(57)【要約】  癌細胞における細胞表面糖の選択的標識のための化合物が開示される。本化合物は、癌細胞に特異的なトリガーによって活性化され、代謝されると、癌細胞表面糖をアジド化学基で標識する。クリックケミストリー反応により促進され、細胞表面発現アジドとアルキニル薬剤コンジュゲートとの組み合わせは、毒性が低下した癌細胞への効率的な標的薬物送達を可能にする。アジド含有癌細胞に薬物を送達するための化合物、及び本発明の化合物を用いて癌を治療する方法も開示される。
2018535198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシル部分と、
トリガーによって切断されるトリガー応答性部分と、
自壊性リンカーと、を含む化合物であって、
前記自壊性リンカーが、前記マンノピラノシル部分及び前記トリガー応答性部分に共有結合している、化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記トリガーは、細胞過酸化物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記トリガー応答性部分は、ボロン酸基、ジアルキルボロネート基、ジアリールボロネート基、ジ（アラルキル）ボロネート基、ボロラン基またはジオキサボロラン基を含む、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
細胞過酸化物による前記トリガー応答性部分の切断時に、前記自壊性リンカーが分解し、それによって、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシドを放出する、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記トリガーは、低酸素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記トリガー応答性部分は、２−ニトロイミダゾール部分またはアゾベンゼンのようなアゾ基を含む、請求項１または５に記載の化合物。
【請求項７】
低酸素条件下での前記トリガー応答性部分の切断時に、前記自壊性リンカーが分解し、それによって、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシドを放出する、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記トリガーは、グルタチオンのようなスルフヒドリルまたはチオレート含有化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記トリガー応答性部分は、ジスルフィド結合を含む、請求項１または８に記載の化合物。
【請求項１０】
スルフヒドリルまたはチオレート含有化合物による前記ジスルフィド結合の切断時に、前記自壊性リンカーが分解し、それによって、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシドを放出する、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記トリガーは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン１）（ＮＱＯ１）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記トリガー応答性部分は、任意に置換されたプロピオン酸またはプロピオンアミド部分に共有結合している、任意に置換されたキノンを含む、請求項１または１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン１）（ＮＱＯ１）によって任意に置換されたプロピオン酸またはプロピオンアミド部分に共有結合している、前記任意に置換されたキノンの切断時に、前記自壊性リンカーが分解し、それによって、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシドを放出する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記トリガーは、カテプシン酵素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
前記トリガー応答性部分は、カテプシン酵素によって切断されるアミド結合を含むアミノ酸またはオリゴペプチド配列である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記アミド結合を含むアミノ酸またはオリゴペプチド配列は、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ（ＮＯ２）、Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｔｓ）を含む、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記アミノ酸またはオリゴペプチド配列は、置換リシンアミドである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
前記カテプシン酵素による前記アミド結合の切断時に、前記自壊性リンカーが分解し、それによって、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシドを放出する、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記カテプシン酵素は、カテプシンＬである、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
式（Ｉ）で表され、
【化１】
2018535198.tif 000045
式中、
Ｒ１は、Ｈまたはトリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリルを表し、
Ｒ２は、出現毎に独立して、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ３及びＲ４は、出現毎に独立して、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ａ１は、前記自壊性リンカーを表し、
ｍは、１、２、または３である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２１】
Ｒ１は、Ｈを表す、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ２は、出現毎に独立して、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３を表す、請求項２０または２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ２のすべての出現が同一である、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ３及びＲ４は、Ｈである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２５】
ｍは、１である、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
Ａ１は、基−Ｘ１−Ｙ１−を表し、
Ｘ１は、結合または−Ｃ（Ｏ）２−を表し、
Ｙ１は、結合または任意に置換された−（（Ｃ１）アルキレン）−アリーレン−または−（（Ｃ１）アルキレン）−ヘテロアリーレン−を表し、
Ｘ１及びＹ１の両方が結合を表さない、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｙ１は、任意に置換された−（（Ｃ１）アルキレン）−アリーレン−を表す、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
前記自壊性リンカーは、
【化２】
2018535198.tif 000046
からなる群から選択され、
式中、
Ｒ５は、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、またはヘテロシクロアルキルを表し、
Ｒ７は、Ｈ、ハロ、−Ｃ（Ｏ）２Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、ジ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）アミノ、−ＮＯ２、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ３を表し、
ｑは、１または２である、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ７は、Ｈである、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
前記自壊性リンカーは、
【化３】
2018535198.tif 000047
である、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３１】
前記自壊性リンカーは、
【化４】
2018535198.tif 000048
である、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ７は、Ｈである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３３】
前記自壊性リンカーは、
【化５】
2018535198.tif 000049
から選択され、
式中、  Ｒ５は、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、またはヘテロシクロアルキルを表し、
ｎは、１または２である、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３４】
式（ＩＩ）で表され、
【化６】
2018535198.tif 000050
式中、Ｒ７は、Ｈ、ハロ、−Ｃ（Ｏ）２Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、ジ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）アミノ、−ＮＯ２、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ３を表し、
ｑは、１または２である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３５】
式（ＩＩ’）で表される、請求項３４に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【化７】
2018535198.tif 000051
【請求項３６】
Ｒ７は、Ｈである、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３７】
式（ＩＩＩ）で表される化合物であって、
【化８】
2018535198.tif 000052
式中、
Ｋは、任意に置換されたシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニル、またはアルキニル部分を表し、
Ｐｏｌは、ポリマー部分を表し、
Ｐｅｐは、アミノ酸またはオリゴペプチド配列を表し、
Ａ２は、自壊性リンカーを表し、
Ｄは、ファルマコフォアを表し、
前記ポリマー部分は、ポリアルキレングリコールまたはポリアルキレンイミドであり、
前記アミノ酸またはオリゴペプチド配列は、（ｉ）対応する健常細胞と比較して悪性細胞で過剰発現する酵素によって、または（ｉｉ）対応する健常細胞で発現せず悪性細胞で発現する酵素によって切断されるアミド結合を含む、化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３８】
前記酵素による前記アミド結合の切断時に、前記自壊性リンカーが分解し、それによって前記ファルマコフォアを放出する、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
前記酵素は、カテプシン酵素である、請求項３７または３８に記載の化合物。
【請求項４０】
前記カテプシン酵素は、カテプシンＢである、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｐｅｐは、任意に置換されたＶａｌ−Ｃｉｔを表す、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４２】
式（ＩＶ）で表され、
【化９】
2018535198.tif 000053
式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、出現毎に独立して、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表す、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４３】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｈである、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
Ｋは、任意に置換されたヘテロシクロアルキニルまたはシクロアルキニルを含む、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４５】
Ｋは、任意に置換されたジベンゾシクロオクタン部分を含む、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
Ｐｏｌは、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール部分を表す、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４７】
Ｐｏｌは、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールの１０〜３０の反復単位を表す、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４８】
Ｐｏｌは、ポリエチレングリコールの１０〜３０の反復単位を表す、請求項４７に記載の化合物。
【請求項４９】
Ｐｏｌは、ポリエチレングリコールの１５〜２５の反復単位を表す、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５０】
Ａ２は、基−Ｙ２−Ｘ２−を表し、
Ｘ２は、結合または−Ｃ（Ｏ）２−を表し、
Ｙ２は、結合または任意に置換された−アリーレン−（（Ｃ１）アルキレン）−または−ヘテロアリーレン−（（Ｃ１）アルキレン）−を表し、
Ｘ２及びＹ２の両方が結合を表さない、請求項３７〜４９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５１】
Ｙ２は、任意に置換された−アリーレン−（（Ｃ１）アルキレン）−を表す、請求項５０に記載の化合物。
【請求項５２】
前記自壊性リンカーは、以下からなる群、
【化１０】
2018535198.tif 000054
から選択され、
式中、
Ｒ５は、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたはヘテロシクロアルキルを表し、
Ｒ７は、Ｈ、ハロ、−Ｃ（Ｏ）２Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、ジ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）アミノ、−ＮＯ２、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ３を表し、
ｑは、１または２である、請求項５１に記載の化合物。
【請求項５３】
Ｒ７は、Ｈである、請求項５２に記載の化合物。
【請求項５４】
前記自壊性リンカーは、
【化１１】
2018535198.tif 000055
である、請求項５２に記載の化合物。
【請求項５５】
前記自壊性リンカーは、
【化１２】
2018535198.tif 000056
から選択され、
式中、
Ｒ５は、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたはヘテロシクロアルキルを表し、
ｎは、１または２である、請求項３７〜４９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５６】
前記ファルマコフォアは、鎮痙剤、麻酔剤、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）のような抗炎症剤、抗癌治療薬、カルシウムチャネル遮断剤、抗生物質剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗増殖剤、抗菌剤、神経成長誘導剤、または平滑筋弛緩剤である、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５７】
前記ファルマコフォアは、抗癌治療薬である、請求項５６に記載の化合物。
【請求項５８】
前記抗癌治療薬は、アクチノマイシンＤ、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ベラクトシンＡ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルフィルゾミブ、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デメトキシビリジン、デキサメタゾン、ジクロロアセテート、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エポキソミシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フェルタミドＢ、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イクサベピロン、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、ロニダミン、マリゾミブ、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトホルミン、メトトレキサート、メチルプレドニゾロン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、モノメチルアウリスタチン、ニルタミド、ノルコダゾール、オクトレオチド、オムラリド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペントスタチン、ペリホシン、プリカマイシン、ポマリドマイド、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロライド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＭＧ−１３２、ＰＳＩ，ＣＥＰ−１８７７０、ＭＬＮ−２２３８、ＭＬＮ−９７０８、ＮＣ−００５、ＹＵ−１０１、ＬＵ−００５、ＹＵ−１０２、ＮＣ−００１、ＬＵ−００１、ＮＣ−０２２、ＰＲ−９５７（ＬＭＰ７）、ＣＰＳＩ（β５）、１０ＬＭＰ２−ｓｐ−ｅｋ、ＢＯＤＩＰＹ−ＮＣ−００１、アジド−ＮＣ−００２、ＯＮＸ−０９１２、ＰＳ−５１９，１２５Ｉ−ＮＩＰ−Ｌ３ＶＳ、ＮＣ−００５−ＶＳ、またはＭＶ１５１である、請求項５７に記載の化合物。
【請求項５９】
前記抗癌治療薬は、ドキソルビシンである、請求項５８に記載の化合物。
【請求項６０】
Ｄは、以下からなる群、
【化１３−１】
2018535198.tif 000057
【化１３−２】
2018535198.tif 000058
【化１３−３】
2018535198.tif 000059
【化１３−４】
2018535198.tif 000060
【化１３−５】
2018535198.tif 000061
【化１３−６】
2018535198.tif 000062
から選択されるファルマコフォアを表す、請求項３７〜５８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６１】
Ｄは、以下からなる群、
【化１４−１】
2018535198.tif 000063
【化１４−２】
2018535198.tif 000064
から選択されるファルマコフォアを表す、請求項３７〜５８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６２】
【化１５】
2018535198.tif 000065
で表され、式中、ｊは、１０〜３０の整数である、請求項３７に記載の化合物。
【請求項６３】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容される賦形剤または担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項６４】
癌細胞の表面上にアジド糖を発現させる方法であって、
癌細胞を請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させ、それによって前記癌細胞の前記表面上に前記アジド糖を発現させることを含む、方法。
【請求項６５】
哺乳動物における悪性組織にアジド糖を発現させる方法であって、悪性組織を有する哺乳動物に、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項６６】
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項６７】
前記対象に、請求項３７〜６２のいずれか１項に記載の化合物の治療有効量を投与することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項６８】
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項３７〜６２のいずれか１項に記載の化合物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１５年１０月７日に出願された米国仮特許出願第６２／２３８，３２６号に対する優先権の利益を主張し、前記出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
癌を標的とした治療は、癌における薬物の蓄積を改善し、身体の他の部分への望ましくない曝露を最小限に抑えるために、長い間追求されてきた。重要な課題は、癌組織における独特な受容体の同定、及び対応する標的指向化リガンド（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）の開発にある。いくつかのタイプの標的指向化リガンドが開発されており、小分子、ペプチド、及びアプタマーが含まれる。しかしながら、それらの対応する受容体は癌特異的であることは稀であり、タンパク質受容体とこれらのリガンドとの間の結合親和性は比較的低い。これまでに開発された最も有望な標的指向化リガンドはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。この領域の進歩により、細胞外／細胞表面タンパク質に特異的なｍＡｂを作製することが可能になり、いくつかの癌占有タンパク質（ｃａｎｃｅｒ−ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が同定されている。臨床で最も成功した標的指向化リガンドであるにもかかわらず、ｍＡｂは、高い製造コスト、大きなサイズ、重篤な免疫原性、受容体飽和、及び乏しい固形腫瘍浸透などの複数の欠点を有する。さらに、標的タンパク質受容体は癌よって異なるので、開発された各ｍＡｂは特定のタイプの癌に対してのみうまく機能する。
【０００３】
注目すべきことに、既存のすべてのアクティブ標的指向化戦略の共通の特徴は、細胞表面タンパク質が標的とみなされることである。この選択は、タンパク質が標的指向化リガンドとの特異的結合のための複数の疎水性及び荷電部位を提供するので理にかなっている。しかし、細胞表面タンパク質の数密度は、細胞膜上の他の２つの主要成分である糖及び脂質と比較して、はるかに低い。表面ペンダント糖は有望な標的であり、細胞認識及びコミュニケーションの調節において極めて重要な役割を果たすことが既に知られている。非天然糖（例えば、テトラアセチルＮ−アジドアセチルマンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＡｚ））は、細胞表面上で代謝的に発現され得ることが最近発見された１−１１。しかし、これらの非天然糖の代謝標識プロセスは、正常細胞及び癌細胞において生じるので、この代謝標識プロセスを癌細胞に対して選択的または排他的にレンダリングすることには重大な課題が存在する。
【０００４】
したがって、癌細胞の細胞表面上で選択的に代謝的に発現され得る糖を開発する必要が存在する。また、選択的代謝標識プロセスを利用することができる、癌を治療するためのさらなる薬剤及び方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一態様は、癌細胞の細胞表面上のアジド糖（例えば、アジドシアル酸、図を参照のこと）を発現させるのに有用な組成物及び方法を提供する。したがって、本発明の一態様は、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシル部分、トリガーによって切断されるトリガー応答性部分、及び自壊性リンカーを含む化合物であって、前記自壊性リンカーが、前記マンノピラノシル部分及び前記トリガー応答性部分に共有結合している、化合物、またはその薬学的に許容される塩である。
【０００６】
特定の態様では、そのような化合物は、式（Ｉ）で表され、
【化１】
2018535198.tif 000003
式中、
Ｒ１は、Ｈまたはトリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリルを表し、
Ｒ２は、出現毎に独立して、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ３及びＲ４は、出現毎に独立して、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ａ１は、前記自壊性リンカーを表し、
ｍは、１、２、または３である、化合物、またはその薬学的に許容される塩である。
【０００７】
他の態様において、本発明は、式（ＩＩＩ）で表され、
【化２】
2018535198.tif 000004
式中、
Ｋは、任意に置換されたシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニル、またはアルキニル部分を表し、
Ｐｏｌはポリマー部分を表し、
Ｐｅｐはアミノ酸またはオリゴペプチド配列を表し、
Ａ２は自壊性リンカーを表し、
Ｄはファルマコフォアを表し、
前記ポリマー部分はポリアルキレングリコールまたはポリアルキレンイミドであり、
前記アミノ酸またはオリゴペプチド配列は、（ｉ）対応する健常細胞と比較して悪性細胞で過剰発現する酵素によって、または（ｉｉ）対応する健常細胞で発現せず悪性細胞で発現する酵素によって切断されるアミド結合を含む、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００８】
他の態様では、本発明は、本発明の化合物（例えば、式（Ｉ）または式（ＩＩＩ）の化合物）及び薬学的に許容される賦形剤または担体を含む薬学的組成物を提供する。
【０００９】
他の態様では、本発明は、哺乳動物の悪性組織中のアジド糖（例えば、アジドシアル酸）を発現させる方法であって、悪性組織を有する哺乳動物に、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシル部分、トリガーによって切断されるトリガー応答性部分、及び自壊性リンカーを含む化合物（例えば、式（Ｉ）の化合物）の有効量を投与することを含む、方法に関する。
【００１０】
他の態様において、本発明は、癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシル部分、トリガーによって切断されるトリガー応答性部分、及び自壊性リンカーを含む化合物（例えば、式（Ｉ）の化合物）を投与することを含む、方法に関する。
【００１１】
他の態様において、本発明は、癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の式（ＩＩＩ）の化合物を投与することを含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ａｃ４ＭａｎＡｚの代謝的標識化プロセスとＡｃ３ＭａｎＡｚ誘導体のトリガー活性化標識化プロセスを示すスキームである。Ｐは保護基を表す。
【図２】パネルａ〜ｅで構成される。パネル（ａ）は、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢを含むＡｃ３ＭａｎＡｚ誘導体の合成経路を示す。パネル（ｂ）は、Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢのＵＶ照射により活性化された代謝標識化及びその後の銅フリークリックケミストリーによるＤＢＣＯ−Ｃｙ５によるアジド基の検出を示すスキームである。パネル（ｃ）は、５０μＭのＡｃ４ＭａｎＡｚ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢ−ＵＶ、またはＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢ＋ＵＶと共に７２時間インキュベートした後、続いて５０μＭのＤＢＣＯ−Ｃｙ５と共にさらに１時間インキュベートしたＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞のＣＬＳＭ画像を含む。強度１０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。スケールバーは１０μｍを表す。パネル（ｄ）は、異なる群、Ａｃ４ＭａｎＡｚ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢ−ＵＶ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢ＋ＵＶ及びＰＢＳについてのＬＳ１７４Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。パネル（ｅ）は、５０μＭのＡｃ４ＭａｎＡｚ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢ−ＵＶ、及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢ＋ＵＶでそれぞれ７２時間処理したＬＳ１７４Ｔ細胞のウェスタンブロット分析である。
