(57)【要約】  本発明は、ヒトＣＤ１９に対する抗体（抗ヒトＣＤ１９抗体）、それらの生成方法、これらの抗体を含む薬学的組成物、及びそれらの使用方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体よりも高い親和性でヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、
（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体断片である、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号９９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
完全長ＩｇＧ１抗体である、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵ指数による番号付け）を有する完全長ＩｇＧ１抗体である、請求項１から７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ヒト及びカニクイザルＣＤ１９に対して交差反応性である、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
二重特異性である抗体であって、ヒトＣＤ１９及び第２の抗原結合部分に特異的に結合し、
（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、
（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む抗体。
【請求項１１】
請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
（ｉ）抗体の発現に適した条件下で請求項１３に記載の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）抗体を回収する工程を含む、請求項１から１０に記載の抗体を生産するための方法。
【請求項１５】
請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される抗体を含む薬学的製剤。
【請求項１６】
医薬として使用するための、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
Ｂ細胞がんの治療に使用するための、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
Ｂ細胞の除去に使用するための、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬または骨疾患の治療に使用するための、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
医薬、特にＢ細胞がんを治療するための医薬の製造における、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤ１９に対するヒト化抗体（抗ヒトＣＤ１９抗体）、それらの生成方法、これらの抗体を含む薬学的組成物、及びそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＣＤ１９は、Ｂ細胞及び濾胞性の樹状細胞に排他的に発現される９５ｋＤａ膜貫通タンパク質（Ｂ細胞共受容体）である。ＣＤ１９は、ＣＤ２１及びＣＤ８１と関連して見出される。ＣＤ１９及びＣＤ２１は、正常なＢ細胞分化に必要とされる（Carter, R.H.等, Immunol. Res. 26 (2002) 45-54）。ＣＤ１９に対する抗体は、いくつかの臨床試験において使用されている（例えば、Hekman, A.等, Cancer Immunol. Immunother. 32 (191) 364-372; Vlasfeld, L.T.等, Cancer Immunol. Immunother. 40 (1995) 37-47; Conry, R.M.等, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 18 (1995) 231-241; Manzke, O.等, Int. J. Cancer 91 (2001) 516-522)を参照されたい）。
【０００３】
ＣＤ１９に対する抗体は、Ｂ細胞活性化において阻害又は刺激効果を有することができる。マイトジェン刺激されたＢ細胞へのＣＤ１９抗体の結合は、その後のＣａ２＋の上昇を阻害し、結果としてのこれらの細胞の活性化及び増殖、並びにＢ細胞の増殖及び分化は、使用される分裂促進刺激、及び抗体による架橋の程度に依存して、ＣＤ１９抗体によって阻害又は増強され得る。ＣＤ１９に対する抗体によって治療されるがんには、例えば、限定されないが、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び急性リンパ芽球性白血病を含む、例えば、Ｂ細胞リンパ腫及びＢ細胞白血病などのＢ細胞系統の悪性腫瘍が含まれる。また、ＣＤ１９に対する抗体は、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬、又は骨疾患の治療に有用であり得る。
【０００４】
国際公開第２０１１／１４７８３４号において、ＣＤ１９に対する抗体及びそれらの使用が報告されている。しかしながら、これらの抗体は、それらの配列中に特定の脱アミノ化ホットスポットを有することが見出されている。本明細書に記載されている抗体は、これらの脱アミド化ホットスポットを欠く配列を特徴とするだけでなく、それらはまた、標的ＣＤ１９に対してより高い親和性を有する。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、本発明は、高親和性を有する抗ヒトＣＤ１９抗体を提供する。
【０００６】
一態様において、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体よりも高い親和性でヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。
【０００７】
別の態様において、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供され、抗体は、
（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、
（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む。
【０００８】
さらなる態様において、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。別の態様において、抗体は、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体断片である。
【０００９】
特定の態様において、抗体は、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体が提供される。
【００１０】
さらなる態様において、完全長ＩｇＧ１抗体である、本明細書において先に記載されている抗体が提供される。
【００１１】
特定の態様において、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵ指数による番号付け）を有する完全長ＩｇＧ１抗体である、本明細書に記載されている抗体が提供される。
【００１２】
特定の態様において、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵ指数による番号付け）を有する完全長ＩｇＧ１抗体である、本明細書に記載されている抗体が提供される。
【００１３】
さらなる態様において、ヒト及びカニクイザルＣＤ１９に対して交差反応性である、本明細書に記載されている抗体が提供される。
【００１４】
別の態様において、二重特異性である抗体が提供され、前記抗体はヒトＣＤ１９及び第２の抗原結合部分に特異的に結合し、
（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、
（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、本明細書において先に定義されている抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらにベクター、特に、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００１６】
別の態様において、（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程を含む、本発明の抗体を生成する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって生成された抗体を包含する。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の抗体及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明によって、医薬として使用するための、本発明の抗体又は本発明の薬学的組成物が包含される。一態様において、それを必要とする個体における疾患の治療に使用するための、本発明の抗体又は本発明の薬学的組成物が提供される。特定の態様において、がんの治療に使用するため、本発明の抗体又は本発明の薬学的組成物が提供される。別の態様において、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患の治療に使用するための、本発明の抗体又は本発明の薬学的組成物が提供される。
【００１９】
また、それを必要とする個体における疾患を治療するための医薬、特にがんを治療するための医薬を製造するための本発明の抗体の使用、並びに前記個体に、薬学的に許容される形態で抗体を含む治療的有効量の組成物を投与することを含む、個体において疾患を治療するための方法が提供される。特定の態様において、疾患はがんである。別の態様において、疾患は、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬、又は骨疾患からなる群から選択される。上記の実施態様の何れかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】親クローン８Ｂ８のＣＤＲ領域についてのランダム化ストラテジーを説明する図面である。親クローン８Ｂ８及びＣＤＲ領域（囲み）の可変ドメインをＫａｂａｔの番号付けに従って示している。ＶＬ配列は、配列番号１１４に相当し、ＶＨ配列は配列番号１１３に相当する。（Ｘ）は、ランダム化された位置を表す。
【図２】ライブラリー生成ストラテジーの概略的説明を示す図である。Ａ）ランダム化した軽鎖及び重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域、又はＢ）ランダム化した軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域並びに重鎖のＣＤＲ３領域を用いた８Ｂ８ベースのライブラリーの生成に使用したＰＣＲ増幅及びクローニングストラテジーを示す。ファージミドへのクローニングに使用した各酵素を示している。
【図３】親抗ＣＤ１９クローン８Ｂ８と選択された親和性成熟結合因子とのアラインメントを示す図である。クローン８Ｂ８及び全ての選択された親和性成熟結合因子の配列を示す。重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲを枠で囲んでいる。
【図４Ａ−Ｂ】親８Ｂ８クローン及びその親和性成熟変異体のＳＰＲ分析に関する図である。ＬＣＤＲ１  Ｎ２７ｄ及びＮ２８ホットスポットを欠くクローン８Ｂ８及びその親和性成熟誘導体のセンサーグラムを示す。
【図４Ｃ−Ｄ】ＬＣＤＲ１  Ｎ２７ｄ及びＮ２８ホットスポットを欠くクローン８Ｂ８の親和性成熟誘導体のセンサーグラムを示す図である。
【図４Ｅ−Ｆ】ＬＣＤＲ１  Ｎ２７ｄ及びＮ２８ホットスポットを欠くクローン８Ｂ８の親和性成熟誘導体のセンサーグラムを示す図である。
【図４Ｇ−Ｈ】ＬＣＤＲ１  Ｎ２７ｄ及びＮ２８ホットスポットを欠くクローン８Ｂ８の親和性成熟誘導体のセンサーグラムを示す図である。
【図５】ヒトＣＤ１９発現腫瘍細胞（ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞）への様々なＣＤ１９ＩｇＧ１クローンの結合を示す図である。結合は、ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片を用いて検出した。試験したクローンの濃度に対する蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する当該技術分野において一般的に使用されるものと同じ意味を有する。本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数形も含み、その逆も同じである
【００２２】
本明細書において使用するとき、用語「抗原結合分子」とは、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及びスキャフォールド抗原結合タンパク質である。
【００２３】
用語「抗原結合部分」とは、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様において、抗原結合部分は、その標的細胞抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様において、抗原結合部分は、それが結合するエンティティを標的部位へと指向させることができる。抗原結合部分には、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗体及びそれらの断片が含まれる。加えて、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合部分には、本明細書において以下に定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインをベースとする結合ドメイン、例えば、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰＩｉｎ）（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号参照）又はリポカリン（アンチカリン）が含まれる。
【００２４】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００２５】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書において使用するとき、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、例えば、天然に存在する変異を含有する又はモノクローナル抗体調製物の生成中に発生する可能性のある変異体を除いて、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合し、このような変異体は、一般的に少量で存在している。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００２６】
用語「単一特異性」抗体は、本明細書において使用するとき、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を示す。用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的である２つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００２７】
用語「価」とは、本出願内において使用するとき、抗原結合分子内における特定数の結合部位の存在を示す。したがって、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗原結合分子内における、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位をそれぞれ示す。
【００２８】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書において互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似した構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、天然に存在する、様々な構造を有する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型のＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖と２つの重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）が続く。抗体の重鎖は、５つのタイプのうちの１つ、即ち、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）に割り当てられ得、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けることができる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの何れかに割り当てることができる。
【００２９】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ等，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３巻，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、及びインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の検討については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ等，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディはまたＨｕｄｓｏｎ等，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照されたい）。抗体断片は、様々な技術によって作製することができ、このような技術には、限定されないが、本明細書に記載されているように、インタクトな抗体のタンパク質分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による生産が含まれる。
【００３０】
インタクトな抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が生成され、これら断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインの各々、及びさらには軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書において使用するとき、用語「Ｆａｂ断片」とは、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片、並びに重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００３１】
用語「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とは、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されているＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成物が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されたものであり、即ちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されているとき、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖を含む。このようなクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００３２】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーかならなるポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し、ここで、前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２から５０個のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化する。加えて、これら単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によりさらに安定し得る。
【００３３】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ＶＨとＶＬは一緒に、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーは少なくとも３０個のアミノ酸のポリペプチドである。加えて、これらｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によりさらに安定し得る。
