(57)【要約】本開示は、フィロウイルス免疫原で過免疫されたウマ由来の免疫グロブリンを含む組成物を提供する。本開示は、かかる組成物の作製方法、及び例えば、エボラウイルス感染を治療するためのかかる組成物の使用方法を更に提供する。フィロウイルスによって生じる疾患のための、有効かつ経済的な治療に対する必要性がなお存在する。本開示は、エボラ出血熱などフィロウイルス媒介疾患に対する効果的な防御を提供できる、ＥＢＯＶ又はＭＡＲＶ  ＧＰの防御エピトープに対する高力価の抗体を含むウマ免疫グロブリンを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィロウイルス糖タンパク質で過免疫されたウマ由来のポリクローナル免疫グロブリンを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記免疫グロブリンが、前記フィロウイルス糖タンパク質で過免疫された前記ウマの血清又は血漿から精製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記精製免疫グロブリンが、ＩｇＧ又はそのフラグメントである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、又はそれ以上の前記精製ＩｇＧが前記フィロウイルス糖タンパク質と結合する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記精製免疫グロブリンが、フィロウイルスに感染した被検体の症状を予防できるか、最小限に抑えることができる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記フィロウイルスが、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、スーダンウイルス（ＳＵＤＶ）、ブンディブギョウイルス（ＢＤＢＶ）、タイフォレストウイルス（ＴＡＦＶ）、レストンウイルス（ＲＥＳＴＶ）、又はマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ウマが、ムチン様ドメインを欠失したフィロウイルススパイク糖タンパク質で免疫される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記スパイク糖タンパク質の膜貫通ドメインが欠失している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記スパイク糖タンパク質が、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、ＲＥＳＴＶ由来のＧＰ１サブユニット若しくはそのフラグメント、又はこれらのＧＰ１サブユニットの組み合わせを含む、請求項７又は請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記スパイク糖タンパク質が、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、ＲＥＳＴＶ由来のＧＰ１サブユニット若しくはそのフラグメント及びＧＰ２サブユニット若しくはそのフラグメント、又はこれらのＧＰ１及びＧＰ２サブユニットの組み合わせを含む、請求項７又は請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記スパイク糖タンパク質が、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ウマが、０日目、２１日目、４２日目、及び６３日目に前記スパイク糖タンパク質で免疫される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリクローナル免疫グロブリンが、９０日目に、血漿交換によって血漿として回収される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫原がＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭを含み、前記回収血漿は、ＥＬＩＳＡで測定したとき、少なくとも１０２、少なくとも５×１０２、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、又は少なくとも５×１０５の、ＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ結合に対するＥＣ５０値を有する、請求項１２又は請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記免疫原がＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭを含み、前記精製ＩｇＧが、ＥＬＩＳＡで測定したとき、３μｇ／ｍｌ未満、２．５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１．５μｇ／ｍｌ未満、又は１μｇ／ｍｌ未満、又は０．５μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭに結合する、請求項１３又は請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
フィロウイルスへの致死的曝露に続いて、マウスに約１００ｍｇ／ｋｇの用量を２回投与することによって、前記致死的曝露に対して前記マウスを防御できる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ウマがプライム−ブーストレジメンで免疫される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記プライム−ブーストレジメンが、フィロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）でプライミング゛することと、前記スパイク糖タンパク質でブーストすることと、を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＶＬＰが、フィロウイルス糖タンパク質と、フィロウイルスＶＰ４０と、を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＶＬＰが、前記フィロウイルス核タンパク質（ＮＰ）を更に含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記プライム用量が、０日目及び２１日目に投与され、前記ブースト用量が４２日目及び６３日目に投与される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ポリクローナル免疫グロブリンが、９０日目に、血漿交換によって血漿として回収される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記プライミング免疫原が、ＧＰ、ＶＰ４０、及びＮＰを含むＥＢＯＶ  ＶＬＰを含み、前記ブースト免疫が、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃを含み、前記回収血漿が、ＥＬＩＳＡで測定したとき、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、又は少なくとも５×１０５の、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ結合に対するＥＣ５０値を有する、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記プライミング免疫原が、ＧＰ、ＶＰ４０、及びＮＰを含むＥＢＯＶ  ＶＬＰを含み、前記ブースト免疫原が、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃを含み、前記精製ＩｇＧが、ＥＬＩＳＡで測定したとき、１μｇ／ｍｌ未満、０．９μｇ／ｍｌ未満、０．８μｇ／ｍｌ未満、０．７μｇ／ｍｌ未満、０．６μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．４μｇ／ｍｌ未満、０．３μｇ／ｍｌ未満、０．２μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、又は０．０９μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ又はＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃに結合する、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
フィロウイルスへの致死的曝露に続いて、マウスに約１００ｍｇ／ｋｇの用量を２回投与することによって、前記致死的曝露に対して前記マウスを防御できる、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法であって、
（ａ）フィロウイルスの防御抗原に対してウマを過免疫するのに十分な量の前記フィロウイルス免疫原を前記ウマに投与することであって、前記免疫原がフィロウイルススパイク糖タンパク質を含む、ことと、
（ｂ）前記ウマから免疫グロブリンを回収することと、を含む、方法。
【請求項２７】
前記免疫グロブリンが血漿として回収される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウマから回収した前記免疫グロブリンを精製することを更に含む、請求項２６又は請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記精製免疫グロブリンが、ＩｇＧ又はそのフラグメントを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
被検体におけるフィロウイルス媒介疾患を予防する、治療する、又は管理する方法であって、治療を要する被検体に、フィロウイルス糖タンパク質で過免疫されたウマ由来のポリクローナル免疫グロブリンを投与することを含む、方法。
【請求項３１】
前記免疫グロブリンが、前記フィロウイルス糖タンパク質で過免疫された前記ウマの血清又は血漿から精製される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記精製免疫グロブリンが、ＩｇＧ又はそのフラグメントである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、又はそれ以上の前記精製ＩｇＧが前記フィロウイルス糖タンパク質と結合する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記精製免疫グロブリンが、フィロウイルスに感染した被検体の症状を予防できるか、最小限に抑えることができる、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記フィロウイルスが、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、又はＲＥＳＴＶである、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ウマが、ムチン様ドメインを欠失したフィロウイルススパイク糖タンパク質で免疫される、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記スパイク糖タンパク質の膜貫通ドメインが欠失している、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記スパイク糖タンパク質が、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、ＲＥＳＴＶ由来のＧＰ１サブユニット若しくはそのフラグメント、又はこれらのＧＰ１サブユニットの組み合わせを含む、請求項３６又は請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記スパイク糖タンパク質が、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、ＲＥＳＴＶ由来のＧＰ１サブユニット若しくはそのフラグメント及びＧＰ２サブユニット若しくはそのフラグメント、又はこれらのＧＰ１及びＧＰ２サブユニットの組み合わせを含む、請求項３６又は請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記スパイク糖タンパク質が、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ウマが、０日目、２１日目、４２日目、及び６３日目に前記スパイク糖タンパク質で免疫される、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリクローナル免疫グロブリンが、９０日目に、血漿交換によって血漿として回収される、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫原がＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭを含み、前記回収血漿が、ＥＬＩＳＡで測定したとき、少なくとも１０２、少なくとも５×１０２、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、又は少なくとも５×１０５の、ＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ結合に対するＥＣ５０値を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫原がＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭを含み、前記精製ＩｇＧが、ＥＬＩＳＡで測定したとき、３μｇ／ｍｌ未満、２．５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１．５μｇ／ｍｌ未満、又は１μｇ／ｍｌ未満、又は０．５μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭに結合する、請求項４２又は請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
