(57)【要約】  本発明は、癌の処置に関し、より詳細には、難治性であるＡＤＡＭ１７基質依存性癌の処置に関する。医薬組成物は、その可変鎖の配列によって特徴づけられたＡＤＡＭ１７抗体（それは、残基５６４〜６４２に局在するＡＤＡＭ１７の膜近位ドメイン内のエピトープを認識する）を含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍の処置に使用のための、有効量の、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる医薬組成物であって、該ＡＤＡＭ１７抗体が、以下の特性を含んでなる医薬組成物：
ａ）３ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７に結合する；
ｂ）残基５６４〜６４２に局在するＡＤＡＭ１７の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内のエピトープを認識する；
ｃ）ＡＤＡＭ１０には結合しない；
ｄ）少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質の細胞シェディングを２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する；
ｅ）３×１０−４以下のＫｏｆｆのＡＤＡＭ１７に対する解離速度を有する；
ｆ）ＡＤＡＭ１７を発現する少なくとも１つの腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長および／または増殖を阻害する；
ｇ）マウスＡＤＡＭ１７には結合しない；および
ｈ）カニクイザルＡＤＡＭ１７に結合する。
【請求項２】
前記ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍が、（ｉ）少なくとも１つのＡＤＡＭ基質の、該少なくとも１つの基質の基底レベルと比較して、上昇したレベルを特徴とする腫瘍、または（ｉｉ）ＥｒｂＢ療法での処置に耐性または難治性な腫瘍からなる、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３】
ＥｒｂＢ療法での処置に難治性または耐性である腫瘍の処置に使用のための、有効量の、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる医薬組成物であって、該ＡＤＡＭ１７抗体が、以下の特性を含んでなる医薬組成物：
ａ）３ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７に結合する；
ｂ）残基５６４〜６４２に局在するＡＤＡＭ１７の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内のエピトープを認識する；
ｃ）ＡＤＡＭ１０には結合しない；
ｄ）少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質の細胞シェディングを２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する；
ｅ）３×１０−４以下のＫｏｆｆのＡＤＡＭ１７に対する解離速度を有する；
ｆ）ＡＤＡＭ１７を発現する少なくとも１つの腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長および／または増殖を阻害する；
ｇ）マウスＡＤＡＭ１７には結合しない；および
ｈ）カニクイザルＡＤＡＭ１７に結合する。
【請求項４】
ＥｒｂＢ療法での処置に難治性または耐性である前記腫瘍が、（ｉ）ＥｒｂＢ療法での処置の前のレベルと比較して、上昇したレベルのＥｒｂＢリガンドを有する腫瘍、または（ｉｉ）健康的な対照と比較して、上昇したレベルのＥｒｂＢリガンドを有する腫瘍からなる、請求項３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５】
前記ＥｒｂＢ療法が、ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、Ｈｅｒ２抗体またはＨｅｒ２キナーゼ阻害剤、Ｈｅｒ３抗体またはＨｅｒ３キナーゼ阻害剤の投与を含んでなる、請求項３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
前記ＡＤＡＭ１７抗体が、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧ、ＨＢ−ＥＧＦから選択される少なくとも１つの基質のシェディングを、５００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項１または３に記載の使用のための医薬組成物。  
【請求項７】
前記ＡＤＡＭ１７抗体が、基質ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦのシェディングを５００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項１または３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
前記ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖ドメイン、ならびに
ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖ドメイン
を含んでなる、請求項１または３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項９】
前記ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号７または８の配列のものである、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍の処置に使用するための、
ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖ドメイン、ならびに
ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖ドメイン
を含んでなる、１０２２Ｃ３と名付けられたＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体が、ｃ１０２２Ｃ３またはｈｚ１０２２Ｃ３からなる、請求項１０に記載の使用のためのＡＤＡＭ１７抗体。
【請求項１２】
請求項１０のＡＤＡＭ１７抗体の親和性成熟突然変異体からなる、ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍の処置に使用のための抗体。
【請求項１３】
対象における、ＥｒｂＢ療法での治療に難治性または耐性である腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、該腫瘍細胞を、有効量の、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させることを含んでなり、該ＡＤＡＭ１７抗体が、以下の特性を含んでなる方法：
ａ）３ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７に結合する；
ｂ）残基５６４〜６４２に局在するＡＤＡＭ１７の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内のエピトープを認識する；
ｃ）ＡＤＡＭ１０には結合しない；
ｄ）少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質の細胞シェディングを２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する；
ｅ）３×１０−４以下のＫｏｆｆのＡＤＡＭ１７に対する解離速度を有する；
ｆ）ＡＤＡＭ１７を発現する少なくとも１つの腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長および／または増殖を阻害する；
ｇ）マウスＡＤＡＭ１７には結合しない；および
ｈ）カニクイザルＡＤＡＭ１７に結合する。
【請求項１４】
前記ＡＤＡＭ１７抗体が、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧ、ＨＢ−ＥＧＦから選択される少なくとも１つの基質のシェディングを、５００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項１３に記載の方法。  
【請求項１５】
前記ＡＤＡＭ１７抗体が、基質ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦのシェディングを５００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＥｒｂＢ療法での処置に難治性または耐性である前記腫瘍が、（ａ）ＥｒｂＢ療法での処置の前のレベルと比較して、上昇したレベルのＥｒｂＢリガンドを特徴とする腫瘍、または（ｂ）健康的な対照と比較して上昇したレベルのＥｒｂＢリガンドにより特徴づけられる腫瘍からなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＥｒｂＢ療法が、ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、Ｈｅｒ２抗体またはＨｅｒ２キナーゼ阻害剤、Ｈｅｒ３抗体またはＨｅｒ３キナーゼ阻害剤の投与を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
対象における、ＥｒｂＢ療法での治療に難治性または耐性である腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、該腫瘍細胞を、
ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖ドメイン、ならびに
ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖ドメイン
を含んでなる、有効量の、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させることを含んでなる方法。
【請求項１９】
前記ＡＤＡＭ１７抗体のＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号７または８の配列のものである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の処置およびより具体的には、例えば、ＥｒｂＢ療法に難治性または耐性であるＡＤＡＭ１７基質依存性癌の処置に関する。
【０００２】
癌の処置は、新規のアプローチおよび標的が加わることを通して、定期的に大きな進歩を伴い、徐々に進歩してきた。外科手術、続くホルモン治療および次いで放射線治療は、１９世紀および２０世紀前半において極めて重要な進歩を記録した。次の大きな進歩は、第二次世界大戦後の化学療法の開発であった。サイトカインおよび関連療法の開発に伴い、初期の免疫療法が続いた。１９７０年代および１９８０年代の分子生物学革命によって、ヒトゲノムのシーケンシングおよび標的療法の誕生に至った。正常細胞に採用されたシグナリング経路およびそれらの癌における脱調節(deregulation)をより良く理解することで、脱調節要素を特異的に標的とする新規の医薬の開発が可能となった。
【０００３】
具体的には、通常、組織の成長、再生および恒常性に関係する、受容体のＥｒｂＢファミリーは、しばしば腫瘍内で脱調節されているのが見つかる。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）としてより一般的に知られているＥｒｂＢ１およびその姉妹受容体ＥｒｂＢ２は、ファミリー内で最も研究され、療法に対して標的療法が作成されている。ＥＧＦＲを標的とするモノクローナル抗体セツキシマブおよびパニツムマブ、Ｈｅｒ２を標的とするトラスツズマブおよびペルツズマブは、広く癌の処置に用いられている。ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性の小分子阻害剤には、ゲフィチニブ、エルロチニブ、およびラパチニブ（同様にＨｅｒ２を阻害する）を含む。これら増殖因子受容体をサイレンシングすることでｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞複製の潜在的阻害が明示される。
【０００４】
開発された標的療法の期待していた効果にもかかわらず、それらの現実世界の成功はより慎重であった(more measured)。セツキシマブが認可された療法である転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）の場合において、処置は２０％の患者にしか効果的でなく、少なくとも７５％の患者は、療法に対する耐性を発展し続け、進行性疾患へと向かっていく。なぜ特定の患者しかＥＧＦＲ標的療法の利益を享受しないのか、そしてなぜ耐性がほとんど必然的に発展するのかという疑問が残る。
【０００５】
この疑問に取り掛かるためには、ＥＧＦＲの場合にシグナリングしている増殖因子受容体がリガンド依存であることを考慮しなければならない。一度リガンドが関与すると、受容体内に構造的変化が起こり、二つ目のＥＧＦＲがシグナル形質導入に向かいながら二量化が発生する。最近になって、リガンド関与が、ヘテロ二量化をも誘発し得、代替の受容体と関連したＥＧＦＲに向かい、シグナル形質導入が果たされることが提唱された。ヘテロ二量体パートナーには、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ｃＭＥＴ、Ａｘｌまたはリガンド誘発シグナリングを容易にする未だ記載されていない受容体が含まれ得る。当該ヘテロ二量体リガンドシグナリングは、ＥＧＦＲ標的療法に対して耐性であり、異常な発癌性を支持するシグナルの結果をもたらす（Wheeler DL et al., Oncogene. 2008 Jun 26; 27(28):3944-56）。
【０００６】
