(57)【要約】鎖特異的cDNAライブラリーを作製するための組成物、キット、および方法が、本明細書において提供される。本組成物、本キット、および本方法は、RNA-cDNA二重鎖などの二本鎖ポリヌクレオチドの特性を用いて、新規の配列決定アダプターを捕捉しかつ取り込む。本方法は、全長RNA配列決定法 (RNA-Seq) および3'タグデジタル遺伝子発現 (DGE) などの超並列配列決定法によるトランスクリプトームプロファイリングに有用である。2018515081.tif 000042
2018515081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、RNA試料中のRNA分子から鎖特異的cDNA分子を生成する方法：
(a) 生体試料から該RNA試料を単離する段階；
(b) 逆転写により、該RNA分子と第1 cDNA鎖とを含むRNA相補的DNA (cDNA) 二重鎖を生成する段階；
(c) 部分的二本鎖オリゴヌクレオチド5'アダプターを該第1 cDNA鎖の3'末端にアニールさせる段階であって、該5'アダプターが、
(i) 少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、該第1 cDNA鎖の3'末端にアニールする約6〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む、第1鎖捕捉オリゴヌクレオチド；および
(ii) 該第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含む、第2鎖ブロックオリゴヌクレオチド
を含む、段階；ならびに
(d) 該鎖特異的cDNA分子を生成する段階。
【請求項２】
段階 (a) の後に前記RNA分子を断片化する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記鎖特異的cDNA分子を生成する段階が、DNAポリメラーゼまたはその断片を用いて前記5'アダプターの前記第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドを伸長させて、前記第1 cDNA鎖と相補的な第2 cDNA鎖を生成することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドと相補的なプライマーを用いて前記第2 cDNA鎖を増幅する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
増幅する段階がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
増幅された前記第2 cDNA鎖の配列を決定する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記3'オーバーハングが、事前に選択された第1 cDNA鎖と実質的に相補的である約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記3'オーバーハングが、事前に選択された第1 cDNA鎖と100%相補的である約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料が動物組織試料である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料が植物組織試料である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記RNA試料を断片化する段階がMg2+含有緩衝液中で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
段階 (c) および／または (d) が室温で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記DNAポリメラーゼまたはその断片がDNAポリメラーゼIである、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記DNAポリメラーゼまたはその断片がクレノウ断片である、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記5'アダプターの前記第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドが5'リン酸化される、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記DNAポリメラーゼがクレノウ断片およびリガーゼである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
(a) 少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、約6〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む、第1鎖捕捉オリゴヌクレオチド、および
(b) 該第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含む、第2鎖ブロックオリゴヌクレオチド
を含む、部分的二本鎖オリゴヌクレオチド5'アダプター；ならびに
該第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドと相補的な配列決定プライマー
を含む、キット。
【請求項１８】
前記第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドが5'リン酸化される、請求項17に記載のキット。
【請求項１９】
前記第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 1に記載される配列を含む、請求項17に記載のキット。
【請求項２０】
前記第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 2に記載される配列を含む、請求項17に記載のキット。
【請求項２１】
前記5'アダプターの前記3'オーバーハングが、約8〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項17に記載のキット。
【請求項２２】
前記約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドが、RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と実質的に相補的である、請求項21に記載のキット。
【請求項２３】
前記約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドが、RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と100%相補的である、請求項21に記載のキット。
【請求項２４】
取扱説明書をさらに含む、請求項17に記載のキット。
【請求項２５】
生体試料に由来するRNA分子と、該RNA分子の逆転写によって生成された第1 cDNA鎖とを含む、RNA-cDNA二重鎖、ならびに
(a) 少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、約6〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む、第1鎖捕捉オリゴヌクレオチド、および
(b) 該第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含む、第2鎖ブロックオリゴヌクレオチド
を含み、該RNA-cDNA二重鎖の該第1 cDNA鎖の3'末端にアニールする、部分的二本鎖オリゴヌクレオチド5'アダプター
を含む、ポリヌクレオチド複合体。
【請求項２６】
前記第1 cDNA鎖が、ランダムなヌクレオチド配列を含む3'アダプターを用いて生成される、請求項25に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項２７】
前記第1 cDNA鎖が、ポリT配列を含む3'アダプターを用いて生成される、請求項25に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項２８】
前記第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 1に記載される配列を含む、請求項25に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項２９】
前記第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 2に記載される配列を含む、請求項25に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項３０】
前記5'アダプターの前記3'オーバーハングが、約8〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項25に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項３１】
前記約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドが、前記RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と実質的に相補的である、請求項30に記載のポリヌクレオチド複合体。
【請求項３２】
前記約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドが、前記RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と100%相補的である、請求項30に記載のポリヌクレオチド複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2015年4月29日に出願された米国仮特許出願第62/154,584号の優先権を主張し、この開示はあらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府支援の研究開発に基づいてなされた発明の権利に関する言明
本発明は、米国国立科学財団による助成金第DBI1238243号のもと、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ハイスループット次世代配列決定 (NGS) 技術における最近の進歩により、任意のトランスクリプトームの包括的な特徴づけおよび定量化を含む、全ゲノム配列決定および機能ゲノム科学への新たなアプローチが可能となった。RNA配列決定法 (RNA-Seq) は、メッセンジャーRNAおよび構造RNAから生成された相補的DNA (cDNA) の直接配列決定、ならびに遺伝子発現解析のためにその配列決定リードを参照ゲノムまたは遺伝子セットにマッピングすることを伴う。この技法を用いて、新規の転写物、低分子RNA、選択的スプライシング産物、融合転写物、センス転写物、およびアンチセンス転写物を同定することができる。デジタル遺伝子発現 (DGE) として知られる別の技法は、NGSを用いて、あるcDNA配列がある試料中で検出される回数を決定するものであり、この回数はその配列に対応するRNAの相対的発現と直接関係する。
【０００４】
標準的RNA-Seqの実施に伴う1つの欠点は、転写方向に関する情報の欠如である。鎖情報により、標的RNA転写物が2本のDNA鎖のうちのどちらに由来したのかが明らかになる。この情報は、例えば、転写物注釈付け、転写物発見、および発現プロファイリングに対する高い信頼性を提供し得る。鎖の配向性を維持することで、遺伝子調節の重要なメディエーターであるアンチセンスRNA発現の同定もまた可能になる。センスおよびアンチセンス発現のレベルを決定する能力は、細胞のトランスクリプトームに関するより多くの情報を提供する。
【０００５】
鎖特異的RNA-Seqライブラリーを作製する方法が近年開発された。例えば、1つの方法では、元のRNA（例えば、亜硫酸水素塩処理による）または転写されたcDNA（例えば、修飾ヌクレオチドの取り込みによる）のいずれか一方の鎖を標識し、次いで非標識鎖を分解する。残念ながら、これらの方法は多大な労力を要する。
【０００６】
次世代配列決定法を用いてRNA-Seqおよびデジタル遺伝子発現 (DGE) 解析を行うための定方向（鎖特異的）cDNAライブラリーを作製する改良法の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００７】
