(57)【要約】本発明は、マクロ多孔質ハイドロゲルを製造するための方法に関する。第１の工程において、２つの溶質の水溶液を製造する。第１の溶質は架橋することができるポリマーであり、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリオキサゾリン（ＰＯｘ）の誘導体であり、並びに第２の溶質はコスモトロピック試薬である。第２の工程において、該溶液に架橋試薬を添加する。ポリマーのゲル化と相分離を同時に開始し、それによりマクロ多孔質ハイドロゲルが形成する。さらに本発明は、本発明の方法によって得ることができるマクロ多孔質ハイドロゲルに関する。このマクロ多孔質ハイドロゲルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリオキサゾリン（ＰＯｘ）の誘導体である架橋されたポリマーを含む。該ハイドロゲルは、２００  ｎｍ〜１０００  μｍ特に５００  ｎｍ〜１００  μｍのサイズの相互接続した細孔を示し、及びｐＨ７．０〜８．０、特に約ｐＨ７．４によって特徴づけられる。【選択図】【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロ多孔質ハイドロゲルを提供するための方法であって、以下の工程、
ａ）第１及び第２の溶質を含む水溶液を提供する工程であって、ここで
ｉ）該第１の溶質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の架橋可能な誘導体及びポリオキサゾリン（ＰＯｘ）の架橋可能な誘導体から選択される架橋可能なポリマーであり；及び
ｉｉ）該第２の溶質がコスモトロピック試薬であり；及び
ｂ）前記架橋可能なポリマーを架橋することができる架橋試薬を前記混合物へ添加し、それにより前記架橋可能なポリマーのゲル化及び相分離を同時に開始する工程
を含む、マクロ多孔質ハイドロゲルを提供するための方法。
【請求項２】
前記架橋可能なポリマーが、
ａ）直鎖又は星型のポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジブロックコポリマー及びポリエチレングリコールトリブロックコポリマー、特にポリマーの５０％以上がＰＥＧで構成され、残りが乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリε−カプロラクトン（ＰＣＬ）及び／又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）で構成されるポリエチレングリコールジブロック又はトリブロックコポリマーを含む群；又は
ｂ）ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリプロピルオキサゾリン及びポリブチルオキサゾリンを含む群；又は
ｃ）直鎖又は星型のオキサゾリン及びオキサゾリンのコポリマー、特に、オキサゾリンを含む、２−メチルオキサゾリンと、カルボン酸又はアルコールを有する２−エチルオキサゾリン、特に２−カルボキシエチルオキサゾリン又は２−ヒドロキシエチルオキサゾリンとのコポリマーを含む群；又は
ｄ）部分的に加水分解されたポリ２−メチルオキサゾリン又はポリ２−エチルオキサゾリンを含む群
ｅ）一方がポリエチレングリコールであり、及び他方がポリエチレン（ＰＥ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリε−カプロラクトン（ＰＣＬ）及びポリスチレンを含む群から選択される、２つのモノマーのブロックで構成されるポリエチレングリコールジブロックコポリマー
ｆ）一方がポリエチレングリコールであり、及び他方がポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）及び乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）から選択される、２つのモノマーのブロックで構成されるポリエチレングリコールトリブロックコポリマー
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋可能なポリマーが、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、ビニルエステル、マレイミド、ビニルスルホン、アルキン、アジド、アルデヒド及びチオール部分を含む群から選択される反応性部分を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記架橋可能なポリマーがビニルスルホンで修飾され、及び前記架橋試薬が、
ａ）２つのチオール（−ＳＨ）部分を含む短いリンカー分子、特に２〜１０の炭素原子若しくはヘテロ原子を含むアルキル又はヘテロアルキル鎖によって隔てられた２つのＳＨ基を含む分子；及び
ｂ）チオール部分、特に１級チオール部分で置換された親水性ポリマー、特に１級チオール（−ＣＨ２ＳＨ）部分を含む星型のポリエチレングリコール又は１級チオール（−ＣＨ２ＳＨ）部分を含む直鎖のポリエチレングリコール：及び
ｃ）２〜１００アミノ酸、特に２〜２０アミノ酸を含むペプチドであって、ここで前記アミノ酸の２つがシステインであり；特に、エンドペプチターゼによって切断可能なペプチド、より特にマトリックスメタロプロテアーゼよって切断可能なペプチド、なおさらに特にＧＣＲＤ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＤＲＣＧのアミノ酸配列のペプチド；及び
ｄ）２つのシステインを含むタンパク質、
を含む群から選択される、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記架橋可能なポリマーの分子量が１，０００〜１，０００，０００  ｇ／ｍｏｌ、特に１０，０００〜４０，０００  ｇ／ｍｏｌである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶液中の前記架橋可能なポリマーの濃度が０．２〜５０％（ｗ／ｖ）、特に０．５〜１０％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記水溶液が、前記ポリエチレングリコールの架橋可能な誘導体を０．５〜３％（ｗ／ｖ）又は前記ポリオキサゾリンの架橋可能な誘導体を４〜１０％（ｗ／ｖ）含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記コスモトロピック試薬が、多糖類並びに金属（特にアルカリ及びアルカリ土類金属）の炭酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩及びリン酸二水素塩を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記コスモトロピック試薬が多糖類、特にペクチン、アルギン酸塩、ジェランガム、セルロース、ヒアルロナン、マンヌロナン及びデキストランを含む群から選択される多糖類であり、及びここで特に前記多糖類が、１，０００  ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００，０００  ｇ／ｍｏｌの範囲、特に１０，０００  ｇ／ｍｏｌ〜２，０００，０００  ｇ／ｍｏｌの範囲、さらに特に１００，０００  ｇ／ｍｏｌ〜１，０００，０００  ｇ／ｍｏｌの範囲、なおさらに特に約１５０，０００  ｇ／ｍｏｌの分子量によって特徴づけられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記水溶液中の前記コスモトロピック試薬の濃度、特に前記多糖類の濃度が、０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、特に０．１〜５％、なおさらに特に０．３５〜０．５％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶液が、ヒアルロナンを０．１〜１％、特にヒアルロナンを約０．４％、又はマンヌロナンを０．５〜５％、特にマンヌロナンを約２％、又はデキストランを０．１〜２０％、特にデキストランを０．５〜１０％、又はそれらの混合物を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記架橋可能なポリマーが、ビニルスルホン部分で修飾した２０  ｋＤａの４アーム−ＰＥＧ−チオールであり、前記多糖類がマンヌロナンであり、及び前記架橋試薬がマトリックスメタロプロテアーゼ切断可能ペプチド、特にアミノ酸配列ＧＣＲＤ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＤＲＣＧを有するペプチドである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記水溶液がｐＨ７．０〜８．０、特にｐＨ７．２〜７．６、より特に約ｐＨ７．４によって特徴づけられ；及び前記架橋試薬の添加を２０〜４０℃、特に約３７℃で行う、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
架橋前に前記水溶液に細胞、特に哺乳動物細胞を添加する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）水性混合物を架橋試薬添加１〜１５分後にシリンジに通し、及び／又は
ｂ）架橋試薬添加１５〜６０分後に固体のマクロ多孔質ゲルが観測される
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法によって得られる、又は得ることができるマクロ多孔質ゲル。
【請求項１７】
マクロ多孔質ハイドロゲルであって、
ａ）架橋されたポリマーを含み、ここで前記架橋されたポリマーはポリエチレングリコール誘導体又はポリオキサゾリン誘導体であり；及び
ｂ）２００  ｎｍ〜１０００  μｍ、特に５００  ｎｍ〜１００  μｍのサイズの相互連結したマクロ細孔を示し；及び
ｃ）ｐＨ７．０〜８．０、特に約ｐＨ７．４によって特徴づけられ、
上記に特徴づけられる、マクロ多孔質ハイドロゲル。
【請求項１８】
前記架橋されたポリマーが
ａ）直鎖及び星型のポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジブロックコポリマー及びポリエチレントリブロックコポリマー、特に、ポリマーの５０％以上がＰＥＧで構成され、残りがＰＬＧＡ、ＰＣＬ及び／又はＰＰＧで構成されるポリエチレングリコールジブロック又はトリブロックコポリマーを含む群；又は
ｂ）ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリプロピルオキサゾリン及びポリブチルオキサゾリンを含む群；又は
ｃ）直鎖又は星型のポリオキサゾリン及びオキサゾリンのコポリマー、特に、オキサゾリンを含む、２−メチルオキサゾリンと、カルボン酸又はアルコールを有する２−エチルオキサゾリン、特に２−カルボキシエチルオキサゾリン又は２−ヒドロキシエチルオキサゾリンとのコポリマーを含む群；又は
ｄ）部分的に加水分解されたポリ２−メチルオキサゾリン又はポリ２−エチルオキサゾリンを含む群
から選択される、請求項１６に記載のマクロ多孔質ハイドロゲル。
【請求項１９】
前記架橋されたポリマーの分子量が１，０００〜１，０００，０００  ｇ／ｍｏｌ、特に１０，０００〜４０，０００  ｇ／ｍｏｌである、請求項１６又は１８に記載のマクロ多孔質ハイドロゲル。
【請求項２０】
前記ハイドロゲル中の前記架橋されたポリマーの濃度が、０．２〜５０％（ｗ／ｖ）、特に０．５〜１０（ｗ／ｖ）である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のマクロ多孔質ハイドロゲル。
【請求項２１】
前記ハイドロゲルが、前記ポリエチレングリコールの架橋可能な誘導体を０．５〜３％（ｗ／ｖ）又は前記ポリオキサゾリンの架橋可能な誘導体を４〜１０％含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のマクロ多孔質ハイドロゲル。
【請求項２２】
ａ）透明であり；及び
ｂ）その剛性が１〜５００，０００  Ｐａ、特に１０〜１０，０００  Ｐａ、特に１０〜１０００  Ｐａ、なおさらに特に５０〜５００  Ｐａである
ことに特徴づけられる、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のマクロ多孔質ハイドロゲル。
【請求項２３】
生細胞を含むことを特徴とする、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のマクロ多孔質ハイドロゲル。
【請求項２４】