フィロウイルスへの致死的曝露に続いて、マウスに約１００ｍｇ／ｋｇの用量を２回投与することによって、前記致死的曝露に対して前記マウスを防御できる、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウマがプライム−ブーストレジメンで免疫される、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記プライム−ブーストレジメンが、フィロウイルスＶＬＰでプライミング゛することと、前記スパイク糖タンパク質でブーストすることと、を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＶＬＰが、フィロウイルス糖タンパク質と、フィロウイルスＶＰ４０と、を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＶＬＰが、前記フィロウイルス核タンパク質（ＮＰ）を更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記プライム用量が、０日目及び２１日目に投与され、前記ブースト用量が４２日目及び６３日目に投与される、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリクローナル免疫グロブリンが、９０日目に、血漿交換によって血漿として回収される、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記プライミング免疫原が、ＧＰ、ＶＰ４０、及びＮＰを含むＥＢＯＶ  ＶＬＰを含み、前記ブースト免疫が、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃを含み、前記回収血漿が、ＥＬＩＳＡで測定したとき、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、又は少なくとも５×１０５の、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ結合に対するＥＣ５０値を有する、請求項５０又は請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記プライミング免疫原が、ＧＰ、ＶＰ４０、及びＮＰを含むＥＢＯＶ  ＶＬＰを含み、前記ブースト免疫原が、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃを含み、前記精製ＩｇＧが、ＥＬＩＳＡで測定したとき、１μｇ／ｍｌ未満、０．９μｇ／ｍｌ未満、０．８μｇ／ｍｌ未満、０．７μｇ／ｍｌ未満、０．６μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．４μｇ／ｍｌ未満、０．３μｇ／ｍｌ未満、０．２μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、又は０．０９μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ又はＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃに結合する、請求項５０又は請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
フィロウイルスへの致死的曝露に続いて、マウスに約１００ｍｇ／ｋｇの用量を２回投与することによって、前記致死的曝露に対して前記マウスを防御できる、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記フィロウイルス媒介疾患が、発熱、内出血、浮腫、臓器不全、頭痛、けん怠感、筋肉痛、悪心、嘔吐、針穿刺部位の出血、吐血、メレナ、点状出血、斑状出血、斑点状丘疹、播種性血管内凝固、ショック状態、黄疸、結膜炎、下痢、咽頭炎、痙攣、せん妄、昏睡、乏尿、及び鼻血からなる群から選択される１つ、又は２つ以上の症状を含む、請求項３０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記被検体がヒトである、請求項３０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年１月２８日出願の米国特許仮出願第６２／１０９，０４２号の優先権を主張するものであり、上記仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表の組み込み）
２０１６年１月２７に作成された「５７８８３＿１５２６３０＿ＰＣＴ  Ｓｅｑ  Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、電子申請により本明細書と共に提出され、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
フィロウイルス科エボラ（ＥＢＯＶ）及びマールブルグ（ＭＡＲＶ）は、ヒト及び非ヒト霊長類で最も病原性の強いウイルスのうちの２つであり（Ｆｅｌｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｌｅｎｋ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．４７：１（１９９６））、重篤な出血熱を引き起こす（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １：５６９（１９９７））。ヒトでの大発生を引き起こす主なフィロウイルス種は、ザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）及びスーダンウイルス（ＳＵＤＶ）、並びにヴィクトリア湖ＭＡＲＶ種である。エボラ又はマールブルグウイルスの感染に伴う死亡率は、最大９０％である（Ｆｅｌｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｌｅｎｋ，１９９６，上記を参照；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，上記を参照）。免疫学的及び薬学的治療手段の欠如は、マールブルグ及びエボラウイルスの公衆衛生の分類に課題をもたらす。
【０００４】
フィロウイルスは、エンベロープを有する、マイナス一本鎖ＲＮＡの繊維状ウイルスであり、７種類のタンパク質をコードする（このうち、スパイクエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）が主な防御抗原とみなされる）。フィロウイルス、例えば、ＥＢＯＶ又はＭＡＲＶ  ＧＰは、フーリンプロテアーゼによって、ジスルフィド結合で結合された２つのサブユニットＧＰ１（〜１４０ｋＤａ）及びＧＰ２（〜３８ｋＤａ）にタンパク質分解的に切断される（Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙ，Ｂ．，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７９：４７９３〜８０５（２００５））。３つのＧＰ１−ＧＰ２ユニットは、ウイルス表面に三量体ＧＰエンベロープスパイク（〜５５０ｋＤａ）を形成する（Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  ７：８１〜１００（１９９３）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８２：３５３〜６（１９９１）；Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｐ．Ｂ．Ｊａｈｒｌｉｎｇ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ３９：１２９〜５０（１９９５）；Ｋｉｌｅｙ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：１９５７〜６７（１９８８））。ＧＰ１は、細胞付着を媒介し（Ｋｉｌｅｙ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）；Ｋｕｈｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：１５９５１〜８（２００６））、配列内で可変であり、重グリコシル化されており、予測された二次構造をほとんど有さないか、全く有さないムチン様ドメインを含む（Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：６４４２〜７（１９９８））。
【０００５】
ＥＢＯＶの主要な防御抗原は、エンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）である（Ｍａｒｚｉ，Ａ．ａｎｄ  Ｈ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，２０１４．１３（４）：ｐ．５２１〜３１）。一連の最近のレポートは、ＧＰのみを標的とする抗体が、エボラ出血熱に対する有意な防御を提供できることを示している。
【０００６】
Ｄｙｅ  ｅｔ  ａｌは、マカク由来の精製された回復期ＩｇＧが曝露後４８時間までに投与されるとき、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）及びＥＢＯＶへの曝露に対して非ヒト霊長類（ＮＨＰ）を防御できることを示した（Ｄｙｅ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０１２）。Ｏｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌは、曝露後２４時間又は４８時間に投与された、ＧＰに対する３種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＭＢ−００３：６Ｄ８、１３Ｃ６、１３Ｆ６）の混合物で治療されたＮＨＰでのザイールＥＢＯＶ（ＺＥＢＯＶ）への曝露からの有意な防御を報告した（Ｏｌｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｇ．，Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０１２．１０９（４４）：ｐ．１８０３０〜５）。ＥＢＯＶに感染したアカゲザルでの症状出現後のＭＢ−００３の投与はまた、４３％の防御をもたらした（Ｐｅｔｔｉｔｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１３．５（１９９）：ｐ．１９９ｒａ１１３）。Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ｌａｂから出版された最近の結果は、異なる抗体の組み合わせ（ＺＭａｂ：１Ｈ３、２Ｇ４、４Ｇ７）は、曝露後２４時間又は４８後の時点で防御的であり（Ｑｉｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１２．４（１３８）：ｐ．１３８ｒａ８１）、これにより、少なくとも１０週間にわたって防御免疫応答が維持された（Ｑｉｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，２０１３．３：ｐ．３３６５）ことを示した。ＺＭａｂとアデノウイルスを発現したＩＦＮαとの組み合わせは、動物が症状を示した後に投与すると、マカクを防御した（Ｑｉｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１３．５（２０７）：ｐ．２０７ｒａ１４３）。最適な治療の組み合わせを最適化することを目的とする更なる研究では、ｍＡｂ  １３Ｃ６（ＭＢ−００３由来）と、２Ｇ４及び４Ｇ７（ＺＭａｂ由来）との組み合わせが、マカクでの曝露後５日までに完全な防御をもたらしたことが判明した（Ｑｉｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４．５１４（７５２０）：４７〜５３）。ＺＭａｐｐと名付けられたこの組み合わせはまた、最近の大発生でＥＢＯＶに感染した少なくとも７個体に与えられ、成功事例を示した。
【０００７】
ウイルス様タンパク質（ＶＬＰ）ワクチンは、３種類の主要フィロウイルスの配列に基づいて生成されている（Ｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９：３２（２０１２））。フィロウイルスＶＬＰの形成については、Ｂａｖａｒｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：５９３〜６０２（２００２）に記載されている。ＶＬＰは、２種類のウイルスタンパク質ＧＰ及びＶＰ４０（本明細書では、ダブルＶＬＰとする）の発現によって形成された。ダブルＶＬＰは、マウスで防御効能を発揮した（Ｗａｒｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１００：１５８８９〜９４（２００３））。ＶＬＰはまた、３種類のウイルスタンパク質ＧＰ、ＶＰ４０、及びＮＰでも産生でき、これにより、ＶＬＰの収率及び安定性が増加する（Ｋａｌｌｓｔｒｏｍ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２７（１）：１〜９（２００５））。
【０００８】
フィロウイルス出血熱に対する防御における抗体の役割Ｔ及びＢの両細胞応答がフィロウイルスに対する防御免疫応答において役割を果たすことが報告されているものの（Ｗａｒｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７５（２）：１１８４〜１１９１）、一連の最近のレポートでは、抗体のみが防御を提供できることを示している。Ｄｙｅ  ｅｔ  ａｌは、マカク由来の精製された回復期ＩｇＧが曝露後４８時間までに投与されるとき、ＭＡＲＶ及びＥＢＯＶの曝露に対して非ヒト霊長類（ＮＨＰ）を防御できることを示した（Ｄｙｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０９（１３）：５０３４〜９）。Ｏｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌは、曝露後２４時間又は４８時間に投与された、ＧＰに対する３種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の混合物で治療されたＮＨＰにおける、ＥＢＯＶへの曝露からの防御を報告した（Ｏｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０９（４４）：１８０３０〜１８０３５）。類似の結果が、他の２つの研究でも報告された（Ｑｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，５（２０７）：２０７ｒａ１４３；Ｑｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８７（１３）：７７５４〜７７５７）。総じて、これらのデータは、液性応答反応が、フィロウイルス感染の制御、緩和、低減、又は予防を実行できることを実証している。
【０００９】
ヒト治療で使用するためのウマ免疫グロブリン：ウマ血清又は血漿からの過免疫抗体の調製は、過去１世紀にわたって各種の感染症、中毒、又は毒物注入を患うヒトの治療に使用されている。ウマ由来の過免疫血漿及び／又は誘導体が使用されてきた、具体的な感染因子及び救急疾患には、ヘビによる毒物注入（Ｔｈｅａｋｓｔｏｎ，Ｒ．Ｄ．ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｗａｒｒｅｌｌ，Ｔｏｘｉｃｏｎ，１９９１．２９（１２）：ｐ．１４１９〜７０）、クモの咬傷（Ｄａｒｔ，Ｒ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ，２０１３．６１（４）：ｐ．４５８〜６７）、ボツリヌス中毒症（Ｆａｇａｎ，Ｒ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２０１１．５３（９）：ｐ．ｅ１２５−８；Ｈｉｌｌ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，２０１３．４７（２）：ｐ．ｅ１２）、狂犬病（Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００６．１９３（６）：ｐ．７９６〜８０１）、ジフテリア（Ｐｅｔｅｒ，Ｇ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１９９７．１００（１）：ｐ．１０９〜１１）、及び破傷風（Ｋａｂｕｒａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ，２００６．１１（７）：ｐ．１０７５〜８１）が挙げられる。加えて、ウマ由来の抗胸腺細胞グロブリン（Ａｔｇａｍ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ））が開発されており、厳しいガイドライン下で、同種移植の拒絶反応管理のために腎移植患者で、及び再生不良性貧血を患う患者で臨床的に用いられている（Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１４）。
