(57)【要約】  本明細書が開示し、提供するのは、（i）葉酸と複合している新規な抗ＣＤ３抗体、および、（i）この複合体から利益を受けうる疾患または状態の処置における、当該複合体の使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１５のうち少なくとも１つを有している、抗ＣＤ３抗体。
【請求項２】
配列番号１〜１５のうち２つを有している、請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体。
【請求項３】
（i）第１結合ドメインおよび（ii）第２結合ドメインを有している、二重特異的に結合する分子であって、
上記第２結合ドメインは、配列番号１〜１５からなる群より選択される、二重特異的に結合する分子。
【請求項４】
配列番号１〜１５の１つ以上に示されるアミノ酸配列を有している、細胞傷害活性を有しておりＣＤ３に特異的に結合する構築物。
【請求項５】
（a）配列番号１〜３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有している、ＶＨドメイン、および、
（b）配列番号４〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有している、ＶＬドメイン、
を有する結合ドメインを有している、抗ＣＤ３抗体。
【請求項６】
上記抗体は、１つ以上の翻訳後修飾を有している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３抗体。
【請求項７】
上記抗体は、リンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子と連結している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３抗体。
【請求項８】
上記生物活性を有する分子は葉酸である、請求項７に記載の抗ＣＤ３抗体。
【請求項９】
上記抗体は、二機能性ポリマー、二機能性リンカー、または、１つ以上の抗体ポリペプチドと連結している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉酸と複合している抗ＣＤ３抗体およびその断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に産生される抗体（Ａｂ）は、２つの同一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖、および２つの同一の免疫グロブリン軽鎖からなる四量体構造をしている。Ａｂの重鎖および軽鎖は、異なるドメインからなる。それぞれの軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）を有している。一方、それぞれの重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ）を有している。それぞれのドメイン（約１１０アミノ酸残基からなる）は、２つの逆平行βシートから形成されている、特徴的なβサンドイッチ構造に折り畳まれている（免疫グロブリンフォールド）。それぞれのＶＬドメインは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）を有しており、それぞれのＶＨドメインは最大で４つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜４）を有している。ＣＤＲとは、可変ドメインの一端でβストランドと連結している、ループ（またはターン）である。軽鎖および重鎖の可変領域はいずれも、通常は、抗原特異性の原因となっている（特異性に対する個々の鎖の寄与度は、同等であるとは限らないが）。抗体分子は、ＣＤＲループをランダム化することによって、多数の分子と結合するように進化してきた。
【０００３】
Ａｂの機能性部分構造は、タンパク質分解および組み換え法によって作製することができる。Ａｂには、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片およびＦｃ部分が含まれている。Ｆａｂ断片には、重鎖のＶＨ−ＣＨ１ドメインおよび軽鎖のＶＬ−ＣＬ１ドメインが含まれており、これらは１本の鎖間ジスルフィド結合で連結している。Ｆｖ断片には、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのみが含まれている。Ｆｃ部分には、抗体分子の抗原と結合しない領域が含まれている。いくつかの例では、１つのＶＨドメインでも、抗原に対する顕著な親和性を保持している（Ward et al., 1989, Nature 341, 554-546）。また、特定の単量体κ軽鎖は、その抗原と特異的に結合することも示されている（L. Masat et al., 1994, PNAS 91:893-896）。分離された軽鎖または重鎖も、ある程度の抗原結合活性を保持する場合があることが判明している（Ward et al., 1989, Nature 341, 554-546）。
【０００４】
他の機能性部分構造には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）がある。ｓｃＦＶは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域からなっており、これらはペプチドリンカーと共有結合している（S-z Hu et al., 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061）。これらの小タンパク質（Ｍｒ：２５，０００）は、通常、１つのポリペプチドの状態で、抗原に対する特異性および親和性を保持している。そして、より大きい抗原特異的な分子のための、便利なビルディングブロックを提供することができる。ｓｃＦｖは循環半減期が短く、多くの場合、治療上の有用性は限られている。
【０００５】
"minibody"と呼ばれる小型のタンパク質骨格は、ＩｇのＶＨドメインの一部をテンプレートに用いて設計された（Pessi et al., 1993, Nature 362, 367-369）。インターロイキン６に対する親和性が高いminibodyが（解離定数（Ｋｄ）：約１０−７Ｍ）、ＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ２に対応するループをランダム化し、次いで変異体をファージディスプレイ法で選抜することによって発見されている（Martin et al., 1994, EMBO J. 13, 5303-5309）。
【０００６】
ラクダの血清由来のＩｇＧ様物質を分析すると、通常、軽鎖可変ドメインを欠いている。このことは、抗体の充分な特異性および親和性が、ＶＨドメイン（３つまたは４つのＣＤＲループ）のみに由来しうることを示唆している。高い親和性を有する「ラクダ化」ＶＨドメインが作製されている。また、ＣＤＲ３のみをランダム化することにより、高い特異性を得ることができる。
【０００７】
"minibody"の代替物に、"diabody"がある。diabodyは、二重特異性を有する２価の小型抗体断片であり、２箇所の抗原結合部位を有している。この断片には、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が含まれており、これらは同じポリペプチド鎖上で連結されている（ＶＨ−ＶＬ）。diabodyの大きさは、Ｆａｂ断片と同程度である。diabodyのリンカーは、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合するには短すぎる。そのため各ドメインは、他の鎖上にある対応するドメインとの間で対合しなければならない。こうして、２箇所の抗原結合部位が作られる。これらの二量体抗体断片（または"diabody"）は、２価であり、二重特異性を有している（P. Holliger et al., PNAS 90:6444-6448 (1993).を参照）。
【０００８】
ＣＤＲペプチドおよびＣＤＲ有機模倣体が作製されている（Dougall et al., 1994, Trends Biotechnol. 12, 372-379）。ＣＤＲペプチドは、通常は環状である短いペプチドで、抗体のＣＤＲループのアミノ酸配列に対応している。ＣＤＲループは、抗体−抗原相互作用の原因となるものである。ＣＤＲペプチドおよびＣＤＲ有機模倣体は、ある程度の結合親和性を保持していることが示されている（Smyth & von Itzstein, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116, 2725-2733）。親和性を失わせることなく、マウスのＣＤＲがヒトのＩｇ骨格上に移植されている（Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann et al., 1988）。
【０００９】
体内では、巨大なライブラリの中から特定のＡｂが選択され増幅される（親和性成熟）。このプロセスは、コンビナトリアル・ライブラリ技術を用いれば、in vitroで再現できる。Ａｂ断片をバクテリオファージ表面に上手く提示させることにより、大量のＣＤＲ変異体を創出し、スクリーニングすることが可能となる（McCafferty et al., 1990, Nature 348, 552-554; Barbas et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,7978-7982; Winter et al., 1994, Annu. Rev. Imμnol. 12, 433-455）。この技術により作製されるＦａｂおよびＦｖ（ならびにその誘導体）が増加している。コンビナトリアル技術は、擬似Ａｂと組み合わせることもできる。
【００１０】
潜在的なタンパク質骨格となりうる数多くのタンパク質ドメインが、ファージのカプシドタンパク質と融合した状態で発現させられてきた。そのレヴューとしては［Clackson & Wells, Trends Biotechnol. 12:173-184 (1994)］を参照。これらのタンパク質ドメインのいくつかは、ランダムなペプチド配列を提示させるための骨格として、既に使用されている。この例としては、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（Roberts et al., PNAS 89:2429-2433 (1992)）、ヒト成長ホルモン（Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838 (1991)), Venturini et al., Protein Peptide Letters 1:70-75 (1994)）、StreptococcusのＩｇＧ結合ドメイン（O'Neil et al., Techniques in Protein Chemistry V (Crabb, L,. ed.) pp. 517-524, Academic Press, San Diego (1994)）が挙げられる。これらの骨格は、１つのランダム化されたループまたは領域を提示する。繊維状ファージＭ１３上における提示のための骨格としては、テンダミスタットが用いられてきた（McConnell and Hoess, 1995, J. Mol. Biol. 250:460-470）。
【００１１】
親水性ポリマーのポリエチレングリコール（略称ＰＥＧ）を共有結合で付加する方法によって、（i）水溶性および生体利用性が向上し、（ii）血清半減期および治療上の半減期が増加し、（iii）免疫原性および生物活性が調節され、または（iv）多くの生物活性を有する分子（例えば、タンパク質、ペプチド、そして特に疎水性の分子）について、循環時間を延長させる。製薬、人工移植、ならびに、生体適合性、毒性の除去および免疫原性の除去が重要となるその他の用途において、ＰＥＧは広範に用いられてきた。ＰＥＧの所望の特性を最大限に引き出すためには、ＰＥＧポリマーまたは生物活性を有する分子に付加するポリマーの合計分子量および水和状態を、充分に高くしなければならない。このようにすれば、ＰＥＧポリマーの付加に関連する、一般的な利点を付与することができる（親分子の生物活性に悪影響を及ぼすことなく、水溶性を増加させたり、循環中の半減期を延長させたりすることなど）。
【００１２】
よく、ＰＥＧ誘導体は、反応性の化学機能部位（リシン残基、システイン残基およびヒスチジン残基、Ｎ末端、ならびに炭化水素部分など）を介して、と生物活性を有する分子と連結される。タンパク質および他の分子は、通常、限られた数の反応部位しかポリマーの付加に利用できない。通常、ポリマー付加修飾に最も好適な部位は、受容体の結合において重要な役割を果たしており、その分子の生物活性を保持するために必須である。結果的に、生物活性を有する分子の反応部位に対して無差別にポリマー鎖を付加すると、通常は、ポリマー修飾分子の生物活性が著しく低下するか、全く失われてしまう（R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271:21969-21977）。標的分子に所望の利点を付与するために充分なポリマー分子量を有する複合体を形成させる従来のアプローチは、概して、分子に対して多数のポリマー鎖をランダム付加させることに関する物であった。それゆえ、親分子の生物活性を低減させるか、全く失ってしまうおそれが大きいアプローチであった。
【００１３】
遺伝的にコードされていないアミノ酸を、タンパク質中に組み込むことができる。これによって、天然の機能性基（例えば、リシンのε−ＮＨ２、システインのスルフヒドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基など）に代わる種々の代替物を提供しうるような、化学機能性基を導入することができる。特定の化学機能性基は、通常の２０種類のアミノ酸（遺伝子にコードされているアミノ酸）が有する機能性基に対しては不活性である一方で、手際よく効率的に反応して安定な結合を形成することが知られている。例えば、アジド基およびアセチレン基は、水性条件下かつ触媒量の銅の存在下で、Huisgen［３＋２］環状付加反応を起こすことが当業者に知られている（例えば、Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064; Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599.を参照）。タンパク質構造中にアジド部分を導入することによって、例えば、タンパク質中のアミン基、スルフヒドリル基、カルボン酸基、ヒドロキシ基に対しては不活性である一方で、アセチレン部分と円滑かつ効率的に反応して環状付加生成物を形成するような、機能性基を組み込むことができる。重要なことには、アセチレン部分がない場合には、アジドは化学的に不活性なままであり、他のタンパク質側鎖の存在下かつ生理的条件下では反応しないのである。
【００１４】
本発明は、特に、抗原結合性ポリペプチドおよびその断片（具体的には、ポリペプチド−小分子複合体）の、活性および産生に関する課題に取り組むものである。本発明はまた、生物学的特性または薬学的特性を向上させた（治療上の半減期の増加など）、抗原結合性ポリペプチドおよびポリペプチド−小分子複合体の産生に取り組むものである。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、抗ＣＤ３抗体、およびその葉酸との複合体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の新規な抗ＣＤ３抗体は、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、完全な抗体重鎖を含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、完全な抗体軽鎖を含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗体軽鎖の可変領域を含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗体重鎖の可変領域を含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗体軽鎖のＣＤＲを１つ以上含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ３抗体の抗体重鎖のＣＤＲを１つ以上含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、軽鎖のＣＤＲの１つ以上と、重鎖のＣＤＲの１つ以上とを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、Ｆａｂを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、２つ以上のＦａｂ含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、ｓｃＦｖを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、２つ以上のｓｃＦｖを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、minibodyを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は２つ以上のminibodyを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、diabodyを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、２つ以上のdiabodyを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、完全な軽鎖と完全な重鎖とを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、Ｆｃドメインまたはその一部を１つ以上含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、上述の実施形態の任意の組み合わせを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、任意の上述の実施形態のホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体またはヘテロ多量体を含んでいる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、結合対象に結合しているポリペプチドを含んでいる（ここで、上記結合対象は、抗原、ポリペプチド、核酸分子、ポリマー、または他の分子もしくは物質を含んでいる）。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗体以外の骨格分子または物質と結合している。
【００１６】
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、１つ以上の翻訳後修飾を有している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、リンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子と連結している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二機能性ポリマー、二機能性リンカー、または１つ以上の追加の抗ＣＤ３抗体と連結している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ３抗体ではないポリペプチドと連結している。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有している抗原結合性ポリペプチドは、１つ以上の追加の抗原結合性ポリペプチドと連結している（追加の抗原結合性ポリペプチドもまた、天然にコードされていないアミノ酸を有していてもよい）。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有している抗原結合性ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチド−小分子複合体と連結している（ポリペプチド−小分子複合体もまた、天然にコードされていないアミノ酸を有していてもよい）。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体は、１つ以上の追加の抗原結合性ポリペプチドと連結している（追加の抗原結合性ポリペプチドもまた、天然にコードされていないアミノ酸を有していてもよい）。
【００１７】
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール部分を含んでいる。いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコール分子は、二機能性ポリマーである。いくつかの実施形態において、二機能性ポリマーは、第２のポリペプチドと連結している。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体におけるアミノ酸の置換は、天然に生じるアミノ酸によるものであってもよいし、天然に生じないアミノ酸によるものであってもよい。ただし、１つ以上の置換は、天然にコードされていないアミノ酸によるものである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を有している。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコール分子の分子量は、約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコール分子の分子量は、０．１ｋＤａ〜５０ｋＤａである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコール分子は、分枝ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコール分枝ポリマーの各分枝の分子量は、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、または１ｋＤａ〜５０ｋＤａである。
【００２２】
本発明はまた、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸と結合しているリンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子を含んでいる、抗ＣＤ３抗体ポリペプチドを提供する（上記天然にコードされていないアミノ酸は、リボソームによって、上記ポリペプチドの事前に選択した位置に組み込まれる）。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｔ細胞の標的細胞に対する攻撃と、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸による傷害が投与量依存的であることを示す。図１（Ａ）は、ＫＢ細胞（ＦＲ＋）、ＯＶ−９０細胞（ＦＲ＋）およびＣＡＫＩ−１細胞（ＦＲ−）を、活性化ヒトＰＢＭＣの存在下にて抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸で処置した際の、Ｔ細胞媒介性細胞傷害が投与量依存的であることを示すグラフである（標的細胞：効果細胞＝１：１０）。抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸または非複合体化抗ＣＤ３Ｆａｂの濃度の増加系列の下で、３７℃、５％ＣＯ２にて１２〜２４時間、標的細胞とインキュベートした。製造元のプロトコルに則り（Cytotox 96 nonradioactive cytotoxicity assay, Promega）、溶解した細胞から放出されるＬＤＨレベルを測定することによって、細胞傷害を定量化した。図１（Ｂ）は、葉酸を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地で維持されている、ＳＫＯＶ−３細胞を示している。この培地には、細胞を４８ウェル細胞培養プレートに播種してプレートに付着させる前に、少なくとも３代にわたって１０％ＦＢＳを添加した。また、細胞を付着させた後には、ヒトＰＢＭＣを添加した（標的細胞：効果細胞＝１：１０）。抗ＣＤ３Ｆａｂまたは抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸を葉酸を含まない培地で稀釈して、図に記載の濃度となるように加え、共培地を１６時間インキュベートした。２５倍の対物顕微鏡で画像を撮影した。