セツキシマブで処置したｍＣＲＣ患者の評価で得られた臨床データを考慮した場合、投与に続いて直ちに、そして処置期間の過程の間中、処置の結果としてＥＧＦＲリガンドレベルは上昇した（Tabernero et al., J Clin Oncol., 2010 Mar 1;28(7):1181-9）。具体的には、血清試料中のアンフィレグリン（ＡＲＥＧ）および形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦα）のレベルは、セツキシマブの投入の間上昇した。セツキシマブおよびイリノテカンで処置したｍＣＲＣ患者の集団においても同一の現象が観察された（Loupakis et al., Target Oncol., 2014 Sep;9(3):205-14）。この研究において、ＡＲＥＧおよびＴＧＦαレベルは、セツキシマブの投入から１時間後に基準から上昇し、処置が開始されてから５７日後には、レベルは一層高くなっていた。最も興味深いことに、６週間の評価期間に応答を示した、セツキシマブ単独療法研究における患者は、ＡＲＥＧおよびＴＧＦαのレベルが最も少なく増加した者であり、研究人口の２８％を表した。従って、リガンドが豊富であること、そして増加することは、少なくとも部分的にセツキシマブのようなＥＧＦＲ標的療法の不活性を担っていることが考えられ得る。セツキシマブのような療法は、ＥＧＦＲとのリガンド相互作用を防止するため、セツキシマブまたは類似の処置の存在下で、それらが結合する受容体の不足に起因して、全身的に循環するリガンドレベルまたは腫瘍によって生じたリガンドレベルは自然に増加することが論理的である。時間の経過とともに、未結合ＥＧＦＲは、もう一度細胞表面に提示され、遊離リガンドレベルはここで上昇し、直ちにシグナリングを刺激するであろう。腫瘍は、非常に上昇したレベルのＥＧＦＲ発現を提示するため、これら細胞は、最初に受容体を代表することとなり、増殖するために新たに刺激される。異種癌細胞集団内の静止細胞は、ＥＧＦＲリガンドの主要起源であり、ＥＧＦＲを標的にすることでより高いレベルの発現が誘発されることも最近主張された（Hobor. S et al., Clin Cancer Res., 2014 Dec 15;20(24):6429-3）。
【０００７】
リガンド依存現象は、ｍＣＲＣに限定されることなく、多数の腫瘍タイプの臨床試験から報告されている。ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦの上昇したレベルは、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）を患っている患者に対しての劣った転帰および再発病に関連していた（Tinhofer et al., Clin Cancer Res., 2011 Aug 1;17(15):5197-204）。ＳＣＣＨＮ患者のＡＲＥＧは、主要組織の免疫組織化学的マーキングによりＡＲＥＧレベルで決定されたドセタキセルと組み合わせてセツキシマブで処置した場合、転帰について予後的であった。別の研究において、セツキシマブに耐性を作ったＳＣＣＨＮ細胞株は、ＨＢ−ＥＧＦおよびＡＲＥＧの上昇したレベルを示し、耐性細胞の処置は、ＴＧＦαレベルの上昇をもたらした（Hatakeyama et al; PLoS One., 2010 Sep 13;5(9):e12702）。同一の研究において、ＨＢ−ＥＧＦレベルを、再発病したＳＣＣＨＮ患者において評価しところ、これらレベルは、平均して非再発性の患者の５倍高いことが見られた（ＨＢ−ＥＧＦレベル：再発性、９５ｐｇ／ｍｌ非再発性、２３ｐｇ／ｍｌ）。
【０００８】
ＥＧＦＲリガンド発現に媒介される療法に対する耐性は、ＥＧＦＲを標的とするセツキシマブに対する応答だけでなく、小分子チロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブで治療した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者にも現われる。ゲフィチニブで処置したＮＳＣＬＣ患者集団において、血清中の上昇したＡＲＥＧレベル（＞９３．８ｐｇ／ｍｌ）またはＴＧＦα（＞１５．６ｐｇ／ｍｌ）レベルを有する者は、低いレベルの患者に比べて、処置に対して十分に応答しなかった（Ishikawa et al., Cancer Res., 2005, 65:9176-9184）。
【０００９】
卵巣がんも、特に攻撃性腫瘍の場合において、そのＨＢ−ＥＧＦ依存性について記載されてきた（Tanaka et al., Clin Cancer Res., 2005 Jul 1;11(13):4783-92.）。高感度な検出方法によって、ＨＢ−ＥＧＦレベルは、卵巣がん患者（２８．６ｐｇ／ｍｌ）において対照（５．４ｐｇ／ｍｌ）と比べて顕著に高いことが示され、レベルは、疾患の後のステージで増加することが見えた（Kasai et al., Am J Transl Res., 2012;4(4):415-21）。
【００１０】
抗癌剤に対する耐性は、癌の処置における主要なハードルである。当該耐性の結果として、患者は多数の異なる薬物の効果に交差耐性を示すようになった。より詳細には、ＥｒｂＢ療法に対する耐性は問題であり、患者を死に至らしめる。
【００１１】
従って、ＥｒｂＢ標的療法に対する耐性などの耐性の共通機序を克服できる新しい癌の処置を提供することが本発明の目的である。
【００１２】
複数のＥＧＦＲおよびＥｒｂＢファミリーリガンドの細胞外放出の鍵となる調節因子は、ＡＤＡＭ１７シェダーゼである。ＡＤＡＭ１７は、腫瘍内でのその存在およびが広く記載され、その局所的かまたは遠隔的な活性は、多数の臨床試験において確認され、増加したリガンド放出または増加したリガンドレベルが記載されてきた。現在の療法は、細胞受容体およびそれらが活性化する下流のシグナリング経路を標的とすることが狙いである一方、ＡＤＡＭ１７を標的とすることは、ＥｒｂＢ受容体ファミリーのシグナリング起源を排除する。サイレンシングされたシグナリングの効果は、複数の局面を持ち、第一に受容体に対するリガンドの直接的効果および下流シグナリングがサイレンシングされ、第二に、追加的リガンドの発現およびシェディング（shedding）に向かう、受容体活性化に起因するオートクリン・ループもサイレンシングされ、最後に、ＥｒｂＢ  標的療法に対して最近発生した耐性機序のうち、ヘテロ二量体形成そのものがヘテロ二量体シグナリングとして影響を受け、依然としてリガンド依存性である（Brand et al., Cancer Res, September 15, 2014, 74:5152-5164; Hobor. S et al., 2014;Troiani et al., Clin Cancer Res, December 15, 2013, vol. 19, no. 24, 6751-6765; Wheeler DL et al., 2008）。従って、ＡＤＡＭ１７を標的とすることは、リガンド活性化ＥｒｂＢシグナリングに依存性、ＥｒｂＢリガンドのシェディングを通したＥｒｂＢ標的療法に対する耐性機序を有するものを標的とすることができる腫瘍のスペクトルを強化し、これらはリガンドの起源次第で、局所的および全身的の両方に影響を与える。前述したように、ＥｒｂＢ標的療法に観察された上昇したリガンドレベルは、処置自体の副産物であり、耐性腫瘍の積極的選択を強制するものである。ＡＤＡＭ１７を標的とすることで、腫瘍環境から刺激性機序が除去されるが、腫瘍耐性が進展するための積極的選択圧力は導入されない。リガンドの不在は、消極的または中立的選択圧力としか見なすことができず、従って耐性進展を導くにははるかに効力がない。
【００１３】
ＡＤＡＭ１７（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１７（A disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17）は、ヘビ毒様プロテアーゼ、ＴＮＦ−αコンベルターゼ、ＴＮＦ−α−変換酵素（ＴＡＣＥ）およびＣＤ  １５６ｂとも呼ばれる、いくつかの病理学的に重要な基質の細胞外切断（エクトドメインシェディング（ectodomain shedding））を担う膜結合メタロプロテアーゼである。最初に膜結合プロＴＮＦ−α遊離可溶性タンパク質の切断を担う酵素として同定され、以来、ＡＤＡＭ１７は多数の膜結合前駆体タンパク質のエクトドメインシェディングにおいて記載されている。ＡＤＡＭ１７によるエクトドメインシェディングは、細胞の膜から多数の可溶性サイトカインおよび増殖因子、例えば、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、エピレグリン、エピジェンおよびニューレグリンを遊離する。ＡＤＡＭ１７はまた、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−１ＲＩＩ、Ｈｅｒ４、ｃ−Ｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ、Ｍｅｒ、ＴＮＦ−α  ＲＩ  ＆  ＩＩを含む多くの受容体のシェディングを媒介し、そこでの生理学的結果は、受容体シェディングもしくは可溶性リガンド捕捉を介したシグナルサイレンシング、またはＩＬ−６Ｒａおよびｇｐ１３０に関して記載されているような受容体のトランス活性化であり得る。ＡＤＡＭ１７は、多数の接着分子のシェディングおよび細胞外微小環境の成分、例えば、Ｌ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ネクチン−４、ＣＤ４４およびコラーゲンＸＶＩＩを介して細胞外マトリックスのリモデリングおよび細胞−細胞接触に積極的に関与することができる。
ＡＤＡＭ１７のよく理解されてない活性としては、細胞プリオンタンパク質およびアミロイド前駆体タンパク質のエクトドメインシェディングが含まれる。
【００１４】
疑念を避けるため、明示されない限り、ＡＤＡＭ１７とは、配列番号２９の配列のヒトＡＤＡＭ１７に関する。
【００１５】
構造的には、ＡＤＡＭ１７は、プレプロタンパク質ドメイン（ａａ１〜２１４）、細胞外ドメイン（ａａ２１５〜６７１）、膜貫通ドメイン（ａａ６７２〜６９２）および細胞質ドメイン（ａａ６９３〜８２４）を含んでなる８２４アミノ酸（ａａ）のタンパク質からなる。
【００１６】
より詳しくは、細胞外ドメインは、配列番号３０の配列（ＡＤＡＭ１７のａａ２１５〜４７４に相当する）のメタロプロテアーゼ（ＭＰ）ドメイン、配列番号３１の配列（ＡＤＡＭ１７のａａ４７５〜５６３に相当する）のディスインテグリン（ＤＩ）ドメインおよび配列番号３２の配列（ＡＤＡＭ１７のａａ５６４〜６７１に相当する）の膜近位（ＭＰＤ）ドメインから構成される。
【００１７】
従って、ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍の新しい腫瘍処置を提供することによって、現行の腫瘍処置に代替案を提案することが本発明の目的である。
【００１８】
本発明は、ＡＤＡＭ１７を標的とすることを介してＥｒｂＢリガンドの細胞表面シェディングを阻害することができる処置も提供する。
【００１９】
第一の態様において、本願は、ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍の処置に使用するための、有効量の、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる医薬組成物に関し、前記ＡＤＡＭ１７抗体は、以下の特性を含んでなる：
ａ）３ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７に結合する；
ｂ）残基５６４〜６４２に局在するＡＤＡＭ１７の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内のエピトープを認識する；
ｃ）ＡＤＡＭ１０には結合しない；
ｄ）少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質の細胞シェディングを２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する；
ｅ）３×１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆのＡＤＡＭ１７に対する解離速度(off rate)を有する；
ｆ）ＡＤＡＭ１７を発現する少なくとも１つの腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長および／または増殖を阻害する；
ｇ）マウスＡＤＡＭ１７には結合しない；および
ｈ）カニクイザルＡＤＡＭ１７に結合する。
【００２０】
本明細書では、本発明は、天然形態の抗体に関するものではなく、すなわち、それはその天然環境にはなく、天然源から精製により単離または取得できた、またはそうでなければ遺伝子組換え、もしくは化学合成により取得できた、本明細書に記載されるように、その後、非天然アミノ酸を含み得ると理解されなければならない。
【００２１】
用語「含んでなる（comprising）」とは、オープン・エンドを意味するとし、指示された成分（複数可）を含み、その他の要素を排除しないと意味する。
【００２２】
本明細書における表現「ＡＤＡＭ１７抗体」とは、「抗ＡＤＡＭ１７抗体」と同様に理解されるべきであり、ＡＤＡＭ１７に結合することができる抗体を意味する。矛盾する指定がない限り、ＡＤＡＭ１７は、マウス、キメラまたはヒト化のＡＤＡＭ１７抗体を含む、本発明の抗体について用いる。
【００２３】
本明細書において用語「処置する（treat）」、「処置する（treating）」および「処置（treatment）」とは、療法を指し、限定することなく、治癒的療法、予防的療法（prophylactic therapy）、および予防的療法（preventative therapy）を含む。予防的療法は、一般的に、全体として障害の発症を防止することか、または個人における障害の全臨床証拠段階の発症を遅延させることのいずれかを構成する。
【００２４】
本発明の態様において、ＡＤＡＭ１７抗体を含んでなる医薬組成物は、１種以上の賦形剤および／または薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなっていてもよい。表現「薬学的に許容可能なビヒクル」または「賦形剤」は、二次的反応を誘発せずに医薬組成物に入る化合物または化合物の組み合わせであって、例えば、活性化合物の投与を容易にさせ、その寿命を増加させおよび／または体内でのその効果を増加させ、溶液内での溶解性を増加させ、またはそうでなければその維持を改善させることを可能とする、化合物または化合物の組み合わせを指示することを意図している。これら薬学的に許容可能なビヒクルおよび賦形剤は、周知であり、当業者であれば、選択された活性化合物の自然の機能として、および投与形態に応じて適応するだろう。  
