(57)【要約】  特定の集団の単球又はマクロファージを調節するための方法及び組成物が開示される。方法は、ある実施形態では、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現又は活性を調節することを含む。本明細書で開示される組成物は、Ｎｕｒ７７の発現又は活性を調節するアゴニスト及びアンタゴニスト作用物質及びその使用を含む。種々の実施形態において、異常な単球又はマクロファージの発生と関係するある障害及び疾患を治療する方法が提供される。さらなる種々の実施形態において、特定の集団の単球又はマクロファージを調節する作用物質、及びＮｕｒ７７の活性及び／又は発現を調節する作用物質を同定する方法が提供される。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現又は活性を調節することを含む、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージを調節する方法。
【請求項２】
Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節する転写因子の発現又は活性を調節することを含む、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージを調節する方法。
【請求項３】
Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節する転写因子の発現又は活性を調節することを含む、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋単球又はマクロファージ細胞の産生、発生、生存、増殖、分化又は活性を刺激、促進、増大又は誘発する方法。
【請求項４】
前記転写因子が、Ｌｙ６Ｃ−単球若しくは上流のそれらの前駆細胞タイプ中の領域Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２又はＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋単球若しくは上流のそれらの前駆細胞タイプ中の相同性領域におけるＤＮＡ配列に結合する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記転写因子が、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
過増殖する細胞、腫瘍細胞、癌細胞、新生物の細胞、転移細胞又は腫瘍の成長を阻害することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記転写因子のアゴニスト又はアンタゴニストを投与することを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記転写因子のアゴニストを投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アゴニスト又はアンタゴニストが、抗体、低分子、ペプチド、阻害核酸、アロステリック阻害剤又はリガンド模倣体である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アンタゴニストが、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの結合性フラグメントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アンタゴニストが、Ｋｌｆ２ポリペプチド又はＫｌｆ４ポリペプチドの発現を指令するｍＲＮＡを標的とするか又はそれに結合する阻害核酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記アゴニスト又はアンタゴニストを対象に投与することを含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
対象における望ましくないか若しくは異常な免疫応答、免疫障害、炎症性応答、炎症性自己免疫応答、自己免疫疾患、有害な心臓血管事象若しくは心臓血管疾患を、減少、低下、阻害、抑制、限定又は制御することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対象における癌を治療することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
対象における異常な免疫応答、免疫障害、炎症性応答、炎症、自己免疫応答、障害又は疾患、癌又は有害な心臓血管事象又は心臓血管疾患を治療するための、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節する転写因子のアゴニスト又はアンタゴニストを含む医薬組成物。
【請求項１６】
前記転写因子が、Ｌｙ６Ｃ−単球若しくは上流のそれらの前駆細胞タイプ中における領域Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２、又はＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋単球若しくは上流のそれらの前駆細胞タイプにおける領域中における相同性領域中におけるＤＮＡ配列に結合する、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記転写因子がＫｌｆ２又はＫｌｆ４である、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記アゴニスト又はアンタゴニストが、抗体、低分子、ペプチド、阻害核酸、アロステリック阻害剤又はリガンド模倣体である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を調節、増大又は減少させる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４及び／又はＮｆ−κＢの存在下で、実験作用物質と、Ｎｒ４ａ１プロモーター領域がレポーター核酸と作動的に連結しているＮｒ４ａ１プロモーター又はエンハンサー領域とを接触させるステップ；
（ｂ）レポーター核酸の量、又はその転写された若しくは翻訳された生成物の量を決定するステップ；
（ｃ）（ｂ）で決定された量と、前記レポーター核酸又はその転写された若しくは翻訳された生成物の対照量とを比較するステップを含み、（ｂ）で決定された量と対照量との間の差が、実験作用物質がＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を、調節、増大又は減少させる作用物質であることを示す方法。
【請求項２０】
前記実験作用物質が抗体又は阻害核酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４に特異的に結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球の機能を、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２配列が欠損しているホモ接合の若しくはヘテロ接合のマウス、又はＮｒ４ａ１ｓｅ＿２に相同性のＤＮＡ配列に欠陥があるか若しくはさもなければ改変された任意の脊椎動物の使用により同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0004]単球は、動脈硬化巣に浸潤する主要な免疫細胞のタイプであり、単球がアテローム性動脈硬化症の初期ステージにおける立役者であると示唆するかなりの証拠がある。マウスは、骨髄（ＢＭ）及び血液循環で見出され得る２種の主要な単球集団を有する。これらの集団は両方共、骨髄腫を特徴づけるマーカーＣＤ１１ｂ及びＣｓｆ１ｒ（ＣＤ１１５）を発現し、それらは、これらの細胞をフローサイトメトリーにより同定するために使用することができる。これら２種の主要な単球集団は、細胞表面抗原Ｌｙ６Ｃの発現に基づいて分離することができる。
【０００２】
[0005]Ｌｙ６Ｃｈｉ単球は、炎症性マクロファージの短寿命の前駆体であり、アテローム性動脈硬化症１の重要な推進力である。Ｌｙ６Ｃｈｉ単球は、アテローム性動脈硬化症の病変部にＣｃｒ２及びＣｃｒ５依存性の様式で補充され、防止的補充は、高食餌で飼育されたマウスにおけるアテローム性動脈硬化症を殆ど完全に妨げる２。しかしながら、約Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球の機能について知られていることは少なく、それらは、浸潤するアテローム性動脈硬化の病変部に浸潤して２、状況証拠は、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球がアテローム性動脈硬化症を防ぎ、創傷を修復するように一般的に作用することを示唆する３，４。Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球は、血管内皮を巡回する特徴的な挙動を発揮して５、損傷した内皮細胞を除去することに役立つ６。
【０００３】
[0006]Ｎｒ４ａ１−／−マウスはＬｙ６Ｃｌｏｗ単球を完全に欠くので７、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球の発生には、転写因子Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７；核受容体亜科４群Ａメンバー１；例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２２７３６）が必要である。Ｎｒ４ａ１は高度に発現し、その効果は、細胞に固有である。それ故、Ｎｒ４ａ１は、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球の系統を決定する転写因子である。アテローム性動脈硬化症の２種の独立のモデル（Ａｐｏｅ−／−及びＬｄｌｒ−／−）で、Ｎｒ４ａ１−／−マウスは、さらに悪い疾患にかかり、これから、アテローム性動脈硬化症におけるＬｙ６Ｃｌｏｗ単球が回復促進機能を有することが示される。この解釈は、アテローム性動脈硬化に悪影響を及ぼす過程３である、Ｎｒ４ａ１−／−マクロファージがより炎症性であるという事実により混乱を増す。
【０００４】
[0007]ヒトのＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球は、マウスのＬｙ６Ｃｈｉ集団と等価であること、及びＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋単球はＬｙ６Ｃｌｏｗ単球と同様であること８，９を示唆する証拠がある。ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋単球は、高いＮｒ４ａ１発現も有することから、保存された機能が示唆され、Ｎｒ４ａ１を調節することによりヒトにおいてこれらの単球のサブセットの操作を可能にし得る可能性がある。
【発明の概要】
【０００５】
[0008]Ｌｙ６Ｃｌｏｗ又はＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋単球の発生中にＮｒ４ａ１を調節する転写因子の同定が本明細書で開示される。そのような転写因子の調節により、本明細書で述べる疾患の治療が可能になる。
【０００６】
[0009]第１の態様において、治療を必要とする対象における自己免疫疾患を治療する方法が提供され、該方法は、有効量のＰＴＰＲＡ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＡ）のアンタゴニストを対象に投与することを含む。
【０００７】
[0010]別の態様では、治療を必要とする対象の滑膜における炎症を減少させる方法が提供され、該方法は、有効量のＰＴＰＲＡアンタゴニストを対象に投与することを含む。
【０００８】
[0011]別の態様では、線維芽細胞様滑膜細胞におけるＰＴＰＲＡの発現を縮小させる方法が提供され、該方法は、前記線維芽細胞様滑膜細胞と有効量のＰＴＰＲＡアンタゴニストとを接触させることを含む。
【０００９】
[0012]別の態様では、線維芽細胞様滑膜細胞におけるＴＮＦ活性、ＩＬ−１活性及び／又はＰＤＧＦ活性を縮小させる方法が提供され、該方法は、線維芽細胞様滑膜細胞と有効量のＰＴＰＲＡアンタゴニストとを接触させることを含む。
【００１０】
[0013]別の態様では、線維芽細胞様滑膜細胞の侵襲性又は移動を縮小させる方法が提供され、該方法は、線維芽細胞様滑膜細胞と有効量のＰＴＰＲＡアンタゴニストとを接触させることを含む。
【００１１】
[0014]別の態様では、ＰＴＰＲＡアンタゴニスト及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００１２】
[0015]幾つかの態様では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージを調節する方法が提供される。幾つかの実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージを調節する方法は、対象（例えば、哺乳動物又はヒト）におけるＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量を増大又は減少させることを含む。本明細書で記載されるように、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現又は活性は、対象におけるＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球／マクロファージ集団の活性及び／又は量に直接効果を及ぼし得る。したがって、ある実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージを調節する方法は、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節する転写因子の発現又は活性を調節することを含む。ある態様において、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージ細胞の産生、発生、生存継続、増殖、分化又は活性を、刺激、促進、増大又は誘発する方法は、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節する転写因子の発現又は活性を調節することを含む。
【００１３】
[0016]ある転写因子が本明細書で開示され、その転写因子は、Ｎｒ４ａ１遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｎｒ４ａ１遺伝子のシス制御プロモーター領域中の、又は任意の他のトランスに作用するＮｒ４ａ１−関連のエンハンサー配列、例えば本発明で同定された配列などの中の５’上流制御ＤＮＡ配列に結合して、そこで、そのような転写因子は、Ｎｒ４ａ１遺伝子の発現を調節することができる。したがって、本明細書においては、ある実施形態で、Ｎｒ４ａ１遺伝子の５’ＵＴＲに位置する特定の制御ＤＮＡ配列、例えば、Ｌｙ６Ｃ−単球若しくはそれらの上流の前駆細胞タイプ中のエンハンサー領域２（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２）、又はＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球若しくはそれらの上流の前駆細胞タイプ中の相同性領域に結合する転写因子が開示される。幾つかの実施形態では、転写因子はＫｌｆ２及びＫｌｆ４である。
【００１４】
[0017]幾つかの態様では、過増殖する細胞、腫瘍細胞、癌細胞、新生物の細胞、転移性細胞又は腫瘍の成長を阻害する方法が提供され、該方法は、アゴニスト又はアンタゴニストを対象に投与することを含む。ある実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニストは、本明細書で同定された転写因子のアゴニスト又はアンタゴニストである。ある実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニストは、Ｎｕｒ７７の転写又は発現のアゴニスト又はアンタゴニストである。ある実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニストは、抗体、低分子、ペプチド、阻害核酸、アロステリック阻害剤又はリガンド模倣体である。幾つかの実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニストは、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの結合フラグメントである。幾つかの実施形態では、アンタゴニストは、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４ポリペプチドの発現を指令するｍＲＮＡを標的とするか又は結合する阻害核酸である。
【００１５】
[0018]幾つかの態様では、方法は、対象における望ましくない又は異常な免疫応答、免疫障害、炎症性応答、炎症性自己免疫応答、自己免疫疾患、有害な心臓血管事象又は心臓血管疾患を、縮小、低下、阻害、抑制、制限又は制御することを含む。ある実施形態では、該方法は、望ましくない又は異常な免疫応答、免疫障害、炎症性応答、炎症性自己免疫応答、自己免疫疾患、有害な心臓血管事象又は心臓血管疾患を治療又は予防するために、作用物質、アゴニスト、又はアンタゴニストを対象に投与することを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、対象における癌を治療することを含む。
【００１６】
[0019]ある態様においては、対象における異常な免疫応答、免疫障害、炎症性応答、炎症、自己免疫応答、障害又は疾患、癌又は有害な心臓血管事象又は心臓血管疾患の治療のための、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節する転写因子のアゴニスト又はアンタゴニストを含む医薬組成物が提供される。幾つかの実施形態では、該転写因子は、Ｌｙ６Ｃ単球若しくはそれらの上流の前駆細胞タイプ中の領域Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２中のＤＮＡ配列又はＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球若しくはそれらの上流の前駆細胞タイプ中の相同性領域に結合する。ある実施形態では、該転写因子は、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４である。ある実施形態では、上記アゴニスト又はアンタゴニストは、抗体、低分子、ペプチド、阻害核酸、アロステリック阻害剤又はリガンド模倣体である。
【００１７】
[0020]本明細書における幾つかの態様では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を調節、増大又は減少させる作用物質を同定する方法が提供される。代表的方法は、（ａ）Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４及び／又はＮｆ−κＢの存在下で、実験作用物質と、レポーター核酸に作動的に連結しているＮｒ４ａ１プロモーター領域とを接触させること；（ｂ）レポーター核酸、又はその転写された若しくは翻訳された生成物の量を決定すること；（ｃ）上記（ｂ）で決定された量と、レポーター核酸、又はそれらの転写された若しくは翻訳された生成物の対照量とを比較することを含み、（ｂ）で決定された量と対照量との差が、実験作用物質は、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージ量又は活性を調節、増大又は減少させる作用物質であることを示す。幾つかの実施形態では、実験作用物質は、抗体又は阻害核酸である。幾つかの実施形態では、実験作用物質は、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４に特異的に結合する抗体である。
【００１８】
[0021]本明細書における幾つかの実施形態では、欠損がある、破壊された又は改変されたＮｒ４ａ１ｓｅ＿２配列を含む脊椎動物（例えば、哺乳動物、例えば齧歯動物；例えばラット、例えばマウス等）が提供される。Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２配列に欠損がある脊椎動物は、欠失のある、改変された又は破壊されたＮｒ４ａ１ｓｅ＿２Ａ配列のホモ接合又はヘテロ接合になっている可能性がある。本明細書の幾つかの実施形態では、欠損がある、破壊された又は改変されたＮｒ４ａ１ｓｅ＿２配列を含む脊椎動物（例えば、哺乳動物、例えば齧歯目；例えばラット、例えばマウス等）を使用して、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球の機能を同定する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】上から下に、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球におけるＰＵ．１ピーク、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ４ｍｅ２を、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球を赤色で、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球を青色で重ねてそれぞれ示すＵＣＳＣゲノムのブラウザー画面コピーを示す図である。下のトラックは、本発明者らのエンハンサー候補の予想及びＮｒ４ａ１遺伝子モデルを示す。
【図２】Ｎｒ４ａ１ｓｅ内の１２種のエンハンサー候補のサブドメイン（ｘ−軸）のＲＡＷ２６４．７細胞におけるルシフェラーゼ活性（ｙ−軸）のグラフを示す。ＳＥＭは、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を示した。
【図３】デザインされたｓｇＲＮＡの位置及び如何にそれらがＮｒ４ａ１ｓｅサブドメインと関係するかを示すＵＣＳＣゲノムブラウザートラックを示す図である。
【図４Ａ】ホモ接合の欠損ファウンダーマウス（野性型（ＷＴ））から得られたＮｒ４ａ１ｓｅ＿ｅ２−／−、ｅ６−／−及びｅ９−／−マウスにおける血中の単球頻度を示す代表的フローサイトメトリーのプロットを示す図である。ゲートをかけたＬｉｎ細胞（ＣＤ３、ＣＤ１９、Ｌｙ６Ｇ）−、ＣＤ１１５＋細胞をＬｙ６Ｃ（ｙ−軸）及びＭＨＣＩＩ（ｘ−軸）について染色して示す。
【図４Ｂ】Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿ｅ２マウスにおけるＬｙ６Ｃｌｏｗ単球の低下を示す棒グラフを示す。
【図５】Ｎｒ４ａ１ｓｅ候補のエンハンサー構成要素において過剰に存在するＴＦＢＳを示す図である。Ｋｌｆ、ＡＲ及びＰＵ．１（Ｓｐｆｉ１）転写因子についてモチーフの位置を例示するＮｒ４ａ１ｓｅからのＥ０２を示すＵＣＳＣゲノムブラウザー画面コピーを示す図である。
【図６】ルシフェラーゼアッセイにより測定されたＮｒ４ａ１ｓｅ＿２におけるエンハンサー活性のグラフを示す。データは、（遺伝子：エンハンサー／遺伝子：プロモーターのみ）ペアの相対レポーター活性としてプロットされて、ｐＥｎｔｒｙ（ｃＤＮＡなし）対照に対して規格化されている。
【図７】Ｋｌｆ転写因子の存在下における増大したＥ２依存性の転写を示す、Ｎｒ４ａ１−ＴＳＳ（プロモーター）、Ｎｒ４ａ１−Ｅ２（プロモーター＋Ｅ２）及びＮｅｇ（プロモーター又はＥ２なし）の存在下におけるＲＡＷ２６４．７細胞中の種々のＫｌｆ転写因子のｃＤＮＡ過剰発現のグラフである。
【図８】Ｎｒ４ａ１−Ｅ２レポーターのＬＰＳ依存性の活性、及びＫｌｆ２転写因子との相互作用効果のグラフである。
【図９】Ｍｏサブセット及び前駆細胞のエピゲノムのプロファイリングは、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏのＬｙ６ＣｌｏｗＭｏへの変換のモデルを支持する。    （ａ）  単球及び上流の前駆細胞を選別するために使用されたゲーティング戦略を示す図である。細胞は、予め生きている単独の細胞（ｓｉｎｇｌｅｔ）でゲートにかけた（ＦＳＣ−Ｗ／ＦＳＣ−Ａゲートを使用して）。    （ｂ）  キーとなる系統遺伝子におけるＨ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ４ｍｅ２タグの分布を示すＵＣＳＣゲノムブラウザー画面のコピーを示す図である。    （ｃ）  ＤＥエンハンサー中のＰＵ．１ピーク中心からのＨ３Ｋ４ｍｅ２及びＨ３Ｋ２７ａｃタグ±１ｋｂの分布を示す図である。
【図１０】Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏは、細胞特異的ＳＥをＮｒ４ａ１遺伝子座位に有する。    （ａ）  Ｌｙ６ＣｈｉＭｏ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの両方におけるＬｙ６ＣｌｏｗＭｏのＰＵ．１及びＣ／ＥＢＰβ結合及びＨ３Ｋ４ｍｅ２及びＨ３Ｋ２７ａｃを描くＮｒ４ａ１遺伝子座位のＵＣＳＣゲノムブラウザー画面コピーを示す図である。    （ｂ）及び（ｃ）  ｘ−軸に表示したＭＤＰ、ｃＭｏＰ、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ中のＮｒ４ａ１ｓｅにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ２及びＨ３Ｋ２７ａｃタグのカウント（ｙ−軸）のグラフである。    （ｄ）  「Ｌａｖｉｎ」と表示したＬａｖｉｎら（２０１４年）からとった種々の組織マクロファージサブセット、及び「Ｔｈｏｍａｓ」と表示した本明細書で開示したデータからのＮｒ４ａ１のｍＲＮＡ−Ｓｅｑの発現レベルのグラフ例示を示す図である。    （ｅ）  図１０の（ｄ）におけるものと同じＭＰ集団についてＮｒ４ａ１ｓｅにおけるＨ３Ｋ２７ａｃのレベルを示す図である。
【図１１】Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ発生のために必須の保存されたＳＥサブドメインの同定を示す図である。    （ａ）  ｐＧＬ４．Ｎｒ４ａ１ベクター中にクローニングされた候補エンハンサー領域のＲＡＷ２６４．７細胞における相対ルシフェラーゼ活性を示す図である。示した結果は、２回の独立の実験で平均された。誤差のバーは、ＳＤを表し、Ｐ値は２要因分散分析により計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。    （ｂ）  ヒトＮｒ４ａ１遺伝子座位のＵＣＳＣゲノムブラウザーの画面のコピーを示す図である。ＣＤ１４＋ＣＤ１６ｄｉｍＭｏ（古典的）及びＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（非古典的）ＭｏについてのＨ３Ｋ２７ａｃのトラックは、マウスＥ２、Ｅ６及びＥ９から得られたヌクレオソームを含まないＤＮＡ配列のＢＬＡＴアラインメントと並べて示す。Ｍｏ  ＤＮａｓｅ−Ｓｅｑのデータは、（Ｂｏｙｌｅら、２００８年）からとった。ヌクレオチド配列の保存は、ＧＥＲＰトラックを使用して示す。    （ｃ）  Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿６及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿９マウスのＰＣＲ遺伝子型同定を示す図である。    （ｄ）及び（ｅ）  Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２（Ｅ２）、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿６（Ｅ６）及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿９（Ｅ９）マウスにおける末梢血中のＭｏの数値を示す図である。ＷＴに対して実施されたパラメトリックｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１。    （ｆ）  図１１の（ｄ）及び図１１の（ｅ）における各遺伝子型についてのＦＡＣＳゲーティング及び代表的流れのプロットを示す図である。
【図１２−１】Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２は、炎症性刺激に対する応答でＮｒ４ａ１ｍＲＮＡ発現を調節することはない。    （ａ）  Ｌｙｓ２−Ｃｒｅ及びＣｓｆ１ｒ−Ｃｒｅと交雑させたＮｒ４ａ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスから得られたチオグリコレートに誘発されたマクロファージにおけるＮｒ４ａ１ｍＲＮＡ発現レベルを示す図である。ＷＴ（Ｃｒｅ−同腹子）は対照として示した。    （ｂ）  単回用量の２．５ｍｇ／ｋｇＬＰＳＩ．Ｐに対する応答において、ＷＴ、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウス及びＮｒ４ａ１−／−マウスの生存継続を示すカプラン−マイヤー曲線を示す図である。マンテル−コックス（Ｌｏｇ  ｒａｎｋ）検定結果：ＷＴ対Ｎｒ４ａ１−／−  ｐ＜０．０１、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−対Ｎｒ４ａ１−／−  ｐ＜０．０５、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−対ＷＴ  ｐ＞０．０５。    （ｃ）  ＬＰＳによる刺激（１００ｎｇ／ｍｌ）に続いて最初のチオグリコレート誘発によるマクロファージにおけるＮｒ４ａ１のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ時間経過を示す図である。    （ｄ）  ＬＰＳによる刺激（１００ｎｇ／ｍｌ）後１時間のＮｒ４ａ１レベルを示すウェスタンブロットを示す図である。
【図１２−２】Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２は、炎症性刺激に対する応答でＮｒ４ａ１ｍＲＮＡ発現を調節することはない。    （ｅ）  ＬＰＳによる刺激後１時間における、用量を段階的に増大させたときのＮｒ４ａ１のｍＲＮＡ発現を示す図である。    （ｆ）  １μｇのＬＰＳのＩ．Ｐ注射後１時間に最初の腹腔内マクロファージ（ＰＭ）における炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現を示す図である。    （ｇ）  ＬＰＳによる刺激後９６時間におけるＰＭ培養上清中の酸化窒素を示す図である。
【図１３】Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ発生と関連するモチーフの同定を示す図である。    （ａ）  ＰＵ．１のピーク中心から±４００塩基の部位のＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ特異的ＰＵ．１のＬｙ６ＣｈｉＭｏ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏにおける規格化されたＰＵ．１のクロマチン免疫沈降シーケンスシグナルを示す図である。    （ｂ）  Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ特異的ＰＵ．１ピークの±５００塩基におけるＨ３Ｋ２７ａｃを示す図である。    （ｃ）  Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ特異的ＰＵ．１ピーク近傍における遺伝子の相対発現を示す図である。    （ｄ）  新たな濃縮分析により同定されたＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ特異的ＰＵ．１ピークに過剰に含まれるモチーフを示す図である。    （ｅ）  図１３の（ｄ）におけるモチーフに結合すると予測されるＴＦのＲＮＡ−Ｓｅｑの発現レベルを示す図である。
