(57)【要約】  本開示は、概して、癌の治療に有用な組成物及び方法を提供する。より具体的には、本方法及び組成物は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を検出し、定量化し、阻害し、死滅させ、分化させ、又は除去するために用いることができ、及びＣＳＣに関連する癌、特にＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６を発現する癌及びＣＳＣの治療に用いることができる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖を阻害する方法であって、前記ＣＳＣの増殖を阻害し及び／又は生存を低下させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせに前記ＣＳＣを接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
前記ＣＳＣがＣＣＬ２０を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＳＣがＣＣＲ６を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌のＣＳＣである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法であって、前記治療抵抗性癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）を阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣの分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせを前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項８】
以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法であって、前記治療抵抗性癌を治療するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせを前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項９】
前記ＣＳＣがＣＣＬ２０を発現する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＳＣがＣＣＲ６を発現する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌のＣＳＣである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法であって、前記癌における前記ＣＳＣを阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣの分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬又はこれらの組み合わせを、治療を必要としている対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法であって、前記癌を治療するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬又はこれらの組み合わせを、治療を必要としている対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記ＣＳＣがＣＣＬ２０を発現する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＳＣがＣＣＲ６を発現する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌のＣＳＣである、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法であって、前記癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣの分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせを対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２２】
再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法であって、前記癌を治療するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせを対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２３】
前記ＣＳＣがＣＣＬ２０を発現する、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＳＣがＣＣＲ６を発現する、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌のＣＳＣである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
癌の再発又は再燃を予防する方法であって、癌の再発又は再燃を予防するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせを癌の再発又は再燃の予防を必要としている対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記癌が癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＳＣがＣＣＬ２０を発現する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＳＣがＣＣＲ６を発現する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌のＣＳＣである、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
癌を有する対象の癌の再燃リスクを低下させる方法であって、前記癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣの分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせを前記対象に投与する工程を含み、それによって前記対象の癌の再燃リスクを低下させる、方法。
【請求項３６】
前記ＣＳＣがＣＣＬ２０を発現する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＣＳＣがＣＣＲ６を発現する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌のＣＳＣである、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
癌幹細胞（ＣＳＣ）を除去する方法であって、ＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせに前記ＣＳＣを接触させる工程を含む方法。
【請求項４２】
前記ＣＳＣがＣＣＬ２０を発現する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＣＳＣがＣＣＲ６を発現する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌のＣＳＣである、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
癌における癌幹細胞（ＣＳＣ）を阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣの自己複製能及び拡大能を低下させるのに有効な量の組成物における、ＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせの使用。
【請求項４８】
前記ＣＳＣがＣＣＬ２０を発現する、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記ＣＳＣがＣＣＲ６を発現する、請求項４７に記載の使用。
【請求項５０】
前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項４７に記載の使用。
【請求項５１】
前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌のＣＳＣである、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５２】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
癌細胞を含む試料中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在を決定する方法であって、
ＣＣＬ２０核酸配列又はＣＣＬ２０アミノ酸配列に結合する薬剤に前記試料を接触させる工程；
前記薬剤と前記ＣＣＬ２０核酸配列又は前記ＣＣＬ２０アミノ酸配列との間の結合の存在又は非存在を検出する工程；及び
前記薬剤と前記ＣＣＬ２０核酸配列又は前記ＣＣＬ２０アミノ酸配列との間の結合の検出に基づき前記試料中の前記ＣＳＣの存在を同定する工程、
を含む方法。
【請求項５４】
前記試料中の前記ＣＣＬ２０核酸配列又は前記ＣＣＬ２０アミノ酸配列の量を定量化する工程、前記ＣＣＬ２０核酸配列又は前記ＣＣＬ２０アミノ酸配列の前記量をＣＣＬ２０核酸又はＣＣＬ２０アミノ酸の基準レベルと比較する工程、及び前記検出された量が前記基準レベルよりも多い場合に前記試料中の前記ＣＳＣの存在を同定する工程を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記薬剤が検出可能部分を更に含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記薬剤が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記ＣＣＬ２０核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬剤が、前記ＣＣＬ２０アミノ酸配列に特異的に結合する抗体を含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５８】
癌細胞集団中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の数を選択的に減少させる方法であって、前記癌細胞集団における前記ＣＳＣを阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣの分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせに前記癌細胞集団を接触させる工程を含む方法。
【請求項５９】
前記ＣＳＣがＣＣＬ２０を発現する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＣＳＣがＣＣＲ６を発現する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＣＳＣがスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＣＳＣが、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌のＣＳＣである、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法であって、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせに前記腫瘍を接触させる工程を含む方法。
【請求項６５】
前記腫瘍がＣＣＬ２０を発現する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記腫瘍がＣＣＲ６を発現する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記腫瘍がスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記腫瘍が、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌の腫瘍である、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
腫瘍のサイズを低下させる方法であって、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせに前記腫瘍を接触させる工程を含む方法。
【請求項７１】
前記腫瘍がＣＣＬ２０を発現する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記腫瘍がＣＣＲ６を発現する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記腫瘍がスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記腫瘍が、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌の腫瘍である、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項７０〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
患者の腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法であって、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせを前記患者に投与する工程を含む方法。
【請求項７７】
前記腫瘍がＣＣＬ２０を発現する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記腫瘍がＣＣＲ６を発現する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記腫瘍がスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記腫瘍が、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌の腫瘍である、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
患者の腫瘍のサイズを低下させる方法であって、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせを前記患者に投与する工程を含む方法。
【請求項８３】
前記腫瘍がＣＣＬ２０を発現する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記腫瘍がＣＣＲ６を発現する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記腫瘍がスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記腫瘍が、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌の腫瘍である、請求項８２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項８２〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
患者の腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防する方法であって、腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせを前記患者に投与する工程を含む方法。
【請求項８９】
前記腫瘍がＣＣＬ２０を発現する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記腫瘍がＣＣＲ６を発現する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記腫瘍がスフェア形成ＣＳＣを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記腫瘍が、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される癌の腫瘍である、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記阻害薬が、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、及びＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項８４〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された配列表の参照
本願は、「ＣＣＬ２０−１００Ｐ１＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５」と題される２０１６年７月１２日に作成されたサイズ１９．２ＫＢのテキストファイルとしてコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）で本願と共に提出される配列表を参照により援用する。
【背景技術】
【０００２】
癌幹細胞（ＣＳＣ）は、その名前が含意するとおり、多能性及び無制限の自己複製という幹細胞様の特性を有する一部の癌細胞である。このように、この部分的細胞集団は腫瘍形成及びその環境への適応に関与していると考えられる。幾つかの種類のエビデンスから、現在、ＣＳＣは、特に残存疾患が最小限の例で、癌の薬剤耐性、転移、及び再燃に関与している可能性が高いことが示唆されている。実際、最近の臨床エビデンスにより、ＣＳＣシグネチャを持つ細胞では標準ケア療法後に生き残る乳癌細胞の割合が高まることが示された（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。同様の研究において、５ｑ欠失ＭＤＳを有する患者もまた、臨床的及び細胞遺伝学的寛解が見られているにも関わらず、その骨髄に残留する悪性幹細胞集団を有することが分かった（Ｔｅｈｒａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。多くの臨床徴候において、現在、初期の治療応答にも関わらず、特徴的な一部の抵抗性癌細胞の保持が再燃及び潜在的に転移につながり得ると考えられている。
【０００３】
癌幹細胞は初めて同定されて以来、多くの腫瘍型で発見され、検証されてきた。当初ＣＳＣがＡＭＬモデルで同定された後（Ｌａｐｉｄｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ＣＳＣは幾つもの血液系及び固形腫瘍の悪性病変で発見され、検証された。固形腫瘍におけるＣＳＣの最初のエビデンスは乳癌から得られ、ここでＣＳＣはＣＤ４４＋／ＣＤ２４−表面マーカー表現型を持つことが分かった（Ａｌ−Ｈａｊｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。膵癌におけるＣＳＣもまた十分に特徴付けられている。様々な報告によって膵癌ＣＳＣはＥｐｃａｍ＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２４＋（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）又はＣＤ１３３＋（Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）のいずれかであることが同定されているが、本発明者らの手では、三重陽性Ｅｐｃａｍ＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２４＋シグネチャはＣＳＣの腫瘍形成表現型で最良にトラッキングする（ｖａｎ  Ｖｌｅｒｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。幾つもの報告で結腸直腸癌におけるＣＳＣが同定され、腸腫瘍及び結腸直腸腫瘍については、諸研究がマウスにおける幹細胞起源を同定している（Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。それにも関わらず、この分野の技術水準ではヒト結腸直腸癌ＣＳＣの表面マーカー表現型に関して意見の一致が見られていない。ＣＤ６６（Ｇｅｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ＬＧＲ５（Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、並びにＣＤ４４及びＣＤ１３３（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）など、多くの表面マーカーが報告されているが、この分野には、これらの表面マーカー表現型のいずれかがヒト結腸直腸癌ＣＳＣに関する一致した意見を表し得るという強固な確証がなく、ＣＳＣの存在の同定には非付着性スフェア成長（例えば、結腸直腸癌ＣＳＣに対するコロスフェア）などの他の技法が一般に利用されることにつながっている。
【０００４】
任意の奏効する対癌療法の重要な要素として、ＣＳＣを標的化する薬物が出始めている。最近の研究では、初期の治療介入成功後もなお、ＣＳＣが癌の化学療法抵抗性、転移、及び最終的に再燃に関与することが示されている。ＣＳＣは胚性幹細胞の多能性をドライブするのと同じ主要な自己複製経路によってドライブされるが、ＣＳＣ活性をドライブする他の細胞経路に関する知識は未だ限られている。
【０００５】
癌の腫瘍形成能を低下させ及び癌幹細胞などの癌細胞を阻害し又は死滅させる（例えばアポトーシス又は分化を誘導する）方法を含め、癌の治療に対する更なる組成物及び方法が利用可能であれば、より多くの治療選択肢が得られるとともに、疾患の寛解及び／又は患者のクオリティ・オブ・ライフの向上など、より良好な臨床転帰となる可能性が広がり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖を阻害する方法に関し、この方法は、ＣＳＣの増殖を阻害し及び／又は生存を低下させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬にＣＳＣを接触させる工程を含む。
【０００７】
ある態様において、本開示は、以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法に関し、この方法は、治療抵抗性癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）を阻害し又は死滅させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、治療抵抗性癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）の分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含み得る。
【０００８】
ある態様において、本開示は、以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法に関し、この方法は、治療抵抗性癌を治療するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含む。
【０００９】
ある態様において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを標的化して阻害し又は死滅させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を、治療を必要としている対象に投与する工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）の分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含み得る。
【００１０】
ある態様において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法に関し、この方法は、癌を治療するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を、治療を必要としている対象に投与する工程を含む。
【００１１】
ある態様において、本開示は、再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、再発癌又は再燃癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）の分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含み得る。
【００１２】
ある態様において、本開示は、再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法に関し、この方法は、癌を治療するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含む。
【００１３】
一態様において、本開示は、癌の再発又は再燃を予防する方法に関し、この方法は、癌の再発又は再燃を予防するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を癌の再発又は再燃の予防を必要としている対象に投与する工程を含む。
【００１４】
