(57)【要約】  本発明は、（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールを投与することによって細胞内防御をダウンレギュレートする方法を含む。これにより、ナチュラルキラー細胞、幹細胞及びマクロファージ細胞へのＲＮＡベースの遺伝子ベクターの送達が改善される。得られた細胞は、養子細胞移入療法に使用可能である。抗ウイルス治療剤と共に（５Ｚ）−７−オキソゼアノールの投与を介してウイルス誘発性炎症を治療する方法も提供される。
2018535661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールとＲＮＡウイルスベクターを栄養培地中の細胞へ同時投与することを含むことを特徴とする、細胞への遺伝子送達を強化する方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡウイルスベクターが、レトロウイルス及びレンチウイルスベクターから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ベクターはレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ベクターはレンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、ナチュラルキラー細胞、幹細胞及びマクロファージから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、ナチュラルキラー細胞であり、ＮＫ９２細胞であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記（５Ｚ）−７−オキソゼアノールは、前記細胞の細胞内防御メカニズムを阻害することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＲＩＧ−Ｉ及び／又はＩＲＦ３の発現が、有効量の（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールを投与することによって阻害されることを特徴とする請求項７に記載の方法。前記経路は、ＲＩＧ−Ｉ及び／又はＩＲＦ３のダウンストリームであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールは、前記栄養培地中で約０．０４μＭ乃至約１０μＭの濃度を達成するのに十分な量で投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞防御メカニズムを阻害するために有効量の（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールを投与することを含むことを特徴とする、細胞の前記細胞内防御メカニズムを阻害する方法。
【請求項１１】
前記細胞が、ナチュラルキラー細胞、幹細胞及びマクロファージから選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＩＧ−１及び／又はＩＲＦ３の発現が、有効量の（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールを投与することによって阻害されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記有効量の５Ｚ）−７−オキソゼアエノールは、栄養培地中で約０．０４μΜ乃至約１０μΜの濃度であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記有効量は０．４乃至約１．５μｍであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記有効量は約０．５μｍ乃至約６μｍであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＦＮλ応答を阻害する遺伝子送達ベクターの前記使用を含むことを特徴とする、細胞の前記形質導入を改善する方法。
【請求項１７】
前記細胞は、ナチュラルキラー細胞、幹キラー細胞、幹細胞及びマクロファージから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ナチュラルキラー細胞はＮＫ９２細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
有効量の（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールを投与することによって、前記ＩＦＮλ応答が阻害されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記有効量の（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールは、約０．０５μＭ乃至約１．５μＭの濃度であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞内防御メカニズムを阻害するのに有効な量の（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールで処理された細胞の患者への投与を含むことを特徴とする、養子細胞移動で治療可能な疾患を有する患者を治療する方法。
【請求項２２】
ＲＩＧ−１及び／又はＩＲＦ３が阻害されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールは、０．２μｍ及び６μｍの標的濃度を達成するために投与されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールの前記濃度は０．２μｍＭ乃至１．５μＭであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（５Ｚ）−７−オキソゼアエノール及びレンチウイルスベクターを患者に投与することを含むことを特徴とする、養子細胞移入で治療可能な疾患を有する患者を治療する方法。
【請求項２６】
前記疾患は、癌及び既知の遺伝的障害を有する疾患から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールの前記標的血漿濃度は０．２μＭ及び６μＭであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールの前記標的血漿濃度は０．２μＭ乃至１．５μＭであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