過免疫ＩｇＧの供給源としてのウマは、ヒト治療で用いる抗体の高収率かつ低コストの抗体源を提供するという点で非常に有利である。従来、ウマ抗血清は、有害反応及び血清病を伴っていた。Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２成分を生成する、現在の処理技術により、全ＩｇＧを用いるウマ由来の過免疫抗体治療の使用に伴う複雑性が大幅に低減される。ウマ由来Ｆ（ａｂ’）２を含むサソリ抗毒素を含む最近の臨床治験では、免疫応答率は、最小限に精製した全ＩｇＧ製品を使用して歴史的に報告されてきた応答範囲よりも２桁以上低かった（Ｂｏｙｅｒ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ，２０１３．７６：ｐ．３８６〜９３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｌｅｎｋ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．４７：１（１９９６）
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １：５６９（１９９７
【非特許文献３】Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙ，Ｂ．，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７９：４７９３〜８０５（２００５）
【非特許文献４】Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  ７：８１〜１００（１９９３）
【非特許文献５】Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８２：３５３〜６（１９９１）
【非特許文献６】Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｐ．Ｂ．Ｊａｈｒｌｉｎｇ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ３９：１２９〜５０（１９９５）
【非特許文献７】Ｋｉｌｅｙ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：１９５７〜６７（１９８８）
【非特許文献８】Ｋｕｈｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：１５９５１〜８（２００６）
【非特許文献９】Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：６４４２〜７（１９９８）
【非特許文献１０】Ｍａｒｚｉ，Ａ．ａｎｄ  Ｈ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，２０１４．１３（４）：ｐ．５２１〜３１
【非特許文献１１】Ｄｙｅ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０１２
【非特許文献１２】Ｏｌｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｇ．，Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０１２．１０９（４４）：ｐ．１８０３０〜５
【非特許文献１３】Ｐｅｔｔｉｔｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１３．５（１９９）：ｐ．１９９ｒａ１１３
【非特許文献１４】Ｑｉｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１２．４（１３８）：ｐ．１３８ｒａ８１
【非特許文献１５】Ｑｉｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，２０１３．３：ｐ．３３６５
【非特許文献１６】Ｑｉｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１３．５（２０７）：ｐ．２０７ｒａ１４３
【非特許文献１７】Ｑｉｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４．５１４（７５２０）：４７〜５３
【非特許文献１８】Ｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９：３２（２０１２）
【非特許文献１９】Ｂａｖａｒｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：５９３〜６０２（２００２）
【非特許文献２０】Ｗａｒｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１００：１５８８９〜９４（２００３）
【非特許文献２１】Ｋａｌｌｓｔｒｏｍ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２７（１）：１〜９（２００５）
【非特許文献２２】Ｗａｒｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７５（２）：１１８４〜１１９１
【非特許文献２３】Ｄｙｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０９（１３）：５０３４〜９
【非特許文献２４】Ｏｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０９（４４）：１８０３０〜１８０３５
【非特許文献２５】Ｑｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８７（１３）：７７５４〜７７５７
【非特許文献２６】Ｔｈｅａｋｓｔｏｎ，Ｒ．Ｄ．ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｗａｒｒｅｌｌ，Ｔｏｘｉｃｏｎ，１９９１．２９（１２）：ｐ．１４１９〜７０
【非特許文献２７】Ｄａｒｔ，Ｒ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ，２０１３．６１（４）：ｐ．４５８〜６７
【非特許文献２８】Ｆａｇａｎ，Ｒ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２０１１．５３（９）：ｐ．ｅ１２５−８
【非特許文献２９】Ｈｉｌｌ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，２０１３．４７（２）：ｐ．ｅ１２
【非特許文献３０】Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００６．１９３（６）：ｐ．７９６〜８０１
【非特許文献３１】Ｐｅｔｅｒ，Ｇ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１９９７．１００（１）：ｐ．１０９〜１１
【非特許文献３２】Ｋａｂｕｒａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ，２００６．１１（７）：ｐ．１０７５〜８１
【非特許文献３３】Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１４
【非特許文献３４】Ｂｏｙｅｒ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ，２０１３．７６：ｐ．３８６〜９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
フィロウイルスによって生じる疾患のための、有効かつ経済的な治療に対する必要性がなお存在する。本開示は、エボラ出血熱などフィロウイルス媒介疾患に対する効果的な防御を提供できる、ＥＢＯＶ又はＭＡＲＶ  ＧＰの防御エピトープに対する高力価の抗体を含むウマ免疫グロブリンを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、フィロウイルス糖タンパク質で過免疫されたウマ由来のポリクローナル免疫グロブリンを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、フィロウイルス糖タンパク質で過免疫されたウマの血清又は血漿から精製される。特定の実施形態では、精製免疫グロブリンは、ＩｇＧ又はそのフラグメントである。特定の実施形態では、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、又はそれ以上の精製ＩｇＧがフィロウイルス糖タンパク質と結合する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、精製免疫グロブリンは、フィロウイルスに感染した被検体での症状を予防できるか、最小限に抑えることができる。特定の実施形態では、フィロウイルスは、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、スーダンウイルス（ＳＵＤＶ）、ブンディブギョウイルス（ＢＤＢＶ）、タイフォレストウイルス（ＴＡＦＶ）、レストンウイルス（ＲＥＳＴＶ）、又はマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ウマは、ムチン様ドメインを欠失したフィロウイルススパイク糖タンパク質で免疫される。いくつかの実施形態では、スパイク糖タンパク質の膜貫通ドメインが欠失している。特定の実施形態では、スパイク糖タンパク質は、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、ＲＥＳＴＶからのＧＰ１サブユニット若しくはそのフラグメント、又はこれらのＧＰ１サブユニットの組み合わせを含む。特定の実施形態では、スパイク糖タンパク質は、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、ＲＥＳＴＶからのＧＰ１サブユニット若しくはそのフラグメント及びＧＰ２サブユニット若しくはそのフラグメント、又はこれらのＧＰ１及びＧＰ２サブユニットの組み合わせを含む。特定の実施形態では、スパイク糖タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ウマは、０日目、２１日目、４２日目、及び６３日目にスパイク糖タンパク質で免疫される。いくつかの実施形態では、ポリクローナル免疫グロブリンは、９０日目に、血漿交換によって血漿として回収される。特定の実施形態では、この免疫原はＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭを含み、回収血漿は、ＥＬＩＳＡで測定したとき、少なくとも１０２、少なくとも５×１０２、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも（least）１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、又は少なくとも５×１０５の、ＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ結合に対するＥＣ５０値を有する。特定の実施形態では、この免疫原はＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭを含み、精製ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡで測定したとき、３μｇ／ｍｌ未満、２．５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１．５μｇ／ｍｌ未満、又は１μｇ／ｍｌ未満、又は０．５μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭに結合する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、フィロウイルスへの致死的曝露に続いて、約１００ｍｇ／ｋｇの用量をマウスに２回投与することにより、致死的曝露に対してマウスを防御することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ウマは、プライム−ブーストレジメンで免疫される。特定の実施形態では、プライム−ブーストレジメンは、フィロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）でプライミング゛することと、スパイク糖タンパク質でブーストすることと、を含む。特定の実施形態では、ＶＬＰは、フィロウイルス糖タンパク質と、フィロウイルスＶＰ４０と、を含む。特定の実施形態では、ＶＬＰは、フィロウイルス核タンパク質（ＮＰ）を更に含む。特定の実施形態では、プライム用量は０日目及び２１日目に投与され、ブースト用量は４２日目及び６３日目に投与される。特定の実施形態では、ポリクローナル免疫グロブリンは、９０日目に、血漿交換によって血漿として回収される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、プライミング免疫原は、ＧＰ、ＶＰ４０、及びＮＰを含むＥＢＯＶ  ＶＬＰを含み、ブースト免疫原は、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃを含み、回収血漿は、ＥＬＩＳＡで測定したとき、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、又は少なくとも５×１０５の、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ結合に対するＥＣ５０値を有する。いくつかの実施形態では、プライミング免疫原は、ＧＰ、ＶＰ４０、及びＮＰを含むＥＢＯＶ  ＶＬＰを含み、ブースト免疫原は、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃを含み、精製ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡで測定したとき、１μｇ／ｍｌ未満、０．９μｇ／ｍｌ未満、０．８μｇ／ｍｌ未満、０．７μｇ／ｍｌ未満、０．６μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．４μｇ／ｍｌ未満、０．３μｇ／ｍｌ未満、０．２μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、又は０．０９μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ又はＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃに結合する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、フィロウイルスへの致死的曝露に続いて、約１００ｍｇ／ｋｇの用量をマウスに２回投与することにより、致死的曝露に対してマウスを防御することができる。
【００２０】
本開示はまた、本明細書に開示するすべての組成物の調製方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、フィロウイルスの防御抗原に対してウマを過免疫するのに十分な量のフィロウイルス免疫原をウマに投与することと（この免疫原は、フィロウイルススパイク糖タンパク質を含む）、ウマから免疫グロブリンを回収することと、を含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、血漿として回収される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、この方法は、ウマから回収した免疫グロブリンを精製することを更に含む。特定の実施形態では、精製免疫グロブリンは、ＩｇＧ又はそのフラグメントを含む。
【００２２】
