(57)【要約】  本発明は、新規の抗ＰＤ−Ｌ１抗体製剤に関する。特に、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体アベルマブの水性医薬製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）緩衝剤として５ｍＭから１５ｍＭの濃度の酢酸塩またはヒスチジン；
（ｉｉｉ）安定剤として２４０ｍＭから３２０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールもしくはトレハロース、または５０から１５０ｍＭの濃度のアルギニンＨＣｌと２５ｍＭから７５ｍＭの濃度のグルタミン酸の組合せ；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のポロキサマー１８８もしくはポリソルベート２０、または界面活性剤なし；
を含み、メチオニンを含まず、さらにｐＨが５．０から６．０である、水性医薬抗体製剤。
【請求項２】
前記ｐＨが５．０から５．６である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
アベルマブの濃度が約１０ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
前記酢酸塩またはヒスチジンの濃度が約１０ｍＭである、請求項１〜３に記載の製剤。
【請求項５】
前記Ｄ−マンニトールもしくはトレハロースの濃度が約２８０ｍＭである、またはアルギニンＨＣｌとグルタミン酸の前記組合せの場合、アルギニンＨＣｌの濃度が約１５０ｍＭでありグルタミン酸の濃度が約５０ｍＭである、請求項１〜３に記載の製剤。
【請求項６】
前記ポロキサマー１８８またはポリソルベート２０の濃度が約０．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜３に記載の製剤。
【請求項７】
前記ｐＨが５．２（±０．１）から５．５（±０．１）である、請求項１〜３に記載の製剤。
【請求項８】
約１０ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、他の緩衝剤を含まない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
約２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロースを含み、他の安定剤を含まない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８を含み、他の界面活性剤を含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
（ｉ）抗体として約１０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度の酢酸塩；
（ｉｉｉ）安定剤として約２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
を含み、メチオニンを含まず、さらにｐＨが５．５（±０．１）である、水性医薬抗体製剤。
【請求項１２】
（ｉ）１０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸塩；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
を含み、ｐＨが５．５（±０．１）である、請求項９に記載の製剤。
【請求項１３】
（ｉ）１０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸ナトリウム三水和物；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌ；
（ｖｉ）溶媒としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．５（±０．１）である、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１４】
（ｉ）１０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸ナトリウム三水和物；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のトレハロース二水和物；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌ；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．５（±０．１）である、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】
（ｉ）１０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸ナトリウム三水和物；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌ；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．５（±０．１）である、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１６】
（ｉ）抗体として約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度の酢酸塩；
（ｉｉｉ）安定剤として約２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
を含み、ｐＨが５．２（±０．１）である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１７】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸塩；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
を含み、ｐＨが５．５（±０．１）である、請求項１６に記載の製剤。
【請求項１８】
抗酸化剤を含まない、請求項１〜１２、１６、または１７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１９】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース二水和物；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
（ｖ）ｐＨを調整するための酢酸ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．２（±０．１）である、請求項１６に記載の製剤。
【請求項２０】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）ｐＨを調整するための酢酸ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．２（±０．１）である、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のトレハロース二水和物；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）ｐＨを調整するための酢酸ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．２（±０．１）である、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２２】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポロキサマー１８８；
（ｖ）ｐＨを調整するための酢酸ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．２（±０．１）である、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２３】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のトレハロース二水和物；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポロキサマー１８８；
（ｖ）ｐＨを調整するための酢酸ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．２（±０．１）である、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２４】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）７．５ｍＭの濃度の水酸化ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．２（±０．１）である、請求項１６に記載の製剤。
【請求項２５】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬのアベルマブ；
（ｉｉ）０．６ｍｇ／ｍＬの氷酢酸；
（ｉｉｉ）５１ｍｇ／ｍＬのＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０；
（ｖ）０．３ｍｇ／ｍＬの水酸化ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
を組み合わせることによって作製される、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）０．６ｍｇ／ｍＬの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）５１ｍｇ／ｍＬの濃度のＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）０．３ｍｇ／ｍＬの濃度の水酸化ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．０から５．６である、請求項２に記載の製剤。
【請求項２７】
有効成分として２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；ならびに賦形剤として氷酢酸、Ｄ−マンニトール、ポリソルベート２０、水酸化ナトリウム、および注射用の水からなり、ｐＨが５．０から５．６である、水性医薬抗体製剤。
【請求項２８】
ｐＨが５．２（±０．１）である、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
前記アベルマブが、（配列番号１）または（配列番号２）のいずれかの重鎖配列、（配列番号３）の軽鎖配列を有し、Ａｓｎ３００にグリコシル化を有し、主なグリカン種としてＦＡ２およびＦＡ２Ｇ１を含み、合わせて全グリカン種の＞７０％を占める、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３０】
前記アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２が全グリカン種の４４％〜５４％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１が全グリカン種の２５％〜４１％を占める、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３１】
前記アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２が全グリカン種の４７％〜５２％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１が全グリカン種の２９％〜３７％を占める、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
前記アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２が全グリカン種の約４９％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１が全グリカン種の約３０％〜約３５％を占める、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３３】
前記アベルマブのグリコシル化が、少ないグリカン種として全グリカン種の＜５％を占めるＡ２、全グリカン種の＜５％を占めるＡ２Ｇ１、全グリカン種の＜５％を占めるＡ２Ｇ２、全グリカン種の＜７％を占めるＦＡ２Ｇ２をさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３４】
前記アベルマブのグリコシル化において、前記Ａ２が全グリカン種の３％〜５％を占め、前記Ａ２Ｇ１が全グリカン種の＜４％を占め、前記Ａ２Ｇ２が全グリカン種の＜３％を占め、前記ＦＡ２Ｇ２が全グリカン種の５％〜６％を占める、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３５】
