(57)【要約】本発明は、一つには、がん患者から得た腫瘍組織を含む試料を採点するためのシステム及び方法に関する。前記方法から得られるスコアは、患者が免疫療法に対して積極的に応答し得る可能性を示す可能性がある。本発明はまた、一つには、がん患者から得た組織試料の視野内に含まれる全細胞若しくは、場合により、１つ以上のそのサブセットに関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）を導き出す方法にも関する。ＰＢＰ値は、免疫療法に対する患者の反応を示すことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
画像処理システムであって、
コンピュータ可読媒体に記憶された指示を実行するように設定された処理回路を含む画像処理コントローラを備えており、前記指示が、前記画像処理システムの前記コントローラに、
がん患者から採取した腫瘍組織試料を表現する画像データをイメージング装置から受信させ、そして
前記画像データを用いて、前記腫瘍組織内の少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する前記少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、前記第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する前記少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めさせる
ものであり、その場合、前記スコアが、前記がん患者が免疫療法に積極的に反応する可能性を示す、前記画像処理システム。
【請求項２】
前記少なくとも１対の細胞間の近接を表す前記スコアが、前記１対の細胞が互いに所定の近接内に存する程度を表す、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記近接が、画素スケールに基づいて評価される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記１対の細胞間の前記所定の近接が、約１画素〜約１００画素までの範囲である、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記１対の細胞間の前記所定の近接が、約５画素〜約４０画素までの範囲である、請求項２に記載のシステム。
【請求項６】
前記１対の細胞間の前記所定の近接が、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である、請求項２に記載のシステム。
【請求項７】
前記１対の細胞間の前記所定の近接が、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である、請求項２に記載のシステム。
【請求項８】
前記スコアが、前記１対の細胞の境界線間の近接を獲得することによって求められる、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記スコアが、前記１対の細胞の質量中心間の近接を獲得することによって求められる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記スコアが、前記１対の細胞の選択された第１細胞周辺の外周に基づいて境界線ロジックを用いて求められる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記スコアが、前記１対の細胞の境界線間の相互作用を求めることによって求められる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記スコアが、前記１対の細胞の重なり領域を求めることによって求められる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記処理回路がさらに、前記画像処理システムの前記コントローラに、
前記画像データを単純画像データに分け、そして
前記データを複数のデータチャネルから提供させる指示を実行するようにも設定されており、その場合、第１データチャネル内の前記単純画像データは、前記第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の前記単純画像データは、前記第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現するものである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記スコアを求めるために、前記処理回路がさらに、前記画像処理システムの前記コントローラに、
前記第１データチャネルからの前記第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、前記第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むように選択された所定のマージン単位で拡張することによって、拡張された第１バイオマーカーマスクを生成させ、
前記第２バイオマーカーを発現しかつ前記第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する前記拡張された蛍光信号に取り囲まれた全細胞に関する第１総面積である相互作用面積を求めさせ、
前記相互作用面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせることによって、空間的近接スコアに至らせる
指示を実行するようにも設定されている、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記正規化因子が、前記第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記相互作用面積が、前記拡張された第１バイオマーカーマスクを、前記第２データチャネルの信号から求められた前記第２バイオマーカーを発現する細胞を表すマスクと組み合わせることによって求められる、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
第３データチャネルが、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、また、第４データチャネルが、前記試料内の腫瘍領域に起因する蛍光信号を表現する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１８】
前記第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の前記総面積が、前記第３データチャネルからの信号に基づく、前記試料内の全細胞を表す細胞マスクと、前記第４データチャネルからの信号に基づく、前記試料上の腫瘍領域を表す腫瘍領域マスクとを組み合わせることによって求められる、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
前記細胞マスクと前記腫瘍領域マスクとを組み合わせることが、前記腫瘍領域マスクを前記細胞マスクから除去することを含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記マスクがそれぞれ、選択されたチャネルからの画像データの各画素に２進値を割り当てることによって生成される、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２１】
前記２進値が、閾値関数によって各値に割り当てられるものであり、その場合、前記閾値関数が、所定の強度閾値以上の強度を有する各画素には値１を割り当てて、前記所定の強度閾値未満の強度を有する各画素には値０を割り当てる、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記２進値が、ヒストグラム閾値関数によって各値に割り当てられるものであり、その場合、前記ヒストグラム閾値関数が、画素強度のスライディングスケールを用いて閾値を求め、そして強度閾値以上の強度を有する各画素には値１を割り当てて、前記強度閾値未満の強度を有する各画素には値０を割り当てる、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
