。
【０２２１】
実施例７：腹腔内に肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウスでの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）特異的抗体応答の誘導。
腹腔内ワクチン接種によって高レベルの肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）特異的抗体応答を誘導することが可能であるかどうかを明らかにするため、さらなる実験を実施した。
【０２２２】
マウスの腹腔内に２用量のγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）をワクチン接種し、２用量目のワクチン接種から２週間後に血液を採取した。ＥＬＩＳＡを用いて、抗原である肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）細胞の全細胞溶解物（ＷＣ）（図１０Ａ）、Ｐｌｙ（図１０Ｂ）およびＣｂｐＡ（図１０Ｃ）に対する血清中の抗原特異的ＩｇＧの力価を求めた。
【０２２３】
腹腔内に注射したワクチンによって、有意な高レベルの抗体力価が誘導された。
【０２２４】
実施例８：鼻腔内投与した肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）によって誘導される防御免疫におけるＢリンパ球の役割。
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）によって誘導される免疫応答へのＢ細胞の関与を評価した。
【０２２５】
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴ）およびＢ細胞欠損Ｃ５７ＢＬ／６（μＭＴ）マウス（Ｂ細胞が欠損している）の鼻腔内に２用量のγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）をワクチン接種した。２用量目のワクチン接種から２週間後、マウスの鼻腔内に致死量の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９による抗原刺激を実施し、２１日間にわたって生存率をモニターした。パーセント生存率を図１１に示す。
【０２２６】
ＷＴマウスにγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種することにより、同種のＷＴ対照マウス（ワクチンではなくＰＢＳを投与したもの）と比較して、Ｄ３９による致死的抗原刺激に対する有意な防御がもたらされた。これに対し、μＭＴマウスにγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種しても、それぞれのμＭＴ対照マウス（ワクチンではなくＰＢＳを投与したもの）と比較して、防御の増大を示す証拠はみられなかった。以上の結果から、したがって、鼻腔内投与したγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）ワクチンが肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する防御免疫を誘導するにはＢ細胞が不可欠であることがわかる。
【０２２７】
実施例９：γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）の鼻腔内投与によって誘導される防御免疫におけるＴリンパ球応答の分析。
γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種した後、Ｔリンパ球応答を評価した。
【０２２８】
マウスの鼻腔内に２用量のγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）をワクチン接種し、２用量目のワクチン接種から２週間後、脾臓を採取した。次いで、脾細胞をワクチン抗原、ＭａｌＸタンパク質または培地単独（陰性対照）のいずれかで７２時間刺激した。７２時間後、細胞培養物から上清を採取し、ＥＬＩＳＡによってサイトカインレベルを求めた（ＩＬ−１７ＡおよびＩＦＮ−γ）（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。
【０２２９】
細胞内サイトカイン染色を実施して、抗原刺激後のＴｈ１細胞（ＩＦＮ−γ＋を使用）、Ｔｈ２細胞（ＩＬ−４＋）、Ｔｈ１７細胞（ＩＬ−１７＋）およびＴ−ｒｅｇ細胞（Ｆｏｘｐ３＋）の割合を検討した（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）。
【０２３０】
ＥＬＩＳＡによって確認されるように、γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）のワクチン接種は、ワクチン抗原またはＭａｌＸで脾細胞を刺激した後の上清中のＩＬ−１７ＡレベルもＩＦＮ−γレベルも増大させないように思われる。これと同じように、細胞内サイトカイン染色から明らかなように、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびＴｒｅｇｓのいずれの割合にも変化はみられなかった。
【０２３１】
実施例１０：γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）の鼻腔内投与後のインフルエンザウイルスによる抗原刺激
事前にγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種することによってインフルエンザによる抗原刺激に対し何らかの有害作用がみられるかどうかを明らかにするため分析を実施した。
【０２３２】
マウスの鼻腔内に２用量のγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）をワクチン接種した。２用量目のワクチン接種から２週間後、マウスにインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ８（約１００ＴＣＩＤ５０）による抗原刺激を実施し、体重減少および生存率をモニターした（図１３Ｂ）。対照マウスには、γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種する代わりにＰＢＳを投与した後、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ８（約１００ＴＣＩＤ５０）による抗原刺激を実施し、体重減少および生存率をモニターした（図１３Ａ）。