1つの局面において、RNA試料中のRNA分子から鎖特異的cDNA分子を生成する方法が、本明細書において提供される。本方法は、(a) 生体試料からRNA試料を単離する段階；(b) RNA分子を断片化する段階；(b) 逆転写により、RNA分子と第1 cDNA鎖とを含むRNA相補的DNA (cDNA) 二重鎖を生成する段階；(c) 部分的二本鎖オリゴヌクレオチド5'アダプターを第1 cDNA鎖の3'末端にアニールさせる段階であって、該5'アダプターが、(i) 少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、第1 cDNA鎖の3'末端にアニールする約6〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む、第1鎖捕捉オリゴヌクレオチド；および (ii) 第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含む、第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドを含む、段階；ならびに (d) 鎖特異的cDNA分子を生成する段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、段階 (a) の後にRNA分子を断片化する段階を含む。いくつかの例において、鎖特異的cDNA分子を生成する段階 (d) は、DNAポリメラーゼまたはその断片を用いて5'アダプターの第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドを伸長させて、第1 cDNA鎖と相補的な第2 cDNA鎖を生成することを含む。いくつかの態様において、本方法はまた、第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドと相補的なプライマーを用いて第2 cDNA鎖を増幅する段階を含む。増幅する段階はポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を含む。
【０００８】
いくつかの態様において、本方法はさらに、増幅された第2 cDNA鎖の配列を決定する段階を含む。場合によっては、約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドは、事前に選択された第1 cDNA鎖と実質的に相補的である。その他の場合には、8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドは、事前に選択された第1 cDNA鎖と100%相補的である。
【０００９】
いくつかの態様において、RNA試料を断片化する段階は、Mg2+含有緩衝液中で行われる。段階 (c) および／または (d) は、室温で行われ得る。
【００１０】
いくつかの例において、DNAポリメラーゼまたはその断片はDNAポリメラーゼIである。他の例では、DNAポリメラーゼまたはその断片はクレノウ断片である。
【００１１】
いくつかの態様において、5'アダプターの第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドは、5'リン酸化される。そのような場合、DNAポリメラーゼはクレノウ断片およびリガーゼであってよい。
【００１２】
生体試料は動物組織試料であってよい。あるいは、生体試料は植物組織試料である。
【００１３】
別の局面において、(i) 少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、第1 cDNA鎖の3'末端にアニールする約6〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む第1鎖捕捉オリゴヌクレオチド；および (ii) 第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含む第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドを含む、第1 cDNA鎖の3'末端に対する部分的二本鎖オリゴヌクレオチド5'アダプター；第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドと相補的な配列決定プライマーを含むキットが、本明細書において提供される。任意に、キットは取扱説明書を含み得る。
【００１４】
第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1に記載される配列を含み得る。第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 2に記載される配列を含み得る。いくつかの態様において、第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドは5'リン酸化される。
【００１５】
5'アダプターの3'オーバーハングは、約8〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドであってよい。いくつかの例では、約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドは、RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と実質的に相補的である。その他の例では、約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドは、RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と100%相補的である。
【００１６】
さらに別の局面において、ポリヌクレオチド複合体が本明細書において提供される。ポリヌクレオチド複合体は、生体試料に由来するRNA分子、およびRNA分子の逆転写によって生成された第1 cDNA鎖を含むRNA-cDNA二重鎖、ならびに第1 cDNA鎖の3'末端に対する部分的二本鎖オリゴヌクレオチド5'アダプターを含み、該5'アダプターは、(i) 少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、第1 cDNA鎖の3'末端にアニールする約6〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む第1鎖捕捉オリゴヌクレオチド；および (ii) 第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含む第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドを含み、該5'アダプターは、RNA-cDNA二重鎖の第1 cDNA鎖の3'末端にアニールする。
【００１７】
第1 cDNA鎖は、ランダムなヌクレオチド配列を含む3'アダプターを用いて生成され得る。あるいは、第1 cDNA鎖は、ポリT配列を含む3'アダプターを用いて生成され得る。
【００１８】
いくつかの態様において、5'アダプターの3'オーバーハングは、約8〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む。約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドは、RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と実質的に相補的であってよい。その他の場合には、約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドは、RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と100%相補的であってよい。
【００１９】
第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1に記載される配列を含み得る。第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 2に記載される配列を含み得る。
【００２０】
本発明のその他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】鎖特異的ライブラリー合成機構の模式図を示す。mRNA (101) を熱およびマグネシウムで断片化し (1)、アダプター含有オリゴヌクレオチドによりcDNA合成のためにプライミングする（2および3）。例示的なmRNA転写物は、ポリA尾部(SEQ ID NO:18; 5’-AAAAAAAAAAAAAAA)を含む。例示的なDGEプライマーは、SEQ ID NO:19 (5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTV)の核酸配列を含む。例示的なSHOプライマーは、SEQ ID NO:20 (5'-NNNNNNNN) の核酸配列を含む。サイズ選択および浄化により、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドおよび小さなcDNA断片を除去する (4)。RNA-cDNAハイブリッドの末端における一過性の二重鎖ブリージング (breathing) により (5)、5-プライム捕捉アダプターの一本鎖部分との相互作用が促進され (6)、大腸菌 (E. coli) DNAポリメラーゼIが、完全なライブラリー分子へのその取り込みを触媒する (7)。例示的な二本鎖5'アダプター (130) は、8個のランダムなデオキシリボヌクレオチド (SEQ ID NO:21; 5'-NNNNNNNN) のオーバーハングを伴って示される。
【図２】図2A〜2Dは、ライブラリーの品質および特徴の解析を提供する。すべての品質フィルタリング段階を通過したリードの割合（図2A）。DGEおよびHTRの配列重複レベル（図2B）。DGEおよびHTRにおけるリードのGC含量（図2C）。HTRよりもDGEにおいて、平均GC含量がより低く、かつ分布の幅がより広い。個々のヌクレオチドの組成は、鎖特異的DGEライブライリーと非鎖特異的HTRライブライリーとの間で異なる（図2D）。配列の偏りは、トリミングされ品質フィルタリングされたリードの最初の数個の位置においてHTRライブラリーでより明白である。エラーバーは、組織および方法により（図2A）または方法により（図2Bおよび2C）分離された試料間の標準偏差を示す。
【図３】図3A〜3Dは、リードマッピングおよび鎖特異性を提供する。アダプター混入（図3A）およびリボソームRNA混入（図3B）に由来するリードの割合。ITAGcds+500参照の両鎖にマッピングされたリード（図3C）。プラス鎖に属する、コード鎖にマッピングされたリード（図3D）。
【図４】図4A〜4Cは、転写物カバー率およびcDNA配列選択の偏りを示す。マッピング参照内でのDGEおよびHTRリードの局在性（図4A）、1.5 KBウィンドウにマッピングされたDGEリードは、注釈付き終止コトンの近傍に局在化する。マッピングされたリードの上流の転写物ヌクレオチドに関する塩基頻度（図4Bおよび4C）。
【図５】各々について代表的な試料対を用いた、各試料DGEおよびHTRの代表的な試料対に関するlog2変換発現相関関係を示す。全DGEおよびHTRに関する平均R2乗値。
【図６】図6Aおよび6Bは、DGEおよびHTRに関する多次元尺度構成法 (MDS) プロットを示す。 SAMおよびLeaf試料（図6A）。DGEとHTRとの間のSAM対Leaf Log2変化倍率比較（図6B）。
【図７】図7A〜7Cは、時間間隔の増加に伴う、94℃での3 mMマグネシウムによるRNA断片化を示す（図7A）。大腸菌ポリメラーゼIを用いたブリージング捕捉反応におけるMgCl濃度の、ライブラリー生産量に及ぼす影響（図7B）。ブリージング捕捉反応は、大腸菌ポリメラーゼI (2.5 U)、クレノウ断片 (1.25 U)、およびクレノウexo- (1.25 U) によってうまく促進される（図7C）。図7Cに示されるレーンは、それぞれ4つ、2つ、および2つの技術的反復物である。ブリージング捕捉反応（図7Bおよび7C）は、室温で15分間行った。
【図８】RNA出発量 対 ライブラリー増幅、使用されたサイクル数、およびプール前の洗浄されたライブラリーの濃度を示す。
【図９】図9Aおよび9Bは、本研究に使用されたDGEライブラリーおよびHTRライブラリーの品質フィルタリング前および後のPHREDスコアを示す。
