(57)【要約】  本発明は、遺伝子一過性発現により完全な植物における標的遺伝子領域上で部位特異的改変を行うための方法であって、以下：前記完全な植物を一過性発現の被検体とし、前記植物における前記標的遺伝子領域に対して特異的なヌクレアーゼを一過的に発現させるステップ、前記ヌクレアーゼの作用下に前記標的領域を切断するステップ、および前記植物のＤＮＡ修復により前記標的領域の部位特異的改変を実現するステップを含む方法を提供する。本発明はさらに、上記方法を用いることにより導入遺伝子を含まない変異植物を培養するための方法および該方法により得られる導入遺伝子を含まない変異植物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全な植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うための方法であって、以下：
前記植物において配列特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させるステップ
を含み、その際、一過性発現のための対象として完全な植物を使用し、前記配列特異的ヌクレアーゼが前記標的断片を標的としてこれを切断し、その結果、前記植物の自己ＤＮＡ修復により前記部位特異的改変が達成される方法。
【請求項２】
前記植物において前記部位特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させるための方法が、以下：
ａ）前記配列特異的ヌクレアーゼまたは前記配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質を前記植物に送達するステップ、および
ｂ）ステップａ）で得られた前記植物を選択圧の非存在下で生育させることにより、前記配列特異的ヌクレアーゼ、または前記植物の染色体に組み込まれていない前記遺伝物質を分解させるステップ
を含み、その際、前記遺伝物質は、組換えベクターまたは線状ＤＮＡ断片またはインビトロ転写ＲＮＡであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記配列特異的ヌクレアーゼまたは前記遺伝物質を、前記配列特異的ヌクレアーゼまたは前記遺伝物質の送達に使用しうる植物の任意の部分を通じて送達することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
送達のための植物の前記部分が、花粉管、花序、茎頂、子房、葉または送達に適した完全な植物の他の任意の部分であることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
植物の前記部分が花粉管であり、前記組換えベクターもしくは線状ＤＮＡ断片もしくはインビトロ転写ＲＮＡを含む溶液または前記配列特異的ヌクレアーゼを含む溶液を受粉後に柱頭に注入することにより前記送達を行う；
植物の前記部分が花序であり、前記組換えベクターまたは線状ＤＮＡ断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の溶液に前記花序を浸漬させることにより前記送達を行う；
植物の前記部分が茎頂であり、前記組換えベクターまたは線状ＤＮＡ断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の溶液に前記茎頂を浸漬させることにより前記送達を行う；
植物の前記部分が子房であり、前記組換えベクターもしくは線状ＤＮＡ断片もしくはインビトロ転写ＲＮＡを含む溶液もしくは前記配列特異的ヌクレアーゼを含む溶液を受粉後に前記子房に注入するか、または前記組換えベクターもしくは線状ＤＮＡ断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の溶液を受粉後に前記子房に注入することにより前記送達を行う；
植物の前記部分が葉であり、前記組換えベクターまたは線状ＤＮＡ断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の溶液を前記葉に注入することにより前記送達を行う
ことを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記配列特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはゲノム編集を達成しうる任意のヌクレアーゼであり、ここで、
前記配列特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、前記遺伝物質が、
ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現することができる１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片から構成されるか、または
ガイドＲＮＡを転写しうる１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片と、Ｃａｓ９タンパク質を発現しうる１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片もしくはＲＮＡと、から構成されるか、または
ガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９タンパク質を発現しうる１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片もしくはＲＮＡと、から構成され、
その際、前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の部分的な塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡであり、前記ｃｒＲＮＡは、前記標的断片に相補的に結合しうるＲＮＡ断片を含む；
前記配列特異的ヌクレアーゼがＴＡＬＥＮヌクレアーゼであり、前記遺伝物質が、対をなすＴＡＬＥＮタンパク質を発現しうる１つの組換えベクターまたはＤＮＡ断片またはＲＮＡであり、その際、前記ＴＡＬＥＮタンパク質は、前記標的部位を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される；
前記配列特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼであり、前記遺伝物質が、対をなすＺＦＮタンパク質を発現しうる１つの組換えベクターまたはＤＮＡ断片またはＲＮＡであり、その際、前記ＺＦＮタンパク質は、前記標的部位を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される
ことを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記部位特異的改変が、前記標的断片における挿入変異、欠失変異および／または置換変異であることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
導入遺伝子を含まない変異体植物および／またはその子孫であって、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法を用いて対象の植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行って該標的遺伝子にその機能を喪失させることにより、該導入遺伝子を含まない変異体植物が得られることを特徴とする、導入遺伝子を含まない変異体植物および／またはその子孫。
【請求項９】
導入遺伝子を含まない変異体植物の製造方法であって、以下：
請求項１から７までのいずれか１項記載の方法を用いて対象の植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うことにより、該標的遺伝子の機能が喪失されており、かつ組み込まれた外来遺伝子を該植物のゲノムが含まない植物を得るステップ
を含む方法。
【請求項１０】
前記植物が、任意の遺伝子型の植物である、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
【請求項１１】
前記植物が、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、綿花、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ライムギ、ロサ・ロクスブンギー（Ｒｏｓａ  ｒｏｘｂｕｎｇｈｉｉ）、エリオボトリャ・ジャポニカ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、ロサ・カニナ（Ｒｏｓａ  ｃａｎｉｎａ）、デンドロビウム・ノビル・リンドル（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ  ｎｏｂｉｌｅ  Ｌｉｎｄｌ．）、ブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ファゴピルム・タタリクム（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ）およびヘベア・ブラジリエンシス（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
【請求項１２】
前記植物がトウモロコシであり、前記配列特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、前記標的遺伝子がＺｍＩＰＫである、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
【請求項１３】
前記標的断片が５’−ＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’であり、前記ガイドＲＮＡを転写するための組換えベクターが、５’−ＡＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴ−３’のＤＮＡ断片をプラスミドｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡの２つのＢｂｓＩ制限部位の間に挿入することにより得られ、かつ前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現させるための組換えベクターがｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９である、請求項１２記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
【請求項１４】
前記標的断片が５’−ＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’であり、前記ガイドＲＮＡを転写しかつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現させるための組換えベクターが、５’−ＡＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴ−３’のＤＮＡ断片をプラスミドｐＢＵＥ４１１の２つのＢｓａＩ制限部位の間に挿入することにより得られる、請求項１２記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
