(57)【要約】  室温での有効期間がより長い、一体化され、かつ活性があるチラコイド膜を得るための、向上した抽出プロセスを提供する。詳細には、抽出物は、ＰＶＰの溶液中で凍結乾燥されて、室温で少なくとも７日間、その本来の活性の少なくとも８０％にて、安定したままである。
2018536414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体から活性チラコイド膜を抽出する方法であって：
Ｆｖ／Ｆｍ比が少なくとも約０．７である植物組織を得る工程と；
粘度が１〜１．３であり、ｐＨが５を超え、かつ８未満である媒質中で前記組織を破壊して、液相中に細胞残渣およびチラコイドの混合物を得る工程と；
前記残渣をチラコイドから分離する工程と；
前記チラコイドを懸濁して濾過して、画分を回収する工程と；
Ｆｖ／Ｆｍが約０．７よりも大きい画分をプールする工程と；
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を加えて、そこから水を除去することによって、プールされた前記画分を安定化させる工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記組織を、ｐＨが約中性の次亜塩素酸ナトリウムで洗浄する工程と；
洗浄された前記組織を、５６５〜５７５ｎｍの光条件下で、かつ約１０℃未満の温度にてコンディショニングする工程と；
前記組織を、請求項１に規定されるように破壊する工程と；
上部フィルタによる遠心分離下でチラコイドから前記残渣を分離して、チラコイドから本質的になる上部フィルタペレットを回収する工程と；
前記ペレットを懸濁して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ１００で濾過して、Ｆｖ／Ｆｍが約０．７よりも大きい画分を回収し、かつプールする工程と；
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む溶液中で凍結乾燥を実行することによって、プールされた前記画分から水を除去して、電子供与体が実質的にない前記抽出物を回収する工程と
をさらに含み、
実質的に純粋な前記チラコイド抽出物は、クロロフィルＡ、クロロフィルＢ、ルテイン、およびカロテンから選択される組織化された光合成色素を含み；クロロフィルＡは、総色素含有量のうち、少なくとも０．６の比率にて存在し；
実質的に純粋な前記チラコイド抽出物の抗酸化活性は、少なくとも約７日間、室温にて安定している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化活性チラコイド抽出物は、４℃にて少なくとも約２ヵ月間安定している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化活性チラコイド抽出物は、４℃にて少なくとも約１年間安定している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程ｄ）の懸濁液は、前記植物組織を前記媒質中に機械的に分散することによって得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記植物はホウレンソウである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記粘度は、前記媒質中に糖を加えることによって部分的に達成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記粘度は、前記媒質中での約０．２〜０．４Ｍの濃度のソルビトールの、または０．２〜０．４Ｍソルビトールに相当する粘度を達成する糖の存在によって、部分的に達成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記媒質は、以下の組成物：ｐＨが約７．５であるトリスバッファ、酢酸バッファ、またはアスコルビン酸バッファ（２０ｍＭ）、および３５０ｍＭのソルビトールまたはスクロースを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離工程ｄ）は、第１の抽出物を、上位部分にフィルタを備えた管内で遠心分離する工程を含み、前記フィルタは、細胞残渣および膜が沈着する一方、前記チラコイドおよび前記液相が前記フィルタを通過する多孔性を有し、前記チラコイドは、前記管の下位部分にペレットを形成する、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
水の前記除去工程は、約０．５〜約５％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を、プールされた前記画分に加えて、凍結乾燥を実行することによって実行される、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＶＰは、約２％の濃度にて存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
約３５０ｍＭのスクロースまたはソルビトールを、プールされた前記画分に、凍結乾燥の前に加える工程をさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
実質的に純粋な前記チラコイド抽出物は、室温にて約５日間安定している一方、その本来のＦｖ／Ｆｍ活性の少なくとも約９０％を維持している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
実質的に純粋な前記チラコイド抽出物は、室温にて約７日間安定している一方、その本来のＦｖ／Ｆｍ活性の少なくとも約８０％を維持している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
実質的に純粋な前記チラコイド抽出物は、４℃にて約１年間安定している一方、その本来のＯＲＡＣ活性の少なくとも約７０％を維持している、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記チラコイド抽出物は、０日目にて本来のＮＯ阻害活性を有し、実質的に純粋な前記チラコイド抽出物は、チラコイドが０．２５ｍｇ／Ｍｌにて評価される場合に、４℃にて少なくとも約１年間安定している一方、その本来のＮＯ阻害活性の少なくとも５０％を維持している、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記チラコイド抽出物は、０日目にて本来のＳＯＤ活性を有し、実質的に純粋な前記チラコイド抽出物は、４℃にて少なくとも約１年間安定している一方、その本来のＳＯＤ活性の少なくとも約６０％を維持している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセスによって製造されたチラコイド抽出物。
【請求項２０】
ＰＶＰとの混合物中に、活性チラコイド抽出物を含む組成物。
【請求項２１】
前記ＰＶＰは、安定化濃度で存在する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＰＶＰは、約０．５〜約５％の濃度にて存在する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＰＶＰは、約２％の濃度にて存在する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記安定化濃度は、前記抽出物の活性がＲＴにて５日後に実質的に不変であり、前記活性が、ＯＲＡＣ、Ｆｖ／Ｆｍ活性、ＮＯ産生の阻害、およびＳＯＤ活性によって測定される抗酸化活性からなる群から選択されることを意味する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
チラコイド１ｇあたり約１３５〜約１６５μｍｏｌのＴｒｏｌｏｘ当量（ＥＴ  μｍｏｌ／ｇ）を含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
０．２５ｍｇ／ｍＬのチラコイド濃度にて少なくとも約３３％のＮＯ阻害を構成する、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
