(57)【要約】本発明は、ＭＨＣにより提示される抗原プレプロカルシトニンのＴ細胞エピトープを持つペプチドの組み合わせに関する。これらのペプチドは、抗腫瘍免疫療法において使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１８の配列より選択される少なくとも二つのペプチド配列を含む組成物であって、前記配列の各々は、８〜１５個のアミノ酸のペプチドの形態で存在するか、またはマルチエピトープキメラポリペプチドに含まれることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
８〜１５個のアミノ酸のペプチドの混合物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
配列番号１〜１８の配列より選択される少なくとも二つの配列を含むキメラポリペプチドを含む、請求項１または２に記載の組成物であって、前記配列は、隣接するか、１〜５個のアミノ酸からなる連結要素により連結されるか、またはプレプロカルシトニン以外のタンパク質のエピトープを含む配列によって隔てられることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
配列番号１〜７の配列より選択される少なくとも二つのペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
配列番号１〜７の配列より選択される少なくとも三つのペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
配列番号４および５、ならびに配列番号６の配列より選択される少なくとも一つの配列を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
配列番号１、２、３、５および６の配列の組み合わせ、配列番号１、３、４、５および６の配列の組み合わせ、配列番号１、２、５および６の配列の組み合わせ、配列番号１、３、５および６の配列の組み合わせ、ならびに配列番号３、４、５および６の配列の組み合わせより選択されるペプチド配列の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
配列番号１〜１８の配列より選択される８〜１５個のアミノ酸の少なくとも二つのペプチドをコードするか、または請求項３に記載のキメラポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸分子を含む、組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチド配列をロードした抗原提示細胞を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも一つの免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
配列番号１９、２０および／または２１のペプチド配列のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
薬物として使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
抗腫瘍免疫療法における使用のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、カルシトニンを発現する腫瘍、またはカルシトニン、プレカルシトニンもしくはプレプロ−α−ＣＧＲＰの高い血清中濃度を伴う病変の免疫療法を対象とすることを特徴とする、請求項１３と同じ使用のための、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、甲状腺髄様癌腫または肺癌腫の免疫療法を対象とすることを特徴とする、請求項１３または１４と同じ使用のための、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、ＴＡＰペプチド輸送体を発現しない細胞を有する腫瘍の免疫療法を対象とすることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか一項と同じ使用のための、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１患者の治療を対象とすることを特徴とする、請求項１２〜１６のいずれか一項と同じ使用のための、請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレプロカルシトニン（ｐｐＣＴ；ｐｒｅｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）のエピトープの組み合わせおよび抗腫瘍免疫療法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種またはペプチド免疫療法は現在、癌の予防または治療の領域において高い関心が集まる治療的アプローチである。その原理は、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ；ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）により認識される腫瘍抗原のＴ細胞エピトープを再生するペプチドによる免疫化に基づき、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、これらの抗原を表面で発現する癌細胞の排除に主要な役割を果たす。
【０００３】
ＣＴＬは、タンパク質抗原全体ではなく、様々な細胞の表面で発現される主要組織適合複合体（ＭＨＣ；ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の分子により提示されるそのペプチド断片を認識することが思い出されよう。これらは、Ｔ細胞エピトープを構成するペプチド断片である。
【０００４】
これらのペプチドの提示は、以下の三つの主なステップを含む「抗原プロセシング」と呼ばれる複雑なプロセスの結果生じる：
−  プロテアソームと呼ばれる多酵素複合体による抗原の細胞質ゾルでの分解、
−  この分解の結果生じるペプチドの、ＴＡＰ輸送体による小胞体（ＥＲ；ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）内への移動、
−  これらペプチドとＭＨＣ分子との結合による、安定したペプチド／ＭＨＣ複合体の形成と、その細胞表面への搬出。
【０００５】
クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ  Ｉ）により提示されるエピトープは通常、８〜１１個のアミノ酸（ａａ；ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）を有し、細胞障害性応答の主要な成分であるＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される。クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ  ＩＩ）により提示されるエピトープは通常、１３〜１８個のアミノ酸を有し、ＣＤ４＋Ｔ細胞により認識される。
【０００６】
これらのエピトープの同定は、抗腫瘍免疫療法組成物の開発に必須のステップである。
【０００７】
プレプロカルシトニンは、神経ペプチド「カルシトニン遺伝子関連ペプチド」のα型（α−ＣＧＲＰ；ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）もコードするＣＡＬＣＡ遺伝子によりコードされる。この遺伝子は、５つのイントロンおよび６つのエキソンを含み、その転写一次産物は、選択的組織特異的スプライシングの対象である。エキソン１、２、３および４の連結は、甲状腺Ｃ細胞においてカルシトニンｍＲＮＡを生産するが、エキソン１、２、３、５および６の連結は、ニューロンにおいてα−ＣＧＲＰ  ｍＲＮＡを生産する（非特許文献１）。