【００３４】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０から約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシンに、並びに溶解度のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、又はその逆に接続することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−９６に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴を有し、即ちＶＬドメインとともに機能性抗原結合部位をアセンブルすることができる、又はＶＬドメインの特徴を有し、即ちＶＨドメインとともに機能性抗原結合部位をアセンブルすることができる単鎖ポリペプチドを含み、それにより完全長抗体の抗原結合特性を提供する。
【００３５】
「スキャフォールド抗原結合タンパク質」は、当該技術分野において公知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインのための代替的スキャフォールドとして使用されている。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ及びＳｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １３：２４５−２５５（２００９）及びＳｔｕｍｐｐ等，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：６９５−７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様において、スキャフォールド抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（エビボディ（Ｅｖｉｂｏｄｙ））、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡ（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ））のＺ−ドメイン、Ａ−ドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ））、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ））、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体ベータ−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ（ｋｕｎｉｔｚ）型、ミクロボディ、例えばノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。
【００３６】
ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋  Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ｉｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を付与するために、異種配列で置換することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディ（例えば米国特許第７１６６６９７Ｂ１号）としても公知である。エビボディは、抗体（例えばドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。さらなる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２），３１−４５（２００１）を参照されたい。
【００３７】
リポカリンは、疎水性の小分子、例えばステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、異なる標的抗原に結合するように操作され得る、円錐構造の開放端に複数のループを有する剛性のベータシート二次構造を有する。アンチカリンは、大きさが１６０から１８０個のアミノ酸であり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４８２：３３７−３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７Ｂ１号及び米国特許出願公開第２００７／０２２４６３３号を参照されたい。
【００３８】
アフィボディは、抗原に結合するように操作され得る黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡに由来するスキャフォールドである。ドメインは、約５８個のアミノ酸の３つのヘリックス束からなる。表面残基の無作為化によりライブラリーが生成されている。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７，４５５−４６２（２００４）及び欧州特許出願公開第１６４１８１８Ａ１号を参照されたい。
【００３９】
アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。約３５個のアミノ酸の天然ドメインは、画定されたジスルフィド結合構造をとる。Ａドメインのファミリーが呈する自然変異のシャフリングにより、多様性が生じる。さらなる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１２），１５５６−１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １６（６），９０９−９１７（２００７年、６月）を参照されたい。
【００４０】
トランスフェリンは単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容表面ループのペプチド配列の挿入により、様々な標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリンスキャフォールドの例には、トランスボディが含まれる。さらなる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４，２４０６６−２４０７３（１９９９）を参照されたい。
【００４１】
設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への結合を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリン反復は、２つのアルファヘリックス及び１つのベータターンからなる３３個の残基モチーフである。これらは、各リピートの１番目のアルファヘリックス及びベータターンの残基を無作為化することにより、様々な標的抗原に結合するように操作することができる。これらの結合接触面は、モジュールの数を増加させることにより増大させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９−５０３（２００３），ＰＮＡＳ  １００（４），１７００−１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９，１０１５−１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４／０１３２０２８Ａ１号を参照されたい。
【００４２】
単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科（ナノボディ又はＶＨＨ断片）由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。
【００４３】
フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作することができるスキャフォールドである。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦＮ３）の１５個の反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。ベータサンドイッチの一端の３つのループは、目的とする治療的標的をアドネクチンが特異的に認識することを可能にするように操作することができる。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８，４３５−４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８／０１３９７９１号、国際公開第２００５／０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８Ｂ１号を参照されたい。
【００４４】
ペプチドアプタマーは、定常スキャフォールドタンパク質、典型的には活性部位に挿入された制限可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細については、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，７８３−７９７（２００５）を参照されたい。
【００４５】
ミクロボディは、３から４個のシステイン架橋を含む、長さが２５から５０個のアミノ酸の天然に存在するマイクロプロテインに由来する−マイクロプロテインの例には、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンが含まれる。マイクロプロテインは、マイクロプロテインのフォールド全体に影響を与えずに、最大２５個のアミノ酸を含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインのさらなる詳細については、国際公開第２００８／０９８７９６号を参照されたい。
【００４６】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。
【００４７】
用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部又は全部に結合し、及び抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗原結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合することができ、この特定の部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００４８】
本明細書において使用するとき、用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり、又は非連続的アミノ酸の別個の領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。別途指示がない限り、本明細書において抗原として有用なタンパク質は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様において、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質に言及する場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、及び細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００４９】
「特異的に結合すること」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器上での解析）（Liljeblad等, Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様において、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様において、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
【００５０】
「親和性」又は「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。特に断らない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表され、これは、解離速度定数の結合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）に対する比である。したがって、同等な親和性は、速度定数の比が同じである状態である限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載されているものを含む当該技術分野で公知の一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００５１】
用語「ＣＤ１９」とは、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２としても知られるＢリンパ球抗原ＣＤ１９を指し、別途指示がない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む何れかの脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号１１５）に示されている。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないヒトＣＤ１９、並びに本明細書において報告される抗体が結合する限りにおいて細胞内でのプロセシングから生じるヒトＣＤ１９の任意の形態を包含する。ＣＤ１９は、ヒトＢ細胞の表面上に発現する構造的に異なる細胞表面受容体であり、限定されないが、プレＢ細胞、発生初期のＢ細胞（即ち、未成熟Ｂ細胞）、形質細胞への最終分化を介した成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞を含む。ＣＤ１９は、大部分のプレＢ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及び一部のＮｕｌｌ急性リンパ芽球性白血病によって発現される。さらに、形質細胞上におけるＣＤ１９の発現は、それが多発性骨髄腫などの分化したＢ細胞腫瘍に発現され得ることを示唆している。したがって、ＣＤ１９抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び／又は急性リンパ芽球性白血病の治療における免疫療法の標的である。
【００５２】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。一般的に、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、各々が４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む類似構造を有する。例えば、Ｋｉｎｄｔ等，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインでは、抗原結合特異性を付与するには十分である。
【００５３】
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、本明細書において使用するとき、配列が超可変である、及び／又は構造的に画定されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４本鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる（Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基、Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書において交換可能に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ等，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）に記載され、それらの定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及して何れかの定義が適用される場合、本明細書において画定され及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記の引用された文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Ａに記載される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化する。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定することができる。
2018535657.tif 000002
1表AのすべてのCDRの定義の番号付けは、Kabat等(以下参照)によって規定された番号付けの慣習に従っている。
2表Aにおいて使用されている小文字の「b」を含む「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるCDRを指す。
【００５４】
Ｋａｂａｔ等はまた、いずれもの抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体を超える任意の実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムをいずれもの可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書において使用するとき、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００５５】
ＶＨのＣＤＲ１を例外として、ＣＤＲは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、略称のＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基、Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照されたい。）別途指示がない限り、可変ドメインのＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上掲のＫａｂａｔ等に従って番号付けされる。
【００５６】
本明細書において使用するとき、抗原結合分子（例えば、抗体）の文脈における用語「親和性成熟した」とは、例えば、変異により、参照抗原結合分子に由来し、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し、抗原に対して参照抗原結合分子より高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は、一般的に、抗原結合分子の一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数のアミノ酸残基の修飾を伴う。典型的には、親和性成熟した抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００５７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００５８】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含み得、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、又は２個以下である。いくつかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００５９】
用語「キメラ」抗体とは、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００６０】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００６１】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を遂げている抗体を指す。本発明によって包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生じさせるように元の抗体の定常領域から追加的に修飾され又は変更されているものである。
【００６２】
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞により生成される、又はヒト抗体のレパートリー若しくは他のヒト抗体コード化配列を利用する非ヒト起源に由来する、抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００６３】
