(57)【要約】  本発明は、標的タンパク質を含む大量のエキソソームを生成する方法、エキソソーム生成のためのベクター、該方法によって生成された、標的タンパク質を含むエキソソーム、生成されたエキソソームを使用することによって標的タンパク質をサイトゾルに充填する方法に関する。本発明によって提供される、標的タンパク質を含むエキソソームの生成方法によれば、標的タンパク質を充填したエキソソームを高収率で生成することができ、そのため、それを、エキソソームを使用して、疾患治療で広く使用することができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜上に標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法であって、
a)エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入することによって、形質転換細胞を調製するステップ、及び
b)ステップa)の形質転換細胞を培養するステップ
を含む大量生成方法。
【請求項２】
標的タンパク質がエキソソームの膜から分離され、エキソソームの内部にとどまる、請求項1に記載のエキソソームの大量生成方法。
【請求項３】
エキソソーム生成細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、樹状細胞、巨核球、及びマクロファージ、幹細胞、及び腫瘍細胞からなる群から選択される1種以上の細胞である、請求項1又は2に記載のエキソソームの大量生成方法。
【請求項４】
エキソソーム特異的マーカーがCD9、CD63、Cd81又はCD82である、請求項1に記載のエキソソームの大量生成方法。
【請求項５】
標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法であって、
(a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質I)をコードするポリヌクレオペプチド、及び標的タンパク質と、第1の光特異的結合タンパク質に連結することができる第2の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質II)をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入するステップ、
(b)第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の間の結合を引き起こすことができる光でエキソソーム生成細胞を照射するステップ、並びに
(c)エキソソーム生成細胞中でエキソソームの生成が終わった後に照射を終了するステップ
を含む大量生成方法。
【請求項６】
第1の光特異的結合タンパク質が、CIB(クリプトクローム相互作用ベーシックヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質)、CIBN(CIBのN末端ドメイン)、PhyB(フィトクロームB)、PIF(フィトクローム相互作用因子)、FKF1(フラビン結合、Kelchリピート、Fボックス1)、GIGANTEA、CRY(クリプトクローム(chryptochrome))及びPHR(フィトリアーゼ相同領域)からなる群から選択される1種以上のタンパク質である、請求項5に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
【請求項７】
第1の光特異的結合タンパク質がCIB又はCIBNである場合、第2の光特異的結合タンパク質がCRY又はPHRであり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が460〜490nmの波長の光の照射によって達成される、請求項5に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
【請求項８】
第1の光特異的結合タンパク質がPhyBである場合、第2の光特異的結合タンパク質がPIFであり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が600〜650nmの波長の光の照射によって達成される、請求項5に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
【請求項９】
第1の光特異的結合タンパク質がGIGANTEAである場合、第2の光特異的結合タンパク質がFKF1であり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が460〜490nmの波長の光の照射によって達成される、請求項5に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
【請求項１０】
請求項1、2又は5に記載の方法によって調整されたエキソソームを使用して、サイトゾルにタンパク質薬物を送達する方法。
【請求項１１】
活性成分として、請求項1、2又は5に記載の方法によって調製されたエキソソームを含む、サイトゾルにタンパク質薬物を送達するための医薬組成物。
【請求項１２】
(a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の融合タンパク質(第1の融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドを含む第1の発現ベクター、並びに
(b)標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することができるマルチクローニングサイト、及び上記の第1の光特異的結合タンパク質に連結される第2の光特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第2の発現ベクター
を含む、エキソソームの生成のためのベクター。
【請求項１３】
第2の発現ベクターが、第2の光特異的結合タンパク質と標的タンパク質で構成される融合タンパク質(第2の融合タンパク質)をエキソソーム生成細胞において発現させるためのものである、請求項12に記載のエキソソームの生成のためのベクター。
【請求項１４】
請求項1、2又は5に記載の方法によって調製された、標的タンパク質を含むエキソソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光特異的結合タンパク質を使用して標的タンパク質を含むエキソソームを調製する方法、及び上記の方法によって調製されたエキソソームを使用してサイトゾルに標的タンパク質を送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体は約200種類の100兆個の細胞で構成され、そこでは、様々なタンパク質の作用によって生理活性が調節されて、生命が維持される。
【０００３】
細胞はリン脂質で構成される二層構造の膜で取り囲まれており、この膜は、細胞中への外来性物質の侵入をブロックする。これまでに開発されたタンパク質薬物の大半は、細胞膜を通過して細胞に入ることができず、生理作用を示すために、細胞の外部に作用するか、細胞膜上の受容体に作用して、細胞中にシグナルを伝えることができる。
【０００４】
サイトゾルは、お互いに相互作用して生理活性を調節する多くのタンパク質を有する。したがって、細胞の内部、すなわちサイトゾルの内部にタンパク質薬物を送達することさえできれば、より効果的に細胞活性が制御されると思われる。
【０００５】