【図１４】Ｋｌｆ２は、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏのＬｙ６ＣｌｏｗＭｏへの変換をＮｒ４ａ１ｓｅ＿２により推進する。    （ａ）  ＲＡＷ２６４．７細胞中のｐＧＬ４．Ｎｒ４ａ１＿ｅ２及びｐＧＬ４．Ｎｒ４ａ１レポーターのベクターの存在下における候補ＴＦの過剰発現を示す図である。エンハンサー指数は方法で記載されたように計算される。    （ｂ）  Ｌｙｓ２−ＣｒｅＫｌｆ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス及びＬｙｓ２−ＣｒｅＫｌｆ４ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおける血液中のＭｏ頻度を示す図である。    （ｃ）  初期のＬｙ６ＣｈｉＭｏにおけるＮｒ４ａ１のｍＲＮＡの発現レベルを示す図である    （ｄ）  Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ中のＮｒ４ａ１に対して補正されたＫｌｆ２ｍＲＮＡを示す図である。    （ｅ）  Ｋｌｆ４ｍＲＮＡについての図１４の（ｄ）と同じデータを示す図である。    （ｆ）  マイクロアレイで測定された最初のヒトＭｏサブセットにおけるＫｌｆ２ｍＲＮＡの発現レベルを示す図である。
【図１５】Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２は単球に特異的なエンハンサーである。    （ａ）  組織マクロファージ選別のためのゲーティングスキームを示す図である。全ての細胞は、生きている単独の細胞で予めゲートにかけられた。肺ＣＤ１１ｃ＋マクロファージの横側の散乱が高いプロファイルを右のパネル（青色）で示す。    （ｂ）及び（ｃ）  組織マクロファージ及び血液中のＬｙ６ＣｈｉＭｏ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏにおける相対Ｎｒ４ａ１ｍＲＮＡ発現を示す図である。図１５の（ｂ）及び図１５の（ｃ）のための統計は、スチューデントのｔ検定により測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。    （ｄ）  ＷＴ、Ｎｒ４ａ１−／−及びＥ２−／−マウスにおけるＢ１６Ｆ１０腫瘍の代表的切片を示す図である。    （ｅ）及び（ｆ）  癌転移域の定量を示す図である。ＳＤ統計を表す誤差バーは、分散分析により分析された。＊ｐ＜０．０５。
【図１６−１】（ａ）  差次的に結合したＨ３Ｋ４ｍｅ２ピークを示す図である（Ｐ、１＊１０−５）。６４０個のエンハンサー領域の合計は、全ての条件の間で異なって調節されたことが見出された。    （ｂ）  差次的に結合したＨ３Ｋ２７ａｃピークを示す図である（Ｐ、１＊１０−５）。合計９，８７９個のエンハンサー領域が、全ての条件の間で異なって調節されたことが見出された。    （ｃ）  ＤＥエンハンサー領域の階層的クラスタリングを示す図である。左側のバンドは、図９（ｃ）で群を明確にするために使用されたクラスターを示す。
【図１６−２】（ｄ）  図９（ｃ）及び図１６の（ｃ）で規定されたＭＤＰ、ＭＤＰ／ｃＭｏＰ、Ｌｙ６Ｃｈｉ／Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ、又はＬｙ６ＣｌｏｗＭｏのみと関連するクラスターにおける新たなモチーフの事例の存在／不在を示す図である。ｐ値が有意性１＊１０−４０の唯一のモチーフ事例を、ＨＯＭＥＲにより同定された代表的モチーフと並べて示す。
【図１７】ｍＲＮＡ−Ｓｅｑデータにおける異なる遺伝子発現を対にして比較した遺伝子発現プロファイルを示す図である。
【図１８】Ｎｒ４ａ１及び周囲の領域のＵＣＳＣゲノムブラウザー画面のコピーを示す図である。Ｎｒ４ａ１関連のスーパーエンハンサー（Ｎｒ４ａ１ｓｅ）を、垂直なグレーのバンドによって強調してある。Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球のためのスーパーエンハンサーの予想を、遺伝子予測トラックの直ぐ上に黒色で示す。
【図１９−１】（ａ）  Ｅ２、Ｅ６及びＥ９ＫＯマウスについてＣＲＩＳＰＲｓｇＲＮＡ部位の位置を示すＵＣＳＣゲノムのブラウザー画面のコピーを示す図である。ＴＦトラックは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏにおけるＰＵ．１及びＣＥＢＰｂ転写因子結合プロファイルを重ねて示す。
【図１９−２】（ｂ）  ＴＳＳの上流のＮｒ４ａ１プロモーターのＮｒ４ａ１  ３００ｂｐ及び５’ＵＴＲ配列を含有するｐＧＬ４．１０ルシフェラーゼレポーターベクターの模式図を示す図である。    （ｃ）  ｓｇＲＮＡのデザインを示す図である。
【図２０ａ】Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球エンハンサー領域に存在する過剰に含まれたモチーフのファミリーに属する転写因子のｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータに基づいて示す図である。
【図２０ｂ】Ｎｒ４ａ１Ｅ２エンハンサーのサブ配列中に存在するＫｌｆモチーフ（ＨＯＭＥＲを使用して同定された）を示す図である。
【図２１】（ａ）  Ｍａｃ−Ｋｌｆ２マウス及びＭａｃ−Ｋｌｆ４マウスの骨髄中におけるＭｏサブセット頻度のフローサイトメトリー分析を示す図である。    （ｂ）  ＧＦＰとＫｌｆ２、Ｋｌｆ４を標的とするレトロウイルスを発現するｓｈＲＮＡと、又は標的でない対照（ＮＴＣ）の配列を形質導入されたＧＦＰ＋細胞の頻度を示す図である。    （ｃ）及び（ｄ）  Ｍａｃ−Ｋｌｆ２マウス及びＭａｃ−Ｋｌｆ４マウスから選別された血液中の単球サブセット中におけるＫｌｆ２（ｃ）及びＫｌｆ４（ｄ）のｍＲＮＡ発現を示す図である。    （ｅ）及び（ｆ）  Ｌｙ６ＣｈｉＭｏにおけるＮｒ４ａ１のｍＲＮＡ発現に対して相関するＫｌｆ２（ｅ）及びＫｌｆ４（ｆ）のｍＲＮＡ発現レベルを示す図である。
【図２２】（ａ）  ＦＡＣＳにより測定されたＷＴ及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウスにおける組織マクロファージのサブセット頻度を示す図である。    （ｂ）  ３００，０００個のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の注射後１８日におけるＷＴ、Ｎｒ４ａ１−／−及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウスにおける血液中の単球サブセット頻度を示す図である。    （ｃ）  組織学的切片のＢ１６Ｆ１０腫瘍についての定量を示す図である。    （ｄ）  図１５の（ｄ）に関係するマウスの肺内の個体腫瘍のサイズ分布を示す図である。  図２２（ｃ）及び図２２（ｄ）のための統計は、スチューデントｔ検定を使用して実施した。ｐ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[0044]エンハンサーは、遺伝子発現の細胞に特異的パターンを調節して、ヒストン改変Ｈ３Ｋ４ｍｅ２に対するＣｈＩＰ−Ｓｅｑを使用してゲノムワイドで定量され得る。活性なエンハンサーは、Ｈ３Ｋ２７ａｃに基づいてさらに同定され得る１０，１１。系統を決定する転写因子（ＬＤＴＦ）は、細胞特異的エンハンサーレパートリーを確立し維持する。主要な骨髄腫ＬＤＴＦはＰＵ．１である１１。差次的なＰＵ．１結合は異なるマクロファージ集団間で起こり、これらの細胞特異的ＰＵ．１ピークは、これらの別個の集団の独自性を維持する転写因子と関連するモチーフと共局在する１２。
【００２１】
[0045]Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球発生を調節する因子を同定するために、初生のＬｙ６Ｃｈｉ単球及びＬｙ６Ｃｌｏｗ単球の、プロファイリングされたエンハンサーのランドスケープを本明細書で開示する。戦略は、ゲノムの広いＣｈＩＰ−Ｓｅｑ分析から推測した規定する情報でＮｒ４ａ１に関連するエンハンサー分子の分析を統合して、優先度の高い標的を定めた。
【００２２】
[0046]初生マウスのＬｙ６Ｃｈｉ及びＬｙ６Ｃｌｏｗ単球についてのＨ３Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＰＵ．１ＣｈＩＰ−Ｓｅｑのデータが、本明細書で開示される。Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球における大きく増大した活性を示すＮｒ４ａ１の上流の大きいエンハンサー領域が同定された（図１）。Ｎｒ４ａ１ｓｅと命名されたこの領域は、スーパーエンハンサーの特性を発揮する。スーパーエンハンサーは、典型的には＞１０ｋｂにわたり、細胞タイプの特定のために重要な遺伝子の近くに見出され、その発現を制御する１３，１４。したがって、Ｎｒ４ａ１ｓｅは、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球においてＮｒ４ａ１を調節することが見出された。
【００２３】
[0047]転写の調節に機能的に関連するＮｒ４ａ１ｓｅの領域を特徴づけるために、活性な転写因子結合の２つの尺度１１であるヌクレオソームの枯渇及びＰＵ．１利用率という基準に基づいて規定された１２個の領域をクローニングした。Ｎｒ４ａ１のプロモーターからなるルシフェラーゼレポーター及びこれらの１２の候補位置の各々（図１及び図２）を、エンハンサー活性について、マクロファージ様のＲＡＷ２６４．７細胞株を使用して試験した。領域Ｅ０２、Ｅ０６及びＥ０９が、基礎的なエンハンサー活性を発揮することが見出された（図２）。必須の転写因子が、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球サブセットに特異的であることが予想されるので、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるこれらのエンハンサーの大きな変化倍率の誘発は予想されなかった。
【００２４】
[0048]ヒトのＣＤ１４＋ＣＤ１６−及びＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋の両方の単球のエンハンサーのランドスケープが報告されている１５。如何なる理論によっても制約されることは望まないが、ヒトのＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋単球集団が、マウスＬｙ６Ｃｌｏｗ単球サブセットと真にオルソロガスであれば、その場合には、系統を決定する転写因子の転写の調節は、天然の選択により保存されるであろう。比較ゲノミクスの手法を使用して、マウスの領域Ｅ０２、Ｅ０６及びＥ０９にオルソロガスなヒトＤＮＡ配列は、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球の等価物において上昇したＨ３Ｋ２７ａｃを含有することが見出された。
【００２５】
[0049]本明細書で開示されたように、Ｅ０２、Ｅ０６及びＥ０９は、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球におけるＮｒ４ａ１遺伝子の発現と関連する機能的な、進化で保存された配列であることが発見された。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム１６，１７を使用して、マウスに、これらの領域の各々の欠失を含有させて、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球発生におけるそれらの役割を試験した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｇＲＮＡ）を使用してＣａｓ９ヌクレアーゼに高精度でゲノムのＤＮＡ開裂の箇所を指示するヌクレアーゼ複合体である。２種のｓｇＲＮＡ分子をＣａｓ９と共に投与すると、その結果、ＤＮＡ二本鎖切断の対が生じ、それは、非相同性端部連結ＤＮＡ修復経路により融合される１８。図３に概略を示したように、この手法は、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２、６及び９−／−マウスをそれぞれ作製するために使用されてきた。
【００２６】
[0050]本明細書で開示されたように、配列決定により、所望の欠失が存在すること、及び生殖細胞系列伝達の複数の事例が、各株について観察されることが発見された。
【００２７】
[0051]全体的なＮｒ４ａ１−／−マウスはＬｙ６Ｃｌｏｗ単球を欠くので、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２、ｅ６及びｅ９−／−ファウンダーマウスにおける血中単球集団頻度を評価した。エキサイティングなことに、単一の領域、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２が、インビボでＬｙ６Ｃｌｏｗ単球サブセットのために要求されることが見出された（図４Ａ、Ｂ）。これらの発見は、単一の、又は少数の転写因子が、単一のゲノムの遺伝子座位に収束することにより、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球の関与を調節するという仮説と矛盾しない。
【００２８】
[0052]如何なる特定の理論にもとらわれず又は制約されず、転写因子が推進するＬｙ６Ｃｌｏｗ単球中におけるＮｒ４ａ１発現は、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球に特異的なエンハンサー内に全体的な転写のシグネチャーを与えることができる。Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球が関連するエンハンサーの新たなモチーフに分析により、ＰＵ．１及びＮｕｒ７７のためのモチーフを含む数種のモチーフが同定された。
【００２９】
[0053]本明細書でも開示されたように、ＣＥＢＰ、ＲＵＮＸ、ＫＬＦ、ＭＥＦ２、ＡＰ−１、ＡＲ／Ｅ２Ｆ及びＳＭＡＤ４転写因子のためのモチーフが同定された。これらの新たなモチーフをＮｒ４ａ１ｓｅ＿２配列にマッピングして、この領域で転写の活性を推進する候補モチーフを同定した。ＫＬＦ、ＡＲ及びＰＵ．１モチーフの事例をＮｒ４ａ１ｓｅ＿２配列の領域で同定した（図５）。それに加えて、Ｅ２領域に存在したＬｙ６Ｃｌｏｗ単球と関連するより低い確実性のＮｆ−κＢモチーフを同定した。
【００３０】
[0054]本明細書で開示されたように、図５で同定されたモチーフに結合する転写因子がＬｙ６Ｃｌｏｗ単球におけるＮｒ４ａ１転写を調節することが決定された。ＲＮＡ−Ｓｅｑ遺伝子の発現データを調べて、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球で及びＬｙ６Ｃｌｏｗ単球ではＬｙ６Ｃｈｉ単球と比較して上方制御されて両方で発現する転写因子を見出した。両方の単球サブセットが、これらのモチーフに結合することができる複数の転写因子を発現する。特に、これらの転写因子は、Ｓｐｉ１（ＰＵ．１）、Ｅｔｓ１（ＰＵ．１）、Ｓｐｉｂ（ＰＵ．１）、Ｎｒ４ａ１（ＡＲ−半部位）、Ｋｌｆ２（ＫＬＦ）、Ｋｌｆ４（ＫＬＦ）、Ｋｌｆ６（ＫＬＦ）、Ｋｌｆ１０（ＫＬＦ）、Ｋｌｆ１３（ＫＬＦ）である。
【００３１】
[0055]Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２エンハンサー要素を通して作用する転写因子を同定するために、インビトロの手法を採用した。上で規定された転写因子の各々のためのｃＤＮＡクローン（ＴｒｕｅＯＲＦ、ｏｒｉｇｅｎｅ）を、マクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞中にＮｒ４ａ１ｓｅ＿２レポーターベクターと共にトランスフェクトした。ＲＡＷ２６４．７細胞は、マクロファージ転写調節のアッセイのために十分確立された役に立つツールである。バックグラウンド対照として、Ｅ２エンハンサー配列を有しないＮｒ４ａ１−ＴＳＳ領域を使用して、ベクターはＮｒ４ａ１−ＴＳＳプロモーターもエンハンサー領域も含有しなかった。図６及び図７は、研究からの結果及びＥ２エンハンサー配列の存在下における転写因子の各々のｃＤＮＡ過剰発現を示す。これらのデータは、Ｋｌｆファミリーの転写因子、及びｋｌｆ２及びＫｌｆ４が特にＮｒ４ａ１−ルシフェラーゼ活性の発現を推進することを明確に示す。
【００３２】
[0056]本明細書で開示されたように、Ｅ２領域内のＮｆ−κＢ箇所も同定して、Ｅ２領域がＮｆ−κＢのシグナル送信に応答性であるかどうかを試験した。この研究のために、Ｅ２レポーター（及びＴＳＳのみ、及び陰性対照プラスミド）を、Ｔｌｒ４リガンドのＬＰＳというＮｆ−κＢ活性の強い制御因子で処理した。この研究からの結果（図８）は、Ｅ２領域もＬＰＳ応答性であること、及びＥ２遺伝子座位においてＫｌｆ２とＮｆ−κＢとの間に相乗効果があることを示す。
【００３３】
[0057]本明細書で開示されたように、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球におけるＮｒ４ａ１の発現を調節する機構（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２領域を通して）は、ドラッガブルな標的を表す。この経路を作動させるとＬｙ６Ｃｌｏｗ単球数が増大し、この経路に拮抗するこれらの細胞の産生が阻止される。如何なる特定の理論にもとらわれず又は制約されず、Ｋｌｆ転写因子及びＮｆ−κＢは、この過程で決定的な役割を演じることができる。
【００３４】
[0058]したがって、一実施形態において、非古典的（マウスにおけるＬｙ６Ｃｌｏｗ及びヒトにおけるＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋）単球発生に影響する（促進する／阻害する）新規な手法が提供される。Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球、又は上流の前駆細胞タイプ（古典的単球、ｃＭｏＰ、ＭＤＰ）中の領域Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２におけるＤＮＡ配列に結合する転写因子の活性を調節することにより、Ｎｒ４ａ１の転写活性を調節することができる。次にこれは、この細胞タイプの活性に影響し、これは、炎症及び創傷の治療行為を含む治療に重要である。提供される方法のある実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージが、Ｎｆ−κＢを調節することにより調節される。本発明方法の特定の実施形態において、Ｎｆ−κＢの機能は、転写因子を調節することと組み合わせて調節される。
【００３５】
[0059]本明細書の幾つかの実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋単球の活性又はマクロファージ細胞の産生、発生、生存、増殖、分化若しくは活性を調節する方法が開示される。単球又はマクロファージを調節する方法は、インビトロの方法又はインビボの方法であり得る。インビトロの方法は、しばしば、１個若しくは複数の細胞、それらの一部と、アゴニスト又はアンタゴニストとを接触させることを含む。インビボの方法は、しばしば、アゴニスト又はアンタゴニストを対象（例えば、哺乳動物、ヒト）に提供するか又は投与することを含む。
【００３６】
[0060]ある実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニストは、抗体、又はそれらの結合フラグメントである。幾つかの実施形態では、抗体、又はそれらの結合フラグメントが、ＫＬｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢに特異的に結合する。したがって、アンタゴニスト抗体、又はそれらの結合フラグメントは、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢに特異的に結合することができ、その結合が、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢの転写調節活性を阻害又は封鎖することができる。例えば、アンタゴニスト抗体のＫｌｆ２に対する特異的結合は、Ｋｌｆ２のＤＮＡ結合箇所に対する結合を阻害若しくは封鎖することができるか、又はＫｌｆ２の転写の調節活性を阻害若しくは封鎖することができる。あるいは、アゴニスト抗体又はそれらの結合フラグメントは、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢに特異的に結合することができ、その結合は、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢの転写活性を促進、増大、刺激又は誘発することができる。例えば、アゴニスト抗体のＫｌｆ２に対する特異的結合は、Ｋｌｆ２のＤＮＡ結合箇所に対する結合を、促進、増大、刺激若しくは誘発することができるか、又はＫｌｆ２の転写の調節活性を促進、増大、刺激若しくは誘発することができる。Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢに特異的に結合する抗体のアゴニスト又はアンタゴニスト活性を同定、選択及び／又は評価する方法が、本明細書で開示される。
【００３７】
[0061]幾つかの実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体が、対象に投与される。ある実施形態では、疾患又は障害（例えば、リンパ組織増殖性の障害（例えば、癌））を有する対象が、対象にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を投与することにより前記障害を治療される。ある実施形態では、自己免疫障害又は疾患を有する対象が、対象にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を投与することにより前記障害を治療される。
【００３８】
[0062]用語「アンタゴニスト」等は、転写因子の活性レベル又は転写因子、例えば、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４の発現のレベルを低下させる作用物質を指す。アンタゴニストは、結合剤、低分子の阻害剤、アロステリック阻害剤、抗体、阻害核酸、ＲＮＡｉ分子、又はリガンド模倣体であり得る。
【００３９】
[0063]用語「対象」、「患者」、「個体」その他は、限定的であることは意図されず、一般的に互換され得る。即ち、「患者」と記載された個体は、所与の疾患を有するとは限らず、単に医学的助言を求めているだけのこともある。
【００４０】
[0064]本明細書において使用される用語「治療する」及び「予防する」は、発症における任意の遅れ、症状の頻度又は重症度における低下、症状の軽快、患者の快適感又は機能（例えばｎｔ機能）における改善、疾患状態の重症度における減少、その他を指すことができる。治療の効果は、所与の治療を受けていない個体又は個体のプールと比較するか、又は治療前若しくは治療中止後の同じ患者を比較することができる。用語「予防する」は、一般的に、所与の疾患（例えば自己免疫、炎症性自己免疫、癌、感染性、免疫、又は他の疾患）又は患者における疾患症状の発症における減少を指す。上で示したように、予防は、完全であることもあり（検出可能な症状がない）又は治療しなければ起こったと思われるよりも少ない症状が観察されるように部分的であることもある。
【００４１】
[0065]本明細書で使用される「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」又は文法的に同じ用語は、少なくとも２つのヌクレオチドが共有結合で連結されて一緒になることを意味する。用語「核酸」は、一本鎖、二重鎖、又は多鎖のらせん状ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらのアナログ（誘導体）を含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、長さが、約５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２５、３０、４０、５０又はそれを超えるヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまでである。核酸及びポリヌクレオチドは、より長いものを含む任意の長さ、例えば、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、１０，０００、又はさらにより長いポリマーである。１個又は複数の炭素環状糖類を含有する核酸も、核酸の１つの定義内に含まれる。リボース−リン酸骨格の改変は、種々の理由で、例えば、生理学的環境におけるそのような分子の安定性及び半減期を増大させるために、又はバイオチップのプローブとして行われ得る。天然に生ずる核酸とアナログの混合物は作製され得る。あるいは、異なる核酸のアナログの混合物、及び天然に生ずる核酸とアナログの混合物が作製されてもよい。
【００４２】
[0066]特定の核酸配列は、「スプライスバリアント」も包含する。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライスバリアントによりコードされる任意のタンパク質を包含する。「スプライスバリアント」は、名前が示唆するように、遺伝子のオルターナティブスプライシングの生成物である。転写の後、最初の核酸転写物がスプライスされることも可能なので、異なる（交替する）核酸スプライス生成物は異なるポリペプチドをコードする。スプライスバリアントの産生機構は多様であるが、エクソンの交替するスプライシングを含む。読み過ごし転写による同じ核酸からの交替するポリペプチドの誘導も、この定義により包含される。スプライス生成物の組換え形態を含むスプライシング反応の任意の生成物は、この定義に含まれる。カリウムチャンネルのスプライスバリアントの例が、Ｌｅｉｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（５２）：３５０９５〜３５１０１頁（１９９８年）で論じられている。
【００４３】
[0067]「阻害核酸」とは、標的核酸（例えば、転写因子に翻訳され得るｍＲＮＡ）に結合して、標的核酸（例えば、ＤＮＡからのｍＲＮＡ）の転写を低下させるか又は標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を低下させるか又は転写物スプライシング（例えば一本鎖モルホリノオリゴ）を変化させることができる核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログのポリマー）である。ある実施形態では、「阻害核酸」は、標的核酸（例えば転写因子に翻訳され得るｍＲＮＡ）に結合して（例えばハイブリダイズして）、標的核酸の翻訳を低下させることができる核酸である。標的核酸は、阻害核酸が結合する（例えば、ハイブリダイズする）１個又は複数の標的核酸配列であるか又はそれを含む。したがって、阻害核酸は、典型的には、標的核酸配列で標的核酸の少なくとも部分とハイブリダイズすることができる配列（本明細書では「アンチセンス核酸配列」とも称する）であるか又はそれを含む。阻害核酸の例はアンチセンス核酸である。阻害核酸の別の例は、ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ（それらの誘導体又は前駆体、例えば、ヌクレオチドアナログなどを含む）である。さらなる例には、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ、又はそれらの誘導体又は前駆体のあるものが含まれる。幾つかの実施形態では、阻害核酸は一本鎖である。幾つかの実施形態では、阻害核酸は二本鎖である。
【００４４】
[0068]「アンチセンス核酸」とは、特異的標的核酸（例えば、標的核酸配列）、例えば、ｍＲＮＡ分子（例えば標的ｍＲＮＡ分子）（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、２６２：４０頁（１９９０年）を参照されたい）などの少なくとも一部と少なくとも部分的に相補性である核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はアナログそれらの）、例えばアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（ミクロＲＮＡ）である。したがって、アンチセンス核酸は、標的核酸（例えば標的ｍＲＮＡ）にハイブリダイズ（例えば選択的にハイブリダイズ）することができる。幾つかの実施形態では、アンチセンス核酸は、ストリンジェントなハイブリダイズ条件下で標的核酸配列（例えばｍＲＮＡ）にハイブリダイズする。幾つかの実施形態では、アンチセンス核酸は、中程度にストリンジェントなハイブリダイズ条件下で標的核酸（例えばｍＲＮＡ）にハイブリダイズする。アンチセンス核酸は、天然に生ずるヌクレオチド又は改変されヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、及びアノマー形態の糖リン酸、骨格を改変されたヌクレオチドなどを含むことができる。
【００４５】
[0069]幾つかの実施形態では、アンタゴニストは阻害核酸である。ある実施形態では、阻害核酸は、阻害ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）であり、それらの例には、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ、モルホリノオリゴ等が含まれ、それらの誘導体及び前駆体、例えば、それらのヌクレオチドアナログ及び組合せを含むものなども含まれるが、これらに限定されない。ｉＲＮＡは、ＲＮＡに誘発されたサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通して、ＲＮＡ転写物の目標とされる開裂を媒介することができる。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる過程によりｍＲＮＡの配列に特異的な分解を指令することができる。幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡは、細胞（例えば、対象内の細胞）中におけるＫｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢポリペプチドの発現を調節する（例えば、阻害、抑制、阻止する）。
【００４６】
[0070]幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列（例えば、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢ標的ｍＲＮＡ配列）と相互作用する一本鎖ＲＮＡを含み、その相互作用は、標的ＲＮＡの開裂又は分解を指令する。別の実施形態において、ｉＲＮＡは、細胞又は有機体中に導入されて標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖のｓｉＲＮＡである。一本鎖のｓｉＲＮＡは、一般的に１５〜１００又は１５〜３０ヌクレオチドの長さであり、化学的に改変されていることもある。一本鎖のｓｉＲＮＡのデザイン及び試験は、米国特許第８，１０１，３４８号及びＬｉｍａら、（２０１２年）Ｃｅｌｌ  １５０巻：８８３〜８９４頁に記載されている。
【００４７】
[0071]幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡは、標的をアンチセンス阻害機構により阻害する一本鎖のアンチセンスＲＮＡ分子である。一本鎖のアンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列としばしば相補性である。アンチセンスＲＮＡは、標的ｍＲＮＡとの塩基対形成により化学量論様式で、翻訳機構を物理的に閉塞することにより、翻訳を阻害することができる；Ｄｉａｓ、Ｎ．ら、（２００２年）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １巻：３４７〜３５５頁を参照されたい。あるいは、一本鎖のアンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズして、標的をＲＮａｓｅＨ開裂事象により開裂することにより、標的ｍＲＮＡを阻害することができる。一本鎖のアンチセンスＲＮＡ分子は、任意の適当な長さであってもよい。幾つかの実施形態では、アンチセンスＲＮＡは、約１５〜約３０ヌクレオチド、又は３０ヌクレオチド以上の長さであり、標的ｍＲＮＡ配列と完全に又は部分的に相補性である配列を有する。
