(57)【要約】  ９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）などの可逆的リンカーを介して結合されたオキシントモジュリンおよびポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を含む組成物が開示される。可逆ペグ化オキシントモジュリンを含む医薬組成物およびそれを使用する方法も開示される。【選択図】なし
2018517697.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式ＩＩで表されるオキシントモジュリン結合体の調製方法であって、
【化１】
2018517697.tif 000053
（式中、Ｒ２はＳＯ３Ｈである）
下記の構造式で表されるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ｒ２＝ＳＯ３Ｈ）を、オキシントモジュリン樹脂（前記オキシントモジュリンのアミノ酸の側鎖を保護しておく）と反応させて、対応するＭＡＬ−ＦＭＳ−保護ＯＸＭを得るステップと、
【化２】
2018517697.tif 000054
（前記ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをトリフルオロ酢酸およびクロロスルホン酸と混合することにより調製する。すなわち、前記ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解し、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した過剰量の前記クロロスルホン酸を前記反応混合物に添加する）
得られた前記ＯＸＭを、スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）と反応させて（前記ＰＥＧ−ＳＨとの反応後またはその前に前記保護基および前記樹脂を除去する）、前記ＯＸＭのＨｉｓ１のアミノ残基を前記ＦＭＳに結合させ、これにより、構造式ＩＩで表される構造物を得るステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記過剰量が、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した６当量のクロロスルホン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０のアミノ残基の保護基が、１−［（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリジン）エチル］、（ｉｖＤｄｅ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）との反応が、６〜６．５の間のｐＨの緩衝液条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＥＧが、２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＥＧが、平均分子量で３０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
下記の構造式ＩＩＩで表されるオキシントモジュリン結合体の調製方法であって、
【化３】
2018517697.tif 000055
（式中、Ｒ２はＳＯ３Ｈである）
下記の構造式で表されるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ｒ２＝ＳＯ３Ｈ）を、オキシントモジュリン樹脂（前記オキシントモジュリンのアミノ酸の側鎖およびＨｉｓ１のα−アミノ基を保護しておく）と反応させて、対応するＭＡＬ−ＦＭＳ−保護ＯＸＭを得るステップと、
【化４】
2018517697.tif 000056
（前記ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをトリフルオロ酢酸およびクロロスルホン酸と混合することにより調製する。すなわち、前記ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解し、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した過剰量の前記クロロスルホン酸を前記反応混合物に添加する）
得られた前記ＯＸＭを、スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）と反応させて（前記ＰＥＧ−ＳＨとの反応後またはその前に前記保護基および前記樹脂を除去する）、前記ＯＸＭのＬｙｓ３０のアミノ残基を前記ＦＭＳに結合させ、これにより、構造式ＩＩＩで表される構造物を得るステップとを含む、方法。
【請求項８】
前記過剰量が、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した６当量のクロロスルホン酸を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｌｙｓ１２のアミノ残基の保護基が、１−［（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリジン）エチル］、（ｉｖＤｄｅ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｈｉｓ１のアミノ残基の保護基が、Ｂｏｃ基である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）との反応が、６〜６．５の間のｐＨの緩衝液条件下で実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＥＧが、２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＥＧが、平均分子量で３０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
下記の構造式ＩＶで表されるオキシントモジュリン結合体の調製方法であって、
【化５】
2018517697.tif 000057
（式中、Ｒ２はＳＯ３Ｈである）
下記の構造式で表されるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ｒ２＝ＳＯ３Ｈ）を、オキシントモジュリン樹脂（前記オキシントモジュリンのアミノ酸の側鎖およびＨｉｓ１のα−アミノ基を保護しておく）と反応させて、対応するＭＡＬ−ＦＭＳ−保護ＯＸＭを得るステップと、
【化６】
2018517697.tif 000058
（前記ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをトリフルオロ酢酸およびクロロスルホン酸と混合することにより調製する。すなわち、前記ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解し、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した過剰量の前記クロロスルホン酸を前記反応混合物に添加する）
得られた前記ＯＸＭを、スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）と反応させて（前記ＰＥＧ−ＳＨとの反応後またはその前に前記保護基および前記樹脂を除去する）、前記ＯＸＭのＬｙｓ１２のアミノ残基を前記ＦＭＳに結合させ、これにより、構造式ＩＶで表される構造物を得るステップとを含む、方法。
【請求項１５】
前記過剰量が、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した６当量のクロロスルホン酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｌｙｓ３０のアミノ残基の保護基が、１−［（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリジン）エチル］、（ｉｖＤｄｅ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｈｉｓ１のアミノ残基の保護基が、Ｂｏｃ基である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）との反応が、６〜６．５の間のｐＨの緩衝液条件下で実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＥＧが、２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＥＧが、平均分子量で３０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
下記の構造式で表されるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの調製方法であって、
【化７】
2018517697.tif 000059
ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをトリフルオロ酢酸およびクロロスルホン酸と混合するステップを含み、
前記ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解し、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した過剰量の前記クロロスルホン酸を前記反応混合物に添加する、方法。
【請求項２２】
前記過剰量が、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した６当量のクロロスルホン酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記調製が、前記ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを精製することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記精製することが、沈殿および濾過を含み、前記ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳが少なくとも約５０％の純度を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記純度が少なくとも９０％である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）などの可逆的リンカーを介して結合されたオキシントモジュリンおよびポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を含む組成物が開示される。可逆ペグ化（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）オキシントモジュリンを含む医薬組成物およびそれを使用する方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
胃腸管は、膵臓タンパク質（ＰＰ）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）およびオキシントモジュリン（ＯＸＭ）を含む、摂食挙動を調節する多くのペプチドホルモンの合成および放出に関与する。ＯＸＭは、腸およびＣＮＳにおけるプログルカゴンの組織特異的な移行後のプロセシングから生じる。ＯＸＭは、Ｃ末端塩基性オクタペプチド伸長部を有する完全なグルカゴン配列を含む３７個のアミノ酸を含む。このオクタペプチド伸長部は、インビトロおよびインビボの両方でＯＸＭの特性に寄与するが、単独ではペプチドの作用に十分ではないことが示された。食物摂取に応答して、ＯＸＭは、腸のＬ細胞によって、食事のカロリー含量に比例して血流中に分泌される。
【０００３】
ＯＸＭは、経口投与と腹腔内投与の両方の後にインスリン分泌の刺激を介してグルコースクリアランスを向上させる。ＯＸＭは食物摂取量も調節する。視床下部の室傍核および弓状核（ＡＲＣ）へのＯＸＭの脳室内注射（ＩＣＶ）ならびに核内注射は、空腹時のラットにおける再摂食を抑制する。この抑制は、暗期の開始時に自由に摂食させたラットにおいても示されている。さらに、ＯＸＭの末梢投与は、絶食誘導食物摂取および暗期の食物摂取の両方を用量依存的に抑制した。
【０００４】
短い血清半減期などの好ましくない薬物動態は、それ以外の点では有望な多くの薬剤候補の医薬品開発を妨げ得る。血清半減期は、実験によって得られる分子の特性であり、それぞれの新しい有望な薬物について実験的に決定する必要がある。例えば、低分子量タンパク質薬物を用いた場合、腎濾過などの生理的クリアランス機構に起因して、必要な投与計画のコストまたは頻度の制約から、治療レベルの薬物を維持することが実現不可能になる場合がある。
【０００５】
タンパク質、特に短ペプチドは、血液、肝臓または腎臓において変性または酵素分解を受けやすい。したがって、タンパク質は通常、循環半減期が数時間と短い。ペプチド薬は、安定性が低いため、活性ペプチドの有効血漿濃度を維持するために、通常、継続的に繰り返して送達される。さらに、ペプチド薬は通常、点滴により投与されるので、ペプチド薬の頻繁な注射は対象に対してかなりの不快感をもたらす。したがって、その高い薬効を維持しながら、治療用タンパク質およびペプチドの半減期を延長させる技術が必要である。このような望ましいペプチド薬はまた、血清安定性が高いこと、活性が高いこと、および対象に注射した場合に望ましくない免疫応答を誘導する可能性の低いこと、の要件も満たすべきである。
【０００６】
本発明は、可逆的ペグ化技術を利用してペプチドの半減期を延長させたＯＸＭ誘導体に関する。
【発明の概要】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）からなる組成物に関し、前記ＰＥＧポリマーは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して前記オキシントモジュリンのアミノ末端に結合している。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）からなる組成物に関し、前記ＰＥＧポリマーは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基（Ｌｙｓ１２）に結合している。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）からなる組成物に関し、前記ＰＥＧポリマーは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号３０のリシン残基（Ｌｙｓ３０）に結合している。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、下記の構造式ＩＩで表されるオキシントモジュリン結合体の調製方法を提供し、
【００１１】
【化１】
2018517697.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ２はＳＯ３Ｈである）
【００１３】
前記方法は、
下記の構造式で表されるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ｒ２＝ＳＯ３Ｈ）を、オキシントモジュリン樹脂（前記オキシントモジュリンのアミノ酸の側鎖を保護しておく）と反応させて、対応するＭＡＬ−ＦＭＳ−保護ＯＸＭを得ること；
続けて、スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）と反応させて（前記ＰＥＧ−ＳＨとの反応後またはその前に前記保護基および前記樹脂を除去する）、前記ＯＸＭのＨｉｓ１のアミノ残基を前記ＦＭＳに結合させ、これにより、構造式ＩＩで表される構造物を得ること、を含む。
【００１４】
【化２】
2018517697.tif 000004
【００１５】
（前記ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをトリフルオロ酢酸およびクロロスルホン酸と混合することにより調製する。すなわち、前記ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解し、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した過剰量の前記クロロスルホン酸をその反応混合物に添加する）
【００１６】
一実施形態では、本発明は、下記の構造式ＩＩＩで表されるオキシントモジュリン結合体の調製方法を提供し
【００１７】
【化３】
2018517697.tif 000005
【００１８】
（式中、Ｒ２はＳＯ３Ｈである）
【００１９】
前記方法は、
下記の構造式で表されるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ｒ２＝ＳＯ３Ｈ）を、オキシントモジュリン樹脂（前記オキシントモジュリンのアミノ酸の側鎖およびＨｉｓ１のα−アミノ基を保護しておく）と反応させて、対応するＭＡＬ−ＦＭＳ−保護ＯＸＭを得ること；
続けて、スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）と反応させて（前記ＰＥＧ−ＳＨとの反応後またはその前に前記保護基および前記樹脂を除去する）、前記ＯＸＭのＬｙｓ３０のアミノ残基を前記ＦＭＳに結合し、構造式ＩＩＩの構造物を得ること、を含む。
【００２０】
【化４】
2018517697.tif 000006
【００２１】
（前記ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをトリフルオロ酢酸およびクロロスルホン酸と混合することにより調製する。すなわち、前記ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解し、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した過剰量の前記クロロスルホン酸をその反応混合物に添加する）
【００２２】
一実施形態では、本発明は、下記の構造式ＩＶで表されるオキシントモジュリン結合体の調製方法を提供し、
【００２３】
【化５】
2018517697.tif 000007
【００２４】
（式中、Ｒ２はＳＯ３Ｈである）
【００２５】
前記方法は、
下記の構造式で表されるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ｒ２＝ＳＯ３Ｈ）を、オキシントモジュリン樹脂（前記オキシントモジュリンのアミノ酸の側鎖およびＨｉｓ１のα−アミノ基を保護しておく）と反応させて、対応するＭＡＬ−ＦＭＳ−保護ＯＸＭを得ること；
続けて、スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）と反応させて（前記ＰＥＧ−ＳＨとの反応後またはその前に前記保護基および前記樹脂を除去する）、前記ＯＸＭのＬｙｓ１２のアミノ残基を前記ＦＭＳに結合し、構造式ＩＶの構造物を得ること、を含む。
【００２６】
【化６】
2018517697.tif 000008
【００２７】
（前記ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをトリフルオロ酢酸およびクロロスルホン酸と混合することにより調製する。すなわち、前記ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解し、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した過剰量の前記クロロスルホン酸をその反応混合物に添加する）
【００２８】
一実施形態では、本発明は、下記の構造式で表されるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの調製方法を提供し、前記方法は、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをトリフルオロ酢酸およびクロロスルホン酸と混合することを含み、前記ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解し、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した過剰量の前記クロロスルホン酸をその反応混合物に添加する。
【００２９】
【化７】
2018517697.tif 000009
【００３０】
一実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した２〜１０当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した６当量のクロロスルホン酸の使用を含む。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載例および図面から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好適実施形態を示してはいるが、この詳細な説明から、本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が当業者には明らかであり、したがって、これらは実例として与えられているにすぎないことを理解されたい。
【００３２】
次の図は、本明細書の一部を構成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含められており、本明細書で提示される具体的実施形態の詳細説明と合わせて、１つまたは複数のこれらの図を参照することにより、本開示の発明がさらに良く理解できる。特許または特許出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。このカラー図面（単一または複数）を含む特許または特許出願公開公報のコピーは、要求があれば、有料で米国特許商標局より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】生成したＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ結合体の種々の変異体を示す図である。
【図２】ＧＬＰ−１受容体を過剰発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞と共にインキュベートした場合の異種混在ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよび３種類のＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体（アミノ、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）のインビトロ活性（ｃＡＭＰの定量化）を示すグラフである。
【図３】ＩＰＧＴＴモデルにおける異種混在ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよび３種類のＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体（アミノ、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）のインビボ活性を示すグラフである。全ての化合物は、ビークル群と比較して耐糖能を誘導した。
【図４】雄のｏｂ／ｏｂマウスの体重に対する異種混在ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよび３種類のＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体（アミノ、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）の効果を示すグラフである。
【図５】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける食物摂取量に対する異種混在ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよび３種類のＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体（アミノ、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）の効果を示すグラフである。
【図６Ａ】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける非空腹時のグルコースに対する異種混在ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよび３種類のＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体（アミノ、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）の効果を示すグラフである。
【図６Ｂ】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける空腹時のグルコースに対する異種混在ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよび３種類のＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体（アミノ、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）の効果を示すグラフである。
【図７】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける累積食物摂取量に対するＭＯＤ−６０３１、ＯＸＭおよびリラグルチドの効果を示すグラフである。
【図８】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける体重に対するＭＯＤ−６０３１、ＯＸＭおよびリラグルチドの効果を示すグラフである。
【図９】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける自由摂食時（図９Ａ）および空腹時（図９Ｂ）の血糖値に対するＭＯＤ−６０３１、ＯＸＭおよびリラグルチドの効果を示すグラフである。
【図１０】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける試験の２日目の耐糖能（２ｇ／ｋｇ  ｐｏ）に対するＭＯＤ−６０３１および同時飼育群の効果を示すグラフである。
【図１１】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける試験の３０日目の耐糖能（２ｇ／ｋｇ  ｐｏ）に対するＭＯＤ−６０３１および同時飼育群の効果を示すグラフである。
【図１２】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける最終血漿コレステロールに対するＭＯＤ−６０３１、ＯＸＭおよびリラグルチドの効果を示すグラフである。
【図１３】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける体重に対するＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、ＭＯＤ−６０３１、およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの効果を示すグラフである。
【図１４】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける累積食物摂取量に対するＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、ＭＯＤ−６０３１、およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの効果を示すグラフである。
【図１５Ａ】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける自由摂食時の血糖値に対するＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、ＭＯＤ−６０３１、およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの反復投与の効果を示すグラフである。
【図１５Ｂ】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける空腹時の血糖値に対するＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、ＭＯＤ−６０３１、およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの反復投与の効果を示すグラフである。
【図１６】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける耐糖能（２ｇ／ｋｇ  ｐｏ）に対するＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、ＭＯＤ−６０３１、およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの効果を示すグラフである。
【図１７】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける耐糖能（２ｇ／ｋｇ  ｐｏ）に対するＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、ＭＯＤ−６０３１、およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの反復投与の効果を示すグラフである。
【図１８】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける非空腹時最終血漿脂質に対するＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、ＭＯＤ−６０３１、およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの反復投与の効果を示すグラフである。
【図１９】雄のｏｂ／ｏｂマウスにおける非空腹時最終血漿フルクトサミンに対するＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、ＭＯＤ−６０３１、およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの反復投与の効果を示すグラフである。
【図２０】種々のｐＨレベルでのリン酸緩衝液中の、ＭＯＤ−６０３１（図２０Ａ）、ＯＸＭ（図２０Ｃ）、およびＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（図２０Ｂ）の平均濃度対時間を示すグラフである。図中に示す樹脂結合ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭはＭＯＤ−６０３１であり、図２８Ａに示す構造式を有する。図中のＰＥＧ−ＦＭＳは、図２８Ｂに示すＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを意味する。
【図２１】種々の温度でのラット血漿中の、ＭＯＤ−６０３１（図２１Ａ）、ＯＸＭ（図２１Ｃ）、およびＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（図２１Ｂ）の平均濃度対時間を示すグラフである。図中に示す樹脂結合ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭはＭＯＤ−６０３１であり、図２８Ａに示す構造式を有する。図中のＰＥＧ−ＦＭＳは、図２８Ｂに示すＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを意味する。
【図２２Ａ】異なる種類の血漿中の、ＭＯＤ−６０３１の平均濃度対時間を示すグラフである。図中に示す樹脂結合ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭはＭＯＤ−６０３１であり、図２８Ａに示す構造式を有する。図中のＰＥＧ−ＦＭＳは、図２８Ｂに示すＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを意味する。
【図２２Ｂ】異なる種類の血漿中の、ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの平均濃度対時間を示すグラフである。図中に示す樹脂結合ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭはＭＯＤ−６０３１であり、図２８Ａに示す構造式を有する。図中のＰＥＧ−ＦＭＳは、図２８Ｂに示すＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを意味する。
【図２２Ｃ】異なる種類の血漿中の、ＯＸＭの平均濃度対時間を示すグラフである。図中に示す樹脂結合ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭはＭＯＤ−６０３１であり、図２８Ａに示す構造式を有する。図中のＰＥＧ−ＦＭＳは、図２８Ｂに示すＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを意味する。
【図２３】ｐＨ＝６でのＯＸＭおよびＯＸＭ＋ＤＰＰＩＶの分解アッセイを示す図である。
【図２４】ｐＨ＝７でのＯＸＭおよびＯＸＭ＋ＤＰＰＩＶの分解アッセイを示す図である。
【図２５】ｐＨ＝６でのＭＯＤ−６０３１、ＭＯＤ−６０３１＋ＤＰＰＩＶ（１Ｘ［ＤＰＰＩＶ濃度］および１０Ｘ［ＤＰＰＩＶ濃度］）の分解アッセイを示す図である。
【図２６】ｐＨ＝６でのＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ＋ＤＰＰＩＶの分解アッセイを示す図である。
【図２７】ＭＯＤ−６０３１は最終グルコースを用量依存的に減らし、インスリンを顕著に減らすこと示す。
【図２８Ａ】ＰＥＧがＰＥＧ３０で、Ｒ２が位置Ｃ２のＳＯ３Ｈである場合のＭＯＤ−６０３１の構造式を示す図である。
【図２８Ｂ】ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの構造式を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