更なる態様において、本開示は、癌を有する対象の癌の再燃リスクを低下させる方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含み、それによって対象の癌の再燃リスクを低下させる。一部の実施形態において、本方法は、癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）の分化を誘導して癌の再燃又は再発リスクを低下させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含み得る。
【００１５】
別の態様において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を除去する方法に関し、この方法は、ＣＳＣを除去するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬にＣＳＣを接触させる工程を含む。
【００１６】
ある態様において、本開示は、癌細胞集団中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の数を選択的に減少させる方法に関し、この方法は、癌細胞集団におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬に癌細胞集団を接触させる工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、癌細胞集団における癌幹細胞（ＣＳＣ）の分化を誘導してＣＳＣの数を減少させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含み得る。
【００１７】
更なる態様において、本開示は、腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法を提供し、この方法は、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬に腫瘍を接触させる工程を含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法を提供し、この方法は、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を患者に投与する工程を含む。
【００１８】
別の態様において、本開示は、腫瘍のサイズを低下させる方法を提供し、この方法は、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬に腫瘍を接触させる工程を含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍のサイズを低下させる方法に関し、この方法は、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を患者に投与する工程を含む。
【００１９】
別の態様において、本開示は、腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防する方法を提供し、この方法は、腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬に腫瘍を接触させる工程を含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防する方法に関し、この方法は、腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を患者に投与する工程を含む。
【００２０】
本開示はまた、治療用組成物及び医薬組成物を含めた、組成物におけるＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせの１つ以上の使用にも関する。実施形態において、本使用及び組成物は、本明細書に開示される様々な方法を提供するのに有効な量の１つ又は複数の阻害薬を含む。実施形態において、１つ以上の使用は、本明細書に記載される腫瘍、癌幹細胞、及び／又は癌の１つ以上を治療する（例えば、死滅させ、除去し、阻害し、細胞増殖の進行及び／又は進行速度を低下させ、病状の進行及び／又は進行速度を低下させ、自己複製能及び拡大能（例えば分化誘導能）を低下させる）ための医薬の製造への使用に関する。
【００２１】
別の態様において、本開示は、癌細胞を含む試料中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在を診断、予測、定量化、同定、及び／又は検出する方法を提供し、ここでこの方法は、
ＣＣＬ２０核酸配列又はＣＣＬ２０アミノ酸配列に結合する薬剤に試料を接触させる工程；
薬剤とＣＣＬ２０核酸配列又はＣＣＬ２０アミノ酸配列との間の結合の存在又は非存在を検出する工程；及び
薬剤とＣＣＬ２０核酸配列又はＣＣＬ２０アミノ酸配列との間の結合の検出に基づき試料中のＣＳＣの存在を同定する工程、を含む。
【００２２】
この態様の実施形態において、本方法は、
試料中のＣＣＬ２０核酸配列又はＣＣＬ２０アミノ酸配列の量を定量化する工程；
ＣＣＬ２０核酸配列又はＣＣＬ２０アミノ酸配列の量をＣＣＬ２０核酸又はＣＣＬ２０アミノ酸の基準レベルと比較する工程；及び／又は
検出された量が基準レベルよりも多い場合に試料中のＣＳＣの存在を同定する工程、のうちの１つ以上を更に含み得る。
【００２３】
更に別の実施形態において、本方法は、検出可能部分を含む薬剤を含み得る。一部の実施形態において、この薬剤は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＣＣＬ２０核酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、この薬剤は、ＣＣＬ２０アミノ酸配列の少なくとも一部分に特異的に結合する抗体を含み得る。
【００２４】
上記の態様の様々な実施形態において、本方法は、ＣＣＬ２０を発現する腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団に関する。上記の態様の一部の実施形態において、本方法は、ＣＣＲ６を発現する腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団に関する。更なる実施形態において、腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団はスフェア形成ＣＳＣを含み得る。
【００２５】
上記の態様の様々な実施形態において、本方法は、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、肝細胞癌、及び乳癌から選択される腫瘍及び／又は癌に関する。
【００２６】
本明細書に記載される態様及び実施形態は、ＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、又はＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６の阻害薬の組み合わせを含む方法に関する。一部の実施形態において阻害薬には、ＣＣＬ２０に結合する抗体、ＣＣＲ６に結合する抗体、ＣＣＬ２０の小分子阻害薬、ＣＣＲ６の小分子阻害薬、ＣＣＬ２０をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、又はＣＣＲ６をコードする核酸にハイブリダイズするｓｉＲＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００２７】
上記の態様及び実施形態はまた、血管新生、腫瘍発生、及び癌に関係する疾患を治療するための追加的な療法を更に含む方法、使用、及び組成物であって、例えば、化学療法、放射線療法、免疫療法、又は当該技術分野において公知の任意の他の活性薬剤若しくは療法などの療法レジメンを含み得る方法、使用、及び組成物にも関する。
【００２８】
当業者には、以下の説明及び例示的図を考察することにより他の態様が明らかとなるであろう。
【００２９】
本開示を説明するため、図面に本開示の特定の態様が示される。しかしながら、本開示は図面に示される態様の正確な構成及び機器に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ−１Ｅ】非ＣＳＣと比べてＣＳＣにＣＣＬ２０の発現の増加が認められることを示す。ＣＳＣエンリッチスフェア培養は、試験した８つ中４つの乳癌株（Ａ）、４つ中２つの膵癌株（Ｂ）、及び７つ中６つの結腸直腸癌株（Ｃ）で標準的な単層培養と比較してＣＣＬ２０の分泌を促進する。ＣＣＬ２０レベルは培養下４日後の細胞の馴化培地からＥＬＩＳＡによってピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍＬ）単位で計測し、続いてｐｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０レベルを同じ株の単層培養細胞と比較した倍数変化に変換した。２つの乳房細胞株（ＭＤＡＭＢ４６８及びＨＣＣ１９３７）からＦＡＣＳで単離したＣＤ４４ｈｉｇｈ／＋ＣＤ２４ｌｏｗ／−ＣＳＣは、同じ株から単離したＣＤ４４ｌｏｗ／−ＣＤ２４ｌｏｗ／−非ＣＳＣと比較してＣＣＬ２０  ｍＲＮＡレベルが上昇している（Ｄ）。同様に、１つの乳房（ＢＲ＿ＰＤＸ＿１）及び２つの膵臓（ＰＡ＿ＰＤＸ＿１及びＰＡ＿ＰＤＸ＿２）患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルから単離されたＣＳＣにおいてもまた、同じ株から単離した非ＣＳＣと比較してＣＣＬ２０  ｍＲＮＡレベルの上昇が明らかである（Ｅ）。ＣＳＣは乳房ＰＤＸモデルについてＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、及び膵臓ＰＤＸモデルについてＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋と同定され、一方、ＰＤＸ乳房非ＣＳＣはＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４−ＣＤ２４−であり、及び膵臓非ＣＳＣはＥｐｃａｍ−ＣＤ４４−ＣＤ２４−であった。パネルＡ〜Ｃについて、ｎ＝３バイオロジカルレプリケート／条件／細胞株；＊＊＊、＊＊、及び＊は、ｔ検定によって決定するときのスフェアと単層培養との間のそれぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。パネルＤ及びＥについては、ｎ＝２テクニカルレプリケート／条件／細胞株。ＲＥ＝１８ＳリボソームＲＮＡに対して正規化し、非ＣＳＣレベルと比較して表したＣｔ値の相対発現。
【図２】スフェア培養におけるＣＣＬ２０分泌を示す。４日目に回収したスフェア培養細胞の馴化培地で計測されたＣＣＬ２０レベルの平均値±ＳＥＭ。絶対ＣＣＬ２０レベルはＥＬＩＳＡによって標準曲線に基づき計測した。Ｎ＝３バイオロジカルレプリケート／細胞株。
【図３−１】ＣＳＣがＣＣＬ２０＋表現型と直接共局在することを示す。Ｂｘｐｃ３膵臓モデルの単層培養からのＣＳＣはフローサイトメトリーによってＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２４ｈｉｇｈと同定され（Ａ）、一方、単層ＨＣＣ１９３７モデルからの乳癌ＣＳＣはＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２４−と同定される（Ｄ）。Ｂｘｐｃ３（Ｂ）及びＨＣＣ１９３７（Ｅ）の両方で、ＡＰＣタグ付加抗ＣＣＬ２０の蛍光強度中央値（中央値：Ｃｏｍｐ−ＡＰＣ  Ａ）によって決定するとき、ＣＳＣは全腫瘍細胞集団（全腫瘍）の平均が有するよりも１．５倍高いＣＣＬ２０発現を有することが見出される。更に、Ｂｘｐｃ３（Ｃ）及びＨＣＣ１９３７（Ｆ）の両方で、黒色の点として示されるＣＳＣは、多色フローサイトメトリーによって決定するとき、主にＣＣＬ２０＋ＣＣＲ６＋細胞集団と重なるように見える。比較のため、全腫瘍細胞のスキャッタを灰色の点として示す。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】ＣＳＣエンリッチスフェア培養がＣＣＬ２０＋ＣＣＲ６＋集団の劇的な拡大を生じさせることを示す。Ｂｘｐｃ３（Ａ、Ｂ）及びＰａｎｃ１（Ｃ、Ｄ）膵癌モデルにおいて細胞をスフェア形成条件下で培養したとき（Ｂ、Ｄ）、単層培養（Ａ、Ｃ）と比較して、多色フローサイトメトリーによって決定したときのＣＣＬ２０＋ＣＣＲ６＋の頻度が劇的に増加する。更に、黒色の点として示される、スフェア培養からＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋と同定された膵癌ＣＳＣは、Ｂｘｐｃ３（Ｅ）及びＰａｎｃ１（Ｆ）モデルにおいて主にＣＣＬ２０＋ＣＣＲ６＋集団と重なる。比較のため、全腫瘍細胞のスキャッタを灰色の点として示す。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５Ａ−５Ｄ】培養に精製ＣＣＬ２０を加えるとＣＳＣエンリッチスフェアの成長がブーストされ、しかし標準的な単層培養細胞ではブーストされないことを示す。Ｂｘｐｃ３膵癌（Ａ）、Ａｓｐｃ１膵癌（Ｂ）、及びＳＵＭ１５９乳癌（Ｃ）モデルをスフェア培養又は単層培養のいずれかで０、２５、５０、１００、及び２００ｐｇ／ｍＬの組換えヒトＣＣＬ２０（ｒｈＣＣＬ２０）によって４日間刺激し、従ってＣＣＬ２０はプレーティングの時点で投与した。ＢＴ５４９細胞（Ｄ）は、２つの別個の商業的供給元、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＣＬ２０  Ａ）及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＣＬ２０  Ｂ）からのＣＣＬ２０（両方とも５０ｐｇ／ｍＬで投与した）によってスフェア成長に対するＣＣＬ２０の増強作用が見られることを示す。ＣＣＬ２０  Ａ及びＣＣＬ２０  Ｂの両方について１５μｇ／ｍＬの抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体を加えてこの効果が消失したとき、この成長刺激の媒介におけるＣＣＬ２０の特異性が確認された（Ｄ）。ｎ＝５バイオロジカルレプリケート／処理／細胞株。＊＊＊、＊＊、及び＊は、ｔ検定によって決定するときの対応するＣＣＬ２０濃度におけるスフェアと単層培養との間のそれぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。＃＃及び＃は、基礎とＣＣＬ２０刺激スフェアとの間のそれぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５の統計的有意性を示し、及び＾は、抗ＣＣＬ２０を加えた場合と加えない場合とのＣＣＬ２０刺激細胞間のｐ＜０．０５の統計的有意性を示す（チューキーの多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定する）。
【図６Ａ−６Ｄ】ＣＣＬ２０によって癌細胞を刺激すると培養下のＣＳＣの頻度が直接ブーストされることを示す。乳癌及び膵癌モデルにおいて２００ｐｇ／ｍＬの組換えヒトＣＣＬ２０をスフェア培養下の細胞に加えると、４日後にＣＳＣの割合が直接増加し、これは（Ａ）ＣＤ４４＋ＣＤ２４−として特徴付けられるＭＤＡＭＢ４６８乳癌細胞、両方ともにＥｐｃａｍｈｉｇｈＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２４ｈｉｇｈとして特徴付けられる（Ｂ）Ｂｘｐｃ３膵癌細胞及び（Ｃ）Ａｓｐｃ１膵癌細胞に見られる。２００ｐｇ／ｍＬで４日間刺激したＢｘｐｃ３スフェアは、幹細胞性遺伝子ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ３／４、ＢＭＩ１、及びＥＺＨ２の対応する増加を示す（Ｄ）。パネルＡ〜Ｃ、ｎ＝３バイオロジカルレプリケート／処理／細胞株。＊は、片側ｔ検定によって決定したときのＣＣＬ２０有り又は無しで処理した細胞間のｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。パネルＤ、ｎ＝２テクニカルレプリケート／処理；ＲＥ＝１８ＳリボソームＲＮＡに対して正規化し、−ＣＣＬ２０レベルと比較して表したＣｔ値の相対発現。
【図７Ａ−７Ｃ】ＣＣＬ２０でスフェアを刺激すると幹細胞性遺伝子の発現が誘導されることを示す。未処理スフェア（−ＣＣＬ２０）と比較した１００ｐｇ／ｍＬ組換えヒトＣＣＬ２０で４日間処理したＨｓ５７８Ｔ（Ａ）、Ｐａｎｃ１（Ｂ）、及びＳＵＭ１５９（Ｃ）スフェア（＋ＣＣＬ２０）における幹細胞性遺伝子ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ３／４、ＥＺＨ２、及びＢＭＩ１の相対発現（ＲＥ）。ＲＥ＝１８ＳリボソームＲＮＡに対して正規化し、−ＣＣＬ２０レベルと比較して表したＣｔ値の相対発現。Ｎ＝２テクニカルレプリケート／処理／細胞株。
【図８Ａ−８Ｄ】ＣＣＬ２０がその受容体ＣＣＲ６を介したシグナル伝達によってＣＳＣを調節することを示す。（Ａ）組換えヒトＣＣＬ２０（ｒｈＣＣＬ２０）は、２０ｎＭ  ｓｉＲＮＡによるＣＣＲ６のノックダウン後、Ｌｏｖｏ結腸直腸癌細胞において処理開始後４日までにスフェア成長の刺激能を失う一方、非標的対照ｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）をトランスフェクトした細胞はＣＣＬ２０に対するその成長応答を維持した。（Ｂ）ＣＣＲ６＋細胞は、ＮＣＩＨ５０８結腸直腸癌モデルから単離したＣＣＲ６−細胞と比較して、ＣＣＬ２０（１００ｐｇ／ｍＬ）による刺激後４８時間で幹細胞性遺伝子の増加を示す。（Ｃ〜Ｄ）ＣＣＬ２０又はＣＣＲ６のいずれかのノックダウン（２０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ）によってＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸を阻害すると、対照ｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）処理と比較してＮＣＩＨ５０８結腸直腸癌細胞（Ｃ）及びＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞（Ｄ）の同レベルのスフェア成長阻害が生じた。パネルＡ、ｎ＝５バイオロジカルレプリケート／条件。＊＊＊、＊＊、及び＊は、ｔ検定によって決定するときの対応するＣＣＬ２０濃度における対照ｓｉＲＮＡ及びＣＣＲ６  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞間のそれぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。パネルＢ、ＲＥ＝１８ＳリボソームＲＮＡに対して正規化し、ＣＣＲ６−レベルと比較して表したＣｔ値の相対発現。パネルＣ、ｎ＝５バイオロジカルレプリケート／処理。＊＊＊は、チューキーの多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定するときの、対照ｓｉＲＮＡとのｐ＜０．００１の統計的有意性を示す。
【図９Ａ−９Ｅ】中和モノクローナルＣＣＬ２０抗体で処理すると、スフェア成長及びフローサイトメトリーによって計測されるＣＳＣが有意に減少することを示す。スフェア成長は、（Ａ）Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞、（Ｂ）ＮＣＩＨ５０８結腸直腸癌細胞、及び（Ｃ）Ｐａｎｃ  １膵癌細胞において、１０μｇ／ｍＬアイソタイプ対照ＩｇＧ処理と比較して１０μｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０  ＩｇＧによる４日間の処理後に減少する。単回用量１０μｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０  ＩｇＧ処理によると、同じ１０μｇ／ｍＬ用量のアイソタイプ対照ＩｇＧ処理と比較してＢｘｐｃ３（Ｄ）及びＰａｎｃ１（Ｅ）スフェアにおいてＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋膵癌ＣＳＣの割合が低下する。パネルＡ〜Ｃ、ｎ＝５バイオロジカルレプリケート／処理／細胞株。パネルＤ〜Ｅ、ｎ＝３バイオロジカルレプリケート／処理／細胞株。＊＊＊、＊＊、及び＊は、ｔ検定によって決定するときの、対照ＩｇＧ及びＣＣＬ２０  ＩｇＧ処理細胞間におけるそれぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。
【図１０】中和モノクローナルＣＣＬ２０抗体で処理するとＣＣＬ２０へのＣＤ４＋  Ｔ細胞の走化性遊走が有意に阻害されることを示す。ヒト健常ドナー血液からＣＤ４＋  Ｔ細胞を単離し、ポリカーボネートフィルタ及び５μＭ細孔を有するトランスウェル遊走プレートにおいて３０ｎＭアイソタイプＩｇＧ又は抗ＣＣＬ２０  ＩｇＧと共に１０ｎＭ組換えヒトＣＣＬ２０へと３時間遊走させた。ｎ＝３バイオロジカルレプリケート／処理／ドナー。＊＊及び＊＊＊は、ｔ検定によって決定するときの、アイソタイプＩｇＧとＣＣＬ２０  ＩｇＧとの間におけるそれぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１の統計的有意性を示す。
【図１１−１】ＴＲ１表現型の多パラメータフローサイトメトリー分析を示す。集団中の生細胞の５７％がＣＣＲ６に関して陽性染色された（Ａ）。これらのＣＣＲ６＋細胞のうち９３％がＣＤ３＋／ＣＤ４＋であることが分かった（Ｂ）。ＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞のうち９４％が２５＋であることが分かり（Ｃ）、及びこれらのＣＤ２５＋細胞のうち８５％がＦＯＸＰ３＋であることが確認された（Ｄ）。陽性対陰性ゲーティングはフル・マイナス・ワン（ＦＭＯ−）染色によって決定し、従って試料は、ＣＤ３（Ｅ）、ＣＤ４（Ｆ）、ＣＤ２５（Ｇ）、ＦｏｘＰ３（Ｈ）、又はＣＣＲ６（Ｉ）を抜いたパネル中の全ての染色を含んだ。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２Ａ−１２Ｃ】ＴＲ１細胞が、ＣＳＣによって分泌されるＣＣＬ２０へと遊走することを示す。非特異的遊走（ＣＣＬ２０無し）と比較した、及び中和抗ＣＣＬ２０  ＩｇＧ（６６７ｎＭ）を加えることによる遊走の阻害と比較した１００ｎＭ  ＣＣＬ２０へのＴＲ１細胞の走化性誘引をトランスウェル遊走アッセイによって決定した（Ａ）。ＮＣＩＨ５０８細胞のスフェア培養によって生じたＣＳＣ馴化培地（ＣＳＣ  ＣＭ）中のＣＣＬ２０濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。未使用のＳＣＭ培地中のＣＣＬ２０レベルを比較としてプロットして、ＣＣＬ２０がＮＣＩＨ５０８  ＣＳＣから産生されたことを確認する（Ｂ）。非特異的遊走（ＣＣＬ２０無し）と比較した、及び中和抗ＣＣＬ２０  ＩｇＧ（６６７ｎＭ）又はアイソタイプ対照ＩｇＧ（６６７ｎＭ）を加えることによる遊走の阻害と比較したＣＳＣ  ＣＭへのＴＲ１細胞の走化性誘引もまた、トランスウェル遊走アッセイによって決定した。ｎ＝４レプリケート／処理。
【図１３−１】図３のＢｘｐｃ３及びＨＣＣ１９３７フローサイトメトリーデータのゲーティング制御を示す。多色フローサイトメトリー実験における各タンパク質について、フル・マイナス・ワン（ＦＭＯ）染色を用いて陽性対陰性染色ゲートを定義した。Ｂｘｐｃ３細胞（上段、Ａ〜Ｃ）は、Ｅｐｃａｍ、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＣＬ２０、及びＣＣＲ６についての５色パネルで染色し、一方、ＨＣＣ１９３７細胞（下段、Ｄ〜Ｅ）は、Ｅｐｃａｍを除く上記の全てについての４色パネルで染色した。（Ａ）フル・マイナス・Ｅｐｃａｍ（ＦＭＯ−Ｅｐｃａｍ）（破線、灰色の網掛け）をフル染色試料（実線、白色の網掛け）と比較した。（Ｂ、Ｄ）フル・マイナス・ＣＤ４４（ＦＭＯ−ＣＤ４４）は灰色で示し、フル・マイナス・ＣＤ２４（ＦＭＯ−ＣＤ２４）は緑色で示す。（Ｃ、Ｅ）フル・マイナス・ＣＣＬ２０（ＦＭＯ−ＣＣＬ２０）は黒色で示し、フル・マイナス・ＣＣＲ６（ＦＭＯ−ＣＣＲ６）は灰色で示す。
【図１３−２】図１３−１の続き。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図４のＢｘｐｃ３及びＰａｎｃ１フローサイトメトリーデータのゲーティング制御を示す。単層培養及びスフェア培養Ｂｘｐｃ３及びＰａｎｃ１細胞は、Ｅｐｃａｍ、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＣＬ２０、及びＣＣＲ６についての５色パネルで染色した。実験毎に、単層培養細胞でゲーティング制御を実行した。Ｂｘｐｃ３（Ａ）及びＰａｎｃ１（Ｂ）単層培養細胞の両方について、フル・マイナス・ＣＣＬ２０（ＦＭＯ−ＣＣＬ２０）は灰色で示し、一方、フル・マイナス・ＣＣＲ６（ＦＭＯ−ＣＣＲ６）は黒色で示す。
【図１５Ａ−１５Ｄ】図９Ｄ、図９ＥのＢｘｐｃ３及びＰａｎｃ１フローサイトメトリーデータのゲーティング制御を示す。スフェア培養Ｂｘｐｃ３（Ａ、Ｂ）及びＰａｎｃ１（Ｃ、Ｄ）細胞は、Ｅｐｃａｍ、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＣＬ２０、及びＣＣＲ６についての５色パネルで染色した。実験毎に、単層培養細胞でゲーティング制御を実行した。（Ａ、Ｃ）フル・マイナス・Ｅｐｃａｍ（ＦＭＯ−Ｅｐｃａｍ）（破線、灰色の網掛け）をフル染色試料（実線、白色の網掛け）と比較した。（Ｂ、Ｄ）フル・マイナス・ＣＤ２４（ＦＭＯ−ＣＤ２４）は黒色で示し、一方、フル・マイナス・ＣＤ４４（ＦＭＯ−ＣＤ４４）は灰色で示す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】ＣＣＬ２０  ＩｇＧが、（Ａ）ｃＡＭＰ及び（Ｂ）β−アレスチン活性によって計測したＣＣＬ２０刺激ＣＣＲ６経路活性をどのように中和するかを示す。ｃＡＭＰアッセイは、１ｎＭ  ＣＣＬ２０及び４ｍＭフォルスコリンで刺激した、ヒトＣＣＲ６を過剰発現するＡｄ２９３細胞を使用して実施し、一方、β−アレスチンアッセイは、６ｎＭ  ＣＣＬ２０で刺激した、ヒトＣＣＲ６を過剰発現するＣＨＯＫＩ細胞を使用して実施した。ｎ＝２テクニカルレプリケート／用量／アッセイ。