【０００８】
カルシトニンｍＲＮＡは、１４１個のアミノ酸の前駆体であるプレプロカルシトニンをコードし、このプレプロカルシトニンは２５残基のＮ末端シグナル配列を含み、このＮ−末端シグナル配列の切断により１１６ａａプロカルシトニンが生じる。プロカルシトニンはＮ−末端領域の５７ａａ、続いて成熟３２ａａカルシトニン、２１ａａＣ末端ペプチドのカタカルシンを含む（非特許文献２）。成熟形態のα−ＣＧＲＰは、多数の組織に見られる血管拡張効果をもつ３７ａａペプチドである（非特許文献３）。プレプロカルシトニンのシグナル配列も、プレプロホルモンα−ＣＧＲＰ内にみられる。
【０００９】
カルシトニンの生理学的役割は主に、成長、妊娠および授乳等の「カルシウムストレス」の期間中に骨格を保護することである。カルシトニンは、甲状腺髄様癌腫（ＭＴＣ；ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞およびある特定の肺癌腫によっても大量に生産される（非特許文献４；非特許文献５）。高い血漿カルシトニン濃度は、これらの腫瘍における診断マーカおよび予後マーカである。
【００１０】
ＭＴＣ免疫療法のために、成熟カルシトニンでパルスした樹状細胞の使用が提案されている（非特許文献６）。より最近では、本発明者らのチームが、プレプロカルシトニンシグナルペプチドから誘導される１０アミノ酸の抗原ペプチドを同定している。このペプチドは、プロテアソームおよびＴＡＰ輸送体とは独立した機序により小胞体でプロセシングされるエピトープに対応する（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００９０１０８７４号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＭＯＲＲＩＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０８，７４６−８，１９８４
【非特許文献２】ＲＯＳＥＮＦＥＬＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０４，１２９−３５，１９８３
【非特許文献３】ＺＡＩＤＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ，２８，１０９−７４，１９９０
【非特許文献４】ＣＯＯＭＢＥＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１，１０８０−３，１９７４
【非特許文献５】ＭＩＬＨＡＵＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１，４６２−３，１９７４
【非特許文献６】ＳＣＨＯＴＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５１，６６３−８，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らはこれまでに、抗腫瘍免疫応答の誘導に関与するプレプロカルシトニンの他の領域を同定し、異なるエピトープの組み合わせがより良好な抗腫瘍応答を可能にすることを明らかにした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下より選択される少なくとも二つのペプチド配列を含む組成物に関する：
−  以下ではｐｐＣＴ１−１５とも呼称されるＭＧＦＱＫＦＳＰＦＬＡＬＳＩＬ（配列番号１）；
−  以下ではｐｐＣＴ７１−８５とも呼称されるＥＲＥＧＳＳＬＤＳＰＲＳＫＲＣ（配列番号２）；
−  以下ではｐｐＣＴ８６−１００とも呼称されるＧＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦ（配列番号３）；
−  以下ではｐｐＣＴ９−１７とも呼称されるＦＬＡＬＳＩＬＶＬ（配列番号４）；
−  以下ではｐｐＣＴ１６−２５とも呼称されるＶＬＬＱＡＧＳＬＨＡ（配列番号５）；
−  以下ではｐｐＣＴ５０−５９とも呼称されるＬＬＡＡＬＶＱＤＹＶ（配列番号６）；
−  以下ではｐｐＣＴ９１−１００とも呼称されるＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦ（配列番号７）；
−  以下ではｐｐＣＴ４５−６０とも呼称されるＥＡＲＬＬＬＡＡＬＶＱＤＹＶＱ（配列番号８）；
−  以下ではｐｐＣＴ１−１０とも呼称されるＭＧＦＱＫＦＳＰＦＬ（配列番号９）；
−  以下ではｐｐＣＴ３−１２とも呼称されるＦＱＫＦＰＦＬＡＬ（配列番号１０）；
−  以下ではｐｐＣＴ５−１４とも呼称されるＫＦＳＰＦＬＡＬＳＩ（配列番号１１）；
−  以下ではｐｐＣＴ６−１５とも呼称されるＦＳＰＦＬＡＬＳＩＬ（配列番号１２）；
−  以下ではｐｐＣＴ８７−９６とも呼称されるＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹ（配列番号１３）；
−  以下ではｐｐＣＴ８８−９７とも呼称されるＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴ（配列番号１４）；
−  以下ではｐｐＣＴ９６−１０５とも呼称されるＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴ（配列番号１５）；
−  以下ではｐｐＣＴ４１−５０とも呼称されるＴＬＳＥＤＥＡＲＬＬ（配列番号１６）；
−  以下ではｐｐＣＴ５３−６２とも呼称されるＡＬＶＱＤＹＶＱＭＫ（配列番号１７）；および
−  以下ではｐｐＣＴ５８−６６とも呼称されるＹＶＱＭＫＡＳＥＬ（配列番号１８）。
【００１５】
本発明による組成物においては、前記配列の各々が８〜１５個のアミノ酸のペプチドの形態で存在するか、またはマルチエピトープキメラポリペプチドに含まれる。ここではキメラポリペプチドは、自然には存在しないアミノ酸の連なりと定義される。ここで理解されるキメラポリペプチドは、配列番号１〜１８の配列より選択される少なくとも二つの配列を含むことができ、前記配列は、前記ポリペプチドにおいて、隣接するか、１〜５個のアミノ酸からなる連結要素により連結されるか、またはプレプロカルシトニン以外のタンパク質のエピトープを含む配列によって隔てられる。
【００１６】
したがって本発明による組成物は、マルチエピトープであり、好ましくは少なくとも一部の個人においてポリ特異的応答を生成できる。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態によれば、本組成物は、プロテアソームおよびＴＡＰ輸送体とは独立した機序により小胞体でプロセシングされるエピトープに対応する配列番号４および５の配列等の少なくとも一つの配列を含む。本組成物は、プロテアソームおよびＴＡＰ輸送体に依存する機序により小胞体でプロセシングされるエピトープに対応する配列番号３および６の配列等の少なくとも一つの配列をさらに含むのがなお好ましい。本発明による組成物は、好ましくは配列番号６の配列を含み、この配列は上記のようにこの配列からなるペプチドの形態で含まれるか、またはキメラポリペプチドに含まれる。
【００１８】
本発明の特定の実施形態によれば、本組成物は９〜１５個のアミノ酸のペプチドの混合物を含む。この混合物は、凍結乾燥されるか、医薬用途に適した溶液に懸濁されうる。
【００１９】