【請求項１５】
前記植物がアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）であり、前記配列特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、前記標的遺伝子がＡｔＰＴＰＡである、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
【請求項１６】
前記標的断片が５’−ＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’であり、前記ガイドＲＮＡを転写しかつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現させるための組換えベクターが、５’−ＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＧＧＣＧＧＡＴＡＴＣＧＴ−３’のＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＳＮ４０１の２つのＢｓａＩ制限部位の間に挿入することにより得られる、請求項１５記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、植物遺伝子工学の分野に属し、遺伝子一過性発現により完全な植物を部位特異的に改変するための方法に関する。
【０００２】
背景技術
遺伝子導入とは、分子生物学的手段により外来遺伝子を特定の生物に導入して、該生物の生物学的な特徴または機能を部分的に変化させるプロセスをいう。１９８３年に、世界初のトランスジェニック植物であるトランスジェニック抗ウイルスタバコの育種が米国で行われた。１９８６年には、トランスジェニック抗ウイルス綿花が米国で開発され、野外試験に供された。１９８７年には、耐虫性遺伝子および除草剤耐性遺伝子が作物に導入された。１９９２年には、トランスジェニックタバコが中国で栽培された。１９９５年には、カナダでトランスジェニック除草剤耐性アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の商業化が開始された。１９９６年には、トランスジェニック耐虫性綿花および除草剤耐性ダイズが米国で大規模に栽培された。現在、世界中には１２０種を超えるトランスジェニック植物が存在し、そのうちダイズ、綿花およびトウモロコシを含む５１種のトランスジェニック作物が商業化されている。
【０００３】
現在、トランスジェニック製品に関する、特にトランスジェニック食品の安全性に対する懸念がますます高まっている。ほとんどの国において、トランスジェニック生物に対する規制は極めて厳しい。トランスジェニック技術またはトランスジェニック製品の規制には、多くの費用および時間がかかる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｒｏｐ  Ｌｉｆｅの調査によれば、トランスジェニック物の商業化には約５．５年および３５００万米ドルを要するとされている。さらに、既に商業化されたトランスジェニック作物は市場にあまり受け入れられておらず、例えば販売が許可された最初のトランスジェニックトマトは、販売不振により最終的には市場から撤退した。したがって、導入遺伝子によらずに作物を改良するための方法を開発することが極めて重要である。
【０００４】
現在、作物の遺伝的改良または遺伝子改変のための方法は、多くの欠点を抱えている。例えば、伝統的な交雑育種は数世代にわたって行う必要があるため時間がかかり、また過度の作業を必要とする。こうした伝統的な交雑育種は種間の生殖的隔離によっても制限されることがあり、また望ましくない遺伝子連鎖に影響を受ける場合がある。物理的または化学的な変異誘発法、例えば放射線変異誘発法、ＥＭＳ変異誘発法などでは、ゲノムにおいて多数の変異部位が無秩序に導入されることがあり、変異部位の特定が極めて困難であるものと考えられる。
【０００５】
近年現れた新規な技術である部位特異的ゲノム改変ツールは主に、配列特異的ヌクレアーゼ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＳＳＮ）の３つのカテゴリー：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＴＡＬＥＮ）、および規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ）が関与する系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を含む。それらの共通の特徴は、それらがエンドヌクレアーゼとして作用して特定のＤＮＡ配列を切断して、ＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）を生じうる点にある。ＤＳＢにより、細胞の固有の修復機構である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え（ＨＲ）を活性化することができ、それによりＤＮＡ損傷が修復される。このＤＮＡ修復プロセス中に、特定のＤＮＡ配列に対する部位特異的改変を達成することができる。
【０００６】
遺伝子導入技術を使用して上記のツールを作物に送達することにより、例えば効率が低い、時間がかかるおよび特異性が低いといった伝統的な育種の欠点を克服することができる。しかしこのプロセスには導入遺伝子が必要であり、したがって子孫集団における分離によって、部位特異的に改変されかつ導入遺伝子を含まない変異体を得る必要がある。（最終的には分離により除去されるとはいえ）外来遺伝子が植物ゲノムに組み込まれているため、依然として安全性の懸念がある。したがって、導入遺伝子を回避して作物を部位特異的に改変するための方法が依然として求められている。
【０００７】
従来の遺伝子導入手段、例えばパーティクルボンバードメント形質転換、アグロバクテリウム媒介型形質転換またはプロトプラストをベースとする形質転換は、組織培養のプロセスを必要とする。植物組織培養とは、所望の組織、細胞またはプロトプラストを植物から単離し、これらを人工的な条件下で培養して完全な植物を再生することを意味する。組織培養は、体細胞変異を生じる傾向にあり、また植物遺伝子型および特定のレシピエントにより制限される。再生された植物を得るのには長い時間がかかり、また多くの資源を必要とする。インサイチュ形質転換とは、組織培養も細胞培養も必要とせずに、（エクスビボではなく）生きている植物を形質転換することを意味する。インサイチュ形質転換では一般に形質転換の被検体として完全な植物が使用され、またインサイチュ形質転換には例えば花粉管法（ｐｏｌｌｅｎ  ｔｕｂｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ）、花序浸漬、茎頂再生、子房への注入(ｏｖａｒｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ)、リーフディスク法などが含まれる。インサイチュ形質転換は組織培養を回避し、したがって実施が容易であり、また特定の装置を必要としない。この方法は遺伝子型にもレシピエントにも依存せず、したがって様々な種の様々な変種への適用が可能である。さらに、トランスジェニックの子孫を直接得ることができる。したがって、インサイチュ形質転換による一過性発現系により植物ゲノムに対する部位特異的改変を達成することができ、このことは、遺伝子編集技術を植物に適用する上で有益である。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、遺伝子一過性発現により完全な植物を部位特異的に改変するための方法を提供することである。
【０００９】
本発明は、対象の植物において配列特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させるステップを含んでよい、植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うための方法であって、一過性発現のための対象として完全な植物を使用し、前記配列特異的ヌクレアーゼが前記標的断片を標的としてこれを切断し、その結果、前記植物の自己ＤＮＡ修復により前記部位特異的改変が達成される、植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うための方法を提供する。本方法は、組織培養プロセスを必要としない。
【００１０】
前記方法の一実施形態において、前記植物において前記部位特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させるための手法は、以下：
ａ）前記配列特異的ヌクレアーゼまたは前記配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質を前記植物に送達するステップ、および
ｂ）ステップａ）で得られた前記植物を選択圧の非存在下で生育させることにより、前記配列特異的ヌクレアーゼ、または前記植物の染色体に組み込まれていない前記遺伝物質を分解させるステップ
を含む。
【００１１】
本発明の方法の一実施形態において、前記遺伝物質は、組換えベクター（例えばＤＮＡプラスミド）または線状ＤＮＡ断片またはインビトロ転写ＲＮＡである。
【００１２】
選択圧の非存在下では、植物の防御系により外来遺伝子の侵入が阻害され、かつ既に該植物に送達された外来遺伝子が分解されるものと考えられる。したがって、一過性発現が生じた完全な植物を生育させた場合に、外来遺伝子（標的断片に特異的なヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質のあらゆる断片を含む）は該植物のゲノムには組み込まれないものと考えられ、また最終的に得られる植物は、導入遺伝子を含まずかつ部位特異的改変を伴う植物である。
【００１３】
本発明の方法の一実施形態においては、配列特異的ヌクレアーゼまたは遺伝物質の送達に使用しうる植物の任意の部分、例えば花粉管、花序、茎頂、子房または葉などを通じて、配列特異的ヌクレアーゼまたは遺伝物質が送達される。
【００１４】
植物の前記部分が花粉管である一実施形態においては、組換えベクター（例えばＤＮＡプラスミド）もしくは線状ＤＮＡ断片もしくはインビトロ転写ＲＮＡを含む溶液または前記配列特異的ヌクレアーゼを含む溶液を受粉後に柱頭に注入することにより送達が行われ、それにより、開花および受精の際に形成される花粉管を通じて、外来遺伝物質または配列特異的ヌクレアーゼが受精卵へと送達される（すなわち花粉管法）。
【００１５】
植物の前記部分が花序である一実施形態においては、組換えベクター（例えばＤＮＡプラスミド）または線状ＤＮＡ断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の溶液に花序を浸漬させることにより送達が行われる（すなわち花序浸漬法またはフローラルディップ法）。
【００１６】
