(57)【要約】  この発明は、シゲラ菌株による細菌感染を原因とする疾病に対する防御をもたらす際に使用するための免疫原性組成物、特にワクチン組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)精製したシゲラ・ソネイGMMA、(b)精製したシゲラ・フレキシネリGMMA、及び(c)アジュバントを含む免疫原性組成物であって、GMMAが改変リピドAを含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
改変リピドAがペンタアシル化リピドAである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
シゲラ・フレキシネリGMMAが、2a、3a及び6からなる群から選択される少なくとも1種の菌株から精製される、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
菌株2a、3a及び6のそれぞれから精製したシゲラ・フレキシネリGMMAを含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
GMMAが、(a)シゲラ・ソネイΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB、(b)シゲラ・フレキシネリ2a  ΔtolR、ΔmsbB又はシゲラ・フレキシネリ2a  ΔtolR、ΔhtrB、(c)シゲラ・フレキシネリ3a  ΔtolR、ΔmsbB又はシゲラ・フレキシネリ3a  ΔtolR、ΔhtrB、及び(d)シゲラ・フレキシネリ6  ΔtolR、ΔmsbB又はシゲラ・フレキシネリ6  ΔtolR、ΔhtrBから精製される、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
S.ソネイ菌株が、S.ソネイ53Gである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
S.フレキシネリ菌株が、S.フレキシネリ2457T(2a)、S.フレキシネリ6885(3a)及びS.フレキシネリ10.8537(6)からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
1b及び2bからなる群から選択される少なくとも1種の更なるシゲラ・フレキシネリ菌株を含む、請求項３〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
更なるシゲラ・フレキシネリ菌株が、S.フレキシネリSTANSFIELD(血清型1b)及びS.フレキシネリ69/50(血清型2b)からなる群から選択される、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
4種のGMMAのうちの少なくとも2種が1:4から4:1の比で存在する、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
GMMAの少なくとも75%が、25nmから40nmの範囲内の直径を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
少なくとも1種の医薬担体及び/又は添加剤を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
医薬組成物又はワクチン組成物である、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
動物、特にヒトにおけるシゲラによる感染の予防又は処置において使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物又はワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、シゲラ(Shigella)菌株による細菌感染を原因とする疾病に対する防御をもたらす際に使用するための免疫原性組成物、特にワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌性赤痢は、7百万超の障害調整生命年及び1年に100,000人の死者の原因であり、特に発展途上国の5歳未満の小児において、主要な世界的健康問題である[1、2、3]。細菌性赤痢は、シゲラ属のグラム陰性細菌によって引き起こされ、シゲラ属は、リポ多糖(LPS)の外側の多糖抗原(O抗原、OAg)の構造及び組成に基づき、4種に分けられ、更に50種の血清型に区別される:s.ソネイ(S. sonnei)(1種の血清型)、S.フレキシネリ(S. flexneri)(15種の血清型)、S.ボイディ(S. boydii)(19種の血清型)及び志賀赤痢菌(S. dysenteriae)(15種の血清型)[4]。限られた数の血清型が世界疾病負担の一因となり、地域間及び経時的に変化する[4、5、6、7]。シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)及びシゲラ・フレキシネリ(Shigella flexneri)2aは、現在世界中で優勢な血清型である[4、6]。
【０００３】
臨床の細菌性赤痢の特徴は、発熱、吐き気、食欲不振、脱水、粘液膿及び血性下痢、及びテネスムスを伴う急性結腸大腸炎である。シゲラが原因の赤痢は、発展途上国において、風土病であり、数百万の疾病事例の原因である。例えば、1年に1億2千5百万症例のシゲラによる下痢が存在すると見積もられ、その症例の99%が発展途上国で起こっており、その69%が5歳未満の小児で起こっている。細菌性赤痢による疾病率及び死亡率は、発展途上国の小児の間で特に高い。
【０００４】
シゲラワクチンに対する既存の手法([8]で概説されている)は、経口免疫化のための弱毒生菌株、注射用にコンジュゲートされたOサッカライド、鼻腔内使用のためのプロテオソーム(proteosome)(付着したシゲラLPSを有する髄膜炎菌外膜ベシクル)、鼻腔内使用のためのinvaplex(IpaB、IpaC及びLPSを含むシゲラの細胞内抽出物)、及び解毒LPSを有するΔmsbB菌株から調製された核タンパク質-リボゾーム複合体を基礎とするものであった。これらのワクチンのうちの2種は野外試験で有効であったが、いずれも複数のシゲラ血清型を防御しない。
【０００５】
最も効果的な最近のワクチン候補である、非経口S.ソネイOAgコンジュゲートは、1回の免疫化後の若年成人における同種のS.ソネイ感染に対する74%の防御を示し[9]、2回の免疫化後の3歳未満の小児において71%の有効性を示した[10]。対照的に、ワクチンは、3歳未満の小児において、低い免疫原性と防御の欠如を示した[10]。防御レベルは、同種のOAgを有するS.ソネイLPSに対する抗体反応(抗LPS反応)として測定した、OAgワクチン特異的抗体反応のレベルに匹敵した[10]。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Murray CJ, Vos T, Lozano R, Naghavi M, Flaxman AD, Michaud C, et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 2012;380: 2197-2223.
【非特許文献２】Lozano R, Naghavi M, Foreman K, Lim S, Shibuya K, Aboyans V, et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 2012;380: 2095-2128.
【非特許文献３】Kotloff KL, Nataro JP, Blackwelder WC, Nasrin D, Farag TH, Panchalingam S, et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): a prospective, case-control study. Lancet. 2013;382: 209-222.
【非特許文献４】Livio S, Strockbine NA, Panchalingam S, Tennant SM, Barry EM, Marohn ME, et al. Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development. Clin Infect Dis. 2014;59: 933-941.
【非特許文献５】Levine MM, Kotloff KL, Barry EM, Pasetti MF, Sztein MB. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 2007;5: 540-553.
【非特許文献６】Chang Z, Lu S, Chen L, Jin Q, Yang J. Causative species and serotypes of shigellosis in mainland China: systematic review and meta-analysis. PLoS One. 2012;7: e52515.
【非特許文献７】Vinh H, Nhu NTK, Nga TVT, Duy PT, Campbell JI, Hoang NVM, et al. A changing picture of shigellosis in southern Vietnam: shifting species dominance, antimicrobial susceptibility and clinical presentation. BMC Infect Dis. 2009;9: 204.
【非特許文献８】Kweon, 2008 Curr Opin Infect Dis. 21(3):313-8.
【非特許文献９】Cohen D, Ashkenazi S, Green MS, Gdalevich M, Robin G, Slepon R, et al. Double-blind vaccine-controlled randomised efficacy trial of an investigational Shigella sonnei conjugate vaccine in young adults. Lancet. 1997;349: 155-159.
【非特許文献１０】Passwell JH, Ashkenzi S, Banet-Levi Y, Ramon-Saraf R, Farzam N, Lerner-Geva L, et al. Age-related efficacy of Shigella O-specific polysaccharide conjugates in 1-4-year-old Israeli children. Vaccine. 2010;28: 2231-2235.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、複数の血清型のシゲラを防御するために使用することのできる改良された免疫原性組成物、特にワクチン組成物を提供することが本発明の目的である。より詳細には、特に幼児において、OAgに対してより強く反応するワクチン組成物を提供することが目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第1の態様では、本発明は、シゲラ・ソネイ及びシゲラ・フレキシネリから精製した膜抗原に関する汎用モジュール(GMMA)を含む免疫原性組成物を提供する。特に、GMMAは改変リピドAを含む。特に、改変リピドAは毒性が低いか又はリピドAの解毒形態であり、非限定例として、ペンタアシル化リピドA、アシル基の1つが置換されている天然に存在しないヘキサアシル化リピドA、及び/又はラウロイル鎖がパルミトレオイル鎖で置き換えられているヘキサアシル化リピドAがある。更により詳細には、シゲラ・ソネイGMMAの少なくとも75%は、電子顕微鏡で決定して25nmから40nmの範囲の直径を有する。シゲラ・ソネイGMMAは32nmから38nmの範囲の平均半径(HPLC-SEC MALLSで決定した)を有してもよく、S.フレキシネリGMMAは21nmから28nmの間の平均半径(HPLC-SEC MALLS)を有してもよい。一実施形態では、シゲラ・フレキシネリGMMAは、2a、3a及び6からなる群から選択される少なくとも1つの菌株から精製される。特に、免疫原性組成物は、菌株2a、3a及び6のそれぞれから精製したシゲラ・フレキシネリGMMAを含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、(a)シゲラ・ソネイ、(b)シゲラ・フレキシネリ2a、(c)シゲラ・フレキシネリ3a及び(d)シゲラ・フレキシネリ6から精製したGMMAを含む。特に、GMMAは1:1:1:1の比で存在する。更により詳細には、免疫原性組成物は、100μg/mL未満の濃度でGMMAタンパク質を含む。特に、免疫原性組成物は、菌株2a、3a及び6のそれぞれから精製したシゲラ・フレキシネリGMMA並びに1b及び2b菌株からなる群から選択される少なくとも1種の更なるシゲラ・フレキシネリ菌株から精製したGMMAを含む。特に、免疫原性組成物は、(a)シゲラ・ソネイΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB、(b)シゲラ・フレキシネリ2a  ΔtolR、ΔmsbB、(c)シゲラ・フレキシネリ3a  ΔtolR、ΔmsbB、及び(d)シゲラ・フレキシネリ6  ΔtolR、ΔmsbB又はΔhtrBから精製したGMMAを含む。更により詳細には、シゲラ・フレキシネリ菌株(複数可)は病原性プラスミドをキュアリングされている。組成物は、他のS.フレキシネリ菌株のGMMAも含有してもよい。
【０００９】
特に、免疫原性組成物はアジュバントを含む。更により詳細には、アジュバントは吸着剤である。また更により詳細には、アジュバントは、例えば抗LPS抗体反応によって測定した、GMMAの免疫原性を増強しない吸着剤である。特定のアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム、ALHYDROGEL(登録商標)、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム及びミョウバンを含むアルミニウムアジュバントを含む。
【００１０】
第2の態様では、本発明は、シゲラによる感染に対して患者を免疫化するための方法であって、本発明の第1の態様の免疫原性組成物を患者に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１１】
