(57)【要約】本発明は、哺乳動物対象における皮膚色素沈着を調整するための、化合物、該化合物を含む組成物、ならび前記調整において前記化合物および／または組成物を使用する方法を含む。特定の態様において、本発明の化合物は、対象における色素過剰と関連する皮膚障害または疾患を治療または予防する。他の態様において、本発明の化合物は、非古典的性ステロイドホルモン受容体GPRE1に対するアンタゴニストとして作用し、古典的核内エストロゲン受容体(ER)には結合しない。さらに他の態様において、本発明の化合物は、非古典的性ステロイドホルモン受容体PAQR7に対するアゴニストとして作用し、古典的核内プロゲステロン受容体(PR)には結合しない。2018517665.tif 000021
2018517665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)の化合物：
2018517665.tif 000016
式中、
R1は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より選択され；
R2は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より選択され；
結合aは、単結合または二重結合であり；
R3は、Hおよびハロからなる群より選択され；
ここで、該化合物は、G-15（rel-(3aS,4S,9bR)-4-(6-ブロモベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-3a,4,5,9b-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[c]キノリン）でも、G-36（rel-(3aS,4R,9bR)-4-(6-ブロモベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-8-イソプロピル-3a,4,5,9b-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[c]キノロン）でもない、
前記化合物、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマー。
【請求項２】
(I)において、R1がHまたは2-プロピルである、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
(I)において、R2がHまたはメチルである、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
(I)において、結合aが二重結合である、請求項1記載の化合物。
【請求項５】
(I)において、結合aが単結合である、請求項1記載の化合物。
【請求項６】
R3が、H、F、Cl、およびBrからなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項７】
2018517665.tif 000017
からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1記載の化合物。
【請求項８】
少なくとも1つの薬学的に許容される担体と、
式(I)の分子：
2018517665.tif 000018
式中、
R1は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より選択され；
R2は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より選択され；
結合aは、単結合または二重結合であり；
R3は、Hおよびハロからなる群より選択される；
ならびに
CH2P4（rel-(8S,9S,10S,13S,14S,17S)-17-アセチル-13-メチル-10-ビニル-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H)-オン）
からなる群より選択される少なくとも1つの化合物、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーとを含む、薬学的組成物。
【請求項９】
局所または経皮投与用に製剤化されている、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記化合物がG-15を含まない、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記化合物がG-36を含まない、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
少なくとも1つの日焼け止め剤をさらに含む、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
少なくとも1つのサンスクリーンローションをさらに含む、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
哺乳動物対象における皮膚色素沈着を減少させるかまたはその増加を予防するかもしくは逆転させる方法であって、(i)古典的核内エストロゲン受容体には結合しないGPERアンタゴニスト、および(ii)古典的核内プロゲステロン受容体には結合しないPAQR7アゴニストからなる群より選択される少なくとも1つの化合物の治療有効量を該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記対象がヒトである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
(i)における古典的核内エストロゲン受容体が、ERαおよびERβからなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
(ii)における古典的核内プロゲステロン受容体が、PR-AおよびPR-Bからなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
(i)における化合物がGPER1アンタゴニストである、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、経口避妊薬の使用、妊娠、および女性における内因性エストロゲンと関連する、色素変化；日光黒子；ざ瘡；湿疹；化学火傷瘢痕、日焼け瘢痕、および熱傷瘢痕；狼瘡；乾癬；サルコイドーシス；粃糠疹；色素異常性固定性紅斑；水疱形成疾患；薬物反応；扁平苔癬；ならびに他の炎症性皮膚傷害からなる群より選択される少なくとも1つの状態を患っている、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物を前記対象に局所または経皮投与する、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物が、局所または経皮投与用の薬学的組成物として製剤化されている、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記薬学的組成物が少なくとも1つの日焼け止め剤をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記薬学的組成物がサンスクリーンローションをさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
前記薬学的組成物が、皮膚漂白剤を本質的に含まない、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーが、
式(I)の分子：
2018517665.tif 000019
式中、
R1は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より選択され；
R2は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より選択され；
結合aは、単結合または二重結合であり；
R3は、Hおよびハロからなる群より選択される；
ならびに
CH2P4
からなる群より選択される少なくとも1つ、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーである、請求項14記載の方法。
【請求項２６】
(I)が：
2018517665.tif 000020
からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が、G-15、G-36およびCH2P4からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物対象における皮膚色素沈着を減少させるかまたはその増加を予防するかもしくは逆転させるためのキットであって、請求項8〜13のいずれか一項記載の少なくとも1つの薬学的組成物；および該少なくとも1つの薬学的組成物を該対象に局所または経皮投与するための使用説明書を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年4月6日に出願された米国仮出願第62/143,597号および2015年9月10日に出願された第62/216,792号に対して米国特許法119条(e)の下で優先権を主張し、これらの出願の全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府支援の研究開発に関する陳述
本発明は、National Institutes of Health / National Cancer Instituteにより拠出されたCA163566の下、およびNational Institutes of Health SPOREにより拠出されたCA174523の下、政府の援助で行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトの皮膚の色は、最も暗い褐色から最も明るいピンクがかった白色の色調まで様々な範囲に及ぶ。ヒトにおける皮膚の色素沈着は、主として、皮膚に浸透する紫外(UV)線の量を調節するために、従って、放射線の生化学的効果を制御するために、進化した。ヒトの実際の皮膚の色に影響を与える最も重要な物質は、メラニンという色素である。
【０００４】
メラニンは、皮膚に浸透する日光からのUV線の量を吸収によって制御する。UV線はビタミンDの産生を助けることができるが、UVへの過度の曝露は健康を害し得る。メラニンは、皮膚内のメラノサイトと呼ばれる細胞において産生され、色黒のヒトの皮膚の色の主な決定要素である。産生されるメラニンの量およびタイプの両方が、不完全優性下で機能する多数の遺伝子によって制御される。基底表皮中に存在するメラノサイトは、アルファ-メラニン細胞刺激ホルモン（αMSH）によって主に調節されると考えられている複雑なプロセスである、メラニンの合成（メラニン産生）を通してヒトの皮膚の色を制御する。αMSHペプチドは、UV損傷に応答して、下垂体によって中枢的に、および周囲のケラチノサイトによって局所的に、分泌される。Gタンパク質共役受容体(GPCR)である、メラノコルチン受容体1(MC1R)へのαMSH結合は、アデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞質cAMPを増加させる。この二次メッセンジャーは、メラニン合成のために必要とされる遺伝子の発現へ至る下流転写事象のカスケードを活性化する。
【０００５】
メラニンの産生は、メラノソームと呼ばれる小さな膜結合型パッケージ内で行われる。メラノソームはメラニンで満ちるにつれて、それらはメラノサイトのスレンダーアーム中へ移動し、そこからそれらはケラチノサイトへ移される。正常な条件下では、メラノソームはケラチノサイトの上部を覆い、遺伝子損傷からそれらを保護する。1つのメラノサイトは、ケラチノサイトからのシグナルに従って約36個のケラチノサイトへメラニンを供給する。それらはまた、メラニン産生およびメラノサイト複製を調節する。メラノサイトが異なる量および種類のメラニンを産生することに主に起因して、人々は異なる皮膚の色を有する。ヒトの皮膚の色の背後にある遺伝機構は、皮膚、眼および髪の濃淡の色を作るチロシナーゼという酵素によって主に調節される。皮膚の色の差異は、皮膚中のメラノソームのサイズおよび分布の差異にも起因する。
【０００６】
ある種の一様でない色素沈着は、バイオエスニック背景または皮膚の色にかかわらず、大抵の人々に影響を与える。皮膚は、正常と比べてより明るくもしくはより暗く見え得るか、または色素沈着を完全に欠き得る。しみだらけの一様でない領域、褐色から灰色の変色した斑、またはそばかすが存在し得る。黄疸、皮膚カロチン症、または銀皮症などの血液関連状態は別として、皮膚の色素沈着障害は一般に、多すぎるまたは少なすぎるメラニンを身体が産生するために生じる。
【０００７】
ヒトなどの哺乳動物対象における皮膚の色素沈着を減少させるかまたはその増加を予防するかもしくは逆転させるための新規の組成物および方法を開発するニーズが当技術分野において存在する。そのような組成物および方法は、非限定的な態様において、色素過剰と関連する皮膚障害または疾患を治療または予防するために有用であろう。そのような組成物および方法は、非限定的な態様において、妊娠と関連する皮膚障害または疾患を治療または予防するために有用であろう。本発明はこのニーズを満たす。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、化合物、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを提供する。本発明は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体と少なくとも1つの本発明の化合物とを含む薬学的組成物をさらに提供する。本発明は、哺乳動物対象における皮膚色素沈着を減少させるかまたはその増加を予防するかもしくは逆転させる方法をさらに提供する。本発明は、哺乳動物対象における皮膚色素沈着を減少させるかまたはその増加を予防するかもしくは逆転させるためのキットをさらに提供する。
【０００９】
特定の態様において、本発明の化合物または分子は、
2018517665.tif 000003
であり、式中、R1は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より選択され；R2は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より選択され；結合aは、単結合または二重結合であり；R3は、Hおよびハロからなる群より選択される。
【００１０】