長時間作用型のオキシントモジュリンならびにその製造方法および使用法が本明細書で提供される。一態様では、本発明は、デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）およびフレキシブルリンカーを含むか、またはそれらからなる結合体を提供する。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーを含むか、またはそれらからなる結合体を提供する。別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）もしくはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーを含むか、またはそれらからなる結合体を提供する。別の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介してオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基（Ｌｙｓ１２）に結合している。一実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、および任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介してオキシントモジュリンアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基（Ｌｙｓ１２）に結合しているポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を含むか、またはそれらからなる結合体である。
【００３６】
別の実施形態では、ペプチドの血清半減期を延長させるための新規な方法が本明細書で提供される。この方法は、天然ペプチドを血流中に徐放させる（ＦＭＳまたはＦｍｏｃと呼ばれる）化学リンカーを介したペプチドへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の可逆的結合を含む結合体の使用に基づいている。その後、放出ペプチドは、血液脳関門を通過して中枢神経系（ＣＮＳ）に入るか、または任意の他の標的臓器に入ることもできる。一実施形態では、ＦＭＳリンカーの独特の化学構造式は、特定の速度のペプチド放出につながる。
【００３７】
したがって、別の実施形態では、ＯＸＭペプチドの生物学的半減期を延長させるための方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、生体液中のＯＸＭの循環時間を延長させるための方法であって、前記循環時間が無損傷のＯＸＭペプチドの徐放により延長される方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、前記ＯＸＭペプチドの前記生物学的半減期または前記循環時間の延長により、前記ＯＸＭは血液脳関門を通過し、ＣＮＳを標的にすることが可能になる。生体液が、血液、血清、および脳脊髄液（ＣＳＦ）などであってもよいことは当業者には理解されよう。
【００３８】
一実施形態では、対象への本発明のペグ化オキシントモジュリン結合体の投与の際に、オキシントモジュリンは、前記結合体の前記ＦＭＳまたは前記Ｆｍｏｃリンカーの化学的加水分解の結果として、対象の生体液中に放出される。別の実施形態では、放出されたオキシントモジュリンは無損傷であり、完全なＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体結合活性を回復する。別の実施形態では、前記ＦＭＳまたは前記Ｆｍｏｃを化学的に加水分解することにより、前記生体液中の前記ＯＸＭペプチドの循環時間が延長される。別の実施形態では、前記ＯＸＭの循環時間の延長により、前記ＯＸＭが血液脳関門を通過し、ＣＮＳを標的にすることが可能になる。別の実施形態では、前記ＯＸＭの循環時間の延長により、前記ＯＸＭが血液脳関門を通過し、視床下部を標的にすることが可能になる。別の実施形態では、前記ＯＸＭの循環時間の延長により、前記ＯＸＭが血液脳関門を通過し、弓状核を標的にすることが可能になる。
【００３９】
一態様では、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体は、二官能性リンカー（ＦＭＳまたはＦｍｏｃ）を介して結合したＯＸＭおよびｍＰＥＧ（３０）−ＳＨを含む部位特異的結合体である。別の実施形態では、ＯＸＭペプチドは、一方の側からリンカー上のＮ−スクシンイミドエステル（ＮＨＳ）基と反応するＮ末端側の末端アミンを介して結合されており、また、ｍＰＥＧ（３０）−ＳＨは、そのチオール基によりＦＭＳリンカーのマレイミド部分に連結されている（本明細書の実施例を参照のこと）。Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０変異体は、それらのリシン残基のアミン基を介してＦＭＳリンカーに結合される。一実施形態では、本明細書による可逆的ペグ化方法を利用して、本明細書で提供される長時間作用型オキシントモジュリン（ＯＸＭ）ペプチド（例えば、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ）を生成する。
【００４０】
一実施形態では、デュアル「ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト」および「アゴニスト」という用語は、本明細書では同義に使用される。別の実施形態では、この用語は、当技術分野で公知の任意のＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストも含む。別の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、天然のデュアルアゴニストを含む。別の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、非天然のデュアルアゴニストを含む。別の実施形態では、非天然のＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、オキシントモジュリンに対するのとは異なるこれらのレセプターに対する親和性で、ＧＬＰ−１およびグルカゴンレセプターに結合する。別の実施形態では、好ましいアゴニストは、オキシントモジュリンもしくはＯＸＭまたはその機能性変異体である。
【００４１】
一実施形態では、「機能性」という用語は、本明細書にさらに提供されるような体重減少、インスリン感受性の増加、インスリン抵抗性の低下、エネルギー消費の増加、耐糖能の誘導、血糖コントロールの誘導、コレステロール値の改善などを含むがこれらに限定されない生物活性を有する、本明細書で提供されるアゴニストまたはＯＸＭの能力を意味する。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーを含む結合体を提供し、このＰＥＧポリマーは、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介して前記オキシントモジュリンアミノ酸配列の位置番号３０のリシン残基（Ｌｙｓ３０）に結合している。一実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、および任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介してオキシントモジュリンアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基（Ｌｙｓ３０）に結合しているポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を含むか、またはそれらからなる結合体である。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーからなる結合体を提供し、このＰＥＧポリマーは、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介して前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号３０のリシン残基（Ｌｙｓ３０）に結合している。一実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、および任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介してオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基（Ｌｙｓ３０）に結合しているポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を含むか、またはそれらからなる結合体である。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーを含む結合体を提供し、このＰＥＧポリマーは、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介して前記オキシントモジュリンのアミノ末端に結合している。一実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、およびＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介してオキシントモジュリンアミノ酸配列のアミノ末端に結合しているポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を含むか、またはそれらからなる組成物である。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーからなる結合体を提供し、このＰＥＧポリマーは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介して前記オキシントモジュリンのアミノ末端に結合している。一実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、およびＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介してオキシントモジュリンのアミノ酸配列のアミノ末端に結合しているポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を含むか、またはそれらからなる結合体である。
【００４６】
別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンペプチド、ならびに９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーを介してオキシントモジュリンペプチドの位置１２のリシンアミノ酸（Ｌｙｓ１２）もしくは位置３０のリシンアミノ酸（Ｌｙｓ３０）またはオキシントモジュリンペプチドのアミノ末端のリシンアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを含む結合体を提供する。別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンペプチド、ならびに９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーを介してオキシントモジュリンペプチドの位置１２のリシンアミノ酸（Ｌｙｓ１２）もしくは位置３０のリシンアミノ酸（Ｌｙｓ３０）またはオキシントモジュリンペプチドのアミノ末端のリシンアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーからなる修飾オキシントモジュリンペプチドを提供する。別の実施形態では、ＰＥＧがＬｙｓ１２、Ｌｙｓ３０またはアミノ末端でオキシントモジュリンに結合している結合体は、それぞれオキシントモジュリンの「Ｌｙｓ１２変異体」、「Ｌｙｓ３０変異体」または「アミノ変異体」と呼ばれる。一実施形態では、「アミノ変異体」または「アミノ末端変異体」という用語は、「Ｎ末端の変異体」、「Ｎ'変異体」または「Ｎ末端変異体」と同義である。当業者が、これらのリシン残基と本明細書で提供されるリンカー（ＦｍｏｃまたはＦＭＳ）／ＰＥＧ結合体を結合させるために、部位特異的にまたはランダムにＯＸＭ配列全体にわたりリシン残基を容易に挿入するように本発明によって導かれ得ることは理解されたい。一実施形態では、１つまたは複数のリシン残基が、ＯＸＭ配列全体にわたって異なる位置に配置され、ＯＸＭをＰＥＧおよび切断可能なリンカー（例えば、ＦＭＳまたはＦｍｏｃ）に結合するために使用されている変異体も本発明に包含される。
【００４７】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンペプチド、ならびに任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーを介してオキシントモジュリンペプチドの位置１２のリシンアミノ酸（Ｌｙｓ１２）および位置３０のリシンアミノ酸（Ｌｙｓ３０）に結合しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを含む結合体を提供する。別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンペプチド、ならびに任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーを介してオキシントモジュリンペプチドの位置１２のリシンアミノ酸（Ｌｙｓ１２）およびアミノ末端のリシンアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを含む結合体を提供する。別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンペプチド、ならびに任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）リンカーを介してオキシントモジュリンペプチドの位置３０のリシンアミノ酸（Ｌｙｓ３０）およびアミノ末端のリシンアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを含む結合体を提供する。
【００４８】
別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、ペグ化オキシントモジュリンである。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは可逆ペグ化オキシントモジュリンである。別の実施形態では、「長時間作用型オキシントモジュリン」、「可逆ペグ化オキシントモジュリン」、「可逆的ペグ化ＯＸＭ」、または「オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）もしくはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含むか、またはそれらからなる結合体」という語句は、同義に使用される。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳリンカーを介してＰＥＧに結合されたＯＸＭである。別の実施形態では、長時間作用型ＯＸＭは、そのＬｙｓ１２残基、もしくはそのＬｙｓ３０残基またはそのアミノ（Ｎ'）末端を介して任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳに結合されている。
【００４９】
一実施形態では、本発明の長時間作用型オキシントモジュリンは、ＰＥＧポリマーを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型オキシントモジュリンは、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してオキシントモジュリンペプチドのアミノ末端に結合しているＰＥＧポリマーを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型オキシントモジュリンは、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してオキシントモジュリンペプチドのリシン残基１２または３０に結合しているＰＥＧポリマーを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリンペプチドのアミノ末端ならびにオキシントモジュリンのリシン残基１２および３０の両方に任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して結合しているＰＥＧポリマーを含む。
【００５０】
別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を１：０．２〜１０：０．２〜１０のモル比で含むか、またはそれらからなる結合体である。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を１：０．５〜２：０．５〜２のモル比で含むか、またはそれらからなる結合体である。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を１：１：１のモル比で含むか、またはそれらからなる結合体である。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してオキシントモジュリンのアミノ末端に結合しているＰＥＧポリマーを含む。別の実施形態では、ＯＸＭ−ＰＥＧ−リンカーのモル比は１：１：１〜１：１：３．５である。別の実施形態では、このモル比は１：１：１〜１：１：１０．０である。別の実施形態では、リンカーの比率が高いと、結合体の収率を最適化できる。
【００５１】
別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、限定されないが任意に置換されてもよいＦｍｏｃおよびＦＭＳなどの可逆的リンカーを介してＰＥＧに結合される。別の実施形態では、ＦｍｏｃおよびＦＭＳは、塩基に感受性があり、生理的条件下で除去可能である。別の実施形態では、可逆的リンカーは、塩基に感受性があり、生理的条件下で除去可能であるリンカーである。別の実施形態では、可逆的リンカーは、塩基に感受性があり、血液、血漿、またはリンパ液中の生理的条件下で除去可能であるリンカーである。別の実施形態では、可逆的リンカーは、塩基に感受性があり、体液中の生理的条件下で除去可能であるリンカーである。別の実施形態では、可逆的リンカーは、塩基性ｐＨを有する体液中で除去可能であるリンカーである。別の実施形態では、塩基に感受性があるリンカーは、塩基性環境への曝露時に切断され、リンカーおよびＰＥＧからＯＸＭを放出する。別の実施形態では、温度に感受性があるリンカーは、このような切断が生じることを可能にする特定の温度に曝されると切断される。別の実施形態では、リンカーの切断を可能にする温度は、生理学的範囲内である。別の実施形態では、可逆的リンカーは、当該技術分野において既知の任意の可逆的リンカーである。
【００５２】
別の実施形態では、可逆ペグ化オキシントモジュリンは、ＯＸＭが可逆的リンカーを介してＰＥＧに結合されている結合体である。別の実施形態では、可逆ペグ化オキシントモジュリンは、塩基性環境にさらされると、遊離ＯＸＭを放出する。別の実施形態では、可逆ペグ化オキシントモジュリンは、血液または血漿に曝露されると、遊離ＯＸＭを放出する。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、標準的なペグ化手順の場合のように、互いに直接結合されていないＰＥＧおよびオキシントモジュリンを含むが、両方の残基はむしろ、塩基に対して非常に感受性があり、通常の生理的条件下で除去可能であるＦｍｏｃまたはＦＭＳの異なる位置に結合されている。別の実施形態では、通常の生理的条件は、血液または血漿などの生理的環境を含む。
【００５３】
別の実施形態では、ＦｍｏｃおよびＦＭＳの構造式および作製プロセスは、米国特許第７５８５８３７号に記載されている。米国特許第７５８５８３７号の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００５４】
一実施形態では、本発明の結合体は、下記の構造式Ｉおよびその薬学的に許容可能な塩で表される。
（Ｘ）ｎ−Ｙ、
式中、
Ｙは、遊離アミノ、カルボキシル、またはヒドロキシルを有するデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストであり、
Ｘは、構造式（ｉ）：
【００５５】
【化８】
2018517697.tif 000010
【００５６】
である。
式中、
Ｒ１は、タンパク質またはポリマー担体部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む基であり、
Ｒ２は、水素、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アリール、アルカリル、アラルキル、ハロゲン、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨＲ、アミノ、アンモニウム、カルボキシル、ＰＯ３Ｈ２およびＯＰＯ３Ｈ２からなる基から選択され、
Ｒは、水素、アルキルおよびアリールからなる基から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、同一または異なり、それぞれ、水素、アルキルおよびアリールからなる基から選択され、
Ａは、この基がＯＸＭ−Ｙのアミノ基またはヒドロキシル基に結合しているときに共有結合であり、
ｎは、少なくとも１の整数である。
【００５７】
一実施形態では、Ｒ１は、タンパク質またはポリマー担体部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む基である。別の実施形態では、ＰＥＧ部分は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−マレイミド−Ｓ−ＰＥＧであり、ｐは１〜６の整数である。別の実施形態では、ｐは２である。
【００５８】
別の実施形態では、構造式Ｉのｎは、少なくとも１の整数である。別の実施形態では、ｎは１である。別の実施形態では、ｎは２である。別の実施形態では、ｎは１〜５である。別の実施形態では、ｎは２〜５である。
【００５９】
別の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、オキシントモジュリン（ＯＸＭ）である。
【００６０】
別の実施形態では、「アルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「アリール」、「アルカリル」および「アラルキル」という用語を使用して、１〜８個、好ましくは１〜４個の炭素原子のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、およびブチル、ならびに６〜１０個の炭素原子のアリール基、例えば、フェニルおよびナフチルを意味する。「ハロゲン」という用語は、ブロモ、フルオロ、クロロおよびヨードを含む。
【００６１】
別の実施形態では、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素である。
【００６２】
別の実施形態では、Ｒ２は水素であり、Ａは、−ＯＣＯ−［−ＯＣ（＝Ｏ）−］、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素、すなわち、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（以下、「Ｆｍｏｃ」）である。
【００６３】
別の実施形態では、Ｒ２は、フルオレン環の位置２にある−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素であり、Ａは、−ＯＣＯ−［−ＯＣ（＝Ｏ）］である。別の実施形態では、Ｒ２は、フルオレン環の位置１にある−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素であり、Ａは、−ＯＣＯ−［−ＯＣ（＝Ｏ）］である。別の実施形態では、Ｒ２は、フルオレン環の位置３にある−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素であり、Ａは、−ＯＣＯ−［−ＯＣ（＝Ｏ）］である。別の実施形態では、Ｒ２は、フルオレン環の位置４にある−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素であり、Ａは、−ＯＣＯ−［−ＯＣ（＝Ｏ）］である。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの１、２、３もしくは４またはこれらの任意の組み合わせの位置にある。
【００６４】
一実施形態では、本発明の結合体は、構造式ＩＩで表され、ＯＸＭは前記ＯＸＭのアミノ末端を介してリンカーに結合される。
【００６５】
【化９】
2018517697.tif 000011
【００６６】
式中、Ｒ２は水素またはＳＯ３Ｈである。一実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置２にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置１にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置３にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置４にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの１、２、３もしくは４またはこれらの任意の組み合わせの位置にある。一実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈで、フルオレンの位置２にあり、ＰＥＧはＰＥＧ３０である。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈで、フルオレンの位置１にあり、ＰＥＧはＰＥＧ３０である。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈで、フルオレンの位置３にあり、ＰＥＧはＰＥＧ３０である。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈで、フルオレンの位置４にあり、ＰＥＧはＰＥＧ３０である。
【００６７】
一実施形態では、ＭＯＤ−６０３１は構造式ＩＩａで表され、ＰＥＧはＰＥＧ３０であり、Ｒ２はフルオレンの位置２にあるＳＯ３Ｈである。
【００６８】
【化１０】
2018517697.tif 000012
【００６９】
一実施形態では、本発明の結合体は、構造式ＩＩＩで表され、ＯＸＭは前記ＯＸＭのアミノ残基のＬｙｓ３０を介してリンカーに結合される。
【００７０】
【化１１】
2018517697.tif 000013
【００７１】
式中、Ｒ２は水素またはＳＯ３Ｈである。一実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置２にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置１にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置３にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置４にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの１、２、３もしくは４またはこれらの任意の組み合わせの位置にある。
【００７２】
一実施形態では、本発明の結合体は、構造式ＩＶで表され、ＯＸＭは前記ＯＸＭのアミノ残基のＬｙｓ１２を介してリンカーに結合される。
【００７３】
【化１２】
2018517697.tif 000014
【００７４】
式中、Ｒ２は水素またはＳＯ３Ｈである。一実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置２にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置１にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置３にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置４にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの１、２、３もしくは４またはこれらの任意の組み合わせの位置にある。
【００７５】
一実施形態では、本発明の結合体は、下記の構造式で表される。ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭ。式中、ｎは、少なくとも１の整数である。別の実施形態では、ＯＸＭは、ＯＸＭのアミノ末端またはＯＸＭアミノ酸の１つのアミノ残基を介してＦＭＳまたはＦｍｏｃに結合される。別の実施形態では、ＰＥＧは、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−マレイミド−Ｓ−を介してＦｍｏｃまたはＦＭＳに結合され、ｐは１〜６の整数であり、ＰＥＧはスルフィド基に結合される。
【００７６】
一実施形態では、本発明のＦｍｏｃは、下記の構造式で表される。
【００７７】
【化１３】
2018517697.tif 000015
【００７８】
一実施形態では、本発明のＦＭＳは、下記の構造式で表される。
【００７９】
【化１４】
2018517697.tif 000016
【００８０】
一実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置２にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置１にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置３にある。別の実施形態では、Ｒ２はＳＯ３Ｈであり、フルオレンの位置４にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの１、２、３もしくは４またはこれらの任意の組み合わせの位置にある。
【００８１】
別の実施形態では、ＯＸＭは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態においては、ＯＸＭは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、配列番号１は、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号１）のアミノ酸（ＡＡ）配列を含むかまたはそれからなる。別の実施形態では、ＯＸＭは、ＣＡＳ番号６２３４０−２９−８で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００８２】
別の実施形態では、ＯＸＭは、ヒトＯＸＭまたは任意の哺乳動物のＯＸＭである。別の実施形態では、ＯＸＭは、グルカゴン−３７または生物活性エンテログルカゴンとも呼ばれている。別の実施形態では、ＯＸＭは、デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストである。別の実施形態では、ＯＸＭは、ＯＸＭの生物活性のある断片である。別の実施形態では、生物活性のあるＯＸＭは、配列番号１のアミノ酸３０〜アミノ酸３７に及ぶ。別の実施形態では、生物活性のあるＯＸＭは、配列番号１のアミノ酸１９〜アミノ酸３７に及ぶ。別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、２個のＣ末端アミノ酸が除去されたオクタペプチドに相当する。別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、本明細書で提供されるようなＯＸＭ活性を保持する配列番号１の任意の断片に相当する。
【００８３】
一実施形態では、ＯＸＭは、配列番号１のペプチドのペプチド相同体を意味する。一実施形態では、本発明のＯＸＭアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いる米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号１に記載のＯＸＭ配列と少なくとも５０％相同である。一実施形態では、本発明のＯＸＭのアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いるＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号１に記載のＯＸＭ配列と少なくとも６０％相同である。一実施形態では、本発明のＯＸＭのアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いるＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号１に記載のＯＸＭ配列と少なくとも７０％相同である。一実施形態では、本発明のＯＸＭのアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いるＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号１に記載のＯＸＭ配列と少なくとも８０％相同である。一実施形態では、本発明のＯＸＭのアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いるＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号１に記載のＯＸＭ配列と少なくとも９０％相同である。一実施形態では、本発明のＯＸＭのアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いるＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて決定した場合に、配列番号１に記載のＯＸＭ配列と少なくとも９５％相同である。
【００８４】
一実施形態では、本発明のＯＸＭは、ＯＸＭが可溶性形態であることを必要とする治療薬に利用される。別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、ヒドロキシル含有側鎖によりタンパク質の溶解度を増加させることができるセリンおよびスレオニンを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の非天然または天然の極性アミノ酸を含む。
【００８５】
一実施形態では、本発明のＯＸＭは、標準的な固相技術などを用いることによって生化学的に合成される。別の実施形態では、これらの生化学的方法には、完全固相合成（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、部分的固相合成、フラグメント縮合、または古典的な溶液合成が含まれる。
【００８６】
一実施形態では、固相ＯＸＭ合成法は、当業者に公知であり、さらには、Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｏｗ  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊａｎｉｓ  Ｄｉｌｌａｈａ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４）に記載されている。別の実施形態では、合成タンパク質は、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製され（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｎ．Ｙ．）、その組成は、当業者に既知の方法によりアミノ酸配列決定を介して確認することができる。
