(57)【要約】ＶＬＰカプシドの内部直径よりも長い二本鎖領域へとフォールディングすることが予測されているＲＮＡ分子を含む、長いセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＲＮＡ分子を含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成、単離、及び精製するための方法及び組成物が開示される。異種積み荷分子を少なくとも１つ、及びパッキング配列を少なくとも１つ、内包しているカプシドを含有しているウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記異種積み荷分子が少なくとも２つのＲＮＡ配列を含有し、そのうちの１つが他方の逆相補であり、各々が３５ヌクレオチドよりも長い、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。【選択図】  図１
2018515079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種積み荷分子を少なくとも１つ、及びパッキング配列を少なくとも１つ、内包しているカプシドを含有しているウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記異種積み荷分子が少なくとも２つのＲＮＡ配列を含有し、そのうちの１つが他方の逆相補であり、各々が３５ヌクレオチドよりも長い、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２】
各ＲＮＡ鎖中の相補的ヌクレオチドの数が、発現された前記カプシドのナノメーターでの内部直径と０．２８の比率よりも大きい、請求項１に記載のＶＬＰ。
【請求項３】
前記２つのＲＮＡ配列が、同じＲＮＡ鎖の一部である、請求項１に記載のＶＬＰ。
【請求項４】
前記２つのＲＮＡ配列が、互いに共有結合されていないＲＮＡ鎖の一部である、請求項１に記載のＶＬＰ。
【請求項５】
少なくとも１つの異種の積み荷分子と、少なくとも１つのパッキング配列を内包するカプシドを含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記異種積み荷分子は、実質的に完全に相補的なｄｓＲＮＡ（ＳＲＰ）の配列を少なくとも１つ含有し、そのＳＲＰは４６塩基対よりも長く、及び以下の算出パラメーターを使用した場合には、５０よりも大きいＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコア又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコアである、ＶＬＰ：ＡＵ対及びＧＣ対に対する合致スコア＝３、ＧＵ対に対する合致スコア＝１、ミスマッチスコア＝−４、及びギャップペナルティ＝５。
【請求項６】
前記ＳＲＰ中の塩基対の数は、発現された前記カプシドのナノメーターでの内部直径と０．２８の比率よりも大きい、請求項５に記載のＶＬＰ。
【請求項７】
前記ＳＲＰは、同じＲＮＡ鎖に含有されるＲＮＡ配列内に形成される、請求項５に記載のＶＬＰ。
【請求項８】
前記ＳＲＰは、互いに共有結合されていないＲＮＡ配列内に形成される、請求項５に記載のＶＬＰ。
【請求項９】
カプシドタンパク質と転写配列をコードする核酸構築物であって、前記転写領域はさらに２つの領域を含有し、ここで１つの領域は、他方の逆相補を含有し、それによって転写配列が、少なくとも３５塩基対の二本鎖ＲＮＡを形成することができ、かかる転写配列はさらにｐａｃ配列を含有している、核酸構築物。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸構築物を含有する宿主細胞。
【請求項１１】
カプシドタンパク質と転写配列をコードする核酸構築物であって、前記転写領域はさらに２つの領域を含有し、ここで１つの領域は他方の逆相補を含有し、それによって前記転写領域がＳＲＰを少なくとも１つ含有し、そのＳＲＰは４６塩基対よりも長く、及び以下の算出パラメーターを使用した場合には、５０よりも大きいＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコア又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコアである、核酸構築物：ＡＵ対及びＧＣ対に対する合致スコア＝３、ＧＵ対に対する合致スコア＝１、ミスマッチスコア＝−４、及びギャップペナルティ＝５。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸構築物を含有する宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全開示内容が本明細書に援用される、２０１５年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／１６０，３２９号の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表の援用
「配列表」の書面の複写の全内容、及び２０１６年５月６日に作成された「103827-5005-WO-SEQ-ST25.txt」という名称のファイルを含有する、光学ディスク上のコンピューター読取可能な形式の、１ＫＢのサイズの配列表は、参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、長い二本鎖ＲＮＡ分子を含有するウイルス様粒子の生成、単離、及び精製を目的としたものである。
【背景技術】
【０００４】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）は、ウイルスカプシドを構成する特定のウイルス構造タンパク質の発現を介してウイルスから部分的に誘導されるものであるが、ＶＬＰはウイルスゲノムを含有せず、非感染性である。ウイルスカプシドは少なくとも１つのタンパク質から構成され、そのいくつかのコピーがアセンブリして、カプシドを形成する。ＶＬＰは、実質的にどのウイルスにも類似しないＲＮＡ配列を含有するよう作製されている。すなわち、ＶＬＰは、異種ＲＮＡをカプシド封入（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅ）している。
【０００５】
ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む核酸は、大部分が化学合成法を使用して製造される。これらの方法は一般的に多数の工程を必要とし、合成反応も複雑であるため、高額で、複雑である。加えて、含まれる合成試薬も高価であり、そのため、バッチサイズを単純に増大させてもスケールメリットは容易には得られない。あるいはまた、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写法を使用したＲＮＡ製造も行われている。これも化学合成法と同様、含まれる試薬は高価であり、同じく、バッチサイズを単純に増大させてもスケールメリットは容易には得られない。
【０００６】
ＲＮＡ鎖を含む核酸鎖は、他の鎖と、非共有結合的相互作用を介してハイブリダイズし、相補的に結合することによって、自身の自由エネルギーを減少させる構造を自発的に形成する。ワトソン−クリック塩基対は、ＣとＧの間、及びＡとＵの間に発生する。揺らぎ塩基対はＧとＵの間に発生し、ＡとＵの塩基対よりもエネルギー的に有利ではなく、ＣとＧの塩基対よりもエネルギー的に有利ではない。ＡとＣの間、ＡとＧの間、及びＵとＣの間の相互作用は、対形成ではなく、ミスマッチである。他の２つの完全な相補鎖のうちの１つに存在しない各塩基に対しては、ギャップ（ｇａｐ）又は湾曲（ｂｕｌｇｅ）が発生する場合がある。塩基を失った鎖という観点では、ギャップとみなされ、過剰な塩基を有する鎖という観点では、湾曲と見なされる。
【０００７】
例えばセンス配列及びアンチセンス配列といったＲＮＡ鎖の中に存在する逆方向反復配列は自発的にハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ステムを形成する。そのようなｄｓＲＮＡ領域の形成は、例えば特にカプシドアセンブリなどの複雑な生物学的工程に必要とされる時間尺度と比較すると、非常に急速である。そのようなステムは、公的に利用可能なソフトウェア、例えば「ｍｆｏｌｄ」プログラム[M. Zuker, Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-15 (2003)]、又はＥＩＮＶＥＲＴＥＤプログラムなどを使用して予測することができる。ＥＩＮＶＥＲＴＥＤは、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプラットフォームの一部であり、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅウェブサイトから利用可能である[Rice, P., Longden, I., and A. Bleasby, Trends in Genetics16(6):276-77 (2000)]。かかるｄｓＲＮＡのステムは、二重らせんＲＮＡ構造を形成する。これら二重らせんはおよそ０．２８ｎｍ／ｂｐの長さである[Taylor, P., Rixon, F. and U. Desselberger, Virus Research 2:175-82(1985)]。二重らせん内の２つの隣接する塩基間にスタッキングが形成されるが、これはそれら各々を含有する平面が本質的に平行しているためである。塩基スタッキングは、二重らせんの安定性に最も大きく貢献している[Yakovchuk, P., Protozanova, E., and Frank-Kamenetskii, M.D.,Nucleic Acids Research, 34: 564-74 (2006)]。ＲＮＡ二重らせんは本質的に剛体棒のようにふるまう。その理由は、スタッキング塩基間の角度が増加することにより、塩基スタッキングの安定性が低下してしまうためである。その角度増加は二重らせんが曲がった場合に発生する。
【０００８】
ｄｓＲＮＡステム内のミスマッチ又は湾曲の非相補的塩基が総塩基数のほんの一部である場合には、二重らせん内の隣接する塩基とまだスタッキングを形成する[M.H. Bailor, A. M., et al., Current Opinion in Structural Biology,21 :296-305 (201 1)]。かかる非相補的塩基又はミスマッチ塩基は、実質的に完全に相補的な（ＳＰＣ：ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）長いｄｓＲＮＡステムの固有剛性を著しくは損なわず、まだ本質的に剛体棒として振る舞う。ＥＩＮＶＥＲＴＥＤプログラムを使用して、ＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムに対するスコアを得ることができる。対照的に、大部分が非相補的塩基であるためにＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムを形成しないＲＮＡ鎖は、柔軟で、非剛性の構造を取り、剛体棒のようにふるまう代わりに、自転車のチェーン又は真珠のネックレスのように振る舞い、ランダムにらせん状になり得、又はほぼ無限に多様な構造で自身の上に折れ曲がり得る。