【図１０】品質フィルタリングされた100万個のリード当たりの配列重複率を示す。ハイスループットHTR 23.12 %（破線）、DGE 66.15%（実線）、ショットガン (SHO) 53.63%（実線）、デオキシウラシル標識 (dU) 48.28%（点線）。
【図１１】図11A〜11Fは、さらなる鎖特異的ライブラリー方法、ショットガン (SHO)（図11A、11C、および11E）ならびにデオキシウラシル標識 (dU) （図11B、11D、および11F）に関する、フィルタリングされたリードの情報におけるFastQC分析論を示す。品質スコア（図11Aおよび11B）、塩基組成（図11Cおよび11D）、GC含量率（図11Eおよび11F）。
【図１２】DGEおよびHTRにおける1カ所にマッピングされたリードのゲノムマッピング位置を提供する。DGEリードは、転写物の3-プライムへの主な局在性を示す。
【図１３】SHOライブラリーに関する転写物カバー率トレースを示す。
【図１４】リード起源の識別を示す。DGEリードは、リードの鎖特異性によって、転写物が重複するかまたは近接している場合に、それらの元の転写物に確実に割り当てられ得る。
【図１５】マッピングされたリードの上流20塩基についての情報量を提示する配列ロゴを示す。
【図１６】方法間よりも各方法内で相関関係がより高いことを示す、差次的発現のペアワイズ比較を提供する。
【図１７】3-プライム末端の近傍にバーコード配列を含む一本鎖アダプターによる、同一mRNA試料からの不均一な増幅を示す。
【図１８】一本鎖バーコード含有アダプターを用いて作製されたライブラリー試料の階層的クラスタリングが、バーコード配列によってのみグループ化されることを示す。
【図１９】グアニン反復を含む位置にマッピングされたリードの過剰出現を示す。
【図２０】原型アダプターを用いて作製されたライブラリーにおけるマッピング位置の高度に不均等な分布を示す。
【図２１】トリミングされたリードのマッピングされた第1ヌクレオチドの上流のリードの配列情報量を示す。
【図２２】本明細書において記載される方法 (BrAD-seq) およびIllumina ScriptSeq v2を用いた場合の、転写物における位置によるリードカバー率を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
I. 序論
次世代配列決定法 (NGS) において使用され得る鎖特異的RNA-seqライブラリーを作製するための組成物、キット、および方法が、本明細書において提供される。鎖特異的cDNAライブラリーを作製するための、所要時間がより少なくかつより費用効率の高いこれらの方法は、DNAブリージングという現象を用いて、二本鎖核酸分子中への定方向配列決定アダプターの捕捉および取り込みを促進する。特定配列の所与の温度において、二本鎖核酸分子（例えば、RNA-cDNA複合体）は、一時的に分離して塩基を露出させ得る（「ブリージングし得る」）。この過程は、二本鎖核酸分子の末端においてより高い割合で起こる。一過性の末端のブリージング中に、ポリヌクレオチドアダプターは、RNA-cDNA複合体の第1 cDNA鎖にアニールし得る。ポリメラーゼの存在下において、アダプターは伸長し、第1 cDNA鎖と相補的な第2鎖cDNAを生成し得る。アダプターが取り込まれた二本鎖cDNA分子は、増幅の準備ができた状態である。この手順により、第2鎖cDNA合成に対するおよびアダプターを添加する前のRNAの除去に対する必要性が回避される。本明細書において記載される方法を用いて、鎖特異的RNAライブラリーおよび3'デジタル遺伝子発現ライブラリーを作製することができる。
【００２３】
II. 定義
本明細書で用いられる場合、以下の用語は、特に指定がない限り、それらに帰する意味を有する。
【００２４】
本明細書において用いられる「1つの (a)」、「1つの (an)」、または「その」という用語は、1つのメンバーを有する局面を含むのみならず、2つ以上のメンバーを有する局面も含む。例えば、「1つの (a)」、「1つの (an)」、または「その (the)」という単数形は、文脈上明白に別の意味を示していない限り、複数の指示対象も含む。したがって、例えば、「1つの細胞」への言及は複数のそのような細胞を含み、「その作用物質」への言及は当業者に公知の1つまたは複数の作用物質を含み、以下同様である。
【００２５】
「鎖特異的」または「定方向」という用語は、二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、元の鋳型鎖と、その元の鋳型鎖と相補的である鎖を区別する能力を指す。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸 (DNA) またはリボ核酸 (RNA)、および一本鎖型もしくは二本鎖型のいずれかのそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、本用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ天然ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。
【００２７】
「RNA分子」または「リボ核酸分子」という用語は、デオキシリボース糖ではなくリボース糖を有し、典型的にはピリミジン塩基の1つとしてチミンではなくウラシルを有するポリヌクレオチドを指す。本発明のRNA分子は一般に一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。RNA試料からのRNA分子との関連において、RNA分子は、細胞核、ミトコンドリア、または葉緑体中のDNAから転写された一本鎖分子を含み得、それが転写されるDNA鎖と相補的なヌクレオチド塩基の線状配列を有する。
【００２８】
「cDNA分子」または「相補的DNA分子」という用語は、逆転写酵素の作用によりRNAから逆転写された合成DNAを指す。cDNA分子は二本鎖であってよく、この場合、一方の鎖はRNA配列の一部と実質的に同一である配列を有し、第2鎖はその相補体である。
【００２９】
「第1鎖合成」という用語は、ポリメラーゼ反応の出発鋳型として元の核酸（例えば、RNA）を使用する第1鎖の合成を指し得る。第1鎖のヌクレオチド配列は、出発鋳型と相補的である配列に対応する。例えば、出発鋳型としてのRNAおよび逆転写酵素（例えば、RNA依存性DNAポリメラーゼ）を使用する第1鎖合成において、結果として得られる第1鎖（例えば、第1鎖cDNA）は、RNA鋳型の相補的配列に対応する。
【００３０】
「第1鎖cDNA」という用語は、第1鎖合成によって合成されたcDNA鎖を指す。第1鎖cDNAの配列は、第1鎖合成の出発鋳型と相補的である。
【００３１】
「第2鎖cDNA」という用語は、鋳型として第1鎖合成反応からの第1鎖cDNAを使用する伸長またはポリメラーゼ反応によって生成されたcDNAの第2鎖を指す。第2鎖cDNAのヌクレオチド配列は、第1鎖合成の元の核酸鋳型（例えば、RNA鋳型）の配列に対応する。
【００３２】
「プライマー」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、標的または鋳型とハイブリダイズすることにより、標的オリゴヌクレオチド、標的ポリヌクレオチド、または鋳型ポリヌクレオチドに結合する、一般に遊離の3'-OH基を有する短いポリヌクレオチドを指す。
【００３３】
「アダプター」または「アダプター分子」という用語は、関心対象の標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド鎖にアニールされ得、その関心対象の標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド鎖の増幅産物の生成を可能にする、公知の配列のオリゴヌクレオチドを指す。適切なアダプターは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15塩基またはそれよりも長い一本鎖オーバーハングを含む二本鎖核酸（DNAまたはRNA）を含む。アダプターの二本鎖DNA部分は、関心対象の試料または配列のいずれかを標識するように設計されたインデックス配列またはバーコード配列をさらに含み得る。
【００３４】
用語「伸長」、「伸長すること」、またはそれらの文法上の等価物は、ポリメラーゼなどの伸長酵素による、プライマー、ポリヌクレオチド、または他の核酸分子に対するdNTPの付加を指す。
【００３５】
用語「連結」、「連結すること」、またはそれらの文法上の等価物は、ホスホジエステル結合による2本のヌクレオチド鎖の連結を指す。そのような反応はリガーゼによって触媒され得る。リガーゼとは、ATPまたは類似の三リン酸の加水分解を伴ってこの反応を触媒する酵素のクラスを指す。
【００３６】
用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズすること」、またはそれらの文法上の等価物は、1つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により少なくとも部分的に形成される（典型的には安定化された）複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン結合、または任意の他の配列特異的様式によって起こり得る。
【００３７】
「逆転写」という用語は、RNA分子のヌクレオチド配列をDNA分子にコピーする過程を指す。逆転写は、RNA鋳型を周知の条件下でRNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素としても公知である）と反応させることによって行われ得る。逆転写酵素とは、一本鎖RNAを一本鎖DNAに転写するDNAポリメラーゼである。使用されるポリメラーゼに応じて、逆転写酵素はまた、その後RNA鋳型を分解するためのRNase H活性を有し得る。
【００３８】
ヌクレオチド配列との関連における「ランダム」という用語は、ポリヌクレオチドの集団内の他のランダムなヌクレオチド配列と組み合わされた場合に、所与の長さのヌクレオチドに関するヌクレオチドのすべてまたは実質的にすべての可能な組み合わせを表す、ヌクレオチドの多様な配列を指す。例えば、任意の所与の位置には4つヌクレオチドが存在する可能性があるため、長さが2であるランダムなヌクレオチドの配列は、16の可能な組み合わせを有し、長さが3であるランダムなヌクレオチドの配列は、64の可能な組み合わせを有し、または長さが4であるランダムなヌクレオチドの配列は、265の可能な組み合わせを有する。
【００３９】
2つの核酸配列との関連における「相補的」という用語は、核酸の間で、例えば第1ポリヌクレオチドと第2ポリヌクレオチドの間などで、ハイブリダイズするまたは塩基対合する能力を指す。相補的ヌクレオチドは、一般にAとT（もしくはAとU）またはCとGである。2つの一本鎖ポリヌクレオチドは、一方の鎖の塩基が、最適に整列させて、他方の鎖の塩基の少なくとも約80%、通常少なくとも約90%〜95%、およびより好ましくは約98〜100%と対合する場合に、実質的に相補的と称される。
【００４０】
III. 態様の詳細な説明
元の一本鎖核酸分子の方向情報を保存する鎖特異的cDNAライブラリーを構築するための方法、組成物、およびキットが、本明細書において提供される。本発明は、cDNA-RNA二重鎖中のcDNAの3'末端に特異的にアニールし、伸長して鎖特異的cDNA分子を生成し得る新規アダプターの発見に一部基づいている。
【００４１】
ある特定の条件下で、5'二本鎖DNAアダプター（捕捉-ブロックアダプター）は、ブリージングを起こしているcDNA-RNA二重鎖にアニールされ得る。cDNA-RNA二重鎖およびDNAアダプターを含む中間複合体の形成時に、DNAポリメラーゼによる伸長により、アダプターの捕捉鎖の3'末端にヌクレオチドが付加され得る。付加されたヌクレオチド（例えば、第2鎖cDNAまたは標的ポリヌクレオチド）は、cDNA-RNA二重鎖のcDNA鎖に関して相補的であり、かつ方向性を有する。本明細書において記載される方法は、標的mRNAの3'末端からの読み取りを提供する鎖特異的3'デジタル遺伝子発現 (3'DGE) ライブラリーを作製するのに有用である。本方法および組成物は、周知の配列決定技法、特にハイスループット配列決定技法と組み合わせることができ、発見適用には、選択的スプライシング事象、遺伝子融合、対立遺伝子特異的発現を同定すること、および稀でかつ新規な転写物を調べることが含まれる。
【００４２】
A. アダプター
