(57)【要約】  生物学的試料又は非生物学的試料中のリファンピシン耐性結核菌（ＭＴＢ）（ＭＴＢ−ＲＩＦ）及び／又はイソニアジド耐性ＭＴＢ（ＭＴＢ−ＩＮＨ）の存在又は非存在の迅速な検出方法が提供される。本方法は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、及び検出工程を行うことを含むことができる。更に、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの検出のために設計されたキットと共に、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ遺伝子を標的化するプライマー、プローブが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のリファンピシン耐性結核菌（ＭＴＢ）（ＭＴＢ−ＲＩＦ）及び／又はイソニアジド耐性ＭＴＢ（ＭＴＢ−ＩＮＨ）を検出する方法であって、
−試料を、少なくとも一組のｒｐｏＢプライマー、一組のｉｎｈＡプライマー、及び一組のｋａｔＧプライマーと接触させ、もしｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的核酸のいずれかが試料中に存在するならば、１又は複数の増幅産物を生成することを含む、増幅工程を実行すること、
−該１又は複数の増幅産物を、少なくとも以下を含む、複数の検出可能なｒｐｏＢプローブ、複数の検出可能なｉｎｈＡプローブ、及び複数の検出可能なｋａｔＧプローブと接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を実行すること、
−ＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個の一塩基多型ＳＮＰの１又は複数の検出のための１７種のｒｐｏＢプローブ；
−ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの１又は複数の検出のための３種のｉｎｈＡプローブ；及び
−ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの１又は複数の検出のための４種のｋａｔＧプローブ；並びに
−該１又は複数の増幅産物の存在又は非存在を検出すること
を含み、
ここで、該１又は複数の増幅産物の存在は、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在の指標であり、且つ該１又は複数の増幅産物の非存在は、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの非存在の指標であり；
ここで、該複数のｒｐｏＢプローブは、ｒｐｏＢ  ５３１Ｌ、ｒｐｏＢ  ５３１Ｗ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｄ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｎ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｌ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｋ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｑ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｗ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｖ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５３３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５１１Ｐ、及びｒｐｏＢ  ５２６Ｒを含む、ＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個のＳＮＰの各々の検出のための、加水分解プローブを含み；
ここで、該複数のｉｎｈＡプローブは、ｉｎｈＡ−１５Ｔ、ｉｎｈＡ−８Ａ、及びｉｎｈＡ−８Ｃを含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含み；
ここで、該複数のｋａｔＧプローブは、ｋａｔＧ  ３１５Ｉ、ｋａｔＧ  ３１５Ｎ、ｋａｔＧ  ３１５Ｔ、及びｋａｔＧ  ３１５Ｔ２を含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含む、
方法。
【請求項２】
−ｒｐｏＢプローブが、配列番号１〜２８９及び４３７〜４３８、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含み；
−ｉｎｈＡプローブが、配列番号３４４〜４０９及び４３６、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含み；並びに
−ｋａｔＧプローブが、配列番号２９０〜３４３及び４３４〜４３５、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
複数の検出可能なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブの各々が、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分により標識され；
ここで、前記検出工程が、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブの１又は複数のドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで蛍光放出の存在又は非存在は、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在又は非存在の指標である、請求項１及び２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
前記増幅が、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記ドナー及びアクセプター蛍光部分が、互いに該プローブ上の８ヌクレオチド以下の範囲内に位置する、請求項３又は４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記アクセプター蛍光部分がクエンチャーである、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
リファンピシン耐性の結核菌（ＭＴＢ）（ＭＴＢ−ＲＩＦ）及び／又はイソニアジド耐性のＭＴＢ（ＭＴＢ−ＩＮＨ）の核酸を検出するためのキットであって：
−ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ遺伝子標的の増幅に特異的なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプライマーの複数のセットと、
−ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ増幅産物の検出に特異的な、複数の検出可能なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブであって、
−ＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個のＳＮＰの１又は複数の検出のための１７種のｒｐｏＢプローブ；
−ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの１又は複数の検出のための３種のｉｎｈＡプローブ；並びに
−ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの１又は複数の検出のための４種のｋａｔＧプローブ
を含む、該複数の検出可能なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブと
を備え、
ここで該複数のｒｐｏＢプローブは、ｒｐｏＢ  ５３１Ｌ、ｒｐｏＢ  ５３１Ｗ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｄ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｎ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｌ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｋ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｑ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｗ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｖ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５３３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５１１Ｐ、及びｒｐｏＢ  ５２６Ｒを含む、ＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含み；
ここで該複数のｉｎｈＡプローブは、ｉｎｈＡ−１５Ｔ、ｉｎｈＡ−８Ａ、及びｉｎｈＡ−８Ｃを含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの各々の検出のための、加水分解プローブを含み；
ここで該複数のｋａｔＧプローブは、ｋａｔＧ  ３１５Ｉ、ｋａｔＧ  ３１５Ｎ、ｋａｔＧ  ３１５Ｔ、及びｋａｔＧ  ３１５Ｔ２を含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの各々の検出のための、加水分解プローブを含む、
キット。
【請求項８】
−ｒｐｏＢプローブが、配列番号１〜２８９及び４３７〜４３８、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含み、
−ｉｎｈＡプローブが、配列番号３４４〜４０９及び４３６、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含み、並びに
−ｋａｔＧプローブが、配列番号２９０〜３４３及び４３４〜４３５、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
前述の複数の検出可能なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブの各プローブが、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分を含む、請求項７及び８のいずれか一項記載のキット。
【請求項１０】
前記アクセプター蛍光部分がクエンチャーである、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を更に備える、請求項７〜１０のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２】
配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８、又はその相補体からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の改変されたヌクレオチドを含む、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の保存的に改変された変種を含む、請求項１２及び１３のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが４０個以下のヌクレオチドを有する、請求項１２〜１４のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
