(57)【要約】  細胞培養物品が提供される。その細胞培養基体は、ペクチン酸またはその塩、および１から４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸またはその塩のうちの少なくとも１つから選択されるポリガラクツロン酸化合物から作られる。そのポリガラクツロン酸化合物は二価陽イオンと架橋しており、その二価陽イオンの濃度は基体の０．５から２ｇ／ｌに及ぶ。
2018520662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物品であって、
ペクチン酸またはその塩、および
１から４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸またはその塩、
の少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物から作られた基体、
を含み、
前記ポリガラクツロン酸化合物は二価陽イオンと架橋しており、該二価陽イオンの濃度は前記基体の０．５から２ｇ／ｌに及ぶ、細胞培養物品。
【請求項２】
前記基体が球状または実質的に球状である、請求項１記載の物品。
【請求項３】
複数の前記細胞培養物品の変動係数が２０％未満である、請求項１または２記載の物品。
【請求項４】
前記基体の表面上に接着高分子をさらに含む、請求項１から３いずれか１項記載の物品。
【請求項５】
前記接着高分子がポリペプチドを含む、請求項４記載の物品。
【請求項６】
細胞培養物品を製造する方法において、
ゲル化浴中に親水コロイド溶液を分配する工程、
を有してなり、
前記親水コロイド溶液は、
ペクチン酸またはその塩、および
１から４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸またはその塩、
の少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物を含み、
前記ゲル化浴は二価金属塩を含む、方法。
【請求項７】
前記二価金属が、カルシウム、マグネシウムおよびバリウムからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記親水コロイド溶液が前記ゲル化浴中に滴下される、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
前記親水コロイド溶液が０．５から５質量％のポリガラクツロン酸を含む、請求項６から８いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲル化浴が１から２０％（ｗ／ｖ）の二価金属塩を含む、請求項６から９いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、その内容が依拠され、ここに全て引用される、２０１５年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／２３３０４４号および２０１５年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／１７２２９９号の米国法典第３５編第１１９条の下での優先権の恩恵を主張するものである。本出願は、その内容が依拠され、ここに全て引用される、同一出願人による米国特許第８４０４４８５号および同第８４２６１７６号、並びに同時係属の同一出願人による国際公開第２０１４／２０９８６５号および同第２０１４／０１２０６１６号に関連する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、広く、可消化基体を製造する方法に関し、より詳しくは、例として、タンパク質、細胞、およびウイルスの単離のため、また診断用途および細胞培養法のために使用できる、透明な可消化マイクロキャリアに関する。
【背景技術】
【０００３】
接着細胞が高いコンフルエンスに到達でき、それゆえ、細胞間の接触阻止により細胞の増殖が制限され得る平面での細胞培養とは対照的に、高い表面積／体積比を有する球状のマイクロキャリアは、採取された細胞または馴化培地のいずれかが所望の生成物であり得る効率的な細胞培養の拡大または拡張のための魅力的なプラットフォームを提示する。
【０００４】
細胞への適切な酸素供給および栄養素供給が、細胞培養にとって義務である。関連する難題としては、成長している細胞を損傷するのに十分な流体力学的ストレスを導入せずに、要求される酸素および栄養素を提供するためのマイクロキャリアの撹拌が挙げられる。従来、撹拌は、羽根車を使用して行われる。
【０００５】
さらに別の難題に、細胞または馴化培地からマイクロキャリアを分離する工程がある。酵素処理を使用して接着細胞を採取してもよいが、例えば、酵素を添加すると、細胞が損傷を受けることがある。例えば、タンパク質分解酵素は、細胞表面の受容体を非選択的に取り除くかもしれない。
【０００６】
培養細胞がコンフルエンスに一旦到達したら、基質から接着細胞を解離するために、トリプシンがしばしば適用される。一例として、コラーゲンで被覆されたマイクロキャリアビーズを用いて足場依存性細胞を培養し、採取する方法において、増殖が一旦完了したら、コラーゲンはマイクロキャリアから消化により除去されるであろう。しかしながら、トリプシンのタンパク質分解活性のために、細胞表面のタンパク質はしばしば開裂され、これにより、細胞機能の望ましくない崩壊がもたらされるであろう。トリプシンは、プロテオームの変化および細胞の生理学的変化を誘発すると考えられる。トリプシン処理は、下方制御された増殖関連と代謝関連のタンパク質発現および上方調節されたアポトーシス関連のタンパク質発現を誘発し、細胞二次培養に使用されるトリプシンが、細胞の生理機能に悪影響を及ぼすであろうことを示唆する。
【０００７】
プロテアーゼの悪影響の別の例として、トリプシンなどのプロテアーゼで細胞を処理すると、癌細胞から抗原が除去され、それゆえ、抗癌治療のためのワクチンを開発するために、それらを使用できなくなるかもしれないことも知られている。その結果、トリプシンを用いずに、またはトリプシンなどのタンパク質分解酵素の不在下で細胞を採取することが、極めて望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記に鑑みて、特に、制御された粒径、組成、均一性および結晶構造、並びにタンパク質分解によらない細胞の分離と採取を可能にする細胞接着および／または増殖を支援する界面化学を有するマイクロキャリアを含む、細胞増殖表面を合成するための低コストの効率的なアプローチを提供することが都合よいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示の実施の形態によれば、細胞培養物品は、ペクチン酸またはその塩および１から４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸またはその塩の少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物から作られた基体を含む。そのポリガラクツロン酸化合物は、二価陽イオンと架橋している。その基体中の二価陽イオンの濃度は、基体の０．５から２ｇ／ｌに及ぶ。
【００１０】
細胞培養物品を製造する方法は、ゲル化浴中に親水コロイド溶液を分配（すなわち、滴下）する工程を有してなる。その親水コロイド溶液は、ペクチン酸またはその塩および１から４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸またはその塩の少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含む。そのゲル化浴は二価金属塩を含む。
【００１１】
細胞を培養する方法は、細胞を、上述したような細胞培養物品を有する細胞培養培地と接触させる工程、およびその培地中で細胞を培養する工程を有してなる。培養細胞を採取する方法は、上述した細胞培養物品の表面上で細胞を培養する工程、および培養した細胞を、ペクチナーゼおよびキレート剤の混合物と接触させて、その物品から細胞を分離する工程を有してなる。
【００１２】
実施の形態において、前記マイクロキャリアは、透明であり、細胞の観察が可能であり、既知組成培地または血清添加培地中の大規模細胞増殖に適している。
【００１３】
ＰＧＡ基体の調製は、既存の高スループット製造過程に適合しており、均一なサイズ分布を有するマイクロキャリアの調製が可能である。均一なサイズ分布により、余計な篩工程の必要がなくなる。この篩工程は、労働集約的であり、時間がかかり、追加の設備と大容量の水と有機溶媒を必要とする。現在開示されている合成は、エマルション過程に基づくものではなく、したがって、界面活性剤または分散媒としての高容量の有機溶媒の使用を必要としない。さらに、この方法では、カルシウムの水溶性形態を使用し、したがって、容易に細胞を観察できる滑らかな表面を有する均質で透明なＰＧＡ基体の調製が可能になる。この方法は、環境にやさしく、乳化または内部ゲル化に基づくアプローチよりも経済的である。
【００１４】
可消化細胞培養物品が、その内容がここに全て引用される、同一出願人による国際公開第２０１４／２０９８６５号に開示されている。
【００１５】
本開示の主題の追加の特徴および利点が、以下の詳細な説明に述べられており、一部は、その説明から当業者に容易に明白となるか、または以下の詳細な説明、特許請求の範囲、並びに添付図面を含む、ここに記載されたような本開示の主題を実施することによって、認識されるであろう。
【００１６】
先の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方とも、本開示の主題の実施の形態を提示しており、請求項に記載された本開示の主題の性質および特徴を理解するための概要または骨子を提供することを目的とすることが理解されよう。添付図面は、本開示の主題のさらなる理解を与えるために含まれ、本明細書に包含され、その一部を構成する。図面は、本開示の主題の様々な実施の形態を示しており、説明と共に、本開示の主題の原理および作動を説明する働きをする。その上、図面と説明は、説明に過ぎないことを意味し、請求項の範囲をどのようにも制限する意図はない。
【００１７】
本開示の特別な実施の形態の以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号により示されている以下の図面と共に読んだときに最も理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ａ、ＢおよびＣは、実施の形態による異なるサイズのマイクロの概略図
【図２】ＰＧＡ濃度の関数としてのカルシウム含有量を示すグラフ
【図３】ある実施の形態による外部架橋したＰＧＡマイクロキャリア上のｈＭＳＣ細胞を示す位相差画像
【図４】さらに別の実施の形態による外部架橋したＰＧＡマイクロキャリア上のｈＭＳＣ細胞を示す位相差画像
【図５】またさらに別の実施の形態による外部架橋したＰＧＡマイクロキャリア上のｈＭＳＣ細胞を示す位相差画像
【図６】ある実施の形態によるゼラチン被覆ＰＧＡマイクロキャリア上のＭＲＣ５およびＶｅｒｏ細胞を示す位相差画像
【図７】ゼラチン被覆デキストランマイクロキャリアおよびゼラチン被覆外部架橋マイクロキャリア上のＶｅｒｏ細胞の増殖倍率のグラフ
【図８】ゼラチン被覆デキストランマイクロキャリアおよびゼラチン被覆外部架橋マイクロキャリア上のＭＲＣ５細胞の増殖倍率のグラフ