【００２５】
化合物の「有効量」または「治療的有効量」とは、化合物が投与されていないその他の同一の細胞と比較した際に、化合物が投与される細胞に検出可能な効果（例えば、癌または腫瘍のサイズまたは重症度の低減）を提供するのに十分な化合物の量である。
【００２６】
「ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍」とは、１種以上のＡＤＡＭ１７基質の血清濃度が低減した際に、その異常増殖が阻害される腫瘍であると理解される。当業者であれば、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、Luminex（商標）、電気化学発光または類似のアプローチのような定量的技術を用いてＡＤＡＭ１７基質の基本血清レベルを容易に確立できる。
【００２７】
「結合(binding)」または「結合する(binds)」などは、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントが生理学的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成することが意図される。２つの分子が結合するかどうかを決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、および表面プラズモン共鳴などが含まれる。疑念を避けるため、それは、前記抗体または抗原結合性フラグメントが別の抗体と低レベルで結合または干渉できないことを意味するものではない。好ましい態様としては、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントは、非特異的分子（ＢＳＡ、カゼインなど）に対する結合に関するその親和性の少なくとも２倍の親和性でその抗原に結合する。しかしながら、別の態様として、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントは、前記抗原にのみ結合する。
【００２８】
「Ｋｄ」または「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原複合体の解離定数を指す。Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ  ここで、Ｋｏｆｆは、抗体−抗原複合体からの抗体解離の解離速度定数であり、Ｋｏｎは、抗体が抗原と会合する速度である。
【００２９】
用語「エピトープ」は、抗体を含む抗原結合性タンパク質により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的エピトープまたは機能的エピトープとして定義され得る。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、コンフォメーショナルエピトープ、即ち、非直鎖状アミノ酸からなるエピトープ、でもあり得る。特定の態様では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面群である決定基を含み得、特定の態様では、特定の三次元構造特徴、および／または特異的電荷特徴を持ち得る。
【００３０】
驚くべき態様において、本明細書に記載のＡＤＡＭ１７抗体は、膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内に含まれてなる、エピトープ、「ＡＤＡＭ１７エピトープ」とも呼ばれる、に結合し、それ自体はアミノ酸５６４〜６７１から構成される。より詳細には、前記ＡＤＡＭ１７抗体は、ＭＰＤのサブ・ドメインに対応するＡＤＡＭ１７のアミノ酸５６４〜６４２を含んでなる領域内に含まれてなるＡＤＡＭ１７エピトープに結合する。
【００３１】
一態様において、以下の実施例にて証明されているように、本明細書に記載のＡＤＡＭ１７抗体のＡＤＡＭ１７エピトープは、アミノ酸５６４〜６４２の部分から構成され、少なくとも残基６０６はアスパラギン酸（Ｄ）である。
【００３２】
一態様において、以下の実施例にて証明されているように、本明細書に記載のＡＤＡＭ１７抗体のＡＤＡＭ１７エピトープは、アミノ酸５６４〜６４２の部分から構成され、少なくとも残基６１０はアルギニン（Ｒ）である。
【００３３】
一態様において、以下の実施例にて証明されているように、本明細書に記載のＡＤＡＭ１７抗体のＡＤＡＭ１７エピトープは、アミノ酸５６４〜６４２の部分から構成され、少なくとも残基６０６はアスパラギン酸（Ｄ）であり、少なくとも残基６１０はアルギニン（Ｒ）である。
【００３４】
特定の側面によれば、本明細書に記載のＡＤＡＭ１７抗体は、メタロプロテアーゼ（ＭＰ）ドメインと結合せず、前記ＭＰドメインはＡＤＡＭ１７のアミノ酸２１５〜４７４から構成される。
【００３５】
特定の側面によれば、本明細書に記載のＡＤＡＭ１７抗体は、ディスインテグリン（ＤＩ）ドメインと結合せず、前記ＤＩドメインは、ＡＤＡＭ１７のアミノ酸４７５〜５６３から構成される。
【００３６】
別の側面によれば、本明細書に記載のＡＤＡＭ１７抗体は、残基６０６がアスパラギン酸（Ｄ）および／または残基６１０がアルギニン（Ｒ）でない場合、膜近位ドメイン（ＭＰＤ）に結合しないか、または結合しにくい。
【００３７】
シェディング活性を担うことが知られているＡＤＡＭ１７の触媒ドメインに干渉せずに、ＡＤＡＭ１７基質のシェディングを低減または阻害し得るアンタゴニスト、より詳しくは抗体、は記載されたことも示唆されたこともないので、この側面は驚くべきものである。言い換えれば、本明細書に記載のＡＤＡＭ１７抗体は、病態の特定の状況において少なくとも１つの基質に関するＡＤＡＭ１７の酵素活性を選択的に低減または阻害することができ、前記病態は癌である。本明細書に記載のＡＤＡＭ１７抗体の利点は、それが触媒ドメインとは結合しないが、その基質の全部または一部に対するＡＤＡＭ１７の酵素活性を低減または阻害できる可能性があることから、ＡＤＡＭ１７の全触媒活性を阻害しないと思われるという事実によるものであり得る。
【００３８】
ＡＤＡＭ１７のＭＰＤに結合する抗体は、限定されるものではないが、免疫およびハイブリドーマ作製、モノクローナルＢ細胞選択、ファージディスプレー、リボゾームディスプレー、酵母ディスプレー、標的化遺伝子合成と組み合わせた発現免疫応答シーケンシングを含む、当業者に周知のいくつかの技術のうちのいずれかによって得ることができる。各方法は、標的抗原としてＡＤＡＭ１７タンパク質または選択されたサブドメインを用いて行うことができる。当業者ならば、ＡＤＡＭ１７細胞外ドメイン、またはより詳しくは、ＭＰＤと結合する抗体の集団からＭＰＤ結合抗体を選択することができるであろう。続いての選択および特性決定は、ＭＰＤ結合に関する選択工程も意味し、それにより、ＡＤＡＭ１７細胞外ドメインに対する総ての結合剤が、ＭＰＤまたはＭＰＤの選択されたサブドメインに対する結合に関して選択的にスクリーニングされる。あるいは、総ての選択工程はＭＰＤまたはＭＰＤの選択されたサブドメインに対して行うことができ、天然のＡＤＡＭ１７細胞外ドメインに対する結合が、続いての選択および特性決定工程として使用される。
【００３９】
本明細書において、「シェディング阻害」とは、膜結合前駆タンパク質の酵素切断による細胞表面タンパク質の細胞外環境への放出の阻害と定義することができ、当業者であれば、放出をＥＬＩＳＡ、Luminex（商標）、電気化学発光または類似のアプローチによって測定可能であり、シェディング阻害を同一の方法によって測定可能である。
【００４０】
一態様において、ＡＤＡＭ１７抗体は、ＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質の細胞シェディングを５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭのＩＣ５０で阻害する。
【００４１】
本発明の文脈において、「ＩＣ５０」という表現は、達成可能な最大の半分の阻害を達成するのに必要な、用量応答評価における抗体の濃度を指す。ＩＣ５０のこのような評価は、細胞からの基質シェディング評価または組換えタンパク質を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペプチド切断アッセイによって行うことができる。
【００４２】
疑念を回避するために、ＡＤＡＭ１７基質は、下記の表１に列挙された基質から選択することができる。
【００４３】
【表１】
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2018505149.tif 000003
【００４４】
一態様において、好ましいＡＤＡＭ１７基質は、下記の群から選択される。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
【表３】
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【００４７】
【表４】
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【００４８】
【表５】
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【００４９】
【表６】
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【００５０】
【表７】
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【００５１】
【表８】
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【００５２】
【表９】
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【００５３】
【表１０】
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【００５４】
【表１１】
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【００５５】
別の態様において、好ましいＡＤＡＭ１７基質は、「増殖因子」（表５）基質の群から選択される。
【００５６】
別の一層好ましい態様において、ＡＤＡＭ１７基質は、ＡＲＥＧ、ＨＢ−ＥＧＦ（ＨＢＥＧＦとも称する）およびＴＧＦα（ＴＧＦＡまたはＴＧＦａとも称する）である。
【００５７】
本発明は、請求項１に記載の使用のための医薬組成物に関し、前記ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍が次からなる：（ｉ）少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質の、前記少なくとも１つの基質の基底レベル(basal level)と比べて、上昇したレベルによって特徴づけられた腫瘍、または（ｉｉ）ＥｒｂＢ療法での処置に耐性または難治性である腫瘍。
【００５８】
第一の側面において上述したように、前記ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍は、少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質の、前記少なくとも１つの基質の基底レベルと比べて、上昇したレベルによって特徴づけられた腫瘍からなる。
【００５９】
「基底レベル」または「基底線レベル」は、ＡＤＡＭ１７基質のレベルについての健康な対照試料または患者試料の集合分析に基づき、確立することができる。ＡＤＡＭ１７基質（単数または複数）の低減した血清レベルをもたらす治療薬は、既述したように、処置前および処置後の基質の血清レベルを比較することで、定量的技術によって決定することができる。事前決定された基底線レベル値と比較して、腫瘍増殖阻害とＡＤＡＭ１７基質（単数または複数）の低減した血清レベルの相関関係は、ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍の存在を決定する役割を果たす。
【００６０】
「少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質の上昇したレベル」とは、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、Luminex（商標）、電気化学発光または類似のアプローチのような定量的技術によって測定された、少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質のレベルであって、健康的集合体からの同一のＡＤＡＭ１７基質の基底線血清試料として確立されたものより少なくとも２倍大きいレベルであると理解されるべきである。具体的には、基底線ＨＢ−ＥＧＦレベルは、５．４ｐｇ／ｍｌとして記載され、ＳＣＣＨＮ集合体ＨＢ−ＥＧＦレベルにおいては、２３ｐｇ／ｍｌにて測定され、再発性疾患集合体において、レベルは９５ｐｇ／ｍｌと測定された。卵巣癌集合体においてＨＢ−ＥＧＦレベルは、２８．６ｐｇ／ｍｌと測定された。一側面によれば、ＡＤＡＭ１７抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に約１０ｎＭ以下、好ましくは約５ｎＭ以下、より好ましくは約2ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７に結合する。当業者において利用可能な任意のその他の方法または技術を使用してもよい。
【００６１】
第二の側面で上述したように、前記ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍は、ＥｒｂＢ療法での処置に耐性または難治性の腫瘍からなる。
【００６２】
本明細書において、療法に対して「難治性」である腫瘍は、初期に応答性であり、時間と伴に（例えば、３か月以内（即ち、疾患進行は、処置から３か月目または３か月以内に観察し得る））非応答性となるか、または処置の中断直後に再発するものである。特定の態様において、「耐性」腫瘍は、「難治性」腫瘍とも称する。
【００６３】
