(57)【要約】  それを必要とする対象における細胞中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α(PPARα)の活性を調節する方法が提供される。該方法は、有効量のPPARαリガンドを該対象に投与することを含み、PPARαリガンドは、3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB)、ヘキサデカンアミド(HEX)及び9-オクタデセンアミド(OCT)から選択される。それを必要とする対象における認知症、神経変性性障害、リソソーム貯蔵疾患及び体重障害を治療する方法が提供される。該方法は、有効量のPPARαリガンドを対象に投与することを含む。【選択図】図８Ａ−Ｃ
2018517728.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象における細胞中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α(PPARα)の活性を調節する方法であって、
3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB)、ヘキサデカンアミド(HEX)及び9-オクタデセンアミド(OCT)からなる群から選択される、有効量のPPARαリガンドを対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
PPARαリガンドがHMBである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
PPARαリガンドがHEXである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
PPARαリガンドがOCTである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
ニューロン細胞中のPPARα活性を調節することを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
海馬細胞中のPPARα活性を調節することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
有効量のPPARαリガンドを、認知症、神経変性性障害、リソソーム貯蔵障害又は肥満症を有する対象に投与することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
神経変性性障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病及びHIV関連認知症からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
リソソーム貯蔵障害が、バッテン病、テイ-サックス病、ファーバー病及びファブリー病からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
有効量のPPARαリガンドが経口的に送達される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
有効量のPPARαリガンドがニューロン細胞中のPPARα活性を活性化させる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
有効量のPPARαリガンドが対象におけるシナプスの機能を強化する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
有効量のPPARαリガンドが、ニューロン細胞へのカルシウムの進入を上方制御する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象における認知症を治療する方法であって、
3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB)、ヘキサデカンアミド(HEX)及び9-オクタデセンアミド(OCT)からなる群から選択される、有効量のPPARαリガンドを対象に投与することを含む方法。
【請求項１５】
対象における神経障害を治療する方法であって、
3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB)、ヘキサデカンアミド(HEX)及び9-オクタデセンアミド(OCT)からなる群から選択される、有効量のPPARαリガンドを対象に投与することを含む方法。
【請求項１６】
対象におけるリソソーム貯蔵障害を治療する方法であって、
3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB)、ヘキサデカンアミド(HEX)及び9-オクタデセンアミド(OCT)からなる群から選択される、有効量のPPARαリガンドを対象に投与することを含む方法。
【請求項１７】
対象における体重障害を治療する方法であって、
3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB)、ヘキサデカンアミド(HEX)及び9-オクタデセンアミド(OCT)からなる群から選択される、有効量のPPARαリガンドを対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる2015年6月15日に出願された米国特許仮出願第62/175,871号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。2016年6月13日に作製されたASCIIのコピーは、14904-157配列リスト_ST25.txtと命名されて、約2KBのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α即ちPPARαは、脂肪酸輸送及び異化作用2、抗炎症3、免疫調節4、及び抗酸化5の制御を含む多様な範囲の生物学的機能に関与する核内ホルモン受容体1のクラスに属する。しかしながら、最近の研究で6、PPARαは、CREBの転写の上方制御により海馬におけるシナプスの機能の調節でも重要な役割を果たすことが示された。海馬のニューロン中のPPARαの活性化は、ADAM10転写の増大及びそれに続くAPPの非アミロイド形成的タンパク質分解21をもたらすことも詳細に記述されている。これらの報告は、脳機能の制御におけるPPARαの脂質非依存性の役割を強調している。他の点では、豊富にあるペルオキシソームの存在が成人脳の海馬におけるミトコンドリアの不安定性を補償するために重要であり得ると考えられた7。
【０００４】
多くの他の核内ホルモン受容体と同様に、PPAR-αの全ての生物学的活性もリガンドとのその結合及びそれに続く核への転座に依存するかどうかは知られていない。リガンドとの相互作用は、大部分の核内ホルモン受容体の生物学的効果を調節するうえで有益な役割を果たすので22、海馬中におけるPPARαの内因性リガンドの存在の究明が促された。PPARαの内因性モジュレーターの同定に成功すれば、PPARαによる海馬の機能及び記憶の内因性の調節を理解する助けになるであろう。しかしながら、海馬におけるPPARαの内因性リガンドの存在及びシナプスの活性を調節することにおけるそれらの役割については殆ど知られていない。オレイルエタノールアミド23, 24及びパルミトイルエタノールアミド25、脂肪酸誘導体20-カルボキシ-アラキドン酸26、及びロイコトリエンB427を含む内因性のカンナビノイド様分子が内因性のPPARαリガンドと考えられてきたが、これらの化合物は、肝臓28、腎臓29及び脳30を含む異なる組織に普遍的に存在する。さらに、これらの化合物は、酸化防止剤、抗炎症から神経保護にまで至る広範囲の生物学的活性を発揮する25, 29。PPAR-αの内因性リガンドを発見する試みで、最近の研究8により、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリン(16:0/18:1-GPC)が肝臓でPPAR-αの強力なリガンドとして役立ち得ることが確認された。しかしながら、現在まで、海馬のニューロンにおいてPPARα活性を調節することができる海馬中における内因性リガンドの存在について何も知られていない。
【０００５】
生理学的に利用可能なリガンドを同定するために、アフィニティー精製を実施し、それに続いて、レンチ*pparaが過剰発現したニューロンの核抽出物における気相質量分析法(GCMS)分析を実施した。次に、これらの分子の存在を、野生型及びPPARA欠損動物から集めた海馬の抽出物をGST-PPAR-α組み替えタンパク質に対してアフィニティー精製し、続いてGCMS分析により確認した。これらの分析により、脳の海馬中の3種の固有のリガンド、3-ヒドロキシ-(2,2)-ジメチルブチレート(HMB)、ヘキサデカンアミド(HEX)、及び9-オクタデセンアミド(OCT)が同定された。さらなる構造的分析により、PPARαリガンド結合ポケット中の2種の重要なアミノ酸残基、チロシン314及び464がこれらのリガンドとの結合のために重要であることが明らかになり、それは、PPARαの部位特異的変異構築物の作製、それに続くレンチウイルス戦略を使用したニューロン細胞中におけるこれらの構築物の発現、及びアフィニティー精製された核分画のGCMS分析によって確認された。シナプスのタンパク質の発現を制御すること及び海馬のニューロンのシナプスの機能を調節することにおけるこれらのリガンドの役割も分析された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
HMB、HEX及びOCTリガンドは、脳細胞中でPPARαの活性化を誘発して、異なるシナプス分子の上方制御及びカルシウムの進入によりシナプスの機能を増強する。当技術分野において、PPARα活性を調節するための、及び障害、例えば、認知症、神経障害、リソソームの貯蔵障害及び体重障害の治療のためのPPARαリガンドが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
それを必要とする対象における細胞中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α(PPARα)の活性を調節する方法が提供される。本方法は、有効量のPPARαリガンドを対象に投与することを含み、PPARαリガンドは、3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB)、ヘキサデカンアミド(hexadecananamide)(HEX)及び9-オクタデセンアミド(OCT)からなる群から選択される。
【０００８】
それを必要とする対象における認知症、神経変性性障害、リソソームの貯蔵疾患及び体重障害を治療する方法が提供される。本方法は、有効量のPPARαリガンドを対象に投与することを含む。PPARαリガンドは、3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB)、ヘキサデカンアミド(HEX)及び9-オクタデセンアミド(OCT)からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−Ｅ】マウス脳の海馬中におけるPPAR-αの内因性リガンドの同定の図である。(図1A)フローチャートは、PPAR-αの核内リガンドのアフィニティー精製のための手順を表す。GST-PPARαでプルダウンされた後、(図1B)アセトニトリル及び、(図1C)クロロホルムで再構成されたWT及びKO海馬の核抽出物のGCMS分析(1群当たりn=3)。(同様なGCMS分析を、Pparaベータ欠損海馬組織の(図1D)アセトニトリル及び(図1E)クロロホルムで再構成された核抽出物(1群当たりn=3)で実施した。3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB)
【図１Ｆ−Ｊ】マウス脳の海馬中におけるPPAR-αの内因性リガンドの同定の図である。(図1F)、ヘキサデカンアミド(HEX)(図1G)、及び9-オクタデセンアミド又はオレアミド(OCT)(図1H)の化学構造。(図1I)抗GST、抗GST-PPAR-α、及び抗GST-PPARβ抗体(上方のパネル)、及び抗PPAR-α又は抗PPARβ抗体(下方のパネル)で探査したグルタチオンカラムから捕集した溶出物のイムノブロット分析。ヒストン3(H3)のイムノブロットは、核溶解産物(インプット)で実施されて、核抽出物の純度を示す(中央のパネル)。(図1J)新たに合成されたPPARαの後に内因性リガンドを同定するためのGCMS分析のフローチャート。
【図１Ｋ−Ｌ】マウス脳の海馬中におけるPPAR-αの内因性リガンドの同定の図である。(図1K)レンチ-ベクター及び(図1L)レンチ-PPARα-LBDを形質導入された海馬のニューロンのクロロホルムで抽出された核分画のGCMS分析。結果は3回の独立の実験の後確認される。
【図２Ａ】高処理能力分析によるOCT、HEX、及びHMBのPPARαとの相互作用の分析の図である。(図2A)内因性リガンドとPPARα-PGC-1A複合体の間の相互作用を分析するTR-FRET分析の概略表示。
【図２Ｂ−Ｇ】高処理能力分析によるOCT、HEX、及びHMBのPPARαとの相互作用の分析の図である。蛍光対リガンド濃度の対数スケールでプロットした(図2B)OCT、(図2C)HEX、及び(図2D)HMBのTR-FRET分析。材料及び方法の項で説明する(図2E)OCT、(図2F)HEX、及び(図2G)HMBの熱シフトアッセイ。結果は3回の独立の実験の後確認される。
【図３Ａ−Ｄ】リガンドとPPARαの間の相互作用を分子のレベルで研究するプロテオミクス手法の図である。(図3A)PPAR-αリガンド結合ポケットとそのリガンドOCT(図3A)、HEX(図3B)、及びHMB(図3C)に沿って重ね合わされた構造のリボン表示。リガンドの周りに4オングストロームの距離で位置するアミノ酸の基も緑色で示した。(図3D)pLenti6ベクターでクローニングされたPPARα遺伝子のプラスミドマップ及び全PPARα遺伝子をクローニングする制限部位を中央パネルに示した。Life technologiesにより供給されるレンチウイルスのパッケージキットを使用してベクターでクローニングされたFLPpara、Y314DPpara、Y464DPpara、及びY314D/Y464DPpara遺伝子の詳細なマップ。
【図３Ｅ−Ｇ】リガンドとPPARαの間の相互作用を分子のレベルで研究するプロテオミクス手法の図である。(図3E)FLPPARα及び(図3F)Y314D/Y464DPPARαタンパク質の熱シフトアッセイ。Tmは、溶融温度を表す。(図3G)フローチャートは、異なるPPARα構築物のレンチウイルス粒子に感染されたPpara欠損ニューロンの抽出物中に内因性リガンドを検出するためのGCMS分析の戦略を表す。
【図３Ｈ−Ｊ】(図3H)GFPのみ、(図3I)GFP-FL Ppara、(図3J)GFP-Y314D Ppara、をウイルスで形質導入したPPARA欠損海馬のニューロンの抽出物を、GFP-アフィニティーで精製したGCMS分析の図である。
【図３Ｋ−Ｌ】(図3K)GFP-Y464D Ppara、及び(図3L)GFP-Y314D/Y464D Pparaをウイルスで形質導入したPPARA欠損海馬のニューロンの抽出物を、GFP-アフィニティーで精製したGCMS分析の図である。
【図４Ａ−Ｄ】マウスの初代の星状膠細胞及びニューロン中のPPREに駆動されるルシフェラーゼ活性におけるPPARαの内因性リガンドの役割の図である。(図4A)OCT、(図4B)HEX、及び(図4C)HMBとそれらの広範囲の濃度で4時間インキュベートした後のマウスの初代の星状膠細胞におけるPPREルシフェラーゼ活性。結果は3回の独立の実験の平均±SDである。*対照に対してp<0.01。(図4D)略画は、異なるPPARα構築物のレンチウイルス粒子に感染された初代の細胞におけるPPREルシフェラーゼアッセイの詳細を表す。
【図４Ｅ−Ｉ】マウスの初代の星状膠細胞及びニューロン中のPPREに駆動されるルシフェラーゼ活性におけるPPARαの内因性リガンドの役割の図である。PPREルシフェラーゼ活性は、異なる用量のHEX、OCT、及びHMBにより処理した後に、(E)ベクターのみ、(図4F)FLPpara、(図4G)Y314D、(図4H)Y464D、及び(図4I)Y314D/Y464D PPARα遺伝子を形質導入されたマウスの初代の星状膠細胞でアッセイされた。