【図３】パネルａ〜ｄで構成される。Ａｃ４ＭａｎＡｚ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ、及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢのインビボ標識化研究を示す。パネル（ａ）は、インビボ標識化研究の時間軸である。糖−Ｎ３を１日１回、３日間、左の腫瘍に注射し、続いてＤＢＣＯ−Ｃｙ５で検出した。右の腫瘍を対照としてＰＢＳで前処置した。パネル（ｂ）は、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５の静脈内注射の４８時間後に、Ａｃ４ＭａｎＡｚ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ、及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢでそれぞれ前処置したマウスのインビボ全身蛍光イメージングを示す一連の画像である。腫瘍は黄色の矢印で示された。パネル（ｃ）は、腫瘍及び主要臓器（１−肝臓、２−脾臓、３−心臓、４−腎臓、５−腎臓、６−肺、７−右腫瘍、８−左腫瘍）のエクスビボ蛍光イメージングを描いた一連の画像である。パネル（ｄ）は、異なる群からの腫瘍の蛍光強度の定量を示すグラフである（Ｒは右の腫瘍を表し、Ｌは左の腫瘍を意味する）。蛍光強度をスケールドカウント／秒に正規化した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として提示し、一元配置分散分析によって分析した（Ｆｉｓｈｅｒ、０．０１＜＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）。
【図４】３つのパネルで構成される。パネル（ａ）は、従来のプロドラッグ系で使用される２つの従来型自壊性リンカー（ＣＬ１及びＣＬ２）の使用を示すスキームを示す。パネル（ｂ）は、ＣＬ２由来の第１の提案リンカーＰＬ１を示す。パネル（ｃ）は、ＰＬ１から改変された第２の提案リンカー（ＰＬ２）を示す。付加的なフェニル環は、切断された生成物を安定化させ、したがって分解プロセスを促進する。
【図５】制御された細胞標識化のための、トリガー活性化可能なＡｃ３ＭａｎＡｚ誘導体（Ｈ２Ｏ２応答性Ａｃ３ＭａｎＡｚＢＢ、低酸素応答性Ａｃ３ＭａｎＡｚＡＢ、ＮＱＯ１応答性Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱ、及びＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ応答性Ｅ−Ｓ）のライブラリーを示す。
【図６】インビトロでのＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ応答性Ｅ−Ｓ媒介性の制御された細胞標識化を示す。パネル（ａ）は、ＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ誘導Ｅ−Ｓ分解の模式図を示す。パネル（ｂ）は、５０μＭのＥ−Ｓ、５０μＭのＥ−Ｓ＋１μＭのＴＳＡ及び５０μＭのＥ−Ｓ＋５０μＭのＺ−ＦＹ−ＣＨＯとそれぞれ７２時間インキュベートし、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５（５０μＭ）で１時間標識した後のＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞及び４Ｔ１乳癌細胞の一連のＣＬＳＭ画像である。細胞核をＤＡＰＩで染色した。スケールバーは１０μｍを表す。パネル（ｃ）は、５０μＭＥ−ＳまたはＰＢＳと共に７２時間インキュベートし、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５で１時間標識した後のＩＭＲ−９０ヒト線維芽細胞のＣＬＳＭ画像を含む。細胞核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１０μｍ。パネル（ｄ）は、異なる処理を行ったＬＳ１７４Ｔ細胞またはＩＭＲ−９０細胞の平均Ｃｙ５蛍光強度を示す棒グラフである。データを平均±ＳＥＭとして提示し、一元配置分散分析によって分析した（Ｆｉｓｈｅｒ、０．０１＜＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）。パネル（ｅ）は、Ｅ−Ｓ、Ｅ−Ｓ＋ＴＳＡ、Ｅ−Ｓ＋Ｚ−ＦＹ−ＣＨＯ及びＰＢＳでそれぞれ処理したＬＳ１７４Ｔ細胞のウェスタンブロット分析である。ゲルをランニングする前に、細胞溶解物をＤＢＣＯ−Ｃｙ５と共に３７℃で１時間、インキュベートした。タンパク質バンドを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０１０システムを用いて可視化した。パネル（ｆ）は、ＬＳ１７４Ｔ細胞における濃度及び時間依存性のＥ−Ｓ標識化を示すグラフである。細胞を異なる時間（０時間、１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間）について、様々な濃度のＥ−Ｓ（１０μＭ、５０μＭ、２００μＭ及び１ｍＭ）で処理し、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５（５０μＭ）で２時間標識した。
【図７】インビボでのＥ−Ｓ媒介性選択的腫瘍標識化を示す一連の画像である。パネル（ａ）は、インビボ標識化研究の時間軸を示す。Ｅ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）またはＡｃ４ＭａｎＡｚ（４０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを３日間毎日１回静脈内注射した。アジド基の代謝発現を、ウェスタンブロット分析によって、または静脈内に注射したＤＢＣＯ−Ｃｙ５（１０ｍｇ／ｋｇ）の生体内分布をモニターすることによって分析した。パネル（ｂ）は、Ｅ−Ｓ、Ａｃ４ＭａｎＡｚ及びＰＢＳで毎日１回３日間それぞれ処置したマウスから採取した組織のウェスタンブロット分析を含む。パネル（ｃ）は、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５の注射後２４時間で、それぞれＥ−Ｓ及びＰＢＳで前処理したマウスのエクスビボ全身蛍光イメージングを示す画像である。腫瘍は黄色の矢印で示された。パネル（ｄ）は、腫瘍及び器官の蛍光強度の定量化を示す棒グラフである。パネル（ｅ）は、それぞれＥ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射８時間後、１２時間後及び２４時間後の胸腺欠損ヌードマウスから採取した腫瘍組織切片のＣＬＳＭ画像である。腫瘍組織切片をＤＢＣＯ−Ｃｙ５で３０分間標識した。スケールバー：１０μｍ。パネル（ｆ）は、Ｅ−Ｓ注射後の異なる時点で採取した腫瘍組織切片の正規化平均Ｃｙ５蛍光強度を示す棒グラフである。パネル（ｇ）は、異なる数のＥ−Ｓ用量で処置したマウス由来の腫瘍組織切片の標準化されたＣｙ５蛍光強度を示す棒グラフである。すべての数値データを平均±ＳＥＭとして提示し、一元配置分散分析によって分析した（Ｆｉｓｈｅｒ、０．０１＜＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）。
【図８】パネルａ〜ｆから構成され、Ｅ−Ｓ媒介性腫瘍標識化が、ＬＳ１７４Ｔ原発腫瘍モデルに対するＤＢＣＯ−薬物コンジュゲートの抗腫瘍効果を改善したことを実証する。パネル（ａ）は、カテプシンＢ応答性ＤＢＣＯ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＤＯＸＯ（Ｄ−Ｄ）の構造を示す。パネル（ｂ）は、急性抗腫瘍効果研究における異なる群のＬＳ１７４Ｔ腫瘍の代表的なＴＵＮＥＬ染色切片を示す一連の画像である。スケールバー：５０μｍ。パネル（ｃ）は、ＩｍａｇｅＪを介したＴＵＮＥＬ染色の定量を示す棒グラフである。アポトーシス指数は、総細胞数（ＤＡＰＩ）に対するアポトーシス細胞数（ＴＵＮＥＬ）の比として決定した。１腫瘍あたり２０個の組織切片をカウントした、ｎ＝４。パネル（ｄ）は、長期有効性試験の経過中の各群の平均腫瘍サイズを示すグラフである。パネル（ｅ）は、すべてのグループのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを含む。マウスの喪失は、処置に関連する死または治療に関連しない死亡または所定の終点に達した後の安楽死のためであった。パネル（ｆ）は、各群の胸腺欠損ヌードマウスの生存分析を含む。ＴＴＥ：終了点までの時間。ＴＧＤ：腫瘍増殖遅延；ＴＧＤ＝ＴＴＥ（処置群）−ＴＴＥ（ＰＢＳ群）。％ＴＧＤ＝１００％×ＴＧＤ／ＴＴＥ（ＰＢＳ群）。すべての数値データを平均±ＳＥＭとして提示し、一元配置分散分析によって分析した（Ｆｉｓｈｅｒ、０．０１＜＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）。
【図９】パネルａ〜ｇから構成され、Ｅ−Ｓ媒介性腫瘍標識化が４Ｔ１転移性腫瘍モデルに対するＤＢＣＯ−薬物コンジュゲートの改善された抗腫瘍効果を示すことを実証する。パネル（ａ）は有効性研究の時間枠を示す。４Ｔ１転移性腫瘍は、ルシフェラーゼ操作された４Ｔ１乳癌細胞を静脈内注射することによりＢａｌｂ／ｃマウスで確立した。Ｅ−Ｓは毎日１回、３日間（１日目、２日目、及び３日目）静脈内注射し、薬物は４日目、８日目、及び１２日目に静脈内注射により投与した。パネル（ｂ）は、それぞれ、５日目、９日目、及び１３日目に異なる処置を施したＢａｌｂ／ｃマウスのバイオルミネセンスイメージングを示す。パネル（ｃ）は、経時的に異なる処置をしたマウスの積分されたバイオルミネセンス強度の変化を示すグラフである。パネル（ｄ）は、異なる群からの肺組織の平均腫瘍数を示すグラフである。パネル（ｅ）は、異なる群からの肺組織の代表的な写真を示す。パネル（ｆ）は、異なる群についての全肺組織面積に対する腫瘍表面積のパーセンテージを示す棒グラフである。パネル（ｇ）は、骨髄及び脾臓切片の代表的な画像を含み、遊離Ｄｏｘｏと比較してＥ−Ｓ＋Ｄ−Ｄ群の全身毒性が有意に低下したことを示す。すべての数値データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝７〜８）として提示し、一元配置分散分析によって分析した（Ｆｉｓｈｅｒ、０．０１＜＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）。
【図１０】パネルａ〜ｄから構成される。パネルは、（ａ）５０μＭのＥ−Ｓ、５０μＭのＥ−Ｓ＋１μＭのＴＳＡ、及び５０μＭのＥ−Ｓ＋５０μＭのＺ−ＦＹ−ＣＨＯでそれぞれ７２時間インキュベートし、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５を用いて１時間標識した後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のＣＬＳＭ画像を示し、細胞核及び細胞膜をＤＡＰＩ及びＣｅｌｌＭａｓｋ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔａｉｎでそれぞれ染色した。スケールバー：１０μｍ。パネル（ｂ）は、５０μＭのＥ−Ｓ、５０μＭのＥ−Ｓ＋１μＭのＴＳＡ及び５０μＭのＥ−Ｓ＋５０μＭのＺ−ＦＹ−ＣＨＯでそれぞれ７２時間インキュベートし、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５で１時間標識した後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の平均Ｃｙ５蛍光強度を示す棒グラフである。パネル（ｃ）は、異なるインキュベーション時間（３０分、１時間及び２時間）にわたるＥ−Ｓ前処理（７２時間）の有りまたは無しでの、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞によるＤ−Ｄ取り込みを示す棒グラフである。すべての数値データを平均±ＳＥＭとして提示し、一元配置分散分析によって分析した（Ｆｉｓｈｅｒ、０．０１＜＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）。
【図１１】パネルａ〜ｆから構成され、皮下に移植されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスにおけるＥ−Ｓ＋Ｄ−Ｄの長期抗腫瘍効果研究の結果を示す。パネル（ａ）は、腫瘍減少研究の時間枠を示す。Ｅ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）を０日目、１日目及び２日目に静脈内注射した。Ｄ−Ｄ（ＤＯＸＯ当量で１２ｍｇ／ｋｇ）を３、７及び１１日目に静脈内注射した。マウスの腫瘍サイズ、体重、及び食物摂取量を詳細にモニターした。パネル（ｂ）は、各群の平均ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍サイズを長期有効性試験の経過にわたってグラフ化する。データは、平均±ＳＥＭとして示した。有意差分析は、一元配置分散分析（Ｆｉｓｈｅｒ、０．０１＜＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）により行った。パネル（ｃ）は、すべての群についてＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを含む。マウスの喪失は、処置に関連する死または治療に関連しない死亡または所定の終点に達した後の安楽死のためであった。パネル（ｄ）は、各群の胸腺欠損ヌードマウスの生存分析を提供する。ＴＴＥ：終点までの時間。ＴＧＤ：腫瘍増殖遅延、ＴＧＤ＝ＴＴＥ（処置群）−ＴＴＥ（ＰＢＳ群）。％ＴＧＤ＝１００％×ＴＧＤ／ＴＴＥ（ＰＢＳ群）。パネル（ｅ）は、有効性試験の経過中の異なる群のマウスの体重を示すチャートである。２匹以上のマウスが死亡または屠殺された場合、曲線をトランケートした。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
癌を標的とした治療は、癌における薬物の蓄積を改善し、身体の他の部分への望ましくない曝露を最小限に抑えるために、長い間追求されてきた。しかしながら、既存の癌標的化技術は、治療用途には満足できるものではない。現存する癌標的化戦略のほとんどは標的として癌細胞表面タンパク質を利用するが、細胞表面密度が高いために、癌細胞表面糖を治療標的として探索しようとした。非天然糖の代謝的グリコエンジニアリングプロセスは、細胞内在化、細胞融合、及び細胞標的化などの他の困難な細胞生物学的問題の詳細な研究を可能にする、細胞表面に化学基を導入する容易な方法を提供する。癌細胞表面糖の制御された標識化、及びこのような癌標的指向化能力を利用するさらなる治療組成物及び方法を容易にする化合物及び方法が本明細書に開示される。
【００１４】
本発明の根底にある原理は、アジド糖の代謝標識化能力が構造の観点から制御され得ることを実証する。Ａｃ４ＭａｎＡｚの代謝ラベリングプロセスを図１に示す。Ａｃ４ＭａｎＡｚは、細胞に入る際に非特異的エステラーゼによって加水分解され、続いて６−ＯＨのリン酸化及び開環異性化が行われる。次いで、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は新しく形成されたカルボニル基を攻撃してシアル酸を形成し、次いで（１）リン酸基を奪われ、（２）タンパク質にコンジュゲートし、そして最後に（３）糖タンパク質の形態で細胞表面上に発現される。開環異性化工程は、代謝標識化の成功に不可欠であり、開環異性化を成功させるためには、Ｃ１部位（１−ＯＨ）におけるヒドロキシル基の曝露が必要であることが予想される。本発明者らは、驚くべきことに、細胞エステラーゼに生存するグリコシド結合を形成することによってＡｃ４ＭａｎＡｚのＣ１部位を改変することにより、開環異性化工程が妨げられ、したがって代謝標識化過程全体がブロックされることを発見した。特定のトリガーの存在下で１−ＯＨを曝露できるトリガー反応性グリコシド（エーテル）結合を設計することにより、代謝標識化プロセスを制御することができる。特定の癌関連トリガーに応答するＡｃ３ＭａｎＡｚ誘導体を使用することによって、癌選択的化学標識化を潜在的に達成することができる。例示的な癌関連トリガーは、酸化還元調節不全、上昇した酸化剤レベル、及び過剰発現した酵素を含み得る。
【００１５】
本発明の化合物
本発明の一態様は、
任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシル部分と、
トリガーによって切断されるトリガー応答性部分と、
自壊性リンカーと、を含む化合物であって、
前記自壊性リンカーが、前記マンノピラノシル部分及び前記トリガー応答性部分に共有結合している、化合物、またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００１６】
特定の実施形態では、トリガーは、健康な組織と比較して癌性組織において高められ、過剰発現され、さもなければ増強される。
【００１７】
特定の実施形態において、トリガーは、細胞過酸化物である。
【００１８】
特定のこのような実施形態では、トリガー応答性部分は、ボロン酸基、ジアルキルボロネート基、ジアリールボロネート基、ジ（アラルキル）ボロネート基、ボロラン基またはジオキサボロラン基を含む。例示的な実施形態を図５に示す。
【００１９】
このような特定の実施形態では、細胞過酸化物によるトリガー応答性部分の切断時に、自壊牲リンカーが分解し、それによって任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシドを放出する。
【００２０】
別の実施形態では、トリガーは、低酸素である。
【００２１】
特定のそのような実施形態において、トリガー応答性部分は、２−ニトロイミダゾール部分またはアゾベンゼンなどのアゾ基を含む。例示的な実施形態を図５に示す。
【００２２】
このような特定の実施形態では、低酸素条件下でトリガー応答部分を切断時に、自壊牲リンカーが分解し、それによって任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシドを放出する。
【００２３】
別の実施形態では、トリガーは、スルフヒドリルまたはチオレート含有化合物、例えばグルタチオンである。
【００２４】
特定のそのような実施形態では、トリガー応答性部分は、ジスルフィド結合を含む。例示的な実施形態を以下に示す。
【化３】
2018535198.tif 000005
【００２５】
このような特定の実施形態では、スルフヒドリルまたはチオレート含有化合物によるジスルフィド結合の切断時に、自壊性リンカーが分解し、それによって、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシドを放出する。
【００２６】
別の実施形態では、トリガーは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン１）（ＮＱＯ１）である。
【００２７】
このような特定の実施形態では、トリガー応答性部分は、任意に置換されたプロピオン酸またはプロピオンアミド部分に共有結合している、任意に置換されたキノンを含む。例示的な実施形態を図５に示す。
【００２８】
このような特定の実施形態では、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン１）（ＮＱＯ１）によって任意に置換されたプロピオン酸またはプロピオンアミド部分に共有結合している任意置換されたキノンの切断時に、自壊性リンカーが分解し、それによって、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシドを放出する。
【００２９】
特定の実施形態では、トリガーは、カテプシン酵素である。
【００３０】
特定のこのような実施形態では、トリガー応答性部分は、カテプシン酵素によって切断されるアミド結合を含むアミノ酸またはオリゴペプチド配列である。
【００３１】
さらなる実施形態では、トリガー応答性基は、イミン、アセタール、ケタールまたはカルバメートなどの酸感受性部分を含む。例示的なトリガー応答性基は、以下に示す実施形態に示される：
【化４】
2018535198.tif 000006
【００３２】
このような特定の実施形態では、アミド結合を含むアミノ酸またはオリゴペプチド配列は、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ（ＮＯ２）、Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｔｓ）を含む。Ｃｉｔは、シトルリンを表し、Ｔｓは、トシレート保護基を表す。
【００３３】
特定の実施形態では、アミノ酸またはオリゴペプチド配列は、置換リシンアミドである。
【００３４】
このような特定の実施形態では、カテプシン酵素によるアミド結合の切断時に、自壊性リンカーが分解し、それによって任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシドを放出する。
【００３５】
特定の実施形態では、カテプシン酵素は、カテプシンＬである。
【００３６】
特定の実施形態では、化合物は、式（Ｉ）で表され、
【化５】
2018535198.tif 000007
式中、
Ｒ１は、Ｈまたはトリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリルを表し、
Ｒ２は、出現毎に独立して、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ３及びＲ４は、出現毎に独立して、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ａ１は、前記自壊性リンカーを表し、
ｍは、１、２、または３である、化合物、またはその薬学的に許容される塩で表される。
【００３７】
特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｈを表す。
【００３８】
特定の実施形態では、Ｒ２は、出現毎に独立して、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３を表す。
【００３９】
特定の実施形態では、Ｒ２のすべての出現が同一である。
【００４０】
特定の実施形態では、Ｒ３及びＲ４は、Ｈである。
【００４１】
特定の実施形態では、ｍは、１である。
【００４２】
本発明の化合物は、マンノピラノシル部分及びトリガー応答性部分に間隔を空けて一緒に共有結合させる自壊性リンカーを含む。自壊性リンカーは、２つの間隔を置いた化学的部分（すなわち、マンノピラノシル部分及びトリガー応答性部分）を、通常安定な３部分分子へ一緒に共有結合させることができる二官能性化学的部分である。自壊性リンカーは、トリガー誘発性切断（例えば、酵素切断）によって３部分分子から間隔を置いた化学的部分の１つを放出させることができ、そのような切断は、分子の残りの部分から自然に切断して、間隔を置いた化学的部分の他方を放出することができる。
【００４３】
特定の実施形態では、
Ａ１は、基−Ｘ１−Ｙ１−を表し、
Ｘ１は、結合または−Ｃ（Ｏ）２−を表し、
Ｙ１は、結合または任意に置換された−（（Ｃ１）アルキレン）−アリーレン−または−（（Ｃ１）アルキレン）−ヘテロアリーレン−を表し、
Ｘ１及びＹ１の両方が結合を表さない。
【００４４】
特定の実施形態では、Ｙ１は、任意に置換された−（（Ｃ１）アルキレン）−アリーレン−を表す。
【００４５】
特定の実施形態では、自壊性リンカーは、
【化６】
2018535198.tif 000008
からなる群から選択され、
式中、
Ｒ５は、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、またはヘテロシクロアルキルを表し、
Ｒ７は、Ｈ、ハロ、−Ｃ（Ｏ）２Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、ジ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）アミノ、−ＮＯ２、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ３を表し、
ｑは、１または２である。
【００４６】
特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。
【００４７】
特定の実施形態では、前記自壊性リンカーは、
【化７】
2018535198.tif 000009
である。
【００４８】
特定の実施形態では、自壊性リンカーは、
【化８】
2018535198.tif 000010
である。
【００４９】
特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。
【００５０】
別の実施形態では、自壊性リンカーは、
【化９】
2018535198.tif 000011
から選択され、
式中、
Ｒ５は、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、またはヘテロシクロアルキルを表し、
ｎは、１または２である。
【００５１】
特定の実施形態では、癌細胞の細胞表面上のアジド糖（例えば、アジドシアル酸）を発現するための化合物は、式（ＩＩ）で表され、
【化１０】
2018535198.tif 000012
式中、Ｒ７は、Ｈ、ハロ、−Ｃ（Ｏ）２Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、ジ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）アミノ、−ＮＯ２、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ３を表し、
ｑは、１または２である、化合物、またはその薬学的に許容される塩である。
【００５２】
さらなる実施形態では、化合物は、式（ＩＩ’）で表される化合物、
【化１１】
2018535198.tif 000013
またはその薬学的に許容される塩である。
【００５３】
さらなるこのような実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。
【００５４】
他の態様では、本発明は、アジド糖（例えばアジドシアル酸）を細胞表面に発現する治療薬を細胞に選択的に送達することができる化合物に関する。したがって、特定の実施形態において、本発明は、式（ＩＩＩ）で表され、
【化１２】
2018535198.tif 000014
式中、
Ｋは、任意に置換されたシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニル、またはアルキニル部分を表し、
Ｐｏｌは、ポリマー部分を表し、
Ｐｅｐは、アミノ酸またはオリゴペプチド配列を表し、
Ａ２は、自壊性リンカーを表し、
Ｄは、ファルマコフォアを表し、
前記ポリマー部分はポリアルキレングリコールまたはポリアルキレンイミドであり、
前記アミノ酸またはオリゴペプチド配列は、（ｉ）対応する健常細胞と比較して悪性細胞で過剰発現する酵素によって、または（ｉｉ）対応する健常細胞で発現せず悪性細胞で発現する酵素によって切断されるアミド結合を含む、化合物に関する。
【００５５】
特定の実施形態では、酵素によるアミド結合の切断時に、自壊牲リンカーが分解し、それによってファルマコフォアを放出する。
【００５６】
特定の実施形態では、酵素は、カテプシン酵素である。例えば酵素はカテプシンＢである。
【００５７】
特定の実施形態では、Ｐｅｐは、任意に置換されたＶａｌ−Ｃｉｔを表す。
【００５８】
特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＶ）で表され、
【化１３】
2018535198.tif 000015
式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、出現毎に独立して、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表す。
【００５９】
特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｈである。
【００６０】
特定の実施形態では、Ｋは、任意に置換されたヘテロシクロアルキニルまたはシクロアルキニルを含む。特定の実施形態では、Ｋは、任意に置換されたジベンゾシクロオクタン部分を含む。
【００６１】
特定の実施形態では、Ｐｏｌは、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール部分を表す。
【００６２】
特定の実施形態では、Ｐｏｌは、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールの１０〜３０の反復単位を表す。
【００６３】
特定の実施形態では、Ｐｏｌは、ポリエチレングリコールの１０〜３０の反復単位、またはポリエチレングリコールの１５〜２５の反復単位を表す。
【００６４】
特定の実施形態では、
Ａ２は、基−Ｙ２−Ｘ２−を表し、
Ｘ２は、結合または−Ｃ（Ｏ）２−を表し、
Ｙ２は、結合または任意に置換された−アリーレン−（（Ｃ１）アルキレン）−または−ヘテロアリーレン−（（Ｃ１）アルキレン）−を表し、
Ｘ２及びＹ２の両方が結合を表さない。
【００６５】
特定の実施形態では、Ｙ２は、任意に置換された−アリーレン−（（Ｃ１）アルキレン）−を表す。
【００６６】
特定の実施形態では、自壊性リンカーは、以下からなる群、
【化１４】
2018535198.tif 000016
から選択され、
式中、
Ｒ５は、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたはヘテロシクロアルキルを表し、
Ｒ７は、Ｈ、ハロ、−Ｃ（Ｏ）２Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、ジ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）アミノ、−ＮＯ２、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ３を表し、
ｑは、１または２である。
【００６７】
特定の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。
【００６８】
特定の実施形態では、自壊性リンカーは、
【化１５】