【０００９】
本発明により予期される、カプシド内に複雑な構造を伴うＲＮＡをパッキングするにあたっての重要な課題は、全体的なカプシド生産に対する、ＲＮＡ構造の形成の比率と、ＶＬＰのアセンブリである。転写は２００〜４００ヌクレオチド／秒の範囲で速やかに発生し、転写されたＲＮＡ鎖は、マイクロ秒の時間尺度で２〜３桁分さらに早く二次構造を取ることができる[C. Geary, P. Rothemund, E. Andersen, Science 345:799-804 (2014)]。他方で、フォールディングされたＲＮＡ周囲のカプシドのアセンブリは、転写よりも少なくとも２桁分ゆっくりと発生する[A. Borodavka, R. Tuma, and P. Stockley, PNAS 109: 15769-774 (2012)]。
ＶＬＰ内にカプシド封入されたＲＮＡ鎖は、最も長いＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムの長さにより制約される。そのステムは速やかに形成され、カプシド内の利用可能な空間内になお適合することができる。例えば、ＭＳ２カプシドはおよそ２０ｎｍの内部直径を有しており、約７０塩基対（１９．６ｎｍ）よりもっと長いＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムを収容することはできない[Kuzmanovic, D.A., et al., Structure 1 1 1339-48 (2003)]。それゆえ、従前の文献では、カプシドの内部直径よりも長いＳＰＣ  ｄｓＲＮＡを形成すると予測された異種ＲＮＡを、ＶＬＰがカプシド封入されることが報告されていなかったことは驚きではない。事実、我々の知識では、４３ｂｐ（約１３ｎｍ）よりも長いＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムを形成すると予測されたＲＮＡのカプシド封入は、従前の文献中に報告されていない[Pan et al., FEBS Journal 279(7): 1198-208 (2012)]。さらに、３４ｂｐ（約１０ｎｍ）よりも長い、完全に相補的なｄｓＲＮＡを形成すると予測されたＲＮＡ鎖のカプシド封入は、文献中に報告されていない[Klovins, J., J. Van Duin, and R. C. L. Olsthoorn. Nucleic AcidsResearch 25(21): 4201-08 (1997)]。既存の文献、及びＲＮＡ構造に関する現在の理解に基づくと、当分野の当業者は、７０ヌクレオチドよりも長いＳＰＣ配列、例えば逆方向反復配列、又はセンス配列とアンチセンス配列が、例えばバクテリオファージＱβ又はＭＳ２により産生されるＶＬＰなどの、およそ２０ｎｍの内部直径を有するＶＬＰ内にパッケージングされ得るとは予測しない。かかる二本鎖ＲＮＡの剛性構造は、カプシドの内部境界内に自身を適合させるには単純に長すぎると考えられている。しかしながら、そのような長いセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＲＮＡ分子は多くの有用な特性を有しており、ｉｎ  ｖｉｖｏでかかる分子を産生することができれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成と比べ、大きく製造コストを下げることができる。ＶＬＰ内へのＲＮＡのパッケージングは、ｉｎ  ｖｉｖｏ合成されたＲＮＡの精製にとって有効な戦略をもたらすことが示されている。ゆえに、ＶＬＰ内に長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖をパッケージングする方法は、当分野における大きな進歩をとなるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】M. Zuker, Nucleic Acids Res.31(13), 3406-15 (2003)
【非特許文献２】Rice, P., Longden, I., and A.Bleasby, Trends in Genetics 16(6):276-77 (2000)
【非特許文献３】Taylor, P., Rixon, F. and U. Desselberger, Virus Research 2:175-82(1985)
【非特許文献４】Yakovchuk, P., Protozanova, E., and Frank-Kamenetskii, M.D., NucleicAcids Research, 34: 564-74 (2006)
【非特許文献５】M.H. Bailor, A. M., et al., Current Opinion in Structural Biology,21 :296-305 (2011)
【非特許文献６】C. Geary, P. Rothemund, E. Andersen, Science 345:799-804 (2014)
【非特許文献７】A. Borodavka, R. Tuma, and P. Stockley, PNAS 109: 15769-774 (2012)
【非特許文献８】Kuzmanovic, D.A., et al., Structure 1 1 1339-48 (2003)
【非特許文献９】Pan et al., FEBS Journal 279(7): 1198-208 (2012)
【非特許文献１０】Klovins, J., J. Van Duin, and R. C. L. Olsthoorn. Nucleic AcidsResearch 25(21): 4201-08 (1997)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖をｉｎ  ｖｉｖｏで生成する方法に関する。いくつかの実施形態において、当該方法は、発現制御配列に操作可能に連結された、カプシドタンパク質をコードする核酸配列、ならびに長いセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、カプシドタンパク質とＲＮＡ配列の発現に適した条件下でインキュベートすることを含む。長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖をコードする核酸配列は、ｐａｃ配列も選択的に含有しており、それにより、カプシドタンパク質への結合が可能となり、当該長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖がＶＬＰ内に選択的にパッケージングされるようになる。発現制御配列に操作可能に連結された、カプシドタンパク質、ならびに長いセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、カプシドタンパク質ならびに長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖の発現に適した条件下で増殖される。それらが発現されるＥ．ｃｏｌｉ細胞内で、カプシドタンパク質ならびに長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＶＬＰを形成し、その中で長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖は、複数のカプシドタンパク質により形成されたカプシド内にパッケージングされる。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は溶解され、ＶＬＰが溶解物から回収される。実質的に純粋なＶＬＰは、その後破壊され、損なわれていないｄｓＲＮＡがそこから単離される。
【００１２】
１つの態様において、カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、誘導性プロモーター配列に操作可能に連結されたレビウイルス科のカプシドタンパク質遺伝子を含有する。好ましくは、カプシドタンパク質遺伝子をコードする核酸配列は、Ｑβ又はＭＳ２カプシドタンパク質配列を含有する。一部の実施形態において、プロモーター配列に操作可能に連結されたカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖をコードする核酸配列に共有結合されている。他の実施形態において、プロモーター配列に操作可能に連結されたカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖に共有結合されていない。好ましくは、カプシドタンパク質、ならびに長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖の発現は誘導的であり、当該方法は、（ａ）カプシドタンパク質ならびに長いセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡをコードするベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を増殖させる工程、及び（ｂ）共有結合されていても、いなくても、カプシドタンパク質ならびに長いセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖の発現を誘導する工程を含む。
【００１３】
関連する態様において、プロファージ、プラスミド、又はＴ７遺伝子１を含有する他の遺伝子エレメントもしくは誘導性プロモーター（例えば、ｌａｃプロモーター）に操作可能に連結された他のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含有する他の遺伝子エレメントを含有するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、カプシドタンパク質コード配列及び１９塩基のｐａｃ配列、次いで所望される異種の長いセンスＲＮＡ鎖配列とアンチセンスＲＮＡ鎖配列、次いで追加の１９塩基のｐａｃ配列に操作可能に連結された同族プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）を含有する発現ベクターを用いて形質転換される。カプシドタンパク質とＲＮＡ配列の発現は、所望されるカプシドタンパク質及び長い二本鎖ＲＮＡの大量産生に充分な条件下で、適切な量の誘導物質（例えば、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））を添加することにより、誘導される。カプシドタンパク質と、長いセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖は自発的にＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞内でＶＬＰを形成し、適切な期間の後、アセンブリされたＶＬＰを含有する宿主細胞が単離され、処理される。