【図９】ゼラチン被覆可消化マイクロキャリアおよびＣｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩ表面が設けられたマイクロキャリアの両方の上のｈＭＳＣ細胞の増殖倍率のグラフ
【図１０】ある実施の形態により製造された単分散ＰＧＡビーズを示す位相差画像
【図１１】ある実施の形態による外部架橋ＰＧＡマイクロキャリア上のＭＲＣ５細胞を示す位相差画像
【図１２】乳化および内部ゲル化により得られた広いサイズ分布を示す、比較のマイクロキャリアを示す位相差画像
【図１３】ＶＮ−グラフト化ＰＧＡマイクロキャリア上に播種した後の無血清培地内のｈＭＳＣ細胞の位相差画像
【図１４】Ａ、ＣおよびＥは、実施の形態によるサイズ制御されたマイクロキャリアの顕微鏡画像、Ｂ、ＤおよびＦは、Ａ、ＣおよびＥに示されたサイズ制御されたマイクロキャリアのサイズ分布を示すグラフ
【図１５】実施の形態におけるキュベットの斜視図
【図１６】標準沈降過程のＯＤを示すグラフを含む、マイクロキャリアの溶液からの沈降の説明図
【図１７】従来技術の製品と比べた、実施の形態による例示のマイクロキャリアの沈降時間を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ここで、その内のいくつかの実施の形態が添付図面に示されている、本開示の主題の様々な実施の形態を詳しく参照する。図面に亘り、同じまたは同様の部品を参照するために、同じ参照番号が使用される。
【００２０】
細胞の接着と増殖を促進し、プロテアーゼを使用せずに細胞を採取できる細胞培養物品が開示されている。例示の細胞培養物品は、ビーズまたはマイクロビーズ（集合的に「マイクロキャリア」）と称されることもあるマイクロキャリアである。図１のＡ、ＢおよびＣは、実施の形態における、３つの異なるサイズのマイクロキャリアビーズ１００を示す。実施の形態において、その細胞培養物品は、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、またはその塩を含むゲルから作られた滑らかで透明な（または半透明な）ビーズである。その細胞培養物品は、球状または実質的に球状であることがあり、外部ゲル化により形成される。その細胞培養物品のカルシウム含有量は、細胞に対する損傷を軽減する穏やかな条件下で迅速な細胞採取ができるように調節されることがある。足場依存性細胞の接着を促進する分子は、化学的結合または物理吸着によって、細胞培養物品の表面に接着されることがある。
【００２１】
現在開示されている外部ゲル化経路とは対照的に、マイクロキャリアは、乳化および内部ゲル化により形成されることがある。この内部ゲル化過程により、ビーズは、水相中に分散した不溶性カルシウム塩を含有するＰＧＡ水溶液のゲル化により形成され、この水相は油相（連続相または分散媒とも呼ばれる）内に乳化される。
【００２２】
内部ゲル化の場合、架橋は、塩から可溶性二価金属イオン（例えば、Ｃａ2+またはＭｇ2+）を放出する油溶性酸の添加により開始される。しかしながら、そのような方法により、エマルションを安定化させるためのかなりの量の界面活性剤のように、大容量の油相が必要である。植物油を連続相として使用することができるが、この分散媒中で調製されたビーズは、濯ぐのが難しい。
【００２３】
内部ゲル化過程に対するさらに別の欠点は、金属イオン源（塩）の一部が、完全なままであり、マイクロキャリアにおいて異成分として現れるかもしれず、これにより、表面粗さおよび透明度が損なわれるかもしれないことである。さらに、そのような維持された金属塩は、マイクロキャリアの使用中に時間の経過により放出されるかもしれず、これは、細胞培養にとって有害であるかもしれない、または細胞採取中にマイクロキャリアの消化を阻害するかもしれない。
【００２４】
開示された外部ゲル化方法は、望ましくない含有物（第二相）および表面欠陥を含まず、タンパク質分解によらない細胞の分離と採取を支援する、透明性が高いＰＧＡマイクロキャリアの調製のための安価かつ環境にやさしい合成経路を提供する。ここに定義されるように、透明なマイクロキャリアは、可視スペクトルに亘り少なくとも９０％の透過率、すなわち、３９０から７００ｎｍで、９０、９２、９４、９６、９８、９９または１００％の透過率と、先の値のいずれかの間の範囲を含む透過率を示す。
【００２５】
その上、実施の形態において、均一なサイズ分布の前記マイクロキャリアを提供することができる。均一なサイズ分布により、使用中の上清からのマイクロキャリアのより速くよりきれいな分離が確実になる。これは、培地の交換と最終的な製品の単離を、より予測可能に、より信頼性にし、より費用をかからなくすることができる。実施の形態において、マイクロキャリアのサイズは、異なる範囲に正確に調整することができる。これにより、ビーズの材料特性を変えずに、異なるバイオプロセスの要求に適合するように、ビーズの沈降速度をカスタマイズすることが可能になる。
【００２６】
ＰＧＡ高分子
マイクロキャリアは、少なくとも１種類のイオンチャンネル的に架橋した多糖類を使用して製造されることがある。例としては、ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）としても知られているペクチン酸またはその塩、もしくはペクチニン酸として知られている部分的にエステル化されたペクチン酸（ＰＥ  ＰＧＡ）またはその塩が挙げられる。
【００２７】
ペクチン酸は、特定のペクチンエステルの加水分解により形成することができる。ペクチンは、細胞壁多糖類であり、実際は、植物において構造的役割を持つ。ペクチンの主要供給源としては、柑橘類の皮（例えば、レモンおよびライムの皮）およびリンゴの皮が挙げられる。ペクチンは、１，２−結合Ｌ−ラムノースが無作為に割り込んだ、１，４−結合アルファ−Ｄ−ガラクツロン酸主鎖に基づく主に線状高分子である。平均分子量は、約５０，０００から約２００，０００ダルトンに及ぶ。
【００２８】
ペクチンのポリガラクツロン酸鎖は、例えば、メチル基で部分的にエステル化されることがあり、遊離酸基は、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムイオンなどの一価イオンにより部分的にまたは完全に中和されることがある。メタノールで部分的にエステル化されたポリガラクツロン酸はペクチニン酸と呼ばれ、その塩はペクチニン酸塩と呼ばれる。高メトキシル（ＨＭ）ペクチンのメチル化度（ＤＭ）は、例えば、６０から７５モル％であり得、低メトキシル（ＬＭ）ペクチンのメチル化度は、１から４０モル％であり得る。
【００２９】
ペクチニン酸が選択された実施の形態において、エステル化度は４０モル％以下（例えば、１、５、１０、２０、３０、または４０モル％と、先の値のいずれかの間の範囲を含む）であることがある。より高度のエステル化では、イオンチャンネル型架橋によるビーズ形成が無効になる。理論により束縛するものではないが、所望の程度のイオンチャンネル型架橋を得るためには、最小量の遊離カルボン酸基（エステル化されていない）が必要であると考えられる。
【００３０】
実施の形態において、２０モル％以下、例えば、０、５、１０、１５または２０モル％のメトキシル基を含有するポリガラクツロン酸などのＬＭペクチンを使用して、マイクロキャリアビーズを形成した。そのようなポリガラクツロン酸は、ペクチン酸としてのメチルエステル含有量がないかまたは取るに足りないであろう。ここに用いたように、メチルエステル含有量がないか取るに足りないペクチニン酸および低メトキシル（ＬＭ）ペクチンは、集合的に、ＰＧＡと称される。
【００３１】
実施の形態において、ペクチン酸およびペクチニン酸の混合物を使用して、マイクロキャリアビーズを形成した。純粋なペクチン酸および／またはペクチニン酸を使用してもよい。相溶性高分子を有するブレンドも使用してよい。例えば、ペクチン酸またはペクチニン酸は、デキストラン、置換セルロース誘導体、アルギン酸、デンプン、グリコーゲン、アラビノキシラン、アガロースなどの多糖類と混合されてもよい。ヒアルロン酸および硫酸コンドロイチンのようなグリコサミノグリカン、またはエラスチン、フィブリン、絹フィブロイン、コラーゲンおよびそれらの誘導体などの様々なタンパク質も使用することができる。他の水溶性合成高分子も、ペクチン酸および／またはペクチニン酸とブレンドすることができる。非限定例としては、ポリアルキレングリコール、ポリ（ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート）、ポリ（メタ）アクリルアミドおよびその誘導体、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。相溶性高分子は、それらの含有がマイクロキャリアの消化を損なわないという条件で、陰イオン、中性、または陽イオンであってよい。
【００３２】
外部イオンチャンネル型ゲル化
拡散凝結(diffusion setting)とも呼ばれる外部ゲル化は、イオン溶液への親水コロイド（ＰＧＡ）溶液の導入を含み、ゲル化は親水コロイド溶液中へのイオンの拡散により生じる。実施の形態において、負に帯電した多糖類水溶液を、カルシウム、マグネシウムまたはバリウムなどの二価陽イオンの溶液中に滴下により分配し、これにより、ＰＧＡ高分子の架橋が誘発される。この架橋はイオン架橋であり、これは、共有架橋とは対照的に、架橋高分子のその後の消化が可能である。
【００３３】
実施の形態によれば、親水コロイド溶液中のＰＧＡ濃度は、０．５から５質量％に及び、例えば、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５質量％と、先の値のいずれかの間の範囲を含む。
【００３４】
親水コロイド（ＰＧＡ）溶液の液滴を形成する例示の方法としては、注射器による滴下または押出し；ビーズ形成が、ノズルから液滴を注ぐ同軸気流により行われる、噴流分裂または粉砕；ノズルからゲル化浴中に液滴を注ぐために静電場を使用する、静電ビーズ生成；磁気駆動振動；ビーズ形成が、噴流を均一な円柱セグメントに切断する回転切削工具により行われる、噴流切断；および回転盤噴霧が挙げられる。
【００３５】
ＰＧＡ溶液の液滴は、球状または実質的に球状であってよく、１０から５００マイクロメートルに及ぶ、例えば、１０、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５２、３００、３５０、４００、４５０または５００マイクロメートルと、先の値のいずれかの間の範囲を含む、平均直径を有することがある。
【００３６】
そのゲル化浴は、二価金属塩の水溶液を含むことがある。実施の形態において、ゲル化浴中の塩（例えば、塩化カルシウム）の濃度は、少なくとも１％（ｗ／ｖ）であり、例えば、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０％と、先の値のいずれかの間の範囲を含む。カルシウム含有量が低すぎると、ビーズは、低すぎる架橋密度のために、不十分な安定性を示す。
【００３７】
前記水溶液は、エタノールなどのアルコールを含むことがある。水に対するアルコールの比（ｖ／ｖ）は、０／１００から８０／２０に及ぶことがあり、例えば、０／１００、１０／９０、２０／８０、３０／７０、４０／６０、５０／５０、６０／４０、７０／３０、および８０／２０であることがある。
【００３８】
実施の形態において、いくらかの共有架橋が生じ得るが、そのような架橋は不可逆的であり、そのレベルは、ビーズの消化性を維持するように、十分に低い、例えば、約１０未満から２０モル％であるべきである。
【００３９】
