(57)【要約】本発明は、ＤＮＡ含有試料から特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を単離するためのポリ（アルキレンオキシド）ポリマーに基づくサイズ選択的ＤＮＡ単離方法であって、（ａ）ＤＮＡ含有試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、および少なくとも１種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合することにより、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しないステップ、（ｂ）結合したＤＮＡ分子を、残りの試料から分離するステップを含み、さらに結合したＤＮＡ分子を洗浄するステップ、結合したＤＮＡ分子を固相から溶出させるステップを含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ含有試料から特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を単離するための、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーに基づくサイズ選択的ＤＮＡ単離方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡ含有試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、および少なくとも１種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、前記カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）結合したＤＮＡ分子を、残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、前記結合したＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、前記結合したＤＮＡ分子を前記固相から溶出させるステップ
を含む方法。
【請求項２】
ＤＮＡ含有試料から上限カットオフ値と下限カットオフ値とによって決定される特定のサイズ範囲内のサイズを有する標的ＤＮＡ分子を単離するためであって、
（ａ）前記ＤＮＡ含有試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、および少なくとも１種の二価カチオンを含む第１の結合用混合物を調製するステップであって、前記第１の結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記上限カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的ＤＮＡ分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）結合したＤＮＡ分子を、前記標的ＤＮＡ分子を含む前記残りの試料から分離するステップ、
（ｃ）前記残りの試料を含む第２の結合用混合物を調製するステップであって、前記第２の結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、前記第２の結合用混合物中の前記ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度が前記第１の結合用混合物と比較して上昇しており、沈殿した標的ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記下限カットオフ値を上回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、前記下限カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｄ）前記結合した標的ＤＮＡ分子を前記残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、前記結合した標的ＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、前記結合した標的ＤＮＡ分子を前記固相から溶出させるステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において、結合用緩衝液を前記ＤＮＡ含有試料に添加して前記結合用混合物を調製し、前記結合用緩衝液が、前記少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、前記少なくとも１種の二価カチオンおよび少なくとも１種の緩衝剤を含み、前記結合用緩衝液が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）において、結合用緩衝液を前記残りの試料に添加して前記第２の結合用混合物を調製し、前記結合用緩衝液が、前記少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、前記少なくとも１種の二価カチオンおよび少なくとも１種の緩衝剤を含み、前記結合用緩衝液が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、任意選択で、ステップ（ａ）におけるものと同じ結合用緩衝液が使用される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記結合用混合物および／または前記結合用緩衝液が、少なくとも１種の塩をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
以下の特性：
ａ）前記塩が、非カオトロピック塩であること、
ｂ）前記塩が、一価の塩であること、
ｃ）前記塩が、アルカリ金属塩、好ましくはアルカリ金属ハロゲン化物であること、
ｄ）前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウムおよび塩化セシウムから選択され、より好ましくは、前記塩が塩化ナトリウムであること、ならびに／または
ｅ）前記塩が、前記結合用混合物中に、≧２５０ｍＭ、≧３５０ｍＭ、≧５００ｍＭ、≧６００ｍＭ、≧６５０ｍＭ、≧７００ｍＭ、≧７５０ｍＭおよび≧８００ｍＭから選択される濃度、ならびに／または、２５０ｍＭ〜２Ｍ、３５０ｍＭ〜１．７５Ｍ、５００ｍＭ〜１．５Ｍ、６００ｍＭ〜１．３Ｍおよび６５０ｍＭ〜１．２５Ｍから選択される範囲の濃度で存在すること
の１つまたは複数を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記二価カチオンが、以下の特性：
ａ）前記二価カチオンが、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋およびＮｉ２＋から選択され、好ましくは、Ｍｇ２＋であること、
ｂ）前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に溶解塩の形態で存在し、前記塩が、任意選択で、ハロゲン化物、硫酸塩、リン酸塩または炭酸塩、好ましくは、ハロゲン化物であること、
ｃ）前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に、塩化マグネシウムである溶解塩の形態で存在すること、
ｄ）前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に、好ましくは溶解塩の形態で、３ｍＭ〜７５ｍＭ、４ｍＭ〜５０ｍＭ、５ｍＭ〜４０ｍＭ、５．５ｍＭ〜３５ｍＭ、６ｍＭ〜３０ｍＭ、６．５ｍＭ〜２５ｍＭ、７ｍＭ〜２０ｍＭおよび７．５ｍＭ〜１５ｍＭから選択される範囲の濃度で存在すること、ならびに／または
ｅ）前記二価カチオンが、前記結合用混合物中に溶解塩の形態で存在し、前記結合用混合物が、アルカリ金属塩、好ましくは、塩化ナトリウムをさらに含有すること
の１つまたは複数を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
以下の特性：
ａ）前記ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーが、ポリエチレングリコールであること、
ｂ）前記ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーが、好ましくはポリエチレングリコールであり、２０００〜４００００、２５００〜３００００、３０００〜２５０００、３５００〜２００００、４０００〜１６０００、４５００〜１２０００および５０００〜１００００から選択される範囲の分子量を有すること、
ｃ）前記カットオフ値が、前記結合用混合物中の前記ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度によって調整されること、ならびに／または
ｄ）前記結合用混合物が、前記ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、好ましくはポリエチレングリコールを少なくとも７．５％の濃度で含み、前記ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー濃度が６％〜２０％、７％〜１７％、７．５％〜１５％、８％〜１３％および８．５％〜１２．５％から選択される範囲内に入ることが好ましいこと
の１つまたは複数を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記結合用混合物が、８．２５〜９．７５、８．５〜９．５または８．６〜９．２から選択される範囲内に入るｐＨ値を有し、ならびに／または、前記結合用混合物が、少なくとも１種の緩衝剤を、好ましくは２５ｍＭ〜６００ｍＭ、５０ｍＭ〜５００ｍＭ、６０ｍＭ〜４５０ｍＭ、７０ｍＭ〜４００ｍＭ、８０ｍＭ〜３５０ｍＭ、９０ｍＭ〜３００ｍＭおよび１００ｍＭ〜２７５ｍＭから選択される濃度で含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合条件が、前記ＤＮＡ含有試料および／または残りの試料と接触させる前記結合用緩衝液によって排他的に確立される、請求項３から９までまたは請求項４から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合用緩衝液が、以下の特性：
ａ）８．２５〜９．７５、８．５〜９．５または８．６〜９．２から選択される範囲内に入るｐＨ値を有すること、
ｂ）緩衝剤を、２５ｍＭ〜１Ｍ、５０ｍＭ〜７５０ｍＭ、７５ｍＭ〜７００ｍＭ、１００ｍＭ〜６５０ｍＭ、１２５ｍＭ〜６００ｍＭ、１５０ｍＭ〜５５０ｍＭ、１７５ｍＭ〜５２５ｍＭおよび２００ｍＭ〜５００ｍＭから選択される濃度で含むこと、
ｃ）塩、好ましくはアルカリ金属塩を、０．５Ｍ〜４Ｍ、０．７Ｍ〜３．５Ｍ、１Ｍ〜３Ｍ、１．２Ｍ〜２．７５Ｍおよび１．３Ｍ〜２．５Ｍから選択される濃度で含むこと、
ｄ）前記ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーが、好ましくはポリエチレングリコールであり、７％〜４５％、１０％〜４０％、１２．５％〜３５％、１５％〜３０％、１７．５％〜２７．５％および２０％〜２５％から選択される濃度で含むこと、ならびに／または
ｅ）以下の特徴：
ｉ）Ｍｇ２＋を二価カチオン、好ましくはＭｇＣｌ２として含むこと、
ｉｉ）ポリエチレングリコールを、好ましくは、１２．５％〜３５％、１５％〜３０％、１７．５％〜２７．５％および２０％〜２５％から選択される濃度で含むこと、
ｉｉｉ）アルカリ金属塩、好ましくは塩化ナトリウムを、０．５Ｍ〜２．７５Ｍ、好ましくは、０．７５Ｍ〜２．５Ｍの範囲内に入る濃度で含むこと、
ｉｖ）前記少なくとも１種の緩衝剤を、１００〜５５０ｍＭの範囲内に入る濃度で含むこと、
ｖ）８．５〜９．５または８．６〜９．２の範囲内に入るｐＨを有すること
を有すること
の１つまたは複数を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）前記ＤＮＡ含有試料、７．５％〜１５％、好ましくは、８％〜１３％の範囲内に入る濃度のポリエチレングリコール、および７ｍＭ〜４０ｍＭ、好ましくは８ｍＭ〜２０ｍＭの範囲内に入る濃度のＭｇＣｌ２を含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、８．５〜９．２５の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、前記カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）前記結合したＤＮＡ分子を、前記残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、前記結合したＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、前記結合したＤＮＡ分子を前記固相から溶出させるステップ
の通り実施される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）前記ＤＮＡ含有試料、８．５％〜９．５％の範囲内に入る濃度のポリエチレングリコール、および、７ｍＭ〜４０ｍＭ、好ましくは８ｍＭ〜２０ｍＭの範囲内に入る濃度のＭｇＣｌ２を含む第１の結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、８．５〜９．２５の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、前記上限カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的ＤＮＡ分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）前記結合したＤＮＡ分子を、前記標的ＤＮＡ分子を含む前記残りの試料から分離するステップ、
（ｃ）前記残りの試料を含む第２の結合用混合物を調製するステップであって、前記第２の結合用混合物が、８．５〜９．２５の範囲内に入るｐＨを有し、前記第２の結合用混合物中のポリエチレングリコールの濃度が前記第１の結合用混合物と比較して上昇しており、１０％〜１２％の範囲内に入り、沈殿した標的ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、標的ＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、前記使用された結合条件下で、前記下限カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は前記固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｄ）前記結合した標的ＤＮＡ分子を前記残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、前記結合した標的ＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、前記結合した標的ＤＮＡ分子を前記固相から溶出させるステップ
の通り実施される、請求項２から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を標的ＤＮＡ分子としてアダプターライゲーション試料であるＤＮＡ含有試料から単離するため、およびアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物を除去するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法であって、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物から、前記アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子のサイズがより大きいことに基づいて分離する、方法。
【請求項１５】
所望のカットオフ値を上回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子のＤＮＡ含有試料からのサイズ選択的単離のためのキットであって、
（ａ）少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、少なくとも１種の二価カチオンおよび少なくとも１種の緩衝剤を含む結合用緩衝液であり、８〜１０の範囲内に入るｐＨ値を有する、結合用緩衝液、
（ｂ）無修飾ケイ素含有表面を有する固相、
（ｃ）任意選択で、少なくとも１種の洗浄用溶液、および
（ｄ）任意選択で、少なくとも１種の溶出用溶液
を含むキット。
【請求項１６】
前記結合用緩衝液が、請求項１１に記載の特性のうちの１つまたは複数を有する、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＤＮＡ分子のサイズ選択的単離の方法を提供する。本発明の方法は、シークエンシングライブラリーを調製するために、所望の最小長を有する標的ＤＮＡ分子を単離するのに特に有用である。さらに、ＤＮＡ分子のサイズ選択的単離に使用することができるキットが提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
核酸を単離するための種々の方法が先行技術において周知である。そのような方法は、目的の核酸を、他の試料構成成分、例えば、タンパク質夾雑物、または潜在的に、非標的核酸と称されることも多い他の核酸などから分離することを伴う。例えば、種々の試料材料から、ＤＮＡなどの核酸を、それらをカオトロピック塩の存在下でシリカ材料に結合させることによって単離するための方法が先行技術において周知であり、確立されている。前記原理に基づく典型的な方法は、例えば、ＥＰ０３８９０６３、ＷＯ０３／０５７９１０、ＥＰ０７５７１０６、ＵＳ６，０３７，４６５およびＷＯ２００６／０８４７５３に記載されている。
【０００３】
目的の特定の核酸を他の核酸から単離することが意図されている場合、分離プロセスは、通常、例えば、それらのトポロジー（例えば、スーパーコイルＤＮＡであるか直鎖ＤＮＡであるか）、それらのサイズ（長さ）または化学的差異（例えば、ＤＮＡであるかＲＮＡであるか）などの、標的核酸と非標的核酸のパラメータの差異に基づく。
【０００４】
特定の適用に関しては、サイズの差異が標的核酸と非標的核酸を区別するための重要な基準である。例えば、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）適用のためのライブラリー構築では、ＤＮＡのサイズ選択的分画が重要なステップである。パイロシークエンシング、合成によるシークエンシングまたはライゲーションによるシークエンシングなどの種々のＮＧＳ技術および方法が存在する。大多数のＮＧＳプラットフォームは、一般的な科学技術的特徴、すなわち、フローセル中でまたは油−水エマルションの生成により空間的に分離された、クローンにより増幅させたまたは単一のＤＮＡ分子の大規模並列シークエンシングを共有する。ＮＧＳでは、ポリメラーゼ媒介性ヌクレオチド伸長のサイクルを繰り返すことによって、または、１つの形式では、オゴヌクレオチドライゲーションの反復サイクルによってシークエンシングを実施する。大規模並列プロセスとして、ＮＧＳでは、プラットフォームに応じて、単回の計器実行で数百メガベース〜ギガベースのヌクレオチド配列アウトプットが生成される。大きな体積の配列データの安価な生成は、従来の方法と比較した主要な利点である。したがって、ＮＧＳ技術は、遺伝学的研究における主要な駆動力になっている。いくつかのＮＧＳ技術プラットフォームに広範にわたる使用が見出されており、それらとして、例えば、以下のＮＧＳプラットフォーム：Ｒｏｃｈｅ／４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｏｌｅｘａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉＤ（商標）システム、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）半導体配列分析機器、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）リアルタイムシークエンシングおよびＨｅｌｉｃｏｓ（商標）単一分子シークエンシング（ＳＭＳ）が挙げられる。ＮＧＳ技術、ＮＧＳプラットフォームおよびＮＧＳ技術の一般的な適用／分野は、例えば、Voelkerdingら（Clinical  Chemistry、５５巻：４号、６４１〜６５８頁、２００９年）およびMetzker（Nature  Reviews/  Genetics、１１巻、２０１０年１月、３１〜４６頁）に概説されている。
【０００５】
ＮＧＳ技術ではシークエンシングが大規模並列様式で実施されるという特徴に加えて、ＮＧＳ技術プラットフォームでは、共通して、大規模並列シークエンシングに適したシークエンシングライブラリーの調製が必要である。そのようなシークエンシングライブラリーの例としては、断片ライブラリー、メイトペア（ｍａｔｅ−ｐａｉｒｅｄ）ライブラリーまたはバーコード化断片ライブラリーが挙げられる。大多数のプラットフォームは、計器での「実行」前に、軽微な改変を伴って一般的なライブラリー調製手順に準拠する。この手順は、ＤＮＡの断片化（ｃＤＮＡから、例えば、超音波処理、水せん断、超音波、噴霧または酵素による断片化などの機械的せん断によって得ることもできる）、その後のＤＮＡ修復および末端処理（平滑末端またはＡ突出部）、ならびに、最後に、プラットフォームに特異的なアダプターライゲーションを含む。そのようなシークエンシングライブラリーの調製および設計は、例えば、Voelkerding、２００９年およびMetzker、２０１０年にも記載されている。
【０００６】
高品質のシークエンシングデータを確実にするために、効率的なライブラリー調製方法が必要とされている。さらに、シークエンシング読み取りのバックグラウンドを低減するために、ライブラリー調製の結果として配列ライブラリー中に存在し得るＤＮＡ夾雑物を除去することが重要である。そのようなＤＮＡ夾雑物の例は、アダプターライゲーション後に多くの場合シークエンシングライブラリー中に存在するアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物である。これらの夾雑物である小さなＤＮＡ分子は、シークエンシングの前に除去しなければならない。
【０００７】
効率的なアダプターライゲーションを確実にするために、アダプターライゲーションの間、アダプターを過剰に使用する。したがって、アダプターライゲーション後、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子に加えて、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプター二量体などのアダプターとアダプターとのライゲーション産物が存在する。ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物をアダプターがライゲートしたＤＮＡ分子から除去することが重要である。そうでなければ、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物によりシークエンシング能力が使い果たされ、それにより、目的の配列を調査するために利用可能な力が低減する。シークエンシングライブラリーがライゲートされていないアダプター単量体およびアダプター二量体を大量に含む場合、有益なシークエンシングリソースが無駄になる。したがって、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物を除去することにより、下流のシークエンシングの価値が上昇する。ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物は、通常、シークエンシングされるＤＮＡ断片を含有する、より大きなアダプターがライゲートしたＤＮＡ分子のサイズ選択的精製によって除去される。
【０００８】
特定の標的サイズの、特定の標的サイズ範囲のＤＮＡを個別に単離するために、先行技術においていくつかの手法が開発された。アダプター二量体および単量体を除去するために、これらのサイズ選択方法を使用することができ、その理由は、これらのＤＮＡ夾雑物が、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子よりも小さなサイズを有するからである。標的サイズのＤＮＡを単離するための古典的な方法は、ゲルにおいてＤＮＡを分離し、所望のゲルバンド（単数または複数）を切り取り、次いで、ゲル断片（単数または複数）から標的サイズのＤＮＡを単離することを伴う。多くの次世代シークエンシングライブラリー調製プロトコールでは、アダプター単量体および二量体を除去するために、それぞれのゲルに基づくサイズ選択方法が多くの場合推奨される。さらに、これらの方法は、所望のサイズよりも大きなＤＮＡが試料中に含有される場合にそれを除去するためにも使用することができる。それにより、下限カットオフ値と上限カットオフ値とによって決定される特定のサイズ範囲内に入るサイズを有するＤＮＡ分子を単離することが可能である。しかし、目的の核酸を含有するゲルの部分を手動で切り取り、次いで、ゲルを分解する処理を行うかまたは他のやり方でゲルスライスから標的サイズのＤＮＡを抽出しなければならないので、それぞれの方法には時間がかかる。
【０００９】
別の広く使用されている技術は、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーを含有する緩衝液、特にポリエチレングリコールに基づく緩衝液（LisおよびSchleif  Nucleic  Acids  Res.、１９７５年３月；２巻（３号）：３８３〜９頁）またはカルボキシル官能性をもたせたビーズ上での結合／沈殿（DeAngelisら、Nuc.  Acid.  Res.、１９９５年、２３巻（２２号）、４７４２〜３頁；ＵＳ５，８９８，０７１およびＵＳ５，７０５，６２８、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（ＡｍＰｕｒｅ  ＸＰ；ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ）により商業化、ならびにＵＳ６，５３４，２６２）を用いたサイズ選択的沈殿である。ＡｍＰｕｒｅ  ＸＰ製品は、広く使用されており、したがって、基準製品と認識することができる。ＡｍＰｕｒｅ  ＸＰ製品では、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を単離することが可能になり、さらに、特定のサイズ範囲（下限カットオフ値と上限カットオフ値とで決定される）内に入るサイズを有するＤＮＡ分子を単離することが可能になる。これらの方法では、所望のサイズの沈殿ＤＮＡ断片を十分な収率で生成させるために、カルボキシル化したビーズ表面が必須である。固相の表面修飾が必要であることにより、核酸結合のために使用する固体支持体をもたらすために使用することができる材料が限定される。さらに、表面修飾は、固相の製作において冗長で時間および費用がかかるステップである。したがって、ポリエチレングリコールに基づくサイズ選択方法がサイズ選択的ＤＮＡ単離のゴールドスタンダードとして確立されているにもかかわらず、改善された方法が必要とされている。