前記生細胞が神経細胞、特に機能的に、シナプス性に接続した神経突起を含む神経細胞、又は神経幹細胞、神経前駆細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、線維芽細胞、内皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞又は筋芽細胞であることに特徴づけられる、請求項２３に記載のマクロ多孔質ハイドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロ多孔質ハイドロゲル、並びに組織工学及び再生医療における該マクロ多孔質ハイドロゲルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロ多孔質ハイドロゲルは、機械的特性、安定性、分子拡散／輸送特性及び細胞浸潤の面で、均質材料よりも有力な利点を有するため、マクロ多孔質ハイドロゲルは組織工学の分野において有力である。それにもかかわらず、マクロ多孔質ハイドロゲルを形成する確立された方法（塩浸出、凍結乾燥、ガスポケット形成）は、一般的には先に厳しい条件下でのテンプレートを必要とし、次いで細胞播種を行わなければならない。そして、最終的に患者に移植中に多くの外傷を誘発するそれらのゲルは注入することができない。細胞適合性の注入可能なハイドロゲルを生成すると報告されたその少数の方法（例えば、微粒子融合、犠牲的分子集合体の封入及び分解）は、それぞれゲル粒子を形成するために非常に大変な前処理工程を有し、又はポロゲン分解が遅いため、細孔形成が遅い。それらはまたアクセス可能な細孔サイズに対する制御を制限する。多孔質ゲルを製造するために二相系も使用されてきたが、注入可能性及び細胞封入化に適合可能な条件下ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、従来技術を改善し、再生医療に使用するための注入可能な、組織適合性のマクロ多孔質ハイドロゲルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この目的は独立請求項の主題によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】高粘度多糖類は、ＰＥＧと二相系を形成し、結果として多孔質ゲルをもたらす。（ａ）多糖類なしでゲル化した対照のＣＬＳＭ画像。（ｂ）高粘度ＨＡ  ０．３５％（ｗ／ｖ）存在下で形成したＰＥＧ１．５％は０．５〜１．５  μｍの多孔質構造を有する。（ｃ）高粘度ＭＡ  １．４％（ｗ／ｖ）存在下で形成したＰＥＧ１．５％は数ミクロンの多孔質構造を有する。（ｄ）細孔ネットワークの３Ｄ測定は、細孔が完全に相互接続していることを示す。（ｅ）細孔の自己相関関数。相関関数の円対称性は多孔質ネットワークが等方性であることを示している。（ｆ）したがって、自己相関関数は半径のみの関数として分析することができる。多孔質ゲルの両タイプについての実験データ（ドット）及び貫通可能球モデル（ライン）によるフィッティングが示されている。最良のフィッティングは、ＨＡについては０．８２＋／−０．１  μｍの細孔直径について、及びＭＡについては２．３９＋／−０．１６  μｍの細孔直径について得られた。エラーバー：標準偏差（ｎ＝３）。（ａ−ｃ）は共焦点顕微鏡からの単一スライスである。（ｄ）はゲル中の２５  μｍ立方体からのレンダリングである。スケールバー：５  μｍ。
【図２】体積排除はマイケル付加によるＰＥＧのゲル化の動態を亢進する。（ａ）ゲル化のレオロジー的モニタリング。ＨＡを添加することにより、ｐＨ８．０で得られる純粋なＰＥＧゲルとほぼ同様の動態で、生理的ｐＨでゲルを形成することができる。（ｂ）３７℃で完全増殖培地中のＨＡ及びＭＡのストック溶液の複合粘度。（ｃ）ゲル化時間。高粘度ＨＡストック溶液によるゲル化培地の置換がおこると、より高いＰＥＧ成分又はより高いｐＨが速いゲル化をもたらす。Ｑ−ゲルは、対照の市販のＰＥＧゲルとして与えられる。（ｄ）６０分間のゲル形成（初期のプラトー）後の剛性。１．２％から１．９％の間のＰＥＧ濃度は発達中の神経系に関連する剛性の範囲にかかり、軸索成長のための最良の条件を与えると考えられる。また、Ｑ−ゲルの剛性は、推奨する製造者が培地を添加する時間としてゲル化１０分後を示している。エラーバー：標準偏差（ｎ＝３）。
【図３】非分解性マクロ多孔質ＰＥＧゲルにおけ後根神経節（ＤＲＧ）（ａ）培養３０日後のゲル全体の画像化はＤＲＧからの軸索の完全な浸潤を示す（中央のクラスター、蛍光画像化１．５  ｍｍ最大強度投影（ＭＩＰ）。（ｂ）高密度な神経突起を示す中心部のクローズアップ（上面図、１．５  ｍｍＭＩＰ）。（ｃ）神経突起を示す前述の側面図は、ゲルの全深さに分布している（１．５  ｍｍＭＩＰ）。ＤＲＧの位置は、下面のみが見えるように強調表示され、円錐形の後ろの残りの部分及び神経突起は、光が到達しづらく、暗く見える。（ｄ）ＤＲＧの断面の生／死画像化。死細胞の冠がみられるが、内部の細胞は生きている。スケールバー：１  ｍｍ（ａ）、２５０  μｍ（ｂ）、２５０  μｍ（ｃ）、１２５  μｍ（ｄ）。
【図４】ＨＡを用いた微細構造は、柔軟なゲルの安定性を向上させ、そして速い神経突起伸長、ｐＨ７．４でのゲル形成及び高い生存率を可能にする。ヒアルロナンは、神経細胞を殺すことなく、ゲルを分解することなく、神経突起伸長を阻害することなく、ゲル化後に除去することができる。（ａ）白色で強調表示された分解された部分及び緑色のＰＤＭＳ基材を有するＤ２の明視野で観測される巨視的なゲルの分解、及び、蛍光顕微鏡によって観測される神経細胞の形態のクローズアップ（２００  μｍ積層の投影）。ＨＡ無しで形成したＰＥＧ１．５％ゲルは２日間安定ではなく、したがって定量することができないため示していない。染色は、カルセイン／ＤＡＰＩ（１〜３）及びβＩＩＩ−チューブリン／ＤＡＰＩ（４及び５）である。両方の方法は、神経時／細胞体全てを染色するが、部分的に分解したゲルは免疫染色に耐えられず、そのため細胞形態はカルセイン染色した生試料において画像化された。（ｂ）ゲル領域のパーセンテージとしてのＤ２における巨視的分解。（ｃ）総神経突起の長さを、Ｄ２におけるサンプル体積中の細胞体の数で割ったもの。（ｄ）Ｄ２の生存率。エラーバー：標準偏差（分解性についてｎ＝６、生存率及び神経突起長についてｎ＝３）＊：他の全ての状態から差異がある（ｐ＜０．０１）。他は同等である（ｐ＞０．０１）。
【図５ａ−ｂ】多孔質ＰＥＧゲル中に封入したＥ１７ラット胚由来の初代皮質神経細胞は、長期安定性の電気的に活性な３Ｄ神経ネットワークを形成する。（ａ）色分けされた深さを有する２００  μｍＭＩＰは封入された神経細胞は均質に分布し、そしてマトリックスを通じて３Ｄに神経突起を伸長させることを示している。封入２日後には長い神経突起が既に観測でき、及び成長は、Ｄ５まで、密度の高いネットワークを形成することができる増加率を維持する。Ｄ２６まで、ゲル全体が高密度の神経突起ネットワークで満たされている。（ｂ）免疫細胞化学的マーカー（２光子レーザー走査顕微鏡取得積層からの２００  μｍＭＩＰｓ）：βＩＩＩ−チューブリンは胚神経細胞の全神経突起を染色する神経マーカーであり、シナプトタグミンは、シナプス前末端のマーカーであり、ＭＡＰ２はこの時点での細胞体及び近位神経突起のみを染色することで知られる分化した神経細胞のマーカーである。スケールバー：色分けした深さ２００  μｍを有する１００  μｍ（ａ）、５０μｍ（ｂ）。
【図５ｃ】多孔質ＰＥＧゲル中に封入したＥ１７ラット胚由来の初代皮質神経細胞は、長期安定性の電気的に活性な３Ｄ神経ネットワークを形成する。（ｃ）ゲル中のスパンキング活性は、細胞内カルシウム蛍光レポーターのオレゴングリーンＢＡＰＴＡ−１を用いて観測した。独立した自発的活動が観測された（例えば細胞体１〜３）だけでなく、同期化された活性が観測され（細胞体５〜１１、１０秒で）、機能的なシナプス連結ネットワークが合成ＥＣＭ中１６日までに確立されたことを証明する。スケールバー：５０  μｍ（ｃ）。
【図６ａ】本方法のヒトｉＰＣ細胞由来の神経細胞への転換。（ａ）Ｄ２で二光子励起顕微鏡（カルセイン／ヘキスト）によって観測される細胞形態（２００  μｍ  ＭＩＰ）における、０．５２５％ＨＡで構造化されたＰＥＧゲル中の細胞密度及び剛性の効果。スケールバー：４０  μｍ。
【図６ｂ−ｄ】本方法のヒトｉＰＣ細胞由来の神経細胞への転換。（ｂ−ｃ）生存率及び神経突起伸長は高剛性及び低細胞密度においては損なわれる。（ｄ）Ｄ５でのゲルの定性的記述：より柔らかいゲル及びより高い細胞密度はより速い分解をもたらし、最も極端な組合せは不安定なゲルをもたらす。エラーバー：標準偏差（ｎ＝３）。＊他の全ての条件と統計的に異なる（ｐ＜０．０１）。それ以外はｐ＞０．０１。
【図６ｅ】本方法のヒトｉＰＣ細胞由来の神経細胞への転換。（ｅ）免疫細胞化学。実質的に全ての生細胞は、神経細胞マーカーであるニューロフィラメント、βＩＩＩ−チューブリン及びＭＡＰ２について陽性であり、星細胞マーカーであるＧＦＡＰについては陰性であった。スケールバー：４０  μｍ。
【図７】ゲル化中の相分離のモニタリング。試料は、架橋試薬としてＰＥＧ−チオールを使用し、ＭＡ２％（ｗ／ｖ）存在下で、室温で（本明細書の残りの部分で使用される３７℃より遅い）ゲル化したＴＭＲ標識ＰＥＧ１．５％であり、ＣＬＳＭで画像化した。時間後混合が指示される。スケールバー：５  μｍ。
【図８】微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）において観測されたゲル透明度。（ａ）ゲルは、形成直後は水とほとんど区別することができない。（ｂ）神経細胞を封入して２週間半後、散乱した細胞片を除いて依然として完全に透明である。スケールバー：５０  μｍ。
【図９】本研究で使用した剛性及びゲル化時間の定義と共に典型的なゲル化プロファイル。初期の剛性は、剛性がプラトーに達する時間である６０分での剛性としてとり、培地を添加してゲル化を停止し、細胞培養へと進む。ゲル化時間は、貯蔵弾性率が対数スケールで最大値の半分に達した時の時間としてとり、この定義は、比較すべき試料の非常に異なる粘度（損失弾性率）のために、貯蔵弾性率及び損失弾性率との間のクロスオーバー時間に対して好ましいものであった。曲線は、ＨＡ０．５２５％（ｗ／ｖ）存在下でゲル化したＰＥＧ１．９％である。
【図１０】ヒアルロナン分解モニタリング。ヒアルロナンは、ＨＡｓｅを１  ｍｇ／ｍｌ添加した培地で速やかに分解され、多孔質ＰＥＧゲルから除去可能である。エラーバー：標準偏差（ｎ＝３）。
【図１１】３Ｄ培養において最適化された機械的条件を使用する場合、接着ペプチドは必要としない。（ａ）ＩＫＶＡＶペプチドは、用量依存的に組織培養プラスチック（ＴＣＰ）における細胞の接着性及び神経突起伸長を促進する。（ｂ）多孔質ＰＥＧゲルにおける神経突起伸長は細孔を形成するために使用する多糖類にかかわらず、高濃度（１００  μＭで示される）でさえ、ＩＫＶＡＶペプチドの存在下及び非存在下で類似している。ＭＡによって作製された大きな細孔において神経細胞が採用した奇形の形態には注意すべきである。スケールバー：４０  μｍ。
【図１２】ＰＥＧ成分と神経細胞との相互作用。（ａ）非常に高分子量のＰＥＧは、懸濁液中で直ちに神経細胞のクラスタリングを誘発するため、粘性添加剤として使用することができなかった。（ｂ）ＴＭＲ標識変異体を用いて観測されるように、ゲル形成のためにしようされる機能化させた高分子量星型ＰＥＧは、神経細胞に取り込まれる。スケールバー：５０  μｍ。
【図１３】多孔質非分解性ＰＥＧゲル中に封入した初代皮質神経細胞からの神経突起伸長。生存率が減少したとしてもＭＭＰ切断可能ペプチドの非存在下でさえ、神経突起伸長は起こる。これは、ＭＡ存在下でのＰＥＧ−ジチオールとのみ架橋するため、残りの作業において接着にＭＭＰ切断可能ペプチドが使用されないという対照としても提供される。２００  μｍＭＩＰ、スケールバー：５０  μｍ。
【図１４】βＩＩＩ−チューブリン２光子画像化からの神経突起伸長の定量。（ａ）封入化の２日後及び５日後の神経突起伸長。強力な剛性依存性は、ＭＡ存在下では桁違いなほど（２０〜２５０Ｐａ）は観測されず、部分的な分解のため、柔らかいゲルのみが神経突起伸長を減少させる。微細構造を有しないように作られたゲルは、多糖類による体積排他の促進効果が高いｐＨによって置換わり、初日以内にゲルは分解する（分解時灰色のクロス）。Ｑ−ゲルは、自由に浮遊しているゲル（古典的なゲル）及び支持体ゲル（本発明者らのプロトコルと同一の鋳型）の両方で、対照として使用される。エラーバー：ＳＥＭ（ｎ＝３）。
【図１５】図１５はマクロ多孔質ゲルの安定性の増加は、酵素分解へのより高い耐性よりも、より低い架橋されたポリマー含有量での安定性に起因することを示している。（ａ）マクロ多孔質ゲルは、非マクロ多孔質ゲルと同様の速度でプロテアーゼによって分解される（マクロ多孔質ゲルについて、１．６  ｋｇ／ｍｏｌのヒアルロナン０．５２５％（ｗ／ｖ）存在下で、２０  ｋｇ／ｍｏｌの４アーム−ＰＥＧ−ビニルスルホン  １．５％（ｗ／ｖ）を、ビニルスルホンのチオールのマイケル付加を介してＭＭＰ切断可能ペプチドＥＲＣＧ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＧＣＲＥで架橋した。分解溶液はパパイン０．５  ｍｇ／ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水＋１  ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンの溶液である。反応は、圧入において使用されるテクスチャアナライザーでモニターし、そして圧入係数は、各測定の初期圧力係数で正規化される。）。エラーバー：ｎ＝３の標準偏差。（ｂ）マクロ多孔質ゲルは通常のゲルより低い架橋されたポリマー成分で安定に維持している（３．８  ｋｇ／ｍｏｌのＰＥＧ−ジチオールで架橋した説明文中に示した体積以上の重量である２０  ｋｇ／ｍｏｌの４アーム−ＰＥＧ−ビニルスルホン。追加の０．５％（ｗ／ｖ）ヒアルロナン及び１％（ｗ／ｖ）のデキストラン存在下で形成したマクロ多孔質ゲル。該ゲルを、ヒアルロニダーゼを１  ｍｇ／ｍｌ含むＰＢＳ溶液での塩及び未結合のポリマーの洗浄、次いで超純水による洗浄を各１日行い、そして凍結乾燥して、該ゲルの乾燥重量を測定した。）。エラーバー：ｎ＝１１〜１６の標準誤差。