第3の態様では、本発明は、シゲラによる感染に対して患者を免疫化する方法において使用するための、本発明の第1の態様の組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】1790GAHB(丸)の用量を含有する100μgのタンパク質又は同等の容量の生理食塩水(ひし形)のIM注射後のウサギにおける平均体温上昇(ワクチン接種後-ワクチン接種前の体温の平均)を示すグラフである。縦線は平均の標準誤差を示す。1790GAHBはN=12、食塩水を注射したウサギは6頭。
【図２Ａ】ヒト対象に関する臨床試験において、免疫化投与1、2及び3後に生成した抗S.ソネイLPS抗体レベル(ワクチン接種後のレベルの中央値)を示すグラフである。
【図２Ｂ】ヒト対象に関する臨床試験において、免疫化3の後6カ月の追跡を含む研究全体にわたる抗S.ソネイLPS抗体レベル(ワクチン接種後レベルの中央値)を示すグラフである。
【図３Ａ】被覆抗原として、(A)S.ソネイから精製したLPSを使用するELISAによって評価した1790GAHB、S.フレキシネリ2a、S.フレキシネリ3a及び4価組合せで免疫化した群における抗体分布を示す箱ひげ図である。(A)においてELISA単位がプロットされる。25から75パーセンタイル値を長方形として示し、最小値と最大値をひげとして、中央値を長方形の中の横棒として示す。アッセイの検出限界は、2.2(A)ELISA単位であった。検出限界未満の結果には検出限界の半分の値(Aでは1.1)を割り当てた。
【図３Ｂ】被覆抗原として、(B)S.フレキシネリ3aから精製したLPSを使用するELISAによって評価した1790GAHB、S.フレキシネリ2a、S.フレキシネリ3a及び4価組合せで免疫化した群における抗体分布を示す箱ひげ図である。(B)においてELISA単位がプロットされる。25から75パーセンタイル値を長方形として示し、最小値と最大値をひげとして、中央値を長方形の中の横棒として示す。アッセイの検出限界は、1.6(B)ELISA単位であった。検出限界未満の結果には検出限界の半分の値(Bでは0.8)を割り当てた。
【図３Ｃ】被覆抗原として、(C)S.フレキシネリ2aから精製したLPSを使用するELISAによって評価した1790GAHB、S.フレキシネリ2a、S.フレキシネリ3a及び4価組合せで免疫化した群における抗体分布を示す箱ひげ図である。(C)においてELISA ODが示されている。25から75パーセンタイル値を長方形として示し、最小値と最大値をひげとして、中央値を長方形の中の横棒として示す。(C)で示されたアッセイの平均バックグラウンドODは0.056であった。
【図４Ａ】対数変換した投薬量に対する各群における抗S.ソネイOAg(A)の対数変換した個々の結果を示す散布図である。単一製剤及び4価製剤の並行用量-反応曲線が示されている。(A)S.ソネイ由来のLPSについての1790GAHB及び4価組合せに対する用量-反応曲線。曲線のy切片は有意に異ならず、P=0.31(A)である。
【図４Ｂ】対数変換した投薬量に対する各群における抗S.フレキシネリ3a(B)の対数変換した個々の結果を示す散布図である。単一製剤及び4価製剤の並行用量-反応曲線が示されている。(B)S.フレキシネリ3a由来のLPSについてのS.フレキシネリ3a及び4価組合せに対する用量-反応曲線。曲線のy切片は有意に異ならず、P=0.74(B)である。
【図４Ｃ】対数変換した投薬量に対する各群における抗S.フレキシネリ2a(C)抗体分布のELISA ODの結果を示す散布図である。単一製剤及び4価製剤の並行用量-反応曲線が示されている。(C)S.フレキシネリ2a由来のLPSについてのS.フレキシネリ2a及び4価組合せに対する用量-反応曲線。曲線のy切片は有意に異ならず、P=0.75(C)である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
膜抗原に関する汎用モジュール、すなわちGMMAは、自然免疫反応を活性化する高レベルのLPS、リポタンパク質、タンパク質及び他の抗原を有するグラム陰性細菌の外膜に由来する粒子である。GMMAは、ベシクル産生を増強し、抗原(例えば、リピドA)を除去又は改変するよう突然変異された遺伝子改変細菌株から産生される。増強されたベシクルの自然発生的発生は、例えば、膜統合性の維持に関わるタンパク質の標的欠失によって達成され得る(以下を参照のこと)。GMMAの外表面は、GMMAが由来する細菌の外表面に相当し、膜の文脈において、全ての膜抗原(例えば、リポ多糖、リポオリゴ糖、リポタンパク質、タンパク質を含む)を保存する。GMMAは(界面活性剤により抽出したOMVとは異なり)、GMMAの外膜成分をその天然立体配座及び正しい方向に保持し、GMMAが由来する細菌株に対する免疫原性をよりよく保存する。したがって、GMMAは免疫原性が高く、この自然免疫の強い活性化によって、ヒト対象において受容できない反応、例えば、発熱反応又は、極端な場合には、特に非経口投与の場合の敗血症性ショックを引き起こす場合がある。
【００１４】
本発明は、遺伝子操作を使用して、例えば発熱性のリスクが低減した、低用量でも免疫原性であるGMMAを産生するシゲラ細菌株をもたらすことができるという知見に基づく。本発明者らは、アルミニウムアジュバントを使用することが、GMMAを含む免疫原性組成物のin vivo忍容性を増加させ、更に、例えば発熱性のリスクを低減させるのに有利であることも発見した。結果として、複数のシゲラ細菌株から精製した複数用量のGMMAを組み合わせて、1用量当たり総GMMAタンパク質濃度が100μg/ml以上までの多価免疫原性組成物を調製することができる。文献では、一般的に、発熱を避けるためにOMV含量を低減させることによって、乳児のワクチン接種スケジュールで界面活性剤由来のOMVを含有するワクチンの受容性を妥当なものとすることができることが研究によって調査されていたため、この知見は驚くべきものである。例えば、4CMenBワクチンであるBexseroの研究では、およそ半数の対象が、最初の投与のワクチン接種後38.5℃以上の体温を経験することが観察された[11]。対照的に、本明細書の例で得られた臨床試験データは、100μg/mlのS.ソネイGMMAを含む免疫原性組成物を用いるワクチン接種(4CMenBにおけるOMV含量の4倍の含量)で忍容性が良好であったことを実証している。ヒトにおけるデータは、マウス及びウサギで得られた免疫原性についての結果によって支持される。
【００１５】
シゲラ細菌
本発明は、志賀赤痢菌、S.フレキシネリ、S.ボイディ及びS.ソネイの血清型の1種以上から選択されるシゲラ細菌の使用に基づく。特に、本発明は、S.フレキシネリ及びS.ソネイの血清型から選択される、特にS.ソネイ、S.フレキシネリ2a、S.フレキシネリ3a及びS.フレキシネリ6からなる群から選択されるシゲラの少なくとも2種の菌株の使用に基づく。ある特定の実施形態では、S.ソネイ53G、S.フレキシネリ1b STANSFIELD、S.フレキシネリ2a 2457T、S.フレキシネリ2b 69/50、S.フレキシネリ3a 6885及び又はS.フレキシネリ6 10.8537を使用してもよい。
【００１６】
特に、本発明において使用するシゲラ菌株は、細菌に、細菌複製の間、より多量のGMMAを培養培地中に放出させる崩壊したTol-Pal系を有するΔtolR菌株である。Tol-Pal複合体における他の遺伝子(例えば、TolA)の欠失も、例えばWO 2011/036564に開示されているように予想され得る。
【００１７】
本発明において使用するシゲラ菌株は、野生型菌株に対して1つ以上の更なる変化を含む。特に、本発明で使用する菌株は、htrB、msbB1及び/又はmsbB2の不活性化を生じる1つ以上の突然変異を含む。非限定例として、適切な突然変異を、ΔhtrB、ΔmsbB1及びΔmsbB2からなる群から選択してもよい。簡単に、msbB1とmsbB2の両方の二重欠失は、ΔDmsbBとも称される得る。htrB又はmsbBl及びmsbB2の不活性化は、リピドAのアシル化を低減させる。一部の実施形態では、本発明で使用する菌株は、LPSにおいてO抗原を欠いており、したがって、血清型特異的反応を回避する。S.ソネイでは、病原性プラスミドが除去されるとO抗原が存在しない。他の実施形態では、本発明で使用する菌株は、O抗原を含むLPSを産生する。O抗原の存在は、免疫原性組成物が、血清型特異的及び更なる交差反応性免疫反応の両方を誘発するため有益である場合もある。LPSにおいてヘキサアシル化リピドAが存在しないことが好ましい。病原性プラスミドの損失は、msbB2遺伝子の損失をもたらし、染色体msbBl遺伝子が不活性化され、それによってミリストイルトランスフェラーゼ活性を除去し、LPSにおけるペンタアシル化リピドAをもたらすことができる。S.フレキシネリmsbBの突然変異では、msb2遺伝子を含有する病原性プラスミドが存在しないことが好ましい。本発明において使用する好ましいシゲラ菌株は、ペンタアシル化LPSを有する。或るいは、htrBの不活性化により、ラウロイル鎖の損失が生じ、したがって、いくつかの菌株でペンタアシル化LPSを得、及び/又は野生型リピドAより毒性の低いリピドAを形成することができる。例えば、S.フレキシネリでは、htrBの不活性化は、ラウロイル鎖がパルミトレオイル鎖によって置き換えられているヘキサアシル化リピドAを生じる別の酵素LpxPの活性によって補ってもよい。パルミトレオイル鎖を含むヘキサアシル化リピドAは、野生型リピドAよりも毒性が低い。したがって、一部の実施形態では、本発明は、シゲラ・ソネイ及びシゲラ・フレキシネリから精製したGMMAを含む免疫原性組成物であって、GMMAが、ペンタアシル化リピドA、及び又はヘキサアシル化リピドAを含み、ここで、ラウロイル鎖がパルミトレオイル鎖で置き換えられている、免疫原性組成物を提供する。特に、本発明において使用する適切な菌株は、以下の突然変異を含む(a)シゲラ・ソネイ:ΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB、(b)シゲラ・フレキシネリ2a:ΔtolR、ΔmsbB、(c)シゲラ・フレキシネリ3a:ΔtolR、ΔmsbB、及び(d)シゲラ・フレキシネリ6:ΔtolR、ΔmsbB又はΔhtrB。適切な菌株は、実施例で開示されている。他の適切な菌株は、当技術分野において、例えばWO2011/036564において公知である。シゲラを増殖させるための培養条件は、当技術分野(例えば、参考文献[12]から[14]を参照のこと)において周知である。例えば、シゲラは、有機窒素供給源(例えば、Ala、Arg、Asn、Aspを含有するアミノ酸混合物等;カザミノ酸が使用されてもよい)、炭素供給源としてのグリセロール等を使用して増殖させてもよい。培地中にL-アスパラギン酸を含むことが特に有益であり、窒素及び炭素両方の供給源として機能できる。
【００１８】
S.ソネイでは、O抗原遺伝子は病原性プラスミド上にあり、OAg構成成分はS.ソネイから精製又は単離したGMMAにとって望ましい。したがって、一部の実施形態では、S.ソネイ菌株は、virGを大腸菌(E. coli)由来のnadA及びnadBで置き換えるように突然変異させ、それによって、病原性プラスミドを保持しながらシゲラのニコチン酸栄養素要求性を除去し、プラスミドによってコードされるOAgの産生がニコチン酸を用いない培地での増殖によって確保される。代表的な突然変異S.ソネイ菌株は、以下の改変を含んでよい:ΔtolR::kan  ΔvirG::nadAB  ΔhtrB::cat。
【００１９】
代表的な突然変異S.フレキシネリ菌株は、以下の改変を含んでもよい:ΔtolR::kan  ΔhtrB::cat又はΔtolR::kan  ΔmsbB1::cat。msbB1突然変異だけが、プラスミドをキュアリングした菌株に導入される。プラスミドの除去がmsbBの第2コピー(msbB2)を除去するためである。
【００２０】
膜抗原に関する汎用モジュール(GMMA)
本発明において使用するシゲラ細菌は、その対応する野生型菌株に対して、高ブレブ形成性である、すなわち、シゲラ細菌は、野生型菌株よりも多量のGMMAを培養培地中に放出する。これらのGMMAは、本発明のシゲラワクチンの構成成分として有用である。用語GMMAは、従来の界面活性剤により抽出した外膜ベシクル(dOMV)、及びグラム陰性細菌から自然発生的に放出される天然外膜ベシクル(NOMV)と明確な区別を与えるために使用される。GMMAは、2つの重要な態様においてNOMVと異なる。第一に、GMMA形成を誘導するために、主要構造構成成分をコードする遺伝子、具体的にはtolRの欠失により膜構造が改変されている。第二に、遺伝子改変の結果として、多量の外膜が「出芽(bud off)」(出芽(bud)に対するイタリア語は「gemma」である)し、ワクチン産生のための膜材料の実用的供給源をもたらし、製造容易性増加と有効なコスト低減をもたらす。NOMVは免疫原性研究に使用されてきたが、実用的ワクチンとしては収率が低すぎる。
【００２１】
本発明において使用するS.ソネイGMMAは、典型的には、電子顕微鏡で25nmから140nm、例えば25nmから40nmの直径を有する。GMMAは、二峰性のサイズ分布を有してもよい。例えば、直径25nmから40nmの平均サイズ(EMで)を有する大多数のGMMAと、65nmから140nmの平均サイズを有する粒子の画分。特に、GMMAの少なくとも70%、少なくとも71%,  少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%は、25nmから140nmの直径を有する。
【００２２】
GMMAは、細菌増殖の間、自然発生的に放出され、培養培地から精製することができる。精製は、理想的には、例えば、GMMAは通過させるがインタクトな細菌は通過させない0.2μmフィルター等のフィルターを使用するサイズベースの濾過によって、又は低速遠心分離を使用して懸濁液中にGMMAを残して細胞をペレット化することによって生きた及び/又はインタクトなシゲラ細菌からGMMAを分離することを含む。適切な精製方法が当技術分野で公知である。好ましい2ステップの濾過精製プロセスが、参照により本明細書に組み込まれるWO2011/036562に記載されている。特に2ステップ濾過プロセスを使用して、遠心分離を使用することなく細胞培養バイオマスからGMMAを分離する。
【００２３】