【００１４】
関連する実施形態において、少なくとも約０．１ｍｇ、少なくとも約０．２ｍｇ、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１．０ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約０．５ｇ、少なくとも約１．０ｇ、少なくとも約２．５ｇ、少なくとも約５．０ｇ、少なくとも約４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ、少なくとも約２５ｇ、少なくとも約５０ｇ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約２５０ｇ、少なくとも約５００ｇ、又は少なくとも約１．０ｋｇの実質的に精製されたＶＬＰを産生するために充分な宿主細胞の発酵が行われる。他の実施形態において、得られるＶＬＰの量は、約０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、約１０ｍｇ〜１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１．０ｇ、約１．０ｇ〜約１０ｇ、約１０ｇ〜約１００ｇ、約１００ｇ〜約１０００ｇである。
【００１５】
１つの態様において、本開示は、少なくとも４７ｂｐの長さのＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムを少なくとも１つ形成すると予測される、異種ＲＮＡ鎖を少なくとも１つ内包するカプシドを含有するＶＬＰを記載している。他の態様において、本開示は、少なくとも７１ｂｐの長さのＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムを少なくとも１つ形成すると予測される、異種ＲＮＡ鎖を少なくとも１つ内包するカプシドを含有するＶＬＰを記載している。他の態様において、本開示は、少なくとも１８０ｂｐの長さのＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムを少なくとも１つ形成すると予測される、異種ＲＮＡ鎖を少なくとも１つ内包するカプシドを含有するＶＬＰを記載している。さらに他の態様において、本開示は、少なくとも３５ｂｐの長さの完全に相補的なｄｓＲＮＡステムを少なくとも１つ形成すると予測される、異種ＲＮＡ鎖を少なくとも１つ内包するカプシドを含有するＶＬＰを記載している。本開示に従うＶＬＰは、野生型エンテロバクテリオファージＭＳ２カプシドのアミノ酸配列と、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも２１％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４５％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５６％、少なくとも５９％、又は少なくとも８６％の配列同一性を有する野生型カプシドタンパク質を含有するカプシドを含有してもよい。カプシドは、野生型のエンテロバクテリオファージＭＳ２カプシドタンパク質、又はエンテロバクテリオファージＱβカプシドタンパク質を含有してもよい。
【００１６】
カプシド封入された異種ＲＮＡは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡであってもよい。本開示はまた、かかる核酸構築物のいずれかを含有するベクター、及びかかるベクターを含有する宿主細胞、ならびにかかるベクターで安定的に形質転換された宿主細胞を包含するものである。宿主細胞は、例えば限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの細菌細胞、植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、又は酵母細胞であってもよい。宿主細胞はさらに、ウイルスカプシドをコードする第二の核酸配列を含有する第二のベクターで安定的に形質転換されていてもよい。第二の核酸配列はたとえば、野生型エンテロバクテリオファージＭＳ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するウイルスカプシドをコードするウイルスタンパク質をコードしてもよい。本明細書に記載される核酸構築物はまた、野生型エンテロバクテリオファージＭＳ２カプシドタンパク質をコードしてもよい。本開示はまた、本明細書に記載される核酸構築物を含有するよう形質転換された植物又は植物組織、及びかかる植物もしくは植物組織の種子又は子孫物を包含するものであり、ここで前記種子又は子孫物は、核酸構築物を含有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、エチジウムブロマイドで染色した、１．２５％ＴＡＥ−アガロース電気泳動ゲルである。レーン１及びレーン５は、分子量マーカーであり、レーン２は、２つの別個のカプシドから形成されたＥｒｋＡ特有の１８０ｂｐのｄｓＲＮＡ産物であり、１つはアンチセンス鎖をコードし、１つはセンス鎖をコードしている（実施例３に記載される）。レーン３は、センス鎖単独であり、レーン４は、アンチセンス鎖単独である。レーン６は、１７１マイクログラムの両鎖を含有するカプシドであり、レーン７は、３４２マイクログラムの両鎖を含有するカプシドであり、及びレーン８は、６８４マイクログラムの両鎖を含有するカプシドである。サンプル調製は、実施例３に詳述されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は様々な形態で具現化され得るが、以下のいくつかの実施形態に関する記載は、本開示が、本発明の例示とみなされるものであり、解説されている特定の実施形態に本発明を限定することは意図していないとの理解によってなされたものである。項目はただ便宜上提示されたものであり、いかなる方法によっても本発明を限定するものとは解釈されない。任意の項目の下、解説される実施形態は、他の任意の項目の下で解説される実施形態と組み合わされることができる。
【００１９】
本出願において特定されている様々な範囲の多くの値の使用は、明白に別段の記載がない限り、既定される範囲内の最小値と最大値の両方ともに、「約」という文言が先行しているかのように、近似値として記載されている。この形式において、記載される範囲の上下の若干の変動を使用して、当該範囲内の値と実質的に同じ結果を得ることができる。本明細書において使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、数値を言及している場合、検討されている関連分野の当業者にとって明白で通常通りの意味を有するものとする。また、範囲の開示は、列挙される最小値と最大値の間の各値を含む連続した範囲として意図されており、ならびにかかる値により形成され得る任意の範囲として意図されている。これには、有限の上限及び／又は下限を含む、又は含まないで形成され得る範囲を含む。これにはまた、所与の開示される数字を他の開示される数字に分割することにより導かれる比率も含む。したがって、当業者には、多くのかかる比率、範囲、及び比率の範囲が明確に、本明細書、及び本発明のすべての描写される様々な実施形態に提示されるデータ及び数値から明確に導かれ得ることが明らかである。
【００２０】
化学、生化学、分子生物学、及び免疫学の様々な従来技術及びツールが、本明細書に記載される方法及び組成物の実施に使用され、及び利用可能であり、当分野の当業者の能力の範囲の内にあり、文献中に詳細に記載されている。かかる技術及びツールには、野生型カプシド又は組み換えカプシドと共に積み荷分子（複数含む）を有するＶＬＰの生成及び精製のための技術、ならびに宿主生物を形質転換するための技術、及び本明細書に記載される組み換えタンパク質及び核酸を発現するための技術が含まれる。例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); andAusubel, et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc.,Wiley-Interscience, NY (1995)を参照のこと。それら各々の開示内容は、参照により本明細書に援用される。
【００２１】
発現系を備える、遺伝子操作された例えばＥ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主細胞からＶＬＰを調製する方法は当分野の当業者に公知である。例えば、かかる系は米国特許出願公開２０１４０３０２５９３  Ａｌに開示されており、その内容は参照により本明細書に援用される。１つの態様において、本方法は、発現系を備えるＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に関するものであり、当該発現系は、誘導性プロモーターに操作可能に連結された、カプシドタンパク質と長いセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有しており、それによって、当該カプシドタンパク質、及び長いセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖は、当該プロモーターが誘導されたときに宿主細胞中で発現される。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞へのプラスミドの導入は、いくつかの標準的な分子生物学的技術のいずれかにより行うことができ、例えば、Davis, et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier SciencePublishing Co., Inc., N.Y. (1986)、及びSambrook, et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989)に記載されており、リン酸カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、接合、感染などが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、宿主中でポリヌクレオチドを維持、増幅、又は発現させるために、及び／又はポリペプチドを発現させるために適した任意の系又はベクターを使用して、本発明を実施してもよい。例えば適切なＤＮＡ配列を、標準的な技術により例えばプラスミドなどのベクターに挿入してもよい。