本明細書において提供されるアダプターは、捕捉プライマーおよびブロックプライマーを含み、この場合、ブロックプライマーは捕捉プライマーの一部と相補的である。当業者は、ブロックプライマーが捕捉プライマーと100%相補的である必要はなく、実質的に相補的（例えば、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%相補的）であってよいことを認識するであろう。アダプターの核酸配列は、本発明の鎖特異的cDNA分子の下流の適用に基づき得る。例えば、アダプター配列は、特定のNGSプラットフォームと適合するように選択され得る。
【００４３】
いくつかの態様において、アダプターの捕捉プライマーは、ブロックプライマーと相補的である少なくとも20個のデオキシリボヌクレオチドを含む。捕捉プライマーはまた、標的第1鎖cDNAの3'末端にアニールし得る、約6〜約12、例えば、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12デオキシリボヌクレオチドの捕捉領域を3'末端に含む。二本鎖アダプター分子の3'オーバーハングは、捕捉プライマーの3'末端に位置する捕捉領域の約6〜約12、例えば、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12デオキシリボヌクレオチドによって形成される。捕捉領域（すなわち、3'オーバーハング）のデオキシリボヌクレオチドの配列は、ランダムであってよい。換言すれば、これらのデオキシリボヌクレオチドは、第1鎖cDNAの配列を考慮せずに、またはその配列の知識をもたずに、ランダムに選択され得る。その他の場合には、捕捉領域の配列は、実質的にランダムな配列、コンセンサス配列、または特異的配列であってよい。いくつかの態様において、3'オーバーハングのデオキシリボヌクレオチドは、1つまたは複数の事前に選択された第1鎖cDNAと実質的に相補的、例えば、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%相補的である。他の態様において、3'オーバーハングのデオキシリボヌクレオチドは、1つまたは複数の事前に選択された第1鎖cDNAと100%相補的であるように選択される。
【００４４】
いくつかの態様において、二本鎖アダプター分子のブロックプライマーは、アダプター分子の3'オーバーハングを形成しない捕捉プライマーの部分と相補的である、少なくとも20、例えば、20、25、30、35、40、45、50個、またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。ブロックプライマーは、捕捉プライマーの一部の逆相補体であってよい。ブロックプライマーの5'末端はリン酸化され得る。
【００４５】
場合によっては、捕捉プライマーは、
2018515081.tif 000003
の核酸配列を含む。捕捉領域を伴う捕捉プライマーは、SEQ ID NO:3 (Nが任意のデオキシリボヌクレオチドであってよい、
2018515081.tif 000004
) の核酸配列を有し得る。いくつかの態様において、捕捉領域を伴う捕捉プライマーは、
2018515081.tif 000005
の核酸配列を有する。場合によっては、ブロックプライマーは、
2018515081.tif 000006
の核酸配列を含む。
【００４６】
部分的二本鎖5'アダプターが、例えば、Illumina（登録商標）、Roche Diagnostics（登録商標）、Applied Biosystems（登録商標）、Pacific Biosciences（登録商標）、Thermo Fisher Scientific（登録商標）、Bio-Rad（登録商標）等によって商品化されたものを含む、いくつかのNGS配列決定プラットフォームに使用される任意の5'アダプターに基づき得ることが企図される。捕捉プライマーおよびその対応するブロックプライマーの配列は、特定のアダプターに基づいて選択され得、捕捉プライマーの捕捉領域の配列は、ランダムであってよく、または関心対象の第1鎖cDNAもしくは関心対象のRNA分子の配列に基づき得る。
【００４７】
二本鎖5'アダプターは、3'オーバーハングを有する複合体が形成される条件下で、捕捉プライマーとブロックプライマーをアニールさせることによって生成され得る。いくつかの例では、3'オーバーハングは、長さが約6〜約12、例えば、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12であるランダムな連続したデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、以下の条件下でアニールされ得る：(1) 94℃で1分、(2) 94℃で10秒を-1℃／サイクルで60サイクル、(3) 20℃で1分、および任意に4℃で保持。場合によっては、結果として得られた二本鎖5'アダプターは、任意のアニールしていない遊離の捕捉プライマーおよびブロックプライマーから分離される。
【００４８】
複数のcDNA分子（例えば、第1鎖cDNAおよび第2鎖cDNA）を含む鎖特異的cDNAライブラリーを作製するために、複数の部分的二本鎖アダプター分子を使用することができる。いくつかの態様において、各アダプター分子の捕捉プライマーおよびブロックプライマーの配列は実質的に同じであり、アダプター分子の3'オーバーハングの配列はランダムであってよい。
【００４９】
B. 鎖特異的cDNAライブラリーを作製する方法
本明細書において記載される方法は、生体試料由来のRNA-cDNA二重鎖の混合物から鎖特異的cDNAライブラリーを作製する段階を含む。そのようなRNA-cDNA二重鎖の混合物を生成することの詳細な説明は、例えば、Kumar et al., Front Plant Sci, 2012, 3 :202；「mRNA Sequencing: Sample Preparation Guide」, Illumina, Cat. # RS-930-1001, Part # 1004898；Maekawa et al., Methods Mol Biol, 2014, 1164:51-65、およびTariq et al., Nucl Acids Res, 2011, 39(18):el20に見出される。
【００５０】
試料は、動物、植物、カビ、真菌、または微生物、例えば、細菌、酵母、ウイルス、ウイロイドからの試料などの、任意の生体試料であってよい。生体試料からのRNA（例えば、mRNAおよび非mRNA）は、当技術分野で公知の標準的な技法を用いて取得または精製することができる。PureLink（登録商標）RNA Miniキット (Thermo Fisher Scientific)、Dynabeads（登録商標）mRNA DIRECT（商標）Micro Purification Kit (Thermo Fisher Scientific)、GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific)、TRIzol（登録商標）(Thermo Fisher Scientific)、およびRNeasy（登録商標）Plus Universal Kit (Qiagen) などのキットおよび試薬を使用して、生体試料を溶解し、RNA試料を抽出することができる。定方向cDNAライブラリーは、10 mgの細胞質高密度植物組織またはその等価物などの少量の生体試料から、本明細書において記載される方法に従って作製することができる。
【００５１】
RNA試料をさらに処理して、RNA分子、例えばmRNAおよびマイクロRNAを単離することができる。Dynabeads（登録商標）mRNA Purification Kit、mRNA Isolation Kit (Roche)、およびIsolation of mRNA Kit (New England Biolabs) などのキットを使用することができる。あるいは、当技術分野で公知の任意の方法を用いて、RNA試料からリボソームRNA (rRNA) を枯渇させることもできる。リボソームRNA枯渇キットは、Qiagen、Thermo Fisher Scientific、New England Biolabs、Illumina等から市販されている。
【００５２】
逆転写してRNA-cDNA二重鎖を生成する前に、単離されたRNA分子（例えば、mRNA分子）を、高温（例えば、90℃〜96℃）下で二価陽イオン（例えば、Zn2+およびMg2+）を用いる部分的アルカリ加水分解によって断片化することができる。断片化緩衝液は、例えばNew England Biolabs（登録商標）およびThermo Fisher Scientific（登録商標）から市販されている。あるいは、Mg2+イオンを含有する第1鎖cDNA合成緩衝液を用いて、高温でmRNAを断片化することもできる。いくつかの態様において、単離されたRNA分子は断片化されない。非断片化RNA分子を用いて、全長転写物ライブラリーを作製することができる。
【００５３】
断片化または非断片化mRNA分子を、下流の適用、例えば特定のNGSプラットフォームと適合する3'アダプターでプライミングすることができる。例えば、3'アダプターに融合されたポリTプライマーまたはランダムなプライマー（例えば、ランダムなヘキサマーもしくはオクタマー）をmRNA分子にアニールさせることができる。
【００５４】
標準的な第1鎖cDNA合成反応法により、上記の3'アダプターでプライミングされたRNA分子からRNA-cDNA二重鎖を生成することができる。例えば、第1鎖cDNAを合成するための条件下で、逆転写緩衝液、DTT、dNTP、および逆転写酵素を含む第1鎖cDNA反応混合物を、3'アダプターでプライミングされたRNA分子と混合することができる。
【００５５】
RNA分子、第1 cDNA鎖、およびアダプターを含む中間複合体を形成させるための条件下で、上記の二本鎖5'アダプターをRNA-cDNA二重鎖に付加することができる。いくつかの態様において、中間複合体は、陽イオン（例えば、Mg2+）の存在下にて20℃〜25℃で形成される。RNA-cDNA二重鎖の末端が一過性に開き、5'アダプターの捕捉一本鎖伸長物（例えば、3'オーバーハング）がcDNA鎖の3'末端にアニールできるようになった場合に、多量体中間複合体が生成され得る。複合体は、アダプターの捕捉プライマーの伸長によってさらに安定化され得る。
【００５６】
いくつかの局面において、本方法は、5'アダプター、例えば第1鎖cDNAにハイブリダイズされる捕捉プライマーを伸長させる段階を含む。場合によっては、第1鎖cDNAから第2鎖cDNAを合成する段階は、ハイブリダイズされた捕捉プライマーを伸長させることを含む。プライマー伸長の方法は、当業者に周知であり、ポリメラーゼなどの伸長酵素を用いる段階を含み得る。有用なDNAポリメラーゼには、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ；鎖置換活性を有するポリメラーゼ；DNAポリメラーゼI (Pol I)；DNAポリメラーゼI、大（クレノウ）断片、およびクレノウ断片exo-が含まれる。場合によっては、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼは、phi 29、Bst DNAポリメラーゼ、大断片；テルムス・アクウァーティクス (Thermus aquaticus) 由来の改変型DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）であるSD DNAポリメラーゼ等であってよい。本発明の第2鎖cDNAは、プライマー伸長によって生成され、捕捉プライマーを含む。いくつかの態様において、鎖特異的cDNAは、捕捉プライマー上でプライミングされてcDNAの3'末端から生成される。
【００５７】
C. 鎖特異的cDNAの増幅
任意の方法、生成物、およびキットを用いて、超並列配列決定法（すなわち、次世代配列決定法）またはハイブリダイゼーションプラットフォームなどの下流の適用のための、鎖特異的cDNAの増幅準備済み産物を生成することができる。いくつかの例では、濃縮PCRは、cDNA分子の5'アダプターおよび3'アダプターと適合するプライマーを用いて行われ、アダプターおよびcDNA分子を増幅し得る。増幅の方法は、当技術分野で周知である。適切な増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応法 (PCR) 鎖置換増幅(SDA)、線形増幅、多置換増幅 (MDA)、ローリングサークル増幅 (RCA)、単一プライマー等温増幅 (SPIA)、Ribo-SPIA、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意のDNA増幅反応を含み得る。
【００５８】