前記閾値が、
画素全ての強度を合計して合計強度とすることと、
閾値（％）に前記合計強度を掛けることによって、カットオフ合計を得ることと、
全画素をヒストグラムの強度によって分類することと、
前記カットオフ合計が得られるまであらゆる前記画素強度を合計すること
によって求められ、その場合、処理中に達した最後の最高画素強度が、前記強度閾値である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記マスクの組み合わせが、「ａｎｄ」演算を用いて行われ、その場合、「ａｎｄ」演算は、第１マスク内の画素の画素強度に第２マスク内の画素の画素強度を掛け合わせることである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２５】
前記マスクの組み合わせが、「ｏｕｔ」演算を用いて行われ、その場合、前記「ｏｕｔ」演算は、第１マスクから第２マスクを除去するものである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記処理回路がさらに、前記画像処理システムの前記コントローラに、
前記画像において前記第１バイオマーカー又は前記第２バイオマーカーの濃度を表す画像データを低倍率で獲得させ、
前記第１バイオマーカー又は前記第２バイオマーカーの最高濃度を含む領域を特定させ、
前記第１バイオマーカー又は前記第２バイオマーカーの最高濃度を含む所定の数の前記領域を選択させ、
前記イメージング装置へ、前記所定の数の領域に対して高倍率画像データを獲得させるように指示を送信させる
指示を実行するようにも設定されており、その場合、前記高倍率画像データが解析のために前記コントローラに供給されて、前記スコアを求めるために使用される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２７】
前記低倍率が１０倍以下であり、前記高倍率が１０倍超である、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記低倍率が１０倍であり、前記高倍率が４０倍である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記低倍率が１０倍であり、前記高倍率が２０倍である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３０】
前記低倍率が４倍であり、前記高倍率が４０倍である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３１】
前記低倍率が４倍であり、前記高倍率が２０倍である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３２】
前記画像処理装置がさらに、前記スコアを、前記試料の前記画像に関するメタデータと結びつけるようにも設定されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記画像処理装置が、前記スコアを包含する報告を作成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３４】
前記画像処理装置がさらに、免疫療法の方針を決定するためにオペレータに前記スコアを提供するようにも設定されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３５】
前記画像処理装置がさらに、データベースに前記スコアを記録するようにも設定される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３６】
前記画像処理装置がさらに、前記スコアを患者の医療記録と結びつけるようにも設定される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３７】
前記画像処理装置がさらに、ディスプレイ装置に前記スコアを表示するようにも設定される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３８】
前記少なくとも１対の細胞の前記第１メンバーが、腫瘍細胞を含み、また、前記少なくとも１対の細胞の前記第２メンバーが、非腫瘍細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３９】
前記非腫瘍細胞が免疫細胞を含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記少なくとも１対の細胞の前記第１メンバー及び前記第２メンバーが、免疫細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４１】
前記少なくとも１対の細胞の前記第１メンバーが、腫瘍細胞、骨髄性細胞、又は間質細胞を含み、また、前記少なくとも１対の細胞の前記第２メンバーが、免疫細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４２】
前記の腫瘍細胞、骨髄性細胞、又は間質細胞が、ＰＤ−Ｌ１を発現し、また、前記免疫細胞が、ＰＤ−１を発現する、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記画像処理装置がさらに、前記がん患者から採取した腫瘍組織を含む前記試料から入手できる所定の数の視野を選択して、各視野に関するデータから前記スコアを求めるようにも設定されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項４４】
前記試料が、複数の蛍光タグで染色されており、そしてその場合、前記蛍光タグがそれぞれ、特有のバイオマーカーを対象としている、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
前記複数の蛍光タグが、前記第１バイオマーカーに関する第１蛍光タグと、前記第２バイオマーカーに関する第２蛍光タグを含む、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４６】
前記マージンが約１画素〜約１００画素までの範囲である、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４７】
前記第２バイオマーカーを発現する前記近接した細胞が、前記第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５〜約５０μｍの範囲に存する、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４８】
前記所定の係数が１０４である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項４９】
前記少なくとも１対の細胞の前記第１メンバーが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第１バイオマーカーを発現し、また、前記少なくとも１対の細胞の前記第２メンバーが、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される第２バイオマーカーを発現する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５０】
前記閾値が約５００〜約５０００までの範囲である、請求項１に記載のシステム。
【請求項５１】
前記閾値が、約９００±１００である、請求項５０に記載のシステム。
【請求項５２】
前記免疫療法が、免疫チェックポイント療法を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５３】
腫瘍組織試料において少なくとも１対の細胞間の近接を表すスコアを求めるためのシステムであって、前記システムがメモリを含む処理回路を備えており、前記メモリが、