少なくとも約０．４ｍＵ／タンパク質ｍｇ／分のＳＯＤ活性を構成する、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チラコイドの単離および回収に関する。当該チラコイドは、実質的にその一体的状態および天然の状態で存在し、少なくともその一部は機能的であり、または活性化可能である。本発明はさらに、特に室温にて、先行技術の方法によって保存される膜よりも長く、高度に安定し、かつ活性があるままである機能的チラコイド膜の抽出に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗酸化剤は、活性酸素種（ＲＯＳ）の形成および有害な活性を防止する能力のため、生物医学分野において、益々普及が進んでいる。植物および他の光合成生物は、ＲＯＳの作用に抵抗するよう特によく適応している。これは、チラコイドと呼ばれる光合成細胞小器官の膜を通る効率的な電子伝達機構のためである。
【０００３】
クロロフィルが、全ての光合成生物によって、励起エネルギー伝達と電子伝達間のリンクとして用いられる。酸素生物（ｏｘｙｇｅｎｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）中の全てのクロロフィルは、チラコイド内に位置決めされて、ＰＳ  ＩＩ、ＰＳ  Ｉと、またはこれらの光化学系中にエネルギーを供給する集光タンパク質と関連する。ＰＳ  ＩＩは、水分解および酸素発生が生ずる複合体である。ＰＳ  ＩＩおよびＰＳ  Ｉを通る電子伝達が、水の酸化（酸素が生じる）およびＮＡＤＰの還元をもたらす。そこでのこのプロセス用のエネルギーは、光によって与えられる。光合成反応中心における初期の電子伝達（電荷分離）反応は、長い一連のレドックス（酸化還元）反応を発動して、バケツリレーのように、補因子の鎖に沿って電子を引き渡して、クロロフィル上の「正孔」を満たす。
【０００４】
真核生物（植物および藻類）において、チラコイドは葉緑体内に位置決めされており、そして多くの場合、膜のスタック（グラナおよびラメラ）中に見出される。チラコイドの組織化は非常に精巧であり、エネルギーを光から抽出して、このエネルギーを適切な位置に伝達し、かつ／または当該エネルギーを消費する。伝達は、電荷を分離することによって可能に、かつ有効となる。そして中性の電気状態を再生する能力が高く、再び電荷の変化を担う準備ができている。
【０００５】
クロロフィルは、チラコイドにおける主要な活性色素である。カロテノイドが、その位置に応じた複数の役割を有する。第１の役割は、光コレクタとしてのものであり、これは結果として、カロテノイドからクロロフィルへのエネルギー伝達をもたらす。第２の役割は、光プロテクタとしてのものであり、この場合、エネルギー伝達は、クロロフィルとカロテノイド間で反対方向に起こる。エネルギー伝達は、色素が互いに非常に近い条件において、そして特定の組織においてのみ、有効である。色素は、チラコイドの機能の維持が求められるならば、チラコイドの単離および精製の直ぐ後に保存されるべき特定の構成を有する。したがって、活性がある、または完全に活性化可能なチラコイドを精製することを所望するならば、色素の天然の構成を乱さないで、膜を一体的状態に維持することが非常に重要である。
【０００６】
無傷のチラコイドを回収する一利点が、ＲＯＳを処理する能力に見出される。そのようなＲＯＳは、フリーラジカル（スーパーオキシドが挙げられる）、ならびに非ラジカル酸化性物質、例えば一重項酸素（１Ｏ２）およびパーオキシドをカバーすることが意図される。最適に活性のある抽出物を得るために、双方の色素（クロロフィルおよびカロテノイド）を基本形の状態で維持するための考えられる全ての措置を講ずることが好ましい。単離したカロテノイド、例えばチラコイド構造において組織化されていないカロテノイドは、三重項クロロフィル分子の有効なクエンチングができないであろう。色素を組織化する利点は、抽出物が、天然のチラコイド膜の活力であって、ＲＯＳを捕捉して、エネルギーを伝達して、新しい活性化サイクルを再び担うことができる状態に戻る能力を有する活力を保持することとなることである。再生するこの活力および能力は、組織化された色素に特有である。
【０００７】
国際公開第２００１／０４９３０５号パンフレットは、チラコイドの抽出方法を開示している。しかしながら、長期間の安定性を有する固有の、組織化された、活性があるチラコイド膜の抽出のための新しいプロセスを開発する必要が、依然としてある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、機能的チラコイドを有する抽出物を得るための単純なプロセスを提供することを目的とする。本発明はまた、長期間の安定性を有する、単離された活性チラコイドを含む抽出物を提供する。安定化抽出物は、チラコイドを活性化することとなるいかなる電子供与体も本質的に含まない。この抽出物は、室温にて少なくとも５日間、実質的に活性があるままである。
【０００９】
最も豊富な電子供与体は水である。したがって、安定化抽出物は、好ましくは無水である。水は、溶媒（例えば両性溶媒）によって、または乾燥（例えば凍結乾燥）によって追い出され得る。このタイプの溶媒は、膜構造の構成成分を溶解も分解もしない。そして、水分子を置き換える利点を有する。したがって、水溶液中での溶解直後の凝集体の形成を妨げる。
【００１０】
安定化抽出物は、水等の電子供与体が加えられない限り、実質的に活性を喪失することのない、より長い貯蔵寿命を有する。安定化抽出物は、活性化を始動するために、使用前に即座に再水和される。一旦活性化されたチラコイドの活性は、他の知られているいかなる抗酸化剤よりもずっと長く続き、このことは、活性の、即時かつ完全な消耗ではなく、一定レベルの再生を示している。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様に従えば、植物体からチラコイド膜を抽出する方法が提供され、当該方法は、以下の工程を含む：特定のＦｖ／Ｆｍ比を有する植物組織を得る工程と；特定の粘度およびｐＨを有する媒質中で組織を破壊して、液相中に細胞残渣およびチラコイドの混合物を得る工程と；前記残渣をチラコイドから分離する工程と；チラコイドを懸濁して濾過する工程と；特定のＦｖ／Ｆｍの画分を回収してプールする工程と；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む溶液中で凍結乾燥を実行することによって、プールされた前記画分から水を除去する工程。
【００１２】
更なる態様に従えば、植物体からチラコイド膜を抽出する方法が提供され、当該方法は、以下の工程を含む：Ｆｖ／Ｆｍ比が少なくとも約０．７である植物組織を得る工程と；粘度が１〜１．３であり、そしてｐＨが５を超え、かつ８未満である媒質中で組織を破壊して、液相中に細胞残渣およびチラコイドの混合物を得る工程と；前記残渣をチラコイドから分離する工程と；チラコイドを懸濁して濾過する工程と；Ｆｖ／Ｆｍが約０．７よりも大きい画分を回収してプールする工程と；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む溶液中で凍結乾燥を実行することによって、プールされた前記画分から水を除去する工程。
【００１３】
本発明の更なる態様に従えば、ＰＶＰとの混合物中に、活性チラコイド抽出物を含む組成物が提供される。
【００１４】
本発明の更なる態様に従えば、ＰＶＰとの混合物中に、実質的に純粋なチラコイド抽出物を含む組成物が提供され、当該抽出物は、クロロフィルＡ、クロロフィルＢ、ルテイン、およびカロテンから選択される組織化された光合成色素を含み；クロロフィルＡは、総色素含有量のうち、少なくとも０．６の比率にて存在し；実質的に純粋なチラコイド抽出物は、少なくとも約５日間、室温にて実質的に安定している。
【００１５】
本発明の他の態様および特徴は、一例としてのみ与えられるそれらの好ましい実施形態の以下の非限定的な記載を、添付の図面を参照して読めば直ぐに、より明らかとなろう。
【００１６】
本開示において引用される文献の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１７】