栄養培地中のナチュラルキラー細胞に（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールとｎＲＮＡウイルスベクターを同時投与することを含むことを特徴とする、ＲＮＡウイルスベクターを介してナチュラルキラー細胞における遺伝子導入を強化する方法。
【請求項３０】
前記ベクターは、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターから選択されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ベクターはレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ベクターはレンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記栄養培地に０．４μＭ乃至約１０μＭの濃度を達成するように前記（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールが添加されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールとＲＮＡウイルスベクターを同時投与することによってトランスフェクトされた細胞を投与することを含むことを特徴とする、癌を治療する方法。
【請求項３５】
前記癌が、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、及び芽細胞腫、急性リンパ芽球性白血病（全て）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連癌、肛門癌、星細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管癌（胆管癌）、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳癌、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫、乳癌、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、軟骨肉腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚ｔ−細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外、性腺外又は卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹のグリオーマ、小児大脳星細胞腫神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、急性リンパ芽球性白血病（急性リンパ性白血病とも呼ばれる）、急性骨髄芽球性白血病（急性骨髄性白血病）、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、ヘアリーセル白血病、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、マクログロブリン血症、ワルデンストローム、男性の乳癌、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫（骨髄癌）、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、乏突起膠腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、上皮性卵巣癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体芽細胞腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、腎盂尿管移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、メラノーマ及び非メラノーマ皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明扁平上皮頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫及びセザリー症候群）、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視経路グリオーマ及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍（腎臓癌）から選択されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が、肝臓癌、多発性骨髄腫又は肉腫から選択されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が肝臓癌であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が多発性骨髄腫であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌が肉腫であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記ベクターがレンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールとＲＮＡウイルスベクターの同時投与によってトランスフェクトされた細胞を投与することを含むことを特徴とする、遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患を治療する方法。
【請求項４３】
前記疾患は、２１−ヒドロキシラーゼ欠損症、軟骨無形成症、急性間欠性ポルフィリン症、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アラジール症候群、アレクサンダー病、アルストレーム症候群、遺伝性エナメル質形成不全症、ビオチニダーゼ欠損症、ＣＧＤ慢性肉芽腫性疾患、ディジョージ症候群、ファンコニ貧血、Ｇ６ＰＤ欠損、リポ蛋白リパーゼ欠損症、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型、シデリアスＸ連鎖性精神遅滞症候群（ＰＨＦ８遺伝子の変異によって引き起こされる）、X連鎖重症複合免疫不全（Ｘ−ＳＣＩＤ）、X連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）から選択されることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患はX連鎖重症複合免疫不全疾患であることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ベクターはレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記ベクターはレンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールとＲＮＡウイルスベクターの同時投与によってトランスフェクトされた細胞を投与することを含むことを特徴とする、既知の遺伝子変異によって引き起こされる代謝障害を治療する方法。