【００１０】
先行技術では、ＤＮＡ分子、特に、特定の最小サイズを有するＤＮＡ分子のサイズ選択的単離を可能にする方法への関心およびその必要性の高まりが示されている。特に、既存の次世代シークエンシングライブラリー調製プロトコールに組み込むことが可能な、特定の最小サイズのＤＮＡおよび／または特定のサイズ範囲内に入るサイズを有するＤＮＡを単離するための、単純であり、有効であり、費用効率のよい方法が必要とされている。さらに、アダプターライゲーション試料、特に、シークエンシングライブラリーの調製において得られるアダプターライゲーション試料から、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプター二量体を除去するための、高速であり、単純であり、信頼できる方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第０３８９０６３号明細書
【特許文献２】国際公開第０３／０５７９１０号
【特許文献３】欧州特許第０７５７１０６号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０３７，４６５号明細書
【特許文献５】国際公開第２００６／０８４７５３号
【特許文献６】米国特許第５，７０５，６２８号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Voelkerdingら、Clinical  Chemistry、５５巻：４号、６４１〜６５８頁、２００９年）
【非特許文献２】Metzker、Nature  Reviews/  Genetics、１１巻、２０１０年１月、３１〜４６頁）
【非特許文献３】LisおよびSchleif  Nucleic  Acids  Res.、１９７５年３月；２巻（３号）：３８３〜９頁
【非特許文献４】DeAngelisら、Nuc.  Acid.  Res.、１９９５年、２３巻（２２号）、４７４２〜３頁；ＵＳ５，８９８，０７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
発明の要旨
異なるサイズのＤＮＡ分子を含むＤＮＡ含有試料から標的サイズまたは標的サイズ範囲のＤＮＡを単離するための方法を提供することは、本発明の目的である。特に、固体支持体材料の表面修飾に依存せずに、標的サイズまたは標的サイズ範囲の標的ＤＮＡ分子を十分な収率で単離することを可能にするポリ（アルキレンオキシド）ポリマーに基づくサイズ選択的ＤＮＡ単離方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ＤＮＡ含有試料から特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を選択的に沈殿させるために、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、例えばポリエチレングリコールを使用する、確立されたサイズ選択的ＤＮＡ単離技術に基づく。沈殿ＤＮＡ分子は固体支持体に結合するようになり、残りの試料から回収し、取り出すことができる。背景技術において議論した通り、先行技術において公知のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーに基づくサイズ選択的方法には、標的ＤＮＡ分子の十分な収率での単離を可能にするために、表面が修飾された固相が必要であるという欠点がある。本発明者らはここで、驚いたことに、無修飾ケイ素含有表面を有する固相を使用する場合でも、結合用混合物中に二価カチオンを含めれば、また、結合用混合物において、８〜１０の範囲内に入るアルカリ性のｐＨ値が確立されれば、標的ＤＮＡ分子の高収率でのサイズ選択的単離も可能であることを見出した。実施例により、特定のカットオフ値を上回るサイズを有する、回収されるＤＮＡ断片の収率が、この特徴の組合せによって有意に増強され、それにより、無修飾ケイ素含有表面を有する固相を、ＤＮＡ結合のために、高い回収率を確実にしながら使用することが可能になることが実証される。それにより、時間がかかり、高価な固相の表面修飾に依存せずに、有効なポリ（アルキレンオキシド）ポリマーに基づくサイズ選択的ＤＮＡ単離方法が提供される。
【００１５】
第１の態様によると、ＤＮＡ含有試料から特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を単離するための、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーに基づくサイズ選択的ＤＮＡ単離方法であって、
（ａ）ＤＮＡ含有試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、および少なくとも１種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）結合したＤＮＡ分子を、残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、結合したＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、結合したＤＮＡ分子を固相から溶出させるステップ
を含む方法が提供される。
【００１６】
前記方法では、所望のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子は固相に効率的に結合し、高収率が伴うが、一方、前記カットオフ値を下回るサイズを有するＤＮＡ分子は、ほとんど結合せず、したがって、ステップ（ａ）において回収されない。カットオフ値は、結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度を、先行技術から公知であり、また実施例によっても実証される通り改変することによって調整することができる。本明細書で特定される二価カチオンの存在およびアルカリ性ｐＨ値により、無修飾ケイ素含有表面を有する固相の使用にもかかわらず、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子の効率的な結合が確実になる。この方法は、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を標的ＤＮＡ分子としてアダプターライゲーション試料から単離するため、ならびにアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物を除去するために、特に適している。
【００１７】
第２の態様によると、所望のカットオフ値を上回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子のＤＮＡ含有試料からのサイズ選択的単離のためのキットであって、
（ａ）少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、少なくとも１種の二価カチオンおよび少なくとも１種の緩衝剤を含む結合用緩衝液であり、８〜１０の範囲内に入るｐＨ値を有する、結合用緩衝液、
（ｂ）無修飾ケイ素含有表面を有する固相、
（ｃ）任意選択で、少なくとも１種の洗浄用溶液、および
（ｄ）任意選択で、少なくとも１種の溶出用溶液
を含むキットが提供される。
【００１８】
それぞれのキットは、本発明の第１の態様による方法と併せて、およびそれを実施するために使用することができる。
【００１９】
本出願の他の目的、特徴、利点および態様が以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになる。しかし、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例は、適用の好ましい実施形態を示すものでありながら、単に例示として示されていることが理解されるべきである。開示されている発明の主旨および範囲内での種々の変化および改変は、以下を読むことにより当業者には容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、結合用緩衝液、したがって、本発明による結合条件および比較用結合用緩衝液／条件を使用したサイズ選択的単離の前後の、せん断により断片化されたＤＮＡの電気泳動図（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡ  ｃｈｉｐ）を示すグラフである。これらの曲線から、無修飾シリカ表面を有する固相を使用した場合に、アルカリ性ｐＨ（本発明では９．０）を使用し、結合用混合物中に二価カチオン（本発明ではＭｇＣｌ２由来）を含めることにより、ＰＥＧ８０００により沈殿するＤＮＡ断片の収率が増加することが実証される。ＦＵ：蛍光単位、ｂｐ：塩基対。
【００２１】
【図２】図２は、本発明による種々の結合条件、および固相として磁気シリカ粒子を使用したサイズ選択的単離の前後の、せん断により断片化されたＤＮＡの電気泳動図（Ａｇｉｌｅｎｔ  ７５００  ｃｈｉｐ）を示すグラフである。見ることができる通り、回収されたＤＮＡ断片のカットオフ値は変動し得、したがって、結合用混合物中で異なる濃度のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー（本発明ではポリエチレングリコール）を使用することによって調整することができる。これは、異なる量の結合用緩衝液をＤＮＡ含有試料に添加することによって実現された。
【００２２】
【図３】図３は、本発明による種々の結合条件および固相としてシリカスピンカラムを使用した、サイズ選択的単離の前後のせん断により断片化されたＤＮＡの電気泳動図（Ａｇｉｌｅｎｔ  ７５００  ｃｈｉｐ）を示すグラフである。見ることができる通り、回収されたＤＮＡ断片のカットオフ値は変動し得、したがって、結合用混合物中に異なる濃度のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー（本発明ではポリエチレングリコール）を使用することによって調整することができる。
【００２３】
【図４ａ】図４〜９は、２重サイズ選択を実施して上限カットオフ値と下限カットオフ値（ｂｐ）とによって規定される範囲内に入るＤＮＡ断片を単離するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例４の結果を示すグラフである。結果を基準製品であるＡＭＰｕｒｅと比較した。黒棒は、第２の溶出ステップ後に得られたＤＮＡの量を示す。図４ａは、緩衝剤としてＣＨＥＳを使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図４ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図５ａは、緩衝剤としてＡＭＰＤを異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図５ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図６ａおよび６ｂは、緩衝剤としてＴＡＰＳを使用した場合の対応する結果を示す。図７は、緩衝剤ＡＭＰＳＯを異なる濃度および異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した場合のＤＮＡ回収率（％）を示す。図８は、緩衝剤としてＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図９は、異なる濃度のＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図４ｂ】図４〜９は、２重サイズ選択を実施して上限カットオフ値と下限カットオフ値（ｂｐ）とによって規定される範囲内に入るＤＮＡ断片を単離するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例４の結果を示すグラフである。結果を基準製品であるＡＭＰｕｒｅと比較した。黒棒は、第２の溶出ステップ後に得られたＤＮＡの量を示す。図４ａは、緩衝剤としてＣＨＥＳを使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図４ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図５ａは、緩衝剤としてＡＭＰＤを異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図５ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図６ａおよび６ｂは、緩衝剤としてＴＡＰＳを使用した場合の対応する結果を示す。図７は、緩衝剤ＡＭＰＳＯを異なる濃度および異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した場合のＤＮＡ回収率（％）を示す。図８は、緩衝剤としてＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図９は、異なる濃度のＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図５ａ】図４〜９は、２重サイズ選択を実施して上限カットオフ値と下限カットオフ値（ｂｐ）とによって規定される範囲内に入るＤＮＡ断片を単離するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例４の結果を示すグラフである。結果を基準製品であるＡＭＰｕｒｅと比較した。黒棒は、第２の溶出ステップ後に得られたＤＮＡの量を示す。図４ａは、緩衝剤としてＣＨＥＳを使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図４ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図５ａは、緩衝剤としてＡＭＰＤを異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図５ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図６ａおよび６ｂは、緩衝剤としてＴＡＰＳを使用した場合の対応する結果を示す。図７は、緩衝剤ＡＭＰＳＯを異なる濃度および異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した場合のＤＮＡ回収率（％）を示す。図８は、緩衝剤としてＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図９は、異なる濃度のＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図５ｂ】図４〜９は、２重サイズ選択を実施して上限カットオフ値と下限カットオフ値（ｂｐ）とによって規定される範囲内に入るＤＮＡ断片を単離するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例４の結果を示すグラフである。結果を基準製品であるＡＭＰｕｒｅと比較した。黒棒は、第２の溶出ステップ後に得られたＤＮＡの量を示す。図４ａは、緩衝剤としてＣＨＥＳを使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図４ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図５ａは、緩衝剤としてＡＭＰＤを異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図５ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図６ａおよび６ｂは、緩衝剤としてＴＡＰＳを使用した場合の対応する結果を示す。図７は、緩衝剤ＡＭＰＳＯを異なる濃度および異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した場合のＤＮＡ回収率（％）を示す。図８は、緩衝剤としてＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図９は、異なる濃度のＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図６ａ】図４〜９は、２重サイズ選択を実施して上限カットオフ値と下限カットオフ値（ｂｐ）とによって規定される範囲内に入るＤＮＡ断片を単離するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例４の結果を示すグラフである。結果を基準製品であるＡＭＰｕｒｅと比較した。黒棒は、第２の溶出ステップ後に得られたＤＮＡの量を示す。図４ａは、緩衝剤としてＣＨＥＳを使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図４ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図５ａは、緩衝剤としてＡＭＰＤを異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図５ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図６ａおよび６ｂは、緩衝剤としてＴＡＰＳを使用した場合の対応する結果を示す。図７は、緩衝剤ＡＭＰＳＯを異なる濃度および異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した場合のＤＮＡ回収率（％）を示す。図８は、緩衝剤としてＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図９は、異なる濃度のＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図６ｂ】図４〜９は、２重サイズ選択を実施して上限カットオフ値と下限カットオフ値（ｂｐ）とによって規定される範囲内に入るＤＮＡ断片を単離するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例４の結果を示すグラフである。結果を基準製品であるＡＭＰｕｒｅと比較した。黒棒は、第２の溶出ステップ後に得られたＤＮＡの量を示す。図４ａは、緩衝剤としてＣＨＥＳを使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図４ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図５ａは、緩衝剤としてＡＭＰＤを異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図５ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図６ａおよび６ｂは、緩衝剤としてＴＡＰＳを使用した場合の対応する結果を示す。図７は、緩衝剤ＡＭＰＳＯを異なる濃度および異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した場合のＤＮＡ回収率（％）を示す。図８は、緩衝剤としてＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図９は、異なる濃度のＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図７】図４〜９は、２重サイズ選択を実施して上限カットオフ値と下限カットオフ値（ｂｐ）とによって規定される範囲内に入るＤＮＡ断片を単離するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例４の結果を示すグラフである。結果を基準製品であるＡＭＰｕｒｅと比較した。黒棒は、第２の溶出ステップ後に得られたＤＮＡの量を示す。図４ａは、緩衝剤としてＣＨＥＳを使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図４ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図５ａは、緩衝剤としてＡＭＰＤを異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図５ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図６ａおよび６ｂは、緩衝剤としてＴＡＰＳを使用した場合の対応する結果を示す。図７は、緩衝剤ＡＭＰＳＯを異なる濃度および異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した場合のＤＮＡ回収率（％）を示す。図８は、緩衝剤としてＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図９は、異なる濃度のＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図８】図４〜９は、２重サイズ選択を実施して上限カットオフ値と下限カットオフ値（ｂｐ）とによって規定される範囲内に入るＤＮＡ断片を単離するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例４の結果を示すグラフである。結果を基準製品であるＡＭＰｕｒｅと比較した。黒棒は、第２の溶出ステップ後に得られたＤＮＡの量を示す。図４ａは、緩衝剤としてＣＨＥＳを使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図４ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図５ａは、緩衝剤としてＡＭＰＤを異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図５ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図６ａおよび６ｂは、緩衝剤としてＴＡＰＳを使用した場合の対応する結果を示す。図７は、緩衝剤ＡＭＰＳＯを異なる濃度および異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した場合のＤＮＡ回収率（％）を示す。図８は、緩衝剤としてＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図９は、異なる濃度のＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図９】図４〜９は、２重サイズ選択を実施して上限カットオフ値と下限カットオフ値（ｂｐ）とによって規定される範囲内に入るＤＮＡ断片を単離するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例４の結果を示すグラフである。結果を基準製品であるＡＭＰｕｒｅと比較した。黒棒は、第２の溶出ステップ後に得られたＤＮＡの量を示す。図４ａは、緩衝剤としてＣＨＥＳを使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図４ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図５ａは、緩衝剤としてＡＭＰＤを異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図５ｂは、結合用混合物中で９％ＰＥＧを異なるｐＨ値で使用した、ＤＮＡ回収率（％）を示す（上限カットオフ値）。図６ａおよび６ｂは、緩衝剤としてＴＡＰＳを使用した場合の対応する結果を示す。図７は、緩衝剤ＡＭＰＳＯを異なる濃度および異なるｐＨ値で使用して２重サイズ選択を実施した場合のＤＮＡ回収率（％）を示す。図８は、緩衝剤としてＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。図９は、異なる濃度のＴＲＩＳ／（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用して２重サイズ選択を実施した後のＤＮＡ回収率（％）を示す。
【００２４】
