(57)【要約】  本発明は、低酸素状態の際に周皮細胞で発現されることが同定された、新規な非コードディングRNA（lncRNA）を提供する。本発明のlncRNAは、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）ベータの発現、周皮細胞増殖及び周皮細胞の内皮細胞への動員に良い影響を与える。本発明は、PDGFR発現によって媒介される疾患の治療に使用されるlncRNAの阻害剤を提供する。例えば、本発明は、本発明のlncRNAを標的とするアンチセンスアプローチを説明する。さらに、本発明は、イマチニブ又は他のチロシンキナーゼ阻害剤等の治療用PDGFR阻害剤の増幅因子としてlncRNA阻害剤を提供する。lncRNA阻害剤、並びにlncRNA発現及び／又は機能の調節因子をスクリーニングする方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患の治療に使用される、TYKRIL、MIR210HG、RP11-367F23.1、H19、RP11-44N21.1、AC006273.7、RP11-120D5.1、AP001046.5、RP11-443B7.1、AC005082.12、RP11-65J21.3、又はAC008746.12から選択される長鎖非コーディングRNA（lncRNA）の阻害剤。
【請求項２】
前記lncRNAがTYKRILであり、配列番号1に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む、請求項1に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記阻害剤が、アンチセンスRNA、RNA干渉（RNAi）、siRNA、esiRNA、shRNA、miRNA、デコイ、RNAアプタマー、GapmeR、LNA分子によって代表されるlncRNAアンチセンス分子、又はアンチセンス発現分子、又は低分子阻害剤、RNA／DNA結合タンパク質／ペプチド、又は抗lncRNA抗体である、請求項1又は2に記載の阻害剤。
【請求項４】
前記lncRNAアンチセンス分子が、合計8個〜100個のヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を有する核酸オリゴマーであり、ここで、前記連続するヌクレオチド配列がlncRNAの配列の逆相補に対して少なくとも80 %同一性である、請求項3に記載の阻害剤。
【請求項５】
前記アンチセンス分子が、2'−O−メトキシ−エチル（MOE）又は2'−O−メチル（OMe）によって代表される2'−O−アルキル改変、エチレン架橋核酸（ENA）、ペプチド核酸（PNA）、2'−フルオロN3−P5'−ホスホラミダイトによって代表される2'−フルオロ（2'-F）核酸、1',5'−無水ヘキシトール核酸（HNA）、及びロックド核酸（LNA）から選択される、少なくとも1つの核酸の改変を有する連続するヌクレオチド配列を含む、請求項3又は4に記載の阻害剤。
【請求項６】
前記疾患が、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）の発現増加と関連する、及び／又はp53もしくはPDGFR-βの発現／機能の減少と関連する疾患、及び／又は眼疾患、線維性疾患（線維症）、血管疾患、及び／又は腫瘍性疾患、及び／又は白血病である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記治療が、lncRNAの阻害剤、及びPDGFR阻害剤によって代表される第2の治療剤の同時の又は順次の投与を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項８】
前記PDGFR阻害剤が、抗PDGFR抗体、低分子チロシンキナーゼ阻害剤、又はイマチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ、BIRB-796及びAZD-1152；AMG706、ザクティマ（ZD6474）、MP-412、ソラフェニブ（BAY 43-9006）、ダサチニブ、CEP-701（レスタウルチニブ）、XL647、XL999、タイケルブ（ラパチニブ）、MLN518、PKC412、STI571、AEE 788、OSI-930、OSI-817、スーテント（マレイン酸スニチニブ）、アキシチニブ（AG-013736）、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、テムシロリムス、若しくはニロチニブ（AMN107）である、請求項7に記載の阻害剤。
【請求項９】
（a）請求項1〜8のいずれか一項に記載のlncRNAの阻害剤と、
（b）PDGFR阻害剤と、
を含む、医薬の組み合わせ。
【請求項１０】
疾患の治療に使用されるPDGFR阻害剤であって、該治療が、請求項1〜9のいずれか一項に記載のlncRNA阻害剤の同時の又は順次の投与を含む、PDGFR阻害剤。
【請求項１１】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のlncRNAの阻害剤、又は請求項9に記載の医薬の組み合わせを、任意に薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項１２】
TYKRIL、MIR210HG、RP11-367F23.1、H19、RP11-44N21.1、AC006273.7、RP11-120D5.1、AP001046.5、RP11-443B7.1、AC005082.12、RP11-65J21.3、又はAC008746.12から選択されるlncRNAの発現及び／又は機能の調節因子をスクリーニングするin vitro方法であって、該方法は、
（a）周皮細胞の試料を準備することと、
（b）任意に、周皮細胞の試料において低酸素状態を誘導することと、
（c）周皮細胞の試料を候補化合物と接触させることと、
（d）周皮細胞の試料において下記の少なくとも1つを判定することと、
（i）lncRNAの発現レベル
（ii）PDGFRの発現レベル
（iii）内皮細胞への周皮細胞の動員
（iv）周皮細胞の増殖
（v）p53の活性又は発現
（vi）p53とヒストンアセチルトランスフェラーゼp300との相互作用
を含み、ここで、対照と比較した（i）〜（vi）のいずれかの著しい変化が、前記候補化合物がlncRNA発現の調節因子であることを示す、方法。
【請求項１３】
対照と比較して（i）及び／又は（ii）における発現の減少、及び／又は対照と比較して（iii）における動員不全、及び／又は（iv）における増殖の減少、及び／又は（v）におけるp53の発現若しくは活性の変更、及び／又は（vi）におけるp53とその活性化補助因子p300との相互作用の変更が、候補化合物がlncRNAの発現及び／又は機能の阻害剤であることを示す、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
工程（b）及び工程（c）を逆順に又は同時に行うことができる、請求項12又は13に記載の方法。
【請求項１５】
阻害剤TYKRILを同定する、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素状態の際に周皮細胞で発現されることが同定された、新規な非コードディングRNA（lncRNA）を提供する。本発明のlncRNAは、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）ベータの発現、周皮細胞増殖及び周皮細胞の内皮細胞への動員に良い影響を与える。本発明は、PDGFR発現によって媒介される疾患の治療に使用されるlncRNAの阻害剤を提供する。例えば、本発明は、本発明のlncRNAを標的とするアンチセンスアプローチを説明する。さらに、本発明は、イマチニブ又は他のチロシンキナーゼ阻害剤等の治療用PDGFR阻害剤の増幅因子としてlncRNA阻害剤を提供する。lncRNA阻害剤、並びにlncRNA発現及び／又は機能の調節因子をスクリーニングする方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
周皮細胞（PC）は、心臓、脳、肺及び腎臓の適切な機能に本質的に寄与する、豊富に発現される血管周囲細胞である。さらに、PCは、様々な悪性プロセスにおける腫瘍血管形成（vascularization：脈管形成）を安定化する。PDGFRβによるチロシンキナーゼシグナル伝達がPC生存、増殖及びPC内皮の相互作用を決定的に調節することが、十分に裏付けられている。血小板由来増殖因子（PDGF）は、4つの異なるアイソフォームサブユニットA、B、C及びDで構成される5つの異なる二量体配置として存在する、強力な有系分裂促進物質である。PDGFの5つの二量体の形態は、AA、BB、AB、CC及びDDであり、対応する個々のPDGF単量体のジスルフィド結合によって形成される。
【０００３】
PDGFリガンドは、PDGF受容体（PDGFR）との相互作用を通じて生物学的作用を発揮する。PDGFRは、アルファ（α）受容体鎖（PDGFRアルファ）及び／又はベータ（β）受容体鎖（PDGFRベータ）のヘテロ二量体又はホモ二量体の会合で構成される、1回膜貫通型チロシンキナーゼ受容体である。したがって、活性PDGFRはαα、ββ又はαβの受容体鎖対合からなってもよい。PDGFRは、5つの細胞外免疫グロブリン（Ig）ループ、膜貫通ドメイン及び分裂した細胞内チロシンキナーゼ（TK）ドメインを含む共通のドメイン構造を有する。二量体PDGFリガンドとPDGFRとの間の相互作用は、受容体鎖二量体化、受容体自己リン酸化及び細胞内情報伝達をもたらす。ββ受容体はPDGF-BB及び-DDによって活性化されるのに対し、αβ受容体はPDGF-BB、-CC、-DD及び-ABによって活性化され、αα受容体は、PDGF-AA、-BB、-CC及び-ABによって活性化されることが、in vitroで実証されている（非特許文献1を参照されたい）。
【０００４】
PDGFシグナル伝達は、病的な新血管形成に関連する疾患、血管疾患及び線維性疾患、腫瘍成長及び眼疾患を含む様々なヒト疾患に関係するとされてきた。したがって、PDGFシグナル伝達の阻害剤は、様々な治療の場での使用が示されている。例えば、PDGFRベータ阻害剤は、各種疾患及び障害を治療する際の使用に対して提案されている（非特許文献1）。PDGFRベータの阻害剤は、抗PDGFRベータ抗体だけでなく、メシル酸イマチニブ、リンゴ酸スニチニブ及びCP-673451等の非特異的少分子チロシンキナーゼ阻害剤を含む（例えば、特許文献1、特許文献2、特許文献3、及び特許文献4を参照されたい）。また、抗リガンドアプタマー（例えば抗PDGF-B）も治療用途に対し提案されている。それにもかかわらず、PDGFシグナル伝達の新たな、非常に特異的で強力な阻害剤が当該技術分野において必要とされている。
【０００５】
RNAシーケンシングにより、大多数のゲノムが転写されるが、殆どの転写産物はタンパク質をコードしないことが明らかになった。それらのサイズによれば、これらのいわゆる「非コーディングRNA」は、天然アンチセンス転写産物（NAT）、長鎖遺伝子間非コーディングRNA（lincRNA）及び環状RNA等の小分子非コーディングRNA（200ヌクレオチド未満）及び長鎖非コーディングRNA（lncRNA；200 nt超）に分けられる。異なる非コーディングRNA種の機能及び機構は十分理解され明確に定義される（例えばmiRNA）のに対し、lncRNAは、例えば、タンパク質／RNAの足場若しくはガイドとして、又は分子スポンジとして作用することによって、様々な分子機能を呈する。したがって、lncRNAは様々な段階で遺伝子発現及びシグナル伝達経路を妨げることができる。具体的には、lncRNAはクロマチン修飾酵素を動員し、RNA及びタンパク質の結合パートナーに対するデコイとして作用し、スプライシング及びmRNA分解を調節することが示された。microRNAは内皮細胞の機能の十分確立された調節因子であるが、血管の成長及びリモデリング、内皮におけるlncRNAの調節及び機能はよく理解されていない。
【０００６】
長鎖ncRNAは、数百ベースから数十キロベースの長さで変化し、タンパク質をコードする遺伝子から離れて位置する場合があり（長鎖遺伝子間ncRNA、すなわちlincRNA）、又はタンパク質をコードする遺伝子の近く若しくはその中に存在する場合がある（非特許文献2、非特許文献3）。最近の証拠から、活性なエンハンサーエレメントもlncRNAとして転写され得ることが示されている（非特許文献4、非特許文献5）。
【０００７】
いくつかのlncRNAは、転写調節に関係があるとされる。例えば、CCND1（サイクリンD1をコードする）プロモーターにおいて、CCND1の2 kb上流で転写されたncRNAは、電離放射線によって誘導され、リボ核タンパク質リプレッサー複合体の形成によりシスでCCND1の転写を調節する（非特許文献6）。このncRNAは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼを阻害する、RNA結合タンパク質TLS（脂肪肉腫において翻訳される）に結合し、アロステリックに活性化し、CCND1転写の抑制をもたらす。別の例は、p15コード配列を重複させるアンチセンスncRNA CDKN2B-AS1（p15AS又はANRILとしても知られる）である。CDKN2B-ASの発現は、ヒト白血病で増加し、p15発現と逆相関する（非特許文献7、非特許文献8）。CDKN2B-AS1は、直接、またヘテロクロマチン形成の誘導によって、p15を転写的にサイレンシングすることができる。遺伝子量補正（dosagecompensation）及びインプリンティングに関与するもの等の多くの十分研究されたlncRNAが、シスで遺伝子発現を調節する（非特許文献9）。HOTAIR及びlinc-p21等の他のlncRNAは、トランスで離れて位置する遺伝子の活性を調節する（非特許文献10、非特許文献11、及び非特許文献12）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第7,060,271号
【特許文献２】米国特許第5,882,644号
【特許文献３】米国特許第7,740,850号
【特許文献４】米国特許出願公開第2011/0177074号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Andrae et al. (2008) Genes Dev 22(10):1276-1312
【非特許文献２】Guttman et al. (2009) Nature 458:223-227
【非特許文献３】Katayama et al. (2005) Science 309:1564-1566
【非特許文献４】Kim et al. (2010) Nature 465:182-187
【非特許文献５】De Santa et al. (2010) PLoS Biol. 8:e1000384
【非特許文献６】Wang et al. (2008) Nature 454:126-130
【非特許文献７】Pasmant et al. (2007) Cancer Res. 67:3963-3969
【非特許文献８】Yu et al. (2008) Nature 451:202-206
【非特許文献９】Lee (2009) Genes Dev. 23:1831-1842
【非特許文献１０】Rinn et al. (2007) Cell 129:1311-1323
【非特許文献１１】Gupta et al. (2010) Nature 464:1071-1076
【非特許文献１２】Huarte et al. (2010) Cell 142:409-419
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、現行の技術水準に鑑み、本発明は、血管新生、悪性の卒中（stroke malignancy）若しくは炎症における内皮バリア機能の崩壊等の周皮細胞の機能及び／又はPDGFRシグナル伝達と関連する疾患、又は心血管障害、具体的には白血病等の癌の治療に対し、新たな選択肢を与えることを目的とした。本発明は、低酸素状態を受けて周皮細胞トランスクリプトームの包括的なディープシーケンシングアプローチに基づいて、これらの疾患に対する新たな薬物標的を提供しようと努める。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題は、1．疾患の治療に使用される、TYKRIL（AP001046.5としても知られる）、MIR210HG、RP11-367F23.1、H19、RP11-44N21.1、AC006273.7、RP11-120D5.1、RP11-443B7.1、AC005082.12、RP11-65J21.3、又はAC008746.12から選択される長鎖非コーディングRNA（lncRNA）の阻害剤によって第1の態様において解決される。
【００１２】