最近の研究は、細胞膜を介して細胞中に標的タンパク質を直接送達する方法を確立するために活発に進められている。標的タンパク質と細胞膜を通過するペプチドであるタンパク質導入ドメイン(PTD)の組換えタンパク質が調製され、投与される場合、これは、細胞膜を通ってサイトゾルに入ることができる(図1)。PTDは、HIV-1 TAT、HSV VP22、Antp、dfTAT及びHph-1で例示される。PTDと標的タンパク質を組み合わせて調製される融合タンパク質は、組換えタンパク質として生成され、この時、分離プロセスが必要となる。しかし、このプロセスは、タンパク質のリフォールディングが正しく行われず、活性が低下し、タンパク質が非特異的に移行され、in vivoで免疫反応を引き起こす危険性が大きく、コストが高く、収率が低いという点において問題がある。
【０００６】
様々なナノ粒子と結合した標的タンパク質は、エンドサイトーシスによって細胞膜を通ってサイトゾルに入ることができる(図2)。この時、ナノ粒子は、金NP、リポソームNP、磁性NP及びポリマーNPなどで例示される。標的タンパク質からのナノ粒子の分離は細胞のリソソームで主に起こるので、標的タンパク質はリソソーム内部で分解されて、その活性を失う。又は、ナノ粒子がサイトゾルで標的タンパク質から分離され難く、ナノ粒子の毒性が別の問題になり得る。
【０００７】
エキソソームは、50〜200nmのサイズの膜構造を有する小さな小胞であり、これは細胞間シグナリングのためのタンパク質、DNA及びRNAを含んで、細胞から外へ分泌される。
【０００８】
エキソソームは、赤血球の成熟化の最終段階で細胞内タンパク質を排出することによって赤血球のヘモグロビンのみを残すプロセスで最初に見つかった。電子顕微鏡下での観察から、エキソソームは原形質膜から直接的に分離されないが、多小胞体(MVB)と呼ばれる細胞内区画から細胞外間隙に放出されることが確認された。すなわち、MVBが原形質膜と融合している場合に、そのような小胞は細胞の外部に放出され、これはエキソソームと呼ばれる(図3)。
【０００９】
エキソソーム生成の分子メカニズムは、はっきりとは明らかにされていないが、Bリンパ球、Tリンパ球、樹状細胞、巨核球、及びマクロファージ、幹細胞、及び腫瘍細胞を含めた様々な免疫細胞が、これらが生きている場合に、エキソソームを生成及び分泌することが知られている。
【００１０】
エキソソームは、様々な細胞内タンパク質、DNA及びRNAを含む。こうしたエキソソームに含まれる、細胞から外へ分泌される物質は、融合又はエンドサイトーシスによって他の細胞に再導入され得、細胞間のメッセンジャーとして働くことができる。エキソソームに含まれている場合に細胞から外へ分泌されるそのような物質を分析することによって、特定の疾患を診断することができる。
【００１１】
エキソソームは様々な種類のマイクロRNAも含む。それらの有無及び存在量を検出することによって疾患を診断する方法が報告されている(KR 10-2010-0127768A)。国際特許公開第WO2009-015357A号は、癌患者由来の試料(血液、唾液、涙など)中のエキソソームを検出することによって、特定の疾患を予測及び診断する方法を記載している。特に、特定の疾患(肺疾患)を有する患者から得たエキソソームが分析され、特定のマイクロRNAと肺疾患の間の関連性が具体的に記載されている。エキソソームに含まれる特定のタンパク質を使用することによって、肺疾患に加えて、腎疾患を診断する方法を確立するために、研究がさらに進められている。
【００１２】
さらに、エキソソームは抗原も含み得る。一方、抗原提示細胞(APC)では、抗原ペプチドが、MVBを含む膜構造を有する細胞内区画中のMHC(主要組織適合抗原複合体)クラスII分子にロードされる。したがって、そこに由来するエキソソームは抗原ペプチドMHCクラスII複合体も含む。したがって、エキソソームは、CD4+Tリンパ球に抗原ペプチドを提示するための免疫原担体として働き、それによって、Tリンパ球の増殖などの免疫応答を誘導することができる。免疫応答を刺激することができる分子、例えば、MHCクラスI及び熱ショックタンパク質(HSP)はエキソソーム中に集中しているため、エキソソームを使用して、癌又は自己免疫疾患の治療のために免疫応答を増大又は低下させることができる。
【００１３】
さらに、標的タンパク質を含むエキソソームをin vivoでの様々な疾患の治療に使用することができる。例えば、抗癌活性を有するタンパク質又はsiRNAを含むようにエキソソームを調製し、次いで、癌治療のために癌細胞に処理することができる(図4)。
【００１４】
したがって、標的タンパク質を含むエキソソームを疾患の治療に使用することができる。そうするために、標的タンパク質を有するように、エキソソームを効率的に調製する必要がある。韓国特許公開第2004-0015508号は、特定の抗原を含むエキソソームを調製する方法を記載している。正確に言えば、これはエキソソームを使用することによって標的タンパク質を放出する方法(特定の抗原をコードする遺伝子を宿主細胞株に挿入し、導入した遺伝子のタンパク質を細胞株中で安定して発現させ、このタンパク質を、エキソソームを介して細胞外に放出させる)及びワクチンとしてエキソソームを使用する方法を記載している。
【００１５】
しかし、エキソソームは細胞内で自然に形成される。したがって、たとえエキソソームを内因的に生成する細胞に標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたとしても、それによって、発現したタンパク質を含むエキソソームを調製することは非常に難しい。
【００１６】
したがって、本発明者らは、標的タンパク質を含むエキソソームをより効率的に調製する方法を開発するために研究した。その結果、本発明者らは、エキソソームを高濃度で内因的に生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって、標的タンパク質を含むエキソソームを効率的に調製することに成功した(図5)。
【００１７】
さらに、上記の方法によれば、標的タンパク質はエキソソームの膜に結合している。したがって、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質とのペアで構成される融合タンパク質を、エキソソームを高濃度で生成する細胞で発現させ、続いて、照射して、融合タンパク質の連結を誘導する。次いで、エキソソーム特異的マーカーの作用によって、エキソソームの内部に融合タンパク質を導入する。導入後に照射が終了すると、エキソソームの内部で融合タンパク質が標的タンパク質と光特異的結合タンパク質に分離する。その結果、融合タンパク質から分離した遊離標的タンパク質を含むエキソソームを効率的に調製することができる(図6)。
【００１８】
本発明者らは、標的タンパク質を含むエキソソームを使用することによって標的タンパク質が標的細胞のサイトゾルに首尾よく送達されることを確認した。それによって、本発明者らは、エキソソームを使用して、サイトゾル内で細胞内シグナリングを効率的に調節することによって、疾患を治療する方法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】KR2010-0127768A
【特許文献２】国際特許公開第WO2009-015357A号
【特許文献３】韓国特許公開第2004-0015508号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の一目的は、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、光特異的結合タンパク質ペアを使用することによってエキソソームの膜から分離した標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法を提供することである。
【００２２】
本発明の目的はまた、エキソソームの調製に使用可能な、エキソソームを調製するためのベクターを提供することでもある。
【００２３】
本発明のさらなる一目的は、上記のエキソソームを使用することによってサイトゾルに標的タンパク質を導入する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成の効率的な方法に関する。
