(57)【要約】  本発明は、式(I)の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド又はその医薬として許容し得る塩、及び、神経変性疾患、特にタウオパチーの治療における、最も好ましくはアルツハイマー病の治療における、その治療的使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミドである化合物
【化１】
2018515536.tif 000047
又はその医薬として許容し得る塩。
【請求項２】
請求項1で定義した通りの化合物又はその医薬として許容し得る塩と、1種以上の医薬として許容し得る担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項３】
請求項1で定義した通りの化合物又はその医薬として許容し得る塩と、1種以上の治療的に活性な薬剤とを含む組み合わせ。
【請求項４】
それを必要とする対象においてカゼインキナーゼ1δ活性を阻害する方法であって、該対象に、請求項1で定義した通りの治療有効量の化合物、又は請求項2で定義した通りのその医薬として許容し得る塩を投与することを含む前記方法。
【請求項５】
神経変性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項1で定義した通りの治療有効量の化合物、若しくはその医薬として許容し得る塩、又は請求項2で定義した通りの医薬組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項６】
前記神経変性疾患が、タウオパチーである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記タウオパチーが、アルツハイマー病、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、進行性核上性麻痺(PSP)、ピック病、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症(MSA)、鉄蓄積を伴う神経基底変性、1型(ハラーホルデン・スパッツ(Hallervorden-Spatz))、嗜銀顆粒性認知症、ダウン症候群、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、パンチドランカー、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病C型、進行性皮質下グリオーシス、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、神経原線維変化型認知症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症/パーキンソン認知症複合、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患/認知症、慢性外傷性脳症、α-シヌクレイン病、及びパーキンソン病から選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記タウオパチーが、アルツハイマー病である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
医薬品としての使用のための、請求項1で定義した通りの化合物、若しくはその医薬として許容し得る塩、又は請求項2で定義した通りの医薬組成物。
【請求項１０】
神経変性疾患の治療における使用のための、請求項1で定義した通りの化合物、若しくはその医薬として許容し得る塩、又は請求項2で定義した通りの医薬組成物。
【請求項１１】
前記神経変性疾患が、タウオパチーである、請求項10記載の使用のための、前記化合物、若しくは前記その医薬として許容し得る塩、又は前記医薬組成物。
【請求項１２】
前記タウオパチーが、アルツハイマー病、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、進行性核上性麻痺(PSP)、ピック病、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症(MSA)、鉄蓄積を伴う神経基底変性、1型(ハラーホルデン・スパッツ(Hallervorden-Spatz))、嗜銀顆粒性認知症、ダウン症候群、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、パンチドランカー、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病C型、進行性皮質下グリオーシス、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、神経原線維変化型認知症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症/パーキンソン認知症複合、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患/認知症、慢性外傷性脳症、α-シヌクレイン病、及びパーキンソン病から選択される、請求項11記載の使用のための、前記化合物若しくは前記その医薬として許容し得る塩、又は前記医薬組成物。
【請求項１３】
前記タウオパチーが、アルツハイマー病である、請求項12記載の使用のための、前記化合物若しくは前記その医薬として許容し得る塩、又は前記医薬組成物。
【請求項１４】
神経変性疾患の治療における使用のための医薬品の製造における、請求項1で定義した通りの化合物、若しくはその医薬として許容し得る塩、又は請求項2で定義した通りの医薬組成物の使用。
【請求項１５】
前記神経変性疾患が、タウオパチーである、請求項14記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療における、カゼインキナーゼ1δの阻害剤である、2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド、その医薬として許容し得る塩、及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
カゼインキナーゼ1は、セリン/トレオニンキナーゼファミリーに属する。これは、哺乳類では、7つのアイソフォーム、すなわち、α、β、γ1から3、δ、及びεで公知である。アルツハイマー病(AD)などの神経変性疾患における哺乳類カゼインキナーゼ1δの潜在的役割は、仮説が立てられている。ADを有する患者の海馬では、カゼインキナーゼ1δは、対照の対象と比較して30倍以上増大し(Ghoshal, N.らの文献(1999) Am J Pathol 155, 1163-1172)、一方で、そのmRNAは、24倍増大する(Yasojima, Kらの文献(2000) Brain Res 865, 116-120)。アミロイドβペプチド(Aβ)、すなわち、もつれ(tangle)(PHFタウがその主成分である)と共にADを特徴付ける老人斑の成分は、カゼインキナーゼ1活性を刺激するように思われる(Chauhan, Aらの文献(1993) Brain Res 629, 47-52)。さらに、PHFタウ(一対のらせん状フィラメントタウとも呼ばれる不溶性タウ、AD患者の脳内の病変から得られる極度にリン酸化された凝集体)内の5つの新規に特定されたセリン/トレオニンリン酸化部位が、カゼインキナーゼ1δによって生成される結果、成人のタウ上のリン酸化部位の総数が10となり、そのうちの3つはカゼインキナーゼ1δによって独占的にリン酸化される可能性があることが確認されている(Hanger DPらの文献(2007) J Biol Chem 282, 23645-23654)。
【０００３】
これらの発見は、カゼインキナーゼ1δが、AD及び他の神経変性疾患の病態形成に重要な貢献をする可能性があることを裏付ける。実際、典型的な神経原線維変化の形態のタウの神経細胞内沈着は、ADに限られる特徴ではない。