ここで本発明を以下の実施例において、添付の図面及び配列を考慮しつつ更に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。本発明の目的のために、本明細書で引用される全ての参考文献は、引用することによりそれらの全体が本明細書の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】A  24時間の1 % O2は、pO2測定によって特定されるようにPC培養物中のpO2レベルの効率的な減少をもたらした（n＞3）。B  低酸素細胞応答の効力を制御するため、VEGFAレベルが低酸素処理（n=7）により有意に増加したことを特定した。C  低酸素状態により、PCにおいてHIF-1αが上方制御された。D  24時間の低酸素状態は、PI及びHoechst対比染色によって特定されるように細胞死の僅かな増加をもたらした（n=3〜4）。E.  TYKRILノックダウンは、PI陽性PCに対するフローサイトメトリーによって特定されるように細胞死の僅かな増加をもたらした（n=4）。F.  （***P＜0.001；**P＜0.01；*P＜0.05）
【図２−１】PC及びTYKRILの特性評価を示す図である。A  免疫染色は、本研究で使用したPCがタンパク質レベルに対してPDGFRβ（赤色）をロバストに発現することを示す（少なくともn=3の実験による代表的な共焦点z-スタック、最大投影）。B  免疫ブロットは、PC溶解物中、PCマーカーであるPDGFRβ、NG2、デスミン及びαSMAのロバストな発現を表す。C  HUVEC（緑色）とPC（赤色の星印で示される細胞）との間の共培養実験は、矢印で印がつけられた黄色の細胞によって示される、両方の細胞型の間での細胞間の染料転写（dye transfer）を示す。D  TYKRILを含む、低酸素状態に際して最も上方制御されたlncRNAを表すヒートマップである（1つの条件当たりn=3の実験、P＜0.05）。E  TYKRILの上方制御をqRT-PCRによって確認した。F  TYKRILは、低酸素状態及び酸素正常状態での核及び細胞質ゾルの細胞画分の両方に位置する（n=4、有意差なし）。パネルGは、TYKRILの推定二次構造（lncipedia.org）を表す。H  RNAディープシーケンシングの読み取りの分析は、転写産物ENST00000435702の隣のchr21に位置するTYKRILのエキソン1及びエキソン2の高い適用範囲を示す。（*P＜0.05）
【図２−２】同上
【図３】TYKRILサイレンシングストラテジーを示す図である。A  TYKRILに特異的に結合するLNA GapmeRを設計した。結合の際、TYKRILは核内のRNAse Hによって切断される。B  LNA GapmeRによる可能性のある非特異的なオフサイド効果（off-side effects）を最小限にするため、効果的にPC中のTYKRIL発現レベルを低下させる2つの別々の配列をTYKRILのサイレンシングに使用した。（***P＜0.001）
【図４−１】PDGFRβ及びPC機能に対する低酸素状態及びTYKRILの影響を示す図である。低酸素状態は、A  mRNAレベル及びB  タンパク質レベルに対するPDGFRβの増加をもたらした。TYKRILサイレンシングは、C  PDGFRβ遺伝子発現及びD  PDGFRβタンパク質発現を有意に減少した。E  溶媒PBSで処理したPCと比較して、イマチニブ（1 μM、24時間）は有意にPC生存率を減少させた。TYKRILサイレンシングにより、MTTアッセイによって特定されるように、スクランブル対照を用いてトランスフェクトしたPCと比較し、PC生存率はイマチニブ処理によって更に有意に減少された（n=2〜4）。F  TYKRILサイレンシングの後、PC細胞数はLNAトランスフェクションの48時間後に有意に減少された。蛍光画像は、PC（カルセイングリーンCellTrace）、細胞核（青色、Hoechst）、及び死細胞（赤色の核を示す矢印、PI=ヨウ化プロピジウム）を表す代表的な画像である。G  PCにおけるKi67染色は、TYKRILノックダウンによる細胞増殖の減少を示し、画像は、1つの条件当たりn＞3の代表的な画像を示す）。（***P＜0.001；**P＜0.01；*P＜0.05；###P＜0.001）
【図４−２】同上
【図５】TYKRILサイレンシングは、AKTのリン酸化の下流にある（downstreaming）PDGFRβを減じる。細胞増殖及び細胞移動にとって不可欠であるAKTは、PDGF-BBによるPDGFRβ刺激の確立された下流のシグナル伝達経路である。溶媒処理対照と比較したAKTのTYKRILリン酸化に対するLNAGapmeRで処理されたPCでは、検出することができた（上部レーン）。しかしながら、LNA GapmeR対照と比較して、AKTのリン酸化は有意に減少された。これは、AKTに関して、TYKRILノックダウンにより減じられたPDGFRβの下流情報伝達を示す。同じフィルタを取り除き、総AKTタンパク質含有量を可視化するためにpan-AKT抗体を適用した。
【図６】TYKRILは内皮細胞へのPC動員に不可欠である。A  LNA GapmeRスクランブル対照で処理された多数のGFP標識化PCは、血管周囲でのHUVEC（赤色）チューブ形成を覆っている。B、C  PCにおけるTYKRILのサイレンシングは、対照Dと比較して50 %未満のPCへのPC動員の有意な減少をもたらす。（***P＜0.001）
【図７−１】LNA GapmeRのLNA#1及びLNA#3によるTYKRILノックダウンによるRNA Seqは周皮細胞の脱分化を明らかにする（A）。qPCR及びイムノブロッティングは、TYKRILノックダウンによるPDGFRβの喪失を確認する（B、C）。TYKRILが細胞の細胞質ゾル及び核の両方に局在化されるの（D）に対し、転写調節因子プロファイリングは、p53活性の顕著な上方制御を実証し（E）、このことはp53及びその下流の標的遺伝子の上方制御を示すRNA seqによって確認される（F）。重要なことには、p53発現は、TYKRIL発現と負の相関がある（G）。ドキソルビシン処理（Dox、H）によるp53の機能取得は、タンパク質（H）、RNAレベル（I）及びTYKRILの喪失（J）に対するPDGFRβの下方制御をもたらす。同時サイレンシング（Co-silencing）p53（K、L）は、TYKRILとp53との間の調節フィードバックループを示すTYKRILノックダウンによる細胞生存能力の喪失をレスキューする。
【図７−２】同上
【図７−３】同上
【図８−１】転写活性化因子VP64（hPC-VP64、B）を持つ、HAタグ付き不活性CAS9を発現するヒト周皮細胞におけるTYKRILプロモーター領域（A）に対するRNAガイドの発現は、TYKRIL及びPDGFRβの有意な上方制御をもたらし（C）、オフターゲット効果を最小化するため様々なガイドRNA配列を試験した。gRNAのトランスフェクションは、タンパク質レベルに対するPDGFRβの上方制御をもたらす（D）。gRNAのLNA GapmeRとの同時トランスフェクションは、同時トランスフェクションが、gRNAが媒介するTYKRIL（E）及び部分的にPDGFRβ（F）の過剰発現を阻むことから、GapmeR及びgRNAの特異性を確認する。
【図８−２】同上
【図９】p53に対するUV架橋、細胞溶解、及びIPに続き（対照：抗GFP IP、A）、RNA免疫沈降を行った。TYKRILはGFP対照と比較してIPp53試料において有意に富化され（B）、TYKRILとp53との間の物理的な相互作用を実証した。
【図１０】特定の近接ライゲーションアッセイ（proximity ligation assay）（陰性対照:A）は、ドキソルビシン（陽性対照、C）で処理したヒト周皮細胞と比較して、スクランブル対照における僅かなp53-p300相互作用を実証する。同様に、TYKRILノックダウンは、核p53-p300相互作用の有意な増加をもたらした。
【図１１−１】対照に由来する患者コホート、及び心不全（HF）と診断された患者においてTYKRILを測定した（A）。対照と比較して、PDGFRβ（B）及びTYKRIL（C）はHFにおいて有意に発現が少なかった。TYKRIL及びPDGFRβの発現は、HFにおいては互いに有意な相関があった（D）。同様に、PAH（n=7）及び対照肺（n=7）におけるTYKRIL-PDGFRβ分析は、ヒトの心肺系におけるTYKRIL-PDGFRβ相互依存を指摘する肺組織中のTYKRIL-PDGFRβ相関を明らかにする（E、F）。膠芽腫試料に由来するRNAseq（G）は、TYKRIL及びPDGFRβがいずれも悪性腫瘍において有意に上昇し（H、I）、p53は上方制御される（J）ことを示す。
【図１１−２】同上
【図１１−３】同上
【図１２】ヒトTYKRIL配列に対する相同性を有する遺伝子座保存配列に対するPCRは、ゲノム遺伝子座chr17:31805539〜31805608（GRCm38/mm10）から+/-3 kpに位置するネズミ科TYKRILを解明した（A）。酸素正常状態及び低酸素状態におけるPCRは、低酸素状態による上方制御を実証する（A）。ネズミ科オルソログのサイレンシングは、イムノブロッティングにおいて4つの異なるLNA GapmeRによって実証されるPDGFRβの喪失をもたらす（B）。
【図１３−１】マウスにmLNA#4を腹腔内注射し、PDGFRβ及びTYKRILの分析のため、臓器を注射から48時間後に採取した（A）。qPCRは、心臓におけるPDGFRβ及びmTYKRILの下方制御を実証し（B）、PDGFRβの喪失はタンパク質レベルでも確認された（B）。また、mTYKRIL及びPDGFRβは、肺（D）、肝臓（E）、脾臓（F）及び腎臓（G）でも減少された。1群当たりn=4匹〜5匹の動物。
【図１３−２】同上
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示において、TYKRIL（AP001046.5としても知られる）は、配列番号1に対して少なくとも60 %、70 %、80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %又は100 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）である。
【００１５】
他のlncRNAは、以下の位置においてヒトゲノム中に見出される：
表1：lncRNA配列（hg19）
【表１】
2018517660.tif 000002
【００１６】
MIR210HGは上記染色体位置配列に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）であり、RP11-367F23.1は上記染色体位置配列に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）であり、H19は上記染色体位置配列に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）であり、RP11-44N21.1は上記染色体位置配列に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）であり、AC006273.7は上記染色体位置配列に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）であり、RP11-120D5.1は上記染色体位置配列に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）であり、RP11-443B7.1は上記染色体位置配列に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）であり、AC005082.12は上記染色体位置配列に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）であり、RP11-65J21.3（HypERrlncとしても知られる）は上記染色体位置配列に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）であり、又はAC008746.12は上記染色体位置配列に対して少なくとも80 %の配列同一性を有する配列を含む長鎖非コーディングRNA（lncRNA）である。
【００１７】
本発明は、RNAディープシーケンシング（RNA seq）により同定された低酸素状態誘導性lncRNAに基づく。正確に制御されたin vitroアッセイでは、低酸素状態誘導性lncRNA TYKRIL（チロシンキナーゼ受容体誘導性lncRNA、AP001046.5としても知られる）が、ヒト周皮細胞におけるPDGFRβ発現の主な調節因子であることを示す。ロックド核酸であるGapmerによるTYKRILのノックダウンは、mRNA及びタンパク質のレベルに対するPDGFRβの重要な下方制御をもたらす。さらに、TYKRILサイレンシングは周皮細胞増殖及び分化を減じる。さらに、TYKRIL欠乏は内皮細胞への周皮細胞動員の機能不全を生じる。したがって、本開示は、TYKRIL、及び別の同定された低酸素状態により調節されるlncRNAが、周皮細胞機能にとって不可欠であることを示し、健康及び疾患におけるPDGFRβ発現の調節の新規な標的を表す。
【００１８】
本開示に記載される本発明の以下の特定の実施形態は、本明細書に開示される本発明の全てのlncRNA分子を指すと理解されるものとする。しかしながら、医学用途での薬物標的としてlncRNATYKRILに関連する一つの実施形態が特に強調される。したがって、lncRNAの阻害剤若しくはアゴニストとしてのTYKRILのアゴニスト若しくは阻害剤、又はかかる化合物をスクリーニングする方法に関連する全ての実施形態は、本発明によって提供される従来技術における課題の好ましい解決策である。
【００１９】
また、lncRNA阻害剤が本発明の好ましい実施形態であることが開示される。
【００２０】
本発明は、好ましくは阻害剤として、lncRNA発現及び／又は機能の阻害剤を提供する。本発明の好ましい実施形態は、阻害剤として、アンチセンスRNA、RNA干渉（RNAi）、siRNA、esiRNA、shRNA、miRNA、デコイ、RNAアプタマー、GapmeR、LNA分子等のlncRNAアンチセンス分子、又はアンチセンス発現分子、又は低分子阻害剤、RNA／DNA結合タンパク質／ペプチド、又は抗lncRNA抗体を提供する。lncRNAアンタゴニスト又は阻害剤の詳細な説明が以下に更に提供される。
【００２１】
lncRNAアンチセンス分子は、より好ましくは合計8個〜100個のヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を有する核酸オリゴマーであり、ここで、上記連続するヌクレオチド配列がlncRNAの配列の逆相補に対して少なくとも80 %同一性である。好ましい実施形態では、lncRNAのアンチセンス分子はTYKRILのアンチセンス分子である。
【００２２】
本発明のアンチセンス分子は、8個〜100個のヌクレオチド、好ましくは8個〜50個、8個〜40個、8個〜30個、8個〜20個、又は9個〜100個、9個〜50個、9個〜40個、9個〜30個、9個〜20個、又は10個〜100個、10個〜50個、10個〜40個、10個〜30個、10個〜20個のヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を有する核酸オリゴマーとすることができる。10個〜30個のヌクレオチドを含むオリゴマーであることが最も好ましい。
【００２３】
本明細書の以下の詳細でも説明されるように、アンチセンス分子は、少なくとも1つの核酸の改変を有する連続するヌクレオチド配列を含むことができる。該少なくとも1つの核酸の改変は、好ましくは2'−O−メトキシ−エチル（MOE）又は2'−O−メチル（OMe）等の2'−O−アルキル改変、エチレン架橋核酸（ENA）、ペプチド核酸（PNA）、2'−フルオロN3−P5'−ホスホラミダイト等の2'−フルオロ（2'-F）核酸、1',5'−無水ヘキシトール核酸（HNA）、及びロックド核酸（LNA）から選択される。
【００２４】
上に言及されるように、本発明のlncRNA阻害剤はTYKRIL発現及び／又は機能の阻害剤であることが特に好ましい。この点に関して、本開示は、好ましい分子として、配列番号2又は配列番号3に対して少なくとも80%、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %又は100 %の配列同一性を有する連続するヌクレオチド配列を含むアンチセンス分子を提供し、ここで、アンチセンス分子がLNA GapmeRであることが好ましい。
【００２５】
本発明は薬物標的としてのlncRNAの開発に基づく。したがって、本発明の中心的な態様は、好ましくは医学的処置の状況における、本明細書に開示されるlncRNAの発現又は機能の調節に関する。lncRNAの発現又は機能を増強する手段又は化合物について、本発明は、かかる手段又は化合物を各lncRNAの「アゴニスト」と呼ぶ。代替的には、lncRNAの発現及び／又は機能は、減少又は阻害されてもよい。この場合、本発明は、該作用のこれらの媒介物質を本発明の各lncRNAの「阻害剤」又は「アンタゴニスト」と呼ぶ。lncRNAが細胞の細胞質ゾル又は細胞核のいずれかにおいてそれらの生物学的活性を媒介するRNA分子であることから、当業者は天然RNA代謝に介在する、全て既知の方法を利用することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明のlncRNAのアゴニストは、本発明のlncRNA分子又はそのホモログから選択される。当業者は、lncRNAアゴニストの本明細書に説明される機能及び効果が、lncRNA阻害剤について開示される機能及び効果と逆又はそれに反することを十分に理解するであろう。lncRNA分子は、本明細書において上に開示されるlncRNA配列（lncRNA配列）に対応するRNA分子である。本発明におけるホモログは、核酸、好ましくはRNA分子であって、本明細書に記載される発明のlncRNAのいずれかに相同性であり、本明細書において上に定義されるlncRNA配列のいずれか1つに対して少なくとも60 %の配列同一性の配列（lncRNA配列）を含むことが好ましい。本発明の更に好ましいホモログは、本明細書において上に定義されるlncRNA配列と少なくとも70 %、80%、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %又は最も好ましくは99 %同一である核酸配列を含む。