具体的な実施形態および添付の図面を参照して、本発明を以下に説明するが、その目的は、本発明の範囲を限定することではなく、本発明を例示することである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】化合物Ａ物質製造プロセスのフロー図である。
【図２】本発明のチラコイド抽出物の色素プロフィールを示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】アトラジンについての標準阻害曲線を示す図である。
【図４】チラコイド抽出物のいくつかの別個のバッチに対する、アトラジンによる必要な阻害についての品質管理チャートを示す図である。
【図５】様々な濃度のＰＶＰ中で凍結乾燥した場合の、時間に応じた本発明の抽出物の相対活性を示す図である。
【図６】２％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）の存在下で凍結乾燥した場合の、時間に応じた室温でのチラコイド抽出物の相対活性を、１または２％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）と比較して示す図である。
【図７】フレッシュな（０年齢）、そして１年齢または６年齢の場合の、本発明の異なる安定化チラコイド抽出物の総抗酸化能力を示す図である。
【図８】本発明の様々な安定化チラコイド抽出物、１年齢および６年齢の、ＲＡＷ２６４，７細胞における一酸化窒素（ＮＯ）阻害を示す図である。
【図９】本発明の様々な安定化チラコイド抽出物、１年齢および６年齢のスーパーオキシドジスムターゼ活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
略語および定義
定義
本明細書中で用いられる用語「約」は、示される数の＋１０％または−１０％の余地を指す。正確さを期すために、用語約が併せて用いられる場合、例えば９０％は、９０％＋／−９％、すなわち８１％〜９９％を意味する。より正確には、用語約は、示される数の＋５％または−５％を指し、例えば９０％は、９０％＋／−４．５％、すなわち８６．５％〜９４．５％を意味する。様々な文脈において、用語「実質的に」は、「約」と同じものを意味し得る。
【００２０】
本明細書中で用いられる単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を示している場合を除き、複数の指示対象を含む。ゆえに、例えば、「細胞」への言及は、複数の当該細胞を含み、そして「培養」への言及は、１つまたは複数の培養、およびその、当業者に知られている均等物への言及を含む、等である。本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、明らかに別の意味を示している場合を除き、本発明が属する当該技術の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２１】
本明細書および特許請求の範囲において用いられる文言、「含む」（および含む、のあらゆる形態、例えば「含み」）、「有する」（および有する、のあらゆる形態、例えば「有し」）、「挙げられる」（および挙げられる、のあらゆる形態、例えば「挙げられ」）、または「含有する」（および含有する、のあらゆる形態、例えば「含有し」）は、包括的であり、または開放型である。そして、追加の、列挙されていない要素も方法工程も除外しない。
【００２２】
本明細書中で用いられる用語「機能的チラコイド抽出物」または「機能的チラコイド」は、そのチラコイド膜環境で（すなわち、依然として活性化され得るような固有の一体的状態で）精製された機能的光合成色素を意味する。
【００２３】
本明細書中で用いられる「抗酸化剤」は、酸化性の生物学的基質を含有する混合物または構造体中に存在する場合に、生物学的基質の酸化を大幅に遅延させ、または妨げる物質である。抗酸化剤は、生物学的に重要な反応性フリーラジカルもしくは他のＲＯＳ（一重項酸素、≫Ｏ２−、Ｈ２Ｏ２、＊ＯＨ、ＨＯＣＬフェリル、ペルオキシル、ペルオキシニトライト、アルコキシル．．．）を排出する（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ）ことによって、それらの形成を妨げることによって、またはフリーラジカルもしくは他のＲＯＳを、より反応性の低い種に触媒的に変換することによって、作用し得る。本発明の抗酸化剤は、細胞培養またはアッセイ反応に加えられる場合に、抗酸化剤で処理されない類似の（ｐａｒａｌｌｅｌ）細胞培養またはアッセイ反応と比較して、フリーラジカル、例えばスーパーオキシド、または非ラジカルＲＯＳ、例えば過酸化水素もしくは一重項酸素の量の、検出可能な減少をもたらすと考えられる。適切な濃度（すなわち有効用量）は、ＱＳＡＲ法または分子モデリング、および薬学で用いられる他の方法を用いることによって、実験に基づいた用量反応曲線を発生させること、同属種の効力および有効性を予測することが挙げられる種々の方法によって、判定され得る。
【００２４】
本明細書中で用いられる用語「チラコイド」は、光合成生物、真核生物、および原核生物から得られる組織化された光合成膜構成成分をカバーすることを意味する。生物が葉緑体を有する場合、チラコイドは、以下の膜構成成分を含む：ＰＳＩＩ、シトクロムｂ６およびｆ、ＰＳＩ、ならびにカップリング因子。チラコイドの完全性および機能性が植物体材料から試験される場合、２つの基準点の間で測定されてきた：ＰＳＩＩに近位の点とカップリング因子から遠位の点。特定の用途について、チラコイドは、活性がある必要はないものの、明らかに一体化されている。そのようなチラコイドは性能を発揮し（ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ）、かつ少なくとも他のあらゆる抗酸化剤と同じくらい安定している。したがって、「活性チラコイド」は、水和の直ぐ後に活性化される能力を有するチラコイドを意味し、これは、一体化されているが、能動的に、または受動的に不活化された不活性チラコイドとは対照的である。この場合、チラコイド構造は実質的に保存されているが、反応中心は不活性である。
【００２５】
特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、単離されたチラコイド、およびチラコイドの単離方法に関する。当該チラコイドは、ＲＯＳに対するスカベンジャ活性を有する強力な抗酸化分子を構成する。この抗酸化組成物は、天然起源のものである。これは、毒性も副作用も知られていない。
【００２６】
この抗酸化組成物は、抗酸化活性の安定性を経時的に達成することで、妥当な有効期間を確実にするように、適切に製剤化されなければならない。安定化は、電子供与体（すなわち水分子）を引き出す（ｗｉｔｈｄｒａｗ）ことによって実行され、これによりチラコイドは休止する。チラコイドは、電子供与体を加えることによって（詳細には、水和により）活性化される。水は、溶媒、例えば両性溶媒、もしくは界面活性剤によって、かつ／または乾燥させることによって、追い出され得る。プロピレングリコール等の界面活性剤が以前に試みられたが、軽い成功に留まった。
【００２７】
したがって、本発明はまた、安定性が向上した、単離されたチラコイドを含む抽出物を提供する。したがって、安定化された抽出物は好ましくは、水分がない。安定化された抽出物は、本質的には、チラコイドを活性化することとなるいかなる電子供与体もなく、そして少なくとも５日間、または最大約７日間、室温にて活性があるままである。
【００２８】
詳細には、安定化された抽出物は、長期間、例えば２ヵ月以上、例えば１年、または最大６年も、４℃にて活性があるままである。
【００２９】
コンディショニング
粗懸濁液中のチラコイドを回収する工程を受ける前に行われる第１の工程として、コンディショニング工程があってよい。このコンディショニング工程は、任意であり、抽出物の組成を変えることができる。色素（すなわち、クロロフィルおよびカロテノイド）のレベルを非活性化状態で最適化するために、コンディショニング工程が、機能条件と同じ条件、例えば緑色光の下で、または暗所で、実行されてよい。そのような状況下では、クロロフィルは好ましくは、一重項状態にある一方、カロテノイドは好ましくは、基本形の状態にある。このように、直ぐに用いられる場合には、カロテノイドは活性化されて、三重項クロロフィルに由来するエネルギーを利用する準備が整うこととなる。