【００４８】
[0072]幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡであり、本明細書では、ｄｓＲＮＡｉ作用物質と称される。ｄｓＲＮＡｉ作用物質は、しばしば、２つの逆平行の及び実質的に相補性の核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸の複合体分子であり、標的ＲＮＡに対して「センス」及び「アンチセンス」配向を有すると称される。本発明の幾つかの実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ作用物質は、本明細書ではＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと称される転写後の遺伝子サイレンシング機構により、標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの分解を開始させる。
【００４９】
[0073]ｉＲＮＡは、一般的に、１本又は２本の鎖を含むことができる。幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡは、一本鎖のｉＲＮＡを含む。ある実施形態では、ｉＲＮＡは２本の実質的に相補性の鎖を含む。幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡの２本の鎖は各々別のＲＮＡ分子である。幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡの２本の鎖は、リンカーにより共有結合で接続されている。
【００５０】
[0074]ある実施形態では、ｉＲＮＡは、モルホリノオリゴを含む。幾つかの実施形態では、アンチセンス核酸は、モルホリノオリゴである。幾つかの実施形態では、モルホリノオリゴは、当技術分野で知られているように、一本鎖のアンチセンス核酸である。幾つかの実施形態では、モルホリノオリゴは、標的のタンパク質発現を減少させ、標的ｍＲＮＡの翻訳を低下させ、標的ｍＲＮＡの翻訳開始を低下させ、又は転写物スプライシングを改変する。幾つかの実施形態では、モルホリノオリゴは、細胞透過性の部分（例えばペプチド）と複合体化されている。アンチセンス核酸は、一本鎖又は二本鎖の核酸であることもある。
【００５１】
[0075]細胞中において、アンチセンス核酸は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができ、二本鎖の分子を形成する。細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないので、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの翻訳を妨げる。遺伝子のインビトロにおける翻訳を阻害するアンチセンス法の使用は、当技術分野において周知である（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７２：２８９、（１９８８年））。ＤＮＡに直接結合するアンチセンス分子が使用され得る。
【００５２】
[0076]阻害核酸は、注射、吸入、又は経口摂取によることを含む当技術分野において知られた任意の適当な手段を使用して、対象に送達することができる。別の適当な送達システムは、コロイド分散液システム、例えば、高分子錯体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームなどを含む脂質系システムである。コロイドシステムの例は、リポソームである。リポソームは、インビトロ及びインビボにおける送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。リポソーム内のＲＮＡ及びＤＮＡを含む核酸は、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、６：７７、１９８１）。リポソームは、当技術分野で知られた任意の手段を使用して、特異的な細胞タイプ又は組織を標的とすることができる。阻害核酸（例えばアンチセンス核酸、モルホリノオリゴ）は、細胞透過性の送達システム（例えば細胞透過性のペプチド）を使用して、細胞に送達することができる。幾つかの実施形態では、阻害核酸は、ウイルスのベクター又はウイルスを使用して、特異的細胞又は組織に送達される。
【００５３】
[0077]「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指し、その二本鎖ＲＮＡは、該ｓｉＲＮＡがある遺伝子又は標的遺伝子と同じ細胞中に存在する（例えば発現する）ときに、その遺伝子又は標的遺伝子の発現を低下又は阻害する能力を有する。ｓｉＲＮＡは、典型的には約５〜約１００ヌクレオチドの長さ、より典型的には約１０〜約５０ヌクレオチドの長さ、より典型的には約１５〜約３０ヌクレオチドの長さ、最も典型的には約２０〜３０塩基ヌクレオチド、又は約２０〜２５又は約２４〜２９ヌクレオチドの長さ、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドの長さである。ｓｉＲＮＡ分子及びｓｉＲＮＡ分子を発生させる方法は、例えば、Ｂａｓｓ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４１１巻、４２８〜４２９頁；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、４１１巻、４９４〜４９８頁；国際公開第００／４４８９５号；国際公開第０１／３６６４６号；国際公開第９９／３２６１９号；国際公開第００／０１８４６号；国際公開第０１／２９０５８号；国際公開第９９／０７４０９号；及び国際公開第００／４４９１４号に記載されている。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを転写する（例えば、ヘアピン二本鎖として）ＤＮＡ分子は、ＲＮＡｉも形成する。ｄｓＲＮＡを転写するためのＤＮＡ分子は、米国特許第６，５７３，０９９号、及び米国特許出願第２００２／０１６０３９３号及び第２００３／００２７７８３号、並びにＴｕｓｃｈｌ及びＢｏｒｋｈａｒｄｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ、２：１５８（２００２年）で開示されている。
【００５４】
[0078]ｓｉＲＮＡは、直接投与することができるか、又はｓｉＲＮＡ発現ベクターを、異なるデザイン基準を有するＲＮＡｉを誘発するために使用することができる。ベクターは、短いスペーサー配列により分離されており、転写を終結させるために使用されるひと続きのＴで終わる、挿入された２つの反転した繰り返しを有することができる。
【００５５】
[0079]所望の治療の遺伝子コード及び対照配列を含有する適当なベクターの構造は、当技術分野で十分理解されている標準的連結及び制限技法を使用する（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２年）を参照されたい）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、又は合成オリゴヌクレオチドは、所望の形態で、開裂され、仕立てられて再連結される。
【００５６】
[0080]用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１個又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然に生ずるアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に生ずるアミノ酸ポリマー及び非天然に生ずるアミノ酸ポリマーに適用される。
【００５７】
[0081]用語「アミノ酸」は、天然に生ずるアミノ酸及び合成アミノ酸並びに天然に生ずるアミノ酸と同様な様式で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣体を指す。天然に生ずるアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされたアミノ酸、並びに後で改変されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に生ずるアミノ酸と同じ基本的化学構造、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。上記のようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に生ずるアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然に生ずるアミノ酸と同様な様式で機能する化学化合物を指す。
【００５８】
[0082]アミノ酸は、それらの一般的に知られた３文字記号によるか又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学的命名法委員会により推薦される１文字記号によるかのいずれかによって、本明細書でも言及されることがある。ヌクレオチドは、同様に、一般的に受け入れられているヌクレオチドの１文字コードにより言及されることがある。
【００５９】
[0083]「保存的に改変されバリアント」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントとは、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする保存的に改変された核酸か、又は核酸がアミノ酸配列をコードしてない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重の理由で、多くの機能的に同一の核酸が、いずれかの所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置で、該コドンは、コードされたポリペプチドを変更せずに、記載された対応するいずれかのコドンに変更され得る。そのような核酸の変化は「サイレントな変化」であり、サイレントな変化は１種の保存的に改変された変化である。ポリペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレントな変化も記載する。当業者は、核酸中の各コドンが（通常メチオニンだけのためのコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンだけのためのコドンであるＴＧＧを除いて）、機能的に同一の分子を生ずるように改変され得ることを認識しているであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントな変化は、発現する生成物に関して各々記載される配列に潜在的に含まれるが、実際のプローブの配列に関しては潜在的ではない。
【００６０】
[0084]アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列で単一のアミノ酸又は小さいパーセンテージのアミノ酸を変更、付加又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、変更が、化学的に同様なアミノ酸によるアミノ酸の置換を生ずる「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するであろう。機能的に同様なアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野で周知である。上記のような保存的に改変されたバリアントは、本明細書で開示された多形性のバリアント、異種間の同族体、及び対立遺伝子を排除せずに加える。
【００６１】
[0085]以下の８群は、各々互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アルパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照されたい）。
【００６２】
[0086]例えば、細胞、又は核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用される場合、用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入又は自然のままの核酸若しくはタンパク質の改造により改変されていること、又は細胞が上記のように改変された細胞から誘導されていることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の自然のままの（非組換え）形態内で見出されない遺伝子を発現するか、又は自然のままの遺伝子を、他の状態で異常に発現するか、不十分に発現するか若しくは全く発現しない。
【００６３】
[0087]用語「異種」は、核酸の部分に関して使用される場合、核酸が、天然で互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、異種核酸は、典型的には、組換えにより産生され、新しい機能的核酸、例えば、１つの供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコード領域を作製するように配列された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、天然で互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００６４】
[0088]「抗体」は、抗原に特異的に結合する及び抗原を認識する免疫グロブリン遺伝子又はそれらのフラグメントからのフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域の遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域の遺伝子を含む。軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンと分類され、次にこれらはそれぞれ、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを規定する。典型的には、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性及び親和性において最も重要である。幾つかの実施形態では、抗体又は抗体のフラグメントは、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ラクダを含む異なる生物体から誘導され得る。本明細書で開示される抗体は、１個又は複数のアミノ酸位置で改変されて又は変異して、抗体の所望の機能（例えば、グリコシル化、発現、抗原認識、エフェクター機能、抗原結合、特異性、その他）が改善又は調節された抗体を含むことができる。
【００６５】
[0089]典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）及び１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担当する約１００〜１１０個又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。
【００６６】
[0090]抗体は、例えば、完全な免疫グロブリンとして又は種々のペプチダーゼによる消化により産生された十分にキャラクタライズされた多くのフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結の下で抗体を消化すると、Ｆ（ａｂ）’２、それ自体ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に接合した軽鎖であるＦａｂのダイマーが生成する。Ｆ（ａｂ）’２は、緩和な条件化で還元することができ、ヒンジ領域中のジスルフィド連結基を切断し、それによりＦ（ａｂ）’２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換することができる。Ｆａｂ’モノマーは、ヒンジ領域の一部を有する本質的にＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年を参照されたい）。種々の抗体フラグメントは、完全な抗体の消化によって規定されるが、当業者は、上記のようなフラグメントが、新たに化学的によるか又ＤＮＡ組換え法を使用することによるかのいずれかで合成され得ることを認識しているであろう。したがって、本明細書において使用される抗体という用語は、完全な抗体の改変により生成したフラグメント、又は組換えＤＮＡ方式を使用して新たに合成されたフラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖ）又はファージディスプレイライブラリーを使用して同定されたフラグメントのいずれかの抗体フラグメントも含む（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）を参照されたい）。
【００６７】
[0091]本明細書で開示された適当な抗体の調製のために、及び本明細書で開示された方法、例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体による使用のために、当技術分野において知られた多くの技法を使用することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５〜４９７頁（１９７５年）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４巻：７２頁（１９８３年）；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．（１９８５年）中の７７〜９６頁；Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）；及びＧｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６年）を参照されたい）。関心のある抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を、細胞からクローニングすることができる、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローニングされて、組換えモノクローナル抗体を産生させるために、使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子のライブラリーは、ハイブリドーマ又は形質細胞からも作製することができる。重鎖及び軽鎖の遺伝子の生成物のランダムな組合せは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きいプールを発生する（例えば、Ｋｕｂｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版、１９９７年）を参照されたい）。一本鎖抗体又は組換え抗体産生のための技法（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）は、本明細書で開示されたポリペプチドに対する抗体を産生させるために構成され得る。トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物などの他の生物体も、ヒト化抗体又はヒト抗体を発現させるために使用することができる（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻：８５６〜８５９頁（１９９４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻：８１２〜１３頁（１９９４年）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻：８４５〜５１頁（１９９６年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８２６頁（１９９６年）；並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３巻：６５〜９３頁（１９９５年）を参照されたい）。あるいは、ファージディスプレイ技法を、選択された抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロマーのＦａｂフラグメントを同定するために使用することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）を参照されたい）。抗体は、二重特異性抗体にすることもできる、即ち、２種の異なる抗原を認識できる（例えば、国際公開第９３／０８８２９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０巻：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）；及びＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１巻：２１０頁（１９８６年）を参照されたい）。抗体は、ヘテロ接合コンジュゲート、例えば、２つの共有結合で接合された抗体、又は抗毒素であることもできる（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／２００３７３号；及び欧州特許第０３０８９号を参照されたい）。
【００６８】
[0092]非ヒト抗体をヒト化するか又は霊長類化する方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，５３０，１０１号；第５，８５９，２０５号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，７７７，０８５号；第６，１８０，３７０号；第６，２１０，６７１号；及び６，３２９，５１１号；国際公開第８７／０２６７１号；欧州特許出願第０１７３４９４号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２頁；及びＶｅｒｈｏｙｅｎら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻：１５３４頁）。ヒト化抗体は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９巻：２９３頁にさらに記載されている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１個又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、輸入残基と称されて、輸入残基は、典型的には、輸入可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的にＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従って、齧歯目のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４巻：６５〜９２頁（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年）及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）、Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．、２８巻：４８９〜４９８頁（１９９１年）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．、３１巻（３号）：１６９〜２１７頁（１９９４年）を参照されたい）。したがって、上記のようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的には完全未満のヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、
典型的には、一部のＣＤＲ残基及び可能性として一部のＦＲ残基が齧歯目抗体における類似の部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。例えば、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域をコードする第１配列及び所望の免疫グロブリンの相補性決定領域をコードする第２の配列の組を含むポリヌクレオチドが、合成的に又は適当なｃＤＮＡ及びゲノムのＤＮＡセグメントを組み合わせることにより産生され得る。ヒト定常領域のＤＮＡ配列は、種々のヒト細胞から周知の手順に従って単離することができる。
【００６９】
[0093]「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域若しくはそれらの一部が、変更されて、置き換えられ若しくは交換されて、その結果、抗原結合箇所（可変領域）が、異なった若しくは変更されたクラスの定常領域、エフェクター機能及び／若しくは種、若しくはキメラ抗体に新しい性質を付与する完全に異なった分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長要因、薬、その他に結合した；又は（ｂ）可変領域、若しくはそれらの一部が、異なった若しくは変更された抗原特異性を有する可変領域に変更されたか、置き換えられたか若しくは交換された抗体分子である。本発明の典型的な抗体、及び本発明による使用のための抗体は、ヒト化及び／又はキメラモノクローナル抗体を含む。
【００７０】
[0094]幾つかの実施形態で、該抗体は、「エフェクター」部分とコンジュゲート化している。エフェクター部分は、放射性標識若しくは蛍光性標識などの標識部分を含む任意の数の分子であることができ、又は治療の部分であることもできる。一態様において抗体は、タンパク質の活性を調節する。上記のようなエフェクター部分は、抗腫瘍薬、毒素、放射性作用物質、サイトカイン、第２抗体又は酵素を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
[0095]イムノコンジュゲートは、細胞、例えばＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋単球を標的とするエフェクター部分として使用することができ、イムノコンジュゲートのアッセイは、試験試料及び対照試料をおよそ同様に搭載されたゲルのバンドを見れば容易に明らかにできる。細胞傷害性作用物質の例は、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍａｎａｓ）のエキソトキシン（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、及びグルココルチコイド及び他の化学療法剤、並びに放射性同位体を含むが、これらに限定されない。適当な検出可能なマーカーは、放射性同位体、蛍光性化合物、生物発光性化合物、化学発性光化合物、金属キレート化剤又は酵素を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
[0096]さらに、本明細書で開示された任意の抗体の抗原結合領域を含む本明細書で開示された組換えタンパク質は、炎症を治療するために使用することができる。そのような状況で、組換えタンパク質の抗原結合領域は、少なくとも治療活性を有する薬に接合されている。第２の薬剤は、非ステロイド抗炎症薬を含むことができるが、これらに限定されない。適当な非ステロイド抗炎症薬剤には、アスピリン、セレブキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、ジクロフェナク（Ｖｏｌｔａｒｅｎ）、ジフルニサール（Ｄｏｌｏｂｉｄ）、エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ）、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ）、インドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）、ケトプロフェン（ｏｒｕｄｉｓ）、ケトロラク（Ｔｏｒａｄｏｌ）、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ）、ナプロキセン（Ａｌｅｖｅ、Ｎａｐｒｏｓｙｎ）、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）、ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ）、サルサラート（Ａｍｉｇｅｓｉｃ）、スリンダク（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ）、トルメチン（Ｔｏｌｅｃｔｉｎ）が含まれる。
【００７３】
[0097]治療剤を抗体とのコンジュゲートにする技法は周知である（例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３〜５６頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５年）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＦＯＲ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＩＮ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３〜５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．１９８７年）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁（１９８５年）；及びＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２巻：１１９〜５８頁（１９８２年）を参照されたい））。
【００７４】
[0098]抗体に「特異的に（又は選択的に）結合する」又は「に対して特異的に（又は選択的に）免疫活性」というフレーズは、タンパク質又はペプチドに言及する場合には、しばしば、タンパク質及び他の生物製剤の不均一な集団におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指し示された免疫測定条件下で、特定された抗体は、特定のタンパク質に、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍を超えて結合する。そのような条件下における抗体に対する特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性のために選択された抗体が必要である。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原とは特異的に免疫活性で他のタンパク質とは特異的でないポリクローナル抗体だけを得るように選択され得る。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を引き去ることにより達成することができる。種々の免疫測定のフォーマットは、特定のタンパク質と特異的に免疫活性な抗体を選択するために使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定は、タンパク質と特異的に免疫活性な抗体を選択するために日常的に使用される（特異的免疫活性を決定するために使用できる免疫測定フォーマット及び条件の説明については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９８年）を参照されたい）。
【００７５】
[0099]「ＲＮＡｉ分子」とは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ又は、ＲＮＡｉを誘発して、転写因子に翻訳されるＲＮＡとハイブリダイズすることができる当技術分野において周知の他の核酸である。ＲＮＡｉ分子は、典型的には、細胞中で翻訳される転写因子の量を減少させることができる。