【００２７】
代替的には、本発明は、本発明のアゴニストとしてlncRNAの発現コンストラクトを提供する。本発明のlncRNA発現コンストラクトは、プロモーター配列に操作可能に連結された、好ましくは本発明のlncRNA、任意にそのホモログの発現可能な配列を含む。発現コンストラクトを本発明のlncRNAのアゴニスト又はアンタゴニストを発現するための両方に使用してもよいことから、発現コンストラクトの詳細な説明を本明細書において以下に提供する。
【００２８】
本明細書に記載される発明に従ってlncRNA発現／機能を減じるため、当業者はRNA発現の阻害のため任意の好適な方法論を選択し得る。標的RNAの阻害又は破壊を媒介することにより、lncRNAの機能を減じる、配列相補的な核酸ポリマー（アンタゴニスト／阻害剤）を適用するアンチセンスのアプローチが特に好ましい。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、本発明のlncRNAは、アンチセンスRNA、RNA干渉（RNAi）、siRNA、esiRNA、shRNA、miRNA、デコイ、RNAアプタマー、低分子阻害剤、RNA／DNA結合タンパク質／ペプチド、GapmeR、LNA分子、又はlncRNAによって果たされる1以上の生理学的作用を阻害するための種々の処方を有する他の化合物等のlncRNAターゲッティング戦略の阻害剤又は治療剤、すなわちアンタゴニストを使用して標的化されてもよい。本発明のアンチセンスのアンタゴニストは、直接投与若しくは使用されてもよく、又は代替的には、発現コンストラクト、例えば本発明のlncRNAに相補的な配列を有するmiRNAを発現するコンストラクトを使用して発現されてもよい。
【００３０】
本発明のlncRNAの阻害について、或る特定の実施形態では、lncRNAの発現又は機能を減じるために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）又はオリゴマー（該用語は互換的に用いられてもよい）は、相補的な標的に結合し、その標的の機能を抑制する合成核酸である。典型的には、ASOはRNA標的の発現を減少させるか変更するために使用され、すなわち、lncRNAはASOによって標的とされ得るRNAの1つの好ましい例である。全般的な原理として、ASOは2つの異なる作用機構、すなわち1）立体的な阻害によって（ここでASOは標的核酸にしっかりと結合してその種を不活性化し、細胞活動へのその関与を妨げる）、又は2）分解を引き起こすことによって（ここでASOは標的を結合し、標的とされた核酸種を分解する細胞ヌクレアーゼの活性化をもたらす）、RNA機能を抑制することができる。一群の「標的分解（target degrading）」である。ASOは、RNA、DNA又はPNA等の数種類の核酸で構成される場合がある。
【００３１】
ASOの半減期を増すため、核酸の修飾を導入することができる。細胞エンドヌクレアーゼによる分解からASOを防御することは特に有用である。広範に用いられる1つの修飾は、ホスホロチオエート基（PS）で修飾されたDNAを含む。ヌクレオチド間結合のPS修飾は、ヌクレアーゼ抵抗性を与えて、血清及び細胞の両方においてASOをより安定にする。付加利益として、PS修飾は、アルブミン等の血清タンパク質へのASOの結合も増加させ、これは静脈注射に続く腎排泄の速度を減少させて薬物動態を改善し、機能性を改善する。したがって、PS修飾ASOは本発明に包含される。
【００３２】
更なる修飾は、ASO分子の3'末端、例えば中心2'−デオキシギャップ領域を挟む3'末端及び5'末端において2'修飾「ウイング（wings）」を提供する2'−メトキシエチルリボース（MOE）を有する「Gapmer」化合物を標的とする。結合親和性及びヌクレアーゼ抵抗性の両方を改善するASO修飾は、典型的には、改変ヌクレオシドであり、これにはメチル架橋が2'−酸素と4'−炭素とを結び付けて、A型構造でリボースをロックする、ロックド核酸（LNA）が含まれ、追加のメチル基を含むエチレン架橋核酸（ENA）、アミノ-LNA及びチオ-LNA等のLNAの変形も利用可能である。さらに、2'−O−メトキシエチル（MOE）又は2'−フルオロ（2'−F）等の他の2'修飾も、ASOに組み込むことができる。かかる例示的な修飾は、本発明に含まれる。
【００３３】
本発明において、これは、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」の用語が、本発明の標的lncRNA配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列に関することを意味する。「オリゴヌクレオチド」の用語は、天然起源の塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシドの単量体のオリゴマー又はポリマーを指す。また、該用語は、同様に機能する、非天然起源の単量体又はその一部を含む、修飾された又は置換されたオリゴマーを含む。かかる修飾された又は置換されたオリゴヌクレオチドは、細胞の取り込みの増強、又は既に上に言及されたヌクレアーゼの存在下での安定性の増加等の特性のため、天然起源型よりも好ましい場合がある。また、該用語は、2以上の化学的に異なる領域を含むキメラオリゴヌクレオチドを含む。例えば、キメラオリゴヌクレオチドは、アンチセンスの結合領域の他に、有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性の増加、細胞へ取り込みの増加）を与える修飾されたヌクレオチドの少なくとも1つの領域を含んでもよい。さらに、2以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが連結してキメラオリゴヌクレオチドを形成してもよい。
【００３４】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸又はデオキシリボ核酸であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含む天然起源塩基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル、2-プロピル及び他のアルキルアデニン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、6-アザチミン、プソイドウラシル、4-チオウラシル、8-ハロアデニン、8-アミノアデニン、8-チオールアデニン、8-チオールアルキルアデニン、8-ヒドロキシルアデニン及び他の8-置換アデニン、8-ハログアニン、8-アミノグアニン、8-チオールグアニン、8-チオールアルキルグアニン、8-ヒドロキシル（hydroxyl）グアニン及び他の8-置換グアニン、他のアザ及びデアザ−ウラシル、チミジン、シトシン、アデニン、又はグアニン、5-トリ-フルオロメチルウラシル、並びに5-トリフルオロシトシン等の修飾塩基を含有していてもよい。
【００３５】
本発明の他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン酸骨格、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合、又は短鎖ヘテロ原子の若しくは複素環の糖間結合において修飾されたリン、酸素ヘテロ原子を含んでもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホン酸塩及びホスホロジチオエートを含んでもよい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連結の組み合わせを含んでもよく、例えば、ホスホロチオエート結合は4個〜6個の3'末端塩基のみを連結してもよく、全てのヌクレオチドを連結してもよく、又は1対の塩基のみを連結してもよい。
【００３６】
また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、治療的又は実験の試薬としてより適する場合があるヌクレオチドアナログを含んでもよい。オリゴヌクレオチドアナログの一例は、ペプチド核酸（PNA）であり、ここではDNA（又はRNA）中のデオキシリボース（又はリボース）リン酸骨格は、ペプチド中に見出されるものに類似するポリイミド骨格に置き換わっている。PNAアナログは、酵素による分解に抵抗性であり、in vivo及びin vitroでの寿命の延長が示された。また、PNAは、PNA鎖とDNA鎖との間の電荷反発の欠如により相補的DNA配列とより強い結合を形成する。他のオリゴヌクレオチドアナログは、ポリマー骨格、環状骨格又は非環状骨格を有するヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ヌクレオチドは、モルフォリノ骨格構造を有してもよい。また、オリゴヌクレオチドアナログは、オリゴヌクレオチドのレポーター基、保護基及び薬物動態特性を改善するための基等の基を含んでもよい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者によって理解される糖模倣物を組み込んでもよい。
【００３７】
アンチセンス核酸分子は、本明細書において提供されるもの等の所与のlncRNA配列に基づく当該技術分野で知られている手順を使用する、化学合成及び酵素ライゲーション反応を使用して構築されてもよい。本発明のアンチセンス核酸分子、又はそのフラグメントは、天然起源のヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増加させるように若しくはmRNA若しくは本来の遺伝子と共に形成された二重螺旋の物理学的安定性を増加させるように設計された、様々に修飾されたヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを使用して、化学的に合成されてもよい。また、アンチセンス配列は、生物学的に産生されてもよい。この場合、アンチセンスをコードする核酸は発現ベクター内に組み込まれ、その後そのベクターは、アンチセンス配列が高効率の制御領域の制御のもと産生される、組換プラスミド、ファージミド又は弱毒化ウイルスの形態で細胞へと導入される、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。
【００３８】
別の実施形態では、siRNA技術は本発明のlncRNAの発現を阻害するために適用されてもよい。lncRNA遺伝子内の領域に対応し、選択的にlncRNAを標的とするsiRNAフラグメント等の核酸フラグメントの適用は、lncRNAの発現又は機能を阻むために使用されてもよい。
【００３９】
siRNA、すなわちlncRNA配列の領域に対応する、低分子干渉RNA分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して上に概説されるように確立した核酸合成方法を使用して作られる。標的lnc-RNAの構造は知られていることから、それと対応するRNA／DNAのフラグメントを容易に作ることができる。例えば、標的化された分解によって、lncRNA機能又は発現を減じる選択されたsiRNAの有効性は、lncRNA発現細胞株を使用して確認することができる。簡潔には、選択されたsiRNAを、適切な生育条件下でlncRNA発現細胞株と共にインキュベートしてもよい。十分な反応時間、すなわち、siRNAがlncRNAに結合してlnc-RNAのレベルの減少をもたらすのに十分な反応時間の後、例えば定量的PCR、ノーザンブロッティング等によって反応混合物を試験し、かかる減少が生じたかどうかを判断する。
【００４０】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端に、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの2つの塩基の間に組み込まれる、少なくとも1つの修飾を含んでもよく、ここで、該修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性及びヌクレアーゼ抵抗性を増加させる。一つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、末端ヌクレオチドの3つの塩基内に位置する少なくとも1つの修飾を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、末端塩基と、オリゴヌクレオチドの3'末端又は5'末端のいずれかから2番目の塩基との間に位置する少なくとも1つの修飾を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの末端に修飾を含む。更なる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、末端に、又は末端塩基とアンチセンスオリゴヌクレオチドの5'末端及び3'末端の双方から2番目の塩基との間に修飾を含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、末端で、又は末端塩基と5'末端及び3'末端から2番目の塩基との間に非塩基修飾因子（non-base modifier）を含む。
【００４１】
また、本発明のlncRNAの阻害（inhibiting）に結合する抗体を含んでもよい。
【００４２】
lncRNA阻害剤、又はアゴニストも、疾患の治療に対する治療剤として医学において特に有用である。本発明の好ましい実施形態において、上記疾患は、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）の発現増加に関連する疾患、及び／又はp53、好ましくはPDGFR-βの発現／機能の増加若しくは減少に関連する疾患であってもよい。かかる疾患は、線維性疾患（線維症）、心血管疾患、肺及び／又は腫瘍性の疾患（癌）等の病的血管新生に関連する疾患から選択されてもよい。
【００４３】
「病的血管新生」の用語は、いくつかの疾患状態の維持及び進行の間の血管の過度の形成及び成長を指す。病的血管新生が起こり得る場所の例は、血管（アテローム性動脈硬化症、血管腫、血管内皮腫）、骨及び関節（関節リウマチ、滑膜炎、骨及び軟骨破壊、骨髄炎、パンヌス増殖、骨棘形成、新生物及び転移）、皮膚（疣贅、化膿性肉芽腫、発毛、カポジ肉腫、ケロイド瘢痕、アレルギー性浮腫（edema）、新生物）、肝臓、腎臓、肺、耳及び他の上皮（炎症過程及び感染過程（肝炎、糸球体腎炎、肺炎を含む）、喘息、鼻茸、耳炎、移植、肝臓再生、新生物及び転移）、子宮、卵巣及び胎盤（機能不全性子宮出血（子宮内避妊具に起因するもの）、卵胞嚢胞形成、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜症、新生物）、脳、神経及び眼（未熟児の網膜症、糖尿病性網膜症、脈絡膜及び他の眼内障害、白質軟化症、新生物及び転移）、作業過負荷に起因する心臓及び骨格筋、脂肪組織（肥満）、内分泌臓器（甲状腺炎、甲状腺肥大、膵臓移植）、造血器（AIDS（カポジ肉腫）、悪性血液疾患（白血病等）、腫瘍によって誘発された新血管）である。病的血管新生が、増殖性障害と関連して、最も好ましくは癌疾患と関連して起こる場合がある。癌は、肝臓癌、脳腫瘍、特に膠芽腫、肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌及び黒色腫からなる群から選択されてもよく、癌が固形癌、更に好ましくは転移性固形癌であることが最も好ましい。
【００４４】
白血病は本発明の好ましい癌である。本明細書で使用される白血病の用語には、限定されないが、慢性骨髄性白血病（CML）及び急性リンパ性白血病（ALL）、特にフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病（Ph＋ALL）が含まれる。好ましくは、本明細書に開示される方法によって治療される白血病の変形はCML、特にイマチニブ耐性白血病等の薬物耐性CMLである。
【００４５】
別の好ましい疾患は、膠芽腫、すなわちグリア細胞を含む原発性脳腫瘍である。
【００４６】
さらに、肺動脈性高血圧症（PAH）、すなわち肺系統での高い動脈圧を伴う疾患は、好ましい疾患である。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、「病的血管新生」は、p53の発現減少又は機能変更又は突然変異と関連する癌疾患又は心肺の疾患である。本発明がp53を上方制御し、p53上のその活性化補助因子p300の結合を増強する阻害剤を提供することから、本発明の化合物は、癌、又は有害な臓器リモデリング及び組織瘢痕化の治療に概ね有用である。