本明細書において、療法に「耐性」な病気は、療法に非応答性であるものである。一態様において、腫瘍は処置の開始時には耐性であってもよく、または処置の間に耐性となってもよい。特定の態様において、「難治性」腫瘍は、「耐性」腫瘍とも称する。
【００６４】
「ＥｒｂＢ標的療法」または「抗ＥｒｂＢ療法」とも称する「ＥｒｂＢ療法」は、ＥｒｂＢ受容体またはリガンドのいずれかに結合する任意の分子が、ＥｒｂＢ受容体のリガンド活性化を遮断することを意味する、「ＥｒｂＢアンタゴニスト」として作用する分子を対象に投与することからなる療法を指定する意図である。このようなアンタゴニストには、限定することなく、修飾リガンド、リガンドペプチド（即ち、リガンドフラグメント）、溶解性ＥｒｂＢ受容体および抗ＥｒｂＢ抗体が含まれる。
【００６５】
本発明の別の側面は、ＥｒｂＢ療法での処置に難治性または耐性な腫瘍の処置に使用するための、有効量の、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる医薬組成物であり、前記ＡＤＡＭ１７抗体は、以下の特性を含んでなる：
ａ）３ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７に結合する；
ｂ）残基５６４〜６４２に局在するＡＤＡＭ１７の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内のエピトープを認識する；
ｃ）ＡＤＡＭ１０には結合しない；
ｄ）少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質の細胞シェディングを２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する；
ｅ）３×１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆのＡＤＡＭ１７に対する解離速度を有する；
ｆ）ＡＤＡＭ１７を発現する少なくとも１つの腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長および／または増殖を阻害する；
ｇ）マウスＡＤＡＭ１７には結合しない；および
ｈ）カニクイザルＡＤＡＭ１７に結合する。
【００６６】
本発明による使用のための医薬組成物の態様によれば、ＥｒｂＢ療法での処置に難治性または耐性な前記腫瘍は、次からなるものである：（ｉ）ＥｒｂＢ療法での処置の前のレベルと比較して、上昇したレベルのＥｒｂＢリガンドを有する腫瘍、または（ｉｉ）健康的な対照と比較してＥｒｂＢリガンドの上昇したレベルを有する腫瘍。
【００６７】
例証的例として、制限することなく、処置の前および後のＥｒｂＢリガンドの異なるレベルは、ＥＬＩＳＡ、LUMINEX（商標）または電気化学発光等の任意の周知な方法によって測定することができる。
【００６８】
表現「健康的対照」によって、例えば、ＡＤＡＭ１７関連病変を欠失している者から選択された個人または集合体を表すことが意図されている。
【００６９】
より明確にするために、ＥｒｂＢリガンドレベルは、ＥｒｂＢ療法での処置の前のレベルと比較して、前記レベルが少なくとも前記処置前のレベルより２倍高い場合、上昇していると見なされるべきである。
【００７０】
本発明による使用のための医薬組成物の一態様において、ＥｒｂＢ療法は、ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、Ｈｅｒ２抗体またはＨｅｒ２キナーゼ阻害剤、Ｈｅｒ３抗体またはＨｅｒ３キナーゼ阻害剤の投与を含んでなる。
【００７１】
当然ながら、その他のＥｒｂＢ療法も本明細書に含まれると見なされるべきである。非制限的例として、ＥｒｂＢ療法は、アファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラバチニブ、イコチニブ、ＢＩＢ２９９２、セツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ  エムタンシンおよびニモツズマブの投与を含んでなる。
【００７２】
本発明による使用のための医薬組成物は、前記ＡＤＡＭ１７抗体が、ＴＮＦα、ＴＧＦα、ＡＲＥＧ、ＨＢ−ＥＧＦから選択される少なくとも１つの基質の細胞シェディングを、５００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害することを特徴とする。
【００７３】
一側面において、ＡＤＡＭ１７抗体は、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子アルファ）のシェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００７４】
一側面において、ＡＤＡＭ１７抗体は、ＴＧＦ−α（トランスフォーミング増殖因子アルファ）のシェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００７５】
一側面において、ＡＤＡＭ１７抗体は、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）のシェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００７６】
一側面において、ＡＤＡＭ１７抗体は、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子）のシェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００７７】
別の態様では、ＡＤＡＭ１７抗体は、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦから選択されるＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害することを特徴とする。
【００７８】
本発明による使用のための医薬組成物は、前記ＡＤＡＭ１７抗体が、基質ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦのシェディングを５００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害することを特徴とする。
【００７９】
ＡＤＡＭ１７抗体の「抗原結合性フラグメント」という表現により、前記ＡＤＡＭ１７抗体の標的（一般には抗原とも呼ばれる）、一般には同じエピトープに結合する能力を保持する、任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を示すことが意図されている。
【００８０】
好ましい態様では、前記抗原結合性フラグメントは、それが由来するＡＤＡＭ１７抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。さらに好ましい態様では、前記抗原結合性フラグメントは、それが由来するＡＤＡＭ１７抗体の２つ、３つ、４つまたは５つのＣＤＲ、より好ましくは６つのＣＤＲを含んでなる。
【００８１】
「抗原結合性フラグメント」は、限定されるものではないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントまたはダイアボディ、またはＸＴＥＮ（延長組換えポリペプチド）もしくはＰＡＳモチーフなどの変性ペプチドとの融合タンパク質、またはその半減期がポリ（エチレン）グリコールなどのポリ（アルキレン）グリコールの付加（「ペグ化」）（ペグ化フラグメントはＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコールを表す）などの化学修飾により、もしくはリポソーム内への組み込みにより延長される任意のフラグメントからなる群から選択することができ、前記フラグメントは、本発明による抗体の特徴的なＣＤＲのうちの少なくとも１つを有する。好ましくは、前記「抗原結合性フラグメント」は、それらが由来する抗体の重鎖または軽鎖の可変の部分配列で構成されるか、または前記部分配列を含んでなり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性および標的に対する十分な親和性、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい様式では少なくとも１／１０に相当する親和性を保持するのに十分なものである。
【００８２】
本発明による使用のための医薬組成物の一態様は、前記その抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’） フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｃフラグメント、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントまたはダイアボディから選択される。
【００８３】
上記の医薬組成物の本発明の態様は、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなることが記載され、以下の特性を伴う：
ａ）３ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７に結合する；
ｂ）残基５６４〜６４２に局在するＡＤＡＭ１７の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内のエピトープを認識する；
ｃ）ＡＤＡＭ１０には結合しない；
ｄ）少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質のシェディングを２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する；
ｅ）３×１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆのＡＤＡＭ１７に対する解離速度を有する；
ｆ）ＡＤＡＭ１７を発現する少なくとも１つの腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長および／または増殖を阻害する；
ｇ）マウスＡＤＡＭ１７には結合しない；および
ｈ）カニクイザル(cynomologous)ＡＤＡＭ１７に結合する；
前記ＡＤＡＭ１７抗体は、６つのＣＤＲを含んでなり、ここで６つのＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つが、配列番号１〜６のアミノ酸配列または配列番号１〜６と少なくとも９０％の同一性を有する任意の配列から選択される。
【００８４】
本発明の別の態様において、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１〜６のアミノ酸配列または配列番号１〜６と少なくとも９０％の同一性を有する任意の配列の６つのＣＤＲを含んでなる。
【００８５】
一態様において、本発明による使用のための医薬組成物は、前記ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントが以下を含んでなることを特徴とする：
ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖ドメイン、ならびに
ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖ドメイン。
【００８６】
疑念を避けるため、文脈がそうではないことを示さない限り、ＣＤＲという表現は、ＩＭＧＴにより定義される抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。
【００８７】
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体であれ、鎖型であれ、または種であれ、可変ドメインを比較するために定義されている[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は、常に同じ位置を持ち、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準的な画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準的な画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧内に示され、ドットで仕切られる、例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Colliers de Perles  [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と呼ばれる２Ｄグラフ、およびＩＭＧＴ／３Ｄ  structure-DB[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造において使用される。
【００８８】
３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。用語ＣＤＲ（単数または複数）は、本明細書では、場合に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対するその抗体の親和性により結合を担うアミノ酸残基の大多数を含むこれらの領域の１つまたはこれらの領域のいくつかを、もしくは全体でさえ示すために使用される。
【００８９】
一態様において、ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１の配列を含んでなり、ここでＸ１と称する残基が、極性アミノ酸から選択される。極性アミノ酸は、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）またはトレオニン（ＴｈｒまたはＴ）から選択されることが好ましい。
【００９０】
別の好ましい態様において、残基Ｘ１は、小サイズ極性アミノ酸から選択される。小サイズ極性アミノ酸は、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）またはトレオニン（ＴｈｒまたはＴ）から選択されることが好ましい。
【００９１】
別の態様において、残基Ｘ１は、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）である。
【００９２】