【００７６】
[00100]「リガンド模倣体」とは、構造において又は結合様式において、知られているリガンドを模倣するようにデザインされたか又は転写因子に対する天然若しくは生理学的リガンドの結合を阻害することができる結合剤である。幾つかの実施形態では、リガンド模倣体は、合成化学化合物、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、ペプチドの模倣体、又は改変された天然リガンドである。例えば、リガンド模倣体は、転写因子の天然リガンドが転写因子の生理学的作用中に結合する転写因子上の同じアミノ酸又は同じアミノ酸のサブセットに結合することができる。リガンド模倣体は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸、又は糖類）、脂質、分子量が５百（５００）ダルトン未満、１千（１０００）ダルトン、５千（５０００）ダルトン、１万（１０，０００）ダルトン未満、２万５千（２５，０００）ダルトン未満、５万（５０，０００）ダルトン未満、７万５千（７５，０００）未満、１０万（１００，０００）未満、又は２５万（２５０，０００）ダルトン未満の化学的分子を含む。幾つかの実施形態では、該合成化学化合物は、２５万（２５０，０００）ダルトンを超える。ある実施形態では、結合剤は、５百（５００）ダルトン未満である。幾つかの実施形態では、リガンド模倣体はタンパク質である。
【００７７】
[00101]幾つかの実施形態では、リガンド模倣体は、小化学的分子である。本明細書において使用される用語「小化学的分子」等は、２千（２０００）ダルトン未満の分子量を有する分子を指す。幾つかの実施形態では、小化学的分子は、１千（１０００）ダルトン未満の分子量を有する分子である。他の実施形態では、小化学的分子は、５百（５００）ダルトン未満の分子量を有する分子である。他の実施形態では、小化学的分子は、５百（５００）ダルトン未満の分子量を有する分子である。他の実施形態では、小化学的分子は、百（１００）ダルトン未満の分子量を有する分子である。
【００７８】
[00102]幾つかの実施形態では、転写因子阻害剤は低分子である。他の実施形態では該阻害剤は、転写因子のアロステリック阻害剤である。
【００７９】
[00103]本明細書における幾つかの実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージを調節する方法が提供され、該方法は、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現又は活性を調節することを含む。本明細書における幾つかの実施形態では、対象におけるＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量を調節する方法が提供される。幾つかの実施形態では、対象におけるＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量を増大又は減少させる方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されたアゴニスト又はアンタゴニストを投与することを含む。単球又はマクロファージの量は、本明細書に記載された作用物質（例えば、アゴニスト又はアンタゴニスト）を投与する前に対象に存在した単球又はマクロファージの量に対して、約２倍〜１０，０００倍又はそれを超えて増大又は減少し得る。本明細書のある実施形態では、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節する転写因子の発現又は活性を調節することを含む、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋単球又はマクロファージ細胞の産生、発生、生存、増殖、分化又は活性を、刺激、促進、増大又は誘発する方法が開示される。
【００８０】
[00104]ある実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージを調節する作用物質を同定する方法が提供される。本明細書のある実施形態では、対象におけるＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量を調節する作用物質を同定する方法が開示される。本明細書のある実施形態では、対象におけるＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量を増大又は減少させる作用物質を同定する方法が開示される。作用物質は、抗体、低分子、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、阻害核酸、アロステリック阻害剤又はリガンド模倣体であり得る。ある実施形態では、作用物質は、Ｎｒ４ａ１の活性又は発現のアゴニスト又はアンタゴニストである。ある実施形態では、作用物質は、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４の活性又は発現のアゴニスト又はアンタゴニストである。
【００８１】
[00105]幾つかの実施形態で、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を調節、増大又は減少させる作用物質を同定する方法は、Ｎｒ４ａ１の発現を調節、増大又は減少させる作用物質を同定することを含む。幾つかの実施形態で、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を調節、増大又は減少させる作用物質を同定する方法は、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節する転写因子の活性又は発現を調節、増大又は減少させる作用物質を同定することを含む。幾つかの実施形態で、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を調節、増大又は減少させる作用物質を同定する方法は、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４及び／又はＮｆ−κＢの活性又は発現を調節、増大又は減少させる作用物質を同定することを含む。ある実施形態では、Ｎｒ４ａ１の発現を調節、増大又は減少させる作用物質は、レポーター配列に作動的に連結することができるＮｒ４ａ１の転写の調節領域の活性をモニターすることにより同定することができる。１つの非限定的例において、適当なレポーターと作動的に連結しているＮｒ４ａ１転写調節領域（例えば、エンハンサー＿０１からエンハンサー＿１２の任意の１種又は複数、例えば、図１９を参照されたい）の存在下で、実験作用物質をＫｌｆ２、Ｋｌｆ４及び／又はＮｆ−κＢと接触させることができる。レポーターの発現又は活性は、実験作用物質がレポーター活性を減少させるか又は増大させるかをモニターして決定することができる。幾つかの実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を、調節、増大又は減少させる作用物質を同定する方法は、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４及び／又はＮｆ−κＢの存在下でＮｒ４ａ１発現を調節、増大、又は減少させる作用物質を同定することを含む。
【００８２】
[00106]幾つかの実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を調節、増大又は減少させる作用物質を同定する方法は、実験作用物質とＮｒ４ａ１プロモーター領域とを接触させることを含む。Ｎｒ４ａ１プロモーター領域は、Ｎｒ４ａ１遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に位置する２０塩基対（ｂｐ）から１５００ｂｐの長さの核酸領域であり得る（ＨＧＮＣ：７９８０、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：３１６４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２３３５８）。幾つかの実施形態では、Ｎｒ４ａ１プロモーター領域は、２０ｂｐ〜１０００ｂｐ、２０ｂｐ〜７５０ｂｐ、２０ｂｐ〜５００ｂｐ、２０ｂｐ〜２５０ｂｐ又は２０ｂｐ〜１００ｂｐの長さである。ある実施形態では、Ｎｒ４ａ１プロモーター領域は、約２０〜１５００塩基対の５’のＮｒ４ａ１転写開始箇所、又はその部分配列を含む。ある実施形態では、Ｎｒ４ａ１プロモーター領域は、エンハンサー領域（例えば、エンハンサー＿０１（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿１）、０２（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２）、０３（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿３）、０４（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿４）、０５（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿５）、０６（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿６）、０７（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿７）、０８（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿８）、０９（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿９）、１０（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿１０）、１１（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿１１）、１２（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿１２）、又はそれらの組合せ、例えば、図１９を参照されたい）を含む。ある実施形態では、Ｎｒ４ａ１プロモーター領域は、表１に示した一組のプライマー配列により単離されたエンハンサー領域、又は本明細書に記載の通り単離されたＮｒ４ａ１プロモーター領域を含む（例えば、「エンハンサークローニング」と題する節を参照されたい）。ある実施形態では、Ｎｒ４ａ１プロモーター領域は、本明細書で開示されたエンハンサー箇所Ｅ２（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２）、Ｅ６（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿６）又はＥ９（Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿９）を含むか又はそれらからなる。
【００８３】
[00107]エンハンサー／プロモーターの活性又は転写因子活性を検出するためには、エンハンサー／プロモーター活性を検出する任意の適当な方法を使用することができる。ある実施形態では、Ｎｒ４ａ１プロモーター領域、エンハンサー領域、それらの部分配列又は組合せは、適当なレポーター核酸に作動的に連結されている。レポーター核酸は、転写で直接検出できるか、又は適当なレポーター配列の翻訳で間接的に検出することができる。多くの適当なレポーター核酸及び適当なレポーターポリペプチドが知られており、それらの任意のものが、本明細書における方法のために使用され得る。幾つかの実施形態で、レポーター核酸は、Ｎｒ４ａ１をコードする核酸である。幾つかの実施形態で、レポーター核酸は、ルシフェラーゼをコードする核酸である。レポーター核酸の発現は、レポーター核酸によりコードされるポリペプチド（例えば、レポーターポリペプチド）の量又は活性を測定することにより間接的に決定することができる。
【００８４】
[00108]幾つかの実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を、調節、増大又は減少させる作用物質を同定する方法は、実験作用物質とレポーター核酸と作動的に連結しているＮｒ４ａ１プロモーター領域とを、転写因子の存在下で接触させることを含み、転写因子の例は、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＮｆ−κＢを含むが、これらに限定されない。任意の適当な対照を、本明細書における方法のために使用することができる。ある実施形態では、対照アッセイは、実験作用物質の不在下で実施される実験方法である。実験作用物質の例は、抗体、阻害核酸、低分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アロステリック阻害剤、リガンド模倣体等又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、実験作用物質は、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢポリペプチドに特異的に結合する。ある実施形態では、実験作用物質は、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＮｆ−κＢポリペプチドをコードする核酸に特異的に結合する。
【００８５】
[00109]ある実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を、調節、増大又は減少させる作用物質は、実験作用物質の存在下で産生されるレポーター核酸又はレポーターポリペプチドの発現、量又は活性と、実験作用物質（例えば、対照）の不在下で産生されるレポーター核酸又はレポーターポリペプチドの量又は活性とを比較することにより同定することができる。ある実施形態では、レポーター核酸又はレポーターポリペプチドの量又は活性を実験作用物質の不在下で産生される対照の量に対して増大させる実験作用物質は、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を調節又は増大させる作用物質である。ある実施形態では、実験作用物質の不在下で産生される対照の量に対してレポーター核酸又はレポーターポリペプチドの量又は活性を減少させる実験作用物質は、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球又はマクロファージの量又は活性を調節又は減少させる作用物質である。
【００８６】
[00110]幾つかの実施形態では、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２配列に欠損がある脊椎動物、（例えば、哺乳動物、例えば、齧歯目；例えば、ラット、例えばマウス等）が生ずる。Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２配列に欠損がある脊椎動物は、欠失した、改変された又は破壊されたＮｒ４ａ１ｓｅ＿２Ａ配列についてホモ接合又はヘテロ接合であり得る。Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２配列に欠損がある脊椎動物は、ある実施形態では、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（ＣＤ１１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１−（Ｌｙ６Ｃ−））単球の機能を確認するために使用することができる。確認される単球機能は、古典的又は非古典的な単球機能であり得る。
【００８７】
[00111]実施形態で、免疫障害、炎症性応答、炎症、自己免疫応答、障害又は疾患は、関節リウマチ、未成年期関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、アレルギー喘息、自己免疫甲状腺炎、アトピー性皮膚炎、湿疹様皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、皮膚の狼瘡エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、癩性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー脳脊髄炎、急性壊死性の出血性脳障害、突発性両側性進行性感覚神経的難聴、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活性肝炎、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、突発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴズ病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、橋本甲状腺炎、自己免疫多腺性症候群、インスリン依存性糖尿病、インスリン耐性糖尿病、免疫−媒介不妊症、自己免疫アジソン病、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫脱毛症、白斑、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、悪性貧血、ギラン−バレー症候群、スティッフマン症候群、急性リウマチ熱、交感性眼炎、グッドパスチャー症候群、全身的壊死性血管炎、抗リン脂質症候群又はアレルギー、ベーチェット病、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、リコンビナーゼ活性化遺伝子（ＲＡＧ１／２）欠損、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損、インターロイキン受容体共通γ鎖（γｃ）欠損、ヤヌス−関連キナーゼ３（ＪＡＫ３）欠損及び網膜異形成；プライマリーＴ細胞免疫不全、例えばディ・ジョージ症候群、ヌード症候群、Ｔ細胞受容体欠損、ＭＨＣクラスＩＩ欠損、ＴＡＰ−２欠損（ＭＨＣクラスＩ欠損）など、ＺＡＰ７０チロシンキナーゼ欠損及びプリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）欠損、抗体欠損、Ｘ染色体関連無ガンマグロブリン血症（ブルートンチロシンキナーゼ欠損）、常染色体劣性無ガンマグロブリン血症、ミュー重鎖欠損、代替軽鎖（γ５／１４．１）欠損、超−ＩｇＭ症候群：Ｘ染色体関連（ＣＤ４０リガンド欠損）又は非Ｘ染色体関連、Ｉｇ重鎖遺伝子欠失、ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラスの欠損（ＩｇＡ欠損あり又はなし）、共通可変免疫不全（ＣＶＩＤ）、免疫グロブリンが正常な抗体欠損症；幼児の一過性低ガンマグロブリン血症、インターフェロンγ受容体（ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２）欠損、インターロイキン１２又はインターロイキン１２受容体欠損、胸腺腫による免疫不全、ワイスコット−アルドリッチ症候群（ＷＡＳタンパク質欠損）、運動失調毛細血管拡張症（ＡＴＭ欠損）、Ｘ染色体関連リンパ組織増殖性症候群（ＳＨ２Ｄ１Ａ／ＳＡＰ欠損）、及び超ＩｇＥ症候群である。
【００８８】
[00112]別の態様では、対象における異常な免疫応答、免疫障害、炎症性応答、炎症、自己免疫応答、障害又は疾患、癌又は有害な心臓血管事象又は心臓血管疾患を治療するための、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節する転写因子のアゴニスト又はアンタゴニストを含む医薬組成物が提供される。ある実施形態では、転写因子は、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４である。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４のアゴニスト又はアンタゴニストを含む。
【００８９】
[00113]ある実施形態では、本明細書に記載された医薬組成物は、対象における異常な免疫応答、免疫障害、炎症性応答、炎症、自己免疫応答、障害又は疾患、リンパ組織増殖性の障害、癌又は有害な心臓血管事象又は心臓血管疾患を治療する目的で、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節するために使用される。ある実施形態では、本明細書に記載された医薬組成物は、自己免疫疾患又はリンパ組織増殖性の疾患を治療するために使用される。
【００９０】
[00114]実施形態で、医薬組成物は、疾患を有する個体を、該個体に、Ｎｒ４ａ１（Ｎｕｒ７７）の発現を調節する転写因子の治療的有効量及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を投与することにより治療するためのものである。
【００９１】
[00115]本明細書で開示される組成物は、当技術分野において知られた任意の手段により投与することができる。例えば、組成物は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、脳内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻内に、硝子体に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、筋肉内に、くも膜下腔内に、皮下、結膜下、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内体腔に、眼内に、経口的に、局所的に、吸入により、注射により、点滴により、連続した点滴により、局所灌流により、カテーテルを通して、洗浄により、クリーム中で、又は脂質組成物中で、対象に投与することを含むこともできる。投与は、局所的又は全身的であり得る。
【００９２】
[00116]遊離塩基又は薬学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適当に混合された水中で調製することができる。分散液は、グリセリン、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中及び油中でも調製することができる。貯蔵及び使用の通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有することができる。
【００９３】
[00117]医薬組成物は、鼻腔内に又は吸入できる溶液又はスプレー、エアロゾル又は吸入剤により送達することができる。鼻用の溶液は、液滴又はスプレーで鼻内を通して投与されるようにデザインされた水溶液であり得る。鼻用の溶液は、鼻内分泌物と多くの点で同様であるように調製することができる。したがって、鼻用水溶液は、通常、等張であり、５．５〜６．５のｐＨを維持するように僅かに緩衝されている。それに加えて、眼科の製剤で使用されるものと同様な抗菌性の防腐剤、及び必要であれば、適当な薬安定剤が、剤形に含まれてもよい。種々の市販の鼻内製剤が知られており、例えば、抗生物質及び抗ヒスタミン剤を含むことができる。
【００９４】
[00118]経口剤形は、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような賦形剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性剤形又は散剤の形態をとる。幾つかの実施形態では、経口医薬組成物は、不活性希釈剤又は同化できる可食性担体を含むか、又はそれらが硬質若しくは軟質のシェルのゼラチンカプセル中に封じられていてもよく、又はそれらが錠剤に圧入されていてもよく、又はそれが食事の食品に直接組み込まれていてもよい。経口治療の投与のためには、活性化合物は、賦形剤に組み込まれて、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェファ等の形態で使用されてもよい。組成物及び製剤のパーセンテージは、言うまでもなく、変えられてもよく、ユニットの重量の約２〜約７５％の間、又は典型的には２５〜６０％の間が便利であり得る。そのような組成物中の活性化合物の量は、適当な投薬が得られ得るような量である。
【００９５】
[00119]水溶液中における非経口的投与のためには、例えば、溶液は、適当に緩衝されているべきで、液体希釈剤は、第１に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされる。水溶液、特に、滅菌水性媒体は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与のために特に適当である。例えば、１回の投薬量は１ｍｌの等張のＮａＣｌ溶液中に溶解され得て、１０００ｍｌの大量皮下注射流体に加えられるか又は提案された点滴箇所で注射されるかのいずれかである。
【００９６】
[00120]滅菌注射用溶液は、活性化合物又は構成物を、必要とされる量で適当な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散液は、種々の滅菌された有効成分を基礎分散媒体を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことにより調製される。有効成分に加えて任意の追加の所望の成分の粉末を生ずる真空乾燥及び凍結乾燥技法を、滅菌注射用溶液の復元のための滅菌散剤を調製するために使用することができる。直接注射のためのより又は高度に濃縮された溶液の調製も考慮される。ＤＭＳＯは、極端に急速な浸透のための溶媒、高濃度の有効な作用物質を小さい区域に送達するための溶媒として使用することができる。
【００９７】
[00121]特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通的に理解される同じ意味を有する。これらの本明細書に記載されるものと同様な又は等価の方法及び材料が、本発明の実施又は試験で使用され得るが、適当な方法及び材料は、本明細書に記載されている。
【００９８】
[00122]本明細書で挙げられた全ての特許、特許出願、公開及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引用及びＡＴＣＣの引用は、それらの全体が参照により組み込まれる。不一致の場合には、定義を含めて、本明細書が支配するものとする。
【００９９】
[00123]本明細書で開示される全ての特徴は、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同じ事物、等価の事物、又は同様な目的の役に立つ代替的特徴により置き換えられることもできる。
【０１００】
[00124]本明細書で開示される方法又は組成物の一態様又は実施形態において開示された任意の適当な要素は、任意の他の態様又は実施形態の方法又は組成物に等しく適用可能である。例えば、本明細書で提供される医薬組成物の記載で説明される治療剤は、治療の方法に等しく適用可能であり、逆も成り立つ。
【０１０１】
[00125]本明細書において使用される、単数形「ａ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に他のように指示されていない限り、複数の指示対象も含む。したがって、例えば、「ａｎアゴニスト」、「ａｎアンタゴニスト」への言及は、複数のそのようなアゴニスト及びアンタゴニストを含む。
【０１０２】
[00126]本明細書において使用される、全ての数値又は数の範囲は、そのような範囲内の整数、及び文脈で明確に他のように指示されていない限り、範囲内で使用されている値又は整数の端数を含む。したがって、例示すると、８０％又は８０％を超えることと同等のことへの言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％等、同様に、８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％、その他、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％等々を含む。
【０１０３】
[00127]〜を超える又は〜未満を伴う整数への言及は、言及される数を超える又は未満の任意の数をそれぞれ含む。したがって、例えば、１００未満への言及は、９９、９８、９７等から数字の一（１）までの全ての数を含み、１０未満は、９、８、７等から数字の一（１）までの全ての数を含む。
【０１０４】
[00128]本明細書において使用される全ての数値又は範囲は、文脈で明確に他のように指示されていない限り、使用される範囲内の値の端数及び整数及び使用される範囲内の整数の端数を含む。したがって、例示すると、数の範囲に対する言及は、例えば１〜１０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等々を含む。１〜５０の範囲に対する言及は、それ故、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等々から５０まで及び５０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等々、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５等々を含む。
【０１０５】
[00129]一連の範囲に対する言及は、シリーズ内の異なる範囲の境界の値を組み合わせた範囲を含む。したがって、例示すると、一連の範囲、例えば、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜８５０に対する言及は、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、５０〜７５、５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００、５０〜２５０、１００〜２００、１００〜２５０、１００〜３００、１００〜３５０、１００〜４００、１００〜５００、１５０〜２５０、１５０〜３００、１５０〜３５０、１５０〜４００、１５０〜４５０、１５０〜５００等々の範囲を含む
[00130]本発明は、本明細書で、多くの実施形態及び態様を記載するために、断定的な言葉を使用して一般的に開示される。本発明は、特定の対象事物、例えば、特定の物質若しくは材料、方法のステップ及び条件、プロトコル、又は手順などの全部若しくは一部が排除される実施形態も特に含む。例えば、本発明のある実施形態又は態様では、材料及び／又は方法のステップが排除される。したがって、本発明は、本発明が含まないもの関しては本明細書で一般的に表現されないが、それにも拘わらず、本発明で明白に除外されていない態様は、本明細書で開示される。
【０１０６】
[00131]本発明の多くの実施形態が記載された。それにも拘わらず、当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を種々の使用法及び条件に適合させるために、本発明の種々の変更及び改変を為すことができる。したがって、以下の例は、請求された本発明の範囲を例示するが決して限定することは意図されない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
Ｎｒ４ａ１スーパーエンハンサーのサブドメインを欠失すると、マクロファージの遺伝子機能を保存しながら、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球が除去される。
【０１０８】
まとめ
[00132]単核食細胞は、全組織にわたって存在し、組織の機能及び全身的ホメオスタシスを支持するために、多くの役割を引き受ける不均一なファミリーである。本発明者らの個々のサブセットの役割を詳細に吟味する能力は、特定の単核食細胞のサブ集団内の遺伝子の機能を除去する技法を欠くことにより限定される。Ｎｒ４ａ１依存性のＬｙ６Ｃｌｏｗ単球を使用して、こうした能力の限界に対処する原理証明手法が開示される。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ及び分子的手法を組み合わせて、本発明者らは、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球発生にとって必須の、Ｎｒ４ａ１エンハンサー内の単一の保存されたサブドメインを同定する。このエンハンサーを欠くマウスは、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球を欠くが、定常状態の間、ＬＰＳに対する応答によるマクロファージにおけるＮｒ４ａ１遺伝子発現は保持する。Ｎｒ４ａ１は炎症性遺伝子の発現及びＬｙ６Ｃｌｏｗ単球を調節するので、これらの過程を切り離すことにより、Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球を、交絡影響なしに研究されることが可能になる。
