(57)【要約】  本発明は、ＥＧＦＲの遮断に耐性のある腫瘍の成長の阻害または減衰方法を提供し、該方法は、ＥＧＦＲの遮断に耐性があるか、または耐性になり得る腫瘍を有する対象に、ＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤及びＦＧＦＲ阻害剤、またはＥＧＦＲ阻害剤、ＦＧＦＲ阻害剤及びＥｒｂＢ３阻害剤を投与することを含む。ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、及び／またはＥｒｂＢ３の遮断は、標的特異的抗体もしくはその断片、小分子チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせを使用して達成され得る。【選択図】図１０
2018536682.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲの遮断に耐性のある腫瘍の成長の阻害または減衰方法であって、ＥＧＦＲ耐性腫瘍を有する対象にＥＧＦＲ阻害剤及びＦＧＦＲ阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、ＥＧＦＲの小分子チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦＲ阻害剤が、抗ＦＧＦＲ抗体またはその断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＧＦＲ阻害剤が、ＦＧＦＲの小分子チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＦＧＦＲ阻害剤が、ＦＧＦＲ３阻害剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象にＥｒｂＢ３阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥｒｂＢ３阻害剤が、抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥｒｂＢ３阻害剤が、ＥｒｂＢ３の小分子チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＧＦＲ小分子チロシンキナーゼ阻害剤が、エルロチニブＨＣＬ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、アファチニブ、カネルチニブ、ラパチニブ、ダコミチニブ、ＷＺ４００２、ＡＺＤ８９３１、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＧ−１４７８、ＰＤ１５３０３５、ＡＥＥ７８８、ＡＣ４８０、ＯＳＩ−４２０、ＷＺ３１４６、ＡＳＴ−１３０６、バルリチニブ、イコチニブ、ＴＡＫ−２８５、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＰＤ１６８３９３、ＣＮＸ−２００６、アファチニブジマレイン酸塩（ａｆａｔｉｎｉｂ  ｄｉｍａｌｅａｔｅ）、ＣＬ−３８７７８５、ポジオチニブ、オシメルチニブ、ＡＺ５１０４、または前述のうちのいずれかの組み合わせから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＦＧＦＲが、ＦＧＦＲ１であり、前記小分子チロシンキナーゼ阻害剤が、ポナチニブ、ＢＧＪ３９８、ニンテダニブ、ＰＤ１７３０７４、ドビチニブ、ＡＺＤ４５４７、ダヌセルチブ、ブリバニブ、ドビチニブ二乳酸、ＭＫ−２４６１、ブリバニブアラニネート、ＳＵ５４０２、ドビチニブ乳酸塩、ＣＨ５１８３２８４、ＬＹ２８７４４５５、または前述のうちのいずれかの組み合わせから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＦＧＦＲが、ＦＧＦＲ２であり、前記小分子チロシンキナーゼ阻害剤が、ＢＧＪ３９８、ニンテダニブ、ＡＺＤ４５４７、ＭＫ−２４６１、ＣＨ５１８３２８４、ＬＹ２８７４４５５、または前述のうちのいずれかの組み合わせから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＦＧＦＲ３小分子チロシンキナーゼ阻害剤が、ＢＧＪ３９８、ニンテダニブ、ドビチニブ、ＡＺＤ４５４７、ドビチニブ二乳酸、ＭＫ−２４６１、ドビチニブ乳酸塩、ＣＨ５１８３２８４、ＬＹ２８７４４５５、ＰＫＣ４１２、または前述のうちのいずれかの組み合わせから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＦＧＦＲが、ＦＧＦＲ４であり、前記小分子チロシンキナーゼ阻害剤が、ＢＧＪ３９８、ＢＬＵ９９３１、及びＬＹ２８７４４５５、または前述のうちのいずれかの組み合わせから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥｒｂＢ３小分子チロシンキナーゼ阻害剤が、サピチニブ、バルリチニブ、カネルチニブ、アムバチニブ、または前述のうちのいずれかの組み合わせから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＧＦＲの前記遮断に耐性のある前記腫瘍が、扁平上皮癌、腺癌、咽頭癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、脳癌、膀胱癌、または膵臓癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、２０１６年１２月９日に作成され、２，９３９バイトを含有するファイル１０２２０ＷＯ０１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータで読み取り可能な形式で提出された配列表を参照により組み込む。
【０００２】
本開示は、ＥＧＦＲ標的療法に対する腫瘍耐性を低減または予防するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
上皮成長因子受容体（「ＥＧＦＲ」）シグナル伝達の阻害剤は、複数のヒト癌の治療のために認可されている。例えば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、ＥＧＦＲキナーゼドメインに活性化突然変異を有する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者を治療するために使用されている（Ｐａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０４：１４９７−１５００、Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：１６９−１８１）。加えて、ＥＧＦＲへのリガンドの結合を遮断する抗体は、ＫＲＡＳ野生型結腸直腸癌（「ＣＲＣ」）及び頭頸部扁平上皮癌（「ＨＮＳＣＣ」）において使用される（Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５４：５６７−５７８、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５１：３３７−３４５、Ｊｏｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００７；３５７：２０４０−２０４８）。しかしながら、ＥＧＦＲ阻害剤の有効性は、他の標的療法と同様に、固有の耐性及び獲得された耐性の多重機構によって限定される（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｊａｎｎｅ（２０１３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９：１３８９−１４００、Ｍｉｓａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．１２６９−１２８０）。
【０００４】
ＥｒｂＢファミリーメンバーＥｒｂＢ３によるシグナル伝達は、近年、いくつかの腫瘍型における標的療法に対する耐性の顕著な機構として特定された（Ａｒｔｅａｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２５：２８２−３０３、Ｇａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０：１４１０−１４１６）。例えば、前臨床研究は、ＥｒｂＢ３抗体が、ＣＲＣ及びＨＮＳＣＣモデルにおいてＥＧＦＲ遮断の効果を増強し得ることを明示した（Ｇａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３：６０２４−６０３５、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３：８２４−８３３、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０：４７２−４８６、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１２：１２４５−１３５５、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１３：１８２６−１８３６）。ＥｒｂＢ３は、著しいチロシンキナーゼ活性を有しないが、他のＥｒｂＢファミリーメンバーとのヘテロ二量体化に続いてリン酸化される（Ａｒｔｅａｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）、Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．２００９  ９（７）：４６３−４７５）。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（「ＰＩ３Ｋ」）の調節サブユニットは、ＥｒｂＢ３細胞質ドメイン内の複数のホスホチロシン残基に動員され、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の強力な活性化をもたらす（Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：３７８８−３７９３、Ｈｏｌｂｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：８９３３−８９３８、Ｓｏｌｔｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：３５５０−３５５８）。ＣＲＣ及びＨＮＳＣＣモデルにおいて、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ２シグナル伝達は、恐らくはこの強力な生存経路の活性化を介して、ＥＧＦＲ遮断の効果を制限する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４））。ヒト癌におけるＥｒｂＢ３を遮断するための前臨床的根拠に基づき、いくつかの抗ＥｒｂＢ３抗体が、診療所で使用されている（Ｇａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）、ＬｏＲｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：３０７８−３０８７、Ｍｉｒｓｃｈｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３：５１８３−５１９４、Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．２：ｒａ３１）。
【０００５】
ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３の複合遮断は、腫瘍の治療において強力な効果を有し得るが、癌性細胞内の耐性機構は、インビボでのこの組み合わせの利益を制限する。したがって、癌におけるＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ３標的療法に対するインビボ耐性を克服するための新たな方法を開発する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腺癌、咽頭癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、膵臓癌、及び頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＳＣ）が挙げられるが、これらに限定されない様々な癌における、臨床的に検証された標的であり、予後指標である。ＥｒｂｉｔｕｘなどのＥＧＦＲ遮断抗体が、様々な癌の第一選択治療のために認可されている。それにもかかわらず、他の標的療法と同様に、ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ３抗体での治療などの治療レジメンに対する固有の耐性または獲得された耐性は、これらの癌療法の有効性を制限する。
【０００７】
本発明者は、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断に耐性となるある特定の癌細胞が、標的療法に対する耐性の内因性駆動因子として構成的に活性なＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現することを発見し、これらの融合タンパク質の機能的能力への洞察を提供する。本発明者の発見は、様々な癌におけるＦＧＦＲ３経路の重要性を強調し、ＥＧＦＲ及びＦＧＦＲの複合遮断などの他のタンパク質の複合遮断が、現在使用されている標的療法に対する癌細胞の耐性を回避し得る新たな療法を提供するであろうことを示す。この発見は、ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ３の複合遮断に耐性のある腫瘍の成長を阻害または減衰させる新たな方法をもたらした。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｃは、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断に耐性のあるＦａＤｕ細胞株の生成を示す。図１Ａは、ランダム化され、示された用量の対照抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＥｒｂＢ３遮断抗体（ＲＥＧＥＮ１４００）（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＦＲ遮断抗体（ＲＥＧＮ９５５）（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＲＥＧＮ１４００及びＲＥＧＮ９５５の組み合わせで連続して治療された、定着ＦａＤｕ腫瘍（体積約２００ｍｍ３）を担持するＳＣＩＤマウスを提示し、これは大幅な退縮を促進する（左パネル）。線グラフは、一連の治療にわたる平均腫瘍体積を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。移植後およそ１１０日目に再成長し始めたＲＥＧＮ１４００及びＲＥＧＮ９５５の組み合わせで治療したマウスにおける腫瘍（中間パネル）を採取し、腫瘍の断片をマウスに再移植した。ＲＥＧＮ１４００及びＲＥＧＮ９５５の組み合わせで感作されたときに急速に成長した腫瘍断片を採取し（右上パネルは、個々の再移植断片の成長を示す）、再移植及び治療手順を繰り返した。複合ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断下で急速に増殖する腫瘍を採取し（右下パネル）、それを使用して、本明細書においてＦａＤｕ  Ｖ２と称される細胞株を生成した。同様の手順を使用して、ＦａＤｕ  Ｖ１耐性細胞株を生成した。図１Ｂ及び１Ｃは、ＳＣＩＤマウスに移植されて腫瘍を生成した培養ＦａＤｕ  Ｖ１またはＶ２細胞の結果を示す。定着腫瘍を有するマウスをランダム化し、対照抗体またはＦｃタンパク質（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＲＥＧＮ１４００（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＲＥＧＮ９５５（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＲＥＧＮ１４００及びＲＥＧＮ９５５の組み合わせで週２回治療した。図１Ｂ及び１Ｃに示される線グラフは、一連の治療にわたる平均腫瘍体積を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２】ＲＥＧＮ１４００及びＲＥＧＮ９５５が、ＦａＤｕ変異体細胞株におけるそれぞれの標的を阻害することを示す。具体的には、図２は、０．５％のＦＢＳを含有する培地中で１時間血清を不足させた後、処理しなかったか、または対照抗体（１５μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ１４００（５μｇ／ｍＬ）、もしくはＲＥＧＮ９５５（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で、ＮＲＧ１（１ｎＭ）及びＥＧＦ（１ｎＭ）で３０分間処理した培養ＦａＤｕ  Ｖ１細胞（左パネル）及び培養ＦａＤｕ  Ｖ２細胞（右パネル）を示す。治療後、細胞溶解物を、ホスホ−ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３、ホスホ−ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｆは、ＥＦＧＲ／ＥｒｂＢ３遮断が、ＦａＤｕ耐性変異体細胞株におけるＥＲＫ活性化及び細胞成長を阻害することに失敗した証拠を提供する。図３Ａ〜３Ｃはそれぞれ、対照抗体（１５μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ１４００（５μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ９５５（１０μｇ／ｍＬ）、またはＲＥＧＮ１４００及びＲＥＧＮ９５５の組み合わせの存在下で７２時間成長させたＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞を示す。棒グラフは、ＭＴＳアッセイにより決定される、各治療群における相対細胞成長を示す。エラーバーは、標準偏差を示し、ｎ＝８である。細胞成長を、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を用いた一元配置分散分析によって比較した（＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示し、対照群との比較の場合、アスタリスクは、阻害が１５％超である場合のみ示される）。図３Ｄは、対照抗体（１０μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ１４００（５μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ９５５（１０μｇ／ｍＬ）、またはＲＥＧＮ１４００及びＲＥＧＮ９５５の組み合わせで２時間処理されたＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞を示す。処理後、細胞溶解物を、図示のとおりホスホ−ＡＫＴ、ＡＫＴ、ホスホ−ＥＲＫ、及びＥＲＫに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。図３Ｅは、対照抗体（５μｇ／ｍＬ）＋ビヒクル、ＲＥＧＮ１４００（５μｇ／ｍＬ）、ＭＥＫ阻害剤ＧＳＫ１１２０２１２（１００ｎＭ）、またはＲＥＧＮ１４００及びＧＳＫ１１２０２１２の組み合わせで２時間処理されたＦａＤｕ  Ｖ２細胞を示す。処理後、細胞溶解物を、図示のとおりホスホ−ＡＫＴ、ＡＫＴ、ホスホ−ＥＲＫ、及びＥＲＫに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。図３Ｆは、対照抗体（５μｇ／ｍＬ）＋ビヒクル、ＲＥＧＮ１４００（５μｇ／ｍＬ）、ＭＥＫ阻害剤ＧＳＫ１１２０２１２（１００ｎＭ）、またはＲＥＧＮ１４００及びＧＳＫ１１２０２１２の組み合わせの存在下で７２時間成長させたＦａＤｕ  Ｖ２細胞を示す。棒グラフは、ＭＴＳアッセイにより決定される、各処理群における相対細胞成長を示す。エラーバーは、標準偏差を示し、ｎ＝８である。細胞成長は、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を用いた一元配置分散分析によって比較した（＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す）。
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−２の続き。