特定の態様において、化合物もしくは分子、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーは、G-15（rel-(3aS,4S,9bR)-4-(6-ブロモベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-3a,4,5,9b-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[c]キノリン）である。他の態様において、化合物もしくは分子、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーは、G-15ではない。
【００１１】
特定の態様において、化合物もしくは分子、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーは、G-36（rel-(3aS,4R,9bR)-4-(6-ブロモベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-8-イソプロピル-3a,4,5,9b-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[c]キノロン）である。他の態様において、化合物もしくは分子、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーは、G-36ではない。
【００１２】
特定の態様において、化合物もしくは分子、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーは、CH2P4（rel-(8S,9S,10S,13S,14S,17S)-17-アセチル-13-メチル-10-ビニル-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H)-オン）である。他の態様において、化合物もしくは分子、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーは、CH2P4ではない。
【００１３】
特定の態様において、(I)において、R1はHまたは2-プロピルである。 他の態様において、(I)において、R2はHまたはメチルである。さらに他の態様において、(I)において、結合aは二重結合である。さらに他の態様において、(I)において、結合aは単結合である。さらに他の態様において、R3は、H、F、Cl、およびBrからなる群より選択される。
【００１４】
特定の態様において、化合物は、
2018517665.tif 000004
からなる群より選択される少なくとも1つである。
【００１５】
特定の態様において、薬学的組成物は、局所または経皮投与用に製剤化されている。他の態様において、薬学的組成物はG-15を含まない。さらに他の態様において、薬学的組成物はG-36を含まない。さらに他の態様において、薬学的組成物はCH2P4を含まない。さらに他の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1つの日焼け止め剤をさらに含む。さらに他の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1つのサンスクリーンローションをさらに含む。
【００１６】
特定の態様において、方法は、(i)古典的（canonical）核内エストロゲン受容体には結合しないGPERアンタゴニスト、および(ii)古典的核内プロゲステロン受容体には結合しないPAQR7アゴニストからなる群より選択される少なくとも1つの化合物の治療有効量を対象に投与する工程を含む。
【００１７】
特定の態様において、対象はヒトである。
【００１８】
特定の態様において、古典的核内エストロゲン受容体は、ERαおよびERβからなる群より選択される少なくとも1つを含む。
【００１９】
特定の態様において、古典的核内プロゲステロン受容体は、PR-AおよびPR-Bからなる群より選択される少なくとも1つを含む。
【００２０】
特定の態様において、化合物はGPER1アンタゴニストである。
【００２１】
特定の態様において、対象は、経口避妊薬の使用、妊娠、および女性における内因性エストロゲンと関連する、色素変化；日光黒子；ざ瘡；湿疹；化学火傷瘢痕、日焼け瘢痕、および熱傷瘢痕；狼瘡；乾癬；サルコイドーシス；粃糠疹；色素異常性固定性紅斑；水疱形成疾患；薬物反応；扁平苔癬；ならびに他の炎症性皮膚傷害からなる群より選択される少なくとも1つの状態を患っている。
【００２２】
特定の態様において、化合物を対象に局所または経皮投与する。さらに他の態様において、化合物は、局所または経皮投与用の薬学的組成物として製剤化されている。さらに他の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1つの日焼け止め剤をさらに含む。さらに他の態様において、薬学的組成物は、サンスクリーンローションをさらに含む。さらに他の態様において、薬学的組成物は、皮膚漂白剤を本質的に含まない。
【００２３】
特定の態様において、化合物は、G-15、G-36およびCH2P4からなる群より選択される少なくとも1つである。
【００２４】
特定の態様において、キットは、本発明の少なくとも1つの化合物および／または薬学的組成物を含む。他の態様において、キットは、対象に少なくとも1つの薬学的組成物を局所または経皮投与するための使用説明書をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明を説明する目的のために、本発明の特定の態様が図面に示されている。しかしながら、本発明は、図面に示されている態様の正確な配置および手段に限定されない。
【００２６】
【図１】図1は、妊娠関連色素沈着障害を示す画像のセットを含む。画像A〜Cは、黒皮症を有する患者の色素沈着障害を示す。画像Dは、色素分界線条を有する患者を示す。画像EおよびFは、母親における典型的な黒線を示す。画像Gは、小児における典型的な黒線を示す。
【図２Ａ】図2A〜2Gは、ヒトメラノサイトにおけるメラニン産生を示すスキームおよび棒グラフのセットを含む。図2Aは、ヒトメラノサイト恒常性の古典的調節の略図を含む。
【図２Ｂ】図2Bは、用量依存様式でαMSHに応答したメラニン産生を示す棒グラフを含む。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図２Ｃ】図2Cは、用量依存様式でエストロゲンに応答したメラニン産生を示す棒グラフを含む。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図２Ｄ】図2Dは、ビヒクル、αMSH、またはエストロゲンで処理されたメラノサイトによるメラニン産生を示す棒グラフを含む。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図２Ｅ】図2Eは、用量依存様式でプロゲステロン(P4)に応答したメラニン産生を示す棒グラフを含む。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図２Ｆ】図2Fは、iPS由来雌性メラノサイトを使用した、エストロゲンおよびプロゲステロンに応答したメラニン産生を示す棒グラフを含む。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図２Ｇ】図2Gは、顔面の成体メラノサイトを使用した、エストロゲンおよびプロゲステロンに応答したメラニン産生を示す棒グラフを含む。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図３−１】図3A〜3Fは、エストロゲンおよびプロゲステロンはメラニン合成を相互に調節するという知見を示す画像および棒グラフのセットを含む。図3Aは、ビヒクル処理対照と比較しての、エストロゲン(E2)で処理された初代ヒトメラノサイトのメラニン含有量を示す棒グラフを含む。図3Bは、ビヒクルまたはエストロゲンで処理された器官型皮膚のフォンタナ・マッソン（メラニン）染色を示す棒グラフおよび画像を含む。相対的メラニン含有量を図の下部にある棒グラフにて示す。図3Cは、ビヒクルまたはエストロゲンで処理された器官型皮膚のMITF（小眼球症関連転写因子）免疫組織化学を示す棒グラフおよび画像を含む。メラノサイト集団密度を図の下部にある棒グラフにて示す。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05、スケールバー＝50μm。
【図３−２】図3Dは、ビヒクルと比較しての、プロゲステロン(P4)で処理された初代ヒトメラノサイトのメラニン含有量を示す棒グラフを含む。図3Eは、プロゲステロンまたはビヒクルで処理された器官型皮膚組織のフォンタナ・マッソン（メラニン）染色を示す棒グラフおよび画像を含む。相対的メラニン含有量を図の下部にある棒グラフにて示す。図3Fは、ビヒクルまたはプロゲステロンで処理された器官型皮膚組織のMITF免疫組織化学を示す棒グラフおよび画像を含む。メラノサイト集団密度を図の下部にある棒グラフにて示す。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05、スケールバー＝50μm。
【図４Ａ】図4A〜4Hは、エストロゲンおよびプロゲステロンが、非古典的（nonclassical）受容体を通して古典的メラニン産生経路にアクセスするという知見を示す画像および棒グラフのセットを含む。図4Aは、エストロゲンで処理されたメラノサイトからのcAMP ELISAを示す棒グラフを含む。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図４Ｂ】図4Bは、エストロゲン処理後の古典的メラニン経路調節因子の変化を示すウェスタンブロット画像のセットを含む。
【図４Ｃ】図4Cは、プロゲステロンで処理されたメラノサイトからのcAMP ELISAを示す棒グラフを含む。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図４Ｄ】図4Dは、プロゲステロン処理後の古典的メラニン経路調節因子の変化を示すウェスタンブロット画像のセットを含む。
【図４Ｅ】図4Eは、エストロゲンおよびプロゲステロンで同時に処理されたメラノサイトからのメラニンアッセイを示す棒グラフを含む。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図４Ｆ】図4Fは、MCF7細胞およびメラノサイトにおけるエストロゲンおよびプロゲステロン受容体についてのウェスタンブロット画像のセットを含む。
【図４Ｇ】図4Gは、対照shRNAまたはGPERを標的とするshRNAが導入されたメラノサイトのメラニン含有量を示す棒グラフを含む。細胞をビヒクルまたはエストロゲンのいずれかで処理した。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図４Ｈ】図4Hは、対照shRNAまたはPAQR7を標的とするshRNAが導入されたメラノサイトに対して行われたメラニンアッセイを示す棒グラフを含む。細胞をビヒクルまたはプロゲステロンのいずれかで処理した。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図５Ａ】図5A〜5Hは、メラノサイトにおけるホルモン受容体を示す棒グラフおよび表のセットを含む。図5Aは、qRT-PCRによって決定された、MCF7細胞およびメラノサイトにおける古典的（classical）ホルモン受容体の相対的遺伝子発現を示す棒グラフを含む。Ct値を、アクチンで正規化し、MCF7細胞におけるアンドロゲン受容体(AR)の発現に対して設定した。エラーバーは±s.d.を表す。
【図５Ｂ】図5Bは、ヒトメラノサイトにおける古典的および非古典的エストロゲンおよびプロゲステロン受容体についてのRPKM値を示す表を含み、慣例により、RPKM値>1は遺伝子が発現されていることを示す。
【図５Ｃ】図5Cは、1/Ct値として表示されるGPERおよびProgestin and AdipoQ Receptor 7 (PAQR7)の発現を示す棒グラフを含む。エラーバーは±s.d.を表す。
【図５Ｄ】図5Dは、qRT-PCRによって決定され、メラノサイトにおける発現レベルと比較して表示される、メラノサイト、線維芽細胞、およびケラチノサイトにおけるGPERおよびPAQR7転写物の相対的発現を示す棒グラフを含む。エラーバーは±s.d.を表す。
【図５Ｅ】図5Eは、GPERを標的とするする2つのヘアピンのmRNAノックダウン効率を表すqRT-PCRを示す棒グラフを含む。エラーバーは±s.d.を表す。
【図５Ｆ】図5Fは、PAQR7を標的とする2つのヘアピンのmRNAノックダウン効率を表すqRT-PCRを示す棒グラフを含む。エラーバーは±s.d.を表す。
【図５Ｇ】図5Gは、GFPまたはGPERを標的とするガイドRNAを有するLentiCRISPRV2が導入されたメラノサイトのメラニン含有量を示す棒グラフのセットを含む。細胞をビヒクルまたはエストロゲンのいずれかで処理した。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図５Ｈ】図5Hは、GFPまたはPAQR7を標的とするガイドRNAを有するLentiCRISPRV2が導入されたメラノサイトのメラニン含有量を示す棒グラフのセットを含む。細胞をビヒクルまたはプロゲステロンのいずれかで処理した。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図６】図6は、百日咳毒素(PTX)、プロゲステロン(P4)、または両方に応答したメラニン合成を示す棒グラフである。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図７Ａ】図7A〜7Bは、メラニン産生が、性ステロイドアナログ（現在臨床使用されているGPERアゴニスト）によって変化するという知見を示す棒グラフのセットを含む。図7Aは、タモキシフェン(TMX)に応答したメラニン産生を示す棒グラフである。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図７Ｂ】図7Bは、エチニルエストラジオール(EE2)に応答したメラニン産生を示す棒グラフである。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図８】図8は、選択的GPERアンタゴニストG-15またはG-36の存在下で、ビヒクル、GPERアゴニスト、またはエストロゲンで処理されたメラノサイトによるメラニン産生を示す棒グラフを含む。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図９】図9A〜9Bは、メラニン産生に対する、PAQR7を標的とする特異的アゴニストの効果を示す棒グラフのセットを含む。図9Aは、特異的PAQR7アゴニストであるCH2P4に応答したメラニン産生を示す棒グラフを含む。図9Bは、対照shRNAまたはPAQR7を標的とするshRNAがレンチウイルスによって導入されたメラノサイトに対して行われたメラニンアッセイを示す棒グラフを含む。これらの細胞をビヒクルまたはCH2P4のいずれかで処理した。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05。
