(57)【要約】  本発明は、腫瘍細胞中の発現が異なる転写物（バイオマーカー）の同定および選択に関する。これらのバイオマーカーのレベルの特異的な測定は、前立腺癌のスクリーニングおよび診断のために使用することができる。これらのバイオマーカーを基礎とするアッセイの臨床的利用は、現在の標準的なスクリーニングアッセイの多数の偽陽性を減らす助けとなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌の診断のための方法において、
ａ）患者の試料における少なくとも２種の核酸の発現レベルを解析するステップを含み、前記少なくとも２種の核酸が、少なくとも２つの核酸の群から選択され、ここで前記群は、
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
からなり、
ｂ）前記少なくとも２種の核酸の発現レベルが定義された閾値を上回っている場合に、その試料は、前立腺癌陽性と認定される、前記方法。
【請求項２】
前記少なくとも２種の核酸の少なくとも１種が、群１の配列番号１および／または群２の配列番号４、５、６、７、８、９および１０から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも５種の核酸の発現レベルが解析され、ここで前記核酸は、少なくとも５種の異なる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
８つの群のそれぞれからの少なくとも１種の核酸の発現レベルが解析される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、前立腺組織、生検材料、リンパ節、尿、射精液、血液、血液血清、血液血漿、血液もしくはリンパ中に循環している腫瘍細胞、転移を含むことが疑われる任意の組織、ならびに前立腺腫瘍細胞もしくはその部分、例えばエキソソームのような小胞体、微小胞およびそれ以外ならびに前立腺腫瘍細胞に由来する遊離のＲＮＡ分子もしくはタンパク質に結合したＲＮＡ分子を含み得る任意の起源を含む群から選択される、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、尿試料である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
発現レベルの解析が、標識されたプライマー、標識されたプローブまたは蛍光性検出剤の蛍光を測定することによって実施される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
発現レベルの解析が、ｑＲＴ−ＰＣＲによって実施される、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも２種の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも２種のプライマーまたはプローブを含む前立腺癌の診断のためのキットにおいて、前記少なくとも２種の核酸が、少なくとも２つの核酸の群から選択され、ここで前記群は、
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
からなる、前記キット。
【請求項１０】
少なくとも８種のプライマーまたはプローブを含み、前記少なくとも８種のプライマーまたはプローブが、ストリンジェントな条件下で、８つの群のそれぞれの少なくとも１種の核酸にハイブリダイズする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前立腺癌の診断および治療のための方法において、
ａ．  患者の試料における少なくとも２種の核酸の発現レベルを解析するステップであって、前記少なくとも２種の核酸が、少なくとも２つの核酸の群から選択され、ここで前記群が、
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
からなるステップと、
ｂ．  ここで、前記少なくとも２種の核酸の発現レベルが定義された閾値を上回っている場合に、その試料は、前立腺癌陽性と認定され、
ｃ．  前記患者に１種以上の前立腺癌治療剤を投与するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前立腺癌治療剤が、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、カバジタキセル（Ｊｅｖｔａｎａ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ−１６）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、酢酸アビラテロン、ビカルタミド、カソデックス、デガレリクス、エンザルタミド、酢酸ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、プレドニゾン、シプリューセル−Ｔ、二塩化ラジウム２２３および／またはビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））を含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および化学の分野におけるものである。特に、本発明は、分子生物学の分野におけるものである。より具体的には、本発明は、ＲＮＡ転写物の解析に関する。最も具体的には、本発明は、前立腺癌の診断の分野におけるものである。
【０００２】
背景
前立腺癌は、男性の最も多く診断される癌である。２０１２年には、新たに前立腺癌と診断された事例の年間数は、アメリカ合衆国では約２４００００事例、そして欧州連合では約３６００００事例として報告され、そのうち６８０００事例がドイツで報告されている。アメリカ合衆国では、前立腺癌の診断および前立腺癌による死亡の生涯リスクは、現在ではそれぞれ１５．９％および２．８％と見積もられている。前立腺癌のスクリーニングの普及および転移性疾患の治療における大きな進歩にもかかわらず、前立腺癌は、西欧諸国で毎年２５００００人を超える死者を出す男性にとっての最も一般的な癌による死因の第２位に留まっている。
【０００３】
最近では、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の血清レベルの試験および直腸指診が、２つの主要なスクリーニング法を代表している。異常な結果を示す患者には、通常、前立腺生検の実施が奨められる。しかしながら、これは重大な帰結をもたらす。多数の偽陽性を生ずるＰＳＡスクリーニングの特異性の欠如は、全世界で年間に何百万人もの男性に不必要な前立腺生検を実施することとなっている。更に、生検を受けることは、実質的な感染性合併症の危険をはらんでいる。前立腺癌スクリーニングを改善するとともに、受ける必要のない数多くの前立腺生検を避けるために、より感度が高く特異的な早期前立腺癌診断のための診断アッセイが必要に迫られている。本発明は、この問題点に対して、前立腺癌のスクリーニングおよび診断のための一式のバイオマーカーを提供することによって対処している。
【０００４】
発明の概要
腫瘍組織と対照組織とで発現の異なる転写物を、前立腺癌患者と対照の６４個の試料の次世代シーケンシングによって同定し、かつそれぞれ２５６個および５６個の試料のマイクロアレイ解析およびｑＲＴ−ＰＣＲ解析によって検証した。本発明は、前立腺癌の診断において使用するのに適していることがこれまで見出されていなかったＲＮＡバイオマーカーを記載している。
【０００５】
本発明は、患者の試料における少なくとも２種の核酸の発現レベルを解析するステップを含む前立腺癌の診断のための方法において、前記少なくとも２種の核酸が、少なくとも２つの核酸の群から選択され、ここで前記群は、
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
からなり、前記少なくとも２種の核酸の発現レベルが閾値を上回っている場合に、その試料は、前立腺癌陽性と認定される、前記方法に関する。
【０００６】
また本発明は、前記群における核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする一式の核酸に関する。
【０００７】
更に本発明は、前記方法の、前立腺癌の診断のための使用に関する。
【０００８】