【請求項４８】
前記ベクターはレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ベクターはレンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールと抗ウイルス治療剤との同時投与を含むことを特徴とする、ウイルス性の発明によって誘発された炎症の治療方法。
【請求項５１】
前記抗ウイルス治療剤が、アマンダチン及びリマンチジン等のアダマンタン抗ウイルス剤、リトナビル及びコビシスタット等の抗ウイルスブースター、マラビロク等のケモカイン受容体アンタゴニスト、マラビロク、ドルテグラビル及びエルビテグラビル等のインテグラーゼ鎖転移阻害剤、ソホスブビル、エンフビルチド、ホスカルネット、ホミビルセン等のその他の抗ウイルス剤、ペルミビル、オセルタミビル及びザナミビル等のノイラミニダーゼ阻害剤、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン及びリルピビリン等の非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ダクラタビル等のＮＳ５ａ阻害剤、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン及びエンテカビル等のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＲＴＩＳ）、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホサンプレナビル、チプラナビル及びダルナビル等のプロテアーゼ阻害剤、リバビリンバラシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル及びシドフォビル等のプリンヌクレオシドのうちの少なくとも１つから選択されることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールとＲＮＡベースのウイルス療法の同時投与を含むことを特徴とする、インビボウイルスベースの治療薬の有効性を高める方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権と参照による結合）
本出願は、２０１５年９月３０日に提出された仮出願６２／２３５，４２７号に対する優先権を主張する。ここで引用された全ての参考文献は、参照により明示的に結合される。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系のリンパ球である。それらはサイトカイン産生であり、ウイルス感染又は腫瘍細胞の両方を殺す細胞傷害性を有する。このため、ＮＫ細胞を用いる養子免疫療法は、癌治療の有望なアプローチである。過去１０年間に、幾つかのＮＫ細胞ベースの抗癌製品が有望な臨床結果で臨床試験段階に採用された。しかしながら、より効率的なＮＫ細胞治療製品を製造するためには、ＮＫ細胞の遺伝子改変のような新規戦略を開発することが不可欠である。更に、活性化又はキメラ抗原受容体のいずれかの導入を介して腫瘍標的に向け直された遺伝子改変ＮＫ細胞を使用すれば、更なる臨床用途のための魅力的な見込みが得られる（非特許文献５）。養子移入されたＮＫ細胞のインビボ生存及び細胞傷害性を強化するために様々なサイトカインを発現する遺伝子導入も様々なアプローチの１つである。強化された増殖と小分子阻害剤による標的細胞内ウイルス防御メカニズムを通じてＮＫ細胞への強化されたレトロウイルス及びレンチウイルス遺伝子送達が開示されているが（非特許文献６）、ＮＫ細胞が本質的にレトロウイルス感染に耐性があるという問題は依然として残っている（非特許文献１、２、４、６）。ウイルスベクターを介してマクロファージ及び幹細胞に遺伝物質を送達することも問題である。当該分野には、細胞、特に、ＮＫ、造血幹細胞及びマクロファージの、より効率的なトランスフェクションの必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ａｌｉｃｉ，  Ｅ．，  Ｓｕｔｌｕ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｓｉｒａｃ  Ｄｉｌｂｅｒ，  Ｍ．  （２００９）．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５０６，  １２７−１３７
【非特許文献２】Ｂｒａｎｄｓｔａｄｔｅｒ，  Ｊ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，  Ｙ．  （２０１１）．  Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎ  ３，  ２７４−２７９
【非特許文献３】Ｃｌａｒｋ，  Ｋ．，  Ｐｌａｔｅｒ，  Ｌ．，  Ｐｅｇｇｉｅ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．  （２００９）．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＢＸ７９５  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＴＢＫ１  ａｎｄ  ＩｋａｐｐａＢ  ｋｉｎａｓｅ  ｅｐｓｉｌｏｎ：  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｋｉｎａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｓｅｒ−１７２  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４，  １４１３６−１４１４６
【非特許文献４】Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．Ｌ．  （２００８）．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｓｔｒｕｇｇｌｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，  ２５９−２６８