植物の前記部分が茎頂である一実施形態においては、組換えベクター（例えばＤＮＡプラスミド）または線状ＤＮＡ断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の溶液に茎頂を浸漬させることにより送達が行われる（すなわち茎頂再生法）。
【００１７】
植物の前記部分が子房である一実施形態においては、組換えベクター（例えばＤＮＡプラスミド）もしくは線状ＤＮＡ断片もしくはインビトロ転写ＲＮＡを含む溶液または前記配列特異的ヌクレアーゼを含む溶液を受粉後に子房に注入することにより送達が行われる（すなわち子房注入法）。
【００１８】
植物の前記部分が子房である一実施形態においては、組換えベクター（例えばＤＮＡプラスミド）または線状ＤＮＡ断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の溶液を受粉後に子房に注入することにより送達が行われる（すなわちアグロバクテリウム子房注入法）。
【００１９】
植物の前記部分が葉である一実施形態においては、組換えベクター（例えばＤＮＡプラスミド）または線状ＤＮＡ断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の溶液を葉に注入することにより送達が行われる（すなわちリーフディスク法）。
【００２０】
前記方法において、標的断片に特異的な配列特異的ヌクレアーゼは、ゲノム編集を達成しうるいずれのヌクレアーゼであってもよく、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどであってよい。
【００２１】
本発明の一実施形態において、「配列特異的ヌクレアーゼ」とは具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態において、標的断片に特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質は特に、
ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させるための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片（またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをそれぞれ転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させるための２つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片）から構成されるか、あるいは特に、
ガイドＲＮＡを転写するための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片（またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをそれぞれ転写するための２つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片）と、Ｃａｓ９タンパク質を発現させるための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片もしくはＲＮＡと、から構成されるか、あるいは特に、
ガイドＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓ９タンパク質を発現させるための１つの組換えベクターもしくはＤＮＡ断片もしくはＲＮＡと、から構成される。前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の部分的な塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡであり、前記ｃｒＲＮＡは、標的断片に相補的に結合しうるＲＮＡ断片を含む。
【００２２】
さらに、ガイドＲＮＡを転写するための組換えベクターまたはＤＮＡ断片において、該ガイドＲＮＡのコードヌクレオチド配列の転写を開始するためのプロモーターは、Ｕ６プロモーターまたはＵ３プロモーターである。
【００２３】
より具体的には、ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させるための組換えベクターは、「標的断片に相補的に結合しうるＲＮＡ断片」のコード配列をプラスミドｐＨＳＮ４０またはｐＨＳＮ４０１の２つのＢｓａＩ制限部位の間に順方向に挿入することにより得られる組換えプラスミドである。
【００２４】
ガイドＲＮＡを転写するための組換えベクターは、「標的断片に相補的に結合しうるＲＮＡ断片」のコード配列をプラスミドｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡの２つのＢｂｓＩ制限部位の間に順方向に挿入することにより得られる組換えプラスミドであり、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現させるための組換えベクターは具体的には、ベクターｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９である。
【００２５】
本発明の他の実施形態において、「配列特異的ヌクレアーゼ」は、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。標的部位に特異的な配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質は、対をなすＴＡＬＥＮタンパク質を発現する組換えベクター（ＤＮＡプラスミド）またはＤＮＡ断片またはＲＮＡであってよく、その際、前記ＴＡＬＥＮタンパク質は、標的断片を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される。
【００２６】
配列特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である場合には、標的部位に特異的な配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質は、対をなすＺＦＮタンパク質を発現する組換えベクター（ＤＮＡプラスミド）またはＤＮＡ断片またはＲＮＡであってよく、その際、前記ＺＦＮタンパク質は、標的断片を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される。
【００２７】
前記方法において、部位特異的改変は具体的には、植物ゲノム中の標的断片における挿入、欠失および／または置換である。いくつかの実施形態において、標的断片は、標的遺伝子のコード領域内に存在する。いくつかの実施形態において、標的断片は、標的遺伝子の転写調節領域内に存在し、例えばプロモーター内に存在する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、構造遺伝子であっても非構造遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態において、前記改変によって、標的遺伝子の機能喪失が生じる。いくつかの実施形態において、前記改変によって、標的遺伝子の機能の獲得（または変更）が生じる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、植物は任意の遺伝子型のものであってよい。植物は、単子葉植物であっても双子葉植物であってもよく、例えばトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、コムギ、ダイズ、綿花、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ライムギ、ロサ・ロクスブンギー（Ｒｏｓａ  ｒｏｘｂｕｎｇｈｉｉ）、エリオボトリャ・ジャポニカ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、ロサ・カニナ（Ｒｏｓａ  ｃａｎｉｎａ）、デンドロビウム・ノビル・リンドル（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ  ｎｏｂｉｌｅ  Ｌｉｎｄｌ．）、ブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ファゴピルム・タタリクム（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ）またはヘベア・ブラジリエンシス（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）であってよい。
【００２９】
植物がトウモロコシ、コムギ、ダイズ、綿花、タバコなどである場合には、配列特異的ヌクレアーゼまたは遺伝物質を花粉管法により送達することができる。植物がアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、コムギ、ライムギなどである場合には、配列特異的ヌクレアーゼまたは遺伝物質を花序浸漬法により送達することができる。植物がトウモロコシ、ロサ・ロクスブンギー（Ｒｏｓａ  ｒｏｘｂｕｎｇｈｉｉ）、エリオボトリャ・ジャポニカ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、ロサ・カニナ（Ｒｏｓａ  ｃａｎｉｎａ）などである場合には、遺伝物質を茎頂再生法により送達することができる。植物がコムギ、ダイズ、綿花、デンドロビウム・ノビル・リンドル（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ  ｎｏｂｉｌｅ  Ｌｉｎｄｌ．）などである場合には、配列特異的ヌクレアーゼまたは遺伝物質を子房注入法により送達することができる。植物がタバコ、ブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ファゴピルム・タタリクム（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ）、ヘベア・ブラジリエンシス（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）などである場合には、遺伝物質をリーフディスク法により送達することができる。
【００３０】
本発明の一実施形態（実施例１）において、植物はトウモロコシ（特に、トウモロコシ交雑種ＨｉＩＩおよび近交系Ｂ７３、Ｚｈｅｎｇ５８など）であり、ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり、標的遺伝子はトウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫであり、標的断片は５’−ＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’であり、ガイドＲＮＡを転写するための組換えベクターは、５’−ＡＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴ−３’で示されるＤＮＡ断片をプラスミドｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡの２つのＢｂｓＩ制限部位の間に順方向に挿入することにより得られる組換えプラスミドであり、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現させるための組換えベクターは具体的には、ベクターｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９であり、ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させるための組換えベクターは、５’−ＧＧＣＧＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴ−３’で示されるＤＮＡ断片をプラスミドｐＢＵＥ４１１の２つのＢｓａＩ制限部位の間に順方向に挿入することにより得られる組換えプラスミドである。