前記マイクロキャリアビーズは、球状または実質的に球状であってよく、１０から５００マイクロメートルに及ぶ、例えば、１０、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００マイクロメートルと、先の値のいずれかの間の範囲を含む、平均直径を有することがある。実施の形態において、相対標準偏差とも称されるマイクロキャリアビーズの変動係数（ＣＶ）は、２０％未満であり、例えば、２、５、１０または１５％と、先の値のいずれかの間の範囲を含む。サイズ分布Δｄ５−ｄ９５（ｄ５はマイクロキャリアの個体数の５％の直径より大きいマイクロキャリアの直径であり、ｄ９５はマイクロキャリアの個体数の９５％の直径より大きいマイクロキャリアの直径である、ｄ９５とｄ５の間の差）は、２５マイクロメートル未満であり、例えば、１０、１５または２０マイクロメートルと、先の値のいずれかの間の範囲を含む。実施の形態において、サイズ分布Δｄ１０−ｄ９０（ｄ１０はマイクロキャリアの個体数の１０％の直径より大きいマイクロキャリアの直径であり、ｄ９０はマイクロキャリアの個体数の９０％の直径より大きいマイクロキャリアの直径である、ｄ９０とｄ１０の間の差）は、２０マイクロメートル未満であり、例えば、５、１０または１５マイクロメートルと、先の値のいずれかの間の範囲を含む。実施の形態において、ｄ５からｄ９５の曲率半径の分布（マイクロキャリアの個体数の５％の直径よりも大きいマイクロキャリアの直径の曲率半径と、マイクロキャリアの個体数の９５％の直径より大きいマイクロキャリアの直径の曲率半径との間の差）は、１０ｃｍ-1未満であり、例えば、２、５または８ｃｍ-1と、先の値のいずれかの間の範囲を含む。
【００４０】
ビーズサイズの制御
実施の形態において、狭く、特定のサイズ範囲内のマイクロキャリアビーズを製造できる。すなわち、それらはサイズ制御することができる。マイクロキャリアビーズのサイズの制御は、いくつかの理由のために重要である。小から大のマイクロキャリアに及ぶ広いサイズ分布がある場合、より小さいサイズのマイクロキャリアは、より大きいサイズのマイクロキャリアよりもずっと長い間、浮遊状態にあるであろう。この過程における正確な沈降時間は、ずっと長い（より小さいビーズの存在のために）か、または規定するのが難しいであろう。使用に際して、上清が、マイクロキャリアがなくきれいであることを確実にするために、より多くの時間が必要であろう。
【００４１】
狭いサイズ分布により、一貫した速度でのビーズの沈降が可能であり、これにより、培地の交換または培地製品の単離の最中に上清からのマイクロキャリアの分離がより予測可能になる。マイクロキャリアのサイズは、沈降速度を制御するために、異なる範囲に微調整することができる。これにより、異なる過程の必要性に適合するように沈降速度のカスタマイズが可能になる。サイズ制御されたマイクロキャリアは均一な表面積を有し、これは、マイクロキャリア当たりの細胞の播種に同じ面積が利用できる。これにより、細胞播種に利用できる表面積を計算することがより容易になる。その上、細胞は、同じ時間、または同様の時間で、コンフルエンスに到達するであろう。ここに用いたように、「コンフルエンス」または「コンフルエント」という用語は、細胞が増殖表面上で凝集性層を形成したときに、全ての細胞が他の細胞と接触し、よって、実質的に全ての利用できる増殖表面が使用されていることを示すために使用される。例えば、「コンフルエント」は、「全ての細胞が他の細胞とその周囲で全て接触しており、利用でき基体は、被覆されていない状態で残っていない」状況として定義された（R.I. Freshney, Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Techniques, Second Edition, Wiley-Liss, Inc. New York, N.Y., 1987, p. 363）。従来のように、細胞により被覆された増殖表面の量は、コンフルエンスの比率として称される。例えば、増殖表面の約半分が細胞により被覆されている状況は、ここでは、５０％のコンフルエンス、または代わりに、半分のコンフルエンスと称される。サイズ制御されたマイクロキャリアは、同じ撹拌条件で懸濁させることができる。これにより、マイクロキャリアの良好な懸濁を釣り合わせるために剪断力の微調整が可能になり、細胞に損傷をあまり与えない条件が可能になるであろう。サイズ制御されたマイクロキャリアの異なる群に関する明白な沈降時間は、異なる時間で供給されたビーズ上での不均一な細胞増殖を防ぐために、連続細胞培養中に容易に分離するのに役立ち得る。例えば、最初に、２５０μｍのサイズを有するサイズ制御されたマイクロキャリア上に細胞を播種することができる。細胞が半分のコンフルエンスに到達した後、３５０μｍのサイズのサイズ制御されたマイクロキャリアを、ビーズからビーズへの移行のために、バイオリアクターに添加することができる。２５０μｍのマイクロキャリアのコンフルエンスの時点で、このサイズを持つマイクロキャリアは、それらの特有の沈降速度または濾過によって、除去することができる。３５０μｍサイズの半分のコンフルエンスのビーズのみが、バイオリアクター中に残される。次に、新たな２５０μｍのマイクロキャリアを添加することができる。３５０μｍのマイクロキャリアがコンフルエンスに到達した後、それらを収集し、新たな３５０μｍのマイクロキャリアを添加する。この過程により、全てのビーズは、コンフルエンスに到達した時に除去されることが確実になるであろう。対照的に、同じサイズのマイクロキャリアが、ビーズからビーズへの移行および連続細胞培養を行うために使用される場合、先の供給からのビーズ上の細胞は、後の供給からのビーズ上の細胞よりも、ずっと長い間バイオリアクター中に滞在し、細胞の品質は、過剰コンフルエンスの結果として、劣化し得る。
【００４２】
実施の形態において、振動カプセル化装置を使用した製造中に、溶けるマイクロキャリアをサイズ制御した。孔サイズ、流量、および振動数が規定されたノズルを通すことによって、サイズ制御されたビーズを形成した。得られたビーズのサイズは、変動係数が１０％未満の狭い範囲に制御された。
【００４３】
ビーズの消化
マイクロキャリアを消化する、細胞を採取する、またはその両方を行うのに適した非タンパク質分解酵素としては、ペクチン分解酵素またはペクチナーゼが挙げられ、それらは、ペクチン物質を加水分解する異質の群の関連酵素である。
【００４４】
細胞採取は、細胞が担持されたマイクロキャリアを、ペクチン分解酵素またはペクチナーゼおよび二価陽イオンキレート剤の混合物を含む溶液と接触させる工程を含む。
【００４５】
培養細胞を採取する例示の方法は、ここに開示されたようなマイクロキャリアの表面上で細胞を培養する工程、および培養した細胞を、ペクチナーゼおよびキレート剤の混合物と接触させて、マイクロキャリアから細胞を分離する工程を有してなる。
【００４６】
ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ）は、複雑なペクチン分子をガラクツロン酸のより短い分子に分解する酵素である。ペクチナーゼは、ポリガラクツロン酸からのペクチンオリゴ糖（ＰＯＳ）の遊離を触媒する。ペクチナーゼは、菌類、酵母、細菌、原虫、昆虫、線虫および植物により生成される。ペクチナーゼの市販の供給源は、アスペルギルス・アクレアタスの選択された菌株から生成されたペクチン分解酵素調製品である、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ｐｅｃｔｉｎｅｘ（商標）ＵＬＴＲＡ  ＳＰＬなどのように、一般に多酵素である。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ「Ｐｅｃｔｉｎｅｘ」ＵＬＴＲＡ  ＳＰＬは、主に、ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１５）、ペクチントランスエリミナーゼ（ＥＣ  ４．２．２．２）、およびペクチンエステラーゼ（ＥＣ：３．１．１．１１）を含有する。このＥＣ名称は、酵素が触媒する化学反応に基づく酵素に関する酵素委員会分類スキームである。ペクチナーゼは、ペクチンを加水分解することが知られている。それらは、メチルエステル化ペクチンまたは脱エステル化ペクチンを攻撃するであろう。
【００４７】
消化溶液中のペクチン分解酵素の濃度は、１から２００Ｕ、例えば、１、２、５、１０、２０、５０、１００、１５０または２００Ｕであることがあり、先の値のいずれかの間の範囲を含む。
【００４８】
例示のキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。消化溶液中のキレート剤の濃度は、１から２００ｍＭ、例えば、１０、２０、５０、１００、１５０または２００ｍＭであることがある。細胞毒性副作用を避けるために、消化溶液中のキレート剤の濃度は、１０ｍＭ以下、例えば、１、２、５または１０ｍＭであることがあり、先の値のいずれかの間の範囲を含む。
【００４９】
実施の形態において、ペクチン分解酵素およびキレート剤を含む消化溶液の全体積は、マイクロキャリアの体積の１０倍未満、例えば、マイクロキャリアの体積の１、２、４、５または１０倍であり、先の値のいずれかの間の範囲を含む。
【００５０】
消化時間、温度、添加するペクチン分解酵素の量、および消化の程度に応じて、ビーズを選択するまたは予め決定することができる。ビーズが完全に消化される前に、マイクロキャリアの表面から細胞が分離することが観察された。したがって、ビーズを完全に消化して、または消化せずに、細胞を採取することが可能である。細胞が、部分的に消化されたマイクロキャリアから採取される実施の形態において、残留マイクロキャリアからの細胞の分離は、濾過、デカンテーション、遠心分離、および同様の処理の１つ以上によって行われることがある。
【００５１】
ビーズは、そのカルシウム含有量が、湿ったビーズの２ｇ／ｌ未満、例えば、２、１．５、１、０．８または０．５ｇ／ｌ未満である場合に容易に消化される。採取段階でのビーズのカルシウム含有量が１ｇ／ｌより大きい場合、より大きい体積および／または濃度のペクチン分解酵素および二価陽イオンキレート剤を使用することができる。完全な消化にかかる時間は、１時間未満、例えば、１０、１５、３０または４５分であることがある。ここに用いたように、「完全な消化」という用語は、「Particulate Matter in Injections」と題する米国薬局方および国民医薬品集セクション７８８（ＵＳＰ＜７８８＞）に記載されているような粒子計数試験に適合するマイクロキャリア粒子数を生じるマイクロキャリアの消化を称する。ＵＳＰ＜７８８＞に示されるように、試験単位中に存在する粒子の平均数が、１０μｍ以上の粒子でｍＬ当たりの２５を超えず、２５μｍ以上の粒子でｍＬ当たりの３を超えない場合、調製品が試験に適合する。実施の形態において、マイクロキャリアの消化後に１０μｍ以上のサイズを有する粒子のマイクロキャリア粒子数が、１０粒子未満、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８または９であり、先の値のいずれかの間の範囲を含む。実施の形態において、マイクロキャリアの消化後に２５μｍ以上のサイズを有する粒子のマイクロキャリア粒子数が、１粒子未満、例えば、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９であり、先の値のいずれかの間の範囲を含む。
【００５２】
