(57)【要約】  本明細書中で提供されるのは、歯牙侵食を修復又は阻止し、歯の再石灰化を促進し、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果を増強する方法において有用な、HABPを含む口腔ケア組成物である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エナメル質及び/若しくは象牙質の表面に結合させるか又はそれらを標的化し、歯牙侵食を修復又は阻止し、歯の再石灰化を促進し、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果を増強する方法であって、
a) HABP；
b) 経口的に許容可能な担体
を含み且つ/又はエナメル質/象牙質の表面上の活性成分の局所濃度を増加させることにより該活性成分の生物学的活性を増強する口腔ケア組成物を歯に適用するステップを含み、ここでHABPは該組成物中に、該組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する、前記方法。
【請求項２】
HABPが、式(I)：
a0-1-b0-10-y1-10-c0-10-d0-1 (I)
(式中、
a、dは、互いに独立して、ハイドロフォビン若しくは不凍タンパク質配列又は口腔ケア活性成分を表し、
b、cは、互いに独立して、アミノ酸を表し、
yは、配列番号1から配列番号16までに示されるポリペプチド配列を表す)
に示されるポリペプチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式Iが、以下の意味：
a、d = 0
b、c = 0、
y1= 配列番号1、2、3、4
を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
HABPがほぼ中性又はわずかに塩基性のpHに中和されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記口腔ケア組成物が有効量のフッ化物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
HABPが、前記組成物中に、前記組成物の総重量の0.1重量％〜3重量％の量で存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
フッ化物の量が約500ppmのフッ化物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が歯磨剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
歯牙侵食を低減、阻止又は修復するための方法である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
歯の再石灰化を促進するための方法である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
フッ化物の虫歯予防効果を増強するための方法である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
以下：
a) ほぼ中性又はわずかに塩基性のpHに中和されているHABP；
b) 有効量のフッ化物、及び
c) 経口的に許容可能な担体
を含む歯磨剤。
【請求項１３】
歯のエナメル質侵食の修復又は阻止、歯のエナメル質の再石灰化の促進、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果の増強において使用するための、
a) HABP；
b) 場合により有効量のフッ化物；
c) 経口的に許容可能な担体
を含む口腔ケア組成物であって、HABPが該組成物中に該組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する、前記口腔ケア組成物。
【請求項１４】
歯牙侵食を修復又は阻止し、歯の再石灰化を促進し、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果を増強するための口腔ケア組成物の製造における、HABPの使用。
【請求項１５】
HABPを含む口腔ケア製品の作製方法であって、以下：
a) 水性バッファー溶液を用いた希釈によりHABP溶液を中和して、ほぼ中性又はわずかに塩基性のpHを有する溶液を得るステップ；
b) a)の溶液生成物を濾過及び遠心分離してHABPを含む濾液を得るステップ；
c) フッ化物及び場合により殺生物剤をb)の濾液生成物に添加するステップ；
d) c)の生成物を経口的に許容可能な担体の成分に混合するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１６】
HABPを含む口腔ケア組成物であって、該口腔ケア組成物が、請求項１５に記載の方法により得られるか又は得ることができる、前記口腔ケア組成物。
【請求項１７】
一般式(I)：
a0-1-b0-10-y1-10-c0-10-d0-1(I)
(式中、
a、dは、互いに独立して、ハイドロフォビン若しくは不凍タンパク質配列又は口腔ケア活性成分を表し、
b、cは、互いに独立して、アミノ酸を表し、
yは、配列番号1、2、3、4に示されるポリペプチド配列を表す)
で表される、ハイドロキシアパタイト結合ポリペプチド。
【請求項１８】
一般式(I)：
a0-1-b0-10-y1-10-c0-10-d0-1(I)
(式中、
a、dは、互いに独立して、0又は口腔ケア活性成分を表し、
b、c = 0であり、
yは、配列番号6、7、8、16に示されるポリペプチド配列を表す)
で表される、ハイドロキシアパタイト結合ポリペプチド。
【請求項１９】
チューインガム組成物であって、
a) ガムベース、
b) 香味料、
c) 甘味料、及び
d) 該チューインガム組成物の約0.01重量％〜約0.5重量％のHABP
を含む、前記チューインガム組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロキシアパタイト結合タンパク質を含む口腔ケア製品及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯のエナメル質は、歯冠を被覆する石灰化物質の薄く硬い層である。歯のエナメル質の主要なミネラル成分は、結晶形態のリン酸カルシウムであるハイドロキシアパタイトである。歯のエナメル質の化学的侵食は、酸性食品及び飲料、又は胃逆流から生じる胃酸に対する歯の曝露から生じ得る。歯のエナメル質の侵食は、象牙質細管の曝露の増加に起因する歯の感受性の増加、及びより黄色い歯の外観につながる象牙質の可視性の増加をもたらし得る。唾液ペリクル(歯上に堆積した唾液糖タンパク質の薄層)は、侵食性の曝露に対する歯の保護において不可欠である。結果として、口内乾燥症を経験する人々は、より酸侵食損傷を受けやすい。
【０００３】
エナメル質侵食の予防を補助するために開発された既存の方法は、遊離フッ化物源を口腔ケア組成物に組み込むステップを含む。フッ化物は、ハイドロキシアパタイトより低いpHで溶解するため酸損傷に対してより耐性のフルオロアパタイトの形成を通して、エナメル質に対する損傷を低下させる。同様に、より酸耐性のミネラル層を形成することによってエナメル質表面を保護するため、第一スズ塩も歯磨き製剤に組み込まれていた。エナメル質表面をコーティング及び保護するポリマーも報告されている。
【０００４】
酸は、齲蝕原性細菌を含むプラークが糖質を代謝する場合も口腔内で生成される。プラークはプロトン動態及びエナメル質を通じたミネラル拡散を抑制するバリアーを形成するため、プラーク酸は齲蝕病変を引き起こす。歯磨き製剤中へのフッ化物イオンの組み込みは、プラーク酸の影響を軽減するための最も一般的な方法である。フッ化物は脱灰の速度を低下させ、再石灰化を増強する。リン酸カルシウム塩を安定化させ、又はプラークpHを制御して再石灰化を増強するための幾つかのアプローチが開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
歯上における非細菌及び細菌産生酸の影響を軽減するための方法が開発されているが、酸侵食及び細菌の酸の影響からエナメル質を有効に修復する改善された口腔ケア組成物を提供する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ハイドロキシアパタイト結合ポリペプチド(HABP)が歯牙侵食の影響の修復又は軽減、歯の再石灰化の促進、及びフッ化物の虫歯予防効果の増強において有効であることを予想外に見出した。
【０００７】
例えば、一実施形態において、HABPは、好適な経口的に許容可能な担体の成分を用いて、バッファー(例えばNa2HPO4バッファーなどのリン酸バッファー(1.5mM)及びCaCl2(2.5mM))中で希釈してほぼ中性又はわずかに塩基性のpH(例えば、pH7〜8、例えば約pH7.5)を有する緩衝化溶液を提供し、この溶液を濾過及び遠心分離してHABPを含む濾液を得ることによって製剤に調製される。この濾液に、殺生物剤(例えば0.1％の塩化セチルピリジニウム)及びフッ化物を添加し得る。次いで、HABPを経口的に許容可能な担体の成分、例えば練り歯磨き又はマウスウォッシュベースと組み合わせて、歯牙侵食の影響を修復又は軽減し、歯の再石灰化を促進し、フッ化物の虫歯予防効果を増強するための口腔ケア組成物を提供することができる。
【０００８】
従ってこの開示は、口腔ケア組成物(組成物1)(例えば歯磨剤)であって：
a) HABP；
b) 経口的に許容可能な担体
を含み、ここでHABPは、上記組成物中に、組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する、上記口腔ケア組成物に関する。例えば、本開示は、以下のものを提供する：
1.1. HABPが配列番号1、2、3、4のポリペプチド配列を有する組成物1。
1.2. フッ化物を含む、任意の前述の組成物。
1.3. HABPが、例えばリン酸バッファーを用いてほぼ中性又はわずかに塩基性のpH(例えばpH7〜8)に中和されている、任意の前述の組成物。
1.4. HABPが、殺生物剤(例えば塩化セチルピリジニウム(CPC))を有効濃度(例えば濾液の0.1重量％)で含む、任意の前述の組成物。
1.5. HABPが、組成物中に、組成物の総重量の0.1重量％〜3重量％、例えば組成物の総重量の0.2重量％〜2重量％(例えば約0.2重量％、約1重量％、約1.5重量％、又は約2重量％)の量で存在する、任意の前述の組成物。
1.6. 組成物が有効量のフッ化物を含む、任意の前述の組成物。
1.7. 100ppm〜2500ppm、例えば250ppm〜750ppmの量のフッ化物、例えば約500ppmのフッ化物を含む、任意の前述の組成物。
1.8. 例えば酸化亜鉛、クエン酸亜鉛、乳酸亜鉛、リン酸亜鉛、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、アミノ酸との亜鉛錯体、及び前述のいずれかの混合物から選択される経口的に許容可能な亜鉛塩又は酸化物を含み、例えば亜鉛の量が、亜鉛イオンの重量で計算して0.1重量％〜3重量％、例えば約1〜約2重量％である、任意の前述の組成物。
1.9. 経口的に許容可能な第一スズ塩、例えばSnF2又はSnCl2を含む、任意の前述の組成物。
1.10. 組成物が、マウスリンス、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉、非研磨ゲル、ムース、フォーム、マウススプレー及びタブレット、例えば歯磨剤(例えば練り歯磨き又はマウスリンス)から選択される形態である、任意の前述の組成物。
1.11. 組成物が、研磨剤、pH改変剤、界面活性剤、発泡調整剤、増粘剤、粘度改質剤、湿潤剤、抗歯石剤又は歯石抑制剤、甘味料、香味料び着色料から選択される1種以上の薬剤をさらに含む、任意の前述の組成物。
1.12. 組成物が練り歯磨きである、任意の前述の組成物。
1.13. 1種以上の可溶性リン酸塩塩を含む任意の前述の組成物であって、例えば「可溶性リン酸塩塩」が、25℃で少なくとも1g/100mlの水中溶解度を有する経口的に許容可能なリン酸塩塩を意味し；例えば1種以上の可溶性リン酸塩塩がピロリン酸塩及び/又はポリリン酸塩(例えばトリポリリン酸塩)のナトリウム塩及び/又はカリウム塩であり；例えば1種以上の可溶性リン酸塩塩が、ピロリン酸四ナトリウム(TSPP)、トリポリリン酸ナトリウム(STPP)又はTSPPとSTPPの組み合わせを含み；例えば1種以上の可溶性リン酸塩塩が、組成物の1〜20重量％、例えば2〜8重量％(例えば約5重量％)の量で存在する、上記組成物。
1.14. フッ化物が、フッ化第一スズ、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、フルオロケイ酸ナトリウム、フルオロケイ酸アンモニウム、フッ化アミン(例えば、N'-オクタデシルトリメチレンジアミン-N,N,N'-トリス(2-エタノール)-ジヒドロフルオリド)、フッ化アンモニウム、フッ化チタン、ヘキサフルオロ硫酸塩、及びそれらの組み合わせから選択される塩により提供される、任意の前述の組成物。