【００２５】
本発明者らは、様々な試みで、標的タンパク質を含むエキソソームを調製するための効率的な方法を開発するために研究した。その研究の過程で、本発明者らは、エキソソーム特異的マーカー(CD9、CD63、CD81及びCD82)に注目した。これらのマーカーは、テトラスパニンファミリーに属し、一般に、4回貫通型膜タンパク質である。本発明者らは、標的タンパク質がエキソソームの膜タンパク質上に結合した場合、標的タンパク質が比較的容易にエキソソームの内部に含まれるであろうと予測した。
【００２６】
したがって、エキソソームの膜上に特に豊富で、細胞膜を貫通することができるエキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を、エキソソームを高濃度で内因的に生成する細胞で発現させることによって、標的タンパク質を含むエキソソームを大規模に生成することができる。
【００２７】
特に、標的タンパク質を含むエキソソームを調製するための本発明の方法は、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、エキソソームを生成する細胞に導入することを特徴とする。
【００２８】
この時、調製したエキソソームでは、標的タンパク質はエキソソームの膜に包埋されたエキソソーム特異的マーカーと融合している。
【００２９】
前記標的タンパク質はエキソソームの膜タンパク質に結合しており、標的細胞に到達した後でさえも分離しない。この問題を解決するために様々な試みを行った。その結果、光特異的結合タンパク質を使用してマーカータンパク質に標的タンパク質を一時的に結合することによって、標的タンパク質を含むエキソソームを調製するための技法を開発した。例えば、CIBN及びCRY2などの光特異的結合タンパク質を本明細書で使用することができる。特に、CIBNをマーカータンパク質のうちの1つであるCD9と融合した形態で発現させる。その一方で、CRY2と標的タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を、エキソソームを生成する細胞に導入する。エキソソーム生成細胞で発現するCIBN-CD9融合タンパク質は、CD9によってエキソソームの内部に含まれ得る。この時、細胞を青色LED光で照射すると、エキソソーム生成細胞で発現する標的タンパク質-CRY2融合タンパク質のCRY2ドメインは、CD9融合CIBNドメインに結合する。その結果、可逆的「標的タンパク質-CRY2-CIBN-CD9融合タンパク質」が生成される。この融合タンパク質は、CD9によってエキソソームの内部に含まれ得る。一旦標的タンパク質を含むエキソソームが生成され、青色LED光の照射が終了すると、CIBN-CRY2連結が破壊され、それによって、エキソソームの細胞膜から離れた標的タンパク質がエキソソーム中に残り、結果的に標的タンパク質を含むエキソソームが調製される(図5〜10)。
【００３０】
本発明の方法によって調製されるこの種のエキソソームは、標的物質を含む従来のエキソソームとその効果が完全に異なる。従来のエキソソームは、エキソソームの内部に標的タンパク質をもたらすために、エキソソーム特異的マーカーに融合したものとして発現され、その結果、標的タンパク質は、たとえエキソソームの内部に含まれるとしても、エキソソームの膜に結合したものとしてもたらされ、これは、標的タンパク質はエキソソームの膜から分離され得ず、したがって、エキソソームが標的細胞の細胞膜に融合する場合だけ標的細胞に送達され得ることを示唆するものである。エキソソームが標的細胞に融合した後でさえも、標的タンパク質はエキソソームの膜に結合したままであり、標的細胞において標的タンパク質がその効果を示す確率は非常に低い。しかし、本発明のエキソソームは、遊離体として存在し、エキソソームの膜に結合していない標的タンパク質をもたらす。したがって、そのようなエキソソームが標的細胞のエンドサイトーシスによってサイトゾルに入る場合、これはエキソソームの膜に接着せず、エキソソームがその中で分解される場合、含まれている標的タンパク質はサイトゾルに送達され得、標的細胞のサイトゾル中を自由に移動でき、これは、標的タンパク質が、標的細胞サイトゾル中でその生理活性をともなって十分に活性であることを示唆するものである(図11)。
【００３１】
さらに、照射する光の強度に応じてマーカータンパク質への標的タンパク質の結合レベルを変えることができ、光の強度を調節することによって、エキソソーム中に集められる標的タンパク質の濃度を制御することができる。
【００３２】
光特異的結合タンパク質を使用することによって標的タンパク質を含むエキソソームを調製する方法はまだ報告されておらず、本発明者らが最初に提唱した。
【００３３】
特に、標的タンパク質を含むエキソソームを調製するための本発明の方法は、以下のステップで構成される:(a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質I)をコードするポリヌクレオペプチド、及び標的タンパク質と、第1の光特異的結合タンパク質に連結することができる第2の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質II)をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入するステップ、(b)第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の間の結合を引き起こすことができる光でエキソソーム生成細胞を照射するステップ、並びに(c)エキソソーム生成細胞中でエキソソームの生成が終わった後に照射を終了するステップ。
【００３４】
本発明では、用語「エキソソーム」は、多小胞体(MVB)と呼ばれる細胞内の特定の区画から生じ、細胞から放出又は分泌される原形質膜構造を有する小さな小胞を示す。
【００３５】
本発明では、エキソソームは、標的タンパク質それ自体を保持することによって標的の細胞又は組織に標的タンパク質を送達するための担体としての役割を果たす。この時、エキソソームによって保持される標的タンパク質は、特定の疾患の治療又は診断に役立つように標的の細胞又は組織で働く。
【００３６】
本発明では、用語「エキソソーム生成細胞」は、エキソソームを生成することができる細胞を示す。
【００３７】
本発明では、エキソソーム生成細胞は限定されないが、好ましくは、Bリンパ球、Tリンパ球、樹状細胞、巨核球、マクロファージ、幹細胞及び腫瘍細胞などで例示される。例えば、本発明では、不死化細胞株の一種であるHEK293T細胞をエキソソーム生成細胞として使用した。
【００３８】
本発明では、用語「エキソソーム特異的マーカー」は、エキソソームの膜上に豊富なタンパク質を示す。
【００３９】
本発明では、エキソソーム特異的マーカーは、限定されないが、好ましくは、CD9、CD63、CD81及びCD82などで例示される。例えば、本発明の好ましい実施形態では、CD9をエキソソーム特異的マーカーとして使用した。CD9、CD63、Cd81及びCD82は、標的タンパク質がエキソソームの膜タンパク質に結合している場合に、標的タンパク質がエキソソーム中に容易に存在できるようにする、4回貫通型膜タンパク質である。
【００４０】
本発明では、用語「光特異的結合タンパク質」は、光誘導性ヘテロ二量体形成タンパク質又は光誘導性ホモ二量体形成タンパク質とも呼ばれ、これは、特定の波長の光が照射される場合に、別のタンパク質と組み合わさることによってヘテロ二量体を形成することができる又は同種の別のタンパク質と組み合わさることによってホモ二量体を形成することができるタンパク質を示す。
【００４１】