本開示はまた、被検体でのフィロウイルス媒介疾患の予防、治療、又は管理方法を提供し、この方法は、治療を要する被検体に、フィロウイルス糖タンパク質で過免疫されたウマ由来のポリクローナル免疫グロブリンを投与することを含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、フィロウイルス糖タンパク質で過免疫されたウマの血清又は血漿から精製される。特定の実施形態では、精製免疫グロブリンは、ＩｇＧ又はそのフラグメントである。特定の実施形態では、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、又はそれ以上の精製ＩｇＧがフィロウイルス糖タンパク質と結合する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、精製免疫グロブリンは、フィロウイルスに感染した被検体での症状を予防できるか、最小限に抑えることができる。特定の実施形態では、フィロウイルスは、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、又はＲＥＳＴＶである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ウマは、ムチン様ドメインを欠失したフィロウイルススパイク糖タンパク質で免疫される。特定の実施形態では、スパイク糖タンパク質の膜貫通ドメインが欠失している。特定の実施形態では、スパイク糖タンパク質は、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、ＲＥＳＴＶからのＧＰ１サブユニット若しくはそのフラグメント、又はこれらのＧＰ１サブユニットの組み合わせを含む。特定の実施形態では、スパイク糖タンパク質は、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、ＲＥＳＴＶからのＧＰ１サブユニット若しくはそのフラグメント及びＧＰ２サブユニット若しくはそのフラグメント、又はこれらのＧＰ１及びＧＰ２サブユニットの組み合わせを含む。特定の実施形態では、スパイク糖タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ウマは、０日目、２１日目、４２日目、及び６３日目にスパイク糖タンパク質で免疫される。特定の実施形態では、ポリクローナル免疫グロブリンは、９０日目に、血漿交換によって血漿として回収される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、この免疫原はＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭを含み、回収血漿は、ＥＬＩＳＡで測定したとき、少なくとも１０２、少なくとも５×１０２、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、又は少なくとも５×１０５の、ＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ結合に対するＥＣ５０値を有する。いくつかの実施形態では、この免疫原はＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭを含み、精製ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡで測定したとき、３μｇ／ｍｌ未満、２．５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１．５μｇ／ｍｌ未満、又は１μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭに結合する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、フィロウイルスへの致死的曝露に続いて、約１００ｍｇ／ｋｇの用量をマウスに２回投与することにより、致死的曝露に対してマウスを防御することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ウマは、プライム−ブーストレジメンで免疫される。特定の実施形態では、プライム−ブーストレジメンは、ＶＬＰでプライミング゛することと、スパイク糖タンパク質でブーストすることと、を含む。特定の実施形態では、ＶＬＰは、フィロウイルス糖タンパク質と、フィロウイルスＶＰ４０と、を含む。特定の実施形態では、ＶＬＰは、フィロウイルス核タンパク質（ＮＰ）を更に含む。特定の実施形態では、プライム用量は０日目及び２１日目に投与され、ブースト用量は４２日目及び６３日目に投与される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ポリクローナル免疫グロブリンは、９０日目に、血漿交換によって血漿として回収される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、プライミング免疫原は、ＧＰ、ＶＰ４０、及びＮＰを含むＥＢＯＶ  ＶＬＰを含み、ブースト免疫原は、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃを含み、回収血漿は、ＥＬＩＳＡで測定したとき、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、又は少なくとも５×１０５の、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ結合に対するＥＣ５０値を有する。いくつかの実施形態では、プライミング免疫原は、ＧＰ、ＶＰ４０、及びＮＰを含むＥＢＯＶ  ＶＬＰを含み、ブースト免疫原は、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃを含み、精製ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡで測定したとき、１μｇ／ｍｌ未満、０．９μｇ／ｍｌ未満、０．８μｇ／ｍｌ未満、０．７μｇ／ｍｌ未満、０．６μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．４μｇ／ｍｌ未満、０．３μｇ／ｍｌ未満、０．２μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、又は０．０９μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ又はＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃに結合する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、フィロウイルスへの致死的曝露に続いて、約１００ｍｇ／ｋｇの用量をマウスに２回投与することにより、致死的曝露に対してマウスを防御することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、フィロウイルス媒介疾患は、発熱、内出血、浮腫、臓器不全、頭痛、けん怠感、筋肉痛、悪心、嘔吐、針穿刺部位の出血、吐血、メレナ、点状出血、斑状出血、斑点状丘疹、播種性血管内凝固、ショック状態、黄疸、結膜炎、下痢、咽頭炎、痙攣、せん妄、昏睡、乏尿（oligura）、及び鼻血からなる群から選択される１つ、又は２つ以上の症状を含む。特定の実施形態では、被検体はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】フィロウイルス糖タンパク質のドメイン構造である。略語ＳＰはシグナルペプチドを指し、ＴＭは膜貫通ドメインを指す。
【図２】フィロウイルスＧＰ−ΔＭｕｃ構築物の概略図である。
【図３】Ａ〜Ｂは、精製ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ及びＧＰ−ΔＭｕｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）及びウエスタンブロット（Ｂ）である。還元レーンでは、上バンドはＧＰｎｕｌｌ、中間バンドはＧＰ１、下バンドはＧＰ２である。レーン１：ＧＰ−ΔＴＭ（還元）、レーン２：ＧＰ−ΔＴＭ（非還元）、レーン３：ＧＰ−ΔＭｕｃ（還元）、レーン４：ＧＰ−ΔＭｕｃ（非還元）。
【図４】ウマＥＢＯＶ４００〜４０７のワクチン接種及び血漿交換スケジュールである。
【図５Ａ】ＥＢＯＶ抗原で免疫されたウマの血漿中でのＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ（Ａ）又はＧＰ−ΔＭｕｃ（Ｂ）に対する抗体応答である。
【図５Ｂ】ＥＢＯＶ抗原で免疫されたウマの血漿中でのＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ（Ａ）又はＧＰ−ΔＭｕｃ（Ｂ）に対する抗体応答である。
【図６Ａ】精製されたＥ４０１  ＩｇＧの品質管理法である。Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｂ）ＥＢＯＶ（上向き三角形、左端の曲線）、スーダン（四角形、中央の曲線）、又はＭＡＲＶ（下向き三角形、右端の曲線）の精製ＧＰ−ΔＴＭを使用したＥＬＩＳＡ。
【図６Ｂ】精製されたＥ４０１  ＩｇＧの品質管理法である。Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｂ）ＥＢＯＶ（上向き三角形、左端の曲線）、スーダン（四角形、中央の曲線）、又はＭＡＲＶ（下向き三角形、右端の曲線）の精製ＧＰ−ΔＴＭを使用したＥＬＩＳＡ。
【図７Ａ】マウス効能研究の結果であり、（Ａ）は体重変化率（％）、（Ｂ）は生存率（％）を示す。
【図７Ｂ】マウス効能研究の結果であり、（Ａ）は体重変化率（％）、（Ｂ）は生存率（％）を示す。
【図８】ウマＭ３００、Ｍ３０４、Ｍ３０５、Ｍ３０６ワクチン接種及び血漿交換スケジュールである。
【図９Ａ】ＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ抗原で免疫されたウマの血漿中でのＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ（Ａ）又はＧＰ−ΔＭｕｃ（Ｂ）に対する抗体応答である。
【図９Ｂ】ＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ抗原で免疫されたウマの血漿中でのＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ（Ａ）又はＧＰ−ΔＭｕｃ（Ｂ）に対する抗体応答である。
【図１０Ａ】精製されたＭ３０４  ＩｇＧの品質管理法である。Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｂ）ＭＡＲＶ（下向き三角形、左端の曲線）、ＳＵＤＶ（四角形、中央の曲線）、又はＥＢＯＶ（上向き三角形、右端の曲線）の精製ＧＰ−ΔＴＭを使用したＥＬＩＳＡ。
【図１０Ｂ】精製されたＭ３０４  ＩｇＧの品質管理法である。Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｂ）ＭＡＲＶ（下向き三角形、左端の曲線）、ＳＵＤＶ（四角形、中央の曲線）、又はＥＢＯＶ（上向き三角形、右端の曲線）の精製ＧＰ−ΔＴＭを使用したＥＬＩＳＡ。
【図１１】ＭＡＲＶ  ＧＰで免疫されたウマ由来のＩｇＧ  １ｍｇ／ｍｌによる、ＭＡＲＶの中和である。
【図１２】致死的ＭＡＲＶ曝露からのマウスのウマＩｇＧ媒介防御である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
用語「ａ」又は「ａｎ」実体は、１つ、又は２つ以上のその実体を意味することに留意されたい。例えば、「結合分子（a  binding  molecule）」は、１つ、又は２つ以上の結合分子を表わすと理解される。また、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ又は２つ以上（one  or  more）」、及び「少なくとも１つ（at  least  one）」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され得る。
【００３５】
更に、本明細書に使用される「及び／又は」は、２つの指定された特徴又は構成要素が、もう一方の有無にかかわらずそれぞれ具体的に開示されるとみなされるべきである。したがって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの語句で用いられる「及び／又は」（and/or）という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で用いられる「及び／又は」という用語は、以下の実施形態のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
【００３６】
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが、本開示に使用される多くの用語の一般辞書を当業者に提供する。
【００３７】
単位、接頭辞、及び記号は、それらの、国際単位系（ＳＩ）に受け入れられた形式で示される。数の範囲は、その範囲を定義する数を含む。他に指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの向きで、左から右に書かれる。本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様又は態様の制限ではなく、本明細書全体を参照することによって得ることができる。したがって、すぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「非天然」物質、組成物、実体、及び／若しくは物質、組成物、実体の任意の組み合わせ、又はこれらの文法上の異形は、当業者によって「天然」として十分に理解されている、又は裁判官若しくは行政機関若しくは裁判機関によっていつでも「天然」と判定され得るか、解釈され得る物質、組成物、実体、及び／又は物質、組成物、若しくは実体の任意の組み合わせのこれらの形態を明示的に除外するが、これらのみを除外する条件付き用語である。
【００３９】
「ａ」又は「ａｎ」実体という用語は、１つ、又は２つ以上のその実体を意味することに留意されたい。また、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ又は２つ以上（one  or  more）」、及び「少なくとも１つ（at  least  one）」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され得る。
【００４０】
「フィロウイルス」は、フィロウイルス科に属するウイルスを意味する。例示的なフィロウイルスは、エボラウイルス及びマールブルグウイルスである。フィロウイルスのビリオンは、７種類のタンパク質を含み、これらは、表面糖タンパク質（ＧＰ）、核タンパク質（ＮＰ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）、及び４種類のビリオン構造タンパク質（ＶＰ２４、ＶＰ３０、ＶＰ３５、及びＶＰ４０）である。
【００４１】