【０２３３】
事前にγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種した後、マウスに生きたインフルエンザウイルスで抗原刺激を実施しても、有害作用は認められなかった。ワクチン接種したマウスが全個体ともインフルエンザＡ／ＰＲ８株による抗原刺激後も生存したことからわかるように、事前にγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種することによって、インフルエンザ抗原刺激に対する防御がいくらかもたらされることを示す証拠がみられる。このことは、何らかの有益なバイスタンダー効果があることを示唆している。
【０２３４】
実施例１１：肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）の効果に対するコレラ毒素アジュバントの影響
γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）とプロトタイプアジュバントのコレラ毒素（ＣＴ）とを組み合わせて、アジュバントによってワクチンの効果を増大させることができるかどうかを評価した。
【０２３５】
マウスの鼻腔内に１μｇ  ＣＴ（対照）を２用量またはγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）＋１μｇ  ＣＴを２用量ワクチン接種した。
【０２３６】
２用量目のワクチン接種から２週間後、マウスに１×１０７ＣＦＵの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＥＦ３０３０、１×１０６ＣＦＵの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９または５×１０６ＣＦＵの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｐ９による抗原刺激を実施した。ＥＦ３０３０感染では、７日後に肺および鼻咽頭部を採取して細菌数を求めた（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。
【０２３７】
Ｄ３９またはＰ９による抗原刺激では、その後２１日間にわたってマウスの生存率をモニターした（図１４Ｃおよび図１４Ｄ）。
【０２３８】
γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をＣＴアジュバントとともにワクチン接種することにより、生きたＥＦ３０３０による感染後の肺の細菌数が非ワクチン接種対照と比較して有意に減少した。ワクチンとＣＴにより、生きたＤ３９およびＰ９による致死的抗原刺激に対する有意な防御がもたらされた。
【０２３９】
γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）ワクチンとアジュバントのコレラ毒素とによって誘導された免疫応答の種類を明らかにするため、γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１２ＫＧＹ  ＤＩ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）に１μｇ  ＣＴを添加したものまたは添加していないものを２用量鼻腔内にワクチン接種したマウスから、２用量目のワクチン接種から２週間後に脾臓および血清を採取した。脾細胞をワクチン抗原、ＭａｌＸまたは培地単独（陰性対照）のいずれかで７２時間刺激した。７２時間後、細胞内サイトカイン染色を実施して、７２時間の刺激後に誘導されたＴｈ１細胞（ＩＦＮ−γ＋を使用）、Ｔｈ２細胞（ＩＬ−４＋）、Ｔｈ１７細胞（ＩＬ−１７＋）およびＴ−ｒｅｇ細胞（Ｆｏｘｐ３＋）の割合を求めた（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。細胞培養から上清を採取してサイトカイン（ＩＬ−１７ＡおよびＩＦＮ−γ）を調べた（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）。
【０２４０】
細胞内サイトカイン染色によって示されるＴｈ１７細胞数の増大およびγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）またはＭａｌＸによる抗原刺激後の上清中のＩＬ−１７Ａの増大からわかるように、γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をＣＴとともに鼻腔内にワクチン接種することによってＴｈ１７応答が二極化した。
【０２４１】
ＥＬＩＳＡによりＲｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）の全細胞に対する血清中のＩｇＡおよびＩｇＧの力価を求めた（図１６）。ＣＴアジュバントの存在下でγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）に感作させたマウスには、ワクチン菌株単独に感作させたマウスと比較して抗体応答の増大がみられた。
【０２４２】
実施例１２：鼻腔内投与したγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）によって誘導される防御免疫に果たすサイトカインの役割。
γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）によって誘導される免疫応答におけるワクチン効果へのＩＦＮ−γおよびＩＬ−７の関与を評価した。
【０２４３】
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴ）の鼻腔内に２用量のγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）をワクチン接種した。２用量目のワクチン接種から２週間後、マウスにＩＦＮ−γもしくはＩＬ−１７に対する中和抗体または関連するアイソタイプ対照抗体２００μｇを抗原刺激の２４時間前、抗原刺激の６時間後および抗原刺激の４８時間後に注射した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。マウスの鼻腔内に致死量の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９による抗原刺激を実施し、２１日間にわたって生存率をモニターした。生存率のパーセントを示す。
