(57)【要約】  本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子および血小板由来増殖因子を含む組成物、および、組織損傷を治療する、または老化を阻害する、または発毛を促進するためのその使用に関する。
2018513839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、
少なくとも１つの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）アイソフォーム、および、少なくとも１つの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）アイソフォームを含む、
組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、
前記の少なくとも１つのｂＦＧＦアイソフォームは、単量体または二量体である、
組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組成物であって、
前記ｂＦＧＦアイソフォームは、ホモ二量体である、
組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載の組成物であって、
前記ｂＦＧＦアイソフォームは、ヘテロ二量体である、
組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記の少なくとも１つのｂＦＧＦアイソフォームは、１８ｋＤａ  ｂＦＧＦ（配列番号１）またはその変異体、２２ｋＤａ  ｂＦＧＦ（配列番号２）またはその変異体、２２．５ｋＤａ  ｂＦＧＦまたはその変異体、２４ｋＤａ  ｂＦＧＦ（配列番号３）またはその変異体および３４Ｄａ  ｂＦＧＦ（配列番号４）またはその変異体、の１つである、
組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記の少なくとも１つのＰＤＧＦアイソフォームは、ホモ二量体である、
組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、
前記の少なくとも１つのＰＤＧＦアイソフォームは、２つのＰＤＧＦ−Ａサブユニット（配列番号５）またはその変異体、２つのＰＤＧＦ  Ｂサブユニット（配列番号６）またはその変異体、２つのＰＤＧＦ−Ｃサブユニット（配列番号７）またはその変異体、または２つのＰＤＧＦ−Ｄサブユニット（配列番号８）またはその変異体を含む、
組成物。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記の少なくとも１つのＰＤＧＦアイソフォームは、ヘテロ二量体である、
組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、
前記の少なくとも１つのＰＤＧＦアイソフォームは、１つのＰＤＧＦ−Ａサブユニット（配列番号５）またはその変異体、および、１つのＰＤＧＦ−Ｂサブユニット（配列番号６）またはその変異体を含む、
組成物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記ｂＦＧＦは、組み換えｂＦＧＦであり、および／または、前記ＰＤＧＦアイソフォームは、組み換えＰＤＧＦアイソフォームである、
組成物。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルの胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）を含まない、
組成物。
【請求項１２】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルの、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンβ、アルテミン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、β神経成長因子（ｂ−ＮＧＦ）、ベタセルリン（ＢＴＣ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（Ｄｋｋ−１）、エンドカン、エオタキシン、エピレグリン、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ−１０）、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、増殖分化因子１（ＧＤＦ−１）、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１５、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、成長ホルモン１（ＧＨ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ヘパリン−結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−１１、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、インヒビンＡ、インターフェロンγ−誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、レフティＡ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、乳脂肪球−ＥＧＦ因子８タンパク質（ＭＦＧ−Ｅ８）、ＭＩＧ、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１ａ）、ＭＩＰ−１ｂ、ニュールツリン、腎芽腫過剰発現遺伝子（ＮＯＶ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４、血小板由来増殖因子Ｃ（ＰＤＧＦ−Ｃ）、パーセフィン、プログラニュリン、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）、Ｓｋｐ、Ｃｕｌｌｉｎ、Ｆ−ｂｏｘ含有複合体（ＳＣＦ）、および、可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）の少なくとも１つを含まない、
組成物。
【請求項１３】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルの、アンジオポエチン、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ１２、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、インターフェロンα（ＩＦＮα）、リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）、プロテアーゼ−活性化受容体４（ＰＡＲ４）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフリガンド）５（ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ）、血小板由来増殖因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、ＰＤＧＦ−ＡＢ、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）、ＴＧＦ−β２、トロンボスポンジン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）および血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）の少なくとも１つを含む、
組成物。
【請求項１４】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルの、アンジオポエチン、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ１２、リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）、プロテアーゼ−活性化受容体４（ＰＡＲ４）およびトロンボスポンジンの少なくとも１つを含む、
組成物。
【請求項１５】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルのアンジオポエチンを含む、
組成物。
【請求項１６】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルの、ｂＦＧＦアイソフォーム、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも１つを含む、
組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、
前記組成物は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＩＧＦおよびＶＥＧＦのいずれかまたは全てを含む、
組成物。
【請求項１８】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、ＴＧＦ−β３およびＦＧＦ−７のいずれかまたは全てを含む、
組成物。
【請求項１９】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
ｂＦＧＦの濃度は、組成物のミリリットルあたり、約５０ｐｇ〜約５００ｐｇの範囲内である、
組成物。
【請求項２０】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
ＰＤＧＦの合計濃度は、組成物のミリリットルあたり、約５０００ｐｇ〜約２５０００ｐｇである、
組成物。
【請求項２１】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
合計ＰＤＧＦに対するｂＦＧＦの比は、約１：１０〜約１：５００である、
組成物。
【請求項２２】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、薬学的に許容できるポリマーをさらに含む、
組成物。
【請求項２３】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、ゲルを含む、
組成物。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の組成物であって、
前記ポリマーは、アルギネートポリマー、エチリデンの二重エステルポリマー、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリペルフルオロオクチルオキシカルボニル−ポリ（乳酸）（ＰＬＡ−ＰＦＯ）、または別のブロック共重合体である、
組成物。
【請求項２５】
請求項２２または２３に記載の組成物であって、
前記ポリマーは、セルロースポリマーである、
組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組成物であって、
前記セルロースポリマーは、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはメチルセルロースである、
組成物。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の組成物であって、
前記セルロースポリマーの濃度は、１．５％（ｗ／ｗ）〜４．０％（ｗ／ｗ）であり、前記ポリマーは、４５０，０００〜４，０００，０００の分子量を有する、
組成物。
【請求項２８】
請求項２２から２７のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、室温で１０００〜５００，０００ｍＰａ・ｓ（ｃｐｓ）の範囲の粘度を有する、
組成物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の組成物であって、
前記粘度は、室温で５０，０００〜１５０，０００ｍＰａ・ｓ（ｃｐｓ）の範囲である、
組成物。
【請求項３０】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
メチルパラベン、プロピルパラベンおよびｍ−クレゾールからなる群より選択される防腐剤をさらに含む、
組成物。
【請求項３１】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、２８０〜３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲の浸透圧を有する、
組成物。
【請求項３２】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、ゼノフリー（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）である、
組成物。
【請求項３３】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、１つまたは複数の治療的細胞を含む、
組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の組成物であって、
前記の１つまたは複数の治療的細胞は、１つまたは複数の中胚葉性系列の前駆細胞（ＰＭＬ）、１つまたは複数の免疫調節前駆（ＩＭＰ）細胞、１つまたは複数の間葉系幹細胞、１つまたは複数の樹状細胞、１つまたは複数の血小板、１つまたは複数の線維芽細胞、１つまたは複数の筋線維芽細胞、またはそれらの組み合わせを含む、
組成物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の組成物であって、
前記の１つまたは複数のＰＭＬは、（ａ）検出可能なレベルの、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１を発現し、および、（ｂ）検出可能なレベルの、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない、
組成物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組成物であって、
前記の１つまたは複数のＰＭＬは、検出可能なレベルの、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）および／またはＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）を発現する、
組成物。
【請求項３７】
請求項３４に記載の組成物であって、
前記の１つまたは複数のＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルの、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＣＤ３０４（ニューロピリン１）、ＣＤ１７８（ＦＡＳリガンド）、ＣＤ２８９（Ｔｏｌｌ様受容体９）、ＣＤ３６３（スフィンゴシン−１−リン酸受容体１）、ＣＤ９９、ＣＤ１８１（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ１；ＣＸＣＲ１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、ＣＸＣＲ２およびＣＤ１２６を発現する、
組成物。
【請求項３８】
請求項３４または３７に記載の組成物であって、
前記の１つまたは複数のＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルの、ＣＤ１０、ＣＤ１１１、ＣＤ２６７、ＣＤ４７、ＣＤ２７３、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１４６、ＣＤ５５、ＣＤ３４０、ＣＤ９１、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ８２、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ６３、ＣＤ２４５、ＣＤ５８、ＣＤ１０８、Ｂ２−ミクログロブリン、ＣＤ１５５、ＣＤ２９８、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２３０、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ９０、ＣＤ９８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１およびＣＤ２７６の１つまたは複数を発現する、
組成物。
【請求項３９】
請求項３３、３６または３７のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記の１つまたは複数のＩＭＰ細胞は、
（ａ）検出可能なレベルの、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ１３０、ＣＤ１４８、ＣＤ２８８、ＣＤ３３７、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ３４９、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０、ＣＤ１１１、ＣＤ２６７、ＣＤ４７、ＣＤ２７３、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１４６、ＣＤ５５、ＣＤ３４０、ＣＤ９１、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ８２、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ６３、ＣＤ２４５、ＣＤ５８、ＣＤ１０８、Ｂ２−ミクログロブリン、ＣＤ１５５、ＣＤ２９８、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２３０、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ９０、ＣＤ９８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１およびＣＤ２７６の１つまたは複数；および／または
（ｂ）検出可能なレベルの、ＣＤ７２、ＣＤ１３３、ＣＤ１９２、ＣＤ２０７、ＣＤ１４４、ＣＤ４１ｂ、ＦＭＣ７、ＣＤ７５、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ２８２、ＣＤ１００、ＣＤ９４、ＣＤ３９、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ４０、ＣＤ３５、ＣＤ１５、ＰＡＣ−１、ＣＬＩＰ、ＣＤ４８、ＣＤ２７８、ＣＤ５、ＣＤ１０３、ＣＤ２０９、ＣＤ３、ＣＤ１９７、ＨＬＡ−ＤＭ、ＣＤ２０、ＣＤ７４、ＣＤ８７、ＣＤ１２９、ＣＤｗ３２９、ＣＤ５７、ＣＤ１６３、ＴＰＢＧ、ＣＤ２０６、ＣＤ２４３（ＢＤ）、ＣＤ１９、ＣＤ８、ＣＤ５２、ＣＤ１８４、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１３８、ＣＤ７、ＣＤ５０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１５８ｅ２、ＣＤ６４、ＤＣＩＲ、ＣＤ４５、ＣＬＡ、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ３４、ＣＤ１０１、ＣＤ２、ＣＤ４１ａ、ＣＤ６９、ＣＤ１３６、ＣＤ６２Ｐ、ＴＣＲαβ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１ａ、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１５４、ＣＤ７０、ＣＤｗ２１８ａ、ＣＤ１３７、ＣＤ４３、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３６、ＣＤ１５０、ＣＤ６６、ＣＤ２１２、ＣＤ１７７、ＣＤ１４２、ＣＤ１６７、ＣＤ３５２、ＣＤ４２ａ、ＣＤ３３６、ＣＤ２４４、ＣＤ２３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２２９、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤＨ６、ＣＤ２８、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ３３５、ＣＤ１３１、ＣＤ３２、ＣＤ１５７、ＣＤ１６５、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ３３２、ＣＤ１８０、ＣＤ６５およびＣＤ２４の１つまたは複数
を発現する、
組成物。
【請求項４０】
患者における損傷組織を修復する方法であって、
治療的有効量の先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与するステップ、および、
それにより、前記患者における前記損傷組織を治療するステップ、
を含む、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、
前記組織は、負傷または疾患によって損傷されている、
方法。
【請求項４２】
患者における老化を阻害する方法であって、
治療的有効量の先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与するステップ、および、
それにより、前記患者における老化組織を治療するステップ、
を含む、
方法。
【請求項４３】
請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法であって、
前記組織は、中胚葉由来である、
方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、
前記組織は、腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織である、
方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、
前記方法は、前記患者における腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織の負傷または疾患の治療のためのものである、
方法。
【請求項４６】
請求項４４に記載の方法であって、
前記方法は、前記患者における腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織の老化を阻害するためのものである、
方法。
【請求項４７】
請求項４５または４６に記載の方法であって、
前記方法は、膣萎縮を治療するためのものである、
方法。
【請求項４８】
患者における発毛を促進する方法であって、
治療的有効量の請求項１から３９のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与するステップを含む、