本明細書における用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで伸びる。一実施態様において、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合している。本明細書におけるＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異ＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域内においてＣＨ２ドメインに対する残基Ｃ末端のストレッチを含む（即ち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基）。本明細書におけるＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異ＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖に「隆起」（「ノブ」）が導入されて、その他方の鎖に導入された「空洞」（「ホール」）に対応しているＣＨ３ドメイン；参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国特許第５８２１３３３号参照）であってもよい。このような変異ＣＨ３ドメインは、本明細書において記載される２つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用される。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで伸びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよく又は存在していなくともよい。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ等，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００６４】
「ノブ・イントゥー・ホール」技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ等，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８，７−１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの接触面で隆起（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチドの接触面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを伴い、それにより、空洞は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置され得る。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作製される。隆起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発又はペプチド合成により、改変させることによって作製することができる。特定の実施態様において、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様において、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、加えてアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、加えてアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。これら２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、したがって、さらに二量体を安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【００６５】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に同等な領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加又は欠失を生成するが、免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害）を媒介する能力を実質的に低下させることがない改変を有する変異体を含むことを意図している。例えば、一又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から削除することができる。このような変異体は、活性における影響が最小となるように、当該技術分野で公知の一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. 等, Science 247:1306-10 (1990)を参照されたい）。
【００６６】
用語「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００６７】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体を保有する細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘起させるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照されたい）。
【００６８】
「エクトドメイン」は、細胞外空間（即ち、標的細胞外の空間）に伸びる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは、通常、シグナル伝達に繋がる表面との接触を開始するタンパク質の部分である。
【００６９】
用語「ペプチドリンカー」とは、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野において公知である又は本明細書に記載されている。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（Ｓｇ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで、「ｎ」は、一般的に、１から１０の数、典型的には１から４の数、特に２である。
【００７０】
用語「アミノ酸」は、本出願内で使用するとき、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を示す。
【００７１】
「融合した」又は「接続した」とは、成分がペプチド結合により、直接的に又は一又は複数のペプチドリンカーを介して結合していることを意味する。
【００７２】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさずに、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のため、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２はプログラム、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる必要がある。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて、変更しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
画分Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なることは理解される。特に他には記述されない限り、本明細書において使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で記載したように得られる。
【００７３】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的に、結果として得られ、さらなる研究のために選択される変異体（複数可）は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）に修飾（例えば、改善）を有し、及び／又は親抗体結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に述べれば、一又は複数のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗原結合分子は、ファージ上に表示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様において、置換、挿入又は欠失は、このような改変が抗原に対する抗原結合分子の結合する能力を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば、本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法において、残基又は標的残基のグループ（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体の相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代替的に又は追加的に、抗体と抗原の間の接点を同定するための抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含有するかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【００７４】
アミノ酸配列の挿入には、１つの残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。
【００７５】
「保存的置換」は、「好ましい置換」という見出し下の表Ｂに提供され、アミノ酸側鎖クラス（１）から（６）を参照して以下でさらに説明される。目的とする分子にアミノ酸置換を導入し、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善について産物をスクリーニングすることができる。
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【００７６】
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７７】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。
【００７８】
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、一又は複数のグリコシル化部位が作製又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に得ることができる。抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合する糖を改変することができる。哺乳動物細胞によって生成される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般的に付着する分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ等  ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な糖、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。いくつかの実施態様において、特定の改善された特性を有する変異体を作製するために、抗原結合分子のオリゴ糖の修飾が行われ得る。一態様において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合するフコースを欠く糖構造を有する抗原結合分子の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、ＡＤＣＣ機能を改善している可能性があり、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。本発明の抗原結合分子のさらなる変異体には、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に結合する二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものが含まれる。このような変異体では、フコシル化が低減し及び／又はＡＤＣＣ機能が改善した可能性があり、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ等）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａ等）、及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ等）を参照されたい。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体もまた提供される。このような抗体変異体は、ＣＤＣ機能が改善された可能性があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ等）；同第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及び同第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【００７９】
特定の実施態様において、本発明の抗原結合分子のシステインが操作された変異体、例えば、分子の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭＡｂ」を作製することが望まれる場合がある。特定の実施態様において、置換される残基は分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基がそれにより抗体の接近可能部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせ、免疫コンジュゲートを作製するために使用することができる。特定の実施態様において、以下の残基のうちの何れかの一又は複数がシステインで置換されてもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システインが遺伝子改変された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載されるように生成され得る。
【００８０】
ある種の態様において、本明細書に提供されている抗原結合分子は、当該技術分野で公知であり、容易に入手可能である追加の非タンパク質様部分を含有するようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーの何れか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分枝状又は非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、１を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じ又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されないが、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、誘導体が規定された条件下での治療法に使用されるかどうかなどを含む検討事項に基づいて決定することができる。別の態様において、放射線への曝露により選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質様部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定されないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質様部分に近い細胞が死滅する温度に非タンパク質様部分を加熱する波長を含む。別の態様において、本明細書に提供されている抗原結合分子のイムノコンジュゲートを得ることができる。「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子（複数可）にコンジュゲートした抗体である。
【００８１】
用語「ポリヌクレオチド」とは、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるものなどのアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチドに存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【００８２】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含有されるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ鎖及びネガティブ鎖の形態、及び二重鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたこのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの制御要素を含んでもよく又は含まなくてもよい。
【００８３】
例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５ポイントの変異を含み得る点以外は同一であることを意図している。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除又は別のヌクレオチドで置換されてよく、又は参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこれらの改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置で、又はこれら末端の間の位置の何れかで、参照配列に含まれる残基中において個々に又は参照配列内の一又は複数の近接する群中において散在して、発生してよい。特定の事項として、何れか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上記で検討したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの公知のコンピュータプログラムを用いて常套的に決定することができる。
【００８４】
用語「発現カセット」とは、標的細胞において特定の核酸の転写を許可する一連の特定の核酸要素を用いて、組換えにより又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列のうちで、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。ある種の実施態様において、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【００８５】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞においてそれが作用可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び指定するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が細胞転写及び／又は翻訳機械により生成される。一実施態様において、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【００８６】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それらには、継代の数に関係なく、それらに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよいが、変異を含み得る。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の抗原結合分子を生成するために使用することができる何れかのタイプの細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞などの哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、いくつか例を挙げると、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内に含まれる細胞もまた含まれる。
【００８７】
「有効量」の薬剤とは、それが投与される細胞又は組織において生理的変化をもたらすために必要とされる量を指す。
【００８８】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又は予防的な結果を達成するために必要とされる用量及び期間での有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【００８９】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【００９０】
用語「薬学的組成物」とは、その中に含有される活性成分の生物活性が有効であることを可能にするこのような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する追加の成分を含まない調製物を指す。
【００９１】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤は、限定しないが、バッファー、安定剤又は防腐剤を含む。
【００９２】
用語「添付文書」とは、治療製品の市販の包装に通例含まれる説明書を指すために用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、このような治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含有する。
【００９３】