本発明のGMMA含有組成物は、一般的に、生きていよと、又は死滅していようと、細菌全体を実質的に含まない。GMMAのサイズは、GMMAを、例えば典型的には濾過滅菌に使用するように、濾過によって細菌全体から容易に分離することができることを意味する。GMMAは、標準の0.22μmフィルターを通過するが、これらは他の物質によってすぐに目詰まりするので、0.22μmフィルターを使用する前に、減少する孔径の一連のフィルターを通す濾過滅菌の連続ステップを実施することが有益である場合がある。先行するフィルターの例は、0.8μm、0.45μm等の孔径を有するものである。GMMAは細菌から自然発生的に放出され、例えば濾過を使用して、培養培地から分離することが好都合である。外膜ベシクルを形成させる外膜の計画的な崩壊に関与する方法(例えば、デオキシコール酸抽出等の界面活性剤処理、又は超音波処理)によって形成された外膜ベシクルは、本発明の範囲から除かれる。本発明において使用するGMMAは、内膜及び細胞質夾雑物を実質的に含まず、脂質及びタンパク質を含有する。
【００２４】
免疫原性組成物
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも2、3、3、4、5又は6つの異なるシゲラ菌株から精製したGMMAを含んでもよい。特に、免疫原性組成物は、シゲラ・ソネイ及びシゲラ・フレキシネリから精製したGMMAを含む。シゲラ・フレキシネリGMMAは、2a、3a及び6からなる群から選択される少なくとも1種の菌株から精製してもよい。特に、免疫原性組成物は、菌株2a、3a及び6のそれぞれから精製したシゲラ・フレキシネリGMMAを含む。免疫原性組成物は、1b及び2bからなる群から選択される少なくとも1種の菌株から精製したシゲラ・フレキシネリGMMAを更に含み得る。一実施形態では、免疫原性組成物は、(a)シゲラ・ソネイ、(b)シゲラ・フレキシネリ2a、(c)シゲラ・フレキシネリ3a及び(d)シゲラ・フレキシネリ6から精製したGMMAを含む。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、シゲラ・ソネイ53G、シゲラ・フレキシネリ2a 2457T、シゲラ・フレキシネリ3a 6885及びシゲラ・フレキシネリ6 10.8537並びに任意選択でシゲラ・フレキシネリ1b STANSFIELD及び/又はシゲラ・フレキシネリ2b 69/50から精製したGMMAを含む。
【００２５】
少なくとも2種の異なるタイプのGMMAを使用する場合、それらは、1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1又は4:1、好ましくは約1:1の比で存在していてもよい。特に、免疫原性組成物における4種の異なるGMMAのうちの少なくとも2種は、1:4から4:1の比で存在する。少なくとも4種の異なる血清型からのGMMAを使用する場合、それらは、以下の表に提示した選択肢から選択される比、例えば1:1:1:1の比(比の選択肢1)で存在していてもよい。このような比を参照すると、正確な比を有する免疫原性組成物を製剤化することが一般的に困難であること及びいくらかの可変性が存在することが明らかとなる。
【００２６】
2018517729.tif 000002
【００２７】
免疫原性組成物は、単位用量当たり任意の適切な量のGMMAを含んでもよい。用語「単位用量」は、医薬活性成分の量、例えば、健全な医療行為に従って単回用量の投与に適切な、GMMAタンパク質の量を指す。GMMAタンパク質の適切な量は、単位用量当たり0.1から200μg、特に10μg、20μg、25μg、50μg又は100μgであってもよい。単位用量当たり、本発明の水性免疫原性組成物は、200μg/ml未満、100μg/ml未満又はそれ未満、80μg/ml以下、50μg/ml以下、25μg/ml以下、20μg/ml以下、15μg/ml以下、10μg/ml以下の総濃度のGMMAタンパク質を含んでもよい。単位用量当たり、本発明の水性免疫原性組成物は、5μg/mlから200μg/ml、5μg/mlから100μg/ml、10μg/mlから100μg/ml、10μg/mlから80μg/ml、10μg/mlから50μg/ml、25μg/mlから50μg/mlの総濃度のGMMAタンパク質を含んでもよい。単位用量当たり、本発明の免疫原性組成物は、100μg/ml超、80μg/ml超、50μg/ml超、25μg/ml超、20μg/ml超、15μg/ml超又は10μg/ml超の総濃度のGMMAタンパク質を含んでもよい。GMMAの量は、OAg多糖を測定することによって定量することもできる。例えば、タンパク質に対するOAg多糖の比(OAg:タンパク質、w/wについて表される)は、タンパク質1μg当たり0.06から1.1μgのOAg、タンパク質1μg当たり0.65から1.1μgのOAg、タンパク質1μg当たり0.75から1.1μgのOAg又はタンパク質1μg当たり0.85から1.0μgのOAgの範囲であってもよい。特に、S.フレキシネリ2aについては、OAg:タンパク質の比は、タンパク質1μg当たり0.85から1.0μgのOAgであってもよく、S.フレキシネリ3aについては、OAg:タンパク質の比は、タンパク質1μg当たり0.75から1.1μgのOAgであってもよく、S.ソネイ及びS.フレキシネリ6については、OAg:タンパク質の比は、タンパク質1μg当たり0.06から1.0μgのOAg、特にタンパク質1μg当たり約0.06μgのOAgであってもよい。したがって、タンパク質1μg当たり0.75μgのOAgのOAg:タンパク質の比に基づいて、単位用量当たり特定量のGMMAは、上述のように、150〜200μg/mlの範囲であってもよく、タンパク質1μg当たり0.8から1.0μgのOAgのOAg:タンパク質の比に基づいて、単位用量当たり特定量のGMMAは、上述のように、特に、160〜200μg/mlの範囲であってもよい。
【００２８】
それぞれ異なる血清型からのGMMAタンパク質は、0.1から200μg、例えば0.1から80μg、0.1から100μg、特に5から25μgの量で存在していてもよい。それぞれ異なる血清型からのGMMAの適切な量は、単位用量当たり0.1、1、5、10、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90及び100μgを含んでもよい。本発明の免疫原性組成物は、2種以上のシゲラ菌株から精製又は単離したGMMAを含み、緩衝剤等の薬学的に許容される添加剤と混合する前に、GMMAが別々に調製されるのが典型的である。各菌株からのGMMAは、別の菌株から精製又は単離したGMMAと組み合わせ、薬学的に許容される添加剤と混合する前に、ALHYDROGEL(登録商標)等のアジュバントを用いて個別に製剤化されてもよい。或いは、各菌株からのGMMAは、精製/単離し、他の菌株(複数可)から精製又は単離したGMMAと組み合わせ、アジュバントを用いて製剤化し、次いで薬学的に許容される添加剤と混合してもよい。他の方法は、当業者に明らかである。
【００２９】
用語「精製した」及び「単離した」は、一般的に、当技術分野の意味を有するものとする。好ましくは、精製又は単離したGMMAは無細胞調製物であり、更により好ましくは、GMMAは、低いレベル、例えば10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満又は4%未満の細胞質タンパク質の夾雑物を有する。例えば、GMMA産生菌株の可溶化細胞の組成物と比較して、無標識の強度に基づいた絶対定量指数(iBAQ)を用いて高感度質量分析法を使用して測定すると、特に、GMMAにおけるタンパク質含量のほとんど全ては、特に90%超、更により詳細には、95%超、96%超、97%超、98%超又は99%超は、外膜又はペリプラズムの局在タンパク質に由来する。したがって、GMMAにおけるタンパク質含量の95%超は、ペリプラズム又は外膜の局在タンパク質を含む。特に、精製/単離したGMMAは、GMMA産生菌株の総細胞タンパク質と比較して、GMMAにおいて、およそ10倍豊富なペリプラズム及び外膜のタンパク質を含む。
【００３０】
手短に言うと、本発明の免疫原性組成物は、単回又は複数回用量で投与されてもよい。本発明の免疫原性組成物の単回用量は有効であり得る。或いは、1回目の単位用量に続く2回目の単位用量が有効であってもよい。典型的には、2回目(又は3回目、4回目、5回目等)の単位用量は、1回目の単位用量と同一である。2回目の単位用量は、1回目の単位用量の後の任意の適切な時、特に1、2又は3カ月後に投与されてもよい。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、筋肉内に、例えば、以下に記載されているように、大腿又は上腕への筋肉内投与によって投与されるが、皮内又は鼻腔内に投与されてもよい。
【００３１】
本発明の免疫原性組成物は、1種以上のアジュバントを含んでもよい。特定のアジュバントは、アルミニウムアジュバント、例えば水酸化アルミニウム、ALHYDROGEL(登録商標)、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム及びミョウバンを含む。アルミニウムアジュバントの使用は、アジュバントへのGMMAの吸着により発熱反応が低減されるため有利であり、ウサギでは、GMMA単独と比較して100倍多い用量のGMMAを投与させる。発熱反応も低減させる他のアジュバントの使用も予想され、以下に例示する試験を使用して当業者によって特定され得る。用語「アジュバント」は、本件では、一般的に、抗原に対する免疫反応を増大させる任意の物質を指すが、仮定に拘泥されることを望むものではなく、ALHYDROGEL(登録商標)等のアジュバントは、GMMAに対する免疫反応を低減させる吸着剤でもある。したがって、用語「吸着剤」は、結合、付着又は吸着されていないGMMAと比較して、GMMAに対する発熱反応が低減するように、GMMAが結合、付着又は吸着してよい(例えば、ファンデルワールス相互作用又は水素結合により)固体基質又は材料を指す。非限定例として、GMMAの免疫原性は、抗LPS抗体反応と比較することによって測定されてもよい。
【００３２】
薬学的方法及び使用
本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体を更に含んでもよい。典型的な「薬学的に許容される担体」は、それ自体が、組成物を受ける個体に対して有害な抗体の生成を誘導しない任意の担体を含む。適切な担体は、典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、ショ糖、トレハロース、ラクトース、及び脂質凝集体(油滴又はリポソーム等)等の大きく、ゆっくりと代謝される高分子である。このような担体は当業者に周知である。本発明の免疫原性組成物は、希釈剤、例えば水、食塩水、グリセロール等を含有してもよい。更に、補助剤、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質等が存在していてもよい。リン酸緩衝食塩水中のリン酸がアルミニウムへのGMMAの結合を妨げる場合があるため、特に、アルミニウムアジュバントを使用する場合は、滅菌発熱性物質除去Tris緩衝生理食塩水が好ましい担体である。
【００３３】
組成物を、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製してもよい。注射の前に液体ビヒクル中の溶液、又は懸濁液に適した固体形態を調製することもできる(例えば、凍結乾燥組成物又は噴霧凍結乾燥組成物)。組成物を、局所投与用、例えば軟膏、クリーム剤又は粉剤として調製してもよい。組成物を、経口投与用、例えば錠剤若しくはカプセル剤として、噴霧剤として、又はシロップ剤(任意選択で着香されている)として調製してもよい。組成物を、肺内投与用、例えば微粉末又は噴霧器を使用する吸入剤として調製してもよい。組成物を、坐剤又は膣坐剤として調製してもよい。組成物を、経鼻、耳内又は点眼投与用、例えば滴剤として調製してもよい。組成物は、組み合わせた組成物が、哺乳動物への投与の直前に再構成されるように設計されたキットの形態であってもよい。このようなキットは、液体形態の1種以上の抗原及び1種以上の凍結乾燥抗原を含んでもよい。組成物はバイアル中に存在してもよく、又は組成物は充填済みシリンジ中に存在していてもよい。シリンジは、針有り又は無しで供給されてもよい。シリンジは単回用量の組成物を含むが、バイアルは単回用量又は複数回用量を含む場合がある。
【００３４】
本発明の水性組成物は、凍結乾燥形態から他のワクチンを再構成するのにも適している。本発明の組成物がこのような即席の再構成に使用される場合、本発明は、2つのバイアルを含んでもよく、又は1つの充填済みシリンジ及び1つのバイアル(シリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性させるために使用される)を含んでもよいキットを提供する。
【００３５】
本発明の組成物は、単位用量形態で又は複数用量形態で包装されてもよい。複数用量形態では、プレフィルドシリンジよりもバイアルが好ましい。効果的な投薬容量は、日常的に確立されるが、組成物の典型的なヒト用量は、例えば筋肉内注射で、0.5mlの容量を有する。
【００３６】
組成物のpHは、好ましくは6から8の間、好ましくは約7である。アセチル化O抗原を含む組成物では、特に、組成物のpHは、7未満、好ましくは約6(エステル分解の速度を遅くするために)である。安定したpHは、緩衝剤の使用によって維持されていてもよい。本発明の免疫原性組成物は、Tris[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]緩衝剤を含んでもよい。Tris緩衝剤は、約1〜20mMの[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]、例えば、1.25mM、2.5mM、5.0mM又は10.0mMを含んでもよい。アセチル化O抗原を含む組成物では、特に、緩衝剤はTris緩衝剤ではない。本発明の免疫原性組成物は、5〜20mMのコハク酸緩衝剤、例えば、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM又は20mMを含んでもよい。本発明の免疫原性組成物は、5〜20mMのヒスチジン緩衝剤、例えば、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM又は20mMを含んでもよい。組成物は無菌である。本発明の組成物は、ヒトに関して等張であってもよい。
【００３７】