「サブユニットワクチン」は、ウイルスの特定のタンパク質サブユニットから産生されたワクチンを意味し、したがって、全ウイルスワクチンよりも低い副作用リスクを有する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「免疫原」は、哺乳類に接種されると、免疫応答、例えば、抗体産生をもたらす液性免疫応答を促す効果を有する抗原を含む組成物を意味する。Ｂ細胞応答は、抗原に結合する抗体の産生をもたらす。ワクチンは、疾病に対して哺乳類を防御するように機能する免疫応答を哺乳類内で引き起こすように機能できる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含するように意図されており、アミド結合（ペプチド結合とも呼ばれる）により直線状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を意味する。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸からなる１本以上の任意の鎖を意味し、特定の長さの生成物を意味しない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は、２つ以上のアミノ酸からなる１本又は複数本の鎖を意味するために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポチペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかに代えて、又は、これらの用語のいずれかと同じ意味で使用され得る。また、「ポリペプチド」という用語では、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を意味することも意図されており、この発現後修飾には、糖化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、たんぱく質分解的開裂、又は非天然アミノ酸による修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドは、生物学的起源から得られ、又は、組み換え技術により生成され得るが、指定された核酸配列からの翻訳は必ずしも必要ではない。ポリペプチドは、化学合成を含む、任意の方法で生成され得る。
【００４４】
「単離された」ポリペプチド、又は、そのフラグメント、変異体、若しくは誘導体では、その天然の環境にないポリペプチドを意図する。特定のレベルで精製されている必要はない。例えば、単離されたポリペプチドは、そのネイティブ又は天然の環境から取り出され得る。宿主細胞中で発現した、組み換え的に生成されたポリペプチド及びタンパク質は、本明細書に開示するように単離されていると考えられ、任意の適切な方法により、分離され、分画され、又は、部分的若しくは実質的に精製されているネイティブ又は組み換えポリペプチドである。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「非天然」ポリペプチド、又はその文法上の異形は、当業者によって「天然」として十分に理解されている、又は裁判官若しくは行政機関若しくは裁判機関によっていつでも「天然」と判定され得るか、解釈され得るポリペプチドのこれらの形態を明示的に除外するが、これらのみを除外する条件付き用語である。
【００４６】
本明細書で開示する他のポリペプチドは、前述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体、又は変異体、及びこれらの組み合わせである。本明細書で開示する場合、用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、及び「類似体」は、例えば、抗原に特異的に結合するなど、対応するネイティブ抗体又はポリペプチドの特性の少なくとも一部を保持する、任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドのフラグメントには、本明細書の他の箇所に記載する特異的抗体フラグメントに加えて、例えば、タンパク質分解フラグメント、並びに欠失フラグメントが挙げられる。例えば、ポリペプチドの変異体には、上記のフラグメント、及びアミノ酸置換、欠失、又は挿入により変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。特定の態様では、変異体は非天然であり得る。非天然の変異体は、当技術分野において公知の変異誘発技術を使用して生成され得る。変異体ポリペプチドは、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、欠失、又は付加を含み得る。誘導体は、元のポリペプチドには見られない追加の特徴を提示するように改変されているポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドはまた、本明細書で「ポリペプチド類似体」と呼ばれる。本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「誘導体」はまた、側鎖官能基の反応によって化学的に誘導された１つ、又は２つ以上のアミノ酸を有する対象ポリペプチドを指し得る。また「誘導体」として含まれるものは、２０個の標準アミノ酸のうちの１つ、又は２つ以上を含有するペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンで置換され得、５−ヒドロキシリジンはリジンで置換され得、３−メチルヒスチジンはヒスチジンで置換され得、ホモセリンはセリンで置換され得、オルニチンはリシンで置換され得る。
【００４７】
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸が類似する側鎖を有する別のアミノ酸で置き換えられているものである。類似する側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、当技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などがある。例えば、フェニルアラニンをチロシンで置換することは、保存的置換である。特定の実施形態では、本開示のポリペプチド及び抗体における保存的置換は、結合分子が結合する抗原へのポリペプチド又はアミノ酸配列を有する抗体の結合を廃棄しない。抗原結合を除外しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を識別する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０〜１  １８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９〜８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：．４１２〜４１７（１９９７）を参照のこと）。
【００４８】
用語「ポリヌクレオチド」は、単独の核酸及び複数の核酸を包含し、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を意味することを意図している。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来的でない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるアミド結合など）を含む。用語「核酸」又は「核酸配列」は、ポリヌクレオチドに存在する、任意の１つ、又は２つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントを意味する。
【００４９】
「単離された」核酸又はポリヌクレオチドでは、そのネイティブ環境から分離されている核酸又はポリヌクレオチドの任意の形態を意図する。例えば、ゲル精製されたポリヌクレオチド、又はベクターに含まれるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドは、「単離された」とみなされるであろう。また、ポリヌクレオチドセグメント、例えば、クローニングのための制限部位を有するように操作されているＰＣＲ産物は、「単離された」とみなされる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞中に維持された組み換えポリヌクレオチド、又は緩衝液若しくは食塩水など非ネイティブ溶液中で（部分的又は実質的に）精製された組み換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子には、ポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのＲＮＡ転写物が挙げられ、この転写物は、自然界に見出されない。単離されたポリヌクレオチド又は核酸には、合成的に産生されたかかる分子が更に挙げられる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなど調節エレメントであり得る、又はこれらを含み得る。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「非天然」ポリヌクレオチド、又はその文法上の異形は、当業者によって「天然」として十分に理解されている、又は裁判官若しくは行政機関若しくは裁判機関によっていつでも「天然」と判定され得るか、解釈され得るポリヌクレオチドのこれらの形態を明示的に除外するが、これらのみを除外する条件付き定義である。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなる核酸の一部である。「ストップコドン」（核酸塩基ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えることができる。ただし、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域は、例えば、単一のベクター上の単一のポリヌクレオチド構築物、又は、例えば、別箇の（異なる）ベクター上の別個のポリヌクレオチド構築物に存在し得る。更に、任意のベクターが単一のコード領域を含むことができる、又は２つ以上のコード領域を含むことができる。例えば、単一のベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別個にコードすることができる。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、別のコード領域に融着しているか、融着していないかのいずれかである、異種コード領域を含むことができる。異種コード領域には、特定のエレメント又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインをコードするもの挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドを正常にコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、１つ、又は２つ以上のコード領域と操作可能に関連付けられた、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントを含み得る。操作可能な関連付けとは、ある遺伝子産物、例えば、あるポリペプチドが、１つ、又は２つ以上の調節配列に対して、その１つ、又は２つ以上の調節領域の影響又は制御下において、その遺伝子産物の発現が生じるような様式で関連付けられる場合である。２つのＤＮＡフラグメント（ポリペプチドコード領域及びそれと関連付けられるプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘因が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、かつ２つのＤＮＡフラグメント間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を行わせる発現制御配列の能力と干渉しないか、転写されるＤＮＡテンプレートの能力と干渉しない場合、「操作可能に関連付けられている」。したがって、プロモーターが核酸の転写に影響を及ぼすことができた場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に関連付けられるであろう。プロモーターは、所定の細胞でＤＮＡの相当な転写を行わせる細胞特異的なプロモーターであり得る。プロモーターを除く他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終了シグナルは、細胞特異的な転写を行わせるようにポリヌクレオチドと操作可能に関連付けられ得る。
【００５３】
各種の転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、脊椎動物細胞中で機能する転写制御領域（例えば、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（イントロンＡに関連する中程度の初期プロモーター）、シミアンウイルス４０由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これに限定されない。他の転写制御領域は、脊椎動物遺伝子由来のもの、例えば、アクチン、ヒートショックたんぱく質、ウシ成長ホルモン、及びウサギβグロビン、並びに、真核生物細胞中で遺伝子発現を制御可能な他の配列を含む。更なる好適な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）を含む。
【００５４】
同様に、各種の翻訳制御エレメントが、当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、転写開始コドン及び終了コドン、並びにピコルナウイルス由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位又はＩＲＥＳ（ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、又はリボゾームＲＮＡの形態のＲＮＡであり得る。
【００５６】
ポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本明細書に開示するようにポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに分泌を行わせる、分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と関連付けられ得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞により分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖の粗面小胞体を通過させるエクスポートが開始されると、成熟たんぱく質から開裂される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドは、完全な又は「全長の」ポリペプチドから開裂されて、分泌型又は「成熟」型のポリペプチドを産生するポリペプチドのＮ末端に融合されるシグナルペプチドを有し得ることを知っている。特定の実施形態では、ネイティブなシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、ポリペプチドに分泌を行わせる能力を保持するその配列の機能性誘導体が、ポリペプチドと操作可能に関連付けられる。あるいは、異種哺乳類のシグナルペプチド又はその機能性誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβグルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「結合分子」は、最も広義には、抗原決定基を特異的に結合する分子を指す。本明細書で更に記載するように、結合分子は、１つ、又は２つ以上（one  of  more）の「結合ドメイン」を含み得る。本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」は、所定の抗原決定基又はエピトープを特異的に結合できる、二次元又は三次元のポリペプチド構造である。結合分子の非限定例は、抗原決定基又はエピトープを特異的に結合する結合ドメインを含む抗体又はそのフラグメントである。結合分子の別の例は、第１エピトープに結合する第１結合ドメインと、第２エピトープに結合する第２結合ドメインと、を含む二重特異性抗体である。
【００５８】