１又は複数の検出可能な標識を更に含む、請求項１２〜１５のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の標識部分及び／又は少なくとも１個のクエンチャー部分を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ウイルス診断の分野に関し、より具体的には、薬物耐性結核菌 (Mycobacterium Tuberculosis)の検出のために、加水分解プローブを利用するＰＣＲ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
結核（ＴＢ）は、肺において最も頻繁に認められる、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核菌）（ＭＴＢ）などの様々なマイコバクテリア菌株により引き起こされる細菌性疾患である。これは、肺結核又は喉頭結核を伴う個体が、咳をするか、くしゃみをするか又は唾を吐き、空気中にＭＴＢを噴射する場合に、空気を介して、ヒトからヒトへと伝染される。世界中の人口の３分の１が、ＭＴＢに感染し、且つ９００万人が、毎年ＴＢを発症することが推定される。ＴＢは、ヒト感染症の主要原因であり続けており、特に発展途上国において、ＭＴＢの薬物耐性菌が増加傾向にある。
【０００３】
二種の一般的なＭＴＢ治療の第一選択肢となる薬物は、イソニアジド（ＩＮＨ）とリファンピシン（ＲＩＦ）であり、並びに患者は、薬物耐性が蔓延している地域に居住するか又は訪問することから、薬物耐性ＭＴＢを獲得し得る。患者はまた、それらの抗生物質治療計画が中断された場合に、薬物耐性ＭＴＢを発症し得る。固体培地又は液体培地における培養が、依然、ＭＴＢ及びＭＴＢ薬物耐性の検出の重要な基準であるとみなされているが、培養は、結果がでるまで最大８週間を要する。ＭＴＢ薬物耐性に関する多くの市販の核酸試験は、非常に迅速な処理の所要時間を有するが、野生種及び変異種の両方を含む混合型感染症において、変異種の少ない割合の集団を検出することができない。従って、感度のよい手法でリファンピシン耐性ＭＴＢ（ＭＴＢ−ＲＩＦ）及び／又はイソニアジド耐性ＭＴＢ（ＭＴＢ−ＩＮＨ）を特異的に検出する迅速且つ信頼できる方法が、当該技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
（発明の概要）
本明細書に説明された実施態様は、生物学的試料又は非生物学的試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在又は非存在を迅速に検出する方法、例えば１本の試験管内のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの多重検出に関する。実施態様は、増幅工程及びハイブリダイゼーション工程を含むことができる少なくとも１回のサイクル工程を行うことを含む、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの検出方法を含む。更に実施態様は、１本の試験管内で、単独のＭＴＢ−ＲＩＦもしくはＭＴＢ−ＩＮＨ、又はＭＴＢ−ＲＩＦ及びＭＴＢ−ＩＮＨの同時感染の検出のために設計された、プライマー、プローブ、及びキットを含む。この検出方法は、同時にｒｐｏＢ（ベータサブユニット原核生物ＲＮＡポリメラーゼ）、ｉｎｈＡ（エノイル−アシルキャリアタンパク質レダクターゼ）、及びｋａｔＧ（カタラーゼ−ペルオキシダーゼ）に関する標的ＭＴＢ遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰ）を特異的に同定するように設計されており、これは１回の試験でＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ感染の検出及び識別を可能にする。例えば、ＭＴＢにおいてリファンピシンに対する耐性を与えるｒｂｏＢ遺伝子には、１７個のＳＮＰが存在し、これはｒｐｏＢ  ５３１Ｌ、ｒｐｏＢ  ５３１Ｗ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｄ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｎ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｌ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｋ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｑ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｗ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｖ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５３３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５１１Ｐ、及びｒｐｏＢ  ５２６Ｒを含み；ＭＴＢにおいてイソニアジドに対する耐性を与えるｉｎｈＡ遺伝子には、３個のＳＮＰが存在し、これはｉｎｈＡ−１５Ｔ、ｉｎｈＡ−８Ａ、及びｉｎｈＡ−８Ｃを含み；並びに、ＭＴＢにおいてイソニアジドに対する耐性を与えるｋａｔＧ遺伝子には、４個のＳＮＰが存在し、これはｋａｔＧ  ３１５Ｉ、ｋａｔＧ  ３１５Ｎ、ｋａｔＧ  ３１５Ｔ、及びｋａｔＧ  ３１５Ｔ２を含む。
【０００５】
一態様において、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨを検出する方法が提供され、これは試料を、少なくとも一組のｒｐｏＢプライマー、一組のｉｎｈＡプライマー、及び一組のｋａｔＧプライマーと接触させ、もしｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的核酸のいずれかが試料中に存在するならば、１又は複数の増幅産物を生成することを含む、増幅工程を実行すること；該１又は複数の増幅産物を、ＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個の一塩基多型ＳＮＰの１又は複数の検出のための少なくとも１７種のｒｐｏＢプローブ；ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの１又は複数の検出のための少なくとも３種のｉｎｈＡプローブ；並びに、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの１又は複数の検出のための少なくとも４種のｋａｔＧプローブ：を含む、複数の検出可能なｒｐｏＢプローブ、複数の検出可能なｉｎｈＡプローブ、及び複数の検出可能なｋａｔＧプローブと接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を実行すること；並びに、該１又は複数の増幅産物の存在又は非存在を検出すること：を含み、ここで、該１又は複数の増幅産物の存在は、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在の指標であり、且つ該１又は複数の増幅産物の非存在は、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの非存在の指標であり；ここで、該複数のｒｐｏＢプローブは、ｒｐｏＢ  ５３１Ｌ、ｒｐｏＢ  ５３１Ｗ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｄ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｎ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｌ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｋ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｑ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｗ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｖ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５３３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５１１Ｐ、及びｒｐｏＢ  ５２６Ｒを含む、ＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個のＳＮＰの各々の検出のための、加水分解プローブを含み；ここで、該複数のｉｎｈＡプローブは、ｉｎｈＡ−１５Ｔ、ｉｎｈＡ−８Ａ、及びｉｎｈＡ−８Ｃを含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含み；並びに、ここで、該複数のｋａｔＧプローブは、ｋａｔＧ  ３１５Ｉ、ｋａｔＧ  ３１５Ｎ、ｋａｔＧ  ３１５Ｔ、及びｋａｔＧ  ３１５Ｔ２を含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含む。いくつかの実施態様において、ｒｐｏＢプローブは、配列番号１〜２８９及び４３７〜４３８、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含むか又はこれからなり；ｉｎｈＡプローブは、配列番号３４４〜４０９及び４３６、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含むか又はこれからなり；並びに、ｋａｔＧプローブは、配列番号２９０〜３４３及び４３４〜４３５、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含むか又はこれからなる。一部の実施態様において、ｒｐｏＢプローブは、配列番号１〜２８９及び４３７〜４３８、又はその相補体からなる群から選択され；ｉｎｈＡプローブは、配列番号３４４〜４０９及び４３６、又はその相補体からなる群から選択され；並びに、ｋａｔＧプローブは、配列番号２９０〜３４３及び４３４〜４３５、又はその相補体からなる群から選択される。一部の実施態様において、複数の検出可能なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブの各々は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分により標識され；並びに、検出工程は、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブの１又は複数のドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで蛍光放出の存在又は非存在は、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在又は非存在の指標である。一部の実施態様において、該増幅は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する。一部の実施態様において、該ドナー及びアクセプター蛍光部分は、該プローブ上の互いにわずか８個のヌクレオチド内にある。一部の実施態様において、該アクセプター蛍光部分は、クエンチャーである。
【０００６】