2018535198.tif 000017
である。
【００６９】
別の実施形態では、自壊性リンカーは、以下から選択され、
【化１６】
2018535198.tif 000018
式中、
Ｒ５は、Ｈ、トリ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）シリル、または−Ｃ（Ｏ）（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）を表し、
Ｒ６は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたはヘテロシクロアルキルを表し、
ｎは、１または２である。
【００７０】
特定の実施形態において、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）の化合物のファルマコフォアは、鎮痙剤、麻酔剤、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、抗癌治療薬、カルシウムチャネル遮断薬、抗生物質製剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗増殖剤、抗菌剤、神経成長誘導剤、または平滑筋弛緩剤を含む。
【００７１】
特定の実施形態では、ファルマコフォアは、抗癌治療薬である。
【００７２】
特定の実施形態では、抗癌治療薬は、アクチノマイシンＤ、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ベラクトシンＡ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルフィルゾミブ、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デメトキシビリジン、デキサメタゾン、ジクロロアセテート、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エポキソミシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フェルタミドＢ、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イクサベピロン、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、ロニダミン、マリゾミブ、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトホルミン、メトトレキサート、メチルプレドニゾロン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、モノメチルアウリスタチン、ニルタミド、ノルコダゾール、オクトレオチド、オムラリド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペントスタチン、ペリホシン、プリカマイシン、ポマリドマイド、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロライド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＭＧ−１３２、ＰＳＩ，ＣＥＰ−１８７７０、ＭＬＮ−２２３８、ＭＬＮ−９７０８、ＮＣ−００５、ＹＵ−１０１、ＬＵ−００５、ＹＵ−１０２、ＮＣ−００１、ＬＵ−００１、ＮＣ−０２２、ＰＲ−９５７（ＬＭＰ７）、ＣＰＳＩ（β５）、１０ＬＭＰ２−ｓｐ−ｅｋ、ＢＯＤＩＰＹ−ＮＣ−００１、アジド−ＮＣ−００２、ＯＮＸ−０９１２、ＰＳ−５１９、１２５Ｉ−ＮＩＰ−Ｌ３ＶＳ、ＮＣ−００５−ＶＳ、またはＭＶ１５１である。
【００７３】
特定の実施形態では、抗癌治療薬は、ドキソルビシンである。
【００７４】
式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）の化合物の特定の実施形態において、Ｄは、以下からなる群、
【化１７−１】
2018535198.tif 000019
【化１７−２】
2018535198.tif 000020
【化１７−３】
2018535198.tif 000021
【化１７−４】
2018535198.tif 000022
【化１７−５】
2018535198.tif 000023
【化１７−６】
2018535198.tif 000024
から選択されるファルマコフォアを表す。
【００７５】
別の実施形態では、Ｄは、以下からなる群、
【化１８−１】
2018535198.tif 000025
【化１８−２】
2018535198.tif 000026
から選択されるファルマコフォアを表す。
【００７６】
特定の実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、
【化１９】
2018535198.tif 000027
で表され、式中、ｊは、１０〜３０の整数である。
【００７７】
特定の態様において、本発明は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。薬学的に許容される担体は、以下に詳細に記載される。
【００７８】
治療の方法
特定の態様において、本発明は、癌細胞の表面上のアジド糖（例えば、アジドシアル酸、図を参照されたい）を発現する方法であって、
癌細胞を化合物と接触させることであって、
前記化合物は、本明細書に記載されており、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシル部分、トリガーによって切断されるトリガー応答性部分、及び自壊性リンカーを含み、前記自壊性リンカーは、マンノピラノシル部分及びトリガー応答性部分に共有結合している、接触させることと、
それによって、癌細胞の表面上にアジド糖を発現させることと、を含む、方法に関する。
【００７９】
特定の態様において、癌細胞の表面上にアジド糖を発現させる方法は、癌細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させ、それによって癌細胞の表面上にアジド糖を発現させることを含む。
【００８０】
ある態様において、本発明は、癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の化合物の治療有効量を投与することを含む、方法を提供し、この化合物は、任意に置換されたＮ−（（アジド）アシル）２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノシル部分、トリガーによって切断されるトリガー応答性部分、及び自壊性リンカーを含み、この自壊性リンカーは、マンノピラノシル部分及びトリガー応答性部分に共有結合している。
【００８１】
特定の実施形態では、癌を治療するそのような方法は、対象に、式（ＩＩＩ）の化合物の治療有効量を投与することをさらに含む。
【００８２】
特定の態様では、本発明は、癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、式（ＩＩＩ）の化合物の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
【００８３】
特定の実施形態では、癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌（カポジ肉腫及びリンパ腫）、肛門癌、虫垂癌、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌（肝外を含む）、膀胱癌、骨癌（骨肉腫及び悪性線維性組織球腫を含む）、脳腫瘍（星状細胞腫、脳及び脊髄腫瘍、脳幹膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽細胞腫、髄膜上皮腫、中分化松果体腫瘍、テント原始神経外胚葉性腫瘍及び松葉芽腫など）、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、基底細胞癌、胆管癌（外肝臓を含む）、膀胱癌、骨癌（骨肉腫及び悪性線維性組織球腫を含む）、カルシノイド腫、原発不明癌、中枢神経系（中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、胚芽腫、リンパ腫など）、子宮頸癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫及びセザリー症候群）、管、胆汁（肝外）、非湿潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、胚性腫瘍（中枢神経系）、子宮内膜癌、上衣芽細胞腫、上皮細胞腫、食道癌、星状芽細胞腫、ユーイング肉腫家族腫瘍、頭蓋外生殖細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌（眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫など）、骨の線維性組織球腫（悪性腫瘍及び骨肉腫を含む）、胆嚢癌、胃部（胃）癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍（頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、グリオーマ、毛状細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、組織球増殖症、ランゲルハンス細胞、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、島細胞腫瘍（内分泌腺、膵臓）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞を含む）、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病（急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、毛状細胞を含む）、口唇及び口腔癌（Ｏｒａｌ  Ｃａｖｉｔｙ  Ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（原発）、非湿潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺癌（非小細胞及び小細胞）、リンパ腫（エイズ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞（菌状息肉腫及びセザリー症候群）、ホジキン、非ホジキン、初中枢神経系（ＣＮＳ）、マクログロブリン血症、ワルデンシュトレーム、男性乳癌、骨及び骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫、髄上皮腫、メラノーマ（眼内（眼）を含む）、メルケル細胞癌、中皮腫（悪性）、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、ＮＵＴ遺伝子に関与するミッドライン管癌（Ｍｉｄｌｉｎｅ  Ｔｒａｃｔ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ＮＵＴ  Ｇｅｎｅ）、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／血漿細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、骨髄性白血病、慢性（ＣＭＬ）、骨髄性白血病、急性（ＡＭＬ）、骨髄腫及び多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患（慢性）、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌（Ｏｒａｌ  Ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（Ｏｒａｌ  Ｃａｖｉｔｙ  Ｃａｎｃｅｒ）、口唇及び中咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌（���えば、上皮細胞、生殖細胞腫瘍、及び低悪性度腫瘍）、膵臓癌（膵島細胞腫瘍を含む）、パラフィン腫、パラガングリオーマ、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、中間分化の松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫及び上皮原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、血漿細胞腫瘍／多発性骨髄腫、肺白血球芽腫、妊娠及び乳癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、腎盂及び尿管、移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（ユーイング肉腫家族腫瘍、カポジ、軟部組織、子宮などの）、セザリー症候群、皮膚癌（例えば、メラノーマ、メルケル細胞癌、非メラノーマ）、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮細胞癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、転移性、胃（胃部）癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫（皮膚、菌状息肉腫及びセザリー症候群）、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌腫、甲状腺癌、尿管及び腎盂の移行上皮癌、栄養芽腫（妊娠性）、原発不明の小児期の異常な癌、尿管及び腎盂、移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜性、子宮肉腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症及びウィルムス腫瘍から選択される。
【００８４】
特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。
【００８５】
定義
本明細書で使用される語句「保護基」は、望ましくない化学反応から反応性官能基を保護する置換基を意味する。そのような保護基の例には、カルボン酸とボロン酸のエステル、アルコールのエーテル、及びアルデヒド及びケトンのアセタール及びケタールが含まれる。例えば、本明細書で使用する「Ｎ末端保護基」または「アミノ保護基」という語句は、合成手順中の望ましくない反応からアミノ酸またはペプチドのＮ末端を保護するために使用することができる様々なアミノ保護基を指す。適切な基の例には、例示すると、ホルミル、ダンシル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル及びメトキシスクシニルのようなアシル保護基、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）のような芳香族ウレタン保護基、及びｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）または９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような脂肪族ウレタン保護基が挙げられる。
【００８６】
本明細書で使用される用語「アミノ末端保護基」は、有機合成、特にペプチド合成において典型的に使用される末端アミノ保護基を指す。アセチル及びベンゾイルのようなアシル保護基を含む保護基の既知のカテゴリーのいずれかを用いることができる。芳香族ウレタン保護基、例えばベンジルオキシカルボニル；及び脂肪族ウレタン保護基、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルが挙げられる。例えば、Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｉｅｎｈｏｆｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１；，Ｖｏｌ．３，３−８８及びＧｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ，Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。好ましい保護基には、アリール−、アラルキル−、ヘテロアリール−及びヘテロアリールアルキル−カルボニル及びスルホニル部分が含まれる。
【００８７】
本明細書で使用される用語「生理学的条件」は、生存可能な生物に適合し、かつ／または生存可能な哺乳類細胞に一般的に細胞内に存在する温度、ｐＨ、イオン強度、粘度及び同様の生化学的パラメータを指す。
【００８８】
本明細書で使用される用語「プロドラッグ」は、生理学的条件下で、治療的に活性な薬剤に変換される化合物を包含する。プロドラッグを作製するための一般的な方法は、生理学的条件下で加水分解されて所望の分子を明らかにする選択された部分を含むことである。他の実施形態では、プロドラッグは、宿主動物の酵素活性によって変換される。
【００８９】
本明細書で使用される語句「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容される担体」は、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を意味し、１つの臓器または身体の一部から他の臓器または身体の一部に、対象の化学物質を運搬または輸送することに関与するものである。各担体は、患者に有害ではなく及び実質的に非発熱性の製剤の他の成分と適合するという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下のものが含まれる：（１）糖、例えばラクトース、グルコース及びスクロース、（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンのようなデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースのようなセルロース及びその誘導体、（４）粉末状のトラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えばカカオバター及び坐薬ワックス、（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油のような油、（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張性生理食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、（２１）薬学的製剤に使用される他の非毒性適合物質。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は非発熱性であり、すなわち、患者に投与したときに顕著な温度上昇を誘導しない。
【００９０】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機及び有機酸付加塩を指す。これらの塩は、化合物の最終的な単離及び精製の間に、または遊離塩基形態の精製された化合物を適切な有機または無機酸と別々に反応させ、そのようにして形成された塩を単離することによってその場で調製することができる。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩及びラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい。
【００９１】
他の場合には、本発明の方法において有用な化合物は、１つ以上の酸性官能基を含み、したがって、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの例における「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機及び有機塩基付加塩を指す。これらの塩は、化合物の最終的な単離及び精製の間に、またはその遊離酸形態の精製化合物を、水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩などの適切な塩基と別々に反応させることにより、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第一級、第二級または第三級アミンとの反応によって調製され得る。代表的なアルカリまたはアルカリ土類の塩には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩及びアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌの上記参照）。
【００９２】
治療における使用に関して化合物の「治療有効量」とは、所望の投与計画（哺乳動物、好ましくはヒト）の一部として投与されたときに、処置される障害または状態ための臨床的に許容される標準に従って、症状を緩和し、症状を改善し、または疾患状態の発症を遅らせる、または化粧目的で、例えば、任意の医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比での、製剤中の化合物の量を指す。
【００９３】
「予防的または治療的」という用語は当該技術分野で認識されており、本発明の組成物の１つまたは複数の宿主への投与を含む。望ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望ましくない状態）の臨床症状の前に投与される場合、治療は予防的である（すなわち、宿主が望ましくない状態を発症するのを防ぐ）一方、投与される場合、望ましくない状態が現れた後に、治療は治療的である（すなわち、それは既存の望ましくない状態またはその副作用を減少させる、改善する、または安定させることを意図する）。
【００９４】
「自己消滅リンカー（ｓｅｌｆ−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｌｉｎｋｅｒ）」または「自壊性リンカー」という用語は、２つの分子を放出するために規定された条件下で切断される化学結合によって２つ以上の分子を一緒に結合する一時的なエキステンダー、スペーサーまたはプレースホルダーユニットを指す。自己消滅リンカーの例としては、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、２，４−ビス（ヒドロキシメチル）アニリン、及び４−（フェニルメチレン）アニリンが挙げられるが、これらに限定されない。自己消滅または自壊性リンカーは、直鎖または分枝鎖であってもよく、２つ以上の同じ分子を一緒に連結してもよく、または２つ以上の異なる分子を一緒に連結してもよい。自己消滅または自壊性リンカーは、例えば、生理学的条件、酸性条件、塩基性条件下で、または特定の化学物質の存在下で低下、分解または断片化することができる。
【００９５】
本発明で使用されるファルマコフォアは、対応する薬物が有効である通常の目的に有効であり、特定の実施形態では、薬物を特に有益である所望の細胞に輸送する、アジド糖標的指向化部分に固有の、能力のために優れた有効性を有する。
【００９６】
本実施形態に使用するのに好ましい治療薬は、癌治療に使用されるような細胞傷害性薬物である。そのような薬物には、一般に、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリンなどの抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、及びコルチコステロイドが含まれる。
【００９７】
当業者は、本発明のコンジュゲートを調製する目的で、その化合物の反応をより簡便にするために、所望の化合物を化学修飾することができる。
【００９８】
特定の実施形態では、Ｄはファルマコフォアがそれにより自壊性リンカーに結合される化学反応性官能基を有するファルマコフォアである。場合によっては、官能基は、第一級アミン、第二級アミン、ヒドロキシル及びスルフヒドリルから選択される。特定の例では、官能基は、第一級アミンまたは第二級アミンである。場合によっては、官能基はヒドロキシルである。
【００９９】
上記のように、本発明の特定の化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性形態で存在し得る。本発明は、シス及びトランス異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、及びそれらの他の混合物を含むすべてのそのような化合物を本発明の範囲に含むことを企図する。追加の不斉炭素原子は、アルキル基などの置換基に存在してもよい。すべてのそのような異性体、ならびにそれらの混合物は、本発明に含まれることが意図されている。
【０１００】
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが所望される場合、不斉合成によって、または得られたジアステレオマー混合物が分離され、補助基が切断されて純粋な所望のエナンチオマーが得られるキラル補助剤で誘導体化されてもよい。あるいは、分子がアミノなどの塩基性官能基またはカルボキシルなどの酸性官能基を含む場合、ジアステレオマー塩が適切な光学活性酸または塩基で形成され、続いて分画結晶化によって形成されたジアステレオマーが分割されるか、または当該技術分野で周知のクロマトグラフィー手段、及びその後の純粋なエナンチオマー回収が行われる。
【０１０１】
脂肪族鎖は、以下に定義されるアルキル、アルケニル及びアルキニルのクラスを含む。直鎖脂肪族鎖は、非分岐炭素鎖部分に限定される。本明細書で使用される「脂肪族基」という用語は、直鎖、分枝鎖または環状脂肪族炭化水素基を意味し、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基などの飽和及び不飽和脂肪族基を含む。
【０１０２】
「アルキル」は、指定された炭素原子数を有する、完全に飽和した環式または非環式、枝分かれしたまたは枝分かれしていない炭素鎖部分を指し、指定がない場合は３０個までの炭素原子を指す。例えば、１〜８個の炭素原子のアルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、及びオクチルなどの部分、及びこれらの部分の位置異性体である部分をいう。オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ヘンエイコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシルなどの炭素数１０〜３０のアルキルが挙げられる。特定の実施形態では、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格に３０個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖の場合はＣ１〜Ｃ３０、分枝鎖の場合はＣ３〜Ｃ３０）、より好ましくは２０個以下である。
【０１０３】
「シクロアルキル」は、それぞれが３〜１２個の炭素原子を有する単環式または二環式または架橋飽和炭素環式環を意味する。同様に、好ましいシクロアルキルは、環構造中に５〜１２個の炭素原子を有し、より好ましくは環構造中に６〜１０個の炭素を有する。
【０１０４】
炭素数が特に指定されない限り、本明細書で使用される「低級アルキル」とは、上で定義したようなアルキル基を意味するが、炭素原子数１〜１０、より好ましくは炭素原子数１〜６の骨格構造、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔｅｒｔ−ブチルである。同様に、「低級アルケニル」及び「低級アルキニル」も同様の鎖長を有する。本出願を通して、好ましいアルキル基は低級アルキルである。特定の実施形態では、アルキルとして本明細書で指定される置換基は、低級アルキルである。
【０１０５】
「アルケニル」は、指定された炭素原子数を有する、または炭素原子数の制限が特定されない場合、２６個までの炭素原子を有する、任意の環式または非環式、枝分かれしたまたは枝分かれしていない不飽和炭素鎖部分を指す。その部分に１つ以上の二重結合を有する。６〜２６個の炭素原子を有するアルケニルの例は、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、ノナデセニル、エイコセニル、ヘネイコソエニル、ドコセニル、トリコセニル及びテトラコセニルに例示され、それらの種々の異性体形態において、不飽和結合は、その部分のどこにでも位置することができ、二重結合の周りに（Ｚ）または（Ｅ）配置のいずれかを有することができる。
【０１０６】
「アルキニル」は、アルケニルの範囲のヒドロカルビル部分を意味するが、その部分に１つ以上の三重結合を有する。
【０１０７】
「アルキルチオ」という用語は、硫黄部分が結合している、上記定義のアルキル基を指す。特定の実施形態において、「アルキルチオ」部分は、−（Ｓ）−アルキル、−（Ｓ）−アルケニル、−（Ｓ）−アルキニル及び（Ｓ）−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１のうちの１つによって表され、Ｒ１は以下に定義される。代表的なアルキルチオ基には、メチルチオ、エチルチオなどが含まれる。
【０１０８】
本明細書で使用される「アルコキシル」または「アルコキシ」という用語は、酸素部分が結合した、以下に定義されるようなアルキル基を指す。代表的なアルコキシル基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが挙げられる。「エーテル」は、酸素によって共有結合した２つの炭化水素である。したがって、そのアルキルをエーテルにするアルキルの置換基は、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１の１つによって表すことができるようなアルコキシルであるかその類似のものであり、ｍ及びＲ１は以下に記載される。
【０１０９】
用語「アミン」及び「アミノ」は当該技術分野で認識されており、非置換アミン及び置換アミンの両方であって、例えば、以下の式、
【化２０】
2018535198.tif 000028
で表すことのできる部分を指し、