前記アベルマブのグリコシル化において、前記Ａ２が全グリカン種の約３．５％〜約４．５％を占め、前記Ａ２Ｇ１が全グリカン種の約０．５％〜約３．５％を占め、前記Ａ２Ｇ２が全グリカン種の＜２．５％を占め、前記ＦＡ２Ｇ２が全グリカン種の約５．５％を占める、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３６】
前記アベルマブが（配列番号２）の重鎖配列を有する、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３７】
静脈内（ＩＶ）投与用である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３８】
請求項３７に記載の製剤を含有するバイアル。
【請求項３９】
２０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液１０ｍＬ中にアベルマブ２００ｍｇを含有する、請求項３８に記載のバイアル。
【請求項４０】
ガラスバイアルである、請求項３８または３９に記載のバイアル。
【請求項４１】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の製剤を患者に投与するステップを含む、がんを処置する方法。
【請求項４２】
前記がんが、非小細胞性肺がん、尿路上皮癌、膀胱がん、中皮腫、メルケル細胞癌、胃もしくは胃食道接合部がん、卵巣がん、乳がん、胸腺腫、胃腺癌、副腎皮質癌、頭頚部扁平上皮癌、腎細胞癌、メラノーマ、および／または古典的ホジキンリンパ腫から選択される、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の抗ＰＤ−Ｌ１抗体製剤に関する。特に、本発明は抗ＰＤ−Ｌ１抗体アベルマブの水性医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
プログラム死１（ＰＤ−１）受容体ならびにＰＤ−１リガンド１および２（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）は、免疫制御に重要な役割を果たす。活性化Ｔ細胞上に発現されると、ＰＤ−１は、間質細胞、腫瘍細胞、またはその両方によって発現されるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２によって活性化され、Ｔ細胞死および局所免疫抑制を開始し（Dong H, Zhu G, Tamada K, Chen L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat Med 1999;5:1365-69；Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med 2000;192:1027-34；Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med 2002; 8:793-800. [Erratum, Nat Med 2002;8:1039；Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Targeting the PD-1/B7-H1(PD-L1) pathway to activate anti-tumor immunity. Curr Opin Immunol 2012;24:207-12）、腫瘍の発生および増殖のために免疫寛容な環境を提供する可能性がある。逆に、この相互作用の阻害により、非臨床動物モデルにおいて局所的なＴ細胞応答を増強し、抗腫瘍活性を媒介することができる（Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Nat Med 2002; 8:793-800. [Erratum, Nat Med 2002;8:1039；Iwai Y, Ishida M, Tanaka Y, et al. Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1 blockade. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:12293-97）。臨床現場において、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断する抗体による処置は、進行性または転移性固形腫瘍を患う患者において客観的奏効率７％から３８％をもたらし、忍容可能な安全性プロファイルを示すことが報告されている（Hamid O, Robert C, Daud A, et al. Safety and tumor responses with lambrolizumab (Anti-PD-1) in melanoma. N Engl J Med 2013;369:134-44；Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ, et al. Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer. N Engl J Med 2012;366(26):2455-65；Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med 2012;366(26):2443-54；Herbst RS, Soria J-C, Kowanetz M, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature 2014;515:563-67）。明らかに、応答は、患者の大半において１年またはそれ以上の期間にわたり継続して現れた。
【０００３】
アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃとしても公知）は、イムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。アベルマブはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の相互作用を競合的に遮断する。
【０００４】
Ｔ細胞を標的とする抗ＰＤ−１抗体と比較して、アベルマブは腫瘍細胞を標的とするため副作用が少ないことが期待され、ＰＤ−Ｌ１の遮断はＰＤ−Ｌ２／ＰＤ−１経路はそのままであり末梢の自己寛容を促進するため、低リスクの自己免疫関連の安全性の問題を含む（Latchman Y, Wood CR, Chernova T, et al. PD-L1 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat Immunol 2001;2(3):261-68）。
【０００５】
アベルマブは現在、非小細胞性肺がん、尿路上皮癌、中皮腫、メルケル細胞癌、胃または胃食道接合部がん、卵巣がん、および乳がんを含む多くの癌種で臨床試験中である。
【０００６】
アベルマブのアミノ酸配列および配列変異体およびそれらの抗原結合断片は国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットに開示され、ここではアベルマブのアミノ酸配列を有する抗体はＡ０９−２４６−２と呼ばれる。また、製造方法および特定の医薬品用途も開示されている。
アベルマブのさらなる医薬品用途は、国際公開第２０１６１３７９８５号パンフレット、ＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５２７４８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３７４９８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５３９３９、米国特許出願公開第６２／３４１，９２１号明細書に記載される。
国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットも、２．４節にアベルマブのアミノ酸配列を有する抗体のヒト水性製剤を記載する。この製剤は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体、抗酸化剤としてのメチオニンを含み、ｐＨが５．５である。
ＩｇＧ１型のアグリコシル抗ＰＤ−Ｌ１抗体の製剤試験は、国際公開第２０１５０４８５２０号パンフレットに記載され、ここではｐＨが５．８の製剤が臨床試験のために選択された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
アベルマブは通常、静脈内注入によって患者に送達され、したがって水性剤形で提供されるため、本発明は、翻訳後修飾を伴うアベルマブの安定化に好適であり、国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットに開示されるように高濃度であるさらなる水性製剤に関する。
【０００８】
図１ａ（配列番号１）は、宿主生物として使用したＣＨＯ細胞によって発現された場合の、アベルマブの全長重鎖配列を示す。しかしながら、抗体産生過程において、重鎖のＣ末端リジン（Ｋ）の切断が頻繁に観察される。Ｆｃ部分に局在して、この修飾は抗体−抗原結合に影響を及ぼさない。したがって、いくつかの実施形態では、アベルマブの重鎖配列のＣ末端リジン（Ｋ）は存在しない。Ｃ末端リジンがないアベルマブの重鎖配列を図１ｂ（配列番号２）に示す。
図２（配列番号３）は、アベルマブの全長軽鎖配列を示す。
【０００９】
関連性の高い翻訳後修飾はグリコシル化である。
真核細胞生物の小胞体内で産生されるほとんどの可溶性タンパク質および膜結合タンパク質はグリコシル化を受け、グリコシルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素は、タンパク質の特定のグリコシル化部位に１つまたはそれ以上の糖単位を結合する。最も頻繁には、結合点はＮＨ２基またはＯＨ基であり、Ｎ−結合グリコシル化またはＯ−結合グリコシル化をもたらす。
これは、真核生物宿主細胞において組換えにより産生される抗体などのタンパク質にもあてはまる。組換えＩｇＧ抗体は、ＣＨ２ドメインにおけるＦｃ領域の特定のアスパラギン残基において保存されたＮ−結合グリコシル化部位を含有する。その可溶性および安定性、プロテアーゼ耐性、Ｆｃ受容体への結合、細胞輸送、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期に影響を及ぼすなど、抗体におけるＮ−結合グリコシル化の多くの公知の身体機能がある（Hamm M. et al., Pharmaceuticals 2013, 6, 393-406）。ＩｇＧ抗体Ｎ−グリカン構造は、ｂ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、ならびに頻繁にはガラクトース（Ｇａｌ）およびフコース（Ｆｕｃ）単位を含む、主に二分岐複合体型構造である。
【００１０】
アベルマブにおける単一のグリコシル化部位はＡｓｎ３００であり、両重鎖のＣＨ２ドメインに位置する。グリコシル化の詳細は実施例１に記載する。
【００１１】
グリコシル化が抗体の可溶性および安定性に影響を及ぼすため、抗体の、安定で薬学的に好適な製剤を開発する場合、このパラメーターを考慮に入れることは賢明である。
【００１２】
驚くべきことに、本特許出願の発明者らによって、５．２まで低いｐＨ値で、抗酸化剤を含まない多くの水性製剤において、そのアミノ酸配列およびその翻訳後修飾によって完全に特性評価されたアベルマブを安定化することが可能なことが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１ａ：アベルマブの重鎖配列（配列番号１）、図１ｂ：Ｃ末端Ｋを欠損している、アベルマブの重鎖配列（配列番号２）
【図２】アベルマブの軽鎖配列（配列番号３）
【図３】アベルマブの二次構造
【図４】アベルマブグリカンの２ＡＢ  ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣクロマトグラム
【図５】図４のピークの番号付け
【図６】ＤｏＥ２製剤のＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集（４０℃）
【図７】ＤｏＥ２製剤のＳＥ−ＨＰＬＣによる総凝集（２５℃）
【図８】ＤｏＥ２製剤のバイオアナライザーによる断片（４０℃）
【図９】ＤｏＥ２製剤のバイオアナライザーによる断片（２５℃）
【図１０】ＤｏＥ２の酸性クラスターおよび主要ピーク存在量（２５℃）
【図１１】２〜８℃での長期安定性ＬＭＷ（％）
【図１２】２〜８℃での長期安定性サブビジブル粒子≧１０μｍ
【図１３】２〜８℃での長期安定性サブビジブル粒子≧２５μｍ
【図１４】２〜８℃での長期安定性酸性クラスター（％）
【図１５】２〜８℃での長期安定性主要ピーク（％）
【図１６】２〜８℃での長期安定性塩基性クラスター（％）
【図１７】２５℃での長期安定性ＬＭＷ（％）
【図１８】２５℃での長期安定性サブビジブル粒子≧１０μｍ
【図１９】２５℃での長期安定性サブビジブル粒子≧２５μｍ
【図２０】２５℃での長期安定性酸性クラスター（％）
【図２１】２５℃での長期安定性主要ピーク（％）
【図２２】２５℃での長期安定性塩基性クラスター（％）
【図２３】４０℃での長期安定性ＬＭＷ（％）