本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本組成物は、配列番号１〜１８の配列より選択される少なくとも二つの配列を含むキメラポリペプチドを含み、前記配列は、隣接するか、１〜５個のアミノ酸からなる連結要素により連結されるか、またはプレプロカルシトニン以外のタンパク質のエピトープを含む配列によって隔てられる。該当する場合には、キメラポリペプチドは同じ配列の複数のコピーを含みうる。また、本発明によるキメラポリペプチドにおいては、免疫原性配列の少なくとも一部が、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ；ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ）に挿入されうる。ＡＣ受容体はＣＤ１１ｂの受容体と同じであり、樹状細胞はＣＤ１１ｂ受容体を発現するため、このような構築物は、免疫原性エピトープを樹状細胞に直接導くことを可能にする。（ＤＡＤＡＧＬＩＯ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５，１４２３−１４３０，２００３）。
【００２０】
本発明による組成物は、ＳＰＦＬＡＬＳＩＬ（配列番号１９またはｐｐＣＴ７−１５）、ＥＡＲＬＬＬＡＡＬ（配列番号２０またはｐｐＣＴ４６−５４）、および／またはＳＰＲＳＫＲＣＧＮＬ（配列番号２１またはｐｐＣＴ７９−８８）の配列のうちの一つ等、前述の配列と異なる少なくとも一つの他のペプチド配列、特にＨＬＡ分子、例えばＨＬＡ−Ｂ７と結合できる配列を任意に含み、前記ペプチド配列は、単離ペプチドの形態であるか、または本発明によるマルチエピトープキメラペプチドに含まれる。
【００２１】
異なるＨＬＡアレルをもつ個人からなる人口に広く使用できるように、本発明によるマルチエピトープ組成物は、異なるＭＨＣ分子により提示されるエピトープを含みうる。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態によれば、本組成物は、少なくとも一つの免疫チェックポイント阻害剤、例えば限定はされないが分子ＰＤ−１、ＰＤＬ−１またはＣＴＬＡ４、好ましくはヒト分子ｈＰＤ−１、ｈＰＤＬ−１またはｈＣＴＬＡ４に対する抗ＰＤ−１、抗ＰＤＬ−１または抗ＣＴＬＡ４、特に抗体、好ましくはモノクローナル抗体も含む。本発明による組成物は、抗ＰＤ−１、特に抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、好ましくは抗ｈＰＤ−１を含むのが有利である。
【００２３】
本発明によるキメラポリペプチドは、それ自体公知の方法により、特に従来の組換えＤＮＡ技術により容易に得られる。
【００２４】
本発明による組成物は、配列番号１〜７の配列より選択される少なくとも二つのペプチド配列を含むのが好ましく、これらの配列のうち少なくとも３つを含むのがより好ましい。プレプロカルシトニンの完全な配列に対する配列番号１〜７のペプチドの位置が図１に示される。
【００２５】
本発明による組成物中に存在する配列の組み合わせの非限定的な例には、以下の組み合わせ：
−  配列番号１、２、３、５および６の配列の組み合わせ；
−  配列番号１、３、４、５および６の配列の組み合わせ；
−  配列番号１、２、５および６の配列の組み合わせ；
−  配列番号１、３、５および６の配列の組み合わせ；
−  配列番号３、４、５および６の配列の組み合わせ
が含まれ、これらの組み合わせは、前述の配列および上記のような少なくとも一つの免疫チェックポイント阻害剤、特に抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、好ましくは抗ｈＰＤ−１抗体、ならびに／または配列番号１９、２０および／もしくは２１の配列のうちの一つを含む。
【００２６】
本発明は、免疫原性ペプチドの混合物、または上記のようなキメラポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにそれを含む組成物にも関する。これらのポリヌクレオチドは、細胞または宿主生物における免疫原性ペプチドまたは本発明のキメラポリペプチドの発現を可能にするために、転写調節または適切なプロモータの下で発現ベクターに挿入されうる。発現ベクターの選択は、特に発現が求められる細胞または生物（原核生物または真核生物）に依存する。治療される患者に直接ポリヌクレオチドを投与することが計画される場合には、裸のＤＮＡプラスミド、または一時的発現を可能にするベクター、例えばアデノウィルスまたはワクシニアウィルス由来のベクターが使用されるのが好ましい。したがって本発明は、配列番号１〜１８の配列より選択される９〜１５個のアミノ酸の少なくとも二つのペプチドをコードするか、または上述のキメラポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸分子を含む組成物にも関する。
【００２７】
本発明による他の組成物は、本発明のペプチドまたはマルチエピトープ組成物をロードしたか、または適切な発現ベクターに挿入された本発明のポリヌクレオチドで形質転換された樹状細胞を含むこともできる。本発明のペプチドまたはマルチエピトープ組成物をロードした人工抗原提示細胞を含むこともできる。人工抗原提示細胞は、特に、国際特許出願公開第１９９９／００３４９９号に記載される腫瘍細胞由来のベシクル（テキソソーム）、またはＶＩＡＵＤ  ｅｔ  ａｌ．の出版物（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３４，６５−７５，２０１１）に記載される樹状細胞由来のエキソソームでありうる。
【００２８】
本発明のもう一つの態様は、薬物として、具体的には抗腫瘍免疫療法を対象とした薬物としての、より具体的にはカルシトニンおよび／またはα−ＣＧＲＰを発現する腫瘍の治療における、上述の組成物の使用である。これには、特に小細胞または非小細胞肺癌腫のほか、甲状腺髄様癌腫が含まれる。本発明による組成物は、以下の癌病変等のカルシトニンもしくはプロカルシトニンまたはプロαＣＧＲＰの高い血清中濃度を伴う病変の治療にも使用されうる：腎癌、乳癌、消化器癌（ＴＡＢＯＬＬＩ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｕｍｏｒｉ，６９，２２７−２３０，１９８３）、膵臓癌、前立腺癌（ＳＩＭ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ．，２６，４８７−９５，１９９６）、肝臓癌（ＣＯＮＴＥ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１０６，１０９−１１，１９８４）または慢性骨髄性白血病（ＴＡＫＵＢＯ  ｅｔ  ａｌ，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ，３１，１７７−９，２００１）、急性未分化型骨髄芽球性白血病（ＫＩＥＦＥＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１３，５０１−５０７，１９９４）、神経内分泌系腫瘍および肝臓癌（ＧＨＩＬＬＩＡＮＩ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４９，６８４５−６８５１，１９８９）。
【００２９】
本発明による組成物は、細胞がＴＡＰペプチド輸送体を発現しない腫瘍の免疫療法のために特に有利な様式で使用できる。
【００３０】
上述の組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の患者の治療に特に適する。
【００３１】