【図１０】図10A〜10Cは、GPERシグナル伝達が、器官型ヒト組織におけるメラニン産生を変化させるために十分であるという知見を示す画像および棒グラフのセットを含む。図10Aは、ビヒクル(左)またはCH2P4(右)で処理された器官型皮膚を示す画像のセットを含む。図10Bは、ビヒクルまたはCH2P4で処理された器官型皮膚のフォンタナ・マッソン（メラニン）染色を示す画像および棒グラフのセットを含む。メラニン含有量の定量化を右に示す。図10Cは、ビヒクルまたはCH2P4で処理された器官型皮膚のMITF免疫組織化学を示す画像および棒グラフのセットを含む。メラノサイト集団密度の定量化を右に示す。N＝各実験について3つの生物学的レプリケート。エラーバーは±s.d.を表す、*p<0.05、スケールバー＝50μm。
【図１１】図11は、本明細書において議論される選択された生物学的経路の略図を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、一局面において、本発明の化合物が、ヒトなどの哺乳動物対象における皮膚色素沈着を調整するという予想外の発見に関する。特定の態様において、本発明の化合物は、対象における皮膚色素過剰を治療または予防する。他の態様において、本発明の化合物は、しわおよび／または早期老化による変色を治療または予防する。さらに他の態様において、本発明の組成物は、皮膚漂白製品および／またはDNA損傷性UV線への曝露無しで審美的利益のために皮膚色を調整する。さらに他の態様において、本発明の組成物は、例えば妊娠中におよび／またはエストロゲンもしくはそのアナログでの治療的処置中に起こり得る、エストロゲン関連皮膚変化（例えば、皮膚の黒ずみ、皮膚斑点の出現など）を戻すまたは最小限にするのを助ける。
【００２８】
ヒトの妊娠および経口避妊薬の使用は、一般的に、表皮色素沈着の変化と関連しており、これは、血中ホルモンの変化がメラノサイト恒常性を調節し得ることを示唆している。しかしながら、これらの効果を媒介する特定のホルモン、受容体、および下流経路が未確定であった。
【００２９】
本明細書において実証されるように、生理学的に関連するレベルの17β-エストラジオール（エストロゲン）は皮膚色素産生を促進し、一方、プロゲステロンは反対の効果を有する。メラニン産生の変化は、哺乳動物の色素沈着の公知の調節因子であるcAMPの並行する変化と関連する。正常な初代メラノサイトは、古典的エストロゲンおよびプロゲステロン受容体(ER/PR)を発現しない。本研究は、メラノサイトが、非古典的（non-canonical）ステロイドホルモン受容体である、Gタンパク質共役エストロゲン受容体1(GPER1)、および、プロゲスチンおよびアジポQ受容体7(PAQR7)を発現することを実証する。これらのタンパク質をレンチウイルス媒介CRISPR-Cas9によって除去すると、エストロゲンおよびプロゲステロンの色素効果が遮断され、これは、エストロゲンおよびプロゲステロンが、それぞれ、非古典的受容体GPER1およびPAQR7を通して相互に色素沈着に影響を与え、ヒトメラノサイト恒常性を調節することを示唆している。特定の局面において、これらの受容体およびそれらの関連するシグナル伝達経路の構成要素の調整は、表皮色素沈着障害における治療的有用性を有する。
【００３０】
遺伝的枯渇ならびに特異的な薬理学的アゴニストおよびアンタゴニストの両方を利用して、本明細書において提示される結果は、エストロゲンおよびプロゲステロンが、非古典的ホルモン受容体GPERおよびPAQR7それぞれの活性化を通して、ヒトメラノサイト色素産生に影響を及ぼすことを立証する（図11）。特定の非限定的な局面において、選択的アゴニストまたはアンタゴニストの使用による、これらの受容体の特異的活性化は、色素合成を増加または減少させるために十分であり、他の細胞タイプにおける古典的エストロゲンおよびプロゲステロン受容体活性化の潜在的に望ましくない効果を回避する。GPERおよびPAQR7は、ケラチノサイトまたは線維芽細胞において発現が減少しており、このため、全ての細胞においてアデニル酸シクラーゼを非特異的に活性化するフォルスコリンとは対照的に、薬物効果が関心対象の細胞へ限定されるだろう。
【００３１】
非限定的な態様において、G-15およびG-36は、GPERアンタゴニストであり、古典的核内ERには結合しない。特定の態様において、古典的核内ERはERαおよび／またはERβを含む。
【００３２】
非限定的な例において、CH2P4は、PAQR7アゴニストであり、古典的核内PRには結合しない。特定の態様において、古典的核内PRはPR-Aおよび／またはPR-Bを含む。
【００３３】
一局面において、特異的GPERアンタゴニストおよびPAQR7アゴニストは、表皮色素沈着障害を正常化するための有用な新規のクラスの治療薬である。一般的な苦痛、例えば、ざ瘡、湿疹、白斑、紫外(UV)線曝露、外傷、および妊娠を含む、無数の遺伝的および後天的状態が、広範囲かつ永続的であり得る皮膚色素沈着の変化と関連する。
【００３４】
特定の非限定的な態様において、本明細書に記載される受容体を標的とすることにより、しわ、および早期老化による変色から皮膚を保護することができ、さらに、DNA損傷性UV線または毒性皮膚漂白剤への曝露無しで審美的利益のために皮膚の色を調整することができる。
【００３５】
本発明は、本明細書に記載される化合物または任意のそのアナログに限定されるように解釈されるべきではない。特定の態様において、本発明は、GPERに対するアンタゴニストとして作用し、古典的核内エストロゲン受容体には結合しない、任意の化合物を包含する。他の態様において、本発明は、PAQR7に対するアゴニストとして作用し、古典的核内プロゲステロン受容体には結合しない、任意の化合物を包含する。
【００３６】
定義
本明細書において使用される場合、以下の用語の各々は、このセクションにおけるそれと関連する意味を有する。
【００３７】
別様に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学および化学における実験室手順は、周知でありかつ当技術分野において一般的に用いられるものである。
【００３８】
本明細書において使用される場合、用語「19-CH2P4」または「CHP4」は、rel-(8S,9S,10S,13S,14S,17S)-17-アセチル-13-メチル-10-ビニル-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H)-オン)、またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを指す。
【００３９】
本明細書において使用される場合、冠詞「1つの（a）」および「1つの（an）」は、その冠詞の文法上の目的語の1つまたは複数（即ち、少なくとも1）を指す。例として、「要素（an element）」は、1つまたは複数の要素を意味する。
【００４０】
本明細書において使用される場合、用語「αMSH」は、アルファ-メラニン細胞刺激ホルモンを指す。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈においてある程度変動する。量、持続時間など測定可能な値を指す際に本明細書において使用される場合、用語「約」は、指定された値から±20%または±10%、±5%、±1%、または±0.1%の変動を、そのような変動が開示された方法を行うのに適切である場合に、包含するように意図される。
【００４２】
本明細書において使用される場合、単独でまたは他の用語と組み合わせて用いられる「アルコキシ」という用語は、特に指定のない限り、酸素原子を介して分子の残りへ連結された、本明細書の他のところに定義されるような、指定された数の炭素原子を有するアルキル基、例えば、メトキシ、エトキシ、1-プロポキシ、2-プロポキシ（またはイソプロポキシ）ならびにより高次のホモログおよび異性体を意味する。具体例は、(C1〜C3)アルコキシ、例えば、これらに限定されないが、エトキシおよびメトキシである。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語「アルキル」は、単独でまたは別の置換基の一部分として、特に指定のない限り、指定された数の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖炭化水素を意味し（即ち、C1〜C10は1〜10個の炭素原子を意味する）、直鎖、分岐鎖、または環状置換基を含む。例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、およびシクロプロピルメチルが挙げられる。具体的な態様は、(C1〜C4)アルキル、例えば、これらに限定されないが、エチル、メチル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、およびシクロプロピルメチルである。
【００４４】
本明細書において使用される場合、用語「AR」は、アンドロゲン受容体を指す。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「cAMP」は、環状アデノシン一リン酸を指す。
【００４６】
本明細書において使用される場合、用語「CREB」は、cAMP応答エレメント結合タンパク質を指す。
【００４７】
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができず、もし疾患が改善されないと、動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持することができるが、動物の健康状態が、障害の非存在下でそうであろうよりも順調ではない、健康状態である。治療せずに放置しても、障害は、動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。
【００４８】
本明細書において使用される場合、用語「E2」はエストロゲンを指す。
【００４９】
本明細書において使用される場合、用語「EE2」はエチニルエストラジオールを指す。
【００５０】
本明細書において使用される場合、化合物の「有効量」または「治療有効量」または「薬学的有効量」という用語は、化合物が投与される対象に有利な効果を提供するために十分である化合物の量を指すため交換可能に使用される。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「ER」はエストロゲン受容体を指す。
【００５２】
本明細書において使用される場合、用語「GPCR」は、Gタンパク質共役受容体を指す。
【００５３】
本明細書において使用される場合、用語「G15」または「G-15」は、rel-(3aS,4R,9bR)-4-(6-ブロモベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-2,3,3a,4,5,9b-ヘキサヒドロ-1H-シクロペンタ[c]キノロン、またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを指す。
【００５４】
本明細書において使用される場合、用語「G36」または「G-36」は、rel-(3aS,4R,9bR)-4-(6-ブロモベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-8-イソプロピル-3a,4,5,9b-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[c]キノロン)、またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーを指す。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「GPR30受容体」(GPER1；CEPR；CMKRL2；DRY12；FEG-1；GPCR-Br；GPER；LERGU；LERGU2；LyGPR；またはmERとしても公知)は、エストロゲン依存性シグナル伝達を媒介する7回膜貫通型(7TM)Gタンパク質共役受容体を指す。GPR30は、高親和性(6 nMのKd)でエストロゲンに結合する、小胞体において見られる細胞内タンパク質であり、カルシウム動員および核内のホスファチジルイノシトール3,4,5-トリスリン酸産生を含む、迅速な細胞応答を媒介する。GPR30受容体は、そのような受容体が見られる組織にかかわらず、全てのタイプのGPR30受容体を指し、哺乳動物（例えば、ヒト、および獣医学的適用が関連する飼い慣らされた哺乳動物）の受容体およびその変異体を含む、任意のその変異体を指す。GPR30について使用されている他の名称としては、特に、CMKRL2、DRY12、FEG-1、GPCR-Br、LERGU、LERGU2、LyGPR、CEPRおよびMGC99678が挙げられる。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、単独でまたは別の置換基の一部分として、特に指定のない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を指す。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「使用説明資料」は、対象における全身免疫反応を抑制または低減するためのキット中の本発明の化合物、組成物、アッセイまたは方法の有用性を伝えるために使用され得る刊行物、録音、図表、または任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの使用説明資料は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、アッセイまたは方法を含有する容器へ貼られてもよいし、同定された化合物、組成物、アッセイまたは方法を含有する容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、使用説明資料は、使用説明資料と化合物、組成物、アッセイまたは方法とが受取人によって協働的に使用される意図で、容器とは別に出荷されてもよい。
【００５８】
本明細書において使用される場合、用語「MC1R」は、メラノコルチン受容体1を指す。
【００５９】
本明細書において使用される場合、用語「MITF」は、小眼球症関連転写因子を指す。