【０１０９】
前置き
[00133]単核食細胞（ＭＰ）は、マクロファージ及び単球（Ｍｏ）で構成されるオントロジー的に多様なファミリーの細胞である（Ｐｅｒｄｉｇｕｅｒｏ及びＧｅｉｓｓｍａｎｎ、２０１６年）。伝統的立場から、ＭＰの主要な機能は、侵入する病原体の認識及び浄化を含み、組織の完全性を維持して炎症を消散させる（Ｓｉｃａ及びＭａｎｔｏｖａｎｉ、２０１２年）。これらの多様な機能を実施するために、ＭＰは、全ての体組織にわたって存在し、とてつもない程の表現型の可塑性を発揮する。近年、転写プロファイリングの試みによってこの不均一性の全貌が明らかになり、機能の研究によって、個々のＭＰサブセットについての多様な、特化された及びしばしば予想外の役割が明らかになった（Ａｍｉｔら、２０１６年）。この関係で、組織マクロファージ及び血中のＭｏは、ホスト組織の最適の性能を可能にする補助的細胞と考えられてもよい（Ｏｋａｂｅ及びＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２０１６年）。免疫及びホスト防衛におけるそれらの役割を補完して、組織ＭＰは、今や、全身的エネルギーバランス（Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＣｈａｗｌａ、２０１１年）、腸蠕動（Ｍｕｌｌｅｒら、２０１４年）及び認知機能（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、２０１３年）を含む高次の生理学的過程の主要な調節因子としても認識されている。健康及び疾患におけるＭＰ機能の全貌を明らかにすることは、免疫学及び生理学の両方における大きく探求されていないフロンティアを描き出すことである。
【０１１０】
[00134]Ｍｏは、ＭＰシステムの血−骨相を構成し、保存されていると考えられる、マウス及びヒトの両方における少なくとも２つのサブセットで構成される（Ｃｒｏｓら、２０１０年）。マウスのＭｏサブセットは、Ｌｙ６Ｃ表面抗原を使用して識別することができ（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎら、２０１０年）、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏは炎症性の前駆細胞、及び一部は組織常駐マクロファージである。Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏは、血管内皮で巡回挙動を示して、内皮層を巡回することにより血管のホメオスタシスに貢献する（Ｃａｒｌｉｎら、２０１３年）。さらに、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏは、肺における腫瘍転移の播種を防ぐ決定的な役割を演ずることが、最近示された（Ｈａｎｎａら、２０１５年）。
【０１１１】
[00135]細胞の挙動を理解するために必要不可欠な手法は、機能の損失によるものである。ＭＰサブセットについての系統決定転写因子（ＬＤＴＦ）の同定は、これらの細胞の機能についての新しい洞察につながった。例えば、転写因子Ｎｒ４ａ１は、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏサブセットの支配的制御因子である（Ｈａｎｎａら、２０１１年）。Ｎｒ４ａ１は、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏで独特に高度に発現して、細胞に固有の様式で必要とされる。したがってＮｒ４ａ１−／−マウスは、腫瘍転移におけるＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの役割を解明する手段になった（Ｈａｎｎａら、２０１５年）。別の例で、転写因子Ｓｐｉｃの損失は、赤色脾髄マクロファージを選択的に除去して、鉄ホメオスタシスにおけるこの集団の役割を明らかにする（Ｋｏｈｙａｍａら、２００９年）。同様に、Ｇａｔａ６のマクロファージ特異的欠失は、腹腔内マクロファージの成熟を損ない、これらの細胞がＢ−１細胞のＩｇＡ産生を調節するという発見を導いた（Ｏｋａｂｅ及びＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２０１４年）。
【０１１２】
[00136]複数の細胞タイプにおける単一の遺伝子の差次的な作用により例証される多面発現性は、細胞特異的遺伝子の機能を理解することにとって主要な障害である。この問題を克服するために、Ｃｒｅリコンビナーゼ−ｌｏｘＰ（Ｃｒｅ−Ｌｏｘ）システムが、Ｃｒｅ酵素の発現を細胞特異的プロモーターで制御することにより、ｌｏｘＰに隣接したエクソンを含有する遺伝子を除去するために常套的に使用される。遺伝子発現を細胞特異的様式で削除するＣｒｅ−Ｌｏｘシステムの能力は、Ｃｒｅ導入遺伝子の細胞特異性と組換えが起こるためにとられる時間とによって制限される（Ｙｏｎａら、２０１２年）。上記のことを考慮すると、密接に関係する細胞の集団内の遺伝子の機能を研究するためにＣｒｅ−Ｌｏｘシステムを使用するときに、問題が提出される。この問題の最良の例はＮｒ４ａ１である。Ｎｒ４ａ１−／−マウスはＬｙ６ＣｌｏｗＭｏを欠き、マクロファージのＮｒ４ａ１もＬＰＳにより誘発されて炎症性遺伝子の発現を抑制する（Ｈａｎｎａら、２０１２年）。交絡影響は、Ｎｒ４ａ１−／−のＬｙ６ＣｌｏｗＭｏに対する研究の有用性を限定する。さらに、現用のＭＰＣｒｅ導入遺伝子（Ｌｙｓ２−Ｃｒｅ、Ｃｓｆ１ｒ−Ｃｒｅ、Ｃｘ３ｃｒ１−Ｃｒｅ）は、ＭＰサブセット全体にわたってＮｒ４ａ１も破壊することなく、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏＮｒ４ａ１を欠失させることはできない。現用の骨髄腫Ｃｒｅ導入遺伝子のこれらの全骨髄腫効果は、多様なＭＰ区画内の遺伝子の及び細胞タイプの機能を決定する条件付きの欠失手法の能力を制限する。
【０１１３】
[00137]エンハンサーは、遺伝子発現の不可欠な決定要因であり（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、２０１４年）、高レベルのヒストンＨ３リシン４モノメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）及びジメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ２）（Ｈｅｉｎｔｚｍａｎら、２００７年；Ｈｅｉｎｚら、２０１０年）を根拠にして、クロマチン免疫沈降配列決定（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）により同定される。ＭＰのエンハンサーは、エンハンサー選択を指示するＬＤＴＦＰＵ．１及びＣ／ＥＢＰβのために富化される（Ｈｅｉｎｚら、２０１０年）。エンハンサーは、追加の調節を受けており、これにより、「身構えている（ｐｏｉｓｅｄ）」か又は「活性な」エンハンサーとしてさらに分類される。エンハンサーは、シグナル依存性の転写因子（ＳＤＴＦ）か結合すると活性化されて、Ｈ３リシン２７におけるアセチル化（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）、及び関連する遺伝子の増大した発現を生じさせる（Ｃｒｅｙｇｈｔｏｎら、２０１０年；Ｈｅｉｎｚら、２０１３年）。ＭＰサブセット間のエンハンサーのランドスケープはかなりの多様性を示し（Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、２０１４年；Ｌａｖｉｎら、２０１４年）、これらのランドスケープはＭＰの集団が曝される無数の環境の活動範囲から生ずる。Ｎｒ４ａ１は、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏで独特の発現特性を示すので、本発明者らは、細胞特異的エンハンサーで作用するＳＤＴＦがＬｙ６ＣｌｏｗＭｏＬＤＴＦＮｒ４ａ１の転写を調節するという仮説を立てている。
【０１１４】
[00138]そこで、本発明者らは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏにおけるＮｒ４ａ１エンハンサーの遺伝子座位をマッピングすることにより上記の仮説を探求する。本発明者らは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ発生のために必須のＮｒ４ａ１転写開始箇所の４ｋｂ上流の単一のサブドメインを同定する。この要素を精密に吟味すれば、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ発生を推進する転写過程への洞察が提供される。さらに、このエンハンサーを欠くマウスを使用して、本発明者らは、マクロファージＮｒ４ａ１の遺伝子発現が、炎症性シグナル伝達に対する応答及び定常状態中であるという両方に影響されないことを示す。
【０１１５】
結果
Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏは、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏにとってオントロジー的に隣りあう細胞である。
[00139]系統の出所の解明及びＢｒｄＵパルス追跡の研究により、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏがＬｙ６ＣｌｏｗＭｏを生じさせるという統一見解が確立された（Ｙｏｎａら、２０１２年）。それでも、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏがＬｙ６Ｃｈｉ集団と独立に生ずる可能性は残る。Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を発現するＭｏ樹状細胞の前駆体（ＭＤＰ）、Ｃｘ３ｃｒ１及びキット（ＣＤ１１７）は、全てのマウスのＭｏを生じさせる（Ｈｅｔｔｉｎｇｅｒら、２０１３年）。ＭＤＰが共通のＭｏの前駆細胞（ｃＭｏＰ）に分化すると、ＭＤＰはＭｏ系統に向かうことにさらなる制限を受け、その時点でＦＬＴ３の発現は失われて、Ｌｙ６Ｃの発現が生ずる（Ｈｅｔｔｉｎｇｅｒら、２０１３年）。
【０１１６】
[00140]本発明者らは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏがＬｙ６Ｃｈｉ集団と独立に生ずるならば、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏとＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの前駆細胞とに共通であるが、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏには共通でないシグネチャーが観察されるはずであると、本発明者らは推論した。この仮説を試験するために、本発明者らは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２を使用して、ＭＤＰ、ｃＭｏＰ、Ｌｙ６Ｃｈｉ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏに対するＣｈＩＰ−Ｓｅｑを実施して（図９のａ）、エンハンサー、及びＨ３Ｋ２７ａｃによる活性を明確にした。データの品質を評価するために、本発明者らは、プロファイリングされた細胞タイプについて始原型マーカー遺伝子と関連する座を視覚的に検査した（図９のｂ）。予期されたように、ＭＤＰは、Ｆｌｔ３遺伝子座位でＨ３Ｋ２７ａｃの富化を示したが、それに対して、上記の集団を選別するために使用されたＭＤＰ及びｃＭｏＰは両方共、キット遺伝子座位にＨ３Ｋ２７ａｃを示した。Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏとは対照的に、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏ及びｃＭｏＰは、Ｌｙ６Ｃ表面抗原をコードするＬｙ６Ｃ２遺伝子座位でエンハンサー活性を示す。驚くべきことにＭＤＰも、低いｍＲＮＡ及び細胞表面タンパク質レベルにも拘わらず、Ｌｙ６Ｃ２遺伝子座位における活性を示したが、この活性は、おそらく転写前のこの遺伝子座位のプライミングを示す（図９のａ、ｂ）。最終的に、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏにおいてＣｘ３ｃｒ１は顕著なＨ３Ｋ２７ａｃを示して、この集団における確固としたＣｘ３ｃｒ１発現を反映する（Ｃａｒｌｉｎら、２０１３年）。
【０１１７】
[00141]Ｍｏ発生中におけるエンハンサーの動向の全体的概要を知るために、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２及びＨ３Ｋ２７ａｃを、最も近い転写開始箇所から２．５ｋｂを超えるＨ３Ｋ４ｍｅ２富化領域として規定された全ての９９，４６２種のエンハンサーで定量した。次に、ヒストンのマークの差次的な富化（ＤＥ）を全ての対にした比較の間で計算して、合計６２０のＤＥ  Ｈ３Ｋ４ｍｅ２領域（合計の０．６２％、図１６の（ａ））及び９，８７９のＨ３Ｋ２７ａｃ領域（合計の９．９３％、図１６の（ｂ））を同定した。ＤＥエンハンサーの無バイアスの階層的クラスタリング（図１（ｃ）、図１６の（ｃ））は、Ｈ３Ｋ２７ａｃにおける有意の変化がＨ３Ｋ４ｍｅ２におけるそれより微妙な変位により反映されていることを示した。これらの明確化されたクラスター内の新たなモチーフ分析により、Ｍｏ分化を推進する転写の過程が同定される（図１６の（ｄ））。全てのエンハンサークラスターでは、ＥＴＳ（ＰＵ．１）モチーフが富化された。前駆細胞に関連するエンハンサーが示したＭｙｂモチーフの過剰に存在は限定的で、これはＬｙ６ＣｈｉＭｏ分化が生じたときに、ＣＥＢＰ、及びＫＬＦモチーフの取得と同時に失われた。全体的アセチル化レベルで、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏエンハンサーは、過表示されたＮＲ４Ａ及びＭｅｆ２ａモチーフにより独特にキャラクタライズされた。本発明者らが、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏといいずれかの前駆細胞との間で共有されるが、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏとの間では共有されないエンハンサー又はモチーフの使用のシグネチャーを観察せず、そのようなパターンはトランスクリプトームのレベルでも現れなかった（図１７）ことは重要である。その代わり、差次的なエンハンサーの使用のパターンは、ＭＤＰとＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの間の連続した転移と一致して、ｃＭｏＰ及びＬｙ６ＣｈｉＭｏは両方共このカスケードにおける中間段階として分類される（ｆａｌｌｉｎｇ）。まとめると、これらのデータは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏがＬｙ６ＣｈｉＭｏ集団から直接派生するＭｏ発生の統一見解モデルを強く支持する。
【０１１８】
Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏは、細胞特異的スーパーエンハンサーをＮｒ４ａ１遺伝子座位に有する。
[00142]スーパーエンハンサー（ＳＥ）は、系統の明細及び機能に関与する遺伝子を選択的にマーク（ｍａｒｋ）する、最近定義された高度に細胞型に特異的なエンハンサーのクラスである（Ｗｈｙｔｅら、２０１３年）。ＳＥの特徴を定義することは、それらの伸びたサイズ、ＬＤＴＦによる装飾及びゲノムの高い遺伝子発現との相関を含む（Ｈｎｉｓｚら、２０１３年）。Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏはＮｒ４ａ１を高度に発現し、Ｎｒ４ａ１の発生のためにＮｒ４ａ１を必要とするので（Ｈａｎｎａら、２０１１年）、本発明者らは、Ｎｒ４ａ１はＳＥで調節される遺伝子であると仮定した。本発明者らは、Ｈ３Ｋ２７ａｃのレベルを使用して、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ中のＳＥの境界を画定し、Ｎｒ４ａ１は実際にＳＥと重なることを確認した（Ｎｒ４ａ１ｓｅ；図１０の（ａ）及び図１７）。Ｎｒ４ａ１ｓｅのＳＥ特性を検証して、本発明者らは、高密度のＭＰ  ＬＤＴＦ  ＰＵ．１及びＣＥＢＰβも観察した（図１８）。ＭＤＰ、ｃＭｏＰ、Ｌｙ６Ｃｈｉ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ中のＮｒ４ａ１ｓｅにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ２及びＨ３Ｋ２７ａｃタグのカウントを数え上げると、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ中におけるＨ３Ｋ２７ａｃの選択的及び頑健な（５倍）取得が示されて、Ｎｒ４ａ１ｓｅは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏに特異的なＳＥ領域であることが示される（図１０のｂ、ｃ）。
【０１１９】
[00143]ＳＥの形成は、発生及び環境の刺激（ｃｕｅ）の合流を意味する（Ｈｎｉｓｚら、２０１５年）。本発明者らは多様なＭＰファミリーの表現型の不均一性を利用して、定常状態のＮｒ４ａ１の発現が異なる機構によって調節され得るかどうかに注意を向けた。第１に、本発明者らは、Ｌａｖｉｎら（２０１４年）から得たＭＰ集団及び本発明者ら自身のＭｏサブセットのデータにおけるＮｒ４ａ１発現を評価した。本発明者らは、３桁の大きさにわたるＮｒ４ａ１の定常状態のレベルを観察している（図１０のｄ）。両方のデータセット（Ｌｙ６Ｃｈｉ及びＭｏｎｏ）からのＬｙ６ＣｈｉＭｏにおけるＮｒ４ａ１発現が一致して、データセットの間の比較を容易にすることは重要である。以前の観察と一致して、本発明者らも、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏにおいて断然最高のＮｒ４ａ１発現を観察している（Ｈａｎｎａら、２０１１年）。
【０１２０】
[00144]次に、本発明者らは、Ｎｒ４ａ１のｍＲＮＡ発現の範囲が、Ｎｒ４ａ１ｓｅにおける固定されたエンハンサーのシグネチャーの連続した取得と関連するかどうか、又はＬｙ６ＣｌｏｗＭｏが独特のＨ３Ｋ２７ａｃプロファイルを有するかどうかを探求した。本発明者らは、ＭＰ集団が対応する組織におけるＮｒ４ａ１ｓｅにおけるＨ３Ｋ２７ａｃを、図１０のｄに可視化した（図１０のｅ）。本発明者らは、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏ集団間の比較可能なＨ３Ｋ２７ａｃタグの分布を観察して、データセットの間の定性的比較を容易にした。各集団は、観察されたヒストンアセチル化の絶対レベル及びＮｒ４ａ１ｓｅにおけるヒストンアセチル化の「指紋」の両方で様々な程度で異なることが見出された（図１０の（ｅ））。Ｎｒ４ａ１ｓｅにおける最も強力なＨ３Ｋ２７ａｃシグネチャーが、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ中で観察されたことは（図１０の（ｄ）及び（ｅ））注目すべきである。まとめると、これらの発見は、性質の異なる機構がＭＰ集団間の定常状態Ｎｒ４ａ１発現を調節し得ることを暗示している。
【０１２１】
Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２はＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ発生のために必須の保存されたＳＥサブドメインである。
[00145]本発明者らは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏにおいてＮｒ４ａ１の遺伝子発現を調節するＮｒ４ａ１ｓｅの領域を同定するために探求した。Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏにおけるＰＵ．１及びＣ／ＥＢＰβの結合に基づいて（図１９の（ａ））、本発明者らは、１２種の候補配列をルシフェラーゼレポーターを含有する最小Ｎｒ４ａ１プロモーター中にクローニングした（図１９の（ｂ）。Ｅ２、Ｅ６、Ｅ８及びＥ９は、控えめであるが一致したルシフェラーゼ活性を、骨髄腫ＲＡＷ２６４．７細胞株で誘発して、上記領域がＬｙ６ＣｌｏｗＭｏにおいてＮｒ４ａ１を調節している可能性があることを示した（図１１のａ）。ヒトＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６ｈｉＭｏはマウスＬｙ６ＣｌｏｗＭｏと相同性であることが示唆された。この見解は、全体的遺伝子発現プロファイリング及びＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６ｈｉＭｏの特徴的な巡回挙動の観察に基づく（Ｃｒｏｓら、２０１０年）。本発明者らは、ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６ｈｉ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏは、真にオルソロガスであれば、Ｎｒ４ａ１は、保存された機構により調節されるべきであると推論した。この仮説を試験するために、本発明者らは、公的に入手できるデータセットを使用して、マウスＥ２、Ｅ６、Ｅ８及びＥ９にオルソロガスなヒトＭｏにおけるヒトＤＮＡ配列の遺伝子調節の状態を評価した（Ｂｏｙｌｅら、２００８年；Ｓｃｈｍｉｄｌら、２０１４年）。ヒトＭｏのＤＮａｓｅ−Ｓｅｑは、マウスのＥ２、Ｅ６及びＥ９にオルソロガスな領域にオープンクロマチンを明確に示すが（図１１のｂ）、しかしながら、ＢＬＡＴを使用して、Ｅ８に対するオルソログは同定されなかった。ヒトＥ２、Ｅ６及びＥ９はＨ３Ｋ２７ａｃも有して、Ｈ３Ｋ２７ａｃのレベルは、Ｅ２及びＥ６で、ＣＤ１４ｈｉＣＤ１６ｎｅｇＭｏよりもＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６ｈｉＭｏにおいて高く、マウスＭｏサブセットの間で観察されたパターンと一致した（図１１のｂ）。このことは、Ｅ２、Ｅ６及びＥ９が種間で機能的に保存されたエンハンサー構成要素である証拠を提供して、これらの領域がＭＰＮｒ４ａ１遺伝子の発現の重要な調節因子であるという見解を支持する。
【０１２２】
[00146]Ｅ２、Ｅ６及びＥ９のインビボにおける機能を試験するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを使用して、エンハンサー配列の欠失を各々含有する３種のマウス株を生じさせ、それぞれ、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿６−／−及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿９−／−マウスを得た（図１１のｃ、図１９の（ｃ））。末梢ＭｏのＦＡＣＳ分析により、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−ではＭｏ頻度における低下、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿９−／−では差なし、及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿６−／−マウスでは控えめな増加が明らかになった（図１１のｄ）。ＷＴ様Ｍｏサブセットの比がＮｒ４ａ１ｓｅ＿６−／−及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿９−／−マウスの両方で保存されていたが、しかしながら、Ｎｒ４ａ１−／−株を表現型模写するＬｙ６ＣｌｏｗＭｏにおける著しい欠損が、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウスで存在した（図１１のｅ、ｆ）（Ｈａｎｎａら、２０１１年）。それ故、保存されたスーパーエンハンサーのサブドメインＮｒ４ａ１ｓｅ＿２はＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ発生のために必要不可欠である。
【０１２３】
Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２欠失は、炎症に関連するＮｒ４ａ１遺伝子発現をＬｙ６ＣｌｏｗＭｏに関連するＮｒ４ａ１発現から切り離す。
[00147]ＭＰＮｒ４ａ１を研究するための現用の遺伝的モデルは、全体的Ｎｒ４ａ１−／−マウス又は骨髄腫特異的な、Ｃｓｆ１ｒ、Ｌｙｓ２（ＬｙｓＭ）及びＣｘ３ｃｒ１を含むが、これらに限定されないＣｒｅ導入遺伝子を使用するＣｒｅリコンビナーゼにより媒介されるＮｒ４ａ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ対立遺伝子の欠失に基づく。これらのツールは、ＭＰＮｒ４ａ１を除去するが、上記のツールは個体のＭＰサブセットに関して非特異的である（Ｃｈｏｗら、２０１１；Ｙｏｎａら、２０１２年）。その結果として、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏを欠くモデルにおいて、Ｎｒ４ａ１も、マクロファージ中で破壊されている（図１２のａ）。Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏはＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウスに存在せず、Ｎｒ４ａ１がマクロファージ炎症性遺伝子発現の決め手のサプレッサーであるので、本発明者らは、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マクロファージが炎症性刺激に対して野性型様応答を有するかどうかを探求した。
【０１２４】
[00148]エンドトキシンショック中にマクロファージにより媒介される炎症性サイトカインの産生は、最終的に突然器官不全及び死亡を生じる（Ｊａｃｏｂら、２００７年）。Ｎｒ４ａ１−／−マウスは、ＬＰＳに誘発された器官不全に対してより感受性であるので（Ｌｉら、２０１５年）、本発明者らは、この背景におけるＮｒ４ａ１ｓｅ＿２の役割を試験することを決定した。本発明者らは、単一の高用量のＬＰＳ（２．５ｍｇ／ｋｇ）をＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−、Ｎｒ４ａ１−／−、及びＷＴマウスにＩＰ注射により投与した。３群の全てが、最初の７２時間以内に毛皮の乱れ及び震えを示したが、しかしながら、それらの症状が７２〜１２０時間の時間枠内に治まったＷＴ及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−群の両方より著しく高い死亡率を、Ｎｒ４ａ１−／−マウスが示した（図１２のｂ）。Ｎｒ４ａ１遺伝子の発現調節におけるＮｒ４ａ１ｓｅ＿２の役割を理解するために、本発明者らは、チオグリコレートに誘発されたマクロファージにおけるＬＰＳによる刺激に対するＮｒ４ａ１の応答を測定した。ＷＴ、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２＋／−及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マクロファージは全て、１時間でＮｒ４ａ１ｍＲＮＡの完全にキャラクタライズされるピークを示し、ピークはその後３時間までにベースラインに戻る（図１２のｃ、Ｐｅｉら、２００５年）。ウェスタンブロット分析も、刺激後１時間でＷＴ及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マクロファージにおけるタンパク質誘発を確認した（図１２のｄ）。さらに、用量に応答する情況で（図１２のｅ）、本発明者らは、ＷＴ、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２＋／−及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マクロファージの間にＮｒ４ａ１ｍＲＮＡレベルの差がないことを観察した。最終的に、ＬＰＳ投与後、本発明者らは、野性タイプの対照とほぼ同じレベルを発現するＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウスと比較してＮｒ４ａ１−／−マウスで高いレベルのＩｌ１２、Ｉｌ１ｂ及びＮｏｓ２ｍＲＮＡ及びｉＮＯＳ活性を検出した（図１２の（ｆ）及び図１２の（ｇ））。これらの研究により、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２領域が、ＴＬＲ４刺激に応答してＮｒ４ａ１発現を調節することはないことが確認される。
【０１２５】
差次的ＰＵ．１結合が、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ遺伝子発現の調節因子の候補を明らかにする。
[00149]本発明者らは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏにおけるＮｒ４ａ１発現を調節する分子の機構を決定することを探求した。ＰＵ．１と二次共同因子の間の協調的相互作用は、マクロファージのエンハンサーレパートリーを確立して維持する（Ｈｅｉｎｚら、２０１０年、２０１３年）。さらに、組織の微小環境内で誘発されるＳＤＴＦ活性における差が、インビボで観察されるＭＰエンハンサーの多様な範囲の原因である（Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、２０１４年；Ｌａｖｉｎら、２０１４年）。エンハンサー取得のための１つの機構は、新たなＨ３Ｋ４ｍｅ２及びＰＵ．１結合と関連する潜在的エンハンサーの形成を推進するＳＤＴＦを含む（Ｋａｉｋｋｏｎｅｎら、２０１３年；Ｏｓｔｕｎｉら、２０１３年）。したがって、新たなＰＵ．１結合事象のサブセットは、モチーフ富化による二次ＳＤＴＦ同等性に関する価値ある情報を提供する（Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、２０１４年）。
【０１２６】
[00150]Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏと関連するモチーフを明確にするために、本発明者らは、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏにおけるＰＵ．１結合プロファイルを決定して、合計６５，０７０個のＰＵ．１ピークを同定した。差次的結合に対する厳格な基準により、潜在的エンハンサーレパートリーの顕著な特徴を有する３４５本のＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ特異的ＰＵ．１ピークの同定が導かれた（図１３のａ）。これらは、ＰＵ．１ピークの直ぐ周りの領域で増大したＨ３Ｋ４ｍｅ２及びヌクレオソームの段階分け（ｐｈａｓｉｎｇ）（図２０ａ）；上流の前駆細胞と比較して上昇したＨ３Ｋ２７ａｃ（図１３のｂ）；及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ中における近接したｍＲＮＡ転写物の増大した発現（図１３のｃ）を含む。したがって、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏのＰＵ．１に特異的なピークのプロファイルは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏの遺伝子発現プログラムを調節するエンハンサーと関連する。Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ遺伝子発現に関係するモチーフを、このＰＵ．１ピークのセットにおける新たなモチーフ富化分析を使用して同定した。本発明者らの初期の分析との強い一致で（図１６の（ｃ））、本発明者らは、予期されたＥＴＳ、Ｃ／ＥＢＰ及びＮＲ４Ａモチーフ（図１３のｄ）を、ＩＲＦ、ＫＬＦ、ＲＵＮＸ及びＭＥＦ２モチーフと共に再確認した。本発明者らは、本発明者らのＲＮＡ−Ｓｅｑデータセットを使用し、最も存在量が高いものを本発明者らの主な候補として考えて、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏで発現しこれらのモチーフに結合することができる転写因子を同定した（図１３の（ｅ））。この手法で、Ｃｅｂｐｂ、Ｉｒｆ５、Ｋｌｆ２、Ｍｅｆ２ａ、Ｎｒ４ａ１、Ｓｆｐｉ１（ＰＵ．１）及びＲｕｎｘ２を、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ遺伝子発現の主たる調節因子と定義した。