【００２２】
Ａ．定義
本明細書において使用される場合、「積み荷分子」という用語は、任意のオリゴヌクレオチド分子、ポリペプチド分子、又はペプチド分子を指し、それらはカプシドに内包されているか、内包され得る。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも２個のヌクレオチドの短いポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）であってもよく、及び例えば限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡなどの短いＲＮＡ分子を包含する。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸モノマーを少なくとも２個、最小限含有する高分子を指し、好ましくは、ペプチド結合により連結された少なくとも約１０個、及びより好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸モノマーを有し、及び約６０個より少ないアミノ酸モノマー、好ましくは約５０個より少ないアミノ酸モノマーを有している。例えば、当該用語は、約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、又は約６０個のアミノ酸残基を有するポリマーを包含する。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸モノマーの鎖を少なくとも１つ含む高分子を指し、ここで当該鎖は少なくとも約７０個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも約８０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも約９０個のアミノ酸残基、及びさらにより好ましくは少なくとも約１００個のアミノ酸残基を含有する。本明細書において使用される場合、当該用語はタンパク質を包含し、１つ以上の連結されたポリペプチド鎖を含有してもよく、補因子又は他のタンパク質にさらに結合されていても、されていなくてもよい。本明細書において使用される場合、「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」という用語と相互交換可能に使用される。
【００２６】
本明細書において使用される場合、分子に関連した「変異体」という用語は、天然又は野生型の分枝の配列と実質的に類似の配列である。ヌクレオチド配列に関しては、変異体は、１つ以上の塩基に関し変化し得るが、遺伝子コードの縮重があるためになお天然型タンパク質と同一のアミノ酸配列をコードしている配列を含む。変異体は、天然型対立遺伝子と、分子生物学分野でよく知られた技術、例えば部位特異的突然変異誘導などを使用して操作され、天然タンパク質をコードし、ならびにアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する。概して、本発明のヌクレオチド配列変異体は、天然（内因性）ヌクレオチド配列に対し、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％の配列同一性を有している。本開示はまた、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列変異体を包含する。
【００２７】
分子の規定領域内もしくは全長配列中のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の配列同一性は、本明細書に記載される、及び当分野に公知の従来のツール及び方法を使用して容易に決定することができる。例えば、複数のオンラインソースから容易に利用可能な、ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-10 (1990)] などのアライメントツールを使用して、２つのアミノ酸配列、又は２つのヌクレオチド配列の配列同一性の程度が容易に決定される。最適な配列アライメントのためのアルゴリズムは当分野に公知であり、報告されている。例えばSmith, T.F. and M.S. Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482-9 (1981)、及びPearson, W.R. and D.J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444-8 (1988)が挙げられる。配列解析のためのアルゴリズムもまた、例えばｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘなどのプログラムにて容易に利用可能である。本開示の目的に対しては、２つのヌクレオチドがストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合でも、それらは「実質的に同一」と見なされ得る。ストリンジェントな条件には、高いハイブリダイゼーション温度と、低塩濃度ハイブリダイゼーション緩衝液が含まれ、それらによって、非常に類似した核酸配列間でのみハイブリダイゼーションが可能となる。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境下では異なってくるが、典型的には、少なくとも約６０℃の温度が含まれ、これは規定のイオン強度及びｐＨでの特定配列に対する熱融解点（Ｔｍ）よりも約１０℃〜約１５℃低い。典型的には塩濃度はｐＨ７で約０．０２モルである。
【００２８】
所与のヌクレオチド配列に関して本明細書において使用される場合、「保存的変異体」という用語は、基準配列と同一、又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。遺伝子コードの縮重を理由として、ほとんど常に２以上のコドンが各アミノ酸に対しコードされ得るため、非常に近縁なタンパク質をコードするヌクレオチド配列でも、高レベルの配列同一性は共有しない場合がある。さらに、異なる生物は、多くのアミノ酸に対し優先されるコドンを有しており、異なる生物又は同じ生物の異なる系統（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株）でさえ、同じアミノ酸に対し、異なる優先コドンを有し得る。ゆえに、第二のヌクレオチド酸配列と本質的に同じポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド酸配列は、最小割合の配列同一性を共有していない場合でも、又はストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしなくても、第二のヌクレオチド配列と実質的に同一であるとみなされる。さらに、通常、メチオニンに対する単独コドンであるＡＴＧのわずかな例外はあるが、標準的な技術により任意の配列を改変して、機能的に同一の分子を産生することができること、及びかかる改変は、本開示に包含されることを理解されたい。本明細書において以下に記載されるように、本開示は、天然タンパク質のタンパク質変異体を具体的に予期させるものであり、当該変異体は、天然ヌクレオチド配列に対し、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも２１％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５６％、少なくとも５９％、又は少なくとも８６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有している。
【００２９】
２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズム[Karlin, S. and S.F. Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-8(1990)]を使用して決定してもよい。配列同一性の割合は、最適に並べられた２つの配列を比較ウインドウ上で比較することにより決定され、この場合において比較ウインドウ中のアミノ酸配列の一部は、２つの配列の最適アライメントのために、基準配列（付加又は欠失を含有していない）と比較し、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含有する場合がある。割合は、両配列中で同じアミノ酸が存在している位置の数を決定し、合致した位置の数を出し、合致した位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じ、配列同一性の割合を出すことにより算出される。
【００３０】
当業者であれば、成熟蛋白質の機能に影響を与えることなくアミノ酸を類似のアミノ酸残基で置き換えられた場合、それらポリペプチドは「実質的に類似」であり得ることを認識しているであろう。「実質的に類似」のポリペプチド配列は、残基の位置を除き、上記のように配列を共有するが、それらは同一ではなく、保存的アミノ酸変化を有し得る。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する、互換性のある残基を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群はセリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリシン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
【００３１】
ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする核酸は、所与のタンパク質に対する推定アミノ酸配列を使用し、選択されたｃＤＮＡライブラリまたはゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得ることができる。例えば、Sambrook, et al, (1989)に記載されるようなプライマー伸長法を使用した従来的な手順を使用して、前駆体及び処理中間体を検出することができる。
【００３２】
ＥＩＮＶＥＲＴＥＤは、ヌクレオチド配列中の逆方向反復配列（ステム−ループ）を特定するための、公的に利用可能なソフトウェアである。ＥＩＮＶＥＲＴＥＤを使用して、ＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムに対する様々なパラメーターのスコアを得ることができる。ＥＩＮＶＥＲＴＥＤはＧＵ対を考慮に入れていないため、一部のＳＰＣ  ｄｓＲＮＡの実際に可能性のある長さが、システム的に低く算出される。これを説明するため、我々は以下のＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤと名付けたプロトコールを使用し、ＲＮＡ鎖中のＳＰＣ領域の範囲のより正確な特定を得た。
