(57)【要約】  本発明は、巨核球または巨核球前駆細胞からの高収率および高品質の血小板産生のために、薬理学的物質の特徴およびマイクロ流体装置の特徴の組み合わせを含む血小板産生のための生体外方法に関する。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球から血小板を産生する生体外方法であって、
（ａ）（ｉ）非多孔質壁、（ｉｉ）一端に入口開口部、および（ｉｉｉ）他端に出口開口部、により画定された少なくとも１つのチャネルを含む産生チャンバを有する流体装置を準備し、
（ｂ）巨核球または巨核球断片を含む細胞懸濁液を前記チャネルの前記入口開口部に導入し、
（ｃ）前記チャネル内が巨核球伸長および巨核球断片化並びに血小板放出に適したずり速度の条件下で、前記細胞懸濁液を前記チャネルの入口から出口へのフローへさらし、
（ｄ）前記チャネルの前記出口で血小板を収集し、
前記細胞懸濁液には少なくとも１つの巨核球調節因子化合物が添加され、前記巨核球調節因子化合物は、
ｉ．Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ経路阻害剤と、
ｉｉ．ＭＬＣＫ経路阻害剤と、
ｉｉｉ．サーチュイン経路阻害剤と、
ｉｖ．ＮＭＭＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤と、
ｖ．微小管構築調節因子と、
を含むグループから選択される、方法。
【請求項２】
前記流体装置の前記チャネルは、巨核球への結合親和性を有するリガンドでコーティングされ、前記リガンドは、（ｉ）フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ：von Willebrand factor）またはその機能的変異体、（ｉｉ）フォン・ヴィレブランド因子の断片を含むポリペプチド、（ｉｉｉ）フィブリノゲン、または（ｉｖ）フィブロネクチン、を含む、  請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記巨核球または前記巨核球断片を含む前記細胞懸濁液は、
（ｉ）巨核球前駆細胞および／または幹細胞としてヒト臍帯血からのＣＤ３４＋を準備し、
（ｉｉ）前記巨核球前駆細胞および／または幹細胞を培養して、前記巨核球前駆細胞および／または幹細胞を増殖させ、増殖させた前記巨核球前駆細胞および／または幹細胞を巨核球へ分化させ、
（ｉｉｉ）培地から除去するために前記巨核球前駆細胞および／または幹細胞を洗浄し、
（ｉｖ）前記巨核球前駆細胞および／または幹細胞をかん流培地に再懸濁させること、
により得られ、
前記巨核球調節因子化合物は、（ｉｉｉ）前記洗浄した後に添加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記巨核球前駆細胞および／または幹細胞は、前記チャネルの前記出口で収集され、
前記チャネルにおける再かん流および血小板産生のために前記チャネルの前記入口に再導入される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記チャネルの前記入口に再導入する前に、収集された前記巨核球前駆細胞および／または幹細胞を成熟させて巨核球になるように培養される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記流体装置の前記チャネルは、正方形または長方形の断面を有する請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記チャネルは、５μｍから１ｍｍの間、好ましくは、２５μｍから１００μｍの間の高さ、および、１００μｍから５ｍｍの間、好ましくは、３００μｍから８００μｍの間の幅を有する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記産生チャンバは、２個から１０６個の間のチャネル数の複数の並列チャネルを有する請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞懸濁液は、少なくとも３００ｓ-1、好ましくは、少なくとも６００ｓ-1、さらに好ましくは、少なくとも１０００ｓ-1のずり速度下、３００ｓ-1から５０００ｓ-1の間、または、６００ｓ-1から２４００ｓ-1の間のずり速度下で、前記チャネルのフローにさらされる請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法により得られた、または、得ることができる血小板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨核球調節因子化合物（megakaryocyte modulator compounds）の使用と、高収率および高品質の血小板産生に適したマイクロ流体デバイス（microfluidic device）の特徴と、の組み合わせを含む血小板産生の生体外（ex vivo）方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、出血を止めるために重要な小さな無核細胞である。血小板の産生または機能が損なわれる多くの臨床的疾患が存在する。さらに、血小板輸血を必要とする患者の数が増加している。現在、解決策は、献血者から得られた血小板の輸血を行うことにある。
治療への応用のための生体外血小板産生は、魅力的な選択肢であるが、依然として大きな技術的課題がある。
【０００３】
血小板は巨核球に由来する。巨核球の分化は、連続ステップを特徴とする連続的な過程である。巨核球の分化は、骨髄で起こるが、血小板産生は、巨核球の断片が骨髄の血管を通過することを必要とする。血小板産生専用のバイオリアクタ（bioreactors）の設計が、試みられている。
【０００４】
巨核球から血小板を産生するために、異なる設計のバイオリアクタが自然の骨髄環境を再現すると考えられていた。
【０００５】
Pallottaら（Tissue Engineering: Part C, Vol. 17, n°12, 1223-1232, 2011）は、骨髄環境の最初の空間再構成を表す３Ｄシステムを報告した。このシステムでは、細胞の断片は、それらが埋め込まれた足場からポロシティ（porosity）またはチューブを介して流動チャネルに自由に移動する。最近では、Di Buduoら（Blood, Vol. 125, Issue 14, 2254-2264, 2015）は、以前のモデルの完全な再設計を行った。彼らは、以前のモデルに対して改善されたヒト骨髄ニッチ環境（human bone marrow niche environment）の生理を完全に再現するために、多孔質絹（porous silk）製の３Ｄ骨髄モデルを設計した。Nakagawaら（Experimental Hematology, Vol. 41, n°8, 742-748, 2013）は、最近、血小板産生のための毛細血管を模倣する２つのバイオリアクタを開示した。これらのシステムでは、特定の方向のフロー（流れ）が圧力およびせん断応力を加え、巨核球は多孔質構造に閉じ込められ、そこで血小板を放出する。血小板は、別の方向の流れのおかげで多孔質構造の出口に集められる。
【０００６】
Thonら（Blood, Vol. 124, n°12, 1857-1867, 2014）は、スリットで孔を開けられた壁の存在を含む、生体外骨髄構造を再現する別のバイオリアクタを開示している。巨核球は、スリットから押し出され、メインフローと接触させられ、せん断応力にさらされる。このようなシステムでは、巨核球に利用可能なスリットの数は限られており、多くの細胞は、リザーバ（reservoir）に留まり、最初のものは伸長し、血小板を放出する。これは、血小板産生プロセスの速度を制限する。
【０００７】
これらのバイオリアクタの設計は、特に、多孔質壁を通過する際の巨核球の潜在的な目詰まりを考慮すると、急速な大規模産生には効率的ではない。欧州特許出願ＥＰ２０１４０７４９０５は、巨核球または巨核球の断片を含む細胞懸濁液をその入口から出口までのフローに導入することができるいくつかのチャネルからなる産生チャンバを含む巨核球の懸濁液から血小板を産生するための別の流体装置を開示する。流体装置のチャネルは、目詰まりを起こすことなく巨核球捕捉を増加させる障害物の３次元配列により有利に特徴付けられる。同様のフローを適用して巨核球を装置に通し、それらをせん断応力にさらすと、血小板前駆体形成および血小板産生の増加を引き起こす。巨核球を産生チャンバに連続的に投入することができるので、前提技術の多孔質膜システムとは反対に産生速度に制限はない。
【０００８】
そのような試験管内（in vitro）産生システムの収率を改善する必要性が依然として存在している。
【０００９】
血小板産生の出発物質は、成熟巨核球を含む細胞懸濁液である。前提技術は、巨核球の増殖および巨核球の分化の間に特定の薬理学的物質が培地に添加される場合に、倍数化および血小板前駆体の膨張（expanding）におけるそのような物質の効果を開示している。例えば、Changら（Blood, Vol. 109, n°10, 4229-4236, 2007）は、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ２：myosin light chain 2）のリン酸化反応は、ＲＯＣＫキナーゼおよびＭＬＣキナーゼの両方によって調整され、血小板形成および血小板断片化を制御することにより血小板発生において重要な役割を果たすことを示唆している。Avanziら（British Journal of Haematology, Vol. 164, 867-876, 2014）は、ＲＯＣＫ阻害が分離膜システム（ＤＭＳ：demarcation membrane system）形成を促進し、静止巨核球成熟の終わりにおいて、血小板前駆体形成および血小板放出を増加させることを確認した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第８０９３２６６号明細書
【特許文献２】米国特許第８５４１４４９号明細書
【特許文献３】米国特許第８６０４２１８号明細書
【特許文献４】米国特許第８６９７９１１号明細書
【特許文献５】米国特許第８７９６４５８号明細書
【特許文献６】米国特許第９０００１５４号明細書
【特許文献７】米国特許第２６５６５０８号明細書
【特許文献８】国際公開第２０１０／０６３８２３１１号
【発明の概要】
【００１１】
しかしながら、本発明とは反対に、そのような薬理学的物質の効果は、せん断応力条件下の流体装置における成熟巨核球の試験管内かん流中には決して観察されなかった。
【００１２】
本発明者らは、驚くべきことに、巨核球前駆体の倍数化において作用する化合物として以前から知られている化合物が、せん断応力条件下の流体装置における巨核球懸濁液のかん流を含む血小板産生の生体外方法のかん流段階においてのみ添加された場合、産生された血小板の量および質に影響を及ぼすことを発見した。産生血小板の収率は、著しく改善される。さらに、そのような巨核球調節因子化合物を用いた生体外方法により得られた血小板は、ヒト血小板により密接に似ている。
【００１３】
かん流段階におけるこのような化合物のこれらの効果は、巨核球前駆体の膨張および分化中の培養段階で観察される倍数化効果とは異なる。
【００１４】
本発明は、第１に、巨核球から血小板を産生する生体外方法に関し、当該方法は、
ａ）巨核球または巨核球断片を含む細胞懸濁液を提供し、
ｂ）流体装置のチャネルに前記細胞懸濁液を導入し、
ｃ）巨核球の伸長および断片化並びに血小板放出に適したずり速度（shear rate）を有するフローにチャネル中の前記細胞懸濁液をさらし、
少なくとも１つの巨核球調節因子化合物を前記細胞懸濁液に添加され、前記巨核球調節因子化合物は、巨核球倍数性を増加させる際に直接的または間接的に関与する化合物および／または細胞骨格構築（cytoskeleton organization）に関与する化合物である。
【００１５】
実施形態において、前記巨核球調節因子化合物は、
（ｉ）Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ経路の阻害剤、
（ｉｉ）ＭＬＣＫ経路の阻害剤、
（ｉｉｉ）サーチュイン経路の阻害剤、
（ｉｖ）ＮＭＭ  ＩＩ  ＡＴＰａｓｅの阻害剤、および
（ｖ）微小管組織化調節剤、
（ｖｉ）細胞骨格シグナル伝達阻害剤、
（ｖｉｉ）マトリックスメタロプロテナーゼ阻害剤、
を含むグループから選択される。
【００１６】
他の実施形態において、流体装置の前記チャネルは、巨核球への結合親和性を有するリガンドでコーティングされ、リガンドは、例えば、（ｉ）フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ：von Willebrand factor）またはその機能的変異体、（ｉｉ）フォン・ヴィレブランド因子の断片を含むポリペプチド、（ｉｉｉ）フィブリノゲン、または（ｉｖ）フィブロネクチン、である。
【００１７】
好ましくは、本発明の上記方法で使用する巨核球または巨核球断片の前記細胞懸濁液は、以下：
ａ）巨核球前駆体および／または幹細胞、例えば、ヒト臍帯血からのＣＤ３４＋細胞を提供し、
ｂ）前記巨核球前駆体をおよび／または幹細胞を培養して細胞を膨張させ、膨張した細胞を巨核球に分化させ、
ｃ）細胞を洗浄して培地を除去し、
ｄ）かん流培地中で当該細胞を再懸濁する、
ことにより得られる。
【００１８】
前記実施形態のいずれかと組み合わされる実施形態において、細胞は、チャネルの出口で収集され、チャネルにおける再かん流および血小板産生のためにチャネルの入口に再導入される。前記実施形態と組み合わされた実施形態において、収集された細胞は、チャネルの入口に再導入される前に、成熟させて巨核球になるようにさらに培養される。
【００１９】
前記実施形態のいずれかと組み合わされる他の実施形態において、本発明の方法は、
（ａ）（ｉ）非多孔質壁、（ｉｉ）一端に少なくとも１つの入口開口部、および（ｉｉｉ）他端に少なくとも１つの出口開口部、により画定された少なくとも１つのチャネルを含む産生チャンバを有する流体装置を準備し、前記チャネルの前記壁の内壁の少なくとも一部は、巨核球に対して親和性を有するリガンド、例えば、（ｉ）フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）またはその機能的変異体、（ｉｉ）フォン・ヴィレブランド因子の断片を含むポリペプチド、フィブリノゲン、または（ｉｖ）フィブロネクチン、でコーティングされており、
（ｂ）巨核球または巨核球断片を含む細胞懸濁液をチャネルの入口開口部に導入し、
（ｃ）前記チャネルにおける巨核球の伸長および断片化並びに血小板放出に適したずり速度の条件下で、前記チャネルの入口から出口へのフローに前記懸濁液をさらし、
（ｄ）チャネルの出口で血小板を収集し、
前記細胞懸濁液に前記巨核球調節因子化合物を添加する方法である。
【００２０】
前記実施形態のいずれかと組み合わされる他の実施形態では、流体装置の前記チャネルは実質的に正方形または長方形の断面を有する。前記実施形態のより具体的な実施形態では、前記チャネルは、高さＨを有し、高さＨは、５μｍから１ｍｍの間の値、好ましくは、２５μｍから１００μｍの間の値であり、幅は、１００μｍから５ｍｍの間の値、好ましくは、３００μｍから８００μｍの間の値である。
【００２１】
他の実施形態では、前記産生チャンバは、複数の平行チャネルを有し、例えば、その数は、２個から１０６個の間のチャネル数である。
【００２２】
前記実施形態のいずれかと組み合わされる他の実施形態では、前記細胞懸濁液は、チャネルで少なくとも３００ｓ-1、好ましくは、少なくとも６００ｓ-1、より好ましくは、少なくとも１０００ｓ-1、のずり速度の条件下のフローにさらされ、例えば、そのずり速度は、３００ｓ-1から５０００ｓ-1の間、または６００ｓ-1から２４００ｓ-1の間の値である。
【００２３】
前記実施形態と組み合わされる他の実施形態において、前記方法は、
ａ）（ｉ）非多孔質壁、（ｉｉ）一端に少なくとも１つの入口開口部、および（ｉｉｉ）他端に少なくとも１つの出口開口部、により画定された少なくとも１つのチャネルを含む産生チャンバを有する流体装置を準備し、前記チャネルの壁の内面の少なくとも一部の複数の障害物がテクスチャ加工（textured）されており、
ｂ）巨核球または巨核球断片を含む細胞懸濁液をチャネルの入口開口部に導入し、
ｃ）前記チャネルの入口から出口へのフローに前記懸濁液をさらすことにより、前記チャネルにおける巨核球の伸長および断片化並びに血小板放出に適したずり速度を生成し、
ｄ）チャネルの出口で血小板を収集し、
前記細胞懸濁液に前記巨核球調節因子化合物を添加する方法である。
【００２４】
前記実施形態の他の実施形態において、障害物の密度、大きさ（サイズ）および形状は、血小板脱落（shedding）のためのチャネルの内面の前記テクスチャ加工部分で巨核球の捕捉が可能となるように決定される。
【００２５】