本明細書において使用するとき、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」などのその文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症候の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行速度の低下、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。いくつかの実施態様において、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させる又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【００９４】
用語「がん」とは、本明細書において使用するとき、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚黒色腫又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫、例えば、上記がんの何れかの難治性型、又は上記がんの一又は複数の組合せが挙げられる。
【００９５】
本発明の抗体
本発明は、生産可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率及び毒性低下などの特に有利な特性を有する新規な抗ヒトＣＤ抗体を提供する。
【００９６】
一態様において、本発明は、高親和性を有する抗ヒトＣＤ１９抗体を提供する。
【００９７】
一態様において、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体よりも高い親和性でヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供される。
【００９８】
別の態様において、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供され、ここで、抗体は、
（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、
（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む。
【００９９】
一態様において、抗体は、（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体よりも高い親和性でヒトＣＤ１９に特異的に結合する。
【０１００】
さらなる態様において、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化又はキメラ抗体である。さらなる態様において、抗体はヒト化抗体である。別の態様において、抗体は、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体断片である。
【０１０１】
本発明のさらなる態様は、ＣＤ１９に特異的に結合する本明細書に開示されている抗体を提供することである。さらなる態様において、本明細書に開示されている抗体は、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する。さらなる態様において、本明細書に開示されている抗体は、カニクイザルＣＤ１９に特異的に結合する。なおさらなる態様において、開示されている抗体は交差反応性を有する。
【０１０２】
ある種の態様において、本明細書に開示されている抗ＣＤ１９抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ若しくは≦０．００１ｎＭ、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ又は１０−９Ｍから１０−１３Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の態様において、本明細書に開示されている抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した場合、１ｎＭ以下の平衡解離定数（Ｋｄ）でＣＤ１９に結合する。
【０１０３】
本発明のなおさらなる態様において、≦１０−２／ｓ、≦１０−３／ｓ、≦１０−４／ｓ、≦１０−５／ｓ、≦１０−６／ｓ、≦１０−７／ｓ若しくは≦１０−８／ｓ、１０−４／ｓから１０−９／ｓ又は１０−５／ｓから１０−１１／ｓの解離定数（Ｋｄ）を有する本明細書に開示されている抗ＣＤ１９抗体が提供される。特定の実施態様において、本明細書に開示されている抗体はＣＤ１９に特異的に結合し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した場合、１０−４／ｓ以下の解離定数（Ｋｄ）によってさらに明白になる。
【０１０４】
別の態様において、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供され、ここで、抗体は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体と比較して、より少ない脱アミノ部位を含む。別の態様において、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供され、ここで、抗体は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体と比較して、より少ないアスパラギン残基を含む。
【０１０５】
さらに別の態様において、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異可変軽鎖及び／又は変異可変重鎖を含む抗体が提供され、ここで、少なくとも１つのアスパラギン残基が置換されている。好ましい態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は少なくとも４つのアスパラギン残基が置換されている。
【０１０６】
特定の態様において、抗体は、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体が提供される。
【０１０７】
別の態様において、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供され、ここで、抗体は、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体、
（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体、
（ｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体、
（ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体、
（ｖ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体、
（ｖｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体、並びに
（ｖｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体。
からなる群から選択される。
【０１０８】
さらなる態様において、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供され、ここで、抗体は、
（ｉ）配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
（ｉｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
（ｉｖ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
（ｖ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
（ｖｉ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｖｉｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１０９】
別の態様において、本明細書において先に定義されている抗体は、安定な結合を可能にする第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。
【０１１０】
さらなる態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的には、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。特定の態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの結合を促進する修飾を含む。
【０１１１】
Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低減するＦｃドメインの修飾
本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に結合することができる。
【０１１２】
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に好ましい薬物動態特性を付与し、そのような特性には、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、及び好ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、それは同時に、本発明の抗体の好ましくない標的化、即ち、好ましい抗原保持細胞よりむしろ、Ｆｃ受容体を発現する細胞への標的化に繋がる。したがって、特定の態様において、本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。一態様において、Ｆｃは、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様において、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下は、限定されないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。
【０１１３】
ある種の態様において、一又は複数のアミノ酸修飾は、本明細書において提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１１４】
特定の態様において、本発明は、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる一又は複数のアミノ酸置換を含む抗体を提供する。
【０１１５】
一態様において、本発明の抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。特に、このＦｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より具体的には、ＩｇＧ重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む、本発明による抗体が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５ＡはいわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組合せは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させ、国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載され、この文献にはまた、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定する方法が記載されている。
【０１１６】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの一又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１１７】
別の態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。さらに特定の態様において、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。さらに具体的な態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメインの変異及びそれらのＦｃγ受容体結合特性はまた国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
【０１１８】
別の態様において、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体が提供され、ここで、抗体は、
（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、
（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、
を含み、抗体は、ＩｇＧ重鎖のアミノ酸残基２３４Ａ、２３５Ａ及び３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む。
【０１１９】
変異Ｆｃドメインは、当該技術分野において周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば、配列決定により確認することができる。
【０１２０】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器、及び組換え発現により得ることができるようなＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができる。あるいは、Ｆｃ受容体に対する、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価され得る。
【０１２１】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の抗体のエフェクター機能は、当該技術分野において公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３，７０５９−７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２，１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ等，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６，１３５１−１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に又は追加的に、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、Ｃｌｙｎｅｓ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，６５２−６５６（１９９８）に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【０１２２】
いくつかの態様において、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、エフェクター機能が低下するようにＦｃドメインが操作されているいくつかの実施態様において、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro等, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等, Blood 101, 1045-1052 (2003)；Cragg及びGlennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照されたい）。
【０１２３】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載されている抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。
【０１２４】
本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能的抗原結合分子を形成することができる。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと結合して免疫グロブリンを形成する。
【０１２５】
いくつかの態様において、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている本発明による抗体全体をコードする。他の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
【０１２６】
ある種の実施態様において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【０１２７】
組換え方法
本発明の抗体は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え生産によって取得し得る。組換え生産のために、例えば上記のような抗体又はそのポリペプチド断片をコードしている一又は複数のポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞における発現のために一又は複数のベクターに挿入する。そのようなポリヌクレオチドは、容易に単離され、一般的手順を使用して配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳コントロールシグナルと共に抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ等、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている技術を参照。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体又はそのポリペプチド断片（つまり、コード化領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳コントロールエレメントと作動可能に結合してクローニングされている発現カセットを含む。本明細書で使用されるとき、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、存在する場合、コード化領域の一部とされうる。一方、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクターに存在してもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば、別個の（異なる）ベクターに存在してもよい。さらに、任意のベクターが、単一のコード化領域又は二以上のコード化領域を含んでもよく、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解的切断を介して最終的なタンパク質に翻訳後又は同時翻訳的に分離される一又は複数のポリペプチドをコードし得る。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合された又は融合されていない異種コード化領域をコードしてもよい。異種コード化領域には、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインなどの特別のエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能に結合しているとは、遺伝子産物、例えばポリペプチドのためのコード化領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響又はコントロール下に置くように一又は複数の調節配列と結合しているときである。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード化領域とそれに結合したプロモーター）は、プロモーター機能の誘導によって所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写がもたらされる場合、及び２つのＤＮＡ断片の間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力に干渉しない又はＤＮＡ鋳型が転写される能力に干渉しない場合、「作動可能に結合」している。そのように、プロモーターが核酸の転写を有効にすることができる場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合している。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的転写を指示する細胞特異的プロモーターでありうる。プロモーターに加えて、他の転写コントロールエレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するために、ポリヌクレオチドに作動可能に結合していてもよい。
【０１２８】