本発明は、薬物、特に抗腫瘍免疫療法、特にカルシトニンおよび／またはα−ＣＧＲＰを発現する腫瘍の治療を対象とした薬物を得るための、本発明による少なくとも二つの免疫原性ペプチドエピトープのマルチエピトープ組成物または核酸分子の使用にも関する。これには、特に小細胞または非小細胞肺癌腫のほか、甲状腺髄様癌腫が含まれる。前記薬物は、以下の癌病変等のカルシトニンもしくはプレカルシトニンまたはプレプロαＣＧＲＰの高い血清中濃度を伴う病変の治療にも使用されうる：腎癌、乳癌、消化器癌（ＴＡＢＯＬＬＩ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｕｍｏｒｉ，６９，２２７−２３０，１９８３）、膵臓癌、前立腺癌（ＳＩＭ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ．，２６，４８７−９５，１９９６）、肝臓癌（ＣＯＮＴＥ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１０６，１０９−１１，１９８４）または慢性骨髄性白血病（ＴＡＫＵＢＯ  ｅｔ  ａｌ，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ，３１，１７７−９，２００１）、急性未分化型骨髄芽球性白血病（ＫＩＥＦＥＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１３，５０１−５０７，１９９４）、神経内分泌系腫瘍および肝臓癌（ＧＨＩＬＬＩＡＮＩ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４９，６８４５−６８５１，１９８９）。
【００３２】
本発明は、本発明による少なくとも一つの免疫原性ペプチド、組成物または核酸分子を活性物質として含む薬物も含む。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記薬物はワクチンであり、特に治療ワクチンである。
【００３４】
本発明による薬物は、免疫療法において通常使用され、例えば活性物質の投与、その安定化、その免疫原性の増加などを促進する一般的な賦形剤およびアジュバントをさらに含みうる。使用可能なアジュバントの例には、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ；ａｐｏｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ；ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＬＲ３アゴニスト（ポリＩ：Ｃ）等のｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ；ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＧＭ−ＣＳＦならびにＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）等のサイトカインおよびケモカインが含まれる。
【００３５】
本発明は、本発明による免疫原性ペプチドの混合物の同定を示した非限定的な例に言及する以下のさらなる説明の助けを借りてよりよく理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】プレプロカルシトニンの完全な配列に対する配列番号１〜７のペプチドの位置を示す。
【図２Ａ】配列番号４〜７のペプチドを用いた患者のＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を示す。Ａ〜Ｃ：９人の肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ；ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）患者のＰＢＭＣをそれぞれ４つのペプチドで刺激した後、ＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋細胞の数をフローサイトメトリで分析した。各ポイント（ｎ）は、８つの独立した刺激ウェルに対応する。各患者および各ペプチドのこれらのポイント（ｎ＝１２）の中央値を表す。統計的に有意な増加を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図２Ｂ】配列番号４〜７のペプチドを用いた患者のＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を示す。Ａ〜Ｃ：９人の肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ；ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）患者のＰＢＭＣをそれぞれ４つのペプチドで刺激した後、ＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋細胞の数をフローサイトメトリで分析した。各ポイント（ｎ）は、８つの独立した刺激ウェルに対応する。各患者および各ペプチドのこれらのポイント（ｎ＝１２）の中央値を表す。統計的に有意な増加を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図２Ｃ】配列番号４〜７のペプチドを用いた患者のＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を示す。Ａ〜Ｃ：９人の肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ；ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）患者のＰＢＭＣをそれぞれ４つのペプチドで刺激した後、ＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋細胞の数をフローサイトメトリで分析した。各ポイント（ｎ）は、８つの独立した刺激ウェルに対応する。各患者および各ペプチドのこれらのポイント（ｎ＝１２）の中央値を表す。統計的に有意な増加を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図３】ＨＬＡ−Ａ２分子のトランスジェニックマウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで試験した異なるペプチドの組み合わせのまとめを示す。
【図４Ａ】９〜１０個のアミノ酸の短鎖ペプチドまたは異なるペプチドの組み合わせによる患者のＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を示す。Ａ〜Ｃ：患者３（Ａ）、１０（Ｂ）および１１（Ｃ）のＰＢＭＣを、配列番号４〜６のペプチドのうちの一つだけにより、または図３に記載の組み合わせ１〜６のうちの一つにより刺激し、その後ＩＦＮγ＋分泌細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。統計的に有意な増加を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図４Ｂ】９〜１０個のアミノ酸の短鎖ペプチドまたは異なるペプチドの組み合わせによる患者のＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を示す。Ａ〜Ｃ：患者３（Ａ）、１０（Ｂ）および１１（Ｃ）のＰＢＭＣを、配列番号４〜６のペプチドのうちの一つだけにより、または図３に記載の組み合わせ１〜６のうちの一つにより刺激し、その後ＩＦＮγ＋分泌細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。統計的に有意な増加を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図４Ｃ】９〜１０個のアミノ酸の短鎖ペプチドまたは異なるペプチドの組み合わせによる患者のＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を示す。Ａ〜Ｃ：患者３（Ａ）、１０（Ｂ）および１１（Ｃ）のＰＢＭＣを、配列番号４〜６のペプチドのうちの一つだけにより、または図３に記載の組み合わせ１〜６のうちの一つにより刺激し、その後ＩＦＮγ＋分泌細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。統計的に有意な増加を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図５Ａ】異なるペプチドの組み合わせを使用したＨＬＡ−Ａ２分子のトランスジェニックマウスの免疫化を示す。Ａ．単独または組み合わせでの各ペプチドによる脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激後のＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔリンパ球の割合。Ｂ’、Ｂ’’およびＢ’’’．異なるペプチドの組み合わせ（Ｃ１〜Ｃ６）によるマウスの免疫化後のＣＤ８  Ｔリンパ球の細胞障害性応答。