【００３０】
抽出方法
本発明の方法の特定の実施形態に従えば、植物体からチラコイド膜を抽出する方法が提供され、当該方法は、以下の工程を含む：ａ）Ｆｖ／Ｆｍ比が少なくとも約０．７である植物組織を得る工程；ｂ）前記組織を、ｐＨが約中性の次亜塩素酸ナトリウムで洗浄する工程；ｃ）洗浄された前記組織を、５６５〜５７５ｎｍの光条件下で、または暗条件下で、かつ約１０℃未満の温度にてコンディショニングする工程；ｄ）前記組織を、粘度が１〜１．３であり、そしてｐＨが５を超え、かつ８未満である媒質中で破壊して、液相中に細胞残渣およびチラコイドの混合物を得る工程；ｄ）上部フィルタによる遠心分離下でチラコイドから前記残渣を分離して、チラコイドから本質的になる上部フィルタペレットを回収する工程；ｅ）前記ペレットを懸濁して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ１００で濾過して、Ｆｖ／Ｆｍが約０．７よりも大きい画分を回収し、かつプールする工程；ならびにｆ）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む溶液中で凍結乾燥を実行することによって、プールされた前記画分から水を除去して、電子供与体が実質的にない前記抽出物を回収する工程。ここで、実質的に純粋な前記チラコイド抽出物は、以下から選択される組織化された光合成色素を含む：クロロフィルＡ、クロロフィルＢ、ルテイン、およびカロテン。ここで、クロロフィルＡは、総色素含有量のうち、少なくとも０．６の比率にて存在する。これによって実質的に純粋な前記チラコイド抽出物は、少なくとも約５日間、室温にて安定している。
【００３１】
植物体全体またはその植物組織から始める場合、抽出の第１の工程は、分散工程、例えばホモジナイゼーション工程である。植物組織は、例えば、機械的に粉砕される。メソフィリウム（ｍｅｓｏｐｈｙｌｉｕｍ）組織（葉または針葉）が、回転ナイフを用いて小さなピースにカットされて、例えばホモジナイザまたは市販の回転カッター内に回収されてよい。セルロース系材料を分離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）してチラコイドをむき出しにするあらゆる手段が適切であろう。
【００３２】
光束を最適に最小にする光源下（緑色光、λ＝５００〜６００ｎｍ）で機能させる他に、機能条件は理想的に、細胞密度を増大させ、かつ酵素によるいかなる分解も妨げる目的で、約２〜２０℃、好ましくは４℃未満の機能温度を含むであろう。また、機能条件として、高張性の剤、例えば糖を用いる高張性条件が挙げられる。これらの条件は、最適な粘度および流動性を達成する。ホモジナイゼーションバッファの具体例は、以下の通りである。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
溶液のｐＨは、５超から８未満まで変化し得、より好ましくは、７〜７．５のほぼ中性値にて維持される。
【００３５】
ホウレンソウを参照植物とすると、植物体の葉組織の湿重量（ｇ）：バッファの容量（ｍｌ）の比率は、約１：３である。ゆえに、先のレシピは、チラコイドを１００ｇのホウレンソウから抽出するのに適している。植物体は、例えば家庭向きの混合機内で約３０秒間、バッファと混合されて、ホモジナイズされる。植物ソースは異なってもよく、媒質容量も異なってよい。バッファは、それ自体、ほぼ中性のｐＨを維持するのに適したあらゆるものであってよい。例えば、先のトリスバッファは、酢酸バッファまたはアスコルビン酸バッファと置き換えられてよい。ソルビトールは、膜の完全性を保存するために、そして粘度が約１〜１．３で変動するのを保証するために加えられてよく、そして、０．２〜１．５Ｍ（好ましくは０．２〜０．４Ｍ）のソルビトールと同じ作用を達成する濃度の、他の適切なあらゆる糖、例えば市販のサッカロース、フルクトース、またはタービナドによって置き換えられてもよい。スクロース０．２〜０．４Ｍは、許容可能な、比較的廉価な構成成分となろう。ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、アスコルビン酸塩／アスコルビン酸等のバッファ構成成分は、本プロセスに必須であると考えられていないが、これらはより高い活性の回収または長期間の活性の保存を補助し得る。
【００３６】
ほぼ中性のｐＨが、好ましくは、Ｈ＋イオンの最適な濃度の維持のために選択された。糖およびｐＨは、光合成色素の分離を妨げるのに重要なパラメータである。細胞流体の密度は、冷温環境または低温環境、すなわち４℃未満で機能する場合に、最大にされる。低温はまた、構成成分を酵素分解から保護し得る。これらの全てのホモジナイゼーション条件は、チラコイドの分子構造的な組織化に実質的に影響を及ぼすことなく、葉緑体における組織化から、膜構造を解放する。したがって、チラコイドを破壊することも分解することもなく、葉緑体は崩壊する。ゆえに、いかなるセルロース保護もない細胞構成成分の表面が増す。
【００３７】
本プロセスにおいて、抽出媒質において直接植物組織を用いることが好都合であった。しかしながら、純粋な葉緑体、もしくは葉緑体が富化された調製物、または葉緑体を有し、もしくは有していない他の光合成生物の調製物を用いることが有利となるならば、そうすることが可能である。また、培養された細胞または組織が、明らかに、植物体全体に代わることもできる。
【００３８】
収率が、選択されたバッファの容量に、そして選択された植物の水含有量に応じて変わり得ることは、価値がある。例えば、マツの針葉は、内水含有量が、ホウレンソウの葉の場合よりもはるかに重要性の度合いが低い。等しい湿重量の植物材料について、チラコイドをマツ針葉から単離するためのバッファの容量は、先の式の全てのパラメータを考慮すると、ホウレンソウ葉と比較した場合に、増すはずである。
【００３９】
このように得られる粗抽出物はその後、以下のように分離／分画される。
【００４０】
植物残渣の分離
ホモジナイゼーション工程の後に、分離工程が続く。チラコイドは、細胞残渣から、そして可溶性の構成成分から、様々な沈降係数に基づいて分離される。チラコイドの沈降係数は、細胞小器官の沈降係数よりも上位である。チラコイドは、移動バケット内で１０，０００×ｇにて１０分間遠心分離される。１０，０００×ｇ未満であるが３，０００ｇよりも上位の遠心分離力が、遠心分離時間を然るべく調整して用いられてよい。チラコイドペレットの最適な簡便性は、１０分間の１００００〜１２０００×ｇにて得られる。等価の結果を達成する他のあらゆる速度および時間が採用されてもよい。異なる速度および時間が、プロセスをスケールアップする際に意図される。
【００４１】
沈降中に、チラコイドは、以下に相当するフィルタを通過する；０．００２≦Ｘ≦０．２。式中、Ｘは、線径あたりの開口部を乗じることによって算出される（全てミリメータ）。細胞残渣および膜は、このフィルタによって、遠心分離管の上位の部分において止められる。ゆえに、チラコイドを含む底部のペレットは容易に回収され、そしてペレットは、直ちに用いられてもよいし、今後のあらゆる使用のためにさらに分画されても安定化されてもよい。勿論、チラコイドを単離するのと同じ結果を達成する他のあらゆる分離方法が用いられてよい。例えば、スクロース勾配のような密度勾配が用いられてよい。
【００４２】
チラコイド富化画分の分離
クロマトグラフィまたはアフィニティの培地および方法が用いられてもよい。先の特定の方法を参照して、グロス分離および細分離が、大規模プロセスにおいて、一工程で達成されないであろうと想像できる。したがって、グロス精製は最初に、プレスまたはフィルタ上でなされてよく、そしてチラコイドおよび液相の細分離は、以下のような後の工程で達成され得る。
【００４３】
膜濾過
サイズ排除クロマトグラフィが、最も活性がある画分を分子量によって分離するように実行されてよい。詳細には、粗チラコイドが、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００濾過でさらに精製されてよく、少なくとも０．７のＦｖ／Ｆｍの比率に対応する画分が回収される。