別の態様において、配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８、又はその相補体から選択されたヌクレオチドの配列を含むか又はこれからなるオリゴヌクレオチドが提供され、このオリゴヌクレオチドは、１００個以下のヌクレオチドを有する。別の態様において、本開示は、配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８、又はその相補体のひとつに対し、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％など）の配列同一性を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは、１００個以下のヌクレオチドを有する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、これらの実施態様においてプライマー核酸、プローブ核酸又は類似のものであってよい。いくつかのこれらの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、４０個以下のヌクレオチド（例えば、３５個以下のヌクレオチド、３０個以下のヌクレオチドなど）を有する。一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば非改変のヌクレオチドに比べ、核酸ハイブリダイゼーション安定性を変更するために、少なくとも１個の改変されたヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、１又は複数の検出可能な標識を含む。任意に、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の標識及び／又は少なくとも１個のクエンチャー部分を含む。一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の保存的に改変された変種を含む。特定の核酸配列の「保存的に改変された変種（Conservatively modified variations）」又は簡単に「保存的変種(conservative variations)」とは、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードしている、それらの核酸をいうか、又は核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合は、本質的に同一の配列をいう。当業者は、コードされた配列中の単独のアミノ酸又は小さい割合のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％もしくは１％未満）を変更、付加又は欠失する個々の置換、欠失又は付加は、これらの変更が、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似のアミノ酸とのアミノ酸の置換を生じる場合、「保存的に改変された変種」であることを認めるであろう。一態様において、増幅は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を利用することができる。従って、第一及び第二の蛍光部分は、プローブの長さに沿って互いに８ヌクレオチド以下の範囲内に位置してよい。
【０００７】
別の態様において、ＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個のＳＮＰの１又は複数の検出のための１７種のｒｐｏＢプローブ；ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの１又は複数の検出のための３種のｉｎｈＡプローブ；並びに、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの１又は複数の検出のための４種のｋａｔＧプローブを含む、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ増幅産物の検出に特異的な複数の検出可能なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブを含む、一組のオリゴヌクレオチドが、提供され；ここで、該複数のｒｐｏＢプローブは、ｒｐｏＢ  ５３１Ｌ、ｒｐｏＢ  ５３１Ｗ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｄ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｎ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｌ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｋ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｑ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｗ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｖ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５３３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５１１Ｐ、及びｒｐｏＢ  ５２６Ｒを含む、ＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含み；ここで、該複数のｉｎｈＡプローブは、ｉｎｈＡ−１５Ｔ、ｉｎｈＡ−８Ａ、及びｉｎｈＡ−８Ｃを含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含み；ここで、該複数のｋａｔＧプローブは、ｋａｔＧ  ３１５Ｉ、ｋａｔＧ  ３１５Ｎ、ｋａｔＧ  ３１５Ｔ、及びｋａｔＧ  ３１５Ｔ２を含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含む。ここで、一組のオリゴヌクレオチドは、試料中のリファンピシン耐性結核菌（ＭＴＢ）（ＭＴＢ−ＲＩＦ）及び／又はイソニアジド耐性ＭＴＢ（ＭＴＢ−ＩＮＨ）の核酸の検出に適している。一部の実施態様において、ｒｐｏＢプローブは、配列番号１〜２８９及び４３７〜４３８、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含み；ｉｎｈＡプローブは、配列番号３４４〜４０９及び４３６、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含み；並びに、ｋａｔＧプローブは、配列番号２９０〜３４３及び４３４〜４３５、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、一組中に、１００個以下のヌクレオチドを含む。これらの実施態様のいくつかにおいて、オリゴヌクレオチドは、４０個以下のヌクレオチド（例えば、３５個以下のヌクレオチド、３０個以下のヌクレオチドなど）を含む。一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば、非改変ヌクレオチドに対し核酸ハイブリダイゼーション安定性を変更するために、少なくとも１個の改変されたヌクレオチドを含む。任意にオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の標識及び／又は少なくとも１個のクエンチャー部分を含む。一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、保存的に改変された変種を少なくとも１個含む。一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、プローブの長さに沿って互いに８ヌクレオチド以下の範囲内に位置してよい第一及び第二の蛍光部分を含む。
【０００８】
更なる態様において、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの１又は複数の核酸を検出するためのキットが、提供される。このキットは、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ遺伝子標的の増幅に特異的なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプライマーの複数のセットと、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ増幅産物の検出に特異的な複数の検出可能なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブと、を備えることができる。一部の実施態様において、複数の検出可能なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブは少なくとも特異的に、ＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個のＳＮＰの１又は複数の検出のための１７種のｒｐｏＢプローブ；ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの１又は複数の検出のための３種のｉｎｈＡプローブ；並びに、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの１又は複数の検出のための４種のｋａｔＧプローブを含み；ここで、該複数のｒｐｏＢプローブは、ｒｐｏＢ  ５３１Ｌ、ｒｐｏＢ  ５３１Ｗ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｄ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｎ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｌ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｋ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｑ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｗ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｖ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５３３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５１１Ｐ、及びｒｐｏＢ  ５２６Ｒを含む、ＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含み；ここで該複数のｉｎｈＡプローブは、ｉｎｈＡ−１５Ｔ、ｉｎｈＡ−８Ａ、及びｉｎｈＡ−８Ｃを含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含み；並びに、該複数のｋａｔＧプローブは、ｋａｔＧ  ３１５Ｉ、ｋａｔＧ  ３１５Ｎ、ｋａｔＧ  ３１５Ｔ、及びｋａｔＧ  ３１５Ｔ２を含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの各々の検出のための加水分解プローブを含む。一部の実施態様において、ｒｐｏＢプローブは、配列番号１〜２８９及び４３７〜４３８、又はその相補体からなる群から選択される核酸配列を含むか又はこれからなり；ｉｎｈＡプローブは、配列番号３４４〜４０９及び４３６、又はその相補体からなる群から選択される核酸を含むか又はこれからなり；並びに、ｋａｔＧプローブは、配列番号２９０〜３４３及び４３４〜４３５、又はその相補体からなる群から選択される核酸を含むか又はこれからなる。一部の実施態様において、ｒｐｏＢプローブは、配列番号１〜２８９及び４３７〜４３８、又はその相補体からなる群から選択され；ｉｎｈＡプローブは、配列番号３４４〜４０９及び４３６、又はその相補体からなる群から選択され；並びに、ｋａｔＧプローブは、配列番号２９０〜３４３及び４３４〜４３５、又はその相補体からなる群から選択される。一部の実施態様において、キットは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分により既に標識されたプローブを備えることができるか、或いはプローブを標識するための発蛍光団部分を含むことができる。一部の実施態様において、該複数の検出可能なｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブの各プローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分を含む。一部の実施態様において、アクセプター蛍光部分は、クエンチャーである。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液も備えている。キットはまた、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在又は非存在を検出するための、プライマー、プローブ、及び発蛍光団部分の使用に関する添付文書及び指示書を備える。