【図２４】４０℃での長期安定性サブビジブル粒子≧１０μｍ
【図２５】４０℃での長期安定性サブビジブル粒子≧２５μｍ
【図２６】４０℃での長期安定性酸性クラスター（％）
【図２７】４０℃での長期安定性主要ピーク（％）
【図２８】４０℃での長期安定性塩基性クラスター（％）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用した以下の用語は下記に記載した以下の意味を有する。
【００１５】
本明細書で参照する「アベルマブ」は、国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットにそのアミノ酸配列を定義され、本特許出願にそのアミノ酸配列およびその翻訳後修飾を定義されたＩｇＧ１型の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。本明細書で参照する「アベルマブ」は、例えば国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットに開示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％、好適には少なくとも８０％、好適には少なくとも８５％、好適には少なくとも９０％、好適には少なくとも９５％、好適には少なくとも９６％、好適には少なくとも９７％、好適には少なくとも９８％、または最も好適には少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を共有するバイオシミラーを含み得る。代わりにまたはさらに、本明細書で参照する「アベルマブ」は、本明細書で開示したものと翻訳後修飾、特にグリコシル化パターンが異なるバイオシミラーを含み得る。
【００１６】
用語「バイオシミラー」（後発生物製剤としても公知）は当技術分野で周知であり、原薬がアベルマブのバイオシミラーであると考えられる場合に、当業者は容易に認識するであろう。用語「バイオシミラー」は、通常、事前に販売承認を公式に認可された「革新的バイオ医薬品」（原薬が生物によって産生される、または生物由来である、または組換えＤＮＡもしくは制御された遺伝子発現方法による「生物製剤」）の後続版（通常異なる供給源由来）を記載するために使用される。生物製剤は分子の複雑性が高く、通常製造工程の変化に感受性であるため（例えば、異なる細胞系をそれらの生産に使用した場合）、ならびに後続の後発製造が通常発案者の分子クローン、細胞バンク、発酵および精製工程に関するノウハウ、または有効な原薬自体（革新者の市販の製剤のみ）にアクセスを持たないため、いずれの「バイオシミラー」も革新的な製剤と全く同じではないようである。本明細書において、用語「緩衝液」または「緩衝溶液」は、通常、酸（通常弱酸、例えば酢酸、クエン酸、ヒスチジンのイミダゾリウム形態）およびその共役塩基（例えば、酢酸塩またはクエン酸塩、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、またはヒスチジン）の混合物、または代わりに塩基（通常弱塩基、例えばヒスチジン）およびその共役酸（例えばプロトン化ヒスチジン塩）の混合物を含む水性溶液を指す。「緩衝溶液」のｐＨは、「緩衝剤」によって付与された「緩衝効果」により少量の強酸または強塩基の添加時に非常にわずかに変化する。
【００１７】
本明細書において、「緩衝系」は１つもしくはそれ以上の緩衝剤および／またはその共役酸／塩基を含み、より好適には１つまたはそれ以上の緩衝剤およびその共役酸／塩基を含み、最も好適には１つのみの緩衝剤およびその共役酸／塩基を含む。特に明記しない限り、「緩衝系」に関して本明細書で規定した任意の濃度（すなわち、緩衝液濃度）は、好適には緩衝剤および／またはその共役酸／塩基を合わせた濃度を指す。言い換えると、「緩衝系」に関して本明細書で規定した濃度は、好適には全ての関連する緩衝種（すなわち、例えばクエン酸塩／クエン酸など互いに動的平衡状態にある種）を合わせた濃度を指す。したがって、ヒスチジン緩衝系の所与の濃度は、通常ヒスチジンおよびヒスチジンのイミダゾリウム形態を合わせた濃度を指す。しかしながら、ヒスチジンの場合、そのような濃度は通常、ヒスチジンまたはその塩の入力量を参照することにより算出しやすい。関連する緩衝系を含む組成物の全体のｐＨは、通常、各関連緩衝種の平衡濃度（すなわち、緩衝剤とその共役酸／塩基とのバランス）を反映する。
【００１８】
本明細書において、用語「緩衝剤」は、緩衝液または緩衝溶液の酸または塩基成分（通常弱酸または弱塩基）を指す。緩衝剤は、所与の溶液のｐＨをあらかじめ決定した値にまたはあらかじめ決定した値付近に維持するのに役立ち、緩衝剤は通常、あらかじめ決定した値を補足するために選択される。緩衝剤は好適には、特に適切な量（あらかじめ決定した所望のｐＨによる）のその相当する「共役酸／塩基」と混合される（好適にはプロトン交換できる）場合、または必要量のその相当する「共役酸／塩基」がｉｎ  ｓｉｔｕで形成される場合−これは必要なｐＨに達するまで強酸または強塩基を添加することにより達成され得る−、所望の緩衝効果を生じる単一の化合物である。例えば、酢酸ナトリウム緩衝系では、酢酸ナトリウム（塩基性）の溶液から始め、次いで例えば塩酸によって酸性化され、または酢酸（酸性）の溶液に水酸化ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムを所望のｐＨに達するまで添加することができる。
【００１９】
通常、「安定剤」は、特に冷凍および／または凍結乾燥および／または保管中（特にストレスに曝露された時）に、バイオ医薬品の構造的完全性の維持を容易にする成分を指す。この安定化効果は様々な理由から生じるが、典型的にはそのような安定剤は、タンパク質変性を軽減するオスモライトとして作用し得る。本明細書で使用する場合、安定剤はアミノ酸（すなわちペプチドまたはタンパク質の一部ではない遊離アミノ酸−例えばグリシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、リジン）および糖ポリオール（例えばマンニトール、ソルビトール）などの糖安定剤、および／または二糖類（例えばトレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース）である。
【００２０】
本発明による緩衝剤、抗酸化剤、または界面活性剤として使用される薬剤は、とりわけそれらが安定化作用を示し得る場合でも、本明細書で使用する用語「安定剤」の意味から除外される。
【００２１】
本明細書において、用語「界面活性剤」は、表面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を指す。本明細書で使用する界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、商標名Ｔｗｅｅｎ２０としても公知）；ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８、両側にポリオキシエチレン（ポリ（酸化エチレン））の２つの親水性鎖があるポリオキシプロピレン（ポリ（酸化プロピレン））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、商標名Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ  ６８としても公知）を含む。本明細書において、用語「安定な」は通常、保存／保管中の成分、典型的には有効成分またはそれらの組成物の物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的安定性を指す。
【００２２】
本発明により緩衝剤、抗酸化剤、または安定剤として使用される薬剤は、とりわけそれらが界面活性作用を示し得る場合でも、本明細書で使用する用語「界面活性剤」の意味から除外される。
【００２３】
本明細書において、用語「抗酸化剤」はバイオ医薬品の酸化を防ぎまたは減少し、製剤中で安定化され得る薬剤を指す。抗酸化剤は、ラジカルスカベンジャー（例えば、アスコルビン酸、ＢＨＴ、亜硫酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、グルタチオン、または没食子酸プロピル）、キレート剤（例えばＥＤＴＡまたはクエン酸）、または連鎖停止剤（例えばメチオニンまたはＮ−アセチルシステイン）を含む。
本発明により緩衝剤、安定剤、または界面活性剤として使用される薬剤は、とりわけそれらが抗酸化作用を示し得る場合でも、本明細書で使用した用語「抗酸化剤」の意味から除外される。
【００２４】
「希釈剤」は、例えば重量百分率が合計１００％になるように任意の液体医薬組成物の成分のバランスを構成する薬剤である。本明細書において、液体医薬組成物は、本明細書で使用する「希釈剤」が水、好ましくは注射用の水（ＷＦＩ）であるため、水性医薬組成物である。
【００２５】
本明細書において、用語「粒子径」または「孔径」はそれぞれ、所与の粒子または孔の最長寸法の長さを指す。両径はレーザー粒子径分析器および／または電子顕微鏡（例えば、トンネル電子顕微鏡、ＴＥＭまたは走査電子顕微鏡、ＳＥＭ）を使用して測定し得る。粒子数（任意の所与の径に関して）は、サブビジブル粒子の粒子数に関する実施例に概説した手順および装置を使用して得ることができる。
【００２６】
本明細書において、用語「約」は、本技術分野において当業者に公知のそれぞれの値の通常のエラー範囲を指す。本明細書において「約」を付した値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。分からない場合、または特定の値もしくはパラメーターのエラー範囲に関して当技術分野において認識される共通の理解がない場合、「約」はこの値またはパラメーターの±５％を意味する。
【００２７】
本明細書において、グリカン種に関連する用語「パーセントを占める」は、異なる種の数を直接指す。例えば、用語「前記ＦＡ２Ｇ１は、全グリカン種の２５％〜４１％を占める」は、１００個の重鎖を有する分析した５０個の抗体分子において、２５〜４１個の重鎖がＦＡ２Ｇ１グリコシル化パターンを示すことを意味する。
【００２８】
「処置する」または「処置」への言及は、病状の確立された症状の予防および軽減を含むと考えられる。したがって、状態、障害、または病状を「処置する」またはそれらの「処置」は以下を含む：（１）状態、障害、または病状に苦しんでいるまたは罹患しやすいが、状態、障害、または病状の臨床症状または無症候性症状はいまだ経験していないまたは表していないヒトで発症する状態、障害、または病状の臨床症状の出現を予防するまたは遅らせること、（２）状態、障害、または病状を阻害する、すなわち疾患の発生またはその再発（維持処置の場合）または少なくとも１つの臨床症状もしくはその無症候性症状を抑止する、軽減する、または遅らせること、あるいは（３）疾患を緩和するまたは減弱する、すなわち状態、障害、もしくは病状、または少なくとも１つのその臨床症状もしくは無症候性症状の退縮を引き起こすこと。
【００２９】
水性抗ＰＤ−Ｌ１抗体製剤
第１の態様では、本発明は、
（ｉ）抗体として１ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）緩衝剤として５ｍＭから１５ｍＭの濃度の酢酸塩またはヒスチジン；
（ｉｉｉ）安定剤として２４０ｍＭから３２０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールもしくはトレハロース、または５０から１５０ｍＭの濃度のアルギニンＨＣｌと２５ｍＭから７５ｍＭの濃度のグルタミン酸の組合せ；
（ｉｖ）界面活性剤として０．２５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のポロキサマー１８８もしくはポリソルベート２０、または界面活性剤なし；
を含み、メチオニンを含まず、さらにｐＨが５．０から６．０、好ましくは５．０から５．６である、新規の水性医薬抗体製剤を提供する。
【００３０】
好ましい実施形態では、製剤は抗酸化剤を含まない。
【００３１】
一実施形態では、前記製剤中のアベルマブの濃度は約１０ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬである。
別の実施形態では、前記製剤中の酢酸塩またはヒスチジンの濃度は約１０ｍＭである。
さらに別の実施形態では、前記製剤中のＤ−マンニトールもしくはトレハロースの濃度は約２８０ｍＭである、またはアルギニンＨＣｌとグルタミン酸の組合せの場合、アルギニンＨＣｌの濃度は約１５０ｍＭでありグルタミン酸の濃度は約５０ｍＭである。
さらに別の実施形態では、前記製剤中のポロキサマー１８８またはポリソルベート２０の濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬである。
さらに別の実施形態では、前記製剤のｐＨは５．２（±０．１）から５．５（±０．１）である。
好ましい実施形態では、前記製剤は約１０ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、他の緩衝剤を含まない。
別の好ましい実施形態では、前記製剤は約２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロースを含み、他の安定剤を含まない。