1.15. 例えばグリセリン、ソルビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、キシリトール、及びそれらの混合物から選択される湿潤剤を含む(例えば、組成物の少なくとも30重量％、例えば40〜50重量％のグリセリンを含む)歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.16. 例えばアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤並びにそれらの混合物から選択される1種以上の界面活性剤を含む歯磨剤である任意の前述の組成物であって、例えば、歯磨剤基剤が、アニオン性界面活性剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムエーテル及びそれらの混合物から選択される界面活性剤)を、例えば組成物の約0.3重量％〜約4.5重量％の量で(例えば組成物の1〜2重量％のラウリル硫酸ナトリウム(SLS)を)含む、上記組成物。
1.17. 両性イオン性界面活性剤、例えばベタイン界面活性剤(例えばコカミドプロピルベタイン)を、例えば組成物の約0.1重量％〜約4.5重量％の量で(例えば組成物の0.5〜2重量％のコカミドプロピルベタインを)含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.18. 粘度改質量の、1種以上の多糖ガム(例えばキサンタンガム又はカラギーナン)、シリカ増粘剤、及びそれらの組み合わせを含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.19. ガムストリップ又はフラグメントを含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.20. 香味料、香料及び/又は着色料を含む、任意の前述の組成物。
1.21. 有効量の1種以上の抗細菌剤を含む歯磨剤である任意の前述の組成物であって、例えば、ハロゲン化ジフェニルエーテル(例えばトリクロサン)、ハーブ抽出物及びエッセンシャルオイル(例えば、ローズマリー抽出物、茶抽出物、モクレン抽出物、チモール、メントール、ユーカリプトール、ゲラニオール、カルバクロール、シトラール、ヒノキトール、カテコール、サリチル酸メチル、没食子酸エピガロカテキン、エピガロカテキン、没食子酸、ミスワク(miswak)抽出物、シーバックソーン抽出物)、ビスグアニド防腐剤(例えば、クロロヘキシジン、アレキシジン又はオクテニジン)、第四級アンモニウム化合物(例えば、塩化セチルピリジニウム(CPC)、塩化ベンザルコニウム、塩化テトラデシルピリジニウム(TPC)、塩化N-テトラデシル-4-エチルピリジニウム(TDEPC))、フェノール性防腐剤、ヘキセチジン、オクテニジン、サングイナリン、ヨウ化ポビドン、デルモピノール、サリフルオル、金属イオン類(例えば、亜鉛塩類(例えばクエン酸亜鉛)、第一スズ塩類、銅塩類、鉄塩類)、サングイナリン、プロポリス及び酸素化剤(例えば、過酸化水素、緩衝された過酸化ホウ酸ナトリウム又は緩衝された過酸化炭酸ナトリウム)、フタル酸及びその塩、モノパーサル酸(monoperthalic acid)並びにその塩及びエステル、ステアリン酸アスコルビル、オレオイルサルコシン(oleoyl sarcosine)、硫酸アルキル、スルホコハク酸ジオクチル、サリチルアニリド、臭化ドミフェン、デルモピノール、オクタピノール及び他のピペリジン誘導体、ニシン(nicin)調製物、亜塩素酸塩塩；及び前述のいずれかの混合物から選択される抗細菌剤を含む(例えばトリクロサン又は塩化セチルピリジニウムを含む)、上記組成物。
1.22. 例えば、過酸化物、金属亜塩素酸塩類、過ホウ酸塩類、過炭酸塩類、過酸類、次亜塩素酸塩類、及びそれらの組み合わせ；例えば、過酸化水素又は酸化水素源、例えば過酸化尿素又は過酸化物塩若しくは過酸化物錯体(例えば、過酸化リン酸塩、過酸化炭酸塩、過ホウ酸塩、過酸化ケイ酸塩、又は過硫酸塩の塩など；例えば、過酸化リン酸カルシウム、過ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム過酸化物、過酸化リン酸ナトリウム、及び過硫酸カリウム)からなる群から選択される美白剤を含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.23. 細菌の付着を妨げるか又は予防する薬剤(例えばソルブロール又はキトサン)を含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.24. 例えば、硫酸カルシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム、及びそれらの組み合わせから選択される可溶性カルシウム塩を含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.25. 生理学的に又は経口的に許容可能なカリウム塩(例えば硝酸カリウム又は塩化カリウム)を、象牙質の感受性を低下させるのに有効な量で含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.26. アニオン性ポリマー(例えば合成アニオン性ポリマー性ポリカルボキシレート)を含む歯磨剤である任意の前述の組成物であって、例えば、上記アニオン性ポリマーが、無水マレイン酸又はマレイン酸の、別の重合可能なエチレン性不飽和モノマーとの1：4〜4：1コポリマーから選択され；例えば上記アニオン性ポリマーが、約30,000〜約1,000,000(例えば約300,000〜約800,000)の平均分子量(M.W.)を有するメチルビニルエーテル/無水マレイン酸(PVM/MA)コポリマーであり、例えば上記アニオン性ポリマーが、組成物の約1〜5重量％(例えば約2重量％)である、上記組成物。
1.27. ブレスフレッシュナー、香料又は香味料を含む歯磨剤である、任意の前述の組成物。
1.28. 組成物のpHがほぼ中性(例えば約pH7)である、任意の前述の組成物。
1.29. 酸侵食を低減及び阻止し、歯を清浄し、細菌が生成したバイオフィルム及びプラークを低減し、歯肉炎を低減し、齲歯及び虫歯の形成を阻止し、象牙質の過敏性を低減するために使用するための、任意の前述の組成物。
1.30. 歯のエナメル質侵食の低減、阻止又は修復において使用するための、任意の前述の組成物。
1.31. 歯のエナメル質の再石灰化の促進において使用するための、任意の前述の組成物。
1.32. フッ化物の虫歯予防効果の増強において使用するための、任意の前述の組成物。
【０００９】
組成物1の特に新規な実施形態は、
a) 例えば少なくとも20.0％の乾燥物質、少なくとも2.5％の総窒素、4.0〜5.0のpH値、及び1.0％以下の灰含有量を含むHABPであって；部分的に加水分解されたコムギタンパク質が、ほぼ中性又はわずかに塩基性のpHに中和されている、上記HABP；
b) 場合により有効量のフッ化物；
c) 経口的に許容可能な担体
を含む歯磨剤であって、例えばHABPの量が0.1重量％〜2重量であり、例えばフッ化物が100ppm〜1000ppm(例えば約500ppm)の量で存在する、上記歯磨剤である。
【００１０】
一態様において、本開示は、歯牙侵食の修復又は阻止、再石灰化の促進、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果の増強において使用するための；例えば方法1(以下参照)による以下の方法のいずれかにおいて使用するための、組成物1(以下参照)のいずれかを提供する。
【００１１】
別の態様において、本開示は、歯牙侵食を修復又は阻止し、歯の再石灰化を促進し、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果を増強する方法(方法1)であって、組成物、例えば組成物1(以下参照)のいずれか、例えば：
a) HABP
b) 経口的に許容可能な担体
を含む口腔ケア組成物であって、HABPが組成物中に、組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する上記組成物を歯に適用するステップを含む、上記方法を提供する。例えば、本開示は、以下を提供する：
1.1. HABPが配列番号1、2、3、4のポリペプチド配列を有する、方法1。
1.2. HABPがフッ化物を含む、任意の前述の方法。
1.3. HABPが、例えばリン酸バッファーを用いて、ほぼ中性又はわずかに塩基性のpH(例えばpH7〜8)に中和されている、任意の前述の方法。
1.4. HABPが、殺生物剤(例えば、塩化セチルピリジニウム(CPC))を有効濃度(例えば濾液の0.1重量％)で含む、任意の前述の方法。
1.5. HABPが、組成物中に、組成物の総重量の0.1重量％〜3重量％、例えば組成物の総重量の0.2重量％〜2重量％(例えば約0.2重量％、約1重量％、約1.5重量％又は約2重量％)の量で存在する、任意の前述の方法。
1.6. 組成物が有効量のフッ化物を含む、任意の前述の組成物。
1.7. フッ化物の量が、100ppm〜1000ppm(例えば約500ppmのフッ化物)である、任意の前述の方法。
1.8. 組成物が、マウスリンス、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉、非研磨ゲル、ムース、フォーム、マウススプレー及びタブレットから選択される形態である、任意の前述の方法。
1.9. 組成物が、研磨剤、pH改変剤、界面活性剤、発泡調整剤、増粘剤、粘度改質剤、湿潤剤、抗歯石剤又は歯石抑制剤、甘味料、香味料及び着色料から選択される1種以上の薬剤をさらに含む、任意の前述の方法。
1.10. 組成物が歯磨剤(例えば練り歯磨き)である、任意の前述の方法。
1.11. 組成物が、組成物1(以下参照)(上記参照)のいずれかから選択される、任意の前述の方法。
1.12. 歯牙侵食(例えばエナメル質の侵食)を低減、阻止又は修復するための方法であって、例えば、組成物が歯牙侵食を有するか又は歯牙侵食を有するリスクが上昇していると同定された患者の歯に適用される上記方法である、任意の前述の方法。
1.13. 歯の再石灰化(例えばエナメル質の再石灰化)を促進するための方法であって、例えば、組成物が脱灰を有すると同定された患者の歯に適用される上記方法である、任意の前述の方法。
1.14. フッ化物の虫歯予防効果を増強するための方法であって、例えば組成物が、齲歯の初期兆候(例えば初期エナメル質齲蝕)を有するか、又は活発な齲歯を有するか、又は齲歯のリスクが上昇していると同定された患者の歯に適用される上記方法である、任意の前述の方法。
1.15. 組成物が有効量のフッ化物を含む、及び/又は方法が、有効量のフッ化物を含む口腔ケア製品、有効量のフッ化物を含むマウスリンス又は練り歯磨きの投与をさらに含む、方法1.15。
【００１２】
別の実施形態において、本開示は、歯牙侵食の修復又は阻止、再石灰化の促進、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果の増強のための口腔ケア組成物(例えば組成物1(以下参照)のいずれかによる口腔ケア組成物)の製造における(例えば方法1(以下参照)のいずれかにおける)、HABPの使用を提供する。
【００１３】
別の態様において、本開示は、口腔ケア製品(例えば歯牙侵食を修復又は阻止し、歯の再石灰化を促進し、及び/あるいはフッ化物の虫歯予防効果を増強するために有用な口腔ケア製品(例えば、組成物1(以下参照)のいずれかによる製品))の作製方法(方法2)であって、以下：
a) 水性バッファー溶液(例えばリン酸バッファー溶液)を用いた希釈によりHABPを中和して、ほぼ中性又はわずかに塩基性のpH(例えばpH7〜8)を有する溶液を得るステップ；
b) a)の溶液生成物を濾過及び遠心分離してHABPを含む濾液を得るステップ；
c) フッ化物(例えば、フッ化物を含有する経口的に許容可能な塩、例えばフッ化ナトリウム又はモノフルオロリン酸ナトリウムの形態のフッ化物)、及び場合により殺生物剤(例えば、有効量(例えば濾液の0.01〜1重量％、例えば約0.1重量％)の塩化セチルピリジニウム)を、b)の濾液生成物に添加するステップ；
d) c)の生成物を経口的に許容可能な担体の成分に混合して、HABPを組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で含む口腔ケア組成物を得るステップ
を含む、上記方法を提供する。
【００１４】