【０００４】
すべてが線維状かつほとんどが過剰リン酸化された状態の、形態的に異なるタウ凝集体が、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、進行性核上性麻痺(PSP)、ピック病、大脳皮質基底核変性症、及び多系統萎縮症(MSA)(これらはすべて、タウオパチーとして分類される)などの、他の神経変性疾患に見られる。これは、タウのリン酸化を調節する際の類似の異常が、すべてのタウオパチーに共有されることを強く示唆する。
【０００５】
したがって、カゼインキナーゼ1δ阻害剤は、AD、及びタウオパチーなどの他の神経変性疾患の治療に有益である可能性がある。WO2012080727は、カゼインキナーゼ1δアッセイにおいて90%を超える阻害を示し、かつ他のキナーゼに対するある程度の選択性も示す、カゼインキナーゼ1δ阻害剤を開示している。
【０００６】
したがって、カゼインキナーゼ1δに対する阻害を保持しながら、改善されたカゼインキナーゼ1δ選択性及び脳透過性を示す、AD及び他のタウオパチーなどの神経変性疾患の治療における治療的利益を有するカゼインキナーゼ阻害剤の必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００７】
(発明の概要)
したがって、本発明は、第１の態様では、次の構造の2-メチル-アミノ- 3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化１】
2018515536.tif 000002
又はその医薬として許容し得る塩を提供する。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、次の構造の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化２】
2018515536.tif 000003
又はその医薬として許容し得る塩と、1種以上の医薬として許容し得る担体又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
第3の態様では、本発明は、次の構造の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化３】
2018515536.tif 000004
又はその医薬として許容し得る塩と、1種以上の治療的に活性な薬剤とを含む組み合わせを提供する。
【００１０】
第4の態様では、本発明は、それを必要とする対象においてカゼインキナーゼ1δ活性を阻害する方法であって、対象に、次の構造の治療有効量の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化４】
2018515536.tif 000005
若しくはその医薬として許容し得る塩又はその医薬組成物を投与することを含む前記方法を提供する。
【００１１】
第5の態様では、本発明は、医薬品としての又は神経変性疾患の治療における使用のための、次の構造の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化５】
2018515536.tif 000006
若しくはその医薬として許容し得る塩、又はその医薬組成物を提供する。
【００１２】
第6の態様では、本発明は、神経変性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、次の構造の治療有効量の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化６】
2018515536.tif 000007
若しくはその医薬として許容し得る塩、又はその医薬組成物を投与することを含む前記方法を提供する。
【００１３】
好ましくは、本発明の第5及び第6の態様における神経変性疾患は、アルツハイマー病、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、進行性核上性麻痺(PSP)、ピック病、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症(MSA)、鉄蓄積を伴う神経基底(neurobasal)変性、1型(ハラーホルデン・スパッツ(Hallervorden-Spatz))、嗜銀顆粒性認知症、ダウン症候群、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、パンチドランカー(dementia pugilistica)、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病C型、進行性皮質下グリオーシス、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、神経原線維変化型認知症(tangle only dementia)、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症/パーキンソン認知症複合、神経原線維変化を伴う非グアム型(non-Guamanian)運動ニューロン疾患/認知症、慢性外傷性脳症、α-シヌクレイン病、及びパーキンソン病などの、タウオパチーである。
【００１４】
ある好ましい実施態様では、タウオパチーは、アルツハイマー病である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
(図面の簡単な説明)
【図１】化合物Aについてのカゼインキナーゼ1δ IC50曲線である。
【００１６】
【図２】モリス水迷路(Morris Water Maze)の描写である。黒い三角形は、マウスの開始位置を示し、黒い四角形は、標的プラットフォームを示す。N=北; W=西; S=南、及びE=東。
【００１７】
【図３】AからD群の動物のモリス水迷路における経路長(標的に到達するまでの軌跡の長さ[メートル])である。グラフは、4日にわたるそれぞれの日についての平均値(1日あたり3実験の平均)を表す。
【００１８】
【図４】AからD群の動物のモリス水迷路における逃避潜時(標的に到達するまでの時間[秒])である。グラフは、4日にわたるそれぞれの日についての平均値(1日あたり3実験の平均)を表す。
【００１９】
(定義)
用語「治療する」、「治療すること」、「治療」、「予防する」、「予防すること」、若しくは「予防」、又はその文法的同等物には、治療的処置、予防的処置、及び対象が障害又は他の危険因子を発生するリスクを低下させる適用が含まれる。治療は、障害の完全な治癒を必要とせず、症状又は潜在的な危険因子の低下を包含する。
【００２０】
用語「診断」又はその文法的同等物には、本明細書で使用する場合、患者における障害の、実在若しくは存在、非実在若しくは非存在、又は可能性に関するあらゆる情報の提供が含まれる。この用語には、これと関連する、経験される又は経験される可能性がある障害の若しくは症状の型又は分類に関する情報の提供が、さらに含まれる。これは、例えば、障害の重症度の診断を含むことができる。これは、障害の医学的経過の予後、例えば、その期間、重症度、及び軽度認識障害(MCI)からAD又は他の認知症への進行の経過を包含する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語「対象」には、あらゆるヒト又は非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、げっ歯類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが含まれる。
【００２２】
用語「〜を含むこと」は、対象が、列挙されたあらゆる要素を含むが、必要に応じて、その他の明記されていない要素も含む可能性があること(すなわち、オープン)を示す。
【００２３】