さらに別の好ましい実施形態では、前記製剤は約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８を含み、他の界面活性剤を含まない。
【００３２】
一実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）抗体として約１０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度の酢酸塩；
（ｉｉｉ）安定剤として約２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
を含み、メチオニンを含まず、ｐＨが約５．５である。
【００３３】
好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）１０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸塩；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
を含み、ｐＨが５．５（±０．１）である。
【００３４】
好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）１０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸ナトリウム三水和物；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌ；
（ｖｉ）溶媒としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．５（±０．１）である。
【００３５】
好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）１０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸ナトリウム三水和物；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のトレハロース二水和物；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌ；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．５（±０．１）である。
【００３６】
より好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）１０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸ナトリウム三水和物；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）ｐＨを調整するためのＨＣｌ；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．５（±０．１）である。
【００３７】
別の実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）抗体として約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）緩衝剤として約１０ｍＭの濃度の酢酸塩；
（ｉｉｉ）安定剤として約２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース；
（ｉｖ）界面活性剤として約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
を含み、メチオニンを含まず、ｐＨが５．２（±０．１）である。
【００３８】
好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸塩；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
を含み、ｐＨが５．５（±０．１）である。
【００３９】
好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトールまたはトレハロース二水和物；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポロキサマー１８８；
（ｖ）ｐＨを調整するための酢酸ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
を含み、ｐＨが５．２（±０．１）である。
【００４０】
より好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）ｐＨを調整するための酢酸ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．２（±０．１）である。
【００４１】
より好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のトレハロース二水和物；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）ｐＨを調整するための酢酸ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．２（±０．１）である。
【００４２】
より好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポロキサマー１８８；
（ｖ）ｐＨを調整するための酢酸ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．２（±０．１）である。
【００４３】
より好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭの濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭの濃度のトレハロース二水和物；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポロキサマー１８８；
（ｖ）ｐＨを調整するための酢酸ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．２（±０．１）である。
【００４４】
好ましい実施形態では、前記製剤は：
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；
（ｉｉ）１０ｍＭ（０．６ｍｇ／ｍＬ）の濃度の酢酸；
（ｉｉｉ）２８０ｍＭ（５１ｍｇ／ｍＬ）の濃度のＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０；
（ｖ）７．５ｍＭ（０．３ｍｇ／ｍＬ）の濃度の水酸化ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
からなり、ｐＨが５．０から５．６、好ましくは５．２（±０．１）である。
【００４５】
好ましい実施形態では、後者の製剤は：
（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬのアベルマブ；
（ｉｉ）０．６ｍｇ／ｍＬの氷酢酸；
（ｉｉｉ）５１ｍｇ／ｍＬのＤ−マンニトール；
（ｉｖ）０．５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０；
（ｖ）０．３ｍｇ／ｍＬの水酸化ナトリウム；
（ｖｉ）希釈剤としての水（注射用）；
を組み合わせることによって作製され、所望の容積の製剤を得る。
【００４６】
さらなる実施形態では、本発明は、そのｐＨが水酸化ナトリウムで調整される水性医薬抗体製剤に関する。したがって、製剤は、有効成分として２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアベルマブ；ならびに賦形剤として氷酢酸、Ｄ−マンニトール、ポリソルベート２０、水酸化ナトリウム、および注射用の水からなり、ｐＨが５．０から５．６、好ましくは５．２（±０．１）である。
【００４７】
好ましい実施形態では、製剤は２７０ｍＯｓｍ／ｋｇと３３０ｍＯｓｍ／ｋｇの間のオスモル濃度を有する。
【００４８】
一実施形態では、上記の製剤中の前記アベルマブは、図１ａ（配列番号１）または図１ｂ（配列番号２）のいずれかの重鎖配列、図２（配列番号３）の軽鎖配列を有し、Ａｓｎ３００にグリコシル化を有し、主なグリカン種（main glycan species）としてＦＡ２およびＦＡ２Ｇ１を含み、合わせて全グリカン種の＞７０％を占める。
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２は全グリカン種の４４％〜５４％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１は全グリカン種の２５％〜４１％を占める。
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２は全グリカン種の４７％〜５２％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１は全グリカン種の２９％〜３７％を占める。
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化において、前記ＦＡ２は全グリカン種の約４９％を占め、前記ＦＡ２Ｇ１は全グリカン種の約３０％〜約３５％を占める。
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化は、少ないグリカン種（minor glycan species）として全グリカン種の＜５％を占めるＡ２、全グリカン種の＜５％を占めるＡ２Ｇ１、全グリカン種の＜５％を占めるＡ２Ｇ２、全グリカン種の＜７％を占めるＦＡ２Ｇ２をさらに含む。
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化において、前記Ａ２は全グリカン種の３％〜５％を占め、前記Ａ２Ｇ１は全グリカン種の＜４％を占め、前記Ａ２Ｇ２は全グリカン種の＜３％を占め、前記ＦＡ２Ｇ２は全グリカン種の＜５％〜６％を占める。
好ましい実施形態では、アベルマブのグリコシル化において、前記Ａ２は全グリカン種の約３．５％〜約４．５％を占め、前記Ａ２Ｇ１は全グリカン種の約０．５％〜約３．５％を占め、前記Ａ２Ｇ２は全グリカン種の＜２．５％を占め、前記ＦＡ２Ｇ２は全グリカン種の約５．５％を占める。
【００４９】
一実施形態では、上記の製剤中の前記アベルマブは、図１ｂ（配列番号２）の重鎖配列を有する。
【００５０】
一実施形態では、上記のアベルマブ製剤は静脈内（ＩＶ）投与用である。
【００５１】
薬物送達デバイス
第２の態様では、本発明は、本明細書に定義した液体医薬組成物を含む薬物送達デバイスを提供する。好適には、薬物送達デバイスは、医薬組成物が内部に存在するチャンバーを含む。好適には薬物送達デバイスは無菌である。
【００５２】
薬物送達デバイスは、バイアル、アンプル、シリンジ、注射ペン（例えば、基本的にはシリンジを含む）、またはｉ．ｖ．（静脈内）バッグであり得る。
水性医薬製剤は、非経口的に投与され、好ましくは皮下注射、筋肉内注射、ｉ．ｖ．注射、またはｉ．ｖ．注入による。投与の最も好ましい方法はｉ．ｖ．注入である。
好ましい実施形態では、薬物送達デバイスは上記の製剤を含有するバイアルである。
より好ましい実施形態では、前記バイアルは、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液１０ｍＬ中にアベルマブ２００ｍｇを含有する。
さらにより好ましい実施形態では、バイアルはガラスバイアルである。
【００５３】
医学的処置
第３の態様では、本発明は、上記の製剤を患者に投与するステップを含む、がんを処置する方法を提供する。
一実施形態では、処置するがんは、非小細胞性肺がん、尿路上皮癌、膀胱がん、中皮腫、メルケル細胞癌、胃もしくは胃食道接合部がん、卵巣がん、乳がん、胸腺腫、胃腺癌、副腎皮質癌、頭頚部扁平上皮癌、腎細胞癌、メラノーマ、および／または古典的ホジキンリンパ腫から選択される。
【００５４】
略語
ＡＮＯＶＡ  分散分析
ＣＤ  円偏光二色性
ＣＥ  キャピラリー電気泳動
ＤｏＥ  実験デザイン
ＤＰ  製剤
ＤＳ  原薬
ＤＳＦ  示差走査型蛍光定量
ＤＴＴ  ジチオトレイトール
ＥＳＩ  エレクトロスプレイイオン化
ＨＩＬＩＣ  親水性相互作用液体クロマトグラフィー
ＨＭＷ  高分子量
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
ｉＣＥ  毛管等電点電気泳動
ＬＣ  液体クロマトグラフィー
ＬＭＷ  低分子量
ＭＡＬＤＩ  マトリックス支援レーザー脱離イオン化法
ＭＳ  質量分析
ＮＴＵ  ネフェロ分析濁度ユニット
ＯＤ  吸光度
ＰＢＳ  ポリ緩衝食塩水
ＰＥＳ  ポリエチレンスルホン
ＰＶＤＦ  フッ化ポリビニリデン
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥ  サイズ排除
ＴＯＦ  飛行時間型
ＵＰＬＣ  超高速液体クロマトグラフィー
ＲＨ  残留湿度
ＵＶ  紫外線
【実施例】
【００５５】