【００８７】
別の実施形態では、組換えタンパク質技術を用いて、本発明のＯＸＭが生成される。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質技術は、本発明のＯＸＭの大量生成に使用される。別の実施形態では、組換え技術については、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９、Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４、Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１、Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０およびＢｒｏｇｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３、Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５ならびにＷｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ  ４２１−４６３、に記載されている。
【００８８】
別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、本発明のＯＸＭをコードするポリヌクレオチドを用いて合成される。いくつかの実施形態では、本発明のＯＸＭをコードするポリヌクレオチドは、シス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御を含む発現ベクターに連結される。いくつかの実施形態では、シス調節配列は、本発明のＯＸＭの構成的発現を指示するのに適する。
【００８９】
一実施形態では、「ポリヌクレオチド」という語句は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組み合わせ）の形態で単離され、提供される一本鎖または二本鎖の核酸配列を意味する。
【００９０】
一実施形態では、「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いてメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を意味する。一実施形態では、その後、この配列は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてインビボまたはインビトロで増幅することができる。
【００９１】
一実施形態では、「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体由来の（単離された）配列を意味し、したがって、染色体の連続した部分を表す。
【００９２】
一実施形態では、「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも部分的に相補的で、少なくとも部分的にゲノムである配列を意味する。一実施形態では、複合配列は、本発明のペプチドをコードするのに必要ないくつかのエクソン配列、ならびにそれらの間に介在するいくつかのイントロン配列を含むことができる。一実施形態では、イントロン配列は、他の遺伝子を含む、任意の供給源のものであり得、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。一実施形態では、イントロン配列には、シス作用性発現調節エレメントが含まれる。
【００９３】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に既知のＰＣＲ技術、または任意の他の方法もしくは手順を用いて調製される。いくつかの実施形態では、この手順は、２つの異なるＤＮＡ配列のライゲーションを含む（例えば、"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２、を参照されたい）。一実施形態では、様々な原核細胞または真核細胞を宿主−発現系として使用して、本発明のＯＸＭを発現させることができる。別の実施形態では、これらには、タンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物、タンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させた植物細胞系またはタンパク質コード配列を含むＴｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターで形質転換した植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
一実施形態では、本発明のＯＸＭを発現させるために、非細菌発現系（ＣＨＯ細胞などの哺乳動物発現系）が使用される。一実施形態では、哺乳動物細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いられる発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＩ−ＤＨＦＲベクターである。
【００９５】
別の実施形態では、本発明の細菌系において、タンパク質発現を意図した使用に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。一実施形態では、大量のＯＸＭが望まれる。一実施形態では、おそらく、タンパク質産物が容易に精製される細菌のペリプラズム中または培地中に発現産物を導く疎水性シグナル配列との融合物として、高レベルのタンパク質産物の発現を指示するベクターが望まれる。一実施形態では、特異的切断部位を有するように遺伝子操作された特定の融合タンパク質は、タンパク質の回収を補助する。一実施形態では、このような操作に適応できるベクターには、大腸菌発現ベクターのｐＥＴシリーズが含まれるが、これらに限定されない［Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９（１９９０）］。
【００９６】
一実施形態では、酵母発現系が使用される。一実施形態では、米国特許出願第５，９３２，４４７号に開示されているような構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むいくつかのベクターが酵母で使用できる。別の実施形態では、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組込みを促進するベクターが使用される。
【００９７】
一実施形態では、本発明の発現ベクターは、さらに、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）およびプロモーター−キメラタンパク質のゲノム組込みのための配列などの単一ｍＲＮＡからのいくつかのタンパク質の翻訳を可能にする追加のポリヌクレオチド配列を含むことができる。
【００９８】
一実施形態では、哺乳動物発現ベクターとして、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびに、それらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
別の実施形態では、レトロウイルスなどの真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが、本発明によって使用される。ＳＶ４０ベクターは、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。別の実施形態では、ウシパピローマウイルス由来のベクターは、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡを含み、エプスタイン・バーウイルス由来のベクターは、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５を含む。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および真核細胞における発現に有効性を示すＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０１００】
一実施形態では、植物発現ベクターが使用される。一実施形態では、ＯＸＭコード配列の発現は、いくつかのプロモーターによって促進される。別の実施形態では、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４（１９８４）］、またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１（１９８７）］が使用される。別の実施形態では、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０（１９８４）およびＢｒｏｇｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３（１９８４）］またはヒートショックプロモーター、例えば、大豆ｈｓｐｌ７．５−Ｅまたはｈｓｐｌ７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５（１９８６）］などの植物プロモーターが使用される。一実施形態では、構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および当業者に公知の他の技術を用いて植物細胞に導入される。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ  ４２１−４６３（１９８８）］を参照されたい。当技術分野で公知である昆虫および哺乳動物宿主細胞系などの他の発現系も本発明により使用することができる。
【０１０１】
（タンパク質をコードする）挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物が、発現タンパク質の安定性、産生、精製、収量または活性を最適化するように遺伝子操作された配列も含むことができることを理解されたい。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、様々な方法を用いて、宿主細胞系に本発明の発現ベクターを導入することができる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２），ｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９），Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）ａｎｄ  Ｇｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に一般的に記載されており、例えば、組換えウイルスベクターの安定なまたは一時的な遺伝子導入、リポフェクション、電気穿孔および感染を含む。さらに、ポジティブ−ネガティブ選択法に関する米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【０１０３】
一実施形態では、形質転換細胞は、多量の組換えＯＸＭの発現を可能にする有効な条件下で培養される。別の実施形態では、有効な培養条件としては、タンパク質産生を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件を挙げることができるが、これらに限定されない。一実施形態では、有効な培地は、細胞が本発明の組換えＯＸＭを生成するために培養される任意の培地を意味する。別の実施形態では、培地は、代表的には、同化可能な炭素、窒素およびリン酸源、適切な塩、ミネラル、金属ならびにビタミンなどの他の栄養素を有する水溶液を含む。一実施形態では、本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿で培養することができる。別の実施形態では、培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量で行われる。別の実施形態では、培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。
【０１０４】
一実施形態では、産生のために使用されるベクターおよび宿主系に応じて、結果として得られる本発明のＯＸＭは、組換え細胞内に残るか、発酵培地中に分泌されるか、大腸菌内の細胞周辺腔などの２つの細胞膜の間のスペースに分泌されるか、または細胞膜もしくはウイルス膜の外表面上に保持される。
【０１０５】
一実施形態では、培養の所定時間後に、組換えＯＸＭの回収が行われる。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書で使用する「組換えＯＸＭの回収」という語句は、ＯＸＭを含む発酵培地全体を収集することを指し、分離または精製の追加のステップを意味する必要はない。
【０１０７】
別の実施形態では、本明細書で提供されるＯＸＭは、化学的に修飾することができる。特に、ＯＸＭのアミノ酸側鎖、アミノ末端および／またはカルボキシル末端を修飾することができる。例えば、ＯＸＭは、アルキル化、ジスルフィド形成、金属錯体形成、アシル化、エステル化、アミド化、ニトロ化、酸を用いた処理、塩基を用いた処理、酸化または還元の内の１種または複数を受けることができる。これらのプロセスを実施するための方法は当技術分野で公知である。特に、ＯＸＭは、低級アルキルエステル、低級アルキルアミド、低級ジアルキルアミド、酸付加塩、カルボン酸塩またはそれらのアルカリ付加塩として提供される。特に、ＯＸＭのアミノ末端またはカルボキシル末端は、例えば、エステル化、アミド化、アシル化、酸化または還元によって誘導体化してよい。特に、ＯＸＭのカルボキシル末端は、アミド部分を形成するように誘導体化することができる。
【０１０８】
別の実施形態では、修飾は、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨ、骨格修飾、および残基修飾（これらに限定されない）などの、限定されないＮ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾を含む。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に記載されており、同文献は、本明細書に全体を記載したものとして、参照により組み込まれる。この点に関するさらなる詳細を以下に提供する。
【０１０９】
別の実施形態では、ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は置換されている。いくつかの実施形態では、ペプチド結合は、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）で置換されている。別の実施形態では、ペプチド結合は、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）で置換されている。別の実施形態では、ペプチド結合は、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）で置換されている。別の実施形態では、ペプチド結合は、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）で置換され、式中、Ｒは任意のアルキル、例えば、メチル、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）である。別の実施形態では、ペプチド結合は、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）で置換されている。別の実施形態では、ペプチド結合は、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）で置換されている。いくつかの実施形態では、ペプチド結合はオレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）で置換されている。別の実施形態では、ペプチド結合はレトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）で置換されている。別の実施形態では、ペプチド結合は、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）で置換されており、式中、Ｒは、天然では炭素原子上に存在する「通常の」側鎖である。いくつかの実施形態では、これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合のいずれかで生じ、さらには、同時に、いくつか（２〜３個）の結合で生じる。
【０１１０】
一実施形態では、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅなどのタンパク質の天然の芳香族アミノ酸は、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチルアラニン（ｎａｐｈｔｈｙｌｅｌａｎｉｎｅ）（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体またはＯ−メチル−Ｔｙｒなどの合成の非天然アミノ酸で置換されている。別の実施形態では、本発明のペプチドには、１つまたは複数の修飾アミノ酸または１つまたは複数の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合糖質など）が含まれる。
【０１１１】
本発明のＯＸＭ誘導体または変異体は、野生型ＯＸＭと比較して、いくつかのアミノ酸置換を含み、かつ／またはペグ化または他の方法で（例えば、組換え的にまたは化学的に）修飾することができる。
【０１１２】
本明細書で提供されるＯＸＭは、上記のＯＸＭ配列の任意の類似体も含む。配列内の任意の１つまたは複数のアミノ酸残基は、当技術分野で公知の保存的置換、すなわち、１つの疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置換することなどのように、アミノ酸を類似の化学的種類のアミノ酸で置換することにより独立に置換できる。あるいは、ＯＸＭの効果を高めるようにまたは生物活性を与えるように、非保存的なアミノ酸変異を行わせることができる。一実施形態では、ＯＸＭは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断および不活性化に耐性があるように修飾される。ＯＸＭの誘導体および変異体ならびにそれらの生成法は、米国特許出願公開第２０１１／０１５２１８２号、同第２０１１／００３４３７４号、同第２０１０／０１４４６１７号に開示されており、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
一実施形態では、「アミノ酸」または「複数アミノ酸」は、２０種の天然アミノ酸を含むと理解され、これらのアミノ酸は、インビボで翻訳後修飾される場合が多く、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホスレオニンを含み、その他のまれなアミノ酸には、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、「アミノ酸」は、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の両方を含む。他の合成アミノ酸または修飾アミノ酸も同様に使用できることを理解されたい。
【０１１４】
一実施形態では、本発明のオキシントモジュリン（ＯＸＭ）は、限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、等電点電気泳動および示差的可溶化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）法などの様々な、標準的なタンパク質精製技術を用いて精製される。
【０１１５】
一実施形態では、回収を容易にするために、発現させるコード配列は、本発明のタンパク質および融合された切断可能な部分をコードするように遺伝子操作することができる。一実施形態では、タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、切断可能な部分に特異的なカラム上への固定によって容易に単離することができるように、融合タンパク質を設計することができる。一実施形態では、切断部位をタンパク質と切断可能な部分の間にあるように遺伝子操作し、この部位で融合タンパク質を特異的に切断する適切な酵素または薬剤での処理によって、タンパク質をクロマトグラフィーカラムから放出することができる［例えば、Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：６５−７０（１９８８）；およびＧａｒｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４−１５８５９（１９９０）を参照されたい］。別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、「実質的に純粋な」形態で取り出される。別の実施形態では、「実質的に純粋な」という語句は、本明細書に記載の用途におけるＯＸＭの効果的な使用を可能にする純度を意味する。
【０１１６】
一実施形態では、本発明のＯＸＭは、インビトロ発現系を用いて合成することもできる。一実施形態では、インビトロ合成法は当技術分野で公知であり、系の構成成分は市販されている。
【０１１７】
別の実施形態では、インビトロ結合活性は、本明細書に記載の天然の、組換え型および／または可逆ペグ化ＯＸＭならびにそれを含む医薬組成物の、限定されないが、糖尿病、肥満、摂食障害、代謝障害などの疾患もしくは病状を処置または改善する能力を測定することによって確認される。別の実施形態では、インビボ活性は、処置される疾患の既知の尺度によって推定される。
【０１１８】
別の実施形態では、ＯＸＭ−ＰＥＧ−リンカーのモル比は１：１：１〜１：１：３．５である。別の実施形態では、このモル比は１：１：１〜１：１：１０．０である。別の実施形態では、リンカーの比率が高いと、組成物の収率を最適化できる。
【０１１９】
別の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して、オキシントモジュリンのアミノ末端またはリシン残基に結合している。別の実施形態では、「結合（ａｔｔａｃｈｅｄ）」および「結合（ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、同義に使用される。別の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、ＯＸＭのα−アミノ酸側鎖に結合される。別の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、ＯＸＭのε−アミノ酸側鎖に結合される。別の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、ＯＸＭの１つまたは複数のε−アミノ酸側鎖に結合される。別の実施形態では、ＰＥＧポリマーはスルフヒドリル部分を含む。
【０１２０】
別の実施形態では、ＰＥＧは直鎖である。別の実施形態では、ＰＥＧは分岐鎖である。別の実施形態では、ＰＥＧは、２００〜２００，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。別の実施形態では、ＰＥＧは、５，０００〜８０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。別の実施形態では、ＰＥＧは、５，０００〜４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。別の実施形態では、ＰＥＧ、２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一実施形態では、ＰＥＧ３０は、３０，０００Ｄａの平均分子量を有するＰＥＧを意味する。ＰＥＧ４０は、４０，０００Ｄａの平均分子量を有するＰＥＧを意味する。
【０１２１】
生物活性
【０１２２】
別の実施形態では、本発明のＯＸＭの可逆ペグ化は、ＯＸＭを長時間作用型ＯＸＭにする。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、生物学的半減期が延長したオキシントモジュリンである。別の実施形態では、可逆ペグ化は、ＯＸＭの分解に対する保護を提供する。別の実施形態では、可逆ペグ化は、ＤＰＰＩＶによるＯＸＭの分解に対する保護を提供する。別の実施形態では、可逆ペグ化は、ＯＸＭのＣｍａｘに作用し、本明細書で提供される結合体の投与に関連する副作用を低減する。別の実施形態では、可逆ペグ化は、ＯＸＭのＴｍａｘを延長させる。別の実施形態では、可逆ペグ化は、ＯＸＭの循環半減期を延長させる。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、非修飾ＯＸＭと比較してバイオアベイラビリティが改善している。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、非修飾ＯＸＭと比較して生物活性が改善している。別の実施形態では、可逆ペグ化は、ＯＸＭの効力を増強する。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、向上したインスリン感受性を有する。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、最終グルコースを用量依存的に減少させる。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、インスリンを用量依存的に減少させる。
【０１２３】
他の実施形態では、本発明の可逆ペグ化ＯＸＭは、生化学的尺度の観点から、非修飾ＯＸＭと少なくとも同等である。他の実施形態において、可逆ペグ化ＯＸＭは、薬理学的尺度の観点から、非修飾ＯＸＭと少なくとも同等である。他の実施形態において、可逆ペグ化ＯＸＭは、結合能（Ｋｄ）の観点から、非修飾ＯＸＭと少なくとも同等である。他の実施形態において、可逆ペグ化ＯＸＭは、消化器系を介した吸収の観点から、非修飾ＯＸＭと少なくとも同等である。他の実施形態において、可逆ペグ化ＯＸＭは、非修飾ＯＸＭよりも消化器系を通る吸収の間に、より安定である。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明の可逆ペグ化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して改善された血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）レベルを示す。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して改善された生物活性および血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）レベルを示す。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して改善された血液保持時間（ｔ１／２）を示す。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して改善された生物活性および血液保持時間（ｔ１／２）を示す。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して改善された血中Ｃｍａｘレベルを示し、別の実施形態では、本明細書で提供される可逆ペグ化組成物の投与に関連する副作用を低減する、より遅い放出プロセスが与えられる。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して改善された生物活性および血中Ｃｍａｘレベルを示す。別の実施形態では、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を遊離ＯＸＭのアミノ末端に結合するステップを含むかまたはそれらからなるＯＸＭのＡＵＣ、Ｃｍａｘ、ｔ１／２、生物活性、もしくはそれらの任意の組み合わせを改善する方法が本明細書で提供される。
【０１２５】
別の実施形態では、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を遊離ＯＸＭのアミノ末端に結合することによるＯＸＭのＡＵＣ、Ｃｍａｘ、ｔ１／２、生物活性、もしくはそれらの任意の組み合わせの改善は、ＯＸＭの投与頻度を減らすことができる。別の実施形態では、ＯＸＭの投与頻度を減らす方法であって、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）をＯＸＭのアミノ末端またはリシン残基に結合するステップを含むか、またはそれからなる方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、本発明のＯＸＭの可逆ペグ化は、より低い投与量の使用を可能とする点で有利である。一実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭは、未修飾ＯＸＭの生物活性を維持する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭは、ＯＸＭの生物活性を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、消化分泌液を減少させることを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、胃内容物排出を減少および遅延させることを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、小腸における摂食運動パターンの抑制を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、ペンタガストリンによって刺激される酸分泌の抑制を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、胃ソマトスタチン放出の増加を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、ペプチドＹＹの効果を増強することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、グレリン放出の抑制を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、アミノピリン蓄積およびｃＡＭＰ産生の刺激を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、ＧＬＰ−１受容体に結合することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、グルカゴン受容体に結合することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、アデニル酸シクラーゼを活性化することによりＨ＋産生を刺激することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、ヒスタミン刺激胃酸分泌を抑制することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、食物摂取を抑制することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、インスリン放出を刺激することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、膵外分泌を抑制することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、インスリン感受性を高めることを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、グルコースレベルを低下させることを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、最終グルコースを低下させることを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、インスリンを低下させることを含む。
【０１２６】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長させる方法をさらに提供し、該方法は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を１：１：１のモル比で結合させるステップからなり、別の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基もしくは位置番号３０のリシン残基またはアミノ末端に結合している。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長させる方法に関し、該方法は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を１：１：１のモル比で結合するステップからなり、前記ＰＥＧポリマーは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基に結合している。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長させる方法に関し、該方法は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を１：１：１のモル比で結合するステップからなり、前記ＰＥＧポリマーは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号３０のリシン残基に結合している。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長させるための方法に関し、該方法は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を１：１：１のモル比で結合するステップからなり、前記ＰＥＧポリマーは、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して前記オキシントモジュリンのアミノ酸配列のアミノ末端に結合している。
【０１３０】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンの曲線下面積（ＡＵＣ）を改善する方法に関し、該方法は、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基もしくは位置番号３０のリシン残基またはアミノ末端に結合するステップからなる。