イメージング装置から画像データを受信して、前記画像データを単純画像データへ分けて、前記データを複数のデータチャネルから供給するように設定された、分光分離装置であって、第１データチャネル内の前記単純画像データが、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、第２データチャネル内の前記単純データが、腫瘍組織に起因する蛍光信号を表現し、また、第３データチャネル内の前記単純データが、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、第４データチャネル内の前記単純画像データが、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する、前記分光分離装置と、
前記第１データチャネルから前記画像データを受信して、視野内に全核を表す画像を生成して、前記画像を拡張することによって、細胞マスクを生成するように設定された、細胞マスカーと、
前記第２データチャネルから前記画像データを受信して、前記視野内に全腫瘍領域のマスクを生成するように設定された、腫瘍領域マスカーと、
前記第３データチャネルから前記画像データを受信して、前記第１バイオマーカーを発現する全細胞の第１バイオマーカーマスクを前記視野内に生成するように設定された、第１バイオマーカーマスカーと、
前記第４データチャネルから前記画像データを受信して、前記第２バイオマーカーを発現する全細胞の第２バイオマーカーマスクを前記視野内に生成するように設定された、第２バイオマーカーマスカーと、
前記細胞マスクと前記腫瘍領域マスクを組み合わせて、非腫瘍細胞マスク及び腫瘍細胞マスクのうち少なくとも１つを生成するように設定された、腫瘍マスカーと、
前記第１バイオマーカーマスクを拡張して拡張された第１バイオマーカーマスクを生成するように設定された、拡張装置と、
前記拡張された第１バイオマーカーマスクと前記第２バイオマーカーマスクが相互作用マスクを生成するように設定された、相互作用マスカーと、
空間的近接スコアを計算するように設定された、相互作用計算機と、
を含む、前記システム。
【請求項５４】
前記相互作用計算機が、前記相互作用マスクの面積を、前記非腫瘍細胞マスク、前記腫瘍細胞マスク及び前記細胞マスクのうち１つの面積で割るように設定されている、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５５】
前記空間的近接スコアが、次の式にしたがって計算される、請求項５３に記載のシステム。
【数１】
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（前記式中、ＡIは、相互作用総面積（前記相互作用マスクの面積）であり、また、ＡＣは、前記非腫瘍細胞マスク、前記腫瘍細胞マスク及び前記細胞マスクのうちの少なくとも１つの総面積である。）
【請求項５６】
組織試料の画像を処理して組織内の少なくとも１対の細胞間の近接を表すスコアを求める方法であって、前記方法が、
がん患者から採取した腫瘍組織を含む前記組織試料に関連する画像データを受信することと、
複数の蛍光タグで染色された前記試料から少なくとも１つの視野を選択することであって、前記選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞をより多く含む少なくとも１つの視野を選択することに偏っている、ことと、
前記の選択された視野それぞれにおいて、前記第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むのに十分なマージン単位で拡張することと、
前記第２バイオマーカーを発現し、かつ前記第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する前記拡張された蛍光信号に取り囲まれた前記選択された視野それぞれからの全細胞に対する第１総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間的近接スコアに至ることと、
前記スコアを記録することと、
を含み、前記スコアが、閾値と比較したときに、前記がん患者が免疫療法に積極的に反応する可能性を示すものである、前記方法。
【請求項５７】
前記方法が、前記第１バイオマーカーの発現の定量化又は前記第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５８】
前記方法が、前記第１バイオマーカーの発現の定量化又は前記第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５９】
前記方法が、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記予測力が、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記陽性予測値が６５％以上である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記陽性予測値が７０％以上である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記陽性予測値が７５％以上である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記陰性予測値が６５％以上である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記陰性予測値が８０％以上である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
腫瘍組織試料においてバイオマーカー陽性値を求めるためのシステムであって、前記システムが、メモリを含む処理回路を備えており、前記メモリが、
イメージング装置から画像データを受信して、前記画像データを単純画像データへ分けて、前記データを複数のデータチャネルから供給するように設定された、分光分離装置であって、第１データチャネル内の前記単純画像データが、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、第２データチャネル内の前記単純データが、対象であるサブセット組織に起因する蛍光信号を表現し、また、第３データチャネル内の前記単純データが、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する、前記分光分離装置と、
前記第１データチャネルからの前記画像データを用いて、視野内に全核を表す画像を生成して、前記画像を拡張することによって、細胞マスクを生成するように設定された、細胞マスカーと、
前記第２データチャネルからの前記画像データを用いて、前記視野内に全サブセット組織領域のマスクを生成するように設定された、サブセット領域マスカーと、
前記第３データチャネルからの前記画像データを用いて、前記第１バイオマーカーを発現する全細胞の第１バイオマーカーマスクを前記視野内に生成するように設定された、第１バイオマーカーマスカーと、
前記細胞マスクと前記サブセット組織領域マスクを組み合わせて、非サブセット細胞マスク及びサブセット細胞マスクのうち少なくとも１つを生成するように設定された、サブセット細胞マスカーと、
前記バイオマーカーマスクを前記非サブセット細胞マスク及び前記サブセット細胞マスクのうち少なくとも１つと組み合わせるように設定された、組み合わせマスカーと、
バイオマーカー陽性値を計算するように設定された、陽性計算装置と、
を含む、前記システム。
【請求項６７】
前記計算機が、前記バイオマーカーマスクの面積を前記非サブセット細胞マスクと前記サブセット細胞マスクのうち少なくとも一方の面積で割って、前記バイオマーカー陽性値を計算するように設定されている、請求項６６に記載のシステム。
【請求項６８】
前記第１バイオマーカーが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から選択されるバイオマーカーを含む、請求項６６に記載のシステム。
【請求項６９】
前記第２バイオマーカーが、前記第１バイオマーカーとは異なり、かつ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から選択されるバイオマーカーを含む、請求項６６に記載のシステム。
【請求項７０】
前記対象であるサブセット組織が腫瘍組織であり、前記サブセット細胞が腫瘍細胞であり、また、前記非サブセット細胞が非腫瘍細胞である、請求項６６に記載のシステム。