【図１０ａ】図１０〜１４は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例５の結果を示す図である。図１０ａは、緩衝剤としてｐＨ９．０、９．１または９．２に調整したＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含む、新しく調製したサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡを示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１０ｂは、試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。図１１〜１４は、６カ月間保存されており、異なる緩衝剤を含むサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られた結果を示す。図１１ａ、１２ａ、１３ａおよび１４ａは、異なる緩衝剤（図１１ａ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ａ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ａ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ａ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を含む選択用緩衝液を用いて処理した分析試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１１ｂ、１２ｂ、１３ｂおよび１４ｂは、それぞれの選択用緩衝液（図１１ｂ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ｂ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ｂ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ｂ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を用いて処理した試料について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図１０ｂ】図１０〜１４は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例５の結果を示す図である。図１０ａは、緩衝剤としてｐＨ９．０、９．１または９．２に調整したＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含む、新しく調製したサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡを示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１０ｂは、試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。図１１〜１４は、６カ月間保存されており、異なる緩衝剤を含むサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られた結果を示す。図１１ａ、１２ａ、１３ａおよび１４ａは、異なる緩衝剤（図１１ａ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ａ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ａ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ａ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を含む選択用緩衝液を用いて処理した分析試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１１ｂ、１２ｂ、１３ｂおよび１４ｂは、それぞれの選択用緩衝液（図１１ｂ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ｂ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ｂ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ｂ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を用いて処理した試料について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図１１ａ】図１０〜１４は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例５の結果を示す図である。図１０ａは、緩衝剤としてｐＨ９．０、９．１または９．２に調整したＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含む、新しく調製したサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡを示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１０ｂは、試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。図１１〜１４は、６カ月間保存されており、異なる緩衝剤を含むサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られた結果を示す。図１１ａ、１２ａ、１３ａおよび１４ａは、異なる緩衝剤（図１１ａ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ａ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ａ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ａ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を含む選択用緩衝液を用いて処理した分析試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１１ｂ、１２ｂ、１３ｂおよび１４ｂは、それぞれの選択用緩衝液（図１１ｂ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ｂ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ｂ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ｂ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を用いて処理した試料について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図１１ｂ】図１０〜１４は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例５の結果を示す図である。図１０ａは、緩衝剤としてｐＨ９．０、９．１または９．２に調整したＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含む、新しく調製したサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡを示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１０ｂは、試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。図１１〜１４は、６カ月間保存されており、異なる緩衝剤を含むサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られた結果を示す。図１１ａ、１２ａ、１３ａおよび１４ａは、異なる緩衝剤（図１１ａ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ａ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ａ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ａ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を含む選択用緩衝液を用いて処理した分析試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１１ｂ、１２ｂ、１３ｂおよび１４ｂは、それぞれの選択用緩衝液（図１１ｂ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ｂ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ｂ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ｂ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を用いて処理した試料について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図１２ａ】図１０〜１４は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例５の結果を示す図である。図１０ａは、緩衝剤としてｐＨ９．０、９．１または９．２に調整したＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含む、新しく調製したサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡを示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１０ｂは、試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。図１１〜１４は、６カ月間保存されており、異なる緩衝剤を含むサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られた結果を示す。図１１ａ、１２ａ、１３ａおよび１４ａは、異なる緩衝剤（図１１ａ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ａ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ａ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ａ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を含む選択用緩衝液を用いて処理した分析試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１１ｂ、１２ｂ、１３ｂおよび１４ｂは、それぞれの選択用緩衝液（図１１ｂ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ｂ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ｂ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ｂ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を用いて処理した試料について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図１２ｂ】図１０〜１４は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例５の結果を示す図である。図１０ａは、緩衝剤としてｐＨ９．０、９．１または９．２に調整したＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含む、新しく調製したサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡを示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１０ｂは、試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。図１１〜１４は、６カ月間保存されており、異なる緩衝剤を含むサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られた結果を示す。図１１ａ、１２ａ、１３ａおよび１４ａは、異なる緩衝剤（図１１ａ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ａ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ａ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ａ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を含む選択用緩衝液を用いて処理した分析試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１１ｂ、１２ｂ、１３ｂおよび１４ｂは、それぞれの選択用緩衝液（図１１ｂ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ｂ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ｂ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ｂ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を用いて処理した試料について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図１３ａ】図１０〜１４は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例５の結果を示す図である。図１０ａは、緩衝剤としてｐＨ９．０、９．１または９．２に調整したＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含む、新しく調製したサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡを示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１０ｂは、試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。図１１〜１４は、６カ月間保存されており、異なる緩衝剤を含むサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られた結果を示す。図１１ａ、１２ａ、１３ａおよび１４ａは、異なる緩衝剤（図１１ａ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ａ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ａ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ａ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を含む選択用緩衝液を用いて処理した分析試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１１ｂ、１２ｂ、１３ｂおよび１４ｂは、それぞれの選択用緩衝液（図１１ｂ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ｂ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ｂ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ｂ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を用いて処理した試料について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図１３ｂ】図１０〜１４は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例５の結果を示す図である。図１０ａは、緩衝剤としてｐＨ９．０、９．１または９．２に調整したＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含む、新しく調製したサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡを示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１０ｂは、試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。図１１〜１４は、６カ月間保存されており、異なる緩衝剤を含むサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られた結果を示す。図１１ａ、１２ａ、１３ａおよび１４ａは、異なる緩衝剤（図１１ａ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ａ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ａ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ａ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を含む選択用緩衝液を用いて処理した分析試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１１ｂ、１２ｂ、１３ｂおよび１４ｂは、それぞれの選択用緩衝液（図１１ｂ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ｂ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ｂ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ｂ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を用いて処理した試料について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図１４ａ】図１０〜１４は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例５の結果を示す図である。図１０ａは、緩衝剤としてｐＨ９．０、９．１または９．２に調整したＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含む、新しく調製したサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡを示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１０ｂは、試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。図１１〜１４は、６カ月間保存されており、異なる緩衝剤を含むサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られた結果を示す。図１１ａ、１２ａ、１３ａおよび１４ａは、異なる緩衝剤（図１１ａ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ａ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ａ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ａ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を含む選択用緩衝液を用いて処理した分析試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１１ｂ、１２ｂ、１３ｂおよび１４ｂは、それぞれの選択用緩衝液（図１１ｂ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ｂ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ｂ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ｂ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を用いて処理した試料について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
【図１４ｂ】図１０〜１４は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌおよび異なるｐＨ値の異なる緩衝剤を含む異なる結合用緩衝液を使用した実施例５の結果を示す図である。図１０ａは、緩衝剤としてｐＨ９．０、９．１または９．２に調整したＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含む、新しく調製したサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡを示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１０ｂは、試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。図１１〜１４は、６カ月間保存されており、異なる緩衝剤を含むサイズ選択用緩衝液を使用した清浄化およびサイズ選択後に分析した遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られた結果を示す。図１１ａ、１２ａ、１３ａおよび１４ａは、異なる緩衝剤（図１１ａ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ａ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ａ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ａ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を含む選択用緩衝液を用いて処理した分析試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。（Ｌ）は、使用したラダーを示す。図１１ｂ、１２ｂ、１３ｂおよび１４ｂは、それぞれの選択用緩衝液（図１１ｂ：ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１２ｂ：ＡＭＰＤ、ｐＨ９．０または９．１、図１３ｂ：ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、９．１または９．２、図１４ｂ：ＴＡＰＳ、ｐＨ９．０または９．３）を用いて処理した試料について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、異なるサイズのＤＮＡ分子を含むＤＮＡ含有試料から標的ＤＮＡ分子をサイズによって単離するための、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーに基づくサイズ選択的方法を提供する。先行技術の方法とは対照的に、本発明の方法では、沈殿した標的ＤＮＡ分子を結合させるために、無修飾のケイ素含有表面を有する固相を使用する。先行技術の方法と組み合わせると、ＤＮＡ回収率が非常に低い（実施例を参照されたい）ので、無修飾固相の使用は実行可能ではなかった。本発明では、とりわけ、二価カチオンが結合用混合物中に存在し、結合用混合物のｐＨが８〜１０の範囲内に入るので、この問題が克服される。実施例により実証される通り、この特徴の組合せにより、沈殿および／または結合効率が増強され、その結果、特定のカットオフ値を上回るサイズを有する沈殿ＤＮＡ分子が高収率で回収される。理論に束縛されることを望むものではないが、ＤＮＡ回収に対するこの有利な効果についての可能性のある説明は、結合／沈殿プロセス中にアルカリ性ｐＨ値を使用すると、ＤＮＡの骨格がより負に荷電するというものである。無修飾ケイ素含有表面を有する固相の表面のより大きな画分もこれらの条件下ではより負に荷電するので、結合用混合物中の二価イオンが、このより負に荷電した表面と負に荷電したＤＮＡの間の橋として機能し得、それにより、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子の回収が潜在的に増大する。
方法
【００２６】
第１の態様によると、ＤＮＡ含有試料から特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を単離するための、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーに基づくサイズ選択的ＤＮＡ単離方法であって、
（ａ）ＤＮＡ含有試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、および少なくとも１種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）結合したＤＮＡ分子を、残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、結合したＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、結合したＤＮＡ分子を固相から溶出させるステップ
を含む方法が提供される。
【００２７】
この方法は、次世代シークエンシングに適したシークエンシングライブラリーの調製の間のＤＮＡ分子のサイズ選択の実施に特に適している。
【００２８】
この方法は、種々の実施形態で実施することができる。この方法は、とりわけ、以下のために使用することができる。
１．所望の特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子（所望のＤＮＡ分子は、本明細書では「標的」ＤＮＡ分子とも称される）を、ステップ（ａ）において前記標的ＤＮＡ分子を固相に結合させることによって単離する。結合した標的ＤＮＡ分子を分離し（ステップ（ｂ））、任意選択で、洗浄し、溶出させる。この実施形態では、「片側だけ」、すなわち、カットオフ値によって決定される特定の最小サイズを有する標的ＤＮＡ分子について、サイズ選択を実施することができる。しかし、標的ＤＮＡ分子の最大サイズ（上限カットオフ値によって決定される）は規定されない。この実施形態は、例えば、所望のカットオフ値を上回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子を、例えば、オリゴヌクレオチド、プライマー、より短いＤＮＡ断片などの、望ましくない夾雑物を表す、より小さなＤＮＡ分子から単離、したがって、分離するために適している。