【００４４】
チラコイドの完全性および活性
抽出物は、実質的に純粋なチラコイドを含む（＞９０％）；これは、光合成的に活性化可能であり；安定しており；そして抽出物は、制御可能である。光合成活性は、様々な技術で評価されてきた：酸素解放（Ｓｃｈｌｏｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）、２，６ジクロロフェノールインドフェノールの光還元（ＤＣＰＩＰ）（Ｂｅｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）、および蛍光（Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。さらに、チラコイドの完全性は、連続電流を測定する技術で評価されてきた：あらゆる組織崩壊が、この電流の何らかの変化によって検出されるはずである。電流は、ＰＳＩＩからカップリング因子まで測定され、これによりチラコイドは、先で一覧にされた主要なサブユニットを含有すること、そして機能的であることが示される。
【００４５】
緑色光が機能条件において用いられる場合、色素は、その基本形の状態（Ｆ０）で安定化されるので、所望されるあらゆる作用の最適化および同期が可能となる。一次電子供与体の引出しのため、安定化が可能である。光合成活性（休止状態の間は不在であり、電子供与体による活性化の直後に存在する）によって測定される安定性、ならびにクロロフィルおよびカロテノイドの濃度は、抽出後数ヵ月間、存続する。クロロフィル／カロテノイドの比率もまた、複合体の活性にとって、そしてエネルギーの吸収および消散を最大にするのに、重要である。
【００４６】
抽出物は、その生来の蛍光のため、容易に検出可能である。毒性のある製品、溶媒、洗剤、または保存剤が、先のチラコイドに加えられずに、その本来の性質が全て保存される。抽出物は、食用に適する。プロピレングリコールがチラコイドを安定化させるのに用いられる場合ですら、この溶媒は、その酸化により、ピルビン酸および酢酸が生じるだけなので、無害である。ＰＶＰは非浸透剤であり、凍結の間に起こる浸透圧アンバランスを改善するように作用する。当該溶媒は現在、食物乳化剤として用いられている。このことは、それが界面活性剤の特性を有する（しかしながら、チラコイドの完全性に有害でない）ことを意味している。当該溶媒はさらに、発酵およびカビの生育に対する阻害活性を有する。
【００４７】
安定化
分離工程の後に、安定化工程が続く。この工程により、電子供与体、例えば膜に結合し、または結合していない水分子の引出しが可能となるので、ＰＳＩＩ系のいかなるアクティベータも除外される。Ｆｖ／Ｆｍが０．７である画分が回収されて、プールされて、清潔なバイアル内に入れられる。バイアルはその後、低温（約−２０〜−５０℃）での減圧乾燥に、少なくとも４時間曝される。そのように凍結乾燥された抽出物は、これに水が加えられるまで、活性化可能なままであるが、より詳細には４℃の場合である。
【００４８】
水性媒質中での再懸濁前の活性の長期保存
凍結乾燥に単独で用いられる場合に、またはスクロースもしくはソルビトールと併用される場合に、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は有利には、活性抽出物のより長い有効期間を実現することが見出された。
【００４９】
ＰＶＰは、立体保護によって、そして溶液の粘度を増大させて氷晶の成長速度を低下させることによって、合成小胞（リポソーム）または生体膜（例えばチラコイド）を安定化させるのに用いられる両親媒性水溶性ポリマーである。この界面活性剤もまた、非毒性である。
【００５０】
本発明の特定の態様に従えば、本明細書中で定義される方法によって製造されるチラコイド抽出物が提供される。代替の態様に従えば、凍結乾燥前の、ＰＶＰと組み合わされたチラコイド抽出物を含む組成物が提供される。より詳細には、ＰＶＰは、凍結乾燥前の溶液の濃度が、約０．５％から約５％に及び、より詳細には約０．５、１％、２％、および５％、最も詳細には約２％である。
【００５１】
特定の実施形態に従えば、本発明の方法は、４℃にて少なくとも約２ヵ月間、詳細には約１年間安定している一方、その本来のＯＲＡＣ活性の少なくとも約７０％、より詳細には約８０％、最も詳細には約９０％を維持している、実質的に純粋なチラコイド抽出物を産出する。
【００５２】
さらに特定の実施形態に従えば、本発明の方法は、０日目にて本来のＮＯ阻害活性を有するチラコイド抽出物を産出し、実質的に純粋な前記チラコイド抽出物は、チラコイドが０．２５ｍｇ／Ｍｌにて評価される場合に、４℃にて少なくとも約２ヵ月間、詳細には少なくとも約１年間安定している一方、その本来のＮＯ阻害活性の少なくとも５０％を維持している。
【００５３】
特定の実施形態に従えば、本発明の方法は、０日目にて本来のＳＯＤ活性を有するチラコイド抽出物を提供し、実質的に純粋な前記チラコイド抽出物は、４℃にて少なくとも約２ヵ月間、詳細には少なくとも約１年間安定している一方、その本来のＳＯＤ活性の少なくとも約６０％を維持している。
【００５４】
より詳細には、抽出物は約１年間、最も詳細には約６年間、安定している。
【００５５】
特定の実施形態に従えば、本発明は、安定化濃度のＰＶＰとの混合物中に、活性チラコイド抽出物を含む組成物を提供する。
【００５６】
詳細には、用語「安定した活性」または「安定性」は、抽出物の活性がＲＴにて少なくとも５日後に実質的に不変であり、活性が、ＯＲＡＣ、Ｆｖ／Ｆｍ活性、ＮＯ産生の阻害、およびＳＯＤ活性の少なくとも１つによって測定される抗酸化活性からなる群から選択されることを意味する。
【００５７】
より詳細には、用語「安定した活性」または「安定性」は、抽出物の活性が４℃にて２ヵ月、１年、または最大６年後に実質的に不変であり、活性が、ＯＲＡＣ、Ｆｖ／Ｆｍ活性、ＮＯ産生の阻害、およびＳＯＤ活性の少なくとも１つによって測定される抗酸化活性からなる群から選択されることを意味する。より詳細には、活性は、その本来の活性の少なくとも約７０％、より詳細にはその本来のＯＲＡＣ活性の約８０％、最も詳細には約９０％である。
【００５８】
特定の実施形態に従えば、本発明は、チラコイド１ｇあたり約１３０〜約１９５μｍｏｌのＴｒｏｌｏｘ当量（ＥＴ  μｍｏｌ／ｇ）を有する、活性チラコイド抽出物を含む組成物を提供する。
【００５９】
特定の実施形態に従えば、本発明は、０．２５ｍｇ／ｍＬのチラコイド濃度にてＮＯ阻害が少なくとも約３３％である、活性チラコイド抽出物を含む組成物を提供する。
【００６０】
特定の実施形態に従えば、本発明は、ＳＯＤ活性が少なくとも約０．３８ｍＵ／タンパク質ｍｇ／分、より詳細には少なくとも約０．４０ｍＵ／タンパク質ｍｇ／分、最も詳細には少なくとも約０．５０ｍＵ／タンパク質ｍｇ／分である活性チラコイド抽出物を含む組成物を提供する。
【００６１】
用いられる製剤
抽出物は、固体の形態（乾いている、または湿っている）で示されても、液体の形態で示されてもよい。しかしながら、チラコイドが再水和の直ぐ後に再活性化されることに注目することが重要である。したがって、抽出物は、その活性が最大のままであるように、使用前に、可能な限り、脱水形態で維持されるべきである。したがって、抽出物は、使用直前に水性媒質中に再懸濁される。したがって、使用直前に懸濁されるように、各用量を別個のアリコート中に分離するのがより良いかもしれない。しかしながら、別個のアリコート（単回用量）として抽出物を提供することは困難であり、または高価であると判明する場合があるので、単一のバイアル内に数投薬量を提供することが有用であり、または都合がよいと判明する場合がある。この例において、水性抽出物の活性は、投与前に、ＲＴにて少なくとも５日間、または４℃にてより長い間、続くこととなる。
【００６２】
したがって、より長い貯蔵寿命を確実にするために、水性媒質中に再懸濁される、チラコイド抽出物の活性の長期保存用の製剤を提供することは、本発明の態様である。
【００６３】
