(57)【要約】  本発明は、タンパク質を製造するための新規な方法、特に、別の分子と結合しているタンパク質を製造するための新規な方法を提供する。本発明はさらに、例えば治療目的のためのタンパク質を得るための工業的規模のタンパク質製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の製造方法であって；
ａ）該タンパク質を発現するような条件下で宿主細胞を培養する工程、および
ｂ）宿主細胞および他の夾雑物を含有する混合物から該タンパク質を精製する工程であって；ここで精製工程は、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含み、還元剤が該混合物に添加され、第１のクロマトグラフィー工程から最後のクロマトグラフィー工程まで該タンパク質は、還元剤の存在下で維持される、工程を含む、
上記製造方法。
【請求項２】
還元剤が、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、システイン及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
還元剤が０．１ｍＭ〜１００ｍＭグルタチオンである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記還元剤は、前記回収されたタンパク質から除去される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項５】
前記タンパク質が別の分子に結合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項６】
タンパク質は、タンパク質のシステイン残基に対する共有結合を介して別の分子に結合される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、別の分子に結合された前記タンパク質を回収することをさらに含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原結合断片がＦａｂ'である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体又は抗原結合断片の前記システイン残基が、抗体ヒンジにある、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分子はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＥＧ分子が４０，０００ＰＥＧ−マレイミドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＥＧ分子に前記システインを介して結合している前記タンパク質を回収することをさらに含む、請求項１１また１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の精製の分野に属する。より具体的には、本発明は、抗体及び抗体断片の精製のプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
治療分野において、特にタンパク質および抗体並びに抗体由来の分子の使用は、常に存在および重要性を獲得しており、その結果、制御された製造プロセスの必要性が並行して啓発されている。治療用タンパク質の商業化は、それらが大量に生成されることを必要とする。この目的のために、投与可能な形態に作成される前に、タンパク質は宿主細胞において頻繁に発現され、続いて回収および精製され得る。発現されるタンパク質に応じて、宿主細胞の選択は、哺乳動物宿主細胞、しばしばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、又は細菌宿主細胞であってよい。第１のケースでは、タンパク質は、典型的には、回収される培養上清中に分泌される、次いで、この溶液をタンパク質精製のために処理する。
【０００３】
宿主細胞がグラム陰性原核細胞である場合、しばしば好ましい発現系は、新たに合成されたタンパク質が、ペリプラズム空間内に蓄積され、ペリプラズム空間から分離されること含む。この場合、所望のレベルのタンパク質発現が達成されると、細胞は収穫され、処理される。次いで、ペリプラズムからのタンパク質を溶液中に放出させ、続いて細胞デブリおよび他の不純物を除去することを含むタンパク質抽出プロセスに、収穫された細胞を供することにより、タンパク質は回収される。タンパク質放出に対する細胞採取のこれらのステップは、典型的には、一次回収と呼ばれるものに含まれる。次いで、得られたタンパク質含有溶液をタンパク質精製のために処理する。ペリプラズム発現に使用される好ましいグラム陰性原核細胞は、一般に、大腸菌株またはシュードモナスフルオレッセンス細胞である。
【０００４】
複合混合物からのタンパク質精製は、標的タンパク質に適合される。抗体および抗体由来製品の場合、精製は典型的には、製品の第1の精製及び有意な濃縮を提供するクロマトグラフィーを介した第1の生成物捕捉段階を含む。この第1の工程は、通常、宿主細胞不純物、培地、精製工程関連不純物及び製品関連不純物のような汚染物質を低減するために使用される1つ以上のさらなるクロマトグラフィー工程によって行われる。
【０００５】
近年、特定の機能を有する別の分子に結合させることは（これは、診断および治療の両方に適用される）、抗体および抗体由来フラグメントを含む、異なるタンパク質についてますます一般的になってきている。いくつかの例を挙げると、特定の一組の細胞に対して抗体を標的化することができ、あるいは、抗体がその特定の作用部位に標的化される薬物であってもよく、または分子は、動物における抗体の半減期を増加させるように向けられていてもよい。後者は、特に、動物の循環から急速に排除される傾向がある抗原結合抗体断片に関する場合である。 
【０００６】
タンパク質中に自然に発生するか、またはタンパク質工学によって人工的に導入されるタンパク質中の反応性基を介して、異なる分子をタンパク質に結合させることができる。第２分子へのタンパク質結合のための有利な反応性基は、不対システイン残基に存在するチオール基であることが多い。この意味では、抗体ヒンジは、システイン残基を含み、かつ、システイン残基を含むので、部位特異的反応のための共通領域であり、抗原結合に関与する可能性のある抗体の他の領域から離れている。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との反応又はチオール基のＰＥＧ化は、部位特異的なＰＥＧ化に対する周知のアプローチであり、多様なチオール特異的試薬が利用可能である。
【０００７】
しかし、天然のタンパク質では、システイン残基は、通常、ジスルフィド架橋に関与し、または金属または他のタンパク質との相互作用に関与する。したがって、部位特異的な結合を達成するために、これらの反応性基は正しい形態である必要があり、すなわち、それらのチオール基が遊離しており、その反応を可能にする必要がある。例えば、単一システイン残基におけるＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化は、Veronese et al. Bioconjugate Chemistry 2007 Nov-Dec;18(6):1824-30に記載されており、過渡的な変性条件下で、ＰＥＧ化が行われた。また、従来技術では、所望の分子に対するその後の反応を可能にするために最適な形態でタンパク質を得るためのプロセスを最適化することが試みられている。例えば、国際公開２００７／００３８９８号は、精製後に組み込まれた特定の二次還元工程を記載しているＦａｂ’は、ＰＥＧとのその後の反応のためにそれを調製するためのものである。多くの場合には、例えばＦａｂ’の場合、タンパク質中に存在する他のシステインを還元することなく、結合のために１つ以上の標的システインに選択的に影響を与えることが望ましい。この場合例えば、Ｆａｂは、重鎖定常領域と軽鎖定常領域との間に天然の鎖間ジスルフィド結合を有し、抗体の他の場所の標的システイン（たとえばヒンジ）を選択的に還元するために、還元は、注意して実施し、ジスルフィド鎖が無傷であり、鎖間システインとの反応が回避される必要がある。典型的には、これは、穏やかな還元条件とみなされるものを用いて達成される。しかし、還元が一般的な化学反応であると仮定すると、このような穏やかな還元条件下でさえ、複合混合物中に存在する異なる化合物は、還元環境で反応し、これに限定されないが、その後のタンパク質の精製に影響を及ぼす結合活性のような性質が変更されうる。このため、従来技術で説明した還元工程は、タンパク質が精製された後に行われる。続いて、所望のタンパク質複合体は、未反応タンパク質または他の望ましくない複合体から精製されなければならない。このカップリング反応プロセスの効率は、生産効率および関連する製造コストに直接関係する。
【０００８】
上述したように、本技術分野において、タンパク質製造のための改善された方法を提供する必要性がさらに存在し、特に、製造されたタンパク質が第２の分子に結合されるべきである場合には必要である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Ｆａｂ’１を発現する細胞から得られる大腸菌ペリプラズム抽出物を用いてなされた２つの並行精製プロセスから回収されたＦａｂ’１のＰＥＧ化反応から得られた試料のサイズ排除ＨＰＬＣ分析を示す。１つのプロセスが対照条件下、つまりグルタチオンなしで、行われ、一方第２のプロセスでは、第１のクロマトグラフィー工程からタンパク質が１ｍＭグルタチオン存在下で維持され、最終クロマトグラフィー工程にたんぱく質を捕捉させた。ＨＭＷＳは、高分子量種または凝集体の量をいい、モノマーは、ＰＥＧに結合されたＦａｂ’１の量を指し、ＤｉＦａｂ’はＦａｂ’１ダイマーの量を指し、そしてＦａｂ’は残りの未結合Ｆａｂ’１の量を指す。
【００１０】
【図２】図２は、ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’を発現する細胞から得られた大腸菌ペリプラズム抽出物から得られたＣＤＰ８７０Ｆａｂ’のＰＥＧ化反応から得られた試料を、続いて第１のクロマトグラフィー工程から１ｍＭグルタチオンの存在下でタンパク質を維持したまま精製して、最終クロマトグラフィー工程までタンパク質を捕捉させたものをサイズ排除ＨＰＬＣ分析したものである。ＨＭＷＳは、高分子量種または凝集体の量をいい、モノマーは、ＰＥＧに結合されたＦａｂ’１の量を指し、ＤｉＦａｂ’はＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’Ｆａｂ’２ダイマーの量を指し、Ｆａｂ’は残りの未結合の量を指す。
【００１１】