【０１２７】
Ｋｌｆ２は、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２を通じてＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの変換を調節する。
[00151]Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２を通じてＮｒ４ａ１発現を調節する転写因子を同定するために、本発明者らは、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２レポーターを有する各候補を過発現させた。Ｃｅｂｐｂ、Ｉｒｆ５、Ｋｌｆ２、Ｍｅｆ２ａ、Ｎｒ４ａ１及びＲｕｎｘ２を、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ中に、Ｎｒ４ａ１−ＴＳＳ又はＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−ＴＳＳのどちらかのルシフェラーゼレポータープラスミドと一緒に共トランスフェクトした。ｃＤＮＡのプロモーター依存性効果及びＥ２配列の固有の活性を説明するために、誘発されたルシフェラーゼ活性のＮｒ４ａ１−Ｅ２−ＴＳＳとＮｒ４ａ１−ＴＳＳの間における比の差を意味するエンハンサー指数を計算した。本発明者らは、Ｋｌｆ２だけがＥ２依存性のルシフェラーゼ発現を推進することを見出した（図１４のａ）。この発見を支えに、Ｅ２領域内で富化されたＩＲＦ、ＫＬＦ、ＲＵＮＸ及びＭＥＦ２モチーフについてモチーフを捜索して、３個のＫＬＦモチーフのクラスターを同定したが、他のモチーフクラスの如何なる事例も見出せなかった（図２０ｂ）。
【０１２８】
[00152]本発明者らは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏの発生におけるＫＬＦ因子の役割を調べることを選択した。ＫＬＦは、Ｋｌｆ２及びＫｌｆ４が最も豊富なＬｙ６ＣｌｏｗＭｏで広く発現する（図１３のｅ）。Ｋｌｆ２−／−及びＫｌｆ４−／−マウスの周産期の及び胚の致死性に基づいて、本発明者らは、骨髄腫特異的Ｌｙｚ２−ＣｒｅＫｌｆ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ及びＬｙｚ２−ＣｒｅＫｌｆ４ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおけるＭｏ頻度を推定した（それぞれ、Ｍａｃ−Ｋｌｆ２及びＭａｃ−Ｋｌｆ４と表示した。Ｌｉａｏら、２０１１年；Ｍａｈａｂｅｌｅｓｈｗａｒら、２０１１年）。Ｍａｃ−Ｋｌｆ４の血液のフローサイトメトリー分析において、Ｍｏは両方集団で減少を示し（図１４のｂ）、以前の報告（Ａｌｄｅｒら、２００８年）と一致した。Ｍａｃ−Ｋｌｆ２マウスでは、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏは影響されなかったが、しかしながら、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏはある程度低下した（図１４のｂ）。同様な結果は、Ｍａｃ−Ｋｌｆ２及びＭａｃ−Ｋｌｆ４マウスの骨髄でも、Ｋｌｆ２及びＫｌｆ４を標的とするｓｈＲＮＡをレトロウイルスで形質導入されたキメラマウスの骨髄でも観察された（図２１の（ａ）及び（ｂ））。
【０１２９】
[00153]本発明者らは、Ｌｙｓ２−Ｃｒｅシステムを使用して、血中Ｍｏ中のｌｏｘＰに隣接した遺伝子の不完全な欠失を以前に観察している（Ｈａｎｎａら、２０１５年）。それ故、Ｍａｃ−Ｋｌｆ２マウスとＭａｃ−Ｋｌｆ４マウスとの間のＭｏ頻度における差は、各遺伝子のＭｏ発生を調節する能力自体の差を反映するか、又は単に各サブセットにおける各ＴＦの存在量の差を反映するかのいずれかであり得る。これを明らかにするために、本発明者らは、ｌｏｘＰに隣接したエクソンに広がるプライマーを使用してＭａｃ−Ｋｌｆ２マウス及びＭａｃ−Ｋｌｆ４マウスから選別されたＬｙ６ＣｈｉＭｏ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ中におけるＫｌｆ２及びＫｌｆ４のｍＲＮＡを測定して、組換えの有効度を決定した。Ｍａｃ−Ｋｌｆ２マウスでは、Ｋｌｆ２ｍＲＮＡの７２％及び９１％損失が、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏについてそれぞれ観察された（図２１の（ｃ））。したがって、Ｍａｃ−Ｋｌｆ２マウス中におけるＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの選択的損失は、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏにおけるＫｌｆ２の不完全な欠失と一致しない。Ｌｙ６ＣｈｉＭｏのＬｙ６ＣｌｏｗＭｏへの変換におけるＫｌｆ２の役割も、サブセット間の移行におけるＫｌｆ２遺伝子発現の誘発と一致する（図１３のｅ）。Ｍａｃ−Ｋｌｆ４マウスにおいて、Ｋｌｆ４ｍＲＮＡは、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏでそれぞれ６３％及び６９％だけ低下した（図２１の（ｄ））。Ｍａｃ−Ｋｌｆ４マウスは、より少ないＬｙ６ＣｌｏｗＭｏを有するが、このことが、より少ない前駆体Ｌｙ６ＣｈｉＭｏから生ずるのか、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏのＬｙ６ＣｌｏｗＭｏへの変換における減少から生ずるのか、又は両方であるのかは明らかでない。本発明者らは、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ４がＬｙ６ＣｈｉＭｏのＬｙ６ＣｌｏｗＭｏへの変換をＮｒ４ａ１を通じて調節するのであれば、Ｋｌｆ２／４遺伝子の発現でＭｏのＮｒ４ａ１発現が予測されるであろうと推論した。実際、Ｎｒ４ａ１ｍＲＮＡの発現レベルは、Ｍａｃ−Ｋｌｆ２マウスから誘導されたＬｙ６ＣｈｉＭｏの方でより低かったが、Ｍａｃ−Ｋｌｆ４マウスからでは低くなかった（図１４のｃ）。それに続く調査により、両方のＭｏサブセットにおけるＫｌｆ２及びＮｒ４ａ１転写物レベルの間の有意の正の相関が明らかになった。しかしながら、Ｋｌｆ４及びＮｒ４ａ１の遺伝子発現の間でそのような関係は見出されなかった（図１４の（ｄ）及び（ｅ）並びに図２１の（ｅ）及び（ｆ））。
【０１３０】
[00154]予備的な性質のものではあるが、これらの相関の発見は、Ｋｌｆ２がＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ発生を、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２を通じて調節することを示唆する。（図１１のｂ）の間のＮｒ４ａ１遺伝子発現の保存された機構に対する本発明者らの証拠が与えられて、本発明者らは、ＫＬＦ２発現はヒトＭｏサブセットにおける同様なパターンにならうと予測する。ヒトＭｏサブセットにおけるＫＬＦ２についてのマイクロアレイデータの調査によりこの仮説は立証され、ヒトのＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６ｈｉＭｏにおいて著しくより高いＫＬＦ２レベルが示された（図１４のｆ）。
【０１３１】
Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２はＭｏ特異的エンハンサーである。
[00155]Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２は、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏにおけるＮｒ４ａ１発現を調節するが、ＬＰＳによる刺激に対する応答では調節しない。さらに、定常状態で、マクロファージＮｒ４ａ１発現は、３桁の大きさにわたる。Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２がＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ特異的である程度を決定するために、本発明者らは、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウスからの種々のＭＰ集団におけるＮｒ４ａ１のレベルを測定した。血中Ｍｏ、Ｆ４／８０ｈｉ大、Ｆ４／８０ｉｎｔ小の腹腔内マクロファージ（それぞれ、ＬＰＭ及びＳＰＭ）、ＣＤ１１ｃ＋肺胞マクロファージ、及びＦ４／８０＋赤色脾髄マクロファージを選択した（図１５のａ）。以前の観察（Ｔａｃｋｅら、２０１５年）と一致して、マクロファージ頻度は、中程度に少ないＦ４／８０ｈｉＬＰＭを除いて、Ｎｒ４ａ１−／−マウスでは大きく変わることはなかった（図２２（ａ））。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、マクロファージ集団間におけるＮｒ４ａ１レベルの予想された範囲をとらえた（図１５のｂ）。しかしながら、Ｎｒ４ａ１のｍＲＮＡ発現における差は、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−脾臓マクロファージにおける中程度に低いレベルを除いて、組織マクロファージ間で検出されなかったことが目立った。このことと対照的に、定常状態のＮｒ４ａ１ｍＲＮＡの発現レベルにおけるこの実質的低下は、Ｌｙ６Ｃｈｉ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの両方で観察され（図１５のｃ）、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２がＭｏ特異的エンハンサーであることを示した。
【０１３２】
[00156]本発明者らは、最近、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏが癌の肺への転移を防止することを報告した（Ｈａｎｎａら、２０１５年）。Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏを研究するためのＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−モデルの有用性を示すために、本発明者らは、十分確立された転移モデルを使用して、マウスにおける腫瘍負荷を評価した。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を、ＷＴ、Ｎｒ４ａ１−／−及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウスの静脈内に注射した。投与後１８日でマウスを犠牲死させて、腫瘍負荷を組織学的に測定した。Ｎｒ４ａ１−／−及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウスは両方共Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏの減少（図２２（ｂ））、及びＷＴよりも顕著に高い腫瘍負荷（図１５のｄ、ｅ）を示した。しかしながら、Ｎｒ４ａ１−／−とＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウスの間で差は観察されなかった。転移を制御することにおけるＬｙ６ＣｌｏｗＭｏのための重要な役割と一致して、この差は腫瘍サイズよりもむしろ腫瘍領域が少ないことにより説明される（図２２（ｃ）及び（ｄ））。それ故、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−モデルは、Ｎｒ４ａ１依存性の炎症性発現形をＬｙ６ＣｌｏｗＭｏ機能から効果的に切り離して、これらの細胞の機能を研究するための新しい及び改善されたツールを提供する。Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステムを使用する条件付きの欠失戦略と対照的に、エンハンサーを目標にすることは前例のない程の特異性を与えて、疾患における個々のＭＰサブセットの原因の推定を可能にする。
【０１３３】
考察
単一のスーパーエンハンサーのサブドメインがＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの発生を調節する。
[00157]Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ発生の転写を調節する経路を本発明者らが調査中に、本発明者らは、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２を、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ発生のために絶対的に必要とされる単一のドメインと同定した。本発明者らは、別個の、細胞サブセットに特異的なＨ３Ｋ２７ａｃのパターンも、Ｎｒ４ａ１ｓｅ遺伝子座位で観察したので、Ｎｒ４ａ１遺伝子発現がＭＰサブセット間で別個の機構により制御されるのかどうかを調べることとなった。Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−マウスはＬｙ６ＣｌｏｗＭｏを欠くが、それでもマクロファージＮｒ４ａ１の発現は、定常状態の間及び炎症中に大きく影響されることがない。このことは、Ｎｒ４ａ１遺伝子座位のためのモジュラー構造が領域Ｎｒ４ａ１ｓｅを制御することを意味して、これらの領域が複数のサブドメインからなることを示す数種類のＳＥの最近の分析と一致する（Ｈｎｉｓｚら、２０１５年）。これらのサブドメインを破壊することは、標的遺伝子の遺伝子座位に依存する発現に差次的に影響した。例えばＳＩＫ１において、サブドメイン間における添加剤の効果は、遺伝子発現の安定な誘発に貢献するが、それに対してＰｒｄｍ１４においては、ｍＲＮＡ発現は、５つのサブドメインのうち１つによって殆ど完全に調節された（Ｈｎｉｓｚら、２０１５年）。本発明者らの研究は、Ｎｒ４ａ１；Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿６及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿９の上流で３種の活性な保存されたＭＰエンハンサーを同定したが、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２だけがＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの発生を調節する。このことは、個々のエンハンサー構成要素、及びこれらの構成要素内のＴＦ結合モチーフの関連性を確立するための、詳細な分子の分析の重要性を際立たせる。Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿６及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿９が、他の刺激に応答してＭＰＮｒ４ａ１遺伝子発現を調節するかどうかは将来調べる前線である。
【０１３４】
組織ＭＰ発生の調節因子を同定するための戦略としてのエンハンサーターゲティング。
[00158]本発明者らの研究は、ＫＬＦ転写因子がＮｒ４ａ１遺伝子発現を、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２を通じて調節することを示唆する。Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏのエンハンサーは、ＫＬＦモチーフに富化されて、これらのモチーフはＮｒ４ａ１ｓｅ＿２中に存在する。複数のＫＬＦファミリーのメンバーは、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏ中に発現し、上記メンバーはＮｒ４ａ１ｓｅ＿２で過剰に作用し得る。Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏにおいてＫｌｆ２及びＫｌｆ４は最も豊富なファミリーメンバーであり、したがって、本発明者らはこれらの遺伝子の役割を調べた。Ｋｌｆ２及びＫｌｆ４は両方共、マクロファージの炎症性遺伝子発現を、ｐ３００及びＰＣＡＦのＮｆ−κＢへの補充を阻害することにより調節する（Ｄａｓら、２００６年；Ｌｉａｏら、２０１１年）。各因子に帰せられる異なる役割は、それらが発現する異なる情況から生じ得る。Ｋｌｆ４は、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏの分化中に誘発されて、ＩＬ−４によりマクロファージ中でさらに上方制御される。この情況でＫｌｆ４は、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏの発生を調節して、マクロファージ活性化のＭ２プログラムを容易にする（Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、２００７年；Ｌｉａｏら、２０１１年）。しかしながら、Ｋｌｆ２は、循環するＭｏ中で発現し、低酸素症により強く低下させられて、増大したＮｆ−κＢ／ＨｉＦ−１活性を導く（Ｍａｈａｂｅｌｅｓｈｗａｒら、２０１１年）。
【０１３５】
[00159]本発明者らの発見は、Ｍｏ発生におけるＫｌｆ２及びＫｌｆ４の重複しない役割を示唆する。Ｋｌｆ４発現は、両方のＭｏサブセットで高く、Ｍａｃ−Ｋｌｆ４マウスはＭｏを少ししか有しない。しかしながら、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏのＬｙ６ＣｌｏｗＭｏに対する比、及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏのＮｒ４ａ１発現は、Ｍａｃ−Ｋｌｆ４マウスでは影響されない（図１４のｃ）。しかしながら、Ｋｌｆ２の枯渇は、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏの選択的損失を容易にし、Ｋｌｆ２ｍＲＮＡレベルはＮｒ４ａ１レベルを予測することから、Ｋｌｆ２及びＮｒ４ａ１の因果関係が暗示された。繰り返された試みにも拘わらず、本発明者らは、高品質の市販の抗体の不在のために、Ｎｒ４ａ１ｓｅ遺伝子座位におけるＫＬＦ２の上首尾の免疫沈降を得ることができず、インビトロでＮｒ４ａ１のｍＲＮＡを上方制御するために十分なＫｌｆ２の過剰発現もなかった（データ掲載せず）。これらの予備的発見は、Ｋｌｆ２がＮｒ４ａ１ｓｅ＿２の遺伝子座位を通して作用して、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏの発生に必要であるが十分ではないことを示唆する。Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２、Ｎｒ４ａ１プロモーター等を通じて作用する追加の重要な共同因子の同定は、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２がＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの発生においてＮｒ４ａ１遺伝子の発現をどのようにして調節するかのより詳細な機構を理解するための道を示すであろう。
【０１３６】
密接に関係する細胞タイプにおける多面発現性効果を克服するための手法としてのエンハンサーターゲティング
[00160]ＭＰは、体の全組織にわたって分布して、そこでこれらの細胞のホメオスタシスを容易にするために特化された機能を実行する。例えば、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏは、損傷した内皮の除去を助長することにより、血管の完全性を維持し（Ｃａｒｌｉｎら、２０１３年）、肺胞マクロファージは、界面活性剤を浄化することにより肺機能を維持し（Ｎａｋａｍｕｒａら、２０１３年）、赤色脾髄マクロファージは赤血球をリサイクルすることにより鉄のホメオスタシスに貢献するが（Ｋｏｈｙａｍａら、２００９年）、それに対して小神経膠細胞が専ら担う機能は、シナプス刈り込みにより脳機能を支持することを含む（Ｐａｏｌｉｃｅｌｌｉら、２０１１年）。これらの特化された機能は、組織に特異的なＬＴＤＦにより与えられ；Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏはＮｒ４ａ１を要求し（Ｈａｎｎａら、２０１１年）；肺胞マクロファージはＰＰＡＲγに依存し（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２０１４年）；赤色脾髄マクロファージはＳｐｉｃを必要とするが（Ｋｏｈｙａｍａら、２００９年）；一方、常駐腹腔内マクロファージは、転写因子ＧＡＴＡ６に依存する（Ｏｋａｂｅ及びＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２０１４年）。
【０１３７】
[00161]幾つかの場合に、例えばＧａｔａ６及びＳｐｉｃについて、ＭＰシステム内におけるＬＤＴＦ発現は細胞特異的であり、その結果、因子のマクロファージ特異的欠失は関連するサブセットの機能を研究するために十分である。しかしながら、大部分の場合、最も重要なＭＰのＴＦの発現及び要求は両方共細胞特異的ではない。ＭＰサブセットの後成的な分析により、複数のサブセットにまたがる共有されるモチーフの使用及び同起源のＴＦの共発現が明らかになる（Ｌａｖｉｎら、２０１４年）。例えば、ＰＰＡＲモチーフは、肺胞及び腎臓のマクロファージエンハンサーに富化されて、ＰＰＡＲγが肺胞マクロファージ及び破骨細胞の両方の分化を調節する（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２０１４年；Ｗａｎら、２００７年）。疾患過程は、動的な転写因子発現をひき起こして、要求を変化させることにより事態をさらに複雑にし、この情況でＰＰＡＲγはＩＬ−４により上方制御されて、代替的マクロファージの活性化を制御する（Ｏｄｅｇａａｒｄら、２００７年）。同様に、Ｎｒ４ａ１は、Ｌｙ６ＣｌｏｗＭｏの発生のために必要とされ、やはりＬＰＳにより誘発される（Ｈａｎｎａら、２０１１年；Ｐｅｉら、２００５年）。これらの多面発現性の効果が、本発明者らの個々のＭＰサブセットを研究する能力を制限し、且つ現用の骨髄腫のＣｒｅ導入遺伝子により提供される特異性の欠如が、個々のサブセットを標的とすることを試みる場合に、大きな問題を提示する。
【０１３８】
[00162]本発明者らは、エンハンサーターゲティングがこれらの制限を克服できることを示した。本発明者らの手法は、各ＭＰのサブセットが占める排他的な環境から生ずる独特のエンハンサーレパートリーを利用する。ＬＤＴＦ発現を制御する細胞特異的エンハンサーの概念は新しくはないが（Ｚｈｅｎｇら、２０１０年）、本発明者らの知るところでは、この応用及び特異性の程度は新しい。本発明者らは、非常に重要なＬＤＴＦ内における細胞特異的なＳＥサブドメインを標的とすることで、隣りの細胞サブセットに関係する遺伝子機能の生理学的特性を保持しながら、遺伝子発現の細胞特異的態様を機能的に切り離すことになることを示す。本発明者らの場合には、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２サブドメインを標的とすることが、他のＭＰ集団におけるＮｒ４ａ１の発現及びＬＰＳシグナルの伝達に応答するＮｒ４ａ１発現の急速な速度の両方を保存するＬｙ６ＣｌｏｗＭｏを研究するための機能破壊の新しいツールの発生に結びついた。概念的に、この戦略は、遺伝子発現が別個のエンハンサー配列により調節される任意のシナリオに適用することができ、密接に関係する細胞タイプにおける遺伝子機能を研究する新しい手法を提供する。
【０１３９】
実験手順
マウス
マウスは、社内で維持するか又はＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。全ての実験は、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＬＩＡＩ）のＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの指針に従い、齧歯動物の使用のための承認は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈからのＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓで概説された基準に従って、ＬＩＡＩから得た。マウスは、ＣＯ２吸入により安楽死させた。
【０１４０】
細胞選別
マウスを、ＣＯ２吸入により犠牲死させて、骨髄又は血液をＤＰＢＳ＋２ｍＭのＥＴＤＡ中に抽出した。ＲＢＣ溶解に続いて、ブロッキングし、表面抗原を染色し、本明細書に記載されたようにフローサイトメトリーにより精製した。
【０１４１】
チオグリコレートで誘発されたマクロファージ
チオグリコレートで誘発されたマクロファージは、１ｍｌの４％Ｂｒｅｗｅｒ’ｓ  Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍの腹腔内注射により誘発した。注射の５日後にマクロファージを採取して、増補の実験手順に記載されたように培養した。
【０１４２】
ＲＮＡ単離及びＲＮＡ−Ｓｅｑ
選別された細胞を直ちに遠心沈降させてトリゾール中で貯蔵した。ＤｉｒｅｃｔＺｏｌカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、配列決定のためにＴｒｕＳｅｑ  ｖ２キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して用意した。
【０１４３】
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ
ヒストンＣｈＩＰを、（Ｇｉｌｆｉｌｌａｎら、２０１２年）に記載されたプロトコルを使用して実施して、転写因子ＣｈＩＰを、増補された方法に記載された改変を加えて本質的に（Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、２０１４年）に記載されたように実施した。ＣｈＩＰ−ＳｅｑライブラリーをＴｈｒｕＰｌｅｘ−ＦＤキット（Ｒｕｂｉｃｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して調製した。
【０１４４】
分子的クローニング及び過剰発現の研究
エンハンサーを、（Ｈｅｉｎｚら、２０１３年）に記載されてＮｒ４ａ１の最小プロモーター（３００ｂｐ）及び５’ＵＴＲを含有するように改変されたｐＧＬ４．１０シリーズのベクターのＳａｌＩ及びＢａｍＨ１部位にクローニングした。トランスフェクションアッセイは、マウスのＲＡＷ２６４．７マクロファージでリポフェクタミンＬＴＸを使用して実施した。ｃＤＮＡ発現ベクターはＯｒｉｇｅｎｅから得た。完全な詳細は増補の実験手順にある。
【０１４５】
ＣＲＩＳＰＲマウスの発生
マウスのゲノム編集は、少し改変して（Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎら、２０１５年；Ｗａｎｇら、２０１３年）に本質的に記載されたように実施した。ＵＣＳＤのトランスジェニックコア施設で、４種のｓｇＲＮＡ（各エンハンサーの隣接領域を標的とする２対）を過剰排卵されたＣ５７ＢＬ／６マウスの胚中にＣａｓ９ｍＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に注入した。ノックアウトマウスをＣ５７ＢＬ／６とかけ合わせて、その後同胞のかけ合わせにより子孫を維持した。
【０１４６】
骨髄キメラ
骨髄は増補の実験方法に記載されたように氷上で波をかぶらせた。受容マウスを致死的に放射線照射して、骨髄を眼窩後部注射により移植した。マウスを実験実施前に少なくとも６週間快復させた。
【０１４７】
癌の研究
３００，０００個のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を、尾静脈を通して受容マウスに注射した。肺を、亜鉛で緩衝されたホルマリンで採取して、パラフィンブロック中に固定した。切片をＨ＆Ｅで染色して、スライドをＡｘｉｏＳｃａｎ  Ｚ１（Ｚｅｉｓｓ）で走査した。増補の実験手順を参照されたい。
【０１４８】
エンドドキシン感度のアッセイ
Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ＬＰＳ−ＥＢ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をＰＢＳ中で作製して、ＩＰ注射した。マウスを、最初の７２時間の間は１日に３回、その後は１日に２回モニターした。
【０１４９】
バイオインフォマティクスデータの分析
ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験のためのＲＮＡ−ＳＴＡＲ、又はＣｈＩＰ−Ｓｅｑ研究のためのＢｏｗｔｉｅを使用して、ＦＡＳＴＱファイルをマウスｍｍ１０の参照ゲノムにマッピングした。ＲＮＡ−Ｓｅｑの発現レベルを、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓを使用して定量して、差次的発現を、ｅｄｇｅＲを使用して分析した。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ分析はＨＯＭＥＲを使用して実施した。完全な詳細については、増補の実験手順を参照されたい。
【０１５０】
受託番号
このプロジェクトのためのＩｌｌｕｍｉｎａによる配列決定を、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）にＳｕｐｅｒＳｅｒｉｅｓとして受託番号ＧＳＥ８００４０で寄託した。
【０１５１】
謝辞
財政的支援の供給源：ＣＣＨに対してＲ０１ＨＬｘ１１８７６５、Ｒ０１ＣＡ２０２９８７及びＲ０１ＨＬ１１２０３９；ＣＫＧに対してＲ０１ＤＫ０９１１８３、Ｒ０１ＣＡ１７３９０及びＲ０１ＨＬ０８８０９３；ＣＥＲに対してＲ００ＨＬ１２３４８５；ＢＡＨに対してＲ０１ＧＭ０８６９１２；ＭＫＪに対してＲ０１ＨＬ０８６５４８及びＲ０１０７５４２７。ＡＨＡの特別研究員の給費：ＧＤＴに対して１６ＰＯＳＴ２７６３０００２、及びＲＮＨに対して１２ＤＧ１２０７０００５。ＫＤＲはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＲｕｔｈ  Ｌ．Ｋｉｒｓｃｈｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ａｗａｒｄ（ＮＲＳＡ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｅｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｔｒａｉｎｉｎｇの助成金、Ｔ３２ＧＭ００８６６６により一部支援された。
【０１５２】
参考文献
Alder, J.K., Georgantas, R.W., Hildreth, R.L., Kaplan, I.M.,Morisot, S., Yu, X., McDevitt, M., and Civin, C.I. (2008). Kruppel-Like Factor4 Is Essential for Inflammatory Monocyte Differentiation In Vivo. J. Immunol. 180,5645-5652.