【図３−４】図３−３の続き。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｆは、ＦＧＦＲ３が、ＦａＤｕ耐性変異体細胞株において活性化され、ＥＧＦＲ遮断時にＥＲＫシグナル伝達を維持する証拠を提供する。図４Ａは、下記の材料及び方法に記載されるように、ヒトホスホ−ＲＴＫアレイキットを用いて、４９ヒト受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のチロシンリン酸化を評価するために使用されたＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞から調製された溶解物を示す。注目すべき活性ＲＴＫは、枠で囲まれ、標識されている。膜の隅角の非標識スポットは、陽性対照である。図４Ｂは、ホスホ−ＭＥＴ、ＭＥＴ、及びアクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供されたＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞からの溶解物を示す。図４Ｃは、アガロースビーズに共役した抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０を用いた免疫沈降に供されたＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞からの溶解物を示す。免疫沈降におけるＦＧＦＲ３及びＳｒｃの存在を、ウェスタンブロットによって評価した。図４Ｄは、対照抗体（１０μｇ／ｍＬ）＋ビヒクル（標識対照）、ＲＥＧＮ９５５（１０μｇ／ｍＬ）、１００ｎＭのＰＨＡ６６５７５２（ＭＥＴチロシンキナーゼ阻害剤）、またはＲＥＧＮ９５５及びＰＨＡ６６５７５２の組み合わせを用いて３０分間処理されたＦａＤｕ  Ｖ２細胞を示す。処理後、細胞溶解物を、ホスホ−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ホスホ−ＭＥＴ、及びＭＥＴに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。図４Ｅは、ビヒクルで、または２５ｎＭのＡＺＤ４５４７、ｐａｎ−ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤で１時間処理されたＦａＤｕ  Ｖ２細胞を示す。処理後、細胞溶解物を、アガロースビーズに共役した抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０を用いた免疫沈降に供した。免疫沈降におけるＦＧＦＲ３及びＳｒｃの存在を、ウェスタンブロットによって評価した。図４Ｆは、対照抗体（１０μｇ／ｍＬ）＋ビヒクル（標識対照）、ＲＥＧＮ９５５（１０μｇ／ｍＬ）、２５ｎＭのＡＺＤ４５４７、またはＲＥＧＮ９５５及びＡＺＤ４５４７の組み合わせを用いて３０分間処理されたＦａＤｕ  Ｖ１またはＶ２細胞を示す。処理後、細胞溶解物を、ホスホ−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ホスホ−ＡＫＴ、及びＡＫＴに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図４−４】図４−３の続き。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｅは、構成的に活性なＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現するＦａＤｕ変異体細胞株を示す。図５Ａは、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞において特定されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の構造の図を示す。図５Ｂは、ＲＮＡ−ｓｅｑによって特定されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合接合部に隣接するプライマーを用いたＰＣＲに供されたＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞からの１００ｎｇのｃＤＮＡを示す（プライマー配列については、材料及び方法を参照されたい）。ｃＤＮＡの完全性についての対照として、シクロフィリン遺伝子の断片を全ての試料から増幅させた。ＰＣＲ反応のアリコートを、２％アガロースゲル（Ｍ、分子量マーカー）上で実行した。予想されるＰＣＲ産物は、１２２ｂｐ（Ｖ１細胞）及び９５ｂｐ（Ｖ２細胞）である。図５Ｃは、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合転写物に特異的なプライマー／プローブセットを使用するＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ分析に供されたＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞からのＲＮＡを示す（プライマー／プローブ配列については、材料及び方法を参照されたい）。各試料について、対照遺伝子シクロフィリンの閾値サイクル（Ｃｔ）値を、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合転写物のＣｔ値から減算して、デルタＣｔ（ΔＣｔ）値を得た。バーは、各試料について平均２−ΔＣｔを示す。エラーバーは、標準偏差を示し、ｎ＝３である。図５Ｄは、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物に存在するＴＡＣＣ３のＣ末端付近のエピトープを認識するＴＡＣＣ３抗体での免疫沈降に続いて、ＦＧＦＲ３またはＴＡＣＣ３についてウェスタンブロットに供されたＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞からの溶解物を示す。加えて、ＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞からの溶解物のアリコートを、直接ウェスタンブロットに供した（最後の３レーン）。ＦＧＦＲ３ウェスタンブロット抗体は、天然ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の両方を認識し、これらが上記の天然ＦＧＦＲ３をわずかに移動させる（タンパク質は、４％  ＳＤＳゲル上で分解して、天然ＦＧＦＲ３とＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質との間の分離を最大化する）。図５Ｅは、アガロースビーズに共役した抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０での免疫沈降に供されたＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞からの溶解物を左パネルに示す。免疫沈降におけるＴＡＣＣ３及びＳｒｃの存在を、ウェスタンブロットによって評価した。右側パネルにおいて、ＦａＤｕ  Ｖ２細胞からの溶解物を、アガロースビーズに共役した抗ホスホチロン抗体４Ｇ１０での免疫沈降に供した。免疫沈降の複数のアリコートを、単一ＳＤＳゲル上で実行した。ＦａＤｕ  Ｐ１親細胞からの溶解物もまた、天然ＦＧＦＲ３及びＴＡＣＣ３の移動を示すために実行した。転移後、ＰＶＤＦ膜を半分に切断し、ＦＧＦＲ３またはＴＡＣＣ３のいずれかについてウェスタンブロットを行った。膜の２つの半分を、シグナル発達及び露光のために１つに戻し、ＦＧＦＲ３及びＴＡＣＣ３抗体によって検出されたチロシン−リン酸化タンパク質の同一の移動を例証する。
【図５−２】図５−１の続き。
【図５−３】図５−２の続き。
【図５−４】図５−３の続き。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｅは、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質が、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断への耐性を促進する証拠を提供する。図６Ａは、空ベクター対照レンチウイルス、または安定した細胞株が生成されたＦａＤｕ変異体において特定された野生型ＦＧＦＲ３もしくはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードするレンチウイルスに感染した親ＦａＤｕ細胞を示す。細胞溶解物を調製し、ＦＧＦＲ３、ホスホ−ＦＧＦＲ、ＴＡＣＣ３、またはアクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。図６Ｂは、野生型ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現する親ＦａＤｕ細胞から調製され、アガロースビーズに共役した抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０での免疫沈降に供された溶解物を示す。免疫沈降におけるＦＧＦＲ３、ＴＡＣＣ３、及びＳｒｃの存在を、ウェスタンブロットによって評価した。図６Ｃは、対照抗体（１５μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ１４００（５μｇ／ｍＬ）、またはＲＥＧＮ９５５（１０μｇ／ｍＬ）で２時間処理された野生型ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質（Ｖ２細胞から）を発現する親ＦａＤｕ細胞を示す。細胞溶解物を調製し、ホスホ−ＥＲＫ及びＥＲＫに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。図６Ｄは、対照抗体（１５μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ１４００（５μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ９５５（１０μｇ／ｍＬ）、またはＲＥＧＮ１４００及びＲＥＧＮ９５５の組み合わせの存在下で７２時間成長させた野生型ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現する親ＦａＤｕ細胞を示す。棒グラフは、ＭＴＳアッセイにより決定される、各処理群における相対細胞成長を示す。エラーバーは、標準偏差を示し、ｎ＝８である。細胞成長を、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を用いた一元配置分散分析によって比較した（＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示し、対照群との比較の場合、アスタリスクは、阻害が１５％超である場合のみ示される）。図６Ｅは、野生型ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質（ＦａＤｕ  Ｖ２細胞から）を発現するか、またはＳＣＩＤマウスに移植された空ベクターで形質導入された親ＦａＤｕ細胞を示す。定着腫瘍を担持するマウスをランダム化し、対照抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ）で、またはＲＥＧＮ１４００（２．５ｍｇ／ｋｇ）及びＲＥＧＮ９５５（１０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせで週２回処理した。線グラフは、一連の処理にわたる平均腫瘍体積を描く。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図６−２】図６−１の続き。
【図６−３】図６−２の続き。
【図６−４】図６−３の続き。
【図７】野生型ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現するＦａＤｕ  Ｐ１細胞のホスホ−キナーゼアレイを示す。溶解物を、示される細胞株から調製した（空ベクター対照レンチウイルス、またはＦａＤｕ  Ｖ１もしくはＶ２細胞において特定された野生型ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードするウイルスで形質導入されたＦａＤｕ  Ｐ１細胞）。
【図８Ａ】ＦＧＦ１を過剰発現するように操作されたＦａＤｕ親細胞が、インビボでＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３の複合遮断に耐性があることを示す。図８Ａは、空ベクター対照ウイルスまたはヒトＦＧＦ１をコードするウイルスで形質導入されたＦａＤｕ親細胞を示し、これらを使用して安定した細胞株を調製した。細胞上清中の分泌ＦＧＦ１のレベルを、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのヒトＦＧＦ酸性Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを使用したＥＬＩＳＡによって決定した。
【図８Ｂ】ＦＧＦ１を過剰発現するように操作されたＦａＤｕ親細胞が、インビボでＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３の複合遮断に耐性があることを示す。図８Ｂは、ヒトＦＧＦ１を発現する親ＦａＤｕ細胞またはＳＣＩＤマウスに移植された空ベクターで形質導入された対照細胞を示す。定着腫瘍を担持するマウスをランダム化し、対照抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、またはＲＥＧＮ１４００（２．５ｍｇ／ｋｇ）及びＲＥＧＮ９５５（１０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせで週２回処理した。線グラフは、一連の処理にわたる平均腫瘍体積を描く。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｄは、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質が、ＦａＤｕ変異体細胞株の耐性表現型に必要とされることを示す。図９Ａは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ単独を発現するか（対照）、またはＦＧＦＲ３に特異的なＣａｓ９＋単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現する（ｓｇＲＮＡ１及び２は、ＦＧＦＲ３遺伝子内の別個の配列を標的とする）レンチウイルスに感染したＦａＤｕ  Ｖ１またはＶ２細胞を示す。感染後１０日目に、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のレベルをウェスタンブロットによって評価した。図９Ｂは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（対照）またはＣａｓ９ヌクレアーゼ及びＦＧＦＲ３  ｓｇＲＮＡ１を安定して発現するＦａＤｕ  Ｖ１またはＶ２細胞を、対照抗体（１０μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ１４００（５μｇ／ｍＬ）、またはＲＥＧＮ９５５（１０μｇ／ｍＬ）で２時間処理したことを示す。処理後、細胞溶解物を、ホスホ−ＥＲＫ及びＥＲＫに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。図９Ｃは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（対照）またはＣａｓ９ヌクレアーゼ＋ＦＧＦＲ３  ｓｇＲＮＡ１またはＦＧＦＲ３  ｓｇＲＮＡ２を安定して発現するＦａＤｕ  Ｖ１またはＶ２細胞を、対照抗体（１５μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ１４００（５μｇ／ｍＬ）、ＲＥＧＮ９５５（１０μｇ／ｍＬ）、またはＲＥＧＮ１４００＋ＲＥＧＮ９５５の組み合わせの存在下で７２時間成長させたことを示す。棒グラフは、ＭＴＳアッセイにより決定される、各処理群における相対細胞成長を示す。エラーバーは、標準偏差を示し、ｎ＝８である。細胞成長を、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を用いた一元配置分散分析によって比較した（＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示し、対照群との比較の場合、アスタリスクは、阻害が１５％超である場合のみ示される）。図９Ｄは、ＦａＤｕ変異体細胞株の耐性におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の役割を描くモデルを提示する。構成的に活性なＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合は、機能的にＥＧＦＲシグナル伝達に代わるＲＡＳ／ＲＡＦ／ＥＲＫ経路の強力な活性化を駆動する。
【図９−２】図９−１の続き。
【図９−３】図９−２の続き。
【図１０】ＦａＤｕ  Ｖ２細胞におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ媒介性不活性化が、長期間の培養時に成長遅延をもたらすことを示す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（対照）またはＣａｓ９ヌクレアーゼ及びＦＧＦＲ３、ｓｇＲＮＡ１またはＦＧＦＲ３  ｓｇＲＮＡ２を安定して発現するＦａＤｕＶ２細胞を、凡例に示される期間にわたって成長させた。棒グラフは、ＭＴＳアッセイにより決定されるように、対照群（値を１．０に設定）に対する各時点における生存細胞の数を示す。エラーバーは、標準偏差を示し、ｎ＝５である。細胞成長を、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を用いたＡＮＯＶＡによって比較した（＊＊＊は、対照に対してＰ＜０．００１を示す）。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｆは、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質が、変異ＰＩ３Ｋによってではなく、ＥＧＦＲによって駆動された癌細胞株における耐性を促進することを示す。図１１Ａは、野生型ＦＧＦＲ３、またはＦａＤｕ  Ｖ１もしくはＶ２細胞において特定されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現するＣａｌ２７細胞を、対照抗体（１５μｇ／ｍＬ）またはＲＥＧＮ１４００（５μｇ／ｍＬ）及びＲＥＧＮ９５５（１０μｇ／ｍＬ）の組み合わせの存在下で７２時間成長させた。棒グラフは、ＭＴＳアッセイにより決定される、各処理群における相対細胞成長を示す。エラーバーは、標準偏差を示し、ｎ＝８である。図１１Ｂは、野生型ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現するＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞を、ビヒクルまたは５０ｎＭのＥＧＦＲ  ＴＫＩ  ＡＺＤ９２９１、これらの細胞において発現されたＴ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ変異体を阻害する第三世代不可逆的ＴＫＩの存在下で７２時間成長させた。棒グラフは、ＭＴＳアッセイにより決定される、各処理群における相対細胞成長を示す。エラーバーは、ＳＤを示し、ｎ＝８である。図１１Ｃ〜１１Ｄはそれぞれ、ビヒクルまたは５μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤ＢＹＬ７１９の存在下で７２時間成長させた野生型ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現するＳＮＵ１０７６またはＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞を示す。棒グラフは、ＭＴＳアッセイにより決定される、各処理群における相対細胞成長を示す。エラーバーは、標準偏差を示し、ｎ＝８である。図１１Ｅは、野生型ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を安定して発現するＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２またはＳＮＵ１０７６細胞から調製され、ＦＧＦＲ３、ホスホ−ＦＧＦＲ、またはＴＡＣＣ３に対する抗体を用いたウェスタンブロットに供された細胞溶解物を示す。１１Ｆは、対照ＳＮＵ１０７６もしくはＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞、またはビヒクルもしくは５μＭのＢＹＬ７１９で６０分間処理されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を（ＦａＤｕ  Ｖ１から）発現する細胞を示す。細胞溶解物を調製し、ホスホ−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ホスホ−ＡＫＴ、またはＡＫＴに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１１−３】図１１−２の続き。
【図１１−４】図１１−３の続き。
【図１２】安定して形質導入された癌細胞株における野生型ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の発現及びリン酸化を示す。Ｃａｌ２７（経口腺扁平上皮癌）及びＮＣＩ−Ｈ１９７５（非小細胞肺癌）細胞を、空ベクター対照レンチウイルス、またはＦａＤｕ変異体及び安定した細胞株において特定された野生型ＦＧＦＲ３もしくはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードするレンチウイルスに感染させた。細胞溶解物を調製し、ＦＧＦＲ３、ホスホ−ＦＧＦＲ、またはＴＡＣＣ３に対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明を説明する前に、記載される特定の方法及び実験条件は異なり得るため、本発明が、そのような方法及び条件に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、限定的であると意図されないこともまた理解されたい。