本明細書で使用する場合の用語「及び/又は」は、他のものの有無にかかわらず、2つの指定された特徴又は要素のそれぞれの具体的な開示とみなされるべきである。例えば「A及び/又はB」は、まさにそれぞれが本明細書に個々に示されるかのような、(i)A、(ii)B、及び(iii)AとBのそれぞれの具体的な開示とみなされるべきである。
【００２４】
文脈によってそうではないと記されない限り、上に示した特徴/用語の定義は、本発明のいずれかの特定の態様又は実施態様に限定されず、本明細書に記載されるすべての態様及び実施態様に等しく適用する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
(詳細な説明)
キナーゼ阻害剤に関する一つの共通の問題は、一般に、キナーゼ阻害剤の多くが、一つには、これらが、高度に保存されたATP-結合ポケットを標的にするという理由で、複数のキナーゼを阻害することである。したがって、交差反応性は、キナーゼ阻害剤を開発する場合の主要な問題点の1つのままである。
【００２６】
最近のクロススクリーニングデータは、p38αのためのいくつかの広く使用される化合物(例えばSB203580)も、カゼインキナーゼ1δを阻害することを明らかにした(Verkaar, Fらの文献(2011) Biochim Biophys Acta 1697, 243-267)。p38αとカゼインキナーゼ1δはどちらも、Wnt/β-カテニンシグナル経路の活性化因子であることが周知である(Peters JMらの文献(1999) Nature 401, 345-350)。p38αとカゼインキナーゼ1δについての交差反応性は、これらのキナーゼが、系統樹においてかなり遠いので、配列類似性によって説明することができない。その薬理学的類似性は、生化学的アッセイにおいて化合物の特性を明らかにすることによってしか実証することができない。
【００２７】
本発明による化合物、すなわち次の構造の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化７】
2018515536.tif 000008
(これは、説明及び実施例全体を通して化合物Aとも呼ばれることになる)は、化合物987(2-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド;WO2012080727)から、一級アミンがモノメチル化されることによって誘導される。この開発は、ATP結合部位に隣接する閉鎖された疎水性ポケットを呈する遊離のカゼインキナーゼ1δの結晶構造を、開放構造に再構築することに基づく(モデルは示さない)。このモデルは、その後、カゼインキナーゼ1δ/ε阻害剤PF4800567との複合体におけるカゼインキナーゼ1δの最新の結晶構造によって確認された(Huang, Xらの文献(2012) J.Med.Chem. 55: 956-960)。カゼインキナーゼ1δにおけるATP結合部位を特徴付ける残基(ゲートキーパー残基)は、メチオニン(Met 85)である。一方、p38αにおける同じ位置は、トレオニン(Thr 106)が占めている。本発明者らのモデルでは、化合物987の一級アミンは、カゼインキナーゼ1δのヒンジ領域との結合相互作用の部分を形成すること、ただし抗標的におけるゲートキーパー残基の側鎖に対する、例えばp38aにおけるThr 106に対する水素結合を形成する可能性も有することが予想された。カゼインキナーゼ1δにおけるゲートキーパーMet 85は、その側鎖のチオエーテルを介する水素結合の形成がそれほどうまくはない。一級アミンのモノメチル化は、p38a、さらにはTGFBR1、ALK4、EGFR、RIPK2、YES、EphA2、及びLCKなどの抗標的のゲートキーパーとの相互作用を低下させ、また、カゼインキナーゼ1δに対する効力を増大させる。
【００２８】
さらに、下に示す実施例全体を通して明らかとなるように、化合物Aは、従来の技術のカゼインキナーゼ1δ阻害剤よりも増大された選択性及び効力を示すだけでなく、脳において優れた脳透過性及び存在も示し、優れた薬理学的プロフィール及び治療的利益を保持し、一方で細胞毒性ではない。
【００２９】
本発明はまた、次の構造の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化８】
2018515536.tif 000009
の医薬として許容し得る塩を提供する。
本発明の文脈では、用語「医薬として許容し得る塩」は、患者にとって有害ではない塩を指すものとする。こうした塩には、医薬として許容し得る酸付加塩、医薬として許容し得る金属塩、及び医薬として許容し得るアルカリ付加塩が含まれる。酸付加塩には、無機酸並びに有機酸の塩が含まれる。
【００３０】
適切な無機酸の代表例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸などが挙げられる。適切な有機酸の代表例としては、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ケイ皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモ酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、EDTA、グリコール酸、p-アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などが挙げられる。金属塩の例としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム塩などが挙げられる。アンモニウム及びアルキル化アンモニウム塩の例としては、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム塩などが挙げられる。
【００３１】
アルカリ塩の代表例としては、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、若しくはアンモニウム、又は有機塩基、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルエタノールアミン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、エタノールアミン、ピリジン、ピペリジン、ピペラジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、モルホリン、ベンジルアミン、プロカイン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、N-メチルグルカミンが挙げられる。
【００３２】
本発明によれば、2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミドは、ラセミ形態、並びに純粋な鏡像異性体、又は鏡像異性体の非ラセミ(スカレミック(scalemic))混合物の形態であり得る。
【００３３】
本発明はまた、次の構造の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化９】
2018515536.tif 000010
又は本明細書に記載した通りのその医薬として許容し得る塩と、1種又は複数の医薬として許容し得る賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、若しくは当業者に周知の他の材料とを含む医薬組成物を提供する。こうした材料は、非毒性であるべきであり、かつ活性成分の有効性を邪魔するべきではない。担体又は他の材料の厳密な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚若しくは皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存し得る。
【００３４】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末、又は液体形態であり得る。錠剤は、ゼラチン又は補助剤などの固体担体を含むことができる。