安定性の測定に使用する方法
試験した抗体製剤の安定性を評価し、最適な候補を選択するため、以下の手順に従って安定性のパラメーターとして熱ストレス、機械的ストレス、光暴露、オスモル濃度、濁度、タンパク質含量、総凝集、断片化、ｐＨ、アイソフォーム、円偏光二色性、サブビジブル粒子、および生物活性を測定した。
【００５６】
熱ストレス：
４０℃において：元のバイアル容器内の試料を４０℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）の温度の恒温キャビネット中でインキュベートし、あらかじめ決定した時点で取り出した。
２５℃において：元のバイアル容器内の試料を２５℃±２℃（ＲＨ６０％±５％）の温度の恒温キャビネット中でインキュベートし、あらかじめ決定した時点で取り出した。
【００５７】
機械的ストレス：
元のバイアル容器内の試料を、２４時間まで３００ｒｐｍ（室温）に維持したオービタル振盪機上に置いた。
【００５８】
光暴露：
元のバイアル容器内の試料を、サンテスト機の照射量を７６５Ｗ／ｍ２（放射波長３２０ｎｍと８００ｎｍの間）に調節し７時間光源に曝露した。
【００５９】
オスモル濃度：
正常なヒトの血漿は、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する（Medical Physiology - Principles for Clinical Medicine. Edited by Rodney A. Rhoades PhD, David R. Bell PhD）。一般に、３００ｍＯｓｍ／ｋｇに近いオスモル濃度の溶液が、非経口製剤を開発する際に目標とされる。許容可能範囲（製品仕様通り）は２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。
ここで、オスモル濃度は溶質添加後の水溶液の凝固点降下を測定する凝固点降下法によって測定した。溶質の量、したがって観察されたオスモル濃度値は、調合した溶液の観察された凝固点降下と比例している。
【００６０】
濁度：
溶液の濁度は、散乱光または減衰光を測定できる比濁計によって測定した（Ｈａｃｈ  Ｌａｎｇｅ  Ｍｏｄｅｌ  ２１００ＡＮ）。小容量キュベット中の約３ｍＬの溶液を８７０±３０ｎｍの発光ダイオード（ＬＥＤ）アセンブリーによって照射した。検出器は散乱光をモニターし、公知の濁度の一連の標準との比較により溶液の濁度（ＮＴＵ）を提供した。
【００６１】
タンパク質含量：
タンパク質含量は、１ｃｍ光路長の石英キュベット内で２８０ｎｍおよび３２０ｎｍでの溶液（適当な緩衝液によってタンパク質濃度〜０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した）の吸光度によって測定した。モル吸光係数を１．４６ｃｍ２／ｍｇと仮定して、式：（Ａ２８０−Ａ３２０）／（１．４６ｃｍ２／ｍｇ×１ｃｍ）を適用してタンパク質濃度を得た。
【００６２】
総凝集：
凝集の量は、ＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定した。２０μＬの試料容積（試料はＰＢＳにより約０．５ｍＬに希釈した）を、流速０．３５ｍＬ／分（移動相は、ｐＨ６．３±０．１で５０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４過塩素酸ナトリウム）で２２±５℃の温度に維持したＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００  ４．６ｍｍ×３０ｃｍ（ｃｏｄ．１８６７５）に注入した。ＵＶは２１４ｎｍで検出した。
【００６３】
断片化：
低分子種（または断片）は、バイオアナライザーによって測定した。試料は１．２５〜３．７５ｍｇ／ｍＬの間の範囲の濃度で分析する（精製水によって作製した希釈物）。３μＬの各希釈試料を、２μＬの相当する試料緩衝液（試験が還元条件下で行われる場合、ＤＴＴを添加）および１μＬの６０ｍＭマレイミド溶液と混合した。試料は７０℃で５分間加熱し、次いで８４μＬの精製水を添加し、溶液をボルテックスして、スピンダウンした。６μＬをチップ上に載せた（０．２５〜０．７５μｇのタンパク質）。チップをＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーに置き、続けて５分以内に分析を開始した。
【００６４】
アイソフォーム：
アイソフォーム分布をｉＣＥによって測定した。Ｆｃコートしたキャピラリーカートリッジ（内径１００ｍｍ、長さ５０ｍｍ）を使用した。分離は、陰極溶液として０．１％メチルセルロース中１００ｍＭ  ＮａＯＨ溶液、陽極溶液として０．１％メチルセルロース中８０ｍＭ  ｏ−リン酸を使用して行った。試料は８０μＬのマスターミックス溶液（７００μＬの０．１％メチルセルロース、１０μＬのＰｈａｒｍａｌｙｔｅ５〜８、７０μＬのＰｈａｒｍａｌｙｔｅ８〜１０．５、１０μＬの７．６５ｐｌマーカー、および１０μＬの９．７７ｐｌマーカーを混合して得た）から調製を始め、好適な容積の洗浄したアベルマブ試料（製剤成分を取り除く洗浄後、２００μｇのタンパク質に相当する）を添加した。相当する量の精製水（１２０μＬ−先のステップで添加した洗浄したアベルマブ試料の容積）を添加した。分離は、プレフォーカス時間およびフォーカス時間をそれぞれ１分および１５分、プレフォーカス電圧およびフォーカス電圧をそれぞれ１５００Ｖおよび３０００Ｖに設定して２８０ｎｍの検出波長で行った。試料は１０００ｍＢａｒの圧力で注入した。
【００６５】
ｐＨ：従来の電位差測定によって測定した。
【００６６】
円偏光二色性（ＣＤ）：
アベルマブの三次構造の調査は、近ＵＶ範囲付近（３２０〜２５０ｎｍ）においてＪａｓｃｏ（ｍｏｄ．Ｊ８１０）のＣＤ分光偏光計測装置を使用して行った。試料は、精製水でタンパク質濃度１．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、１ｃｍ光路長の石英キュベットに充填し、室温、走査速度２０ｎｍ／分、データ間隔０．５ｎｍ、時間積分８秒、および標準的な感度で分析した。
【００６７】
サブビジブル粒子：
サブビジブル粒子は、Ｐａｍａｓ  ＳＶＳＳ−Ｃパーティクルカウンターを使用する光オブスキュレーション法の技術により数えた。試料は精製水によって５倍に希釈し、試験するために少なくとも２５ｍＬの最終容積を得た。
【００６８】
生物活性：
実施例５に記載の長期安定性試験に関して、生物活性をさらなる安定性パラメーターとして測定した。
使用した方法は、ＨＥＫ２９３細胞系（ＰＤ−Ｌ１を永続的にトランスフェクトしたｈＰＤＬ１）に存在するその抗原ＰＤ−Ｌ１に用量依存的な方法で結合する、ＥＬＩＳＡプレートで吸収されるアベルマブの能力に基づく。使用した投与量は４００、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および３．１２ｎｇ／ｍＬであった。得られたデータから、ＥＣ５０値を算出した。試料の生物活性（効力）は、標準に対する試料の生理活性の割合として表され、以下のように算出される：効力（試料）［％］＝（ＥＣ５０（試料）／ＥＣ５０（標準））＊１００．７。
【００６９】
製造方法
本発明は、本明細書に定義した水性医薬製剤を製造する方法も提供する。本方法は、好適には、適切だと思われる任意の特定の順番で、水性医薬製剤を形成するために必要な任意の関連する成分を一緒に混合するステップを含む。当業者は、水性医薬製剤（特に、シリンジによる注射またはｉ．ｖ．注入のためのもの）を形成するための当技術分野で周知の実施例または技術を参照することができる。
【００７０】
本方法は、まずアベルマブを除くいくつかのまたは全ての成分（任意選択により、いくつかのまたは全ての希釈物を含む）の予混合物（または予溶液）を調製するステップを含み、次いでアベルマブはそれ自体（任意選択により、いくつかの希釈物を含むまたはいくつかの希釈物にあらかじめ溶解する）、予混合物（または予溶液）と混合されて水性医薬製剤を得る、または次いで最終成分が添加される組成物を得て最終水性医薬製剤を供給する。好ましくは、本方法は、緩衝系、好適には本明細書に定義した緩衝剤を含む緩衝系を形成するステップを含む。緩衝系は、好適には、アベルマブの添加前の予混合物において形成される。緩衝系は、緩衝剤（既製で供給される）とその共役酸／塩基（好適には、所望のｐＨを提供するのに適切な相対量−これは当業者によって理論的にまたは実験的に決定され得る）を単に混合することにより形成され得る。酢酸塩緩衝系の場合、これは例えば酢酸ナトリウムとＨＣｌを混合すること、または酢酸とＮａＯＨもしくは酢酸塩を混合することを意味する。最終水性医薬製剤の予混合物のいずれかのｐＨは、必要量の塩基もしくは酸、または緩衝剤もしくは共役酸／塩基を添加することによって賢明に調整され得る。
【００７１】
特定の実施形態では、緩衝剤および／または緩衝系は別々の混合物としてあらかじめ形成され、緩衝系は、緩衝液交換（例えば、関連濃度またはオスモル濃度に達するまで透析濾過を使用する）によって水性医薬製剤（緩衝剤および／または緩衝系を除くいくつかのまたは全ての成分を含み、好適にはアベルマブを含み、アベルマブのみの可能性もある）の前駆体へと移される。その後必要であれば、最終液体医薬組成物を産生するためにさらなる賦形剤が添加され得る。ｐＨは全ての成分が存在すると、または全ての成分が存在する前に調整され得る。
【００７２】
いずれかの、いくつかの、または全ての成分は、あらかじめ溶解される、または他の成分と混合する前に希釈剤とあらかじめ混合される。
最終水性医薬製剤は濾過され、好適には粒子状物質を除去され得る。好適には、濾過は１μｍのまたは１μｍ未満のサイズのフィルター、好適には０．２２μｍのフィルターを通す。好適には、濾過はＰＥＳフィルターまたはＰＶＤＦフィルターのいずれかを通し、好適には０．２２μｍのＰＥＳフィルターによる。
【００７３】
当業者は、抗体原薬が静脈内に投与され得るようにどのように水性医薬製剤がＩＶ溶液を調製するために使用され得るかを周知している。
ＩＶ溶液の調製は、典型的にはプラスチックシリンジ（ＰＰ）および針によって生理食塩水バッグ（例えば、０．９％または０．４５％生理食塩水）から吸引される特定の量の溶液からなり、水性医薬製剤と置き換えられる。置き換えられる溶液の量は患者の体重に依存する。
【実施例１】
【００７４】
アベルマブの構造
１．１  一次構造
アベルマブは２つの重鎖分子および２つの軽鎖分子を有するＩｇＧである。２つの鎖のアミノ酸配列は、それぞれ図１ａ（配列番号１）／１ｂ（配列番号２）および２（配列番号３）に示す。
【００７５】
１．２  二次構造
ＬＣ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ法は、分子の完全な鎖およびタンパク質への翻訳後修飾の存在を確認するために使用された。アベルマブ分子サブユニットの二次構造は図３に示す。
【００７６】
トリプシン消化によって得られたペプチドのＵＰＬＣ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって確認されたように、ジスルフィド結合Ｃｙｓ２１−Ｃｙｓ９６、Ｃｙｓ２１−Ｃｙｓ９０、Ｃｙｓ１４７−Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ１３８−Ｃｙｓ１９７、Ｃｙｓ２１５−Ｃｙｓ２２３、Ｃｙｓ２２９−Ｃｙｓ２２９、Ｃｙｓ２３２−Ｃｙｓ２３２、Ｃｙｓ２６４−Ｃｙｓ３２４およびＣｙｓ３７０−Ｃｙｓ４２８は、９つの典型的なＩｇＧ結合パターンを形成する。
【００７７】
１．３  グリコシル化
分子は、重鎖のＡｓｎ３００に１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。ペプチドマッピングによって決定したように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって同定された主な構造は、０個（Ｇ０Ｆ）、１個（Ｇ１Ｆ）、または２個のガラクトース（Ｇ２Ｆ）残基を有する複雑な二分岐型のコアフコシル化オリゴサッカライドであった。主な種はＧ０ＦおよびＧ１Ｆである。２−アミノベンズアミドによって蛍光標識したアベルマブグリカンを、ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦによって分析した。図４は、見出されたグリカン種のＵＰＬＣプロファイルを示す。
【００７８】
【表１−１】
2018536676.tif 000002
【００７９】
【表１−２】
2018536676.tif 000003
【００８０】
使用したグリカンの命名法は、Harvey et al. (Proteomics 2009, 9, 3796-3801)によって提案されたＯｘｆｏｒｄ  Ｎｏｔａｔｉｏｎに従った。フコースを含有する種において（ＦＡ２、ＦＡ２Ｇ１、ＦＡ２Ｇ２）、Ｆｕｃ−ＧｌｃＮＡｃ連結はα１〜６である。末端ＧｌｃＮＡｃを有する種において、ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ連結はβ１〜２である。ガラクトースを含有する種において、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ連結はβ１〜４である。
【００８１】
報告したクロマトグラフプロファイルは統合され、表２ａに示すようにアベルマブのグリカン種分布をもたらした。