また本発明は、少なくとも２種の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも２種のプライマーまたはプローブを含む前立腺癌の診断のためのキットにおいて、前記少なくとも２種の核酸が、少なくとも２つの核酸の群から選択され、ここで前記群は、
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
からなる、前記キットに関する。
【０００９】
定義
以下の定義は、本出願の文面で使用される特定の用語について与えられる。
【００１０】
本明細書で使用される場合に、「核酸（複数を含む）」または「核酸分子」は、一般的に、非修飾または修飾ＤＮＡであってよい、任意のリボ核酸またはデオキシリボ核酸を指す。「核酸」には、制限されるものではないが、一本鎖核酸および二本鎖核酸が含まれる。本明細書で使用される場合に、用語「核酸（複数を含む）」には、また、１つ以上の修飾塩基を含む前記のＤＮＡが含まれる。こうして、安定性またはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡが「核酸」である。用語「核酸」は、本明細書で使用される場合に、そのような核酸の化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形を含むだけでなく、ウイルスおよび、例えば単純型細胞および複雑型細胞を含む細胞のＤＮＡ特徴の化学的な形も含む。
【００１１】
本発明の文脈における用語「レベル」または「発現レベル」は、患者の試料中にバイオマーカーが存在するレベルに関連している。バイオマーカーの発現レベルは、一般的に、その発現レベルを、正規化のための試料中の１種または幾つかの種類のハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較することによって測定される。患者からの試料は、バイオマーカーの発現レベルが、適切な対照（例えば健常組織）中での同じバイオマーカーの発現レベルを、規定の閾値だけ超過している場合に、前立腺癌陽性と認定される。
【００１２】
本明細書で使用される用語「核酸の存在および／またはレベルについて試料を解析する」または「核酸のレベルを具体的に見積もる」は、核酸のレベルを評価および定量化するために有用な手段および方法に関連している。１つの有用な方法は、例えば定量的逆転写ＰＣＲである。同様に、ＲＮＡのレベルは、例えばノーザンブロット、次世代シーケンシングによって、または増幅後に、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定することを含む分光測定技術を使用することによって解析することもできる。
【００１３】
本明細書で使用される場合に、用語「増幅される」とは、核酸配列に用いられる場合には、特定の核酸の１つ以上のコピーが、核酸鋳型配列から、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応の方法によって生成される過程を指す。その他の増幅の方法には、制限されるものではないが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチド特異的塩基増幅（ＮＳＢＡ）または当該技術分野で公知の任意のその他の方法が含まれる。
【００１４】
本明細書において、診断マーカー（複数を含む）および予後マーカー（複数を含む）の使用に関して使用される用語「相関させる」とは、患者からの試料中のマーカー（複数を含む）の存在または量を、所定の状態を患っていることが知られている人または所定の状態を患う危険性のある人からの試料中のその存在または発現レベルと比較することを指す。患者試料中のマーカー発現レベルは、特定の診断と関連していることが知られているレベルと比較され得る。
【００１５】
本明細書で使用される場合に、用語「診断」とは、疾患、この場合には前立腺癌をその発症の任意の段階で鑑定することを指し、またその用語には、被験者が該疾患を発症する素因を決定することが含まれる。
【００１６】
用語「Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３」は、Ｅｎｓｅｍｂｌによる遺伝子ＩＤ配列アノテーションに関連している。同じ遺伝子ＩＤに属する転写物は、スプライシング状況、エキソンの点で異なってよく、非常に様々なタンパク質を生ずることができる。これらは、選択的スプライシングから生ずるアイソフォームである。そのＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤは、その他のアノテーションシステムにおける幾つかの等価物、例えばＲＰ１１−２７９Ｆ６．１または遺伝子座（ｈｇ１９）１５番染色体：６９，７５５，３６５−６９，８６３，７７５（＋）を有する。このＥｎｓｅｍｂｌアノテーションに対するどの等価物を、その代わりに使用してもよい。
【００１７】
用語「Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３」は、Ｅｎｓｅｍｂｌによる遺伝子ＩＤ配列アノテーションに関連している。同じ遺伝子ＩＤに属する転写物は、スプライシング状況、エキソンの点で異なってよく、非常に様々なタンパク質を生ずることができる。これらは、選択的スプライシングから生ずるアイソフォームである。そのＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤは、その他のアノテーションシステムにおける幾つかの等価物、例えばＲＰ１１−６２７Ｇ２３．１または遺伝子座（ｈｇ１９）１１番染色体：１３４，３０６，３６７−１３４，３７５，５５５（＋）を有する。このＥｎｓｅｍｂｌアノテーションに対するどの等価物を、その代わりに使用してもよい。
【００１８】
本明細書で使用される場合に、用語「蛍光色素」とは、特定波長の光エネルギーを吸収し、異なる波長の光を再び発する任意の化学物質を指す。核酸の標識のために適した蛍光色素には、例えばＦＡＭ（５−または６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テキサスレッド、ヤキマイエロー、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、ＰＥＴ等が含まれる。
【００１９】
本明細書で使用される場合に、「単離される」とは、核酸に対して使用される場合には、天然に存在する配列が、その通常の細胞（例えば染色体）環境から取り出されたこと、または非天然環境で合成される（例えば人工的に合成される）ことを意味する。こうして、「単離された」配列は、細胞不含溶液中にあってよく、または種々の細胞環境に置かれてよい。
【００２０】
本明細書で使用される場合に、「キット」は、一体形の組合せ物であって、任意に該組合せ物およびその他の反応の使用のための説明書ならびにそのような使用のための成分を含む組合せ物である。キットが核酸を含む場合に、該キットは、前記核酸の合成または非天然の多様体を含んでもよい。合成または非天然の核酸とは、任意の化学的、生化学的、または生物学的な修飾を含む核酸であって、該核酸は天然にはこの形で存在しないような核酸であると理解されるべきである。そのような修飾には、制限されるものではないが、蛍光色素もしくはクエンチャー部、ビオチンタグでの標識だけでなく、核酸の骨格中の修飾（複数を含む）または要素をその天然の対応物と区別する任意のその他の修飾も含まれる。その他の天然化合物、例えばタンパク質、脂質等にも同じことが当てはまる。
【００２１】
本明細書で使用される用語「患者」とは、医療を受けているか、または疾患のため医療を受けることが望ましいか、または疾患を有することが疑われている生きているヒトもしくは非ヒト生物を指す。これには、定義された病気を有さない人であって、病状の徴候について調査されている人も含まれる。このように、本明細書に記載される方法およびアッセイは、ヒト疾患および獣医学的疾患の両方に適用することができる。
【００２２】