【００３５】
液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物若しくは植物油、鉱油、又は合成油などの液体担体を含む。
【００３６】
生理食塩水、ブドウ糖若しくは他の糖類溶液、又はグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコールなどを含めることができる。
【００３７】
静脈内、皮膚、若しくは皮下注射、又は苦痛の部位での注射については、活性成分は、パイロジェンフリーであり、かつ適切なpH、等張性、及び安定性を有する、非経口的に許容し得る水溶液の形態となるであろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤、及び/又は他の添加剤を含めることができる。
【００３８】
次の構造の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化１０】
2018515536.tif 000011
又はその医薬として許容し得る塩と、1種以上の治療的に活性な薬剤との組み合わせも、本明細書に包含される。
【００３９】
前記1種以上の治療的に活性な薬剤は、好ましくは、神経変性疾患の治療に適した薬剤であるが、例えば認知症に関連する心理的及び精神的副作用などの、こうした神経変性疾患の副作用を治療するのに適した薬剤を包含することもできる。
【００４０】
前記1種以上の治療的に活性な薬剤は、抗アミロイド剤、抗タウ抗体、タウキナーゼ阻害剤、抗タウ凝集阻害剤を包含することもできる。
【００４１】
より好ましくは、前記1種以上の治療的に活性な薬剤は、メマンチン(例えばNamenda(登録商標))、ガランタミン(例えばRazadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えばExelon(登録商標))、ドネペジル(例えばAricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組み合わせの群から選択される。
【００４２】
化合物2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミドは、カゼインキナーゼ1δ活性を阻害し、それを必要とする対象に、化合物A若しくはその医薬として許容し得る塩、又は2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド若しくはその医薬として許容し得る塩を含む医薬組成物、又は2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド若しくはその医薬として許容し得る塩を含む医薬組成物を投与することを含む方法において使用することができる。
【００４３】
カゼインキナーゼ1δ活性を阻害する方法の一実施態様では、2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミドのIC50は、インビトロで、少なくとも30nM、より好ましくは20nMと30nMの間と算出され、より一層好ましくは、それを必要とする対象においてカゼインキナーゼ1δを阻害するための方法における使用のための化合物2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミドのインビトロIC50は、20nM未満である。
【００４４】
本発明はまた、次の構造の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化１１】
2018515536.tif 000012
若しくはその医薬として許容し得る塩、或いは医薬品としての使用のための又は神経変性疾患の治療におけるその医薬組成物、或いはそれを必要とする対象に次の構造の治療有効量の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化１２】
2018515536.tif 000013
若しくはその医薬として許容し得る塩、又はその医薬組成物を投与することを含む神経変性疾患を治療する方法を包含する。
【００４５】
好ましくは、神経変性疾患は、タウオパチーである。タウオパチーは、神経原線維変化又はタウタンパク質の凝集体を特徴とする、認識されるクラスの状態である。タウタンパク質の細胞内沈着は、通常、神経細胞又はグリア上であり、線維状であり、一般に、これらは、対照のヒト脳由来のタウにおけるリン酸化のレベルと比較すると過剰リン酸化された状態でもたらされる。
【００４６】
本発明の文脈では、好ましいタウオパチーの例は、アルツハイマー病、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、進行性核上性麻痺(PSP)、ピック病、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症(MSA)、鉄蓄積を伴う神経基底変性、1型(ハラーホルデン・スパッツ(Hallervorden-Spatz))、嗜銀顆粒性認知症、ダウン症候群、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、パンチドランカー、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病C型、進行性皮質下グリオーシス、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、神経原線維変化型認知症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症/パーキンソン認知症複合、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患/認知症、慢性外傷性脳症、α-シヌクレイン病、及びパーキンソン病である。
【００４７】
ある好ましい実施態様では、タウオパチーは、アルツハイマー病であり、本発明は、アルツハイマー病の治療における使用のための、次の構造の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化１３】
2018515536.tif 000014
若しくはその医薬として許容し得る塩又はその医薬組成物、或いは、アルツハイマー病を治療する方法であって、次の構造の治療有効量の2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド
【化１４】
2018515536.tif 000015
若しくはその医薬として許容し得る塩又はその医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む前記方法を包含する。
【００４８】
本発明のある種の態様及び実施態様を、これから、実施例によって、また、本明細書に記載する図及び表に準拠して例示することとする。本明細書に言及したすべての文書の全体を、あらゆる目的のために、参照によって本明細書に組み込む。
【実施例】
【００４９】
(5.実施例)
(化合物)
化合物A(2-メチル-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド)は、本明細書に示した合成に従って、社内で合成した。比較化合物324(5-(1,3-ベンゾオキサゾール-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)ピリミジン-2-アミン)及び比較化合物987(2-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド)は、Peakdale Molecular社(登録商標)から入手し、比較化合物315(4-((4-メトキシフェニル)メチレン)-2-(2-チエニル)-5(4H)-オキサロン(oxalone))及びPF4800567(3-[(3-クロロフェノキシ)メチル]-1-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン)は、Tocris社(登録商標)から入手した。