以下の実施例は、本発明を実現して用いる方法の完全な開示および記載を当業者に与えており、発明者らが発明とみなす発明の範囲を限定しようとするものでもないし、以下の実験が全てであり、または実行される唯一の実験であると示そうとするものでもない。用いられる数値（例えば、量、温度その他）に関する精度を確実にする努力がなされたが、一部の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力はほぼ気圧である。
【実施例】
【００６４】
実施例１−チラコイド抽出物の調製
チラコイドは、ベビーホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．）の、葉緑体が豊富である葉の葉肉組織に由来する。構造が組織化されている、チラコイドとして知られている葉緑体の内膜を、ベビーホウレンソウから抽出して、濃縮して、固体の粉末形態に安定化させる。チラコイド膜の主要な構成成分は、色素、タンパク質、および脂質である。
【００６５】
チラコイド抽出物の抽出プロセスを、図１のフロー図に概略的に示す。プロセシング工程を、以下の順序で実行した：ホウレンソウ葉の調査および次亜塩素酸ナトリウム溶液による洗浄；機械的な崩壊およびホモジナイゼーション；遠心分離による濾過；Ｓｅｐｈａｄｅｘ−１００による濾過；凍結乾燥；ならびにガンマ線照射。
【００６６】
ホウレンソウ葉の調査および次亜塩素酸ナトリウム溶液による洗浄
大きさを確認し、かつ属性（例えば、退色した領域も黄色がかったペック（ｐｅｃｋ）（クロロース（ｃｈｌｏｒｏｓｅ））もない緑色の葉）を同定する視覚的な調査を実行した後に、ホウレンソウ葉を最初に、質量ベースで固定溶液対葉の比率（４４ｋｇ：５．４ｋｇ）にて、７．０から８．０のｐＨ（標的ｐＨ：７．４）に調整した次亜塩素酸ナトリウム溶液で、フレッシュな産物の葉の上に自然に見出される微生物フローラを減らすために、洗浄した。
【００６７】
機械的な崩壊およびホモジナイゼーション
過剰な次亜塩素酸ナトリウム溶液を排液した後に、葉を、質量ベースで固定溶液対葉の比率（５．４ｋｇ：３．７ｋｇ）にて、ｐＨ７．０〜８．０（標的ｐＨ：７．４）のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンバッファ溶液の固定容量と共に、機械カッター／ミキサーに移した。これを段階的に用いて、葉をカットしてホモジナイズして、粗懸濁液にする一方、葉緑体に由来するチラコイド膜の断片を解放した。
【００６８】
遠心分離
次に、懸濁液を、バスケット遠心分離機で濾過した。遠心分離を、１００００ｒｐｍの標的速度にて約１０分間実行した。この工程により、スクリーン上に保持される繊維、残渣、および粗大物質の除去が可能となり、副産物ケーキを破棄した。チラコイドは遠心分離物（ペレット）中に見出されるので、これを収集して、更なるプロセシングのために、１０℃未満の温度に維持した。
【００６９】
濾過
遠心分離後、チラコイド抽出物を、その少なくとも３倍の容量のトリス−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５およびＮａＣｌ  ５０ｍＭ中に懸濁して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００カラム上に載せて、同じバッファで平衡化した。次に、チラコイドを同バッファ中に溶出して、各溶出画分を、そのＦｖ／Ｆｍ比について試験した。０．７を超えるＦｖ／Ｆｍ比を示すものを維持して、プールした。
【００７０】
凍結乾燥
バッファ単独による
チラコイドを−３５℃にて４時間凍結して、同じ温度にて１００ｍトルの圧力で７２時間凍結乾燥した。凍結乾燥の後、チラコイドを減圧下ですり潰して、安定性検定に従って、様々な温度（ＲＴ、４℃、または−２０℃）にて保存した（実施例４を参照）。
【００７１】
バッファおよびＰＶＰによる
ＰＶＰを、プールしたチラコイド画分に加えた。その後、−２０℃にて２時間凍結して、以下の条件下で凍結乾燥した：ａ）−２０℃にて４８時間；ｂ）−１０℃にて３．５時間；ｃ）０℃にて１．５時間；およびｄ）＋２０℃にて１８時間。
【００７２】
実施例２−色素の組成および他の特性
ホウレンソウは、生来の抗酸化剤（例えばフラボノイド）および光合成色素（クロロフィルおよびカロテノイド）を含有する。葉緑体の内膜は、構造が組織化されており、チラコイドとして知られている。チラコイド膜の主要な構成成分は、色素、タンパク質、および脂質である。
【００７３】
チラコイドは、ホウレンソウの、葉緑体が豊富である葉の葉肉組織に由来する。現在まで、ＨＰＬＣ分析を用いて、以下の色素がチラコイド抽出物中で同定された：ルテイン、クロロフィルｂ、クロロフィルａ、フェオフィチン、およびβ−カロテン。チラコイド抽出物の色素プロフィールを面積％で示す典型的なクロマトグラムを図２に示す。この分析は、チラコイド抽出物の主要な構成成分が、クロロフィルａ（６２．５％）に続いて、クロロフィルｂ（１３．１％）、ルテイン（９．４％）、β−カロテン（２．９８％）、およびフェオフィチン（０．４５％）であることを示す。
【００７４】
好ましくは、アメリカ農務省（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ：ＵＳＤＡ）の全米オーガニック認証基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）に従って認定された栽培者由来の生のベビーホウレンソウの葉を用いて、チラコイド抽出物中の肥料または殺虫剤由来の潜在的な化学物質残留物の存在のリスクを最小にした。
【００７５】
規格値の妥当性
チラコイド抽出物は、その色素含有量によって特徴付けられ、これは、粉末抽出物の１グラムあたりの色素ミリグラムで表される。プロセスケイパビリティに基づいて、そして草本の出発材料における季節変化を認めて、少なくとも２５ｍｇ／ｇの規格値を、解放時に設定した。現在まで集められた安定性データに基づいて、初期の色素含有量の８０％の限界を、有効期間について設定した。
【００７６】
また、色素プロフィールにより、チラコイド抽出物中に存在する種々の色素、およびそれらの面積パーセント比率の同定が可能となる。現在まで製造されたバッチにおいて判定されたプロフィールを考えると、クロロフィルａ、クロロフィルｂ、ルテイン、およびβ−カロテンが存在するはずであり、そしてクロロフィルａの、総ピーク面積反応に対する平均比率は、少なくとも０．６０であるはずであると確認されている（図２）。
【００７７】
製造プロセスにおいて水を抽出溶媒として用いたので、チラコイド抽出物中の水含有量を判定する試験を含めた。水の１０ｗ／ｗ％以下の規格値を、対照水分に設定した。
【００７８】
【表２】
2018536414.tif 000004
【００７９】
実施例３−安定性の研究
チラコイド抽出物の様々なバッチを、同じバッファ中で、しかし様々な凍結防止剤と共に凍結乾燥して、スクリューキャップで隙間なくジャー内にパッケージして、光から保護して、室温にて少なくとも７日間、棚に置いた。以前に開示されるように（国際公開第０１／０４９３０５号パンフレット）、第１のバッチをＰＥＧ入りバッファと凍結乾燥した。第２のバッチをＰＶＰと凍結乾燥した。
【００８０】
チラコイド抽出物を、以下のバッファ中で凍結乾燥した：トリス−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５；ソルビトール３３０ｍＭ；ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ；ＰＥＧを１〜２％にて、またはＰＶＰ（０．５％〜５％）を加えてから、更なる使用まで−２０℃にて保存した。
【００８１】
再水和後の室温での安定性を判定するために、双方の凍結乾燥したチラコイド抽出物を、以下の中に、Ｐｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に従って測定して５μｇ／ｍＬのクロロフィルにて再懸濁した：トリス−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５；ソルビトール３３０ｍＭ；ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ。再懸濁した各抽出物を、適切なアトラジン濃度で１５分間、暗所でインキュベートした。