【図１６】図１６は、ＰＥＧゲル中の高分子の平衡濃度が上澄み液より低いが、マクロ多孔質ゲルは細孔内で完全な濃度に達することを可能にし、それは結局のところ、ゲル中の深くに細胞を封入することができることを示している。（Ａ）３．８  ｋｇ／ｍｏｌのＰＥＧジチオール架橋剤と１．５％（ｗ／ｖ）で２０  ｋｇ／ｍｏｌの４アーム−ＰＥＧ−ＶＳとから作製したＰＥＧゲルは、蛍光で標識したニュートラアビジン溶液に浸漬し、そしてそれぞれの蛍光強度から、上清中及び細孔の濃度と比較したＰＥＧゲル中のニュートラアビジン濃度を測定した。濃度比は底面のゲル及び上面の上清を示す蛍光画像を元に示される。Ｂ）蛍光標識スクシン化キトサンについても同様に行った。Ｃ）５００  ｋｇ／ｍｏｌの蛍光標識デキストランについても同様に行った。
【図１７】図１７は、粘度を増加させるための添加ヒアルロナン及び、多糖類相からのＰＥＧの相反を増加させるための種々の量のデキストランを使用することにより、調整可能な細孔サイズを有するマクロ多孔質ＰＥＧゲルを形成することができることを示している。１マイクロメートル未満から５０マクロメートルを超えるようにの細孔サイズを有するマクロ多孔質ＰＥＧゲルの形成が図に示されている（上記蛍光写真で示される、多糖類存在下でＰＥＧ−ジチオールで架橋した１．５％（ｗ／ｖ）の２０  ｋｇ／ｍｏｌの４アーム−ＰＥＧビニルスルホン。可視化のために蛍光タグをＰＥＧに結合している。）。
【図１８】図１８は、ビニルスルホンへのチオールのマイケル付加以外の架橋化学で形成されたマクロ多孔質ＰＥＧゲルを示している。特定の多糖類濃度に起因する細孔サイズが異なるにもかかわらず、本方法の原理は同様に機能する。トランスグルタミナーゼ活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子についての基質であるペプチド（ＦＫＧＧ−ＥＲＣＧ及びＮＱＥＱＶＳＰＬ−ＥＲＣＧ）で末端官能化された２０  ｋｇ／ｍｏｌの４アーム−ＰＥＧ前駆体から形成されたＰＥＧゲルによって、トランスグルタミナーゼ架橋化ＰＥＧはここに例示される。１０  ｋｇ／ｍｏｌの分子量の直鎖ＰＥＧ−ジアクリレートを緩衝水溶液（グルコース  １００  ｍｍｏｌ／Ｌ、ＴＲＩＳ  ５０  ｍｍｏｌ／Ｌ、カルシウム  ５０  ｍｍｍｏｌ／Ｌ）中に１０％（ｗ／ｖ）で溶解した。４５０〜５５０  ｋｇ／ｍｏｌの分子量のデキストランを同一の緩衝液に５％（ｗ／ｖ）で溶解した。光活性化ラジカル開始剤イルガキュア２９５９を同一の緩衝液に０．２％（ｗ／ｖ）で溶解した。次いで４０  μｌのＰＥＧ溶液、４０  μｌのデキストラン溶液及び１０  μｌのイルガキュア２９５９溶液を混合した。該混合溶液は透明で均一な溶液であり、１  ｍｍ間隔の２つのカバースリップの間に配置し、およそ１０  ｍＷ／ｃｍ２の光強度で３６５  ｎｍのＵＶに１０分間露光して架橋させた。細孔形成の評価のために得られたハイドロゲルを、わずかな未反応のアクリル基と反応する４−メチル７−チオクマリンの飽和溶液中で２０分間インキュベートし、それによりＰＥＧを青色蛍光色素で標識した。蛍光性多孔質ＰＥＧゲルは、７１０  ｎｍでの励起及び４００  ｎｍから５００  ｎｍ間の光収集を伴う２光子励起蛍光で画像化し、３Ｄ構造化された均一な多孔質構造を示した。活性化第ＸＩＩＩ因子及びカルシウム存在下において、４アーム−ＰＥＧ前駆体はゲル中に架橋される。１０  ｋｇ／ｍｏｌＰＥＧ−ジアクリレート（末端機能化）及び３６５  ｎｍのＵＶ照射で活性化されるラジカル開始剤として０．０２５％（ｗ／ｖ）のイルガキュア２９５９を用いるＰＥＧジアクリレートのフリーラジカル重合をここに示す。ヒアルロナン（ＨＡ）及びデキストランはマクロ細孔を形成するために使用する。画像は、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）フィルターを備えた顕微鏡で得られる。スケールバー：１０マイクロメートル。
【図１９】図１９は、マイケル付加により形成され、蛍光標識し、及び２光子励起蛍光レーザー共焦点走査顕微鏡で画像化したマクロ多孔質ポリオキサゾリンハイドロゲルを示す。出発物質として、９３％の２−エチル２−オキサゾリン及び７％の２−カルボキシエチル２−オキサゾリンの１５０ユニット長コポリマーを使用した。これは、架橋可能部分を導入するのに有用なカルボン酸を含む直鎖ポリ２−エチル２−オキサゾリンである。チオール含有誘導体は、ｐＨ４．５の３００  ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液中で２倍過剰の３，３’−ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）（ＤＴＰＨＹ）と標準ＥＤＣ活性化したカルボキシレートとの反応により、次いで１０倍過剰のトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）との反応により、次いで透析及び凍結乾燥により得られた。ビニルスルホン誘導体は、窒素雰囲気下で、ｐＨ８．０のトリエタノールアミン緩衝液溶液中で、チオール誘導体と５０倍過剰ビニルスルホンとを１時間反応し、次いで透析及び凍結乾燥により得られた。ポリ（２−エチル２−オキサゾリン）のチオ及びビニルスルホン誘導体を、ｍＱ水へ、及びｐＨ８．０の３００  ｍＭ  トリエタノールアミン緩衝液へ、それぞれ１０％（ｗ／ｖ）となるように再懸濁した。分子量１０００〜２０００  ｋｇ／ｍｏｌのヒアルロナンを同一の緩衝液に７．５  ｍｇ／ｍｌで溶解した。ヒアルロナン溶液４０  μｌにそれぞれポリオキサゾリン誘導体２０  μｌを混合し溶液を作製した。多孔質構造の可視化のために、少量のチオール結合系抗クマリンをビニルスルホン機能化ポリオキサゾリンに予備反応させた。完全に混合した後、マイケル付加によるゲル化を室温で１時間進行し、蛍光標識したマクロ多孔質ポリオキサゾリンハイドロゲルは共焦点蛍光走査顕微鏡で画像化した。
【図２０】図２０は、ＰＥＧゲル中に封入したラット皮質神経細胞において測定されたカルシウムスパイク活性が、グルタミン酸作動性伝達阻害剤であるｄ−１−３［（±）−２−カルボキシピペラジン−４−イル］−プロピル−１−ホスホン酸（ＣＰＰ）及び６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジカルボン酸（ＣＮＱＸ）によって、及び電位依存性ナトリウムチャンネル阻害剤テトロドトキシン（ＴＴＸ）によって、阻害されることから、神経細胞のグルタミン酸作動性興奮及び活性電位の発火に起因することを示している。蛍光インジケーター、オレゴングリーンＢＡＰＴＡ−１によって報告されるカルシウムスパイクは、広視野顕微鏡で５×対物レンズを用いて得られる９０秒間の蛍光動画の視野内で測定される。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
用語及び定義
本明細書の文脈において、ポリアルキルオキサゾリン（ＰＯｘ）という用語は、アルキル誘導体（特にメチル−、エチル−、又はプロピル−置換された）オキサゾリン又はオキサジンのポリマーを指す。
【０００７】
本明細書の文脈において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、一般式Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（ＣＡＳ番号  ２５３２２−６８−３）のポリマーを指す。
【０００８】
本明細書の文脈において、星型のＰＥＧ／ＰＯｘという用語は、中心の核にいくつかの（３以上の）直鎖ＰＥＧ／ＰＯｘが連結した構造である樹状ポリマーを指す。ポリマーの核は、単一原子、分子又は巨大な分子であってもよい。特にポリエチレングリコール鎖又はポリアルキルオキサゾリン鎖を連結するための一般的なものは、ペンタエリスリトール（ＣＡＳ番号  １１５−７７−５）、２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（ＣＡＳ番号  ４７０４−９４−３）、ジペンタエリスリトール（ＣＡＳ番号  １２６−５８−９）、トリペンタエリスリトール（ＣＡＳ番号  ７８−２４−０）、グリセロール、テトラキス（ブロモメチル）エチレン（ＣＡＳ番号  ３０４３２−１６−７）、１，３，５トリブロモフェニル、１，３，５トリヒドロキシフェニル、シリコン及びジアルキルシラン部分である。
【０００９】
本明細書の文脈において、ヒアルロナン（又はその同義語のヒアルロン酸又はヒアルロン酸塩）はＨＡと略され、Ｄ−グルクロン酸部分及びＮ−アセチルグルコサミン部分が交互にβ１，３結合及びβ１，４結合している一般式を含む繰返し単位のポリマーを指す。
【００１０】
【化１】
2018535704.tif 000002
【００１１】
該繰返し単位の分子量は３７９  ｇ／ｍｏｌである。体内のヒアルロン酸は１分子あたり２５００を超える繰返し単位を有している。ヒアルロナンはＣＡＳ番号  ９００４−６１−９（酸）、９０６７−３２−７（ナトリウム塩）及び３１７００−９１−４（カリウム塩）で参照される。
【００１２】
マンヌロン（ＭＡ）は（１−４）結合によって連結されるβ−Ｄ−マンヌロネート残基の直鎖状ポリマーである（ＣＡＳ番号  ６８１４−３６−４）。
【００１３】
本明細書で使用される場合、本明細書で記載されたいずれのポリマーについてもポリマーという用語は、記載のモノマーの重合体を意味し、そのいくつかは架橋性の反応性基によって置換されていると理解される。
【００１４】
ポリマー又は他の巨大分子を定義するために本明細書で使用される分子量値（数平均分子量）は、特に明記しない限り、校正用の同一ポリマーのほぼ単分散な標準物質（多分散指数が１．０から１．１の間）を用いたゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって決定され、この詳細はアンドレ  シュトリーゲル、  ウォーレンス  Ｗ．ヤオ、  ジョーゼフ  Ｊ．  カークランド及びドナルド  Ｄ．ブライ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００９による「現代サイズ排除液体クロマトグラフィー：ゲル浸透およびゲルろ過クロマトグラフィーの実践」に記載されている。標準の質量は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を使用して測定される。
【００１５】
本明細書の文脈において、コスモトロピック試薬という用語は、水溶液中でＰＥＧ又はＰＯｘの水溶液と二相系を形成することができる任意の薬剤を指す。
【００１６】
発明の概要
本発明の第１の側面によれば、以下の工程を含むマクロ多孔質ゲルを提供するための方法を提供する。
ａ）第１及び第２の溶質を含む水溶液を提供する工程であって、ここで第１の溶質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の架橋可能な誘導体及びポリオキサゾリンの架橋可能な誘導体から選択される架橋可能なポリマーであり；及び第２の溶質はコスモストロピック試薬であり、
ｂ）該混合物へ架橋可能なポリマーを架橋することができる架橋試薬を添加し、それにより架橋可能なポリマーのゲル化及び相分離を同時に開始する工程。
【００１７】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、星型のポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジブロックコポリマー及びポリエチレントリブロックコポリマーを含む群；又はポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリプロピルオキサゾリン及びポリブチルオキサゾリンを含む群；又は星型のポリオキサゾリン及びオキサゾリンのコポリマー、特に、オキサゾリンを含む、２−メチルオキサゾリンとカルボン酸又はアルコールを有する２−エチルオキサゾリン、特に２−カルボキシエチルオキサゾリン又は２−ヒドロキシエチルオキサゾリンとのコポリマーを含む群；又は部分的に加水分解されたポリ２−メチルオキサゾリン又はポリ２−エチルオキサゾリンを含む群より選択される。
【００１８】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは直鎖のポリエチレングリコールである。
【００１９】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、ペンタエリスリトールの核を有し、及び分子量が１０〜４０  ｋｇ／ｍｏｌ、特に約２０  ｋｇ／ｍｏｌである星型のポリエチレングリコールである（シグマ製品番号ＪＫＡ７０２５など）。一実施態様において、架橋可能なポリマーは、ジペンタエリスリトール核を有し、１０〜４０  ｋｇ／ｍｏｌの星型ポリエチレングリコールである（Ｓｉｇｍａ製品番号ＪＫＡ１００３４など）。一実施態様においては、架橋可能なポリマーはグリセロールの核を有する星型ポリエチレングリコールである。