例えば、上記実施形態において、前記障害物は、ポスト（posts：くい、棒、柱）またはビーム（beams：梁、桁）である。例えば、障害物は、半径ｒの実質的に円形の断面を有するポストであり、前記ポストは、前記チャネルの少なくとも一部の内面に配置され、六角形の周期構造を有する規則的なパターンを形成し、
（ｉ）ポストの半径ｒは、好ましくは、５０ｎｍから１５ｍｍの間、より好ましくは、５００ｎｍから１．５ｍｍの間の値であり、
（ｉｉ）２つのポストの中心間の最も近い距離ｐは、少なくとも１００ｎｍ、好ましくは、１００ｎｍから５０ｍｍの間の値、より好ましくは、５００ｎｍから１０ｍｍの間の値、さらに好ましくは、５μｍから１ｍｍの間の値、に等しく、
（ｉｉｉ）チャネルの縦方向により規定される最小角度である角度α、および、六方晶系のブラベー格子の格子ベクトルのうちの１つ、例えば、αは、０°から９０°の間、好ましくは、０°から３０°の間であり、
（ｉｖ）任意に、前記ポストは、０＜ｈ≦Ｈのような高さｈを有し、Ｈは、チャネルの断面における２つの対向する壁の間で計測される最小距離である。
【００２６】
上記方法のさらに好ましい実施形態において、前記チャネルは、複数の障害物がテクスチャ加工され、２つの障害物間の縦方向および／または横方向の距離は、フロー方向に対して減少し、結果として、チャネル内の障害物の密度が高まる。
【００２７】
本発明はさらに、巨核球から血小板を産生するための生体外方法であって、前記方法は、
ａ）巨核球または巨核球断片を含む細胞懸濁液を提供し、
ｂ）流体装置のチャネルに前記細胞懸濁液を導入し、
ｃ）チャネル中の前記細胞懸濁液を巨核球の伸長および断片化並びに血小板放出に適したずり速度を有するフローにさらし、前記細胞をチャネルの出口で収集し、血小板産生用のチャネルの入口に再導入する、
ことを含む。
【００２８】
細胞の再循環ステップを含むこのような方法の実施形態において、前記収集された細胞は、チャネルの入口に再導入する前に、成熟させて巨核球になるように培養される。
【００２９】
本発明はさらに、上記方法によって得られたまたは得られる血小板に関する。
【００３０】
本発明はまた、巨核球または巨核球断片を含む細胞懸濁液から血小板を産生する流体装置に関し、当該装置は、（ｉ）非多孔質壁、（ｉｉ）一端に少なくとも１つの入口開口部、および（ｉｉｉ）他端に少なくとも１つの出口開口部、により規定される少なくとも１つのチャネルを含む産生チャンバを含み、前記チャネルの壁の内壁の少なくとも一部に複数の障害物がテクスチャ加工され、前記障害物の密度、大きさおよび形状は、血小板脱落のためのチャネルの内面の前記テクスチャ加工部分で巨核球の捕捉が可能となるように決定され、２つの障害物間の縦方向および／または横方向の距離は、チャネルの入口から出口へのフロー方向に対して減少し、結果として、障害物の密度が高まる。
【００３１】
本発明はまた、上述したように障害物の密度が高まる流体装置で巨核球を含む細胞懸濁液をかん流するステップを含む血小板産生方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の第１実施形態は、巨核球または巨核球断片から血小板を産生する生体外方法に関し、前記生体外方法は、
巨核球または巨核球断片を含む細胞懸濁液を提供し、
流体装置のチャネルに前記細胞懸濁液を導入し、
巨核球の伸長および断片化並びに血小板放出に適したずり速度下のフローに前記懸濁液をさらし、
少なくとも１つの巨核球調節因子化合物が前記細胞懸濁液に添加され、前記巨核球調節因子化合物は、巨核球倍数性を増加させる際に直接的または間接的に、および／または細胞骨格構築に関与する化合物である。
【００３３】
本明細書において、「血小板」という用語は、血栓の形成をもたらす一次止血の細胞機構に関与する無核細胞をいう。
【００３４】
本明細書において、「血小板前駆体」という用語は、巨核球または巨核球断片、例えば、細胞質結合血小板様粒子の任意の構造形態をいう。構造形態は、根粒（nodules）、ビーズ（beads）などの様々な形成段階における血小板体を包含する膨潤（swellings）を含む長い細胞質（long cytoplasmic）の伸長（extensions）、突起または偽足を有する細胞を含むが、これらには限定されない。
【００３５】
本明細書において、「巨核球」という用語は、正常止血に必要な血小板の産生を担う骨髄細胞をいう。巨核球は、巨核球系統に限定された造血前駆細胞に由来する。巨核球産生の最初のシグナルは、トロンボポエチンまたはＴＰＯである。ＴＰＯは、最終巨核球表現型に向かって骨髄の前駆細胞の分化を誘導するために必要である。巨核球分化の他の分子シグナルは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｆｌｔ−３リガンドおよびＳＣＦを含む。巨核球前駆細胞は、試験管内培養により得られる。
【００３６】
血小板産生の生体外方法は、２つの主要段階により特徴付けられる。
【００３７】
以下、「培養段階」と呼ばれる第１段階は、巨核球への増殖、分化および成熟のために巨核球前駆細胞および／または幹細胞を培養することを含む。
【００３８】
以下、「かん流段階」と呼ばれる第２段階は、血小板放出のための流体装置において巨核球または巨核球断片を含む細胞懸濁液をかん流することを含む。
【００３９】
典型的には、培養段階の後、細胞を洗浄して培地を除去し、かん流培地に再懸濁する。
【００４０】
かん流段階は、巨核球を伸長および断片化し、それらから血小板を放出させることを目的とする。
【００４１】
＜血小板産生方法に用いる巨核球を含む細胞懸濁液の調製＞
血小板産生方法に用いる巨核球を含む細胞懸濁液は、好ましくは、以下により得られる。
（ｉ）巨核球前駆細胞および／または幹細胞、例えば、臍帯血からのＣＤ３４＋細胞を提供し、
（ｉｉ）細胞を増殖させ、および増殖した細胞を巨核球へ分化させるために前記巨核球前駆細胞および／または幹細胞を培養し、
（ｉｉｉ）必要に応じて、細胞を洗浄して培地を除去し、かん流培地に再懸濁させること、
を含む。
【００４２】
上記（ｉ）について、巨核球前駆細胞は、典型的には、造血幹細胞（例えば、臍帯血、末梢血または骨髄）、または胚性幹細胞と人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）とを含むグループから選択される幹細胞から選択される。
【００４３】
上記（ｉｉ）は、かん流段階で用いるための十分な量の成熟巨核球をまたは十分な量の成熟巨核球断片を得ることを目的とし、培養段階の必須のステップを構成する。
【００４４】
前駆細胞または幹細胞からの巨核球産生の詳細については、例えば、Balduiniら(J Thromb Haemost, Vol. 6, 1900-1907, 2008)、またはTakayamaら(The Journal of Experimental Medicine, Vol. 207, 2817-2830, 2010)に開示されています。最近では、Nakamuraら(Cell Stem Cell, Vol. 14, 1-14, 2014)は、凍結保存後でも長期間にわたって培養で増殖することができる安定した不死化巨核球前駆体細胞株を有するｉＰＳ細胞からの新しい培養の改良を確立した。Fengら(Stem Cell Reports, Vol. 3, 1-15, 2014)は、拡張性のある方法で、ｉＰＳ細胞から巨核球を産生する再生可能な細胞源を開発した。それらの方法は、巨核球前駆細胞の凍結保存を可能にする。
【００４５】
培養段階は２４時間以上、例えば、２日から８週間の間続く。
【００４６】
特定の実施形態においては、例えば、Avanziら(British Journal of Haematology, Vol. 164, 867-876, 2014)に記載されているように、巨核球倍数性および／または血小板前駆体産生を改善するために、次のセクションで説明されるような１つ以上の巨核球調節因子化合物が培養段階で培地に添加される。他の実施形態においては、巨核球調節因子化合物は、培養段階では添加されない。
【００４７】
典型的には、上記方法の（ｉｉｉ）において、流体装置においてかん流される巨核球を含む細胞集団が（例えば、培地の遠心分離および廃棄によって、培地の成分の大部分を除去するために）洗浄され、次のセクションで説明される少なくとも１つの巨核球調節因子化合物を含む、適切なかん流培地で再懸濁される。他の実施形態において、前記かん流培地は、必要に応じて、α−モノチオグリセロール（α-monothioglycerol）およびリポソーム（liposomes）や、次のセクションで説明される少なくとも１つの巨核球調節因子化合物を補充された、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ：Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）で濾過された（filtered）ものである。
【００４８】
かん流段階で用いられる懸濁液は、好ましくは、巨核球の大部分を含むが、巨核球に加えて巨核球の断片または血小板前駆体も含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、細胞懸濁液の大部分は、巨核球であるが、巨核球前駆細胞、細胞質断片および血小板前駆体を含むがこれらに限定されない他の細胞または細胞残基（cell residues）が細胞懸濁液の中に少量存在している。他の実施形態において、細胞懸濁液は、本発明の装置または方法に用いるための巨核球を含み、巨核球断片、特に血小板前駆体または血小板をさらに含む。例えば、巨核球を含む細胞の大部分は、その膜上にＣＤ４１およびＣＤ４２ｂ抗原を発現する。
【００５０】
一実施形態において、装置に導入された巨核球を含む細胞懸濁液は、かん流培地において、１０３／ｍＬから１０８／ｍＬ、好ましくは、１０５／ｍＬから５０×１０６／ｍＬの細胞濃度を示す。
【００５１】
＜少なくとも１つの巨核球調節因子化合物を有する細胞懸濁液の補足＞
本発明者らは、巨核球の倍数性に直接的または間接的に関与することが知られている化合物および／または培養条件下の細胞骨格構築に関与する化合物が、かん流断段階で補足されると、血小板産生を増加させる能力も有することを見出した。
【００５２】
したがって、血小板産生の生体外方法は、せん断応力条件下で流体装置でかん流される前記細胞懸濁液に少なくとも１つの巨核球調節因子化合物を添加することを含む。
【００５３】
１つ以上の異なる巨核球調節因子化合物が、細胞懸濁液に同時にまたは連続して添加される。
【００５４】
効果的な濃度の前記１つ以上の巨核球調節因子化合物が、細胞懸濁液に添加され、流体装置のチャネルを循環する巨核球１個あたりに放出される血小板の数の大幅な増加を可能にする。したがって、当業者は、かん流培地の巨核球の濃度、流体装置の形状、流速（flow rate）等を含むが、これらには限定されない多くの因子に依存する各巨核球調節因子化合物の濃度を適合させる。
【００５５】
例えば、０．０５μＭから１ｍＭの間のＲｈｏ／ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２化合物）、より好ましくは、２μＭから５０μＭの間の効果的な濃度の化合物を細胞懸濁液に添加することができる。他の実施形態においては、１００μＭから１００ｍＭの間、より好ましくは、２ｍＭから５０ｍＭの間の効果的な濃度のサーチュイン阻害剤（例えば、ニコチンアミド（nicotinamide））が、細胞懸濁液に添加される。他の実施形態においては、０．０５μＭから２ｍＭの間、より好ましくは、０．５μＭから１５０μＭの間の効果的な濃度のＮＭＭ  ＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤（例えば、ブレビスタチン（blebbistatin））が、細胞懸濁液に添加される。他の実施形態においては、１ｎＭから１００ｍＭの間、より好ましくは、１μＭから２ｍＭの間の効果的な濃度の微小管構築調節因子（microtubule organizing regulators）が、細胞懸濁液に添加される。他の実施形態においては、０．０５μＭから１ｍＭの間、より好ましくは、２μＭから５０μＭの間の効果的な濃度の細胞骨格シグナル伝達阻害剤（例えば、ラトルンキュリン（Latrunculin））が、細胞懸濁液に添加される。他の実施形態においては、０．０５μＭから２ｍＭの間、より好ましくは、２μＭから１００μＭの間の効果的な濃度のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（例えば、ＧＭ６００１）が、細胞懸濁液に添加される。
【００５６】
具体的な実施形態においては、効果的な濃度の１つ以上の巨核球調節因子化合物が、かん流培地に含まれ、かん流培地は、培養ステップおよび洗浄ステップの後に細胞を再懸濁するために添加された培地である。
【００５７】
他の実施形態においては、流体装置に前記細胞懸濁液を導入する前に、再懸濁細胞を含むかん流培地において、効果的な濃度の１つ以上の巨核球調節因子化合物が再懸濁ステップの後に添加される。あるいは、細胞のかん流ステップの間に、１つ以上の巨核球調節因子化合物が流体装置に直接添加される。
【００５８】
具体的な実施形態においては、効果的な濃度の前記巨核球調節因子化合物は、洗浄ステップの後の細胞懸濁液にのみ添加され、培養ステップの間は存在しない。あるいは、他の実施形態においては、前記巨核球調節因子化合物は、培養ステップの間、効果的な濃度で、倍数化および血小板前駆体形成のために添加され、流体装置のチャネルを循環する巨核球１個あたりに放出される血小板の数を増加させるための効果的な濃度で洗浄ステップの後（かん流段階の間存在する）、２回目の添加がなされる。
【００５９】
本明細書において、「巨核球調節因子」という用語は、巨核球倍数性を直接的または間接的に増加させることが知られている、および／または、細胞骨格構築に関与する、任意の化合物に関する。
【００６０】
本明細書において、「巨核球倍数性」という用語は、前記巨核球における染色体の組数Ｎをいう。倍数性の増加は、分裂巨核球が後期Ｂ（anaphase B）に停止し、分裂溝が変性し、その結果、以前のＤＮＡ含量の２倍の倍数対細胞が核内分裂（endomitosis）によって生じる。巨核球倍数性の増加は、巨核球体積の増大、大きなサイズおよび豊富な細胞質と関連する（Ravidら, J Cell physiology, Vol. 190, 7-20, 2002）。培養条件下における、巨核球倍数性の増加は、例えば、Avanziら(British Journal of Haematology, Vol. 164, 867-876, 2014)に記載されているフローサイトメトリー分析法により視覚化される。
【００６１】
本明細書において、細胞骨格構築に関与する化合物は、真核細胞の細胞骨格構築に目に見える効果を有する任意の化合物をいう。例えば、このような目に見える効果は、例えば、ダイニン（dynein）モータ、ダイナクチン（dynactin）モータおよびキネシン（kinesin）モータによるアクチンフィラメント（actin filaments）、ミオシンフィラメント（myosin filaments）、微小管の再構築（例えば、重合（polymerization）および／または脱重合（depolymerization））をいう。
【００６２】
１つの実施形態において、前記巨核球調節因子化合物は、ｉからｖｉｉを含む以下のグループから選択される。
ｉ．  Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ経路の阻害剤、
ｉｉ．  ＭＬＣＫ経路の阻害剤、
ｉｉｉ．  サーチュイン経路の阻害剤、
ｉｖ．  ＮＭＭ  ＩＩ  ＡＴＰアーゼの阻害剤、
ｖ．  微小管構築調節因子、
ｖｉ．  細胞骨格シグナル伝達阻害剤、および
ｖｉｉ．  マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤
【００６３】
これらの７つの化合物群は、以下に詳細に説明する。
【００６４】
＜Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ経路の阻害剤＞
巨核球倍数性を増加させることが知られ、巨核球調節因子化合物として用いられる化合物には、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ阻害剤が含まれる。
【００６５】
本明細書において、「Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ阻害剤」または「Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ経路の阻害剤」という用語は、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫシグナル伝達経路を完全にまたは部分的に防止するか、または、低減もしくは阻害する化合物に関連する。
【００６６】