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書において同じ意味で使用され得る。抗体（又は本明細書で開示するようにこれらのフラグメント、変異体、若しくは）は、少なくとも重鎖の可変ドメイン又は少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系の基本免疫グロブリン構造は、比較的よく解明されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照されたい。特に明記しない限り、用語「抗体」は、抗体の小型の抗原結合フラグメントからフルサイズの抗体、例えば、２つの完全重鎖と、２つの完全軽鎖と、を含むＩｇＧ抗体までの範囲のすべてを包含する。
【００５９】
結合分子、例えば、その抗体又は抗原結合フラグメント、変異体、又は誘導体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、短鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されたフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本開示によって包含される免疫グロブリン又は抗体分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又は免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。
【００６０】
本明細書において同じ意味で使用される「被検体」、又は「個体」、又は「宿主」、又は「患者」は、任意の非検体、特に予防又は治療が所望される哺乳類の被験体、特にヒトを意味する。他の被検体には、非ヒト霊長類、畜牛、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが挙げられ得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「治療」、「治療中」などは、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾病若しくはその症状の完全な、若しくは部分的な予防に関して予防的であり得る、並びに／又は疾病及び／若しくは疾病に起因する有害効果の部分的な若しくは完全な治療に関して役立ち得る。本明細書で使用する場合、「治療」は、哺乳類、特にヒトにおける疾病の任意の治療を対象とし、（ａ）フィロウイルスによる感染後の疾病及び／又は死亡のリスクを低減させること、フィロウイルスによる感染後の発症率及び／又は死亡率を低減させること、フィロウイルスによる感染率及び感染リスクを低減すること、並びにフィロウイルスによる感染後の疾病の程度を低減させることが挙げられるが、これらに限定されない、疾病にかかりやすいが（predisposed  to  the  disease  or  susceptible  to  the  disease）、まだ発症したと診断されていない（例えば、被検体が病原体に感染しやすいが、まだ病原体に感染していない）被検体で疾病が発症しないように予防することと、（ｂ）疾病を阻止すること、すなわち、その進行を阻止し、その進行を遅滞させることと、（ｃ）疾病を緩和すること、すなわち、疾病を退行させることと、を含む。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「フィロウイルス媒介疾患」は、フィロウイルス感染の直接的な結果である容態と、フィロウイルス感染の間接的な結果である容態、例えば、後遺症と、を包含する。かかる状態には、発熱、内出血、発熱、内出血、浮腫、臓器不全、頭痛、けん怠感、筋肉痛、悪心、嘔吐、針穿刺部位の出血、吐血、メレナ、点状出血、斑状出血、斑点状丘疹、播種性血管内凝固、ショック状態、黄疸、結膜炎、下痢、咽頭炎、痙攣、せん妄、昏睡、乏尿、及び鼻血が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
「有効量」は、ウマ（本明細書に開示の免疫原の場合）を免疫するため、又はフィロウイルス媒介疾患（例えば、エボラウイルス又はマールブルグウイルスなど本明細書に記載の任意のウイルス）を患う患者を臨床的に意義のある方法で治療するため（本明細書に記載のウマ由来過免疫の免疫グロブリン組成物の場合）に必要である、単独での、又は別の治療レジメンと組み合わせた化合物の量を意味する。ウマを免疫するため、及び／又はウイルスによって生じた状態を治療するために使用される活性化合物の十分量は、投与方法、年齢、体重、及び患者の全身の健康に応じて異なる。最終的には、処方者が、適当量及び投与レジメンを決定するであろう。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質又は賦形剤を包含することを意図する。アジュバントには、抗原が吸収される、鉱物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、又はリン酸塩）の懸濁液、又は抗原溶液が、死菌マイコバクテリア（フロイント完全アジュバント）を含むことがある鉱油（例えば、フロイント不完全アジュバント）中で乳化して、抗原性を増強させる水中油エマルジョンが挙げられ得る。
【００６５】
キメラフィロウイルス糖タンパク質ポリペプチド及びポリヌクレオチド
本開示は、キメラフィロウイルススパイク糖タンパク質ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、キメラフィロウイルススパイク糖タンパク質ポリペプチドは、ＧＰ１よりも効率的にフィロウイルス受容体陽性細胞を結合するが、受容体陰性細胞には結合せず、これらの対応のウイルスの侵入を阻害することが以前に示された（Ｋｕｈｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００６））、およそ１５０個のアミノ酸のＭＡＲＶ又はＥＢＯＶ  ＧＰ１の特異的領域を含む。糖タンパク質のこの領域は、本明細書において受容体結合領域（ＲＢＲ）と呼び、高グリコシル化された、巨大ムチン様ドメイン（ＭＬＤ）を除く、より大型のドメインの一部である（本明細書では、ＧＰ−ｄｅｌｔａＭｕｃ、ＧＰ−ΔＭｕｃ、又はＧＰ−ｄＭｕｃと呼ぶ）。図１は、典型的なフィロウイルス糖タンパク質のドメイン構造を示す。図２は、フィロウイルスＧＰ−ΔＭｕｃ構築物のドメイン構造を示す。
【００６６】
いくつかの実施形態では、キメラフィロウイルススパイク糖タンパク質ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み得る。２つ又はそれ以上のアミノ酸の文脈における用語「同一」又は「同一性」パーセントは、比較期間にわたって比較し、最大の一致を得るためにアライメントしたとき、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は手動アライメント及び目視検査によって測定する、同一である、又は指定されたパーセントのアミノ酸残基を有する２つ、又はそれ以上の配列又はサブ配列を指す。
【００６７】
比較するための配列の最適なアライメントは、例えば、局地的相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））によって、全体的アルゴリズムアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）によって、類似検索法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２（１９９７））によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ制御での実施（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）でのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＢＬＡＳＴ）によって（典型的にはデフォルト設定を使用）、又は手動アライメント及び目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９４を参照のこと）によって実施され得る。例えば、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を使用して実行して、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２のアミノ酸配列と８０％超同一であるアミノ酸配列を得ることができる。
【００６８】
キメラフィロウイルスの糖タンパク質ポリペプチドは、発現ベクターを使用して発現され、精製され得る。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組み入れられるベクターのいずれかであり得る。概して、発現ベクターは、標的タンパク質をコードする核酸に操作可能に結合された、転写及び翻訳制御核酸配列を含む。用語「制御配列」は、特定の宿主有機体内において操作可能に関連付けられているコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核に好適な制御配列には、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを用いることが既知である。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれたとき、「操作可能に関連付けられている」。例えば、プレ配列若しくは分泌リーダー用のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチド用のＤＮＡに操作可能に結合される、プロモーター若しくはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に操作可能に結合される、又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするよう位置付けられる場合、コーディング配列に操作可能に結合される。操作可能に関連付けられたＤＮＡ配列は、隣接又は非隣接であり得る。ＤＮＡ配列を関連付ける方法は当該技術分野において周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応及びライゲーションの使用が挙げられる。転写及び翻訳制御核酸は、標的タンパク質を発現させるために使用する宿主細胞に概ね適しており、例えば、大腸菌由来の転写及び翻訳制御核酸配列は、大腸菌において標的タンパク質を発現させるために使用され得る。
【００６９】
各種宿主細胞には、多様な種類の適した発現ベクター及び好適な制御配列が当該技術分野において周知である。ポリペプチドを発現させる方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１〜３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）。
【００７０】
キメラフィロウイルス糖タンパク質は、ポリペプチドの発現を誘発する、又は生じさせるのに適切な条件下で、キメラフィロウイルス糖タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターを使用して形質転換された宿主細胞を培養することによって産生され得る。タンパク質発現に適した条件は、選択した発現ベクター及び宿主細胞によって異なり、当業者は、日常の実験を使用して容易に確認するであろう。例えば、宿主細胞の成長及び繁殖は、発現ベクター内で構成的プロモーターを使用するために最適化され得、誘発のための適切な成長条件は、誘導プロモーターを使用するために設けられる。加えて、いくつかの実施形態では、例えば、バキュロウイルス系（baculoviral  systems）を使用するときの採取のタイミングは因子である。当業者は、選択した宿主細胞内での発現のためにコーディング配列が最適化され得ることを認識するであろう。
【００７１】
適切な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、菌類、並びに哺乳類細胞など昆虫及び動物細胞が挙げられる。宿主細胞には、キイロショウジョウバエ細胞、サッカロマイセスセレビジアエ及び他の酵母、大腸菌、枯草菌、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、ニューロスポラ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細胞、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞、並びにヒト細胞及び細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
本開示は、提供されたキメラフィロウイルス糖タンパク質をコードする単離された核酸分子を更に提供する。したがって、いくつかの実施形態は、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。用語「単離された核酸分子」は、そのネイティブ環境から取り出した核酸分子、核酸分子、ＤＮＡ、又はＲＮＡを指す。例えば、ベクターに含まれる組み換えＤＮＡ分子は、本開示の目的のために、単離され、かつ非天然であるとみなされる。単離されたＤＮＡ分子の更なる例には、異種宿主細胞中に維持された組み換えＤＮＡ分子、又は溶液中の（部分的又は実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。
【００７３】
本開示は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、又は配列番号１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドを更に提供する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するために分泌配列として機能するリーダー配列）からのポリペプチドの発現及び分泌を補助するポリヌクレオチドに対して同一の読み枠で融合される、所定のキメラフィロウイルス糖タンパク質ポリペプチドのコーディング配列を含み得る。
【００７４】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、コードされたポリペプチドを精製できるようにするマーカー配列に対して同一の読み枠で融合される、成熟ポリペプチドのコーディング配列を含み得る。例えば、マーカー配列は、ｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであって、細菌宿主の場合にマーカーに融合されている成熟ポリペプチドの精製をもたらし得るか、マーカー配列は、哺乳類宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用されるとき、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来の血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。
【００７５】
別の態様では、キメラフィロウイルスの糖タンパク質ポリペプチドを使用して、被検体、例えば、ウマ、又は他のウマ科動物で、免疫グロブリンを産生するためにフィロウイルスに対する免疫応答を誘発させることができる。有効量は、被移植者内での免疫応答を誘発させるために十分である。本明細書で提供する組成物及び方法で使用するための免疫原性組成物は、好適な送達賦形剤中で処方され得る。例えば、１つの好適な担体には、各種の緩衝液（例えば、リン酸緩衝塩類溶液）を使用して処方され得る食塩水が挙げられる。他の例示的な担体には、無菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ごま油、及び水が挙げられる。
【００７６】
ウマ免疫グロブリン組成物