Amit, I., Winter, D.R., and Jung, S.(2016). The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophageidentity and their effect on tissue homeostasis. Nat. Immunol. 17, 18-25.
Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada,I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki,T., et al. (2014). An atlas of active enhancers across human cell types andtissues. Nature 507, 455-461.
Boyle, A.P., Davis, S., Shulha, H.P.,Meltzer, P., Margulies, E.H., Weng, Z., Furey, T.S., and Crawford, G.E. (2008).High-resolution mapping and characterization of open chromatin across thegenome. Cell 132, 311-322.
Carlin, L.M., Stamatiades, E.G., Auffray,C., Hanna, R.N., Glover, L., Vizcay-Barrena, G., Hedrick, C.C., Cook, H.T.,Diebold, S., and Geissmann, F. (2013). Nr4a1-Dependent Ly6Clow MonocytesMonitor Endothelial Cells and Orchestrate Their Disposal. Cell 153, 362-375.
Chow, A., Brown, B.D., and Merad, M.(2011). Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nat.Rev. Immunol. 11, 788-798.
Concepcion, D., Ross, K.D., Hutt, K.R.,Yeo, G.W., and Hamilton, B.A. (2015). Nxf1 natural variant E610G is asemi-dominant suppressor of IAP-induced RNA processing defects. PLoS Genet. 11,e1005123.
Creyghton, M.P., Cheng, A.W., Welstead,G.G., Kooistra, T., Carey, B.W., Steine, E.J., Hanna, J., Lodato, M.A.,Frampton, G.M., Sharp, P.A., et al. (2010). Histone H3K27ac separates activefrom poised enhancers and predicts developmental state. Proc. Natl. Acad. Sci.
Cros, J., Cagnard, N., Woollard, K., Patey,N., Zhang, S.-Y., Senechal, B., Puel, A., Biswas, S.K., Moshous, D., Picard,C., et al. (2010). Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids andviruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity 33, 375-386.
Das, H., Kumar, A., Lin, Z., Patino, W.D.,Hwang, P.M., Feinberg, M.W., Majumder, P.K., and Jain, M.K. (2006).Kruppel-like factor 2 (KLF2) regulates proinflammatory activation of monocytes.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6653-6658.
Feinberg, M.W., Wara, A.K., Cao, Z.,Lebedeva, M.A., Rosenbauer, F., Iwasaki, H., Hirai, H., Katz, J.P., Haspel,R.L., Gray, S., et al. (2007). The Kruppel-like factor KLF4 is a criticalregulator of monocyte differentiation. EMBO J. 26, 4138-4148.
Geissmann, F., Manz, M.G., Jung, S.,Sieweke, M.H., Merad, M., and Ley, K. (2010). Development of monocytes,macrophages, and dendritic cells. Science 327, 656-661.
Gilfillan, G.D., Hughes, T., Sheng, Y.,Hjorthaug, H.S., Straub, T., Gervin, K., Harris, J.R., Undlien, D.E., and Lyle,R. (2012). Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMCGenomics 13, 645.
Gosselin, D., Link, V.M., Romanoski, C.E.,Fonseca, G.J., Eichenfield, D.Z., Spann, N.J., Stender, J.D., Chun, H.B.,Garner, H., Geissmann, F., et al. (2014). Environment Drives Selection andFunction of Enhancers Controlling Tissue-Specific Macrophage Identities. Cell 159,1327-1340.
Hanna, R.N., Carlin, L.M., Hubbeling, H.G.,Nackiewicz, D., Green, A.M., Punt, J.A., Geissmann, F., and Hedrick, C.C.(2011). The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrowdifferentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat. Immunol. 12, 778-785.
Hanna, R.N., Shaked, I., Hubbeling, H.G.,Punt, J.A., Wu, R., Herrley, E., Zaugg, C., Pei, H., Geissmann, F., Ley, K., etal. (2012). NR4A1 (Nur77) deletion polarizes macrophages toward an inflammatoryphenotype and increases atherosclerosis. Circ. Res. 110, 416-427.
Hanna, R.N., Cekic, C., Sag, D., Tacke, R.,Thomas, G.D., Nowyhed, H., Herrley, E., Rasquinha, N., McArdle, S., Wu, R., etal. (2015). Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung. Science.
Heintzman, N.D., Stuart, R.K., Hon, G., Fu,Y., Ching, C.W., Hawkins, R.D., Barrera, L.O., Van Calcar, S., Qu, C., Ching,K.A., et al. (2007). Distinct and predictive chromatin signatures oftranscriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat. Genet. 39,311-318.
Heinz, S., Benner, C., Spann, N.,Bertolino, E., Lin, Y.C., Laslo, P., Cheng, J.X., Murre, C., Singh, H., andGlass, C.K. (2010). Simple combinations of lineage-determining transcriptionfactors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cellidentities. Mol. Cell 38, 576-589.
Heinz, S., Romanoski, C.E., Benner, C.,Allison, K.A., Kaikkonen, M.U., Orozco, L.D., and Glass, C.K. (2013). Effect ofnatural genetic variation on enhancer selection and function. Nature.
Hettinger, J., Richards, D.M., Hansson, J.,Barra, M.M., Joschko, A.-C., Krijgsveld, J., and Feuerer, M. (2013). Origin ofmonocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat. Immunol. 14, 821-830.
Hnisz, D., Abraham, B.J., Lee, T.I., Lau,A., Saint-Andre, V., Sigova, A.A., Hoke, H.A., and Young, R.A. (2013).Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell 155, 934-947.
Hnisz, D., Schuijers, J., Lin, C.Y.,Weintraub, A.S., Abraham, B.J., Lee, T.I., Bradner, J.E., and Young, R.A.(2015). Convergence of Developmental and Oncogenic Signaling Pathways atTranscriptional Super-Enhancers. Mol. Cell 58, 362-370.
Jacob, A., Zhou, M., Wu, R., Halpern, V.J.,Ravikumar, T.S., and Wang, P. (2007). PRO-INFLAMMATORY CYTOKINES FROM KUPFFERCELLS DOWNREGULATE HEPATOCYTE EXPRESSION OF ADRENOMEDULLIN BINDING PROTEIN-1.Biochim. Biophys. Acta 1772, 766-772.
Kaikkonen, M.U., Spann, N.J., Heinz, S.,Romanoski, C.E., Allison, K.A., Stender, J.D., Chun, H.B., Tough, D.F.,Prinjha, R.K., Benner, C., et al. (2013). Remodeling of the Enhancer Landscapeduring Macrophage Activation Is Coupled to Enhancer Transcription. Mol. Cell 51,310-325.
Kohyama, M., Ise, W., Edelson, B.T.,Wilker, P.R., Hildner, K., Mejia, C., Frazier, W.A., Murphy, T.L., and Murphy,K.M. (2009). Role for Spi-C in the development of red pulp macrophages andsplenic iron homeostasis. Nature 457, 318-321.
Lavin, Y., Winter, D., Blecher-Gonen, R.,David, E., Keren-Shaul, H., Merad, M., Jung, S., and Amit, I. (2014).Tissue-Resident Macrophage Enhancer Landscapes Are Shaped by the LocalMicroenvironment. Cell 159, 1312-1326.
Li, L., Liu, Y., Chen, H., Li, F., Wu, J.,Zhang, H., He, J., Xing, Y., Chen, Y., Wang, W., et al. (2015). Impeding theinteraction between Nur77 and p38 reduces LPS-induced inflammation. Nat. Chem.Biol. 11, 339-346.
Liao, X., Sharma, N., Kapadia, F., Zhou,G., Lu, Y., Hong, H., Paruchuri, K., Mahabeleshwar, G.H., Dalmas, E.,Venteclef, N., et al. (2011). Kruppel-like factor 4 regulatesmacrophage polarization. J. Clin. Invest. 121, 2736-2749.
Mahabeleshwar, G.H., Kawanami, D., Sharma,N., Takami, Y., Zhou, G., Shi, H., Nayak, L., Jeyaraj, D., Grealy, R., White,M., et al. (2011). The myeloid transcription factor KLF2 regulates the hostresponse to polymicrobial infection and endotoxic shock. Immunity 34, 715-728.
Muller, P.A., Koscso, B., Rajani,G.M., Stevanovic, K., Berres, M.-L., Hashimoto, D., Mortha, A., Leboeuf, M., Li,X.-M., Mucida, D., et al. (2014). Crosstalk between muscularis macrophages andenteric neurons regulates gastrointestinal motility. Cell 158, 300-313.
Nakamura, A., Ebina-Shibuya, R.,Itoh-Nakadai, A., Muto, A., Shima, H., Saigusa, D., Aoki, J., Ebina, M.,Nukiwa, T., and Igarashi, K. (2013). Transcription repressor Bach2 is requiredfor pulmonary surfactant homeostasis and alveolar macrophage function. J. Exp.Med. 210, 2191-2204.
Odegaard, J.I., and Chawla, A. (2011).Alternative macrophage activation and metabolism. Annu. Rev. Pathol. 6, 275-297.
Odegaard, J.I., Ricardo-Gonzalez, R.R.,Goforth, M.H., Morel, C.R., Subramanian, V., Mukundan, L., Red Eagle, A., Vats,D., Brombacher, F., Ferrante, A.W., et al. (2007). Macrophage-specificPPARgamma controls alternative activation and improves insulin resistance.Nature 447, 1116-1120.
Okabe, Y., and Medzhitov, R. (2014).Tissue-Specific Signals Control Reversible Program of Localization andFunctional Polarization of Macrophages. Cell 157, 832-844.
Okabe, Y., and Medzhitov, R. (2016). Tissuebiology perspective on macrophages. Nat. Immunol. 17, 9-17.
Ostuni, R., Piccolo, V., Barozzi, I.,Polletti, S., Termanini, A., Bonifacio, S., Curina, A., Prosperini, E.,Ghisletti, S., and Natoli, G. (2013). Latent Enhancers Activated by Stimulationin Differentiated Cells. Cell 152, 157-171.
Paolicelli, R.C., Bolasco, G., Pagani, F.,Maggi, L., Scianni, M., Panzanelli, P., Giustetto, M., Ferreira, T.A.,Guiducci, E., Dumas, L., et al. (2011). Synaptic pruning by microglia isnecessary for normal brain development. Science 333, 1456-1458.
Parkhurst, C.N., Yang, G., Ninan, I.,Savas, J.N., Yates III, J.R., Lafaille, J.J., Hempstead, B.L., Littman, D.R.,and Gan, W.-B. (2013). Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formationthrough Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell 155, 1596-1609.
Pei, L., Castrillo, A., Chen, M., Hoffmann,A., and Tontonoz, P. (2005). Induction of NR4A orphan nuclear receptorexpression in macrophages in response to inflammatory stimuli. J. Biol. Chem. 280,29256-29262.
Perdiguero, E.G., and Geissmann, F. (2016).The development and maintenance of resident macrophages. Nat. Immunol. 17, 2-8.
Schmidl, C., Renner, K., Peter, K., Eder,R., Lassmann, T., Balwierz, P.J., Itoh, M., Nagao-Sato, S., Kawaji, H.,Carninci, P., et al. (2014). Transcription and enhancer profiling in humanmonocyte subsets. Blood blood - 2013-02 - 484188.
Schneider, C., Nobs, S.P., Kurrer, M.,Rehrauer, H., Thiele, C., and Kopf, M. (2014). Induction of the nuclearreceptor PPAR-γ by the cytokine GM-CSF is critical for the differentiation of fetalmonocytes into alveolar macrophages. Nat. Immunol. 15, 1026-1037.
Sica, A., and Mantovani, A. (2012).Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122,787-795.
Tacke, R., Hilgendorf, I., Garner, H.,Waterborg, C., Park, K., Nowyhed, H., Hanna, R.N., Wu, R., Swirski, F.K.,Geissmann, F., et al. (2015). The transcription factor NR4A1 is essential forthe development of a novel macrophage subset in the thymus. Sci. Rep. 5, 10055.
Varol, C., Landsman, L., Fogg, D.K.,Greenshtein, L., Gildor, B., Margalit, R., Kalchenko, V., Geissmann, F., andJung, S. (2007). Monocytes give rise to mucosal, but not splenic, conventionaldendritic cells. J. Exp. Med. 204, 171-180.
Wan, Y., Chong, L.-W., and Evans, R.M.(2007). PPAR-gamma regulates osteoclastogenesis in mice. Nat. Med. 13, 1496-1503.
Wang, H., Yang, H., Shivalila, C.S.,Dawlaty, M.M., Cheng, A.W., Zhang, F., and Jaenisch, R. (2013). One-stepgeneration of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediatedgenome engineering. Cell 153, 910-918.
Whyte, W.A., Orlando, D.A., Hnisz, D.,Abraham, B.J., Lin, C.Y., Kagey, M.H., Rahl, P.B., Lee, T.I., and Young, R.A.(2013). Master transcription factors and mediator establish super-enhancers atkey cell identity genes. Cell 153, 307-319.
Yona, S., Kim, K.-W., Wolf, Y., Mildner,A., Varol, D., Breker, M., Strauss-Ayali, D., Viukov, S., Guilliams, M.,Misharin, A., et al. (2012). Fate Mapping Reveals Origins and Dynamics ofMonocytes and Tissue Macrophages under Homeostasis. Immunity.
Zheng, Y., Josefowicz, S., Chaudhry, A.,Peng, X.P., Forbush, K., and Rudensky, A.Y. (2010). Role of conservednon-coding DNA elements in the Foxp3 gene in regulatory T-cell fate. Nature 463,808-812.