【００５０】
(略語)
g  グラム
h  時間
HPLC  高速液体クロマトグラフィー
Me  メチル
min  分
mg  ミリグラム
mL  ミリリットル
mmol  ミリモル
MS  質量分析
NMR  核磁気共鳴
RT  保持時間
TOF  飛行時間型
UPLC  超高速液体クロマトグラフィー
【００５１】
(一般条件)
MS分析は、試料の直接注入によるUPLC(Waters社)と一体化された、エレクトロスプレーイオン化(ESI)を用いるQ-TOF-2ハイブリッド四重極・飛行時間型質量分析計で実施した。
【００５２】
HPLC分析は、Alliance 2695 HPLCシステム(Waters社)、及び4.6mm i.d.及び250mmの長さを有するMacherey-Nagel社のNucleosil 100-5 C18 カラムを用いて実施した。42分での100%水から100%アセトニトリル(どちらも0.1%トリフルオロ酢酸を含む)までの勾配。
【００５３】
NMRスペクトルは、ToSpinプログラム制御下でICON-NMRを使用するBruker AVANCE 500MHz NMR分光計で実施した。スペクトルは、298.2Kで測定し、溶媒共鳴と関連付けた。
【００５４】
(2-メチル-アミノ-3-[((4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド(化合物A)の合成)
【化１５】
2018515536.tif 000016
(ステップ1:臭化2-クロロ-1-(4-フルオロフェナシル)-ピリジニウムの合成)
【化１６】
2018515536.tif 000017
2-ブロモ-1-(4-フルオロフェニル)-エタノン(25g、115mmol)のエタノール(120ml)溶液に、2-クロロピリジン(32.7g、288mmol)を添加し、反応物を、5時間加熱還流した。この溶液を、一晩4℃で置いておき、沈殿を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させて、表題生成物をもたらした。
HPLC RT:17.41分
LCMS:[M+1]+=250
【化１７】
2018515536.tif 000018
【００５５】
(ステップ2:2-アミノ-3-(4-フルオロベンゾイル)-インドリジン-1-カルボン酸アミドの合成(Pauls H.らの文献、Chem. Ber. 110、1294-1303 (1977)))
【化１８】
2018515536.tif 000019
臭化2-クロロ-1-(4-フルオロフェナシル)-ピリジニウム(12.43g、37.6mmol)、シアノアセトアミド(4.74g、56.4mmol)、及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(39.3ml、225.6mmol)(1-プロパノール(150ml)中)を、3時間加熱還流した。まだ熱い溶液を、90mlの水を滴加することによって希釈し、一晩4℃で置いておいた。沈殿を濾過し、水/1-プロパノール(1:1)で洗浄し、真空中で乾燥させて、表題生成物をもたらした。
HPLC RT: 22.65分
LCMS:[M+1]+=298
【化１９】
2018515536.tif 000020
【００５６】
(ステップ3:2-(N-メチルアミノ)-3-(4-フルオロベンゾイル)-インドリジン-1-カルボン酸アミドの合成(Gonzalez I.らの文献、Organic Letters 11, No. 8, 1677-1680 (2009)))
【化２０】
2018515536.tif 000021
2-アミノ-3-(4-フルオロベンゾイル)-インドリジン-1-カルボン酸アミド(3.09g、10.4mmol)とピリジン(2.94ml、36.4mmol)とをジオキサン(150ml)に入れた溶液に、酢酸銅(II)(4.72g、26.0mmol)を添加した。この溶液を、室温で15分間攪拌し、メチルボロン酸(2.19g、26mmol)を添加し、反応物を、7時間加熱還流した。溶液を室温にし、濾過助剤を用いて濾過し、真空中で蒸発させた。残渣をジクロロメタン(400ml)に溶解し、半飽和炭酸水素ナトリウム溶液(2×250ml部分)で洗浄し、蒸発乾固させた。残渣を、中性の酸化アルミニウム上でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。収率を高めるために、この反応を、析出物を回収しながら繰り返すことができる。
HPLC rt:24.14分
LCMS:[M+1]+=312
【化２１】
2018515536.tif 000022
【００５７】
(生物学的データ)
(5.1 キナーゼスクリーニングアッセイ及び結合能)
このアッセイは、確立されたKINOMEscan(登録商標)技術(DiscoveRx社(登録商標)LeadHunter(登録商標)、Discovery Services、www.discoverx.com)に従って実施した。これは、活性部位指向型の競合結合アッセイを利用して、化合物とキナーゼとの間の相互作用を定量的に測定する。このアッセイは、(ATP濃度に依存し得るIC50値とは対照的に)ATPを必要としないので、真の熱力学的な相互作用・親和性を報告する。キナーゼ活性部位と結合し、固定されたリガンドへのキナーゼ結合を直接的(立体的)又は間接的(アロステリック)に妨げる化合物は、固形状支持体に捕捉されるキナーゼの量を低下させることとなる。逆に、キナーゼと結合しない化合物は、固形状支持体に捕捉されるキナーゼの量に対する影響を有しない。スクリーニングの「ヒット」は、結合させたDNA標識を検出する定量qPCR方法を使用することによって、対照試料に対する試験において捕捉されたキナーゼの量を測定することによって識別される。ほとんどのアッセイについては、キナーゼでタグ付けされたT7ファージ株を、BL21株由来の大腸菌(E.coli)宿主内で、24ウェルブロック中で同時に増殖させた。大腸菌は、対数期まで増殖させ、凍結ストックからのT7ファージに感染させ(感染多重度=0.4)、32℃で振盪しながら溶解まで(90〜150分)インキュベートした。溶解物を遠心し(6,000×g)、濾過して(0.2μm)、細胞残屑を除去した。残りのキナーゼは、HEK293細胞中で産生され、その後、qPCR検出のために、DNAでタグ付けした。ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを、室温で30分間、ビオチン標識された小分子リガンドで処理して、キナーゼアッセイのためのアフィニティ樹脂をもたらした。リガンド結合されたビーズを、過剰なビオチンでブロックし、ブロッキング緩衝液(SeaBlock(Pierce社)、1% BSA、0.05% Tween 20、1mM DTT)で洗浄して、結合しなかったリガンドを除去し、また、非特異的なファージ結合を低下させた。1×結合緩衝液(20% SeaBlock、0.17×PBS、0.05% Tween 20、6mM DTT)中でキナーゼ、リガンド結合されたアフィニティビーズ、及び試験化合物を組み合わせることによって、結合反応を構築した。化合物A及び比較化合物324は、40×ストック(100% DMSO中)として調製し、アッセイに向けて直接希釈した(最終濃度10μM)。すべての反応は、ポリプロピレン384ウェルプレートで、0.04mlの最終体積で実施した。このアッセイプレートを、振盪しながら室温で1時間インキュベートし、アフィニティビーズを洗浄緩衝液(1×PBS、0.05% Tween 20)で洗浄した。次いで、このビーズを、溶出緩衝液(1×PBS、0.05% Tween 20、0.5μM非ビオチン標識アフィニティリガンド)に再懸濁し、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。溶出液中のキナーゼ濃度を、qPCRによって測定した。