別の態様において、残基Ｘ１は、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）である。
【００９３】
一態様において、本発明による使用のための医薬組成物は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号７または８の配列であることを特徴とする。
【００９４】
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２配列間の「同一性パーセンテージ」または「同一性％」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基パーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計学的なものであり、２配列間の差異はそれらの長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の比較は、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって慣例的に行われ、前記比較はセグメントにより、または「アラインメントウインドウ」を使用することによって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]ローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐによる）の手段によって行うことができる。
【００９５】
２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、ここで、比較する核酸配列またはアミノ酸配列は、その２配列間の最適なアラインメントの参照配列と比較して付加または欠失を持ち得る。同一性パーセンテージは、２配列間、好ましくは２つの全配列の間でアミノ酸、ヌクレオチドまたは残基が同一である位置の数を決定し、その同一の位置の数をアラインメントウインドウ内の位置の総数で割り、その商に１００を掛けて２配列間の同一性パーセンテージを得ることによって計算される。
【００９６】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（Tatusova et al., “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250）をデフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２に関して；選択されるマトリックスは、このプログラムによって提案される例えば「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックスである）とともに使用し、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムによって直接計算される。
【００９７】
参照アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例としては、参照配列、特定の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含有するものが含まれる。１以上の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」は、構造アミノ酸の１つに関しておそらく置換されるが、対応する抗体の生物活性を変更しないいずれのアミノ酸も示すものとする。
【００９８】
等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成される可能性のある種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果かのいずれかに基づいて決定され得る。
【００９９】
限定されない例として、下記表１２は、対応する改変抗体の生物活性に有意な改変をもたらさずに行えると思われる潜在的置換をまとめたものであり、同じ条件下で逆の置換も通常可能である。
【０１００】
【表１２】
2018505149.tif 000014
【０１０１】
ＡＤＡＭ１７抗体または任意のその抗原結合性フラグメントはまた、ｉ）それぞれ配列番号７、２および３のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３、または最適なアラインメントの後に配列番号７、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖と、ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなると記載することもできる。
【０１０２】
ＡＤＡＭ１７抗体または任意のその抗原結合性フラグメントはまた、ｉ）それぞれ配列番号８、２および３のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号８、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなると記載することもできる。
【０１０３】
さらに別の態様によれば、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号９のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性有する配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【０１０４】
さらに別の態様によれば、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１１のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【０１０５】
さらに別の態様によれば、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１２のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【０１０６】
さらに別の態様によれば、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１０のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１０の配列となくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【０１０７】
さらに別の態様によれば、ＡＤＡＭ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、以下を含んでなる：
ｉ）配列番号９、１１または１２から選択されるアミノ酸配列あるいは適切なアライメント後に配列番号９、１１または１２の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメイン、および
ｉｉ）配列番号１０あるいは適切なアライメント後に配列番号１０の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメイン。
【０１０８】
別の態様において、ＡＤＡＭ１７抗体は、キメラ抗体からなる。この場合、それをｃ１０２２Ｃ３と称することもできる。
【０１０９】
一態様において、ＡＤＡＭ１７抗体は、ヒト化抗体からなる。この場合、それをｈｚ１０２２Ｃ３と称することもできる。
【０１１０】
一態様において、ＡＤＡＭ１７抗体は、ヒト抗体からなる。この場合、それをｈ１０２２Ｃ３と称することもできる。
【０１１１】
疑念を回避するため、接頭後のない１０２２Ｃ３は、ｍ１０２２Ｃ３、ｃ１０２２Ｃ３、ｈ１０２２Ｃ３およびｈｚ１０２２Ｃ３を含むと見なすべきである。同じ意味で、１０２２Ｃ３、ｍ１０２２Ｃ３、ｃ１０２２Ｃ３、ｈ１０２２Ｃ３およびｈｚ１０２２Ｃ３は、全てＡＤＡＭ１７抗体という表現に含まれる。
【０１１２】
より明確にするために、以下の表１３にてＡＤＡＭ１７抗体に対応する種々のアミノ酸配列がまとめられている。
【０１１３】
【表１３】
2018505149.tif 000015
【０１１４】
特定の側面において、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントは、キメラ抗体からなる。
【０１１５】
キメラ抗体は、所与の種の抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を、前記の所与の種とは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含有するものである。
【０１１６】
本抗体またはそのキメラフラグメントは、組換え遺伝学の技術を使用することにより作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターおよび本発明の非ヒト、特にマウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列、およびヒト抗体定常領域をコードする配列を含有する組換えＤＮＡをクローニングすることにより作製することができる。このような１つの組換え遺伝子によりコードされる本発明によるキメラ抗体は、例えばマウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性はマウスＤＮＡに由来する可変領域より決定され、そのアイソタイプはヒトＤＮＡに由来する定常領域により決定される。キメラ抗体を作製するための方法についてはVerhoeyn et al. （BioEssays, 8:74, 1988）を参照。
【０１１７】
本発明の特定の側面は、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントに関し、前記ＡＤＡＭ１７抗体は、以下から選択されるキメラ抗体からなる：
ｉ）ａ）それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列、または配列番号１、２および３の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域；およびｂ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列、または配列番号４、５および６の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域；およびｃ）マウスとは異種の抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域を含んでなるキメラＡＤＡＭ１７抗体；
ｉｉ）配列番号９、１１もしくは１２の配列、または配列番号９、１１もしくは１２の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列の重鎖可変ドメイン、および／または、配列番号１０の配列または配列番号１０の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列の軽鎖可変ドメインを含んでなるキメラＡＤＡＭ１７抗体；
ｉｉｉ）配列番号３３の配列または配列番号３３の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列の重鎖ドメイン、および／または、配列番号３５の配列または配列番号３５の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列の軽鎖ドメインを含んでなるキメラＡＤＡＭ１７抗体；および
ｉｖ）配列番号３４の配列または配列番号３４の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列の重鎖ドメイン、および／または、配列番号３５の配列または配列番号３５の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列の軽鎖ドメインを含んでなるキメラＡＤＡＭ１７抗体。
【０１１８】
本発明による使用のための医薬組成物は、ｉ）前記キメラＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号９、１１または１２の配列の重鎖可変ドメイン、および／または、配列番号１０の軽鎖可変ドメインを含んでなり、またはｉｉ）前記キメラＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号３３または３４の配列の重鎖ドメイン、および／または、配列番号３５の軽鎖ドメインを含んでなることを特徴とする。
【０１１９】
一態様において、前記マウスとは異種であるのはヒト（人間と称することも可能である）である。
【０１２０】
特定の側面において、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒト化抗体からなる。
【０１２１】
「ヒト化抗体」は、ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、抗体分子の他の部分は１つ（または複数の）非ヒト抗体に由来する抗体を意味する。加えて、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）の一部は結合親和性を保存するように改変することができる（Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988）。
【０１２２】
本発明のヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術（例えば、文献Singer et al, J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992;およびBebbington et al, Bio/Technology, 10: 169-175, 1992に記載されているものなど）によって作製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける予防的および／または治療的処置を含む方法におけるそれらの使用のために好ましい。例えば、ＰＤＬにより特許ＥＰ０４５１２６１、ＥＰ０６８２０４０、ＥＰ０９３９１２７、ＥＰ０５６６６４７またはＵＳ５，５３０，１０１、ＵＳ６，１８０，３７０、ＵＳ５，５８５，０８９およびＵＳ５，６９３，７６１に記載されている「ＣＤＲグラフト」技術などの他のヒト化技術も当業者に公知である。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も引用され得る。