【００４８】
本発明における心血管疾患は、病理学的に抑制された内皮細胞修復、細胞増殖、及び／又は細胞分裂と関連する疾患であってもよく、又は内皮細胞修復、細胞増殖、及び／又は細胞分裂を改善することにより治療可能な疾患である。一般に、本明細書で使用される「心血管疾患」の用語は、全身の血管の狭窄及び／又は閉塞をもたらす全ての病的状態を指すことが意図される。特に、「心血管疾患」の用語は、特に心臓及び脳の動脈におけるアテローム性動脈硬化症、血栓症及び他の関連する病的状態を含む病態を指す。したがって、「心血管疾患」の用語は、限定されず、アルツハイマー病及び血管の大きさに加えて様々な種類の心疾患を包含する。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、心血管疾患は、急性冠動脈症候群、急性肺損傷（ALI）、急性心筋梗塞（AMI）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、動脈閉塞症、動脈硬化症、関節軟骨欠損、無菌性全身性炎症、アテローム動脈硬化性心血管疾患、自己免疫疾患、骨折、骨折、脳浮腫、脳低灌流、バージャー病、熱傷、癌、心血管疾患、軟骨損傷、脳梗塞、脳虚血、脳卒中、脳血管疾患、化学療法誘発性神経障害、慢性感染症、慢性腸間膜虚血、跛行、鬱血性心不全、結合組織損傷、挫傷、冠動脈疾患（CAD）、重症下肢虚血（CLI）、クローン病、深部静脈血栓症、深創傷、潰瘍治癒の遅滞、創傷治癒の遅滞、糖尿病（I型及びII型）、糖尿病性神経障害、糖尿病誘発性虚血、播種性血管内凝固（DIC）、閉栓性脳虚血、凍傷、移植片対宿主病、遺伝性出血性毛細血管拡張症（telangiectasia）、虚血性血管疾患、高酸素傷害、低酸素症、炎症、炎症性腸疾患、炎症性疾患、腱損傷、間欠性跛行、腸管虚血、虚血、虚血性脳疾患、虚血性心疾患、虚血性末梢血管疾患、虚血性胎盤、虚血性腎疾患、虚血性血管疾患、虚血性再灌流傷害、裂傷、左主幹冠動脈疾患、肢虚血、下肢虚血、心筋梗塞、心筋虚血、臓器虚血、骨関節炎、骨粗鬆症、骨肉腫、パーキンソン病、末梢動脈性疾患（PAD）、末梢動脈疾患、末梢性虚血、末梢神経障害、末梢血管疾患、前癌病変、肺浮腫、肺閉塞症、骨リモデリング障害、腎虚血、網膜虚血、網膜症、敗血症、皮膚潰瘍、臓器移植、脊髄損傷、発作、軟骨下骨嚢胞、血栓症、血栓性脳虚血、組織虚血、一過性脳虚血発作（TIA）、外傷性脳損傷、潰瘍性大腸炎、腎臓の血管疾患、血管炎症状態、フォンヒッペル−リンドウ症候群、又は組織若しくは臓器の創傷からなる群から選択される。本発明の阻害剤は、上述の心血管疾患の状況において臓器リモデリングを予防するのに有用である。また、好ましい1つの疾患は肺動脈性高血圧症（PAH）である。
【００５０】
本発明の阻害剤を投与することにより治療可能な線維性疾患の例としては、肺線維症（例えば、突発性肺線維症、ブレオマイシン誘発性肺線維症、アスベスト誘発性肺線維症、及び閉塞性細気管支炎症候群）、慢性喘息、急性肺損傷及び急性呼吸窮迫に伴う線維症（例えば、細菌性肺炎誘発性線維症、外傷誘発性線維症、ウイルス性肺炎誘発性線維症、人工呼吸器誘発性線維症、非肺敗血症誘発性線維症、及び誤嚥誘発性線維症）、ケイ肺症、放射線誘発性線維症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、眼線維症（例えば眼線維性瘢痕）、皮膚線維症（例えば強皮症）、肝線維症（例えば肝硬変、アルコール誘発性肝臓線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、胆管損傷、原発性胆汁（biliary）肝硬変、感染又はウイルス誘発性肝臓線維症（例えば慢性HCV感染症）、自己免疫性肝炎）、腎臓（腎）線維症、心線維症、アテローム性動脈硬化症、ステント再狭窄、並びに骨髄線維症が挙げられる。
【００５１】
本発明の他の好ましい実施形態は、本明細書に開示されるlncRNAの阻害剤、特にTYKRIL阻害剤の医学的使用に関し、ここで、該治療はlncRNAの阻害剤と、PDGFR阻害剤等の2つ目の治療薬との同時投与又は連続投与を含む。前記PDGFR阻害剤が、抗PDGFR抗体、低分子チロシンキナーゼ阻害剤、（好ましくは）イマチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ、BIRB-796及びAZD-1152等；AMG706、ザクティマ（ZD6474）、MP-412、ソラフェニブ（BAY 43-9006）、ダサチニブ、CEP-701（レスタウルチニブ）、XL647、XL999、タイケルブ（ラパチニブ）、MLN518、PKC412、STI571、AEE 788、OSI-930、OSI-817、スーテント（マレイン酸スニチニブ）、アキシチニブ（AG-013736）、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、テムシロリムス、及びニロチニブ（AMN107）であることが好ましい。
【００５２】
PDGFR阻害剤は、PDGFRβ阻害剤であることが好ましい場合がある。
【００５３】
したがって、本発明の上記の課題もまた、（a）本明細書において前に定義されるlncRNAの阻害剤（特にTYKRIL阻害剤）と、（b）上に定義されるPDGFR阻害剤とを含む医薬の組み合わせによって解決される。
【００５４】
かかる組み合わせは、本明細書の上記に記載されるような疾患の治療に使用されることが好ましい。
【００５５】
次に、本発明の別の実施形態は、疾患の治療に使用されるPDGFR阻害剤であって、該治療が、先の請求項のいずれかに記載のlncRNA阻害剤の同時の又は順次の投与を含む、阻害剤に関する。
【００５６】
上で言及される化合物の使用は、かかる治療を必要とする被験体を治療する方法に更に適用され、該方法は、治療的有効量の阻害剤又はアゴニストの被験体への投与を含む。
【００５７】
本明細書の上記に記載されるアゴニスト又は阻害剤は、上に言及される各種疾患の治療に有用である。したがって、本発明は、かかる治療を必要とする被験体への治療的有効量の上記化合物の投与を含む、治癒的又は予防的な医学的処置における本発明の化合物の使用を提供する。
【００５８】
記載されるアゴニスト又はアンタゴニストは、単独で又は血管新生と関連する各種疾患を治療する他の方法と組み合わせて使用されてもよい。例えば、被験体が癌と診察されている場合、上に記載される1以上の作用因子を、この癌の治療に対して治療的に活性である治療的有効量の化合物、例えば化学療法剤の投与と組み合わせてもよい。
【００５９】
本明細書で使用される「有効量」の用語は、所望の効果を生じる化合物の量を指す。例えば、in vitro（例えば、細胞培養物）でのその効果を検討するため、又はex vivo若しくはin vitroで所望の治療効果を生じさせるため、細胞の集団を有効量の化合物と接触させてもよい。有効量の化合物は、被験体において、標的とする病態の予防若しくは治療、その病態と関連する症状の緩和、又は所望の生理学的作用を生じること等の治療効果を生じるのに使用されてもよい。かかる場合では、化合物の有効量は、「治療的有効量」、「治療的有効濃度」又は「治療的有効用量」である。正確な有効量又は治療的有効量は、所与の被験体又は細胞の集団における治療の効力の点から最も有効な結果を生じる組成物の量である。この量は、限定されないが、化合物の特性（活性、薬物動態、薬効及びバイオアベイラビリティーを含む）、被験体の生理学的な状態（年齢、性別、疾患の種類及びステージ、全身健康状態、所与の投与量に対する反応性、及び薬物治療の種類を含む）又は細胞の生理学的な状態、製剤中の薬学的に許容可能な担体（単数又は複数）の性質、及び投与経路を含む、様々な要因に応じて変化する。さらに有効量又は治療的有効量は、化合物が単独で又は別の化合物、薬物、治療若しくは他の治療方法若しくは様式と組み合わせて投与されるかどうかに応じて変化し得る。臨床及び薬理学の分野の当業者は、日常の実験を通じて、すなわち、細胞の又は被験体の化合物の投与に対する反応をモニタリングし、それに応じて投与量を調整することによって、有効量又は治療的有効量を決定することができる。更なる手引きについては、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Univ.of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia, Pa., 2005を参照されたい。これは本明細書においてその全体が述べられるかのように、引用により本明細書の一部をなす。
【００６０】
本明細書で使用される「組み合わせで」、又は「と組み合わせて」の用語は、同じ患者における同じ疾患の治療の中で、任意の順で2以上の作用因子、薬物、治療レジメン、治療様式、又はそれらの組み合わせを使用することを意味する。これには、同時の実施に加えて最長数日の一時的に間隔をおかれた順序での適用が含まれる。また、かかる併用療法は、作用因子、薬物、治療レジメン又は治療様式のいずれか1以上の2回以上の適用を含んでもよい。さらに、2以上の作用因子、薬物、治療レジメン、治療様式又はそれらの組み合わせは、同じ又は異なる投与経路によるものであってもよい。
【００６１】
本明細書で使用される「被験体」の用語は、ヒト又は他の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、被験体は、本明細書に開示される疾患に罹っている、又はその危険のある患者であってもよい。
【００６２】
したがって、任意に薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と共に、開示されるlncRNAの阻害剤、又は開示される組み合わせ、又は開示されるPDGFR阻害剤を含む医薬組成物が更に提供される。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という語は、医薬投与に適合したあらゆる溶媒、可溶化剤、充填剤、安定化剤、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝剤、滑沢剤、制御放出ビヒクル、ナノ粒子、リポソーム、希釈剤、乳化剤、保湿剤、滑沢剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤又は抗真菌剤、等張性吸収遅延剤等を含むことを意図する。医薬品作用物質用のそのような媒体及び作用因子の使用は、当該技術分野でよく知られている。何らかの慣例的な媒体又は作用因子が活性化合物と非相容性である場合を除き、組成物中ではその使用が検討される。補助剤を該組成物中に導入することもできる。或る特定の実施形態においては、薬学的に許容可能な担体は、血清アルブミンを含む。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口投与、例えば髄腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経皮的（局所的）投与及び経粘膜的投与が含まれる。
【００６５】
非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：滅菌希釈液、例えば注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン；プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば酢酸、クエン酸又はリン酸、及び等張性を調整するための物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースを含み得る。pHは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口用調剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は複数回投与用バイアル中に封入されていてよい。
【００６６】
注射に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製物のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に適した担体には、生理食塩水、制菌水、Cremophor EL（商標）（BASF（ニュージャージー州パルシッパニー））又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）が含まれる。全ての場合において、注射用組成物は、滅菌されているべきであり、かつ簡単に注射可能である程度に流動性であるべきである。該組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌及び真菌類のような微生物の汚染作用に対して保護されねばならない。上記担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってよい。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングを使用することによって、分散液の場合に必要とされる（required）粒度を維持することによって、そして界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール及び塩化ナトリウムが上記組成物中に含まれることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、該組成物中に吸収を遅延させる作用因子、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによって引き起こすことができる。
【００６７】
滅菌注射用溶液は、活性化合物（例えばニューレグリン）を必要とされる量で適切な溶媒中に先に列挙された成分の1つ又はその組み合わせと一緒に導入し、所望であれば引き続き濾過滅菌することによって製造することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒及び先に列挙された成分からの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に導入することによって製造される。滅菌注射用溶液の製造のための滅菌粉末の場合に、好ましい製造方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、該乾燥により、事前に滅菌濾過されたその溶液から、有効成分と任意の付加的な所望の成分との粉末が得られる。
【００６８】
経口用組成物は、一般的に不活性希釈剤又は可食性担体を含む。経口用組成物は、ゼラチンカプセル中に封入されてよく、又は錠剤へと圧縮されてよい。経口治療的投与のために、活性化合物は、賦形剤と一緒に導入することができ、かつ錠剤、トローチ又はカプセルの形で使用することができる。経口用組成物は、マウスウォッシュとして使用するための流動性担体を使用して製造することもでき、その際、流動性担体中の化合物は、経口で適用されて、濯いで吐き出されるか、又は飲み込まれる。医薬品に適合性の結合剤及び／又はアジュバント材料は、上記組成物の一部として含まれてよい。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分のいずれか又は類似の性質の化合物を含有することができる：微晶質セルロース、トラガカントガム若しくはゼラチン等の結合剤；デンプン若しくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）若しくはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはステーテス（Stertes）等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤；スクロース若しくはサッカリン等の甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ風味剤等の着香剤。
【００６９】
吸入による投与のためには、上記化合物は、加圧容器又は適切な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含むディスペンサー又はネブライザーからエアロゾルスプレーの形で送達される。
【００７０】
全身性投与は、経粘膜手段又は経皮手段によるものであってもよい。経粘膜投与又は経皮投与のために、浸透するべき障壁に適切な浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野において一般的に知られており、例えば経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻内スプレー又は坐剤を使用することによって実現することができる。経皮投与のためには、医薬組成物は、当該技術分野で一般的に知られる軟膏剤、膏薬、ゲル剤又はクリーム剤へと製剤化される。
【００７１】