【０００９】
別に指定しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されたものに類似した又は同等の方法又は材料は、本主題の実践又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料が以下に説明される。加えて、これらの材料、方法及び実施例は、単に例証するものであり、限定を意図しない。
【００１０】
１又は複数の実施態様の詳細は、添付図面及び以下の説明において説明される。他の特徴、目的及び利点は、これらの図面及び詳細な説明から、並びに請求項から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、ｒｐｏＢ遺伝子標的に関する野生型及び変異体アンプリコン配列、並びにＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個のＳＮＰの各々の指標を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｒｐｏＢ遺伝子標的に関する野生型及び変異体アンプリコン配列、並びにＭＴＢにリファンピシン耐性を与える１７個のＳＮＰの各々の指標を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ｉｎｈＡ遺伝子標的に関する野生型及び変異体アンプリコン配列、並びにＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの各々の指標を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｉｎｈＡ遺伝子標的に関する野生型及び変異体アンプリコン配列、並びにＭＴＢにイソニアジド耐性を与える３個のＳＮＰの各々の指標を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ｋａｔＧ遺伝子標的に関する野生型及び変異体アンプリコン配列、並びにＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの各々の指標を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｋａｔＧ遺伝子標的に関する野生型及び変異体アンプリコン配列、並びにＭＴＢにイソニアジド耐性を与える４個のＳＮＰの各々の指標を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、５２２Ｌ  ＳＮＰについての改変プローブの使用と比べた、５２２Ｌ  ＳＮＰについての非改変プローブを使用する、シングルプレックスＰＣＲ  ＳＮＰ−特異的プローブ検出に関する、増幅曲線アッセイを示す（ＷＴと比較したＭＴ標的（〜１ｅ６、１ｅ２、１ｅ３  １０ｃ／ＰＣＲ））。
【図４Ｂ】図４Ｂは、５２２Ｌ  ＳＮＰについての改変プローブの使用と比べた、５２２Ｌ  ＳＮＰについての非改変プローブを使用する、シングルプレックスＰＣＲ  ＳＮＰ−特異的プローブ検出に関する、増幅曲線アッセイを示す（ＷＴと比較したＭＴ標的（〜１ｅ６、１ｅ２、１ｅ３  １０ｃ／ＰＣＲ））。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
核酸増幅によるＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ感染の診断は、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ感染を迅速且つ正確に検出する方法を提供する。試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの検出のためのリアルタイムアッセイが、本明細書において説明される。ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨのｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的核酸の検出のためのプライマー及びプローブが、かかるプライマー及びプローブを備える製品又はキットとして提供される。他の方法と比較した、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの検出のためのリアルタイムＰＣＲの増大した感受性、並びに試料汚染及び増幅産物のリアルタイム検出を含む、リアルタイムＰＣＲの改善された特徴は、臨床検査室においてＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ感染の慣習的診断のためにこの技術を実行することを実現可能にしている。
【００１３】
薬物耐性ＭＴＢの同定は、いくつかの異なる遺伝子上に配置されたＭＴＢゲノム中の数多くの一塩基多型（ＳＮＰ）の検出を必要とする。加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎプローブとしても公知）設計の新たな変動を使用し、マルチプレックスの高度に識別するＴａｑＭａｎプローブを作製し、ここで各ＴａｑＭａｎプローブは、交差反応性を伴わない単独のＳＮＰを検出することができる。これらのプローブは、完全にマッチした薬物耐性（変異体）配列に対してのみ大きい特異性で結合し且つ切断するために、非常に短く且つ高度に安定しているように設計される。
【００１４】
本開示は、ＭＴＢ−ＲＩＦ及びＭＴＢ−ＩＮＨに対し耐性を与える様々なＳＮＰを検出するためのＴａｑｍａｎプローブを提供する。ＴａｑＭａｎ互換性プローブは一般に、単独の塩基対ミスマッチを検出することができない。一般にＴａｑＭａｎプローブは、プライマーの前に標的配列への適切なプローブ結合を確実にし、且つＰＣＲ時に最大のプローブ切断を達成するために、関連したＰＣＲプライマーよりも、はるかに長く、有意に高い融解温度を持つように設計される。かかるプローブの高い融解温度及び長さのために、これらは概して、プローブ領域下の単独の塩基ミスマッチに非常に忍容性があり、従って単独の塩基のみが異なる２個の標的間を識別しない。本開示において、加水分解ＴａｑＭａｎプローブは、薬物耐性ＭＴＢのみをうまく検出することができ、且つ単独の塩基のみ異なり得る薬物感受性ＭＴＢとは、交差反応しない。本開示は、プローブ領域下の単独の塩基対ミスマッチを検出することができる、多くの短い、高度に改変されたプローブを提供する。プローブ設計において置換することができる改変された塩基は、プロピニル−ｄＣ、ｔ−ブチル−ベンジルｄＣ、プロピニル−ｄＵ、Ｇ−クランプ、メチル−ｄＣ、Ｎ６−メチル（ｍｅｔｈｌ）ｄＡ、及び７−デアザ−ｄＧを含む。プローブ設計において、本発明者らは、プローブの識別能を最大化するために、プローブ配列内にいくつかの改変された塩基対を戦略的に配置した。いくつかの改変は、他よりも優れて働くこと、及び識別能は、プローブの改変の配置により影響されることを発見した。
【００１５】
本開示は、複数の高度に改変されたＴａｑＭａｎプローブを利用することができる、マルチプレックス化されたアッセイのための方法及びキットを提供し、ここで各プローブは、薬物感受性（野生型）ＭＴＢとい有意に交差反応することなく、ＭＴＢゲノムにおいてリファンピシン（ＲＩＦ）及びイソニアジド（ＩＮＨ）薬物耐性を与えることが分かっている単独のＳＮＰを検出することができる。開示されたＴａｑＭａｎプローブの著しいＷＴ交差反応を伴わずに変異体ＳＮＰを検出する独自の能力は、野生型（ＷＴ）バックグラウンドと混合された場合に、このアッセイが薬物耐性ＭＴＢのわずかな存在を検出することを可能にする。混合型感染の存在が報告されており、且つ現在市販のアッセイは薬物感受性ＭＴＢの存在下で薬物耐性ＭＴＢを検出することができないので、混合型感染の蔓延は低く報告されることが示唆されている。ＷＴバックグラウンドにおいて１％と少ない薬物耐性ＭＴＢに感染している患者は、患者に提唱された治療計画が失敗することがあることが、米国疾病対策センター（ＣＤＣ）により報告されている。
【００１６】
本方法は、各々、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧをコードしている核酸配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプライマーを指す、本明細書で使用されるｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ特異的プライマーを含む、複数のプライマー対を使用し、試料由来のｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ核酸分子遺伝子標的の１又は複数の部分を増幅することを含み、並びに適当な条件下でのそれからの合成を開始する、少なくとも１サイクル工程を実行することを含む。考察したｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプライマーの各々は、それぞれのｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的核酸分子内又はそれに隣接する標的にアニーリングし、結果的に各増幅産物の少なくとも一部分は、それぞれの標的に対応する核酸配列を含む。ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ増幅産物の１又は複数は、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ核酸の１又は複数が試料中に存在する場合に作製され、従って、１又は複数のｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ増幅産物の存在は、試料中のｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧの存在の指標である。増幅産物は、ＭＴＢにリファンピシン及び／又はイソニアジド耐性を与えるｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ中のＳＮＰの検出のための１又は複数の検出可能なプローブに相補的である核酸配列を含むはずである。各サイクル工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、及び検出工程を含み、ここで試料は、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在又は非存在の検出のために、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧについて１又は複数の検出可能なプローブと接触される。
【００１７】
本明細書で使用される用語「増幅する」とは、鋳型核酸分子（例えば、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ核酸分子）の１本鎖又は２本鎖に相補的である核酸分子を合成するプロセスをいう。核酸分子の増幅は、典型的には、鋳型核酸の変性、プライマーの融解温度を下回る温度での鋳型核酸へのプライマーのアニーリング、並びにプライマーからの酵素的伸長による増幅産物の作製を含む。増幅は典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）、並びに好適な緩衝液及び／又はポリメラーゼ酵素の最適活性のための補因子（例えば、ＭｇＣｌ2及び／又はＫＣｌ）の存在を必要とする。