【図３】図３は、大腸菌ペリプラズム抽出物から回収され、先行技術の方法に従って精製されたＦａｂ’１のＰＥＧ化反応から得られた試料のサイズ排除ＨＰＬＣ分析を示す。ＨＭＷＳは、高分子量種または凝集体の量をいい、モノマーは、ＰＥＧに結合されたＦａｂ’１の量を指し、ＤｉＦａｂ’はＦａｂ’１ダイマーの量を指し、そしてＦａｂ’は残りの未結合Ｆａｂ’１の量を指す。ＨＭＷＳは、高分子量種または凝集体の量をいい、モノマーは、ＰＥＧに結合されたＦａｂ’１の量を指し、ＤｉＦａｂ’はＦａｂ’１ダイマーの量を指し、そしてＦａｂ’は残りの未結合Ｆａｂ’１の量を指す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の詳細な説明 
本発明は、特に前記タンパク質が別の分子と結合されるべきである場合、特に、例えば治療用の、タンパク質を得るための工業的なタンパク質の製造において、タンパク質を製造するための新規な方法を提供することにより、上記に同定された必要性を解決する。
第１の実施形態では、本発明は、
ａ）宿主細胞中でタンパク質を発現させる工程、
ｂ）前記宿主細胞および他の夾雑物を含有する混合物から前記タンパク質を精製する工程であって、前記精製は、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含み、還元剤が前記混合物に添加され、第１のクロマトグラフィー工程から最後のクロマトグラフィー工程まで前記タンパク質は、前記の前記還元剤の存在下で維持される、
前記タンパク質を製造する方法を提供する。
【００１３】
典型的には、第１のクロマトグラフィー工程は、タンパク質捕捉工程として役立ち、そのために当業者に利用可能な異なるクロマトグラフィー工程が存在し、例えば親和性クロマトグラフィー、陽イオンクロマトグラフィー、アニオンクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィーに使用するための固相として適切な官能性を有するビーズ型樹脂または膜を使用するクロマトグラフィーなどが使用することができる、生成物捕捉は、通常、結合および溶出モードで行われ、対象タンパク質を固相に結合させることにより、関心のあるタンパク質が固相に結合したままである間に、夾雑タンパク質のような不純物がクロマトグラフィー媒体を通って流れることを可能にする。次いで、目的の結合タンパク質は、目的タンパク質が固相に結合するメカニズムを崩壊させる溶出バッファーを用いて固相から回収される。最も適切な生成物捕捉ステップは、精製されるべきタンパク質の性質に基づいて決定され、例えば、全長抗体を製造する際の共通生成物捕捉工程は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａに基づくアフィニティークロマトグラフィーである。
【００１４】
本発明の特定の実施形態では、前記第１のクロマトグラフィー工程はカチオン交換クロマトグラフィー工程であり、目的タンパク質はクロマトグラフィー媒体に結合し、続いて前記タンパク質を含む第１の溶出液に溶出される。
【００１５】
本発明の方法のさらなる特定の実施形態では、前記カチオン交換クロマトグラフィーの間に使用されるバッファー中に還元剤が存在する。より詳細には、還元剤は、ロードバッファー中、洗浄バッファー中および溶出バッファー中に存在する。
前のセクションで説明したように、第１のクロマトグラフィー工程は、一般に、さらなる不純物、典型的には残留工程及び製品関連不純物を除去するのを助けるための、１つ以上の後続のクロマトグラフィー工程が続く。一般に、このような工程は、ゲル濾過クロマトグラフィー、陽イオンクロマトグラフィー、アニオンクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよび疎水性電荷誘導クロマトグラフィーを使用するための適切な官能性を有する固相を使用する非親和性クロマトグラフィー工程を用いる。これらは、結合および溶出モードまたは通過画分（フロースルー）モードで操作することができる。通過画分モードでは、不純物は固相に結合するか、固相で移動度が減少し、一方標的タンパク質は、溶出又は通過画分で回収される。
【００１６】
本発明の方法の別の特定の実施形態では、第１のクロマトグラフィー工程に続いてアニオン交換クロマトグラフィー工程が行われ、不純物が捕捉されタンパク質を含む通過画分が生成する。
【００１７】
本発明の方法のさらなる特定の実施形態では、該アニオン交換クロマトグラフィーの間に使用されるバッファー中に還元剤が存在して不純物を捕捉し、該タンパク質を含む通過画分を生成する。より詳細には、還元剤がロードバッファーおよび溶出バッファー中に存在する。
【００１８】
本発明の方法のさらなる特定の実施形態では、混合物からのタンパク質精製の工程が、タンパク質を含む第１の溶出液が溶出されるカチオン交換クロマトグラフィー工程である第１のクロマトグラフィー工程と、該タンパク質を含む通過画分を生成するアニオン交換クロマトグラフィー工程である第２のクロマトグラフィー工程を含む。
【００１９】
本発明の方法のさらなる特定の実施形態では、前記カチオン交換クロマトグラフィー中に還元剤が存在し、前記アニオン交換クロマトグラフィーの間に還元剤が存在する。より特定的には、前記還元剤は、前記陽イオン交換クロマトグラフィーおよび前記アニオン交換クロマトグラフィーの間に使用されるバッファー中に存在する。さらなる実施形態では、１つ以上の限外濾過または透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程が、クロマトグラフィー工程の間で行われる。工業的スケールのタンパク質製造において、これは典型的には、製品の濃縮とバッファー交換のためになされる膜による接線流ろ過ステップを用いて行われる。これらは通常、低タンパク質結合性で、製品ロスを防ぐため、特定の標準分子量カットオフがあり、例えば、これらは、１０ｋＤａの標準分子量カットオフを有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｔ−シリーズオメガ  ＰＥＳ膜）や、１０ｋＤａの標準分子量カットオフを有する再生セルロース（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製デルタ再生セルロース膜）を含む。
精製方法は、標的タンパク質の物理化学的性質に適合するために、これらのステップのいずれかを様々な組み合わせで含むことができる。本発明の方法に従って使用できる特定の精製方法は、ＷＯ２０１２／０１３６８２号に開示されているものである、その全体が本明細書に組み込まれている。
【００２０】
本発明の方法のさらなる特定の実施形態では、混合物からのタンパク質精製の工程は、タンパク質を含む第１の溶出液が溶出する陽イオン交換クロマトグラフィーである第１のクロマトグラフィー；第１の溶出液に適用される第１の限外濾過または透析濾過工程；陰イオン交換クロマトグラフィーである第２のクロマトグラフィー工程であって、前記タンパク質を含む通過画分を生成する第２のクロマトグラフィー工程；及び、通過画分に適用される第２の限外濾過または透析濾過工程を含む。より詳細には、還元剤は、タンパク質を含む第１溶出液が溶出する陽イオン交換クロマトグラフィーの間に用いられるバッファー；前記第１の溶出液に適用された前記第１の限外濾過または透析濾過工程の間に用いられるバッファー；及び前記タンパク質を含む通過画分を生成するためのアニオン交換クロマトグラフィーである前記第２のクロマトグラフィー工程の間に使用されるバッファーのすべての中に存在する。
【００２１】
別の実施形態では、混合物からのタンパク質精製の段階が、タンパク質を含む第１の溶出液を溶出させる第１のクロマトグラフィー工程、第１の溶出液に適用される第１の限外濾過または透析濾過工程、前記タンパク質を含む第２の溶出液が溶出する結合溶出モードで行われる第２のクロマトグラフィー工程を含む。好ましくは、還元剤は、タンパク質を含む第１溶出液が溶出する陽イオン交換クロマトグラフィー工程の間に用いられるバッファー；及び前記第１の溶出液に適用された前記第１の限外濾過または透析濾過して、還元剤存在下でタンパク質が回収し、前記第２のクロマトグラフィー工程に処される工程の間に用いられるバッファーのすべてに存在するものの、前記第２のクロマトグラフィー工程から溶出液中に回収されたタンパク質は、還元剤を本質的に含まない。
当業者に利用可能な多数の還元剤が存在する。最も好適な還元剤は、例えば、回収されたタンパク質サンプル中の標的チオールの還元状態を決定することによって経験的に決定され得、例えば、Lyons et al. 1990, Protein Engineering 3,703に記載されているような遊離チオールアッセイを用いられる。また、最も好適な還元剤は、回収されたタンパク質サンプルにおける望ましくない分子内及び分子間ジスルフィド結合の量を決定する手段によって選択されてもよく、あるいは、分析サイズ排除または逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により、回収された所望の反応タンパク質分子量を測定することにより選択されてもよい。
サイズ排除ＨＰＬＣは、小分子がカラムを流れる分子量に基づいて粒子をより小さいものよりも早く分離する。一方、逆相ＨＰＬＣは、疎水性相互作用の原理で作動して、固定相上のリガンドと会合すると、分子の固定相への結合は分子の非極性セグメントの周囲に配置されている接触表面積に比例し；極性が低い分子については、保持時間が長くなる。両方の場合において、ジスルフィド結合の存在または不在は、異なる溶出プロフィールを有する種をもたらす。
【００２２】
本発明の方法の第２の実施形態では、還元剤はグルタチオン、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンシステインおよびこれらの組み合わせから選択される。
【００２３】
本発明の方法の第３の実施形態では、還元剤は０．１ｍＭ〜１００ｍＭグルタチオンである。還元剤の量は、製造するタンパク質に応じて調節することができる。本発明のさらなる特定の実施形態では、前記還元剤は０．１ｍＭ〜２０ｍＭ、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜２ｍＭグルタチオンである。
疑いを避けるために、本明細書で言及されるグルタチオンの用語は、ＣＡＳ番号７０−１８−８で定義される単量体または還元グルタチオン単量体を意味する。
【００２４】
本発明の方法の第４の実施形態では、還元剤は、回収されたタンパク質から除去される  。
当業者に知られている溶液から還元剤を除去するための異なる方法があり、そのいずれもが現在のプロセスに適していてもよく、透析濾過、ゲル濾過、透析又はさらなるクロマトグラフィー工程が挙げられる。本願方法の別の態様において、還元剤はタンパク質試料から透析濾過で除去される。