本明細書で使用される用語「プライマー」とは、精製された制限消化物として天然に存在するかまたは合成で生成されるかにかかわらず、ある核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される、すなわちヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤の存在下で、かつ適切な温度およびｐＨで誘導される条件下に置かれたときに合成の開始点として作用することができる核酸を指す。該プライマーは、一本鎖または二本鎖のいずれかであってよく、かつ誘導剤の存在下に所望の伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの起源および使用される方法を含む多くの要因に依存することとなる。好ましくは、プライマーは、約１５塩基〜１００塩基の長さ、より好ましくは約２０塩基〜５０塩基の長さ、より好ましくは約２０塩基〜４０塩基の長さを有する。適切なプライマーの長さを決めるにあたり関与する要因は、当業者には容易に認識される。場合により、プライマーは、化学的、生化学的、または生物学的な修飾を含むという点で、合成的なエレメントであってよい。そのような修飾には、制限されるものではないが、蛍光色素もしくはクエンチャー部での標識、または核酸の骨格中の修飾、またはプライマーをその天然の核酸対応物と区別する任意のその他の修飾も含まれる。
【００２３】
用語「プローブ」とは、生物学的実体、例えば核酸、タンパク質または脂質を特異的に検出するために使用することができる任意のエレメントを指す。該生物学的実体に特異的に結合することが可能なプローブの部分の他にも、該プローブは、アッセイにおいてその検出を可能にする少なくとも１つの修飾を含む。そのような修飾には、制限されるものではないが、蛍光色素、特別に導入された放射活性元素またはビオチンタグの場合のような標識が含まれる。プローブは、その構造中に修飾を含んでもよく、例えばロックド核酸であってよい。
【００２４】
本明細書で使用される用語「試料」とは、対象となる被験体、例えば患者の診断、予後または評価の目的のために得られる体液または組織の試料を指す。好ましい試験試料には、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、痰および胸膜滲出液が含まれる。更に、当業者であれば、幾つかの試験試料が、分別手順または精製手順の後に、例えば全血を血清または血漿成分へと分離した後に、より容易に解析されることを理解するであろう。
【００２５】
このように、本発明の好ましい一実施形態においては、該試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、脳脊髄液試料、唾液試料および尿試料または上述の試料のいずれかの抽出物ならびに血液もしくはリンパ中に循環している腫瘍細胞、転移を含むことが疑われる任意の組織、ならびに前立腺腫瘍細胞もしくはその部分、例えばエキソソームのような小胞体、微小胞およびそれ以外ならびに前立腺腫瘍細胞に由来する遊離のＲＮＡ分子もしくはタンパク質に結合したＲＮＡ分子を含み得る任意の起源を含む群から選択される。好ましくは、該試料は、血液試料、最も好ましくは血清試料または血漿試料である。重要なことには、尿（特に直腸指診の後）および射精液は、最も好ましい試料に該当する。組織試料は、生検材料または手術の間に得られた組織試料であってもよい。
【００２６】
本明細書に記載される用語「曲線下面積（ＡＵＣ）」は、受信者動作特性の曲線（ＲＯＣ）またはＲＯＣ曲線下の面積を記載している。ＡＵＣは、バイオマーカーがどれほど特異的であり、かつ感度が高いかに関連している。完璧なマーカー（ＡＵＣ＝１．０）では、１００％の感度（偽陰性なし）および１００％の特異性（偽陽性なし）を表す、ＲＯＣ空間の左上角または座標（０，１）の点が得られることとなる。
【００２７】
用語「ｐ値」は、帰無仮説が事実上真である場合に、すなわち群の平均の間に差が存在しない場合に、観察された試料の結果（またはより極端な結果）が得られる確率に関連している。ｐ値が小さいほど、対立仮説が、観察された結果を帰無仮説よりも良好に説明する尤度がより高くなる。
【００２８】
用語「調整済みｐ値」とは、多重比較（試験された遺伝子／プローブの数）に関して調整されたｐ値を指す。利用した方法は、実験部で詳説されている。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、前立腺癌の診断方法を記載している。この方法は、患者から採取された試料を解析するステップを含み、具体的には、前記患者試料中のバイオマーカーの組合せ物のレベルを測定する。次いで、それぞれのバイオマーカーの結果を、閾値と相関させ、結果がその閾値を上回っている場合には、前記患者試料は、前立腺癌陽性と認定される。
【００３０】
本発明は、配列番号１〜配列番号４２を含む配列の幾つかの群に関する。それらの配列を以下に列挙する。紙面の制約上、最初の１００ヌクレオチドだけが列挙される。その配列の残りの部分は、配列表中に見出すことができる。
【００３１】
特に、本発明は、
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
の８つの異なる配列の群に関する。
【００３２】
配列番号３および配列番号１１の核酸配列は、遺伝子座（ｈｇ１９）：２番染色体：１，５５０，４３７−１，６２９，１９１（−）からスプライシングされた転写物に相当する。
【００３３】
配列番号３６および配列番号３８の転写物は、それぞれ３８３４２のヌクレオチド長および３４６８３２のヌクレオチド長である。発明者らは、驚くべきことに、これらの２種の核酸が単独の長い転写物に相応することを見出した。従って、これらの長い転写物の任意の部分の発現レベルの検出は、本発明の方法に適している。
【００３４】
２つの種類の配列が存在する。一つ目に、幾つかの転写物は、関連データベースで既にアノテーションされた公知の配列である。それらの配列は、該配列のそれぞれのアノテーションによって特定される。二つ目に、まだアノテーションされていない新たな転写物が特定された。それらの転写物は、本明細書においては、ＸＬＯＣ＿の後に数が続くもので指定される。これらの指定は、転写物のゲノム起源についての情報を提供するが、所定の転写物の全配列を必ずしも表し得るものではない。検出される配列は、幾つかの場合には、より長いこともあり、またはより短いこともある。ＸＬＯＣ転写物の場合に、断片が検出される場合には、これらの断片は、１０００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、９ヌクレオチド、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、または５ヌクレオチドほどの小ささであってよい。
【００３５】
第１表：配列番号の一覧：  配列番号１〜配列番号４２を、相応の転写物および遺伝子アノテーションと一緒に列挙する。それぞれの配列番号の最初の１００ヌクレオチドが示されている。
【００３６】
【表１】
2018505656.tif 000002
【００３７】
【表２】
2018505656.tif 000003
【００３８】
【表３】
2018505656.tif 000004
【００３９】
【表４】
2018505656.tif 000005
【００４０】
【表５】
2018505656.tif 000006
【００４１】
バイオマーカーＰＣＡ３は、ごく普通に前立腺癌（ＰＣａ）診断のために使用されている。従って、予想通り、ＰＣＡ３発現レベルは、発明者らにより次世代シーケンシングによって試験された被験体におけるＰＣａを指し示した（図２）。しかしながら、該バイオマーカーは、非常に低リスクの腫瘍（Ｖ）においてその最高の発現レベルを示し、その発現レベルは、腫瘍のリスク因子が高まるほどに減少することが判明した。この知見により、ＰＣＡ３は中リスク腫瘍および高リスク腫瘍については信頼できないマーカーであり、より良い前立腺癌バイオマーカーが必要であることを示している。
【００４２】
発明者らによって見出された新規のバイオマーカーの多くは、特異性および感度の点でＰＣＡ３よりも大幅に良好である。例えば、Ｒｅｔｒｏ−ＲＰＬ７（配列番号１）では、ＰＣＡ３の場合の０．８５１に対して、０．９３５の値のＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）が得られた（図３）。
【００４３】
配列番号１および配列番号１２を有するバイオマーカーの組合せ物では、０．９８５のＡＵＣが得られた（第７表を参照のこと）。
【００４４】
以下のバイオマーカーの群：
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
は、組み合わせることで、前立腺癌についての指示性が高いことが判明した。
【００４５】
全ての８つの群から選択されるバイオマーカーの組合せ物は、１．０のＡＵＣをもたらす（図６を参照のこと）。
【００４６】
従って、本発明は、患者の試料における少なくとも２種の核酸の発現レベルを解析するステップを含む前立腺癌の診断のための方法において、前記少なくとも２種の核酸が、少なくとも２つの核酸の群から選択され、ここで前記群は、