【００２０】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、ポリエチレングリコールと、ポリエチレン（ＰＥ）、又はポリ乳酸（ＰＬＡ）又は乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリε−カプロラクトン（ＰＣＬ）又はポリスチレンとのコポリマーを含む、ポリエチレングリコールジブロックコポリマーである。
【００２１】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）とのコポリマー、又はポリエチレングリコールと乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）とのコポリマーを含むポリエチレングリコールトリブロックコポリマー。
【００２２】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、少なくとも５０％のＰＥＧと、ＰＣＬ、ＰＰＧ及びＰＬＧＡから選択される少なくとも１つの他のポリマーとを含むポリエチレングリコールコポリマーである。
【００２３】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、メチルオキサゾリン又はエチルオキサゾリンとカルボキシエチルオキサゾリンとのランダムコポリマーを含むポリオキサゾリンであり、及び該カルボン酸は反応性部分で置換されており、特に、チオール、ビニルスルホン、マレイミド、トランスグルタミナーゼ基質ペプチド、チラミン、ドーパミン、アクリレート、メタクリレート、ビニルエステル、アルキン、アジド、アルデヒド及びアクリルアミドからなる群から、より特にチオール、ビニルスルホン、マレイミド、アクリレート及びメタクリレートからなる群から選択される１つまたは複数の反応性部分で置換されている。
【００２４】
一実施態様において、架橋可能なポリマーはテトラキス（ブロモメチル）エチレン開始剤で重合した星型のポリオキサゾリンである。一実施態様において、架橋可能なポリマーは１，３，５−トリブロモフェニル開始剤で重合した星型のポリオキサゾリンである。
【００２５】
一実施態様において、本明細書で記載される星型のポリオキサゾリンポリマーのいずれも、ヒドロキシル基、アミノ基又はカルボン酸基で末端化されており、さらに本明細書の一実施例では、その末端は本明細書で特定した１つ又は複数の反応性部分、特にチオール、ビニルスルホン、マレイミド、トランスグルタミナーゼ基質ペプチド、チラミン、ドーパミン、アクリレート、メタクリレート、ビニルエステル、アルキン、アジド、アルデヒド及びアクリルアミドから選択された反応性部分でさらに置換されている。一代替的な実施態様において、所望の架橋性基によってオキサゾリン重合を停止させることによって星型のポリオキサゾリンを反応性部分で直接末端化する。
【００２６】
一実施態様において、酸又は塩基を含む水溶液中で加熱することによって直鎖のポリオキサゾリンは部分的に加水分解され、その側鎖の１から４０％が除去され（例えばポリ（２メチル−２−オキサゾリン）からのアセテート放出）、及び放出された２級アミンは反応性部分と置換される。
【００２７】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、ビニルエステル、マレイミド、ビニルスルホン、アルキン、アジド、アルデヒド、チラミン、ドーパミン及びチオール部分を含む群から選択された反応性部分を含む。反応性部分は、星型のポリマー鎖の末端、又は直鎖のポリマー上のおよそ５〜２５％の側鎖のいずれかに付加される。
【００２８】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、反応性部分としてトランスグルタミナーゼ基質ペプチド、具体的には、血液凝固第ＸＩＩＩ因子基質ペプチド、より特にはＫＦＧＧ及びＮＱＥＱＶＳＰＬ配列を含むペプチドを含む。
【００２９】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、ビニルスルホンで修飾されており、及び架橋試薬は２つのチオール（−ＳＨ）を含む短いリンカー分子、特に２〜１０個の炭素原子又はヘテロ原子を含むアルキル鎖又はヘテロアルキル鎖によって隔てられた２つのＳＨ部分を含む分子、又は２つのシステインアミノ酸で構成されるブロックを有するペプチドである。
【００３０】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、ビニルスルホンで修飾されており、並びに前記架橋試薬は、チオール部分、特に１級チオール部分で置換された親水性ポリマー、特に１級チオール（−ＣＨ２ＳＨ）部分を含む星型のポリエチレングリコール又は１級チオール（−ＣＨ２ＳＨ）部分を含む直鎖のポリエチレングリコール、及び２〜１００アミノ酸、特に２〜２０アミノ酸、より特に４〜１６アミノ酸を含むペプチドであって、ここで前記アミノ酸の２つがシステインであり；特にエンドペプチターゼ、より特にマトリックスメタロプロテアーゼによって切断可能なペプチド、さらにより特にＧＣＲＤ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＤＲＣＧ又はＧＣＲＥ−ＧＰＱＧＩＡＧＱ−ＥＲＣＧのアミノ酸配列のペプチドを含む群から選択される。
【００３１】
一実施態様において、架橋可能なポリマーの分子量は１，０００〜１，０００，０００  ｇ／ｍｏｌ、特に１０，０００〜４０，０００  ｇ／ｍｏｌである。
【００３２】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、長さが５０〜１０００モノマー、特に７５〜５００モノマー、さらにより特に１００〜３００モノマー、最も特に１５０モノマーの長さの直鎖のポリマーである。
【００３３】
一実施態様において、水溶液中の架橋可能なポリマーの濃度は０．２％〜５０％（ｗ／ｖ）、特に０．５％〜１０％（ｗ／ｖ）である。
【００３４】
一実施態様において、水溶液は、前記ポリエチレングリコールの架橋可能な誘導体を０．５％〜３％（ｗ／ｖ）、又は前記ポリオキサゾリンの架橋可能な誘導体を１％〜１０％（ｗ／ｖ）含んでいる。
【００３５】
一実施態様において、コスモトロピック試薬は多糖類、高分子電解質、並びに金属（特にアルカリ及びアルカリ土類金属）の炭酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩及びリン酸二水素塩を含む群から選択される。
【００３６】
一実施態様において、コスモトロピック試薬は、多糖類、特にヒアルロナン、マンヌロナン、カラギーナン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デキストラン、ヒドロキシプロピルデキストラン、ペクチン、アルギン酸塩、ジェランガム、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、アセチルセルロース 、デンプン、ヒドロキシプロピルデンプンを含む群から選択され、及びここで特に前記多糖類は、分子量が１，０００〜１０，０００，０００  ｇ／ｍｏｌ、より特に１０，０００〜２，０００，０００  ｇ／ｍｏｌ、さらにより特に１００，０００  ｇ／ｍｏｌ〜１，０００，０００  ｇ／ｍｏｌ、さらにより特に約１５０，０００  ｇ／ｍｏｌである。
【００３７】
一実施態様において、水溶液中の多糖類の濃度は、０．１％〜５０％（ｗ／ｖ）、特に０．１％〜５％、さらにより特に０．３５％から０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００３８】
一実施態様において、水溶液は、０．１％〜１％のヒアルロナン、特に約０．４％のヒアルロナン、又は０．５％〜５％のマンヌロナン、特に約２％のマンヌロナン、又は０．１％〜１０％のデキストラン又はその混合物を含む。
【００３９】
一実施態様において、コスモトロピック試薬は、１，０００  ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００，０００  ｇ／ｍｏｌ、特に１０，０００〜１００，０００  ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量によって特徴づけられる高分子電解質、特にポリエチレンイミン又はポリアクリル酸である。
【００４０】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、２０，０００  ｇ／ｍｏｌの４アーム−ＰＥＧ−ビニルスルホンであり、多糖類はマンヌロナンであり、及び架橋試薬はマトリックスメタロプロテアーゼ切断性ペプチド、特にアミノ酸配列ＧＰＱＧＩＷＧＱを含むペプチドである。一実施態様において、架橋可能なポリマーは２０，０００  ｇ／ｍｏｌの４アーム−ＰＥＧ−ビニルスルホンであり、多糖類はマンヌロナンであり、及び架橋試薬はＧＣＲＤ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＤＲＣＧのペプチドである。
【００４１】
一実施態様において、架橋可能なポリマーは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、ビニルエステル、又はマレイミド誘導体であり、及び加熱又は光暴露においてゲル化を誘発するためにラジカル開始剤を使用する。特に、光誘発性ラジカル開始剤存在下で、１〜１０  ｋｇ／ｍｏｌの直鎖のＰＥＧジアクリレート若しくはＰＥＧジメタクリレート、又は１〜１０  ｋｇ／ｍｏｌのＰＯｘ−ジアクリレート若しくはＰＯｘ−ジメタクリレートである。
【００４２】
一実施態様において、ラジカル開始剤は、イルガキュア２９５９（ＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９）であり、０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）、特に０．０２５％〜０．１％（ｗ／ｖ）の濃度、及び青色光から近紫外光、特に約３６５  ｎｍ及び１０  ｍＷ／ｃｍ２の光を使用して架橋化を誘発する。
【００４３】
一実施態様において、ラジカル開始剤は、２，２−ジメチル−２−フェニル−アセトフェノン、特にＮ−ビニルピロリドン若しくはリチウムアシルホスフィン塩存在下であり、又はＮ−ビニルピロリドン存在下でトリエタノールアミンのようなアミン存在下でのローズベンガルである。
【００４４】
一実施態様において、架橋可能なポリマーはトランスグルタミナーゼ基質ペプチド誘導体であり、そしてトランスグルタミナーゼを添加してゲル化を誘発する。特に、ＦＫＧＧ及びＮＱＥＱＶＳＰＬの配列を含むペプチドで末端化した星型のＰＥＧは活性化トランスグルタミナーゼ血液凝固第ＸＩＩＩ因子の添加により架橋する。
【００４５】
一実施態様において、架橋可能なポリマーはチラミン又はドーパミン誘導体であり、及び過酸化水素と共に西洋わさびペルオキシダーゼを使用して、架橋化を誘発する。あるいは、ローズベンガル、エオシン−Ｙ、メチレンブルー又はリボフラビンなどの感光性一重項酸素開始剤が、可視又は近紫外における可視光露光と組み合わせて使用される。特に１〜１００  μｍｏｌ／Ｌの濃度のリボフラビン及び０．０１〜１％（ｗ／ｖ）の濃度のローズベンガル、エオシン−Ｙ又はメチレンブルーを使用し、近紫外／可視光に露光し、ゲル化を誘発する。西洋わさびペルオキシダーゼは、０．０１〜１  ｍｍｏｌ／Ｌの過酸化水素と共に０．１〜１０ Ｕｎｉｔｓ／ｍＬで、特に０．１  ｍｍｏｌ／Ｌの過酸化水素と共に１  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬで使用される。
【００４６】
一実施態様において、水溶液はｐＨ７．０〜８．０、特に約ｐＨ７．４によって特徴づけられ、前記架橋試薬の添加は、２０℃〜４０℃、特に約３７℃で行われる。
【００４７】
一実施態様において、細胞、特に哺乳動物細胞は架橋前に水溶液に添加する。
【００４８】
一実施態様において、架橋試薬を添加１０秒〜１５分後に水性混合物をシリンジに通し、及び／又は、架橋試薬添加１〜６０分後に固体のマクロ多孔質ゲルが観測される。
【００４９】
一実施態様において、架橋試薬及び架橋可能なポリマーは、いずれか側にコスモトロピック試薬を有し、二重バレルシリンジに分けて充填し、該２つのバレルは注入時に混合され、結果として１〜３０分後に固体マクロ多孔質ゲルが形成される。
【００５０】
本発明の第２の側面によれば、マクロ多孔質ハイドロゲルが提供され、それは架橋されたポリマーを含むことで特徴づけられ、ここで前記架橋されたポリマーはポリエチレングリコールの誘導体又はポリオキサゾリンの誘導体であり；及び２００  ｎｍ〜１０００  μｍのサイズによって特徴づけられる、特に５００  ｎｍ〜１００  μｍのサイズによって特徴づけられる相互連結した細孔を示し；及び該ゲルはさらにｐＨ７．０〜８．０、特に約ｐＨ７．４によって特徴づけられる。
【００５１】
一実施態様において、ゲルは架橋可能なポリマーとして前述したポリマーのいずれか１つで作製される。
【００５２】
一実施態様において、マクロ多孔質ハイドロゲルは透明であり；及びその剛性は１〜５００，０００  Ｐａ、特に１０〜１０，０００  Ｐａ、特に１０〜１０００  Ｐａ、さらにより特に５０〜５００  Ｐａである。