例えば、本開示は、HABPを含む口腔ケア組成物(例えば組成物1(以下参照)のいずれかによる組成物)であって、上記口腔ケア組成物が、方法2(以下参照)の工程により得られるか又は得ることができる、上記口腔ケア組成物を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる利用可能領域は、本明細書中以降に提供される詳細な説明から明らかとなるであろう。詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のみを目的とすることが意図されており、本発明の範囲を限定することは意図されていないことが理解されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
好ましい実施形態(1つ又は複数)の以下の記載は、単に例示的な性質のものであり、決して本発明、その利用、又は用途を限定することを意図するものではない。
【００１７】
本明細書全体を通して、範囲は、その範囲内にある各値及び全ての値の記載の省略表現として用いられる。範囲内の任意の値を範囲の終端として選択することができる。さらに、本明細書中で引用される全ての参考文献は、それらの全体を参照することにより本明細書中に組み込まれる。本開示中の定義と引用される参考文献中の定義に矛盾がある場合は、本開示がコントロールする。
【００１８】
別段に特定されない限り、本明細書中の他の場所において表現される全てのパーセント及び量は、重量パーセントを指すと理解されるべきである。所与の量は、その物質の活性重量に基づく。
【００１９】
ハイドロキシアパタイト結合ポリペプチド(HABP)
本発明によるハイドロキシアパタイト結合ポリペプチド(HABP)は、歯のエナメル質の主成分であるハイドロキシアパタイトへの特異的結合のため、並びに歯の再石灰化を促進するため、及びフッ化物の虫歯予防効果を増強するために設計されたポリペプチドである。
【００２０】
1. HABPは、一般式(I)：
a0-1-b0-10-y1-10-c0-10-d0-1 (I)
(式中、
a、dは、互いに独立して、ハイドロフォビン若しくは不凍タンパク質配列又は口腔ケア活性成分(例えば冷却化合物、抗菌化合物、美白化合物)を表し、
b、cは、互いに独立してアミノ酸を表し、
yは、配列番号1から配列番号16までに示されるポリペプチド配列を表す)
によって表すことができる。
【００２１】
HABPは、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16の群から選択されるポリペプチドであるコア配列(「y」)を有する。好ましい配列yは、配列番号1、2、3、4である。HABPは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のy配列を有し得る。y配列が複数ある場合、yは同一であってもよく(「ホモマー」)、異なっていてもよく(「ヘテロマー」)、あるいは部分的に同一で部分的に異なっていてもよい。例えばy3は、配列番号1-配列番号3-配列番号11(すなわち21アミノ酸)のポリペプチドを表すことができる。
【００２２】
HABPは、yのアミノ末端及び/又はカルボキシ末端に、付加アミノ酸b0-10及びC0-10を有し得る。「b」及び「c」は、20個の天然アミノ酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)のいずれかを表し、指数0-10は、無し(0)、1個(1)、2個(2)、3個(3)〜10個(10)までのアミノ酸を表す。例えば4アミノ酸の場合、これらの4個のアミノ酸は同一であっても異なっていてもよい。例えば、b4は、Ala-Gly-Ser-Serを表し得る。配列「b」及び「c」はスペーサー配列又は付加配列であり、これらは各遺伝子断片(制限酵素又はプライマーの認識部位)をクローニングすることにより創出される場合があり、通常はハイドロキシアパタイト結合又は歯の再石灰化増強に特定の影響を及ぼさない。配列「b」及び「c」は、必要であれば、口腔内で生じるプロテアーゼの切断部位を含有し得る。
【００２３】
b及びCに好ましいアミノ酸は、かさ高くない側鎖(例えばGly、Ala、Ser、Thr)を有する非荷電アミノ酸である。
【００２４】
さらに、HABPは、「y」並びに所望の場合は「b」及び/又は「c」に加えて、ハイドロフォビンポリペプチド及び/若しくは不凍タンパク質(AFP)又は口腔ケア活性成分であり得る、さらなるポリペプチド「a」及び/又は「d」を含み得る。例えば、HABPの一実施形態は、ハイドロフォビンポリペプチドがy配列に融合し、その後に別のハイドロフォビンが続いたものを有し得る。HABPの別の実施形態は、AFPポリペプチド(「a」)がy配列に融合し、このy配列が別のy配列に融合し、その後に口腔ケア活性成分分子が続いたものであり得る。
【００２５】
ハイドロフォビンは、疎水性/親水性界面で自己集合することが可能であり、且つ保存配列：
Xn-C-X5-9-C-C-X11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-Xm
(式中、Xは任意のアミノ酸を表し、n及びmは、独立して、整数を表す)を有する、十分に定義されたクラスのタンパク質を意味する(Wessels, 1997, Adv. Microb. Physio. 38: 1-45; Wosten, 2001, Annu Rev. Microbiol. 55: 625-646)。典型的には、ハイドロフォビンは、125アミノ酸以下の長さを有する。保存配列中のシステイン残基(C)は、ジスルフィド架橋の一部である。本発明の文脈において、用語「ハイドロフォビン」は、タンパク質膜を生じる疎水性-親水性界面における自己集合特性を依然として示す機能的に同等のタンパク質、又はタンパク質膜を生じる疎水性-親水性界面における自己集合特性を依然として示すそれらの部分を包含する、比較的広い意味を有する。本発明の定義によれば、自己集合は、タンパク質をテフロン(登録商標)に吸着させ、円偏光二色性分析を用いて二次構造(一般的には、αへリックス)の存在を証明することによって検出することができる(De Vochtら, 1998, Biophys. J. 74: 2059-68)。
【００２６】
膜の形成は、テフロン(登録商標)シートをタンパク質溶液中でインキュベートし、その後水又はバッファーで少なくとも3回洗浄することによって証明することができる(Wostenら, 1994, Embo. J. 13: 5848-54)。タンパク質膜は、当技術分野において十分に確立されているとおり、任意の好適な方法(例えば蛍光マーカーを用いた標識)により、又は蛍光抗体の使用によって可視化することができる。m及びnは、典型的には0〜2000の範囲の値を有するが、より一般的には、m及びnは、合計で200未満又は300未満である。本発明の文脈におけるハイドロフォビンの定義は、ハイドロフォビンと別のポリペプチドとの融合タンパク質、並びにハイドロフォビンと他の分子(例えば多糖類)とのコンジュゲートを包含する。
【００２７】
今までに同定されたハイドロフォビンは、一般的に、クラスI又はクラスIIのいずれかに分類される。いずれのタイプも、菌類中で、疎水性-親水性界面において両親媒性膜へと自己集合する分泌タンパク質として同定されている。
【００２８】
ハイドロフォビンは、天然源(例えば糸状菌類)からの任意の好適な工程による抽出によって得ることができる。例えば、ハイドロフォビンは、ハイドロフォビンを成長培地中に分泌する糸状菌類を培養することにより、又は60％エタノールを用いた菌類の菌糸からの抽出によって得ることができる。ハイドロフォビンを天然に分泌する宿主生物からハイドロフォビンを単離することが特に好ましい。好ましい宿主は、糸状不完全菌類(hyphomycetes)(例えばトリコデルマ属(Trichoderma))、担子菌類(basidiomycetes)及び子嚢菌類(ascomycetes)である。特に好ましい宿主は、食品等級生物、例えば、クリパリン(cryparin)と呼ばれるハイドロフォビンを分泌するクリフォネクトリア・パラシティカ(Cryphonectria parasitica)である(Maccabe及びVan Alfen, 1999, App. Environ. Microbiol 65: 5431-5435)。
【００２９】
あるいは、ハイドロフォビンは、組換え技術の使用によって得ることができる。例えば、宿主細胞(典型的には微生物)を、ハイドロフォビンを発現するように改変し、その後ハイドロフォビンを単離して本発明により使用することができる。ハイドロフォビンをコードする核酸構築物を宿主細胞に導入するための技術は、当技術分野において周知である。34個超の、ハイドロフォビンをコードする遺伝子が、16種超の菌種からクローン化されている(例えば、アガリクス・ビスポラス(Agaricus bisporus)において同定されたハイドロフォビンの配列を与えるW096/41882；及びWosten, 2001, Annu. Rev. Microbiol. 55: 625-646を参照)。組換え技術は、ハイドロフォビン配列を改変するため、又は所望の/高められた特性を有する新規なハイドロフォビンを合成するためにも使用し得る。典型的には、適切な宿主細胞又は生物を、所望のハイドロフォビンをコードする核酸構築物で形質転換する。上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳に必要なエレメントをコードする好適な発現ベクターに、これらのポリペプチドが適切な条件下で発現されるような様式で(例えば適切な方向及び正しいリーディングフレームに、適切な標的化配列及び発現配列を用いて)挿入することができる。これらの発現ベクターを構築するために必要とされる方法は、当業者に周知である。
【００３０】
本ポリペプチドコーディング配列を発現させるために、多数の発現系を使用することができる。これらの発現系としては、限定するものではないが、細菌、真菌(酵母を含む)、昆虫細胞系、植物細胞培養系及び植物(全て適切な発現ベクターを用いて形質転換される)が挙げられる。好ましい宿主は、食品等級とみなされる(「一般に安全と認められる」(GRAS))宿主である。
【００３１】
好適な真菌種としては、酵母、例えば(限定するものではないが)、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、クルベロマイセス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、ハンセヌラ属(Hansenula)、カンジダ属(Candida)、シゾサッカロマイセス属(Schizo Saccharomyces)などの酵母、及び糸状菌種、例えば(限定するものではないが)、アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ムコール属(Mucor)、ニューロスポラ属(Neurospora)、フザリウム属(Fusarium)などの糸状菌種が挙げられる。
【００３２】
ハイドロフォビンをコードする配列は、天然に同定されたハイドロフォビンと、アミノ酸レベルで好ましくは少なくとも80％同一であり、より好ましくは少なくとも95％又は100％同一である。しかし、当業者であれば、ハイドロフォビンの生物学的活性を低下させない保存的置換又は他のアミノ酸変更を行うことができる。本発明の目的のため、天然に生じるハイドロフォビンとこの高レベルの同一性を有するこれらのハイドロフォビンもまた、用語「ハイドロフォビン」の範囲内に包含される。
【００３３】
ハイドロフォビンは、培養培地又は細胞抽出物から、例えば、ハイドロフォビン含有溶液中に存在するハイドロフォビンを表面に吸着させ、その後その表面に界面活性剤(例えばTween20)を接触させて、上記表面からハイドロフォビンを溶出するステップを含む、WO01/57076に記載される手順によって精製することができる。Collenら, 2002, Biochim Biophys Acta. 1569: 139-50；Calonjeら, 2002, Can. J. Microbiol. 48: 1030-4；Askolinら, 2001, Appl Microbiol Biotechnol. 57: 124-30；及びDe Vriesら, 1999, Eur J Biochem. 262: 377-85も参照されたい。典型的には、ハイドロフォビンは単離された形態であり、典型的には少なくとも部分的に精製された形態(例えば固体重量で少なくとも10％純粋)である。「単離された形態」という用語により、本発明者らは、ハイドロフォビンが、ハイドロフォビンを天然に発現する天然生物(例えばマッシュルーム)の一部としては添加されないことを意味する。その代わりに、本ハイドロフォビンは、典型的には天然源から抽出されるか、又は宿主生物中の組換え発現によって得られるであろう。
【００３４】
ハイドロフォビンタンパク質は、2つのクラス：水中でほぼ不溶性のクラスIと、水中で容易に可溶性のクラスIIに分けることができる。
【００３５】