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
からなり、前記少なくとも２種の核酸の発現レベルが閾値を上回っている場合に、その試料は、前立腺癌陽性と認定される、前記方法に関する。
【００４７】
更に、本発明は、前立腺癌の診断および／または治療のための方法であって、患者の試料における少なくとも２種の核酸の発現レベルを解析するステップ、ここで前記少なくとも２種の核酸が、少なくとも２つの核酸の群から選択され、ここで前記群は、
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
からなり、前記少なくとも２種の核酸の発現レベルが閾値を上回っている場合に、その試料は、前立腺癌陽性と認定される当該ステップと、その患者に１種以上の前立腺癌治療剤を投与するステップとを含む、前記方法に関する。
【００４８】
好ましい前立腺癌治療剤は、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、カバジタキセル（Ｊｅｖｔａｎａ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ−１６）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、酢酸アビラテロン、ビカルタミド、カソデックス、デガレリクス、エンザルタミド、酢酸ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、プレドニゾン、シプリューセル−Ｔ、二塩化ラジウム２２３および／またはビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））を含む。
【００４９】
好ましい一実施形態においては、本発明は、少なくとも２種の核酸の発現レベルを解析するステップを含む前立腺癌の診断のための方法であって、前記少なくとも２種の核酸の少なくとも１種が、群２の配列番号４、５、６、７、８、９および１０および／または群１の配列番号１から選択される、前記方法に関する。
【００５０】
本発明のもう一つの実施形態においては、少なくとも３種の核酸の発現レベルが解析され、ここで前記核酸は、少なくとも３種の異なる群から選択される。本発明のもう一つの実施形態においては、少なくとも４種の核酸の発現レベルが解析され、ここで前記核酸は、少なくとも４種の異なる群から選択される。本発明のもう一つの実施形態においては、少なくとも５種の核酸の発現レベルが解析され、ここで前記核酸は、少なくとも５種の異なる群から選択される。本発明のもう一つの実施形態においては、少なくとも６種の核酸の発現レベルが解析され、ここで前記核酸は、少なくとも６種の異なる群から選択される。本発明のもう一つの実施形態においては、少なくとも７種の核酸の発現レベルが解析され、ここで前記核酸は、少なくとも７種の異なる群から選択される。最も好ましい実施形態においては、それぞれの群からの少なくとも１種の核酸の発現レベルが解析される。
【００５１】
前記試料は、前立腺組織、生検材料、リンパ節、尿、射精液、血液、血液血清、血液血漿、血液もしくはリンパ中に循環している腫瘍細胞、転移を含むことが疑われる任意の組織、ならびに前立腺腫瘍細胞もしくはその部分、例えばエキソソームのような小胞体、微小胞およびそれ以外ならびに前立腺腫瘍細胞に由来する遊離のＲＮＡ分子もしくはタンパク質に結合したＲＮＡ分子を含み得る任意の起源を含む群から選択され得る。より好ましくは、該試料は、尿であり、最も好ましくは、該試料は、直腸指診（ＤＲＥ）後に患者から取得した尿である。
【００５２】
核酸の定量化のための任意の適切な方法を、核酸の発現レベルの解析のために使用することができる。一実施形態においては、核酸の定量化は、蛍光ベースのアッセイを使用して実施される。好ましい一実施形態においては、発現レベルの解析は、標識されたプライマー、標識されたプローブまたは蛍光性検出剤の蛍光を測定することによって実施される。
【００５３】
本発明のもう一つの実施形態においては、該定量化は、核酸増幅をベースとするアッセイを使用して実施される。好ましい一実施形態においては、該定量化は、ＰＣＲ法またはシーケンシング法を使用して実施される。最も好ましい実施形態においては、核酸の定量化は、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して実施される。
【００５４】
もう一つの実施形態においては、核酸またはそれらの逆相補鎖によってコードされるタンパク質が解析されて定量化される。
【００５５】
更に、本発明は、少なくとも２種の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも２種のプライマーまたはプローブを含む前立腺癌の診断のためのキットであって、前記少なくとも２種の核酸が、少なくとも２つの核酸の群から選択され、ここで前記群は、
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
からなる、前記キットに関する。
【００５６】
該キットは、２種より多くの核酸を含んでよい。好ましい一実施形態においては、該キットは、発現レベルの解析を実施するための試薬を含んでもよい。好ましい一実施形態においては、該キットは、核酸増幅および／または核酸定量化および／または核酸検出のための試薬を更に含む。もう一つの実施形態においては、該キットは、対照試料を含む。
【００５７】
実験結果は、ＰＣａの検出のための新規のバイオマーカーの組合せ物の高い特異性および感度を裏付ける。
【００５８】
理想的には、それらの群の核酸の転写物の発現レベルは、試料中の１種または数種類のその他の遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子の転写物の発現レベルと比較される。適切なハウスキーピング遺伝子の例を、以下の第２表に示す：
第２表：
【表６】
2018505656.tif 000007
【００５９】
その閾値は、試験試料と対照試料との間の、試験試料が癌陽性と認定される最小発現差である。
【００６０】
理想的には、試験試料と対照試料との間のバイオマーカーの発現レベルの差は、１．５倍（±２０％）、２倍（±２０％）、３倍（±２０％）、４倍（±２０％）および最も好ましくは５倍（±２０％）以上である。ｐ値（Ｔ検定）は、２×１０-5未満である。ＦＤＲは、好ましくは５×１０-4未満である。
【００６１】
選択された遺伝子の群については、閾値は、好ましくは、２倍（±２０％）の腫瘍試料と対照試料との間の発現増加である。
【００６２】
本発明は、ＲＮＡバイオマーカーレベルの解析に関する。これは、数多くの方法、例えばＰＣＲベースの方法、例えば定量的逆転写ＰＣＲによって達成され得る。
【００６３】
本発明は、バイオマーカーのレベルを特異的に測定するための増幅方法に関する。この方法では、試料は、少なくとも以下の配列の群
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
から選択される配列の核酸に特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーと混合され、そして増幅サイクルが実施される。プローブまたはプライマーは、それらがストリンジェントな条件下で前記標的配列にハイブリダイズするように設計される。少なくとも２つの増幅反応が、並行して、または多重増幅の形で実施され得る。
【００６４】
一実施形態においては、該方法における解析は、標識されたプライマー、標識されたプローブまたは蛍光性検出剤の蛍光を測定することによって実施される。より好ましくは、発現レベルの解析は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって実施される。
【００６５】
更なる一実施形態においては、少なくとも２種の核酸の発現レベルの解析は、シーケンシング法を使用して実施される。
【００６６】
