(57)【要約】本発明は、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤、ならびに、それを必要とする被験体におけるｍｉＲ−９２の機能および／または活性を阻害するための前記阻害剤の使用方法を提供する。本発明は、創傷治癒を促進するための治療薬の有効性を評価またはモニタリングするため、ならびにｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する治療薬を用いた処置のために被験体を選択するための方法も提供する。本発明は、被験体における血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進させる方法であって、被験体に、表２から選択されるオリゴヌクレオチドなどの、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も提供する。
2018503646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における創傷治癒を促進するための方法であって、ｍｉＲ−９２と少なくとも部分的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、該オリゴヌクレオチドの投与によりｍｉＲ−９２の機能または活性が低下し、それにより、創傷治癒を促進する、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、２’−４’メチレン架橋を含有する少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍｉＲ−９２と少なくとも部分的に相補的な配列を含む前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１６ヌクレオチドの配列を含み、該配列が、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、該配列の５’末端から３’末端までの、１位、６位、１０位、１１位、１３位および１６位がＬＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記配列が、５’末端から３’末端までの、３位、９位、および１４位にＬＮＡをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記配列が、５’末端から３’末端までの、３位、８位、および１４位にＬＮＡをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記配列が、５’末端から３’末端までの、５位、８位、および１５位にＬＮＡをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記配列が、５’末端から３’末端までの、２番目のヌクレオチド位置にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドをさらに含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記２番目のヌクレオチド位置の前記ＤＮＡヌクレオチドが、化学修飾された窒素塩基を含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化学修飾された窒素塩基が、５−メチルシトシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、２’−デオキシ、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロ修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
完全にホスホロチオエート結合している、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ペンダント親油基をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、表１または２から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体がヒトである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体が、糖尿病に罹患している、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記創傷治癒が、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡に対するものである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドの投与により、無処置または創傷治癒を促進することが公知の薬剤を用いた処置と比較して、創傷治癒の間の再上皮化、肉芽、および／または新血管新生の速度が増大する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
創傷治癒を促進することが公知の前記薬剤が、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）または血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
表２から選択される配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドが、２’デオキシ、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロ修飾されている、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）が、２’−４’メチレン架橋を有する、請求項２１または２２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する、請求項２１から２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
完全にホスホロチオエート結合している、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
ペンダント親油基をさらに含む、請求項２１から２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
有効量の請求項２１から２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩、および薬学的に許容されるキャリアもしくは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項２９】
前記薬学的に許容されるキャリアが、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
細胞におけるｍｉＲ−９２の活性を低下させるまたは阻害する方法であって、該細胞を請求項２１から２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。
【請求項３１】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、心臓細胞、筋肉細胞、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
被験体における血管新生を促進させる方法であって、該被験体に、請求項２１から２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
【請求項３５】
前記被験体が、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）、末梢血管疾患または末梢動脈疾患に罹患している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体が、ヒトである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
糖尿病、慢性創傷（複数可）、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、または末梢動脈疾患を処置する方法であって、前記被験体に、請求項２１から２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
【請求項３８】
前記被験体が、ヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
血管新生を調節するための治療薬の、該治療薬を受けている被験体における有効性を評価またはモニタリングするための方法であって、
ａ）該被験体由来の試料中の、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および
ｂ）該１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の該１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により該治療薬の有効性が示されること
を含む方法。
【請求項４０】
前記被験体に対して歩行時間試験を実施すること、前記被験体についての足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）を決定すること、前記被験体に対して動脈造影または血管造影を実施すること、または前記被験体に対してＳＰＥＣＴ分析を実施することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
創傷治癒を調節するための治療薬の、該治療薬を受けている被験体における有効性を評価またはモニタリングするための方法であって、
ａ）該被験体由来の試料中の、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および
ｂ）該１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の該１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により該治療薬の有効性が示されること
を含む方法。
【請求項４２】
前記治療薬が、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療薬が、ｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤が、表１および２から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記被験体が、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）、末梢血管疾患または末梢動脈疾患に罹患している、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験体がヒトである、請求項３９から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
血管新生または創傷治癒を促進する薬剤の能力を評価するための方法であって、
ａ）該薬剤と接触させた細胞における、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および
ｂ）該１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の該１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により、血管新生または創傷治癒を促進する該薬剤の能力が示されること
を含む方法。
【請求項４８】
前記薬剤と接触させた前記細胞におけるｍｉＲ−９２の機能および／または活性を決定することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、心臓細胞、筋肉細胞、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する治療薬を用いた処置のために被験体を選択するための方法であって、
ａ）該治療薬で処置される該被験体由来の試料中の、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および
ｂ）該１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の該１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により該被験体が該治療薬を用いた処置のために選択されるべきかどうかが示されること
を含む方法。
【請求項５３】
前記被験体に対して歩行時間試験を実施すること、前記被験体についての足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）を決定すること、前記被験体に対して動脈造影または血管造影を実施すること、または前記被験体に対してＳＰＥＣＴ分析を実施することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記試料中のｍｉＲ−９２の機能および／または活性を決定することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療薬が、ｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤である、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤が、表１および２から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記被験体が、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）、末梢血管疾患または末梢動脈疾患に罹患している、請求項５２から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記被験体が、ヒトである、請求項５２から５７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１月２０日に提出された米国仮出願６２／１０５，５４６号のの利益を主張し、その全体を参照によって援用する。
【０００２】
本発明は、一般に、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性の調節物質、例えば、ｍｉＲ−９２阻害剤であるオリゴヌクレオチド、ならびにｍｉＲ−９２の機能および／または活性の調節物質についてのバイオマーカー、ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病および非治癒性糖尿病性足部潰瘍は、米国における非外傷性下肢切断の主な原因になっている。糖尿病性足部潰瘍は、血液供給不十分、虚血、ニューロパチー、グルコース制御不全、感染、および他の寄与因子に起因して、治癒できない。処置は、一般に、デブリードマン、感染制御、免荷を含み、成長因子（例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ））または生体包帯のいずれかを施すことを含み得る。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）とは、特異的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）をターゲティングし、それらの分解または翻訳の抑制を誘導することにより、遺伝子発現を負に調節することが可能な、小型で内因性の非コードＲＮＡのクラスである（Ａｍｂｒｏｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：３５０−３５５（２００４年）；Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ  １３６：２１５−２３３（２００９年））。近年の研究は、ｍＲＮＡの分解を、ｍＲＮＡ標的に関するｍｉＲＮＡの主要な機構的効果と規定している（Ｇｕｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０年  ４６６：８３５−８４０）。
【０００５】
マイクロＲＮＡは、心機能の制御および維持、血管炎症および血管病態の発生を含めた、いくつもの生物学的プロセスに関係づけられている（Ｅｖａ  Ｖａｎ  ＲｏｏｉｊおよびＥｒｉｃ  Ｏｌｓｏｎ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７巻（９号）：２３６９〜２３７６頁（２００７年）；Ｃｈｉｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４４７巻：３８９〜３９０頁（２００７年）；ＫａｒｔｈａおよびＳｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｒｅｓ．、３巻：２５６〜２７０頁（２０１０年）；Ｕｒｂｉｃｈら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｒｅｓ．、７９巻：５８１〜５８８頁（２００８年）を参照されたい）。ｍｉＲＮＡはまた、生物体の発生に関与し（Ａｍｂｒｏｓ、Ｃｅｌｌ、１１３巻：６７３〜６７６頁（２００３年））、多数の組織において（Ｘｕら、Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．、１３巻：７９０〜７９５頁（２００３年）；Ｌａｎｄｇｒａｆら、Ｃｅｌｌ、１２９巻：１４０１〜１４頁（２００７年））、ウイルス感染プロセスにおいて（Ｐｆｅｆｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４巻：７３４〜７３６頁（２００４年））示差的に発現し、また、発がんに関連する（Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０１巻：２９９９〜３００４頁（２００４年）；Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９９巻（２４号）：１５５２４〜１５５２９頁（２００２年））ことも報告されている。
したがって、マイクロＲＮＡの機能および／または活性の調節は、種々の状態に対する有効な処置の開発における治療標的を示し得る。しかし、ｍｉＲＮＡをターゲティングするアンチセンスベースの治療剤の送達は、複数の難題を提起しうる。特異的なｍｉＲＮＡに対する結合アフィニティーおよび結合特異性、細胞内の取込みの効率、ならびにヌクレアーゼ耐性は全て、オリゴヌクレオチドベースの治療剤の送達および活性における因子であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、無傷細胞へと導入されると、ヌクレアーゼにより攻撃および分解され、活性の喪失がもたらされることがあり得る。したがって、有用なアンチセンス治療剤は、細胞外および細胞内のヌクレアーゼに対する耐性が大きいほか、細胞膜を透過することも可能であるかもしれない。逆に、治療薬が投与される組織および部位以外の組織および部位においてオンターゲット効果が望ましくない場合には、ヌクレアーゼ分解に対する感受性により、遠位組織の曝露および活性を限定する、または全身毒性を限定することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｍｂｒｏｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：３５０−３５５（２００４年）
【非特許文献２】Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ  １３６：２１５−２３３（２００９年）
【非特許文献３】Ｅｖａ  Ｖａｎ  ＲｏｏｉｊおよびＥｒｉｃ  Ｏｌｓｏｎ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７巻（９号）：２３６９〜２３７６頁（２００７年）
【非特許文献４】Ｃｈｉｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４４７巻：３８９〜３９０頁（２００７年）
【非特許文献５】ＫａｒｔｈａおよびＳｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｒｅｓ．、３巻：２５６〜２７０頁（２０１０年）
【非特許文献６】Ｕｒｂｉｃｈら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｒｅｓ．、７９巻：５８１〜５８８頁（２００８年）
【非特許文献７】Ａｍｂｒｏｓ、Ｃｅｌｌ、１１３巻：６７３〜６７６頁（２００３年）
【非特許文献８】Ｘｕら、Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．、１３巻：７９０〜７９５頁（２００３年）
【非特許文献９】Ｌａｎｄｇｒａｆら、Ｃｅｌｌ、１２９巻：１４０１〜１４頁（２００７年）
【非特許文献１０】Ｐｆｅｆｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４巻：７３４〜７３６頁（２００４年）
【非特許文献１１】Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０１巻：２９９９〜３００４頁（２００４年）
【非特許文献１２】Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９９巻（２４号）：１５５２４〜１５５２９頁（２００２年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、例えばｍｉＲ−９２などのｍｉＲＮＡに対するものを含めた、安定かつ効果的なオリゴヌクレオチドに基づく阻害剤が必要とされている。処置の決定の指針とするための、ｍｉＲＮＡ調節物質についてのバイオマーカーの同定も必要とされている。本発明のオリゴヌクレオチドは、被験体に投与した際の効力、送達の効率、標的特異性、安定性、および／または毒性において利点を有し得る。
【０００８】
本発明は、表１および表２から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロ修飾されている少なくとも１つの非ロックドヌクレオチド（ｎｏｎ−ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含んでよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−４’メチレン架橋（2’ to 4’ methylenebridge）を有する少なくとも１つのＬＮＡを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート結合している。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペンダント親油基を含む。有効量のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩、および薬学的に許容されるキャリアもしくは希釈剤を含む医薬組成物も本明細書に提供される。一部の実施形態では、薬学的に許容されるキャリアは、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含む。