適切なプロモーター及び他の転写コントロール領域は本明細書に開示されている。様々な転写コントロール領域が、当業者に既知である。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞で機能する転写コントロール領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来（例えば、イントロンＡと接続された即時早期プロモーター）、シミアンウイルス４０由来（例えば、早期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスなど）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写コントロール領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギa−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来する領域、並びに真核細胞の遺伝子発現をコントロールすることができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写コントロール領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター）が含まれる。同様に、様々な転写コントロールエレメントが、当業者に既知である。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、転写開始及び終結コドン、並びにウイルス系に由来するエレメント（特に、内部リボソーム進入部位、つまりＩＲＥＳ、又はＣＩＴＥ配列と言及される）が含まれる。発現カセットには、複製開始点及び／又は染色体統合エレメント、例えばレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴が含まれてもよい。
【０１２９】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード化領域と結合していてもよい。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置してもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横切る増殖タンパク質鎖のエクスポートが開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが一般にポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。翻訳されたポリペプチドからこのシグナルペプチドが切断されて、分泌ポリペプチド、つまりポリペプチドの「成熟」形態が生じる。ある特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド、又は、作動可能に結合されたポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能性誘導体を使用する。代替的に異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換してもよい。
【０１３０】
後の精製を容易にするために使用し得る短いタンパク質配列（例えばヒスチジンタグ）又は融合タンパク質の標識化を援助するために使用し得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド内又はその末端に含めてもよい。
【０１３１】
本発明のさらなる態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載の任意の特徴が、個々に或いは組み合わせて、組み込まれていてもよい。一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、そのベクターで形質転換されている又はそのベクターをトランスフェクトされている）。本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製又はその発現を支持するために適切な宿主細胞は、当該技術分野で周知である。そのような細胞に、特定の発現ベクターを適宜にトランスフェクト又は形質導入してもよく、大量のベクターを含有する細胞を増殖させて大規模な発酵装置に播種し、臨床適用のために十分な量の抗原結合分子を取得してもよい。適切な宿主細胞には、大腸菌などの原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などの様々な真核細胞が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でないとき、細菌で生産されてもよい。発現後、ポリペプチドは、細菌細胞ペーストから可溶型画分で単離され、さらに精製されうる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核生物は、ポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。例えば、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生産をもたらす真菌及び酵母株が挙げられる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２、１４０９−１４１４（２００４）及びＬｉ等、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４、２１０−２１５（２００６）を参照。
【０１３２】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために使用し得る様々なバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養物も宿主として利用し得る。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生産のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照。脊椎動物細胞も宿主として使用し得る。例えば、懸濁液で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（例えば、Graham等、J Gen Virol 36、59(1977)に記載の２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather、Biol Reprod 23、243-251(1980）に記載されているようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Mather等、Annals N.Y. Acad Sci 383、44-68(1982)に記載の細胞）、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub等、Proc Natl Acad Sci USA 77、4216(1980)）並びにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。タンパク質生産に適切な特定の哺乳動物宿主細胞株については、例えばＹａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．  Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２５、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照。宿主細胞には、培養細胞、例えば、いくつか挙げると哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられ、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは培養動物組織内に含まれる細胞も含まれる。一実施態様では、宿主細胞として、真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）が挙げられる。これらの系で外来遺伝子を発現するための標準技術は、当該技術分野で既知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の何れかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現産物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方も発現するように操作されていてもよい。
【０１３３】
一態様では、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を製造する方法であって、本明細書で提供される本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を発現するために適切な条件下で培養すること、及び宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を回収することを含む、方法が提供される。
【０１３４】
ある特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する標的細胞抗原（例えば、Ｆａｂ断片）に特異的に結合することができる部分は、抗原に結合することができる免疫グロブリン可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然の又は非天然の抗体及びその断片の一部を形成し得る又はそれに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築してもよく、組換えにより生産してもよく（例えば、米国特許第４１８６５６７号に記載）、又は、例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより取得してもよい（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）。
【０１３５】
任意の動物種の免疫グロブリンを、本発明において使用し得る。本発明で有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類又はヒト起源の免疫グロブリンでありうる。融合タンパク質が、ヒト使用を目的とするものである場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来である免疫グロブリンのキメラ形態を使用してもよい。免疫グロブリンのヒト化又は完全ヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製し得る（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、例えば限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲを、ヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域に、重要なフレームワーク残基（例えば良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要な残基）の保持の有り又は無しでグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はＣＤＲ；抗体−抗原相互作用のために重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフトすること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するがヒト様切片で表面残基の置き換えにより「クローキング」することが挙げられる。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３、１６１９−１６３３（２００８）に総説が記載されており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２、３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６、１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１、５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１、６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４、６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９、１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎ  ３１（３）、１６９−２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフト化を記載）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８、４８９−４９８（１９９１）（「表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ等、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３、２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「ガイド付き選択」手法を記載）に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野で既知の様々な技術を使用して製造し得る。ヒト抗体は、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５、３６８−７４（２００１）並びにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０、４５０−４５９（２００８��において全体的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されるヒトモノクローナル抗体の一部を形成していてもよく又はそれから誘導されてもよい（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、pp.51-63(Marcel Dekker, Inc.、New York、1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して無傷なヒト抗体又はヒト可変領域を有する無傷な抗体を生じるように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製されてもよい（例えば、Lonberg、Nat Biotech 23、1117-1125(2005)参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成されてもよい（例えば、Hoogenboom等、Methods in Molecular Biology 178、1-37(O’Brienら編、Human Press、Totowa、NJ、2001);及びMcCafferty等、Nature 348、552-554;Clackson等、Nature 352、624-628(1991)を参照）。ファージは、通常、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片として抗体断片を提示する。
【０１３６】
ある特定の態様では、抗体は、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例を参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法により結合親和性を強化するよう操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明の抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴法（Liljeblad等、Glyco J 17、323-329(2000)）及び従来の結合アッセイ（Heeley、Endocr Res 28、217-229(2002)）の何れかを通じて測定されうる。競合アッセイは、特定の抗原に結合する参照抗体と競合する抗原結合分子を同定するために使用されうる。ある特定の実施態様では、そのような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子が結合するエピトープと同じエピトープ（例えば、線状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原を、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原の結合について第１の抗原結合分子と競合する能力が試験される第２の未標識抗原結合分子とを含む溶液で、インキュベートする。第２の抗原結合分子は、ハイブリドーマ上清に存在し得る。コントロールとして、固定化された抗原を、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の未標識抗原結合分子は含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合が許容される条件下でインキュベートした後、過剰の未結合抗体を除去し、固定化された抗原と結合した標識の量を測定する。固定化された抗原と結合した標識の量が、試験試料において、コントロール試料と比較して実質的に減少している場合に、第２の抗原結合分子は、第１の抗原結合分子と抗原の結合に対して実質的に競合していることが示される。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照。
【０１３７】
本明細書に記載されるように調製された本発明の抗体は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの既知の技術によって精製し得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部において、正味電荷、疎水性、親水性などの要因に依存し、それらの条件は当業者にとって明らかである。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧとのマトリックスが使用されうる。シーケンシャルプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、実施例に本質的に記載されるような抗原結合分子を単離することができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む周知の様々な分析方法の何れかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現された抗原結合分子は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、無傷であり、適切に組み立てられていることが示された。
【０１３８】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子は、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイにより、同定され、スクリーニングされ、又は特徴付けされる。
【０１３９】
１．親和性アッセイ
標的細胞抗原への抗原結合分子の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器、及び組換え発現により得ることができるような受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することもできる。結合親和性を測定するための代表的及び例示的実施態様は、実施例４に記載されている。一態様によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を２５℃で使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。
【０１４０】
２．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本明細書に報告される抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットなどの既知の方法によって、抗原結合活性について試験される。
【０１４１】
３．活性アッセイ
一態様では、生物活性を有するその抗ヒトＣＤ１９抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、Ｂ細胞増殖の阻害又はＢ細胞の殺傷が含まれうる。インビボ及び／又はインビトロでそのような生物活性を有する抗体も提供される。
【０１４２】
ある特定の実施態様では、本明細書に報告される抗体は、そのような生物活性について試験される。
【０１４３】
薬学的組成物、製剤及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、下記の治療方法の何れかで使用するための、本明細書で提供される何れかの抗体を含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体と、例えば、下記に記載の少なくとも１つのさらなる治療剤とを含む。