方法。
【請求項４９】
請求項４０から４８のいずれか一項に記載の方法であって、
前記組成物の投与は、組織再生を改善し、および／または、アポトーシスを低減させる、
方法。
【請求項５０】
患者における損傷組織を修復する方法での使用のための、請求項１から３９のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記方法は、治療的有効量の前記組成物を、前記患者に投与するステップを含む、
組成物。
【請求項５１】
それを必要とする患者における老化を阻害する方法での使用のための、請求項１から３９のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記方法は、治療的有効量の前記組成物を、前記患者に投与するステップを含む、
組成物。
【請求項５２】
患者における発毛を促進する方法での使用のための、請求項１から３９のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記方法は、治療的有効量の前記組成物を、前記患者に投与するステップを含む、
組成物。
【請求項５３】
損傷組織を治療する、または老化を阻害する、または発毛を促進する方法での使用のための、細胞の集団を生産する方法であって、
前記方法は、請求項１から３２に定義される組成物の存在下で、単核細胞（ＭＣ）、ＰＭＬおよび／またはＩＭＰを培養するステップ、および、
前記のＭＣ、ＰＭＬおよび／またはＩＭＰの少なくとも一部が増殖するのを可能にするステップ、を含む、
方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、
前記ＭＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、
方法。
【請求項５５】
請求項５３に記載の方法であって、
前記ＰＭＬは、請求項３５または３６に定義される、
方法。
【請求項５６】
請求項５３に記載の方法であって、
前記ＩＭＰは、請求項３７から３９に定義される、
方法。
【請求項５７】
請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記方法は、前記の増殖された細胞を単離するステップをさらに含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子および血小板由来増殖因子を含む組成物、および、組織損傷を治療する、老化を阻害する、または発毛を促進するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様の負傷および病理学的プロセスが、組織内で生じ得る。損傷組織の修復は、組織再生、損傷組織を置き換えるための健康な隣接組織からの新たな組織の増殖に依存する。組織再生は、生理学的な細胞および分子レベルで厳重に制御され、増殖因子、炎症促進性および抗炎症性分子、およびプロテアーゼを含む、多くの因子の作用およびバランスを必要とする。これらの因子の調和された制御は、再生された組織が、その解剖学的および生理学的役割を満たす適切な構造、形状および機能を有することを確実にさせる。
【０００３】
損傷組織の修復は、以下の理由から、しばしば非効率である。（１）新たな組織の形成は、組織損傷の近くの細胞のアポトーシスによって打ち消される、（２）進行中の疾患プロセスは、組織再生に対して有害な作用を有する、および、（３）局所的な微小環境は、組織修復および再生の助けとならない。これらの制限は、しばしば、損傷組織または老化組織の準最適または部分的な修復をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも１つの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）アイソフォームおよび少なくとも１つの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）アイソフォームを含む組成物は、損傷組織および老化組織の効果的な修復を促進することを見いだした。組成物は、したがって、治療的なものとして用いることができる。また、組成物は、発毛を促進するためにも用いられる。組成物は、治療的細胞を生産する方法において、さらに用いられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明は、少なくとも１つの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）アイソフォームおよび少なくとも１つの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）アイソフォームを含む、組成物を提供する。
【０００６】
また、本発明は、以下も提供する：
−治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップ、およびそれにより、患者における損傷組織を治療するステップを含む、患者における損傷組織を修復する方法；
−治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップ、およびそれにより、患者における老化を阻害するステップを含む、患者における老化を阻害する方法；
−治療的な量の本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者における発毛を促進する方法；
−患者における損傷組織を修復する方法での使用のための、本発明の組成物であって、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む；
−患者における老化を阻害する方法での使用のための、本発明の組成物であって、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む；
−患者における発毛を促進する方法での使用のための、本発明の組成物であって、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む；および
−損傷組織を治療する、または老化を阻害する、または発毛を促進する方法での使用のための、細胞の集団を生産する方法であって、当該方法は、
本発明の組成物の存在下で、単核細胞（ＭＣ）、中胚葉性系列の前駆細胞（ＰＭＬ）および／または免疫調節性前駆細胞（ＩＭＰ）を培養するステップ、および、ＭＣ、ＰＭＬおよび／またはＩＭＰの少なくとも一部が増殖するのを可能にするステップ、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】メチルセルロースおよびＰＦ−１２７プラセボゲルの振動温度傾斜（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｒａｍｐ）を示す。貯蔵弾性率Ｇ’、損失弾性率Ｇ’’、および、メチルセルロースについて、２％（Ａ）、２．５％（Ｂ）、および３％（Ｃ）で、および、ＰＦ−１２７について、２５％（Ｄ）、３０％（Ｅ）および３５％（Ｆ）で、０．２、０．４３、０．９３および２．０Ｈｚで、温度の関数としての位相角δ。傾斜率は、分あたり２℃であり、トルクは２５０μＮ．ｍであった。ＰＦ−１２７ゲルのグラフにおけるギャップは、低温での溶液の低粘性に起因した。
【図２】メチルセルロースおよびＰＦ−１２７プラセボゲルの写真を示す。メチルセルロースプラセボ（２％、２．５％および３％）およびＰＦ−１２７プラセボ（２０％、２５％および３０％）を、４℃、２２℃または３７℃で保管して、吸収表面上に注入した。ネガティブコントロールとして水を用いて、ポジティブコントロールとしてＮｕｒｏｆｅｎ（登録商標）イブプロフェンゲルを用いた。プラセボゲルを、コントロールと視覚的に比較した。
【図３】メチルセルロースおよびＰＦ−１２７治療的ゲルの振動温度傾斜を示す。貯蔵弾性率Ｇ’、損失弾性率Ｇ’’、および、メチルセルロースＰＬに関して、２．５％（Ａ）で、ＰＦ−１２７  ＰＬに関して、２５％（Ｂ）、および３０％（Ｃ）で、０．２、０．４３、０．９３および２．０Ｈｚで、温度の関数としての位相角δ。傾斜率は、分あたり２℃であり、トルクは、２５０μＮ．ｍであった。３つのゲルの代表例を示す。
【図４】メチルセルロースおよびＰＦ−１２７  ＰＬゲルの写真を示す。メチルセルロースＰＬ（２．５％）およびＰＦ−１２７  ＰＬ（２５％および３０％）を、４℃、２２℃または３７℃で保管して、吸収表面上に注入した。ネガティブコントロールとして水を用いて、ポジティブコントロールとしてＮｕｒｏｆｅｎ（登録商標）イブプロフェンゲルを用いた。ＰＬゲルを、コントロールと視覚的に比較した。
【図５】メチルセルロースまたはＰＦ−１２７治療的ゲルを用いた、線維芽細胞増殖を示す。線維芽細胞を、変化する濃度のＰＬ（０、１２．５、２５、３７．５、５０％または１００％［ＰＦＰＬのみ］）を含む、２％メチルセルロースＰＬ（ＭＣＰＬ）または２％ＰＦ−１２７  ＰＬ（ＰＦＰＬ）を用いて培養した。４８時間後、生存細胞の相対的レベルを示すために、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイを行なった。ポジティブコントロールとしてＰＬ（２％）を用いて、ネガティブコントロールとしてシスプラチン（１５μＭ）を用いた。示される蛍光強度は、ＦＢＳ（２％）コントロールに対するものである。統計的有意性、ｎ＝３、＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１。
【図６】異なる条件下での保管後の、メチルセルロースまたはＰＦ−１２７治療的ゲルを用いた、線維芽細胞増殖を示す。線維芽細胞を、室温（ＲＴ）または４℃で０日、７日、１４日、２８日、２ヶ月、３ヶ月、または６ヶ月間保管された、２％ＰＦ−１２７  ＰＬ（ＰＦＰＬ）または２％メチルセルロースＰＬ（ＭＣＰＬ）を用いて培養した。４８時間後、生存細胞の相対的レベルを示すために、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイを行なった。ポジティブコントロールとしてＰＬ（２％）を用いて、ネガティブコントロールとしてシスプラチン（１５μＭ）を用いた。示される蛍光強度は、ＦＢＳ（２％）コントロールに対するものである。統計的有意性、ｎ＝３。
【図７】実施例４に関する、５パラメーターロジスティック（５−ＰＬ）を用いて生産された検量線を示す。
【図８】実施例４に関する結果を示す。図８Ａは、分析されたそれぞれの治療的ゲルにおける、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、トロンボスポンジンおよびアンジオポエチンの濃度を示す。ＶＥＧＦ−Ｄのレベルは、検出限界よりも低かったので示さない。図８Ｂは、サンプルセットにわたって計算された、それぞれの増殖因子に関する、最小、最大、メジアン、平均、およびＳＥＭを要約する。図８Ｃは、それぞれの増殖因子のメジアン濃度を示し、図８Ｄは、この情報を箱髭図として示す。
【図９】実施例５に関する、５パラメーターロジスティック（５−ＰＬ）を用いて生産された検量線を示す。
【図１０】実施例５に関する結果を示す。図１０Ｂは、分析されたそれぞれの治療的ゲルにおける、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、トロンボスポンジンおよびアンジオポエチンの濃度を示す。図１０Ａは、サンプルセットにわたって計算された、それぞれの増殖因子に関する、最小、最大、メジアン、平均、ＳＤおよびＳＥＭを要約する。図１０Ｃは、それぞれの増殖因子のメジアン濃度を示す。ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｄは、検出不可能であった。
【図１１】フレッシュおよび２週間保管されたゲルの、増殖因子含有量を比較する。図１１Ａは、フレッシュおよび２週間保管されたゲルの両方の、メジアン増殖因子濃度を示す。図１１Ｂは、２週間の保管後の、フレッシュな治療的ゲルからの増殖因子の平均損失パーセントを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
開示された産物および方法の異なる適用は、当該分野における特定のニーズに合わせられ得ることが理解されるよう。また、本明細書において用いられる専門用語は、本発明の特定の実施態様を説明する目的のためだけのものであり、限定されることを意図しないことも理解されよう。
【０００９】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別段の指示をしない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」との言及は２以上のそのような細胞（ｃｅｌｌｓ）を含み、「組織（ａ  ｔｉｓｓｕｅ）」との言及は２以上のそのような組織（ｔｉｓｓｕｅｓ）を含み、「患者（ａ  ｐａｔｉｅｎｔ）」との言及は２以上のそのような患者（ｐａｔｉｅｎｔｓ）を含むなどである。
【００１０】
上記であろうと下記であろうと、本明細書中に挙げられる全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体で参照により本明細書に援用される。
【００１１】
［本発明の組成物］
本発明は、少なくとも１つの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）アイソフォームおよび少なくとも１つの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）アイソフォームを含む、組成物を提供する。組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５つのｂＦＧＦアイソフォームを含んでよい。組成物は、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４つのＰＤＧＦアイソフォームを含んでよい。
【００１２】
組成物は、損傷組織を修復するのに適している。組成物は、損傷組織と接触されてよく、それに適用されてよく、またはそれに注入されてよい。また、組成物は、老化を阻害するのにも適している。組成物は、老化組織と接触されてよく、それに適用されてよく、またはそれに注入されてよい。また、組成物は、発毛を促進するのにも適している。
【００１３】
［塩基性線維芽細胞増殖因子］
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ−βとしても知られる）は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。線維芽細胞増殖因子ファミリーは、分泌成長因子の大きなファミリーであり、そのメンバーは、創傷治癒、血管新生、エンドクリンシグナリングおよび多数の発生プロセスにおける機能を有する。それらは、数多くの細胞および組織の増殖および分化に重要である。全ての線維芽細胞増殖因子は、似た内部コアを共有し、ヘパリンに関して高い親和性を有する。線維芽細胞増殖因子は、３つの免疫グロブリン様ドメインおよびヘパリン結合配列を含むチロシンキナーゼ受容体である線維芽細胞増殖因子受容体の結合および活性化を通して作用する。また、細胞表面上のヘパランサルフェートプロテオグリカンも、線維芽細胞増殖因子シグナルの伝達において役割を果たす。
【００１４】
多くの線維芽細胞増殖因子と同様に、ｂＦＧＦは、多面的な生物学的役割を有する。それは特に、神経系における胚形成および形態形成、および骨形成に関与する。また、塩基性線維芽細胞増殖因子は、主な血管新生因子でもあり、創傷治癒において重要な役割を有する。塩基性線維芽細胞増殖因子は、基底膜内に、および、正常組織内の血管の内皮下の細胞外マトリックス内に存在する。創傷治癒の間、血管新生を開始するために、ヘパランサルフェート−分解酵素の作用がｂＦＧＦを活性化させると考えられている。
【００１５】
一部の例では、ｂＦＧＦは、パラクリンまたはオートクリン様式で作用する。別の例では、ｂＦＧＦは、イントラクリン活性を示す。換言すれば、ｂＦＧＦは、分泌物の不存在下で、細胞内標的に対して直接的な効果を有することができる。
【００１６】
前記の少なくとも１つのｂＦＧＦアイソフォームは、典型的にヒトである。あるいは、前記の少なくとも１つのｂＦＧＦアイソフォームは、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来であってよい。
【００１７】
ヒトｂＦＧＦの作用の異なるモードは、５つの異なるｂＦＧＦアイソフォームが単一のＦＧＦ２遺伝子から形成され得るという事実に起因し得る。ｂＦＧＦアイソフォームは全て、同一の機能を発揮する潜在性を有するが、異なる位置に見られる傾向がある。それぞれのアイソフォームは、異なるｍＲＮＡ翻訳開始部位と関連する。ＡＵＧ開始コドンは、１８ｋＤａ（１５５アミノ酸）細胞質アイソフォームへ導き、それはオートクリンおよびパラクリン作用を担う。４つのＣＵＧ開始コドンは、２２ｋＤａ（１９６アミノ酸）、２２．５（２０１アミノ酸）、２４ｋＤａ（２１０アミノ酸）、および３４ｋＤａ（２８８アミノ酸）のｂＦＧＦアイソフォームを生じさせる。これらのアイソフォームは、核に局在し、ｂＦＧＦのイントラクリン効果を担う。
【００１８】
本発明の組成物は、任意のｂＦＧＦアイソフォームを含んでよい。本発明の組成物は、好ましくは、（ａ）１８ｋＤａ  ｂＦＧＦ（配列番号１）またはその変異体、（ｂ）２２ｋＤａ  ｂＦＧＦ（配列番号２）またはその変異体、（ｃ）２２．５ｋＤａ  ｂＦＧＦまたはその変異体、（ｄ）２４ｋＤａ  ｂＦＧＦ（配列番号３）またはその変異体、および、（ｅ）３４ｋＤａ  ｂＦＧＦ（配列番号４）またはその変異体の、少なくとも１つを含む。組成物は、任意の数および任意の組み合わせのｂＦＧＦアイソフォームを含んでよい。組成物は、全てのｂＦＧＦアイソフォームを含んでよい。
【００１９】
本発明の組成物は、（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ｄ）；（ｅ）；（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ａ）および（ｅ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｅ）；（ｃ）および（ｄ）；（ｃ）および（ｅ）；（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｃ）および（ｅ）；（ａ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を含んでよい。（ａ）〜（ｅ）のそれぞれの定義に関する組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
【００２０】
ｂＦＧＦアイソフォームの変異体は、ｂＦＧＦアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有していて少なくとも部分的なｂＦＧＦ活性を保持する、ポリペプチドである。変異体の活性は、それが由来するｂＦＧＦアイソフォームの活性と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％低減され得る。ｂＦＧＦアイソフォームの変異体は、好ましくは、ｂＦＧＦアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有していてｂＦＧＦ活性を保持する、ポリペプチドである。ｂＦＧＦ活性は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて決定することができる。例えば、ｂＦＧＦ変異体をインビトロ血管新生アッセイに加える効果を試験することができる。血管新生アッセイは、当技術分野で知られている（Ａｕｅｒｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｊａｎ；４９（１）：３２−４０）。
【００２１】
配列番号１、２、３または４のような、ｂＦＧＦアイソフォームのアミノ酸配列の全長にわたって、変異体は、アミノ酸同一性に基づいて、好ましくは、その配列と少なくとも５０％相同であり、例えば、その配列と５０％同一である。より好ましくは、変異体は、配列全体にわたって、ｂＦＧＦアイソフォームのアミノ酸配列に対するアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、およびより好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってよく、または、配列全体にわたってｂＦＧＦアイソフォームのアミノ酸配列と同一であってよい。一続きの１００またはそれよりも多い、例えば１２５、１５０、１７５または２００またはそれよりも多い、連続するアミノ酸にわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％、アミノ酸同一性が存在してよい（「ハードホモロジー」）。
【００２２】
当技術分野における標準的な方法を用いてホモロジーを決定してよい。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供し、それを用いてホモロジーを計算することができ、例えば、そのデフォルト設定で用いられる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，ｐ３８７−３９５）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載されるように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、ホモロジーを計算し、または、配列を整列させることができる（例えば、同等の残基または対応する配列を（典型的に、それらのデフォルト設定で）同定する）。ＢＬＡＳＴ分析を行なうためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公に利用可能である。
【００２３】
アミノ酸置換は、ｂＦＧＦアイソフォームのアミノ酸配列に対して、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換までされ得る。保存的置換は、同様の化学構造、同様の化学特性または同様の側鎖ボリュームの他のアミノ酸によって、アミノ酸を置換する。導入されたアミノ酸は、それらが置換するアミノ酸と、同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性または電荷を有してよい。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の場所において、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してよい。保存的アミノ酸変更は、当技術分野でよく知られていて、以下の表１に定義される２０個の主なアミノ酸の特性に従って選択してよい。アミノ酸が同様の極性を有する場合は、これは、表２におけるアミノ酸側鎖に関するハイドロパシースケールを参照して決定することもできる。