【０００９】
本発明は、細胞におけるｍｉＲ−９２の活性を低下させるまたは阻害する方法であって、細胞を、表２から選択されるオリゴヌクレオチドなどの、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法も提供する。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞または筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、創傷治癒に関与する。一部の実施形態では、細胞は、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある。
【００１０】
本発明は、被験体における血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進させる方法であって、被験体に、表２から選択されるオリゴヌクレオチドなどの、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も提供する。一部の実施形態では、被験体は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）、または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患している。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００１１】
本発明は、被験体における創傷治癒を促進する方法であって、被験体にｍｉＲ−９２阻害剤を投与することを含む方法も提供する。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、ｍｉＲ−９２と少なくとも部分的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロ修飾された少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−４’メチレン架橋を有する少なくとも１つのＬＮＡを含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであり、配列は、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、配列の５’末端から３’末端までの、１位、６位、１０位、１１位、１３位および１６位がＬＮＡである。一部の実施形態では、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドの５’末端からの、２位は、５−メチルシトシンであるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであり、配列は、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、配列の５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位がＬＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであり、配列は、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、配列の５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位および１６位がＬＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであり、配列は、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、配列の５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、９位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位がＬＮＡである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート結合している。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペンダント親油基を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、表１または２から選択されるオリゴヌクレオチドなどの、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、被験体は、糖尿病、創傷、末梢もしくは冠動脈閉塞、または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患している。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。一部の実施形態では、創傷は、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡である。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤の投与により、創傷治癒の間の被験体における創傷の再上皮化、肉芽および／または新血管新生（ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の改善がもたらされる。一部の実施形態では、創傷の再上皮化、肉芽および／または新血管新生（新生血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ））の改善は、処置を受けていない被験体と比較したものである。一部の実施形態では、創傷の再上皮化、肉芽および／または新血管新生の改善は、創傷治癒を促進することが公知の薬剤を用いた処置を受けた被験体と比較したものである。一部の実施形態では、創傷治癒を促進することが公知の薬剤は、成長因子である。一部の実施形態では、成長因子は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）または血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である。
【００１２】
本発明は、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであって、配列が、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、配列の５’末端から３’末端までの、１位、６位、１０位、１１位、１３位および１６位がＬＮＡであり、また、５’末端からの、２位が、５−メチルシトシンであるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドも提供する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位にＬＮＡを含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位および１６位にＬＮＡを含む。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、９位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位にＬＮＡを含む。オリゴヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロ修飾された少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドをさらに含んでよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ての非ロックドヌクレオチドは２’−デオキシ修飾されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−４’メチレン架橋を有する少なくとも１つのＬＮＡを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート結合している。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペンダント親油基を含む。一部の実施形態では、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端からの、２位に５−メチルシトシンが存在することにより、同じ配列ならびにＬＮＡの数および位置を含有するが５−メチルシトシンを欠くオリゴヌクレオチド阻害剤と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける有効性の増大が付与される。一部の実施形態では、有効性の増大は、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性の排除または低下の増強によって証明される。
【００１３】
本発明は、細胞におけるｍｉＲＮＡの活性または機能を低下させるまたは阻害する方法であって、細胞を、１６ヌクレオチドの配列を含む、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドであって、配列が、ｍｉＲＮＡと相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、配列の５’末端から３’末端までの、１位、６位、１０位、１１位、１３位および１６位がＬＮＡである、オリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法も提供する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位にＬＮＡを含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位および１６位にＬＮＡを含む。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、９位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位にＬＮＡを含む。一部の実施形態では、配列は、ｍｉＲ−９２と相補的である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞または筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、創傷治癒に関与する。一部の実施形態では、細胞は、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある。
【００１４】
本発明は、被験体における血管新生を促進させる方法であって、被験体に、１６ヌクレオチドの配列を含む、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドであって、配列が、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、配列の５’末端から３’末端までの、１位、６位、１０位、１１位、１３位および１６位がＬＮＡである、オリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も提供する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位にＬＮＡを含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位および１６位にＬＮＡを含む。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、９位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位にＬＮＡを含む。一部の実施形態では、被験体は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）、または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患している。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００１５】
本発明は、被験体において虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）または末梢動脈疾患を処置する方法であって、被験体に、１６ヌクレオチドの配列を含む、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドであって、配列が、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、配列の５’末端から３’末端までの、１位、６位、１０位、１１位、１３位および１６位がＬＮＡである、オリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も提供する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位にＬＮＡを含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位および１６位にＬＮＡを含む。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、９位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位にＬＮＡを含む。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００１６】
本発明はまた、一部において、ｍｉＲ−９２によって有意に制御される遺伝子の発見にも基づく。したがって、本発明の別の態様は、血管新生を調節するおよび／または慢性創傷を処置するための治療薬の、該治療薬を受けている被験体における有効性を評価またはモニタリングするための方法であって、被験体由来の試料中の、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により治療薬の有効性が示されることを含む方法である。本発明の別の態様は、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する治療薬を用いた処置のために被験体を選択するための方法であって、治療薬を用いた処置を受けた被験体由来の試料中の、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により被験体が治療薬を用いた処置（例えば、さらなる処置または処置の継続）のために選択されるべきかどうかが示されることを含む方法である。一部の実施形態では、方法は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患している被験体を含む。一部の実施形態では、被験体は、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡を有する。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００１７】
一部の実施形態では、方法は、被験体に対して歩行時間試験（ｗａｌｋ  ｔｉｍｅ  ｔｅｓｔ）を実施すること、被験体についての足関節上腕血圧比（ankle-bronchial index）（ＡＢＩ）を決定すること、被験体に対して動脈造影もしくは血管造影を実施すること、または被験体に対してＳＰＥＣＴ分析を実施することをさらに含む。一部の実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する。治療薬は、表１および２から選択されるｍｉＲ−９２阻害剤などのｍｉＲ−９２アンタゴニストであってよい。他の実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−９２模倣物などのｍｉＲ−９２アゴニストである。一部の実施形態では、方法は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患している被験体を含む。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００１８】
血管新生を促進する薬剤の能力を評価するための方法であって、薬剤と接触させた細胞における、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により血管新生を促進する薬剤の能力が示されることを含む方法も本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、薬剤と接触させた細胞におけるｍｉＲ−９２の機能および／または活性を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞または筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、創傷治癒に関与する。一部の実施形態では、細胞は、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある。
【００１９】
本発明の別の態様は、創傷治癒を促進するための治療薬の、治療薬を受けている被験体における有効性を評価またはモニタリングするための方法であって、被験体由来の試料中の、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により治療薬の有効性が示されることを含む方法である。一部の実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する。治療薬は、表１および２から選択されるｍｉＲ−９２阻害剤などのｍｉＲ−９２アンタゴニストであってよい。他の実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−９２模倣物などのｍｉＲ−９２アゴニストである。一部の実施形態では、方法は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患している被験体を含む。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００２０】
創傷治癒を促進する薬剤の能力を評価するための方法であって、薬剤と接触させた細胞における、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により創傷治癒を促進する薬剤の能力が示されることを含む方法も本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、薬剤と接触させた細胞におけるｍｉＲ−９２の機能および／または活性を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においてｍｉＲ−９２ａ調節によって有意に制御される多数の遺伝子を例示する図である。
【００２２】
【図２】図２Ａ〜Ｃは、ＨＵＶＥＣにおけるｍｉＲ−９２ａによるインテグリンα５発現制御を例示するグラフである。インテグリンα５（ＩＴＧＡ５）転写物（図２Ａ〜Ｂ）およびタンパク質（図２Ｃ）のレベルは、ｍｉＲ−９２ａ阻害に応答して上昇し、ｍｉＲ−９２ａ模倣物に応答して低下する。図２Ａ〜Ｂは、指示オリゴヌクレオチドをそれぞれＨＵＶＥＣに脂質トランスフェクトしたまたは受動的に送達した指示濃度を示す。図２Ｃは、脂質媒介性トランスフェクション後のインテグリンα５タンパク質レベルを示す。受動的送達とは、補助を伴わないオリゴヌクレオチドの取り込みを指す。Ａ（配列番号７）、Ｂ（配列番号６１）およびＣ（配列番号６２）は、ＬＮＡ／ＤＮＡを含有するｍｉＲ−９２ａ阻害剤である。「アンタゴｍｉＲ」は、Ｏ−メチル化された、コレステロールとコンジュゲートした阻害剤である。Ｄは、一本鎖ＬＮＡ／ＤＮＡ対照阻害剤である。
【００２３】
【図３】図３は、リアルタイムＰＣＲによる、マイクロアレイプロファイリングによって同定された標的の制御を例示するグラフである。マイクロアレイプロファイリングによって同定された４つの遺伝子は、独立したＨＵＶＥＣ脂質トランスフェクション実験において、ｍｉＲ−９２ａ阻害に応答して上昇し、ｍｉＲ−９２ａ模倣物に応答して低下する。レーダープロットは、オリゴヌクレオチドを伴わずに脂質を用いてトランスフェクトしたＨＵＶＥＣに対して正規化した、ｍｉＲ−９２ａ阻害剤または模倣物に応答したＭＡＮ２Ａ１、ＣＮＥＰ１Ｒ１、ＥＲＧＩＣ２、およびＣＤ９３の相対的な発現量を示す。黒い線は、変化がない場合の遺伝子発現を示し、赤い線は、Ｄ（対照オリゴ）トランスフェクションに応答した遺伝子発現を示す。
【００２４】
【図４】図４は、阻害剤デザインの活性（inhibitor designactivity）を試験するための二重ルシフェラーゼアッセイを例示するグラフである。ｍｉＲ−９２ａ阻害剤を、二重ルシフェラーゼレポータープラスミドからのルシフェラーゼの発現を抑制解除するそれらの能力に基づいて順位付けした。３回の反復実験の最初の実験からのデータの例のセットが示されている。
【００２５】
【図５】図５Ａ〜Ｆは、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおけるｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤の活性を調査する第１の試験の結果を例示するグラフである。図５Ａは、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ビヒクル対照）処置群、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ；陽性対照）処置群およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ（配列番号７）；Ｃ（配列番号６２））処置群からの、創傷のパーセント再上皮化を例示する。図５Ｂは、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置群、ＶＥＧＦ（陽性対照）処置群およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ；Ｃ）処置群からの、創傷における肉芽組織内部成長もしくは充填のパーセントを例示する。図５Ｃは、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置群、ＶＥＧＦ（陽性対照）処置群およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ；Ｃ）処置群からの、創傷における肉芽組織面積を例示する。図５Ｄは、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置群、ＶＥＧＦ（陽性対照）処置群およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ；Ｃ）処置群からの、創傷にわたる肉芽組織の厚さの平均（創傷面積を創傷の幅で割ったもの）を例示する。図５Ｅ〜Ｆは、新生血管形成／血管新生の指標として免疫組織化学的検査を使用した、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置群およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ）処置群からの、創傷におけるＣＤ３１＋内皮細胞の数（図５Ｅ）およびＣＤ３１＋の組織面積（図５Ｆ）を例示する。