【非特許文献５】Ｐｅｇｒａｍ，  Ｈ．Ｊ．，  Ｋｅｒｓｈａｗ，  Ｍ．Ｈ．，  ａｎｄ  Ｄａｒｃｙ，  Ｐ．Ｋ．  （２００９）．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  １，  ６２３−６３０
【非特許文献６】Ｓｕｔｌｕ，  Ｔ．，  Ｎｙｓｔｒｏｍ，  Ｓ．，  Ｇｉｌｌｊａｍ，  Ｍ．，  Ｓｔｅｌｌａｎ，  Ｂ．，  Ａｐｐｌｅｑｕｉｓｔ，  Ｓ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ａｌｉｃｉ，  Ｅ．  （２０１２）．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２３，  １０９０−１１００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールとウイルスベクターを同時投与することによって細胞のトランスフェクションを改善することである。
【０００５】
本発明の目的は、（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールを投与することによって細胞内防御メカニズムをダウンレギュレートすることである。
【０００６】
本発明の目的は、（５Ｚ）−７−オキソゼアエノールを細胞に投与することによって養子細胞移入治療を改善することである。
【０００７】
本発明の目的は、（５Ｚ）−７−オキソゼアノールをウイルスベクターと共にナチュラルキラー細胞、マクロファージ及び幹細胞に投与することにより、このような細胞のトランスフェクションを改善することである。
【０００８】
本発明の目的は、ウイルスベクター及び（５Ｚ）−７−オキソゼアノールを用いてトランスフェクトされた細胞を、ヒト疾患を治療するために使用することである。
【０００９】
本発明の目的は、レンチウイルス又はレトロウイルスベースのベクターを用いて細胞を形質導入することである。
【００１０】
本発明の目的は、（５Ｚ）−７−オキソゼアエノール及びＲＮＡウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞を用いて癌及び増殖性疾患を治療することである。
【００１１】
本発明の目的は、（５Ｚ）−７−オキソゼアエノール及びＲＮＡウイルスベクターを用いてトランスフェクトされた細胞を用いて、遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患を治療することである。
【００１２】
本発明の目的は、（５Ｚ）−７−オキソゼアエノール及びＲＮＡウイルスベクターを用いてトランスフェクトされた細胞を用いて、代謝障害を治療することである。
【００１３】
本発明の目的は、ウイルス感染によって誘発される炎症を治療することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、トランスフェクションを改善し、それによりＮＫ、幹細胞及びマクロファージの増殖を強化するためにＲＮＡウイルスベクターを用いてインビトロで（５Ｚ）−７−オキソゼアエノール（ｉＸ）を細胞に投与することを含む。いかなる理論によっても制限されることを望まないが、観察された遺伝子改変の増加は、ＲＩＧ-Ｉによって媒介される細胞内防御メカニズムのダウンレギュレーションによるものと考えられる。このように処理された細胞は、癌、既知の遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患、及び既知の遺伝子突然変異によって引き起こされる代謝障害を使用するのに使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ｉＸによる先天性免疫シグナル伝達の阻害がＮＫ細胞におけるレンチウイルス形質導入効率を高めることを示す２つの棒グラフを含む。健康なドナーＰＢＭＣから単離された初代ヒトＮＫ細胞及びＮＫ９２細胞は、６μＭＢＸ７９５又はｉＸの存在下で６時間レンチウイルス形質導入を受けた。７２時間後にＧＦＰ発現が獲得される。陽性細胞パーセンテージをグラフ上に示す。
【図２Ａ】ｉＸがＮＫ細胞に対して最小の毒性で用量依存効果を有することを示すチャートである。初代ヒトＮＫ細胞及びＫ−９２細胞は、様々な用量のＢＸ７９５又はｉＸの存在下で６時間、ＬｅＧＯ−Ｇ２ウイルスで形質導入される。ＧＦＰ発現は、形質導入の７２時間後にフローサイトメトリーによって分析される。ＧＦＰ陽性細胞パーセンテージをグラフ上に示す。三つの独立した実験からのデータで、それぞれ三組行われる。
【図２Ｂ】アポトーシス細胞と死細胞をアネキシン−Ｖ＋／ＰＦ−細胞で比較する２つの棒グラフを含む。
【図３】レンチウイルス形質導入中のｉＸ処理がＲＩＧ−Ｉ及びＩＲＦ−３を減少させることを示すゲルの写真を含む。
【図４】ｉＸ処理が抗ウイルスサイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦ分泌を妨害することを示す２つの棒グラフを含む。
【図５Ａ】ｉＸ処理がＢＸ７９５と比較してユニークなトランスクリプトームシグネチャーを有することを示すグラフである。
【図５Ｂ】ｉＸ処理がＢＸ７９５と比較してユニークなトランスクリプトームシグネチャーを有することを示すグラフである。
【図６Ａ】ＢＸｘ７９５の影響を受けたとされるシグナル伝達経路を示す。
【図６Ｂ】ＢＸｘ７９５の影響を受けたとされるシグナル伝達経路を示す。
【図６Ｃ】ＢＸｘ７９５の影響を受けたとされるシグナル伝達経路を示す。
【図６Ｄ】ＢＸｘ７９５の影響を受けたとされるシグナル伝達経路を示す。
【図６Ｅ】ｉＸの影響を受けたとされるシグナル伝達経路を示す。
【図６Ｆ】ｉＸの影響を受けたとされるシグナル伝達経路を示す。
【図６Ｇ】ｉＸの影響を受けたとされるシグナル伝達経路を示す。
【図６Ｈ】ｉＸの影響を受けたとされるシグナル伝達経路を示す。
【図７】ｉＸの投与が遺伝子編集を増加させることを示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
細胞治療は、哺乳類の疾患治療のための実行可能な手段に急速になっている。残念なことに、多くの治療用途は、遺伝子が標的細胞に送達可能な低効率によって制限される。以下の方法と共にｉＸを使用すると、予期せぬ結果が得られる。これらの実験の前に、小分子がＲＩＧ-Ｉを標的とし、細胞内防御メカニズムをダウンレギュレートできることは知られていなかった。本発明を用いると、所望の遺伝子を標的細胞により容易に導入することができる。ｉＸの類似体、誘導体又は模倣物も有効であろうと考えられる。