本開示は、１つ、又は２つ以上のフィロウイルス免疫原、例えば、フィロウイルス糖タンパク質で過免疫されたウマのポリクローナル免疫グロブリン由来の医薬組成物を提供する。任意のフィロウイルス、又はフィロウイルスの混合物に特異的な免疫グロブリンが産生され得る。例えば、フィロウイルスは、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、スーダンウイルス（ＳＵＤＶ）、ブンディブギョウイルス（ＢＤＢＶ）、タイフォレストウイルス（ＴＡＦＶ）、レストンウイルス（ＲＥＳＴＶ）、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）、又は任意のこれらの組み合わせであり得る。この組成物は、血漿、血清、又は精製免疫グロブリンの形態、例えば、精製ＩｇＧ又はそのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントであり得る。この組成物は、ウマ科動物、例えば、ウマを、１つ、又は２つ以上のフィロウイルス免疫原、例えば、フィロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）及び／又はフィロウイルス糖タンパク質、例えば、本明細書に記載のＧＰ−ΔＭｕｃ又はＧＰ−ΔＴＭ、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含むフィロウイルス糖タンパク質で免疫することにより調製される。
【００７７】
ウマは、強力な免疫応答を免疫原に備え付け、それによって大量の抗フィロウイルス抗体を産生するように免疫される。血液、血清、又は血漿は、例えば、血漿交換の静脈穿刺によって免疫されたウマから回収され得、免疫グロブリンは、精製され得る、及び／又は当業者に周知の技法で処理され得る。次いで、回収された免疫グロブリンは好適な担体、賦形剤、保存剤、及び／又は他の添加物を使用して処方されて、被験者に投与するための医薬組成物を産生し得る。
【００７８】
特定の態様では、ウマは、ウマ血中循環ＩｇＧの大部分がフィロウイルスに対して特異的であるように、フィロウイルス免疫原、例えば、フィロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）及び／又はフィロウイルス糖タンパク質で過免疫される。例えば、特定の態様では、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、又は更にはそれ以上のウマ血中循環ＩｇＧがフィロウイルスに対して特異的である。このフィロウイルス特異的ＩｇＧは、高い効能を有する治療をもたらすように精製され得る。特定の態様では、回収血清又は血漿中のフィロウイルス特異的抗体の力価は、ＥＬＩＳＡで測定したとき、例えば、少なくとも１０２、少なくとも５×１０２、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、又は少なくとも５×１０５、少なくとも１０６、少なくとも５×１０６、少なくとも１０７、少なくとも５×１０７の、フィロウイルス糖タンパク質、ＥＢＯＶ又はＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ又はＧＰ−ΔＭｕｃ結合に対するＥＣ５０抗体価をもたらし得る。
【００７９】
特定の態様では、本明細書で提供するウマ免疫グロブリン医薬組成物、例えば、精製免疫グロブリン、例えば、精製ＩｇＧは、フィロウイルス糖タンパク質、例えば、ＥＢＯＶ、又はＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ、又はＧＰ−ΔＭｕｃに対して高い効能を有し得る。例えば、特定の態様では、精製ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡで測定したとき、３μｇ／ｍｌ未満、２．５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１．５μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．９μｇ／ｍｌ未満、０．８μｇ／ｍｌ未満、０．７μｇ／ｍｌ未満、０．６μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．４μｇ／ｍｌ未満、０．３μｇ／ｍｌ未満、０．２μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、又は０．０９μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で、ＭＡＲＶ又はＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ又はＧＰ−ΔＭｕｃに結合できる。
【００８０】
特定の態様では、本明細書で提供するウマ免疫グロブリン医薬組成物、例えば、精製免疫グロブリン、例えば、精製ＩｇＧを使用して、フィロウイルスに感染した非検体を治療できる、又はフィロウイルスに感染しやすい被検体を防御できる。特定の態様では、本明細書で提供する組成物は、フィロウイルス感染前又は感染後に、例えば、感染してから、若しくは症状の検知後１２、２４、３６、４８、若しくは６０時間以内、又は更にはそれ以降に投与され得る。特定の態様では、フィロウイルスへの致死的曝露に続いて、マウスに約１００ｍｇ／ｋｇを２回投与することにより、致死的曝露に対してマウスを防御することができ、例えば、治癒する、症状を低減する、生存期間を延長する。
【００８１】
特定の態様では、本明細書で提供するウマ免疫グロブリン医薬組成物、例えば、精製免疫グロブリンは、例えば、ＩＶ注射によって被検体に投与されるとき、フィロウイルスに感染した検体の症状を予防できるか、最小限に抑えることができる。
【００８２】
特定の態様では、ウマは、フィロウイルス糖タンパク質の免疫原を投与される。特定の態様では、免疫原は、ムチン様ドメインを欠失したフィロウイルススパイク糖タンパク質である。特定の態様では、スパイク糖タンパク質の膜貫通ドメインは、ムチン様ドメイン欠失の代わりに、又はそれと組み合わせて、欠失している。特定の態様では、免疫原は、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、ＲＥＳＴＶからのＧＰ１サブユニット若しくはそのフラグメント、又はこれらのＧＰ１サブユニットの組み合わせを含む。特定の態様では、免疫原は、ＭＡＲＶ、ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、ＢＤＢＶ、ＴＡＦＶ、ＲＥＳＴＶからのＧＰ１サブユニット若しくはそのフラグメント及びＧＰ２サブユニット若しくはそのフラグメント、又はこれらのＧＰ１及びＧＰ２サブユニットの組み合わせを含む。特定の態様では、免疫原は、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８３】
特定の態様では、本明細書で提供するウマ免疫グロブリン医薬組成物、例えば、精製免疫グロブリンは、ウマの多重免疫化によって産生され得、一定間隔の免疫レジメンは、当業者によって容易に決定され得る。一態様では、ウマは、０日目、２１日目、４２日目、及び６３日目にスパイク糖タンパク質で免疫され、ポリクローナル免疫グロブリンは、９０日目に血漿交換によって血漿として回収される。他の態様では、ウマは、０日目及び２１日目にＶＬＰ、例えば、フィロウイルス糖タンパク質、フィロウイルスＶＰ４０、及びフィロウイルス核タンパク質（ＮＰ）を含むＶＬＰで免疫されてから、４２日目及び６３日目にフィロウイルススパイク糖タンパク質でブーストされる。
【００８４】
特定の態様では、ウマはプライム−ブーストレジメンで免疫される。例えば、この免疫レジメンは、例えば、ＶＬＰを使用した１回、２回、又はそれ以上の回数のプライミング免疫と、例えば、糖タンパク質サブユニット、例えば、ＧＰ−ΔＭｕｃ、ＧＰ−ΔＴＭ、又はこれらの組み合わせを使用した１回、２回、又はそれ以上の回数のブースト免疫と、を含む。特定の態様では、ＶＬＰは、フィロウイルス糖タンパク質と、フィロウイルスＶＰ４０と、を含む。特定の態様では、ＶＬＰは、フィロウイルス核タンパク質（ＮＰ）を更に含む。
【００８５】
特定の態様では、本開示は、本明細書で提供するウマ免疫グロブリン医薬組成物、例えば、精製免疫グロブリンを調製する方法を提供し、この方法は、フィロウイルス免疫原、例えば、１種、２種、３種、又はそれ以上の種類のフィロウイルス免疫原を、フィロウイルスの防御抗原に対してウマを過免疫するのに十分な量でウマに投与することを含む。特定の態様では、少なくとも１つのフィロウイルス免疫原は、フィロウイルススパイク糖タンパク質、例えば、ＧＰ−ΔＭｕｃ、ＧＰ−ΔＴＭ、又はこれらの組み合わせを含む。この方法は、例えば、採血又は血漿交換によって、ウマから免疫グロブリンを回収することを更に含む。特定の態様では、免疫グロブリンは、血漿として回収される。特定の態様では、この方法は、ウマから回収した免疫グロブリンを精製することを更に含む。特定の態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ又はそのフラグメントを含む。
【００８６】
本開示は、被検体でのフィロウイルス媒介疾患の予防、治療、又は管理方法を更に提供し、この方法は、治療を要する被検体に、フィロウイルス糖タンパク質で過免疫されたウマ由来のポリクローナル免疫グロブリンを含む、本明細書に記載の組成物を投与することを含む。
【００８７】
特定の態様では、フィロウイルス媒介疾患は、発熱、内出血、浮腫、臓器不全、頭痛、けん怠感、筋肉痛、悪心、嘔吐、針穿刺部位の出血、吐血、メレナ、点状出血、斑状出血、斑点状丘疹、播種性血管内凝固、ショック状態、黄疸、結膜炎、下痢、咽頭炎、痙攣、せん妄、昏睡、乏尿、及び鼻血からなる群から選択される１つ、又は２つ以上の症状を含む。特定の態様では、フィロウイルス媒介疾患は、エボラ出血熱である。特定の態様では、治療を受ける被検体はヒト、例えば、エボラウイルスに感染したヒトである。
【００８８】
本開示の実施は、別途記載のない限り、当業者の技能範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技法を用いるであろう。かかる技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ：４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照されたい。
【００８９】
免疫学の一般原則を示す標準的な参考文献には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」ｉｎ  Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４），Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．Ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．Ｋｉｎｄｔ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｒａ  Ａ．Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ  ＆  Ｃｏ．（２０００）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍａｌｅ  Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６ｔｈ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ  Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ（２００３）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）が挙げられる。
【実施例】
【００９０】
実施例１：フィロウイルス糖タンパク質受容体結合領域（ＲＢＲ）の同定及び哺乳類細胞におけるＧＰ−ΔＭｕｃタンパク質の産生
中和抗体ＫＺ５２と複合した糖タンパク質の融合前三量体構造の結晶構造を３．４オングストローム（Å）で得た（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５４：１７７〜８２（２００８））。この構造では、３つのＧＰ１サブユニットが集まって、ＧＰ２融合サブユニットからなる台に抱かれた杯を形成し、ムチン様ドメイン（ＭＬＤ）は、杯状ボウルに隔離された保存ＲＢＲへのアクセスを制限する。この構造に基づいて、ＲＢＲは、ＧＰ杯のボウルに隔離され、部分的には大型の付着ＭＬＤによって被覆されるが、標的細胞エンドソーム内のカテプシン酵素によるタンパク質リモデリング後に更に露出されるようになり得る。ＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ、及びＭＡＲＶ糖タンパク質は、侵入時の必須工程として、カテプシンプロテアーゼによって切断される。切断により、ＧＰ１は〜１８ｋＤａ産物へと縮小する（Ｃｈａｎｄｒａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｋａｌｅｔｓｋｙ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：１３３７８〜８４（２００７）；Ｓｃｈｏｒｎｂｅｒｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：４１７４〜８（２００６））。この構造は、最も可能性の高いカテプシン切断部位が、ＧＰ１のβ１３〜β１４可撓性ループであることを示唆しており、その部位における切断が、いかにして高度にグリコシル化された領域をＧＰから解放し、ＧＰ２に囲まれたＧＰ１のコアのみを残し、受容体結合部位が曝露されるようになるかを示している。ＥＢＯＶ  ＧＰに関する生化学的研究は、カテプシンの切断によって付着が増強され、恐らく、ウイルスとやり取りしてエンドソームに入れる細胞表面因子との相互作用のために、ＲＢＲが更に曝露されるであろうことを裏付けている（Ｄｕｂｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：２８８３〜２８９１（２００９））。しかしながら、ＲＢＲは、少なくとも部分的に、又は一時的にウイルス表面上で曝露され、したがって、この部位を標的にし得る任意の抗体が、治療に有益である。
【００９１】
ＭＬＤは、恐らく、フィロウイルスＧＰの宿主相互作用表面を独占するであろう。実際、ＭＬＤに対する抗体は、頻繁に同定されている。侵入中の全長のＧＰにおけるＲＢＲの隔絶及びカテプシン切断時のその曝露は、巨大ＭＬＤを欠く抗原が、ＧＰの脆弱部分を免疫系に曝露するであろうことを示唆する。したがって、様々なエボラ及びマールブルグ株の間で広範な防御を提供することができる汎フィロウイルスワクチンとして作用する、かかる欠失変異株（ＧＰ−ΔＭｕｃ）の能力を調べた。
【００９２】
この実施例では、ＧＰ１のアミノ末端サブドメイン（ＭＬＤを欠く）を発現し、膜貫通ドメイン（ジスルフィド結合によって結合される）を欠くＧＰ２と複合した構築物を生成した。ＳＵＤＶ、ＥＢＯＶ、及びＭＡＲＶ由来の組み換えＧＰ−ΔＭｕｃ（膜貫通を含まないＧＰ、ムチン様ドメイン、配列番号２、４、及び６）及びＧＰ−ΔＴＭタンパク質（膜貫通ドメインを含まないＧＰ、配列番号８、１０、及び１２）は、２９３Ｔ細胞内で一時的に発現し、ウイルス株に応じて、アニオン交換捕捉工程、及びタンパク質を更に精製するためのサイズ排除クロマトグラフィー又はレクチン親和性樹脂を含む、多段階のカラムクロマトグラフィー法で精製した。図３Ａは、精製ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ及びＧＰ−ΔＭｕｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）及びウエスタンブロット（Ｂ）を示す。還元レーンでは、上バンドはＧＰｎｕｌｌ、中間バンドはＧＰ１、下バンドはＧＰ２である。図３Ｂに示すように、ＧＰ２は、ウエスタンに使用される抗体では認識されない。レーン１：ＧＰ−ΔＴＭ（還元）、レーン２：ＧＰ−ΔＴＭ（非還元）、レーン３：ＧＰ−ΔＭｕｃ（還元）、レーン４：ＧＰ−ΔＭｕｃ（非還元）。