【００３３】
１番目に、ＥＩＮＶＥＲＴＥＤは、ＲＮＡ鎖のＳＰＣ断片を特定する。２番目に、我々はただちに、追加のＧＵ、ＡＴ、及びＧＣの対に関し、隣接する断片を評価する。３番目に、我々は特定されたＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムを拡張させ、かかる隣接断片が含まれるようにする。４番目に、我々は、拡張されたＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムに対する最大推定スコアを算出する。５番目に、我々は、短いＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムに対しては、最大推定スコアがＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコア及びＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコアよりも高い場合に、拡張ＳＰＣ  ｄｓＲＮＡステムを受入れ、そうでなければ拒絶した。これによって、安定的だが短いＳＰＣ  ｄｓＲＮＡ構造が確実に適切に認識される。ＳＰＣ領域内に組み込まれている塩基の数は、その特定のＳＰＣ領域を算出ために使用された方法に応じて、ＥＩＮＶＥＲＴＥＤの長さ、又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤの長さと見なされる。
【００３４】
「ＳＲＰ」は、実質的に完全に相補的なｄｓＲＮＡ配列を含有する構造を取ることができるＲＮＡであり、本明細書において、２ｓｓＲＮＡ配列を含有する任意のＲＮＡと定義され、もし同じＲＮＡ鎖の中にある場合、以下の算出パラメーターを使用したときには、少なくとも４６ｂｐのＥＩＮＶＥＲＴＥＤの長さ又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤの長さを有し、及び５０よりも大きいＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコア又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコアを有している：
ＡＵ＆ＧＣ対に対する合致スコア＝３
ＧＵ対に対する合致スコア＝１
ミスマッチスコア＝−４
ギャップペナルティ＝５
最小スコア閾値＝５０
反復の最大拡張＝３，０００
【００３５】
Pan,et al., [Pan, et al, FEBS Journal 279(7): 1 198-208 (2012)]は、配列番号１（表２のＰ１４６、Pan, et al.の１２０５ページ）を含有するセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖のカプシド封入を記載しており、各々、ＭＳ２にパッケージングされた１つのＳＲＰを含有していた。配列番号１は、どのようにして特定の配列が有意に異なるＥＩＮＶＥＲＴＥＤ及びＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤの長さとスコアを生み出すことができるかの例を表している。上述のパラメーターを有する配列番号１の解析によって、ＥＩＮＶＥＲＴＥＤの長さが４２、ＥＩＮＶＥＲＴＥＤのスコアが６６と判明した。同じＥＩＮＶＥＲＴＥＤパラメーターに基づき、配列番号１にＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤプロトコールを適用したところ、ＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤの長さが４６、ＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤのスコアが８５と判明した。
【００３６】
上述のように、ＥＩＮＶＥＲＴＥＤは配列番号１の中の２つのＳＰＣ鎖、つまりセンス鎖上の配列番号２：ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵＡＧＣＵＣＵＧＡＧＡＡＣＵＧ  ＡＡＵＵＣＣＡＵＧＧＧＵ、ならびにアンチセンス鎖上の合致配列の配列番号３：ＡＣＣＵＧＵＧＡＡＡＵＵＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＧＣＵＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵを特定した。
【００３７】
ＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤ解析によって、２つの追加のＧＵ合致、ならびに追加のＧＣ合致が明らかとなり、それらによって、配列番号１の中の２つのＳＰＣ鎖の拡張、つまりセンス鎖上の配列番号４：ＣＵＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵＡＧＣＵＣＵＧＡＧＡＡＣＵ  ＧＡＡＵＵＣＣＡＵＧＧＧＵＵならびにアンチセンス鎖上の合致配列の配列番号５：ＧＡＣＣＵＧＵＧＡＡＡＵＵＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＧＣＵＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣ  ＣＡＵＧＵＧＧが生じた。
【００３８】
ゆえに、ＥＩＮＶＥＲＴＥＤによって、ＳＰＣ  ｄｓＲＮＡの基礎パラメーターを決定するための簡便なツールが提供されているが、例えばＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤプロトコールに記載されているような追加の工程によって、特定のＳＰＣ  ｄｓＲＮＡが有意に異なるパラメーターを有していることが明らかになる場合がある。ＶＬＰの中にパッケージングされ得るか、否かの決定に、ＳＰＣ  ｄｓＲＮＡの長さが特に関係していることから、これは重要なことである。一部の場合において、ＥＩＮＶＥＲＴＥＤは、ＳＰＣ  ｄｓＲＮＡの長さを少なく見積もる場合があるが、これはｄｓＲＮＡの形成中に発生する可能性がある非正規の塩基対を識別してしまうためである。
【００３９】
「ＳＲＰｓ」は、２個以上のＳＲＰと定義される。
Ｂ．少なくとも１つのＳＲＰ構造を取ることができるＲＮＡを内包するＶＬＰ
【００４０】
本明細書に記載される方法及び組成物は、部分的には、特定のウイルスカプシドが新規の製造方法及び精製方法において調製され、及び／又は使用され、それによって、ＳＲＰｓの商業化手段が改善できることを理解した結果である。
【００４１】
カプシドは、野生型カプシドであってもよく、又は当該カプシドがＳＲＰを内包できるのであれば野生型カプシドから誘導された変異カプシドであってもよい。
【００４２】
本開示は、複数のウイルス様粒子を含有する組成物を包含するものであり、各粒子は、野生型ウイルスカプシドと、当該野生型ウイルスカプシド中に少なくとも１つのＳＲＰを含有している。その後、積み荷分子が当該カプシドから容易に回収され得る。したがって、かかる組成物は、高い純度及び／又は高い生産効率が必要とされるすべてのアプリケーションにとって、非常に望ましいものである。
【００４３】
カプシドは、例えばオリゴリボヌクレオチドなどのヌクレオチド積み荷の存在下で、カプシドタンパク質から自己アセンブリすることができる。非限定的な例では、本明細書に記載されるカプシドは、例えば、エンテロバクテリオファージＭＳ２由来の１９ｍｅｒ  ｐａｃ部位を含む、トータルで１，８００〜２，２４８のリボヌクレオチドを含有する標的異種ＲＮＡ鎖などの、標的異種ＲＮＡ鎖を内包してもよく、Wei, et al., J. Clin. Microbiol. 46: 1734-40 (2008)に記載されるように、かかるＲＮＡ鎖はカプシドタンパク質をコードするプラスミドとは別のプラスミドから転写され、又はカプシドタンパク質をコードするプラスミドと同じプラスミドから転写される。
【００４４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、例えばｓｉＲＮＡ分子などの短いＲＮＡ分子により介在される現象であり、対象の標的遺伝子の選択抑制に使用することができ、バイオテクノロジー及び医療において複数の応用を有している。例えば、短いＲＮＡ分子を使用して、生物体（標的宿主）中の特定の対象遺伝子を標的化し、所望される表現型を得ることができる。例えばＳＲＰなどの長いｄｓＲＮＡ分子も、ＲＮＡｉ目的に使用することができる。しかしながらｓｉＲＮＡ及びＳＲＰをはじめとするＲＮＡ分子は、ＲＮＡｓｅと呼ばれる、至る処に存在する酵素により簡単に分解されてしまう。例えば本明細書に記載されるカプシドは、酵素分解から、カプシド封入されたＲＮＡを防御する。
【００４５】
本明細書に記載される、ＳＲＰを形成することができるＲＮＡ鎖を含有するＶＬＰは、ＥＩＮＶＥＲＴＥＤにより特定される、４２ｂｐよりも長い、又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤを使用して特定されたときには４６ｂｐよりも長い、任意の実質的に完全相補的なｄｓＲＮＡを含有し、その鎖のうちの少なくとも１つは、少なくとも１９ｎｔの長さで標的宿主中に存在するＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイズすることができる配列を含有している。標的宿主中に存在するかかるＲＮＡ又はＤＮＡは、標的宿主ゲノムＤＮＡであってもよく、又は標的宿主ゲノムＤＮＡから生じてもよく、又はＳＲＰが標的宿主に送達される前、送達される間、もしくは送達された後に標的宿主中に存在するウイルス配列、細菌配列、又は真菌配列であってもよい。ＳＲＰの例は、プレ−ｍｉＲＮＡ、プレ−ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、特定のヘアピン形成ｍＲＮＡ、ｄｓＲＮＡウイルスの断片、ｓｓＲＮＡウイルスの複製中間体の断片である。
【００４６】
かかる組成物は、ＲＮＡ送達用の現在の代替物よりも、よりシンプルで、より低価格で、より確実に製造される。
【００４７】