【００１８】
用語「プライマー」は、当業者に公知であるように本明細書において使用され、且つオリゴマー型化合物、主としてオリゴヌクレオチドをいうが、鋳型依存型ＤＮＡポリメラーゼにより、ＤＮＡ合成を「プライミングする」改変されたオリゴヌクレオチドもいい、すなわち、例えばこのオリゴヌクレオチドの３’−末端は、遊離３’−ＯＨ基を提供し、これに更に、「ヌクレオチド」が鋳型依存型ＤＮＡポリメラーゼにより付着され、３’−５’ホスホジエステル結合を確立し、これによりデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、且つピロリン酸が放出される。従って−可能性のある意図された機能を除いて−「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」、又は「プローブ」の間に根本的差異は存在しない。
【００１９】
用語「ハイブリダイジング」は、１又は複数のプローブの増幅産物へのアニーリングをいう。ハイブリダイゼーション条件は典型的には、プローブの融解温度を下回るが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
【００２０】
用語「５’→３’ヌクレアーゼ活性」は、核酸ポリメラーゼの活性、典型的には核酸鎖合成に関連した活性をいい、これによりヌクレオチドは、核酸鎖の５’末端から除去される。
【００２１】
用語「熱安定性ポリメラーゼ」は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素をいい、すなわちこの酵素は、鋳型に対し相補的であるプライマー伸長産物の形成を触媒し、且つ二本鎖鋳型核酸の変性に作用するのに必要な時間高温に供された場合に、不可逆的に変性しない。一般にこの合成は、各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って、５’→３’方向に進む。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ・ルベル（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ・サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ・アクアチカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ・ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ・ルーベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアルセルモフィラス、及びメタノセルマス・フェルビダスから単離される。それにもかかわらず、熱安定性でないポリメラーゼも、酵素が補給される場合、ＰＣＲアッセイにおいて使用することができる。
【００２２】
用語「その相補体（complement thereof）」は、所与の核酸と両方共同じ長さであり、且つこれに正確に相補性である核酸をいう。
【００２３】
用語「延長（extension）」又は「伸長 (elongation)」は、核酸について使用される場合、追加のヌクレオチド（又は他の類似分子）が核酸に導入される場合をいう。例えば、核酸は、典型的にはヌクレオチドを核酸の３’末端に付加するポリメラーゼなどの、ヌクレオチドを取り込む生体触媒により、任意に延長される。
【００２４】
２種又はそれよりも多い核酸配列の文脈における用語「同一」又はパーセント「同一性」は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの一つを使用し測定するか又は目視検査により測定した、最大対応物と比較し且つ並置する場合に、同じであるか、又は同じであるヌクレオチドの特定された割合を有する、２種又はそれよりも多い配列又は部分配列をいう。パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に適しているアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴプログラムであり、これは例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）、「ベーシックローカルアラインメントサーチツール（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈら、（１９９３）、「データベース類似性検索によるタンパク質コード領域の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈ）」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎら、（１９９６）、「ネットワークＢＬＡＳＴサーバーの応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅｒｖｅｒ）」、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）、「ギャップ付きＢＬＡＳＴ及びＰＳＴ−ＢＬＡＳＴ：新世代タンパク質データベース検索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２；及び、Ｚｈａｎｇら、（１９９７）、「パワーＢＬＡＳＴ；対話式又は自動式配列分析及び注釈のための新規ネットワークＢＬＡＳＴ応用（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：  Ａ  ｎｅｗ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７：６４９−６５６に説明されている。
【００２５】
オリゴヌクレオチドの文脈における「改変されたヌクレオチド（modified nucleotide）」は、そのオリゴヌクレオチド配列の少なくとも１個のヌクレオチドが、そのオリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドにより置き換えられている変更をいう。本明細書記載のオリゴヌクレオチドにおいて置換され得る改変されたヌクレオチドの例としては、例えば、Ｃ５−メチル−ｄＣ、Ｃ５−エチル−ｄＣ、Ｃ５−メチル−ｄＵ、Ｃ５−エチル−ｄＵ、２，６−ジアミノプリン、Ｃ５−プロピニル−ｄＣ、Ｃ５−プロピニル−ｄＵ、Ｃ７−プロピニル−ｄＡ、Ｃ７−プロピニル−ｄＧ、Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＣ、Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＵ、Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＡ、Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＧ、７−デアザ−２−デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジンアナログ、シュード−ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’−Ｏ−メチルリボ−Ｕ、２’−Ｏ−メチルリボ−Ｃ、Ｎ４−エチル−ｄＣ、Ｎ６−メチル−ｄＡ及びその類似物が挙げられる。オリゴヌクレオチドにおいて置換され得る多くの他の改変されたヌクレオチドは、本明細書において言及されているか、又はそうでなければ当該技術分野において公知である。いくつかの実施態様において、改変されたヌクレオチド置換は、対応する改変されないオリゴヌクレオチドの融解温度と比べ、このオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を変更する。更なる例証のために、ある種の改変されたヌクレオチド置換は、非特異的核酸増幅を減少すること（例えば、プライマー二量体形成を最小化するなど）、意図された標的アンプリコンの収量を増大すること、及び／又は一部の実施態様において類似のことができる。これらの型の核酸改変の例は、例えば米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。
【００２６】
（ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ核酸及びオリゴヌクレオチド）
本開示は、例えば、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ核酸配列の１又は複数の部分を増幅することにより、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨを検出する方法を提供する。ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧの核酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋにより入手可能である。具体的には、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ核酸分子標的を増幅し及び検出するためのプライマー及びプローブは、本開示の実施態様により提供される。
【００２７】
より具体的には、各オリゴヌクレオチドの実施態様は、配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８、その変種が配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８のひとつと少なくとも例えば８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するそれらと実質的に同一の変種、又は配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８及び変種の相補体から選択された配列を伴う核酸を含む。
【００２８】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
2018500024.tif 000025
【表１−２５】
2018500024.tif 000026
【表１−２６】
2018500024.tif 000027
【００２９】
一実施態様において、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨを含むことが疑われる生物学的試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの検出を提供するために、先に説明したｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプライマー及びプローブの複数のセットが使用される。これらのプライマー及びプローブのセットは、配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８の核酸配列を含むか又はこれからなる、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ核酸配列に特異的なプライマー及びプローブを含むか又はこれからなることができる。別の実施態様において、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的のためのプライマー及びプローブは、配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８の任意のプライマーの機能活性変種を含むか又はこれからなる。
【００３０】
配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８のプローブの任意の機能活性変種は、開示された方法においてプローブを使用することにより、同定することができる。任意の配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８のプローブの機能活性変種は、配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８のそれぞれの配列と比べ、本明細書記載の方法又はキットにおいて同様の又はより高い特異性及び感受性を提供するプライマーに関係する。