式中、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１を表すか、またはＲ３及びＲ５は、それらが結合しているＮ原子と一緒になって、環構造中に４〜８個の原子を有する複素環を完成し、Ｒ１は、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、またはポリシクリルを表し、ｍは０または１〜８の範囲の整数である。ある実施形態では、Ｒ３またはＲ５の一方のみがカルボニルであってよく、例えばＲ３、Ｒ５、及び窒素は一緒になってイミドを形成しない。さらにより特定の実施形態において、Ｒ３及びＲ５（及び任意にＲ６）は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、または−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１を表す。したがって、本明細書で使用される用語「アルキルアミン」は、置換または非置換アルキルが結合した、すなわち、Ｒ３及びＲ５の少なくとも１つがアルキル基である、上記定義のアミン基を意味する。特定の実施形態では、アミノ基またはアルキルアミンは塩基性であり、ｐＫａ≧７．００を有する共役酸を有すること、すなわちこれらの官能基のプロトン化形態は約７．００を超える水に対するｐＫａを有する。
【０１１０】
本明細書で使用される用語「アリール」は、環の各原子が炭素（すなわち炭素環式アリール）であるか、または１個以上の原子がヘテロ原子である３〜１２員の置換または非置換の単環式芳香族基を含む（すなわち、ヘテロアリール）。好ましくは、アリール基は５〜１２員環、より好ましくは６〜１０員環を含む。特定の実施形態において、アリールは、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールを含む。用語「アリール」はまた、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通であり、環の少なくとも１つが芳香族である２つ以上の環式環を有する多環式環系、例えば、他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール及び／またはヘテロシクリルである。炭素環式アリール基には、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリンなどが含まれる。ヘテロアリール基は、置換または非置換の芳香族３〜１２員環構造、より好ましくは５〜１２員環、より好ましくは６〜１０員環を含み、その環構造は１〜４個のヘテロ原子を含む。特定の実施形態において、ヘテロアリールには、（Ｃ２〜Ｃ９）ヘテロアリールが含まれる。ヘテロアリール基には、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン及びピリミジンなどが含まれる。
【０１１１】
用語「アラルキル」は当該技術分野で認識されており、アリール基で置換されたアルキル基を指す。
【０１１２】
「ヘテロアラルキル」という用語は当該技術分野で認識されており、ヘテロアリール基で置換されたアルキル基を指す。
【０１１３】
用語「ヘテロ原子」は当該技術分野で認識されており、炭素または水素以外の任意の元素の原子を指す。例示的なヘテロ原子としては、ホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄及びセレンが挙げられる。
【０１１４】
用語「ヘテロシクリル」または「複素環式基」は、環構造が１〜４個のヘテロ原子を含む、３〜１２員環構造、より好ましくは５〜１２員環、より好ましくは６〜１０員環をいう。複素環は多環であってもよい。特定の実施形態において、ヘテロシクリルには、（Ｃ２〜Ｃ９）ヘテロシクリルが含まれる。例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、ラクタム、例えばアゼチジノン及びピロリジノン、スルタム、スルトンなどが含まれる。複素環は、１つ以上の位置で、上記のような置換基で置換されていてもよく、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、スルファモイル、スルフィニル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどである。
【０１１５】
用語「カルボニル」は当該技術分野で認識されており、以下の式、
【化２１】
2018535198.tif 000029
で表すことのできるような部分を含み、
Ｘは、結合または酸素または硫黄を表し、Ｒ７は、水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１、または薬学的に許容される塩を表し、Ｒ８は、水素、アルキル、アルケニルまたは−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１を表し、ここで、ｍ及びＲ１は、上記で定義したとおりである。Ｘが酸素であり、Ｒ７またはＲ８が水素でない場合、式は「エステル」を表す。Ｘが酸素であり、Ｒ７が上で定義したとおりである場合、この部分は本明細書においてカルボキシル基と称され、特にＲ７は水素である場合、式は「カルボン酸」を表す。Ｘが酸素であり、Ｒ８が水素である場合、式は「ギ酸塩」を表す。一般に、上記式の酸素原子が硫黄で置き換えられている場合、式は「チオカルボニル」基を表す。Ｘが硫黄であり、Ｒ７またはＲ８が水素でない場合、式は「チオエステル」基を表す。Ｘが硫黄であり、Ｒ７が水素である場合、式は「チオカルボン酸」基を表す。Ｘが硫黄であり、Ｒ８が水素である場合、式は「チオホルメート」基を表す。他方、Ｘが結合であり、Ｒ７が水素でない場合、上記の式は「ケトン」基を表す。Ｘが結合であり、Ｒ７が水素である場合、上記式は「アルデヒド」基を表す。
【０１１６】
用語「チオキサミド」は、本明細書中で使用される場合、以下の式、
【化２２】
2018535198.tif 000030
で表される部分を指し、式中、Ｒｔは、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキルまたはアリールからなる群から選択され、好ましくは水素またはアルキルである。さらに、「チオキサミド誘導化合物」または「チオキサミド類似体」は、１つまたは複数のアミド基が１つまたは複数の対応するチオキサミド基で置換されている化合物を指す。チオキサミドは、当該技術分野では「チオアミド」とも呼ばれている。
【０１１７】
用語「アミド」は、アミノ置換カルボニルとして当該技術分野で認識されており、一般式、
【化２３】
2018535198.tif 000031
で表すことができる部分を含み、式中、Ｒ５０及びＲ５１は上記で定義したとおりである。本発明におけるアミドの特定の実施形態は、不安定であり得るイミドを含まない。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、用語「置換された」は、有機化合物のすべての許容可能な置換基を含むことが意図される。広範な態様において、許容される置換基には、有機化合物の非環式及び環式、分枝及び非分枝、炭素環式及び複素環式、芳香族及び非芳香族置換基が含まれる。例示的な置換基には、例えば、上記のものが含まれる。許容される置換基は、適切な有機化合物について、１つ以上であり、同じであっても異なっていてもよい。本発明の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満たす本明細書に記載の水素置換基及び／または任意の許容される置換基を有していてもよい。本発明は、有機化合物の許容可能な置換基によって決して限定されるものではない。「置換」または「〜で置換された」とは、そのような置換が置換された原子及び置換基の許容される原子価に従うことを条件とし、その置換によって、例えば自発的に転位、環化、脱離などの変換を受ける。
【０１１９】
本明細書で使用される用語「ニトロ」は、−ＮＯ２を意味し、用語「ハロゲン」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを示し、用語「スルフヒドリル」は−ＳＨを意味し、用語「ヒドロキシル」は−ＯＨを意味し、用語「スルホニル」は、−ＳＯ２−を意味し、用語「アジド」は−Ｎ３を意味し、用語「シアノ」は−ＣＮを意味し、用語「イソシアナト」は、−ＮＣＯを意味し、用語「チオシアナト」は−ＳＣＮを意味し、用語「イソチオシアナト」は、−ＮＣＳを意味し、用語「シアナト」は−ＯＣＮを意味する。
【０１２０】
用語「ハロアルキル」は、本明細書で定義されるアルキル基を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義される少なくとも１つのハロゲンを意味する。ハロアルキルの代表例には、クロロメチル、２−フルオロエチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル及び２−クロロ−３−フルオロペンチルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
用語「スルファモイル」は当該技術分野で認識されており、以下の式、
【化２４】
2018535198.tif 000032
で表すことができる部分を含み、式中、Ｒ３及びＲ５は、上記で定義した通りである。
【０１２２】
用語「硫酸塩」は、当該技術分野で認識されており、以下の式、
【化２５】
2018535198.tif 000033
で表すことができる部分を含み、式中、Ｒ７は、上記で定義した通りである。
【０１２３】
用語「スルホンアミド」は当該技術分野で認識されており、以下の式、
【化２６】
2018535198.tif 000034
で表すことができる部分を含み、式中、Ｒ３及びＲ８は、上記で定義した通りである。
【０１２４】
用語「スルホネート」は当該技術分野で認識されており、以下の式、
【化２７】
2018535198.tif 000035
で表すことの出来る部分を含み、式中、Ｒ７は、電子対、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである。
【０１２５】
本明細書で使用される用語「スルホキシド」または「スルフィニル」は、以下の式、
【化２８】
2018535198.tif 000036
で表すことのできる部分を指し、式中、Ｒ１２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アラルキル、またはアリールからなる群から選択される。
【０１２６】
本明細書中で使用される場合、各構造、例えば、アルキル、ｍ、ｎなどの定義は、それがいずれかの構造において２回以上出現する場合、同じ構造内の他の場所におけるその定義から独立するように意図される。
【０１２７】
本発明の目的のために、化学元素は、ｔｈｅ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，６７ｔｈ  ｅｄ．，１９８６−８７，ｉｎｓｉｄｅ  ｃｏｖｅｒに従って識別される。
【０１２８】
薬学的組成物
また、本発明の化合物（例えば、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれか１つの化合物）またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む薬学的組成物も提供される。そのような薬学的組成物の製造方法も提供される。この方法は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される賦形剤または担体に入れることを含む。
【０１２９】
本発明の化合物及び本発明の薬学的組成物は、対象における癌の治療に有用である。特定の実施形態において、治療有効量の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩は、それを必要とする対象に投与され、それによって癌を治療する。
【０１３０】
本明細書で使用する「阻害する」または「阻害すること」とは、対照と比較して客観的に測定可能な量または程度で減少することを意味する。一実施形態において、阻害または阻害手段は、対照と比較して少なくとも統計的に有意な量だけ減少する。一実施形態において、阻害または阻害手段は、対照と比較して少なくとも５パーセント減少する。様々な個々の実施形態において、阻害または阻害手段は、対照と比較して少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３３、４０、５０、６０、６７、７０、７５、８０、９０、または９５パーセント（％）減少する。
【０１３１】
本明細書中で使用される場合、用語「治療する」及び「治療する」は、（ａ）状態または疾患を発症する危険性がある可能性がある対象において病態または疾患の発症を予防するが、まだそれを持っていると診断されていないこと、（ｂ）状態または疾患を阻害すること、例えば、その発達を遅くするまたは停止すること、（ｃ）状態または疾患の軽減または改善、例えば、状態または疾患の退行を引き起こすことを含む。一実施形態では、「治療する」及び「治療する」という用語は、（ａ）状態または疾患を阻害する、例えばその発達を遅くするまたは停止すること、（ｂ）状態または疾患の緩和または改善、例えば、状態または疾患の退行を引き起こすことを含む。
【０１３２】
本明細書で使用される「対象」は、生きた哺乳動物を指す。種々の実施形態において、対象は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、または非ヒト霊長類を含む、非ヒト哺乳動物であるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０１３３】
特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０１３４】
本明細書中で使用される場合、「投与する」とは、その通常の意味を有し、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、眼内（例えば、硝子体内）、皮下、直接注射（例えば、腫瘍）、粘膜、吸入、経口及び局所投与が挙げられる。
【０１３５】
一実施形態では、投与は静脈内投与である。
【０１３６】
一実施形態では、投与は経口である。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「有効量」という語句は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な任意の量を指す。
【０１３８】
本発明の化合物は、他の治療薬と組み合わせることができ、または本発明の他の化合物と組み合わせて使用することができる。本発明の化合物及び他の治療薬は、同時にまたは連続的に投与することができる。他の治療薬が同時に投与される場合、それらは同じ製剤または別個の製剤で投与することができるが、それらは実質的に同時に投与される。他の治療薬及び本発明の化合物の投与が一時的に分離される場合、他の治療薬は互いに及び本発明の化合物と順次投与される。これらの化合物の投与間の時間間隔は数分であってもよく、またはそれより長くてもよい。
【０１３９】
他の治療薬の例には、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗不整脈剤、ベータ遮断薬、鎮痛剤及び抗癌剤が含まれる。
【０１４０】
上記のように、「有効量」は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な任意の量を指す。本明細書中に提供される教示と組み合わせることにより、効力、相対的生物学的利用能、患者の体重、有害な副作用の重症度及び好ましい投与様式のような種々の活性化合物及び秤量因子の中から選択することにより、効果的な予防または治療処置養生法を計画することができ、それは実質的な望ましくない毒性を引き起こさず、しかも特定の対象を治療するのに有効である。任意の特定の適用に対する有効量は、治療される疾患または状態、投与される本発明の特定の化合物、対象のサイズ、または疾患または状態の重篤度などの因子に依存して変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、本発明の特定の化合物及び／または他の治療薬の有効量を経験的に決定することができる。最大用量を使用すること、すなわち、いくつかの医学的判断に基づいて最高の安全用量を使用することが時々好ましい。適切な全身レベルの化合物を達成するために、１日当たり複数の用量が企図され得る。適切な全身レベルは、例えば、薬物の患者のピーク血漿レベルまたは持続血漿レベルの測定によって決定することができる。「用量」及び「投薬量」は、本明細書では互換的に使用される。
【０１４１】
一般に、活性化合物の１日の経口用量は、ヒト対象の場合、約０．０１ミリグラム／ｋｇ／日〜１０００ミリグラム／ｋｇ／日である。１日当たり１回または数回の投与で０．５〜５０ミリグラム／ｋｇの範囲の経口用量が所望の結果をもたらすことが期待される。投薬量は、投与様式に応じて、局所または全身の所望の薬物レベルを達成するように適切に調整され得る。例えば、静脈内投与は１日あたり１桁から数桁少ない低用量であることが期待される。対象における応答がそのような用量では不十分である場合、より高い用量（または異なるより局所的な送達経路による有効なより高い用量）を、患者の耐容性が許す範囲で使用することができる。適切な全身レベルの化合物を達成するために、１日に複数回の投与が企図される。
【０１４２】
一実施形態では、本発明の化合物の静脈内投与は、一般には０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。
【０１４３】
本明細書に記載の任意の化合物について、治療有効量は、最初に動物モデルから決定することができる。ヒトにおいて試験された本発明の化合物についてのヒトデータ及び同様の薬理活性を示すことが知られている化合物、例えば他の関連する活性薬剤についても、治療有効用量を決定することができる。非経口投与にはより高い用量が必要とされ得る。適用される用量は、投与された化合物の相対的生物学的利用能及び効力に基づいて調整することができる。上記の方法及び当該技術分野で周知の他の方法に基づいて最大有効性を達成するために用量を調節することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１４４】
本発明の製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、アジュバント、及び場合により他の治療成分を日常的に含み得る薬学的に許容される溶液で投与され得る。
【０１４５】
治療に使用するために、有効量の本発明の化合物を、本発明の化合物を所望の場所または表面に送達する任意の様式によって対象に投与することができる。本発明の薬学的組成物の投与は、当業者に知られている任意の手段によって達成することができる。投与経路には、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直接注射（例えば、腫瘍または膿瘍への）、粘膜、吸入及び局所が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
静脈内及び他の非経口投与経路のために、化合物は、デソキシコール酸を含む凍結乾燥製剤として、リポソームインターカレートまたはカプセル封入活性化合物の凍結乾燥製剤として、水性懸濁液中の脂質複合体として、またはコレステリル硫酸複合体として製剤化することができる。凍結乾燥製剤は、一般に、投与の直前に適切な水溶液、例えば滅菌水または生理食塩水中で再構成される。
【０１４７】
経口投与の場合、化合物（すなわち、本発明の化合物及び他の治療薬）は、活性化合物を当該技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体は、本発明の化合物を、治療される対象による経口摂取のための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望により適切な助剤を添加した後、経口使用のための医薬調製物を固体賦形剤として得ることができ、場合により得られる混合物を粉砕し、顆粒混合物を加工することができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤、コムギデンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物を含む。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加してもよい。必要に応じて、経口製剤はまた、生理食塩水または緩衝液、例えば、内部酸条件を中和するためのＥＤＴＡ中に処方してもよく、または担体なしで投与してもよい。
【０１４８】
また、上記の成分または複数の成分の経口剤形も具体的に企図される。成分または複数の成分は、誘導体の経口送達が有効であるように化学的に修飾され得る。一般に、企図される化学修飾は、成分分子自体に少なくとも１つの部分の結合であり、前記部分は、（ａ）酸加水分解の阻害、（ｂ）胃または腸からの血流への取り込みを可能にする。また、成分または複数の成分の全体的な安定性の増加及び体内の循環時間の増加も望まれる。そのような部分の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが挙げられる。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ”，Ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．３６７−３８３（１９８１）、Ｎｅｗｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４：１８５−９（１９８２）。使用することができる他のポリマーは、ポリ１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。上記のように、医薬用途には、ポリエチレングリコール部分が好ましい。
【０１４９】
成分（または誘導体）について、放出の位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸または回腸）、または大腸であり得る。当業者は、胃に溶解しないが、十二指腸または腸の他の場所の物質を放出するであろう利用可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、本発明の化合物（または誘導体）の保護によるか、または腸内などの胃環境を超えた生物学的に活性な物質の放出によって、胃環境の有害な影響を回避する。
【０１５０】
完全な胃耐性を確実にするためには、少なくともｐＨ５．０まで不浸透性であるコーティングが不可欠である。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリ酢酸ビニルフタレート（ＰＶＡＰ）、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ、及びシェラックである。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用することができる。
【０１５１】
コーティングまたはコーティングの混合物は、胃に対する保護を意図していない錠剤にも使用することができる。これには、糖衣または錠剤を飲み込みやすくするコーティングが含まれ得る。カプセルは、乾燥した治療薬（例えば、粉末）の送達のための硬質シェル（例えば、ゼラチン）、液体形態の場合、軟質ゼラチン殻を使用することができる。カシェのシェル材料は、厚いデンプンまたは他の食用紙であってもよい。丸薬、トローチ剤、成型錠剤または錠剤粉砕物については、湿潤マスキング技術を使用することができる。
【０１５２】
治療薬は、約１ｍｍの粒度の顆粒またはペレットの形態の微細多粒子として製剤に含まれ得る。カプセル投与のための材料の処方は、粉末、軽く圧縮されたプラグまたは錠剤であってもよい。治療薬は圧縮によって調製することができる。
【０１５３】
着色剤及び香味剤がすべて含まれていてもよい。例えば、本発明の化合物（または誘導体）は、（例えば、リポソームまたは微小球カプセル化によって）製剤化され得、次いで、着色剤及び香味剤を含む冷蔵飲料のような食用製品内にさらに含有され得る。
【０１５４】
不活性物質で治療薬の容量を希釈または増加させることができる。これらの希釈剤は、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水乳糖、セルロース、スクロース、修飾デキストラン及びデンプンを含むことができる。特定の無機塩を、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含む充填剤として使用することもできる。市販の希釈剤の中には、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌがある。
【０１５５】
崩壊剤は、治療薬の製剤に固体剤形に含めてもよい。崩壊剤として使用される材料は、デンプンをベースとする市販の崩壊剤を含むデンプン、Ｅｘｐｌｏｔａｂを含むが、これに限定されない。アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ及びベントナイトをすべて使用することができる。崩壊剤の別の形態は、不溶性カチオン交換樹脂である。粉末ガムは、崩壊剤及び結合剤として使用することができ、これらは、寒天、カラヤまたはトラガカントなどの粉末ガムを含むことができる。アルギン酸及びそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【０１５６】
結合剤は、治療薬を一緒に保持して硬い錠剤を形成するために使用され、アカシア、トラガカント、デンプン及びゼラチンのような天然産物からの材料を含む。その他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方ともアルコール溶液中で治療薬を顆粒化するために使用することができる。
【０１５７】
製剤化プロセス中の粘着を防止するために、治療薬の配合物に抗摩擦剤を含めることができる。潤滑剤は、治療用壁とダイ壁との間の層として使用することができ、これらには限定されないが、ステアリン酸（そのマグネシウム塩及びカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油及びワックスを含むことができる。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ  ４０００及び６０００のような可溶性潤滑剤も使用することができる。
【０１５８】
製剤化中の薬物の流動特性を改善し、圧縮中の再配列を助長する可能性のある流動促進剤を添加することができる。流動促進剤は、デンプン、タルク、熱分解法シリカ及び水和したシリコアルミネートを含むことができる。
【０１５９】
治療薬の水性環境への溶解を助けるために、湿潤剤として界面活性剤を添加することができる。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムのような陰イオン性界面活性剤を含み得る。使用することができるカチオン性洗剤は、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含むことができる。界面活性剤として製剤に含まれ得る潜在的な非イオン性界面活性剤は、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は、本発明の化合物またはその誘導体の製剤中に、単独で、または異なる比率で混合物として存在することができる。
【０１６０】
経口的に使用することができる医薬製剤は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチン及びグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤でできた軟質密封カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、活性成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、及び場合によっては安定剤と混合して含むことができる。ソフトカプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与のために処方された微小球を使用することもできる。かかる微小球は、当該技術分野において十分に定義されている。経口投与のためのすべての製剤は、そのような投与に適した投与量でなければならない。
【０１６１】
口腔投与のために、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０１６２】
吸入による投与のために、本発明に従う使用のための化合物は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭素の使用を伴う加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で、二酸化炭素または他の適切なガスである。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器で使用するための例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含むように製剤化することができる。
【０１６３】
また、本発明の化合物（またはその誘導体）の肺送達が企図される。本発明の化合物（または誘導体）は、吸入中に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層を横切って血流に移動する。吸入分子の他の報告には、Ａｄｊｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ７：５６５−５６９（１９９０）、Ａｄｊｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３：１３５−１４４（１９９０）（酢酸ロイプロリド）、Ｂｒａｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３（ｓｕｐｐｌ．５）：１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）、Ｈｕｂｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌ  Ｉｎｔ  Ｍｅｄ  ３：２０６−２１２（１９８９）α１−抗トリプシン）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８４：１１４５−１１４６（ａ−１−プロテイナーゼ）、Ｏｓｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，”Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，Ｍａｒｃｈ，（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４０：３４８２−３４８８（インターフェロン−ガンマ及び腫瘍壊死因子アルファ）及びＰｌａｔｚ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が含まれる。全身作用のための薬物の肺送達のための方法及び組成物は、１９９５年９月１９日に発行されたＷｏｎｇらの米国特許第５，４５１，５６９号に記載されている。