【実施例１】
【００１７】
（材料及び方法）
（細胞株）
２９３ＦＴ細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（アメリカ合衆国ニューヨーク州グランドアイランド、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、６ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ、アメリカ合衆国ニューヨーク州グランドアイランド、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で維持された。ＮＫ９２細胞を、２０％ＦＢＳ及び１０００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が添加されたＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）培地で維持された。
（レンチウイルスベクターの作製）
ＶＳＶ−Ｇシュードタイプのレンチウイルスベクターを作製するために、１４×１０６個の２９３ＦＴ細胞をポリ−Ｄ−リジンでコートされた１５０ｍｍディッシュ（アメリカ合衆国カリフォルニア州サンノゼ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にプレーティングされた。翌日、細胞は、２５μＭクロロキン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、３０μｇのＬｅＧＯ−Ｇ２プラスミド（ドイツ、ハンブルグ、ハンブルク・エッペンドルフ大学医療センターのボリス・フェッセ教授の好意）、１５μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（アメリカ合衆国マサチューセッツ州ケンブリッジ、Ａｄｄｇｅｎｅ）、１０μｇのｐＲＳＶ−ＲＥＶ（Ａｄｄｇｅｎｅ）及び５μｇのｐｈＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）でトランスフェクトされた。トランスフェクションの１０時間後、培地を交換し、その後、上清を含むウイルスを２〜３日間２４時間毎に収集し、その後の使用まで−８０℃で保存した。各産物からの少量のアリコートが、２９３ＦＴ細胞を連続希釈した量のウイルス上清で形質導入することによってウイルス力価を決定するのに使用された。
（初代ナチュラルキラー細胞の単離及び培養）
バフィーコートは、フッディンゲのカロリンスカ大学病院の血液バンクを介して健康なドナーから得られた。実験プロトコルは、地元の研究倫理委員会によって承認された。
【００１８】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ノルウェー、オスロ、Ｎｙｅｇａａｒｄ）を用いた勾配遠心分離によって単離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（アメリカ合衆国ニューヨーク州グランドアイランド、ＧＩＢＣＯ）で２回洗浄した。細胞数及び生存率は、ターク及びトリパンブルー色素排除によって評価した。ＮＫ細胞単離キット（ドイツ、ケルン、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）及びＡｕｔｏＭＡＣＳ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、製造者の指示に従って、ＮＫ細胞を得た。単離後、ＮＫ細胞を、１０％ヒトＡＢ血清（スイス、バーゼル、Ｌｏｎｚａ）及び１０００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が添加されたＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）において、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で培養した。形質導入（図１）前のサイトカイン刺激の初期試験のために、ＩＬ−１２（アメリカ合衆国ニュージャージー州ロッキーヒルＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びＩＬ−２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。残りの実験では、１０００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２及び２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２１のみを使用した。
（ナチュラルキラー細胞のレンチウイルス形質導入）
各レンチウイルス形質導入のために、２４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にウェルあたり０．２５×１０６個のＮＫ細胞を播種し、最終容量を１ｍｌ以下で、８μｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）又はポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）下で、適量のウイルス上清と混合した。サイトカインが添加され、プレートが室温で１時間１０００Ｇで遠心分離した。遠心分離後、ウイルス上清を除去せずに、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４〜６時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、室温で１時間１０００Ｇで２回目の遠心分離を行い、その後、上清をウェルから除去し、ウェル毎に１ｍｌの新鮮なＮＫ細胞増殖培地（１０％ヒトＡＢ血清が添加されたＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ）が添加された。細胞が毎日添加するサイトカインで（ＩＬ−２：１０００Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−２１：２０ｎｇ／ｍｌ、図１に示すように、サイトカインの組み合わせを使用した。残りの実験ではＩＬ−２及びＩＬ−２１のみを使用した）、ｅＧＦＰ発現の獲得を行う前少なくとも３日間、この培地で維持された。表示された実験では、ＢＸ７９５（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）及び（５Ｚ）−７−オキソゼアエノール（ｉＸ）（Ｔｏｃｒｉｓ）の阻害剤が形質導入中に存在した。