また本発明は、組合せ物中に含まれるバイオマーカーの発現レベルの定量化に関する。増幅後に、定量化へと直接進み、定量化は、数多くの方法によって達成することができる。少なくとも１種のプライマーに蛍光色素が結合されているプライマーが使用される場合に、定量化は、その色素からの蛍光シグナルを使用することで可能である。ＳＹＢＲグリーン、マルチプレックスプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコンおよびＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーのような様々なプライマー系および色素を利用することができる。その他の定量化の考えられる手段は、例えばノーザンブロッティング、次世代シーケンシングまたは２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度測定である。
【００６７】
以下の実施例から明らかとなるように、本発明は、前立腺癌のためのバイオマーカー組合せ物であって、現在のバイオマーカーよりも正確かつ感度が高い該疾患の診断を可能にする組合せ物を開示している。
【００６８】
実施例
臨床コホート
ドレスデン大学病院で根治的前立腺全摘除術（ＲＰＥ）または良性前立腺肥大（ＢＰＨ）の除去手術を受けた前立腺癌（ＰＣａ）患者は、ＰＣａのための新規のバイオマーカーを同定することを目的とする後ろ向き臨床コホートに含まれていた。地元の倫理委員会からの承認および患者からのインフォームドコンセントは、法的規制に従って取得した。ＰＣａ患者に関して、少なくとも５年間の臨床的追跡を収集した。
【００６９】
４０人のＰＣａ患者および８人のＢＰＨ患者のコホートからの前立腺組織試料を、全ゲノムＲＮＡシーケンシングによって診断的に関連したバイオマーカーを同定するために使用した。４つのＰＣａ群を、グリーソンによる進行度（Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒａｎ’ｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ：ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｇｒａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｇｅｒ．第１７１頁〜第１９８頁における）およびＲＰＥに際しての隣接リンパ節における転移の存在に基づいて定義した（第３表を参照のこと）。
【００７０】
【表７】
2018505656.tif 000008
【００７１】
第３表：  全ゲノムＲＮＡシーケンシングのためのＰＣａコホート：  対照群（Ｃ）は、ＢＰＨ試料からなる。非常に低リスク（Ｖ）の群および低リスク（Ｌ）の群は、それぞれ７未満および７と等しいグリーソンスコア（ＧＳ）で格付けされた、全てリンパ節転移を有さない（ｐＮ０）患者からの試料を含む。中リスク（Ｍ）の群は、７以下のＧＳを有し、リンパ節転移を示す（ｐＮ＋）事例を含み、そして高リスク（Ｈ）の群は、７より大きいＧＳを有する組織からなる。最後の群については、同じ患者から得られた腫瘍組織試料と腫瘍不含組織試料の対を解析した。
【００７２】
選択された候補バイオマーカーを、それぞれ、２５６人の患者（４０の対照ＢＰＨ試料、２１６の腫瘍試料）および５６人の患者（１６の対照ＢＰＨ試料、４０の腫瘍試料）を含むコホートに対して、カスタムマイクロアレイおよび定量的逆転写リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって更に検証した。
【００７３】
前立腺組織試料
前立腺組織試料を、ドレスデン大学病院泌尿器科で実施された手術から取得し、ドレスデン大学の総合がんセンターで液体窒素中で貯蔵した。前立腺癌（ＰＣａ）患者の根治的前立腺全摘除術（ＲＰＥ）から取得した前立腺組織試料を、腫瘍試料と腫瘍不含試料とに分けた。良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）を有する患者からの前立腺組織試料を、非腫瘍の対照として使用した。常に患者の同意は取られた。
【００７４】
それらの試料の状態および該試料の腫瘍細胞含量を検証するために、全ての試料を、一連の凍結切片に分割した。このために、凍結組織試料を、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＧｍｂＨ）中に包埋し、金属製圧子上に凍結によって固定した。凍結切片を、−２８℃にまで冷却されたミクロトームブレードＣ３５（ＦＥＡＴＨＥＲ）を備えた凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して調製した。全ての試料を、全部で２０８個の凍結切片へと切断し、そのうちの４個をＨＥ染色し、病理医によってそれらの腫瘍細胞含量に関して評価した（図１）。これにより、それぞれＨＥ染色切片が隣り合っている連続凍結切片の３つの積層物が得られた。少なくとも６０％の腫瘍細胞または多くとも５％の腫瘍細胞を含む切片がどちらか一方の側に隣り合った積層物だけは、それぞれ腫瘍試料または腫瘍不含試料として使用した。次いで、選択された積層物の５０個の凍結切片を、ＲＮＡ調製に供した。
【００７５】
ＲＮＡ単離
全ＲＮＡを、凍結保存された組織からＱｉａｚｏｌおよびｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ＫｉｔをＱＩＡｃｕｂｅ（全てＱｉａｇｅｎ社製）において使用して、引き続き手作業でＤＮａｓｅＩ消化を行うことで単離した。ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００（Ｐｅｑｌａｂ）を使用して測定した。ＲＮＡ完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、パロアルト）において検証し、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）が少なくとも６であるＲＮＡ試料だけを更に処理した。
【００７６】
全ゲノム長鎖ＲＮＡ次世代シーケンシング
全ゲノム長鎖ＲＮＡシーケンシングは、対照として良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）由来の前立腺組織試料８個と、腫瘍組織試料５６個（グリーソンスコア＞７を有する試料からの腫瘍組織と腫瘍不含組織の対を含む）を含む後ろ向きＰＣａコホートのサブセットを使用して実施した。１μｇの全ＲＮＡから、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用してリボソームＲＮＡを除去した。シーケンシングライブラリを、５０ｎｇのｒＲＮＡ除去されたＲＮＡから、ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ  ｖ２  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して調製した。二重タグｃＤＮＡを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製した。ＰＣＲを、１０サイクルを通じて実施することで、試料多重化のためのインデックスバーコードを導入し、ｃＤＮＡライブラリを増幅した。増幅されたライブラリの量および濃度を、ＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＫｉｔをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において使用して測定した。８つの試料のそれぞれ４ｎｇをプールし、アガロースゲル電気泳動を使用して２％アガロースゲルでサイズ選択した。１５０ｂｐおよび６００ｂｐの間の試料範囲のゲルを切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の指示に従って精製した。精製したライブラリを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいてＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量化した。次いで、精製されサイズ選択されたライブラリのプールを全て、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００フローセルにそれを全てのレーンの間で分けてロードした。クラスター生成を、ＴｒｕＳｅｑ  ＰＥ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔｓ  ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ  ｃＢＯＴ機器において製造業者のプロトコールに従って実施した。シーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００シーケンシング装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）で実施した。シーケンシング実行の詳細は、以下の通りである：ペアエンドシーケンシングストラテジー；リード１について１０１サイクル、インデックス配列について７サイクル、そしてリード２について１０１サイクル。