【０１６４】
本発明の実施に使用するために企図されるのは、限定するものではないが、当業者に良く知られている噴霧器、定量吸入器、及び粉末吸入器を含む治療用製品の肺送達用に設計された広範囲の機械的装置である。
【０１６５】
本発明の実施に適した商業的に入手可能な装置のいくつかの特定の例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯによって製造されたＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー、Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．によって製造されたＡｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー、Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａによって製造されたＶｅｎｔｏｌｉｎ計量吸入器、Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓによって製造されたスピンヘル・パウダー吸入器（Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ  ｐｏｗｄｅｒ  ｉｎｈａｌｅｒ）である。
【０１６６】
そのような装置はすべて、本発明の化合物（または誘導体）の分配に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は、使用される装置のタイプに特有であり、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント及び／または担体に加えて、適切な推進剤物質の使用を含み得る。また、リポソーム、マイクロカプセルまたは微小球、封入複合体、または他のタイプの担体の使用が意図される。本発明の化学的に修飾された化合物はまた、化学的修飾のタイプまたは使用されるデバイスのタイプに依存して異なる配合物で調製されてもよい。
【０１６７】
ジェットまたは超音波のいずれかの噴霧器での使用に適した製剤は、典型的には、溶液１ｍＬ当たり約０．１〜２５ｍｇの本発明の生物学的に活性な化合物の濃度で水に溶解した本発明の化合物（または誘導体）を含む。製剤はまた、緩衝液及び単純糖（例えば、本発明の化合物の安定化及び浸透圧の調節のため）を含み得る。ネブライザー製剤は、エアロゾルを形成する際の溶液の霧化によって引き起こされる本発明の化合物の表面に誘起された凝集を低減または防止するために、界面活性剤を含有してもよい。
【０１６８】
定量吸入器で使用するための処方物は、一般に、噴射剤中に懸濁された本発明の化合物（または誘導体）を界面活性剤の助けにより含む微粉を含む。噴射剤は、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、またはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む炭化水素、またはそれらの組み合わせなどの、この目的のために使用される任意の従来の材料であり得る。好適な界面活性剤には、トリオレイン酸ソルビタン及び大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も界面活性剤として有用であり得る。
【０１６９】
粉末吸入器から調剤するための製剤は、本発明の化合物（または誘導体）を含有する微細に分割された乾燥粉末を含み、粉末の分散を容易にする量で乳糖、ソルビトール、スクロースまたはマンニトールなどの増量剤も含み得る例えば製剤の５０〜９０重量％の量で存在する。本発明の化合物（または誘導体）は、深部肺への最も効果的な送達のために、１０マイクロメートル（μｍ）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒子サイズを有する微粒子形態で有利に調製されるべきである。
【０１７０】
本発明の薬学的組成物の経鼻送達も考えられる。鼻内送達は、肺への製品の沈着の必要性なしに、治療用製品を鼻に投与した直後に、本発明の薬学的組成物が血流を通過することを可能にする。経鼻送達のための製剤には、デキストランまたはシクロデキストランを含むものが含まれる。
【０１７１】
鼻内投与の場合、有用な装置は、計量式噴霧器が取り付けられた小型のハードボトルである。一実施形態では、計量された用量は、本発明の薬学的組成物の溶液を所定の容量のチャンバに引き込むことによって送達され、このチャンバは、チャンバ内の液体が圧縮されたときにスプレーを形成することによって、エアロゾル化及びエアロゾル製剤に寸法決めされた開口部を有する。チャンバを圧縮して本発明の薬学的組成物を投与する。特定の実施形態では、チャンバはピストン装置である。このような装置は市販されている。
【０１７２】
あるいは、圧搾されたときにスプレーを形成することによってエアロゾル製剤をエアロゾル化するように寸法決めされた開口部または開口部を有するプラスチック製のスクイズボトルが使用される。開口部は、通常、ボトルの上部に見られ、上部は、エアロゾル製剤の効率的な投与のために、鼻通路に部分的に収まるように、一般に先細になっている。好ましくは、経鼻吸入器は、測定された用量の薬物を投与するために、計量された量のエアロゾル製剤を提供する。
【０１７３】
化合物は、それらを全身に送達することが望ましい場合、例えば、ボーラス注射または連続注入による注射による非経口投与のために製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプルまたは複数用量容器中に、防腐剤を加えて提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションのような形態をとり、懸濁剤、安定化剤及び／または分散剤のような調合剤を含み得る。
【０１７４】
非経口投与のための薬学的製剤は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。場合により、懸濁液はまた、化合物の溶解度を高めて高濃度の溶液の調製を可能にする適切な安定剤または薬剤を含有してもよい。
【０１７５】
あるいは、活性化合物は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で構成するための粉末形態であってもよい。
【０１７６】
化合物はまた、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸のような直腸または膣組成物中に製剤化することができる。
【０１７７】
上記の製剤に加えて、化合物はデポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用性の製剤は、適切なポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂、または難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として処方することができる。
【０１７８】
薬学的組成物はまた、適切な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含み得る。そのような担体または賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
適切な液体または固体医薬製剤形態は、例えば、吸入用の水性または生理食塩水の、マイクロカプセルの、渦巻き状の、微細金粒子上へのコーティングの、リポソームに含まれる噴霧の、エアロゾルの、皮膚への移植のためのペレットのまたは皮膚に引っかかる鋭利な物体の上で乾燥させたものの形態である。薬学的組成物はまた、顆粒、粉末、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルション、懸濁液、クリーム、滴剤または活性成分の持続放出を伴う調製物を含み、その調製において、賦形剤及び添加剤及び／または助剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、滑沢剤、香味剤、甘味料または可溶化剤、が上記のように慣習的に使用される。この薬学的組成物は、種々の薬物送達系における使用に適している。薬物送達のための方法の簡単な概説については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−３３（１９９０）を参照されたい。
【０１８０】
本発明の化合物及び場合により他の治療薬は、そのまま（生のままの）または薬学的に許容される塩の形態で投与することができる。医薬に使用される場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、その薬学的に許容される塩を調製するために便利に使用され得る。このような塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸及びベンゼンスルホン酸が挙げられる。また、そのような塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩のようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として製造することができる。
【０１８１】
適切な緩衝剤には、酢酸及び塩（１〜２％ｗ／ｖ）、クエン酸及び塩（１〜３％ｗ／ｖ）、ホウ酸及び塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）、及びリン酸及び塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）を含む。適切な防腐剤には、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）、クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）、パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）及びチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）を含む。
【０１８２】
本発明の医薬組成物は、有効量の本発明の化合物、及び場合により医薬的に許容される担体中に含まれる治療薬を含有する。「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒトまたは他の脊椎動物に投与するのに適した、１つまたは複数の適合する固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。「担体」という用語は、天然または合成の有機または無機成分を意味し、活性成分を組み合わせて適用を容易にする。薬学的組成物の成分はまた、所望の薬学的効率を実質的に損なう相互作用がないような方法で、本発明の化合物と互いに混合することができる。
【０１８３】
特に限定されないが、本発明の化合物を含む治療薬は、粒子中に提供されてもよい。本明細書で使用される粒子は、本明細書に記載の本発明の化合物または他の治療薬の全体または一部からなることができるナノ粒子または微粒子（または場合によってはより大きな粒子）を意味する。粒子は、限定はしないが、腸溶性コーティングを含むコーティングによって取り囲まれたコア中に治療薬を含有することができる。治療薬はまた、粒子全体に分散されていてもよい。治療薬はまた、粒子に吸着されてもよい。粒子は、ゼロ次放出、一次放出、二次放出、遅延放出、持続放出、即時放出、及びそれらの任意の組み合わせなどを含む、任意の秩序放出動態であり得る。粒子は、生体内分解性材料、または非生体内分解性材料またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない薬学及び医学の分野において日常的に使用される材料のいずれかを含むが、これらに限定されない。粒子は、本発明の化合物を溶液または半固体状態で含有するマイクロカプセルであってもよい。粒子は、実質的に任意の形状であり得る。
【０１８４】
非生体内分解性及び生体内分解性ポリマー材料の両方を、治療薬を送達するための粒子の製造に使用することができる。このようなポリマーは、天然または合成ポリマーであってもよい。ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて選択される。特に興味のある生体接着性ポリマーとしては、Ｓａｗｈｎｅｙ  Ｈ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１−７に記載されている生体内分解性ヒドロゲルが挙げられる。これらにはポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルタミン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）及びポリ（アクリル酸オクタデシル）が含まれる。
【０１８５】
治療薬は制御放出系に含まれていてもよい。「制御放出」という用語は、製剤からの薬物放出の様式及びプロファイルが制御される任意の薬物含有製剤を指すものとする。これは、即時放出製剤と同様に非即時放出製剤を指し、持続放出製剤及び遅延放出製剤を含むがこれに限定されない非即時放出製剤を指す。「持続放出」（「持続放出」とも呼ばれる）という用語は、その従来の意味において、長期間にわたり徐々に薬物を放出する薬物製剤を指すために使用され、好ましくは、長期間にわたって薬物の血中濃度が実質的に一定になる。用語「遅延放出」は、従来の意味において、製剤の投与とそこからの薬物の放出との間に時間遅延がある薬物製剤を指すために使用される。「遅延放出」は、長期間にわたり薬物の徐放を伴っても伴わなくてもよいため、「持続放出」であってもなくてもよい。
【０１８６】
長期徐放インプラントの使用は、慢性状態の治療に特に適切であり得る。本明細書で使用される「長期間」の放出は、少なくとも７日間、好ましくは３０〜６０日間、治療レベルの活性成分を送達するようにインプラントが構築され、配置されることを意味する。長期徐放インプラントは、当業者に周知であり、上述の放出システムのいくつかを含む。
【０１８７】
当業者であれば、本明細書に記載の組成物及び方法に対する他の適切な改変及び適合は、当業者に知られている情報を考慮して本明細書に含まれる本発明の説明から容易に明らかであり、本発明の範囲またはその任意の実施形態から逸脱することなく行うことができることが理解されるであろう。
【実施例】
【０１８８】
本発明を詳細に説明してきたが、以下の、例示のみのために本明細書に含まれ、本発明を限定するものではない、実施例を参照することにより、本発明をより明確に理解することができる。
【０１８９】
実施例１．Ａｃ４ＭａｎＡｚ誘導体の合成
【化２９】
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２−アジド酢酸（１）の合成。ブロモ酢酸（２．７８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を脱イオン水（３０ｍＬ）に溶解し、続いてアジ化ナトリウム（２．６０ｇ、４０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２４時間撹拌した。得られた溶液を塩化水素溶液を用いてｐＨ＝１に調整し、次いでジエチルエーテルで３回抽出した（１００ｍＬ×３）。有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色油状物を得た（収率８０％、１．６２ｇ）。
【０１９０】
Ｎ−（２−アジドアセチル）スクシンイミド（２）の合成。Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２．０６ｇ、１０ｍｍｏｌ）及び１（１．０１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦに溶解し、続いてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．１５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌した。沈殿物を除去した後、溶媒を除去して黄色固体を得た。粗生成物をジクロロメタン／ヘキサンから再結晶して白色固体を得た（収率７０％、１．３９ｇ）。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ  ４．２５（ｓ，２Ｈ，Ｎ３ＣＨ２）、２．８８（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：１６８．７，１６４．４，４８．２，２５．８。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ６Ｈ７Ｎ４Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋１９９．０に対する計算値、実測値１９９．０。
【０１９１】
Ａｃ４ＭａｎＡｚの合成。Ｄ−マンノサミン塩酸塩（５３９ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２５３ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍＬ）に溶解し、続いて２（５４５ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をピリジンに再溶解した。無水酢酸（１０ｍＬ）を加え、反応混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。溶媒を除去した後、粗生成物を、溶離剤として酢酸エチル／ヘキサン（１／１、ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色固体を得た（収率４５％、４８４．５ｍｇ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ１６Ｈ２２Ｎ４Ｏ１０Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋４５３．１に対する計算値、実測値４５３．１。
【０１９２】
Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔの合成。Ａｃ４ＭａｎＡｚ（４３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及び無水エタノール（１４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶解し、窒素で１０分間パージした。三フッ化ホウ素エーテラート（７１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をシリンジを通して添加した。混合物を室温で一晩暗下で撹拌した。次いで、ＤＣＭ（３０ｍＬ）を加え、溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液で２回（１０ｍＬ×２）及び脱イオン水で２回（１０ｍＬ×２）それぞれ洗浄した。有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して黄色油状物を得た。粗生成物を、溶離剤として酢酸エチル／ヘキサン（１／１、ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固体を得た（収率３０％、１２．５ｍｇ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ１６Ｈ２５Ｎ４Ｏ９［Ｍ＋Ｈ］＋４１７．２に対する計算値、実測値４１７．２。
【０１９３】
Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢの合成。Ａｃ４ＭａｎＡｚ（４３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及び２−ニトロベンジルアルコール（３０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶解し、窒素で１０分間パージした。三フッ化ホウ素エーテラート（７０．９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をシリンジを通して添加した。混合物を窒素雰囲気下、室温で一晩撹拌した。次いで、ＤＣＭ（３０ｍＬ）を加え、溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液で２回（１０ｍＬ×２）及び脱イオン水で２回（１０ｍＬ×２）それぞれ洗浄した。有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して褐色油状物を得た。粗生成物を、溶離剤として酢酸エチル／ヘキサン（１／１、ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、淡赤色固体を得た（収率２５％、１３．０ｍｇ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ２５Ｎ５Ｏ１１Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋５４６．２に対する計算値、実測値５４６．２。
【０１９４】
Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢのＵＶ誘導分解。Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢ（１ｍｇ）を無水ＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解し、室温でＵＶ照射下で撹拌した。ＵＶ照射の強度は２０ｍＷ／ｃｍ２に設定した。選択した時点（０、５、１５、及び３０分）でＨＰＬＣ測定の前に２０μＬの反応溶液を取り出し、６００μＬに希釈した。ＨＰＬＣが出発物質の完全な分解を示した後、反応溶液のＥＳＩ質量スペクトルを測定して、分解生成物を確認した。
【０１９５】
スキームＳ２．Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＢの合成経路
【化３０】
2018535198.tif 000038
Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＢの合成。Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＢは、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢと同様に合成した。Ａｃ４ＭａｎＡｚ（４３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及び４−ヒドロキシフェニルボロン酸ピナコールエステル（４４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶解し、窒素で１０分間パージした。三フッ化ホウ素エーテラート（７１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をシリンジを通して添加した。混合物を室温で一晩暗下で撹拌した。ＤＣＭ（３０ｍＬ）を添加し、溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液で２回（１０ｍＬ×２）及び脱イオン水で２回（１０ｍＬ×２）それぞれ洗浄した。有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して黄色油状物を得た。粗生成物を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（２／１〜１／１、ｖ／ｖ）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、無色の油状物を得た（収率５０％、３０．０ｍｇ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ２７Ｈ３８ＢＮ４Ｏ１１［Ｍ＋Ｈ］＋６０５．３に対する計算値、実測値６０５．１。
【０１９６】
Ｈ２Ｏ２の存在下でのＡｃ３ＭａｎＡｚＨＢの分解研究。Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＢ（２ｍｇ）を乾燥メタノール（１．０ｍＬ）に溶解した。最終Ｈ２Ｏ２濃度１０ｍＭのＨ２Ｏ２水溶液を加え、得られた混合物を３７℃でインキュベートした。異なる時点（０分、１時間、６時間、２４時間及び４８時間）で、ＨＰＬＣ測定の前に２０μＬの反応溶液を取り出し、６００μＬに希釈した。分解した生成物をＥＳＩマススペクトルによって確認した。
【０１９７】
スキームＳ３．Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱの合成経路
【化３１】
2018535198.tif 000039
ＨＱ−ＮＨＳ（４）の合成。ＨＱ−ＣＯＯＨを、報告された手順に従って合成された。１ＨＱ−ＣＯＯＨ（２．０ｍｍｏｌ、５０１ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、２．１ｍｍｏｌ、２４２ｍｇ）及びトリメチルアミン（２．０ｍｍｏｌ、２０２ｍｇ）を無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解し、続いてＮ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２．１ｍｍｏｌ、４３３ｍｇ）を添加した。混合物を室温で２４時間撹拌した。沈殿物をろ別し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（３／１、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体を得た（収率７５％）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ１８Ｈ２２ＮＯ６［Ｍ＋Ｈ］＋３４８．１に対する計算値、実測値３４８．１。
【０１９８】
化合物５の合成。４−アミノベンゾフェノン（５ｍｍｏｌ、９８５ｍｇ）を乾燥メタノール（５０ｍＬ）に溶解し、続いてＮａＢＨ４（１０ｍｍｏｌ、３７８ｍｇ）を添加した。混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を除去した後、粗生成物を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（６／１〜３／１）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。化合物５を淡黄色固体として得た（収率８０％）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ１３Ｈ１４ＮＯ［Ｍ＋Ｈ］＋２００．１に対する計算値、実測値２００．１。
【０１９９】
化合物６の合成。化合物４（１．０ｍｍｏｌ、３４７ｍｇ）及び５（１．０ｍｍｏｌ、１９９ｍｇ）を無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、続いてトリエチルアミン（１．０ｍｍｏｌ、１０１ｍｇ）を加えた。混合物を５０℃で４８時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（１／１）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。化合物６を淡黄色固体として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ２７Ｈ３０ＮＯ４［Ｍ＋Ｈ］＋４３２．２に対する計算値、実測値４３２．２。
【０２００】
Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱの合成。Ａｃ４ＭａｎＡｚ（０．２ｍｍｏｌ、８６ｍｇ）を無水ＴＨＦに溶解し、続いてＴＨＦ中のＴＭＳＯＴｆ（０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で４８時間撹拌した。モレキュラーシーブ（３Å）を加え、混合物を室温でさらに６時間撹拌した。次に化合物６を添加し、反応溶液を室温でさらに２４時間撹拌した。溶媒を除去した後、粗生成物を、溶離剤として酢酸エチルから酢酸エチル／メタノール（９５／５、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。淡黄色固体が得られた（収率３５％）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ４１Ｈ４７Ｎ５Ｏ１２Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋８２４．３に対する計算値、実測値８２４．３。
【０２０１】
Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱのＮａ２Ｓ２Ｏ４誘導性分解。Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱ（１ｍｇ）をメタノール／Ｈ２Ｏ（９／１、ｖ／ｖ、１ｍＬ）に溶解し、続いてＮａ２Ｓ２Ｏ４（１ｍｇ）を添加した。混合物を３７℃（１００ｒｐｍ）で撹拌した。選択した時点で、２０μＬの溶液をＨＰＬＣに注入して、Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱの分解プロセスをモニターした。ＨＰＬＣが完全な分解を示した後、ＥＳＩマススペクトルを測定して分解生成物を確認した。
【０２０２】
実施例２．細胞標識化におけるＡｃ４ＭａｎＡｚ誘導体の研究