【００３１】
本発明の他の実施形態（実施例２）において、植物はアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）であり、ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり、標的遺伝子はアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内在性遺伝子ＡｔＰＴＰＡであり、標的断片は５’−ＡＣＧＡＴＡＴＣＣＧＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣ−３’であり、ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させるための組換えベクターは、５’−ＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＧＧＣＧＧＡＴＡＴＣＧＴ−３’で示されるＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＳＮ４０１の２つのＢｓａＩ制限部位の間に順方向に挿入することにより得られる組換えプラスミドである。
【００３２】
本発明の方法を用いて対象の植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行って該標的遺伝子にその機能を喪失させることにより得られる、導入遺伝子を含まない変異体植物および／またはその子孫もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００３３】
本発明はまた、導入遺伝子を含まない変異体植物の製造方法であって、以下：
本発明の方法を用いて対象の植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うことにより、該標的遺伝子の機能が喪失されておりかつ組み込まれた外来遺伝子をゲノムが含まない植物を得るステップ
を含む方法を提供する。
【００３４】
本明細書において使用する場合に、トランスジェニック植物とは、そのゲノムに組み込まれた外来遺伝子を有する植物を指す。導入遺伝子を含まない植物とは、そのゲノムに組み込まれた外来遺伝子を有しない植物を指す。
【００３５】
本発明により、ゲノム編集技術と、完全な植物を発現の対象として使用する一過性発現系とが組み合わせられる。すなわち本発明においては、花粉管法、花序浸漬、茎頂再生、子房注入、リーフディスク法などにより完全な植物における細胞または組織に配列特異的ヌクレアーゼを導入し、次いで該配列特異的ヌクレアーゼの一過性発現により植物ゲノムの改変を達成する。高い安全性を有する変異体の子孫を直接得ることができる。例えば花粉管法においては、配列特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼを発現させるためのＤＮＡ／ＲＮＡを含む溶液を、植物の開花または受精の際に形成される花粉管を通じて受精卵細胞または生殖細胞（精子または卵子）に送達する。これらの細胞はプロトプラスト様（細胞壁が形成されていない）であり、活発なＤＮＡ複製および組換えを行い、したがって配列特異的ヌクレアーゼにより効率的に編集される。改変された受精卵細胞または生殖細胞は、インタクトな変異体植物へと成長しうる。導入された配列特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼをコードするＲＮＡは、植物細胞により分解される。本方法は完全に選択圧の非存在下で行われるため、配列特異的ヌクレアーゼをコードするＤＮＡもまた、植物細胞により分解される。したがって、外来遺伝子はゲノムに組み込まれず、得られた変異体はより高い生物学的安全性を有するであろう。
【００３６】
本発明の利点としては、例えば次のものが挙げられる：組織培養を行わないこと、完全な植物の水準で変異が得られること、本方法は遺伝子型にもレシピエントにも依存せず、したがって本方法は様々な種の様々な変種への適用が可能であること、Ｔ１変異体を直接得ることができ、かつ変異を安定的に子孫に遺伝させうること、さらに重要なことに、得られた変異体植物が外来遺伝子を含まず、したがってより高い生物学的安全性を有すること。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、プロトプラストにおけるｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系の一過性発現によるトウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫの部位特異的変異誘発を示す。図１ａは、ゲル電気泳動図である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐであり、レーン２およびレーン３は、プロトプラストＤＮＡのＰＣＲ産物に関するＳａｃＩ制限消化の結果であり、その際、これらのプロトプラストはｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系を用いて形質転換されたものであり、レーン４は、野生型プロトプラストＤＮＡのＰＣＲ産物に関するＳａｃＩ消化の結果であり、レーン５は、野生型プロトプラストのＰＣＲ産物である。図１ｂは、いくつかの変異体のシーケンシング結果である。
【図２】図２は、花粉管法によるトウモロコシ変種ＨｉＩＩにおけるｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系の一過性発現によるトウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫの部位特異的変異誘発およびシーケンシング結果を示す。図２ａは、ゲル電気泳動図である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐであり、レーン２からレーン１２までは、変異体のＰＣＲ産物に関するＳａｃＩ制限消化の結果であり、レーン１３は、野生型対照のＰＣＲ産物に関するＳａｃＩ消化の結果である。図２ｂは、いくつかの変異体のシーケンシング結果である。
【図３】図３は、花粉管法によるトウモロコシ変種Ｂ７３におけるｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系の一過性発現によるトウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫの部位特異的変異誘発およびシーケンシング結果を示す。図３ａは、ゲル電気泳動図である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐであり、レーン２からレーン６までは、変異体のＰＣＲ産物に関するＳａｃＩ制限消化の結果であり、レーン７は、野生型対照のＰＣＲ産物に関するＳａｃＩ消化の結果である。図３ｂは、いくつかの変異体のシーケンシング結果である。
【図４】図４は、花粉管法によるトウモロコシ変種Ｚｈｅｎｇ５８におけるｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系の一過性発現によるトウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫの部位特異的変異誘発およびシーケンシング結果を示す。図４ａは、ゲル電気泳動図である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐであり、レーン２からレーン９までは、変異体のＰＣＲ産物に関するＳａｃＩ制限消化の結果であり、レーン１０は、野生型対照のＰＣＲ産物に関するＳａｃＩ消化の結果である。図４ｂは、いくつかの変異体のシーケンシング結果である。
【図５】図５は、ｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡ−Ｃ１ベクターおよびｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９ベクター上の２つのプライマーを使用した、花粉管法による異なるトウモロコシ変種からのＺｍＩＰＫ遺伝子変異体の増幅を示すゲル電気泳動図である。図５ａは、プライマー対ＺｍＵ３−Ｆ／Ｃ１Ｒを用いた増幅結果であり、図５ｂは、プライマー対Ｃａｓ９−１Ｆ／Ｃａｓ９−１Ｒを用いた増幅結果である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐであり、レーン２からレーン１０までは試験した変異体であり、レーン１１は陽性対照（プラスミドｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡ−Ｃ１またはｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９）である。
【図６】図６は、プロトプラストにおけるｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系の一過性発現によるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内在性遺伝子ＡｔＰＴＰＡの部位特異的変異誘発を示す。図６ａは、ゲル電気泳動図である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２およびレーン３は、プロトプラストＤＮＡのＰＣＲ産物に関するＥｃｏＲＶ制限消化の結果であり、その際、これらのプロトプラストはｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系を用いて形質転換されたものであり、レーン４は、野生型プロトプラストＤＮＡのＰＣＲ産物に関するＥｃｏＲＶ消化の結果であり、レーン５は野生型プロトプラストのＰＣＲ産物である。図６ｂは、未切断のバンドのシーケンシング結果である。
【図７】図７は、花序浸漬法によるｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系の一過性発現によるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内在性遺伝子ＡｔＰＴＰＡの部位特異的変異誘発を示す。図７ａは、ゲル電気泳動図である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２からレーン９までは、変異体のＰＣＲ産物に対するＥｃｏＲＶ制限消化の結果であり、レーン１０は、野生型対照のＰＣＲ産物に関するＥｃｏＲＶ消化の結果である。図７ｂは、いくつかの変異体のシーケンシング結果である。