（ＮＫ９２細胞株のレンチウイルス形質導入）
細胞株の形質導入のために、ウェルあたり２×１０５個の細胞を２４ウェルプレートに播種した。６μＭ ＢＸ７９５及び（５Ｚ）−７−オキソゼアエノール（ｉＸ）を用いた処理を、形質導入プロセスと同時に開始した。適量のウイルス上清を硫酸プロタミン（ＮＫ９２、細胞）と共にウェルに添加し、総量が５００μｌに調整された。プレートが１０００Ｇで１時間遠心分離され、３７℃、５％ＣＯ２で４〜６時間インキュベートされた後、上清を含むウイルスが除去され、新鮮な増殖培地が添加された。ｅＧＦＰ発現の獲得が行われる前の３日間、細胞が少なくとも増殖された。
（遺伝子編集）
遺伝子編集のための、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ：クリスパー）システムの最近の出現は、これらの限界を克服する可能性がある。クリスパー技術は、ヌクレアーゼを特定ＤＮＡ配列に標的化するショートガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と組み合わされて、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の固定されたヌクレアーゼ、しばしばクリスパー関連タンパク質９（Ｃａｓ９）を利用する。我々は、ｉＸ阻害剤の導入により、ｇＲＮＡ認識及び編集有効性が増加し得ることを確認した。ヒト初代マクロファージ、ＣＤ３４陽性ＨＳＣ及びＮＫ９２細胞株は、グループの半分に、我々が製造者のトランスフェクション試薬にｌｕＭ ｉＸを添加したことを除いて、製造者の指示に従って、それぞれＡｍａｘａキット及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ装置（ＣＤ３４陽性ＨＳＣ用のＶＡＰＡ−１００３、マクロファージ細胞用のＶＡＰＡ−１００８、及びＮＫ９２細胞用のＶＶＰＡ−１００５）を用いた細胞特異プログラム用いて、プラスミドをコードするＣａｓ９−２Ａ−及びｇＲＮＡでトランスフェクトされた。
【００１９】
Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから以下の市販ガイドＲＮＡがベータ２ミクログロブリンに対して試験された。GATGTCTCGCTCCGTGGCCT （配列番号１）、CTCGCGCTACTCTCTCTTTC（配列番号２）、GACTCACGCTGGATAGCCTC（配列番号３）、CAGAAAGAGAGAGTAGCGC （配列番号４）、CACAGCTAAGGCCACGGAGC（配列番号５）、GGCCGAGATGTCTCGCTCCG（配列番号６）、TTGCGGGAGCGCATGCCTTT （配列番号７）、CCACCTCTTGATGGGGCTAG（配列番号８）、ATACCTTGGGTTGATCCACT（配列番号９）、CGTGAGTAAACCTGAATCTT （配列番号１０）、AAGTCAACTTCAATGTCGGA（配列番号１１）、CATAGATCGAGACATGTAAG（配列番号１２）、GCTACTCTCTCTTTCTGGCC（配列番号１３）、ACCCAAACCAAGCCTTTCTA（配列番号１４）、及びTATAAGTGGAGGCGTCGCGC （配列番号１５）。トランスフェクション後４８時間、抗Ｂ２Ｍ抗体（クローン：２Ｍ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で細胞が染色され、β２ｍ発現の消失を比較した。次に、後述するように、フローサイトメトリーを用いて細胞を分析した。
（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーのための全ての抗体染色は、以下のプロトコルに従って行った。即ち、表面染色のために、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４℃で３０分間適量の抗体でインキュベートした。次いで、ラベルされた細胞をＰＢＳで洗浄し、データ取得前に１％ＰＦＡに固定した。データ収集は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣｙＦｌｏｗ  ＭＬ（ドイツ、マンスター、Ｐａｒｔｅｃ  ＧｍｂＨ）及びＬＳＲＩＩ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標準フィルターを用いて行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いてデータを解析した。ＮＫ細胞に使用される抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来のＣＤ５６（ＮＣＡＭ１６．２）、ＣＤ５６（Ｂ１５９）、ＣＤ３（ＳＫ７）、ＣＤ３（ＳＰ３４−２）であった。
（結果と考察）
（細胞内先天性免疫センサー経路の阻害は、ＮＫ細胞におけるレンチウイルス遺伝子送達効率を高める。）
我々は、ウイルスベクター成分の先天性免疫センサー媒介検出が、ＮＫ細胞における抗ウイルス応答を活性化し、レンチウイルス形質導入の効率に悪影響を及ぼすことを示した。我々は、成功裏にレンチウイルス形質導入中の先天性免疫シグナル伝達の小分子阻害剤を、抗ウイルス応答を不活性化又は減少させるために使用した。
【００２０】
以前に報告したように（非特許文献６）、ＢＸ７９５の使用は、ＮＫ細胞の形質導入効率を劇的に増加させる。ＢＸ７９５は、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５及びＴＬＲ３のシグナル伝達経路において共通のメディエーターとして作用するΤＢΚＩ／ＩＫΚε複合体の阻害剤である（非特許文献３）。このため、レンチウイルスＲＮＡがこれらの受容体の一以上によって認識され、抗ウイルス応答が誘発され、ＢＸ７９５の使用によって阻害され得ることを述べることが可能であろう。
【００２１】
ここで我々は、ＴＡＫ１阻害剤ｉＸの使用が、ＢＸ７９５と比較した範囲までＮＫ細胞へのレンチウイルス遺伝子送達を強化することを示す。レンチウイルス形質導入中に６μＭ濃度で使用されると、ｉＸは、初代ヒトＮＫ細胞及びヒトＮＫ細胞株ＮＫ−９２の両方への遺伝子送達において統計的に有意な改善を与える（図１）。
【００２２】
つまり、これらの結果は、形質導入中、細胞内抗ウイルス防御メカニズムが活性化され、レンチウイルス遺伝子改変に対するＮＫ細胞の耐性に有意に寄与するという仮説を支持する。小分子阻害剤を用いたこの応答阻害は、遺伝子送達効率を有意に高める。
【００２３】
我々は、ｉＸが、造血幹細胞、マクロファージ及びＮＫ細胞における遺伝子編集有効性を増加させることを示した。短期間で１μＭレベルでｉＸを試験することは、３つの細胞種類の全てにおいてβ２Ｍ編集を有意に増加させた。結果を図７（ｎ＝４）にまとめる。