したがって、本発明の組成物は、ワクチンとして有用であり得る。本発明によるワクチンは、予防的(すなわち、感染症を予防するため)であっても又は治療的(すなわち、感染症を処置するため)であってもよいが、典型的には、予防的である。用語「感染症に対して防御した」は、対象の免疫系が、免疫反応を誘発し、感染症を撃退するために準備刺激された(例えばワクチン接種によって)ことを意味する。したがって、ワクチン接種された対象は感染するかもしれないが、対照対象よりも感染症を容易に撃退することができることは、当業者にとって明らかである。用語「処置すること」は、目的が感染症を予防する又は弱めることである、治療的処置並びに予防的若しくは予防としての処置の両方を含む。例えば、処置することは、例えば、感染症に直接影響を与えること若しくは感染症を治すこと、抑制すること、阻害すること、予防すること、感染症の重症度を低減させること、感染症の発症を遅らせること、感染症に伴う症状を低減させること、又はその組合せを含んでもよい。「予防すること」は、とりわけ、症状の発症を遅らせること、疾患の再発を予防すること等を指す。処置することはまた、感染症又は疾病を「抑制すること」又は「阻害すること」、例えば症状の重症度、数、発病率若しくは潜伏を低減させること、症状を軽快させること、二次症状を低減させること、二次感染を低減させること、患者の生存を延長すること、又はその組合せを含んでもよい。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原、及び必要であれば、任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」によって、個体へのその量の投与は、単回用量で又は一連の用量の一部としてのいずれかで、処置又は予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康及び身体的状態、年齢、処置される個体の分類学上の群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類等)、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の防御度、ワクチンの配合、医学的状況についての担当医の評価、及び他の関連因子に応じて変わる。この量は、通常の試験によって決定され得る比較的広い範囲内にあることが期待される。
【００３８】
本発明の組成物は、特に複数回用量形式で包装された場合、抗菌剤を含んでもよい。本発明の組成物は、等張性を与えるためにナトリウム塩(例えば、塩化ナトリウム)を含んでもよい。10±2mg/mlの濃度のNaClが典型的である。一部の実施形態では、4から10mg/mlの濃度、例えば9.0、7.0、6.75又は4.5mg/mlのNaClが使用されてもよい。本発明の組成物は、一般的に、緩衝剤を含む。
【００３９】
処置方法
本発明は、哺乳動物の免疫反応を上昇させるための方法であって、本発明の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法も提供する。免疫反応は、好ましくは防御的であり、好ましくは抗体を含む。この方法は、ブースター反応を上昇させてもよい。
【００４０】
哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防的使用のためである場合、ヒトは、成人、小児(例えば、幼児若しくは乳児)又はティーンエージャーであってもよく、ワクチンが治療的使用のためである場合、ヒトは好ましくは小児である。小児向けワクチンは、安全性、投薬量、免疫原性等を評価するために成人に投与されてもよい。処置に対するヒトの好ましい分類は、妊娠可能年齢(例えば、ティーンエージャー及びそれより上の年齢)の女性である。別の好ましい分類は、妊娠した女性である。
【００４１】
本発明は、医薬として使用するための本発明の組成物も提供する。医薬は、好ましくは哺乳動物の免疫反応を上昇させることができ(すなわち、それが免疫原性組成物である)、より好ましくはワクチンである。
【００４２】
本発明は、哺乳動物の免疫反応を上昇させるための医薬の製造における本発明の組成物の使用も提供する。
【００４３】
これらの使用及び方法は、好ましくは、シゲラを原因とする疾病、例えば細菌性赤痢、赤痢及び下痢、発熱、腹痛、テネスムス等を含む関連する症状の予防及び/又は処置のためのものである。これらの使用及び方法は、好ましくは、シゲラ・ソネイとシゲラ・フレキシネリの両方を原因とする疾病の予防及び/又は処置のためのものである。
【００４４】
本発明の組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接的な送達は、非経口注射によって(例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、又は組織の間質腔に)、又は直腸内、経口、膣内、局所、経皮、鼻腔内、点眼、耳内、肺内若しくは他の粘膜投与によって達成されてもよい。大腿又は上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は針(例えば、皮下注射針)を介してであってもよいが、無針注射を代わりに使用してもよい。典型的な筋肉内用量は、0.5mlである。ヒト投与のために、用量は、タンパク質で測定して約100μgであってもよく、例えば1ml当たり200μgタンパク質の濃度で0.5ml用量で送達されてもよい。本発明を使用して、全身及び/又は粘膜免疫を誘発することができる。投薬処置は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであり得る。複数回投与を、一次免疫化スケジュールで及び/又はブースター免疫化スケジュールで使用してもよい。一次投与スケジュールの次にブースター投与スケジュールを行ってもよい。プライミング投与間(例えば、4〜16週間の間)、及びプライミングとブースティングの間の適切なタイミングは、日常的に決定することができる。
【００４５】
全般
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」及び「からなる(consisting)」を包含し、例えばXを「含む(comprising)」組成物は、排他的にXからなってもよく、又は付加的なものを含んでもよい(例えば、X+Y)。
【００４６】
語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。必要であれば、語「実質的に」は、本発明の定義から省略されていてもよい。
【００４７】
特筆しなければ、2種以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、混合についていずれの特定の順序も要求しない。したがって、成分は任意の順序で混合され得る。3種の成分が存在する場合、2種の成分を互いに組み合わせることができ、次いでその組合せを3番目の成分等と組み合わせてもよい。
【００４８】
他に記載がなければ、ポリペプチド配列間の同一性は、好ましくは、パラメータギャップ・オープン・ペナルティ=12及びギャップ・エクステンション・ペナルティ=1を有するアフィンギャップ検索を使用するMPSRCHプログラム(Oxford Molecular)において実施されるSmith-Watermanホモロジー検索アルゴリズムによって決定される。
【００４９】
他に示されていなければ、本発明の実行には、当技術分野の技術の範囲内で、化学、生化学、分子生物学、免疫学及び薬理学の従来法が用いられる。このような技術は文献で十分に説明されている。
【００５０】
一部の実施では、用語「含むこと(comprising)」は、記載されたポリペプチド又はGMMA等の示された活性剤を含むこと、並びに医薬産業で知られている他の活性剤、及び薬学的に許容される担体、添加剤、軟化剤、安定剤等を含むことを指す。一部の実施では、用語「から本質的になる(consisting essentially of)」は、唯一の活性成分が示された活性成分(複数可)であるが、配合を安定化する、維持する等のためであるが、示された活性成分の治療的効果に直接関与しない他の化合物を含んでもよい組成物を指す。移行句「から本質的になる(consisting essentially)」は、ある請求項の範囲が、その請求項に記載された特定の材料又はステップと、特許請求された発明の基本的且つ新規な特徴(複数可)に物質的な影響を及ぼさないものとを包含するものと解釈されるべきであることを意味する。In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (原文において強調)を参照のこと、MPEP  §  2111.03も参照のこと。したがって、この発明のある請求項で使用される場合の用語「から本質的になる(consisting essentially of)」は、「含む(comprising)」と同等であるた解釈されることを意図しない。用語「からなる(consisting of)」及びその変形は、他に明示的に特定されていなければ、含み、それらに限定される(including and limited to)を含む。用語「約」は、数値xに関して、例えば、x+10%、x+5%、x+4%、x+3%、x+2%、x+1%を意味する。
【実施例】
【００５１】
発明を実施するための形態
S.ソネイ菌株の生成
S.ソネイ53G [15]を親株として選択した。S.ソネイ菌株NVGH1859(S.ソネイ53G  ΔtolR::kan  ΔvirG::nadAB)を、S.ソネイ53G  ΔtolR::kan[17]のプラスミドにコードされたvirG遺伝子[16]を大腸菌由来の遺伝子nadA及びnadB[18]で置き換えることによって得た。virGの上流及び下流領域を、プライマー対virGup-5/virGup-3(上流)及びvirGdown-5/virGdown-3(下流)を使用して増幅した(表1)。「nadAB」カセットは、プライマー対nadA-5/nadA-3及びnadB-5/nadB-3(表1)を使用して大腸菌由来のnadA及びnadBを増幅することによって生成した。nadAとnadBを連結させ、virGの隣接領域で挟むように、断片をpBluescript(Stratagene)に挿入した。置き換えた構築物(virGup-nadAB-virGdown)を、プライマーvirGup-5/virGdown-3を使用して増幅し、以前に記載した組換えを起こしやすいS.ソネイΔtolR::kan[17]を形質転換するために使用した。
【００５２】
S.ソネイ菌株NVGH1790(S.ソネイ53G  ΔtolR::kan  ΔvirG::nadAB  ΔhtrB::cat)を、htrB遺伝子[19]をRossi et al.[20]に記載されているクロラムフェニコール耐性遺伝子catで置き換えることによってNVGH1859から生成した。
【００５３】
【表１】
2018517729.tif 000003
【００５４】
S.フレキシネリ2a菌株の生成
S.フレキシネリ突然変異体を、J Biol Chem. 2014 Sep 5; 289(36): 24922-24935に以前に記載されているように調製した。S.フレキシネリ2a 2457Tを親株として選択した。病原性プラスミドを有さないS.フレキシネリ2a由来の突然変異体の生成のために、遺伝子改変の開始前に、白色コロニーをコンゴーレッド寒天培地上の白色の外観によって選択した。病原性プラスミド(pINV)のキュアリングを、PCRを使用して、複製起点(ori)並びにプラスミドにコードされた遺伝子virG及びospD3が存在しないことによって確認した。プライマーを表2に列挙する。S.フレキシネリ2aにおけるtolRの欠失及びプラスミドをキュアリングしたS.フレキシネリ2a-pINVを生成するために、S.ソネイΔtolR突然変異体(2)の生成のために以前に記載したのと同じ戦略及びプライマーを使用した。
【００５５】
msbB1又はhtrBのヌル変異体を、以下の戦略を使用して、目的の遺伝子を抗生物質耐性カセットで置き換えることによって得た。上流及び下流領域を、プライマー対gene-U及びgene-Dを使用して増幅した。遺伝子を置き換えるために使用した耐性カセットをプライマー対EcoRV.Ery.F/EcoRV.Ery.R又はEcoRV.Cm.F/EcoRV.Cm.Rを使用して増幅した。抗生物質耐性遺伝子が遺伝子の隣接領域で挟まれるように、断片をpBluescript(Stratagene)に挿入した。置き換えた構築物(上流領域-耐性カセット-下流領域)を、遺伝子の上流隣接領域の5'末端及び下流隣接領域の3'末端に結合するプライマー(表2を参照のこと)を使用して増幅し、S.フレキシネリを形質転換するために使用した。S.フレキシネリ2aでは、msbB1及びhtrBをcatで置き換えた。msbB1突然変異だけが、プラスミドをキュアリングした株に導入するために必要とされた。プラスミドがmsbBの第2コピー(msbB2)を保有し、これはプラスミドをキュアリングした株には存在しないためである。簡単に、突然変異体をΔmsbBと称する。S.フレキシネリ2a菌株NVGH2404(S.  フレキシネリ2457T  ΔtolR::kan,  ΔmsbB::cat)を生成した。
【００５６】
【表２】
2018517729.tif 000004
【００５７】
S.フレキシネリ1b、2b、3a及び6の生成
S.フレキシネリ1b、2b、3a及び6突然変異体を[32]に記載されている方法を採用することによって調製した。
【００５８】
菌株
シゲラ・フレキシネリ1b STANSFIELD、シゲラ・フレキシネリ2b 69/50、シゲラ・フレキシネリ3a 6885及びシゲラ・フレキシネリ6 10.8537を親株として選択した。病原性プラスミドを有さない突然変異体の生成のために、遺伝子改変の開始前に、白色コロニーをコンゴーレッド寒天上の白色の外観によって選択した。病原性プラスミド(pINV)のキュアリングを、PCRを使用して、プラスミドにコードされた病原性遺伝子、特にvirG(プライマー88/89)及びmxiA(プライマー53/54)が存在しないことによって確認した。プライマーを表3に列挙する。
【００５９】
S.フレキシネリ1b、2b、3a及び6におけるtolRの欠失を生成するために、カナマイシンカセットをプライマー45/46(表3)を使用してプラスミドpKD4[32]から増幅した。プラスミドpKD46又はpAJD434を保有する菌株中のtolR遺伝子の置換えをPCR(プライマー39/40)によって確認した。抗生物質選択マーカーの除去を、プラスミドpCP20を使用して、[32]に記載されているように実施した。これらの菌株中のhtrB及びmsbB遺伝子の欠失に対して、プラスミドpKD3(プライマー45/46)からのPCRによって得られるクロラムフェニコールカセットの増幅のために、それぞれプライマー49/50及び51/52を使用して、同じ戦略を使用した。或いは、htrB及びmsbBの置換えを、それぞれプライマー78-81及び74-77(表3)によるクロラムフェニコールカセットの増幅から得られた断片を使用して行った。htrB及びmsbB遺伝子の置換えを、それぞれプライマー82/83及び55/56を使用するPCRによって確認した。クロラムフェニコール選択マーカー(cat)を[32]に記載されているように除去した。S.フレキシネリ3a株  NVGH2766(S.フレキシネリ6885  ΔtolR::kan,  ΔmsbB::cat)を生成した。