【図４Ｊ−Ｎ】マウスの初代の星状膠細胞及びニューロン中のPPREに駆動されるルシフェラーゼ活性におけるPPARαの内因性リガンドの役割の図である。Wy14643、フェノフィブラート、及びクロフィブラート[(図4J)ベクターのみ、(図4K)FLPpara、(図4L)Y314D、(図4M)Y464D、及び(図4N)Y314D/Y464D]の用量を増やして処理した後、レンチウイルスに予め感染されたマウスの初代の星状膠細胞におけるPPREルシフェラーゼ活性。
【図４Ｏ−Ｓ】マウスの初代の星状膠細胞及びニューロン中のPPREに駆動されるルシフェラーゼ活性におけるPPARαの内因性リガンドの役割の図である。P PREルシフェラーゼ活性を、異なる用量のHEX、OCT、及びHMBにより処理した後、(図4O)ベクター、(図4P)FLPpara、(図4Q)Y314D、(図4R)Y464D、及び(図4S)Y314D/Y464DPPARα遺伝子を形質導入されたマウス初代の海馬のニューロンでアッセイした。結果は3回の独立の実験の平均±SDである。
【図５Ａ−Ｄ】海馬のニューロンの形態学的可塑性に対するPPARαの内因性リガンドの役割の図である。(図5A)溶媒(DMSOのみ)、(図5B)OCT、(図5C)HEX、及び(図5D)HMBで処理後にベクター、FLPpara、及びY464DPparaウイルスを形質導入された海馬のニューロンにおけるスパイン密度を測定するためのマップ-2及びファロイジンの二重免疫染色。
【図５Ｅ−Ｌ】海馬のニューロンの形態学的可塑性に対するPPARαの内因性リガンドの役割の図である。AMPAに駆動されるカルシウム流入を、(図5E)FLPpara、(図5F)Y314D、(図5G)Y464D、及び(図5H)Y314D/Y464DPPARα遺伝子を形質導入したPPARA欠損海馬のニューロンに、OCT(赤色)、HEX(緑色)及びHMB(紫色)で処理して測定した。全てのニューロンを、50μMのNMDA受容体アンタゴニストN20Cで処理して、NMDA受容体を通る受動カルシウムの流れを阻害した。(図5I〜L)同様にNMDAで駆動されるカルシウム流入を、レンチウイルスに感染させた海馬のニューロンで、異なる内因性リガンドの存在下で測定した。これらの場合には、Naspm HClを処理してAMPA受容体を通るカルシウム流の受動流れを停止させた。
【図６Ａ】マウス脳の海馬中におけるPPARα、β及びγイソ型の細胞内局在化の図である。(図6A)PPARα、β及びγの細胞内分布を、海馬のCA1領域における免疫蛍光(NeuN=緑色、PPAR=赤色)分析により示した。
【図６Ｂ】マウス脳の海馬中におけるPPARα、β及びγイソ型の細胞内局在化の図である。(図6B)核(NE)及び海馬組織の細胞質の抽出物(CE)をPPAR-α、β、及びγに対してイムノブロットした。イムノブロット分析は、週齢6〜8週のWTマウス及びPPARA欠損マウス(1群当たりn=3)で実施した。細胞質の分画の純度を、GAPDHイムノブロット分析により検証したが、核分画の純度を評価するためには、ヒストン3(H3)のイムノブロットを実施した。
【図７Ａ−Ｃ】マウス脳の海馬中における内因性のPPARαのリガンドの同定の図である。GST-PPARα-LBDでプルダウンされた後、WT海馬のクロロホルム-(図7A及び7B)及びアセトニトリル-(図7C)で再構成された核抽出物のGC-MS分析。
【図７Ｄ−Ｆ】マウス脳の海馬中における内因性のPPARαのリガンドの同定の図である。同様なGC-MS分析を、GST-PPARβ-LBDでプルダウンされた後、クロロホルム(図7D)及びアセトニトリル(図7E)で再構成された核抽出物で実施した。抗GST抗体(上方のパネル)、及び抗PPARα又は抗PPARβ抗体(下方のパネル)で探査された、グルタチオンカラムから捕集した溶出物のイムノブロット分析(図7F)。ヒストン3(H3)イムノブロットは、核抽出物の純度を示すために核溶解産物(インプット)で実施した(中央のパネル)。
【図７Ｇ−Ｉ】マウス脳の海馬中における内因性のPPARαのリガンドの同定の図である。レンチ-ベクター-(図7G)及びレンチ-PPARα-(図7H)を形質導入したPPARA欠損海馬のニューロンのクロロホルム抽出核分画のGC-MS分析。図7I)レンチ-ベクター及びレンチ-PPARαに感染させたニューロンの抽出物をPPARαについて分析し、次にアクチンで標準化した。結果を3回の独立の実験によって確認した。
【図８Ａ−Ｃ】OCT、HEX及びHMBのPPARαとの相互作用のTR-FRETによる分析の図である。リガンド濃度の対数スケールに対する蛍光としてプロットされたOCT(図8A)、HEX(図8B)及びHMB(図8C)のTR-FRET分析。
【図８Ｄ−Ｆ】OCT、HEX及びHMBのPPARαとの相互作用のTR-FRETによる分析の図である。OCT(図8D)、HEX(図8E)及びHMB(図8F)の熱シフトのアッセイは、材料及び方法の項の下で記載したように実施した。全長タンパク質のみのための方程式:y=50=-0.0652x3+9.053x2-408.09x+6012.7;x=45.96321OCTを有する全長タンパク質方程式:y=50=-0.0002x5+0.052x4-5.1349x3+250.52x2-6041.9x+57653;x=59.6128HEXを有する全長タンパク質方程式:y=0.0074x3-0.8528x2+31.967x-389.74;x=59.2835HMBを有する全長タンパク質方程式:y=-0.06529x3+9.053x2-408.09x +6012.7;x=58.494798
【図８Ｇ−Ｉ】OCT、HEX及びHMBのPPARαとの相互作用のTR-FRETによる分析の図である。PPARαリガンド結合ポケットの、そのリガンドOCT(図8G)、HEX(図8H)及びHMB(図8I)に沿って重ね合わされた構造のリボン表示を示す。結果は3回の独立の実験によって確認する。
【図９Ａ−Ｆ】リガンドとPPARαの間の分子のレベルにおける相互作用の図である。OCT(図9A)、HEX(図9B)及びHMB(図9C)に沿って重ね合わされたY464D-PPARαリガンドの結合ポケットの構造の原子特異的表示。リガンドの周りで4オングストロームの距離に位置するアミノ酸も黄色で示した。図9D)FL-Ppara、Y314D-Ppara、Y464D-Ppara、及びY314D/Y464D-Pparaの詳細なマップを示す。(図9E)FL-PPARα及び(図9F)Y314D/Y464D-PPARαタンパク質の熱シフトのアッセイ。Tmは、溶融温度を表す。
【図９Ｇ−Ｉ】リガンドとPPARαの間の分子のレベルにおける相互作用の図である。(図9G)Y464D-PPARα単独及び3種のリガンドと一緒の熱シフトのアッセイ。GFP(図9H)、GFP-FL-Ppara(図9I)を含有するレンチウイルス粒子を形質導入したPPARA欠損海馬のニューロンの、GFP-アフィニティーで精製した抽出物のGC-MS分析。
【図９Ｊ−Ｌ】リガンドとPPARαの間の分子のレベルにおける相互作用の図である。GFP-Y314D-Ppara(図9J)、GFP-Y464D-Ppara(図9K)、及びGFP-Y314D/Y464D-Ppara(図9L)を含有するレンチウイルス粒子を形質導入したPPARA欠損海馬のニューロンの、GFP-アフィニティーで精製した抽出物のGC-MS分析。
【図１０Ａ−Ｆ】海馬のPPARαリガンドが、PPREに駆動されるルシフェラーゼ活性を、初代のマウス星状膠細胞及びニューロン中で誘発することを示す図である。60〜70%のコンフルエンスでプレート上に培養された星状膠細胞に、tk-PPREx3-Luc、PPRE依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を形質導入した。トランスフェクションの24時間後に、細胞を異なる濃度のHEX(図10A)、OCT(図10B)及びHMB(図10C)で4時間処理し、続いてルシフェラーゼ活性をモニターした。細胞の生存能力に対するこれらのリガンドの効果を理解するために、同様な実験条件下で、MTTを実施した(図10D、HEX;図10E、OCT;図10F、HMB)。結果は3回の独立の実験の平均±SDである。対照に対してap<0.001。
【図１０Ｇ−Ｋ】海馬のPPARαリガンドが、PPREに駆動されるルシフェラーゼ活性を、初代のマウス星状膠細胞及びニューロン中で誘発することを示す図である。PPARA欠損星状膠細胞に空のベクター(図10G)、FL-Ppara(図10H)、Y314D-Ppara(図10I)、Y464D-Ppara(図10J)、及びY314D/Y464D-Ppara(図10K)を含有するレンチウイルス粒子を48時間形質導入し、続いてtk-PPREx3-Lucをトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、細胞を異なる用量のHEX、OCT及びHMBで4時間処理して、続いてルシフェラーゼ活性をモニターした。
【図１０Ｌ−Ｐ】海馬のPPARαリガンドが、PPREに駆動されるルシフェラーゼ活性を、初代のマウス星状膠細胞及びニューロン中で誘発することを示す図である。PPREルシフェラーゼ活性を、空のベクター(図10L)、FL-Ppara(図10M)、Y314D-Ppara(図10N)、Y464D-Ppara(図10O)、及びY314D/Y464D-Ppara(図10P)を含有するレンチウイルス粒子を形質導入したPPARA欠損星状膠細胞に、異なる用量のWY14643、フェノブラート、及びクロフィブラートで処理した後、アッセイした。
【図１０Ｑ−Ｕ】海馬のPPARαリガンドが、PPREに駆動されるルシフェラーゼ活性を、初代のマウス星状膠細胞及びニューロン中で誘発することを示す図である。PPREルシフェラーゼ活性は、空のベクター(図10Q)、FL-Ppara(図10R)、Y314D-Ppara(図10S)、Y464D-Ppara(図10T)、及びY314D/Y464D-Ppara(図10U)を含有するレンチウイルス粒子を形質導入された初代の海馬のニューロンに、異なる用量のHEX、OCT及びHMBで処理した後アッセイした。結果は3回の独立の実験の平均±SDである。対照に対してap<0.001。
【図１１Ａ−Ｅ】海馬のニューロンの形態学的可塑性に対する内因性PPARαリガンドの役割の図である。PPARA欠損海馬のニューロンに、GFP(ベクター)、FL-Ppara、及びY464D-Pparaを含有するレンチウイルス粒子を、48時間形質導入し、続いてビヒクル(DMSO)(図11A)、OCT(図11B)、HEX(図11C)、HMB(図11D)、及びWY14643(図11E)で24時間処理した。
【図１１Ｆ−Ｈ】海馬のニューロンの形態学的可塑性に対する内因性PPARαリガンドの役割の図である。次にニューロンをファロイジンで染色してスパイン密度を測定した。F)スパイン頭部の面積を数えるために使用したスパイン(シアン)を有する樹状突起の代表的写真。10μmの樹状突起中のスパイン頭部の面積(図11G)及びスパインの数(図11H)。結果は1群当たり5ニューロンの平均±SEMである。
【図１１Ｉ−Ｐ】海馬のニューロンの形態学的可塑性に対する内因性PPARαリガンドの役割の図である。ベクターのみに対してap<0.05;FL-Pparaに対してbp<0.05。AMPAに駆動されるカルシウム流入を、FL-Ppara(図11I)、Y314D-Ppara(図11J)、Y464D-Ppara(図11K)、及びY314D/Y464D-Ppara(図11L)を含有するレンチウイルス粒子を形質導入した、OCT(赤色)、HEX(緑色)及びHMB(紫色)で処理したPPARA欠損海馬のニューロンで測定した。NMDA受容体を通る受動カルシウム流れを阻害するために、全てのニューロンを、50μMのNMDA受容体アンタゴニストN20Cで処理した。(図11M〜P)同様にNMDAに駆動されるカルシウム流入を、レンチウイルスに感染させたPPARA欠損海馬のニューロンで、異なる内因性リガンドの存在下で測定した。これらの場合に、Naspm-HCl処理してAMPA受容体を通るカルシウム流の受動流れを停止させた。結果は3回の独立の実験の平均である。
【図１２Ａ−Ｅ】マウス脳の海馬中におけるPPARα、β及びγイソ型の細胞内局在化の図である。(図12A)PPARα、β及びγの細胞内分布を、海馬のCA1領域の免疫蛍光(NeuN、緑色;PPAR、赤色)分析により示した。(図12B)核に富む(NE)及び細胞質に富む(CE)海馬の組織の分画を、PPARα、β、及びγについてイムノブロットした。ヒストン3(H3)及びGAPDHが、核抽出物及び細胞質抽出物の純度を、それぞれモニターするために含まれた。イムノブロット分析は、週齢6〜8週雄WTマウス及びPPARA欠損マウス(1群当たりn=3)で実施した。バンドを走査してタンパク質/H3の値を、CEに対して表示した(図12C、PPARα;図12D、PPARβ;図12E、PPARγ)。結果は1群当たり3匹のマウスの平均±SEMである。CEに対してap<0.0001。
【図１３Ａ−Ｃ】TR-FRET及びEC50値の抽出。OCT(図13A)、HEX(図13B)及びHMB(図13C)に対する曲線の当てはめ(図13C)の図である。
【図１４Ａ−Ｃ】PPARA欠損星状膠細胞への異なるPpara構築物を含有するレンチウイルス粒子の形質導入の図である。図14A)カバースリップ上で培養されたPPARA欠損星状膠細胞に、FL-Ppara、Y314D-Ppara、Y464D-Ppara、及びY314D/Y464D-Pparaを含有するレンチウイルス粒子を形質導入した。形質導入の48時間後に、GFPのレベルをOlympus IX81蛍光顕微鏡でモニターした。DAPIを、核を可視化するために使用した。図14B)同様に、形質導入の48時間後に、PPARα[PPARα(53kDa)+GFP(27kDa)]のレベルをウェスタンブロットによりモニターした。図14C)バンドを走査して値(PPARα/アクチン)を対照に対して表示した。結果は3回の独立の実験の平均±SDである。対照に対してap<0.0001。
【図１５Ａ−Ｆ】GC-MSのピーク積分統計の図である。2,4-ビス(α,α-ジメチルベンジル)フェノールをGC-MS分析における内部標準として使用した(矢頭)(図15A、ベクターのみ;図15B、FL Ppara;図15C、Y314D Ppara;図15D、Y464D Ppara;図15E、Y314D/Y464D Ppara)。図15F)2,4-ビス(α,α-ジメチルベンジル)フェノールの化学構造、分子量及びCAS番号。
【図１６Ａ−Ｄ】OCT、HEX及びHMBは、PPREに駆動されるルシフェラーゼ活性を、Pparb欠損星状膠細胞中で、PPARγのアンタゴニストの存在下で誘発することを示す図である。図16A)12ウェルのプレートで60〜70%のコンフルエンスに培養されたPparb欠損初代の星状膠細胞に、0.25μgのtkPPREx3-Luc(PPREに依存するルシフェラーゼレポーター構築物)を形質導入した。トランスフェクションの24時間後に、細胞を異なる濃度のGW9662で30分間処理して、続いてロシグリタゾンで刺激した。4時間後に、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。データは、3回の異なる実験の平均±SDである。対照に対してap<0.001;ロシグリタゾンに対してbp<0.05及びcp<0.01。トランスフェクションの後、細胞をGW9662でも処理して、続いてOCT(図16B)、HEX(図16C)及びHMB(図16D)で刺激した。4時間後に、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。対照に対してap<0.001;nsは、有意でないこと。
【図１６Ｅ−Ｈ】OCT、HEX及びHMBは、PPREに駆動されるルシフェラーゼ活性を、Pparb欠損星状膠細胞中で、PPARγのアンタゴニストの存在下で誘発することを示す図である。(図16E、配列番号9)CREBのプロモーターマップは、コンセンサスPPREの存在を示す。PPARα及びPGC1αでプルダウンされた後、ChIP分析(図16F)に続いてCREBプロモーターのリアルタイムの(図16G〜H)検証を行なった。データは3回の異なる実験の平均±SDである。対照に対してap<0.001。