【００７７】
シーケンシングデータの解析：生データの準備
ベースコールファイル（ＢＣＬファイル）を含む生シーケンシングデータを、ＣＡＳＡＶＡ  ｖ１．８．１（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で処理して、ＦＡＳＴＱファイルを得た。ＦＡＳＴＱファイルは、各々の臨床試料について全てのシーケンシングされたＲＮＡ断片を含み、それを以下では「リード」と呼ぶ。特定のアダプター配列を、ｃｕｔａｄａｐｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄｅ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｐ／ｃｕｔａｄａｐｔ／）を使用することによって除去した。
【００７８】
シーケンシングデータの解析：ゲノムマッピングおよび転写物アセンブリング：
リードを、ヒトゲノム（アセンブリｈｇ１９）にｓｅｇｅｍｅｈｌ  ｖ０．１．４−３８２およびＴｏｐＨａｔ  ｖ２．０．９を使用してマッピングした。新規の転写物、すなわちＧｅｎｃｏｄｅ  ｖ１７でアノテーションされていない転写物を、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ  ｖ２．１．１およびＣｕｆｆｍｅｒｇｅ  ｖ２．１．１を使用してアセンブリングした。全ての新規の転写物および全ての既知のＧｅｎｃｏｄｅ  ｖ１７転写物を、包括的アノテーションセットにまとめた。
【００７９】
シーケンシングデータの解析：統計解析
Ｈｔｓｅｑ−ｃｏｕｎｔ  ｖ０．５．４ｐ１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｈｕｂｅｒ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／ｕｓｅｒｓ／ａｎｄｅｒｓ／ＨＴＳｅｑ／ｄｏｃ／ｃｏｕｎｔ．ｈｔｍｌ）を使用して、新規の転写物および既知の転写物の総括的アノテーションセットに含まれる転写物および遺伝子につきリードカウントを算出した。発現の異なる転写物および遺伝子を、ＲおよびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒライブラリｅｄｇｅＲを使用して同定した。臨床試料の異なるＲＮＡ組成を、それぞれの試料についてライブラリサイズをスケーリングすることによって調整した（ＴＭＭ法）。負の二項分布の対数線形モデルを、それぞれの転写物または遺伝子についてリードカウントに、および尤度比検定によって特定された０とは異なる係数に、フィッティングした。偽発見率は、ベンジャミニ−ホフバーグ補正によって制御した。
【００８０】
カスタムマイクロアレイによる検証
シーケンシングの結果に基づいて、１８００００種のプローブを有するカスタムマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｅｘｏｎ  Ａｒｒａｙ，４ｘ１８０Ｋ，Ｄｅｓｉｇｎ−ＩＤ  ０５８０２９）を、ｍＲＮＡ、長鎖非コーディングＲＮＡ（ｇｅｎｃｏｄｅ  ｖ１５）、新規の転写物および全ての発現が異なる転写物を含めて設計した。
【００８１】
マイクロアレイスクリーニングを、対照としての良性前立腺肥大症からの４０個の前立腺組織試料と、根治的前立腺全摘除術後のＰＣａ患者のそれぞれ１６４個の腫瘍組織試料および５２個の腫瘍不含組織試料とを含む後ろ向きＰＣａコホートを使用して実施した。Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ｃＲＮＡを２００ｎｇの全ＲＮＡから合成し、そして１６５０ｎｇのｃＲＮＡを、アレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）にハイブリダイズさせた。
【００８２】
定量的リアルタイムＰＣＲによる検証
次世代シーケンシングおよびマイクロアレイスクリーニングによって得られた結果の検証のために、全体で５６個の試料（１６個の腫瘍不含試料および４０個の腫瘍試料）を、定量的リアルタイムＰＣＲによってスクリーニングした。
【００８３】
ｃＤＮＡを、１００ｎｇの全ＲＮＡからＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびランダムプライマーを使用して製造業者の指示に従って合成した。引き続き、ＰＣＲアッセイを、４μｌの希釈されたｃＤＮＡを使用して実行した。定量的リアルタイムＰＣＲを、カスタムデザインのＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とハウスキーピング転写物および標的転写物についてデザイン済みのものを使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて実施した。
全ての試料を三回反復で測定し、これらの測定値の平均を更なる計算のために使用した。
【００８４】
【表８】
2018505656.tif 000009
【００８５】
第４表：前立腺組織試料におけるｑＲＴ−ＰＣＲ検証のために使用されたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＡｓｓａｙのＩＤ。
【００８６】
ＲＴ−ｑＰＣＲ結果の統計解析
データの正規化は、それぞれ非調節のハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（配列番号１）ならびにＨＰＲＴ１（配列番号３および配列番号９）のそれぞれに対して実施した。相対的定量化のために、それぞれの試料の遺伝子発現の変化を、対照試料のメジアン発現値に対して解析した。全ての統計解析は、統計ソフトウェアＲを使用して実施した。
【００８７】
ｌｏｇ２変換されたバイオマーカーの相対発現レベルを、腫瘍試料および対照試料の間でスチューデントのｔ検定を使用して比較した。曲線下面積（ＡＵＣ）による各々のマーカーの診断力の尺度を表す受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を、パッケージｐＲＯＣを使用して計算した。全ての試料を三回反復で測定し、これらの測定値の平均を更なる計算のために使用した。
【００８８】
ＤＲＥ尿試料における検証
ＤＲＥ尿試料の採集およびＲＮＡ単離
尿試料を、前立腺の直腸指診（ＤＲＥ）後に採集した（ＤＲＥ尿）。このごく普通に実施される試験法により、一定量の前立腺細胞を含む尿試料を得ることが可能である。ＤＲＥ尿試料を、遠心分離し、ＰＢＳを使用して２回洗浄した。得られた細胞ペレットを、７００μｌのＱｉａｚｏｌ中に再懸濁した。全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ＫｉｔをＱＩＡｃｕｂｅ（全てＱｉａｇｅｎ社製）において使用して、引き続き手作業でＤＮａｓｅＩ消化を行うことで単離した。ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００（Ｐｅｑｌａｂ）を使用して測定した。ＲＮＡ完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ社製のＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、パロアルト）において検証した。
【００８９】
ＤＲＥ尿試料の定量的リアルタイムＰＣＲスクリーニング
ｃＤＮＡを、２×５０ｎｇの全ＲＮＡからＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびランダムプライマーを使用して製造業者の指示に従って合成した。引き続き、ＰＣＲアッセイを、４μｌのｃＤＮＡを使用して実行した。定量的リアルタイムＰＣＲを、カスタムデザインのＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とハウスキーピング転写物（ＰＳＡ）および標的転写物についてデザイン済みのものを使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて実施した。全ての試料を二回反復で測定し、これらの測定値の平均を更なる計算のために使用した。