【０１３１】
別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンの曲線下面積（ＡＵＣ）を改善する方法に関し、該方法は、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基に結合するステップからなる。
【０１３２】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンの曲線下面積（ＡＵＣ）を改善する方法に関し、該方法は、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号３０のリシン残基に結合するステップからなる。
【０１３３】
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンの曲線下面積（ＡＵＣ）を改善する方法に関し、該方法は、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）をオキシントモジュリンのアミノ酸配列のアミノ末端に結合するステップからなる。
【０１３４】
一態様では、オキシントモジュリンの投与頻度を減らす方法が本明細書で提供され、該方法は、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基もしくは位置番号３０のリシン残基またはアミノ末端に結合するステップからなる。
【０１３５】
別の実施形態では、オキシントモジュリンの投与頻度を減らす方法が本明細書で提供され、該方法は、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号１２のリシン残基に結合するステップからなる。
【０１３６】
別の実施形態では、オキシントモジュリンの投与頻度を減らす方法が本明細書で提供され、該方法は、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）をオキシントモジュリンのアミノ酸配列の位置番号３０のリシン残基に結合するステップからなる。
【０１３７】
別の実施形態では、オキシントモジュリンの投与頻度を減らす方法が本明細書で提供され、該方法は、任意に置換されてもよい９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはスルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）をオキシントモジュリンのアミノ酸配列のアミノ末端に結合するステップからなる。
【０１３８】
別の実施形態では、本発明は、対象における食物摂取量を低下させる方法をさらに提供し、該方法は、本発明の結合体を投与するステップを含む。別の実施形態では、結合体は、構造式Ｉ〜ＩＶの構造式で表される。
【０１３９】
別の実施形態では、本発明は、対象における体重を低下させる方法をさらに提供し、該方法は、本発明の結合体を対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、結合体は、構造式Ｉ〜ＩＶの構造式で表される。
【０１４０】
別の実施形態では、本発明は、対象における血糖コントロールを誘導する方法をさらに提供し、該方法は、本発明の結合体を投与するステップを含む。別の実施形態では、結合体は、構造式Ｉ〜ＩＶの構造式で表される。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明は、対象における血糖および脂質プロファイルを改善する方法をさらに提供し、該方法は、本発明の結合体を対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、結合体は、構造式Ｉ〜ＩＶの構造式で表される。
【０１４２】
さらに別の実施形態では、本発明は、対象における血糖プロファイルを改善する方法をさらに提供し、該方法は、本発明の結合体を対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、結合体は、構造式Ｉ〜ＩＶの構造式で表される。
【０１４３】
さらなる実施形態では、本発明は、対象における脂質プロファイルを改善する方法をさらに提供し、該方法は、本発明の結合体を対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、結合体は、構造式Ｉ〜ＩＶの構造式で表される。
【０１４４】
本明細書で提供されるアミノ変異体、例えば、末端アミノ基を介してＦＭＳがＯＸＭに結合されている変異体は、意外にも、本明細書に例示されるように（実施例５参照）、食物摂取量の減少、体重管理および血糖コントロールを達成する。一実施形態では、本明細書で提供されるＯＸＭペプチドのＰＥＧ修飾は、予想外にも、ＯＸＭの機能を妨げない。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明は、対象のコレステロール値を改善するための方法を提供し、該方法は、有効量の本明細書の結合体を対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、結合体は、構造式Ｉ〜ＩＶの構造式で表される。別の実施形態では、コレステロール値を改善することは、対象におけるＬＤＬコレステロールを低下させる一方で、ＨＤＬコレステロールを増加させることを含む。別の実施形態では、ＬＤＬコレステロール値は、０ｍｇ／ｄＬを超えるが、２００ｍｇ／ｄＬ未満まで低下する。別の実施形態では、ＬＤＬコレステロール値は約１００〜１２９ｍｇ／ｄＬまで低下する。別の実施形態では、ＬＤＬコレステロール値は、０ｍｇ／ｄＬを超えるが、１００ｍｇ／ｄＬ未満まで低下する。別の実施形態では、ＬＤＬコレステロール値は、０ｍｇ／ｄＬを超えるが、７０ｍｇ／ｄＬ未満まで低下する。別の実施形態では、ＬＤＬコレステロール値は、０ミリモル／Ｌを超えるが、５．２ミリモル／Ｌ未満まで低下する。別の実施形態では、ＬＤＬコレステロール値は、約２．６〜３．３ミリモル／Ｌまで低下する。別の実施形態では、ＬＤＬコレステロール値は、０ミリモル／Ｌを超えるが、２．６ミリモル／Ｌ未満まで低下する。別の実施形態では、ＬＤＬコレステロール値は、０ミリモル／Ｌを超えるが、１．８ミリモル／Ｌ未満まで低下する。
【０１４６】
別の実施形態では、本発明は、さらに、対象におけるインスリン抵抗性を低下させる方法をさらに提供し、該方法は、有効量の本発明の結合体を対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、結合体は、構造式Ｉ〜ＩＶの構造式で表される。
【０１４７】
別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、迷走神経の間接的機構を介して膵臓分泌を抑制することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、小腸を通る水電解質輸送の低下を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、グルコースの取込みを刺激することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、ソマトスタチン分泌を調節／刺激することを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、食物摂取量および体重増加の両方の低下を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、体脂肪蓄積の低下を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、食欲抑制を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、血糖および脂質プロファイルの改善を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、食欲不振の誘導を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、体重過剰および肥満の対象における体重の減少を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、脂肪ホルモンのレプチンおよびアディポネクチンのレベルの変化の誘導を含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物活性は、体重過剰および肥満の対象におけるエネルギー摂取を減少させることに加えて、エネルギー消費を増加させることを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭは、構造式Ｉ〜ＩＶの結合体である。
【０１４８】
調製プロセス
【０１４９】
別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭは、限定されないが、ＦｍｏｃまたはＦＭＳ部分のフルオレン環に存在するＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＰＯ２Ｃｌ、−（ＣＨ２）ｘＨａｌなどの官能基と反応することができる任意のＰＥＧ誘導体を意味するペグ化剤を用いて調製される。別の実施形態では、ペグ化剤は、通常、ＰＥＧ分子の一端にある１つだけのヒドロキシル基が結合に利用可能であるモノメトキシル化形態で使用される。別の実施形態では、両方の末端が結合に利用可能であるＰＥＧの二官能型は、例えば、単一のＰＥＧ部分に共有結合した２つのペプチドまたはタンパク質の残基との結合を得ることが望ましい場合などに使用することができる。
【０１５０】
別の実施形態では、分岐鎖のＰＥＧは、Ｒ（ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして表され、式中、Ｒは、ペンタエリスリトールまたはグリセロールなどの中心コア部分を表し、ｍは分岐アームの数を表す。分枝アームの数（ｍ）は、３〜１００以上の範囲とすることができる。別の実施形態では、ヒドロキシル基は、化学的修飾を受けやすい。別の実施形態では、分枝鎖のＰＥＧ分子については、米国特許第６，１１３，９０６号、同第５，９１９，４５５号、同第５，６４３，５７５号、同第５，６８１，５６７号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
別の実施形態では、本発明は、標準的なペグ化手順のように、ＯＸＭに直接結合していないＰＥＧ部分を有するＯＸＭを提供するが、このＰＥＧ部分はむしろ、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳなどのリンカーを介して結合している。別の実施形態では、このリンカーは、塩基に極めて感受性があり、温和な塩基性条件下で除去可能である。別の実施形態では、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧに連結されたＯＸＭは、遊離ＯＸＭと同等の活性がある。別の実施形態では、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧに連結されたＯＸＭは、遊離ＯＸＭよりも活性がある。別の実施形態では、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧに連結されたＯＸＭは、遊離ＯＸＭとは異なる活性を含む。別の実施形態では、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧに連結されたＯＸＭは、遊離ＯＸＭとは異なり、中枢神経系活性を有していない。別の実施形態では、任意に置換されてもよいＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧに連結されたＯＸＭは、遊離ＯＸＭとは異なり、血液脳関門を通って脳に進入することができない。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧに連結されたＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して延長した循環半減期を含む。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧに連結されたＯＸＭは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳ部分と共にそのＰＥＧ部分を失い、したがって遊離ＯＸＭに戻る。
【０１５２】
別の実施形態では、ＯＸＭのペグ化および（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭ結合体の調製は、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳまたはＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをＯＸＭのアミン成分に結合することによって、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭまたはＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ結合体を得て、次いで、ＰＥＧ−ＳＨをＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ上のマレイミド部分と反応させて、それぞれＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭまたはＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭ結合体を生成することを含む。
【０１５３】
別の実施形態では、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳは、下記の構造式で表される。
【０１５４】
【化１５】
2018517697.tif 000017
【０１５５】
別の実施形態では、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、下記の構造式で表される。
【０１５６】
【化１６】
2018517697.tif 000018
【０１５７】
一実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置２にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置１にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置３にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置４にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの１、２、３もしくは４またはこれらの任意の組み合わせの位置にある。
【０１５８】
別の実施形態では、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭは、下記の構造式で表される。
【０１５９】
【化１７】
2018517697.tif 000019
【０１６０】
別の実施形態では、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭは、下記の構造式で表される。
【０１６１】
【化１８】
2018517697.tif 000020
【０１６２】
一実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置２にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置１にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置３にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置４にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの１、２、３もしくは４またはこれらの任意の組み合わせの位置にある。
【０１６３】
別の実施形態では、（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭは、下記の構造式で表される。
【０１６４】
【化１９】
2018517697.tif 000021
【０１６５】
別の実施形態では、（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭは、下記の構造式で表される。
【０１６６】
【化２０】
2018517697.tif 000022
【０１６７】
一実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置２にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置１にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置３にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置４にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの１、２、３もしくは４またはこれらの任意の組み合わせの位置にある。
【０１６８】
別の実施形態では、ＯＸＭのペグ化は、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳまたはＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳとＰＥＧ−ＳＨとを反応させることによって、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳまたはＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ結合体を形成し、次いで、これをＯＸＭのアミン成分と反応させて、それぞれ所望の（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭ結合体を得ることを含む。別の実施形態では、ＯＸＭなどのペプチド／タンパク質のペグ化については、米国特許第７５８５８３７号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳによるＯＸＭなどのペプチド／タンパク質の可逆ペグ化については、米国特許第７５８５８３７号に記載されている。
【０１６９】
別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳは、下記の構造式で表される。
【０１７０】
【化２１】
2018517697.tif 000023
【０１７１】
別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳは、下記の構造式で表される。
【０１７２】
【化２２】
2018517697.tif 000024
【０１７３】
一実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置２にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置１にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置３にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの位置４にある。別の実施形態では、ＳＯ３Ｈは、フルオレンの１、２、３もしくは４またはこれらの任意の組み合わせの位置にある。
【０１７４】
別の実施形態では、「長時間作用型ＯＸＭ」および「可逆ペグ化ＯＸＭ」という語句は、同義に使用され、本発明の結合体を意味する。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭの構造式によって本明細書で特定されるＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭで構成され、式中、ｎは少なくとも１の整数であり、ＯＸＭは、少なくとも１つのアミノ基を介してＦＭＳまたはＦｍｏｃ基に結合されている。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭの構造式によって本明細書で特定されるＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭで構成され、式中、ｎは少なくとも１の整数であり、ＯＸＭは、少なくとも１つのアミノ基を介してＦＭＳまたはＦｍｏｃ基に結合されている。
【０１７５】
一実施形態では、本発明は、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭまたはＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭの調製プロセスを提供し、前記ＯＸＭのアミノ末端は、ＦｍｏｃまたはＦＭＳに結合され、前記ＯＸＭは、配列番号１に記載のアミノ酸配列［Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨ］からなり、前記プロセスは、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭまたはＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ：
【０１７６】
【化２３】
2018517697.tif 000025
【０１７７】
を、オキシントモジュリン樹脂（前記オキシントモジュリンのアミノ残基は保護されている）と反応させて、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−保護ＯＸＭまたはＭＡＬ−ＦＭＳ−保護ＯＸＭ（前記オキシントモジュリンのアミノ残基はそれぞれ保護されている）を得ること、
続けて、スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）（前記ＰＥＧ−ＳＨとの反応後またはその前に前記保護基および前記樹脂を除去する）と反応させて、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭまたはＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ（前記ＯＸＭのアミノ末端はＦｍｏｃまたはＦＭＳに結合されている）を得ることを含む。
【０１７８】
一実施形態では、本発明は、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭまたはＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ結合体の調製プロセスを提供し、前記ＯＸＭの前記アミノ残基のＬｙｓ１２は、ＦｍｏｃまたはＦＭＳに結合され、前記オキシントモジュリン（ＯＸＭ）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列［Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨ］からなり、前記プロセスは、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭまたはＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ：
【０１７９】
【化２４】
2018517697.tif 000026
【０１８０】
を、オキシントモジュリン樹脂（前記オキシントモジュリンのアミノ残基（Ｌｙｓ１２は含まない）およびアミノ末端のＨｉｓ１は保護されている）と反応させて、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−保護ＯＸＭまたはＭＡＬ−ＦＭＳ−保護ＯＸＭ（前記オキシントモジュリンのアミノ残基（Ｌｙｓ１２は含まない）およびアミノ末端のＨｉｓ１は、それぞれ保護されている）を得ること、
続けて、スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）と反応させて（前記ＰＥＧ−ＳＨとの反応後またはその前に前記保護基および前記樹脂を除去する）、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭまたはＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ（前記ＯＸＭのアミノ残基のＬｙｓ１２は前記ＦｍｏｃまたはＦＭＳに結合されている）を得ることを含む。
【０１８１】
一実施形態では、本発明は、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭまたはＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ結合体の調製プロセスを提供し、前記ＯＸＭの前記アミノ残基のＬｙｓ３０は、ＦｍｏｃまたはＦＭＳに結合され、前記オキシントモジュリン（ＯＸＭ）は、 配列番号１に記載のアミノ酸配列［Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨ］からなり、前記プロセスは、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭまたはＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ：
【０１８２】
【化２５】
2018517697.tif 000027
【０１８３】
を、オキシントモジュリン樹脂（前記オキシントモジュリンのアミノ残基（Ｌｙｓ３０は含まない）およびアミノ末端のＨｉｓ１は保護されている）と反応させて、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−保護ＯＸＭまたはＭＡＬ−ＦＭＳ−保護ＯＸＭ（前記オキシントモジュリンのアミノ残基（Ｌｙｓ３０は含まない）およびアミノ末端のＨｉｓ１は、それぞれ保護されている）を得ること、
続けて、スルフヒドリルＰＥＧポリマー（ＰＥＧ−ＳＨ）と反応させて（前記ＰＥＧ−ＳＨとの反応後またはその前に前記保護基および前記樹脂を除去する）、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭまたはＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ（前記ＯＸＭのアミノ残基のＬｙｓ１２は前記ＦｍｏｃまたはＦＭＳに結合されている）を得ることを含む。
【０１８４】
一実施形態では、本発明は、下記の構造式で表されるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの調製方法を提供し、前記方法は、ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをトリフルオロ酢酸およびクロロスルホン酸と混合することを含み、前記ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解し、未希釈のトリフルオロ酢酸に溶解した過剰量の前記クロロスルホン酸をその反応混合物に添加する。
【０１８５】
【化２６】
2018517697.tif 000028
【０１８６】
一実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した２〜２０当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した２〜１０当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した２当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した３当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した４当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した５当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した６当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した７当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した８当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した９当量のクロロスルホン酸の使用を含む。別の実施形態では、方法は、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した１０当量のクロロスルホン酸の使用を含む。
【０１８７】
一実施形態では、未希釈のトリフルオロ酢酸中に溶解した過剰クロロスルホン酸の使用を含むＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳからＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳをＴＦＡ塩として調製するプロセスにより、８０％〜１００％の純度を有する純粋な中間体のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−ＴＦＡ塩が得られる。別の実施形態では、この方法により、８５％〜１００％の純度を有する純粋な中間体のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−ＴＦＡ塩が得られる。別の実施形態では、この方法により、９０％〜１００％の純度を有する純粋な中間体のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−ＴＦＡ塩が得られる。別の実施形態では、この方法により、９５％〜１００％の純度を有する純粋な中間体のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−ＴＦＡ塩が得られる。別の実施形態では、この方法により、９８％〜１００％の純度を有する純粋な中間体のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−ＴＦＡ塩が得られる。
【０１８８】
一実施形態では、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−ＴＦＡ塩は、構造式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩおよびＩＶの結合体を調製する方法のための中間体として使用されており、８５％〜１００％の純度を有する結合体が得られている。別の実施形態では、９０％〜１００％の純度を有する結合体が得られている。別の実施形態では、９５％〜１００％の純度を有する結合体が得られている。別の実施形態では、９８％〜１００％の純度を有する結合体が得られている。
【０１８９】
別の実施形態では、ＯＸＭのＬｙｓ１２もしくはＬｙｓ３０またはアミノ末端へのＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦｍｏｃまたはＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳの結合は、ＯＸＭを不活性にしない。
【０１９０】
一実施形態では、Ｌｙｓ１２変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも体重管理を行う上でより有効である。別の実施形態では、本明細書で提供されるＬｙｓ３０変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも体重管理を達成する上でより有効である。別の実施形態では、本明細書で提供されるアミノ変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも体重管理を達成する上でより有効である。
【０１９１】
一実施形態では、Ｌｙｓ１２変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも長期血糖コントロールを達成する上でより有効である。別の実施形態では、本明細書で提供されるＬｙｓ３０変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも長期血糖コントロールを達成する上でより有効である。別の実施形態では、本明細書で提供されるアミノ変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも血糖コントロールを達成する上でより有効である。
【０１９２】
さらなる実施形態では、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも体重管理を行う上でより有効である。さらなる実施形態では、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも血糖コントロールを達成する上でより有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも体重を減らす上でより有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも累積食物摂取量を減らす上でより有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも血漿グルコース摂取量を減らす上でより有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも耐糖能を改善する上でより有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも最終血漿コレステロール値を減らす上でより有効である。
【０１９３】
一実施形態では、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭは、最終血漿フルクトサミンレベルを減らす上で有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭは、最終血漿フルクトサミンレベルを減らす上で有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体は、最終血漿フルクトサミンレベルを減らす上で有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体は、本明細書で提供される他の変異体よりも最終血漿コレステロール値を減らす上でより有効である。
【０１９４】
医薬組成物および使用方法
【０１９５】
一実施形態では、本発明は、本発明の結合体ならびに担体および賦形剤を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では、結合体は、構造式Ｉ〜ＩＶで表される。
【０１９６】