【図１７Ａ−Ｄ】PPARA欠損海馬のニューロン及び異なるPpara構築物を形質導入されたニューロン中におけるシナプスの分子の発現に対するHEX、OCT及びHMBの効果の図である。(図17A)イムノブロット分析に続いて、NR2A(図17B)、GluR1(図17C)及びCREB(図17D)のデンシトメーターによる分析を、5μMのHEX、5μMのOCT及び50μMのHMBで処理されたPPARA欠損及びWT海馬のニューロンで実施した。データは3回の異なる実験の平均±SDである。WT-対照に対してap<0.05。
【図１７Ｅ】PPARA欠損海馬のニューロン及び異なるPpara構築物を形質導入されたニューロン中におけるシナプスの分子の発現に対するHEX、OCT及びHMBの効果の図である。HEX、OCT及びHMBで処理されたWT及びPPARA欠損海馬のニューロンにおけるNR2A免疫細胞化学分析。
【図１７Ｆ】PPARA欠損海馬のニューロン及び異なるPpara構築物を形質導入されたニューロン中におけるシナプスの分子の発現に対するHEX、OCT及びHMBの効果の図である。HEX、OCT及びHMBで処理されたWT及びPPARA欠損海馬のニューロンにおけるGluR1の免疫細胞化学分析。
【図１７Ｇ−Ｌ】PPARA欠損海馬のニューロン及び異なるPpara構築物を形質導入されたニューロン中におけるシナプスの分子の発現に対するHEX、OCT及びHMBの効果の図である。海馬のニューロンにレンチ-GFPを48時間形質導入し、続いて異なるリガンドで処理した。イムノブロット分析に続いて、異なるPpara構築物を含有するレンチウイルス粒子を形質導入したPPARA欠損海馬のニューロンのCREBの相対的デンシトメーターに分析、続いてHEX(図17G〜H)、OCT(図17I〜J)及びHMB(図17K〜L)による処理。バンドを走査して、対照に対して表示した(図17H、HEX;図17J、OCT;図17L、HMB)。データは3回の異なる実験の平均±SDである。FLPpara対照に対してap<0.05。
【図１８】GW7647のPPARαとの相互作用のTR-FRETによる分析の図である。GW7647のTR-FRET分析を、リガンド濃度の対数スケールに対する蛍光としてプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に記載される実施形態は、網羅的であったり、又は本開示の範囲を以下の詳細な説明に記載の詳細な形態に限定したりすることを意図するものではない。そうではなく、実施形態は、他の当業者がその教示を利用可能になるように、例として選択され、記載されるものである。
【００１１】
対象における細胞中でペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α(PPARα)の活性を調節する方法が提供される。有効量のPPARαリガンドを対象に投与することができる。PPARαリガンドは、3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB)、ヘキサデカンアミド(HEX)及び9-オクタデセンアミド(OCT)からなる群から選択される。
【００１２】
PPARα活性は、海馬のニューロン及び他の脳細胞を含む種々の細胞で調節することができる。
【００１３】
PPARαリガンドは、認知症、神経変性性障害、リソソームの貯蔵障害又は肥満症を治療するために投与することができる。
【００１４】
本発明の文脈内の「治療すること」、「治療する」又は「治療」は、障害若しくは疾患と関連する症状の軽減、又はこれらの症状のさらなる進行若しくは増悪の停止、又は疾患若しくは障害の防止若しくは予防を意味する。例えば、本発明の文脈で、成功した治療は、認知症、神経変性性障害、リソソーム貯蔵障害、及び体重障害に関係する症状の軽減を意味し得る。治療は、有効量のPPARαリガンドを対象に投与して、障害若しくは疾患に関連する症状の軽減、又はこれらの症状のさらなる進行若しくは増悪の停止、又は疾患若しくは障害の防止若しくは予防を生じさせることを含むことができる。
【００１５】
非限定的な例として、神経変性性障害は、ニューロンのセロイドリポフスチン症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、例えばパーキンソンに加わる疾患例えば、多系統萎縮症(MSA)、進行性核上麻痺(PSP)、大脳皮質基底核変性症(CBD)及びレヴィ小体型認知症(DLB)を含むから選択され得る。
【００１６】
非限定的な例として、リソソームの貯蔵障害は、テイ-サックス病、ファブリー病、ニーマンピック病、ゴーシェ病、ハンター症候群、アルファ-マンノシド蓄積症、アスパルチルグリコサミン尿症、コレステロールエステル貯蔵病、慢性ヘキソサミニダーゼA欠損、シスチン蓄積症、ダノン病、ファーバー病、フコシド蓄積症、及びガラクトシアリドーシスから選択され得る。
【００１７】
本明細書において使用する用語「対象」又は「患者」は、哺乳類、好ましくは、ヒトを指す。
【００１８】
幾つかの実施形態において、本発明の実施には、特に断りのない限り、当技術分野の内である、分子生物学、免疫学、微生物学、細胞生物学及び組み替えDNAの従来の技法を使用するであろう。例えば、Sambrook, Fritsch及びManiatis, MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,(最新版);CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M. Ausubelら編、(最新版));METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ(Academic Press, Inc.):PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(最新版)ANTIBODIES、A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE(R. I. Freshney編(1987))。DNA Cloning:A Practical Approach, I及びII巻(D. Glover編);Oligonucleotide Synthesis(N. Gait編、最新版);Nucleic Acid Hybridization(B. Hames及びS. Higgins編、最新版);Transcription and Translation(B. Hames及びS. Higgins編、最新版);Fundamental Virology、第2版、I及びII巻(B. N. Fields及びD. M. Knipe編)を参照されたい。
【００１９】
医薬組成物
【００２０】
本明細書に記載されるリガンドは、単独で又は薬学的に許容される担体若しくは賦形剤と一緒の組成物で使用することができる。本発明の医薬組成物は、3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート、ヘキサデカンアミド又は9-オクタデセンアミドを含む治療有効量のPPARαのリガンドを、1種以上の薬学的に許容される担体と一緒に含む。本明細書において使用する、用語「薬学的に許容される担体」は、無毒性で不活性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は任意のタイプの剤形化助剤を意味する。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料の幾つかの例は、糖類、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース;デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン;セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びセルロースアセテート;粉末トラガカント;モルト;ゼラチン;タルク;賦形剤、例えば、ココアバター及び座剤ワックス;油、例えば、ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油;グリコール、例えばプロピレングリコール;エステル、例えば、エチルオレエート及びエチルラウレート;寒天;緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム、アルギン酸;発熱物質を含まない水;等張の生理食塩水;リンゲル溶液;エチルアルコール、及びリン酸緩衝溶液、並びに他の無毒性の適合性潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味料、調味料及び香料であり、防腐剤及び抗酸化剤も、調合者の判断に従って、組成物中に存在することができる。他の適当な薬学的に許容される賦形剤は、参照により本明細書に組み込まれる「Remington's Pharmaceutical Sciences」Mack Pub.Co.、New Jersey、1991に記載されている。
【００２１】
本明細書に記載されるリガンドは、任意に従来の無毒性の薬学的に許容される担体、補助剤、及びビヒクルを含有する投薬単位剤形でヒト及び動物に投与することができる。
【００２２】
剤形化の方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、Mack Publishing Company(ペンシルバニア州、Easton)、第19版(1995)に開示されている。本発明で使用するための医薬組成物は、滅菌、非発熱性溶液又は懸濁液、コーティングされたカプセル又は脂質粒子、凍結乾燥された粉剤の形態、又は当技術分野において公知の他の形態であることができる。
【００２３】
本発明の組成物は、液体エアロゾル又は吸入できる乾燥粉末として送達するために剤形化することができる。液体エアロゾル剤形は、主に末端の及び呼吸器の細気管支に送達され得る粒子サイズに霧化され得る。
【００２４】
経口投与のための液体投与形態は、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを含む。活性なリガンド加えて、液体の投与形態は、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、EtOAc、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及びそれらの混合物を含むことができる。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、補助剤、例えば、加湿剤(wetting agent)、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、調味料、及び香料も含むことができる。
【００２５】
経口投与のための固体の剤形は、カプセル、錠剤、ピル、粉剤、及び顆粒を含む。そのような固体剤形において、活性なリガンドは、少なくとも1種の不活性で薬学的に許容される賦形剤又は担体、例えば、クエン酸ナトリウム又は第二リン酸カルシウム及び/又はa)充填剤又は増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸、b)結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアラビアゴム、c)湿潤剤(humectant)、例えば、グリセロール、d)崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリケート、及び炭酸ナトリウム、e)溶解遅延剤、例えば、パラフィン、f)吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、g)加湿剤、例えば、アセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート、h)吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイト粘土、及びi)潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤及びピルの場合には、投薬形態は緩衝剤も含むことができる。
【００２６】
同様なタイプの固体組成物は、ラクトース即ち乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用する軟質及び硬質の充填されたゼラチンカプセルにおける充填剤としても使用することができる。
【００２７】
錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、及び顆粒の固体剤形は、コーティング及びシェル、例えば、腸溶性コーティング及び他の製薬剤形化技術分野で周知のコーティングで調製することができる。それらは場合により乳白剤を含有することができて、それらは活性成分のみを、又は腸管のある部分で優先的に、場合により、遅延様式で放出する組成物であることもできる。使用され得る埋め込み組成物の例には、ポリマー性物質及びワックスが含まれる。
【００２８】
活性なリガンドは、上で記した1種以上の賦形剤でマイクロカプセル化された形態であることもできる。錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、及び顆粒の固体剤形は、コーティング及びシェル、例えば、腸溶性コーティング、放出制御コーティング及び製薬技術分野で周知の他のコーティングを用いて調製することができる。そのような固体剤形では、活性なリガンドは、少なくとも1種の不活性希釈剤、例えば、スクロース、ラクトース又はデンプンと混合されてもよい。そのような投与形態は、通常の実施のように、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、錠剤化潤滑剤及び他の錠剤化助剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム及び微結晶性セルロースを含むこともできる。カプセル、錠剤及びピルの場合に、投与形態は、緩衝剤も含むことができる。それらは、場合により、乳白剤を含むこともできて、それらは、活性な成分のみ、又は腸管のある部分で優先的に、場合により、遅延様式で放出する組成物であることもできる。使用され得る埋め込み組成物の例には、ポリマー性物質及びワックスが含まれる。
【００２９】
本発明のリガンドの局所又は経皮投与のための投与形態は、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、粉剤、溶液剤、噴霧剤、吸入剤又は貼付剤を含む。活性成分は、滅菌条件下で、必要に応じて薬学的に許容される担体及び要求され得る任意の必要な防腐剤又は緩衝剤と混合される。眼科の剤形、点耳剤等も、本発明の範囲内であると考えられる。
【００３０】
軟膏、ペースト剤、クリーム剤及びゲル剤は、本発明の活性なリガンドに加えて、賦形剤、例えば、動物及び植物の油脂、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はそれらの混合物を含むこともできる。
【００３１】
本発明のリガンドは、本発明のリガンドに加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、カルシウムシリケート及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物を含むことができる局所粉剤及び噴霧剤としての使用のために剤形化されてもよい。噴霧剤は、さらに、通例の噴射剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素を含むことができる。
【００３２】