【０１２３】
本発明の特定の側面は、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントに関し、前記ＡＤＡＭ１７抗体は、以下から選択される、ヒト化抗体からなる：
ｉ）ａ）それぞれ配列番号１、２および３の配列または配列番号１、２および３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を有する、重鎖可変ドメイン；ならびに
ｂ）それぞれ配列番号４、５および６または配列番号４、５および６と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化ＡＤＡＭ１７抗体；
ｉｉ）配列番号３９もしくは４０の配列または配列番号３９もしくは４０と少なくとも９０％の同一性を有する配列の重鎖可変ドメイン、および／または、配列番号４５もしくは４６または配列番号４５もしくは４６と少なくとも９０％の同一性を有する配列の軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化ＡＤＡＭ１７抗体；
ｉｉｉ）配列番号４１の配列または配列番号４１と少なくとも９０％の同一性を有する配列の重鎖ドメイン、および／または、配列番号４７または配列番号４７と少なくとも９０％の同一性を有する配列の軽鎖ドメインを含んでなるヒト化ＡＤＡＭ１７抗体；
ｉｖ）配列番号４２の配列または配列番号４２と少なくとも９０％の同一性を有する配列の重鎖ドメイン、および／または、配列番号４７または配列番号４７と少なくとも９０％の同一性を有する配列の軽鎖ドメインを含んでなるヒト化ＡＤＡＭ１７抗体；
ｖ）配列番号４３の配列または配列番号４３と少なくとも９０％の同一性を有する配列の重鎖ドメイン、および／または、配列番号４７または配列番号４７と少なくとも９０％の同一性を有する配列の軽鎖ドメインを含んでなるヒト化ＡＤＡＭ１７抗体；および
ｖｉ）配列番号４４の配列または配列番号４４と少なくとも９０％の同一性を有する配列の重鎖ドメイン、および／または、配列番号４７または配列番号４７と少なくとも９０％の同一性を有する配列の軽鎖ドメインを含んでなるヒト化ＡＤＡＭ１７抗体。
【０１２４】
本発明による使用のための医薬組成物は、i) 前記ヒト化ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号３９または４０の配列の重鎖可変ドメイン、および／または、配列番号４５または４６の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなるか、または前記ヒト化ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号４１、４２、４３または４４の配列の重鎖ドメイン、および／または配列番号３７の配列の軽鎖ドメインを含んでなることを特徴とする。
【０１２５】
一態様において、本発明による使用のための医薬組成物は、前記ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントが、以下から選択されることを特徴とする：
（ｉ）配列番号９、１１または１２の配列の重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる、キメラ抗体；
（ｉｉ）配列番号３３または３４の配列の重鎖ドメイン、および／または配列番号３５の配列の軽鎖ドメインを含んでなる、キメラ抗体；
（ｉｉｉ）配列番号３９または４０の配列の重鎖可変ドメイン、および／または、配列番号４５または４６の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる、ヒト化抗体；または
（ｉｖ）配列番号４１、４２、４３または４４の配列の重鎖ドメイン、および／または配列番号３７の配列の軽鎖ドメインを含んでなる、ヒト化抗体。
【０１２６】
本発明は、ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍の処置に使用するための、
ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖ドメイン、ならびに
ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖ドメイン
を含んでなる、１０２２Ｃ３と名付けられたＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントにも関する。
【０１２７】
抗体が、ｃ１０２２Ｃ３またはｈｚ１０２２Ｃ３からなる、上記の使用のためのＡＤＡＭ１７抗体も含まれる。
【０１２８】
上で規定のとおりに特徴づけられたＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントは、２０１２年１０月１８日にフランス、パリ75725 Cedex 15、5 Rue du Docteur Roux、パスツール研究所、ＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＩ−４６８６から得られたモノクローナル抗体１０２２Ｃ３からなっていてもよい。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４系統の細胞の融合によって得られたものである。
【０１２９】
言い換えると、本発明は、以下を含んでなる、マウス、キメラ、ヒト化またはヒトＡＤＡＭ１７抗体あるいはその抗原結合性フラグメントにも関する：
ｉ）ＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマ細胞株Ｉ−４６８６によって発現された抗体の重鎖ドメインのアミノ酸配列；および
ｉｉ）ＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマ細胞株Ｉ−４６８６によって発現された抗体の軽鎖ドメインのアミノ酸配列。
【０１３０】
本発明の範囲の目的は、ＡＤＡＭ１７基質依存性腫瘍の処置に使用するための抗体であり、それは記載されたＡＤＡＭ１７抗体の親和性飽和突然変異体からなる。
【０１３１】
好ましい態様において、前記親和性成熟突然変異体は、前記初期ＡＤＡＭ１７抗体と比較してより高い親和性を有する突然変異体からなる。
【０１３２】
親和性成熟のために、当業者に既知のいずれかの方法を使用するべきである。限定されない例として、それは、可変ドメインの標的としたまたはランダムな突然変異生成、ＣＤＲ（複数可）の標的としたまたはランダムな突然変異生成、抗体ライブラリーまたは新規の重鎖または軽鎖との鎖混合、細胞改善またはその他の類似の適切な方法を言及することができ、その後選択およびより高い親和性のクローンのためのスクリーニングが続く。
【０１３３】
対象におけるＥｒｂＢ療法に難治性または耐性な腫瘍細胞の成長を阻害する方法を特許請求することも本発明の目的であって、前記方法には、前記腫瘍細胞を、有効量のＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させることを含んでなり、前記ＡＤＡＭ１７抗体は、以下の特性を含んでなる：
ａ）３ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７に結合する；
ｂ）残基５６４〜６４２に局在するＡＤＡＭ１７の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内のエピトープを認識する；
ｃ）ＡＤＡＭ１０には結合しない；
ｄ）少なくとも１つのＡＤＡＭ１７基質の細胞シェディングを２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する；
ｅ）３×１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆのＡＤＡＭ１７に対する解離速度を有する；
ｆ）ＡＤＡＭ１７を発現する少なくとも１つの腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長および／または増殖を阻害する；
ｇ）マウスＡＤＡＭ１７には結合しない；および
ｈ）カニクイザルＡＤＡＭ１７に結合する。
【０１３４】
本明細書で使用する用語「対象」とは、ウシ、ウマ、イヌおよびネコなどのヒトおよび動物を含む任意の哺乳類を指す。従って、本発明はヒト患者同様に獣医対象および患者に使用し得る。本発明の一態様において、対象はヒトである。
【０１３５】
特定の態様において、本発明による方法は、前記ＡＤＡＭ１７抗体が、ＴＮＦα、ＴＧＦα、ＡＲＥＧ、ＨＢ−ＥＧＦから選択される少なくとも１つの基質の細胞シェディングを５００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害することを特徴とする。
【０１３６】
別の特定の態様において、本発明による方法は、前記ＡＤＡＭ１７抗体が、ＴＮＦα、ＴＧＦα、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦの基質の細胞シェディングを５００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害することを特徴とする。
【０１３７】
前に言及されたように、本発明による方法の側面は、ＥｒｂＢ療法での処置に難治性または耐性な前記腫瘍が、（ａ）ＥｒｂＢ療法での処置前のレベルと比較してＥｒｂＢリガンドの上昇したレベルにより特徴づけられた腫瘍または（ｂ）健康的な対照と比較してＥｒｂＢリガンドの上昇したレベルにより特徴づけられた腫瘍であることである。
【０１３８】
限定されない一態様において、本発明による方法は、ＥｒｂＢ療法が、ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、Ｈｅｒ２抗体またはＨｅｒ２キナーゼ阻害剤、Ｈｅｒ３抗体またはＨｅｒ３キナーゼ阻害剤の投与を含んでなることを特徴とする．好ましい例として、ＥｒｂＢ療法は、アファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラバチニブ、イコチニブ、ＢＩＢ２９９２、セツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ  エムタンシンおよびニモツズマブの投与を含んでなる。
【０１３９】
対象におけるＥｒｂＢ療法に難治性または耐性な腫瘍細胞の成長を阻害する方法も本明細書に記載され、前記方法は、前記腫瘍細胞を、
ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖ドメイン、ならびに
ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖ドメイン
を含んでなる、有効量の、ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させることを含んでなることを特徴とする。
【０１４０】
一態様によれば、ＡＤＡＭ１７抗体のＣＤＲ−Ｈ１は配列番号７または８の配列のものである。
【０１４１】
本発明の別の態様は、前記ＡＤＡＭ１７抗体またはその抗原結合性フラグメントが、以下からなる方法である：
（ｉ）配列番号９、１１または１２の配列の重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる、キメラ抗体；
（ｉｉ）配列番号３３または３４の配列の重鎖ドメイン、および／または配列番号３５の配列の軽鎖ドメインを含んでなる、キメラ抗体；
（ｉｉｉ）配列番号３９または４０の配列の重鎖可変ドメイン、および／または、配列番号４５または４６の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる、ヒト化抗体；または
（ｉｖ）配列番号４１、４２、４３または４４の配列の重鎖ドメイン、および／または配列番号３７の配列の軽鎖ドメインを含んでなる、ヒト化抗体。
【０１４２】
本発明の他の特徴および利点は、例および図面とともに本明細書に示され、図面の凡例を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図１：Ａ４３１−ＴＧＦα−Ｎｌｕｃ細胞のＴＧＦα−Ｎｌｕｃ遊離に及ぼす１０２２Ｃ３の影響。
【図２】図２：Ａ４３１−ＡＲＥＧ−Ｎｌｕｃ細胞のＡＲＥＧ−Ｎｌｕｃ遊離に及ぼす１０２２Ｃ３の影響。
【図３】図３：Ａ４３１−ＴＮＦα−Ｎｌｕｃ細胞のＴＮＦα−Ｎｌｕｃ遊離に及ぼす１０２２Ｃ３の影響。
【図４】図４：Ａ４３１−ＨＢ−ＥＧＦ−Ｎｌｕｃ細胞のＨＢ−ＥＧＦ−Ｎｌｕｃ遊離に及ぼす１０２２Ｃ３の影響。
【図５】図５：１０２２Ｃ３変異体に関するＦＲＥＴペプチド切断アッセイ。
【図６】図６：腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ１２９９に対するグリコシル化されたおよび酵素的に脱グリコシル化されたｍ１０２２Ｃ３の結合。
【図７】図７：１０２２Ｃ３およびＡｂ９３６のＥＬＩＳＡ（ポリクローナル抗＜ヒトＡＤＡＭ１０）の組換えヒト（ｒｈ）ＡＤＡＭ１７およびｒｈＡＤＡＭ１０への結合。
【図８ａ】図８ａ：１．２５ｍｇ／ｋｇで使用した際のＣａＯＶ−３異種移植モデルにおけるマウス１０２２Ｃ３（ｍ１０２２Ｃ３）とそのヒト化型（ｈｚ１０２２Ｃ３）の比較
【図８ｂ】図８ｂ：５ｍｇ／ｋｇで使用した際のＣａＯＶ−３異種移植モデルにおけるマウス１０２２Ｃ３（ｍ１０２２Ｃ３）とそのヒト化型（ｈｚ１０２２Ｃ３）の比較
【図９】図９：１０２２Ｃ３またはｍ２２５で処置したＡ４３１  ＷＴ細胞。
【図１０】図１０：１０２２Ｃ３またはｍ２２５で処置したＡ４３１−ＡＲＥＧ細胞。
【図１１】図１１：ＡＤＡＭ１７抗体１０２２Ｃ３または１０４０Ｈ５で処置したＡ４３１−ＡＲＥＧ細胞。
【図１２】図１２：１０２２Ｃ３またはｍ２２５で処置したＡ４３１−ＨＢ−ＥＧＦ細胞。
【図１３】図１３：ＡＤＡＭ１７抗体１０２２Ｃ３または１０４０Ｈ５で処置したＡ４３１−ＨＢＥＧＦ細胞。
【図１４】図１４：２０日目から１０２２Ｃ３で処置したＡ４３１−ＡＲＥＧ（低ｍ２２５応答モデル）大腫瘍体積細胞。
【図１５】図１５：２０日目から１０２２Ｃ３で処置したＡ４３１−ＨＢＥＧＦ（ｍ２２５耐性モデル）大腫瘍体積細胞。