PCRにおいて、DNAの逆の鎖にアニールする2つの異なるPCRプライマーは、一方のプライマーのポリメラーゼ触媒伸長産物が他方の鋳型鎖として働き、長さがオリゴヌクレオチドプライマーの5’末端の間の距離によって規定される、分離した二本鎖断片の蓄積をもたらし得るように配置される。変性、プライマー伸長、およびポリメラーゼによるプライマー伸長の反復サイクルにより、プライマーが隣接している標的ポリヌクレオチドの所望の配列のコピーが指数関数的に増加する。
【００５９】
D. 次世代配列決定法
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、その配列が標的RNA分子に対応する増幅産物をDNA配列決定する段階を含む。DNA配列決定法の非限定的な例には、Sanger自動化シーケンシング（AB 13730x1ゲノム解析機）、固体支持体上でのピロシーケンシング（454シーケンシング、Roche）、可逆的ターミネーターを用いる合成によるシーケンシング（Illumina（登録商標）Genome Analyzer）、半導体を用いた合成によるシーケンシング（Ion Torrent（商標））、ライゲーションによるシーケンシング（ABI SOLiD（登録商標））、またはバーチャルターミネーターを用いる合成によるシーケンシング（HeliScope（商標））が含まれる。配列決定のための有用な方法は、Illumina、454/Roche Life Sciences、Applied Biosystems、Helicos Biosciences、Pacific Biosciences、Life Technologies等により商品化されている。
【００６０】
E. キット
部分的二本鎖5'アダプター、および5'アダプターを配列決定するのに有用な配列決定プライマーを含むキットが、本明細書において提供される。5'アダプターは、少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、約6〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む捕捉プライマー、および捕捉プライマーの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含むブロックプライマーを含む。ブロックプライマーは、ブロックプライマーの長さにわたって、捕捉プライマーと100%相補的であってよい。3'オーバーハングを形成する6〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドは、ランダムであってよく、または関心対象の第1鎖cDNAに基づいて事前に選択された配列を示し得る。いくつかの例では、事前に選択された配列は、関心対象のcDNAの末端と少なくとも50%、例えば、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%相補的である。他の例では、事前に選択された配列は、関心対象のcDNAの末端と100%相補的である。
【００６１】
キットの配列決定プライマーは、本明細書において記載される方法に従って生成された第2鎖cDNAの配列を決定するために用いられる。配列プライマーの配列は、5'アダプター分子に基づく。いくつかの態様において、配列決定プライマーは、アダプターのブロックプライマーと相補的である。
【００６２】
キットは、ポリメラーゼ緩衝液、ポリメラーゼ、DTT、dNTP、滅菌水、MgCl2、断片化緩衝液、cDNA増幅プライマー、およびライブラリーを精製するための試薬などの、鎖特異的cDNAライブラリーを作製するために必要な試薬を含み得る。キットは取扱説明書もまた含み得る。
【実施例】
【００６３】
IV. 実施例
以下の実施例は説明のために提供するものであり、主張される本発明を限定するために提供するものではない。
【００６４】
実施例1：ブリージングアダプター定方向配列決定法 (BrAD-seq)：DNAおよび鎖特異的mRNAのライブラリー構築のための、合理化され、超簡易型で、かつ迅速なライブラリー調製プロトコール
次世代配列決定 (NGS) 技術は、急速にゲノム研究の基礎的手段となった (Koboldt et al., 2013)。特に、RNA配列決定 (RNA-seq) は、遺伝子発現解析を一変させ、実質的に任意の種のトランスクリプトームアセンブリを作成する能力により、非モデル生物の研究をかつてない詳細度で促進した (Semon, 2014)。最も一般的に使用されているIlluminaプラットフォームにおいて、多数の生体試料を配列決定する能力は、分子の末端において指定配列「アダプター」を用いて核酸試料からライブラリーを作製することを必要とする。種々の供給源材料由来の核酸試料からアダプター付加ライブラリーを作製するために使用可能な種々の方法が存在するが、その工程はなお技術的に困難で、手が掛かり、かつ高価なままであり、それによってこの技術への広範なアクセスは限定されている。
【００６５】
ここで本発明者らは、単純で、迅速で、かつ安価なモジュール形式で鎖特異的RNA-seqライブラリーを構築するための新規でかつ効率的な方法を示す。本方法は、種々のDNA供給源材料を用いることに加えて、鎖特異的3-プライムデジタル遺伝子発現（DGE‐mRNAの3'末端からの読み取りを提供する）を作成するために最適化され、鎖特異的非DGEショットガン型 (SHO) RNA-seqライブラリーおよびより慣習的な非鎖特異的 (CNV) RNA-seqライブラリーに適合化され得る。3-プライムDGEライブラリーは、単一のmRNAがおよそ1つの配列リードをもたらし、潜在的バイアス要因を軽減するという理由で、遺伝子発現研究に好まれる場合が多い。
【００６６】
鎖特異的RNA-seqは、cDNAライブラリーの調製中に、特有の5-プライムおよび3-プライムアダプター配列の定方向付加を必要とする。これは、様々なNGSライブラリー調製プロトコールの中のいくつかの方法で達成される。これらには、cDNA合成の前のmRNA分子の5-プライム部分への公知の配列のライゲーション (Lister et al., 2008)、鋳型RNA鎖の除去とその後のランダムプライミングによる第2鎖合成 (Armour et al., 2009)、濃縮前の酵素分解のための第1鎖または第2鎖cDNA分子のdUTPによる標識 (Parkhomchuk et al., 2009)、およびcDNA分子に規定のヌクレオチドを付加するためのターミナルトランスフェラーゼの使用 (Zhu et al., 2001；Tang et al., 2010) が含まれ、それぞれの方法に利点および欠点がある (Regev et al., 2012)。定方向NGSライブラリー構築のための本発明者らの方法は、ライブラリー構築過程を大幅に単純化し、加速させる。RNA-seqライブラリーの作製には、およそ10ミリグラムの、茎頂分裂組織 (SAM) または葉原基（成熟組織についてはわずかにより多量）などの細胞質高密度植物組織しか必要とせず、個々の作業者は、組織から開始して手順を一日で容易に完了することができる。
【００６７】
本発明者らは、鎖特異的ライブラリーを作製するために使用可能な方法において活用されていない核酸化学の局面を用いる。二本鎖核酸は、個々の鎖が一時的に分離して塩基を露出させる、「ブリージング」と称される現象を起こす (von Hippel et al., 2013)。この過程は、二本鎖核酸の末端においてより高い割合で起こる (von Hippel et al., 2013)。本発明者らは、RNA-cDNA二重鎖の5-プライム末端において特異的に、Illumina TruSeq PE1配列を含むアダプターオリゴヌクレオチドを取り込むために、この一過性の末端ブリージングを活用する。ブリージング捕捉により、事前の第2鎖合成も鋳型RNAの除去も必要としない、合理化された鎖特異的ライブラリープロトコールが可能になり、それによって3-プライムDGE鎖特異的ライブラリーまたはショットガン (SHO) 型鎖特異的ライブラリーのいずれかの構築が可能になる。
【００６８】
これらの基本的な鎖特異的モジュールから、本発明者らは、インプット材料としての種々の核酸種‐一本鎖RNA、二本鎖DNA、および一本鎖DNAを適応させるための付加的な互換性モジュールをさらに開発した。これは、遺伝子発現研究のためのライブラリー、ゲノムDNAライブラリー、ならびにクロマチン免疫沈降 (ChIP) 実験で得られたDNAおよびレーザーキャプチャー マイクロダイセクションされた (LCM) 組織試料からのRNAなどの微小試料の増幅産物からのライブラリーを作製するための汎用プラットフォームを提供する。このプラットフォームにおいて共通モジュールを使用することで、いくつものライブラリー型を作製するために必要な個々の試薬の数が最小限に抑えられ、ならびに取扱いおよび操作段階が標準化され、それによって学習曲線が軽減され、かつ人的過誤の可能性が最小限に抑えられる。
【００６９】
材料および方法
鎖特異的ライブラリー合成のための反応段階の模式図を図1に示す。非鎖特異的な「慣習的」(CNV) RNA-seqライブラリーのための簡潔なプロトコールは、以下に見出され得る。鎖特異的DGE RNA-seqおよび鎖特異的SHO RNA-seq、ならびに非鎖CNV RNA-seqおよびDNA-seqのプロトコール変形の詳細な説明もまた、以下に見出され得る。この研究で使用されるオリゴヌクレオチドはすべて、50ナノモルスケールでLife Technologies (Thermo Fisher Scientific) に注文したものであり、脱塩され、さらなる精製はされていない。
【００７０】
A. 植物材料
トマト種子（トマト (S. lycopersicum) cv M82: LA3475）は、Tomato Genetics Resource Center, University of California, Davisにより提供された。滅菌（50%漂白剤で1分間、およびその後の水によるすすぎ）後、種子をPhytatray (Sigma) 中の水に浸したペーパータオル上に乗せ、室温にて暗下で3日間おき、発芽させた。Phytatray内の発芽した種子を、22℃、相対湿度70%、および明期16時間／暗期8時間の光周期の生育チャンバー内に入れ、さらに4日間おいた。次いで、実生をSunshine Mix土壌 (Sun Gro) に移植した。土壌中で11日間生育させた後、かみそりの刃を用いて、P5葉原基（葉試料）ならびにSAM（SAMおよびより若い4つの葉原基からなる）を慎重に切断し、RNase不含チューブ中に収集した。
【００７１】
B. mRNAの単離
ジルコンビーズ、およびドデシル硫酸リチウムの代わりにドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶解物結合緩衝液を用いて、Kumarら (Kumar et al., 2012) によって以前に記載されたように、組織を処理し溶解した。試料当たり200μlの溶解物からmRNAを単離した。5-プライム20ヌクレオチド任意スペーサー配列に続いて20個のチアミンヌクレオチドを含有する、12.5μMの5-プライムビオチン化ポリTオリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000007
1μlを各溶解物試料に添加し、数回のピペット操作により混合し、10分間静置させた。インキュベーション後、LBBで洗浄したストレプトアビジン被覆磁気ビーズ (New England BioLabs, Cat. # S1420S) 20μlを添加することにより、捕捉されたmRNAを溶解物から単離した。ビーズ-溶解物混合物をピペット操作によって混合し、さらに10分間静置させた。試料を96ウェル磁気分離器 (Edge BioSystems, Cat. # 57624) 上に置き、以下の修正を加えて、以前に記載されたように洗浄した (Kumar et al., 2012)。(A) WBA、WBB、およびLSBの洗浄容量はそれぞれ300μlとし、使用前に緩衝液を氷上で冷却した。(B) 1 mM β-メルカプトエタノールを含有する16μlの10 mM Tris-HCl pH 8中へのmRNAの溶出を行った。
【００７２】
C. mRNAの断片化、3-プライムアダプターによるプライミング
mRNAの断片化は、高温でマグネシウムイオンを使用することにより達成した（図7A〜C）。cDNA合成反応のプライミングは、鎖特異的DGE用、鎖特異的RND用の単一反応混合物中で行い、かつ、非鎖特異的ライブラリーは、10μlの総反応容量中に1.5μlの5×RT緩衝液 (Thermo scientific, Cat. # EP0441)、1μlのプライミングアダプター、および7.5μlの試料mRNAを含有する反応物中で断片化された。混合物を遠心沈殿させ、サーモサイクラー中でインキュベートした。各ライブラリー型について、以下のオリゴヌクレオチドおよびサーモサイクラープログラムを使用した。