【図８】図８は、ｐＨＳＮ４０１−Ｃ２ベクター上のプライマーを使用したＡｔＰＴＰＡ遺伝子変異体の増幅を示すゲル電気泳動図である。図８ａは、プライマー対ｐＨＳＮ４０１−１Ｆ／Ｃ２Ｒを用いた増幅結果であり、図８ｂは、プライマー対ＣＡＳ９−２Ｆ／ＣＡＳ９−２Ｒを用いた増幅結果である。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２からレーン９までは試験した変異体であり、レーン１０は陽性対照（プラスミドｐＨＳＮ４０１）である。
【図９】図９は、ＡｔＰＴＰＡ遺伝子変異体の子孫における変異を示す。レーン１はマーカーであり、下部から上部に向かってそれぞれ１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐであり、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５はホモ接合型変異体の子孫であり、レーン６、レーン７は、分離により得られた野生型子孫であり、レーン８、レーン９、レーン１０は、ヘテロ接合型変異体の子孫である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な実施形態
以下の実施例において用いた実験方法は、別段の記載がない限りいずれも従来の方法である。
【００３９】
以下の実施例において使用した材料、試薬は、別段の記載がない限りいずれも市販されている。
【００４０】
発現ベクターｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡは、“Ｌｉａｎｇ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４１：６３−６８，（２０１４）”に開示されている。
【００４１】
発現ベクターｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９は、“Ｗａｎｇ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｈｏｍｏｅｏａｌｌｅｌｅｓ  ｉｎ  ｈｅｘａｐｌｏｉｄ  ｂｒｅａｄ  ｗｈｅａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｐｏｗｄｅｒｙ  ｍｉｌｄｅｗ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ３２，  ９４７−９５１（２０１４）”に開示されている。
【００４２】
発現ベクターｐＨＳＮ４０１およびｐＢＵＥ４１１は、“Ｘｉｎｇ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１４：３２７，（２０１４）”に開示されている。
【００４３】
トウモロコシ変種ＨｉＩＩは、“Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｇｒｅｅｎ，  Ｃ．Ｅ．＆  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｒ．Ｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｒｍｐｌａｓｍ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｃｏｏｐ．  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ．  ６５，９２−９３（１９９１）”に開示されている。
【００４４】
トウモロコシ変種Ｂ７３は、“Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｗ．Ａ．  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ７０  ａｎｄ  Ｂ７３  ｐａｒｅｎｔａｌ  ｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ．  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．  １２，  ７２１（１９７２）”に開示されている。
【００４５】
トウモロコシ変種Ｚｈｅｎｇ５８は、“Ｚｈａｎｇ  Ｆａｌｉｎ，  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍａｉｚｅ  ｉｎｂｒｅｄ  ｌｉｎｅ  Ｚｈｅｎｇ５８．  Ｃｒｏｐ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２００１（４）：３１−３１”に開示されている。
【００４６】
アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）生態型コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）は、“Ｋｏｏｒｎｅｅｆ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｎｋａｇｅ  ｍａｐ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．  Ｊｏｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ．  ７４，２６５−２７２（１９８３）”に開示されている。
【００４７】
ＭＳ培地：４．４３ｇ／Ｌ  ＭＳ塩（Ｓｉｇｍａ、Ｍ５５２４）、３０ｇ／Ｌ  スクロース、３ｇ／Ｌ  フィトゲル（ｐｈｙｔｏｇｅｌ）、ｐＨ５．７、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理したもの。
【００４８】
ＬＢ培地：１０ｇ／Ｌ  トリプトン、５ｇ／Ｌ  酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（固形ＬＢ培地の場合には、液体培地１リットル当たり１５ｇのアガロースを加えた）、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理したもの。
【００４９】
プロトプラストの調製および形質転換に用いた溶液を、表１から表６までに示す。
【００５０】
表１：アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のための酵素溶解溶液５０ｍｌ
【表１】
2018503392.tif 000002
【００５１】
表２：トウモロコシのための酵素分解溶液５０ｍｌ
【表２】
2018503392.tif 000003
【００５２】
表３：Ｗ５  ５００ｍｌ
【表３】
2018503392.tif 000004
【００５３】
表４：ＷＩ溶液２５０ｍｌ
【表４】
2018503392.tif 000005
【００５４】
表５：ＭＭＧ溶液１０ｍｌ
【表５】
2018503392.tif 000006
【００５５】
表６：ＰＥＧ溶液４ｍｌ
【表６】
2018503392.tif 000007
【００５６】
上記表１から表６までにおける％は、質量／体積百分率（ｇ／１００ｍｌ）を示す。
【００５７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の形質転換：
１）（−８０℃で保存した）コンピテントセルを氷上で解凍し、次いでプラスミドＤＮＡ  ２μｇを加えて混合し、この混合物を氷上に３０分間置いた。
２）ＥＰ管を液体窒素中に１分間浸漬し、３７℃の水浴に素早く移して解凍した（２分間）。
３）次いでＬＢ液体培地１ｍｌを加え、低速（１５０ｒｐｍ）で振盪しながら２８℃で４〜５時間インキュベートした。
４）１００００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより細菌細胞を収穫し、上清を廃棄し、再懸濁させた細菌細胞１００μｌを、相応する抗生物質を含む選択プレートにプレーティングした。
５）白色コロニー（形質転換体）が出現するまで、プレートを上下逆にして２８℃でインキュベートした。
【００５８】
実施例１  花粉管法および茎頂再生法によるトウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫの部位特異的編集
Ｉ．標的断片：標的Ｃ１の設計
標的Ｃ１：５’−ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ１７２６３５で示される遺伝子ＺｍＩＰＫの３９３〜４１５位）。
【００５９】
ＩＩ．Ｃ１部位を含むｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡプラスミドおよびｐＢＵＥ４１１プラスミドの調製
Ｃ１は、標的Ｃ１に相補的に結合しうるＲＮＡのＤＮＡ配列である。
【００６０】
以下の粘着末端（下線部）を有する１本鎖オリゴヌクレオチドを合成した：
Ｃ１−１Ｆ：５’−ＡＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴ−３’；
Ｃ１−２Ｆ：５’−ＧＧＣＧＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴ−３’；
Ｃ１Ｒ：５’−ＡＡＡＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’。
【００６１】
Ｃ１−１Ｆ／Ｃ１Ｒ間のアニーリングにより粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成し、これをｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡプラスミド中の２つのＢｂｓＩ制限部位の間に挿入して、Ｃ１部位を含むｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡプラスミドを得た。陽性プラスミドをシーケンシングによって確認した。５’−ＡＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴ−３’で示されるＤＮＡ断片をｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡプラスミドのＢｂｓＩ制限部位で順方向に挿入することにより得られた組換えプラスミドは陽性であり、これをｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡ−Ｃ１と命名した。
【００６２】
Ｃ１−２Ｆ／Ｃ１Ｒ間のアニーリングにより粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成し、これをｐＢＵＥ４１１プラスミド中の２つのＢｓａＩ制限部位の間に挿入して、Ｃ１部位を含むｐＢＵＥ４１１プラスミドを得た。陽性プラスミドをシーケンシングによって確認した。５’−ＧＧＣＧＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴ−３’で示されるＤＮＡ断片をｐＢＵＥ４１１プラスミドのＢｓａＩ制限部位で順方向に挿入することにより得られた組換えプラスミドは陽性であり、これをｐＢＵＥ４１１−Ｃ１と命名した。