本明細書において「シグナル伝達経路」または「シグナル伝達活性」という用語は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達をもたらす受容体への成長因子の結合などの、一般にタンパク質間相互作用によって開始される生化学的因果関係をいう。一般に、この伝達は、シグナル変換を引き起こす一連の反応において、１つ以上のタンパク質上の１つ以上のチロシン残基（tyrosine residues）、セリン残基（serine residues）またはトレオニン残基（threonine residues）の特定のリン酸化反応を含む。最後から２番目のプロセスは、典型的に、核イベント（nuclear events）を含み、遺伝子発現の変化をもたらす。
【００６７】
具体的な実施形態において、「Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ阻害剤」は、例えば、ＲＯＣＫキナーゼ（ROCK kinase）のリン酸化された基質タンパク質の相対的な量によって測定されるようなＲｈｏ／ＲＯＣＫシグナル伝達活性を削減し、低下させ、および／または阻害する物質をいう。
【００６８】
具体的な実施形態において、前記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫキナーゼ活性を阻害する化合物阻害剤である。特異的阻害は、ＲＯＣＫキナーゼ活性の機能分析においてＩＣ５０として測定され、選択された阻害剤は、１００μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０を含む。
【００６９】
ＲＯＣＫ酵素のリン酸化された基質タンパク質の相対的な量を検出および測定するための免疫学的測定法およびキットなどの方法が市販されている（例えば、メルクミリポア社（Merck Millipore），ＣＳＡ００１／Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）活性アッセイ(Assay)、セルバイオラボ社（CellBiolabs），ＩＮＣ．／ＳＴＡ−４１６／Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）活性アッセイ(Assay)、９６ウェル（96 Wells）、セルバイオラボ社，ＩＮＣ．／ＳＴＡ−４１５／Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）活性免疫ブロット法キット参照）。
【００７０】
したがって、このような阻害剤は、小分子、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（小ヘアピンＲＮＡ）およびアンチセンスＤＮＡなどから選択される。
【００７１】
Ｒｈｏ−Ｒｏｃｋ阻害剤の例は、以下の化学式を有するファスジル（fasudil）（ＣＡＳ  １０３７４５−３９−７，または、５−（１，４−ジアゼパン−１−スルホニルイソキノリン（5-(1,4-Diazepane-1-sulfonyl)isoquinoline））
【化１】
2018515099.tif 000002
または、より好ましくは、これの活性代謝物であるヒドロキシファスジル（hydroxyfasudil）（「Ｙ２７６３２」とも呼ばれる、ＣＡＳ  １５５５５８−３２−０；１−（１−ヒドロキシ−５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン（1-(1-Hydroxy-5-isoquinolinesulfonyl)homopiperazine））であり、いずれも市販されている。他の例は、チアゾビビン（thiazovivin）であり、この化合物は、Xuら(PNAS, Vol. 107(18), 8129-8134, 2010)に開示されている。巨核球調節因子化合物として用いられる他のＲｈｏ−Ｒｏｃｋ阻害剤は、例えば、これらには限定されないが、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６に記載されている。
【００７２】
Ｒｈｏ−Ｒｏｃｋ阻害剤を巨核球培地に添加すると、高い倍数性細胞の割合の劇的な増加を示した。Ｒｈｏ−Ｒｏｃｋ阻害剤は、Ｒｈｏ−Ｒｏｃｋ経路を阻害し、結果として、（ＭＬＣ２（ミオシン様鎖ＩＩ（Myosin Like Chain II））リン酸化反応の阻害を介して）ミオシン活性化および収縮環形成を阻害する。これはおそらく、巨核球が倍数化を受けるようにし（Lordierら, Blood, Vol.112(8), 3164-3174, 2008)）、その後、血小板前駆体の形成を引き起こす（Changら, Blood, Vol. 109, n° 10, 4229-4236, 2007; Avanziら, British Journal of Haematology, Vol. 164, 867-876, 2014)）。
【００７３】
Ｃ３トランスフェラーゼ、直接的ＲｈｏＡ阻害剤またはＲｈｏ阻害剤Ｔａｔ−Ｃ３化合物は、ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ阻害剤としても用いられる（Shiら, The Journal of Clinical Investigation, Vol. 124, n° 9, 3757-3766, 2014; Changら, Blood, Vol. 109, n° 10, 4229-4236, 2007）。
【００７４】
＜ＭＬＣＫ経路の阻害剤＞
ＭＬＣ２リン酸化反応は、主に２つの異なるキナーゼ：ＲＯＣＫおよびＭＬＣＫ（ミオシン軽鎖キナーゼ（Myosin Light Chain Kinase））によって調整される。
【００７５】
したがって、ＭＬＣＫ阻害剤の存在下では、ＭＬＣ２リン酸化反応も阻害され、血小板前駆体形成が増加する。
【００７６】
具体的な実施形態においては、「ＭＬＣＫ阻害剤」という用語は、例えば、リン酸化ＭＬＣ２タンパク質の相対的な量によって測定されるＭＬＣＫシグナル伝達活性を削減し、減少させ、および／または阻害する物質をいう。
【００７７】
具体的な実施形態において、前記ＭＬＣＫ阻害剤は、ＭＬＣＫキナーゼ活性を阻害する化合物阻害剤である。具体的な阻害は、ＭＬＣＫキナーゼ活性の機能分析において、ＩＣ５０として測定することができ、選択された阻害剤は、１００μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。
【００７８】
リン酸化ＭＬＣタンパク質の相対的な量を検出および測定する免疫測定法およびキットなどの方法は、例えば、Egotら(Thrombosis and Haemostasis, Vol. 110, 1215-1222, 2013)に記載されている。
【００７９】
したがって、このような阻害剤は、小分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡなどから選択される。
【００８０】
ＭＬＣＫ阻害剤の例は、これらには限定されないが、 Lukasら, Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 42, n° 5, 910-919, 1999に開示されている化合物Ｐ１８、およびEgotら, Thrombosis and Haemostasis, Vol. 110, 1215-1222, 2013に開示されている化合物ＭＬ−７を含む。
【００８１】
＜サーチュイン経路の阻害剤＞
巨核球倍数性を増加させることが知られ、巨核球調節因子化合物として用いられる化合物は、巨核球倍数性に影響を与えるニコチンアミドのようなサーチュイン阻害剤を含む（Avanziら, British Journal of Haematology, Vol. 164, 867-876, 2014）。
【００８２】
本明細書において、「サーチュイン阻害剤」または「サーチュイン経路阻害剤」という用語は、例えば、ＳＩＲＴ１シグナル伝達、ＳＩＲＴ２シグナル伝達またはＳＩＲＴ３シグナル伝達のようなサーチュインシグナル伝達経路を完全にまたは部分的に防止するか、または削減または阻害することができる化合物に関する。
【００８３】
具体的な実施形態において、「サーチュイン阻害剤」という用語は、例えば、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２またはＳＩＲＴ３のアセチル化（または脱アセチル化）基質タンパク質の相対的な量により測定されるＳＩＲＴ１シグナル伝達活性、ＳＩＲＴ２シグナル伝達活性またはＳＩＲＴ３シグナル伝達活性を削減し、減少させ、および／または阻害する物質をいう。
【００８４】
具体的な実施形態において、前記サーチュイン阻害剤は、ＳＩＲＴ１脱アセチル化活性、ＳＩＲＴ２脱アセチル化活性、またはＳＩＲＴ３脱アセチル化活性ほ阻害する化合物阻害剤である。具体的な阻害は、ＳＩＲＴ１／２／３脱アセチル化活性の機能分析においてＩＣ５０として測定され、選択された阻害剤は、１００μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。
【００８５】
ＳＩＲＴ１酵素、ＳＩＲＴ２酵素またはＳＩＲＴ３酵素のリン酸化基質タンパク質の相対的な量を検知および測定するための免疫測定法およびキットなどの方法が販売されている（例えば、ＳＩＧＭＡ，  ＣＳ１０４０／ＳＩＲＴ１  アッセイキット（Assay Kit）;Ａｂｃａｍ，ａｂ１５６０６５／ＳＩＲＴ１  活性アッセイキット;Ａｂｃａｍ，ａｂ１５６０６６／ＳＩＲＴ２  活性アッセイキット；Ａｂｃａｍ，ａｂ１５６０６７／ＳＩＲＴ３  活性アッセイキット参照）。
【００８６】
サーチュイン阻害剤の例は、ナイアシン（niacin）（ビタミンＢ３）（Giammonaら, British Journal of Haematology, Vol. 135, 554-566, 2006）の１つの形態であるニコチンアミド（ＮＩＣまたはピリジン−３−カルボキサミド（pyridine-3-carboxamide））であり、以下の化学式を有する。
【化２】
2018515099.tif 000003
【００８７】
ニコチンアミドの細胞機能の１つは、ヒストン／タンパク質脱アセチル化（サーチュインまたはＳＩＲＴｓ）の休止情報調節因子（Ｓｉｒ２）群の活性の阻害である。Giammonaら(Exp Hematol., Vol. 37(11), 1340-1352, 2009)は、ニコチンアミドが、ＳＩＲＴ１および／またはＳＩＲＴ２の阻害により、巨核球倍数性を増加させることを示唆した。これは、ＳＩＲＴ脱アセチル化のターゲットの１つであるｐ５３のアセチル化を増加させた。サーチュイン阻害剤としてのニコチンアミドの効果は、少なくともｐ５３アセチル化を増加させることにより、巨核球倍数性を増加させる。
【００８８】
他のサーチュイン阻害剤には、例えば、ケイマンケミカル（Cayman Chemical）のサーチュイン阻害剤ＩＶ（ＣＡＳ  １４５１３−１５−６または２，３−ジヒドロ−５−［（２−ヒドロキシ−１−ナフタレニル）メチル］−６−フェニル−２−チオキソ−４（１Ｈ）−ピリミジノン）（CAS 14513-15-6 or 2,3-dihydro-5-[(2-hydroxy-1-naphthalenyl)methyl]-6-phenyl-2-thioxo-4(1H)-pyrimidinone）があり、または、例えば、Villalbaら(Biofactors, Vol. 38(5), 349-359, 2012)に記載されているように、スプリトマイシン（splitomicin）、ＨＲ７３、サーチノール（Sirtinol）、ＡＧＫ２、カンビノール（Cambinol）、サレルミド（Salermide）、テノヴィン（Tenovin）、スラミン（Suramin）がある。
【００８９】
＜ＮＭＭＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤＞
巨核球倍数性の増大を示し、巨核球調節因子化合物として用いられる他の化合物は、巨核球倍数性に影響を及ぼすことが示されているブレビスタンチン（blebbistatin）などのＮＭＭＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤を含む（Avanziら, British Journal of Haematology, Vol. 164, 867-876, 2014）。
【００９０】
本明細書で用いる「ＮＭＭＩＩ  ＡＴＰアーゼ（NMM II ATPase inhibitorsまたはinhibitors of the NMMII ATPase）」という用語は、非筋肉性ミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼ活性（ＮＭＭＩＩ  ＡＴＰアーゼは、ＭＹＨ９またはＭＹＨ１０としても知られている）を完全にまたは部分的に防止する、または削減若しくは阻害することができる化合物をいう。
【００９１】
具体的な実施形態において、「ＮＭＭＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤」という用語は、
例えば、Shinら(PNAS, Vol. 108, n°28, 11458-11463, 2011)により実施されたリン酸化ＮＭＭ  ＩＩＡを検出する免疫ブロット法、またはLimouzeら(J Muscle Res Cell Motil, Vol.25(4-5), 337-341, 2004)が測定したアクチン活性化ＭｇＡＴＰアーゼ活性として測定されるようなＮＭＭＩＩ  ＡＴＰアーゼ活性を削減し、減少させおよび／または阻害する物質を意味する。
【００９２】
具体的な阻害は、ＮＭＭＩＩ  ＡＴＰアーゼ活性の機能分析におけるＩＣ５０として測定され、選択された阻害剤は、１００μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下のＩＣ５０を含む。
【００９３】
したがって、そのような阻害剤は、小分子、ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどから選択することができる。
【００９４】
そのようなＮＭＭＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤の例は、細胞質分裂、膜剛性およびマトリックス収縮（Shinら, PNAS, Vol. 108, n° 28, 11458-11463, 2011; Avanzi et al, 2014は上記参照）に関与する非筋肉性ミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼ（ＮＭＭ  ＩＩ）を阻害する化合物ブレビスタンチン（ＣＡＳ６７４２８９−５５−５または１−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロ−４−ヒドロキシピロロ［２，３−ｂ−］−７−メチルキノリン−４−ワン）（CAS 674289-55-5 or 1-Phenyl-1,2,3,4-tetrahydro-4-hydroxpyrrolo[2,3-b]-7-methylquinolin-4-one）であり、以下の化学式を有する。
【化３】
2018515099.tif 000004
【００９５】
他の阻害剤は、例えば、アアジドブレビスタンチン（azidoblebbistatin）（Bondら, Future Med Chem, Vol. 5(1), 41-52, 2013）を含む。
【００９６】
＜微小管構築調節因子＞
巨核球調節因子化合物として用いられる微小管タンパク質は、微小管構築およびその機能的変異体および／またはアイソフォーム（isoforms）に直接的または間接的に関連するタンパク質を含む。
【００９７】
本明細書において、巨核球調節因子化合物として用いられる微小管構築調節因子は、例えば、チューブリンの重合（polymerization）、チューブリンの脱重合（depolymerization）および微小管の安定化またはスライド（sliding）に関与する、前記微小管タンパク質の動的（再）構築（(re)organization）をもたらす機能的メカニズムに直接的または間接的に関与するタンパク質をいう。
【００９８】
具体的な実施形態において、そのような微小管構築調節因子は、微小管関連タンパク質（ＭＡＰｓ）、プラスエンド追跡タンパク質（Plus-end tracking protein）、ダイニン（dynein）、ダイナクチン（dynactin）またはキネシン（kinesin）などのモータタンパク質、リン酸化チューブリン、ユビキチン化（ubiquitinated）チューブリン、ＳＵＭＯ化（sumoylated）チューブリンまたはパルミトイル化（palmitoylated）チューブリンを導くチューブリン翻訳後修飾に関与するタンパク質、小さなＧＴＰタンパク質並びに微小管ポリメラーゼ（polymerase）および微小管デポリメラーゼ（depolymerase）のような動的チューブリン不安定性に関与するタンパク質、を含む。