本明細書に記載されるＶＬＰは、１つ以上の積み荷分子をカプシド封入している、アセンブリ化カプシドを有するＶＬＰを生成するための任意の利用可能な方法（複数含む）によりアセンブリされてもよい。例えば、カプシドと積み荷分子は、任意の発現系で共発現されてもよい。１つ以上のカプシドタンパク質、１つ以上の積み荷分子をコードする組み換えＤＮＡは、例えば細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞、及び動物細胞（昆虫細胞及び哺乳類細胞を含む）などの宿主細胞に、１つ以上の発現ベクターを用いたトランスフェクションを、かかるベクターの特定の細胞への導入、及び細胞への安定的なトランスフェクションに有用な任意の手段によって行い、組み換え配列（複数含む）を発現する細胞を生成することにより容易に導入されることができる。
【００４８】
宿主細胞は好ましくは、植物、哺乳類、昆虫、酵母、又は真菌を源とする、真核生物起源の細胞が好ましいが、非真核生物の宿主細胞も使用することができる。適切な発現系としては、限定されないが、例えばＶＬＰエレメントのコード配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換された細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）などの微生物が挙げられる。非限定的な例では、Ｅ．ｃｏｌｉが、ＭＳ２カプシドタンパク質を含有するＶＬＰに適した発現系である。
【００４９】
本開示は、本明細書に記載される核酸構築物を使用して形質転換され、カプシドコートタンパク質及び積み荷分子を発現する植物細胞を明白に予期するものである。植物細胞をはじめとする細胞を形質転換する手段、及びトランスジェニック細胞を調製する手段は当分野に公知である。ベクター、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、及びＤＮＡ部分を使用して、細胞を形質転換することができ、一般的に認識されているように、それらはプロモーター、エンハンサー、及び／又はポリリンカーを含有している。具体的に予期されるトランスジェニック細胞としては、限定されないが、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、野菜、穀類、豆類、果樹などから得られる細胞、又は本明細書に記載されるＶＬＰの導入から利益を得る任意の植物から得られる細胞をはじめとするトランスジェニック植物細胞が挙げられる。また、本明細書に記載されるように形質転換された細胞から得られる植物、植物組織もまた予期され、当該植物もしくは植物組織の種子又は子孫物も予期される。
【００５０】
アセンブリされたＶＬＰの発現は、例えばＶＬＰの全てのエレメントをコードする配列を含む発現ベクターを少なくとも１つ構築することにより得ることができる。場合によっては２つのベクターを使用し、１つ目のベクターは積み荷分子（複数含む）をコードする配列を含み、２つ目のベクターはカプシドタンパク質をコードする配列を含む。ＳＲＰを含有する例示的なＶＬＰを作製する例示的な方法において、実施例においてさらに詳細に記載されるように、ＶＬＰを生成するために、１つのベクターを宿主細胞中で発現させてもよい。コード配列、ならびに転写制御配列、及び翻訳制御配列を含有するかかる発現ベクターを構築するための方法及びツールは当分野に公知である。ベクター（複数含む）が構築されたら、また当分野に公知の技術を使用して宿主細胞へと移し、その後、細胞を、ＶＬＰの発現とアセンブリを発生させるために充分な時間と条件下で、維持する。それらすべては従来的な技術を使用する。ゆえに本開示は、任意のかかるベクターを含有する宿主細胞、かかるベクターにより形質転換されている細胞、ならびにＶＬＰを含有する細胞を包含するものである。
【００５１】
ＶＬＰが宿主細胞中で発現され、アセンブリされたら、当分野に公知のウイルス精製のための任意の方法を使用してそれらを単離及び精製してもよい。例えば、細胞は、従来的な細胞溶解技術及び剤を使用して溶解されてもよい。加水分解後の細胞溶解物中のＶＬＰは、従来的なタンパク質単離技術を使用して取り出され、精製される。
【００５２】
カプシド、ＶＬＰ又はタンパク質の精製はまた、当分野に一般的に公知の方法を含んでもよい。例えば、カプシドの発現後、カプシド、ＶＬＰ、又はタンパク質の精製は、例えば少なくとも１つの液体−液体抽出工程、少なくとも１つの分別沈殿工程、少なくとも１つの超ろ過工程、又は少なくとも１つの結晶化工程を含有してもよい。液体−液体抽出は、例えば限定されないが、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、クロロホルム、ジクロロメタン、又は四塩化炭素などの不混和の非水性、非極性溶媒の使用を含んでもよい。精製は、少なくとも１つの結晶化工程を含んでもよい。
【００５３】
精製後、カプシドを開き、積み荷分子を得てもよく、積み荷分子は本明細書に記載されるタンパク質もしくはポリペプチド、ペプチド又は核酸分子であってもよい。カプシドは、当分野に公知のいくつかの可能な手順のうちの任意の１つを使用して開くことができ、例えば水性溶液中で５０℃超に加熱すること、凍結融解を繰り返すこと、例えばホルムアミドなどの変性剤とインキュベーションすること、１つ以上のプロテアーゼとインキュベーションすること、又はこれらの手順の任意の組み合わせが挙げられる。
【００５４】
したがって、本開示に従い、本方法及び処理のいずれかで使用されるＶＬＰは、野生型エンテロバクテリオファージＭＳ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも１５％、１６％、２１％、４０％、４１％、５２％、５３％、５６％、５９％、又は少なくとも８６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含有するものを包含する。
【００５５】
本明細書に記載される特殊化されたＶＬＰは、研究開発、及び産業製造設備において使用され、産生量の改善をもたらすことができる。その理由は、両設定で使用される精製処理は同じマトリクス組成を有しているからである。そのような同じ組成を有するかどうかは主に、研究開発及び製造処理の両方で同じ細胞株を使用しているかどうかによる。
【００５６】
Ｃ．好ましい実施形態
以下は、本発明の好ましい実施形態の１つである。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明は、ＶＬＰカプシドの内部直径よりも長いセンスＲＮＡ領域及びアンチセンス鎖領域を形成することができる異種ＲＮＡ配列を含有するＶＬＰを生成する方法である。
【００５８】
他の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの異種の積み荷分子と、少なくとも１つのパッキング配列を内包するカプシドを含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、この場合において異種積み荷分子は、少なくとも２つのＲＮＡ配列を含有し、そのうちの１つは、他方の逆相補であり、各々が３５ヌクレオチドよりも長い。
【００５９】
さらに他の実施形態において、少なくとも１つの異種積み荷分子と少なくとも１つのパッキング配列を内包するカプシドを含有するＶＬＰであって、異種積み荷分子は、少なくとも２つのＲＮＡ配列を含有し、そのうちの１つは、他方の逆相補であり、各ＲＮＡ鎖中の相補的ヌクレオチドの数は、発現されたカプシドのナノメーターでの内部直径と０．２８の比率よりも大きい。
【００６０】
さらに他の実施形態において、ＶＬＰは、少なくとも１つの異種積み荷分子と少なくとも１つのパッキング配列を内包するカプシドを含有し、異種積み荷分子は、少なくとも２つのＲＮＡ配列を含有し、そのうちの１つは、他方の逆相補であり、その２つのＲＮＡ配列は、同じＲＮＡ鎖の一部である。
【００６１】
さらに他の実施形態において、ＶＬＰは、少なくとも１つの異種積み荷分子と少なくとも１つのパッキング配列を内包するカプシドを含有し、異種積み荷分子は、少なくとも２つのＲＮＡ配列を含有し、そのうちの１つは、他方の逆相補であり、その２つのＲＮＡ配列は、互いに共有結合されていないＲＮＡ鎖の一部である。
【００６２】
さらに他の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの異種の積み荷分子と、少なくとも１つのパッキング配列を内包するカプシドを含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、この場合において異種積み荷分子は、少なくとも１つのＳＲＰを含有し、そのＳＲＰは４６塩基対よりも長く、及び以下の算出パラメーターを使用した場合には、５０よりも大きいＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコア又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコアである：ＡＵ対及びＧＣ対に対する合致スコア＝３、ＧＵ対に対する合致スコア＝１、ミスマッチスコア＝−４、及びギャップペナルティ＝５。
【００６３】
さらに他の実施形態において、少なくとも１つの異種の積み荷分子と、少なくとも１つのパッキング配列を内包するカプシドを含有するＶＬＰであって、異種積み荷分子は、ＳＲＰを少なくとも１つ含有し、そのＳＲＰは４６塩基対よりも長く、及び以下の算出パラメーターを使用した場合には、５０よりも大きいＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコア又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコアである：ＡＵ対及びＧＣ対に対する合致スコア＝３、ＧＵ対に対する合致スコア＝１、ミスマッチスコア＝−４、及びギャップペナルティ＝５。ＳＲＰ中の塩基対の数は、発現されたカプシドのナノメーターでの内部直径と０．２８の間の比率よりも大きい。
【００６４】
さらに他の実施形態において、少なくとも１つの異種の積み荷分子と、少なくとも１つのパッキング配列を内包するカプシドを含有するＶＬＰであって、異種積み荷分子は、ＳＲＰを少なくとも１つ含有し、そのＳＲＰは４６塩基対よりも長く、及び以下の算出パラメーターを使用した場合には、５０よりも大きいＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコア又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコアである：ＡＵ対及びＧＣ対に対する合致スコア＝３、ＧＵ対に対する合致スコア＝１、ミスマッチスコア＝−４、及びギャップペナルティ＝５。ＳＲＰは、同じＲＮＡ鎖に含有されるＲＮＡ配列内に形成される。
【００６５】
さらに他の実施形態において、少なくとも１つの異種の積み荷分子と、少なくとも１つのパッキング配列を内包するカプシドを含有するＶＬＰであって、異種積み荷分子は、ＳＲＰを少なくとも１つ含有し、そのＳＲＰは４６塩基対よりも長く、及び以下の算出パラメーターを使用した場合には、５０よりも大きいＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコア又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコアである：ＡＵ対及びＧＣ対に対する合致スコア＝３、ＧＵ対に対する合致スコア＝１、ミスマッチスコア＝−４、及びギャップペナルティ＝５。ＳＲＰは、互いに共有結合されていないＲＮＡ配列内に形成される。