【００２４】
【表１】
2018513839.tif 000003
【００２５】
【表２】
2018513839.tif 000004
【００２６】
ｂＦＧＦアイソフォームのアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上述のポリペプチドからさらに欠失してよい。１、２、３、４、５、１０、２０または３０個まで、またはそれよりも多くの残基が欠失してよい。
【００２７】
変異体は、ｂＦＧＦアイソフォームのフラグメントを含んでよい。そのようなフラグメントは、少なくとも部分的なｂＦＧＦ活性を保持する。フラグメントは、少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸の長さであってよい。
【００２８】
これに代え又はこれに加えて、１つまたは複数のアミノ酸が、上述のポリペプチドに付加されてよい。伸長は、ｂＦＧＦアイソフォームまたはその変異体のアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端に提供されてよい。伸長は、かなり短く、例えば、１〜１０アミノ酸の長さであってよい。あるいは、伸長は、より長く、例えば、５０または１００アミノ酸までであってよい。
【００２９】
塩基性線維芽細胞増殖因子は、単量体として分泌されるが、細胞表面のヘパランサルフェートとの相互作用の際に、二量体を形成することができる。実際に、二量体ｂＦＧＦは、線維芽細胞増殖因子受容体の活性化および二量体化が可能な、非共有の左右交互（ｓｉｄｅ−ｔｏ−ｓｉｄｅ）構造を有する。
【００３０】
本発明の組成物は、上記に示したｂＦＧＦの少なくとも１つのアイソフォームを含む。前記の少なくとも１つのｂＦＧＦアイソフォームは、単量体であってよい。前記の少なくとも１つのｂＦＧＦアイソフォームは、二量体であってよい。組成物が少なくとも２つのｂＦＧＦアイソフォームを含む場合は、アイソフォームの全てが単量体であってよい。あるいは、アイソフォームの全てが二量体であってよい。組成物が少なくとも２つのｂＦＧＦアイソフォームを含む場合は、組成物は、単量体ｂＦＧＦおよび二量体ｂＦＧＦの両方を含んでよい。前記の少なくとも１つの二量体ｂＦＧＦは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であってよい。配列番号１〜５およびそれらの変異体は、（ａ）〜（ｅ）として上述される。ホモ二量体ｂＦＧＦは、（ａ）および（ａ）、（ｂ）および（ｂ）、（ｃ）および（ｃ）、（ｄ）および（ｄ）または（ｅ）および（ｅ）を含んでよい。ヘテロ二量体ｂＦＧＦは、任意の２つの異なるｂＦＧＦアイソフォームまたはそれらの変異体を含んでよい。ヘテロ二量体ｂＦＧＦは、（ａ）〜（ｅ）として上述される、任意の２つの異なるｂＦＧＦアイソフォームまたはそれらの変異体を含んでよい。ヘテロ二量体ｂＦＧＦは、好ましくは、（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ａ）および（ｅ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｅ）；（ｃ）および（ｄ）；（ｃ）および（ｅ）；または（ｄ）および（ｅ）を含む。本発明の組成物は、（ｉ）単量体ｂＦＧＦ、（ｉｉ）ホモ二量体ｂＦＧＦ、および（ｉｉｉ）ヘテロ二量体ｂＦＧＦの少なくとも１つ、例えば、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；または（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む。組成物は、単量体ｂＦＧＦ、ホモ二量体ｂＦＧＦ、およびヘテロ二量体ｂＦＧＦの全てを含んでよい。組成物は、ヘテロ二量体ＦＧＦの１つよりも多い形態、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の形態のヘテロ二量体ＦＧＦを含んでよい。
【００３１】
前記の少なくとも１つのｂＦＧＦは、好ましくは組み換えｂＦＧＦである。組み換えタンパク質を生産する方法は、当技術分野でよく知られている。
【００３２】
組成物における、ｂＦＧＦポリペプチドの合計濃度（すなわち、前記の少なくとも１つのｂＦＧＦアイソフォームの合計量）は、好ましくは、組成物のミリリットルあたり、約５０ｐｇおよび約５００ｐｇの範囲内である。例えば、ｂＦＧＦポリペプチドの合計濃度（すなわち、前記の少なくとも１つのｂＦＧＦアイソフォームの合計量）は、組成物のミリリットルあたり、約７５ｐｇ〜約４７５ｐｇ、約１００ｐｇ〜約４５０ｐｇ、約１２５ｐｇ〜約４２５ｐｇ、約１５０ｐｇ〜約４００ｐｇ、約１７５ｐｇ〜約３７５ｐｇ、約２００ｐｇ〜３５０ｐｇ、約２２５ｐｇ〜約３２５ｐｇ、約２５０ｐｇ〜約３００ｐｇ、または約２７５ｐｇであってよい。
【００３３】
［血小板由来増殖因子］
ｂＦＧＦ同様に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、細胞の増殖および分裂を制御する。それは、血小板によって生産され、それらのα顆粒内に保管され、そして、血小板活性化の際に放出される。また、ＰＤＧＦは、平滑筋細胞、活性化マクロファージ、および内皮細胞を含む、多くの他の細胞によっても生産される。
【００３４】
ＰＤＧＦは、間葉系細胞および特定の他の細胞型の、増殖、生存および運動性を刺激する。この増殖因子は、胚発生、および、成体における組織恒常性のために特に重要である。また、ＰＤＧＦは、血管新生の制御においても重要な役割を果たす。ＰＤＧＦアイソフォームは、α−およびβ−チロシンキナーゼ受容体（ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβ）に結合して、それらの細胞効果を発揮する。ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβは、５つの免疫グロブリン様ドメインを有する細胞外ドメイン、および、キナーゼドメインを保有する細胞内部分を含む、似た構造を共有する。
【００３５】
前記の少なくとも１つのＰＤＧＦアイソフォームは、典型的にヒトＰＤＧＦである。あるいは、前記の少なくとも１つのＰＤＧＦアイソフォームは、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来であってよい。
【００３６】
ヒトＰＤＧＦの５つの公知のアイソフォームが存在する。全てのアイソフォームは、ジスルフィド結合された二量体タンパク質である。ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣおよびＰＤＧＦ−ＤＤはホモ二量体であり、それぞれ、２つのＡ−（配列番号５）、Ｂ−（配列番号６）、Ｃ−（配列番号７）またはＤ−（配列番号８）ポリペプチド鎖からなる。また、ＰＤＧＦは、ヘテロ二量体、ＰＤＧＦ−ＡＢとして存在してもよい。ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂは、細胞内で活性化されて、続いて分泌されるが、ＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄは、細胞外プロテアーゼによる活性化を必要とする潜伏性の因子として分泌される。機能の違いが、異なるアイソフォーム間に存在する。
【００３７】
本発明の組成物は、少なくとも１つのＰＤＧＦアイソフォームを含む。組成物は、好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの、ＰＤＧＦのアイソフォームを含む。組成物は、好ましくは、少なくとも１つのホモ二量体ＰＤＧＦを含む。ホモ二量体ＰＤＧＦは、（ａ）２つのＰＤＧＦ−Ａサブユニット（配列番号５）またはその変異体、（ｂ）２つのＰＤＧＦ  Ｂサブユニット（配列番号６）またはその変異体、（ｃ）２つのＰＤＧＦ−Ｃサブユニット（配列番号７）またはその変異体、または（ｄ）２つのＰＤＧＦ−Ｄサブユニット（配列番号８）またはその変異体を含んでよい。組成物は、好ましくは、少なくとも１つのヘテロ二量体のＰＤＧＦを含む。ヘテロ二量体のＰＤＧＦは、（ｅ）１つのＰＤＧＦ−Ａサブユニット（配列番号５）またはその変異体および１つのＰＤＧＦ−Ｂサブユニット（配列番号６）またはその変異体を含んでよい。
【００３８】
組成物は、任意の数のホモ二量体およびヘテロ二量体ＰＤＧＦアイソフォームを、任意の組み合わせで含んでよい。組成物は、全てのホモ二量体およびヘテロ二量体のＰＧＤＦアイソフォームを含んでよい。換言すれば、本発明の組成物は、（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ｄ）；（ｅ）；（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ａ）および（ｅ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｅ）；（ｃ）および（ｄ）；（ｃ）および（ｅ）；（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｃ）および（ｅ）；（ａ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を含んでよい。（ａ）〜（ｅ）のそれぞれの定義に関する組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
【００３９】
ＰＤＧＦアイソフォームの変異体は、ＰＤＧＦアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有していて少なくとも部分的なＰＤＧＦ活性を保持する、ポリペプチドである。変異体の活性は、それが由来するＰＤＧＦアイソフォームの活性と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％低減され得る。ＰＤＧＦアイソフォームの変異体は、好ましくは、ＰＤＧＦアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有していてＰＤＧＦ活性を保持する、ポリペプチドである。ＰＤＧＦ活性は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて決定することができる。例えば、ＰＤＧＦ変異体をインビトロ血管新生アッセイに加える効果を試験することができる。血管新生アッセイは、当技術分野で知られている（Ａｕｅｒｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｊａｎ；４９（１）：３２−４０）。
【００４０】
配列番号５、６、７または８のような、ＰＤＧＦアイソフォームのアミノ酸配列の全長にわたって、変異体は、アミノ酸同一性に基づいて、好ましくは、その配列と少なくとも５０％相同であり、例えば、その配列と５０％同一である。より好ましくは、変異体は、配列全体にわたって、ＰＤＧＦアイソフォームのアミノ酸配列に対するアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および、より好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってよく、または、配列全体にわたってＰＤＧＦアイソフォームのアミノ酸配列と同一であってよい。一続きの１００またはそれよりも多い、例えば１２５、１５０、１７５または２００またはそれよりも多い、連続するアミノ酸にわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％、アミノ酸同一性が存在してよい（「ハードホモロジー」）。
【００４１】
ＰＤＧＦは、好ましくは、組み換えＰＤＧＦである。組み換えタンパク質を生産する方法は、当技術分野でよく知られている。
【００４２】
物本発明の組成物における、ＰＤＧＦポリペプチドの合計濃度（すなわち、前記の少なくとも１つのＰＤＧＦアイソフォームの合計量）は、好ましくは、組成物のミリリットルあたり、約５０００ｐｇおよび約２５０００ｐｇの範囲内である。例えば、ＰＤＧＦポリペプチドの合計濃度（すなわち、前記の少なくとも１つのＰＤＧＦアイソフォームの合計量）は、組成物のミリリットルあたり、約６０００ｐｇ〜約２４０００ｐｇ、約７０００ｐｇ〜約２３０００ｐｇ、約８０００ｐｇ〜約２２０００ｐｇ、約９０００ｐｇ〜約２１０００ｐｇ、約１００００ｐｇ〜約２００００ｐｇ、約１１０００ｐｇ〜約１９０００ｐｇ、約１２０００ｐｇ〜約１８０００ｐｇ、約１３０００ｐｇ〜約１７０００ｐｇ、約１４０００ｐｇ〜約１６０００ｐｇ、約１５０００ｐｇであってよい。
【００４３】
組成物における、合計ＰＤＧＦポリペプチドに対する合計ｂＦＧＦポリペプチドの比は、約１：１０および約１：５００の範囲内、例えば、約１：５０〜約１：４５０、約１：１００〜約１：４００、約１：１５０〜約１：３５０、または、約１：２００〜約１：３００である。
【００４４】
［他の増殖因子および生体活性成分］
本発明の組成物におけるｂＦＧＦおよびＰＤＧＦは、損傷組織内の隣接細胞の生存、修復および再生を促進する。また、それらは血管新生も促進する。したがって、本発明の組成物は、好ましくは、組織再生を増大または改善し、および／または、アポトーシスを低減または低下させる。組成物は、好ましくは、組成物の不存在と比較して、組織再生を増大または改善する。
【００４５】
ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦに加えて、本発明の組成物は、検出可能なレベルの１つまたは複数の他の増殖因子または生体活性成分を含んでよい。前記の１つまたは複数の他の増殖因子または生体活性成分のレベルは、以下に記載のように、公知技術を用いて測定され得る。
【００４６】
上記のｂＦＧＦおよびＰＤＧＦに関しては、以下に述べる増殖因子または他の生体活性成分は、典型的にヒトである。あるいは、それらは、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来であってよい。
【００４７】
組成物は、好ましくは、検出可能なレベルの、アンジオポエチン、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ１２、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、インターフェロンα（ＩＦＮα）、リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）、プロテアーゼ−活性化受容体４（ＰＡＲ４）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフリガンド）５（ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）、ＴＧＦ−β２、トロンボスポンジン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）および血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）の、少なくとも１つ、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８または少なくとも１９個を含む。組成物は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらの増殖因子または生体活性成分を含んでよい。組成物は、検出可能なレベルのこれらの成分の全てを含んでよい。
【００４８】
組成物は、好ましくは、検出可能なレベルの、（ｉ）アンジオポエチン、（ｉｉ）ＣＸＣＬ４、（ｉｉｉ）ＣＸＣＬ７、（ｉｖ）ＣＸＣＬ１２、（ｖ）リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）、（ｖｉ）プロテアーゼ−活性化受容体４（ＰＡＲ４）および（ｖｉｉ）トロンボスポンジンの、少なくとも１つを含む。組成物は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらの増殖因子または生体活性成分を含んでよい。組成物は、検出可能なレベルの全てのこれらの成分を含んでよい。具体的には、組成物は、検出可能なレベルの（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｖ）；（ｖｉ）；（ｖｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）および（ｖ）；（ｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｖ）および（ｖｉ）；（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ、）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）およびｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）およびｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）を含んでよい。（ｉ）〜（ｖｉｉ）のそれぞれの定義に関する組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
【００４９】
好ましくは、組成物は、検出可能なレベルのアンジオポエチンを含む。
【００５０】
本発明の組成物は、好ましくは、検出可能なレベルの、ｂＦＧＦアイソフォーム、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも１つを含む。より好ましくは、組成物は、（ａ）ＥＧＦ、（ｂ）ＴＧＦ−β１、（ｃ）ＴＧＦ−β２、（ｄ）インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）および（ｅ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の任意または全てを含んでよい。換言すれば、本発明の組成物は、（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ｄ）；（ｅ）；（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ａ）および（ｅ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｅ）；（ｃ）および（ｄ）；（ｃ）および（ｅ）；（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｃ）および（ｅ）；（ａ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を含んでよい。（ａ）〜（ｅ）のそれぞれの定義に関する組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
【００５１】
ＩＧＦは、好ましくは、ＩＧＦ−１である。ＩＧＦ−１は、好ましくはヒトＩＧＦ−１である。組成物は、検出可能なレベルの、ＩＧＦ−１アイソフォーム１（配列番号９）またはその変異体、ＩＧＦ−１アイソフォーム２（配列番号１０）またはその変異体、ＩＧＦ−１アイソフォーム３（配列番号１１）またはその変異体、またはＩＧＦ−１アイソフォーム４またはその変異体のいずれかまたは全てを含んでよい。ＩＧＦは、好ましくは、ＩＧＦ−２である。ＩＧＦは、好ましくはヒトＩＧＦ−２である。組成物は、ＩＧＦ−２アイソフォーム１（配列番号１２）またはその変異体、ＩＧＦ−２アイソフォーム２（配列番号１３）またはその変異体、ＩＧＦ−１アイソフォーム３のいずれかまたは全てを含んでよい。組成物は、検出可能なレベルの少なくとも１つのＩＧＦ−１アイソフォームおよび少なくとも１つのＩＧＦ−２アイソフォームを含んでよい。ＩＧＦアイソフォームの変異体は、ＩＧＦアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有して少なくとも部分的なＩＧＦ活性を保持する、ポリペプチドである。ＩＧＦ活性を評価する方法は、当技術分野で知られている。変異体の特徴、例えば、ホモロジーまたは同一性の％は、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦに関して上記に示され、ＩＧＦの変異体に等しく適用可能である。
【００５２】
ＶＥＧＦは、好ましくは、ヒトＶＥＧＦである。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ１２１（配列番号１４）またはその変異体、ＶＥＧＦ１４５（配列番号１５）またはその変異体、ＶＥＧＦ１６５（配列番号１６）またはその変異体、ＶＥＧＦ１６５ｂ（配列番号１７）またはその変異体、ＶＥＧＦ１８９（配列番号１８）またはその変異体、または、ＶＥＧＦ２０６（配列番号１９）またはその変異体であってよい。組成物は、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９またはＶＥＧＦ２０６のいずれかまたは全てを含んでよい。ＶＥＧＦアイソフォームの変異体は、ＶＥＧＦアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有して少なくとも部分的なＶＥＧＦ活性を保持する、ポリペプチドである。ＶＥＧＦ活性を評価する方法は、当技術分野で知られている。変異体の特徴、例えば、ホモロジーまたは同一性の％は、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦに関して上記に示され、ＶＥＧＦの変異体に等しく適用可能である。
【００５３】
組成物は、（Ａ）形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、（Ｂ）酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、（Ｃ）ＴＧＦ−β３および（Ｄ）ＦＧＦ−７のいずれかまたは全てを含んでよい。例えば、組成物は、（Ａ）；（Ｂ）；（Ｃ）；（Ｄ）；（Ａ）および（Ｂ）；（Ａ）および（Ｃ）；（Ａ）および（Ｄ）；（Ｂ）および（Ｃ）；（Ｂ）および（Ｄ）；（Ｃ）および（Ｄ）；（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）；（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）；（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）；（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）；または（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含んでよい。（Ａ）〜（Ｄ）のそれぞれの定義に関する組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
【００５４】