【００６０】
【表３】
2018517729.tif 000005
【００６１】
シゲラ増殖条件
シゲラ・ソネイ及びシゲラ・フレキシネリのGMMA産生菌株は、通常、炭素供給源としてグルコースを有するS.ソネイDefined Medium(SSDM, [17])で培養した。SSDMは以下のように調製した:13.3g/kgのKH2PO4、4g/kgの(NH4)2HPO4、1.7g/kgのクエン酸一水和物、2.5g/kgのL-アスパラギン酸、493mg/kgのMgSO4*H2O、2.7mg/kgのCo(NH3)6Cl3、15mg/kgのMnCl2*4H2O、1.5mg/kgのCuCl2*H2O、3mg/kgのH3BO3、2.5mg/kgのNa2MoO4*2H2O、2.5mg/kgの酢酸亜鉛一水和物、0.49mg/kgのクエン酸第二鉄、50mg/kgのチアミン。グルコースは、固体培地に対して5g/kgの濃度で添加し、フラスコの培地を振盪した。発酵器での増殖のために、27.3g/kgのグルコース及び0.25g/kgのポリプロピレングリコール(PPG)を添加した。固体SSDMは18g/Lの寒天を含有した。シゲラ・フレキシネリの培地には、更にアミノ酸、ビタミン、及び高濃度の鉄を補充した。
【００６２】
セルバンキング
伝達性海綿状脳症(TSE)又は他の外来性作用因子による夾雑のリスクを最小限にするために、S.ソネイ細胞株を、SSDMを用いて調製した寒天プレート上での3継代培養により、GMPの下で清浄化した、及びS.フレキシネリ株も同様に清浄化する。GMPマスター及び又はワーキングセルバンクバイアルを調製する。
【００６３】
細菌又はGMMAのフローサイトメトリー
発酵器又はフラスコスケールの培養からのシゲラ細菌を、0.5%のホルムアルデヒド中で固定することによってフローサイトメトリー分析のために保存した。9×104から9×105個の細胞を、シゲラ血清型についてALHYDROGEL(登録商標)を配合したGMMAに対して上昇したO抗原(OAg)又はポリクローナルマウス抗血清と反応する、一価ウサギ抗血清(デンカ生研株式会社)で染色した。結合した抗体を、フルオレセインコンジュゲートF(ab')2断片ヤギ抗ウサギ又は抗マウスIgG、IgM又はIgA(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)を使用して検出した。試料を4%のホルムアルデヒドを使用して固定し、FACScanto(商標)IIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して分析した。データは、FlowJoソフトウェア(Tree Star Inc.)を使用して処理した。
【００６４】
GMMA産生
以下の記載は、S.ソネイ1790-GMMAの産生に基づく。プロセスがS.フレキシネリからのGMMAの産生と異なる場合、更なる指示が与えられる。
【００６５】
発酵
各産生バッチに対して、リサーチ又はGMPセルバンクからのシゲラ菌株を、600nmで測定した光学密度(OD600)が0.02から開始し、培地のOD600が1.5±0.5に等しくなるまで(通常は9±2時間)、SSDM中、30℃で撹拌しながら(200rpm)、振盪フラスコ内で増殖させた。バイオリアクター(Sartorius社のBiostat D75 Bioreactor中30Lのスケール、又はLP35 Bioengineering Bioreactor中25Lのスケール)中で、制御された培養条件:28%のNH4OHの添加によりpH6.7に保たれ、30℃、1分間当たり培地量当たりの通気量(vvm)が1のエアフローで30%の飽和を保って溶解された酸素、撹拌及び圧力のカスケード(200〜800rpm、50〜1250mbarg)で、2%の接種サイズから開始して最終OD600が35まで、菌株をバッチモードで培養する。
【００６６】
精製
発酵ブロスに放出されたGMMAを2つの連続するタンジェンシャルフローフィルトレーション(TFF)ステップを使用して精製した:GMMAを含有する培養上清を細菌から分離する精密濾過、及びGMMAを可溶性タンパク質から分離する限外濾過。精密濾過ステップでは(1.2m2の0.2μm孔径セルロース膜)、バイオリアクターをTFFシステムに接続して、再循環タンクとして発酵容器を使用した。培養上清を最初に3回濃縮し、「1容量」の濃縮上清とし、続いて増殖培地中の緩衝剤(13.3g/kgのKH2PO4、4g/kgのNH4HPO4、1.7g/kgのクエン酸、4mL/LのNH4OH、pH 6.7)5容量に対する断続的な透析を行った。生理食塩水を使用することもできる。次いで、GMMAを含有する精密濾過した材料を、0.45μmのフィルターカプセル、次いで0.2μmのフィルター(Sartorius)を通して濾過し、更なる処理の前にいかなる生存可能なシゲラ細菌も存在しないことを確保した。限外濾過ステップ(1.4m2の300kDa孔径PES膜)は、濃縮、続いて、10容量のTris緩衝食塩水(TBS)、0.9%のNaCl、10mMのTris/Tris HCl pH 7.4又は0.9%w/vの塩化ナトリウムに対して精密濾過したGMMA溶液の連続透析、並びに核酸及び可溶性タンパク質の可能な実質的除去からなった。精製したGMMAの最終濃度は、製剤化プロセスに必要な濃度を得るために実施され、GMMAバルクに関する抽出可能性、溶出可能性及び細菌保持能について検証されたSartorius社の酢酸セルロース滅菌フィルターを通して濾過した。S.ソネイGMMAの3つの非GMPコンシステンシーバッチを、30Lの発酵体積から調製した。更に、2つのGMPロットを産生し、毒物学及び臨床ワクチンの更なる製造を支持するためにリリースした。S.ソネイGMMAのバルクを、外観、同一性、総タンパク質含量及び可溶性タンパク質含量、O抗原含量、LPS含量、pH浸透圧、純度及びサイズについて試験した。
【００６７】
製剤化
GMMA懸濁液を室温で2時間絶えず撹拌しながらALHYDROGEL(登録商標)に添加し、続いてバイアルに入れることによって、GMMAを水酸化アルミニウム(ALHYDROGEL(登録商標)2%、Brenntag Biosector, Denmark)に吸着させた。GMMA ALHYDROGEL(登録商標)製剤は、TBS中に12.7μg/mLのS.ソネイO抗原、200μg/mLのGMMAタンパク質及び0.7mg/mLのALHYDROGEL(登録商標)としてのアルミニウム-III-イオン(Al3+)を含有する。ヒスチジン緩衝剤を使用することもできる。製剤を、3mLの単回用量バイアル当たり0.7mL分注した。製剤を、同一性、総タンパク質含量、アルミニウム含量、抽出可能体積、非吸着タンパク質、視覚による外観、pH、浸透圧、無菌性、免疫原性、及び発熱性について試験した。
【００６８】
S.ソネイ1790GAHBの3つのGMPロット、毒性学ロット及び2つの臨床ロットを調製し、リリースした。小さい(140mL)非GMP安定性ロットも生成した。新たに製剤化した小さいスケールの実験室バッチを最初の発熱性及び免疫原性研究のために製造した。
【００６９】
GAHB-プラセボのGMP製剤化
希釈剤としても使用されるプラセボ(TBS中にALHYDROGEL(登録商標)として0.7mg/mLのAl3+を含有する)を調製し、3mLバイアル当たり0.7mLで分注した。ヒスチジン緩衝剤を使用することもできる。GAHB-プラセボを、同一性、アルミニウム含量、抽出可能体積、視覚による外観、pH、浸透圧、無菌性及び発熱性について試験した。2つのGAHB-プラセボのGMPロットを製造し、リリースした。
【００７０】
物理化学分析方法
GMMAのタンパク質定量
菌株NVGH1790から産生されたGMMAを1790-GMMAと呼ぶ。タンパク質定量は、通常、Lowryアッセイによって実施した。GMMAのタンパク質濃度を決定するために、アッセイは、定量的アミノ酸分析で決定したタンパク質含量に関する一次1790-GMMA基準に対し、以前に[28]に記載されているように較正した二次BSA基準を使用した。したがって、全てのGMMAタンパク質濃度は、アミノ酸分析によって決定したタンパク質濃度を間接的に基準としている。Trisを含有する試料を希釈して、Lowryアッセイにおける干渉を避けるために最終Tris濃度を1mM以下とした。GMMAタンパク質定量のために、microBCAアッセイを使用することもできる。
【００７１】
ALHYDROGEL(登録商標)を用いて製剤化したGMMAのタンパク質定量
ALHYDROGEL(登録商標)に吸着したGMMA(例えば、1790GAHB)のタンパク質定量のために、Lowry又はmicroBCAも使用し、二次BSA基準をALHYDROGEL(登録商標)に吸着させた。発色現象の後、試料を遠心分離して、上清の吸光度を決定した。GMMA調製物に吸着されなかった可溶性タンパク質を、定量的アミノ酸分析で定量した一次可溶性タンパク質基準に対して較正した二次BSA基準を使用して、186,000gで4℃で2時間限外濾過した後のALHYDROGEL(登録商標)製剤の上清中で決定した。
【００７２】
ALHYDROGEL(登録商標)に吸着されたGMMA中の非結合タンパク質含量は、少なすぎてLowry又はmicroBCAで測定することができず、試料を遠心分離した後に回収した上清のSDS-PAGE(10%のビスアクリルアミドゲル)による限界試験として評価し、並行レーンを流れる基準1790-GMMAと比較した。タンパク質のバンドは、銀染色によって可視化し、濃度測定によって定量し、データをImageScanner IIIソフトウェアを使用して分析した。上清試料中の検出可能なバンドの強度を、1790-GMMA試料中の対応するバンドの強度と比較した(限界試験)。限界は、5μg/mLの非吸着タンパク質に相当する(1790GAHB製剤の総タンパク質の2.5%)。
【００７３】
GMMAタンパク質プロファイル
1790-GMMAを、SDS(Invitrogen、LDS NuPAGE試料緩衝剤)及び50mMのジチオトレイトール(DTT)を含有するドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)試料緩衝剤において100℃で10分間変性させた。3μgのタンパク質を10%(wt/vol)のポリアクリルアミドゲル(Invitrogen、Novex 10%)にロードした。3-(N-モルホリノ)-プロパンスルホン酸(MOPS)緩衝剤(Invitrogen)中で40mAで75分間、電気泳動を実施した。分離したタンパク質をブリリアントブルーG-コロイダルクマシー(Sigma-Aldrich)で染色し、濃度測定を使用して定量し、ImageScanner IIIソフトウェアを使用して分析した。試験試料のタンパク質プロファイルを、同じゲル上に電気泳動した基準GMMAのプロファイルと比較した。
【００７４】
GMMAにおけるO抗原定量
詳細な特徴付け及びロットリリースアッセイのために、O抗原(OAg)濃度をHPAEC-PAD分析により測定した。定量は、試料中に存在する総OAgのmg重量を決定する。
【００７５】
O抗原参照基準:S.ソネイNVGH1859(1859-GMMA)由来のGMMAを1%酢酸中で100℃で2時間加水分解した。切断したリピドAと沈殿したタンパク質は、遠心分離によって両方除去した[21]。OAgの主な画分(中間分子量、MMW)をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC、GE Sephacryl S-100HRカラム)によって回収した。OAgサイズを1H-NMRによって繰り返し単位の数を測定することによって決定した[22]。平均は33であった。O抗原の量を繰返し単位の平均数、及び上述し、以下のLPS定量で記載されているように、HPAEC-PAD分析によって測定されたガラクトースによるLPSコアのモル濃度から決定した。代替として、OAgの定量は、内部標準としてマレイン酸を使用する定量的1H-NMR(qNMR)によって実施し得る。
【００７６】
GMMAにおけるO抗原の定量:LPSを以下のようにしてホットフェノール-水抽出[23]によって精製した:400μLの試料を、同等の体積の90%フェノールpH8溶液(Sigma-Aldrich)に添加し、80℃で2時間インキュベートした。4℃まで冷却した後、試料を18000gで4℃で15分間インキュベートし、LPSを含有する上部水相を回収した。フェノール相を再度400μLの水で抽出し(80℃で1時間)、遠心分離(18000gで4℃で15分間)後、水相を回収し、最初の水抽出物と合わせ、遠心エバポレーター中で終夜乾燥させた。試料を水(400μL)中で再構成し、最終的に水で希釈して2.5から30μg/mLの間の濃度のO抗原を得た。上述のようにガラクトースを使用して測定したLPSコアの回収率によって判断すると、LPS収率は90%より多かった。LPSをアルカリ加水分解反応に供し、Vi多糖について報告されたように[40]HPAEC-PAD分析によって糖を測定し、O抗原参照基準と比較した。
【００７７】
GMMAにおけるLPSの定量
HPAEC-PAD分析によるコア糖ガラクトースの定量的決定[21]を使用して、コア当たり2つのガラクトースに基づき[22]、1790-GMMAにおけるLPSの量を定量した。定量は、LPS分子のモル数を決定する。ガラクトースの標準的希釈系列を各分析において実行する。1790-GMMA及びガラクトース標準を2Mのトリフルオロ酢酸で100℃で4時間同時に処理する。試料を2〜8℃で冷やし、終夜乾燥させ、水に再度溶解させ、濾過して分析する。HPAEC-PADをCarboPac PA10カラム及びPA10 guardカラムを使用してDionex ICS3000で実施する。分離は、18mMのNaOHで溶出する均一溶媒条件を使用して実施する。S.フレキシネリのGMMAについて、LPSの定量のための一般的方法として、リピド構造中にエステルとして存在する3-ヒドロキシ脂肪酸の定量を使用する。試料のアルカリ加水分解反応とそれに続くHPLC-RP-QqQ(SRM)によって、較正曲線を製作するために3OH脂肪酸標準を使用して定量を実施する。
【００７８】
GMMAにおけるLPSサイズ分布