或る特定の実施形態においては、医薬組成物は、有効成分の持続放出又は制御放出のために製剤化される。生分解性の生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類及びポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤の製造方法は、当業者には明らかであろう。それらの材料は、例えばAlza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む）又はポリ（dl-ラクチド-co-グリコリド）を含有するナノ粒子は、薬学的に許容可能な担体として使用することもできる。これらは、当業者に既知の方法に従って製造することができる。
【００７２】
経口用組成物又は非経口用組成物を、投与を容易にし、かつ投与量を均一にするための投与単位形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形は、治療される被験体のための単位投与量として適した物理的に別々の単位を含み、それぞれの単位は、必要とされる医薬用担体と共同して所望の治療効果をもたらすように計算された予め決められた量の活性化合物を含む。本発明の投与単位形のための仕様は、活性化合物の特有の特性及び達成されるべき具体的な治療効果並びにそのような活性化合物の個人の治療のための配合分野に固有な制約によって決まり、それらに直接的に依存している。
【００７３】
このような化合物の毒性及び治療効力は、細胞培養物又は実験動物における、例えばLD50（集団の50 %までの致死用量）及びED50（集団の50 %に治療的に有効な用量）の測定のための標準的な製剤的手法によって測定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療係数であり、LD50/ED50の比率として表現することができる。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用することができるが、未感染細胞への損傷の可能性を最小限にすることで副作用を減らすように、そのような化合物を罹患組織の位置に向ける送達系を設計することに留意すべきである。
【００７４】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を考えるにあたり使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、殆ど毒性が無いか又は全く毒性が無いED50を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、この範囲内で、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて様々であってよい。本発明の方法で使用されるあらゆる化合物について、治療的有効用量は、まずは細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で測定されたIC50（すなわち、症状の半最大抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む血中血漿濃度範囲に達するように考えることができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に定めるために使用することができる。上記医薬組成物は、投与のための使用説明書と一緒に容器、包装又はディスペンサー中に含まれていてよい。
【００７５】
本発明によるlncRNAの阻害剤は、好ましい実施形態では、外科若しくは医療用のデバイス若しくはインプラントの内部に含まれるか、又はそれによって放出されるように適合されて製剤化され得る。或る特定の態様では、インプラントは本発明の化合物で被覆されてもよく、別様に処理されてもよい。例えば、生体適合性及び／又は生分解性のポリマー等のヒドロゲル又は他のポリマーを使用して、本発明の化合物又はそれらを含有する組成物でインプラントを被覆してもよい（すなわち、組成物又は医薬組成物を、ヒドロゲル又は他のポリマーの使用により医療用デバイスとの使用に適合させてもよい）。作用因子と共に医療用デバイスを被覆するポリマー及びコポリマーは当該技術分野でよく知られている。インプラントの例として、限定されないが、ステント、薬物溶出ステント、縫合糸、プロテーゼ、血管カテーテル、透析カテーテル、人工血管、人工弁、心臓ペースメーカー、植込み型除細動器、IV針、ピン、スクリュー、プレート及び他のデバイス等の接骨用又は骨形成用デバイス、並びに創傷治癒用の人工組織マトリクスが挙げられる。本発明は、外科用又は医療用のデバイスの製造における本発明のlncRNAの調節因子の使用、また同様に、そのように改造された外科用又は医療用のデバイス又はインプラント自体に関する。本発明のデバイス及びインプラントは、標的とされる組織又は臓器、例えば血管又は心臓である作用部位における、制御され、空間的に制限された本発明のlncRNAの調節因子の投与に有用である。
【００７６】
本発明は、別の態様において、TYKRIL（AP001046.5としても知られる）、MIR210HG、RP11-367F23.1、H19、RP11-44N21.1、AC006273.7、RP11-120D5.1、RP11-443B7.1、AC005082.12、RP11-65J21.3、又はAC008746.12から選択されるlncRNAの発現及び／又は機能の調節因子をスクリーニングするin vitro方法であって、該方法は、
（a）周皮細胞の試料を準備することと、
（b）任意に、周皮細胞の試料において低酸素状態を誘導することと、
（c）周皮細胞の試料を候補化合物と接触させることと、
（d）周皮細胞の試料において下記の少なくとも1つを判定することと、
（i）lncRNAの発現レベル
（ii）PDGFRの発現レベル
（iii）内皮細胞への周皮細胞の動員
（iv）周皮細胞の増殖
（v）p53の活性又は発現
（vi）p53とヒストンアセチルトランスフェラーゼp300との（of）相互作用
を含み、ここで、対照と比較した（i）〜（vi）のいずれかの著しい変化が、前記候補化合物がlncRNA発現及び／又は機能の調節因子であることを示す、方法を提供する。
【００７７】
この方法は、上述の実施形態の状況で使用される阻害剤を同定するために使用されることが好ましい。
【００７８】
対照と比較して（i）及び／又は（ii）における発現の減少、及び／又は対照と比較して（iii）における動員不全、及び／又は（iv）における増殖の減少、及び／又は（v）におけるp53の発現若しくは活性の変更、及び／又は（vi）におけるp53とその活性化補助因子p300との相互作用の変更が、候補化合物がlncRNAの発現及び／又は機能の阻害剤であることを示す。
【００７９】
工程（d）において少なくとも（i）が判定される上のスクリーニング方法が最も好ましい。
【００８０】
スクリーニング方法において、工程（b）及び工程（c）が逆順に、又は同時に行われてもよいことは当業者にとって明らかである。
【００８１】
本発明において、本発明のlncRNAの発現レベルは、当業者によく知られている定量的PCR分析によって判定されることが好ましい。周皮細胞の動員を検出するため、例えば、実施例の欄に記載されているように、マトリゲルアッセイを行うことが好ましい。
【００８２】
上記方法は、別の実施形態では、TYKRIL（AP001046.5としても知られる）、MIR210HG、RP11-367F23.1、H19、RP11-44N21.1、AC006273.7、RP11-120D5.1、RP11-443B7.1、AC005082.12、RP11-65J21.3又はAC008746.12から選択されるlncRNAの阻害剤を同定するためにある。
【００８３】
本明細書において上に言及されるように、本発明はまた、本発明のlncRNAのアゴニストを提供する。かかるアゴニストは、好ましい実施形態ではlncRNA発現コンストラクトから選択されてもよい。
【００８４】
本発明の態様は、本発明の、核酸分子、好ましくはアンチセンス分子又はlncRNA分子を含む様々なビヒクルに関する。ビヒクルとは、それと共に遺伝物質を移すことが可能な作用因子と理解される。本明細書では、かかるビヒクルは、核酸コンストラクト、ベクター、並びにウイルス及び細胞等の送達ビヒクルとして例示される。
【００８５】
核酸コンストラクト又は発現コンストラクトとは、遺伝子操作された核酸と理解される。核酸コンストラクトは、非複製的な線形核酸、環状発現ベクター、自律複製プラスミド、又はウイルス発現ベクターであってもよい。核酸コンストラクトは、限定されないが、遺伝子若しくはそのフラグメント、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリAテイル（通常、lncRNAに必要でない）、リンカー、マーカー、及び統合のための宿主相同配列等のいくつかの要素を含んでもよい。核酸コンストラクトを操作する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds., ColdSpring Harbor Laboratory, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい）。さらに、本発明は、本発明のlncRNA配列の送達に直接使用することができる、修飾された核酸、特に化学修飾されたRNA（modRNA）を提供する（Zangi L. et al, "ModifiedmRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascularregeneration after myocardial infarction" 2013, Nat Biotechnol）。かかる修飾RNAは、3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')Gキャップアナログの使用によって産生され、Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, et al. Highly efficient reprogrammingto pluripotency and directed differentiation of human cells with syntheticmodified mRNA. Cell Stem Cell. 2011;7:618-630に記載される。
【００８６】
いくつかの核酸分子は、同じコンストラクト内にコードされてもよく、有効なリンカーによって連結されてもよい。有効なリンカーの用語は、コンストラクトを介して、コードされた核酸の発現を確実にするように2つの部分の核酸コンストラクトを接続する、ヌクレオチドの配列を指すと理解される。
【００８７】
プロモーターの用語は、RNAポリメラーゼに対する開始部位に密集する一群の転写調節モジュールを指すため本明細書において使用される。この最もよく知られている例はTATAボックスであるが、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチド転換酵素遺伝子に対するプロモーター及びSV40後期遺伝子に対するプロモーター等のTATAボックスを欠くいくつかのプロモーターでは、開始部位自体に重なる別々のエレメントが開始の場所を固定することを支援する。
【００８８】
追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の上流30 bp〜110 bpの領域に位置するが、最近、多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示された。プロモーターに応じて、個別のエレメントが転写を活性化するために協働して又は独立して機能することができるようである。核酸コンストラクトによってコードされる配列の転写開始を指示することができる任意のプロモーターを本発明において使用してもよい。
【００８９】
本発明の態様は、少なくとも1つの核酸分子の配列の前に少なくとも1つの核酸分子の発現を可能とするプロモーターがある核酸コンストラクトを含む。
【００９０】
プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、生物特異的プロモーター、組織特異的プロモーター及び細胞型特異的プロモーターの群から選択されることが更なる態様である。プロモーターの例として、限定されないが、構成的プロモーター、例えばシミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス長鎖末端反復配列プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、ヒトアクチンプロモーター、ヒトミオシンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、及びヒト筋肉クレアチンプロモーター等、誘導性プロモーター、例えばメタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーター（tet-on又はtet-off）等、組織特異的プロモーター、例えばHER-2プロモーター及びPSA随伴プロモーター等が挙げられる。
【００９１】
本発明の態様は、ベクターと呼ばれる送達ビヒクルに含まれる、上記のいずれかに記載される核酸コンストラクトを含む。送達ビヒクルは、ヌクレオチド配列を少なくとも一方の媒体から他方へと移すことが可能な実体である。送達ビヒクルは、核酸コンストラクト内にコードされた配列の発現、及び／又はコンストラクトの細胞内の送達に一般に使用される。送達ビヒクルが、RNAに基づくビヒクル、DNAに基づくビヒクル／ベクター、脂質に基づくビヒクル、ウイルスに基づくビヒクル及び細胞に基づくビヒクルの群から選択されるビヒクルであることが本発明の範囲に含まれる。かかる送達ビヒクルの例として、限定されないが、生分解性ポリマーミクロスフェア、脂質に基づく製剤、例えばコロイド金粒子上にコンストラクトを被覆する、リポソーム担体、リポ多糖、ポリペプチド、多糖、ウイルスビヒクルのペグ化が挙げられる。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態は伝達ビヒクルとしてウイルスを含み、このウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、フォーミーウイルス、サイトメガロウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ポックスウイルス、RNAウイルスベクター及びDNAウイルスベクターの完全に網羅しているわけではない群から選択される。かかるウイルスベクターは、当該技術分野においてよく知られている。
【００９３】
また、in vitroで周皮細胞の機能を調節するため、本明細書に開示されるlncRNAの上述のアゴニスト又は阻害剤の使用が提供される。調節は、アゴニスト又は阻害剤が使用されるかどうかに応じて、周皮細胞の増殖、PDGFR発現又は内皮細胞動員に正に又は負に影響を及ぼし得る。
【００９４】
本発明のlncRNAは、低酸素状態により上方制御されると同定されることから、心血管の虚血及び腫瘍低酸素状態の指標である。したがって、本発明のlncRNAは、診断マーカーとして更に有用である。したがって、別の態様において本発明は、患者において心血管の虚血又は腫瘍低酸素状態を層別化する、モニタリングする又は診断する方法であって、（a）患者の試料を準備する工程と、（b）TYKRIL（AP001046.5としても知られている）、MIR210HG、RP11-367F23.1、H19、RP11-44N21.1、AC006273.7、RP11-120D5.1、RP11-443B7.1、AC005082.12、RP11-65J21.3又はAC008746.12から選択される少なくとも1つのlncRNAのレベルを判定する工程とを含み、健常な対照と比較したlncRNAのレベルの増加が、患者における心血管の虚血又は腫瘍低酸素状態を示す、方法を提供する。特に、心血管の虚血又は腫瘍低酸素状態は、本明細書に別記される心血管疾患又は各腫瘍性疾患の存在の指標である。
【００９５】
患者から「試料を準備する」工程は、患者で直接行われるいかなる侵襲的な手技も除外すると理解されるものとする。したがって、本発明の診断方法は、ex vivo法又はin vitro診断方法等の非侵襲的な方法であることが好ましい。
【００９６】
lncRNAのレベルを判定する工程は、本発明のlncRNAの配列と同一又は相補的である少なくとも1つのプライマー又はプローブの使用を含むことが好ましい。本発明の知識を使用する当業者は、発明活動を利用することなく、開示される診断目的のための少なくとも1つのlncRNAの発現レベルを検出するためプライマー又はプローブを設計し得る。
【００９７】
本発明において「患者」の用語は、その実施形態及び態様の全てにおいて哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００９８】
「試料」の用語は、組織試料、例えば心臓／肺／脳／腎臓／肝臓／脾臓の組織試料、又は液体試料、好ましくは全血試料、血清試料若しくは血漿試料等の血液試料、又は腫瘍試料である。
【００９９】