【図５Ｂ−１】異なるペプチドの組み合わせを使用したＨＬＡ−Ａ２分子のトランスジェニックマウスの免疫化を示す。Ａ．単独または組み合わせでの各ペプチドによる脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激後のＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔリンパ球の割合。Ｂ’、Ｂ’’およびＢ’’’．異なるペプチドの組み合わせ（Ｃ１〜Ｃ６）によるマウスの免疫化後のＣＤ８  Ｔリンパ球の細胞障害性応答。
【図５Ｂ−２】異なるペプチドの組み合わせを使用したＨＬＡ−Ａ２分子のトランスジェニックマウスの免疫化を示す。Ａ．単独または組み合わせでの各ペプチドによる脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激後のＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔリンパ球の割合。Ｂ’、Ｂ’’およびＢ’’’．異なるペプチドの組み合わせ（Ｃ１〜Ｃ６）によるマウスの免疫化後のＣＤ８  Ｔリンパ球の細胞障害性応答。
【図５Ｂ−３】異なるペプチドの組み合わせを使用したＨＬＡ−Ａ２分子のトランスジェニックマウスの免疫化を示す。Ａ．単独または組み合わせでの各ペプチドによる脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激後のＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔリンパ球の割合。Ｂ’、Ｂ’’およびＢ’’’．異なるペプチドの組み合わせ（Ｃ１〜Ｃ６）によるマウスの免疫化後のＣＤ８  Ｔリンパ球の細胞障害性応答。
【図６】ＨＬＡ−Ａ２分子のトランスジェニックマウスモデルにおけるペプチドの組み合わせＣ６の抗腫瘍効果を示す。１×１０６個のＤ１２２−ｐｐＣＴ腫瘍細胞を、０日目（Ｄ０）にトランスジェニックマウスの側腹部皮下に移植した。その後、Ｄ０、Ｄ３、Ｄ４およびＤ１４に、組み合わせＣ６に含まれる各ペプチド１００μＭおよびアジュバント２５μｇを用いてマウスの皮下にワクチン接種した。腫瘍のサイズは、長さ＊幅＊深さの式により定義する。腫瘍成長の統計的に有意な差を示す（＊ｐ＜０．０５）。
【図７Ａ】組み合わせ免疫療法による抗腫瘍応答および腫瘍成長制御の強化を示す。Ａ．組み合わせ療法が腫瘍成長の制御を最適化する。ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスの側腹部にＨｅｕ−ｎＩＲ腫瘍断片を移植した後、１０日目に健常ドナーからのヒトＰＢＭＣを養子移入し、その後１１日目にペプチド混合物Ｃ６に基づくワクチンを用いた静脈内ワクチン接種を、１２日目からの抗ＰＤ１モノクローナル抗体と組み合わせて、または組み合わせずに行った。実験の終わりまで、二日ごとに腫瘍成長を記録した。
【図７Ｂ】Ｂ．組み合わせ療法（ワクチン＋抗ＰＤ−１）で処置したマウスは、ワクチンのみ（＊ｐ＜０．０４）または抗ＰＤ−１のみ（＊ｐ＜０．０３）で処置したマウスと比較して、腫瘍重量の最も強い減少がみられた。
【図７Ｃ】Ｃ．ｉｎ  ｖｉｖｏ組み合わせ療法により誘導されるサイトカイン産生。実験の終了前に処置または無処置マウスの血清中のヒトＩＦＮ−γプラスミド濃度をＥＬＩＳＡにより決定した（＊ｐ＜０．０１）。
【図７Ｄ】Ｄ．処置および無処置マウスの脾細胞によるＩＦＮ−γ、グランザイムＢ（ＧｒｍＢ）およびパーフォリン（Ｐｅｒｆ）の産生ＩＦＮ−γ、グランザイムＢ（ＧｒｍＢ）およびパーフォリン（Ｐｅｒｆ）を産生するＣＤ８＋Ｔ細胞を、細胞内蛍光分析により評価した。値は、平均蛍光強度（ＭＦＩ；ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）に対応する。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１。
【図８Ａ】組み合わせ免疫療法による腫瘍成長制御の強化を示す。Ａ．組み合わせ療法が腫瘍成長の制御を最適化する。ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスの側腹部にＨｅｕ−ｎＩＲ腫瘍断片を移植した後、１０日目に健常ドナーからのヒトＰＢＭＣを養子移入し、その後１１日目にペプチド混合物Ｃ６ａに基づくワクチンを用いた静脈内ワクチン接種を、１２日目からの抗ＰＤ１モノクローナル抗体と組み合わせて、または組み合わせずに行った。実験の終わりまで、二日ごとに腫瘍成長を記録した。
【図８Ｂ】Ｂ．組み合わせ療法（ワクチン＋抗ＰＤ−１）で処置したマウスは、抗ＰＤ−１のみで処置したマウスと比較して腫瘍重量の最も強い減少がみられた。
【実施例】
【００３７】
実施例１  プレプロカルシトニンの９または１０アミノ酸ペプチドによる患者のＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激
【００３８】
材料および方法
ペプチド
以下のペプチドを選択した：
ｐｐＣＴ９−１７  ＦＬＡＬＳＩＬＶＬ（配列番号４）；
ｐｐＣＴ１６−２５  ＶＬＬＱＡＧＳＬＨＡ（配列番号５）；
ｐｐＣＴ５０−５９  ＬＬＡＡＬＶＱＤＹＶ（配列番号６）；
ｐｐＣＴ９１−１００  ＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦ（配列番号７）。
【００３９】
使用した細胞および刺激
Ｆｉｃｏｌｌにより１１人の肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）を末梢血から分離した。ペプチドごとに、２０μＭのペプチドによりＰＢＭＣを二回（Ｄ０およびＤ７）刺激した。ＰＢＭＣを９６ウェルプレートで２週間、２，０００万細胞／プレートの割合で、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＳＡＢ、１％ピルビン酸ナトリウム、０．１％ペニシリン／ストレプトアビジン）でＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）＋ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。
【００４０】
サイトメトリによる分析
１５日後に、ＰＢＭＣを、１００μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下で、第一刺激ステップの間に使用したペプチド２．５μＭで再び刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。その後、細胞を抗ＣＤ８−ＡＰＣ抗体で２０分間インキュベートし、その後ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ−ホルムアルデヒド２％で固定し、ＢＳＡ／サポニンにより透過処理する。その後、細胞を抗ＩＦＮ−γ−ＰＥ抗体でインキュベートする。フローサイトメトリにより分析を行う。マン−ホイットニー検定を用いて統計研究を行い、統計的に有意な増加を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【００４１】