【００２５】
本発明の方法の第５の実施形態では、タンパク質は別の分子に結合される。
一般に、タンパク質を別の分子に結合させるプロセスは、溶媒中で行われ、例えば、リン酸塩、クエン酸塩または酢酸塩などの水性バッファーが用いられる。典型的には、これは、タンパク質が、透析濾過又はゲル濾過によって転送される。反応は、一般に、任意の適切な温度、例えば約５℃〜約７０℃で実施することができる、例えば、室温、すなわち２０℃、２１℃または２２℃であるバッファーは、必要に応じて、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡまたはＤＴＰＡなどのキレート化剤を含有し得る。あるいはまた、バッファーは、クエン酸、シュウ酸、葉酸、ビシン、トリシン、またはＴｒｉｓのようなキレート化バッファーであってもよい。分子は、一般に、タンパク質の濃度に対して少なくとも等モル濃度、すなわち少なくとも１：１である。典型的には、タンパク質の濃度に対して過剰な濃度で使用される。典型的には、分子は、１〜１００倍モル過剰で使用される、１．１，１．５，２，３，５，１０又は５０倍モル過剰である。好適な濃度のさらなる例は、１．２，１．２５，１．３及び１．４倍モル過剰である。あるいは、２以上のタンパク質が単一分子に結合されている場合には、前記分子は過剰でなくてもよい、例えば、タンパク質に対する分子の比は、０．１〜１であり得、好ましくは０．５であり得る。反応の持続時間は、当業者が経験的に決定することができ、典型的には１〜２０時間である。一実施形態では、反応は１７時間の期間にわたって行われる。
【００２６】
必要に応じて、従来の手段により、出発材料又はプロセス中に生成される他の製品から、他の分子に結合された所望のタンパク質を分離することができ、例えばイオン交換、サイズ排除または疎水性相互作用クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー技術によって、分離することができる。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、別の分子に結合したタンパク質を回収する追加の工程を含む。
前記カップリングは、１つ以上のシステインを介して行うことができる。当業者は、カップリングに利用可能なタンパク質中のシステインの数を経験的に立証することができる、例えば、タンパク質が還元剤で処理された後に生成される遊離チオールの数を決定することによって達成される。遊離チオールの数を決定する方法は、当該技術分野で周知である、例えば、Lyons et al.,1990,Protein Engineering,3,703を参照されたい。あるいは、当業者は、上記反応から得られた種を、例えば、分析逆相またはサイズ排除ＨＰＬＣによって分析することができる。あるいは、種々の遺伝子工学又はタンパク質工学技術を用いてタンパク質を修飾して、結合部位として使用するためにタンパク質にシステインを導入してもよい。したがって、カップリングに使用されるシステインは、タンパク質中に自然に発生し得るか、および／または組換えＤＮＡ技術によってタンパク質に設計され得る。したがって、結合に利用可能なシステインの数および位置は、たんぱく質の用途と必要とされる共役分子の数とに依拠して、具体的に制御することができる。
【００２７】
本発明の方法の第６の実施形態では、タンパク質は、タンパク質上のシステイン残基への共有結合を介して別の分子に結合される。
本発明の方法の別の実施形態では、タンパク質はシステイン残基を介して２以上の分子に結合される。
【００２８】
第７の実施形態では、本発明の方法は、別の分子に結合されたタンパク質を回収する工程をさらに含む。
【００２９】
本発明の方法の第８の実施形態では、タンパク質は抗体またはその抗原結合断片である。
【００３０】
本発明の方法の第９の実施形態では、前記抗原結合断片はＦａｂ’である。
さらに別の実施形態では、前記Ｆａｂ’は、ＴＮＦαに特異的に結合する。さらなるより具体的な実施形態では、ＴＮＦαに特異的に結合するＦａｂ’は、ＷＯ０１／０９４５８５号に開示されているようにＣＤＰ８７０であり、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００３１】
本発明の方法の第１０の実施形態では、前記抗体または抗原結合断片中のシステインは、抗体ヒンジにある。
当業者は知っているように、所望の効果に応じて、前記抗体または抗原結合断片を異なる分子に結合させることができる。このような抗体または抗原結合断片は、例えば、抗腫瘍剤、薬物、毒素または生物学的に活性なペプチドに結合することができる。一方、前記抗体または抗原結合断片は循環中の半減期を増加させるように不活性体、例えばアルブミンのような天然に存在するタンパク質、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの合成ポリマーと結合していてもよい。
【００３２】
本発明の方法の第１１の実施形態では、前記分子はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。
ＰＥＧ分子は、エチレンオキシドの重合から得られ、３００Ｄａ〜１０，０００，０００Ｄａの広い範囲の分子量で市販されている。本発明の特定の実施形態によるＰＥＧ分子は、市販又は公知の方法で化学的に合成された直鎖状又は分岐状であってもよい。異なる分子量を有するＰＥＧ分子は、異なる用途において使用され、鎖長効果による粘度等の物性が異なる一方、それらの化学的性質は大きく変化しない。ポリマーの大きさは、特に、腫瘍のような特定の組織に局在化したり、循環半減期を延長させたりする能力などの製品の意図された用途に基づいて選択することができる（Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545を参照されたい）。例えば、製品が循環から離れ、組織を貫通することが意図され、例えば腫瘍の治療に使用する場合、低分子量、例えば約５０００Ｄａの分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。製品が循環中に残る場合、より高い分子量、例えば２５，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａの分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。
ＰＥＧ分子は市販されているか、またはポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体として合成することができ、その際カップリング剤またはカップリングまたは活性化基を有する誘導体（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アザジン、オキシラン、または好ましくはマレイミド基例えば、ＰＥＧ−マレイミド）を用いて又は用いないで合成できる。他の適切なポリアルキレングリコール化合物としては、マレイミドモノメトキシＰＥＧ、活性化されたＰＥＧポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない、それ以外にも、以下のタイプの荷電または中性のポリマーも含む：デキストラン、コリン酸、または他の炭水化物系ポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチンおよび他の親和性試薬誘導体。ＰＥＧ部分を結合することは、しばしば、ＰＥＧ化と呼ばれ、タンパク質をＰＥＧ分子と反応させるプロセスをいい、このような反応の結果として、ＰＥＧ分子は、前記タンパク質に共有結合される。
【００３３】
一般に、ＰＥＧ基を取り付けることについては、“Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”,1992, J.Milton Harris (ed),Plenum Press,New York； “Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications”，１９９７，J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds),American Chemical Society,Washington DC及び “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”,1998,M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers,New Yorkを参照されたい。
【００３４】
ＰＥＧ化およびＰＥＧ化タンパク質を考慮する場合、プロセスの様々な態様、例えばタンパク質上の結合部位、ＰＥＧ試薬の活性化型、性質（永久的または切断可能）、リンカーの長さおよび形状、ならびにＰＥＧ試薬の長さ、形状および構造などを考慮しなければならない。ＰＥＧ化は、ランダムであってよく、タンパク質上のアミノ基が標的化され、そして種々のＰＥＧ化種の複雑な混合物をもたらす。あるいは、ＰＥＧ化は、典型的には、Ｎ末端およびシステイン特異的反応を介して、部位特異的であってもよい。システイン残基は天然のタンパク質に自然に存在し得る。あるいは、遺伝子導入されたシステインを用いて、分子内の正確に決定された部位にＰＥＧ分子を導く。したがって、ＰＥＧ化に利用可能なシステインの数および位置は、タンパク質の意図する用途および必要なＰＥＧ分子の数に依拠して、特異的に制御することができる。マレイミド、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、チオール試薬などの種々のチオール特異的試薬が利用可能である。形成された結合の安定性に起因して、マレイミド−ＰＥＧ試薬がしばしば好ましい選択である。
本発明の方法のさらなる実施形態では、ＰＥＧ分子は、マレイミド基を介してタンパク質上の単一のシステインに共有結合する。
【００３５】
特定の実施形態では、ＰＥＧ分子はマレイミド基を介して、抗体またはその抗原結合フラグメントのヒンジ領域に存在する単一のシステインに共有結合される。
本発明の方法の第１２の実施形態では、前記ＰＥＧ分子は、４０，０００ＰＥＧ−マレイミドである。
特定の実施形態では、前記ＰＥＧ分子は、分岐４０，０００ＰＥＧ−マレイミドである。特に、前記ＰＥＧ分子は２分枝を有する。
【００３６】
第１３の実施形態では、本発明の第１１又は第１２の実施形態による方法は、タンパク質を回収することをさらに含み、前記タンパク質はシステインを介して前記ＰＥＧ分子に結合されている。
【００３７】