【図２】抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異性薬剤のin vivoにおける効果を、メスのNOD-SCIDマウスを用いた異種移植モデルで評価した。動物を低葉酸食で飼育して、二重特異性薬剤の競合するおそれのある、循環血清中の葉酸レベルを低下させた。ＫＢ細胞（ＦＲ＋）またはＡ５４９細胞（ＦＲ−）には、非活性化ヒトＰＢＭＣ（標的細胞：効果細胞＝１：１００）または活性化ヒトＰＢＭＣ（標的細胞：効果細胞＝１：１０）と混合した際に腫瘍形成能がみられ、この混合物をマウスに皮下注射した。ヒトＰＢＭＣと混合したＫＢ細胞（標的細胞：効果細胞＝１：１０）をマウスに埋入した。その後上記マウスに、１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸またはＰＢＳを静脈内注射した（腫瘍細胞の埋入と同じ日に開始し、１０日間毎日続けた）。図２（Ａ）は、この実験における腫瘍体積を示している。ＰＢＳで処置したマウスにおいては、腫瘍体積の急激な増加が見られた（約５日間で倍増する速度）。これとは対照的に、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸で処置したマウスの腫瘍は、研究の間を通して、辛うじて検出できる程度であった。並行研究では、非活性化ヒトＰＢＭＣ（標的細胞：効果細胞＝１：１００）と混合したＫＢ細胞をマウスに埋入した。そして、１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸またはＰＢＳで静脈内処置した（腫瘍細胞の埋入と同じ日に開始し、１０日間毎日続けた）。図２（Ｂ）に、標的細胞：効果細胞＝１：１００とした実験における腫瘍体積を示す。腫瘍が減少する速度は、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸で処置したマウスの方が速かった。研究３５日目以降、ＰＢＳで処置したマウスの腫瘍は、体積が徐々に増加していった。一方、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸で処置したマウスの腫瘍は、辛うじて検出できる程度まで減少した。このことは、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体によれば、活性化Ｔ細胞の非存在下であっても、細胞傷害性Ｔ細胞の攻撃によって腫瘍が排除されることを示している。図２（Ｃ）は、両処置群のマウスについて、体重の変化をグラフに表したものである。図２（Ｄ）は、３種類の試験群のラットにおける、経時的な血清濃度を示している。この試験群とは、１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸を注射した群；５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸を注入した群；および、１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ３Ｆａｂを注射した群である。一定間隔で血清を採取し、ＥＬＩＳＡで分析した。抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸も、対応する非複合体化抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体も、いずれも、血清濃度は同じ速度で減少した（血清半減期：６０分間）。
【図３】ＦＲおよびＣＤ３に対する、葉酸複合体の結合を示す。図３（Ａ）は、葉酸−ＣＦ４８８が、ＫＢ細胞（ＦＲ＋）に対しては結合するが、Ａ５４９細胞（ＦＲ−）に対しては結合しないことをグラフに表したものである（遊離葉酸との競合によって分析した）。複合体濃度の増加系列の下に、１００ｎＭの葉酸を含む培地と共に、４℃にて３０分間細胞をインキュベートした。そして、細胞と結合している蛍光をフローサイトメトリーで分析した。図３（Ｂ）は、抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＣＦ４８８が、Jurkat細胞（ＣＤ３＋）に対しては結合するが、ＫＢ細胞（ＣＤ３−）に対しては結合しないことをグラフに表したものである。複合体濃度の増加系列の下に、４℃にて３０分間細胞をインキュベートした。結合はフローサイトメトリーで分析した。
【図４】２種類の独立した細胞傷害アッセイによる、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体のＴ細胞媒介性傷害を示す。非活性化ヒトＰＢＭＣ（標的細胞：効果細胞＝１：１０）の存在下で抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸で処置したところ、ＫＢ細胞（ＦＲ＋）においては投与量依存的なＴ細胞媒介性細胞傷害が見られたのに対し、Ａ５４９細胞（ＦＲ−）では見られなかった。抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸の濃度の増加系列の下で、３７℃、５％ＣＯ２にて１２〜２４時間、標的細胞と共にインキュベートした。図４（Ａ）では、細胞をＤＩＯで標識付けし（細胞膜を緑色に染色）、ヨウ化プロピジウムを最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるように加えた。細胞傷害は、フローサイトメトリーによって測定した。図４ (B)は、ＰＢＭＣを洗い流してから２４時間後における、ＫＢ細胞のＡＴＰ含有量をグラフに表したものである（Cell Titer Glo（Promega）を用いて測定した）。
【図５】ヒト化ＳＰ３４Ｆａｂおよび複合体に含まれる新規な配列（配列番号１〜１５）の、ＳＫＯＶ−３に対する結合を示す。葉酸を含まない媒体でアッセイした。
【図６】ヒト化ＳＰ３４Ｆａｂおよび複合体に含まれる新規な配列（配列番号１〜１５）の、ＳＫＯＶ−３に対する結合を示す。５０ｎＭのＳＦＡを含む媒体でアッセイした。
【図７】（ａ）は、キメラ化ＳＰ３４−葉酸の投与によって誘導される、ＣＤ６９の発現を示す。（ｂ）は、図７（ａ）と同じ血清サンプルで処置したＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の生存を示す。
【図８】ヒトＰＢＭＣ中における細胞傷害の割合を示す、殺傷アッセイである。図６における、５０ｎＭ  ＳＦＡの条件を再現した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
〔定義〕
本発明は、本明細書で説明している具体的な方法、プロトコル、細胞株、構成および薬剤に限定されるものではなく、変更を施しうるものであることを理解されたい。また、本明細書で使用する術語は、具体的な実施形態を説明するためにのみ用いられるのであって、本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【００２５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いるとき、単数形("a," "an," "the")には、文脈上明らかに除外されない限り、複数の対象が包含される。したがって、例えば、「ポリペプチド−小分子複合体」または「抗ＣＤ３抗体」に対する言及は、このようなタンパク質の１つ以上にたいする言及であって、当業者に知られている均等物なども含まれている。
【００２６】
別途定義されていない限り、本明細書において用いる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味である。本明細書に記載の方法、装置および物質と類似または均等である任意ものを、本発明の実施または試験において使用することができる。しかし、好ましい方法、装置及び物質は、ここに記載されているものである。
【００２７】
本明細書において言及する刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。これは、説明および開示を目的とする（例えば、本発明との関連において用いられるかもしれない、当該刊行物に記載の構成および方法の）。本明細書で論じる刊行物は、単に、本出願の出願日以前における開示を提供するためのものである。本明細書における何らの記載も、先行発明または他の理由を根拠に、本発明者らが上述の開示に先行する資格を有していないことの自白と解釈すべきではない。
【００２８】
用語「実質的に精製されている」とは、抗ＣＤ３抗体が、天然に産生される環境（つまり天然細胞）または宿主細胞（組み換えで産生された抗ＣＤ３抗体の場合）において、タンパク質が通常伴ったり、タンパク質と相互作用したりする成分を、実質的または本質的に含みえないことを表す。細胞性の物質を実質的に含みえない抗ＣＤ３抗体としては、例えば、混入しているタンパク質を乾燥重量で、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満含んでいるタンパク質の調製物が挙げられる。抗ＣＤ３抗体またはその変異体が組み換えによって宿主細胞から産生される場合は、このようなタンパク質が、細胞の乾燥重量の約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下存在してもよい。抗ＣＤ３抗体またはその変異体が組み換えによって宿主細胞から産生される場合は、培地中にこのようなタンパク質が、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ以下、約４ｇ／Ｌ以下、約３ｇ／Ｌ以下、約２ｇ／Ｌ以下、約１ｇ／Ｌ以下、約７５０ｍｇ／Ｌ以下、約５００ｍｇ／Ｌ以下、約２５０ｍｇ／Ｌ以下、約１００ｍｇ／Ｌ以下、約５０ｍｇ／Ｌ以下、約１０ｍｇ／Ｌ以下、または約１ｍｇ／Ｌ以下存在していてもよい。したがって、本発明の方法によって提供されるとき、「実質的に精製されている」抗ＣＤ３抗体の純度は、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上であってもよい。具体的には、純度は約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上であってもよい。より具体的には、純度約９０％以上、純度約９５％以上、純度約９９％以上、またはそれを超えていてもよい。ここで、純度は、適切な方法により決定する（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣおよびキャピラリー電気泳動など）。
【００２９】
「組み換え宿主細胞」または「宿主細胞」とは、外来性のポリヌクレオチドを含んでいる細胞を表す。外来性のポリヌクレオチドを挿入する方法は問わない（例えば、直接の取り込み、形質導入、ｆ交配、または組み換え宿主細胞の作製に係る技術分野で公知の方法）。外来性ポリヌクレオチドは、組み込まれないベクター（例えばプラスミド）として維持してもよいし、そうではなく宿主ゲノムに組み込んでもよい。
【００３０】
抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質である。天然の抗体は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽鎖（Ｌ鎖）および２つの同一の重鎖（Ｈ鎖）から構成されている。各軽鎖は、１本の共有性ジスルフィド結合によって重鎖と連結している。重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによって異なる。また、各重鎖および各軽鎖には、一定間隔で鎖間にジスルフィド架橋がある。各重鎖の一端には可変ドメイン（ＶＨ）があり、いくつかの定常ドメインがそれに続く。各軽鎖の一端には可変ドメイン（ＶＬ）があり、他端には定常ドメインがある。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと位置が揃っている。また、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと位置が揃っている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの間の境界面を形成すると考えられている。
【００３１】
用語「可変」とは、抗体の中でも、可変ドメインの特定の部分の配列が著しく異なっていることを表す。この配列の差異は、それぞれの特定の抗体の、特定の抗原に対する結合特異性の原因となっている。しかし、この可変性は、抗体の可変ドメインの中に均等に分布しているわけではない。軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方に存在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの部分に、可変性が集中している。可変ドメインのより保存性が高い部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインには、いずれも、４つのＦＲ領域が含まれている。その多くはβシート構造を取っており、３つまたは４つのＣＤＲと連結している。ＣＤＲはループ構造を形成しており、場合によってはβシート構造の一部を形成している。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接した状態でまとまって位置している。そして、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照）。
【００３２】
定常ドメインは、抗体の抗原に対する結合に直接は関わらないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンを異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラスがあり（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、そのうちいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に分類することができる（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域を、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ぶ。種々のヒト免疫グロブリンのクラスの中でも、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３およびヒトＩｇＭだけが、補体を活性化させることが知られている。
【００３３】
in vivoにおける抗体の親和性成熟は、主として体細胞超変異によって作られる親和性の高い抗体変異体を、抗原選択することによって進行する。また通常は、「レパートリー・シフト」も発生する。レパートリー・シフトでは、二次応答または三次応答の主要な生殖細胞遺伝子は、一次応答および二次応答のものとは異なっていることが判っている。
【００３４】
免疫系の親和性成熟のプロセスは、in vitroで抗体遺伝子に変異を導入し、親和性選択で親和性が向上している変異体を単離するによって、再現することができる。このような変異体抗体を、繊維状バクテリオファージまたは微生物（酵母など）の表面に提示させることができる。そして、抗原に対する親和性によって抗体を選抜したり、抗原からの解離速度（off-rate）によって抗体を選抜したりすることができる（Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)）。CDR walking mutagenesisによって、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のヒトエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０に結合するヒト抗体を親和性成熟させた事例がある（Barbas III et al. PNAS (USA) 91: 3809-3813 (1994); Yang et al. J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)）。また、同様の手法で抗ｃ−ｅｒｂＢ−２一本鎖Ｆｖ断片を親和性成熟させた事例もある（Schier et al. J. Mol. Biol. 263:551567 (1996)）。抗体鎖シャッフリングおよびＣＤＲ変異導入によって、ＨＩＶの第３超可変ループに対する親和性の高いヒト抗体を親和性成熟させた事例がある（Thompson et al. J. Mol. Biol. 256:77-88 (1996)）。［Balint and Larrick Gene 137:109-118 (1993)］には、コンピュータを使用したオリゴデオキシリボヌクレオチド特異的なscanning mutagenesisが開示されている。この手法では、改良型変異体を得るために、可変領域遺伝子のＣＤＲの全体を同時にサーチする。initial limited mutagenesis strategyにより、αｖβ３に特異的なヒト化抗体を親和性成熟させた事例もある。この手法では、６つのＣＤＲの全ての位置に突然変異を導入して発現させ、スクリーニングにより親和性が最大の変異体が含まれるコンビナトリアル・ライブラリを得る（Wu et al. PNAS (USA) 95: 6037-6-42 (1998)）。ファージに提示された抗体については、［Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992); Rader and Barbas III Current Opinion in Biotech. 8:503-508 (1997)］のレヴューがある。上述の文献のうち、親抗体よりも親和性が向上された変異抗体が報告されているいずれの例でも、変異抗体はＣＤＲにアミノ酸の置換を有していた。
【００３５】
本明細書において「親和性成熟」とは、抗体の抗原に対する親和性を向上させるプロセスを意味する。親和性成熟の方法としては、コンピュータによるスクリーニング法および実験的方法が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００３６】
本明細書において「抗体」とは、抗体遺伝子の全部または一部によって実質的にコードされているポリペプチドの１つ以上を含んでいる、タンパク質を意味する。免疫グロブリン遺伝子としては、定常領域遺伝子であるκ、λ、α、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、δ、εおよびμ、ならびに無数にある免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。本明細書における抗体には、全長抗体および抗体断片が含まれる。また、任意の生物において天然に存在する抗体も、人工的に作製された抗体（例えば変異体）も含まれる。
【００３７】
「抗体断片」とは、全長形態以外の任意の形態である抗体を意味する。本明細書における抗体断片には、（i）全長抗体の中に含まれる小部分である抗体と、（ii）人工的に作製された抗体と、が含まれる。抗体断片としては、これらには限定されないが、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、diabody、triabody、tetrabody、二機能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域などが挙げられる（Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402）。
【００３８】
本明細書において「コンピュータによるスクリーニング法」とは、タンパク質における１つ以上の変異を設計する、任意の方法を意味する。この方法では、可能なアミノ酸側鎖の置換同士による相互作用エネルギーの評価、および／または、可能なアミノ酸側鎖の置換とタンパク質の残りの部分との相互作用エネルギーの評価、にコンピュータを利用する。
【００３９】
「Ｆｃ」とは、免疫グロブリンのＣγ２ドメインおよびＣγ３ドメイン（Ｃγ２およびＣγ３）から構成される、抗体の部分を意味する。Ｆｃは、Ｃγ２とＣγ１（Ｃγ１）との間のＮ末端ヒンジに存在する、任意の残基を含んでいてもよい。「Ｆｃ」とは、単離された状態の上記領域を指してもよいし、抗体または抗体断片中にある上記領域を指してもよい。Ｆｃには、Ｆｃの任意の修飾形態も含まれる。例えば、天然の単量体、天然の二量体（ジスルフィド結合で連結されている）、修飾された二量体（ジスルフィド結合および／または非共有結合している）、および修飾された単量体（つまり誘導体）が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００４０】
本明細書において「全長抗体」とは、抗体のＨ鎖および／またはＬ鎖の、天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。多くの哺乳動物では（例えばヒトおよびマウス）、上記の形態は四量体であり、２本の免疫グロブリン鎖の組み合わせ２組（同一の組み合わせが２組）からなる。それぞれの組み合わせには、１本の軽鎖および１本の重鎖が含まれている。それぞれの軽鎖には、免疫グロブリンのＶＬドメインおよびＣＬドメインが含まれている。それぞれの重鎖には、免疫グロブリンのＶＨドメイン、Ｃγ１ドメイン、Ｃγ２ドメインおよびＣγ３ドメインが含まれている。それぞれの組み合わせの中で、軽鎖可変領域および重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）は、抗原に対する結合を共に担っている。定常領域（ＣＬ、Ｃγ１、Ｃγ２およびＣγ３、とりわけＣγ２およびＣγ３）は、抗体のエフェクター機能を担っている。ある種の哺乳動物では（例えばラクダおよびラマ）、全長抗体は２本の重鎖のみからなっていてもよい。それぞれの重鎖には、免疫グロブリンのＶＨドメイン、Ｃγ２ドメインおよびＣγ３ドメインが含まれている。
【００４１】
本明細書において「免疫グロブリン（Ｉｇ）」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされているポリペプチドの１つ以上から構成される、タンパク質を意味する。免疫グロブリンとしては、抗体などが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。免疫グロブリンは、種々の構造上の形態をとってもよい。例えば、これらには限定されないが、全長抗体、抗体断片、免疫グロブリンの個々のドメイン（例えば、これらには限定されないが、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬおよびＣＬ）が挙げられる。
【００４２】
本明細書において「免疫グロブリン（Ｉｇ）のドメイン」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされているポリペプチドから構成される、タンパク質ドメインを意味する。Ｉｇのドメインとしては、これらには限定されないが、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬおよびＣＬが挙げられる（図１に示す通り）。
【００４３】
本明細書において用いる「変異タンパク質配列」とは、他の類似のタンパク質配列とはアミノ酸同一性が異なる残基を１つ以上有している、タンパク質配列を意味する。上記の「類似のタンパク質配列」は、天然の野生型タンパク質配列であってもよいし、野生型配列とは異なる変異型であってもよい。一般的に、元の配列を「親配列」と表現する。親配列は、野生型配列であっても変異型配列であってもよい。例えば、本発明の好ましい実施形態では、ヒト化親配列を利用して、これをコンピュータ解析することによって変異型を作製してもよい。
【００４４】
本明細書において、抗体の「可変領域」とは、図１に示すように、免疫グロブリンのＶＨドメイン、免疫グロブリンのＶＬドメイン、または免疫グロブリンのＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成される、１または複数のポリペプチドを意味する（変異体も含まれる）。「可変領域」は、単離された状態のこれらのポリペプチドを指してもよいし（Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、より大型の抗体断片に含まれる当該領域として）、全長抗体（あるいは、抗体ではない骨格分子）に含まれる当該領域を指してもよい。
【００４５】
本発明は、広汎な出所から得られる抗体に応用しうる。抗体は、任意の生物に由来する１または複数の抗体遺伝子によって、実質的にコードされうる。このような生物としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、サルが挙げられ、具体的には哺乳動物であり、具体的にはヒトであり、具体的にはマウスおよびラットである（ただし、これらに限定されない）。一実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体である。完全ヒト抗体は、例えば、患者または被験体からトランスジェニックマウスまたは他の動物を用いて得ることもできるし（Bruggemann & Taussig, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458）、ヒト抗体ライブラリと選抜方法を組み合わせて得ることもできる（Griffiths & Duncan, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:102-108）。抗体は、任意の出所（人工的な出所および天然に生じる出所を含む）に由来していてよい。例えば、本発明は、人工抗体を利用してもよい。人工抗体としては、ラクダ化抗体およびヒト化抗体（Clark, 2000, Immunol. Today 21:397-402））、またはコンビナトリアル・ライブラリに由来する抗体が挙げられる（ただし、これらには限定されない）。さらに、天然の抗体遺伝子の１つ以上によって実質的にコードされている抗体の人工変異体は、最適化抗体であってもよい。例えば、一実施形態において、最適化抗体は、親和性成熟によって特定された抗体である。
【００４６】
本発明の抗ＣＤ３抗体に関して、用語「抗原特異的」または「特異的に結合する」とは、抗原を含む混合物を含有するサンプル中で、所定の抗原または所定の結合対象のエピトープの１つ以上と結合するが、他の分子を実質的に認識せず結合しないような抗ＣＤ３抗体を表す。