２．ＤＮＡ含有試料から、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を取り出す。これらのより長いＤＮＡ分子を、ステップ（ａ）において固相に結合させ、ステップ（ｂ）において分離し、したがって、残りの試料から取り出す。それにより、試料から、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を効率的に枯渇させる。次いで、例えば、残りの試料中になお存在する核酸または他の構成成分を単離するために、残りの試料をさらに処理することができる。残りの試料を分析方法において直接使用することもできる。固相に結合した、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子は、目的のものでない場合には廃棄することもでき、例えば、場合によってそれらを洗浄し、溶出させることによってさらに処理することもできる。
３．特定のサイズ範囲のＤＮＡ分子を含む１つまたは複数の画分を得るために、ＤＮＡ含有試料のサイズ分画を実施する。これは、本発明の教示に従ってサイズ選択を２ラウンドまたはそれ超実施することによって実現することができる。例えば、方法は、各ラウンドにおける結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度を上昇させながら、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すことを含んでよい。それにより、各ラウンドにおいてカットオフ値を低下させる。例えば、第１のラウンドにおいて、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を固相に結合させ、試料から分離する。第２のラウンドにおいて、ポリ（オキシアルキレンオキシド）ポリマーの濃度を上昇させ、それにより、第２のラウンドにおけるカットオフ値を低下させる。この第２のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が固相に結合し、残りの試料から分離される。第２のラウンドにおいて結合したＤＮＡ分子は、上限カットオフ値（第１のカットオフ値によって決定される）および下限カットオフ値（第２のカットオフ値によって決定される）に対してサイズ選択されたものであり、したがって、規定のサイズ範囲内のサイズを有する。各ラウンドにおいて固相に結合し、したがって、回収されたＤＮＡ分子は、廃棄するか、または、例えば、任意選択の洗浄ステップ後に溶出させることができる。このサイズ分画を、同じ原理を使用して３ラウンドまたはそれ超実施することもできる。これにより、シリカまたはガラス表面などの無修飾ケイ素含有表面を有する固相を使用して、ＤＮＡ含有試料をサイズ分画すること、および長さが異なるＤＮＡ分子を異なる溶出液画分としてもたらすことが可能になる。
【００２９】
好ましい実施形態によると、第１の態様による方法は、ＤＮＡ含有試料から上限カットオフ値と下限カットオフ値とによって決定される特定のサイズ範囲内のサイズを有する標的ＤＮＡ分子を単離するための方法であって、
（ａ）ＤＮＡ含有試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、および少なくとも１種の二価カチオンを含む第１の結合用混合物を調製するステップであって、前記第１の結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、上限カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的ＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）結合したＤＮＡ分子を、標的ＤＮＡ分子を含む残りの試料から分離するステップ、
（ｃ）残りの試料を含む第２の結合用混合物を調製するステップであって、前記第２の結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、第２の結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度が第１の結合用混合物と比較して上昇しており、沈殿した標的ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、下限カットオフ値を上回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、下限カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｄ）結合した標的ＤＮＡ分子を残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、結合した標的ＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、結合した標的ＤＮＡ分子を固相から溶出させるステップ
を含む。
【００３０】
この実施形態は、上限カットオフ値と下限カットオフ値とによって決定される規定の範囲内に入るサイズを有する標的ＤＮＡ分子を単離することを可能にするので、有利である。
【００３１】
個々のステップ（ａ）および（ｂ）ならびに非限定的な適切かつ好ましい実施形態をここで詳細に記載する。
【００３２】
ステップ（ａ）において、ＤＮＡ含有試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、および少なくとも１種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製する。結合用混合物は、８〜１０、好ましくは、８．５〜９．５の範囲内に入るｐＨを有することが重要である。結合用混合物は、ＤＮＡ含有試料を、８〜１０、好ましくは、８．５〜９．５の範囲内に入るｐＨを有し、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、少なくとも１種の二価カチオンを含み、少なくとも１種の緩衝剤を含む結合用緩衝液と接触させることによって調製されることが好ましい。本発明において使用される結合用緩衝液は、本明細書では「沈殿用緩衝液」とも称される。含有されるポリ（アルキレンオキシド）ポリマーにより、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が沈殿し、したがって、それらのＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合する。それにより、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされる。使用された結合条件下で、カットオフ値未満の分子サイズを有するＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない。実施例によって示される通り、また、先行技術において公知の通り、カットオフ値は、結合用混合物中の少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度を変動させることによって調整することができる。したがって、ステップ（ａ）において、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子は固相に効率的に吸着するが、一方、カットオフ値を下回るサイズを有する小さなＤＮＡ分子は、このサイズ選択的結合ステップ（ａ）において無修飾ケイ素含有表面を有する固相に実質的に結合せず、したがって、結合用混合物中に残る。
【００３３】
結合用混合物を調製するために、ＤＮＡ含有試料を、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、少なくとも１種の二価カチオンおよび少なくとも１種の緩衝剤を含む結合用緩衝液と接触させることが好ましい。結合条件は、結合用緩衝液によって排他的に確立され、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を固相に結合させるための結合条件を確立するためにさらなる添加剤または試薬は添加されないことが好ましい。これにより、取扱いが単純になる。したがって、一実施形態によると、結合用混合物におけるサイズ選択的結合条件は、ＤＮＡ含有試料に添加される結合用緩衝液によって排他的に決定される。しかし、結合用混合物において所望のｐＨ値を実現する必要があるので、適切な塩基または酸を添加することによって結合用混合物のｐＨ値を手動で調整することは本発明の範囲内に入る。結合用緩衝液、それぞれ結合用混合物のｐＨは、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を結合させるために無修飾ケイ素含有表面を有する固相を使用した場合のＤＮＡ収率に有意に影響を及ぼすので、結合用混合物のｐＨ値は重要である。実施例により実証される通り、標的ＤＮＡ回収率は、結合の間にアルカリ性ｐＨ値を使用しない場合、非常に低い。さらに、ｐＨは、回収されるＤＮＡ分子のサイズにも影響を及ぼし、したがって、カットオフ値に影響を及ぼすために使用することができる。したがって、結合用混合物のｐＨ値は特許請求された範囲内に入ることが重要である。
【００３４】
一実施形態によると、結合用混合物および／または結合用混合物を調製するためにＤＮＡ含有試料に添加する結合用緩衝液は、８．２５〜９．７５、８．３〜９．６、８．４〜９．５、８．５〜９．４、８．６〜９．３および８．７〜９．２から選択される範囲内に入るｐＨ値を有する。ｐＨ値は、好ましくは８．５〜９．５または８．６〜９．２、より好ましくは８．７〜９．１、最も好ましくは８．７〜９．０、例えば８．８〜８．９の範囲内に入る。
【００３５】
結合用混合物は、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーを含む。ポリマーにより、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が沈殿し、サイズ選択的結合条件の実現が支持される（上記の背景技術の節も参照されたい）。「ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー」という用語は、本明細書で使用される場合、特に、アルキレンオキシド単位のオリゴマーまたはポリマーを指す。低分子量および高分子量のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーが公知である。分子量は、通常、その単量体（単数または複数）の分子量（例えば、エチレンオキシドの場合、４４）の群衆であり、５００００またはさらには１０００００までにわたり得る。分子量はＤａで示される。ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、他の幾何学的配置を有してもよい。直鎖ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーが好ましい。ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーは非置換型であっても置換型であってもよい。置換型ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーとしては、例えば、アルキルポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、例えば、アルキルポリエチレングリコールが挙げられるが、ポリ（アルキレンオキシド）エステル、ポリ（アルキレンオキシド）アミン、ポリ（アルキレンオキシド）チオール化合物およびその他も挙げられる。アルキレンオキシド単位は、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドからなる群から選択することができる。例えばエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの共重合体などの共重合体もポリ（アルキレンオキシド）ポリマーという用語に包含される。ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーはポリ（エチレンオキシド）ポリマーまたはポリ（プロピレンオキシド）ポリマーであることが好ましく、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーはポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールであることがより好ましい。ポリエチレングリコールは、上記の先行技術によっても証明される通り、サイズ選択的ＤＮＡ単離方法においても一般に使用されるので、特に好ましい。しかし、置換型ポリ（エチレンオキシド）ポリマー、例えば、アルキルポリエチレングリコールなどのアルキルポリ（エチレンオキシド）ポリマーなどの他のポリ（エチレンオキシド）ポリマーも使用することができる。ポリエチレングリコールは、非分岐であることが好ましく、また、非置換型であっても置換型であってもよい。公知の置換形態のポリエチレングリコールとして、例えば、一方の末端または両方の末端がＣ１〜Ｃ５アルキル基により置換されたアルキルポリエチレングリコールが挙げられる。本発明では、式ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈの非置換型ポリエチレングリコールを使用することが好ましい。ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーに関して本出願に記載されている全ての開示は、一般に、明記されていなくても、好ましい実施形態であるポリエチレングリコール、特に非置換型ポリエチレングリコールに具体的に適用され、特にそれについて言及するものである。
【００３６】
ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーは、種々の分子量で使用することができる。一実施形態によると、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーは、好ましくはポリエチレングリコールであり、２０００〜４００００、２５００〜３００００、３０００〜２５０００、３５００〜２００００、４０００〜１６０００、４５００〜１２０００および５０００〜１００００から選択される範囲内に入る分子量を有する。５０００〜１００００、より好ましくは６０００〜９０００、例えば８０００の分子量が好ましい。そのような分子量は、ポリエチレングリコールに関して特に適切である。実施例においてもポリエチレングリコール８０００を使用した。
【００３７】
実施例において実証される通り、カットオフ値は、結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度による影響を受け、それにより調整することができる。したがって、結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度を変動させることによって、カットオフ値を再配置する、したがって、調整することができる。結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度を上昇させると、カットオフ値は低下する。同じく実施例により実証される通り、そのような変動は、例えば、それぞれがポリ（アルキレンオキシド）ポリマーを異なる濃度で含む異なる結合用緩衝液を調製することによって、または、同じ結合用緩衝液を異なる体積でＤＮＡ含有試料に添加することによって実現することができる。
【００３８】
ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーは、結合用混合物中に、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が沈殿し、次いで、それが無修飾シリカ固相に結合するのに十分な濃度で存在する。一実施形態によると、結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー濃度は、６％〜２０％、７％〜１７％、７．５％〜１５％および８％〜１３％から選択される範囲内に入る。カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子の効率的な沈殿および固相への結合を確実にするためには、結合用混合物がポリ（アルキレンオキシド）ポリマーを少なくとも７．５％の濃度で含むことが好ましい。８．５％〜１２．５％の範囲が特に好ましい。したがって、結合用混合物を調製するためにＤＮＡ含有試料に添加する結合用緩衝液は、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーを、意図された体積のＤＮＡ含有試料を適切な体積の結合用緩衝液と接触させた際に、結合用混合物中の対応する濃度が実現される量で含む。ステップ（ｃ）において、例えば、下限カットオフ値についての結合条件を確立するために、結合用緩衝液を残りの試料に添加する場合にも同じことが当てはまる。
【００３９】
一実施形態によると、上限カットオフ値と下限カットオフ値とによって決定されるサイズ範囲内のサイズを有する標的ＤＮＡ分子を単離する、したがって、本明細書に記載されている通り、少なくとも２回のサイズ選択的ＤＮＡ単離ステップを実施する。一実施形態によると、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー（好ましくは、ポリエチレングリコール）は、第１の結合用混合物中に、８．５％〜９．５％の範囲内に入る濃度で存在し（上限カットオフ値用）、第２の結合用混合物中に、１０％〜１２％、好ましくは１０．５〜１１．５％の濃度で存在する（下限カットオフ値用）。実施例において実証される通り、この組合せにより、好都合な結果が導かれる。第１の結合用混合物および第２の結合用混合物における結合条件は、同じ結合用緩衝液を異なる体積で添加することによって調整することができる。
【００４０】
一実施形態によると、結合条件を確立するためにＤＮＡ含有試料と接触させる結合用緩衝液中の少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度は、７％〜４５％、１０％〜４０％、１２．５％〜３５％、１５％〜３０％、１７．５％〜２７．５％および２０％〜２５％から選択される。
【００４１】
一実施形態によると、二価カチオンは、アルカリ土類金属、例えば、Ｍｇ２＋によってもたらされる。
【００４２】
二価カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋およびＮｉ２＋から選択することができる。二価カチオンは、Ｍｇ２＋であることが好ましい。結合用混合物および／または結合用緩衝液は、二価カチオンを溶解塩の形態で含んでよい。そのような塩は、例えば、ハロゲン化物、硫酸塩、リン酸塩または炭酸塩であってよく、ハロゲン化物であることが好ましい。溶解塩は塩化マグネシウムであることが好ましい。
【００４３】
結合用混合物中に含めることができるさらなる塩は、塩化カルシウムおよび塩化バリウムである。
【００４４】
ＤＮＡ回収に対する有益な効果は、結合用混合物中の低濃度の二価カチオンですでに見られる。一実施形態によると、二価カチオンは、結合用混合物中に、好ましくは溶解塩の形態で、３ｍＭ〜７５ｍＭ、４ｍＭ〜５０ｍＭ、５ｍＭ〜４０ｍＭ、５．５ｍＭ〜３５ｍＭ、６ｍＭ〜３０ｍＭ、６．５ｍＭ〜２５ｍＭ、７ｍＭ〜２０ｍＭおよび７．５ｍＭ〜１５ｍＭから選択される範囲の濃度で存在する。一実施形態によると、濃度は、５ｍＭ〜２０ｍＭ、７ｍＭ〜１７．５ｍＭ、７．５ｍＭ〜１５ｍＭおよび８ｍＭ〜１２．５ｍＭから選択することができる。
【００４５】
一実施形態によると、結合用混合物および／または結合用緩衝液は、二価カチオン（溶解塩としてもたらされることが好ましい、上記参照）に加えて、少なくとも１種の塩を含む。さらなる塩を含めることにより、特定のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子の固相への結合が促進され得る。これは、二価カチオンをより低い濃度で使用した場合に特に可能性がある。塩は、一価の塩であってよい。塩は、アルカリ金属塩、好ましくは、ハロゲン化物であってよい。塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウムおよび塩化セシウムから選択されることが好ましい。塩は、塩化ナトリウムであることがより好ましい。一実施形態によると、非カオトロピック塩を追加的な塩として使用する。一実施形態によると、結合用混合物は、グアニジニウム塩、ヨウ化物、チオシアン酸塩、過塩素酸または他の同等もしくはより強力なカオトロピック性のカオトロピック塩などのカオトロピック塩を含まない。
【００４６】
結合用混合物は、追加的な塩を、≧２５０ｍＭ、≧３５０ｍＭ、≧５００ｍＭ、≧６００ｍＭ、≧６５０ｍＭ、≧７００ｍＭ、≧７５０ｍＭおよび≧８００ｍＭから選択される濃度で含んでよい。濃度は、例えば、２５０ｍＭ〜３Ｍ、２５０ｍＭ〜２Ｍ、３５０ｍＭ〜１．７５Ｍ、５００ｍＭ〜１．５Ｍ、６００ｍＭ〜１．３Ｍおよび６５０ｍＭ〜１．２５Ｍから選択することができる。結合用緩衝液は、塩を、０．５Ｍ〜４Ｍ、０．７Ｍ〜３．５Ｍ、１Ｍ〜３Ｍ、１．２Ｍ〜２．７５Ｍおよび１．３Ｍ〜２．５Ｍから選択される濃度で含んでよい。塩は、一価の塩、特に、ＮａＣｌまたはＫＣｌなどのハロゲン化物であることが好ましい。
【００４７】
一実施形態によると、結合用混合物および／または結合用緩衝液は、溶解塩の形態の二価カチオン、好ましくは、ＭｇＣｌ２を含み、アルカリ金属塩、好ましくは、ハロゲン化物、より好ましくは、塩化ナトリウムをさらに含む。実施例により実証される通り、この組合せにより、特に良好な結果が導かれる。
【００４８】
一実施形態によると、結合用緩衝液をＤＮＡ含有試料と接触させた後、得られた結合用混合物において、結合用緩衝液のｐＨ値に対応するまたは実質的に対応するｐＨ値がもたらされる。したがって、一実施形態によると、結合用緩衝液のｐＨ値が、得られた結合用混合物において実質的に維持される。これは、結合用緩衝液中に含まれる少なくとも１種の緩衝剤によって実現され、それぞれ支持される。結合用混合物のｐＨ値は、結合用緩衝液のｐＨ値から、＋／−０．２ｐＨ単位を超えて逸脱しない、好ましくは、＋／−０．１５ｐＨ単位を超えて逸脱しない、より好ましくは＋／−０．１ｐＨ単位を超えて逸脱しない、最も好ましくは＋／−０．０５ｐＨ単位を超えて逸脱しないことが好ましい。
【００４９】
結合条件（したがって、カットオフ値）は、ＤＮＡ含有試料に添加される結合用緩衝液によって制御することができ、それが好ましい。一実施形態によると、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度、二価カチオンおよび結合ｐＨ値などの結合条件は、ＤＮＡ含有試料と結合用緩衝液を接触させることによって確立される。結合用混合物における結合条件を確立するためにさらなる調整は行わないことが好ましい。したがって、結合用混合物は、結合用緩衝液とＤＮＡ含有試料を接触させることによって排他的にもたらされ、沈殿した標的ＤＮＡ分子を無修飾表面を有する固相に結合させるための結合条件を確立するためにさらなる緩衝液または他の試薬の添加は行わないことが好ましい。これにより、取扱いおよび調整の誤差が有利に回避される。例えば、１体積のＤＮＡ含有試料を、０．１〜１０体積の結合用緩衝液、０．１５〜５体積の結合用緩衝液、好ましくは、０．１５〜３体積の結合用緩衝液、より好ましくは０．２〜２体積の結合用緩衝液、最も好ましくは０．２〜１体積の結合用緩衝液と接触させることができる。結合用緩衝液とＤＮＡ含有試料を接触させることにより、希釈効果に起因して、得られる結合用混合物中の結合用緩衝液中に含有される成分の濃度が低下する。実施例において実証される通り、例えば、異なる量の結合用緩衝液をＤＮＡ含有試料に添加することにより、カットオフ値を柔軟に調整し、したがって、再配置することができる。
【００５０】
多くの適用について、ＤＮＡ含有試料と結合用緩衝液を接触させることによって結合用混合物のｐＨを確立することが好ましいにもかかわらず、本発明は、ＤＮＡ含有試料と結合用緩衝液を接触させた後に、結合用混合物のｐＨ値を調整し、したがって、改変する実施形態も包含する。したがって、一実施形態によると、結合用混合物のｐＨ値を、８〜１０、好ましくは、８．５〜９．５の範囲内に入る結合ｐＨ値に調整する。適切なｐＨ値は、上記されており、それぞれの開示で言及される。例えば、調整は、手動で行うことができる。結合用混合物のｐＨ値を決定し、次いで、酸または塩基などの適切なｐＨ改変物質を添加することによって所望のアルカリ性結合ｐＨ値に調整することができる。そのような手順は、ＤＮＡ含有試料が普通でない高ｐＨ値または低ｐＨ値を有する場合に有利であり得る。しかし、結合用混合物のｐＨは、結合用緩衝液の添加によって排他的に確立されることが好ましい。
【００５１】
上記の通り、結合用混合物は、ＤＮＡ含有試料と結合用緩衝液を接触させることによって調製されることが好ましい。結合用緩衝液は、緩衝剤を含む。緩衝剤により、結合用混合物のｐＨ値が、記載の通り、無修飾ケイ素含有表面を有する固相を使用する場合に二価カチオンと組み合わせて標的ＤＮＡ分子の良好な回収率を確実にするために重要な所望のアルカリ性結合ｐＨ値に維持されることが支持される。したがって、結合用混合物のｐＨ値も決定するものである結合用緩衝液のｐＨ値は、所望の結合ｐＨを確実にもたらすために十分に安定であることが重要である。緩衝剤は、所望の結合ｐＨ値を含む緩衝能力を有するように選択する。大まかな推定値として、緩衝剤の有用な緩衝能力は、多くの場合、ｐＫａ±１である。適切な緩衝剤は先行技術において周知であり、それらとして、これだけに限定されないが、ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＡＭＰＤおよび（ＮＨ４）２ＳＯ４が挙げられる。適切な緩衝剤としては、これだけに限定されないが、ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＡＭＰＤおよび（ＮＨ４）２ＳＯ４が挙げられる。実施例により実証される通り、緩衝剤の組合せを使用することもできる。一実施形態によると、ＡＭＰＳＯおよび／またはＴｒｉｓ／（ＮＨ４）２ＳＯ４の組合せを緩衝剤として使用する。
【００５２】