別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、高血糖の予防のため、血糖コントロールを改善するため、非インスリン依存性糖尿病（一実施形態では、２型糖尿病）、インスリン依存性糖尿病（一実施形態では、１型糖尿病）、および妊娠糖尿病、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される糖尿病の処置のために利用される。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、２型糖尿病を処置するために利用される。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、インスリンに対する感受性を高めるために利用される。別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、インスリン抵抗性を下げるために利用される。
【０１９７】
別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、食欲の抑制のために利用される。別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、満腹感誘導するために利用される。別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、体重を減らすために利用される。別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、体脂肪を減らすために利用される。別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、肥満度指数を下げるために利用される。別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、食物消費量を減らすために利用される。別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、肥満症を処置するために利用される。別の実施形態では、本明細書による本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、肥満症に関連する糖尿病を処置するために利用される。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、心拍数を高めるために利用される。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、基礎代謝率（ＢＭＲ）を高めるために利用される。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、エネルギー消費を高めるために利用される。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、耐糖能を誘導するために利用される。別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、血糖および脂質プロファイルを改善するために利用される。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、血糖コントロールを誘導するために利用される。一実施形態では、血糖のコントロールは、高くないおよび／または変動しない血糖値、および／または高くないおよび／または変動しないグリコシル化ヘモグロビン値を意味する。
【０１９８】
別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、体重増加を抑制するために利用され、別の実施形態では、この体重増加は脂肪の増加に起因する。別の実施形態では、本明細書による本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、血糖値を下げるために利用される。別の実施形態では、本明細書による本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、カロリー摂取を下げるために利用される。別の実施形態では、本明細書による本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、食欲を下げるために利用される。別の実施形態では、本明細書による本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、体重管理に利用される。別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、減量を誘導するまたは促進するために利用される。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、所望の体重、所望の肥満度指数、所望の外観および良好な健康状態のうちのいずれか１つまたは複数を維持するために利用される。別の実施形態では、本明細書による本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、脂質プロファイルを調節するために利用される。別の実施形態では、本明細書による本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、トリグリセリド値を下げるために利用される。別の実施形態では、本明細書による本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、グリセロール値を下げるために利用される。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、アディポネクチンレベルを高めるために利用される。別の実施形態では、本明細書で提供される本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、遊離脂肪酸レベルを下げるために利用される。
【０１９９】
一実施形態では、「レベルの低下」という用語は、元のレベル、野生型のレベル、正常なレベルまたは対照のレベルに対して約１〜１０％の低下を意味する。別の実施形態では、低下は、約１１〜２０％である。別の実施形態では、低下は約２１〜３０％である。別の実施形態では、低下は約３１〜４０％である。別の実施形態では、低下は約４１〜５０％である。別の実施形態では、低下は約５１〜６０％である。別の実施形態では、低下は約６１〜７０％である。別の実施形態では、低下は約７１〜８０％である。別の実施形態では、低下は約８１〜９０％である。別の実施形態では、低下は約９１〜９５％である。別の実施形態では、低下は約９６〜１００％である。
【０２００】
一実施形態では、「レベルの増加」または「延長」という用語は、元のレベル、野生型のレベル、正常なレベルまたは対照のレベルに対して約１〜１０％の増加を意味する。別の実施形態では、増加は約１１〜２０％である。別の実施形態では、増加は約２１〜３０％である。別の実施形態では、増加は約３１〜４０％である。別の実施形態では、増加は約４１〜５０％である。別の実施形態では、増加は約５１〜６０％である。別の実施形態では、増加は約６１〜７０％である。別の実施形態では、増加は約７１〜８０％である。別の実施形態では、増加は約８１〜９０％である。別の実施形態では、増加は約９１〜９５％である。別の実施形態では、増加は約９６〜１００％である。
【０２０１】
別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を下げるために利用される。一実施形態では、コレステロール値の低下は、天然のＯＸＭの投与後に観察される低下よりも大きい。一実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を６０〜７０％低下させる。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を５０〜１００％低下させる。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を２５〜９０％低下させる。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を５０〜８０％低下させる。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、コレステロール値を４０〜９０％低下させる。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、ＨＤＬコレステロール値を上げるために利用される。
【０２０２】
一実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、投与の間に有効性が著しく低下することなく、本明細書に記載の目的のために使用できる。一実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、１日の間、有効なままである。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、２〜６日にわたり有効なままである。一実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、１週間にわたり有効なままである。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、２週間にわたり有効なままである。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、３週間にわたり有効なままである。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、４週間にわたり有効なままである。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、６週間にわたり有効なままである。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、２ヶ月間にわたり有効なままである。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、４ヶ月間にわたり有効なままである。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、６ヶ月間にわたり有効なままである。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、１年間以上にわたり有効なままである。
【０２０３】
一実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、本明細書に記載の目的のために使用してよく、また、最初の用量の投与時にすぐに有効になり得る。別の実施形態では、本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物は、２回以上の用量が投与された後に有効になる。
【０２０４】
別の実施形態では、上述したような本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物の利用方法は、ＯＸＭによって軽減、抑制、および／または処置され得る疾患または病状に罹患しているヒト対象に適用される。別の実施形態では、上述したような本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物を利用する方法は、獣医学方法である。別の実施形態では、上述したような本発明の結合体およびそれらを含む医薬組成物を利用する方法は、家畜、ペットおよび実験動物などの動物に適用される。したがって、一実施形態では、本発明の対象は、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、マウス、ウマなどである。
【０２０５】
別の実施形態では、本発明は、ＯＸＭもしくはそれを含む医薬製剤により処置可能または軽減可能な対象における疾患を処置または軽減する方法を提供し、該方法は、治療有効量の本発明の結合体を対象に投与することによって、ＯＸＭにより処置可能または軽減可能な対象における疾患を処置または軽減するステップを含む。
【０２０６】
別の実施形態では、本明細書で使用するＯＸＭ、「ペプチド」または「タンパク質」は、天然ペプチド（分解産物、合成タンパク質または組換えタンパク質のいずれか）およびペプチド模倣体（典型的には、合成タンパク質）、ならびにいくつかの実施形態では、これらのタンパク質を体内でより安定にさせるか、またはさらには細胞への浸透を可能にするように修飾したタンパク質類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドを包含する。
【０２０７】
別の実施形態では、「ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよび／またはＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体」は、本発明の結合体である。別の実施形態では、「ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよび／またはＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体」は、それぞれＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭまたはＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭを意味し、これらは本発明の結合体である。別の実施形態では、本発明の結合体は、構造式Ｉ〜ＩＶで表される。別の実施形態では、本発明の結合体は、ＦＭＳまたはＦｍｏｃを介してＰＥＧと結合したＯＸＭであり、ＯＸＭは、ＯＸＭのＬｙｓ１２を介して、もしくはＯＸＭのＬｙｓ３０を介して、またはＯＸＭのアミノ末端を介して、ＦＭＳまたはＦｍｏｃに結合される。別の実施形態では、医薬組成物は、注射溶液中に０．００５〜０．１ｍｇ／ｋｇの本発明のＯＸＭペプチドを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、０．００５〜０．５ｍｇ／ｋｇのＯＸＭペプチドを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、０．０５〜０．１μｇのＯＸＭペプチドを含む。
【０２０８】
別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、１日１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、３６時間毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、４８時間毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、６０時間毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、７２時間毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、８４時間毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、９６時間毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、５日毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、６日毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、７日毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、８〜１０日毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、１０〜１２日毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、１２〜１５日毎に１回投与される。別の実施形態では、本発明の結合体を含む医薬組成物は、１５〜２５日毎に１回投与される。
【０２０９】
別の実施形態では、本発明の結合体は、筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射によって週に１回投与される。
【０２１０】
別の実施形態では、本発明の結合体は、個人自体に提供することができる。一実施形態では、本発明の可逆ペグ化ＯＸＭは、薬学的に許容される担体と混合される医薬組成物の一部として個人に提供することができる。
【０２１１】
別の実施形態では、「医薬組成物」は、生理学的に好適な担体および賦形剤などの他の化学成分を含む本明細書に記載の長時間作用型ＯＸＮの製剤を意味する。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは生物学的効果を有する。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の結合体、薬学的に許容可能なキャリアおよび賦形剤を含む。
【０２１２】
別の実施形態では、本発明の組成物はいずれも、少なくとも可逆ペグ化ＯＸＭを含む。一実施形態では、本発明は混合製剤を提供する。一実施形態では、「混合製剤」は、上記で定義した組み合わせ相手が、独立して投与されるか、または特徴量の組み合わせ相手との異なる一定の組み合わせの使用により、すなわち、同時に、並行して、別々にまたは逐次投与され得るという意味において、特に「パーツキット」を定義する。いくつかの実施形態では、パーツキットのパーツは、その後、例えば、同時に投与されるか、経時的に、すなわち、異なる時点でおよびパーツキットの任意のパーツについて等しい時間間隔または異なる時間間隔で調製することができる。一定比率の組み合わせ相手の合計量は、いくつかの実施形態では、混合製剤で投与することができる。一実施形態では、例えば、処置される患者の亜集団のニーズまたは異なるニーズが特定の疾患、疾患の重症度、年齢、性別、または体重によるものであり得る単一患者のニーズに対処するために、当業者が容易に行うことができるように、混合製剤を変更することができる。
【０２１３】
別の実施形態では、同義に使用される「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に対して著しい刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を意味する。アジュバントはこれらの語句に包含される。一実施形態では、薬学的に許容される担体に含まれる成分の１つは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、有機媒体および水性媒体の両方において広範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマーとすることができる（Ｍｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９））。
【０２１４】
別の実施形態では、「賦形剤」は、長時間作用型ＯＸＮの投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を意味する。一実施形態では、賦形剤としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類および様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールを挙げることができる。
【０２１５】
薬物の製剤化および投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれる、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、の最新版に見られる。
【０２１６】
別の実施形態では、本発明のペプチドの適切な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、経鼻、腸または筋肉内、皮下および髄内への注射を含む非経口送達、ならびに髄腔内、直接的な脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、もしくは眼内注射を挙げることができる。
【０２１７】
本発明はまた、上記の治療方法のいずれかのために、脳への末梢経路による投与のための薬物の製造に使用するための可逆ペグ化ＯＸＭも含む。末梢経路の例としては、吸入による投与を含め、経口、直腸、非経口、例えば、静脈内、筋肉内、もしくは腹腔内、粘膜、例えば、口腔、舌下、鼻腔、皮下または経皮投与が挙げられる。これらの薬物のためのＯＸＭの好ましい投与量を以下に示す。
【０２１８】
本発明は、吸入による投与を含め、経口、直腸、非経口、例えば、静脈内、筋肉内または腹腔内、粘膜、例えば、口腔、舌下、鼻腔、皮下もしくは経皮投与に適した形態で、可逆ペグ化ＯＸＭおよび薬学的に適切な担体を含む医薬組成物を提供する。単位剤形の場合は、単位当たりの投与量は、例えば、下記のようにまたは以下に与えられる１ｋｇ当たりの投与量に基づいて算出されるような量であってよい。
【０２１９】
別の実施形態では、製剤は、全身的な方法よりもむしろ局所的に、例えば、製剤の注射を介して患者の身体の特定の領域に直接投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、鼻腔内剤形として製剤化される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、注射可能な剤形として製剤化される。
【０２２０】
種々の投与量範囲の実施形態が本発明により意図されている：可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド成分は、３日ごとに０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される（ＰＥＧの大きさがかなり異なる場合があるので、可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭの重量のみで示される）。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド成分は、７日毎に０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド成分は、１０日ごとに０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド成分は、１４日ごとに０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される。別の実施形態では、予想外に、可逆ペグ化ＯＸＭ組成物中のＯＸＭの有効量は、遊離ＯＸＭの有効量の１／４〜１／１０である。別の実施形態では、予想外に、ＯＸＭの可逆ペグ化は、遊離ＯＸＭと比較して、患者に処方されるＯＸＭの量を少なくとも５０％に制限することができる。別の実施形態では、予想外に、ＯＸＭの可逆ペグ化は、遊離ＯＸＭと比較して、患者に処方されるＯＸＭの量を少なくとも７０％に制限することができる。別の実施形態では、予想外に、ＯＸＭの可逆ペグ化は、遊離ＯＸＭと比較して、患者に処方されるＯＸＭの量を少なくとも７５％に制限することができる。別の実施形態では、予想外に、ＯＸＭの可逆ペグ化は、遊離ＯＸＭと比較して、患者に処方されるＯＸＭの量を少なくとも８０％に制限することができる。別の実施形態では、予想外に、ＯＸＭの可逆ペグ化は、遊離ＯＸＭと比較して、患者に処方されるＯＸＭの量を少なくとも８５％に制限することができる。別の実施形態では、予想外に、ＯＸＭの可逆ペグ化は、遊離ＯＸＭと比較して、患者に処方されるＯＸＭの量を少なくとも９０％に制限することができる。
【０２２１】
別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド成分は、３日毎に１回、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される（ＰＥＧの大きさがかなり異なる場合があるので、可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭの重量のみで示される）。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド成分は、７日毎に１回、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド成分は、１０日毎に１回、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド成分は、１４日毎に１回、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される。
【０２２２】
別の実施形態では、遊離ＯＸＭと比較して、可逆ペグ化ＯＸＭは、有効投与頻度を少なくとも２倍減らし、有効週用量を少なくとも２倍低下させ、したがって有害事象のリスクを制限し、ＯＸＭ療法の使用による服薬遵守を高める。別の実施形態では、遊離ＯＸＭと比較して、可逆ペグ化ＯＸＭは、有効投与頻度を少なくとも３倍減らし、有効週用量を少なくとも３倍低下させ、したがって有害事象のリスクを制限し、ＯＸＭ療法の使用による服薬遵守を高める。別の実施形態では、遊離ＯＸＭと比較して、可逆ペグ化ＯＸＭは、有効投与頻度を少なくとも４倍減らし、有効週用量を少なくとも４倍低下させ、したがって有害事象のリスクを制限し、ＯＸＭ療法の使用による服薬遵守を高める。別の実施形態では、遊離ＯＸＭと比較して、可逆ペグ化ＯＸＭは、有効投与頻度を少なくとも５倍減らし、有効週用量を少なくとも５倍低下させ、したがって有害事象のリスクを制限し、ＯＸＭ療法の使用による服薬遵守を高める。別の実施形態では、遊離ＯＸＭと比較して、可逆ペグ化ＯＸＭは、有効投与頻度を少なくとも６倍減らし、有効週用量を少なくとも６倍低下させ、したがって有害事象のリスクを制限し、ＯＸＭ療法の使用による服薬遵守を高める。別の実施形態では、有効投薬頻度および有効週用量は、（１）可逆ペグ化ＯＸＭ組成物内の投与されるＯＸＭ成分の重量、および（２）遊離ＯＸＭ（非修飾ＯＸＭ）組成物内の投与されるＯＸＭ成分の重量を基準にしている。
【０２２３】
別の実施形態では、本発明の方法は、ＯＸＭ療法を必要としている慢性疾患に罹患した患者の服薬遵守を高めることを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、上述したように可逆ペグ化ＯＸＭによりＯＸＭの投与頻度の低減化を可能にする。別の実施形態では、本発明の方法は、ＯＸＭの投与の頻度の低減化によってＯＸＭ治療を必要とする患者の服薬遵守を高めることを含む。別の実施形態では、ＯＸＭの投与頻度の低減化は、ＯＸＭをより安定に、より強力にする可逆ペグ化の結果として達成される。別の実施形態では、ＯＸＭの投与頻度の低減化は、ＯＸＭのＴ１／２の増加の結果として達成される。別の実施形態では、ＯＸＭの投与頻度の低減化は、ＯＸＭの血液クリアランスの低下の結果として達成される。別の実施形態では、ＯＸＭの投与頻度の低減化は、ＯＸＭのＴ１／２の増加の結果として達成される。別の実施形態では、ＯＸＭの投与頻度の低減化は、ＯＸＭのＡＵＣ測定値の増加の結果として達成される。
【０２２４】
別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは１日に１回対象に投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、２日毎に１回対象に投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、３日毎に１回対象に投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、４日毎に１回対象に投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、５日毎に１回対象に投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、６日毎に１回患者に投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、週毎に１回対象に投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、７〜１４日毎に１回対象に投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、１０〜２０日毎に１回対象に投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、５〜１５日毎に１回対象に投与される。別の実施形態では、可逆ペグ化ＯＸＭは、１５〜３０日毎に１回対象に投与される。
【０２２５】
一実施形態では、経口投与は、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、チュアブル錠、懸濁液、および乳剤などを含む単位剤形を含む。このような単位剤形は、本発明の安全かつ有効な量のＯＸＭを含み、それらの各々は、一実施形態では、約０．７もしくは３．５ｍｇから約２８０ｍｇ／７０ｋｇ、または別の実施形態では、約０．５もしくは１０ｍｇから約２１０ｍｇ／７０ｋｇである。経口投与用の単位剤形の調製に適する薬学的に許容される担体は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、錠剤は通常、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、マンニトール、乳糖およびセルロースなどの不活性希釈剤、デンプン、ゼラチンおよびショ糖などの結合剤、デンプン、アルギン酸およびクロスカルメロースなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびタルクなどの潤滑剤のような従来の薬学的に適合性のあるアジュバントを含む。一実施形態では、二酸化ケイ素などの流動促進剤を用いて、粉末混合物の流動特性を改善することができる。一実施形態では、ＦＤ＆Ｃ染料などの着色剤は、外観のために添加することができる。アスパルテーム、サッカリン、メントール、ペパーミント、およびフルーツフレーバーなどの甘味料および香味剤は、チュアブル錠に有用なアジュバントである。カプセル剤は通常、上記で開示した１種または複数の固体希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、担体成分の選択は、本発明の目的にとって重要ではない味、コストおよび貯蔵安定性などの二次的考慮事項に依存し、当業者によって容易になされ得る。
【０２２６】
一実施形態では、経口剤形は、あらかじめ定められた放出プロファイルを含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、持続放出錠剤、カプセル剤、トローチ剤またはチュアブル錠を含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、徐放錠剤、カプセル剤、トローチ剤またはチュアブル錠を含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、即時放出錠剤、カプセル剤、トローチ剤またはチュアブル錠を含む。一実施形態では、経口剤形は、当業者に既知の長時間作用型ＯＸＮの所望の放出プロファイルに従って製剤化される。
【０２２７】
別の実施形態では、本発明の方法で使用するための組成物は、溶液または乳濁液を含み、これらは、別の実施形態では、安全かつ有効な量の本発明の化合物、および必要に応じて、局所鼻腔内投与用の他の化合物を含む水性溶液または乳濁液である。いくつかの実施形態では、これらの組成物は、鼻腔内経路によって化合物の全身送達のために使用される主題化合物を約０．００１％〜約１０．０％ｗ／ｖ、より好ましくは、約０．０１％〜約２．０％含む。
【０２２８】
別の実施形態では、これらの医薬組成物は、液体製剤の静脈内、動脈内、皮下、または筋肉内注射により投与される。別の実施形態では、液体製剤は、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、および油類などを含む。一実施形態では、これらの医薬組成物は、静脈内投与され、したがって、静脈内投与に適した形態で製剤化される。別の実施形態では、これらの医薬組成物は動脈内投与され、したがって、動脈内投与に適した形態で製剤化される。別の実施形態では、これらの医薬組成物は筋肉内投与され、したがって、筋肉内投与に適した形態で製剤化される。
【０２２９】
さらに、別の実施形態では、これらの医薬組成物は体表面に局所的に投与され、したがって、局所投与に適した形態で製剤化される。適切な局所製剤としては、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、および点滴薬などを挙げることができる。局所投与のために、本発明の化合物は、医薬担体の有無にかかわらず、追加の適切な治療薬と組み合わされ、生理学的に許容される希釈剤中の液剤、懸濁剤、または乳剤として調製、適用される。
【０２３０】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のプロセスなどの、当技術分野で公知のプロセスによって製造される。
【０２３１】
一実施形態では、本発明に従って使用するための医薬組成物は、薬学的に使用できる製剤へのＯＸＭの処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む１種または複数の生理学的に許容される担体を用いて従来の方法で製剤化される。一実施形態では、製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０２３２】
一実施形態では、本発明の注射剤は水溶液として製剤化される。一実施形態では、本発明の注射剤は、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的塩緩衝液などの生理的に適合する緩衝液中で製剤化される。いくつかの実施形態では、経粘膜投与のために、透過すべき障壁に適する浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は当該技術分野において既知である。
【０２３３】
一実施形態では、本明細書に記載の製剤は、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化される。別の実施形態では、注射用製剤は、単位剤形で、例えば、必要に応じて防腐剤を添加したアンプルまたは多用量容器に入れて提供される。別の実施形態では、組成物は、油性または水性ビークル中の懸濁剤、液剤または乳剤であり、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含む。
【０２３４】