【００９９】
少なくとも小分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどの前記微小管構築調節因子の効果を測定または検出するための免疫測定法またはキットなどの方法は、例えば、細胞骨格，INC., BK038 / Microtubule/Tubulin In Vivo Assay Biochem Kit、および細胞骨格，INC., BK027 / Kinesin Motility Assay Biochem Kitからの分析試料（assay）を含む。
【０１００】
＜細胞骨格シグナル伝達阻害剤＞
細胞骨格シグナル伝達を阻害することが知られており、巨核球調節因子化合物として用いられる化合物は、アクチン重合阻害剤を含む。
【０１０１】
本明細書において、「細胞骨格シグナル伝達阻害」という用語は、「細胞骨格シグナル伝達阻害剤（nhibitors of cytoskeletal signalingまたはcytoskeletal signaling inhibitors）」に関し、細胞骨格シグナル伝達を完全にまたは部分的に防止し、削減し、阻害することができる化合物に関連する。
【０１０２】
具体的な実施形態において、「細胞骨格シグナル伝達阻害剤」という用語は、アポトーシスを誘導することでも知られているアクチン重合を阻害する物質を含むが、これには限定されない。
【０１０３】
非筋肉性アクチン重合（non-muscle actin polymerization）の相対的な量を検出および測定するための免疫測定法およびキットなどの方法は、市販されている（例えば、Cytoskeleton, cat#BK003 or cat#AP05 combined with cat # APHL99参照）。
【０１０４】
したがって、そのような阻害剤は、小分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどから選択される。
【０１０５】
アクチン重合阻害剤の例は、分子ラトルンキュリン（molecule Latrunculin）、より具体的には、ラトルンキュリンＡ（Latrunculin A）、ラトルンキュリン・マグニフィカ（Latrunculia magnifica）（（CAS 76343-93-6) - Santa Cruz Biotechnologies）、単量体Ｇ−アクチン（G-actin）および重合阻害剤の安定剤であり、以下の化学式を有する。
【化４】
2018515099.tif 000005
【０１０６】
ラトルンキュリンＡは、Avanziら, PLoS ONE, 10(4): e0125057に記載され、巨核球倍数化および巨核球アポトーシス活性を増大させる。
【０１０７】
他のアクチン重合阻害剤は、以下の化学式を有するラトルンキュリンＢ（CAS 76343-94-7 - Santa Cruz Biotechnology）、
【化５】
2018515099.tif 000006
【０１０８】
以下の化学式を有するビステオネライドＡ（CAS 105304-96-9 - Santa Cruz Biotechnology）、
【化６】
2018515099.tif 000007
【０１０９】
以下の化学式を有するＣＫ６６６（CAT No 3950 - Tocris）、
【化７】
2018515099.tif 000008
【０１１０】
以下の配列cyclo(Lys-D-Phe-D-Pro-D-Phe-Phe-D-Pro-Gln)を有する１８７−１  Ｎ−ＷＡＳＰ阻害剤（CAT No 2067 - Tocris）、
【０１１１】
以下の化学式を有するＣＫ８６９（CAT No 4984 - Tocris）、
【化８】
2018515099.tif 000009
【０１１２】
以下の化学式を有するナルシクラシン（CAT No 3715 - Tocris）、
【化９】
2018515099.tif 000010
【０１１３】
以下の化学式を有するサイトカラシンＢ（またはＡからＪ）（CAT No 5474 - Tocris）
【化１０】
2018515099.tif 000011
であるが、これらには限定されない。
【０１１４】
＜プロテアーゼ阻害剤＞
プロテアーゼを阻害することが知られている化合物は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤を含む。
【０１１５】
本明細書において、「プロテアーゼ阻害剤」は「プロテアーゼ阻害剤（inhibitors of proteaseまたはprotease inhibitors）」に関し、プロテアーゼを完全にまたは部分的に防止し、削減し、阻害することができる化合物に関する。
【０１１６】
具体的な実施形態において、「プロテアーゼ阻害剤」という用語は、ＭＭＰを阻害する物質を含むが、これには限定されない。
【０１１７】
したがって、このような阻害剤は、小分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどから選択される。
【０１１８】
ＭＭＰ阻害剤の例は、ｐａｎ  ＭＭＰ阻害剤ＧＭ６００１（ab120845 - Abcam）、イロマスタット（Ilomastat）（ガラルジン（Galardin））またはＮ−［（２Ｒ）−２−（ヒドロキシアミドカルボニルメチル）−４−メチルペンタノール］−Ｌ−トリプトファン  メチルアミド（N-[(2R)-2-(hydroxamidocarbonylmethyl)-4-methylpentanoyl]-L-tryptophan methylamide）としても知られ、ＭＭＰの生物学的活性を制御し、以下の化学式を有する次の分子をいう。
【化１１】
2018515099.tif 000012
【０１１９】
プロテアーゼ阻害剤は、２つ以上のプロテアーゼ阻害剤でもよく、プロテアーゼソア議材の例は、ＭＭＰ特異的阻害剤であり、例えば、ＭＭＰ８−Ｉ（（３Ｒ）−（＋）−２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート（MMP8-I ((3R)-(+)-[2-(4-Methoxybenzenesulfonyl)-l,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-hydroxamate）、ＭＭＰ−３阻害剤、ＭＭＰ−１２阻害剤、ＭＭＰ２阻害剤、ＭＭＰ９阻害剤、ＭＭＰ１３阻害剤、または、例えば、バチマスタット（Batimastat）、ＣＴＳ−１０２７、マリマスタット（Marimastat）、ＮＳＣ−４０５０２０、ＳＢ−３ＣＴまたはＧＭ１４８９などの広域スペクトラムＭＭＰ阻害剤などのＭＭＰ阻害剤である。
【０１２０】
例えば、ｐａｎ  ＭＭＰ阻害剤（例えば、ＧＭ６００１）などのプロテアーゼ阻害剤の使用は、ＣＤ４２ｂ受容体（ＣＤ４２ｂ＋血小板）を発現する血小板産生の本発明の生体外方法において特に有利である。
【０１２１】
＜流体装置＞
チャネルの入口および出口としてさらに開示される少なくとも２つの開口部を含み少なくとも１つのチャネルを有する産生チャンバを備える流体装置が開示されている。チャネルは、巨核球懸濁液または巨核球断片懸濁液が、チャネルの入口から出口へと流れるものである。好ましくは、チャネルは、１つの入口と１つの出口を有し、前記入口から前記出口に巨核球懸濁液を流すためにメインフローを適用することができる。このような、流体装置は、血小板産生のための本発明の方法に用いることができる。
【０１２２】
具体的な実施形態において、産生チャンバは、さらにいくつかの並列チャネルに分割することができ、並列チャネルの各々は、非多孔質壁によって区切られており、巨核球を含む細胞懸濁液を導入できる入口開口部をチャンバの一端に少なくとも１つ有し、血小板を収集する少なくとも１つの出口開口部をチャンバの他端に有し、チャネルは、入口から出口への単一の流れを形成する。
【０１２３】
本明細書において、「非多孔質」という用語は、（血小板または血小板前駆体を含む）巨核球または巨核球断片が壁を横切ることができず、それにより、チャネルの入口から出口へのメインフローに巨核球または巨核球断片が留まることを意味する。
【０１２４】
高収率で血小板を産生するために、流体装置のチャネルは、流体装置の内壁の少なくとも一部、すなわち、チャネル壁の表面の少なくとも一部がテクスチャ加工され、巨核球懸濁液と接触する。テクスチャは、複数の障害物により作り出される。好ましくは、前記障害物は、チャネルの少なくとも１つの２次元表面上に配置され、それによって、障害物の３次元配列が形成される。前記障害物があるために、チャネルの内面は滑らかではない。障害物は、周期的な方法で配列される。
【０１２５】
具体的な実施形態において、障害物の密度は、チャネルに沿って一定であってもよい。テクスチャ加工されたチャネルを流れるとき、テクスチャ加工の表面における巨核球の捕捉およびそれらの血小板への脱落（shedding）が改善される。
【０１２６】
本発明者らは、障害物の密度のバリエーションにより、細胞の目詰まりを削減させ、巨核球の捕捉に影響を及ぼすことををさらに発見した。テクスチャ加工されたチャネルを通る流れに巨核球をさらすことによって生成される血小板は、循環血小板の流れに類似するいくつかの機能的特徴を示す。特に、具体的な実施形態において、本発明の装置で産生される血小板は、活性化されない血小板様粒子とは対照的に、天然血小板または循環血小板のように活性化される。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態によれば、チャンネルの内面の少なくとも一部、必要に応じて、テクスチャ加工された部分は、例えば、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）若しくは、その機能的変異体、またはフィブリノゲン、若しくは、フィブロネクチンのような巨核球に対する結合親和性を有するリガンドでさらにコーティングされる。そのようなリガンドは、血小板および／または巨核球、またはそれらの特異的受容体に対して特異的親和性を有し、血小板および／または巨核球に対して非特異的親和性を有する。そのようなコーティングは、チャネルの内壁または障害物に対する細胞接着を増加させる。
【０１２８】
本明細書において、「フォン・ヴィレブランド因子」または「ＶＷＦ」という用語は、止血に関するいくつかの単量体を含む多量体タンパク質をいう。ヒト・フォン・ヴィレブランド因子の例示的アミノ酸配列は、受入番号ＡＡＢ５９４５８として、GenPeptデータベースに登録されている。好ましくは、本発明のフォン・ヴィレブランド因子は、哺乳類フォン・ヴィレブランド因子、さらに好ましくは、ネズミ・フォン・ヴィレブランド因子または霊長類フォン・ヴィレブランド因子、さらにより好ましくは、ヒト・フォン・ヴィレブランド因子である。
【０１２９】
「ＶＷＦ」という用語は、任意の哺乳類起源のＶＷＦ、例えば、霊長類起源のＶＷＦ、好ましくは、ヒト起源のＶＷＦを含む。本発明によれば、ＶＷＦ因子は、組み換えＶＷＦまたは天然ＶＷＦであってもよい。ＶＷＦの天然の形態では、精製すること、または、他の成分を含む組成物（例えば、細胞外マトリックス）中に含めることができる。当業者は、当該技術分野における標準技術により、そのような組み換えＶＷＦを容易に産生することができ、例えば、トランスフェクト宿主細胞を用いて、組み換えＶＷＦまたはその機能的変異体を産生することができる。
【０１３０】
本明細書において、ＶＷＦの「機能的変異体」という用語は、ＶＷＦ因子の天然断片若しくは組み換え断片、または、ＧＰＩｂ、特にヒトＧＰＩｂに結合する能力を有するＶＷＦ因子のホモログ（homologue）若しくはアナログ（analogue）をいう。
【０１３１】
ＶＷＦのホモログは、ヒトＶＷＦアミノ酸配列に対して、５０％の同一性、好ましくは、少なくとも、６０％、７０％、８０％、９０％および９５％の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１３２】
本明細書において、２つの配列の間のパーセント同一性（percent identity）は、２つの配列の最適アライメント（optimal alignment）のために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮すると、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝（同一位置の数／位置の総数）×１００）。配列の比較および２つの配列の間のパーセント同一性は、後述するように、数学的アルゴリズムを用いることにより達成することができる。
【０１３３】
２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれているＥ.ＭｙｅｒｓおよびＷ.Ｍｉｌｌｅｒ（Comput. Appl. Biosci. Vol. 4: 1 1-17, 1988）のアルゴリズムを用いて決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. Vol. 48, 443-453, 1970）のアルゴリズムを用いて決定することができる。パーセント同一性を決定するさらに他のプログラムは、ＣＬＵＳＴＡＬ（M. Larkinら, Bioinformatics Vol. 23, 2947-2948, 2007;最初にD. HigginsおよびP. Sharp, Gene, Vol. 73, 237-244, 1988に記載された）であり、これはスタンドアロンプログラムとしても、Ｗｅｂサーバ経由でも利用することができる（http://www.clustal.org/参照）。
【０１３４】
変異体は、異種ポリペプチド配列に融合されたＶＷＦ因子の断片を有するポリペプチドまたは融合タンパク質をさらに含み、これは前記ＶＷＦには天然では結合しない。他の変異体は、ＶＷＦドメインの多量体型を含み、前記ＶＷＦドメインは、ＧＰＩｂに対する親和性を有するＶＷＦ断片である。
【０１３５】
本明細書において、「断片」という用語は、所与のポリペプチドの少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個または少なくとも２０個の連続アミノ酸の天然または組み換え部分アミノ酸配列を含む。
【０１３６】
本発明の装置をコーティングするためのＶＷＦ変異体はの例は、大腸菌（Escherichia coli）で発現される組み換えＶＷＦ−Ａ１（アミノ酸  Ｑ１２３８−Ｐ１４７１）ポリペプチド、または、哺乳類細胞で発現され、Martinら(Journal of Thrombosis and Haemostasis, Vol. 5, 1363-1370 2007, doi: 10.1111/j.1538-7836.2007.02536.x.)に記載されているように精製することができる組み換えＶＥＦ−Ａ１Ａ２Ａ３（アミノ酸  Ｄ１２６１−Ｇ１８７４）ポリペプチドを含むが、これらには限定されない。
【０１３７】
その代り、当業者は、ＶＷＦのアナログ（analogues）、すなわち、ＶＷＦ一次アミノ酸配列と配列ホモロジー（homology）を共有しないが、巨核球結合親和性および／または血小板結合親和性の同様の特性を示すタンパク質またはポリペプチドを選択してもよい。そのような、アナログは、フィブリノゲン、フィブロネクチン、コラーゲンおよびテネイシン（tenascin）を含むグループから選択されるが、これらには限定されない。
【０１３８】
本発明の流体装置のチャネルは、入口と出口との間の長さＬにより規定される。チャネルの断面は、円形、卵形、長方形または正方形であって、チャネルの全長に渡って同一であることが好ましい。本明細書において、チャネルの高さＨは、チャネルの断面いおける２つの対向する壁の間で計測される最小距離をいう。例えば、円形断面では、チャネルの高さＨは、チャネルの円形断面の直径である。１つの好ましい実施形態によれば、前記チャネルは、実質的に正方形断面または長方形断面を有し、底壁および上壁がチャネル高さＨを決定し、側壁がチャネル幅Ｗを決定する。チャネルは、好ましくは直線形状であり、直線形状のチャネルの軸は、チャネルの長手方向を規定する。
【０１３９】
本発明の好ましい実施形態によれば、流体装置は、マイクロ流体装置であり、すなわち、装置の断面の寸法の１つが１ｍｍよりも小さい。チャネルは、マイクロチャネルと呼ばれる。
【０１４０】
チャネルの寸法に関して、これらは、血小板産生に使用できる巨核球の平均サイズに依存して最適化される。本明細書を通して、Ｄｃｅｌｌと呼ばれるこのようなパラメータは、本発明の方法で使用する懸濁液中の平均巨核球直径として定義され、インピーダンス細胞計数器検出（impedance cell counter detection）（例えば、特許文献７に記載されているコールター・カウンター（Coulter counter））または光学顕微鏡の後の画像解析のような異なる技術により測定できる。
【０１４１】