一実施形態によると、結合用緩衝液は、少なくとも１種の緩衝剤を、２５ｍＭ〜１Ｍ、５０ｍＭ〜７５０ｍＭ、７５ｍＭ〜７００ｍＭ、１００ｍＭ〜６５０ｍＭ、１２５ｍＭ〜６００ｍＭ、１５０ｍＭ〜５５０ｍＭ、１７５ｍＭ〜５２５ｍＭおよび２００ｍＭ〜５００ｍＭから選択される濃度で含む。結合用緩衝液中に少なくとも１種の緩衝剤をより高い濃度、好ましくは、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも７５ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも１７５ｍＭ、または少なくとも２００ｍＭで使用することが好ましい。これにより、より大量のＤＮＡ含有試料を処理する場合および／または２ラウンドまたはそれ超のサイズ選択を実施する場合であっても、信頼できる緩衝能力が確実になる。これにより、試料と結合用緩衝液を接触させると創出される結合用混合物のｐＨ値の変化が低減するまたは回避される。したがって、結合用混合物も緩衝剤を含む。結合用混合物は、緩衝剤または緩衝剤の組合せを、２５ｍＭ〜６００ｍＭ、５０ｍＭ〜５００ｍＭ、６０ｍＭ〜４５０、７０ｍＭ〜４００ｍＭ、８０ｍＭ〜３５０ｍＭ、９０ｍＭ〜３００ｍＭおよび１００ｍＭ〜２７５ｍＭから選択される濃度で含んでよい。１つ超の緩衝剤を使用する場合、示されている濃度／範囲は、緩衝剤の総濃度を指す。最適な濃度は、いずれの緩衝剤または緩衝剤の組合せを使用するかにも左右され、当業者が本明細書に記載の原理に従って決定することができる。
【００５３】
一実施形態によると、ステップ（ａ）は、ＤＮＡ含有試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、好ましくはポリエチレングリコール、および少なくとも１種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製することを含み、前記結合用混合物は、ＤＮＡ含有試料と、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、少なくとも１種の二価カチオンおよび少なくとも１種の緩衝剤を含む結合用緩衝液を接触させることにより、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、結合用緩衝液は、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相が生じ、使用された結合条件下で、カットオフ値未満の分子サイズを有するＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない。上記の通り、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）ポリマーであることが好ましく、より好ましくはポリエチレングリコールであり、より好ましくは非置換型ポリエチレングリコールであり、二価カチオンは、Ｍｇ２＋であることが好ましい。二価カチオンは、結合用混合物中に、５ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは７ｍＭ〜２５ｍＭの範囲内に入る濃度で含まれてよい。さらに、結合用混合物は、追加的な塩、例えば塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、好ましくは塩化ナトリウムを含むことが好ましい。適切な濃度範囲は上に記載されている。結合用混合物のｐＨ値は、８．５〜９．５の範囲内であることが好ましく、特に好ましいｐＨ値は上にも記載されている。
【００５４】
一実施形態によると、結合用混合物を調製するためにＤＮＡ含有試料に添加する結合用緩衝液は、以下の特性を有する：
ｉ）二価カチオンとしてＭｇ２＋を、好ましくはＭｇＣｌ２の形態で含む、
ｉｉ）ポリエチレングリコールを、好ましくは７％〜４５％、１０％〜４０％、１２．５％〜３５％、１５％〜３０％、１７．５％〜２７．５％および２０％〜２５％から選択される濃度で含む、
ｉｉｉ）アルカリ金属塩、好ましくは塩化ナトリウムを、０．５Ｍ〜２．７５Ｍ、好ましくは、０．７５Ｍ〜２．５Ｍの範囲内に入る濃度で含む、
ｉｖ）少なくとも１種の緩衝剤を、１００〜５５０ｍＭの範囲内に入る濃度で含む、
ｖ）８．５〜９．５の範囲内に入るｐＨを有する。
【００５５】
選択された結合条件下で無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合するＤＮＡ分子の平均の長さはカットオフ値を上回るが、固相に結合しないＤＮＡ分子の平均の長さはカットオフ値を下回る。本明細書で使用される、「カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子は固相に結合する」という表現および同様の表現は、カットオフ値またはそれを上回るサイズを有するＤＮＡ分子が固相に結合することを具体的に明示する。すなわち、カットオフ値が１００ｎｔであると記載されている場合、これは、１００ｎｔまたはそれより大きなサイズを有するＤＮＡ分子が固相に結合することを意味する。したがって、カットオフ値により、それぞれの結合条件下で固相に実質的に結合しない、より小さなＤＮＡ分子のサイズが具体的に規定される。一実施形態によると、カットオフ値は、電気泳動図によって可視化することができる最も短いＤＮＡ断片の長さを指す。一実施形態によると、カットオフ値は、電気泳動図の曲線がｘ軸と交わる点に対応する。それにもかかわらず、この点、それぞれこのカットオフ値で、通常は、ＤＮＡの定量的回収はないが、捕捉されるＤＮＡ分子の百分率は、ＤＮＡ分子のサイズが増大するにしたがって上昇することが指摘される。
【００５６】
ＤＮＡ含有試料は、異なるサイズ（長さ）のＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ含有試料は、一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡを含み得る。本発明による方法により、一本鎖ＤＮＡのサイズ選択および二本鎖ＤＮＡのサイズ選択が可能になる。ＤＮＡ分子は、直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子であることが好ましい。ＤＮＡ含有試料は、これだけに限定されないが、生体試料および核酸処理中に得られた人工試料を含めた、種々の起源のものであってよい。一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、溶解物ではない。一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、抽出されたＤＮＡ、または、例えばせん断によってもしくは酵素反応によってさらに処理された抽出されたＤＮＡの試料である。一実施形態によると、酵素反応後にＤＮＡ含有試料を得る。本発明のサイズ選択的ＤＮＡ単離方法を使用して処理することができるＤＮＡ含有試料をもたらす例示的な酵素反応としては、これだけに限定されないが、増幅反応、リガーゼ反応、特にアダプターライゲーション反応、および、ポリヌクレオチド、例えばポリＡ、尾部付加反応が挙げられる。一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、例えば、せん断されたＤＮＡなどの断片化されたＤＮＡを含む。一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、せん断されたゲノムＤＮＡまたはせん断されたｃＤＮＡを含む。一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、サイズせん断手順によって生じる溶液である。そのようなＤＮＡ含有試料は、異なるサイズのＤＮＡ断片を含む。前記断片化されたＤＮＡを末端修復して平滑末端を有するＤＮＡ断片をもたらすこともできる。したがって、一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、直鎖状、平滑末端の、異なるサイズのＤＮＡ断片を含む。好ましい実施形態によると、ＤＮＡ含有試料をシークエンシングライブラリーの調製の間に、特に次世代シークエンシングライブラリーの調製の間に得た。一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、例えば、シークエンシングライブラリーの調製の間に、アダプターライゲーションステップの結果として得られたアダプターライゲーション試料である。好ましい実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、（ｉ）５’および／または３’にアダプターが隣接する二本鎖ＤＮＡ分子、（ｉｉ）アダプター単量体および（ｉｉｉ）例えばアダプター二量体などのアダプターとアダプターとのライゲーション産物を含むアダプターライゲーション試料である。さらに、ＤＮＡ含有試料は、例えば、例えば以前の酵素的シークエンシングライブラリー処理ステップからＤＮＡ含有試料中になお存在する酵素などの、モノ、オリゴ−および／またはポリヌクレオチドおよびタンパク質などの追加的な夾雑物である構成成分を含み得る。本発明による方法により、とりわけ、５’および／または３’にアダプターが隣接する、好ましくは、それらの５’末端および３’末端にアダプターが隣接する二本鎖ＤＮＡ分子をサイズ選択的に精製し、それにより、それぞれの夾雑物を効率的に除去することが可能になる。一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、増幅産物、例えば、ＰＣＲ産物を含む。したがって、一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、増幅手順の結果として生じた試料、特にＰＣＲ増幅の結果として生じた試料である。
【００５７】
一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料は、以下の特性の１つまたは複数を有する：
ｉ）ＤＮＡ含有試料は、抽出されたＤＮＡ、または、例えばせん断によってもしくは酵素反応によってさらに処理された抽出されたＤＮＡの試料である、
ｉｉ）ＤＮＡ含有試料は、酵素反応、好ましくは増幅反応またはリガーゼ反応、特にアダプターライゲーション反応後に得られたものである、
ｉｉｉ）ＤＮＡ含有試料は、断片化されたＤＮＡ、例えば、せん断されたＤＮＡを含む、
ｉｖ）ＤＮＡ含有試料は、直鎖状、平滑末端の、異なるサイズのＤＮＡ断片を含む、
ｖ）ＤＮＡ含有試料は、増幅産物、好ましくは、ＰＣＲ産物を含む、
ｖｉ）ＤＮＡ含有試料は、アダプターライゲーションステップの結果として得られたアダプターライゲーション試料である、ならびに／または
ｖｉｉ）ＤＮＡ含有試料は、（ｉ）５’および／または３’にアダプターが隣接する二本鎖ＤＮＡ分子、（ｉｉ）アダプター単量体および（ｉｉｉ）例えばアダプター二量体などのアダプターとアダプターとのライゲーション産物を含むアダプターライゲーション試料である。
【００５８】
結合条件、特に結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度は、例えば、例えばアダプター、アダプターとアダプターとのライゲーション産物およびプライマーなどの望ましくない小さなＤＮＡ分子を除去することが可能になる所望のカットオフ値が得られるように選択する。本発明による方法では、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子は効率的に固相に結合し、したがって、サイズ選択の間に回収または除去することができる。選択される的確なカットオフ値は、例えば、標的ＤＮＡ分子の意図された使用に左右され、また、サイズ選択の間に、例えば、結合すること、したがって、サイズ選択の間に回収されることが想定されていない夾雑物である小さなＤＮＡ分子のサイズにも左右される。本発明を用いて実現される小さなＤＮＡ分子の除去は、必ずしも完全なものである必要はない。いくつかの適用に関しては、望ましくない小さなＤＮＡ分子が、意図された下流の反応を有意に乱すまたは妨害することがない程度に枯渇すれば十分である。しかし、記載されている通り、多くの場合、より小さなＤＮＡの１００％が除去される必要はない。記載されている通り、この方法は、特定の上限カットオフ値と下限カットオフ値とによって決定されるサイズ範囲内の長さを有するＤＮＡ断片を、少なくとも２つのサイズ選択的結合ステップを実施することによってサイズ選択的に単離するために実施することもできる。
【００５９】
本明細書においてヌクレオチド「ｎｔ」を参照して示されるサイズ、それぞれカットオフ値は、ＤＮＡ分子の鎖長を指し、したがって、一本鎖分子および二本鎖ＤＮＡ分子の長さを記載するため、それぞれ一本鎖分子ならびに二本鎖ＤＮＡ分子についてのカットオフ値を記載するために使用される。二本鎖ＤＮＡ分子では、前記ヌクレオチドが対合している。したがって、ＤＮＡが、好ましいものである、二本鎖分子である場合、上記の「ｎｔ」でのサイズまたは長さに関する指標は、「ｂｐ」を指す。したがって、二本鎖ＤＮＡ分子が、それぞれ１００ｎｔのサイズの鎖長を有する場合、前記二本鎖ＤＮＡ分子は、１００ｂｐのサイズを有する。同じことが二本鎖ＤＮＡ分子についてのカットオフ値の定義に当てはまる。
【００６０】
１２５ｎｔ〜２００ｎｔ、好ましくは、１３５ｎｔ〜２００ｎｔ、例えば１５０ｎｔ〜１９０ｎｔなどの範囲内に入る（より低い）カットオフ値は、例えば、シークエンシングライブラリーの調製の間のサイズ選択に特に適切である。本発明では、サイズ選択的ＤＮＡ単離ステップは、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子をライゲートされていないアダプター単量体およびアダプター二量体などのアダプターとアダプターとのライゲーション産物から分離するために特に実施される。次世代シークエンシングのためのシークエンシングライブラリーを調製するために一般に使用されるアダプターのサイズは、多くの場合、２５ｎｔ〜７５ｎｔ、特に３０ｎｔ〜６０ｎｔの範囲内に入る。ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物（例えば、特にアダプター二量体）の除去に関しては、カットオフ値は、一実施形態によると、アダプター単量体（単数または複数）のサイズを上回り、予測されるアダプターとアダプターとのライゲーション産物（単数または複数）のサイズを上回るように選択される。アダプター単量体（単数または複数）およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物（単数または複数）の効率的な除去を確実にするために、カットオフ値は、予測されたアダプターとアダプターとのライゲーション産物（単数または複数）のサイズよりも少なくとも１０ｎｔ、好ましくは、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔまたは少なくとも３０ｎｔ大きいことが好ましい。一実施形態によると、１２５ｎｔ〜２００ｎｔの範囲および上記の好ましい部分範囲内のカットオフ値は、上限カットオフ値と下限カットオフ値とによって規定される特定のサイズ範囲内のサイズを有する標的ＤＮＡ分子を単離する方法における、下限カットオフ値を表す。この実施形態によると、上限カットオフ値は、２５０ｎｔ〜１０００ｎｔ、２７５ｎｔ〜７５０ｎｔおよび３００ｎｔ〜５００ｎｔの範囲内に入り得る。有利に、上限カットオフ値および下限カットオフ値は、結合用混合物におけるサイズ選択的結合条件を確立するために、適量の結合用緩衝液を添加することによって容易に調整することができる。
【００６１】
結合ステップ（ステップ（ａ）および任意選択のさらなる結合ステップ（単数または複数））において、所望のカットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子は、ＤＮＡ結合のためのケイ質表面をもたらすことが好ましい無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合する。一実施形態によると、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子の少なくとも７５％、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％またはより好ましくは少なくとも９７％が、ステップ（ａ）（および実施する場合にはステップ（ｃ））において結合する。一実施形態によると、ステップ（ａ）（および、実施する場合にはさらなる結合ステップ（単数または複数））において固相に結合する、カットオフ値を下回るサイズを有するＤＮＡ分子は、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７％以下または５％以下である。
【００６２】
固相は、カットオフ値を上回るサイズを有する沈殿した標的ＤＮＡ分子が選択された結合条件下で結合する無修飾ケイ素含有表面を含む。結合は、特に吸着によって実現される。固相は、シリカ表面などのケイ質表面をもたらすことが好ましい。「シリカ表面」という用語は、本明細書で使用される場合、二酸化ケイ素および／または他の酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、シリカゲル、ゼオライト（zeolithe）、ベントナイト、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウムおよびホウケイ酸塩を含む、またはそれからなる表面を含む。固相は、無修飾ケイ素含有表面を有する。したがって、表面は、核酸結合性リガンドまたは他の核酸結合性基で修飾されていない。例えば、固相は、その結合表面にイオン交換基含むリガンドを有さない、特に、固相の表面は、機能性リガンドで修飾されたものではない。特に、固相の表面は、好収率を確実にするために、先行技術の方法において共通するような、例えばアミン基またはカルボキシル基などの陰イオン交換基または陽イオン交換基を含むリガンドで修飾されたものではない。一実施形態によると、シリカ表面は、シラノール基または酸化物などの他の酸化形態のケイ素の他に、いかなる官能基も含まない。本発明と併せて使用することができる例示的な固相としては、これだけに限定されないが、シリカ粒子、シリカ繊維、例えばガラス粉末、ガラス繊維、ガラス粒子または制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）などのガラス材料、二酸化ケイ素、粉末、ビーズまたはフリットなどの粒子の形態のガラスまたはシリカを含めた、無修飾シリカ表面を含む固相が挙げられるが、これだけに限定されない。固相という用語は、その形態または設計に関していかなる限定も意味するものではない。したがって、固相という用語は、多孔質または非多孔質であり、浸透性または不浸透性である、無修飾ケイ素含有表面、特に無修飾シリカ表面を有する適切な材料を包含する。適切な固相としては、これだけに限定されないが、膜、フィルター、シート、粒子、磁気粒子、ビーズ、ゲル、粉末、繊維などが挙げられる。シリカゲルなどのシリカ、およびポリケイ酸材料、ホウケイ酸塩、ケイ酸塩および無機ガラスを固相として使用することが特に好ましい。無修飾シリカ表面を含む固相は、例えば、フィルター、繊維、膜または粒子の形態を有してよい。本発明によると、カラムに基づく固相の使用、または、粒子、特に磁気粒子の使用が好ましい。
【００６３】
一実施形態によると、ビーズの形態を有し得る無修飾シリカ表面を有するシリカ粒子を使用する。前記粒子は、約０．０２〜３０μｍ、０．１〜１５μｍ、０．２〜１２．５μｍ、０．５〜１０μｍおよび０．７５〜７μｍのサイズを有することが好ましい。核酸結合性固相の処理を容易にするために、磁気シリカ粒子を使用することが好ましい。磁気粒子は磁場に応答する。磁気シリカ粒子は、例えば、フェリ磁性、強磁性、常磁性または超常磁性であってよい。適切な磁気シリカ粒子は、例えば、ＷＯ０１／７１７３２、ＷＯ２００４／００３２３１およびＷＯ２００３／００４１５０に記載されている。他の磁気シリカ粒子も先行技術から公知であり、例えば、ＷＯ９８／３１８４０、ＷＯ９８／３１４６１、ＥＰ１  ２６０  ５９５、ＷＯ９６／４１８１１およびＥＰ０  ３４３  ９３４に記載されており、また、それらとして、例えば、磁気シリカガラス粒子も挙げられる。ＤＮＡが結合した磁気粒子は、磁場の助けを借りて、例えば恒久的な磁石を使用することによって容易に処理することができるので、磁気粒子の使用には利点がある。この実施形態は、例えば、磁気粒子を処理することができる確立されたロボット系に適合する。現在、先行技術において、標的ＤＮＡ分子が結合した磁気シリカ粒子を処理するために本発明と併せて使用することができる種々のロボット系が存在する。一実施形態によると、磁気粒子を反応槽の底部または側面に収集し、残りの液体試料を反応槽から除去し、収集された、ＤＮＡ分子が結合した磁気粒子を残す。残りの試料の除去は、デカンテーションまたは吸引によって行うことができる。そのような系は先行技術において周知であり、したがって、本明細書で詳細に説明する必要はない。磁気粒子を処理するための公知の代替的システムでは、通常は、カバーまたはエンベロープによって覆われた磁石を反応槽に入れて磁気粒子を収集する。それぞれの系は先行技術において周知であり、また、市販もされている（例えば、ＱＩＡＳＹＭＰＨＯＮＹ（登録商標）、ＱＩＡＧＥＮ）ので、本明細書においてはいかなる詳細な説明も必要ない。磁気粒子を処理するための公知のさらなる代替的システムでは、磁気シリカ粒子を含む試料をピペットチップ中に吸引することができ、磁石を、例えば、ピペットチップの側面に適用することにより、磁気粒子をピペットチップ中で収集することができる。次いで、残りの試料をピペットチップから放出させる一方で、収集された、標的ＤＮＡ分子が結合した磁石シリカ粒子は、磁石により、ピペットチップ中に残すことができる。次いで、収集された磁気粒子をさらに処理することができる。そのような系も先行技術において周知であり、また、市販もされており（例えば、ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺ１、ＱＩＡＧＥＮ）、したがって、本明細書においてはいかなる詳細な説明も必要ない。
【００６４】
一実施形態によると、固相は、カラム内に含まれる。「カラム」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも２つの開口部を有する容器を特に記載する。それにより、溶液および／または試料が前記カラムを通過することができる。「カラム」という用語は、容器の形状に関してはいかなる制限も特に意味するものではなく、例えば、丸状または角状、好ましくは、円柱状であってよい。しかし、特にマルチカラムを使用する場合には、他の形状も使用することができる。カラムは、ＤＮＡ結合のために使用される無修飾ケイ素含有表面を有する固相を含む。カラム内に含まれる前記固相により、溶液、それぞれ結合用混合物がカラムに適用された際の通過が可能になるべきである。これは、例えば遠心分離力をカラムに適用した場合に、溶液および／または結合用混合物が、遠心分離力の方向にカラムを通過することが可能になることを意味する。上記の通り、それぞれのカラムに基づくＤＮＡ単離手順を使用すると、結合用混合物は通常、例えば遠心分離または減圧により補助されてカラムを通過し、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が前記通過の間に、含まれる固相に結合する。カラムは単一形式でもマルチ形式でも使用することができる。マルチウェルプレートと同様の形式を有し、シリカ膜またはガラス繊維などの固相を含むそのようなマルチカラムは先行技術において周知であり、また、市販もされている。カラムはスピンカラムであることが好ましい。ケイ素含有表面をもたらすＤＮＡ結合性膜またはＤＮＡ結合性繊維を固相として使用することが好ましい。例としては、これだけに限定されないが、ＤＮＡ結合のためのケイ素含有表面をもたらすシリカ膜、ガラス繊維膜またはフィルターが挙げられる。膜は多孔質であることが好ましい。カラムに基づく手順に関しては、カラム内の、シリカを含む、またはそれからなる固相として、膜または繊維を使用することが好ましい。実施例において示される通り、それぞれのカラム材料は、カットオフ値を狭い範囲内に正確に調整するためにも適している。適切かつ好ましい、ＤＮＡ結合に適したシリカ表面をもたらすシリカに基づく材料も上に記載されている。カラム内に含まれるさらなる一般的な固相は、シリカ粒子のフィル、またはシリカ材料の層（例えば、シリカゲル）である。例えば、シリカ粒子を不活性なフィルターまたは膜上に層として配置し、それにより、ＤＮＡ固相を形成することができる。結合用混合物のカラム内に含まれる固相の通過を緩和するために、例えば、遠心分離、または、例えば、試料をカラム、それぞれ固相を通して圧縮するもしくは減圧を適用することによって固相を通して吸引する、圧力差を生じさせる器具の使用などの適切な手段を使用することができる。それぞれの手段は先行技術において周知であり、したがって、本明細書においてさらに説明する必要はない。
【００６５】
ＤＮＡ含有試料と結合用緩衝液を接触させて結合用混合物をもたらすことと、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を固相に結合させることは、同時に行うこともでき、逐次的に行うこともできる。一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料を結合用緩衝液と接触させ、次いで、得られた結合用混合物を固相と接触させる。この実施形態は、例えば、カラムに基づく単離プロトコールを使用する場合に可能である。例えば磁気シリカ粒子などの粒子固相を使用する場合にも同様の手法を使用することができる。粒子固相を使用する場合、固相、結合用緩衝液およびＤＮＡ含有試料は、任意の順序で添加することができる。例えば、まず固相および結合用緩衝液をもたらし、次いで、試料を添加すること、またはまず試料、固相をもたらし、次いで、結合用緩衝液を添加することは本発明の範囲内に入る。結合用緩衝液と試料を混合して結合用混合物をもたらすことが好ましい。
【００６６】
ステップ（ａ）の最後に、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を、無修飾シリカ表面を有する固相に結合させる。
【００６７】
ステップ（ｂ）において、固相に結合したＤＮＡ分子を残りの試料から分離する。それにより、カットオフ値を上回るサイズを有する結合したより大きなＤＮＡ分子を、試料中に存在する結合していないＤＮＡ分子から分離する。適切な分離方法は先行技術において周知であり、適切な分離技法はまた、使用される固相にも左右される。例えば、カラムに基づく手法を使用する場合、分離は、通常、結合用混合物がカラムを通過したときに実現される。カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子はカラム内に含まれる固相に結合し、一方、残りの試料はカラムを通過し、それにより、結合したＤＮＡ分子から分離される。上記の通り、このプロセスは、例えば、遠心分離によって、または減圧を適用することによって補助することができる。例えばシリカ粒子などの粒子固相を使用する場合、遠心分離または磁気粒子を使用する場合には磁気分離により補助することができる沈降によって粒子を収集することができ、そして、上清を分離する（例えば、デカンテーションするもしくは吸引する、または粒子を液体から取り出す）。適切な実施形態は異なる形式の固相およびそれらの処理と併せて上に記載しており、また、当業者に周知である。