グリコシド（エーテル）結合を形成することによってＡｃ４ＭａｎＡｚのＣ１部位を修飾することが代謝標識化プロセスをブロックできるかどうかを実証するために、本発明者らはまず、対応するエチルグリコシドＡｃ３ＭａｎＡｚＥｔ（図２パネルａ）を合成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでその細胞標識化能力を調べた。ＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞を、それぞれＡｃ４ＭａｎＡｚ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ、及びＰＢＳと共に３日間インキュベートし、潜在的に発現するアジド基をクリック反応によってＤＢＣＯ−Ｃｙ５で検出した。図２のパネルｃに示すように、Ａｃ４ＭａｎＡｚで処理した細胞は細胞表面上に強いＣｙ５蛍光を示し、アジド基の発現が成功したことを示している。対照的に、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔまたはＰＢＳで処理したＬＳ１７４Ｔ細胞は、細胞表面上で無視できる程わずかなＣｙ５蛍光を示し、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔが代謝標識化プロセスを介して細胞表面上にアジド基を導入することができなかったことを示している。Ａｃ４ＭａｎＡｚで処理したＬＳ１７４Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析は、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔまたはＰＢＳで処理した細胞よりも有意にＣｙ５蛍光を増強した（図２、パネルｄ）。アジド基が糖タンパク質の形で細胞表面上に発現していることを確認するために、Ａｃ４ＭａｎＡｚ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ及びＰＢＳでそれぞれ処理したＬＳ１７４Ｔ細胞のウェスタンブロット分析を行った。アジド糖タンパク質は、ホスフィン−ＰＥＧ３−ビオチンと共にインキュベートすることによってビオチン化され、したがって容易に検出することができた。結果を図２のパネルｅに示し、これはＡｃ４ＭａｎＡｚ群では一連のタンパク質バンドを示したが、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ及びＰＢＳ群のＬＳ１７４Ｔ細胞では２つの内因性ビオチン化タンパク質のみを示した。これらのデータは、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔが癌細胞を代謝的にアジド基で標識できなかったことを実証した。
【０２０３】
Ｃ１部位のグリコシド結合が代謝標識化プロセスのブロッキングの原因であり、１−ＯＨを露出させるこの結合の切断が標識プロセスを再活性化できることをさらに証明するために、ＵＶ切断可能なＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢを合成し（図２、パネルｂ）、その制御された標識化能力をインビトロで調べた。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、ＵＶ処理（１０分、１０ｍＷ／ｃｍ２）の有りまたは無しでＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢと共に３日間インキュベートし、細胞表面アジド基をＤＢＣＯ−Ｃｙ５によって検出した。ＵＶ照射無しでは、Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢで処理したＬＳ１７４Ｔ細胞は細胞表面上で無視できる程わずかなＣｙ５蛍光を示し、Ｃ１部位での化学修飾のブロッキング効果をさらに実証した（図２、パネルｃ）。しかしながら、ＵＶ照射の存在下で、ＬＳ１７４Ｔ細胞は、Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢのＡｃ３ＭａｎＡｚＯＨへの分解のために強いＣｙ５蛍光を示し、これは標識化プロセスを再活性化した。フローサイトメトリー分析はまた、Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢのみで処理した細胞と比較して、Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢ及びＵＶ照射で処理したＬＳ１７４Ｔ細胞でＣｙ５蛍光を有意に増強したことを示した（図２、パネルｄ）。Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢ／ＵＶで処理したＬＳ１７４Ｔ細胞のウェスタンブロット分析は、アジド基の細胞表面糖タンパク質への取り込みが成功したことを示す一連のタンパク質バンドを示した。これと比較して、Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢのみで処理したＬＳ１７４Ｔ細胞は、ＰＢＳ群と同様２つの内因性ビオチン化タンパク質バンドを示した。このようにして、本発明者らは、グリコシドを形成することによるＡｃ４ＭａｎＡｚのＣ１部位の化学修飾が代謝標識化プロセス全体をブロックすることができ、これがグリコシド結合を切断して１−ＯＨを露出させることができる特定のトリガーの存在下で再活性化されるという仮説を十分に実証した。
【０２０４】
アジド糖標識細胞の共焦点イメージングのための一般的手順。細胞を４０ｋ／ウェルの細胞密度で６ウェルプレート中のカバースリップ上に播種した。Ａｃ４ＭａｎＡｚまたはＡｃ３ＭａｎＡｚ誘導体を最終濃度５０μＭで添加し、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。培地を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中のＤＢＣＯ−Ｃｙ５（５０μＭ）を添加し、細胞をさらに１時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液を加えて細胞を１０分間固定し、続いて細胞核をＤＡＰＩ（２μｇ／ｍＬ）で１０分間染色した。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬を加えた顕微鏡スライド上に載せ、調製した試料をイメージングのために暗所で保存した。
【０２０５】
アジド糖標識細胞のフローサイトメトリー分析のための一般手順。細胞を４０ｋ／ウェルの細胞密度で６ウェルプレート中のカバースリップ上に播種した。Ａｃ４ＭａｎＡｚまたはＡｃ３ＭａｎＡｚ誘導体を添加し、細胞と共に７２時間インキュベートした。培地を除去し及び複数回の洗浄ステップ後、ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中のＤＢＣＯ−Ｃｙ５を添加し、細胞と共に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ｏｐｔｉ−ＭＥＭを除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。トリプシン溶液（１ｍＬ）と共に３７℃で３分間インキュベートすることによって細胞を持ち上げ、４％ＰＦＡ溶液（０．５ｍＬ）を添加して試験管に移した。１サンプルあたり２万細胞をフローサイトメトリーで分析し、データ解析をＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアで行った。
【０２０６】
Ａｃ３ＭａｎＡｚＮＢ媒介の制御された細胞標識化。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、６ウェルプレートのカバースリップ上に４０ｋ／ウェルの細胞密度で播種した。最終濃度が５０μＭのＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢを添加した。細胞を１２時間付着させ、その時点でＵＶ光（２０ｍＷ／ｍ２）を１０分間適用し、細胞をさらに６０時間インキュベートした。ＵＶ照射のない細胞を７２時間連続的にインキュベートした。次いで、共焦点イメージング及びフローサイトメトリーのための細胞試料を、上記の手順に従って調製した。
【０２０７】
Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱ媒介の制御された細胞標識化。ＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞またはＣａｃｏ−２結腸癌細胞またはヒト線維芽細胞ＩＭＲ９０細胞を、６ウェルプレートのカバーガラスに４０ｋ／ウェルの細胞密度で播種し、一晩付着させた。最終濃度が５０μＭのＡｃ３ＭａｎＡｚＨＱを添加し、続いて最終濃度が５０μＭのクルクミンを添加した。ＰＢＳまたはＡｃ３ＭａｎＡｚＨＱのみで処理した細胞を対照として使用した。７２時間のインキュベーションの後、上記手順に従って、共焦点イメージング及びフローサイトメトリーのための細胞試料を調製した。
【０２０８】
アジド糖で処理した細胞のウェスタンブロット分析。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、細胞培養フラスコ（２５ｃｍ２増殖領域）上に、５ｍＬの培地中のプレートあたり１×１０６細胞の密度で播種した。異なるアジド糖を加え、７２時間細胞と共にインキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、セルスクレーパーを用いてフラスコから採取した。１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により細胞をペレット化し、１錠のプロテアーゼインヒビター（ＥＤＴＡフリー）を含有する２００μＬの溶解緩衝液（１％ＳＤＳ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。溶解物を４℃で３０分間インキュベートし、続いて不溶性破片を除去するために３０００ｒｃｆで１０分間遠心分離した。各試料中の可溶性タンパク質の全濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって測定し、同じ濃度に調整した。次いで、溶解物２０μＬを取り出し、ホスフィン−ＰＥＧ３−ビオチン（２μＬ、ＰＢＳ中５ｍＭ）と共に３７℃で６時間インキュベートした。ローディングバッファーを各サンプルに添加し、サンプルを９５℃で加熱した後に１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲルを１００分間ランニング後、タンパク質をＨｙｂｏｎｄ  Ｐ膜に移し、続いてＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間膜のブロッキングをした。次いで膜をストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＴＢＳＴ中１：２０００で希釈）と共に４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回リンスし、ＥＣＬウェスタンブロッティング基質により発色させた。タンパク質バンドの蛍光可視化のために、２０μＬの細胞溶解物をＤＢＣＯ−Ｃｙ３溶液と共に３時間直接インキュベートした。ゲルランニング及び膜移動の後、Ｃｙ３／Ｃｙ３（励起／放出）チャネルを有するＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０１０システムを用いてタンパク質バンドを可視化した。
【０２０９】
実施例３．インビボでの細胞標識化におけるＡｃ４ＭａｎＡｚ誘導体の研究
次に、本発明者らは、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢを含むＡｃ３ＭａｎＡｚ誘導体がインビボでそのブロッキング効果を維持できるかどうかを検討した。皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスに、Ａｃ４ＭａｎＡｚ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔまたはＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢをそれぞれ１日１回、３日間、左の腫瘍に注射した。右の腫瘍を対照として使用した。注射２４時間後（ｐ．ｉ．）、腫瘍細胞を採取して、腫瘍細胞が代謝的にアジド基で標識されているかどうかを判定した。予想通り、Ａｃ４ＭａｎＡｚで処理した腫瘍は一連のアジド修飾糖タンパク質を示したが、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔまたはＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢで処理した腫瘍はＰＢＳグループと同じ内因性タンパク質バンドを示し、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢはインビボで癌細胞をアジド基で代謝的に標識できなかった。別の研究で、発現したアジド基がＤＢＣＯ−カーゴの腫瘍蓄積をどのように改善するかを理解するために、アジド糖の注射２４時間後に、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５を静脈内注射（ｉ．ｖ．）し、インビボ蛍光イメージングを用いてその体内分布をモニターした（図３、パネルａ）。注射２４時間後では、Ａｃ４ＭａｎＡｚで前処理した左の腫瘍は、右の腫瘍よりもはるかに強いＣｙ５蛍光強度（ＦＩ）を示し（図３、パネルｂ）、Ａｃ４ＭａｎＡｚによる腫瘍細胞の標識化が成功し、その結果インビボでのクリック反応によるＤＢＣＯ−Ｃｙ５の腫瘍保持の有意な増強を示唆している。これと比較して、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔまたはＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢで前処置した腫瘍は、対照腫瘍と比較して無視できる程わずかなＣｙ５保持の増強を示した。Ａｃ４ＭａｎＡｚ処置腫瘍のエクスビボ画像化は、対照腫瘍と比較してＣｙ５ＦＩの４倍以上の増加を示した（図３、パネルｃ及びｄ）。Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢ群では、処置した腫瘍と対照腫瘍との間にＣｙ５ＦＩに有意差は認められなかった。Ａｃ４ＭａｎＡｚで処理した腫瘍切片の共焦点イメージングはまた、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢ群における無視できる程度にわずかなＣｙ５蛍光とはきわだって対照的に強いＣｙ５蛍光を示した。これらの実験は、インビボでのＡｃ３ＭａｎＡｚＥｔ及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢのブロッキング効果を実証しただけでなく、効率的なクリックケミストリーによって媒介される優れたインビボ癌標的指向効果を示した。
【０２１０】
Ａｃ４ＭａｎＡｚ、Ａｃ３ＭａｎＡｚＥｔ及びＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢのインビボ腫瘍標識化。ＨＢＳＳ／マトリゲル（１／１、ｖ／ｖ）中のＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞（１５０万個）を両方の側腹部に皮下注射することにより、６週齢の胸腺欠損ヌードマウスに、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍モデルを樹立した。腫瘍が５〜６ｍｍに成長したとき、Ａｃ４ＭａｎＡｚまたはＡｃ３ＭａｎＡｚＥｔまたはＡｃ３ＭａｎＡｚＮＢ（２５ｍＭ、２０μＬ）を左腫瘍に１日１回３日間注入し、同量のＰＢＳを対照として右腫瘍に注射した（１群あたりＮ＝３）。最後の注射の２４時間後に、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５（５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射し、インビボでの蛍光イメージングによってその体内分布をモニターした。イメージングに先立って、麻酔インプット及びアウトプットポートを備えた試料ステージ上にヌードマウスを置き、Ｍａｅｓｔｒｏ  Ｉｎ−Ｖｉｖｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍで画像化した。５７５〜６０５ｎｍの励起フィルタを使用した。調整可能な発光フィルタは、各波長で撮影された画像に対して５０ｍｓの露光時間で、６３０〜８５０ｎｍまで１０ｎｍの増分で自動的にステップされた。収集された画像は、スペクトルアンミキシングアルゴリズムを用いて自己蛍光をＣｙ５シグナルから差し引くＭａｅｓｔｒｏソフトウェアによって分析した。ＤＢＣＯ−Ｃｙ５の注射２４時間後に、腫瘍及び主要な器官をマウスから採取した。エクスビボ画像は、Ｍａｅｓｔｒｏシステムを用いて同様に収集した。選択されたＲＯＩでの蛍光強度を、Ｍａｅｓｔｒｏイメージングソフトウェアを用いて定量した。すべての値を平均±標準偏差（ｎ＝３）として表した。
【０２１１】
組織のウェスタンブロット分析。アジド糖処理マウスから採取した腫瘍及び器官を、２ｍＬの溶解緩衝液（１％ＳＤＳ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を含むガラス管に移し、ホモジナイズし、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、溶解物を３０００ｒｃｆで１０分間遠心分離して、不溶性破片を除去した。総可溶性タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって測定し、各群について５ｍｇ／ｍＬに調整した。残りの手順は、上記の細胞のウェスタンブロット分析と同じであった。
【０２１２】
腫瘍組織切片の共焦点イメージング。エクスビボイメージングの後、腫瘍をＯ．Ｃ．Ｔ．化合物中で直接凍結させ、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ）上で６〜８μｍの厚さで切片化した。ＰＢＳ中のＤＡＰＩ（２μｇ／ｍＬ）を組織を取り付けている顕微鏡スライド上に加え、細胞核を染色した。１０分後、ＤＡＰＩ溶液を除去し、組織をＰＢＳで３回洗浄した。ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬を加えてカバースリップを顕微鏡スライド上に載せ、調製した試料を共焦点イメージングのために暗所で保存した。
【０２１３】
実施例４．代替の自壊性リンカーの研究
制御された標識化戦略を実証した後、本発明者らは次にインビボでの癌標識化及び標的指向化にそれを適用することを目標とした。組織浸透が乏しく健康な組織に損傷を与える可能性があるため、紫外線はインビボで実際的なトリガーではないので、レドックス調節不全、酸化剤レベル上昇、酵素過剰発現などの内因性癌特異的トリガーに応答するＡｃ３ＭａｎＡｚ誘導体の開発を目標にした。しかしながら、２−ニトロベンジルグリコシド結合を直接切断してヒドロキシル基にすることができるＵＶ照射とは異なり、これらのトリガーはグリコシド結合を直接切断することができず、したがって、保護基のトリガー誘発性の切断後にヒドロキシル基を最終的に放出することができる自壊性リンカーの取り込みを必要とする。
２つの従来の自壊性リンカー、ＣＬ１及びＣＬ２は、プロドラッグ設計において広く使用されている（図４、パネルａ）。保護基を除去する時、ＣＬ１は迅速にＣＯ２分子を除去してヒドロキシル基を露出させることができる。しかしながら、ＣＬ１は、細胞エステラーゼによって容易に分解され得るカーボネート結合を含有し、したがってこの設計には利用できない。ＣＬ２は、保護基の除去時に良好な脱離基としてフェノール構造を迅速に放出することができる。マスクされていない１−ＯＨを有する糖化合物が良好な脱離基である可能性を考慮して、ＣＬ２と同様の構造を有するＰＬ１（図４、パネルｂ）を設計し、これを過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）応答性Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＢに組み込む。しかしながら、保護基がＨ２Ｏ２によって容易に除去されたにもかかわらず、Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＢはＡｃ３ＭａｎＡｚＯＨを放出できなかった。次に、非常に安定化された分解生成物が自壊性リンカーの切断を容易にするという仮定に基づいて、ＰＬ１のα−炭素に結合したさらなるフェニル基を有するＰＬ２を設計した（図４、パネルｃ）。
【０２１４】
実施例５．追加のトリガー応答性基の調査
自壊性リンカーとしてのＰＬ２の実現可能性を調べるために、ＮＱＯ１酵素応答性保護基を有するＡｃ３ＭａｎＡｚＨＱを合成し、代表的な還元剤として亜ジチオン酸ナトリウムを用いてインビトロでのその分解を調べた。Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱは亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で急速分解し、ＥＳＩ  ＭＳを用いて分解生成物としてのＡｃ３ＭａｎＡｚＯＨの生成を確認した。次いで、本発明者らは、ＮＱＯ１応答性Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱの制御された代謝標識化能力をインビトロで試験した。Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱで３日間、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５で１時間インキュベートした後、ＮＱＯ１酵素が豊富なＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞は、細胞表面上で均一なＣｙ５蛍光を示し、アジド基の好結果の発現を示した。しかしながら、ＮＱＯ１欠損であるＣａｃｏ−２結腸癌及びＩＭＲ−９０ヒト線維芽細胞系は、細胞表面上で無視できる程ごくわずかなＣｙ５蛍光しか示さなかった。Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱの代謝標識化能力を活性化するＮＱＯ１酵素の重要な役割をさらに確認するために、ＮＱＯ１酵素の阻害剤である、クルクミンがＡｃ３ＭａｎＡｚＨＱ媒介細胞標識化を阻害できるかどうかを検討した。その結果、Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱのみで処理した細胞と比較して、Ａｃ３ＭａｎＡｚＨＱとクルクミンとを共にインキュベートしたＬＳ１７４Ｔ細胞では、標識化効率の有意な低下が観察された。
【０２１５】
外部トリガー（近赤外（ＮＩＲ）光）または内部トリガー（Ｈ２Ｏ２、腫瘍低酸素環境、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン１（ＮＱＯ１）、及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ））／カテプシンＬ（ＣＴＳＬ））に応答するトリガー活性化可能なＡｃ３ＭａｎＡｚ誘導体のライブラリーを図５に示す。そのうち、ＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ応答性糖誘導体であるＥ−Ｓは、インビトロ及びインビボの両方で選択的な癌標識を可能にした。
【０２１６】
実施例６．ＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ応答性糖誘導体Ｅ−Ｓの合成
【化３２】
2018535198.tif 000040
ＡｃＬｙｓ（ＮＨＳ）（７）の合成。ＡｃＬｙｓ（ＯＨ）（２．０ｍｍｏｌ、４６０ｍｇ）及びトリメチルアミン（２．１ｍｍｏｌ、２１２ｍｇ）を無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、続いてＤＣＣ（２．１ｍｍｏｌ、４３３ｍｇ）及びＮＨＳ（２．１ｍｍｏｌ、２４２ｍｇ）を添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。沈殿物をろ別し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、溶離剤として酢酸エチルを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色固体を得た（収率７０％）。
【０２１７】
化合物８の合成。ＡｃＬｙｓ（ＮＨＳ）（１．２ｍｍｏｌ）及び化合物５（１．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解し、続いてトリメチルアミン（１．２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４０℃で２４時間撹拌した。溶媒を除去した後、粗生成物を、溶離剤として酢酸エチルから酢酸エチル／メタノール（２０／１、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色固体を得た（収率６０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ）、７．３４（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ）、７．２９（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ）、７．２１（ｔ，１Ｈ，Ｐｈ）、５．７４（ｓ，１Ｈ，ＣＨ（ＯＨ））、４．３９（ｍ，１Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、３．１５（ｔ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、２．００（ｓ，３Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、１．８９（ｓ，３Ｈ，ＣＨＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、１．８３＆１．７２（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、１．５３（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、１．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：１７２．２，１７２．０，１７１．７，１４４．７，１４０．９，１３７．３，１２８．１，１２７．０，１２６．５，１２０．１，７５．３，５４．４，３８．９，３１．７，２８．９，２３．１，２１．４，２１．２。ＥＳＩ  ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ２３Ｈ２９Ｎ３Ｏ４Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋４３４．２に対する計算値、実測値４３４．２。
【０２１８】
ＡｃＬｙｓ（ＤＰＭ−ＣＮＣＣｌ３）（９）の合成。化合物８（０．５ｍｍｏｌ）及びＣＮＣＣｌ３（５．０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦに溶解し、続いて１，８−ジアザビシクロイドデセ−７−エン（ＤＢＵ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を除去した後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して白色固体を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）７．９９（ｍ，１Ｈ）、７．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．３８−７．１９（ｍ，７Ｈ）、５．２７（ｓ，１Ｈ）、４．４３（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｍ，１Ｈ）、３．１７（ｍ，２Ｈ）、２．０２（ｓ，３Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）、１．８４＆１．７３（ｍ，２Ｈ）、１．５５（ｍ，２Ｈ）、１．４４（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：２０８．４２，１７２．２，１７２．１，１７１．７，１４２．４，１３８．５，１３７．６，１２８．２，１２７．３，１２６．８，１２０．２，１０１．８，８５．０，６４．４，５４．３，３９．１，３１．７，２８．９，２３．１，２１．４，２１．３。
【０２１９】
Ａｃ３ＭａｎＡｚＯＨ（１０）の合成。Ａｃ４ＭａｎＡｚ（０．５ｍｍｏｌ）及び炭酸アンモニウム（０．７５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）に溶解し、室温で撹拌した。１２時間後、溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して白色固体を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）６．５６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．４４（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，４．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．２２（ｓ，１Ｈ）、５．１８（ｔ，１Ｈ）、４．６３（ｄｄｄ，Ｊ＝９．２，４．２，１．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．３１−４．０１（ｍ，５Ｈ）、３．７４（ｍ，１Ｈ）、２．１４＆２．０８＆２．０５（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）１７１．０，１７０．４，１７０．１，１６７．１，９３．４，６９．２，６８．４，６６．０，６２．５，５２．７，５０．９，２１．１，２１．０，２０．９。
【０２２０】