【図１６】図１６：２０日目から二次治療として１０２２Ｃ３で処置したＡ４３１−ＡＲＥＧ（低ｍ２２５応答モデル）大腫瘍体積細胞。
【図１７】図１７：２０日目から二次治療として１０２２Ｃ３で処置したＡ４３１−ＨＢＥＧＦ（ｍ２２５耐性モデル）大腫瘍体積細胞。
【実施例】
【０１４４】
実施例１：抗体の作製
ヒトＡＤＡＭ１７に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１５〜２０μｇのヒトＡＤＡＭ１７組換えタンパク質（R and D Systems、ref:930-ADB、ｒｈＡＤＡＭ１７）で３回皮下免疫した。最初の免疫は完全フロイントアジュバント（Sigma、アメリカ合衆国、メリーランド州、セントルイス）の存在下で行った。以降の免疫にはフロイントの不完全アジュバント（Sigma）を加えた。
【０１４５】
融合の３日前に、２個体の免疫マウス（血清力価測定に基づいて選択）をフロイントの不完全アジュバントとともに１５〜２０μｇのｒｈＡＤＡＭ１７タンパク質で追加免疫した。近位リンパ節の細断によりリンパ球を調製した後、それらをＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と１：４比（リンパ球：骨髄腫）で融合させた（ＡＴＣＣ、メリカ合衆国、メリーランド州、ロックヴィル）。融合プロトコールはKohler and Milstein (1975)により記載されているものであり、最後に、５０枚の９６ウェルプレートに播種した。次に、融合細胞に対して代謝ＨＡＴ選択を行った。融合およそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングでは、ハイブリドーマの上清を、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＡＤＡＭ１７に対して生成したｍＡｂの分泌に関して評価した。
【０１４６】
簡単に述べれば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Costar 3690、Corning、アメリカ合衆国、ニューヨーク州）をＰＢＳ中０．７μｇ／ｍｌの組換えヒトＡＤＡＭ１７タンパク質（R and D Systems、ｒｅｆ：９３０  ＡＤＢ）５０μｌ／ウェルで、４℃にて一晩コーティングした。次に、これらのプレートを０．５％ゼラチン（＃２２１５１、Serva Electrophoresis GmbH、ドイツ、ハイデルベルク）を含有するＰＢＳで、３７℃にて２時間ブロックした(blocked)。プレートを軽く打ち付けることで飽和バッファーを排出し、５０μｌのサンプル（ハイブリドーマ上清または精製抗体）をＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、５０μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Jackson Immuno-Research Laboratories、Inc.、アメリカ合衆国、ペンシルバニア州、ウエストグローブ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中、１／５０００希釈液として３７℃で１時間加えた。ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Uptima、Interchim、フランス）基質を加えた。室温で１０分のインキュベーション後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０１４７】
第２のスクリーニング工程として、選択されたハイブリドーマ上清をＡ１７２ヒト腫瘍細胞の表面で発現される細胞型のＡＤＡＭ１７と結合し得るｍＡｂに関してＦＡＣＳ分析により評価した。フローサイトメトリーによる選択のために、２×１０５細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルの、１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に１／５００希釈したＡｌｅｘａ  ４８８結合ヤギ抗マウス抗体（＃Ａ１１０１７、Molecular Probes Inc.、アメリカ合衆国、ユージーン）を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄の後、各試験管にヨウ化プロピジウムを終濃度４０μｇ／ｍｌで加えた後に細胞をＦＡＣＳ（Facscalibur、Becton-Dickinson）により分析した。細胞単独およびＡｌｅｘａ  ４８８結合二次抗体とともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。各実験でアイソタイプ対照（Sigma、ｒｅｆ  Ｍ９０３５１ＭＧ）を使用した。少なくとも５０００細胞を用いて、蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を評価した。
【０１４８】
できるだけ速やかに、選択されたハイブリドーマを限界希釈によってクローニングした。各コードにつき１枚の９６ウェルプレートを準備した。クローニング専用培養培地で８細胞／ｍｌに調整した１００μｌ容量の細胞懸濁液を各ウェルに添加した。７日目に、これらのウェルを顕微鏡で観察してクローニングおよびプレーティング効率を確認した後、これらのプレートに１００μｌのクローニング専用培養培地を再供給した。その後、９〜１０日目に、ハイブリドーマ上清を、それらのｒｈＡＤＡＭ１７タンパク質に対する反応性に関してスクリーニングした。次に、アイソタイピングキット（カタログ番号５３００．０５、Southern Biotech、アメリカ合衆国、アラバマ州、バーミンガム）を用いてクローニングされたｍＡｂのアイソタイプを調べた。各ハイブリドーマから１つのクローンを選択し、ｒｈＡＤＡＭ１７およびヒト腫瘍細胞（Ａ  １７２）に対するそれらの結合特異性確認するために拡大培養した。
【０１４９】
実施例２：腫瘍細胞株Ａ４３１からの組換え基質のＡＤＡＭ１７シェディング
それぞれナノルシフェラーゼ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）と融合されたプロＴＧＦα、プロＨＢ−ＥＧＦ、プロアンフィレグリンまたは変異型プロＴＮＦαを原形質膜で発現する安定トランスフェクトＡ４３１細胞株を作製した。これらの細胞の原形質膜におけるＡＤＡＭ１７活性は、ナノルシフェラーゼ（商標）に融合された成熟基質の培養培地中への遊離をもたらした。培養培地サンプルにおけるナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）活性の時間依存的測定はＡＤＡＭ１７活性を反映した。Ａ４３１基質−Ｎｌｕｃ細胞を９６ウェル培養プレート中に３００００細胞／ウェルで播種した。２日後、培養培地を除去し、抗ＡＤＡＭ１７  ｍＡｂ（１０２２Ｃ３）または無関連ｍＡｂ（９Ｇ４）が種々の濃度で希釈された２００μｌの新鮮培養培地に置き換えた。培養（３７℃、ＣＯ２  ５％）２４時間後、総ての試験ウェルから５μｌの培養培地を採取し、ホワイトハーフエリア９６ウェルプレートのウェルに分注した。１５μｌの（ＰＢＳ希釈）Ｎａｎｏ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ基質（フリマジン）の添加後、各試験の総発光をBerthold Mithras LB940マルチモードマイクロプレートリーダーにて０．１秒間読み取った。
【０１５０】
１０２２Ｃ３は、ｉ）培養培地中のＴＧＦα−Ｎｌｕｃ遊離（図１）、ｉｉ）培養培地中のＡＲＥＧ−Ｎｌｕｃ遊離（図２）、ｉｉｉ）培養培地中のＴＮＦα−Ｎｌｕｃ遊離（図３）およびｉｖ）培養培地中のＨＢ−ＥＧＦ−Ｎｌｕｃ遊離（図４）の用量依存的低下を誘導した。
【０１５１】
実施例３：ＡＤＡＭ１７に結合するｍＡｂ  １０２２Ｃ３
１０２２Ｃ３のヒト、マウスおよびキメラＡＤＡＭ１７に対する結合プロファイルは、ウエスタンブロットおよび表面プラズモン共鳴により決定した。いくつかのＡＤＡＭ１７サブドメインおよびヒト／マウスキメラタンパク質をＨＥＫ２９３細胞からヒトＦｃ融合タンパク質として発現させた。Ａタンパク質により精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離とその後の１０２２Ｃ３を用いたウエスタンブロット解析および表面プラズモン共鳴に従って結合に関して試験した。作製し、結合に関して試験したタンパク質を表４に詳細に示す。アミノ酸の位置は、ヒトＡＤＡＭ１７：受託番号Ｐ７８５３６およびマウスＡＤＡＭ１７：受託番号ＡＡＩ３８４２１を参照して引用する。発現したヒト起源のＡＤＡＭ１７ドメインを大文字で、マウス起源のドメインを小文字で記載する。ドメイン名は次のように略す：Ｐ、プロドメイン；Ｃ、触媒ドメイン；Ｄ、ディスインテグリンドメイン；ＭＰＤ、膜近位ドメイン。断片化されたドメインは、アミノ末端側（Ｎｔｅｒ）かカルボキシ末端側（Ｃｔｅｒ）か、タンパク質構造におけるそれらの位置により示す。
【０１５２】
ウエスタンブロット結合アッセイ：
等量の精製タンパク質を、非還元条件下、４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中１％の脱脂乳とともにこのメンブレンをインキュベートすることによりブロッキングを行った。次に、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔ中１μｇ／ｍｌ  １０２２Ｃ３抗体とともに、連続振盪下、室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔ中１：３０００希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧとともに、連続振盪下、室温で１時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質は、増強化学発光検出系キットにより製造者の説明書に従って可視化した。
【０１５３】
BIAcore結合アッセイ：
試験はBiacore X100装置で行った。１０２２Ｃ３をリガンドとして模試医、ＡＤＡＭ１７フラグメントおよびキメラ構築物をアナライトとして用いる。試験はアミンカップリングキット（ＢＲ−１０００−５０、GE Healthcare）を用い、ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（ＢＲ−１００８−２６、GE Healthcare）をランニングバッファーとして用いて、ＣＭ５センサーチップ（ＢＲ−１０００−１２）の両フローセルのマトリックスに共有結合されたウサギ抗マウスポリクローナル抗体（マウス抗体捕捉キット、ＢＲ−１００８−３８、GE Healthcare）に対して２５℃、１０μｌ／分で行った。このバッファーをリガンドおよびアナライトの希釈のために使用する。
【０１５４】
１５μｇ／ｍｌ濃度の１０２２Ｃ３の溶液を１分間、第２のフローセルに注入した（作業面）。各サイクルで、ＡＤＡＭ１７キメラ構築物（Ｃ末端位置にヒトＦｃドメインを有する）の１つを両フローセルに３分間２５０ｎＭの濃度で注入する：１０２２Ｃ３（ＦＣ１）を含まない参照および７００ＲＵ前後のｍ１０２２Ｃ３（ＦＣ２）を含む作業セル。記録されたシグナルは、ＦＣ２応答とＦＣ１応答の間の違いに相当する。
【０１５５】
陽性応答は９０ＲＵと１４０ＲＵの間である。陰性応答は総て１０ＲＵより小さい。各サイクルの終わりに、１０２２Ｃ３を１０ｍＭグリシンＨＣｌ  ｐＨ１．７バッファーの注入によって（マウス抗体捕捉キットから）３分間除去した。
【０１５６】
【表１４】
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【０１５７】
実施例４：表面プラズモン共鳴試験を用いたモノクローナル抗体１０２２Ｃ３に対するＡＤＡＭ−１７の細胞外ドメインの結合の解離定数の定義
両フローセル上で、カルボキシメチルデキストランマトリックスに共有結合したウサギ抗マウス（ＲＡＭ）ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で活性化されたＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare）の第２のフローセルに抗体（リガンド）を結合させた。２倍希釈スキームにより得られた４００〜１２．５ｎＭの範囲の濃度の可溶性ＡＤＡＭ１７（アナライト）（５２ｋＤａの分子量を推定）を、流速３０μｌ／分で、解離相の測定のために１２０秒パルス（会合）および延長１８０秒の遅延で表面に注入した。ＲＡＭ表面を、ＮａＯＨ  ３０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび１０ｍＭグリシン，ＨＣｌ  ｐＨ１．５バッファー溶液を用いて再生した。各濃度で得られた曲線を、参照ＦＣ１表面（マウス抗ＴＡＣＥ  ｍＡｂを含まないＲＡＭ）からシグナルを差し引き、次に、ランニングバッファー注入（Biacore HBS-EPバッファー）から得られたシグナルを差し引くことにより二重参照した。
【０１５８】
データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１ソフトウエアを用い、１：１ラングミュアモデルを用いて処理した。フィットの適合性は、０傾向でなければならない屈折率（ＲＩ）およびκ２値により測定した。
結果を下記の表１５にまとめる。
【０１５９】
【表１５】
2018505149.tif 000017
【０１６０】
実施例５：脱グリコシル化ＣＤＲＨ１の結合評価およびＦＲＥＴ阻害
１０２２Ｃ３はＣＤＲＨ１内に位置するＮ−グリコシル化部位を有し、これは分泌タンパク質において翻訳後修飾される。このグリコシル化部位の影響を決定するために、ｍ１０２２Ｃ３を酵素的に脱グリコシル化した（アスパラギン残基をアスパラギン酸に変換するプロセス）。
【０１６１】
１０２２Ｃ３を、２つのグリコシダーゼを用いて連続的に脱グリコシル化した。１μｌのノイラミダーゼ（New England Biolabs、Ｐ０７２０Ｓ、５００００Ｕ／ｍＬ）を２０μｇの１ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ溶液に加え、この混合物を穏やかに振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。次に、１μＬのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（New England Biolabs、Ｐ０７０４Ｓ、５０００００Ｕ／ｍＬ）を加え、その後、さらなるインキュベーション工程を３７℃で一晩行った。