組成物は、アンジオポエチン、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ１２、ＥＧＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＦＮα、ＬＸＡ４、ＰＡＲ４、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、トロンボスポンジン、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ−Ｄ、ｂＦＧＦアイソフォーム、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ａＦＧＦ）、ＴＧＦ−β３およびＦＧＦ−７の全てを含んでよい。
【００５５】
本発明の組成物は、検出可能なレベルの、少なくとも１つの、他の増殖因子または生体活性成分（例えば、少なくとも２〜９１個のいずれかの、他の増殖因子または生体活性成分を含める）が、欠けていてよい。例えば、本発明の組成物は、好ましくは、検出可能なレベルの胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）を含まない。組成物は、好ましくは、検出可能なレベルの、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンβ、アルテミン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、β神経成長因子（ｂ−ＮＧＦ）、ベタセルリン（ＢＴＣ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（Ｄｋｋ−１）、エンドカン、エオタキシン、エピレグリン、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ−１０）、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、増殖分化因子１（ＧＤＦ−１）、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１５、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、成長ホルモン１（ＧＨ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ヘパリン−結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−１１、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、インヒビンＡ、インターフェロンγ−誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、レフティＡ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、乳脂肪球−ＥＧＦ因子８タンパク質（ＭＦＧ−Ｅ８）、ＭＩＧ、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１ａ）、ＭＩＰ−１ｂ、ニュールツリン、腎芽腫過剰発現遺伝子（ＮＯＶ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４、血小板由来増殖因子Ｃ（ＰＤＧＦ−Ｃ）、パーセフィン、プログラニュリン、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）、Ｓｋｐ、Ｃｕｌｌｉｎ、Ｆ−ｂｏｘ含有複合体（ＳＣＦ）および可溶性血管細胞接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）の、少なくとも１つを含まない。任意の数および組み合わせのこれらの増殖因子または生体活性成分は、組成物に、検出可能なレベルで存在しなくてよい。組成物は、検出可能なレベルのこれらの成分の全てが欠けていてよい。
【００５６】
［薬学的に許容できるポリマー］
本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも１つの薬学的に許容できるポリマーを含む。組成物は、例えば、１、２、３、４、５、１０またはそれよりも多くの、任意の数の薬学的に許容できるポリマーを含んでよい。
【００５７】
ポリマーは、治療での使用に適切であるならば、薬学的に許容できる。ポリマーは、好ましくは、損傷組織、例えば、腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織への、局所投与に適切である。ポリマーは、好ましくは、発毛の促進または膣萎縮の治療のための、局所投与に適切である。
【００５８】
薬学的に許容できるポリマーは、当技術分野でよく知られている。任意のそのようなポリマーは、本発明に従って使用され得る。適切なポリマーは、限定されないが、アルギネートポリマー、エチリデンの二重エステルポリマー、共重合体ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、共重合体ポリペルフルオロオクチルオキシカルボニル−ポリ（乳酸）（ＰＬＡ−ＰＦＯ）、および、他のブロック共重合体を含む。ブロック共重合体は、一緒に重合される２以上の単量体サブユニットが単一のポリマー鎖を作る、ポリマー材料である。ブロック共重合体は、典型的に、それぞれの単量体サブユニットが寄与する特性を有する。しかしながら、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成されたポリマーが保有しない独特な特性を有し得る。ブロック共重合体は、単量体サブユニットの一方は疎水性（すなわち親油性）であり、一方で、他方のサブユニット（単数または複数）は水性媒体中で親水性であるように、改変することができる。この場合では、ブロック共重合体は、両親媒性の特性を保有することができ、生物学的な膜を真似た構造を形成し得る。ブロック共重合体は、ジブロック（２つの単量体サブユニットからなる）であってよいが、２つよりも多い単量体サブユニットから構成されて、両親媒性物質（ａｍｐｈｉｐｉｌｅ）として振舞う、より複雑な配列を形成してもよい。共重合体は、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロック共重合体であってよい。またブロック共重合体は、脂質サブ材料として分類されないサブユニットから構成されてもよく；例えば、疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素系モノマーから作られてよい。また、ブロック共重合体の親水性サブセクションは、低いタンパク質結合特性を保有することができ、生の生物学的サンプルに曝された場合に耐性が高い膜の作製を可能にする。また、この頭部基ユニットは、非古典的な脂質頭部基に由来してもよい。
【００５９】
ポリマー濃度は、好ましくは、約１５％（ｗ／ｗ）〜約３０％（ｗ／ｗ）、例えば、約１７％（ｗ／ｗ）〜約２５％（ｗ／ｗ）、または、約２０％（ｗ／ｗ）〜約２３％（ｗ／ｗ）である。
【００６０】
ポリマーは、好ましくは、セルロースポリマーである。適切なセルロースポリマーは、当技術分野で知られている。セルロースポリマーは、好ましくは、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはメチルセルロースである。セルロースポリマー濃度は、好ましくは、約１．５％（ｗ／ｗ）〜約４．０％（ｗ／ｗ）、例えば、約２．０％（ｗ／ｗ）〜約３．０％（ｗ／ｗ）である。セルロースポリマーは、好ましくは、約４５０，０００〜約４，０００，０００、例えば、約５００，０００〜約３，５００，０００、約５００，０００〜約３，０００，０００、または、約７５０，０００〜約２，５００，０００、または、約１，０００，０００〜約２，０００，０００の分子量を有する。
【００６１】
ポリマーは、好ましくは、プルロニック酸、場合により、プルロニックＦ−１２７である。
【００６２】
ポリマーは、好ましくは、ゲルである。適切なゲルは、当技術分野で知られている。生体適合性ゲルは、天然または合成であってよい。好ましいゲルは、限定されないが、セルロースゲル、コラーゲンゲル、ゼラチンゲル、フィブリンゲル、キトサンゲル、スターチゲル、アルギネートゲル、ヒアルロン酸ゲル、アガロースゲル、ポロクサマー（ｐｏｌｏａｘｍｅｒ）ゲル、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６３】
ポリマーは、典型的に生体適合性である。ポリマーは、損傷組織と接触させたときにいかなる有害反応または副作用も引き起こさないならば、生体適合性である。
【００６４】
［粘度］
本発明の組成物は、好ましくは、上記に示したゲルである。本発明の組成物は、好ましくは、ヒドロゲルである。
【００６５】
ゲルは、室温で、約１０００〜約５００，０００マイクロパスカル−秒（ｍＰａ・ｓ）（センチポイズ；ｃｐｓとしても知られる）の範囲の粘度を有する。粘度は、ゲルが剪断応力または引張応力のいずれかによって変形される耐性の尺度である。粘度は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて測定することができる。適切な方法は、限定されないが、粘度計またはレオメータの使用を含む。
【００６６】
室温は、典型的に、約１８℃〜約２５℃、例えば、約１９℃〜約２４℃、または約２０℃〜約２３℃、または約２１℃〜約２２℃である。室温は、好ましくは、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃および２５℃のいずれかである。粘度は、最も好ましくは、２５℃で測定される。
【００６７】
ゲルは、好ましくは、室温で約１０００〜約５００，０００ｍＰａ・ｓの範囲、例えば、室温で約１５００〜約４５０，０００ｍＰａ・ｓ、室温で約２０００〜約４００，０００ｍＰａ・ｓ、室温で約２５００〜約３５０，０００ｍＰａ・ｓ、室温で約５０００〜約３００、０００ｍＰａ・ｓ、室温で約１０，０００〜約２５０，０００ｍＰａ・ｓ、室温で約５０，０００〜約２００，０００ｍＰａ・ｓ、または、室温で約５０，０００〜約１５０，０００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。
【００６８】
ゲルは、最も好ましくは、２５℃で約５０，０００〜約１５０，０００ｍＰａ・ｓ（ｃｐｓ）の範囲の粘度を有する。
【００６９】
［防腐剤］
本発明の組成物は、１つまたは複数の防腐剤をさらに含んでよい。適切な防腐剤は、当技術分野で知られている。適切な防腐剤は、限定されないが、メチルパラベン、プロピルパラベンおよびｍ−クレゾールを含む。
【００７０】
［浸透圧］
本発明の組成物は、好ましくは、１００〜５００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、例えば、１５０〜４５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、２００〜４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、または、２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲の浸透圧を有する。組成物は、好ましくは、２８０〜３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲の浸透圧を有する。
【００７１】
［ゼノフリー（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）］
本発明の組成物は、好ましくはゼノフリーである。ゼノフリー組成物は、動物由来成分を含まないが、ヒト由来成分を含んでよい。また、組成物は、動物由来成分およびヒト由来成分の両方を欠いていてもよい。
【００７２】
［治療的細胞］
組成物は、好ましくは、１つまたは複数の治療的細胞を含む。治療的細胞は、治療的効果を有することが可能な細胞である。治療的細胞は、典型的に、生細胞である。治療的細胞は、典型的に、損傷組織または老化組織を修復することが可能な細胞である。前記の１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは自己由来である。換言すれば、前記の１つまたは複数の細胞は、好ましくは、損傷組織を修復するため、老化を阻害するため、または、発毛を促進するために細胞が投与される、患者から採取される。あるいは、前記の１つまたは複数の細胞は、好ましくは同種異系である。換言すれば、細胞は、好ましくは、損傷組織を修復するため、老化を阻害するため、または、発毛を促進するために細胞が投与される、患者と免疫学的に適合する患者から採取される。前記の１つまたは複数の細胞は、半−同種異系であってよい。半−同種異系の集団は、典型的に、細胞が投与される患者と免疫学的に適合する２以上の患者から生産される。換言すれば、前記の１つまたは複数の細胞の全ては、好ましくは、それらが投与される患者と遺伝学的に同一であり、または、それらが投与される患者と細胞が免疫学的に適合するように十分に遺伝学的に同一である。
【００７３】
任意の数の細胞が、組成物内に存在してよい。組成物は、たった１つの細胞を含んでよい。
【００７４】
組成物は、典型的に、１よりも多い細胞、例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、少なくとも５００００、少なくとも１０００００、少なくとも５×１０５、少なくとも１×１０６、少なくとも２×１０６、少なくとも５×１０６、少なくとも１×１０７、少なくとも２×１０７、少なくとも５×１０７、少なくとも１×１０８または少なくとも２×１０８の細胞を含む。ある場合には、組成物は、少なくとも１．０×１０７、少なくとも１．０×１０８、少なくとも１．０×１０９、少なくとも１．０×１０１０、少なくとも１．０×１０１１または少なくとも１．０×１０１２の細胞、またはさらに多くの細胞を含んでよい。
【００７５】
１よりも多い細胞が組成物内に存在する場合、細胞の集団は、同種であってよい。換言すれば、集団内の全ての細胞は、同じタイプの細胞、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であってよい。あるいは、細胞の集団は、異種であってよい。換言すれば、細胞の集団は、異なるタイプの細胞、例えば、ＭＳＣおよび中胚葉性系列の前駆細胞（ＰＭＬ）を含んでよい。
【００７６】
前記の１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、１つまたは複数のＰＭＬである。ＰＭＬは、ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１６００（ＷＯ２０１３／００５０５３として公開）に開示される。そこに開示される任意の細胞を用いてよい。ＰＭＬは、検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１を発現するが、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。
【００７７】
ＰＭＬを有利に用いて、患者における損傷組織を修復し、老化を阻害し、または、発毛を促進し得る。ＰＭＬは、組織において抗−炎症性効果を効率的に発揮することが可能である。ＰＭＬの抗−炎症性効果は、損傷組織または老化組織内の隣接細胞の生存、修復および再生を促進する。また、細胞は、血管新生、走化性および抗−アポトーシス因子の分泌のような、パラクリン作用を発揮することも可能である。
【００７８】
以下により詳細に述べるように、ＰＭＬは、ヒト個体のような個体から得られる単核細胞（ＭＣ）、例えば末梢ＭＣから生産される。ＰＭＬはＭＣから生産されるので、それらは（例えば末梢血から）容易に生産され得て、処置される患者にとって自己由来であり得て、それにより、患者による免疫学的拒絶のリスクを回避する。
【００７９】
ＭＣの様々なサンプル（すなわち、血液の様々なサンプル）を得ることができるので、原理的には、単一の個体または患者から無制限の数のＰＭＬを生産することが可能である。非常に大きな数のＰＭＬを単一の個体または患者から生産することが、確実に可能である。本発明のＰＭＬは、したがって、大きな数で作ることができる。
【００８０】
ＰＭＬは、臨床関連の条件下で、例えば、微量のエンドトキシンおよび他の環境汚染物質ならびにウシ胎仔血清のような動物産物の不存在下で生産される。このことは、ＰＭＬを、患者への投与に特に適切にさせる。
【００８１】
ＰＭＬはＭＣから生産されるので、それらは実質的に同質であり、自己由来であり得る。またそれらは、ＭＳＣで頻繁に生じるドナー間の変動も避ける。ＰＭＬの非常に多くの集団は、化学療法または放射線療法のような任意の他の治療が始まる前に、患者から得られた単一のサンプルから生産することができる。したがって、ＰＭＬは、これらの治療の任意の有害な効果を回避することができる。
【００８２】
ＰＭＬは、迅速に作製することができる。ＰＭＬは、３０日未満、例えば約２２日で、ＭＣから生産することができる。
【００８３】
ＭＣからのＰＭＬの生産は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の使用と関連する道徳的および倫理的影響を回避する。
【００８４】
ＰＭＬは、典型的に、ヒトＭＣから生産される。したがって、ＰＭＬは、典型的にヒトである。あるいは、ＩＭＰ細胞は、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来のＭＣから生産され得る。
【００８５】
ＰＭＬは、系列限定マーカーの発現、構造的および機能的特徴を含む、当技術分野で知られている標準的な方法を用いて、中胚葉性系列の前駆細胞として同定することができる。ＰＭＬは、検出可能なレベルの、中胚葉性系列の前駆細胞の特徴であることが知られる細胞表面マーカーを発現する。特に、以下により詳細に述べられるマーカーに加えて、ＰＭＬは、α−平滑筋アクチン、Ｉ型コラーゲンα−鎖、ＧＡＴＡ６、Ｍｏｈａｗｋ、およびビメンチンを発現し得る（Ｓａｇｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１２  Ｍａｒ  ２０；２１（５）：８１４−２８）。
【００８６】
ＰＭＬは、分化アッセイをインビトロでうまく完了させて、それらが中胚葉性系列であることを確認することが可能である。そのようなアッセイは、限定されないが、脂肪生成分化アッセイ、骨分化アッセイおよび神経分化アッセイを含む（Ｚａｉｍ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１２  Ａｕｇ；９１（８）：１１７５−８６）。
【００８７】
ＰＭＬは、幹細胞ではない。具体的には、それらはＭＳＣではない。それらは最終分化している。それらは、インビトロで適切な条件下で、例えば軟骨または骨細胞へ分化させることができるが、インビボでは分化しない。ＰＭＬは、損傷組織においてパラクリンシグナリングを発揮することにより、それらの効果を有する。具体的には、ＰＭＬは、好ましくは、損傷組織において抗炎症性（ａｎｔｉ−ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）効果を誘導することが可能である。このことは以下により詳細に述べられる。
【００８８】
ＰＭＬは典型的に、紡錘形の形態により特徴付けられる。ＰＭＬは典型的に、線維芽細胞様であり、すなわちそれらは、長細い多少の細胞突起を有する小さな細胞体を有する。細胞は典型的に、約１０〜約２０μｍの直径である。
【００８９】
ＰＭＬは、それらのマーカー発現パターンを介して他の細胞から区別される。ＰＭＬは、検出可能なレベルの、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１を発現する。ＰＭＬは、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１の１つまたは複数、例えば全てを過剰発現し得る。ＰＭＬは、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１の１つまたは複数を、それらが他のＰＭＬおよび／またはＭＳＣよりも多く発現する場合に過剰発現する。ＰＭＬは、検出可能なレベルの、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。ＰＭＬは、好ましくは、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）および／またはＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）を発現する。
【００９０】
当該分野で知られている標準的な方法を用いて、上記（および以下）に述べる様々なマーカーの、検出可能な発現、低い発現、またはその欠如を判定し得る。適切な方法は、限定されないが、免疫細胞化学、免疫測定法、フローサイトメトリー、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。適切な免疫測定法は、限定されないが、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫吸着スポット分析（ＥＬＩＳＰＯＴ分析）、競合的酵素免疫分析法、放射性アレルゲン吸着（ＲＡＳＴ）試験、ラジオイムノアッセイ、ラジオバインディングアッセイおよび免疫蛍光を含む。ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡおよびＲＴ−ＰＣＲは、全て定量的なので、存在するならば様々なマーカーの発現のレベルを測定するために用いることができる。ＦＡＣＳの使用が好ましい。本明細書において述べられる様々なマーカーの全てに関する抗体および蛍光標識抗体は市販される。
【００９１】
１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、ＵＫ出願ＧＢ  １４１０５０４．３に開示される１つまたは複数の免疫調節前駆（ＩＭＰ）細胞である。ＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルの、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＣＤ３０４（ニューロピリン１）、ＣＤ１７８（ＦＡＳリガンド）、ＣＤ２８９（Ｔｏｌｌ様受容体９）、ＣＤ３６３（スフィンゴシン−１−リン酸受容体１）、ＣＤ９９、ＣＤ１８１（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ１；ＣＸＣＲ１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、ＣＸＣＲ２およびＣＤ１２６を発現する。
【００９２】