【００５８】
結果は、「%Ctrl」として報告した。ここでは、数値が小さいほど強いヒットを示す。「%Ctrl」の計算は、次の通りである:
【数１】
2018515536.tif 000023
陰性対照=DMSO(100%Ctrl)
陽性対照=比較化合物324(0%Ctrl)
【００５９】
表1
【表１】
2018515536.tif 000024
2018515536.tif 000025
2018515536.tif 000026
2018515536.tif 000027
2018515536.tif 000028
2018515536.tif 000029
Cmp 324=比較化合物 324; Cmp A=化合物A;
【００６０】
表1に太字で示す通り、化合物Aは、カゼインキナーゼ1アイソフォームα1(CSNK1A1)、α1様(CSNK1A1L)、δ(CSNK1D)、及びε(CSNK1E)に対する高い結合能を示し; これらのキナーゼについて、化合物Aの結合能は、対照化合物(比較化合物324)よりも2.7から67倍強力であった。
【００６１】
結合能に加えて、選択性スコア(又はS-スコア)を算出した(Karaman, M.W.らの文献「キナーゼ阻害剤選択性の定量分析(A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity)」Nat. Biotechnol. 26、127-132(2008)。S-スコアは、化合物選択性の定量的尺度である。S-スコアは、化合物が結合したキナーゼの数を、試験された異なるキナーゼの総数(突然変異体は除く)で割ることによって算出される。
S-スコア=ヒットの数/アッセイの数
【００６２】
この値は、効力閾値としての%Ctrlを使用して算出することができ、異なる化合物の比較を容易にするために化合物選択性を説明する定量的方法を提供する。
S(35)=(%Ctrl＜35を有する非変異キナーゼの数)/(試験された非変異キナーゼの数)
S(10)=(%Ctrl＜10を有する非変異キナーゼの数)/(試験された非変異キナーゼの数)
S(1)=(%Ctrl＜1を有する非変異キナーゼの数)/(試験された非変異キナーゼの数)
スクリーニング濃度は、10μMであった。S-スコアが低いほど、その化合物の選択性が高い。
【００６３】
表2
【表２】
2018515536.tif 000030
【００６４】
287種の異なるヒトタンパク質キナーゼ及び3種の脂質キナーゼの一団に対して、38種のキナーゼ阻害剤(21種のチロシンキナーゼ阻害剤、15種のセリン-トレオニンキナーゼ阻害剤、1種の脂質キナーゼ阻害剤、及びスタウロスポリンが含まれる)を評価するために使用される、2007年8月時点のKINOMEscanのインビトロ競合結合アッセイ(http://www.discoverx.com/services/drug-discovery-development-services/kinase-profiling/kinomescan/scanmax)に基づくと、化合物Aは、ラパチニミブ(Lapatinimib)、イマチニブ、及びゲフィチニニブ(Gefitininib)(データは示さない)などの、ヒト使用のために認可された化合物に匹敵する選択性スコア(表2)を有する結果となった。
【００６５】
(5.2 化合物Aの選択性及びIC50)
化合物Aの選択性を決定するために、2段階戦略を適用した:最初に、この化合物を、単一の濃度で(2連で)試験して、標的キナーゼの残存活性(%)を決定した。続いて、化合物A及び比較化合物の、カゼインキナーゼ1δに対するIC50を決定した。
【００６６】
化合物Aを、29種のキナーゼに対して、4種の比較化合物:比較化合物324(5-(1,3-ベンゾオキサゾール-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)ピリミジン-2-アミン)、比較化合物987(2-アミノ-3-[(4-フルオロフェニル)カルボニル]インドリジン-1-カルボキサミド)、比較化合物315(4-((4-メトキシフェニル)メチレン)-2-(2-チエニル)-5(4H)-オキサロン(oxalone);WO2010092660)、及びPF4800567(3-[(3-クロロフェノキシ)メチル]-1-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン)と共に試験した。
【００６７】
化合物は、10μM(DMSO中)の濃度で、単一用量の2連方式で試験し、反応は、10μM ATPで実施した。表3は、(DMSOに対する)残存活性の割合(%)を報告する。
【００６８】
表3
【表３】
2018515536.tif 000031
Cmp A=化合物A; Cmp 324=比較化合物324; Cmp 987=比較化合物987; Cmp 315=比較化合物315。
【００６９】
化合物Aは、カゼインキナーゼ1α、δ、及びε(表3中の太字)に対して、比較化合物と比較して最も高い選択性を有し、カゼインキナーゼ1δに対して最も高い選択性、カゼインキナーゼ1α1及びεに対して、より高い又は匹敵する選択性を有することが判明した。さらに、化合物Aは、p38αに対して(表3では*によって示される)、他の比較化合物と比較して、特に、化合物Aと構造的に最も近い比較化合物987(表3では$によって示される)と比較して、低下された選択性を有することが判明した。
【００７０】
化合物A並びに比較化合物(比較化合物324、比較化合物987、比較化合物315、及びPF4800567)のカゼインキナーゼ1δに対するIC50算出については、これらの化合物を、10μM又は30μMで開始する3倍段階希釈を用いる10用量で試験した。対照化合物GW5074(Tocris社(登録商標))は、20μMで開始して試験した。反応は、10μM ATPで実施した。結果を、(すべての化合物について)表4に報告し、化合物Aについては、IC50曲線を図1に示す。
【００７１】
表4
【表４】
2018515536.tif 000032
Cmp A=化合物A; Cmp 324=比較化合物324; Cmp 987=比較化合物987; Cmp 315=比較化合物315。
【００７２】
化合物Aは、陽性対照化合物GW5074並びに比較化合物324、987、及び315に関して、より高い効力を示した(表4)。特に、化合物Aに対するIC50は、比較化合物987よりも17倍強力であった。
【００７３】
(5.3 細胞毒性スクリーニングパネル)
細胞毒性スクリーニングパネルを、その確立されたプロトコルに従って、Cyprotex社(登録商標)によって実施した。HepG2細胞を、96ウェルの組織培養処理された黒色壁の透明底ポリスチレンプレート(100μL/ウェル)に蒔いた。細胞に、0.04μM、0.1μM、0.4μM、1.0μM、4.0μM、10μM、40μM、及び100μMの化合物A及び比較化合物324(WO2012080727; 5-(1,3-ベンゾオキサゾール-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)ピリミジン-2-アミン)を投与した。インキュベーション期間(72h)の最後に、細胞に、各細胞の健康マーカーのための適切な色素/抗体を負荷した。次いで、プレートを、自動蛍光細胞イメージャー(imager)、ArrayScan(登録商標)VTI(Thermo Scientific Cellomics)を使用してスキャンした。
【００７４】