別の実施形態では、組成物はまた、塩化ベンザルコニウムおよびチメロサールなどの保存剤、エデト酸ナトリウムなどのキレート剤、リン酸、クエン酸および酢酸などの緩衝剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびマンニトールなどの等張化剤、アスコルビン酸、アセチルシスチン、およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、芳香剤、セルロースおよびその誘導体を含むポリマーなどの粘度調整剤、ポリビニルアルコール、ならびに必要に応じてこれらの水性組成物のｐＨを調整するための酸および塩基も含む。これらの組成物はまた、いくつかの実施形態では、局所麻酔薬または他の活性成分も含む。これらの組成物はスプレー、ミスト、および点滴薬などとして使用することができる。
【０２３５】
一実施形態では、非経口投与用の医薬組成物は、水溶性形態の活性製剤の水溶液を含む。さらに、長時間作用型ＯＸＭの懸濁液は、いくつかの実施形態では、必要に応じて油性または水系の注射用懸濁液として調製される。適切な親油性溶媒またはビークルには、いくつかの実施形態では、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリドもしくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射用懸濁液は、いくつかの実施形態では、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含む。別の実施形態では、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にする長時間作用型ＯＸＭの溶解度を増大させる好適な安定化剤または薬剤も含む。
【０２３６】
別の実施形態では、活性化合物は、小胞、特に、リポソームに入れて送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−  Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、中のＴｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．、ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；同書中のＬｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、ｐｐ．３１７−３２７を参照されたい。また、一般的な内容については同書を参照されたい）。
【０２３７】
別の実施形態では、制御放出系で送達される医薬組成物は、静脈内注入、植込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式用として製剤化される。一実施形態では、ポンプが使用される（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）、を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を用いることができる。さらに別の実施形態では、制御放出系は、治療標的、すなわち、脳の近傍に配置することができ、したがって、全身用量の一部しか必要ではない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）、を参照されたい）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））で考察されている。
【０２３８】
一実施形態では、長時間作用型ＯＸＭは、適当なビークル、例えば、無菌の、発熱物質を含まない水ベースの溶液で使用前に構成するための粉末形態である。組成物は、いくつかの実施形態では、微粒化および吸入投与用に製剤化される。別の実施形態では、組成物は微粒化手段を備えた容器に入れられる。
【０２３９】
一実施形態では、本発明の製剤は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に製剤化される。
【０２４０】
一実施形態では、本発明の文脈における使用に適する医薬組成物は、長時間作用型ＯＸＭが、意図された目的を達成するための有効量で含まれる組成物を含む。別の実施形態では、治療有効量は、治療される対象の疾患の症状を予防、緩和もしくは改善するか、または生存を延長するのに有効な長時間作用型ＯＸＭの量を意味する。
【０２４１】
一実施形態では、治療有効量の決定は十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２４２】
組成物は、塩化ベンザルコニウムおよびチメロサールなどの保存剤、エデト酸ナトリウムなどのキレート剤、リン酸、クエン酸および酢酸などの緩衝剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびマンニトールなどの等張化剤、アスコルビン酸、アセチルシスチン、およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、芳香剤、セルロースおよびその誘導体を含むポリマーなどの粘度調整剤、ポリビニルアルコール、ならびに必要に応じてこれらの水性組成物のｐＨを調整するための酸および塩基も含む。これらの組成物は、局所麻酔薬、または他の活性物質も含む。これらの組成物はスプレー、ミスト、および点滴薬などとして使用することができる。
【０２４３】
薬学的に許容される担体またはその成分として機能し得る物質のいくつかの例としては、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、およびメチルセルロースなどのセルロースおよびその誘導体、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなどの固体潤滑剤、硫酸カルシウム、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびカカオ油などの植物油類、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール類、アルギン酸、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）ブランドの乳化剤などの乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤、着色剤、香味剤、錠剤化剤、安定化剤、酸化防止剤、防腐剤、発熱物質を含まない水、等張食塩水、ならびにリン酸緩衝液が挙げられる。化合物と組み合わせて使用される薬学的に許容される担体の選択は、基本的に化合物が投与される方法により決定される。主題化合物が注入される場合に、一実施形態では、薬学的に許容される担体は、ｐＨが約７．４に調整されている、血液適合性懸濁剤を有する無菌の生理食塩水である。
【０２４４】
さらに、組成物は、結合剤（例えば、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、デンプングリコール酸ナトリウム）、様々なｐＨおよびイオン強度の緩衝液（例えば、トリス塩酸塩、酢酸塩、リン酸塩）、表面への吸収を防ぐためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、プルロニックＦ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、透過促進剤、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定化剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増粘剤（例えば、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味料（例えば、アスパルテーム、クエン酸）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、滑剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動助剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマーコーティング（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）、コーティング剤およびフィルム形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリレート、ポリメタクリレート）ならびに／またはアジュバントをさらに含む。
【０２４５】
シロップ剤、エリキシル剤、乳濁液および懸濁剤用の担体の典型的な成分としては、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液体スクロース、ソルビトールおよび水を挙げることができる。懸濁液については、典型的な懸濁剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（商標）、ＲＣ−５９１）、トラガカントおよびアルギン酸ナトリウムが含まれ、典型的な湿潤剤としては、レシチンおよびポリエチレンオキシドソルビタン（例えば、ポリソルベート８０）を挙げることができる。典型的な防腐剤としては、メチルパラベンおよび安息香酸ナトリウムを挙げることができる。別の実施形態では、経口液体組成物はまた、上記に開示した甘味料、香味剤および着色剤などの１種または複数の成分も含む。
【０２４６】
これらの組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどの高分子化合物の粒子状製剤の中もしくは上、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層の小胞、赤血球ゴースト、もしくはスフェロプラスト上への活性物質の取り込みも含む。このような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼすであろう。
【０２４７】
ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）でコーティングされた粒子組成物、および組織特異的な受容体、リガンドもしくは抗原に対する抗体に結合した化合物または組織特異的受容体のリガンドに結合した化合物も本発明に包含される。
【０２４８】
一実施形態では、化合物は、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリンなどの水溶性ポリマーの共有結合によって修飾される。別の実施形態では、修飾された化合物は、実質的に、対応する非修飾化合物よりも静脈内注射後の血中半減期が長い。一実施形態では、修飾は、水溶液中の化合物の溶解度を増加させ、凝集を排除し、化合物の物理的および化学的安定性を高め、化合物の免疫原性および反応性を著しく低下させる。別の実施形態では、所望のインビボ生物活性は、非修飾化合物を用いた場合よりも少ない頻度または低い用量でのこのような高分子化合物の投与により達成される。
【０２４９】
別の実施形態では、有効量または有効用量の製剤は、インビトロアッセイから最初に推定することができる。一実施形態では、動物モデルにおける用量を製剤化することができ、そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０２５０】
一実施形態では、本明細書に記載の長時間作用型ＯＸＭの毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における、インビトロの標準的な薬学的手順によって決定することができる。一実施形態では、これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を製剤化するのに用いることができる。一実施形態では、投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変化する。一実施形態では、正確な製剤、投与経路および投与量は、患者の病状を考慮して個々の医師が選択することができる［例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）"Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１  ｐ．１、を参照されたい］。
【０２５１】
一実施形態では、処置すべき病状の重症度および応答性に応じて、投薬は、数日〜数週間続く治療の過程での、または治癒が得られるか、または病態の縮小が達成されるまでの単回または複数回投与であり得る。
【０２５２】
一実施形態では、投与されるべき組成物の量は、当然、治療される対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０２５３】
一実施形態では、適合する医薬担体中に製剤化される本発明の製剤を含む組成物も、調製され、適切な容器に入れられ、示した病状の処置について表示される。
【０２５４】
別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭは、全身投与によって投与される。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭは、静脈内、筋肉内または皮下注射によって投与される。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭは、非イオン性界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）（すなわち、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ））、各種糖類、有機ポリオール類および／またはヒト血清アルブミンなどの複合有機賦形剤および安定化剤と組み合わせた凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅ）（すなわち、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ））製剤である。別の実施形態では、医薬組成物は、注射用滅菌水中の本明細書に記載の凍結乾燥可逆ペグ化ＯＸＭを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、注射用滅菌ＰＢＳ中の本明細書に記載の凍結乾燥可逆ペグ化ＯＸＭを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、注射用の滅菌０．９％ＮａＣｌ中の本明細書に記載の凍結乾燥可逆ペグ化ＯＸＭを含む。
【０２５５】
別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭならびにヒト血清アルブミン、ポリオール、糖類、アニオン性界面活性剤、および安定化剤などの複合担体を含む。例えば、国際公開第８９／１０７５６号（Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、ポリオールおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸を含む）を参照されたい。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭならびにラクトビオン酸および酢酸／グリシン緩衝液を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭおよび水中におけるインターフェロン組成物の溶解性を高めるアルギニンまたはグルタミン酸などのアミノ酸を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の凍結乾燥可逆ペグ化ＯＸＭならびにグリシンまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、緩衝剤（例えば、酢酸）、および等張剤（例えば、ＮａＣｌ）を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の凍結乾燥可逆ペグ化ＯＸＭならびにリン酸緩衝液、グリシンおよびＨＳＡを含む。
【０２５６】
別の実施形態では、本明細書に記載のペグ化または可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、ｐＨ約４〜７．２の緩衝溶液中に置かれたときに安定化する。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、安定化剤としてのアミノ酸および場合によって（アミノ酸が荷電側鎖を含まない場合）塩で安定化される。
【０２５７】
別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、約０．３％〜５重量％のアミノ酸である安定化剤を含む液体組成物である。
【０２５８】
別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、投薬精度および製品の安全性を提供する。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、注射可能な用途に使用するための生物活性のある安定な液体製剤を提供する。別の実施形態では、この医薬組成物は、本明細書に記載の凍結乾燥されていない可逆ペグ化ＯＸＭを含む。
【０２５９】
別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、保管を容易にし、投与前に出荷するために、液体状態で長期間保管できる液体製剤を提供する。
【０２６０】
別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、マトリックス材料として固体脂質を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む注射可能な医薬組成物は、マトリックス材料として固体脂質を含む。別の実施形態では、噴霧凝固による脂質微粒子の生成は、Ｓｐｅｉｓｅｒ（Ｓｐｅｉｓｅｒ  ａｎｄ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（１９９１）４７−５４）によって記載されており、その後、経口投与のための脂質ナノペレットにされる（Ｓｐｅｉｓｅｒによる欧州特許第０１６７８２５号（１９９０））。別の実施形態では、使用される脂質（例えば、非経口栄養用の乳濁液中に存在する脂肪酸からなるグリセリド）は、体内で耐容性良好である。
【０２６１】
別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、リポソームの形態である（Ｊ．Ｅ．Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ  ａｎｄ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．／ｎｄ．５６（１９９４）２６７−２７５）。
【０２６２】
別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、ポリマー微粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む注射用医薬組成物は、ポリマー微粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、リポソームを含む。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、脂質乳濁液を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、マイクロスフェアを含む。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、両親媒性脂質を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の可逆ペグ化ＯＸＭを含む医薬組成物は、薬物、脂質マトリックスおよび界面活性剤を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、脂質マトリックスは、少なくとも５０％ｗ／ｗのモノグリセリド含量を有する。
【０２６３】
一実施形態では、本発明の組成物は、長時間作用型ＯＸＭを含む１つまたは複数の単位剤形を含有する米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されたキットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供される。一実施形態では、パックは、例えば、金属またはブリスターパックなどのプラスチックホイルを含む。一実施形態では、パックまたはディスペンサー装置は、投与のための説明書が添付されている。一実施形態では、パックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形式で容器に添付された通知が収容されており、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。このような通知は、一実施形態では、処方薬または承認された製品添付文書について米国食品医薬品局によって承認されたラベリングである。
【０２６４】
一実施形態では、本発明の可逆ペグ化ＯＸＭは、各薬剤を単独で用いた処置と比較して改善された治療効果を達成するために、追加の活性薬剤を個体に提供することができることが理解されるであろう。別の実施形態では、併用療法に関連する有害副作用に対して処置（例えば、相補的な薬剤の投薬および選択）が行われる。
【０２６５】
本発明の追加の目的、利点、および新規特徴は、限定を意図するものではない次の実施例を考察することにより、当業者に明らかとなるであろう。さらに、本明細書中上記に詳述されたような、および、下記の特許請求の範囲のセクションにおいて請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれに関する実験的裏付けが下記の実施例において認められる。
【０２６６】
実施例
【０２６７】
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で使用される検査法には、分子、生化学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術が含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば、以下の文献を参照されたい。"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，"Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ"，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ"，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）"Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ"，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に示された方法；"Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ"，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；"Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ"  ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），"Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），"Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範囲にわたり記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号を参照されたい；"Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"  Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；"Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ"  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；"Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ"  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；"Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ"  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；"Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ"  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；"Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ"  Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ"  Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；"ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ"  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これら全て、参照により組み込まれる。その他の一般的な文献は、本明細書全体を通して提供される。
【０２６８】
実施例１
ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭの調製
【０２６９】
ＯＸＭの合成
【０２７０】
オキシントモジュリンアミノ酸配列は、次のペプチド配列により示される：ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号１）
【０２７１】
このペプチドを、ペプチド鎖のアセンブリ全体にＦｍｏｃ戦略を用いた固相法により合成した（Ａｌｍａｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）。
【０２７２】
ペプチド配列を次のステップを使ってアセンブルした。
【０２７３】
１．キャッピング
【０２７４】
樹脂をＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）中の０．５Ｍ無水酢酸（Ｆｌｕｋａ）溶液を用いてキャッピングした。
【０２７５】
２．脱保護
【０２７６】
Ｆｍｏｃ−保護基を、ＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）中２０％ｖ／ｖのピペリジン（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）溶液を用いて、成長するペプチド鎖から除去した。
【０２７７】
３．アミノ酸カップリング
【０２７８】
０．５ＭのＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）中アミノ酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）溶液を、ＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）中１ＭのＨＯＢｔ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）溶液および１ＭのＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）中ＤＩＣ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）溶液を用いて活性化した。カップリング毎に４当量のアミノ酸をそれぞれ使用した。
【０２７９】
粗ペプチドを樹脂から切断し、保護基をトリイソプロピルシラン（Ｆｌｕｋａ）、水、ジメチルスルフィド（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヨウ化アンモニウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴＦＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の反応混液中で４時間撹拌することにより除去する。粗ペプチドを冷ジエチルエーテルからの沈殿により回収する。
【０２８０】
ペプチド精製
【０２８１】
粗ペプチドを、アセトニトリル（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）／水（ミリＱ）（５：９５）に溶解し、分取ＨＰＬＣカラムにロードした。クロマトグラフパラメータを以下に示す。
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８  ２５０ｍｍ×３０、１５μｍ、３００Ａ
移動相Ａ：水＋０．１％ｖ／ｖのＴＦＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
移動相Ｂ：アセトニトリル（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）＋０．１％ｖ／ｖのＴＦＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
紫外検出：２１４または２２０ｎｍ
勾配：カラム体積の４倍を超える量の２５％Ｂ〜３１％Ｂによる勾配
流速：４３ｍＬ／分
【０２８２】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの合成
【０２８３】
スキーム１−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳおよびＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳリンカーの合成
【０２８４】
【化２７】
2018517697.tif 000029
【０２８５】
化合物２〜５の合成は、ＡｌｂｅｒｉｃｉｏらのＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２００１，３１（２），２２５−２３２に記載の手順に基づく。
【０２８６】
２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（２）：
【０２８７】
２−アミノフルオレン（１８ｇ、９９ミリモル）を、氷浴中で磁気撹拌しながらジオキサン：水（２：１）（２００ｍｌ）および２ＮのＮａＯＨ（６０ｍｌ）の混合物に懸濁させた。次いで、Ｂｏｃ２Ｏ（１０９ミリモル、１．１当量）を加え、室温で攪拌し続けた。反応をＴＬＣ（Ｒｆ＝０．５、ヘキサン／酢酸エチル２：１）によって監視し、２ＮのＮａＯＨの添加によりｐＨを９〜１０に維持した。反応完了時に、懸濁液を１ＭのＫＨＳＯ４を使ってｐＨ＝３に酸性化した。固形物を濾過し、冷水（５０ｍｌ）、ジオキサン−水（２：１）で洗浄し、次いで、次のステップで使用する前に２回トルエンで共沸した。
【０２８８】
９−ホルミル−２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（３）：
【０２８９】
３口ＲＢＦに、ＮａＨ（油中６０％；３３０ミリモル、３．３当量）を、乾燥ＴＨＦ（５０ｍｌ）中に懸濁し、ステップ２に記載の乾燥ＴＨＦ（２３０ｍｌ）中に−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン溶液（２８ｇ；１００ミリモル）を２０分かけて滴加した。濃厚な黄色のスラリーが観察され、混合物を窒素下、室温で１０分間攪拌した。ギ酸エチル（２０．１ｍｌ、２５０ミリモル、２．５当量）を滴加した（注意：ガス発生）。このスラリーは淡褐色溶液に変化した。この溶液を２０分間攪拌した。反応をＴＬＣ（Ｒｆ＝０．５、ヘキサン／酢酸エチル１：１）によって監視し、微量の出発材料のみが観察された場合、氷水（３００ｍｌ）でクエンチした。混合物を、ＴＨＦの大部分が除去されるまで減圧下で蒸発させた。得られた混合物をｐＨ＝５まで酢酸で処理した。得られた白色沈殿物を酢酸エチルに溶解し、有機層を分離した。水層を酢酸エチルで抽出し、全ての有機層を合わせ、飽和重炭酸ナトリウム、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過および溶媒除去後、黄色固体が得られた。この物質を次のステップで使用した。
【０２９０】
９−ヒドロキシメチル−２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（４）：
【０２９１】
上記の化合物３をＭｅＯＨ（２００ｍｌ）に懸濁し、ホウ素化水素ナトリウムを１５分かけて少しずつ添加した。混合物を３０分間撹拌した（注意：発熱反応およびガス発生）。反応をＴＬＣ（Ｒｆ＝０．５、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  １：１）により監視し、完結させた。水（５００ｍｌ）を添加し、酢酸でｐＨを５に調整した。後処理には、酢酸エチルでの２回抽出、合わせた有機層の重炭酸ナトリウムおよびブラインでの洗浄、ＭｇＳＯ４上での乾燥、濾過および濃縮乾固を必要とした。得られた粗生成物を、ヘプタン／ＥｔＯＡｃ（３：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、黄色発泡体を得た（３６ｇ、純度９７．５％、微量の酢酸エチルおよびジエチルエーテルが１Ｈ−ＮＭＲで観察された）。
【０２９２】
ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ（７）：
【０２９３】
オーバーヘッド撹拌によるクリーン乾燥ＲＢＦ５００ｍｌに乾燥ＴＨＦ（５５ｍｌ）中のトリホスゲン（１．５８ｇ、０．３５当量）を添加し、周囲環境で溶液を形成させた。これを氷／水浴で０℃まで冷却し、乾燥ＴＨＦ（１９ｍｌ）中ＮＨＳ（０．６７ｇ、０．３８当量）の溶液を窒素下、０℃で１０分間かけて滴加した。得られた溶液を３０分間攪拌した。追加分の乾燥ＴＨＦ（３６ｍｌ）中のＮＨＳ（１．３４ｇ、０．７７当量）を、０℃で１０分かけて滴加し、１５分間撹拌した。
【０２９４】
化合物６（５．５ｇ、１当量）、乾燥ＴＨＦ（５５ｍｌ）およびピリジン（３．０７ｍｌ、２．５当量）を共に撹拌し、懸濁液を形成させた。これを０〜５℃でＮＨＳ溶液に少しずつ添加し、次いで、氷浴を除去して、室温まで放置した。
【０２９５】
２０時間後、反応を停止した（出発原料がまだ存在しており、反応を完了させると、わずかな不純物が観察された）。
【０２９６】