【００６６】
さらに他の実施形態において、本発明は、カプシドタンパク質と転写配列をコードする核酸構築物を含有し、転写領域はさらに２つの領域を含有し、ここで１つの領域は他方の逆相補を含有し、それによって転写配列が、少なくとも３５塩基対の二本鎖ＲＮＡを形成できるようになり、かかる転写配列はｐａｃ配列をさらに含有している。
【００６７】
さらに他の実施形態において、本発明は、カプシドタンパク質と転写配列をコードする核酸構築物を含有する宿主細胞を含有し、転写領域はさらに２つの領域を含有し、１つの領域は他方の逆相補を含有し、それによって転写配列が、少なくとも３５塩基対の二本鎖ＲＮＡを形成できるようになり、かかる転写配列はｐａｃ配列をさらに含有している。
【００６８】
さらに他の実施形態において、本発明は、カプシドタンパク質と転写配列をコードする核酸構築物を含有し、転写領域はさらに２つの領域を含有し、１つの領域は他方の逆相補を含有し、それによって転写領域がＳＲＰを少なくとも１つ含有し、そのＳＲＰは４６塩基対よりも長く、及び以下の算出パラメーターを使用した場合には、５０よりも大きいＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコア又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコアである：ＡＵ対及びＧＣ対に対する合致スコア＝３、ＧＵ対に対する合致スコア＝１、ミスマッチスコア＝−４、及びギャップペナルティ＝５。
【００６９】
さらに他の実施形態において、本発明は、カプシドタンパク質と転写配列をコードする核酸構築物を含有する宿主細胞を含有し、転写領域はさらに２つの領域を含有し、１つの領域は他方の逆相補を含有し、それによって転写領域がＳＲＰを少なくとも１つ含有し、そのＳＲＰは４６塩基対よりも長く、及び以下の算出パラメーターを使用した場合には、５０よりも大きいＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコア又はＸＥＩＮＶＥＲＴＥＤスコアである：ＡＵ対及びＧＣ対に対する合致スコア＝３、ＧＵ対に対する合致スコア＝１、ミスマッチスコア＝−４、及びギャップペナルティ＝５。
【実施例】
【００７０】
実施例１
１つのカプシド内に、ＰＡＣ配列に隣接するセンスＥｒｋＡ配列及びアンチセンスＥｒｋＡ配列を含有する一本鎖ＲＮＡを含有するＶＬＰの生成
プラスミドｐＡＰＳＥ１０１１４（配列番号６）は、ＭＳ２コートタンパク質の上流にＴ７プロモーター配列（配列番号７）、次いで２つの異なるＭＳ２  １９ｍｅｒＲＮＡヘアピンに隣接するマルチプルクローニングサイトをコードし、標的配列（標的配列部位）のパッキングを増強している。標的配列部位の５’に存在するｐａｃ部位は、野生型配列ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＵＡＣＣＣＡＵＧＵを有し、標的配列部位の３’に存在するＣ−ＰＡＣ部位は、配列ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵを有するＭＳ２コートタンパク質との結合に対し高いアフィニティを有する改変ｐａｃ部位である。Ｔ７ターミネーターもまたベクター中にコードされ、ＲＮＡの転写を止めている。この構築物を、プラスミドｐＢＲ３２２のＳｍａｌ制限酵素部位に挿入する。
【００７１】
キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のＥｒｋＡ（配列番号８）のセンス及びアンチセンスの１８０ｂｐ断片（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ＿００１３００７０６の１５６〜３３５位）のクローニングは、対象領域のＰＣＲ増幅を行い、次いでｐＡＰＳＥ１０１１４（配列番号６）へとライゲーションし、ｐＡＰＳＥ１０１３１（配列番号９）を形成させることにより行われ、ｐＡＰＳＥ１０１３１は４０ｂｐのリンカーにより連結されたＥｒｋＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を含有していた。
【００７２】
化学的コンピテントＨＴＥ１１５（ＤＥ３）細胞を、ｐＡＰＳＥ１０１３１を用いて形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択した。ＶＬＰ産生に対し、これらの形質転換体を、アンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬ中、３７℃で増殖させた。培養液密度がＯＤ６００  ０．８に達したら、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を最終濃度１ｍＭまで添加した。誘導後４時間で、４℃、３，０００ｇ、１０分間の遠心により細胞を回収した。溶解時まで細胞を４℃で保存した。
【００７３】
実施例２
酵素処置、及び硫酸アンモニウムを用いた分別沈殿によるＶＬＰの精製
ＶＬＰの精製は、以下の様に行われた。実施例１から得られた細胞沈殿物の半分を、１０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する、およそ１０体積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐｈ７．０中に再懸濁し、ソニケートして、細胞を溶解させた。細胞残渣を１６，０００ｇの遠心により除去した。サンプルをさらに、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を最終濃度１００単位／ｍＬまで添加することにより処理し、２時間、３７℃でインキュベートした。次いでプロテナーゼＫを、最終濃度１５０マイクログラム／ｍＬまで加え、さらに３時間、３７℃でインキュベートした。この時点でＶＬＰサンプルは、硫酸アンモニウム分別沈殿を行う準備が整った。
【００７４】
ＶＬＰの分別沈殿は以下の様に行われた。飽和硫酸アンモニウム溶液は、水に硫酸アンモニウムを最終濃度４．１Ｍまで添加することにより調製された。酵素処理されたＶＬＰに飽和硫酸アンモニウムを最終濃度１８６ｍＭまで添加し（およそ１：２２希釈）、２時間氷上に置いた。１６，０００ｇの遠心により、不要な沈殿物が溶解物から除去された。乾燥硫酸アンモニウム１５５ｍｇを直接、清浄化溶解物の各１ｍＬに加えることにより、サンプルが２回目の沈殿に供された。サンプルをボルテックスし、氷上で２時間インキュベートした。沈殿物を１６，０００ｇでスピンダウンし、固形沈殿物を維持して、１０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する、元の量の１０分の１の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０に再懸濁した。
【００７５】
実施例３
ＶＬＰが、ＲＮＡｓｅＡ処置に抵抗性の二本鎖ＲＮＡを生成する
実施例１の１００ｍＬ培養から得られ、実施例２に記載されるように精製されたＭＳ２カプシドを含有するＶＬＰを使用して、以下のようにｄｓＲＮＡを生成した。本実験に使用されたカプシドの量は、Ａ２６０を測定することにより、及びＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用したタンパク質アッセイにより定量された。タンパク質濃度は、２８．５０マイクログラム／マイクロリットルであると決定された。Ａ２６０値は１２３であった。カプシド内のＲＮＡの、二本鎖ＲＮＡを形成する能力を検証するために、以下の量のカプシドを使用した：１７１、３４２、及び６８４マイクログラム。
【００７６】
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０において、７５℃、５分間、４０マイクロリットルのカプシドをインキュベーションすることにより、ＲＮＡが溶液中に放出され、次いで、それを４℃／分の速度で室温まで冷却させた。終了した時点で、放出されたＲＮＡを、０．４００ナノグラムのＲＮＡｓｅＡ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて処置し、４０分間、３７℃でインキュベートした。ＲＮＡｓｅを不活化させるために、トリチラチウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来のプロテナーゼＫを０．００１単位、加えて、４０分間、３７℃でインキュベートした。得られたＲＮＡは、二本鎖形態であるためにＲＮＡｓｅＡ切断から防御され、１．２５％  ＴＡＥアガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。図１を参照のこと。レーン１とレーン５は分子量マーカーであり、レーン２は、２つの別個のＶＬＰのカプシドから単離されたＲＮＡから形成されたＥｒｋＡの１８０ｂｐのｄｓＲＮＡ産物であり、１つはアンチセンス鎖をカプシド封入し、１つはセンス鎖をカプシド封入していた。レーン３は、センス鎖単独であり、レーン４は、アンチセンス鎖単独である。レーン６は、１つのカプシド内にカプシド封入された、センス配列とアンチセンス配列の両配列を含有する１つのＲＮＡ配列を含有するＶＬＰ、１７１マイクログラムからのＲＮＡである。レーン７は、かかるＶＬＰの３４２マイクログラムを用いてロードされ、及びレーン８は、かかるＶＬＰの６８４マイクログラムを用いてロードされた。
【００７７】
実施例４
ＶＬＰ調製物の製造。１つは一本鎖ＲＮＡ  ＥｒｋＡセンス鎖を含有し、他方は相補的ＥｒｋＡアンチセンス鎖を含有している。各々、別のカプシド内でＰＡＣ配列が隣接している
キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のＥｒｋＡ（配列番号８）の１８０ｂｐの断片（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ＿００１３００７０６の１５６〜３３５位）を、ＰＣＲにより増幅させ、次いでｐＡＰＳＥ１０１１４（配列番号６）のＡｓｉＳＩ制限酵素部位とＰｍｅＩ制限酵素部位にライゲートさせ、ｐＡＰＳＥ１０１２０（配列番号１０）を形成させた。ｐＡＰＳＥ１０１２０は、Ｔ７プロモーターに対してセンス方向にＥｒｋＡ断片を含有した。別の構築物であるｐＡＰＳＥ１０１２１（配列番号１１）も同様に作製され、Ｔ７プロモーターに対してアンチセンス方向にＥｒｋＡ断片を含有した。
【００７８】