結果
結果を図２に示す。
【００４２】
様々な９または１０アミノ酸ペプチドによる刺激に対する応答のフローサイトメトリによる分析により、ｐＣＴ９−１７、ｐｐＣＴ１６−２５、ｐｐＣＴ５０−５９およびｐｐＣＴ９１−１００ペプチドによる刺激が被験患者のＣＤ８＋／ＩＮＦγ＋Ｔリンパ球のベースレベルの１〜４．５倍の増加をもたらすことが示された。異なる刺激ウェルの分析により、このＣＤ８応答の増加が統計学に有意であることが示された（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５）。しかしながら、異なる患者が各ペプチドに同じように応答するわけではない。患者１、２、６、８および９は、試験した全てのペプチドによる刺激の後にＣＤ８  Ｔリンパ球によるＩＦＮγの分泌を誘発するが、患者４、５および７は、ペプチドｐｐＣＴ９−１７およびｐｐＣＴ５０−５９による刺激の後にのみリンパ球応答を誘発し、患者３はペプチドｐｐＣＴ５０−５９およびｐｐＣＴ９１−１００で応答を誘発する。
【００４３】
結論として、ペプチドは被験患者によっては免疫原性であり、ＣＤ８  Ｔリンパ球を介した免疫応答を可能にするようである。異なるペプチドに対する応答のばらつき故に、ペプチドの組み合わせは、含まれる患者の大多数において抗ｐｐＣＴ応答を誘導する可能性がより高いと考えられる。
【００４４】
実施例２  短鎖９ＡＡまたは１０ＡＡペプチドまたは異なるペプチドの組み合わせによる患者のＩＮ  ＶＩＴＲＯ刺激
【００４５】
材料および方法
ペプチド
以下のペプチドを選択した：
ｐｐＣＴ１−１５：ＭＧＦＱＫＦＳＰＦＬＡＬＳＩＬ（配列番号１）；
ｐｐＣＴ７１−８５：ＥＲＥＧＳＳＬＤＳＰＲＳＫＲＣ（配列番号２）；
ｐｐＣＴ８６−１００：ＧＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦ（配列番号３）；
ｐｐＣＴ９−１７  ＦＬＡＬＳＩＬＶＬ（配列番号４）；
ｐｐＣＴ１６−２５  ＶＬＬＱＡＧＳＬＨＡ（配列番号５）；
ｐｐＣＴ５０−５９  ＬＬＡＡＬＶＱＤＹＶ（配列番号６）；
ｐｐＣＴ９１−１００  ＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦ（配列番号７）。
【００４６】
使用した細胞および刺激
Ｆｉｃｏｌｌにより３人の肺非小細胞癌患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を末梢血から分離し、その後、図３に記載の各ペプチド２０μＭで、または等モル濃度の２０μＭの各ペプチドで、二回（Ｄ０およびＤ７）刺激した。ＰＢＭＣを９６ウェルプレートで２週間、２，０００万細胞／プレートの割合で、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＳＡＢ、１％ピルビン酸ナトリウム、０．１％ペニシリン／ストレプトアビジン）でＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）＋ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養する。
【００４７】
ＥＬＩＳＰＯＴによる分析
１５日後にＰＢＭＣを回収し、ＥＬＩＳＰＯＴプレートで１００，０００細胞／ウェルの割合で、２．５μＭの各ペプチドまたは刺激のために使用した２．５μＭの各ペプチドの等モルの組み合わせを含む培地の存在下でインキュベートする。プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で１５〜１８時間インキュベートする。製造業者の指示（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｄｉａｃｌｏｎｅ）にしたがってＩＦＮγスポットを明らかにする。Ｃ．Ｔ．Ｌ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔシステム（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）を使用して、ＩＦＮγ分泌細胞により形成されるスポットを計数および分析する。マン−ホイットニー検定を用いて統計研究を行い、統計的に有意な増加を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【００４８】
結果
結果は図４に示される。
【００４９】
図３に記載の組み合わせを使用した３人の患者のＰＢＭＣの刺激後のＩＦＮγ分泌細胞の数の分析により、異なる組み合わせがこれらのペプチドによる特定のリンパ球の刺激ひいては増幅を可能にすることが示された。実際、患者１１では３つの組み合わせで、患者１０では４つの組み合わせで、患者３では６つの組み合わせで、ＩＦＮγ分泌細胞の数の有意な増加が観察される。
【００５０】
さらに、組み合わせＣ２、Ｃ５およびＣ６による刺激は、ペプチド単独による刺激と比較してもＩＦＮγ分泌細胞の数を増加させる。これらの応答は、患者に依存する。実際、組み合わせＣ２、Ｃ５およびＣ６による患者３のＰＢＭＣの刺激は、ＩＦＮγ分泌細胞の数をＣ２で６倍、Ｃ５で３倍、Ｃ６で２倍増加させる一方、患者１０については、組み合わせＣ２によるＰＢＭＣの刺激のみがＩＦＮγ分泌細胞の数を３倍増加させ、組み合わせＣ５およびＣ６による患者１１のＰＢＭＣの刺激は、ＩＦＮγ分泌細胞の数をＣ５で３倍、Ｃ６で２倍増加させる。
【００５１】
この結果は、ｐｐＣＴ抗原に由来する複数のペプチドの組み合わせがＣＤ８  Ｔリンパ球により進行する免疫応答を増加させることを示す。さらに、これらの結果は、大多数の患者において免疫応答を誘起するための、一つのペプチドと比較したペプチドの組み合わせを使用する利点も示す。
【００５２】
実施例３  異なるペプチドの組み合わせによるトランスジェニックマウスの免疫化
【００５３】
材料および方法
ペプチド
以下のペプチドを選択した：
ｐｐＣＴ１−１５：ＭＧＦＱＫＦＳＰＦＬＡＬＳＩＬ（配列番号１）；
ｐｐＣＴ７１−８５：ＥＲＥＧＳＳＬＤＳＰＲＳＫＲＣ（配列番号２）；
ｐｐＣＴ８６−１００：ＧＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦ（配列番号３）；
ｐｐＣＴ９−１７  ＦＬＡＬＳＩＬＶＬ（配列番号４）；
ｐｐＣＴ１６−２５  ＶＬＬＱＡＧＳＬＨＡ（配列番号５）；
ｐｐＣＴ５０−５９  ＬＬＡＡＬＶＱＤＹＶ（配列番号６）；
ｐｐＣＴ９１−１００  ＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦ（配列番号７）。
【００５４】
使用した細胞
抗原ｐｐＣＴを発現する（甲状腺髄様腫瘍からの）ヒトＴＴ腫瘍細胞株および（患者ＨｅｕのＮＳＣＬＣ腫瘍から分離された）ＩＧＲ−Ｈｅｕ腫瘍細胞株を標的細胞として使用する。（慢性骨髄性白血病の患者からの）Ｋ５６２細胞株を陰性対照として使用する。（患者ＨｅｕのＢリンパ球からの）Ｈｅｕ−ＥＢＶ株を溶解の特異性を決定するために使用する。５１Ｃｒで標識後、Ｈｅｕ−ＥＢＶ細胞を、（図４に記載される）２０μＭの各ペプチドを含む等モル混合物でインキュベートする。
【００５５】
マウスの免疫化