【００６８】
分離されたＤＮＡ分子は、結合したＤＮＡが目的のものではなく、ただ単に取り出すべき場合には廃棄することもでき、結合したＤＮＡが標的ＤＮＡである場合には、さらに処理することもできる。種々の使用および選択肢はすでに上に記載しており、以下にもさらに詳細に記載する。
【００６９】
結合したＤＮＡは、任意選択で、洗浄することができる。本発明では、１つまたは複数の洗浄ステップを実施することができる。このステップは任意選択であるが、例えば、結合したＤＮＡが標的ＤＮＡである場合には、以前の反応からのヌクレオチドおよび酵素などの、結合していない構成成分および不純物を効率的に除去するために、実施することが好ましい。これは、シークエンシングライブラリーの調製の間にＤＮＡ含有試料を得る場合に特に適切である。さらに、洗浄ステップは、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、二価カチオンおよび任意選択で、結合の間に使用する場合、塩の痕跡を除去するためにも適切である。したがって、一実施形態によると、結合したＤＮＡ分子をさらに精製するために、１つまたは複数の洗浄ステップを実施する。この目的のために、一般的な適切な洗浄用溶液を使用することができる。適切な洗浄用溶液により不純物は除去されるが、固相に結合した標的ＤＮＡは除去されない。一実施形態によると、洗浄に使用する溶液は、少なくとも１種のアルコールを含む。アルコールとして、炭素原子を１〜５個有することが好ましい短鎖の分岐または非分岐アルコールを洗浄に使用することができ、それぞれ洗浄用溶液の状態で使用することができる。アルコールの混合物も使用することができる。適切なアルコールとしては、これだけに限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよびブタノールが挙げられる。イソプロパノールおよび／またはエタノールを洗浄用溶液中に使用することが好ましい。上記の洗浄用溶液の代わりにまたはそれに加えて使用することができるさらなる適切な洗浄用溶液は、アルコールおよび緩衝剤を含む。生物学的緩衝液などの適切なアルコールおよび緩衝剤は、上記されている。この第２の洗浄ステップにはイソプロパノールまたはエタノールを使用することが好ましく、エタノールを使用することが最も好ましい。エタノールは、少なくとも６０％（ｖ／ｖ）、少なくとも７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも８０％（ｖ／ｖ）の濃度で使用することが好ましい。緩衝剤は、好ましくは、例えばｐＨがおよそ７〜８のＴｒｉｓであり得る。上記の洗浄用溶液の代わりに、または場合によってそれに加えて使用することができる別の適切な洗浄用溶液は、アルコールを含むが、塩は含まない。これにより、塩を取り除くことが可能になる。洗浄にはイソプロパノールまたはエタノールを使用することが好ましく、エタノールを使用することが最も好ましい。アルコールは、少なくとも５０％ｖ／ｖ、少なくとも６０％ｖ／ｖ、好ましくは、少なくとも７０％ｖ／ｖの濃度で含まれることが好ましい。この濃度は、５０％ｖ／ｖ〜１００％ｖ／ｖ、より好ましくは７０％ｖ／ｖ〜１００％ｖ／ｖの範囲内に入ることが好ましい。
【００７０】
アルコールを含有する洗浄用溶液を使用する場合には、洗浄ステップの後に存在する可能性がある残留アルコールを、例えば、風乾によって（例えば、粒子固相を用いて作業する場合に適切である）、または、カラムに基づく固相を使用する場合には追加的な遠心分離ステップによって、除去することができる。それぞれの方法および手順は先行技術において周知であり、したがって、本発明においてはいかなるさらなる説明も必要ない。
【００７１】
さらに、サイズ選択された標的ＤＮＡを溶出させるために、１つまたは複数の溶出ステップを実施する。しかし、結合したＤＮＡ分子は、意図された下流の適用、それぞれサイズ選択されたＤＮＡの意図された使用に応じて、固相に結合したままで処理することもできる。例えば、磁気粒子などの粒子固相を、結合したＤＮＡを事前に別々に溶出させずに、増幅反応に直接供することができる。
【００７２】
しかし、ＤＮＡを溶出させることが好ましい。本発明では、基本的に全ての、結合したＤＮＡの固相からの脱離をもたらす溶出用溶液を使用することができる。ＤＮＡをシリカ表面から有効に溶出させることが公知の古典的な溶出用溶液としては、これだけに限定されないが、水（例えば、脱イオン水）、ＴＥ緩衝液などの溶出用緩衝液、および、塩含有量が１５０ｍＭまたはそれ未満、好ましくは、１００ｍＭまたはそれ未満、より好ましくは７５ｍＭまたはそれ未満、５０ｍＭまたはそれ未満、２５ｍＭまたはそれ未満、２０ｍＭまたはそれ未満、１５ｍＭまたはそれ未満、１０ｍＭまたはそれ未満である、または塩を含まない、低塩類溶液が挙げられる。溶出用溶液は、例えば、緩衝剤を含んでよく、特に、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、プロパンおよびその他などの生物学的緩衝液を含んでよい。緩衝剤は、１５０ｍＭまたはそれ未満、好ましくは、１００ｍＭまたはそれ未満、より好ましくは７５ｍＭまたはそれ未満、５０ｍＭまたはそれ未満、２５ｍＭまたはそれ未満、２０ｍＭまたはそれ未満、１５ｍＭまたはそれ未満または１０ｍＭまたはそれ未満の濃度で存在してよい。一実施形態によると、溶出用緩衝液は、ｐＨ６．５〜ｐＨ１０、ｐＨ７〜ｐＨ９．５、ｐＨ７．５〜９．０、ｐＨ７．７５〜ｐＨ８．７５およびｐＨ８〜ｐＨ８．６から選択されるｐＨ値を有する。溶出は、例えば、加熱および／または振とうによって補助することができ、これは粒子固相を使用する場合に特に可能である。カラムに基づく固相を使用する場合、通常は溶出用緩衝液をカラムに適用し、固相を通過させ、これもまた、例えば、遠心分離によって、または圧力もしくは減圧を適用することによって補助することができる。
【００７３】
意図された下流の適用に干渉しない溶出用溶液を使用することが好ましい。したがって、一実施形態によると、溶出用緩衝液は、ＥＤＴＡなどの複合剤を含まない。ＥＤＴＡは、特に高濃度で、下流の反応を阻害する可能性がある。
【００７４】
さらに、結合したＤＮＡが固相から効率的に放出されることを確実にするために、溶出ステップを繰り返すことも本発明の範囲内である。
【００７５】
本発明による、ＤＮＡをサイズによって単離するための方法は、単離されるＤＮＡ分子のサイズに関して的確かつ再現性があり、結合用混合物中に使用されるアルカリ性ｐＨ値および二価カチオンに起因して、無修飾ケイ素含有表面を有する固相を使用するにもかかわらず高いＤＮＡ回収率をもたらす。したがって、先行技術の方法とは対照的に、費用のかかる表面修飾固相は必要ない。本発明による方法は、バッチ手順に適している。これにより、例えば、本発明の方法が、例えば、力価測定可能な陰イオン交換組成を使用する、核酸のサイズによる分離のために使用される先行技術のクロマトグラフィー法と区別される。本発明の方法は、特に、高度に特異的であり費用のかかる器具を必要とせず、結合用緩衝液および／または溶出用緩衝液の勾配の生成および使用、ならびに多数の溶出画分の収集およびスクリーニングを必要としない。したがって、一実施形態によると、本発明による方法においてｐＨ勾配は使用しない。この方法は、自動化に有利に適する。本発明では、固相をもたらすために磁気粒子を使用することが都合よい。
【００７６】
本発明による方法の非限定的な好ましい実施形態および適用を以下にさらに記載する。上記の通り、本発明によるサイズ選択的ＤＮＡ単離方法は、特定のカットオフ値を上回る所望のサイズを有する、および／または、特定のサイズ範囲内に入るサイズ（上限カットオフ値および下限カットオフ値によって決定される）を有するＤＮＡ分子を、長さが異なるＤＮＡ分子の混合集団から富化させるために特に適している。方法は、特定のカットオフ値を下回るサイズを有する非標的ＤＮＡ分子を結合させることによって除去し、したがって、カットオフ値を上回る所望の最小のサイズを有する標的ＤＮＡ分子をＤＮＡ含有試料から単離するために特に適している。さらに、特定のカットオフを上回る非標的分子を除去し、したがって、例えば、ＤＮＡライブラリーの不均一性を改善すること、およびＰＣＲ反復などの望ましくないアーチファクトを除去することが可能である。
【００７７】
一実施形態によると、方法は、
（ａ）ＤＮＡ含有試料、７．５％〜１５％、好ましくは、８％〜１３％の範囲内に入る濃度のポリエチレングリコール、および７ｍＭ〜４０ｍＭ、好ましくは８ｍＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは、８ｍＭ〜２０ｍＭの範囲内に入る濃度のＭｇＣｌ２を含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、８．５〜９．２５の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）結合したＤＮＡ分子を、残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、結合したＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、結合したＤＮＡ分子を固相から溶出させるステップ
の通り実施される。
【００７８】
好ましい実施形態によると、方法を、ＤＮＡ含有試料から上限カットオフ値と下限カットオフ値とによって決定される特定のサイズ範囲内のサイズを有する標的ＤＮＡ分子を単離するために使用し、前記方法は、
（ａ）ＤＮＡ含有試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、および少なくとも１種の二価カチオンを含む第１の結合用混合物を調製するステップであって、前記第１の結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、上限カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的ＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）結合したＤＮＡ分子を、標的ＤＮＡ分子を含む残りの試料から分離するステップ、
（ｃ）残りの試料を含む第２の結合用混合物を調製するステップであって、前記第２の結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、第２の結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度が第１の結合用混合物と比較して上昇しており、沈殿した標的ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、下限カットオフ値を上回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、下限カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｄ）結合した標的ＤＮＡ分子を残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、結合した標的ＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、結合した標的ＤＮＡ分子を固相から溶出させるステップ
を含む。
【００７９】
これにより、規定のサイズ範囲内の標的ＤＮＡ分子を単離することが有利に可能になる。第１の結合ステップおよび第２の結合ステップのためのポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの適切な濃度は上に記載されている。本明細書で議論した通り、第１の結合用混合物および第２の結合用混合物における結合条件を、上記の結合用緩衝液を使用して調整することが好ましい。一実施形態によると、第１の結合用混合物の調製と第２の結合用混合物の調製に同じ結合用緩衝液を使用する。結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度は、例えば、変動してよく、異なる体積の結合用緩衝液を添加することによって調整することができる。
【００８０】
一実施形態によると、方法は、
（ａ）ＤＮＡ含有試料、８．５％〜９．５％の範囲内に入る濃度のポリエチレングリコール、および、７ｍＭ〜４０ｍＭ、好ましくは８ｍＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは、８ｍＭ〜２０ｍＭの範囲内に入る濃度のＭｇＣｌ２を含む第１の結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、８．５〜９．２５の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、上限カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、
使用された結合条件下で、上限カットオフ値未満のサイズを有する標的ＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）結合したＤＮＡ分子を、標的ＤＮＡ分子を含む残りの試料から分離するステップ、
（ｃ）残りの試料を含む第２の結合用混合物を調製するステップであって、前記第２の結合用混合物が、８．５〜９．２５の範囲内に入るｐＨを有し、第２の結合用混合物中のポリエチレングリコールの濃度が第１の結合用混合物と比較して上昇しており、１０％〜１２％の範囲内に入り、沈殿した標的ＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、標的ＤＮＡ分子が結合した固相がもたらされ、使用された結合条件下で、下限カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子は固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｄ）結合した標的ＤＮＡ分子を残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、結合した標的ＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、結合した標的ＤＮＡ分子を固相から溶出させるステップ
の通り実施される。
【００８１】
上記の通り、本発明による方法は、次世代シークエンシングの状況でのサイズ選択に特に適している。次世代シークエンシングに適したシークエンシングライブラリーの調製は、通常、多段階プロセスであり、前記プロセスの種々の段階で、もたらされたＤＮＡ分子のサイズ選択を実施することができる。前記プロセスのいずれの段階でサイズ選択を実施するかは、使用されるライブラリー調製方法にも左右される。適切な実施形態を以下に記載する。本発明によるサイズ選択方法は、次世代シークエンシング適用のためのライブラリー構築プロトコールにおいてほんの小さなサイズの差異を有するＤＮＡ断片の分離、例えば、本明細書に記載の通り、望ましくないアダプター二量体（およそ１２０ｂｐ）の所望のＤＮＡ断片（１５０ｂｐおよびそれより大きい）からの除去を可能にするので、シークエンシングライブラリーの調製の状況での使用に特に適している。
【００８２】
大規模並列シークエンシングに適した、したがって、次世代シークエンシングに適したシークエンシングライブラリーは、先行技術において公知の方法を使用して調製することができる。それぞれのシークエンシングライブラリーの調製は、多くの場合、核酸を含有する試料から複数の二本鎖の直鎖ＤＮＡ断片を生成することを伴う。例えば、その後のシークエンシングに適したＤＮＡ断片をもたらすために、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのようなＤＮＡを、例えば、超音波処理、水せん断、超音波、噴霧または酵素による断片化などの、せん断によって断片化することができる。断片の長さは、その後のシークエンシングに使用される次世代シークエンシングプラットフォームのシークエンシング能力に基づいて選択することができる。通常、得られる断片の長さは、１５００ｂｐまたはそれ未満、１０００ｂｐまたはそれ未満、７５０ｂｐまたはそれ未満、６００ｂｐまたはそれ未満、好ましくは、５００ｂｐまたはそれ未満であり、これは、最新の次世代シークエンシングプラットフォームのシークエンシング能力に対応する。得られる断片の長さは、主に５０ｂｐ〜１０００ｂｐ、より好ましくは７５ｂｐ〜９００ｂｐ、１００ｂｐ〜８５０ｂｐ、１１０ｂｐ〜８００ｂｐ、１１５ｂｐ〜７５０ｂｐ、１２０ｂｐ〜７００ｂｐ、１２５ｂｐ〜６５０ｂｐ、１３０ｂｐ〜６００ｂｐ、１３５ｂｐ〜５５０ｂｐ、１４０ｂｐ〜５００ｂｐおよび１４５ｂｐ〜４５０ｂｐの範囲内に入ることが好ましい。それぞれの断片サイズは、エクソンのサイズがおよそ１５０ｂｐ〜２００ｂｐの長さであり、それぞれの短い断片を一般的な次世代シークエンシングプラットフォームを使用して効率的にシークエンシングすることができることを考えると、ゲノムＤＮＡに特に適している。しかし、例えば、より長い配列の読み取りが可能になる次世代シークエンシング方法を使用する場合、より長い断片も有用であり得る。
【００８３】
一実施形態によると、断片化されたＤＮＡを、先行技術において公知の方法を使用して断片化後に修復し、末端処理し、それにより、平滑末端を有するＤＮＡ断片をもたらす。先行技術において周知であるそのような方法では、断片化プロセスによって生じた突出部を平滑末端に変換する。それぞれの方法は先行技術において周知であるので、本明細書においてはいかなる詳細な説明も必要ない。
【００８４】
一実施形態によると、本発明によるサイズ選択的ＤＮＡ単離方法は、ＤＮＡ断片を得た後、好ましくは、断片化されたＤＮＡを末端処理して平滑末端を有するＤＮＡ断片をもたらした後に実施する。この段階におけるサイズ選択的ＤＮＡ単離により、例えば、その後のシークエンシングに適さない、非常に短いＤＮＡ断片を排除することが可能になる。上記の通り、ＤＮＡ結合についてのカットオフ値は、結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度を適切に選択することによって調整することができる。本方法により、規定のサイズ範囲内のサイズを実質的に有するＤＮＡ断片を単離することが可能になる。
【００８５】
一実施形態によると、末端修復、および任意選択でサイズ選択の後、平滑末端断片の３’末端に突出部を付加する。一塩基突出部を添加することが好ましい。例えば、単一の「Ａ」ヌクレオチドを、先行技術において周知の方法を使用して付加することができる。これは、「Ａ尾部付加」とも称される。それぞれのヌクレオチド突出部により、その後のアダプターライゲーション反応の間に断片が互いとライゲートすることが防止される。例えば、対応する単一の「Ｔ」または他の相補的な突出部をアダプターの３’末端にもたらして、アダプターとＤＮＡ断片をライゲートするための相補的な突出部をもたらすことができる。これにより、低率のキメラ（連鎖状鋳型）形成が確実になる。しかし、シークエンシングアダプターの適切なライゲーションを確実にするための他の戦略も先行技術において公知である。例えば、平滑末端アダプターをライゲートすることもできる。
【００８６】
好ましい実施形態によると、アダプターを、得られたＤＮＡ断片の５’末端および／または３’末端、好ましくは、ＤＮＡ断片の両末端にライゲートする。アダプターの特定の設計は、使用される次世代シークエンシングプラットフォームに左右され、本発明の目的に関して、次世代シークエンシングのためのシークエンシングライブラリーを調製するために使用される基本的に全てのアダプターを使用することができる。アダプター配列により、例えば、その後のライブラリー増幅および／またはシークエンシングプライマーアニーリングを可能にする公知の配列組成がもたらされる。アダプターとして、公知の配列の二本鎖または部分的に二本鎖である核酸を使用することができる。アダプターは、平滑末端を有してよく、３’または５’突出部を有する付着末端を、Ｙ形状のアダプターによって、またはステムループ形状のアダプターによってもたらすことができる。Ｙ形状のアダプターは、例えば、ＵＳ７，７４１，４６３に記載されており、ステムループ形状のアダプターは、例えば、ＵＳ２００９／０２９８０７５に記載されており、これらは、アダプターの特定の設計に関して参照により本明細書に組み込まれる。アダプターは、少なくとも７塩基、好ましくは少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基の長さを有することが好ましい。アダプターの長さは、１０〜１００塩基、好ましくは、１５〜７５塩基、より好ましくは２０〜６０塩基の範囲内に入ることが好ましい。ＤＮＡ断片の３’末端および５’末端に同じアダプターまたは異なるアダプターを使用することができる。両末端に、例えばＹ形状またはステムループ形状のアダプターなどの同じ型のアダプターを使用することには、アダプター誤対合に起因してライブラリー調製の間に失われる断片がないという利点があり、これは、少量のＤＮＡを用いて作業する際に利点になる。
【００８７】
したがって、一実施形態によると、３’末端および５’末端においてアダプター配列とライゲートされるランダムに断片化された二本鎖ＤＮＡ分子を含むシークエンシングライブラリーを調製する。アダプターにより、公知の配列がもたらされ、したがって、増幅のための公知の鋳型および／またはシークエンシングプライマーがもたらされる。任意選択で、アダプターにより、個々の指標がもたらされ得、それにより、その後の、２つまたはそれ超の標的が富化されたシークエンシングライブラリーをシークエンシングの前にプールすることが可能になる。この実施形態を以下でさらに詳細に記載する。
【００８８】
効率的なアダプターライゲーションを確実にするために、アダプターライゲーションステップの間、通常はアダプターを過剰に使用する。したがって、アダプターライゲーション後、アダプターが隣接するＤＮＡ分子、加えて、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプター二量体などのアダプターとアダプターとのライゲーション産物を含むＤＮＡ含有試料がもたらされる。ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物は、通常、アダプターライゲーションプロセス後に得られる試料中に大量に含まれる。これらのライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物は、除去しなければその後のシークエンシング反応のシークエンシング力を低下させるので、除去することが重要である。ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物ならびに酵素および他の夾雑物をアダプターライゲーション試料から除去するために、本発明による方法を使用したサイズ選択的ＤＮＡ単離を実施することが好ましい。ＤＮＡについてのカットオフ値は、ライゲートされていないアダプター単量体のサイズを上回り、予測されるアダプターとアダプターとのライゲーション産物のサイズを上回るように選択する。これにより、ライゲートされていないアダプター単量体および望ましくないアダプターとアダプターとのライゲーション産物が前記サイズ選択的ＤＮＡ単離ステップの間に捕捉されず、したがって、カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を主に含む、単離された標的ＤＮＡから枯渇することが確実になる。本発明による方法は、実施例により実証される通り、結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度を変動させることによってカットオフ値を狭い範囲内に正確に調整することができるので、この目的のために特に有利である。
【００８９】
したがって、一実施形態によると、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を標的ＤＮＡ分子としてアダプターライゲーション試料であるＤＮＡ含有試料から単離し、アダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物を除去するために本発明の方法を使用し、ここで、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子は、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物から、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子のサイズがより大きいことに基づいて分離される。前記方法は、
（ａ）アダプターライゲーション試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、および少なくとも１種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製するステップであって、前記結合用混合物が、８〜１０、好ましくは、８．５〜９．５の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿したアダプターがライゲートしたＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子が結合した固相が生じ、使用された結合条件下で、アダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物は固相に実質的に結合しない、ステップ、
（ｂ）結合したアダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を残りの試料から分離するステップ、
−  任意選択で、結合したアダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を洗浄するステップ、ならびに
−  任意選択で、結合したアダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を固相から溶出させるステップ
を含み得る。
【００９０】
カットオフ値は、アダプター単量体のサイズを上回り、予測されるアダプターとアダプターとのライゲーション産物のサイズを上回る。一実施形態によると、カットオフ値は、予測されるアダプターとアダプターとのライゲーション産物（単数または複数）のサイズを少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔまたは少なくとも３０ｎｔ上回る。さらに、上記の通り、アダプターライゲーション試料をＤＮＡ含有試料として使用して２重サイズ選択を実施することができる。