【０１４４】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤に溶解又は分散している治療的有効量の一又は複数の抗体を含む。「薬学的に又は薬理的に許容される」という表現は、採用される投薬量及び濃度で一般的にレシピエントに対して非毒性であり、つまり、動物、例えばヒトに適切に投与されたとき、有害なアレルギー性又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つの抗体と任意選択的にさらなる活性成分とを含む薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０に記載されているように、本開示に照らして当業者に明らかである。特に組成物は凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者によって既知であるような任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤及びその組合せを含む。
【０１４５】
非経口組成物には、注射、例えば、皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による投与のために設計される組成物が含まれる。注射のために、本発明の抗原結合分子は、水溶液中、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩バッファー中で製剤化されてもよい。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含んでもよい。代替的に、融合タンパク質は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水と共に構成するための粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、本発明の融合タンパク質を、必要に応じて下記に列挙される種々の他の成分と共に、必要な量で適切な溶媒に組み込むことによって調製される。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通じて濾過することにより、容易に達成されうる。一般に、分散体は、基礎の分散媒及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに、種々の滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンの調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分と任意のさらなる望ましい成分との粉末を、事前に滅菌濾過したその液体媒体からうる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要に応じて適切に緩衝化され、希釈液体は、注射の前に、十分な生理食塩水又はグルコースで最初に等張化されるべきである。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌及び真菌の混入に対して保護されていなければならない。エンドトキシン混入は、安全レベルで最小、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持されるべきであることが理解されよう。適切な、薬学的に許容される賦形剤としては、限定されないが、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及び他の糖（炭水化物）、例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる化合物、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどを含んでもよい。任意選択的に、懸濁液は、高濃度の溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増加させる適切な安定剤又は薬剤を含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、エチルクリート（ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド若しくはリポソームが含まれる。
【０１４６】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入されていてもよい。適切な技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、例えばフィルム又はマイクロカプセルなどの成形品の形態であるマトリックスが含まれる。特定の実施態様では、注射用組成物の延長された吸収が、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はその組合せを組成物で使用することによりもたらされてもよい。
【０１４７】
本明細書における例示的な薬学的に許容される賦形剤には、さらに、間質性薬物分散剤、例えば、可溶型中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶型ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）が含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に開示されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、一又は複数のさらなるグルコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと混合される。
【０１４８】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載のものが含まれ、後者の製剤には、ヒスチジン酢酸塩バッファーが含まれる。
【０１４９】
先に記載の組成物に加えて、融合タンパク質が、持効性製剤として製剤化されてもよい。そのような長時間作用型製剤は、移植（例えば、皮下若しくは筋肉内）によって、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切な重合性又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂と共に、又は難溶型誘導体、例えば、難溶型塩として製剤化されうる。
【０１５０】
本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は薬学的に使用し得る調製物へのタンパク質の処理を容易にする佐剤を使用して、従来の様式で製剤化されてもよい。適切な製剤は選択される投与経路に依存する。
【０１５１】
本発明の抗体は、遊離の酸若しくは塩基、中性、又は塩の形態で、組成物中に製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩は、遊離の酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と共に形成される塩、又は例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸などの有機酸と共に形成される酸などが含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化物鉄、又は有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインに由来するものでもよい。薬学的な塩は、対応する遊離の塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒により溶解し易い。
【０１５２】
本明細書の組成物は、治療される特定の症状のための必要に応じて一つを超える活性成分を含んでもよく、好ましくは、それらは互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものである。そのような活性成分は、特定の目的のために有効な量で組み合わされて適切に存在する。
【０１５３】
インビボ投与のために使用される製剤は、一般的に滅菌されている。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通じて濾過することにより、容易に達成されうる。
【０１５４】
治療方法及び組成物
本明細書で提供される任意の抗ヒトＣＤ１９抗体は、単独で又は組合せで、単一特異性抗体として又は多重特異性抗体として、治療方法で使用されうる。
【０１５５】
ＣＤ１９は、幹細胞及び形質細胞を除くほとんどのＢ細胞で発現しており（ｐａｎ−Ｂ細胞マーカー）、多発性骨髄腫を除くリンパ腫及び白血病、例えば非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病などのほとんどのヒトＢ細胞悪性腫瘍で頻繁に発現している（腫瘍関連抗原）。
【０１５６】
異なる細胞集団の２つの細胞表面タンパク質を認識する二重特異性抗体は、病原性標的細胞を破壊するように細胞傷害性免疫細胞を再指向化することが期待できる。
【０１５７】
一つの態様では、医薬として使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。さらなる態様では、Ｂ細胞がんを治療するために使用される抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。ある特定の実施態様では、治療方法において使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。ある特定の実施態様では、Ｂ細胞がんを有する個体を治療する方法であって、有効量の抗ヒトＣＤ１９抗体を前記個体に投与することを含む方法において使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が本明細書で提供される。一つのそのような実施態様では、方法は、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を前記個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、Ｂ細胞の除去に使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が本明細書で提供される。ある特定の実施態様では、個体におけるＢ細胞を除去する方法であって、Ｂ細胞を除去するために有効量の抗ヒトＣＤ１９抗体を前記個体に投与することを含む方法において使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が本明細書で提供される。上記実施態様の何れかによる「個体」は、好ましくはヒトである。Ｂ細胞がんは、一実施態様では、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一実施態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。
【０１５８】
さらなる態様では、がん免疫療法で使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。ある特定の実施態様では、がん免疫療法の方法で使用するための抗ヒトＣＤ１９抗体が提供される。上記実施態様の何れかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
【０１５９】
さらなる態様では、医薬の製造又は調製における抗ヒトＣＤ１９抗体の使用が本明細書において提供される。一実施態様では、医薬は、Ｂ細胞がんの治療のための医薬である。さらなる実施態様では、医薬は、Ｂ細胞がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、Ｂ細胞がんの治療方法において使用するための医薬である。一つのそのような実施態様では、方法は、有効量の、例えば下記に記載されるような少なくとも１つのさらなる治療剤を、前記個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、Ｂ細胞を除去するための医薬である。さらなる実施態様では、医薬は、個体におけるＢ細胞を除去する方法であって、Ｂ細胞を除去するために有効量の医薬を前記個体に投与することを含む方法において使用するための医薬である。上記実施態様の何れかによる「個体」は、ヒトでありうる。Ｂ細胞がんは、一実施態様では、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一実施態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。
【０１６０】
さらなる態様では、Ｂ細胞がんを治療するための方法が本明細書で提供される。一実施態様では、当該方法は、そのようなＢ細胞がんを有する個体に、有効量の抗ヒトＣＤ１９抗体を投与することを含む。一つのそのような実施態様では、方法は、有効量の、下記に記載されるような少なくとも１つのさらなる治療剤を、前記個体に投与することをさらに含む。上記実施態様の何れかによる「個体」は、ヒトでありうる。Ｂ細胞がんは、一実施態様では、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一実施態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。
【０１６１】
さらなる態様では、個体におけるＢ細胞を除去するための方法が本明細書で提供される。一実施態様では、方法は、Ｂ細胞を除去するために、有効量の抗ヒトＣＤ１９抗体を前記個体に投与することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。Ｂ細胞がんは、一実施態様では、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一実施態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。
【０１６２】
さらなる態様では、例えば、上記治療方法の何れかで使用するための、本明細書に報告される抗ヒトＣＤ１９抗体の何れかを含む薬学的製剤が本明細書で提供される。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書に報告される抗ヒトＣＤ１９抗体の何れかと薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的製剤は、本明細書に報告される抗ヒトＣＤ１９抗体の何れかと少なくとも１つのさらなる治療剤とを含む。
【０１６３】
本明細書に報告される抗体は、単独で、又は治療上の他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本明細書に報告される抗体は、少なくとも１つのさらなる治療剤と共投与されてもよい。
【０１６４】
上記のそのような併用療法には、混合投与（二以上の治療剤が、同じ又は別個の製剤に含まれる）並びに別個の投与が含まれ、この場合に、本明細書で報告される抗体の投与は、さらなる治療剤又は薬剤の投与の前、同時、及び／又は後に生じうる。一実施態様では、抗ヒトＣＤ１９抗体の投与とさらなる治療剤の投与とは、互いに約１カ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５若しくは６日以内に行われる。
【０１６５】
本明細書に報告される抗体（及び任意のさらなる治療剤）は、任意の適切な手段、例えば、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに所望であれば、局所治療、病巣内投与によって投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投与は、任意の適切な経路であってよく、例えば、一部において投与が短期的又は長期的であるかに依存して、静脈内又は皮下注射などの注射によるものであってもよい。様々な投与スケジュール、例えば限定されないが、様々な時間点にわたる単回又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス点滴が、本明細書で企図されている。
【０１６６】
本明細書に報告される抗体は、医学行動規範と一致した様式で、処方、用量設定、及び投与される。この状況で考慮される要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に既知の他の要因が含まれる。抗体は、必ずではないが、問題の障害の予防又は治療のために現在使用されている一又は複数の薬剤と共に任意選択的に処方される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤に存在する抗体の量、障害若しくは治療の種類、並びに上記で説明した他の要因に依存する。これらは、一般的に、本明細書の記載と同じ投薬量及び投与経路、又は本明細書の記載の投薬量の約１−９９％、又は実験的に／臨床的に適切と判断される任意の投薬量及び投与経路で使用される。
【０１６７】
疾患を予防又は治療するために、本明細書に報告される抗体の適切な投薬量は（単独で又は他の一若しくは複数のさらなる治療剤と組み合わせて使用されるとき）、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的で投与されるか、従前の治療、患者の病歴、抗体への応答、及び主治医の裁量に依存する。抗体は、単回又は一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、抗体の約１μｇ／ｋｇ−１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）を、例えば、一若しくは複数の別個の投与によって又は連続注入によって、患者へ投与するための最初の候補用量とすることができる。一つの典型的な一日投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲でありうる。数日間以上にわたる繰り返し投与について、病徴の望まれる抑制が生じるまで、条件に応じて、治療が一般的に持続される。一つの例示的な抗体の投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ−約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）の一又は複数の用量が患者に投与されてもよい。そのような用量は、（例えば、患者に約２−約２０用量又は例えば６用量の抗体が投与されるように）例えば毎週又は３週間毎に間欠的に投与されてもよい。最初に高負荷用量が投与され、その後、一又は複数の低い負荷用量が投与されてもよい。しかしながら、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進行は従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０１６８】
さらに、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬、及び骨疾患を治療するための方法であって、そのような疾患を有すると診断された患者（及びそのような治療を必要とする患者）に、本明細書に報告されるヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体を投与することを含む方法が本明細書で提供される。抗体は、薬学的組成物において単独で、又は代替的に、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬、又は骨疾患を治療するための他の医薬と組み合わせて投与されてもよい。抗体は、薬学的有効量で投与される。
【０１６９】
さらに、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患の治療のための、並びに本明細書に報告される抗体を含む薬学的組成物の製造のための、本明細書に報告される抗体の使用が本明細書で提供される。加えて、本明細書に報告される抗体を含む薬学的組成物の製造のための方法が本明細書で提供される。
【０１７０】
さらに、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患の治療のための本明細書に報告される抗体が本明細書で提供される。
【０１７１】
さらに、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患の治療のための薬学的組成物の製造のための本明細書に報告される抗体の使用が本明細書で提供される。抗体は、薬学的有効量で使用される。
【０１７２】
さらに、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、狼瘡、乾癬又は骨疾患の治療のための薬学的組成物の製造のための本明細書に報告される抗体の使用が本明細書で提供される。抗体は、薬学的有効量で使用される。
【０１７３】
上記の製剤又は治療方法は何れも、抗ヒトＣＤ１９抗体に代えて又は加えて、本明細書に報告されるイムノコンジュゲートを使用して実施されてよいことが理解される。
【０１７４】
他の薬剤及び治療
本発明の抗原結合分子は、治療上の一又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の抗原結合分子は、少なくとも１つのさらなる治療剤と共投与されてもよい。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症候又は疾患を治療するために投与され得る任意の薬剤を包含する。そのようなさらなる治療剤は、治療される特定の症状に適切な任意の活性成分を含んでよく、好ましくは、それらは互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものである。ある特定の実施態様では、さらなる治療剤は、別の抗がん剤である。