【００３１】
この変種は、例えば、配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８のそれぞれの配列の５’末端及び／又は３’末端での１又は複数のヌクレオチド付加、欠失又は置換などの、１又は複数のヌクレオチド付加、欠失又は置換により、配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８の配列から、変動することができる。先に詳述したように、プライマー（及び／又はプローブ）は、化学的に改変されることができ、すなわち、プライマー及び／又はプローブは、改変されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含むことができる。プローブ（又はプライマー）は次に、改変されたオリゴヌクレオチドである。「改変されたヌクレオチド」（又は「ヌクレオチドアナログ」）は、天然の「ヌクレオチド」とは、数個の改変が異なるが、依然塩基又は塩基様化合物、ペントフラノシル糖又はペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分又はリン酸様部分、或いはそれらの組合せからなる。例えば、「標識」は、「ヌクレオチド」の塩基部分に結合することができ、これにより「改変されたヌクレオチド」が得られる。「ヌクレオチド」中の天然の塩基はまた、例えば、７−デスアザプリンにより置き換えることもでき、これにより更に「改変されたヌクレオチド」が得られる。用語「改変されたヌクレオチド」又は「ヌクレオチドアナログ」は、本出願において互換的に使用される。「改変されたヌクレオシド」（又は「ヌクレオシドアナログ」）は、天然のヌクレオシドとは、先に「改変されたヌクレオチド」（又は「ヌクレオチドアナログ」）について概説されたように、いくつかの改変により異なる。
【００３２】
ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ核酸配列をコードしている核酸分子、例えばｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧの代替部分をコードしている核酸を増幅している、改変されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社、カスケード、コロラド州）などのコンピュータプログラムを用いて、設計することができる。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際に重要な特徴は、検出（例えば電気泳動による）を促進するのに適したサイズの増幅産物、プライマー対の一員と類似の融解温度、並びに各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし且つ合成を開始するのに十分な長さを必要とするが、オリゴヌクレオチド合成時に忠実度が低下するほどは長くはない）を含むが、これらに限定されるものではない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは、長さが８〜５０ヌクレオチド、特に１０〜４０ヌクレオチド又は１２〜４０ヌクレオチド（例えば、長さが８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、又は５０ヌクレオチド）である。
【００３３】
開示された方法は、一組のプライマーに加え、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在又は非存在を検出するために、１又は複数のプローブを使用することができる。用語「プローブ」は、合成的又は生物学的に生成された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）をいい、これは設計又は選択により、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ（標的）核酸が存在する場合には、規定された予め決定されたストリンジェンシー下で、「標的核酸」へ特異的に（すなわち、優先的に）それらがハイブリダイズすることを可能にする、特異的ヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、それが標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称することができる。
【００３４】
一部の実施態様において、説明されたｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブは、少なくとも１個の蛍光標識により標識されることができる。一実施態様において、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブは、ドナー蛍光部分、例えば蛍光色素、並びに対応するアクセプター蛍光部分、例えばクエンチャーにより、標識されることができる。
【００３５】
一実施態様において、プローブは、蛍光部分、並びに配列番号１〜４０９及び４３４〜４３８を含むか又はこれからなる核酸配列を含むか又はこれからなる。
【００３６】
ハイブリダイゼーションプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計に類似の様式で実行することができる。実施態様は、増幅産物の検出のために、単独のプローブ又はプローブ対を使用することができる。実施態様に応じて、プローブ（複数可）の使用は、少なくとも１個の標識及び／又は少なくとも１個のクエンチャー部分を含むことができる。プライマーのように、プローブは通常、類似の融解温度を有し、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが生じるのに十分でなければならないが、合成時に忠実度が低下するほどは長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは一般に、４０個以下のヌクレオチドを有し、且つ特に長さが１２〜４０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド及び１５〜３０ヌクレオチド（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド）である。
【００３７】
（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））
米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、及び第４，９６５，１８８号は、従来型ＰＣＲ技術を開示している。ＰＣＲは典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合する、２種のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。一部の実施態様において有用なプライマーは、説明されたｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ核酸配列内で核酸合成の開始点として作用することが可能であるオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来型方法による制限消化から精製することができるか、又は合成により作製することができる。プライマーは、最大の増幅効率のためには好ましくは１本鎖であるが、プライマーは二本鎖であることができる。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわちこれらの鎖を分離するように処理される。２本鎖核酸を変性する一つの方法は、加熱によるものである。
【００３８】
鋳型核酸が二本鎖である場合、これをＰＣＲにおける鋳型として使用し得る前に、これらの２本鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的又は酵素的手段を含むいずれかの好適な変性方法により、達成することができる。核酸鎖を分離する一つの方法は、核酸が優先的に変性される（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多くが変性される）まで、核酸を加熱することに関与している。鋳型核酸の変性に必要な加熱条件は、例えば、緩衝液塩濃度並びに変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成によって左右されるが、典型的には約９０℃〜約１０５℃で、時間は温度及び核酸長などの反応の特徴によって左右される。変性は典型的には、約３０秒〜４分間（例えば、１分〜２分３０秒、又は１．５分間）実行される。
【００３９】
二本鎖の鋳型核酸が熱により変性される場合、この反応混合物は、各プライマーの、説明されたｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ核酸分子上のその標的配列へのアニーリングを促進する温度まで、冷却される。アニーリング温度は、通常約３５℃〜約６５℃（例えば、約４０℃〜約６０℃；約４５℃〜約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒〜約１分（例えば、約２０秒〜約５０秒；約３０秒〜約４０秒）であることができる。次に反応混合物は、ポリメラーゼの活性が促進されるか又は最適化される温度、すなわち延長がアニーリングされたプライマーから生じ、鋳型核酸に相補的な産物を作製するのに十分な温度に調節される。この温度は、核酸鋳型にアニーリングされる各プライマーから延長産物を合成するのに十分でなければならないが、その相補的鋳型からの延長産物を変性するほど高くてはならない（例えば、延長の温度は一般に、約４０℃〜約８０℃（例えば、約５０℃〜約７０℃；約６０℃）の範囲である）。延長時間は、約１０秒〜約５分（例えば、約３０秒〜約４分；約１分〜約３分；約１分３０秒〜約２分）であることができる。
【００４０】
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡ又はＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などの、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ核酸を利用することができる。鋳型核酸は精製されないことを必要とし；これは、ヒト細胞に含まれるＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ核酸などの、複雑な混合物の小さい画分であってよい。ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ核酸分子は、「診断分子微生物学：原理と応用（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（Ｐｅｒｓｉｎｇら（編集）、１９９３，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ワシントン）に記載されたもののような、慣習的技術により、生物学的試料から抽出されることができる。核酸は、プラスミド、又は細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、もしくは植物又は動物などのより高等生物を含む天然の給源などの、いくつかの給源から得ることができる。
【００４１】
オリゴヌクレオチドプライマーは、プライマー延長を誘導する反応条件下で、ＰＣＲ試薬と一緒にされる。例えば鎖延長反応は一般に、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５〜１．０μｇ変性した鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ、及び１０％ＤＭＳＯを含む。この反応は通常、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの各々、又はそれらの１もしくは複数のアナログを１５０〜３２０μＭ含む。