DGE：1μlの2μMオリゴL-3ILL-20TV.2
2018515081.tif 000008
（25℃で1秒、94℃で1.5分、30℃で1分、20℃で4分、20℃で保持）。
SHO：1μlの5μMオリゴL-3ILL-N8.2
2018515081.tif 000009
（25℃で1秒、94℃で1.5分、4℃で5分、20℃で保持）。
【００７３】
D. cDNA合成
断片化およびプライミングされたmRNAに5μlの以下の反応混合物を添加することにより、cDNAを合成した：1.5μl 5×Thermo Scientific RT緩衝液 (Thermo scientific, Cat. # EP0441)、1.5μl 0.1 Mジチオスレイトール (DTT)、1μl H20、0.5μl 25 mM dNTP (Thermo Scientific, Cat. # R1121)、0.5μl RevertAid RT酵素 (Thermo Scientific, Cat. # EP0441)（総反応容量15μl）。反応混合物を室温で構成し、以下のプログラムを実行するサーモサイクラー中に入れた（25℃で10分、42℃で50分、50℃で10分、70℃で10分、4℃で保持）。「ブリージング捕捉」または第2鎖合成の前に、各試料に5μl 50 mM EDTA pH 8.0および30μl Agencourt AMPure XPビーズ (Beckman, Cat. # A63881) を添加し、ピペット操作で混合することにより、cDNAを浄化し、サイズ選択した。5分後、試料を磁気トレイ上に置き、上清を除去し、ペレットを破壊することなく300μl 80%エタノールでペレットを2回洗浄した。残存エタノールを20μlピペットチップで除去し、目に見える微量の液体が検出不能となるまで試料を風乾させた。
【００７４】
E. 5-プライム二重鎖ブリージング捕捉アダプターの付加（鎖特異的）
5-プライムアダプターの付加は、10μMの事前にアニールさせた5-プライム二本鎖アダプターオリゴ4μlで、ビーズ-ペレットに結合しているcDNAを室温で再水和することによって行った。二本鎖5-プライムアダプターは、H2O中にそれぞれ10 mMのオリゴ5pSense8n
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および5pAnti
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を含有する貯蔵溶液を作製し、ストリップチューブ中に100μL容量を分注し、以下のプログラムを実行するサーモサイクラー中でそれらをアニールさせることによって調製した：［94℃で1分（94℃で10秒） -1℃／サイクルで60サイクル、20℃で1分、4℃で保持］。その後、6μlの以下の反応混合物を添加し、ペレットを完全に再懸濁するようにピペット操作により混合し、室温で15分間インキュベートした：3.5μl H2O、1μl 10×Thermo Pol I反応緩衝液 (Thermo Scientific, Cat. # EP0041)、1μl 250 mM MgCl2（新たに作製し、-20℃で貯蔵）、0.25μl 25 mM dNTP (Thermo Scientific, Cat. # R1121)、0.25μl Thermo DNA Pol I (Thermo Scientific, Cat. # EP0041)（総反応容量10μl）。10μl 50 mM EDTA pH 8.0および30μl ABRを添加することにより、前段階から存在するAgencourt AMPure XPビーズを用いて、ビーズ上の濃縮前ライブラリーを洗浄してサイズ選択し、ピペット操作により完全に混合し、5分間静置させてから磁気トレイ上に置いた。上清を除去し、ペレットを破壊することなく300μl 80%エタノールでペレットを2回洗浄した。残存エタノールを20μlピペットチップで除去し、目に見える微量の液体が検出不能となるまで試料を風乾させた。ペレットを22μl 10 mM Tris pH 8.0中に再懸濁し、1分間静置させ、磁気トレイ上に置いた。ビーズを含めずに上清を新たなストリップチューブに移し、濃縮の前に-20℃で貯蔵した。
【００７５】
F. PCR濃縮およびインデックス配列の付加（鎖特異的および非鎖特異的）
濃縮段階は、全アダプター配列を含有する全長オリゴヌクレオチド、および主として全長増幅産物とするための、アダプターアームの最遠位部と相補的な短いオリゴヌクレオチドを用いて行った。PCR濃縮は、20μlの総反応容量中に、1μlの2μM特有インデックス付きILL-INDEXオリゴヌクレオチド
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を、9μLのマスターミックス：4μl 5×Phusion HF緩衝液、2.6μl H20、1μl 2μM PE1プライマー
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、1μl 各8μM S1 + S2プライマー
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、0.2μl 25 mM dNTP、0.2μl Phusionポリメラーゼ (Thermo Scientific, Cat. # F-530L)、および10μlの濃縮前cDNAを組み合わせることによって行った。PCR混合物の半量 (10μl) を別の試料チューブに入れ、より多くの濃縮サイクルが必要となった場合の試料のバックアップとして-20 Cで貯蔵した。残りの10μlを遠心沈殿させ、プログラム：［98℃で30秒、（98℃で10秒、65℃で30秒、72℃で30秒）を11サイクル、72℃で5分、10℃で保持］を用いるサーモサイクラー中に入れた。非常にわずかな濃縮しか示さない試料は、バックアップPCR試料から13サイクルの濃縮を用いて再増幅させた。2μlの各ライブラリー試料を、サイズおよび量の参照のための1μlのO'GeneRuler 100 bp DNAラダー (Thermo Scientific, Cat. # SM1143) と共に、1%アガロースゲル上で100ボルトで20分間泳動した。濃縮ライブラリー試料の残り8μlを、12μlの新たなAgencourt AMPure XPビーズを用いて浄化しサイズ選択し、以前の洗浄段階と同様に80%エタノールで2回洗浄した。10μlの10 mM Tris pH 8.0でライブラリーをペレットから溶出し、定量化し、以前に記載されたようにプールした (Kumar et al., 2012)。UC BerkeleyのVincent J. Coates Genomic sequencing Facilityにおいて、50 bp単一末端配列決定を行った。
【００７６】
G. バイオインフォマティクス
バイオインフォマティクスおよび統計解析は、iPlant Atmosphereクラウドサービス (Goff et al., 2011) を用いて行った。リードは、FASTX-Toolkit（hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/のウェブサイトを参照されたい）およびComai lab, UC Davisによって開発されたスクリプト（comailab.genomecenter.ucdavis.eduのウェブサイトを参照されたい）を用いて、42 bpまでトリミングし、品質フィルタリングを行った。表1に指定されたパラメータと共にBowtie (Langmead et al., 2009) を用いて、リードをマッピングした。リードの品質解析は、FASTQC（www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/のウェブサイトを参照されたい）を用いて行った。バイオインフォマティクス段階の各々を実行するために使用されたコードは、ウェブサイトgithub.com/SinhaLab/townsley-fips-2015/において入手可能であり、本研究で用いられるRNA-seqデータのためのFASTQファイルは、Dryadデータリポジトリ（リンクは、Dryadデータホスティングポリシーにより、証明される場合に限り提供され得る）からダウンロードすることができる。
【００７７】
（表１）DGEおよびHTRライブラリー試料の差次的遺伝子発現コール
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【００７８】
結果および考察
本発明者らの鎖特異的ライブラリー調製法を評価するために、ペアワイズ比較解析用に、新たなBrAD-seq DGE法および本発明者らが以前に開発したHTR法を用いて、茎頂分裂組織 (SAM) および葉原基 (Leaf) 試料を調製した。このプロトコールにおいて、本発明者らは、濃縮段階中に試料識別インデックス配列をライブラリー分子に付加した (Meyer and Kircher, 2010)。
【００７９】
A. ライブラリー濃縮
手順の問題として本発明者らは典型的には、より高い処理量を維持するためにライブラリー合成の前にmRNA濃度を定量化しないが、不慣れな材料で実験を開始する場合には、どのくらいの濃縮サイクルが試すのに合理的であるかという考えをある程度もっておくことは有用であり得る。投入mRNA濃度と選択される濃縮サイクル数の関係を確認するために、DGEライブラリー合成に使用された22件のmRNA試料を、RNA 6000 Picoキット (Agilent Technologies) を用いてBIOANALYZER（商標）で定量化した。この情報を、各ライブラリー試料の濃縮に使用されたサイクル数および洗浄されたライブラリーの濃度と相互に関連づけた（図8）。この関係から、約10 ng/μl未満のmRNAでは、最初の試みにおいて約14の濃縮サイクルから開始することが有意義であり得ることが示唆されるが、ゲル像の解釈における個々の好みおよび試料のプールのための目標最終濃度が、最終的には、理想的な濃縮サイクル数を決定する際の重要な要素となると考えられる。
【００８０】
B. リードの品質
5-プライムアダプター捕捉鎖に起因する配列の包含を回避するために、DGEライブラリーの最初の8塩基を解析前にトリミングした。HTRライブラリーに関しても、最初の8塩基をトリミングした場合に、リードマッピングの割合がより高い（77.8%対74.1%）ことが見出されたため、すべての解析に関して、品質フィルタリング段階の前に、トリミングされたFASTQファイルを試料について作成した。cDNA合成中に、ランダムプライマーはミスマッチを伴ってアニールし、それによって非天然配列がcDNA分子中に取り込まれるため、マッピング率は、トリミングされたHTRライブラリーにおいて改善する。
【００８１】
生DGEライブラリーの全体的な品質スコアは、ポリAトラクトを含有するcDNA挿入物の包含に起因して、HTRよりも低かった（図8）。複雑度の低いこれらの配列は参照配列にマッピングされ得ず、それらは大部分が品質フィルタリングによってマッピングの前に除去される（図2Aおよび図9A〜9B）。
【００８２】
mRNA転写物の3-プライムにおいて高度に濃縮された鎖特異的cDNA分子の集団は、各転写物についてより少数の特有配列からなるはずであるため、独立したcDNA分子に由来する同一のリードは、非鎖特異的ライブラリーおよび非DGEライブラリーよりも高レベルで予測される。本発明者らは実際に、HTRよりもDGEについてより高い配列重複を認める（図2B）。非DGE鎖特異的ライブラリーは、転写物長のカバー率がより十分であり、より高い配列複雑度に起因してDGEライブラリーよりも低い配列重複を示す（図10）。同様の成長段階にあるトマト葉から作製された鎖特異的トマトSHOライブラリー、およびデオキシウラシル (dU) 標識鎖特異的法 (Wang et al, 2011) を用いて作製された、Gene Expression Omnibus（アクセッション：GSE38879）からダウンロードされたシロイヌナズナ鎖特異的ライブラリー (Hsu et al., 2013) も評価したが、互いに類似の重複率を有する（図10）。リード重複カウントにおける一要素としての、試料間の配列決定深度の違いを取り除くために、重複解析には、各FASTQファイルから100万個のリードのランダムなサブ標本を使用した。
【００８３】