【０２４４】
アイソタイプ対照抗体のいずれを投与しても、Ｄ３９による抗原刺激に対するワクチンの防御効果に変化はみられなかった。重要なのは、ワクチン接種すると、ＩＦＮ−γを中和したにもかかわらず、感作マウスにその関連する対照と比較して有意な防御が誘導されたことである（図１７Ａ）。それに対し、この防御はＩＬ−１７Ａの中和によって打ち消された（図１７Ｂ）。以上のデータから、γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）によって誘起される防御の機序はＩＬ−１７Ａに依存性であり、かつＩＦＮ−γに非依存性であることがわかる。
【０２４５】
実施例１３：γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）は自然ＩＬ−１７応答を誘導する。
ＩＬ−１７依存性防御の発生源に到達した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴ）の鼻腔内に２用量のγ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）（１×１０８ＣＦＵ／用量）をワクチン接種した。２用量目のワクチン接種から２週間後、マウスに肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９による抗原刺激を実施した。抗原刺激から２４時間後および４８時間後、肺を採取し、Ｔエフェクター細胞（Ｔｈ１およびＴｈ１７）、γδＴ細胞（γδＴ１およびγδＴ１７）および貪食細胞（マクロファージおよび好中球）の割合を解析した。γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種しても、Ｄ３９抗原刺激から２４時間後の肺のＴエフェクター細胞の総数にもＴｈ１細胞またはＴｈ１７細胞の相対集団数にも変化はみられなかった（図１８Ａ）。４８時間後のＴエフェクター細胞全体およびＴｈ１７細胞についても同様の結果が観察された。抗原刺激から４８時間後、ＰＢＳ処置対照に比して感作マウスにＴｈ１細胞数の有意な減少が認められた。Ｔエフェクター細胞とは対照的に、γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）の鼻腔内ワクチン接種によって、Ｄ３９抗原刺激後の肺にγδＴ細胞集団数の有意な変化が引き起こされた（図１８Ａ）。ワクチン接種マウスの肺の総γδＴ細胞数には非感作マウスに比して有意な差はみられなかったが、データから、感作マウスでは、抗原刺激から２４時間後に肺のγδＴ１７細胞数が特異的に増大し、抗原刺激から４８時間後にさらに増大したことがわかる。２４時間後、ワクチン接種マウスにＴ１細胞数の減少がみられ、４８時間後には対照マウスに比して有意な差が検出されるに至った。以上のデータ全体から、γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）ワクチンによってγδＴ１７細胞応答の有意な増大とともにＴｈ１細胞およびγδＴ１細胞の有意な減少が促進され、Ｔｈ１７集団には差がみられないことがわかる。したがって、このデータから、γδＴ１７細胞がワクチン接種マウスの防御免疫の媒介に関与するＩＬ−１７Ａの天然の発生源である可能性が示唆される。
【０２４６】
γ線照射肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）をワクチン接種したマウスまたはワクチン接種していないマウス（ＰＢＳ対照）で肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｄ３９による抗原刺激から２４時間後および４８時間後のマウス肺のマクロファージおよび好中球の相対数を比較した（図１８Ｂ）。ワクチン接種マウスでは、抗原刺激の２４時間後および４８時間後ともに両細胞型の数がほぼ同じであったのに対し、ＰＢＳ対照マウスでは、抗原刺激の２４時間後と４８時間後の間に肺のマクロファージの有意な増加がみられた。このことは好中球でも明らかであった。
【０２４７】
実施例１４：毒性決定因子をコードする遺伝子に遺伝子変異のある肺炎球菌派生株の作製。
下の流れ図に示すように、肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓａＡ）をコードする遺伝子を除去することによって肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１株（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）にさらに遺伝子改変を実施した。
【０２４８】
各形質転換段階の後、ＰＣＲ、シーケンシングおよびウエスタンブロットを実施して、形質転換が成功を収めたことを確認し、Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）株が作製されたことを確認した（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。図１９Ｃから、Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）からｐｓａＡ遺伝子を欠失させてＲｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）を作製することに成功したことが確認されるほか、Ｍｎ２＋を添加していない培地ではＲｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）株が増殖欠陥を示すことがわかる。
【０２４９】
流れ図：Ｒｘ１株（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）を改変して肺炎球菌表面抗原ＡをコードするｐｓａＡ遺伝子を除去するのに採用した手順。
【化５】
2018513877.tif 000007
【０２５０】