ここに定義されたような、「湿ったビーズ」の体積は、デカンテーションまたは遠心分離後のビーズ床の体積である。その床は、膨潤したビーズ、並びに間隙水（すなわち、膨潤したビーズの間に存在する水）を含む。測定によれば、湿ったビーズは、７０体積％の膨潤したビーズおよび３０体積％の間隙水を含有する。その膨潤したビーズは、１％のＰＧＡ溶液では９９％の水、２％のＰＧＡ溶液では９８％の水、３％のＰＧＡ溶液では９７％の水などを含有する。
【００５３】
一例として、３％（ｗ／ｖ）のＰＧＡゾルから調製されたマイクロビーズは、平衡状態で、約１．４８ｇ／ｌのカルシウムイオンを含有する。１０分未満のマイクロビーズの完全な消化は、５倍の体積の消化溶液（ビーズの体積と比べて）を使用して、少なくとも１０ｍＭのＥＤＴＡおよび少なくとも５０Ｕの酵素への暴露により行われる。
【００５４】
細胞接着
ＰＧＡビーズは、そのヒドロゲルの性質および負電荷のために、特別な処理をしなければ、細胞接着を進んで支援しない。足場依存性細胞の接着を促進するために、マイクロビーズにコーティングまたは他の表面処理を施すことができる。一例として、ＰＧＡビーズは、細胞接着を促進する部分、例えば、ＲＧＤ配列を含むものなどのペプチドで官能化することができる。
【００５５】
さらに別の候補のペプチドは、細胞接着を維持することができる細胞分子との相互作用をもたらす、またはインテグリンファミリーからのタンパク質により潜在的に認識されるアミノ酸配列を含有するものを含む。その例としては、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン（ゼラチン）、および同様のペプチド、並びにそれらの混合物が挙げられる。さらに別の例示のペプチドは、それぞれ、以下の配列：Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号１）、およびＡｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＮＨ2（配列番号２）を有する、ＢＳＰおよびビトロネクチン（ＶＮ）ペプチドである。
【００５６】
実施の形態において、前記マイクロビーズは、グラフト化できるまたはコーティングとして施せる、細胞接着促進組み換えタンパク質で表面官能化されている。例示の組み換えタンパク質としては、商標名ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）および「ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ」ｐｌｕｓで市販されているフィブロネクチン様の遺伝子操作されたタンパク質が挙げられるが、足場依存性細胞の接着を促進する他の組み換えタンパク質を使用しても差し支えない。
【実施例】
【００５７】
実施例１．３％のカルシウムと架橋した１％のＰＧＡマイクロビーズ
ポリガラクツロン酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａカタログ番号＃Ｐ３８５０）を一定の撹拌条件下において８０〜８５℃で水に溶かすことによって、ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）の１質量％溶液からマイクロビーズを調製した。真空下で２０マイクロメートルのポリプロピレンフィルタを使用して溶液を濾過して、懸濁液中の粒子を除去した。
【００５８】
４００ｍｌの３％ｗ／ｖ塩化カルシウムの水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を使用して、別のビーカー内でゲル化浴を生成し、これを磁気撹拌子を使用して撹拌した。
【００５９】
３０ゲージの針を備えた注射器を使用して、２５ｍｌのＰＧＡ溶液をゲル化浴中に添加することによって、液滴を生成した。約２バール（２００ｋＰａ）の注射器圧を印加した。
【００６０】
水で４回洗浄する前に、１２０分間に亘り、塩化ナトリウム浴中でビーズを硬化させた。ビーズ内のカルシウム含有量は、実施例９において記載されたように決定した。４回の濯ぎ後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．５〜０．６ｇ／ｌであった。
【００６１】
ビーズを、被覆前に４℃で滅菌容器内の滅菌水中に貯蔵した。ビーズは、観察できる表面欠陥がなく、極めて透明であった。
【００６２】
ビーズは、２５℃で５ｍＭのＥＤＴＡ／５０Ｕのペクチナーゼと接触させたときに、５分以内で完全に溶けた。
【００６３】
実施例２．１２％のカルシウムと架橋した１％のＰＧＡマイクロキャリア
３％ｗ／ｖ塩化カルシウムの水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を１２％ｗ／ｖ塩化カルシウムの水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液と置き換えたことを除いて、実施例１の手順を繰り返した。４回の濯ぎ後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．５〜０．６ｇ／ｌであった。ビーズは、観察できる表面欠陥がなく、極めて透明であった。
【００６４】
ビーズは、２５℃で５ｍＭのＥＤＴＡ／５０Ｕのペクチナーゼと接触させたときに、５分以内で完全に溶けた。
【００６５】
実施例３．３％のカルシウムと架橋した１．５％のＰＧＡマイクロキャリア
ポリガラクツロン酸の１．５質量％溶液および４バール（４００ｋＰａ）の圧力を使用したことを除いて、実施例１の手順を繰り返した。
【００６６】
４回の濯ぎ後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．７〜０．８ｇ／ｌであった。ビーズは、観察できる表面欠陥がなく、極めて透明であった。
【００６７】
実施例４．１２％のカルシウムと架橋した１．５％のＰＧＡマイクロキャリア
３％ｗ／ｖ塩化カルシウムの水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液の代わりに、１２％ｗ／ｖ塩化カルシウムの水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を使用したことを除いて、実施例３の手順を繰り返した。
【００６８】
４回の濯ぎ後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．７〜０．８ｇ／ｌであった。
【００６９】
実施例５−ａ．３％のカルシウムと架橋した２％のＰＧＡマイクロキャリア
ポリガラクツロン酸の２質量％溶液および５バール（５００ｋＰａ）の圧力を使用したことを除いて、実施例１の手順を繰り返した。そのＰＧＡ溶液を３０℃で予熱し、ゲル化浴中に３０℃で噴射し、その浴を２５℃に維持した。
【００７０】
４回の濯ぎ後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．９〜１．０ｇ／ｌであった。ビーズは、観察できる表面欠陥がなく、極めて透明であった。
【００７１】
実施例５−ｂ．３％のカルシウムと架橋した３％のＰＧＡマイクロキャリア
ポリガラクツロン酸の３質量％溶液および６バール（６００ｋＰａ）の圧力を使用したことを除いて、実施例１の手順を繰り返した。そのＰＧＡ溶液を４０℃で予熱し、ゲル化浴中に４０℃で噴射し、その浴を２５℃に維持した。
【００７２】
４回の濯ぎ後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの１．４８ｇ／ｌであった。ビーズは、観察できる表面欠陥がなく、極めて透明であった。
【００７３】
ビーズは、２５℃で５ｍＭのＥＤＴＡ／５０Ｕのペクチナーゼと接触させたときに、１０分以内で完全に溶けた。
【００７４】
実施例６．１２％のカルシウムと架橋した２％のＰＧＡマイクロキャリア
１２％ｗ／ｖ塩化カルシウムの水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を用いたことを除いて、実施例５−ａの手順を繰り返した。
【００７５】
４回の濯ぎ後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．９〜１．０ｇ／ｌであった。
【００７６】
実施例７．グルタルアルデヒドと架橋した０．１％のゼラチンで被覆されたＰＧＡビーズ
最初に、２０ｍｌの水中に０．５ｇ（Ａ型）のブタの表皮（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｇ１８９０）を浸漬し、次に、４８０ｍｌの温水（６０℃〜８０℃）を加えることによって、０．１％のブタ表皮ゼラチン溶液を調製した。
【００７７】
実施例１〜６にしたがって調製した１０ミリリットルのＰＧＡビーズを遠心分離によって収集し、これに、１０ｍＬのブタ表皮ゼラチン溶液を加えた。得られた混合物を穏やかに振盪し、２５℃で６０分間に亘りインキュベーションした。上清を除去し、ビーズを水中で一回洗浄した。
【００７８】
このゼラチンコーティングを架橋するために、２５％の貯蔵液（Ｓｉｇｍａ  Ｃ５８８２）から調製した１００ｍｌの０．０５％のグルタルアルデヒド溶液をビーズ床に加え、穏やかに振盪しながら、２３℃で１時間に亘りインキュベーションした。その後、ビーズを水で３回濯ぎ、滅菌容器内において４℃で貯蔵した。
【００７９】
実施例８．「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣ合成コポリマー表面を有するＰＧＡビーズ
実施例１により調製した約９ｍｌの膨潤ビーズを５０ｍｌのブラスチック遠心管に入れた。このビーズに３６ｍｌの接着促進ペプチドの０．２５ｍｇ／ｍｌ水溶液を加えて、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣ表面を形成した。その遠心管を穏やかに振盪し、４０℃で３０分間に亘り平静な状態のままにして、合成コポリマーにビーズを官能化させた。冷却後、官能化ビーズを脱イオン水で３回洗浄した。ビーズを滅菌容器内において４℃の水中に貯蔵した。
【００８０】
実施例９．カルシウム滴定
カルシウム含有量を数量化するために、１ｍｌのＰＧＡビーズを、１０ｍｌの５ｍＭのＥＤＴＡ／５０Ｕのペクチナーゼ溶液と組み合わせることによって、消化した。その懸濁液を激しく振盪し、消化が完了するまで、穏やかに振盪しながら、２５℃で１時間に亘り放置した。
【００８１】
ビーズのカルシウム含有量は、誘導結合プラズマ発光分析（Ａｘｉａｌ  ＩＣＰ−ＯＥＳ、Ｖａｒｉａｎ  ７２０ＥＳ器具）によって数量化した。分析すべき試料は、消化されたビーズを含有する１００μｌの溶液を９．９ｍｌの１％ＨＮＯ3中に希釈することによって調製した。１ｇ／ｌの標準水溶液（各試料について行ったように、ＨＮＯ3で希釈した）から調製した既知のカルシウム濃度の溶液を使用して、較正曲線を作成した。
【００８２】
平衡状態のカルシウム含有量（非結合カルシウムを除去するために、水による大がかりな洗浄後）と外部ゲル化によりビーズを調製するために使用したＰＧＡナトリウム塩の量との間の直線関係が、図２に示されている。そのカルシウム含有量は、ポリガラクツロン酸ヒドロゲルのカルシウム捕捉能力に相当する。
【００８３】
実施例１０−ａ．ペプチドコポリマー被覆マイクロキャリアによるｈＭＳＣ静置培養