Ｅ−Ｓの合成。Ａｃ３ＭａｎＡｚＯＨ（０．２ｍｍｏｌ）及びＡｃＬｙｓ（ＤＰＭ−ＣＮＣＣｌ３）を無水アセトニトリルに溶解し、続いて三フッ化ホウ素エーテラート（２．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で１時間撹拌した。溶媒を除去した後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー及びＨＰＬＣによって精製して白色固体を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．５５（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）、７．３５−７．２８（ｍ，７Ｈ，Ｐｈ）、６．７３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ）、６．５０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ）、５．９５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２）、５．６５（ｓ，１Ｈ，ＰｈＣＨ）、５．４３（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．１，８．３，４．２Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨＣＨＣＨ）、５．１７（ｔｄ，Ｊ＝１０．２，３．２Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨＣＨＣＨ）、４．７５−４．８０（ｍ，１Ｈ，ＮＨＣＨＣＨＯ）、４．６８（ｍ，１Ｈ，ＮＨＣＨＣＨＯ）、４．５５（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、４．１８＆４．０５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨＣＨＣＨ）、４．０２（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２Ｎ３）、３．９４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨＣＨＣＨ）、３．２２（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、２．１２＆２．０６＆２．０３＆１．９９＆１．９６（１５Ｈ，ＣＨ３Ｃ（Ｏ）Ｏ）、１．９３＆１．７４（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、１．５１（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、１．３８（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）１７１．５，１７１．２，１７０．７，１７０．４，１７０．０，１７０．０，１６６．８，１４１．２，１３７．８，１３７．２，１３５．６，１２９．１，１２８．８，１２８．５，１２７．５，１２６．７，１２０．２，８０．０，７７．５，７７．５，７７．３，７７．２，７７．０，６９．９，６９．０，６５．８，６２．３，５３．９，５２．７，５０．５，３８．８，３１．３，２９．１，２３．４，２２．５，２１．１，２０．９。ＨＲ  ＥＳＩ  ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ３７Ｈ４８Ｎ７Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋７８２．３３６１に対する計算値、実測値７８２．３３５４。
【０２２１】
実施例７．癌細胞を標識化するための選択性を改善するためのインビトロ研究。
トリガー活性化可能なケージ化糖前駆体の設計のためのＰＬ２の実現可能性を実証した後、本発明者らは、より良好な癌選択的標識化能力を有するＡｃ３ＭａｎＡｚ誘導体の開発を目指した。ＮＱＯ１酵素と比較して、いくつかの他の酵素は、癌細胞と正常細胞との間の一般的な差異をより良く表す。例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）及びカテプシンＬ（ＣＴＳＬ）の両方が癌細胞株で過剰発現されることが報告されている。ＨＤＡＣとＣＴＳＬを１つのトリガーとして組み合わせた本発明者らのＥ−Ｓの設計では、まずＨＤＡＣがリジン残基のアセチル基を除去した後、ＣＴＳＬによるペプチド結合の切断と自壊性リンカーの除去が続き、代謝的に活性なＡｃ３ＭａｎＡｚＯＨを放出する（図６、パネルＡ）。異なる細胞株におけるＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ活性を検出するために、本発明者らは最初に、ＨＤＡＣ及びＣＴＳＬの両方の存在下で蛍光がオンになる蛍光レポーター（Ｎａｐｈ−Ｌｙｓ）を合成した。ＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞、ＭＣＦ−７乳癌細胞、４Ｔ１三重陰性乳癌細胞、ＨｅＬａ細胞、及びＨｅｐＧ２肝癌細胞を含むほとんどの癌細胞株におけるＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ活性は、ＩＭＲ−９０ヒト線維芽細胞を含む健常細胞株よりもはるかに高かった。しかしながら、ＨＤＡＣ（トリコスタチンＡ（ＴＳＡ））またはＣＴＳＬ（Ｚ−ＦＹ−ＣＨＯ）のいずれかの阻害剤の存在下で、Ｎａｐｈ−Ｌｙｓのターンオン蛍光強度は、酵素活性の低下の結果として大きく減少した。次に、本発明者らは、異なる細胞株をＥ−Ｓと３日間インキュベートし、続いて潜在的に発現するアジド基をＤＢＣＯ−Ｃｙ５を用いて検出することにより、インビトロでのＥ−Ｓの制御された細胞標識化能力を調べた。ＣＬＳＭイメージは、ＩＭＲ−９０細胞の表面上に観察される無視できる程にわずかなＣｙ５蛍光とは対照的に、ＬＳ１７４Ｔ細胞の表面上に明瞭かつ明るいＣｙ５蛍光シグナルを示し（図６、パネルｂ及びｃ）、ヒト線維芽細胞を超えるＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞のＥ−Ｓの選択的標化能力を示唆する。ＬＳ１７４Ｔ細胞をＥ−Ｓ及びＨＤＡＣ（ＴＳＡ）またはＣＴＳＬ（Ｚ−ＦＹ−ＣＨＯ）の阻害剤と共にインキュベートすると、Ｅ−Ｓの標識化効率が大幅に低下し  図６、パネルｂ及びｄ）、Ｅ−Ｓの標識化プロセスのＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ誘発性再活性化が示唆された。
【０２２２】
Ｅ−Ｓの代謝ラベリングプロセスのより良い理解を得るために、本発明者らは、インビトロでＥ−Ｓの標識化動態学を分析した。異なる時間（１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間）の様々な濃度（１０μＭ、５０μＭ、２００μＭ及び１ｍＭ）のＥ−ＳでＬＳ１７４Ｔ細胞をインキュベートした後、細胞表面アジドをＤＢＣＯ−Ｃｙ５によって検出した。ＤＢＣＯ−Ｃｙ５の低い細胞取り込みのために、Ｃｙ５蛍光強度の測定を介して細胞表面アジドを半定量的に決定し、比較することができた。Ｅ−Ｓの代謝標識化プロセスは、時間及び濃度依存性であり、細胞表面アジドの数は４８時間でプラトー値に近づく。細胞表面アジドの数密度の推定は、ＬＳ１７４Ｔ細胞をＥ−Ｓ（２００μＭ）と共に４８時間インキュベートした後に細胞あたり１０６〜１０７のアジドの値を示した。１細胞あたり約１０３〜１０４であると報告された従来の標的指向化戦略におけるタンパク質レセプターの数密度と比較して、クリック反応と組み合わせたアジド糖に起因する標的指向化効率は潜在的にはるかに高い可能性があった。
【０２２３】
ＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ蛍光レポーター（Ｎａｐｈ−Ｌｙｓ）の合成経路
【化３３】
2018535198.tif 000041
Ｎａｐｈ−ＮＨ２の合成。４−アミノ−１，８−ナフタル酸無水物（１０ｍｍｏｌ、２．１３ｇ）をエタノールに窒素雰囲気下で溶解し、還流させた。次いで、１−ブチルアミンを添加し、混合物をさらに８時間還流した。冷却後、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を、溶離剤としてＤＣＭ／酢酸エチル（２／１、ｖ／ｖ）（７５％収率）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ  ８．６０（ｄ，１Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＣＨＣＨＣＨ）、８．４２（ｄ，１Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＣＨＣＨＣＨ）、８．１０（ｄ，１Ｈ  Ｃ（Ｏ）ＣＣＨＣＨＣＨ）、７．６６（ｔ，１  Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＣＨＣＨ）、６．８９（ｄ，１Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＣＨＣＨ）、４．９４（ｓ，２Ｈ，ＮＨ２）、４．１８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、１．７１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、１．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、０．９７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）。
【０２２４】
Ｎａｐｈ−Ｌｙｓの合成。Ｎａｐｈ−ＮＨ２（１．０ｍｍｏｌ）及びＡｃＬｙｓ（ＯＨ）（１．０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、続いてＤＣＣ（１．１ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（１．１ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４５℃で４８時間撹拌した。沈殿物をろ別し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、溶離液としてヘキサン／酢酸エチル（３／１、ｖ／ｖ）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体を得た（収率６０％）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ３３Ｎ４Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋４８１．２に対する計算値、実測値４８１．２。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：δ  ８．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＣＨＣＨＣＨ）、８．５２（ｄ，１Ｈ  Ｃ（Ｏ）ＣＣＨＣＨ）、８．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＣＨＣＨＣＨ）、８．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＣＨＣＨ）、７．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＣＨＣＨＣＨ）、４．６２（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、４．１４（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３．２２（ｔ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、２．０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ）、１．９８（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、１．９２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２）、１．６９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、１．６０（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、１．５３（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、１．４３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、０．９９（ｍ，３Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）。
【０２２５】
細胞性ＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ活性の検出。細胞を２４ウェルプレートに８ｋ／ウェルの細胞密度で播種し、一晩付着させた。ＯｐｔｉＭＥＭ中のＮａｐｈ−Ｌｙｓ（５０μＭ）を添加し、異なる時間（３０分、１時間、２時間及び４時間）細胞と共にインキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭを除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を４％ＰＦＡで１０分間固定し、ＤＡＰＩ（２μｇ／ｍＬ）で１０分間染色した。細胞の平均蛍光強度を、ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣチャネルを用いてＧＥ−Ａｎａｌｙｚｅｒで測定した。１ウェルあたりの細胞数を決定するためにＤＡＰＩチャネルを用いた。ＦＩＴＣチャネルを使用して、１ウェルあたり放出されたＮａｐｈ−ＮＨ２の全蛍光強度を決定した。データは、細胞あたりの平均蛍光強度で示した。
【０２２６】
細胞ＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ活性に対するＴＳＡ及びＺ−ＦＹ−ＣＨＯの阻害効果。ＴＳＡ及びＺ−ＦＹ−ＣＨＯは、それぞれＨＤＡＣ及びＣＴＳＬの阻害剤であることが知られている。それらの阻害効果を調べるために、細胞を８ｋ／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。次いで、細胞を４群に分けた：第１群の細胞にＮａｐｈ−Ｌｙｓ（５０μＭ）を添加し、第２群の細胞にＮａｐｈ−Ｌｙｓ（５０μＭ）＋ＴＳＡ（１μＭ）を添加し、第３群の細胞にＮａｐｈ−Ｌｙｓ（５０μＭ）＋Ｚ−ＦＹ−ＣＨＯ（２０μＭ）を添加し、第４群の細胞に陰性対照としてＰＢＳを添加した。細胞を４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで１０分間固定し、ＤＡＰＩ（２μｇ／ｍＬ）で１０分間染色した。細胞の平均蛍光強度を、ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣチャネルを用いてＧＥ−Ａｎａｌｙｚｅｒで測定した。
【０２２７】
インビトロでのＥ−Ｓ媒介の制御された細胞標識化。ＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞またはヒト線維芽細胞ＩＭＲ９０細胞を、６ウェルプレート中のカバースリップ上に、４０ｋ／ウェルの細胞密度で播種した。最終濃度５０μＭのＥ−Ｓを添加し、続いてＴＳＡ（１μＭ）またはＺ−ＦＹ−ＣＨＯ（５０μＭ）のいずれかを添加した。ＰＢＳまたはＥ−Ｓのみで処理した細胞を対照として用いた。７２時間のインキュベーション後、培地を除去し、共焦点イメージング及びＧＥ−Ａｎａｌｙｚｅｒ測定のための細胞試料を上記の手順と同様に調製した。
【０２２８】
インビトロでのＥ−Ｓの標識化動態学。ＬＳ１７４Ｔ細胞を黒色の９６ウェルプレートに播種し、様々な濃度のＥ−Ｓ（１０μＭ、５０μＭ、２００μＭ、及び１ｍＭ）と異なる時間（３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間）インキュベートした。培地を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中のＤＢＣＯ−Ｃｙ３（２０μＭ）と共に２時間インキュベートした。ＤＢＣＯ−Ｃｙ３溶液を除去した後、３つの三連ウェルの細胞をトリプシンで持ち上げ、ウェルあたりの細胞数（Ｎ細胞／ウェル）を決定するために顕微鏡下で計数した。別の３つの三連ウェルの細胞を溶解し、プレートリーダーでＣｙ３蛍光を測定した。標準曲線の決定及び細胞表面上のアジド基の数の計算のために、ＤＢＣＯ−Ｃｙ３溶液の勾配濃度を用いた。細胞あたりの発現したアジド基の数（Ｎアジド／細胞）を以下の方法を用いて評価した：
【表１】
2018535198.tif 000042
【０２２９】
Ｅ−Ｓ処理細胞のウェスタンブロット分析。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、細胞培養フラスコ（２５ｃｍ２の増殖領域）上に５ｍＬの培地中の１プレート当たり１×１０６細胞の密度で播種し、一晩付着させた。次に細胞をＥ−Ｓ（５０μＭ）、Ｅ−Ｓ（５０μＭ）＋ＴＳＡ（１μＭ）、Ｅ−Ｓ（５０μＭ）＋Ｚ−ＦＹ−ＣＨＯ（５０μＭ）及びＰＢＳでそれぞれ７２時間処理した。溶媒を除去し、ＰＢＳで複数回洗浄した後、セルスクレーパーを用いてフラスコから細胞を採取した。残りの手順は、細胞のウェスタンブロット分析のための上記の一般的手順と同じであった。
【０２３０】
Ｅ−Ｓの薬物動態プロファイル
Ｅ−Ｓの放射性標識化
【化３４】
2018535198.tif 000043
ＤＢＣＯ−ＤＯＴＡの合成。Ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ（０．０５ｍｍｏｌ、３４ｍｇ）及びＤＢＣＯ−アミン（０．０５ｍｍｏｌ、１４ｍｇ）を無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に懸濁させた。トリエチルアミン（０．２ｍｍｏｌ、２０ｍｇ）を加え、混合物を４０℃で撹拌した。ＨＰＬＣ測定は、１２時間後に完全な反応を示した。溶媒を減圧下で除去し、生成物をさらに精製することなく使用した。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ４２Ｈ５０Ｎ７Ｏ９Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋８２８．３に対する計算値、実測値８２８．２。
【０２３１】
Ｅ−Ｓ−ＤＯＴＡの合成。ＤＢＣＯ−ＤＯＴＡ（０．００３ｍｍｏｌ、２．５ｍｇ）及びＥ−Ｓ（０．００３ｍｍｏｌ、２．３ｍｇ）をメタノールに溶解した。混合物を室温で１時間撹拌し、その時点でＨＰＬＣは出発物質の完全な消費を示した。
【０２３２】
Ｅ−Ｓ−ＤＯＴＡの６４Ｃｕ標識化。ＮＨ４ＯＡｃ緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ＝５．５，１ｍＬ）中の６４Ｃｕ塩化物（４００μＣｉ、０．１ｎｇの６４Ｃｕ）をＰＢＳ中のＥ−Ｓ−ＤＯＴＡ（２ｍｇ）と混合した。混合物を８０℃で１時間激しく撹拌し、その時点でＨＰＬＣは遊離の６４Ｃｕの完全な消費を示した。生成物溶液をさらに精製することなく直接使用した。
【０２３３】
Ｅ−Ｓ−ＤＯＴＡ−６４Ｃｕの薬物動態研究。Ｅ−Ｓ−ＤＯＴＡ−６４Ｃｕ溶液（約１００μＣｉ）をＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウス（Ｎ＝３）に静脈内注射した。選択した時点（１０分、３０分、１時間、３時間、６時間、１２時間、及び２４時間）で、毛細管チューブを用いて眼窩静脈叢から血液を採取した。採血前に毛細管チューブを秤量した。採取した血液試料を計量し、５１１ＫｅＶの光電ピークで適切なエネルギーウィンドウを用いてＷｉｚａｒｄ２自動ガンマカウンターで６４Ｃｕ放射能を測定した。バックグラウンド、減衰、及び重量について生のカウントを補正した。補正された計数を、予め決定された検量線を介して、血液１グラムあたりのマイクロキュリー（μＣｉ）に変換した。各血液サンプル中の放射能を計算し、血液１グラム当たりの注入量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として提示した。注射２４時間後に採血した後、残存放射能の測定のために腫瘍及び主要臓器を採取した。各組織試料中の放射能を、組織１ｇ当たりの注入量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として計算した。
【０２３４】
実施例８．癌細胞を標識化するための選択性を改善するためのインビボ研究。
インビトロでのＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ応答性Ｅ−Ｓの制御された標識化特性を実証した後、本発明者らは、インビボでのＥ−Ｓの癌選択的標識化能力を次に研究した。Ｅ−Ｓは３日間連続してＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスに１日１回静脈内注射した。Ａｃ４ＭａｎＡｚ及びＰＢＳで静脈内処置したマウスを対照として用いた（図７、パネル（ａ））。アジド糖の、注射２４時間後における腫瘍組織のウエスタンブロッティング分析は、Ｅ−Ｓ群のアジド修飾タンパク質の量がＰＢＳ群と比較して増加したが、肝臓、脾臓、心臓、及び肺のアジド修飾タンパク質の量の差は無視できる程にわずかでＥ−ＳとＰＢＳとの間で観察された（図７、パネル（ｂ））。対照的に、標識化選択性をもたないＡｃ４ＭａｎＡｚは、肝臓、脾臓、肺及び腎臓組織において発現しているかなりの量のアジド基と共に、正常組織において非特異的標識を示した（図７、パネルｂ）。これらの実験は、Ａｃ４ＭａｎＡｚと比較してインビボでのＥ−Ｓの優れた癌選択的標識化能力を実証した。別の研究では、アジド糖注射の２４時間後にＤＢＣＯ−Ｃｙ５を静脈内注射し、その生体内分布をモニターした。ＤＢＣＯ−Ｃｙ５の注射４８時間後、Ｅ−Ｓ群の腫瘍は、ＰＢＳ群の腫瘍よりも有意に高いＣｙ５保持を示した（図７、パネルｃ）。肝臓、脾臓、心臓、肺、及び腎臓でのＣｙ５保持は有意に変化しなかったが、Ｅ−Ｓ群における採取した腫瘍のイメージングはＰＢＳ群と比較して１．５２倍のＣｙ５蛍光強度を示した（図７、パネルｃ及びｄ）。Ａｃ４ＭａｎＡｚ群と比較して、Ｅ−Ｓ群のＤＢＣＯ−Ｃｙ５は、腫瘍における蓄積の改善を示した。総合すると、これらの実験は、Ｅ−ＳがインビボでＬＳ１７４Ｔ腫瘍を選択的に標識することができ、発現したアジド基がクリックケミストリーによってＤＢＣＯ−Ｃｙ５の腫瘍蓄積を有意に増強できることを示した。
【０２３５】
次に、本発明者らは、Ｅ−Ｓ媒介性腫瘍標識化及びクリック反応によるその後の腫瘍標的指向化効果の可能性をより良く理解するためのインビボでのＥ−Ｓの標識化動態を研究した。放射性標識されたＥ−Ｓの薬物動態学的研究は、注入後２４時間で腫瘍組織に４．９６％ＩＤ／ｇの放射性標識Ｅ−Ｓが保持される、静脈内注射後の急速な腎クリアランスを示した。Ｅ−Ｓのインビボ標識動態を研究するために、Ｅ−ＳをＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスに静脈内注射により投与し、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５を用いて発現アジド基を検出するために、注射後異なる時間（８時間、２４時間及び４８時間）で腫瘍を採取し、切片化した。注射後８時間で採取した腫瘍組織切片は、Ｅ−Ｓ処理なしの対照群と比較して細胞膜上のＤＢＣＯ−Ｃｙ５シグナルが有意に増強され、Ｅ−Ｓが腫瘍細胞をアジド基で首尾よく標識したことを示唆した（図７、パネルｅ及びｆ）。腫瘍細胞におけるＥ−Ｓの代謝標識化プロセスのためにより多くの時間（２４時間または４８時間）を許容すると、発現されるアジドの量は有意に増加した。おそらく速い標識動態及び限られたＥ−Ｓの腫瘍蓄積の集合的結果として、２４時間群と４８時間群の腫瘍組織切片との間の細胞表面アジドの量に有意差は見られなかったことは注目に値する。本発明者らは、次に、より多くのＥ−Ｓ注射が腫瘍領域におけるアジド基の量を増加させるかどうかを検討した。２回のＥ−Ｓ注射をしたマウスの腫瘍組織切片は、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５の細胞表面への付着を有意に増強し、細胞表面アジドの量の増加を示唆した（図７、パネルｇ）。３回のＥ−Ｓの静脈内注射は、腫瘍細胞によるアジド基の代謝発現をさらに改善した。これらの結果は、２４時間間隔の複数のＥ−Ｓ注射が、腫瘍組織中のアジド基の発現量を連続的に増加させることができることを示した。
【０２３６】
インビボでのＥ−Ｓ介在性癌選択的標識化：
（１）組織のウェスタンブロット分析。ＬＳ１７４Ｔ腫瘍モデルは、ＨＢＳＳ／マトリゲル（１／１、ｖ／ｖ）中のＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞（１５０万）の皮下注射により、６週齢の胸腺欠損ヌードマウスに確立された。腫瘍が５〜６ｍｍに成長したとき、Ｅ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、３日間静脈内注射した。Ａｃ４ＭａｎＡｚ（４０ｍｇ／ｋｇ、ＰＢＳ中１０％ＤＭＳＯ）またはＰＢＳによる静脈内注射で投与したマウスを対照として使用した。最後の注射の２４時間後に、腫瘍及び主要器官を採取し、溶解緩衝液（２ｍＬ）に移し、ホモジナイズした。溶解物を４℃で３０分間インキュベートし、不溶性破片を３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって除去した。総可溶性タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって測定し、各群について５ｍｇ／ｍＬに調整した。残りの手順は、ウェスタンブロット分析のための上記の一般的手順と同じであった。３群すべての腫瘍組織及び健康な組織におけるアジド標識されたタンパク質バンドを可視化し、インビボでのＥ−Ｓの癌選択的標識化能力を理解するために比較した。
【０２３７】
（２）ＤＢＣＯ−Ｃｙ５のインビボ及びエクスビボ生体内分布。別の研究では、腫瘍が５〜６ｍｍに成長したとき、Ｅ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、３日間静脈内注射した。Ａｃ４ＭａｎＡｚ（４０ｍｇ／ｋｇ）及びＰＢＳを静脈内注射したマウスを対照として使用した。最後の注射の２４時間後に、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射し、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎ−Ｖｉｖｏ  Ｘｔｒｅｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用したインビボ蛍光イメージングを介してその生体内分布をモニターした。ＤＢＣＯ−Ｃｙ５の注射４８時間後に、腫瘍及び器官をマウスから採取した。エクスビボ画像は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎ−Ｖｉｖｏ  Ｘｔｒｅｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて同様に収集した。選択された関心領域（ＲＯＩ）での蛍光強度を、Ｂｒｕｋｅｒイメージングソフトウェアを用いて定量した。すべての値を平均±標準偏差（ｎ＝３）として表した。
【０２３８】
インビボでのＥ−Ｓの腫瘍標識化動態。皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスに、Ｅ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。Ｅ−Ｓ注射のないマウスを対照として使用した。Ｅ−Ｓ注射後の異なる時間（８、２４、及び４８時間）で、腫瘍を収穫し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物内で凍結させ、厚さ８μｍに切断した。腫瘍組織切片を５％ＢＳＡと共に２時間インキュベートし、次いでＤＢＣＯ−Ｃｙ５（２０μＭ）で３０分間標識した。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＰＩ（２μｇ／ｍＬ）及びＣｅｌｌＭａｓｋ  ｏｒａｎｇｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｔａｉｎ（１μｇ／ｍＬ）を加えて細胞核及び膜を染色した。腫瘍組織切片を共焦点レーザー走査顕微鏡下でイメージングした。イメージングパラメータは、イメージングされたすべての試料について同一に保たれた。データ解析は、ＺＥＮ  ２０１１ソフトウェアを用いて行った。各画像の平均Ｃｙ５蛍光強度を抽出し、２０個の画像にわたって平均して、各組織切片の平均Ｃｙ５蛍光強度を得、次いで、２０個の組織切片にわたって平均して各腫瘍の平均Ｃｙ５蛍光強度を得た。
【０２３９】
インビボでの用量依存性Ｅ−Ｓ媒介性腫瘍標識化。皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウス（１群あたりｎ＝３）は、Ｅ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）を異なる回数（１回、２回または３回の注射）２４時間間隔にて静脈内注射で投与した。Ｅ−Ｓ注射のないマウスを対照として使用した。Ｅ−Ｓの最後の注射の２４時間後に、腫瘍を採取し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物中で凍結し、厚さ８μｍに切片化した。腫瘍組織切片を染色し、イメージングし、上記の手順に従って分析した。
【０２４０】
実施例９．クリックケミストリー反応による抗癌剤の送達。
Ｅ−Ｓがインビボでアジド基にとって選択的に癌細胞を標識し、発現アジド基がクリック反応によりＤＢＣＯ−Ｃｙ５を良好に保持できることを実証した後、本発明者らはＥ−Ｓ前処置が小分子ＤＢＣＯ−薬物コンジュゲートの抗癌効果を高めるかどうかを調べた。カテプシンＢ切断性リンカーを有するＤＢＣＯ−ドキソルビシンコンジュゲート（ＤＢＣＯ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＤＯＸＯ（Ｄ−Ｄ））を合成した（図８、パネルａ）。このリンカーは、カテプシンＢ切断可能ジペプチド（ｖａｌ−ｃｉｔ）と、酵素分解プロセス中の立体障害を減少させる自壊性β−アミノベンジルカルボメート（ＰＡＢＣ）リンカーと、水溶性を改善するための短いポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントとからなる。