【００５３】
一実施態様において、マクロ多孔質ハイドロゲルは生細胞を含む。
【００５４】
一実施態様において、マクロ多孔質ハイドロゲルは機能的にシナプス性に接続した神経突起を含む神経細胞を含む。
【００５５】
一実施態様において、マクロ多孔質ハイドロゲルは、神経又は脊髄損傷の治療において使用され、ここで前記ゲルは、付加的な支持導管の有無にかかわらず、移植されるか又は損傷部位でインサイチュゲル化するかのいずれかで行われる。
【００５６】
一実施態様において、マクロ多孔質ハイドロゲルは組織再生を支持するために使用される。特に、該マクロ多孔質ハイドロゲルは、細胞の有無にかかわらず前培養して、移植されるか、又はマクロ多孔質ハイドロゲルは、細胞の有無にかかわらず損傷部位でインサイチュゲル化され、再生を支持する。より特に、神経、脊髄、皮膚、骨、軟骨又は椎間板へ送達するゲル中には、神経細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、線維芽細胞、内皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞または筋芽細胞が封入される。
【００５７】
本発明の詳細な説明
本発明において、２つの溶質の水溶液が提供される。該２つの溶質は水性二相系を形成できることで知られている。２つの溶質の濃度は相分離を生成するほど十分高いわけではないので、最初は混和性がある。２つの溶質のうちの１つはポリマーであり、それは化学的に架橋され、それはポリマーの分子量が経時的に増加することを意味し、結果としてゲル形成が起こる。しかしこの工程において、分子量の増加が相分離を誘発し、それはほとんどの場合、より高い分子量が好まれる。これにより、結果としてゲル形成中に動的細孔形成がもたらされる。この工程は、動物又は患者への注入へ適用でき、そして細胞封入に適用できる。典型的な実施においては、星型のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリメチルオキサゾリン若しくはポリエチルオキサゾリン（ＰＯｘ）は、ビニルスルホンで修飾し、そして、架橋試薬（２つ以上のチオールを含む分子）存在下でゲル相を形成する架橋可能なポリマーとして使用する。第２の溶質は、ＰＥＧ及びＰＯｘと水性二相系を形成可能なコスモトロピック試薬である。該第２の溶質はヒアルロナン、マンヌロン及びデキストランのような多糖類であってもよく、又は金属（特にアルカリ又はアルカリ土類金属）の炭酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩及びリン酸二水素塩を含む群から選択されてもよい。いくつかのＰＥＧ／ＰＯｘ誘導体、又はいくつかのコスモトロピック試薬もまた組合せてもよい。これらの３つの成分は一緒に混合して、最初は均一な溶液を形成する。該混合物は細胞を懸濁するために使用してもよく、そして均一な液体溶液として、鋳型の形に又は細胞培養支持体上に、注入又は形を形成して置いてもよい。架橋の工程とともに、架橋されたポリマーに富んだ相と多糖類に富んだ相とを有する相分離が誘発される。ＰＥＧ／ＰＯｘ相のみがゲル化を生じ、多糖類相は液体のままであり、これによりマクロ多孔質ハイドロゲルが生成する。
【００５８】
すべての実施態様において、架橋可能なポリマーは、架橋可能な反応性部分で修飾されることを含む。
【００５９】
共有結合による架橋は、当業者に知られる任意の化学的手法によって達成され、これに限定されないが、：メタクリレート、アクリルレート、アクリルアミド、ビニルエステル又は他のエン含有分子のフリーラジカル重合；チオール−エン付加、マレイミド又はアクリレートのような他の受容体へのマイケル付加などである。チオールはいくつかのチオールを含む任意のペプチド又はタンパク質でありえるが、典型的には必ずしもシステイン残基を通して導入される必要はない。チオール成分はまた、チオール末端を有する直鎖若しくは枝分れ状ＰＥＧ、又は直鎖若しくは枝分かれ状の形状で、末端若しくは側鎖のいずれかにチオールを有するＰＯｘといったチオール化ポリマーであってもよい。チラミン又はドーパミンの酸化を通じた、又はトランスグルタミナーゼを用いた、酵素的架橋も用いてもよい。他の古典的な手段は、アルデヒドとアミノ基から形成されるシッフ塩基、銅触媒又はひずみ促進アジド−イン  クリックケミストリー、ディールズアルダー反応、２＋２シクロ付加、カルボジイミドで活性したカルボン酸へのアミンアジド又はヒドラジドの結合、及びその他である。
【００６０】
架橋は疎水性相互作用（例えば、プルオニック）又は特異的認識（例えばストレプトアビジン−ビオチン）のような非共有相互作用を通じて起こってもよい。
【００６１】
ペクチン、アルギン酸塩、ジェランガム、セルロース、マンヌロナン、ヒアルロナン、デキストラン、又はこれら前記天然多糖類のいずれかの誘導体によって例示される自然／天然多糖類のような、いずれの他の多糖類又は多糖類誘導体を第２の溶質、つまりコスモトロピック溶質に使用することができる。これらの多糖類は１，０００ ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００，０００  ｇ／ｍｏｌ、特に１０，０００  ｇ／ｍｏｌ〜２，０００，０００  ｇ／ｍｏｌ、より特に１００，０００  ｇ／ｍｏｌ〜１，０００，０００  ｇ／ｍｏｌの範囲、さらにより特に約１５０，０００  ｇ／ｍｏｌの分子量によって特徴づけられる。ポリマーを除く相は、相分離が失われない限り、非多糖類又は合成された新しい多糖類ポリマーであってもよい。
【００６２】
本発明の方法は、非常に安価で簡便であり、迅速に使用でき、規模が自明であり、それは他の方法の場合ではない。先行技術の方法及びゲルとは対照的に、本発明の方法及びゲルは、注入可能なマクロ多孔質ハイドロゲルの必要な特性を全て同時に提供する。これらには、細胞封入を有する生体適合性、インサイチュ細孔形成（理論的には患者内でのインビボを含む）、非常に広い範囲にわたるマクロ細孔のサイズの完全な同調性、及び容易な取扱い性を含む。加えて、該方法は、細孔の相互接続性、完全なヒドロゲル透明性、細胞浸潤に対する優れたハイドロゲル許容及び改善された安定性も提供する。
【００６３】
直接的な使用は、スクリーニングのためのインビトロ３Ｄ培養においてである。ハイドロゲルは、フィブリンゲル、コラーゲンゲル及びマトリゲルのような他の選択肢が存在するにもかかわらず、特に３Ｄ神経細胞培養について、現在の最良の標準と同様に実施されている。それにもかかわらず、これらのマトリックスは動物由来のものであり、それは免疫原性又はウイルス汚染のリスクという深刻な問題をもたらすだけでなく、高コストであり、それらは通常細胞存在下では分解が早すぎるのだが、その全てを本願のハイドロゲルによって克服することができる。本明細書の場合のような、優れた生存可能性及び封入した神経細胞の３Ｄ神経突起伸長を提供するための完全に合成されたハイドロゲルは報告されていない。
【００６４】
インビボの細胞の送達及びマクロ多孔質ゲルの形成については、既知の代替法では重大な制限を有し、それは本発明のみが克服する。以前に提供された解決方法は、容易に拡大可能な取扱い、直接細孔形成及び細胞適合性を有する注入可能なマクロ多孔質ハイドロゲルを可能とするものではなかった。現在のプロトコルはまた特に、設置が簡便であり、並びに容易にアクセス可能な剛性及び細孔サイズの範囲に関してより柔軟である。
【００６５】
本発明はさらに以下の実施例及び図面によりさらに説明され、それによりさらなる実施態様及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は本発明を説明することを意図しており、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６６】
相互接続したマクロ多孔質ネットワークの形成に基づいて、封入したＤＲＧｓ及び解離中央神経細胞（初代ラット皮質及びヒトｉＰＳＣ由来）の存在下において、前例のない３Ｄ神経突起伸長及び安定性を実施するプロトコルが提供される。本プロトコルの鍵は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の排他のための、非修飾高分子量の多糖類（ＰＳｓ）（ヒアルロナン（ＨＡ）又は非相互作用マンヌロナン（ＭＡ））の使用である。ＰＳ相からのＰＥＧの排他は、ビニルスルホン（ＶＳ）へのチオールのマイケル付加による架橋の動態を改善するため、神経細胞のような感受性の高い細胞へダメージを与えるｐＨ８．０を必要とするかわりに、生理的ｐＨで培地中において数分以内でゲル化が進行する。ＰＥＧと多糖類間の相分離はまた結果として、非微細構造の同等のものと比較して、安定性及び神経突起伸長が増加したゲルをもたらす。この系においては、ペプチドに結合するタンパク質又はインテグリンのような接着の手掛かりを必要とせず、神経突起を許容するＥＣＭの設計における物理的性質の圧倒的な重要性を示している。最適化された条件においては、封入した皮質神経細胞は、第１週から１００  μｍ／神経細胞／日の典型的な割合で神経突起を伸ばし、合成マトリックス内にシナプスを形成し、それは結果として、２週間後に自発的に調整された電気活性を有する３Ｄ神経ネットワークをもたらし、培地中で少なくとも１ヶ月間安定して維持できる。
【００６７】
ＰＳを用いたＰＥＧハイドロゲルの微細構造
ＰＥＧは、その水組織化特性によって、デキストラン及びいくつかの塩と水性二相系を形成することは古くから知られいている。この物理的効果は、タンパク質抽出のために広く使われてきており、ゲルミクロスフィア形成に有用であることが示されているが、マクロ多孔質足場のインサイチュ自己会合についての可能性はまだ示されていない。これはおそらく、相分離は典型的には高速ミクロスフィア形成、それに続く融合及びデカンテーションを通じて進み、それは細孔及びゲルの浸透したネットワークを提供しないからである。相互接続されたネットワークは、ＰＥＧ／デキストラン混合物の高割合のデキストランをタンブリングしながら一晩光架橋することによって得ることができた。その利点にもかかわらず、この方法はインサイチュゲル化及び細胞封入を可能とせず、そして得られる足場の透明性は低い。本発明者らは、細胞封入及び注入に適合する方法でマクロ多孔質ハイドロゲルを作製するための鍵が、低いポリマー含有量及び高い粘度を組み合わせることであることを見出した。低いポリマー含有量は、ＰＥＧ及び多糖類が最初は混和性であることを保証する。次に、水系において分子量に大きく依存する相分離は、架橋試薬存在下で起こるＰＥＧ鎖伸長によって誘発される（図７）。
【００６８】
図１は、本方法の２つの典型的な実施形態を示しており、これは結果として劇的に異なる微細構造を有するゲルが得られる：それぞれマンヌロナン（ＭＡ）２％（ｗ／ｖ）溶液又はヒアルロナン（ＨＡ）０．５％（ｗ／ｖ）溶液を７０％（ｖ／ｖ）有し、ＭＭＰ切断可能ペプチド（２つのシステインが提供する、マイケル付加によって架橋するためのチオールを含む）で架橋された４アーム−ＰＥＧ−ＶＳ（星型のポリエチレングリコール、ビニルスルホン末端）１．５％（ｗ／ｖ）（ＰＥＧ＋ＭＡ及びＰＥＧ＋ＨＡと示す）。ゲル化はｐＨ７．４  ＨＥＰＥＳ緩衝液を補充した細胞培養培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｂ２７）中で行う。多糖類は、化学的に不活性で、低濃度で高い粘度を保証する高分子量である、その両方を備えたものであり、特異的な生物学的効果を持たない（ＭＡについて）、又は特異的な生物学的効果が僅かである（ＨＡについて）ものについて選択された。ＨＡ／ＭＡストックの濃度は、静的粘度が１  Ｐａ（ＲＴのグリセロールに類似）付近であり、広い周波数範囲にわたって同様の複合粘度を得るように調節された（図２ｂ）。均質溶液から出発する利点は、最初の溶液が十分に混合されている限り、最終的な微細構造は正確な混合及び注入プロトコルに依存しないことである。それは再現性があり、均一で等方的な細孔を形成するための基礎となる。細孔の大きさと連結性及び等方性を定量するために、蛍光タグを付けた４アーム−ＰＥＧ−ＶＳ誘導体及び共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いた。多糖類の非存在下で形成されたＰＥＧゲルは完全に均質のようであり（ＰＥＧ間の距離は５〜５０ｎｍと推定され、及び使用した画像化条件おける回折限界は１８５ｎｍである）、一方、ＨＡ又はＭＡ存在下で形成されたＰＥＧゲルはマクロ多孔質であった（図１ａ、ｃ）。３Ｄ検査により、細孔が完全に相互接続されていることが明らかになった。自己相関関数を計算し（図１ｅ）、等方性であることがわかった。細孔サイズの定量は貫通可能球モデルでデータをフィッティングし（図１ｆ）、ＰＥＧ＋ＨＡについては、０．８２＋／−０．１  μｍ、ＰＥＧ＋ＭＡについては２．３９＋／−０．１６  μｍの特有の細孔径が得られた。Ｒ２値は０．８以上であり、モデルと良好な一致を示した。細孔体積分率、Ｓ２（０）は、ＰＥＧ＋ＭＡについては５８＋／−４％、ＰＥＧ＋ＨＡについては４３＋／−  １．６％（ＨＡ存在下で作製された該細孔は回折限界に近いため、この最後の値は慎重に取り扱われるべきであり、したがって、ぼやけている；一方ＰＥＧ＋ＭＡ中の細孔は十分な解像である）。注目すべきは、同じ粘度のＨＡ溶液とＭＡ溶液が劇的に異なる多孔質構造を生じさせたことである：これは相分離動態が、粘度だけでなく、界面張力にも依存すると知られることが期待される。細孔サイズはまた、可変量のデキストランを添加することにより調節することができ、これは粘度を顕著に変化させることなく速いＰＥＧ排他を与え、サイズを調節可能な細孔を生じる（データの表示無し）。