「健常な対照」の用語は、本発明の診断において（i）心血管の虚血若しくは腫瘍低酸素状態を患っていない、若しくはそれを発症するリスクのない被験体に由来する試料中の1以上のlncRNAのレベル、又は（ii）例えば、医学的治療を行う前又は行った後の種々の時間点における同じ被験体に由来する試料中の1以上のlncRNAのレベルに対応する。後者の対照は、モニタリング目的に特に有用である。
【０１００】
本発明において、患者の層別化のため、患者の試料において上記診断方法に従ってlncRNAレベルを検出してもよい。対照と比較して試料中でlncRNAが上方制御される場合、患者の腫瘍は、lncRNA阻害剤及び治療の使用に関連する本明細書に開示される態様によるlncRNAの阻害剤を使用する治療に対して適格とする。
【０１０１】
さらに、診断方法は、患者における治療の成功をモニターするために適用されてもよい。この目的のため、本発明の診断方法は、適用された治療が患者において（in thepatient）心血管の虚血又は腫瘍低酸素状態の軽減に成功したかどうかを観察するため、定期的な時間点で繰り返される。
【０１０２】
患者の試料中のlncRNAのレベルを判定するため、当業者は、直接的又は間接的にRNA分子を定量するのに適用可能な任意の方法を使用してもよい。これは、ELISA、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、フローサイトメトリー、フローサイトメトリー−FISH、lncRNAに対する抗体、in situハイブリダイゼーション、及び定量的PCR技術等の技術を含む。
【０１０３】
本発明の好ましい診断用lncRNAは、TYKRILである。したがって、本発明の好ましいプライマー及びプローブは、TYKRIL発現の検出について実施例の欄で開示されるそれらの配列である。しかしながら、本発明は、それらの特に好ましい実施形態に限定されると理解されるものではない。
【０１０４】
配列番号1：TYKRIL配列（TYKRILゲノムDNA配列が提供される。TYKRIL RNA分子は同じ配列を含むが、RNAであるため、チミンに代えてウラシルを含む）。
配列番号2、配列番号3、配列番号4：TYKRIL LNA-GapmeR配列及び対照
配列番号5、配列番号6  TYKRILプライマー
配列番号7、配列番号8  ネズミ科TYKRILプライマー
配列番号9〜配列番号12  ネズミ科TYKRILLNA GapmeR配列。
【実施例】
【０１０５】
材料及び方法
細胞培養
製造業者によって推奨されるヒト周皮細胞（2継代〜9継代；米国カリフォルニア州カールスバッドのScienCell製）を培養した。細胞を5 % CO2、20 % O2、37℃及び加湿雰囲気で維持した。hPC培地は、ペニシリン／ストレプトマイシン（Roche Diagnostics）及び10 %ウシ胎仔血清を補足したDMEM Glutamax（米国カリフォルニア州カールスバッドのGibco、Life Technologies）で構成された。先に記載される通りHUVECを培養した22。
【０１０６】
低酸素状態の誘導
低酸素状態を、低酸素インキュベータ（ドイツ国ゲッティンゲンのLabotect）を使用して誘導した。使用に先立ち、加湿雰囲気において1 % O2、5 % CO2で一晩、細胞培養培地を予め平衡化した。酸素正常状態の細胞培養培地を、低酸素状態の培地に注意深く切り替え、低酸素状態のpO2レベルを、以前に詳細に記載されるOxford Optronix（英国オックスフォード）製の低酸素感知プローブでpO2レベルを測定することにより確認した32。PCを24時間に亘って低酸素雰囲気で維持した。実験操作を24時間後に行った。
【０１０７】
トランスフェクション
細胞を60 %〜80 %の培養密度に生育し、製造業者の指示に従って50 nmol/lのLNA GapmeR（デンマーク国（Denmark）ベズベックのExiqon）と共にLipfectamineを使用して、Optimem培地（いずれも米国カリフォルニア州カールスバッドのLifetechnologies製）で4時間トランスフェクトした。対照を、スクランブルLNA GapmeR対照でトランスフェクトした。LNA Gapmerトランスフェクションの4時間後、Optimem培地を正常細胞培養培地と交換した。全ての実験操作を、トランスフェクションの48時間後に行った。
【０１０８】
マトリゲル共培養アッセイ
緑色蛍光タンパク質を発現するヒト周皮細胞を、標準的な形質導入手順に従い、レンチウイルスを用いたウイルス形質導入によって作出した。希望に応じ、詳細な形質導入プロトコルを入手することができる。形質導入に続き、PCをLNA GapmeR又はスクランブル対照で処理した。内皮細胞は、アセチル化されたLDLを特異的に吸収する（take up）ことが知られている33。内皮細胞を特異的に標識化するため、共培養処置に先立ってHUVECをアセチル化Dil-LDLで一晩染色した（10 μg/ml、Cellsystems）。マトリゲルアッセイのため、細胞外マトリクスゲルを氷上で溶かした。その後、冷たいゲル150 μlを、ピペットを使用して、予め冷却した24ウェルプレート（Corning）へ注意深く移した。100.000 HUVECをゲルに適用し（applied）、37℃、5 %CO2で3時間インキュベートした。後に、10.000のGFP発現PCを添加した。インキュベーションの更に3時間後、PC培地を注意深く除去し、別の部分の冷たいゲルをウェルへ注意深く移した。30分後、別の500 μlの細胞培養培地を用いた。一晩のインキュベーションの後、4 % PFA（Roti-Histofix、Carl Roth）中で10分間、ゲル内の細胞を固定し、共焦点画像化を使用して、1つのプローブ当たり3つの無作為に選ばれた視野（field per view）を取得した。動員された周皮細胞を、HUVEC内皮細胞膜に付着しているGFP陽性細胞として定義した。1つの視野当たりの動員されたPCを、Fiji Cellカウンターツールを使用して計数した。対照と関係するPC動員における相対的変化が提示される。
【０１０９】
細胞間染料転写アッセイ
HUVECを6ウェルプレートに蒔いた。60%〜80 %の培養密度で、製造業者の指示に従って、CellTraceカルセイングリーンAM（Lifetechnologies）でHUVECを染色した。PCを培養皿中でコンフルエント（confluency）まで生育させ、CellTraceカルセインレッドAM（10 μmol/l、30分間、Lifetechnologies）で標識化した。その後、PCを洗浄し、トリプシン処理してHUVECを生育させた培養6ウェルプレートに移した（30.000 PC/ウェル）。7時間の共培養の後、生存する細胞の画像化を行った。
【０１１０】
RNAディープシーケンシング
リボソームを枯渇させたヒト周皮細胞由来全RNAの分析をすることによって、RNAディープシーケンシングを行った。DNA消化を含む製造業者の指示に従ってRNeasy Mini Kit（Qiagen）を使用して、RNAを単離した。後に、RNAを断片化し、cDNA合成のためにプライムした（primed）。製造業者によって推奨されるTruSeq RNA Ribo-ZeroGlobinキット（Illumina製）を使用してライブラリを作製した。Illumina HiSeq 2000フローセルをシーケンシングに使用した。lncRNAアノテーションをNONCODEデータベース（noncode.org）に基づいて行った。
【０１１１】
定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）及びRNA単離
DNA消化工程を含む、製造業者によって推奨されるRNeasy Mini Kit（ドイツ国ヒルデンのQiagen）を使用して、PCから全RNAを単離した。核及び細胞質基質の画分を、別記される通り作製した34。500 ng〜1000 ngのRNAを、40 μlの反応容量で、MulV逆転写酵素（Lifetechnologies）によってランダムヘキサマープライマー（米国ウォルサムのThermoScientific）を用い、逆転写した。Fast SYBRグリーン又はSYBRグリーン（米国、フォスターシティのApplied Biosystems）及びcDNAを、qRT-PCRに使用した。Viia7又はAppliedBiosystems製のStepOnePlusを使用した。CT値をリボソームRPLP0に対して正規化した。相対的な遺伝子発現レベルを下記式によって特定した：2−デルタCT；デルタCT＝CT標的−CT対照。
【０１１２】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析を、FACSCento II（BD Biosciences）において標準的な手順に従って行った。各ヨウ化プロピジウム染色手順に対する詳細なプロトコルを、希望に応じ入手することができる。
【０１１３】
タンパク質単離、SDS-Page及びウェスタンブロッティング、並びに免疫蛍光法
標準的な免疫蛍光染色手順を、以前に記載される通り行った35〜37。簡潔には、細胞をPBSで洗浄し、約5分間氷冷アセトン中で固定した。洗浄後、細胞をPBS中、5 %ロバ血清（ドイツ国ハンブルク（Humburg）のDianova）、0.3 % Triton X-100で室温にて2時間ブロックした。2 % BSA、0.1% Triton X-100を含むPBS中で、一次抗体を一晩インキュベートした。二次抗体及びHoechst（Lifetechnologies、1/1000）を、2 % BSA、0.1%アジド中で更に2時間インキュベートした。SDS Pageのタンパク質単離のため、細胞を氷冷PBSで一回洗浄し、液体窒素中で急速凍結し、プロテアーゼ阻害剤（Roche Diagnostics）を補足したRIPAバッファー（米国ロックフォードのThermo Scientific）を適用した。その後、細胞を氷冷したラバーポリスマンで掻き取り、撹拌しながら氷上で45分間インキュベートした。後に、プローブを4℃、5000 RPMで10分間遠心分離機にかけた。上清を氷冷バイアルに移し、 製造業者の指示に従って、Roti-Quant（ドイツ国カールスルーエのCarl Roth）を用いるBradfordアッセイを行うことによってタンパク質濃度を特定した。タンパク質試料を、等容量の2×Laemmliバッファー（SigmaAldrich）と混合した。ゲル（Mini-Protean TGX、BioRad）に1つのレーン当たり20 μg〜30 μgのタンパク質を入れた。TBST（BioRad）中、100 Vで1時間に亘って、SDS pageを行った。製造業者の指示（ThermoScientific）に従ってPierce G2 Fast Blotterを使用し、ウェスタンブロッティングを行った。
【０１１４】
PDGF刺激
周皮細胞を80 %の培養密度まで生育させ、PDGF刺激を以前に記載される通り行った2。その後、血清不含PC培養培地中においてPCを1時間に亘って飢餓状態にした。飢餓の後、PCを100 ng/mlのPDGF-AA（Sigma Aldrich製）又は溶媒対照で2時間処理した。後に、更に5分間、PCをPDGF-BB（Sigma製、30 ng/ml）で刺激した。最後に、PCに由来するタンパク質内容物を単離し、リン酸化AKT（ser473）に対してイムノブロッティングを行った。タンパク質試料中の全AKT内容物を可視化するため、同じフィルタ剥がして、pan-AKT抗体を用いて再度免疫ブロッティングした。
【０１１５】
LNA Gapmerトランスフェクション
以前に詳細に記される通り、LNA Gapmerトランスフェクションを行った22。簡潔には、細胞を50 %〜60 %の培養密度まで生育させた。後に、トランスフェクションは製造業者の指示に従い、Lipofectamine（Lifetechnologies製）を用いて行った。GapmeR又は対照の配列を50 nmol/lの濃度で使用した。PCをOptiMEM培地（Gibco製）で短時間洗浄した後、OptiMEM培地中、トランスフェクション混合物と共にPCを4時間インキュベートした。最後に、トランスフェクション剤を含むOptiMEM培地を除去し、PC培養培地中、5 % CO2、37℃にて、加湿雰囲気で更に48時間、PCをインキュベートした。GapmeR配列は以下の通りであった：
【０１１６】
LNA #1：5'-3'：AGAGGTGATTAAGGT
LNA #3：5'-3'：AGTGAAGGACAGAGGC
対照：5'-3'：AACACGTCTATACGC
【０１１７】
抗体
一次抗体：抗PDGFRβ（Neuromics、GT15065、wb：1/2000；IF：1/200）、抗αSMA（Abcamab7817、wb 1/200；IF：1/100）、抗デスミン（Abcam ab32362、wb：1/300）、抗NG2（Millipore AB 5320、wb：1/1000）、抗Ki67（Abcamab15580、IF：1/200）、抗チューブリン（ab6160、wb：1/5000）、抗vWF（Abcam ab11713、IF：1/200）、抗HIF1α（BDTransduction610958、wb：1/1000）、抗pan-AKT（Cell Signaling 9272、1：1000）；抗ホスホ-AKTSer473（Cell Signaling 9271）。抗p53（近接ライゲーションアッセイ用のAbcam ab179477）、抗p300（ActivMotif #61401）、抗p53（Thermo Scientific、MA5-12557、1：100、免疫ブロッティング用）、抗HA（Cell Signaling、#2367s 1：1000）、抗Cas9（CellSignaling、#14697S 1：1000）。
二次抗体：抗ヤギcy3（Dianova 705-165-147、1/200）；抗ウサギ647（Dianova647711-605-152、1/200）；抗ウサギcy2（Abcam ab150073、1）；抗ウサギHRP（Abcam ab16284）；抗ラットHRP（Abcam ab102265）；抗マウスHRP（ab97030）；抗ヤギHRP（Abcam ab97110）：
【０１１８】
共焦点顕微鏡検査及び画像解析
Leica SP5共焦点セットアップ（Leica Microsystems）を画像解析に使用した。Zスタックを2 μm以下のステップサイズで取得した。励起波長は以下の通りであった：405 nm、488 nm、552 nm又は638 nm。画像を、windows用のFijiis just ImageJを使用して更に分析し、加工した。Ki67又はPIの陽性細胞を分析するため、自動化Fiji粒子分析を使用した。G1、S、G2及び有糸分裂における細胞、又は死細胞のパーセンテージをそれぞれ特定するため、Ki67又はPIの数をHoechst陽性細胞数と関連づけた。自動化された細胞計数処理の工程プロトコルによる詳細な工程は、希望に応じ入手可能である。
【０１１９】
統計学的分析
結果を、平均+/-平均の標準誤差（SEM）で示す。全ての実験を、少なくとも1つの実験及び条件当たり3回行った。データを、windows用のGraphPad Prism 6（米国カリフォルニア州サンディエゴのGraphpad）、及びマイクロソフトexcelを使用して分析した。帰無仮説をα＜0.05で棄却した。データセットをピアソン及びダゴスティーノオムニバス法を使用し、正規性について確認した。ガウス分布の場合、データセットを独立両側スチューデントのt検定を使用して分析した。ピアソン及びダゴスティーノオムニバス検定に合格しなかったデータセットを、両側マンホイットニーU検定を使用して分析した。
【０１２０】
プライマー
TYKRIL：
フォワードプライマー配列5'-3'：CACCTGCCTGGGAAGTTTCA
リバース（Backward）配列5'-3'：ATCTGGATCTGTGTGGTGCC
更なるプライマー配列が、希望に応じ入手可能である。
【０１２１】
近接ライゲーションアッセイ
製造業者（DUO92101 SIGMA、Sigma製のDuolink（商標）In Situ Red Starter Kit Mouse/Rabbit）によって推奨される通りにアッセイを行った。簡潔には、先に記載されるように細胞を12ウェルチャンバースライドに蒔き、LNA GapmeRで処理した。ドキソルビシン（Doxo）処理のため、染色処置に先立って、細胞を1 μg/mlドキソルビシンと共に24時間インキュベートした。LNAトランスフェクション又はDoxo処理の後、細胞を氷冷PBSで洗浄し、氷冷アセトン中で10分間固定した。洗浄及び30分間のブロッキングの後、一次抗体（p53：Abcam #ab179477ウサギ  1：500；ActivMotic製p300#61401、マウス、1：2000）を、37℃で2時間インキュベートした。その後、PLAプローブ（1:5）を添加し、37℃で1時間、インキュベートした。その後、細胞を2回洗浄し、ライゲーション試薬（1:5）を37℃で30分間インキュベートした後、ポリメラーゼ溶液（Sigma）を用いて増幅した。最後に、Hoechstを10分間インキュベートし、プローブをフルオロマウント（fluoromount）に包埋した。画像化をLeica SP5共焦点によって行い、励起波長は以下の通りであった：405 nm、488 nm、553 nm。Zスタック最大投射は、2 μmのzステップサイズで示される。
【０１２２】
デュアルルシフェラーゼレポーター配列：