【００９０】
ＤＲＥ尿試料の全ゲノム長鎖ＲＮＡ次世代シーケンシング
全ゲノム長鎖ＲＮＡシーケンシングのために、７つのＤＲＥ尿試料からの全ＲＮＡをエタノールを使用して沈殿させて、ＲＮＡ量を濃縮し、１０μｌのＲＮアーゼ不含の水中に再懸濁した。ｒＲＮＡ除去は、４ｎｇの全ＲＮＡでＬｏｗ  ｉｎｐｕｔ  Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈによって変更されたＥｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して実施して、１０μｌのｒＲＮＡ除去ＲＮＡが得られた。シーケンシングライブラリを、８μｌのｒＲＮＡ除去ＲＮＡから、ＳＭＡＲＴＥＲ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡｓｅｑ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して調製した。二重タグｃＤＮＡを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製した。ＰＣＲを、１８サイクルを通じて実施することで、試料多重化のためのインデックスバーコードを導入し、ｃＤＮＡライブラリを増幅した。増幅されたライブラリの量および濃度を、ＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＫｉｔをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において使用して測定した。試料をプールし、そしてクラスター生成を、１５ｐｍｏｌ／ｌのプールしたライブラリおよびＴｒｕＳｅｑ  ＰＥ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔ  ｖ４（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ  ｃＢＯＴ機器において製造業者のプロトコールに従って実施した。シーケンシングは、ＨｉＳｅｑ  ＳＢＳ  ｖ４シーケンシング試薬（２５０サイクル）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００シーケンシング装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）で実施した。シーケンシング実行の詳細は、以下の通りである：ペアエンドシーケンシングストラテジー；リード１について１２６サイクル、インデックス配列について７サイクル、そしてリード２について１２６サイクル。
【００９１】
ＤＲＥ尿からのｑＲＴ−ＰＣＲ結果の統計解析
ＤＲＥ尿試料からのｑＲＴ−ＰＣＲ結果の解析のために、データ正規化を、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に対して実施した。相対的定量化のために、それぞれの試料の遺伝子発現の変化を、対照試料のメジアン発現値に対して解析した。全ての統計解析は、統計ソフトウェアＲを使用して実施した。
【００９２】
【表９】
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【００９３】
第５表：ｑＲＴ−ＰＣＲ検証のために使用されたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＡｓｓａｙのＩＤ。
【００９４】
結果
ＲＰＥに際して得られた４０個のＰＣａ腫瘍試料および１６個の腫瘍不含試料ならびに良性の非腫瘍の対照としての８個のＢＰＨ前立腺組織試料のトランスクリプトームを、鎖特異的なペアエンド長鎖ＲＮＡ次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して解析した。試料１つ当たり少なくとも３つのセグメントにおいて約１５０個の凍結切片を、最適なデータ品質および解析の強さを目的として調製した。病理学的評価に際して、腫瘍試料および腫瘍不含試料のそれぞれにおいて６０％および５％の最大腫瘍細胞カウントおよび最小腫瘍細胞カウントを満たすセグメントだけを、更なる解析のために確保した。トランスクリプトームシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）アプローチは、正常前立腺組織または癌前立腺組織において発現されるＲＮＡの総括的な同定および定量化を目的としていた。全てのクラスのコーディング転写物および長鎖非コーディング転写物を、ポリアデニル化状態とは無関係にシーケンシングした。高いライブラリ複雑性を保証するために、ＲＮＡの多量のインプット量を使用した。更に、平均して２００Ｍのペアエンドリード２×１００ｎｔを１ライブラリ当たりにシーケンシングすることで、高いカバレッジのため発現の低い新規の転写物のアセンブリングが可能となった。このアプローチは、より数多くの試料を解析する最も類似した公表された研究を凌ぐものであった。Ｇｅｎｃｏｄｅ  ｖ１７でアノテーションされていない転写物とエキソン重複を示さない全体で約３０００個の新規の転写物がアセンブリングされた。０．０１の偽発見率で、全ての対比にわたる６４４２個の発現が異なる遺伝子が観察された。具体的な対比についての発現が異なる遺伝子の数は、第４表に示されている。
【００９５】
第６表：多様な対比およびＧｅｎｃｏｄｅバイオタイプについての発現が異なる遺伝子の数
【表１０】
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【００９６】
それらの結果は、前立腺腫瘍組織および正常組織の間で発現が異なることが予め報告されている多数の転写物を好結果に再現した。更に、数多くの新規のＰＣａ関連転写物が同定され、それらは、ＰＣａの診断のためのアッセイを開発するために使用することができる。選択された最も有望な転写物を、ＰＣＡ腫瘍およびＢＰＨ対照試料の試験コホートにおいてｑＲＴ−ＰＣＲによって検証した。
【００９７】
これらの新規の候補バイオマーカーの幾つかは、ＰＣａ診断のために既に使用されているバイオマーカーＰＣＡ３の特異性および感度を大きく凌駕している。シーケンシングコホートにおいて、ＰＣＡ３は、ＰＣａと明らかに対応付けられていることが分かるが、高リスク群において低下する傾向が強い（図２）。
【００９８】
試験コホートにおいては、新規バイオマーカーのＲｅｔｒｏ−ＲＰＬ７（配列番号１）では、ＰＣＡ３の場合の０．８５１に対して、０．９３５の値のＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）が得られた（図３）。本発明のバイオマーカーＲｅｔｒｏ−ＲＰＬ７とＸＬＯＣ１３３８９７との組合せは、０．９７５のＡＵＣを示した（図６）。
【００９９】
それらの実験結果は、ＰＣａの検出のための新規のバイオマーカーの高い特異性および感度を裏付ける。従って、アッセイは、これらの新たに見出されたバイオマーカーの単独または組合せでの（もしくは既に既知のマーカーとの組合せでの）測定に基づいて、ＰＣａの診断のために使用されるべき前立腺腫瘍細胞またはそれらの部分（例えばエキソソームのような小胞体、微小胞およびそれ以外ならびに前立腺腫瘍細胞に由来する遊離のＲＮＡ分子もしくはタンパク質に結合したＲＮＡ分子）を含み得る全ての起源において構成され得る。これらの起源には、（制限されるものではないが）前立腺組織、生検材料、リンパ節、尿、射精液、血液、血液血清、血液血漿、血液もしくはリンパ中に循環している腫瘍細胞、ならびにＰＣａ転移を含むことが疑われる任意の組織が含まれる。本発明のＲＮＡバイオマーカーの測定は、ＲＮＡレベルを具体的に見積もるために適した任意の方法、例えばｑＲＴ−ＰＣＲのようなＰＣＲベースの方法によって行うことができる。該アッセイは、ＰＣａの早期診断（スクリーニング）のために、腫瘍の攻撃性を予測（予後）するために、および／または治療の選択を補助するために適用することができる。
【０１００】
従って、これらのバイオマーカーを基礎とする診断アッセイは、現在のアッセイの高い偽陽性率を劇的に低下させることができ、それにより不必要な侵襲性の前立腺生検を避ける助けとなり得る。
【０１０１】
以下の
群１：  配列番号１
群２：  配列番号４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２４５７５０．３のスプライスバリアント