本発明では、光特異的結合タンパク質は、限定されないが、好ましくは光誘導性ヘテロ二量体形成タンパク質又はCIB(クリプトクローム相互作用ベーシック-ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質)、CIBN(CIBのN末端ドメイン)、PhyB(フィトクロームB)、PIF(フィトクローム相互作用因子)、FKF1(フラビン結合、Kelchリピート、F-ボックス1)、GIGANTEA、CRY(クリプトクローム)及びPHR(フィトリアーゼ(phytolyase)相同領域)などで例示される。
【００４２】
特に、光特異的結合タンパク質が光誘導性ヘテロ二量体形成タンパク質である場合は、2種の光特異的結合タンパク質(第1及び第2の光特異的結合タンパク質)を使用することができる。第1の光特異的結合タンパク質がCIB又はCIBNである場合、第2の光特異的結合タンパク質はCRY又はPHRでもよい。第1の光特異的結合タンパク質がPhyBである場合、第2の光特異的結合タンパク質はPIFでもよい。第1の光特異的結合タンパク質がGIGANTEAである場合、第2の光特異的結合タンパク質はFKF1でもよい。
【００４３】
例えば、本発明の好ましい実施形態では、第1の光特異的結合タンパク質としてCIBNを使用し、第2の光特異的結合タンパク質としてCRY2を使用した。本明細書で使用する光の波長は、460〜490nmの青色光であった。光の強度は20〜50μWであった。
【００４４】
その一方で、エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される第1の融合タンパク質の発現を確認し、その位置を見つけるために、これにマーカータンパク質を融合することができる。例えば、本発明の好ましい実施形態では、蛍光タンパク質EGFPが、CIBNとCD9又はGIGANTEAとCDが一緒に連結している第1の融合タンパク質に挿入された。したがって、第1の融合タンパク質の発現パターン(発現及び発現レベル)並びに細胞内位置を、蛍光タンパク質EGFPを持つ第1の融合タンパク質の発現によって調べることができる。
【００４５】
本発明では、用語「標的タンパク質」は、エキソソームの内部に標的タンパク質を位置づけるための第2の光特異的結合タンパク質と結合した融合タンパク質として発現するタンパク質を示す。
【００４６】
本発明では、標的タンパク質は、細胞で発現した後にエキソソームによって保持され得る。標的タンパク質は限定されないが、好ましくは、疾患治療用タンパク質又は疾患診断用タンパク質である。例えば、本発明の好ましい実施形態では、蛍光を有するmCherryを標的タンパク質として使用した。
【００４７】
本発明では、用語「培養」は、適切に制御された環境で細胞又は微生物を増殖させる方法を示す。
【００４８】
本発明では、形質転換体を1〜3日間培養し、次いで、培地をウシ胎仔血清フリー培地に交換し、続いてさらに2〜5日間培養した。
【００４９】
本発明では、形質転換体を培養する方法は当業者に周知のもののうちのいずれかである。
【００５０】
本明細書では、前記培地は動物細胞培養に広く使用されている発表された培地を示し、市販の血清フリー培地、タンパク質フリー培地及び合成培地からなる群から選択することができる。
【００５１】
上記の血清フリー培地は動物細胞培養に使用され、ウシ胎仔血清を含まず、SFM4CHO(HyClone)及びEX-Cell(JHR Bioscience)で例示される。インスリン様増殖因子I(IGF-I)、エタノールアミン、塩化第二鉄及びホスファチジルコリンを培地に加えることができるが、必ずしもこれらに限定されるとは限らない。
【００５２】
上記のタンパク質フリー培地は、動物由来タンパク質、とりわけ、特に少なくとも10kDaの分子量を有する高分子タンパク質が排除されたウシ胎仔血清フリー培地由来の動物細胞培養培地である。タンパク質フリー培地は、ProCHO(Lonza)及びPF-CHO(HyClone)でもよいが、必ずしもこれらに限定されるとは限らない。
【００５３】
上記の合成培地は、いかなる動物由来成分も含まず、代わりにすべてが定義された化学構造を有する成分を有する、動物細胞培養培地である。合成培地は、CDM4CHO(HyClone)、PowerCHO2CD(Lonza)及びCD-optiCHO(Life Technologies)でもよいが、必ずしもこれらに限定されるとは限らない。
【００５４】
本発明では、用語「第1の融合タンパク質」は、エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の間の結合によって作製される融合タンパク質を示す。
【００５５】
本発明では、第1の融合タンパク質に含まれるエキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の配置の順序は、第1の融合タンパク質がエキソソーム生成細胞で発現する場合に第1の光特異的結合タンパク質がエキソソームの内部に向かう方向に位置する限り限定されない。例えば、第1の光特異的結合タンパク質のN末端をエキソソーム特異的マーカーのC末端に結合することができる。
【００５６】
さらに、第1の融合タンパク質を構成するエキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質は互いに直接連結されるか、リンカーによって結合され得る。上記のリンカーは、第1の融合タンパク質がエキソソーム生成細胞で発現し、エキソソームの内部に向かう方向に位置する第1の光特異的結合タンパク質をもたらす限り限定されないが、好ましくは、アミノ酸で構成されるペプチドリンカー、より好ましくは、可動性ペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは発現ベクターを使用することによって発現させることができ、ここでは、リンカーをコードする核酸が各ドメインをコードする他の核酸とインフレームで結合している。
【００５７】
用語「第2の融合タンパク質」は、第2の光特異的結合タンパク質と標的タンパク質が結合している融合タンパク質を示す。
【００５８】
本発明では、第2の融合タンパク質に含まれる第2の光特異的結合タンパク質と標的タンパク質の配置の順序は、エキソソーム生成細胞において第1の融合タンパク質の第1の光特異的結合タンパク質の領域と結合するように第2の融合タンパク質がエキソソームの内部に位置する限り限定されない。例えば、標的タンパク質のN末端を第2の光特異的結合タンパク質のC末端に結合することができる。
【００５９】
さらに、第2の融合タンパク質を構成する第2の光特異的結合タンパク質と標的タンパク質は互いに直接連結されるか、リンカーによって結合され得る。上記のリンカーは、エキソソーム生成細胞において第1の融合タンパク質の第1の光特異的結合タンパク質と結合するように第2の融合タンパク質がエキソソームの内部に位置する限り限定されないが、好ましくは、アミノ酸で構成されるペプチドリンカー、より好ましくは、可動性ペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは発現ベクターを使用することによって発現させることができ、ここでは、リンカーをコードする核酸が各ドメインをコードする他の核酸とインフレームで結合している。
【００６０】
さらに、上記の各融合タンパク質は、1つ以上のアミノ酸残基が、その中に含まれる各ドメインの野生型アミノ酸配列のアミノ酸残基と異なる配列を有するポリペプチドを含むことができる。分子の全体的な活性の変化をともなわない、タンパク質及びポリペプチドにおけるアミノ酸交換は、当技術分野で周知である。最も一般的な交換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及びAsp/Glyの間で生じる。さらに、アミノ酸配列の変異又は修飾によって、熱若しくはpHに対する構造安定性が増大した、又はタンパク質活性が増大したタンパク質が含まれ得る。
【００６１】