【図１７Ａ−１７Ｂ】Ｐａｎｃ１スフェアを１０ｕｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０  ＩｇＧで前処理したとき、腫瘍接種前に１０ｕｇ／ｍＬアイソタイプＩｇＧによってインビトロで４日間前処理したＰａｎｃ１スフェアと比較して（従って最初の触知可能腫瘍の形成例から腫瘍取り込みが計測される）、（Ａ）Ｐａｎｃ１腫瘍の取り込み速度（％腫瘍担持動物）が低下することを示す。（Ｂ）Ｐａｎｃ１スフェアを接種前に１０ｕｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０  ＩｇＧで前処理すると、アイソタイプＩｇＧで前処理したＰａｎｃ１スフェア（１０ｕｇ／ｍＬ）と比較して有意な腫瘍成長の低下につながる。パネルＡについて、カプラン・マイヤー生存分析によって腫瘍取り込み時間の中央値を決定した。パネルＢについて、＊＊、及び＊は、二元配置ＡＮＯＶＡによって決定したときの、アイソタイプＩｇＧ処理腫瘍とＣＣＬ２０  ＩｇＧ処理腫瘍との間におけるそれぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。
【図１８】抗マウスＣＣＬ２０  ＩｇＧ（クローン１１４９０８）が、β−アレスチン活性によって計測されるＣＣＬ２０刺激ＣＣＲ６経路活性を中和することを示す。このアッセイは、１．２ｎＭのマウスＣＣＬ２０で刺激した、マウスＣＣＲ６を過剰発現するＣＨＯＫＩ細胞を使用して実施した。
【図１９−１】脾臓におけるゲーティング及び免疫細胞分析を示す代表的なフローサイトメトリー図を示す。細胞は、初めに汎白血球マーカーとしてのｃｄ４５に関してゲーティングした。次に、ｃｄ３染色によってＴ細胞を同定し、成熟及び未熟樹状細胞を分けるため全細胞又はｃｄ１１ｃ／ｃｄ８３についてｃｄ１１ｃによって樹状細胞を同定し、及びｃｄ１１ｂ／ｌｙ６ｇによって好中球／顆粒球骨髄由来抑制細胞（ｇＭＤＳＣ）を同定した。ｃｄ３＋  Ｔ細胞はｃｄ４及びｃｄ８染色に関して更にサブセットに分け、次にｃｄ４＋細胞をｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ又はｒｏｒｇｔ＋  Ｔｈ１７細胞に分けた。全てのゲートをＦＭＯ対照により決定し、全試料間で一定に保った。
【図１９−２】図１９−１の続き。
【図２０−１】腫瘍におけるゲーティング及び免疫細胞分析を示す代表的なフローサイトメトリー図を示す。細胞は、初めに汎白血球マーカーとしてのｃｄ４５に関してゲーティングした。次に、ｃｄ３染色によってＴ細胞を同定し、成熟及び未熟樹状細胞を分けるため全細胞又はｃｄ１１ｃ／ｃｄ８３についてｃｄ１１ｃによって樹状細胞を同定し、及びｃｄ１１ｂ／ｌｙ６ｇによって好中球／顆粒球骨髄由来抑制細胞（ｇＭＤＳＣ）を同定した。ｃｄ３＋  Ｔ細胞はｃｄ４及びｃｄ８染色に関して更にサブセットに分け、次にｃｄ４＋細胞をｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ又はｒｏｒｇｔ＋  Ｔｈ１７細胞に分けた。全てのゲートをＦＭＯ対照により決定し、全試料間で一定に保った。
【図２０−２】図２０−１の続き。
【図２１Ａ−２１Ｅ】１０ｍｇ／ｋｇの抗マウスＣＣＬ２０  ＩｇＧ又はアイソタイプ対照ＩｇＧを４用量にわたって週２回投与した４Ｔ１腫瘍担持マウスの脾臓における免疫細胞集団の頻度を示す。（Ａ）ｃｄ３＋ｃｄ４＋ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、（Ｂ）ｃｄ３＋ｃｄ４＋ｒｏｒγｔ＋Ｔｈ１７細胞、（Ｃ）ｃｄ１１ｂ＋全樹状細胞、（Ｄ）ｃｄ１１ｂ＋  ｃｄ８３−未熟樹状細胞、及び（Ｅ）ｃｄ１１ｂ＋  ｃｄ８３＋成熟樹状細胞。細胞頻度は全て、全白血球（ｃｄ４５＋細胞）に対する％として示す。ｎ＝５動物／群。統計的有意性は両側スチューデントｔ検定によって決定した。
【図２２Ａ−２２Ｅ】１０ｍｇ／ｋｇの抗マウスＣＣＬ２０  ＩｇＧ又はアイソタイプ対照ＩｇＧを４用量にわたって週２回投与した４Ｔ１腫瘍担持マウスの腫瘍における免疫細胞集団の頻度を示す。（Ａ）ｃｄ３＋  ｃｄ４＋  ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ細胞、（Ｂ）ｃｄ３＋  ｃｄ４＋  ｒｏｒγｔ＋  Ｔｈ１７細胞、（Ｃ）ｃｄ１１ｂ＋全樹状細胞、（Ｄ）ｃｄ１１ｂ＋  ｃｄ８３−未熟樹状細胞、及び（Ｅ）ｃｄ１１ｂ＋  ｃｄ８３＋成熟樹状細胞。細胞頻度は全て、全白血球（ｃｄ４５＋細胞）に対する％として示す。ｎ＝５動物／群。統計的有意性は両側スチューデントｔ検定によって決定した。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書に記載されるとおり、本発明者らは、ＣＣＬ２０がＣＳＣによって過剰発現し、機能上それに関連していることを初めて実証する説明を提供する。幾つかの癌においてＣＣＬ２０発現の可能性に言及している報告はあるが、ＣＣＬ２０の発現及び機能を同定し、それを任意のＣＳＣ表現型と関係付けた報告はなく、これが癌を治療し及びＣＳＣを阻害する新規の予期せぬ方法をもたらす。本明細書に開示される特定の態様及び非限定的な実施形態に示されるとおり、ＣＣＬ２０活性を標的化して阻害するこれらの新規方法は、ＣＳＣ表現型を有する細胞を含み及びそれを呈する癌に対して有用且つ有効である。一部の例示的実施形態において、本明細書に開示される方法及び薬剤は、例えば、膵癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、及び乳癌を含めた、ＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６を発現するＣＳＣを含む癌の標的化に用いることができる。従って、本開示は、癌に罹患している患者の様々な癌の阻害及び／又は治療並びにクオリティ・オブ・ライフの改善に用いることのできる、ＣＳＣを阻害する方法及び薬剤を含む新規標的化戦略を提供する。
【００３２】
本開示は、乳癌ＣＳＣに関する全ゲノムｍＲＮＡ解析の説明及び概説を含み、この解析により、意外にも、遺伝子ＣＣＬ２０の発現の変化がＣＳＣのエンリッチメント又は阻害と直接相関しているように思われることが同定された（ｖａｎ  Ｖｌｅｒｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２０（ＣＣＬ２０）はまた、一般に、マクロファージ炎症性タンパク質３−α（ＭＩＰ−３α）又は肝活性化調節ケモカイン（ＬＡＲＣ）とも称される（Ｓｃｈｕｔｙｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＣＣＬ２０は通常、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び未熟樹状細胞をリクルートする走化性因子として機能し、主に肝臓、肺、及び胃腸管の細胞によって産生される（Ｓｃｈｕｔｙｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）がＣＣＬ２０の受容体として同定されており（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、現在までのところ、これがＣＣＬ２０リガンドについて同定された未だ唯一の機能的受容体である。免疫細胞のリクルートにおけるその役割にも関わらず、幾つかの種類のエビデンスからは、癌におけるＣＣＬ２０の関連性が示唆されている。ある報告ではＣＣＬ２０が膵癌の病因に寄与する因子として同定されており、それによって著者らは、膵癌成長の刺激におけるＣＣＬ２０の直接の効果を結論付けた（Ｋｌｅｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。この初期の同定は膵癌に関連したが、最も多いエビデンスは、現在までのところ、ＣＣＬ２０発現を結腸直腸癌に関連付けるものである（Ｇｈａｄｊａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。実際、最近の研究では、高血清ＣＣＬ２０レベルが結腸直腸癌における予後不良のバイオマーカーとして提案された（Ｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。本発明者らは乳癌モデルでＣＣＬ２０を同定しており、これは、ＣＣＬ２０が乳癌細胞の遊走及び増殖に直接影響を及ぼし得ることを示す外的エビデンスによって裏付けられている（Ｍａｒｓｉｇｌｉａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。腫瘍細胞に対するＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸の直接的なオートクリン効果を示唆する報告もあるが、大多数の報告は、腫瘍細胞によるＣＣＬ２０過剰発現が免疫細胞のリクルートを促進する働きをすることを提案している。本開示はＣＳＣに対するＣＣＬ２０のオートクリン機能が関係しているとするが、本開示はまた、ＣＳＣによるＣＣＬ２０分泌が腫瘍免疫浸潤のリクルートを補助し得ることも提供する。例えば、エビデンスから、同様にＣＳＣによって産生されるＣＣＬ２０へと動員されるものと見られるＢ細胞及び樹状細胞に加えて、特にＴｒｅｇ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）及びＴｈ１７細胞（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）がＣＣＬ２０産生に応答して腫瘍浸潤を起こし易いことが示唆される。
【００３３】
本明細書に開示されるとおり、本発明者らはＣＳＣの成長及び活性におけるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２０（ＣＣＬ２０）の役割を明らかにし、これはＣＳＣ生物学にとって全く新規の知見である。本開示は、代表的な乳癌、膵癌、及び結腸直腸癌モデルのＣＳＣがＣＣＬ２０を過剰発現すること、及びひいてはＣＣＬ２０が、同様にＣＳＣで発現するその受容体ＣＣＲ６を介したシグナル伝達によってＣＳＣの自己複製及び増殖をドライブし得ることを実証する例示的な実施形態を提供する。モノクローナル抗体によってＣＣＬ２０を中和するとＣＳＣ阻害に有意な効果が及ぶことから、腫瘍のＣＳＣを減少させるためこのケモカインを標的化する療法の大きな可能性が裏付けられる。
【００３４】
本開示の更に詳細な説明を続ける前に、本開示が具体的な組成物又は方法工程に（それらが異なってもよいとおり）限定されないことが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象が含まれることに留意しなければならない。
【００３５】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが、本発明で用いられる用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【００３６】
用語「約」及び「近似的に」は、本発明との関連において、当業者が問題の特徴の技術的効果がなおも確保されると理解するであろう精度の幅を指す。この用語は、典型的には、指示される数値からの約±１０％、又は約±５％の偏差を包含する。
【００３７】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、好ましくは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７の数学的アルゴリズムを用いて達成される。かかるアルゴリズムは、例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトで利用可能なＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｐプログラムに組み込まれている。パーセント同一性の決定は、好ましくはＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｐプログラムの標準パラメータで実施される。
【００３８】
アミノ酸については、本明細書では、その一般に知られている三文字記号によるか、或いはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨する一文字記号によって言及され得る。ヌクレオチドも同様に、その一般に認められている一文字コードによって言及され得る。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、免疫グロブリンとしても知られる用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片で形成される多重特異性抗体（例えば、多重特異性抗体、例えば、国際公開第２００９０１８３８６号パンフレット、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４５２２９号明細書（全体として参照により本明細書に援用される））、ｂｉＭａｂ、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科動物抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、シングルドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物学的活性を呈する抗体断片（例えば抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、イントラボディ、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を包含する。詳細には、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、即ち、少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子が含まれる。抗体にはまた、Ｆｃドメインに融合したタンパク質など、抗体又はその一部分を有するペプチド融合物も含まれる。免疫グロブリン分子は任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ又はｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、又はｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、及びＫｍ（１、２又は３））であってもよい。抗体は、限定はされないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス等を含めた任意の哺乳動物、又はトリ（例えばニワトリ）などの他の動物に由来し得る。
【００４０】
用語「ケモカイン受容体ＣＣＲ６」又は「ＣＣＲ６受容体」、又は「ＣＣＲ６」及び「ケモカインリガンド２０」又は「ＣＣＬ２０」は、本明細書で使用されるとき、当該技術分野において公知の生体分子（核酸分子及びアミノ酸分子）を指す。当業者は、任意の配列データベース（例えばＮＣＢＩデータベース）から、ＣＣＲ６受容体及びＣＣＬ２０、並びにＣＣＲ６及びＣＣＬ２０の任意のオルソログ及びスプライス変異体アイソフォームのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を同定することが可能であろう。
【００４１】
一部の実施形態において用語「ＣＣＲ６受容体」又は「ＣＣＬ２０」は哺乳類ＣＣＲ６受容体及びＣＣＬ２０を指し、特定の実施形態ではヒトＣＣＲ６受容体及びヒトＣＣＬ２０を指す。上述のとおり、ヒトＣＣＲ６受容体の配列は、例えばＮＣＢＩデータベースなど、公開されている配列データベースから利用可能である（受託番号ＮＭ＿００４３６７．５（転写変異体１；配列番号１、配列番号２をコードする）又はＮＭ＿０３１４０９．３（転写変異体２；配列番号３、配列番号４をコードする）。同様に、ヒトＣＣＬ２０の配列が公的に利用可能である（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００４５９１．２（転写変異体１；配列番号５、配列番号６をコードする）又はＮＭ＿００１１３００４６．１（転写変異体２；配列番号７、配列番号８をコードする）。他のオルソログ及び変異体が当業者には公知であり、及び／又は同定可能であり得る。
【００４２】
ＣＣＲ６は、時にＣＤ１９６又はＣＤ１９６抗原とも称される。当該技術分野においては、ＣＣＲ６に幾つもの他の用語、例えば、ＣＣ−ＣＫＲ−６、Ｃ−Ｃ−ＣＫＲ−６、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６、ケモカイン（Ｃ−Ｃ）受容体６、Ｃ−Ｃケモカイン受容体６型、ＣＫＲＬ３、ＣＫＲ−Ｌ３、ケモカイン受容体様３、ＳＴＲＬ２２、ＣＭＫＢＲ６、Ｇタンパク質共役受容体２９、ＧＰＲ２９、７回膜貫通型受容体、リンパ球２２、ＧＰＲＣＹ４、ＧＰＲ−ＣＹ４、ＤＲＹ６、ＬＡＲＣ受容体、及びＢＮ−１が様々な頻度で用いられている。
【００４３】
同様に、ＣＣＬ２０、又はＣ−Ｃモチーフケモカイン２０は、マクロファージ炎症性タンパク質−３α（ＭＩＰ３α、ＭＩＰ３−アルファ、ＭＩＰ３Ａ、ＭＩＰ３ａ、ＭＩＰ−３ａ）、肝臓及び活性化調節ケモカイン（ＬＡＲＣ）、ＣＣケモカインＬＡＲＣ、ＳＣＹＡ２０、小さい誘導性サイトカインＡ２０、小さい誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）、メンバー２０、ＳＴ３８、ＣＫｂ４、βケモカインエクソダス−１、β−ケモカインエクソダス−１、又はエクソダス−１としても知られる。上述のとおり、ＣＣＬ２０は９ｋＤａのＣＣ型ケモカインであり、これは様々な組織（例えば、皮膚、腸粘膜、肝臓）のケラチノサイトが低レベルで構成的に発現する。ヒトケモカインネットワークには重複性があるが、ＣＣＬ２０は、その受容体ＣＣＲ６のユニークなケモカインリガンドである。ＣＣＬ２０発現は、ヒト結腸直腸腺癌、肺腺癌、膵腺癌及び乳腺癌、悪性神経膠腫、白血病、リンパ腫及び黒色腫を含め、種々のヒト新生物において記載されている。しかしながら、現在までのところ、及び本開示以前には、特に癌及び癌療法の文脈におけるＣＣＬ２０のインビボでの役割については確立されていない。
【００４４】
Ａ．方法
本開示は、ＣＣＬ２０の阻害薬又はＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせを取り入れた方法に関する幾つもの態様及び実施形態を提供する。本明細書で考察するとおり、これらの態様及び実施形態は、疾患の治療方法、予防方法、進行を阻害し及び／又は遅延させる方法、再燃及び／又は再燃リスクの低減方法；特定の細胞集団を標的化し及び／又は死滅させる方法；分化を誘導し及び／又はＣＳＣの自己複製能及び拡大能を低下させる方法；病期を判定することを含め、特定の細胞集団及び／又は疾患を検出し、診断し、及び／又は定量化する方法、及び疾患のモニタリング及び／又は予後判定方法を含めた、疾患に関する様々な方法を包含する。
【００４５】
実施形態において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、ＣＳＣの増殖を阻害し及び／又は生存を低下させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬にＣＳＣを接触させる工程を含む。実施形態において、本方法は、ＣＣＲ６に選択的なＣＣＲ６阻害薬の有効量を投与する工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、ＣＣＬ２０に選択的なＣＣＬ２０阻害薬の有効量を投与する工程を含む。一部の実施形態において、阻害薬は、ＣＣＲ６／ＣＣＬ２０生化学的カスケード又は軸を選択的に阻害する。用語「選択的」は、「阻害薬」又は「阻害する」に関連して使用されるとき、標的、例えばＣＣＲ６又はＣＣＬ２０に対する阻害活性が他の生体分子に対する阻害活性と比べて増加した化合物（例えば、本明細書に記載されるとおりの小分子又は生物学的分子）に関する。
【００４６】
実施形態において、本開示は、以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法に関し、この方法は、治療抵抗性癌に存在する癌幹細胞（ＣＳＣ）を阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣに分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含む。
【００４７】
更なる実施形態において、本開示は、以前療法を受けたことのある及び治療を必要としている対象の治療抵抗性癌を治療する方法に関し、この方法は、治療抵抗性癌を治療するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含む。
【００４８】
他の実施形態において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを標的化して阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣに分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を、治療を必要としている対象に投与する工程を含む。
【００４９】
他の実施形態において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を含む癌を治療する方法に関し、この方法は、癌を治療するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を、治療を必要としている対象に投与する工程を含む。
【００５０】
更なる実施形態において、本開示は、再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣに分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含む。
【００５１】
更なる実施形態において、本開示は、再発癌又は再燃癌を有する対象の癌を治療する方法に関し、この方法は、癌を治療するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含む。
【００５２】
本開示の他の実施形態は、癌の再発又は再燃を予防する方法に関し、この方法は、癌の再発又は再燃を予防するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を癌の再発又は再燃の予防を必要としている対象に投与する工程を含む。
【００５３】
更なる実施形態において、本開示は、癌を有する対象の癌の再燃リスクを低下させる方法に関し、この方法は、癌におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣに分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を対象に投与する工程を含み、それによって対象の癌の再燃リスクを低下させる。
【００５４】
実施形態において、本開示は、癌幹細胞（ＣＳＣ）を除去する方法に関し、この方法は、ＣＳＣを除去するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬にＣＳＣを接触させる工程を含む。
【００５５】
一部の実施形態において、本開示は、癌細胞集団中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の数を選択的に減少させる方法に関し、この方法は、癌細胞集団におけるＣＳＣを阻害し又は死滅させ及び／又はＣＳＣに分化を誘導するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬に癌細胞集団を接触させる工程を含む。従って、阻害薬は、ＣＳＣの更なる増殖を妨げるのに十分な量で治療を必要としている対象に投与してもよく、及び／又は幾つものＣＳＣに接触させてもよい。一部の実施形態において、阻害薬は、ＣＳＣ集団に細胞死（アポトーシス）を誘導することによりＣＳＣの数を減少させるのに有効な量で投与してもよい。更に他の実施形態において、阻害薬は、ＣＳＣ集団に細胞分化を誘導することによりＣＳＣの数を減少させるのに有効な量で投与してもよい。従って、一部の実施形態において、阻害薬は、必ずしもＣＳＣにアポトーシスを誘導しないこともある量であるが、ＣＳＣが対象又は腫瘍形成組織においてＣＳＣの分化を誘導することにより自己複製しＣＳＣ細胞集団を拡大する能力を低下させ又は調節解除するのに有効な量で提供される。阻害薬はまた、ＣＳＣニッチがもはやＣＳＣ及び／又は腫瘍組織再生を維持することができないようにＣＳＣ「ニッチ」を乱すのに有効な量で提供されてもよい。
【００５６】
一部の実施形態において、本開示は、腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法を提供し、この方法は、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬に腫瘍を接触させる工程を含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍成長を低下させ又は阻害する方法を提供し、この方法は、腫瘍成長を低下させ又は阻害するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を患者に投与する工程を含む。
【００５７】
更なる実施形態において、本開示は、腫瘍のサイズを低下させる方法を提供し、この方法は、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬に腫瘍を接触させる工程を含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍のサイズを低下させる方法に関し、この方法は、腫瘍サイズを低下させるのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を患者に投与する工程を含む。