経皮貼付剤は、身体へのリガンドの制御送達を提供するという追加される利点を有する。そのような投与形態は、リガンドを適当な媒体中に溶解又は分配することにより作製することができる。吸収増進剤は、皮膚を越えるリガンドの流れを増大させるために使用することもできる。速度は、速度を制御する膜を提供すること又はリガンドをポリマーマトリックス又はゲル中に分配することのいずれかにより制御することができる。本発明のリガンドは、リポソームの形態で投与することもできる。当技術分野において知られているように、リポソームは、一般的に、リン脂質又は他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒体中に分散された単層又は多層の水和された液晶により形成される。任意の非毒性の、生理学的に許容される及びリポソームを形成し得る代謝性脂質が使用され得る。本発明のリポソーム形態の組成物は、本発明のリガンドに加えて、安定剤、防腐剤、賦形剤等を含むことができる。好ましい脂質は、リン脂質及び天然及び合成の両方のホスファチジルコリン(レクチン)である。リポソームを形成する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Prescott(編)、「Methods in Cell Biology」、XIV巻、Academic Press、New York、1976、p.33以下を参照されたい。
【００３３】
本発明のエアロゾル化された剤形は、エアロゾル形成デバイス、例えば、好ましくは、主に1から5μmの間の中間的質量平均直径（mass medium average diameter）を有するエアロゾル粒子の形成を可能にするように選択された噴射ネブライザー、振動多孔質板ネブライザー又は超音波ネブライザーを使用して、送達され得る。さらに、剤形は、好ましくは、バランスのとれた浸透圧モル濃度のイオン強度及び塩化物濃度、及び効果的な用量の本発明のリガンドを感染部位に送達することができるエアロゾル化可能な最小の体積を有する。それに加えて、エアロゾル化された剤形は、気道の機能を損傷せず、望ましくない副作用の原因とならないことが好ましい。
【００３４】
本発明のエアロゾル剤形を投与するために適当なエアロゾル化デバイスは、例えば、本発明の剤形を、主にサイズ範囲が1〜5μmのエアロゾル粒子に霧化することができる噴射ネブライザー、振動多孔質板ネブライザー、超音波ネブライザー及びエネルギーを与えた乾燥粉末吸入器を含む。主に、本出願では、全ての発生したエアロゾル粒子の少なくとも70%、しかし好ましくは90%を超えるものが1〜5μmの範囲内であることが意味される。噴射ネブライザーは、空気の圧力により作動して、液体溶液を砕いてエアロゾル液滴にする。振動する多孔質板ネブライザーは、急速に振動する多孔質板により生じた音波の真空を使用することにより作動して、多孔質板を通して溶媒液滴を押し出す。超音波ネブライザーは、圧電性の結晶により作動して、液体を剪断して小さいエアロゾル液滴にする。例えば、AERONEB及びAERODOSE振動多孔質板ネブライザー(AeroGen, Inc.、カリフォルニア州、Sunnyvale)、SIDESTREAMネブライザー(Medic Aid Ltd.、West Sussex、イングランド)、PARI LC及びPARI LC STAR噴射ネブライザー(Pari Respiratory Equipment, Inc.、バージニア州、Richmond)、及びAEROSONIC(DeVilbiss Medizinische Produkte(Deutschland)GmbH、Heiden、ドイツ)及びULTRAAIRE(Omron Healthcare, Inc.、イリノイ州、Vernon Hills)超音波ネブライザーを含む種々の適したデバイスが使用可能である。
【００３５】
注射用製剤、例えば、滅菌注射用の水性又は油性の懸濁液は、適当な分散剤又は加湿剤及び懸濁剤を使用する既知の技術によって剤形化することができる。滅菌注射用製剤は、例えば1,3-プロパンジオール又は1,3-ブタンジオール中の溶液のような無毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液又はエマルションであってもよい。使用することができる許容されるビヒクル及び溶媒の中に、水、リンゲル溶液、U.S.P.及び等張の塩化ナトリウム溶液がある。それに加えて、滅菌不揮発性油は、従来溶媒又は懸濁媒体として使用されている。この目的のために、合成モノ又はジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発性油が使用され得る。それに加えて、脂肪酸、例えば、オレイン酸は、注射可能薬物の調製に用途を見出す。注射用剤形は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過により、又は使用前に滅菌水又は他の滅菌注射用媒体に溶解又は分散され得る滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより滅菌することができる。
【００３６】
薬剤の効果を延長するために、皮下又は筋肉注射からの薬剤の吸収を遅くすることがしばしば望ましい。これは、水溶解性の低い結晶性又は非晶質材料の液体懸濁液の使用により達成され得る。その際、薬剤の吸収速度はその溶解速度に依存し、それは、その次に、結晶サイズ及び結晶形に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された薬剤形態の遅延された吸収は、薬剤を油ビヒクルに溶解又は懸濁することにより達成され得る。注射用デポの形態は、薬剤のマイクロカプセルマトリックスを生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチドポリグリコリド中に形成させることにより作製される。薬剤のポリマーに対する比及び使用される特定のポリマーの性質に依存して、薬剤放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)及びポリ(酸無水物)が含まれる。デポ注射用剤形は、薬剤を身体組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルションに捕捉することによっても調製することができる。
【００３７】
本明細書に記載されたリガンドは、互い違いに又は互いに独立に与えられる可能な組合せ療法について、単独で又は他のリガンドとの組合せで投与することができる。長期療法は、上で記したような他の治療戦略の関係で、補助的療法であるので、同様に可能である。他の可能な治療は、初期治療後の患者の状態を維持するための療法、又はさらに、例えば、リスクがある患者における予防的療法である。
【００３８】
本発明のリガンドの有効量は、一般的に、症状を検出可能な阻害又は軽減のために十分な任意の量を含む。担体材料と組み合わされて単独投与形態を生じさせ得る活性成分の量は、治療される宿主及び特定の投与様式に依存して変化するであろう。しかしながら、任意の特定の患者のための特定の用量レベルは、使用される特定のリガンドの活性、年齢、体重、総合的健康、性、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬剤の組合せ、及び療法を受けている特定の疾患の重症度を含む種々の要因に依存するであろうということは理解されるであろう。所与の状況のための治療的有効量は、日常的実験により容易に決定することができ、普通の臨床医の技術及び判断のうちである。
【００３９】
リガンドが他の化合物との組合せで投与される場合、用語「PPARα活性を調節するために効果的な量」とは、所望の効果を達成するために追加の化合物と組み合されたリガンドのその量を意味すると理解される。換言すれば、本発明による適当な組合せ療法は、そのいずれも、単独で特定の用量で与えられた場合に有効量を構成しないが、組合せで投与されたら「PPARαの活性を調節することに効果的な量」であるリガンドの量及び追加の化合物の量を含む。
【００４０】
しかしながら、本発明のリガンド及び組成物の毎日の使用量の合計が、主治医により正しい医学的判断の範囲内で決定されることは理解されるであろう。任意の特定の患者のための特定の治療的に有効な用量のレベルは、治療される障害及びその障害の重症度;使用される特定のリガンドの活性;使用される特定の組成物;患者の年齢、体重、総合的健康、性及び食事;投与時間、投与経路、及び使用される特定のリガンドの排泄速度;治療の継続期間;使用される特定のリガンドと組合せで又は同時に使用される薬剤;及び医学技術分野で周知の同様な要因を含む種々の要因に依存するであろう。
【００４１】
温血動物、例えば約70kg体重のヒトに投与されるべきリガンドの用量は、好ましくは、1から3回の例えば、同じサイズであってもよい単回用量に分割して、好ましくは一人当たり1日に約3mgから約5g、より好ましくは約10mgから約1.5g、最も好ましくは約100mgから約1000mgである。通常、小児は、成人用量の半分を受ける。
【００４２】
結果
【００４３】
海馬中における可塑性に関係する遺伝子の発現におけるPPARαの役割
【００４４】
PPARαは海馬のニューロンで強く発現される6, 31。海馬のニューロンは、長期増強現象(LTP)10及び長期うつ病(LTD)11に関係する広いスペクトルのシナプスタンパク質を備えるので、異なるLTP-及びLTDに関連するシナプスの分子の発現制御におけるPPARαの役割を調べた。LTPは、シナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの間のシナプスの強度に持続性の増大を生じさせるのに対し、LTDは、シナプスの強度の持続性の低下を起こさせる。mRNAベースのマイクロアレイに続くヒートマップ分析により、野生型(WT)ではなく、PPARA欠損(KO)マウスの海馬で、28個の遺伝子の下方制御、34個の遺伝子の上方制御及び22個の遺伝子の無変化が明確に示された(データ掲載せず)。下方制御されたmRNAの大部分は、LTPに関与して、イオンチャネル型AMPA受容体のGria 1及びGria 3のmRNA;イオンチャネル型NMDA受容体Grin 1、Grin 2a及びGrin 2bのmRNA;Arc、Homer 1及びFosを含む最初期遺伝子(IEG)のmRNA;及び異なるシナプスの膜がコードされたmRNA、Adam10、Dlg4、Synpo、及びAdcy1を含んでいた。それに対して、上方制御mRNAの大部分は、LTDと関連して、種々のタンパク質のホスファターゼのmRNA、例えば、Ngfr、Pick1、Nos1、及びNfkb1を含んでいた。KO海馬中における幾つかの重要なLTPと関連する、Arc、Gria 1、Grin2a、Grin2b、及びCrebを含むmRNAの下方制御が、リアルタイムPCR分析により別々に確認された。CA1海馬のシナプス前線維中のPSD-95(Dlg4遺伝子によりコードされる)の免疫組織化学分析及びNR2A(Grin2aによりコードされる)、GluR1(グリア1によりコードされる)、PSD-95、Arc、及びCREBのイムノブロットアッセイにより、KO脳の海馬は、WTマウスの海馬より少ないLTPに関連する分子を発現したことがさらに示された。
【００４５】
海馬中のPPARαの新規核内リガンドの同定
PPARは、遺伝子発現の活性化のためにリガンドの結合を必要とする核内受容体である。海馬の切片の免疫染色(図12A)及び海馬の抽出物の核に富む分画のイムノブロット分析(図12B〜E)により、核内に、PPARαは存在するが、PPARβもPPARγも存在しないことが明確に示された。これらの結果は、海馬は、PPARαのアゴニストの内因性の発現を有して、そのようなリガンドは、核内に存在するはずであることを示唆する。これらのリガンドを同定するために、ガスクロマトグラフィー質量分析(GCMS)技法を採用した。簡単に説明すると、核抽出物を、マウス海馬から調製し、GSTタグをつけたPPARαリガンド結合ドメイン(LBD)とインキュベートして、アフィニティークロマトグラフィーで精製し、クロロホルム又はアセトニトリルで再構成して、GCMS分析を実施した(図1A、図7A〜C)。クロロホルム抽出物の分析は、23.03分にm/zのある9-オクタデセンアミド(OCT)(図7A)及び21.45分にm/zのあるヘキサデカンアミド(HEX)と合致する(図7B)、2本の明瞭なピークを示した。他方、アフィニティーで精製された海馬の核抽出物のアセトニトリル分画のGC-MS分析は、14.48分にm/z160.0の明瞭なピークを生じ、それは、3-ヒドロキシ(2,2)-ジメチル酪酸エチルエステル(HMB)(図7C)についてNISTライブラリーと一致した。興味深いことに、PPARβ-LBDによるプルダウン後の海馬の核抽出物のGCMS分析は、如何なるピークも示さず(図7D〜E)、これはこれらの3種の海馬のリガンドが、PPARαに特異的であり得ることを示唆している。グルタチオンカラムを通して溶出された海馬の核抽出物の分画を、さらにイムノブロットして、アフィニティー精製手順の正確さを検証したが、それは、海馬の組織の量、組み替えタンパク質の量、及び溶出物の体積を含む全てのパラメータがアッセイ全体を通じて全ての場合に一定に保たれたことを明確に示した(図1I、図7F)。しかしながら、上記のアッセイは、これらのリガンドが新たに合成されたPPARαと同様の相互作用を示すことができるかどうかを示すために使用することはできなかった。それ故、次に培養されたPPARA欠損海馬のニューロンに全長PPARαのレンチウイルスの粒子を感染させて、次に免疫沈殿を実施して、続いてGCMSで分析した(図1J、図7G〜H)。前の観察と同様に、OCT(図1K)及びHEX(図1L)の両方が、lenti-FLParaで形質導入された新たに合成されたPPARαと結合したことが見出されたが(図7H)、空のレンチ-ベクターを形質導入されたPPARA欠損ニューロンとは結合しなかったことが見出された(図7G)。遺伝子の形質導入の効率を、PPARα抗体を用いる細胞抽出物のイムノブロット分析により測定した(図7I)。それに加えて、これらの分析で、海馬中で内因的に産生されるPPARαの生物学的リガンドの群を同定することに成功した。これらの検出された化合物の一部は、硫黄を含有する未知の化合物、例えば、チアゾール類(MW220〜240)、チオセミカルバゾン類(MW190〜200)及びチアゾリジンエステル類(MW250〜270)である(表2)。しかしながら、これらの化合物は、それらの未知の生合成経路、比較的乏しい合致要因(<65)、及び市販で入手不能という理由で、この研究から除外した。トランス-O-ジチアン-4,5ジオールは、緩衝剤で使用されるDTTの酸化産物であるが、それに対してD-ガラクトノ-1,4-ラクトン-5,6-オクチリデンは、PPARαとのその関連を確認するために必要とされるこの化合物の市販入手��能性のため、除外した。まとめると、本発明者らのGC-MS分析により、OCT、HEX及びHMBが3種の推定の、内因性で産生されるが、市販もされているPPARαリガンドとして同定された。
【００４６】
次に、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)分析を実施して、これらのリガンドとPPARαの間の相互作用を確認した。最適化されたTR-FRET分析(図2A、図8A〜C)は、PGC-1α-PPARαLBD複合体がこれら3種のリガンドの全てと強い相互作用を発揮することを示した(図2B〜D、図8A〜C)。図13は、OCT(A)、HEX(B)及びHMB(C)についてこれらのデータが如何にフィットするか、及び抽出されたEC50値を示す。全ての場合に、PPARαLBDによって出されたTR-FRETシグナル(図2D、図8A〜C))は、定常的な増大を示した。シグナル強度はOCT(図2B、図8A)及びHEX(図2C、図8B)と比較してHMBでより高いことが観察されたが、OCT及びHEXは両方ともHMBより低い濃度でFRETシグナルを発生した。一方、大きい熱シフトが、これらのリガンドとインキュベートされた際の、精製されたPPARα-LBDタンパク質の溶融温度における変化により証拠づけられる様に観察され(図2E〜G、図8D〜F)、これはこれらのリガンドがPPARαリガンド結合ドメインと高い効率で真に相互作用することを示唆した。
【００４７】
PPARαリガンド結合ドメインとその新規リガンドとの間の相互作用の分子的特徴づけ
【００４８】