加えて、3-プライムDGEライブラリーでは、品質フィルタリングによってすべてのポリA鎖が除去されるわけではない。ホモヌクレオチド「A」反復は、DGEライブラリーにおける主な重複配列を構成し、品質フィルタリングされたリードの〜0.3%を占める。品質フィルタリング後、GC含量およびper base sequence contentはDGEとHTRとで異なり（図2C）、鎖特異的DGEライブラリーのリードにおいてGC含量はより低い。非鎖特異的ライブラリー（例えば、HTRライブラリー）における個々の塩基組成は、およそ等量のG対CヌクレオチドとA対Tヌクレオチドを含むはずであるが、G/CとA/Tの割合はmRNAのコード鎖については不均等である。注釈付きトマトコード配列のセンス鎖における各ヌクレオチドの割合は、22.1% G、18.5% C、29.9% A、29.4% Tであった。これは、DGE配列において観察された割合：22.5% G、15.2% C、28.5% A、33.8% Tと厳密に一致した（図2D）。SHOライブラリー法とdUライブラリー法との間で、品質スコア、sequence content、およびGC分布は同様の性能を示す（図11）。
【００８４】
C. アダプターおよびrRNAの混入
アダプターの混入は、HTRではリードの〜1%からなるのに対してDGEではリードの〜5%からなり、HTRよりもDGEライブラリーにおいてより高かった（図3A）。これは、DGEプロトコールのビーズ洗浄段階においてより高いPEG濃度を使用したことに起因し得る。これは小さい産物のビーズ結合を増加させる可能性がある。HTRライブラリーでは0.22%〜0.39%（図3B）、および市販のIlluminaキット (Kumar et al., 2012) を用いて作製されたトマトライブラリーではおよそ3%であるのに対して、DGEライブラリーからのリードのおよそ1%がリボソームの混入に起因し得る。HTRと比較してDGEにおいてrRNAが増加しているのは、HTR過程では2段階のmRNA再単離であるのに対して、単一段階のmRNA単離であることによる可能性が高い。
【００８５】
D. リードマッピング
DGEライブラリーとHTRライブラリーを確実に比較するため、本発明者らは、注釈付きトマトコード配列＋終止コドンの3-プライム側のゲノム配列に対応する付加的な下流部分からなる、一組の参照配列を作出した。植物の3-プライム非翻訳領域 (3'-UTR) は、長さが可変で平均およそ200 bpであるが (Mignone et al., 2002)、多くの3'-UTRは注釈付けられない。本研究の目的のために、大部分の3'-UTR配列を包含するよう500 bpの下流ゲノム配列を選択し、注釈付きITAG2.4コード配列に付加した (ITAGcds+500)。特にDGEライブラリーのために、コード配列の3-プライム側500 bp＋3'-UTRを示すさらなる500 bpからなる、さらなるマッピング参照を作成して (ITAG500+500)、コード配列内の任意のAリッチ領域に対する3-プライムポリT含有アダプターの誤プライミングの影響を最小限に抑えた。
【００８６】
ITAGcds+500参照のプラス鎖およびマイナス鎖に対する1回または複数回のリードマッピングの割合は、HTR（77〜78%）よりもDGE（85〜87%）においてより高く（図3C）、これにより両方法における大多数のリードがmRNAに由来することが実証される。
【００８７】
E. DGEの3-プライム選択性
mRNA転写物の3-プライム部分に関して、DGEライブラリープロトコールの強い選択性が存在するが、HTRに由来するリードは、転写物にわたってより均等に分布している（図12）。ITAG500+500参照配列はITAGcds+500参照配列よりも平均して608 bp短いが、ITAGcds+500参照に特有にマッピングされるHTRリード（73%〜78%）よりも多くのDGEリードが、ITAG500+500参照に特有かつ鎖特異的にマッピングされる（78%〜81%）。
【００８８】
F. 鎖特異性
DGEライブラリーの鎖特異性を評価するため、重複するUTR領域へのリードマッピングを排除するように、リードをトマトコード配列のみにマッピングした（図3D）。DGEライブラリーにおいてマッピングされたリードのおよそ99%およびHTRライブラリーにおいてマッピングされたリードの50%は、センス鎖に局在化し、これによりDGEライブラリーの鎖特異性が非常に高度であることが示される。RNA-cDNA二重鎖のcDNA鎖のみがPol Iの鋳型として機能し得るため、cDNA分子の方向情報が保存される。本発明者らは、大腸菌Pol I、クレノウ断片、およびクレノウexo-と共にこの方法を用いてライブラリーの作製に成功し（図7C）、これにより、この過程が効率的に働くのにPol Iのエキソヌクレアーゼ活性は必要ではないことが示される。
【００８９】
DGEライブラリーにおいて特有にマッピングされたリードの大多数 (95%) は、ITAGcds+500参照の注釈付き終止コドンの+/- 500 bpの領域にマッピングされるのに対して（表2）、HTRライブラリーは転写物にわたるより均等な分布を示す（図4A）。DGEリードは、注釈付き終止コドンの下流を含む転写物の3-プライム領域にほぼ完全に局在化し、これによりDGEリードのマッピングにはこの区間のみが必要であることが示唆される。HTRリードは、比較すると、より均等な分布を示すが、それでもやはり転写物の3-プライム側の配列に偏っている。すべてのコード配列が1 kbまたはそれ以上の長さであるとは限らないため、リード位置をまた、コード配列の部分に合わせて調整した（図4B）。HTRライブラリーはやはり、CDSの3-プライム末端近傍の配列に対するわずかな偏りを示す。SHOライブラリーは、HTRと類似の転写物カバー率を示すが、SHOのカバー率はいくらか高い5-プライム転写物表現を示す（図13）。
【００９０】
（表２）終止コドンに対するITAGcds+500参照におけるDGEリードマッピング位置
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【００９１】
アダプター捕捉過程によって導入される配列選択の偏りの程度を確認するため、各リードのマッピングされた第1ヌクレオチドの上流20ヌクレオチドを、塩基組成（図4C）および情報量（図14）のためにFASTAマッピング参照から抽出した。-8位〜-1位は、DNA-RNA二重鎖のブリージング捕捉を担うアダプターの8 bp一本鎖部分にアニールされたcDNA領域に対応する。-20位〜-9位は、Illumina TruSeq PE1配列を含むアダプターの「遮蔽」二本鎖部分に対応する。遮蔽（ブロック）オリゴヌクレオチドの存在にもかかわらず、アダプターの最後の数塩基に対応する-9マップ位置に接近する位置は、二本鎖領域の末端の近傍でいくらかの配列の偏りを示す（図15）。これにより、捕捉末端におけるアダプターの二重鎖ブリージングが最初の数個の内部塩基を一過性に露出させ、それによっていくらかの相補性を有するcDNA配列との相互作用が増加することが示唆される。この配列選択の偏りの程度および範囲は、非遮蔽一本鎖アダプターを用いるこのプロトコールの旧型よりも顕著に改善されているが、これは、ランダムな8-merの第1塩基を、伸長した二本鎖遮蔽領域に変換することによって、まださらに改善される可能性がある。鋳型mRNA鎖の保持により、cDNAの内部への接近が妨げられる。このことはアダプターの相互作用をcDNAの末端部に限定し、これにより、mRNA断片化によるライブラリーサイズの制御が提供され、配列特異的二次構造の影響が制限される。ブリージング捕捉反応中のマグネシウム濃度を20 mMに上昇させることにより、潜在的にcDNA鎖とアダプターの捕捉ヌクレオチドとの塩基対相互作用の強度が増加するために、ライブラリー収率が改善される（図7B）。DGEライブラリーの鎖特異性により、ターミネーター領域が重複する遺伝子に関して、元の転写物の明白な割り当てがまた可能になる（図14）。
【００９２】
G. 遺伝子発現の検出
事前に品質フィルタリングされたリードの同等サイズのサブセットから、リードを解析した（表3）。リードがマッピングされた転写物の数は、複数カ所にマッピングされたリードを除外した場合に、DGEライブラリーおよびHTRライブラリーの両方において減少する。DGEライブラリーに組み込まれた転写物の限られた範囲を、1カ所にマッピングされたリードのみを保持することおよび配列特異性と組み合わせることで、転写物のゲノム位置が重複している、およびコード配列が高度に保存される転写物の偽検出が減少し得る。
【００９３】
（表３）それぞれDGEおよびHTRに関する6.5Mリードの事前に品質フィルタリングされたサブセットの転写物検出
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【００９４】
ITAGcds+500参照の両鎖にマッピングされた、複数カ所にマッピングされるリード、ITAGcds+500の両鎖にマッピングされた、1カ所にマッピングされるリード、およびITAG500+500参照のセンス鎖にマッピングされた、1カ所にマッピングされるリード。
【００９５】
反復物間の相関関係は、HTR試料よりもDGE試料についてより高い（図5および表5）。Log2変換発現の全ペアワイズ比較に関するR2乗値は、HTR（SAM 0.91、Leaf 0.93）よりもDGE（SAM 0.96、Leaf 0.95）反復物間でより高い相関関係を示した。これらの値はまた、DGEとシロイヌナズナdUライブラリー (0.96) について、およびHTRとSHO (0.92) の間で類似している。DGE実験試料とHTR実験試料との間の変動もまた、多次元尺度構成法 (MDS) を用いて評価した（図6A）。DGE試料およびHTR試料のいずれも組織型によってクラスター化するが、SAMクラスターとLeafクラスターとの間の距離は、DGEライブラリーで次元2に沿ってより大きく、これにより遺伝子発現による組織間の識別力が高いことが示唆される。DGEとHTRとの間の差次的遺伝子発現コールは、高度の重複を示す（表4）。本発明者らは、両方のライブラリー調製法に関して、SAM試料 対 leaf試料において差次的に調節される遺伝子 (FDR < 0.05) のlog2変化倍率間に非常に強い相関関係 (rs = 0.92) を認めた。DGE法のみ（rs = 0.87；図6Bにおけるオレンジ色）またはHTR法のみ（rs = 0.87；図6Bにおける青色）で差次的に調節される遺伝子を考慮した場合、相関関係は非常に強いままである。
【００９６】
（表４）DGEおよびHTRライブラリー試料の差次的遺伝子発現コール
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【００９７】
方法内および方法間の差次的発現結果を比較するために、本発明者らは試料を反復物2つの10群に分類した。10個の試料群は、2つのHTR leaf、2つのHTR SAM、3つのDGE leaf、および3つのDGE SAMであった。各ライブラリー調製法内で、leaf×SAMの全組み合わせについて差次的遺伝子発現解析を行った。これは、HTRについて4つの比較およびDGEについて9つの比較をもたらした。これらを用いて、各ライブラリー調製法内（DGEについて45およびHTRについて6）ならびに各ライブラリー調製法間（DGE対HTRについて36）のleaf-SAM差次的発現遺伝子の全組み合わせについて、スピアマンの順位相関係数を算出することができた（図12）。本発明者らは、ライブラリー調製法内よりもライブラリー調製法間を比較した場合に、差次的に調節される遺伝子の変化倍率の相関が低いものの、方法間の比較および方法内の比較のいずれもが非常に強い相関関係を示すことを見出した。
【００９８】
H. コスト
本発明者らは、主に非修飾オリゴヌクレオチドを使用し、取扱い、段階、および試薬を最小限に抑えるプロトコールを開発することにより、ライブラリー調製のコストおよび複雑度を最小限に抑えようと努めた。mRNAを単離し、本方法を用いて鎖特異的ライブラリーを作製するコストは並外れて低く、磁気ビーズ、dNTP、および酵素のコストはmRNA単離を含め総額で$2.96／試料であり、またはmRNAからライブラリーを作製する場合には$1.98である。消耗品、化学試薬、および反応マスターミックスの追加の10%容量のさらなるコストを考慮に入れても、本方法は、使用可能な市販の鎖特異的方法（例えば、NEBNext（登録商標）Ultra（商標）Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（登録商標）96反応 Cat. # E7420L、SureSelect Strand Specific RNA-Seq Library Preparation kit 96試料反応用 Cat. # G9691A）の20〜40倍のコスト削減を提供する。
【００９９】
I. プロトコール開発