【００１０】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値を参照して使用されるとき、その値が、列挙された値から１％以下だけ異なり得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」は、９９及び１０１、ならびにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
【００１１】
本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料が、本発明の試験の実施に使用され得るが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本明細書において言及される全ての特許、出願、及び非特許刊行物は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００１２】
６．１．抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び抗ＦＧＦＲ抗体
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む免疫グロブリン分子を指す。各重重は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）、及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）、及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領
域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。本発明の異なる実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系配列と同一であり得るか、または天然にもしくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」等という用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成の、または遺伝子的に操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質消化、または抗体可変ドメイン及び任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を伴う組み換え遺伝子操作技法などの任意の好適な標準技法を使用して、完全抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは既知であり、かつ／または例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成され得る。ＤＮＡを配列決定し、化学的にまたは分子生物学技法を使用することによって操作して、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／もしくは定常ドメインを好適な構成に配置するか、またはコドンを導入する、システイン残基を作成する、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失させる等が可能である。
【００１４】
「抗原結合断片」の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ′）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離相補性決定領域（ＣＤＲ））、または規制ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失した抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子もまた、本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という表現に包含される。
【００１５】
抗体の抗原結合断片は、典型的に、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であってよく、一般的に少なくとも１つのフレームワーク配列に隣接するか、またはそれを有するフレーム内に少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬと関連付けられたＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨ及びＶＬドメインは、任意の好適な配置において互いに相対的に位置してもよい。例えば、可変領域は、二量体であってよく、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ二量体を含有し得る。代替的に、抗体の抗原結合断片は、モノマーＶＨまたはＶＬドメインを含有し得る。
【００１６】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合断片内で見出され得る可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的な例示的構成としては、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬが挙げられる。上に列挙される例示的な構成のうちのいずれかを含む可変ドメイン及び定常ドメインのいずれの構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結され得るか、または完全もしくは部分的ヒンジもしくはリンカー領域によって連結され得る。ヒンジ領域は、少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０以上）のアミノ酸からなり得、これが単一ポリペプチド分子中の隣接する可変ドメイン及び／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性連結をもたらす。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いに及び／または１つ以上のモノマーＶＨもしくはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合（複数可）による）非共有会合で上に列挙される可変ドメイン構成及び定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
【００１７】
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的に少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合可能である。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体形式を含む任意の多重特異性抗体形式は、当該技術分野において利用可能なルーチン技法を使用して、本発明の抗体の抗原結合断片の文脈における使用のために適合され得る。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲにおいて、及び特定のＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によるか、またはインビボでの体細胞変異によって誘導された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「組み換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞に形質転換された組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体などの、組み換え手段によって調製、発現、作成、または単離された全てのヒト抗体（下でさらに記載される）、組み換え、複合ヒト抗体ライブラリから単離された抗体（下でさらに記載される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子にトランスジェニックである動物から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照されたい）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作成、または単離された抗体を含む。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組み換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物が使用される場合はインビボ体細胞変異誘発）に供され、したがって組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列に由来する一方で、インビボではヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然に存在しない場合がある。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「単離抗体」は、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定及び分離され、かつ／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するか、もしくは天然に産生される組織または細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的で「単離抗体」である。単離抗体はまた、組み換え細胞内の原位置に抗体も含む。単離抗体は、少なくとも１つの精製または単離ステップに供された抗体である。ある特定の実施形態によると、単離抗体は、他の細胞材料及び／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００２１】
「特異的に結合する」等の用語は、抗体またはその抗原結合断片が、生理的条件下で比較的安定している抗原と複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴等が挙げられる。例えば、本発明の文脈において使用される場合、ヒトＥＧＦＲまたはＦＧＦＲに「特異的に結合する」抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫＤを有するヒトＥＧＦＲもしくはＦＧＦＲまたはその一部分に結合する抗体を含む。（例えば、本明細書における実施例３を参照されたい）。しかしながら、ヒトＥＧＦＲまたはＦＧＦＲに特異的に結合する単離抗体は、他（非ヒト）からのＥｒｂＢ３分子などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「ＥＧＦＲ」または「ＥＧＦＲ断片」という表現は、非ヒト種に由来するものとして特定されない限り、ヒトＥＧＦＲタンパク質またはその断片を指す。ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインは、例えば、米国特許第９，１３２，１９２号の配列番号３８５のアミノ酸２５〜６４５に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ＥｒｂＢ３」及び「ＥｒｂＢ３断片」という表現は、非ヒト種に由来するものとして特定されない限り、ヒトＥｒｂＢ３タンパク質またはその断片を指す。ヒトＥｒｂＢ３の細胞外ドメインは、例えば、米国特許第８，７９１，２４４号に開示される配列番号４９７〜４９９のアミノ酸１〜６１３に示されるアミノ酸配列を有する。抗ＥｒｂＢ３抗体は、米国特許第８，７９１，２４４号号及び／または米国公開第２０１４／００７２５６３号に記載される抗体を含む。ＥｒｂＢ３は、ＨＥＲ３としても知られている。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ＦＧＦＲ」及び「ＦＧＦＲ断片」という表現は、非ヒト種に由来するものとして特定されない限り、ヒトＦＧＦＲタンパク質またはその断片を指す。本明細書で使用される場合、「ＦＧＦＲ」及び「ＦＧＦＲ断片」は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、もしくはＦＧＦＲ５、またはそれらの断片を指し得る。特定の実施形態では、「ＦＧＦＲ」または「ＦＧＦＲ断片」は、それぞれＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３の断片を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「ＥＧＦＲに結合する抗体」または「抗ＥＧＦＲ抗体」は、ＥＧＦＲタンパク質の可溶性断片（例えば、ＥＧＦＲの細胞外ドメインの一部分）に結合する抗体及びその抗原結合断片、ならびに／または米国特許第９，１３２，１９２号に記載される細胞表面発現ＥＧＦＲを含む。「細胞表面発現ＥＧＦＲ」という表現は、ＥＧＦＲタンパク質の少なくとも一部分が、細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボで細胞の表面上に発現されるＥＧＦＲタンパク質またはその部分を意味する。可溶性分子としては、例えば、米国特許第９，１３２，１９２号の実施例３に記載される単量体及び二量体ＥＧＦＲ構築物、またはそれに実質的に類似した構築物が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲ抗体は、米国特許第９，１３２，１９２号または米国公開第２０１４／００７２５６３号に記載される抗体である。様々な実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、米国公開第２０１４／００７２５６３号に記載される抗体のうちの１つ以上から選択される。特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ１Ｈ０８６Ｎ、Ｈ１Ｈ１０２Ｎ、Ｈ１Ｈ１３４Ｐ、Ｈ１Ｈ１４１Ｐ、Ｈ１Ｈ１４３Ｐ、Ｈ１Ｈ１４４Ｐ、Ｈ１Ｈ１４７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５９Ｐ、Ｈ１Ｈ１６１Ｐ、Ｈ１Ｈ１６３Ｐ、及びＨ１Ｈ１６９Ｐから選択される。特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈ１Ｈ１４１Ｐである。他の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（ＩｍＣｌｏｎｅ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｓ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ａｍｇｅｎ）、Ｔｈｅｒａｃｉｍ（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ，ＹＭ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（Ｉｍｃｌｏｎｅ）、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲ（Ｇｅｎｍａｂ）、ＥＭＤ７２０００（Ｔａｋａｄａ）、ＲＧ７１６０（Ｇｌｙｃａｒｔ，Ｒｏｃｈｅ）、ＡＢＴ−４１４（Ａｂｂｖｉｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ｍＡｂ８０６（Ａｂｂｏｔｔ，ＬＳＰ）、Ｐ１Ｘ（Ａｄｉｍａｂ，Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、ＧＴ−ＭＡＢ  ５．２−ＧＥＸ（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ）、及び（Ｊ２８９８Ａ（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）から選択される。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ＦＧＦＲに結合する抗体」または「抗ＦＧＦＲ抗体」は、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）タンパク質の可溶性断片（例えば、ＦＧＦＲの細胞外ドメインの一部分）に結合する抗体及びその抗原結合断片、ならびに／または細胞表面発現ＦＧＦＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ抗体は、ＦＧＦＲ１などの特定のＦＧＦＲに結合するが、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ３には結合しない。他の実施形態では、抗ＦＧＦＲ抗体は、１つより多くのＦＧＦＲに結合し、例えば、抗ＦＧＦＲ抗体は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に結合する。「細胞表面発現ＦＧＦＲ」という表現は、ＦＧＦＲタンパク質の少なくとも一部分が、細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボで細胞の表面上に発現されるＦＧＦＲタンパク質またはその部分を意味する。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ抗体は、ＦＧＦＲ３などの１種のＦＧＦＲに特異的に結合する。他の実施形態では、抗ＦＧＦＲ抗体は、１つより多くのＦＧＦＲ変異体、例えば、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ４等に結合する。様々なＦＧＦＲ抗体が、当該技術分野において既知である。代表的な抗ＦＧＦＲ１抗体は、ＷＯ２０１２／１５８７０４、ＵＳ２０１４／０１８７７５４、及びＵＳ９，０８５，６２６（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＵＳ８，２３６，０７４、ＷＯ２０１２／０１５６７４、及びＷＯ２００５／０３７２３５（Ｌｉｌｌｙ）、ならびにＵＳ８，４８７，０８３及びＷＯ２０１２／１０８７８２（Ｏｎｃｏｍａｘ）に開示されている。代表的な抗ＦＧＦＲ２抗体は、ＵＳ２０１４／０３２２２２０及びＷＯ２０１３／０７６１８６（Ｂａｙｅｒ）、ＵＳ２０１５／０１２５４５４及びＷＯ２０１３１５４２０６（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）に開示されている。代表的な抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＵＳ８，４０４，２４０、ＵＳ８，１８２，８１５、及びＵＳ８，０４３，６１８（ＩｍＣｌｏｎｅ）、ＵＳ８，７１０，１８９、ＵＳ８，４１０，２５０、及びＵＳ９，１６１，９７７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示されている。代表的な抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＵＳ２０１４／００３７６２４及びＷＯ２０１２／１３８９７５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＵＳ２０１１／０１５０９０３及びＷＯ２０１０／００４２０４（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＵＳ８，３９４，９２７及びＷＯ２００８／０２５７９６（Ｕ３  Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨ）、ならびにＷＯ２０１４／１０５８４９（Ｘｏｍａ）に開示されている。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ＥｒｂＢ３に結合する抗体」または「抗ＥｒｂＢ３抗体」は、ＥｒｂＢ３タンパク質の可溶性断片（例えば、ＥｒｂＢ３の細胞外ドメインの一部分）に結合する抗体及びその抗原結合断片、ならびに／または細胞表面発現ＥｒｂＢ３を含む。「細胞表面発現ＥｒｂＢ３」という表現は、ＥｒｂＢ３タンパク質の少なくとも一部分が、細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボで細胞の表面上に発現されるＥｒｂＢ３タンパク質またはその部分を意味する。いくつかの実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、ＥｒｂＢ３などの１種のＥｒｂＢに特異的に結合するが、ＥｒｂＢ２などの別のＥｒｂＢにはしない。他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ抗体は、ＥｒｂＢ３に、ならびにＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＭｅｔ、Ｈｅｒ４、及びＶＥＧＦを含むが、これらに限定されない別のタンパク質に結合する。様々な実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、ヒトＥｒｂＢ３に結合するニューレグリン１ｂ結合を遮断する。他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、細胞表面ＥｒｂＢ３を内在化する。さらに他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、Ａｋｔリン酸化を阻害する。さらなる実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、Ａ４３１類表皮癌細胞成長を阻害する。ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、米国特許第８，７９１，２４４号に記載されるものから選択される。さらなる実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、米国特許第８，７９１，２４４号に開示される、Ｈ４Ｈ１８１９Ｎ、Ｈ４Ｈ１８２１Ｎ、Ｈ４Ｈ２０８４Ｐ、Ｈ４Ｈ２０９２Ｐ、Ｈ４Ｈ２０９８Ｐ、Ｈ４Ｈ２１３２Ｐ、Ｈ４Ｈ２１３８Ｐ、Ｈ４Ｈ２１４８Ｐ、及びＨ４Ｈ２２９０Ｐが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