好ましくは、選択されるハイドロフォビンは、クラスIハイドロフォビンである。より好ましくは、使用されるハイドロフォビンは、DewA、RodAなどのクラスIハイドロフォビンである。ハイドロフォビンは、単一の供給源に由来するものであってもよいし、複数の供給源(例えば2種以上の異なるハイドロフォビンの混合物)に由来するものであってもよい。本発明の組成物中のハイドロフォビンの総量は、一般的に、本組成物の総重量に対して、ハイドロフォビンの総重量で少なくとも0.001重量％、より好ましくは少なくとも0.005重量％又は0.01重量％、一般的には2重量％以下であろう。
【００３６】
本発明において用いられる定義におけるハイドロフォビンは、ハイドロフォビンと別のタンパク質との融合タンパク質も包含する。これらは、一般式(II)：
Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (II)
(式中、Xは、20個の天然アミノ酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)のいずれかであってよく、Xの指数はアミノ酸の数を示し、指数n及びmは0〜500(好ましくは15〜300)の数字であり、Cはシステインであるが、但しXn又はXmと省略されるペプチド配列の少なくとも1つは、ハイドロフォビンに天然には結合していない少なくとも20アミノ酸長さのペプチド配列であり、このポリペプチドは、ガラス面のコーティング後に接触角度を少なくとも20°変化させる)
によって表すことができる。
【００３７】
C1〜C8により示されるシステインは、還元形態であってもよいし、又は本発明のタンパク質中で互いにジスルフィド架橋を形成してもよい。特に好ましいのは、C-C架橋の分子内形成、特に以下の群：C1とC2、C3とC4、C5とC6、C7とC8から選択される、少なくとも1つの、好ましくは2つ、特に好ましくは3つ、極めて特に好ましくは4つの分子内ジスルフィド架橋を有するハイドロフォビンである。
【００３８】
システインが、Xにより示される位置においても用いられる場合、一般式中の個々のシステイン位置のナンバリングは、それに応じて変更することができる。
【００３９】
特に有利なポリペプチドは、一般式(III)：
Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (III)
(式中、Xは、20個の天然アミノ酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)のいずれかであってよく、Xの指数はアミノ酸の数を示し、指数n及びmは2〜300の数字であり、Cはシステインであるが、但しXn又はXmと省略されるペプチド配列の少なくとも1つは、ハイドロフォビンに天然には結合していない少なくとも35アミノ酸長さのペプチド配列であり、このポリペプチドは、ガラス面のコーティング後に接触角度を少なくとも20°変化させる)
で表されるポリペプチドである。
【００４０】
極めて特に有利なのは、一般式(IV)：
Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (IV)
(式中、Xは、20個の天然アミノ酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)のいずれかであってよく、Xの指数はアミノ酸の数を示し、指数n及びmは0〜200の数字であり、Cはシステインであるが、但しXn又はXmと省略されるペプチド配列の少なくとも1つは、ハイドロフォビンに天然には結合していない少なくとも40アミノ酸長さのペプチド配列であり、このポリペプチドは、ガラス面のコーティング後に接触角度を少なくとも20°変化させる)
で表されるポリペプチドである。
【００４１】
記載される発明の好ましい実施形態は、一般構造式(I)、(II)又は(III)を有するポリペプチドであり、この構造式は、少なくとも1つのクラスIハイドロフォビン、好ましくは少なくとも1つのdewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basf1、basf2、ハイドロフォビン、又はそれらの一部若しくは誘導体を含む。前記ハイドロフォビンは、以下の配列リストにおいて構造的に特徴づけられる。複数の(好ましくは2つ又は3つの)構造的に同一のまたは異なるハイドロフォビンを、互いに、及びハイドロフォビンと天然には結合していない対応する好適なポリペプチド配列と結合することも可能である。
【００４２】
本発明の特に好ましい実施形態は、配列番号17(dewA)、配列番号18(rodA)、配列番号19(HypA)、配列番号20(HypB)、配列番号21(Sc3)、配列番号22(BASF1)、配列番号23(BASF2)に示されるポリペプチド配列を有するハイドロフォビンタンパク質である。
【００４３】
本発明のタンパク質は、Xn又はXmにより省略される少なくとも1つの位置に、ハイドロフォビンに天然には結合していない、少なくとも20個、好ましくは少なくとも35個、特に好ましくは少なくとも50個、特に少なくとも100個のアミノ酸を含むポリペプチド配列(本明細書中以下に融合パートナーとも呼ばれる)を有する。これは、本発明のタンパク質が、ハイドロフォビン部分と融合パートナー部分からなる(天然にはこの形で一緒に生じることはない)という事実を表すことが意図される。
【００４４】
融合パートナー部分は、非常に多数のタンパク質から選択することができる。複数の融合パートナーを1つのハイドロフォビン部分に(例えばハイドロフォビン部分のアミノ末端(Xn)及びカルボキシ末端(Xm)に)結合することも可能である。しかし、例えば、2つの融合パートナーを本発明のタンパク質の単一の位置(Xn又はXm)に結合することも可能である。
【００４５】
特に好適な融合パートナーは、微生物中で(特に大腸菌(E. coli)又はバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)中で)天然に生じるポリペプチドである。このような融合パートナーの例は、新たなハイドロフォビン融合タンパク質(例えば配列番号26及び配列番号27)を生じる、配列yaad(配列番号24)、yaae(配列番号25)である。別の好ましい融合パートナーは、チオレドキシンである。前記配列の一部のみ(好ましくは70〜99％、特に好ましくは80〜98％)を含むか、又は前記配列と比較して個々のアミノ酸又はヌクレオチドが変更されている、前記配列の断片又は誘導体も極めて有用である。例えば、付加アミノ酸、特に2つの付加アミノ酸(好ましくはアミノ酸Arg、Ser)を、yaad配列及びyaae配列のC末端に結合させることができる。天然配列と比較して、付加アミノ酸(例えばアミノ酸No. 2(Gly))を優先してyaae配列又はyaad配列に挿入することも可能である。
【００４６】
「AFP」は、特定の脊椎動物、植物、真菌及び細菌などの生物の氷点下環境における生存を可能とする、それらの生物由来のタンパク質である不凍タンパク質(AFP)を意味する。AFPは、氷構造タンパク質とも呼ばれる。AFPは小さな氷の結晶に結合し、生物に致命的となり得る氷の成長および再結晶化を阻害する。AFPの共通の特徴は、融点と凝固点間の差である温度ヒステリシスである。AFPを固体の氷と液体の水の間の界面に添加すると、熱力学的に有利な氷の結晶の成長を阻害する。氷の成長は、水が接触可能な氷表面を覆うAFPによって動力学的に阻害される。温度ヒステリシスは、ナノリットル浸透圧計を用いて実験室中で容易に測定される。
【００４７】
異なる生物に由来する、AFPの共通のコンセンサス配列は存在しない(Crit Rev Biotechnol. 2008; 28: 57-82., Properties, potentials, and prospects of antifreeze proteins, Venketesh S1, Dayananda C.; Journal of Experimental Biology 2015; 218: 1846-1855., Animal ice-binding (antifreeze) proteins and glycolipids: an overview with emphasis on physiological function, John G Duman)。
【００４８】
本発明に有用なのは、例えばマクロゾアルセス・アメリカヌス(macrozoarces americanus)などの魚由来のAFP、又はロリウム・ペレネ(lolium perenne)などの植物由来のAFPである。好ましいAFPは昆虫由来のAFPである。2種類の既知のタイプの昆虫AFP、テネブリオ(Tenebrio)AFP及びデンドロイデス(Dendroides)AFP(いずれも異なる昆虫科のAFP)が存在する。これらは互いに類似し、約8.3kD〜12.5kDの、様々な数の12マー反復又は13マー反復から成る。特に好ましい昆虫由来のAFPは、コリストネウラ・フミフェラナ(choristoneura fumiferana)由来のAFPである。
【００４９】
特に好ましいAFPは、以下のポリペプチド配列：
BM 82 (配列番号28)、
BM 80(配列番号29)、
BM 83(配列番号30)
を有するAFPである。
【００５０】
本発明の意味におけるAFPは、複数コピー(すなわち多量体)のAFPが共に融合していること、例えば同一構造(すなわちホモマー)又は異なる構造(すなわちヘテロマー)を有する2つ又は3つのAFPが「スーパーAFP」を形成することも意味し得る。例えば、魚由来のAFPが昆虫由来のAFPと共に融合していてもよく、又は2つの同一の魚AFPが共に融合していてもよい。
【００５１】
さらに、HABPは、「y」並びに、所望の場合は「b」及び/又は「c」に加えて、口腔ケア活性成分であり得るさらなる活性成分「a」又は「d」を含み得る。
【００５２】
「口腔ケア活性成分」は、歯又は口腔に対して、有利な効果、保護的効果、治療的効果(例えばクロロヘキシジン)、又は化粧的効果(例えばデクスパンテノール((+)-(R)-2,4-ジヒドロキシ-N-(3-ヒドロキシプロピル)-3,3-ジメチルブチルアミド)、ビタミンE)を有し得る化合物、特に低分子量化合物を意味する。口腔ケア活性成分は、口腔内で抗菌作用を有する物質(例えばトリクロサン)、又は口内に涼感をもたらす化合物(例えばメントール)、あるいはさらにカフェインのような幾つかの刺激剤も含む。歯美白化合物もまた、本発明の意味における口腔ケア活性成分として使用することができる。
【００５３】
メントールなどの冷却化合物は当業者に公知であり、特許出願US 20150086491 A1に記載されている。冷却化合物の公知例としては、メントール、メントン、N-エチル-p-メンタンカルボキサミド(WS-3、メンタン-3-カルボン酸-N-エチルアミドとしても知られている)、N-2,3-トリメチル-2-イソプロピルブタンアミド(WS-23)、乳酸メンチル(Frescolate(登録商標)ML)、メントングリセリンアセタール(Frescolate(登録商標)MGA)、モノメンチルスクシネート(Physcool(登録商標))、モノメンチルグルタレート、O-メンチルグリセリン、及びメンチル-N,N-ジメチルスクシナメートが挙げられる。
【００５４】
このため本発明によるHABPは、7アミノ酸から数百アミノ酸までの長さのポリペプチドである。全てのHABPは、1個若しくは2個若しくは3個、又は10個までのy配列を有し、また幾つかのスペーサーアミノ酸又は末端アミノ酸のb及びCを有する可能性、並びにハイドロフォビン及び/若しくはAFP並びに/又は口腔ケア活性成分(例えば冷却化合物、抗菌化合物、美白化合物)の群から選択される幾つかの付加的成分を有する可能性もある。1個のy配列のみを有する最も短いHABPは、特異的ハイドロキシアパタイト結合特性及び歯の再石灰化特性を既に有する。付加配列a及び又はdにより(すなわちハイドロフォビン及び/又はAFPタンパク質により)、この再石灰化特性は、エナメル質/象牙質の表面に対するさらなる特性をそれぞれ増強する。
【００５５】
HABPは、公知のペプチド合成法(例えばMerrifieldによる固相合成法)により化学的に製造することができる。この方法は、比較的小さなHABP(例えば7〜18アミノ酸の鎖長を有するペプチド)に特に好ましい。
【００５６】
しかし、特に有用なのは、HABPをコードする核酸配列(特にDNA配列)が、組み合わせられた核酸配列の遺伝子発現が宿主生物中で所望のタンパク質を生成するような方法で組み合わせられる、遺伝子的製造方法である。
【００５７】
ここでの好適な宿主生物(産生生物)は、原核生物(古細菌を含む)又は真核生物、特に細菌類(ハロバクテリウム綱及びメタノコックス綱を含む)、真菌類、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞、特に好ましくは大腸菌(Escherichia coli)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzea)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、シュードモナス種(Pseudomonas spec.)、ラクトバシレン(Lactobacillen)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、トリコデルマ・リーセイ(Torichoderma reesei)、SF9(又は関連細胞)、及びその他の生物であり得る。