反応混合物を濾過し、濾液に、４％ブライン（２００ｍｌ）およびＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）を添加した。分離後、有機層を５％クエン酸（２２０ｍｌ）および水（２２０ｍｌ）で洗浄した。次いで、有機層を濃縮し、７．６７ｇのＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ（純度は９３〜９７％）を得た。この物質を、シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃの７０：３０〜４０：６０の勾配を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含む画分を真空濃縮し、３．４７ｇ（４５％）のＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを得た。
【０２９７】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−（Ａ）
【０２９８】
トリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）中のＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ（１００ｍｇ、０．２ミリモル）の溶液に、クロロスルホン酸（０．５ｍｌ）を加えた。１５分後、氷冷したジエチルエーテル（９０ｍｌ）を添加し、生成物が沈殿した。この物質を遠心分離により収集し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥した。ベージュ色の固体４１．３ｍｇ（３５％）を得た。
【０２９９】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−（Ｂ）
【０３００】
出発材料のＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを不活性雰囲気下で、典型例では５分間、未希釈のＴＦＡ（典型例では５２０ｍＬ）中に溶解した。６当量のクロロスルホン酸を未希釈のＴＦＡ（典型例では１０６ｍＬ）中に溶解し、反応混合物に滴加した（典型例では４５分間）。スルホン化の完了後（典型例では５０分間）、沈殿させるために、反応混合物を冷ジエチルエーテルに注ぎ込んだ（典型例では２５．４Ｌ）。沈殿物の濾過および真空中乾燥（典型例では９０分）により、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（純度９３〜９７％）を得て、これをカップリング段階に直接供した。ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを９３〜９７％の十分な純度で得た。
【０３０１】
実施例１Ａ
ＯＸＭ＋ＰＥＧＳＨ＋ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−（Ａ）の結合−ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ（ＭＯＤ６０３０）異種混在結合体を得るための「ワンポット反応」
【０３０２】
ＯＸＭペプチド中の３つのアミン部位（Ｌｙｓ１２、Ｌｙｓ３０およびアミノ末端）の異種混在結合反応を「ワンポット反応」として行い、ＯＸＭ、ｍＰＥＧ−ＳＨおよびＦＭＳリンカーの各成分の１当量を、ｐＨ７．２で３０分間混合した。酢酸を添加し、ｐＨを４まで下げて反応を停止した。
【０３０３】
異種混在結合体（ＭＯＤ−６０３０、図１、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ）の合成を次のように実施した：ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−（Ａ）［上述の通り］を、ＯＸＭおよびＰＥＧ（３０）−ＳＨと混合した（ワンポット反応として）。このＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−（Ａ）スペーサーを、一方の側でそのＮＨＳ活性化エステルによってＯＸＭに結合させ、同時にもう一方の側でマレイミド基に連結されたＰＥＧ−ＳＨによってＯＸＭに結合させた。このように、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ結合体の異種混在物は、ＯＸＭペプチドの３つのアミン（Ｎ末端、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）の内の１つによって連結された３種類の変異体で構成されている。
【０３０４】
異種混在結合反応では、オキシントモジュリン合成が完了し、切断中に全ての保護基が除去されることにより、一級アミンを有するペプチドはＮＨＳ基とさらに反応できる。粗オキシントモジュリンは精製され、ワンポット反応が実施される。
【０３０５】
実施例１Ｂ
ＯＸＭ＋ＰＥＧＳＨ＋ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−（Ａ）の結合−ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭの同種結合体を得るための二段法
【０３０６】
結合手順を、制御された部位特異的な方法でＦＭＳスペーサーへの結合を行う二段法へとさらに発展させた。最初のステップでは、ＦＭＳスペーサーを保護ＯＸＭ＊（樹脂上の部分的に保護されたＯＸＭで、好ましい保護ＯＸＭとして、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０が保護されたＮ末端ＯＸＭ）に結合させ、次いで、切断し、続けて、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭの脱保護および（ＲＰ−ＨＰＬＣによる）精製を行った。
【０３０７】
＊Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳ法を使ったＯＸＭのペプチド合成中に、アミノ酸のそれぞれのＲ基に対する種々の保護基によりアミノ酸が保護され、これは、樹脂からのＴＦＡによる切断中に脱保護される。Ｌｙｓ１２またはＬｙｓ３０部位特異的ＦＭＳカップリングを行うために、ｉｖＤｄｅを使ってリシンのアミノ基を保護した。例えば、ＯＸＭ−Ｌｙｓ１２−ＦＭＳに対しては、Ｌｙｓ１２のＲ基中のＮＨ２をｉｖＤｄｅにより保護し、これは、弱酸条件により選択的に除去されるが、他の保護基が使用されている他の全てのアミノ酸は、その時点でも保護されたままである。特異的Ｎ末端カップリングに対しては、通常のＳＰＰＳが使われ、すなわち、ＯＸＭの合成は、引き続いて行われる、非保護Ｎ末端基に対してのみカップリングするＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの添加により完結した。
【０３０８】
第２のステップは、精製された同種のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭへのＰＥＧ３０−ＳＨの結合であった。最終結合生成物（ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ）は、ＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製される。追加の精製ステップには、イオン交換もしくはＳＥＣ−ＨＰＬＣまたは任意の他の精製ステップなどを適用してよい。
【０３０９】
樹脂上の３種類のペプチドを、Ｆｍｏｃ固相法を用いて合成した。ＯＸＭの位置１２または３０にアミノ酸リシンで連結された同種結合体の合成には、ＯＸＭのＬｙｓ１２またはＬｙｓ３０のいずれかに対しｉｖＤｄｅ（１−［（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリジン）エチル］）などの選択的な保護基を適用した。これは、塩基性条件下で除去することができ、同時に、ペプチドの他の保護基を有する残りの部分が樹脂上に依然として残っている。
【０３１０】
したがって、Ｎ末端には、Ｆｍｏｃ戦略による固相合成法に適する保護基（通常は、Ｂｏｃ保護基が、εアミンのために使用される）を用い、Ｌｙｓ１２またはＬｙｓ３０にはｉｖＤｄｅ保護基を用いて、３種類の樹脂結合ＯＸＭを合成した。これらのＯＸＭペプチドは、ＦＭＳリンカーとの更なる選択的結合用のものであった。
【０３１１】
同種結合体を、「樹脂上合成」として行った。以下の２つのステップで結合体を合成した。
１．ＯＸＭとＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ間でのカップリング、切断および精製。
２．ＰＥＧ３０−ＳＨによるＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭのペグ化。この手順では、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ化合物のカップリングは、いずれかの保護ＯＸＭ（遊離Ｎ末端−ＯＸＭ、遊離Ｌｙｓ１２−ＯＸＭまたは遊離Ｌｙｓ３０−ＯＸＭ）と実施される。保護ＯＸＭは目的外の遊離アミン部位を保護し、ＯＸＭ上の所望の特定非保護アミノ酸部位をＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ上のＮＨＳ部分と反応させることを可能にする。精製されたＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭをＰＥＧ３０−ＳＨと反応させ、粗結合体を生成し、これをＨＰＬＣ（ＲＰもしくは陽イオン交換または両方）を使って精製した。
【０３１２】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ａ）のＬｙｓ１２／Ｌｙｓ３０を保護したＮ末端ＯＸＭへのカップリング（ＭＯＤ−６０３１）：
【０３１３】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳリンカー溶液（０．７４６ｍｌ、ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌ、２当量）をＬｙｓ１２／Ｌｙｓ３０を保護したＮ末端ＯＸＭ樹脂＊（１当量、樹脂２００ｍｇ、３１．９９８μモル／ｇの遊離アミン）に添加した。樹脂が自由に移動可能になるまでＤＭＦを添加し、次いで、１９時間超音波処理した。樹脂をＤＭＦおよびメタノールで洗浄し、真空デシケーター中で一晩乾燥した。切断反応混液には、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏを含めた。切断を、室温で３．５時間かけて行った。樹脂を濾過した後、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭを冷ジエチルエーテルで沈殿させた。切断段階の最後に、粗ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ（３６％純度）４２．１ｍｇを得た。
【０３１４】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ａ）のＬｙｓ１２部位特異的ＯＸＭへのカップリング：
【０３１５】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳリンカー溶液（ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌ、２．５当量）を、（Ｌｙｓ１２）ＯＸＭ樹脂（１当量）に添加し、ＤＩＥＡ（５当量）を添加した。樹脂が自由に移動可能になる量までＤＭＦを添加し、次いで、一晩超音波処理した。樹脂をＤＭＦおよびメタノールで洗浄した後、真空デシケーター中で一晩乾燥した。切断および沈殿を、Ｎ末端部位特異的ＯＸＭについて記載したように行った。
【０３１６】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ａ）のＬｙｓ３０部位特異的ＯＸＭへのカップリング：
【０３１７】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳリンカー（２．５当量）を、ＤＩＥＡ（５当量）を加えたＤＣＭに溶解した。このリンカー／ＤＩＥＡ溶液を（Ｌｙｓ３０）ＯＸＭ樹脂に添加し、次いで、一晩超音波処理した。樹脂をＤＣＭおよびメタノールで洗浄した後、真空デシケーター中で一晩乾燥した。切断および沈殿を、Ｎ末端部位特異的ＯＸＭについて記載したように行った。
【０３１８】
精製
【０３１９】
上記で生成により得られたいずれかの同種中間体から得られた粗ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭを、次の条件下で１度に精製した。
試料希釈剤：水中の１０％アセトニトリル
カラム：Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）、１００Å、２５０ｘ２１．２ｍｍ
注入流量：９ｍｌ／分
実行中の流量：９ｍｌ／分
緩衝液Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）
緩衝液Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
勾配：３２分間かけて１０〜４５％Ｂ
監視：２３０ｎｍ
【０３２０】
上記で生成したいずれか１つの同種中間体を使って、次のステップで同種結合体を形成した：
【０３２１】
ＰＥＧ３０ＳＨのＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭへの結合
【０３２２】
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ溶液（１当量、１．５ｍｌのＤＭＦ中１５．１ｍｇ）を調製した。ＰＥＧ３０ＳＨ（１当量、１０ｍｇ／ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中９．２ｍｌ）をＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ溶液に添加した。次いで、反応混合物を、室温で３０分撹拌した後、氷酢酸（２００μｌ）を加え、ｐＨを低下させることによって反応をクエンチした。
【０３２３】
次いで、得られた生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて所望の同種結合体ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ（ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ）を得た。
カラム：Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）、１００Å、２５０ｘ２１．２ｍｍ
注入流量：５ｍｌ／分
実行中の流量：２０ｍｌ／分
緩衝液Ａ：水＆０．１％ＴＦＡ
緩衝液Ｂ：アセトニトリル／水（７５：２５）＆０．１％ＴＦＡ
勾配：４１分かけて１０〜６５％Ｂ
監視：２２０、２４０、２８０ｎｍ
【０３２４】
実施例１Ｃ
ＯＸＭ＋ＰＥＧＳＨ＋ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ−（Ｂ）の結合−ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭの同種結合体を得るための二段法
【０３２５】
不活性雰囲気下で、ＯＸＭ樹脂（Ｌｙｓ１２／Ｌｙｓ３０を保護したＮ末端ＯＸＭ、またはＬｙｓ１２／Ｎ末端を保護したＯＸＭまたはＬｙｓ３０／Ｎ末端を保護したＯＸＭ＊を使って、典型例では２ＬのＤＭＦ中２３６ｇ）をＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ｂ）の未希釈のＤＭＦ／ＤＣＭ溶液（１：１、ｖ／ｖ、典型例では１２ｇ／Ｌの濃度）中に懸濁させ、その後、反応混合物を未希釈のＤＩＰＥＡ（典型例では７．５ｍＬ）を使って、６．０〜６．５のみかけのｐＨに調節することによりカップリングを実施した。カップリングは室温で撹拌を行いながら実施した。ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳリンカーを２回に分けて加えた（１回目の部分：１．５当量；２回目の部分：０．５当量のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ；当量はペプチド樹脂の使用量に対し計算した；２回目の部分は１回目の部分がなくなってから添加した）。それぞれのカップリングステップを、２２〜２４時間実施した。濾過後、樹脂を、ＤＭＦ（典型例では８．５ｍＬ／ｇ樹脂、３回）、ＭｅＯＨ（典型例では８．５ｍＬ／ｇ、３回）およびイソプロピルエーテル（典型例では８．５ｍＬ／ｇ、３回）で連続的に洗浄し、その後、真空乾燥（６９〜１１８時間）して、完全保護ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ樹脂を得た。１１６ｇ〜２４３ｇまでの典型量のＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭを得た。
【０３２６】
＊Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳ法を使ったＯＸＭのペプチド合成中に、アミノ酸のそれぞれのＲ基に対する種々の保護基によりアミノ酸が保護され、これは、樹脂からのＴＦＡによる切断中に脱保護される。Ｌｙｓ１２またはＬｙｓ３０部位特異的ＦＭＳカップリングを行うために、ｉｖＤｄｅを使ってリシンのアミノ基を保護した。例えば、ＯＸＭ−Ｌｙｓ１２−ＦＭＳに対しては、Ｌｙｓ１２のＲ基中のＮＨ２をｉｖＤｄｅにより保護し、これは、弱酸条件により選択的に除去されるが、他の保護基が使用されている他の全てのアミノ酸は、その時点でも保護されたままである。特異的Ｎ末端カップリングに対しては、通常のＳＰＰＳが使われ、すなわち、ＯＸＭの合成は、引き続いて行われる、非保護Ｎ末端基に対してのみカップリングするＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの添加により完結した。
【０３２７】
切断：
【０３２８】
室温で３．５時間、ペプチド樹脂をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（８４：８．５：７．５、ｖ／ｖ／ｖ）で処理することにより粗ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭを得た。３．５時間後、Ｍｅｔ（Ｏ）還元のために、１当量のヨウ化アンモニウムを固形分として加えた。４．０時間後、アスコルビン酸１．５当量を固形分として加えた。切断反応混液をさらに５分間撹拌し、イソプロピルエーテル（ＩＰＥ）（典型例では１ｍＬの切断反応混液当たり５ｍＬ）中で沈殿させた。濾過および真空乾燥（典型例では４１〜９０時間）により単離した。
【０３２９】
精製
【０３３０】
二次元精製スキームを適用した（一次元に代えて）
固定相および勾配を変更した。
試料希釈剤：５０％酢酸
カラム：Ｌｕｎａ  Ｃ８（１０μｍ、１００Å）、３０ｃｍｘ２５ｃｍ
注入流量：１５００ｍｌ／分
実行中の流量：１５００ｍｌ／分
緩衝系および勾配：一次元に対しては、０．１％Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ２）（Ａ：３％、Ｂ：６０％ＡＣＮ）（勾配プロファイル：０％Ｂ−７０分−１００％Ｂ）および二次元に対しては、０．１％ＴＦＡ溶出液（ｐＨ２）（Ａ：３％、Ｂ：１００％ＡＣＮ）（勾配プロファイル：０％Ｂ−９７分−１００％Ｂ）。
検出波長：２２０ｎｍ
【０３３１】
ＰＥＧＳＨのＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭへの結合
【０３３２】
ペプチドＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ（Ｂ）（１２．３ｇ、１当量）およびＰＥＧ３０−ＳＨ（１．１当量、６７．８ｇ（活性ＳＨ基））を別々に１０％ＡＣＮ（ペプチドに対しては１２ｇ／Ｌ、ＰＥＧ３０−ＳＨに対しては１０ｇ／Ｌ）を含む２０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．７）に溶解した。（ＮａＯＡｃ水溶液、ｐＨ９．３を使って）ｐＨを６．１に調節後、その溶液を、不活性雰囲気下、室温で、典型例では１時間撹拌した。その後、ＡｃＯＨ（２５％ｖ／ｖ）でｐＨを４．５〜５．０に調節し、得られた反応混合物を分取ＨＰＬＣ精製に供した。
【０３３３】
サンプル希釈剤：ペグ化反応由来の粗生成物
カラム：Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）（１０μｍ、１００Å）、２０ｃｍｘ２８ｃｍ
注入流量：９０７ｍｌ／分
実行中の流量：９０７ｍｌ／分
緩衝系：０．１％ＴＦＡ溶出液（ｐＨ２．０）（Ａ：５％ＡＣＮ、Ｂ：９０％ＡＣＮ）
勾配プロファイル：５％Ｂ−３０分−５％Ｂ−６６分−７８％Ｂ−１分−９０％Ｂ−１５分−９０％Ｂ
検出波長：２２０ｎｍ
精製画分をプールし、凍結乾燥した。
【０３３４】
実施例２
ＧＬＰ−１受容体活性化のインビトロキャラクタリゼーション
【０３３５】
ＧＬＰ−１受容体活性化を、共にＧＬＰ−１受容体を過剰発現している２種類の異なる細胞株のＨＴＳ１６３Ｃ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびｃＡＭＰハンター（商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＬＰ１Ｒ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ）を用いて評価した。ＨＴＳ１６３Ｃ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１００，０００細胞／ｍｌの密度で９６ウェルハーフエリアホワイトプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。これらの細胞を、異種混在ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭおよび３種類の同種ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体（アミノ、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）の濃度を増加させてインキュベートした。細胞のｃＡＭＰ濃度をＨＴＲＦアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ  ６２ＡＭ４ＰＥＢ）によって定量し、ＥＣ５０パラメータをＰＲＩＳＭソフトウェアにより解析した。ｃＡＭＰハンター（商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＬＰ１Ｒは、リガンドの受容体への結合の際にｃＡＭＰを分泌する。５０００００細胞／ｍｌの密度で細胞を９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートした。リガンドを、ＩＢＭＸを含む希釈剤で希釈し、５％ＣＯ２、３７℃で３０分間、培養ウェルに二つ組で添加した。ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭの濃度範囲を１．５ｘ１０−１０〜１．２ｘ１０−６Ｍとした。リシスバッファーおよび検出試薬をウェルに添加し、化学発光シグナルを用いてｃＡＭＰ濃度を検出した。用量依存曲線を作成し、様々なリガンドの結合親和性（ＥＣ５０）を、最適用量反応モデル（４パラメータ）を適用することによってＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて算出した。
【０３３６】
ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ（ＭＯＤ−６０３０；異種混在）のＧＬＰ−１ならびにＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭの３種類の異なる同種変異体であるアミノ（ＭＯＤ−６０３１）、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０の受容体結合活性化を、ＧＬＰ−１受容体を過剰発現する２種類の異なる細胞株：ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＨＴＳ１６３Ｃ２細胞株およびｃＡＭＰハンター（商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＬＰ１Ｒを用いて評価した。各変異体のＥＣ５０を算出し、その後、異種混在（ＭＯＤ−６０３０）変異体に対する各変異体の相対的効力を算出する（各同種変異体のＥＣ５０を異種混在変異体のＥＣ５０で割り、それに１００を掛ける）ことにより効力を決定した。ＥＣ５０値および算出した相対的効力を表４に示す。比較のために、ｃＡＭＰハンターＣＨＯ−Ｋ１  ＧＬＰ１Ｒ細胞株のＧＬＰ−１受容体に対するＯＸＭおよびＧＬＰ−１の結合親和性を測定した。
【０３３７】
【表４】
2018517697.tif 000030
【０３３８】
同種変異体の相対的効力を異種混在変異体と比較し、表４にまとめた。アミノ変異体および異種混在変異体の同等の生物活性は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＨＴＳ１６３Ｃ２およびｃＡＭＰハンター（商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＬＰ１Ｒを用いて測定した場合に、それぞれ７２．２％および９９．１％の相対的効力を示した。
【０３３９】
Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０変異体は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＨＴＳ１６３Ｃ２細胞株を用いた場合に、ＧＬＰ−１受容体結合活性化をそれぞれ２および４倍低下させたが、ｃＡＭＰハンター（登録商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＬＰ１Ｒ細胞株を用いた場合は、それぞれわずかな低下および２倍の低下を示した。ＯＸＭのＮ末端が、ＧＬＰ−１受容体へのＯＸＭの結合に関与することが報告された（Ｄｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）けれども、他の変異体と比較して、アミノ変異体が優れた結合活性を示したという事実は予想外である。全体的に、アミノ変異体および異種混在変異体に関し、同程度の生物活性が示された。ＯＸＭおよびＧＬＰ−１ペプチドのＧＬＰ−１受容体結合活性化を測定した。ＯＸＭおよびＧＬＰ−１は、異種混在ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭと比較して、５．９および５０８．７倍高い受容体結合活性化を示すことが判明した。
【０３４０】
実施例３
グルカゴン受容体活性化のインビトロキャラクタリゼーション
【０３４１】
グルカゴン受容体活性化を、グルカゴン受容体を過剰発現するｃＡＭＰハンター（登録商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＣＧＲ細胞株を用いて評価した。この細胞株は、リガンドのグルカゴン受容体への結合の際にｃＡＭＰを分泌する。細胞を９６ウェルプレートに５０００００細胞／ｍｌの密度で播種し、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートした。リガンドを、ＩＢＭＸを含む希釈剤で希釈し、５％ＣＯ２、３７℃で３０分間、培養ウェルに二つ組で添加した。ＭＯＤ−６０３１の濃度範囲は、５．８×１０−１１〜２．７×１０−７Ｍであった。リシスバッファーおよび検出試薬をウェルに添加し、化学発光シグナルを用いてｃＡＭＰ濃度を検出した。用量依存曲線を作成し、様々なリガンドの結合親和性（ＥＣ５０）を、最適用量反応モデル（４パラメータ）を適用することによってＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて算出した。
【０３４２】
ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体のグルカゴン受容体への結合親和性を、グルカゴン受容体を過剰発現するｃＡＭＰハンター（商標）ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＣＧＲ細胞株を用いて決定した。この細胞株を用いて、異種混在ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ（ＭＯＤ−６０３０）およびＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭの３種類の異なる同種変異体であるアミノ（ＭＯＤ−６０３１）、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０の特定評価を行った。各変異体のＥＣ５０を算出し、その後、異種混在変異体に対する各変異体の相対的効力を算出する（各同種変異体のＥＣ５０を異種混在変異体のＥＣ５０で割り、それに１００を掛ける）ことにより効力を決定した。ＥＣ５０値および算出した相対的効力を表４に示す。アミノ変異体は、異種混在変異体と同程度の結合活性を示した。Ｌｙｓ３０変異体は、最も高い生物活性を示し、Ｌｙｓ１２は１．８倍の低下を示した。ＯＸＭおよびグルカゴンペプチドのグルカゴン受容体結合活性化を測定した。ＯＸＭおよびグルカゴンが、異種混在ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭと比較して、１１．１倍および２８３倍高い受容体結合活性化を示すことが判明した。
【０３４３】
実施例４
ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体による耐糖能の誘導
【０３４４】
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを一晩絶食させ、秤量し、血糖値を、ハンドヘルド血糖計を用いて尾静脈サンプリングにより測定した。マウスに、ＰＥＧ−ＳＨ（ビークル）、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（異種混在）およびＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭの３種類の同種変異体（アミノ、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）をＩＰ注射した。グルコース（１．５ｇ／ｋｇ）を試験品投与後１５分の時点でＩＰ投与した。血糖値を、グルコース投与前ならびにグルコース投与後１０、２０、３０、６０、９０、１２０および１８０分の時点でハンドヘルド血糖計を用いて尾静脈サンプリングにより測定した。
【０３４５】
異種混在ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよび３種類のＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体（アミノ、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）のインビボ作用を評価するために、ＩＰＧＴＴモデルを適用した。一晩絶食させたＣ５７ＢＬ／６マウスに異なる化合物およびビークル（ＰＥＧ−ＳＨ）をＩＰ注射し、その後、グルコースのＩＰ注射を行い、血糖計を用いて尾静脈から血糖値を測定した。ＰＥＧ−ＳＨ（２３８．１０ナノモル／ｋｇ）、異種混在および同種のＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ（１００ナノモル／ｋｇのペプチド含量）を、グルコースのＩＰ注射（１．５ｇ／ｋｇ）の１５分前にＩＰ投与した。全ての化合物は、ビークル群と比較して耐糖能を誘導した。意外にも、同種のアミノ変異体は、インビトロ活性の結果と対照的に、その他の変異体と比較してわずかに高いグルコースＡＵＣを反映して、他の２つの変異体および異種混在ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭと比較して効力はわずかに低かった（表５、図３）。しかし、ビークルＰＥＧ−ＳＨ対照と比較して、全ての変異体において耐糖能が著しく改善した。
【０３４６】
【表５】
2018517697.tif 000031
【０３４７】
可逆的ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭの異種混在および同種変異体は、インビトロおよびＩＰＧＴＴモデルでのインビボの両方において活性があることが示された。意外にも、インビトロの結果は、天然のＯＸＭのＮ末端がＧＬＰ−１受容体へのペプチド結合に関与しているという文献において提案されているものと整合しなかった。したがって、アミノ末端変異体がインビトロおよびインビボの両方で最も低い効力を示すことが予想された。しかし、同種のアミノ変異体ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭは、２種類の異なる細胞株を用いて他の２種類の同種変異体と比較した場合に改善されたＧＬＰ−１受容体活性化を示すが（表４）、ＩＰＧＴＴインビボモデルにおいては同程度の効力を示した。ＩＰＧＴＴインビボモデルは、（動物間のばらつきを考慮して）同程度の活性を示すように思われる。ＧＬＰ−１ＲおよびＧＣＧＲへの異なるインビトロ結合活性化がＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭの異なる変異体間で観察されたが、耐糖能を誘導する能力は同程度であることが示された（表４および表５）。意外なことに、ｃＡＭＰ誘導アッセイにおいて示されるように、同種のアミノＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭの優れたインビトロ活性は、インビボＩＰグルコース負荷試験には反映されなかった。同種のアミノ変異体ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭは、他の２種類の変異体および異種混在ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭと比較して、最も低い耐糖能プロファイルを示した。しかし、ビークルと比較して、依然として大きな耐糖能効果を示した（図３）。
【０３４８】
実施例５
ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおけるＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ変異体による体重、血糖および脂質プロファイルの改善
【０３４９】
材料および方法
【０３５０】
試験１：
【０３５１】