【請求項７１】
画像処理装置を備えたシステムであって、
患者から採取した組織試料を表現する画像データをイメージング装置から受信し、そして
対象であるバイオマーカーを発現するタイプの前記試料内の細胞の量を前記試料中の前記タイプの細胞の全量と比較して表すバイオマーカー陽性値を求める
ように設定された、前記システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本発明は、２０１５年１０月２３日出願の米国仮特許出願番号第６２／２４５，９３８号、２０１５年１１月２４日出願同第６２／２５９，３２８号及び２０１６年２月２９日出願同６２／３０１，０３７号に基づく優先権を主張するものであり、これら特許出願はいずれも、その全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、一般に、がん治療分野に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第７，５５５，１５０号明細書
【発明の概要】
【０００４】
本明細書には、一態様において、コンピュータ可読媒体に記憶された指示を実行するように設定された処理回路を含む画像処理コントローラを備えた、イメージングシステムであって、前記指示は、前記画像処理システムのコントローラに、がん患者から採取した腫瘍組織試料を表現するイメージング装置から画像データを受信させて、前記画像データを用いて、腫瘍組織中の少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めさせるように設定されたものであり、その場合、前記スコアは、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである、前記イメージングシステムを開示している。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞間の近接を表すスコアは、１対の細胞同士が所定の近接の範囲内に存する程度を表している。いくつかの実施形態において、近接は、画素スケールに基づいて評価される。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約１画素〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約５画素〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の境界線間の近接を得ることによって求められる。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の質量中心間の近接を得ることによって求められる。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の選択された第１細胞周辺の外周に基づいて境界線ロジックを用いて求められる。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の境界線の交点を求めることによって求められる。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の重なり領域を求めることによって求められる。いくつかの実施形態において、画像処理コントローラはさらに、画像データを単純画像データに分けて、データを複数のデータチャネルから提供するようにも設定されており、その場合、第１データチャネル内の単純画像データは、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の単純画像データは、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する。いくつかの実施形態において、スコアを求めるために、画像処理コントローラは、第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲むように選択された所定のマージン単位で第１データチャネルからの第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することによって、拡張された第１バイオマーカーマスクを生成して、第２バイオマーカーを発現する全細胞の第１総面積でありかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれている相互作用面積を求めて、相互作用面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間近接スコアに至るように設定される。いくつかの実施形態において、正���化因子は、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積である。いくつかの実施形態において、相互作用面積は、拡張された第１バイオマーカーマスクと、第２データチャネルの信号から求められる、第２バイオマーカーを発現する細胞を表すマスクとを組み合わせることによって求められる。いくつかの実施形態において、第３データチャネルは、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、また、第４データチャネルは、試料内の腫瘍領域に起因する蛍光信号を表現する。いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積は、第３データチャネルからの信号に基づく、試料内の全細胞を表す細胞マスクと、第４データチャネルからの信号に基づく、試料内の腫瘍領域を表す腫瘍領域マスクとを組み合わせることによって求められる。いくつかの実施形態において、細胞マスクと腫瘍領域を組み合わせることは、腫瘍領域マスクを細胞マスクから除去することを含む。いくつかの実施形態において、マスクはそれぞれ、選択されたチャネルからの画像データの画素それぞれに２進値を割り当てることによって生成される。いくつかの実施形態において、２進値は、閾値関数によって各値に割り当てられるが、その場合、閾値関数は、所定の強度閾値以上の強度を有する各画素には値１を割り当てて、所定の強度閾値未満の強度を有する各画素には値０を割り当てる。いくつかの実施形態において、２進値は、ヒストグラム閾値関数によって各値に割り当てられ、その場合、ヒストグラム閾値関数は、画素強度のスライディングスケールを用いて閾値を求めて、強度閾値以上の強度を有する各画素には値１を割り当て、強度閾値未満の強度を有する各画素には値０を割り当てる。いくつかの実施形態において、閾値は、全ての画素強度を合計して合計強度とすることと、閾値百分率に合計強度を掛けてカットオフ合計を得て；ヒストグラムの強度によって全ての画素を分類することと、カットオフ合計が得られるまであらゆる画素強度を合計することとによって求められ、その場合、処理中に現れる最後の最高画素強度が強度閾値である。いくつかの実施形態において、マスクを組み合わせることは、「ａｎｄ」演算を用いて行われ、その場合、「ａｎｄ」演算は、第１マスク内の画素の画素強度に第２マスク内の画素の画素強度を掛け合わせることである。いくつかの実施形態において、マスクを組み合わせることは、「ｏｕｔ」演算を用いて行われ、その場合、「ｏｕｔ」演算は、第１マスクから第２マスクを除去するものである。いくつかの実施形態において、画像処理コントローラはさらに、画像内の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーの濃度を表す低倍率で画像データを獲得し、最も高濃度の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーを包含する領域を特定し、最も高濃度の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーを包含する領域を所定の数選択し、所定の数の領域に対して高倍率の画像データを獲得するようにイメージング装置に指示を送るようにも設定されており、そしてその場合、高倍率の画像データは、解析されるためにコントローラに供給されて、スコアを求めるために使用される。いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍以下であり���高倍率は、１０倍超である。いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍であり、高倍率は、４０倍である。いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍であり、高倍率は、２０倍である。いくつかの実施形態において、低倍率は、４倍であり、高倍率は、４０倍である。いくつかの実施形態において、低倍率は、４倍であり、高倍率は、２０倍である。いくつかの実施形態において、画像処理装置はさらに、スコアを、試料の画像に関するメタデータと結びつけるようにも設定される。いくつかの実施形態において、画像処理装置は、スコアを包含する報告を作成する。いくつかの実施形態において、画像処理装置はさらに、免疫療法の方針を決定するためにオペレータにスコアを提供するようにも設定される。いくつかの実施形態において、画像処理装置はさらに、データベースにスコアを記録するようにも設定される。いくつかの実施形態において、画像処理装置はさらに、スコアを患者の医療記録と結び付けるようにも設定される。いくつかの実施形態において、画像処理装置はさらに、ディスプレイ装置にスコアを表示するようにも設定される。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、腫瘍細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、非腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、非腫瘍細胞は、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバー及び第２メンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、腫瘍細胞、骨髄性細胞、又は間質細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞、骨髄性細胞、又は間質細胞は、ＰＤ−Ｌ１を発現し、また、免疫細胞は、ＰＤ−１を発現する。いくつかの実施形態において、画像処理装置はさらに、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手できる所定の数の視野を選択して、各視野に関するデータからスコアを求めるようにも設定される。いくつかの実施形態において、試料は、複数の蛍光タグで染色されており、そしてその場合、各蛍光タグは、特定のバイオマーカーを対象としている。いくつかの実施形態において、複数の蛍光タグは、第１バイオマーカーに関する第１蛍光タグと、第２バイオマーカーに関する第２蛍光タグを含む。いくつかの実施形態において、マージンは、約１画素〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーを発現する近接する細胞は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５〜約５０μｍの範囲にある。いくつかの実施形態において、所定の係数は、１０４である。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第１バイオマーカーを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ��８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される第２バイオマーカーを発現する。いくつかの実施形態において、閾値は、約５００〜約５０００までの範囲である。いくつかの実施形態において、閾値は、約９００±１００である。いくつかの実施形態において、免疫療法は、免疫チェックポイント法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。
【０００５】
別の態様において、本明細書では、腫瘍組織試料中の少なくとも１対の細胞間の近接を表すスコアを求めるためのシステムであって、前記システムは、メモリを備えており、前記メモリは、イメージング装置から画像データを受信し、画像データを単純画像データへ分け、そしてそのデータを複数のデータチャネルから供給する、分光分離装置であって、第１データチャネル内の単純画像データは、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、第２データチャネル内の単純データは、腫瘍組織に起因する蛍光信号を表現し、第３データチャネル内の単純データは、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、そして第４データチャネル内の単純画像データは、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する、前記分光分離装置と；
第１データチャネルからの画像データを使用して、視野内の全ての核を表す画像を生成し、そして画像を拡張して細胞マスクを生成する、細胞マスカーと；
第２データチャネルからの画像データを使用して、視野内の全ての腫瘍領域のマスクを生成する、腫瘍領域マスカーと；第３データチャネルからのデータを使用して、視野内の全細胞の第１バイオマーカーマスクを生成する、第１バイオマーカーマスカーと；
第４データチャネルからのデータを使用して、第２バイオマーカーを発現する視野内の全細胞の第２バイオマーカーマスクを生成する、第２バイオマーカーマスカーと；
細胞マスクと腫瘍領域マスクとを組み合わせて非腫瘍細胞マスクと腫瘍細胞マスクのうち少なくとも一方を生成する、腫瘍マスカーと；
第１バイオマーカーを拡張して第１バイオマーカーマスクを生成する、拡張装置と；
拡張された第１バイオマーカーマスクと第２バイオマーカーマスクとを組み合わせて相互作用マスクを生成する、相互作用マスカーと；
空間的近接スコアを計算する、相互作用計算機と
を備えている、前記システムを開示している。いくつかの実施形態において、相互作用計算機は、相互作用マスクの面積を、非腫瘍細胞マスク、腫瘍細胞マスク及び細胞マスクのうち１つの面積で割る。いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、次の式にしたがって計算される。
【数１】
2018536852.tif 000003
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（相互作用マスクの面積）であり、ＡＣは、非腫瘍細胞マスク、腫瘍細胞マスク及び細胞マスクのうちの少なくとも１つの総面積である。いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。
【０００６】
別の態様において、本明細書には、組織試料の画像を処理して組織内の少なくとも１対の細胞間の近接を表すスコアを求める方法であって、前記方法が、がん患者から採取した腫瘍組織を含む組織試料に関する画像データを受信することと；がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から少なくとも１つの視野を選択することであって、前記試料が複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野よりも第１バイオマーカーを発現する細胞を多く含有する少なくとも１つの視野を選択することに偏っている、ことと；選択された各視野において、第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲むのに十分なマージン単位で、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することと；選択された各視野からの全細胞に対する第１総面積であって、第２バイオマーカーを発現してかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内に取り囲まれている前記第１総面積を正規化因子で割って、その結果得られた商を所定の係数と掛けて空間的近接スコアに至ることと；前記スコアを記録することであって、前記スコアが、閾値と比較したときにがん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである、ことを含む、前記方法が開示されている。いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。