【００２６】
【図６】図６Ａ〜Ｆは、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおけるｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤の活性を調査する第２の試験の結果を例示するグラフである。図６Ａは、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置群、ＶＥＧＦ（陽性対照）処置群、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ；陽性対照）処置群およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ；Ｃ）処置群からの、創傷のパーセント再上皮化を例示する。図６Ｂは、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置群、ＶＥＧＦ（陽性対照）処置群、ＰＤＧＦ（陽性対照）処置群およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ；Ｃ）処置群からの、創傷における肉芽組織内部成長もしくは充填のパーセントを例示する。図６Ｃは、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置群、ＶＥＧＦ（陽性対照）処置群、ＰＤＧＦ（陽性対照）処置群およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ；Ｃ）処置群からの、創傷における肉芽組織面積を例示する。図６Ｄは、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置群、ＶＥＧＦ（陽性対照）処置群、ＰＤＧＦ（陽性対照）処置群およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ；Ｃ）処置群からの、創傷にわたる肉芽組織の厚さの平均（創傷面積を創傷の幅で割ったもの）を例示する。図６Ｅ〜Ｆは、新生血管形成／血管新生の指標として免疫組織化学的検査を使用した、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置群、ＶＥＧＦ（陽性対照）処置群、ＰＤＧＦ（陽性対照）処置群およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ）処置群からの、創傷におけるＣＤ３１＋内皮細胞の数（図６Ｅ）およびＣＤ３１＋の組織面積（図６Ｆ）を例示する。
【００２７】
【図７】図７は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した、ｄｂ／ｄｂマウス切除創における１つのｉｎ  ｖｉｖｏ試験からの、ｍｉＲ−９２ａのオリゴヌクレオチド阻害剤による選択されたｍｉＲ−９２ａ標的遺伝子の抑制解除を例示するグラフである。
【００２８】
【図８】図８Ａ〜Ｄは、免疫組織化学的検査を使用して評価した、創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける、創傷におけるｍｉＲ−９２標的ＩＴＧＡ５のタンパク質の発現に対する食塩水（ビヒクル対照；図８Ａ）による処置、ＰＤＧＦ（陽性対照；図８Ｂ）による処置、およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤（Ａ；図８Ｃ〜Ｄ）による処置の効果を例示する図である。
【００２９】
【図９】図９は、阻害剤デザインの活性に対する５−メチルシトシンの存在の効果を試験するための二重ルシフェラーゼアッセイを例示するグラフである。５−メチルシトシンを伴う場合と伴わない場合のｍｉＲ−９２ａ阻害剤を、二重ルシフェラーゼレポータープラスミドからのルシフェラーゼの発現を抑制解除するそれらの能力に基づいて分析した。データの例のセットが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、ｍｉＲ−９２の活性または機能を阻害するオリゴヌクレオチド阻害剤および組成物ならびにその使用を提供する。ｍｉＲ−９２模倣物などのｍｉＲ−９２アゴニストも本明細書に提供される。
【００３１】
ｍｉＲ−９２は、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、およびｍｉＲ−９２−１からなるｍｉＲ−１７−９２クラスターに位置する（Venturiniら、Blood １０９巻、１０号：４３９９〜４４０５頁（２００７年））。ｍｉＲ−９２のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列がプロセシングされて成熟配列（３ｐ）およびアスタリスク付きの（star）（すなわち副または５ｐ）配列になる。アスタリスク付きの配列は、幹ループ構造の他方の腕からプロセシングされる。ヒトｍｉＲ−９２、マウスｍｉＲ−９２、およびラットｍｉＲ−９２の成熟ｍｉＲＮＡ配列およびアスタリスク付きのｍｉＲＮＡ配列を提示する：
【化１】
2018503646.tif 000003
【化２】
2018503646.tif 000004
【００３２】
上記の配列は、リボ核酸配列の場合もあり、デオキシリボ核酸配列の場合もあり、これら２つの組合せ（すなわち、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む核酸）の場合もある。本明細書で記載される配列のうちのいずれか１つを含む核酸は、ＤＮＡ配列では、ウリジン塩基の代わりにチミジン塩基を有し、ＲＮＡ配列では、チミジン塩基の代わりにウリジン塩基を有することが理解される。
【００３３】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２阻害剤である。ｍｉＲ−９２と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド阻害剤であってよい。本発明に関しては、「オリゴヌクレオチド阻害剤」、「抗ｍｉＲ」、「アンタゴニスト」、「アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＡＳＯ」、「オリゴマー」、「抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＡＭＯ」、または「ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）」という用語は広範に使用され、標的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の活性または機能を、ｍｉＲＮＡと完全にまたは部分的にハイブリダイズし、それにより、標的ｍｉＲＮＡの機能または活性を抑制することによって阻害するリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたリボヌクレオチド、修飾されたデオキシリボヌクレオチドまたはこれらの組合せを含むオリゴマーを包含する。
【００３４】
「ｍｉＲ−９２」という用語は、本明細書で使用される場合、ｐｒｉ−ｍｉＲ−９２、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−９２ｂ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐを含む。
【００３５】
一部の実施形態では、本発明のある特定のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のｍｉＲ−９２阻害剤と比較して、細胞におけるｍｉＲ−９２の活性または機能のより大きな阻害を示し得る。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞または筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、創傷治癒に関与する。一部の実施形態では、細胞は、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある。一部の実施形態では、本発明のｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、表３から選択される遺伝子などの、ｍｉＲ−９２の標的の抑制解除の量によって測定される通り、他のｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤と比較してより高い有効性を示す。
【００３６】
「他のｍｉＲ−９２阻害剤」という用語は、ｍｉＲ−９２の発現または活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ｍｉＲ、アンタゴｍｉＲ、ミクスマー、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ；抗体もしくはその抗原結合性断片；および／または薬物などの核酸阻害剤を含む。本発明の特定のオリゴヌクレオチド阻害剤は、本発明の他のオリゴヌクレオチド阻害剤と比較して、細胞（例えば、筋肉細胞、心臓細胞、内皮細胞、線維細胞（fiborcyte）、線維芽細胞、またはケラチノサイト）におけるｍｉＲ−９２のより大きな阻害を示し得る可能性がある。「より大きな」という用語は、本明細書で使用される場合、定量的により多いことまたは統計的に有意により多いことを指す。
【００３７】
ｍｉＲ−９２の機能および／または活性の調節におけるオリゴヌクレオチドの活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで決定することができる。例えば、ｍｉＲ−９２活性の阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する場合、活性は、二重ルシフェラーゼアッセイを使用して決定することができる。二重ルシフェラーゼアッセイは、当技術分野で公知の任意の二重ルシフェラーゼアッセイであってよい。二重ルシフェラーゼアッセイは、市販の二重ルシフェラーゼアッセイであってよい。市販品であるＰｓｉＣＨＥＣＫ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）により例示される二重ルシフェラーゼアッセイは、検出用タンパク質（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ）のためのｍｉＲ認識部位の、遺伝子の３’ＵＴＲ内の配置を伴い得る。阻害剤活性を、シグナルの変化により決定しうるように、構築物を、ｍｉＲ−９２と共に共発現させ得る。検出用タンパク質（例えば、ホタルルシフェラーゼ）をコードする第２の遺伝子も、同じプラスミドに組み入れることができ、シグナルの比を、候補オリゴヌクレオチドのａｎｔｉｍｉＲ−９２活性の指標として決定する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二重ルシフェラーゼ活性により決定されるこのような活性を、約５０ｎＭもしくはそれ未満、または他の実施形態では、４０ｎＭもしくはそれ未満、２０ｎＭもしくはそれ未満、または１０ｎＭもしくはそれ未満の濃度で著明に阻害する。例えば、二重ルシフェラーゼ活性により決定される通り、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２活性の阻害についてのＩＣ５０が、約５０ｎＭもしくはそれ未満、４０ｎＭもしくはそれ未満、３０ｎＭもしくはそれ未満、または２０ｎＭもしくはそれ未満でありうる。
【００３８】
その代わりに、またはそれに加えて、本明細書に提供されるｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−９２）のオリゴヌクレオチド阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、適切な動物モデルにおいて決定することもできる。動物モデルは、げっ歯類モデル（例えば、マウスモデルまたはラットモデル）であってよい。オリゴヌクレオチドは、５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、１０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満または５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量で、少なくとも５０％のｍｉＲ−９２の標的抑制解除を示し得る。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、マウスの静脈内または皮下に投薬、送達または投与することも、筋肉または創傷（例えば、創縁または創床）への局部注射など、局部に送達することもでき、また、オリゴヌクレオチドは、食塩水中で製剤化されていてよい。一部の実施形態では、適用を、マウスに、例えば創傷（例えば、創縁または創床）に、局所的にまたは皮内に（すなわち、皮内注射）投薬することができる。本明細書に提供されるｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、他のｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤と比較して、特定の組織においてｉｎ  ｖｉｖｏ有効性が増大し得る。
【００３９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を適切な糖尿病のマウスモデルまたはラットモデルにおいて決定する。一実施形態では、マウスモデルは、ｄｂ／ｄｂマウスなどの遺伝的ＩＩ型糖尿病マウスである（Ｊａｃｋｓｏｎ  カタログ番号０００６４２  ＢＫＳ．Ｃｇ  Ｄｏｃｋ（Ｈｏｍ）７ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／ｊ）。一実施形態では、モデルに全層皮膚切除パンチ生検を使用する。他の実施形態では、モデルに切開、熱湯傷または熱傷を利用する。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、マウスの静脈内または皮下に投薬することも、創傷（例えば、創縁または創床）への局部注射または局所適用など、局部に送達することもできる。
【００４０】
これらまたは他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、投与後に安定であり得、投与後少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、または少なくとも６週間、またはそれ超にわたって、循環中および／または標的器官において検出可能である。したがって、本明細書に提供されるｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−９２）のオリゴヌクレオチド阻害剤により、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−９２）の他のオリゴヌクレオチド阻害剤と比較して、より頻度の低い投与、より低い用量、および／またはより長い治療効果の持続時間がもたらされ得る。
【００４１】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡのヌクレオチド配列と実質的に相補的であってよい。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡのヌクレオチド配列と完全に相補的であってよい。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９２またはｍｉＲ−９２ａである。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡ、例えば、少なくとも２つのＬＮＡ、少なくとも３つのＬＮＡ、少なくとも５つのＬＮＡ、少なくとも７つのＬＮＡまたは少なくとも９つのＬＮＡを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡと非ロックドヌクレオチドとの混合物を含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つまたは少なくとも７つまたは少なくとも９つのロックドヌクレオチドと、少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドとを含有してよい。
【００４２】
一般に、オリゴヌクレオチドの長さならびにロックトヌクレオチドの数および位置は、オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−９２機能および／または活性を低減するような、長さならびに数および位置である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さならびにロックトヌクレオチドの数および位置は、オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−９２機能および／または活性を、各々が記載されている通りに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのルシフェラーゼアッセイにおいて、約５０ｎＭまたはそれ未満のオリゴヌクレオチド濃度で、あるいは適切なマウスモデルまたはラットモデルにおいて、約５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、または約２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量で低減するような、長さならびに数および位置である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さならびにロックトヌクレオチドの数および位置は、本明細書で記載されているマウスモデルまたはラットモデルなどの、適切なマウスモデルまたはラットモデルにおいて、約５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、または約２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量で、標的の抑制解除により決定される通り、オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−９２の活性を低減するような、長さならびに数および位置である。
【００４３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、配列の５’末端にあるＬＮＡ、配列の３’末端にあるＬＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含むヌクレオチドの配列を含んでよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、配列の５’末端にあるＬＮＡ、配列の３’末端にあるＬＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含むヌクレオチドの配列を含み、ヌクレオチドの３つ以下は連続したＬＮＡである。例えば、オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続したＬＮＡを含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、５’末端にあるＬＮＡ、３’末端にあるＬＮＡ、および３つ以下の連続したＬＮＡを有する配列を含んでよい。オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、５’末端にあるＬＮＡ、３’末端にあるＬＮＡ、および３つ以下の連続したＬＮＡを有する配列を含んでよく、配列は少なくとも１６ヌクレオチドの長さである。配列は、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡと実質的にまたは完全に相補的であってよく、実質的に相補的な配列は、その標的配列に対して１〜４つのミスマッチ（例えば、１つまたは２つのミスマッチ）を有してよい。一実施形態では、標的配列はｍｉＲＮＡであり、したがって、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡ阻害剤または抗ｍｉＲである。一実施形態では、標的配列は、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２配列である。
【００４４】