合成されたＤ−Ｄは生理学的条件下で優れた安定性を示し、同時に活性化カテプシンＢの存在下で遊離ＤＯＸＯを迅速に放出させた。インビトロのＬＴ１７４Ｔ細胞に対するＤ−Ｄの抗癌活性を、ＭＴＴアッセイによって調べたところ、ＩＣ５０値２．５μＭを示した。Ｅ−Ｓで３日間前処理されたＬＳ１７４Ｔ細胞は、一定量のインキュベーション時間（３０分、１時間及び４２時間）内に対照細胞と比較して、クリック反応によるＤ−Ｄの細胞取り込みを有意に増強した。アジド修飾された癌細胞による共有結合したＤＢＣＯ−カーゴの細胞内運命を、その低い受動的細胞の取り込みを利用する、モデル化合物としての蛍光ＤＢＣＯ−Ｃｙ５を用いて調べた。ＤＢＣＯ−Ｃｙ５と１時間インキュベートし、非結合のＤＢＣＯ−Ｃｙ５を洗い流した後、Ｅ−Ｓ前処理したＬＳ１７４Ｔ細胞を蛍光顕微鏡下でモニターした。Ｅ−Ｓ前処理を行わない対照細胞では無視できる程わずかなＣｙ５シグナルはＤＢＣＯ−Ｃｙ５の受動的取り込みを排除した。ＤＢＣＯ−Ｃｙ５は、最初に細胞表面に共有結合的に付着し（細胞膜染色剤とオーバーレイ）、インキュベーション時間にわたって徐々にリソソームに入った（リソトラッカーとオーバーレイ）。細胞をさらに１２時間インキュベートすると、細胞膜上のＤＢＣＯ−Ｃｙ５の完全な消失が観察された。共有結合的に付着したＤ−Ｄは、細胞リソソーム中のカテプシンＢの存在下で薬物を放出することができると想像することができる。遊離ＤＯＸＯと比較して、Ｄ−Ｄも有意に延長した血液循環を示した。次に、本発明者らは、Ｅ−Ｓ前処置が、腫瘍保持及びＤ−Ｄの蓄積を増強し、それにより増幅された治療効果を付与するかどうかを検討した。急性の抗腫瘍効力試験において、皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスに、Ｅ−ＳまたはＰＢＳを１日１回、３日間（０日目、１日目及び２日目）静脈内注射で投与し、及び３日目に薬物Ｄ−Ｄを静脈内注射で投与した。注射４８時間後に、腫瘍及び主要器官を採取した。肝臓、脾臓、肺、心臓、及び腎臓におけるＤ−Ｄ蓄積の有意な変化は観察されなかったが、組織で保持された薬物の定量化は、ＰＢＳで処置した対照マウスと比較して、Ｅ−Ｓで処置したマウスにおいて、１．４６倍の腫瘍のＤ−Ｄ蓄積を示した（図８、パネル（ｂ））。Ｅ−Ｓ／Ｄ−Ｄで処置した腫瘍は、３３．５±４．２％のアポトーシス指数を示し、Ｄ−Ｄのみで処置した腫瘍（１８．３±４．０％）よりも有意に大きかった（図８、パネル（ｃ））。陰性対照として、Ｅ−ＳまたはＰＢＳで処置した腫瘍は、それぞれ１．５±０．６％または１．７±０．５％という、より低いアポトーシス指数を示した（図８、パネル（ｃ））。これらの実験は、Ｅ−Ｓ媒介性癌選択的標識化が、Ｄ−Ｄの腫瘍蓄積及び急性の抗腫瘍効果を有意に改善し得ることを確認した。
【０２４１】
Ｅ−Ｓ標識によって媒介されるＤ−Ｄの増強された腫瘍蓄積がどのようにして改善された抗腫瘍活性を与えるかをさらに理解するために、腫瘍容積を長期にわたってモニターすることによって別個の有効性試験を行った。ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスを、Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄ、Ｄ−Ｄ、Ｅ−Ｓ、及びＰＢＳの４つの群に分けた。ＰＢＳ及びＥ−Ｓ群と比較して、Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄ群は、より大きな腫瘍成長阻害を示した（図８、パネルｄ）。Ｄ−Ｄと比較して、Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄも腫瘍増殖速度を有意に低下させた（図８、パネルｄ）。Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄは、ＰＢＳ群と比較してマウスの生存期間を８６．０％改善し、Ｄ−Ｄのみの生存期間（１７．１％）よりも実質的に大きかった（図８、パネルｅ）。総合すると、クリックケミストリーによる薬剤の腫瘍蓄積の増大の結果、Ｅ−Ｓ＋Ｄ−ＤはＤ−Ｄ単独よりも大幅に改善された抗癌効力を発揮した。
【０２４２】
転移性の癌は、手術、放射線療法、化学療法などの従来の癌療法を逃れることができるため、癌患者の死因の主因である。抗体ベースの療法を含む新興の癌標的療法は、転移性癌の治療において大きな可能性を示している。原発結腸腫瘍モデルにおけるＥ−Ｓ／Ｄ−Ｄの優れた癌標的化効果を実証した後、本発明者らは、Ｅ−Ｓ及びＤ−Ｄの組み合わせ標的療法が４Ｔ１肺転移性癌の増殖を阻害するのに有効であるかどうかを調べた。効力研究の前に、インビトロでの４Ｔ１癌細胞のＥ−Ｓ媒介性化学標識を研究した。予想どおり、Ｅ−Ｓは、インビトロでアジド基を有するルシフェラーゼで操作された４Ｔ１癌細胞を効率的に標識することができ、クリック反応によるＤ−Ｄの細胞取り込みを有意に改善することができた。４Ｔ１転移性癌は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて０日目でのルシフェラーゼで操作された４Ｔ１癌細胞の静脈内注射によって確立された。１日１回、３日間（１日目、２日目及び３日目）Ｅ−Ｓで処置した後、４日目から開始してマウスにＤ−Ｄまたは遊離ＤＯＸＯ（本明細書ではＤｏｘとも表記される）を投与して転移阻害におけるそれらの有効性を調べた。時間の経過と共にＰＢＳ群マウスのバイオルミネセンスシグナルが強くなることにより、肺実質における４Ｔ１転移の増殖が確認された（図９、パネル（ｂ））。すべての薬物治療群は、ＰＢＳ及びＤＣＬ−ＡＡＭ群と比較して、バイオルミネセンスシグナル及び腫瘍結節数の有意な減少を示した（図９、パネル（ｂ））。Ｄ−Ｄ群と比較して、Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄ群マウスは、バイオルミネセンスシグナルの減少（図９、パネルｂ及びｃ）、より少ない腫瘍結節数（４７．９±７．１％対６７．４±１３．５％）（図９、パネルｄ）、及び腫瘍表面積の減少率（１８．２±８．３％対３８．２±１０．４％）（図９、パネルｅ及びｆ）によって証明されるように、肺転移を有意に減少させた。Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄと同様の肺転移の重症度をもたらすにもかかわらず、Ｄｏｘｏはマウス組織、特に骨髄及び脾臓においてはるかに大きな毒性を発揮した（図９、パネルｇ）。総合すると、クリックケミストリーによるＤ−Ｄの腫瘍蓄積の増強及び癌組織と正常組織との間のカテプシンＢ活性差によってもたらされる癌優勢の薬物放出の集合的結果として、Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄは、毒性が大幅に低減された最良の抗癌効力を発揮した。
【０２４３】
ＤＢＣＯ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＤＯＸＯ（Ｄ−Ｄ）の合成経路
【化３５】
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ＤＢＣＯ−ＰＥＧ１ｋ−ＮＨＳの合成。ＤＢＣＯ−ＮＨＳ（０．１１ｍｍｏｌ、４４ｍｇ）及びＮＨ２−ＰＥＧ１ｋ−ＣＯＯＨ（０．１ｍｍｏｌ、１００ｍｇ）を無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解し、続いてトリメチルアミン（０．１１ｍｍｏｌ、１１ｍｇ）を加えた。混合物を４５℃で２４時間撹拌した。ＤＭＦ中のＤＣＣ（０．１２ｍｍｏｌ、２５ｍｇ）及びＮＨＳ（０．１２ｍｍｏｌ、１４ｍｇ）を添加した。反応混合物をさらに４５℃で２４時間撹拌した。沈殿物をろ別し、ろ液を１ｋのカットオフ分子量で超遠心分離（２回反復）した。残留溶液をＤＣＭで希釈し、集め、濃縮して淡黄色固体を得た（収率７０％）。
【０２４４】
ＤＢＣＯ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＤＯＸＯ（Ｄ−Ｄ）の合成。ドキソルビシン塩酸塩（０．０５ｍｍｏｌ、２９ｍｇ）及びＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ（０．０５ｍｍｏｌ、３８ｍｇ）を無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（０．０６ｍｍｏｌ、６ｍｇ）を加え、混合物を窒素雰囲気下、４０℃で撹拌した。ＨＰＬＣ測定は１２時間後にＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰの完全な消費を示し、その時点でジイソプロピルエチルアミン（１００μＬ）を一度に加えた。反応混合物の色はすぐに暗色になった。１２時間後、ＨＰＬＣプロファイルのピークシフトによって確認されるようにＦｍｏｃ基の切断が完了した。ＤＭＦ（１００μＬ）中のＤＢＣＯ−ＰＥＧ１ｋ−ＮＨＳ（０．０５ｍｍｏｌ、６５ｍｇ）を加え、混合物を４０℃でさらに２４時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、ジエチルエーテル中に沈殿させて赤色固体を得た。ジエチルエーテルで２回洗浄した後、固体をメタノールに再溶解し、メタノールに対して４８時間透析（１ｋカットオフ分子量）して小分子を除去した。残渣溶液を集め、濃縮して赤色固体を得た（収率６５％）。
【０２４５】
カテプシンＢ誘導性Ｄ−Ｄの分解。凍結乾燥した固体（２．１ｍｇ）を１ｍＬの２５ｍＭ酢酸ナトリウム／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ＝５．０）に溶解することにより、ウシ脾臓カテプシンＢのストック溶液を調製した。ストック溶液１５μＬを、３０ｍＭ  ＤＴＴ／１５ｍＭ  ＥＤＴＡ（３０μＬ）の溶液に添加し、３０分間インキュベートすることによって氷上で活性化した。活性化されたカテプシンＢを２ｍＬの酢酸ナトリウム／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈した。活性化された酵素液にメタノール中のＤ−Ｄ（１０ｍＭ、１０μＬ）を加え、３７℃でインキュベートした。混合物の２０μＬアリコートを、選択した時点で取り出し、ＨＰＬＣ測定のために６００μＬに希釈した。
【０２４６】
Ｄ−Ｄと遊離ＤＯＸＯのＭＴＴ研究。ＬＳ１７４Ｔ細胞を４ｋ／ウェルの初期密度で９６ウェルプレートに播種し、２４時間付着させ、様々なＤＯＸＯ濃度の遊離ＤＯＸＯまたはＤ−Ｄで３７℃、７２時間処理した。ＰＢＳで処理した細胞を対照として使用した。ＭＴＴアッセイは、標準手順に従って実施した。
【０２４７】
Ｅ−Ｓ処理したＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＤ−Ｄの取り込み。ＬＳ１７４Ｔ細胞を２４ウェルプレートに播種し、Ｅ−Ｓ（５０μＭ）と共に３日間インキュベートした。Ｅ−Ｓ前処理をしていない細胞を対照として使用した。古い培地を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＯｐｔｉＭＥＭ中のＤ−Ｄ（２０μＭ）を異なる時点（フローサイトメトリー分析のための試料調製の前４時間、２時間、１時間及び３０分間）で添加した。ＯｐｔｉＭＥＭを除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞を無色トリプシンで分離し、フローサイトメトリー分析のために４％ＰＦＡの添加と共にフローチューブに移した。
【０２４８】
インビトロでのＤＢＣＯ−Ｃｙ５またはＤ−Ｄの取り込み機構。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、カバーガラス底部を有する組織培養皿上に播種し、Ｅ−Ｓ（５０μＭ）と共に３日間インキュベートした。ＰＢＳで複数回洗浄した後、新鮮な培地中のリソトラッカーグリーン（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎ）を加え、１時間インキュベートした。次にＤＢＣＯ−Ｃｙ５を添加し、細胞をさらに１時間インキュベートした。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（１０μｇ／ｍＬ）及びＣｅｌｌＭａｓｋ  ｏｒａｎｇｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｔａｉｎ（１μｇ／ｍＬ）を添加して、細胞核及び細胞膜をそれぞれ１０分間染色した。培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞をさらに３７℃でインキュベートした。異なる時点（１時間、３時間、６時間、１２時間及び２４時間）で、細胞を蛍光顕微鏡下でイメージングし、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５の取り込みをモニターした。Ｅ−Ｓ前処理をしていない細胞を対照として使用した。Ｄ−Ｄ処理細胞の生細胞イメージングのために、ＣｅｌｌＭａｓｋ  ｄｅｅｐ  ｒｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｔａｉｎを用いて細胞膜を染色し、Ｄ−Ｄの蛍光シグナルに対する干渉を避けるためにリソソームを染色しなかった。
【０２４９】
Ｄ−Ｄ及び遊離ＤＯＸＯの薬物動態研究。循環半減期を評価するために、Ｄ−Ｄ（ＤＯＸＯ当量で５ｍｇ／ｋｇ）または遊離ＤＯＸＯ（５ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈を介して雌の胸腺欠損ヌードマウス（ｎ＝３）に静脈内注射した。選択された時点（注射後１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間及び２４時間）に、眼窩静脈叢を介して血液を採取した。採取した血液試料（２５μＬ）をメタノール／Ｈ２Ｏ（１／１、ｖ／ｖ、７５μＬ）の混合物で希釈し、１０分間ボルテックスした。１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、蛍光測定のために上清を黒色９６ウェルプレートに移した。勾配濃度のＤ−Ｄまたは遊離ＤＯＸＯを標準曲線の決定に使用した。Ｄ−Ｄまたは遊離ＤＯＸＯの血漿濃度をμｇ／ｍＬで計算した。
【０２５０】
皮下ＬＳ１７４Ｔ結腸腫瘍に対するＥ−Ｓ／Ｄ−Ｄの急性有効性試験。ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を、ＨＢＳＳ／マトリゲル（１／１、ｖ／ｖ、５０μＬ）中のＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞（１５０万細胞）を両方の側腹部に皮下注射することにより、６週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウスに確立した。腫瘍が約５０ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に４群に分けた（第１群：Ｅ−Ｓ／Ｄ−Ｄ、第２群：Ｄ−Ｄ、第３群：Ｅ−Ｓ、第４群：ＰＢＳ、ｎ＝３）。第１群及び第３群では、Ｅ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回３日間（０日目、１日目及び２日目）静脈内注射した。他の２つの群のマウスは、対照としてＰＢＳを静脈内注射した。２４時間後にＥ−Ｓ、Ｄ−Ｄ（ＤＯＸＯ当量で１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳの最後の注射を静脈内注射した。注射４８時間後で、腫瘍を採取し、二分した。腫瘍の半分をＯ．Ｃ．Ｔ．化合物と共に凍結し、８μｍの厚さに切片化し、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識化（ＴＵＮＥＬ）アッセイを介してアポトーシスについて分析した。器官及び腫瘍の他の半分を計量し、ホモジナイズし、溶解させた。酸性化イソプロパノールの添加後、混合物をボルテックスし、−２０℃で一晩凍結させた。遠心分離後、上清をＨＰＬＣに注入して、組織中に保持されたＤＯＸＯを定量した。データを％Ｉ．Ｄ．／ｇとして示した。
【０２５１】
皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍に対するＥ−Ｓ／Ｄ−Ｄの長期腫瘍減少効果。ＬＳ１７４Ｔ腫瘍は、ＬＳ１７４Ｔ細胞（ＨＢＳＳ／マトリゲル（１／１、ｖ／ｖ、５０μＬ）中の１．５×１０６細胞）を両方の側腹部に皮下注射することにより、６週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウスに確立した。腫瘍が約５０ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に４群に分けた（第１群：Ｅ−Ｓ／Ｄ−Ｄ、第２群：Ｄ−Ｄ、第３群：Ｅ−Ｓ、第４群：ＰＢＳ、ｎ＝５〜６）。第１群及び第３群のマウスでは、Ｅ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）を０日目、１日目及び２日目に静脈内注射した。他の２つの群のマウスは、対照としてＰＢＳを静脈内注射した。Ｄ−Ｄ（Ｄｏｘ当量で１２ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを３日目、７日目及び１１日目に静脈内注射した。マウスの腫瘍体積及び体重を１日おきに測定した。腫瘍体積を、式（長さ）×（幅）２／２を用いて算出し、ここで、長軸の直径を長さとし、短軸の直径を幅とした。腫瘍体積が（予め定められた終点として）２０００ｍｍ３に達したとき、または動物が瀕死状態になったとき、または体重減少が元の体重の２０％を超えたとき、動物を屠殺した。腫瘍体積または治療に関連する死により動物が研究を終了したとき、動物について記録された最終腫瘍体積を用いて、その後の時点での平均腫瘍体積を計算した。各動物の終了点（ＴＴＥ）までの時間は、その腫瘍体積が所定の終了点に達した日として定義された。治療関連死として分類された動物には、死亡日に等しいＴＴＥ値が割り当てられた。治療効力は、対照（ＰＢＳ）群と比較して、治療群のＴＴＥの中央値の増加として定義された腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）によって決定し、それは日数で表され、
ＴＧＤ＝ＴＴＥ（Ｔ）−ＴＴＥ（Ｃ）
または対照群のＴＴＥ中央値のパーセンテージとして、
％ＴＧＤ＝１００％×（ＴＴＥ（Ｔ）−ＴＴＥ（Ｃ））／ＴＴＥ（Ｃ）であった。
【０２５２】
ＭＢ−ＭＤＡ乳癌モデル
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＥ−Ｓ媒介性インビトロ標識化。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を、６ウェルプレート中のカバースリップ上に、４０ｋ／ウェルの細胞密度で播種した。最終濃度５０μＭのＥ−Ｓを添加し、続いてＴＳＡ（１μＭ）またはＺ−ＦＹ−ＣＨＯ（５０μＭ）のいずれかを添加した。ＰＢＳまたはＥ−Ｓのみで処理した細胞を対照として使用した。７２時間のインキュベーションの後、培地を除去し、上記の手順に従って、共焦点イメージング及びＩＮ細胞アナライザー測定のための細胞試料を調製した。
【０２５３】
Ｅ−Ｓ標識化ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＤ−Ｄ取り込み。細胞を１ウェル当たり１×１０４細胞の密度で２４ウェルプレートに播種し、Ｅ−Ｓ（５０μＭ）またはＰＢＳと共に３日間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を異なる時間（３０分、１時間、２時間及び４時間）Ｄ−Ｄ（２０μＭ）と共にインキュベートし、溶解させ、Ｄ−Ｄの蛍光強度についてプレートリーダーで測定した。蛍光測定後、ＢＣＡアッセイにより各ウェルのタンパク質濃度を測定した。最終データは、ミリグラムタンパク質当たりのＤ−Ｄの蛍光強度として示された。
【０２５４】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＤ−Ｄ及び遊離ＤＯＸＯのＭＴＴアッセイ。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を、４ｋ細胞／ウェルの初期密度で９６ウェルプレートに播種し、１２時間付着させ、種々のＤＯＸＯ濃度の遊離ＤＯＸＯまたはＤ−Ｄで３７℃、７２時間処理した。ＰＢＳで処理した細胞を対照として使用した。ＭＴＴアッセイは、標準手順に従って実施した。
【０２５５】
皮下ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺腫瘍に対するＥ−Ｓ＋Ｄ−Ｄの長期腫瘍減少効果。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＨＢＳＳ／マトリゲル（５０μＬ、１／１、ｖ／ｖ）中の１．５×１０６細胞）の両方の側腹部への皮下注射により６週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウスに確立された。腫瘍が約５０ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に４群に分けた（第１群：Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄ、第２群：Ｄ−Ｄ、第３群：Ｅ−Ｓ、第４群：ＰＢＳ、ｎ＝５）。第１群及び第３群のマウスに、Ｅ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）を３日連続して１日１回（０日目、１日目及び２日目）静脈内注射した。Ｄ−Ｄ（Ｄｏｘｏ当量で１２ｍｇ／ｋｇ）を３日目、７日目及び１１日目に静脈内注射した。マウスの腫瘍体積及び体重を４日ごとに測定した。腫瘍体積の終了点は１５００ｍｍ３に設定した。データ分析は、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍に対する上記の長期有効性試験と同じであった。
【０２５６】
４Ｔ１転移性癌モデル
Ｅ−Ｓ媒介性インビトロ４Ｔ１細胞の標識化。ルシフェラーゼで操作された４Ｔ１乳癌細胞を、６ウェルプレート中のカバースリップ上に４０ｋ／ウェルの細胞密度で播種した。最終濃度５０μＭのＥ−Ｓを添加し、続いてＴＳＡ（１μＭ）またはＺ−ＦＹ−ＣＨＯ（５０μＭ）のいずれかを添加した。ＰＢＳまたはＥ−Ｓのみで処理した４Ｔ１細胞を対照として使用した。７２時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞を共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリーによって分析した。
【０２５７】
Ｅ−Ｓ標識４Ｔ１細胞のＤ−Ｄ取り込み。ルシフェラーゼで操作された４Ｔ１細胞を９６ウェルブラックプレートに播種し、Ｅ−Ｓ（５０μＭ）と共に３日間インキュベートした。Ｅ−Ｓ前処理をしていない細胞を対照として使用した。培地を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＯｐｔｉＭＥＭ中のＤ−Ｄ（２０μＭ）を異なる時点（試料調製の４時間、２時間、１時間、及び３０分前）に添加した。ＯｐｔｉＭＥＭを除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。各ウェルに１００μＬの溶解緩衝液を添加し、各ウェルの内在化Ｄ−Ｄの蛍光強度をプレートリーダーで測定した。蛍光測定後、ＢＣＡアッセイにより各ウェルのタンパク質濃度を測定した。最終データは、１ｍｇタンパク質当たりのＤ−Ｄの蛍光強度（Ｄ−Ｄ取り込み／ｍｇタンパク質）を提示した。
【０２５８】
４Ｔ１細胞に対するＤ−Ｄ及び遊離ＤＯＸＯのＭＴＴアッセイ。ルシフェラーゼで操作された４Ｔ１細胞を９６ウェルプレートに４ｋ細胞／ウェルの初期密度で播種し、１２時間付着させ、３７℃で７２時間、様々なＤＯＸＯ濃度の遊離ＤＯＸＯまたはＤ−Ｄで処理した。ＰＢＳで処理した細胞を対照として使用した。ＭＴＴアッセイは、標準手順に従って実施した。
【０２５９】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける４Ｔ１転移性癌に対する抗癌効果研究。４Ｔ１転移性癌モデルは、０日目に６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにルシフェラーゼで操作した４Ｔ１細胞（２００μＬのＨＢＳＳ中１×１０５細胞）の尾静脈注射によって確立した。マウスを次に無作為に５群に分けた（第１群：Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄ、第２群：Ｄ−Ｄ、第３群：Ｄｏｘ、第４群：Ｅ−Ｓ、第５群：ＰＢＳ、ｎ＝７〜８）。Ｅ−Ｓ（６０ｍｇ／ｋｇ）を３日間（１日目、２日目、及び３日目）毎日１回静脈内注射した。Ｄ−Ｄ（Ｄｏｘｏ当量で１２ｍｇ／ｋｇ）またはＤｏｘｏ（７．５ｍｇ／ｋｇ、最大耐量）を４日目、８日目及び１２日目に静脈内注射した。各マウスの体重及び食物摂取量を１日おきに測定した。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎ−Ｖｉｖｏ  Ｘｔｒｅｍｅイメージングシステムを使用して、５日目から４日ごとにＢＡＬＢ／ｃマウスのバイオルミネセンスイメージングによって肺転移をモニターした。イメージングの３分前にＤ−ルシフェリンカリウム塩（１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。バイオルミネセンスイメージングデータは、Ｂｒｕｋｅｒイメージングソフトウェアを用いて処理した。１３日目の最後のイメージングの後、すべてのマウスを麻酔下で屠殺した。各動物の肺及び心臓全体を切除し、体重を計り、肺が膨脹するまで気管に１０％ホルマリンを注射した。肺における腫瘍結節（ｎ＝７〜８／群）を解剖顕微鏡下で計数した。ホルマリン固定後、各肺葉を分離した。すべての肺組織をパラフィン包埋し、４μｍの厚さで切片にし、Ｈ＆Ｅで染色した。すべての肺切片をスキャンし、分析した。腫瘍及び肺の表面積を測定して、全肺表面積にわたる腫瘍表面積のパーセンテージ（Ａ腫瘍／Ａ全体）を計算した。
【０２６０】
Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄ及び遊離ＤＯＸＯの毒性評価。肝臓、心臓、腎臓、脾臓、脳、胸骨及び脊髄（頸部胸部及び腰部）をホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、厚さ４μｍで切片にし、Ｈ＆Ｅで染色した。処置介在毒性を調べるために、認定専門医によって組織を分析した。これらの分析は、認定専門医によって行われた。
【０２６１】
統計分析。統計分析は、事後のフィッシャーのＬＳＤ検定（ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８．５）を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により実施し、Ｐ値＜０．０５を統計的に有意と見なした。結果は、０．０１＜＊Ｐ≦０．０５で有意、０．００１＜＊＊Ｐ≦０．０１で非常に有意であり、＊＊＊Ｐ≦０．００１で極めて有意であると考えられた。標本サイズは、インビトロ細胞実験ではｎ＝３〜６、インビボでの生体内分布及びイメージング研究ではｎ＝３〜４、異種移植腫瘍研究ではｎ＝５〜６、転移性腫瘍研究ではｎ＝７〜８で経験的に設定した。
【０２６２】
実施例１０：ＴＮＢＣモデルにおける動物データ。
エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、及びＨｅｒ２の限定された発現を特徴とするトリプルネガティブ乳癌は、乳癌のための従来の複数の抗体療法を無効にした。本発明者らは、アジドを用いたトリプルネガティブＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のＥ−Ｓ媒介性標識化が、ＤＢＣＯ−薬物コンジュゲート（例えば、Ｄ−Ｄ）の腫瘍蓄積及び抗癌効力を改善するかどうかを調べることに関心があった。インビトロでのＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞におけるＥ−Ｓの標識能力を最初に評価した。Ｅ−Ｓと共に３日間、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５と１時間インキュベートした後、細胞膜上の強いＣｙ５蛍光が観察され（図１０、パネルａ）、アジド基の発現が成功したことが示された。ＴＳＡ及びＺ−ＦＹ−ＣＨＯの両方は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞におけるＥ−Ｓの代謝標識プロセスのＨＤＡＣ／ＣＴＳＬ誘発再活性化を有効にしたＥ−Ｓの標識化効率を有意に低下させた（図１０、パネルｂ）。Ｅ−Ｓ前処理は、インビトロで一定量のインキュベーション時間（３０分、１時間及び２時間）内にＤ−Ｄの取り込みを増強することができた（図１０、パネルｄ）。次に、本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞のＥ−Ｓ媒介標識化がＤ−Ｄの蓄積及び抗腫瘍効果を改善するかどうかを検討した。皮下ＭＤＡ−ＭＢ−２３１原発腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスを、Ｅ−Ｓ＋Ｄ−Ｄ、Ｄ−Ｄ、Ｅ−Ｓ及びＰＢＳの４つの群に分けた。Ｅ−Ｓは０日目、１日目及び２日目に静脈内注射で投与した。Ｄ−Ｄは３日目、７日目及び１１日目に静脈内注射で投与した（図１１、パネルａ）。ＰＢＳ群と比較して、Ｅ−Ｓ群は、抗腫瘍効果におけるＥ−Ｓ単独の影響を除いて、腫瘍成長速度に無視できる程わずかな差を示した（図１１、パネルｂ）。両方の薬剤処置群は、それぞれ、ＰＢＳ群と比較して、６２．６及び２９．０の中央値ＴＴＥ値を有する有意に減少した腫瘍成長速度を示した（図１１、パネルｂ、ｃ及びｄ）。Ｄ−Ｄ群と比較してＥ−Ｓ＋Ｄ−Ｄ群は、おそらくＥ−Ｓ媒介性腫瘍標識化の結果として、及びＤ−Ｄの改善された腫瘍蓄積及び保持の結果として、早くも２４日目から有意に小さい腫瘍サイズでより良好な抗腫瘍効力を示した（図１１、パネルｂ、ｃ、及びｄ）。
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１０．Ｃｈａｎｇ，Ｐ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ａｎｉｍａｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｋｙｎｙｌ  ｓｕｇａｒｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４８，４０３０−４０３３（２００９）。
１１．Ｂｒｅｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｓｕｇａｒｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７，３９８８−３９９３（２０１０）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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