最後に、上記の融合タンパク質又は融合タンパク質を含む各ドメインのポリペプチドは、当業者によく知られている化学的ペプチド合成方法によって調製することができ、又は以下の方法によって調製することができる。各ドメインをコードする遺伝子をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって増幅するか、当業者に周知の従来の方法によって合成する。遺伝子を発現ベクターにクローニングし、発現させる。
【００６２】
その一方で、各融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入することによって、各融合タンパク質をエキソソーム生成細胞で発現させることができる。この時、当業者によく知られている従来の方法によって、ポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入する。例えば、発現ベクターを導入に使用することができる。
【００６３】
本発明では、用語「発現ベクター」は、標的ペプチドを宿主細胞で発現させることができる組換えベクターである。このベクターは、遺伝子インサートを発現するように作動可能に連結される必須調節因子を含む遺伝子コンストラクトを示す。発現ベクターは、発現制御エレメント、例えば、開始コドン、終止コドン、プロモーター及びオペレーターを含む。開始コドン及び終止コドンは、一般に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部として理解される。これらは、遺伝子コンストラクトが導入される場合に働くはずであり、インフレームでコード配列に存在するはずである。ベクターのプロモーターは、構成的でもよいし、誘導的でもよい。
【００６４】
本発明では、用語「作動可能に連結される」は、通常通り機能する核酸発現調節配列及び標的タンパク質又はRNAをコードする核酸配列が機能的連結によって連結している状況を示す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすようにタンパク質又はRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。発現ベクターとの機能的連結は、当業者に周知の組換えDNA技術によって達成することができ、特に、部位特異的なDNAの切断及び連結は、当業者に周知の従来の酵素を使用することによって達成することができる。
【００６５】
さらに、前記発現ベクターは、細胞培養培地からのタンパク質の分離を促進するために、融合ポリペプチドの放出のためのシグナル配列を含むことができる。挿入核酸配列の効率的な翻訳のために、特定の開始シグナルが必要である可能性がある。これらのシグナルは、ATG開始コドン及びその隣接配列を含む。いくつかの場合には、ATG開始コドンを含み得る外来性翻訳制御シグナルを設けるべきである。これらの外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、様々な天然源及び合成源であり得る。適切な転写又は翻訳エンハンサーの導入によって、発現効率を増大させることができる。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態では、発現ベクターは、エキソソームの内部への標的タンパク質の挿入を確認するために、タグと結合した標的タンパク質を発現させることができる。本明細書のタグは、標的タンパク質の存在を確認するためのものであり、これは、第2の光特異的結合タンパク質の結合の領域と反対の領域に結合することができる。例えば、赤色蛍光タンパク質及び緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質が、標的タンパク質のC末端に結合するタグとして使用される。
【００６７】
上記のように調製される標的タンパク質の目的は、エキソソーム生成細胞で発現される。一旦エキソソームが生成されれば、蛍光タンパク質タグが検出されるかどうかを調べ、それによって、エキソソーム中の標的タンパク質の存在を確認することができる。
【００６８】
本発明では、用語「光」は、エキソソーム生成細胞で発現する第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質を一時的に結合するために照射する光を示す。
【００６９】
前述のように、第1の光特異的結合タンパク質はエキソソーム特異的マーカーと結合した第1の融合タンパク質として発現し、一方で、第2の光特異的結合タンパク質は標的タンパク質と結合した第2の融合タンパク質として発現する。光がエキソソーム生成細胞に照射されると、第1の光特異的結合タンパク質が第2の光特異的結合タンパク質と結合し、その結果、エキソソーム特異的マーカー-第1の光特異的結合タンパク質-第2の光特異的結合タンパク質-標的タンパク質を含む融合タンパク質複合体が一時的に形成される。エキソソーム生成細胞中でエキソソームが生成されると、標的タンパク質は、エキソソーム特異的マーカーによってエキソソームと連結することができる。この時、標的タンパク質がエキソソームの内部に現れ、エキソソームの生成後に光照射が停止すると、第1の光特異的結合タンパク質が第2の光特異的結合タンパク質から分離し、それによって、エキソソームに含まれる標的タンパク質が、エキソソームの一部としてエキソソームとともに放出されることになる。エキソソームの内部に標的タンパク質をより効率的に送達するために、継続的ではなく断続的に細胞に光が照射されることが好ましい。すなわち、光が断続的に照射される場合、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合及び分離が繰り返され、その結果、標的タンパク質がエキソソームに導入される確率が高まり得る。
【００７０】
その一方で、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合を誘導するのに十分な光の波長は、第1及び第2の光特異的結合タンパク質の種類によって変わる。第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合を誘導する光の波長はタンパク質の種類に依存する。したがって、適切な光の波長は、当業者に知られている通りに選択され得る。例えば、CRY2をCIBNに連結するためには、460〜490nmの波長の光が好ましい。光が10分未満照射されると、CRY2とCIBNは互いに分離される。PhyBがPIFと結合する場合は、650nmの波長の光が10分間照射される。750nmの波長の光が5分間照射される場合、PhyBとPIFは互いに分離される。FKF1がGIGANTEAと結合する場合は、460nmの波長の光が30分間照射される。本発明の好ましい実施形態では、CIBNとCRY2の結合を誘導するために、460〜490nmの波長の光を照射した。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態では、CRY2/mCherry融合タンパク質及びCIB/CD9融合タンパク質を大量のエキソソームを生成する不死化細胞株であるHEK293Tで発現させた。その結果、サイトゾル中に均一に分布したmCherryタンパク質の分布は、青色光を照射した場合、細胞膜及びエンドソーム様構造体の膜の中であることが分かった(図7)。FKF1/mCherry融合タンパク質及びGIGANTEA/CD9融合タンパク質をHEK293T細胞で発現させた場合、同様の結果が観察された(図12)。CRY2/mCherry融合タンパク質及びCIBN/CD9融合タンパク質をHEK293T細胞で発現させ、続いて、光の強度を調節しながら青色光で照射した。その結果、20〜50μWの強度で光を照射した場合、エキソソーム中に集められるmCherryタンパク質のレベルが最も高かった(図9)。細胞から単離したエキソソームを、およそ250μg/mlの濃度でHT1080細胞に処理した。その結果、エキソソームは、HT1080細胞に対していかなる特定の細胞毒性も示さず、且つmCherryタンパク質がそのサイトゾルに送達されることが確認された(図10)。