使用される前駆細胞の供給源および巨核球生成方法に依存して、Ｄｃｅｌｌは、典型的には、５μｍから１５０μｍの間、例えば、７μｍから１００μｍの間、また、例えば、１０μｍから５０μｍの間である。具体的な実施形態において、本発明の装置の寸法は、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍおよび４５μｍのサイズから選択されるＤｃｅｌｌに対して最適化される。
【０１４２】
具体的な実施形態において、チャネルの高さＨは、Ｄｃｅｌｌと１ｍｍとの間、好ましくは、Ｄｃｅｌｌと１００μｍとの間である。チャネルの幅Ｈは、Ｄｃｅｌｌと１ｍｍと間、好ましくは、１０×Ｄｃｅｌｌと１ｃｍとの間である。チャネルの長さＬは、１ｍｍと１０ｍとの間、好ましくは、１０ｍｍと１ｍとの間、より好ましくは、１０ｃｍと１ｍとの間である。
【０１４３】
本発明の流体チャネルの産生チャンバは、１つの単一チャネル、または複数のチャネルを含んでもよく、それらは異なっていても、同じであってもよい。複数のチャネルの場合、並列化されたチャネルは、同じ流入口と同じ流出口を共有する。本発明の好ましい実施形態によれば、産生チャンバは、複数の並列化チャネルを含む。産生チャンバのチャネルの数Ｎは、２個から１，０００，０００個の間、好ましくは、２個から１００，０００個の間である。
【０１４４】
並列化チャネルの場合、産生チャンバは、さらに分配チャネルを有するのが好ましく、分配チャネルは、入口の懸濁液を各チャネルに分配する。分配チャネルは、三角形であってもよい。有利には、分配チャネルの形状は、例えば、並列化チャネルに使用される高さよりも大きい高さを有することにより、非常に高いずり速度による細胞損傷を回避する形状である。
【０１４５】
チャネルの内面は、少なくとも１つの部分にテクスチャ加工が施されている。チャネルの前記テクスチャ加工部分は、チャネルの長さＬの１％からチャネルの長さＬの１００％の間、好ましくは、チャネルの長さＬの５０％からチャネルの長さＬの１００％の間である。
【０１４６】
テクスチャは、複数の障害物から生成される。障害物の密度、大きさおよび形状は、さらなる血小板脱落のために、障害物の表面上および／または内部チャネル壁で巨核球を捕捉できるように決定される。
【０１４７】
本明細書において、「捕捉」という用語は、巨核球が、障害物および／または内部チャネルの表面に接触し、フローの平均流速と比較して著しく減速することをいう。巨核球は、障害物の表面に接触した後、停止する。
【０１４８】
障害物は、例えば、ポスト（posts）、支柱（pillars）、ビーム（beams）、三日月形（crescent）、穴のあいた三日月形（pierced-crescent）、星形（stars）、空洞（cavities）またはピラミッド（pyramids）形状である。好ましくは、障害物は、ポスト形状である。ポストは、正方形または三角形の断面を有するのが好ましく、その半径ｒおよび高さｈにより定義される。本明細書において、ポストの「半径」は、ポストの断面の最大寸法の半分の大きさとして定義される。
【０１４９】
ポストの大きさに関して、ポストの高さは、０からＨの間の値であることが好ましい。ポストの半径ｒは、Ｄｃｅｌｌ／１００から１００×Ｄｃｅｌｌの間、より好ましくは、Ｄｃｅｌｌ／１０から１０×Ｄｃｅｌｌの間の値である。Ｄｃｅｌｌは、しばしば、５μｍから１５０μｍの間の値であり、ポストの高さｈは、０から１ｍｍの間の値が好ましい。ポストの半径ｒは、５０ｎｍから１５ｍｍの間の値が好ましく、５００ｎｍから１．５ｍｍの間の値がより好ましい。
【０１５０】
障害物は、チャネルの内面にランダムに、または特定のパターンに従って配置される。したがって、テクスチャは不規則的または規則的である。規則的なパターンは、その周期構造、格子ピッチおよびチャネルの長手方向に対する格子方向の傾斜のようないくつかの特徴により特徴付けられる。パターンが不規則である場合、そのパターンは、障害物の密度または縦方向および横方向の障害物間の平均距離により特徴付けられる。
【０１５１】
本発明の具体的な実施形態によれば、障害物は、規則的パターンを形成するために、チャネルの少なくとも一部の内面に配置される。
【０１５２】
流体装置の他の具体的な実施形態によれば、障害物密度は、チャネルに沿って変化する。
【０１５３】
例えば、好ましい実施形態において、前記チャネルは、複数の障害物を有するテクスチャ加工が施され、２つの障害物間の縦方向および／または横方向の距離が（チャネルの入口から出口への）流れの方向（フロー方向）に対して減少し、その結果、障害物の密度が増加する。
【０１５４】
障害物の密度は、チャネルのテクスチャ加工が施された部分の表面積あたりの障害物の数により測定される。
【０１５５】
より具体的な実施形態において、前記障害物は、チャネルの少なくとも一部の内面に配置され、六角形周期構造を形成し、障害物の密度は、フロー方向の各障害物間の最も小さい距離を減少させることにより、増加する。
【０１５６】
具体的な実施形態によれば、障害物は、半径ｒの実質的に円形断面のポストであり、前記ポストは、前記チャネルの少なくとも一部の内面に配置され、以下のような六角形周期構造の規則的なパターンを形成する。
（ｉ）縦軸および横軸に沿った２つのポスト中心間の最も近い距離ｐとｇとは少なくとも２ｒに等しく、好ましくは、（２ｒ＋Ｄｃｅｌｌ／１０）から（２ｒ＋１００×Ｄｃｅｌｌ）の間、より好ましくは、（２Ｒ＋Ｄｃｅｌｌ）から（２ｒ＋１０×Ｄｃｅｌｌ）の間の値であり、
（ｉｉ）横軸に沿った２つのポスト中心間の距離ｐは、チャネルに沿って変化し、および／または、縦軸に沿った２つのポスト中心間の距離ｇは、フロー方向、すなわち、チャネルの入口から出口までの障害物密度を増加させるために、チャネルに沿って変化する。
（ｉｉｉ）チャネルの長手方向と六角形周期構造の単純格子の格子ベクトルの１つとによって定義される最小角度αは、
ｒ≧Ｄｃｅｌｌ／２の場合、αは、ａｒｃｓｉｎ（ｒ／１０ｇ）からａｒｃｓｉｎ（２ｒ／ｇ）の間であり、
ｒ＜Ｄｃｅｌｌ／２の場合、αは、ａｒｃｓｉｎ（Ｄｃｅｌｌ／２０ｇ）からａｒｃｓｉｎ（Ｄｃｅｌｌ／ｇ）の間である。
（ｉｖ）必要に応じて、前記ポストは、０＜ｈ≦Ｈの高さｈを有し、Ｈは、チャネルの高さであり、例えば、ｈ＝Ｈである。
【０１５７】
具体的な実施形態において、障害物は、半径ｒの実質的に円形断面のポストであり、前記ポストは、六角形周期構造を有する規則パターンを形成する前記チャネルの少なくとも一部分の内面に配置される。
（ｉ）ポストの半径ｒは、好ましくは、５０ｎｍから１５ｍｍの間、より好ましくは、５００ｎｍから１．５ｍｍの間の値である。
（ｉｉ）横軸に沿った２つのポスト中心間の最近接距離ｐおよび縦軸に沿った２つのポスト中心間の最近接距離ｇは、少なくとも１００ｎｍに等しく、好ましくは、１００ｎｍから５０ｍｍの間、好ましくは、５００ｎｍから１０ｍｍの間、より好ましくは、５μｍから１ｍｍの間の値である。
（ｉｉｉ）チャンネルの長手方向と六角形ブラベー格子の格子ベクトルの一つとで規定される最小角度αは、０°から９０°の間、好ましくは、０°から３０°の間の値である。
（ｉｖ）必要に応じて、前記ポストは、０＜ｈ≦Ｈの高さｈを有し、Ｈは、チャンネルの断面の２つの対向する壁の間で測定される最小距離であり、例えば、ｈ＝Ｈである。
【０１５８】
流体装置は、マイクロ流体システムの製造において一般に知られている技術、例えば、ソフトリソグラフィー（Xiaら, Annual Review of Materials Science, Vol. 28, n°1, 153-184, 1998）に従って製造することができる。
【０１５９】
少なくとも部分的にテクスチャ加工されたチャネルの凸状の起伏（positive relief）を有する装置のマスター（master）は、標準的な方法で準備することができる。１つの方法は、チャネルのデザインを含むコンピュータ支援設計（computer assisted design；ＣＡＤ）ファイルからトランスペアレンシー（transparencies）を作成することを含む。その後、これらのトランスペアレンシーをマスクとして、パターンをネガティブフォトレジストに転写して、マスターを作る。
【０１６０】
流体装置は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で作成され、ガラススライド（glass slides）上に密封（sealed）される。この材料は、装置を視覚的に制御するのに有利である。しかしながら、シリコン（silicon）、ガラス（glass）、ポリスチレン（polystyrene）、ポリカーボネート（polycarbonate）、ポリ塩化ビニル（polyvinyl chloride）、環状オレフィン共重合体（cyclic olefin copolymer）、ポリ（メタクリル酸メチル）（poly(methyl methacrylate)）、熱硬化性ポリエステル（thermoset polyester）、ポリウレタンメタクリル樹脂（polyurethane methacrylate）、ノーランド光学接着剤（Norland Optical Adhesive）、ヒドロゲル（hydrogels）（例えば、アルギン酸（alginate）、コラーゲン（collagen）、アガロース（agarose）、ポリアクリルアミド（polyacrylamide）、多糖類（polysaccharide））などの他の材料も流体装置の製造に用いることができる。
【０１６１】
有利には、流体装置、および、より具体的には産生チャンバは、無菌状態で動作する。好ましい実施形態において、前記流体装置は、無菌である。本発明による流体装置の製造方法は、装置の殺菌ステップを含む。この殺菌ステップは、装置の密封の前後に行うことができる。
【０１６２】
さらに、流体装置の製造方法は、チャネルの内面の少なくともテクスチャ加工された部分に、例えば、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）またはその機能的変異体などの巨核球に対する結合親和性を有するリガンドをコーティングステップを含む。具体的な実施形態において、チャネルの内面は、フォン・ヴィレブランド因子またはその機能的変異体の溶液の培養によってコーティングされる。典型的には、固相のコーティングに用いられるＶＷＦの濃度は、５から１００μｇ／ｍＬの間の濃度である。好ましい実施形態において、ＶＷＦの濃度は、２０から４０μｇ／ｍＬの間の濃度である。ある実施形態において、チャネルの内面は、単量体または二量体ポリペプチドとして、大腸菌または哺乳類細胞で発現される組み換え野生型ＶＷＦ（recombinant wild-type VWF）または変異ＶＷＦポリペプチド（mutated VWF polypeptides）を含むグループから選択されたＶＷＦの機能的変異体でコーティングされる。
【０１６３】
本発明の流体装置は、産生チャンバにさらに以下のような任意の構成、
チャネル中の前記懸濁液のフローを制御する流速コントローラと、
必要に応じて、産生チャンバの上流で、巨核球懸濁液を濃縮し、巨核球懸濁液を均質化する巨核球ソータ（sorter）および／または巨核球ミキサ（mixer）と、
必要に応じて、巨核球または他の細胞残渣から血小板を選別することにより、流出懸濁液を精製する産生チャンバの下流にある血小板ソータと、
を加えることができる。
【０１６４】
流速コントローラは、好ましくは、チャネルの入口またはチャネルの出口で流速を制御するために、チャネル上に配置される。この構成は、必要に応じて、流体装置への巨核球懸濁液のフローを生成するポンプと接続される。
【０１６５】
産生チャンバの上流へ巨核球ソータを配置すると、細胞集団に関して均質な懸濁液を得るのに都合がよく、血小板の工業的産生のための一貫した収量および品質を得るのに都合がよい。特に、巨核球ソータは、巨核球を血小板および他の細胞残渣から分離する構成を含む。血小板細胞ソータについて、以下に記載されるような典型的な細胞ソータを用いることができる。特に、巨核球ソータの使用により、巨核球が豊富な細胞懸濁液、すなわち、懸濁液中の細胞の少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９５％または約１００％が巨核球である細胞懸濁液を得ることができる。
【０１６６】
ミキサを使用すると、特に産生チャンバが複数のチャネルを含む場合、流体装置の産生チャンバに流入する懸濁液の均質性を保証するために都合がよい。細胞ミキサは、例えば、Stroockら(Science, Vol. 295, n°5555, 647-651, 2002)に記載されている。
【０１６７】
産生チャンバの出口において、流出物は産生された血小板を含むが、さらに、裸の核および／または無傷の巨核球を含んでもよい。したがって、産生血小板を分離する構成は、産生チャンバの下流に配置すると都合がよい。マイクロ流体技術または大量に適したアフェレーシス技術のような、典型的な細胞ソータ装置を用いることができる。血小板ソータは、クロスフローろ過装置、層流細胞ソータ、誘導泳動活性化細胞ソータ、光学力細胞ソータ、磁気力細胞ソータ、音響力細胞ソータおよび慣性力細胞ソータを含むグループから選択される。層流細胞ソータの中で、装置は、例えば、Takagiら(Lab Chip, Vol. 5, n°7, 778, 2005)に開示されているピンチフロー分別技術に基づく細胞ソータ、または、例えば、L. R. Huang etら(Science, Vol. 304, 987, 2004)に開示されている決定論的側方変位に基づく細胞ソータであってもよい。
【０１６８】
本発明は、上述した流体装置それ自体にも関し、チャネルの内側に存在する障害物を有していても、有していなくてもよい。
【０１６９】
＜かん流段階＞
本発明はさらに、巨核球または巨核球断片を含む細胞懸濁液から血小板を産生する生体外方法に関する。前記方法は、上述した本発明の流体装置に細胞懸濁液をかん流することにより行われ、必要に応じて、少なくとも１つの巨核球調節因子化合物を補充した細胞懸濁液をかん流することにより行われる。したがって、流体装置のために上述した全ての特定の特徴および実施形態は、当該方法の特徴および実施形態である。
【０１７０】
初めに、この方法は、巨核球または巨核球断片の懸濁液を本発明の流体装置に導入するステップを含む。好ましい実施形態において、細胞を含むかん流培地は、効率的な濃度の少なくとも１つの巨核球調節因子化合物、例えば、Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋ阻害剤、ＭＬＣＫ経路阻害剤、サーチュイン経路阻害剤、ＮＭＭ  ＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤、微小管構築調節因子、細胞骨格シグナル伝達阻害剤、および／またはマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を含む。懸濁液のフローは、必要に応じて流速コントローラに連結されたポンプにより生成および制御される。典型的には、産生チャンバの各チャネルは、単一のフローを規定し、巨核球または巨核球断片の懸濁液を、チャネルの入口から出口まで産生チャンバを通すことを可能とする。したがって、フローは、チャネルの入口からチャネルの出口に向けられる。好ましい実施形態によれば、流体装置に導入されたフローは、連続的である。
【０１７１】
上述したように、巨核球懸濁液は、ドナーから単離された細胞から得られた懸濁液であっても、例えば、造血幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞を含むグループから選択された前駆細胞の分化により得られた懸濁液であってもよい。
【０１７２】
流体装置において、巨核球または巨核球断片の懸濁液は産生チャンバに運ばれる。好ましい実施形態によれば、産生チャンバに入る前に、前記懸濁液は、前記細胞ソータを用いてソートされ、および／または均質化される。均質化は、産生チャンバの上流のミキサで行われる。そして、巨核球または巨核球断片の懸濁液は、産生チャンバの１つ以上のチャネルの入口に運ばれる。
【０１７３】
他の具体的な実施形態によれば、前記巨核球懸濁液は、流体装置の最初の経路にさらされた巨核球を含み、したがって、前記巨核球懸濁液は、少なくとも１つの巨核球調節因子化合物を必要に応じて補充されて、チャネルの入口に再導入される。
【０１７４】
導入後、巨核球または巨核球断片の懸濁液は、巨核球の伸長、断片化、および産生チャンバのチャネルにおける血小板放出に適したずり速度の下でフローにさらされる。当業者は、適切なずり速度を選択できる。
【０１７５】
例えば、具体的な実施形態において、好ましくは、障害物のないチャネル（すなわち、チャネルにテクスチャ加工された部分がない）の場合、チャネルにおけるずり速度は、少なくとも３００ｓ-1、好ましくは、少なくとも６００ｓ-1、より好ましくは、少なくとも１０００ｓ-1、例えば、３００ｓ-1から８０００ｓ-1の間、または、６００ｓ-1から２４００ｓ-1の間である。
【０１７６】