このようにウエスタンブロット、ＰＣＲおよびシーケンシングにより肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１株（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）の作製の成功を確認した。
【０２５１】
実施例１５：ΔｐｓａＡ遺伝子由来のｍＲＮＡ転写産物の二次構造解析。
ΔｐｓａＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の二次構造を予測するため解析を実施した。
【０２５２】
欠失前のＲｘ１株（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ）のｐｓａＡ遺伝子のＤＮＡ配列を隣接領域を含めて配列番号４に示す（下を参照されたい）。スプライス−オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ変異誘発によって計８６５ヌクレオチドを欠失させることにより、転写開始部位から、停止コドンの上流５６ヌクレオチドのＧＴＡＡＡから始まる配列までの領域を欠失させた。得られたΔｐｓａＡ遺伝子配列を配列番号５に示す（下を参照されたい）。ΔｐｓａＡ遺伝子配列がコードするｍＲＮＡ転写産物を配列番号６に示す（下を参照されたい）。
【０２５３】
ＲＮＡｆｏｌｄ（ＲＮＡｆｏｌｄ  ＷｅｂＳｅｒｖｅｒ（［ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ］）を用いてｍＲＮＡ転写産物の二次構造を予測し、図２０に示した。図２０に示されるΔｐｓａＡ遺伝子がコードするｍＲＮＡ転写産物の予測二次構造は、自由エネルギーの最小値が−２０．２０ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【０２５４】
配列番号４
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の隣接領域を含めたＰｓａＡ遺伝子配列
【化６−１】
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【化６−２】
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【０２５５】
肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓａＡ）のｐｓａＡコード配列をイタリック体／下線で示し、ＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ停止コドンを太字／イタリック体で強調した。−３５および−１０ならびにシグマ７０プロモーター認識配列にはそれぞれ、淡灰色および濃灰色で影を付けた。ＡＴＧ開始コドンの９ヌクレオチド上流にある太字のＧは、ＰｓａＡ  ｍＲＮＡの予測転写開始部位（ＴＳＳ）である。ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流のヌクレオチドおよびＴＡＡ停止コドンの上流５６ヌクレオチドは四角／太字で表され、ＰＣＲプライマーのアニーリング部位を構成する。
【０２５６】
ｐｓａＡの配列番号４の四角／太字のヌクレオチド配列が互いに融合するように、プライマーアニーリング部位の間にあるｐｓａＡ遺伝子のコード領域をスプライス−オーバーラップ・エクステンションＰＣＲによって欠失させた。
【０２５７】
配列番号５
ｐｓａＡ遺伝子欠失後の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１株ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡの遺伝子配列。
【化７】
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【０２５８】
ΔｐｓａＡ遺伝子がコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物を配列番号６に示す。黒い太字と下線で示されるリボヌクレオチドは、Ｒｈｏ依存性の停止を可能にする典型的な二本鎖（ｄｓ）ステムループを形成するものと予測される。
【０２５９】
配列番号６
ΔｐｓａＡ遺伝子がコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物
【化８】
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【０２６０】
実施例１６：γ線照射の線量および条件が肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）の生存能および形態に及ぼす影響。
様々な照射線量でγ線照射が濃縮ワクチン試料の生存能および形態に及ぼす影響。
【０２６１】
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）をＴＨＹブロスで培養して、細胞密度を１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌにした。遠心分離により細菌を濃縮し、ＰＢＳで洗浄し、再び遠心分離し、最終濃度１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌでＰＢＳ−１０％グリセロールに再懸濁させた。ドライアイス（ＤＩ）上、様々な線量（０．５〜２５ｋＧｙ）でストック肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）（１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌ）にγ線照射した。γ線照射後、ワクチン株の試料を血液寒天プレート上に播き、生存能を評価し、不活化を確認した（図２１Ａ）。照射していない肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒｘ１（ΔＬｙｔＡ，ＰｄＴ，ΔＰｓａＡ）（図２１Ｂ）または２５ｋＧｙで照射した同菌株（図２１Ｃ）の物理的形態の走査型電子顕微鏡像を示す。γ線照射が細菌の全体的な形態に影響を及ぼすことはなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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