【００５８】
本発明はさらに、調節核酸配列の遺伝子制御下で本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物、及びまた前記発現構築物の少なくとも1つを含むベクターに関する。
【００５９】
好ましいのは、特定のコーディング配列の5’上流にプロモーターを、3’下流にターミネーター配列を、また適切であればさらなる慣用の調節エレメントも含む(いずれの場合も前記コーディング配列に機能的に連結されている)、かかる本発明の構築物である。
【００６０】
「機能的連結」は、プロモーター、コーディング配列、ターミネーター及び、適切な場合、さらなる調節エレメントの(それぞれの調節エレメントが、コーディング配列の発現に関して意図される用途によるその機能を満たし得るような方法での)連続的配置を意味する。
【００６１】
機能的に連結され得る配列の例は、標的化配列、及びまたエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。さらなる調節エレメントは、選択可能マーカー、増幅シグナル、複製起点などを含む。好適な調節配列の例は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【００６２】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の天然の調節が実際の構造遺伝子の上流に依然として存在していてもよく、適切な場合、これらの調節配列は、天然の調節がオフにされて上記遺伝子の発現が増加するように遺伝子的に改変されている。
【００６３】
好ましい核酸構築物は、プロモーターに機能的に連結されており、増加させるべき核酸配列の発現を可能とする、既に言及した1つ以上のエンハンサー配列も有利に含む。さらなる有利な配列(例えばさらなる調節エレメント又はターミネーター)が、DNA配列の3'末端に挿入されていてもよい。
【００６４】
本発明の核酸は、構築物中に1つ以上のコピーで存在し得る。構築物は、適切であれば、構築物の選択のため、なおさらなるマーカー(例えば抗生物質耐性又は栄養要求性を相補する遺伝子)を含み得る。
【００６５】
本発明の方法に有利な調節配列の例は、cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)、SP6、ラムダ-PR又はラムダ-Pプロモーターなどのプロモーター中に存在し、これらはグラム陰性細菌中で有利に用いられる。有利な調節配列のさらなる例は、グラム陽性プロモーターamy及びSP02、酵母又は真菌のプロモーターADC1、MFアルファ、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中に存在する。調節用の人工プロモーターを使用することも可能である。
【００６６】
宿主生物中で発現させるため、核酸構築物は、例えば遺伝子が宿主中で最適に発現されることを可能にするプラスミド又はファージなどのベクターに有利に挿入される。プラスミド及びファージだけでなく、「ベクター」は、当業者に公知の任意の他のベクター(すなわち、例えばSV40、CMV、バキュロウイルス及びアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、並びに直鎖又は環状DNA及びまたアグロバクテリウム系)も意味する。
【００６７】
これらのベクターは、宿主生物中で自律的に複製してもよいし、染色体的に複製されてもよい。これらのベクターは、本発明の別の実施形態を構成する。好適なプラスミドの例は、大腸菌のpLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III’’3-B1、tgt11若しくはpBdCl、ストレプトマイセス属(Streptomyces)のpIJ101、pIJ364、pIJ702若しくはpIJ361、バチルス属(Bacillus)のPUB110、pC194若しくはpBD214、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)のpSA77若しくはpAJ667、真菌類のpALS1、pIL2若しくはpBB116、酵母菌の2アルファ、pAG-1、YEp6、YEp13若しくはpEMBLYe23、又は植物のpLGV23、pGHIac+、pBIN19、pAK2004若しくはpDH51である。前記プラスミドは、可能なプラスミドの小選択である。さらなるプラスミドは当業者に周知であり、例えば、Cloning Vectors (Pouwels P.H.ら編 Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)の本に見出し得る。
【００６８】
有利なことに、上記の核酸構築物は、存在する他の遺伝子を発現させる目的のため、選択される宿主生物及び遺伝子に応じた最適な発現について選択される、発現を増加させるための3’及び/又は5’末端調節配列もさらに含む。
【００６９】
これらの調節配列は、遺伝子及びタンパク質発現が特異的に発現されることを可能にすることが意図される。これは、宿主生物に応じて、例えば、遺伝子が誘導後にのみ発現又は過剰発現されることを意味する場合もあれば、直ぐに発現及び/又は過剰発現されることを意味する場合もある。
【００７０】
これに関連して、調節配列又は調節因子は、好ましくは導入遺伝子の遺伝子発現に有益な影響を及ぼし、これにより上記遺伝子発現を増加させることができる。このようにして、調節エレメントは、プロモーター及び/又はエンハンサーなどの強力な転写シグナルを用いることにより、転写レベルで有利に増強させることができる。しかし、それだけではなく、例えばmRNA安定性を高めることによって翻訳を増強することも可能である。
【００７１】
ベクターの別の実施形態において、本発明の核酸構築物又は本発明の核酸を含むベクターも、直鎖DNAの形態で微生物に好都合に導入され、異種組換え又は相同組換えにより宿主生物のゲノムに組み込まれ得る。前記直鎖DNAは、直鎖化ベクター(例えばプラスミド)で構成されていてもよいし、本発明の核酸構築物又は核酸のみで構成されていてもよい。
【００７２】
生物中の異種遺伝子の最適な発現を達成するため、その生物において用いられる特異的コドン使用頻度に従って核酸配列を改変することが有利である。コドン使用頻度は、当該生物の他の既知遺伝子のコンピューター分析に基づいて容易に決定することができる。
【００７３】
本発明の発現カセットは、好適なプロモーターを、好適なコーディングヌクレオチド配列及びターミネーターシグナル又はポリアデニル化シグナルに融合させることにより作製される。この目的のため、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch及びJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、さらにまたT.J. Silhavy, M.L. Berman及びL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)、及びAusubel, F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されているような、よく知られた組換え技術及びクローニング技術が用いられる。
【００７４】
好適な宿主生物における発現のため、組換え核酸構築物又は遺伝子構築物は、遺伝子が宿主中で最適に発現されることを可能にする宿主特異的ベクターに有利に挿入される。ベクターは当業者に周知であり、例えば「Cloning Vectors」(Pouwels P.H.ら, Elsevier編、Amsterdam-New York-Oxford、1985)中に見出だし得る。
【００７５】
本発明のベクターは組換え微生物を作製するために使用することが可能であり、この組換え微生物は、例えば少なくとも1つの本発明のベクターで形質転換され、本発明のポリペプチドの産生に使用され得る。有利には、上記の本発明の組換え構築物は好適な宿主系に導入されて発現される。ここでは、前記核酸を特定の発現系において発現させるため、当業者に公知の一般的なクローニング法及びトランスフェクション法、例えば、共沈殿、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いることが好ましい。好適な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubelら, Wiley Interscience編, New York 1997、又はSambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【００７６】
本発明によれば、相同組み換え微生物を作製することも可能である。この目的のため、本発明の遺伝子又はコーディング配列の少なくとも1つの断片を含むベクターが作製され、このベクターには、適切であれば、本発明の配列を改変する(例えば機能的に破壊する)ために少なくとも1つのアミノ酸欠失、付加又は置換が導入されている(ノックアウトベクター)。導入される配列は、例えば、関連微生物由来の相同体であってもよいし、哺乳動物源、酵母源又は昆虫源に由来するものであってもよい。相同組換えに用いられるベクターは、相同組換え中に内在性遺伝子が変異するか、又は幾つかの他の方法で改変されるが依然として機能的タンパク質をコードするように代替的に設計され得る(例えば、上流調節領域が内在性タンパク質の発現を改変するように改変されていてもよい)。本発明の遺伝子の改変断片は、相同組換えベクター中にある。相同組換えのための好適なベクターの構築は、例えば、Thomas, K.R.及びCapecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503に記載されている。
【００７７】
任意の原核生物又は真核生物は、原理上、本発明の核酸又は核酸構築物のための組換え宿主生物として用いるのに適している。有利に用いられる宿主生物は、細菌、真菌又は酵母などの微生物である。グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌、好ましくはエンテロバクテリアセアエ科(Enterobacteriaceae)、シュードモナダセアエ科(Pseudomonadaceae)、リゾビアセアエ科(Rhizobiaceae)、ストレプトミセタセアエ科(Streptomycetaceae)又はノカルディアセアエ科(Nocardiaceae)の細菌、特に好ましくはエシェリキア属(Escherichia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、ノカルディア属(Nocardia)、ブルクホルデリア属(Burkholderia)、サルモネラ属(Salmonella)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、又はロドコッカス属(Rhodococcus)の細菌が有利に用いられる。
【００７８】
宿主生物に応じて、本発明の方法において使用される生物は、当業者に公知の方法で増殖又は培養される。微生物は、通常、通常は糖の形態の炭素源、通常は有機窒素源の形態の窒素源(例えば酵母抽出物、又は硫酸アンモニウムなどの塩)、微量元素(例えば鉄、マンガン、マグネシウム塩)、さらに適切な場合はビタミンを含む液体培地中で、0〜100℃、好ましくは10〜60℃の温度で、酸素を吸気させながら増殖される。ここで栄養液体のpHは、固定値に維持されていてもよいし、維持されていなくてもよい(すなわち増殖中に調節される)。増殖は、バッチ様、半バッチ様又は連続的に行うことができる。栄養は、発酵の開始時点で最初に導入されてもよいし、後で半連続的又は連続的に供給されてもよい。酵素は、実施例に記載される方法を用いて生物から単離することもできるし、粗抽出物として反応に用いることもできる。
【００７９】
本発明はさらに、本発明のポリペプチド又はそれらの機能的な、生物学的に活性な断片を組換え的に生産する方法に関し、この方法は、ポリペプチド産生微生物を培養するステップ、適切であれば前記ポリペプチドの発現を誘導し、これらを培養液から単離するステップを含む。このようにして、所望の場合はポリペプチドを工業的スケールで生産することもできる。公知の方法により組換え微生物を培養及び発酵することができる。例えば、TB培地又はLB培地中で、20〜40℃の温度及びpH6〜9で、細菌を増殖させることができる。好適な培養条件は、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch及びJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に詳細に記載されている。