ＨＬＡ−Ａ２分子のトランスジェニックマウスに、１００μＭの各ペプチドの等モル混合物を含む１００μｌのペプチドの組み合わせとアジュバント（２５μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））とを用いて、側腹部皮下に４回（Ｄ０、Ｄ７、Ｄ１４およびＤ２１）免疫化を行った（図４）。最初の注射の２８日後に、マウスを屠殺して脾細胞を回収し、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、０．１％ペニシリン／ストレプトアビジン）でＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）の存在下で一晩培養した。
【００５６】
サイトメトリによる分析および細胞障害性テストによる分析
翌日、１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下で、単独または組み合わせでの２．５μＭの各ペプチドで脾細胞を刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。その後、細胞を抗ＣＤ８−ＰＥ抗体で２０分間インキュベートし、その後ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ−ホルムアルデヒド２％で固定し、ＢＳＡ／サポニンで透過処理する。その後、細胞を抗ＩＦＮγ−ＡＰＣ抗体でインキュベートする。フローサイトメトリにより分析を行う。
【００５７】
細胞毒性活性の分析のために、ネガティブディプリーション（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により脾細胞からＣＤ８  Ｔリンパ球を分離した。このように得られたＣＤ８  Ｔリンパ球の細胞毒性活性を、クロム５１（５１Ｃｒ）溶出試験により評価した。標的細胞（上記の段落に記載）を、２０μＭの５１Ｃｒの存在下で、３７℃で１時間インキュベートする。その後、細胞をＲＰＭＩで洗浄した後、５０：１、２５：１および１２：１のエフェクタ／標的比でＣＤ８  Ｔリンパ球とともに３７℃で共培養する。４時間のインキュベーションの後、共培養上清中に溶出した５１Ｃｒの濃度を測定する。以下の式を用いて溶解率を計算する：
【００５８】
【数１】
2018520152.tif 000002
【００５９】
結果
ペプチドの組み合わせＣ１〜Ｃ６によるマウスの免疫化後に分離された脾細胞のフローサイトメトリ分析は、ＩＦＮγを発現するＣＤ８  Ｔリンパ球の割合の増加を示す（図５Ａ）。この増加は使用される組み合わせに依存し、３〜１３倍（Ｃ１で４．８倍、Ｃ２で３倍、Ｃ３で３．４倍、Ｃ４で５．５倍、Ｃ５で４．３倍およびＣ６で１３．６倍）の変化を含む。これらの結果は、異なるペプチドの組み合わせによるトランスジェニックマウスの免疫化が、ＣＤ８  Ｔリンパ球の誘導を通じて免疫応答の進行を可能にすることを示す。
【００６０】
さらに、組み合わせからの各ペプチドによるｅｘ  ｖｉｖｏ刺激により、組み合わせのさらなる効果が示される。組み合わせＣ１では、ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激後の応答が、ペプチドｐｐＣＴ１−１５、ｐｐＣＴ７１−８５およびｐｐＣＴ８６−１００によるｅｘ  ｖｉｖｏ刺激と比較してそれぞれ４．２倍、５．２倍および４．６倍に増加することが分かる。全ての組み合わせでＣＤ８  Ｔリンパ球を介した免疫応答の有効性について同じ観察がなされうる。にもかかわらず、いずれの組み合わせもペプチドｐｐＣＴ５０−５９に対する効果は示さないが、これはペプチドｐｐＣＴ５０−５９が自然に誘導する強い応答に特に起因するものである。
【００６１】
最後に、ペプチドの組み合わせによるマウスの免疫化により生成されたＣＤ８  Ｔリンパ球は、ＩＧＲ−ＨｅｕおよびＴＴ等の抗原ｐｐＣＴを発現する細胞を特異的様式で認識および溶解することができる（図５Ｂ）。実際、図５Ｂは、非免疫化マウスの脾細胞からのＣＤ８  Ｔリンパ球は、免疫化マウスの脾細胞からのＣＤ８  Ｔリンパ球と異なり、ＩＧＲ−Ｈｅｕ腫瘍株もＴＴ腫瘍株も溶解できないことを示す。免疫化条件に応じて、リンパ球は、抗原ｐｐＣＴを発現する細胞を７〜１５％溶解する。Ｋ５６２細胞またはＨｅｕ−ＥＢＶ細胞にペプチドの組み合わせがロードされた場合を除き、Ｔリンパ球はＫ５６２細胞またはＨｅｕ−ＥＢＶ細胞を溶解しない。この結果は、抗原ｐｐＣＴを発現する腫瘍細胞に対して得られた溶解の特異性を示す。
【００６２】
トランスジェニックマウスの免疫化により得られた全ての結果が、ペプチドの組み合わせの使用によりＣＤ８  Ｔリンパ球が抗原ｐｐＣＴを発現する細胞に対して及ぼす免疫応答が活性化および増加しうることを示す。
【００６３】
実施例４  組み合わせＣ６によるトランスジェニックマウスのワクチン接種
【００６４】
材料および方法
ペプチド
以下のペプチドを選択した：
ｐｐＣＴ１−１５：ＭＧＦＱＫＦＳＰＦＬＡＬＳＩＬ（配列番号１）；
ｐｐＣＴ８６−１００：ＧＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦ（配列番号３）；
ｐｐＣＴ９−１７  ＦＬＡＬＳＩＬＶＬ（配列番号４）；
ｐｐＣＴ１６−２５  ＶＬＬＱＡＧＳＬＨＡ（配列番号５）；
ｐｐＣＴ５０−５９  ＬＬＡＡＬＶＱＤＹＶ（配列番号６）。
【００６５】
使用した細胞
分子ＨＬＡ−Ａ２（株Ｄ１２２）のトランスジェニックマウス株ＬＬ２（ルイス肺癌種）に、ＧＦＰを発現しヒト抗原ｐｐＣＴをコードするレンチウイルスに感染させた。その後、１０６個の細胞をマウスの側腹部の皮下に注入した。
【００６６】
マウスの免疫化
ＨＬＡ−Ａ２分子のトランスジェニックマウスに、１００μＭの各ペプチドの等モル混合物を含む１００μｌのペプチドの組み合わせＣ６とアジュバント（２５μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））とを用いて、側腹部皮下に４回（Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７およびＤ１４）ワクチン接種を行った。
【００６７】
腫瘍成長のモニタリング
腫瘍細胞の移植後、マウスの体重を毎日モニタリングし、腫瘍を７日目から開始して２〜３日毎に測定した。サイズを次の方法でｍｍ３で計算する：長さ×幅×深さ。統計的に有意な腫瘍成長差をｔ検定により計算し示す（＊ｐ＜０．０５）。
【００６８】
結果
ｐｐＣＴを発現する腫瘍を有するＨＬＡ−Ａ２分子のトランスジェニックマウスモデルにおいて、組み合わせＣ６によるワクチン接種は、ワクチン接種していないマウスと比較して有意な腫瘍成長の減少を誘導する。実際、２１日の終わりには、ワクチン接種した三匹中一匹のマウスが１９０ｍｍ３のサイズの腫瘍を有し、三匹の対照マウスは３５０ｍｍ３の平均サイズの腫瘍ができていた（図６）。
【００６９】
この結果は、ｐｐＣＴを発現する腫瘍に対して有効な免疫応答を生成する組み合わせＣ６によるワクチン接種の能力を示し、抗腫瘍免疫療法においてこれらの組み合わせを使用する利点を示す。
【００７０】
実施例５  組み合わせＣ６のみまたは抗ＰＤ−１と組み合わせた組み合わせＣ６によるヒト化マウスのワクチン接種
【００７１】
材料および方法
マウス、ヒト腫瘍移植およびヒトＰＢＭＣの移入。
生後３〜４週のＮＯＤ−ｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＳＧ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、Ｔリンパ球による腫瘍の浸潤および標的細胞と相互作用する能力を最適化するために炎症性細胞遊走因子ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）および接着分子ＩＣＡＭ−１で予めトランスフェクションし、ヌードマウス（Ｆｒａｎｃｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９，６９，６２４９−６２５５）に維持したヒト腫瘍細胞株ＩＧＲ−Ｈｅｕの移植により生成されたヒト腫瘍Ｈｅｕ−ｎＩＲを皮下移植した。それから１０日後に腫瘍が触知可能となったときに、抗原ペプチドｐｐＣＴに対するＣＤ８  Ｔ細胞の応答を誘導する能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで予め試験した健常同種異系ヒトドナーからの２．１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をマウスの尾に静脈内注入した。その後、Ｔ細胞の生存を促進するために組換えＩＬ−１５（３μｇ／マウス／日）を腹腔内投与した。