動物取扱プロトコルに従って、２５匹の雄のｏｂ／ｏｂマウス（雄、Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐ＾ｏｂ／ＯｌａＨｓｄ、５〜６週齢、Ｈａｒｌａｎ）を施設に順応させ（１０日間）、あたかも投与するかのように取り扱い（１０日間）、実際には秤量または投与は行わなかった。その後、動物に、２０ｍｌ／ｋｇの体積で皮下経路により適切なビークルを週に２回投与する７日間のベースライン期間に供した。体重、食物および水の摂取量を毎日記録し、非空腹時および空腹時グルコース測定および非空腹時および空腹時インスリン測定のために試料を採取した。その後、動物を、体重および血糖プロファイルに基づいて５つの処置群（Ｎ＝５）に割り当てた。表１に記載したように４日毎（１、５、９、１３および１６日目）に、動物に投与した。処置期間中、投与前に、食物摂取量、水分摂取量および体重を毎日測定し、記録した。２、６、１４および１７日目に非空腹時および空腹時グルコース（１７日目のみ非空腹時グルコースを測定した）、空腹時および非空腹時のインスリン（２、６および１４日目）などのいくつかの手順およびサンプリングを行った。１９日目の最終試料はコレステロールを分析した。
【０３５２】
【表１】
2018517697.tif 000032
【０３５３】
試験２：
【０３５４】
動物取扱プロトコルに従って、１００匹の雄のｏｂ／ｏｂマウス（５〜６週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を施設に順応させ（３日間）、あたかも投与するかのように取り扱い（７日間）、実際には秤量または投与は行わなかった。その後、動物に、２０ｍｌ／ｋｇの容量で皮下経路によりＰＥＧ３０−ＳＨビークル（１４６ｍｇ／ｍｌ）を週に２回投与する７日間のベースライン期間に供した。体重、食物および水の摂取量を毎日記録した。その後、動物を、８つの処置群（群Ａ〜Ｈ、Ｎ＝８）、対照群、同時飼育群に割り当てた（表２）。同時飼育群を、高用量（６０００ナノモル／ｋｇ）のＭＯＤ−６０３１の群と同時飼育し、群Ｄのペアの相手が前日に摂取したのと同量の食糧供給を毎日与えた。３種類の追加群（群Ｉ〜Ｋ、Ｎ＝１２）に、１０００、３０００および６０００ナノモル／ｋｇでＭＯＤ−６０３１を投与し、ＰＫ分析のサンプリングのために使用した。これらの同時飼育群に、ＰＥＧ−ＳＨビークル（２９２ｍｇ／ｍｌ）、１０００、３０００および６０００ナノモル／ｋｇのＭＯＤ−６０３１を、週に２回、３２日間投与し、ＯＸＭ、リラグルチド（登録商標）およびＰＢＳを１日に２回投与した。体重、食物および水の摂取量を毎日測定した。非空腹時および空腹時グルコースを週に１回測定し、ＯＧＴＴを２日目および３０日目に行った。最終血液試料（３３日目）のグルコース、インスリン、コレステロール、およびＭＯＤ−６０３１、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳおよびＯＸＭの濃度を分析した。ＰＫ群のマウスにＭＯＤ−６０３１を単回投与し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法によってＭＯＤ−６０３１およびその化合物の濃度の定量化を可能にするＰＫ分析のために、血液試料を４、８、２４、３６、４８、７２、９６および１２０時間の時点（各時点につきｎ＝３）で採取した。
【０３５５】
【表２】
2018517697.tif 000033
【０３５６】
試験３：
【０３５７】
動物取扱プロトコルに従って、４２匹の雄のｏｂ／ｏｂマウス（７週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｉｔａｌｙ）を施設に順応させ（１０日間）、あたかも投与するかのように取り扱い、実際には秤量または投与は行わなかった。その後、動物を、２０ｍｌ／ｋｇの体積で皮下経路によりＰＥＧ３０−ＳＨを２回投与する１週間のベースライン期間に供した。体重、食物および水の摂取量を毎日記録し、非空腹時および空腹時グルコース測定および非空腹時および空腹時インスリン測定のために試料を採取した。その後、動物を、血糖値、体重および毎日食物および水摂取量を基準にして、３種の処置、対照および同時飼育の群（群Ａ、Ｎ＝１０、群Ｂ〜Ｅ、Ｎ＝８）に割り当てた。同時飼育群を、群Ｂ（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ）と同時飼育したが、ＰＥＧ−ＳＨ（２０４．５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。同時飼育群に、群Ｂのペアの相手が前日に摂取したのと同量の食糧供給を毎日与えた。従って、群Ｅの動物は、全ての試験手順および測定において、群Ｂとは１日位相がずれることになる。試験中、表３に記載したように４日ごと（１、５、９、１３、１７、２１、２５および２９日目）に、動物に投与した。処置期間中、投与前に、食物摂取量、水分摂取量および体重を毎日測定し、記録した。１、６、１４、２２および２９日目に非空腹時グルコース、１０、１８および２６日目に空腹時グルコースなどのいくつかの手順およびサンプリングを行った。２日目および３０日目の空腹時グルコース試料をＯＧＴＴ手順の一部として採取し、グルコースと並行してインスリンを測定した。３３日目の最終試料はコレステロール、トリグリセリドおよびフルクトサミンを分析した。
【０３５８】
【表３】
2018517697.tif 000034
【０３５９】
結果
【０３６０】
ｏｂ／ｏｂマウスモデルは、レプチンを産生することができず、高インスリン血症、肥満、過食症、インスリン抵抗性およびその後の高血糖症を特徴とする表現型を生ずるようなｏｂ遺伝子の変異を示す。これらのマウスを、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（異種混在）およびＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭの３種類の同種変異体（アミノ酸、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）の有効性を評価するために、２つの異なる試験で糖尿病の遺伝モデルとして用いた。
【０３６１】
試験１：
【０３６２】
この試験では、２０００ナノモル／ｋｇで投与した場合の同種変異体（アミノ、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０）および異種混在ＭＯＤ−６０３０の有効性を比較した。ビークル（ＰＥＧ−ＳＨ）群と比較して全ての試験品について体重が減少し、Ｌｙｓ１２、ＭＯＤ−６０３０、アミノおよびＬｙｓ３０変異体は、最終的（１８日目）にそれぞれ３．１％、４．７％、４．９％および６．５％減少した（図４）。体重減少は、１日目、５日目、１３日目および１６日目における薬物注射後に観察された（図４）。食物摂取量の減少が、薬物投与後の全ての処置群について観察された（９日目を除く）（図５）。試験中の血糖パラメータの測定により、アミノおよびＬｙｓ１２処置群では非空腹時グルコースの改善が示され（図６Ａ）、全ての処置群で空腹時グルコースの改善が示された（図６Ｂ）。全ての処置群は、対照と比較して、著しく低いインスリンレベルを示した。注目すべきは、この試験において投与される用量は、ＭＯＤ−６０３０のより低い有効用量である２０００ナノモル／ｋｇであり、したがって体重、食物摂取量および血糖プロファイルの改善は比較的緩やかであったことである。予想外にも、アミノ変異体は、体重を減らし、食物摂取量を抑制し、血糖のコントロールを改善する能力に優れた有効性を示した唯一の変異体であった。製造の観点から、アミノ変異体の樹脂上合成は、固相合成のペプチドがアミノ末端から延長されることを考慮すると、最も簡単な手順である。末端アミンは、位置１２および３０のリシンの内部アミン基よりもカップリングに対して好ましい有用性を有する。このアクセシビリティは、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０変異体と比較して、アミノ変異体のより高い製造収率に反映されている。さらなる利点は、アミノ変異体に向けた合成が異種混在変異体のためのＯＸＭ合成と比較して変わらず、一方、Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ３０変異体の合成が、ペプチド合成のために使用されるＬｙｓの変更および追加の選択的切断ステップ（Ｌｙｓの保護基を選択的に除去すること）により変えられたことである。異種混在変異体のために以前に開発されたようなＯＸＭ合成は、優れた収率および堅牢性を実現するためにすでに最適化されていた。全体的に、製造の観点から、樹脂上でのアミノ変異体の合成は簡単明瞭であり、代替的な変異体に勝る利点を有する。同種変異体であるので、薬物開発および薬物処置に対してより適しているという点で異種混在変異体を上回る利点も有する。
【０３６３】
試験２：
【０３６４】
本試験では、ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおいて、薬理学的および薬物動態学的パラメータに対する、１０００、３０００および６０００ナノモル／ｋｇでのＭＯＤ−６０３１（アミノ変異体）の週２回投与の長期的影響を調べ、同時に、ＯＸＭおよびリラグルチド（長時間作用型ＧＬＰ−１受容体アゴニスト）を基準化合物として評価した。測定した薬理学的パラメータは、体重、食物および水の摂取量、グルコースコントロールおよび脂質プロファイルであった。高用量のＭＯＤ−６０３１（６０００ナノモル／ｋｇ）の週２回投与は、食物摂取量および体重を著しく減少させたが（図７、図８）、低用量（３０００および１０００ナノモル／ｋｇ）はより低い効果を示した。試験終了時（３３日目）に、１０００、３０００および６０００ナノモル／ｋｇを投与された動物は、それぞれ５．２％、１２．３％および２８．３％の体重減少を示した。同様の食物摂取を受けている間、高用量群とペアにし、等量の食物を摂取（絶食時を除く）した同時飼育群は、体重が１２．７％減少した。この現象は、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭのアミノ変異体のエネルギー消費を増加させる能力に起因し得、したがって６０００ナノモル／ｋｇのアミノ変異体で処理した動物は、同時飼育群の体重減少を上回るほど体重が減少した。試験の間、ＯＸＭおよびリラグルチドは両方とも、それぞれ体重を１０．３％および８．３％と、著しく減少させた。１、５、１２、１９、２６および２９日目に非空腹時グルコース値ならびに２、９、１６、２３および３０日目に空腹時グルコース値を監視する血糖プロファイルの測定は、特に６０００ナノモル／ｋｇについて、これらのパラメータの著しい改善を示した（図９Ａ、図９Ｂ）。経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）を２日目および３０日目に行った（それぞれ、図１０および図１１）。これらの結果は、ＭＯＤ−６０３１（アミノ変異体）が、大きく、また用量依存的に耐糖能を改善し、血糖値が１０００、３０００および６０００ナノモル／ｋｇの群において著しく低下したことを示した。最高用量のＭＯＤ−６０３１群と同時飼育した動物は、試験の時点のいずれにおいても対照と有意な差はないグルコース投与後のグルコース変動幅を示した。ＯＧＴＴ試験の２日目におけるグルコースプロファイルの改善はインスリン反応の遅延に関連し、これはわずかに遅延し、ＡＵＣ  ０−１２０分に対しより高い刺激を与えた（図１０）。これは、血液中へのグルコース放出および第２のインスリン分泌相の遅延を生じさせるＭＯＤ−６０３１の薬理学的活性によって誘発される胃内容排出の抑制に起因し得る。３０日目のＯＧＴＴ試験では、インスリン応答が低下し、対照と比較して、化合物がインスリン感受性を改善することを示す（図１１）。さらに、ＭＯＤ−６０３１は用量依存的に最終コレステロールを低減させ、６０００ナノモル／ｋｇの用量のＭＯＤ−６０３１で観察された低下は、同時飼育対応物の低下よりもはるかに大きかった（図１２）。体重、食物摂取量、血糖および脂質プロファイルにおけるこれらの薬理学的な改善の全ては、ＯＸＭまたはリラグルチドで１日に２回処置した動物よりも大きいだけでなく、同時飼育対応物で観察された効果よりも著しく大きかった。
【０３６５】
ＭＯＤ−６０３１（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ）およびその加水分解化合物（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳおよびＯＸＭ）の最終血中濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量法を用いて測定した。ＭＯＤ−６０３１処置群の結果は、用量依存性濃度を示した（表６）。（単回投与後）このデータと２日目の化合物レベルとを比較すると、１週間に２回投与した場合は、ＯＸＭペプチドが試験期間中に蓄積されなかったことが示された。ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳおよびＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭは、試験期間中、中程度の蓄積を示した（表６）。最後の注射（３３日目）後２４時間の時点での最高用量のＭＯＤ−６０３１における、ＭＯＤ−６０３１およびＯＸＭペプチドの実際の濃度は、それぞれ４９０μｇ／ｍｌおよび０．３７μｇ／ｍｌであった。対照動物からの全ての試料は、アッセイの下限値未満であった。
【０３６６】
【表６】
2018517697.tif 000035
【０３６７】
実施例６
ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおけるＭＯＤ−６０３１変異体による薬物動態パラメータの改善
【０３６８】
結果
【０３６９】
ｏｂ／ｏｂマウスの３つの群（ｎ＝１２）に、１０００、３０００および６０００ナノモル／ｋｇのＭＯＤ−６０３１を単回投与し、ＰＫ分析のために投与後４、８、２４、３６、４８、７２、９６および１２０時間の時点で採血し（時点当たりｎ＝３）、ＭＯＤ−６０３１の量およびその化合物濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により決定した。Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ、Ｔ１／２ＣｌおよびＶｚなどの薬物動態パラメータをＭＯＤ−６０３１（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ）およびその加水分解物であるＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳおよびＯＸＭについて算出し、これらのパラメータをそれぞれ、表７ａ、図７ｂおよび図７ｃに示す。全投与量で、ＡＵＣ  ０−∞は、全成分のＡＵＣ  ０−ｔの１５％以内であり、サンプリング計画が各成分の薬物動態プロファイルの特性評価を行うのに十分であったことを示す。全３種類の成分について、暴露は用量に比例しているように見えた。一般的に、ＣｍａｘおよびＡＵＣ０−ｔは投与量と共に、投与量が増加するのとほぼ同じ割合で増加した。
【０３７０】
各成分のパラメータを表８にモル濃度で示す。Ｃｍａｘ値は、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳではほぼ同等であり、ＯＸＭについては低かった。ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＯＸＭの観測されたＴ１／２は、それぞれ約９時間および１２時間であった。ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの最終Ｔ１／２は、はるかに長く、約３０時間であった。対照動物からの全ての試料および投与前に収集された全ての試料は、アッセイの下限値未満であった。
【０３７１】
薬物動態学的および薬理学的データから、ＭＯＤ−６０３１の長時間作用型の性質が裏付けられる。３０００ナノモル／ｋｇのＭＯＤ−６０３１の週２回投与は、体重および摂食量を著しく減少させ、６０００ナノモル／ｋｇ用量で１日に２回投与したＯＸＭペプチド処置群に匹敵し、薬物負荷の著しい低下にもつながった。
【０３７２】
【表７ａ】
2018517697.tif 000036
【０３７３】
【表７ｂ】
2018517697.tif 000037
【０３７４】
【表７ｃ】
2018517697.tif 000038
【０３７５】
【表８】
2018517697.tif 000039
【０３７６】
ＭＯＤ−６０３１は動物中の最終グルコースを用量依存的に低減し、インスリンを顕著に減らし（ｐ＜０．０１、図２７）、ＭＯＤ−６０３１処置によりインスリン感受性が改善されたことを示している。両方の変数に対し、６０００ナノモル／ｋｇの用量のＭＯＤ−６０３１で観察された低下は、同時飼育対応物の低下よりも有意に大きかった（ｐ＜０．００１）。リラグルチドは、試験終了時に、血漿中インスリンまたはグルコースに対し統計的に有意な効果がなかった。対照的に、オキシントモジュリンは、両方のパラメータを有意に低減させた（グルコースに対してｐ＜０．０５、インスリンに対してｐ＜０．００１）。
【０３７７】
実施例７
ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおけるＰＥＧ３０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭに比較して、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭによる体重、血糖および脂質プロファイルの改善
【０３７８】
この試験では、糖尿病の遺伝的モデルとしてｏｂ／ｏｂマウスモデルを使って、ＭＯＤ−６０３１（ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ）対その低速加水分解変異体（ＰＥＧ３０−Ｓ−ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ）およびその非可逆型（ＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ）（Ｎ−（イプシロン−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）が、リンカーとしてＦｍｏｃを置換している）の薬理学的効力を評価した。全てのこれらの３種のペグ化結合体では、リンカーは、ＯＸＭペプチドのＮアミノ末端に部位特異的である。
【０３７９】
この試験は、試験対照としてＰＥＧ−ＳＨを使用して、６０００ナノモル／ｋｇを４日毎に投与する場合の、ＭＯＤ−６０３１、ＰＥＧ３０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの薬理学的効力を比較した。測定した薬理学的パラメータは、体重、食物および水の摂取量、グルコースおよびインスリンコントロールならびに脂質プロファイルであった。３種全ての結合体の投与は、試験の最初の２または３週間の間、ビークル（ＰＥＧ−ＳＨ）群に比べて、体重および食物摂取量を有意に低減した（図１３，図１４）が、ＭＯＤ−６０３１のみがこの傾向を試験終了までおよびより大きな程度に示した。対照（ＰＥＧ−ＳＨ）に比べた場合の、ＭＯＤ−６０３１、ＰＥＧ３０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭのそれぞれによる（３３日目の）最終的体重減少は、２５．４％、５．１％、２．４％であった。ＭＯＤ−６０３１のみが対照に比べて有意に低い体重値を示した。その同時飼育群に比べた、ＰＥＧ３０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭによる体重の減少は、ほんのわずか（２．６％）であった。ＭＯＤ−６０３１およびＰＥＧ３０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭでは、体重減少がそれぞれの薬物注射の後で観察され、一方、ＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭでは、投与後に一晩絶食した日にのみ重量減少が発生した。食物摂取量の減少に関しても、同じプロファイルが観察された。試験中の血糖パラメータの測定により、ＭＯＤ−６０３１群（図１５Ａ）の非空腹時グルコースの有意な改善ならびにＭＯＤ−６０３１および、ＰＥＧ３０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ群（図１５Ｂ）の空腹時グルコースの有意な改善が示された。ＯＧＴＴ試験を２日目および３０日目に実施した（それぞれ、図１６および１７）。２日目のＯＧＴＴでは、ＭＯＤ−６０３１およびＰＥＧ３０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの耐糖能が有意に改善され、血糖値は有意に減少し、同時に、インスリン分泌は有意に増加した（図１６）。同時飼育群の動物は、試験の時点のいずれにおいても対照と有意差のないグルコース投与後のグルコース変動幅を示した。３０日目のＯＧＴＴでは、ＭＯＤ−６０３１およびＰＥＧ３０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの両方によるグルコースプロファイルの有意な改善が観察されたが、後者に対してはより少ない程度であった。さらに、対照と比較して、両群でインスリン応答が低下することが観察され、化合物がインスリン感受性を改善することを示す（図１７）。脂質プロファイルおよびフルクトサミンを解析した最終血漿試料では、ＭＯＤ−６０３１およびＰＥＧ３０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭに対する両方の検査で有意な減少が示された（図１８、図１９）。両方の場合で、他の全ての結果と同様に、ＭＯＤ−６０３１は、ＰＥＧ３０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭに優ることが示された。
【０３８０】
実施例８
ＭＯＤ−６０３１のエクスビボ加水分解速度のインビトロキャラクタリゼーション
この試験は、異なる条件下：異なるｐＨ、温度、および異なる血漿種の条件下でのＭＯＤ−６０３１のエクスビボ加水分解速度を特性解析および比較するために実施される。
【０３８１】
材料および方法
【０３８２】
液体クロマトグラフィー大気圧イオン化タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による、Ｋ２ＥＤＴＡラットおよびサル血漿中のＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ、およびＯＸＭの測定のための生物学的分析法を検証した。安定標識ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、安定標識ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ、および１３Ｃ２４、１５Ｎ４−ＯＸＭを、それぞれ、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳおよびＯＸＭ用の内部標準として使用した。ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ、およびＯＸＭならびにそれらの内部標準を、アセトニトリルを使って低ｐＨでのタンパク質沈殿により、試験した血漿サンプルから抽出した。蒸発乾固および再構成後、抽出物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳおよびＯＸＭ用の較正曲線を全てのデータセットに対し新しく調製し、分析した成分の定量化に使用した。
【０３８３】
リン酸緩衝液を使って、ｐＨ６．８、７．４および７．８の異なるｐＨ値を得た。３５℃、３７℃および４１℃の温度で、ラット血漿中、インキュベーションの試験をした。ラット、カニクイザルまたはヒト血漿中でインキュベートしたＭＯＤ−６０３１の加水分解速度の比較を３７℃で評価した。ヒト血漿では、プールしたおよび個々の試料の両方を男性および女性の対象由来の血漿を使って測定した。ＭＯＤ−６０３１（４００μ／ｍｌの合計材料）を当該血漿または緩衝液（Ｎ＝３）を含むチューブに加え、試料を、上記異なる条件下で、０（材料を添加直後）、４、８、２４、４８および７２時間インキュベートした。試料を−７０℃で凍結することにより、指定時点で加水分解を停止した。タンパク分解性酵素による無関係で非特異的切断を避けるために、ＭＯＤ−６０３１の添加前に、ＤＰＰＩＶ阻害剤（１％）およびアプロチニン（５００ＫＩＵ／ｍｌ）を血漿試料に添加した。それぞれの条件に対し、３つの独立した試料を調製した。試料を３５℃、３７℃または４１℃のいずれかの所定温度でインキュベートした。分析の前に、全試料を−７０℃で保存した。ＭＯＤ−６０３１（ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭ）、ＯＸＭおよびＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳの濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を使って定量化した。ＭＯＤ−６０３１加水分解プロファイルを確立し、異なる血漿マトリックス中での加水分解速度を計算した。
【０３８４】
調査条件は以下の通り：
ａ．ｐＨ、加水分解をｐＨ６．８、７．４および７．８で試験した；
ｂ．温度、加水分解を３５℃、３７℃、および４１℃で試験した；および
ｃ．血漿源、加水分解を、ラット、カニクイザルおよびヒトから得た血漿試料中で試験した。ヒト血漿では、プールした試料および個々の試料の両方を試験し、男性および女性由来の血漿に対し、加水分解速度を別々に測定した。
【０３８５】
ＭＯＤ−６０３１（全材料の４００μｇ／ｍｌ）を異なる条件下で７２時間までインキュベートした。指定時点で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用の試料を採取した。ＭＯＤ−６０３１およびその分解生成物のＯＸＭおよびＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳを定量化し、それに応じて薬物動態解析を実施した。
【０３８６】
結果は、ｐＨレベルがＭＯＤ−６０３１の加水分解速度に影響を与え、より高いｐＨ（ｐＨ７．８）では、より低いｐＨ（ｐＨ６．８）に比べて、加水分解速度が高い（図９、図２０Ａ〜２０Ｃ）ことを示した。温度に関しては、４１℃でのインキュベーションは、３５℃または３７℃でのインキュベーションに対する加水分解速度に比べて、より高い加水分解速度をもたらした（表１０、図２１Ａ〜２１Ｃ）。ＭＯＤ−６０３１は、ほとんどの血漿試料中で同等の加水分解速度であり、これは、測定したマトリックス中での、類似のクリアランス速度ならびに類似のＯＸＭおよびＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ濃度の増加を反映したものである（表１１、図２２Ａ〜２２Ｃ）。同じ種の異なるロットおよび種間でＯＸＭのクリアランス速度のばらつきがあった。ＰＥＧ−Ｓ−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳのクリアランス速度は、異なる血漿種間で極めて類似していた。
【０３８７】
結論：
【０３８８】
ラット、サルおよびヒトマトリックス由来の血漿中でのＭＯＤ−６０３１の加水分解速度および加水分解パターンは、極めて類似しており、それぞれの種の異なる個体間で観察されたものより大きい差異を示さなかった。
【０３８９】
【表９】
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【０３９０】
【表１０】
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【０３９１】
【表１１−１】
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【０３９２】
【表１１−２】
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【０３９３】
実施例９
ＭＯＤ−６０３１のＰＥＧ部分により提供されるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）消化からの保護のインビトロ評価
【０３９４】
ＭＯＤ−６０３１、ＯＸＭペプチドおよびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭをＤＰＰＩＶと共にインキュベートし、それぞれの消化をＲＰ−ＨＰＬＣにより試験した。消化および非消化形態を特定し、測定した。
【０３９５】
最初に、１０ｍＭトリス緩衝液中、２つの異なるｐＨレベル（ｐＨ＝６およびｐＨ＝７）でＯＸＭペプチド分解の予備的な試験を評価した。各反応物を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌの反応物質を１００μｌのＤＤＷ中０．１％ＴＦＡで希釈した。次に、この溶液の１０μｌをＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｉｎｔｒａｄａ  ＷＰ−ＲＰ  ２ｘ５０ｍｍ、３μｍ、３００Åカラムにロードした（合計３．３μｇ）。
【０３９６】
ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを使って、非消化および消化形態のＯＸＭおよびＭＯＤ−６０３１を特定した。切断された、不活性型ＯＸＭである、ＯＸＭ３−３７の溶出時間は、ＯＸＭペプチドとは０．２分だけ差異がある。相対的面積パーセンテージを測定することにより、消化パーセンテージを評価した。それぞれの反応に対し、ＤＰＰＩＶ不含の対照試料を調製し、測定した。
【０３９７】
ＭＯＤ−６０３１およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭをＤＰＰＩＶと共にインキュベートし、消化パーセンテージを測定した。反応条件は上記ＯＸＭペプチドに対する記載と同じである。
【０３９８】
酵素のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）は、内在性膜糖タンパク質で、ほとんどの細胞型で発現し、ポリペプチドのＮ−末端からジペプチドを切断する。ＤＰＰＩＶによるＯＸＭ消化は、インビトロおよびインビボで示されており、血流中でのペプチドの短い半減期の主原因であると見なされている。ＯＸＭは、アミノ酸の位置２と３との間で切断され、非活性型ＯＸＭ３−３７を生ずる。この試験では、可逆的および非可逆的結合によりＰＥＧに結合されたＯＸＭペプチド、ＭＯＤ−６０３１およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ、のＤＰＰＩＶによる消化をそれぞれ調査した。
【０３９９】
ＤＰＰＩＶ酵素によるＯＸＭペプチド分解速度のｐＨ＝６対ｐＨ＝７での予備的評価により、３７℃で１時間のインキュベーション後、ｐＨ＝７での２６．５２の相対面積％に比べて、ｐＨ＝６では、ＤＰＰＩＶ酵素はより効果的で、ｐＨ＝６のＯＸＭ３−３７に対して４６．１２の相対面積％が示された（図２３〜２４、表１２〜１５）。したがって、ＭＯＤ−６０３１の消化試験をｐＨ＝６で実施した。これは、ＭＯＤ−６０３１の加水分解防止にとっても好ましい条件である。
【０４００】
ＤＰＰＩＶによるＭＯＤ−６０３１およびＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの消化パーセントを測定した。ＭＯＤ−６０３１結合体の分解を、ＤＰＰＩＶとのインキュベーション（図２５、表１７）、およびＯＸＭペプチドに使用したものと同じ条件を使ってＲＰ−ＨＰＬＣカラムにより分析することにより評価した。ネガティブコントロールとして、様々なｐＨおよび／または温度での、ＤＰＰＩＶを含まない反応を実施し、ＯＸＭが加水分解されていないことを確認した。ポジティブコントロールとして、結合体の一部ではないＯＸＭの加水分解を評価する反応を測定した。（図２５、表１６）。
【０４０１】
酵素ＤＰＰＩＶの非存在下では、ＭＯＤ−６０３１のインキュベーション後、ＭＯＤ−６０３１の分解のないこと、したがって、ＯＸＭの加水分解のないことが観察された。相対面積パーセンテージは、９８．２８であった。ＤＰＰＩＶ  １Ｘ［ＤＰＰＩＶ濃度］（表１７）および１０Ｘ［ＤＰＰＩＶ濃度］（表１８）の２つの反応を実施した。両方の反応でＯＸＭの分解は観察されず、ＭＯＤ−６０３１の相対面積パーセンテージは、それぞれ、９８．４９および９８．２４であった。
【０４０２】
非可逆的ペグ化ＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭについても、同様にしてＤＰＰＩＶによるＯＸＭ分解の試験をした（図２６、表２０）。対照として、ＤＰＰＩＶを含まない系の反応を実施した（図２６、表１９）。両方の反応で、結合体の分解は観察されなかった。ＰＥＧ−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの相対面積パーセンテージは、それぞれ、９８．４８および９９．０９であった。
【０４０３】
ここで示した結果に基づいて、ＯＸＭの加水分解性または非加水分解性リンカーを介したＰＥＧ部分への結合は、ＤＰＰＩＶによる分解から保護されていると結論付けることができる。
【０４０４】
【表１２】
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【０４０５】
【表１３】
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【０４０６】
【表１４】
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【０４０７】
【表１５】
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【０４０８】
【表１６】
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【０４０９】
【表１７】
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【０４１０】
【表１８】
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【０４１１】
【表１９】
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【０４１２】
【表２０】
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【０４１３】
本発明の特定の特徴を本明細書で例証し、説明してきたが、当業者であれば、多くの修正、置き換え、変更、および等価物をすぐに思いつくであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内に入る全てのこのような修正および変更を包含することを意図していることは理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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