【００８２】
Ｆｖ／Ｆｍの阻害
暗順応条件により、光化学の阻害、ＰＳＩ電子アクセプタの完全な再酸化、およびＰＳＩＩ反応中心の開放が可能となる。その後、チラコイドが光に再度曝されると、吸収光が光化学に最大限に用いられ得る。
【００８３】
ＦＭＳ１  Ｈａｎｓａｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；ラボベースに調節した蛍光）により、吸収光を、４７０ｎｍの光束による励起下で測定した。暗順応条件において、以下の蛍光パラメータを得、または算出することができる：
Ｆｏ：ＰＳＩＩ反応中心が完全に酸化状態にある場合の最小の蛍光。これは、調節光束のみが照らされているときに、蛍光測定の始めに得られる。
Ｆｍ：最大ＰＳＩＩ蛍光放射を可能にする強い飽和パルス（２０００μｍｏｌ光子ｍ２／ｓ）で得られる。
Ｆｖ：可変的な蛍光が、ＦｍとＦｏ間の差異によって得られ、光化学エネルギークエンチングの最大能力に相当する。
【００８４】
Ｆｖ／Ｆｍ：この比率は、ＰＳＩＩ反応中心の量子効率と比例し（Ｂｕｔｋｅｒ  １９７７，１９７８）、クロロフィル蛍光と光化学反応（例えば酸素発生）との相関を示す。これは、ストレス反応のスクリーニングパラメータとし、広く用いられている（Ｂｊｏｅｒｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｄｅｍｍｉｇ  １９８７）。好ましくは、チラコイドの光合成効率は、０．７±０．１のＦｖ／Ｆｍにて、経時的に安定している（アトラジンの０％阻害）。
【００８５】
安定性は、特定のアトラジン濃度にて得られる阻害％の安定性、またはＩＣ５０（効率パラメータの５０％を阻害するアトラジン濃度）の安定性と呼ばれる。
【００８６】
【表３】
2018536414.tif 000005
【００８７】
光化学系に影響を及ぼすあらゆる分子が、ＦｏまたはＦｍのいずれかを改変することとなり、この改変は必然的に、光合成効率を破壊する（増大または減少させる）。特定の分子の阻害曲線を、当該分子の不在下で、そして存在下で、光化学系の効率比率を算出することによって、そして双方の効率を以下のように比較することによって、判定した（Ｃｏｎｒａｄ  １９９３に記載されている）。抽出物を２０℃にて７日過ごさせた後に、阻害曲線をアトラジンで測定して、５０％の阻害を得るのに必要とされる濃度として、ＩＣ５０を判定した（図３）。
【００８８】
ＩＣ５０は、解放される凍結乾燥について、平均ＩＣ５０の２σ（９５％の信頼度）の間に含まれなければならなかった。したがって、受け入れたロットのＩＣ５０は、０．０１６５〜０．０４７０μｇ／ｍＬの間になければならない（図４）。この場合、アトラジン濃度は、０．０２５μｇ／ｍｌであると判定した。
【００８９】
安定性の比較
安定性の研究を、ＰＥＧまたはＰＶＰを加えて凍結乾燥したバッチに実行した。凍結乾燥後、チラコイドを、減圧暗所下で２０℃にて保存した。阻害（効率％）を、０．０２５μｇ／ｍＬのアトラジンで得た阻害の％によって与えた。図５は、ＰＶＰの濃度が増すにつれ、７日目のＦｖ／Ｆｍ阻害％の安定性が増すことを示す。安定性は、凍結乾燥バッファ中２％のＰＶＰ濃度で最適化されて、室温にて７日後に、その本来の活性の約８４％の保持をもたらした。
【００９０】
また、阻害％を、１％または２％の濃度のＰＥＧを凍結乾燥バッファに加えた場合の０．０２５μｇ／ｍＬアトラジンでも評価した。凍結乾燥の後、チラコイドを、暗所減圧条件下で２０℃にて保存した。Ｆｖ／Ｆｍ阻害は、凍結乾燥後直ぐ（０日目）に、そして５日後（５日目）に、２０℃にて測定した。驚くべきことに、図６は、ＰＥＧが、２０℃にて５日後に、２％ＰＶＰを凍結乾燥バッファに加えた場合に測定したのと同じ活性保持を提供しないことを示す。実際、凍結乾燥における２％ＰＶＰでは、抽出物が、ＲＴにて５日後に、その本来の活性の少なくとも約９０％を保持することができる。
【００９１】
表４に示すように、ＰＶＰを凍結乾燥バッファに加えると、水和溶液の安定性は、以前に開示された他の多くの安定化方法よりも予想外に長くなった。
【００９２】
【表４】
2018536414.tif 000006
【００９３】
実施例４−チラコイド抽出物の抗酸化能力の経時的な安定性
チラコイド膜中に見出される色素は、高いレベルの抗酸化能力／活性を実現する。この活性を、本発明に記載するようにして安定化させたチラコイド抽出物で試験した。酸素ラジカル吸収性能力−蛍光試験（ＯＲＡＣＦＬ）を、フレッシュなチラコイド抽出物で、そして１年齢および６年齢のサンプルで評価して、抗酸化能力のそれぞれの安定性を比較した。
【００９４】
ＯＲＡＣＦＬ試験
親油性の抗酸化能力および親水性の抗酸化能力を、ＯＲＡＣＦＬ試験を用いて、蛍光プローブとしてのフルオレセイン、そしてペルオキシルラジカルのジェネレータとしての２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）から、チラコイド抽出物粉末で判定した。ＡＡＰＨによって発生するフリーラジカルの存在下で、チラコイドの親水性画分および疎水性画分は、ペルオキシルラジカルによって徐々に阻害される蛍光プローブを保護する。抽出物の抗酸化能力が高いほど、フルオレセインはより蛍光性のままである。抗酸化能力の結果は、参照分子：Ｔｒｏｌｏｘの抗酸化能力に対して定義される。
【００９５】
蛍光を、蛍光フィルタを備えたＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙプレートリーダ（ＢＭＧ  Ｌａｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）で読んで、４８５および５２０ｎｍでの励起波長および放射波長がそれぞれ得られた（マイクロプレートは９６ウェル）。
【００９６】
サンプルの調製ならびに親水性画分および疎水性画分
チラコイド抽出物を手動で抽出した：１グラムのサンプルを、ヘキサン／ジクロロメタン（１：１  Ｈｅｘ／Ｄｃ）に続いてアセトン／水／酢酸（７０／２９．５／０．５）の存在下に入れた。後者の画分は、親水性または水性の画分を示した一方、Ｈｅｘ／Ｄｃ混合液に由来する画分は、疎水性または親油性の部分を構成した。
【００９７】
画分Ｈｅｘ／Ｄｃを、３０℃のウォーターバス内で窒素雰囲気下で乾燥して、残留物を、Ｂ−シクロデキストリンを含有する１０ｍｌのアセトン：水で溶解した。遠心分離後、上澄みを用いて、必要に応じてアッセイバッファでの更なる希釈後に、親油性ＯＲＡＣＦＬを測定した。親水性画分を２５ｍｌのメスフラスコ中に移して、２５ｍｌアセトン／水／酢酸（７０／２９．５／０．５）（総容量）で希釈した。この溶液を用いて、親水性のＯＲＡＣＦＬ画分を測定した。各サンプルを抽出して、２通り試験した。
【００９８】
親水性の、そして親油性のＯＲＡＣアッセイの双方を、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙプレートリーダで実行した。ＡＡＰＨをペルオキシルジェネレータとして、そしてＴｒｏｌｏｘを参照として用いた。最終のＯＲＡＣＦＬ値を、Ｔｒｏｌｏｘまたはサンプルの濃度と正味のフルオレセイン減衰曲線下面積との二次回帰式（ｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃ）を用いて算出した。データを、サンプルのグラムあたりのマイクロモル当量Ｔｒｏｌｏｘ（ＥＴ）（ＥＴ  μｍｏｌ／ｇ）で表した。総抗酸化能力（ＴＡＣ）を、疎水性の、そして親水性のＯＲＡＣの結果を加えることによって、算出した。
【００９９】
図７の結果は、抗酸化能力が、チラコイド膜の抽出後に少なくとも６年間、その本来の活性の約７０％以上残っていることを実証している。ＰＶＰ中で安定化したチラコイド抽出物おいて、総抗酸化能力は、チラコイド抽出物の当量Ｔｒｏｌｏｘ／ｇ（ＥＴ  μｍｏｌ／ｇ）の約１３５から１６５μｍｏｌまで変化した。
【０１００】
実施例５−チラコイド抽出物のＮＯ産生の経時的な安定性
実施例４で用いたものと同じチラコイド抽出物を、ＮＯ産生に及ぼす作用について試験した。本発明の安定化チラコイド粉末抽出物を、Ｈａｎｋバッファ中に５ｍｇ／ｍＬにて溶解した。