【００５８】
一部の実施形態において、本開示は、腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防する方法を提供し、この方法は、腫瘍の侵襲性又は転移を予防し、低下させ、又は阻害するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬に腫瘍を接触させる工程を含む。関連する態様において、本開示は、患者の腫瘍の侵襲性又は転移を阻害し、低下させ、又は予防する方法を提供し、この方法は、腫瘍の侵襲性又は転移を予防し、低下させ、又は阻害するのに有効な量のＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を患者に投与する工程を含む。
【００５９】
本開示によって提供される実施形態において、本方法は、ＣＣＬ２０を発現する腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団に関する。一部の実施形態において、本方法は、ＣＣＲ６を発現する腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団に関する。一部の実施形態において、本方法は、ＣＣＲ６及びＣＣＬ２０を発現する腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団に関する。更なる実施形態において、腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団はスフェア形成ＣＳＣを含み得る。
【００６０】
上記の態様の様々な実施形態において、本方法は、対象を腫瘍疾患及び／又は癌疾患に関して治療することに関する。一部の実施形態において、癌は、消化器癌又は胃腸管癌（例えば、肛門癌；胆管癌；肝外胆管癌；虫垂癌；カルチノイド腫瘍、消化管癌；結腸癌；小児結腸直腸癌を含む結腸直腸癌；小児食道癌を含む食道癌；胆嚢癌；小児胃癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）（胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ））；成人（原発性）肝細胞癌及び小児肝細胞癌を含む肝細胞癌（例えば、肝細胞癌腫）；小児膵癌を含む膵癌；肉腫、横紋筋肉腫；膵島細胞膵癌；直腸癌；及び小腸癌）；肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ））；頭頸部癌（例えば、口唇・口腔癌；小児口腔癌を含む口腔癌；下咽頭癌；小児喉頭癌を含む喉頭癌；原発不明の頸部転移性扁平上皮癌；口腔癌；鼻腔・副鼻腔癌；小児鼻咽腔癌を含む鼻咽腔癌；中咽頭癌；副甲状腺癌；咽頭癌；小児唾液腺癌を含む唾液腺癌；咽喉癌；及び甲状腺癌）；卵巣癌及び乳癌から選択される。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物、特に哺乳動物を含むことが意図される。対象の例としては、ヒト対象、例えば障害、例えば癌などの本明細書に記載される障害を有するヒト患者、又は正常な対象が挙げられる。「非ヒト動物」には、全ての脊椎動物、例えば、非哺乳動物（ニワトリ、両生類、爬虫類など）及び哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、家畜化された及び／又は農業に有用な動物（ヒツジ、イヌ、ネコ、雌ウシ、ブタ等）、及びげっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）が含まれる。詳細な実施形態において、対象はヒト患者である。
【００６２】
「治療」又は「治療する」は、療法的治療及び予防的若しくは防御的手段の両方を指す。治療を必要としている対象には、既に障害を有する対象並びに障害に罹り易い対象又は障害を予防すべき対象が含まれる。従って、疾患又は治療を必要としている対象に関連して使用されるとき、これらの用語には、限定はされないが、未治療の対象と比較したときの疾患の進行の停止又は遅延、疾患の寛解、症状の予防、疾患及び／又は症状の重症度の低減、又は疾患の長さの短縮が含まれる。実施形態において、本治療方法は治療下の特定の疾患の１つ以上の臨床徴候を抑えることができる。ＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６を発現するＣＳＣ、並びに活性化ＣＣＲ６／ＣＣＬ２０カスケード又は軸を有するＣＳＣに関連する疾患又は病態の治療方法に関する特定の実施形態は、ＣＣＲ６、ＣＣＬ２０、又はＣＣＲ６とＣＣＬ２０との両方を阻害する化合物、並びにその医薬組成物の治療有効量の投与を含む。実施形態において、本治療方法は、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０を発現するＣＳＣに関連する癌及びＣＳＣに関連する疾患及び／又は症状の更なる進行を防ぎ、疾患を消失させ、疾患及び／又は症状の更なる進行を遅延させ又は低減し、又は疾患及び／又は臨床症状を好転させる任意の方法に関し得る。
【００６３】
一部の実施形態において、本方法は、癌の進行を阻止し又は遅延させるのに十分な治療有効量の薬剤を含み得る。更なる実施形態において、治療有効量とは、対象のＣＳＣを含めた癌細胞の数を減少させる（例えば、癌細胞を死滅させ、及び／又は癌細胞の増殖を阻害し、及び／又はＣＳＣの分化を誘導する）のに十分な量である。対象の癌細胞の増殖及び癌の進行（例えば、腫瘍サイズ、細胞数、生化学的マーカー、二次徴候等）をモニタする方法は本明細書で考察され、当該技術分野において一般に公知の技法もまた含み得る。
【００６４】
本明細書で考察するとおり、一部の実施形態は、放射線照射、外科手術、免疫療法、又は他の化学療法と併せて阻害薬を投与する工程を含む治療方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用したＣＣＬ２０の阻害薬の治療有効量の投与を含む。他の実施形態において、本方法は、追加の抗癌剤と併用したＣＣＲ６の阻害薬の治療有効量の投与を含む。多種多様な抗癌剤（即ち抗新生物剤）が当該技術分野において公知であり、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗薬、天然抗新生物剤、ホルモン性抗新生物剤、血管新生阻害薬、分化誘導試薬、ＲＮＡ阻害薬、抗体又は免疫療法剤、遺伝子療法剤、小分子酵素阻害薬、生物学的反応修飾物質、微小管阻害薬、ＤＮＡ損傷応答阻害薬、抗転移剤及び他の化学療法剤が挙げられる。
【００６５】
「投与」又は「投与する」は、本明細書で使用されるとき、所望の効果を実現するため任意の適切な経路によって１つ又は複数の化合物を供給し、接触させ、及び／又は送達することを指す。投与には、限定はされないが、経口、舌下、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内又は脳内注射）、経皮、局所、頬側、直腸、腟内、経鼻、眼内、吸入を介する、及びインプラントが含まれ得る。
【００６６】
「共投与される」は、本明細書で使用されるとき、複数の化合物又は薬剤の同時の又は逐次的な投与を指す。第１の化合物又は薬剤が第２の化合物又は薬剤の投与の前に、それと同時に、又はその後に投与されてもよい。第１の化合物又は薬剤と第２の化合物又は薬剤とは、同じ日に同時に又は逐次的に投与されてもよく、又は互いに１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間又は１ヵ月以内に逐次的に投与されてもよい。好適には、化合物又は薬剤は、それらの化合物又は薬剤の各々が少なくとも何らかの生理学的効果を及ぼしている間及び／又は有効性を保ったままである間に共投与される。
【００６７】
「接触させる」は、「細胞を接触させる」のように本明細書で使用されるとき、細胞をインビトロ、エキソビボ、又はインビボ（即ち、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、及びイヌを含めた哺乳類などの対象の体内）で直接又は間接的に接触させることを指す。細胞を接触させること（これにはまた、阻害薬化合物と細胞を「反応させる」こと又はそれに細胞を「曝露する」ことも含まれ得る）は、化合物又は薬剤を対象に一般的に投与する結果又は細胞若しくは組織が入った容器又は細胞若しくは組織が入った流体に阻害薬を添加又は適用する結果として起こり得る。従って、細胞を阻害薬に接触させるとは、細胞（例えば、対象の局所領域又は全身（例えば、リンパ、循環等）にあるＣＳＣ細胞）を含む対象、組織、又は対象若しくは組織の領域への阻害薬の投与を指してもよく、標的細胞に物理的に接触しないこともあり得る。接触には、細胞、組織、哺乳類、対象、患者、又はヒトへの投与が包含される。更に、細胞を接触されることには、細胞培養物に薬剤を加えることが含まれる。他の好適な方法としては、本明細書で考察するとおりの又はその他当該技術分野において公知の適切な手順及び投与経路を用いて細胞、組織、哺乳類、対象、又は患者に薬剤を導入又は投与することが含まれ得る。
【００６８】
本開示はまた、治療用組成物及び医薬組成物を含めた、組成物におけるＣＣＬ２０の阻害薬及び／又はＣＣＲ６の阻害薬、又はこれらの組み合わせの１つ以上の使用にも関する。実施形態において、本使用及び組成物は、本明細書に開示される様々な方法を提供するのに有効な量の１つ又は複数の阻害薬を含む。実施形態において、この１つ以上の使用は、本明細書に記載される腫瘍型、癌幹細胞、及び／又は癌の１つ以上を治療する（例えば、死滅させ、除去し、阻害し、細胞増殖の進行及び／又は進行速度を低下させ細胞（ＣＳＣ）の自己複製能及び／又は拡大能を低下させ、病状の進行及び／又は進行速度を低下させる）ための医薬の製造への使用に関する。
【００６９】
検出方法
一部の態様及び実施形態において、本明細書に開示される方法は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の検出、同定、及び／又は定量化に有用な１つ以上の方法を提供し、及び／又はそれを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＣＳＣを含む生体試料中のＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６を検出し、同定し、及び／又はその量を定量化する工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、癌細胞を含む試料中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在の診断、予測、定量化、同定、及び／又は検出を提供し、本方法は、
ＣＣＬ２０核酸配列又はＣＣＬ２０アミノ酸配列に結合する薬剤に試料を接触させる工程；
薬剤とＣＣＬ２０核酸配列又はＣＣＬ２０アミノ酸配列との間の結合の存在又は非存在を検出する工程；及び／又は
薬剤とＣＣＬ２０核酸配列又はＣＣＬ２０アミノ酸配列との間の結合の検出に基づき試料中のＣＳＣの存在を同定する工程、
のうちの１つ以上を含み得る。
【００７０】
一部の実施形態において、本方法は、癌細胞を含む試料中の癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在の診断、予測、定量化、同定、及び／又は検出を提供し、本方法は、
ＣＣＲ６核酸配列又はＣＣＲ６アミノ酸配列に結合する薬剤に試料を接触させる工程；
薬剤とＣＣＲ６核酸配列又はＣＣＲ６アミノ酸配列との間の結合の存在又は非存在を検出する工程；及び／又は
薬剤とＣＣＲ６核酸配列又はＣＣＲ６アミノ酸配列との間の結合の検出に基づき試料中のＣＳＣの存在を同定する工程、
のうちの１つ以上を含み得る。
【００７１】
これらの方法において、工程は単独で用いられても、又は任意の一連の互いの又は当該技術分野において一般に公知の他の技法との組み合わせで用いられてもよい。この態様の一部の実施形態において、本方法は、
試料中のＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６核酸配列又はＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６アミノ酸配列の量を定量化する工程；
ＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６核酸配列又はＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６アミノ酸配列の量をＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６核酸又はＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６アミノ酸の基準レベルと比較する工程；及び／又は
検出された量が基準レベルよりも多い場合に試料中のＣＳＣの存在を同定する工程、
のうちの１つ以上を更に含み得る。
【００７２】
更に別の実施形態において、本方法は、検出可能部分を含む薬剤を含み得る。一部の実施形態において、この薬剤は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６核酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、この薬剤は、ＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６アミノ酸配列の少なくとも一部分に特異的に結合する抗体を含み得る。
【００７３】
上記の態様の様々な実施形態において、本方法は、ＣＣＬ２０を発現する腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団に関する。上記の態様の一部の実施形態において、本方法は、ＣＣＲ６を発現する腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団に関する。更なる実施形態において、腫瘍及び／又はＣＳＣ、又はＣＳＣ集団は、スフェア形成ＣＳＣを含み得る。
【００７４】
試料中のＣＳＣの検出、同定、及び／又は定量化に有用な本明細書に記載される方法に加えて、これらの態様及び実施形態はまた、当業者に利用可能な任意の方法及び技法も含み得る。非限定的な例として、ＣＳＣは、特定のＣＳＣで発現するか、又はそれに特異的な細胞表面マーカーに基づくフローサイトメトリー；色素排除法によるサイドポピュレーション（ＳＰ）表現型の検出（例えば、Ｍｏｓｅｒｌｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００８）６８；５６５８−５６６８に開示されるとおり、ヘキスト３３３４２）；無血清培地中の浮遊スフェアとしての成長／増殖能力（例えば、本明細書並びにＲｙｂａｃｋ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２０１１）１８１３；６８３−６９４に開示される）；及び例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性などの特定の酵素活性の決定、並びにポリコームヘテロクロマチンマーカー、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベル、及びｚｅｓｔｅ  ２のポリコーム群タンパク質エンハンサー（ＥＺＨ２）を含めたポリコームマーカーレベルを含む技法を用いて同定、検出、及び単離されてもよい。
【００７５】
一部の実施形態において、例えば、様々な系統（例えば、造血、乳腺、内皮、間葉、神経）の癌前駆細胞においてアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）の発現及び活性の上昇が報告されており、本明細書における様々な態様及び実施形態に関連して技法及び市販のキット（例えば、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し得る。同様に、現在、ＣＳＣの同定用にユニバーサルに発現する細胞表面マーカーはないが、複数の表面マーカーが、例えば、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ３２６を含め、ＣＳＣ及び関連する腫瘍型に関連付けられている（例えば、Ｘｉａ，Ｐ．，Ｃｕｒｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．（２０１４）Ｍａｒ；９（２）：１０２−１１；Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．，（２０１４）６１（５）：４８１−９０；Ｔｉｒｉｎｏ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，（２０１３）Ｊａｎ；２７（１）：１３−２４を参照のこと）。
【００７６】
一部の実施形態において、試料中のＣＳＣを検出又は同定する１つ以上のユニバーサルな表面マーカーがないため、検出、同定、及び／又は定量化する方法は、本明細書に開示されるような又はその他当該技術分野において公知のスフェア培養及び成長アッセイを含む細胞培養技法を含む。
【００７７】
Ｂ．阻害薬
本明細書に記載される方法、使用、及び組成物は、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０の活性及び／又は発現を阻害し、下方制御し、又は消失させる能力を有する薬剤、又は１つ以上のかかる阻害薬剤の任意の組み合わせに関連する実施形態を含む。その薬剤が阻害機能を有する（例えば、ＣＣＲ６、ＣＣＬ２０、又はＣＣＲ６とＣＣＬ２０との両方の発現及び／又は活性を阻害する）限り、阻害薬剤は任意の化合物クラスから選択することができる。例えば、阻害薬は、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０を阻害するポリペプチド、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０を阻害する小分子、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０を阻害するポリヌクレオチド、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０を阻害するアプタマー、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０を阻害する抗体、又はＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０を阻害するアンチセンス分子又はｓｉＲＮＡ分子からなる群から選択され得る。従って、阻害薬とは、本明細書で使用されるとき、関連性のある分子（例えば、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０）の発現及び／又は機能を低下させ、阻害し、下方制御し、又は消失させる任意の化合物、又は分子の発現又は機能を中和し、低下させ、又は阻害するのに好適な薬剤を指す。本明細書に記載される阻害薬は、例えばＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０への結合を含め、任意の機構によって作用を及ぼし得る。結合すると、阻害薬は例えばＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０と受容体又はリガンドの相互作用を阻害し得るため、ＣＣＲ６又はＣＣＬ２０が受容体を活性化させることができなくなり、又はリガンドによって活性化されることができなくなる。他の実施形態において、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０の活性の阻害能を有する１つ又は複数の薬剤は走化活性を阻害してもよく、タンパク質を封鎖してバイオアベイラビリティを低下させてもよく、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００７８】
一部の実施形態において、阻害薬は、ＣＣＲ６又はＣＣＬ２０、又は両方への結合能を有するポリペプチド又は小分子であってもよく、当該技術分野においてルーチンの任意の技法（例えば、小規模化合物又はポリペプチドライブラリのスクリーニング）によって同定され得る。「小分子」は、本明細書で使用されるとき、概して、低分子量の小さい有機化合物を指す。小分子は、天然に存在することが知られていない合成化合物であっても、又は例えば細胞、植物、真菌、動物などの天然の供給源から単離された、若しくはそれに存在することが知られている天然に存在する化合物であってもよい。一部の実施形態において、小分子は分子量が５０００ダルトン未満、４０００ダルトン未満、３０００ダルトン未満、２０００ダルトン未満、１０００ダルトン未満、又は約８００ダルトン未満であり得る。かかる実施形態において、小分子は典型的には分子量が約１００ダルトンより大きい。
【００７９】
小分子又はポリペプチドがＣＣＲ６又はＣＣＬ２０との結合能を有するかどうかは、任意のルーチンの技法又はアッセイ、並びに本明細書に記載される技法及びアッセイによって決定し得る。例えば、技法には、酵母２ハイブリッドアッセイ又は生化学アッセイ、例えば、プルダウンアッセイ、免疫共沈降アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、定量的放射性リガンド結合アッセイ、プラズモン共鳴アッセイ又は当該技術分野においてルーチンで用いられる任意の他の方法などが含まれ得る。典型的には、プルダウン又はプラズモン共鳴アッセイを用いる場合、タンパク質のうちの少なくとも１つをアフィニティータグ、例えば、ＨＩＳタグ、ＧＳＴタグ又は当該技術分野で一般的に用いられる他の検出可能部分に融合するか又は他の方法で連結させることが有用である。試験するポリペプチド又は任意の他の化合物がＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０の活性の阻害能を有するかどうかは、膜結合型ポリペプチドの活性を計測することにより決定し得る。好適には、ポリペプチドはＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０の活性の阻害能を有する。
【００８０】
実施形態において、阻害薬は、ＣＣＲ６又はＣＣＬ２０に対して特異性を有するＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドアプタマーを指す「アプタマー」であってもよい。ポリヌクレオチドアプタマーは約１０〜約３００ヌクレオチド長の範囲に含まれる。典型的には、アプタマーは約３０〜約１００ヌクレオチド長の範囲であり、一部の実施形態では約１０〜６０ヌクレオチド長の範囲であり得る。アプタマーは、合成、組換え、及び精製方法を含め、任意の公知の方法によって調製することができ、単独で、又はＣＣＲ６若しくはＣＣＬ２０に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用し得る。
【００８１】
一部の実施形態において、阻害薬は、ＣＣＲ６又はＣＣＬ２０に特異的に結合する抗体であってもよい。一部の実施形態において、抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、又は多特異性抗血清であってもよい。かかる実施形態において、抗体にはまた、例えば、一本鎖抗体、ダイアボディ、ミニボディ、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃ（Ｆｖ））、ｓｃ（Ｆｖ）２抗体、Ｆａｂ断片、又はＦ（ａｂ’）２断片など、抗体変異体又は断片も（その変異体又は断片が標的（例えばＣＣＲ６又はＣＣＬ２０）に対する特異的結合特性を維持している限り）含まれる。
【００８２】
他の実施形態において、阻害薬は、ＣＣＲ６  ｍＲＮＡ、又はＣＣＬ２０  ｍＲＮＡ、又は両方の少なくとも一部分に相補的なポリヌクレオチドを含むアンチセンス分子であってもよい。一部の実施形態において、このアンチセンス分子は、細胞のｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法における使用に好適である。アンチセンス分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡとの両方、並びに化学的に修飾された核酸が含まれ得る。更に、一部の実施形態においてアンチセンス分子は一本鎖又は二本鎖であってもよい。アンチセンス分子は約１０〜約５００ヌクレオチドを含むことができ、一部の実施形態では、例えば、約１１〜約２００ヌクレオチド、約１２〜約１００ヌクレオチド、約１３〜約７５ヌクレオチド、約１４〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約４０ヌクレオチド、約１６〜約３０ヌクレオチド、又は約１７〜約２５ヌクレオチドの範囲の、任意の長さを有し得る。当業者は、これらの範囲が例示的実施形態を表すことを理解するであろう。
【００８３】
一部の実施形態において、阻害薬は、ＣＣＲ６又はＣＣＬ２０、又はＣＣＲ６とＣＣＬ２０との両方の発現を低下させ又は阻害するｓｉＲＮＡ分子を含み得る。ｓｉＲＮＡ分子は、一部の実施形態では、ＣＣＲ６  ｍＲＮＡ、ＣＣＬ２０  ｍＲＮＡ、又は両方にハイブリダイズ可能な配列を含み、且つタンパク質の発現を低下させ又は阻害するＲＮＡ干渉又は別のアンチセンス機構を誘導する一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり得る。ｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を誘導してＣＣＲ６タンパク質又はＣＣＬ２０タンパク質の発現の低下又は阻害を生じさせることを可能にする任意の配列であってよい。ｓｉＲＮＡ分子は、一部の実施形態では、１０〜１００、１２〜８０、１４〜６０、１６〜５０、１７〜４０の長さを有し得る。好適にはｓｉＲＮＡは、１８〜３０ヌクレオチド、特定の実施形態では約１８〜約２６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００８４】