次の目標は、これらのリガンドのPPARα-LBDとの分子間相互作用を特徴づけすることである。in silicoコンピューター支援ケモインフォマティクス分析は、PPARα-LBDにおけるこれらのリガンドの妥当な連結された姿勢を生成した(図3A〜C、図8G〜I)。全ての3種のリガンドの連結された姿勢は、リガンドとPPARα-LBDの2つの活性部位の残基、Tyr314(Y314)及びTyr464(Y464)との間の2通りの可能な水素結合を示した(図3B)。リガンド結合表面は、負に荷電した静電的表面と大部分親油性で若干親水性の区画を有する部分的に正に荷電した表面の少しの区画との両方を共有するので、両親媒性である。最も厳格な連結プロトコルを課して、OCT(合計スコア10.15、極性スコア1.05、及びクラッシュスコア-1.49;合計結合エネルギー-25.56kcal/mol)、HEX(合計スコア10.01、極性スコア1.81、及びクラッシュスコア-1.04;合計結合エネルギー-26.3kcal/mol)、及びHMB(合計スコア5.63、極性スコア1.93、及びクラッシュスコア-1.55;合計結合エネルギー-10.5kcal/mol)の妥当な連結された姿勢がPPARαについて得られた。興味深いことに、PPARβ及びPPARγの両方の場合に、同様な連結プロトコルを適用することにより、本発明者らは、これらのリガンドについてどのような連結された姿勢を得ることにも失敗し、これにより全ての3種のリガンドとPPARα-LBDとの相互作用は特異的であり、PPARの他のイソ形態では可能でないことが示唆された。この観察をさらに確認するために、OCT、HEX、及びHMBがY464D-PPARαリガンド-結合ポケットに置かれるin silicoで変異分析を実施した。エネルギー最小化(合計結合エネルギーは、OCTについて-15.6kcal/mol、HEXについて-14.3kcal/mol及びHMBについて-5.04kcal/molである)の後、全ての3種のリガンドがアスパラギン酸(D)残基から離れた位置(>4オングストローム)にあって何らかの水素結合を確立していることが確認され(図9A〜C)、これはチロシン464のアスパラギン酸への変異が、これらのリガンドとPPARαとの相互作用を大きく損なっていることが示唆された。しかしながら、タンパク質-リガンド相互作用のin silicoモデル化は仮説的であり、さらなる検証のために厳密な実験による分析が必要である。
【００４９】
レンチウイルスに媒介された新たな発現の研究を実施し、本研究では野生型の全長(GFP-FLPpara)を過剰発現させて、LBDが変異した3種の異なるPPARα(GFP-Y314D、GFP-Y464D及びGFP-Y314D/Y464D Ppara)組み替えタンパク質(図9D)をニューロンで発現させた後、3種の内因性リガンドとの結合分析を行なった。簡単に説明すると、部位特異的突然変異誘発をマウスPPARαで実施して、Y314及びY464残基を別々に又は一緒にアスパラギン酸(D)で置き換えた。その後で、マウスGFP-Ppara遺伝子(GFP-FLPpara)全体及び3種の異なる変異した遺伝子をpレンチ6/V5-TOPOレンチウイルスの発現ベクター中でクローニングして(図3D)、HEK293FT細胞でレンチウイルス粒子中にパッケージングし、全長及び変異したPPARαタンパク質をGFP-アフィニティーカラムで精製して、最終的にそれらの配座安定性を分析するために、熱シフトアッセイを実施した。全長(図3E、図9E)及び変異した(図3F、図9F)タンパク質の両方とも同様なパターンの熱シフトを同値の溶融温度(Tm)で示し、これはY314及びY464残基における変異は、PPARαの配座安定性を変化させなかったことを示唆している。その上、OCT、HEX及びHMBは、Y464D-PPARαでTmを変化させず、これはチロシン464のアスパラギン酸への変異はこれらのリガンドのPPARαのLBDへの結合に大きく影響したことを示している(図9G)。他の実験で、PPARA欠損海馬のニューロンに異なったレンチウイルスのPPARα構築物を形質導入して、形質導入の有効性は、全ての場合に基本的に同じであり(図14A)、PPARαのレベルは、異なった構築物を形質導入された細胞で同程度であった(図14B〜C)。形質導入の48時間後に、細胞を均質化して、GFP-アフィニティーカラムに通し、溶出させて、クロロホルム-メタノールで分画し、最終的にリガンドを検出するためにGC-MSによって分析した。興味深いことに、本発明者らは、PPARA欠損ニューロンのレンチ-GFP-FLPparaのアフィニティー精製された核抽出物はこれらのリガンドを含有したが(図3I、図9I)、レンチ-GFPを形質導入された場合はこれらのリガンドを含有しなかった(図3H、図9H)ことを観察した。興味深いことに、本発明者らは、レンチ-GFP-Y134D-Pparaを形質導入されたPPARA欠損ニューロンの核抽出物中に少量のOCT及びHEXの両方を検出したので、Y314の変異はPPARαリガンドへの結合親和性に部分的に影響することが見出された(図3J、図9J)。一方、本発明者らは、レンチ-GFP-Y464D-Ppara(図3K、図9K)及びレンチ-GFP-Y314D/Y464D-Ppara(図3L、図9L)を形質導入したPPARA欠損ニューロンの両方で、リガンド結合の重大な消失を観察したので、Y464の変異は、リガンドの結合親和性を完全にノックダウンした。これらの分析全体を通して、本発明者らは、2,4-ビス(α,α-ジメチルベンジル)フェノールを内部標準として使用した(補完的図5A〜F)。本発明者らは、異なるリガンドのピーク面積を内部標準の面積で標準化して、次にこれらのリガンドのPPARαの異なる構築物との結合親和性を、ピークの積分の統計によって定量化した(表1)。まとめると、詳細なGC-MS分析は、PPARα-LBDのY314及びY464残基の両方が内因性リガンドとのその相互作用にとって重要であることを明確に示した。
【００５０】
次に、PPARαの転写の活性を制御することにおけるこれらのリガンドの役割をモニターした。第1に、PPREに駆動されるルシフェラーゼ活性のアッセイを、異なる濃度のOCT(図4A、図10B)、HEX(図4B、図10A)、及びHMB(図4C、図10C)で処理された、培養された星状膠細胞で実施した。全ての3種のリガンドが、PPREルシフェラーゼ活性を用量依存的に増大させた(図10A〜C)。しかしながら、PPREルシフェラーゼ遺伝子が形質導入された星状膠細胞は、比較的高い濃度のHEX(図10D)、OCT(図10E)及びHMB(図10F)で有意なレベルの細胞傷害性を示し、これはより高い用量のリガンドによるPPREルシフェラーゼ活性の低下を理由づけた(図10A〜C)。TR-FRETアッセイと一致して、OCT及びHEXの両方ともHMBと比較してはるかに低い濃度でPPREルシフェラーゼ活性を増大させた(図10A〜C)。同様に、これらのリガンドも、PPARA欠損星状膠細胞にレンチ-FLPParaを形質導入してPPREルシフェラーゼ活性を誘発することができた(図4E、図10E)が、レンチ-ベクターではできなかった(図10D)。
【００５１】
これらのリガンドのPPARαに対する特異性をさらに確認するために、本発明者らは、PPARβKO(Pparbは存在しない)星状膠細胞でPPREルシフェラーゼのアッセイを実施した。これらの星状膠細胞は、PPARγ-アンタゴニストGW9662で事前に処理して、レポーターアッセイにおけるPPARγの関与を無効にした。GW9662によるPPREルシフェラーゼ活性におけるロシグリタゾンに媒介される増大の阻害(図16A)は、この阻害剤がPparb欠損星状膠細胞においてPPARγの機能を抑制することができることを示唆する。OCT(図16B)、HEX(図16C)及びHMB(図16D)は、Pparb欠損星状膠細胞でPPREルシフェラーゼ活性を顕著に増大させた。興味深いことに、GW9662は、Pparb欠損星状膠細胞におけるPPREルシフェラーゼ活性の、OCT-、HEX-及びHMBに媒介される増大を阻害できないままであり(図16B〜D)、これはPPARαに対するこれらのリガンドの特異性を示している。この発見をさらに確認するために、本発明者らは、最近記載された6ようにしてCREBプロモーターのChIP分析を実施して(図16E)、全ての3種のリガンドが、PPARα及びそのコアクティベーターPGC1αのCREBプロモーターへの動員を刺激したことを観察した(図16F〜H)。PPARα-LBDのY314及びY464残基は、海馬のリガンドとの相互作用に決定的に重要なので、本発明者らは、これらの残基も海馬のリガンドに媒介されるPPARαの活性化に関与するかどうかを調べた。予想されたように、HEX、OCT及びHMBは、PPARA欠損星状膠細胞でPPREに駆動されるルシフェラーゼ活性を誘発することができないままであった(図11G)。しかしながら、全ての3種のリガンドは、FL-Pparaを含有するレンチウイルス粒子を形質導入したPPARA欠損星状膠細胞におけるPPREレポーター活性を顕著に誘発した(図10H)。一方、本発明者らが本発明者らのGC-MS分析で全ての3種のリガンドの相互作用がY314DPPARαによって部分的に弱められたことを観察したように、PPARα-LBDにおけるY314Dの変異は、PPREルシフェラーゼ活性の部分的誘発を示した(図4G、図10I)。GC-MSの結果と一致して、全ての3種のリガンドは、Y464D-Ppara(図4H、図10J)又はY314D/Y464DPpara(図4I、図10K)ウイルスのいずれかを含有するレンチウイルスを感染させたPPARA欠損星状膠細胞におけるPPREルシフェラーゼ活性を刺激することができず、これは、Y464D変異はがその内因性の海馬のリガンドによるPPARα活性化をノックダウンするために十分であることを示唆している。PPARαの市販のリガンド(WY14643、フェノフィブラート及びクロフィブラート)も、PPARA欠損星状膠細胞で、PPREルシフェラーゼ活性を誘発することができなかった(図10L)。しかしながら、これらの市販のリガンドは、レンチ-FL-Pparaが形質導入されたPPARA欠損星状膠細胞ににおけるPPREルシフェラーゼ活性を顕著に誘発した(図10M)。一方、PPARA欠損星状膠細胞にレンチ-Y314D-Ppara(図4L、図10N)、レンチ-Y464D-Ppara(図4M、図10O)、及びレンチ-Y314D/Y464D-Ppara(図4N、図10P)が形質導入された場合には、PPARαの市販のリガンドは、ルシフェラーゼ活性を示さず、、これはPPARαのY314及びY464残基の両方が、市販のリガンドとの結合のために重要であることを示唆している。星状膠細胞と同様に、レンチ-Y464D-Ppara(図4R、図10T)又はレンチ-Y314D/Y464D-Ppara(図4S、図5U)のいずれかの形質導入が、OCT-、HEX-、及びHMBで処理されたPPARA欠損海馬のニューロンにおけるPPREルシフェラーゼ活性を完全に無効にしたが、レンチ-FL-Pparaも(図4P、図10Q〜R)レンチ-Y314D-Pparaも(図4Q、図10S)無効にしなかった。まとめると、これらの結果は、内因性の海馬のリガンドによるPPARαの結合及び活性化において、Y464残基に対して必須の役割を、及びY314残基に対して部分的役割を示唆する。
【００５２】
海馬のニューロンのシナプスの機能を調節することにおけるPPARαの内因性リガンドの役割
【００５３】
次に、本発明者らは、これらの海馬のリガンドが、海馬のニューロンのシナプスの機能を改善することができるかどうかを調べた。NR2A(図17E)及びGluR1(図17F)のイムノブロット(図17A)に続くデンシトメーターによる相対的分析(図17B〜D)及び免疫蛍光分析は、HEX、OCT及びHMBが、WTではNR2A、GluR1及びCREBを上方制御したが、PPARA欠損海馬のニューロンではしなかったことを明確に示し、これはこれらのリガンドがPPARαによってシナプスの分子の発現を増大させたことを示唆した。
【００５４】
樹状突起スパインは、中枢ニューロンの中でシナプスの伝達の重要なメディエーターであり、しばしばニューロンの可塑性の長期形態学的基質(morphological substrates)のための第一の候補となる12,13。それ故、培養された海馬のニューロンにおけるスパイン密度の増大に対するこれらのリガンドの効果を研究した。簡単に説明すると、マウスのPPARA欠損海馬のニューロンに、空のベクター、FL-Ppara、又はY464D-Pparaを含有するレンチウイルスを1週間形質導入し、続いてOCT、HEX、及びHMBを用いて4日間以上処理した。その後、ニューロンをファロイジンで標識してスパイン密度をモニターした。興味深いことに、PPARA欠損ニューロンへのレンチ-Y464D-Pparaの形質導入は、樹状突起スパインの密度を有意に低下させたが、レンチ-FL-Pparaは低下させなかった(図5A、図11A)。その上、OCT(図5B、図11B)、HEX(図5C、図11C)、及びHMB(図5D)及び合成アゴニストWY14643(図11D)による処理は、PPARA欠損ニューロンにレンチ-FL-Pparaが形質導入された場合にのみスパインの密度を刺激したが、レンチ-Y464D-Pparaの形質導入では刺激せず、これはPPARαのY464残基が、その内因性リガンドによる形態学的可塑性の誘発のために重要であることをさらに示唆した。この観察を、スパイン頭部の面積(図11F〜G)及びスパインの数(図11H)を、HEX、OCT、及びHMBで処理されたPPARA欠損ニューロンで測定することによりさらに検証した。HEX(図17G〜H)、OCT(図17I〜J)及びHMB(図17K〜L)は、FL-Ppara遺伝子を含有するレンチウイルス粒子が形質導入されたPPARA欠損海馬のニューロンにおいて、CREBの発現を刺激した。一方、HEX、OCT及びHMBは、レンチ-Y464D-Ppara及びレンチ-Y464D/Y314D-Pparaが形質導入されたPPARA欠損海馬のニューロンにおいて、CREBの発現を増大させることができないままであった(図17G〜L)。その上、Y314D変異は、レンチ-Y314D-Pparaが形質導入されたPPARA欠損ニューロンに、OCT、HEX、及びHMBに対する応答で、CREBの発現を部分的にのみ回復させた(図17G〜L)。
【００５５】
代謝型の受容体を通るカルシウムの変動は、シナプスの可塑性と関係があるとされており、最近本発明者らは、AMPA及びNMDAの両方が、Pparα欠損において、WTの海馬ニューロンよりもはるかに弱いカルシウム流入及びより小さい振幅の変動を惹起することを示した6。それと矛楯なく、本発明者らは、HEX、OCT及びHMBが、ニューロンにレンチ-FL-PPARAが形質導入されたPPARA欠損海馬において、AMPA-及びNMDAに媒介されるカルシウム流入が刺激したことを観察した(図11I〜P)。しかしながら、HEX、OCT及びHMBは、レンチ-Y464D-Ppara又はレンチ-Y314D/Y464D-Pparaのいずれかが形質導入されたPPARA欠損海馬のニューロンにおいて、AMPA-(図5E〜H、図11I〜L)及びNMDA-(図5I〜L、図11M〜P)に媒介されるカルシウム流入を増大させることができないままであった。一方、AMPA-又はNMDAで処理されたPPARA欠損海馬のニューロンで、レンチ-Y314D-Pparaは、HEX-、OCT-及びHMBに惹起されたカルシウム流入を、部分的に回復させることができただけであった(図6J及びM)。これらの結果は、NMDA及びAMPA感受性の受容体を通るOCT-、HEX-、及びHMBで刺激されたカルシウム流入におけるPPARαのY464残基の中心的な役割及びY314残基の限定された役割を示唆する。
【００５６】
考察
【００５７】