【００６９】
ポリマーの濃度が低いと、両二相間の密度及び光学的屈折率の僅かな差も保証する。前者は、ゲルの上部と下部の細孔のサイズ間の差異をもたらす沈降を避けるために興味深いものである。後者は、ゲル内の光回折を避け、それは完全なゲル透過性をもたらし（図８）、多孔質足場について比較的まれなことである。これにより、数ミリメートルの深さにわたる光学的撮像が可能となり、微分干渉観察（ＤＩＣ）における細胞の観察が容易になる。そのような浸透性多孔質ゲルは、細孔サイズに依存して、輸送特性を最大にし、及び迅速な神経突起伸長または細胞の浸潤を可能にする、自由な通路を有するため、組織工学のための強い関心がある。そのような大きな相互連結した細孔は、典型的にはコラーゲンやフィブリンのような天然の原繊維マトリックスには見出されるが、典型的に５〜５０  ｎｍの細孔サイズを有する古典的な化学的架橋ハイドロゲルにおいては見出されない。
【００７０】
ゲル化動力学
粘度の増加はゆるやかな分布を与え、よって動態を与える。しかし、この効果は、容積排他を通した濃縮による相殺以上であり、そして結果として亢進された動態で多孔質ＰＥＧゲルが形成される。特に興味深いことに、これが生理的なｐＨで最適な動態のゲルの形成を可能にし、一方、同様に良好なゲル化時間は一般的にはｐＨ８．０でのみ達成され（図２ａ／ｃ）、それは一般的に細胞にストレスを与え、神経細胞のような感受性細胞の損傷又は死をもたらす。高粘度はまたゲル化が起こる前に細胞が沈降することを防止する。
【００７１】
後根神経節（ＤＲＧ）封入
ＤＲＧは、完全な移植片として、末梢軸索再生の最も一般的なインビトロモデルであり、化学的及び生物学的ストレスに対する耐性のため、培養が容易である。それらは、移植片の周囲のプロテアーゼの濃度が高くなるために数日以内に分解する傾向があるにもかかわらず、それらは、通常様々な基質の生理活性を評価するために２Ｄで、及びフィブリンまたはコラーゲン中の３Ｄで培養する。本発明者らは非分解性多孔質ＰＥＧゲルが末梢軸索浸潤に許容的であり、そして長時間安定であることを見出した（図３）。このため、Ｅ９．５ニワトリ胚由来のＤＲＧ移植片を、ＨＡ  ０．５２５％（ｗ／ｖ）及びデキストラン  １．４％（ｗ／ｖ）存在下で、ＰＥＧジチオールの化学量数で架橋した４アームＰＥＧ−ＶＳ  ０．８％（ｗ／ｖ）から形成されるＰＥＧゲルのディスク（４  ｍｍ×１．５  ｍｍ）に封入した。３０日後の生存細胞プロセス（カルセインＡＭで染色）の全ゲル画像化により、ゲル全体で軸索の密集した網が侵入していることが明らかとなり、許容性および長期安定性が示された。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、死細胞）／カルセインＡＭ（生細胞）染色パターンから観測されるように、細胞死は移植片の表面では明白であったが、内部ではみられなかった。これは、外側の細胞層が封入に関連するストレスから内部細胞を保護するのに役立つことを示唆している。
【００７２】
多孔質ＰＥＧ中のラット皮質神経細胞からの３Ｄ神経ネットワーク
初代ラット皮質神経細胞をＨＡの量を増加させながら形成した多孔質ゲル中に封入した（図４）。神経細胞生存率、神経突起伸長割合及びゲル分解は、３Ｄ神経ネットワーク形成について最適化するために最も重要なパラメーターであるため、定量化した。市販のＱ−ゲルは、現在の最良の標準を代表するものであり、多くの異なる細胞の封入に成功しているため、非多孔質な古典的なＰＥＧゲルの対照として使用した。
【００７３】
この一連の実験について、神経細胞は非常に柔らかいフィブリン及びコラーゲンマトリックス中で最もよく増殖することが知られているため、本願発明者らは、ゲル化直後に７０Ｐａの貯蔵弾性率を有する、１．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧの濃度を選択した。彼らはまた、パイロット試験で切断可能でない架橋試薬を使用した場合、生存率が著しく低下したことから架橋についてはＭＭＰ切断可能なペプチドを使用した（図１３）。これを説明する試みにおいて、本願発明者らはＴＭＲ標識４アームＰＥＧ−ＶＳはゲル形成にわたって神経細胞に取り込まれてもよいことを見出し（図１２）、神経細胞は毒性を防ぐためにゲル断片を代謝することができるはずであると仮定した。クラスターとして増殖する神経細胞は、外層の神経細胞はＰＥＧの暴露から遮蔽し、クラスターは非分解性多孔質ＰＥＧゲル中で直接増殖することができるため、この制約は適用されない（例えば図３）。封入２日後（Ｄ２）の定量は多孔質ゲル中において非常に高生存率（９０％以上）で神経細胞が維持されていることが示され、これは、現在最も成功した神経細胞を支持する合成ゲル、プラマトリックス（Ｐｕｒａｍａｔｒｉｘ）の到達から離れた、有力なスタート地点である。Ｑ−ゲル対照中の生存率は、７０％に減少し、これはおそらく古典的アプローチで使用されるより高いｐＨのへの短時間の暴露だけでなく濃いＰＥＧ成分への短時間の暴露に起因するものである。神経突起の伸長は、ＨＡの割合とは独立してＤ２において平均〜１００  μｍ／神経細胞であり（図４ｃ）、これは選択された低い剛性が速い神経突起の伸長を支持するのに適切であることを示している。微細構造はゲルの安定性に大きな影響を与えた：ＨＡの量の増加は巨視的分解の低減をもたらした（図４ｂ）。ＨＡを含まずに形成されたゲルは、２日以内に完全に分解され（その条件は図４には記載されていない）、一方、０．５２５％（ｗ／ｖ）のＨＡを含んで形成したゲルは１ヶ月後以上でも完全に安定していた。これは、架橋していないＨＡにより残された弱い流路によって分離された、濃縮されたＰＥＧゲルのより高密度で強固な柱を有する微細構造化ゲルであると期待される。これは、微細構造化ゲルを、より速い神経突起伸長を支持する可能性を維持しながら、分解に対して抵抗性する。
【００７４】
ＭＡで微細構造化されたハイドロゲルは、細胞体が数ミクロンサイズの細孔に形状を適合させ、細胞が横たわり、神経突起がそれに続いて鋭いターンを形成するため、奇形細胞形態論をもたらす大きな開口の細孔構造を有していた（図１１、１３）。したがって、この用途についてはさらに研究はされていない。かわりに、ＨＡによって形成されたサブミクロンサイズの細孔は、細胞体及び細胞突起がインビボで行われるように滑らかに薄く、密集したネットワークを形成させる。３Ｄハイドロゲルにおける神経突起伸長についてラミニン又はラミニンペプチドが必要であると長い間考えられてきたが、ここで本発明者らは、いずれの接着の手掛かりのない微細構造化ＰＥＧ＋ＨＡにおいて優れた神経突起伸長を示している。これはＰＥＧのステルス性、抗接着性及び非相互作用特性を考慮すると特に注目に値する。いくつかの一連のデータは、神経突起伸長は主として物理的特性に依存していることを示唆している。
【００７５】
ＨＡの存在を通してゲルが固有の接着の手掛かりを有するかどうか試験するために、ゲル形成後直ちに１  ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（ＨＡｓｅ）で分解した。レオメトリーによって観測されるようにＨＡはこれらの状態で数秒以内に分解され（図１０）、そしてゲルを通したタンパク質の分散は懸念されない（例えば、完全ゲル免疫染色が容易に行われる）。さらに、ＭＡを相排他微細構造化のために選択した場合、この海洋／バクテリア  ポリマーに対する受容体を欠損しているにもかかわらず神経細胞は依然として増殖した。さらに、ＰＥＧ＋ＨＡ及びＰＥＧ＋ＭＡゲルが共有結合的にＩＫＶＡＶで機能化された場合、高濃度でさえ、神経突起伸長は定性的にＩＫＶＡＶがない対照と類似していたが、一方、２Ｄ組織培養プラスチック対照では、ペプチドは濃度依存的に神経突起伸長を強力に誘導した（図１１）。これは特定の手掛かりがすでに最適な物理的背景において不可欠ではないことを示している。本願発明者らは無血清状態及び成長因子無しで行っているため、神経細胞がゲル中に封入されたタンパク質に非特異的に接着することも考えられない。最初の神経突起伸長もまた、細胞によるマトリックス沈着について非常に速く起こり、大きな役割を果たす（典型的には封入化後１時間で多くの〜１０  μｍの神経突起が観測される）。最後に、本願発明者らはＭＭＰ切断可能ペプチドへの非選択的な接着を排除した：ＰＥＧ−ジチオールで架橋した微細構造化非分解性ＰＥＧゲルは、生存率が低下するにもかかわらず、アミノ酸又は電荷を完全に含まず、及び神経突起伸長を許容する（図１３）。それゆえに、全体的に本願発明者らのデータは接着の手掛かりよりむしろ物理的特性のほうが、３Ｄにおける速い神経突起伸長を可能にするのに圧倒的に重要であることを示している。マクロマー含有量において１．２〜１．９％（ｗ／ｖ）（１８〜２５０  Ｐａ）までの変動は２日又は５日にわたって神経突起伸長に有意に影響しなかった（図１４）。最も柔らかいゲルはより不安定であり、より多くの損傷及び神経突起の損失をもたらし得る。ＨＡを含まず、ｐＨ８．０でゲル化した１．５％及び１．９％（ｗ／ｖ）の非多孔性の対照は、数日後に分解した。Ｑ−ゲルは完全に安定であったが、多孔質ＰＥＧほどの神経突起伸長はほとんど可能ではなかった。最適化された条件下では、封入した初代神経細胞は数日以内に広範囲のネットワークを形成し、密度が増加し、少なくとも１ヶ月間安定していた（図５ａ）。主要な分化した神経細胞のマーカーは、２Ｄ培養で知られているものと類似のものが発現しており（図５ｂ）、多数の前駆シナプス集合が存在した。細胞内カルシウムの蛍光レポーターを使用して１６日間培養後に固体スパイク活性が観測された。調整された活性であることは明らかであり（図５ｃ）、これは合成ＥＣＭにおいて機能的シナプス接合性を有する３Ｄネットワークが形成されていることを証明するものである。
【００７６】
ｈｉＰＳＣ由来神経細胞への転換
初代ラット神経細胞の培養は、長年、細胞生物学研究のための対照モデルとされてきたが、ヒトの神経学的条件のより関連性の高いモデルとしてｈｉＰＳＣ由来神経細胞が出現してきている。それらは、特定の突然変異又は薬剤の効果を研究することができる、規定された細胞の再現性ある供給を提供し、そしてそれらは治療可能性を有すると考えられている。それらは、典型的には２Ｄで、規定された無血清培地中で増殖するが、しかし３Ｄ培養には一般的にマトリゲルが使用される。ここで、本願発明者らは、臨床応用への転換を妨げる免疫原性材料に依存しないｈｉＰＳＣ由来神経細胞について効果的に規定された３Ｄ培養系を確立する。ｈｉＰＳＣ由来神経細胞を高い生存率（最大８５％）を有する０．５２５％（ｗ／ｖ）ＨＡで微細構造化されたＰＥＧゲル中に封入し、そして初代神経細胞と同じ高速度で神経突起を伸長した（図６）。それらは剛性及び細胞密度に非常に敏感であり、ゲルを著しく速く分解した。結果として、ゲルは接続したネットワークを形成するために必要な５日間は安定であったが、残念ながらスパイク活性を得るために必要な２〜３週間は安定ではなかった。速い神経突起伸長及び高い生存率を有して１週間以上ゲルを安定させる最良の妥協点は、これらの微細構造化条件において２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ及び５Ｍ  ｃｅｌｌ／ｍｌであった。細胞は、神経細胞マーカーであるニューロフィラメント、βＩＩＩ−チューブリン及びＭＡＰ２に対して陽性であり、星状細胞マーカーＧＦＡＰに対して陰性であり、完全に分化していた。
【００７７】
結論
典型的には塩析出、凍結乾燥又はエレクトロスピニングによって巨視的又は階層的な多孔性を有する足場を製造するための多くの方法が開発されてきた。しかしながら、それらの方法は、細胞を封入又はインサイチュ形成が可能ではない。ここで本願発明者らは、ＰＥＧが段階的な成長重合を起こす際に、ＰＥＧと高粘度の多糖類との間の相分離により形成される多孔質構造に細胞を直接封入することが可能な独創的な方法を提示する。速い神経突起伸長及びシナプス形成を可能にする規定された３Ｄ培養は、軸索誘導、成長円錐機構、シナプス会合及び再生のような神経細胞−マトリックス相互作用に依存する研究について主要な関心事である。空白のバックグランドにおいて細胞外合図の生物学的活性を研究するための可能性は重要なツールであり、特に神経系疾患の再現性ある重要なモデルを提供する、様々な患者特異的及びトランスジェニック細胞系由来の市販されているｈｉＰＳＣ由来神経細胞と組み合わせた重要なツールである。それらの完全な透明性により記載した微細構造化ゲルは特に画像化研究に適している。
【００７８】
電気的に活性な３Ｄモデルも、２Ｄモデルよりも大幅に改善されている。インビトロ神経ネットワークは、電気生理学、神経調節、神経毒性学の研究のため又は薬物スクリーニングのために重要なツールである。それらの３Ｄ対応物は劇的に異なる接続性を有し、それはインビボ状況により関連性の高いデータが得られる。ネットワークの接続性は、最近積層した２Ｄ表面において研究されたが、しかし本願発明者らによって記載されたシステムは、完全な３Ｄ環境に神経細胞を置くことによって、さらに一歩進んでいる。
【００７９】