【００８２】
【表２】
2018536676.tif 000004
【００８３】
グリカンマッピング分析により、ペプチドマッピングによって行った同定（２つの主なグリカン種の同定が可能）を確認し、さらにグリカン分析に特異的なこの方法によって、二次および少ない種も特性評価された。
【００８４】
別の測定において、以下のグリカン種分布が観察された。
【００８５】
【表３】
2018536676.tif 000005
【実施例２】
【００８６】
ＤｏＥ１スクリーニング
１０ｍｇ／ｍＬのアベルマブでのＤｏＥ１をスクリーニングする第一の実験デザインは、様々な緩衝液型／ｐＨ、賦形剤、界面活性剤型、および関連濃度などのいくつかの因子の影響を評価した。試験は、タンパク質の安定性を最大にし得る最適な条件の選択をもたらした。
【００８７】
ＤｏＥ１スクリーニングにおいて、以下の因子を調査の考慮に入れた：
−  緩衝液型およびｐＨ：ｐＨ範囲５．０〜６．０で評価される酢酸塩、クエン酸、およびヒスチジン緩衝液。
−  賦形剤：糖／ポリオールまたはアミノ酸が製剤中に調合するのに好ましいかどうかに関する指標を与えるために３つの異なる賦形剤が考えられた。
−  界面活性剤型および濃度：様々な濃度（０〜１ｍｇ／ｍＬ）で評価される２つの代替えの界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０およびポロキサマー１８８）。
試験は１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で充填量８ｍＬ（８０ｍｇ／バイアル）により、ＤＩＮ６Ｒバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ）中で行った。
表３は調査したＤｏＥ１製剤の選択を例示する。
ＤｏＥ１は、作製される好適な緩衝液／ｐＨ、賦形剤型および界面活性剤型の選択を可能にし、続く実施例３に記載のＤｏＥ２試験のために使用された。
【００８８】
【表４−１】
2018536676.tif 000006
【００８９】
【表４−２】
2018536676.tif 000007
【００９０】
２．１  製造
あらかじめ配合した原薬（ＤＳ）（１０（±１）ｍｇ／ｍＬアベルマブ、１．３６ｍｇ／ｍＬ酢酸ナトリウム三水和物、５１ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−マンニトール、０．２１ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−メチオニン、塩酸によりｐＨ５．５に調整）は、３倍容積交換が達成されるまで、３つの緩衝液：１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０、１０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０および１０ｍＭヒスチジンｐＨ５．７５中でタンジェント流濾過（１０ｋＤａの排除限界でＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓを使用）によって緩衝液交換した。各ステップにおいて、ＤＳ溶液を適当な緩衝液によって５倍希釈した。交換したＤＳ材料における最終目標タンパク質濃度は、＞１０ｍｇ／ｍＬであった。次いで、必要な賦形剤を適当な緩衝液交換ＤＳ材料に添加し、表３に列挙したＤＰ組成物を得るためにｐＨおよび最終溶液重量を目標に調整した。
交換したＤＳ溶液への成分の添加の順番は、以下の通りであった：
Ｄ−マンニトールまたはトレハロース二水和物またはアルギニンＨＣｌ＋グルタミン酸を交換したＤＳ溶液に添加し、完全に溶解するまで撹拌し、Ｌ−メチオニンを添加し完全に溶解するまで撹拌し（参照のためのみ）、ポロキサマー１８８またはポリソルベート２０（５０ｍｇ／ｍＬ保存溶液）を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、ｐＨを調べて水酸化ナトリウムで目標に調整した。
【００９１】
製剤（ＤＰ）溶液をＤＩＮ６Ｒバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ）に充填した（８ｍＬ）。ＤＳ透析濾過工程中の目視検査により、クエン酸ナトリウム緩衝液は、通常、より高い白濁を生じ、一方で交換が酢酸ナトリウム緩衝液およびヒスチジン緩衝液中で行われる場合、明らかに透明な溶液が得られることが明らかになった。
【００９２】
表４では、緩衝液交換時の３つのＤＳ材料のタンパク質回収、オスモル濃度（Ｏｓｍｏｍａｔ  ０３０／Ｄ、Ｇｏｎｏｔｅｃ）および濁度を測定するために行われた実験の結果を示す。十分なタンパク質回収（＞８９％）および最終オスモル濃度値（＜６１ｍＯｓｍ／ｋｇ）を得た。濁度分析により、クエン酸ナトリウムで交換されたＤＳのより高い白濁を確認した。
【００９３】
【表５】
2018536676.tif 000008
【００９４】
２．２．オスモル濃度
ＤｏＥ１スクリーニングに適当なＤＰ製剤のオスモル濃度値は、２９９〜３９６ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に含まれ、ほとんどの製剤は約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有した。
測定は、時間０、製造の完了時に行った。
【００９５】
得られた値は、目標と一致した（許容可能範囲２５０〜４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ）。トレハロース二水和物を含有する溶液は、この成分の凝固点および続くオスモル濃度の（明らかな）増加への効果により、より高い値（４００ｍＯｓｍ／ｋｇ付近）を示した。
【００９６】
２．３  熱ストレス
２．３．１  タンパク質含量
ＯＤ測定によって測定されたように、時間０の含量値は理論値（１０ｍｇ／ｍＬ）と一致した。４０℃で１カ月後、著しい変化は観察されなかった。
【００９７】
２．３．２  総凝集
ＤｏＥ１製剤の総凝集を時間０、４０℃での保管の２および４週間後にＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した。
４０℃での熱ストレス時の凝集に関して統計的に有意な変化は強調されず、したがって試験した異なるマトリックスが凝集パターンの不変の／無視できる変化をもたらすことを示した。
【００９８】
２．３．３  断片化
ＤｏＥ１製剤において、時間０、４０℃での保管の２および４週間後にバイオアナライザー（２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ）によって断片化を測定した。
データは、以下を示した：
−  ｐＨは、４０℃でのタンパク質断片化に重要な因子である。ｐＨ＞５．７５では、断片化は著しく増加する傾向がある（最も典型的には、クエン酸およびヒスチジン緩衝液中、ＤｏＥ１−１３からＤｏＥ１−１９の製剤において）。
−  最も少ない断片化の変化を示す製剤はｐＨ範囲５．０〜５．７５、好ましくはＤ−マンニトールまたはトレハロース二水和物いずれかの存在下のもの（ＤｏＥ１−２−８−９−１０−１２）である。
−  製剤ＤｏＥ１−７（ｐＨ５．２５のクエン酸緩衝液、Ｄ−マンニトールおよびＴｗｅｅｎ２０の存在下）は２倍のピークと一致する異常なプロファイルを示した（濁度／白濁の増加を伴う製造中にすでに強調されたものに加えて、いくつかの事象は、断片化において緩衝剤としてのクエン酸塩の使用と関連し得た）。
【００９９】
２．３．４  濁度
ＤｏＥ１製剤における比濁計による濁度を、時間０、４０℃での保管の２および４週間後に測定した。
白濁／強白濁はｐＨ緩衝剤としてクエン酸塩を含有する全てのＤＰ製剤において一貫して観察された。
酢酸ナトリウムおよびヒスチジン中の全ての製剤は透明／わずかに白濁であり、４０℃での保管の１カ月にわたり著しい変化は見られなかったことが見出された。
【０１００】
２．３．５  ｐＨ
ｐＨの変化は観察されなかった。
【０１０１】
２．４  機械的ストレス
ＤｏＥ１製剤はバイアル中３００ｒｐｍ（室温）で２４時間オービタル振盪に供した。ストレスの終了時、試料の凝集および白濁を試験した。
【０１０２】
２．４．１  総凝集
総凝集は機械的ストレス後ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定し、時間０の結果と比較した。無視できる変化が観察された。
【０１０３】
２．４．２  濁度
ＤｏＥ１製剤の濁度は、機械的ストレス後に比濁計（２１００ＡＮ  ＩＳ、Ｈａｃｈ  Ｌａｎｇｅ）によって測定し、時間０の結果と比較した。データはＡＮＯＶＡによって評価し、界面活性剤の存在による適度に有意な効果（０．０１＜ｐ値＜０．０５）が観察された。Ｔｗｅｅｎ２０またはポロキサマー１８８のいずれかが、機械的ストレス後の濁度変化を最小限にするのに役立ち得る。
【０１０４】
２．５  光暴露
ＤｏＥ１製剤を７６５Ｗ／ｍ２での７時間照射に供した（Ｓｕｎｔｅｓｔ  ＣＰＳ、Ａｔｌａｓ）。光ストレス終了時に、試料の凝集、白濁、ｐＨおよびアイソフォームプロファイルを試験した。
【０１０５】
２．５．１  総凝集
ＳＥ−ＨＰＬＣ（Ａｌｌｉａｎｃｅ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用してわずかな変化が観察され、クエン酸ナトリウム緩衝液を使用した場合（ｐ値＜０．０１）、最も頻繁であった。
酢酸ナトリウムおよびヒスチジンは、凝集変化を最小限にするために好ましい緩衝液である。
【０１０６】
２．５．２  濁度
比濁計によって測定されたように、最も明らかな濁度の増加は、典型的にはｐＨ値＞５．７５（ＤｏＥ１−１３およびＤｏＥ１−１６およびＤｏＥ１−１７）のクエン酸緩衝液で見出された。
【０１０７】
２．５．３  ｐＨ
変化は観察されなかった。
【０１０８】
２．６  ＤｏＥ１：結果
熱ストレス、機械的ストレス、および光ストレスの枠内で得られたデータは、ストレスに対する最大のタンパク質耐性を提供する条件を決定するために評価した。
分析の結果は表５に報告する。
【０１０９】
【表６】
2018536676.tif 000009
【０１１０】
推定の製剤は緑で強調し（ＩＤ＃＝推定）、試験したセットの最も類似の製剤はＤｏＥ１−４であることも報告する。これらのデータは、酢酸塩緩衝液ｐＨ５．０〜５．５がタンパク質の安定性を改善すること、およびＴｗｅｅｎ２０またはポロキサマー１８８のいずれかなど、０．２ｍｇ／ｍＬよりも高い濃度の界面活性剤の存在も、製剤におけるタンパク質の安定性の改善に重要であることを実証する。
【実施例３】
【０１１１】
第二のＤｏＥスクリーニング「ＤｏＥ２」は、ＤｏＥ１完了時に選択された製剤の微調整、同時にタンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍＬに増加することを目指す。
【０１１２】
この第二の製剤スクリーニングにより、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．２の存在下で、賦形剤（Ｄ−マンニトール、トレハロース二水和物）および界面活性剤（界面活性剤なし、０．５ｍｇ／ｍＬのポロキサマー１８８またはポリソルベート２０）が異なるタンパク質濃度２０ｍｇ／ｍＬの６つの製剤を、熱ストレス（４０℃で１カ月、２５℃および２〜８℃で８週間）および機械的振盪（３００ｒｐｍ、室温で２４時間）後に試験した。適当な組成物を表６に列挙する。
【０１１３】
【表７】
2018536676.tif 000010
【０１１４】
ＤｏＥ２試験は、Ｄ−マンニトール対トレハロース二水和物の効果、およびｐＨ５．２、２０ｍｇ／ｍＬの増加したタンパク質濃度の酢酸ナトリウム緩衝液における界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０もしくはポロキサマー１８８、または界面活性剤なし）の影響を比較的に評価するために実施した。２つのｐＨ５．５の参照試料がデザインに含まれる：Ｌ−メチオニンを有する「参照」、およびＬ−メチオニンを有さない参照製剤、ＤｏＥ１−８に相当。
【０１１５】
３．１  製造
あらかじめ製剤化した原薬（ＤＳ）（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５中２７．１ｍｇ／ｍＬアベルマブ）を使用した。次いで、必要な賦形剤をＤＳ材料に添加した。
ＤＳ溶液への成分の添加の順番は、以下の通りであった：
Ｄ−マンニトールまたはトレハロース二水和物を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、ポロキサマー１８８またはポリソルベート２０（２０ｍｇ／ｍＬ保存溶液）を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、Ｌ−メチオニンを添加し完全に溶解するまで撹拌し（参照のためのみ）、完全に溶解するまで撹拌し、ｐＨを調べて水酸化ナトリウムまたは希釈した酢酸によって目標に調整した。
溶液は、表７に列挙したＤＰ組成物を得るために適当な緩衝液によって目標に重量調整した。
ＤＰ溶液をＤＩＮ６Ｒバイアル中に充填した（８ｍＬ）
【０１１６】
３．２  熱ストレス
３．２．１  タンパク質含量