PPARαは、脳の異なる部分に局在化されており32、異なる脳機能を制御することにおいて重要な役割を果たすかもしれないと報告されているので6,14、この組織におけるPPAR-αに対する内因性のアゴニストを同定することにおける関心が大きくなっている。種々の研究で、アナンダミド又は9-オレイルエタノールアミドがPPARαの中心的リガンドとして役割を果たし得ると推測されているが15、9-オレイルエタノールアミドとPPARαの間の分子の相互作用を示す実験的証拠はなく、しかしながら9-オレイルエタノールアミドは、PPARα-に独立の効果を発揮することが示された16。その上、潜在的なPPARαの内因性リガンドとして評価されたことがない、CNSにおいて利用可能な多くの構造的に同様な脂肪族アシルアミドが存在する。海馬からのPPARαの3種の新規リガンドの単離及び特徴づけが詳述された(オクタデセンアミド(OCT)、ヘキサデカンアミド(HEX)、及び3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルブチレート(HMB))。第1に、海馬の核抽出物のPPARα-LBDのプルダウンされた分画のGC-MS分析は、これらの化合物の存在を明らかにした。興味深いことに、これらの3種の化合物は、PPARαLBDからプルダウンされた分画でのみ検出されたが、海馬の核抽出物のPPARβLBDからプルダウンされた分画では検出されず、これはこれらのリガンドがPPARαに対して特異的であることを示唆している。これらの3種の主要なリガンドに加えて、本発明者らは、GC-MS分析を実施する間に、チアゾール類(mw220〜240)、チオセミカルバゾン類(mw190〜200)、及びチアゾリジンエステル類(mw250〜270)を含む幾つかのチオン化された化合物も検出した。第2に、PPARA欠損海馬のニューロンにおけるPpara遺伝子のレンチウイルスの形質導入による、PPARαの新たな確立に続く、同様なGC-MS分析もこれらの3種のリガンドの検出をもたらした。第3に、TR-FRET及び熱シフトのアッセイによるこれらの分子のさらなる特徴づけにより、HEX、OCT及びHMBは、PPARαのLBDと強く相互作用することが明らかになった。高処理能力の研究は、本発明者らがFRET及び熱シフトのアッセイの両方から誘導された曲線の、X軸の正の方向に沿って偏移した勾配を観察した通り、3種全てのリガンドが、PPARαの完全リガンドとして役立つことを示した。それらの親和性を測定すると、これらのリガンドのEC50値(EC50OCT=4.31μM;EC50HEX=4.36μM;EC50HMB=31.6μM)は、GW7647(EC50=6.62nM)、PPARαの薬理学的アゴニストに対するEC50値より高いことが観察された(図18)。これらの結果は、これらの新しく発見された海馬のリガンドは、市販のリガンドと比較してより低い親和性を有することを示唆する。
【００５８】
in silico分析、PPARαのY314及びY464残基の部位特異的変異に続くPPARA欠損海馬のニューロン中におけるこれらの遺伝子のレンチウイルス操作により、GC-MS分析で証明されるように、PPARαとこれらのリガンドとの最小の結合が明らかになった。この結果によって、PPARαのY314及びY464残基の両方がこれらのリガンドとの相互作用に関与しており、PPARαのY464残基が内因性リガンドとのその相互作用の関係で、Y314残基よりも重要であることも見出された。この観察は、PPREルシフェラーゼアッセイによるPPARαの転写の活性の分析によりさらに検証され、ここでPPARαのY464Dにおける変異は、OCT-、HEX-、及びHMBで処理されたPPARA欠損海馬のニューロンで、PPREルシフェラーゼ活性を回復させなかった。チロシンのアスパラギン酸への変異は、PPARαタンパク質に配座不安定性を生じさせ得る。しかしながら、FL-PPARα及び変異したPPARαの熱溶融曲線は、タンパク質の溶融温度に関して大きな相違は示さず、これはこの変異がPPARαの配座安定性に影響しないことを示唆した。以前の研究で、9-オレイルエタノールアミンが、脳中のPPARαに対するリガンドとして役立ち得ると報告された。しかしながら、本発明者らは、海馬の抽出物を組み替えPPARαLBDでプルダウンされた後のGC-MSによっては、海馬中の9-オレイルエタノールアミン検出することができなかった。1つの可能性は、PPARαLBDが核抽出物からのみプルダウンされたこと及び9-オレイルエタノールアミンが核に存在しなかったことである。PPARαは、海馬のニューロンの核中に構成的に存在するので、PPARαの核分画が、そのリガンド検出のための目標にされた。
【００５９】
最近、PPARαは、CREBの転写を調節して、CREBに関連するシナプスの遺伝子の発現を制御することが示された6。他の研究で、本発明者らは、PPARαのスタチンに媒介される核の活性化も、異なった脳細胞中におけるニューロトロフィンの発現を調節するために重要であることを示した31。本発明者らの詳細な分子の相互作用の分析により、スタチンは、PPARαLBDのL331及びY334残基とPGC1αの存在下で相互作用して、CREBの転写を制御することが明らかになった。しかしながら、市販のリガンド及びこの研究に記載された内因性リガンドは、PPARαのこれら2種の残基と相互作用しない。その代わりに、これらの分子は、PPARαLBDのY314及びY464残基と相互作用する。本発明者らの部位特異的突然変異誘発の研究に続くGC-MS分析により、PPARαのこれらの残基が、内因性リガンドとのその関連を制御することが確認されたが、しかしながらPPARαのY464残基は、Y314よりも重要であるように思われる。その上、PPREに駆動されるレポーターのアッセイは、PPARαのY464の変異は、PPARαの活性化を完全に消失させるが、それに対してY314の変異は、PPARαの転写の有効度を部分的に弱めるだけであることを示し、これはPPARα-LBD中のY464の重要性は、内因性リガンドとのその相互作用のために最も重要なアミノ酸残基であることを示唆した。
【００６０】
シナプスの可塑性を改善するための薬剤を特徴づけることは、研究の重要な領域である。興味深いことに、これらの海馬のリガンドは、海馬のニューロンのシナプスの性質を向上させた。しかしながら、これらの化合物は、WTで異なるシナプスの分子の発現を刺激したが、PPARA欠損ニューロンでは刺激しなかった。Y464DPparaではなく、FLPparaの確立時のPPARA欠損海馬のニューロンにおける海馬のリガンドによる、樹状突起スパイン形成の刺激及びNMDA-及びAMPAに駆動されるカルシウム流入の増大は、海馬のリガンドのシナプスの性質におけるPPARαのY464残基の重要性を示す。PPARαのY464残基は、これらのリガンドが機能することに完全に責任があるが、それに対してY314残基もこのプロセスに部分的に関与した。初期の研究では、OCTが睡眠遮断の間に脳脊髄液中に見出されたので、それが睡眠を制御することに役立ち得ることを示唆された34。OCT及び2種の他の化合物HEX及びHMBは、海馬中にPPARαリガンドとして構成的に存在するので、これらの化合物がPPARαを通じて睡眠を増進するかどうかを観察することは興味深いことであろう。
【００６１】
材料及び方法:
【００６２】
動物:動物の維持及び実験は、National Institute of Healthの指針に従い、the Institutional Animal Care and Use committee of the Rush University of Medical Center(イリノイ州、Chicago)により承認された。PPARA欠損マウス及びそれらの野生型(WT)対照は、Jackson Laboratoryから購入した。マウスを、環境が制御された動物施設(7:00A.M./7:00P.M.の点灯サイクル;温度は21〜23℃に維持;湿度35〜55%)中の換気のあるマイクロアイソレーターケージに収容した。動物は標準的なマウスの食物及び水を随意に提供されて健康及び全体的福祉について毎日獣医スタッフ及び調査員により密接にモニターされた。
【００６３】
試薬:ウサギポリクローナル抗PPARα抗体(Abcam;カタログ番号ab189159;WB及びIHC)、マウス抗NeuN抗体(ミリポア;カタログ番号MAB377)、ウサギポリクローナル抗PPARβ抗体(Abcam;カタログ番号ab8937;WB及びIHC)、抗PPARγ抗体(Abcam;カタログ番号ab66343;WB及びIHC)、抗NMDAR2A抗体(WBのため1:1000の希釈、Cell signaning、カタログ番号4205;IHCのためには、Abcam、カタログ番号ab169873)、抗GluR1抗体(WBのため1:1000の希釈、Cell signaning、カタログ番号13185;IHCのためには、Abcam、カタログ番号ab131507)、抗CREB抗体(WBのため1:1000の希釈、Cell signaning、及びICのために1:200の希釈、カタログ番号9104)、及び抗Arc抗体(WBのために1:1000の希釈、Abcam、カタログ番号ab118929)をこの研究で使用した。9-オクタデセンアミド(カタログ番号O2136)、ヘキサデカンアミド(カタログ番号S350435)、2,4-ビス(α,α-ジメチルベンジル)フェノール(カタログ番号372129)、ゲムフィブロジル(カタログ番号G9518)、クロフィブラート(カタログ番号C6643)、フェノフィブラート(カタログ番号F6020)、GW9662(カタログ番号M6191)、WY-14643(カタログ番号C7081)、及びMTTに基づく毒性アッセイキット(Stock No.TOX-1)を含む種々の薬理学的化合物をSigma-Aldrichから購入した。GST-PPARα-LBD及びGST-PPARβ-LBDは、Protein Oneから購入した。一方、3-ヒドロキシ2,2-ジメチル酪酸エチルエステル(カタログ番号sc-216452)は、Santa Cruzから購入した。
【００６４】
マウス海馬のニューロンの単離:海馬のニューロンを、妊娠している雌のPPARA欠損及び系統の合致したWT同腹子マウスの胎児(E18)を、少し改変して本発明者らにより記載されたように6, 13, 35〜36単離した。簡単に説明すると、解離及び単離手順は、氷冷スクロース緩衝溶液(スクロース0.32M、トリス0.025M;pH7.4)中で実施した37。皮膚及び頭蓋を注意深く脳から鋏により除去し、続いて一対の細いピンセットにより髄膜を剥離した。次に、ウィリス環の周りの中心線を小さく切りこみ、内側側頭葉を切開した。海馬を内側側頭葉の皮質縁近くに位置する組織の薄片として単離した。全ての胎児から単離された海馬の組織(n>10)を一緒に合わせて、1mlのトリプシンで5分間37℃で均質化し、続いてトリプシンで中和した。海馬の組織の単一の細胞懸濁液をポリ-D-リシンで予めコーティングされた75mmのフラスコ中に固定した。固定の5分後に、上清を注意深く除去して完全ニューロベーサル(Neurobasal)培地で置き換えた。翌日、10μMのAraCを加えてニューロン培養中のグリアの汚染を除去した。純粋培養の海馬のニューロンを、治療前に9〜10日間完全に分化させた35, 36, 38。
【００６５】
マウス星状膠細胞の単離:星状膠細胞を、7日齢のマウスの子の混合されたグリア培養物から、以前記載されたGuilian及びBakerの手順39に従って単離した17, 31, 40。
【００６６】
FLPpara及び変異したPpara(ΔsbdPpara)のレンチウイルスクローニング
【００６７】
部位特異的変異:pCMV6-AC-GFPベクター(カタログ番号MG227641)にクローニングされたマウスPPARαORFを、Origeneから購入した。MG227641を、Tyr314をアスパラギン酸で(Y314D)、及びTyr464をアスパラギン酸で(Y464D)、部位特異的変異キット(Stratagene)により変異させた6。反対配向の2種のプライマーを使用して、変異したプラスミドを単一のPCR反応で増幅した。PCR生成物をエタノールで沈殿させて、次にT4キナーゼによりリン酸化した。リン酸化されたフラグメントをT4DNAリガーゼにより自己連結させて、制限酵素DpnIで消化して変異していないテンプレートを排除した。変異したプラスミドをクローニングして大腸菌(DH5-a株)のコンピテント細胞で増幅させた。
【００６８】
FLPpara及びΔsbdPparaのpレンチ6.3/V5-TOPO(登録商標)構築物の作製
【００６９】
簡単に説明すると、各構築物をPCRにより、プライマーの対(配列)を使用して増幅させたところ、生成物は全て3'末端に単一のアデノシン(A)を有した。次にTOPOクローニング反応を、pレンチ6.3/V5-TOPOベクターでInvitrogenのキット(K5315-20)を使用して実施した。形質転換のためにOne-Shot Stbl3コンピテント細胞を使用した。クローンの配列決定はACGT Incで実施された。
【００７０】
293FT細胞におけるレンチウイルスの産生
【００７１】
293FT細胞を、95%コンフルエンスで抗生物質を含まないOpti-MEM培地中で培養した。翌日、ViraPower(商標)Packaging Mix(9μg/反応)及びFLPpara又はΔsbdPpara(3μg/反応)のいずれかを含有する(12μg合計)pレンチ発現プラスミドDNAを1.5mLの無血清Opti-MEM(登録商標)I培地中で混合した。他のチューブに、36μLのLipofectamine(登録商標)2000を、1.5mLの無血清Opti-MEM(登録商標)I培地中で穏やかに混合しながら加えた。室温で5分のインキュベーション後、両方の反応液を合わせて20分間インキュベートした。その後で、該混合物をHEK-293FT細胞に適用して加湿された5%CO2インキュベーター中で終夜37℃でインキュベートした。翌日、培地を、無血清Opti-MEM培地で置き換えて、加湿された5%CO2インキュベーター中で48〜72時間37℃でさらにインキュベートして、次にウイルスの粒子を含有する上清を集めた。ウイルスの粒子を、レンチ-濃縮溶液で濃縮してMOIを計算した。
【００７２】
核抽出物の単離及びPPARα-リガンドの相互作用のガスクロマトグラフィー質量スペクトル(GC-MS)による分析
【００７３】
試料調製
E18の培養されたマウス海馬のニューロン又は6〜8週齢の雄C57/BL6マウスの海馬の組織のいずれかを、氷冷した界面活性剤を含まない低張緩衝液[10mM HEPES(pH7.9)、1.5mM MgCl2、10mM KCl、100mM DTT、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル]中で均質化した。低張緩衝液中で10分追加のインキュベーションの後、ホモジネートを8,000g、4℃で10分間遠心分離した。次に、ペレットを氷冷抽出緩衝液[10mM HEPES(pH7.9)、1.5mM MgCl2、0.21M NaCl、0.2mM EDTA、25%(v/v)グリセロール、100mM DTT、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル]中で均質化して、回転振盪機上に4℃で1時間置いて、次に18,000gで10分間遠心分離した。上清(核分画)を、1.5μgのGST PPARαLBD(Protein One)と4℃で6時間、回転振盪機でインキュベートした。反応混合物をグルタチオンカラム(Pierce(登録商標)GST Spin Purificationキット)に通して、4回洗浄して[50mMトリスHCl(pH7.4)、100mM NaCl、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル]で、次に遊離グルタチオンで溶出させた。溶出物をメタノール:クロロホルム:水(4:3:1)混合物に移して、次に14,000rpmで90秒間遠心分離した。有機相を集めて、SpeedVacで蒸発させて、30μLのクロロホルム又はアセトニトリルで再構成して、次にGC-MSによって分析した。他の場合に、E18の培養された海馬のニューロンに、PPARα-LBD又は異なるGFPタグ付きの変異した構築物と複合体化したレンチウイルスの粒子を形質導入し、続いて抗PPARα抗体でプルダウンするか又は抽出物をVector Fusion-Aid GFP KitのGFP-カラム(カタログ番号MB-0732)を通した。その後、溶出物をカラムから5M NaCl溶液を用いて回収して、PD-10脱塩カラムで濃縮して及びGC-MSで分析した。
【００７４】
GC-MS分析
【００７５】