この研究において記載されたマクロ多孔質ハイドロゲルは、神経細胞外マトリックスの生物物理学的特性に優れた模倣物を提供し、合成ＰＥＧゲル中で安定した及び機能的なネットワークを初めて形成することを可能にする。インビボ応用について、ここで使用される成分及び架橋化学物質は全て生体適合性であることは興味深い。特に、ＰＥＧ、ＨＡ及びアルギン酸塩は既に臨床で使用されている。本システムはミクロン範囲に容易な調整できるため、それはまた他の細胞型の封入を想定して、３Ｄ空間におけるそれらの移動、会合及び相互作用を制御することができる。これらのハイドロゲルのメソ−／マクロ多孔質性は非常に高い表面積をもたらし、物質輸送を改善し、及び均質系と比較してより組織化された組織類似体の開発を可能にするであろう。
【００８０】
方法
特に明記しないかぎり、全ての化学物質はシグマ−アルドリッチ製であり、細胞培養試薬はインビトロジェン製であり、実験は３回行っており、画像は最小限に改変している（神経突起と細胞本体の両方が鮮明に区別できるように、全ての図において輝度／コントラスト及び神経細胞の図のみガンマを調節した）。
【００８１】
４アーム−ＰＥＧ−ビニルスルホン（４アーム−ＰＥＧ−ＶＳ）
２０  ｋＤａの４アーム−ＰＥＧ−チオール（Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ）１  ｇ（５０  μｍｏｌ）を３００ｍＭ、ｐＨ８．０のトリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）緩衝液４ｍｌに溶解し、そしてこれを直ちに、１００４  μｌ（１０  ｍｍｏｌ）のビニルスルホンを溶解した同緩衝液４ｍｌへ激しく撹拌しながら滴下して添加した。該反応は数分以内に実質的に完了し、そして２ｈ進行させた。生成物をｍＱ−水に対して透析し（各少なくとも６時間に対して少なくとも６回水の交換）、凍結乾燥した。チオールはプロトン−ＮＭＲ（４００  Ｍｈｚ装置で重クロロホルム中）の検出限界内において完全に置換されていることが確認された。生成物をｍＱ−水中に４％（ｗ／ｖ）で再懸濁し、ろ過滅菌し、２００  μｌ（８  ｍｇ）に等分し、凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００８２】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断可能なペプチド操作
Ａｃ−ＧＣＲＤ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＤＲＣＧ−ＮＨ２（１７４６  Ｄａ）配列を有するＭＭＰ切断可能なペプチド（ナガセ  Ｈ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４０，  ３３９−４１６，  １９９６；  ルトルフ，  Ｂ．  Ｍ．  Ｐ．，  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １５，  ８８８−８９２，  ２００３）はＡｎａｗａ（スイス）製で、純度９５％以上であった。ＨＰＬＣ精製されたペプチドは、酸性ＴＦＡ塩として生じ、それは中和する必要がある。この目的のため、〜１００  ｍｇのペプチド粉末を最小量の水（〜１  ｍｌ）に分散させ、ｐＨ指示薬として最小量のフェノールレッドを補充し、そして３００  ｍＭのＮａＯＨ水溶液で中和した（黄色の溶液をオレンジに変化させた）。プロトン化された形態のペプチドは難溶性であるが、最初のスラリーは工程中に透明になる。チオールがｐＨ７．０より大きい（指示薬は赤みがかった橙色に変わる）と速やかに酸化するので過剰のＮａＯＨを添加することは避けることが重要である。次いで、中和したペプチドをｍＱ−水で１％（ｗ／ｖ）に希釈し、ろ過滅菌し、４００  μｌ（４  ｍｇ）に等分し、凍結乾燥し、密封して使用するまで−２０℃で保存した。この形態で少なくとも６ヶ月は安定であることがわかった。ペプチド粉末は典型的には有意な量の対イオン及び少量の酸化ペプチドを含むため、各バッチについて、再懸濁した分割量中の遊離チオールの正確な濃度をβ−メルカプトエタノール較正曲線を用いたエルマンアッセイ（エルマン，  Ｇ．  Ｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ７０−７７，  １９５９）で決定した。ｐＨバランスのために使用する少量のフェノールレッドは、このアッセイの文脈においては無視できるほどの吸光度を有するように制御した。
【００８３】
緩衝液
非常にｐＨ感受性であるマイケル付加（ルトルフ，  Ｍ．Ｐ．，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ４，  ７１３−７２２，  ２００３）によるゲル形成で使用するために、特別に注意を払ってＨＥＰＥＳ緩衝液（２００  ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１００  ｍＭのＮａＯＨ  ｍＱ−水の水溶液、ｐＨ７．４に調整）を調製した。５５８／４３３  ｎｍでのｐＨ指示薬フェノールレッドの吸光度測定は、より漂う傾向にある較正溶液及び電極に頼らず再現性のある実験を保証するために、最も信頼できるｐＨ値を提供すると判明した。５５８／４３３  ｎｍでの吸光度の比は２に調整し、これは２４℃、ｐＨ７．４０及び３００  ｍＭイオン強度に相当する（ヤオ，  Ｗ．，  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３５，  １１９７−２０１，  ２００１）（両性イオンが２つの電荷を有していると仮定している。代わりにそれらが電荷を持たない分子のように扱われる場合は、これは１００  ｍＭイオン強度及びｐＨ７．５に相当する）。
【００８４】
ｐＨ８．０のＴＥＯＡも同様に調製したが、ｐＨ６．０のＰＢＳは、ｐＨ７．４のＰＢＳ（ギブコ）のｐＨを３００  ｍＭのＨＣｌで低下させて調製した。
【００８５】
マンヌロナン（ＭＡ）
高粘度（図Ｓ１参照）バクテリアＭＡ（エルテバーグ，  Ｈ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０，  ７１−７８，  １９９９）は、スクジャック−ブラエク教授（ノルウェー科学技術大学バイオポリマー研究所）から寄贈されたものである。ＨＡとは異なり、アルギン酸塩は哺乳動物には存在しないため、それ故にいずれの神経細胞受容体によっても特異的に認識されないと予想される。さらに、アルギン酸塩のこの形態は純粋な粘性があり、グルロン酸塩（野生型アルギン酸塩のカルシウム架橋を可能にする）が欠損しているためである。
【００８６】
ゲル形成
支持体は事前に準備した。１  ｍｍの層のＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４  １０％（ｗ／ｖ）架橋剤）を５０℃で２時間、ペトリ皿上で加熱した。４及び６  ｍｍの連続的な同心の打ち抜き（カイメディカル製真皮パンチ）でリング状の型を得た。ウェル当たり１つの滅菌カバースリップを用い、その上に１つのＰＤＭＳモールドを置いた２４ウェルプレートを準備した。ＰＤＭＳはガラスに貼り付いており、そしてゲルはこの支持体中に直接作製することができ、これにより、神経細胞を機械的に妨害することなく全て容易な移動、画像化又は免疫染色が可能となる。他の細胞型において通例であるゲルを自由に浮遊させるという試みは、はるかに悪い結果であった：神経細胞は典型的には、培地交換中又はゲル移動中に機械的に破損を被る。ＰＤＭＳモールドは、洗浄剤及びＵＶ滅菌で洗浄した後、再利用することができる。エタノールはＰＤＭＳ中に内包され、培地中に溶出するため避けるべきである。ゲル作製の直前に、４アーム−ＰＥＧ−ＶＳの分割量をｐＨ７．４のＨＥＰＥＳへ２０％（ｗ／ｖ）となるように再懸濁した（ビニルスルホン４０  ｍＭとなる）。ＭＭＰ切断可能ペプチドはｐＨ６．０のＰＢＳ中に８％（ｗ／ｖ）となるように再懸濁した（エルマンテストで一般的にチオールが５０  ｍＭとなる）。ペプチド溶液のｐＨがわずかに酸性であるのは、チオールの酸化を避けるのに重要であり、これはｐＨ７．４で数時間で顕著になる。ヒアルロナン（ＨＡ、シグマ５３７４７）を０．７５％（ｗ／ｖ）添加したろ過滅菌済みの完全培地の分割量を４℃で保存した。ＨＡを０．５％（ｗ／ｖ）より多く含む溶液は粘度が高いため、正確に溶液をピペットするために、Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｍａｎ  Ｍ５０Ｅのようなポジティブディスプレイスメントピペットが必要である。ＰＥＧ  ２％（ｗ／ｖ）、ＨＡ  ０．５２５％（ｗ／ｖ）及び１ｅ７  ｃｅｌｌｓ／ｍｌを含む典型的なゲル１００  μｌを調製するために、ストック溶液を以下の様に組み合わせた：４アーム−ＰＥＧ−ＶＳのストック溶液  １０  μｌ、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液  １２  μｌ、ＨＡを添加した培地中に細胞が１．４３ｅ７  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液  ７０  μｌ、及び最後にＭＭＰ切断可能ペプチドのストック  ８μｌをチューブの側面に水滴として置いた。素早くボルテックス後、ポジティブディスプレイメントピペットで〜１０秒激しく混合し、液体前駆体をＰＤＭＳモールド当たり１５μｌ分注した。ゲル化はこの濃度で３〜４分以内で起こるが、柔らかいゲルについては１５分までかかるので全てのゲルを細胞培養インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２）で１時間進行させてから１ｍｌの増殖培地を添加した。ゲル化混合物は、生理学的なｐＨ及び浸透圧だけでなく、完全培地が大半である：結果として、細胞が受けるストレスは最小限であり、１時間でゲル化を停止した時には、神経突起伸長が既に位相差で観察される。強く緩衝されたｐＨ７．４のＨＥＰＥＳの〜２０％の溶液によってｐＨを安定に保つ。各実験において示されているように、４アーム−ＰＥＧ−ＶＳ及びＭＭＰペプチドストックを対応する混合物へ添加する量を変更し、緩衝液をｐＨ８．０のＴＥＯＡに置換え、ＨＡ及びストック内���細胞濃度を変更し、培地を各細胞型に合わせたものに変更し、又はＨＡを別の高粘度の添加物で置換えることによって、他の条件は得られる。同一の緩衝液及びチオール濃度において、ＭＭＰ切断可能ペプチドをＰＥＧ−ジチオール（Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ，  ３．４  ｋＤａ）によって置換することによって、非分解性ゲルが形成された。例示した場合では、ＣＳＲＡＲＫＱＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ−ＮＨ２の配列を有するラミニンα１（２１１０−２１２７）ペプチド（単にＩＫＶＡＶと示す、ＡＮＡＷＡ）を添加した。それを実施するために、ＩＫＶＡＶペプチドは、最初に４  ｍｇ／ｍｌストックから４アーム−ＰＥＧ−ＶＳ溶液に添加し、結合するために３０分維持し、残りのプロトコルを実施した（この場合、終容量が同じとなるように、添加するＨＥＰＥＳ緩衝液の量を減少させた）。クマリン標識ＩＫＶＡＶペプチドを用いてＦＲＡＰ試験を用いて、ゲル中へのペプチドの固定が成功していることを確認した。ＩＫＶＡＶ生物活性は、公表されたプロトコル（タシロ，Ｋ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、１６１７４−８２，１９８９）に従って２Ｄでアッセイした。
【００８７】
レオメトリー
動的せん断測定は、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＭＣＲ  ３０１レオメータで行った。ゲルの液体前駆体は前述のように調製し、完全増殖培地は有しているが細胞は有しておらず、それを金属床プレートと直径２０  ｍｍの平行なプレートからなる形状に挿入した。貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’の増加を水飽和雰囲気下、ペルチェ制御により３７℃の温度、０．２５  ｍｍギャップ及び５％ひずみで、１Ｈｚ振動で観測した。このひずみは、ゲルの線形粘弾性領域内に良好に入るように選択された（１Ｈｚで少なくとも１〜４００％ひずみが及ぶ）。剛性は、６０分での貯蔵弾性率（全てのサンプルがプラトーに達し、細胞培養培地の添加によりゲル化が停止したポイント）として定義され、及びゲル化時間は、補足図１において典型的な実験曲線で示すように、Ｌｏｇスケールでプラトーな剛性の半分に達する時間として定義した。増殖培地中の０．５％（ｗ／ｖ）ＨＡ及び２％（ｗ／ｖ）ＭＡの複合粘度は、水飽和雰囲気下、３７℃、０．２  ｍｍギャップ及び２％ひずみ、及び０．０１〜１０  Ｈｚの間で測定した。
【００８８】
テトラメチルローダミン標識４アーム−ＰＥＧ−ビニルスルホン（ＴＭＲ標識４アーム−ＰＥＧ−ＶＳ）
２０  ｋＤａの４アームＰＥＧ−チオール  １００  ｍｇ（５  μｍｏｌ）を２  ｍｌのｍＱ−水に溶解した。次いでテトラメチルローダミン−５−マレイミド（シグマ  ９４５０６）  ０．１２  ｍｇ（０．２５  μｍｏｌ）のｐＨ７．４ＰＢＳ溶液  ２  ｍＬを撹拌しながら滴下した。結合は数秒内に起こるが、さらに１０分間進行させた。得られた混合物を、３００  ｍＭ、ｐＨ８．０のＴＥＯＡ緩衝液４  ｍｌ中に２２０  μｌ（２．２  ｍｍｏｌ）のジビニルスルホンを溶解させた溶液に滴下し、３０分間反応させ、透析し、凍結乾燥した。全ての操作は暗闇中で行われた。