【００６３】
ＩＩＩ．トウモロコシプロトプラストへのｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系の送達
ｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９ベクターと、ステップＩＩで得られたｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡ−Ｃ１プラスミドを、トウモロコシプロトプラストのプロトプラストに導入した。具体的なプロセスは、以下のものを含む。
【００６４】
１．トウモロコシ実生の成長
トウモロコシ交雑変種ＨｉＩＩならびに近交系Ｂ７３およびＺｈｅｎｇ５８の種子を一晩水に浸漬させ、（水を加えた）吸収紙を入れたプレートに移し、明条件で３日間処理して発芽させた。発芽したトウモロコシ種子を土壌中で２４℃で１０〜１１日間生育させて、トウモロコシ実生を得た。
【００６５】
２．プロトプラストの単離
１）トウモロコシの柔らかい葉を採取し、カッター刃を使用してこれらの葉の中央部分を切断して０．５〜１ｍｍの糸状物とし、これらの糸状物を酵素分解溶液５０ｍｌ中に５時間置いて消化させた（酵素分解を真空中で０．５時間行い、次いで１０ｒｍｐでゆっくりと４．５時間振盪した）。
注釈：酵素分解時の温度を２０〜２５℃に保持することが望ましく、この反応を暗所で行うことが望ましく、また反応後に溶液を穏やかに振盪してプロトプラストを放出させることが望ましい。
２）３０ｍｌのＷ５を加えることによりこの酵素分解物を希釈し、７５μｍのナイロンろ過膜を用いてこれをろ過して、５０ｍｌ丸底遠沈管に入れた。
注釈：ナイロンろ過膜を７５％（体積％）エタノール中に沈め、水で洗浄し、次いで使用前にＷ５中に２分間浸漬させることが望ましい。
３）２３℃で、１５０×ｇの遠心分離を３分間行い、上清を廃棄した。
４）このペレットを１０ｍｌのＷ５で懸濁させ、１５０×ｇで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。
５）適量のＭＭＧ溶液を加えることによりこれらのプロトプラストを懸濁させ、形質転換を行うまでこれらを氷上に置いた。
注釈：これらのプロトプラストの濃度を顕微鏡検査（×１００）により測定する必要がある。プロトプラストの量は、２×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌであった。
【００６６】
３．トウモロコシプロトプラストの形質転換
１）ｐＪＩＴ１６３−２ＮＬＳＣａｓ９ベクター１０μｇと、ｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡ−Ｃ１プラスミド１０μｇとを、２ｍｌ遠沈管に加えた。ピペットを用いて２００μｌの上記プロトプラストを加え、次いで穏やかに叩くことにより混合し、３〜５分間静置した。次いで２２０μｌのＰＥＧ４０００溶液を加え、穏やかに叩くことにより混合した。形質転換を、暗所で１５分間行った。
２）８８０μｌのＷ５（室温）を加え、反転により混合し、１００×ｇの遠心分離を３分間行い、かつ上清を廃棄した。
３）１ｍｌのＷＩ溶液を加え、反転により混合し、内容物を（予めＷＩ溶液１ｍｌを加えておいた）６ウェルプレートに穏やかに移し、次いで２３℃で一晩培養した。
【００６７】
ＩＶ．ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系を用いたトウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫの変異誘発の、ＰＣＲ／ＲＥ実験を用いた解析
トウモロコシプロトプラストの形質転換の４８時間後にゲノムＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ／ＲＥ（ポリメラーゼ連鎖反応／制限消化）実験解析用の鋳型として使用した。同時に、野生型トウモロコシ変種ＨｉＩＩのプロトプラストを対照として使用した。ＰＣＲ／ＲＥ解析方法は、Ｓｈａｎ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ（２０１３）に基づく。トウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ１７２６３５）の標的断片（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ１７２６３５の３９３〜４１５位）は、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ認識配列（５’−ＧＡＧＣＴＣ−３’）を含むため、ＰＣＲ／ＲＥ試験を行うために実験において制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩを使用した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった：
ＺｍＩＰＫ−１Ｆ：５’−ＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡＡ−３’；
ＺｍＩＰＫ−１Ｒ：５’−ＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＣＣ−３’。
【００６８】
ＰＣＲ／ＲＥ実験の結果を図１に示す。これらの結果から、ＺｍＩＰＫ遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。未切断のバンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＺｍＩＰＫ遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した。
【００６９】
Ｖ．花粉管法によるトウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫの部位特異的編集
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、巨大分子（タンパク質および核酸を含む）を細胞に運びうる短鎖ペプチドの一クラスである。近年の研究から、細胞透過性ペプチドはＤＮＡに結合すると酵素分解から該ＤＮＡを保護しうることが分かっている。したがって、効率を向上させるべく、一般的に花粉管法においては細胞透過性ペプチドが使用されている。
１）ＣＰＰを含むＤＮＡ溶液の調製：固体粉末ＣＰＰ（アミノ酸配列：ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｉｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．により合成）に滅菌水を配合して、３０ｍｇ／ｍｌストック溶液とした。ｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡ−Ｃ１プラスミドとｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９プラスミドとの混合物（この混合物におけるｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡ−Ｃ１とｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９との質量比は、１：１である）に、１：１の質量比でＣＰＰを加えたところ、ＤＮＡおよびＣＰＰの最終濃度は２５〜３０μｇ／ｍｌであった（これらの２つのプラスミドの合計の最終濃度は２５〜３０μｇ／ｍｌであり、ＣＰＰの最終濃度は２５〜３０μｇ／ｍｌである）。
２）野外の強いトウモロコシ植物（ＨｉＩＩ、Ｂ７３およびＺｈｅｎｇ５８）を、レシピエント材料として選択した。開花後、これらの植物の柱頭に袋をかけることにより、他家受精または自家受精を避けた。適切な時点で手動による受粉を実施した。受粉の１８〜２１時間後に袋を取り除き、穂軸の頂部から２〜３ｃｍの長さを残して花糸および包葉を切断した。花糸の切断面は包葉の切断面よりもわずかに小さく、これらの花糸と包葉との間には小さな溝が形成され、この溝に、ステップ１）からのＤＮＡ溶液３００〜４００μｌをピペットで素早く滴下した。花糸をＤＮＡ溶液に浸漬させ、柱頭に再び袋をかけた。各実験を、トウモロコシ穂軸４０〜５０本において行った。粒の成熟後にこれらのトウモロコシ穂軸を収穫し、個別に乾燥させた。
３）乾燥させた種子を成長させ、発芽後にＰＣＲ／ＲＥ法（具体的なステップおよび使用したプライマーはＩＶに示す）を用いてＺｍＩＰＫ遺伝子変異体を検出した。
【００７０】
異なる遺伝子型のトウモロコシ植物について、花粉管法により変異体を得た。いくつかの変異体の検出結果を図２から図４までに示す。これらから、異なるトウモロコシ変種におけるＺｍＩＰＫ遺伝子の標的部位内で変異が生じたことが判明した。未切断のバンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＺｍＩＰＫ遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した。遺伝子型にもレシピエントにも依存しない本発明において提供される花粉管法により、完全な植物の水準で変異体を得ることができることが判明した。
【００７１】
ＶＩ．茎頂再生法によるトウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫの部位特異的編集
１．トウモロコシ材料の調製
１）トウモロコシ近交系ＨｉＩＩの種子を三角フラスコに入れ、７０％（ｖ／ｖ）アルコールで５分間および５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムで３０分間滅菌し、次いで滅菌水中で５回洗浄した。１．５体積の水を加え、このフラスコを密封し、２８℃で４〜６時間インキュベートした。
２）２回目の滅菌。種子を５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムで３０分間滅菌し、次いで滅菌水中で５回洗浄した。
３）滅菌したこれらの種子を、ろ紙を備えた滅菌プレート上に置き、暗所で２８℃で３〜４日間インキュベートして発芽させた。発芽した種子を同期成長させたものをＭＳ培地上に移し、実生が４〜５ｃｍに達するまで暗所で２８℃で３〜４日間培養した。
【００７２】
２．トウモロコシ茎頂の再生
１）芽の切断：節の１．５〜２ｍｍ上方で横方向に茎を切断して、この茎の内側の芽を露出させた。その後、この芽を、節の０．２ｍｍ下方で（またはちょうど節を通るように）縦方向に中央で切断した。根を約０．８ｍｍ残した。
２）Ｃ１を含むｐＢＵＥ４１１−Ｃ１プラスミドをアグロバクテリウムコンピテントセルＡＧＬ１に導入して形質転換させた。ＰＣＲおよび制限消化による検定を行った後、陽性株を使用してこれらの植物を感染させた。
３）陽性株をＬＢ固体培地上にプレーティングし、暗所で２８℃で２日間培養した。若干の細菌を掻き取って２０ｍｌのＭＳ液体培地に入れ、２８℃で培養してＯＤ６００を約０．８とした。その後、２００μＭのアセトシリンゴンを加えた。