阻害性核酸分子を含む実施形態において、かかる阻害薬はストリンジェントな結合条件下で標的ＣＣＲ６又はＣＣＬ２０核酸配列に結合することができる。用語「ストリンジェントな条件」、「ストリンジェントな結合条件」、又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドが他の配列よりも検出可能に高い程度で（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）標的配列にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件の一つの非限定的な例としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ中６０℃〜６５℃での洗浄が行われるものが挙げられる。
【００８５】
ＣＣＲ６又はＣＣＬ２０のポリヌクレオチド配列を所与とすれば、当該技術分野の標準的な技法を用いて阻害性核酸分子を、モチーフを使用して設計し、阻害活性に有効であると予想し得る領域に標的化させることができる。
【００８６】
それに代えて又は加えて、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０の活性を決定するのに適した、且つ当業者に利用可能な任意の更なる方法が用いられ得る。本明細書に記載される様々な態様及び実施形態において有用な阻害薬は、対照と比較したときＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０の活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％阻害し得る。詳細な実施形態において、阻害薬は、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０の活性を少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７０％阻害するのに有効である。他の実施形態において、阻害薬は、ＣＣＲ６及び／又はＣＣＬ２０の活性を少なくとも８５％〜約１００％、少なくとも９０％〜約１００％、少なくとも９５％〜約１００％、又は約１００％阻害し得る。
【００８７】
実施形態において、阻害薬は、腫瘍疾患及び／又は癌の治療又は予防に好適な１つ以上の更なる活性薬剤を含む組成物中に組み合わせてもよい。かかる活性化合物の一部の非限定的な例としては、当該技術分野において一般に公知の化学療法剤、例えば、テモゾロミド、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソイド類（例えば、パクリタキセル）、トキソテール（ｔｏｘｏｔｅｒｅ）、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、メルファラン及び腫瘍に対するホルモン作用を調節し又は阻害するように作用するタモキシフェン及びオナプリストンなどの他の関連するナイトロジェンマスタード及びホルモン剤が挙げられる。
【００８８】
Ｃ．医薬組成物及び製剤
一部の態様において、本開示は医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、ＣＣＬ２０の阻害薬、ＣＣＲ６の阻害薬、ＣＣＬ２０及びＣＣＲ６の阻害薬の組み合わせ、又はこれらの任意の他の組み合わせを含む組成物であってもよい。かかる医薬組成物はまた、薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物であってもよい。特定の態様において、本開示の医薬組成物は医薬として用いられる。
【００８９】
特定の態様において、本明細書に開示される阻害薬は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と共に医薬組成物として製剤化され得る。特定の態様において、かかる医薬組成物は、当該技術分野において公知の方法を用いた任意の１つ以上の投与経路によるヒト又は非ヒト動物への投与に好適である。当業者は理解するであろうとおり、投与の経路及び／又は方法は所望される結果に応じて異なり得る。用語「薬学的に許容可能な担体」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない１つ以上の非毒性物質を意味する。かかる製剤は、ルーチンで、塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、及び任意選択で他の治療剤を含有し得る。かかる薬学的に許容可能な製剤はまた、ヒトへの投与に好適な適合性のある固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入物質も含有し得る。本明細書に記載される製剤に利用し得る他の企図される担体、賦形剤、及び／又は添加剤としては、例えば、香味剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、脂質、タンパク質賦形剤、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン、塩形成対イオン、例えばナトリウムなどが挙げられる。本明細書に記載される製剤での使用に好適なこれらの及び更なる公知の医薬担体、賦形剤及び／又は添加剤は当該技術分野において公知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２１ｓｔｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）、及び“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，６０ｔｈｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（２００５）に列挙されるとおりである。薬学的に許容可能な担体は、所望の又は必要な投与方法、溶解度及び／又は安定性に好適なものを選択することができる。
【００９０】
一態様において、本開示の製剤は、エンドトキシン類及び／又は関連する発熱物質を実質的に含まないパイロジェンフリー製剤である。エンドトキシン類には、微生物の内部に閉じ込められた、且つ微生物が破壊されるか又は死んだときにのみ放出される毒素が含まれる。発熱物質にはまた、細菌及び他の微生物の外膜に由来する発熱誘発性の熱安定性物質（糖タンパク質類）も含まれる。これらの物質のいずれも、ヒトに投与された場合には発熱、低血圧及びショックを引き起こし得る。潜在的な有害作用ゆえに、低量のエンドトキシンであっても、静脈内投与される医薬品薬物溶液からは取り除かなければならない。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物適用について単回１時間の間に体重１キログラムにつき１用量当たり５エンドトキシン単位（ＥＵ）の上限を設定している（米国薬局方コンベンション（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）、薬局方フォーラム（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ）２６（１）：２２３（２０００））。特定の具体的な態様において、組成物中のエンドトキシン及び発熱物質レベルは１０ＥＵ／ｍｇ未満、又は５ＥＵ／ｍｇ未満、又は１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【００９１】
生体内投与に用いられる場合、本開示の製剤は無菌でなければならない。本開示の製剤は、滅菌ろ過、放射線照射等を含め、様々な滅菌方法によって滅菌され得る。一態様において、製剤は予め滅菌された０．２２ミクロンフィルタでろ過滅菌される。注射用の無菌組成物は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２１ｓｔｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）に記載されるとおりの従来の薬学実践に従い製剤化することができる。
【００９２】
この態様の実施形態において、治療組成物は、経口、経鼻、肺内、局所（頬側及び舌下を含む）、直腸、腟内及び／又は非経口投与など、詳細な投与経路用に製剤化することができる。語句「非経口投与」及び「非経口的に投与される」は、本明細書で使用されるとき、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与方法を指し、限定なしに、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。局所又は経皮投与に好適な本開示の製剤には、散剤、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。阻害薬及び他の活性分は薬学的に許容可能な担体と、及び必要となり得る任意の保存剤、緩衝剤、又は噴射剤と無菌条件下で混合され得る（例えば、米国特許第７，３７８，１１０号明細書；同第７，２５８，８７３号明細書；同第７，１３５，１８０号明細書；米国特許出願公開第２００４−００４２９７２号明細書；及び同第２００４−００４２９７１号明細書を参照のこと）。
【００９３】
製剤は、好都合には単位投薬量形態に調製されてもよく、薬学の技術分野において公知の任意の方法により調製され得る。本開示の医薬組成物中における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって有毒でない、特定の患者、組成物、及び投与方法に所望される治療応答を実現するのに有効な活性成分の量（例えば「治療有効量」）が達成されるように様々であり得る。選択される投薬量レベルは、用いられる詳細な組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる詳細な化合物の排泄速度、治療継続期間、用いられる詳細な組成物と併用して用いられる他の薬物、化合物及び／又は物質、治療下の患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康及び前病歴、及び医学分野で周知の同様の要因を含め、種々の薬物動態学的要因に依存し得る。これらの投薬量は、投薬量、投与方法、治療する１つ又は複数の障害又は症状、及び個々の対象の特性に応じて毎日、毎週、隔週、毎月、又はそれより少ない頻度で、例えば半年毎に投与され得る。投薬量はまた、持続注入によって（ポンプを用いるなどして）投与することもできる。投与される用量はまた、投与経路にも依存し得る。例えば、皮下投与には静脈内投与よりも高い投薬量が必要であり得る。上述のとおり、任意の一般的に用いられている投与レジメン（例えば、注射又は注入によって毎日又は週２回投与される１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を適合させてもよく、ヒト癌患者の治療に関する方法において好適であり得る。
【００９４】
本開示は、同様に、診断及び研究用途に好適な製剤もまた作製し得ることも企図する。かかる製剤中の活性薬剤の濃度並びに賦形剤及び／又は発熱物質の存在又は非存在は、詳細な適用及び使用目的に基づき選択することができる。
【００９５】
Ｄ．キット
本開示の別の態様は、キットに関する。一態様において、キットは、上記に記載したとおりの阻害薬、試薬、組成物、又は医薬組成物のいずれか、及び適切な使用又は投与を指示する説明書又はラベルを含む。任意選択で、キットはまた、１つ以上の容器及び／又はシリンジ又は送達若しくは使用を促進する他の装置も含み得る。本開示は、研究アッセイ、診断アッセイを実行するための、及び／又は治療有効量を投与するための構成要素の全部又は任意の一部がキットに封入され得ることを企図する。同様に、キットは、例えばコンジュゲートの形成に好適な条件下で本開示の阻害薬と治療用又は診断用部分との間に共有結合を形成することによる、コンジュゲートの作製に関する説明書を含み得る。更なる例として、本開示の治療法に用いられるキットは、ＣＣＬ２０又は／及びＣＣＲ６の１つ又は複数の阻害薬の医薬製剤を含有する溶液、又は１つ以上の阻害薬の凍結乾燥製剤、及びそれを必要としている患者への組成物の投与及び／又は凍結乾燥製品の再構成に関する説明書を含み得る。
【００９６】
本開示はまた、包装されラベルが付された完成品の医薬製品も包含する。この製品は、適切なベッセル又は容器、例えばガラスバイアル又はハーメチックに密閉される他の容器内にある適切な単位投薬形態を含む。非経口投与に好適な投薬形態の場合、活性成分は無菌であり、且つ粒子状物質不含溶液として投与に好適である。特定の態様において、製剤はヒト又は動物への静脈内注入など、静脈内投与に好適である。
【００９７】
ある具体的な態様において、本開示の製剤は単回投与バイアルに滅菌液として製剤化される。例示的容器としては、限定はされないが、バイアル、ボトル、プレフィルドシリンジ、ＩＶバッグ、ブリスターパック（１つ以上の丸薬を含む）が挙げられる。任意選択で、かかる容器には、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する行政当局によって規定された形式の通知を関連付けることができ、この通知は、ヒトの診断及び／又は投与に関する製造、使用又は販売の当局による認可を反映するものである。
【００９８】
任意の医薬製品と同様に、包装材料及び容器は、保管及び輸送中の製品の安定性を保護するように設計される。更に、本開示の製品は、使用説明書又はその他の、問題の疾患又は障害を適切に予防又は治療する方法を医師、技師又は患者に助言する情報資料を含む。換言すれば、本製品は、限定はされないが、実際の用量、モニタリング手順等を含む投与レジメン、及び他のモニタリング情報を指示又は提案する説明手段を含む。
【００９９】
診断アッセイ用のキットは、本明細書に開示されるとおりのＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６の阻害薬を含有する溶液、又はそれに代えて又は加えて、ＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６の存在の検出用試薬を含み得る。当該技術分野において公知の及び本明細書に記載される方法により、限定はされないが、小分子蛍光タグなどの標識、ビオチン、ＧＦＰ又は他の蛍光タンパク質などのタンパク質、又はｈｉｓ又はｍｙｃなどのエピトープ配列を含め、様々な試薬を標識し得る。同様に、ＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６の検出に使用する一次抗体がキットに含まれてもよい。一次抗体は、ＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６上の配列に対するものか、又はＣＣＬ２０及び／又はＣＣＲ６を標識し得る標識、タグ、又はエピトープに対するものであり得る。次には一次抗体が検出用に標識されてもよく、又はシグナルの更なる増幅が望ましい場合には、同様にキットに含まれてもよい二次抗体によって一次抗体が検出されてもよい。
【０１００】
研究用途のキットもまた企図される。かかるキットは、例えば、診断又は治療用途が意図されるキットに類似しているが、キット及びその使用が研究目的にのみ制限されることを明記するラベルを更に含む。
【０１０１】
標識、コンジュゲート及び部分
本開示は、診断及び他のアッセイのため標識にコンジュゲートされ得る試薬を含む方法、組成物、及びキットに関し、ここで１つ以上の標的分子は、かかる１つ又は複数の標識された試薬によって結合及び検出され得る。標識としては、限定なしに、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素及び放射性同位元素が挙げられる。
【０１０２】
特定の態様において、試薬はフルオロフォアにコンジュゲートされる。１つ又は複数の試薬に付加されるフルオロフォアの選択により、コンジュゲートされた分子の吸収及び蛍光発光特性が決まることになる。使用し得るフルオロフォア標識の物理的特性としては、限定はされないが、スペクトル特性（吸収、発光及びストークスシフト）、蛍光強度、寿命、分極及び光退色速度、又はこれらの組み合わせが挙げられる。これらの物理的特性は全て、あるフルオロフォアを別のフルオロフォアと区別するのに用いることができ、それによって多重化分析が可能となる。蛍光標識の他の好適な特性としては、例えば１つ又は複数の標的の標識が細胞又は生物（例えば、生きている動物）で実施される場合に、細胞透過性及び低毒性を挙げることができる。
【０１０３】
特定の態様において、酵素が標識であり、試薬にコンジュゲートされる。酵素は、検出可能シグナルの増幅を達成してアッセイ感度の増加をもたらすことができるため、好適な標識であり得る。酵素それ自体は検出可能な反応を生じないが、それに適切な基質が接触したときに基質を分解する働きをし、変換された基質が蛍光、比色又は発光シグナルを生じることになる。標識試薬上の１つの酵素が複数の基質の検出可能シグナルへの変換をもたらすことができるため、酵素は検出可能シグナルを増幅する。酵素基質は、好ましい計測可能な産物、例えば比色、蛍光又は化学発光が得られるように選択される。かかる基質は当該技術分野において広範に用いられており、当業者に周知であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのオキシドレダクターゼと３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）などの基質；酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼなどのホスファターゼ酵素と５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）などの基質；β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−グルコシダーゼなどのグリコシダーゼと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）などの基質が挙げられ；更なる酵素としては、それに対する好適な基質が公知のコリンエステラーゼ及びペプチダーゼなどのヒドロラーゼ、グルコースオキシダーゼ及びシトクロムオキシダーゼなどのオキシダーゼ、及びレダクターゼが挙げられる。
【０１０４】
一部のアッセイには、化学発光を生じる酵素及びそれらの適切な基質が好適である。それらとしては、限定はされないが、天然及び組換え形態のルシフェラーゼ及びエクオリンが挙げられる。安定ジオキセタン、ルミノール、イソルミノール及びアクリジニウムエステル類を含有するものなど、ホスファターゼ、グリコシダーゼ及びオキシダーゼに対する化学発光生成基質が更に有用である。
【０１０５】
別の態様において、ビオチンなどのハプテンもまた標識として利用される。ビオチンは、酵素系で検出可能シグナルを更に増幅する働きをすることができ、且つ単離目的のアフィニティークロマトグラフィーに使用されるタグとして働くことができるため、有用である。検出目的では、アビジン−ＨＲＰなど、ビオチンに親和性を有する酵素コンジュゲートが使用される。続いてペルオキシダーゼ基質を加えると、検出可能シグナルが生成される。
【０１０６】
ハプテンにはまた、ホルモン、天然に存在する及び合成の薬物、汚染物質、アレルゲン、作用分子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学的中間体、ヌクレオチドなども含まれる。
【０１０７】
特定の態様において、蛍光タンパク質が標識として１つ又は複数の試薬にコンジュゲートされてもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフィコビリタンパク質及びこれらの誘導体が挙げられる。蛍光タンパク質、特にフィコビリタンパク質は、タンデム色素で標識された標識試薬を作成するのに特に有用である。これらのタンデム色素には、より大きいストークスシフトを達成するための蛍光タンパク質及びフルオロフォアが含まれ、ここでは発光スペクトルが蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長から更にシフトする。
【０１０８】
特定の態様において、標識は放射性同位元素である。好適な放射性物質の例としては、限定はされないが、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３５Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３ＳＭ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ，１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ及び９７Ｒｕが挙げられる。
【０１０９】
一部の態様において、薬物又は毒素が１つ又は複数の試薬にコンジュゲートされる。例えば、試薬が細胞傷害性薬物にコンジュゲートされてもよい。この例では、試薬は、例えばＣＣＲ６などの細胞表面上の標的抗原、又はＣＣＲ６とＣＣＬ２０との間の複合体に結合してもよく、次には細胞に細胞傷害性薬物が送達される。一部の実施形態において、試薬コンジュゲートは細胞にインターナライズされることができ、これにより細胞傷害性薬物が細胞に放出される。当該技術分野において公知の任意の細胞傷害性薬物をコンジュゲートし得る。一部の抗体コンジュゲートはＦＤＡによって既に承認されており、又は／及び現在臨床試験が行われているところである。
【０１１０】
上記に開示される態様及び実施形態の一部についての更なる説明を提供するため、以下の実施例を示す。これらの実施例は、いかなる形であれ、本開示の範囲又は添付の特許請求の範囲の広さを限定するものと解釈されてはならない。
【実施例】
【０１１１】
材料及び方法
単層及びスフェア培養。細胞培養実験のため、様々な乳癌サブタイプにわたる８個の乳癌細胞株、ＭＤＡＭＢ４６８、ＨＣＣ１９３７、ＳＵＭ１５９ＰＴ、ＭＣＦ７、ＢＴ５４９、ＢＴ４７４、Ｔ４７Ｄ、及びＨｓ５７８Ｔのパネル、４個の膵癌細胞株、Ａｓｐｃ１、Ｂｘｐｃ３、ＨＰＡＣ、及びＰａｎｃ１のパネル、及び７個の結腸直腸癌細胞株、ＬＳ４１１Ｎ、ＳＷ１４１７、ＮＣＩ−Ｈ５０８、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、Ｌｏｖｏのパネルを加湿したインキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２で供給者の推奨する培地に維持した。Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）から入手したＳＵＭ１５９ＰＴを除き、細胞株は全て、当初ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手したものであった。
【０１１２】
標準的な単層組織培養については、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で細胞を回収し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３回洗浄し、及び全血清培地中、組織培養処理プレートに播いた。スフェア培養については、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで細胞を回収し、ハンクス平衡塩類溶液で３回洗浄し、及び上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びノックアウト血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足した無血清限定培地中、超低付着性組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播いた。
【０１１３】
４日間のインキュベーション期間後に供給者の推奨に従いＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ｇｌｏ（登録商標）（ＣＴＧ）発光細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって単層アッセイにおける細胞成長を読み取った。スフェア成長アッセイは、４日間のインキュベーション期間後に、ハイコンテントイメージング（Ａｒｒａｙｓｃａｎ  ＶＴＩ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いてスフェアコロニーを直接カウントすることによるとともに、ＣＴＧアッセイによっても読み取った。
【０１１４】
ＣＣＲ６ベースの細胞単離。細胞株におけるＣＣＲ６陽性（ＣＣＲ６＋）細胞をＣＣＲ６陰性（ＣＣＲ６−）細胞と磁気ビーズ分離によって分離した。マウス抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を「ドゥー・イット・ユアセルフ」ＥａｓｙＳｅｐ選択キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）と複合体化することにより、四量体抗体複合体（ＴＡＣ）ポジティブ選択システムを開発した。供給者の推奨プロトコルに従いこのポジティブ選択キットを用いると、磁気ビーズ単離によってＣＣＲ６＋細胞が捕捉された一方、ＣＣＲ６−細胞が未結合上清中に保持された。次に、単離されたＣＣＲ６＋及びＣＣＲ６−細胞を単層培養に播き、他の節に記載するとおりの組換えヒトＣＣＬ２０（ｒｈＣＣＬ２０）で刺激した。