【０１０１】
マウス細胞培養
ネズミマクロファージ様細胞ＲＡＷ２６４，７は、種々の炎症性メディエータに応じた単球およびマクロファージの機能および分化を調査するのに最も広く用いられている細胞株の１つである。ＲＡＷ２６４，７は、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、細菌感染、または細菌産物、例えばＬＰＳに応じて大量のＮＯを産生するマクロファージ様細胞モデルである。この実験では、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有する、１０％熱不活化ウシ血清を補ったＲＰＭＩ−１６４０媒質中に、５％ＣＯ２を含有する水分飽和雰囲気内で３７℃にて、ＲＡＷ２６４，７細胞を維持した。
【０１０２】
グリース試薬法によるＮＯ産生の評価
ＲＡＷ２６４，７細胞（２５×１０３細胞／ウェル）を増殖して、種々の溶解チラコイド抽出物で、２．５μｇ／ｍＬの、そして１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度にて前処理した。前処理の後、細胞を１０％  ＦＢ  ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄してから活性化して、ＮＯを２４時間産生させた。ＮＯ産生を、生理学的条件下でのＮＯの自発酸化によって形成された亜硝酸イオン（ＮＯ２−）の検出を含むグリース試薬法を用いて測定した。等容量のスルファニル酸およびＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミンを一緒に混合して、グリース試薬を形成する。ＮＯ２−の存在下で、スルファニル酸はジアゾニウム塩に変換され、これが次にＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミンに結合して、ピンク色の色合いが生じ、これを分光計で５４８ｎｍにて測定する。ＮＯ濃度を、μＭで表す。
【０１０３】
一酸化窒素（ＮＯ）産生の阻害
ＮＯは、免疫応答を調節することによる、免疫の重要なメディエータである。活性酸素種（ＲＯＳ）と関連して、それは、病原体の根絶をトリガーする。ＮＯおよびＲＯＳはまた、免疫抑制を調節することもできる。ＮＯ産生に及ぼす安定化チラコイドの作用を、マウス細胞で試験した。結果を図８に示す。未処理マウス細胞（対照）が１５０μＭのＮＯを産生することを観察することができる。この産生は、マウス細胞を０．２５ｍｇ／ｍＬのチラコイド抽出物で処理した場合に、約８０〜１００μＭ  ＮＯに引き下げられ（３３％から最大ほぼ５０％の阻害）、そしてマウス細胞を１ｍｇ／ｍｌのチラコイドで処理した場合に、約１５〜２８μＭ  ＮＯに引き下げられる。ＮＯ産生に及ぼすチラコイドの作用は、経時的に安定しており、１年齢および６年齢のチラコイド抽出物は、ＮＯ産生に対して実質的に同じ阻害活性を示す。
【０１０４】
実施例６−チラコイド抽出物のＳＯＤ活性の経時的な安定性
活性酸素種（ＲＯＳ）は、酸素のフリーラジカル誘導体である。最も周知されているＲＯＳとして、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、およびヒドロキシルラジカル（ＯＨ−）が挙げられる。これらは、種々の代謝活性（細胞呼吸および光合成）の間に、そして種々の外因性因子（日光、空気汚染、ＵＶ光、電離放射線）によって、体内で常に産生されている。生きている生物は、酸化還元系の活性を相殺するための抗酸化系を発達させており、そのＳＯＤは、スーパーオキシド（Ｏ２−、細胞の酸化還元系によって産生される最初のＲＯＳ）を排出して、Ｈ２Ｏ２を産生するので、マスター抗酸化酵素である。反応のカスケードが後に続いて、Ｈ２Ｏ２および他のＲＯＳを中和する。
【０１０５】
ＳＯＤアッセイ
ＲＯＳ発生試薬としてリボフラビンの光酸化を用いて、ＳＯＤ活性を評価した。リボフラビンは信頼性が高い基質であり、いくつかの研究において、光依存性のスーパーオキシドの産生を刺激するのに利用されており、これは、ＳＯＤによってＨ２Ｏ２に迅速に変換される。間接的なアッセイを用いる方法は、いくつかの反応を含む：光化学的に励起状態のリボフラビンは、最初に、メチオニンによってセミキノンに還元され、これは電子を酸素に供与して、スーパーオキシドソースを形成する。スーパーオキシドは、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を青色のホルマザン産物に変換し、これをＡ５６０ｎｍにて測定する。このように、ＳＯＤ活性は、産生されるホルマザンの量と反比例関係にある。
【０１０６】
以下のプロトコルにおいて、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を、５６０ｎｍにてＮＢＴの光化学的還元を阻害する能力によって評価した。チラコイド（０．１ｇ）を、１０ｍＬの抽出バッファ（５０ｍＭリン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および２％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ）中に再懸濁した。懸濁液を、１４０００ｒｐｍ、４℃にて３０分遠心分離して、上澄みをＳＯＤ活性について評価した。
【０１０７】
ＳＯＤアッセイ用の反応混合物は、以下を含んだ：２０μＬの上澄み、１８０μＬの抽出バッファ、１．３ｍＬのアッセイバッファ（５０ｍＭ  Ｋ−ＰＯ４バッファ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＮＢＴ、５００ｍＭ  Ｌ−メチオニン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および２．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ）。この混合物を、アッセイ基質、リボフラビン（０．２ｍＭ）を加えるまで、暗所で維持した。リボフラビンを含有する反応混合物を、発光ランプで室温にて５分照らすことから反応を始めた。次に、サンプルを、５６０ｎｍにて読んだ。ウシＳＯＤによる標準曲線（活性％についてのＳＯＤ酵素単位）を作成して、様々なチラコイド抽出物のＳＯＤ活性を判定するのに用いた。結果を、総タンパク質のＳＯＤ／ｇのｍＵとして、チラコイド抽出物／分で表した。様々なチラコイド抽出物のタンパク質含有量を、ブラッドフォード法によって判定した。
【０１０８】
図９は、チラコイド抽出物中に見出されるＳＯＤ活性が、約０．４〜０．５ｍＵ／タンパク質ｍｇ／分であることを示す。最も活性がある抽出物は、約０．５６ｍＵ／タンパク質ｍｇ／分に達し、１年齢のチラコイド抽出物について得られた。たとえＳＯＤ活性が０．３８〜０．５６ｍＵ／タンパク質ｍｇ／分に及んだとしても、チラコイド抽出物の年数は、この活性を大幅に改変すると考えられない。なぜなら、他の２つの１年齢および６年齢の抽出物が、それぞれ約０．３８および０．４５ｍＵ／タンパク質ｍｇ／分を実証したからである。
【０１０９】
様々な年齢の様々なチラコイド抽出物から得られたこれらの結果は、本発明の抽出および安定化方法が、４℃にて６年後にすら活性があり得るようにチラコイド膜の構造的完全性を維持することを示している。
【０１１０】
本発明を、その特定の実施形態に関して記載してきたが、更なる改変が可能であること、本出願が、一般に、本発明の原理に従って、本発明のあらゆる変形、使用、または改作をカバーすること、そして、本発明が属する技術の範囲内の知られている、または慣習的な実行に入り、以前に示された本明細書中の必須の特徴に当てはまり得、かつ添付の特許請求の範囲に従うような、本開示からの逸脱を含むことが意図されていると理解されよう。
【０１１１】
本明細書中に記載した全ての特許、特許出願、および刊行物は、それぞれの独立した特許、特許出願、または刊行物が、参照によって組み込まれると具体的に、かつ個々に示されているかのようにして、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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