【０００７】
別の態様において、本明細書では、組織試料中のバイオマーカー陽性値を求めるためのシステムであって、前記システムは、メモリを含む処理回路を備えており、前記メモリは、イメージング装置から画像データを受信し、画像データを単純画像データへ分け、そしてそのデータを複数のデータチャネルから供給する、分光分離装置であって、第１データチャネル内の単純画像データは、細胞核に起因する蛍光信号を発現し、第２データチャネル内の単純データは、対象であるサブセット組織に起因する蛍光信号を表現し、そして第３データチャネル内の単純データは、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する、前記分光分離装置と；第１データチャネルからの画像データを使用して、視野内の全ての核を表す画像を生成し、そして画像を拡張して細胞マスクを生成する、細胞マスカーと；第２データチャネルからの画像データを使用して、視野内の全てのサブセット領域マスクを生成する、サブセット領域マスカーと；第３データチャネルからのデータを使用して、第１バイオマーカーを発現する視野内の全細胞の第１バイオマーカーマスクを生成する、第１バイオマーカーマスカーと；細胞マスクとサブセット領域マスクとを組み合わせて、非サブセット細胞マスクとサブセット細胞マスクのうち少なくとも一方を生成する、サブセットマスカーと；バイオマーカーマスクと、非サブセット細胞マスクとサブセット細胞マスクのうち少なくとも一方とを組み合わせるための組み合わせマスクと；バイオマーカー陽性値を計算するための陽性計算機とを備えている、前記システムを開示している。いくつかの実施形態において、計算機は、バイオマーカーマスクの面積を非サブセット細胞マスクとサブセット細胞マスクのうち少なくとも一方の面積で割る。いくつかの実施形態において、対象であるサブセット組織は腫瘍組織であり、サブセット細胞は腫瘍細胞であり、また、非サブセット細胞は非腫瘍細胞である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から選択されるバイオマーカーを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーは、第１バイオマーカーとは異なり、かつＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から選択されるバイオマーカーを含む。
【００１０】
別の態様において、本明細書には、画像処理装置であって、患者から採取された組織試料を表現する画像データをイメージング装置から受信し、そして対象であるバイオマーカーを発現するタイプの試料中の細胞の量を試料中の前記タイプの細胞全量と比較して表すバイオマーカー陽性値を求めるように設定された前記画像処理装置を備える、システムが開示されている。
【００１１】
本明細書には、一態様において、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するためのイメージングシステムであって、イメージング領域内で試料の位置決めをするためのステージを備えたイメージング装置と、試料に電磁放射線を向けるための電磁放射線源と、試料からの電磁放射線を検出するように設定された検出器と、コントローラとを含む、前記イメージングシステムが開示されている。コントローラは、オペレータとコントローラとの間で情報を変換するためのユーザインターフェースと、コンピュータ可読媒体に記憶された指示を実行するように設定された処理回路とを備えている。指示は、コントローラに、（ｉ）検出された電磁放射線についての情報をイメージング装置から受信させ、（ｉｉ）検出された電磁放射線に基づいて画像データを生成させ、（ｉｉｉ）画像データを解析して少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めさせ、そして（ｉｖ）スコアを記録させるように設定されており、ここで、前記スコアは、閾値と比較したとき、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、スコアは、少なくとも１対の細胞間の近接を表すものであって、１対の細胞同士が所定の近接の範囲内に存する程度を表している。いくつかの実施形態において、近接は、画素スケールに基づいて評価される。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約１画素〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約５画素〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の境界線間の近接を得ることによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の質量中心間の近接を得ることによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の選択された第１細胞周辺の外周に基づいて境界線ロジックを用いて計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の境界線の交点を求めることによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の重なり領域を求めることによって計算される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、画像データを生成することは、（ｉ）検出された電磁放射線についての情報を単純画像データに分けることと、（ｉｉ）前記データを複数のデータチャネルから提供することを含み、その場合、第１データチャネル内の単純画像データは、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の単純画像データは、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、データを解析することは、（ｉ）処理回路の拡張装置を使用して、第１データチャネルからの第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むように選択された所定のマージン単位で割って、拡張された第１バイオマーカーを生成することと、（ｉｉ）相互作用面積を求めることであって、前記相互作用面積が、第２バイオマーカーを発現する全細胞の第１総面積であり、かつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれている、ことと、（ｉｉｉ）処理回路の相互作用計算機を使用して、相互作用面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間近接スコアに至ることを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、正規化因子は、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積である。いくつかの実施形態において、相互作用面積は、拡張された第１バイオマーカーマスクを、第２データチャネルの信号から求められた第２バイオマーカーを発現する細胞を表すマスクと組み合わせることによって求められる。いくつかの実施形態において、第３データチャネルは、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、また、第４データチャネルは、試料内の腫瘍領域に起因する蛍光信号を表現する。いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積は、第３データチャネルからの信号に基づく、試料内の全細胞を表す細胞マスクと、第４データチャネルからの信号に基づく、試料上の腫瘍領域を表す腫瘍領域マスクとを組み合わせることによって求められる。