【００７２】
ペプチド
使用したペプチドは、
−  ＨＬＡ−Ａ拘束性エピトープを含むペプチドｐｐＣＴ９−１７、ｐｐＣＴ１６−２５およびｐｐＣＴ５０−５９と長鎖ペプチドｐｐＣＴ１−１５およびｐｐＣＴ８６−１００とからなる組み合わせＣ６、ならびに
−  組み合わせＣ６のペプチドを同様に含み、ＨＬＡ−Ｂ７拘束性の三つのペプチド：ｐｐＣＴ７−１５（配列番号１９）、ｐｐＣＴ４６−５４（配列番号２０）およびｐｐＣＴ７９−８８（配列番号２１）を含む、組み合わせＣ６ａ
である。
【００７３】
マウスの免疫化および腫瘍成長のモニタリング
Ｈｅｕ−ｎＩＲ腫瘍移植およびＰＢＭＣの養子移入を受けたＮＳＧマウスに、ＰＢＭＣの移入から一日後に、各ペプチドの等モル混合物とアジュバント（２５μｇのポリ（Ｉ：Ｃ））とを含む１００μｌのペプチドの組み合わせＣ６またはＣ６ａを用いて、一週間間隔で２回ワクチン接種した。組み合わせ療法のために、ワクチン接種したマウスを、ＰＢＭＣの移入の二日後から二日毎に、抗ｈＰＤ−１抗体（２２０ｍｇ／注入）または同じアイソタイプの対照抗体（２２０ｍｇの非関連ｈＩｇＧ４）で静脈内処置した。
【００７４】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ；ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）を回避するために３または４週間だけマウスの体重を毎日モニタリングし、腫瘍を２日毎に測定した。実験の最終日にマウスの屠殺前に血漿サンプルをとり、使用まで−８０℃で保存した。マウスを屠殺し、腫瘍を秤量した後、フローサイトメトリによる浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ；ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の分析のために分離した。並行して脾臓のサンプルをとり、ペプチドの組み合わせでのｅｘ  ｖｉｖｏ刺激の後にガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）を分泌する脾細胞の能力を試験した。
【００７５】
ＥＬＩＳＡ試験
ワクチン接種したマウスおよびワクチン接種していないマウスの血漿中ヒトＩＦＮ−γ濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ；ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標），ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造業者の推奨にしたがって測定した。すべてのサンプルをデュプリケートで測定した。
【００７６】
抗体および免疫蛍光分析
使用した抗体は、ヒトモノクローナル抗体抗ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ４４、ＰＤ−１、パーフォリン、グランザイムＢおよびＩＦＮ−γ、ならびにアイソタイプのマウスおよびウサギ対照（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）ならびにヒトモノクローナル抗体抗ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ヒトモノクローナル抗体抗ＰＤ−１および同じいずれかのタイプの非関連対照抗体でブロッキング実験を行った。これらの表現型分析は、ＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメータを用いて、直接免疫蛍光法によって行った。ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアを使用してデータを分析した。
【００７７】
統計分析
Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して統計分析を行った。異なる群からの結果を、独立サンプルのｔ検定を用いて比較する。両側試験でＰ＜０．０５の値が統計的に有意であると考えられる。
【００７８】
結果
プレプロカルシトニンの抗原ペプチドに基づくペプチドワクチンの抗腫瘍効果を、ヒト化マウスモデルＮＯＤ−ｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）で評価した。活性Ｔリンパ球の枯渇を逆転させ、癌に対するワクチンの有益な治療効果を有利に強化するために、この能動免疫療法戦略を臨床的に使用される抗ＰＤ１モノクローナル抗体と組み合わせた。ＮＳＧマウスに、Ｈｅｕ−ｎＩＲ腫瘍を移植後、健常ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーからのＰＢＭＣの養子移入を行い、それから組み合わせＣ６またはＣ６ａに基づくワクチンを単独で、またはＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて用いて免疫化した。
【００７９】
結果は、組み合わせ免疫療法によるヒト化マウスの処置により、単独療法のそれぞれよりもはるかに強い腫瘍成長に対する応答が誘導されることを示す（図７Ａ）。腫瘍成長の制御は、ワクチンまたは抗ＰＤｌ単独で処置したマウスと比較して、組み合わせ療法で処置したマウスの腫瘍の重量の減少と相関する（図７Ｂ）。
【００８０】
それから三つのマウス群によるヒトＩＦＮ−γの産生を評価して、腫瘍成長の減少が免疫応答の増加に関連するか否かを分析した。組み合わせ免疫療法で処置したマウスの血清では、各療法単独で処置したマウスと比較して、血漿中ヒトＩＦＮ−γ濃度の２倍の増加が検出された（図７Ｃ）。加えて、組み合わせ療法で処置したマウスの脾細胞の細胞内染色は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＦＮ−γ、グランザイムＢおよびパーフォリンをより高いレベルで発現することを示す（図７Ｄ）。これらの結果は、二つの単独療法と比較して、組み合わせ療法は腫瘍の成長を制御するためにより有効であり、この効果がＴ細胞のより有効な機能と相関することを示す。
【００８１】
試験したペプチドの二つの組み合わせ、すなわちＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドと長鎖ペプチドとを含む組み合わせＣ６（図７Ａおよび７Ｂ）、および組み合わせＣ６のペプチドに加えてＨＬＡ−Ｂ７拘束性ペプチドも含む組み合わせＣ６ａ（図８Ａおよび８Ｂ）により、組み合わせ療法の抗腫瘍効果を観察する。
【００８２】
組み合わせアプローチは、腫瘍成長の減少と相関する、ＣＤ８  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの分泌および活性Ｔ細胞による腫瘍の浸潤の増加を誘導する。したがって、組み合わせ療法は、ＣＤ８  Ｔ細胞免疫または従来の免疫療法を逃れた腫瘍を治療するための興味深い戦略である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｂ−３】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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