スクリーニング目的として、SDS-PAGE分析を使用してもよい。LPSは、改変を加えたフェノール-水方法(上記を参照のこと)を使用して精製した。GMMA(1mg/mL)を3分間沸騰させ、0.5μg/μLのプロテイナーゼK(Sigma Aldrich)を用いて60℃で終夜インキュベートし、pH8.0の飽和フェノール(Sigma Aldrich)を用いて1:1(vol/vol)で混合し、70℃で30分間インキュベートし、室温で10,000gで1時間遠心分離した。上部相を回収し、100%エタノールを用いて2:1(vol/vol)で混合し、LPSを-80℃で1時間沈殿させ、室温で12,000gで30分間遠心分離することによってペレット化した。ペレットをSpeedVacを使用して乾燥させ、水に溶解させ、LPSを12%ビス-トリスポリアクリルアミドゲル(Life technologies)で電気泳動し、Silver Quest(商標)銀染色キット(Life technologies)を使用して染色した。より正確な特徴付けのために、HPLC-SECを使用してよい。リピドA及びタンパク質を1%酢酸加水分解(2時間  100℃)/低速遠心分離(14000rcf 5分)によって試験試料から除去し、乾燥した(又は脱塩した)上清を、屈折率検出器を備えたTSK-GEL(登録商標) 3000 PWカラムを使用するHPLCに注入する。分子サイズをMW標準デキストランを使用するGPCソフトウェアによって決定する。試料をセミカルボジド(semicarbozide)を用いて誘導体化する場合、得られるピークを使用してOAgの量を確認することができる。
【００７９】
細菌又はGMMAにおけるリピドAのMALDI-TOF分析
マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI_TOF)方法によるリピドAの同一性アッセイにより、LPS中のリピドAのタイプを決定する。100℃で2時間1%酢酸を用いる緩やかな酸加水分解を使用して、以前に記載したように[20]、リピドAをGMMA又は細菌セルバンクから沈殿させた。試料を14,000gで15分間遠心分離し、ペレットを水に再懸濁させ、水で2回洗浄した。Speedvacを使用してペレットを終夜乾燥させ、クロロホルム-メタノール4:1中に再懸濁させ、同等の体積のSuper DHB(Sigma-Aldrich)の水/アセトニトリル1:1(vol/vol)中溶液と混合した。2μLの混合物を標的プレート(MTP 384 target plate ground steel BC、Bruker Daltonics)にロードし、リフレクトロンイオン-ネガティブモードでUltraflex MALDI-TOF(Bruker Daltonics)によって分析した。Super DHB溶液と混合したペプチド較正標準(Bruker Daltonics)は、各分析において含まれた。m/z比は、ペプチド標準と比較してFlex Analysisソフトウェアで決定した。リピドAの種を、試料に対して期待される分子ピーク質量m/zの比較によって特定する。
【００８０】
GMMA粒子サイズ
動的光散乱により、Malvern Zetasizer Nano ZS(商標)を使用してGMMAのサイズ分布が決定される。粒子サイズ分布を、材料設定として「タンパク質」及び「一般的目的(通常の解像度)」に関して、173°の後方散乱光の3つの異なる測定値のz-平均値を使用して散乱光の強度として得た。この技法によって得た直径は、測定された粒子と同じ移動拡散係数を有する球のものである。電子顕微鏡で測定したものと異なることが期待されるサイズは、粒子サイズの範囲と製造の一貫性についての有効な尺度となる。
【００８１】
ネガティブ染色透過電子顕微鏡法もGMMAの粒子サイズを評価するために使用されてきた。GMMAは、以前に記載されているように[20]、調製し、電子顕微鏡で観察した。電子顕微鏡写真を、公称倍率の105,000×で記録した。GMMAの直径を、スケールバーと比較して、電子顕微鏡写真の印刷されたものについて手作業で測定した。電子顕微鏡で得たデータとより良好に合致するサイズ測定のために使用される別の技術は、連続して接続されたTSKGEL(登録商標) 6000PW及び4000PWカラムを使用するMALLS(多角度光散乱検出器)と連結したHPLC-SECである。
【００８２】
ALHYDROGEL(登録商標)を用いて製剤化したGMMAの同一性及びO抗原の定量
ALHYDROGEL(登録商標)を用いて製剤化したGMMAの同一性は、免疫学ベースの技術によって決定することができる。
【００８３】
直接ALHYDROGEL(登録商標)製剤免疫アッセイ[31]に改変を加えて用いた。GMMAの同一性は、ウサギで産生された市販のタイピング抗血清又はマウスで産生されたタイピングモノクローナル抗体を使用して、製剤中に存在するO抗原を検出することによって確認される。GMMA-ALHYDROGEL(登録商標)懸濁液のアリコートをBSAでブロックし、OAg特異的抗体を用いてインキュベートする。次いで、タイピング抗体の結合を、酵素標識抗ウサギ抗体又は抗マウス抗体を使用して検出する。免疫反応性O抗原の存在を、基質溶液の添加及び吸光度で測定することができる色の形成によって検出する。同一性は、試験試料の吸光度を同じアッセイに含まれる基準の吸光度と比較することによって確認する。
【００８４】
同一性及びO抗原の定量は、競合ELISAによって実施することもできる。作動原理は、シゲラ特異的O抗原又はLPSと血清群特異的モノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清と結合するためのALHYDROGEL(登録商標)を用いて製剤化したGMMAとの間の競合に基づく。懸濁液中に存在する製剤化したGMMAが多ければ、抗原被覆プレートに結合できるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は少なく、標準ELISA法によって検出できるシグナルも少ない。試験製剤に存在するO抗原は、既知量のALHYDROGEL(登録商標)を用いて製剤化したGMMAを用いてモノクローナル抗体をスパイクすることによって製作した標準曲線を用いて得たシグナルと比較して定量される。
【００８５】
生物学的アッセイ
PBMC単離及びMAT
GMMAを用いた刺激後のPBMCによるin vtroインターロイキン6(IL-6)産生をin vitroサロゲートとして使用し、Rossi et al. [20]に記載されている手順を使用して反応可能性を評価した。簡単には、異なるドナーからのバフィーコートを使用して、[24]で報告されているFicoll密度遠心分離を使用してPMBCを単離した。PBMCを、96ウェル丸底プレート中、25mMのHEPES、2mMのグルタミン、10%のFBS、1%のPen-Strep(InvitroGen)を補充した180μLのRPMI-1640を用いて2×105細胞/ウェルの密度で播種した。TBS中GMMAの10倍連続希釈液20μL(アッセイの最終濃度が0.0001〜1,000ng/mL)を添加し、細胞を37℃で4時間インキュベートし、遠心分離(5分、400g)後に上清を回収し、IL-6濃度を分析するまで-80℃で保存した。
【００８６】
マウスにおける免疫原性/効能研究
1群当たり8頭のBALB/cマウス又はCD-1マウス(雌、4から6週齢)は、0.5mLの容量で、0日目及び21日目に、異なる用量のGMMA製剤化ALHYDROGELの1又は2回の腹腔内注射を受けた。対照マウスは、0.5mLのGAHB-プラセボを受けた。7、14、21、28、35日目に、又は一部の研究では21日目だけに、血液試料を採取した。効能アッセイでは、マウスの群を4種の異なる用量のワクチン又は効能標準(-80℃で保存し、ALHYDROGELで新たに製剤化した基準GMMA)で免疫化した。
【００８７】
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)
S.ソネイ又はS.フレキシネリGMMAに誘発された抗体を、プレート被覆抗原としてシゲラ・ソネイのLPS又はS.フレキシネリ血清型O抗原を使用するELISAで評価する。Nunc(商標) Maxisorp(商標) 96ウェルプレートを、2〜8℃で、リン酸緩衝食塩水(PBS)中0.5μg/mLのLPS又は5μg/mL未満のOAgを用いて終夜被覆した。PBS中5%のミルクを用いてプレートを1時間ブロックし、次に、0.05%のTWEEN(登録商標) 20を含有するPBS(PBST)で3回洗浄した。マウス血清を、0.1%BSAを有するPBST中で1:100及び1:4000希釈し、ウサギ血清を、PBS中5%ミルク中に希釈した。希釈した血清をELISAプレートで2時間、三連でインキュベートした。以前に確立し、較正したプレートのそれぞれについて二連の希釈液に含まれる抗S.ソネイLPS又は抗S.フレキシネリ血清型O抗原と比較して、試料を試験した。試料と基準血清を用いるインキュベーション後、上記のようにプレートを3回洗浄した。結合した抗体を、PBSTで希釈したアルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG又はヤギ抗ウサギIgGを使用して検出し、続いて、3回洗浄ステップとp-ニトロフェニルリン酸基質を用いる呈色反応を実施した。1時間後、405nm及び490nm波長で吸光度(光学密度、OD)を測定し、OD405nm〜490nmを計算した。結果は、標準血清に対して決定したELISA単位で表す。1ELISA単位は、標準アッセイでOD405nm〜490nm 1を与える標準血清の希釈率の逆数に等しい。
【００８８】
抗体の機能性の尺度としての血清殺菌力アッセイ
S.ソネイ及びS.フレキシネリ細菌を、ログ相(OD:0.2)に増殖させ、PBSで1:15,000に希釈し、滅菌ポリスチレンU底96ウェルマイクロタイタープレートに分配した。各ウェルに対し、8〜12倍に連続して希釈した(ウェル希釈で1:100から開始する)血清試料を添加した。使用前に、血清を56℃で30分間加熱し、内因性の補体を不活性化した。最終体積の7〜20%で使用した活性幼若ウサギ補体(BRC、Cederlane CL3441 lot6288)を各ウェルに添加した。SBA反応混合物中で使用したBRC供給源、ロット及びパーセンテージは、各特異的細菌に対する毒性の低さについて前もって選択した。BRC又はマウス血清の可能な非特異的阻害作用を評価するために、細菌を、同じ試験血清及び熱不活性化BRC、血清のみ(BRC無し)、SBA緩衝剤及び活性BRCでもインキュベートした。SBAミックスにおける3時間のインキュベーション後、細菌増殖阻害を測定した。殺菌活性を、50%のパーセント細菌増殖を得るために必要な血清希釈率として定義される血清力価について測定した。殺菌活性が検出されなかった場合に、10に等しい血清力価が与えられた。
【００８９】
発熱性
本発明者らは、筋肉内に送達された総ヒト用量の投与を使用するヨーロッパ薬局方の静脈内発熱性試験方法(Ph.Eur. 2.6.8 pyrogens、[25])の改変法を確立した。2セットの実験を、アッセイを確立するために実施した。最初の実験では(非GMP条件下だが、GMP施設で)、Ph.Eur. 2.6.8 pyrogensに従って予め選択された3頭のウサギからなる3群を、保持箱に入れ、直腸プローブを使用して体温を記録し、初期体温を決定した。ワクチン(0.5mL)の毒性学ロットを2つのワクチン群の3頭のウサギそれぞれに、0.5mLの滅菌生理食塩水を対照群の3頭のウサギに筋肉内注射した。初期体温と投与後の可能な体温上昇を決定するために、注射の90分前から投与後3時間まで、自動システムによって体温を連続して記録した。3.5、4、5、5.5、6、6.5及び7時間に体温を手作業で記録した。次の日、ウサギを保持箱に戻し、順化させ、24時間に別の読取りを実施した。
【００９０】
データに基づき(結果を参照のこと)、以下の試験を1790GAHBに対する筋肉内発熱試験のために選択した。3頭のウサギからなる2群(1つのワクチン試験と1つの対照群)をPh.Eur. 2.6.8に従って選択し、保持箱に入れ、直腸プローブを使用して最初の体温を決定した。ワクチン群のウサギにはワクチン(0.5mL)を、対照群のウサギには0.5mLの滅菌生理食塩水を筋肉内注射する。体温を、3時間自動システムによって連続して記録し、更なる読取りは3.5及び4時間に手作業で実施する。各ウサギに対する最大体温上昇を決定する(投与後4時間の期間中に測定した最も高い体温と初期体温の間の差)。有効な試験では、3つの対照の最大体温上昇の平均は0.3℃未満でなければならない。3頭のワクチン試験ウサギの平均最大体温上昇が0.8℃未満である場合試験は合格であり、平均最大体温上昇が1.2以上である場合不合格である。3頭の更なるウサギでの繰り返し試験では、3頭のウサギの平均最大体温上昇が0.8℃以下である場合試験は合格であり、その他の場合は不合格である。毒性学及び臨床ワクチンロットの発熱性を評価するために、上記基準を使用して、GMP施設におけるGMP条件下で第二の研究を実施した。この研究における体温の記録は、アッセイの強さに関する更なるデータをもたらし、体温上昇を評価するために決定的な時間として4時間を選択するために、24時間の期間に拡張した。IM発熱性試験方法を使用して、S.ソネイ1790GAHBの3つのGMPロットをリリースした。
【００９１】
反復投与毒性試験
S.ソネイ1790GAHBワクチンの最大3回の免疫化の臨床投与を支持するために、Good Laboratory Practice(GLP) standards(WIL Research Europe、Lyon、France)に従ってニュージーランドホワイトウサギを用いて毒性学研究を実施した。ワクチンを、2週間おきに4回、筋肉内(IM)、鼻腔内(IN)、又は皮内(ID)臨床ルートに投与し、続いて2週間の観察期間とした。免疫反応を生じる能力を実証する予備調査研究に基づく動物モデルとしてウサギを選択した。試験設計は表3に表す。全ての動物について、試験経過中、疾病率/死亡率、臨床観察/検査、Draize注射部位、眼科学、体重、摂食量について観察した。凝固パラメータ及びC-反応タンパク質(プレ試験、2日目及び両方の解剖時)を含む臨床病理学、抗体分析(プレ試験、投与前及び両方の解剖時)、解剖時の肉眼による観察、器官重量、並びに組織病理学(完全なWHOの組織リスト)も全ての群で実施した。最初の免疫化において群2及び5(IM)の体温は、投与の1.5時間前、0.5時間前、及び2分前(0時間)並びに注射の0.5、2、6、及び24時間後に測定した。-0.5時間と0時間の体温の平均は、ウサギの初期体温とみなした。群2及び5の2回目、3回目、及び4回目の免疫化、並びに群1、3、4、6、及び7の全免疫化において、投与前(0時間)、及び投与の2、6、及び24時間後に体温を記録した。
【００９２】
2018517729.tif 000006
【００９３】