ＩＭＰ細胞は、患者における、損傷組織を修復するため、老化を阻害するため、または、発毛を促進するために、有利に用いられ得る。ＩＭＰ細胞は、組織において、抗−炎症性効果を発揮することが可能である。ＩＭＰ細胞の抗−炎症性効果は、損傷組織または老化組織における隣接細胞の、生存、修復および再生を促進する。また、細胞は、血管新生、走化性および抗−アポトーシス因子の分泌のような、パラクリン作用を発揮することも可能である。
【００９３】
ＩＭＰ細胞は、典型的に、ヒトＭＣから生産される。本発明のＩＭＰ細胞は、したがって、典型的にヒトである。あるいは、ＩＭＰ細胞は、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来のＭＣから生産され得る。
【００９４】
また、ＩＭＰ細胞は、ヒト個体または患者のような個体または患者から得られる、末梢ＭＣのようなＭＣからも生産される。それ故に、それらは、上述したＰＭＬと同一の利点を有する。ＩＭＰ細胞は、分化アッセイをインビトロでうまく完了して、それらが中胚葉性系列であることを確認することが可能である。そのようなアッセイは、限定されないが、脂肪生成分化アッセイ、骨分化アッセイ、および、神経分化アッセイを含む（Ｚａｉｍ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１２  Ａｕｇ；９１（８）：１１７５−８６）。
【００９５】
ＩＭＰ細胞は、幹細胞ではない。具体的には、それらはＭＳＣではない。それらは最終分化されている。それらは、インビトロで適切な条件下で、例えば軟骨または骨細胞へ分化させることができるが、典型的に、インビボでは分化しない。本発明のＩＭＰ細胞は、損傷組織においてパラクリンシグナリングを発揮することにより、それらの効果を有する。具体的には、ＩＭＰ細胞は、好ましくは、損傷組織において抗−炎症性効果を誘導することが可能である。このことは以下により詳細に述べられる。
【００９６】
ＩＭＰ細胞は典型的に、紡錘形の形態により特徴付けられる。ＩＭＰ細胞は典型的に、線維芽細胞様であり、すなわちそれらは、長細い多少の細胞突起を有する小さな細胞体を有する。細胞は典型的に、約１０〜約２０μｍの直径である。
【００９７】
本発明のＩＭＰ細胞は、それらのマーカー発現パターンを介して、ＭＳＣを含む公知の細胞から区別される。ＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルの、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＣＤ３０４（ニューロピリン１）、ＣＤ１７８（ＦＡＳリガンド）、ＣＤ２８９（Ｔｏｌｌ様受容体９）、ＣＤ３６３（スフィンゴシン−１−リン酸受容体１）、ＣＤ９９、ＣＤ１８１（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ１；ＣＸＣＲ１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、ＣＸＣＲ２およびＣＤ１２６を発現する。ＩＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＳＣと比較して増加した量のこれらのマーカーを発現する。これは、同一の条件下で同一の技術を用いて、本発明のＩＭＰでのマーカーの発現レベル／量を、ＭＳＣでの発現レベル／量と比較することにより判定することができる。適切なＭＳＣは市販されている。比較に用いるＭＳＣは、好ましくは、ヒトＭＳＣである。ヒトＭＳＣは、Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ（登録商標）Ｌｔｄ、Ｏｓｉｒｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（登録商標）Ｉｎｃ．またはＬｏｎｚａ（登録商標）から市販される。ヒトＭＳＣは、好ましくはＬｏｎｚａ（登録商標）から得られる。そのような細胞を実施例で比較に用いた。ＭＳＣは、上記に述べた動物または哺乳類のいずれかから得てよい。
【００９８】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＳＣと比較して増加した量の、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＣＤ３０４（ニューロピリン１）、ＣＤ１７８（ＦＡＳリガンド）、ＣＤ２８９（Ｔｏｌｌ様受容体９）、ＣＤ３６３（スフィンゴシン−１−リン酸受容体１）、ＣＤ９９、ＣＤ１８１（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ１；ＣＸＣＲ１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、ＣＸＣＲ２およびＣＤ１２６の１つまたは複数を発現する。ＩＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＳＣと比較して、増加した量の１０個のマーカー全てを発現する
【００９９】
上記に開示した任意の方法を用いて、これらのマーカーの検出可能な発現または増加した発現を判定してよい。本明細書に開示される任意のマーカーの発現または増加した発現は、好ましくは、ハイスループットＦＡＣＳ（ＨＴ−ＦＡＣＳ）を用いてなされる。
【０１００】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＩＣ  Ａ／Ｂに関して少なくとも３３０、例えば少なくとも３５０または少なくとも４００の抗体平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＤ３０４（ニューロピリン１）に関して少なくとも２１０、例えば少なくとも２５０または少なくとも３００のＭＦＩ、ＣＤ１７８（ＦＡＳリガンド）に関して少なくとも２２１、例えば少なくとも２５０または少なくとも３００のＭＦＩ、ＣＤ２８９（Ｔｏｌｌ様受容体９）に関して少なくとも１８６、例えば少なくとも２００または少なくとも２５０のＭＦＩ、ＣＤ３６３（スフィンゴシン−１−リン酸受容体１）に関して少なくとも１８１、例えば少なくとも２００または少なくとも２５０のＭＦＩ、ＣＤ９９に関して少なくとも１８４、例えば少なくとも２００または少なくとも２５０のＭＦＩ、ＣＤ１８１（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ１；ＣＸＣＲ１）に関して少なくとも３００、例えば少なくとも３５０または少なくとも４００のＭＦＩ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）に関して少なくとも１７３、例えば少なくとも２００または少なくとも２５０のＭＦＩ、ＣＸＣＲ２に関して少なくとも２３６、例えば少なくとも２５０または少なくとも３００のＭＦＩ、および、ＣＤ１２６に関して少なくとも１６０、例えば少なくとも２００または少なくとも２５０のＭＦＩを示す。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、平方メートルあたりのワットで測定される、強度、時間平均エネルギー束の測定単位である。それはＳＩ単位である。各マーカーに関するＭＦＩは、典型的に、ＨＴ−ＦＡＣＳを用いて測定される。各マーカーに関するＭＦＩは、好ましくは、本出願と同時に出願されるＵＫ出願ＧＢ  １４１０５０４．３の実施例に記載のようにＨＴ−ＦＡＣＳを用いて測定される。
【０１０１】
上記に規定される１０個のマーカーに加えて、ＩＭＰ細胞は、典型的に、検出可能なレベルの、ＧＢ  １４１０５０４．３の表１に示される他のマーカーの１つまたは複数を発現する。ＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらのマーカーを発現し得る。
【０１０２】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、ＣＤ２６７、ＣＤ４７、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１４６、ＣＤ３４０、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ５８、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ９０、ＣＤ９８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１およびＣＤ２７６の１つまたは複数を発現する。ＩＭＰ細胞は、より好ましくは、検出可能なレベルの、ＣＤ１０、ＣＤ１１１、ＣＤ２６７、ＣＤ４７、ＣＤ２７３、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１４６、ＣＤ５５、ＣＤ３４０、ＣＤ９１、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ８２、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ６３、ＣＤ２４５、ＣＤ５８、ＣＤ１０８、Ｂ２−ミクログロブリン、ＣＤ１５５、ＣＤ２９８、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２３０、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ９０、ＣＤ９８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１およびＣＤ２７６の１つまたは複数を発現する。ＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルのこれらのマーカーの任意の数および組み合わせを発現し得る。ＩＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのこれらのマーカーの全てを発現する。
【０１０３】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ１３０、ＣＤ１４８、ＣＤ２８８、ＣＤ３３７、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ３４９およびＣＤ１４０ｂの１つまたは複数を発現する。ＩＭＰ細胞は、より好ましくは、検出可能なレベルの、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ１３０、ＣＤ１４８、ＣＤ２８８、ＣＤ３３７、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ３４９、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０、ＣＤ１１１、ＣＤ２６７、ＣＤ４７、ＣＤ２７３、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１４６、ＣＤ５５、ＣＤ３４０、ＣＤ９１、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ８２、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ６３、ＣＤ２４５、ＣＤ５８、ＣＤ１０８、Ｂ２−ミクログロブリン、ＣＤ１５５、ＣＤ２９８、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２３０、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ９０、ＣＤ９８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１およびＣＤ２７６の１つまたは複数を発現する。ＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルのこれらのマーカーの任意の数および組み合わせを発現し得る。ＩＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのこれらのマーカーの全てを発現する。
【０１０４】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、ＣＤ７２、ＣＤ１３３、ＣＤ１９２、ＣＤ２０７、ＣＤ１４４、ＣＤ４１ｂ、ＦＭＣ７、ＣＤ７５、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ２８２、ＣＤ１００、ＣＤ９４、ＣＤ３９、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ４０、ＣＤ３５、ＣＤ１５、ＰＡＣ−１、ＣＬＩＰ、ＣＤ４８、ＣＤ２７８、ＣＤ５、ＣＤ１０３、ＣＤ２０９、ＣＤ３、ＣＤ１９７、ＨＬＡ−ＤＭ、ＣＤ２０、ＣＤ７４、ＣＤ８７、ＣＤ１２９、ＣＤｗ３２９、ＣＤ５７、ＣＤ１６３、ＴＰＢＧ、ＣＤ２０６、ＣＤ２４３（ＢＤ）、ＣＤ１９、ＣＤ８、ＣＤ５２、ＣＤ１８４、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１３８、ＣＤ７、ＣＤ５０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１５８ｅ２、ＣＤ６４、ＤＣＩＲ、ＣＤ４５、ＣＬＡ、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ３４、ＣＤ１０１、ＣＤ２、ＣＤ４１ａ、ＣＤ６９、ＣＤ１３６、ＣＤ６２Ｐ、ＴＣＲαβ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１ａ、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１５４、ＣＤ７０、ＣＤｗ２１８ａ、ＣＤ１３７、ＣＤ４３、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３６、ＣＤ１５０、ＣＤ６６、ＣＤ２１２、ＣＤ１７７、ＣＤ１４２、ＣＤ１６７、ＣＤ３５２、ＣＤ４２ａ、ＣＤ３３６、ＣＤ２４４、ＣＤ２３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２２９、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤＨ６、ＣＤ２８、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ３３５、ＣＤ１３１、ＣＤ３２、ＣＤ１５７、ＣＤ１６５、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ３３２、ＣＤ１８０、ＣＤ６５およびＣＤ２４の１つまたは複数を発現する。ＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルのこれらのマーカーの任意の数および組み合わせを発現し得る。ＩＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのこれらのマーカーの全てを発現する。
【０１０５】
前記の１つまたは複数のＩＭＰ細胞は、ＧＢ  １４１０５０４．３に開示される任意の集団の一部であってよい。
【０１０６】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、患者における特定の損傷組織に付着することが可能である。付着および接着アッセイは、当該分野で知られている（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；５２２：２０３−１０）。
【０１０７】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、患者における特定の損傷組織において、増殖することが可能である。細胞増殖アッセイは、当該分野でよく知られている。そのようなアッセイは、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）から市販されている。
【０１０８】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、患者における特定の損傷組織において、血管新生を促進することが可能である。血管新生アッセイは、当該分野で知られている（Ａｕｅｒｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｊａｎ；４９（１）：３２−４０）。
【０１０９】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、患者の損傷組織において、抗−炎症性効果を有することが可能である。また、本発明のＩＭＰ細胞が抗−炎症性効果を有する能力は、当該分野で知られている標準的なアッセイを用いて測定してもよい。適切な方法は、限定されないが、サイトカインの分泌に関する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、増強された混合白血球反応、および、共刺激分子および成熟マーカーの上方制御（フローサイトメトリーにより測定される）を含む。測定されるサイトカインは、典型的に、インターロイキン、例えばインターロイキン−８（ＩＬ−８）、セレクチン、接着分子、例えば細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、および化学誘引物質タンパク質、例えば単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）である。これらのサイトカインに関するアッセイは市販されている。抗−炎症性因子は、好ましくは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて検出および測定される。そのようなアッセイは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）から市販される。
【０１１０】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０；インターフェロンγ−誘導タンパク質１０；ＩＰ−１０）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２；単球走化性タンパク質−１；ＭＣＰ−１）およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５；ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ；ＲＡＮＴＥＳ）の１つまたは複数を分泌する。ＩＭＰ細胞は、これらの因子の任意の数および組み合わせを分泌し得る。ＩＭＰ細胞は、好ましくは、これらの因子の全てを分泌する。
【０１１１】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＳＣと比較して増加した量の、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳの１つまたは複数を分泌する。ＩＭＰ細胞は、増加した量のこれらの因子の任意の数および組み合わせを分泌し得る。ＩＭＰ細胞は、好ましくは、増加した量のこれらのマーカーの全てを分泌する。
【０１１２】
ＩＭＰ細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞ＭＳＣと比較して減少した量の、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）および／またはＩＬ−１２を分泌する。ＩＬ−１０およびＩＬ−１２は、炎症促進性サイトカインである。
【０１１３】
ＩＭＰ細胞は、上述のものに加えて、様々な異なる他のマーカーを発現する。これらの一部は、ＩＭＰ細胞が、損傷組織において抗−炎症性効果を有するそれらの能力を助ける。本発明の任意のＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルの、（ｉ）インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、（ｉｉ）ＩＧＦ−１受容体；（ｉｉｉ）Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＣＲ１）、（ｉｖ）ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、（ｖ）低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、（ｖｉ）Ａｋｔ１および（ｖｉｉ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および／または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の１つまたは複数をさらに発現し得る。
【０１１４】
ＩＧＦ‐１受容体は、ＩＧＦ−１勾配に向かう遊走能力を促進する。ＩＧＦ−１が遊走を増大させるメカニズムの１つは、細胞の表面上のＣＸＣＲ４の上方制御によるものであり、ＳＤＦ−１シグナリングに対してそれらをより感受性にさせる。
【０１１５】
ＣＣＲ１は、ＣＣＬ７（以前はＭＣＰ３として知られる）の受容体であり、ＭＳＣのホーミングおよび生着能力を高め（したがって、本発明のＩＭＰ細胞に関する同一の効果を有することが期待される）、および、パラクリンシグナリングを介して、負傷した心筋において毛管密度を増大させることができる。
【０１１６】
ＨＩＦ−１αは、酸素送達を増大させかつ適応性の生存促進性の応答を促進するパスウェイを活性化する。多くのＨＩＦ−１αの標的遺伝子の中には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、エンドセリンおよびＶＥＧＦ（その受容体Ｆｌｋ−１を有する）がある。ＨＩＦ−１αを発現する、または増加した量のＨＩＦ−１αを発現するＩＭＰ細胞は、より治療的なサブタイプを促進し得る様々な血管原性の増殖因子などのパラクリン刺激の発現が上方制御される。以下により詳細に記載するように、本発明のＩＭＰ細胞は、低酸素（２０％未満の酸素）、例えば、約２％または約０％の酸素の条件下でそれらを培養することにより、より治療的なサブタイプへ前もって調整することができる。
【０１１７】
Ａｋｔ１は、グルコース代謝、細胞増殖、アポトーシス、転写および細胞遊走などの複数の細胞のプロセスにおいて重要な役割を果たす、細胞内セリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。Ａｋｔ１の過剰発現は、ラットＭＳＣがアポトーシスを受けるのを防ぐことが示されていて、本発明のＩＭＰ細胞において同一の効果を有するであろう。アポトーシスからの保護は、ＩＭＰ細胞の治療効果を高める。
【０１１８】
ＭＳＣによるＨＧＦの過剰発現は、血管新生およびカルシニューリンが仲介するパスウェイを介したアポトーシスの阻害により、虚血後の心不全を防ぐことが示されている。ＨＧＦおよびＧ−ＣＳＦは、この点について相乗効果を示す。また、ＨＧＦおよびその受容体ｃ−ｍｅｔが高発現であるＭＳＣは、損傷組織への遊走能力も高い（ホルモンのパラクリンおよびオートクリンシグナリングを介して達成される）。ＨＧＦおよび／またはＧ−ＣＳＦを発現している本発明のＩＭＰ細胞についても同様である。