【０１６２】
１０２２Ｃ３の酵素的脱グリコシル化は、親ｍＡｂの阻害レベルを保持するＦＲＥＴペプチド切断アッセイ（図５）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価される１０２２Ｃ３の阻害活性を低減しなかった。
【０１６３】
酵素的に脱グリコシル化された１０２２Ｃ３は、腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ１２９９との結合に関して評価し、親抗体の結合能を保持していたことが示された（図６）。
【０１６４】
実施例６：ＡＤＡＭ１７への特異的結合
抗ヒトＡＤＡＭ１０抗体ＡＢ９３６（R&D Systems）と比較して、ヒトＡＤＡＭ１７およびＡＤＡＭ１０への１０２２Ｃ３の結合をＥＬＩＳＡによって測定した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ／ウェルの組換えヒト（ｒｈ）ＡＤＡＭ１７（930-ADB, R&D Systems）または２．５μｇ／ｍｌの濃度でｒｈＡＤＡＭ１０ （AD936, R&D Systems）でコーティングした。コーティング溶液を４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、０．５％ゼラチン（#22151、 ドイツ、ハイデルベルク、Serva Electrophoresis GmbH）を含有するＰＢＳで３７℃にて２時間ブロックした。プレートを軽く打ち付けることで飽和バッファーを排出し、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌの１０２２Ｃ３または５μｇ／ｍｌの抗ヒトＡＤＡＭ１０ポリクローナル（AB936, R&D Systems）をＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ＰＢＳ中１／５０００に希釈した、１００μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒト（A7164, Sigma）または抗ヤギ（115-035-164, Jackson ImmunoResearch Europe Ltd）抗体溶液を、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（#UP664782、Uptima 、Interchim、フランス）を加えた。室温で１０分のインキュベーション後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した（図７）。
【０１６５】
実施例７：ＣａＯＶ−３異種移植モデルにおけるマウス１０２２Ｃ３（ｍ１０２２Ｃ３）とそのヒト化型（ｈｚ１０２２Ｃ３）の比較
ｍ１０２２Ｃ３とそのヒト化型を比較するために、ＣａＯＶ−３異種移植モデルを、上記のＳＣＩＤマウスへの細胞移植によって確立した。
【０１６６】
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝２００００）を発現する卵巣癌細胞株ＣａＯＶ−３を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。
【０１６７】
当業者ならば、サイトメトリー、免疫組織化学、抗体結合能（ＡＢＣ）などの既知の技術のいずれかによってＡＤＡＭ１７の発現レベルを容易に決定できるであろう。限定されない例として、発現レベルは、ＡＤＡＭ１７に対する標識抗体の抗体結合能（ＡＢＣ）をサイトメトリーにより測定することで決定することができる。一態様において、腫瘍細胞は、少なくとも５０００のＡＢＣを有するＡＤＡ１７を発現すると見なされる。別の態様では、腫瘍細胞は、少なくとも１００００のＡＢＣを有するＡＤＡ１７を発現すると見なされる。
【０１６８】
０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１２０ｍｍ３に到達した際に（腫瘍細胞注入後１９日）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する５個体ずつ２群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇ維持量で、その後、毎週、１．２５ｍｇ／ｋｇの維持量で、ｍ１０２２Ｃ３およびｈｚ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１６９】
図８ａおよび８ｂに示された結果により、２つの化合物は、腫瘍阻害において同程度であることが示され、１．２５ｍｇ／ｋｇで使用した際にそれぞれｍ１０２２Ｃ３およびｈｚ１０２２Ｃ３について９３％および９４％に到達し、５ｍｇ／ｋｇで使用した際に両抗体について９４％に到達した。
【０１７０】
実施例８：１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
総てのｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために、６〜８週齢の無胸腺マウスを使用した。これらのマウスは、上部に滅菌フィルターの付いたケージで飼い、無菌条件で維持し、仏国・欧州ガイドラインに従って取り扱った。
【０１７１】
ＡＤＡＭ１７、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２発現レベルは、飽和濃度を決定するために、ＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）４℃で２０分間インキュベートした１×１０５細胞／１００μｌを、漸増濃度のそれぞれＭＡＢ９３０１（クローン１１１６３３、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、２２５および４Ｄ５で染色することにより測定した。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。細胞を再懸濁させ、４℃で２０分間、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８抗体（Invitrogen Corporation、スコットランド、＃  Ａ１１０１７）とともにインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。次に、標識された細胞を１００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた後、Facscaliburサイトメーター（Becton Dickinson、フランスル、・ポン＝ド＝クレ）で分析した。生存細胞のみを分析するためにヨウ化プロピジウムを加えた。並行して、ＱＩＦＩＫＩＴビーズをフローサイトメトリーおよびモノクローナル抗体結合による抗体結合および細胞当たりの抗原密度の決定に用いた。ＱＩＦＩＫＩＴは、１０μｍ径の、異なるが、十分に定義された量のマウスｍＡｂ分子でコーティングされた一連のビーズを含む。ビーズは、一次マウスｍＡｂで標識された種々の抗原密度を有する細胞を模倣する。定量された抗原は抗体結合能（ＡＢＣ）単位で表す。
【０１７２】
８．１  Ａ４３１異種移植モデル（ｗｔ）：確立された腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝１７０００）を発現する類表皮癌細胞株Ａ４３１を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に１０×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後２５日）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する６個体ずつ３群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇの１０２２Ｃ３または２２５抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１７３】
得られた結果を図９にまとめた。それらは、両方の抗体により媒介される劇的な腫瘍阻害（５３日目で９４％）を示した。
【０１７４】
８．２  Ａ４３１−ＡＲＥＧ異種移植モデル：確立された腫瘍
Ａ４３１−ＡＲＥＧを、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に１０×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ７０ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後５日）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する６個体ずつ３群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇの１０２２Ｃ３または２２５抗体の維持量で処置した（図１０）あるいは１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇの１０２２Ｃ３または１０４０Ｈ５抗体の維持量で処置した（図１１）。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１７５】
得られた結果を図１０および図１１にまとめた。それらは、１０２２Ｃ３  により媒介される劇的な腫瘍阻害（３３日目で９８％）を示した一方、２２５および１０４０Ｈ５は、より弱い活性を示した：それぞれ８２％および８７％の増殖阻害。これら後の２つの抗体は、１０２２Ｃ３で観察されたような増殖退化を誘発しない。
【０１７６】
８．３  Ａ４３１−ＨＢ−ＥＧＦ異種移植モデル：確立された腫瘍
Ａ４３１−ＨＢ−ＥＧＦを、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。
０日目にマウスの皮下に１０×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ９０ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後５日）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する６個体ずつの群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３または２２５抗体の維持量で処置した（図１２）あるいは１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇの１０２２Ｃ３または１０４０Ｈ５抗体の維持量で処置した（図１３）。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１７７】
得られた結果を図１２および図１３にまとめた。それらは、１０２２Ｃ３  により媒介される劇的な腫瘍阻害（３３日目で９２％）を示した一方、２２５は、活性を失い（図１２）、かつ１０４０Ｈ５は、より弱い活性を示した（図１３）：それぞれ４７％および９０％の増殖阻害。これら後の２つの抗体は、１０２２Ｃ３で観察されたような増殖退化を誘発しない。  
【０１７８】
８．４  Ａ４３１基質モデルＡ４３１−ＡＲＥＧおよびＡ４３１−ＨＢ−ＥＧＦにおける１０２２Ｃ３ローバスト性
１０２２Ｃ３療法のローバスト性を改善するために、Ａ４３１−ＡＲＥＧおよびＡ４３１−ＨＢ−ＥＧＦをｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に１×１０７細胞を注入した。腫瘍がおよそ７００ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後２０日）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する６個体ずつの群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇの１０２２Ｃ３の維持量で処置した（図１４および図１５）。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１７９】
得られた結果を図１４および図１５にまとめ、両モデルにおいて１０２２Ｃ３により媒介される腫瘍増殖の安定化が示された。
【０１８０】
８．５  １０２２Ｃ３抗腫瘍応答に対する２２５療法の影響
高いレベルの循環リガンド（ＨＢ−ＥＧＦまたはＡＲＥＧ）は、患者選択の除外因子ではないため、我々は、２２５を用いたＥＧＦＲ標的治療後の１０２２Ｃ３の抗腫瘍応答を研究することを決断した。Ａ４３１−ＨＢ−ＥＧＦおよびＡ４３１−ＡＲＥＧをこれらｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に１×１０７細胞を注入した。腫瘍がおよそ７０〜９０ｍｍ３に到達した際に（Ａ４３１−ＡＲＥＧおよびＡ４３１−ＨＢ−ＥＧＦそれぞれについて腫瘍細胞注入後５日）、マウスを、同等の腫瘍サイズを有する６個体ずつの群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、５日目〜２０日目に、毎週、５ｍｇ／ｋｇの維持量の２２５で処置した。２０日目に、２２５療法を、１０２２Ｃ３療法と置き換え、２２５について上記の同一の注入プロトコルを用いた。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１８１】
得られた結果を、Ａ４３１−ＡＲＥＧモデルおよびＡ４３１−ＨＢ−ＥＧＦモデルそれぞれについて図１６および図１７にまとめた。２２５から１０２２Ｃ３への処置の変化から、両モデルにおける向上した抗腫瘍効果が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018505149.tif 000033
【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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