（ｉＸは、ＮＫ細胞に対して最小の毒性で用量依存効果を示す。）
異なる濃度のｉＸを試験することにより、以前にＢＸ７９５について示されたように、阻害剤がＮＫ細胞において増加する遺伝子改変効率に対する用量依存効果を有することが示された（図２Ａ）。ｉＸに対して、既に０．５μＭの濃度で有意な効果が見られるが、この効果は更に１．５μＭまで増加し、その後安定するように見える。ＢＸ７９５と比較して、ｉＸはより低用量でより良く機能し、レンチウイルス遺伝子送達効率をかなり高い程度まで高める。
【００２４】
注目すべきことに、最適濃度でｉＸを使用すると、ＢＸ７９５処理後のアネキシン−Ｖ／ＰＩ染色によって決定されるように、ＮＫ細胞に直接的な毒性効果を示さない（図２ｂ）。１．５μＭの最適用量では、ＤＭＳＯ制御と比較すると、ｉＸはＮＫ細胞にあまり毒性を示さない。１．５μＭでは、ＢＸ７９５も同様に毒性を示さないが、６μＭの最適用量では、培養物中のアポトーシス細胞及び死細胞で、非常に小さいが統計的に有意な増加が観察される。逆に、６μＭの濃度でも、ｉＸに対してＮＫ細胞への即時毒性の徴候は観察されなかった。
【００２５】
つまり、これらの結果は、ｉＸがレンチウイルス遺伝子送達効率を高める際にＢＸ７９５よりも効率的であるだけでなく、細胞に対して有意に毒性が低いことを示している。
（レンチウイルス遺伝子伝達中のｉＸ処理は、ＲＩＧ−１及びＩＲＦ３をダウンレギュレートする。）
レンチウイルス形質導入中の先天性免疫シグナル伝達に対する阻害剤の効果をより良く特徴付けるために、我々は、ウイルスＲＮＡセンサー分子ＲＩＧ−Ｉ及びＲＩＧ−Ｉのダウンストリームで作用する転写ファクターＩＲＦ３の発現を解析した。これらの遺伝子の変化発現は、６時間の形質導入期間後にタンパク質レベルで検出できなかったが、ＢＸ７９５及びｉＸの使用に起因するＲＩＧ−１及びＩＲＦ３発現の両方で有意な減少が２４時間で観察された（図３）。
【００２６】
更に、我々は、ＢＸ７９５の使用と比較して、ｉＸを使用した場合、ＲＩＧ−Ｉ及びＩＲＦ３におけるダウンレギュレーションの程度が有意に大きかったことを観察した。これは、レンチウイルスの遺伝子送達を強化する上で、ｉＸがＢＸ７９５よりも優れた性能を示す根拠となり得る。
（レンチウイルス遺伝子送達中のｉＸ処理は、ＩＦＮγ及びＴＮＦ応答を抑制する。）
ｉＸによって誘発される優れたレンチウイルス遺伝子送達を支持するメカニズムを更に特徴付けるために、ＢＸ７９５及びｉＸの存在下で、レンチウイルス粒子に曝した際のサイトカイン媒介応答を試験した。レンチウイルス遺伝子送達中にｉＸで処理されたＮＫ９２細胞は、既に６時間で抗ウイルス性サイトカインＩＦＮγの分泌を有意に減少させたが、ＢＸ７９５はレンチウイルス粒子に曝した２４時間後に同様の効果を有意に誘発するだけであった。（図４）。更に、他の抗ウイルスサイトカインＴＮＦについても同一設定において同様の傾向が観察された。（図４）。全体として、レンチウイルス遺伝子送達中にｉＸを使用することは、ＢＸ７９５よりも優れており、これは、ＲＩＧ−Ｉ経路及びダウンストリームシグナル伝達分子ＩＲＦ−３の不活性化のためであり、危険なシグナル、抗ウイルスサイトカインの分泌を低下させる。（図４）。
（ｉＸ及びＢＸ７９５は、差次的遺伝子発現プロファイルを有する。）
小分子阻害剤の非存在下及び存在下におけるレンチウイルス侵入によって誘発される経路を同定するために、ＲＮＡｓｅｑによる遺伝子発現プロファイリングが評価される。ＮＫ−９２細胞は、前述のように形質導入される。６時間の形質導入プロトコルの終わりに、細胞由来のＲＮＡがＨｉＳｅｑ２５００装置で抽出、配列決定される。品質管理後、ＳＴＡＲアライナーを用いて読み取りがヒトゲノムにマッピングされ、遺伝子存在量をＨＴ−Ｓｅｑで推定される。差次的発現は、ＤｅＳｅｑソフトウェアを用いて解析される。簡潔には、ｉＸ及びＢＸ７９５の前処理は、異なるｍＲＮＡプロファイルをもたらした。（図５）。更に、以前のインビトロ実験に沿って、レンチウイルス遺伝子送達中のｉＸ処理は、ＴＮＦ、ＩＦＮ及びパターン認識経路（図６Ｅ〜Ｈ）等の抗ウイルス応答に関連する経路に影響を与えたが、ＢＸ７９５は同様の抗ウイルス応答をｍＲＮＡレベルで十分抑制できなかった（図６Ａ〜Ｄ）。
【実施例２】
【００２７】
（インビボ投与）
細胞内ＲＮＡ認識経路に対するｉＸの固有の抑制効果及び制御不能なウイルス感染に対する感受性の増加のために推奨されていないが、ｉＸは、０．２〜６ｍＭの血清濃度でインビボ遺伝子送達に使用できる。ｉＸは、当該分野で既知の技術を使用して、注射、経口、経鼻又は粘膜送達によって投与可能である。ｉＸの潜在的治療用途は、腫瘍再標的化遺伝子に加えて、癌、肝臓遺伝子治療、単一遺伝子障害、記憶障害が挙げられる。
【００２８】
本発明で治療可能な癌は、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、及び芽細胞腫、即ち、急性リンパ芽球性白血病（全て）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連癌、肛門癌、星細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管癌（胆管癌）、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳癌、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫、乳癌、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、軟骨肉腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚ｔ−細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外、性腺外又は卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹のグリオーマ、小児大脳星細胞腫神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、急性リンパ芽球性白血病（急性リンパ性白血病とも呼ばれる）、急性骨髄芽球性白血病（急性骨髄性白血病）、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、ヘアリーセル白血病、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、マクログロブリン血症、ワルデンストローム、男性の乳癌、