いくつかの実施形態において、細胞マスクと腫瘍領域マスクとを組み合わせることは、腫瘍領域マスクを細胞マスクから除去することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、処理回路はさらに、（ｉ）画像内の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーの濃度を表す低倍率で画像データを獲得させ、（ｉｉ）最も高濃度の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーを包含する領域を特定させて、（ｉｉｉ）最も高濃度の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーを包含する所定数の領域を選択させ、（ｉｖ）イメージング装置へ指示を送って所定数の領域に対して高倍率の画像データを獲得させるようにも設定されており、その場合、高倍率の画像データは、分析のためにコントローラへ供給されて、スコアを求めるために使用される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍以下であり、高倍率は、１０倍超である。いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍であり、高倍率は、４０倍である。いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍であり、高倍率は、２０倍である。いくつかの実施形態において、低倍率は、４倍であり、高倍率は、４０倍である。いくつかの実施形態において、低倍率は、４倍であり、高倍率は、２０倍である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、コントローラは、スコアを、試料の画像に関するメタデータと結びつける。いくつかの実施形態において、コントローラは、スコアを包含する報告を作成する。いくつかの実施形態において、コントローラは、免疫療法の方針を決定するためにオペレータにスコアを提供する。いくつかの実施形態において、コントローラは、データベースにスコアを記録する。いくつかの実施形態において、コントローラは、スコアを患者の医療記録と結び付ける。
【００２０】
いくつかの実施形態において、電磁放射線源は、白熱ランプ、蛍光ランプ、又はダイオードからなる群から選択されるインコヒーレント電磁放射線源である。いくつかの実施形態において、電磁放射線源は、コヒーレント電磁放射線源である。いくつかの実施形態において、システムはさらに、電磁放射線源からの電磁放射線を試料に向けるように配置された電磁放射線調整用光学系部品も備えている。いくつかの実施形態において、電磁放射線調整用光学系部品は、異なる電磁放射線波長帯域を用いて試料を照らすように設定された、調節可能な分光フィルター素子を包含する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、システムはさらに、試料から発光された電磁放射線を収容して、その発光された電磁放射線を出力電磁放射線として検出器へ向けるように設定された、磁放射線集光光学系部品も備えている。いくつかの実施形態において、電磁放射線集光光学系部品は、試料からの電磁放射線から特定の電磁放射線波長帯域を選択するように設定された、調節可能な分光フィルター素子を包含する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、検出器は、少なくとも１つのＣＣＤセンサーを備えている。いくつかの実施形態において、検出器は、光電子増倍管を備えている。いくつかの実施形態において、検出器は、試料からの電磁放射線に応じて電気信号を発生して、その電気信号をコントローラへ伝えるように設定されている。
【００２３】
いくつかの実施形態において、コントローラはさらに、電気信号をステージ、電磁放射線源及び検出器のうち１つ以上へ送ることによって、ステージ、電磁放射線源及び／又は検出器のうち少なくとも１つの特性を調節するようにも設定されている。いくつかの実施形態において、システムはさらに、情報をオペレータへ表示するためのディスプレイ装置も備えている。いくつかの実施形態において、表示される情報は、システムのパラメータ、システムの特性及び試料の取り込み画像のうち１つである。いくつかの実施形態において、コントローラは、ディスプレイ装置にスコアを表示する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、イメージング装置からの検出された電磁放射線についての情報は、複数の分光画像である。いくつかの実施形態において、複数の分光画像はそれぞれ、試料から発光された及び検出器によって検出された様々な波長の電磁放射線に対応する。いくつかの実施形態において、試料によって発光された電磁放射線の波長はそれぞれ、試料における具体的な特徴を示すために試料に追加された様々な蛍光色素分子に対応している。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。
【００２６】
別の態様において、本明細書には、（ｉ）イメージングシステムを用いてがん患者から採取した組織試料に対する画像データを獲得することを含む、組織試料を採点する方法が開示されている。イメージングシステムは、試料をイメージング領域において位置付けるためのステージを備えたハウジングと、電磁放射線を試料に向けるための電磁放射線源と、電磁放射線出力を収集するための検出器と、メモリと画像処理モジュールを有する処理回路とを含むコントローラを備えている。前記方法はさらに、（ｉｉ）画像処理モジュールを用いて画像データを解析して、１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めることと、（ｉｉｉ）スコアをメモリに記録することであって、ここで、スコアは、閾値と比較したとき、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである、ことも含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞間の近接を表すものであって、１対の細胞同士が所定の近接の範囲内に存する程度を表している。いくつかの実施形態において、画像データを解析することは、近接を画素スケールで評価することを含む。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約１画素〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約５画素〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の境界線間の近接を獲得することによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の質量中心間の近接を獲得することによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の選択された第１細胞周辺の外周に基づいて境界線ロジックを用いて計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の境界線の交点を求めることによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の重なり領域を求めることによって計算される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、画像データを生成することは、（ｉ）検出された電磁放射線についての情報を単純画像データに分けることと、（ｉｉ）前記データを複数のデータチャネルから提供することと、を含み、その場合、第１データチャネル内の単純画像データは、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の単純画像データは、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、画像データを解析することは、（ｉ）処理回路の拡張装置を使用して、第１データチャネルからの第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むように選択された所定のマージン単位で拡張することによって、拡張された第１バイオマーカーを生成することと、（ｉｉ）相互作用面積を求めることであって、前記相互作用面積が、第２バイオマーカーを発現する全細胞の第１総面積であり、かつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれている、ことと、（ｉｉｉ）処理回路の相互作用計算機を使用して、相互作用面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間近接スコアに至ることを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、正規化因子は、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積である。