実施例２にしたがって調製され、実施例８による「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣコポリマー表面が設けられたビーズを７０％エタノール／水で消毒し、リン酸緩衝食塩水（ｄＰＢＳ）で２回濯ぎ、次いで、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ完全培地（ＭＣ−ＸＦ）で濯いだ。骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）培養を、２４ウェルＵＬＡプレート内のＭＣ−ＸＦ中において静止条件下で行った。細胞は、１００ｋ細胞／ウェルで播種した。細胞は、５分間に亘る５０Ｕのペクチナーゼ／５ｍＭのＥＤＴＡによる処理によって、マイクロキャリアから採取した。播種から２日後の細胞形態が図３に示されている。播種から４日後の細胞形態が図４に示されている。
【００８４】
実施例１０−ｂ．ゼラチン被覆マイクロキャリアによるｈＭＳＣ静置培養
ビーズを、実施例４にしたがって調製し、実施例７にしたがってゼラチンで被覆した。図５は、２４ウェルプレート内において１００ｋ細胞／ウェルでの播種から２日後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の接着および増殖の例示の位相差顕微鏡画像を示す。
【００８５】
実施例１１．ゼラチン被覆ＰＧＡマイクロキャリア上でのＶｅｒｏ細胞の増殖
Ｖｅｒｏ細胞を、実施例２にしたがって調製され、実施例７にしたがって被覆されたゼラチン被覆、外部架橋１％ＰＧＡマイクロキャリア上で連続的に撹拌することによって培養した。
【００８６】
ビーズを最初に、７０％エタノール／水で消毒し、リン酸緩衝食塩水（ｄＰＢＳ）で２回濯ぎ、次いで、（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ＋５ｍｌペニシリンストレプトマイシン＋５ｍｌＧｌｕｔａｍａｘ（商標）培地）で濯いだ。
【００８７】
細胞培養は、培地として１０％ＦＢＳ＋５ｍｌペニシリンストレプトマイシン＋５ｍｌ「Ｇｌｕｔａｍａｘ」培地を添加したＩＭＤＭを用いて、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の使い捨てスピナーフラスコ内で行った。このフラスコに１ＭのＶｅｒｏ（ｐ５）を播種し、２時間に亘り撹拌せず、続いて、連続的に撹拌した。継代数表示（ｐ＃、この実施例において「ｐ５」）は、細胞を産生するために使用した増殖および採取サイクルの数（＃）（すなわち、細胞が培養において分割された数）を表す。
【００８８】
５日目の細胞の採取は、１０ｍＬの５０Ｕ／ｍｌペクチナーゼ、５ｍＭのＥＤＴＡにより行った。
【００８９】
図６は、播種から４日後のＶｅｒｏ細胞の接着および増殖の例示の位相差顕微鏡画像を示す。増殖倍率データが図７に示されている。
【００９０】
実施例１２．ゼラチン被覆ＰＧＡマイクロキャリア上でのＭＲＣ５細胞の増殖
ヒト胎児肺線維芽（ＭＲＣ５）細胞を、実施例２にしたがって調製され、実施例７にしたがって被覆されたゼラチン被覆、外部架橋１％ＰＧＡマイクロキャリア上で断続的に撹拌することによって培養した。
【００９１】
ビーズを最初に、７０％エタノール／水で消毒し、リン酸緩衝食塩水（ｄＰＢＳ）で２回濯ぎ、次いで、（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ＋５ｍｌペニシリンストレプトマイシン＋５ｍｌ「Ｇｌｕｔａｍａｘ」培地）で濯いだ。
【００９２】
細胞培養は、培地として１０％ＦＢＳ＋５ｍｌペニシリンストレプトマイシン＋５ｍｌ「Ｇｌｕｔａｍａｘ」培地を添加したＩＭＤＭを用いて、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の使い捨てスピナーフラスコ内で行った。このフラスコに１ＭのＭＲＣ５細胞（ｐ４）を播種し、一晩に亘り撹拌せず、続いて、断続的に撹拌した（２時間当たり１／４時間）。
【００９３】
５日目の細胞の採取は、１０ｍＬの５０Ｕ／ｍｌペクチナーゼ、５ｍＭのＥＤＴＡにより行った。
【００９４】
図６は、播種から４日後のＭＲＣ５細胞の接着および増殖の例示の位相差顕微鏡画像を示す。増殖倍率データが図８に示されている。
【００９５】
図６に示された顕微鏡写真は、ＶｅｒｏおよびＭＲＣ５細胞が、ＰＧＡマイクロキャリア上に接着し、コンフルエンスに到達できたことを示す。
【００９６】
実施例１３．ペプチドコポリマー被覆マイクロキャリア上でのｈＭＳＣ細胞の増殖
ｈＭＳＣ細胞を、実施例１に記載されたように調製され、実施例８にしたがって「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣコポリマー表面が設けられた外部架橋ＰＧＡビーズ上で連続的に撹拌することによって培養した。
【００９７】
ビーズを最初に、７０％エタノール／水で消毒し、リン酸緩衝食塩水（ｄＰＢＳ）で２回濯ぎ、次いで、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」−ＸＦ完全培地（ＭＣ−ＸＦ）で濯いだ。細胞は、１Ｍの細胞／フラスコで播種し、細胞培養は、ＭＣ−ＸＦを用いて、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の使い捨てスピナーフラスコ内で行った。
【００９８】
細胞は、５分間に亘る１０ｍｌの５０Ｕのペクチナーゼ／５ｍＭのＥＤＴＡによる処理で、７日目にマイクロキャリアから採取した。増殖倍率データが図９に示されている。
【００９９】
実施例１４．ペプチドコポリマー被覆マイクロキャリア上でのｈＭＳＣ細胞の増殖
実施例５−ａに記載されたように調製した２％のＰＧＡ溶液から調製し、実施例８に記載されたようにＣｏｒｎｉｎｇ「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ合成ペプチドコポリマー表面が設けられた外部架橋ＰＧＡビーズを使用したことを除いて、実施例１３に記載されたような連続撹拌条件下でのｈＭＳＣ細胞の増殖を繰り返した。増殖倍率データが図９に示されている。
【０１００】
実施例１５．ゼラチン被覆マイクロキャリア上でのｈＭＳＣ細胞の増殖
ｈＭＳＣ細胞を、実施例１に記載されたように調製され、実施例７に記載されたようにゼラチンで被覆した外部架橋ＰＧＡビーズ上で連続的に撹拌することによって培養した。
【０１０１】
ビーズを最初に、７０％エタノール／水で消毒し、リン酸緩衝食塩水（ｄＰＢＳ）で２回濯ぎ、次いで、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」−ＸＦ完全培地（ＭＣ−ＸＦ）で濯いだ。細胞は、１Ｍの細胞／フラスコで播種し、細胞培養は、ＭＣ−ＸＦを用いて、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の使い捨てスピナーフラスコ内で行った。
【０１０２】
細胞は、５分間に亘る１０ｍｌの５０Ｕのペクチナーゼ／５ｍＭのＥＤＴＡによる処理で、７日目にマイクロキャリアから採取した。増殖倍率データが図９に示されている。
【０１０３】
実施例１６．ゼラチン被覆マイクロキャリア上でのｈＭＳＣ細胞の増殖
実施例５−ａに記載されたように調製され、実施例７に記載されたようにゼラチンで被覆された外部架橋ゼラチン被覆ＰＧＡビーズを使用したことを除いて、実施例１５に記載されたような連続撹拌条件下でのｈＭＳＣ細胞の増殖を繰り返した。増殖倍率データが図９に示されている。
【０１０４】
実施例１７．ＰＧＡマイクロキャリアの化学安定性
マイクロキャリアビーズの化学安定性を、プラスチック遠心管に１ｍｌの膨潤ビーズおよび５ｍｌのダルベッコリン酸緩衝食塩水（ｄＰＢＳ）（１Ｘ）を加えることによって評価した。その管を３７℃で２４時間に亘りインキュベーションした。２４時間後のビーズの体積は初期体積に匹敵し、ビーズはリン酸緩衝液中に溶けないことを示した。
【０１０５】
実施例１８．
電磁駆動層流ジェット・ノズル・システム（スイス国、チューリッヒ所在のＮｉｓｃｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＡＧ）を使用して、１．５質量％のＰＧＡ溶液から単分散マイクロキャリアビーズを製造した。このシステムは、１００μｍのノズルを備えている。周波数を２．５ｋＨｚに設定し、振幅を１００％に設定した。約３ｐｓｉ（約２１ｋＰａ）の圧力を印加することによって生じる溶液の流量は、約１００ｍｌ／ｈであった。
【０１０６】
ノズルは、ゲル化浴（５０：５０ｖ／ｖの水／エタノール中の４質量％のＣａＣｌ2溶液）の表面から約７．５ｃｍ上に配置した。その浴を連続的に撹拌した（１７０ｒｐｍ）。
【０１０７】
得られたマイクロビーズの平均直径は２４０±１５μｍであり、これは６．２５％の変動係数（ＣＶ）に相当する。この狭いサイズ分布が図１０に示されている（倍率：４Ｘ）。
【０１０８】
ゲル化コーティングを架橋するために、１００ｍｌの代わりに、５０ｍｌの０．０５％のグルタルアルデヒド溶液を使用することを除いて、実施例７に記載されたように、ビーズにゼラチンを被覆した。
【０１０９】
実施例１０−ｃ．ゼラチン被覆マイクロキャリアによるＭＲＣ５静置培養
実施例１８にしたがって調製され、ゼラチンを被覆したマイクロビーズ上で、静止条件下でヒト胎児肺線維芽（ＭＲＣ５）細胞を培養した。細胞を、培地として１０％のＦＢＳが添加されたＩＭＤＭを使用して、２４ウェルＵＬＡプレート内において１００ｋ細胞／ウェルで播種した。播種から１日後の細胞形態が、図１１の位相差顕微鏡画像に示されている。
【０１１０】
実施例１９．ＰＧＡマイクロキャリアへのビトロネクチンペプチドのグラフト化
実施例１８にしたがって調製した膨潤ビーズ約３ｍｌを１５ｍｌのプラスチック遠心管に入れた。２００ｍＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む１２ミリリットルの水溶液を加えた。この管を２３℃で３０分間に亘り穏やかに振盪して、ＰＧＡビーズ内のカルボン酸基を活性化させた。活性化したマイクロキャリアを遠心分離で収集し、１０ｍｌの脱イオン水で３回濯いだ。
【０１１１】
濯いだマイクロキャリアを、４９ｍｇのビトロネクチンペプチド（Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＮＨ2；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ社から入手できるカタログ番号：３４１５８７）を含有する１２ｍｌのホウ酸塩緩衝液中に再び懸濁させた。懸濁させたマイクロキャリアを、穏やかに振盪しつつ、３０分間に亘り反応させた。
【０１１２】
このペプチド導入されたマイクロキャリアを遠心分離により収集し、１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４で３回洗浄した。過剰な活性化エステルは、６０分間に亘り１２ｍｌの１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．４）で遮断することによって、不活性化させた。
【０１１３】
ペプチドがグラフト化され、遮断されたマイクロキャリアを収集し、ＰＢＳで３回濯いだ。過剰なＰＢＳを除去した後、マイクロキャリアをエタノール／水（７０／３０ｖ／ｖ）で２回濯ぎ、滅菌容器内おいて４℃で、細胞培養前に貯蔵した。
【０１１４】
実施例１０−ｄ．ＶＮ−グラフト化マイクロキャリアを使用したｈＭＳＣ静置培養
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ２６３７、ｐ３）を、実施例１９にしたがって調製したＶＮ−グラフト化マイクロキャリアビーズ上において静止条件下で培養した。細胞は、２４ウェルＵＬＡプレート内において５０ｋの細胞／ウェルで播種した。図１３は、播種から２４時間後の無血清培地（「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」ＸＦ）内のｈＭＳＣ細胞を示す位相差画像である。