【０１７５】
そのような他の薬剤は、特定の目的のために有効な量で組み合わされて適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用される抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、並びに上記で説明した他の要因に依存する。抗原結合分子は、一般的に、本明細書の記載と同じ投薬量及び投与経路、又は本明細書の記載の投薬量の約１−９９％、又は実験的に／臨床的に適切と判断される任意の投薬量及び投与経路で使用される。
【０１７６】
上記のそのような併用療法には、混合投与（二以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）並びに別個の投与が含まれ、この場合に、本発明の抗原結合分子の投与は、さらなる治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に生じうる。
【０１７７】
製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器、並びに容器上の又は容器に付随している標識又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、単独で又は別の組成物との組合せで症状の治療、予防及び／又は診断に有効な組成物を保持しており、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。組成物における少なくとも１つの活性剤は、本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子である。
【０１７８】
標識又は添付文書は、組成物が、選択される状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗原結合分子を含む組成物が含まれる第１の容器、及び（ｂ）さらなる細胞傷害剤又は他の治療剤を含む組成物が含まれる第２の容器を含んでもよい。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が、特定の状態を治療するために使用し得ることを示す添付文書をさらに含んでもよい。
【０１７９】
代替的に又はさらに、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストローズ溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含んでもよい。さらに市販の及び使用者の観点から好ましい他の材料、例えば、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及び注射器を含んでもよい。
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【０１８０】
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する全体的な情報は、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に示されている。抗体鎖のアミノ酸は、上記のように、Ｋａｂａｔ（Kabat、E.A等、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991)）の番号付けシステムに従って番号付け及び参照した。
【実施例】
【０１８１】
本発明の方法及び組成物の例を以下に示す。上記の一般的説明で示されたように他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０１８２】
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９に記載されるような標準方法を使用して、ＤＮＡを操作した。分子生物系試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する全体的な情報は、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．等、（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２に示されている。
【０１８３】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定法により決定した。
【０１８４】
遺伝子合成
所望される遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用してＰＣＲにより生成又は合成オリゴヌクレオチド及び自動化遺伝子合成によるＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が利用可能でない場合は、オリゴヌクレオチドプライマーを、最も近いホモログ由来の配列に基づいて設計し、遺伝子を、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位によって隣接された遺伝子セグメントを、標準クローニング／シーケンシングベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡを、形質転換された細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって決定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターにサブクローニングされるように適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞で分泌するためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
【０１８５】
細胞培養技術
標準細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．及びＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されている技術を使用した。
【０１８６】
タンパク質の精製
タンパク質を、濾過した細胞培養上清から標準プロトコールを参照して精製した。簡単に述べると、抗体を、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出をｐＨ２．８で行い、その後すぐに試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、ＰＢＳ中又は２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で、単量体の抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を使用して（必要な場合）濃縮し、凍結し、−２０℃又は−８０℃で保存した。試料の一部は、後のプロテイン分析及び、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）若しくは質量分析による分析的特徴付けのために用いた。
【０１８７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の指示に従って使用した。特に、１０％又は４−１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０１８８】
分析サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔に述べると、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムで３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５中Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムにかけるか、又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステムで２×ＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。溶出タンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積積分により定量した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ１５１−１９０１を標準として用いた。
【０１８９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用するそれぞれの抗原に対する抗体の結合及び結合親和性の決定
生成された抗体のそれぞれの抗原に対する結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、表面プラズモン共鳴によって調べた。簡潔に述べると、親和性測定のために、それぞれの抗原に対する抗体を提示するため、アミンカップリングを介して、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ１０９−００５−０９８抗体をＣＭ５チップに固定化する。結合を、ＨＢＳバッファー（ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）中、２５℃（又は３７℃）で測定する。抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内で精製したもの）を様々な濃度で溶液に加えた。結合は、８０秒から３分間の抗原注入によって測定し、解離はチップ表面をＨＢＳバッファーで３−１０分間洗浄することによって測定し、ＫＤ値はラングミュア型の１：１結合モデルを使用して評価した。ネガティブコントロールデータ（例えば、バッファー曲線）を、系固有のベースラインドリフトの較正及びノイズシグナル減少のために、試料曲線から差し引く。それぞれＢｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを、センサーグラムの分析及び親和性データの計算のために使用する。
【０１９０】
実施例１
ファージディスプレイキャンペーンのための抗原Ｆｃ融合体の調製、精製及び特徴付け
単量体状態でヒト及びカニクイザルＣＤ１９エクトドメイン（表１）を発現及び精製するために、各ＤＮＡ断片を、「ノブ（ｋｎｏｂ）」変異を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子セグメント（ヒト：配列番号４；カニクイザル：配列番号７）に融合し、「Ｆｃ−ホール（ｈｏｌｅ）」（配列番号３）対応物（Merchant等、(1998)Nat Biotechnol 16、677-681）と共にトランスフェクトした。ＩｇＡ切断部位（ＰＴＰＰＴＰ）を、抗原エクトドメインとＦｃノブ鎖との間に導入した。指定されたビオチン化のためのａｖｉタグを、抗原−Ｆｃノブ鎖のＣ末端に導入し、精製の目的のために、変異Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６ＦをＦｃホールに導入した（Jendeberg L.等、J.Immunological methods、1997）。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含有する抗原−Ｆｃノブ鎖（ヒト：配列番号６；カニクイザル：配列番号８）と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含有するＦｃホール鎖（配列番号５）とを組み合わせると、ＣＤ１９エクトドメインの単一コピーを含むヘテロダイマーＦｃ融合断片が生成される。表２に、抗原Ｆｃ−融合コンストラクトのｃＤＮＡとアミノ酸配列を列挙する。
表1:抗原エクトドメイン(ECD)のアミノ酸番号付け及びその起源
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表2:単量体ヒト及びカニクイザルCD19Fc(kih)融合分子のcDNA及びアミノ酸配列
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【０１９１】
単量体抗原／Ｆｃ融合分子の生産のために、指数関数的に増殖させた懸濁ＣＨＯ細胞に、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）をコードする２つのプラスミドを、標準方法を使用してコトランスフェクトした。
【０１９２】
分泌タンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞培養物上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、クエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、０．５Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（カラム容積（ＣＶ）＝５−１５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製樹脂）に負荷した。未結合のタンパク質を、少なくとも６カラム容積の同じバッファーで洗浄することによって除去した。結合タンパク質を、直線勾配を使用して溶出した；ステップ１、１０ＣＶ  ０−６０％溶出バッファー（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ２．５））；ステップ２、２ＣＶ  ６０−１００％溶出バッファー。直線勾配のために、１００％溶出バッファーを用いてさらに２カラム容積のステップ溶出にかけた。
【０１９３】
回収画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を加えることによって調整した。タンパク質を濃縮し、濾過し、２ｍＭ  ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムのｐＨ７．４の溶液で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。
【０１９４】
表３に、単量体ヒト及びカニクイザルＣＤ１９Ｆｃ（ｋｉｈ）融合タンパク質の収率及び最終単量体含有量をまとめる。
表3-単量体ヒト及びカニクイザルCD19Fc(kih)融合タンパク質の生化学分析
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【０１９５】
精製抗原の一部を、製造業者の説明書に従ってＢｉｒＡビオチン−タンパク質リガーゼ標準反応キット（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ｃａｔ．＃ＢｉｒＡ５００）を使用して、インビトロでビオチン化した。ヒトＣＤ１９含有融合体のビオチン化度は９４％であり、カニクイザルＣＤ１９コンストラクトのビオチン化度は１００％であった。次いで、ビオチン化タンパク質を、脱アミドホットスポットＮ２７ｄ及びＮ２８を欠く親和性成熟８Ｂ８由来クローンの選択、スクリーニング及び特徴付けのために使用した。
【０１９６】
実施例２
親和性成熟ＣＤ１９特異的抗体の選択
ヒト化クローン８Ｂ８（国際公開第２０１１／１４７８３４号に記載）の軽鎖のＣＤＲ１に位置する２７ｄ及び２８位のアスパラギン残基の脱アミド化は、生物活性の顕著な減少を導く。したがって、ａ）２７ｄ及び２８位の両方のアスパラギン残基が除かれ、ｂ）重鎖及び軽鎖のさらなるＣＤＲがランダム化された２つのファージディスプレイライブラリーを、改善された親和性を有する８Ｂ８変異体を選択するために生成した。
【０１９７】
２．１  ＬＣＤＲ１ホットスポットを欠く８Ｂ８親和性成熟ライブラリーの生成
ＬＣＤＲ１に位置する脱アミド化部位Ｎ２７ｄ及びＮ２８を有しない親和性成熟８Ｂ８由来抗体の生成を、標準プロトコールを使用するファージディスプレイによって実施した（Silacci等、2005）。第１の工程では、ヒト化親クローン８Ｂ８のＶＬ及びＶＨ  ＤＮＡ配列（配列番号９及び配列番号１０）を、本発明者らのファージミドにクローニングし、これをランダム化の鋳型として使用した。次の工程では、ファージディスプレイによって好ましいクローンを選択するための２つのライブラリーを生成した。上述のホットスポット位置を除去するため、２７ｄ及び２８位でアミノ酸ＳＴＱＥのみを許容するＬＣＤＲ１ランダム化プライマー（配列番号１１）を両方のライブラリーに使用した。成熟ライブラリー１を、軽鎖及び重鎖の両方のＣＤＲ１及び２でランダム化し、一方で成熟ライブラリー２を、軽鎖のＣＤＲ１及び３並びに重鎖のＣＤＲ３でランダム化した。それぞれのＣＤＲ領域におけるランダム化された位置を図１に示す。軽鎖及び重鎖の両方のＣＤＲ１及び２でランダム化された成熟ライブラリー１の生成のために、３つの断片を、「スプライシングオーバーラップ伸長法（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」（ＳＯＥ）ＰＣＲにより構築し、ファージベクターにクローニングした（図２）。ライブラリー断片の生成のために、以下のプライマーの組合せを使用した：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１６）及びＣＤ１９  Ｌ１リバース・ランダム（配列番号１１）、断片２（ＣＤ１９  Ｌ２フォワード・ランダム（配列番号１２）及びＣＤ１９  Ｈ１リバース・ランダム（配列番号１３）並びに断片３（ＣＤ１９  Ｈ２フォワード・ランダム（配列番号１４）及びＣＤ１９  Ｈ３リバース・定常（配列番号１５）（表４）。十分な量の完全長ランダム化断片が構築された後、同様に処理したアクセプターファージミドベクターと一緒に、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩを用いて消化した。３倍モル過剰のライブラリーインサートを、１０μｇのファージミドベクターとライゲートした。精製したライゲーション物を使用して、２０形質転換し、２×１０ｅｘｐ９の形質転換体を得た。８Ｂ８親和性成熟ライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製し、選択のために使用した。
【０１９８】
軽鎖のＣＤＲ１及び３並びに重鎖のＣＤＲ３でランダム化した第２のライブラリーの生成を同様に行った。ライブラリー断片の生成のために、以下のプライマーの組合せを使用した：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１６）及びＣＤ１９  Ｌ１リバース・ランダム（配列番号１１）、断片２（ＣＤ１９  Ｌ１フォワード・定常（配列番号２２３）及びＣＤ１９  Ｌ３リバース・ランダム（配列番号２２４）並びに断片３（ＣＤ１９  Ｌ３フォワード・定常（配列番号２２５）及びＣＤ１９  Ｈ３リバース・ランダム（配列番号２２６）（表５）。十分な量の完全長ランダム化断片が構築された後、同様に処理したアクセプターファージミドベクターと一緒に、ＮｃｏＩ／ＫｐｎＩを用いて消化した。３倍モル過剰のライブラリーインサートを、２０ｕｇのファージミドベクターとライゲートした。精製したライゲーション物を使用して、４０形質転換し、２×１０ｅｘｐ９の形質転換体を得た。８Ｂ８親和性成熟ライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製し、選択のために使用した。
表4:8B8親和性成熟及びホットスポット除去ライブラリーのためのプライマーL1_L2/H1_H2
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表5:8B8親和性成熟及びホットスポット除去ライブラリーのためのプライマーL1_L3/H3
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【０１９９】
２．２  ＬＣＤＲ１ホットスポットＮ２７ｄ及びＮ２８を欠く親和性成熟８Ｂ８由来クローンの選択
ＬＣＤＲ１ホットスポットＮ２７ｄ及びＮ２８を欠く親和性成熟クローンの選択のために、ファージディスプレイによる２つの選択手法を実施した。
【０２００】
第１の手法では、両方のファージディスプレイライブラリーを使用して、ヒトＣＤ１９−Ｆｃ融合タンパク質に対して選択を行った。パニングラウンドを、以下のパターンに従って溶液中で実施した：１．  〜１０１２のファージミド粒子を、３０ｎＭのビオチン化ＣＤ１９−Ｆｃタンパク質に、全体積１ｍｌで０．５時間結合させる。２．  ５．４×１０７ストレプトアビジン被覆磁気粒子を１０分間加えることにより、ビオチン化ＣＤ１９−Ｆｃタンパク質及び特異的に結合したファージ粒子を捕捉する。３．  ５×１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×１ｍｌのＰＢＳを使用してビーズを洗浄する。４．  １ｍｌの１００ｍＭ  ＴＥＡを１０分間添加することによりファージ粒子を溶出し、５００ｕｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４を添加することにより中和する。５．  指数関数的に増殖させた大腸菌ＴＧ１細菌への再感染を行う。６．  ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を感染させ、続けてファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させ、次の選択ラウンドで使用する。選択は、漸減抗原濃度（３０×１０−９Ｍ、１０×１０−９Ｍ、及び３×１０−９Ｍ）を使用して３ラウンドにわたって実施した。ラウンド２及び３では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを使用して、抗原：ファージ複合体の捕捉を実施した。ニュートラアビジンプレートを、５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×ＰＢＳで洗浄した。ラウンド３では、ニュートラアビジンプレートを、「オフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）」選択のために、２リットルのＰＢＳ中で一晩インキュベートし、その後、ファージをプレートから溶出した。さらに、カニクイザルＣＤ１９−Ｆｃタンパク質をラウンド２で使用して、交差反応性結合因子を濃縮した。