４０℃で４週間（表７）および２５℃で８週間（表８）にわたり、タンパク質含量（ＯＤ、Ｌａｍｂｄａ３５、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の変化は観察されなかった。
【０１１７】
【表８】
2018536676.tif 000011
【０１１８】
【表９】
2018536676.tif 000012
【０１１９】
３．２．２  総凝集
４０℃および２５℃での安定性に関してＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した総凝集をそれぞれ図６および図７に示す。凝集の少ない、顕著ではない変化のみが観察された。
【０１２０】
３．２．３  バイオアナライザーによる断片化
断片は４０℃で１カ月にわたり、および２５℃で２カ月後に評価した。適当な結果を、それぞれ図８および図９に示す。
４０℃では、１カ月後に７％より多くの量の断片を示す製剤ＤｏＥ２−１は別として、他の製剤は、製剤ＤｏＥ２−４、ＤｏＥ２−５、およびＤｏＥ２−６（４０℃で１カ月後、断片４．０〜４．５％）の性能よりわずかに良い同様の性質（１カ月後、断片４〜６％）を持つことが観察された。
２５℃では、同様の断片化の割合は２カ月後に見出された（４．６〜６．１％）
【０１２１】
３．２．４  アイソフォームプロファイル
ＤｏＥ２製剤において、ｉＣＥ２８０（Ｆａｓｔ  ＩＥＦ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によるアイソフォームプロファイルを、時間０および４０℃での保管の４週間後に測定した。４０℃での保管時、典型的には酸性クラスターの増加が測定されるが、塩基性アイソフォームにおいて同時に減少が観察される。
アイソフォームプロファイルは、４０℃で１カ月にわたり（表９）、および２５℃で８週間後（表１０）に評価された。
相当する変化が、両ストレス条件で全ての試料において観察された。
【０１２２】
【表１０】
2018536676.tif 000013
【０１２３】
３．２．６  濁度
４０℃で１カ月後（表８）、および２５℃で２カ月後（表９）に変化は観察されなかった。
【０１２４】
【表１１】
2018536676.tif 000014
【０１２５】
【表１２】
2018536676.tif 000015
【０１２６】
３．２．７  ｐＨ
４０℃で１カ月後（表１２）、および２５℃で２カ月後（表１３）に変化は観察されなかった。
【０１２７】
【表１３】
2018536676.tif 000016
【０１２８】
【表１４】
2018536676.tif 000017
【０１２９】
３．２．８  円偏光二色性
ＤｏＥ２製剤のＣＤスペクトル（Ｊ−８１０  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ、Ｊａｓｃｏ）を時間０、４０℃で４週間後、および２５℃で８週間後に近ＵＶ範囲付近で回収した。全ての製剤中のタンパク質は、通常４０℃で４週間後、および２５℃で８週間後にその三次構造を維持する。
【０１３０】
３．２．９  サブビジブル粒子
ＤｏＥ２製剤のサブビジブル粒子を、２〜８℃での保管の８週間後に測定した。結果は表１４に示す。値は、ヨーロッパ薬局方限度内に見出された（１００ｍＬより少ない名目量を容器に供給した溶液）。
【０１３１】
【表１５】
2018536676.tif 000018
【０１３２】
３．３  機械的ストレス
３．３．１  バイオアナライザーによる断片化
３００ｒｐｍで２４時間後、断片のわずかな変化（表１５）が試験した特定の組成物に特定の関係なく全ての試料（５．０〜６．５％まで）において観察された。
【０１３３】
【表１６】
2018536676.tif 000019
【０１３４】
３．３．２  凝集
機械的振盪後、変化が観察されなかった（表１６）。
【０１３５】
【表１７】
2018536676.tif 000020
【０１３６】
３．３．３  ｐＨ
機械的振盪後、変化が観察されなかった（表１７）。
【０１３７】
【表１８】
2018536676.tif 000021
【０１３８】
３．４  濁度
機械的振盪後、変化が観察されなかった（表１８）。
【０１３９】
【表１９】
2018536676.tif 000022
【０１４０】
３．５  ＤｏＥ２：結果
これらの結果は、ｐＨ５．２（ＤｏＥ１から推定）が断片化に影響せず、したがって安定な製剤での使用に好適であることを実証する。タンパク質の安定性を保つために最適なｐＨは５．０〜５．５の範囲内であることが実証された（ＤｏＥ１）。対照的に、ｐＨ値５．６〜５．７はより高い断片化をもたらし得た。
マンニトールおよびトレハロース二水和物は同様の性質をもたらした。
Ｔｗｅｅｎ２０を上回るポロキサマー１８８の優位性は見出されなかった。
これらの結果は、ＤｏＥ２製剤中のより高いタンパク質濃度（２０ｍｇ／ｍＬ）が、観察されないまたは予測される安定性事象を実現可能であることも実証する。
【０１４１】
ＤｏＥ２：製剤３（最も好ましい、および２０ｍｇ／ｍＬでさらなる使用のために最終的に選択される製剤）を、異なる条件での安定時間にわたり２つの製剤間の異なる性質が存在するかどうか評価するため、時間０、４０℃で４週間後および２５℃で８週間後に参照製剤とアイソフォームプロファイルに関して比較した。結果を表１９に示す。
【０１４２】
【表２０】
2018536676.tif 000023
【０１４３】
２５℃でのさらなる時点（８週間）も、参照製剤に関して減少したｐＨに由来する主な事象を強調しなかった。
【実施例４】
【０１４４】
抗酸化剤（Ｌ−メチオニン）の効果
国際公開第２０１３０７９１７４号パンフレットに開示の製剤においてメチオニンが使用されたように、本アベルマブ製剤開発は、抗酸化剤としてのこの化合物の影響を明らかにすることも目的とした。
【０１４５】
１０ｍｇ／ｍＬの試料（ＤｏＥ１セットから）を２００μＬの６％Ｈ２Ｏ２によって２倍に希釈し、約５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度および３％Ｈ２Ｏ２を得て、次いで５℃で３時間インキュベートした。インキュベートの終わりに、試料をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）４ｍＬ  １０ｋＤａを使用して超遠心分離によって水に対して洗浄した（各ステップ、１ｍＬを４回洗浄）。Ａｍｉｃｏｎ処置後の最終タンパク質濃度は約１０ｍｇ／ｍＬであった。
【０１４６】
ＤｏＥ１：製剤８は、Ｌ−メチオニンの存在を除いてＤｏＥ２の参照製剤と同一である：２つの製剤のＨ２Ｏ２による強制的な酸化（２〜８℃で３時間）、ならびに続くｉＣＥ２８０（酸化は通常、電気泳動図におけるより酸性種の増加をもたらす）およびバイオアナライザーによる試験は、抗酸化剤の存在により２つの製剤にいずれかの違いが生じるかどうか測定することを目的とした。結果を表２０および２１に示す。
【０１４７】
【表２１】
2018536676.tif 000024
【０１４８】
相当する酸性クラスターの存在量を２つの製剤に関して観察した（メチオニンありまたはなし）。
【０１４９】
バイオアナライザーにより、断片もこれらの試料に関して試験した（表２１）：
相当するレベルの断片化が２つの製剤に関して観察された（メチオニンありまたはなし）。
【０１５０】
【表２２】
2018536676.tif 000025
【０１５１】
これらの結果は、抗酸化剤がアベルマブの安定化に必要ではなく、したがって製剤から除かれ得ることを示す。
【実施例５】
【０１５２】
長期安定性試験
５．１  製剤組成および濃度
表２２に列挙したアベルマブ製剤１、２、３、４、および５を製造し、長期安定性試験に使用した。製造工程は、調合に続いてバイアルへの最終充填前に０．２２μｍ膜（ＰＥＳおよびＰＶＤＦフィルターを試験した）を通す滅菌二重濾過ステップを含んだ。実施例２および３に記載のように参照に相当する製剤５はＤｏＥ１およびＤｏＥ２試験にも使用した。
【０１５３】
【表２３】
2018536676.tif 000026
【０１５４】
製造時（時間０）、オスモル濃度を測定し、期待値（範囲：３２０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ）に一致していることを見出した。
【０１５５】
５．２  安定性試験計画および期間
製剤の安定性に関して、試験スケジュール、保管条件、および適用される試験を表２３に要約する。各時点に関して、表は試験される保管条件を示す。
試料の保管は、立位のバイアルで行った。試験は４０℃で１カ月、促進条件（２５℃）で６カ月、長期条件（２〜８℃）で１２カ月にわたり実施した。
【０１５６】
【表２４】
2018536676.tif 000027
【０１５７】
データは、４０℃（１カ月まで）、２５℃（６カ月まで）、および２〜８℃（１２カ月まで）で回収した。
【０１５８】
５．３  ２〜８℃での安定性
５．３．１  目視検査による呈色の程度
安定性に関して変化は観察されなかった。全ての溶液は、最も透明な標準液（＜Ｙ７）よりも透明なままである。値は規定内である。
【０１５９】
５．３．２  比濁計による白濁の程度
全ての溶液は、透明な溶液の範囲（１〜３ＮＴＵ）に含まれる濁度を示す。値は規定内である。
【０１６０】
５．３．３  ｐＨ
安定性に関して、変化は観察されなかった。全ての溶液は目標に一致したｐＨ値を示す（製剤１から４は５．２±０．１、参照ＤＰは５．５±０．１）。値は規定内である。
【０１６１】
５．３．４  ＯＤによるタンパク質含量
製剤１および２の濃度（目標濃度＝２０ｍｇ／ｍＬ）は、試験中１８．７〜１９．８ｍｇ／ｍＬの範囲内（目標に対して±１０％限度内）であり、経時的に著しい変化がないことが見出された。
製剤３および４、ならびに参照ＤＰの濃度（目標濃度＝１０ｍｇ／ｍＬ）は、試験中９．３〜１０．２ｍｇ／ｍＬの範囲内であることが見出され、著しい変化が見出されなかった。
したがって、タンパク質含量は、２〜８℃での安定性が１２カ月にわたり変わらないままである（値は規定内である）。
【０１６２】
５．３．５  ＳＥ−ＨＰＬＣによるダイマーおよびＨＭＷ
時間０に関して２〜８℃で１２カ月にわたり凝集の変化は見られなかった。値は規定内である。
【０１６３】
５．３．６  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎ−Ｒｅｄによる断片（ＬＭＷ）
図１１に示すように、試料は、１１．９〜１６．２％の範囲のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎ−ＲＥＤによるＬＭＷの時間０値を示し、続いて次の時点（８週間）で＋５〜７％増加、および安定性試験の残りの間、６カ月まで小さな変化を示した。
【０１６４】
５．３．７  サブビジブル粒子
容器当たりのサブビジブル粒子に関して、数値は１００ｍＬより少ない規準含量の注入または注射用溶液のために米国、欧州、および日本薬局方によって設定された限度未満であった（１０μｍ以上である容器あたり６０００および２５μｍ以上である容器あたり６００）。２つの粒子サイズ範囲に関する適当な棒グラフをサブビジブル粒子≧１０μｍおよびサブビジブル粒子≧２５μｍについてそれぞれ図１２および図１３に示す。
保管時のサブビジブル粒子の変化は強調されなかった。
【０１６５】
５．３．８  生物活性
生物活性値は、典型的には安定性試験のうちに試験した全ての時点で８９〜１１０％の範囲であった。保管時に低下は観察されなかった。
【０１６６】
５．３．９  アイソフォームパターン
ｉＣＥ２８０実験からの結果を図１４（酸性クラスター、ピーク１−２−３−４の合計）、図１５（主要ピーク）、および図１６（塩基性クラスター、ピーク６−７の合計）に報告する。アイソフォームプロファイルは、１２カ月の安定性期間を通して保持される。冷蔵条件では、抗体のアイソフォームへのｐＨの影響は観察されない。
【０１６７】
５．３．１０  ２〜８℃での安定性の結果
試験した５つの製剤の物理化学的特性は、２〜８℃での１２カ月の安定性に関して著しい変化を受けないことが見出された。このことは特にアイソフォームパターンに関して、製剤１から４においてメチオニンが存在しないため驚きである。
【０１６８】
５．４  ２５℃での安定性
５．４．１  目視検査による呈色の程度
安定性に関して変化は観察されなかった。全ての溶液は、最も透明な標準液（＜Ｙ７）よりも透明なままである。値は規定内である。
【０１６９】
５．４．２  比濁計による白濁の程度
全ての溶液は、１〜３ＮＴＵの間（透明な溶液の範囲）に含まれる濁度を示す。値は規定内である。
【０１７０】
５．４．３  ｐＨ
安定性に関して変化は観察されなかった。全ての溶液は目標に一致したｐＨ値を示す（製剤１−２−３−４は５．２±０．１、参照ＤＰは５．５±０．１）。値は規定内である。
【０１７１】
５．４．４  ＯＤによるタンパク質含量
製剤１および２の濃度（目標濃度＝２０ｍｇ／ｍＬ）は、試験中１８．５〜２０．０ｍｇ／ｍＬの範囲内（目標に対して±１０％限度内）であり、経時的に著しい変化がないことが見出された。
製剤３および４、ならびに参照ＤＰの濃度（目標濃度＝１０ｍｇ／ｍＬ）は、試験中９．５〜１０．０ｍｇ／ｍＬの範囲内であることが見出され、著しい変化は見出されなかった。
したがって、タンパク質含量は、２５℃での６カ月の安定性に関して変わらないままである。値は規定内である。