INワクチン接種したラットにおけるIrwin研究
1790GAHBのIN投与を更に支持するために、神経行動学的総合評価[26]によって判断する中枢及び末梢神経系への1790GAHBの有効な望ましくない作用を特定するために、GLP Irwin試験を実施した。6頭の雄からなる3群、およそ0.3kgのHan Wistarラットを使用した。第1の群は食塩水対照、第2の群はGAHB-プラセボ及び第3の群は1790GAHBを受けた。各ラットは、各鼻の穴に15μlの単回用量を受けた(合計30μl)。この投与量は最大実行用量であった。試験群は、合計6μgの1790GAHBタンパク質を受けた。体重を基準として、0.3kgのラットにおける0.6μgのタンパク質用量は、フェーズ1試験において60kgの対象にIN投与される最も高い推定用量のおよそ15倍である。投与前、投与の0.5、1、2、5、及び24時間後にラットをモニタリングした。
【００９４】
全ての動物研究は、科学的目的に対する動物保護に関するEU Directive 2010/63、並びにイタリア及びフランスのそれぞれの関連する地域法の履行に従った。改変したGMP発熱性試験は、Charles River France Ethics Committee(Study numbers T 13.1446-48, T 13.1678-80, T 13.1702)に承認された。
【００９５】
結果
シゲラ・ソネイのNVGH1790細胞株のO抗原発現
菌株NVGH1790は、大腸菌nadA及びnadB遺伝子を病原性プラスミドに組み込むことによって遺伝子改変し、シゲラのニコチン酸栄養素要求性を除去した[18]。したがって、病原性プラスミドの保持及び結果として、プラスミドにコードされたOAgの生成[27]は、ニコチン酸を含まない培地での増殖によって確かめられる。フラスコ内で25世代後及び30Lの発酵後のS.ソネイNVGH1790のFACS分析により、細菌の95%超がOAgに対して陽性であり、したがってこのプラスミドの保持を示したことが示された。
【００９６】
1790-GMMAのパイロットスケールでの製造と特徴付け
3つの30Lについて整合性の実行を実施した。各バッチについて、30Lで最適化した発酵プロセスは、OD600がおよそ35であった場合、バイオリアクターの注入から20±4時間以内、溶解pO2スパイクが生じ、pHが上昇し始めた場合に停止した。発酵の終わりに、培養物を精密濾過によって採取した。次に、GMMAを限外濾過で精製した。2つの1790-GMMAのGMPロットの製造のために、プロセスを外部の医薬品製造受託機関に移した。GMPバッチを25Lスケールで製造した。データは、NVGH、1790-GMMAバッチNVGH1883(基準バッチ)で製造したコンシステンシーロットの1つに対してと、2つのGMP薬物物質、1790-GMMAバッチ1112及びバッチ1014に対して表す。
【００９７】
GMMAの収率及び特徴付け
サイズ及び完全性
電子顕微鏡で、基準及びGMPバッチから精製したGMMAは、二峰性のサイズ分布を有する粒子を示した。粒子の大多数は、直径およそ25〜40nmの平均サイズの小さいものである。粒子の少数の画分は、65から140nmの間のサイズを有する大きいものであった(粒子の16%)。
【００９８】
Malvern Zetasizer Nanoを使用する動的光散乱(DLS)による次元解析により、基準及び2つのGMPバッチに対し、それぞれ117nm、113nm及び116nmのZ-平均が与えられた。多分散指数0.19、0.21及び0.20に対する結果が、それぞれ基準及び2つのGMPバッチに対して得られた。重要なことには、DLS結果は、複数回の凍結解凍サイクル又は-80℃での保存によって変わらず、GMMAがインタクトなままであり、これらの条件下で凝集しなかったことを示す。したがって、1790-GMMAは、製剤化前に、通常-80℃で保存した。
【００９９】
収率
基準及び2つのGMPバッチにより、精製GMMAにおいて、それぞれ2.4gのタンパク質(30mLから)、1.7gのタンパク質(25Lから)及び0.42gのタンパク質(25mLから)の最終収率が得られた。これらのロットは、それぞれ145mg、106mg及び25mgのOAgを含有し、タンパク質に対するOAgの比はほぼ同一であった(60.3μg/mg、63.6μg/mg及び59.0μg/mg)。他の2つのコンシシテンシーロット(30mLから)は同様であり、それぞれ収率、2.0g及び3.2g、タンパク質に対するOAgの比、61.6μg/mg及び50.3μg/mgであった。
【０１００】
タンパク質プロファイル
1790-GMMAのSDS-PAGEプロファイルは、以前の研究[22、36]で示したものと同様であった。およそ39kDaサイズの有力なバンドは、質量分析法によってOmpA及びOmpCと同定された。
【０１０１】
LPS及びO抗原プロファイル
基準及びGMPバッチから抽出したLPSの銀染色SDS-PAGEは、二峰性の分布を有するLPSラダーを示した(データは示さない)。有力なバンドは、5 OAgまでの繰り返しを有する低分子量LPSであり、中程度の分子量LPSは、少数画分として目に見えた。これらのデータは、屈折率検出を使用する抽出OAg/コアの分析的サイズ排除クロマトグラフィーと一致した(データは示さない)。有力なピークは低分子量多糖である。1790-GMMAにおける有力な低分子量LPSのサイズ分布は、NMRで測定して平均33回の繰り返しを有するLPS改変を有さない親菌株に由来する基準LPS(1859-GMMA)のサイズと著しく異なる。
【０１０２】
LPSコアの組成はHPAEC-PAD分析によって決定した。この方法により、1790-GMMAに存在するLPS中のグルコースに対するガラクトースのモル比が2:4であり、一方LPS改変を有さない親菌株由来のGMMA(1859-GMMA)において、比は2:3であり、S.ソネイ野生型菌株と同様である[22]ことが実証された。1790-GMMAにおけるLPSコアのグルコース含量の変化は、第3のLPSコア糖、末端のKDOの分析によって確認した。1790-GMMA及び1859-GMMAでは、KDOに対するガラクトースの比は同じであった。KDOに対するグルコースの比は異なり、1790-GMMAのLPSコアでは、より高いグルコース含量が確認された。
【０１０３】
リピドAの構造
基準バッチから精製したリピドAの構造を、MALDI-TOFを使用する質量分析法によって決定した(データは示さない)。記録スペクトルは、最も高いピークに相当するペンタアシル化リピドAとその断片化(すなわち、1種以上の脂肪酸鎖の損失)、ナトリウムを有する凝集体の形成(+23m/z)及び脱リン酸化(-80m/z)に起因するいくつかの他のピークを示した。MALDI-TOFでは、ヘキサ又はヘプタアシル化リピドAは検出されなかった。
【０１０４】
MATにおけるIL-6産生
改変されていないLPSを含有する1859-GMMAは、PBMCから高レベルのIL-6放出を誘導し、0.004ngタンパク質/mLの濃度でバックグラウンドに対してIL-6放出の10倍の増加をもたらす一方、ペンタアシル化LPSを含有する1790-GMMAは、同じIL-6放出をもたらすために600倍高い濃度(2.37ngのタンパク質/mL)を必要とした。
【０１０５】
筋肉内発熱性試験
GMMAワクチンを受けた全12頭のウサギにおいて(毒性学ロットを受ける第1研究で6頭、毒性学ロットを受ける第2研究で3頭及び臨床ロットを受ける3頭)、ワクチン接種の7時間後まで、及び24時間後に、異なるインターバルで観察した平均体温上昇を、食塩水を受けた6頭の動物の平均体温上昇と比較して、図1に示す。ワクチン群の平均体温上昇は、静脈内発熱性試験の通常3時間の終点でも依然として増加していた。対照動物における5時間後の平均体温上昇は、著しい増加を示し、ワクチン群と対照群の間の差は減少した。24時間まで、ワクチン群と対照群は有意に異ならなかった(ワクチン群はより低い平均体温上昇を有した)。これらの結果に基づき、4時間を決定的な時点として選択した。上記で詳述したように開発した基準を使用して、毒性学及び2つの臨床群は、繰り返しアッセイを必要とすることなく、発熱性試験を合格した。毒性学ロット及び2つの臨床ロットの投与後最初の4時間の平均「最大体温上昇」は、それぞれ0.48℃、0.53℃及び0.40℃であった。対照群については、値は0.27℃であった。
【０１０６】
毒性学研究
1790GAHBワクチン又はGAHB-プラセボで処置したウサギにおいて、死亡率、処置に関連する臨床徴候及び体重又は摂食量の変化のいずれも存在しなかった。処置に関連する眼科的な知見もなかった。ワクチン又はプラセボ投与のいずれかに関連すると考えられる器官重量の変化は、44日目又は56日目(すなわち、最終ワクチン接種の2又は14日後)に見られなかった。ワクチンは、鼻腔内及び筋肉内経路で局所的に忍容性が良好であり、IN経路では局所反応は観察されず、IM投与後のウサギの何頭かで非常に軽度(紅斑、浮腫)から中等度の局所反応(浮腫)までが観察された。ID投与は、対応するGAHB-プラセボ群におけるより1790GAHB群においてより明らかであった、非常に軽度から中等度の局所反応(硬結、紅斑及び浮腫)を誘導した。局所反応原性は、IM注射部位では、2週間の回復期の終わりまでに、完全に又は部分的に解決したが、注射のID部位では解決しなかった。しかしながら、ID投与によるワクチンに対する忍容性は、受容可能なままであった。排出リンパ節及び脾臓における変化を含む低い重症度及び大きさの炎症性変化は、組織病理学検査で見られ、これらの変化は、C-反応性タンパク質及びフィブリノーゲンの増加と相関し、免疫原に対するこの薬理学反応と一致した。臨床病理学パラメータにおける変化及び最小から中程度の微視的変化は、一般にIN及びID処置群では回復期の終わりまでに解決するが、IM処置群で見られる変化はわずかに減少し、炎症変化からの回復が進行中であることを示した。
【０１０７】
IM 1790GAHBを受けたウサギでは、IMプラセボ群と比較して、体温において統計的に有意な増加が存在した。これは、IM群に対してのみ見られ、主に雄で見られた。最初のIMワクチン接種後に、ワクチン接種前と比較して、2時間ではプラセボでは0.12℃に対して1790GABHでは0.43℃(P=0.009、t検定)、6時間ではプラセボでは0.38℃に対して1790GABHでは0.64℃(P=0.005、t検定)の平均体温上昇が存在した。注射の24時間後では、これらの群に差はなかった(それぞれ、ワクチン接種前の初期体温と比較して0.21及び0.22℃の増加)。同様の体温上昇が、3回目及び4回目の注射後のIM群でも見られた(1790GAHB対プラセボとして、ワクチン接種前と比較して、6時間で0.44対0.11及び0.63対0.33℃の体温上昇)。同様であるが統計的に有意ではない増加が2回目の免疫化後で見られた(ワクチン接種前と比較して、6時間で0.28対0.14℃)。ばらつきの大きさが非常に低いこと及び増加期間が短いことから、差は、1790GAHBに関連するものであると考えられるが、作用は毒性学的に関連するものとは考えられなかった。
【０１０８】
Irwin研究
INワクチン接種とそれに続く1790GAHBの単回投与の神経毒性作用を評価するためのラットにおけるIrwin研究は、主な中枢及び末梢神経系機能に関する、一連の行動学的及び生理学的パラメータに対して関連する作用を示さなかった。
【０１０９】
マウスにおける免疫原性及び効能
最初の免疫原性研究では、腹腔内に注射した29ngから238μgまで(1.75ngから14.35μgのOAg)4倍増加する7種の異なる用量の1790GAHBを評価し、ワクチンの免疫原性が高いことを示した。抗体は、単回注射後の全ての投与で検出可能であり、2回目の注射後にブースティングした。1.86μgのタンパク質(0.11μg OAg)は、最大の抗体反応を誘発した。これらの結果に基づき、効能試験の基礎を形成し、効能によって判断した経時的安定性を評価するために、免疫原性プロトコルを開発した。最終の効能試験設計では、8頭のマウスの群で、29ngから1.86μgまでの4種の4倍増加する用量の1790GAHBを使用し、血清IgGレベルを、単回免疫化の3週間後の同種OAgを有するLPSについてのELISAによって評価した。基準1790GAHB調製物を各効能試験に対して新たに製剤化し、試験ワクチンと同じ用量で投与した。試験ワクチン及び参照基準によって誘発された抗体レベルの用量反応曲線を比較した。対数用量に関して対数変換した抗LPS抗体の線形回帰の傾斜又は切片に有意な差はなく、ワクチン安定性バッチは新たに製剤化した基準材料と同じ効能を有することが示された。
【０１１０】
ウサギにおける免疫原性
毒性学研究からウサギにおけるIgG反応を各ワクチン接種後及び最終の出血時に評価した。3つの経路全てが、高いレベルの循環抗LPS IgGを与えた(データは示さない)。最大反応は、100μg用量の1790GAHBの単回IM注射の14日後に実現した。IN経路については、最大抗体反応に2回の免疫化が必要であった。最終ワクチン接種の14日後の循環IgG抗LPSレベルは、100μg用量の1790GAHBのIM送達で達成したレベルと有意に異ならなかった。10μgのIDワクチン接種も次のワクチン接種に反応して増加を示したが(Spearmanランク検定 p<0.0001)、効果はIN経路に関するよりも明らかではなかった。最終循環抗LPS IgGレベルは、IM経路よりID経路で有意に高かった(対数変換した抗体のt検定p=0.002)。
【０１１１】
S.ソネイ1790GAHBを用いるフェーズI臨床試験
臨床試験を、健康な成人(参加者の年齢は18から45歳)に異なる投薬量で投与した場合に、シゲラ・ソネイに対する3用量の候補ワクチン(1790GAHBワクチン)の安全性及び免疫原性を評価するために実施した。1790GAHBワクチンの安全性プロファイルは、研究ワクチン製剤と同じ濃度を有する水酸化アルミニウム懸濁液で構築したプラセボ(GAHB-プラセボ)のものと比較して評価する。対象を無作為化して、4週おきに、1790GAHBワクチン(5つの抗原濃度で)又はGAHBプラセボのいずれかの3回の免疫化を受けた。
【０１１２】
産生菌株
以下の遺伝子改変を含有するシゲラ・ソネイ:ΔtolR:内膜及び外膜の連結を切断し、多量の外膜ブレブを与える(GMMA)、ΔhtrB:LPSの反応原性を低減させるため、virG nadA/Bノックイン:O抗原(OAg)をコードする病原性プラスミドを安定化させる。
【０１１３】
0.5mL用量(i.m.)に対する最大量
100μgGMMAのタンパク質
6.1μgのOAg
ALHYDROGEL(登録商標)として0.35mgのアルミニウム
等張Tris緩衝食塩水中
0.5mL用量当たりのプラセボ(i.m.)