本明細書において、「壁ずり速度」（ベクトルγｗ）は、チャネル、障害物または巨核球の表面とフローとの相互作用を特徴付けるために用いられるパラメータをいう。
【０１７７】
壁ずり速度（ベクトルγｗ）は、任意の局所表面要素で定義される。特定の表面要素上では、法線ベクトルｎと、表面に対して接線方向であり、流体速度ｖの局所方向であるベクトルｍと、を定義することができ、（ベクトルｎ，ベクトルｍ）は平面デカルト座標系である。壁ずり速度は、従って、∂／∂ｎ（ベクトルｖ・ベクトルｍ）で定義される。ずり速度のＳＩ単位は、ｓ-1である。
【０１７８】
流体装置のチャネルが巨核球の捕捉を改善するための障害物（すなわち、チャネルのテクスチャ加工された部分）を含む具体的な実施形態において、ずり速度の値は、障害物のサイズ、形状および位置により局所的に変化する。結果として、本発明の装置のチャネルのテクスチャ加工された部分において、巨核球または巨核球断片の懸濁液は、ずり速度γ下でフローにさらされ、ずり速度は、最小値γｍｉｎから最大値γｍａｘの間で変化する。
【０１７９】
このような具体的な実施形態において、本発明の好ましい実施形態によれば、流速は、チャネルのテクスチャ加工された部分における前記巨核球を、０から最大値γｍａｘの範囲、好ましくは、３００００ｓ-1を超えない、好ましくは、１００００ｓ-1、より好ましくは、８０００ｓ-1およびさらに好ましくは、５０００ｓ-1の壁ずり速度γｗにさらすことができる範囲値に固定される。
【０１８０】
本発明による装置のチャネルのテクスチャ加工された部分のずり速度γｗは、チャネル形状、懸濁液液相パラメータおよび流速に対して、有限要素法を用いて数値的に計算される。
【０１８１】
比較すると、ヒトの循環において、壁ずり速度は、最大静脈の３０から４０ｓ-1から微小循環の５０００ｓ-1まで変化する。
【０１８２】
チャネルの出口において、収集された懸濁液は、産生された血小板を含む。本発明の一実施形態によれば、チャネルの出口で収集された懸濁液は、裸の核および／または無傷の巨核球をさらに含む。
【０１８３】
結果として、当該方法は、前記懸濁液から血小板を精製、濃縮または分離するステップをさらに含む。さらに、前記血小板は、チャネルの出口でソートされる。ソートは、上述したように、産生チャンバの下流の細胞ソータにより実行される。例えば、ソートは、クロスフローろ過、層流ソート、誘導泳動活ソート、光学力ソート、磁気力ソート、音響力ソートまたは慣性力ソートを含むグループから選択された方法により実行される。
【０１８４】
前記実施形態と組み合わせることができる具体的な実施形態において、（最初の経路で伸長されていない）ソートされた無傷の巨核球または細胞懸濁液全体のいずれか一方が、チャネルの出口で収集され、さらなる血小板放出のために、流体装置のチャネル内の１つ以上のさらなる経路に再導入される。
【０１８５】
前記実施形態に関連する他の実施形態において、ソートされた無傷の巨核球または細胞懸濁液全体のいずれか一方が、チャネルの出口で収集され、さらなる血小板放出のために、流体装置内の細胞懸濁液として再導入される前に、成熟させて巨核球になるように培養される。
【０１８６】
＜本方法により得られる血小板およびその使用＞
有利には、本発明の流体装置は、新たに産生された血小板の機能的性質を維持しながら、高収率産生で巨核球懸濁液から血小板を産生することができる。
【０１８７】
したがって、本発明は、上記方法および／または上記流体装置により得られた、および／または得ることができる血小板に関する。
【０１８８】
上記方法および／または流体装置により得られたまたは得ることができる血小板は、例えば、血小板数の減少異常、特に、血小板減少症および血小板病症の治療用の医薬組成物の調合に用いることができる。
【０１８９】
例えば、本発明の方法または流体装置により得られた、または得ることができる血小板は、血小板産生障害を患う被験者に効果的な量を輸血できる。
【０１９０】
さらに、本発明の血小板産生方法は、高品質で標準化された血小板の大規模産生に適している。結果として、産生された血小板は、診断目的として使える。それらは、血小板機能の標準化のための正常対照群（normal control）として使える。実際に、血小板機能検査は、正常な個体および病気に冒された個体からの自然な機能状態の新鮮な血液の血小板を必要とする。血小板機能検査の標準化では、実施された血小板機能検査の全てのバッチに対して実験室が正常対照群を実行する必要がある。しかしながら、静脈穿刺による連続的定期的な採血は、いくつかの健康問題および倫理的問題を引き起こす。有利には、本発明の方法または流体装置により得られた、または得ることができる血小板は、血小板機能を測定するための試験管内診断試験において陽性対照群（positive control）として使うことができる。細胞培養における胎児子牛血清（foetal calf serum）、より正確には、間葉幹細胞（mesenchymal stem cells）の許容可能な代替案として提案されている血小板溶解物の開発と同様に、創傷治癒のように、細胞療法の広範囲においてますます利用されるようになり、より多くの用途が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
本発明のより完全な理解は、本発明の例示的な実施形態の以下の詳細な説明を添付の図面と併せて検討することにより達成される。
【図１】図１は、培養段階におけるＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）の不存在下（左パネル）または存在下（右パネル）のかん流段階において添加されたＲｉの効果を示す図である。（Ａ）は、捕捉巨核球（黒線）および伸長巨核球（グレー線）の平均表面密度の比（Ｒｉの添加なし対かん流段階でＲｉを添加）を示す。平均値の標準誤差は、マイクロ流体装置のｎ＝１６チャネルで計算される。統計解析は、スチューデントｔ検定（Student t-test ）（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）を用いて行った。計数は、３５分間のかん流後に行った。３つのうち１つの実験データを示す。（Ｂ）は、かん流段階における流体懸濁液にＲｉを添加した効果の一実施形態を示す拡大画像を示す。提示された画像は、Ｒｉの不存在下（左パネル）または存在下（右パネル）で培養された巨核球の３５分間のかん流後；および、かん流段階の間、流体懸濁液中のＲｉの不存在下（上パネル）または存在下（下パネル）において、テクスチャ加工された領域の始まりからｘ＝１ｃｍの位置で撮影された。尺度図は、１００μｍを表す。
【図２】図２は、細胞捕捉および細胞伸長に対するＶＷＦの効果を示す。（Ａ）は、捕捉巨核球（黒線）の平均表面密度と伸長巨核球（グレー線）との比（ＶＷＦ表面コーティング  対  ＢＳＡ表面コーティング）を示す。平均値の標準誤差は、マイクロ流体装置のｎ＝１６チャネルで計算される。統計解析は、スチューデントｔ検定（＊＊＊ｐ＜０．００１）を用いて行った。計数は、かん流段階および巨核球培養段階の間に、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）を含む巨核球懸濁液で３５分間のかん流後に各実験について行われる。（Ｂ）は、ＶＷＦでコーティングされたマイクロチャネル（上パネル）およびＢＳＡでコーティングされたマイクロチャネル（下パネル）を用いた場合、テクスチャ加工された領域の始まりからｘ＝１ｃｍの位置における、３５分間のかん流後の表面の典型的な画像を示す。尺度図は、１００μｍを表す。
【図３】図３は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む入口溶液からの成熟巨核球の伸長および断片化を示す画像であり、伸長プロセスおよび断片化プロセルを変化させない。時間モンタージュは、伸長構造が破裂（黒矢印）する糸に通されたビーズ様構造（bead-on-a-thread-like structure）を有する補足された巨核球を示す。白矢印は、伸長巨核球の先端を示す。尺度図は、２０μｍを表す。
【図４】図４は、比（実験条件  対  ２４時間静的血小板（ＳＴＡＴ  ２４ｈ）産生）を表すグラフを示す。実験条件は、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）の存在下での２４時間静的血小板産生（ＳＴＡＴ  ２４ｈ  Ｒｉ）、Ｒｉの不存在下（＋／＋  ２ｈ）または存在下（＋／＋  ２ｈ  Ｒｉ）の巨核球懸濁液からの血小板産生であり、いずれも、マイクロ流体システムを介した２時間のかん流後である。上グラフの培養段階ではＲｉは添加されなかったが、下グラフについてはＲｉは添加された。血小板濃度（［ＰＬＰ］）は、血球計で計数することにより得られる。血小板産生の比の平均値の標準誤差（上グラフ：ＳＴＡＴ  ２４ｈ：ｎ＝３，ＳＴＡＴ  ２４ｈ  Ｒｉ：Ｎ＝２，他の条件：ｎ＝６；下グラフ：各条件について、ｎ＝２）が提供される。統計解析は、スチューデントｔ検定（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）を用いて行った。
【図５】図５は、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）の（Ａ）不存在下および（Ｂ）存在下で培養された巨核球懸濁液からのかん流段階において産生されたＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋血小板の集団を示す、血小板受容体の２色フローサイトメトリー分析を示す写真である。各パネルについて、実験条件は、Ｒｉ不存在下の２４時間静的血小板（ＳＴＡＴ  ２４ｈ）およびＲｉ存在下の２４時間静的血小板（ＳＴＡＴ  ２４ｈ  Ｒｉ）であり、Ｒｉの不存在下（＋／＋  ２ｈ）またはＲｉの存在下（＋／＋  ２ｈ  Ｒｉ）における巨核球懸濁液からのかん流段階の血小板産生を示す。
【図６】図６は、血小板受容体の単色フローサイトメトリー分析を示す写真であり、培養段階において、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）の不存在下（上グラフ）および存在下（下グラフ）で培養された巨核球から産生された血小板表面のＣＤ６１、ＣＤ４２ｂおよびＣＤ４９ｂ受容体の数を示す。それぞれについて、対照群は、一人のドナーの血液サンプル（黒棒）から調製された血小板、および、Ｒｉの不存在下（ＳＴＡＴ  ２４ｈ）またはＲｉの存在下（ＳＴＡＴ  ２４ｈ  Ｒｉ）における巨核球からの２４時間静的血小板産生である。実験条件は、Ｒｉの不存在下（＋／＋  ２ｈ）またはＲｉの存在下（＋／＋  ２ｈ  Ｒｉ）における巨核球懸濁液からのかん流段階における血小板産生である。それぞれ、ｎ＝１である。
【図７】図７は、２時間のマイクロ流体かん流およびＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）不存在下（ＳＴＡＴ  ２４ｈ）の巨核球からの２４時間静的血小板産生の間、Ｒｉの存在下（＋／＋  ２ｈ  Ｒｉ）またはＲｉの不存在下（＋／＋  ２ｈ）における巨核球懸濁液からのマイクロ流体システムで産生された血小板の接着の顕微鏡写真を示す。抗αチューブリン抗体による間接免疫蛍光標識が、二次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗マウス抗体により明らかにされ、Ｆアクチン染色用のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６ファロイジンがＰＡＲ−１トロンビン調節因子（ＴＲＡＰ６）の不存在下（左パネル）または存在下（右パネル）で行われる。血小板はフィブリノゲンに付着している。
【図８】図８は、ＰＡＲ−１トロンビン受容体（ＴＲＡＰ６）のペプチド作動薬（agonist peptide）によるＣＤ４１／ＣＤ６１受容体の活性化を、有するまたは有しない血小板受容体の２色フローサイトメトリー分析を示す写真である。（Ａ）ヒストグラムは、血小板ゲート内の、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）の不存在下（＋／＋  ２ｈ）または存在下（＋／＋  ２ｈ  Ｒｉ）における巨核球懸濁液からの、マイクロ流体装置における血小板産生のＴＲＡＰ−６活性化の前（黒棒）または後（グレー棒）のＰＡＣ−１／ＣＤ４２ｂ正の要素（positive element）の％を示す。（Ｂ）は、血小板ゲート内の対応するドットプロットを表示し、非刺激（左パネル）およびＲｉの不存在下（＋／＋  ２ｈ）またはＲｉの存在下（＋／＋  ２ｈ  Ｒｉ）における巨核球懸濁液からのマイクロ流体装置で産生されたＴＲＡＰ−６刺激サンプル（右パネル）におけるＰＡＣ−１＋／ＣＤ４２ｂ＋血小板の集団、および、Ｒｉの存在下で２４時間静的血小板産生（ＳＴＡＴ  ２４ｈ  Ｒｉ）の制御を示す。かん流段階でＲｉの不存在下または存在下のマイクロ流体装置で産生されたＴＲＡＰ−６刺激血小板におけるＰＡＣ１＋／ＣＤ４２ｂ＋集団のシフトに注意する。培養段階でＲｉは添加されなかった。ｎ＝１である。
【図９】図９は、ＰＡＲ−１トロンビン受容体（ＴＲＡＰ６）のペプチド作動薬によるＣＤ４１／ＣＤ６１受容体の活性化の不存在下または存在下での血小板受容体の２色フローサイトメトリー分析を示す写真である。パネルＡおよびパネルＢは、培養段階中にＲｉが添加されたことを除き、図８の凡例に記載されたデータを示す。ｎ＝１である。
【図１０】図１０（Ａ）は、２時間のかん流（［ＰＬＰ］ｅｎｄ）後に産生された血小板の濃度を表すグラフである。実験条件は、マイクロ流体システムを介したかん流の２時間後のニコチンアミドの不存在下（＋／＋）または存在下（＋／＋  ＮＩＣ）における巨核球懸濁液からの血小板産生を含む。マイクロ流体チップを含まない対照群は、２時間のかん流の間、ニコチンアミドの不存在下（＋／−）または存在下（＋／−  ＮＩＣ）で行われた。４つの最初の実験条件では培養段階でニコチンアミドは添加されなかったが、３つの最後の実験条件ではニコチンアミドが添加された。血小板濃度（［ＰＬＰ］）は、血球計で計数することにより得られる。血小板濃度の平均値の標準誤差（＋／＋  および  ＋／＋  ＮＩＣ：ｎ＝３；他の条件：ｎ＝２）が、提供される。（Ｂ−Ｃ）は、血小板受容体の２色フローサイトメトリー分析を示す写真であり、培養段階でニコチンアミドの（Ｂ）不存在下および（Ｃ）存在下で培養された巨核球懸濁液から、かん流段階で、産生されたＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋血小板の集団を示す。各パネルについて、実験条件は、ニコチンアミドの不存在下（＋／＋）または存在下（＋／＋  ＮＩＣ）で、巨核球懸濁液から、２時間のかん流段階の間の血小板産生を含む。追加の対照群は、２時間のかん流段階を含み、マイクロ流体チップ（＋／−）なしで、これらの２時間のかん流の間、不存在下（＋／−）または存在下（＋／−  ＮＩＣ）で行われた。
【図１１】図１１（Ａ）は、比（実験条件  対  ＋／＋（化合物導入なし）産生）を示すグラフである。実験条件は、ブレビスタンチン（ＢＬＥＢＢ）の不存在下（＋／＋）または存在下（＋／＋  ＢＬＥＢＢ）、および、対照群として、ＤＭＳＯの存在下、かん流段階の間、マイクロ流体システムを介した２時間のかん流の後における巨核球懸濁液からの血小板産生（［ＰＬＰ］ｅｎｄ）を含む。３つの最初の実験条件では培養段階の間にブレビスタンチンは添加されなかったが、３つの最後の実験条件では培養段階の間にブレビスタンチンが添加された。血小板濃度（［ＰＬＰ］）は、血球計で計数することにより得られる。平均値の標準誤差（ｎ＝３）が、提供される。（Ｂ−Ｃ）は、血小板受容体の２色フローサイトメトリー分析を示す写真であり、ブレビスタンチンの（Ｂ）不存在下および（Ｃ）存在下で培養された巨核球懸濁液からかん流段階で産生されたＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋血小板の集団を示す。各パネルについて、実験条件は、ブレビスタンチンの不存在下（＋／＋）または存在下（＋／＋  ＢＬＥＢＢ）における巨核球懸濁液から２時間のかん流段階での血小板産生を含む。ＤＭＳＯ（＋／＋  ＤＭＳＯ）が導入された２時間のかん流段階を含む追加の対照群が、提供される。
【図１２】図１２（Ａ）は、比（実験条件  対  （化合物導入なし）産生）を表すグラフである。実験条件は、マイクロ流体システムを介した２時間のかん流後における、かん流の間、ラトルンキュリン（ＬＡ）の不存在下（＋／＋）または存在下（＋／＋  ＬＡ）での巨核球懸濁液からの血小板産生（［ＰＬＰ］ｅｎｄ）を含む。２つの最初の実験条件では培養段階の間にラトルンキュリンが添加されなかったが、２つの最後の実験条件ではラトルンキュリンが添加された。血小板濃度（［ＰＬＰ］）は、血球計で計数することにより得られる。血小板濃度のｎ＝１が提供される。平均値の標準誤差（培養ＭＫｓにおいてＬＡを含まない＋／＋ＤＭＳＯ、ｎ＝２；他の条件：ｎ＝３）が、提供される。（Ｂ−Ｃ）は、血小板受容体の２色フローサイトメトリー分析を示す写真であり、ラトルンキュリンの不存在下および存在下で培養された巨核球懸濁液からかん流段階で産生されたＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋血小板の集団を示す。各パネルについて、実験条件は、かん流中のラトルンキュリンの不存在下（＋／＋）または存在下（＋／＋  ＬＡ）における巨核球懸濁液から２時間のかん流段階での血小板産生を含む。