さらなる実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、ＥｒｂＢ３及びＡｋｔリン酸化を阻害する。代表的な抗ＥｒｂＢ３抗体は、ＷＯ２０１１／１４４７４９、ＵＳ２０１３／０１３６７４８、及びＥＰ２５７１９０１（Ａｂｌｙｎｘ  ＮＶ）、ＵＳ２０１３／０３３０７７２、ＵＳ２０１４／０２４２５９７、ＵＳ８，４８１，６８７、及びＷＯ２０１１／１３６９１１（ＡＶＥＯ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＵＳ９，１９２，６６３、ＵＳ８，７３５，５５１（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＷＯ２０１３／１４８３１５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＵＳ９，０８５，６２２（Ｇｌａｘｏ）、ＵＳ９，０３４，３２８（ＫＨＫ）、ＵＳ２０１４／０３６３４２９、ＷＯ２０１５／１５７６３４、ＷＯ２０１５／０４８００８、ＷＯ２０１３０７８１９１（Ｋｏｌｌｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ＵＳ８８５９７３７、ＵＳ９１８０１８５（Ｒｏｃｈｅ  Ｇｌｙｃａｒｔ，Ｒｏｃｈｅ）、ＵＳ９，１２７，０６５（Ｍｉｌｌｅｇｅｎ）、ＵＳ２０１３／０２２４２２０（Ｍｅｄｉａｐｈａｒｍａ  Ｓ．Ｒ．Ｌ．）、ＵＳ７，７０５，１３０（Ａｍｇｅｎ，Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ，Ｕ３  Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨ）、ＷＯ２０１５／０４９３５５（Ｒｏｃｈｅ）、ＷＯ２０１３／０１６７１４（Ｓｅａ  Ｌａｎｅ）、ＵＳ８，８９５，００１、ＵＳ８，９６１，９６６、ＵＳ８，６９１，２２５（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＵＳ２０１４／０１２００９２（Ｓｏｒｅｎｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ＵＳ２０１３／０２８７６８４、ＵＳ９，１５５，８０２（Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ  Ａ／Ｓ）、ＵＳ２０１４／００１７２５９（Ｔａｋｉｓ）、ＵＳ８，８２８，３８８、ＵＳ８，３６２，２１５（Ｔｒｅｌｌｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に開示されている。ＥｒｂＢ３及びＥＧＦＲの両方に結合する代表的な多重特異性抗体は、ＵＳ８，５９７，６５２、ＵＳ２０１４／００５６８９９（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＵＳ８，３２９，８７３、ＵＳ８，５８０，２６３（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ）、及びＷＯ２０１５／１３０１７２（Ｍｅｒｕｓ）に開示されている。ＥｒｂＢ３及びＨＥＲ２／ｎｅｕの両方に結合する代表的な多重特異性抗体としては、ＵＳ８，９８０，２５８（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ）、ＷＯ２０１５／１３０１７３（Ｍｅｒｕｓ）、ＵＳ２０１４／００７９７０３７、ＵＳ７，８４６，４４０（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＷＯ２０１５／１７３２４８（Ｒｏｃｈｅ）、ＷＯ２０１５／０６６５４３（Ｕ．Ｔｅｘａｓ）、及びＷＯ２０１４／１８２９７０（Ｚｙｍｅｕｓ）が挙げられる。ＥｒｂＢ３及びＩＧＦ−１Ｒに結合する代表的な多重特異性抗体としては、ＵＳ８，４７６，４０９、ＵＳ２０１２／０２４４１６３、及びＷＯ２０１５／１３０５５４（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．／Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。ＥｒｂＢ３及びｃＭｅｔに結合する代表的な多重特異性抗体としては、ＵＳ２０１５／０３２２１６５及びＵＳ２０１５／０２１０７６６（Ｓａｍｓｕｎｇ）が挙げられる。
【００２９】
本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ３抗体、及び／または抗ＦＧＦＲ抗体を含む。ある特定の実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾が有用であり得るか、または例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるために、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体が有用であり得る。例えば、Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照されたい。他の実施形態では、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために、ガラクトシル化の修飾が行われ得る。
【００３０】
様々な実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能し得る。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下で本明細書に記載の方法で使用される抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、ナチュラルキラー細胞、好中球、及びマクロファージなどのＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞、すなわち癌細胞上の結合抗体を認識し、それによりその細胞の溶解をもたらす細胞媒介性反応を指す。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当該技術分野において既知のアッセイにより測定され得る。例えば、米国特許第５，５００，３６２号及び同第５，８２１，３３７号、ならびにＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６を参照されたい。本明細書に記載される抗体の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいか否かに基づいて選択され得る。
【００３１】
本明細書に記載の方法に開示される抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ３抗体、及び／または抗ＦＧＦＲ抗体は、抗体が由来する対応する生殖細胞系配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公用抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系配列と比較することによって容易に確認され得る。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗体、及びその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖細胞系配列の対応する残基（複数可）に、または別のヒト生殖細胞系配列の対応する残基（複数可）に、または対応する生殖細胞系残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異される（そのような配列変化は、本明細書において集合的に「生殖細胞系変異」と称される）。当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列で開始して、１つ以上の個々の生殖細胞系変異またはそれらの組み合わせを含む、多くの抗体及び抗原結合断片を容易に生成することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨ及び／またはＶＬドメイン内のフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基の全ては、抗体が由来する元の生殖細胞系配列に見出される残基に変異される。他の実施形態では、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内、またはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見出される変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見出される変異残基のみが、元の生殖細胞系配列に変異される。他の実施形態では、フレームワーク及び／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの１つ以上は、異なる生殖細胞系配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖細胞系配列とは異なる生殖細胞系配列）の対応する残基（複数可）に変異される。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の２つ以上の生殖細胞系変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基が、特定の生殖細胞系配列の対応する残基に変異される一方で、元の生殖細胞系配列とは異なる、ある特定の他の残基が維持されるか、または異なる生殖細胞系配列の対応する残基に変異される。一旦得られると、１つ以上の生殖細胞系変異を含有する抗体及び抗原結合断片は、改善された結合特異性、増加した結合親和性、改善または強化されたアンタゴニストまたはアゴニスト生物学的特性（場合によって）、低減した免疫原性等の１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般方法において得られる抗体及び抗原結合断片は、本発明に包含される。
【００３２】
様々な実施形態では、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、及び／またはＦＧＦＲ抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む、ヒト抗体である。本明細書に記載の方法で使用されるヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基、例えばインビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって、例えばＣＤＲにおいて誘導された変異を含む。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という句は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。本明細書に記載の方法で使用するためのヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連する２つの形態で存在し得る。したがって、いくつかの実施形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持される、およそ１５０〜１６０ｋＤａの安定した４鎖構築物を含む。他の実施形態では、第２の形態において、二量体は、鎖間ジスルフィド結合を介して結合されず、共有結合された軽鎖及び重鎖（半抗体）からなる約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される。特定の実施形態では、４鎖構築物及び半抗体の両方が、治療組成物中に存在する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「中和」または「遮断」抗体は、その標的に結合する抗体を指すよう意図され、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、またはＦＧＦＲは、（ｉ）ＥＧＦＲもしくはＥＧＦＲ断片とＥＧＦＲリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α）との間の相互作用に干渉するか、またはＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ３断片とＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリン、及びＮＲＧ−２）との間の相互作用を干渉するか、またはＦＧＦＲもしくはＦＧＦＲ断片とＦＧＦＲリガンドとの間の相互作用を干渉し、かつ／または（ｉｉ）ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、もしくはＦＧＦＲの少なくとも１つの生物学的機能の阻害をもたらす。ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、またはＦＧＦＲ中和または遮断抗体によって引き起こされる阻害は、適切なアッセイを使用して検出可能な限り完全である必要はない。
【００３４】
ポリペプチドに適用されるように、「実質的類似性」または「実質的に類似の」という用語は、例えばデフォルトのギャップ重量を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列されるとき、２つのペプチド配列が、少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも約９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖を有する別のアミノ酸残基（Ｒ基）によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能性特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性のパーセントまたは類似性の程度を上方調整して、置換の保存的性質を補正することができる。これらの調整を行うための様々な手段は、Ｐｅａｒｓｏｎ（水）１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１に見出すことができる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、当業者に既知であり、米国特許第９，１３２，１９２号及びＧｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３３−１４４５に記載されている。ポリペプチドの配列類似性（または配列同一性）は、典型的に、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられる類似性の尺度、例えば、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して測定される。
【００３５】
抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び抗ＦＧＦＲ抗体、ならびにその抗原結合断片はそれぞれ、例えば、米国特許９，１３２，１９２号の実施例３に記載されるアッセイ形式を使用した表面プラズモン共鳴により測定して、約２０ｐＭ未満のＫＤを有する二量体ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、またはＦＧＦＲに結合する、高い親和性を有する単量体または二量体ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、またはＦＧＦＲに結合する。様々な実施形態では、表面プラズモン共鳴により測定して、約１５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約８ｐＭ未満、約６ｐＭ未満、約４ｐＭ未満、約２ｐＭ未満、または約１ｐＭ未満のＫＤを有する抗体または抗原結合断片は、二量体ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、またはＦＧＦＲに結合する。他の好適な抗体としては、表面プラズモン共鳴により測定して、約２００分超、表面プラズモン共鳴により測定して、約２１０分超、約２２０分超、約２５０分超、約２６０分超、約２８０分超、約３００分超、約３２０分超、約３４０分超、約３６０分超、約３８０分超、約４００分超、約４５０分超、約５００分超、約５５０分超、約６００分超、約６５０分超、約８００分超、約１０００分以上のｔ１／２を有する二量体ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、またはＦＧＦＲに結合する、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、またはＦＧＦＲ抗体及びその抗原結合断片が挙げられる。
【００３６】
様々な実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合断片、ならびに／または抗ＦＧＦＲ抗体及びその抗原結合断片、ならびに／または抗ＥｒｂＢ３抗体はそれぞれ、ＥＧＦＲ発現及び／またはＦＧＦＲ発現及び／またはＥｒｂＢ３発現腫瘍細胞の成長を阻害する。加えて、本発明はまた、それぞれＥＧＦＲ及び／またはＦＧＦＲ及び／またはＥｒｂＢを発現する細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する、抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合断片、任意の抗ＥｒｂＢ３抗体及びその抗原結合断片、ならびに抗ＦＧＦＲ抗体及びその抗原結合断片を含む。さらに、本発明は、米国特許第９，１３２，１９２号に記載されるＡＤＣＣアッセイにおいて測定して、約２５％超の最大細胞殺滅率、例えば約３０％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％以上の最大細胞殺滅率をもたらす、抗ＥＧＦＲ抗体及び／または抗ＦＧＦＲ抗体及び／またはＥｒｂＢ３抗体を含む。
【００３７】
様々な実施形態では、本発明は、インビトロまたはインビボで腫瘍成長を阻害する抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合断片、ならびに／またはＥｒｂＢ２抗体及び／またはその抗原結合断片、ならびに／または抗ＦＧＦＲ抗体及びその抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、腫瘍退縮または収縮を引き起こす。様々な実施形態では、抗体及びその抗原結合断片は、単独で、または組み合わせで、対照抗体よりも５０％超、例えば約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上腫瘍細胞成長を阻害する。
【００３８】
本発明の抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び抗ＦＧＦＲ抗体、ならびに抗体断片は、記載される抗体のものとは異なるが、それぞれＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、及びＦＧＦＲに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異体抗体及び抗体断片は、親配列と比較したとき、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載される抗体のものと本質的に同等である生物学的活性を呈する。２つの抗原結合タンパク質、または抗体は、例えば同様の実験条件下、同じモル用量で、単一用量または複数用量のいずれかで投与されたとき、吸収の速度及び程度が著しい差異を示さない薬学的同等物または薬学的代替物である場合、生物学的に同等であるとみなされる。
【００３９】
抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び抗ＦＧＦＲ抗体はまた、多重特異性抗体も含む。様々な実施形態では、抗ＥＧＦＲ及び／または抗ＥｒｂＢ３及び／または抗ＦＧＦＲ抗体は、それらが１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または１つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得ることにおいて多重特異性であり得る。したがって、多重特異性抗体または抗体断片は、ＥＧＦＲに特異的な免疫グロブリンの１つのアーム、及びＦＧＦＲに特異的な免疫グロブリンの第２のアーム、すなわちＦＧＦＲ３などを有し得る。例示的な二重特異性抗体形式は、米国特許第９，１３２，１９２号に見出され得る。
【００４０】
様々な実施形態では、本発明は、細胞傷害性薬剤、化学療法薬、または放射性同位体などの治療的部分に複合された抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片、及び／または細胞傷害性薬剤、化学療法薬、または放射性同位体などの治療的部分に複合された抗ＥｒｂＢ３抗体またはその抗原結合断片、及び／または細胞傷害性薬剤、化学療法薬、または放射性同位体などの治療的部分に複合された抗ＦＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片を含む抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を提供する。