【００７２】
さらに、エキソソームへの標的タンパク質の導入効率及び標的細胞へのエキソソームの移行効率を従来の方法のものと比較するために、従来の方法についてXPACKベクターを使用し、CRY2/mCherry融合タンパク質及びCIBN/CD9融合タンパク質の発現ベクターをHEK293T細胞に導入した。次いで、エキソソーム中での標的タンパク質の生成を比較した。その結果、本発明の方法の方法を使用した場合、導入効率が著しく高いことが確認された(図15)。エキソソーム生成細胞から分離したエキソソームを標的細胞(HeLa)に処理して、標的タンパク質の発現を比較した。本発明の方法によって分離したエキソソームを使用した場合、標的細胞中において、標的タンパク質の発現が最も高かった(図16)。
【００７３】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明は、(a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の融合タンパク質(第1の融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドを含む第1の発現ベクター、並びに(b)標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することができるマルチクローニングサイト、及び上記の第1の光特異的結合タンパク質に連結される第2の光特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第2の発現ベクターを含む、エキソソームの生成のためのベクターを提供する。
【００７４】
本発明では、本発明によって提供されるエキソソームの生成のためのベクターにおいて、エキソソーム特異的マーカー、第1の光特異的結合タンパク質、エキソソーム生成細胞、及び第2の光特異的結合タンパク質は上記と同様である。
【００７５】
本発明では、用語「エキソソーム生成のための形質転換細胞」は、第1の融合タンパク質を発現させることによってエキソソームを生成することができる細胞であって、エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の融合タンパク質(第1の融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドが導入されている細胞を示す。
【００７６】
本発明では、第2の発現ベクターは、第2の光特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び隣接したマルチクローニングサイトを含む。標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドがマルチクローニングサイトに挿入される場合、これは、第2の光特異的結合タンパク質と標的タンパク質を含む融合タンパク質(第2の融合タンパク質)として発現する。
【００７７】
本発明によって提供されるエキソソームを調製するためのベクターは、エキソソーム生成のための形質転換細胞及び発現ベクターだけでなく、発現ベクターの導入、エキソソーム生成のための形質転換細胞の培養、並びにエキソソーム生成のための形質転換細胞から生成されたエキソソームの分離及び精製にも使用可能な1種以上の構成成分、溶液又は装置を含むことができる。例えば、発現ベクターの導入に適した緩衝液並びにエキソソーム生成のための形質転換細胞の培養に必要である培地及び容器をさらに含むことができる。
【００７８】
本発明の別の態様は、本発明の方法によって調製された、標的タンパク質が含まれるエキソソームを提供する。
【００７９】
上記の方法によって調製されたエキソソームは、その原形質膜上のエキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(第1の融合タンパク質)、及び第1の光特異的結合タンパク質に結合することができる第2の光特異的結合タンパク質と標的タンパク質で構成される別の融合タンパク質(第2の融合タンパク質)を含む。したがって、そのようなエキソソームを標的組織細胞に処理する場合、エキソソームに含まれる第2の融合タンパク質は、原形質膜の融合を介して標的組織細胞のサイトゾルに送達され得る。
【００８０】
標的タンパク質を含む前記エキソソームは、in vivoでの様々な疾患の治療に使用することができる。例えば、標的タンパク質として抗癌活性を示すタンパク質ポリマー(例えば、抗体など)を含むエキソソームを調製し、次いで、これを癌細胞に処理する。すなわち、エキソソームを従来のリポソームよりも良く作用する生体適合性抗癌剤として使用することができる。
【発明の効果】
【００８１】
本発明では、本発明の標的タンパク質、標的タンパク質を含むエキソソームを高収率で調製することができる。さらに、標的タンパク質は、エキソソームの膜から分離したものとして現れ、その結果、疾患を治療するために広く利用することができる。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態の用途は、添付の図面を参照することで、最もよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】標的タンパク質とタンパク質導入ドメイン(PTD)の組換えタンパク質を介して標的タンパク質を送達する方法(Steven R.ら、Protein transduction: unrestricted delivery into all cells? Trends in Cell Biology、2000)を示す図である。
【図２】エンドサイトーシスを介して、ナノ粒子と標的タンパク質の複合体を使用してサイトゾルに標的タンパク質を送達する方法(Munish Chananaら、Physicochemical properties of protein-coated gold nanoparticles in biological fluids and cells before and after proteolytic digestion. Angew. Chem. Int.編、2013)を示す図である。
【図３】エキソソームが多小胞体(MVB)から分離及び放出されるプロセス(Graca Raposo and Willem Stoorvogel、 Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Cell Biology 200(4)、373-383、2013)を示す図である。
【図４】ターゲッティングされたエキソソームを介してin vivoでsiRNAを送達することによって癌を治療する方法(Alvarez-Erviti, L.ら、Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology 29、341-345、2011)を示す図である。
【図５】本発明による光遺伝学的に設計されたタンパク質保持エキソソーム(optogenetically-designed protein-carrying exosomes)(EXPLOR)の調製方法を示す模式図である。
【図６】EXPLORに対する光照射を停止した場合に、エキソソームの内部で標的タンパク質と光特異的結合タンパク質の融合タンパク質を分離するプロセスを示す図である。
【図７】CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子を導入した形質転換HEK293T細胞における、青色光照射によるmCherryタンパク質の細胞内位置の変化を示す蛍光画像である。
【図８】本発明によるEXPLORを得るための実験手順を示す図である。
【図９】青色光の強度に応じてエキソソームに捕捉された標的タンパク質(mCherryタンパク質)含量の変化の測定結果を示す免疫ブロット分析の画像である。