本発明の第１２の実施形態による方法の特定の実施形態では、前記ＰＥＧ分子に結合されたタンパク質は回収され、例えばさらなるクロマトグラフィー工程のような当該技術分野で知られている手段によって、非結合タンパク質及びＰＥＧ分子からさらに精製される。
さらなる特定の実施形態では、前記ＰＥＧ分子に結合されたタンパク質は抗体またはその抗原結合断片であり、特に前記タンパク質はＦａｂ’である。
本発明の方法の特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片を２つ以上のＰＥＧ分子に結合させる。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは両方の重鎖上にＰＥＧ化される、または１つまたは両方の軽鎖上または重鎖および軽鎖の両方にＰＥＧ化されてもよい。
【００３８】
本発明のさらなる特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合領域が結合されているＰＥＧ分子は、重鎖、軽鎖またはその両方にＰＥＧ分子が結合したＦａｂ’である。好ましい実施形態において、タンパク質は、抗体ヒンジ領域上のシステインを介してＰＥＧ分子に結合されたＦａｂ’である。特定の実施形態では、ＰＥＧ化抗体は、少なくとも２４ｋＤの流体力学的サイズを有する。他の実施形態では、ＰＥＧは、２０〜６０ｋＤ（包括的）のいずれかからサイズが変化し得る。さらなる実施形態では、ＰＥＧ結合抗体は、少なくとも２００ｋＤの流体力学的サイズを有する。抗体がＰＥＧ部分に結合されている本発明の実施形態では、抗体は、ＰＥＧ部分に結合される、ＰＥＧ化抗体は、ＰＥＧ部分を欠く抗体に対してインビボ半減期を増加させることができる。
【００３９】
代替実施形態では、本発明は、ＰＥＧ分子に結合された抗体またはその抗原結合断片の製造方法に関し：
ａ）抗体またはその抗原結合断片を発現するような条件下で宿主細胞を培養する工程、そして
ｂ）宿主細胞および他の不純物を含む混合物から、その抗体またはその抗原結合断片を精製する工程であって、ここで前記精製は、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含み、還元剤を前記混合物に添加し、前記抗体またはその抗原結合断片を、前記第１のクロマトグラフィー工程から最後のクロマトグラフィー工程までの前記還元剤の存在下で維持する、工程
ｃ）抗体またはその抗原結合断片にＰＥＧを添加する工程、そして
ｄ）ＰＥＧに結合された抗体またはその抗原結合断片を回収する工程
を含む。
あるいは、本発明は、タンパク質を精製する方法に関し、前記タンパク質は、前記タンパク質を発現するような条件下、宿主細胞中で発現され、前記宿主細胞と他の不純物を含む混合物から前記タンパク質を精製することを含み、前記精製は、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含み、還元剤が前記混合物に添加され、前記タンパク質は、前記第１のクロマトグラフィー工程から最後のクロマトグラフィー工程までの前記還元剤の存在下で維持される、精製方法に関する。
【００４０】
本発明の方法に従って製造することができる抗体または抗体断片は、組換え抗体断片をコードする１または複数の発現ベクターでトランスフェクトされた真核生物宿主細胞を培養することによって製造することができる。真核生物宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
哺乳動物細胞は、組換えタンパク質の増殖および発現を支持する任意の培地中で培養することができ、好ましくは、培地は、動物由来の製品、例えば動物血清およびペプトンを含まない化学的に規定された培地である。ビタミン、アミノ酸、ホルモン、成長因子、イオン、バッファー、ヌクレオシド、グルコースまたは等価エネルギー源の異なる組み合わせを含む細胞培養培地、は当業者には利用可能であり、適切な濃度で存在させて、細胞の増殖およびタンパク質の産生を可能にする。さらなる細胞培養培地成分は、当業者に知られている細胞培養サイクル中に、異なる時期に適切な濃度で細胞培養培地に含まれ得る。
哺乳動物細胞培養は、振とうフラスコまたはバイオリアクターなどの任意の適切な容器中で行うことができ、必要とされる生産規模に応じて、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）方式で動作させても、させなくてもよい。これらのバイオリアクターは、攪拌タンクまたはエアリフト反応器のいずれであってもよい。様々な大規模なバイオリアクターは、１，０００Ｌ〜５０，０００Ｌの容量より大きく、好ましくは５，０００Ｌ〜２０，０００Ｌ、又は〜１０，０００Ｌの容量で利用可能である。あるいは、２Ｌと１００Ｌの間のようなより小さなスケールのバイオリアクターを、本発明の方法に従って抗体または抗体断片を製造するためにも使用することができる。
【００４１】
本発明の方法に従って製造することができる抗体またはその抗原結合断片は、典型的には、哺乳動物宿主細胞培養物、典型的にはＣＨＯ細胞培養物の上清中に見出される。抗体やその抗原結合断片などの目的タンパク質が上清中に分泌されるＣＨＯ培養方法において、前記上清は、当業界で知られている方法、典型的には遠心分離によって回収される。
したがって、本発明の特定の実施形態では、この方法は、タンパク質精製前に遠心分離および上清回収のステップを含む。さらに特定の実施形態では、前記遠心分離は連続的な遠心分離である。疑いを避けるために、上清は、細胞培養物の遠心分離に起因する沈降細胞の上に位置する液体を意味する。
【００４２】
あるいは、宿主細胞は好ましくは原核細胞、好ましくはグラム陰性細菌である。より好ましくは、宿主細胞は大腸菌細胞である。タンパク質発現のための原核生物宿主細胞は、当該技術分野において周知である(Terpe, K. (2006) Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol 72, 211-222.)。宿主細胞は、抗体断片のような目的のタンパク質を産生するように遺伝子操作された組換え細胞である。組換え大腸菌宿主細胞は、ＭＣ４１００  、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＤＨ１、ＢＬ２１、Ｋ１２、ＸＬ１ｕｂｌｕｅ、及びＪＭ１０９を含む任意の適切な大腸菌由来であってもよい。一例は、組換えタンパク質発酵のための一般的に使用される宿主株である、大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）である。抗体断片はまた、改変された大腸菌株、例えば代謝突然変異体またはプロテアーゼ欠損大腸菌株を培養することにより産生され得る。
【００４３】
本発明の方法に従って精製することができる抗体断片は、典型的には、蛋白質の性質、生産規模及び用いる大腸菌に応じて、大腸菌宿主細胞のペリプラズムまたは宿主細胞培養上清のいずれかに見出される。これらの区画にタンパク質を標的化するための方法は、当該技術分野で周知である（Makrides,S.C.(1996). Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol Rev 60,512-538.）。タンパク質をペリプラズムに導く適切なシグナル配列の例は、大腸菌ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、ＬａｍＢおよびＯｍｐＦシグナル配列が挙げられる。
自然分泌経路に依存することにより、または外膜の限定された漏出を誘発することによってタンパク質分泌を引き起こして、タンパク質を上清に向かわせる。その例は、pelBリーダー、タンパク質Ａリーダー、バクテリオシン放出タンパク質の共発現、培地へのグリシンの添加に伴うマイトマイシン誘発性バクテリオシン放出タンパク質、及び膜透過化のためのkil遺伝子の共発現の使用である。最も好ましくは、本発明の方法において、組換えタンパク質は、宿主大腸菌のペリプラズム中で発現される。
【００４４】
大腸菌宿主細胞における組換えタンパク質の発現はまた、誘導性システムの制御下であってもよく、その結果大腸菌における組換え抗体の発現が誘導性プロモーターの制御下にあってよい。大腸菌での使用に適した多くの誘導性プロモーターは、当該分野で周知であり、組換えタンパク質のプロモーター発現に依存して、温度または成長培地中の特定の物質の濃度のような様々な因子によって誘導される。誘導性プロモーターの例としては、ラクトースまたは非加水分解性ラクトース類似体であるイソプロピル−ｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なことを特徴とするＥ．ｃｏｌｉのＬａｃ、ｔａｃ及びｔｒｃプロモーター；並びにリン酸、トリプトファン、およびＬ−アラビノースによってそれぞれ誘導されるｐｈｏＡ、ｔｒｐおよびａｒａＢＡＤプロモーターが挙げられる。発現は、例えば、誘導物質の添加または誘導が温度依存性である場合温度変化によって誘導されてもよい。誘導物質を培養物に添加することにより、組換えタンパク質発現の誘導を達成する場合、誘導物質は、培養システムおよび誘導物質に応じて、任意の適切な方法、例えば、一度または複数回の瞬間的な添加によって、または、培養中誘導物質の漸進的な添加によって達成される。誘導物質の添加と実際のタンパク質発現の誘導との間に遅延が存在し得ることが理解されるであろう、例えば、誘導物質がラクトースの場合、ラクトース前に既存の炭素源が利用されるので、タンパク質発現の誘導が起こる前に遅延が存在し得る。大腸菌宿主細胞培養物(発酵)は、大腸菌の増殖および組換えタンパク質の発現を支持する任意の培地で培養することができる、培地は、例えば、Durany O,C.G.d.M.C.L.-S.J. (2004) Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphate aldolase in Escherichia coli. Process Biochem 39, 1677-1684.に記載されているような任意の化学培地であってもよい。 
【００４５】
大腸菌宿主細胞の培養は、必要な生産規模に応じて、振とうフラスコや発酵槽などの任意の適切な容器で行うことができる。様々な大規模発酵槽は、１、０００リットルを超える容量から、約１００、０００リットルまでの容量で利用可能である。好ましくは、１，０００〜５０，０００リットルの発酵槽が使用され、より好ましくは１，０００〜２５，０００，２０，０００，１５，０００，１２，０００又は１０，０００Ｌである。より小規模な発酵槽を０．５〜１，０００Ｌの間の容量で使用することもできる。
【００４６】