【００４１】
細胞傷害性薬剤としては、細胞の成長、生存力、または繁殖に有害な任意の薬剤が挙げられる。本発明の態様に従って抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び／または抗ＦＧＦＲ抗体に複合され得る好適な細胞傷害性薬剤及び化学療法剤の例としては、例えば、１−（２クロロエチル）−１，２−ジメタンスルホニルヒドラジド、１，８−ジヒドロキシ−ビシクロ［７．３．１］トリデカ−４，９−ジエン−２，６−ジイン−１３−オン、１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、９−アミノカンプトテシン、アクチノマイシンＤ、アマニチン、アミノプテリン、アングイジン、アントラシクリン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、オーリスタチン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチル酸、カリケアミシン、カンプトテシン、カルミノマイシン、カルムスチン、セマドチン、シスプラチン、コルチシン、コンブレタスタチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デカルバジン、ジアセトキシペンチルドキソルビシン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ジソラゾール、ドラスタチン（例えば、ドラスタチン１０）、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、エチノマイシン、エリュテロビン、エメチン、エポチロン、エスペラミシン、エストラムスチン、臭化エチジウム、エトポシド、フルオロウラシル、ゲルダナマイシン、グラミシジンＤ、グルココルチコイド、イリノテカン、キネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）阻害剤、レプトマイシン、ロイロシン、リドカイン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、マイタンシノイド、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトプテリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、ミトマイシン、ミトキサントロン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、ポドフィロトキシン、プロカイン、プロプラノロール、プテリジン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、リゾキシン、ストレプトゾトシン、タリソマイシン、タキソール、テノポシド、テトラカイン、チオエパクロラムブシル、トメイマイシン、トポテカン、チューブリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及び前述のうちのいずれかの誘導体が挙げられる。特定の実施形態によれば、抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び／または抗ＦＧＦＲ抗体に複合された細胞傷害性薬剤は、ＤＭ１もしくはＤＭ４などのメイタンシノイド、トマイマイシン誘導体、またはドラスタチン誘導体である。特定の実施形態によれば、抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び／または抗ＦＧＦＲ抗体に複合された細胞傷害性薬剤は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦなどのオーリスタチン、またはその誘導体である。例えば、リシン、Ｃ．ディフィシル毒素、シュードモナス外毒素、リシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ブリオジン、サポリン、ヨウシュヤマゴボウ毒素（すなわち、フィトラカトキシ及びフィトラッキゲニン）などのタンパク質毒素、及びＳａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １３８：４５２−４６９に記載されるものなどのその他を含む、当該技術分野で既知の他の細胞傷害性薬剤が、本発明の範囲内で企図される。
【００４２】
本発明はまた、１つ以上の放射性核種に複合された抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び／または抗ＦＧＦＲ抗体を含む、抗体／放射性核種複合体（ＡＲＣ）を含む。本発明のこの態様の文脈において使用され得る例示的な放射性核種としては、例えば、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２２７Ｔｈ、２２２Ｒｎ、２２３Ｒａ、２２４Ｒａ、及び９０Ｙが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明のある特定の実施形態では、リンカー分子を介して細胞傷害性薬剤（例えば、上に開示される細胞傷害性薬剤のうちのいずれか）に複合された抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び／または抗ＦＧＦＲを含むＡＤＣが提供される。当該技術分野で既知の任意のリンカー分子またはリンカー技術を使用して、本発明のＡＤＣを作成または構築することができる。ある特定の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。他の実施形態によれば、リンカーは、切断可能でないリンカーである。本発明の文脈において使用され得る例示的なリンカーとしては、例えば、ＭＣ（６−マレイミドカプロイル）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ−ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、ｖａｌ−ａｌａ（バリン−アラニン）、プロテアーゼ切断可能なリンカーにおけるジペプチド部位、ａｌａ−ｐｈｅ（アラニン−フェニルアラニン）、プロテアーゼ切断可能なリンカーにおけるジペプチド部位、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート）、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート）、ならびにそれらの変異体及び組み合わせを含むか、またはそれからなるリンカーが挙げられる。本発明の文脈において使用され得るリンカーの追加の例は、例えば、ＵＳ７，７５４，６８１及びＤｕｃｒｙ（２０１０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２１：５−１３、及びそこに引用される参考文献において開示され、それらの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
本発明は、リンカーが抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び／または抗ＦＧＦＲ抗体または抗原結合分子を、抗体または抗原結合分子内の特定のアミノ酸における付着によって薬物または細胞毒素に接続するＡＤＣを含む。本発明の態様の文脈において使用され得る例示的なアミノ酸付着としては、例えば、リジン（例えば、ＵＳ５，２０８，０２０、ＵＳ２０１０／０１２９３１４、Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１９：３５８−３６１、ＷＯ２００５／０８９８０８、ＵＳ５，７１４，５８６、ＵＳ２０１３／０１０１５４６、及びＵＳ２０１２／０５８５５９２を参照されたい）、システイン（例えば、ＵＳ２００７／０２５８９８７、ＷＯ２０１３／０５５９９３、ＷＯ２０１３／０５５９９０、ＷＯ２０１３／０５３８７３、ＷＯ２０１３／０５３８７２、ＷＯ２０１１／１３０５９８、ＵＳ２０１３／０１０１５４６、及びＵＳ７，７５０，１１６を参照されたい）、セレノシステイン（例えば、ＷＯ２００８／１２２０３９、及びＨｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（２０１３）１１０：４６−５１、及びＲａｂｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１２）１０：１０５２−１０６７を参照されたい）、非天然アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１３／０６８８７４及びＷＯ２０１２／１６６５５９を参照されたい）、及び酸性アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１２／０５９８２を参照されたい）が挙げられる。リンカーもまた、炭水化物（例えば、ＵＳ２００８／０３０５４９７、ＷＯ２０１４／０６５６６１、及びＲｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ＆Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１３：１２７−１３０を参照されたい）及びジスルフィドリンカー（例えば、ＷＯ２０１３／０８５９２５、ＷＯ２０１０／０１０３２４、ＷＯ２０１１／０１８６１１、及びＳｈａｕｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００６）２：３１２−３１３を参照されたい）への付着を介して抗原結合タンパク質に共役され得る。
【００４５】
ある特定の実施形態によれば、本発明は、ＡＤＣを提供し、本明細書に記載される抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び／または抗ＦＧＦＲ抗体は、２０１４年３月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／２９７５７号（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、リンカー薬物組成物（例えば、本明細書では「Ｍ００２６」とも称される化合物「７」）に共役される。
【００４６】
化学部分をペプチド、ポリペプチド、または他の巨大分子に共役するための当該技術分野において既知の任意の方法を、本発明の文脈において使用して、抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、及び／または抗ＦＧＦＲ  ＡＤＣを作製することができる。これらの方法に関する変形は、当業者によって理解され、本発明の範囲内で企図される。
【００４７】
本明細書に記載の抗体及びＡＤＣは、当該技術分野において既知の任意の方法によって作製され得る。特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ及び／または抗ＥｒｂＢ３及び／または抗ＦＧＦＲ抗体は、米国特許第９，１３２，１９２号、米国特許第８，７９１，２４４号、及び米国公開第２０１４／００７２５６３号に開示される方法によって作製され、ＡＤＣは、ＰＣＴ／ＵＳ１４／２９７５７に記載の方法によって作製される。
【００４８】
６．２．小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）
「小分子ＦＧＦＲ阻害剤」は、１つ以上のＦＧＦＲ、例えばＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼに結合する小分子を指す。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ１であり、小分子阻害剤は、ポナチニブ、ＢＧＪ３９８、ニンテダニブ、ＰＤ１７３０７４、ドビチニブ、ＡＺＤ４５４７、ダヌセルチブ、ブリバニブ、ドビチニブ二乳酸、ＭＬ−２４６１、ブリバニブアラニネート、ＳＵ５４０２、ドビチニブ乳酸塩、ＣＨ５１８３２８４、及びＬＹ２８７４４５５から選択される。特定の実施形態では、阻害剤は、ＦＧＦＲ３チロシンキナーゼを阻害し、ポナチニブ、ＢＧＪ３９８、ニンテダニブ、ＰＤＩ１７３０７４、ドビチニブ、ドビジニブ乳酸塩、ＳＵ５４０２、ＢＬＵ９９３１、ＡＺＤ４５４７、ＣＨ５１８３２８４、ダヌセルチブ、ＬＹ２８７４４５５、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ、及びＭＫ−２４６１から選択される。他の実施形態では、ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ２であり、小分子阻害剤は、ＢＧＪ３９８、ニンテダニブ、ＡＺＤ４５４７、ＭＬ−２４６１、ＣＨ５１８３２８４、及びＬＹ２８７４４５５から選択される。さらに他の実施形態では、ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ３であり、小分子阻害剤は、ＢＧＪ３９８、ニンテダニブ、ドビチニブ、ＡＺＤ４５４７、ドビチニブ二乳酸、ＭＫ−２４６１、ドビチニブ乳酸塩、ＣＨ５１８３２８４、ＬＹ２８７４４５５、及びＰＫＣ４１２から選択される（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：８２５９−８２６７を参照されたい）。さらに他の実施形態では、ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ４であり、小分子阻害剤は、ＢＧＪ３９８、ＢＬＵ９９３１、及びＬＹ２８７４４５５、または前述のうちのいずれかの組み合わせから選択される。
【００４９】
「小分子ＥＧＦＲ阻害剤」という表現は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼに結合する小分子を指す。特定の実施形態では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブ、ＨＣＬ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、アファチニブ、カネルチニブ、ラパチニブ、ダコミチニブ、ＷＺ４００２、ＡＺＤ８９３１、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＧ−１４７８、ＰＤ１５３０３５、ＡＥＥ７８８、ＡＣ４８０、ＯＳＩ−４２０、ＷＺ３１４６、ＡＳＴ−１３０６、バルリチニブ、イコチニブ、ＴＡＫ−２８５、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＰＤ１６８３９３、ＣＮＸ−２００６、アファチニブジマレイン酸塩（ａｆａｔｉｎｉｂ  ｄｉｍａｌｅａｔｅ）、ＣＬ−３８７７８５、ポジオチニブ、オシメルチニブ、ＡＺ５１０４、または前述のうちのいずれかの組み合わせから選択される。
【００５０】
「小分子ＥｒｂＢ３阻害剤」という表現は、ＥｒｂＢ３のチロシンキナーゼに結合する小分子を指す。特定の実施形態では、ＥｒｂＢ３チロシンキナーゼ阻害剤は、ＡＺＤ８９３１（サピチニブ）、バルリチニブ、カネルチニブ、及びアムバチニブから選択されるが、これらに限定されない。
【００５１】
様々な実施形態では、小分子チロシンキナーゼ阻害剤またはチロシンキナーゼ阻害剤は、他の小分子チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用され得る。他の実施形態では、小分子チロシンキナーゼ阻害剤は、本明細書に記載される１つ以上の抗体と共に使用され得る。当業者であれば、小分子ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、及び／またはＥｒｂＢ３チロシンキナーゼ阻害剤がまた、他のチロシンキナーゼを阻害することができ（例えば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、ＥｒｂＢ１チロシンキナーゼを阻害し得る）、治療レジメンのための１つ以上の阻害剤を選択するときにそれを考慮することを理解するであろう。
【００５２】
６．３．治療製剤及び投与
本発明は、抗ＦＧＦＲ抗体、特定の実施形態では抗ＦＧＦＲ３抗体、及び抗ＥＧＦＲ抗体、またはそれらの抗原結合断片を含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体は、同じ組成物中にある。他の実施形態では、抗ＦＧＦＲ抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体は、異なる組成物中にある。本発明の薬学的組成物は、好適な担体、賦形剤、及び改善された輸送、送達、耐性等をもたらす他の薬剤と共に製剤化される。多数の適切な製剤は、全ての薬学的化学において既知の処方集、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出され得る。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡ共役体、無水吸収ペースト、水中油及び油中水乳剤、乳剤カルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。また、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．″Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ″ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１を参照されたい。
【００５３】
患者に投与されるＥＧＦＲ及び／またはＦＧＦＲ抗体の用量は、患者の年齢及びサイズ、標的疾患、病態、投与経路等に応じて異なり得る。好ましい用量は、典型的に、体重または体表面積に従って算出される。本発明の抗体が、成体患者におけるＥＧＦＲ及び／またはＦＧＦＲ活性に関連した病態または疾患を治療するために使用されるとき、本発明の抗体を、通常は体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約２０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇの単回用量で静脈内投与することが有利であり得る。病態の重症度に応じて、治療の頻度及び期間が調整され得る。抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＦＧＦＲ抗体を投与するための有効投与量及びスケジュールは、経験的に決定されてもよく、例えば、患者の進行を定期的評価によって監視することができ、それに従って用量が調整される。さらに、当該技術分野において周知の方法を使用して、投与量の種間スケーリングを行うことができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
【００５４】
様々な送達系、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することができる組み換え細胞におけるカプセル化、受容体媒介性エンドサイトーシスが既知であり、本発明の薬学的組成物を投与するために使用され得る（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照）。導入の方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜下、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、任意の便利な経路によって、例えば、注射またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚の内側（例えば、経口粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通じた吸収によって投与されてよく、他の生物学的活性剤と共に投与され得る。投与は、全身性または局所性であり得る。
【００５５】
本発明の薬学的組成物は、標準的な針及びシリンジで皮下的または静脈内的に送達され得る。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の送達において、容易に用途を見出す。そのようなペン型送達デバイスは、再利用可能であるか、または使い捨てであり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、一般的に、薬学的組成物を含有する交換式のカートリッジを利用する。一旦カートリッジ内部の薬学的組成物の全てが投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは、容易に廃棄され得、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと交換され得る。次いで、ペン型送達デバイスが再利用され得る。使い捨てペン型送達デバイスには、交換式のカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、薬学的組成物で事前に充填され、デバイス内部のリザーバ内に保たれる。一旦リザーバの薬学的組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
【００５６】