４）これらの切った植物を、切り口を下方にしてプレートに入れた。このプレートを真空装置内に斜めに入れ（３０〜４５℃）、アグロバクテリウム溶液を加えてこれらの切り口を沈めて、２０分間感染させた。感染の間、排気を０．０５ＭＰの圧力で１０分間設定した。
５）感染後、これらの植物をアグロバクテリウム溶液から取り出し（ろ紙を用いて、これらの植物上のアグロバクテリウム溶液の余剰分を取り除き）、ＭＳ培地に導入して暗所で２３℃で３日間培養した。
６）共培養後、これらの材料を取り出して洗浄して培地を除去し、次いでポット（４／５は通常の土壌であり、１／５は上方のバーミキュライトである）内で成長させた。移植後、実生を暗所で２８℃で２日間培養し、次いで明所で７〜１０日間培養し、次いで結実するまで通常の条件下で成長させた。得られたトウモロコシ種子を成長させ、発芽後にＰＣＲ／ＲＥ法によりＺｍＩＰＫ遺伝子変異に関して試験した。
【００７３】
これらの結果から、ＺｍＩＰＫ遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。未切断のバンドを回収してシーケンシングを行った。これらのシーケンシング結果から、ＺｍＩＰＫ遺伝子において挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した。
【００７４】
ＶＩＩ．花粉管法により得られたトウモロコシ変異体中にｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡ−Ｃ１およびｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９が存在するか否かの判定
ｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡ−Ｃ１プラスミドとｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９プラスミドとをそれぞれ増幅するため、これら２つのプラスミドの配列にしたがって２つのプライマーセットを設計した。
【００７５】
ＺｍＵ３と標的断片との間に配置されたＺｍＵ３−Ｆ／Ｃ１Ｒ：
ＺｍＵ３−Ｆ：５’−ＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡ−３’；
Ｃ１Ｒ：５’−ＡＡＡＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’。
理論的には、増幅される断片は約３２２ｂｐであるはずであり、配列は、配列番号１の４６７〜７８８位に存在するはずである。配列番号１は、ｐＺｍＵ３−ｇＲＮＡ−Ｃ１の配列である。
【００７６】
ｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９ベクター上に配置されたＣａｓ９−１Ｆ／Ｃａｓ９−１Ｒ：
Ｃａｓ９−１Ｆ：５’−ＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＴＴＣＣＣＴＣＣＴＧＴ−３’；
Ｃａｓ９−１Ｒ：５’−ＣＴＴＡＴＧＣＣＧＴＣＣＣＡＴＧＡＣＣＴＴＣ−３’。
理論的には、増幅される断片は約７４４ｂｐであるはずであり、配列は、配列番号２の１５７３〜２３１６位に存在するはずである。配列番号２は、ｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９におけるＣａｓ９の配列である。
【００７７】
これらいずれの植物についても標的バンドは増幅されず（図５）、このことから、本発明によって、植物に対して部位特異的改変を行った場合には導入遺伝子の挿入も保有も阻止され、かつ得られた変異体は比較的高い生物学的安全性を有することが判明した。
【００７８】
ＶＩＩＩ．茎頂再生法により得られたトウモロコシ変異体中にｐＢＵＥ４１１−Ｃ１が存在するか否かの判定
ＯｓＵ３ｐとＣａｓ９とをそれぞれ増幅するために、ｐＢＵＥ４１１−Ｃ１プラスミドの配列にしたがって２つのプライマーセットを設計した。
【００７９】
ＯｓＵ３ｐと標的断片との間に配置されたｐＢＵＥ４１１−１Ｆ／Ｃ１Ｒ：
ｐＢＵＥ４１１−１Ｆ：５’−ＧＡＣＡＧＧＣＧＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣ−３’；
Ｃ１Ｒ：５’−ＡＡＡＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’
理論的には、増幅される断片は約２８９ｂｐであるはずであり、配列は、配列番号３の１７４〜４６２位に存在するはずである。配列番号３は、ｐＢＵＥ４１１−Ｃ１のｇＲＮＡ配列である。
【００８０】
ｐＢＵＥ４１１−Ｃ１ベクター上のＣａｓ９領域内に配置されたＣＡＳ９−２Ｆ／ＣＡＳ９−２Ｒ：
ＣＡＳ９−２Ｆ：５’−ＣＴＣＣＣＴＡＡＧＣＡＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴ−３’；
ＣＡＳ９−２Ｒ：５’−ＴＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＣＴＣＣＣ−３’
理論的には、増幅される断片は約７９４ｂｐであるはずであり、配列は、配列番号４の１６３９〜２４３２位に存在するはずである。配列番号４は、ｐＨＳＮ４１１−Ｃ１のＣａｓ９配列である。
【００８１】
これらいずれの植物についても標的バンドは増幅されず、このことから、本発明によって、植物に対して部位特異的改変を行った場合には導入遺伝子の挿入も保有も阻止され、かつ得られた変異体は比較的高い生物学的安全性を有することが判明した。
【００８２】
実施例２  花序浸漬法によるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内在性遺伝子ＡｔＰＴＰＡの部位特異的編集
Ｉ．標的断片：標的Ｃ２の設計
標的Ｃ２：５’−ＣＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＧＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣ−３’（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３６０１３３で示される遺伝子ＡｔＰＴＰＡの３５１〜３７３位）。
【００８３】
ＩＩ．Ｃ２断片を含むｐＨＳＮ４０１プラスミドの調製
Ｃ２は、標的Ｃ２に相補的に結合しうるＲＮＡのＤＮＡ配列である。
【００８４】
以下の粘着末端（下線部）を有する１本鎖オリゴヌクレオチドを合成した：
Ｃ２Ｆ：５’−ＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＧＧＣＧＧＡＴＡＴＣＧＴ−３’；
Ｃ２Ｒ：５’−ＡＡＡＣＡＣＧＡＴＡＴＣＣＧＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣ−３’。
【００８５】
オリゴヌクレオチドのアニーリングにより粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成し、これをｐＨＳＮ４０１プラスミド中の２つのＢｓａＩ制限部位の間に挿入して、Ｃ２部位を含むｐＨＳＮ４０１プラスミドを得た。陽性プラスミドをシーケンシングによって確認した。５’−ＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＧＧＣＧＧＡＴＡＴＣＧＴ−３’で示されるＤＮＡ断片をｐＨＳＮ４０１プラスミドのＢｓａＩ制限部位で順方向に挿入することにより得られた組換えプラスミドは陽性であり、これをｐＨＳＮ４０１−Ｃ２と命名した。
【００８６】
ＩＩＩ．アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）プロトプラストへのｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系の送達
ステップＩＩで得られたｐＨＳＮ４０１−Ｃ２プラスミドを、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）生態型コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）のプロトプラストに導入した。具体的なプロセスは、以下のものを含む。
【００８７】
１．アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）実生の成長
１）種子の処理：アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）生態型コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の種子を１．５ｍＬの管に入れ、７５％（ｖ／ｖ）アルコールに１分間および１０％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムに１５分間浸漬させ、次いで滅菌水中で５〜６回洗浄した。
２）滅菌したこれらの種子を、マイクロピペットでＭＳ培地上に個々にプレーティングした。これらのプレートを密閉し、４℃で３〜４日間置いて春化処理した。
３）春化処理後、これらのプレートをインキュベーターに移して以下の条件下で培養した：２５±２℃、照度５５００±３００Ｌｘ、明所１２時間／日。３週間成長させた後、実生を移植した。
４）これらの実生を土壌（泥炭土：バーミキュライト：パーライト＝１：１：１）に慎重に移植し、３〜４日間フィルムで覆い、次いで２１℃で６３００±３００Ｌｘで培養した。
【００８８】
２．プロトプラストの単離
１）（約１ヶ月間成長させた）アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）生態型コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の柔らかい葉を採取し、カッター刃を使用して切断して０．５ｍｍの糸状物とし、これらの糸状物を酵素分解溶液５０ｍｌ中に５時間入れて消化した（酵素分解を真空中で０．５時間行い、次いで１０ｒｍｐでゆっくりと４．５時間振盪した）。
注釈：酵素分解時の温度を２０〜２５℃に保持することが望ましく、この反応を暗所で行うことが望ましく、また反応後に溶液を穏やかに振盪してプロトプラストを放出させることが望ましい。
２）３０ｍｌのＷ５を加えることによりこの酵素分解物を希釈し、７５μｍのナイロンろ過膜を用いてこれをろ過して、５０ｍｌ丸底遠沈管に入れた。
注釈：ナイロンろ過膜を７５％（体積％）エタノール中に沈め、水で洗浄し、次いで使用前にＷ５中に２分間浸漬させることが望ましい。
３）２３℃で、６０×ｇの遠心分離を５分間行い、上清を廃棄した。
４）穏やかに振盪することによりこのペレットを１０ｍｌのＷ５で再懸濁させ、６０×ｇの遠心分離を５分間行い、かつ上清を廃棄した。
５）適量のＭＭＧ溶液を加えることによりこれらのプロトプラストを懸濁させ、形質転換を行うまでこれらを氷上に置いた。
注釈：これらのプロトプラストの濃度を顕微鏡検査（×１００）により測定する必要がある。プロトプラストの量は、２×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌであった。