大腸菌の発酵は、タンパク質および収率に応じて、任意の適切なシステム、例えば連続培養、回分培養（ｂａｔｃｈ）又は流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）のモードで実施することができる。回分培養モードは、必要とされる栄養物または誘導物質の瞬間的添加と共に使用され得る。あるいは、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養を使用してもよく、すなわち発酵槽に存在する最初の栄養素を使用して持続的な最大の比増殖速度で回分培養モード前培養で成長させた培養し、１つまたは複数の栄養供給体制発酵が完了するまでは、成長率を制御するために使用してもよい。流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）モードは、前誘導時に使用してもよく、大腸菌の宿主細胞の代謝を制御して、高い細胞密度を達成できる。所望であれば、宿主細胞は、発酵培地から回収され、例えば、宿主細胞は、遠心分離、濾過、または濃縮によって試料から採取され得る。
【００４７】
一実施形態では、本発明による方法は、タンパク質を抽出する前に、遠心分離および細胞回収のステップを含む。
宿主細胞のペリプラズム空間に抗体断片などの目的のタンパク質が見出される大腸菌発酵プロセスにおいて、宿主細胞からタンパク質を放出させることが必要である。放出は、機械的または圧力処理による細胞溶解、凍結融解処理、浸透性ショック、抽出剤または熱処理などの任意の適切な方法によって達成することができる。タンパク質放出のためのこのような抽出方法は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、本発明の方法は、タンパク質精製の前に追加のタンパク質抽出ステップを含む。より特定の実施形態では、前記タンパク質抽出ステップは、還元剤の存在下で行われる。
【００４８】
本発明による方法のさらなる実施形態では、さらに、細胞培地から宿主細胞を回収し、還元剤の存在下で行われるタンパク質抽出工程を用いてタンパク質を採取し、前記タンパク質抽出工程から得られたタンパク質含有混合物を回収し、前記タンパク質を前記混合物から精製する工程を含み、前記精製は、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含み、前記混合物に還元剤を添加され、前記タンパク質は、前記第１のクロマトグラフィー工程から最後のクロマトグラフィー工程まで前記還元剤の存在下で維持される。
【００４９】
本発明による方法のさらなる実施形態では、本発明のタンパク質抽出工程において存在する還元剤は、本発明の方法のタンパク質精製工程中に存在する還元剤と同一であっても異なっていてもよい。
好ましい実施形態では、抽出バッファーを試料に添加し、次いで、試料を熱処理工程にかける。熱処理工程は、米国特許第５，６５５，８６６号明細書に詳細に記載されているようなものであることが好ましく、この熱処理工程により、他の抗体関連物質の除去を容易にすることにより、正確に折り畳まれ、組み立てられた抗体断片の可溶な試料を得ることができる。
【００５０】
熱処理工程は、試料を所望の高温にすることにより行われる。最も好ましくは、熱処理工程は、３０℃〜７０℃の範囲内で行われる所望に応じて温度を選択することができ、精製する抗体の安定性に依存し得る。別の実施形態では、温度は４０℃〜６５℃の範囲内である、好ましくは４０℃〜６０℃の範囲であり、より好ましくは４５℃〜６０℃の範囲内である、より好ましくは５０℃〜６０℃の範囲であり、最も好ましくは５５℃〜６０℃の範囲であり、５８℃から６０℃または５９℃までの間であり、最低温度は３０℃、３５℃または４０℃であり、最高温度は６０℃、６５℃又は７０℃である。
熱処理工程は、長期間行われることが好ましい。熱処理の長さは１〜２４時間であることが好ましい、より好ましくは４〜１８時間であり、さらに好ましくは６〜１６時間であり、１０〜１４時間または１０〜１２時間、例えば１２時間の間であることが最も好ましい。これにより、最小限の熱処理時間が１，２又は３時間であり、最大は２０時間、２２時間又は２４時間である。
特定の実施形態では、熱処理は、５０℃〜６０℃で１０〜１６時間行われる、より好ましくは５９℃で１０〜１２時間である。当業者は、問題のサンプルおよび生成される抗体の特性に適合するように、温度および時間を選択することができることを理解するであろう。
【００５１】
目的のタンパク質を含む混合物を抽出する工程に続いて、抗体断片は、遠心分離および／または濾過の段階に供され得る。
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、抽出工程に続いてそして前記混合物から前記タンパク質を精製する前に、目的のタンパク質を含有する混合物のｐＨを調整するステップを含むことができる。
【００５２】
本発明によるタンパク質製造方法のさらなる実施形態では、前記熱処理工程中に還元剤も存在する。特定の実施形態では、試料に添加される抽出バッファーは、前記還元剤を含有する。この意味で、前記熱処理工程中に存在する還元剤は、本発明の方法によるタンパク質精製中に存在する還元剤と同一であっても異なっていてもよい。
本発明の方法のさらなる特定の実施形態では、熱処理工程中に存在する還元剤はグルタチオン、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンシステインおよびこれらの組み合わせから選択される。
本発明の方法のさらなる特定の実施形態では、熱処理工程中に存在する還元剤は、０．１ｍＭ〜１００ｍＭグルタチオンである。還元剤の量は、製造するタンパク質に応じて調節することができる。本発明のさらなる特定の実施形態では、前記グルタチオンは０．５ｍＭ〜８０ｍＭ、１ｍＭ〜５０ｍＭ、１ｍＭ〜２５ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの量で存在する。
【００５３】
定義
本明細書で使用される“抗体（単数）”または“抗体（複数）”という用語は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体をいう。本明細書で使用される“抗体（単数）”または“抗体（複数）”という用語は、当該技術分野で知られているように、組換え技術によって生成される組換え抗体を含むが、これらに限定されない。“抗体”または“抗体”は、任意の種、特に哺乳動物種の抗体；ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ及びＩｇＭ及びその改変変異体を含む任意のアイソタイプのヒト抗体などのヒト抗体；非ヒト霊長類抗体（例えばチンパンジー、ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザル）；非ヒト霊長類抗体（例えばマウス、ラットまたはウサギからの齧歯類抗体；ヤギまたはウマ抗体；およびラクダ抗体（例えば、ナノボディ（商標）などのラクダまたはリャマ）およびそれらの誘導体；ニワトリ抗体のような鳥種またはサメ抗体のような魚種のいずれかである。
用語“抗体”または“抗体”はまた、少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第一の部分が第一の種由来であり、重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第二部分が第二の種からのものであるキメラ抗体を指す。本明細書中の目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル、カニクイザルなど）由来の可変ドメインの抗原結合配列及びヒト定常領域列を含む“霊長類化された”抗体を含む。“ヒト化”抗体は、非ヒト抗体由来の配列を含むキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体は、その超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性および活性を有する、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域（または相補性決定領域（ＣＤＲ））の残基で置換されているヒト抗体（レシピエント抗体）である。
多くの場合、ＣＤＲの外側のヒト（レシピエント）抗体の残基、ようするにフレームワーク領域（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基にさらに置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善するためになされる。ヒト化は、ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性を減少させ、従って、ヒト疾患の治療に対する抗体の適用を容易にする。ヒト化抗体およびそれらを生成するためのいくつかの異なる技術が当該技術分野で周知である。“抗体（単数）”または“抗体（複数）”という用語は、ヒト化の代替として生成することができるヒト抗体も指す。
【００５４】
例えば、内因性マウス抗体の産生の無い状態でヒト抗体の完全なレパートリーを免疫化で産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を製造することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが報告されている。
このような生殖系列突然変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の移植は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニック動物を特定抗原で免疫する際に、特定抗原に対する特異性を有するヒト抗体の産生をもたらす。このようなトランスジェニック動物を製造するための技術およびそのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離および産生するための技術は、当該技術分野で知られている。
前記トランスジェニック動物、例えば、マウスにおいて、マウス抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン遺伝子のみを、対応するヒト可変免疫グロブリン遺伝子配列に置換する。抗体定常領域をコードするマウス生殖系列免疫グロブリン遺伝子は変化しないままである。このようにして、抗体エフェクターは、本発明の免疫系において機能し、その結果、Ｂ細胞の発現は本質的に変化せず、生体内での抗原刺激に対する抗体応答の改善につながる可能性がある。対象の特定の抗体をコードする遺伝子がこのようなトランスジェニック動物から単離されると、定常領域をコードする遺伝子を、完全なヒト抗体を得るためにヒト定常領域遺伝子に置換することができる。インビトロでヒト抗体／抗体フラグメントを得るための他の方法は、ファージディスプレイ技術またはリボソームディスプレイ技術のようなディスプレイ技術に基づき、少なくとも部分的に人為的にまたはドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから生成される組換えＤＮＡライブラリーが使用される。ヒト抗体を生成するためのファージおよびリボソームディスプレイ技術は、当該技術分野で周知である。ヒト抗体はまた、対象の抗原でｅｘ  ｖｉｖｏ免疫化され、続いて融合されてハイブリドーマを生成する単離されたヒトＢ細胞からも生成され得、次いでハイブリドーマは最適なヒト抗体についてスクリーニングされ得る。