転写調節因子の活性の測定を、製造業者（manufacturer's）の指示に従って、Qiagen製のデュアルルシフェラーゼ「Cignal 45-PathwayReporter Array」を用いて、TYKRILノックダウンの際に48時間行った。簡潔には、前に記載される通り、TYKRILをサイレンシングした。ノックダウンの48時間後、cignal 45-Pathway Reporter Arrayプレートにおいて、細胞を1ウェル当たり4×104細胞の密度で蒔き、LipofectamineRNAimaxと共に37℃、5 % CO2で4時間、インキュベートした。その後、培地を周皮細胞成長培地に切り替えた。それから24時間後、ホタル由来のルシフェラーゼ活性及びウミシイタケルシフェラーゼを、promegaGloMax多重検出システムで測定した。
【０１２３】
内因性TYKRIL過剰発現RNAに導かれる遺伝子活性化
ヒト周皮細胞を、ピューロマイシン選択マーカー及びHAタグを持つレンチウイルスpHAGE Ef1alpha dCAS9-VP64（Addgene #50918）で形質導入した。形質導入の後、形質導入に成功した周皮細胞を、ピューロマイシン処理（10 mg/ml）によって選択した。形質導入の成功の確認のため、HA及びCAS9に対するイムノブロッティングを、形質導入の成功を確認するためにタンパク質試料において行った。その後、TYKRILプロモーター領域に対するガイドRNAブロックにより、dCAS9-VP64を発現するhPCをトランスフェクトした。TYKRIL及びPDGFRβの分析のためのRNA及びタンパク質の試料を、gRNAブロックトランスフェクションの48時間後に収集した。gRNAブロックミックス及びプライマーの配列は希望に応じ入手可能である。
【０１２４】
架橋RNA免疫沈降
周皮細胞タンパク質溶解物に由来するp53免疫沈降を、p53ビーズ（p53-trapChromotek #pta-20-キット）を使用して行った。陰性対照として、GFPビーズを使用した（Chromotek製GFP-trap）。簡潔には、周皮細胞を洗浄し、急速凍結し、溶解した。タンパク質溶解物を製造業者によって推奨されるp53又はGFPのビーズと共にインキュベートした。IPに続いて、ビーズを20 μlのプロテイナーゼKバッファー中に再懸濁させ、55℃にて30分間インキュベートした。その後、プローブを4℃、1000 gで約60分間、遠心分離機にかけた。遠心分離の後、先に記載されるQiazol（Qiagen MiniRNA Kitによる700 μlのQiazol）を使用してRNAを単離した。RNAを逆転写し、リアルタイムPCRによって前に述べられた通りTYKRILを測定した。タンパク質単離に先立ち、タンパク質結合RNAを共有結合するため、周皮細胞をUV-C光に曝した。
【０１２５】
ネズミ科TYKRILに対するプライマー配列
フォワード：AATAAAGCAGTGGGTGCTGGG（配列番号7）
リバース：ACTGTTGCAACCCATTTATCTGA（配列番号8）
【０１２６】
ネズミ科LNA Gapmerの配列：
mLNA#1：GGCACACGAACAGCTG（配列番号9）
mLNA#2：TGGCACACGAACAGCT（配列番号10）
mLNA#3：TGTCTGCACTTAATTA（配列番号11）
mLNA#4：GTCTGCACTTAATTAA（配列番号12）
【０１２７】
in vivoでのネズミ科TYKRILノックアウト：
HPLCで精製したLNA GapmeRを、20 mg/体重kgの用量で腹腔内注射した。注射の48時間後、マウスをイソフルラン過剰服用によって屠殺し、9 ml/分の定流でPBSにより心臓を通して灌流した。後に、臓器を摘除し、RNA及びタンパク質の単離のため急速凍結した（snapfrozen）。
【０１２８】
実施例1：ヒト周皮細胞の特性評価
本研究で使用されるヒトPCを有効にするため、本発明者らは、タンパク質レベルに対していくつかの確立されているPCマーカーの発現を評価した。免疫蛍光法は、PC中のPDGFRβ（図2A）、αSMA及びNG2のロバストな発現を明らかにした。定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）と同様、PDGFRβ、NG2、デスミン及びαSMAに対するPC溶解物の免疫ブロッティング（図2B）は、免疫蛍光法の知見を更に裏付けた。内皮マーカーであるフォンビルブラント因子に対する対比染色は、内皮細胞によるPC培養物のいかなる顕著な量の汚染も示さなかった。PCを同定する別の特徴は、内皮細胞との細胞間結合を形成するそれらの能力である。PCとHUVECとの間の共培養アッセイにおける生細胞画像化は、両方の細胞型の間の細胞間染料転写を明らかにし、HUVECとPCとの間の細胞質画分の交換を示した（図2C）。
【０１２９】
実施例2：ヒト周皮細胞における低酸素状態により調節されたlncRNA TYKRILの同定及び特性評価
PCにおける病理学的に関連するlncRNAを同定するため、本発明者らは、心血管虚血及び腫瘍低酸素状態を模倣するために大気性低酸素状態にPCを供した。細胞を、加湿雰囲気において1 % O2及び5 % CO2に24時間曝した。低酸素状態は、細胞培養培地におけるpO2の有意な低下をもたらした（図1A）。さらに、低酸素状態は、模範的な低酸素状態応答遺伝子であるVEGFAの上方制御（図1B）、及び免疫ブロッティングによって示されるHIF-1α発現の増加（図1C）を誘導した。虚血は、ヒトPCにおいて約3パーセントの僅かな細胞死の比率をもたらし（図1D及び図1E）、大多数のPCが本発明者らの実験的低酸素状態の設定において生存したことを示した。ディープシーケンシング分析は、PC中の30の有意に（n=3；P＜0.05）調節されたlncRNAを同定した。ヒートマップは、TYKRILを含む最も有意に調節されたlncRNAの選択を表す（図2D）。低酸素状態によるTYKRILの上方制御を、qRT-PCRによって確認した（図2E）。TYKRILの細胞内局在性を特定するため、本発明者らは、酸素正常状態及び低酸素状態の下での細胞質ゾルの及び（und）核の画分においてqRT-PCRを行った。ここで、本発明者らは、TYKRILが低酸素状態下の核へ局在する傾向により、両方の細胞コンパートメント中に存在することを見出した（図2F）。図2Gのパネルは、TYKRIL（出所：lncipedia.org）の推定される二次構造を表す。TYKRILは、コーディング遺伝子CRYAA（上流）及びSIK-1（下流）によって挟まれた、長鎖遺伝子間非コーディングRNAであり、転写産物ENST00000435702の隣の染色体21:44778027-44782229に局在化される（図2H）。本発明者らのRNAseqデータに由来するFKPM読取り範囲（coverage）に関するデータは、低酸素状態下のエキソン1及びエキソン2の高い読取り範囲を示す一方、近隣の配列の上流及び下流の読取り範囲は、FKPM読取りにおいて僅かである。
【０１３０】
実施例3：LNA GapmeRによるTYKRILノックダウン
TYKRILの生体機能を研究するため、本発明者らは、ロックド核酸（nucleic acid）GapmeR戦略を使用して、TYKRILをサイレンシングした。TYKRILアンチセンス配列を挟むロックド核酸を設計した（Exiqonから購入した）。TYKRILに対するLNA GapmeRの結合は、PC中のTYKRIL発現レベルの有意なノックダウンをもたらす（図3B）、RNアーゼH消化を誘導する（図3A）。TYKRILノックダウンの生物学的意義を強化するため、2つの異なるLNA GapmeR配列（LNA#1及びLNA#3）を使用して、LNA GapmeRの可能性のあるオフターゲット効果を最小限にするため、標的をサイレンシングした。両方の配列は、TYKRILの有意な減少をもたらす。
【０１３１】
実施例4：TYKRILサイレンシングはタンパク質及びmRNAのレベルでPDGFRβ発現を下方制御する
本発明者らが低酸素状態によるmRNA及びタンパク質のレベルに対するPDGFRβの有意な上方制御を観察したことから（図4A、図4B）、本発明者らは、低酸素状態誘導性lncRNA TYKRILがPDGFRβ発現の効果を有するかどうかという疑問に興味を持った。LNA GapmeRによるTYKRILのサイレンシングは、PDGFRβ mRNA（図4C）及びPDGFRβタンパク質レベル（図4D）の減少をもたらした。PDGFRβは周皮細胞機能、細胞生存及び増殖に極めて重要であることがよく知られている。イマチニブによるチロシンキナーゼ阻害がPCの喪失を誘導することが、更に詳しく記載されている。イマチニブは、幹細胞受容体Abl及びKit25等のPDGF受容体に作用する非選択的キナーゼ阻害剤であり、臨床では、例えば癌治療において使用される。したがって、TYKRILサイレンシングによる特定のPDGFRβの下方制御がin vitroでのイマチニブの効力を強める可能性があるかどうかという疑問に対し、本発明者らは興味を持った。本発明者らは、PCがTYKRILノックダウンによりイマチニブに対する化学療法の処理により敏感になることを見出した（図4E）。イマチニブ単独処理は細胞の生存率を約20 %減少させたのに対し、TYKRILサイレンシングはこの作用を押し上げ、およそ45 %の細胞生存率の減少をもたらした。興味深いことには、Ki67増殖指数の減少によって示されるように（図4G）、TYKRILノックダウンによるPDGFRβの喪失は、細胞増殖の阻害によってPC細胞数を減少させた（図4F）。さらに、本発明者らは、スクランブル対照に対して、TYKRILサイレンシングによる細胞死の僅かな増加を検出した（図1F）。
【０１３２】
実施例5：TYKRILノックダウンは下流PDGFRβシグナル伝達を減じる
PDGFRβ下流シグナル伝達に対するTYKRILサイレンシングの効果を検討するため、本発明者らは、PDGF刺激実験を行った。選択的なPDGFRβ刺激を達成するため、本発明者らは、前に記載されるPDGF-AAでPCを前処理した。細胞増殖等の細胞機能を制御するPDGFRβの確立された下流のシグナル伝達経路は、AKT2である。予想通り、AKTリン酸化は、免疫ブロッティングによって示されるように、TYKRIL LNAGapmerで処理したPCでは有意に減少される（図5）。これらの結果は、TYKRILの喪失がPDGFRβの損失をもたらすことを説明し、また下流のシグナル伝達（signaling transduction）と関連づけた。
【０１３３】
実施例6：TYKRILは内皮細胞へのPC動員に不可欠である
PDGFRβシグナル伝達は内皮細胞へのPC動員に不可欠である。TYKRILがPC動員に影響を及ぼすかどうかを評価するため、本発明者らはTYKRILノックダウンの際にマトリゲル共培養アッセイを行った。ここで、LNA調節配列で処理したPCと比較して、TYKRILサイレンシングがHUVECへのPC動員を有意に減じたことがわかった（図6）。
【０１３４】
ここで、本発明者らは、低酸素状態がヒトPCにおけるlncRNA発現の著しい変化を引き起こすことを実証する。さらに本発明者らは、低酸素状態により誘導された長鎖非コーディングRNA TYKRILは血管新生促進性lncRNAであり、すなわち、PDGFRβ発現の誘導による、PC増殖の安定化、PC動員、及びPC細胞死の予防によって適切なヒトPC機能に必須であることを示す。
【０１３５】
本発明の主な知見は次のとおりである：i）TYKRILは、周皮細胞における低酸素状態によって誘導され、PCの核と同様に細胞質ゾルでも発現される。ii）LNA GapmeRによってTYKRILを効果的にサイレンシングすることができ、mRNA及びタンパク質のレベルに対するチロシンキナーゼ受容体PDGFRβの著しい下方制御をもたらす。iii）TYKRILサイレンシングによるPDGFRβの喪失は、PC増殖の減少、PC細胞死の増加、化学療法による治療に対する感受性を増強し、内皮細胞へのPC動員を減じる。
【０１３６】
様々な研究により、遺伝子破壊、又は薬理学的阻害による標的とするPDGFRβシグナル伝達が、マウスのリンパ腫モデルにおいて腫瘍成長を減少させることが可能な血管の機能不全に付随するPCの喪失を誘導することが示された（Ruan, J. et al. Imatinibdisrupts lymphoma angiogenesis by targeting vascular pericytes. Blood 121,5192-5202 (2013)）。さらに、臨床試験は、化学療法によってPC又はPDGFβを標的とすることは、腫瘍の新血管形成の阻害によって臨床転帰を改善することを示した（Apperley, J. F. et al. Response to imatinib mesylate in patientswith chronic myeloproliferative diseases with rearrangements of theplatelet-derived growth factor receptor beta. N. Engl. J. Med. 347, 481-487(2002)）。したがって、TYKRILは、癌の血管新生を減じる新たな治療標的であり、本明細書に記載されるTKRIL阻害剤は、本明細書に上に記載されるような様々な増殖性疾患を治療するのに有用な新薬である。
【０１３７】
PDGFRβシグナル伝達は、内皮細胞、いくつかの腫物細胞株及び血小板を含む様々な細胞型によって分泌される、ペプチドPDGF-BB、すなわちPDGFRα及びPDGFRβに対する強力なリガンドの結合によって開始される。PDGF-BB刺激は、例えば、Ras、PI3キナーゼ及びPLC-γを含むいくつかのシグナル伝達経路を活性化する、様々なチロシン残基の自己リン酸化を誘導する細胞内PDGFRβドメインの二量体化をもたらす。無傷のPDGFRβが細胞増殖に不可欠であり、内皮細胞へのPCの動員を媒介することが十分示され（Tallquist, M. D., French,W. J. & Soriano, P. Additive effects of PDGF receptor beta signalingpathways in vascular smooth muscle cell development. PLoS Biol. 1, E52 (2003)）、それにより血管の成熟を促し、内皮のバリア機能を安定化する。
【０１３８】
また興味深いことに、本発明者らは、TYKRILのサイレンシングが、イマチニブによって薬理学的なPDGFRβ阻害に対するPCの感受性を更に増加させることを見出した。AKTシグナル伝達は、血管の成熟及び安定性に極めて重要であることを示した。ここに示される（shown）データと一致して、Chen et al.はAKTの喪失が血管成熟に影響を及ぼすことを示した。本研究では、本発明者らはTYKRIL欠損PC、周皮細胞の内皮細胞への動員、血管成熟に対する特徴が、おそらくはAKTリン酸化の減少により、有意に減じられることを観察した。したがって、TYKRILは、イマチニブと共に相乗的に作用し、これは驚くべきことである。したがって、TYKRILは、例えば、イマチニブの効力を押し上げることによりリンパ腫治療において癌抵抗性（cancer resistancy）を克服することを支援する。イマチニブに対するTYKRILの相乗的な（synergistic）効果は、他のチロシンキナーゼ阻害剤、具体的には、本明細書で上に言及されるような他のマルチキナーゼ阻害剤、又はPDGFRβ阻害剤へと伝達可能であることは、当業者に明らかである。
【０１３９】
本発明者らはmRNA及びタンパク質のレベルに対するPDGFRβ発現の減少を見出したことから、本発明者らは、PDGFRβの転写を減少させることにより、又はPDGFRβ mRNAの分解により、TYKRILがその機能を働かせることを示唆する。本発明者らの知見は、臨床状況において治療上、妥当である。TYKRILは、低酸素状態条件下で特異的に上方制御され、それは悪性又は血管新生のプロセス及び心血管虚血にも存在する（Zehendner, C. M. et al. Moderate Hypoxia Followed by ReoxygenationResults in Blood-Brain Barrier Breakdown via Oxidative Stress-DependentTight-Junction Protein Disruption. PLoS ONE 8, e82823 (2013)）。さらに、本発明者らは、TYKRILの顕著な調節、並びにi）心不全、ii）PAH及びiii）膠芽腫等の疾患状態におけるTYKRIL-PDGFRβ相互依存を実証する。したがって、TYKRILのサイレンシングは、癌（例えば膠芽腫）における血管新生を阻止するか、又はPAH、卒中又は心筋梗塞における臓器のリモデリングを予防するのに有効な戦略である。
【０１４０】
実施例7：TYKRILはPDGFRβ発現を調節し、腫瘍抗原p53の抑制因子として働く