【０１１５】
実施例１０ａ〜１０ｄからのデータは、完全合成マイクロキャリアおよびゼラチン被覆マイクロキャリアの各々が、ｈＭＳＣの接着と増殖を支援することを示している。
【０１１６】
実施例２０．外部ゲル化を使用した、異なるサイズを有する溶けるマイクロキャリアの生成
ポリガラクツロン酸ナトリウム塩を水中に２％で溶かした。ＮＩＳＣＯ単一ノズル振動カプセル化システムを使用して、外部ゲル化を行った。エタノールおよび水の１：１（ｖ／ｖ）混合物中に溶かした４％のＣａＣｌ2中にビーズを落下させた。目標サイズ範囲について、表Ｉにしたがって、異なるノズルサイズ、流量および振動数を使用した。図１４は、異なるパラメータで製造されたビーズの光学顕微鏡画像およびサイズ分布を示している。光画像を使用して、２５０μｍ（図１４Ａおよび図１４Ｂに示されている）、３５０μｍ（図１４Ｃおよび図１４Ｄに示されている）、および４５０μｍ（図１４Ｅおよび図１４Ｆに示されている）の目標サイズについての平均サイズおよび変動係数を分析した。
【０１１７】
【表１】
2018520662.tif 000003
【０１１８】
実施例２１．沈降時間測定および分析
沈降速度を評価するために、異なるサイズのマイクロキャリアの実施の形態を、市販のマイクロキャリア：Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）−１（ペンシルベニア州、ピッツバーグ所在のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている架橋デキストラン系マイクロキャリア）、ＳｏｌｏＨｉｌｌ（登録商標）Ｐ１０２−１５２１（ニューヨーク州、ポートワシントン所在のＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているプラスチック架橋ポリスチレンマイクロキャリア）、およびＨｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩ（ニューヨーク州、ポートワシントン所在のＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている修飾ポリスチレンマイクロキャリア）と比較した。これら３種類の市販のマイクロキャリアは、ヒドロゲルから固体プラスチックに及び、１．０２から１．０９に及ぶ密度を有する。光学密度（ＯＤ）を、下記に詳しく記載したように測定し、懸濁液中のビーズの濃度を決定するために使用した。マイクロキャリアは、オブスキュレーションのために、可視光を遮断することができる。概して、より低いＯＤは、懸濁液中のより低い濃度のマイクロキャリアに相関する。
【０１１９】
図１６は、ＯＤを測定するために使用した例示の方法を示している。図１６の上部は、異なる段階でのキュベット内でのビーズの沈降の概略画像を示している。キュベットの画像を横切る幅広い矢印は、ＯＤを測定する方法に使用した光路を示す。図のように、光路は、キュベットの底部に近いであろう。図１５は、例示のキュベットを示す。図１６は、図１５に示したものなどのキュベット内でのマイクロキャリアの沈降の説明図である。図１６の底部は、マイクロキャリアビーズが溶液から沈降する最中の期間に亘るＯＤの変化を示すグラフである。概して、測定の始めに、マイクロキャリアビーズは、図１６（ａ）に示されるように、溶液中に完全に懸濁されており、光が最高レベルで遮断されている。マイクロキャリアビーズが沈降し始めるにつれて、マイクロキャリアビーズが同じ方向に移動するので、懸濁液の上部が澄み始める。けれども、光路内のマイクロキャリアビーズの濃度は、図１６（ｂ）に示されるように、比較的不変のままである。マイクロキャリアビーズが、光路の上限より下に沈降し始めるのにつれて、ＯＤは、図１６（ｃ）に示されるように、減少する。マイクロキャリアビーズが、図１６（ｄ）に示されるように、光路のほぼ中央に到達したときに、ＯＤが半分に減少する。マイクロキャリアビーズが光路のほぼ中央に到達するのにかかる期間は、ｔmにより表される。全懸濁液の高さおよび光路の位置が固定された場合、ビーズが小さいほど、沈降するのが速くなる。ここではｖmにより表される沈降速度は、懸濁液の上部から光路の中央までの、ここでｌmにより表される距離をマイクロキャリアが移動するのにかかる、ここではｔmにより表される時間によって測定できる。これを式（１）：
【０１２０】
【数１】
2018520662.tif 000004
【０１２１】
に示すことができる。不均一なサイズを有するマイクロキャリアビーズの個体群について、異なるサイズのマイクロキャリアビーズでは、異なる沈降速度が予測される。それゆえ、沈降速度ｖmは、その個体群の中間の沈降速度を表す。
【０１２２】
光路は、ここではｌwにより表される幅を有し、幅ｌwをマイクロキャリアビーズが移動するのにかかる、ここではｔwにより表される時間は、図１６（ｃ）から図１６（ｅ）に進行することにより示される。マイクロキャリアビーズの個体群が均一な沈降速度を有する（すなわち、マイクロキャリアビーズが均一なサイズ分布を有する）場合、ｔwは、式（２）：
【０１２３】
【数２】
2018520662.tif 000005
【０１２４】
に示されるように、光路の幅ｌwおよぴ沈降速度ｖmを使用して推定することができる。マイクロキャリアビーズの個体群が異なる沈降速度の分布を有する（すなわち、マイクロキャリアビーズが不均一なサイズ分布を有する）場合、最速で沈降するマイクロキャリアビーズは、最も遅く沈降するマイクロキャリアビーズよりも早く光路に到達する。最速で沈降するマイクロキャリアビーズが光路を通過するときに、ＯＤの減少が観察されるが、最も遅く沈降するマイクロキャリアビーズが光路を通過するまで、ＯＤの完全な減少は観察されない。異なる沈降速度の分布を有するマイクロキャリアビーズの個体群は、均一な沈降速度を有するマイクロキャリアビーズの個体群よりも長いｔwを示すであろう。このように、ｔwが短いほど、マイクロキャリアビーズの個体群の沈降速度がより均一であり、そのマイクロキャリアの個体群のサイズ分布がより均一である。上記は、ＯＤ変化の開始点と終点を決定できると仮定しているが、そのような開始点と終点は規定するのが難しいかもしれないことを理解すべきである。それゆえ、ＯＤ変化の勾配を使用して、マイクロキャリアの個体群における沈降速度の変動の大きさを表すことができる。
【０１２５】
実際には、沈降過程を断定するために、ビーズの全てが上清から完全に分離するのを待つことが好ましい。したがって、ＯＤの完全な低下を観察するための、ここではｔにより表される時間は、最終的な沈降時間を推定するのにより適している。最終的な沈降時間は、マイクロキャリアの個体群の平均沈降時間およびマイクロキャリアの個体群の沈降時間の変動の両方を使用して決定してもよい。定量的測定のために、最終的な沈降時間は、ｔmおよびｔwを使用して、またはＯＤ変化の勾配を使用して、決定してよい。
【０１２６】
本実験において、３種類の市販のマイクロキャリアを再水和させ、ＤＰＢＳ溶液中に懸濁させた。実験１に記載されたように、３つの異なるサイズ（２５０μｍ、３５０μｍ、および４５０μｍ）を有する溶けるマイクロキャリア（ＤＭＣ）を形成した。各キュベット中に約０．５ｍｌの充填マイクロキャリアを加えた。次に、ＤＰＢＳを、３．５ｍｌの総体積までキュベット中に充填した。測定の直前に、マイクロキャリアを、１０回上下にピペットで移動させることによって懸濁させた。ＯＤは、上述した方法にしたがって測定し、４００ｎｍの波長で測定した。同様に、他の可視波長を選択しても差し支えない。ＯＤ測定は、２．０秒毎に行った。様々な種類のマイクロキャリアが、異なる光学指数を有する異なる材料から形成され、サイズが異なり、異なる光学的透明度を有するので、異なる試料を比較できるように、各試料の測定値を正規化するために、初期ＯＤを使用した。
【０１２７】
沈降速度の測定結果が、図１７に示されている。３つのサイズのＤＭＣを３種類の市販のマイクロキャリアと比べた。その結果は、直径３５０μｍのＤＭＣが、２５０μｍのＤＭＣの２倍速く沈降し、直径４５０μｍのＤＭＣが、２５０μｍのＤＭＣの３倍速く沈降することを示した。ＤＭＣのサイズを変えることにより、沈降速度は、異なる材料から製造された、密度が異なる３種類の市販のビーズの中間の沈降速度に一致させることができた。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」−１および「ＳｏｌｏＨｉｌｌ」Ｐ１０２−１５２１マイクロキャリアと比べた場合、２５０μｍおよび３５０μｍのサイズを有するＤＭＣは、匹敵する中間沈降速度を示したが、ずっと短いｔwおよびずっと急勾配のＯＤ変化を示した。実施例２１により詳しく論じられるように、より短いｔwおよびより急勾配のＯＤ変化は、市販のマイクロキャリアと比べて、より一貫した沈降速度を与える、市販のマイクロキャリアよりも小さいサイズ分布の結果である。沈降時間ｔを比べると、２５０μｍおよび３５０μｍのサイズを有するＤＭＣは、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」−１および「ＳｏｌｏＨｉｌｌ」Ｐ１０２−１５２１マイクロキャリアよりも早く沈降し、これは、ＤＭＣが、市販のマイクロキャリアと比べて、沈降を完了するまでずっと短い時間しか必要としないことを示唆している。
【０１２８】
実施例２１．マイクロキャリアのサイズ分布および曲率半径の分析
実施例２０における２５０μｍの目標サイズを有するマイクロキャリアにしたがって形成された溶けるマイクロキャリア（ＤＭＣ）のサイズ分布および曲率半径を、３種類の市販のマイクロキャリア：「Ｃｙｔｏｄｅｘ」−１、「ＳｏｌｏＨｉｌｌ」Ｐ１０２−１５２１、および「Ｃｙｔｏｄｅｘ」−３（ペンシルベニア州、ピッツバーグ所在のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている架橋デキストラン系マイクロキャリア）と比べた。公知の光学顕微鏡技術および光学顕微鏡により捕捉された画像を分析するためのソフトウェアを使用して、マイクロキャリアのサイズを決定した。次に、式（３）：
【０１２９】
【数３】
2018520662.tif 000006
【０１３０】
を使用して、決定したマイクロキャリアのサイズから曲率半径を計算した。式中、Ｋはマイクロキャリアの曲率半径であり、Ｒはマイクロキャリアの半径である。各種類のマイクロキャリアについて、表ＩＩは、サイズ範囲ｄ５−ｄ９５（ｄ５はマイクロキャリアの個体数の５％の直径より大きいマイクロキャリアの直径であり、ｄ９５はマイクロキャリアの個体数の９５％の直径より大きいマイクロキャリアの直径である）、サイズ範囲ｄ１０−ｄ９０（ｄ１０はマイクロキャリアの個体数の１０％の直径より大きいマイクロキャリアの直径であり、ｄ９０はマイクロキャリアの個体数の９０％の直径より大きいマイクロキャリアの直径である）、サイズ分布Δｄ５−ｄ９５（ｄ９５とｄ５の間の差）、ｄ５−ｄ９５の変動係数、サイズ分布Δｄ１０−ｄ９０（ｄ９０とｄ１０の間の差）、およびｄ１０−ｄ９０の変動係数を示す。
【０１３１】
【表２】
2018520662.tif 000007
【０１３２】
各種類のマイクロキャリアについて、表ＩＩＩは、マイクロキャリアの平均直径（ｄ）、平均曲率半径（Ｋ）、ｄ５での曲率半径、ｄ９５での曲率半径、およびｄ５からｄ９５の曲率半径の分布（ｄ５の曲率半径とｄ９５の曲率半径との間の差）を示す。