【図１３】図１３は、血小板受容体の２色フローサイトメトリー分析を示す写真であり、ＧＭ６００１の（Ａ）不存在下および（Ｂ）存在下における培養された巨核球懸濁液からかん流段階で産生されたＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋血小板の集合を示す。各パネルについて、実験条件は、かん流中のＧＭ６００１の不存在下（＋／＋）または存在下（＋／＋  ＬＡ）における巨核球懸濁液から２時間のかん流段階における血小板産生を含む。追加の対照群は、２時間のかん流段階の間にＤＭＳＯ（＋／＋  ＤＭＳＯ）を添加することを含む。
【図１４】図１４（Ａ）は、２時間のかん流（［ＰＬＰ］ｅｎｄ）後に産生された血小板の濃度を表すグラフである。実験条件は、巨核球懸濁液からの血小板産生を含み、成熟の１２日目（＋／＋１２）にマイクロ流体システムに導入された巨核球懸濁液を成熟の１０日目にマイクロ流体システムに導入された巨核球懸濁液と比較し、そして、培養液に戻し、１２日目（＋／＋  Ｄ１０＋Ｄ１２）にマイクロ流体システムに再導入した。血小板濃度の平均値の標準誤差（ｎ＝３）が、提供される。（Ｂ）は、血小板受容体の２色フローサイトメトリー分析を示す写真であり、上記２つの実験条件（Ｄ１０＋Ｄ１２と比較されたＤ１２）の間に産生されたＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋血小板の集合を示す。
【図１５】図１５は、ポスト形状を有する障害物による血小板産生の幾何学的形状の一実施形態を概略的に示している。図１５Ａは上面図であり、図１５Ｂは断面図である。ｒはポストの半径を示し、ｐは横軸に沿った２つのポスト中心間の最近接距離であり、ｇは縦軸に沿った２つのポスト中心間の最近接距離である。αは、チャネルの長手方向と六角形周期構造の単純格子の格子ベクトルの１つとで定義される角度である。Ｈは、マイクロチャネルの高さであり、ｈは、ポストの高さである。
【図１６】図１６は、この例で用いられる２つの異なる勾配配置を表し、（Ａ）は勾配配置１、（Ｂ）は勾配配置２である。装置内部の数字は、チャネルの対応する部分の距離ｐを表し、ｘは、ポスト領域の開始点からの距離を表す。
【図１７】図１７は、巨核球捕捉における障害物密度の影響を示す画像である。左パネルは、障害物密度勾配（ｐは８５μｍに等しい）を有しないマイクロ流体装置を表し、右パネルは、障害物密度勾配（ｐは、「勾配配置２」の装置に沿って１２０μｍから７０μｍまで変化する）を有するマイクロ流体装置を表す。上から下への画像は、テクスチャ加工された領域の開始位置から０，２．２，６．６，８．８および１３．２の所を表す。画像は、実験開始から３５分後に記録した。尺度図は、５００μｍを表す。
【図１８】図１８は、２つの配置例についての巨核球の捕捉に対する障害物密度を変化させた場合の効果を表すグラフである。黒三角は、ポスト密度が増加するチャネルにおける捕捉巨核球の密度σに対応し、白四角は、障害物密度勾配のないチャネルにおける捕捉巨核球の密度σに対応する。破線は、ポスト密度の変化を示す。テクスチャは、ｒ＝１５μｍ、Ｈ＝５０μｍおよびｈ＝５０μｍで定義される配置に対応する。一定のポスト密度を有する装置は、ｐ＝ｇ＝８５μｍで定義される。上部パネルは、この装置を「勾配配置１」と比較し、ｇおよびｐで定義され、ｇ＝８５μｍ、ｐは８５μｍから５５μｍの間で変化する。下側パネルは、一定のｐを「勾配配置２」と比較し、１２０μｍから７０μｍの間で変化するｐにより定義される。ｘ軸は、テクスチャ加工された領域の入口からの距離を表す。画像は、実験開始から３５分後に記録した。
【０１９２】
＜実施例＞
材料および方法
ＣＤ３４＋細胞の培養および分化
ＣＤ３４＋細胞は、以前に報告されたように（Poirault-Chassacら, “Notch/Delta4 signaling inhibits human megakaryocytic terminal differentiation”, Blood, vol.116, n°25, p.5670-5678, 2010参照）、免疫磁性技術（Miltenyi Biotec, Paris, France）によりヒト臍帯血（ＵＣＢ）から単離される。これらの血液サンプルは、インフォームド・コンセントおよび我々の学会倫理委員会（our Institute Ethics Committee）の承認を得た後に、ヘルシンキ宣言に従って採取された。ＣＤ４３＋細胞は、１５％ＢＩＴ９５００血清代替物（Stem Cells Technologies, Grenoble, France）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove modified Dulbecco medium）（ＩＭＤＭ；Gibco Life Technologies, Saint-Aubin, France）、α−モノチオグリセロール（α-monothioglycerol）（Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France）およびリポソーム（ホスファチジル−コリン（phosphatidyl-choline）、コレステロール（cholesterol）およびオレイン酸（oleic acid）；SigmaAldrich）を含む完全培地中で３７℃、５％ＣＯ２の湿った環境で培養された。ヒト組み換え幹細胞因子（ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬ；Miltenyi Biotec）およびトロンボポエチン・ペプチド作動薬（thrombopoietin peptide agonist）ＡＦ１３９４８（ＴＰＯ、５０ｎＭ）（Dunois-Lardeら, “Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production”, Blood, vol.114, n°9, p.1875-1883, 2009参照）が、０日目に培地に１回添加され、続いて、５日目にＳＣＦなしで２０ｎＭのＴＰＯが添加された。成熟巨核球は、培養の１２から１４日後に得られる。培養中およびせん断にさらす直前に形成された血小板の除去は、（Robert A, Cortin V, Garnier A, Pineault N. Megakaryocyte and platelet production from human cord blood stem cells. Methods Mol Biol. 2012; 788: 219-47）で報告された方法に従ったＢＳＡ勾配により行った。そして、濃度は、２００，０００巨核球／ｍＬに調整した。１０μＭＲＯＣＫ阻害剤（Y27632, Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France）が、培養の８日目に巨核球の培養物に添加される。１０μＭＲＯＣＫ阻害剤の添加は、マイクロ流体装置の入口チャンバに巨核球懸濁液を導入する前に行われる。６．２５μＭニコチンアミド（N0636, Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France）が、培養の８日目に巨核球の培養物に添加される。６．２５μＭニコチンアミドの添加は、マイクロ流体装置の地理口チャンバに巨核球懸濁液を導入する前に行われる。２０μＭブレビスタンチン（203390, Calbiochem）が、培養の８日目に巨核球の培養物に添加される。２０μＭブレビスタンチンの添加は、マイクロ流体装置の入口チャンバに巨核球懸濁液を導入する前に行われる。１０μＭラトルンキュリン−Ａ（sc202691, Santa Cruz Biotechnology）が、培養の８日目に巨核球の培養物に添加される。１０μＭラトルンキュリン−Ａの添加は、マイクロ流体装置の入口チャンバに巨核球懸濁液を導入する前に行われる。２５μＭＧＭ６００１（ab120845, Abcam）が、培養の８日目に巨核球の培養物に添加される。２５μＭＧＭ６００１の添加は、マイクロ流体装置の入口チャンバに巨核球懸濁液を導入する前に行われる。
【０１９３】
システム構成
成熟巨核球懸濁液は、少なくとも３００ｒｐｍで回転する、オービタルミキサ（orbital mixer）に固定された５０ｍＬチューブ（Falcon tube, Dutscher, France）に導入される。オービタルミキサは、懸濁液中の細胞濃度の均質性を維持するために用いられる。チューブ内の巨核球濃度範囲は、少なくとも１００ｍＬ-1であり、１０１２ｍＬ-1を超えない。
【０１９４】
異なるコンポーネントを通るフローを制御するために多くの方法、例えば、差圧コントローラ、シリンジポンプおよび蠕動ポンプを用いることができる。蠕動ポンプ（205U/CA, Watson Marlow, France）を用いる場合、入口チューブおよび出口チューブは、巨核球懸濁液を含む同じ回転チューブに到着する。チューブは、フレキシブルチューブ（Tygon ST R-3607, Idex Health and Science, Germany）を用いてマイクロ流体チップの入口に接続される。懸濁液は、出口で収集される。蠕動ポンプは、マイクロ流体コンポーネントの上流または下流に接続することができる。
【０１９５】
３つのマイクロ流体コンポーネント、上流の巨核球ソータおよび／または側方細胞ミキサ、血小板産生チャネルおよび下流の細胞ソータは、順番に配置することができる。細胞ミキサおよび細胞ソータは、任意である。
【０１９６】
装置製造
マイクロ流体コンポーネントは、ソフトリソグラフィー・ラピッドプロトタイピング（Xiaら 1998. “Soft lithography”. Annual Review of Materials Science. vol.28, n°1, p.153-184）により製造される。まず。マイクロチャネルのデザインを含むコンピュータ支援設計ファイル（ＣＡＤファイル）からトランスペアレンシー（transparencies）を作成する。これらのトランスペアレンシーは、典型的なフォトリソグラフィーにより、ネガティブ・フォトレジスト（SU-8 2000 and 3000 series, Microchem, US）にパターンを転写する際のマスクとして用いられ、マイクロチャネルの凸状の起伏（positive relief）を有するマスタが得られる。チャネルは、成形ポリジメチルシロキサン（PDMS, Sylgard, Dow Corning, USA）から作製され、ガラススライド上に密封される。ＰＤＭＳプレポリマーおよび硬化剤が、混合され、脱気された。混合物がマスターの上に注がれ、７０℃で２時間硬化させ、個々のチップにカットし、入口孔および出口孔が打ち抜かれた。ガラススライドをイソプロパノールで洗浄し、乾燥させた。ＰＤＭＳの個々の構造およびガラススライドの両方を酸素プラズマオーブン（oxygen plasma oven）で処理し、その後密封した。
【０１９７】
血小板産生チャネル
テクスチャ加工された表面は、チャネル壁（ガラスまたはＰＤＭＳ）上の３Ｄパターンで定義される。これらのパターンは、ポスト密度が変化する（Ｏｘｙ）平面内のディスクアレイを含む。ここでは、これらの可能なバリエーションの２つを提示する。
【０１９８】
これらのパターンの幾何学的形状は、図１５および図１６に記載されている。ポストアレイの設計は、４つのパラメータ、ディスク半径ｒ、横軸に沿った２つのディスク中心間の距離ｐ、縦軸に沿った２つのディスク中心間の距離ｇおよび入口におけるフローの方向と２つのピラー中心（pillar centers）により規定される方向とで規定される角度αにより規定される。ここでの実験に用いた幾何学的形状において、αは、以下の基準、ｓｉｎα＝ｒ／ｇにより規定される。この基準は、最初のフロー方向に垂直な軸に投影された２つの隣接ディスク中心が、１つの半径分だけ離れていることを幾何学的に示唆している。実験的に、ｒは１５μｍから２０μｍまで変化し、ｇは８５μｍから１２０μｍまで変化し、ｐは５５μｍから１２０μｍまで変化する。図１５（Ｂ）は、（Ｏｘｚ）平面内の障害物のプロファイルを示す。チャネルの高さおよび障害物の高さは、Ｈおよびｈによりそれぞれ定義される。パラメータｈ／Ｈは、実験的に１に等しい（全ピラー）。
【０１９９】
図１６（Ａ）および図１６（Ｂ）に示したように、この例では、ｐの２つの異なる勾配を用いた。
最初のものは、「勾配配置１」であり、血小板産生を増大させるために、巨核球捕捉を増やすために用いた。距離ｇは８５μｍに固定され、距離ｐはチャネルに沿って８５μｍから５５μｍまで変化する。したがって、ポスト密度は、チャネルに沿って徐々に増加する。
２つ目のものは、「勾配配置２」であり、開始距離ｐ＝１２０μｍの結果、装置に沿って細胞密度を均質化するために用いた。さらに、この距離ｐは、チャネルに沿って１２０μｍから７０μｍまで変化する。これらのバリエーションは、ポスト密度の急激な増加を誘発し、それにより、巨核球捕捉の急激な増加を誘発する。巨核球伸長のための十分な空間を確保するために、距離ｇを以下のように定義した。
ｐ≧８５μｍの場合、ｇ＝ｐ
ｐ＜８５μｍの場合ｇ＝８５μｍ
【０２００】
すべての装置は、サーペンタイン（serpentine）形状に整理された１６の並列チャネルで構成される（図１６）。チャネルは、直線部分（長さ、１３．２ｃｍ）にテクスチャ加工が施され、ｒ＝１５μｍ、Ｈ＝５０μｍ、Ｈ／ｈ＝１のパラメータでパターン化されている。
【０２０１】
ずり速度
我々は、ガラスまたは（ＰＤＭＳ障害物を含む）ＰＤＭＳ上のどのようなものであれ、チャネル壁上に表面要素を定義する。この表面要素では、平面の単位ベクトルそれに垂直に作用するベクトルｎで定義する。（ベクトルｎ，ベクトルｍ）は平面デカルト座標系であるように、流体速度ｖの法線方向および局所方向に接する単位ベクトルｍが決定される。壁ずり速度ベクトルγ（ｓ-1）は、ベクトルγ＝∂／∂ｎ（ベクトルｖ・ベクトルｍ）で定義される。壁ずり速度は、装置内の流速と装置の幾何学的形状との両方によって制御される。
【０２０２】
ビデオ顕微鏡システム
マイクロ流体チップは、倒立顕微鏡（DMI6000 B, Leica Microsystems GmbH, Germany）のステージ上に配置された。コンピュータ支援伝導ステージ制御を用いて、チャネル長に沿った位置を記録した。我々は、実験時間に沿って、観測フィールド位置とそれらの間の交互記録画像とを記録した。微分干渉対物レンズ（Differential interference contrast objective）を用いて、１０倍から４０倍の間の動画および画像を記録した。ＣＭＯＳ高速カメラ（Fastcam SA3, Photron, USA）を用いて、０．５から１５００Ｈｚの周波数で画像を記録した。
【０２０３】
表面で捕捉された細胞は、記録されたチャネル画像から手動で計数し、懸濁液中の細胞は、血球計で計数する。
【０２０４】
タンパク質表面処理
ヒト・フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、Laboratoire Francais du fractionnement et des Biotechnologiesの贈り物であった。それは、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Lonza, Belgium）中で４０μｇ・ｍＬ−１に希釈され、密封マイクロチャネルでかん流した。我々は、この表面コーティングを血小板産生チャネルにおいてのみ使用した。
【０２０５】
ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich La Verpilleres, France）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で４０μｇ・ｍＬ−１で希釈し、マイクロチャネルでかん流した。
【０２０６】
両方のタンパク質の処理のために、チップの入口および出口はカバースリップ（cover slip）により覆われている。チップを４℃で一晩培養し、実験前にＰＢＳで洗浄した。ガラスおよびＰＤＭＳの両方に対するＶＷＦ吸着を、一次ポリクロナールウサギ抗ＶＷＦ抗体（primary polyclonal rabbit anti-vWF antibody）（Dako, １０μｇ・ｍＬL-1）および二次Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５４６ポリクロナールヤギ抗ウサギ抗体（secondary Alexa fluor 546 polyclonal goat anti-rabbit antibody）による蛍光標識法により検証した。