【００５５】
本明細書で使用される“抗体（単数）”または“抗体（複数）”という用語は、また、脱グリコシル化抗体を意味する。
【００５６】
本明細書で使用される“抗体断片”という用語は、当該技術分野で知られている少なくとも１つの重鎖または軽鎖イムノグロブリンドメインを含み、抗原に結合する抗体分子をいう。本発明による抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２並びに、ＦｖおよびｓｃＦｖフラグメントを含み、ならびにダイアボディー；トリボディー；テトラボディー；ミニボディー、ｓｄＡｂｓのようなドメイン抗体（ｄＡｂ）、ＶＨＨおよびＶｎａｒ断片、単鎖抗体、抗体断片または抗体から形成された二重特異性、三特異的、四重特異的または多重特異的抗体を含み、これらに限定されないが、Ｆａｂ−ＦｖまたはＦａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ構築物を含む。上記で定義した抗体断片は、当該技術分野で公知である。
【００５７】
本明細書で使用される用語“クロマトグラフィー”は、混合物の個々の溶質が移動相の影響下で静止媒体を通って移動する速度の差の結果として、混合物中の目的の溶質が他の溶質から分離されるプロセスをいう。
【００５８】
本明細書で使用される“アニオン交換クロマトグラフィー”という用語は、例えば4級アミノ基のような１またはそれ以上の正に荷電したリガンドを結合させた固相が正に荷電されるクロマトグラフィーをいう。市販のアニオン交換樹脂としては、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）及びＦＡＳＴ  Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（ＧＥヘルスケア）が挙げられる。
【００５９】
本明細書で使用される“陽イオン交換クロマトグラフィー”という用語は、例えばカルボン酸塩またはスルホネート基のような１以上の負に荷電した配位子を有する、負に荷電された固相を含むクロマトグラフィーをいう。市販されている陽イオン交換樹脂としては、アガロース上に固定化されたカルボキシ−メチル−セルロース、スルホプロピル（ＳＰ）およびアガロース上に固定されたカルボキシ−メチル−セルロース、スルホニルが挙げられる  。
【００６０】
本明細書で使用される“洗浄バッファー”という用語は、目的のポリペプチド分子を溶出させる前にイオン交換樹脂を洗浄または再平衡化するために使用されるバッファーを意味する。簡便に、洗浄バッファーおよびローディングバッファーは同じであってもよいが、これは必須ではない。
【００６１】
本明細書で使用される“ロードバッファー”という用語は、対象のタンパク質を固相にロードするために使用されるバッファーを意味する。
【００６２】
本明細書で使用される“溶出バッファー”という用語は、固相から関心のあるタンパク質を溶出するために使用されるバッファーをいう。これは、クロマトグラフィーの固相から目的のポリペプチドが溶出するように、添加剤を使用、および／または溶出バッファーの導電性および／またはｐＨを調整することによって、達成することができる。
【００６３】
本明細書で使用される“限外濾過”という用語は、例えば、目的のタンパク質を含む溶液のような混合物を濃縮または精製目的のための膜を通過させる、圧力駆動プロセスを意味する。限外濾過膜は、典型的には、１〜５０ｎｍの間の平均細孔径を有し、逆浸透膜と精密濾過膜との間の平均細孔径を有する。細孔径は、通常、特定の分子量のタンパク質を保持する能力によって定量化され、通常、ｋＤａの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）に関して引用されている。限外濾過は、溶質の大きさに依存する所与の圧力駆動力に応答して、膜を横切る異なる物質の濾過速度の差に基づいて溶質を分離する。このようにして、混合物または溶液中の溶質は、サイズ差に基づき分離される。限外濾過は、タンパク質濃度、バッファー交換、脱塩、タンパク質精製、ウイルスクリアランス、および清澄化のための下流の処理において頻繁に使用される。“限外濾過”という用語は、溶液のような混合物が限外濾過膜に沿って水平に通過する接線流濾過（ＴＦＦ）を含む。“限外濾過”という用語は、溶質が、大きさのみだけでなく、大きさ及び電荷に基づいて分離される高性能接線流濾過（ＨＰＦＦ）を含まない。
【００６４】
本明細書で使用される“透析濾過”という用語は、タンパク質、ペプチド、核酸、および他の生体分子を含む溶液から塩または溶媒の濃度を本質的に置換する限外濾過膜技術のタイプをいう。プロセスは、透過性膜フィルタを選択的に使用して、それらの分子量に基づいて、溶液および懸濁液の成分を分離する。より小さい分子、例えば塩、溶媒及び水は、より大きな分子を保持する限外濾過膜を自由に通過する。タンパク質サンプル、典型的には緩衝液は、タンパク質を保持し、緩衝交換を可能にする膜を横切って反濾過される。経時的に、タンパク質を含む元のバッファーは、新しいバッファーに置換される。
あるいは、実験規模に応じて、元のバッファーを新たなバッファーに置き換える手段としてゲル濾過（重力下で操作されるセファデックスＧ−２５脱塩カラムなど）を使用してもよい。この場合、樹脂細孔よりも大きい分子が樹脂細孔から排除され、固相を速く移動する一方、小さい分子は樹脂細孔内に拡散し、それ故よりゆっくりと保持され、よりゆっくりと固相を移動する場合に、バッファー置換が起こる。所望のタンパク質のようなより大きな分子は、樹脂平衡化バッファー中に溶出した画分に回収される。
【００６５】
本明細書で使用される“ＰＥＧ化”という用語は、ＰＥＧ分子に共有結合したタンパク質を意味する。
【実施例】
【００６６】
実施例１
Ｆａｂ’１（部位特異的なＰＥＧ化を目的とする単一のヒンジチオールを含むＦａｂ’抗体断片）が大腸菌Ｗ３１１０宿主細胞において異種タンパク質として発現され；ｐＨ７．４に調整した１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ−ＥＤＴＡバッファーを添加し、５７．５℃で加熱処理することにより、異種タンパク質が宿主細胞のペリプラズム空間から放出された。細胞物質を遠心分離により除去し、ｐＨ４．５の酢酸を添加して異種タンパク質を含む細胞抽出物を調整した。遠心分離と０．２μｍ濾過の組み合わせを用いてｐＨ調整した細胞抽出液を清澄化した。次いで、清澄化された抽出物（供給流）を約６．０ｍＳ／ｃｍの導電率を目標にして、水で希釈した。
【００６７】
次いで、Ｆａｂ’１を含有する供給流を、ＧＥヘルスケア社のＣａｐｔｏ  Ｓ（登録商標）陽イオン交換カラム［デキストランリンカーを介して結合されたスルホン酸陽イオン交換リガンド（イオン容量０．１１〜０．１４ｍｍｏｌＮａ＋／ｍｌ）を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ（平均粒径９０μｍ）］にロードした。カラムは、供給流をロードする前、酢酸でｐＨ４．５に調整された６カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで平衡化されていた。
【００６８】
ロード後、酢酸でｐＨ４．５に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄し、全ての未結合物質が洗浄除去した。Ｆａｂ’１含有画分は、酢酸でｐＨ４．５に調整された５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１９０ｍＭＮａＣｌで溶出された。
得られたＦａｂ’１含有溶出液を、１０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜（Ｔシリーズ膜（Ｐａｌｌ社製））を用いて限外濾過し、約５倍に濃縮し、ｐＨ８．２に調整された２０ｍＭＴｒｉｓバッファーの約８容量に対して透析濾過した。Ｆａｂ’１プールを、ＧＥヘルスケア社のＣａｔｑｏ（商標）アニオン交換クロマトグラフィーカラム［デキストランリンカーを介して結合された四級アミンアニオン交換リガンド（イオン性容量０．１６〜０．２２ｍｍｏｌＣｌ−／ｍｌ）を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ（平均粒径９０μｍ）］にロードした。カラムはタンパク質ロードの前に、ｐＨ８．２に調整された２０ｍＭＴｒｉｓバッファーで平衡化されていた。
【００６９】
カラムにロードした後、ｐＨ８．２に調整した２０ｍＭＴｒｉｓバッファーを用いてカラムを洗浄した。Ｆａｂ’１は、ロード及び洗浄工程に起因する通過画分に回収された。
【００７０】
得られたＦａｂ’１を含有するアニオン交換クロマトグラフィー溶出液を、ＧＥヘルスケア社のＰＤ−１０脱塩カラム（粒径８５〜２６０μｍ、５０００Ｄａの排除限界を有するＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５  ｍａｔｒｉｘゲル濾過クロマトグラフィーを用いたゲル濾過クロマトグラフィー）にロードした。ｐＨ４．５に調整された２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを前平衡バッファー、ロード後の洗浄バッファー及び溶出バッファーとして使用した。
【００７１】
Ｆａｂ’１溶出液を回収し、２０ｋＤａの２分枝を有する４０ｋＤａＰＥＧ−マレイミド（（３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）］−１−（３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル））アミノ］プロピルオキシ）プロパン、ＮＯＦ株式会社、東京、日本）をＦａｂ’１−ＰＥＧモル比１：２になるよう加え、１８〜２２℃で１７時間反応させた。
【００７２】
サイズ排除ＨＰＬＣを使用して決定されたＰＥＧ化効率は、４３％Ｆａｂ’１−ＰＥＧモノマーの生成をもたらした（図１）。
【００７３】
実施例２
ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’を、大腸菌ｗ３１１０宿主細胞において異種タンパク質として発現させ、ｐＨ７．４に調整した１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ−ＥＤＴＡバッファーを添加し、５９℃の熱処理を行うことにより、宿主細胞のペリプラズム空間から異種タンパク質を放出させた。
遠心分離により細胞材料を除去し、酢酸を添加して、異種タンパク質を含む細胞抽出物をｐＨ４．５に調整した。次いで、ｐＨ調整された細胞抽出物を、遠心分離と０．２μｍ濾過との組み合わせを用いて清澄化した。カラムは、供給流をロードする前、酢酸でｐＨ４．５に調整された６カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで平衡化されていた。
清澄化された抽出物（供給流）を水で約４ｍＳ／ｃｍの目標導電率まで希釈し、１ｍＭグルタチオンを補充した。
【００７４】
次いで、ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’を含む供給流を、ＧＥヘルスケア社のＣａｐｔｏ  Ｓ（登録商標）陽イオン交換カラム［デキストランリンカーを介して結合されたスルホン酸陽イオン交換リガンド（イオン容量０．１１〜０．１４ｍｍｏｌＮａ＋／ｍｌ）を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ（平均粒径９０μｍ）］にロードした。カラムは、供給流をロードする前、１ｍＭグルタチオンを含有する、酢酸でｐＨ４．５に調整された６カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで平衡化されていた。
【００７５】
ロード後、酢酸でｐＨ４．５に調整した１ｍＭグルタチオンを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーでカラムを洗浄し、全ての未結合物質が洗浄除去した。Ｆａｂ’１含有画分は、（酢酸でｐＨ４．５に調整された）１ｍＭグルタチオンを含有する、５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された。
得られたＦａｂ’１含有溶出液を、１０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜（Ｔシリーズ膜（Ｐａｌｌ社製））を用いて限外濾過し、容積が約半分になるよう濃縮し、ｐＨ８．５に調整された１ｍＭグルタチオンを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファーに対して透析濾過した。バッファーの７倍量が透析濾過に用いられた。
【００７６】
このプールを、ＧＥヘルスケア社のＣａｔｑｏ（商標）  アニオン交換クロマトグラフィーカラム［デキストランリンカーを介して結合された四級アミンアニオン交換リガンド（イオン性容量０．１６〜０．２２ｍｍｏｌＣｌ−／ｍｌ）を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ（平均粒径９０μｍ）］にロードした。カラムはタンパク質ロードの前に、ｐＨ８．５に調整された１ｍＭグルタチオンを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファーで平衡化されていた。
【００７７】
ローディング後、１ｍＭグルタチオンを含有するｐＨ８．５に調整した２０ｍＭＴｒｉｓバッファーを用いてカラムを洗浄した。ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’は、ロード及び洗浄工程に起因する通過画分から回収された。得られたＣＤＰ８７０Ｆａｂ’を含有するアニオン交換クロマトグラフィー溶出液を、ＧＥヘルスケア社のＰＤ−１０脱塩カラム（粒径８５〜２６０μｍ、５０００Ｄａの排除限界を有するＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５  ｍａｔｒｉｘゲル濾過クロマトグラフィーを用いたゲル濾過クロマトグラフィー）にロードした。ｐＨ４．５に調整された２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを前平衡バッファー、ロード後の洗浄バッファー及び溶出バッファーとして使用した。
【００７８】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’溶出液を回収し、２０ｋＤａの２分枝を有する４０ｋＤａＰＥＧ−マレイミド（ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）のマレイミドプロピオンアミド、修飾リシン、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ株式会社、カリフォルニア、ＵＳ）を１：２．８のＰＥＧモル比過剰になるよう加え、１８〜２２℃で反応させた。
【００７９】
サイズ排除ＨＰＬＣを用いて決定されたＰＥＧ化効率は、７８．１％ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’−ＰＥＧモノマーの生成をもたらした（図２）。
【００８０】
実施例３
ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’を、大腸菌ｗ３１１０宿主細胞において異種タンパク質として発現させ、ｐＨ７．４に調整し、１ｍＭグルタチオンを含有した１００ｍＭＴｒｉｓ／１０ｍＭ−ＥＤＴＡバッファーを添加し、５９℃で熱処理を行い、宿主細胞のペリプラズム空間から異種タンパク質を放出させた。遠心分離により細胞材料を除去し、酢酸を添加することにより、異種タンパク質を含む細胞抽出物をｐＨ４．５に調整した。次いで、ｐＨ調整された細胞抽出物を０．２μＭ濾過により、清澄化した。
清澄化された抽出物（供給流）を水で４ｍＳ／ｃｍの目標導電率まで希釈し、１ｍＭグルタチオンを補充した。
【００８１】
次いで、ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’を含む供給流を、ＧＥヘルスケア社のＣａｐｔｏ  Ｓ（登録商標）陽イオン交換カラム［デキストランリンカーを介して結合されたスルホン酸陽イオン交換リガンド（イオン容量０．１１〜０．１４ｍｍｏｌＮａ＋／ｍｌ）を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ（平均粒径９０μｍ）］にロードした。カラムは、供給流をロードする前、酢酸でｐＨ４．５に調整された１ｍＭグルタチオンを含有する６カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで平衡化されていた。
【００８２】
ロード後、１ｍＭグルタチオンを含む酢酸でｐＨ４．５に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、全ての未結合物質を洗浄除去した。ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’画分を、酢酸を用いてｐＨ４に調整された１ｍＭグルタチオンを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。
【００８３】
得られたＣＤＰ８７０Ｆａｂ’含有溶出液を、１０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜を用いて限外濾過し、容積が約三分の１になるよう濃縮し、９倍量のｐＨ８．５に調整された１ｍＭグルタチオンを含有する２０ｍＭＴｒｉｓバッファーに対して透析濾過した。
【００８４】
ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’プールを、ＧＥヘルスケア社のＣａｔｑｏ（商標）アニオン交換クロマトグラフィーカラム［デキストランリンカーを介して結合された四級アミンアニオン交換リガンド（イオン性容量０．１６〜０．２２ｍｍｏｌＣｌ−／ｍｌ）を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ（平均粒径９０μｍ）］にロードした。カラムはタンパク質ロードの前に、ｐＨ８．５に調整された１ｍＭグルタチオンを含有する２０ｍＭＴｒｉｓバッファーで平衡化されていた。ローディング後、ｐＨ８．５に調整した１ｍｍグルタチオンを含有する２０ｍＭＴｒｉｓバッファーを用いてカラムを洗浄した。ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’は、ローディングおよび洗浄工程に起因する通過画分中に回収された。
【００８５】
得られたＣＤＰ８７０Ｆａｂ’含有溶出液を、１０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜を用いて限外濾過し、ＰＥＧ化のための調製において２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５に透析濾過した。
２０ｋＤａの２分枝を有する４０ｋＤａＰＥＧ−マレイミド（ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）のマレイミドプロピオンアミド、修飾リシン、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ株式会社、カリフォルニア、ＵＳ）を回収されたタンパク質に、ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’：ＰＥＧモル比で１：１．４及び１：２で添加し、そして１８−２２℃で１７時間反応させた。
逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって決定されるようなＰＥＧ化効率は、ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’：ＰＥＧモル比１：１．４及び１：２でそれぞれ、７４％および７４．４％のＣＤＰ８７０Ｆａｂ’−ＰＥＧモノマーの生成を明らかにした。
【００８６】
実施例４  
Ｆａｂ’１（部位特異的なＰＥＧ化を目的とする単一のヒンジチオールを含むＦａｂ’抗体断片）が大腸菌Ｗ３１１０宿主細胞において異種タンパク質として発現され；ｐＨ７．４に調整した１ｍＭグルタチオンを含有する１００ｍＭＴｒｉｓ／１０ｍＭ−ＥＤＴＡバッファーを添加し、５７．５℃で加熱処理することにより、異種タンパク質が宿主細胞のペリプラズム空間から放出された。細胞物質を遠心分離により除去し、ｐＨ４．５の酢酸を添加して異種タンパク質を含む細胞抽出物を調整した。遠心分離と０．２μｍ濾過の組み合わせを用いてｐＨ調整した細胞抽出液を清澄化した。次いで、清澄化された抽出物（供給流）を約６．０ｍＳ／ｃｍの導電率を目標にして、水で希釈した（希釈率約４）。