【００４７】
本明細書において用いるとき、用語「二重特異的抗ＣＤ３抗体」または「多重特異的抗ＣＤ３抗体」とは、２つ以上の抗原結合部位または結合対象結合部位を有している抗ＣＤ３抗体を表す。ここで、第１の結合部位は第１の抗原またはエピトープに対する親和性を有しており、第２の結合部位は第２の抗原またはエピトープ（第１の抗原またはエピトープとは異なる）に対する結合親和性を有している。
【００４８】
本明細書において用いるとき、用語「エピトープ」とは、抗ＣＤ３抗体によって認識される、抗原上の部位または結合対象上の部位を表す。抗原がポリペプチドを含んでいる場合、エピトープは、直線または立体的に形成されるアミノ酸の配列または形状でありうる。また、エピトープは、任意の種類の抗原上にある、抗ＣＤ３抗体が当該抗原に結合する任意の位置でもありうる。
【００４９】
本明細書において用いるとき、「抗原結合性ポリペプチド」または「抗ＣＤ３抗体」には、特定の結合対象（抗原など）に対する特異的結合の生物活性を少なくとも有している、ポリペプチドおよびタンパク質が包含されねばならない。また、上記ポリペプチドおよびタンパク質の、抗ＣＤ３抗体アナログ、イソ型抗ＣＤ３抗体(isoforms)、抗ＣＤ３抗体模倣体(mimetics)、抗ＣＤ３抗体断片、ハイブリッド抗ＣＤ３抗体タンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよび多量体、ホモログ、グリコシル化変異体、ならびに突然変異タンパク質も、同様の生物活性の有無にかかわらず包含されねばならない。さらに、これらの物質の合成方法または作製方法も限定されない。このような合成または作製方法としては、組み換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは核酸の他の形態のいずれから作製されるかにかかわらない）、in vitroまたはin vivoでの核酸分子のマイクロインジェクションによる方法、合成法、トランスジェニック法、および遺伝子活性化法(gene activated methods)が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。抗ＣＤ３抗体の具体例としては、抗体分子、重鎖、軽鎖、可変領域、ＣＤＲ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、他の骨格を有する非抗体分子、リガンド、受容体、ペプチド、または抗原と結合する任意のアミノ酸配列が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００５０】
用語「抗ＣＤ３抗体」または「抗原結合性ポリペプチド」とは、上述の抗ＣＤ３抗体に加えて、天然の抗体が有する生物活性の１つ以上を保持しているポリペプチドを表す。このような生物活性には、抗原に対する結合以外の活性も含まれる（ただし、これらに限定されない）。抗原に対する結合以外の活性としては、Ｆｃと関連する１つ以上の任意の活性が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００５１】
抗原結合性ポリペプチドとしては、薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグがある。プロドラッグとしては、天然のヒト抗ＣＤ３抗体の、塩、多形体、水和物、溶媒和物、生物活性を有する断片、生物活性を有する変異体、および立体異性体がある。天然のヒト抗ＣＤ３抗体のアゴニスト変異体、模倣体およびアンタゴニスト変異体、ならびにそれらのポリペプチド融合体に対する塩、多形体なども、上記プロドラッグである。アミノ末端、カルボキシ末端またはその両方に追加のアミノ酸を有する融合体も、用語「抗原結合性ポリペプチド」に包含される。融合体の代表例としては、組み換え発現の結果として抗ＣＤ３抗体のＮ末端にメチオニンが連結している、メチオニル抗ＣＤ３抗体が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。また、精製目的のための融合体（例えば、これらには限定されないが、ポリヒスチジンまたは親和性エピトープ）、抗ＣＤ３抗体と他の生物活性を有する分子とを連結するための融合体、血清アルブミン結合ペプチドとの融合体、血清タンパク質（血清アルブミンなど）との融合体も挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００５２】
用語「抗原」または「結合対象(binding partner)」とは、抗ＣＤ３抗体が示す結合活性の標的となる物質を表す。実質的には、任意の物質は、抗ＣＤ３抗体の抗原または結合対象でありうる。
【００５３】
本発明の二重特異性抗体には、ヒト化ＳＰ３４抗体または抗体断片である、抗ＣＤ３二重特異性抗体が含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を重鎖の１６０位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を軽鎖の１７２位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を軽鎖の１５７位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を重鎖の１２９位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を、重鎖の１２９位および軽鎖の１７２位に有している。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本発明には、重鎖の２０４位に天然にコードされていないアミノ酸を有しているヒト化ＳＰ３４抗体が含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を重鎖の２１０位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を重鎖の１９１に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を重鎖の１８７位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を重鎖の１３３位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を重鎖の１１４位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を重鎖の１１５位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を軽鎖の１１１位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を軽鎖の１１５位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を軽鎖の２０４位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を軽鎖の１９１位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を軽鎖の１９３位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、天然にコードされていないアミノ酸を軽鎖の１８６位に有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、上述のアミノ酸変異のうち２つを有している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、上述のアミノ酸変異のうち２つ以上を有している。
【００５５】
本発明の二重特異性抗体には、ヒト化ＳＰ３４抗体または抗体断片である、抗ＣＤ３二重特異性抗体が含まれている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１６０位のＴｈｒが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１７２位のＬｙｓが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１５７位のＬｅｕが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１２９位のＬｙｓが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１２９位のＬｙｓおよび軽鎖の１７２位のＬｙｓが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１２９位のＬｙｓおよび軽鎖の１５７位のＬｅｕが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の２０４位のＡｓｎが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の２１０位のＬｙｓが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１９１位のＴｈｒが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１８７位のＳｅｒが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１３３位のＧｌｙが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１１４位のＡｌａが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１１５位のＳｅｒが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１１１位のＡｒｇが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１１５位のＡｌａが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の２０４位のＬｅｕが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１９１位のＬｙｓが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１９３位のＬｙｓが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１８６位のＬｙｓが天然にコードされていないアミノ酸に置換されている。
【００５７】
本発明の二重特異性抗体には、葉酸と複合しているヒト化ＳＰ３４抗体または抗体断片である、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異性抗体が含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１６０位のＴｈｒにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１７２位のＬｙｓにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１５７位のＬｅｕにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１２９位のＬｙｓにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１２９位のＬｙｓおよび軽鎖の１７２位のＬｙｓにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１２９位のＬｙｓおよび軽鎖の１５７位のＬｅｕにおいて葉酸と複合している。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の２０４位のＡｓｎにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の２１０位のＬｙｓにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１９１位のＴｈｒにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１８７位のＳｅｒにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１３３位のＧｌｙにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１１４位のＡｌａにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、重鎖の１１５位のＳｅｒにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１１１位のＡｒｇにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１１５位のＡｌａにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の２０４位のＬｅｕにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１９１位のＬｙｓにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１９３位のＬｙｓにおいて葉酸と複合している。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化ＳＰ３４抗体は、軽鎖の１８６位のＬｙｓにおいて葉酸と複合している。
【００５９】
種々の文献が、ポリマーとの複合体化またはグリコシル化によるポリペプチドの修飾について開示している。用語「抗ＣＤ３抗体」または「抗原結合性ポリペプチド」には、ＰＥＧなどのポリマーと複合しているポリペプチドであって、システイン、リシン、Ｎ末端もしくはＣ末端のアミノ酸、または他の残基の１つ以上が、追加で誘導体化されていてもよいポリペプチドが含まれる（ただし、これらに限定されない）。さらに、抗ＣＤ３抗体は、リンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子を有していてもよい。ここで、上記リンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子と複合しているアミノ酸は、本発明に係る非天然アミノ酸であってもよい。あるいは、公知の技術（リシンまたはシステインとのカップリングなど）を利用して、天然にコードされているアミノ酸と複合させてもよい。米国特許第４,９０４,５８４号は、リシンを低減させたＰＥＧ化ポリペプチドを開示している。上記ＰＥＧ化ポリペプチドは、１つ以上のリシン残基が欠失しているか、他のアミノ酸残基に置換されている。国際公開第９９／６７２９１号は、タンパク質をＰＥＧと複合体化させる方法を開示している。上記方法では、タンパク質の１つ以上のアミノ酸残基を欠失させ、タンパク質の複合体化に充分な条件下にて、当該タンパク質をＰＥＧと接触させる。国際公開第９９／０３８８７は、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドの、ＰＥＧ化変異体を開示している。上記ＰＥＧ化変異体のシステイン残基は、上記ポリペプチドの特定の領域に位置する非必須アミノ酸残基に置換されている。国際公開第００／２６３５４号は、アレルゲン性を低減させたグリコシル化ポリペプチド変異体の製造方法を開示している。上記ポリペプチド変異体は、対応する親ポリペプチドと比較して、１つ以上の追加のグリコシル化部位を有している。
【００６０】
用語「抗原結合性ポリペプチド」には、グリコシル化抗ＣＤ３抗体も含まれる。グリコシル化抗ＣＤ３抗体とは、任意のアミノ酸の位置においてグリコシル化されたポリペプチドであって、当該ポリペプチドがＮ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化したものなどである（ただし、これらに限定されない）。また、１個のヌクレオチド変異を有する変異体も、生物活性を有する抗ＣＤ３抗体変異体と考えられる。さらに、スプライシング変異体も抗原結合性ポリペプチドに含まれる。用語「抗原結合性ポリペプチド」には、１つ以上の任意の抗ＣＤ３抗体の、ヘテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体またはホモ多量体も含まれる。あるいは、抗原結合性ポリペプチドには、任意の他のポリペプチド、タンパク質、炭化水素、ポリマー、小分子、リンカー、リガンド、または他の任意の種類の生物活性を有する分子と、化学的手段で連結している、または融合タンパク質として発現している物質も含まれる。同様に、例えば特定の欠失または他の修飾を有するポリペプチドアナログであって、生物活性が依然として維持されている物質も含まれる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、抗原結合性ポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体の生物活性を調節する付加、置換または欠失をさらに有している。例えば、付加、置換または欠失により、抗ＣＤ３抗体の特性または活性の１つ以上を調節してもよい。このような調節の例としては、（i）抗原に対する親和性の調節、（ii）抗原の立体配置または他の二次構造、三次構造、四次構造の変化の調節（例えば変化量の増減であるが、これらには限定されない）、（iii）抗原の立体配置または他の二次構造、三次構造、四次構造の変化の安定化、（iv）抗原の立体配置または他の二次構造、三次構造、四次構造の変化の誘導、（v）循環半減期の調節、（vi）治療上の半減期の調節、（vii）ポリペプチドの安定性の調節、（viii）投与量の調節、（ix）放出または生体利用性の調節、（x）精製の促進、（xi）特定の投与経路の改善または変更、が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。同様に、抗原結合性ポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列、反応性の基、抗体結合ドメイン（例えばＦＬＡＧまたはポリＨｉｓであるが、これらには限定されない）、または他の親和性配列（例えばＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなどであるが、これらには限定されない）、または結合分子（例えばビオチンであるが、これには限定されない）を有していてもよい。上記結合分子には、ポリペプチドの検出を容易にするもの（例えばＧＦＰだが、これらには限定されない）、精製を容易にするもの、他の特質を改善するものがある。
【００６２】
用語「抗原結合性ポリペプチド」には、連結されている抗ＣＤ３抗体のホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体およびヘテロ多量体も含まれる。連結の様式としては、（i）天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介した直接の連結、（ii）同じまたは異なる天然にコードされていないアミノ酸の側鎖の間の連結、（iii）天然にコードされているアミノ酸の側鎖間の連結、（iv）融合による連結、または（v）がリンカーを介した間接的な連結、が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。リンカーの代表例としては、小型の有機化合物、様々な長さの水溶性ポリマー（様々な長さのポリエチレングリコール、ポリデキストランまたはポリペプチドなど）が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００６３】
特定の抗原結合性ポリペプチド配列中の位置に対応しているアミノ酸の位置を、当該抗原結合性ポリペプチドの断片または関連する抗原結合性ポリペプチドなどにおいて容易に特定できることを、当業者ならば理解するであろう。例えば、配列アライメントプログラム（ＢＬＡＳＴなど）を用いて、関連配列中の位置に対応しているタンパク質中の特定の位置を、整列させ特定することができる。
【００６４】
用語「抗原結合性ポリペプチド」には、１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失を有している、抗原結合性ポリペプチドも含まれる。本発明の抗原結合性ポリペプチドは、１つ以上の天然アミノ酸が１つ以上の非天然アミノ酸と複合体化している修飾を有していてもよい。天然の抗ＣＤ３抗体ポリペプチド中の種々のアミノ酸の位置における置換の代表例については、既に説明した。例えば、抗原結合性ポリペプチドの生物活性の１つ以上を調節する置換が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。具体的には、アゴニスト活性の向上、ポリペプチドの溶解性の向上、ポリペプチドのアンタゴニストへの変換などである（ただし、これらに限定されない）。これらの例も、用語「抗ＣＤ３抗体」に含まれる。
【００６５】
「天然にコードされていないアミノ酸」とは、２０種類の通常アミノ酸、またはピロリシンもしくはセレノシステインのうちの１種類ではないアミノ酸を表す。用語「天然にコードされていないアミノ酸」の同義語として用いられうる用語には、「非天然アミノ酸、非天然のアミノ酸("non-natural amino acid," "unnatural amino acid," "non-naturally-occurring amino acid")」、および上記の語にハイフンを付した、またはハイフンを付さない形態がある。用語「天然にコードされていないアミノ酸」には、天然にコードされているアミノ酸（２０種類の通常アミノ酸またはピロリシンおよびセレノシステインなどであるが、これらには限定されない）の修飾（例えば翻訳後修飾）により生じるが、それ自体としては、通常、翻訳複合体によって伸長するポリペプチド鎖に組み込まれることがないアミノ酸も含まれる（ただし、これらに限定されない）。このような非天然のアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニンおよびＯ−ホスホチロシンが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００６６】
「アミノ末端修飾基」とは、ポリペプチドのアミノ末端に付加させることのできる、任意の分子を表す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」とは、ポリペプチドのカルボキシ末端に付加させることのできる、任意の分子を表す。末端修飾基としては、種々の水溶性ポリマー、ペプチドもしくはタンパク質（血清アルブミンなど）、またはペプチドの血清半減期を延長させる他の部分が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００６７】
用語「機能性基」「活性部位」「活性化基」「脱離基」「反応部位」「化学反応基」および「化学反応部位」は、本技術分野および本明細書において、分子中の区別可能かつ定義可能な部分またはユニットを表すために用いられる。これらの用語は、化学の技術分野においては、概ね同じ意味を有している。また、本明細書においては、何らかの機能または活性を有したり、他の分子と反応したりする分子の部分を示すために用いる。
【００６８】
本明細書において、用語「結合(linkage)」または「リンカー」とは、化学反応の結果として通常は形成され、通常は共有結合である、基または結合を表すために用いる。「加水分解に対して安定な結合」とは、当該結合が水中で実質的に安定であり、実用的なｐＨ値において水と反応しないことを意味する（例えば、これらには限定されないが、生理的条件下において長期間（場合によってはいつまでも）反応しない）。「加水分解に対して不安定な結合」または「加水分解に対して分解性の結合」とは、当該結合が水中または水溶液中（例えば血液中）において分解性であることを意味する。「酵素に対して不安定な結合」または「酵素に対して分解性の結合」とは、当該結合が１種類以上の酵素によって分解されうることを意味する。本技術分野において知られているように、ＰＥＧおよび関連ポリマーは、（i）ポリマー骨格中、または（ii）ポリマー骨格と当該ポリマー分子の末端機能性基の１つ以上との間にあるリンカー基中に、分解性の結合を有していてもよい。例えば、ＰＥＧカルボン酸または活性化ＰＥＧカルボン酸と、生物活性を有する薬剤のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合は、通常、生理的条件下において加水分解して、上記薬剤を放出する。他の加水分解に対して分解性の結合としては、（i）カーボネート結合、（ii）アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン結合、（iii）アルコールとリン酸基との反応により形成されるリン酸エステル結合、（iv）ヒドラジドとアルデヒドとの反応産物であるヒドラゾン結合、（v）アルデヒドとアルコールとの反応産物であるアセタール結合、（vi）蟻酸塩とアルコールとの反応産物であるオルトエステル結合、（vii）アミン基（例えば、ＰＥＧなどのポリマー末端にあるが、これには限定されない）と、ペプチドのカルボキシ基によって形成されるペプチド結合、（viii）ホスホラミダイト基（例えば、ポリマーの末端にあるが、これには限定されない）と、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド結合、が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。本発明の抗原結合性ポリペプチドにおいては、分枝のあるリンカーを用いてもよい。