群３：  配列番号２６、２７、２８および２９の群から選択される、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００２５５５４５．３のスプライスバリアント
群４：  配列番号３および配列番号１１
群５：  配列番号１２
群６：  配列番号２４
群７：  配列番号３６
群８：  配列番号３８
からなる群から選択されるバイオマーカーの組合せ物は、それらの診断値についても組み合わせて解析されている。発明者らは、前記群の組合せが、以下の表および図７に示されるように解析された場合に、診断値およびＡＵＣが大きく増加することを見出した。これは、単独の新規のバイオマーカーが以前から既知のバイオマーカーより優れているだけでなく、それらの組合せ物が、驚くべきことに、ＰＣａ診断の更なる本質的な改善を可能にすることを示している。
【０１０２】
第７表：群５からの配列を含むマーカー組合せ物のＡＵＣ値と、群５単独のＡＵＣ値との対比。２５６個の前立腺組織試料のカスタムマイクロアレイ解析から得られたデータ。
【０１０３】
【表１１】
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【０１０４】
第８表：群２からの配列を含むマーカー組合せ物のＡＵＣ値と、群２単独のＡＵＣ値との対比。２５６個の前立腺組織試料のカスタムマイクロアレイ解析から得られたデータ。
【０１０５】
【表１２】
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【０１０６】
第９表：群３からの配列を含むマーカー組合せ物のＡＵＣ値と、群３単独のＡＵＣ値との対比。２５６個の前立腺組織試料のカスタムマイクロアレイ解析から得られたデータ。
【０１０７】
【表１３】
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【０１０８】
第１０表：群４からの配列を含むマーカー組合せ物のＡＵＣ値と、群４単独のＡＵＣ値との対比。２５６個の前立腺組織試料のカスタムマイクロアレイ解析から得られたデータ。
【０１０９】
【表１４】
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【０１１０】
第１１表：群１からの配列を含むマーカー組合せ物のＡＵＣ値と、群１単独のＡＵＣ値との対比。２５６個の前立腺組織試料のカスタムマイクロアレイ解析から得られたデータ。
【０１１１】
【表１５】
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【０１１２】
第１２表：群６からの配列を含むマーカー組合せ物のＡＵＣ値と、群６単独のＡＵＣ値との対比。６４個の前立腺組織試料のＲＮＡ次世代シーケンシングから得られたデータ。
【０１１３】
【表１６】
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【０１１４】
第１３表：群７および群８からの配列を含むマーカー組合せ物のＡＵＣ値と、群７単独または群８単独のＡＵＣ値との対比。２５６個の前立腺組織試料のカスタムマイクロアレイ解析から得られたデータ。
【０１１５】
【表１７】
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【０１１６】
また発明者らは、全ての群の発現が、患者の尿試料中で検出できるが、健康な患者においては存在しないかまたは発現が低いことを見出した（図８）。このことは、Ｆｏｎｔｅｎｅｔｅら（Ｉｎｔ．ｂｒａｚ  ｊ  ｕｒｏｌ．ｖｏｌ．３７  ｎｏ．６  Ｒｉｏ  ｄｅ  Ｊａｎｅｉｒｏ  Ｎｏｖ．／Ｄｅｃ．２０１１）により、健康な患者ではＰＣａ患者よりも頻繁に尿試料中でＰＳＡのｍＲＮＡが過剰発現されることが見出されるので、該ｍＲＮＡは、これらの試料中で前立腺癌のために適したバイオマーカーではないと示されていたため驚くべきことである。従って、尿試料中でのバイオマーカー発現レベルの解析を前立腺癌を確実に診断するために使用できたことが明らかであると推測されるものではなかった。
【０１１７】
これらのバイオマーカーの組合せを基礎とする診断アッセイの利点により、現在のアッセイと比較して劇的に低い偽陽性率が可能となり、そして尿試料中でのそれらの発現レベルを測定することで、不必要な侵襲性の前立腺生検を実施する必要性が避けられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】組織試料品質の検証：組織試料の腫瘍細胞含量を測定するために、凍結切片を、凍結試料から上記のように調製した。ＨＥ：ヘマトキシリン／エオシン、ＩＨＣ：免疫組織化学。組織試料品質の検証：４μｍの凍結切片を、凍結試料から上記のように、ＨＥ染色（組織試料の腫瘍細胞含量を確認するため）、ＲＮＡおよびＤＮＡの単離のため、ならびにＩＨＣのために調製した。ＨＥ：ヘマトキシリン／エオシン、ＩＨＣ：免疫組織化学。
【図２】転写物ＰＣＡ３についてのＲＮＡ配列データのボックスブロット。対照としての良性前立腺肥大症からの８個の前立腺組織試料（Ｃ）、それぞれ群Ｖ（非常に低リスク；グリーソン＜７、ｐＮ０）、Ｌ（低リスク；グリーソンスコア＝７、ｐＮ０）およびＭ（中リスク；グリーソンスコア＜＝７、ｐＮ＋）それぞれの８個のＰＣａ腫瘍試料、ならびに群Ｈ（高リスク；グリーソンスコア＞７）からの１６対の腫瘍組織および腫瘍不含組織の試料を含む後ろ向きＰＣａコホートのＲＮＡシーケンシングからの結果。
【図３】５６個の前立腺組織試料のｑＲＴ−ＰＣＲ解析から得られたＲｅｔｒｏ−ＲＰＬ７（配列番号１）およびＰＣＡ３のＲＯＣ曲線。
【図４】配列番号１２についてのカスタムマイクロアレイのボックスブロット。対照としての良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）からの４０個の前立腺組織試料と、根治的前立腺全摘除術（ＲＰＥ）後のＰＣａ患者のそれぞれ１６４個の腫瘍組織試料および５２個の腫瘍不含組織試料とを含む後ろ向きＰＣａコホートのカスタムマイクロアレイ解析からの結果。
【図５】図４に記載される２５６個の前立腺組織試料のカスタムマイクロアレイ解析から得られた配列番号１２のＲＯＣ曲線。
【図６】２転写物シグネチャを基礎とするロジットモデル。ＲＯＣ曲線は、Ｒｅｔｒｏ−ＲＰＬ７（配列番号１）およびＸＬＯＣ１３３８９７（配列番号２）を含む多変量ロジットモデルについて示されている（ＡＵＣ＝０．９７５）。
【図７】バイオマーカーシグネチャ：Ａ）配列番号１、３、４〜１０、１１、１２、２４、２６〜２９、３６および３８の全ての転写物についての、８個の対照組織試料（良性前立腺肥大症、ＢＰＨ）および４０個の前立腺癌組織試料からのＲＮＡ次世代シーケンシングによって得られたデータを、より高い特異性および感度を得るために１つのシグネチャとしてまとめた。データは、ボックスプロット（左）およびＲＯＣ曲線（右）によって示される。得られるＡＵＣ値は、１．０である。Ｂ）配列番号１、３、４〜１０、１１、１２、２４、２６〜２９および３８の全ての転写物についての、４０個の対照組織試料（良性前立腺肥大症、ＢＰＨ）および１６４個の前立腺癌組織試料からのカスタムマイクロアレイ解析によって得られたデータを、より高い特異性および感度を得るために１つのシグネチャとしてまとめた。データは、ボックスプロット（左）およびＲＯＣ曲線（右）によって示される。得られるＡＵＣ値は、１．０である。
【図８】ＲＮＡ次世代シーケンシングによる尿試料中のバイオマーカー検出：尿試料は、泌尿器科医による患者の直腸指診後に取得した。これらの試料から単離されたＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００次世代シーケンサーを使用した全トランスクリプトームＲＮＡシーケンシングに供した。リードを、標準的なアルゴリズムによってゲノムにマッピングし、示された配列番号のゲノム遺伝子座へのリードのマッピングをカウントし、尿中の前立腺上皮細胞の存在のための尺度としての前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の遺伝子座から得られたリードへと正規化した。前立腺癌を有すると診断された患者と有さないと診断された患者の試料を比較した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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