【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「調整する」は、本発明において意図される受容体への本発明の化合物の結合と関連する疾患状態または状態に関して、本発明の化合物の投与前は、最適以下であり、多くの場合において、衰弱的、さらには致死的であった、状態または疾患状態の改善または軽減を直接的にまたは間接的にもたらすことを意味する。調整は、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、またはアゴニスト／アンタゴニスト活性の組み合わせによって生じ得る（受容体部位に依存する）。
【００６１】
本明細書において使用される場合、用語「P4」はプロゲステロンを指す。
【００６２】
組成物の「非経口」投与は、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)、もしくは胸骨内注射、または注入技術を含む。
【００６３】
本明細書において使用される場合、用語「PAQR7」は、プロゲスチンおよびアジポQ受容体7（Progestin and AdipoQ Receptor 7）を指す。
【００６４】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的組成物」または「組成物」は、本発明における有用な少なくとも1つの化合物と、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、および／または賦形剤などの他の化学成分との混合物を指す。薬学的組成物は、生物への化合物の投与を容易にする。静脈内投与、経口投与、エアロゾル投与、非経口投与、眼投与、肺投与、頭蓋内投与、経皮投与および局所投与を含むがこれらに限定されない、化合物を投与する複数の技術が、当技術分野に存在する。特定の態様において、投与は局所投与を含む。
【００６５】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、組成物の生物学的活性または特性を撤廃せず、かつ比較的非毒性である、担体または希釈剤などの物質を指し、即ち、当該物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことも、中に含有される組成物の構成要素のいずれとも有害な様式で相互作用することもなく、個体に投与され得る。
【００６６】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、本発明における有用な化合物を、その意図される機能を果たし得るように対象内にまたは対象に運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体の充填剤、安定剤、分散剤、懸濁化剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、またはカプセル化材料などの、薬学的に許容される物質、組成物、または担体を意味する。典型的に、そのような構築物は、身体のある器官または部分から、身体の別の器官または部分へと運搬または輸送される。各担体は、本発明における有用な化合物を含む、製剤の他の成分と適合性であり、かつ対象に対して有害ではないという意味で、「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る物質のいくつかの例は、以下を含む：糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン；セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス；油、例えば、落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；界面活性剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに薬学的製剤において使用される他の非毒性の適合性物質。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」はまた、本発明における有用な化合物の活性と適合性であり、かつ対象に生理的に許容される、あらゆるコーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤などを含む。補足的な活性化合物が組成物に組み入れられてもよい。「薬学的に許容される担体」はさらに、本発明における有用な化合物の薬学的に許容される塩を含んでもよい。本発明の実施において使用される薬学的組成物中に含まれ得る他の追加的な成分が、当技術分野において公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される塩」という言語は、その無機酸、無機塩基、有機酸、無機塩基、溶媒和物（水和物を含む）、および包接化合物を含む、薬学的に許容される非毒性の酸および／または塩基から調製される、投与される化合物の塩を指す。
【００６８】
本明細書において使用される場合、化合物の「薬学的有効量」、「治療有効量」または「有効量」は、化合物が投与される対象に有利な効果を提供するために十分である化合物の量である。
【００６９】
本明細書において使用される場合、用語「PR」はプロゲステロン受容体を指す。
【００７０】
用語「予防する」、「予防すること」または「予防」は、本明細書において使用される場合、薬剤または化合物の投与の開始時点でそのような症状を示していない対象における疾患または状態と関連する症状の発症を回避するかまたは遅らせることを意味する。疾患、状態、および障害は、本明細書において交換可能に使用される。
【００７１】
用語「特異的に結合する」は、本明細書において使用される場合、第1の分子が第2の分子（例えば、特定の受容体または酵素）と優先的に結合するが、必ずしもその第2の分子とのみ結合するとは限らないことを意味する。
【００７２】
本明細書において使用される場合、用語「対象」および「個体」および「患者」は、交換可能に使用され得、ヒトまたは非ヒト哺乳動物またはトリを指し得る。非ヒト哺乳動物としては、例えば、家畜およびペット、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウス哺乳動物が挙げられる。特定の態様において、対象はヒトである。
【００７３】
本明細書において使用される場合、用語「TMX」はタモキシフェンを指す。
【００７４】
本明細書において使用される場合、「局所投与」または「局所適用」は、皮膚または粘膜などの体表面に適用される投薬法を指す。
【００７５】
「処置する（治療する）」という用語は、本明細書において使用される場合、患者または対象が症状を経験する頻度を低減すること、または経験する症状の重症度を低減するために薬剤または化合物を投与することを意味する。任意の個々の症例における適切な処置量は、日常的な実験を使用して当業者によって決定され得る。
【００７６】
本明細書において使用される場合、用語「処置」または「処置すること」は、対象に対する、治療剤、即ち、本発明において有用な化合物の適用もしくは投与（単独でまたは別の薬学的薬剤と組み合わせて）、または、対象から単離された組織もしくは細胞株に対する治療剤の適用もしくは投与（例えば、診断またはエクスビボ適用のため）であって、該対象が、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害を発症する可能性を有し、該疾患もしくは障害、該疾患もしくは障害の症状、または該疾患もしくは障害を発症する可能性を治療する、治癒する、緩和する、軽減する、変更する、修復する、改善する、改良する、または影響を及ぼす目的での、適用もしくは投与として定義される。そのような処置は、ゲノム薬理学の分野から得られた知識に基づいて、特異的に調整または改変されてもよい。
【００７７】
本明細書において使用される場合、用語「UV」は紫外線を指す。
【００７８】
本開示の全体にわたって、本発明の様々な局面は範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきでないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと見なされるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、部分範囲、例えば、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6など、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したものと見なされるべきである。これは、範囲の大きさにかかわらず当てはまる。
【００７９】
化合物および組成物
一局面において、本発明は、PAQR7に結合し、古典的核内プロゲステロン受容体(PR)には結合しない、化合物を包含する。特定の態様において、化合物はPAQR7アゴニストである。
【００８０】
特定の態様において、本発明の化合物、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーは、CH2P4（19-CH2P4としても公知；rel-(8S,9S,10S,13S,14S,17S)-17-アセチル-13-メチル-10-ビニル-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3(2H)-オン）：
2018517665.tif 000005
である。
【００８１】
別の局面において、本発明は、GPER（例えば、これに限定されないが、GPER1）に結合し、古典的核内エストロゲン受容体(ER)には結合しない、エストロゲン誘導体またはそのアナログを包含する。特定の態様において、エストロゲン誘導体またはアナログは、GPERアンタゴニストである。
【００８２】
特定の態様において、本発明の化合物、またはその塩、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーは、式(I)の分子の少なくとも1つである：
2018517665.tif 000006
式中、R1は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より選択され；R2は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より選択され；結合aは、単結合または二重結合であり；R3は、Hおよびハロからなる群より選択される。
【００８３】
特定の態様において、化合物はG-15ではない。他の態様において、化合物はG-36ではない。さらに他の態様において、化合物はG-15でもG-36でもない。
【００８４】
特定の態様において、R1は、H、メチル、エチル、1-プロピルおよび2-プロピルからなる群より選択される。他の態様において、R2は、Hまたは2-プロピルである。
【００８５】
特定の態様において、結合aは二重結合である。他の態様において、結合aは単結合である。
【００８６】
特定の態様において、R2は、H、メチル、エチル、1-プロピルおよび2-プロピルからなる群より選択される。特定の態様において、R2はHである。
【００８７】
特定の態様において、R3は、H、F、Cl、BrおよびIからなる群より選択される。特定の態様において、R3はBrである。
【００８８】
特定の態様において、化合物は、
2018517665.tif 000007
からなる群より選択される少なくとも1つである。
【００８９】
特定の態様において、化合物は、
G15またはG-15（rel-(3aS,4S,9bR)-4-(6-ブロモベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-3a,4,5,9b-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[c]キノリン）：
2018517665.tif 000008
；
G36またはG-36（rel-(3aS,4R,9bR)-4-(6-ブロモベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-8-イソプロピル-3a,4,5,9b-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[c]キノロン）：
2018517665.tif 000009
；
rel-1-(2-((3aS,4S,9bR)-4-(6-ブロモベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-3a,4,5,9b-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[c]キノリン-8-イル)エチル)-3-(3-ヨードフェニル)尿素(Ramesh, et al., 2010, J. Med. Chem. 53:1004-1014に記載)：
2018517665.tif 000010
；
rel-(3aS,4S,9bR)-4-(6-ブロモベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-8-((E)-1-(2-(5-ヨードピリジン-2-イル)ヒドラゾノ)エチル)-3a,4,5,9b-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[c]キノリン(Ramesh, et al., 2010, J. Med. Chem. 53:1004-1014に記載)：
2018517665.tif 000011
からなる群より選択される少なくとも1つである。
【００９０】
特定の態様において、本発明の方法において有用な化合物、またはその塩、溶媒和物、エナンチオマーもしくはジアステレオマーは、米国特許出願公開第2008/0167334号および第2011/0092533号（これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる）に記載されている少なくとも1つのGPERアンタゴニスト：
2018517665.tif 000012
であり、式中、
Xは、=N-、O、S、またはN-Rであり、但し、XがN-RでありかつRが結合である場合、Nは、R1と一緒に、5〜7員の置換されていてもよい複素環式基を形成し；
Rは、結合、H、OH、NO2、置換されていてもよいC1〜C6ヒドロカルビル（例えば、置換されていてもよいアルキル）、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロ環、置換されていてもよい-C(O)-(C1〜C6)アルキル(アミド)、置換されていてもよい-C(O)-O-(C1〜C6)アルキル(ウレタン)、置換されていてもよい-C(O)-NH(C1〜C6)アルキル(尿素)、置換されていてもよい-C(O)-N(C1〜C6)ジアルキル、置換されていてもよい-C(O)-NH(アリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロ環)または置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロ環)であり；