【００６９】
本明細書において用いるとき、用語「生物活性を有する分子」「生物活性を有する部分」または「生物活性を有する薬剤」とは、生体システム、生体経路、生体分子、または生物（例えば、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物およびヒトであるが、これらには限定されない）に関連する相互作用の、何らかの物理的特性または生化学的特性に対して、何らかの影響を与えることができる任意の物質を意味する。具体的には、本明細書において用いるとき、「生物活性を有する分子」には、（i）ヒトまたは他の動物の疾患の診断、治療、緩和、処置または予防を目的とする任意の物質、あるいは、（ii）ヒトまたは動物の肉体的または精神的福祉を改善することを目的とする任意の物質、が含まれる（ただし、これらに限定されない）。生物活性を有する分子の例としては、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬、強い薬(hard drugs)、弱い薬(soft drugs)、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。本発明において好適に用いられる生物活性を有する薬剤の種類としては、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管作用薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、微生物由来の毒素などが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００７０】
本発明の抗ＣＤ３抗体は、ＰＥＧなどの分子と複合して、in vivoにおける送達および薬物動態プロファイルを改善させてもよい。Leong et al.は、抗ＩＬ−８抗体のＦａｂ’断片を部位特異的にＰＥＧ化するによって、抗原結合活性をほとんど（または全く）失うことなく、非ＰＥＧ化状態のものよりもクリアランス速度を低減させた旨を開示している（Leong, S.R. et al. (2001) Cytokine 16:106-119）。
【００７１】
他にも、数多くの切断可能なリンカーが当業者に知られている（米国特許第４，６１８，４９２号、同第４，５４２，２２５号および同第４，６２５，０１４号を参照）。これらのリンカー基から薬剤が放出される機構としては、例えば、光に対して不安定な結合に対する光照射、および酸触媒による加水分解がある。例えば、米国特許第４，６７１，９５８号には、in vivoにおいて、患者の補体系のタンパク質分解酵素によって標的部位で切断されるリンカーを有している、免疫複合体の記載がある。リンカーの長さは、事前に決定されていてもよいし、抗ＣＤ３抗体とこれに連結している分子との間における所望の空間的位置関係に応じて選択してもよい。種々の放射性診断用化合物、放射性治療用化合物、薬物、毒素および他の薬剤を抗体に付加する方法について、数多くの報告がなされており、この視座に立つと、当業者ならば、所定の薬剤を抗ＣＤ３抗体または他のポリペプチドに付加する適切な方法を決定することができるであろう。
【００７２】
「二機能性ポリマー」とは、２つの別々の機能性基を有しているポリマーを表す。この機能性基は、他の部分（例えばアミノ酸の側鎖があるが、これには限定されない）と特異的に反応して、共有結合または非共有結合を形成することができる。（i）特定の生物活性を有する成分が有する基と反応できる一方の機能性基と、（ii）第２の生物学的成分が有する基と反応できる他方の基と、を有している二機能性リンカーを、第１の生物活性を有する成分、二機能性リンカーおよび第２の生物活性を有する成分を含んでいる複合体の形成に使用してもよい。種々の化合物をペプチドに付加するための、多くの手法およびリンカー分子が知られている。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号、同第４，６８０，３３８号、同第４，５６９，７８９号および同第４，５８９，０７１号を参照（参照により本明細書に組み込まれる）。「多機能性ポリマー」とは、２つ以上の別々の機能性基を有しているポリマーを表す。この機能性基は、他の部分（例えばアミノ酸の側鎖があるが、これには限定されない）と特異的に反応して、共有結合または非共有結合を形成することができる。二機能性ポリマーまたは多機能性ポリマーは、任意かつ所望の分子長または分子量であってもよい。また、抗ＣＤ３抗体に連結している分子間において、所望かつ特定の間隙または立体配置を与えるように選択してもよい。
【００７３】
本明細書において用いるとき、用語「水溶性ポリマー」とは、水性溶媒に溶解させられる任意のポリマーを表す。水溶性ポリマーと抗ＣＤ３抗体との結合により、例えば以下のような変化が生じる（ただし、これらに限定されない）：（i）修飾していないものと比較した際の、血清半減期の延長もしくは調節、または治療上の半減期の延長もしくは調節、（ii）免疫原性の調節、（iii）物理的な会合特性の調節（凝集および多量体形成など）、（iv）受容体への結合の改変、および受容体の二量化または多量化の改変。水溶性ポリマーは、それ自体として生物活性を有していてもよいし、有していなくてもよい。また、水溶性ポリマーを、抗ＣＤ３抗体に他の物質を付加するためのリンカーに利用してもよい。他の物質としては、１つ以上の抗ＣＤ３抗体、または１つ以上の生物活性を有する分子が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。好適なポリマーとしては、以下が挙げられる（ただし、これらに限定されない）：ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−プロピオンアルデヒド、ポリエチレングリコールのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシ誘導体またはアリーロキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号に記載。参照により本明細書に組み込まれる）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（硫酸デキストランなど）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(polyoxyethylated polyol)、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、オリゴ糖類、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（例えば、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースがあるが、これらには限定されない）、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコール共重合体およびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、α−β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパラギン酸アミドなど、またはこれらの混合物。このような水溶性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００７４】
本明細書において用いるとき、用語「ポリアルキレングリコール("polyアルキルene glycol," "poly(alkene glycol)")」とは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびこれらの誘導体を表す。用語「ポリアルキレングリコール」には、直鎖ポリマーも分枝ポリマーも含まれる。ポリアルキレングリコールの平均分子量は、０．１ｋＤａ〜１００ｋＤａである。例えば、商業的製造業者のカタログ（Shearwater Corporationのカタログ"Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)など）には、他の例示的実施形態がまとめられている。
【００７５】
本明細書において用いるとき、用語「調節された血清半減期／血清半減期を調節する」とは、修飾した抗ＣＤ３抗体を修飾していないものと比較した際の、循環半減期における正または負の変化を意味する。血清半減期は、抗ＣＤ３抗体投与後の種々の時点において血液サンプルを採取し、各サンプル中の当該分子の濃度を決定することによって測定する。血清濃度と時間とは相関関係にあるので、血清半減期を計算することができる。約２倍以上の血清半減期の延長が望ましいが、例えば充分な投与計画を与えたり毒性効果を防止したりする場合には、より小さな血清半減期の延長も有用でありうる。いくつかの実施形態において、血清半減期の延長は、約３倍以上、約５倍以上または約１０倍以上である。
【００７６】
本明細書において用いるとき、用語「調節された治療上の半減期(therapeutic half-life)／治療上の半減期を調節する」とは、治療上有効な量の（i）抗ＣＤ３抗体、または（ii）修飾された生物活性を有する分子を有している抗ＣＤ３抗体を、修飾していないものと比較した際の、半減期における正または負の変化を意味する。治療上の半減期は、投与後種々の時点における、当該分子の薬物動態学的特性および／または薬力学的特性を測定することによって測定される。治療上の半減期を延長することにより、投与計画または総投与量に特定の利点が与えられたり、望ましくない効果を避けられたりすることが望ましい。いくつかの実施形態においては、効能を増強させたり、修飾された分子の標的に対する結合を強化または弱化させたり、修飾されていない分子の他のパラメータまたは作用機序における増加または減少によって、治療上の半減期が延長される。
【００７７】
用語「単離／単離された」とは、核酸またはタンパク質に使用する場合、当該核酸またはタンパク質が天然の状態では伴っている他の細胞成分を、実質的に含んでいないことを意味する。これは、均質な状態でありうる。単離された物質は、乾燥状態であってもよいし、半乾燥状態であってもよいし、溶液状態であってもよい（例えば水溶液があるが、これには限定されない）。通常は、分析科学の技術（ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィなど）を用いて、純度および均質性を決定する。調製物中に存在する種類のうち趨勢を占めているタンパク質は、実質的に精製されている。具体的には、単離された遺伝子は、当該遺伝子の隣に位置しており、当該遺伝子のもの以外のタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームからは分離されている。用語「精製／精製された」とは、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で実質的に１本のバンドとして現れることを意味する。具体的には、「精製された」とは、核酸またはタンパク質の純度が８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、またはそれを超えることを意味する。
【００７８】
用語「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチド、およびこれらの重合体を表す。「核酸」は、一本鎖の形態であっても二本鎖の形態であってもよい。具体的な限定がない限り、この用語には、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含んでいる核酸も含まれる。このアナログは、比較対象の核酸と同等の結合特性を有しており、天然に生じるヌクレオチドと同様の様式で代謝される。別途具体的に限定されない限り、この用語は、オリゴヌクレオチドアナログ（ＰＮＡ（ペプチド核酸）など）、アンチセンス技術に用いられるＤＮＡアナログ（チオリン酸、アミドリン酸など）、も表す。別途記載のない限り、特定の核酸配列には、明示的に示されている配列に加えて、（i）保存的に改変された変異体（例えば、縮重しているコドンによる置換があるが、これには限定されない）、および（ii）相補的配列も、実質的には含まれる。具体的には、縮重しているコドンによる置換は、１つ以上の（または全ての）選択されたコドンの３番目の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を生成することによって行ってもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【００７９】
本明細書において、用語「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を表すために、互いに可換に使用される。つまり、ポリペプチドに関する記載は、ペプチドに関する記載およびタンパク質に関する記載に対しても、同様に適用される（逆もまた同様）。この用語は、天然に生じるアミノ酸重合体にも、１つ以上のアミノ酸残基が天然にコードされていないアミノ酸であるアミノ酸重合体にも適用できる。本明細書において用いるとき、この用語には、任意の長さのアミノ酸鎖が含まれる（例えば、アミノ酸残基が共有性ペプチド結合で連結されている全長タンパク質（すなわち抗原））。
【００８０】
用語「アミノ酸」とは、天然に生じるアミノ酸および天然に生じないアミノ酸、さらに、これに加えて、天然に生じるアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を表す。天然にコードされているアミノ酸とは、２０種類の通常アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）、ならびにピロリシンおよびセレノシステインである。「アミノ酸アナログ」とは、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造（すなわち、水素、カルボキシ基、アミノ基およびＲ基と結合しているα炭素）を有する化合物を表す（ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなど）。このようなアナログは、修飾されたＲ基を有しているか（ノルロイシンなど）、修飾されたペプチド骨格を有している。しかし、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造は保存されている。
【００８１】
本明細書においては、一般的に知られている３文字の記号によってアミノ酸を表記してもよいし、IUPAC-IUB生化学命名委員会が推奨する１文字の記号によって表記してもよい。同様にヌクレオチドも、一般的に使用されている１文字の記号によって表記してもよい。
【００８２】
「保存的に改変された変異体(conservatively modified variants)」は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列について、「保存的に改変された変異体」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードしている核酸を表す。核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合は、本質的に同一の配列を表す。遺伝暗号の縮重のため、任意の所与のタンパク質をコードしている、機能上同一の核酸が多数ある。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸のアラニンをコードしている。したがって、あるコドンによってアラニンが特定される場所ならばどこでも、コードされているポリペプチドを変化させることなく、当該コドンを任意の上記の対応するコドンと変更することができる。このような核酸の変異が「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。本明細書においては、ポリペプチドをコードしている全ての核酸配列によって、当該核酸の全ての可能なサイレント変異も記載されているものとする。核酸中の各コドンを改変して、機能上同一の分子を得られることを、当業者ならば理解するであろう（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）。したがって、ポリペプチドをコードしている核酸のそれぞれのサイレント変異は、記載されている各配列に実質的に含まれる。
【００８３】
アミノ酸配列について、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加によって、コードされる配列における１個または小さな割合のアミノ酸が変更、追加または削除される場合、これも「保存的に改変された変異体」であることを当業者は理解するであろう（変化の結果、アミノ酸が化学的に類似しているアミノ酸に置換されるならば）。機能的に類似しているアミノ酸を与える、保存的置換の一覧は、本技術分野において周知である。さらに、このような保存的に改変された変異体には、本発明の多形変異体、種間ホモログおよびアレルも含まれる。
【００８４】
下記の８群には、それぞれ、互いに保存的置換されるアミノ酸が記載されている：
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、［Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)］を参照）。
【００８５】
本明細書において用いるとき、用語「被験体」とは、処置、観察または実験の対象となる動物を表し、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００８６】
本明細書において用いるとき、用語「有効量／有効な量」とは、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの投与量によって、処置すべき疾患、状態または障害の症状の１つ以上が、ある程度軽減されることを表す。本明細書に記載の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物は、予防処置、増強処置および／または治療処置のために投与することができる。
【００８７】
用語「増強／増強する("enhance," "enhancing")」とは、所望の効果を、強さまたは持続期間のいずれかの点において、増加または延長させることを意味する。したがって、治療用薬剤の効果の増強に関しては、用語「増強／増強する」とは、あるシステムにおける他の治療用薬剤の効果を、強さまたは持続期間のいずれかの点において、増加または延長させる能力を表す。本明細書において用いるとき、「増強に有効な量」とは、所望のシステムにおける治療用薬剤の効果を増強するために充分な量を表す。患者に関して用いられる場合、このような使用に有効な量は、疾患、障害または状態の重篤度および経過、治療歴、当該患者の健康状態および薬物に対する反応、ならびに処置医の判断に依存する。
【００８８】
本明細書において用いるとき、用語「修飾／修飾された」とは、ポリペプチドにおける翻訳後修飾の存在を表す。「（修飾された）」という用語の形式は、議論されているポリペプチドが、任意構成で修飾されていることを意味する。つまり、議論されているポリペプチドは、修飾されていてもよいし、修飾されていなくてもよい。
【００８９】
用語「翻訳後修飾された」および「修飾された」とは、アミノ酸がポリペプチド鎖中に組み込まれた後に生じる、天然アミノ酸または非天然アミノ酸の任意の修飾を表す。この用語には、翻訳時におけるin vivoでの修飾、翻訳後におけるin vivoでの修飾、および翻訳後におけるin vitroでの修飾、が含まれる（ただし、以上は単なる例示である）。
【００９０】
治療への応用においては、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物を、疾患、状態または障害に既に苛まれている患者に対して、治療に充分な量（または、少なくとも部分的に疾患、障害または状態の症状を抑制する量）だけ投与する。このような量を、「治療上有効な量」と定義する。治療上有効な量は、疾患、障害または状態の重篤度および経過、治療歴、当該患者の健康状態および薬物に対する反応、ならびに処置医の判断に依存する。このような治療上有効な量を、通常の実験（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定可能であると、本技術分野においては理解される。
【００９１】
用語「処置」は、予防処置および／または治療処置のいずれもを表すために用いる。
【００９２】
別途記載のない限り、本技術分野の範囲内にある質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術および薬学の常法が採用される。
【００９３】
〔発明の詳細な説明〕
［序論］
本発明では、１つ以上の非天然アミノ酸を有している、抗ＣＤ３抗体分子を提供する。本発明の特定の実施形態において、１つ以上の非天然アミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体は、１つ以上の翻訳後修飾を有している。一実施形態において、１つ以上の翻訳後修飾には、分子の付加が含まれている。このとき付加される分子としては、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、薬物、第２のタンパク質またはポリペプチドもしくはポリペプチドアナログ、抗体または抗体断片、生物活性を有する薬剤、小分子、または上記の任意の組み合わせ、または他の任意の望ましい化合物または物質、が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。これらの分子は第２の反応基を有しており、第１の反応基を有している上記１つ以上の非天然アミノ酸と反応する。この反応は、特定の反応基に適していると当業者に知られている化学的方法による。例えば、第１の反応基はアルキニル部分であり（例えば、非天然アミノ酸であるｐ−プロパルギロキシフェニルアラニン（プロパルギル基は、時にアセチレン部分とも呼ばれる）中のものがあるが、これには限定されない）、第２の反応基はアジド部分である。この例では、［３＋２］環状付加の化学的方法が利用される。他の例においては、第１の反応基はアジド部分であり（例えば、非天然アミノ酸のｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン中のものがあるが、これには限定されない）、第２の反応基はアルキニル部分である。本発明の修飾された抗ＣＤ３抗体ポリペプチドの特定の実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾にある糖部分において、１つ以上の翻訳後修飾を有している１つ以上の非天然アミノ酸（例えば、ケト機能性基を有する非天然アミノ酸が挙げられるが、これには限定されない）が使用されている。特定の実施形態において、翻訳後修飾は、真核細胞または非真核細胞中で、in vivoにてなされる。
【００９４】
表１は、本発明の抗ＣＤ３抗体の、新規なヒト化可変重鎖配列、ヒト化可変軽鎖配列、ならびにヒト化可変重鎖配列およびヒト化可変軽鎖配列の一覧である。
【００９５】
【表１】
2018535972.tif 000002
【００９６】
2018535972.tif 000003
【００９７】
抗原結合性ポリペプチドと小分子とは、リンカーで連結されていてもよいし、ポリマーで連結されていてもよいし、共有結合で連結されていてもよい。リンカー、ポリマーまたは小分子は、それ自体として、２０種類の通常アミノ酸とは反応しない機能性基を有していてもよい。リンカーまたはポリマーは、二機能性であってもよい。リンカー、ポリマーまたは共有結合を介した抗原結合性ポリペプチドと生物活性を有する分子との連結に関係する１つ以上の結合は、所望の環境下において、不可逆であってもよいし、可逆であってもよいし、不安定であってもよい。リンカー、ポリマーまたは共有結合を介した抗原結合性ポリペプチドと分子との連結に関係している１つ以上の結合は、抗原結合性ポリペプチドまたは他の分子の放出を調節するものであってもよい。種々の小分子は、当業者によって、化学的手段で作製されたものでもよいし、天然の産物として単離されたものでもよいし、他の手段により作製されたものでもよい。
【００９８】
［Rader et al. in Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Apr 29;100(9):5396-400］は、一般抗体(generic antibody)分子と反応させることによって、合成小分子にエフェクター機能を与え、血清半減期を延長させる方法を開示している（参照により本明細書に組み込まれる）。上記文献に開示されている複合体は、mAb 38C2（天然のアルドラーゼ酵素を模倣した触媒抗体）と、インテグリンを標的とするＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド模倣体のジケトン誘導体との間を、抗体上の反応性リシン残基を介して可逆な共有結合で結合することよって創出された。ペプチド模倣体の半減期が延長されただけでなく、この複合体には、インテグリンαｖβ３およびαｖβ５を発現している細胞表面を選択的に標的とするよう、標的の切り替えが認められた。
【００９９】