【００９１】
一実施形態によると、標的ＤＮＡ断片を、アダプターライゲーション（好ましくは、上記のサイズ選択）の後に、増幅、好ましくはＰＣＲ増幅によって富化する。そのような富化ステップは任意選択であるが、一部の適用には好ましい。例えば、ＰＣＲ増幅などの増幅反応を使用して、両末端にアダプター分子を有するＤＮＡ断片を選択的に富化すること、およびライブラリー中のＤＮＡの量を増幅することができる。一実施形態によると、ＰＣＲは、アダプターとアニーリングする１つまたは複数のプライマーを用いて実施する。それぞれの増幅ステップは先行技術において周知であり、したがって、本明細書においてはいかなる詳細な説明も必要ない。一実施形態によると、本発明の方法によるサイズ選択的ＤＮＡ単離を増幅後に実施する。カットオフ値を、増幅の間に存在している可能性があり、増幅された可能性がある、プライマー、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物がＤＮＡ結合の間に捕捉されないように、再度選択する。一実施形態によると、アダプターライゲーションステップ後にサイズ選択的ＤＮＡ単離を実施した際に使用したものと同じカットオフ値を使用する。
【００９２】
したがって、一実施形態によると、本発明による方法は、富化されたシークエンシングライブラリーをもたらすために、単離され、サイズ選択された、アダプターがライゲートした二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するステップを含み、増幅後、
（ａ）増幅された試料を、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、少なくとも１種の二価カチオンおよび少なくとも１種の緩衝剤を含む結合用緩衝液と接触させることであって、前記結合用緩衝液が、結合用混合物をもたらすために８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、沈殿した標的カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合すること、
（ｂ）結合した標的ＤＮＡを残りの試料から分離すること、
−  任意選択で、結合した標的ＤＮＡを洗浄すること、ならびに
−  任意選択で、結合した標的ＤＮＡを固相から溶出させること
を含む、サイズ選択ステップを実施する。
【００９３】
増幅による富化の後、好ましくはその後に本発明によるサイズ選択的ＤＮＡ単離の後、シークエンシングライブラリーは、使える状態である。任意選択で、得られたアダプターがライゲートした断片、それぞれＰＣＲにより富化された断片のサイズを確証するために、調製したシークエンシングライブラリーを検証、数量化することができ、ならびに／または品質管理を実施することができる。
【００９４】
シークエンシングライブラリーを調製するための適切な一般的な方法は、Metzker、２０１１年、Voelkerding、２００９年、およびＷＯ１２／００３３７４にも記載されており、また、本発明によるサイズ選択的ＤＮＡ単離方法と組み合わせることができる。
【００９５】
一実施形態によると、本発明は、大規模並列シークエンシングに適したシークエンシングライブラリーを調製するための方法であって、
Ａ）ＤＮＡを断片化するステップであって、任意選択でＤＮＡ断片を末端修復して、異なるサイズの平滑末端ＤＮＡ断片を含む試料をもたらすステップ、
Ｂ）任意選択で、特定のカットオフ値を上回る断片サイズを有する標的ＤＮＡを単離するステップを実施するステップであって、前記任意選択のサイズ選択ステップが、
（ａ）異なるサイズのＤＮＡ断片を含む試料を、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、少なくとも１種の二価カチオンおよび少なくとも１種の緩衝剤を含む結合用緩衝液と接触することであって、対応する結合用混合物をもたらし、沈殿した標的カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合すること、
（ｂ）結合した標的ＤＮＡを残りの試料から分離すること、
−  結合した標的ＤＮＡを洗浄すること、および
−  結合した標的ＤＮＡを固相から溶出させること、
を含む、ステップ
Ｃ）アダプターライゲーションステップを実施するステップであって、５’および／または３’にアダプターが隣接する二本鎖ＤＮＡ分子を含む試料をもたらすステップ、
Ｄ）アダプターがライゲートした二本鎖ＤＮＡ分子を、ライゲートされていないアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物から、アダプターがライゲートした二本鎖ＤＮＡ分子のサイズがより大きいことに基づいて単離するステップ、したがって、分離するステップであって、前記サイズ選択ステップが、
（ａ）アダプターライゲーション試料、少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、および少なくとも１種の二価カチオンを含む結合用混合物を調製することであって、前記結合用混合物が、８〜１０の範囲内に入るｐＨを有し、前記結合用混合物から沈殿したアダプターがライゲートしたＤＮＡ分子が無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合し、それにより、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子が結合した固相が生じ、使用された結合条件下で、アダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物は固相に実質的に結合しないこと、
（ｂ）結合したアダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を残りの試料から分離すること、
−  結合したアダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を洗浄すること、および
−  結合したアダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を固相から溶出させること、
を含む、ステップ、
Ｅ）任意選択で、アダプターがライゲートしたＤＮＡ分子を増幅するステップ
を含む方法を提供する。
【００９６】
この実施形態は、適切な最小長さを有するアダプターがライゲートしたＤＮＡ断片を含むシークエンシングライブラリーを提供する。上記の通り、ＤＮＡ断片の３’末端および５’末端にアダプターがもたらされることが好ましい。さらに、ステップＤ）で実施するサイズ選択ステップにより、アダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物ならびに他の夾雑物がライゲーション反応から効率的に除去される。これにより、シークエンシングライブラリーの品質が改善される。ステップＤ）は、実質的に全てのアダプター単量体およびアダプターとアダプターとのライゲーション産物の効率的な除去を確実にするため、およびサイズ選択ストリンジェンシーを高めるために、繰り返すこと、したがって、２回またはそれ超実施することもできる。この方法は、速く、信頼でき、高品質のシークエンシングライブラリーをもたらす。さらに、前記方法は、既存のシークエンシングライブラリー調製方法に容易に組み込むことができる。記載の方法は、特定のサイズ範囲内のサイズを有する標的ＤＮＡ分子をもたらすために上限カットオフ値および下限カットオフ値についてサイズ選択を行う実施形態（請求項２参照）を使用し、必要な変更を加えて実施することができる。
【００９７】
通常、単回のＮＧＳ実行により、いくつかの標的富化シークエンシングライブラリーを一度にシークエンシングするのに十分な読み取りがもたらされる。したがって、プール戦略および指標付け手法が、試料当たりの費用を削減するための実用的なやり方である。それぞれの多重化戦略を本発明の教示と併せて使用することもできる。富化プロセスの異なる段階において多重化を可能にする特徴を組み入れることができる。一実施形態によると、シークエンシングライブラリーを、ライブラリーの標識付けおよび鑑別のための特異的な配列モチーフを含有するアダプター（「バーコード付けされた」または「指標」アダプター）を使用することによって生成する。各シークエンシングライブラリーには、個々の、そしてそれ故、ライブラリー特異的配列をもたらすライブラリー特異的アダプターが提供される。各アダプターは、指標領域に加えて、全てのライブラリーに対して使用することができるＰＣＲプライマーおよび／またはシークエンシングプライマーの公知の鋳型をもたらす共通する普遍的領域を含むことが好ましい。標的富化シークエンシングライブラリーを得た後、それらをプールし、単回の実行でシークエンシングすることができる。したがって、それぞれの指標アダプターを有するシークエンシングライブラリーのＤＮＡ断片をもたらすことにより、シークエンシングされる断片を指標アダプターのライブラリー特異的配列に基づいて区別することができるので、その後にいくつかの標的富化シークエンシングライブラリーを同じシークエンシング実行でシークエンシングすることが可能になる。シークエンシング後、それで得られた配列において見いだされるライブラリー特異的指標により、個々のライブラリーに属する個々の配列を選別することができる。それぞれの指標手法は先行技術において公知であり、指標アダプターも市販されており、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでの使用に適したＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＤＮＡ試料プレップキットで提供される。
【００９８】
一実施形態によると、シークエンシングライブラリーは、二本鎖ＤＮＡ分子を３μｇまたはそれ未満、２μｇまたはそれ未満、１．５μｇまたはそれ未満、１μｇまたはそれ未満、０．７５μｇまたはそれ未満または０．５μｇまたはそれ未満の全体量で含む。一実施形態によると、シークエンシングライブラリーは、二本鎖ＤＮＡ分子を少なくとも０．２μｇ、少なくとも０．５μｇまたは少なくとも０．７５μｇの全体量で含む。本発明による方法は、サイズ選択的ＤＮＡ単離を可能にするだけでなく、所望のサイズを有するＤＮＡ分子の効率的な捕捉も確実にするものである。多くの場合、ＤＮＡ材料はシークエンシングライブラリーの調製の間にも失われる可能性があるのでシークエンシングライブラリーに含まれるＤＮＡは少量であることから、これは重要な利点である。
【００９９】
シークエンシングライブラリーを調製するための出発材料をもたらすために、先行技術において公知の方法に従って、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡなどの核酸を目的の試料から単離することができる。ＲＮＡは、通常、シークエンシングライブラリーを調製する前にまずｃＤＮＡに転写させる。
【０１００】
上記の通り、シークエンシングは、次世代シークエンシングプラットフォームで実施することが好ましい。全てのＮＧＳプラットフォームは、一般的な科学技術的特徴、すなわち、例えば、クローン増幅された、またはフローセル中でもしくは油−水エマルションの生成により空間的に分離された単一のＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の大規模並列シークエンシングを共有する。ＮＧＳでは、ポリメラーゼ媒介性ヌクレオチド伸長のサイクルを繰り返すことによって、または、１つの共通する形式で、オリゴヌクレオチドライゲーションの反復サイクルによって、シークエンシングを実施する。本発明による方法を使用してシークエンシングライブラリーを得た後、単一分子のクローン分離およびその後の増幅を、エマルションＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ  ４５４のパイロシークエンシング、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔの半導体シークエンシング、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳＯＬｉＤライゲーションによるシークエンシング、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの合成によるシークエンシング）、フローセル上でのブリッジ増幅（例えば、Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎ（ａ）、Ｗｉｌｄｆｉｒｅ技術（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による等温増幅またはローリングサークル増幅によって生成されるロロニー／ナノボール（ｒｏｌｏｎｉｅｓ／ｎａｎｏｂａｌｌｓ）（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ）のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ鋳型調製反応によって実施する。Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、ＳＭＲＴ技術（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはナノポアシークエンシング（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ）のようなシークエンシング技術により、事前にクローン的増幅を行わずに単一分子を直接シークエンシングすることが可能になる。使用することができる適切なＮＧＳ法およびプラットフォームは発明の背景においても記載しており、それぞれの開示で言及されている。シークエンシングは、それぞれのプラットフォームのいずれかで実施することができる。ライゲートされていないアダプター単量体またはアダプター二量体を除去するために本発明の方法を使用する一実施形態によると、それぞれ得られたシークエンシングライブラリーのシークエンシング後、読み取りの総数に対するアダプター二量体についての読み取りは、≦１．５％、好ましくは、≦１．２５％、≦１％、≦０．７５％、≦０．６％、より好ましくは≦０．５％、≦０．４％、≦０．３％、より好ましくは≦０．２％および最も好ましくは≦０．１５％である。
【０１０１】
一実施形態によると、本発明による方法を１回超実施する。したがって、一実施形態によると、ステップ（ａ）および（ｂ）を含む本発明の方法を使用したサイズ選択的ＤＮＡ単離サイクルを少なくとも２回実施する。一実施形態によると、第１のサイズ選択サイクルにおいて得られる溶出液から第２のサイズ選択サイクルのためのＤＮＡ含有試料がもたらされる。したがって、第１のサイズ選択サイクル後に得られる溶出液を、第２のサイズ選択サイクルのステップ（ａ）において結合用緩衝液と接触させて、結合用混合物をもたらし、所望のカットオフ値を上回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子を、無修飾ケイ素含有表面を有する固相に結合させる。一実施形態によると、第２のサイズ選択サイクルにおいて第１のサイズ選択サイクルと同じ結合条件を使用する。別の実施形態によると、第２のサイズ選択サイクルでは異なる結合条件を使用し、例えば、異なるカットオフ値を調整するために、結合用混合物中の少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーを異なる濃度で使用する。第１のサイズ選択サイクルおよび第２のサイズ選択サイクルにおいて同じ型の無修飾ケイ素含有表面を有する固相を使用することができる。シークエンシングライブラリー、特に次世代シークエンシングに適したシークエンシングライブラリーの調製の間に、大量の、例えばアダプター単量体またはアダプターとアダプターとのライゲーション産物などの夾雑物である短いＤＮＡ断片を除去するために、本発明によるサイズ選択サイクルを少なくとも２回実施することが都合よい場合がある。
【０１０２】
一実施形態によると、ＤＮＡ含有試料中に含まれるＤＮＡ分子をそれらのサイズに応じて分画化するために本発明による方法を使用する。それにより、２つまたはそれ超の画分が得られ、異なる画分に含まれるＤＮＡ分子は平均して長さが異なる。本発明による方法はまた、前記目的にも適する。ＤＮＡ含有試料を分画化するために、例えば、サイズ選択的ＤＮＡ単離サイクルを２回またはそれ超実施する。サイズ分画は、例えば、以下の通り実現することができる：
−  第１のサイズ選択的ＤＮＡ単離サイクルＡにおいて、結合用混合物においてカットオフ値Ａを決定する結合条件Ａをもたらし、得られる溶出液Ａから、カットオフ値Ａを上回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子を主に含む画分がもたらされる、
−  第１のサイズ選択的ＤＮＡ単離サイクルＡのステップ（ｂ）において得られる、分離された残りの試料から、第２のサイズ選択的ＤＮＡ単離サイクルＢのためのＤＮＡ含有試料がもたらされ、結合用混合物においてカットオフ値Ｂを決定する結合条件Ｂをもたらし、カットオフ値Ｂは、カットオフ値Ａよりも低く、得られる溶出液Ｂから、カットオフ値Ｂを上回るがカットオフ値Ａは下回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子を主に含む画分がもたらされる。
【０１０３】
適切な結合条件に関する詳細は、上にすでに記載しており、それぞれの開示で言及される。一実施形態によると、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー（好ましくは、ポリエチレングリコール）は、第１の結合用混合物中には８．５％〜９．５％（上限カットオフ値Ａ）の範囲内に入る濃度で存在し、第２の結合用混合物中には１０％〜１２％、好ましくは、１０．５〜１１．５％の濃度で存在する（下限カットオフ値Ｂ）。結合条件は、同じ結合用緩衝液を異なる体積で添加することによって調整することができる。所望であれば、残りの試料中になお含まれる、カットオフ値Ｂよりも小さなサイズを有するＤＮＡ分子を第３のサイズ選択的ＤＮＡ単離サイクルＣに供すことができる。したがって、一実施形態によると、サイズ選択的ＤＮＡ単離サイクルＣを実施し、ここで、第２のサイズ選択的ＤＮＡ単離サイクルＢのステップ（ｂ）において得られる分離された残りの試料から、第３のサイズ選択的ＤＮＡ単離サイクルＣのためのＤＮＡ含有試料がもたらされ、結合用混合物においてカットオフ値Ｃを決定する結合条件Ｃをもたらし、カットオフ値Ｃは、カットオフ値Ｂよりも小さく、得られる溶出液Ｃから、カットオフ値Ｃを上回るがカットオフ値Ｂは下回るサイズを有するＤＮＡ分子を主に含む画分がもたらされる。
キット
【０１０４】
第２の態様によると、ＤＮＡ含有試料から所望のカットオフ値を上回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子をサイズ選択的単離するためのキットであって、
（ａ）少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、少なくとも１種の二価カチオンおよび少なくとも１種の緩衝剤を含む結合用緩衝液であり、８〜１０の範囲内に入るｐＨ値を有する、結合用緩衝液、
（ｂ）無修飾ケイ素含有表面を有する固相、
（ｃ）任意選択で、少なくとも１種の洗浄用溶液、および
（ｄ）任意選択で、少なくとも１種の溶出用溶液
を含むキットが提供される。
【０１０５】
結合用緩衝液、特に適切かつ好ましい結合用緩衝液の構成成分、結合用緩衝液の構成成分の濃度およびｐＨ値に関する詳細、ならびに固相、洗浄用溶液および溶出用溶液に関する詳細は、本発明による方法と併せて上に詳細に記載されている。本発明において同じく当てはまる上記の開示で言及される。非限定的な選択された実施形態を引き続き再度記載する。
【０１０６】
結合用緩衝液中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの適切かつ好ましい濃度は上に記載されており、上記の開示で言及される。結合用緩衝液中の少なくとも１種のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度は、７％〜４５％、１０％〜４０％、１２．５％〜３５％、１５％〜３０％、１７．５％〜２７．５％および２０％〜２５％から選択されることが好ましい。ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）ポリマー、好ましくは、ポリエチレングリコール、より好ましくは、非置換型ポリエチレングリコールであることが好ましい。
【０１０７】
結合用緩衝液は、８．２５〜９．７５、８．５〜９．５または８．６〜９．２から選択される範囲内に入るｐＨ値を有することが好ましい。
【０１０８】
結合用緩衝液中の適切な緩衝剤および濃度は上に記載されており、本発明において同じく当てはまる上記の開示で言及される。結合用緩衝液は、緩衝剤を、２５ｍＭ〜１Ｍ、５０ｍＭ〜７５０ｍＭ、７５ｍＭ〜７００ｍＭ、１００ｍＭ〜６５０ｍＭ、１２５ｍＭ〜６００ｍＭ、１５０ｍＭ〜５５０ｍＭ、１７５ｍＭ〜５２５ｍＭおよび２００ｍＭ〜５００ｍＭから選択される濃度で含んでよい。
【０１０９】
一実施形態によると、結合用緩衝液は、塩、好ましくはアルカリ金属塩、好ましくはアルカリ金属ハロゲン化物を含む。塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウムおよび塩化セシウムから選択されることが好ましく、塩は塩化ナトリウムであることがより好ましい。塩も方法と併せて記載されており、それぞれの開示で言及される。塩の濃度は、０．５Ｍ〜４Ｍ、０．７Ｍ〜３．５Ｍ、１Ｍ〜３Ｍ、１．２Ｍ〜２．７５Ｍおよび１．３Ｍ〜２．５Ｍから選択することができる。
【０１１０】
固相の適切かつ好ましい実施形態も本発明による方法と併せて記載されている。上記の通り、固相は、無修飾シリカ表面をもたらすものであることが好ましい。
【０１１１】
一実施形態によると、結合用緩衝液は、以下の特徴を有する：
ｉ）Ｍｇ２＋を二価カチオン、好ましくはＭｇＣｌ２として含む、
ｉｉ）ポリエチレングリコールを、好ましくは、１２．５％〜３５％、１５％〜３０％、１７．５％〜２７．５％および２０％〜２５％から選択される濃度で含む、
ｉｉｉ）アルカリ金属塩、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、より好ましくは、塩化ナトリウムを、０．５Ｍ〜２．７５Ｍ、好ましくは、０．７５Ｍ〜２．５Ｍの範囲内に入る濃度で含む、
ｉｖ）少なくとも１種の緩衝剤を、１００〜５５０ｍＭの範囲内に入る濃度で含む、および
ｖ）８．５〜９．５または８．６〜９．２の範囲内に入るｐＨを有する。
【０１１２】
さらに、キットは、使用に関する説明書および／または情報を含んでよい。例えば、キットは、特定の体積の結合用緩衝液と特定の体積のＤＮＡ含有試料を混合した場合に実現されるカットオフ値、および／またはＤＮＡ含有試料と結合用緩衝液を特定の比率で混合した場合に実現されるカットオフ値（単数または複数）に関する説明書および／または情報を含んでよい。ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度が異なる２つまたはそれ超の結合用緩衝液がキット中に含まれる場合には、キットにより、キット中に含まれる特定の結合用緩衝液を使用した場合にいずれのカットオフ値が実現されるかの情報をもたらすことができる。したがって、本発明は、例えば、特定の体積の結合用緩衝液と特定の体積のＤＮＡ含有試料を混合することによるカットオフ値の柔軟な調整を可能にするキットも提供する。
【０１１３】
それぞれのキットは、特に、第１の態様による方法において使用され得る。特に、キットは、ＤＮＡ含有試料中に含まれるＤＮＡ分子をそれらの長さに応じて分画化するために使用され得る。
【０１１４】
本発明は、本明細書に開示されている典型的な方法および材料によって限定されず、本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値の範囲は、その範囲を規定している数を含む。本明細書で提供される表題は、本明細書を全体として参照することによって読み取ることができる本発明の種々の態様または実施形態の限定ではない。
【０１１５】
「溶液」という用語は、本明細書で使用される場合、特に、液体組成物、好ましくは水性組成物を指す。溶液は、ただ１つの相の均一な混合物であり得るが、例えば沈殿物などの、固体構成物を含む溶液も本発明の範囲内に入る。
【０１１６】
主題の明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の態様を包含する。したがって、例えば、「１つのポリ（アルキレンオキシド）ポリマー」への言及は、単一の型のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、ならびに２つまたはそれ超のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーを含む。同様に、「１つの二価カチオン」、「１つの追加的な塩」、「１つの緩衝剤」などへの言及は、単一の実体および２つまたはそれ超のそのような実体の組合せを含む。「本開示」および「本発明」などへの言及は、本明細書において教示される単一の態様または多数の態様を含む、などである。本明細書において教示される態様は、「発明」という用語に包含される。
【０１１７】
結合用混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、二価カチオン、塩または緩衝剤などの構成成分の濃度を決定する際に固相は考慮しない。
【０１１８】
一実施形態によると、方法の場合では、特定のステップを含む、または、組成物、溶液および／もしくは緩衝液の場合では、特定の成分を含むと本明細書に記載されている主題は、それぞれのステップまたは成分からなる主題を指す。本明細書に記載の好ましい実施形態を選択し、組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組合せから生じる特定の主題も本開示に属する。
【実施例】
【０１１９】
本発明を以下の非限定的な実施例によって例示する。
（実施例１）
【０１２０】