R1、R2およびR5は、各々独立して、H、OH、NO2、ハロゲン、C1〜C6の置換されていてもよいカルボン酸基、置換されていてもよいO-(C1〜C6)アルキル、置換されていてもよいC1〜C6ヒドロカルビル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロ環、置換されていてもよい-C(O)-(C1〜C6)アルキル(ケトン)、置換されていてもよい-C(O)-O-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよいO-C(O)-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよい-C(O)-NH(C1〜C6)アルキル(尿素)、置換されていてもよい-C(O)-N(C1〜C6)ジアルキル、置換されていてもよい-C(O)-NH(アリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロ環)または置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロ環)より選択され；
R3およびR4は、各々独立して、H、OH、NO2、ハロゲン、C1〜C6の置換されていてもよいカルボン酸基、置換されていてもよいO-(C1〜C6)アルキル、置換されていてもよいC1〜C6ヒドロカルビル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロ環、置換されていてもよい-C(O)-(C1〜C6)アルキル(ケトン)、置換されていてもよい-C(O)-O-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよいO-C(O)-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよい-C(O)-NH(C1〜C6)アルキル(尿素)、置換されていてもよい-C(O)-N(C1〜C6)ジアルキル、置換されていてもよい-C(O)-NH(アリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロ環)または置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)より選択されるか、または、R3およびR4は、一緒に、5または6員の置換されていてもよい（飽和であっても不飽和であってもよい）炭素環式基、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールまたは置換されていてもよい複素環式基を形成し；
R6およびR7は、各々独立して、存在しないか、または、H、OH、NO2、ハロゲン、C1〜C6の置換されていてもよいカルボン酸基、置換されていてもよいO-(C1〜C6)アルキル、置換されていてもよいC1〜C6ヒドロカルビル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロ環、置換されていてもよい-C(O)-(C1〜C6)アルキル(ケトン)、置換されていてもよい-C(O)-O-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよいO-C(O)-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよい-C(O)-NH(C1〜C6)アルキル(尿素)、置換されていてもよい-C(O)-N(C1〜C6)ジアルキル、置換されていてもよい-C(O)-NH(アリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロ環)または置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)より選択されるか、または、R6およびR7は、一緒に、4、5、6もしくは7員の置換されていてもよい（飽和であっても不飽和であってもよい）炭素環式基、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールもしくは置換されていてもよい複素環式基、または5〜9員の置換されていてもよい炭素環式もしくは複素環式二環式基を形成し、但し、R7′およびR7″が両方とも存在しない場合、R7は存在し；
R6′は、存在しないか、H、C1〜C6の置換されていてもよいヒドロカルビル基（例えば、H、CH3またはCH2CH3）であるか、または、R6と一緒に=Oを形成し；
R7′は、存在しないか、H、置換されていてもよいヒドロカルビル基（例えば、H、CH3またはCH2CH3）であるか、または、R7と一緒に=Oを形成し；
R7″は、存在しないか、H、OH、ハロゲン、置換されていてもよいO-(C1〜C6)アルキル、置換されていてもよいC1〜C6ヒドロカルビル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロ環、置換されていてもよい-C(O)-(C1〜C6)アルキル(ケトン)、置換されていてもよい-C(O)-O-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよいO-C(O)-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよい-C(O)-NH(C1〜C6)アルキル(尿素)、置換されていてもよい-C(O)-N(C1〜C6)ジアルキル、置換されていてもよい-C(O)-NH(アリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロ環)または置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)であり；
R8′は、存在しない（R8′が結合している炭素と、R6が結合している炭素とが、任意の二重結合を形成する場合）か、H、CH3またはCH2CH3であり；
R10、R11、R12およびR13は、各々独立して、H、OH、NO2、ハロゲン、C1〜C6の置換されていてもよいカルボン酸基、置換されていてもよいO-(C1〜C6)アルキル、置換されていてもよいC1〜C6ヒドロカルビル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロ環、置換されていてもよい-C(O)-(C1〜C6)アルキル(ケトン)、置換されていてもよい-C(O)-O-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよいO-C(O)-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよい-C(O)-NH(C1〜C6)アルキル(尿素)、置換されていてもよい-C(O)-N(C1〜C6)ジアルキル、置換されていてもよい-C(O)-NH(アリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロ環)または置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)であり；
R14は、H、OH、NO2、ハロゲン、C1〜C6の置換されていてもよいカルボン酸基、置換されていてもよいO-(C1〜C6)アルキル、置換されていてもよいC1〜C6ヒドロカルビル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロ環、置換されていてもよい-C(O)-(C1〜C6)アルキル(ケトン)、置換されていてもよい-C(O)-O-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよいO-C(O)-(C1〜C6)アルキル(エステル)、置換されていてもよい-C(O)-NH(C1〜C6)アルキル(尿素)、置換されていてもよい-C(O)-N(C1〜C6)ジアルキル、置換されていてもよい-C(O)-NH(アリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロアリール)、置換されていてもよい-C(O)-NH(ヘテロ環)または置換されていてもよい-C(O)-N(ジヘテロ環)であるか、または、R7が結合している炭素と一緒に、5、6または7員の置換されていてもよい（飽和であっても不飽和であってもよい）炭素環式基、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールまたは置換されていてもよい複素環式環を形成し；
Yは、置換されていてもよい(CH2)n基（ここでnは0、1または2である）、置換されていてもよい=CH-基、C=O基、O、S、置換されていてもよいN-(C1〜C6)アルキル、置換されていてもよいN-アリール、置換されていてもよいN-ヘテロアリール、置換されていてもよいN-ヘテロ環、置換されていてもよいN-C(O)-(C1〜C6)アルキル、置換されていてもよいN-C(O)-アリール、置換されていてもよいN-C(O)-ヘテロアリール、置換されていてもよいN-C(O)-ヘテロ環であり；
Zは、置換されていてもよい(CH2)n基（ここでnは1または2である）、置換されていてもよい=CH-基、C=O基、O、S、置換されていてもよいN-(C1〜C6)アルキル、置換されていてもよいN-アリール、置換されていてもよいN-ヘテロアリール、置換されていてもよいN-ヘテロ環、置換されていてもよいN-C(O)-(C1〜C6)アルキル、置換されていてもよいN-C(O)-アリール、置換されていてもよいN-C(O)-ヘテロアリール、置換されていてもよいN-C(O)-ヘテロ環である。
【００９１】
本発明の化合物は、1つまたは複数の立体中心を有し得、各立体中心は、(R)または(S)立体配置のいずれかで独立して存在し得る。特定の態様において、本明細書に記載される化合物は、光学活性体またはラセミ体で存在する。本明細書に記載される化合物は、本明細書に記載される治療上有用な特性を有するラセミ体、光学活性体、位置異性体および立体異性体、またはそれらの組み合わせを包含する。光学活性体の調製は、非限定的な例として、再結晶技術でのラセミ体の分割、光学活性出発物質からの合成、キラル合成、またはキラル固定相を使用したクロマトグラフ分離を含む、任意の適切な方法で達成される。ラセミ化合物の式によって本明細書において示される化合物は、2つのエナンチオマーのいずれかもしくはそれらの混合物、または、2つ以上のキラル中心が存在する場合は、全てのジアステレオマーもしくはそれらの混合物をさらに表す。
【００９２】
特定の態様において、本発明の化合物は互変異性体として存在する。全ての互変異性体が、本明細書に記載される化合物の範囲内に含まれる。
【００９３】
本明細書に記載される化合物はまた、同位体で標識された化合物を含み、ここで、1つまたは複数の原子が、同じ原子番号を有するが、天然において通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられている。本明細書に記載される化合物中に含めるのに適した同位体の例としては、2H、3H、11C、13C、14C、36Cl、18F、123I、125I、13N、15N、15O、17O、18O、32P、および35Sが挙げられ、これらに限定されない。特定の態様において、重水素などのより重い同位体での置換はより大きな化学安定性を与える。同位体で標識された化合物は、任意の適切な方法によって、または、そうでなければ使用される非標識試薬の代わりに適切な同位体で標識された試薬を使用するプロセスによって、調製される。
【００９４】
特定の態様において、本明細書に記載される化合物は、発色団もしくは蛍光性部分、生物発光標識、または化学発光標識の使用を含むが、これらに限定されない、他の手段によって標識される。
【００９５】
本明細書に提供される態様の全てにおいて、適切な随意の置換基の例は、特許請求される発明の範囲を限定するようには意図されない。本発明の化合物は、本明細書に提供される置換基、または置換基の組み合わせのいずれかを含有し得る。
【００９６】
特定の態様において、本発明は、少なくとも1つの本発明の化合物と少なくとも1つの薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物をさらに提供する。他の態様において、薬学的組成物は、局所および／または経皮適用用に製剤化されている。本発明において意図される化合物の局所製剤は、皮膚美白のために、ならびに色素過剰と関連する皮膚状態または疾患を治療するために使用され得る。これらの状態または疾患としては、ざ瘡；湿疹；化学火傷瘢痕、日焼け瘢痕、および熱傷瘢痕；狼瘡；乾癬；サルコイドーシス；粃糠疹；色素異常性固定性紅斑；水疱形成疾患；薬物反応；扁平苔癬；または他の炎症性皮膚傷害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
特定の態様において、本発明は、少なくとも1つの日焼け止め剤と少なくとも1つの本発明の化合物とを含む局所製剤を提供する。他の態様において、局所製剤は、製剤化された日焼け止めまたはサンスクリーンローションおよび少なくとも1つの本発明の化合物を含む。さらに他の態様において、少なくとも1つの日焼け止め剤は、自然の太陽光によって引き起こされるUV光損傷からの保護を可能にし、1つまたは複数の本発明の化合物は、皮膚の美白を可能にする。さらに他の態様において、少なくとも1つの本発明の化合物によって誘発されるメラニン産生は、自然の太陽光によって引き起こされるUV光損傷から皮膚をさらに保護する。さらに他の態様において、局所製剤は、UV誘発皮膚損傷および／または老化から保護する。
【００９８】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の方法のいずれかにおいて有用なキットに関する。そのようなキットは、例えば、ヒトなどの哺乳動物対象における皮膚色素沈着を調整するための組成物および方法を含む、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて有用な構成要素、本明細書の他のところに記載される本発明の態様のいずれかの構成要素を含有するための1つまたは複数の容器（例えば、試験管、細胞培養皿、細胞培養プレート、細胞培養フラスコ、細胞培養バッグ）、および使用説明資料を含む。
【００９９】
塩
本明細書に記載される化合物は、酸または塩基と塩を形成し得、そのような塩は本発明に含まれる。用語「塩」は、本発明の方法において有用である遊離の酸または塩基の付加塩を包含する。用語「薬学的に許容される塩」は、薬学的適用において有用性を与える範囲内の毒性プロフィールを有する塩を指す。特定の態様において、塩は薬学的に許容される塩である。薬学的に許容されない塩は、それでも、高結晶度などの特性を有し得、これは本発明の実施における有用性、例えば、本発明の方法において有用な化合物の合成、精製、または製剤化のプロセスにおける有用性を有する。