さらに別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡのシード領域（例えば、ｍｉＲ−９２）と相補的であり、少なくとも５つのＬＮＡを含む配列を含んでよい。「ｍｉＲＮＡのシード領域」とは、ｍｉＲＮＡの５’末端にある塩基２〜９にわたる部分である。ｍｉＲＮＡのシード領域（例えば、ｍｉＲ−９２）と相補的であり、少なくとも５つのＬＮＡを含む配列を含むオリゴヌクレオチドは、５’末端にあるＬＮＡまたは３’末端にあるＬＮＡ、または５’末端と３’末端の両方にあるＬＮＡを含んでよい。一実施形態では、少なくとも５つのＬＮＡ、５’末端にあるＬＮＡおよび／または３’末端にあるＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続したＬＮＡも有する。一部の実施形態では、配列は少なくとも１６ヌクレオチドの長さである。ｍｉＲＮＡのシード領域と相補的な配列は実質的に相補的であっても完全に相補的であってもよい。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）残基、または「ロックドヌクレオチド」を含んでよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）残基、または「ロックドヌクレオチド」を含有してよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、他の糖または塩基修飾を含有する１つまたは複数のヌクレオチドを含んでよい。「ロックドヌクレオチド」、「ロックド核酸単位」、「ロックド核酸残基」、「ＬＮＡ」または「ＬＮＡ単位」という用語は、本開示全体を通して互換的に使用することができ、二環式ヌクレオシド類似体を指す。例えば、適切なオリゴヌクレオチド阻害剤は、ＢＳＮを含有するオリゴヌクレオチドとそれらの相補的な標的鎖との間で形成される複合体に増強された熱安定性を付与する、１つまたは複数の「コンフォメーション的に制約された」または二環式糖ヌクレオシド修飾（ＢＳＮ）で構成されてよい。ＬＮＡは、例えば、全てが本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，２６８，４９０号；同第６，３１６，１９８号；同第６，４０３，５６６号；同第６，７７０，７４８号；同第６，９９８，４８４号；同第６，６７０，４６１号；および同第７，０３４，１３３号に記載されている。ＬＮＡは、「ロックド」コンフォメーションをもたらすリボース糖部分の２’炭素と４’炭素との間の追加の架橋、および／または二環式構造を含有する修飾されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ａによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含有する。その代わりにまたはそれに加えて、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ｂによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含有してよい。その代わりにまたはそれに加えて、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ｃによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含有する。
【化３】
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【００４６】
本発明に関しては、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドの、その対応するロックドヌクレオチドによる置換について言及する場合、「対応するロックドヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオチドが、それが置き換えられたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオチドと同じ天然に存在する窒素塩基または化学修飾された同じ窒素塩基を含有するロックドヌクレオチドによって置き換えられていることを意味するものとする。例えば、窒素塩基Ｃを含有するＤＮＡヌクレオチドの対応するロックドヌクレオチドは、同じ窒素塩基Ｃまたは化学修飾された同じ窒素塩基Ｃ、例えば５−メチルシトシンを含有してよい。
【００４７】
「非ロックドヌクレオチド」という用語は、ロックドヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを指す、すなわち、「非ロックドヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ならびに、修飾がロックド修飾ではないことを除いては、塩基および／または糖が修飾されたものである、修飾されたヌクレオチドを含む。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドに組み入れることができる他の適切なロックドヌクレオチドとしては、どちらも本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，４０３，５６６号および同第６，８３３，３６１号に記載されているものが挙げられる。
【００４９】
例示的な実施形態では、ロックドヌクレオチドは、例えば構造Ａに示されている２’−４’メチレン架橋を有する。他の実施形態では、架橋は、メチレン基またはエチレン基を含み、これは置換されていてもよく、そして２’位にエーテル結合を有しても有さなくてもよい。
【００５０】
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、塩基修飾または置換を有する修飾されたヌクレオチドを含んでよい。ＲＮＡ内の天然のまたは修飾されていない塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）（ＤＮＡはチミン（Ｔ）を有する）である。修飾された塩基は、複素環式塩基部分とも称され、それらとして、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシンを含む）、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−９２を標的とするオリゴヌクレオチド阻害剤は、１つまたは複数のＢＳＮ修飾（すなわち、ＬＮＡ）を塩基修飾（例えば、５−メチルシチジン）と組み合わせて含む。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、修飾された糖部分を有するヌクレオチドを含んでよい。代表的な修飾された糖としては、炭素環式または非環式糖、それらの２’位、３’位または４’位の１つまたは複数に置換基群を有する糖、および、糖の１つまたは複数の水素原子の代わりに置換基を有する糖が挙げられる。ある特定の実施形態では、糖は、２’位に置換基群を有することによって修飾されている。追加の実施形態では、糖は、３’位に置換基群を有することによって修飾されている。他の実施形態では、糖は、４’位に置換基群を有することによって修飾されている。糖がこれらの位置の１つ超に修飾を有してよいこと、またはオリゴヌクレオチド阻害剤が１つの位置に糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドならびに異なる位置にも糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを有してよいことも意図されている。
【００５２】
オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２に対するアンチセンス配列を含んでも、それから本質的になっても、それからなってもよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２を対象とするアンチセンス配列を含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−９２配列と少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、ヒト成熟ｍｉＲ−９２配列と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である配列を含んでよい。一実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤は、成熟ｍｉＲ−９２配列と１００％または完全に相補的である配列を含む。オリゴヌクレオチド阻害剤の配列は、オリゴヌクレオチド阻害剤配列が天然に存在するヌクレオチドの代わりに修飾されたヌクレオチドを含んでいたとしても、ｍｉＲ−９２と相補的であるとみなされることが理解される。例えば、ｍｉＲ−９２の成熟配列が特定の位置にグアノシンヌクレオチドを含む場合、オリゴヌクレオチド阻害剤は、対応する位置にロックドシチジンヌクレオチドまたは２’−フルオロ−シチジンなどの修飾されたシチジンヌクレオチドを含んでよい。
【００５３】
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、＋／−１０％、より好ましくは＋／−５％の変動を包含するものとし、そのような変動は本発明の実行に適するものである。
【００５４】
ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２のヌクレオチド配列と完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２と相補的なヌクレオチド配列を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。この場合、「から本質的になる」とは、５’末端と３’末端のいずれかまたはその両方への任意選択のヌクレオチドの付加（例えば、１つまたは２つ）を、追加のヌクレオチド（複数可）が、二重ルシフェラーゼアッセイまたは動物（例えば、マウス）モデルにおけるオリゴヌクレオチドによる標的ｍｉＲＮＡ活性の阻害に実質的に影響を及ぼさない（ＩＣ５０の増加が２０％以下であることによって定義される）限りは含む。
【００５５】
オリゴヌクレオチドは一般に、成熟ｍｉＲ−９２をターゲティングするようにデザインされたヌクレオチド配列を有する。オリゴヌクレオチドは、これらの実施形態または他の実施形態ではまた、ｍｉＲ−９２のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ形態またはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ形態もターゲティングするようにデザインされる場合もあり、代替的に、これらをターゲティングするようにデザインされる場合もある。ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、完全に相補的な（成熟）ｍｉＲ−９２配列と比べて、１〜５カ所（例えば、１、２、３、または４カ所）のミスマッチを含有する配列を有するようにデザインすることができる。ある種の実施形態では、このようなアンチセンス配列を、例えば、ステム部分およびループ部分を含有するｓｈＲＮＡ構造内または他のＲＮＡ構造内に組み込むことができる。
【００５６】
オリゴヌクレオチドは、８〜２０ヌクレオチドの長さ、１５〜５０ヌクレオチドの長さ、１８〜５０ヌクレオチドの長さ、１０〜１８ヌクレオチドの長さ、または１１〜１６ヌクレオチドの長さでありうる。オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１６ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、本発明は、１１〜１６ヌクレオチドの長さを有するｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。種々の実施形態では、ｍｉＲ−９２を標的とするオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、または１６ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１６ヌクレオチドの長さである。
【００５７】
一般に、ＬＮＡの数および位置は、オリゴヌクレオチドによりｍｉＲ−９２の活性または機能が低下するようなものであり得る。一実施形態では、ＬＮＡの数および位置は、オリゴヌクレオチドの有効性が対照と比較して増大するようなものである。一部の実施形態では、有効性とは、有益なまたは所望の結果（例えば、臨床結果）を生じさせる能力である。有益なまたは所望の結果とは、疾患または状態の症状（１つまたは複数）の低下、好転、または除去であってよい。有益なまたは所望の結果は、ｍｉＲ−９２の活性または機能の阻害、低下、好転、または除去であってよい。有効性の増大は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏにおける増大であってよい。対照は、本明細書に提供されるＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドと同じ配列を含有するが化学修飾は含有しないオリゴヌクレオチドであってよい。対照は、本明細書に提供されるＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドと同じ配列を含有するが、異なる化学修飾モチーフまたはパターンを含有するオリゴヌクレオチドであってよい。対照は、本明細書に提供されるＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドと同じ配列を含有するが、数および／または位置が異なるＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドであってよい。対照は、同じ配列ならびに同じ数および／または位置のＬＮＡを含有するが、１つまたは複数の５−メチルシトシンの存在など、異なる追加の修飾を含有するオリゴヌクレオチドであってよい。
【００５８】
本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、一般には、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約７つ、または少なくとも約９つのＬＮＡを含有するが、種々の実施形態では、完全にＬＮＡで構成されるのではない。一般に、ＬＮＡの数および位置は、オリゴヌクレオチドによりｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの機能または活性が低下するようなものである。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４つより多くまたは３つより多く連続したＬＮＡを有するひと続きのヌクレオチドを含有しない。例えば、オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続したＬＮＡを含む。これらまたは他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡシード領域と実質的にまたは完全に相補的であり、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのロックドヌクレオチドを含む領域または配列を含んでよい。
【００５９】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのＤＮＡヌクレオチドを含有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１つのＬＮＡを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤内の各非ロックドヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも２つのＬＮＡを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤内の各非ロックドヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。一実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのＤＮＡヌクレオチドが化学修飾された窒素塩基を含有する。一実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から２番目のヌクレオチドは化学修飾された窒素塩基を含有する。化学修飾された窒素塩基は、５−メチルシトシンであってよい。一実施形態では、５’末端から２番目のヌクレオチドは、５−メチルシトシンである。一実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤は、シトシンである各ＬＮＡに５−メチルシトシンを含む。
【００６０】
一実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１６ヌクレオチドの配列を含み、配列は、ｍｉＲ−９２の成熟配列と少なくとも部分的にまたは完全に相補的であり、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、少なくとも最初のヌクレオチド位置および最後のヌクレオチド位置はＬＮＡである。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１３ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１４ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１５ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１６ヌクレオチドの長さを有する。オリゴヌクレオチドは、完全なまたは部分的な（すなわち、１つまたは複数の）ホスホロチオエート骨格を有してよい。オリゴヌクレオチドは、これだけに限定されないが、１つまたは複数の化学修飾された窒素塩基、５’および／もしくは３’キャップ構造、ペンダント親油基および／または２’デオキシ、２’Ｏ−アルキルもしくは２’ハロ修飾（複数可）を含めた、本明細書に提供される任意の追加の修飾をさらに含んでよい。ある特定の実施形態では、１２ヌクレオチドから１６ヌクレオチドまでの配列を含むｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、化学修飾された窒素塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。化学修飾された窒素塩基は、メチル化された塩基であってよい。ある特定の実施形態では、化学修飾された窒素塩基は、５−メチルシトシンである。一実施形態では、シトシンである各ＬＮＡは、５−メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、化学修飾された窒素塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、５−メチルシトシン）を含む本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤は、化学修飾された窒素塩基を欠く同じオリゴヌクレオチド阻害剤と比較して、有効性の増大を示す。有効性の増大は、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性の低下または阻害の増大であってよい。有効性の増大は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるものであってよい。
【００６１】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１３〜１６ヌクレオチドの配列を含んでよく、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、１位、６位、１０位、１１位および１３位はＬＮＡであり、残りの位置は非ロックドヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのシード領域と少なくとも部分的に相補的であり、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２であってよい。オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと完全に相補的であってよく、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２であってよい。一部の実施形態では、少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドは、化学修飾された窒素塩基を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、２番目のヌクレオチド位置に化学修飾された窒素塩基を含有するヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、２番目のヌクレオチド位置はシトシンであり、化学修飾された窒素塩基は５−メチルシトシンである。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤における化学修飾された窒素塩基（複数可）（例えば、５−メチルシトシン）が存在すると、同じ数および／または位置のＬＮＡを有するが、化学修飾された窒素塩基（例えば、５−メチルシトシン）は有さないオリゴヌクレオチドと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける有効性が増大した。有効性の増大は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−９２）の機能および／または活性の低下の増大であってよい。
【００６２】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１６ヌクレオチドを含んでよく、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１４位、および１６位はＬＮＡであり、残りの位置は非ロックドヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのシード領域と少なくとも部分的に相補的であり、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２であってよい。オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと完全に相補的であってよく、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２であってよい。一部の実施形態では、５’末端から２番目のヌクレオチドは、化学修飾された窒素塩基（例えば、５−メチルシトシン）を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤における化学修飾された窒素塩基（複数可）（例えば、５−メチルシトシン）が存在すると、同じ数および／または位置のＬＮＡを有するが、化学修飾された窒素塩基（例えば、５−メチルシトシン）は有さないオリゴヌクレオチドと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける有効性が増大した。有効性の増大は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−９２）の機能および／または活性の低下の増大であってよい。