JEOL GCMate II(JEOL USA、マサチューセッツ州、Peabody)質量分析計をこれらの実験で使用した。ガスクロマトグラフは、G1512Aコントローラーに接続された100バイアル試料トレー付きのG1513A自動注入器を備えたAgilent 6890Plus(デラウェア州、Wilmington)であった。ガスクロマトグラフィーのカラムは、非極性の5%フェニル95%ジメチルポリシロキサン相(Agilent HP-5ms)、長さ30メートル、内径0.25mm、フィルム厚さ0.25μmの溶融シリカキャピラリーカラムであった。担体ガスは、STGの三重フィルター(Restek Corp.)を通して一定の流速1.1mL/分で流れるヘリウム(99.9995%研究規格)であった。注入器は275℃に保たれてAgilentの不活化されたガラスウールを含有する4mm IDの単一テーパースプリットライナーで適合されている。1μLの溶液を20:1のスプリット比で注入した。初期オーブン温度を40℃に2分保ち、1分当たり10℃(図2A〜E)又は20℃(図2K及び2L)の速度で300℃に上昇させ、次に17分間(図2A〜E)又は30分間(図2K及び2L)保った。これは、同定された化合物の可変の保持時間を説明する。合計運転時間は45分であった。
【００７６】
質量分析計は、2500ボルトの加速電圧を使用して公称分解能500で作動する卓上型磁性セクターであった。該分析計を全走査EI様式(+Ve)で作動させ、フィラメントは70eVで作動させ、リニア磁石走査を使用して、m/z 10からm/z 850まで走査した。走査速度は1走査当たり0.3秒であった。溶媒の遅れは4.0分であった。データ分析は、該分析計に備えられたTSS Proソフトウェア(Shrader analytical & Consulting Laboratories, Inc.、ミシガン州、Detroit)を使用して実施した。各化合物に遍在するイオンを使用して再構成されたイオン電流(RIC)クロマトグラフィーのピークを、定量のために使用した。質量較正は、ペルフルオロケロシン(PFK)を使用して実施した。
【００７７】
OCT、HEX及びHMBと複合体化させたPPARαのIn Silico構造分析
【００７８】
リガンド調製
【００７９】
リガンド(OCT、HEX及びHMB)を、Tripos softwareX1を実装したLigPrepモジュールにかけて、2D構造を3D構造に変換した。次にイオン化エンジンを使用して、リガンドをpH7.0±1で調製した。適当な立体異性体を低エネルギー配座に加えて作製した。
【００８０】
タンパク質の調製
【００８１】
PPARα(3VI8.pdb)、β(3GWX.pdb)、及びγ(3U9Q.pdb)の結晶構造を、pdbデータバンクから取り入れた。Triposのタンパク質調製モジュールを利用して、水素結合の配向、結合次数、電荷、消失した側鎖原子、消失したループ、生理学的pHにおけるプロトン化、及び側鎖の衝突を定めた。最終的に、計画された最小化を全ての3種のタンパク質構造について実施した。
【００８２】
リガンドの連結
【００８３】
Triposに実装されたSurflexの連結モジュール41を使用して、PPARα、β及びγの結晶構造におけるOCT、HEX及びHMBの連結を実施した。連結の後、3種の主要なスコアづけ機能、例えば、合計スコア(-LogKdの関数)、クラッシュスコア(リガンドの活性部位ポケット中への不適切な浸透を反映する減点スコア)及び極性スコア(全ての有利な極性相互作用を表す)が得られる。
【００８４】
本発明者らは、分子力学一般化ボルン表面面積手法42を使用して、PPARαにおけるOCT、HEX及びHMBの結合自由エネルギーも計算した。結合による構造の変形を説明するために、本発明者らは、分子内エネルギー収支における変化(ΔG0int)を説明する適応損失を含めた。リガンドの歪みエネルギーとして、本発明者らは、リガンドの質量中心から受容体の5オングストローム領域までが可撓性であると特定し、その結果、タンパク質の構造がリガンドの結合エネルギーの計算で緩和された。
【００８５】
リガンドの非極性部分についてのポテンシャルを下げるために、原子のファンデルワールス半径を標準の連結実験における0.8に調整した。これにより、リガンド原子とタンパク質原子との間の距離が互いから1オングストローム未満であったとしても、連結姿勢が成功した姿勢を示すことが可能となる。本発明者らは、妥当でない姿勢を排除するために、スケーリング因子を1.2に増大させた。
【００８６】
TR-FRET分析
【００８７】
Lanthascreen TR-FRET PPAR-αコアクティベーターアッセイキット(カタログ番号PV4684)を使用して、TR-FRETアッセイを実施した。このアッセイでは、異なる用量のスタチン薬を、GSTタグ付き組み替えPPARαLBDタンパク質、テルビウム(Tb)タグ付き抗GST抗体及びフルオレセイン(FL)タグ付きPGC1αと、メーカーのプロトコルで指示されているようにインキュベートした。全反応物質を、自動化されたロボット注入器によりコーニングの384ウェルプレートに準備した。各プレートを遠心分離して、暗所で30分間インキュベートして、次に二色性のミラーを備えた「分子デバイスアナリスト」機械で分析した。励起波長及び放出波長は、それぞれ340nm及び540nmの波長に設定した。
【００８８】
熱シフトのアッセイ
【００８９】
熱シフトのアッセイは、Applied Biosystems7500標準的リアルタイムの熱的サイクラー機で市販の熱シフト染料キット(Life technologies;カタログ番号4461146)を用いて実施した。各反応のために、精製されたタンパク質(0.5μgから1μg)を、キットで提供される熱シフト緩衝液の18μL及び1〜2μLの染料に加えた。反応物質を暗所で96ウェルのPCRプレートに整えて、次に以下の2段階のプログラム[(25℃、2分間)の1サイクル、(27℃で15秒間、26℃で1分間)の70サイクル;両方の段階で自動的に1℃ずつ上昇]を使用する熱的サイクラー機に配置した。フィルターを、消光フィルターなし及び受動フィルターなしでROXにセットした。
【００９０】
マイクロアレイ分析
【００９１】
RNA試料を、WT及びPPARA欠損(αKO)マウスの海馬組織からQiagen RNeasyキット(カタログ番号74104)を使用して集めた。RNAの量及び純度を、NanoDrop LTE(Nanodrop Technologies、米国デラウェア州、Wilmington)を使用して決定した。各試料のmRNAを、SuperScript IIIFirst-Strand合成キット(Thermofisher;カタログ番号18080-051)を使用してcDNAに変換した。次に、各cDNA試料を1:2比で希釈して、SYBR Green qPCR Master Mix(Applied Biosystems、Thermofisher;カタログ番号4309155)と混合し、次に96ウェルのマウス適応性qPCR-アレイ(SA Biosciences;カタログ番号PAMM-126Z)に等分した。次に96ウェルプレートをABI Prism 7500標準qPCRシステムに置いて段階2、ステップ2(1:00分で60.0℃)「データ収集」モジュールで実行した。PCRを行ったら、Ct値をPCRコンソールから取り込んで、さらに分析するためにSABiosciencesのウェブサイトにアップロードした。推奨されるように、本発明者らは、オンラインソフトウェアモジュールを使用して、さらに計算を進めた。データの標準化は、アレイに存在する12種の定常的に発現されるハウスキーピング遺伝子(HKG)の平均Ct値で、全てのCt値を補正することにより実施した。PCR-アレイの結果は、緑色(低発現)から黒色を経て赤色(高発現)で3色で提示してクラスターグラム分析により示した。
【００９２】
RT-PCR分析
【００９３】
全RNAをDNアーゼで消化して、前に記載したようにr17, 18ClontechからのRT-PCRキットを使用してRT-PCRを実施した。GAPDH(グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ)を使用して、等量のcDNAが異なる試料から合成されたことを確かめた。
【００９４】
リアルタイムPCR分析
【００９５】
リアルタイムPCRは、ABI-Prism7700配列検出システム(Applied Biosystems、カリフォルニア州、Foster City)で、前に記載したように17, 18、TaqMan ユニバーサルマスターミックス及びFAMで標識されたプローブ及びプライマー(Applied Biosystems)を使用して実施した。データは、ABI Sequence Detection System 1.6ソフトウェアで処理して分散分析により分析した。
【００９６】
イムノブロット分析
【００９７】
細胞全体及び組織の溶解物を得るために、試料を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤(Sigma)を含有するRIPA緩衝液中で均質化して、26-ゲージの注射針に10回通して、4℃で30分間転倒回転させ、10分間18,000×gで遠心分離した。上清を等分して、使用するまで-80℃で貯蔵した。タンパク質濃度は、NanoDrop 2000(Thermo Fisher)を使用して決定して、15〜30μgの試料を熱変成させて、10%又は12%ポリアクリルアミド-SDSゲルで分析して、0.45μmニトロセルロース膜に半乾燥条件下で移動させた(15V12分間)。膜をブロッキング緩衝液(Li-Cor)で1時間かけてブロッキングして、一次抗体を終夜4℃で振盪条件下でインキュベートして洗浄し、IR染料で標識された二次抗体(1:17,000;Li-Cor)と45分間室温でインキュベートし、洗浄し、Odyssey Infrared Imaging System(Li-Cor)で可視化した。ブロットをグレースケール及び次に2元に変換して、Fijiを使用して分析し、適当なローディングコントロールに対して標準化した。
【００９８】
免疫組織化学分析
【００９９】
海馬領域を、他の箇所で記載したように(PMID:25007337)、18日齢の胚胎児から切り取って合わせて、ポリ-D-リシンでコーティングされたプレートでさらに2〜3週間分枝させるために培養した。その後、これらのニューロンに、GFPを含有するレンチウイルス粒子を2日間で形質導入した。ニューロンをDylight-554と複合したファロイジン(カタログ番号21834;Thermofisher)で製造業者のプロトコルにより染色して、蛍光顕微鏡で可視化した。組織染色のために、10μmのパラフィンに包埋したマウス脳海馬の切片を8から10週齢の雄WT及びPPARA欠損マウスから作製して、抗PPARα及び抗NeuN抗体で免疫染色した。
【０１００】
統計分析
【０１０１】
全ての値は、平均±SDで表した。平均間の差を、独立の要因としてリガンド又は遺伝子型の用量を用いて一元又は二元分散分析で分析した。挙動測定における差は、SPSSを使用する独立の一元又は反復測定分散分析により調べた。試験群間の変動の均質性は、Leveneの検定を使用して調べた。対象間の効果の事後の分析は、シェフェ、テューキー又はゲイムス-ハウエルの検定を、必要に応じて使用して実施した。p<0.05を統計的に有意とみなした。
【０１０２】
以下の実験が、神経変性性障害、リソソームの貯蔵障害及び体重制御の治療のためのHMB、HEX及びOCTの効力を試験するために実施されるであろう。下で説明する例は、HMBの使用を例証する実験を例示する。同様な実験がHEX及びOCTについても実施されるであろう。
【０１０３】
養子移入された実験アレルギー性脳脊髄炎(EAE)。MSモデル。雌SJL/Jマウス(4〜5週齢)を使用する。供与体マウスを、不完全フロイントアジュバント(IFA)中の400μgのウシミエリン塩基性タンパク質(MBP)及び60μgの結核菌(M. tuberculosis)で皮下に免疫する。動物を免疫後10〜12日で屠殺して、排膿するリンパ節を回収して、単一の細胞懸濁液を、10%ウシ胎児血清(FBS)、50μg/mL MBP、50μM 2-ME、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI1640中で培養する。4日めに、細胞を回収してHankバランス塩溶液(HBSS)に再懸濁する。200μLの体積中の合計2×107の生存可能な細胞を未処理マウスの尾部静脈中に注射する。百日咳毒素(150ng/マウス;Sigma-Aldrich)を、細胞の移入日後(dpt)0日目にi.p.経路を通して1回注射する。マウスをOCT(2及び5mg/kg体重/日)、HEX(2及び5mg/kg体重/日)及びHMB(10及び20mg/kg体重/日)で経管栄養により処置する。処置中に、これらの薬剤を0.5%メチルセルロースと混合する。それ故、対照動物は、0.5%メチルセルロースだけをビヒクルとして受けることになる。6匹のマウスを各群で使用する。雌マウス(4〜5週齢)を無作為に任意の群のために選択する。実験動物は、30日間毎日マスクをつけた調査員により以下のようにスコアづけされる:0、臨床的疾患なし;0.5、立毛;1、尾衰弱;1.5、尾麻痺;2、後肢衰弱;3、後肢麻痺;3.5、前肢衰弱;4、前肢麻痺;5、瀕死又は死。
【０１０４】
5B6PLP-TCR TgマウスにおけるEAEの再発。PLP139〜151-特異的5B6TCR Tgマウス(Vijay Kuchroo教授、Harvard Medical School、マサチューセッツ州、Bostonにより提供される)を使用する。雌Tgマウス(4〜5週齢)を上記のIFA中の結核菌中の10μgのPLP139-151で免疫する。マウスをOCT(2及び5mg/kg体重/日)、HEX(2及び5mg/kg体重/日)及びHMB(10及び20mg/kg体重/日)で経管栄養により処置する。処置中、これらの薬剤は0.5%メチルセルロース中で混合される。それ故、対照動物は、0.5%メチルセルロースをビヒクルとして受けるだけである。各群で6匹のマウスを使用する。雌マウス(4〜5週齢)は任意の群から無作為に選択する。実験動物は30日間毎日マスクをつけた調査員によってスコアづけされる。
【０１０５】
慢性EAE。C57BL/6マウスを、上記のように100μgのMOG35-55で免疫する。マウスは、やはり0及び2dpiで2用量の百日咳毒素(150ng/マウス)を受ける。マウスをOCT(2及び5mg/kg体重/日)、HEX(2及び5mg/kg体重/日)及びHMB(10及び20mg/kg体重/日)で経管栄養により処置する。処置中、これらの薬剤は0.5%メチルセルロース中で混合される。それ故、対照動物は、0.5%メチルセルロースをビヒクルとして受けるだけである。各群で6匹のマウスを使用する。雌マウス(4〜5週齢)は任意の群から無作為に選択する。実験動物は30日間毎日マスクをつけた調査員によってスコアづけされる。
【０１０６】
組織学的顕微鏡検査。14dpiに(最初の慢性期)、以下の群(対照、EAE、EAE+HMB、及びEAE+ビヒクル)の各々からの5匹のマウスを麻酔する。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.4)で、次にPBS中の4%(w/v)パラホルムアルデヒド溶液で灌流した後、小脳及び脊髄全体を、各マウスから切り出す。組織をさらに固定して、次に半々に分割する。半分を組織染色のために使用し、他の半分をミエリン染色のために使用する。組織学的分析のために、日常的な組織学的検査を実施してEAEマウスの血管周囲細胞浸潤（perivascular cuffing）及びCNS組織の形態学的詳細を得る。パラホルムアルデヒドで固定された組織をパラフィンに包埋して、一続きの切片(4μm)を切る。切片は、従来のH&E染色法で染色する。明視野の設定の下で×40対物レンズを使用してデジタル像を集める。スライドは、3名の検査員により盲検様式で、異なる解剖学的区画(脳膜及び実質)における炎症について評価される。炎症は、以下で述べる尺度を使用してスコアづけされる:脳膜及び実質について:0、浸潤細胞なし;1、わずかな浸潤細胞;2、多数の浸潤細胞あり;及び3、広がった浸潤あり。血管について:0、カフ付き血管なし;1、1切片当たり1又は2個のカフ付き血管;2、1切片当たり3から5個のカフ付き血管;及び3、1切片当たり5個を超えるカフ付き血管。1群当たり5匹のマウスの各々からの各脊髄の少なくとも6個の一続きの切片をスコアづけして、分散分析により統計的に分析する。
【０１０７】
ミエリンの染色。切片をルクソールファストブルーでミエリンを染色する。スライドは、盲検様式で脱ミエリン形成について、3名の検査員により以下の尺度を使用して評価される:0、正常な白色物質;1、稀な病巣;2、少しの脱ミエリン形成の区域;及び3、脱ミエリン形成の大きい区域。1群当たり5匹のマウスの各々からの各脊髄の少なくとも6枚の一続きの切片をスコアづけして、分散分析により統計的に分析する。