【００８９】
３．アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）プロトプラストの形質転換
１）ｐＨＳＮ４０１−Ｃ２プラスミド２０μｇを２ｍｌ遠沈管に加えた。ピペットを用いて、上記ステップ２で得られたプロトプラスト２００μｌを加え、次いで穏やかに叩くことにより混合した。次いで、２５０μｌのＰＥＧ４０００を加え、穏やかに叩くことにより混合した。形質転換を、暗所で１５〜３０分間行った。
２）８８０μｌのＷ５（室温）を加え、反転により混合し、６０×ｇの遠心分離を５分間行い、かつ上清を廃棄した。
３）１ｍｌのＷ５を加え、反転により混合し、内容物を（予め１ｍｌのＷ５を加えておいた）６ウェルプレートに穏やかに移し、次いで２３℃で一晩培養した。
【００９０】
ＩＶ．ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９系を用いたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内在性遺伝子ＡｔＰＴＰＡの部位特異的変異誘発の、ＰＣＲ／ＲＥ実験を用いた解析
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）プロトプラストの形質転換の４８時間後にゲノムＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ／ＲＥ（ポリメラーゼ連鎖反応／制限消化）実験解析用の鋳型として使用した。ＰＣＲ／ＲＥ解析方法は、Ｓｈａｎ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ（２０１３）に基づく。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内在性遺伝子ＡｔＰＴＰＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３６０１３３）の標的断片（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３６０１３３の３５１〜３７３位）は、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ認識配列（５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’）を含むため、ＰＣＲ／ＲＥ試験を行うために実験において制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶを使用した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった：
ＰＴＰＡ−Ｆ：５’−ＧＡＴＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＡＴＣ−３’；
ＰＴＰＡ−Ｒ：５’−ＣＡＧＴＴＣＧＧＴＡＣＡＣＣＡＣＴＴＡＴＡＴＣＡ−３’。
【００９１】
ＰＣＲ／ＲＥ実験の結果を図６に示す。これらの結果から、ＡｔＰＴＰＡ遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。図６中の未切断のバンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＡｔＰＴＰＡ遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した。
【００９２】
Ｖ．花序浸漬法によるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内在性遺伝子ＡｔＰＴＰＡの部位特異的編集
１）アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）材料の調製
分枝し易くするために、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の芽を最初の開花時に取り除いた。花序浸漬による形質転換の前に、長角果を切り落とした。
【００９３】
２）Ｃ２を含むｐＨＳＮ４０１−Ｃ２プラスミドをアグロバクテリウムコンピテントセルＧＶ３１０１に導入して形質転換させた。ＰＣＲおよび制限消化による検定を行った後、陽性株を使用してこれらの植物を感染させた。
【００９４】
３）アグロバクテリウム陽性株を２ｍｌ管の中で８〜１０時間培養し、次いで２００ｍｌのＬＢ培地に移し（１：１００の比率で接種し）、一晩培養してＯＤ６００を約０．８〜１．０とした。１５分間遠心分離することによりアグロバクテリウム細胞を回収し、感染バッファー（２．１６ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、５％スクロース、０．０２％ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）中で再懸濁させて、これらの植物を感染させた。
【００９５】
４）大きなプレートに収容された感染バッファー１００ｍｌにアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の花序を２分間浸漬させ、これらの植物を継続的に植物を回転させた。感染後、ろ紙を用いて、これらの植物上のアグロバクテリウム溶液の余剰分を取り除いた。これらの植物を、暗所で黒色のプラスチックの袋またはフィルムで覆って２４時間培養した。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の開花期間は比較的長いため、総じて２〜３回の感染が必要である。
【００９６】
５）植物を通常の条件下で成長させた。Ｔ１種子を収穫して成長させた。発芽後に、ＰＣＲ／ＲＥ法（具体的なステップおよび使用したプライマーは、ＩＶに示す）を用いてＡｔＰＴＰＡ遺伝子を試験した。得られた５００体の植物において、２０体はＡｔＰＴＰＡ遺伝子の変異体である。野生型アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）生態型コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を対照とした。
結果を図７に示す。これらの結果から、ＡｔＰＴＰＡ遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。図７中の未切断のバンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＡｔＰＴＰＡ遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した。
【００９７】
６）５）で得られた２０体の変異体に対してＰＣＲを行って、これらの変異体中にｐＨＳＮ４０１−Ｃ２が存在するか否かを判定した。（それぞれＵ６−２６ｐとＣａｓ９とを対象とする）増幅のために、２つのプライマーセットを設計した。
Ｕ６−２６ｐと標的断片との間に配置されたｐＨＳＮ４０１−１Ｆ／Ｃ２Ｒ：
ＨＳＮ４０１−１Ｆ：５’−ＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＡＴＧＡＴＴＡＧＧＣ−３’；
Ｃ２Ｒ：５’−ＡＡＡＣＡＣＧＡＴＡＴＣＣＧＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣ−３’
理論的には、増幅される断片は約２８６ｂｐであるはずであり、配列は、配列番号５の１７０〜４５５位に存在するはずである。配列番号５は、ｐＨＳＮ４０１−Ｃ２中のｇＤＮＡの部分配列である。
ｐＨＳＮ４０１−Ｃ２ベクターのＣａｓ９領域内に配置されたＣＡＳ９−２Ｆ／ＣＡＳ９−２Ｒ：
ＣＡＳ９−２Ｆ：５’−ＣＴＣＣＣＴＡＡＧＣＡＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴ−３’；
ＣＡＳ９−２Ｒ：５’−ＴＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＣＴＣＣＣ−３’
理論的には、増幅される断片は約７９４ｂｐであるはずであり、配列は、配列番号４の１６３９〜２４３２位に存在するはずである。配列番号４は、ｐＨＳＮ４０１−Ｃ２中のＣａｓ９配列である。
ｐＨＳＮ４０１−Ｃ２上のプライマーｐＨＳＮ４０１−１Ｆ／Ｃ２Ｒを用いたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡｔＰＴＰＡ遺伝子変異体の増幅のゲル電気泳動図を、図８ａに示す。ｐＨＳＮ４０１−Ｃ２上のプライマーＣＡＳ９−２Ｆ／ＣＡＳ９−２Ｒを用いたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡｔＰＴＰＡ遺伝子変異体の増幅のゲル電気泳動図を、図８ｂに示す。５）で得られたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡｔＰＴＰＡ遺伝子変異体において標的バンドが増幅されなかったことが判明し、このことから、これらの変異体中にはｇＤＮＡ：Ｃａｓ９系のいかなる断片も存在しないことが判明した。
【００９８】
７）５）で得られた２０体の変異体の子孫から９体の植物をランダムに選択してＰＣＲ／ＲＥ解析を行い、これらの結果を図９に示した。得られたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡｔＰＴＰＡ遺伝子変異が子孫に安定的に伝達されうることが判明した。したがって、本発明によって、植物に対して部位特異的改変を行った場合には導入遺伝子の挿入も保有も阻止され、それによりトランスジェニック製品の安全性に関する周知の懸念が回避され、また組織培養プロセスも回避される。
【図１ａ】
2018503392.tif 000008
【図１ｂ】
2018503392.tif 000009
【図２ａ】
2018503392.tif 000010
【図２ｂ】
2018503392.tif 000011
【図３ａ】
2018503392.tif 000012
【図３ｂ】
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【図４ａ】
2018503392.tif 000014
【図４ｂ】
2018503392.tif 000015
【図５ａ】
2018503392.tif 000016
【図５ｂ】
2018503392.tif 000017
【図６ａ】
2018503392.tif 000018
【図６ｂ】
2018503392.tif 000019
【図７ａ】
2018503392.tif 000020
【図７ｂ】
2018503392.tif 000021
【図８ａ】
2018503392.tif 000022
【図８ｂ】
2018503392.tif 000023
【図９】
2018503392.tif 000024
【配列表】
2018503392000001.app
【国際調査報告】
2018503392.tif 000025
2018503392.tif 000026
2018503392.tif 000027
2018503392.tif 000028
2018503392.tif 000029
2018503392.tif 000030