結合／沈殿用緩衝液ストック溶液：２２％ＰＥＧ８０００、２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２を伴うかまたは伴わない２００ｍＭのＴｒｉｓ。これらの沈殿用緩衝液のｐＨを、図１にも示されている通り、ｐＨ６または９のいずれかに調整した。この沈殿用緩衝液ストック溶液をＤＮＡ含有試料として、せん断されたヒトＤＮＡと接触させた。ＤＮＡは、Ｃｏｖａｒｉｓウルトラソニケーターを用いてＴＥ緩衝液中でせん断してＤＮＡ含有試料をもたらした。このＤＮＡ含有試料９０μｌを沈殿用緩衝液ストック溶液と混合した（結合用混合物中の濃度：１１％ＰＥＧ８０００、１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を伴うかまたは伴わない１００ｍＭのＴｒｉｓ）９０μｌ。せん断されたＤＮＡを、磁気シリカ粒子（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ  Ｇビーズ−ＱＩＡＧＥＮ）を含む懸濁液１０μｌに沈殿させた。磁気シリカ粒子上に沈殿させたＤＮＡを８０％エタノールで２回洗浄し、溶出用緩衝液５０μｌを用いて溶出させた。
【０１２１】
異なる結合／沈殿用緩衝液を用いて実現されるカットオフ値およびＤＮＡ収率を分析するために、得られた溶出液をＡｇｉｌｅｎｔ  ７５００  ｃｈｉｐで分析した。結果を図１に示す（電気泳動図）。５０ｂｐおよび１０３８０ｂｐにおいて示される大きなピークは、較正マーカーに由来するものである。マーカー間の曲線は、異なる結合用緩衝液を用いて単離された異なるサイズのＤＮＡ断片に類似する。したがって、較正マーカー間の曲線により、単離されたＤＮＡ断片のサイズ分布が示され、曲線の高さにより、得られた収率が示される。さらに、インプットＤＮＡの曲線が示されている。
【０１２２】
図１から、二価カチオンＭｇ２＋を添加することと併せて沈殿用緩衝液のｐＨをおよそｐＨ９にシフトさせることにより、驚いたことに、無修飾ケイ素含有表面を有する固相を使用した場合に回収されるＤＮＡ断片の収率が増強されることが実証される。したがって、本発明において使用される結合条件は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により沈殿ＤＮＡ断片の無修飾シリカ表面上への回収を増強し、それにより、そのような無修飾固相の、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーを用いたサイズ選択的ＤＮＡ単離における使用を可能にするものである。
（実施例２）
【０１２３】
実施例２は、本発明の結合用緩衝液、したがって、沈殿用緩衝液を異なる量で添加することにより、回収されるＤＮＡ断片のカットオフ値を再配置することができ、したがって、調整することができることを実証するものである。ＤＮＡ含有試料は、せん断されたヒトＤＮＡであった。結合／沈殿用緩衝液ストック溶液は、２２％ＰＥＧ８０００、２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．８８を含むものであった。この結合用緩衝液を、ＤＮＡ含有試料に、結合用混合物において以下のＰＥＧ８０００の最終濃度：１４％、１２％、１０％および８％が実現される量で添加した。
【０１２４】
せん断されたＤＮＡをＭａｇＡｔｔｒａｃｔ懸濁液Ｇ（磁気シリカ粒子）５μｌ上に沈殿させた。前もって、シリカ粒子を再緩衝させるために、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ  Ｇビーズを、２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．８９を含有する緩衝液と一緒にプレインキュベートした。ＤＮＡが結合したビーズを８０％エタノールで２回洗浄し、溶出用緩衝液１７μｌを用いて溶出させた。試料をＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ７５００チップで再度分析した。得られた電気泳動図を図２に示す。見ることができる通り、ポリエチレングリコール濃度と相関して、カットオフ値が濃度依存的にシフトする。ポリエチレングリコールの濃度が高いほど、より小さなＤＮＡ断片が回収される。結合用混合物中のポリエチレングリコールの濃度を低下させると、カットオフ値は濃度依存的に増大した。したがって、異なる量のＰＥＧを含む沈殿用緩衝液を使用することによって、または異なる量の沈殿用緩衝液を結合用混合物中に含めることによって、カットオフ値を正確に調整することができる。
【０１２５】
したがって、実施例２から、異なる量の本発明による結合／沈殿用緩衝液をＤＮＡ含有試料に添加することによって、異なる長さのＤＮＡ断片を分離することができることが示される。サイズ選択的分離方法は、アダプターのような望ましくない、小さなＤＮＡ断片またはミスプライミングされたＰＣＲ産物のような大きな断片を除去しなければならないのと同時に、ライブラリーＤＮＡをできるだけ効率的に保持しなければならない、次世代シークエンシングのためのライブラリー調製などの適用に特に適している。ライブラリー調製のような適用における本発明によるサイズ選択方法の別の利点は、カットオフの柔軟な再配置である。本発明は、この柔軟な再配置、したがって、回収されるＤＮＡ分子の増強された収率の維持と同時にカットオフ値の適合を可能にするものである。単に結合用緩衝液を異なる量で添加することにより、全てのカットオフ値を再配置することができる。
（実施例３）
【０１２６】
実施例３は、高い標的ＤＮＡ収率およびカットオフ値の適合が、固相としてシリカスピンカラムを使用した場合にも実現されることを実証するものである。ＤＮＡ含有試料は、この場合もまた、せん断されたヒトＤＮＡである。沈殿用緩衝液ストック溶液の濃度は、２２％Ｐｅｇ８０００、２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．８８であった。この結合／沈殿用緩衝液をＤＮＡ含有試料に、結合用混合物において以下のＰＥＧ８０００の最終濃度：９％、８％、７％が実現されるように添加した。せん断されたＤＮＡを、前もって、２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．８９を含有する緩衝液と一緒にプレインキュベートしたＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラム上に沈殿させた。含有されるシリカ膜に結合した、沈殿ＤＮＡを、８０％エタノールで２回洗浄し、溶出用緩衝液１７％μｌで溶出させた。溶出液をＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ７５００チップで分析した。電気泳動図を図３に示す。見ることができる通り、同じ、カットオフ値のポリエチレングリコール濃度依存的再配置が実現される。さらに、ＤＮＡ断片の回収率は高かった。
（実施例４）
【０１２７】
実施例４では、ＤＮＡ含有試料から上限カットオフ値と下限カットオフ値とによって決定される特定のサイズ範囲内のサイズを有する標的ＤＮＡ分子を単離するために本発明の方法を実施した。結果を、参考ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰを製造者の説明書に従って用いて得られた結果と比較した。簡単に述べると、ＡＭｐｕｒｅ  ＸＰビーズプロトコールを以下に従って実施した：ＡＭｐｕｒｅ  ＸＰビーズを再懸濁させた。ビーズ８０μｌまたは２０μｌをマイクロタイタープレートにおいて試料１００μｌまたは上清に添加した。ピペットを１６０μｌに調整し、全体積を、徹底的に混合するために１０回ピペッティングした。各試料の後にピペットチップを取り換えた。マイクロタイタープレートを室温で１５分間インキュベートした。マイクロタイタープレートを磁石プレート上に載せ、室温で１５分間、または液体が透明に見えるまで静置した。次いで、各上清の約半分を取り出し、廃棄し、ビーズに触れないように注意を払い、このステップを２回実施した。各試料の後にピペットチップを取り換え、また、ウェル中には液体が残留する可能性がある。マイクロタイタープレートを磁石プレート上に載せたまま、新しく調製した８０％エタノール２００μｌを各試料に添加し、ビーズが再懸濁しないように注意を払った。マイクロタイタープレートを室温で少なくとも３０秒間インキュベートした。その後、完全な上清を各ウェルから取り出し、廃棄した。ビーズに触れないように注意を払った。各試料の後にピペットチップを取り換えた。エタノールでの洗浄を繰り返した。マイクロタイタープレートを磁石プレートから外し、乾燥させるために室温で１５分間、静置した。乾燥したペレットを、本発明ではＥＢである再懸濁用緩衝液１７．５μｌに、全体積を慎重に１０回ピペッティングすることによって再懸濁させた。マイクロタイタープレートを室温で２分間インキュベートした。マイクロタイタープレートを磁石プレート上で５分間または液体が透明に見えるまで静置した。透明な上清１５μｌを新しいチューブに移した。各試料の後にチップを取り換えた。
【０１２８】
実施例４では、本発明の方法において多数の異なる結合用緩衝液をさらに試験した。特に明記されていなければ、実施例４では、ＤＮＡ含有試料は、せん断されたヒトＤＮＡであり、方法を以下に従って実施した：
−  磁気シリカ粒子（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ  Ｇビーズ、ＱＩＡＧＥＮ）を洗浄緩衝液（ビーズ５μｌ＋洗浄緩衝液１０μｌ、ボルテックスすることにより混合したもの）中でプレインキュベートした。洗浄緩衝液は、ＰＥＧを含有しない以外は結合用緩衝液と同じ組成を有するものであった。磁気シリカ粒子を、磁石の力を借りて分離し、洗浄緩衝液を除去した。
−  洗浄した磁気シリカ粒子（５μｌ）を結合用緩衝液６３μｌおよびＤＮＡ含有試料（１μｇ）９０μｌと接触させた。それにより、およそ９％のＰＥＧを含む第１の結合用混合物がもたらされる（１部分のＤＮＡ試料に対して０．７部分の結合用緩衝液）。磁気シリカ粒子は、結合用混合物中の構成成分の濃度の算出において考慮に入れない。第１の結合用混合物をボルテックスすることにより混合し、上限カットオフ値を上回るサイズを有するＤＮＡ分子を磁気粒子に結合させるために、第１の結合用混合物を振とうしながら１０分間インキュベートした。
−  ＤＮＡ分子が結合した磁気粒子を、試料を磁気ラック上に置くことによって磁気により分離した。それにより、上限カットオフ値を上回るサイズを有するより大きなＤＮＡ分子が第１の結合用混合物から除去された。残りの試料をさらに処理した。
−  磁気シリカ粒子（上記の通り洗浄したもの）５μｌを、別の体積の結合用緩衝液（２５．５μｌ）および残りの試料１４０ｍｌと接触させた。それにより、およそ１１％のＰＥＧを含む第２の結合用混合物がもたらされた。この場合でもまた、結合用混合物中の構成成分の濃度の算出において磁気シリカ粒子は考慮に入れない。第２の結合用混合物をボルテックスすることにより混合し、下限カットオフ値を上回るサイズを有する標的ＤＮＡ分子を磁気粒子に結合させるために、第２の結合用混合物を振とうしながら１０分間インキュベートした。
−  標的ＤＮＡ分子が結合した磁気粒子を、試料を磁気ラック上に置くことによって磁気により分離した。上清を取り出し、廃棄した。
−  標的ＤＮＡ分子が結合した磁気シリカ粒子を８０％エタノール５００μｌで洗浄し、ＲＴ、振とう下で５分間インキュベートし、磁気ラック上で１分間の磁気分離を行った。上清を取り出し、廃棄した。洗浄ステップを２回実施した。
−  洗浄した、標的ＤＮＡ分子が結合した磁気シリカビーズを５分間風乾した。
−  第１の溶出ステップを、緩衝液ＴＥ（ＱＩＡＧＥＮ）１７μｌを添加し、ＲＴ、振とう下で５分間インキュベートすることによって実施した。懸濁液を分離のために磁気ラック上に置き、得られた溶出液１５μｌを取り出した。
−  第２の溶出ステップを、緩衝液ＥＢ（ＱＩＡＧＥＮ）５０μｌを使用し、ＲＴ、振とう下で５分間インキュベートして実施した。懸濁液を分離のために磁気ラック上に置き、得られた溶出液を取り出した。本実施例では、全ての結合したＤＮＡの回収を確実にするために第２の溶出ステップを実施した。
【０１２９】
以下の結合用緩衝液を本発明のこのプロトコールに従って試験し、参考製品（ＡＭＰｕｒｅ）と比較した：
【表１−１】
2018526968.tif 000002
【表１−２】
2018526968.tif 000003
【０１３０】
結果から、種々の結合用緩衝液を本発明による方法において使用すること、および核酸結合のために無修飾ケイ素含有表面を有する固相を使用した場合に良好な結果をもたらすことができることが実証される。本発明の方法は対費用効果が大きくかつロバストであり、それにより、当技術分野に重要な寄与をなす。
（実施例５）
【０１３１】
本実施例は、ＮＧＳ（標的化シークエンシング）ライブラリー調製ワークフローにおける清浄化およびサイズ選択を示すものである。
実験計画：
【０１３２】
「Ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐａｎｅｌ」（ＧＲＴＰ−１０１Ｘ−１２）によって定義されるＰＣＲアンプリコンのセットであるＤＮＡシークエンシングパネルを生成するための試料材料としてヒトゲノムＤＮＡを使用した。この遺伝子パネルは、関連性のあるがん関連遺伝子内の領域のセットを増幅してこれらのＤＮＡ領域の標的化シークエンシングを可能にするためのＰＣＲプライマーセットである。この遺伝子パネルの領域を増幅するための多重ＰＣＲを「QIAact  Gene  Panels  Handbook」（２０１５年１２月；ＱＩＡＧＥＮ）に従って実施した。
【０１３３】
次いで、増幅された遺伝子パネルＤＮＡを、望ましくないプライマー、非特異的な増幅産物および他の不純物を除去するために、清浄化およびサイズ選択プロトコールに供する。
プロトコール詳細：
【０１３４】
１）ＤＮＡ（精製されていないＰＣＲ産物）１００μｌに、無希釈の法医学的ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ懸濁液Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ）３０μｌを添加して、試料の総体積を１３０μｌにする。
【０１３５】
２）サイズ選択用緩衝液を試料に４６％＊濃度まで添加し、混合する。
【０１３６】
３）ＲＴで振とうしながら２０分間インキュベートする。
【０１３７】
４）磁気ラックによってビーズを懸濁液から分離する。上清を移し、ビーズを廃棄する。
【０１３８】
５）無希釈の法医学的ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ  Ｇビーズ３０μｌをステップ４からの上清に添加する。
【０１３９】
６）サイズ選択用緩衝液を７０％＊濃度まで添加し、混合する。
【０１４０】
７）ＲＴで振とうしながら２０分間インキュベートする。
【０１４１】
８）磁気ラック上でビーズを懸濁液から分離する。上清を取り出し、廃棄する。
【０１４２】
９）８０％エタノール５００μｌをビーズに添加し、混合する。
【０１４３】
１０）ＲＴで振とうしながら５分間インキュベートする。
【０１４４】
１１）磁石スタンド上でビーズを懸濁液から分離する。上清を取り出し、廃棄する。
【０１４５】
１２）ステップ９〜１１を１回繰り返す。
【０１４６】
１３）ビーズを２０分間、風乾する。
【０１４７】
１４）溶出用緩衝液５０μｌをビーズに添加する。ボルテックスすることによって混合する。
【０１４８】
１５）ＲＴで振とうしながら５分間インキュベートする。
【０１４９】
１６）磁気ラック上でビーズを懸濁液から分離する。
【０１５０】
１７）溶出液約５０μｌを新しいチューブに移す。
＊結合用混合物中のサイズ選択用緩衝液の百分率
使用するサイズ選択用緩衝液：
【０１５１】
使用するサイズ選択用緩衝液−一般的な組成：
【表２】
2018526968.tif 000004
【０１５２】
使用する緩衝剤：
１）ＣＡＰＳＯ（Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）
２）ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）
３）ＣＨＥＳ（Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）
４）ＴＡＰＳ（Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸）
【０１５３】
以下にさらに示す通り、それぞれの緩衝液を９．０〜９．３の異なるｐＨ値に調整した。
【０１５４】
試験したサイズ選択用緩衝液の４種のバリアントの安定性を決定するために、緩衝液を、新しく作製した後、２５℃で６カ月間保管し、その後、ＤＮＡ清浄化およびサイズ選択プロトコールのために使用した（結果２〜４）。参照として、緩衝剤としてＣＡＰＳＯおよびＣＨＥＳを使用して新しく作製した緩衝液を試験した（結果１）。
【０１５５】
清浄化後、ＤＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒキャピラリー電気泳動システムを製造者の説明書に従って使用して分析した。
【０１５６】
ＤＮＡ回収率を、清浄化プロトコールに供したＤＮＡの量および標的化されたサイズ範囲（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを使用して決定される）内の遺伝子パネルＤＮＡの量に基づいて算出した。
結果１−ＣＡＰＳＯ／ＣＨＥＳ（新しく調製したもの）を用いたサイズ選択用緩衝液：
【０１５７】
緩衝剤としてＣＡＰＳＯおよびＣＨＥＳを使用して新しく作製した緩衝液を試験した。ＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳのいずれかを使用して、サイズ選択用緩衝液のｐＨをそれぞれ９．０、９．１、９．２に調整した。ＤＮＡ清浄化およびサイズ選択プロトコール（上記）の完了後、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用してＤＮＡを分析し、数量化した。結果を図１０ａに示す。この図は、ラダー（Ｌ）について、および遺伝子パネルＤＮＡの試料について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す。試料１〜６を清浄化およびサイズ選択後に分析した。試料７は、１：１００に希釈した、清浄化前の遺伝子パネルＤＮＡである。
【表３】
2018526968.tif 000005
【０１５８】
精製された遺伝子パネルＤＮＡ（試料１〜６）と１００倍希釈した精製されていないＤＮＡ（試料７）の純度の比較から見ることができるように、サイズ選択プロトコールは、例えば、遺伝学的がんプロファイリング適用において次世代シークエンシング適用のためのＤＮＡ領域のセットを増幅するために一般的に使用されるので、高度に多重化されたＰＣＲ反応に由来するＤＮＡを精製するためによく適する。
【０１５９】
図１０ｂは、上記の遺伝子パネルＤＮＡ試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
結果２〜４−ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰＤ、ＣＨＥＳまたはＴＡＰＳを用いたサイズ選択用緩衝液（６カ月間の保管）：
【０１６０】
試験したサイズ選択用緩衝液の４種のバリアントの安定性を決定するために（上記、緩衝剤としてＣＡＰＳＯ、ＡＭＰＤ、ＣＨＥＳまたはＴＡＰＳを含む）、緩衝液を、新しく作製した後、２５℃で６カ月間保管し、その後、ＤＮＡ清浄化およびサイズ選択プロトコールのために使用した。個々の緩衝剤について得られた結果を以下および図１１〜１４に提示する。
結果２−ＣＡＰＳＯを用いたサイズ選択用緩衝液（６カ月間の保管）：
【０１６１】
緩衝剤としてＣＡＰＳＯ（ｐＨ９．０／９．１／９．２）を用いたサイズ選択用緩衝液をそれぞれ三連で試験した。ＤＮＡ清浄化およびサイズ選択プロトコール（上記）の完了後、ＤＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用して分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅキャピラリーゲル電気泳動の結果を図１１ａに示す。この図は、ラダー（Ｌ）について、および遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜９について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す：
【表４】
2018526968.tif 000006
【０１６２】
図１１ｂは、遺伝子パネルＤＮＡ試料１〜９について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
結果３−ＡＭＰＤを用いたサイズ選択用緩衝液（６カ月間の保管）：
【０１６３】
緩衝剤としてＡＭＰＤ（ｐＨ９．０／９．１）を用いたサイズ選択用緩衝液をそれぞれ三連で試験した。ＤＮＡ清浄化およびサイズ選択プロトコール（上記）の完了後、ＤＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用して分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒキャピラリーゲル電気泳動の結果を図１２ａに示す。この図は、ラダー（Ｌ）について、および遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す：
【表５】
2018526968.tif 000007
【０１６４】
図１２ｂは、遺伝子パネルＤＮＡ試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
結果４−ＣＨＥＳを用いたサイズ選択用緩衝液（６カ月間の保管）：
【０１６５】
緩衝剤としてＣＨＥＳ（ｐＨ９．０／９．１／９．２）を用いたサイズ選択用緩衝液をそれぞれ三連で試験した。ＤＮＡ清浄化およびサイズ選択プロトコール（上記）の完了後、ＤＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用して分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒキャピラリーゲル電気泳動の結果を図１３ａに示す。この図は、ラダー（Ｌ）について、および遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜９について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す：
【表６】
2018526968.tif 000008
【０１６６】
図１３ｂは、遺伝子パネルＤＮＡ試料１〜９について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
結果５−ＴＡＰＳを用いたサイズ選択用緩衝液（６カ月間の保管）：
【０１６７】
緩衝剤としてＴＡＰＳ（ｐＨ９．０／９．３）を用いたサイズ選択用緩衝液をそれぞれ三連で試験した。ＤＮＡ清浄化およびサイズ選択プロトコール（上記）の完了後、ＤＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用して分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒキャピラリーゲル電気泳動の結果を図１４ａに示す。この図は、ラダー（Ｌ）について、および遺伝子パネルＤＮＡの試料１〜６について得られたＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル様画像を示す：
【表７】
2018526968.tif 000009
【０１６８】
図１４ｂは、遺伝子パネルＤＮＡ試料１〜６について算出されたＤＮＡ回収率（％）を示す。
結論：
【０１６９】
試験した緩衝剤の４種全てが、ＤＮＡをシリカ表面にサイズ依存的に結合させるためのＤＮＡサイズ選択用緩衝液として適切である。
【０１７０】
「結果１」の節（精製された遺伝子パネルＤＮＡと１００倍希釈した精製されていないＤＮＡの純度の比較）に示されている通り、サイズ選択プロトコールは、例えば、遺伝学的がんプロファイリング適用において次世代シークエンシング適用のためのＤＮＡ領域のセットを増幅するために一般的に使用されるので、高度に多重化されたＰＣＲ反応に由来するＤＮＡを精製するためによく適する。
【０１７１】
ＤＮＡ回収はアルカリ性ｐＨで改善される。ｐＨ９．２または９．３では、ｐＨ９．０よりもなお一層高いＤＮＡ回収率が導かれる。
【０１７２】
試験した緩衝液バリアントは良好に作用することが見いだされた。
−  ＣＡＰＳＯ、ｐＨ９．２
−  ＡＭＰＤ、ｐＨ９．１
−  ＣＨＥＳ、ｐＨ９．２
−  ＴＡＰＳ、ｐＨ９．３
を用いたサイズ選択用緩衝液バリアントにより、
【０１７３】
２５℃で６カ月間保管した後、最も高いＤＮＡ回収率が示される（結果２〜４）。回収率はまた、新しく作製した、ＣＡＰＳＯまたはＣＨＥＳを含有するサイズ選択用緩衝液を用いて得られたＤＮＡ回収率とも同等である（結果１）。
【図１】
2018526968.tif 000010
【図２】
2018526968.tif 000011
【図３】
2018526968.tif 000012
【図４ａ】
2018526968.tif 000013
【図４ｂ】
2018526968.tif 000014
【図５ａ】
2018526968.tif 000015
【図５ｂ】
2018526968.tif 000016
【図６ａ】
2018526968.tif 000017
【図６ｂ】
2018526968.tif 000018
【図７】
2018526968.tif 000019
【図８】
2018526968.tif 000020
【図９】
2018526968.tif 000021
【図１０ａ】
2018526968.tif 000022
【図１０ｂ】
2018526968.tif 000023
【図１１ａ】
2018526968.tif 000024
【図１１ｂ】
2018526968.tif 000025
【図１２ａ】
2018526968.tif 000026
【図１２ｂ】
2018526968.tif 000027
【図１３ａ】
2018526968.tif 000028
【図１３ｂ】
2018526968.tif 000029
【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【国際調査報告】
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