【００６３】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１６ヌクレオチドを含んでよく、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位、および１６位はＬＮＡであり、残りの位置は非ロックドヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのシード領域と少なくとも部分的に相補的であり、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２であってよい。オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと完全に相補的であってよく、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２であってよい。一部の実施形態では、５’末端から２番目のヌクレオチドは、化学修飾された窒素塩基（例えば、５−メチルシトシン）を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤における化学修飾された窒素塩基（複数可）（例えば、５−メチルシトシン）が存在すると、同じ数および／または位置のＬＮＡを有するが、化学修飾された窒素塩基（例えば、５−メチルシトシン）は有さないオリゴヌクレオチドと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける有効性が増大した。有効性の増大は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−９２）の機能および／または活性の低下の増大であってよい。
【００６４】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１６ヌクレオチドを含んでよく、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、９位、１０位、１１位、１３位、１４位、および１６位はＬＮＡであり、残りの位置は非ロックドヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのシード領域と少なくとも部分的に相補的であり、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２であってよい。オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと完全に相補的であってよく、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２であってよい。一部の実施形態では、５’末端から２番目のヌクレオチドは、化学修飾された窒素塩基（例えば、５−メチルシトシン）を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤における化学修飾された窒素塩基（複数可）（例えば、５−メチルシトシン）が存在すると、同じ数および／または位置のＬＮＡを有するが、化学修飾された窒素塩基（例えば、５−メチルシトシン）は有さないオリゴヌクレオチドと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける有効性が増大した。有効性の増大は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−９２）の機能および／または活性の低下の増大であってよい。
【００６５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは表１または２から選択される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表２から選択されるオリゴヌクレオチド阻害剤である。
【００６６】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤）は、標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−９２）の他の阻害剤と比較して、標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−９２）の機能および／または活性の少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９９％大きな阻害を示す。改善または増大は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものであってよい。
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書に提供される５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤）により、同じヌクレオチド配列ならびにＬＮＡ／ＤＮＡパターンを有するが５−メチルシトシンを欠くオリゴヌクレオチドと比較して、標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−９２）の機能および／または活性の低下の少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９９％の増大または改善がもたらされる。改善または増大は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものであってよい。一部の場合では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤の全てのＬＮＡシトシンは、５−メチルシトシンＬＮＡである。
【００６８】
非ロックドヌクレオチドについての一部の実施形態では、ヌクレオチドは、２’ヒドロキシルに関して２’修飾を含有してよい。例えば、２’修飾は２’デオキシであってよい。２’修飾されたヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れることにより、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する抵抗性が増大し得る。２’修飾されたヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れることにより、相補的なＲＮＡとのそれらの熱安定性が増大し得る。２’修飾されたヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れることにより、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する抵抗性および相補的なＲＮＡとのそれらの熱安定性の両方が増大し得る。２’位における種々の修飾は、独立に、ＲＮＡ標的または細胞機構との分子相互作用を損なうことなくヌクレアーゼ感受性の増大をもたらす修飾から選択することができる。そのような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの効力の増大に基づいて選択することができる。ｍｉＲ−９２の阻害に関する効力の増大（例えば、ＩＣ５０）を決定するための例示的な方法は、二重ルシフェラーゼアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍｉＲ−９２の存在度または標的抑制解除を含むが、これに限定されず、本明細書に記載されている。 
【００６９】
一部の実施形態では、２’修飾は、独立に、Ｏ−アルキル（置換されていてもよい）、ハロ、およびデオキシ（Ｈ）から選択することができる。ある特定の実施形態では、非ロックドヌクレオチドの実質的に全てまたは全てのヌクレオチドの２’位を、例えば、独立に、Ｏ−アルキル（例えば、Ｏ−メチル）、ハロ（例えば、フルオロ）、デオキシ（Ｈ）、およびアミノから選択される通り修飾することができる。例えば、２’修飾は、各々独立に、Ｏ−メチル（ＯＭｅ）およびフルオロ（Ｆ）から選択することができる。例示的な実施形態では、プリンヌクレオチドは各々２’ＯＭｅを有し、ピリミジンヌクレオチドは各々２’−Ｆを有する。ある特定の実施形態では、１つ〜約５つの２’位、または約１つ〜約３つの２’位が修飾されていないままである（例えば、２’ヒドロキシルのように）。
【００７０】
本発明による２’修飾は、小さな炭化水素置換基も含み得る。炭化水素置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシアルキルが挙げられ、アルキル（アルコキシのアルキル部分を含む）、アルケニルおよびアルキニルは置換されていても置換されていなくてもよい。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル、アルケニルまたはアルキニル、例えば、Ｃ１、Ｃ２、またはＣ３などであってよい。炭化水素置換基は、１つまたは２つまたは３つの非炭素原子を含んでよく、これは、独立に、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、および／または硫黄（Ｓ）から選択することができる。２’修飾は、アルキル、アルケニル、およびアルキニルをＯ−アルキル、Ｏ−アルケニル、およびＯ−アルキニルとしてさらに含んでよい。
【００７１】
本発明による２’修飾の例としては、２’−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’ＯＭｅまたは２’ＯＥｔなど）置換、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）置換、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）置換、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）置換が挙げられ得る。
【００７２】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−ハロ修飾（例えば、２’ヒドロキシルの代わりに）、例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ、および２’−ヨードなどを含有する。一部の実施形態では、２’ハロ修飾はフルオロである。オリゴヌクレオチドは、１つ〜約５つの２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）、または１つ〜約３つの２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）を含有してよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全ての２’−フルオロヌクレオチドを非ロックド位に含有する、または全ての非ロックドピリミジンヌクレオチド上に２’−フルオロを含有する。ある特定の実施形態では、２’−フルオロ基は、独立に、ジメチル化されている、トリメチル化されている、またはメチル化されていない。
【００７３】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の２’−デオキシ修飾（例えば、２’ヒドロキシルについてのＨ）を有してよく、一部の実施形態では、２〜約１０の２’−デオキシ修飾を非ロックド位に含有する、または、全ての非ロックド位に２’デオキシを含有する。
【００７４】
例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅに修飾された２’位を非ロックド位に含有する。あるいは、非ロックドプリンヌクレオチドは２’位で２’ＯＭｅに修飾されており、非ロックドピリミジンヌクレオチドは２’位で２’−フルオロに修飾され得る。
【００７５】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端修飾または「キャップ」をさらに含む。キャップは、５’および／または３’キャップ構造であってよい。「キャップ」または「末端キャップ」という用語は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端における化学修飾（末端リボヌクレオチドに関して）を含み、そして５’末端上の最後の２つのヌクレオチドと３’末端上の最後の２つのヌクレオチドの間の連結における修飾を含む。本明細書に記載のキャップ構造により、ｍｉＲＮＡ標的（すなわち、ｍｉＲ−９２）または細胞機構との分子相互作用を損なうことなくオリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させることができる。そのような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの効力の増大に基づいて選択することができる。キャップは５’末端に存在してもよく（５’キャップ）、３’末端に存在してもよく（３’キャップ）、両末端上に存在してもよい。ある特定の実施形態では、５’キャップおよび／または３’キャップは、独立に、ホスホロチオエートモノホスフェート、脱塩基残基（部分）、ホスホロチオエート結合、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、反転ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）または反転脱塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ）部分（２’−３’または３’−３’）、ホスホロジチオエートモノホスフェート、およびメチルホスホネート部分から選択される。ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合（複数可）は、キャップ構造の一部である場合、一般に、５’末端上の２つの末端ヌクレオチドと３’末端上の２つの末端ヌクレオチドの間に配置される。
【００７６】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する。ホスホロチオエートモノホスフェートは、エキソヌクレアーゼの作用を阻害することによってより高い効力を支持し得る。ホスホロチオエートモノホスフェートは、オリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にあってよい。ホスホロチオエートモノホスフェートは以下の構造によって定義され、式中、Ｂは塩基であり、Ｒは上記の２’修飾である：
【化４】
2018503646.tif 000006
【００７７】
キャップ構造によりロックドヌクレオチドの化学的性質を支持することができる場合、キャップ構造に本明細書に記載のＬＮＡを組み入れることができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、例えば、５’末端および３’末端上の最後の２つのヌクレオチド間に存在してもよく（例えば、キャップ構造の一部として）、リン酸ジエステル結合と交互に存在してもよい。これらのまたは他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端と３’末端のいずれかまたはその両方に少なくとも１つの末端脱塩基残基を含有してよい。脱塩基部分は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの一般に認識されているプリンヌクレオチド塩基またはピリミジンヌクレオチド塩基を含有しない。したがって、そのような脱塩基部分はヌクレオチド塩基を欠く、または１’位にヌクレオチド塩基ではない他の化学基を有する。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、例えば、逆脱塩基（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｂａｓｉｃ）ホスホルアミダイトが５’アミダイト（３’アミダイトの代わりに）を介してカップリングし、それにより５’−５’リン酸結合が生じた、逆脱塩基ヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端の逆脱塩基ヌクレオシドの構造が下に示されている。
【化５】
2018503646.tif 000007
【００７９】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含有してよい。ホスホロチオエート結合は、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼによる切断に対してより抵抗性にするために使用されて得る。例えば、ポリヌクレオチドは部分的にホスホロチオエート結合していてよく、例えば、ホスホロチオエート結合とリン酸ジエステル結合が交互になっていてよい。しかし、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは完全にホスホロチオエート結合している。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１つ〜５つまたは１つ〜３つのリン酸結合を有する。
【００８０】
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、本明細書によって参照により組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１１／５９５８８に記載されている１つまたは複数のカルボキシアミド修飾塩基を、そこに複素環置換基と共に開示されている例示的なピリミジンカルボキシアミド修飾の全てに関しても含めて有する。
【００８１】
修飾されたポリヌクレオチドを含めたオリゴヌクレオチドの固相合成による合成は周知であり、Caruthersら、Nucleic Acids Symp. Ser.、７巻：２１５〜２３頁（１９８０年）に概説されている。
【００８２】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表１および２から選択される配列を含み、表１および２では、「＋」または「ｌ」はヌクレオチドがＬＮＡであることを示し、「ｄ」はヌクレオチドがＤＮＡであることを示し、「ｓ」は２つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を示し、「ｍｄＣ」はヌクレオチドが５−メチルシトシンＤＮＡであることを示す。
【００８３】
【表１】
2018503646.tif 000008
【００８４】
【表２−１】
2018503646.tif 000009
【表２−２】
2018503646.tif 000010
【表２−３】
2018503646.tif 000011
【表２−４】
2018503646.tif 000012
【表２−５】
2018503646.tif 000013
【表２−６】
2018503646.tif 000014
【表２−７】
2018503646.tif 000015
【表２−８】
2018503646.tif 000016
【表２−９】
2018503646.tif 000017
【表２−１０】
2018503646.tif 000018
【表２−１１】
2018503646.tif 000019
【表２−１２】
2018503646.tif 000020
【００８５】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表１および２から選択される配列を含み、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロ修飾された少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−４’メチレン架橋を有する少なくとも１つのＬＮＡを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペンダント親油基を含む。
【００８６】
オリゴヌクレオチドは種々の高分子集合体または組成物に組み入れることができる。そのような送達用の複合体としては、患者に送達するために製剤化された種々のリポソーム、ナノ粒子、およびミセルを挙げることができる。複合体は、細胞膜透過を開始させるための１つまたは複数の融合性分子または親油性分子を含んでよい。そのような分子は、例えば、本明細書によってそれらの全体が参照により組み込まれる米国特許第７，４０４，９６９号および米国特許第７，２０２，２２７号に記載されている。代替的に、オリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／１２９６７２において記載されている親油性のペンダント基など、細胞内送達の一助となる親油性のペンダント基をさらに含みうる。
【００８７】
本発明はまた、細胞内のｍｉＲ−９２の活性または機能を低減または阻害するために、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを、細胞へと（例えば、本明細書で記載される組成物または処方物の一部として）送達するための方法も提供する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２と少なくとも部分的に相補的な配列を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは表１または２から選択される。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞または筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、創傷治癒に関与する。一部の実施形態では、細胞は、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある。
【００８８】
本明細書ではまた、被験体における状態の進行を処置、改善、または防止するための方法であって、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法も提示される。方法は一般に、オリゴヌクレオチドまたはこれを含む組成物を、被験体へと投与するステップを含む。「被験体」または「患者」という用語は、限定せずに述べると、ヒトおよび他の霊長動物（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種）を含む、任意の脊椎動物、農場動物（例えば、畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、愛玩用哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、およびモルモットなどの齧歯動物）、および鳥類（例えば、愛玩用鳥類、野生鳥類、ならびにニワトリなどの闘鶏用鳥類、シチメンチョウ、および他の家禽、カモ、ガチョウなど）を指す。いくつかの実施形態では、被験体は、哺乳動物である。他の実施形態では、被験体は、ヒトである。被験体は、ｍｉＲ−９２の発現に関連する、それによって媒介される、またはそれによって生じる状態を有してよい。
【００８９】