【０１１５】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。培養４日目に、商業的に入手したサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を供給者のプロトコルに従い用いて培養細胞の馴化培地中に分泌されたＣＣＬ２０レベルを計測した。ＣＣＬ２０レベルはピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍＬ）単位で直接計測し、標準曲線から補間法で推定した。分泌ＣＣＬ２０レベルは同じ株からの単層培養細胞に対して正規化し、それと比較したＸ倍変化として報告した。
【０１１６】
ＣＣＬ２０刺激及び阻害。比較のため組換えヒトＣＣＬ２０をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからもまた入手した図５Ｄに示すデータを除き、全ての試験について、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから供給される商業的に入手した組換えヒトＣＣＬ２０（ｒｈＣＣＬ２０又はＣＣＬ２０）を使用した。アイソタイプ対照及び抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体もまた商業的に供給されたものであった（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。材料は全て、製造者の推奨に従い再構成し、保存した。
【０１１７】
刺激及び阻害試験のため、上記に記載したとおり単層アッセイ又はスフェアアッセイ用に細胞を播いた。プレーティング時に、実験及び結果に記載する用量のｒｈＣＣＬ２０又は抗体処理で細胞を処理した。図８Ａについては、細胞を２０ｎＭ  ＣＣＲ６  ｓｉＲＮＡ又は非標的対照ｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡから入手した、プールされたコンストラクト）で４８時間トランスフェクトした後にｒｈＣＣＬ２０を加えた一方、図８Ｃ、図８Ｄについては、プレーティング時に、細胞の抗体処理と同時に細胞を２０ｎＭ  ＣＣＬ２０、ＣＣＲ６、又は非標的対照ｓｉＲＮＡ（プールされたコンストラクト、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を担体として用いて実施し、１：２．５のｓｉＲＮＡ：脂質比でｓｉＲＮＡに複合体化させた。全ての処理は４日間妨げなく行われ、その後、前出の節又は以降の節に記載されるとおり、単層／スフェアアッセイ、フローサイトメトリー解析、又はＲＮＡ抽出のため細胞を移して調製した。
【０１１８】
患者由来の異種移植片動物モデルのケア及び使用。動物は全て、１２：１２時間の明：暗サイクルで、水及び固形飼料を自由に摂取させて飼育し、試験開始前の少なくとも１週間順化させた。全ての動物試験はＭｅｄＩｍｍｕｎｅの動物の管理及び使用に関する施設内委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【０１１９】
Ｐ１継代（ＰＡ＿ＰＤＸ＿１）又はＰ２継代（ＢＲ＿ＰＤＸ＿１）で皮下原発性ヒト膵腫瘍異種移植片を担持する雌ＮＳＧマウスとしてＢＲ＿ＰＤＸ＿１及びＰＡ＿ＰＤＸ＿１モデルをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。原発性ヒト膵腺癌切除としてＰＡ＿ＰＤＸ＿２モデルをＡｓｔｅｒａｎｄから入手した。試料は全て、本発明者らがＭｅｄＩｍｍｕｎｅのヒト生体試料取得方針に従いレビュー及び承認したそれぞれのＩＲＢに従い患者のインフォームドコンセントを得て入手した。
【０１２０】
腫瘍材料は全て、無菌条件下で６〜８週齢の雌ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又は雌ベージュヌードＸＩＤマウス（ＬｙｓｔｂｇＦｏｘｎ１ｎｕＢｔｋｘｉｄ、Ｅｎｖｉｇｏ）の後側腹部に腫瘍塊を皮下移植することによって増殖させた。この方法論によって腫瘍を６代（Ｐ６）まで継代したため、従って継代０代（Ｐ０）が患者生検から樹立された最初の異種移植片と見なされる。
【０１２１】
約７５０ｍｍ３に達したところで腫瘍を回収し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、滅菌かみそり刃で刻み、２０Ｕ／ｍＬコラゲナーゼＩＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）における単一細胞懸濁液に解離させた。解離した腫瘍細胞を、以下に記載するとおりの蛍光活性化細胞選別に使用した。
【０１２２】
インビボ腫瘍形成能試験については、プレーティングの時点から開始した１０μｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０  ＩｇＧ又は対照としてのアイソタイプＩｇＧによる処理下でＰａｎｃ１細胞をスフェア形成条件に培養した。４日間の培養後、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅでスフェアを解離させて単一細胞懸濁液にした。解離したスフェア細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ  ＧＦＲ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）と１：１で混合し、６〜８週齢雌ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ、Ｅｎｖｉｇｏ）の後側腹部にマウス当たり３０，０００細胞で皮下注射した。腫瘍容積を経時的にモニタして計測し、それによって触知可能な腫瘍の最初の観察として時間対腫瘍取り込みを記録した。
【０１２３】
フローサイトメトリー及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）。生細胞をＧｏｌｇｉｓｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に３７℃で１時間インキュベートしてＣＣＬ２０分泌を停止させることにより、フローサイトメトリー実験用の試料を調製した。この後、アキュターゼ細胞解離溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞を回収し、洗浄し、及び約２．５×１０６細胞／ｍＬでハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に再懸濁した。以下の抗体の全部又は数個からなる多色パネルで細胞を染色した：抗ヒトＣＣＬ２０−ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ヒトＣＣＲ６−ＢＶ６０５、抗ヒトＣＤ２４−ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ４４−ＰＥ−Ｃｙ７、及び抗ヒトＥｐｃａｍ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５又はＥｐｃａｍ−ＢＶ４２１（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）。原発性腫瘍異種移植片を抗マウスＨ２Ｋｄ−ＰＥ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で更に染色することにより、全ての腫瘍関連マウス内皮及び間質細胞を続く分析から除外することが可能になった。ＣＣＬ２０染色を含む実験では、細胞を全ての表面受容体に関して染色してから、抗ＣＣＬ２０染色のためそれらを固定し、透過処理した。単染色対照を使用してコンペンセーションマトリックスを定義し、フル・マイナス・ワン染色対照を使用してゲートを定義した。生細胞に関する細胞数測定実験については、各試料に３０μＭでＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて死細胞をゲートアウトした。４レーザー構成のＬＳＲＩＩで標準的なフローサイトメトリー実験を行った一方、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞選別実験を行った。図１３、図１４、及び図１５に示されるとおり、蛍光・マイナス・ワン（ＦＭＯ）染色によってＦＡＣＳゲーティングを決定した。
【０１２４】
定量ＲＴ−ＰＣＲ。試料は全て、Ａｍｂｉｏｎ  ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲＮＡ抽出用に処理した。ＲＮＡの収率及び品質を２６０／２８０ｎｍでＵＶ分光測定法によって決定した。各試料につき１０〜１００ナノグラムのｍＲＮＡをランダムプライマーオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下４２℃で逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に供した。ＲＴ−ＰＣＲ後、以下の遺伝子について、プールしたＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して各０．２×濃度で２０ｎｇ  ｃＤＮＡ産物を１４サイクルにわたり予め増幅した。
【０１２５】
【表１】
2018520177.tif 000003
【０１２６】
各試料について予め増幅した材料を脱イオン水（ＤＩ−Ｈ２Ｏ）で２０倍希釈し、７９００ＨＴサーモサイクラー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で供給者の推奨プロトコルに従いテクニカルレプリケートで上記に列挙したプライムを使用した定量（ｑｕａｎｔｉｔｉａｔｉｖｅ）ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析に供した。
【０１２７】
ＳＤＳ２．４ソフトウェア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｑＰＣＲランからＣｔ値を得て、式ＲＥ＝２−ΔΔＣｔ［式中
ΔＣｔ＝正規化Ｃｔ＝遺伝子Ｃｔ−１８ＳＣｔ
ΔΔＣｔ＝正規化試料Ｃｔ−正規化対照Ｃｔ］
を用いて比較Ｃｔ法によって相対発現（ＲＥ）値に変換した。
【０１２８】
テクニカルレプリケートの間でＲＥ値について平均±平均値の標準誤差を決定し、続いて最終的なデータ表現としてプロットした。
【０１２９】
ＴＲ１培養及びフローサイトメトリー解析。健康ヒトドナー血液からヒトナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞を供給者のプロトコルに従い（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞単離キットＩＩを使用して新鮮に単離し、Ｖｏｏ，ｅｔ  ａｌに記載されるプロトコルに従い培養下でＴＲ１細胞に偏らせた。ヒトドナー血液は全てインフォームドコンセントに基づき得られ、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａのヒト生体試料方針に従い使用／処分した。
【０１３０】
８日目、培養からＴＲ１細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー解析用に染色してＴｒｅｇマーカー表現型を確認した。細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に０．５×１０６細胞／０．１ｍＬの濃度となるように再懸濁し、供給者の推奨濃度のＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ２５−ＢＶ７１１（両方ともにＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した）、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＦＯＸＰ３−ＰＥ、及びＣＣＲ６−ＤＬ６４７（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した）からなる多色抗体パネルで染色した。細胞表面染色に先立ち、細胞をＺｏｍｂｉｅ−ＵＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で供給者のプロトコルに従い処理して死細胞を分析からゲートアウトした。この後、全ての細胞表面マーカーに関して生細胞を氷上で１５分間染色した。次に、染色された細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、推奨プロトコルに従いＢＤ  ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定した。この固定工程の後、細胞を細胞内ＦＯＸＰ３に関して氷上で１５分間染色し、続いてＰＢＳ＋２％ＦＢＳで更に２回洗浄した。ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａでフローサイトメトリー解析を実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析した。細胞と並行してコンペンセーションビーズ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して多色コンペンセーションを実施し、染色し、及び分析し、各色につきフル・マイナス・ワン（ＦＭＯ）対照をセットアップして陽性／陰性ゲーティングを決定した。
【０１３１】
ＴＲ１走化性アッセイ。ＮＣＩＨ５０８結腸癌細胞を上記に記載したとおり無血清限定培地の超低付着性プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播き、ＣＳＣによってドライブされるスフェア成長を促進した。安定培養の４日後、細胞からの馴化培地（ＣＭ）を収集し、０．２μＭろ過し、及び後の使用時まで４℃で保存した。培地中のＣＣＬ２０濃度を上記に記載したとおりＥＬＩＳＡによって決定した。このＣＳＣ  ＣＭは回収から１週間以内に走化性アッセイに使用した。
【０１３２】
培養８日目に回収したＴＲ１細胞をＰＢＳで洗浄し、０．４×１０６細胞／ｍＬでＰＢＳ＋２％ＦＢＳ又は無血清限定培地（ＳＣＭ）のいずれかに再懸濁した。単離ＣＣＬ２０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中１００ｎＭ濃度で調製した。抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体又はアイソタイプ対照抗体（両方ともにＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから）を単離ＣＣＬ２０又はＣＳＣ  ＣＭのいずれかに６６７ｎＭの最終濃度で加え、室温で３０分間インキュベートさせておいた。調製した処理物を、８μＭ細孔を有するトランスウェル遊走プレート（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）の受け入れウェルにｎ＝４ウェル／処理で移した。ＴＲ１細胞を供給者のプロトコルに従いフィルタプレートの上部に対応する培地（単離ＣＣＬ２０処理についてＰＢＳ＋２％ＦＢＳ、及びＣＳＣ  ＣＭ処理についてＳＣＭ）中５０，０００細胞／ウェルで播いた。プレートを３７℃で６０分間インキュベートさせておき、その後非遊走細胞をフィルタプレートからブロットオフし、フィルタをＰＢＳで穏やかに洗浄した。プレートを２００ｒｐｍで２分間遠心して遊走細胞を受け入れウェルに収集した。供給者のプロトコルに従い細胞力価ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって遊走細胞数を決定し、それによって細胞数対相対ルミネセンス（ＲＬＵ）の標準曲線を使用してＲＬＵを遊走したＴＲ１細胞の％に変換した。統計的有意性は処理と対照との間の両側スチューデントｔ検定によって決定し、それによってｎ＝４レプリケート／処理であった。
【０１３３】
β−アレスチン及びｃＡＭＰ経路アッセイ。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｅＸｐｒｅｓｓ  ＣＣＲ６  ＣＨＯ−Ｋ１  β−アレスチンＧＰＣＲアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を用いてヒト及びマウスの両方のＣＣＬ２０−ＣＣＲ６経路活性化に関するレポーターとしてのβ−アレスチンのリクルートを計測し、それによって細胞は、マウス経路アッセイについてマウスＣＣＲ６を、及びヒト経路アッセイについてヒトＣＣＲ６を安定に発現した。アッセイは供給者のプロトコルに従い行い、但し修正を加えて、細胞は６ｎＭ組換えヒトＣＣＬ２０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は１．２ｎＭ組換えマウスＣＣＬ２０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって３７℃で９０分間刺激した。別個のアッセイで、ヒトＣＣＲ６を安定にトランスフェクトしたＡｄ２９３細胞を使用して、供給者のプロトコルに従いＬＡＮＣＥ  ｃＡＭＰアッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いることによりヒトＣＣＬ２０−ＣＣＲ６経路活性化に関するレポーターとしてのｃＡＭＰレベルの変化を更に計測した。このアッセイでは、細胞は１ｎＭ組換えＣＣＬ２０と組み合わせた４μＭフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）によって室温で６０分間刺激した。両方のアッセイで、ＣＣＬ２０  ＩｇＧ又はアイソタイプ対照ＩｇＧ（両方ともにＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）による処理後に経路の中和が計測された。
【０１３４】
インビボ同系マウスモデル。４Ｔ１マウス乳癌を４〜６週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄ、Ｅｎｖｉｇｏ）の後側腹部に皮下異種移植した。腫瘍が約５０〜１００ｍｍ３に達したとき、マウスは、１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．で週２回、４連続用量にわたって投与された抗マウスＣＣＬ２０モノクローナル抗体（クローン１１４９０８）又はアイソタイプ対照抗体（両方ともにＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかによる治療を受け始めた。最終用量後２４時間でマウスを人道的に安楽死させ、分析のため脾臓及び腫瘍を採取した。脾臓及び腫瘍組織の両方を消化して単一細胞懸濁液にし、得られた細胞を免疫細胞のフローサイトメトリー分析時までＣｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において凍結保存した。
【０１３５】
マウス免疫細胞フローサイトメトリー分析。アイソタイプ又は抗マウスＣＣＬ２０モノクローナル抗体のいずれかで治療したマウスの凍結保存脾臓及び腫瘍細胞を３７℃で解凍し、洗浄し、及びマウス免疫細胞分析のため以下の抗体パネルを使用して染色した：抗ｃｄ４５−ＢＶ２１、抗ｃｄ４−ＢＶ７１１、抗ｃｄ１１ｂ−ＢＶ５１０（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した）、抗ｃｄ３−ＦＩＴＣ、抗ｃｄ８ａ−ＡＰＣ−Ｃｙ７、抗ｆｏｘｐ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、抗ｒｏｒγｔ−ＰＥ（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した）、抗ｃｄ１１ｃ−ＢＶ６０５、抗ｃｄ８３−ＰＥ−Ｃｙ７、抗ｌｙ６ｇ−ＢＶ７８５（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した）。初めに生細胞を４％マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でブロックし、続いてＺｏｍｂｉｅ−ＵＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて生／死細胞に関して染色し、次に細胞外抗原（ｆｏｘｐ３及びｒｏｒγｔを除く全ての標的）に関して染色した。この後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して固定及び透過処理してから、細胞内抗原ｆｏｘｐ３及びｒｏｒγｔに対する抗体で細胞を染色した。３５５ｎｍ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、及び６４０ｎｍレーザー励起を備えたＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａでフローサイトメトリーを実行し、ｆｌｏｗｊｏ  Ｖ１０ソフトウェアを使用して分析した。統計的有意性は処理と対照との間の両側スチューデントｔ検定によって決定し、それによってｎ＝５マウス／処理／組織型であった。平均値の標準誤差の３倍を超えるデータ点は外れ値と見なし、分析から除去した。
【０１３６】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞走化性アッセイ。Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞エンリッチメントキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したネガティブ選択によって健康ヒトドナー血液からＣＤ４＋  Ｔ細胞を単離した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁した。単離ＣＣＬ２０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中に１０ｎＭ濃度で調製した。単離したＣＣＬ２０に抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体又はアイソタイプ対照抗体（両方ともにＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）を３０ｎＭの最終濃度で加え、室温で３０分間インキュベートさせておいた。調製した処理物を、５μＭ細孔を備えたトランスウェル遊走プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の受け入れウェルにｎ＝３ウェル／処理で移し、インサート中、ポリカーボネートフィルタ上にＣＤ４＋  Ｔ細胞を対応する培地（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）中５０，０００細胞／ウェルでロードし、プレートを３７℃で３時間インキュベートさせておいた。供給者のプロトコルに従い細胞力価ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって遊走細胞数を決定し、それによって細胞数対相対ルミネセンス（ＲＬＵ）の標準曲線を用いてＲＬＵを遊走したＣＤ４＋  Ｔ細胞の％に変換した。統計的有意性は処理材料と対照との間の両側スチューデントｔ検定によって決定し、それによってｎ＝３レプリケート／処理／ドナーとなった。
【０１３７】
実施例１：培養下の癌幹細胞におけるＣＣＬ２０の発現
上記で考察したとおり、ＣＣＬ２０は免疫細胞をリクルートするための化学誘引物質として知られるが、本明細書で考察される結果は、ＣＣＬ２０が、乳癌、膵癌、及び結腸直腸癌を含め、本明細書に一部が例示される癌細胞株中のＣＳＣによって産生される因子であることを実証している。組織培養下では、単層培養条件と比べてＣＳＣをエンリッチするスフェア条件下で培養したとき大多数の細胞株がＣＣＬ２０の分泌を大いに増加させることが認められる（図１Ａ〜図１Ｃ）。図１が示すとおり、スフェア培養条件は、単層培養と比較したとき、試験した乳癌株（図１Ａ）、膵癌株（図１Ｂ）、及び結腸直腸癌株（図１Ｃ）の多くにおいてＣＣＬ２０分泌の有意な増加をもたらした。スフェア培養条件下で細胞によって分泌されたＣＣＬ２０の典型的なレベルは約１〜約１０００ｐｇ／ｍＬの範囲であったとともに、それによってスフェア培養下でＣＣＬ２０の増加がない細胞株は、概して１ｐｇ／ｍＬ又はそれ以下で低い又は検出不能なタンパク質レベルを有した（図２）。
【０１３８】
スフェアに関連するＣＣＬ２０レベルの増加の原因がＣＳＣにあることを確認するため、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて乳癌株及び膵癌株からＣＳＣ及び非ＣＳＣを単離し、それによって各細胞集団におけるＣＣＬ２０  ｍＲＮＡのレベルを計測した。２つの乳房細胞株（ＭＤＡＭＢ４６８及びＨＣＣ１９３７）から単離されたＣＤ４４ｈｉｇｈ／＋ＣＤ２４ｌｏｗ／−ＣＳＣでは、同じ株から単離されたＣＤ４４ｌｏｗ／−ＣＤ２４ｌｏｗ／−非ＣＳＣと比較してＣＣＬ２０  ｍＲＮＡレベルが劇的に上昇している（図１Ｄ）。ＭＤＡＭＢ４６８及びＨＣＣ１９３７細胞からのＣＳＣは非ＣＳＣと比べてそれぞれ２３倍及び１０倍高いＣＣＬ２０  転写物を産生する（ＣＳＣ対非ＣＳＣのＲＥ＝ＭＤＡＭＢ４６８において２３．３±１６対１．０±０．２及びＨＣＣ１９３７において９．３±４．６対０．９±０．３）。この観察の臨床的関連性を確かめるため、原発性患者由来腫瘍異種移植片（ＰＤＸ）からのＦＡＣＳ単離ＣＳＣ対非ＣＳＣにおいてＣＣＬ２０転写物レベルもまた計測した。２つの膵癌（ＰＡ＿ＰＤＸ＿１及びＰＡ＿ＰＤＸ＿２）及び１つの乳癌（ＢＲ＿ＰＤＸ＿１）ＰＤＸモデルからの腫瘍も同様にＦＡＣＳ選別して、膵癌についてはＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＣＳＣをＥｐｃａｍ−ＣＤ４４−ＣＤ２４−非ＣＳＣと共に単離し、及び乳癌についてはＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４−ＣＳＣをＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４−ＣＤ２４−非ＣＳＣと共に単離した。図１Ｅに示されるとおり、３つ全ての患者異種移植モデルが、単離ＣＳＣにおいて非ＣＳＣと比べたＣＣＬ２０  ｍＲＮＡレベルの有意な増加を示し、ＣＳＣ対非ＣＳＣの相対発現＝７１．８±４１．６対１．２±０．６（ＢＲ＿ＰＤＸ＿１について）、４８．８±８．６対１．０±０．０（ＰＡ＿ＰＤＸ＿１について）、及び８．６±１．３対１．０±０．０（についてＰＡ＿ＰＤＸ＿２について）であった。