細胞毒性を、ハイコンテントスクリーニング(High Content Screening)(HCS)(O’Brien P及びHaskins JRの文献(2007)「ハイコンテントスクリーニング:システム細胞生物学及び創薬への強力なアプローチ(High Content Screening: A Powerful Approach to Systems Cell Biology and Drug Discovery)」Taylorら編; 415-425)を使用する多パラメータ手法を使用して評価した。細胞数の減少は、毒性の直接的指標であるが、多くの化合物は、インキュベーション期間にわたって細胞生存率の変化を引き起こさない、致死未満の毒性をもたらす。このアッセイスコアは、毒性の直接的及び間接的尺度全体を組み合わせる。
【００７５】
表5
【表５】
2018515536.tif 000033
【００７６】
化合物Aと比較化合物324はどちらも、IC50を十分に超える濃度で、ウェルあたりの細胞の数が減少する。細胞数の減少は、壊死による毒性、アポトーシス、又は細胞増殖の低下を示す。
【００７７】
核サイズの増大が、壊死又はG2細胞周期停止を示す可能性があるのに対して、DNA構造の増大は、染色体不安定性及びDNA断片化を示す可能性がある。化合物Aと比較化合物324はどちらも、そのIC50を十分に超える濃度で、核サイズ及びDNA構造を増大させる。
【００７８】
同様に、化合物Aと比較化合物324はどちらも、そのIC50を十分に超える濃度で、細胞膜透過性(細胞死の一般的な指標)を増大させた。
【００７９】
ミトコンドリア質量及びミトコンドリア膜電位(Δψm)の増大が、ミトコンドリア膨張、又は細胞エネルギー需要に対する適応応答を示唆するのに対して、ミトコンドリア膜電位の低下は、ミトコンドリア毒性、並びにアポトーシスシグナル伝達における潜在的役割を示す。
【００８０】
最後に、シトクロムc放出の増大は、アポトーシスシグナル伝達カスケードの特徴の一つである。比較化合物324に対する化合物Aについて、応答は認められなかった。
【００８１】
(5.4 雄CD-1マウスにおける化合物Aの薬物動態)
約25〜35g(約8週齢)の6群の雄CD-1マウスに、比較化合物324及び化合物Aを、表6に示すレジメンに従って、静脈内に(IV)(10% DMSO:90% ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(20%水溶液 w/v)中)、又は経口的に(PO)(0.5%w/v メチルセルロース(水溶液)中)投与した。
【００８２】
表6
【表６】
2018515536.tif 000034
n=群あたりのマウスの数。
【００８３】
静脈内投与は、3mg/kgの投与レベルを達成するように、5mL/kgの一定投与体積で、尾静脈に投与した。経口投与は、3mg/kg(2及び4群)及び30mg/kg (3及び6群)の投与レベルを達成するように、10mL/kgの一定投与体積で、ポリプロピレン経管チューブを取り付けた注射器を介する単回ボーラス投与として投与した。
【００８４】
投与後、血液試料を、時点あたり3動物から、終末(terminal)麻酔(イソフルラン)下での心臓穿刺によって、個々のK3EDTA管に収集した。収集後、動物は、頚椎脱臼によって屠殺した。試料は、IV投与の5、15、及び30分後、その後1、2、4、8、及び24時間後に、また、OP投与の15及び30分後、その後1、2、4、8、及び24時間後に採取した。
【００８５】
収集時に、血液試料を、4℃で10,000×gで2分、遠心し、生じた血漿を抜き取り、化合物の濃度のLC-MS/MSによる分析のために-20℃で保管した。残りの血液細胞ペレットは廃棄した。
【００８６】
薬物動態パラメータは、WinNonlin(Version 4.1又はそれ以降)ソフトウェアを使用するノンコンパートメント解析(線形/対数台形)によって得た。以下のパラメータは、血漿濃度-時間プロフィールから決定した:
・Cmax(ng/mL):測定された最大濃度
・Tmax(h):最大濃度が出現した時間
・T1/2(h):終末相半減期
・AUC0-t(h*ng/mL):0から最後の定量化可能なデータ点までの曲線下面積
・AUC0-24(h*ng/mL):0から24時間までの曲線下面積
・AUC0-inf(h*ng/mL):時間0から無限大までの曲線下面積(予測)
・AUC(推定)(AUCex):推定される(予測される)AUC0-infのパーセント
・CL/F*(mL/分/kg):単位時間あたりの血漿クリアランスされる薬物の体積(予測)
・Vdss/F*(mL/分/kg)(Vz/F):定常状態での分布の容積(予測)
・F%:経口生体利用効率
【００８７】
薬物動態を、表7に示す。化合物Aは、投与の24時間後に完全にクリアランスされた。
【００８８】
表7
【表７】
2018515536.tif 000035
G=群; Cmp A=化合物A; Cmp 324=比較化合物324; NC=決定されず; NR=除外基準に該当すると報告されていない; *1つのPK外れ値が除外されている。
【００８９】
(5.5 タウトランスジェニックマウスを用いるインビボ有効性アッセイ)
TMHT(Thy-1変異型ヒトタウ)マウス(QPS(登録商標)Austria社によって開発、http://www.qps-austria.com)は、アルツハイマー病だけでなく、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)及びニーマン・ピック病などの他のタウオパチーにも適したモデルに相当する。TMHTモデルにおいて、異なるクラスの様々な化合物(その中には抗体処理も)が、その有効性について積極的に試験された。公開された例は、γ-セクレターゼモジュレーターCHF5074(Lanzilotta A.らの文献「γ-セクレターゼモジュレーターCHF5074は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、天然の過剰リン酸化されたタウの蓄積を低下させる(The γ-secretase modulator CHF5074 reduces the accumulation of native hyperphosphorylated tau in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease)」J Mol Neurosci. 45(1):22-31 (2010))、セレン酸ナトリウム(Corcoran NMらの文献「セレン酸ナトリウムは、アルツハイマー病モデルにおいて、PP2Aホスファターゼを特異的に活性化し、タウを脱リン酸化し、記憶欠損を逆戻りさせる(Sodium selenate specifically activates PP2A phosphatase, dephosphorylates tau and reverses memory deficits in an Alzheimer's disease model)」J Clin Neurosci. 17(8):1025-33 (2010))、及びブドウ種子ポリフェノール抽出物(Wang Jらの文献「ブドウ由来のポリフェノールは、アルツハイマー病のマウスモデルにおいて、タウ神経病態を減衰させる(Grape derived polyphenols attenuate tau neuropathology in a mouse model of Alzheimer's disease)」J Alzheimers Dis. 22(2):653-61 (2010))である。
【００９０】
TMHTマウスは、化合物A、比較化合物324、若しくは比較化合物PF4800567(3-[(3-クロロフェノキシ)メチル]-1-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン)、又はビヒクル(0.5%w/v メチルセルロース)を、月齢8.5か月(±2週)で開始し、経管栄養を介して経口的に、30mg/kg(体重)の投薬量で、8週間(54回適用)与えられた。これらの化合物の、モリス水迷路(MWM)における学習に対する効果を評価した。血液(血漿)及び脳試料は、屠殺後に収集した。屠殺時に収集した試料は、血漿、左の皮質、左の海馬、右の皮質、右の海馬、左脳半球の残部、右脳半球の残部であった。
【００９１】