【００４２】
新たに合成された鎖は、この反応の後続の工程において使用することができる二本鎖分子を形成する。鎖の分離、アニーリング及び伸長の工程は、標的ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ核酸分子に対応する増幅産物を所望の量を生成するのに必要なだけ反復することができる。この反応における制限因子は、反応において存在するプライマー、熱安定した酵素、及びヌクレオシド三リン酸の量である。サイクル工程（すなわち、変性、アニーリング、及び延長）は、少なくとも１回反復されることが好ましい。検出において使用するために、サイクル工程の数は、例えば、試料の性質によって決まるであろう。試料が、核酸の複雑な混合物である場合、より多くのサイクル工程が、検出に十分な標的配列を増幅するために必要とされるであろう。一般にサイクル工程は、少なくとも約２０回反復されるが、４０、６０回と多く、又は１００回さえも反復されてよい。
【００４３】
（蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ））
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、第５，５６５，３２２号、第５，８４９，４８９号、及び第６，１６２，６０３号参照）は、ドナー蛍光部分と対応するアクセプター蛍光部分が、互いに特定の距離内に位置した場合に、２種の蛍光部分の間で、可視化できるか又はそうでなければ検出及び／又は定量することができるエネルギー移動が起こるという概念を基にしている。好適な波長の光放射によりドナーが励起される場合に、ドナーは典型的には、アクセプターへエネルギーを移動する。アクセプターは典型的には、異なる波長の光放射の形で、移動されたエネルギーを再放出する。
【００４４】
一例において、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分と、蛍光であってもなくてよく且つ移動されたエネルギーを光以外の形で消散させる対応するクエンチャーを含むことができる。プローブが完全な状態である場合、エネルギー移動は典型的には、これら２個の蛍光部分の間で生じ、結果的にドナー蛍光部分からの蛍光放出は消光される。ポリメラーゼ連鎖反応の延長工程時に、増幅産物に結合されたプローブは、例えばＴａｑポリメラーゼのような、５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、結果的にドナー蛍光部分の蛍光放出は最早消光されない。この目的のためのプローブの例は、例えば米国特許第５，２１０，０１５号、第５，９９４，０５６号、及び第６，１７１，７８５号に説明されている。一般に使用されるドナー−アクセプター対は、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対を含む。一般に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。一般に使用されるダーククエンチャーは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ノバト、カリフォルニア州）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈ．社、コーラルビル、アイオワ州）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ６５０（ＢＢＱ−６５０）（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃ．社、デクスター、ミシガン州）が挙げられる。
【００４５】
別の例において、各々蛍光部分を含む２個のオリゴヌクレオチドプローブは、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性により決定された特定の位置で、増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブの増幅産物核酸への適当な位置でのハイブリダイゼーション時に、ＦＲＥＴシグナルが発生する。ハイブリダイゼーション温度は、約３５℃〜約６５℃で、約１０秒〜約１分の範囲であることができる。
【００４６】
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（特定範囲の蛍光放出をモニタリングするのに適したダイクロイックミラー及びダイクロイックフィルターを備える）、光子計数光電子倍増管システム、又は蛍光光度計を用いて、実行することができる。エネルギー移動を開始する励起は、アルゴンイオンレーザー、高密度水銀（Ｈｇ）アーク灯、光ファイバー光源、又は所望の範囲の励起について適宜フィルタリングされる他の高輝度光源により実行することができる。
【００４７】
ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分に関して本明細書において使用される「対応する」とは、ドナー蛍光部分の励起スペクトルと重複する放出スペクトルを有するアクセプター蛍光部分をいう。アクセプター蛍光部分の放出スペクトルの最大波長は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの最大波長よりも、少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。従って、効率的非照射性エネルギー移動が、これらの間に存在し得る。
【００４８】
蛍光ドナー部分及び対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率のフェルスターエネルギー移動；（ｂ）大きい最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）；（ｃ）可視スペクトルの赤色部分へのできる限りの放出シフト（＞６００ｎｍ）；並びに、（ｄ）ドナー励起波長での励起により作製される水のラマン蛍光放出よりもより高い波長への放出シフト：のように選択される。例えば、レーザーライン（例えば、ヘリウム−カドミニウム４４２ｎｍ又はアルゴン４８８ｎｍ）の近傍でのその最大励起、高い消光係数、高い量子収量、及びその蛍光放出の対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するドナー蛍光部分が、選択され得る。高い消光係数、高い量子収量、その励起のドナー蛍光部分の放出との良好な重複、及び可視スペクトルの赤色部分での放出（＞６００ｎｍ）を有する対応するアクセプター蛍光部分が、選択され得る。
【００４９】
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的ドナー蛍光部分は、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、１−ピレンブチル酸スクシンイミジル、及び４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体を含む。代表的アクセプター蛍光部分は、使用されるドナー蛍光部分によって左右されるが、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミン五酢酸、又は他のランタノイドイオン（例えば、ユウロピウム又はテルビウム）のキレートを含む。ドナー及びアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（ジャンクションシティ、オレゴン州）又はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス、ミズーリ州）から入手することができる。
【００５０】
ドナー及びアクセプター蛍光部分は、リンカーアームを介して、適切なプローブオリゴヌクレオチドへ結合することができる。リンカーアームは、ドナー及びアクセプター蛍光部分の間の距離に影響を及ぼすので、各リンカーアームの長さは、重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離である。概して、リンカーアームは、約１０Å〜約２５Åである。リンカーアームは、ＷＯ  ８４／０３２８５に説明された種類であってよい。ＷＯ  ８４／０３２８５はまた、リンカーアームが特定のヌクレオチド塩基に結合する方法、同じく蛍光部分がリンカーアームに結合する方法も開示している。
【００５１】
ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０などの、アクセプター蛍光部分は、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ社（フォスターシティ、カリフォルニア州）又はＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（スターリング、バージニア州）から入手可能なＣ６−アミノホスホロアミダイト）を含むオリゴヌクレオチドと組合せ、例えば、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０−標識されたオリゴヌクレオチドを生成することができる。オリゴヌクレオチドへのフルオレセインなどのドナー蛍光部分とのカップリングのために頻繁に使用されるリンカーは、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ−誘導型、例えばＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｒ  ＣｈｅｍＧｅｎｅ社（アッシュランド、マサチューセッツ州）からのフルオレセイン−ＣＰＧ’ｓなど）、アミド−リンカー（フルオレセイン−ＮＨＳ−エステル−誘導型、ＢｉｏＧｅｎｅｘ社（サンラモン、カリフォルニア州）からのＣＸ−フルオレセイン−ＣＰＧなど）、又はオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン−ＮＨＳ−エステルの結合を必要とする３’−アミノ−ＣＰＧｓがある。
【００５２】
（ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの検出）
本開示は、生物学的試料又は非生物学的試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在又は非存在を検出する方法を提供する。本明細書に提供された方法は、試料夾雑、偽陰性、及び偽陽性の問題点を回避する。これらの方法は、複数のｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプライマーの対を使用し、試料からのｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的核酸分子の一部を増幅すること、並びにＦＲＥＴ検出工程を含む、少なくとも１回のサイクル工程を行うことを含む。多回サイクル工程は、好ましくはサーマルサイクラーで実行される。本明細書記載の方法は、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的の存在を検出するために、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプライマー及びプローブを使用し行うことができ、並びにｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的中の説明されたＳＮＰの検出は、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在を示す。
【００５３】