一実施形態では、被験体における血管新生を促進させる方法は、被験体に本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドを投与することを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２と少なくとも部分的に相補的な配列を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表１または２から選択される。一部の実施形態では、被験体は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）、または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患している。
【００９０】
一実施形態では、被験体における創傷治癒を促進する方法は、被験体に本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドなどのｍｉＲ−９２阻害剤を投与することを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２と少なくとも部分的に相補的な配列を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表１または２から選択される。一部の実施形態では、被験体は、糖尿病に罹患している。一部の実施形態では、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡の治癒は、ｍｉＲ−９２阻害剤の投与により促進される。
【００９１】
一実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤の投与により、ｍｉＲ−９２阻害剤を投与していない創傷と比較して、創傷の再上皮化または創傷閉鎖において少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の改善がもたらされる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤の投与により、ｍｉＲ−９２阻害剤を投与していない創傷と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い肉芽組織形成または新生血管形成がもたらされる。
【００９２】
一実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤の投与により、創傷を処置するための当技術分野で公知の薬剤を投与した創傷と比較して、創傷の再上皮化または創傷閉鎖において少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の改善がもたらされる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤の投与により、創傷を処置するための当技術分野で公知の薬剤を投与した創傷と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い肉芽組織形成または新生血管形成がもたらされる。薬剤は、例えば血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および／または血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの成長因子であってよい。
【００９３】
ｍｉＲ−９２のアゴニストも本明細書に提供される。ｍｉＲ−９２のアゴニストは成熟ｍｉＲ−９２配列を含むオリゴヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を含む。成熟ｍｉＲ−９２、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２、またはｐｒｉ−ｍｉＲ−９２配列を含むオリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一実施形態では、ｍｉＲ−９２アゴニストは、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さ、約１８〜約３０ヌクレオチドの長さ、約２０〜約２５ヌクレオチドの長さ、または約１０〜約１４ヌクレオチドの長さであってよい。ｍｉＲ−９２アゴニストは、ｍｉＲ−９２の成熟配列、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってよい。オリゴヌクレオチドであるｍｉＲ−９２アゴニストは、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾などの糖修飾、ならびに１つまたは複数のホスホロチオエート、モルホリノ、またはホスホノカルボン酸結合などの骨格修飾などの、１つまたは複数の化学修飾を含有してよい。一実施形態では、ｍｉＲ−９２配列を含むオリゴヌクレオチドは、コレステロールとコンジュゲートしている。ｍｉＲ−９２配列を含むオリゴヌクレオチドは、ベクターから、および／またはプロモーターに作動可能に連結して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現させることができる。別の実施形態では、ｍｉＲ−９２のアゴニストは、ｍｉＲ−９２の機能を増大させる、補う、または置き換えるように作用する、ｍｉＲ−９２とは別個の薬剤であってよい。
【００９４】
本発明は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物もさらに提供する。臨床適用が想定される場合、医薬組成物は、意図される適用に適する形態で調製され得る。一般に、これは、発熱物質のほか、ヒトまたは動物に有害でありうる他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
【００９５】
一実施形態では、医薬組成物は、有効用量のｍｉＲ−９２阻害剤と、薬学的に許容されるキャリアとを含む。例えば、医薬組成物は、有効用量または有効量の、本発明のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む。オリゴヌクレオチドは、表１および表２から選択することができる。
【００９６】
一部の実施形態では、「有効用量」は、有益なまたは所望の臨床結果に影響を及ぼすために十分な量である。「有効用量」は、疾患および／または状態の症状（１つまたは複数）を実質的に低下させる、排除するまたは好転させるために十分なまたは必要な量であり得る。これは、無処置の被験体に対して相対的なものであってよい。「有効用量」は、被験体における病態を遅らせる、安定化する、予防する、またはその重症度を低下させるために十分なまたは必要な量であり得る。これは、無処置の被験体に対して相対的なものであってよい。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの有効用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇでありうる。一部の実施形態では、有効用量は、創傷エリアに適用されるオリゴヌクレオチドの量である。一部の実施形態では、有効用量は、創傷エリア１ｃｍ２当たり約０．０１ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約５０ｍｇ  創傷エリア１ｃｍ２当たりｍｇ、創傷エリア１ｃｍ２当たり約０．０２ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約２０ｍｇ、創傷エリア１ｃｍ２当たり約０．１ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約１０ｍｇ、創傷エリア１ｃｍ２当たり約１ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約１０ｍｇ、創傷エリア１ｃｍ２当たり約２．５ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約５０ｍｇ、または創傷エリア１ｃｍ２当たり約５ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約２５ｍｇ、または約０．０５〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約２５ｍｇである。有効用量と考えられる量の正確な決定は、患者の体格、年齢、を含む、各患者に個別の因子と、オリゴヌクレオチドの性質（例えば、溶融温度、ＬＮＡ含量など）とに基づきうる。したがって、当業者は、投与量を、本開示および当技術分野における知見から、たやすく確認することができる。いくつかの実施形態では、方法は、有効用量の医薬組成物を、毎日１、２、３、４、５、または６回投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、投与は、毎週１、２、３、４、５、６または７回である。他の実施形態では、投与は、隔週または毎月である。
【００９７】
コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めた脂質ベースの系を、ｍｉＲ−９２機能のオリゴヌクレオチド阻害剤の送達ビヒクルとして使用することができる。本発明の核酸を心臓組織および骨格筋組織に送達するために適した市販の脂肪エマルションとして、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の同様の脂質エマルションが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達ビヒクルとして使用するのに好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は当技術分野において周知である。例示的な製剤は、全てが本明細書によってその全体が参照により組み込まれる、米国特許第５，９８１，５０５号；同第６，２１７，９００号；同第６，３８３，５１２号；同第５，７８３，５６５号；同第７，２０２，２２７号；同第６，３７９，９６５号；同第６，１２７，１７０号；同第５，８３７，５３３号；同第６，７４７，０１４号；およびＷＯ０３／０９３４４９にも開示されている。
【００９８】
ある特定の実施形態では、送達のために使用されるリポソームは、米国付与前公開第２０１１００７６３２２号に詳しく記載されているＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）のような両性リポソームである。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）上の表面電荷は、完全に可逆的であり、それにより、核酸の送達に特に適したものになっている。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）は、注射によって送達することができ、安定なままであり、凝集せず、かつ、細胞膜を渡って核酸を送達する。
【００９９】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−９２ａのオリゴヌクレオチド阻害剤）はいずれも、標的細胞（例えば、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞）に、細胞にオリゴヌクレオチド阻害剤をコードする発現ベクターを送達することにより、送達することができる。「ベクター」は、目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。これだけに限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含めた多数のベクターが当技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製性プラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、これだけに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。特定の一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。発現構築物は、生細胞において複製することもでき、合成により作製することもできる。本出願の目的に関しては、「発現構築物」、「発現ベクター」および「ベクター」という用語は、一般的な例示的な意味で本発明の適用を示すために互換的に使用され、本発明を限定するものではない。
【０１００】
一実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−９２ａのオリゴヌクレオチド阻害剤）を発現させるための発現ベクターは、オリゴヌクレオチド阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。「作動可能に連結した」または「転写制御下」という句は、本明細書で使用される場合、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドとの関連で妥当な位置および配向にあることを意味する。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」とは、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要な細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。適切なプロモーターとしては、これだけに限定されないが、ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ、およびウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルスの長い末端反復）が挙げられる。一実施形態では、プロモーターは、例えばＦＳＰ１プロモーターなどの線維芽細胞（fibroplast）特異的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、例えばＩＣＡＭ−２プロモーターなどの内皮特異的プロモーターである。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−９２ａのオリゴヌクレオチド阻害剤）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターは、誘導性プロモーターであってよい。誘導性プロモーターは、当技術分野で公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、および誘導性マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲが挙げられる。
【０１０３】
発現構築物および核酸を細胞に送達する方法は、当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、リン酸カルシウム共沈澱、電気穿孔、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクション、細胞超音波処理、高速微粒子銃を使用した遺伝子銃撃、および受容体媒介性トランスフェクションを挙げることができる。
【０１０４】
一般に、送達ビヒクルを安定なものにし、標的細胞による取り込みを可能にするために、適切な塩およびバッファを用いることが望まれる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容されるキャリアまたは水性媒体に溶解または分散させた阻害剤ポリヌクレオチド（例えば、リポソーム、もしくは他の複合体、まあは発現ベクター）を含む送達ビヒクルを有効量で含み得る。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という句は、動物またはヒトに投与した際に有害な反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるキャリア」は、ヒトに投与するために適した医薬品などの医薬品の製剤化において使用するために許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の媒質または薬剤が、本発明の有効成分に不適合である場合を除き、治療用組成物中のその使用が想定される。また、補助的有効成分も、それらが組成物のオリゴヌクレオチドを不活化しない限りにおいて、組成物へと組み込むことができる。
【０１０５】
本発明の活性組成物は、古典的な医薬調製物を含みうる。本発明に従うこれらの組成物の投与は、標的組織が、その経路を介して到達可能である限りにおいて、任意の一般的な経路を介しうる。これは、経口経路、鼻腔内経路、または口腔内経路を含む。代替的に、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、動脈内注射、または静脈内注射も介しうる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、肺組織または心臓組織への注射を指向する。一部の実施形態では、医薬組成物を創傷エリアに直接注射する。一部の実施形態では、医薬組成物を創傷エリアに局所的に適用する。
【０１０６】
ｍｉＲ−９２阻害剤を含む医薬組成物は、カテーテルシステムまたは治療剤を心臓および肺に送達するために冠循環／肺循環を隔離するシステムによって投与することもできる。治療剤を心臓および冠血管系に送達するための種々のカテーテルシステムが当該技術分野で公知である。本発明において使用するために適したカテーテルに基づく送達方法または冠血管の隔離方法のいくつかの非限定的な例は、全て本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，４１６，５１０号；同第６，７１６，１９６号；および同第６，９５３，４６６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０８２４４０号および同第ＷＯ２００６／０８９３４０号；および米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、同第２００６／０１４８７４２号、および同第２００７／００６０９０７号に開示されている。そのような組成物は、通常、本明細書に記載の薬学的に許容される組成物として投与される。
【０１０７】
活性化合物はまた、非経口的にまたは腹腔内に投与することもできる。例示として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩として活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性物質と適切に混合されている水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ならびにそれらの混合物中、および油中で分散液を調製することもできる。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、一般に、微生物の成長を予防するために防腐剤を含有する。
【０１０８】
注射用の使用、カテーテルによる送達、または吸入による送達に適する薬学的形態は、例えば、滅菌水溶液または滅菌水性分散液および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液（例えば、エアゾール溶液、ネブライザー溶液）の即席調製のための滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、容易な注射可能性またはエアゾール化／噴霧化がなされる程度に滅菌であり、かつ、流体である。調製物は製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有してよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性物質を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【０１０９】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤を含む組成物は、創縁または創床への投与などの局所適用に適する。一部の実施形態では、組成物は、水、食塩水、ＰＢＳまたは他の水溶液を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、ローション、クリーム、軟膏、ゲルまたはハイドロゲルの状態である。一部の実施形態では、局所適用に適した組成物は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、または脂質ベースの系（例えば、水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム）を送達ビヒクルとして含む。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、乾燥粉末の形態であるか、または創傷被覆材に組み入れられている。
【０１１０】
滅菌注射用溶液は、濾過滅菌の前に、所望の通り、適量のコンジュゲートを任意の他の成分（例えば、上に列挙されているもの）と一緒に溶媒中に組み入れることによって調製することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および所望の他の成分、例えば、上に列挙されているものを含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法として、活性成分（複数可）と任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過したその溶液から得る真空乾燥技法および凍結乾燥技法が挙げられる。いくつかの実施形態では、滅菌粉末は、例えば、粉体噴霧器または吸入デバイスにより、被験体へと直接（すなわち、希釈剤中の再構成を伴わずに）投与することができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤の投与は、創傷（例えば、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡）へなどの皮下注射または皮内注射による。投与は、創縁または創床へなど、創傷部位におけるものであってよい。
【０１１２】
本発明の組成物は一般に、中性形態または塩形態で製剤化することができる。薬学的に許容可能な塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）に由来する酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）を含む。また、タンパク質の遊離カルボキシル基により形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）に由来する場合もあり、有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）に由来する場合もある。
【０１１３】