【０１０８】
半定量的RT-PCR分析。全RNAを、脾臓のT細胞及び脊髄からRNeasyミニキット(Qiagen、カリフォルニア州、Valencia)を使用することにより、及び脾臓及び小脳からUltraspec-II RNA試薬(Biotecx laboratories, Inc、テキサス州、Houston)を製造業者のプロトコルに従って使用することにより単離する。全ての夾雑ゲノムDNAを除去するために、全RNAをDNアーゼで消化する。半定量的RT-PCRは、Clonetech(カリフォルニア州、Mountain View)からのRT-PCRキットを使用して実施する。簡単に説明すると、1μgの全RNAを、オリゴ(dT)をプライマーとして及びMMLV逆転写酵素(Clontech)を使用して、20μLの反応混合物中で逆転写する。生じるcDNAを適当に希釈して、希釈されたcDNAを、Titanium Taq DNAポリメラーゼ及び以下のプライマーを使用して増幅する。増幅された生成物を1.8%アガロースゲル上で電気泳動して、臭化エチジウム染色により可視化する。
【０１０９】
(配列番号1)iNOS:センス:5'-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3'
【０１１０】
(配列番号2)アンチセンス:5'-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3'
【０１１１】
(配列番号3)IL-1β:センス:5'-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3'
【０１１２】
(配列番号4)アンチセンス:5'-TGCTGATGTACCAGTTGGGG-3'
【０１１３】
(配列番号5)MBP:センス:5'-TGGAGAGATTCACCGAGGAGA-3'
【０１１４】
(配列番号6)アンチセンス:5'-TGAAGCTCGTCGGACTCTGAG-3'
【０１１５】
(配列番号7)GAPDH:センス:5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'
【０１１６】
(配列番号8)アンチセンス:5'-TTGGCTCCACCCTTCAAGTG-3'
【０１１７】
GAPDHに対する各遺伝子の相対的発現を、Fluor Chem 8800イメージングシステム(Alpha Innotech、カリフォルニア州、San Leandro)を用いてバンドをスキャンした後、測定する。
【０１１８】
リアルタイムPCR分析を、ABI-Prism 7700配列検出システム(Applied Biosystems、カリフォルニア州、Foster City)を使用して実施する。簡単に説明すると、反応は、96ウェル光学的反応プレートで、DNアーゼで消化されたRNAの50ngに等価のcDNAに対して、12.5μLのTaqManユニバーサルマスターミックス及び最適化された濃度のFAMで標識されたプローブ、フォワード及びリバースプライマーを含有する25μLの体積中で、製造業者のプロトコルに従って実施する。マウス遺伝子及びGAPDHのための全てのプライマー及びFAMで標識されたプローブは、Applied Biosystemsから得られる。それぞれの遺伝子のmRNAの発現は、GAPDHのmRNAのレベルに対して標準化される。データは、ABI配列検出システム1.6ソフトウェアにより処理されて、分散分析により分析される。
【０１１９】
フローサイトメトリー。2色フローサイトメトリーを実施する。簡単に説明すると、流れる染色緩衝液に懸濁された1×106のリンパ節細胞(LNC)又は脾臓細胞を、CD4に対する適切に希釈されたFITCで標識されたAbと、4℃で30分間インキュベートし、洗浄し、固定及び透過処理溶液に再懸濁する。暗所で30分間インキュベーションの後、細胞を洗浄して、細胞の透過処理緩衝液中の試験Fcブロック(抗マウスCD16/32)でブロッキングして、その後、適切に希釈されたPEで標識されたFoxp3に対するAbと4℃の暗所でインキュベートする。インキュベーションの後、細胞懸濁液を遠心分離して、3回洗浄し、流れる染色緩衝液に再懸濁する。次に細胞を、FACS(BD Biosciences、カリフォルニア州、San Jose)によって分析する。細胞を、形態学的特性に基づいてゲートにかける。アポトーシス及び壊死細胞は、FACS分析のために受け入れない。
【０１２０】
OCT、HEX及びHMBを、EAEの脊髄における単核細胞の浸潤、炎症及び脱ミエリン形成の阻害について試験する。自己反応性T細胞及び関連する単核細胞の浸潤は、EAE並びにMSの顕著な特徴である。OCT、HEX及びHMB処置を、養子移入されたEAEマウスにおける浸潤及び炎症の減衰について試験する。8dpt(急性相の発症)からOCT、HEX及びHMBを受けるマウスを16dptに屠殺する。H&E染色を、HMBで処置したマウスに対する、EAEマウスの脊髄中への炎症性細胞の広範な浸潤について検査する。炎症性細胞の相対的レベルを定量する。
【０１２１】
OCT、HEX及びHMB処置を、これらの薬剤が、EAEマウスの脊髄における炎症誘発性分子の発現を阻止できるかどうかを決定するために調べる。iNOS及びIL-1βのような炎症誘発性分子の発現を、対照マウス及びHMBで処置したマウスと比較して、未処置EAEマウスの脊髄において観察する。
【０１２２】
脱ミエリン形成は、MSにおける最も重要な病理学的特徴であり、それもEAE動物においてモデル化される。それ故、OCT、HEX及びHMB処置が、EAEマウスを脱ミエリン形成から保護するかどうかを調べる。脊髄切片を、ルクソールファストブルー(LFB)によりミエリンについて染色して、白色物質中の広がった脱ミエリン帯又はミエリンの回復について観察する。これらの発見を確認するために、ミエリン遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)及びプロテオリピドタンパク質(PLP)の3種の発現を調べる。
【０１２３】
パーキンソン病(PD)との関係でHMB、HEX及び/又はOCT処置を試験する実験も実施する。例にHMBを使用して説明する。
【０１２４】
動物及びMPTP中毒。6から8週齢のC57BL/6マウスを使用する。急性MPTP中毒のために、マウスは、生理食塩水中のMPTP-HCl(18mg/kgの遊離塩基;Sigma Chemical Co.、ミズーリ州、St. Louis)4回の腹腔内(i.p.)注射を2時間間隔で受ける。対照動物は生理食塩水のみを受ける。
【０１２５】
HMB処置。マウスを、HMB(10及び20mg/kg体重/日)で経管栄養により処置する。HMBを0.5%メチルセルロース(MC)中で混合して、MPTPの最後の注射の後3時間から、マウスに1日に1回、経管栄養注射針を使用して100μLのHMB混合MCを経管栄養する。それ故、対照MPTPマウスは、MCだけをビヒクルとして受ける。
【０１２６】
ウェスタンブロット分析。DJ-1及びTHについてのイムノブロット分析を実施する。簡単に説明すると、細胞ホモジネートを電気泳動にかけて、タンパク質をニトロセルロース膜上に移動して、バンドが、それぞれの一次抗体、続いて赤外色蛍光団タグ付き二次抗体(Invitrogen)で免疫標識された後、Odyssey赤外スキャナーで可視化された。
【０１２７】
HPLC分析。ドーパミンの線条体のレベルを、Complete Stand-Alone HPLC-ECD System EiCOMHTEC-500(JM Science Inc.、ニューヨーク州、Grand Island)で定量化する。簡単に説明すると、マウスを、MPTP中毒の7日後に頚椎脱臼により屠殺して、それらの線条体を集めて直ちにドライアイスで凍結して、分析するまで-80℃で貯蔵する。分析する日に、組織をイソプレテレノールを含有する0.2Mの過塩素酸中で音波処理して、生じるホモジネートを20,000×gで15分間4℃で遠心分離する。pHを調節して濾過した後、10μlの上清を、Eicompak SC-3ODSカラム(JM Science Inc.(ニューヨーク州、Grand Island)からのComplete Stand-Alone HPLC-ECD System EiCOMHTEC-500)に注入して、製造業者のプロトコルに従って分析する。
【０１２８】
神経変性性障害中の黒質におけるPDに関係する有益なタンパク質、例えば、DJ-1の上方制御及び/又は維持は、PDにおいて治療の効力を有することができる。MPTP中毒は、in vivoで黒質中でDJ-1のレベルを低下させるはずである。MPTP中毒マウスのHMBを用いる経口処置を、黒質中のDJ-1の保護について試験する。線条体における黒質のチロシンヒドロキシラーゼ(TH)レベル及びドーパミン(DA)レベルの保護も、HMBの存在及び不在下でMPTP処置後に調べる。
【０１２９】
将来の実験で、MPTP中毒マウスでHMB処置が運動機能を改善するかどうかを評価するであろう。雄C57/BL6マウスをMPTP中毒にして、MPTPの最後の注射の6時間後から、マウスは、HMB(10及び20mg/kg体重/日)を経管栄養により受ける。マウスは、MPTPの最後の注射の7日後に、運動機能(A、ローターロッド;B、運動時間;C、運動数;D、休憩時間;E、水平な活動性;F、合計距離;G、後退;及びH、常同症)について、試験される。データは1群当たり6匹のマウスの平均±SEMである。
【０１３０】
追加の実験は、5XFADマウス、アルツハイマー病の動物モデルにおいて、HMB、HEX及び/又はOCT処置が海馬のニューロンを保護するか並びに記憶及び学習を改善するかどうかを決定するために実施される。簡単に説明すると、6月齢の雄5XFADマウスを、OCT(2及び5mg/kg体重/日)、HEX(2及び5mg/kg体重/日)及びHMB(10及び20mg/kg体重/日)で経管栄養により処置する。処置中に、これらの薬剤は0.5%メチルセルロース中で混合される。それ故、対照動物は、0.5%メチルセルロースだけをビヒクルとして受ける。処置の30日後に、マウスをBarnes迷路、T迷路及び新規目的認識について試験する。結論は、1群当たり少なくとも6匹のマウスの分析から引き出す。海馬の切片も、NeuN(ニューロンのマーカー)及びTUNEL(アポトーシスのマーカー)について二重標識される。結果は、1群当たり6匹のマウスの各々の2つの海馬の切片の分析を表す。
【０１３１】
実験は、リソソーム貯蔵障害の1種であるBatten疾患の患者の線維芽細胞でも実施する。後期幼児Batten疾患を有する患者の線維芽細胞をOCT(1及び2μM)、HEX(1及び2μM)及びHMB(10及び20μM)で24時間処置して、続いて、トリペプチジルペプチダーゼ1(TPP1)の活性を、本発明者らにより記載されたように19測定する。薬剤処置の後、細胞をリソソームの生合成についても、本発明者らにより記載されたように20、Lysotrackerを使用してモニターする。
【０１３２】
OCT、HEX及びHMBが、体重減少を誘発することができるかどうかを調べるために、肥満(ob/ob)マウスをOCT(2及び5mg/kg体重/日)、HEX(2及び5mg/kg体重/日)及びHMB(10及び20mg/kg体重/日)で経管栄養により処置する。処置中に、これらの薬剤は0.5%メチルセルロース中で混合される。それ故、動物の1群は0.5%メチルセルロースだけをビヒクルとして受ける。処置の1カ月後、体重をモニターする。各群で6匹のマウスを使用する。
【０１３３】
上の図及び開示は、例示であることを意図されており、網羅的であることは意図されない。この記載は、多くの変化及び代替を当業者に示唆するであろう。全てのそのような変化及び代替は、添付の請求項の範囲内に包含されることが意図されている。当業者は、本明細書に記載された特定の実施形態に等価の他の事物を認識し得るが、それらの等価事物も添付の請求項により包含されることが意図されている。
【０１３４】
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20. Ghosh, A. et al. Gemfibrozil and fenofibrate, Food and Drug Administration-approved lipid-lowering drugs, up-regulate tripeptidyl-peptidase 1 in brain cells via peroxisome proliferator-activated receptor α: implications for late infantile Batten disease therapy. J. Biol. Chem. 290, 10309-24 (2015).
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【０１３５】
【表１】
2018517728.tif 000003
【０１３６】
【表２】
2018517728.tif 000004
【図１Ａ−Ｅ】
2018517728.tif 000005
【図１Ｆ−Ｊ】
2018517728.tif 000006
【図１Ｋ−Ｌ】
2018517728.tif 000007
【図２Ａ】
2018517728.tif 000008
【図２Ｂ−Ｇ】
2018517728.tif 000009
【図３Ａ−Ｄ】
2018517728.tif 000010
【図３Ｅ−Ｇ】
2018517728.tif 000011
【図３Ｈ−Ｊ】
2018517728.tif 000012
【図３Ｋ−Ｌ】
2018517728.tif 000013
【図４Ａ−Ｄ】
2018517728.tif 000014
【図４Ｅ−Ｉ】
2018517728.tif 000015
【図４Ｊ−Ｎ】
2018517728.tif 000016
【図４Ｏ−Ｓ】
2018517728.tif 000017
【図５Ａ−Ｄ】
2018517728.tif 000018
【図５Ｅ−Ｌ】
2018517728.tif 000019
【図６Ａ】
2018517728.tif 000020
【図６Ｂ】
2018517728.tif 000021
【図７Ａ−Ｃ】
2018517728.tif 000022
【図７Ｄ−Ｆ】
2018517728.tif 000023
【図７Ｇ−Ｉ】
2018517728.tif 000024
【図８Ａ−Ｃ】
2018517728.tif 000025
【図８Ｄ−Ｆ】
2018517728.tif 000026
【図８Ｇ−Ｉ】
2018517728.tif 000027
【図９Ａ−Ｆ】
2018517728.tif 000028
【図９Ｇ−Ｉ】
2018517728.tif 000029
【図９Ｊ−Ｌ】
2018517728.tif 000030
【図１０Ａ−Ｆ】
2018517728.tif 000031
【図１０Ｇ−Ｋ】
2018517728.tif 000032
【図１０Ｌ−Ｐ】
2018517728.tif 000033
【図１０Ｑ−Ｕ】
2018517728.tif 000034
【図１１Ａ−Ｅ】
2018517728.tif 000035
【図１１Ｆ−Ｈ】
2018517728.tif 000036
【図１１Ｉ−Ｐ】
2018517728.tif 000037
【図１２Ａ−Ｅ】
2018517728.tif 000038
【図１３Ａ−Ｃ】
2018517728.tif 000039
【図１４Ａ−Ｃ】
2018517728.tif 000040
【図１５Ａ−Ｆ】
2018517728.tif 000041
【図１６Ａ−Ｄ】
2018517728.tif 000042
【図１６Ｅ−Ｈ】
2018517728.tif 000043
【図１７Ａ−Ｄ】
2018517728.tif 000044
【図１７Ｅ】
2018517728.tif 000045
【図１７Ｆ】
2018517728.tif 000046
【図１７Ｇ−Ｌ】
2018517728.tif 000047
【図１８】
2018517728.tif 000048
【配列表】
2018517728000001.app
【国際調査報告】
2018517728.tif 000049
2018517728.tif 000050