多数の再利用可能なペン型及び自動注入装置送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達において用途を見出す。例としては、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下送達において用途を見出す使い捨てペン送達デバイスの例としては、ほんの数例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫＴＭ自動注入装置（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴＴＭ（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、及びＨＵＭＩＲＡＴＭペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
ある特定の状況では、薬学的組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプが使用されてもよい（Ｌａｎｇｅｒ，上記、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態では、制御放出系は、組成物の標的に近接して配置され得るため、全身用量の一部分のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照されたい）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による批評において論じられる。
【００５８】
注入可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、及び筋肉内注入、点滴等の投与形態を含み得る。これらの注入可能な調製物は、公的に既知の方法によって調製され得る。例えば、注入可能な調製物は、例えば、注入に従来使用される無菌水性媒体または油性媒体において上述される抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化させることによって調製され得る。注入用の水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張溶液等が存在し、これらは例えばアルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、水素化ヒマシ油のＨＣＯ−５０（ポリオキシエチレン（５０モル）付加物］等の適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体として、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、これらは例えばベンジル安息香酸塩、ベンジルアルコール等の可溶化剤と組み合わせて使用され得る。したがって、調製された注入液は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【００５９】
有利に、上述の経口または非経口使用のための薬学的組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量で剤形に調製される。単位用量でのそのような剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、注入液（アンプル）、坐薬等が挙げられる。含有される前述の抗体の量は、一般的に、単位用量での剤形当たり約５〜約５００ｍｇ、特に注入液の形態では、前述の抗体は、約５〜約１００ｍｇで、また他の剤形の場合は約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【００６０】
当業者であれば、いくつかの実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＦＧＦＲ抗体が同じ製剤で投与されることを理解するであろう。他の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＦＧＦＲ抗体は、異なる製剤で同時にまたは異なる時間に投与され、同じ頻度または異なる頻度で投与され得る（すなわち、一方の抗体は７日に１回投与されるが、他方の抗体は３日に１回投与される）。また当業者であれば、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＦＧＦＲ抗体が、同じ経路によってまたは異なる経路によって、かつ同じ剤形または異なる剤形で投与され得る（例えば、一方の抗体は注射によって投与され得、他方は経口投与され得る）ことも理解するであろう。
【００６１】
６．４．抗ＥＧＦＲ及び抗ＦＧＦＲ遮断剤の治療的使用
本発明の抗ＥＧＦＲ及び抗ＦＧＦＲ抗体は、特に既知の複合抗体及び／または小分子遮断を使用する療法、例えば治療的遮断としてのＥＧＦＲ抗体及びＥｒｂＢ抗体の組み合わせの投与に対する耐性を獲得する、疾患または障害の治療、予防、及び／または寛解のために有用である。様々な実施形態では、耐性細胞は、癌細胞である。ある特定の実施形態では、耐性細胞は、転移性肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、直腸結腸癌、膵臓癌、及び頭頚部癌、例えば扁平上皮癌が挙げられるが、これらに限定されない癌である。特定の実施形態では、耐性細胞は、ＥｒｂＢ受容体の遮断に対する耐性の天然機構として、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合などの融合タンパク質を生成する。特定の実施形態では、疾患または障害は、ＦＧＦＲ３発現または活性などのＥＧＦＲ及び／またはＦＧＦＲに関連するか、または媒介される。例えば、本発明の抗体及び抗原結合断片は、高レベルのＥＧＦＲ及び／またはＦＧＦＲ３などの高レベルのＦＧＦＲを発現する腫瘍の治療に有用である。本発明の抗体及び抗原結合断片は、脳及び髄膜、中咽頭、肺、及び気管支、胃腸管、男性及び女性生殖路、筋肉、骨、皮膚及び付属器官、結合組織、脾臓、免疫系、血液形成細胞及び骨髄、肝臓及び尿路、ならびに目などの特別感覚器官において生じる腫瘍が挙げられるが、これらに限定されないＥＧＦＲ遮断に耐性があるか、または耐性になる任意の疾患または障害を治療するために使用されてもよい。ある特定の実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、以下の癌、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、頭頸部癌、前立腺癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を有する胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（例えば、ＥＧＦＲ依存性非小細胞肺癌）、滑膜肉腫、甲状腺癌、または黒色腫のうちの１つ以上を治療するために使用される。
【００６２】
６．５．複合療法及び製剤
本発明は、米国特許第９，１３２，１９２号に記載される抗ＥＧＦＲ抗体などの抗ＥＧＦＲ抗体、及び／または抗ＦＧＦＲ３抗体を、少なくとも１つの追加の治療的活性成分と組み合わせて投与することを含む、治療的投与レジメンを含む。そのような追加の治療的活性成分の非限定的な例としては、他のＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、第２の抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブもしくはパニツムマブ］またはＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブもしくはエルロチニブ］）、別のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト、例えばＨｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４（例えば、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴアナゴニスト（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ−ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０）、ＰＤＧＦＲ−α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−α抗体）、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−β抗体）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、例えば、ＵＳ７，０８７，４１１号を参照されたい（本明細書では「ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質」とも称される）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、またはパゾパニブ））、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＵＳ２００９／０１４２３５４に開示される抗ＤＬＬ４抗体、例えばＲＥＧＮ４２１）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、ＵＳ２０１１／００２７２８６に開示される抗Ａｎｇ２抗体、例えばＨ１Ｈ６８５Ｐ）等が挙げられる。
【００６３】
さらなる治療的活性成分の非限定的な例としては、ＦＧＦＲアンタゴニスト、例えばポナチニブ、ＢＧＪ３９８、ニンテダニブ、ＰＤ１７３０７４、ドビチニブ、ドビジニブ乳酸塩、ＳＵ５４０２、ＢＬＵ９９３１、ＡＺＤ４５４７、ＣＨ５１８３２８４、ダヌセルチブ、ＬＹ２８７４４５５、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ、ＭＫ−２４６１、ＰＫＣ４１２、ＣＨＩＲ−２５８、ＳＵ−５４０２、ＰＤ−１７３０７４、ＣＨＩＲ−２５８、ＴＫＩ−２５８、米国特許第８，８１５，９０６号に開示される化合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲアンタゴニストは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ４などの別のＦＧＦＲファミリーメンバーのものである。
【００６４】
抗ＥＧＦＲ抗体及びＦＧＦＲ抗体と組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤としては、小分子サイトカイン阻害剤などのサイトカイン阻害剤、及びＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのサイトカインに、またはそれらそれぞれの受容体に結合する抗体が挙げられる。
【００６５】
本発明はまた、本明細書で述べられる抗ＥＧＦＲ抗体及び／または抗ＦＧＦＲ抗体のいずれか、ならびにＦＧＦＲ３、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ−ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−βのうちの１つ以上の阻害剤のいずれか、または前述のサイトカインのうちのいずれかを含む、治療的組み合わせの使用を含み、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディ、または抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ断片、または他の操作された分子、例えばダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、及び最小認識単位）である。抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＦＧＦＲ３抗体はまた、抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、及び／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与及び／または共製剤化され得る。抗ＥＧＦＲまたは抗ＦＧＦＲ３抗体はまた、放射線治療及び／または従来の化学療法も含む治療レジメンの一部として投与され得る。
【００６６】
追加の治療的活性成分（複数可）は、抗ＥＧＦＲ抗体及び／または抗ＦＧＦＲ３抗体の投与の直前、同時、または直後に投与され得る（本開示の目的のために、そのような投与レジメンは、追加の治療的活性成分「と組み合わせた」抗ＥＧＦＲ抗体の投与が考慮される）。本発明は、抗ＥＧＦＲ抗体及び／または抗ＦＧＦＲ３抗体が、本明細書の別の箇所に記載される、追加の治療的活性成分（複数可）のうちの１つ以上と共製剤化される、薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＦＧＦＲ３抗体は共製剤化される。
【００６７】
本発明はまた、「分解抗体」及び「リガンド遮断抗体」の組み合わせを含む方法も含む。「分解抗体」は、必ずしもリガンド受容体相互作用を遮断することなく、細胞内のＥＧＦＲ及びＦＧＦＲ３の分解をそれぞれ引き起こす抗ＥＧＦＲ抗体及び／または抗ＦＧＦＲ３抗体を意味する。抗ＥＧＦＲ分解抗体の非限定的な例は、米国特許第９，１３２，１９２号に記載される、Ｈ１Ｈ１３４Ｐと指定される抗体である。「リガンド遮断抗体」は、ＥＧＦＲまたはＦＧＦＲ３とそのリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、またはＦＧＦ１）のうちの１つ以上との間の相互作用を遮断する抗ＥＧＦＲまたは抗ＦＧＦＲ３抗体を意味する。リガンド遮断ＥＧＦＲ抗体の非限定的な例は、米国特許第９，１３２，１９２号に記載される、Ｈ１Ｈ１４１Ｐと指定される抗体である。リガンド遮断抗体の別の例は、セツキシマブである。本発明者は、相乗的にまたは他の方法で抗腫瘍有効性を改善するために、分解抗体及びリガンド遮断抗体を組み合わせることを想到した。したがって、本発明は、少なくとも１つの分解抗体及び少なくとも１つのリガンド遮断抗体を含む薬学的組成物を含む。本発明はまた、分解抗体及びリガンド遮断抗体の組み合わせを（別個の投与として、または共製剤として）対象に投与することを含む、治療方法を含む。
【００６８】
７．実施例
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物の作製及び使用方法に関する完全な開示及び説明を当業者に提供するように施行され、本発明者がそれらの発明としてみなすものの範囲を限定することを意図しない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関する正確性を保証する努力が為されてきたが、いくらかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはその付近である。
【００６９】
実施例１：材料及び方法。
ＥｒｂＢ３及びＥＧＦＲ遮断抗体の生成。ヒトＥｒｂＢ３（ＲＥＧＮ１４００）及びヒトＥＧＦＲ（ＲＥＧＮ９５５）に対する遮断抗体を、既述のとおり（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）及び米国特許第８，７９１，２４４号、同第９，１３２，１９２号、及び米国公開第２０１４／００７２５６３号において）、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）マウスを使用して生成した。これらの抗体は、高い親和性を有するそれぞれの標的と相互作用し、リガンド結合を強力に遮断する。これらの抗体の機能的特性は、インビトロ及び腫瘍異種移植片モデルの両方において既述されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４））。
【００７０】
ヒト腫瘍細胞株。ヒト腫瘍細胞株ＦａＤｕ、Ｃａｌ２７、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、及びＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２を、ＡＴＣＣから入手した。ＳＮＵ１０７６細胞は、Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋから入手した。細胞株は、ＡＴＣＣ／Ｐｒｏｍｅｇａにおける短いタンデム反復プロファイリングによって認証された。全ての実験を、低継代細胞培養物（継代１０未満）で行った。全ての細胞株を、供給元により推奨される培地及び補助剤中で培養した。
【００７１】
ＦａＤｕ耐性変異体細胞株の生成。ＦａＤｕ  Ｖ２細胞株を生成するために（図１Ａを参照されたい）、親ＦａＤｕ腫瘍を、５×１０６個のＦａＤｕ細胞を６〜８週齢のＣ．Ｂ．−１７  ＳＣＩＤマウスの後横腹に皮下的に移植することによって形成した。一旦腫瘍が定着すると（体積約２００ｍｍ３）、マウスをランダム化し、対照抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＲＥＧＮ１４００（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＲＥＧＮ９５５（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＲＥＧＮ１４００＋ＲＥＧＮ１４００の組み合わせで連続して治療した。連続薬物治療下で、１つの腫瘍が、移植後およそ１１０日（複合治療の開始後９２日）で再成長し始めた。この腫瘍を採取し、腫瘍の断片をＳＣＩＤマウスに再移植した。ＲＥＧＮ９５５及びＲＥＧＮ１４００の複合治療で感作されたとき、腫瘍断片のいくつかは急速に成長することができた。そのような腫瘍を採取し、この腫瘍の断片をＳＣＩＤマウスに再移植した。複合ＲＥＧＮ９５５及びＲＥＧＮ１４００治療の存在下で急速に成長した腫瘍断片を採取し、細分化し、ピペットで上下させて大きな細胞塊を粉砕した。細胞懸濁液を組織培養皿に入れ、培地を１日毎に変えて、腫瘍細胞の均一な単層が得られるまで（１〜２週間）残屑及び死細胞を除去した。
【００７２】
ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断が、ＲＥＧＮ９５５及びＲＥＧＮ１４００の組み合わせの代わりに、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３二重特異性抗体を使用して達成されたことを除いて、上述と同じ手順を使用して、ＦａＤｕ  Ｖ１細胞株を生成した。二重特異性抗体は、抗体の組み合わせと同程度のＦａＤｕ腫瘍退縮をもたらした。加えて、連続抗体治療下での再成長ではなく、インビボで２回再継代してＦａＤｕ  Ｖ１細胞株を生成した腫瘍を、抗体再感作に対する無反応性に基づいて最初に採取した。全ての手順は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って行った。
【００７３】
腫瘍細胞成長アッセイ。腫瘍細胞成長を評価するために、２〜３，０００個の細胞を、血清含有培地中で９６ウェルプレート（ｎ＝８複製ウェル／治療群）に播種した。播種の翌日、ベースライン（０時間）細胞数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ａｑｕｅｓｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＭＴＳアッセイにより決定した。次いで、細胞を、図面の凡例に示される濃度のＲＥＧＮ１４００、ＲＥＧＮ９５５、ＭＥＫ阻害剤ＧＳＫ１１２０２１２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ＥＧＦＲ  ＴＫＩ  ＡＺＤ９２９１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、またはＰＩ３Ｋ阻害剤ＢＹＬ７１９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で処理した。７２時間で、最終細胞数をＭＴＳアッセイにより決定した。各処理群に対する相対細胞成長は、ベースラインＭＴＳ読み取り値を最終ＭＴＳ読み取り値から減算することにより決定した。
【００７４】
腫瘍細胞シグナル伝達の分析。ウェスタンブロットによる細胞シグナル伝達の分析に関して、腫瘍細胞を以下の試薬、ＥｒｂＢ３遮断ＲＥＧＮ１４００、ＥＧＦＲ遮断抗体ＲＥＧＮ９５５、ＭＥＫ阻害剤ＧＳＫ１１２０２１２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ＦＧＦＲ  ＴＫＩ  ＡＺＤ４５４７（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ＭＥＴ  ＴＫＩ  ＰＨＡ６６５７５２（Ｓｉｇｍａ）、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＢＹＬ７１９、ヒトＮＲＧ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理した。処理後、細胞溶解物を、以下の抗体、ホスホ−ＥｒｂＢ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＳＴ）、カタログ番号４５６１）、ＥＧＦＲ（ＣＳＴ、カタログ番号２６４６）、ホスホ−ＥＧＦＲ（ＣＳＴ、カタログ番号２２３４）、Ａｋｔ（ＣＳＴ、カタログ番号９２７２）、ホスホ−Ａｋｔ（ＣＳＴ、カタログ番号４０６０）、ＥＲＫ（ＣＳＴ、カタログ番号４６９５）、ホスホ−ＥＲＫ（ＣＳＴ、カタログ番号４３７０）、ＭＥＴ（ＣＳＴ、カタログ番号８１９８）、ホスホ−ＭＥＴ（ＣＳＴ、カタログ番号３０７７）、ＥｒｂＢ３（ＣＳＴ、カタログ番号４７５４）、ホスホ−ＦＧＦＲ（ＣＳＴ、カタログ番号３４７６）を用いてウェスタンブロットに供した。
【００７５】