ALHYDROGEL(登録商標)として0.35mgのアルミニウム
等張Tris緩衝食塩水中
プラセボで最大用量を希釈することによって調製した送達のための低用量
注射容量:i.m:0.5mL
【０１１４】
2018517729.tif 000007
【０１１５】
全用量の1790GAHBは忍容性が良好であり、IM経路で送達した場合、安全性データは、用量当たり100μg以下の1790GAHBタンパク質の使用を支持する。血清学評価は、25μg、50μg及び100μgの1790GAHBを受ける対象において、1回目、2回目及び3回目のワクチン接種の1カ月後に、十分な血清IgG抗S.ソネイLPSレベルが誘発されることを示している(図2(a)及び(b))。これらの群における抗体の中央値レベルは、回復期血清で観察されるものより高い。これらのデータは、GMMAベースのS.ソネイワクチンとしての1790GAHB、及び1790GAHBと同様の反応原性-免疫原性プロファイルを想定する、多価製剤における4から6種の異なるGMMAの組合せの使用を支持する。
【０１１６】
マウスにおける多価シゲラワクチン(I)の免疫原性評価
この研究では、多価シゲラGMMAワクチン、特に4種の最も流行している血清型のGEMS研究、S.ソネイ、並びにS.フレキシネリ2a、3a及び6由来のGMMAを含有するALHYDROGEL(登録商標)製剤を試験した。
【０１１７】
この目的のために、S.フレキシネリ菌株のGMMA産生をS.ソネイにおけるようにtolR欠失によって増大させ、LPSの反応原性をhtrB遺伝子の欠失によるリピドAの遺伝子改変によって低減させた。ALHYDROGEL(登録商標)製剤を、水酸化アルミニウムへの吸着が忍容性を増大させるという、ウサギにおける1790GAHBを用いた経験に基づいて、4価製剤及び単一のGMMA製剤に対して選択した。この研究は、S.フレキシネリ血清型に対する最初の免疫原性研究であった。1790GAHBに対して使用したようにタンパク質含量に基づいて製剤を調製した。生化学的特徴付けに基づいて、S.フレキシネリ2aGMMAは、1790-GMMAよりタンパク質1mg当たりおよそ10倍多いOAgを含有する。したがって、通常の1790GMMA効能研究における(29ng、上記を参照のこと)より10倍低い開始濃度を選択した。同様の投与を、S.フレキシネリ3aGMMA及びS.フレキシネリ6GMMAについても確立した。単一のGMMA製剤(S.ソネイ又はS.フレキシネリ2a、3a又は6)に対するOAg反応を、4価製剤によって誘発した同じOAgに対する反応と比較した。4価製剤に含まれるすべての成分の強い免疫原性は、多価製剤に対する免疫原性の概念を証明し、多価OAg-GMMA製剤の更なる開発を支持する。
【０１１８】
4価製剤では、各成分は、以前に記載した単一製剤におけるのと同じ濃度で存在する。したがって、4価製剤の総タンパク質含量は160μg/mLである。4価製剤として、S.ソネイGMMA、S.フレキシネリ2aGMMA、S.フレキシネリ3aGMMA及びS.フレキシネリ6GMMAを、同じ濃度で混合し、次いで、上記で特定したように水酸化アルミニウムを用いて製剤化する。GAHB ALHYDROGEL(登録商標)希釈剤プラセボは以下を含有した:1790GAHBにおけるものと同じ濃度でのTris緩衝食塩水中のALHYDROGEL(登録商標)(ALHYDROGEL(登録商標)0.7mgのAl3+/mL、10mMのTris、pH7.4、9g/Lの塩化ナトリウム)。
【０１１９】
免疫化
以下の表に記載したように、BALB/cマウス(群当たり8頭)を、4種の異なる用量の製剤を用いて、0日目に腹腔内に免疫化した。対照として、1つの群をALHYDROGEL(登録商標)希釈剤(GAHB-プラセボ)を用いて免疫化した。全ての製剤を、免疫化前に細菌夾雑について試験した。簡単に、50μLの各製剤を三連でLB寒天プレートに入れ、24時間のインキュベーション後、37℃で、プレートを増殖について試験した。細菌増殖のない製剤だけを免疫化に使用した。
【０１２０】
2018517729.tif 000008
【０１２１】
血清学のための出血:21日目に全ての動物から血液を得、血清を回収し、血清を試験まで2〜8℃で保存した。
【０１２２】
ELISA
ELISAを実施して、それぞれ単独で又は4価ワクチンの一部として投与したS.ソネイ、S.フレキシネリ2a、S.フレキシネリ3a及びS.フレキシネリ6由来のALHYDROGEL(登録商標)を用いて製剤化したGMMAを用いて免疫化したマウスの抗S.ソネイLPS、抗S.フレキシネリ2aのOAg、抗S.フレキシネリ3aのOAg、抗S.フレキシネリ6のOAg抗体レベルを決定した。S.ソネイ、S.フレキシネリ2a及びS.フレキシネリ3aに対する結果を図3及び4に示す。
【０１２３】
増加する濃度の1790GAHBで免疫化したマウスでは、P<0.0001(アルファ=0.05)を有する有意なSpearmanランク及び相関係数0.86を与える特定の抗S.ソネイLPS抗体(ELISA単位で測定)が上昇し、増加する濃度の4価製剤で免疫化したマウスでは、P<0.0001(アルファ=0.05)を有する有意なSpearmanランク及び相関係数0.86を有する特定の抗S.ソネイLPS抗体(ELISA単位で測定)が上昇した。
【０１２４】
増加する濃度のS.フレキシネリ3aで免疫化したマウスでは、特定の抗S.フレキシネリ3aOAg抗体が上昇し、P<0.0001(アルファ=0.05)を有する有意なSpearmanランク及び相関係数0.84であった。同様に、増加する濃度の4価製剤で免疫化したマウスでは、P<0.0001(アルファ=0.05)を有する有意なSpearmanランク及び相関係数0.73を有する特定の抗S.フレキシネリ3aOAg抗体が上昇した。増加する濃度のS.フレキシネリ2aで免疫化したマウス由来の血清について得た抗S.フレキシネリ2aのOAg ELISA ODは、P<0.0001(アルファ=0.05)を有する有意なSpearmanランク及び相関係数0.75を与えた。また、増加する濃度の4価製剤で免疫化したマウスでは、P<0.0001(アルファ=0.05)を有する有意なSpearmanランク及び相関係数0.75を有する抗S.フレキシネリ2aのOAg抗体が上昇した。それぞれの用量反応曲線の比較の結果を図4に示す。単一のGMMA製剤と4価製剤の間のいずれの血清型特異的反応についても有意な差は観察されず、干渉が存在しないことを示した。
【０１２５】
FACS分析
4価のGMMA製剤に対して生じた抗血清は、野生型S.ソネイ、S.フレキシネリ2a、S.フレキシネリ3a及びS.フレキシネリ6を認識した。一方、個々のGMMA抗血清は、同種の細菌株を認識した。
【０１２６】
結論
4価のシゲラ製剤によって誘発される特異的シゲラ血清型に対する血清抗体反応は、個々の構成成分と異ならない。したがって、干渉の証拠は存在しない。
【０１２７】
多価シゲラワクチン(II)
多価シゲラGMMAワクチン、特に、S.ソネイ、及びS.フレキシネリ1b、2a、3a及び6由来のGMMAを含有するALHYDROGEL(登録商標)製剤を例示する。
【０１２８】
S.フレキシネリ菌株のGMMA産生は、S.ソネイにおけるようにtolR欠失によって増大され、LPSの反応原性をmsbB又はhtrB遺伝子のいずれかの欠失によるリピドAの遺伝子改変によって低減させる。前のように、ALHYDROGEL(登録商標)製剤を、水酸化アルミニウムへの吸着が忍容性を増大させるという、ウサギにおける1790GAHBを用いた経験に基づいて、5価製剤及び単一のGMMA製剤に対して選択した。
【０１２９】
5価製剤において、各構成成分は、以前に記載した単一製剤におけるのと同じ濃度で存在する。5価製剤として、S.ソネイGMMA、S.フレキシネリ1bGMMA、S.フレキシネリ2aGMMA、S.フレキシネリ3aGMMA及びS.フレキシネリ6GMMAを、同じ濃度で混合し、次いで、上記で特定したように水酸化アルミニウムを用いて製剤化する。
【０１３０】
多価シゲラワクチン(III)
多価シゲラGMMAワクチン、特に、S.ソネイ、及びS.フレキシネリ1b、2a、2b、3a及び6由来のGMMAを含有するALHYDROGEL(登録商標)製剤を例示する。
【０１３１】
S.フレキシネリ菌株のGMMA産生は、S.ソネイにおけるようにtolR欠失によって増大され、LPSの反応原性をmsbB又はhtrB遺伝子のいずれかの欠失によるリピドAの遺伝子改変によって低減させる。前のように、ALHYDROGEL(登録商標)製剤を、水酸化アルミニウムへの吸着が忍容性を増大させるという、ウサギにおける1790GAHBを用いた経験に基づいて、6価製剤及び単一のGMMA製剤に対して選択した。
【０１３２】
6価製剤において、各構成成分は、以前に記載した単一製剤におけるのと同じタンパク質又はO抗原濃度で存在する。6価製剤として、S.ソネイGMMA、S.フレキシネリ1bGMMA、S.フレキシネリ2aGMMA、フレキシネリ2bGMMA、S.フレキシネリ3aGMMA及びS.フレキシネリ6GMMAは、同じ濃度で混合され、次いで、上記で特定したように水酸化アルミニウムを用いて製剤化される。
【０１３３】
特定の組合せ
A)(a)シゲラ・ソネイ53G  ΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB突然変異体から精製したGMMA、(b)シゲラ・フレキシネリ2a 2457T  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(c)シゲラ・フレキシネリ3a 6885  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(d)シゲラ・フレキシネリ6 10.8537  ΔtolR、ΔhtrB  ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、及び(e)アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物であって、GMMAが改変リピドAを含み、シゲラ・フレキシネリ菌株が病原性プラスミドをキュアリングされている、免疫原性組成物。
B)(a)シゲラ・ソネイ53G  ΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB突然変異体から精製したGMMA、(b)シゲラ・フレキシネリ2a 2457T  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(c)シゲラ・フレキシネリ3a 6885  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(d)シゲラ・フレキシネリ6 10.8537  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(e)シゲラ・フレキシネリ1b STANSFIELD  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、及び(f)アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物であって、GMMAが改変リピドAを含み、シゲラ・フレキシネリ菌株が病原性プラスミドをキュアリングされている、免疫原性組成物。
C)(a)シゲラ・ソネイ53G  ΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB突然変異体から精製したGMMA、(b)シゲラ・フレキシネリ2a 2457T  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(c)シゲラ・フレキシネリ3a 6885  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(d)シゲラ・フレキシネリ6 10.8537  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(e)シゲラ・フレキシネリ2b 69/50  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、及び(f)アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物であって、GMMAが改変リピドAを含み、シゲラ・フレキシネリ菌株が病原性プラスミドをキュアリングされている、免疫原性組成物。
D)(a)シゲラ・ソネイ53G  ΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB突然変異体から精製したGMMA、(b)シゲラ・フレキシネリ2a 2457T  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(c)シゲラ・フレキシネリ3a 6885  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(d)シゲラ・フレキシネリ6 10.8537  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(e)シゲラ・フレキシネリ1b STANSFIELD  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(f)シゲラ・フレキシネリ2b 69/50  ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、及び(g)アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物であって、GMMAが改変リピドAを含み、シゲラ・フレキシネリ菌株が病原性プラスミドをキュアリングされている、免疫原性組成物。
E)アジュバントが水酸化アルミニウム、例えばALHYDROGEL(登録商標)である、(A)、(B)、(C)、又は(D)の免疫原性組成物。
F)少なくとも1種の医薬担体及び/又は添加剤を含む、(A)、(B)、(C)、(D)又は(E)のいずれかの免疫原性組成物。
G)医薬組成物又はワクチン組成物である、Fの免疫原性組成物。
H)動物、特にヒトにおけるシゲラによる感染の予防又は処置において使用するための、Gの医薬組成物又はワクチン組成物。
【０１３４】
本発明のある特定の実施形態が上記で説明され、詳細に例示されているが、本発明をそのような実施形態に制限することを意図するものではない。以下の特許請求の範囲に示すように、本発明の範囲及び精神を逸脱しなければ、それらに種々の修正を加えることができる。
【０１３５】
(参考文献)
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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