【０１００】
好適な薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸からまたは有機酸から調製され得る。無機酸の例としては、硫酸塩、硫酸水素塩、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、およびリン酸（リン酸水素塩およびリン酸二水素塩を含む）が挙げられる。適切な有機酸は、有機酸の脂肪族類、脂環式類、芳香族類、芳香脂肪族類、複素環式類、カルボン酸類、およびスルホン酸類より選択され得、この例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（またはパモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、スルファニル酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β-ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸、ガラクツロン酸、グリセロホスホン酸、およびサッカリン（例えば、サッカリネート、サッカレート）が挙げられる。塩は、本発明の任意の化合物に対して、数分の1モル当量の、1モル当量の、または1モル当量を超える、酸または塩基から構成され得る。
【０１０１】
本発明の化合物の好適な薬学的に許容される塩基付加塩としては、例えば、アンモニウム塩、ならびに、例えば、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛の塩などの、アルカリ金属、アルカリ土類金属、および遷移金属の塩を含む金属塩が挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩はまた、例えば、N,N'-ジベンジルエチレン-ジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（またはN-メチルグルカミン）、およびプロカインなどの塩基性アミンから作られた有機塩を含む。これらの塩の全ては、例えば、適切な酸または塩基を化合物と反応させることにより、対応の化合物から調製され得る。
【０１０２】
方法
一局面において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物対象における皮膚色素沈着を調整する方法を含む。特定の態様において、本発明の方法は、対象における皮膚色素過剰を治療または予防する。他の態様において、本発明の方法は、対象における皮膚美白を促進する。他の態様において、化合物を対象に局所または経皮投与する。
【０１０３】
特定の態様において、方法は、メラノサイト上に存在する非古典的ホルモン受容体に結合し、かつ、エストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体などの古典的性ステロイドホルモン受容体には結合しない、化合物の治療有効量を対象に投与する工程を含む。他の態様において、非古典的ホルモン受容体はPAQR7を含む。他の態様において、非古典的ホルモン受容体はGPERを含む。さらに他の態様において、非古典的ホルモン受容体はGPER1(GPR30としても公知)を含む。さらに他の態様において、化合物はGPERアンタゴニストであり、皮膚色素沈着を減少させるか、またはそのさらなる増加を予防する。さらに他の態様において、化合物はPAQR7アゴニストであり、皮膚色素沈着を減少させるか、またはそのさらなる増加を予防する。
【０１０４】
特定の態様において、対象は、経口避妊薬の使用、妊娠、および女性における内因性エストロゲンと関連する、色素変化（例えば、黒皮症および肝斑）；日光黒子；ざ瘡；湿疹；化学火傷瘢痕、日焼け瘢痕、および熱傷瘢痕；狼瘡；乾癬；サルコイドーシス；粃糠疹；色素異常性固定性紅斑；水疱形成疾患；薬物反応；扁平苔癬；または他の炎症性皮膚傷害からなる群より選択される少なくとも1つを含む状態を患っている。
【０１０５】
製剤／投与
本発明の薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、および任意の追加的な成分の相対量は、処置される対象のアイデンティティー、サイズ、および状態に依存して変動する。例えば、組成物は、約0.005%〜約100%(w/w)の活性薬剤、またはその任意の分数もしくは倍数を含み得る。
【０１０６】
本明細書に提供される薬学的組成物の記載は、主に、ヒトへの倫理的な投与に適している薬学的組成物に関するが、そのような組成物は、概ね全ての種類の動物への投与に適していることが当業者によって理解されるだろう。組成物を様々な動物への投与に適しているものにするための、ヒトへの投与に適した薬学的組成物の改変は、十分に理解され、通常の熟練した獣医薬理学者は、たとえあったとしても、そのような改変を、単に通常の実験で設計および実行することができる。本発明の薬学的組成物の投与が意図される対象としては、ヒトおよび他の霊長動物、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌなどの商業上関連する哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
特定の態様において、本発明において意図される化合物を含む組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または担体を使用して製剤化される。特定の態様において、本発明の薬学的組成物は、治療有効量の少なくとも1つの本発明において意図される化合物と、薬学的に許容される担体とを含む。有用である、薬学的に許容される担体としては、グリセロール、水、食塩水、エタノールおよび他の薬学的に許容される塩溶液、例えば、リン酸塩および有機酸の塩が挙げられるが、これらに限定されない。これらおよび他の薬学的に許容される担体の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (1991, Mack Publication Co., New Jersey)に記載されている。
【０１０８】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、ならびに植物油を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要な粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合において、等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウム、または多価アルコール、例えば、マンニトールおよびソルビトールが、組成物中に含まれる。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【０１０９】
製剤は、従来の賦形剤、即ち、当技術分野において公知の、経口、非経口、経鼻、静脈内、皮下、経腸、または任意の他の好適な投与様式に適した、薬学的に許容される有機または無機担体物質との混合物で用いられ得る。特定の態様において、投与は局所投与を含む。薬学的調製物は、滅菌され得、必要に応じて、助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝液に影響を与えるための塩、着色剤、矯味矯臭剤および／または芳香物質などと混合され得る。それらはまた、必要に応じて、他の活性薬剤、例えば、他の鎮痛剤と組み合わされ得る。
【０１１０】
本明細書において使用される場合、「追加的な成分」としては、以下のうちの1つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；矯味矯臭剤；着色剤；保存剤；生理学的に分解性の組成物、例えば、ゼラチン；水性ビヒクルおよび溶媒；油性ビヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；ならびに薬学的に許容されるポリマー物質または疎水性物質。本発明の薬学的組成物中に含まれ得る他の「追加的な成分」は、当技術分野において公知であり、例えば、Genaro, ed. (1985, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA)に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１１】
本発明の組成物は、組成物の総重量の約0.005%〜2.0%の保存剤を含み得る。保存剤は、環境中の汚染物質への曝露の場合の腐敗を防ぐために使用される。本発明に従って有用な保存剤の例としては、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な保存剤は、約0.5%〜2.0%ベンジルアルコールおよび0.05%〜0.5%ソルビン酸の組み合わせである。
【０１１２】
組成物は、化合物の分解を抑制する抗酸化剤およびキレート剤を含み得る。いくつかの化合物について選択される抗酸化剤は、約0.01%〜0.3%の例示的な範囲内のBHT、BHA、α-トコフェロールおよびアスコルビン酸、例えば、組成物の総重量の0.03重量%〜0.1重量%の範囲内のBHTである。例えば、キレート剤は、組成物の総重量の0.01重量%〜0.5重量%の量で存在する。例示的なキレート剤は、約0.01%〜0.20%の重量範囲内で、または組成物の総重量の0.02重量%〜0.10重量%の範囲内で、エデト酸塩（例えば、エデト酸二ナトリウム）およびクエン酸を含む。キレート剤は、製剤の貯蔵寿命に有害であり得る組成物中の金属イオンをキレートするために有用である。BHTおよびエデト酸二ナトリウムは、それぞれ、いくつかの化合物についての例示的な抗酸化剤およびキレート剤であるが、当業者に公知であるように、他の好適かつ等価な抗酸化剤およびキレート剤を代わりに用いてもよい。
【０１１３】
本発明において意図される化合物を含む組成物は、1日数回と同じぐらい頻繁に哺乳動物に投与されてもよいし、または、より少ない頻度で、例えば、1日1回、週1回、2週間毎に1回、月1回、またはさらにより少ない頻度で、例えば、数ヶ月毎に1回またはさらには年1回またはより少ない頻度で、投与されてもよい。
【０１１４】
1日当たりの投薬される化合物の量は、非限定的な例において、毎日、一日おきに、2日毎に、3日毎に、4日毎に、または5日毎に投与され得ることが理解される。例えば、一日おきの投与では、月曜日に0.5〜5 mg/日の投与が始められ得、次に水曜日に第1の後続投与0.5〜5 mg/日が行われ得、次に金曜日に第2の後続投与0.5〜5 mg/日が行われ得るなどである。投与頻度は、当業者に容易に明らかとなり、任意の数々の要因、例えば、これらに限定されないが、治療される疾患のタイプおよび重症度、動物のタイプおよび年齢などに依存する。
【０１１５】
局所投与
薬の局所投与にとっての障害物は、表皮の角質層である。角質層は、タンパク質、コレステロール、スフィンゴ脂質、遊離脂肪酸、および種々の他の脂質から構成される非常に抵抗性の層であり、角化した細胞および生細胞を含む。角質層を通る化合物の浸透速度（流動）を限定する要因の1つは、皮膚表面上に負荷または適用することができる活性物質の量である。皮膚の面積の単位当たりに適用される活性物質の量が多ければ多いほど、皮膚表面と皮膚の下層との間の濃度勾配が大きくなり、次に、皮膚を通る活性物質の拡散力が大きくなる。従って、全ての他のことが等しければ、より高い濃度の活性物質を含有する製剤が、より低い濃度を有する製剤よりも、皮膚を通る活性物質の浸透を、より多く、かつより一貫した速度でもたらす可能性がより高い。
【０１１６】
局所投与に適した製剤としては、液体または半液体の調製物、例えば、リニメント剤、ローション剤、水中油型もしくは油中水型乳剤、例えば、クリーム剤、軟膏剤またはペースト剤、および液剤または懸濁剤が挙げられるが、これらに限定されない。そのような製剤は、直接、または綿棒、塗布具、へらなどの使用を通して、ならびに経皮パッチの形態で、皮膚へ適用され得る。特定の態様において、パッチは、皮膚の洗浄、擦れ、引っ掻きおよび／または摩擦による薬の減少を最小限にする。他の態様において、パッチは、薬への皮膚の曝露を最小限にしながら、皮膚を通した薬の吸収を増加させる。
【０１１７】
局所投与可能な製剤は、例えば、約0.005%〜約10%(w/w)の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限界ほど高くてもよい。局所投与のための製剤は、1つまたは複数の本明細書において記載されている追加的な成分をさらに含み得る。
【０１１８】
透過増強剤が使用されてもよい。これらの物質は、皮膚を横切る薬物の浸透の速度を増大させる。当技術分野における典型的な増強剤としては、エタノール、グリセロールモノラウラート、PGML（ポリエチレングリコールモノラウラート）、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。他の増強剤としては、オレイン酸、オレイルアルコール、エトキシジグリコール、ラウロカプラム、アルカンカルボン酸、ジメチルスルホキシド、極性脂質、またはN-メチル-2-ピロリドンが挙げられる。
【０１１９】
本発明の組成物のいくつかの局所的送達のための1つの許容されるビヒクルは、リポソームを含有し得る。リポソームの組成およびその使用は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第6,323,219号）。
【０１２０】
代替の態様において、本発明の薬学的組成物は、任意で、アジュバント、抗酸化剤、キレート剤、界面活性剤、発泡剤、湿潤剤、乳化剤、粘稠剤（viscosifier）、緩衝剤、保存剤などの成分と組み合わされてもよい。他の態様において、透過または浸透の増強剤が、組成物中に含まれ、透過増強剤を欠いている組成物に対して、活性成分の角質層中へのおよび角質層を通る経皮的浸透を改善するのに有効である。オレイン酸、オレイルアルコール、エトキシジグリコール、ラウロカプラム、アルカンカルボン酸、ジメチルスルホキシド、極性脂質、またはN-メチル-2-ピロリドンを含む種々の透過増強剤が、当業者に公知である。別の局面において、組成物は、角質層の構造中の無秩序さを増大させるように機能し、従って角質層を横切る輸送の増大を可能にする、ハイドロトロープ剤（hydrotropic agent）をさらに含んでもよい。イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、またはキシレンスルホン酸ナトリウムなどの種々のハイドロトロープ剤が、当業者に公知である。
【０１２１】