４９ヒト受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のチロシンリン酸化状態を、ヒトホスホ−ＲＴＫアレイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して評価した。簡潔には、ＦａＤｕ親または変異体腫瘍細胞を、血清含有培地中の６ウェルプレートに播種し、細胞がほぼ合流するまで培養した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した０．２ｍＬの溶解緩衝液（キットで供給される）中にこすり落とした。細胞溶解物中のリン酸化ＲＴＫを、キット説明書に従って検出した。
【００７６】
ＦａＤｕ変異体細胞株におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３転写物の特定。ＦａＤｕ変異体対親ＦａＤｕ細胞に固有の遺伝子改変を特定するために、ｍＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して５μｇの全ＲＮＡから精製した。鎖特異的ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリを、ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ（商標）ｍＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリ調製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して調製した。１２サイクルＰＣＲを行ってライブラリを増幅させた。増幅されたライブラリを、０．７Ｘ  ＳＰＲＩ選択ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製し、３００ｂｐより大きい断片を富化した。配列決定を、２×１００サイクルでの多重化対合読み取り実行によって、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００上で行った。
【００７７】
ＲＮＡ−ｓｅｑによりＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞において特定された融合転写物の接合部における配列を確認するために、ＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、またはＶ２細胞からの１００ｎｇのｃＤＮＡをＰＣＲに供した。ＦＧＦＲ３エクソン１８−ＴＡＣＣ３イントロン９−ＴＡＣＣ３エクソン１１融合接合部に隣接する領域（Ｖ１）を増幅させるために、第１の反応に対してＦＧＦＲ３エクソン１７における順方向プライマー（５’−ＡＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣ）（配列番号１）及びＴＡＣＣ３エクソン１６における逆方向プライマー（５’−ＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣ）（配列番号２）を使用して、ネステッドＰＣＲを行った。第２のＰＣＲ反応は、ＦＧＦＲ３エクソン１８における順方向プライマー（５’−ＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＡＣＴＣ）（配列番号３）及びＴＡＣＣ３エクソン１１における逆方向プライマー（５’−ＴＣＡＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＧＣ）（配列番号４）を用いた。ＦＧＦＲ３エクソン１７−ＴＡＣＣ３エクソン９融合接合部に隣接する領域（Ｖ２）を増幅させるために、ＦＧＦＲ３エクソン１７における順方向プライマー（５’−ＡＴＧＣＧＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＴＧ）（配列番号５）及びＴＡＣＣ３エクソン９における逆方向プライマー（５’−ＡＣＧＴＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＴＣＴＣＡＴＴＴＧ）（配列番号６）を使用した。ｃＤＮＡ試料の完全性のための対照として、ハウスキーピング遺伝子シクロフィリンの断片も増幅させた。反応産物を、２％アガロースゲル上で分解し、対象とするバンドを切除し、精製して、Ｓａｎｇｅｒ配列決定に供した。
【００７８】
ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによってＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合転写物の発現を定量するために、全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを高能力ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して合成した。ＦＧＦＲ３エクソン１８−ＴＡＣＣ３イントロン９−ＴＡＣＣ３エクソン１１転写物（Ｖ１）を検出するために、上記の順方向ＦＧＦＲ３エクソン１８プライマー及び逆方向ＴＡＣＣ３エクソン１１プライマー、ならびにプローブ５’−ＣＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣ（配列番号７）を使用した。ＦＧＦＲ３エクソン１７−ＴＡＣＣ３エクソン９転写物（Ｖ２）を検出するために、上記の順方向ＦＧＦＲ３エクソン１７プライマー及び逆方向ＴＡＣＣ３エクソン９プライマー、ならびにプローブ５’−ＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧ（配列番号８）を使用した。閾値サイクルを決定するための自動設定を使用して、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ器具上の標準Ｔａｑｍａｎ条件下でアッセイを実行した。全てのプローブは、二重標識された５’ＦＡＭ／３’ＢＨＱ−１（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）であった。
【００７９】
ＦａＤｕ変異体細胞株におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の検出。ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞株におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のチロシンリン酸化状態を評価するために、１０ｃｍの皿中で成長した細胞を、Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する１ｍＬの緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に溶解した。可溶化後、２５μＬのタンパク質Ａ／Ｇ  ＰＬＵＳ−アガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、４℃で１時間のインキュベーションにより事前に除去し、次いで２０μＬの４Ｇ１０白金抗ホスホチロシンアガロース共役体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、４℃で１６時間インキュベートした。次いで、ビーズを冷たい溶解緩衝液で洗浄し、ＦＧＦＲ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＢ−９）、ＴＡＣＣ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ５７２０）またはＳｒｃ（ＣＳＴ、カタログ番号２１２３）に対する抗体を使用したウェスタンブロット分析のためにＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁した。
【００８０】
免疫沈降によるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を検出するために、１０ｃｍの皿で成長させたＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、及びＶ２細胞を、Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する１ｍＬの緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に溶解した。細胞溶解物は、２５μＬのタンパク質Ａ／Ｇ  ＰＬＵＳ−アガロースビーズを用いて、４℃で１時間インキュベーションすることによって事前に除去した。次いで、溶解物を、５μｇのＴＡＣＣ３抗体を用いて、４℃で１６時間インキュベートした。免疫複合体を、２５μＬのタンパク質Ａ／Ｇ  ＰＬＵＳ−アガロースビーズを用いて、４℃で１時間のインキュベーションによって収集した。ビーズを冷たい溶解緩衝液で洗浄し、ＦＧＦＲ３及びＴＡＣＣ３に対する抗体を使用したウェスタンブロット分析のためにＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を天然ＦＧＦＲ３から分離することを目的とする実験では、他のウェスタンブロットに使用された４〜２０％の勾配ゲルよりも良好な分解能を可能にしたため、４％  ＳＤＳゲルを用いた。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質はまた、ＦＧＦＲ３抗体を用いた細胞溶解物の直接ウェスタンブロッティングにより、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞において検出された。
【００８１】
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現する細胞株の生成。癌細胞における野生型ＦＧＦＲ３及びＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の発現を可能にするために、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＣＭＶプロモータがＥＦ１ａプロモータによって置き換えられたレンチウイルス発現ベクターｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏにクローン化した。レンチウイルスを生成するために、２９３Ｔ細胞を、ＦｕＧＥＮＥ  ６形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、様々なｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏプラスミド＋パッケージングベクターｐｓＰＡＸ２、及びエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇで同時形質移入した。形質移入後７２時間で、ウイルスを含有する上清を収集し、濾過した。プールされた安定した細胞株を生成するために、細胞（ＦａＤｕ親、Ｃａｌ２７、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＳＮＵ１０７６、Ｄｅｔｒｏｉｄ  ５６２）を、０．３のＭＯＩにおいて、様々なレンチウイルスに感染させ、４００〜８００μｇ／ｍＬのＧ４１８中で約２週間選別した。操作されたＦａＤｕ親細胞を用いた腫瘍異種移植片実験の場合、５×１０６個の細胞を、６〜８週齢のＣ．Ｂ．−１７  ＳＣＩＤマウスの後横腹に皮下移植した。一旦腫瘍が定着すると（体積約２００ｍｍ３）、マウスをランダム化し、図面の簡単な説明において上に示される抗体で治療した。
【００８２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子の破壊。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子の不活性化を可能にするために、ＦＧＦＲ３に特異的な単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを、レンチＣＲＩＳＰＲプラスミド、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするレンチウイルス発現ベクター、ｓｇＲＮＡ、及びピューロマイシン選択マーカーにクローン化した。Ｓｈａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：８４−８７を参照されたい。レンチウイルスを生成するために、２９３Ｔ細胞を、ＦｕＧＥＮＥ  ６形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、レンチＣＲＩＳＰＲプラスミド＋パッケージングベクターｐｓＰＡＸ２、及びエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇで同時形質移入した。形質移入後７２時間で、ウイルスを含有する上清を収集し、濾過し、超遠心分離により濃縮した。ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞を、０．３のＭＯＩにおいて、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ＋ＦＧＦＲ３  ｓｇＲＮＡ１もしくはＦＧＦＲ３  ｓｇＲＮＡ２をコードするレンチウイルス、またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼのみをコードする対照レンチウイルスに感染させた。ＦＧＦＲ３  ｓｇＲＮＡ１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ部分をコードするＤＮＡの配列は、５’−ＧＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＧ（配列番号９）（ＦＧＦＲ３エクソン２において結合する）であり、ＦＧＦＲ３  ｓｇＲＮＡ２のものは、５’−ＣＧＣＧＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣ（配列番号１０）（ＦＧＦＲ３エクソン３において結合する）である。感染から約２４時間後、細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで処理し、非感染細胞を殺滅させた。安定して形質導入された細胞を、感染後１０〜１４日の間に実験（細胞成長または細胞シグナル伝達）に使用した。
【００８３】
実施例２：ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断への耐性のために選択された頭頚部細胞は、活性化ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現する。
ＥＧＦＲ（ＲＥＧＮ９５５）及びＥｒｂＢ３（ＲＥＧＮ１４００）に対する特定の遮断抗体の生成、ならびにこれらの抗体の組み合わせがＦａＤｕ  ＨＮＳＣＣ異種移植片腫瘍の実質的な退縮を促進したという証明は、以前に開示された。（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）を参照されたい）。ＦａＤｕ細胞において、ＥＧＦＲの遮断は、主にＥＲＫ経路の活性化を阻害し、一方ＥｒｂＢ３遮断は、主にＡＫＴ経路の活性化を阻害し、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）に開示される複合治療の優れた有効性を説明する可能性がある。
【００８４】
ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３に対するＦａＤｕ腫瘍の獲得耐性を媒介する分子機構を発見するために、この治療に対する完全な耐性を呈する変異体細胞株を、図１に概説されるように生成した。ＲＥＧＮ９５５及びＲＥＧＮ１４００の組み合わせで治療されたＦａＤｕ腫瘍は縮小し、実質的に検出不能になり、腫瘍細胞の大部分がアポトーシスを受けたことを示唆している（図１Ａ、第１のパネル）。しかしながら、最終的に、個々の腫瘍は再成長することが分かった（図１Ａ、第２のパネル）。再成長している腫瘍を採取し、断片化し、薬物治療下でインビボで再継代した（図１Ａ、第３及び第４のパネル）。インビボで２回再継代された後、複合ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断に対して耐性を呈した腫瘍を使用して、細胞株を生成した。２つのそのような変異体細胞株（ＦａＤｕ  Ｖ１及びＦａＤｕ  Ｖ２）から形成された腫瘍は、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断に対して完全な耐性を呈した（それぞれ図１Ｂ及び１Ｃ）。ＦａＤｕ  Ｐ１と呼ばれる対照細胞株は、マウスが対照タンパク質ヒトＦｃで治療されたことを除いて、インビボで親ＦａＤｕ腫瘍の断片を再継代することによって生成された。ＦａＤｕ  Ｐ１細胞株は、耐性変異体のその後の遺伝的及び生化学的特性評価のための比較細胞株であった。
【００８５】
ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞株の、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ遮断に対する耐性が、抗体がＶ１及びＶ２細胞株に結合不能であることに起因した可能性を除外するために、ＲＥＧＮ９５５及びＲＥＧＮ１４００抗体が結合し、これらの細胞においてそれぞれの標的を遮断したことを明示した。これは、変異体が、これらの抗体によってもはや阻害されなくなったＥＧＦＲまたはＥｒｂＢの変異型を発現しなかったことを確認した。変異体細胞株の耐性に関する分子基準を調査するために、ＲＥＧＮ９５５及びＲＥＧＮ１４００がインビトロでこれらの細胞の増殖を阻害する能力を評価した。ＥＧＦＲ＋ＥｒｂＢ３の複合遮断は、ＦａＤｕ  Ｐ１親細胞の成長を（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）に示されるとおり）約８０％阻害する一方で、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２の成長は約２５％阻害するだけであり（図３Ａ〜３Ｃ）、これらの細胞株のインビボ耐性を促進する機構が、インビトロで同様に主として動作することを示す。興味深いことに、ＥＧＦＲ遮断抗体は、親細胞の成長を著しく阻害することができたが（約４０％阻害）、変異体細胞株においてはほとんど効果がなかった（５〜１０％の阻害のみ）（図３Ａ〜３Ｃ）。対照的に、ＥｒｂＢ３遮断抗体の効果は、親及び変異体細胞株において類似していた（図３Ａ〜３Ｃ）。
【００８６】
ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞の成長に対するＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断の比較的弱い効果が、下流シグナル伝達経路の阻害に失敗したことを反映したかどうかを評価するために、ＡＫＴ及びＥＲＫ活性化に対するＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断の効果を試験した。興味深いことに、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞の両方において、ＲＥＧＮ１４００は、それがＦａＤｕ  Ｐ１細胞内と同程度に効果的にＡＫＴ活性化を阻害した（図３Ｄ）。しかしながら、ＦａＤｕ  Ｐ１細胞において観察されたほぼ完全なＥＲＫ阻害とは対照的に、ＲＥＧＮ９５５もＲＥＧＮ９５５及びＲＥＧＮ１４００の組み合わせも、ＦａＤｕ  Ｖ１またはＶ２細胞においてＥＲＫ活性化を効果的に阻害することができなかった（図３Ｄ）。したがって、変異体細胞株においてＥＧＦＲを効果的に阻害するＲＥＧＮ９５５の能力にもかかわらず、抗体は、下流ＥＲＫ活性化を遮断することができなかった。ＥＧＦＲ遮断時のＭＡＰキナーゼ経路の持続活性化が、耐性表現型の重要な要素である可能性と一致して、ＲＥＧＮ４００＋ＭＥＫ阻害剤ＧＳＫ１１２０２１２（トラメチニブ、ＧＳＫ）での複合治療は、親ＦａＤｕ細胞の成長に対する複合ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断の効果と同様に、ＦａＤｕ  Ｖ２細胞におけるＡＫＴ及びＥＲＫ両方のリン酸化を効果的に遮断し（図３Ｅ）、細胞成長を約７０％阻害した（図３Ｆ）。
【００８７】
これらの発見は、ＦａＤｕ  Ｐ１親細胞において活性でない別の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）が、ＥＧＦＲが遮断されるとき、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞株におけるＥＲＫシグナル伝達を維持する可能性を示唆する。したがって、ホスホ−ＲＴＫアレイを使用して、ＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、及びＶ２細胞における全てのＲＴＫの活性化状態を評価した。以前に示されたように、親ＦａＤｕ細胞は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びＥｒｂＢ３の活性化を呈する（図４Ａ）。これらのＲＴＫはまた、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞において活性であったが、耐性細胞株の両方もまた、活性化ＦＧＦＲ３を発現し、親細胞において検出不能であった（図４Ａ）。加えて、ＦａＤｕ  Ｖ２細胞は、ＦａＤｕ  Ｐ１またはＦａＤｕ  Ｖ１細胞よりもはるかに強いＭＥＴの活性化を呈した（図４Ａ）。全細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、ＦａＤｕ  Ｖ２細胞における増加したＭＥＴリン酸化を確認した（図４Ｂ）。抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫沈降に続いて、ＦＧＦＲ３のウェスタンブロットは、ＦａＤｕ  Ｐ１細胞ではなく（高レベルのホスホ−ＦＧＦＲ３がＦａＤｕ  Ｖ２細胞に存在する）、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞の両方における活性化ＦＧＦＲ３の存在を確認した（図４Ｃ）。免疫沈降のための対照として、当量のチロシンリン酸化Ｓｒｃを、ＦａＤｕ  Ｐ１、Ｖ１、及びＶ２細胞溶解物から回収した（図４Ｃ）。