本発明は、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を有する抗原結合性ポリペプチド（または抗ＣＤ３抗体）に基づいた、方法および組成物を提供する。抗ＣＤ３抗体に１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を導入することにより、特定の化学反応に関係する複合体化の化学への応用が可能となった。このような化学反応は、例えば、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸との間には発生するが、通常生じる２０種類のアミノ酸との間では発生しないものである（ただし、これらに限定されない）。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体は、当該天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）と連結されている。本発明は、タンパク質をＰＥＧ誘導体によって選択的に修飾するための、非常に効率的な方法を提供する。この方法は、遺伝子にコードされていないアミノ酸を選択的に組み込む方法と関係している。遺伝子にコードされていないアミノ酸としては、選択コドンに対応してタンパク質に通常組み込まれる２０種類のアミノ酸には見られない機能性基または置換基（例えば、ケトン部分、アジド部分またはアセチレン部分であるが、これらには限定されない）を有するアミノ酸が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。そしてその結果、アミノ酸はＰＥＧ誘導体と適切に反応して修飾される。一度組み込まれると、次に、当業者に知られている適切な化学的方法によって、天然にコードされているアミノ酸にある特定の機能性基または置換基に対して、アミノ酸側鎖を修飾することができる。様々な種類の公知の化学的方法が、水溶性ポリマーをタンパク質に組み込むにあたって、本発明に好適に用いられる。このような方法としては、限定はされないが、それぞれアセチレン誘導体またはアジド誘導体（ただし、これらには限定されない）との間における、Huisgen［３＋２］環状付加反応（例えば［Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176］を参照）が挙げられる。
【０１００】
Huisgen［３＋２］環状付加法は、求核性置換反応よりも環状付加に関係しているため、タンパク質を非常に高い選択性で修飾することができる。この反応は、触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を反応混合物に加えることによって、水性条件下、室温にて、優れた部位特異性（１，４＞１，５）で発生させることができる（例えば、［Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064; Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599］および国際公開第０３／１０１９７２号を参照）。［３＋２］環状付加によって本発明のタンパク質に付加することができる分子としては、適切な機能性基または置換基（アジド誘導体またはアセチレン誘導体が挙げられるが、これらには限定されない）を有する、実質的にあらゆる分子が挙げられる。これらの分子を、アセチレン基を有する非天然アミノ酸（例えばｐ−プロパルギロキシフェニルアラニンであるが、これには限定されない）、またはアジド基を有する非天然アミノ酸（例えばｐ−アジド−フェニルアラニンであるが、これには限定されない）に、それぞれ付加することができる。
【０１０１】
Huisgen［３＋２］環状付加の結果生じる５員環は、還元性環境下では一般的に不可逆であり、水性環境下でも加水分解に対して長期間安定している。それゆえ、厳しい水性環境下においても、広範な種類の物質の物理的特性および化学的特性を、本発明の活性化ＰＥＧ誘導体により改変することができる。より重要なことには、アジド部分およびアセチレン部分は互いに特異的であるため（また、例えば、遺伝子にコードされている２０種類の通常のアミノ酸のいずれとも反応しないため）、１つ以上の特異的な部位において、非常に高い選択性でタンパク質を修飾することができる。
【０１０２】
本発明はまた、１つ以上のアセチレン部分またはアジド部分を有しているＰＥＧ誘導体および関連する親水性ポリマーの、水溶性で加水分解に対して安定な誘導体を提供する。アセチレン部分を有しているＰＥＧポリマー誘導体は、選択コドンに対応して選択的にタンパク質に導入されたアジド部分と、高い選択性でカップリングする。同様に、アジド部分を有しているＰＥＧポリマー誘導体は、選択コドンに対応して選択的にタンパク質に導入されたアセチレン部分と、高い選択性でカップリングする。
【０１０３】
より具体的に、アジド部分としては、アルキルアジド、アリールアジド、およびこれらのアジドの誘導体が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。アルキルアジドおよびアリールアジドの誘導体は、アセチレンに特異的な反応性が保存されている限り、他の置換基を有していてもよい。アセチレン部分としては、アルキルアセチレンおよびアリールアセチレン、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。アルキルアセチレンおよびアリールアセチレンの誘導体は、アジドに特異的な反応性が保存されている限り、他の置換基を有していてもよい。
【０１０４】
したがって、抗ＣＤ３抗体には、標的分子または抗原に対する特異的な結合能を示す任意のポリペプチドが包含されることが意図される。任意の公知の抗体または抗体断片は、抗ＣＤ３抗体である。
【０１０５】
本発明の抗ＣＤ３抗体は、Ｆｃ領域またはＦｃ様領域を含んでいてもよい。Ｆｃドメインにより、エフェクター機能（補体または貪食細胞など）との連携が得られる。免疫グロブリンのＦｃ部分は血漿半減期が長いのに対し、Ｆａｂは短命である（Capon, et al. (1989), Nature, 337:525-531）。治療用タンパク質と共に構築した場合、Ｆｃドメインはより長い半減期を与えることができる。あるいは、Ｆｃ受容体に対する結合、タンパク質Ａとの結合、補体結合、そして恐らくは胎盤通過などの機能を与えることができる。例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域は、ＣＤ３０−Ｌ（ＣＤ３０受容体を発現しているホジキン病腫瘍細胞、未分化リンパ腫細胞、Ｔ細胞白血病細胞、および他の悪性細胞型と結合する分子）のＮ末端と融合されている（米国特許第５，４８０，９８１号）。抗炎症剤および拒絶反応抑制剤であるＩＬ−１０は、このサイトカインの短い循環半減期を延長させるために、ネズミＦｃγ２と融合されている（Zheng, X. et al. (1995), The Journal of Immunology, 154: 5590-5600）。また、研究によれば、ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質と連結した腫瘍壊死因子受容体を用いて、敗血症性ショック患者（Fisher, C. et al., N. Engl. J. Med., 334: 1697-1702 (1996); Van Zee, K. et al., The Journal of Immunology, 156: 2221-2230 (1996)）および関節リウマチ患者（Moreland, et al. (1997), N. Engl. J. Med., 337(3):141-147）を処置することも調査されている。また、Ｆｃは、ＡＩＤＳ処置用の治療タンパク質を作製するために、ＣＤ４受容体と融合されている（Capon et al. (1989), Nature, 337:525-531）。さらに、インターロイキン２の短い半減期と全身性の毒性とを改善するために、インターロイキン２のＮ末端が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分と融合されている（Harvill et al. (1995), Immunotechnology, 1: 95-105）。
【０１０６】
抗体のＦｃ領域は、単量体のポリペプチド単位から構成されていることがよく知られている。この単量体は、ジスルフィド結合または共有結合性の会合によって、二量体形態または多量体形態に連結することができる。天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間に存在する分子間ジスルフィド結合の本数は、抗体のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）によって、１本〜４本の開きがある。本明細書において用いるとき、用語「Ｆｃ」とは、Ｆｃ分子の単量体形態、二量体形態、多量体形態の総称である。Ｆｃ単量体は、ジスルフィド結合の形成による二量化を阻害するような特定の条件下でない限り、適当なＣｙｓ残基が存在すれば自然に二量化することに留意されたい。仮に、通常はジスルフィド結合を形成するＦｃ二量体中のＣｙｓ残基が除去されたり、他の残基に置換されたりしていたとしても、単量体鎖は、通常、非共有結合性相互作用によって二量化する。本明細書において、用語「Ｆｃ」とは、以下の形態の全てを意味するために用いる：天然の単量体、天然の二量体（ジスルフィド結合で連結）、改変二量体（ジスルフィド結合および／または非共有結合で連結）、および改良単量体（すなわち誘導体）。
【０１０７】
例えば、残基を様々に置換させたり、天然にコードされていないアミノ酸を有する配列を作製したりすることよって、Ｆｃ部分の変異体、アナログまたは誘導体を構築してもよい。ポリペプチド変異体（またはアナログ）としては、１つ以上のアミノ酸残基がＦｃアミノ酸配列に追加された、挿入変異体が挙げられる。挿入は、タンパク質の一端または両端に挿入が位置していてもよいし、Ｆｃアミノ酸配列の中間領域に位置していてもよい。一端または両端に追加の残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたはアミノ酸ラベルを有するタンパク質が含まれうる。例えば、Ｆｃ分子は、Ｎ末端にＭｅｔを任意構成で有していてもよい（とりわけ、細菌細胞（E. coliなど）中で、当該分子を組み換えにより発現させる場合には）。Ｆｃの欠失変異体においては、Ｆｃポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基が除去されている。Ｆｃポリペプチドの一端または両端に欠失が生じていてもよいし、Ｆｃアミノ酸配列中の１つ以上残基が除去されていてもよい。したがって、欠失変異体には、Ｆｃポリペプチド配列の全ての断片が含まれる。Ｆｃの置換変異体においては、Ｆｃポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が除去され、別の残基に置換されている。一態様において、置換は本質的に保存的である。しかし、非保存的な置換もまた、本発明の範囲内にある。例えば、システイン残基を欠失させたり他のアミノ酸で置換したりして、Ｆｃ配列の一部または全部のジスルフィド架橋を阻害することができる。タンパク質が１つ以上のシステイン残基を有しているならば、当該システイン残基のそれぞれを除去してもよいし、あるいは当該システイン残基の１つ以上を他のアミノ酸（ＡｌａもしくはＳｅｒ、または天然にコードされていないアミノ酸など）で置換してもよい。他の例としては、以下の目的で、改変によりアミノ酸の置換を導入してもよい：（１）Ｆｃ受容体結合部位の除去、（２）補体（Ｃｌｑ）結合部位の除去、および／または（３）抗体依存−細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）部位の除去。このような部位は、本技術分野において公知である（例えば、ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位については［Molecular Immunology, Vol. 29, No. 5, 633-639 (1992)］を参照）。また、本明細書において用いるとき、任意の公知の置換が「Ｆｃ」の範囲に含まれる。同様に、１つ以上のチロシン残基を、フェニルアラニン残基によって置換してもよい。さらに、他の変異体アミノ酸の挿入、（例えば１〜２５アミノ酸の）欠失、および／または置換も予期されており、本発明の範囲内に包含される。一般的には、保存的なアミノ酸の置換が好ましい。また、変異は、変異アミノ酸の形態を取ってもよい（ペプチド模倣体またはＤアミノ酸など）。
【０１０８】
また、Ｆｃ配列を誘導体化してもよい。すなわち、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外の修飾を施してもよい。修飾は本質的に共有結合性であることが好ましく、その例としては、ポリマー、脂質、他の有機部分および無機部分との間の化学結合が挙げられる。本発明の誘導体は、循環半減期を延長するように作製してもよい。あるいは、ポリペプチドの所望の細胞、組織または器官に対する標的能を向上させるように設計してもよい。完全なＦｃ分子のサルベージ受容体結合ドメインを、本発明の化合物のＦｃ部分として用いることもできる（国際公開第９６／３２４７８号（"Altered Polypeptides with Increased Half-Life"の項目）に記載のように）。本明細書においてＦｃと称される、他の一連の分子群には、国際公開第９７／３４６３１号（"Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives"の項目）に記載のものがある。本段落で引用した２つのＰＣＴ出願公開は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
一実施形態においては、非天然アミノ酸（ｐ−プロパルギロキシフェニルアラニンなど）を有している抗ＣＤ３抗体の組成物が提供される。また、ｐ−プロパルギロキシフェニルアラニンと、さらにタンパク質および／または細胞（ただし、これらに限定されない）とを含んでいる、種々の組成物も提供される。一態様において、非天然アミノ酸であるｐ−プロパルギロキシフェニルアラニンを含んでいる組成物は、直交なｔＲＮＡをさらに含んでいる。非天然アミノ酸は、直交なｔＲＮＡと結合していてもよい（例えば共有結合によってであるが、これには限定されない）。この結合の例としては、（i）アミノ−アシル結合を介した、直交なｔＲＮＡとの共有結合、（ii）直交なｔＲＮＡの末端にあるリボース糖の、３’ＯＨまたは２’ＯＨとの共有結合、などが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【０１１０】
［抗ＣＤ３抗体の抗原または結合対象に対する、抗ＣＤ３抗体の活性および抗ＣＤ３抗体の親和性の測定］
抗ＣＤ３抗体の活性は、標準的なin vitroまたはin vivoのアッセイによって測定することができる。例えば、抗ＣＤ３抗体と結合する細胞または細胞株（例えば、天然の抗ＣＤ３抗体抗原または結合対象を含んでいる細胞、または、抗ＣＤ３抗体抗原または結合対象を組み換えにより産生する細胞であるが、これらには限定されない）を、抗ＣＤ３抗体の結合を評価するために用いることができる。非天然アミノ酸を有している、ＰＥＧ化されていない抗原結合性ポリペプチドまたはＰＥＧ化抗原結合性ポリペプチドに関しては、抗ＣＤ３抗体の抗原または結合対象に対する当該抗ＣＤ３抗体の親和性を、公知の技術を用いて測定することができる（例えば、BIAcore（商標）biosensor（Pharmacia）など）。
【０１１１】
抗ＣＤ３抗体の作製にどのような方法を採用するかにかかわらず、当該抗ＣＤ３抗体は生物活性を評価するアッセイに課せられる。適切な場合には、トリチウム化チミジンアッセイを行って細胞分裂の程度を確認してもよい。しかし、他の生物学的アッセイを所望の活性を確認するために用いてもよい。例えば、抗原の生物活性（酵素活性、増殖活性または代謝活性など）の阻害能を測定する生物学的アッセイによっても、抗ＣＤ３抗体の活性が示される。他のin vitroアッセイを生物活性の確認に用いてもよい。一般的に、抗原の生物活性に対して適切であるときには、生物活性の試験は所望の結果に対する分析を与えるものでなくてはならない。この分析とは、例えば、（改変していない抗ＣＤ３抗体と比較した）生物活性の上昇もしくは減少、（改変していない抗ＣＤ３抗体と比較した）生物活性の変化、受容体との親和性分析、立体配置もしくは構造の変化、または、血清半減期の分析などである。
【０１１２】
アッセイの方法に関する上記の記載の集成は、過度の負担を強いるものではない。また、当業者ならば、所望の最終結果を試験するために有用な、他のアッセイをも認知しているであろう。
【０１１３】
［効能、in vivoにおける機能上の半減期、および薬物動態学的パラメータの測定］
本発明の重要な態様は、抗ＣＤ３抗体（抗ＣＤ３抗体と水溶性ポリマー部分との複合体化を伴うものも、伴わないものも含む）の構築によって獲得された、生物学的半減期の延長である。抗ＣＤ３抗体の血清濃度は急速に低下するため、複合体化もしくは非複合体化抗ＣＤ３抗体およびその変異体による処置に対する、生物学的応答の評価が重要となっていた。好ましくは、本発明の複合体化もしくは非複合体化抗ＣＤ３抗体およびその変異体は、静脈内投与の後でも血清半減期を延長させる。このため、例えばＥＬＩＳＡ法または一次スクリーニングアッセイによる測定が可能となる。in vivoにおける生物学的半減期の測定は、本明細書に記載の方法で行われる。
【０１１４】
天然にコードされていないアミノ酸を有している抗原結合性ポリペプチドの薬物動態学的パラメータは、通常のSprague-Dawleyラット（オス）によって評価できる（処置群あたりＮ＝５動物）。動物に、１匹あたり２５μｇを静脈内に１回投与するか、１匹あたり５０μｇを皮下に１回投与する。そして、事前に決めてある時間経過に沿って、５〜７個程度の血液サンプルを採取する。この時間経過は、水溶性ポリマーと複合しておらず、天然にコードされていないアミノ酸を有している抗原結合性ポリペプチドの場合には、通常、約６時間に及ぶものである。一方、水溶性ポリマーと複合しており、天然にコードされていないアミノ酸を有している抗原結合性ポリペプチドの場合には、通常、約４日間に及ぶものである。抗ＣＤ３抗体の薬物動態学的データは、いくつかの種においてよく研究されており、天然にコードされていないアミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体に関して得られたデータと直接比較することができる。
【０１１５】
本発明に係る抗ＣＤ３抗体の特異的な活性は、種々の公知のアッセイによって測定できる。本発明に係る抗ＣＤ３抗体突然変異タンパク質またはその断片の生物活性は、得られたものであっても精製されたものであっても、本明細書に記載もしくは援用されている方法、または当業者に知られた方法により試験することができる。
【０１１６】
［投与および薬学的組成物］
本発明のポリペプチドまたはタンパク質（１つ以上の非天然アミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体、合成酵素、タンパク質などであるが、これらには限定されない）を、任意で、治療用途に採用してもよい（例えば、適切な薬物学的キャリアと組み合わせて採用するが、これには限定されない）。このような組成物は、例えば、治療上有効な量の化合物と、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤とを含んでいる。このようなキャリアまたは賦形剤としては、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよび／またはこれらの組み合わせが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。製剤は、投与の形態に合うように成される。一般的に、タンパク質を投与する方法は本技術分野においてよく知られており、本発明のポリペプチドの投与にも適用することができる。
【０１１７】
本発明のポリペプチドの１種類以上を含んでいる治療用組成物を、任意で、適当な疾患のin vitroおよび／またはin vivo動物モデルの１つ以上において試験して、効能および組織中での代謝を確認してもよいし、投与量を評価してもよい。この試験は、本技術分野で周知の方法に従う。具体的には、投与量を、活性、安定性、または本明細書における非天然アミノ酸の天然アミノ酸ホモログに対する他の適切な尺度（すなわち比較アッセイ）によって最初に決定することができる（例えば、１つ以上の非天然アミノ酸を有するように改変した抗ＣＤ３抗体と、天然アミノ酸からなる抗ＣＤ３抗体との比較があるが、これには限定されない）。
【０１１８】
投与は、分子と血液または組織細胞とが最終的に接触するような導入に通常使用される、任意の経路によるものであってよい。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは、任意構成で１種類以上の薬学的に許容可能なキャリアを伴って、任意の適切な様式により投与される。本発明に関するポリペプチドを、患者に対して投与する適切な方法が利用可能である。また、特定の経路は、通常、他の経路よりも即効性があり、より効果的な作用または反応をもたらすことができる（ただし、１種類以上の経路を、特定の組成物の投与に使用することができる）。
【０１１９】
薬学的に許容可能なキャリアは、投与する特定の組成物、および当該組成物の投与に用いる特定の方法によって、ある程度決定される。それゆえ、本発明の薬学的組成物の適切な製剤には、様々な種類がある。
【０１２０】
種々の経路によって、ポリペプチド組成物を投与することができる。このような経路としては、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、皮下投与、局所投与、舌下投与または直腸投与が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。（修飾または非修飾の）非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物を、リポソームを用いて投与することもできる。このような投与経路および適切な製剤は、当業者に周知である。
【０１２１】
非天然アミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体を、それ単独でまたは他の適切な成分と組み合わせて、吸入により投与されるエアロゾル製剤とすることもできる（つまり、「噴霧」することができる）。エアロゾル製剤は、加圧可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に配置することができる。
【０１２２】
非経口投与（例えば、関節内経路（関節内へ）、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路および皮下経路など）に好適な製剤としては、水性または非水性の、等張無菌注入溶液が挙げられる。この注入溶液は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象患者の血液と等張に保つ溶質、ならびに、水性および非水性の無菌懸濁液（懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、防腐剤を含有していてもよい）、を含んでいてもよい。包装された抗ＣＤ３抗体製剤は、封入容器内（アンプルおよびバイアルなど）において、１回投与量ずつが封入されていてもよいし、複数回投与分が封入されていてもよい。
【０１２３】
非経口投与および静脈内投与が、好適な投与方法である。とりわけ、天然アミノ酸ホモログによる治療において既に使用されている投与経路（例えば、ＥＰＯ、ＧＨ、抗ＣＤ３抗体、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体、および／または他の任意の薬学的に送達されるタンパク質において典型的に使用される経路であるが、これらには限定されない）は、その投与経路と共に使用されている剤型と併せて、本発明のポリペプチドにとって好適な投与経路および剤型を与える。
【０１２４】
本発明に関して、患者に投与する投与量は、当該患者に長期にわたって有利な治療反応を引き起こさせるのに充分な量である。あるいは、用途によっては、病原体による感染を防止する量、または他の適当な活性を阻害する量でもありうる（ただし、これらに限定されない）。投与量は、（i）具体的なベクターまたは製剤の効果、（ii）採用する非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性または血清半減期、（iii）患者の状態、（iv）処置する患者の体重または体表面積、に応じて決定される。また、１回量は、特定の患者の生活、体質、および、特定のベクター、製剤などの投与に伴う何らかの好ましくない副作用の程度、に応じて決定される。
【０１２５】
疾患（癌、遺伝性疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなどであるが、これらには限定されない）の処置または予防において、投与するベクターまたは製剤の有効な量を決定するにあたっては、循環血漿中のレベル、製剤の毒性、疾患の進行、および／または、（関係のある場合には）抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生が、医師により評価される。
【０１２６】
例えば、７０ｋｇの患者に投与する投与量は、通常、現在使用されている治療用タンパク質の投与量と等価である範囲内であり、本組成物の変化した活性または血清半減期に合わせて調節する。本発明のベクターは、任意の公知の療法によって、状態の処置を補うことができる。このような公知の療法としては、抗体の投与、ワクチンの投与、および、細胞傷害性の物質、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチドアナログ、生体応答調節薬などの投与、が挙げられる。