製剤化されたら、溶液は、投薬製剤と適合する様式で、かつ治療的に有効な量で投与されることが好ましい。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル剤、単一用量吸入器などの種々の剤形で容易に投与することができる。水溶液中で非経口投与するためには、例えば、一般に、溶液を適切に緩衝し、液体希釈剤を、まず、例えば、十分な食塩水またはグルコースを用いて等張性にする。そのような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、動脈内投与および腹腔内投与のために使用することができる。滅菌水性媒体を当業者に公知の通り、特に本開示に照らして使用することが好ましい。例示として、単一用量を等張性ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解させ、皮下注入用液１０００ｍｌに添加するか、または提案される注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。治療されている被験体の状態に応じて投与量のいくらかの変動が必ず生じる。投与を担当する人は、いかなる場合においても、個々の被験体に適した用量を決定する。さらに、ヒトに投与するためには、調製物は、必要に応じてＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによる滅菌、発熱性、ならびに一般的な安全性および純度の基準に適合するべきである。
【０１１４】
組成物または処方物は、本明細書で記載される少なくとも１つの治療用オリゴヌクレオチドを含む、複数の治療用オリゴヌクレオチドを援用しうる。例えば、組成物または処方物は、本明細書で記載される、少なくとも２、３、４、または５つのｍｉＲ−９２阻害剤を援用しうる。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、他の治療モダリティーと組み合わせて使用することができる。組合せはまた、細胞を、複数の顕著に異なる組成物または処方物と同時に接触させることにより達成することもできる。代替的に、組合せは、逐次的に投与することもできる。
【０１１５】
本発明の一実施形態ではｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤を、他の治療モダリティーと組み合わせて使用する。組合せ療法の例は、前出のうちのいずれかを含む。組合せは、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的処方物により達成することもでき、２つの顕著に異なる組成物または処方物であって、一方の組成物が、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤を含み、もう一方の組成物が他の薬剤を含む組成物または処方物の同時的な組合せにより達成することもできる。代替的に、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤を使用する治療は、数分間〜数週間の範囲の間隔で、他の薬剤の投与に先行する場合もあり、これに後続する場合もある。他の薬剤とｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤とを、細胞へと個別に適用する実施形態では、薬剤とｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤とが、有利に組み合わされた効果を細胞に対して及ぼすことがやはり可能であるように、各送達時点の間でそれほど長い時間が経過しないことが一般に確認される。このような場合は典型的に、細胞を、互いから約１２〜２４時間以内に、互いから約６〜１２時間以内に、または遅延時間を約１２時間に限って、両方のモダリティーと接触させることが想定される。しかし、それぞれの投与の間で、数日間（２、３、４、５、６、または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過するいくつかの状況では、処置のための期間を著明に延長することが所望でありうる。
【０１１６】
一実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤または他の薬剤の複数回の投与が所望となる。この点で、多様な組合せを援用することができる。例示を目的として述べると、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤が「Ａ」であり、他の薬剤が「Ｂ」である場合、合計３回および４回の投与に基づく以下の順列：Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂを、例として提示する。他の組合せも同様に想定される。他の薬剤および治療の具体例を、下記に提供する。
【０１１７】
本発明の一実施形態では、血管新生を促進することを必要とする被験体において血管新生を促進する方法は、被験体に、本明細書に記載のｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤などのｍｉＲ−９２阻害剤および血管新生を促進する別の薬剤を投与することを含む。本発明の一実施形態では、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）を処置または予防することを必要とする被験体において末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）を処置または予防する方法は、被験体に、本明細書に記載のｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤などのｍｉＲ−９２阻害剤を投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤と一緒に別の薬剤を投与することをさらに含む。他の薬剤は、血管新生を促進し得るか、またはアテローム性動脈硬化症もしくは末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）を処置するために使用される薬剤であってよい。他の薬剤は、ホスホジエステラーゼ３型阻害剤（シロスタゾールなど）、スタチン、抗血小板薬、Ｌ−カルニチン、プロピオニル−Ｌ−カルニチン、ペントキシフィリン、またはナフチドロフリルであってよい。末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）を処置または予防することを必要とする被験体において末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）を処置または予防する方法は、被験体にｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することも含んでよく、ここで、被験体はまた、遺伝子療法（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＩＦ−１α、ＨＧＦ、またはＤｅｌ−１などの血管新生促進因子を用いた）、細胞療法、および／または抗血小板療法も受けているかまたは受ける予定である。一部の実施形態では、方法は、被験体にｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤および抗菌物質を投与することを含む。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、創傷治癒を促進することを必要とする被験体において創傷治癒を促進する方法は、被験体に本明細書に記載のｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤などのｍｉＲ−９２阻害剤を投与することを含む。一実施形態では、被験体は糖尿病を有する。一部の実施形態では、被験体は、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡を有する。別の実施形態では、被験体は末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）を有する。一部の実施形態では、方法は、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤と一緒に別の薬剤を投与することをさらに含む。他の薬剤は、例えば上記の、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）を処置するために使用される薬剤であってよい。一部の実施形態では、他の薬剤は、創傷治癒を促進する、または糖尿病を処置するために使用される。他の薬剤は、血管新生促進因子であってよい。一部の実施形態では、他の薬剤は、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦなどの成長因子である。一部の実施形態では、他の薬剤は、ＶＥＧＦ発現もしくは活性またはＰＤＧＦ発現もしくは活性を促進する。一部の実施形態では、他の薬剤は、同種異系皮膚代替物または生体包帯（例えば、Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡから入手可能なＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）またはＡｐｌｉｇｒａｆ（登録商標））、または、ベカプレルミン（Buchbergerら、Experimental and ClinicalEndocrinology and Diabetes、１１９巻：４７２〜４７９頁（２０１１年））などの血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ゲルである。一部の実施形態では、他の薬剤は、デブリードマン用薬剤または抗菌剤である。
【０１１９】
本発明はまた、一部において、ｍｉＲ−９２によって有意に制御される遺伝子の発見にも基づく。したがって、本発明の別の態様は、血管新生または創傷治癒を調節するための治療薬の有効性を、治療薬を受けている被験体において評価またはモニタリングするための方法であって、被験体から試料を得ること；試料中の、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により治療薬の有効性が示されることを含む方法である。一部の実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する。治療薬は、表１および２から選択されるｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤などのｍｉＲ−９２アンタゴニストであってよい。他の実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−９２模倣物などのｍｉＲ−９２アゴニストである。一部の実施形態では、被験体は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患している。一部の実施形態では、被験体は、糖尿病、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡に罹患している。
【０１２０】
一部の実施形態では、血管新生または創傷治癒を調節するための治療薬の有効性を、治療薬を受けている被験体において評価またはモニタリングする方法は、被験体における血管新生を評価する、別の診断アッセイまたは試験を実施することをさらに含む。一部の実施形態では、血管新生を調節するための治療薬の有効性を評価またはモニタリングするための追加の診断アッセイまたは試験は、被験体に対する歩行時間試験、足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）、動脈造影もしくは血管造影、またはＳＰＥＣＴ分析である。
【０１２１】
本発明の別の態様は、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する治療薬を用いた処置のために被験体を選択するための方法であって、被験体から試料を得ること；試料中の、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の１つまたは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により被験体が治療薬を用いた処置のために選択されるべきかどうかが示されることを含む方法である。一部の実施形態では、治療薬は、表１および２から選択されるｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤などのｍｉＲ−９２アンタゴニストである。他の実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−９２模倣物などのｍｉＲ−９２アゴニストである。一部の実施形態では、被験体は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患している。一部の実施形態では、被験体は、糖尿病、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡に罹患している。
【０１２２】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する治療薬を用いた処置のために被験体を選択するための方法は、治療薬を用いて処置した被験体から試料を得ることを含む。一部の実施形態では、被験体は治療薬を用いて処置せず、試料を治療薬で処理する。一部の実施形態では、被験体を、治療薬を用いて処置し、かつ試料を治療薬で処理する。一部の実施形態では、方法は、被験体における血管新生または創傷治癒を評価する、別の診断アッセイまたは試験を実施することをさらに含む。一部の実施形態では、血管新生を評価するための追加の診断アッセイまたは試験は、被験体に対する歩行時間試験、足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）、動脈造影もしくは血管造影、またはＳＰＥＣＴ分析である。
【０１２３】
歩行試験は、療法に応答した、最大または無痛の歩行時間の変化を測定するための非侵襲的トレッドミル試験であってよい。足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）は、超音波によって測定されるものなどの、上腕および足首で行う血圧測定であってよい。次いで、指数を上腕での血圧に対する足首での血圧の比として表すことができる。動脈造影は、動脈または静脈を通る血流を測定するための造影剤（contrast dye）法であってよい。ＳＰＥＣＴ（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）分析は、毛細血管を通る血流を測定するために放射線を使用する３−Ｄイメージングシステムを用いて実施することができる。
【０１２４】
血管新生または創傷治癒を促進する薬剤の能力を評価するための方法であって、細胞を薬剤に接触させること；薬剤と接触させた細胞における、表３に列挙されている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中の１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、その比較により血管新生を促進する薬剤の能力が示されることを含む方法も本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、薬剤と接触させた細胞におけるｍｉＲ−９２の機能および／または活性を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞または筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、創傷治癒に関与する。一部の実施形態では、細胞は、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある。
【０１２５】
遺伝子の発現の測定または検出は、当業者に公知の任意の様式で実施することができ、遺伝子のレベルを測定または検出するためのそのような技法は周知であり、容易に用いることができる。遺伝子発現レベルは、遺伝子のｍＲＮＡレベルまたは遺伝子によりコードされるタンパク質のタンパク質レベルを測定することによって決定することができる（may be determined measuring）。遺伝子発現を検出するための種々の方法が記載されており、それらとして、ウエスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、電気化学的方法、生物発光、生物発光タンパク質再集合、ＢＲＥＴに基づくもの（ＢＲＥＴ：生物発光共鳴エネルギー移動）、ＲＴ−ＰＣＲ、蛍光相関分光法および表面増強ラマン分光法が挙げられる。市販のキットも使用することができる。遺伝子発現を検出するための方法は、ハイブリダイゼーションに基づく技術プラットフォームおよび複数の遺伝子を同時に検出することを可能にする大規模並列処理次世代配列決定（massively-parallel next generation sequencing）を含み得る。
【０１２６】
一部の実施形態では、被験体において状態（例えば、末梢動脈疾患または創傷）を処置するための治療薬の治療有効性を決定するための方法は、治療薬（例えば、ｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤）を用いた処置のために被験体を選択すること、治療薬（例えば、ｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤）を用いた処置のために被験体を選択すること、または血管新生または創傷治癒を促進する薬剤の能力を評価すること；表３から選択されるものなどの１つまたは複数の遺伝子のレベルを決定することを含む。
【０１２７】
試料（例えば、治療薬を投与されている被験体由来の試料、または、被験体もしくは細胞培養物由来の、治療薬で処理された試料）における遺伝子発現を、それぞれが参照レベルと称することができる、上記状態を有する被験体または健康な集団内の被験体由来の試料中に存在する遺伝子の標準の量と比較することができる。他の実施形態では、遺伝子発現のレベルを、対照試料（状態を有する被験体に由来しない試料）中のレベルと比較する、または処理されていない試料（例えば、治療薬を用いた処置前に被験体から取得した試料、または無処置の被験体から取得した試料、または、治療薬を用いて処理されていない細胞培養試料）中の遺伝子発現レベルと比較する。遺伝子の標準レベルは、正常な、健康な対照の被験体から得た十分に多数の試料中の遺伝子発現レベルを決定して所定の参照値または閾値を得ることによって決定することができる。本明細書で使用される場合、「参照値」とは、公知の試料から確認された遺伝子発現レベルの所定の値を指す。
【０１２８】
標準レベルは、治療薬を用いた処理前の試料中の遺伝子発現レベルを決定することによって決定することもできる。さらに、標準レベル情報および標準レベルを決定するための方法は、公的に入手可能なデータベース、ならびに他の供給源から得ることができる。一部の実施形態では、通常は試料中に存在しない、既知量の別の遺伝子を試料に添加し（すなわち、試料を既知量の外因性ｍＲＮＡまたはタンパク質を用いてスパイクする）、１つまたは複数の目的の遺伝子のレベルを、スパイクされたｍＲＮＡまたはタンパク質の既知量に基づいて算出する。１つまたは複数の遺伝子の測定されたレベルと、対照試料中の遺伝子の１つまたは複数の参照量またはレベルとの比較は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。
【０１２９】
本発明に従って、一部の実施形態では、対照試料（例えば、処置を受ける前の患者または無処置の患者における試料）中の遺伝子のレベルまたは所定の参照値と比較した、測定された遺伝子のレベルの差異（上昇または低下）により、治療薬の治療有効性、治療薬を用いた処置のための被験体の選択、または血管新生を促進もしくは阻害する薬剤の能力が示される。
【０１３０】
例えばＡＣＴＡ２、ＬＡＣＴＢ、ＳＥＳＮ１、およびＫＩＡＡ１５９８から選択される１つもしくは複数の遺伝子のレベルが対照試料中のレベルもしくは所定の参照値と比較して低下し、かつ／またはＬＰＣＡＴ４、ＭＹＯ５Ａ、ＥＲＧＩＣ２、ＬＥＰＲＥＬ２、ＳＥＲＰＩＮＤ１、ＴＳＰＡＮ８、ＩＴＧＡ５、ＮＯＭＡ／／／ＮＯＭＯ２／／／ＮＯＭＯ３、ＮＰＴＮ、ＣＤ９３、ＬＯＣ１００５０７２４６、ＭＡＮ２Ａ１、ＣＮＥＰ１Ｒ１、ＥＦＲ３Ａ、ＵＢＥ２Ｑ２、ＲＮＦ４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＦＺＤ６、ＭＹＯ１Ｃ、ＰＰＰ３ＣＢ、ＣＹＹＲ１、ＥＤＥＭ１、ＬＨＦＰＬ２、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＵＢＥ２Ｚから選択される１つもしくは複数の遺伝子のレベルが治療薬を投与されている被験体由来の試料もしくは治療薬で処理された試料において上昇した場合、結果から、治療薬がｍｉＲ−９２阻害剤であり、かつ／もしくは血管新生を促進すること、および／または被験体がｍｉＲ−９２治療薬（例えば、ｍｉＲ−９２阻害剤またはアゴニストを用いた）を用いた処置のために選択されるべきであることが示される。
【０１３１】
別の例では、ＡＣＴＡ２、ＬＡＣＴＢ、ＳＥＳＮ１、およびＫＩＡＡ１５９８から選択される１つもしくは複数の遺伝子のレベルが対照試料中のレベルもしくは所定の参照値と比較して上昇し、かつ／またはＬＰＣＡＴ４、ＭＹＯ５Ａ、ＥＲＧＩＣ２、ＬＥＰＲＥＬ２、ＳＥＲＰＩＮＤ１、ＴＳＰＡＮ８、ＩＴＧＡ５、ＮＯＭＡ／／／ＮＯＭＯ２／／／ＮＯＭＯ３、ＮＰＴＮ、ＣＤ９３、ＬＯＣ１００５０７２４６、ＭＡＮ２Ａ１、ＣＮＥＰ１Ｒ１、ＥＦＲ３Ａ、ＵＢＥ２Ｑ２、ＲＮＦ４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＦＺＤ６、ＭＹＯ１Ｃ、ＰＰＰ３ＣＢ、ＣＹＹＲ１、ＥＤＥＭ１、ＬＨＦＰＬ２、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＵＢＥ２Ｚから選択される１つもしくは複数の遺伝子のレベルが治療薬を投与された被験体由来の試料もしくは治療薬で処理された試料において低下した場合、結果から、治療薬が、ｍｉＲ−９２アゴニストであり、かつ／もしくは血管新生を阻害すること、および／または被験体がｍｉＲ−９２治療薬（例えば、ｍｉＲ−９２阻害剤またはアゴニストを用いた）を用いた処置のために選択されるべきであることが示される。
【０１３２】
試料採取方法は当業者に周知であり、任意の型の生体試料を得るための任意の適用可能な技法が意図されており、それを本発明の方法で用いることができる（例えば、Clinical Proteolytics: Methods and Protocols、Methods in Molecular Biology、４２８巻、AntoniaVlahou編、（２００８年）を参照されたい）。試料としては、ｍＲＮＡまたはタンパク質を単離することが可能な任意の生体試料を挙げることができる。そのような試料としては、血清、血液、血漿、全血およびそれらの誘導体、心臓組織、筋肉、皮膚、毛髪、毛包、唾液、口腔粘液、膣粘液、汗、涙、上皮組織、尿、精液（semen）、精液（seminal fluid）、精漿、前立腺液、尿道球腺液（カウパー腺液）、排泄物、生検材料、腹水、脳脊髄液、リンパ、心臓組織、ならびに他の組織抽出試料または生検材料を挙げることができ、一部の実施形態では、生体試料は、血漿または血清である。