【００８０】
ポリペプチドが培養培地中に分泌されない場合、細胞はその後破壊され、生産物はタンパク質を単離する公知の方法により溶解物から単離される。細胞は、場合によって、高周波超音波により、高圧により(例えばフレンチプレッシャーセル中で)、オスモリシスにより、界面活性剤、溶菌酵素又は有機溶媒の作用により、ホモジナイザーを用いることにより、あるいは上記に挙げた方法の幾つかの組み合わせによって破壊することもできる。
【００８１】
ポリペプチドは、Q-セファロースクロマトグラフィーなどの分子篩クロマトグラフィー(ゲル濾過)、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーなどの公知のクロマトグラフィー法を用いて、さらにまた限外濾過法、結晶化法、塩析法、透析法及びネイティブゲル電気泳動法などの他の慣用の方法を用いて精製することができる。好適な方法は、例えば、Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [元の標題：The tools of biochemistry], Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York、又はScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【００８２】
本発明の別の実施形態は、式I：
a0-1-b0-10-y1-10-c0-10-d0-1 (I)
(式中、
a、dは、互いに独立して、ハイドロフォビン若しくは不凍タンパク質配列又は口腔ケア活性成分を表し
b、cは、互いに独立して、アミノ酸を表し、
yは、配列番号1から配列番号61までに示されるポリペプチド配列を表す)
による新規なHABPである。
【００８３】
好ましいHABPは、yが配列番号1、2、3、4を表すようなHABPである。
【００８４】
配列番号1 IDDYTRA
配列番号2 HPPLHHA
配列番号3 SPSTHWK
配列番号4 GSPATAA
配列番号5 GKVQAQS
配列番号6 YPVTPSI
配列番号7 IPTLPSS
配列番号8 YQGASEN
配列番号9 EHITTSN
配列番号10 RILITIP
配列番号11 IPITNLR
配列番号12 TTSTRHI
配列番号13 NERALTL
配列番号14 MQTVEVT
配列番号15 SWGTQTD
配列番号16 TLPASSV。
【００８５】
一部の実施形態において、HABPは、組成物中に、組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する。一部の実施形態において、HABPは、組成物中に、組成物の総重量の0.1重量％〜3重量％、又は0.1重量％〜2重量％、又は0.1重量％〜1重量％の量で存在する。他の実施形態において、HABPは、組成物中に、組成物の総重量の0.05重量％〜1重量％、又は0.1重量％〜0.5重量％の量で存在する。さらなる実施形態において、HABPは、組成物中に、組成物の総重量の0.5重量％〜3重量％、又は0.5重量％〜2重量％、又は0.5重量％〜1重量％の量で存在する。なおさらなる実施形態において、HABPは、組成物中に、組成物の総重量の1重量％〜3重量％、又は1重量％〜2重量％の量で存在する。
【００８６】
口腔ケア活性成分は、「HBAPペプチド-口腔ケア活性成分-ハイブリッド分子」の形態で、上記のHBAPペプチドと結合させることができる。好ましくは、「HBAPペプチド-冷却化合物ハイブリッド分子」が形成される。当業者は、HBAPペプチドへの口腔ケア活性成分(例えば冷却化合物)の結合方法について熟知している。個々の方法の適合性は、口腔ケア活性成分(好ましくは冷却化合物)上の官能基の利用可能性によって決まる。HBAPペプチド上の活性基としては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、及びチオール基が挙げられる。好ましいのは、HBAPペプチドの末端アミノ基又は末端カルボキシル基を介した結合である。
【００８７】
一実施形態において、口腔ケア活性成分(好ましくは冷却化合物)は、HBAPペプチドに直接結合される。
【００８８】
一実施形態において、口腔ケア活性成分(好ましくは冷却化合物)は、二官能性リンカー/架橋剤/スペーサーを介してHBAPペプチドに結合する。様々な分子が入手可能であり、当業者であれば、最も好適な分子を選択することができる。
【００８９】
架橋剤は、ホモ二官能性架橋剤及びヘテロ二官能性架橋剤から選択することができる。ホモ二官能性架橋剤は2つの同一反応基を有する架橋剤であり、多くの場合、タンパク質/ペプチド/口腔ケア活性成分を互いに架橋する一段階反応工程において用いられる。
【００９０】
本発明によるヘテロ二官能性架橋剤は、連続(2段階)コンジュゲーションを可能とする2つの異なる反応基を有し、望ましくない重合又は自己コンジュゲーションを最小限に抑えるのに役立つ。可能性のある部分、例えばアミン、スルフヒドリル、カルボキシル、フェノール及び糖は、反応の標的であり得る。この2段階戦略は、異なる接触可能基を有する分子の修飾を可能にする。好適な架橋剤の非限定的な例として、一端はアミン反応性であり、他端はスルフヒドリル反応性である架橋剤が挙げられる。連続工程において、最初に、ヘテロ二官能性試薬を、例えば架橋剤の最も反応性の高い基を用いて一つの反応パートナーと反応させることができる。過剰の未反応の架橋剤を除去した後、修飾された第1の反応パートナーを、第2の反応パートナーを含む溶液に添加することが可能であり、ここで架橋剤の第2の反応基を通じた反応が生じ得る。
【００９１】
好適なヘテロ二官能性架橋剤としては、一端にアミン反応性スクシンイミジルエステル(例えば、NHS-エステル)を有し、他端にスルフヒドリル反応基を有するものが挙げられる。スルフヒドリル反応基は、通常、マレイミド、ピリジルジスルフィド及びα-ハロアセチルである。NHS-エステル反応性は水溶液中で安定性が低い場合があり、このため最初に連続架橋工程で反応させることができる。NHS-エステルは、アミンと反応してアミド結合を形成し得る。
【００９２】
カルボジイミドは、ゼロ長さの架橋剤(例えばEDC)であり、カルボキシレート(-COOH)と第一級アミン(-NH2)間の直接結合に影響を及ぼし得る。他の好適なヘテロ二官能性試薬は、熱反応性ではなく光反応性の1つの反応基を有し得る。この反応性は、最初に熱反応性基の特異的付着を可能とし；その後、UV光を用いた活性化により、光反応性基を通じて任意の隣接するN-H部位又はC-H部位へのコンジュゲーションを開始することができる。光化学的試薬の反応性は、基特異的試薬によっては可能ではない場合があるコンジュゲートの形成を可能とし得る。SFAD(スルホスクシンイミジル(ペルフルオロアジドベンズアミド＝エチル-1,3’-ジチオプロピオネート)は、約70％の挿入効率を有するペルフルオロフェニルアジドを含有する光活性化可能な試薬の一例である。
【００９３】
さらなる好適なリンカー/スペーサー/架橋剤は、商業的に入手可能である(例えば、ウェブサイト「www.thermo.com/pierce」上では架橋剤選択ガイドが関連のパラメータと共に挙げられ、「Crosslinking Technical Handbook」が掲載されている)。非限定的な例として、反応性架橋基及びそれらの官能基標的、並びに/又はアミン/カルボキシル、アミン/スルフヒドリル、スルホ-SMCCアミン/スルフヒドリル、MBSアミン/スルフヒドリル、スルホ-MBSアミン/スルフヒドリル、SMPBアミン/スルフヒドリル、スルホ-SMPBアミン/スルフヒドリル、GMBSアミン/スルフヒドリル、及びスルホ-GMBSアミン/スルフヒドリルが挙げられる。当業者は、好適な化合物及び対応する結合反応の選択について熟知している。
【００９４】
好適な架橋剤としては、例えばポリ(エチレングリコール)(PEG)が挙げられるが、これはPEGが一般的には不活性であり、目的のペプチド及び活性分子間に親水性スペーサーを与えることが知られているからである。リンカーのスペーサー鎖の長さは、ペプチド又はリンカーの遠位端に付着している他の分子の大きさに応じて異なり得る。しかし、1〜20エチレングリコール単位の長さが好ましい。
【００９５】
好適なリンカー/スペーサー/架橋剤としては、例えば、ジカルボン酸(例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライク酸、セバシン酸、デカン二酸、ブラッシル酸、タプシン酸)、並びにジアミン(例えばエチレンジアミン及び関連誘導体、例えばN-アルキル化化合物、1,1-ジメチルエチレンジアミン、1,1-ジメチルエチレンジアミン、エタムブトール及びTMEDA；1,3-ジアミノプロパン；プトレシン(ブタン-1,4-ジアミン)；カダベリン(ペンタン-1,5-ジアミン)；ヘキサメチレンジアミン；フェニレンジアミン；2,5-ジアミノトルエン；ジメチル-4-フェニレンジアミン、N,N'-ジ-2-ブチル-1,4-フェニレンジアミン；4,4'-ジアミノビフェニル；1,8-ジアミノナフタレン)が挙げられる。
【００９６】
上記の架橋剤を介してペプチドに結合される冷却化合物としては、例えば、限定するものではないが、メントール及びメントール誘導体(例えばL-メントール、D-メントール、ラセミのメントール、イソメントール、ネオイソメントール、ネオメントール)、メントン、メントングリセリンアセタール(Frescolate(登録商標)MGA)、モノメンチルスクシネート(Physcool(登録商標))、モノメンチルグルタレート、O-メンチルグリセリン、又はメンチル-N,N-ジメチルスクシナメート)、メンチルエーテル(例えば(1-メントキシ)-1,2-プロパンジオール、(1-メントキシ)-2-メチル-1,2-プロパンジオール、1-メンチル-メチルエーテル)、メンチルエステル(例えばメンチルホルミエート、メンチルアセテート、メンチルイソブチレート、メンチルラクテート、L-メンチル-L-ラクテート、L-メンチル-D-ラクテート、メンチル-(2-メトキシ)アセテート、メンチル-(2-メトキシエトキシ)アセテート、メンチルピログルタメート)、メンチルカーボネート(例えばメンチルプロピレングリコールカーボネート、メンチルエチレングリコールカーボネート、メンチルグリセリンカーボネート又はそれらの混合物)、メントールとジカルボン酸又はそれらの誘導体とのセミエステル(例えばモノメンチルスクシネート、モノメンチルグルタレート、モノメンチルマロネート、O-メンチルコハク酸エステル-N,N-(ジメチル)アミド、O-メンチルコハク酸エステルアミド)、メンタンカルボン酸アミド(例えばメンタンカルボン酸-N-エチルアミド[WS3]、Nα-(メンタン-カルボニル)グリシンエチルエステル[WS5]、メンタンカルボン酸-N-(4-シアノフェニル)アミド、メンタンカルボン酸-N-(アルコキシアルキル)アミド)、メントン及びメントン誘導体(例えばL-メントングリセリンケタール)、2,3-ジメチル-2-(2-プロピル)-ブタン酸誘導体(例えば2,3-ジメチル-2-(2-プロピル)-ブタン酸-N-メチルアミド[WS23])、イソプレゴール又はそのエステル(1-(-)-イソプレゴール、I-)-イソプレゴールアセテート)、メンタン誘導体(例えばp-メンタン-3,8-ジオール)、クベボール又はクベボールを含有する合成又は天然混合物、シクロアルキルジオン誘導体のピロリドン誘導体(例えば、3-メチル-2(1-ピロリジニル)-2-シクロペンテン-1-オン)又はテトラヒドロピリミジン-2-オン(例えばイシリン又は関連化合物、例えばWO 2004/026840に記載されているもの)が挙げられる。さらなる例はUS 20150086491 A1中に開示され得、本明細書における好適な冷却化合物とみなされる。好ましいのは、メントール及びメントール誘導体、例えば5-メチル-2-(プロパン-2-イル)シクロヘキサン-1-カルボン酸である。
【００９７】
本発明の別の実施形態は、エナメル質及び/若しくは象牙質の表面に結合させるか又はそれらを標的化する方法であって：
a. HABP；
b. 経口的に許容可能な担体
を含む口腔ケア組成物を歯に適用するステップを含み、ここでHABPは、上記組成物中に、組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する、上記方法である。
【００９８】
本発明の別の実施形態は、歯牙侵食を修復又は阻止する方法であって：
a. HABP；
b. 経口的に許容可能な担体
口腔ケア組成物を歯に適用するステップを含み、ここでHABPは、上記組成物中に、組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する、上記方法である。
【００９９】