【０１１９】
ＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルの、上記に定義した（ｉ）〜（ｖｉｉ）の１または複数を発現し得る。本発明のＩＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＳＣと比較して増加した量の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の１または複数を発現する。細胞マーカーに関する定量分析は上述される。これらのマーカーの検出可能な発現およびそれらの発現レベルは、上述のように測定し得る。
【０１２０】
任意のＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルの、（ｉ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、（ｉｉ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、（ｉｉｉ）インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、（ｉｖ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、（ｖ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、（ｖｉ）インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および（ｖｉｉ）インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）の１つまたは複数を発現し得る。ＶＥＧＦを過剰発現している細胞由来の馴化培地は、ハムスターモデルにおいて心不全を緩和することが示されている。それ故に、ＶＥＧＦを発現する、または増加した量のＶＥＧＦを発現する本発明のＩＭＰ細胞は、損傷した心臓の組織の同一効果を有する。
【０１２１】
ＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルの（ｉ）〜（ｖｉｉ）の１つまたは複数を発現し得る。ＩＭＰ細胞は、ＭＳＣと比較して増加した量の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の１つまたは複数を発現し得る。細胞マーカーに関する定量分析は上述される。これらのマーカーの検出可能な発現およびそれらの発現レベルは、上述のように測定し得る。
【０１２２】
上記に示した（ｉ）〜（ｖｉｉ）の定義の両方のセットにおいて、（ｉ）〜（ｖｉｉ）の１つまたは複数の任意の組み合わせが発現され得て、または、増加した量で発現され得る。例えば、（ｉ）〜（ｖｉｉ）の各定義に関して、ＩＭＰ細胞は、検出可能なレベルの、または、増加した量の、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｖ）；（ｖｉ）；（ｖｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）および（ｖ）；（ｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｖ）および（ｖｉ）；（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ、）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）およびｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）およびｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）を、発現し得る。（ｉ）〜（ｖｉｉ）のそれぞれの定義の組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
【０１２３】
上述の任意のマーカーに加えて、ＩＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、ＬＩＦおよび／またはＰＤＧＦ受容体も発現する。本発明のＩＭＰ細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞と比較して増加した量の、ＬＩＦおよび／またはＰＤＧＦ受容体を発現する。ＰＤＧＦ受容体は、好ましくは、ＰＤＧＦ−Ａ受容体および／またはＰＤＧＦ−Ｂ受容体である。これらの受容体が高発現であるＭＳＣは、血小板が活性化されている領域、例えば創傷および血栓性血管へ、効率的に遊走することができる。当該受容体を発現または増加した量で発現しているＩＭＰ細胞についても同様である。
【０１２４】
ＰＭＬおよび／またはＩＭＰ細胞は、好ましくは自己由来である。換言すれば、細胞は、好ましくは、細胞が投与される患者から採取される。あるいは、ＰＭＬおよび／またはＩＭＰ細胞は、好ましくは同種異系である。換言すれば、細胞は、好ましくは、細胞が投与される患者と免疫学的に適合する患者から採取される。
【０１２５】
ＰＭＬおよび／またはＩＭＰ細胞は、抗体に基づく技術を含む様々な技術を用いて単離され得る。細胞は、ＰＭＬおよび／またはＩＭＰ細胞上に存在するこれらの表面マーカー（上記参照）に対するモノクローナル抗体の結合に基づくネガティブおよびポジティブ選択技術を用いて単離され得る。それ故に、ＰＭＬおよび／またはＩＭＰ細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）および磁気ビーズ分離を含む、任意の抗体に基づく技術を用いて分離され得る。
【０１２６】
以下に述べるように、ＰＭＬおよび／またはＩＭＰ細胞は、エクスビボで処置され得る。したがって、細胞は、治療薬または診断薬がロードまたはトランスフェクトされ得て、その結果、本発明の方法において治療的に用いられる。
【０１２７】
前記の１つまたは複数のＰＭＬおよび／またはＩＭＰ細胞は、任意の公知の方法を用いて生産され得る。前記の１つまたは複数のＰＭＬは、好ましくは、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１６００（ＷＯ２０１３／００５０５３として公開）に記載の方法を用いて生産される。前記の１つまたは複数のＩＭＰ細胞は、好ましくは、ＧＢ  １４１０５０４．３に開示の方法を用いて生産される。
【０１２８】
これは典型的に、ＭＣがＰＭＬまたはＩＭＰ細胞へ分化するのを誘導する条件下でＭＣを培養するステップ、およびそれから、上述のマーカーを発現するＰＭＬまたはＩＭＰ細胞を採取および培養するステップを含む。
【０１２９】
単核細胞（ＭＣ）およびそれらを単離する方法は、当該分野で知られている。ＭＣは、骨髄から単離される初期の（ｐｒｉｍａｒｙ）ＭＣであってよい。ＭＣは、好ましくは末梢血ＭＣ（ＰＢＭＣ）、例えば、リンパ球、単球および／またはマクロファージである。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）などの親水性多糖類を用いて、血液から単離することができる。例えば、ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）（市販の密度培地）を用いて血液から単離され得る。
【０１３０】
培養する前に、ＭＣを、間葉系幹細胞エンリッチメントカクテルに曝してよい。カクテルは、好ましくは、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ６６ｂ（不要な細胞上に存在する）を認識する抗体および赤血球の成分を含む。そのようなカクテルは、不要な細胞を赤血球と架橋させてイムノロゼット（ｉｍｍｕｎｏｒｏｓｅｔｔｅ）を形成し、それは必要なＭＣから除去され得る。好ましいカクテルはＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）である。
【０１３１】
ＭＣが間葉系細胞（主に中胚葉に由来する組織）へ分化するのを誘導する適切な条件は、当該分野で知られている。例えば、適切な条件は、Ｃａｐｅｌｌｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｌｙｓａｔｅ  ａｌｌｏｗｓ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｓｍａｌｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｓｐｉｒａｔｅｓ  ｏｒ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｉｌｔｅｒ  ｗａｓｈｏｕｔｓ．Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００７．４０：ｐ．７８５−７９１）に開示される。これらの条件を用いて、本発明に従ってＭＣがＰＭＬ分化するのを誘導してもよい。
【０１３２】
当該方法は、好ましくは、ＭＣを血漿溶解物とともに培養して、ＭＣがＰＭＬまたはＩＭＰ細胞へ分化するのを誘導するステップを含む。血小板溶解物とは、血小板に含まれる天然の増殖因子の組み合わせ（これらの血小板の溶解により放出されたもの）をいう。溶解は、化学的手段（すなわちＣａＣｌ２）、浸透圧的手段（蒸留Ｈ２Ｏの使用）を介して、または、凍結／融解の手順を介して、達成することができる。血小板溶解物は、米国特許第５，１９８，３５７号に記載のとおりに、全血から得ることができる。血小板溶解物は、好ましくは、ＰＣＴ／ＧＢ１２／０５２９１１（ＷＯ２０１３／０７６５０７として公開）に記載のとおりに調製される。血漿溶解物は、好ましくはヒト血漿溶解物である。
【０１３３】
例えば、ＭＣは、血小板溶解物を含む培地中で、ＭＣがＰＭＬまたはＩＭＰ細胞へ分化するのを誘導するのに十分な時間、培養され得る。十分な時間は典型的に、約１５〜約２５日、好ましくは約２２日である。培地は、好ましくは、約２０体積％またはそれ未満の血小板溶解物、例えば約１５体積％またはそれ未満、または約１０体積％またはそれ未満を含む。培地は、好ましくは、約５体積％〜約２０体積％の血小板溶解物、例えば約１０体積％〜約１５体積％を含む。培地は、好ましくは、約１０体積％の血小板溶解物を含む。
【０１３４】
あるいは、ＭＣは、間葉性エンリッチメントカクテルに曝され、それから、ＭＣがＰＭＬまたはＩＭＰ細胞へ分化するのを誘導するのに十分な時間、血小板溶解物を含む培地中で培養され得る。十分な時間は、典型的に、約１５〜約２５日、好ましくは約２２日である。
【０１３５】
培地は、好ましくは最小必須培地（ＭＥＭ）である。ＭＥＭは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを含む様々な供給源から市販される。培地は、好ましくは、ヘパリン、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／Ｓ）の１つまたは複数をさらに含む。Ｌ−グルタミンは、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販される）と置き換えてよい。
【０１３６】
ＭＣは、典型的に、ＰＭＬまたはＩＭＰ細胞が付着するのを可能にする条件下で培養される。適切な条件は、上記により詳細に述べられている。
【０１３７】
ＭＣは、好ましくは、低酸素条件下で培養される。ＭＣは、好ましくは、約２０％未満の酸素（Ｏ２）、例えば約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の酸素（Ｏ２）において培養される。ＭＣは、好ましくは、約０％〜約１９％のＯ２、例えば約１％〜約１５％のＯ２、約２％〜約１０％のＯ２、または約５％〜約８％のＯ２において培養される。ＭＣは、最も好ましくは、約０％のＯ２において培養される。上記で見積もられた酸素の％（またはＯ２の％）に関する数字は、例えば細胞インキュベーターにより、培養中に細胞に供給されるガス中の酸素の体積％に関連する。一部の酸素は、インキュベーター内に漏れ得て、または、ドアーが開いているときに入り得ることが可能である。
【０１３８】
ＭＣは、最も好ましくは、血小板溶解物の存在下および低酸素条件下で培養される。この組み合わせは、損傷組織内の自然な条件を模倣するので、より健康的かつより治療的に強力な細胞をもたらす。従来の細胞培養は、２０％または２１％酸素（およそ大気の含有量）で行われるが、ヒト体内に、この酸素レベルを有する場所はない。肺内の上皮細胞は、この酸素レベルを「見る」が、酸素が溶解して肺を去る時点で、１７％付近に減少する。それから、組織の大部分でさらにいっそう約１〜２％まで減少するが、関節内の軟骨のような無血管組織では０．１％という低さになる。
【０１３９】
また、１つまたは複数のＰＭＬまたはＩＭＰ細胞を生産するステップは、上述の必須マーカー発現パターンを有するＰＭＬまたはＩＭＰ細胞を採取および培養するステップも含む。必須マーカー発現パターンを有するＰＭＬまたはＩＭＰ細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）および磁気ビーズ分離を含む任意の抗体に基づく技術を用いて採取してよい。ＦＡＣＳが好ましい。
【０１４０】
上述から明らかなように、１つまたは複数のＰＭＬまたはＩＭＰ細胞の生産は、臨床関連の条件、すなわち、微量のエンドトキシンおよび他の環境汚染物質、例えば、リポ多糖、リポペプチドおよびペプチドグリカンなどの不存在下で行なわれる。このことは、ＰＭＬまたはＩＭＰ細胞を、患者への投与に特に適切にさせる。
【０１４１】
ＭＣは、好ましくは、患者または同種異系ドナーから得られる。
【０１４２】
前記の１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、１つまたは複数の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。適切なＭＳＣは、当該分野で知られている。上記に開示の任意のＭＳＣを用いてよい。
【０１４３】
前記の１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、１つまたは複数の間葉前駆細胞（ＭＰＣ）である。前記の１つまたは複数の治療的細胞は、より好ましくは、１つまたは複数のヒトＭＰＣである。
【０１４４】
前記の１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、１つまたは複数の樹状細胞である。
【０１４５】
前記の１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、１つまたは複数の血小板である。
【０１４６】
前記の１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、１つまたは複数の線維芽細胞である。
【０１４７】
前記の１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、１つまたは複数の筋線維芽細胞である。
【０１４８】
前記の１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくはヒトである。前記の１つまたは複数の治療的細胞は、ＰＭＬおよびＩＭＰ細胞の由来に関して上述した任意の動物または哺乳類から採取してよい。
【０１４９】
前記の１つまたは複数の治療的細胞は、典型的に、組成物中の他の成分と組み合わせられる前に、インビトロで培養される。細胞を培養する技術は、当業者によく知られている。細胞は、血清を含まない培地中、３７℃、５％ＣＯ２の標準的な条件下で培養され得る。細胞は、好ましくは、以下により詳細に述べる低酸素条件下で培養される。細胞は、標準的な６ウェルプレートのような平板のウェルを含む任意の適切なフラスコまたは容器内で培養してよい。そのようなプレートは、Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶＷＲ  ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ、Ｎｕｎｃ、ＳｔａｒｓｔｅｄｔまたはＦａｌｃｏｎから市販される。ウェルは典型的に、約１ｍｌ〜約４ｍｌの容量を有する。
【０１５０】
フラスコ、容器またはウェル（その中に集団が含まれ、または培養される）は、細胞のハンドリングを促進するように改変され得る。例えば、フラスコ、容器またはウェルは、細胞の培養を促進するように、例えば、増殖マトリックスを含むことによって改変され得る。フラスコ、容器またはウェルは、細胞の付着を可能にするように、または表面上への細胞の固定化を可能にするように、改変され得る。１つまたは複数の表面は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、ラミニンまたはコラーゲン、または、細胞に結合してそれらを表面（単数または複数）上に固定化または補足する任意の他の捕捉分子によりコーティングされ得る。
【０１５１】
細胞は、本明細書に記載の任意の技術を用いて、エクスビボで改変され得る。例えば、集団は、治療薬または診断薬がトランスフェクトまたはロードされ得る。それから集団は、以下により詳細に述べる治療方法において用いられ得る。
【０１５２】
［薬物、方法および治療的用途］
本発明の組成物は、ヒトまたは動物の体の治療の方法で用いられ得る。したがって、本発明は、患者における損傷組織を修復する方法での使用のための、本発明の組成物を提供し、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む。
【０１５３】
また、本発明は、それを必要とする患者における老化を阻害する方法での使用のための、本発明の組成物も提供し、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む。老化は、細胞およびこれらの細胞を含む生物の機能の徐々な悪化である。本発明は、したがって、患者における老化を阻害するステップに関し得る。本発明は、したがって、患者の１つまたは複数の組織における老化を阻害するステップに関し得る。前記の１つまたは複数の組織は、以下に述べられるもののいずれかであってよい。本発明の組成物は、典型的に、インビトロで細胞集団のヘイフリック限界を増大させる。ヘイフリック限界は、細胞分裂が止まるまでに正常の細胞集団（典型的に、正常のヒト細胞集団）が分裂する回数であり、Ｓｈａｙ  ａｎｄＷｒｉｇｈｔ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００  Ｏｃｔ；１（１）：７２−６に述べられている。また、本発明は、加齢の阻害にも関する。
【０１５４】
本発明は、患者における発毛を促進する方法での使用のための、本発明の組成物をさらに提供し、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む。
【０１５５】
また、本発明は、治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップ、およびそれにより、患者における損傷組織を治療するステップ、を含む、患者における損傷組織を修復する方法も提供する。損傷組織は、好ましくは負傷または疾患によって損傷されている。加えて、本発明は、治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップ、およびそれにより、患者における老化を阻害するステップ、を含む、患者における老化を阻害する方法を提供する。また、本発明は、治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者における発毛を促進する方法も提供する。
【０１５６】
損傷組織または老化組織は、好ましくは、中胚葉由来である。損傷組織または老化組織は、より好ましくは、腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織である。当該方法は、したがって、患者における、腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織の疾患または負傷を治療するために用いられ得る。また、当該方法は、患者における、腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織の老化を阻害するためにも用いられ得る。
【０１５７】
加えて、当該方法は、膣萎縮を治療するためのものであってよい。膣萎縮（萎縮性腟炎または泌尿生殖器萎縮としても知られる）は、組織のスリム化および縮小、ならびに、潤滑低減に起因する、膣（および、外側尿路）の炎症である。それは典型的に、ホルモンエストロゲンの分泌の低下によって引き起こされる。
【０１５８】
心臓の負傷、疾患、または老化は、好ましくは、心筋梗塞（ＭＩ）、左室肥大、右室肥大、塞栓、心不全、先天性心臓欠損、心臓弁膜症、不整脈および心筋炎から選択される。
【０１５９】
ＭＩは、心筋によって放出されるＶＥＧＦおよびＥＰＯのレベルを増大させる。さらに、ＭＩは、炎症性反応と関連し、梗塞組織は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、インターロイキン（ＩＬ‐６）およびＫＣ／Ｇｒｏ‐αも放出する。ＣＣＬ７（以前はＭＣＰ３として知られる）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２は、心筋梗塞（ＭＩ）の後に心臓内で著しく上方制御され、梗塞心筋へのＭＳＣのホーミングおよび生着の制御に関与し得る。
【０１６０】
心筋梗塞マウスモデルでは、ＩＬ‐８は、まず、ＭＩ後の最初の２日に遺伝子発現を高度に上方制御することが示された。驚くべきことに、ＩＬ‐８発現の増加は、主に、梗塞領域および境界域で生じ、残りの心筋ではよりいっそう低い程度であった。ＣＸＣＲ２を活性化することにより、ＭＩＦは、ケモカイン様の機能を示し、炎症性細胞動員およびアテローム発生の主なレギュレーターとして作用する。
【０１６１】
骨の疾患または負傷は、好ましくは、骨折、Ｓａｌｔｅｒ−Ｈａｒｒｉｓ骨折、若木骨折、骨棘、頭蓋骨癒合症、コフィン−ローリー症候群、進行性骨化線維異形成症、線維性骨異形成症、Ｆｏｎｇ疾患（または爪膝蓋骨症候群）、低ホスファターゼ症、クリッペル・ファイル症候群、代謝性骨疾患、爪膝蓋骨症候群、変形性関節症、変形性骨炎（または骨パジェット病）、嚢胞性線維性骨炎（または線維性骨炎またはフォンレックリングハウゼン骨病）、恥骨骨炎、硬化性骨炎（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ  ｏｓｔｅｉｔｉｓ）（または硬化性骨炎（ｏｓｔｅｉｔｉｓ  ｃｏｎｄｅｎｓａｎｓ））、硬化性腸骨炎、離断性骨軟骨炎、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨減少症、大理石骨病、骨粗鬆症、骨壊死、骨萎縮性骨化過剰症、原発性副甲状腺機能亢進症、腎性骨ジストロフィー、骨癌、転移性癌と関連する骨病変、Ｇｏｒｈａｍ  Ｓｔｏｕｔ疾患、原発性副甲状腺機能亢進症、歯周病、および、関節置換の無菌弛緩から選択される。骨癌は、ユーイング肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫（骨の巨大な腫瘍）、骨軟骨腫または破骨細胞腫であってよい。骨病変をもたらす転移性癌は、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌および／または成人Ｔ細胞白血病であってよい。