本発明の局所的に活性な薬学的組成物は、望ましい変化に影響を及ぼすのに有効な量において適用されるべきである。本明細書において使用される場合、「有効な量」とは、変化が望ましい皮膚表面の領域を覆うのに十分な量を意味するものとする。活性化合物は、組成物の重量体積で約0.0001%〜約15%の量で；または組成物の約0.0005%〜約5%の量で；または組成物の約0.005%〜約1%の量で、存在するべきである。そのような化合物は、合成由来であってもよいし、天然由来であってもよい。
【０１２２】
制御放出性製剤および薬物送達システム
本発明の薬学的組成物の制御放出性または持続放出性の製剤は、従来の技術を用いて作製され得る。いくつかの場合において、使用される投薬形態は、種々の割合において望ましい放出プロフィールを提供するように、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過性膜、浸透圧システム、多層コーティング、微粒子、リポソーム、もしくはマイクロスフェア、またはこれらの組み合わせを用いて、その中の1つまたは複数の活性成分の緩徐放出または制御放出として提供され得る。本明細書において記載されているものを含む、当業者に公知である適した制御放出性製剤が、本発明の薬学的組成物での使用のために容易に選択され得る。従って、制御放出に適している、局所投与に適した単一単位投薬形態、例えば、リニメント剤、ローション剤、水中油型もしくは油中水型乳剤、例えば、クリーム剤、軟膏剤またはペースト剤、経皮パッチ、および液剤または懸濁剤が、本発明に包含される。
【０１２３】
多くの制御放出性薬学的製品は、その制御されていない対応物により達成されるものを上回って薬物療法を改善する共通の目標を有する。理想的には、医学的処置における最適に設計された制御放出性調製物の使用は、最小量の時間で状態を治療または制御するために使用される最小の原薬を特徴とする。制御放出性製剤の利点は、薬物の長期の活性、投薬頻度の低減、および患者の服薬遵守の増大を含む。加えて、制御放出性製剤は、作用の開始の時間または他の特徴、例えば薬物の血液レベルに影響を及ぼすために使用することができ、従って、副作用の出現に影響を及ぼし得る。
【０１２４】
多くの制御放出性製剤は、望ましい治療効果を迅速にもたらす量の薬物を最初に放出し、長期間にわたってこのレベルの治療効果を維持するために他の量の薬物を徐々にかつ継続的に放出するように設計されている。この一定レベルの薬物を身体中で維持するために、薬物は、代謝されて身体から排出される薬物の量に取って代わるであろう速度で、投薬形態から放出されなければならない。
【０１２５】
活性成分の制御放出は、種々の誘導因子、例えば、pH、温度、酵素、水、または他の生理学的状態もしくは化合物により、刺激することができる。本発明の文脈における「制御放出性構成要素」という用語は、活性成分の制御放出を促進する、ポリマー、ポリマーマトリクス、ゲル、透過性膜、リポソーム、もしくはマイクロスフェア、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、1つまたは複数の化合物として、本明細書において定義される。
【０１２６】
特定の態様において、本発明の製剤は、短期の、迅速な消失の、ならびに制御された、例えば、持続放出性、遅延放出性、および拍動放出性の製剤であり得るが、これらに限定されない。
【０１２７】
持続放出という用語は、長期間にわたって徐々に薬物を放出することを提供し、かつ、必ずではないが、長期間にわたって実質的に一定の血中薬物レベルをもたらし得る薬物製剤を指すように、その従来の意味において使用される。期間は、1ヵ月以上もの長い間であってもよく、ボーラス形態において投与された同量の薬剤よりも長い放出であるべきである。
【０１２８】
持続放出のために、化合物は、化合物に持続放出特性を提供する、適したポリマーまたは疎水性物質と共に製剤化されてもよい。そのように、本発明の方法における使用のための化合物は、例えば注射により微粒子の形態において、または、移植によりウエハーまたはディスクの形態において投与されてもよい。
【０１２９】
本発明の特定の態様において、本発明の化合物は、持続放出性製剤を用いて、単独でまたは別の薬学的薬剤と組み合わせて、患者に投与される。
【０１３０】
遅延放出という用語は、薬物投与に続くいくらかの遅延後に、薬物の最初の放出を提供し、かつ、必ずではないが、約10分間から約12時間までの遅延を含み得る薬物製剤を指すように、本明細書中でその従来の意味において使用される。
【０１３１】
拍動放出という用語は、薬物投与後に薬物のパルス状の血漿プロフィールを生じるような方法で薬物の放出を提供する薬物製剤を指すように、本明細書中でその従来の意味において使用される。
【０１３２】
即時放出という用語は、薬物投与直後に薬物の放出を提供する薬物製剤を指すように、その従来の意味において使用される。
【０１３３】
本明細書において使用される場合、短期とは、薬物投与後の、約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分間、約20分間、または約10分間までおよびそれを含む任意の時間、ならびにその任意または全ての全体または部分的な増加分を指す。
【０１３４】
本明細書において使用される場合、迅速な消失とは、薬物投与後の、約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分間、約20分間、または約10分間までおよびそれを含む任意の時間、ならびにその任意および全ての全体または部分的な増加分を指す。
【０１３５】
当業者は、本明細書に記載されている特定の手順、態様、特許請求の範囲、および実施例に対する多数の同等物を認識するか、または、日常的に過ぎない実験法を用いて確認できるであろう。そのような同等物は、本発明の範囲内にあり、本明細書に添付されている特許請求の範囲により包含されるとみなされる。例えば、当技術分野で認識されている代替物でのおよび日常的に過ぎない実験法を用いた、反応時間、反応サイズ／体積、および実験試薬、例えば、溶媒、触媒、圧力、大気条件、例えば、窒素雰囲気、および還元剤／酸化剤を含むがこれらに限定されない反応条件における改変が、本出願の範囲内にあることが理解されるべきである。
【０１３６】
値および範囲が本明細書において提供されている場合は必ず、これらの値および範囲により包含されている全ての値および範囲は、本発明の範囲内に包含されるように意図されていることが、理解されるべきである。さらに、これらの範囲内に入る全ての値、および値の範囲の上限または下限もまた、本出願により企図される。
【０１３７】
以下の実施例は本発明の局面をさらに説明する。しかしながら、それらは、本明細書に記載される本発明の教示または開示の限定では決してない。
【実施例】
【０１３８】
以下の実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例は、説明の目的のためにのみ提供され、本発明はこれらの実施例に限定されず、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかとなる全ての変形物を包含する。
【０１３９】
材料および方法
特に断りのない限り、全ての細胞株、生物学的材料、化学的材料、試薬および樹脂を供給業者から得、精製することなく使用した。
【０１４０】
メラノサイトの培養
初代メラノサイトを、廃棄された新鮮な外科的ヒト包皮標本から抽出した。ディスパーゼ中で一晩インキュベーションした後、表皮を真皮から分離し、10分間トリプシンで処理した。細胞をペレット化し、ヒトメラノサイト増殖サプリメントならびに1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む選択的MC培地254(Invitrogen)にて平板培養した。軽く色素沈着した初代メラノサイトを、エストロゲンおよびGPERアゴニスト効果をアッセイする実験のために利用し、強く色素沈着した初代メラノサイトを、メラニン産生におけるプロゲステロンおよびPAQR7効果をアッセイする実験のために利用した。プロゲステロン(P8783)、17β-エストラジオール(E8875)、およびαMSH(M4135)をSigma-Aldrichから購入した。G-15(14673)およびG-36(14397)をCayman Chemicalから購入した。CH2P4(2085)をAxon Medchemから購入した。百日咳毒素をR&D systemsから購入した(3097)。これらの化合物を、培地254中のワーキングストック溶液へ希釈した。
【０１４１】
メラニンアッセイ
2×105個のメラノサイトを6-ウェル組織培養プレート上に均一に播種した。細胞をビヒクル対照、性ステロイド、ホルモン誘導体、または百日咳毒素で4日間処理した。次いで、細胞をトリプシン処理し、カウントし、300 x gで5分間遠沈した。得られた細胞ペレットを1M NaOH中に可溶化し、5分間煮沸した。得られた溶液の光学密度を、EMaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して450 nmで読み取った。吸光度を各サンプル中の細胞数で正規化し、メラニンの相対量をビヒクル処理対照に基づいて設定した。組織メラニンアッセイのために、組織の重さを量り、その後、1M NaOH中で20分間煮沸した。サンプルを遠沈し、不溶性物質を排除し、次いで、サンプルの光学密度を測定し、組織の重量で正規化した。
【０１４２】
cAMP ELISA
初代ヒトメラノサイトについてのcAMP ELISAを、製造業者の使用説明書に従って環状AMP XPアッセイキット（Cell Signaling Technology, #4339）を使用して行った。
【０１４３】
ウェスタンブロット解析および抗体
接着細胞を、1μM用量のE2およびP4で一晩処理し、DPBSで1回洗浄し、1×プロテアーゼ阻害剤(Roche)および1×ホスファターゼ阻害剤(Roche)を含有する1% NP-40緩衝液(150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA, および1% NP-40)で溶解させた。溶解物を定量化し(Bradfordアッセイ)、正規化し、還元し、変性させ(95℃)、4-15% Tris/グリシンゲル(Bio-Rad)上でのSDSゲル電気泳動によって分離した。分離されたタンパク質を、Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad)を使用してPVDF膜(Millipore)へ転写し、TBS-T中5%ドライミルク中でブロッキングし、MITF (Cell Signaling Technology, #12590, 1:1000)、pCREB (Cell Signaling Technology, #9198, 1:1000)、CREB (Cell Signaling Technology, #9104, 1:1000)、およびβ-アクチン(Cell Signaling Technology, #3700, 1:4000)を認識する一次抗体でプローブした。適切な二次抗体と共にインキュベーションした後、タンパク質を、Luminata Crescendo Western HRP Substrate (Millipore)またはECL Western Blotting Analysis System (GE Healthcare)のいずれかを使用して検出した。
【０１４４】
メラニン染色
ホルマリン固定パラフィン包埋組織を5μmで切片化し、スーパーフロストプラススライド(Fisher)上に集め、メラニンについてのフォンタナ・マッソン染色へ供した。簡潔には、切片を脱パラフィンし、再水和し、以下の溶液中でインキュベートした：2.5%水性硝酸銀中で10分間、0.1%水性塩化金中で15分間、そして5%水性チオ硫酸ナトリウム中で5分間。蒸留脱イオン水をすすぎのために使用し、硝酸銀についての60℃を除いて、インキュベーションを室温で行った。スライドガラスを0.1%ヌクレアファストレッドKernechtrotで5分間対比染色し、脱水し、クリアし、MM24マウンティング媒体(Leica)を使用してカバースリップした。全ての染色試薬はPolyscientific R & D Corporation製であった。
【０１４５】
免疫組織化学
器官型組織からのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ヒト皮膚組織切片を、MITFに対する一次抗体(Leica Biosystems, NCL-L-MITF, 1:15)を使用してMITFタンパク質発現について染色した。パラフィン切片上での免疫組織化学実証のための高温抗原脱マスキング技術についての製造業者プロトコルに従って、染色を行った。
【０１４６】
メラニン染色の定量化
器官型培養物からの組織切片を、本明細書の他のところに記載される方法を使用して染色した。定量化に関して、簡潔には、代表的な組織切片の20×顕微鏡写真画像を、Zeiss Axiophot顕微鏡を使用して撮影した。画像のtiffファイルを保存し、Adobe PHOTOSHOP（登録商標）へ転送し、ここで、フォンタナ・マッソン染色および表皮対比染色に対応するピクセルを、カラー選択ツールを使用して選択した。次いで、単一の特定の色に対応する画像を、FIJI (Image J)を使用して解析し、各サンプル中のピクセルの数を決定した。フォンタナ・マッソン染色を示すピクセルの数を、表皮対比染色の総量で正規化した。表皮中のフォンタナ・マッソン染色の最終比率を、ビヒクル処理対照中の染色の量に対して設定した。
【０１４７】
定量的RT/PCR
RNeasy Mini Kitプロトコル(Qiagen)に従ってmRNAをメラノサイトから抽出し、High Capacity RNA-to cDNAキット(Applied Biosystems)を使用してcDNAへ逆転写した。得られたcDNAの定量的PCRを、ViiA 7 Real-Time PCR System (Life Technologies)において、トリプリケートで、Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)および遺伝子特異的プライマーを使用して行った。
【０１４８】
以下のプライマー：
2018517665.tif 000013
を検出のために使用した。2-ΔΔCt法、続いてMCF7細胞中のAR受容体転写物レベルに対する正規化を使用して、相対的発現を決定した。
【０１４９】
レンチウイルスベクター
以下のshRNA：
2018517665.tif 000014
をGIPZベクター(Open Biosystems)から発現させた。
【０１５０】
ウェブサイトwww dot genome-engineering dot org/上に提供されたソフトウェアツールを使用して、ガイドRNAを設計した。その後、ガイドRNAを、添付のプロトコルに従ってlentiCRISPRv2 (Addgene # 52961)中へクローニングした。ガイドRNA配列は以下の通りである。