lncRNAが核において転写因子活性を調節することにより、それらの機能を発揮し得ることが知られている。TYKRILノックダウンは、RNA seq、免疫ブロッティング及びqPCR（図7A〜図7C）によって示される、周皮細胞（pericyte）脱分化及びPDGFRβの喪失をもたらす。TYKRILが部分的に核に局所化したことから（図7D）、転写因子アレイプロファイリング分析を行ってTYKRILの喪失が転写因子活性に効果があるかどうかを評価した。ここで、腫瘍抑制因子p53がTYKRIL喪失の後に最も顕著に上方制御されることがわかった（図7E）。TYKRILノックダウンにおけるRNAseqは、TYKRIL及びp53、並びにp53依存性遺伝子の有意な逆調節（inverse regulation）を実証する（図7F及び図7G）。ドキソルビシン処理による内因性p53活性化は、PDGFRβ発現及びTYKRIL下方制御の有意な低下をもたらした（図7H〜図7J）。p53とTYKRILとの同時サイレンシングは、TYKRILノックダウンによる細胞の生存率喪失に関して完全なレスキューをもたらした（図7L）。これらのデータは、PDGFRβを調節する、TYKRILとp53との間の調節性フィードバックループを指摘する（図7L）。LNA#2の配列は図1〜図6中のLNA#3に相当する。
【０１４１】
TYKRIL機能の獲得を検討するため、RNA誘導性遺伝子活性化5（図8A、図8B）を可能とする転写活性化因子ドメインVP64を持つCAS9突然変異体を本質的に発現するヒト初代周皮細胞を樹立した。TYKRILのRNA誘導性遺伝子活性化は、TYKRIL及びPDGFRβの有意な上方制御をもたらした（図8C、図8D）。重要なことには、gRNAによるLNA GapmeRの同時トランスフェクションは、TYKRIL上方制御を弱め、PDGFRβ過剰発現を減少し（図8E、図8F）、LNA GapmeRの特異性を実証した。LNA#2の配列は図1〜図6中のLNA#3に相当する。
【０１４２】
実施例8：TYKRILは物理的にp53と相互作用することにより、p53活性化補助因子p300の結合を妨げる
TYKRILがどのようにp53活性を調節するかを更に細かく調べるため、架橋RNA免疫沈降実験を行った。TYKRILが腫瘍抗原p53と直接相互作用することがわかった（図9）。p53は、アセチル化及びリン酸化等の翻訳後修飾によってしっかりと調節される。そのため、アセチルトランスフェラーゼp300等の活性化補助因子はp53アセチル化、及び核へのp53-p300複合体の移動をもたらすのに対し、ユビキチンリガーゼMDM2は急速にp53を分解する。近接ライゲーションアッセイ（PLA）は、タンパク質−タンパク質相互作用を正確に定量し、視覚化することを可能とする。TYKRILノックダウンの際のPLA画像化は、TYKRIL喪失の際のp53-p300相互作用の有意な増加を実証する（図10）。これらの結果は、p53に直接結合してp53活性化補助因子p300との直接の相互作用、及びタンパク質複合体の後の核化を遮断することによってTYKRILがp53-p300相互作用を妨げることを説明する。LNA#2の配列は図1〜図6中のLNA#3に相当する。
【０１４３】
実施例9：TYKRIL及びPDGFRβの発現は、肺動脈性高血圧症、心不全及び多形膠芽腫において有意に相関する
ヒト疾患におけるTYKRIL-PDGFRβ相互依存を示すため、心不全と診察された患者の心筋においてTYKRILを測定した（図11A）。心不全は、有意に損なわれた微小循環と関連した。ここで、心不全と診断されていない患者に由来する心筋標本と比較して、TYKRIL及びPDGFRβが有意に減少されたことがわかった（図11B、図11C）。さらに、有意な正相関が心不全疾患におけるTYKRILとPDGFRβとの間にあることがわかった（図11D）。興味深いことに、lncRNA RP11-65J21.3もまた、心不全において有意に減少されるとわかった（対照に対して0.52倍変化、n＝18HF心不全患者、p＜0.05）。要約すると、これらのデータはヒト心疾患におけるTYKRIL-PDGFRβの相互依存を確認する。
【０１４４】
肺動脈性高血圧症は、肺動脈の抵抗を増強する肺の微細血管の内腔を狭くする、収縮細胞の成長異常に部分的に起因する疾患状態である。周皮細胞が収縮特性を示すことが知られているため、TYKRIL及びPDGFRβを、PAHと診断された患者及び対照コホートに由来する肺組織において測定した（図11E）。興味深いことに、TYKRIL及びPDGFRβは互いに有意に相関したことが見出され（図11F）、TYKRIL発現の増強は、健康及び肺疾患におけるPDGFRβの発現の増強に付随することを示した。したがって、異常なPDGFRβ発現がCOPD、線維症、肺気腫等（such as）の肺疾患において役割を果たすことが知られていることから、TYKRILは、肺系統におけるPDGFRβ発現を調節するのに有望な分子標的である（Tomasovic, A. et al. Sestrin 2 Protein Regulates Platelet-derivedGrowth Factor Receptor β (Pdgfrβ) Expression by Modulating Proteasomal and Nrf2 Transcription FactorFunctions. J. Biol. Chem. 290, 9738-9752 (2015)、及びRowley,J. E. & Johnson, J. R. Pericytes in Chronic Lung Disease. Int. Arch.Allergy Immunol. 164, 178-188 (2014)）。
【０１４５】
多形膠芽腫は、異常な血管新生を伴い、予後不良で、ほとんど治療選択肢のない悪性脳腫瘍である。これは、膠芽腫幹細胞が膠芽腫組織の血管再生を促進する周皮細胞を生成する場合があるため、化学療法の無効力、及び切除後の早期の腫瘍再発に起因する。癲癇と診察された患者に由来するn＝19の脳切片と比較した39例の膠芽腫コア領域に由来するRNA seq分析（図11G）は、多形膠芽腫におけるTYKRIL及びPDGFRβの有意な上方制御（図11H、図11I）を明らかにした。これらのデータに基づけば、TYKRILは、PDGFRβ発現を安定化することによって制御されない腫瘍血管新生を促進する。興味深いことに、p53は腫瘍コホートにおいて有意に増強され（図11J）、生理学的条件下でのTYKRIL-p53フィードバックループの離脱を指摘する。
【０１４６】
実施例10：抗TYKRIL LNA GapmeRの単発投与はTYKRIL下方制御及びPDGFRβの喪失をin vivoにおいて誘導する
TYKRILシグナル伝達のin vivoでの関連を実証するため、遺伝子座保存におけるネズミ科TYKRILオルソログを同定した。酸素正常状態及び低酸素状態の条件下での初代マウス周皮細胞から単離したRNAからのゲノム遺伝子座chr17:31805539-31805608（GRCm38/mm10）（図12A）に対するプライマーを用いるPCRは、遺伝子座chr17:31805539-31805608（GRCm38/mm10）から+/-3 kbpに存在する、以前には知られていない低酸素状態により調節されるネズミ科の転写産物の存在を実証する（図12A）。様々なmLNA GapmeRによるネズミ科TYKRILのサイレンシングは、PDGFRβの下方制御をもたらした（図12B）。in vivoでのTYKRILシグナル伝達の関連性を実証するため、mLNA#4を更なるin vivo実験に使用した。マウスにおけるネズミ科TYKRILオルソログを、LNA GapmeRの腹腔内単発注射によってサイレンシングした（図13A）。ここで、心臓（図13B、図13C）、肺（図13D）、肝臓（図13E）、脾臓（図13F）及び腎臓（図13G）におけるTYKRIL及びPDGFRβの下方制御が見られた。これらの結果は、血液脳関門の選択性により、健常なCNS以外の全ての主な臓器系においてin vivoで十分にTYKRILを標的化することができることを示す。重要なことに、ネズミ科TYKRILオルソログの同定は、ヒト疾患を模倣する入手可能な全てのマウスin vivoモデルにおいて、TYKRILシグナル伝達の重要性についてスクリーニングすることを可能とする。
【符号の説明】
【０１４７】
図1
Normoxia  酸素正常状態
Hypoxia  低酸素状態
fold change  倍変化
Actin  アクチン
Cell death  細胞死
Propidiumiodide  ヨウ化プロピジウム
Ctrl  対照
図2
Desmin  デスミン
Actin  アクチン
αTubulin  αチューブリン
Normoxia  酸素正常状態
Hypoxia  低酸素状態
Color Key  色キー
TYKRIL relativeexpression  TYKRIL相対発現
fold change  倍変化
Localisationratio  局在比率
nucleus/cytosol  核／細胞質ゾル
coverage of FKPMreads  FKPM読取りの範囲
図3
TYKRIL relativeexpression  TYKRIL相対発現
fold change  倍変化
Ctrl  対照
図4
PDGFRβ relative expression  PDGFRβ相対発現
fold change  倍変化
Normoxia  酸素正常状態
Hypoxia  低酸素状態
Actin  アクチン
Ctrl  対照
PDGFRβ protein expression  PDGFRβタンパク質発現
αTubulin  αチューブリン
Absorbance  吸光度
Imatinib  イマチニブ
cell numbers  細胞数
Ki67 index  Ki67指数
Control  対照
図6
Control  対照
recruitedpericytes  動員された周皮細胞
fold change  倍変化
Ctrl  対照
図7
Control  対照
Desmin  デスミン
Unchanged  変化なし
Down  低下
PDGFRβ mRNA expression  PDGFRβ mRNA発現
fold change  倍変化
Ctrl  対照
PDGFRβ protein expression  PDGFRβタンパク質発現
RNA Expression  RNA発現
Nucleus vs.Cytosol  核対細胞質ゾル
Normoxia  酸素正常状態
Hypoxia  低酸素状態
relativeluciferase activity  相対ルシフェラーゼ活性
fold change vs.Control  対照に対する倍変化
Up  増加
mRNA relativeexpression  mRNA相対発現
Solvent  溶媒
TYKRIL Knockdownin Pericytes  周皮細胞におけるTYKRILノックダウン
Cell ViabilityAssessment  細胞生存率の評価
Cell viability  細胞生存率
absorbance foldchange  吸光度の倍変化
Scramble  スクランブル
図8
guide RNA  ガイドRNA
TranscriptionalActivation Of Endogenous TYKRIL  内因性TYKRILの転写活性化
TYKRIL Promoter  TYKRILプロモーター
TYKRIL Sequence  TYKRIL配列
αTubulin  αチューブリン
relative RNAExpression  相対RNA発現
Fold Change  倍変化
gRNA mixes  gRNAミックス
Ctrl  対照
Actin  アクチン
TYKRIL Expression  TYKRIL発現
gRNA Ctrl  gRNA対照
PDGFRβ RNA Expression  PDGFRβ RNA発現
図9
human Pericytes  ヒト周皮細胞
Cell lysis andsubsequent IP  細胞溶解及びその後のIP
RNAImmunoprecipitation  RNA免疫沈降
TYKRIL Enrichment  TYKRIL富化
fold change  倍変化
図10
p53-p300interaction  p53-p300相互作用
Doxo neg. Ctrl  ドキソルビシン陰性対照
Doxo  ドキソルビシン
Scramble  スクランブル
p53-p300interactions/nucleus  p53-p300相互作用／核
Control  対照
図11
Patients withDiagnosis of Heart Failure (HF, n=19)  心不全と診断された患者（HF、n=19）
Patients WithoutKnown History Of HF (n=5)  既知のHFの病歴のない患者（n=5）
HeartExplantation for Transplantation  移植用の心臓外移植
HeartExplantation After Fatal Car Accident  致命的な自動車事故後の心臓外移植
TYKRIL and PDGFRβ Expression Analyses In Left Ventricular Myocardium  左心室心筋におけるTYKRIL及びPDGFRβの発現分析
TYKRIL SignificantlyCorrelates With PDGFRβ Expression in the Myocardium of HeartFailure Patients:  TYKRILは心不全患者の心筋においてPDGFRβ発現と有意に相関する。
PDGFRβ Relative Expression  PDGFRβ相対発現
fold change  倍変化
Ctrl  対照
TYKRIL RelativeExpression  TYKRIL相対発現
PAH patients  PAH患者
Control donors  対照ドナー
SurgicalResection + qPCR  外科的切除＋定量的PCR
TYKRIL, PDGFRβ Analyses  TYKRIL、PDGFRβ分析
Pearson  ピアソン
ContrastEnhancing Glioblastoma Patients  コントラスト強調膠芽腫患者
Epilepsy Patients  癲癇患者
SurgicalResection + RNA seq  外科的切除＋RNA seq
TYKRIL, PDGFRβ, p53 Analyses  TYKRIL、PDGFRβ p53の分析
TYKRILExpression  TYKRIL発現
Transcriptsper Million  百万当たりの転写産物
Control  対照
PDGFRβ Expression  PDGFRβ発現
p53Expression  p53発現
図12
Normoxia  酸素正常状態
Hypoxia  低酸素状態
Ctrl  対照
mTYKRILexpression  mTYKRIL発現
fold change  倍変化
Primary MousePericytes  初代マウス周皮細胞
Murine TYKRILKnockdown  ネズミ科TYKRILノックダウン
PDGFRβ Expression Analyses with WB  WBによるPDGFRβ発現分析
αTubulin  αチューブリン
Control  対照
図13
i.p.  腹腔内注射
OrganExplantation After 48 hours  48時間後の臓器外移植
PDGFRβ & TYKRIL analyses  PDGFRβ及びTYKRILの分析
Heart  心臓
relative RNAexpression  相対RNA発現
fold change  倍変化
Ctrl  対照
relative mRNAexpression  相対mRNA発現
αTubulin  αチューブリン
Control  対照
relative proteinexpression  相対タンパク質発現
Lung  肺
Liver  肝臓
Spleen  脾臓
Kidney  腎臓
【図１】
2018517660.tif 000003
【図２−１】
2018517660.tif 000004
【図２−２】
2018517660.tif 000005
【図３】
2018517660.tif 000006
【図４−１】
2018517660.tif 000007
【図４−２】
2018517660.tif 000008
【図５】
2018517660.tif 000009
【図６】
2018517660.tif 000010
【図７−１】
2018517660.tif 000011
【図７−２】
2018517660.tif 000012
【図７−３】
2018517660.tif 000013
【図８−１】
2018517660.tif 000014
【図８−２】
2018517660.tif 000015
【図９】
2018517660.tif 000016
【図１０】
2018517660.tif 000017
【図１１−１】
2018517660.tif 000018
【図１１−２】
2018517660.tif 000019
【図１１−３】
2018517660.tif 000020
【図１２】
2018517660.tif 000021
【図１３−１】
2018517660.tif 000022
【図１３−２】
2018517660.tif 000023
【配列表】
2018517660000001.app
【国際調査報告】
2018517660.tif 000024
2018517660.tif 000025
2018517660.tif 000026
2018517660.tif 000027
2018517660.tif 000028