【００８８】
ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞における活性化ＦＧＦＲ３ならびにＦａＤｕ  Ｖ２細胞における活性化ＭＥＴの存在は、ＥＧＦＲが遮断されるとき、これらのＲＴＫの一方または両方が、これらの細胞株におけるＥＲＫ活性化を維持する可能性を示唆する。この可能性を調査するために、ＦａＤｕ  Ｖ２細胞におけるＥＲＫ活性化を阻害するＲＥＧＮ９５５の能力に対するＭＥＴ  ＴＫＩ  ＰＨＡ６６５７５２の効果を試験した。ＭＥＴリン酸化を完全に遮断するも、ＭＥＴ  ＴＫＩは、それ自体でまたはＲＥＧＮ９５５との組み合わせでＥＲＫ活性化を阻害せず（図４Ｄ）、ＲＥＧＮ９５５がＦａＤｕ  Ｖ２細胞においてＥＲＫの阻害に失敗したことは、増加したＭＥＴ活性化の結果ではないことを示す。
【００８９】
次に、選択的ｐａｎ−ＦＧＦＲ  ＴＫＩ（ＡＺＤ４５４７）及びＲＥＧＮ９５５での複合治療が、変異体細胞株におけるＥＲＫ活性化を効果的に阻害し得るかどうかを評価した。図４Ｅに示されるように、２５ｎＭのＡＺＤ４５４７でのＦａＤｕ  Ｖ２細胞の処理は、ＦＧＦＲ３リン酸化を完全に遮断した（これらの細胞においてＲＴＫアレイによって検出する唯一のリン酸化ＦＧＦＲ）。ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２の両方において、ＡＺＤ４５４７＋ＲＥＧＮ９５５の組み合わせは、ＥＲＫ活性化を完全に阻害し、一方単剤は、効果を有しなかったか、または部分効果を有していた（図４Ｆ）。この発見は、ＥＧＦＲが遮断されるとき、活性ＦＧＦＲ３が、ＦａＤｕ変異体細胞におけるＥＲＫ活性化を維持するために必須であることを示唆する。ＡＺＤ４５４７は、単独でまたはＲＥＧＮ９５５との組み合わせでＡＫＴ活性化に影響を与えず（図４Ｆ）、ＦＧＦＲ３シグナル伝達が、ＦａＤｕ変異体細胞におけるＡＫＴの活性化に必要でないことを示し、ＥｒｂＢ３単独の阻害が、これらの細胞における活性化ＡＫＴのほぼ完全な喪失をもたらすという観察と一致する（図３Ｄ）。
【００９０】
ＦａＤｕ変異体細胞株におけるＦＧＦＲ３の活性化は、ＦＧＦＲ３の増加したリガンド依存性刺激、またはＦＧＦＲ３の遺伝子改変のいずれかに起因し得る。例えば、ＦＧＦＲ３における活性化点変異は、複数の癌において特定され、膀胱癌において最も顕著に特定された。Ｋｎｏｗｌｅｓ（２００８）Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．４：７１−８３を参照されたい。したがって、ＲＮＡ−ｓｅｑを行い、耐性表現型の基礎となり得るＦａＤｕ変異体細胞株におけるＦＧＦＲ３及び／または他の遺伝子の遺伝子変化を特定した。変異体細胞株における活性化ＦＧＦＲ３の存在と一致して、親ＦａＤｕ細胞においてではなく、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞の両方において、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ３融合転写物を特定した（各細胞株は、別個の融合転写物を発現した）。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合は、最近、複数のヒト癌において特定され、全ての場合において、これらの融合タンパク質は、チロシンキナーゼドメイン及びＴＡＣＣ３二重コイルドメインを含むＦＧＦＲ３タンパク質の大部分を含有し、ＴＡＣＣ３二重コイルにより媒介される融合タンパク質の構成的二量体化が、ＦＧＦＲ３キナーゼ活性化の基礎となることを示唆する。例えば、Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：８５５−８６５、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：１２３１−１２６５、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２２：７９５−８０３、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．３：６３６−６４７を参照されたい。ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞において特定される融合転写物は、以前に報告されたものと同様であった（図５Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ（推定融合接合部に隣接するプライマーを有する）は、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞におけるそれぞれの融合転写物の存在を確認した（図５Ｂ）。この発見と一致して、定量的リアルタイムＰＣＲは、これらの転写物が検出不能であった親ＦａＤｕ細胞においてではなく、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞におけるそれぞれの融合転写物の著しい発現を明らかにした。
【００９１】
ＦＧＦＲ３抗体を有するＦａＤｕ親及び変異体細胞株からの全細胞溶解物のウェスタンブロットは、親細胞と比較して、Ｖ１及びＶ２細胞の両方において、より高い分子量のＦＧＦＲ含有タンパク質の存在を明らかにした（図５Ｄ、最後の３レーン）。ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞におけるより大きいＦＧＦＲ３含有タンパク質は、我々が特定した融合転写物と一致する分子量で移動し、すなわち（約１１０〜１３０ｋＤａで移動する）天然ＦＧＦＲ３よりもおよそ２０ｋＤａ大きい。ＦａＤｕ変異体細胞株において発現されたより大きいＦＧＦＲ３含有タンパク質が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物であったことを確認するために、推定ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質中に存在するＣ末端ＴＡＣＣ３エピトープを認識したＴＡＣＣ３抗体での免疫沈降に供した。図５Ｄに示されるように、ＴＡＣＣ３抗体は、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞の両方からより大きいＦＧＦＲ３含有タンパク質を選択的に免疫沈降させたが、細胞株のうちのいずれからも天然ＦＧＦＲ３を免疫沈降させなかった。天然ＴＡＣＣ３は、３つの細胞株全てから免疫沈降し、免疫沈降手順を制御する（図５Ｄ、下パネル）。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、天然ＴＡＣＣ３よりもはるかに低いレベルで発現し、図５Ｄの下パネルに示される露光で、なぜ天然ＴＡＣＣ３のみが見えるかを説明する。したがって、ＴＡＣＣ３抗体は、ＦａＤｕ変異体細胞株から特異的にＦＧＦＲ３含有タンパク質を免疫沈降させることができ、これらの細胞株におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合の発現を確認する。
【００９２】
図４Ｃに示されるように、ＦＧＦＲ３は、親細胞からではなく、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞の両方から抗ホスホチロシン免疫沈降において検出された。これらのチロシンリン酸化ＦＧＦＲ３含有タンパク質が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質である場合、それらもまた、ＴＡＣＣ３抗体を用いたウェスタンブロットによって検出可能であるはずである。図５Ｅ（左パネル）に示されるように、ＴＡＣＣ３（ＦＧＦＲ３と同様）は、ＦａＤｕ  Ｐ１細胞からではなく、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞の両方から抗ホスホチロシン免疫沈降において検出された。ＦＧＦＲ３及びＴＡＣＣ３抗体によって認識されるＦａＤｕ  Ｖ２細胞からのチロシンリン酸化タンパク質は、ＳＤＳゲルにおいて同じく移動し、それらが同じタンパク質であることを確認する。したがって、親ＦａＤｕ細胞ではなく、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞株の両方は、ＥＧＦＲ遮断時にＥＲＫシグナル伝達を維持すると思われるチロシンリン酸化ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を発現し、これら２つの細胞株の耐性表現型において役割を果たし得る。
【００９３】
実施例３：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ遮断に対する親ＦａＤｕ細胞の耐性を促進する。
ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞において特定されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質が耐性を駆動する能力を評価するために、融合タンパク質（及び対照として野生型ＦＧＦＲ３）を、ＦａＤｕ  Ｐ１親細胞において安定して発現させた。細胞株を、低ＭＯＩ（０．３）でのレンチウイルス感染によって生成して、多重積分に起因する過剰発現を最小限に抑えた。図６Ａに示されるように、野生型ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の強力な発現は、安定して形質導入されたＦａＤｕ親細胞において検出された。野生型ＦＧＦＲ３は、ある程度リン酸化されたが、ホスホ−ＦＧＦＲ抗体を用いたウェスタンブロットによって評価されるように、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の両方が、より高い程度にリン酸化され（図６Ａ）、より高いレベルの構成的活性を示す。全タンパク質レベルに正規化される場合、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞からのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、野生型ＦＧＦＲ３よりも、それぞれ約２０倍及び約４倍高いレベルでリン酸化された。ＴＡＣＣ３のウェスタンブロッティングは、安定して発現されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質におけるＴＡＣＣ３配列の存在を確認した（図６Ａ）。図６Ａに示される露光において、内因性ＦＧＦＲ３の発現は、空ベクターで形質導入されたＦａＤｕ親細胞において検出不能であり、レンチウイルスでコードされたタンパク質が実際に過剰発現されることを示す。しかしながら、ホスホ−キナーゼアレイを使用した下流シグナル伝達の変化の分析は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合の発現が、親ＦａＤｕ細胞におけるシグナル伝達経路の一般的な再配線を促進しなかったことを明らかにした。実際、変化はほとんど観察されなかった（図７）。
【００９４】
ホスホチロシン抗体による細胞溶解物の免疫沈降は、野生型ＦＧＦＲ３と比較して、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の増加したリン酸化を確認した（図６Ｂ）。ＥＧＦＲ遮断が、ＦａＤｕ変異体細胞におけるＥＲＫ活性化を阻害できないという観察と一致して（図３Ｄ）、野生型ＦＧＦＲ３ではなく、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の発現は、ＲＥＧＥＮ９５５がＦａＤｕ親細胞におけるＥＲＫ活性化を著しく阻害するのを防ぎ（図６Ｃ）、融合タンパク質が、ＥＲＫ経路の強力な活性化を駆動することを確認する。
【００９５】
ＥＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の発現が、耐性を駆動するのに十分であるかどうかを決定するために、野生型ＦＧＦＲ３または融合タンパク質を発現する親ＦａＤｕ細胞を、ＲＥＧＮ１４００及びＲＥＧＮ９５５で処理した。野生型ＦＧＦＲ３を発現する親細胞は、依然として成長阻害に感受性であったが、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のいずれかを発現する細胞は耐性であった（図６Ｄ）。融合タンパク質がインビトロで耐性を駆動する能力と一致して、野生型ＦＧＦＲ３ではなく、ＦａＤｕ  Ｖ２細胞からのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、複合ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断に対するＦａＤｕ親腫瘍異種移植片の耐性を促進するのに十分であった（図６Ｅ）。耐性における活性化ＦＧＦＲ３の重要な役割と一致して、ＦＧＦ１リガンドを過剰発現するように操作された親ＦａＤｕ腫瘍は、インビボでＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断に対して完全な耐性を呈した（図８）。
【００９６】
実施例４：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、ＦａＤｕ変異体の耐性に必要である
ＦａＤｕ変異体において発現された内因性ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質が、耐性表現型に関与するかどうかを調査するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術（Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）３２：３４７−５５）を用いて、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子を不活性化した。レンチウイルスを使用して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞に送達した。ＦＧＦＲ３における早期エクソン（エクソン２またはエクソン３）を標的とする４つのｓｇＲＮＡを試験し、４つのｓｇＲＮＡのうちの２つは、ＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質（及び天然ＦＧＦＲ３）の発現をほぼ完全に排除した（図９Ａ）。ＦＧＦＲ  ＴＫＩ及びＥＧＦＲ抗体ＲＥＧＮ９５５での複合治療が、耐性細胞におけるＥＲＫ活性化を効果的に遮断し（図４Ｄ）、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ媒介性不活性化は、ＲＥＧＮ９５５がＶ１及びＶ２細胞株の両方におけるＥＲＫ活性化を阻害するのを可能にし（図９Ｂ）、ＥＧＦＲが遮断されるときに、これらの融合タンパク質によるシグナル伝達が、ＥＲＫ活性化を維持することを立証する。
【００９７】
この観察と一致して、ｓｇＲＮＡ１またはｓｇＲＮＡ２のいずれかによるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３のＣＲＩＳＰＲ媒介性不活性化は、ＲＥＧＮ９５５が単剤としてＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞の成長を阻害すること、及びＲＥＧＮ１４００により媒介される成長阻害を著しく増進させることを可能にした。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３不活性化を有するＦａＤｕ  Ｖ１及びＶ２細胞において、ＲＥＧＮ９５５＋ＲＥＧＮ１４００の組み合わせにより媒介される成長阻害の程度は、親ＦａＤｕ細胞において観察されるものと同様であった（図３Ａ）。したがって、ＦａＤｕ変異体における追加の耐性機構の関与を除外することはできないが、当データは、耐性表現型の実質的な構成要素が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質によるシグナル伝達に起因することを示す（モデルについては図９Ｄを参照されたい）。
【００９８】
実施例５：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、変異ＰＩ３Ｋによってではなく、ＥＧＦＲによって駆動された癌細胞株における標的療法に対する耐性を促進する
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の機能的能力をさらに調査するために、それらが標的療法に対する追加の癌細胞の耐性を促進する能力を評価した。最近のゲノムデータは、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子がＨＮＳＣＣにおいて頻繁に突然変異されることを示し、ＰＩ３Ｋがこの指摘における重要な駆動因子であることを示唆するため、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３シグナル伝達（Ｃａｌ２７  ＨＮＳＣＣ）、変異ＥＧＦＲ（ＮＣＩ−Ｈ１９７５  ＮＳＣＬＣ）、または変異ＰＩ３Ｋ（ＳＮＵ１０７６及びＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２  ＨＮＳＣＣ）により駆動された癌細胞を用いた。Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｎ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｓｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１５）５１７：５７６−５８２を参照されたい。ＦａＤｕ親細胞と同様に、（野生型ＦＧＦＲ３ではなく）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、複合ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３遮断に対するＣａｌ２７細胞の耐性（図１１Ａ）、及びＥＧＦＲ  ＴＫＩ  ＡＺＤ９２９１に対するＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の耐性を促進することができた（図１１Ｂ、これらの細胞株における融合タンパク質の発現及びリン酸化の確認については、補足図１２を参照されたい）。
【００９９】
対照的に、融合物の高い発現及びリン酸化にもかかわらず（図１１Ｅ）、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のいずれも、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＢＹＬ７１９（アルペリシブ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に対するＳＮＵ１０７６またはＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２の実質的な耐性を付与することができなかった（図１１Ｃ、１１Ｄ）。ＦａＤｕ細胞における当観察と同様に、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、これらの細胞株の両方におけるＥＲＫシグナル伝達を強力に活性化し、ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＳＮＵ１０７６細胞）の存在下でＥＲＫシグナル伝達を完全に回復するか、またはＥＲＫ活性化のベースラインレベルを著しく増加させる（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞）（図１１Ｆ）。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、ＰＩＫ３遮断時にＡＫＴ活性化を回復しなかったが（図１１Ｆ）、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合がこれらの細胞におけるＡＫＴを活性化することができた場合であっても、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、それを防止した可能性があった。したがって、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質によるＥＲＫシグナル伝達の強力な活性化は、ＰＩ３Ｋ経路に「常習された」ＨＮＳＣＣ細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の喪失を補償せず、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質が、ＰＩＫ３ＣＡ変異体ＨＮＳＣＣにおけるＰＩ３Ｋ阻害剤に対する耐性の関連媒介物質である可能性は低い。
【０１００】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
2018536682.tif 000007
【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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