【０１２７】
本発明の製剤の投与にあたっては、当該製剤のＬＤ−５０もしくはＥＤ−５０によって決定されるペースで投与するか、および／または、種々の濃度の非天然アミノ酸による何らかの副作用を観察することによって決定されるペースで投与する。後者の場合、この観察結果を、患者の体重および全体的な健康状態に適用してもよいが、これには限定されない。１回投与量で投与を完了させてもよいし、投与量を分割して投与を完了させてもよい。
【０１２８】
製剤を注入されている患者が、発熱、悪寒または筋肉痛を訴える場合は、適量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンまたは他の解熱鎮痛剤を投与する。注入に対して発熱、筋肉痛および悪寒などの反応を示す患者は、さらなる注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェンまたはジフェンヒドラミンなど（ただし、これらに限定されない）のいずれかを前投薬する。解熱剤および抗ヒスタミン剤に対する速やかな反応が見られない、より重篤な悪寒および筋肉痛には、メペリジンを使用する。反応の重篤度によっては、細胞注入をのペースを緩めるか、または停止する。
【０１２９】
本発明のヒト抗原結合性ポリペプチドは、哺乳動物の被検体に直接投与することができる。投与は、抗ＣＤ３抗体の被検体への導入に通常使用される、任意の経路による。本発明の実施形態に係る抗ＣＤ３抗体組成物には、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入投与（エアロゾルなどによるが、これには限定されない）、頬側投与（舌下投与を含むが、これには限定されない）、膣内投与、非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、関節内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、脳内投与、動脈内投与または静脈内投与などがあるが、これらには限定されない）、局所投与（すなわち、皮膚表面および粘膜表面への投与であり、気道表面への投与も含む）、ならびに経皮投与に好適であるものが包含される。しかし、任意の所与の症例において、最適な経路は、処置しようとする状態の性質および重篤度によりけりである。投与は、局所的であってもよいし、全身的であってもよい。化合物の製剤は、密封容器内に（アンプルおよびバイアルなど）、１回投与量分だけ格納されていてもよいし、複数回投与量分が格納されていてもよい。本発明の抗ＣＤ３抗体は、薬学的に許容可能なキャリアと一緒に、１回投与量分の注入可能な形態の混合物として調製することができる（溶液、懸濁液またはエマルジョンなどであるが、これらには限定されない）。また、本発明の抗ＣＤ３抗体を、持続注入により投与してもよいし（例えば、浸透圧ポンプなどの小型ポンプを用いるが、これには限定されない）、１回のボーラス投与としてもよいし、徐放性のデポ剤として投与してもよい。
【０１３０】
投与に適した製剤としては、水性または非水性の溶液（無菌等張溶液）があり、これらには、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を等張に保つ溶質を含ませることができる。また、水性または非水性の無菌懸濁液も投与に適した製剤であり、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含ませることができる。溶液および懸濁液は、無菌粉末、無菌顆粒、および上述した類の錠剤から調製することができる。
【０１３１】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含んでいてもよい。薬薬学的に許容可能なキャリアは、投与する特定の組成物、および当該組成物の投与に用いる特定の方法によって、ある程度決定される。それゆえ、本発明の薬学的組成物の適切な製剤（任意構成として、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤を含んでいる）には、様々な種類がある（例えば［Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1985)］を参照）。
【０１３２】
好適なキャリアとしては、以下が挙げられる：緩衝剤（リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩および他の有機酸）；酸化防止剤（アスコルビン酸など）；低分子量のポリペプチド（約１０残基未満）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど）；単糖類、二糖類および他の炭化水素（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；２価金属イオン（亜鉛、コバルトまたは銅など）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；塩を形成する対イオン（ナトリウムなど）；および／または、非イオン性界面活性剤（Tween（商標）、Pluronics（商標）またはＰＥＧなど）。
【０１３３】
本発明の抗ＣＤ３抗体（水溶性ポリマー（ＰＥＧなど）と連結している抗体も含む）は、持続的放出系として（あるいは部分的に持続的放出系として）投与することができる。持続的放出する組成物としては、半透性ポリマー基剤の成形加工品（フィルムまたはマイクロカプセルなどであるが、これらには限定されない）が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。持続的放出する基剤としては、以下のような生体適合性物質が挙げられる：ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)）；エチレン−酢酸ビニル（Langer et al., supra）；または、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）；ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）；ポリグリコリド（グリコール酸の重合体）；ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド無水物重合体（乳酸とグリコール酸との共重合体）；Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体（U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)）；ポリ（オルト）エステル；ポリペプチド；ヒアルロン酸；コラーゲン；コンドロイチン硫酸；カルボン酸；脂肪酸；リン脂質；多糖類；核酸；ポリアミノ酸；アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなど）；ポリヌクレオチド；ポリビニルプロピレン；ポリビニルピロリドン；およびシリコーン。また、持続的放出する組成物は、リポソームに封入された化合物をさらに含んでいてもよい。化合物を含んでいるリポソームは、それ自体として公知の方法により調製される。ＤＥ３，２１８，１２１、［Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)］、［Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)］、ＥＰ５２，３２２、ＥＰ３６，６７６、ＥＰ８８，０４６、ＥＰ１４３，９４９、ＥＰ１４２，６４１、日本国特許出願昭第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号、同第４，５４４，５４５号、ＥＰ１０２，３２４を参照（援用した全ての刊行物および特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３４】
リポソームに封入された抗ＣＤ３抗体は、例えば以下の文献に記載の方法によって調製することができる：ＤＥ３，２１８，１２１、［Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)］、［Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)］、ＥＰ５２，３２２、ＥＰ３６，６７６、ＥＰ８８，０４６、ＥＰ１４３，９４９、ＥＰ１４２，６４１、日本国特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号、同４，５４４，５４５号、ＥＰ１０２，３２４。リポソームの組成および大きさは周知であり、また、当業者はこれを容易に経験的に決定することもできる。リポソームに関するいくつかの例が、例えば、以下に記載されている：［Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995)］、［Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): Medical Applications of Liposomes (1998)］、［Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): Cancer Drug Discovery and Development (2002)］、［Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002)］、［Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002)、Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)］（援用した全ての刊行物および特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３５】
本発明に関して、患者に投与する投与量は、被検体に長期間にわたって有利な反応を引き起こすのに充分な量でなくてはならない。本発明の抗ＣＤ３抗体を非経口的に投与する場合の、投与量あたりの薬学的に有効な量の合計は、通常、約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである（患者の体重あたり）。しかし、投与量は治療上の判断に委ねられている。また、投与頻度も、治療上の判断に委ねられている。ヒトおける使用が認可されている市販の抗ＣＤ３抗体製品よりも、高頻度で投与してもよいし、低頻度で投与してもよい。本発明のＰＥＧ化抗原結合性ポリペプチドは、通常、上述の投与経路のいずれによっても投与することができる。
【０１３６】
［本発明の抗原結合性ポリペプチドの治療的使用］
本発明の抗ＣＤ３抗体ポリペプチドは、広範な種類の障害の処置に有用である。抗ＣＤ３抗体アゴニストまたはアンタゴニストの使用による効果を受けうる障害に苛まれているヒト患者に対して、種々の手段で投与した際に効果的な強さとなるように、抗ＣＤ３抗体を含んでいる薬学的組成物を製剤することができる。抗ＣＤ３抗体アゴニストまたはアンタゴニストによる効果としては、抗増殖、抗炎症、抗ウイルスなどが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。この効果は、状態または疾患そのものに対するものでもよいし、状態または疾患の一部に対するものでもよい。抗ＣＤ３抗体の平均量は変化しうる。とりわけ、適格な医師の推奨および処方に基づいて変化させるべきである。抗ＣＤ３抗体の正確な量は、処置する状態の正確な種類、処置する患者の状態、および組成物中の他の成分などの前提要因を満たすならば、選好の問題である。本発明はまた、治療上有効な量の他の有効成分（抗癌用化学治療薬など）の投与も提供する。当業者ならば、抗ＣＤ３抗体を用いる治療に基づいて、投与量を容易に決定することができる。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は説明のために供されているのであって、特許請求の範囲に係る発明を制限するものではない。
【０１３８】
〔実施例１〕
本実施例では、抗ＣＤ３抗体中に天然にコードされていないアミノ酸を組み込むにあたって、好適な部位を選択するための、数多くある可能な基準群のうちの１群について説明する。
【０１３９】
本実施例で示されるのは、天然にコードされていないアミノ酸を導入するために、抗原結合性ポリペプチド中の好適な部位を選択する方法である。２つの抗ＣＤ３抗体分子から構成される三次元構造、または、抗ＣＤ３抗体の二次構造、三次構造もしくは四次構造を利用して、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を導入しうる好適な位置を決定する。
【０１４０】
以下の基準は、天然にコードされていないアミノ酸を導入するにあたって、抗ＣＤ３抗体の各々の位置を評価するために用いられる。
すなわち、残基は、
（a）抗ＣＤ３抗体の結合を三次元構造の構造解析に基づいて妨げてはならず、また、抗ＣＤ３抗体の二次構造、三次構造または四次構造に基づいて妨げてもならない；
（b）アラニンまたはホモログを用いたscanning mutagenesisによる影響を受けてはならない；
（c）表面に露出していなくてはならず、周囲の残基との間におけるvan der Waals相互作用または水素結合相互作用は最小限にとどめねばならない；
（d）抗ＣＤ３抗体の露出表面の１箇所以上であってもよい；
（e）第２の抗ＣＤ３抗体、または他の分子もしくはその断片の近位に位置する、１または複数の抗ＣＤ３抗体の部位であってもよい；
（f）抗ＣＤ３抗体変異体においては、欠失しているか、可変であるか、のいずれかでなければならない；
（g）天然にコードされていないアミノ酸と置換した結果、保存的に変化しうる；
（h）完全な構造の柔軟性または剛直性を望ましく変化させることによって、抗ＣＤ３抗体自体、または１つ以上の抗ＣＤ３抗体を含む二量体もしくは多量体の立体配置を調節してもよい；
（i）柔軟性の高い領域(highly flexible regions)または構造上固定された領域(structurally rigid regions)のいずれにあってもよい；
（j）相補性決定領域（ＣＤＲ）にあってもよいし、なくてもよい。
【０１４１】
また、抗ＣＤ３抗体分子にＣｘプログラムでさらなる計算を実行し（Pintar et al. Bioinformatics, 18, pp 980）、タンパク質中の各原子について、突出の程度を評価する。その結果、いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体の１つ以上の部位が、天然にコードされていないアミノ酸で置換されている（ただし、これに限定されない）。
【０１４２】
〔実施例２〕
本実施例では、天然にコードされていないアミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体の、E. coliを用いたクローニングおよび発現について詳述する。
【０１４３】
直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を備えている導入翻訳系を用いて、天然にコードされていないアミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体を発現させる。上記Ｏ−ＲＳは、天然にコードされていないアミノ酸とＯ−ｔＲＮＡとを、優先的にアミノアシル化する。その次に、上記翻訳系によって、コードされている選択コドンに対応して、天然にコードされていないアミノ酸が抗ＣＤ３抗体に挿入される。
【０１４４】
改変抗ＣＤ３抗体遺伝子と、直交なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対（所望の天然にコードされていないアミノ酸に対して特異的である）とを含んでいるプラスミドを用いてE. coliを形質転換することによって、抗ＣＤ３抗体に、部位特異的に天然にコードされていないアミノ酸を組み込むことができる。形質転換させたE. coliを、３７℃にて、特定の天然にコードされていないアミノ酸を０．０１〜１００ｍＭ含んでいる培地で培養することにより、高い正確性および効率で改変抗ＣＤ３抗体を発現させる。Ｈｉｓタグを付加した天然にコードされていないアミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体を、E. coli宿主細胞に産生させる。産生物は、封入体として得られるか、会合体として得られる。会合体は可溶化させ、変性環境下において（６Ｍ  塩酸グアニジン）、親和性により精製する。透析法によって、タンパク質を再度折り畳ませる（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０μＭ  ＣｕＳＯ４および２％（w/v）サルコシル中で、４℃にて一晩）。次に、得られた物質を、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＣａＣｌ２中で透析し、その後Ｈｉｓタグを除去する（［Boissel et al., (1993) 268:15983-93］を参照）。抗ＣＤ３抗体の精製方法は周知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタン・ブロット分析、またはエレクトロスプレーイオン化−イオントラップ質量分析などにより確認することができる。
【０１４５】
［発現／抑制］
（パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）による抑制）
公知の標準的なプロトコルに則って、E. coliのアンバー変異を抑制した。要約すると、E. coliのペリプラズムにおいて抗体断片（ｓｃＦｖおよびＦａｂ）を抑制するために、次の操作を施した。まず、発現ベクターコンストラクト（M. jannaschii由来の直交なチロシルｔＲＮＡ合成酵素（MjTyrRS）をコードしているプラスミド）により、E. coli宿主細胞を形質転換させた。一晩後、ＬＢ（Luria-Bertani）培地またはSuperbrothを入れたフラスコ内で、振盪しながら細菌培地を１：１００に稀釈した。そして、３７℃にて、ＯＤが０．８程度となるまで培養した。ＦａｂおよびｓｃＦｖの発現を誘導した。また、パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）を最終濃度４ｍＭとなるように加えて、アンバーコドンを抑制した。培地を２５℃にて一晩インキュベートした。
【０１４６】
（aa9.2による抑制）
このアミノ酸に特異的である、M. jannaschii由来の直交なチロシルｔＲＮＡ合成酵素を用いた以外は、ｐＡｃＦと同様の方法によって、アンバー変異をｐＡｃＦ誘導体（aa9.2）によって抑制した。誘導の際に、aa9.2を４ｍＭ加えることによって抑制した。
【０１４７】
［タンパク質の抽出および精製］
遠心分離により細胞を回収し、１００μｇ／ｍＬのリゾチームを添加したペリプラズム放出バッファ（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、２０％  スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）中で再懸濁した。その後、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離の後、上清中の抗体断片を、当該抗体断片のＨｉｓタグを利用してProBindビーズ（Invitrogen; Carlsbad, CA）上に固定した。ビーズを結合バッファでよく洗った後、結合している断片を０．５Ｍのイミダゾールでビーズから溶離させた。精製した断片は、保存バッファ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、５％  スクロース；ｐＨ７．８）中で透析した。細胞質中で発現しているｓｃＦｖ断片の小規模な分析のために、１５ｍＬの培地中にいるE. coliを遠心分離により回収した。その後、１０μｇ／ｍＬのＤＮＡアーゼを添加した１ｍＬの溶解バッファ（B-PER, Pierce Biotechnology; Rockford, IL）中で再懸濁した。混合物を３７℃にて３０分間インキュベートし、Protein Loadingバッファ（Invitrogen; Carlsbad, CA）で１×に稀釈して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１４８】
〔実施例３〕
本実施例では、カルボニルを有するアミノ酸の導入について詳述する。そしてこれに引き続く、アミノオキシを有するＰＥＧとの反応についても詳述する。
【０１４９】
本実施例では、天然にコードされていないケトンを有するアミノ酸が組み込まれている、抗原結合性ポリペプチドの作製方法を示す。このケトンを有するアミノ酸は、その後、アミノオキシを有するＰＥＧ（分子量：約５，０００）と反応する。実施例１の基準によって特定される残基のそれぞれを個別に、下記の構造を有する天然にコードされていないアミノ酸で置換する。
【０１５０】
【化１】
2018535972.tif 000004
【０１５１】
改変後、カルボニルを有するアミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体変異体を、アミノオキシを有するＰＥＧ誘導体（構造は下記）と反応させる。
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２。
【０１５２】
式中、Ｒはメチルであり、ｎは３であり、Ｎの分子量は約５，０００である。ｐ−アセチルフェニルアラニンを有している抗ＣＤ３抗体を精製し、（i）２５ｍＭのＭＥＳ（Sigma Chemical, St. Louis, MO；ｐＨ６．０）、（ii）２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（Sigma Chemical, St. Louis, MO；ｐＨ７．０）、または（iii）１０ｍＭの酢酸ナトリウム（Sigma Chemical, St. Louis, MO；ｐＨ４．５）に溶解させる（濃度１０ｍｇ／ｍＬ）。この溶液を、アミノオキシを有するＰＥＧの１０〜１００倍過剰量と反応させる。そして、そして、室温にて１０〜１６時間攪拌する（Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475）。次に、ＰＥＧ−抗ＣＤ３抗体を適当なバッファで稀釈して、直ちに精製して分析する。
【０１５３】
〔実施例４〕
アミド結合を介してＰＥＧと連結しているヒドロキシルアミン基を有している、ＰＥＧとの複合体化。
【０１５４】
下記の構造を有しているＰＥＧ試薬を、実施例３に記載の方法によって、天然にコードされていないケトンを有するアミノ酸とカップリングさせる。
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２。
【０１５５】
式中、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、Ｎの分子量は約２０，０００である。反応、精製および分析の条件は、実施例３に記載の通りである。
【０１５６】
〔実施例５〕
本実施例では、抗ＣＤ３抗体中への、２種類の異なる天然にコードされていないアミノ酸の導入について詳述する。
【０１５７】
本実施例では、天然にコードされていないケトン機能を有するアミノ酸が２箇所に組み込まれている、抗原結合性ポリペプチドの作製方法を示す。組み込みの位置は実施例１に従って特定されており、Ｘ＊は天然にコードされていないアミノ酸を表している。抑制コドンを核酸中の２箇所の異なる部位に導入する以外は、実施例１および２に記載の通りにして、抗原結合性ポリペプチドを作製する。
【０１５８】
〔実施例６〕
本実施例では、抗原結合性ポリペプチドと、ヒドラジドを有するＰＥＧとの複合体化について詳述する。また、これに引き続くin situでの還元についても手術する。
【０１５９】
実施例２および３に記載の手順に従って、カルボニルを有するアミノ酸が組み込まれている抗原結合性ポリペプチドを作製する。改変後、ヒドラジドを有するＰＥＧ（構造は下記）を、抗ＣＤ３抗体と複合体化させる。
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２。
【０１６０】
式中、Ｒはメチルであり、ｎは２であり、Ｎの分子量は１０，０００であり、Ｘはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。ｐ−アセチルフェニルアラニンを有している抗ＣＤ３抗体を精製し、（i）２５ｍＭのＭＥＳ（Sigma Chemical, St. Louis, MO；ｐＨ６．０）、（ii）２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（Sigma Chemical, St. Louis, MO；ｐＨ７．０）、または（iii）１０ｍＭの酢酸ナトリウム（Sigma Chemical, St. Louis, MO；ｐＨ４．５）に溶解させる（濃度０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ）。この溶液を、ヒドラジドを有しているＰＥＧの１〜１００倍過剰量と反応させる。そして、１ＭのＮａＣＮＢＨ３ストック（Sigma Chemical, St. Louis, MO；最終濃度１０〜５０ｍＭ；Ｈ２Ｏ中に溶解）を加えて、対応するヒドラゾンをin situで還元する。反応は、遮光下、４℃〜室温にて、１８〜２４時間行わせる。１ＭのＴｒｉｓ（Sigma Chemical, St. Louis, MO；ｐＨ約７．６；Ｔｒｉｓの最終濃度５０ｍＭまたは適当なバッファで稀釈）を加えて反応を停止させ、直ちに精製する。