【０１３９】
次に、本発明者らは、ＣＳＣが残りの腫瘍細胞集団と比較して実際にＣＣＬ２０レベルの上昇によって特徴付けられることをフローサイトメトリーによって確認した。ＣＳＣは一般に、膵癌においてＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋及び乳癌においてＣＤ４４＋ＣＤ２４−と同定されるが、本発明者らは、腫瘍形成能、スフェア形成、及び幹細胞性遺伝子発現によって決定されるとおりの幹細胞表現型が、多くの場合にＣＤ４４及び／又はＣＤ２４が高発現の単層細胞株モデル（ひいては単層培養の膵癌におけるＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２４ｈｉｇｈ及び単層培養の乳癌におけるＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２４−）においてより良好にトラッキングすることを見出している。この同定により、本発明者らは、Ｂｘｐｃ３膵臓モデルからのＣＳＣ（図３Ａ）及びＨＣＣ１９３７乳癌モデルからのＣＳＣ（図３Ｄ）が両方ともに全腫瘍細胞集団と比べてＣＣＬ２０蛍光強度中央値（ＭＦＩ）レベルの１．５倍の増加を示したことを見出した。Ｂｘｐｃ３  ＣＳＣ（図３Ｂ）は１８９のＭＦＩのシフトを呈した一方、全腫瘍細胞集団は平均して１２４のＣＣＬ２０ＭＦＩであった。同様に、ＨＣＣ１９３７  ＣＳＣ（図３Ｅ）もまた、全腫瘍細胞における２４３から特にＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２４−ＣＳＣについての３６１へのＣＣＬ２０ＭＦＩのシフトの増加を示した。このデータは、ＣＣＬ２０レベルの上昇が主にＣＳＣエンリッチスフェア及び単離ＣＳＣに関連することを示す図１に示される知見及び結果を裏付けている。ＣＳＣゲーティングは、図１３に示すとおりフル・マイナス・ワン染色によって決定した。
【０１４０】
実施例２：ＣＣＲ６の関連性及び癌幹細胞におけるＣＣＬ２０との共局在
興味深いことに、本発明者らは、ＣＳＣ集団を腫瘍細胞に関するＣＣＬ２０／ＣＣＲ６染色と重ね合わせると、Ｂｘｐｃ３及びＨＣＣ１９３７の両方の株のＣＳＣの大多数が、リガンド及び受容体の両方に関して二重陽性である、即ちＣＣＬ２０＋ＣＣＲ６＋である細胞と共局在するように思われることを見出した（図３Ｃ及び図３Ｅ）。顕著には、本発明者らは、スフェア培養が単層培養と比べてこの二重陽性ＣＣＬ２０＋ＣＣＲ６＋集団を劇的に増加させることを発見した。図４は、Ｂｘｐｃ３及びＰａｎｃ１膵癌モデルにおけるこの効果を示す。標準的な単層で培養したとき、いずれのモデルにおいてもＣＣＬ２０＋ＣＣＲ６＋と同定される細胞はごく一部である（図４Ａ及び図４Ｃ、及びゲーティング制御について図１３）。しかしながら、スフェアとして培養すると、両方のモデルで大多数の細胞がＣＣＬ２０及びＣＣＲ６の両方に関して陽性染色される（図４Ｂ及び図４Ｄ）。Ｂｘｐｃ３モデルでは、このＣＣＬ２０＋ＣＣＲ６＋集団は、単層としての３．７６％（図４Ａ）からスフェアでの７１．２％（図４Ｂ）に増加する。同様に、単層として培養したＰａｎｃ１細胞は５．８７％のＣＣＬ２０＋ＣＣＲ６＋細胞を有し（図４Ｃ）、スフェア培養で８３．５％にブーストされる集団である（図４Ｄ）。興味深いことに、本発明者らがこれらのスフェアにおけるＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋細胞をゲートオンすると、これらは再びＢｘｐｃ３（図４Ｅ）及びＰａｎｃ１（図４Ｆ）スフェアにおけるＣＣＬ２０＋ＣＣＲ６＋集団とほぼ完全に重なり合う。これらの観察から、ＣＳＣがＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸に関してオートクリン依存性を有し得ることが示唆された。
【０１４１】
実施例３：ＣＣＬ２０レベルと癌幹細胞活性との相関
ＣＣＬ２０が実際にＣＳＣ集団で過剰発現し、且つそれと関連付けられることを確認した後、本発明者らは、この分子とＣＳＣ活性の表現型上の関連性を確認しようとした。図５は、精製ＣＣＬ２０の外因的な添加が如何にスフェア成長（これは、ＣＳＣによってドライブされる腫瘍原性（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｔｙ）のモデルとして働く）をブーストするかを示す。組換えヒトＣＣＬ２０（ｒｈＣＣＬ２０）をＣＳＣ培養に加えると、３つの癌モデル、Ａｓｐｃ１（図５Ａ）、Ｂｘｐｃ３（図５Ｂ）、及びＳＵＭ１５９（図５Ｃ）においてスフェア成長が４日目に用量依存的に有意に刺激された。ＣＣＬ２０を加えることによってスフェア成長の用量依存的増加が生じたが、標準的な単層培養では、このリガンドは細胞の成長の刺激に対して何ら効果を示さない（図５Ａ〜図５Ｃ）。この観察は、ＣＣＬ２０の効果がＣＳＣに特異的に向けられることを示唆する傾向がある。この効果の特異性は、２つの別個の商業的供給元から得た５０ｐｇ／ｍＬ用量のＣＣＬ２０（ＣＣＬ２０  Ａ及びＣＣＬ２０  Ｂ）がＢＴ５４９乳癌細胞のスフェア成長を同程度に刺激することを示す図５Ｄで確認された。例えば、ＣＣＬ２０  Ａは基礎細胞の１００．０±１６．７％と比較して３３３．３±６４．９％まで成長を刺激した一方、ＣＣＬ２０  Ｂは基礎と比べて３００．０±５４．６％まで成長を刺激した（それぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５、基礎スフェア成長と比較したとき）。更に、この刺激効果は、抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体（１５μｇ／ｍＬ）を加えると中和し、又は無効にすることができ、それによって同じ５０ｐｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０  Ａ又はＣＣＬ２０  Ｂが存在するにも関わらず、スフェア成長は最大でＣＣＬ２０  Ａ＋抗ＣＣＬ２０抗体について１５４±１６．９％及びＣＣＬ２０  Ｂ＋抗ＣＣＬ２０抗体について１２５．０±１６．１％であった（図５Ｄを参照；抗ＣＣＬ２０抗体なしでＣＣＬ２０処理したスフェアと比較してｐ＜０．０５）。
【０１４２】
全体的に見て、この反応の特異性から、ＣＣＬ２０が実際に表現型ＣＳＣ活性を媒介することが確認される。しかしながら、スフェア成長はＣＳＣ活性の間接的尺度であるため、本発明者らは、単独因子としてのＣＣＬ２０がＣＳＣを直接増加させることを確認しようとした。端的には、２００ｐｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０有り又は無しで４日間処理したスフェアをフローサイトメトリー解析に供してＣＣＬ２０のドライブによるＣＳＣ集団の増加を直接計測した。図６は、ＣＣＬ２０処理によってＭＤＡＭＢ４６８細胞のＣＤ４４＋ＣＤ２４−乳癌ＣＳＣの割合が０．９±０．１％（ＣＣＬ２０無し）から１．３±０．１％（ＣＣＬ２０有り）に有意に増加する（ｐ＜０．０５）ことを実証している（図６Ａ）。同様に、Ｂｘｐｃ３（図６Ｂ）及びＡｓｐｃ１（図６Ｃ）膵癌細胞は、ＣＣＬ２０刺激後に、Ｂｘｐｃ３において０．９±０．１％から１．２±０．１％への、及びＡｓｐｃ１において２．７±０．１％から３．６±０．４％へのそのＥｐｃａｍ＋ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２４ｈｉｇｈＣＳＣ頻度の有意な増加を示す（両方の細胞型でｐ＜０．０５）。スフェア成長及びフローサイトメトリーに加えて、本発明者ら、及び他の研究者らは、５つの幹細胞性関連遺伝子のパネルもまた、ＣＳＣ表現型で良好にトラッキングすることを見出している。多能性に関連することが知られる転写因子ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＯＣＴ３／４の発現は、ＣＳＣ集団の対応する増加及び減少に伴い増加及び減少する。ポリコームタンパク質ＥＺＨ２及びＢＭＩ１の転写物発現は、両方とも、同様にＣＳＣ集団の変化に良好に関係する。図６Ｄは、２００ｐｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０をＢｘｐｃ３スフェアに加えると、実際に４日間の処理後に５つ全ての幹細胞性に関連する遺伝子の発現が増加することを示す。Ｈｓ５７８Ｔ、ＳＵＭ１５９、及びＰａｎｃ１細胞株においても同様の結果が認められた（図７）。スフェア成長で見られた効果及びＣＳＣ表面マーカーを担持する細胞の割合で計測された増加と合わせると、これらのデータは実際に、リガンドＣＣＬ２０が試験した細胞株においてＣＳＣ活性を直接促進し得ることを示唆している。
【０１４３】
実施例４：癌幹細胞におけるＣＣＬ２０の効果はその受容体、ＣＣＲ６によって媒介される
実施例１〜３で考察した実験の結果から、ＣＣＬ２０がＣＳＣ活性に直接影響を及ぼしたことが確認されたが、ＣＣＬ２０がこの活性を発揮するため実際にその公知の受容体、ＣＣＲ６を介してシグナルを送ったかどうかは依然として不明であった。図５に示すデータから、精製ＣＣＬ２０を加えるとスフェア成長が刺激されたことが示された。このことから、ＣＣＬ２０がＣＣＲ６シグナル伝達を介してその機能を発揮したならばＣＣＲ６のノックダウンがＣＣＬ２０の刺激によるスフェア成長を妨げるであろうという論拠で、ＣＣＬ２０の効果がその受容体ＣＣＲ６を介したシグナル伝達によって媒介されたかどうかを評価する実験を設計した。
【０１４４】
図８Ａにおいて、本発明者らは、２０ｎＭ  ｓｉＲＮＡによるＣＣＲ６のノックダウン後、組換えヒトＣＣＬ２０（ｒｈＣＣＬ２０）がＬｏｖｏ結腸直腸癌細胞におけるスフェア成長の刺激能を失う一方、非標的対照ｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）をトランスフェクトした細胞はＣＣＬ２０に対するその成長応答を維持したことを示す。ＣＣＲ６がＣＳＣに対するこのＣＣＬ２０軸にとって必須成分であったことを確認するため、本発明者らはＮＣＩＨ５０８細胞株でＣＣＲ６＋細胞をＣＣＲ６−細胞と分離し、両方の画分を１００ｐｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０で４８時間刺激し、続いて幹細胞性に関連する遺伝子の発現を判定した。図８Ｂは、ＣＣＲ６＋細胞が、ＣＣＲ６−細胞と比較したとき、１００ｐｇ／ｍＬによる刺激から４８時間後にＮＡＮＯＧ、ＢＭＩ１、ＯＣＴ３／４、及びＳＯＸ２の約２倍の発現増加で応答したことを示す。これらの結果は、ＣＣＬ２０刺激に応答したＣＳＣ関連活性が受容体としてのＣＣＲ６の存在に依存することを実証している。この知見を更に裏付けるため、本発明者らは、腫瘍細胞上のこのＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸の阻害が、ＣＣＬ２０の欠損によるにしろ、ＣＣＲ６の欠損によるにしろ、同様のスフェア成長結果をもたらしたことを観察した（図８Ｃ及び図８Ｄ）。ＣＣＬ２０又はＣＣＲ６のいずれかのＲＮＡｉ媒介性ノックダウンにより、ＮＣＩＨ５０８細胞においてスフェア成長は同程度低下し、即ち非標的対照ｓｉＲＮＡ（１００．０±２．０％、ｐ＜０．００１）と比較して５９．６±２．９％又は７０．３±２．２％であった（図８Ｃ）。Ｈｓ５７８Ｔ細胞においても同じ観察が得られ、ここではＲＮＡｉ媒介性ノックダウンにより、対照ｓｉＲＮＡでの１００．０±７．０％成長と比較して（ｐ＜０．００１）、スフェア成長がＣＣＬ２０  ｓｉＲＮＡで５５．４±３．９％に低下し、及びＣＣＲ６  ｓｉＲＮＡで２１．８±１．８％に低下した（図８Ｄ）。まとめると、これらの結果から、ＣＳＣに対するＣＣＬ２０の効果の促進にＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸が関与していることが確認される。
【０１４５】
実施例５：ＣＣＬ２０の中和は癌幹細胞活性を阻害する
上記の実施例で検証されるとおり、ＣＣＬ２０はＣＳＣ活性の明らかなメディエーターである。本例では、次にこの標的の中和がひいてはＣＳＣを阻害し得るかどうかを評価した。これを試験するため、一連の実験において、中和能が報告されているＣＣＬ２０に対する市販のモノクローナルＩｇＧ抗体を使用した。１０μｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０  ＩｇＧを単回用量投与すると、同じ１０μｇ／ｍＬ用量のアイソタイプ対照ＩｇＧと比較して、試験した３つ全ての徴候のモデルで処理後４日目にスフェア形成が有意に低下した（図９）。Ｈｓ５７８Ｔ乳癌スフェアの成長は、対照ＩｇＧによる１００．０±２７．２％スフェア成長と比較してほんの１１．１±１１．１％に低下した（ｐ＜０．０５、図９Ａ）。同様に、ＮＣＩＨ５０８結腸直腸癌スフェアの成長は、対照ＩｇＧによる１００．０±４．８％に対して６２．８±５．８％に低下し（ｐ＜０．００１、図９Ｂ）、一方、Ｐａｎｃ１膵癌スフェアの成長は、対照ＩｇＧ処理による１００．０±１３．０％から１８．１±２．１％にまで低下した（ｐ＜０．００１、図９Ｃ）。ＣＳＣ同定のためのゲーティング制御は図１５に示す。
【０１４６】
ＣＳＣの減少に対するＣＣＬ２０阻害の効果がフローサイトメトリーによって確認され、ここでは１０μｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０  ＩｇＧの単回用量投与によるＢｘｐｃ３スフェアの同様の４日間処理により、Ｅｐｃａｍ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＣＳＣの割合が、１０μｇ／ｍＬの対照ＩｇＧ処理による５．６±０．１％から４．５±０．４％にまで減少した（ｐ＜０．０５、図９Ｄ）。Ｐａｎｃ１膵癌ＣＳＣの頻度はスフェアで対照ＩｇＧ処理による９．３±０．９からＣＣＬ２０  ＩｇＧ後の６．６±０．７％に低下した（ｐ＜０．０５、図９Ｅ）。まとめると、これらの結果から、モノクローナル抗体によるＣＣＬ２０の中和を、実際にＣＳＣ集団を減少させる可能性のある治療薬として使用し得ることが確認され、抗ＣＳＣ療法の標的としてのＣＣＬ２０の有望な機会が明らかとなる。
【０１４７】
実施例６：Ｔｒｅｇ移動性はＣＳＣによって産生されるＣＣＬ２０により媒介される
ＣＣＬ２０は、主にＢ細胞、Ｔ細胞、及び樹状細胞サブセットでＣＣＲ６＋免疫細胞の走化性遊走を指図することが知られている。陽性対照として、本発明者らは、抗ＣＣＬ２０  ＩｇＧが公知の細胞型、即ちＣＤ４＋  Ｔ細胞の走化性遊走を遮断する能力を確認した。図１０では、３０ｎＭで投与した抗ＣＣＬ２０  ＩｇＧが、２人の健康ヒトドナーの末梢血から単離されたＣＤ４＋  Ｔ細胞の走化性遊走を有意に阻害し得ることが確認される。
【０１４８】
ＣＳＣによって産生されるＣＣＬ２０がＴｒｅｇの遊走に影響を及ぼし得るかどうかを試験するため、本発明者らは、上記の材料及び方法に記載したとおり、培養下でヒトナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞を１型調節性Ｔ細胞（ＴＲ１）に偏らせた。細胞のフローサイトメトリー解析により、ＴＲ１細胞はＴｒｅｇに表面表現型が類似しており、それらが主にＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋  Ｔ細胞であるとおりであること、及びこれらのＴＲ１細胞がＣＣＲ６を発現したことが確認された（図１１）。トランスウェル遊走アッセイにより、これらのＴＲ１細胞が単離ＣＣＬ２０へと選択的に遊走することができ、それによって非特異的に遊走した細胞の１０．２±０．６％と比較して１４．７±０．９％の細胞がＣＣＬ２０へと遊走した（ｐ＜０．０１、図１２Ａ）ことが明らかになった。抗ＣＣＬ２０抗体を６倍モル過剰で加えると、７．９±０．６％への細胞遊走の低下によって見られるように、この遊走を遮断することができた（１００ｎＭ  ＣＣＬ２０処理と比較してｐ＜０．０１、図１２Ａ）。
【０１４９】
次に、本発明者らは、ＴＲ１細胞がＣＳＣによって産生されるＣＣＬ２０に遊走することができるかどうかを問うた。本発明者らは、ＣＳＣによってドライブされるスフェア形成条件下で４日間培養したＮＣＩＨ５０８結腸癌細胞からのＣＳＣ馴化培地を作成し、これは、ＥＬＩＳＡによって決定するとき、２１１ｐｇ／ｍＬ（＝２６．４ｐＭ）の平均濃度のＣＣＬ２０を含有することが見出された（図１２Ｂ）。ＴＲ１細胞（１９．３±０．９％）は、非特異的に遊走した細胞の１０．３±０．６％と比較して、ＣＳＣ  ＣＭに遊走することができた（ｐ＜０．０１、図１２Ｃ）。中和抗ＣＣＬ２０抗体を加えると遊走が１３．８±０．７％にまで再び有意に低下したため、遊走は実際に馴化培地中のＣＣＬ２０に向かった（ＣＳＣ  ＣＭ又はＣＳＣ  ＣＭ＋アイソタイプ対照ＩｇＧと比較してｐ＜０．０１、図１２Ｃ）。アイソタイプ対照ＩｇＧを加えても、ＣＳＣ  ＣＭへのＴＲ１遊走の低下に対して何ら効果はなかった（アイソタイプ対照ＩｇＧで１７．９±１．７％の遊走）。これらの結果は、１型調節性Ｔ細胞がＣＳＣによって産生されるＣＣＬ２０に遊走することができるという仮説を確認するものであり、それにより、ＣＣＬ２０に対する中和抗体が腫瘍環境へのＴｒｅｇの浸潤を低下させ得ることが示唆される。
【０１５０】
実施例７：ＣＣＬ２０中和抗体はインビボで腫瘍発生及び免疫抑制を低下させる
ＣＣＬ２０がＣＳＣ活性の明らかなメディエーターとして確定された後、本発明者らは、次にこの標的の中和がひいてはＣＳＣを阻害することができるかどうかを調べた。これを試験するため、本発明者らは、ＣＣＬ２０に対する市販の中和ヒトモノクローナル抗体（クローン６７３１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ｃＡＭＰアッセイ及びβ−アレスチン転位アッセイ（それぞれ図１６Ａ及び図１６Ｂ）の両方でこの抗体がＣＣＬ２０刺激ＣＣＲ６経路活性を阻害する能力から、潜在的中和能力が確認された。細胞を１ｎＭ  ＣＣＬ２０で刺激したときはｃＡＭＰアッセイにおいて０．８ｎＭでＩＣ５０を計測し、一方、細胞を６ｎＭ  ＣＣＬ２０で刺激したときは２．７ｎＭでＩＣ５０を計測した。
【０１５１】
インビトロでのＣＣＬ２０中和によるＣＳＣ含有量の低下は腫瘍取り込み速度及び腫瘍成長速度の遅延につながった。腫瘍接種前の４日間にわたりＰａｎｃ１腫瘍を１０ｕｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２０  ＩｇＧで前処理したときのＰａｎｃ１腫瘍の腫瘍取り込み時間中央値（％腫瘍担持動物）は、１０ｕｇ／ｍＬアイソタイプＩｇＧによってインビトロで前処理したＰａｎｃ１腫瘍と比較して５６．５日遅くなった（図１７Ａ）。この場合の腫瘍取り込みは、最初の触知可能な腫瘍形成例から計測した。ＣＣＬ２０  ＩｇＧで処理した腫瘍は、試験が行われている間にわたってアイソタイプＩｇＧで処理した腫瘍と比べて平均腫瘍容積も有意に小さかった（図１７Ｂ）。
【０１５２】
免疫担当同系マウスモデルにおけるＣＣＬ２０中和の役割を判定するため、本発明者らは、抗ヒトＣＣＬ２０モノクローナル抗体のサロゲートとして働くのに十分な潜在的遮断／中和能力を有する市販の抗マウスＣＣＬ２０モノクローナル抗体（クローン１１４９０８；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を同定した。抗マウスＣＣＬ２０  ＩｇＧ抗体は、細胞を１．２ｎＭマウスＣＣＬ２０で刺激したとき、１４．０ｎＭのＩＣ５０でβ−アレスチン転位アッセイによって計測されるとおりマウスＣＣＬ２０−マウスＣＣＲ６経路を阻害することができた（図１８）。しかしながら、ＣＣＬ２０と抗体とのＩＣ５０値の比をヒトとマウスとの間で比較したとき、マウスＣＣＬ２０  ＩｇＧの効力はヒトＣＣＬ２０  ＩｇＧと比較して著しく低下する（０１７４に記載される）。
【０１５３】
同系腫瘍モデルを用いて末梢及び腫瘍浸潤性免疫細胞に対するインビボでのＣＣＬ２０中和の効果を判定した。４Ｔ１マウス乳癌細胞株はＣＣＬ２０を天然で発現することが知られており、従って本試験に選択される。免疫担当マウスにＨＬＡ対応４Ｔ１細胞を皮下異種移植し、腫瘍が約５０〜１００ｍｍ３に達したところで抗マウスＣＣＬ２０  ＩｇＧ又は対応するアイソタイプ対照ＩｇＧを１０ｍｇ／ｋｇで週２回、４連続用量にわたって投与した。死後、４回目の投与後２４時間で回収した脾臓及び腫瘍組織で免疫表現型タイピングを実施した。
【０１５４】
リンパ系及び骨髄系免疫細胞サブセットの頻度を、脾臓については図１９及び腫瘍組織については図２０に示すゲーティング概略に従い多色フローサイトメトリーによって決定した。フル・マイナス・ワン（ＦＭＯ）対照をゲーティングに使用して、パネル中の任意の特定のマーカーについて陽性対陰性であった細胞を同定した。
【０１５５】
データは、抗ＣＣＬ２０  ＩｇＧによるインビボ治療が末梢及び腫瘍浸潤免疫細胞の頻度に有意な影響を及ぼすことを示している。脾臓では、ＣＣＬ２０の阻害によってｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ（図２１Ａ）及びｒｏｒγｔ＋  Ｔｈ１７細胞（図２１Ｂ）の有意な低下が生じ、それによって両方の集団の頻度が、アイソタイプ対照で治療した動物と比較して約２倍減少した（アイソタイプＩｇＧ対抗ＣＣＬ２０  ＩｇＧで治療した動物において、それぞれ１１．５±０．４％対６．５±１．２％Ｔｒｅｇ及び４．７±０．４％対２．２±０．５％Ｔｈ１７）。これと同じ効果が腫瘍においてもまた得られ、Ｔｒｅｇの頻度はアイソタイプＩｇＧ治療後の１．５±０．０５％から抗ＣＣＬ２０  ＩｇＧ治療に応答した１．０±０．１％に低下し（図２２Ａ）、及びＴｈ１７細胞の頻度もまた、アイソタイプＩｇＧで治療された腫瘍の０．４±０．０５％からＣＣＬ２０  ＩｇＧ治療後の０．３±０．０２％に低下した（図２２Ｂ）。この結果は、インビボでＣＣＬ２０を遮断すると、腫瘍環境で免疫抑制を促進することが知られている２つの細胞型、即ちＴｒｅｇ及びＴｈ１７の末梢及び腫瘍特異的低下の両方につながることを示唆しており、ＣＣＬ２０を阻害する療法が抗癌療法戦略の一環として免疫抑制を軽減する助けとなり得ることが示唆される。
【０１５６】
ＣＣＬ２０がＴｒｅｇ及びＴｈ１７集団に及ぼす効果に加えて、ＣＣＬ２０の中和はまた、樹状細胞にも有意に影響を与える。腫瘍環境では、樹状細胞の頻度がアイソタイプＩｇＧ治療マウスの１８．２±２．２％からＣＣＬ２０  ＩｇＧ治療後の１１．９±２．３％に低下した（図２２Ｃ、有意差なし）。この低下の原因は、主として成熟ｃｄ８３＋樹状細胞の有意な減少であり（図２２Ｅ）、未熟ｃｄ８３−樹状細胞ではなかった（図２２Ｄ）。これと逆に、脾臓では、ＣＣＬ２０の中和は、アイソタイプＩｇＧ治療マウスの６．９±０．５％からＣＣＬ２０  ＩｇＧ治療マウスの９．８±０．６％への樹状細胞の有意な増加を引き起こした（図２１Ｃ）。樹状細胞の増加は、主にｃｄ８３−未熟樹状細胞の増加であり（図２１Ｄ）、ｃｄ８３＋成熟樹状細胞ではなかった（図２１Ｅ）。この結果は、インビボでＣＣＬ２０を中和すると、樹状細胞の成熟、ひいてはこの細胞型の腫瘍への浸潤が阻害されることを示している。
【０１５７】
プロファイリングした残りの免疫細胞集団、即ちアイソタイプ対照治療マウスと比較した抗ＣＣＬ２０で治療したマウスの脾臓又は腫瘍のいずれかにおけるｃｄ８＋  Ｔ細胞及び好中球／顆粒球性骨髄由来抑制細胞（ｇＭＤＳＣ）には変化は認められなかった（データは示さず）。
【０１５８】
考察
上記の実施例のデータは、免疫細胞のリクルートにおけるその公知の役割に加えて、ＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸のこれまでに同定されていない予想外の機能を実証している。詳細には、本明細書に示す研究は、癌に関してＣＣＬ２０がＣＳＣ機能において特異的な役割を有することを実証しており、これはこれまでに報告されていない知見に相当する。示される実施例の幾つかにおいて、それらの結果は、乳癌、結腸直腸癌、及び膵癌のモデルでＣＣＬ２０が非ＣＳＣ腫瘍細胞と比較してＣＳＣにおいて転写物レベル及びタンパク質レベルの両方で特異的に過剰発現することを示している。ＣＣＬ２０を細胞培養物に外因的に投与すると、表面マーカー分析によって決定するときＣＳＣの割合の直接的な増加がもたらされるとおり、これらの例からはまた、ＣＳＣ活性におけるＣＣＬ２０タンパク質の機能的役割も確認される。ＣＣＬ２０はまた、それぞれ幹細胞性遺伝子活性化及びスフェア成長を直接増加させるその効果によって分かるとおり、ＣＳＣの自己複製及び増殖機能も増加させる。インビトロでは、ＣＣＬ２０は、本発明者らの研究で培養培地中に分泌されるレベルと同程度であるのみならず、予後不良の結腸直腸癌患者に認められる循環レベル（Ｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）ともまた同程度である生理学的に関連性のある濃度でＣＳＣに活性を及ぼす。
【０１５９】