【０１６２】
本発明の方法に係る本発明の組成物の投与は、好ましくは、改善された組織再生をもたらす。さらに、本発明の方法に係る本発明の組成物の投与は、好ましくは、アポトーシスの低減をもたらす。
【０１６３】
本発明は、治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップに関する。治療的有効量は、損傷組織または老化組織の症状の１つまたは複数を改善する、または、発毛を促進する量である。治療的有効量は、好ましくは、損傷組織または老化組織を修復する、または発毛をもたらす量である。
【０１６４】
本発明の組成物は、任意の適切な患者に投与され得る。患者は、一般に、ヒトである。患者は、任意の哺乳類であってよい。そのような哺乳類は、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物、マウスまたはラットのような実験動物、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペットを含む。
【０１６５】
患者は、幼児、子どもまたは成人であってよい。患者は、損傷組織または老化組織を有することが知られていてよく、または、損傷組織または老化組織を有する疑いがある。患者は、関連のある疾患、負傷または老化を起こしやすく、またはそのリスクがあってよい。例えば、患者は、遺伝学的に心不全に罹りやすくてよい。
【０１６６】
本発明は、損傷組織を修復、老化を阻害、または、疼痛緩和を提供するための、他の手段および物質と組み合わせて用いてよい。ある場合には、本発明の組成物は、損傷組織を修復する、老化を阻害する、または、疼痛緩和を提供することを目的とする他の物質と、同時に、連続して、または別々に投与され得る。本発明の組成物は、損傷組織を修復する、または老化を阻害するための、既存の物質と組み合わせて用いてよく、および、例えば、そのような治療と単純にミックスしてよい。したがって、本発明を用いて、老化阻害または損傷組織のための既存の物質の有効性を増大させ得る。同様に、本発明の組成物は、発毛を促進するための他の手段および物質と組み合わせて用いてよい。
【０１６７】
上記に示したように、本発明の組成物は、１つまたは複数の治療的細胞を含んでよい。全ての例において、前記の１つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、患者または同種異系ドナーから採取される。患者から細胞を採取することは、患者の免疫系によって細胞自身が拒絶されないことを確実にするはずである。ドナーおよびレシピエントの間の任意の違いは、細胞のクリアランスを最終的に引き起こすが、損傷組織または老化組織の少なくとも一部をそれらが修復する前ではない。
【０１６８】
本発明の一態様は、患者に治療的に効果的な数の治療的細胞を患者へ投与するステップに関する。治療的に効果的な数は、損傷、疾患、負傷または老化の症状の１つまたは複数を改善する数である。治療的に効果的な数は、好ましくは、損傷組織を修復する、または、疾患、負傷または老化を治療する数である。
【０１６９】
治療的細胞は、治療薬および／または診断薬がロードまたはトランスフェクトされ得る。治療薬は、損傷組織または老化組織を修復するのを助け得る。蛍光分子のような診断薬は、患者内での組成物の位置を特定するのを助け得る。細胞は、当技術分野で知られている任意の方法を用いてロードまたはトランスフェクトされ得る。細胞のロードは、インビトロまたはエクスビボで行なわれ得る。それぞれの場合において、細胞は、培養物中で薬剤と単純に接触され得る。あるいは、細胞は、リポソームのような送達ビヒクルを用いて、薬剤がロードされ得る。そのようなビヒクルは、当技術分野で知られている。
【０１７０】
ＰＭＬまたはＩＭＰ細胞のような細胞のトランスフェクションは、インビトロまたはエクスビボで行なわれ得る。あるいは、安定したトランスフェクションは、ＭＣ段階で行なわれ得て、導入遺伝子を発現するＰＭＬが、それらから分化するのを可能にする。細胞は典型的に、薬剤をコードする核酸によってトランスフェクトされる。例えば、薬剤をコードする、ウイルス粒子または他のベクターが用いられ得る。これを行なう方法は、当該分野で知られている。
【０１７１】
核酸は、細胞内で薬剤の発現を生じさせる。核酸分子は、好ましくは、薬剤をコードする配列に動作可能に連結されて、およびＰＭＬ内で活性であり、または細胞内で誘導され得る、プロモーターを含む。
【０１７２】
特に好ましい実施態様では、薬剤をコードする核酸は、ウイルス粒子を介して送達され得る。ウイルス粒子は、標的化分子を含み、効率的なトランスフェクションを確実にし得る。標的化分子は典型的に、その分子がウイルスを細胞に対して標的化することができるように、ウイルスの表面上に全体的または部分的に与えられる。
【０１７３】
任意の適切なウイルスを、そのような実施態様で用いてよい。ウイルスは、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、または単純ヘルペスウイルスであってよい。特に好ましい実施態様では、ウイルスは、レンチウイルスであってよい。レンチウイルスは、遺伝子を送達する使用に適切な改変ＨＩＶウイルスであってよい。レンチウイルスは、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＱＩＡ）に基づくベクターであってよい。ウイルスは、モロニーミューリン白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）であってよい。本発明で用いられるウイルスは、好ましくは複製欠損型である。
【０１７４】
ウイルス粒子を使用する必要はない。従来のプラスミドＤＮＡまたはＲＮＡトランスフェクションなど、細胞をトランスフェクトすることが可能な任意のベクターを用いてよい。
【０１７５】
核酸構築物の取り込みは、トランスフェクション剤の使用を含むもののようないくつかの公知のトランスフェクション技術により増強され得る。これらの試薬の例は、カチオン剤、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランおよびリポフェクタント（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｎｔ）、例えば、リポフェクタミン、フュージーン（ｆｕｇｅｎｅ）およびトランスフェクタム（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）を含む。
【０１７６】
細胞は、適切な条件下でロードまたはトランスフェクトされ得る。細胞および薬剤またはベクターは、例えば、５分〜１０日、好ましくは１時間〜５日、より好ましくは５時間〜２日、さらにより好ましくは１２時間〜１日の間、接触させてよい。
【０１７７】
一部の実施態様では、ＭＣは、患者から回収され、上述のようにＰＭＬおよび／またはＩＭＰ細胞に変換され、インビトロでロードまたはトランスフェクトされ、およびそれから、同一患者に戻してよい。そのような例では、本発明で用いられるＰＭＬおよび／またはＩＭＰ細胞は、自己由来の細胞であり、患者と完全に一致する。好ましい例では、本発明で用いられる細胞は、患者から回収され、エクスビボで使用され、その後に同一患者へ戻される。
【０１７８】
［医薬組成物および投与］
本発明の組成物は、任意の適切な方法を用いて製剤化され得る。標準的な薬学的に許容できる担体および／または賦形剤を用いた細胞の製剤化は、調剤分野における常法を用いて行なわれ得る。製剤の厳密な性質は、投与される細胞および所望の投与経路を含むいくつかの因子に依存する。適切な製剤タイプは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡに完全に記載されている。
【０１７９】
本発明の組成物は、典型的に滅菌されている。
【０１８０】
本発明の組成物は、任意の経路により投与され得る。適切な経路は、限定されないが、局所、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内または他の適切な投与経路を含む。組成物は、好ましくは、損傷組織または老化組織に直接投与される。また、組成物は、組成物が投与される領域において発毛を促進するために、局所的に投与してもよい。膣萎縮は、本発明の組成物を局所的に適用することによって治療され得る。
【０１８１】
本発明の組成物は、生理的に許容できる担体または希釈剤を一緒に用いて調製され得る。適切な担体または賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロールなど、およびそれらの組み合わせである。凍結乾燥された組成物は、典型的に、治療的使用の前に再水和される。
【０１８２】
加えて、必要に応じて、本発明の医薬組成物は、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／または有効性を高めるアジュバントを含んでよい。そのような薬剤は、当技術分野で知られている。組成物は、好ましくは、ヒト血清アルブミンを含む。組成物は、好ましくはゼノフリーである。
【０１８３】
適切な担体または希釈剤の１つは、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（登録商標）である。これは、静脈内投与のための、滅菌の、非発熱性の等張液である。各１００ｍＬは、５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）；５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）；３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）；３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣｌ）；および３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を含む。それは抗菌剤を含まない。ｐＨは水酸化ナトリウムを用いて調整される。ｐＨは７．４（６．５〜８．０）である。
【０１８４】
本発明の組成物は、投与製剤と適合する様式で、治療的に効果的であるような量で投与される。投与される量は、治療される対象、対象の免疫系の能力、および、所望の修復または治療の程度に依存する。投与される必要がある正確な量は、熟練者の判断に依存し得て、および、それぞれの対象に特有であり得る。
【０１８５】
任意の適切な量の本発明の組成物が、対象に投与され得る。例えば、投与される本発明の医薬組成物の量は、約０．１ｇ〜１００ｇ、例えば、約０．５ｇ〜約７５ｇ、約１ｇ〜約５０ｇ、約２ｇ〜約２０ｇ、または、約３ｇ〜１０ｇの範囲であり得る。
【０１８６】
組成物が治療的細胞を含む場合、投与される治療的細胞の量は、治療される対象、対象の免疫系の能力、および、所望の修復の程度に依存する。投与される必要がある細胞の正確な量は、熟練者の判断に依存し得て、および、それぞれの対象に特有であり得る。
【０１８７】
任意の適切な数の細胞が、対象に投与され得る。例えば、患者のｋｇあたり、少なくとも、または約、０．２×１０６、０．２５×１０６、０．５×１０６、１．５×１０６、４．０×１０６または５．０×１０６の細胞が投与され得る。例えば、少なくとも、または約、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９の細胞が投与され得る。目安として、投与される細胞の数は、１０５〜１０９、好ましくは、１０６〜１０８であり得る。典型的に、２×１０８までのＩＭＰ細胞が、それぞれの患者に投与される。上述の任意の特定の数が投与され得る。
【０１８８】
本発明の組成物は、凍結乾燥された形態であってよい。凍結乾燥プロセスは、安定化された、凍結−乾燥された、増殖因子および潜在的に上述の他の生体活性成分を含む薬剤粉末を生産する。この凍結乾燥された組成物は、異なる温度でよりいっそう長期の安定性で、損傷組織または老化組織を有する患者、または発毛の促進を必要とする患者の効果的な治療のために、他の技術と組み合わせることができる。このことは、治療の輸送および製剤の物流プロセスを回避する。
【０１８９】
一実施態様は、乾燥された、凍結乾燥された本発明の組成物である。治療の直前に水と組み合わせると、ゲル様の粘性が形成される。
【０１９０】
他の実施態様では、本発明の医薬組成物または本発明の血小板溶解物は、代替的に、異なる以下のものと組み合わせることができる：
【０１９１】
・以下のような製剤／送達方法：
‐ローション、シェイクローション、クリーム、軟膏、ジェル、フォーム、経皮パッチ、粉末、固体、スポンジ、テープ、ペースト、絆創膏、ガーゼ、シリンジ、スプレー
・以下のような処理：
‐間葉系幹細胞、造血性幹細胞、単核細胞、内皮前駆細胞、中胚葉性前駆細胞、抗生物質、鎮痛剤、銀、創傷清拭剤、医療機器
・以下のようなパッケージ方法：
‐滅菌パッケージ、ボトル、ボックス、缶
・保管方法
‐理想的に室温粉末；必要に応じて冷蔵または冷凍される。
【０１９２】
［細胞の集団を生産する方法］
本発明は、損傷組織を治療する、または老化を阻害する、または発毛を促進する方法での使用のための、細胞の集団を生産する方法を提供する。当該方法は、ＭＣ、ＰＭＬおよび／またはＩＭＰを、本発明の組成物の存在下で培養するステップ、および、ＭＣ、ＰＭＬおよび／またはＩＭＰの少なくとも一部が増殖するのを可能にするステップ、を含む。
【０１９３】
ＭＣおよびそれらを単離する方法は、当技術分野で知られている。ＭＣは、骨髄から単離される初期の（ｐｒｉｍａｒｙ）ＭＣであってよい。ＭＣは、好ましくは、末梢血ＭＣ（ＰＢＭＣ）、例えば、リンパ球、単球および／またはマクロファージである。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）のような親水性多糖類を用いて、血液から単離することができる。例えば、ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）（市販の密度培地）を用いて血液から単離され得る。
【０１９４】
ＩＭＰおよび／またはＰＭＬは、好ましくは、上記に定義されるとおりである。
【０１９５】
本発明の方法は、臨床関連の条件下で、すなわち、微量のエンドトキシンおよび他の環境汚染物質、例えば、リポ多糖類、リポペプチドおよびペプチドグリカンなどの不存在下で、行なわれ得る。このことは、生じる細胞の集団を、患者への投与に特に適切にさせる。
【０１９６】
ＭＣ、ＰＭＬまたはＩＭＰは、好ましくは、患者または同種異系ドナーから採取される。この場合、本発明の方法によって生産される細胞の集団は、患者と自己由来であり、したがって、患者への投与の際に拒絶されない。
【０１９７】
また、ＭＣ、ＰＭＬまたはＩＭＰは、細胞が最終的に投与される患者と免疫学的に適合する１または複数の異なる患者から採取してもよい。この場合、本発明の方法によって生産される細胞の集団は、患者と同種異系または半−同種異系である。したがって、患者への集団の投与の際の拒絶の機会は、低減される。
【０１９８】
また、本発明は、患者への投与に適切であって本発明の方法を用いて生産される、細胞の集団も提供する。細胞の集団は、上記に定義したＰＭＬ、ＭＳＣまたはＩＭＰを含んでよい。
【０１９９】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【０２００】
実施例１−組成物の調製
本発明の組成物を、ヒト血小板から調製した。ヒト輸注のための血小板は、貯蔵寿命が短いので、Ｗｅｌｓｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅからすぐに利用可能である。
【０２０１】
血小板を凍結保存バッグ内に置いて、中身が完全に凍るまで、バッグを液体窒素に移した。それからバッグを、中身が完全に解凍するまで、３７℃の水浴に移した。この凍結融解サイクルを４回繰り返して、血小板の溶解をもたらし、それらの中身の血漿相への放出をもたらした。溶解物を遠心分離菅へ移して、室温にて３２００ｇで２０分間、遠心分離して、血小板デブリをペレット化した。上清を未使用のチューブ中に集めて、細かい（４０μｍ）メッシュを通して注ぎ、デブリを減らした。それから、組成物を、−８０℃にてアリコートで保管した
【０２０２】
実施例２−治療的ゲルの調製
実施例１の組成物をＰＢＳ中メチルセルロースと混合することによって、治療的ゲルを作製した。この場合、最終ゲルは、２．５％メチルセルロース、０．５×ＰＢＳおよび５０％組成物であった。しかしながら、同様の方法を用いて任意のゲル製剤を調製することができる。
【０２０３】
実施例１で生産された組成物を、４℃にて一晩解凍して、室温にて２０分間、３２００ｇで遠心分離した。上清を未使用のチューブ中に集めて、細かい（４０μｍ）メッシュを通して注ぎ、デブリを減らした。
【０２０４】
メチルセルロースの必要な量を、パーチメントコーティングされたコイルの上に計量してその中にパッケージして、注意深く密封した。ＰＢＳの必要な量をボトル中に測定して、スターラーバーを加えた。それから、パッケージされたメチルセルロース、および、ＰＢＳのボトルを、オートクレーブした。
【０２０５】
オートクレーブの後に、ＰＢＳを８０℃の水浴中で温めた。安全キャビネット内で、メチルセルロースの封を開けて、熱いＰＢＳ中に分注して、勢いよく撹拌した。メチルセルロース懸濁液をそのまま撹拌して、手で触れる熱さ（ｈａｎｄ  ｈｏｔ）まで冷やした。
【０２０６】
解凍された組成物を、それから、手で触れる熱さのメチルセルロース懸濁液に加えた。混合物を、さらに２０分間撹拌した。最後に、生じたゲルを冷蔵庫に移して、そこで、メチルセルロースの完全な水和が、ゲルの濃縮および浄化をもたらした。
【０２０７】
実施例３−ゲル製剤の最適化
組成物およびメチルセルロースまたはＰＦ−１２７を含むゲル製剤を、ゲル化温度、ゲルの粘性、線維芽細胞の増殖を高めるその能力、および、長期保管に関するその適合性を調べることによって最適化した。
【０２０８】
方法
［ゲル製剤］
エンドトキシンフリーの試薬、および、滅菌された使い捨て、またはオートクレーブされた消耗品を用いて、クラスＩＩラミナーフローフード内でゲルを調製した。全ての試薬および消耗品は、７０％ｖ／ｖエタノールを用いて汚染除去した。
【０２０９】
［プラセボゲル］
Ｓｔｕａｒｔホットプレートマグネチックスターラー（Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）上で、ガラスボトル中で８０℃にて、１０ｍｌの滅菌脱イオン水に、０．４ｇ、０．５ｇまたは０．６ｇのメチルセルロース（２％溶液で、４０００ｃＰ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ；滅菌のためにオートクレーブした）をゆっくり加えることによって、メチルセルロースゲルを２％、２．５％または３％で調製した。この溶液を、さらに撹拌しながら、３７℃まで冷やされる前に１５分間、撹拌した。さらに１０ｍｌの滅菌脱イオン水を加えて、マグネチックスターラーから取り除かれる前に、溶液を３０分間撹拌して、４℃にて一晩保管した。
【０２１０】
マグネチックスターラー上で、ガラスボトル中で、４℃にて２０ｍｌの脱イオン水に、４ｇ、５ｇまたは６ｇのＰＦ−１２７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）をゆっくり加えることによって、ＰＦ−１２７ゲルを２０％、２５％および３０％で調製した。マグネチックスターラーから取り除かれる前に４℃にて４０分間、溶液を撹拌して、４℃にて一晩保管した。
【０２１１】
［治療的ゲル］
治療的メチルセルロースゲルを、実施例２に従って調製した。
マグネチックスターラー上で、ガラスボトル中で４℃にて、１５ｍｌの組成物に、３．７５ｇまたは４．５ｇのポリマー粉末をゆっくり加えることによって、治療的ＰＦ−１２７ゲルを２５％および３０％で調製した。マグネチックスターラーから取り除かれる前に４℃にて１時間、溶液を撹拌して、４℃にて一晩保管した。
【０２１２】
［レオロジー測定］
プラセボゲルおよび治療的ゲル製剤のゾル−ゲル遷移温度を決定するために、レオロジー測定を行なった。
【０２１３】
［写真観察］
また、ゲル密度を写真でも観察した。吸収表面（Ｗｙｐａｌｌ  ｂｌｕｅ  ｒｏｌｌ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）上に注入される前に、ゲルを、４℃、２２℃または３７℃にて３０分間、２ｍｌシリンジ中に保管した。写真は、Ｃａｎｏｎ  ＥＯＳカメラを用いて直ちに撮った。局所適用に適切なゲル密度を示すためのポジティブコントロールとしてＮｕｒｏｆｅｎ（登録商標）イブプロフェンゲル（Ｒｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ，ＵＫ）を用いて、液体を示すためのネガティブコントロールとして水を用いた。
【０２１４】
［線維芽細胞増殖アッセイ］
メチルセルロース治療的ゲルおよびＰＦ−１２７治療的ゲルを、それぞれ２．５％および２５％で調製した。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイのために９６ウェルプレート中に蒔かれる前に、線維芽細胞（ＭＲＣ  ５ＣＶ１）を培養して採取した。ＦＢＳ（２％）をコントロールとして用い、組成物（２％）をポジティブコントロールとして用い、および、１５μＭのシスプラチンをネガティブコントロールとして用いた。ゲル処置（ｇｅｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を、血清フリー培地に加えた（２％）。処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を個々のウェルに加えて、それぞれのウェルにおいてゲルの均一な分散を確実にした。
【０２１５】
［組成物濃度の最適化］
メチルセルロースおよびＰＦ−１２７ゲル中の組成物の最適濃度を決定するために、組成物の濃度が異なるゲルを調製した。均一な分散を確実にするためには、メチルセルロース粉末を液体に８０℃で添加しなければならず、したがって、高温でのタンパク質変性のせいで、１００％組成物でメチルセルロースゲルを調製することは不可能であった。したがって、メチルセルロースゲルは、５０、３７．５、２５、１２．５、および０％組成物で調製して、一方で、ＰＦ−１２７ゲルは、１００、５０、３７．５、２５、１２．５、および０％組成物で調製した。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイを行なった。ＦＢＳ（２％）をコントロールとして用い、組成物（２％）をポジティブコントロールとして用い、および、１５μＭのシスプラチンをネガティブコントロールとして用いた。ゲル処置（ｇｅｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を、血清フリー培地に加えた（２％）。