【０１５３】
実施例２
補完材料及び方法
細胞調製及び単離
骨髄単球は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から得た８〜１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（株００６６６４）の大腿骨、脛骨及び寛骨から採取した。ＦＡＣＳで染色する前に、細胞を室温で短時間の（３分）赤血球溶解（ＲＢＣ溶解緩衝液、ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけた。全てのＦＡＣＳ染色は、ＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で実施した。表面染色の前に、ＦＣ受容体を抗ＣＤ１６／３２（クローン９３）で３０分間かけて封鎖した。表面染色は、ＦＡＣＳ選別のために３０分間５００μｌ及び通常のフローサイトメトリーのために１００μｌの最終の体積で実施した。表面染色は、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄイエロー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）及び抗体の組合せを使用して図のゲーティングスキームに従って実施した。系統陽性細胞を、プールされたＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ３、ＣＤ１９、Ｌｙ６Ｇ及びＮＫ１．１（それぞれ、クローン１４５−２Ｃ１１、１Ｄ３、１Ａ８及びＰＫ１３６）を使用して同定した。使用した追加の細胞表面マーカーは、ＣＤ１１７−ＰＥ−Ｃｙ７（ＡＣＫ２）、ＣＤ１１５ＰＥ又はＢＶ４２１（クローンＡＦＳ９８）、Ｌｙ６ＣＡＰＣ−Ｃｙ７又はＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローンＨＫ１．４）、ＣＤ１３５−ＰＥ（クローンＡ２Ｆ１０．１）、ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ（クローンＮ４１８）、Ｆ４／８０ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＢＭ８）、ＣＤ１１ｂＦＩＴＣ（クローンＭ１／７０）及びＭＨＣＩＩ−ＢＶ６０５（クローンＭ１／７０）であった。全ての抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から得た。試料は、取得前に少なくとも２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＬＳＲＩＩ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する従来のフローサイトメトリーを使用して選別した。全てのフローサイトメトリーは生きている細胞で実施した。
【０１５４】
ＣｈＩＰ及び配列決定ライブラリーの調製
ヒストン改変のためのＣｈＩＰアッセイは、以前に記載されたように（Ｇｉｌｆｉｌｌａｎら、２０１２年）実施した。十分な数のＭＤＰを得るために、骨髄を１０匹のマウスからプールして選別した。各ＣｈＩＰアッセイのために、５００，０００個のＦＡＣＳで単離された細胞をＰＢＳで直ちに洗浄して、ＭＮａｓｅ消化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２％トリトンＸ−１００）中に再懸濁させた。次に、細胞を、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州）を使用してモノヌクレオソームのフラグメントに消化した。酵素による消化を、１／１０体積の停止緩衝液（１１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５５ｍＭ  ＥＤＴＡ）の添加により停止させて、試料を短時間Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ、ベルギー）を使用して超音波処理し、次に同体積の２×ＲＩＰＡ緩衝液（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．８％トリトンｘ１００、０．２％ＳＤＳ、０．２％ナトリウムデオキシコレート、５ｍＭ  ＥＧＴＡ）の添加によりＲＩＰＡ緩衝条件に調節した。免疫沈降を１００μｌの最終の体積で実施した。２μｇの抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（ミリポア０７−０３０）又は２μｇの抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ  Ｃ１５４１０１９６）を添加して終夜４℃で回転させてインキュベートした。抗体−抗原−ＤＮＡ複合体を、予めＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、０．２％ＳＤＳ、０．２％ナトリウムデオキシコレート）で洗浄された１０μｌのタンパク質Ａ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓと２時間インキュベートすることにより回収した。次に錯体を、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液で５回及びＬｉＣｌ洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＩｇｅｐａｌＣＡ−６３０、０．５％ナトリウムデオキシコレート）で１回洗浄し、各洗浄は２００μｌを４℃で５分間回転させて実施した。全ての上の緩衝液には１×プロテアーゼ阻害剤カクテル、１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び５ｍＭ酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を補完した。ビーズを、２００μｌの氷冷ＴＥ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でプロテアーゼ阻害剤は加えずに最終洗浄して、１００μｌの１％ＳＤＳ−ＴＥ緩衝液中で、３７℃で２０分間溶離させた。最終的に、タンパク質を２μｌプロテイナーゼＫ（Ａｍｂｉｏｎ）で１時間５５℃で処理して、ＤＮＡを、ＣｈＩＰ  Ｃｌｅａｎ及び濃縮カラム（Ｚｙｍｏ、アーバイン、カリフォルニア州）を使用して精製し、３０μｌの最終の体積に溶離させた。
【０１５５】
ＰＵ．１及びＣ／ＥＢＰｂのためのＣｈＩＰを、以前に記載されているように（Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、２０１４年）実施した。５００，０００個の選別された細胞をＰＢＳで洗浄して、直ちに、９分間室温でＰＢＳ中のメタノールを含まない１％ホルムアルデヒド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で固定した。固定を１／２０体積の２．６２５Ｍグリシン溶液の添加により停止させて、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞ペレットをドライアイス／メタノール浴中で急速凍結して、必要になるまで−８０℃で貯蔵した。細胞ペレットを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、８５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０中に再懸濁させることにより核を富化させて、氷上で１０分間インキュベートした。核を３０００ｇで１０分間遠心分離することにより採取して、１３０μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ナトリウムデオキシコレート、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン）中で溶解させた。ＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓマイクロチューブ（Ｃｏｖａｒｉｓ、マサチューセッツ州）中に移して、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｅ２２０を使用して剪断し（１４分、デューティーサイクル３％、１バースト当たり１００サイクル）、１５０〜６００ｂｐのフラグメントにした。最終体積を２００μｌに合わせて２２μｌの１０％トリトンＸ−１００を添加し、次に、細胞の破片を、最大速度で５分間遠心分離することにより清浄化した。３μｇの抗ＰＵ．１又はＣ／ＥＢＰｂ（それぞれｓｃ−３５２ｘ及びｓｃ−１５０ｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州）に予めコンジュゲートしておいた２０μｌのタンパク質Ａ−ｄｙｎａｂｅａｄｓを各クロマチン調製物に添加して、回転させながら２時間４℃でインキュベートした。それから抗体−抗原−ＤＮＡ複合体を３×ＷＢＩ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）、３×ＬｉＣｌ  ＷＢ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．７％ナトリウムデオキシコレート、１％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０）及び１×ＴＥＴ（ＴＥ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０）緩衝液で洗浄した。洗浄液の体積は全部で２００μｌであった。ＤＮＡを１％ＳＤＳ−ＴＥ中に３０分間３７℃で溶離させて、ＮａＣｌを最終濃度３００ｍＭに添加して、架橋を終夜６５℃で逆行させた。最終的に、タンパク質を２μｌのプロテイナーゼＫ（Ａｍｂｉｏｎ）で１時間５５℃で処理して、ＤＮＡをＣｈＩＰ  Ｃｌｅａｎ及び濃縮カラム（Ｚｙｍｏ、アーバイン、カリフォルニア州）を使用して精製し、３０μｌの最終の体積に溶離させた。
【０１５６】
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑライブラリーを、最初０．３〜５ｎｇのＤＮＡを使用して、ＴｈｒｕＰｌｅｘ−ＦＤキット（Ｒｕｂｉｃｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ミシガン州）をメーカーの指針に従って使用して調製した。ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーは、Ｔｒｕ−Ｓｅｑ  ｖ２ライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ラホヤ、カリフォルニア州）をメーカーの使用説明書に従って使用して調製した。
【０１５７】
ＲＮＡ−Ｓｅｑの差次的発現の分析
配列決定ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑをＬＩＡＩ配列決定コア施設で使用して配列決定した。ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーは、ペアエンド５０塩基読み取りとして配列決定し、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑライブラリーは、シングルエンド５０塩基読み取りとして配列決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢＣＬファイルをｂｃｌ２ｆａｓｔｑ（ｖ１．８．４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＦＡＳＴＱ書式に変換した。
【０１５８】
Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｖ７３ゲノム注解セットから導き出された遺伝子モデルで編集されたＲＮＡ−ＳＴＡＲ  ｖ２．３．０（Ｄｏｂｉｎら、２０１３年）を使用して、ペアエンドＲＮＡ−Ｓｅｑ読み取りを、マウスｍｍ１０の参照ゲノムにマッピングした。遺伝子のカウントを、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（Ｌｉａｏら、２０１３年）を使用して、同じ注解セットを用いて定量した。差次的発現の分析は、ｅｄｇｅＲ  ｖ３．４．２（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２０１０年）を使用して実施した。変動の計算は、共通分散方法及び「相対対数表現」方法を使用して調節された配列決定深度の差を計算した。差次的発現は、全ての対にした比較に対して及びＦＤＲ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）補正されたＰ−値の統計的有意性を検出するために適用した１ｅ−５の閾値に対して計算した。ＲＰＫＭの計算は、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓから導き出された遺伝子の長さを使用してｅｄｇｅＲで計算した。公的に利用できるＬｅｖｉｎらからのＲＮＡ−Ｓｅｑデータを、ＧＥＯ  ＧＳＥ６３３４０（Ｌｅｖｉｎら、２０１４年）から得て上記のように加工処理した。
【０１５９】
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑピーク検出、差次的な結合及びＵＣＳＣゲノムブラウザー可視化
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ読み取りを、Ｂｏｗｔｉｅ（ｖ、Ｌａｎｇｍｅａｄら、２００９年）を使用してｍｍ１０参照ゲノムにマッピングした。Ｈｏｍｅｒ（ｖ４．４、Ｈｅｉｎｚら、２０１０年）をＣｈＩＰ−Ｓｅｑピーク検出のために使用した。
【０１６０】
エンハンサー領域を、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２ライブラリーについて生物学的複製を合同させて、ＭＮａｓｅ処理されたＤＮＡ入力対照に対して、ｆｉｎｄＰｅａｋｓアルゴリズムを「ｓｔｙｌｅ−ｈｉｓｔｏｎｅ」で走らせることにより規定した。次に、各細胞タイプにより規定されたＨ３Ｋ４ｍｅ２プロファイルを統合し、ｍｅｒｇｅＰｅａｋｓを使用して最終のＨ３Ｋ４ｍｅ２ピークのセットを得た。これらのピークは、ＨＯＭＥＲを使用して標的遺伝子に帰属させて、中心が最も近い注解された転写開始箇所から＞２．５ｋｂにあるＨ３Ｋ４ｍｅ２ピークとエンハンサーを規定した。エンハンサー活性は、これらの規定されたエンハンサー領域内のＨ３Ｋ４ｍｅ２及びＨ３Ｋ２７ａｃを定量することにより測定した。配列決定深度における差については、レーン当たり１×１０７の読み取りの効果的なライブラリーサイズを規格化することにより調節された。ＨＯＭＥＲを使用して、「ｓｔｙｌｅ−ｆａｃｔｏｒ」フラグを用いてＣＨ２Ｏ処理された入力ＤＮＡ対照をバックグラウンド配列として使用して、ｆｉｎｄＰｅａｋｓアルゴリズムを走らせることにより、転写因子のＣｈＩＰ−Ｓｅｑピークを検出した。転写因子ピークを各レーンについて独立に検出して、ＨＯＭＥＲにおけるａｎｎｏｔａｔｅＰｅａｋｓのコマンドを使用して、ピーク内のタグの定量に先立ってｍｅｒｇｅＰｅａｋを使用して統合した。可視化は、ＨＯＭＥＲで発生させたｂｉｇＷｉｇファイルを使用して、ＵＣＳＣゲノムブラウザーで実施した。
【０１６１】
Ｌａｖｉｎら（２０１４年）のＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータは、ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ６３３３９を使用して得て、上記のように加工処理した。ヒトのＣｈＩＰ−ＳｅｑデータをＧＥＯ受託番号ＳＲＰ０１５３２８から入手して、上で概略を説明したプロトコルを使用して、ヒトｈｇ１９参照ゲノムにマッピングした。ヒト単球ＤＮａｓｅ−ＳｅｑのｂｉｇＷｉｇファイルを、２０１５年９月１０日にアクセスされた＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｎｃｏｄｅｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅｓ／ＥＮＣＦＦ０００ＴＡＵ／＠＠ｄｏｗｎｌｏａｄ／ＥＮＣＦＦ０００ＴＡＵ．ｂｉｇＷｉｇ＞におけるＥＮＣＯＤＥプロジェクトからダウンロードして、ＵＣＳＣゲノムブラウザーで直接可視化した。
【０１６２】
マイクロアレイデータ
ヒト単球Ｋｌｆ２の発現を、ＮＣＢＩ  ＧＥＯプロファイルから受託番号ＧＤＳ４２１９で得たが、示されたデータは、この実験においてこのアレイタイプでＫｌｆ２のために利用できる３種のプローブの代表的なものであるプローブＩＤ２１９３７１＿ｓ＿ａｔのためのものである。
【０１６３】
差次的エンハンサーのプロファイリング、階層的クラスターの形成及びＣｈＩＰ−Ｓｅｑの可視化
差次的なヒストンと転写因子の結合は、ｅｄｇｅＲを使用して決定した。ＭＤＰ、ｃＭｏＰ、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球及びＬｙ６Ｃｌｏｗ単球の間におけるエンハンサーの使用のパターンを同定するために、本発明者らは、差次的発現のために非常に寛容な閾値を使用した。この閾値の使用は、密接に関係する上記細胞タイプから生ずるデータにおけるどのような弱いシグナルも同定するためであった。統計的有意性は、ＦＤＲ補正（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）ｐ値を、０．０１の閾値で、２倍変化のカットオフを適用せずに使用して、細胞タイプの全ての対にした比較の間で計算した。変動は、全ての条件を単一の群の擬似複製として扱うことにより、共通の分散推定値を使用して推定した。差次的に富化された（ＤＥ）エンハンサーの最終のセットは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２又はＨ３Ｋ２７ａｃの任意の対にされた比較により決定された、全ての差次的に結合したエンハンサーの集合を表す。
【０１６４】
階層的クラスタリングを実施するために、ＤＥエンハンサーのセットについてＨ３Ｋ４ｍｅ２及びＨ３Ｋ２７ａｃについてのタグカウントのマトリックスを得た。各マトリックスは、独立に平均に集中して、変動は安定化されていた（エンハンサーに関して、行の平均／行のＳＤ）。次に、規格化されたマトリックスを連結して、ユークリッド距離を使用する階層的クラスタリング、及びＲのベース関数を使用する完全なリンケージクラスタリングアプローチに供した。視覚的検査に基づいて、結果である樹形図を９個のクラスターに切り分け、これらのクラスターの順序が最終のヒストグラム図の順序を決めるために使用された（図９のｃ）。次に、各クラスター内でエンハンサーが、ＨＯＭＥＲにより決定されたエンハンサーの「ピークスコア」に従って順位づけられ、この順位づけが、図９のｃでクラスター内の行の順序を決めるために使用された。各ＤＥエンハンサーと重なる全てのＰＵ．１ピークを抽出して、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２／Ｈ３Ｋ２７ａｃタグのカウントを、ＨＯＭＥＲのオプション「−ｇｈｉｓｔ」付きのａｎｎｏｔａｔｅＰｅａｋｓを使用して、各ＰＵ．１のピークの中心から＋／−１ｋｂで計算した。最終結果をＲパッケージのｇｐｌｏｔｓを使用してプロットした。
【０１６５】
ＵＣＳＣゲノムブラウザートラックを、ＨＯＭＥＲのプログラムｍａｋｅＢｉｇＷｉｇＨｕｂ．ｐｌを用いて発生させたトラックハブを使用して可視化した。
【０１６６】
Ｌｙ６ＣｈｉＭｏとＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの間の差次的なＰＵ．１ピーク検出
完全な単球のＰＵ．１ピークセットを、「ＣｈＩＰ−Ｓｅｑピーク検出、差次的な結合及びＵＣＳＣゲノムブラウザー可視化」に記載されたように、Ｌｙ６ＣｈｉＭｏ及びＬｙ６ＣｌｏｗＭｏの両方で規定されたＰＵ．１ピークを連結することにより得た。ＰＵ．１ライブラリーについてのタグのカウントを、このピークセット内で、単球集団及び差次的な結合の両方について数えて、差次的なヒストン結合のためと同じ手順を使用して、分析をｅｄｇｅＲで実施した。ＰＵ．１ピークについては、ＦＤＲ補正した（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）ｐ−値の１ｅ−５のカットオフ及びｌｏｇ２倍変化のカットオフ３を適用した。
【０１６７】
エンハンサークローニング
個々の配列についての全ての特定のクローニングの詳細は表１にある。プロモーター配列のＮｒ４ａ１の５’ＵＴＲ及び６５０塩基を、最小ｐＧＬ４．１０ｌｕｃ２レポーターベクターのＫｐｎＩ及びＳａｌＩ部位にクローニングした。ｐＧＬ４．１０−ＴＳＳと称されるこのベクターを、全てのエンハンサークローンのためのホストベクターとして使用した。全てのエンハンサー配列は、ゲノムのＤＮＡから、表１に詳細を記したプライマーを使用してＰＣＲにより単離した。Ｐｈｕｓｉｏｎ高信頼性ポリメラーゼ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州）を使用するＰＣＲのために、１回の反応当たり、１０μｌの５×ＨＦ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５μｌのＦプライマー（１０μｌ）、２．５μｌのＲプライマー（１０μｌ）、２μｌのマウスゲノムのＤＮＡ（２５０ｎｇ）、１．５μｌのＤＭＳＯ、３０μｌのＨ２Ｏ及び０．５μｌのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用した。ＰＣＲは、以下のプロトコルを、示されたアニーリング温度で使用して実施した：−１×９８℃３０秒；３０×９８℃１０秒、アニール３０秒、７２℃３０秒；７２℃１０分。ＬＡ  Ｔａｑ  ＧＣ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を使用するＰＣＲのために、１回の反応当たり、２５μｌのＧＣ緩衝液Ｉ、８μｌのｄＮＴＰ、２．５μｌのＦプライマー（１０μｌ）、２．５μｌのＲプライマー（１０μｌ）、２μｌのＤＮＡ（２５０ｎｇ）、９．５μｌのＨ２Ｏ及び０．５μｌのＬＡ−Ｔａｑを使用した。ＰＣＲは、メーカーの使用説明書により表１のアニーリング温度及び１分延長時間を使用して実施した。ＰＣＲ生成物を、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｎ  ＤＮＡ回収カラム（Ｚｙｍｏ、アーバイン、カリフォルニア州）を使用してゲル抽出により精製した。全てのクローニングは、１：４のベクター：挿入物のモル比でＮＥＢ試薬（イプスウィッチ、マサチューセッツ州）を使用して実施し、クローンをＰＣＲ配列決定により検証した。ＰＣＲは、ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ、アーバイン、カリフォルニア州）を使用して実施した。
【０１６８】
トランスフェクション及び過剰発現の実験
ＲＡＷ２６４．７マクロファージを、ＡＴＣＣから得て、低継代（＜１５）でＤＭＥＭ＋（１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−ｇｌｕｔ）中で維持した。トランスフェクションの研究は、０．３μｇのｐＧＬ４．１０ルシフェラーゼレポーター及び０．２μｇのｃＤＮＡ又は０．５μｇのｐＧＬ４．１０ルシフェラーゼレポーターのみ、さらに０．０４μｇのｐｍａｘＧＦＰ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ）及び０．０１μｇのｐＴＫウミシイタケ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州）ルシフェラーゼ対照を加えて使用して実施した。メーカーの指針により、０．５５μｇのプラスミドＤＮＡを８：１比でリポフェクタミンＬＴＸと複合化させて、１ウェル当たり１００μｌをＲＡＷ．２６４．７細胞に約７０％コンフルエンスで与えて、活性を、典型的には１２〜１６時間後に二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を使用して、Ｓｉｒｉｕｓルミノメーター（Ｔｉｔｅｒｋｅｋ−Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、プフォルツハイム、ドイツ）で測定した。
【０１６９】
ｓｈＲＮＡウイルスＢＭＴの実験
ＰＬＡＴ−Ｅパッケージング細胞を、６０〜７０％コンフルエンスまで、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、＋１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−ｇｌｕｔ、１μｇ／ｍｌピューロマイシン、１０μｇ／ｍｌブラスチシジン）中で、１０％ＣＯ２中の１０ｃｍのディッシュ中３７℃で増殖させた。Ｋｌｆ２（ＵＬＴＲＡ−３２２４７５０、ＵＬＴＲＡ−３２２４７４８、ＵＬＴＲＡ−３２２４７４７）、Ｋｌｆ４（ＵＬＴＲＡ−３２２４７７０、ＵＬＴＲＡ−３２２４７６９、ＵＬＴＲＡ−３２２４７６８）及び非ターゲティングｓｈＲＮＡ対照のための３種類のＵｌｔｒａｍｉＲ（ＴＲＡＮＳｏｍｉＣ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ハンツビル、アラバマ州）レトロウイルスベクター（ＬＭＮ）のプールを、メーカーの指針に従ってＪｅｔＰｒｉｍｅトランスフェクションを使用して、ＰＬＡＴ−Ｅ細胞中にトランスフェクトした。１０ｃｍのプレート当たり合計７μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの１時間前に、培地を抗生物質を含まない培地で置き換えて、細胞を終夜インキュベートした。その後も抗生物質を含まない新鮮な１０ｍｌのＤＭＥＭで置き換えた。翌朝、レトロウイルスの上清を採取して骨髄幹細胞の形質導入のために使用した（以下）。８ｍｌの新鮮ＤＭＥＭを細胞に加えて、最後のステップを翌日繰り返した。
【０１７０】
マウスの幹細胞は、ＥａｓｙＳｅｐマウス造血前駆細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州）をメーカーの指針に従って使用して陰性選択により骨髄から単離した。細胞を、２ｍｌの２５μｇ／ｍｌヒトフィブロネクチンで２時間予めコートされてＰＢＳで１回洗浄されたプレートの６個のウェル中で、２００ｎｇ／ｍｌのｒｍＳＣＦ、４０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−６及び２０ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−３を含有する２．５ｍｌのＳＴＥＭＳＰＡＮ  ＳＦＥＭ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー）中に再懸濁させた。１匹のマウスからの骨髄幹細胞を、２つのウェルに分割して、同体積（１．２５ｍｌ）のレトロウイルス上清を各ウェルに加えた。次に、細胞を８５０ｇで１時間３７℃で遠心分離して、１０％ＣＯ２中で２２時間３７℃でインキュベートした。レトロウイルスの第２のバッチを、翌日加えて遠心分離と形質導入を繰り返した。第２の形質導入の後、細胞を採取して、眼窩後部注射により致死的に放射線照射されたＣ５７ＢＬ／６ホストマウスに移入した（２×６００ラド、２〜３時間おいて）。骨髄は、分析の６週間前に再構成させた。
【０１７１】
ＣＲＩＳＰＲマウスの発生
ｓｇＲＮＡ配列を、ＣＲＩＳＰＲ  Ｄｅｓｉｇｎのｗｅｂツールオンラインで＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ＞を使用してデザインした。的外れ効果を最小にするために、本発明者らは、スコア＞７０のｓｇＲＮＡのみを考慮した。各エンハンサーについて、標的領域に隣接するｓｇＲＮＡの欠失の２対を少なくとも５０塩基対離してデザインした。ｓｇＲＮＡのテンプレートを、キメラＴ７プロモーター配列、可変ｃｒＲＮＡ（個々の配列情報については表２を参照されたい）及び不変ｔｒａｃｒＲＮＡとして、ＩＤＴ（コーラルビル、アイオワ州）からのＵｌｔｒａｍｅｒとして注文した。Ｔ７プロモーターからの頑強な転写を促進するために、各ｓｇＲＮＡ配列の第１の２つの塩基をグアニンで置換した。各ｓｇＲＮＡのためのｄｓＤＮＡテンプレートを、Ｐｆｕ  ＵｌｔｒａＩＩポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、カリフォルニア州）を使用してＰＣＲにより発生させた。ＰＣＲ反応は、ＣｈＩＰ  Ｃｌｅａｎ及び濃縮カラム（Ｚｙｍｏ、アーバイン、カリフォルニア州）を使用して清浄化し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７のキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州）をメーカーの使用説明書に従って使用して、インビトロ転写のための入力として使用した。ＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）をメーカーの指針に従って使用して清浄化した。
【０１７２】
胚を注入するために、受精して０．５日の胚を、ＰＭＳＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及びｈＣＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の各５．０Ｉ．Ｕ．を注射することにより、過剰排卵した３〜４週齢のＣ５７ＢＬ／６の雌（ハーラン、ウィスコンシン州）から集めた。胚をＭ２培地（ミリポア）中に移して、各々２５ｎｇ／μｌで５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ（ＧｅｎｅＡｒｔ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼｍＲＮＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と混合して一緒ににしたｓｇＲＮＡと共に細胞質中に注入して、ＩＤＴＥ緩衝液中で最終１５０ｎｇ／μｌのＲＮＡを得た。これらの注入された胚を、インキュベーター中のＫＳＯＭａａ培地（Ｚｅｎｉｔｈ）中で５％ＣＯ２の加湿された雰囲気下に３７℃で終夜培養した。胚を、２細胞ステージで受容偽妊娠ＩＣＲ雌マウスに移植した。胚注入は、カリフォルニア大学、サンディエゴのトランスジェニックコア施設で実施された。
【０１７３】
ＣＲＩＳＰＲマウスの飼育及び遺伝子型の同定
ファウンダーマウスを、予期される変異に隣接する１つ又は２つの部分的に変更された対立遺伝子の存在を求めて、ＰＣＲ戦略を使用してスクリーニングした。ＰＣＲは、野性タイプの生成物が２〜３ｋｂであり、それぞれの欠失対立遺伝子がそれよりおよそ１ｋｂ短いようにデザインされた。プライマー配列及びＰＣＲの詳細は表３中にある。ＰＣＲは、特定されたキットをメーカーの指針に従って使用して、表に記されたプライマー延長及びアニーリング温度で実施した。ファウンダー動物を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得たＣ５７ＢＬ／６マウス（株０００６６４）と交配させてヘテロ接合のＦ１動物を得て、それを同胞交接により血族結婚させてＮｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−、Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿６−／−、及びＮｒ４ａ１ｓｅ＿９−／−マウスを発生させた。観察された発現形は、各株について少なくとも３匹の独立のファウンダーマウスから誘導されたホモ接合の欠損マウスで存在した。Ｎｒ４ａ１ｓｅ＿２−／−株について、本発明者らは、欠失からＮｒ４ａ１にかけて下流の最初のイントロンまでＤＮＡ配列は改変されていなかったことも、サンガー配列決定によって確認した。
【０１７４】
ＬＰＳの攻撃
８〜１５週齢の雄マウスの腹腔内にＰＢＳ中２．５＊１０６ＥＵ／ｋｇ（２．５ｍｇ／ｋｇと等価）のＵｌｔｒａｐｕｒｅ  ＬＰ−ＥＢ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を注射した。マウスは、年齢及び性別を全ての実験で合わせた。注射する前にＬＰＳを５分間室温で浴中ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（ＦＳ２０Ｈ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で超音波処理した。マウスを、最初の７２時間は１日に３回、その後は１日に２回モニターした。
【０１７５】
Ｂ１６Ｆ１０、組織学及び顕微鏡定量
３００，０００個のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を、以前記載されたように（Ｈａｎｎａら、２０１５年）、尾静脈注射により受容マウスに静脈注射した。注射の１８日後に、マウスを犠牲死させて、肺を亜鉛緩衝ホルマリンで満たして、パラフィンブロック中に包埋する前に同じ緩衝液中に貯蔵した。切片を４μｍに切り、正に荷電したスライドに付着させて終夜乾燥させた。切片を、Ｓｌｉｄｅ  Ｂｒｉｔｅで脱ワックスして、再水和し、ヘマトキシリン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色して、酸性アルコールで分別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）して、Ｓｃｏｔｔ水で青くして、エオシン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色した。１０×／０．３ＮＡ又は２０×／０．８ＮＡ対物レンズを使用してＺＥＩＳＳ  ＡｘｉｏＳｃａｎ  Ｚ１スライドスキャナーでスライドを走査した。
【０１７６】
Ｋｌｆマウス
Ｌｙｓ２ＣｒｅＫｌｆ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ及びＬｙｓ２ＣｒｅＫｌｆ４ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘの研究のために、骨髄（大腿骨、脛骨及び寛骨）及びＣｒｅ陰性の同腹子の対照を採取して清浄化し、ＢＭＭ（ＲＰＭＩ、１％Ｈｅｐｅｓ、１％Ａｎｔｉ／Ａｎｔｉ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＢＭＥ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＣＳ）中の濡れた氷上で終夜波をかぶらせた。きれいに骨を掻きとることにより骨髄を採取し、７０％エタノールに１０秒間浸した後、５，９００ｇで１５秒間１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で遠心分離することにより、骨髄を抽出した。直ちに骨髄を室温の滅菌ＰＢＳ中に再懸濁させて、致死的に放射線照射された受容マウス（２×６００ラド）に眼窩後部注射により、３：１（受容体対供与体）の比で注射した。マウスを犠牲死及び分析の前に少なくとも６週間快復（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）させた。
【０１７７】
【表１】
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【表２】
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ｓｇＲＮＡを、
【化１】
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で示した上流のＴ７プロモーター（下線を引いた）、ｃｒＲＮＡ（下側の場合）及び不変の下流のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（箱に入れた）で構成されるｕｌｔｒａｍｅｒとして注文した。
【０１７８】
【表３】
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［関連出願］
[0001]本特許出願は、２０１５年９月１０日出願の米国特許仮出願第６２／２１６，９７６号の利益及び優先権を主張する。前述の出願の本文、表及び図面の全てを含む全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
［配列リスト］
[0002]本出願は、ＡＳＣＩＩの書式でＥＦＳ−Ｗｅｂを通して提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列のリストを含有する。２０１６年９月９日に創られた前記ＡＳＣＩＩのコピーは、ＬＩＡＩ０４４８５１３＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズは１５ＫＢ（１５，０２２バイト）である。
【０１８０】
［政府の支援］
[0003]本発明は、ＮＩＨにより与えられた認可番号ＲＯ１ＨＬ１３４２３６の下に一部政府の支援を得て為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６（ｃ）】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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