【００８９】
このプロトコルは、結合効率１００％を上限とした場合において、４アーム−ＰＥＧの末端の１／８０を置換し、これはゲル形成においての影響を無視できる。
【００９０】
空隙率画像化及び定量
ゲルはＰＥＧ  １．９％（ｗ／ｖ）、細胞なし、及びＴＭＲ標識４アーム−ＰＥＧ−ＶＳを用いて上記のとおり作製した。異なる細孔サイズを作製するために、培地（混合物が７０％）にＨＡを０又は０．５％又は２％添加した。各ゲルの微細構造は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で３日間培養後、６３×／１．４油浸対物レンズを有するライカＳＰ８共焦点顕微鏡上で及び５２０  ｎｍ励起で、５０×５０×２００  ｎｍ３ピクセルサイズの２５  μｍの積層立方体として画像化された。検出のために、非常に低ノイズで光子計測を行い、そしてそれゆえに「純粋」な黒レベルを提供する利点があるライカＨｙＤｓを使用した。漂白補正、２ｐｘガウス平滑化、閾値処理、Ｍａｔｌａｂ等値面による表面三角測量、及びパッチ機能削減及びブレンダーレンダリングをした細孔の結合性の３Ｄビューが得られた。細孔サイズの定量化について、条件あたりの３つの積層それぞれを、漂白補正（フィジー、単純比、バックグラウンドレベル０）及び１ｐｘガウス平滑化でフィルタリングした。次いで積層は、閾値処理し、反転処理して、１の値をつけた細孔と０とした蛍光ＰＥＧとの２進画像を得、そして２次相関関数Ｓ２（ｘ，ｙ）をカスタムＭａｔｌａｂスクリプトで計算した。等方性が確認されたので、ｒについて５０  ｎｍ  ｂｉｎを使用してデータを
【数１】
2018535704.tif 000003
に単純化させた。最後に、得られた結果を貫通可能球モデル（ベリーマン，Ｊ．Ｇ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  ５７，  ２３７４−２３８４，１９８５）を用いて適合させた。
【００９１】
ラットＥ１７解離皮質神経細胞
Ｅ１７ウィスターラットの胚由来の皮質を以前の記述のとおり解剖し、及び解離した（ブリュリ，  Ｔ．，  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２，  ３０９０−１０１，  ２００７）。簡単に述べると、細かく刻んだ皮質を、１  ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、１０  ｍＭグルコース、０．５  μｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ（シグマ  Ｄ−５０２０）及び０．５  ｍｇ／ｍｌパパイン（シグマ  Ｐ−４７６２）を添加したＰＢＳ中で、３７℃で１５分間インキュベートし、ＤＭＥＭと１０％ＦＢＳからなるブロッキング培地で洗浄した。次いで、それらを２  ｍｌのブロッキング培地に再懸濁し、火仕上げしたパスツールピペットを用いた倍散によって解離させた。解離した細胞を、１×グルタマックス及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｂ２７（ギブコ２１１０３−０４９及び１７５０４−０４４）からなる無血清増殖培地に再懸濁し、そしてＰＬＬで被覆したフラスコ（５０  μｇ／ｍｌ  ＰＬＬホウ酸溶液ｐＨ８．４を３７℃で１時間インキュベートしたもの）上で一晩平面培養した。翌日、まず平面培養した神経細胞をＴｒｙｐＬＥ  ｅｘｐｒｅｓｓで５分間洗浄し、弱く接着している非生存細胞及び細胞の残骸を剥離した。その後、残りの健常細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ１２６０５−０１０及び２５２００−０７２）で剥離させた。２倍容量のブロッキング培地を添加後、細胞を遠心分離し、無血清増殖培地へ再懸濁した。この後の２Ｄ又は３Ｄにおける細胞培養は全て、無血清増殖培地で行い、週に１回その半分を交換した。
【００９２】
後根神経節（ＤＲＧ）の単離及び培養
ＤＲＧは封入直前に、Ｅ１０ニワトリ胚から単離した。それらを、１  ｍｇ／ｍｌアルブミン及び５０  ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦを添加した無血清増殖培地で培養した。封入は、ゲル形成セクションに記載されているとおり、４アーム−ＰＥＧ−ＶＳ  ０．８％（ｗ／ｖ）を、ＨＡ  ０．５２５％（ｗ／ｖ）及びデキストラン１．４％（ｗ／ｖ）存在下で、化学量論量のＰＥＧチオールで架橋した。
【００９３】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来神経細胞
ｈｉＰＳＣ由来神経細胞前駆細胞（Ａｘｏｌ  ａｘ００１６）を増殖させ、オンライン供給者プロトコルに従って分化させた。次いで、得られた大脳皮質神経細胞を、初代神経細胞と同様のプロトコルで、微細構造化のためのＨＡ０．５２５％（ｗ／ｖ）存在下で、増殖培地をＡｘｏｌ維持培地（また無血清）と置換えて、ゲル内へ封入した。
【００９４】
カルシウムセンサーによるスパイキング画像化
カルシウム画像化のためにゲルの培地を除去し、１  ｍＭのオレゴングリーンＢＡＰＴＡ−１（ライフテクノロジーズ）乾燥ＤＭＳＯ溶液を６  μＭとなるように添加した新鮮な完全培地と交換した。１時間インキュベーション後、ゲルを元の培地で１時間洗浄し、８ｋＨｚの共鳴スキャナー及び４８８  ｎｍの照射を伴い、２０×／０．９５水浸対物レンズを用いてライカＳＰ８共焦点顕微鏡で画像化した。得られた画像率は７．４４Ｈｚであった。
【００９５】
生存率アッセイ
生存率アッセイは、ゲルの培地に、カルセインＡＭ（緑色の細胞質、生細胞、４  ｍＭのストックＤＭＳＯ溶液から２μＭ）、ヘキストの核染色（青色の核、全ての細胞、１０  ｍｇ／ｍｌのストックｍＱ−水溶液から１０  μｇ／ｍｌ）、エチジウムホモダイマー−１（赤色の核、死細胞、２ｍＭストックＤＭＳＯ／水１：４溶液から２  μＭ）、及びヨウ化プロピジウム（赤色の核、死細胞、０．３３ｍｇ／ｍｌのｍＱ−水溶液から６．６  μｇ／ｍｌ）を添加することにより行った。ゲルを、添加した培地で１時間インキュベートし、次いで、１時間新鮮な培地で洗浄し、そしてライカＳＰ８多光子顕微鏡で、解離した細胞については２００  μＭ深さに対する２０×／０．９５水浸対物レンズで、又はＤＲＧ外植片については、単一スライスとして１０×／０．３空気対物レンズで、画像化した。生細胞及び死細胞を手動で数えた。
【００９６】
ゲルの分解
Ｚｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  ２顕微鏡上で５×空気対物レンズで明視野において、全ゲルをカバーするタイルスキャンを行うことにより、直径４  ｍｍのゲル層上において２日後に（培養１ヶ月以内に溶解する条件では、既にこの時点で可視的に分解された）ゲル安定性を定量した。タイルはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｅｄｉｔｏｒで組み立てた。分解した領域は、それらは懸濁した細胞体がなく、分解した部分の側面や底に凝集した暗い細胞凝集体で輪郭が縁取られているため、分解した領域ははっきりと目に見える。それらは、Ｆｉｊｉを用いて手動でセグメント化し、及び分解のパーセンテージを、ゲル全体に対する分解領域として報告した（６サンプルからの平均及び標準偏差）。
【００９７】
ＰＥＧ誘導クラスター化及びＰＥＧ取り込み
粘性成分として、１０％（ｗ／ｖ）の高分子量ＰＥＧ（シグマ  ２００  ｋＰａ）を用いて、神経細胞を封入する際に、混合直後に細胞クラスター化が観測された。画像化は２０倍空気対物レンズでＰｌａｓＤＩＣを用いて画像化を行った。最良の可視条件においてＰＥＧの取り込みを研究するために、神経細胞はＰＬＬを被覆した組織培養プラスチック上で６日間、２Ｄで培養し、組織剥離から完全に回復させた。次いでそれらの培地に１％（ｗ／ｖ）ＴＭＲ標識４アーム−ＰＥＧ−ＶＳを添加し、封入中のＰＥＧへの暴露を模倣した。培養物を新しい増殖培地で１０分間５回注意深く洗浄し、そして直ちにｉｎ  ＰｌａｓＤＩＣにおいて、及び２０×空気対物レンズにおける蛍光を画像化した。さらに培養１２日後に同一の観測を行いＰＥＧの保持を観測した。蛍光チャネルは、バックグランドの差分及び３ｐｘ中央値フィルタリングで光の不均一性及びノイズについて補正した。
【００９８】
神経突起伸長の定量
神経突起の長さを、Ｄ２では、最大の正確性と信頼性をあたえることから手動追跡で定量化したが、Ｄ５では、この時点での長さが手動追跡では困難になるため、自動追跡で定量した。自動追跡から得られる全てのイメージは、適切な追跡について視覚的にチェックした。手動追跡は単純な神経突起トレーサー（ロンゲア，  Ｍ．  Ｈ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，  ２４５３−２４５４，  ２０１１）を用いて行い、及びＮｅｕｒｉｔｅＱｕａｎｔを用いた自動追跡（ディーメルト，  Ｌ．，  ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １２，  １００，  ２０１１）を行った。追跡は２００  μｍの深さ及び６２０  μｍの幅の２光子画像化３Ｄ積層で行った。蛍光染色はデフォルトでβＩＩＩ−チューブリン（固定した試料の全ての神経突起を染色）であり、及び、免疫染色に耐えるには弱すぎるものである部分的に分解したゲルを含む一連についてはカルセインＡＭを用いた（図４及び６に記載のＨＡ応答曲線）。ＤＡＰＩで染色された核の数を計測し、細胞数の標準化に用いた。
【００９９】
免疫細胞化学及び画像化
１次抗体は、βＩＩＩ−チューブリン（シグマ  Ｔ５０７６、１：５００）、ニューロフィラメント（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ）（シグマ  Ｎ４１４２、１：１５０）、シナプトタグミン（ＵＣＳＦ  からライハルト教授によって開発されたＤＳＨＢ  ｍＡＢ  ３０、８  μｇ／ｍｌ）、ＭＡＰ−２（シグマ  Ｍ３６９６、１：２００）、ＧＦＡＰ（Ｒ＆Ｄ  システムズ  ＡＦ２５９４、１０  μｇ／ｍｌ）に対する抗体を用いた。Ａｌｅｘａ４８８及び５９４を結合した２次抗体（インビトロジェン  Ａ１１００５、Ａ１１００８、Ａ１０６８０、Ａ１１０１５）を１：２００で使用した。本願発明者らは標準的な免疫細胞化学のプロトコルを適用して、ゲル全体を直接染色し、画像化した。試料を、０．１％トリトンＸ−１００を含む１０％ホルマリン中、４℃で１時間、固定及び浸透処理し、５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で一晩ブロッキングし、ＰＢＳで洗浄した（１時間を２回、一晩を１回）。次いで、それらを１次抗体でインキュベートし（３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で希釈し、室温で一晩穏やかに振盪）、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体中で一晩インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、０．３  μＭ  ＤＡＰＩのＰＢＳ溶液で１時間染色し、最後にＰＢＳで洗浄した。免疫染色した試料の画像化は、６２０μｍ幅及び２００μｍ深さにわたり２０×／０．９５水浸対物レンズを備えたＬｅｉｃａ  ＳＰ８多光子顕微鏡上で、１  μｍステップ、６００Ｈｚ走査速度、１０２４×１０２４ｐｘ、及びＭａｉＴａｉ  Ｄｅｅｐｓｅｅ及びＩｎｓｉｇｈｔ  Ｄｅｅｐｓｅｅレーザーをそれぞれ使用した７１０  ｎｍ及び１１００  ｎｍの同時励起（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）で行った。２〜３色を同時に収集した。結果として得られた積層に最大強度投影（ＭＩＰ）を適用し、フルオレセイン参照画像によって割ることにより光の不均一性を補正し、それらの色の表示を調整した（輝度／コントラスト／ガンマ）。
【０１００】
統計分析
一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びテューキーポストホックテスト（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を用いて系列内の差異を定量化し、ｐ＜０．０１を有意であるとみなした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ−ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ−ｄ】
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【図６ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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