一実施形態において、「HBAPペプチド-口腔ケア活性成分-ハイブリッド分子」のエナメル質の表面への結合は、本来、非共有結合である。好ましくは、冷却化合物は、HABPを介してエナメル質に非共有結合している。その結果、冷却化合物は、エナメル質表面から、機械的な力及び/若しくは酵素的切断並びに/又は自然な減少によって経時的に放出され得る。徐放形態の冷却化合物は、HABPに結合していない冷却化合物と比較した場合に異なる動態により、長続きする冷却効果をもたらし得る。
【０１００】
本発明の別の実施形態は、歯の再石灰化を促進し、及び/又はフッ化物の虫歯予防効果を増強する方法であって：
a. HABP；
b. 経口的に許容可能な担体
を含む口腔ケア組成物を歯に適用するステップを含み、ここでHABPは、上記組成物中に、組成物の総重量の0.01重量％〜3重量％の量で存在する、上記方法である。
【０１０１】
本明細書中で使用される「経口的に許容可能な担体」との表現は、意図される量及び濃度における経口用途に安全且つ許容可能な物質(例えば従来の練り歯磨き及びマウスウォッシュ中に見られるような物質)から作製される担体を示す。このような物質としては、水、又は湿潤剤(例えばグリセリン、ソルビトール、キシリトールなど)を含有し得る他の溶媒が挙げられる。一部の態様において、「経口的に許容可能な担体」という用語は、加水分解された植物タンパク質及びフッ化物を除く、口腔ケア組成物の全ての成分を包含する。他の態様において、この用語は、加水分解された植物タンパク質、及び/又は任意の他の機能的成分を口腔に送達する役割を果たす不活性な(inert又はinactive)成分を指す。
【０１０２】
本発明において使用するための経口的に許容可能な担体としては、例えば、マウスリンス又はマウスウォッシュ、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉、ロゼンジ、ガム、ビーズ、可食ストリップ、タブレットなどの作製において用いられる従来の及び公知の担体が挙げられる。担体は、相互の及び組成物の他の成分との適合性について選択されなければならない。
【０１０３】
以下の非限定的な例が提供される。練り歯磨き組成物において、担体は、典型的には、組成物の重量で主要分画を占める水/湿潤剤系である。あるいは、練り歯磨き組成物の担体成分は、水、1種以上の湿潤剤、及び加水分解されたコムギタンパク質又は加水分解されたコメタンパク質以外の他の機能的成分を含み得る。マウスリンス製剤又はマウスウォッシュ製剤において、担体は、典型的には、加水分解されたコムギタンパク質又は加水分解されたコメタンパク質が溶解又は分散している水/アルコール液体混合物である。溶解可能なロゼンジにおいて、担体は、典型的には口腔内でゆっくりと溶解する固体マトリックス物質を含む。チューインガムにおいて、担体は、典型的にはガムベースを含むが、可食ストリップにおいては、担体は、典型的には1種以上のフィルム形成ポリマーを含む。
【０１０４】
本明細書において提供される口腔ケア組成物は、研磨剤、pH改変剤、界面活性剤、発泡調整剤、増粘剤、粘度改質剤、湿潤剤、抗歯石剤又は歯石抑制剤、甘味料、香味料、着色料及び保存料から選択される1種以上の付加的成分をさらに含み得る。これらの成分もまた、担体物質と考えることができる。非限定的な例は以下に提供される。
【０１０５】
一実施形態において、本発明の組成物は、例えば、光沢剤として有用な少なくとも1種の研磨剤を含む。任意の経口的に許容可能な研磨剤を使用することができるが、研磨剤の種類、粉末度(粒径)及び量は、組成物の通常の使用中に歯のエナメル質が過剰に摩耗されないように選択されなければならない。好適な研磨剤としては、限定するものではないが、シリカ(例えばシリカゲルの形態)、水和シリカ又は沈降シリカ、アルミナ、不溶性リン酸塩、炭酸カルシウム、樹脂性研磨剤(例えば尿素-ホルムアルデヒド縮合生成物)などが挙げられる。不溶性リン酸塩の中でも、研磨剤として有用なのは、オルトリン酸塩、ポリメタリン酸塩及びピロリン酸塩である。例示的な例は、オルトリン酸二カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、ピロリン酸[ベータ]-カルシウム、リン酸三カルシウム、ポリメタリン酸カルシウム及び不溶性ポリメタリン酸ナトリウムである。1種以上の研磨剤が、本発明の口腔ケア組成物中に、組成物の総重量の1重量％〜5重量％の量で、任意選択で存在する。研磨剤の平均粒径は、存在する場合、一般的には0.1〜30μm、好ましくは5〜15μmである。
【０１０６】
さらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、例えば、発泡及び炭酸ガスの放出により歯及び歯肉に「清浄感」を与えるために有用な少なくとも1種の重炭酸塩の塩を含む。任意の経口的に許容可能な重炭酸塩を使用することが可能であり、例えば、限定するものではないが、アルカリ金属重炭酸塩、例えば重炭酸ナトリウム及び重炭酸カリウム、重炭酸アンモニウムなどが挙げられる。1種以上の重炭酸塩の塩が、組成物の1重量％〜10重量％の総量で、任意選択で存在する。
【０１０７】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、少なくとも1種のpH改変剤を含む。このような薬剤としては、例えば、pHを低下させる酸性化剤、pHを上昇させる塩基性化剤及びpHを所望の範囲内に制御するバッファー剤が挙げられる。例えば、pH2〜10、又は様々な例示的実施形態においてはpH2〜8、3〜9、4〜8、5〜7、6〜10、又は7〜9を与えるために、酸性化剤、塩基性化剤及びバッファー剤から選択される1種以上の化合物を包含することができる。任意の経口的に許容可能なpH改変剤を使用することが可能であり、例えば、限定するものではないが、カルボン酸、リン酸及びスルホン酸、酸塩(例えば、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、リンゴ酸一ナトリウム)、アルカリ金属水酸化物(例えば水酸化ナトリウム)、炭酸塩(例えば炭酸ナトリウム)、重炭酸塩、ホウ酸塩、ケイ酸塩、リン酸塩(例えば、リン酸一ナトリウム、リン酸三ナトリウム、ピロリン酸塩の塩)、イミダゾールなどが挙げられる。1種以上のpH改変剤が、経口的に許容可能なpH範囲内に組成物を維持するために有効な総量で、任意選択で存在する。
【０１０８】
なおさらなる実施形態において、本発明の組成物は、例えば、本組成物及びその中に含有される成分に高められた安定性を提供し、洗浄作用を通して歯の表面の清浄を助け、撹拌の際に(例えば、本発明の歯磨剤組成物を用いたブラッシング中に)泡を提供するために有用な少なくとも1種の界面活性剤を含む。任意の経口的に許容可能な界面活性剤、例えばアニオン性の界面活性剤、非イオン性の界面活性剤又は両性の界面活性剤などを使用することができる。好適なアニオン性界面活性剤としては、例えば、限定するものではないが、C8-20硫酸アルキルの水溶性塩、C8-20脂肪酸のスルホン化モノグリセリド、サルコシン酸塩、タウリン酸塩などが挙げられる。好適な非イオン性界面活性剤としては、例えば、限定するものではないが、ポロキサマー、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、脂肪アルコールエトキシレート、アルキルフェノールエトキシレート、第三級アミン、酸化物、第三級ホスフィンオキシド、ジアルキルスルホキシドなどが挙げられる。好適な両性界面活性剤は、限定するものではないが、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート又はホスホネートなどのアニオン性基を有するC8-20脂肪族第二級及び第三級アミンの誘導体である。好適な例は、ココアミドプロピルベタインである。1種以上の界面活性剤が、組成物の総重量の0.01重量％〜10重量％、例えば、0.05重量％〜5重量％、又は0.1重量％〜2重量％の総量で、任意選択で存在する。
【０１０９】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、例えば、撹拌の際に組成物により生成される泡の量、厚さ又は安定性を増加させるために有用な少なくとも1種の発泡調整剤を含む。任意の経口的に許容可能な発泡調整剤、例えば、限定するものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)などを使用することができる。1種以上のPEGが、組成物の総重量の0.1重量％〜10重量の総量で、任意選択で存在する。
【０１１０】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、例えば、組成物に所望の稠度及び/又は口当たりを与えるために有用な少なくとも1種の増粘剤を含む。任意の経口的に許容可能な増粘剤、例えば、限定するものではないが、カルボマー(カルボキシビニルポリマー)、カラギーナン、セルロース性ポリマー(例えばヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース(CMC)及びそれらの塩)、天然ガム(例えばカラヤガム、キサンタンガム、アラビアガム及びトラガカント)、コロイド性ケイ酸マグネシウムアルミニウム、コロイド性シリカなどを使用することができる。1種以上の増粘剤が、組成物の総重量の0.01重量％〜15重量％の総量で、任意選択で存在する。
【０１１１】
なおさらなる実施形態において、本発明の組成物は、例えば、成分の沈降又は分離を阻害するため、又は液体組成物の撹拌の際の成分の再分散を促進するために有用な少なくとも1種の粘度改質剤を含む。任意の経口的に許容可能な粘度改質剤、例えば、限定するものではないが、鉱油、ワセリン、クレイ、シリカなどを使用することができる。1種以上の粘度改質剤が、組成物の総重量の0.01重量％〜10重量％の総量で、任意選択で存在する。
【０１１２】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、空気に曝露された際の練り歯磨きの硬化を防止するために使用し得る少なくとも1種の湿潤剤を含む。任意の経口的に許容可能な湿潤剤、例えば、限定するものではないが、多価アルコール(例えばグリセリン)、ソルビトール、キシリトール又は低分子量PEGなどを使用することができる。ほとんどの湿潤剤は、甘味料としても機能する。1種以上の湿潤剤が、組成物の総重量の1重量％〜50重量％の総量で、任意選択で存在する。
【０１１３】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、組成物の味を高める少なくとも1種の甘味料を含む。任意の経口的に許容可能な天然甘味料又は人工甘味料、例えば、限定するものではないが、デキストロース、スクロース、マルトース、デキストリン、マンノース、キシロース、リボース、フルクトース、レブロース、ガラクトース、コーンシロップ、部分的に加水分解されたデンプン、水素化デンプン加水分解物、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、イソマルト、アスパルテーム、ネオテーム、サッカリン及びそれらの塩、ジペプチドベースの強甘味料、シクラメートなどを使用することができる。1種以上の甘味料が、組成物の総重量の0.005重量％〜5重量％の総量で、任意選択で存在する。
【０１１４】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、組成物の味を高める少なくとも1種の香味料を含む。任意の経口的に許容可能な天然香味料又は合成香味料、例えば、限定するものではないが、バニリン、セージ、マジョラム、パセリ油、スペアミント油、シナモン油、ウインターグリーン油(メチルサリシレート)、ペパーミント油、クローブ油、ベイ油、アニス油、ユーカリ油、柑橘油、果実油及び精油などを使用することができる。香味料の範囲内には、口内に香り及び/又は他の感覚作用(例えば冷却作用又は加温作用など)を提供する成分も包含される。このような成分としては、例示的に、メントール、メンチルアセテート、メンチルラクテート、ショウノウ、ユーカリ油、ユーカリプトール、オイゲノール、カッシア、オキサノン、α-イリソン、チモール、リナロール、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、N-エチル-p-メンタン-3-カルボキサミン、N,2,3-トリメチル-2-イソプロピルブタンアミド、3-(1-メントキシ)-プロパン-1,2-ジオール、シンナムアルデヒドグリセロールアセタール(CGA)、メントングリセロールアセタール(MGA)などが挙げられる。1種以上の香味料が、組成物の総重量の0.01重量％〜5重量％の総量で、任意選択で存在する。