2018517665.tif 000015
【０１５１】
非限定的な例示的な局所処置
DMSO中で2% (w/v)化合物を調製する。この溶液20μLを、4週齢のC57BL/6マウスの右耳へ毎日適用し、ビヒクルのみを左耳へ適用する。これらの研究を、包含／除外基準、無作為化、または盲検化無しに行う。2倍予想効果に基づいて、この実験を3つの生物学的レプリケートで行う。
【０１５２】
統計解析
*は対応のない両側スチューデントt検定における0.05未満のP値を意味する。
【０１５３】
実施例1：3-D器官型皮膚培養物の調製
MCを含有する器官型皮膚移植片を、以前詳述された方法（Ridky, et al., Nature Med. 2010, 16, 1450-1455; Chudnovsky, et al., Nature Gen. 2005, 37, 745-749）の改変法を使用して確立した。ケラチノサイトのみの皮膚移植片について使用されたケラチノサイト増殖培地(KGM)を、改変メラノサイト異種移植片播種培地(MXSM)で置き換えた。MXSMは、2% FBS、1.2 mM塩化カルシウム、100 nM Et-3（エンドセリン3）、10 ng/mL rhSCF（組換えヒト幹細胞因子）、および4.5 ng/mL r-塩基性FGF（組換え塩基性線維芽細胞増殖因子）を含有するケラチノサイト培地50/50 (Gibco)とKGM（コレラ毒素を欠く）との1:1混合物である。1.5×105個のメラノサイトおよび5.0×105個のケラチノサイトを、80μL MXSM中に懸濁し、真皮上へ播種し、37℃にて8日間、気液界面でインキュベートした。
【０１５４】
実施例2：エストロゲンおよびプロゲステロンはメラニン合成を相互に調節する
性ステロイドがメラニン合成に直接影響を及ぼすかどうかを調べるために、正常な初代ヒトメラノサイトをエストロゲン(17β-エストラジオール)で処理したところ、これは、メラニン産生の用量依存増加をもたらした（図2C）。妊娠第2および第3三半期の間に観察される医学的に関連する濃度である、25 nMエストロゲンを、その後の実験のために使用した。4日後、メラニン産生が著しく増加した(208 ± 27%)（図3A）。メラニン産生の変化は、αMSHで観察された変化と大きさが同様であった（図2Bおよび2D）。このメラニン促進におけるエストロゲンの効果は、メラニン合成におけるエストロゲンの関与と一致した。インタクトなヒト表皮の状況におけるメラノサイト恒常性に対するエストロゲンの効果を調べるために、天然の間質およびインタクトな基底膜の骨組み内で正常な初代表皮ケラチノサイトおよびメラノサイトを用いて、構造的に忠実な3-D器官型皮膚を確立した。1週間後、エストロゲンで処理した皮膚は、メラニン含有量の3倍増加を示し（図3B）、総メラノサイト数や密度の増加は無かった（図3C）。
【０１５５】
他の組織タイプにおける生理学的なエストロゲンの効果は、妊娠中に著しく増加する別の性ステロイドであるプロゲステロンへの同時曝露によって、しばしば相殺される。この相互関係がメラノサイトにおいても機能しているかどうかを決定するために、細胞を生理学的レベルのプロゲステロンで処理したところ、当該処理によって、メラノサイトによるメラニン産生の用量依存的な減少がもたらされた（図2E）。妊娠第3三半期の間に見られる濃度を反映するレベルである、500 nMの濃度を、その後の実験に使用した。プロゲステロンは、培養物（図3D）および皮膚組織（図3E）の両方において、ほぼ半分にメラニン産生を減少させ(58 ± 11.4%)、全体的なメラノサイト細胞数に影響を与えることはなかった（図3F）。
【０１５６】
雌性細胞も同様に応答するかどうかを決定するために、雌性iPS由来メラノサイトをエストロゲンおよびプロゲステロンで処理した。雄性細胞で観察されたものと同様の応答が認められた（図2F）。
【０１５７】
包皮以外の身体部位から単離されたメラノサイトも性ホルモンに対して同様に応答するかどうかを決定するために、成体顔面皮膚からのメラノサイトをエストロゲンおよびプロゲステロンで処理したところ、観察された応答は、包皮メラノサイトで観察されたものと同様であった（図2G）。
【０１５８】
実施例3：初代ヒトメラノサイトは核内エストロゲンまたはプロゲステロン受容体(ER/PR)を発現せず、cAMPシグナル伝達の変更を介して性ステロイドに応答する
エストロゲンおよびプロゲステロンがそれらの色素効果を媒介するメカニズムを決定するために、古典的色素産生経路の構成要素を調べた。エストロゲン処理でcAMPの増加（図4A）が観察された。これは、エストロゲンがMC1Rの下流の古典的色素産生経路にアクセスすることを示唆している。これと一致して、pCREBおよびMITFタンパク質が同様に誘導された（図4B）。対照的に、プロゲステロン処理は、色素産生を減少させ、cAMP、pCREBおよびMITFの対応の減少を伴った（図4C〜4D）。
【０１５９】
いかなる理論によっても制限されることを望まないが、これらのデータは、エストロゲン、プロゲステロン、およびα-MSHが、アデニル酸シクラーゼのレベルで古典的メラニン産生経路に集中し、メラニン合成を相互に調整することを示唆している。これと一致して、エストロゲン色素効果が、生理学的プロゲステロンの存在下で有意に弱められた（図4E）。これは、妊娠関連色素過剰が全身にわたっては観察されないが、顔面、生殖器および乳輪領域を含む、メラノサイト密度またはUV線曝露が最も高い特定の領域に特徴的に限定される理由を恐らく説明する。
【０１６０】
ステロイドホルモンはMC1R（その天然リガンドはペプチドホルモンαMSHである）を介してシグナルを伝達するとは予想されないため、エストロゲンおよびプロゲステロンがメラニン合成に対するそれらの効果を媒介する特異的受容体を同定しようと努力した。古典的なエストロゲン(ER)およびプロゲステロン(PR)の受容体は、ER/PR陽性乳腺細胞株MCF7においてロバストに発現しているにもかかわらず、メラノサイトにおいてはqRT-PCRを使用して検出されなかった（図5A）。初代ヒトメラノサイトにおけるRNAseq試験は、ER転写物もPR転写物も検出しなかった（図5B）。メラノサイトタンパク質溶解物のウェスタンブロット法によってERタンパク質もPRタンパク質も検出されなかったが、両方の受容体はMCF7抽出物中には容易に見られた（図4F）。
【０１６１】
実施例4：メラノサイトにおける性ステロイドシグナル伝達は非古典的膜結合型Gタンパク質共役性ホルモン受容体GPERに依存する
MC1RはGタンパク質共役受容体(GPCR)であるため、代替のGPCRが、色素効果を媒介するために性ホルモンに結合し得ると仮定された。可能性のある候補を同定するために、他の発現されるGPCRを同定するために初代ヒトMCからの全トランスクリプトームRNAseqデータを解析した。膜結合型のGタンパク質共役エストロゲン受容体(GPER)が発現されていた（図5B）。類似する非古典的Gタンパク質共役プロゲステロン受容体である、プロゲスチンおよびアジポQ受容体7も検出された（図5B）。初代ヒトMCをqRT-PCRによってGPERおよびPAQR7の発現について解析したところ、それらの発現が確認された（図5C）。特に、GPERおよびPAQR7発現は、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を含む他の皮膚細胞タイプにおいては著しくより低かった（図5D）。
【０１６２】
shRNA媒介ノックダウンを利用し、MCにおける性ホルモン効果を媒介するためのGPERおよびPAQR7の必要性を立証した（図5E〜5F）。2つの独立したヘアピンのいずれかの使用によるGPERまたはPAQR7の枯渇は、エストロゲンおよびプロゲステロンそれぞれに対するメラノサイト色素沈着応答を完全に排除した（図4G〜4H）。
【０１６３】
これらの結果を確認するために、GPERまたはPAQR7のCRISPR-Cas9媒介遺伝子破壊に基づく相補的遺伝子アプローチを使用したところ、これもまた、それぞれ、エストロゲンおよびプロゲステロンに対する色素応答を完全に遮断した（図5G〜5H）。
【０１６４】
PAQR7は、プロゲステロンに結合し、cAMP減少によってマス卵母細胞減数分裂の最終段階を調節する。その魚システムにおいて、PAQR7は、阻害性Gサブユニット(Gi)を含有するGタンパク質複合体を通してシグナル伝達する。Giサブユニットは、アデニル酸シクラーゼを抑制するように機能し、細胞質cAMPの減少がもたらされる。このシグナル伝達機構が哺乳動物においても機能的でありかつ関連するかどうかを調べるために、初代ヒトメラノサイトを百日咳毒素(PTX)（GiサブユニットのADPリボシル化を触媒する外毒素）の存在下においてプロゲステロンで処理した。この修飾は、GiがGPCRと相互作用するのを防ぎ、従って、GPCRリガンド結合でのそれらの活性化を防ぐ。PTXでのメラノサイトの処理は、プロゲステロン色素効果を完全に遮断し、プロゲステロンがメラノサイトにおいてGiサブユニットを介してシグナル伝達することが立証された（図6）。PAQR7が阻害性Giサブユニットを介して作用するという知見は興味深く、何故ならば、「刺激性」MC1Rシグナルの強さを調整する古典的に定義される色素制御機構とは対照的に、それが、Gタンパク質シグナル伝達のレベルでメラニン合成を「能動的に抑制する」メラノサイト細胞シグナル伝達カスケードの最初の例であるためである。多くの動物システムにおいて、アグーチタンパク質は、能動的な抑制機構を通してではなく、MC1Rへ物理的に結合してαMSH刺激を阻害することを介して、色素産生を減少させる。
【０１６５】
実施例5：GPERの特異的活性化はヒト皮膚組織における色素産生を変化させる
エストロゲンおよびプロゲステロンの色素効果は非古典的性ステロイド受容体を通して媒介されることを立証するこれらの遺伝学試験を補完するために、ER、PR、GPER、またはPQAR7に対する特異的アゴニスト活性を有する小分子ステロイドアナログを利用した。ERアンタゴニストであるタモキシフェンは、乳癌患者における黒皮症の発症と関連する。この臨床観察についての機構基礎は、以前は不明であり、タモキシフェンはエストロゲン受容体の機能を遮断し従ってメラニン合成を制限すると予想され得ることを考慮すると、いくぶん困惑させるものであった。しかしながら、タモキシフェンはGPERアゴニストとして作用する。タモキシフェン処理は、GPER活性化がメラニン合成を促進するモデルと一致して、天然エストロゲンで観察されたものに匹敵するレベルへのメラニン産生の用量依存増加をもたらした（図7A）。大抵の経口避妊薬は、エストロゲン成分としてエストロゲン誘導体（エチニルエストラジオール）を組み入れる。エチニルエストラジオールでの初代ヒトMCの処理もまた、等しい濃度での天然エストロゲンと区別できない、メラニン産生の用量依存増加をもたらした（図7B）。
【０１６６】
GPERがメラノサイトエストロゲン受容体であることをさらに立証するために、GPERアゴニスト（G-1; rel-1-[4-(6-ブロモ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-3aR,4S,5,9bS-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[c]キノリン-8-イル]-エタノン）およびエストロゲンの効果を、ERに対しては阻害活性を有さない2つの特異的GPERアンタゴニストであるG-15およびG-36のいずれかによって遮断した（図8）。PAQR7シグナル伝達がメラニン産生を減少させるために十分であることを立証するために、PRには結合しない特異的PAQR7アゴニストOrg OD-02(CH2P4)を使用した。CH2P4は、用量依存的、PAQR7依存的に、メラニン産生の減少を引き起こした（図9A〜9Bおよび10A〜10C）。
【０１６７】
実施例8：インビボ試験
本明細書の他のところで作製された組織を、免疫不全マウス上へ同所異種移植し、インビボでのヒト皮膚の解析を可能にする。ホルモンを皮下または局所投与し、色素沈着のホルモン誘導変化を媒介するためのGPERの必要性を実証する。特異的アゴニストの効果を評価する。
【０１６８】
この機構は包皮由来メラノサイトに限定されないことを実証するために、メラノサイトを、様々な身体部位、ならびに異なる年齢、性別および人種のドナーから単離する。これらの供給源からのメラノサイトで3-D器官型培養物を確立し、GPERシグナル伝達の必要性および十分性を評価する。
【０１６９】
実施例9：GPERが色素沈着に影響を与える機構の評価
エストロゲンおよびプロゲステロンがGPERの下流の色素沈着に影響を与える機構を解析するために、受容体によって活性化されるGαサブユニットを同定する。これを達成するために、アゴニスト促進[35S]GTPγS交換アッセイを使用し、続いて、特定のGタンパク質サブグループの免疫濃縮を行う。Gタンパク質共役受容体シグナル伝達は、Gαサブユニット上のグアニンヌクレオチド交換を駆動し、GDPをGTPにスイッチングする。[35S]GTPγSは、GTPの同位体非加水分解性アナログである。初代ヒトメラノサイトからの膜調製物を単離し、[35S]GTPγSの存在下で、GPERアゴニスト、およびビヒクル対照で刺激する。次に、GsおよびGiサブユニットをサンプルから免疫沈降させ、シンチレーション分光光度計を使用して[35S]GTPγS結合を測定する。GPERが除去されているメラノサイトを、これらのアッセイにおいて陰性対照として使用する。
【０１７０】
GsおよびGiサブユニットは両方とも、cAMPを生成するように機能するアデニル酸シクラーゼ活性に影響を与える。GPERがGタンパク質シグナル伝達の下流の古典的色素沈着経路を調節している機構を調べるために、アデニル酸シクラーゼ活性を、ビヒクル処理対照と比べて、cAMP ELISAを使用して、エストロゲンおよびプロゲステロンの存在下で解析する。ウェスタン解析を使用して、ビヒクル処理対照と比べてのpCREBおよびMITFの下流変化を調べる。
【０１７１】
本明細書において引用されるあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０１７２】
具体的な態様を参照して本発明を開示したが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物が当業者によって考案され得ることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および等価の変形物の全てを含むと解釈されるように意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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