【０１６１】
〔実施例７〕
本実施例は、抗ＣＤ３抗体中への、アルキンを有しているアミノ酸の導入について詳述する。また、ｍＰＥＧ−アジドによる誘導体化についても詳述する。
【０１６２】
実施例１に従って特定される任意の残基を、下記の天然にコードされていないアミノ酸で置換する。
【０１６３】
【化２】
2018535972.tif 000005
【０１６４】
プロパルギルチロシンを有している抗ＣＤ３抗体を精製して、ＰＢバッファ（１００ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；ｐＨ８）中に溶解させる（濃度０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ）。この反応混合物に、アジドを有しているＰＥＧを１０〜１０００倍過剰量加える。次に、反応混合物に、触媒量のＣｕＳＯ４および銅線を加える。混合物をインキュベートした後（例えば、室温もしくは３７℃にて約４時間、または４℃にて一晩であるが、これには限定されない）、Ｈ２Ｏを加えて、混合物を透析膜で濾過する。実施例３に記載の手順と同様の手順によって（ただし、これに限定されない）、サンプルを分析することができる。
【０１６５】
本実施例におけるＰＥＧの構造は、以下である。
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３。
【０１６６】
式中、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、Ｎの分子量は１０，０００である。
【０１６７】
〔実施例８〕
本実施例では、抗ＣＤ３抗体中の疎水性大型アミノ酸の、プロパルギルチロシンによる置換について詳述する。
【０１６８】
抗ＣＤ３抗体の配列中に存在する、Ｐｈｅ残基、Ｔｒｐ残基またはＴｙｒ残基を、実施例７に記載の通りに、下記の天然にコードされていないアミノ酸で置換する。
【０１６９】
【化３】
2018535972.tif 000006
【０１７０】
改変後、アルキンを有するアミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体変異体に、ＰＥＧを付加する。このＰＥＧの構造は以下であり、カップリングの手順は実施例７に記載のものに準じる。
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３。
【０１７１】
これによって、（i）天然に生じる疎水性大型アミノ酸とほぼ等価である、天然にコードされていないアミノ酸を有しており、（ii）ポリペプチド中の別々の部位においてＰＥＧ誘導体で修飾されている、抗ＣＤ３抗体変異体が作製される。
【０１７２】
〔実施例９〕
本実施例では、１つ以上のＰＥＧリンカーによって隔てられている、抗ＣＤ３抗体のホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体またはヘテロ多量体の作製について詳述する。
【０１７３】
実施例７により作製される、アルキンを有している抗ＣＤ３抗体変異体を、二機能性ＰＥＧ誘導体（構造は下記）と反応させる。
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３。
【０１７４】
式中、ｎは４であり、ＰＥＧの平均分子量は５，０００程度である。反応により、対応する抗ＣＤ３抗体のホモ二量体を作製する。この二量体では、２つの抗ＣＤ３抗体分子がＰＥＧによって物理的に隔てられている。同様の手法により、抗原結合性ポリペプチドを１つ以上の他のポリペプチドとカップリングさせて、ヘテロ二量体、ホモ多量体またはヘテロ多量体を形成させることができる。カップリング、精製および分析は、実施例７および３と同様に行う。
【０１７５】
〔実施例１０〕
本実施例では、天然にコードされていないアミノ酸を有している抗ＣＤ３抗体、およびＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体の、in vitroおよびin vivoにおける活性の測定方法について説明する。
【０１７６】
［細胞結合アッセイ］
ＰＢＳ／１％  ＢＳＡ（１００μＬ）中で、細胞（３×１０６個）を１組ずつインキュベートする。インキュベーションは、（i）様々な濃度の標識付けしていない抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体またはネガティヴ・コントロール（体積：１０μＬ）の存在下または非存在下、ならびに（ii）１２５Ｉ−抗ＣＤ３抗体（約１００，０００ｃｐｍまたは１ｎｇ）の存在下で、０℃にて９０分間行う（総体積：１２０μＬ）。次に、細胞を再懸濁し、３５０μＬのプラスチック製遠心チューブ中で氷冷したＦＣＳ（２００μＬ）上に積層し、遠心分離する（１０００ｇ；１分間）。チューブの末端を切断してペレットを回収し、ペレットと上清とをそれぞれ別々にガンマカウンター（Packard）で測定する。
【０１７７】
特異的な結合（ｃｐｍ）は、競合対象の非存在下における全結合（２組のうちの片方の平均）から、１００倍過剰量の標識付けしていない抗ＣＤ３抗体存在下における結合（非特異的結合；ｃｐｍ）を引いて決定する。使用する細胞型のそれぞれについて、非特異的結合を測定する。異なる日程で同じ１２５Ｉ−抗ＣＤ３抗体調製物を用いて実験を行い、試行結果は内部整合性を示していなくてはならない。結合は、標識付けしていない天然の抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ３抗体の投与量に依存して阻害されるが、ネガティヴ・コントロールによっては阻害されない。天然の１２５Ｉ−抗ＣＤ３抗体の結合に対する、抗ＣＤ３抗体の競合能からは、受容体はいずれの形態をも同程度に認識していることが示唆される。
【０１７８】
［ＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体のin vivoにおける検討］
ＰＥＧ−抗ＣＤ３抗体、非修飾抗ＣＤ３抗体およびバッファ溶液を、マウスまたはラットに投与する。本発明のＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体は、非修飾抗ＣＤ３抗体と比較して、活性が向上しており、半減期も延長されていることが示されると予期される。
【０１７９】
［複合体化抗ＣＤ３抗体、非複合体化抗ＣＤ３抗体およびその変異体の、in vivoにおける半減期の測定］
オスのSprague Dawleyラット（約７週齢）を使用する。投与日に、それぞれの動物の体重を測定する。それぞれ３匹ずつのラットに、体重１ｋｇあたり１００μｇの非複合体化抗ＣＤ３抗体または複合体化抗ＣＤ３抗体サンプルを、尾静脈から静脈内注入する。注入から１分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後および２４時間後に、ＣＯ２により麻酔した状態で、それぞれのラットから５００μＬの血液を採取する。血液サンプルを室温で１．５時間保存した後、遠心分離によって血清を分離する（４℃、１８，０００×ｇにて５分間）。血清サンプルは、分析の日まで−８０℃で保存する。サンプルを氷上で解凍した後、抗ＣＤ３抗体in vitro活性アッセイによって、血清サンプル中の活性な抗ＣＤ３抗体の量を求める。
【０１８０】
〔実施例１１〕
天然にコードされていないアミノ酸を有しているＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体の、ヒトにおける安全性および／または効果の臨床試験。
【０１８１】
［目的］
天然にコードされていないアミノ酸を有しているＰＥＧ化組み換えヒト抗ＣＤ３抗体を皮下投与した際の、同じ標的抗原に対して特異的である市販品と比較した、安全性および薬物動態を比較する。市販品の例としては、Herceptin、Bexxar、Campath、CEA-Scan、Enbrel、Erbitux、Humira、Myoscint、Prostascint、Raptiva、Remicade、ReoPro、Rituxan、Siμlect、Synagis、Verluma、Xolair、Zenapax、ZevalinまたはAvastinがある（すべて登録商標）。
【０１８２】
［患者］
１８人の健康な協力者を、本研究に参加させる（年齢２０〜４０歳；体重６０〜９０ｋｇ）。被験者は、血液学上または血清化学上の臨床的に重要な臨床検査異常値を示さず、尿の毒性スクリーニング、ＨＩＶスクリーニングおよびＢ型肝炎表面抗原のいずれもが陰性である。被験者は、以下の徴候を呈していてはならない：高血圧；あらゆる原発性血液疾患の病歴；重篤な肝疾患、腎疾患、心血管疾患、胃腸疾患、腎尿路生殖器疾患、代謝性疾患、神経疾患の病歴；貧血または発作障害の病歴；細菌もしくは哺乳動物由来の産物、ＰＥＧまたはヒト血清アルブミンに対する既知の感受性；カフェイン含有飲料の常習的かつ重度の消費；他のあらゆる臨床試験への参加、または試験開始前３０日以内の輸血もしくは献血への参加；試験開始前３箇月以内の抗ＣＤ３抗体への曝露；試験開始前７日以内の疾病への罹患；試験前の健康診断、または試験開始前１４日以内の臨床試験評価における重篤な異常。被検者全員について、安全性の評価が可能である。また、薬物動態分析のための血液は、スケジュールに沿って採取する。試験の全体が、施設内倫理委員会の承認および患者の同意の下に行われる。
【０１８３】
［試験デザイン］
本試験は健康な男性協力者を対象とする、フェーズＩ、一施設、オープンラベル、ランダム化、２期クロスオーバー試験である。１８人の被検者を、２種類の処置シーケンス群の一方にランダムに割り振る（１群あたり９人の被検者）。抗ＣＤ３抗体を、２回に分割した投与期間で、上腿に皮下ボーラス注入により投与する。投与するのは、それぞれ等価な投与量の、天然にコードされていないアミノ酸を有しているＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体および選ばれた市販品である。市販品の投与量および投与頻度は、添付文書の指示に従う。市販品を使用する、追加の用量、投与頻度または他の所望のパラメータを、追加の被検者群を含めることによって、本試験に追加してもよい。各投与期間の間には、１４日間のウォッシュアウト期間が挟まれている。２回の投与期間のそれぞれについて、投与の１２時間以上前〜投与後７２時間の間、被験者を試験施設に拘束する。ただし、投与期間の間には拘束しない。ＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体についても、追加の用量、投与頻度または他のパラメータを試験するならば、さらなる被検者群を追加してもよい。抗ＣＤ３抗体の実験対象となる製剤は、天然にコードされていないアミノ酸を有しているＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体である。
【０１８４】
［血液サンプリング］
抗ＣＤ３抗体の投与前後に、静脈への直接穿刺によって一連の血液を採取する。血清中の抗ＣＤ３抗体濃度を検査するために、（i）投与前約３０分、２０分および１０分において（３つのベースラインサンプル）、ならびに、（ii）投与後約３０分、１時間、２時間、５時間、８時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、６０時間および７２時間において、静脈血サンプル（５ｍＬ）を採取する。それぞれの血清サンプルを２等分する。全ての血清サンプルを−２０℃で保存する。血清サンプルは、ドライアイス中に入れて輸送する。空腹時の臨床検査試験（血液検査、血清化学検査および尿検査）を、１日目の初回投与直前、４日目の朝、１６日目の投与直前、および１９日目の朝に実施する。
【０１８５】
［生体分析の方法］
ラジオイムノアッセイ（ＲＡ）法またはＥＬＩＳＡキット法により、血清中の抗ＣＤ３抗体濃度を決定する。
【０１８６】
［安全性の判定］
各投与（１日目および１６日目）の直前、ならびに各投与の６時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に、バイタルサインを記録する。安全性の判定は、有害事象の発生および類型、ならびに臨床検査試験のベースラインからの変化に基づく。さらに、バイタルサイン（血圧を含む）の測定結果および健康診断結果の、試験前からの変化も評価する。
【０１８７】
［データ分析］
投与後の値のそれぞれから、ベースライン抗ＣＤ３抗体濃度の平均値を減じることによって、投与後の血清濃度の値を投与前のベースライン抗ＣＤ３抗体濃度で較正する。ベースライン抗ＣＤ３抗体濃度の平均値は、投与前３０分、２０分および１０分に採取した３つのサンプルに由来する抗ＣＤ３抗体レベルの平均値から求める。投与前の血清中抗ＣＤ３抗体濃度がアッセイの定量レベルに満たない場合には、これを平均値の計算に含めない。薬物動態学的パラメータは、ベースライン抗ＣＤ３抗体濃度で較正した血清濃度データから決定する。Digital Equipment Corporation VAX 8600コンピュータシステムで最新バージョンのBIOAVLソフトウェアを用い、モデルに依存しない方法によって、薬物動態学的パラメータを計算する。以下の薬物動態学的パラメータを求める：ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）；ピーク血清濃度に達した時間（ｔｍａｘ）；線形台形則で計算した、時刻０〜最後の血液サンプリング時（ＡＵＣ０−７２）における濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）；消失速度定数から計算した、消失半減期（ｔ１／２）。消失速度定数は、対数線形な濃度−時間プロットの末端線形領域における連続するデータ点を、線形回帰することによって推定する。それぞれの処置について、薬物動態学的パラメータの平均、標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）を計算する。パラメータの平均値の割合（保存されている製剤／保存されていない製剤）を計算する。
【０１８８】
［安全性の結果］
有害事象の発生は、処置群の間で均等に分布している。ベースライン、試験前の臨床検査試験または血圧からの、臨床的に重要な変化は存在しない。また、試験前の健康診断結果およびバイタルサイン測定からの、特筆すべき変化も存在しない。２つの処置群の間で、安全性プロファイルは類似していなくてはならない。
【０１８９】
［薬物動態の結果］
１８人の被検者全員について、同じ標的抗原に特異的な１種類以上の市販品を１回投与した後の血清中抗ＣＤ３抗体濃度の平均−時間のプロファイル（ベースライン抗ＣＤ３抗体レベルでの較正前）を、同じ時点において測定した天然にコードされていないアミノ酸を有しているＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体のものと比較した。全ての被検者の投与前ベースライン抗ＣＤ３抗体濃度は、正常な生理的範囲に収まっていなければならない。投与前のベースライン抗ＣＤ３抗体濃度の平均から得た血清データによって、薬物動態学的パラメータを決定する。その後、Ｃｍａｘおよびｔｍａｘを決定する。選ばれた１または複数の臨床的比較対象のｔｍａｘの平均は、天然にコードされていないアミノ酸を有しているＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体のｔｍａｘよりも有意に短い。試験に供した市販の抗ＣＤ３抗体製品の消失半減期の値は、天然にコードされていないアミノ酸を有しているＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体の消失半減期と比較して有意に短い。
【０１９０】
本試験は健康な男性被検者に対して実施するものであるが、他の患者集団においても同様の吸収特性および安全性プロファイルが見込まれる（癌もしくは慢性腎不全を有する男性もしくは女性患者、小児腎不全の患者、術前自己貯血が計画されている患者、または待機的手術が予定されている患者など）。
【０１９１】
結論として、健康な男性被検者にとって、１回投与量の天然にコードされていないアミノ酸を有しているＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体の皮下投与は安全であり、耐えうるものである。有害事象の発生、臨床検査値、バイタルサインおよび健康診断結果の比較に基づくと、市販形態の抗ＣＤ３抗体と天然にコードされていないアミノ酸を有しているＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体とは、同等の安全性プロファイルを有する。天然にコードされていないアミノ酸を有しているＰＥＧ化抗ＣＤ３抗体は、患者および医療関係者に対して、多大な臨床上の便益を供与しうるものである。
【０１９２】
〔実施例１２〕
ＦＲ＋細胞株およびＦＲ−細胞株を用いて、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体の親和性および特異性を評価した。葉酸を含まない培地中での培養後にフローサイトメトリー測定を行ったところ、上咽頭癌細胞株（ＫＢ）および卵巣癌細胞株（ＯＶ−９０、ＳＫＯＶ−３）は、ＦＲを過剰発現していた。ＦＲを発現していない腎臓癌細胞株（ＣＡＫＩ−１）および肺胞基底上皮細胞腺癌（Ａ５４９）を、ネガティヴ・コントロールとした。抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体は、ＫＢ細胞（ＦＲ＋）に対して、葉酸と複合体化していない抗体と同等の親和性での結合能を有していた。このことは、抗ＣＤ３Ｆａｂとの複合体化によっては、葉酸受容体に対する結合がほとんど失われないことを示している。同様に、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸は、Jurkat 細胞（ＣＤ３＋）に対して、抗ＣＤ３と同等の親和性で結合した。一方、Ａ５４９細胞（ＦＲ−）に対する結合は見られなかった。
【０１９３】
〔実施例１３〕
次に、ＫＢ細胞およびＯＶ−９０細胞（ＦＲ＋）を用いたin vitro細胞傷害アッセイによって、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体の活性を検討した。ＣＡＫＩ−１細胞およびＡ５４９細胞（ＦＲ−）を対照群とした。活性化ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）と共に細胞を培養し（標的細胞：効果細胞＝１：１０）、様々な濃度の抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸または抗ＣＤ３Ｆａｂのみで処置した。溶解した細胞から放出されるＬＤＨレベルを測定し、さらにCellTiter-GloおよびＦＡＣＳを利用した傷害アッセイを行って、細胞傷害を定量化した。ＰＢＭＣ存在下において、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体は、それぞれ１０ｐＭおよび１００ｐＭのＥＣ５０でＫＢ細胞およびＯＶ−９０細胞を傷害した（図２Ａ、附録図４）。しかし、ＣＡＫＩ−１細胞（図２Ａ）およびＡ５４９細胞（附録図４）は、１００ｎＭの複合体によっても影響を受けなかった。抗ＣＤ３Ｆａｂのみによる処置では、検討した全ての細胞株において無視できる程度の傷害しか誘導されなかった（図２Ａ）。さらに、ＳＫＯＶ−３細胞（図２Ｂ）またはＫＢ細胞（附録図５）を、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体の存在下で、活性化ＰＢＭＣと共に葉酸を含まない培地中で１６時間インキュベートしたところ（標的細胞：効果細胞＝１：１０）、ロゼットが形成された。これは、Ｔ細胞による標的化について、さらなる証拠を提供するものである。これとは対照的に、抗ＣＤ３Ｆａｂは、Ｔ細胞による攻撃に影響を及ぼさず、ＰＢＭＣの非存在下またはＫＢ細胞における凝集は認められなかった（附録図５）。
【０１９４】
〔実施例１４〕
次に、齧歯類において、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体および非複合体化抗ＣＤ３Ｆａｂの薬物動態を検討した。（i）１ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸（ＰＢＳ中）、または（ii）１ｍｇ／ｋｇの非複合体化抗ＣＤ３Ｆａｂを、３匹のラットに静脈内注入により１回投与した。そして、一定間隔で採取した血清を、ＥＬＩＳＡで分析した。抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸も、対応する非複合体化抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体も、いずれも同じ速度で血清濃度が減少した（血清半減期：６０分間、図３Ｄ）。したがって、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸は、非複合体化抗ＣＤ３Ｆａｂと同様の薬物動態であった。このことは、複合体のＰＫプロファイルが、葉酸による誘導体化の影響を受けていないを示している。
【０１９５】
〔実施例１５〕
次に、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異性薬剤のin vivoにおける効果を、メスのNOD-SCIDマウスを用いた異種移植モデルで評価した。動物を低葉酸食で飼育して、二重特異性薬剤の競合するおそれのある、循環血清中の葉酸レベルを低下させた。ＫＢ細胞（ＦＲ＋）またはＡ５４９細胞（ＦＲ−）には、非活性化ヒトＰＢＭＣ（標的細胞：効果細胞＝１：１００）または活性化ヒトＰＢＭＣ（標的細胞：効果細胞＝１：１０）と混合した際に腫瘍形成能がみられ、この混合物をマウスに皮下注射した。したがって、ヒトＰＢＭＣと混合したＫＢ細胞（標的細胞：効果細胞＝１：１０）をマウスに埋入した。その後、同じマウスに、１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸またはＰＢＳを静脈内注射した（腫瘍細胞の埋入と同じ日に開始し、１０日間毎日続けた）。この投与レジメンは、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体の薬物動態学的特性と、二重特異性抗体に関する以前の研究１０に基づいて選択されたものであった。ＰＢＳで処置したマウスにおいては、腫瘍体積の急激な増加が見られた（約５日間で倍増する速度）。これとは対照的に、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸で処置したマウスの腫瘍は、研究の間を通して、辛うじて検出できる程度であった（図３Ａ）。並行研究では、非活性化ヒトＰＢＭＣ（標的細胞：効果細胞＝１：１００）と混合したＫＢ細胞をマウスに埋入した。そして、１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸またはＰＢＳで静脈内処置した（腫瘍細胞の埋入と同じ日に開始し、１０日間毎日続けた）。両群のマウスとも、研究の最初の３０日間、腫瘍体積が減少した。これは恐らく、注入部位におけるＰＢＭＣの高負荷に起因すると思われる。しかし、腫瘍の減少速度は、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸で処置したマウスの方が速かった。研究３５日目以降、ＰＢＳで処置したマウスの腫瘍は、体積が徐々に増加していった。一方、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸で処置したマウスの腫瘍は、辛うじて検出できる程度まで減少した。このことは、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体によれば、活性化Ｔ細胞の非存在下であっても、細胞傷害性Ｔ細胞の攻撃によって腫瘍が排除されることを示している。ＦＲを発現している腫瘍に関して、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体のin vivoにおける選択性を検討するために、Ａ５４９細胞（ＦＲ−）を非活性化ヒトＰＢＭＣ（標的細胞：効果細胞＝１：１００）と混合して、マウスに埋入した。同様の方法でマウスを処置した（１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸を、１０日間続けて静脈内投与）。その結果、処置から２０日後において、ＰＢＳで処置した腫瘍との有意差は認められなかった。上記の全実験を通じて、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸で処置したマウスにも、ＰＢＳで処置したマウスにも、体重の減少または明白な毒性は認められなかった（図３Ｃ、附録図６Ｂ）。さらに、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸を注入したマウスおよび注入していないマウスの、組織病理学的な分析を行った。抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸またはＰＢＳで処置したマウスの腎臓染色像には、Ｔ細胞の侵入は認められなかった。また、他の組織（脾臓、肺および肝臓など）に関しても、処置群と対照群との間で、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色像における明確な病理学的な差異も認められなかった。
【０１９６】
〔実施例１６〕