【０１３３】
開示されている方法において使用するための生体試料は、治療薬の投与開始後の任意の時点で被験体から得ることができる。一部の実施形態では、試料は、治療介入開始の少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、または６カ月後に得る。一部の実施形態では、試料は、治療介入開始の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、６週間または８週間後に得る。一部の実施形態では、試料は、治療介入開始の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日後に得る。一部の実施形態では、試料は、治療介入開始の少なくとも１時間、６時間、１２時間、１８時間または２４時間後に得る。他の実施形態では、試料は、治療介入開始の少なくとも１週間後に得る。
【０１３４】
本発明の方法は、治療薬の処置レジメンを変更するための方法も含み得る。処置レジメンの変更は、これだけに限定されないが、治療介入の型、治療介入を投与するときの投与量、治療介入の投与の頻度、治療介入の投与経路、ならびに変化および／または改変が医師に周知である任意の他のパラメータを変化させることおよび／または改変することを含んでよい。
【０１３５】
一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入を継続するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入を中止するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入を改変するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入の投与量を増やすか減らすかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入の投薬頻度を変更するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入の投与の数または頻度を変更するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、１日当たり、１週間当たりの用量の数、１日当たりの回数を変更するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、投薬量を変更するかどうかを決定するために使用することができる。
【０１３６】
本発明を、限定的とみなされるべきではない、以下のさらなる例によりさらに例示する。当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態に多くの変化を施すことができ、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、やはり同様または類似の結果を得うることを察知する。
【実施例】
【０１３７】
（実施例１）
ＨＵＶＥＣにおいて、ｍｉＲ−９２ａの調節により複数の遺伝子が有意に制御される。
ＨＵＶＥＣに、ｍｉＲ−９２ａ（１ｎＭ）またはｍｉＲ−９２ａのオリゴヌクレオチド阻害剤（化合物Ａ；配列番号７；１０ｎＭ）を脂質媒介性トランスフェクションによってトランスフェクトし、４８時間後に、発現プロファイリングのためにＲＮＡを単離した。各処理について３回の個々の反復をプロファイリングした。ｍｉＲ−９２ａによる処理についての１つの試料はＱＣできず、したがって、分析から除いた。ｍｉＲ−９２ａによる処理細胞対無処理細胞について、示差的な発現（ＦＤＲ  ｐ値≦０．０５）に基づいて遺伝子を選択した。興味深いことに、図１に示されている通り、この遺伝子のシグネチャーは、ｍｉＲ−９２ａのオリゴヌクレオチド阻害剤によって相反的に制御される。抗ｍｉＲによって遺伝子のシグネチャー全体が相反的に制御されるという事実が顕著である。ｍｉＲ−９２ａ模倣物によって下方制御される遺伝子の全てがｍｉＲ−９２ａのオリゴヌクレオチド阻害剤によって上方制御され、ｍｉＲ−９２ａ模倣物に応答して上方制御される遺伝子はｍｉＲ−９２ａのオリゴヌクレオチド阻害剤によって下方制御される。これらの遺伝子は表３に列挙されている。
【表３−１】
2018503646.tif 000021
【表３−２】
2018503646.tif 000022
【０１３８】
図１に示されている遺伝子および表３に列挙されている遺伝子をＰｕｂＭｅｄ文献検索に供して、それらの潜在的な機能を同定した。血管の血管新生に関する機能を有することが報告されている遺伝子を表４に列挙する。表４にはまた、抗ｍｉＲまたはｍｉＲトランスフェクションに応答した遺伝子発現の倍数変化、ならびに遺伝子の３’ＵＴＲがｍｉＲ−９２ａの標的となるシード配列を含有するか否かも示す。
【表４】
2018503646.tif 000023
（実施例２）
ＨＵＶＥＣにおけるｍｉＲ−９２ａの調節による遺伝子制御の確認
【０１３９】
実施例１に記載の通り、ＨＵＶＥＣに、ｍｉＲ−９２ａ（５ｎＭ）またはｍｉＲ−９２ａのオリゴヌクレオチド阻害剤（アンタゴｍｉＲ；Ａ（配列番号７）；Ｂ（配列番号６３）；Ｃ（配列番号６４）；それぞれ５ｎＭ）を脂質媒介性トランスフェクションによってトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＲＮＡを単離し、実施例１においてマイクロアレイプロファイリングによって同定された標的の制御をリアルタイムＰＣＲによって評価した。図３に示されている通り、マイクロアレイプロファイリングによって同定された４つの遺伝子は、独立したＨＵＶＥＣ脂質トランスフェクション実験において、ｍｉＲ−９２ａ阻害に応答して上昇し、ｍｉＲ−９２ａ模倣物に応答して低下する。図３のレーダープロットは、オリゴヌクレオチドを伴わずに脂質を用いてトランスフェクトしたＨＵＶＥＣに対して正規化した、ｍｉＲ−９２ａ阻害剤または模倣物に応答したＭＡＮ２Ａ１、ＣＮＥＰ１Ｒ１、ＥＲＧＩＣ２、およびＣＤ９３の相対的な発現量を示す。太い黒い線は、変化がない場合の遺伝子発現を示し、矢印は、Ｄ対照オリゴトランスフェクションに応答した遺伝子発現を示す線を指す。
（実施例３）
ＨＵＶＥＣにおけるｍｉＲ−９２ａによるインテグリンα５発現の制御
【０１４０】
ｍｉＲ−９２ａの調節によるインテグリンα５の制御を、ＨＵＶＥＣにおいて、様々な濃度のｍｉＲ−９２ａ（模倣物）または抗ｍｉＲ−９２ａオリゴヌクレオチド（アンタゴｍｉＲ；Ａ（配列番号７）；Ｂ（配列番号６３）；Ｃ（配列番号６４））の脂質媒介性トランスフェクション（図２Ａ）または受動的送達（図２Ｂ）によって調査した。脂質媒介性トランスフェクションについては、薬剤を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、または５０ｎＭでトランスフェクトし、一方、オリゴヌクレオチドの受動的送達については、細胞を、０．０１μＭ、０．１μＭ、または１μＭの濃度の、図２Ｂに示されているオリゴヌクレオチドに曝露した。図２Ａに示されている通り、脂質媒介性トランスフェクションの２４時間後、インテグリンα５  ｍＲＮＡの相対的な発現量は、ｍｉＲ−９２ａ阻害に応答して増加し、ｍｉＲ−９２ａ模倣物に応答して低下した。脂質媒介性トランスフェクション後のインテグリンα５  ｍＲＮＡの相対的な発現量を、ＨＵＶＥＣ細胞から全ＲＮＡを抽出し、その後、ＲＴ−ＰＣＲを行うことによって調査した。ｍｉＲ−９２ａ阻害剤または模倣物に応答したインテグリンα５  ｍＲＮＡの相対的な発現量を、オリゴヌクレオチドを伴わずに脂質を用いてトランスフェクトしたＨＵＶＥＣに対して正規化した。図２Ｂに示されている通り、受動的送達の７２時間後、インテグリンα５の相対的な発現量は、高濃度のオリゴヌクレオチドで、対照オリゴヌクレオチドに対して増加した。受動的送達後のインテグリンα５  ｍＲＮＡの相対的な発現量を、ＨＵＶＥＣ細胞から全ＲＮＡを抽出し、その後、ＲＴ−ＰＣＲを行うことによって調査した。ｍｉＲ−９２ａ阻害剤または模倣物に応答したインテグリンα５  ｍＲＮＡの相対的な発現量を、オリゴヌクレオチドを伴わずにトランスフェクトしたＨＵＶＥＣに対して正規化した。相対的なｍＲＮＡレベルの調査に加えて、インテグリンα５タンパク質の相対的な発現量を脂質媒介性トランスフェクション実験において調査した。ｍＲＮＡ発現の結果と同様に、脂質媒介性トランスフェクションの２４時間後のインテグリンα５タンパク質の相対的な発現量も、ｍｉＲ−９２ａ阻害後に増加し、ｍｉＲ−９２ａ模倣物に応答して低下した（図２Ｃを参照されたい）。脂質媒介性トランスフェクション後のインテグリンα５タンパク質の相対的な発現量を、ＨＵＶＥＣ細胞からタンパク質を抽出し、その後、ウエスタンブロット分析を行うことによって調査した。ｍｉＲ−９２ａ阻害剤または模倣物に応答したインテグリンα５タンパク質の相対的な発現量を、無処理のＨＵＶＥＣに対して正規化した。
（実施例４）
ｍｉＲ−９２阻害剤デザインの活性を試験するための二重ルシフェラーゼアッセイ
【０１４１】
ｍｉＲ−９２阻害剤を指示濃度で二重ルシフェラーゼレポーターと共トランスフェクトした（図４）。ルシフェラーゼレポーターは、遺伝子の３’ＵＴＲ内のｍｉＲ−９２ａシード配列に対する結合部位を含有し、したがって、ルシフェラーゼ活性の増大により、ｍｉＲ−９２ａ阻害の増大が示される。ルシフェラーゼ活性をトランスフェクションの４８時間後に測定した。阻害剤の全てが２ｎＭおよび０．２ｎＭの用量で活性を示したので、０．０２ｎＭの用量を使用して、阻害剤を順位付けした。図４の各阻害剤群の中で、２ｎＭの用量が左側の棒に示されており、０．２ｎＭの用量が中央の棒であり、０．０２ｎＭの用量が右側の棒である。
【０１４２】
さらに、例えば５−メチルシトシンなどの化学修飾された窒素塩基が存在することの、ｍｉＲ−９２オリゴヌクレオチド阻害剤の活性に対する効果も試験した。５−メチルシトシンを有するｍｉＲ−９２阻害剤と５−メチルシトシンを有さないｍｉＲ−９２阻害剤の活性を比較するために、図９に示されている通り、ＨｅＬａ細胞に、二重ルシフェラーゼレポーターと、ｍｉＲ−９２ａアンタゴｍｉＲ、化合物Ａ（Ａ；配列番号７）、化合物Ｂ（Ｂ；配列番号６３）、５−メチルシトシンを欠く化合物Ｂ（Ｂマイナス５−Ｍｅ；配列番号８）、化合物Ｃ（Ｃ；配列番号６４）、５−メチルシトシンを欠く化合物Ｃ（Ｃマイナス５−Ｍｅ；配列番号９）、化合物Ｄ（Ｄ）またはｍｉＲ−９２ａ模倣物のいずれかとを共トランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞に、化合物を図９に示されている濃度（すなわち、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、または０．０１ｎＭ）でトランスフェクトした。本明細書に記載の通り、ルシフェラーゼレポーターは、遺伝子の３’ＵＴＲ内のｍｉＲ−９２ａシード配列に対する結合部位を含有し、したがって、ルシフェラーゼ活性の増大により、ｍｉＲ−９２ａ阻害の増大が示される。正規化したルシフェラーゼ活性を発光の測定によって評価した。ルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの４８時間後に測定した。各化合物についての用量曲線全体にわたる二元配置ＡＮＯＶＡ分析により、化合物ＢとＢマイナス５−Ｍｅの間に統計学的有意差があることが明らかになり、化合物ＢはＢマイナス５−Ｍｅよりも活性が高かった（Ｈｏｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較ポストホック検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによってｐ値＜０．０５）。同様の分析により、化合物Ｃマイナス５−メチルシトシンと化合物Ｃの間にも統計学的有意差が観察されることが示され、ｐ値は０．０５未満であった（Ｈｏｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較ポストホック検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。化合物ＣはＣマイナス５−Ｍｅよりも活性が高かった。
（実施例５）
創傷治癒不良のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける抗ｍｉＲ−９２化合物の活性
【０１４３】
抗ｍｉＲ−９２化合物（すなわち、ｍｉＲ−９２ａオリゴヌクレオチド阻害剤）をｉｎ  ｖｉｖｏ慢性創傷モデルにおいて創傷血管新生の増大および創傷治癒の加速について試験した。ｄｂ／ｄｂ（ＢＫＳ．Ｃｇ  Ｄｏｃｋ（Ｈｏｍ）７ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／ｊ）マウスは、６週齢までに２型糖尿病および創傷治癒不全を発症することが示されている。２つの別々の試験において、年齢および性別をマッチさせた成体マウスに麻酔を行い、背側を脱毛した。マウスの背中の肩部と臀部から等距離のところで脊椎のいずれかの側面に直径６ｍｍの切除によるパンチ創傷を２つ作製し、創傷を半閉鎖包帯で覆った。
【０１４４】
外科手術のとき、および手術後２日目、４日目および８日目に、化合物を創傷当たり１００ｎｍｏｌ（約０．５５ｍｇ）の用量で創縁の周囲の複数部位への皮内注射によって適用した。創傷治癒増強についての陽性対照として、組換えヒトＶＥＧＦ（すなわち、ｒｈＶＥＧＦ−１６５）を創傷当たり１μｇの用量で、および、組換えＰＤＧＦ−Ｂ（すなわち、ｒｈＰＤＧＦ−Ｂ）を創傷当たり２μｇの用量で使用した。陰性対照として、ビヒクル対照（すなわち、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））を投与したマウスまたはマウス（mice or mice）を使用した。
【０１４５】
外科手術後１０日目に動物を屠殺した。再上皮化の割合、肉芽組織内部成長の割合、ならびに新しい上皮および肉芽組織の厚さおよび断面積を評価するために組織学的分析を実施した。組織学的分析は、標準のプロトコールに従い、各皮膚創傷の半分を１０％中性緩衝ホルマリン中に２４時間固定し、パラフィン包埋することによって実施した。４μｍの組織切片を脱パラフィンし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。４〜２０×倍率で組織学的画像を取得し、画像を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＣＢＩ）を使用して再上皮化の割合、肉芽組織内部成長の割合、ならびに新しい上皮および肉芽組織の面積および厚さおよび断面積について分析した。
【０１４６】
２つの試験からのデータをそれぞれ図５Ａ〜Ｆおよび図６Ａ〜Ｆに示す。図５Ａおよび６Ａは、パーセント再上皮化（（１−［上皮の間隙を創傷の幅で割ったもの］）×１００）を例示し、図５Ｂおよび６Ｂは、肉芽組織で充填された各創傷のパーセント（（１−［肉芽組織の間隙を創傷の幅で割ったもの］）×１００）を示し、図５Ｃおよび６Ｃは、創傷内の肉芽組織面積を示し、図５Ｄおよび６Ｄは、創傷内の肉芽組織の厚さの平均を示す。ＶＥＧＦ−１６５では創傷の再上皮化（図５Ａおよび６Ａ）および肉芽組織の厚さ（図５Ｄおよび６Ｄ）は有意ではなく増大したが、肉芽組織で充填された各創傷のパーセントは有意に増大した（図５Ｂおよび６Ｂ）。ＰＤＧＦ−Ｂでは、創傷の再上皮化（図６Ａ）および肉芽組織内部成長（図６Ｂ）が有意に増大し、肉芽組織面積（図６Ｃを参照されたい）および厚さ（図６Ｄ）は有意ではなく増大した。逆に、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤ＡおよびＣでは、肉芽組織形成（％肉芽組織充填（図６Ｂ）、肉芽組織面積（図５Ｂおよび６Ｂ）および肉芽組織の厚さの平均（図５Ｄおよび６Ｄ）が有意に増大し、Ａでは創傷の再上皮化のいくらかの増大も示された（図５Ａおよび６Ａ）。これらの結果から、複数のｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤により、創傷治癒および新しい組織形成がＶＥＧＦペプチドまたはＰＤＧＦペプチドのいずれよりも大きな程度まで加速されることが示される。
【０１４７】
ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤による慢性創傷の治癒が加速する機構は、血管新生の増加によるものと考えられる。２つのｄｂ／ｄｂ創傷治癒試験からの群のサブセットに対して、新生血管形成／血管新生の尺度として血管内部成長および内皮細胞の数を評価するために免疫組織化学的検査を実施した。免疫組織化学的検査は、４μｍの脱パラフィン組織切片を、ＣＤ３１に特異的な一次抗体を用い、その後、核を可視化するために蛍光二次抗体およびＤＡＰＩよって染色するか（第１の試験）、または、ＨＲＰとコンジュゲートした二次抗体により、その後、それぞれ免疫複合体および核を可視化するためにＤＡＢおよびヘマトキシリンで染色するか（第２の試験）して実施した。４〜２０×倍率で蛍光画像または発色画像を取得し、ＩｍａｇｅＪにおいて自動閾値設定および画像解析マクロを使用して創縁におけるＣＤ３１＋内皮細胞の数および血管を計数した。これらのデータは、第１の試験については図５Ｅに、および第２の試験については図６Ｅに示されている。同様に、ＩｍａｇｅＪを使用してＣＤ３１＋の組織の面積を自動で算出し、それが第１の試験については図５Ｆに、および第２の試験については図６Ｆに示されている。どちらの試験によっても、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤を用いた処理に伴ってＣＤ３１＋内皮細胞およびＣＤ３１＋の組織面積の有意な増大が実証された。この試験では、ＰＤＧＦによる処理では新血管新生（neoangiogenesis）は加速されなかった。
【０１４８】
ｍｉＲ−９２標的遺伝子のｍＲＮＡ発現（例えば、表３に列挙されている）に対する化合物の効果を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。全ＲＮＡを、皮膚組織１０〜５０ｍｇから、Ｏｍｎｉ  ＢｅａｄＲｕｐｔｏｒにおいてＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１ｍｌを用いて組織をホモジナイズすることによって単離した。全ＲＮＡ単離は製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の指示に従って実施した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ）で測定した。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応分析（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて遺伝子発現を測定した。ｉｎ  ｖｉｖｏ組織試料のＲＴ−ＰＣＲ分析については、１００ｎｇの全ＲＮＡをＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  ＲＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、製造者の仕様に従って逆転写した。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを用いて遺伝子発現を測定した。遺伝子発現をＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子に対して正規化し、対照群の平均と比較した相対的な発現量として算出した。図７は、ｄｂ／ｄｂマウス切除創における１つのｉｎ  ｖｉｖｏ試験からの、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤による選択されたｍｉＲ−９２ａ標的遺伝子の抑制解除を示す。
【０１４９】
ｍｉＲ−９２標的ＩＴＧＡ５のタンパク質発現に対する化合物の効果を、免疫組織化学的検査を使用して評価した。免疫組織化学的検査は、４μｍの脱パラフィン組織切片をＩＴＧＡ５に特異的な一次抗体で染色し、その後、ＨＲＰとコンジュゲートした二次抗体で染色し、次いで、それぞれ免疫複合体および核を可視化するためにＤＡＢおよびヘマトキシリンで染色することによって実施した。発色画像を４〜２０×倍率で取得した。代表的な切片を図８Ａ〜Ｄに示す。ＰＢＳ（図８Ａ）またはｒｈＰＤＧＦ（図８Ｂ）で処置したｄｂ／ｄｂマウス創傷ではわずかな染色が見られたが、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤で処置した（例えば、図８Ｃ〜Ｄの化合物Ａ）創傷では、内皮細胞および血管壁に局在する高レベルの染色が示された。全ての画像において、矢印は選択された血管を示す；ＰＢＳ群およびＰＤＧＦ群では染色が見られず、Ａで処置した創傷では染色の程度が高いことに留意されたい。これにより、抗ｍｉＲ−９２ａオリゴヌクレオチドによる、ｍｉＲ−９２ａ標的ＩＴＧＡ５の抑制解除が示される。
【０１５０】
抗ｍｉＲ−９２化合物により、陰性対照と比較して、およびｒｈＶＥＧＦまたはｒｈＰＤＧＦと比較して、創傷治癒が増強された。表３に列挙されているｍｉＲ−９２ａの標的は、創傷治癒を増強するｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与したマウスにおいて調節された。
【０１５１】
本明細書で論じられ、引用された、全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。開示された発明は、それらは変化しうるので、記載された特定の方法、プロトコール、および材料に限定されないことが理解される。また、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載することだけを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲だけにより限定される、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
【０１５２】
当業者は、単に日常的な実験のみを使用して、本明細書で記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識または確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包摂されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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