【０２０１】
第２の選択手法では、細胞表面でヒト又はカニクイザルＣＤ１９  ＥＣＤの何れかを一過性発現させた細胞でファージパニングを実施した。ＨＥＫ細胞の一過性トランスフェクションのために、以下のタンパク質セグメントについてのＤＮＡ配列（５’から３’へ）を有する発現プラスミドを生成した：Ｆｌａｇタグ、ＳＮＡＰタグ、ヒト又はカニクイザル起源のＣＤ１９  ＥＣＤ、及び血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通領域（配列番号２１及び２２）。細胞表面におけるそれぞれのタンパク質（配列番号２３及び２４）の発現を、抗Ｆｌａｇ抗体を使用して検出するフローサイトメトリーによって確認した。両方のライブラリーを、第１選択ラウンドで、ヒト又はカニクイザルＣＤ１９  ＥＣＤ含有タンパク質融合の何れかを発現する細胞に曝露させた。その後のパニングラウンドのため、ＣＤ１９  ＥＣＤ種を適宜改変した。無関係の膜タンパク質を一過性トランスフェクトした細胞を、プレクリアリングに使用した。
【０２０２】
パニングラウンドは、以下のパターンに従って実施した：１．  先に記載の標準手順に従って、ＨＥＫ細胞に、ＣＤ１９  ＥＣＤ又は無関係の膜貫通タンパク質の何れかを発現するコンストラクトをトランスフェクトする。２．  細胞を、５％ＣＯ２雰囲気を有するインキュベータ中３７℃で全４８時間インキュベートする。３．  遠心分離（２５０×ｇで３分間）により細胞を単離し、ＰＢＳ／５％ＢＳＡ中で、１×１０Ｅ７個のＣＤ１９  ＥＣＤ陽性細胞及び１×１０Ｅ７個の陰性細胞をそれぞれ再懸濁する。３．  ファージライブラリーを、１×１０７個のＣＤ１９陰性細胞と共に、穏やかに回転するチューブローテーターを使用して４℃で６０分間インキュベートすることによって、非特異的ファージをプレクリアリングする。４．  細胞を、２５０×ｇで３分間遠心分離し、上清を未使用のチューブに移す。１×１０Ｅ７個のＣＤ１９陽性細胞を加え、チューブローテーターで穏やかに回転することによって４℃で６０分間インキュベートする。５．  細胞を、遠心分離により２５０×ｇで１分間洗浄し、上清を吸引し、１ｍｌのＰＢＳ（８倍）中に再懸濁する。６．  １ｍｌの１００ｍＭ  ＴＥＡでファージ溶出し、ＲＴで５分間インキュベートし、５００ｕｌの１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６で溶出液を中和する。７．  指数関数的に増殖させた大腸菌ＴＧ１細菌への再感染を行う。８．  ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を感染させ、続けてファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させ、次の選択ラウンドで使用する。選択は３ラウンドにわたって実施した。
【０２０３】
両方の選択手法について、特異的結合因子を、ＥＬＩＳＡにより、以下のように特定した：ウェルあたり１００ｕｌの３０ｎＭのビオチン化ＣＤ１９−Ｆｃタンパク質を、ニュートラアビジンプレートに被覆した。Ｆａｂ含有細菌上清を加え、結合Ｆａｂを、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用してＦｌａｇタグを介して検出した。
【０２０４】
組換えヒトＣＤ１９に対してＥＬＩＳＡ陽性であるクローンに、ヒトＣＤ１９  ＥＣＤ含有発現プラスミド（配列番号２２７）を一過性トランスフェクトした細胞を使用する細胞ベースのＥＬＩＳＡで、さらに試験した。分析は以下のように行った：トランスフェクション後４８時間で、ＨＥＫ細胞を収集し、２５０×ｇで５分間遠心分離した。次いで、細胞を、氷冷ＰＢＳ  ＢＳＡ２％で４×１０６細胞／ｍｌに再懸濁して、氷上で２０分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。１００ｕｌ中４×１０５個の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに分配し、２５０×ｇで、４℃で３分間遠心分離した。上清を吸引し、可溶型Ｆａｂ断片を含有する５０ｕｌの細菌上清を、５０ｕｌの氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡ２％で希釈し、プレートに加え、細胞と混合し、１時間４℃でインキュベートした。次いで、細胞を、氷冷ＰＢＳで３回洗浄してから、１：２０００希釈抗Ｆａｂ−ＨＲＰ抗体を含有するウェルあたり１００ｕｌのＰＢＳ  ＢＳＡ２％に加えた。１時間のインキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。展開後、１００ｕｌの「１−Ｓｔｅｐ  ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ」基質をウェルごとに加えた。１０分間のインキュベーション後、上清を、ウェルあたり４０ｕｌのＨ２ＳＯ４  １Ｍを含む新たな９６ウェルプレートに移し、吸光度を４５０ｎＭで測定した。バックグラウンドに対して顕著なシグナルを示すクローンを、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６を使用するＳＰＲ分析による速度論的スクリーニング実験にかけた。
【０２０５】
２．３  ＳＰＲによる親和性成熟８Ｂ８由来変異体の同定
ＥＬＩＳＡ陽性クローンの特徴をさらに明らかにするために、オフ速度を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器を使用して表面プラズモン共鳴によって測定し、親ヒト化クローン８Ｂ８と比較した。
【０２０６】
この実験のために、７０００ＲＵのポリクローナル抗ヒトＦａｂ抗体を、アミンカップリング（ＮａＡｃｅｔａｔｅ  ｐＨ４．５、２５μｌ／分、２４０秒）によってＧＬＭチップの全６チャネルに固定化した（垂直方向）。それぞれの抗体含有細菌上清を濾過し、ＰＢＳで２倍希釈し、次いで２５μｌ／分で３６０秒注射して、垂直方向で１００−４００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成した。単量体ＣＤ１９−Ｆｃの注射：ワンショット速度論的測定のために、注射の向きを水平方向に変え、精製した単量体ＣＤ１９−Ｆｃの３倍希釈系列（１５０−６ｎＭの範囲で濃度変化）を、５０μｌ／分で別個のチャネル１−４に、結合時間１８０秒及び解離時間３００秒で同時注射した。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（１５０ｎＭ）を、単量体ＣＤ１９−Ｆｃへの特異的結合のネガティブコントロールとして、チャネル５に注射した。バッファー（ＰＢＳＴ）を、第６チャネルに沿って注射し、参照のための「インライン」ブランクを作製した。再生は、１０ｍＭグリシン  ｐＨ１．５及び５０ｍＭ  ＮａＯＨの３０秒、９０ｕｌ／分の２つのパルス（水平方向）により行った。解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアでラングミュア型単純１：１結合モデルを使用して、センサーグラムを同時にフィッティングさせて計算した。最も遅い解離速度定数を有するＦａｂ発現クローンを同定した（表６）。なお、クローン５Ａ０７及び５Ｂ０８の解離速度定数は、不十分なフィッティングにより決定することができなかった。しかしながら、得られる結果から非常に遅い解離が示唆されたことから、両方のクローンを選択した。対応するファージミドの可変ドメインを配列決定した。重要なことに、ＬＣＤＲ１の両方のアスパラギン残基（２７ｄ及び２８位）がセリン又はスレオニンに置き換えられ、両方の脱アミド化部位が除去されたことが実証された。アラインメントを図３に示す。最適クローンのＣＤＲを表７に示す（軽鎖の可変領域）及び表８（重鎖の可変領域）（クローン５Ｈ０９：（配列番号２５−３０）；クローン７Ｈ０７：（配列番号３１−３６）；クローン２Ｂ０３：（配列番号３７−４２）；クローン２Ｂ１１：（配列番号４３−４８）；クローン５Ａ０７：（配列番号４９−５４）；クローン５Ｂ０８：（配列番号５５−６０）；クローン５Ｄ０８：（配列番号６１−６６）。
表6:細菌上清を用いたスクリーニング分析で得られた選択されたクローンの解離定数
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表7:選択された8B8軽鎖のCDR配列
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表8:選択された8B8重鎖のCDR配列
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【０２０７】
実施例３
親和性成熟８Ｂ８由来抗体の特徴付け
３．１  可変抗体ドメインの発現ベクターへのクローニング
選択された抗ＣＤ１９結合因子の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖の何れかにインフレームでサブクローニングした。重鎖では、国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載された方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を排除するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。
【０２０８】
抗ＣＤ１９ＩｇＧのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を、表９及び表１０にそれぞれ示す。キメラＭＰＳＶプロモーターでインサートの転写を駆動し、ＣＤＳの３’端に配置された合成ポリＡシグナル配列を有する発現ベクターに、全ての抗体コード配列をクローニングした。ベクターはさらに、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含んでいる。
表9:P329GLALAヒトIgG1フォーマットにおける抗CD19クローン8B8のcDNA及びアミノ酸配列
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表10:P329GLALAヒトIgG1フォーマットにおける親和性成熟抗CD19クローンのcDNA及びアミノ酸配列
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【０２０９】
３．２  ＳＰＲによる選択された抗体の親和性決定
ＳＰＲによって親和性を正確に決定するために、ポリエチレンイミンを使用して哺乳動物発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞にコトランスフェクトすることによって、選択された抗ＣＤ１９抗体を製造した。細胞に、１：１比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）の対応発現ベクターを、標準手順に従ってトランスフェクトした。トランスフェクションの７日後、上清の抗体価を測定し、全ての力価を１０μｇ／ｍｌに平衡化した。
【０２１０】
親抗体８Ｂ８並びにその誘導体の親和性（ＫＤ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）を２５℃で使用して、ＳＰＲによって測定した。７０００ＲＵのポリクローナル抗ヒトＦａｂ抗体を、アミンカップリング（ＮａＡｃｅｔａｔｅ  ｐＨ４．５、２５ｕｌ／分、２４０秒）（垂直方向）によってＧＬＭチップの全６チャネルに固定化した。それぞれの抗体含有ＨＥＫ上清を濾過し、ＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．４、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で１０ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈し、次いで２５μｌ／分で３６０秒注射して、垂直方向で５００−８００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成した。単量体ＣＤ１９−Ｆｃの注射：ワンショット速度論的測定のために、注射の向きを水平の方向に変え、精製した単量体ＣＤ１９−Ｆｃの３倍希釈系列（１５０−６ｎＭの範囲で濃度変化）を、５０μｌ／分で別個のチャネル１−４に、結合時間１８０秒及び解離時間３００秒で同時注射した。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（１５０ｎＭ）を、単量体ＣＤ１９−Ｆｃへの特異的結合のネガティブコントロールとして、チャネル５に注射した。バッファー（ＰＢＳＴ）を、第６チャネルに沿って注射し、参照のための「インライン」ブランクを作製した。それぞれのセンサーグラムの概要を図４Ａ−４Ｈに示す。再生は、１０ｍＭグリシン  ｐＨ１．５及び５０ｍＭ  ＮａＯＨの３０秒、９０ｕｌ／分の２つのパルス（垂直方向）により行った。結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアでラングミュア型単純１：１結合モデルを使用して、結合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングさせて計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算した。速度論的及び熱力学的データの概要を表１１に示す。全ての親和性成熟クローンの解離定数が、その親クローン８Ｂ８と比較して改善した。
表11:抗CD19 huIgG1とヒトCD19との間の相互作用についての速度論的及び熱力学的データの概要
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【０２１１】
実施例４
抗ＣＤ１９ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡの調製及び精製
ポリエチレンイミンを使用して哺乳動物発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞にコトランスフェクトすることによって、選択された抗ＣＤ１９抗体を製造した。細胞に、１：１比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）の対応発現ベクターをトランスフェクトした。
【０２１２】
５００ｍＬの振盪フラスコで製造するために、４億個のＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクション前に、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を、予熱されたＣＤ  ＣＨＯ培地に置き換えた。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を、２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地と混合した。５４０μＬのＰＥＩを加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ中３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸と、補助剤を含む７％Ｆｅｅｄとを加えた。７日間培養した後、上清を２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって回収した。溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、アジ化ナトリウムを補足して最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）とし、４℃で維持した。
【０２１３】
細胞培養物上清からの抗体分子の精製は、抗原Ｆｃ融合体の精製について上述したように、プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって実施した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０の溶液で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。
【０２１４】
精製抗体のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでＯＤを測定することによって決定した。抗体の純度及び分子量は、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下でＣＥ−ＳＤＳによって分析した。抗体試料の凝集含有量を、２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで、２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した（表１２）。
表12:抗CD19P329G LALA IgG1クローンの生化学分析
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【０２１５】
二重特異性コンストラクトの調製のために、３つの脱アミドホットスポットを欠くクローン２Ｂ１１を選択した。
【０２１６】
実施例５
ＣＤ１９発現腫瘍細胞への結合
ＩｇＧ１クローンのＣＤ１９発現細胞への結合を確認するために、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫に罹患した４１歳白人男性の胸水に由来するＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ５７５）を使用した。ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、型番１４１９０  ３２６）に再懸濁した０．１×１０６個の腫瘍細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、型番６５０１８５）の各ウェルに加えた。細胞を、２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、１：５０００希釈Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、型番６５−０８６４−１８）を含有する１００μＬ／ウェルの４℃の冷ＤＰＢＳバッファーに再懸濁し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃の冷ＤＰＢＳバッファーで１度洗浄し、ＣＤ１９結合因子を一連の濃度で含有する５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、型番Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）で補足したＤＰＢＳ）に再懸濁し、その後、４℃で１時間インキュベートした。徹底して洗浄した後、細胞を、５０μＬ／ウェルの５μｇ／ｍＬのＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、型番１０９  １１６  ０９８）を含有する４℃の冷ＦＡＣＳバッファーを用いて４℃で３０分間さらに染色した。細胞を、２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、細胞を、５０μＬ／ウェルの１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）含有ＤＰＢＳ中に固定した。細胞を１００μＬ／ウェルＦＡＣＳ−バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
【０２１７】
図５は、ＣＤ１９ＩｇＧ１クローンのヒトＣＤ１９発現ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞への結合を示す。表１３は、測定されるＥＣ５０値を示す。
表13:ヒトFAP発現腫瘍細胞への結合
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｆ】
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【図４Ｇ−Ｈ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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