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫（骨髄癌）、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、乏突起膠腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、上皮性卵巣癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体芽細胞腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、腎盂尿管移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、メラノーマ及び非メラノーマ皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明扁平上皮頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫及びセザリー症候群）、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視経路グリオーマ及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍（腎臓癌）を含む。
【００２９】
本発明は、２１−ヒドロキシラーゼ欠損症、軟骨無形成症、急性間欠性ポルフィリン症、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アラジール症候群、アレクサンダー病、アルストレーム症候群、遺伝性エナメル質形成不全症、ビオチニダーゼ欠損症、ＣＧＤ慢性肉芽腫性疾患、ディジョージ症候群、ファンコニ貧血、Ｇ６ＰＤ欠損、リポ蛋白リパーゼ欠損症、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型、シデリアスＸ連鎖性精神遅滞症候群（ＰＨＦ８遺伝子の変異によって引き起こされる）、X連鎖重症複合免疫不全（Ｘ−ＳＣＩＤ）、X連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）等の遺伝性疾患の治療にも有効である。
【００３０】
本発明で治療可能な代謝性疾患は、ニーマン・ピック病、テイ・サックス病、ゴーシェ病、ファブリー病を含む。
【実施例３】
【００３１】
（養子細胞移動）
最も好ましい使用において、ｉＸは、患者への養子細胞移動前に細胞を処理するために使用される。上記プロトコルを使用すると、エクスビボ操作中にいつでもｉＸを使用することができる。培養範囲におけるｉＸの好ましい濃度は、約０．４ｍＭ〜約１０ｍＭである。最も好ましくは、０．５ｍＭ〜６ｍＭである。これらの細胞は、それにより、当技術分野で周知のプロトコルを使用して、後の注入時間点で直ちに注入又は凍結可能である。ｉＸ投与は、インビボ及びエクスビボの両方で、単回用量として又は用量ウィンドウを用いて繰り返しなされることができ、阻害剤の血清濃度は０．４乃至６μＭ、優先的により低い用量であってもよい。そのような養子細胞移入を用いて、上記の実施例２に記載の状態を治療することができる。
【実施例４】
【００３２】
（ウイルス性炎症の治療）
本発明は、筋炎、心筋炎、ウイルス性関節炎、ウイルス性脳炎及び髄膜炎等のウイルス感染によって引き起こされる炎症を患っている患者を治療するために使用することもできる。このような疾患において、免疫系によるウイルスの認識を低減又は停止し、それによって炎症を軽減、予防又は排除するために、ｉＸを抗ウイルス療法と同時投与することができる。これは、免疫応答に依存しない又は完全に利用しない抗ウイルス療法と共に使用可能である。そのような抗ウイルス剤は、アマンダチン及びリマンチジン等のアダマンタン抗ウイルス剤、リトナビル及びコビシスタット等の抗ウイルスブースター、マラビロク等のケモカイン受容体アンタゴニスト、マラビロク、ドルテグラビル及びエルビテグラビル等のインテグラーゼ鎖転移阻害剤、ソホスブビル、エンフビルチド、ホスカルネット、ホミビルセン等のその他の抗ウイルス剤、ペルミビル、オセルタミビル及びザナミビル等のノイラミニダーゼ阻害剤、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン及びリルピビリン等の非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ダクラタビル等のＮＳ５ａ阻害剤、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン及びエンテカビル等のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＲＴＩＳ）、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホサンプレナビル、チプラナビル及びダルナビル等のプロテアーゼ阻害剤、リバビリンバラシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル及びシドフォビル等のプリンヌクレオシドを含む。これらの薬物の単独又は組み合わせの用量指示は、当該技術分野において周知である。
【実施例５】
【００３３】
（ＲＮＡウイルス療法のインビボ効力の増加）
本発明は、インビボ投与されると、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、セネカウイルス、ＥＣＨＯウイルス、例えば、膀胱癌、脳腫瘍、婦人科腫瘍、肝細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、前立腺癌、軟部組織肉腫及び固形腫瘍のような適応症のためのＲＩＧＶＩＲ等のＲＮＡウイルスベースの腫瘍溶解性ウイルス療法のインビボ有効性を増加させるのにも有用である。ｉＸは、細胞内抗ウイルス防御メカニズムを阻害し、腫瘍内の腫瘍溶解性ウイルスの分布有効性を高めるのに役立つであろう。ｉＸのインビボ投与のための標的血清レベルは、０．２乃至６ｍＭである。
【００３４】
このように、本発明の好ましい実施形態であると現在考えられていることが記載されているが、当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく、他のそして更なる実施形態が可能であり、本明細書に記載された特許請求の範囲の真の範囲内にあるそのような更なる改変及び変更の全てを含む。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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