標準的なペプチド合成装置を用いて、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を行った。ペプチドおよびペプチド複合体は全て、調製用逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）装置（Waters, xTerra C18 10μm; 19 x 250 mm）を用いて精製した。そして、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Waters, X-Bridge C18 5μm; 3.0 x 50 mm）および液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって分析した。Varian 400 MHz NMR分光器を用いて、１Ｈのスペクトルを得た。サンプルは、ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ中を移動させた。１Ｈのシグナルは全て、残留溶媒またはＤＭＳＯ（２．５０ｐｐｍ）をレファレンスとして、ｐｐｍで記録した。スピン結合定数（Ｈｚ）と共に、ｓ：一重線、ｄ：二重線、ｔ：三重線、ｑ：四重線、ｍ：多重線または分解不能、ｂ：幅広線と記載した。タンパク質の質量は、Ambrx質量分析施設（La Jolla, CA）で得た。
【０１９７】
〔実施例１７〕
発現プラスミドの構築、E. coli細胞株W3110B60、タンパク質の産生。
【０１９８】
pET-20b (+)プラスミドおよびpET-24 (+)プラスミド（EMD4Biosciences）から、発現プラスミド（ＡＸＩＤ）を構築した。改変M. jannaschiiｔＲＮＡ合成酵素（ｐＡｃＰｈｅに特異的）からなるアンバー抑制カセットを、ＡＸＩＤのＢａｍＨＩサイト内にクローニングした（タイプＩＩクローニング）。UCHT1 Version.2 Fab CD3配列は、先行文献によって得た１，２。この配列を、ＡＸＩＤベクター内のｐｈｏＡプロモーターの下流、オープンリーディングフレームの中にサブクローニングした。重鎖のリシン１３６（ＨＣ−Ｌｙｓ１３６）を、「ＴＡＧ」のアンバーナンセンスコドンにQuickChangeした（Stratagene）。野生型E. coliのK-12 W3110細胞株（ＡＴＣＣ）を、下記の遺伝子型を有するように相同組み換えによって改変した３：F- IN (rrnD-rrnE) λ- araB::g1 tetA fhuA::dhfr proSW375R::cat。W3110B60ゲノム中にある温度感受性の表現型ｐｒｏＳは、この発現プラスミド中のｐｒｏＳの機能性コピーである、野生型のものによって補った。ベクターをW311B60細胞に形質転換させた。この細胞を、カナマイシン硫酸塩（５０μｇ／ｍＬ）を補った合成培地（２．１Ｌ）中、３７℃、ｐＨ７、４８０〜１２００ｒｐｍのカスケード制御にて、培養槽内で増殖させた。産生フェーズとするために、ＯＤ６００＝３０となった時点でｐＨを６．８に変更し、合成培地を加えた。次に、水に溶解させたｐＡｃＰｈｅ（１００ｇ／Ｌ）を、培養槽に加えた。溶存酸素は３０％を維持するように設定し、攪拌は最初の条件のまま（４８０〜１２００ｒｐｍ）とした。２４時間後、細胞を回収し、UCHT1を細胞から抽出した。UCHT1の抽出は、ＴＥＳバッファ（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  スクロース）中、４：１（v/w）の割合で４℃にてインキュベートし、浸透圧ショックを与えることによって行った。抽出物を遠心分離によって清澄化させ（１８０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）、０．２２ミクロンのフィルタで濾過し、Protein Gカラム（GE healthcare）に装填した。カラムを５倍ベッド体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、１０倍ベッド体積の０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）でタンパク質を溶離させた。各画分は、１０％の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を入れたチューブ中に回収した。集めた画分を、カチオン交換によってさらに精製した（カラム：SP650S（Tosoh Bioscience）、バッファＡ：０．０２Ｍ  リン酸塩（ｐＨ６．０）、バッファＢ：０．０２Ｍ  リン酸塩（ｐＨ６．０）＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ）。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび質量分析により分析した。
【０１９９】
〔実施例１８〕
葉酸−Ｎ１０（ＴＦＡ）−Ｌｙｓリンカー（１）の合成。
【０２００】
【化４】
2018535972.tif 000007
【０２０１】
H-Lys-(Boc)-2-ClTrt-Resin樹脂（Peptide international）から始める標準的な固相ペプチド合成によって、葉酸−Ｌｙｓを合成した４。要約すると、H-Lys-(Boc)-2-ClTrt-Resin樹脂（５００ｍｇ、０．８９ｍＭ）をＤＣＭ（５ｍＬ）で膨潤させた後、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、５ｍＬ）でさらに膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．５等量）、ＨＡＴＵ（１．５等量）およびＤＩＰＥＡ（４．０等量）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。アルゴンで２時間バブリングし、ＤＭＦ（３×３ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（３×３ｍＬ）で樹脂を洗浄した。Kaiserテストにより、カップリング効率を評価した。樹脂をＤＭＦ（３ｍＬ）中で膨潤させた後、プテロイル酸（１．５等量）、ＨＡＴＵ（１．５等量）およびＤＩＰＥＡ（４．０等量）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。アルゴンで２時間バブリングし、ＤＭＦ（３×３ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（３×３ｍＬ）で樹脂を洗浄した。Kaiserテストにより、カップリング効率を評価した。樹脂をＤＣＭ（３ｍＬ）中で膨潤させた後、アルゴン下で乾燥させた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（９５．５：２．５：２．５）カクテルを用いて最終化合物を樹脂から直接切断し（３×５ｍＬ）、ジエチルエーテル（３００ｍＬ）を入れた丸底フラスコ中にて、沈殿した粗生成物を得た。濾過および乾燥を経た後、調製用逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣを用いて粗生成物を精製した（Ｃ１８カラム、０％Ｂ〜５０％Ｂ（２５分間）、バッファＡ：０．１ＴＦＡ（水溶液）、バッファＢ：０．１ＴＦＡ（アセトニトリル溶液）、λ＝２８０ｎｍ）。ＡＣＮを真空下で除去し、精製された画分を乾燥凍結して、淡黄色固体の１を得た。
1H NMR (ＤＭＳＯ-d6/D2O): δ 1.18 (m, 2H, Pep-H); 1.45 (m, 1H, Pep-H); 1.54 (m, 3H, Pep-H); 1.81 (m, 1H, Pep-H); 1.95 (m, 1H, Pep-H); 2.11 (m, 2H, Pep-H); 2.88 (m, 2H, Pep-H); 3.94 (m, 1H, Lys-αH); 4.12 (m, 1H, Glu-αH); 4.46 (s, 2H, Pte-H); 6.61 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Pte-Ar-H); 7.56 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Pte-Ar-H); 8.60 (s, 1H, Pte-Ar-H)
LC-MS (M + H)+: calcd for C27H30F3N9O8 = 665.6; found = 666.0 g/mol。
【０２０２】
〔実施例１９〕
フタルイミド−ＰＥＧ４−ＣＯＯＨの合成。
【０２０３】
【化５】
2018535972.tif 000008
【０２０４】
トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ、２１６．７ｍｇ、０．８２６ｍｍｏｌ）およびジエチルアゾジカルボキシラート（ＤＥＡＤ、１４３．９ｍｇ、０．８２６ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）に溶解させた溶液に、０℃、アルゴン雰囲気下にて、無水ＴＨＦに溶解させたｔＢｕＯＯＣ−ＰＥＧ４−ＯＨ（２００．０ｍｇ、０．７５１ｍｍｏｌ）を加えた。攪拌しながら１５分間反応させた後、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１３４．８ｍｇ、０．８２６ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液を、１０分間かけて加えた。反応混合物を、室温、アルゴン雰囲気下にて１２時間攪拌した。真空下で溶媒を除去した後、粗生成物にＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（９５：２．５：２．５；５ｍＬ）を加えた。そして、室温にて１時間攪拌して、ｔｅｒｔ−ブチル基の保護を外した。最終生成物を、フラッシュクロマトグラフィで精製した（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１）。精製された画分を一纏めにし、その溶媒を真空下で蒸発させて、油状液体の最終産物を得た。
1HNMR (CDCl3): δ 2.63 (m, 2H); 3.59~3.65 (m, 14H); 3.88 (m, 2H); 4.38 (m, 2H); 7.75 (m, 2H), 7.84 (m, 2H)
LC/MS (ESI) (m/z): (M + H )+ calcd. for C19H25NO9, 411.4, found, 411.4 g/mol。
【０２０５】
〔実施例２０〕
フタルイミド−ＰＥＧ４−ＮＨＳ（２）の合成。
【０２０６】
【化６】
2018535972.tif 000009
【０２０７】
ＨＯＯＣ−ＰＥＧ４−Ｏ−Ｎ−フタルイミド（５０ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、１５．４ｍｇ、０．１３４ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１．５ｍｇ、０．０１２２ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶解させた溶液に、アルゴン雰囲気下で、無水ＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶解させたエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、２０．８ｍｇ、０．１３４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温、アルゴン雰囲気下にて４時間攪拌した。その後、フラッシュクロマトグラフィによって精製して（ヘキサン：ＤＣＭ＝１：１）、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｏ−Ｎ−フタルイミドを得た。精製された画分を一纏めにし、その溶媒を真空下で蒸発させて、油状液体の最終産物を得た。
1HNMR: δ 2.90 (t, J=6.4, 2H); 2.75 (bs, 4H); 3.56~3.63 (m, 12H), 3.83~3.87 (m, 4H), 4.37 (t, J=4.5, 2H); 7.75 (m, 2H), 7.83 (m, 2H)
LC/MS (ESI) (m/z): (M + H)+ calcd. for C23H28N2O11, 508.5, found, 509.0 g/mol。
【０２０８】
〔実施例２１〕
葉酸−Ｌｙｓ−ＰＥＧ４−フタルイミド（３）の合成。
【０２０９】
【化７】
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【０２１０】
ＮＨＳ−ＯＣ−ＰＥＧ４−Ｏ−Ｎ−フタルイミド（２１ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）および葉酸−Ｎ１０（ＴＦＡ）−Ｌｙｓ（２５ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（３００μＬ）に溶解させた溶液に、アルゴン雰囲気下で、ＤＩＰＥＡ（１０１．４μＬ、０．６０１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて２時間攪拌し続けて、反応の進行をＬＣ／ＭＳで追跡した。調製用ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、最終産物を精製した（Ｃ１８カラム、０％Ｂ〜５０％Ｂ（２５分間）、バッファＡ：０．１ＴＦＡ（水溶液）、バッファＢ：０．１ＴＦＡ（アセトニトリル溶液）、λ＝２８０ｎｍ）。ＡＣＮを真空下で除去した後、精製された画分を凍結乾燥して、淡黄色の固体を得た。
LC/MS (ESI) (m/z): (M + H )+ calcd. for C46H53F3N10O16, 1058.9, found, 1059.0 g/mol。
【０２１１】
〔実施例２２〕
葉酸−Ｌｙｓ−ＰＥＧ４−アミノオキシリンカー（４）の合成。
【０２１２】
【化８】
2018535972.tif 000011
【０２１３】
葉酸−Ｎ１０（ＴＦＡ）−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−フタルイミド（３０ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させた溶液に、ヒドラジン（１３μＬ、０．４２ｍｍｏｌ）を加えた。反応時のｐＨは、ｐＨ９．３５に維持した。ＬＣ／ＭＳにより、フタルイミド基およびＴＦＡ基の脱保護を監視した。調製用逆相ＨＰＬＣを用いて、葉酸−Ｌｙｓ−ＰＥＧ４−アミノオキシリンカーを精製した（Ｃ１８カラム、０％Ｂ〜５０％Ｂ（２５分間）、バッファＡ：０．１ＴＦＡ（水溶液）、バッファＢ：０．１ＴＦＡ（アセトニトリル溶液）λ＝２８０ｎｍ）。ＡＣＮを真空下で除去した後、精製された画分を凍結乾燥して、黄色の固体を得た。
1H NMR (DMSO-d6/ D2O) δ 1.88 (m, 1H, Pep-H); 2.03 (m, 1H, Pep-H); 2.15 (t, J = 7.4, 2H); 2.28 (t, J = 6.4, 2H); 3.05 (m, 4H); 3.20-3.60 (m, xH ); 3.94 (m, 1H, Lys-αH); 4.23 (m, 1H, Glu-αH); 4.48 (s, 2H, Ptc-H); 6.64 (d, J = 8.8 Hz, 2H, Ptc-Ar-H); 7.64 (d, J = 8.8 Hz, 2H, Ptc-Ar-H); 8.63 (s, 1H, Pte-Ar-H)
LC/MS (ESI) (m/z): (M + H )+ calcd. for C36H52N10O13, 832.9 g/mol, found, 833.0 g/mol。
【０２１４】
〔実施例２３〕
葉酸−抗ＣＤ３への複合体化。
【０２１５】
【化９】
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【０２１６】
ｐＡｃＰｈｅを有している抗ＣＤ３Ｆａｂ（１０ｍｇ、０．２１μｍｏｌ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４、１ｍＬ）に溶解させた溶液を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０、９００μＬ）とバッファ交換した。１Ｍの酢酸ヒドラジド（１００μＬ）を加えた後、葉酸−Ｌｙｓ−ＰＥＧ４−アミノオキシリンカー（１．７ｍｇ、２．１０μｍｏｌ）を反応混合物に加えて、２８℃にて４８時間、振盪しながら（５０ｒｐｍ）インキュベートした。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Zorbax 300SB C3 column, 4.6x150mm; Agilent）によって、反応の進行を監視した。３０％Ｂ〜９０％Ｂの線形勾配で、複合体を溶離させた（Ａ：水および０．１％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡ）。Agilent 1100 seriesＨＰＬＣシステムおよびChemstationソフトウェアを利用して、葉酸−リンカーと複合体化したＦａｂの割合を分析・定量した。反応は４８時間以内に完了し、変換効率は９５％超であった。カチオン交換カラム（SP 650S, Tosoh Biosciences）を用いて最終複合体を精製し、ＰＢＳとバッファ交換して、使用まで４℃で保存した。
Expected MS: 48539.64 Da, Observed MS: 48538.89 Da。
【０２１７】
〔実施例２４〕
in vitroにおける効果の研究。
【０２１８】
アッセイに使用する前に、標的細胞であるＫＢ細胞、ＯＶＣＡＲ−３細胞、ＳＫＯＶ−３細胞およびＯＶ−９０細胞を、葉酸を含まないＲＰＭＩ−１６４０（１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加）中で、５代以上継代して維持した。Jurkat細胞およびＡ５４９細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０（１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加）中で維持した。全ての細胞は、５％二酸化炭素、９５％湿度雰囲気下、３７℃にて、単層で増殖させた。
【０２１９】
ＦＲを発現させるために、いずれもR&D systems製の抗ＦＲ−ＰＥ抗体（青）およびＩｇＧ１アイソタイプ−ＰＥコントロール（赤）と共に、４℃にて１時間、細胞をインキュベートした。結合は、フローサイトメトリーにより評価した。ＫＢ細胞またはＡ５４９細胞をＴ７５フラスコに播種し、４８時間にわたって単層を形成させた。トリプシンで分解した後、細胞を遠心チューブに移し（チューブ１本あたり１×１０６細胞）、遠心分離した。葉酸−ＦＩＴＣ濃度が増加系列にある新しい培地に取り換え、４℃にて３０分間インキュベートした。新しい培地（２×１．０ｍＬ）およびＰＢＳ（１×１．０ｍＬ）ですすいだ後、細胞をＰＢＳ（１．０ｍＬ）中に再懸濁した。そして、細胞に結合している蛍光を、フローサイトメーターによって分析した（１サンプルあたり３０，０００細胞）。ＫＢ細胞をＴ７５フラスコ中で平板培養して、４８時間にわたって単層を形成させた。トリプシンで分解した後、分離した細胞を遠心チューブに移し（チューブ１本あたり１×１０６細胞）、遠心分離した。それぞれのチューブ中の使用済みの培地を、新しい培地（０．５ｍＬ）で置き換えた。この新しい培地には、１００ｎＭのＦＡ−ＦＩＴＣと、濃度が増加系列にある抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸（０．１ｎＭ〜０．８ｎＭ）と、が含まれていた。４℃にて３０分間インキュベートした後、細胞を培養培地（２×１．０ｍＬ）およびＰＢＳ（１×１．０ｍＬ）ですすいで、結合していない放射能を全て除去した。次に、細胞をＰＢＳ（０．５ｍＬ）中に再懸濁し、細胞と結合している蛍光をフローサイトメーターで計測した。
【０２２０】
Ficoll Hypaque Plus（GE Heathcare）勾配遠心分離機によって、バフィーコート（San Diego Blood Bank）からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。充分な細胞が単一のドナーから得られない場合は、複数のドナー由来のものを使用した。ただし、in vitroにおける使用でも、in vivoにおける使用でも、これらは互いに分けて（つまり、混合せずに）用いた。ｒｈＩＬ−２（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＧＭＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、aCD3/aCD28 supramagnetic beads（Life Technologies）によってＰＢＭＣを活性化させた。
【０２２１】
細胞傷害アッセイのために、Accutaseで標的細胞をフラスコから剥離させ、Ｕ底の９６ウェルプレートに播種した。活性化ＰＢＭＣ（エフェクター細胞）または非活性化ＰＢＭＣ（エフェクター細胞）を加え、特定の（標的細胞：エフェクター細胞）比において、細胞を標的とさせた。抗ＣＤ３葉酸を完全培養培地で稀釈して共培地に加え、短時間遠心分離にかけた後、５％ＣＯ２、３７℃にて２４時間、プレートをインキュベートした。ＬＤＨの放出による細胞傷害に関しては、Promega製のキットを用いて、製造者の説明書に則ってＬＤＨを測定した。フローサイトメトリーによる細胞傷害に関しては、細胞をＤＩＯ（細胞膜を緑色に染色）で標識付けし、ヨウ化プロピジウムを最終濃度１μｇ／ｍＬで加えた９。ＡＴＰ含有量による細胞傷害に関しては、２４時間後にＰＢＭＣを洗い流し、Cell Titer Glo（Promega）を用いてＫＢ細胞のＡＴＰ含有量を測定した。
【０２２２】
〔実施例２５〕
薬物動態研究。
【０２２３】
抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸および非複合体化ＣＤ３Ｆａｂを、Sprague-Dawleyラット（Charles River Laboratories）に投与した。投与は、静脈内への１回のボーラス注入であった。一定間隔で血液を採取し、ＥＬＩＳＡによってラット血清中の抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸を定量した。時間vs.血清濃度を、複合体の薬物動態特性の指標とした。
【０２２４】
〔実施例２６〕
in vivoにおける効果の研究。
【０２２５】
６〜８週齢のメスのNOD-SCIDマウスを、TSRI animal facilitiesまたはThe Jackson Laboratoryから購入した。研究に先立ち、これらのマウスを、葉酸欠乏・γ線照射特別食（Teklad）で２週間以上飼育した。動物は１ケージ当たり５匹を飼育し、バリアシステム内で病原体を保有させず、棚に覆いを被せた状態においた。食餌およびオートクレーブ処理した水道水は、無制限に摂取させた。マウスのそれぞれの個体は、尾の付根のタトゥーまたは耳の穿孔によって区別した。動物に対する扱いは全て、The Scripps Research Institute Animal CareおよびAmbrx, Inc. Animal Care and Use Committeeの承認を受けている。また、動物の扱いはnational and international guidelines for the humane treatment of animalsに則った。
【０２２６】
腫瘍細胞（マウス１匹あたり５×１０５個のＫＢ細胞）を、特定の（標的細胞：エフェクター細胞）比で、活性化ＰＢＭＣまたは非活性化ＰＭＢＣと混合した。この混合物を、左脇腹に２００μＬ皮下注射して埋入した。１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸またはＰＢＳを、１日に１回（合計１０回）静脈内注射して動物を処置した（黒矢印）。この処置は腫瘍細胞の埋入と同じ日に開始し、週末に対応させるため、時折２日間の投与停止期間を設けた。腫瘍の増殖は、週に２回、互いに垂直な２方向の長さを測定することによって監視した。腫瘍の体積は、次の式によって推定した：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２  （式中、Ｖは体積、Ｗは最短径、Ｌは最長径である）。体重は、マウスを電子天秤に載せて測定した。群の平均腫瘍サイズが１，０００ｍｍ３程度に達するか、または投与開始から３５日目に達したときの、いずれか早かった時点で実験を終了した。
【０２２７】
免疫組織化学分析に関して、イソフルランによって動物を致死させ、腫瘍および種々の器官を摘出し、ホルマリン−亜鉛中で一晩固定した。組織をパラフィンに包埋し、染色用の薄片を作製した。常法に則り、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を施した。スライドは、Leicaスキャナでスキャニングした。
【０２２８】
本明細書に記載の実施例および実施形態は説明のみを目的としており、当業者にとっては、これらの実施例および実施形態を考慮に入れた多様な改変または変更が示唆されていることを理解されたい。そして、このような改変または変更も、本出願の趣旨および範囲に含まれ、添付の特許請求の範囲に含まれることも理解されたい。本明細書で援用した刊行物、特許および特許出願の全ては、その全体があらゆる目的において、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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