【０１１５】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、少なくとも1種の着色料を含む。着色料は、多くの機能を果たし得る。これらの機能としては、例えば、歯の表面に白又明色のコーティングを提供すること、歯の表面上の組成物が有効に接触した位置を示すこと、及び/又は消費者に対する魅力を高めるために組成物の外観を改変することが挙げられる。任意の経口的に許容可能な着色料、例えば、限定するものではないが、タルク、マイカ、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、シリカ、二酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄、第二鉄アンモニウムフェロシアン化物、マンガンバイオレット、チタン化マイカ、オキシ塩化ビスマスなどを使用することができる。1種以上の着色料が、組成物の総重量の0.001重量％〜20重量％の総量で、任意選択で存在する。
【０１１６】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は保存料を含む。保存料は、パラベン、ソルビン酸カリウム、ベンジルアルコール、フェノキシエタノール、ポリアミノプロピルビグアニド、カプリル酸、安息香酸ナトリウム及び塩化セチルピリジニウムから選択することができる。一部の実施形態において、保存料は、組成物の総重量の約0.001〜約1重量％の濃度で存在する。
【０１１７】
なおさらなる実施形態において、本発明の口腔ケア組成物は、ガムベース、香味料、甘味料及びHABPを含むチューインガムである。ガムベースは約4.8％〜約90％、香味料は約0.1％〜約10％、甘味料は約0.1％〜約95％、HABPは約0.01％〜約0.5％存在する。
【０１１８】
以下の実施例は、本発明の組成物及びそれらの使用を説明する。例示される組成物は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１１９】
実施例1 - 結合アッセイ
i. ペプチド/タンパク質標識
結合研究のため、5(6)-カルボキシフルオレセインを、対応するスクシンイミジルエステル(Invitrogen、ダルムシュタット、ドイツ)を用いることにより、本ペプチド/タンパク質のN末端にコンジュゲートした。製造プロトコルに従って標識化反応を実施した(Invitrogen、ダルムシュタット、ドイツ)。コンジュゲーション後、標識ペプチド/タンパク質を、5kDaより大きなタンパク質についてはPD-10脱塩カラムを、若しくは比較的小さなタンパク質についてはPD MidiTrap G-10のいずれかを用いて(GE Healthcare、バッキンガムシャー、イギリス)、又はペプチドについてはRP18カラム上のHPLCにより精製した。
【０１２０】
ii. ペプチド/タンパク質結合
結合実験のため、N末端標識ペプチド/タンパク質を、2μMの最終濃度で使用した。結合は、HBS-Tバッファー(150mM NaCl、50mM HEPES(pH7.5)、0.1％ Tween20)中で実施した。ペプチド/タンパク質を、10mgハイドロキシアパタイト粉末(Fluka)に37℃で2時間曝露した。HBS-Tバッファーによる5回の洗浄ステップ後、結合したペプチド/タンパク質を、適切なフィルター(励起475/50；発光525/50)を備えた蛍光顕微鏡により可視化した。結合を定量化するため、結合前の溶液の蛍光強度(Fi)及び結合後の溶液の蛍光強度(Ff)を、Fluostar Galaxy (BMG、オルテンベルク、ドイツ)を用いて測定し、結合したペプチド/タンパク質の量を推定した(cbound=[1-(Ff/Fi)]xc0)。ハイドロキシアパタイトに対する非結合ペプチドとして記載されたペプチドLIKHILHRLを、陰性対照として使用した[Yarbrough DK, Hagerman E, Eckert R, He J, Choi H, Cao Nら Specific binding and mineralization of calcified surfaces by small peptides. Calcif Tissue Int 2010;86(1):58-66.]。全ての結合実験は3複製で実施した。
【０１２１】
評価：+：HAP上に30〜50％結合したペプチド；++：HAP上に50〜100％結合したペプチド
配列番号1 IDDYTRA ++
配列番号2 HPPLHHA +
配列番号3 SPSTHWK +
配列番号4 GSPATAA +
配列番号5 GKVQAQS +
配列番号6 YPVTPSI +
配列番号7 IPTLPSS ++
配列番号8 YQGASEN ++
配列番号9 EHITTSN +
配列番号10 RILITIP +
配列番号11 IPITNLR +
配列番号12 TTSTRHI +
配列番号13 NERALTL +
配列番号14 MQTVEVT +
配列番号15 SWGTQTD +
配列番号16 TLPASSV ++
配列番号17 AFP4-His6 +(35％)
配列番号18 IPTLPSS-GGG-AFP4-His6 ++(60％)
【０１２２】
実施例2 - ハイドロキシアパタイト核形成アッセイ
非標識ペプチド/タンパク質の抗侵食/HAP-核形成能を決定するため、Ca2+濃度の低下を測定した。人工唾液中で核形成を実施した[Panich M, Poolthong S. The effect of casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate and a cola soft drink on in vitro enamel hardness. J Am Dent Assoc 2009; 140:455-60.]。手短に言えば、46.2mM K2HPO4、26.8mM KH2PO4の1つの10xストック溶液、及び87.2mM KCl、6.1mM MgCl2、14.9 mM CaCl2の第2の10xストック溶液を調製した。核形成実験のため、8.7mM KCl、0.6mM MgCl2、1.5mM CaCl2、4.6mM K2HPO4、2.7mM KH2PO4及び25μMペプチド/タンパク質を含む人工唾液を、1mLの最終体積で調製した。陰性対照として、ペプチド/タンパク質を全く含まない核形成溶液のみを使用した。使用の前に全溶液を濾過(0.2μm)し、小粒子に起因する未制御の核形成を回避した。定期的に、30μLのサンプルを毎時間(合計5時間)採取し、2分間、13000rpmで遠心分離し、上清のカルシウム濃度を決定した。カルシウム検出のため、30μMのo-クレゾールフタレイン、2.7mMの8-ヒドロキシキノリン、20mMの2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール(pH10.5)及び20μLのサンプルを混合し、Spectramax(Molecular Devices, ビーベラッハ、ドイツ)を用いて575nmで吸光度をモニターした。全ての核形成実験は、37℃において3複製で実施した。非標識ペプチド(配列番号1〜16)の添加は、核形成の1.3〜2倍の増加をもたらした。
【０１２３】
実施例3 - HABPペプチド-冷却化合物ハイブリッド分子
配列番号1〜16によるペプチドは、架橋剤として、例えばオキサレート(式A)、グルタレート(式B)、又はスクシネート(式C)：
【０１２４】
【化１】
2018536644.tif 000002
2018536644.tif 000003
を使用することにより、冷却化合物に結合させることができる。
【０１２５】
実施例4 -HABPペプチド-メントールハイブリッド分子
配列番号6、7、8及び16による樹脂結合HBAPペプチドのN末端における5-メチル-2-(プロパン-2-イル)シクロヘキサン-1-カルボン酸の結合を実施し、式D：
【０１２６】
【化２】
2018536644.tif 000004
による分子を形成した。
【０１２７】
実施例5 - リン酸カルシウムディスクからのHABPペプチド-メントールハイブリッド分子の放出
実施例4のハイブリッド分子(Trisバッファー(pH8)中5μM)を、リン酸カルシウムディスク(Himed製のHA-ディスク)と共に37℃で1時間インキュベートした。Trisバッファーで3回洗浄することにより、未結合分子を除去した。
【０１２８】
コーティングしたリン酸カルシウムディスクを、対照としてのバッファーと共にインキュベートし、平行して、プールしたヒト唾液と共にインキュベートした(5人の供与者；37℃、2時間)。上清を遠心分離し、ヒト冷感受容体TRPM8の特異的活性化による冷却活性について評価した。
【０１２９】
実施例6 - リン酸カルシウムディスク(HA-ディスク)由来のHABPペプチド-メントールハイブリッド分子のインキュベーション
実施例4のHABPペプチド-冷却化合物-ハイブリッド分子(Trisバッファー(pH8)中1μM)をプールしたヒト唾液(5人の供与者)と共に1：1でインキュベートし、又は参照としてTrisバッファー(pH8)中1：1でインキュベートした；37℃、37℃で2時間。サンプルを、ヒトTRPM8受容体の活性化についての細胞ベースのアッセイにおける評価まで凍結させた。
【０１３０】
実施例7 - TRPM8活性化についてのアッセイ
Behrendt H. J.ら, Br. J. Pharmacol. 141, 2004, 737-745による文献において先に記載された試験と同等の試験を実施した(US 20150086491 A1も参照)。Ca2+-感受性色素(例えばFURA、Fluo-4、等)を用いて、受容体のアゴニゼーション又はアンタゴニゼーションを定量した。アゴニストは、それら自体でCa2+シグナルの増加をもたらし；例えばメントールの存在下のアンタゴニストは、Ca2+シグナルの低下をもたらす(いずれの場合も、Ca2+が他の蛍光特性を有するためFluo-4色素を用いて検出される)。
【０１３１】
最初に、それ自体公知の方法で、細胞培養フラスコ中で形質転換されたHEK細胞の新たな培養液を調製した。上記の細胞培養フラスコから、トリプシンを用いてHEK293-TRPM8試験細胞を取り出し、40,000細胞/ウェルを100μl培地と共に96ウェルプレート(Greiner #655948、ポリ-D-リシンコーティングされたプレート)に播種した。TRPM8受容体を誘導するため、成長培地(DMEM/HG、テトラサイクリン非含有10％FCS、4mM L-グルタミン、15μg/mlブラスチシジン、100μg/mlハイグロマイシンB、1μg/mlテトラサイクリン)にテトラサイクリンを混合した。その翌日、細胞にFluo-4色素を充填し(非蛍光アセトキシメチルエステルFluo-4 AM；2,2'-((2-(2-(2-(ビス(カルボキシメチル)アミノ)-5-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンタン-9-イル)フェノキシ)エトキシ)-4-メチルフェニル)アザンジイル)二酢酸)、試験を実施した。手順は以下のとおりであった：
100μlの培地(DMEM/HG、テトラサイクリン非含有10％FCS、4mM L-グルタミン、15μg/mlブラスチシジン、100μg/mlハイグロマイシンB、1μg/mlテトラサイクリン)当たり100μl/ウェルの色素溶液Ca-4キット(RB 141、Molecular Devices)の添加。
30分間/37℃/5％CO2、30分間/20℃の、インキュベーターにおけるインキュベーション。
試験サンプル = リン酸カルシウムディスク又はペプチド-活性成分-ハイブリッド + 唾液のインキュベーション(3複製)(異なる希釈のサンプル：200μl HBSSバッファー中1μl／5μl／10μl)の上清、並びに陽性対照(200μl HBSSバッファー中異なる濃度のメントール又はイシリン又はイオノマイシン)及び陰性対照(200μlのHBSSバッファーのみ)の調製。
【０１３２】
50μl/ウェルの量の試験サンプルの添加、及び485nm励起、520nm発光の蛍光変化の測定(例えばFLIPRアッセイデバイス中、Molecular Devices又はNovoStar、BMG)、並びに様々な物質／濃度の有効強度の評価、及びEC50値の決定。
【０１３３】
【表１】
2018536644.tif 000005
【０１３４】
上記の評価は、参照分子であるメントールが、(唾液と共にインキュベーションする前及び後に)ヒト冷感受容体TRPM8に対して生物活性を有するが、ハイドロキシアパタイト上には全く結合しないことを示した。メントールのペプチド修飾は特性の変化をもたらした：ハイブリッド分子はハイドロキシアパタイト上に結合し、ヒト唾液と共にインキュベーションされた後、冷却活性成分として放出された。
【０１３５】
本発明の特定の実施形態が例示及び記載されているが、当業者には、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更及び改変を行い得ることが明らかであろう。
【配列表】
2018536644000001.app
【国際調査報告】
2018536644.tif 000006
2018536644.tif 000007
2018536644.tif 000008
2018536644.tif 000009