本明細書記載のように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を巧みに利用する標識されたハイブリダイゼーションプローブを用い、検出することができる。ひとつのＦＲＥＴフォーマットは、増幅産物の存在又は非存在を検出、ここで標的核酸の存在又は非存在を検出するために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば、１種の蛍光色素、及び蛍光であってもなくともよい１種のクエンチャーなどで標識された１種の１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第一の蛍光部分が好適な波長の光により励起される場合、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従い、第二の蛍光部分へ移動される。第二の蛍光部分は一般にクエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程時に、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち増幅産物）に結合し、且つ後続の伸長相の間に、例えばＴａｑポリメラーゼなどの５’→３’ヌクレアーゼ活性により分解される。結果として、蛍光部分及びクエンチャー部分は、他方から空間的に分離され始める。その結果、クエンチャーの非存在下、第一の蛍光部分の励起時に、第一の蛍光部分からの蛍光放出が検出され得る。例としてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、且つ試料中の標的核酸の存在又は非存在を検出するための本明細書記載の方法を実行するのに適している。
【００５４】
一般に、ＦＲＥＴの存在は、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの存在を示し、且つＦＲＥＴの非存在は、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの非存在を示す。しかし、不適格な標本収集、輸送の遅延、不適切な輸送条件、又はある種の収集用スワブの使用（アルギン酸カルシウム塩又はアルミニウムシャフト）は、全て、試験結果の成功及び／又は精度に影響を及ぼし得る条件である。本明細書に開示された方法を使用し、例えば４５回のサイクル工程内でのＦＲＥＴの検出は、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ感染の指標である。
【００５５】
使用することができる代表的生物学的試料は、皮膚スワブ検体、鼻スワブ検体、創傷スワブ検体、血液培養物、皮膚及び軟組織感染物を含むが、これらに限定されるものではない。生物学的試料の収集及び貯蔵は、当業者に公知である。生物学的試料は、処理され（例えば、当該技術分野において公知の核酸抽出法及び／又はキットにより）、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨ核酸を放出することができるか、或いは場合によっては、生物学的試料は、ＰＣＲ反応成分及び好適なオリゴヌクレオチドと直接接触される。
【００５６】
各サーマルサイクラーの試行内では、対照試料もサイクルされ得る。陽性対照試料は、例えば、対照プライマー及び対照プローブを使用し、標的核酸対照鋳型（標的遺伝子の説明された増幅産物以外）を増幅することができる。陽性対照試料は、例えば、標的核酸分子を含むプラスミド構築体も、増幅することができる。そのようなプラスミド対照は、内部で（例えば、試料内で）、又は意図した標的の検出に使用されるものと同じプライマー及びプローブを使用し、患者の試料と並んで試行される別の試料において、増幅されることができる。このような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション、及び／又はＦＲＥＴ反応の成功又は失敗の指標である。各サーマルサイクラー試行はまた、例えば、標的鋳型ＤＮＡを欠いているような、陰性対照も含むことができる。陰性対照は、夾雑を測定することができる。これは、このシステム及び試薬が、疑陽性シグナルを生じないことを確実にする。従って対照反応は、例えば、プライマーの配列特異的にアニーリングする能力及び伸長開始する能力、並びにプローブの配列特異的にハイブリダイズする能力及びＦＲＥＴが生じる能力を、容易に決定することができる。
【００５７】
一実施態様において、これらの方法は、夾雑を回避する工程を含む。例えば１回のサーマルサイクラー試行と次回の試行の間の夾雑を減少又は除去するために、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを使用する酵素的方法が、米国特許第５，０３５，９９６号、第５，６８３，８９６号及び第５，９４５，３１３号に説明されている。
【００５８】
ＦＲＥＴ技術と結びつけて従来型ＰＣＲ法を使用することができる。一実施態様において、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）装置が使用される。以下の特許出願は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術において使用されるようなリアルタイムＰＣＲを説明している：ＷＯ  ９７／４６７０７、ＷＯ  ９７／４６７１４、及びＷＯ  ９７／４６７１２。
【００５９】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用し、操作することができ、且つＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＮＴオペレーションシステムを利用することができる。試料からのシグナルを、機械位置として、光学ユニット上のキャピラリーを逐次獲得する。このソフトウェアは、各測定直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示することができる。蛍光捕捉時間は、１０〜１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクル工程後、サイクル回数に対する蛍光の定量表示を、全ての試料について、継続的に更新することができる。作製されたデータは、更なる分析のために保存することができる。
【００６０】
本明細書に記載された実施態様は、１又は複数の市販の装置の構成により限定されるものではないことは、理解される。
【００６１】
（製品／キット）
本発明の実施態様は、ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨを検出するための製品又はキットを更に提供する。製品は、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧを検出するために使用されるプライマー及びプローブを、好適な包装材料と一緒に含むことができる。ＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨの検出ための代表的プライマー及びプローブは、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的核酸分子にハイブリダイズすることが可能である。加えて、これらのキットは、固体支持体、緩衝液、酵素、及びＤＮＡ鎖などの、ＤＮＡの固定、ハイブリダイゼーション、及び検出に必要とされる好適に包装された試薬及び物質も含むことができる。プライマー及びプローブを設計する方法は、本明細書に開示されており、且つｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的核酸分子を増幅及びハイブリダイズするプライマー及びプローブの代表例が、提供される。
【００６２】
製品はまた、プローブを標識するための１又は複数の蛍光部分を含むか、或いはキットで供給されたプローブを、標識することができる。例えば、製品は、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプローブを標識するためのドナー及び／又はアクセプター蛍光部分を含んでよい。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分の例は、先に提供されている。
【００６３】
製品はまた、試料中のＭＴＢ−ＲＩＦ及び／又はＭＴＢ−ＩＮＨを検出するためのｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧプライマー及びプローブの使用に関する指示を有する添付文書又は包装ラベルも含むことができる。製品は加えて、本明細書に明らかにされた方法を実行するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、又は夾雑を予防する物質）を含んでよい。このような試薬は、本明細書に記載された市販の装置のひとつに特定されてよい。
【００６４】
本開示の実施態様は更に、以下の実施例において更に説明されるが、これらは請求項において説明された本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６５】
（実施例）
（ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧの例証的プローブを使用する、特異的ＳＮＰの検出）
例証的プローブを、ｒｐｏＢ  ５３１Ｌ、ｒｐｏＢ  ５３１Ｗ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｄ、ｒｐｏＢ  ５２６Ｎ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｌ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｋ、ｒｐｏＢ  ５１３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｌ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｑ、ｒｐｏＢ  ５２２Ｗ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｖ、ｒｐｏＢ  ５１６Ｙ、ｒｐｏＢ  ５３３Ｐ、ｒｐｏＢ  ５１１Ｐ、及びｒｐｏＢ  ５２６Ｒを含む、ＭＴＢにリファンピシン耐性を与えるｒｂｏＢ遺伝子中の１７個のＳＮＰ；ｉｎｈＡ−１５Ｔ、ｉｎｈＡ−８Ａ、及びｉｎｈＡ−８Ｃを含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与えるｉｎｈＡ遺伝子中の３個のＳＮＰ；並びに、ｋａｔＧ  ３１５Ｉ、ｋａｔＧ  ３１５Ｎ、ｋａｔＧ  ３１５Ｔ、及びｋａｔＧ  ３１５Ｔ２を含む、ＭＴＢにイソニアジド耐性を与えるｋａｔＧ遺伝子中の４個のＳＮＰを検出するプローブの能力について試験した。
【００６６】
各々が１、２又は３個のＳＮＰを表すそれぞれの核酸を含む様々なプラスミドを、使用した。ここで、各ウェル中の、緩衝液、ＺＯ５  ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡ、及びｋａｔＧ標的領域の増幅が可能なプライマー対、並びに表ＩＩに示された例証的プローブを含むＭａｓｔｅｒｍｉｘ（ＭＭＸ）を、各々表ＩＩに示された１、２又は３個の特定のＳＮＰを含むひとつの型のプラスミドＤＮＡでスパイクした。１６Ｓ配列を含むプラスミドを、１６Ｓ特異的プライマー対及びプローブを使用する陽性対照として使用した。引き続き、マルチウェルプレートを、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）上に搭載し、増幅及び検出反応に供した。結果を、表ＩＩに示す。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
先の本発明は、明瞭さと理解を目的として一部詳細に説明されているが、発明の真の範囲から逸脱しない限りは、本開示の内容から、形式及び詳細において様々な変更を行うことができることは、当業者には明らかであろう。例えば、先に説明された技術及び装置は全て、様々な組合せで使用することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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