【０１３３】
【表３】
2018520662.tif 000008
【０１３４】
表ＩＩおよびＩＩＩのデータは、ここに開示されたＤＭＣが、３種類の市販のマイクロキャリアよりも、より均一なサイズ分布およびより均一な曲率半径を有することを示す。先に述べたように、均一なサイズ分布により、一貫した速度でのビーズの沈降が可能であり、これにより、培地交換または培養産物の単離中に上清からのマイクロキャリアの分離がより予測可能になる。均一なサイズ分布および均一な曲率半径は、マイクロキャリア当たりの細胞を播種するのに利用できる同じ表面積も与え、これにより、細胞が、同じ時間、または同様の時間で、コンフルエンスに到達することができる。
【０１３５】
実施例２２．マイクロキャリア粒子の計数分析
実施例２０に記載されたマイクロキャリアにしたがって形成された溶けるマイクロキャリア（ＤＭＣ）から得られた破片粒子数を、２種類の市販のマイクロキャリア：「ＳｏｌｏＨｉｌｌ」Ｐ１０２−１５２１および「Ｃｙｔｏｄｅｘ」−３と比べた。粒子の数をｍｌ当たり２未満の粒子まで減少させるために、撹拌前に、各種類のマイクロキャリアの多段階洗浄を行った。各種類のマイクロキャリアについて、約１０００ｃｍ2の体積のマイクロキャリアを別々のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）１２５ｍＬの使い捨てスピナーフラスコ（ニューヨーク州、コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．から市販されている）に入れ、約１００ｍＬのダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中に懸濁させた。２つの使い捨てスピナーフラスコにＤＭＣを充填した。マイクロキャリアを、合計で６日間に亘り室温で約６０ｒｐｍの速度で連続的に撹拌した。使い捨てスピナーフラスコの内の一方のＤＭＣを、ここに記載された方法にしたがって溶かし、使い捨てスピナーフラスコの内の他方のＤＭＣは溶かさなかった。撹拌を完了した後、マイクロキャリアをＤＰＢＳから分離し、ＤＰＢＳ中の粒子数を、「Particulate Matter in Injections」と題する米国薬局方および国民医薬品集セクション７８８（ＵＳＰ＜７８８＞）に記載されているような光オブスキュレーション粒子計数試験を使用して、ＨＩＡＣ９７０３＋Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（インディアナ州、インディアナポリス所在のＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている）により測定した。ＵＳＰ＜７８８＞に示されるように、試験したユニット内に存在する粒子の平均数が、１０μｍ以上の粒子でｍＬ当たり２５を超えず、２５μｍ以上の粒子でｍＬ当たり３を超えない場合、調製品は試験に準拠する。表ＩＶは、溶かさないＤＭＣおよび溶かしたＤＭＣを含む、マイクロキャリアの各々に関するＤＰＢＳのｍＬ当たり２５μｍ以上のサイズを有する残留粒子の数を示す。表Ｖは、溶かさないＤＭＣおよび溶かしたＤＭＣを含む、マイクロキャリアの各々に関するＤＰＢＳのｍＬ当たり１０μｍ以上のサイズを有する粒子の残留数を示す。
【０１３６】
【表４】
2018520662.tif 000009
【０１３７】
【表５】
2018520662.tif 000010
【０１３８】
表ＩＶおよびＶに示されるように、ＤＭＣが溶けたものと溶けなかったものの両方で、他の２種類の市販のマイクロキャリアを撹拌した後に残留したよりも、使い捨てスピナーフラスコ内で撹拌した後により少ないＤＭＣ粒子が残留した。このことは、１０μｍ超のサイズを有する粒子、および２５μｍ超のサイズを有する粒子にとっても当てはまる。
【０１３９】
比較例１
ＰＧＡマイクロキャリアの代わりに、非消化性「Ｃｙｔｏｄｅｘ」−３基体を使用したことを除いて、Ｖｅｒｏ細胞の培養を実施例１１に記載されたように繰り返した。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」−３ビーズの表面から細胞を分離するために、トリプシンが必要であった。増殖倍率データが図７に示されている。可消化マイクロキャリアにより得られた増殖は、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」−３上での増殖に匹敵する。
【０１４０】
比較例２
ＰＧＡマイクロキャリアの代わりに、非消化性「Ｃｙｔｏｄｅｘ」−３基体を使用したことを除いて、ＭＲＣ５細胞の培養を実施例１２に記載されたように繰り返した。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」ビーズの表面から細胞を分離するために、トリプシンが必要であった。増殖倍率データが図８に示されている。可消化マイクロキャリアにより得られた増殖は、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」−３上での増殖に匹敵する。
【０１４１】
比較例３
図１２は、国際公開第２０１４／２０９８６５号の実施例１にしたがう内部ゲル化により形成されたビーズの位相差顕微鏡画像である。このビーズの平均直径は２３１±５４μｍであり、これは、２３％の変動係数（ＣＶ）に相当する。
【０１４２】
開示された方法は、望ましくない含有物および表面欠陥がなく、タンパク質分解によらない細胞の分離と採取を支援する、透明性の高いＰＧＡマイクロキャリアを調製するための安価かつ環境にやさしい経路を提供する。
【０１４３】
本開示の態様（１）によれば、細胞培養物品が提供される。その細胞培養物品は、ペクチン酸またはその塩および１から４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸またはその塩の少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物から作られた基体を含み、そのポリガラクツロン酸化合物は二価陽イオンと架橋しており、その二価陽イオンの濃度はその基体の０．５から２ｇ／ｌに及ぶ。
【０１４４】
本開示の別の態様（２）によれば、前記基体が球状または実質的に球状である、態様（１）による物品が提供される。
【０１４５】
本開示の別の態様（３）によれば、前記基体の直径が１０から５００マイクロメートルである、態様（２）による物品が提供される。
【０１４６】
本開示の別の態様（４）によれば、複数の前記細胞培養物品の変動係数が２０％未満である、態様（１）〜（３）のいずれかによる物品が提供される。
【０１４７】
本開示の別の態様（５）によれば、複数の前記細胞培養物品の変動係数が１０％未満である、態様（１）〜（４）のいずれかによる物品が提供される。
【０１４８】
本開示の別の態様（６）によれば、複数の前記細胞培養物品のサイズ分布Δｄ５−ｄ９５が２５マイクロメートル未満であり、ｄ５は前記複数の細胞培養物品の５％の直径より大きい直径であり、ｄ９５は該複数の細胞培養物品の９５％の直径より大きい直径であり、Δｄ５−ｄ９５はｄ９５とｄ５の間の差である、態様（２）〜（５）のいずれかによる物品が提供される。
【０１４９】
本開示の別の態様（７）によれば、複数の前記細胞培養物品のサイズ分布Δｄ１０−ｄ９０が２０マイクロメートル未満であり、ｄ１０は前記複数の細胞培養物品の１０％の直径より大きい直径であり、ｄ９０は該複数の細胞培養物品の９０％の直径より大きい直径であり、Δｄ１０−ｄ９０はｄ９０とｄ１０の間の差である、態様（２）〜（６）のいずれかによる物品が提供される。
【０１５０】
本開示の別の態様（８）によれば、複数の前記細胞培養物品の曲率半径の分布ΔＫd5−Ｋd95が１０ｃｍ-1未満であり、Ｋd5は、前記複数の細胞培養物品の５％の直径より大きい直径を有する細胞培養物品の曲率半径であり、Ｋd95は、前記複数の細胞培養物品の９５％の直径より大きい直径を有する細胞培養物品の曲率半径であり、ΔＫd5−Ｋd95はＫd5とＫd95の間の差である、態様（２）〜（７）のいずれかによる物品が提供される。
【０１５１】
本開示の別の態様（９）によれば、前記二価陽イオンが、カルシウム、マグネシウムおよびバリウムからなる群より選択される、態様（１）〜（８）のいずれかによる物品が提供される。
【０１５２】
本開示の別の態様（１０）によれば、前記基体の表面上に接着高分子をさらに含む、態様（１）〜（９）のいずれかによる物品が提供される。
【０１５３】
本開示の別の態様（１１）によれば、前記接着高分子がポリペプチドを含む、態様（１０）による物品が提供される。
【０１５４】
本開示の別の態様（１２）によれば、前記接着高分子が前記基体の表面にグラフト化されている、または表面上に被覆されている、態様（１０）または（１１）による物品が提供される。
【０１５５】
本開示の別の態様（１３）によれば、前記基体のサイズが制御されている、態様（１）〜（１２）のいずれかによる物品が提供される。
【０１５６】
本開示の別の態様（１４）によれば、細胞培養物品を製造する方法が提供される。その方法は、ゲル化浴中に親水コロイド溶液を分配する工程を有してなり、前記親水コロイド溶液は、ペクチン酸またはその塩および１から４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸またはその塩の少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物を含み、前記ゲル化浴は二価金属塩を含む。
【０１５７】
本開示の別の態様（１５）によれば、前記二価金属が、カルシウム、マグネシウムおよびバリウムからなる群より選択される、態様（１４）の方法が提供される。
【０１５８】
本開示の別の態様（１６）によれば、前記親水コロイド溶液が前記ゲル化浴中に滴下される、態様（１４）または（１５）の方法が提供される。
【０１５９】
本開示の別の態様（１７）によれば、前記親水コロイド溶液を前記ゲル化浴中に分配する工程が、注射器による押出しを含む、態様（１４）〜（１６）のいずれかの方法が提供される。
【０１６０】
本開示の別の態様（１８）によれば、前記親水コロイド溶液が０．５から５質量％のポリガラクツロン酸を含む、態様（１４）〜（１７）のいずれかの方法が提供される。
【０１６１】
本開示の別の態様（１９）によれば、前記ゲル化浴が１から２０％（ｗ／ｖ）の二価金属塩を含む、態様（１４）〜（１８）のいずれかの方法が提供される。
【０１６２】
本開示の別の態様（２０）によれば、前記ゲル化浴がアルコールをさらに含む、態様（１４）〜（１９）のいずれかの方法が提供される。
【０１６３】
本開示の別の態様（２１）によれば、前記細胞培養物品をペプチド含有溶液中に懸濁させる工程をさらに含む、態様（１４）〜（２０）のいずれかの方法が提供される。
【０１６４】
本開示の別の態様（２２）によれば、細胞を培養する方法が提供される。その方法は、細胞を、態様（１）〜（１３）のいずれかによる細胞培養物品を有する細胞培養培地と接触させる工程、および該細胞を該培地中で培養する工程を有してなる。
【０１６５】
本開示の別の態様（２３）によれば、培養した細胞を採取する方法が提供される。その方法は、態様（１）〜（１３）のいずれかによる細胞培養物品の表面上で細胞を培養する工程、および培養した細胞を、ペクチナーゼおよびキレート剤の混合物と接触させて、前記細胞培養物品から前記細胞を分離する工程を有してなる。
【０１６６】
本開示の別の態様（２４）によれば、前記キレート剤がＥＤＴＡを含む、態様（２３）の方法が提供される。