【０２０７】
血小板産生チャネルの並列化
血小板産生数を増加させるには、装置における巨核球の流速が高いことが望ましい。障害物のパターンおよびチャネルの高さについて、チャネル幅を大きくすることにより流速を増加させることができる。ＰＤＭＳチャネルの機械的制約は、チャネル崩壊を回避する高さに対する最大幅の比を課すので、有効幅を広げるためにチャネルを並列化した。
【０２０８】
巨核球は、チュービングにより血小板産生チャネルに導入される。細胞は、三角形形状の入口を介して並列チャネルに分配され、細胞は各チャネルに運ばれる。チャネルの高さに対して、壁ずり速度はチャネル幅に反比例する。その結果、壁ずり速度は、並列化チャネルの入口よりも入口壁の近くでより高くなる。細胞を損傷する壁ずり速度にさらされることを避けるために、分配チャネルは、並列化ずりチャネルに用いられるものよりも高い高さにより製造される。これらの２つの高さの比は、典型的には、２から２０の間である。
【０２０９】
血小板ソーティング
裸の核および無傷の巨核球は、血小板産生チャネルからの流出懸濁液を連続的にソーティングすることにより血小板から除去することができる。これはマイクロ流体技術により行うことができる。アフェレーシス技術もたくさん考えられる。我々は、ピンチフロー分画法（Takagiら, Lab Chip, vol.5, n°7, p.778, 2005）および決定論的横置換法（Deterministic Lateral Displacement）（(L. R. Huangら Science, 304, 987, 2004）を用いた血小板ソーティングの２つの例を与えた。決定論的横置換装置は、１つの入口、球形のポストアレイおよび２つの出口（中央および側方）を含む。この装置は、長さ５ｃｍ、幅３ｍｍおよび高さ４０μｍである。ポストの直径は、８５μｍであり、ポスト間の間隔は１５μｍである。ポストのローシフト（row shifting）は、０．０５ラジアンの角度を形成する。表面はＢＳＡコーティングで覆われている。細胞は、中央出口で軌道を変えられ、ソートされるが、血小板は、側方出口で軌道を変えられず、ソートされない。細胞懸濁液から血小板を分離する他の技術は、超音波定常波力（ultrasonic standing wave forces）（Antfolkら, Lab Chip, vol 14, 2791-2799, 2014）を用いる技術である。連続的に流れる細胞懸濁液に音響定常波場（acoustic standing wave field）を適用することにより、細胞は、物理的性質に依存する周囲の培地から分離される。その後、血小板をソートすることができる。
【０２１０】
収集血小板の特徴
勾配配置２のマイクロ流体装置における血小板産生が、マイクロ流体チップなしの２４時間静的条件からの血小板産生を含む対照群サンプルと比較された。ＣＤ４１抗原およびＣＤ４２抗原の発現は、フローサイトメータＢＤ蛍光Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６（登録商標）（flow cytometer BD Fluorescence Accuri C6）（BD Biosciences, Le Pont de Claix, France）と用いて特徴付けた。血小板をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役抗ヒトＣＤ４１（αＩＩｂ）、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）共役抗ヒトＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（いずれも、Beckman Coulter, Villepinte, France）およびＦＩＴＣ共役抗ヒト活性化αＩＩｂｂ３（BD Biosciences）により、１５分間、２２℃で培養し、対照群は、ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１（Beckman Coulter）、ＰＥマウスＩｇＧ１（Ｇ１）を用いて行われた。血小板受容体の単色フローサイトメトリー分析は、ＧＰスクリーンアッセイ（GP screen assay）（Biocytex, Marseille, France）を用いて行われた。抗原部位の数は、較正されたビーズ標準曲線（bead standard curve）に基づいて、蛍光強度を血小板に結合した対応するモノクロナール抗体の数に変換することにより決定される。活性化が、ＰＡＲ−１トロンビン受容体（ＴＲＡＰ６）のペプチド作動薬の存在下で得られたことを除いて、上記のDunois-Larde,の刊行物に以前に報告されたように、フィブリノゲン接着分析（adhesion assay）および落射蛍光法（epifluorescence）を行った。落射蛍光法が、高解像度生体イメージングプラットフォーム（QIClick-F-CLR-12 Digital CCD camera, Q-imaging, Microvisions Instruments, Evry, France）を用いて、４９４ｎｍおよび５２２ｎｍ（それぞれ、吸収および発光）で解析された。
【０２１１】
巨核球捕捉
我々は、（非移動細胞を含む）移動速度（translocation velocity）および伸長プロセスとは無関係に、表面付着巨核球により捕捉巨核球を定義する。我々は、特定のネックレス構造を既に示している巨核球と同様に、糸に通されたビーズ様構造（bead-on-a-thread-like structure）を形成するために巨核球が再組織化を開始する表面付着および伸長巨核球により伸長巨核球を定義する。我々は、図１５および図１６に示した勾配配置１または勾配配置２を示すマイクロ流体装置に導入された巨核球懸濁液の巨核球捕捉を評価した。結果は、図１７および図１８に示されている。捕捉巨核球の密度は、テクスチャ加工された領域（σ〜３００から５００ｍｍ−２）の入口で非常に高いが、この密度は、固定されたｐで装置に沿って急激に減少する（テクスチャ加工された領域の端部で５０ｍｍ−２）。対照的に、細胞がポストの勾配を経験する場合、付着巨核球の密度は、各遷移で増加する（距離ｐの減少に対応する）。細胞の密度が、維持され、テクスチャ加工された領域の端部で高くなる（「勾配配置１」で〜１００ｍｍ−２）。
【０２１２】
特定の巨核球培養および巨核球懸濁液濃度について、我々は、入口で巨核球密度が高く、固定距離ｐ＝８５μｍで装置に沿ってより低く、軸依存と呼ばれる現象を観察した。この密度の不均衡は、入口で高い距離ｐが用いられる場合に減少する（図１７の「勾配配置２」に対してｐ＝１２０μｍ）。本発明者らは、チャネルに沿ったポスト密度が増加すると軸依存の影響を部分的に相殺し、装置に沿ってより均一化された巨核球分布が保証されることを見出した。
【０２１３】
我々は、マイクロ流体装置に導入された異なる巨核球懸濁液による巨核球捕捉を評価した。結果を図１に示す。捕捉巨核球および伸長巨核球の密度が測定され、培養段階においてＲＯＣＫ阻害剤が存在しない場合、我々は、ＲＯＣＫ阻害剤の補充をしたか否かに関わらず、巨核球懸濁液を受け取る装置の間で、はっきりした密度差を観察した。ＲＯＣＫ阻害剤が添加された場合、伸長巨核球密度が、２．９８±０．２８倍重要であるので、流体プロセス中の懸濁液中のＲＯＣＫ阻害剤の存在は、伸長プロセスを促進するようであり、ＲＯＣＫ阻害剤が添加された場合、捕捉巨核球密度が１．４２±０．１３倍重要であるので、同様に巨核球捕捉を促進するようである。培養段階でＲＯＣＫ阻害剤を添加すると、同様の効果が観察される。
【０２１４】
タンパク質表面コーティング効果
血管内皮細胞では、ＶＷＦは、ＧＰＩｂ受容体の結合を介して高いずり速度（＞１０００ｓ-1）にさらされると、循環血小板の移動を可能とする（Huizingaら, Science, vol.297, n°5584, p.1176-1179, 2002）。試験管内において、ＶＷＦの吸着により、巨核球、血小板および血小板前駆体がＰＤＭＳおよびガラス表面へ移動することが可能となる（Dunois-Lardeら, Blood, vol.114, n°9, p.1875-1883, 2009）。我々は、培養の８日目およびマイクロ流体かん流の２時間の間に添加されたＲＯＣＫ阻害剤を有する巨核球が付着するチャネル表面をコーティングするＶＷＦおよびＢＳＡの効果を比較した。
【０２１５】
我々は、ＶＷＦでコーティングした実験とＢＳＡでコーティングした実験とを並行して行った。我々は、ｔ＝３５分で、巨核球の表面密度を比較した。結果は図２に示す。ＶＷＦでコーティングした場合、伸長巨核球密度は、７．７２±１．３２倍重要であり、ＢＳＡでコーティングした場合、捕捉巨核球密度は、５．８６±１倍重要である。ＶＷＦは、チャネル中の付着細胞および伸長細胞の密度を急激の増加させる。
【０２１６】
巨核球破裂および血小板放出
我々は、表面付着巨核球からの血小板脱落を観察した。巨核球がチャネル壁上を移動すると、ＶＷＦとの一時的な相互作用が壁表面で起こり、巨核球からの血小板脱落まで、次第に形態変化が起こる。脱落は、伸長および細胞体の両方が移動している場合に起こる。このプロセスは、上記Dunois-Lardeの刊行物および特許文献８に記載されている。破裂の後、両者は壁面上を移動し続ける。
【０２１７】
脱落は、細胞体がピラーの周りまたは後ろに捕捉されるまで移動する場合にも起きる。数分間の時間スケールで、上記Dunois-Lardeで以前に報告されたように、巨核球は、形態変化を受け、伸長の形成を引き起こし、糸に通されたビーズ様構造を採用する。さらに、コーティングされた表面との完全な細胞接触の代わりに、いくつかの伸長は、細胞が少なくとも１つの接点により同じ位置に留まっていても、フローとともに自由に移動する（ぶら下がる）ようである。糸に通されたビーズ様伸長のサイズが大きくなるにつれて、図３に示したように、血小板および／または血小板前駆体を放出する破裂が生じる。ＲＯＣＫ阻害剤が巨核球懸濁液に添加された場合、伸長プロセスと糸に通されたビーズ様構造形成とには違いは観察されなかった。しかしながら、我々は、ＲＯＣＫ阻害剤がかん流段階の間に巨核球懸濁液に導入され、培養段階の間に存在しない場合、有意に高い血小板放出を観察した。異なる条件からの血小板産生の血球計係数が測定された。血小板産生（実験条件  対  ＲＯＣＫ阻害剤血小板産生を伴わない２４時間静的）の比が、計算され、図４に示されている。血小板産生は、マイクロ流体装置を通るせん断応力の存在下で有意に高く、２４時間マイクロ流体かん流に対してＲＯＣＫ阻害剤が巨核球懸濁液に添加された場合にはさらに高い。ＲＯＣＫ阻害剤を含む巨核球懸濁液を受け取った流体装置における産生血小板は、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない巨核球懸濁液を受け取った流体装置と比較して有意により重要である血小板産生を示した。培養段階において、ＲＯＣＫ阻害剤が添加された場合、同様の傾向が観察される。
【０２１８】
他の巨核球調節因子化合物は、本発明による血小板産生の生体外方法のかん流段階において特に添加された場合に、産生血小板の量および質に対するそれらの効果についてテストされた。
【０２１９】
サーチュイン経路の阻害剤であるニコチンアミドが、マイクロ流体装置の２時間のかん流の間に巨核球懸濁液に導入された。伸長プロセスおよび糸に通されたビーズ様構造形成の違いは観察されなかった。しかしながら、我々は、かん流段階の間に巨核球懸濁液にニコチンアミドが導入され、培養段階の間にニコチンアミドを導入しなかった場合に、高い血小板放出を観察した（図１０（Ａ））。異なる条件からの血小板産生の血球計による計数を行った。ニコチンアミドを含む巨核球懸濁液を受け取った流体装置における産生血小板は、ニコチンアミドを含まない巨核球懸濁液を受け取った流体装置と比較してより重要な血小板産生を示した。培養段階の間にニコチンアミドが添加された場合にも、同様の傾向が観察される。
【０２２０】
ブレビスタンチン（図１１）またはラトルンキュリン（図１２）が、かん流段階の間に巨核球懸濁液に導入され、培養段階の以前に導入され、または導入されていなくても、同様の結果が観察された。
【０２２１】
図１４は、血小板産生の日よりも早い日のせん断応力が最終血小板産生に及ぼす影響を示す。言い換えれば、培養の１０日目に、ＶＷＦでコーティングされたマイクロ流体装置に巨核球懸濁液を導入した。この装置で２時間循環させた後、残りの巨核球（捕捉されていない巨核球を意味する）をさらに２日間培養液に戻した。そして、１２日目に、それらを新鮮なＶＷＦでコーティングされたマイクロ流体装置に再導入し、血小板産生を、１２日目にＶＷＦでコーティングされたマイクロ流体装置に１度導入した巨核球懸濁液からの産生と比較した。図１４（Ａ）に示すように、巨核球懸濁液が既にＶＷＦでコーティングされたマイクロ流体装置で循環された場合、より高い血小板放出が定量化される。この産生はまた、より高いＣＤ４１＋／ＣＤ４２＋血小板の割合を示した。
【０２２２】
流体装置で産生された血小板の特性評価
２時間のかん流の後、ＲＯＣＫ阻害剤を含む巨核球懸濁液を受け取った流体装置中の産生血小板は、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない巨核球懸濁液を受け取った流体装置で産生された血小板と比較して優れたいくつかの特性を示した。図５に示したように、ＣＤ４２ｂ受容体を発現する血小板の割合は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む巨核球懸濁液を受け取った流体装置により生成された場合、より高くなった。それらはまた、天然の血小板、すなわち血液から単離された血小板と同等の類似の特性を示した（図６）。興味深いことに、図７において、ＴＲＡＰ−６刺激時に、ＲＯＣＫ阻害剤を含む巨核球懸濁液からの血小板は、一時的活性化に特有であるチューブリン構造を示すのに対し、アクチンフィラメントは、血液から単離されたトロンビン活性化血小板として再構成される。それらは、ＲＯＣＫ阻害剤を添加しない場合に、流動対照群からのサンプルでは観察されない安静構造に戻ることができる。刺激がなければ、図７は、血小板のチューブリンリング特性が、流体装置から収集されたサンプル中に存在するが、静的サンプルからでは存在しないことを示している。事実、静的サンプルは、ＴＲＡＰ−６の存在下および不存在下での糸状仮足（filopodia）および葉状仮足（lamellipodia）の存在を示す。ＴＲＡＰ−６刺激時に、マイクロ流体装置で産生された血小板は、血小板を特徴付けることが知られているものと同様の活性化特徴を受けることができ、例えば、αＩＩｂβ３受容体の活性化構造に特異的なＰＡＣ１モノクロナール抗体の結合レベルを増加させる。図８および図９によれば、ＲＯＣＫ阻害剤を含むまたは含まない巨核球懸濁液の両方から産生された血小板は、ＴＲＡＰ−６刺激時にαＩＩｂβ３受容体の活性化構造を示す。
【０２２３】
ニコチンアミド（図１０（Ｂ−Ｃ））、ブレビスタンチン（図１１（Ｂ−Ｃ））またはラトルンキュリン（図１２（Ｂ−Ｃ））などの他の巨核球調節因子化合物がテストされ、培養段階の以前に導入され、または導入されていなくても、２時間のかん流の間にニコチンアミド、ブレビスタンチンまたはラトルンキュリンを含む巨核球懸濁液を受け取った流体装置により産生された場合、ＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋血小板の高い割合が示された。各テスト化合物について、２つのさらなる実験についても同様の傾向が観察された（データは示されていない）。
【０２２４】
メタロプロテイナーゼ阻害剤、ＧＭ６００１は、ＣＤ４２＋血小板の最終収量の改善の効果についてテストされた。ＣＤ４２ｂ受容体は、生体外で産生される血小板の表面上で不安定であることが示された。メタロプロテイナーゼによる切断（cleavage）の可能性がある。培養中および２時間のかん流段階の間にメタロプロテイナーゼ阻害剤ＧＭ６００１を添加すると、血小板ＣＤ４２＋の割合が増加した。図１３に示したように、ＣＤ４２受容体を発現する血小板の割合は、２時間ＧＭ６００１を補充した巨核球懸濁液を受け取った流体装置で産生された場合に、より高かった。巨核球懸濁液を後の段階でＧＭ６００１と共に培養すると、同様の効果が検出された。２つのさらなる実験について、同様の傾向が観察された（データは示されていない）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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2018515099.tif 000032
2018515099.tif 000033
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