本発明者らは、最初に鋳型乗換えプロトコールを修正しようと試みたが、最終的に、今日までにほぼ間違いなく最も安価でかつ最も迅速なRNA-seqプロトコーの作出を可能にする発見をした。本発明者らの本来の目標は、アダプターにコードされたインデックス配列を一次リード内のバーコード配列と共に用いて、試料の超高密度多重化を達成しようとすることであった。5-プライムアダプターは、部分的Illumina PE1配列の後に、MMLVポリメラーゼによりcDNAに付加される非鋳型性シトシンとの塩基対合を促進するための9塩基対配列（6塩基対バーコードおよび3つの末端グアニン）が続く一本鎖分子として設計された。アダプター配列のcDNAへの付加は、アダプターコンカテマーからなる「バックグラウンドcDNA」を回避するためのサイズ選択ビーズ浄化の後に、大腸菌ポリメラーゼIを用いる二次反応で行われた。
【０１００】
本発明者らの最初のライブラリーは、アダプター内に含まれるバーコード配列に依存して、同一のプールされた試験mRNAの高度に不均一な濃縮を示し（図17）、アダプターバーコード配列によって変動する特定アンプリコンの大規模な過剰出現に起因する顕著な可視バンド形成を伴った。Illuminaリードから最初の9ヌクレオチドをトリミングした後、トマト転写物へのマッピングおよび試料のクラスター化は予想外に、試料型ではなくバーコード配列に基づいたグループ化を示した（図18）。加えて、最初に試みたライブラリーでは、少数の転写物がリードカウントの大部分を占めるにすぎなかった。
【０１０１】
これらの予期せぬ結果のさらなる研究から、Illuminaプラットフォームで配列決定され得るcDNAライブラリーが作製される際に、プライミング機構は、最初に想定された鋳型乗換えを用いなかったことが示された。トリミングされたリードのマッピングされた第1ヌクレオチドの5-プライム側に位置する転写物参照配列の配列解析により、バーコード配列および「G」反復と一致するヌクレオチド（図19〜20）、ならびにアダプターのPE1配列との類似性を含むように続くさらなる上流配列についての、配列決定されたトマト転写物における極端な偏りが示された。これにより、二本鎖cDNAの末端部分とアダプターのバーコード含有部分との塩基対合相互作用が、ライブラリー中に表される転写物を選択していたことが示される。
【０１０２】
所与のゲノムにおいて任意の特定の9塩基対配列は稀であるにもかかわらず（3.8e-06塩基ごとに1例）、リードの74%が、リードの事前にトリミングされた部分内に、バーコードおよびそれに続く3つの「G」に対する完全な9塩基対の一致を含んでいた（図21）。これにより、配列決定反応のための主要な鋳型が、鋳型としてcDNAを用いてアダプターの3-プライム末端からプライミングされた鎖であることが示された。結果として、cDNA分子に対する、MMLV逆転写酵素による非鋳型性「C」の付加は、配列決定された分子の大部分を第2鎖から生じさせる、アダプターオリゴヌクレオチド上でのプライミングを阻止した可能性が高い。
【０１０３】
これにより、二本鎖鋳型においてブリージング効果が存在することが示唆された。本発明者らは、このブリージング-捕捉効果を利用し、本発明者らの初期のアダプターによって生じる配列の偏りを排除するように、5-プライムアダプターを再設計した。Illumina PE1配列を含むアダプターの部分は、相補的配列オリゴヌクレオチドをアニールさせることによって遮蔽され、その後の9塩基はランダムな混合塩基配列の可変長伸長物と置き換えられたが、6〜8ヌクレオチドの伸長物がより短い変種およびより長い変種よりも優れている。ランダムなヌクレオチド伸長物の3-プライム末端において保護基を取り込んでいるアダプター変種は、性能が極めて低く、これによってこの鎖からのプライミングがこの過程を用いたライブラリー形成に必須であることが示された。
【０１０４】
転写物における塩基位置によるリードカバー率の解析（図22）により、ブリージングアダプター定方向配列決定 (BrAD-Seq) 法によって、転写物の5-プライム領域の表示が増加したことが示される。これはゲノム注釈付けおよび医療診断において非常に有用である。
【０１０５】
結論
本発明者らは、多重化形式で組織から鎖特異的3-プライムDGE RNA-seqライブラリーを作製するための迅速でかつ安価な方法を開発した。1日の作業日で全過程を完了することができる。本発明者らの知る限り、これは、アダプター配列を選択的かつ定方向に付加するために核酸二重鎖の末端ブリージングを用いる初めてのライブラリー構築過程である。本発明者らはさらに、種々のライブラリー型の作製を可能にするモジュールを含めるための過程を開発した。本発明者らはまた、トマトに加え、アメリカネナシカズラ (C. pentagona)、S. ペンネリイ (S. pennellii)、S. ピンピネリフォリウム (S. pimpinellifolium)、S. ネオリッキイ (S. neorickii)、およびタバコ (N. tobacum) を含むいくつかの種において、核となるDGE法を使用した。今日までに、本発明者らのDGEプロトコールをうまく使用して、発生および非生物的ストレスに関するいくつかの研究において差次的遺伝子発現を研究し、良好な結果を得ている。本発明者らは自身の目的のためにこの核となるプロトコールにモジュールを付加して適合化させ、その上、他者もまたこのプロトコールを汎用性RNAおよびDNA-seqライブラリープロトコールファミリーの基礎として使用することができるように、それらのモジュールを提供する。NGS配列決定技術の大衆化の一助となることを望んで、本発明者らは、NGSライブラリーを調製するための安価でかつ容易に実行されるプロトコールを提供する。この研究は、Townsley et al., Frontiers in Plant Science, 2015, 6(366): 1-11, doi: 10.3389/fpls.2015.00366として発表された。
【０１０６】
（表５）log2正規化リードカウントの全ペアワイズ反復試料比較に関するR2乗値
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【０１０７】
参照文献
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2018515081.tif 000021
【０１０８】
理解を明確にするために例示および実施例によって前記の発明をある程度詳細に記載したが、当業者は、いくらかの変更および修正が添付の特許請求の範囲内において行われ得ることを認識するであろう。加えて、本明細書において提供される各参照文献は、各参照文献が参照により個々に組み入れられるのと同程度に、参照によりその全体が組み入れられる。
【０１０９】
略式の配列表
SEQ ID NO: 1
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000022
SEQ ID NO: 2
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000023
SEQ ID NO: 3
合成オリゴヌクレオチド
Nが任意のデオキシリボヌクレオチドであってよい、
2018515081.tif 000024
SEQ ID NO: 4
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000025
SEQ ID NO: 5
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000026
SEQ ID NO: 6
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000027
SEQ ID NO: 7
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000028
SEQ ID NO: 8
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000029
SEQ ID NO: 9
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000030
SEQ ID NO: 10
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000031
SEQ ID NO: 11
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000032
SEQ ID NO: 11
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000033
SEQ ID NO: 12
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000034
SEQ ID NO: 13
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000035
SEQ ID NO: 14
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000036
SEQ ID NO: 15
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000037
SEQ ID NO: 16
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000038
SEQ ID NO: 17
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000039
SEQ ID NO: 18
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000040
SEQ ID NO: 19
合成オリゴヌクレオチド
2018515081.tif 000041
SEQ ID NO: 20
合成オリゴヌクレオチド
5'-NNNNNNNN
SEQ ID NO: 21
合成オリゴヌクレオチド
5'-NNNNNNNN
【図１】
2018515081.tif 000043
【図２Ａ】
2018515081.tif 000044
【図２Ｂ】
2018515081.tif 000045
【図２Ｃ】
2018515081.tif 000046
【図２Ｄ】
2018515081.tif 000047
【図３Ａ】
2018515081.tif 000048
【図３Ｂ】
2018515081.tif 000049
【図３Ｃ】
2018515081.tif 000050
【図３Ｄ】
2018515081.tif 000051
【図４Ａ】
2018515081.tif 000052
【図４Ｂ】
2018515081.tif 000053
【図４Ｃ】
2018515081.tif 000054
【図５】
2018515081.tif 000055
【図６】
2018515081.tif 000056
【図７】
2018515081.tif 000057
【図８】
2018515081.tif 000058
【図９Ａ】
2018515081.tif 000059
【図９Ｂ】
2018515081.tif 000060
【図１０】
2018515081.tif 000061
【図１１】
2018515081.tif 000062
【図１２】
2018515081.tif 000063
【図１３】
2018515081.tif 000064
【図１４】
2018515081.tif 000065
【図１５】
2018515081.tif 000066
【図１６】
2018515081.tif 000067
【図１７】
2018515081.tif 000068
【図１８】
2018515081.tif 000069
【図１９】
2018515081.tif 000070
【図２０】
2018515081.tif 000071
【図２１】
2018515081.tif 000072
【図２２】
2018515081.tif 000073
【配列表】
2018515081000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月28日(2017.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018515081000001.app
【国際調査報告】
2018515081.tif 000096
2018515081.tif 000097
2018515081.tif 000098
2018515081.tif 000099