全部で48匹の動物を使用し、4つの治療群に割り当てた。表8は、動物、コホート及び治療群割り当て、動物の性別及び月齢を記載する。
【００９２】
表8
【表８】
2018515536.tif 000036
Cmp 324=対照; Cmp A=化合物A; f=雌; m=雄
【００９３】
48匹のトランスジェニック動物のうち、1匹(表8では*によって示した)は、治療開始の4日後に、人道的エンドポイント規定(麻痺及び高度の脱水)により安楽死させた。死亡率は、この月齢及び観察期間における治療されていないトランスジェニック動物の正常範囲内であった。
【００９４】
MWMの様々な実験における、マウスの開始位置及びプラットフォームの位置(図1)は、表9に示した通りであった:
【００９５】
表9
【表９】
2018515536.tif 000037
SE=南東; NW=北西; SW=南西; NE=北東(図2を参照)
【００９６】
モリス水迷路における認知に対する効果は、
・経路長(標的に到達するまでの軌跡の長さ[メートル])
・逃避潜時(標的に到達するまでの時間[秒])
・経路長及び逃避潜時における、第1日とそれに続くすべての日とのΔ
・プローブ実験における標的四分円への滞在
の分析によって評価した。
【００９７】
評価されるすべてのパラメータに対して、記述統計解析を実施した。すべてのデータは、平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表した。1日あたり3実験のMWM学習曲線データを平均した。
【００９８】
認知機能を明らかにする、MWMにおける結果を、図3及び4に示す。視覚的手掛かりを使用して隠されたプラットフォームを発見する能力を、1日3実験を実施して、4日の期間にわたって測定した。学習曲線の比較によって、様々な治療群の認知能力及び薬物効果の可能性を評価した。
【００９９】
図3は、4日間のそれぞれの日についての平均値を示し; 表10は、4日の試験を通した各化合物についての平均値及び平均値の標準誤差(SEM)の値を示す。実施されなかったものは除外した。
【０１００】
表10
【表１０】
2018515536.tif 000038
Cmp A=化合物A; Cmp 324=比較化合物324; SEM=平均値の標準誤差。
【０１０１】
標的に到達するまでの経路長についての学習曲線は、陰性対照(ビヒクル)に対する第1日と比較した経路長の短縮と定義される(表11中の太字)場合、統計的に有意な学習を示した(表11)。
【０１０２】
表11
【表１１】
2018515536.tif 000039
Cmp A=化合物A; Cmp 324=比較化合物324
【０１０３】
逃避潜時、すなわち標的に到達するまでの時間に関して、経路長と類似の 結果が認められた。図4は、4日間のそれぞれの日についての平均値を示し; 表12は、4日の試験を通した各化合物についての平均値及び平均値の標準誤差(SEM)の値を示す。実施されなかったものは除外した。
【０１０４】
表12
【表１２】
2018515536.tif 000040
Cmp A=化合物A; Cmp 324=比較化合物324; SEM=平均値の標準誤差。
【０１０５】
さらに、比較化合物324で治療された動物が、すべての群の中で最も急勾配の学習曲線を示し、化合物Aで治療された動物がそれに続いた(図4、表13太字)。逃避潜時については、学習は、ビヒクル及びPF4800567で治療された動物について、統計的有意に到達しなかった。
【０１０６】
表13
【表１３】
2018515536.tif 000041
Cmp A=化合物A; Cmp 324=比較化合物324
【０１０７】
動物の泳ぐ速度は、第1日から第4日までに、わずかに低下し、これは、MWMにおいて一般的に見られるが、統計的に有意ではなかった。同様に、MWMの最後に実施されるプローブ実験では、プラットフォームを除去した標的四分円での滞在を評価した。治療群の間に有意差は認められなかった。この結果は、強力な化合物を用いるマウスの行動においてもしばしば見られる。
【０１０８】
(5.6 CD-1マウスの血漿及び脳における化合物Aの決定)
5.5において実験から得られた、単一時点からの血漿及び脳試料をプールし、タンパク質沈殿後にLC-MS/MSによって、0.5〜10,000ng/mLの較正範囲にわたって、比較化合物324及び化合物Aの存在及び濃度について分析した。クリシン(Sigma社(登録商標))、対照マウス血漿、及び脳(市販品供給業者から得られるもの)を、内部標準として使用した。
【０１０９】
すべての機器制御、データ収集、ピーク面積積分、及び保管は、Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra Mass Spectrometerを、LCQuan ソフトウェア(v.2.5.6)と共に使用して実施した。各較正標準の質量分析計応答(内部標準に対する分析物のピーク面積比)を、Watson LIMS(v.7.2)によって算出し、公称濃度に対してプロットした。加重最小二乗二次回帰分析を使用して、Watson LIMSにおいて標準の適合の一つを使用する検量線の式を算出した。血漿及び脳試料における比較化合物324及び化合物Aの濃度を、有効数字3桁まで、検量線から逆算した。報告されたすべての結果は、次の基準を通過した試料由来である:
【数２】
2018515536.tif 000042
・少なくとも7の較正標準が、その標的濃度の±20% RE以内である。
・少なくとも66%のQC試料が、そのそれぞれの標的値の±20% RE以内である。n=3の場合には各レベルで少なくとも1つが許容される範囲内であり、n=6の場合には2つが範囲内である。
【０１１０】
分析方法は、下の表14にまとめた通りであった。
【０１１１】
表14
【表１４】
2018515536.tif 000043
前駆体/生成物イオンの質量は、公称である。Cmp 324=比較化合物324; Cmp A=化合物A。
【０１１２】
全部で32の試料を分析した。10、100、及び1000ng/mLの濃度の品質管理(QC)試料を、分析の日に新たに調製した。表15及び16は、実験5.5のTMHTマウスの、血漿中の、並びに皮質、海馬、及び脳の残部における、比較化合物324及び化合物Aの濃度(ng/mL)をそれぞれ示す。
【０１１３】
表15
【表１５】
2018515536.tif 000044
BLQ=定量限界未満;
【０１１４】
表16
【表１６】
2018515536.tif 000045
BLQ=定量限界未満;
【０１１５】
これらの結果は、化合物Aが、約11.13ng/mL±1.05(平均値±SEM)の一定の濃度で脳内に見られ、脳の分析されたすべての領域に分布していたことを示す。
【０１１６】
(5.7 化合物Aの物理化学的パラメータ)
物理化学的パラメータは、ソフトウェアChemAxon社のJChem for Officeスイート(v. 15.4.2700.2610)によって算出した。結果を、下の表17に示す。
表17
【表１７】
2018515536.tif 000046
【０１１７】
化合物Aは、比較化合物987、PF670462、及びPF4800567(どちらもTocris社(登録商標))と比較して改善された物理化学的パラメータを有する。さらに、化合物Aの物理化学的パラメータは、中枢神経系のための119種の販売されている薬物に典型的な最も望ましい範囲の範囲内であった(Wager T.T.らの文献, ACS Chem. Neurosci. (2010), 1, 435-449)。特に、化合物Aは、その構造的に最も近い化合物、すなわち76.6Å2のTPSAを有する比較化合物987と比較した場合に、十分に最も望ましい範囲の範囲内である改善された血液脳関門(BBB)透過を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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