化学的コンピテントＨＴＥ１１５（ＤＥ３）細胞を、ｐＡＰＳＥ１０１２０とｐＡＰＳＥ１０１２１を用いて別々に形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を個々に選択した。カプシド産生に対し、これらの形質転換体の各々を、アンピシリンを含有する１００ｍＬ  ＬＢ培地中、別々に３７℃で増殖させた。培養液密度がＯＤ６００  ０．８に達したら、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を最終濃度１ｍＭまで添加した。誘導後４時間で、４℃、３，０００ｇ、１０分間の遠心により細胞を回収した。溶解時まで細胞を４℃で保存した。
【００７９】
実施例５
実施例４のＶＬＰは、ＲＮＡｓｅＡヌクレアーゼ処置に抵抗性の二本鎖ＲＮＡを生成することができる
実施例４で得られたＭＳ２カプシドを含有するＶＬＰは、実施例２に記載されるように精製され、以下の方法によりｄｓＲＮＡを生成させるために使用された。本実験に使用されたカプシドの量は、Ａ２６０により、及びＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により定量された。これらの値に基づき、等量のｐＡＰＳＥ１０１２０由来ＶＬＰとｐＡＰＳＥ１０１２１由来ＶＬＰを混合させ、総反応量４０マイクロリットル中、カプシド封入されたＲＮＡはトータルで３０マイクログラムであった。
【００８０】
ＶＬＰにカプシド封入された核酸のＴｒｉｚｏｌ抽出に対する代替として、以下の手順を使用して、ＶＬＰを「ヒートクラック」させた。４０マイクロリットルのカプシドを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中、７５℃で５分間、インキュベーションして、ＲＮＡを溶液中に放出させた。その後、４℃／分の速度で室温まで冷却した。終了した時点で、放出されたＲＮＡを、０．４００ナノグラムのＲＮＡｓｅＡ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて処置し、４０分間、３７℃でインキュベートした。ＲＮＡｓｅＡを不活化させるために、トリチラチウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来のプロテナーゼＫを０．００１単位加えて、さらに４０分間、３７℃で溶液をインキュベートした。ＲＮＡｓｅＡ消化から防御された、残ったＲＮＡを、１．２５％  ＴＡＥアガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。図１を参照のこと。レーン１とレーン５は分子量マーカー（Ｌａｍｂｄａ  １００ｂｐ  ｄｓＤＮＡラダー。マーカーは、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、１０００、及び１５００ｂｐのサイズ）であり、レーン２は、２つの別個のカプシド源から形成されたＥｒｋＡの１８０ｂｐのｄｓＲＮＡ産物であり、１つはセンスＲＮＡ鎖（ｐＡＰＳＥ１０１２０から産生された）を含有し、１つはアンチセンスＲＮＡ鎖（ｐＡＰＳＥ１０１２１から産生された）を含有している。レーン３は、ＲＮＡセンス配列鎖単独であり、レーン４は、ＲＮＡアンチセンス配列鎖単独である。レーン６は、実施例１に記載されるように４０塩基のループにより分離されるセンス配列及びアンチセンス配列を含有する、逆方向反復配列を伴うＲＮＡを含有するｐＡＰＳＥ１０１３１から生成されたカプシド、１７１マイクログラムである。レーン７は、ｐＡＰＳＥ１０１３１から生成されたカプシドからのＲＮＡ、３４２マイクログラムであり、レーン８は、ｐＡＰＳＥ１０１３１カプシドから生成されたＲＮＡ、６８４マイクログラムである。
【００８１】
結果は、２つのＶＬＰ、センスとアンチセンスが共にヒートクラックされた場合、それらが含有する一本鎖ＲＮＡが、１８０ｂｐのＲＮＡｓｅＡ抵抗性分子に相当するｄｓＲＮＡ産物を形成し得ることを明白に示していた。また、ＶＬＰにカプシド封入された１つのＲＮＡ分子内にセンス鎖及びアンチセンス鎖をコードするＶＬＰから、同じｄｓＲＮＡ産物を形成することもできる。１８０ｂｐのｄｓＲＮＡは約４０ナノメーターの長さを有し、およそ２０ナノメーターの内部空間直径のＭＳ２の中に適合するには長すぎると予測されていたことから、これは驚くべき結果である。このことから、非常に大きなサイズのＳＲＰを１つのカプシド内にパッキングすることを可能とする様式で、ＲＮＡがカプシド内に組み込まれていることが示唆される。
【００８２】
当業者であれば、ｐＡＰＳＥ１０１２０、ｐＡＰＳＥ１０１２１、及びｐＡＰＳＥ１０１３１に似たプラスミドを構築し、本実施例に記載されるように、ＥｒｋＡ特異的配列の代わりに、別のクローン化ＤＮＡ配列を置き換えることにより、任意の特定の配列又は長さのセンスＲＮＡ産物及びアンチセンスＲＮＡ産物を容易に生成し得ることが理解されるであろう。さらにまた、当業者であれば、ｐａｃ部位配列を完全に欠くＲＮＡ鎖の生成は、発現プラスミドｐＡＰＳＥ１０１１４からかかる配列を削除する、又は組み込まないことにより成し得ることを理解するであろう。例えば、９０８〜９２６と、１１１９９〜１１３７の間の配列を欠くプラスミドｐＡＰＳＥ１０１１４は、ｐａｃ部位配列を欠くＲＮＡ分子の生成に適した発現プラットフォームを提供する。
【００８３】
実施例６
ＭＳ２  ＰＡＣ配列に隣接する３０ｂｐのｄｓＲＮＡの存在下で自己アセンブリしたＭＳ２カプシドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成
ＭＳ２ｐａｃ配列に隣接した３０ｂｐのｄｓＲＮＡは、ＭＳ２ｐａｃ部位を３’末端に各々有する３０ヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖を同時に転写することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができる。ＭＳ２コートタンパク質を調製し、次いでＭＳ２カプシドを、Ashley, et al., [Ashley, et al, ACSNano 6(3):2174-88 (2012)]に記載されるようにアニーリングされたＲＮＡ鎖を含有する溶液中でＶＬＰへと自発的にアセンブリさせる。
【００８４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアセンブリされたＭＳ２  ＶＬＰは、１００単位のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で処置し、２時間、３７℃でインキュベーションすることにより精製する。１５０マイクログラムのプロテナーゼＫを加え、３７℃でさらに３時間インキュベートする。この時点で、ＶＬＰは実施例２に記載されるように硫酸アンモニウム沈殿により精製され得る。
【００８５】
精製されたＭＳ２カプシドを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０において、７５℃で５分間、インキュベートし、溶液中にＲＮＡを放出させ、４℃／分の速度で室温まで冷却させる。冷却したら、放出されたＲＮＡを、０．４００ナノグラムのＲＮＡｓｅＡ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて処置し、４０分間、３７℃でインキュベートする。ＲＮＡｓｅＡを不活化させるために、トリチラチウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来のプロテナーゼＫを０．００１単位加えて、４０分間、３７℃でインキュベートする。得られたＲＮＡは、二本鎖形態であるためにＲＮＡｓｅＡ切断から防御され、１．２５％  ＴＡＥアガロースゲルで泳動され、エチジウムブロマイドで染色される。約３０ｂｐのｄｓＲＮＡの強いバンドは、二本鎖ＲＮＡが上手くパッキングされ、精製されたことを示す。
【００８６】
実施例７
ＭＳ２  ＰＡＣ配列に隣接する１８０ｂｐのｄｓＲＮＡの存在下で自己アセンブリしたＭＳ２カプシドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成
ＭＳ２ｐａｃ配列に隣接した１８０ｂｐのｄｓＲＮＡは、ＭＳ２ｐａｃ部位を３’末端に各々有する１８０ヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖を同時に転写することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができる。ＭＳ２コートタンパク質を調製し、次いでＭＳ２カプシドを、実施例６に記載されるようにアニーリングされたＲＮＡ鎖を含有する溶液中でＶＬＰへと自発的にアセンブリさせる。
【００８７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアセンブリされたＭＳ２  ＶＬＰは、１００単位のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で処置し、２時間、３７℃でインキュベーションすることにより精製する。１５０マイクログラムのプロテナーゼＫを加え、３７℃でさらに３時間インキュベートする。この時点で、ＶＬＰは実施例２に記載されるように硫酸アンモニウム沈殿により精製され得る。
【００８８】
精製されたＭＳ２カプシドを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０において、７５℃で５分間、インキュベートし、溶液中にＲＮＡを放出させ、４℃／分の速度で室温まで冷却させる。冷却したら、放出されたＲＮＡを、０．４００ナノグラムのＲＮＡｓｅＡ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて処置し、４０分間、３７℃でインキュベートする。ＲＮＡｓｅＡを不活化させるために、トリチラチウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来のプロテナーゼＫを０．００１単位加えて、さらに４０分間、３７℃で溶液をインキュベートする。得られたＲＮＡは、二本鎖形態であるためにＲＮＡｓｅＡ切断から防御され、１．２５％  ＴＡＥアガロースゲルで泳動され、エチジウムブロマイドで染色される。約１８０ｂｐのｄｓＲＮＡのバンドが無いことは、二本鎖ＲＮＡが成功裏にパッキング及び精製されなかったことを示す。
【００８９】
これらの結果から、本明細書に記載される方法が、従前に文献で報告されていなかったタイプの長いセンスＲＮＡ鎖分子及びアンチセンスＲＮＡ鎖分子のパッキング及び精製に適していることを示す。かかる方法により、二本鎖構造を形成することができる長い相補配列を有する複雑なＲＮＡ分子の安価で大規模なＲＮＡ合成が促進される。
【図１】
2018515079.tif 000003
【配列表】
2018515079000001.app
【国際調査報告】
2018515079.tif 000004
2018515079.tif 000005