【００９３】
防御の確実なマーカーとしての抗体：
８１例のマカクでＥＢＯＶ  ＧＰを発現するＥＢＯＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチン又はアデノウイルスワクチンを使用して実施したワクチン接種研究からの血清を分析して、致死的曝露からの防御と、全長ＧＰ細胞外ドメイン（ＧＰ−ΔＴＭ）、ＧＰ−ΔＭｕｃ、及びＶＰ４０に対する抗体応答との関係を評価した。ＧＰに対する抗体値の増加（ただし、ＶＰ４０に対しては増加しない）は、致死的曝露後の生存確率の増加と有意に関連した（表１）。
【００９４】
【表１】
2018505185.tif 000002
【００９５】
ＧＰ−ΔＭｕｃに結合した、最も防御的な抗体コアＧＰ構造を被覆するＭＬＤドメインは周知であり（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２００８．４５４（７２０１）：ｐ．１７７〜８２）、したがって、ＭＬＤを除去すると、ＥＢＯＶを効果的に中和するために標的エピトープを曝露することが期待される。例えば、構造研究に基づいて、ｍＡｂ  ２Ｇ４及び４Ｇ７（ＺＭａｐｐの成分）結合部位は、ＧＰ１及びＧＰ２の接点に位置し（Ｍｕｒｉｎ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０１４．１１１（４８）：ｐ．１７１８２〜７）、１３Ｃ６（ＺＭａｐｐの別の成分）は、グリカンキャップ内の立体構造エピトープに結合する（Ｓａｐｈｉｒｅ，Ｅ．Ｏ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１３．５（１１）：ｐ．１２２１〜３３）。したがって、ＺＭａｐｐに含まれる３つのｍＡｂのエピトープのすべてが、ＧＰの非ＭＬＤ部分に位置する。ＧＰ−ΔＭｕｃに位置する最も防御的な抗体の概念は、マカクを防御した受容体結合領域に位置する２つの更なる抗体の報告によって更に強化される（Ｍａｒｚｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２．７（４）：ｐ．ｅ３６１９２）。
【００９６】
実施例２：エボラ過免疫ウマ血漿及び精製ＩｇＧの調製及び使用
この例では、過免疫したウマからＥＢＯＶ  ＧＰに対する、高力価の高効能免疫グロブリンを単離し、精製し、特性化した。目的は、１０％超の抗ＧＰ含量を有するＩｇＧ調製物を生成することであった。かかる調製物は、１５０〜２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合、１５〜２０ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰ抗体をもたらすであろう。
【００９７】
ウマと免疫化
図４に示すプライムブーストスケジュールに従って、８例のウマ（ＥＢＯＶ４００、ＥＢＯＶ４０１、ＥＢＯＶ４０２、ＥＢＯＶ４０３、ＥＢＯＶ４０４、ＥＢＯＶ４０５、ＥＢＯＶ４０６、ＥＢＯＶ４０７）に２回分のＥＢＯＶ  ＶＬＰプライミング用量（２ｍｇの「トリプル」ＶＬＰ（ＧＰ、ＶＰ４０、及びＮＰを含む）、１回目は筋肉内、２回目は皮下）及び２回分のＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃブースター用量（配列番号４、２５０μｇ、皮下）でワクチン接種した。通常の群れ単位での健康管理の一環として、これらのウマには、東部及び西部ウマ脳炎ウイルス、（死滅）、西ナイルウイルス（死菌）破傷風毒素、ウマインフルエンザウイルス（死菌）、ストレプ卜コッカスエクイ（変性生又は死菌）、ウマヘルペスウイルス（死菌）、及び狂犬病ウイルス（死菌）に対して毎年ワクチン接種した。
【００９８】
抗原は、アジュバントとしてＴｉｔｅｒｍａｘ  Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ）を使用して処方し、０日目に筋肉注射、２１日目、４２日目、及び６３日目に皮下注射で合計２ｍｌ投与した。血液検体は、抗体応答を評価するために０日目、２１日目、４２日目、５６日目、及び７０日目にすべてのウマから得た。９０日目の研究日に１例のウマ（ＥＢＯＶ４０１）で試験的血漿交換を行った。
【００９９】
ＥＢＯＶ抗原に対する免疫応答
定量的ＥＬＩＳＡによって、ＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭ（膜貫通ドメインのみを欠く）並びにＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃに対する全体的なＩｇＧ応答を評価した。各試料の完全希釈曲線を使用して、各血漿試料のＥＣ５０値を測定した。図５に示すように、免疫されたウマでは、５×１０３〜１０５の範囲のＥＣ５０値を観測した。これらの力価は、ＮＨＰを使用した前述の研究（表１を参照）で観測した防御的力価と比較して遜色がない。
【０１００】
抗エボラウマＩｇＧの精製及び試験
ＩｇＧの精製及び予備効能試験のために、ウマＥ４０１を選択した。９０日目に得た血漿を使用して、タンパク質ＧカラムでＩｇＧを精製した。合計３００ｍｇのＩｇＧ（ＥＥＩＧ）を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＬＩＳＡで試験した。図６は、Ｅ４０１  ＩｇＧに対する品質管理試験の結果を示す。精製したＥ４０１  ＩｇＧでは、０．３０６μｇ／ｍｌのＥＣ５０値でＥＢＯＶ  ＧＰ−ΔＴＭを検出した。Ｅ４０１ウマＩｇＧはまた、１４．６μｇ／ｍｌのＥＣ５０でＳＵＤＶ  ＧＰと交差反応した。ＭＡＲＶ  ＧＰは、４７４μｇ／ｍｌのＥＣ５０で検出された。ＧＰ−ΔＭｕｃへの結合も試験し（データは図示せず）、以下のＥＣ５０値、つまりＥＢＯＶ（０．３０８μｇ／ｍｌ）、ＳＵＤＶ（３．０５μｇ／ｍｌ）、及びＭＡＲＶ（２０７μｇ／ｍｌ）を測定した。
【０１０１】
これらのウマ調製物中のＥＢＯＶ特異的ＩｇＧの正確な比率は測定しなかった。理論に束縛されるものではないが、エボラ特異的抗体の平均ＥＣ５０が５０〜６０ｎｇ／ｍｌであるという保守的推定に基づくと、Ｅ４０１  ＩｇＧは、少なくとも２０％のエボラ特異的抗体を有し得た。この保守的推定に基づくと、動物試験用の１００ｍｇ／ｋｇの用量は、約２０ｍｇ／ｋｇのエボラ特異的ポリクローナル抗体となる。
【０１０２】
ＥＢＯＶ感染モデルにおけるＥ４０１  ＩｇＧの効能試験：
Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルでｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＢＯＶ感染を中和化するＥＥＩＧの効能を評価するために、概念研究の実証を行った。この研究では、マウス適合ＥＢＯＶ（１０００ＰＦＵ）への致死的曝露の１時間後、及び３日後に、１００ｍｇ／ｋｇの用量で２回のＥ４０１  ＩｇＧ腹腔内注射としてＥＥＩＧを与えた。１５日にわたって感染後の生存率を監視し、４週間監視する。この研究の結果は、ＥＢＯＶの致死効果からのマウスの完全防御を示した。抗体は、１００ｍｇ／ｋｇの用量において完全に防御的であった。５例のマウスの集団を１０００ＰＦＵのマウス適合ＥＢＯＶに曝露した。マウスは、感染の１時間後に腹腔内（ＩＰ）注射によって１００ｍｇ／ｋｇでＥ４０１−ＩｇＧの１回目の投与を受けた。マウスは、感染後３日目に２回目の１００ｍｇ／ｋｇのＥ４０１−ＩｇＧ投与を受けた。２つの陰性対照動物集団は、治療も、不適切なモノクローナル抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）も受けなかった。陽性対照として、２５ｍｇ／ｋｇで抗ＥＢＯＶモノクローナル抗体６Ｄ８を使用した（１日目及び３日目）。
【０１０３】
対照集団内のすべてのマウスは、５〜７日目に感染に屈したが（図７）、６Ｄ８での治療を受けたすべてのマウスは、曝露に屈することなく生存した。（データは図示せず）。同様に、Ｅ４０１−ＩｇＧを受けたすべてのマウスは、致死的曝露にもかかわらず生存した（図７）。
【０１０４】
実施例３：マールブルグウマ免疫グロブリンの調製及び使用
ウマと免疫化
４例のウマ（Ｍ３００、Ｍ３０４、Ｍ３０５、Ｍ３０６と表す）は、図８に示すスケジュールに従って、Ｔｉｔｅｒｍａｘ  Ｇｏｌｄでアジュバント化した、精製マールブルグ−アンゴラＧＰ−ΔＴＭタンパク質（配列番号１２）を使用して免疫した。
【０１０５】
ＭＡＲＶ抗原に対する免疫応答
定量的ＥＬＩＳＡによって、ＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭ（膜貫通ドメインのみを欠く）並びにＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＭｕｃに対する全体的なＩｇＧ応答を評価した。各試料の完全希釈曲線を使用して、各血漿試料（reach  plasma  sample）のＥＣ５０値を測定した。図９に示すように、ウマのうちの１例（Ｍ３００）は感知され得る応答を示さなかったが、他の３例のウマは、調査７７日目に５×１０３〜７×１０３（ＧＰ−ΔＴＭ）、６×１０３〜１×１０４（ＧＰ−ΔＭｕｃ）の範囲の強い抗体応答を示した。力価は、７７日目と９６日目との間でやや低下した。これらの力価は、表１に示すＮＨＰデータと比較して概ね好ましい範囲内にある。力価は、ＥＢＯＶに関して得たレベルよりも低いが、これは、例えば、免疫戦略の違い、すなわち、ＥＢＯＶに対するプライムブーストの使用、並びにＧＰ抗原タイプ（ＧＰ−ΔＴＭ対ＧＰ−ΔＭｕｃ）の選択によるものである。ＭＡＲＶ研究で使用したウマはまた、廃棄された取り組みで以前に（〜２年前）マールブルグに対して免疫されている。図９６に見られる当初の力価は、この既存の応答を反映する。
【０１０６】
抗ＭＡＲＶウマＩｇＧの精製及び試験
ＩｇＧを精製するために、ウマＭ３０４〜３０６を選択した。７７日目に回収した血漿を使用して、タンパク質ＧカラムでＩｇＧを精製した。図１０は、Ｍ３０４  ＩｇＧに対する品質管理試験の結果を示す。精製したＭ３０４  ＩｇＧでは、２．１１μｇ／ｍｌのＥＣ５０値でＭＡＲＶ  ＧＰ−ΔＴＭを検出した。３種の精製ＩｇＧ（μｇ／ｍｌ単位）のＥＣ５０値をすべて表２に示す。ＭＡＲＶのＥＣ５０は、２μｇ／ｍｌの範囲内であった。
【０１０７】
【表２】
2018505185.tif 000003
【０１０８】
これらのウマ調製物中のＭＡＲＶ特異的ＩｇＧの正確な比率は測定しなかった。理論に束縛されるものではないが、ＭＡＲＶ特異的抗体の平均ＥＣ５０が５０〜６０ｎｇ／ｍｌであるという保守的推定に基づくと、これらの３例のウマから精製したＩｇＧは、約２〜３％のＭＡＲＶ特異的抗体を有する。この推定に基づくと、１００ｍｇ／ｋｇの用量は、約２〜３ｍｇ／ｋｇのＭＡＲＶ特異的ポリクローナル抗体となる。
【０１０９】
真正ＭＡＲＶウイルスを中和する精製ＩｇＧの能力は、プラーク減少アッセイを使用して評価した。ＭＡＲＶウイルスは、ウェルあたり〜１５０プラークを標的として希釈した。ウイルスは、ＭＡＲＶで免疫されたウマ由来のＰＢＳ若しくはＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）、又はＭＡＲＶ  ＶＬＰワクチンを接種したＮＨＰ由来のポリクローナル血清の１：１００希釈物のいずれかを使用してプレインキュベートした。次いで、標準的なプラークアッセイでウイルスを列挙した。図１１に示すように、表示した濃度において３種のＩｇＧが４０％〜６５％の中和を達成した。
【０１１０】
ＭＡＲＶ感染モデルにおけるウマ抗ＭＡＲＶ  ＩｇＧの効能試験：
５例のマウスの集団を１０００ＰＦＵのマウス適合ＭＡＲＶに曝露した。マウスは、感染の１時間後に腹腔内（ＩＰ）注射によって１００ｍｇ／ｋｇでＩｇＧの１回目の投与を受けた。マウスは、感染後３日目に２回目の１００ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ投与を受けた。２つの陰性対照動物集団は、治療も、不適切なモノクローナル抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）も受けなかった。
【０１１１】
対照集団内のすべてのマウスは、曝露後６〜８日目に感染に屈した（図１２）。Ｍ３０４で治療を受けた集団では、５例中４例のマウスが、Ｍ３０５集団では、５例中３例のマウスが曝露を経て生存した（図１２）。対照的に、Ｍ３０６  ＩｇＧを受けたマウスは、すべて感染に屈した（図１２）。したがって、３例中２例のウマに由来するＩｇＧは、部分的防御をもたらした。
【０１１２】
ＭＡＲＶウマＩｇＧの開発に関する更なる取り組みは、ＥＢＯＶに類似のプライムブースト戦略に重点を置くことになるであろう。
【０１１３】
本開示は、本開示の個々の態様の１つの例示として意図して記載される特定の実施形態による範囲に限定されるものではなく、機能的に均等の任意の組成及び方法が、本開示の範囲内である。実際に、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本開示の種々の変形形態が、前述の説明及び添付の図面から、当業者に明らかとなるであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図している。
【０１１４】
本明細書で言及されたすべての刊行物、及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が具体的に、かつ個々に参照により組み込まれることが示されているのと同様に、参照により組み込まれる。
【０１１５】
配列
【０１１６】
【化１】
2018505185.tif 000004
【０１１７】
【化２】
2018505185.tif 000005
【０１１８】
【化３】
2018505185.tif 000006
【０１１９】
【化４】
2018505185.tif 000007
【０１２０】
【化５】
2018505185.tif 000008
【０１２１】
【化６】
2018505185.tif 000009
【０１２２】
【化７】
2018505185.tif 000010
【０１２３】
【化８】
2018505185.tif 000011
【０１２４】
【化９】
2018505185.tif 000012
【０１２５】
【化１０】
2018505185.tif 000013
【０１２６】
【化１１】
2018505185.tif 000014
【０１２７】
【化１２】
2018505185.tif 000015
【図１】
2018505185.tif 000016
【図２】
2018505185.tif 000017
【図３】
2018505185.tif 000018
【図４】
2018505185.tif 000019
【図５Ａ】
2018505185.tif 000020
【図５Ｂ】
2018505185.tif 000021
【図６Ａ】
2018505185.tif 000022
【図６Ｂ】
2018505185.tif 000023
【図７Ａ】
2018505185.tif 000024
【図７Ｂ】
2018505185.tif 000025
【図８】
2018505185.tif 000026
【図９Ａ】
2018505185.tif 000027
【図９Ｂ】
2018505185.tif 000028
【図１０Ａ】
2018505185.tif 000029
【図１０Ｂ】
2018505185.tif 000030
【図１１】
2018505185.tif 000031
【図１２】
2018505185.tif 000032
【配列表】
2018505185000001.app
【国際調査報告】
2018505185.tif 000033
2018505185.tif 000034