【０１６７】
本開示の別の態様（２５）によれば、培養した細胞を、ペクチナーゼおよびキレート剤の混合物と接触させて、前記細胞培養物品から前記細胞を分離する工程が、プロテアーゼを使用しない、態様（２３）または（２４）の方法が提供される。
【０１６８】
ここに用いたように、名詞は、文脈がそうではないと明白に示さない限り、複数の対象を指す。それゆえ、例えば、「二価陽イオン」への言及は、文脈がそうではないと明白に示さない限り、そのような「二価陽イオン」を２つ以上有する例を含む。
【０１６９】
「含む」という用語は、包含するが、それに限定されないこと、すなわち、包括的であって、排他的ではないことを意味する。
【０１７０】
「随意的な」または「必要に応じて」は、続いて記載された事象、環境、または構成要素が生じ得るまたは生じ得ないことを意味し、その記載は、その事象、環境、または構成要素が生じる例、および生じない例を含むことを意味する。
【０１７１】
範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、とここに表すことができる。そのような範囲が表された場合、例は、そのある特定の値から、および／または他方の特定値までを含む。同様に、値が、「約」という先行詞を使用して、近似として表されている場合、特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。範囲の各々の端点は、他の端点に関連してと、他の端点とは関係なくの両方で有意であることがさらに理解されよう。
【０１７２】
特に明記のない限り、ここに述べられたどの方法も、その工程が特定の順序で行われることを必要とすると解釈されることは決して意図されていない。したがって、方法の請求項が、その工程がしたがうべき順序を実際に列挙していない場合、またはそうではなく、その工程が特定の順序に限定されることが請求項または説明に明白に述べられていない場合、どの特定の順序も暗示されることは決して意図されていない。いずれか１つの請求項におけるどの列挙された１つまたは多数の特徴または態様も、どの他の請求項におけるどの他の列挙された特徴または態様と組み合わせても、または置換しても差し支えない。
【０１７３】
ここでの列挙は、特定の様式で機能するように「構成されている」または「適合されている」構成要素を称することも留意されたい。この点に関して、そのような構成要素は、特定の性質を具体化する、または特定の様式で機能するように、「構成されており」または「適合されており」、ここでそのような列挙は、目的とする使用の列挙とは対照的に、構造的列挙である。より詳しくは、ある構成要素が「構成されている」または「適合されている」様式へのここでの言及は、その構成要素の既存の物理的条件を示し、それゆえ、その構成要素の構造的特徴の明白な列挙と解釈すべきである。
【０１７４】
特定の実施の形態の様々な特徴、要素または工程が、「含む」という移行句を使用して開示されることがあるが、「からなる」、または「から実質的になる」という移行句を使用して記載されることがある実施の形態を含む代わりの実施の形態が暗示されることを理解すべきである。それゆえ、例えば、ペクチン酸および水を含む親水コロイド溶液に対して暗示される代わりの実施の形態は、親水コロイド溶液がペクチン酸および水からなる実施の形態、および親水コロイド溶液がペクチン酸および水から実質的になる実施の形態を含む。
【０１７５】
本開示の精神および範囲から逸脱せずに、本発明の技術に様々な改変および変更を行えることが当業者に明白であろう。本発明の技術の精神および実体を含む開示された実施の形態の改変、組合せ、下位の組合せおよび変更が、当業者に想起されるであろうから、本発明の技術は、付随の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の全てを含むと考えるべきである。
【０１７６】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【０１７７】
実施形態１
細胞培養物品であって、
ペクチン酸またはその塩、および
１から４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸またはその塩、
の少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物から作られた基体、
を含み、
前記ポリガラクツロン酸化合物は二価陽イオンと架橋しており、該二価陽イオンの濃度は前記基体の０．５から２ｇ／ｌに及ぶ、細胞培養物品。
【０１７８】
実施形態２
前記基体が球状または実質的に球状である、実施形態１に記載の物品。
【０１７９】
実施形態３
前記基体の直径が１０から５００マイクロメートルである、実施形態２に記載の物品。
【０１８０】
実施形態４
複数の前記細胞培養物品の変動係数が２０％未満である、実施形態１から３いずれか１つに記載の物品。
【０１８１】
実施形態５
複数の前記細胞培養物品の変動係数が１０％未満である、実施形態１から４いずれか１つに記載の物品。
【０１８２】
実施形態６
複数の前記細胞培養物品のサイズ分布Δｄ５−ｄ９５が２５マイクロメートル未満であり、ｄ５は前記複数の細胞培養物品の５％の直径より大きい直径であり、ｄ９５は該複数の細胞培養物品の９５％の直径より大きい直径であり、Δｄ５−ｄ９５はｄ９５とｄ５の間の差である、実施形態２から５いずれか１つに記載の物品。
【０１８３】
実施形態７
複数の前記細胞培養物品のサイズ分布Δｄ１０−ｄ９０が２０マイクロメートル未満であり、ｄ１０は前記複数の細胞培養物品の１０％の直径より大きい直径であり、ｄ９０は該複数の細胞培養物品の９０％の直径より大きい直径であり、Δｄ１０−ｄ９０はｄ９０とｄ１０の間の差である、実施形態２から６いずれか１つに記載の物品。
【０１８４】
実施形態８
複数の前記細胞培養物品の曲率半径の分布ΔＫd5−Ｋd95が１０ｃｍ-1未満であり、Ｋd5は、前記複数の細胞培養物品の５％の直径より大きい直径を有する細胞培養物品の曲率半径であり、Ｋd95は、前記複数の細胞培養物品の９５％の直径より大きい直径を有する細胞培養物品の曲率半径であり、ΔＫd5−Ｋd95はＫd5とＫd95の間の差である、実施形態２から７いずれか１つに記載の物品。
【０１８５】
実施形態９
前記二価陽イオンが、カルシウム、マグネシウムおよびバリウムからなる群より選択される、実施形態１から８いずれか１つに記載の物品。
【０１８６】
実施形態１０
前記基体の表面上に接着高分子をさらに含む、実施形態１から９いずれか１つに記載の物品。
【０１８７】
実施形態１１
前記接着高分子がポリペプチドを含む、実施形態１０に記載の物品。
【０１８８】
実施形態１２
前記接着高分子が前記基体の表面にグラフト化されている、または表面上に被覆されている、実施形態１０または１１に記載の物品。
【０１８９】
実施形態１３
前記基体のサイズが制御されている、実施形態１から１２いずれか１つに記載の物品。
【０１９０】
実施形態１４
細胞培養物品を製造する方法において、
ゲル化浴中に親水コロイド溶液を分配する工程、
を有してなり、
前記親水コロイド溶液は、
ペクチン酸またはその塩、および
１から４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸またはその塩、
の少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物を含み、
前記ゲル化浴は二価金属塩を含む、方法。
【０１９１】
実施形態１５
前記二価金属が、カルシウム、マグネシウムおよびバリウムからなる群より選択される、実施形態１４に記載の方法。
【０１９２】
実施形態１６
前記親水コロイド溶液が前記ゲル化浴中に滴下される、実施形態１４または１５に記載の方法。
【０１９３】
実施形態１７
前記親水コロイド溶液を前記ゲル化浴中に分配する工程が、注射器による押出しを含む、実施形態１４から１６いずれか１つに記載の方法。
【０１９４】
実施形態１８
前記親水コロイド溶液が０．５から５質量％のポリガラクツロン酸を含む、実施形態１４から１７いずれか１つに記載の方法。
【０１９５】
実施形態１９
前記ゲル化浴が１から２０％（ｗ／ｖ）の二価金属塩を含む、実施形態１４から１８いずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
実施形態２０
前記ゲル化浴がアルコールをさらに含む、実施形態１４から１９いずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
実施形態２１
前記細胞培養物品をペプチド含有溶液中に懸濁させる工程をさらに含む、実施形態１４から２０いずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
実施形態２２
細胞を培養する方法において、
細胞を、実施形態１から１３いずれか１つに記載の細胞培養物品を有する細胞培養培地と接触させる工程、および該細胞を該培地中で培養する工程を有してなる方法。
【０１９９】
実施形態２３
培養した細胞を採取する方法であって、
実施形態１から１３いずれか１つに記載の細胞培養物品の表面上で細胞を培養する工程、および
培養した細胞を、ペクチナーゼおよびキレート剤の混合物と接触させて、前記細胞培養物品から前記細胞を分離する工程、
を有してなる方法。
【０２００】
実施形態２４
前記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態２３に記載の方法。
【０２０１】
実施形態２５
培養した細胞を、ペクチナーゼおよびキレート剤の混合物と接触させて、前記細胞培養物品から前記細胞を分離する工程が、プロテアーゼを使用しない、実施形態２３または２４に記載の方法。
【符号の説明】
【０２０２】
１００    マイクロキャリアビーズ
【図１Ａ】
2018520662.tif 000011
【図１Ｂ】
2018520662.tif 000012
【図１Ｃ】
2018520662.tif 000013
【図２】
2018520662.tif 000014
【図３】
2018520662.tif 000015
【図４】
2018520662.tif 000016
【図５】
2018520662.tif 000017
【図６Ａ】
2018520662.tif 000018
【図６Ｂ】
2018520662.tif 000019
【図７】
2018520662.tif 000020
【図８】
2018520662.tif 000021
【図９】
2018520662.tif 000022
【図１０】
2018520662.tif 000023
【図１１】
2018520662.tif 000024
【図１２】
2018520662.tif 000025
【図１３】
2018520662.tif 000026
【図１４Ａ】
2018520662.tif 000027
【図１４Ｂ】
2018520662.tif 000028
【図１４Ｃ】
2018520662.tif 000029
【図１４Ｄ】
2018520662.tif 000030
【図１４Ｅ】
2018520662.tif 000031
【図１４Ｆ】
2018520662.tif 000032
【図１５】
2018520662.tif 000033
【図１６】
2018520662.tif 000034
【図１７】
2018520662.tif 000035
【国際調査報告】
2018520662.tif 000036
2018520662.tif 000037