【図１０】標的タンパク質(mCherry)を含むエキソソームで標的細胞(HT1080)を処理した後の標的細胞への標的タンパク質の導入に関する調査結果を示す電子顕微鏡写真であり、左側はエキソソームで処理していない標的細胞を示し、右側はエキソソームで処理した標的細胞を示す。
【図１１】(a)標的タンパク質(mCherry)を含むエキソソームで標的細胞(HT1080)を処理した後の標的細胞への標的タンパク質の導入に関する調査結果を示す一連の蛍光画像、及び(b)エキソソーム処理によって誘導されるアポトーシス細胞の比の比較結果を示すグラフである。
【図１２】GIGANTEA-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-FKF1LOVを導入した形質転換HEK293T細胞における、青色光照射によるmCherryタンパク質の細胞内位置の変化を示す蛍光画像である。
【図１３】蛍光イメージングによって測定した、ルシフェラーゼ-mCherry融合タンパク質の発現(a)並びに生成細胞におけるルシフェラーゼ活性及び分子数(b)を示す一連の図である。対照:無処理のHEK293T細胞、オーバー:ルシフェラーゼ-mCherry-CRY2を単独で導入したHEK293T細胞、XP:エキソソームローディング技法用に設計された市販のベクターであるXPACK(Systems Biosciences)を使用することによってXPACK-ルシフェラーゼ-mCherryを導入したHEK293T細胞、EXPLOR:本発明によるルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9を導入したHEK293T細胞。
【図１４】生成されたエキソソームにおけるルシフェラーゼ活性(a)及び分子数(b)を示す図である。NEG:無処理のHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、オーバー:ルシフェラーゼ-mCherry-CRY2を導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、XP:エキソソームローディング技法用に設計された市販のベクターであるXPACK(Systems Biosciences)を使用することによってXPACK-ルシフェラーゼ-mCherryを導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、EXPLOR:本発明によるルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9を導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、オン:200μWの青色光照射下で72時間培養することによって生成されたエキソソーム、オフ:光がない条件下で72時間培養することによって生成されたエキソソーム。
【図１５】上記で生成されたエキソソームにおける、標的タンパク質のローディング効率を示す図である。
【図１６】エキソソームを使用する標的細胞(HeLa)への標的タンパク質の移行効率を示す図である。対照:無処理のHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、オーバー:ルシフェラーゼ-mCherry-CRY2を導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、XP:エキソソームローディング技法用に設計された市販のベクターであるXPACK(Systems Biosciences)を使用することによってXPACK-ルシフェラーゼ-mCherryを導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、EXPLOR:本発明によるルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9を導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、オン:200μWの青色光照射下で72時間培養することによって生成されたエキソソーム、オフ:光がない条件下で72時間培養することによって生成されたエキソソーム。
【図１７】HEK293T細胞におけるルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
実際的且つ現在好ましい本発明の実施形態を以下の実施例に示すように例示する。
【００８５】
しかし、当業者が、本開示を考慮して、本発明の趣旨及び範囲内で修正及び改良を行うことができることが理解されよう。
【実施例】
【００８６】
[実施例1]
エキソソームの調製
<1-1>エキソソームの生成のためのCIBNとCRY2の結合の確認
CIBN-EGFP-CD9遺伝子を含むPcDNA3.1(+)ベクター及びmCherry-CRY2遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを、光がない条件下で、エキソソーム生成細胞であるHEK293T細胞に導入し、続いて24時間培養した。培地を血清フリー培地と交換し、続いて、さらに48時間培養した。培養が完了すると、460〜490nmの波長の青色光で細胞を照射した。共焦点顕微鏡を使用することによって、青色光照射の前後にmCherryで示される赤色蛍光の位置を確認した(図7)。
【００８７】
図7は、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子を導入した形質転換HEK293T細胞における、青色光照射によるmCherryタンパク質の細胞内位置の変化を示す蛍光画像である。図7に示すように、光特異的結合タンパク質のCIBNとCRY2の結合を引き起こすことができる青色光を照射する前は、mCherryタンパク質はサイトゾル中に均等に分布していた。しかし、青色光を照射した後は、mCherryタンパク質は膜に集中した。mCherryタンパク質のこのクラスター形成は光特異的結合タンパク質であるCIBNとCRY2の結合によって引き起こされると分析された。
【００８８】
<1-2>エキソソームの生成のためのGIGANTEAとFKF1の結合の確認
GIGANTEA-EGFP-CD9遺伝子を含むPcDNA3.1(+)ベクター及びmCherry-FKF1LOV遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを本実施例で使用した。細胞内のエキソソームを実施例<1-1>に記載されているものと同じ方法で確認した。(上記のFKF1LOV中のLOVは、FKF1タンパク質中の、光によって他のタンパク質に結合するドメインを示す、光-酸素-電圧ドメインの省略形であり、したがって、本明細書では、FKF1とFKF1LOVは実際同じである)。
【００８９】
実施例<1-1>と同様に、図12に示すように、光特異的結合タンパク質のGIGANTEAとFKF1の結合を引き起こすことができる青色光を照射する前は、mCherryタンパク質はサイトゾル中に均等に分布していた。しかし、青色光を照射した後は、mCherryタンパク質は膜に集中した。mCherryタンパク質のこのクラスター形成は、光特異的結合タンパク質であるGIGANTEAとFKF1の結合によって引き起こされると分析された。
【００９０】
[実施例2]
エキソソーム生成及びエキソソーム生成への光強度の効果
CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子をそれぞれ含む各発現ベクターを、0、5、20、50及び200μWの強度で、460nmの波長のLED光下でHEK293T細胞に導入し、続いて、24時間培養した。次いで、培地を血清フリー培地と交換し、続いて、さらに48時間培養した。培養が完了すると、培養培地を分離し、これを遠心分離(3000×g、15分)して、細胞デブリを除いた上清を得た。ExoQuick-TCエキソソーム沈殿溶液(System Biosciences、Mountain View、California、USA)を上清の5倍量で得られた上清に加えた。混合した後、遠心分離(1500×g、30分)を行って、沈殿したエキソソームを得た。得られたエキソソームをPBSに懸濁し、エキソソームの懸濁液を得た。27-Gのニードルを備えたシリンジを使用して、このエキソソームの懸濁液を0.2μmのフィルターで濾過した。その結果、単一サイズのエキソソームを得た(図8)。次いで、溶解緩衝液を使用してエキソソームの可溶化液を調製し、続いて免疫ブロッティングを行って、エキソソーム中のmCherryタンパク質の量を比較した(図9)。
【００９１】
図9は、青色光の強度に応じてエキソソームに捕捉された標的タンパク質(mCherryタンパク質)含量の変化の測定結果を示す免疫ブロット分析の画像である。図9に示すように、20〜50μWの強度の青色光で細胞を照射した場合、標的タンパク質であるmCherryのエキソソーム中の量が最も高かった。上記の結果から、光特異的結合タンパク質の結合の過程で、細胞に照射する光の強度を制御することによって、エキソソームに捕捉される標的タンパク質の含量を調節できることが確認された。
【００９２】
[実施例3]
エキソソーム処理の効果
CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子をそれぞれ含む各発現ベクターを50μWの強度で、460nmの波長のLED光下でHEK293T細胞に導入し、続いて、実施例2に記載されているものと同じ方法でエキソソームを抽出した。抽出したエキソソームを250μg/mlの濃度でHT1080細胞に24時間処理した。4%PFA及び0.01%GAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)を加えることによって、HT1080細胞を10%ゼラチンゲル上に固定した。液体窒素を使用することによって、ゼラチンゲル上に付着した細胞を1日冷却した。クライオウルトラミクロトームを使用することによって45nmにカットした薄切片を-120℃で得た。抗mCherry抗体及びプロテインA-金を使用することによって、この薄切片を免疫染色した。Tecnai G2 Spirit Twin TEMでmCherryタンパク質を観察した(図10)。
【００９３】
図10は、標的タンパク質(mCherry)を含むエキソソームで標的細胞(HT1080)を処理した後の標的細胞への標的タンパク質の導入に関する調査結果を示す電子顕微鏡写真であり、左側はエキソソームで処理していない標的細胞を示し、右側はエキソソームで処理した標的細胞を示す。図10に示すように、本発明のエキソソームで標的細胞を処理した場合に、標的タンパク質が標的細胞中に移行することが確認された。
【００９４】
[実施例4]
標的タンパク質を含むエキソソームの分析
CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子をそれぞれ含む各発現ベクターを、50μWの強度で、460nmの波長のLED光下でHEK293T細胞に導入し、続いて、実施例2に記載されているものと同じ方法でエキソソームを抽出した。抽出したエキソソームを250μg/mlの濃度でHT1080細胞に24時間処理した。次いで、mCherryタンパク質の赤色蛍光を蛍光顕微鏡下で確認し、LDH細胞死アッセイによって、エキソソームで処理した細胞とエキソソームで処理していない細胞の間で死細胞の比を比較した(図11)。
【００９５】
図11は、(a)標的タンパク質(mCherry)を含むエキソソームで標的細胞(HT1080)を処理した後の標的細胞への標的タンパク質の導入に関する調査結果を示す一連の蛍光画像、及び(b)エキソソーム処理によって誘導されるアポトーシス細胞の比の比較結果を示すグラフである。図11に示すように、アポトーシスがエキソソーム処理によって誘導されなかったことが確認された。
【００９６】
[実施例5]
エキソソーム生成及び生成されたエキソソームへの標的タンパク質の導入効率の比較
<5-1>エキソソーム生成効率の確認
エキソソーム生成及び本発明によって生成されたエキソソームへの標的タンパク質の導入効率を従来の方法のものと比較するために、エキソソーム生成細胞における標的タンパク質の発現を、その中のルシフェラーゼ活性を測定することによって調べた。
【００９７】
従来の方法に従って、エキソソームローディング技法(XP)用に設計された市販のベクターであるXPACK(Systems Biosciences)を使用することによって、XPACK-ルシフェラーゼ-mCherryをHEK293T細胞に導入した。一方で、本発明の方法に従って、ルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9をHEK293T細胞に導入した(EXPLOR)。次いで、両細胞のルシフェラーゼ活性を測定して、2つの方法の効率を比較した。ルシフェラーゼ活性は、製造者の指示書(ルシフェラーゼアッセイ試薬、Promega)に従って測定した。結果の検量線をプロットし、次いで、細胞中のエキソソームの数を定量的に算出した。
【００９８】
図14に示すように、本発明の光特異的結合タンパク質CIBN及びCRY2を使用する方法は、従来の方法(XP)よりもエキソソームへの導入効率が有意に高かったことが確認された(図14)。
【００９９】
<5-2>生成されたエキソソームにおける標的タンパク質の発現
実施例<5-1>の細胞を72時間培養し、続いて、エキソソームを抽出した(ExoQuick-TC、Systems Biosciences)。従来の方法(XP)又は本発明の方法によって分離したエキソソームに含まれる標的タンパク質の濃度をその中のルシフェラーゼ活性を測定することによって間接的に比較した。図15に示すように、本発明の方法は従来の方法よりも著しく大量の標的タンパク質を含むエキソソームを生成できたことが確認された(図15)。
【０１００】
<5-3>標的タンパク質の導入効率の比較
標的タンパク質の導入効率(E)を、実施例<5-1>及び<5-2>で測定したルシフェラーゼ活性に基づいて、以下の数式によって計算した。
[数式1]
E=生成されたエキソソーム中のルシフェラーゼ活性の測定値/エキソソーム生成細胞中のルシフェラーゼ活性の測定値
【０１０１】
図15に示すように、本発明のCRY2とCIBNの結合を使用して生成されたエキソソームは、他の比較群のものよりも4〜120倍高い効率を示したことが確認された(図15)。
【０１０２】
[実施例6]
標的細胞へのエキソソームの移行効率の比較
エキソソームの移行効率を比較するために、標的タンパク質を含むエキソソームで標的細胞を処理した。特に、HeLa細胞を5×109個のエキソソームで24時間処理し、次いで、細胞で発現する蛍光強度を測定した。図16に示すように、本発明のエキソソーム(EXPLOR)中の蛍光強度が著しく高かったことが確認された(図16)。
【０１０３】
したがって、本発明のエキソソームを使用する方法は標的細胞に標的タンパク質をより効率的に送達できたことが確認された。
【０１０４】
前述の説明に開示される概念及び特定の実施形態を本発明の同じ目的を実施するために他の実施形態を修正又は設計するための基礎として容易に利用できることを当業者なら理解するであろう。当業者はまた、そのような同等な実施形態は添付の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨及び範囲から逸脱しないことを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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