【０２１６】
［ゲル保管溶液］
治療的ゲルを室温および４℃で保管することができる時間の長さを決定するために、メチルセルロース治療的ゲルおよびＰＦ−１２７治療的ゲルを、それぞれ、２．５％および２５％で調製した。ゲルを室温または４℃で保管して、ゲルを作成するために用いた組成物の一部を等分して、アッセイまで−８０℃にて保管した。０日、７日、１４日、２８日、２ヶ月、３ヶ月、および６ヶ月に、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイを行なった。ＦＢＳ（２％）をコントロールとして用い、組成物（２％）をポジティブコントロールとして用い、および、１５μＭのシスプラチンをネガティブコントロールとして用いた。ゲル処置（ｇｅｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を、血清フリー培地に加えた（２％）。
【０２１７】
結果
［レオロジー測定およびプラセボゲルの写真］
メチルセルロースおよびＰＦ−１２７プラセボのゾル−ゲル遷移温度を測定するために、振動温度傾斜をＡＲ−Ｇ２レオメータで行なった。溶液は、損失弾性率Ｇ’’（粘性の尺度）よりも低い貯蔵弾性率Ｇ’（弾性の尺度）を有し、したがって、弾性であるよりも粘性である。対照的に、ゲルは、損失弾性率Ｇ’’よりも高い貯蔵弾性率Ｇ’を有し、したがって、粘性であるよりも弾性である。Ｇ’がＧ’’に等しい点は、ゾル−ゲル遷移温度として知られる。位相角δは、ゲル化点の別の示度である。溶液では、最低周波数は最高位相角δを有し、最高周波数は最低位相角δを有する。周波数がクロスオーバーする点は、ゾル−ゲル遷移温度である。
【０２１８】
室温（２２℃）および体温（３７℃）では、メチルセルロースプラセボ（２．０〜３．０％）は、弾性よりも粘性であることが分かり（図１Ａ〜Ｃ）、したがって、それらは、ゲルであるように見た目上は見えるにもかかわらず、技術的には粘性の液体であった（図２）。ＰＦ−１２７プラセボ（２０〜３０％）は、体温でゲルであることが見られたが、室温でのそれらの状態は、ポリマー濃度に依存した（図１Ｄ〜Ｆ）。ポリマー濃度の増加は、メチルセルロースおよびＰＦ−１２７プラセボの両方に関して、ゾル−ゲル遷移温度を低下させた（表３）。
【０２１９】
【表３】
2018513839.tif 000005
【０２２０】
写真を用いて、４℃、２２℃および３７℃でのゲル粘性の目視観察を提供した（図２）。メチルセルロースは、４℃と３７℃との間で、粘性が変化しないようであった。このことは、５０℃を超えるまで粘性の増加は無いことを示すレオロジー測定と一致する。ＰＦ−１２７は、温度上昇に伴って粘性が増加することを明らかに見ることができ、これもまた、レオロジーデータと一致する。これらの観察に続いて、メチルセルロースに関する最適濃度として２．５％を選択して、一方で、ＰＦ−１２７に関する最適濃度として２５％および３０％を選択した。
【０２２１】
［治療的ゲルのレオロジー測定および写真］
メチルセルロースおよびＰＦ−１２７に対する、組成物の効果を観察するために、振動温度傾斜および写真を、組成物によって調製されたゲルに関して繰り返した。ゲルに対する組成物の添加は、ゾル−ゲル遷移温度に効果を有した（表４）。組成物によって調製されたメチルセルロースは、２０〜６５℃の間でゲルを形成しなかった（図３Ａ）。しかしながら、３７℃では、組成物によるメチルセルロースの粘性は、ポジティブコントロールのものとなお同様である（図４）。対照的に、組成物は、ＰＦ−１２７がゲルを形成する能力を改善し、ゾル−ゲル遷移温度を低下させることが分かった（図３Ｂ〜Ｃ）。また、粘性の増加は、図４においても視覚的に観察することができる。ＰＦ−１２７  ＰＬ（３０％）は、非常に濃く、その結果として、注入しにくいことが分かった。したがって、２．５％メチルセルロースおよび２５％  ＰＦ−１２７を、組成物ゲル形成に関する最適濃度として選択した。
【０２２２】
【表４】
2018513839.tif 000006
【０２２３】
［組成物濃度の最適化］
線維芽細胞上での治療的ゲルの増殖性能力を調べるために、線維芽細胞を、様々な濃度の組成物を含む治療的ゲルとともに４８時間培養した。図５に示される結果は、メチルセルロース治療的ゲルが、ＦＢＳコントロールよりも有意に多くの線維芽細胞増殖を促進したことを示す。ＰＦ−１２７治療的ゲルとＦＢＳコントロールとの間に有意差はなかった。組成物の濃度が増加すると細胞の数が増加する全般的な傾向があったが、これは有意でなかった。組成物の一番高い濃度をさらなる実験に選択した（メチルセルロースに関して５０％、および、ＰＦ−１２７に関して１００％）。
【０２２４】
［治療的ゲルの保管］
治療的ゲルが線維芽細胞増殖に対するそれらの有益な効果を失わずに保管することができる時間の長さを決定するために、ゲルを、線維芽細胞を培養するために用いられてＦＢＳおよび組成物コントロールと比較される前に、０日、７日、１４日、２８日、２ヶ月、３ヶ月または６ヶ月の期間のあいだ、室温または４℃で保管した。結果を図６に示す。３ヶ月までのあいだ４℃で保管されたメチルセルロース治療的ゲルは、ＦＢＳコントロールよりも有意に多い線維芽細胞増殖（Ｐ≦０．０１）を生じた。このメチルセルロース治療的ゲルを室温で保管した場合、増殖の効果は、２ヶ月までのあいだのみ、ＦＢＳよりも有意に大きかった（Ｐ≦０．０１）。４℃で保管されたＰＦ−１２７治療的ゲルは、ＦＢＳと比較して、線維芽細胞増殖にいかなる有意差もなかった。しかしながら、ＰＦ−１２７治療的ゲルを、室温で２８日を超えて保管した場合、ＦＢＳよりも有意に悪い、線維芽細胞に対する増殖効果を有した（Ｐ≦０．０５）。期待されたとおり、４℃での保管は、室温での保管よりも長い間、治療的ゲルの生物学的特性を保持した。
【０２２５】
［結論］
ゾル−ゲル遷移温度は、ゲル産物を定義するための重要なパラメーターである。メチルセルロースおよびＰＦ−１２７ゲルの両方のレオロジー測定は、ポリマー濃度の増加に伴い、ゾル−ゲル遷移温度（Ｇ’＝Ｇ’’）の低下を示した。その観察は、以前に報告されている。体温では、メチルセルロース（２．０〜３．０％）は粘性溶液であることが分かり、一方で、ＰＦ−１２７（２０％〜３０％）はゲルであった。ＰＦ−１２７への組成物の添加は、ゾル−ゲル遷移温度を２〜５℃低下させることが分かった。ＰＦ−１２７のゲル化は、温度の上昇に起因し得て、ミセルの形成を引き起こし、その後に、温度が上昇し続けるにつれて、これらのミセルを立方構造に秩序よく詰める。対照的に、メチルセルロースへの組成物の添加は、ゲル形成を防ぐことが分かった。低い温度では、メチルセルロースは、疎水性メチル基を取り囲む籠様構造の形成に起因して、水溶性である。温度の上昇は、これらの籠構造を破壊して、疎水性基を曝露させて、疎水性凝集体の形成をもたらし、ゲルを産生する。メチルセルロースへの、塩類の添加は、ゾル−ゲル遷移を補助するか、または抑制する（ｓｕｐｒｅｓｓ）かのいずれかであることが報告されている。塩類は、水に関してポリマーと競合し得て、籠様構造の一部を破壊し、および、温度の上昇を模倣する。一方で、塩類は、メチルセルロース鎖の間に存在し得て、その鎖から水を反発させて、疎水性凝集体が形成するのをより困難にさせる。ゾル−ゲル遷移が２０〜６５℃の間で観察されなかったので、組成物は、メチルセルロースに対してこの後者の効果を有していたかもしれない。
【０２２６】
ゲルの目視検査を用いて、局所適用に所望の粘性を有するゲルを選択した。ゲルの粘性は、ポリマー濃度が増加するに伴って増加することを見ることができた。それは、レオロジー測定と一致する。これらの試験に続いて、２．５％メチルセルロースおよび２５％  ＰＦ−１２７を、治療的ゲルの調製に関する最適濃度として選択した。これらのポリマーは価格が同程度であるので、メチルセルロースの使用は、ポリマー粉末の費用を１０倍低下させ、したがってこれは、ＰＦ−１２７よりも商業的に魅力的な選択肢である。
【０２２７】
最大濃度の組成物（メチルセルロースに関して５０％組成物、および、ＰＦ−１２７に関して１００％  ＰＬ）を含む、メチルセルロースおよびＰＦ−１２７ゲルは、より低い濃度よりも大きな程度で、線維芽細胞増殖を誘導するようであった。メチルセルロース治療的ゲル（１２．５〜５０％組成物）は、ＦＢＳコントロールよりも有意に多い、および、組成物ポジティブコントロールと同様レベルの、細胞増殖を誘導することが分かった。対照的に、ＰＦ−１２７組成物ゲル（１２．５〜１００％）は、ＦＢＳコントロールと統計的に異ならなかった。これは、３７℃でのＰＦ−１２７のより高い粘性に起因し得て、ゲルの外への増殖因子の拡散を制限した。最大組成物濃度を、今後のゲル製剤のための最適として選択した。
【０２２８】
最後に、治療的ゲルの貯蔵寿命を、室温および４℃で評価した。メチルセルロース治療的ゲルは、室温で２ヶ月までのあいだ、および、４℃で３ヶ月まで、その増殖性能力を保持した。ＰＦ−１２７治療的ゲルは、室温で２８日後に、線維芽細胞に対する増殖性効果が有意により悪かったが、４℃で保管した場合、６ヶ月までのあいだ、その効果を維持することができた。しかしながら、ＰＦ−１２７治療的ゲルは、全ての時点において、メチルセルロース治療的ゲルよりも、増殖の誘導が低レベルであった。加えて、ＰＦ−１２７治療的ゲルは、４℃で溶液であり、ポリマーから組成物の分離を生じさせた。これは、短期間の保管後に、均一でない産物をもたらした。
【０２２９】
要約すると、本実施例は、調製後３ヶ月までのあいだ、線維芽細胞増殖をうまく促進することが可能な治療的ゲルを開発した。最適ゲルは、５０％組成物および２．５％メチルセルロースを担体マトリックスとして含んだ。このマトリックスは、血小板ゲルの貯蔵寿命を改善し得て、増殖因子の徐放性をサポートし得る。ＰＦ−１２７は、メチルセルロースのようには上手くしなかった。それは、このゲルからの増殖因子の拡散の低下に起因し得る。最適化ゲルは、３ヶ月までの間、４℃で保管することができる。
【０２３０】
実施例４−Ｌｕｍｉｎｅｘ  ７ｐｌｅｘ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐａｎｅｌを用いた、組成物中の増殖因子のスクリーニング
方法
実施例１に従って、２１個の異なる血小板サンプルから組成物を調製した。生じた組成物を用いて、実施例２に従った治療的ゲルを調製した。それぞれの最終的なゲルは、２．５％メチルセルロース、０．５×ＰＢＳおよび５０％組成物を含んだ。
【０２３１】
それぞれの治療的ゲルの増殖因子含有量を、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ７ｐｌｅｘ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐａｎｅｌキット（パート＃８９３６０５；ロット＃３１１５４４）を用いて分析した。１００μｌの治療的ゲルを、トリプリケートで希釈チューブに分注して、４００μｌの希釈剤を加えて、そして、サンプルを注意深く混合した。１００μｌのそれぞれの希釈サンプルを、９６ウェルのアッセイプレートに移した。それぞれの２１個の治療的ゲルの過剰分を、今後の使用のために−８０℃で保管した（実施例５を参照）。
【０２３２】
スタンダードカクテルを希釈剤で再構成して、キットの説明書のとおりに、検量線を作成するために用いた。１００μｌのそれぞれのスタンダードを、９６ウェルプレートのカラム１および２に移した。
【０２３３】
５０μｌのそれぞれの微粒子のカクテルを５ｍｌの微粒子希釈剤中に懸濁することによって、微粒子懸濁液を調製した。懸濁液を、ボルテックスによって完全に混合して、５０μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを、プレートシーラーホイルによって密封して、８００ｒｐｍで、水平シェーカー上で室温にて２時間インキュベートした。
【０２３４】
５０μｌの各ビオチン−コンジュゲート抗体を、ビオチン抗体希釈剤のバイアルに添加した。２０ｍｌの２５×ウォッシュバッファー濃縮物を４８０ｍｌのＨ２Ｏに添加することによって、Ｌｕｍｉｎｅｘウォッシュバッファーを調製した。アッセイプレートを、ウォッシュバッファー中で３回洗浄して、５０μｌの希釈されたビオチン−コンジュゲート抗体を各ウェルに添加した。プレートをホイルで密封して、８００ｒｐｍで、水平シェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。そのあいだに、Ｌｕｍｉｎｅｘマシンのレーザーを温めて、マシンをキャリブレーションした。分析物のパラメーターを、表５に示すように入力した。マシンに関するサンプルテンプレートを設定した。
【０２３５】
【表５】
2018513839.tif 000007
【０２３６】
ストレプアミジン（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ＰＥを、キットの説明書に従って作製した。プレートを前のとおりに洗浄して、ストレプトアビジン−ＰＥを各ウェルに。プレートをホイルシーラーで覆って、８００ｒｐｍで、水平シェーカー上で室温にて３０分間インキュベートした。プレートを前のとおりに洗浄して、１００μｌのウォッシュバッファー中にサンプルを再懸濁した。サンプルを、それから、Ｌｕｍｉｎｅｘマシンにロードした。
【０２３７】
５パラメーターロジスティック（５−ＰＬ）カーブフィットを用いて検量線を作った（図７）。
【０２３８】
結果
結果を図８に示す。図８Ａは、分析されたそれぞれの治療的ゲルにおける、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、トロンボスポンジンおよびアンジオポエチンの濃度を示す。ＶＥＧＦ−Ｄのレベルは、検出限界よりも低かったので示さない。図８Ｂは、サンプルセットにわたって計算された、それぞれの増殖因子に関する、最小、最大、メジアン、平均、およびＳＥＭを要約する。図８Ｃは、それぞれの増殖因子のメジアン濃度を示し、図８Ｄは、この情報を箱髭図として示す。
【０２３９】
結論
分析した増殖因子のうち、アンジオポエチンが最も豊富な因子であり、次がＰＤＧＦ−ＢＢであった。ＶＥＧＦ−Ｄは検出されなかった。
【０２４０】
実施例５−増殖因子濃度に対する、保管の効果
方法
実施例４で調製されたそれぞれの２１個の治療的ゲルの過剰分を、４℃にて２週間保管した。ゲルのチューブ内で、タンパク質の層化の明らかな兆候はなかった。この実施例で使用する前に、それぞれのチューブを転がすことによって穏やかに混合した。
【０２４１】
それぞれの治療的ゲルの増殖因子含有量を、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ７ｐｌｅｘ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐａｎｅｌキット（パート＃８９３６０５；ロット＃３１１５４４）を用いて分析した。５０μｌの治療的ゲルを、希釈チューブにトリプリケートで分注して、２００μｌの希釈剤を加えて、そして、サンプルを注意深く混合した。１００μｌのそれぞれの希釈されたサンプルを、９６ウェルアッセイプレートに移した。
【０２４２】
スタンダードカクテルを希釈剤で再構成して、キットの説明書のとおりに、検量線を作成するために用いた。１００μｌのそれぞれのスタンダードを、９６ウェルプレートのカラム１および２に移した。
【０２４３】
５０μｌのそれぞれの微粒子のカクテルを５ｍｌの微粒子希釈剤中に懸濁することによって、微粒子懸濁液を調製した。懸濁液を、ボルテックスによって完全に混合して、５０μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを、プレートシーラーホイルによって密封して、８００ｒｐｍで、水平シェーカー上で室温にて２時間インキュベートした。
【０２４４】
５０μｌの各ビオチン−コンジュゲート抗体を、ビオチン抗体希釈剤のバイアルに添加した。２０ｍｌの２５×ウォッシュバッファー濃縮物を４８０ｍｌのＨ２Ｏに添加することによって、Ｌｕｍｉｎｅｘウォッシュバッファーを調製した。アッセイプレートを、ウォッシュバッファー中で３回洗浄して、５０μｌの希釈されたビオチン−コンジュゲート抗体を各ウェルに添加した。プレートをホイルで密封して、８００ｒｐｍで、水平シェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。そのあいだに、Ｌｕｍｉｎｅｘマシンのレーザーを温めて、マシンをキャリブレーションした。分析物のパラメーターを、表６に示すように入力した。マシンに関するサンプルテンプレートを設定した。
【０２４５】
【表６】
2018513839.tif 000008
【０２４６】
ストレプアミジン（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ＰＥを、キットの説明書に従って作製した。プレートを前のとおりに洗浄して、ストレプトアビジン−ＰＥを各ウェルに。プレートをホイルシーラーで覆って、８００ｒｐｍで、水平シェーカー上で室温にて３０分間インキュベートした。プレートを前のとおりに洗浄して、１００μｌのウォッシュバッファー中にサンプルを再懸濁した。サンプルを、それから、Ｌｕｍｉｎｅｘマシンにロードした。
【０２４７】
５パラメーターロジスティック（５−ＰＬ）カーブフィットを用いて検量線を作った（図９）。
【０２４８】
結果
結果を図１０に示す。図１０Ｂは、分析されたそれぞれの治療的ゲルにおける、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、トロンボスポンジンおよびアンジオポエチンの濃度を示す。図１０Ａは、サンプルセットにわたって計算された、それぞれの増殖因子に関する、最小、最大、メジアン、平均、ＳＤおよびＳＥＭを要約する。図１０Ｃは、それぞれの増殖因子のメジアン濃度を示す。ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｄは、検出不可能であった。
【０２４９】
図１１は、フレッシュおよび２週間保管されたゲルの、増殖因子含有量を比較する。図１１Ａは、フレッシュおよび２週間保管されたゲルの両方の、メジアン増殖因子濃度を示す。図１１Ｂは、２週間の保管後の、フレッシュな治療的ゲルからの増殖因子の平均損失パーセントを示す。
【０２５０】
結論
保管の２週後、ＰＤＧＦ−ＢＢが治療的ゲル中で最も豊富な増殖因子であり、アンジオポエチンが後に続いた。しかしながら、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＡを除く全ての増殖因子は、保管の２週後、それらの活性の８０％よりも多くを失った。
【０２５１】
配列リストの説明
配列番号１は、ヒトｂＦＧＦの１８ｋＤａアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、ヒトｂＦＧＦの２２ｋＤａアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ヒトｂＦＧＦの２４ｋＤａアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、ヒトｂＦＧＦ３４ｋＤａのアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ヒトＰＤＧＦサブユニットＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ヒトＰＤＧＦサブユニットＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ヒトＰＤＧＦサブユニットＣのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ヒトＰＤＧＦサブユニットＤのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ヒトＩＧＦ−１アイソフォーム１のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ヒトＩＧＦ−１アイソフォーム２のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ヒトＩＧＦ−１アイソフォーム３のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、ヒトＩＧＦ−２アイソフォーム１のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ヒトＩＧＦ−２アイソフォーム２のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、ヒトＶＥＧＦ１２１のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、ヒトＶＥＧＦ１４５のアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ヒトＶＥＧＦ１６５のアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ヒトＶＥＧＦ１６５ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、ヒトＶＥＧＦ１８９のアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ヒトＶＥＧＦ２０６のアミノ酸配列を示す。
【図１−１】
2018513839.tif 000009
【図１−２】
2018513839.tif 000010
【図１−３】
2018513839.tif 000011
【図１−４】
2018513839.tif 000012
【図１−５】
2018513839.tif 000013
【図１−６】
2018513839.tif 000014
【図２】
2018513839.tif 000015
【図３−１】
2018513839.tif 000016
【図３−２】
2018513839.tif 000017
【図３−３】
2018513839.tif 000018
【図４】
2018513839.tif 000019
【図５】
2018513839.tif 000020
【図６】
2018513839.tif 000021
【図７−１】
2018513839.tif 000022
【図７−２】
2018513839.tif 000023
【図８−１】
2018513839.tif 000024
【図８−２】
2018513839.tif 000025
【図８−３】
2018513839.tif 000026
【図９−１】
2018513839.tif 000027
【図９−２】
2018513839.tif 000028
【図１０】
2018513839.tif 000029
【図１１】
2018513839.tif 000030
【配列表】
2018513839000001.app
【国際調査報告】
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