【００８７】
次いで、Ｆａｂ’１を含有する供給流を、ＧＥヘルスケア社のＣａｐｔｏ  Ｓ（登録商標）陽イオン交換カラム［デキストランリンカーを介して結合されたスルホン酸陽イオン交換リガンド（イオン容量０．１１〜０．１４ｍｍｏｌＮａ＋／ｍｌ）を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ（平均粒径９０μｍ）］にロードした。カラムは、供給流をロードする前、酢酸でｐＨ４．５に調整された１ｍＭグルタチオンを含有する６カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで平衡化されていた。
【００８８】
ロード後、１ｍＭグルタチオンを含む酢酸でｐＨ４．５に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、全ての未結合物質を洗浄除去した。Ｆａｂ’１画分を、酢酸を用いてｐＨ４．５に調整された１ｍＭグルタチオンを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１９０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。
得られたＦａｂ’１含有溶出液を、１０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜を用いて限外濾過し、容積が約四分の１になるよう濃縮し、８倍量のｐＨ８．２に調整された１ｍＭグルタチオンを含有する２０ｍＭＴｒｉｓバッファーに対して透析濾過した。
【００８９】
Ｆａｂ’１プールを、ＧＥヘルスケア社のＣａｔｑｏ（商標）アニオン交換クロマトグラフィーカラム［デキストランリンカーを介して結合された四級アミンアニオン交換リガンド（イオン性容量０．１６〜０．２２ｍｍｏｌＣｌ−／ｍｌ）を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ（平均粒径９０μｍ）］にロードした。カラムはタンパク質ロードの前に、ｐＨ８．２に調整された１ｍＭグルタチオンを含有する２０ｍＭＴｒｉｓバッファーで平衡化されていた。
カラムにローディング後、ｐＨ８．２に調整した１ｍＭグルタチオンを含有する２０ｍＭＴｒｉｓバッファーを用いてカラムを洗浄した。Ｆａｂ’１は、ローディングおよび洗浄工程に起因する通過画分中に回収された。
【００９０】
得られたＦａｂ’１を含有するアニオン交換クロマトグラフィー溶出液を、ＧＥヘルスケア社のＰＤ−１０脱塩カラム（粒径８５〜２６０μｍ、５０００Ｄａの排除限界を有するＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５  ｍａｔｒｉｘゲル濾過クロマトグラフィーを用いたゲル濾過クロマトグラフィー）にロードした。ｐＨ４．５に調整された２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを前平衡バッファー、ロード後の洗浄バッファー及び溶出バッファーとして使用した。ｐＨ４．５に調整された２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを前平衡バッファー、ロード後の洗浄バッファー及び溶出バッファーとして使用した。
Ｆａｂ’１溶出液を回収し、２０ｋＤａの２分枝を有する４０ｋＤａＰＥＧ−マレイミド（（３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）］−１−（３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル））アミノ］プロピルオキシ）プロパン、ＮＯＦ株式会社、東京、日本）をＦａｂ’１−ＰＥＧモル比１：２になるよう加え、２０℃で１７時間反応させた。
【００９１】
サイズ排除ＨＰＬＣを用いて決定されたＰＥＧ化効率は、７１．５％のＦａｂ’１−ＰＥＧモノマーの生成をもたらした（図１）。
【００９２】
実施例５
Ｆａｂ’１（部位特異的なＰＥＧ化を目的とする単一のヒンジチオールを含むＦａｂ’抗体断片）が大腸菌Ｗ３１１０宿主細胞において異種タンパク質として発現され；ｐＨ７．４に調整した１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ−ＥＤＴＡバッファーを添加し、５７．５℃で加熱処理することにより、異種タンパク質が宿主細胞のペリプラズム空間から放出された。細胞物質を遠心分離により除去し、ｐＨ４．５の酢酸を添加して異種タンパク質を含む細胞抽出物を調整した。遠心分離と０．２μｍ濾過の組み合わせを用いてｐＨ調整した細胞抽出液を清澄化した。次いで、清澄化された抽出物（供給流）を水で希釈して、６．０ｍＳ／ｃｍの導電率にした。
【００９３】
次いで、Ｆａｂ’１を含有する供給流を、ＧＥヘルスケア社のＣａｐｔｏ  Ｓ（登録商標）陽イオン交換カラム［デキストランリンカーを介して結合されたスルホン酸陽イオン交換リガンド（イオン容量０．１１〜０．１４ｍｍｏｌＮａ＋／ｍｌ）を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ（平均粒径９０μｍ）］にロードした。カラムは、供給流をロードする前、酢酸でｐＨ４．５に調整された５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで平衡化されていた。
カラムをロードした後、酢酸でｐＨ４．５に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄して、全ての未結合物質が洗浄除去した。Ｆａｂ’１含有画分は、酢酸でｐＨ４．５に調整された５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１９０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された。
【００９４】
得られたＦａｂ’１含有溶出液を、１０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜を用いて限外濾過し、容積が約四分の１になるよう濃縮し、８倍量のｐＨ８．２に調整された２０ｍＭＴｒｉｓバッファーに対して透析濾過した。
Ｆａｂ’１プールを、ＧＥヘルスケア社のＣａｔｑｏ（商標）アニオン交換クロマトグラフィーカラム［デキストランリンカーを介して結合された四級アミンアニオン交換リガンド（イオン性容量０．１６〜０．２２ｍｍｏｌＣｌ−／ｍｌ）を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ（平均粒径９０μｍ）］にロードした。カラムはタンパク質ロードの前に、ｐＨ８．２に調整された２０ｍＭＴｒｉｓバッファーで平衡化されていた。
【００９５】
カラムにローディング後、ｐＨ８．２に調整した２０ｍＭＴｒｉｓバッファーを用いてカラムを洗浄した。Ｆａｂ’１は、ローディングおよび洗浄工程に起因する通過画分中に回収された。
回収されたＦａｂ’１を含有するアニオン交換クロマトグラフィー溶出液を、１０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜を用いて限外濾過し、２０ｍｇ／ｍｌになるよう濃縮し、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファーｐＨ６．８に透析濾過した。
【００９６】
次いで、得られたＦａｂ’１含有試料を、同じ膜とｐＨ６．８に調整された２ｍＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍリン酸バッファーおよび１ｍＭ  ２−メルカプトエチルアミンを用いた透析濾過により６．５時間かけて還元した。
さらに、ｐＨ４．５に調整された２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーへの限外濾過／透析濾過を同じ膜上で行い、ＰＥＧ化のための調製のために還元剤を除去した。
２０ｋＤａの２分枝を有する４０ｋＤａＰＥＧ−マレイミド（（３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）］−１−（３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル））アミノ］プロピルオキシ）プロパン、ＮＯＦ株式会社、東京、日本）を回収したＦａｂ’１タンパク質にＦａｂ’：ＰＥＧ重量対重量比で１：１．２５になるよう加え、２０℃で１７時間反応させた。
【００９７】
サイズ排除ＨＰＬＣを用いて決定されたＰＥＧ化効率は、７１．５％のＦａｂ’１−ＰＥＧモノマーの生成をもたらした（図１）。する８倍量のｐＨ８．２に調整された２０ｍＭＴｒｉｓバッファーに対して透析濾過した。ＧＥヘルスケア社のＰＤ−１０脱塩カラム（粒径８５〜２６０μｍ、５０００Ｄａの排除限界を有するＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５  ｍａｔｒｉｘゲル濾過クロマトグラフィーを用いたゲル濾過クロマトグラフィー）にロードした。ｐＨ４．５に調整された２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを前平衡バッファー、ロード後の洗浄バッファー及び溶出バッファーとして使用した。ｐＨ４．５に調整された２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを前平衡バッファー、ロード後の洗浄バッファー及び溶出バッファーとして使用した。
【００９８】
Ｆａｂ’１溶出液を回収し、２０ｋＤａの２分枝を有する４０ｋＤａＰＥＧ−マレイミド（（３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）］−１−（３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル））アミノ］プロピルオキシ）プロパン、ＮＯＦ株式会社、東京、日本）をＦａｂ’１−ＰＥＧモル比１：２になるよう加え、１８〜２２℃で１７時間反応させた。
【００９９】
サイズ排除ＨＰＬＣを用いて決定されたＰＥＧ化効率は、７７．４％のＦａｂ’１−ＰＥＧモノマーの生成をもたらした（図３）。
【図１】
2018505210.tif 000002
【図２】
2018505210.tif 000003
【図３】
2018505210.tif 000004
【国際調査報告】
2018505210.tif 000005
2018505210.tif 000006
2018505210.tif 000007