【０１７２】
５．４．５  ＳＥ−ＨＰＬＣによるダイマーおよびＨＭＷ
時間０に関して２５℃で６カ月にわたり凝集の変化は見られなかった。試験を通して、規定限度（５％以下）より少ない凝集が見出された。
【０１７３】
５．４．６  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎ−Ｒｅｄによる断片（ＬＭＷ）
試料は、１１．９〜１６．２％の範囲のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎ−ＲＥＤによるＬＭＷの時間０値を示し、続いて次の時点（４週間）で段階的増加、続いて安定性試験の残りの間、６カ月まで小さな変化を示した（図１７）。
【０１７４】
５．４．７  サブビジブル粒子
容器当たりのサブビジブル粒子に関して、数値は１００ｍＬより少ない規準含量の注入または注射用溶液のために米国、欧州、および日本薬局方によって設定された限度未満であった（１０μｍ以上である容器あたり６０００および２５μｍ以上である容器あたり６００）。適当な棒グラフを図１８および図１９に示す。
２５℃でのサブビジブル粒子の安定性の変化は強調されなかった。
【０１７５】
５．４．８  生物活性
生物活性値は、典型的には安定性試験のうちに試験した全ての時点で９０〜１１０％の範囲であった。２５℃での安定時に低下は観察されなかった。
【０１７６】
５．４．９  アイソフォームパターン
ｉＣＥ２８０実験からの結果を図２０（酸性クラスター、ピーク１−２−３−４の合計）、図２１（主要ピーク）、および図２２（塩基性クラスター、ピーク６−７の合計）に報告する。
酸性クラスターは２５℃での保管時に増加する傾向がある。全ての試料は、２５℃で６カ月後、約＋１０％の酸性クラスターの増加を示し、同時に主要ピーク（６カ月後、−５％）および塩基性クラスター（６カ月後、−５％）の減少を示した。
【０１７７】
５．４．１０  ２５℃での安定性の結果
２５℃で６カ月の安定性に関して、試験した５つの製剤は、時間０に対するタンパク質含量、外観、透明度、ｐＨ、凝集、サブビジブル粒子、および生物活性に関して変化を示さなかった。
２５℃で６カ月後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎ−ＲＥＤにより、断片は＋５パーセントポイント増加することが見出されたが、バイオアナライザーによって統計的に有意な変化は強調されなかった。
ｉＣＥ２８０によるアイソフォームプロファイルにおける類似の性質：全ての製剤の酸性クラスターは、６カ月試験に関して＋１０％増加し、同時に主要ピークおよび塩基性クラスターが減少する傾向がある。
【０１７８】
５．５  ４０℃での安定性
５．５．１  目視検査による呈色の程度
安定性に関して変化は観察されなかった。全ての溶液は、最も透明な標準液（＜Ｙ７）よりも透明なままである。
【０１７９】
５．５．２  比濁計による白濁の程度
安定性に関して変化は観察されなかった。全ての溶液は、２ＮＴＵ（透明な溶液の範囲）からなる濁度を示す。値は規定内である。
【０１８０】
５．５．３  ｐＨ
安定性に関して変化は観察されなかった。全ての溶液は目標に一致したｐＨ値を示す（製剤１−２−３−４は５．２±０．１、参照ＤＰは５．５±０．１）。値は規定内である。
【０１８１】
５．５．４  ＯＤによるタンパク質含量
製剤１および２の濃度（目標濃度＝２０ｍｇ／ｍＬ）は、試験中１８．０〜１９．０ｍｇ／ｍＬの範囲内（目標に対して±１０％限度内）であり、経時的なタンパク質の減少に向かう傾向はないことが見出された。
製剤３および４、ならびに参照ＤＰの濃度（目標濃度＝１０ｍｇ／ｍＬ）は、試験中９．５〜１０．０ｍｇ／ｍＬの範囲内であり、経時的なタンパク質の減少に向かう傾向はないことが見出された。値は規定内である。
結論として、熱ストレスは、試験した条件でのタンパク質含量に有害ではない（４０℃で１カ月まで）。
【０１８２】
５．５．５  ＳＥ−ＨＰＬＣによるダイマーおよびＨＭＷ
１カ月後、凝集の主な変化は強調されなかった。１カ月後、全ての値は１％総凝集未満であった（規定限度より低く、５％以下である）。
【０１８３】
５．５．６  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎ−Ｒｅｄ、バイオアナライザーによる断片（ＬＭＷ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎ−ＲＥＤ法の変動性を考慮すると（例えば、ＤＰ０１−１９０２１４およびＤＰ０２−１９０２１４では、時間０値はそれぞれ１１．９および１４．５が測定された）、４０℃での試験中主な変化は生じなかったと結論付けられる（図２３）。
【０１８４】
５．５．７  サブビジブル粒子
容器当たりのサブビジブル粒子に関して、数値は１００ｍＬより少ない規準含量の注入または注射用溶液のために米国、欧州、および日本薬局方によって設定された限度未満であった（１０μｍ以上である容器あたり６０００および２５μｍ以上である容器あたり６００）。適当な棒グラフを図２４および図２５に示す。
熱ストレス時のサブビジブル粒子の変化は強調されなかった。
【０１８５】
５．５．８  生物活性
生物活性値は、典型的には安定性試験のうちに試験した全ての時点で９９〜１２０％の範囲であった。試料の熱ストレス時に低下は観察されなかった。
【０１８６】
５．５．９  アイソフォームパターン
ｉＣＥ２８０実験からの結果を図２６（酸性クラスター、ピーク１−２−３−４の合計）、図２７（主要ピーク）、および図２８（塩基性クラスター、ピーク６−７の合計）に報告する。
酸性クラスターは４０℃での保管時に増加する傾向がある。
【０１８７】
主要ピークの変化により（Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden）、１０ｍｇ／ｍＬの新しい製剤のわずかに良い安定性および残りの組成物の同一の性質を確認した。
【０１８８】
塩基性クラスター測定によって得られた結果により上記の結果を確認した。
２週間まで、５つの組成物において同様の性質が観察された。より高い安定時間において、２０ｍｇ／ｍＬのアベルマブＤＰと１０ｍｇ／ｍＬのアベルマブＤＰの間においてわずかな差が生じる（１０ｍｇ／ｍＬの製剤においてわずかに良い耐性）。
【０１８９】
５．５．１０  ４０℃での安定性の結果
４０℃（１カ月）において、試験した５つの製剤は、時間０に対するタンパク質含量、外観、透明度、ｐＨ、凝集、サブビジブル粒子、および生物活性に関して変化を示さなかった。
１０ｍｇ／ｍＬのＤＰ製剤と２０ｍｇ／ｍＬのＤＰ製剤の間のわずかな違いは、ｉＣＥ２８０によって強調された（酸性クラスターは、保管時にいくらかの増加を受ける傾向があり、１０ｍｇ／ｍＬのＤＰ製剤よりも２０ｍｇ／ｍＬのＤＰ製剤においてわずかに明らかである）。
【０１９０】
５．６  結論
５．６．１  ２〜８℃での安定性（１２カ月）
全ての製剤が安定であることが見出された：時間０に対する外観、濁度（比濁計による）、サブビジブル粒子、ｐＨ、タンパク質含量（ＯＤによる）、凝集（ＳＥ−ＨＰＬＣによる）、断片（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎ−ＲＥＤおよびバイオアナライザーによる）、アイソフォームプロファイル（ｉＣＥ２８０による）、および生物活性（バイオアッセイによる）に関して著しい変化は観察されなかった。
５．６．２  ２５℃での安定性（６カ月）
時間０に対するタンパク質含量、外観、透明度、ｐＨ、凝集、サブビジブル粒子、および生物活性に関して変化は見られなかった。
断片は、２５℃で６カ月後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎ−ＲＥＤにより＋５％の増加が見出されたが、バイオアナライザー（断片化の発生の結論にロバスト性を追加する追加のツールとして使用した方法）により統計的に有意な変化は強調されなかった。
同様の性質がｉＣＥ２８０によるアイソフォームプロファイルにおいて観察された：全ての製剤の酸性クラスターは、６カ月試験に関して＋１０％増加し、同時に主要ピークおよび塩基性クラスターが減少する傾向がある。
【０１９１】
５．６．３  ４０℃での安定性（１カ月）
時間０に対するタンパク質含量、外観、透明度、ｐＨ、凝集、サブビジブル粒子、および生物活性に関して変化は見られなかった。
１０ｍｇ／ｍＬのＤＰ製剤と２０ｍｇ／ｍＬのＤＰ製剤の間のわずかな違いはｉＣＥ２８０によって強調された（酸性クラスターは、保管時にいくらかの増加を受ける傾向があり、１０ｍｇ／ｍＬのＤＰ製剤よりも２０ｍｇ／ｍＬのＤＰ製剤においてわずかにより明らかである）。
【０１９２】
５．７  ２４カ月にわたる安定性
５．７．１  ＤＰ組成物の製造
以下のＤＰ組成物を製造し、それらの安定性を２４カ月の期間にわたって試験した。
【０１９３】
【表２５】
2018536676.tif 000028
【０１９４】
表２２に示したように、両製剤は製剤ＤＰ  ０１−１９０２１４に相当する。違いは、固定量０．３ｍｇ／ｍＬ（７．５ｍＭ）の水酸化ナトリウムが使用され、０．６ｍｇ／ｍＬの氷酢酸と組み合わせた場合にｐＨ５．２を生じたことのみである。製剤ＤＰ  ０１−１６０４１４とＤＰ  ０２−１６０４１４の間の唯一の違いは、後者の製剤がバイアルあたり３０ｍＬの容積であるのに対し前者はバイアルあたり１０ｍＬであることである。
【０１９５】
両製剤は、０．２２μｍ  ＰＶＤＦ膜を通して二重濾過し、続いてバイアルに手動で充填した。濾過の前後にタンパク質含量を試験し、関連する結果は、二重無菌濾過時にタンパク質の喪失が生じないことを示す。
【０１９６】
２４カ月まで（＋５±３℃）、および＋２５℃±２℃（ＲＨ６０％±５％）で６カ月までの安定性データをそれぞれの最終濃度（バイアル）の２つの製剤において回収した。
【０１９７】
５．７．２  ２４カ月までの安定性（＋５±３℃）
＋５±３℃で、２４カ月まで、タンパク質含量（ＯＤによる）、ＨＭＷ（ＳＥ−ＨＰＬＣによる）、濁度（比濁計による）、粒子形成（光オブスキュレーションによる）、呈色の程度（目視検査による）、および生物作用能において変化が観察されなかった。酸性アイソフォームにおいてわずかな増加（２年後、全ての組成物に関して＋５％が観察された）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｎ−ＲＥＤ，バイオアナライザー、およびＣＥ−ＳＤＳ  Ｎ−ＲＥＤによる断片化に関して、統計的に有意な変化は観察されなかった。
【０１９８】
５．７．３  ＋２５℃±２℃（ＲＨ６０％±５％）での６カ月までの安定性
＋２５℃±２℃（ＲＨ６０％±５％）で、６カ月まで、タンパク質含量（ＯＤによる）、ＨＭＷ（ＳＥ−ＨＰＬＣによる）、濁度（比濁計による）、粒子形成（光オブスキュレーションによる）、アイソフォームプロファイル（ｉＣＥ２８０による）、呈色の程度（目視検査による）、電気泳動の純度（ＳＤＳ／−ＰＡＧＥ  ＲＥＤによる）、および生物作用能において変化は観察されなかった。５℃での安定性と同様に、断片化の統計的に有意な増加は＋２５℃±２℃（ＲＨ６０％±５％）で観察されなかった（結果はバイオアナライザーによって確認した）。
【０１９９】
５．７．４  保留時間
濾過前の保留時間（バッグ内、室温で２４時間まで）、濾過後の保留時間（バッグ内、室温で７２時間まで）、および振盪（室温、２００ｒｐｍで２４時間まで）は、タンパク質含量、粒子形成、凝集、および濁度において著しい変化を示さず、したがって、典型的には製造工程中と考えられる標準的な操作時間中に生じ得る主要な事象はないことを示した。
【０２００】
５．７．５  凍結／融解試験
凍結／融解試験は、試験した製剤が−８０℃で安全に凍結され、次いでタンパク質に主な変化を生じずに、＋５±３℃、または＋２５℃まで加温することができることを証明した。
【図１】
2018536676.tif 000029
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018536676.tif 000035
【図８】
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【図９】
2018536676.tif 000037
【図１０】
2018536676.tif 000038
【図１１】
2018536676.tif 000039
【図１２】
2018536676.tif 000040
【図１３】
2018536676.tif 000041
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
2018536676.tif 000051
【図２４】
2018536676.tif 000052
【図２５】
2018536676.tif 000053
【図２６】
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【図２７】
2018536676.tif 000055
【図２８】
2018536676.tif 000056
【配列表】
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【国際調査報告】
2018536676.tif 000057
2018536676.tif 000058
2018536676.tif 000059