ＣＳＣに対するＣＣＬ２０のこの活性は予想外の知見であったが、他のケモカイン／サイトカインもまたＣＳＣ活性に直接的な効果を有することが示されている。インターロイキン−６（ＩＬ６）及びインターロイキン−８（ＩＬ８）は、両方ともに、乳癌ＣＳＣに直接的な効果をもたらすことが示されている（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｉｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。同様に、ＣＸＣ−モチーフリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）の調節は膠芽腫ＣＳＣを調節することが示されており（Ｗｕｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、一方でＣＣＬ３の活性はＣＭＬ白血病開始細胞のコンテクストに置かれた（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。従って、この知見と合わせると、増えつつある一連のエビデンスは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達、Ｗｎｔシグナル伝達、及びヘッジホッグシグナル伝達など、ＣＳＣの機能を調節するための従来の自己複製経路外におけるメディエーターの役割を指し示している。ＣＣＬ２０と受容体ＣＣＲ６との間のユニークな関係性を所与として、本発明者らは、ＣＣＬ２０がその受容体ＣＣＲ６へのシグナル伝達によってその活性をＣＳＣに及ぼすはずであると仮定した。ＣＣＲ６をノックアウトすることにより、本発明者らは、機能性ＣＳＣ活性の促進におけるＣＣＬ２０の活性にこの受容体が実際必要であることを確認した。しかし更には、本発明者らは、癌細胞株をこの受容体に関して陽性又は陰性のいずれかの画分に分離したとき、受容体陽性細胞のみがＣＣＬ２０刺激後に幹細胞性遺伝子の活性化を示したことを見出した。最後に、ＣＳＣが主にＣＣＬ２０＋／ＣＣＲ６＋細胞表面表現型と共局在するように思われるという観察から、ＣＳＣに対するＣＣＬ２０の活性がオートクリンループの結果であり得ることが示唆されるが、しかしながらこの仮説を確かめるには更なる研究が必要であろう。まとめると、このエビデンスは、ＣＣＬ２０が腫瘍細胞上のその受容体ＣＣＲ６を介したシグナル伝達によってＣＳＣにその活性を及ぼし、従って全体としてのＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸が、乳癌、膵癌、及び結腸直腸癌におけるＣＳＣ活性により実現し得るという結論を裏付けている。
【０１６０】
最近の発表において、ＡＰＣｍｉｎマウスはＣＣＲ６をノックアウトしたとき腸腫瘍発生の低下を示すことが実証された（Ｎａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。この結果は、ＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸を腸の腫瘍発生に関係付けるものであり、この場合もまた腫瘍の発生及び進行の根底にあるイベントにおけるこの軸の役割を強化する。このＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸がＣＳＣ表現型に関連するという我々の知見を所与として、本発明者らは、この軸の治療介入がＣＳＣを根絶する助けになり得ると予想した。実際、本発明者らは、ＣＣＬ２０に対する中和モノクローナル抗体による治療が、試験した３つ全ての腫瘍型のモデルにおいてＣＳＣ頻度及び活性を有意に低下させることを見出している。本発明者らは、ＣＣＬ２０の中和が膵癌モデルにおいて表面表現型陽性のＣＳＣの割合を直接低下させることを認めているが、本発明者らはまた、ＣＣＬ２０の中和が乳癌、膵癌、及び結腸直腸癌モデルにおいてスフェア成長を有意に阻害することも見出している。これらの結果から、本発明者らはＣＳＣ数だけでなく、更に重要なことにはＣＳＣ機能を阻害し得ることが確認される。
【０１６１】
インビボでは、ＣＳＣ機能はその腫瘍発生能によって計測することができる。本発明者らは、ＣＳＣエンリッチ膵癌スフェアをＣＣＬ２０中和モノクローナル抗体で処理すると、マウスモデルにおいて腫瘍形成の開始が劇的に遅延することを見出した。更に、抗ＣＣＬ２０  ＩｇＧで処理されたＣＳＣから実に形成される腫瘍は、アイソタイプ対照処理腫瘍と比較して腫瘍成長の有意な低下を示す。この知見から、上記の実施例で同定された、ＣＳＣ機能をドライブすることにおけるＣＣＬ２０の役割が、腫瘍発生及び腫瘍成長速度に与えるインビボでの影響につながることが確認される。
【０１６２】
ＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸は免疫細胞のリクルートにおける基本的機能を提供するため、本発明者らは、ＣＳＣが分泌するＣＣＬ２０が、腫瘍細胞に対するその直接的な効果に加えて、潜在的に腫瘍浸潤リンパ球のリクルートに影響を及ぼし得ると仮定する。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＣＬ２０レベルが肝細胞癌患者の腫瘍生検で調節性Ｔ細胞レベルと直接相関し、及びＣＣＬ２０がこの徴候で調節性Ｔ細胞の遊走を有意に促進したというエビデンスを示した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。多くの腫瘍型における調節性Ｔ細胞と予後不良の関連性を所与とすれば（Ｗａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、ＣＣＬ２０が、ＣＳＣ画分を調節することと腫瘍環境への免疫抑制性調節性Ｔ細胞のリクルートを刺激することとの両方によるワンツーパンチで腫瘍形成能を促進する機構を想定することができる。
【０１６３】
免疫担当腫瘍担持マウスを用いてインビボで試験したとき、本発明者らは、実際にＣＣＬ２０の中和がＴｒｅｇの腫瘍浸潤を阻害することを確認した。しかしながら、ＣＣＬ２０の中和はまたＴｈ１７の腫瘍浸潤も阻害しており、Ｔｈ１７細胞はＣＣＲ６＋として特徴付けられるため、これは予想される知見である。興味深いことに、本発明者らは、ＣＣＬ２０阻害が腫瘍におけるこれらの２つの免疫細胞型の頻度に影響を及ぼすのみならず、脾臓におけるＴｒｅｇ及びＴｈ１７細胞の頻度もまた低下させることを発見しており、単なる腫瘍浸潤を越えた、これらの２つの細胞型の阻害に対する末梢応答が示唆される。これとは逆に、本発明者らはまた、ＣＣＬ２０の中和が腫瘍における成熟樹状細胞の頻度を低下させたことも同定したが、しかしながら、この知見は脾臓における増加した未熟樹状細胞の存在によって反論された。この結果は、ＣＣＬ２０がまた、樹状細胞の成熟及びひいては腫瘍環境への浸潤においても役割を果たすことを示唆している。
【０１６４】
多くの腫瘍型におけるＴｒｅｇ及びＴｈ１７細胞と予後不良及び免疫抑制との関連性、及びＣＣＬ２０が腫瘍及び脾臓においてこれらの２つの細胞型の頻度を有意に低下させるという知見を所与とすれば、本発明者らの総合的知見は、ＣＣＬ２０が腫瘍環境において、１）ＣＳＣの活性及び腫瘍形成能をドライブすることにより、及び２）免疫抑制表現型を促進することにより、二重の役割を果たしていることを提案する。
【０１６５】
多数の前臨床及び臨床エビデンスが、癌治療におけるＣＳＣの決定的に重要な機能を指摘しており、従ってこの腫瘍細胞集団を標的化する治療には高い価値があり得る。本明細書に記載される研究は、ＣＳＣ管理におけるＣＣＬ２０−ＣＣＲ６軸の新規の重要な役割のみならず、免疫抑制表現型の支持におけるＣＣＬ２０の決定的に重要な役割もまた指摘している。この知見は、ＣＣＬ２０がＣＳＣ機能の促進と抗腫瘍免疫応答の妨害とによる２つの戦線で腫瘍促進的に作用するという仮説を裏付けている。本発明者らのデータは、ＣＣＬ２０の中和がＣＳＣ機能の阻害と免疫抑制表現型の軽減とを同時に行うのに有用な戦略であり得ることを示している。総じて、本発明者らは、この二重機構により、ＣＣＬ２０を遮断することによるＣＳＣの阻害が、癌を治療し及び患者の生活を改善するユニークで有効な療法を実現し得ると仮定する。
【０１６６】
参照による援用
本明細書で言及している全ての刊行物及び特許は、各個別の刊行物又は特許が参照によって援用されることを具体的且つ個別的に指示されたものとして本明細書によって全体として参照により援用される。
【０１６７】
本開示の具体的な態様が考察されているが、上記の明細書は例示的なものであり、制限するものではない。当業者には、本明細書及び以下の特許請求の範囲を精査することにより、本開示の多くの変形例が明らかになるであろう。本開示の完全な範囲は、特許請求の範囲をそれらの均等物の完全な範囲と共に参照し、及び本明細書をかかる変形例と共に参照することによって決定されるべきである。
【０１６８】
参照文献
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Ｇｈａｄｊａｒ，Ｐ．，Ｒｕｂｉｅ，Ｃ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｅｉｌｈｏｌｚ，Ｕ．（２００９）．Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ＣＣＬ２０  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＣＲ６  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ｗｉｔｈ  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｕ  ｃａｎｃｅｒ  １２５，７４１−７４５．
Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ，Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｓ．，Ｄｉｅｂｅｌ，Ｍ．Ｅ．，Ｋｏｒｋａｙａ，Ｈ．，Ｌｕｏ，Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．，Ｗｉｃｉｎｓｋｉ，Ｊ．，Ｃａｂａｕｄ，Ｏ．，Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ，Ｅ．，Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．ＣＸＣＲ１  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２０，４８５−４９７．
Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｐ．Ｃ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｈｅｒｒｌｅｒ，Ｔ．，Ａｉｃｈｅｒ，Ａ．，Ｅｌｌｗａｒｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｇｕｂａ，Ｍ．，Ｂｒｕｎｓ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｈｅｅｓｃｈｅｎ，Ｃ．（２００７）．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  １，３１３−３２３．
Ｈｉｒｓｃｈ，Ｄ．，Ｂａｒｋｅｒ，Ｎ．，ＭｃＮｅｉｌ，Ｎ．，Ｈｕ，Ｙ．，Ｃａｍｐｓ，Ｊ．，ＭｃＫｉｎｎｏｎ，Ｋ．，Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．，Ｒｉｅｄ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｇａｉｓｅｒ，Ｔ．（２０１４）．ＬＧＲ５  ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３５，８４９−８５８．
Ｉｌｉｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．，Ｈｉｒｓｃｈ，Ｈ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．（２０１１）．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎ−ｓｔｅｍ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ＩＬ６  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８，１３９７−１４０２．
Ｉｗａｔａ，Ｔ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．，Ｔｏｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｈｉｒｏ，Ｊ．，Ｆｕｊｉｋａｗａ，Ｈ．，Ｏｋｕｇａｗａ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．，Ｍｏｈｒｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｋｕｓｕｎｏｋｉ，Ｍ．（２０１３）．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３  ａｌｐｈａ（ＭＩＰ−３ａ）ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １０７，１６０−１６６．
Ｋｌｅｅｆｆ，Ｊ．，Ｋｕｓａｍａ，Ｔ．，Ｒｏｓｓｉ，Ｄ．Ｌ．，Ｉｓｈｉｗａｔａ，Ｔ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｈ．，Ｆｒｉｅｓｓ，Ｈ．，Ｂｕｃｈｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｚｌｏｔｎｉｋ，Ａ．，ａｎｄ  Ｋｏｒｃ，Ｍ．（１９９９）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｐ−３ａｌｐｈａ／ＬＡＲＣ／Ｅｘｏｄｕｓ，ａ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ａｎｄ  ｉｔｓ  ＣＣＲ６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｕ  ｃａｎｃｅｒ  ８１，６５０−６５７．
Ｌａｐｉｄｏｔ，Ｔ．，Ｓｉｒａｒｄ，Ｃ．，Ｖｏｒｍｏｏｒ，Ｊ．，Ｍｕｒｄｏｃｈ，Ｂ．，Ｈｏａｎｇ，Ｔ．，Ｃａｃｅｒｅｓ−Ｃｏｒｔｅｓ，Ｊ．，Ｍｉｎｄｅｎ，Ｍ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．，Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｄｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．（１９９４）．Ａ  ｃｅｌｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６７，６４５−６４８．
Ｌｉ，Ｃ．，Ｈｅｉｄｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｄａｌｅｒｂａ，Ｐ．，Ｂｕｒａｎｔ，Ｃ．Ｆ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ａｄｓａｙ，Ｖ．，Ｗｉｃｈａ，Ｍ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｍ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｓｉｍｅｏｎｅ，Ｄ．Ｍ．（２００７）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７，１０３０−１０３７．
Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｎ．，Ｌｉ，Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｋｅ，Ｆ．，Ｌｅｎｇ，Ｑ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｒｅｃｒｕｉｔ  ＣＣＲ６＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｖｉａ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ＣＣＬ２０  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１  Ａｐｒ  ２９；６（４）：ｅ１９４９５．
Ｍａｒｓｉｇｌｉａｎｔｅ，Ｓ．，Ｖｅｔｒｕｇｎｏ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｍｕｓｃｅｌｌａ，Ａ．（２０１３）．ＣＣＬ２０  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２２８，１８７３−１８８３．
Ｎａｎｄｉ，Ｂ．，Ｐａｉ，Ｃ．，Ｈｕａｎｇ，Ｑ．，Ｐｒａｂｈａｌａ，Ｒ．Ｈ．，Ｍｕｎｓｈｉ，Ｎ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｓ．（２０１４）．ＣＣＲ６，ｔｈｅ  ｓｏｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ＣＣＬ２０，ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ９，ｅ９７５６６．
Ｓｃｈｕｔｙｓｅｒ，Ｅ．，Ｓｔｒｕｙｆ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ，Ｊ．（２００３）．Ｔｈｅ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ＣＣＬ２０  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＣＲ６．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｖｉｅｗｓ  １４，４０９−４２６．
Ｔｅｈｒａｎｃｈｉ，Ｒ．，Ｗｏｌｌ，Ｐ．Ｓ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．，Ｂｕｚａ−Ｖｉｄａｓ，Ｎ．，Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｔ．，Ｍｅａｄ，Ａ．Ｊ．，Åｓｔｒａｎｄ−Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍ，Ｉ．，Ｓｔｒｏｅｍｂｅｃｋ，Ｂ．，Ｈｏｒｖａｔ，Ａ．，Ｆｅｒｒｙ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｄｅｌ（５ｑ）Ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｉｎ  Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６３，１０２５−１０３７．
ｖａｎ  Ｖｌｅｒｋｅｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｋｉｅｆｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｍｏｒｅｈｏｕｓｅ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｇｒｏｖｅｓ，Ｃ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｙａｏ，Ｙ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｈｕｒｔ，Ｅ．Ｍ．（２０１３）．ＥＺＨ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２，４３−５２．
Ｖｏｏ，ＫＳ，Ｂｏｖｅｒ，Ｌ，Ｈａｒｌｉｎｅ，ＭＬ，Ｖｉｅｎ，ＬＴ，Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉ  Ｖ，Ａｒｉｍａ，Ｋ，Ｋｗａｋ，ＬＷ，ａｎｄ  Ｌｉｕ，ＹＪ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＯＸ４０  ｅｘｐａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｂｌｏｃｋ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３  Ｏｃｔ  １；１９１（７）：３６４１−３６５０．
Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｇｕｏ，Ｊ．，Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｈ．Ｃ．，Ｇｏｒｅ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｇｕｏ，Ｎ．（２０１２）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４４  ａｎｄ  ＣＤ１３３  ａｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ２８，１３０１−１３０８．
Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｍａ，Ｙ．，Ｆａｎｇ，Ｙ．，Ｗｕ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｆｕ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｎ，Ｘ．（２０１２）．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ：ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６，４２５−４３６．
Ｗｕｒｔｈ，Ｒ．，Ｂａｊｅｔｔｏ，Ａ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｂａｒｂｉｅｒｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｆｌｏｒｉｏ，Ｔ．（２０１４）．ＣＸＣＬ１２  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４  ａｎｄ  ＣＸＣＲ７  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８，１４４．
Ｙｕ，Ｑ．，Ｌｏｕ，Ｘ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｅ，Ｙ．Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈ１７  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ｖｉａ  ＣＣＲ６−ＣＣＬ２０  Ｐａｔｈｗａｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１５  Ｍａｒ  １３；１０（３）：ｅ０１２０８５５．
Ｚｈａｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｑｉ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｘ．Ｎ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｄ．Ｌ．，Ｚｈａｏ，Ｊ．，Ｚｈｕ，Ｄ．Ｙ．，Ｗｕ，Ｋ．，Ｚｈｏｕ，Ｘ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｚｈａｏ，Ｓ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＣＬ２０／ＣＣＲ６  ａｘｉｓ  ｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ  Ｔｒｅｇ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ＮＳＣＬＣ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ２０１５  Ｆｅｂ；６９：２４２−８．
【図１Ａ−１Ｅ】
2018520177.tif 000004
【図２】
2018520177.tif 000005
【図３−１】
2018520177.tif 000006
【図３−２】
2018520177.tif 000007
【図４−１】
2018520177.tif 000008
【図４−２】
2018520177.tif 000009
【図５Ａ−５Ｄ】
2018520177.tif 000010
【図６Ａ−６Ｄ】
2018520177.tif 000011
【図７Ａ−７Ｃ】
2018520177.tif 000012
【図８Ａ−８Ｄ】
2018520177.tif 000013
【図９Ａ−９Ｅ】
2018520177.tif 000014
【図１０】
2018520177.tif 000015
【図１１−１】
2018520177.tif 000016
【図１１−２】
2018520177.tif 000017
【図１２Ａ−１２Ｃ】
2018520177.tif 000018
【図１３−１】
2018520177.tif 000019
【図１３−２】
2018520177.tif 000020
【図１４Ａ−１４Ｂ】
2018520177.tif 000021
【図１５Ａ−１５Ｄ】
2018520177.tif 000022
【図１６Ａ−１６Ｂ】
2018520177.tif 000023
【図１７Ａ−１７Ｂ】
2018520177.tif 000024
【図１８】
2018520177.tif 000025
【図１９−１】
2018520177.tif 000026
【図１９−２】
2018520177.tif 000027
【図２０−１】
2018520177.tif 000028
【図２０−２】
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【図２１Ａ−２１Ｅ】
2018520177.tif 000030
【図２２Ａ−２２Ｅ】
2018520177.tif 000031
【配列表】
2018520177000001.app
【国際調査報告】
2018520177.tif 000032
2018520177.tif 000033
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