いくつかの実施形態において、相互作用面積を求めることは、拡張された第１バイオマーカーマスクを、第２データチャネルの信号から求められた第２バイオマーカーを発現する細胞を表すマスクと組み合わせることを含む。いくつかの実施形態において、第３データチャネルは、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、また、第４データチャネルは、試料内の腫瘍領域に起因する蛍光信号を表現する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、第３データチャネルからの信号に基づく、試料内の全細胞を表す細胞マスクと、第４データチャネルからの信号に基づく、試料上の腫瘍領域を表す腫瘍領域マスクとを組み合わせることによって、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積を求めることも含む。いくつかの実施形態において、細胞マスクと腫瘍領域マスクとを組み合わせることは、腫瘍領域マスクを細胞マスクから除去することを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、（ｉ）画像において第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーの濃度を表すデータを低倍率で画像化するためにイメージングシステムを使用することと、（ｉｉ）最も高濃度の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーを包含する領域を特定することと、（ｉｉｉ）最も高濃度の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーを包含する所定数の領域を選択することと、（ｉｖ）イメージング装置へ指示を送って所定数の領域に対して高倍率の画像データを獲得することも含み、そして（ｉｖ）その場合、高倍率の画像データは、分析のためにコントローラへ供給されて、スコアを求めるために使用される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍以下であり、高倍率は、１０倍超である。いくつかの実施形態において、低倍率は、４倍であり、高倍率は、２０倍である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、スコアを、試料の画像に関するメタデータと結びつけることも含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、スコアを包含する報告を作成することも含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、免疫療法の方針を決定するために専門家にスコアを提供することも含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、データベースにスコアを記録することも含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、スコアを患者の医療記録と結び付けることも含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、スコアをディスプレイ装置に表示することも含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。
【００３６】
別の態様において、本明細書には、組織試料採点システムであって、前記システムが、（ｉ）がん患者から採取した組織試料の画像データを獲得するイメージング装置、及び（ｉｉ）イメージング装置から画像データを受信して、データを解析することによって、１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めるコントローラと、を備えており、そして（ｉｉｉ）その場合、スコアは、閾値と比較したとき、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである、前記システムが開示されている。
【００３７】
いくつかの実施形態において、イメージング装置は、試料をイメージング領域に位置づけするためのステージと、電磁放射線を試料に向けるための電磁放射線源と、試料からの電磁放射線を検出するように設定された検出器と、を備えている。
【００３８】
いくつかの実施形態において、電磁放射線は、可視光及び非可視光からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。いくつかの実施形態において、可視光は、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。いくつかの実施形態において、可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、発光された電磁放射線又は出力電磁放射線は、約４４０ｎｍ〜約４８０ｎｍ、約４９０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５０５ｎｍ〜約５３５ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約５９５ｎｍ、約５８５ｎｍ〜約６３０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約６４０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７１０ｎｍの範囲の波長を包含する帯域からなる群からの１つ以上の可視光帯域を含む。いくつかの実施形態において、電磁放射線は、可視光及び非可視光からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。いくつかの実施形態において、可視光は、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。いくつかの実施形態において、可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】試料の画像データを獲得するためのイメージング装置のブロック図である。
【図２】典型的な実施形態による、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するように設定されたコントローラのブロック図である。
【図３】典型的な実施形態による、腫瘍組織を含む試料を採点するためのプロセスのフローチャートである。
【図４】第２の典型的な実施形態による、腫瘍組織を含む試料を採点するためのプロセスのフローチャートである。
【図５】典型的な実施形態による、腫瘍組織を含む試料を採点するのに使用される画像処理工程の作業工程図である。
【図６】イメージング及び解析のための組織試料の調製に使用される抗体及び検出試薬の概要の非限定例を示す。
【図７ａ】画像内のＤＡＰＩで検出された全ての核の非限定例を示す。
【図７ｂ】図７ａにおける全細胞の拡張されたバイナリマスクの非限定例を示す。
【図８ａ】４８８染料で検出されたＳ１００の画像の非限定例を示す。
【図８ｂ】図８ａにおける全腫瘍領域のバイナリマスクの非限定例を示す。
【図８ｃ】図８ａにおける全腫瘍細胞のマスクの非限定例を示す。
【図８ｄ】図８ａにおける全非腫瘍細胞のマスクの非限定例を示す。
【図９ａ】Ｃｙ（登録商標）５で検出されたＰＤ−Ｌ１の画像の非限定例を示す。
【図９ｂ】図９ａにおける全ＰＤ−Ｌ１陽性細胞のバイナリマスクの非限定例を示す。
【図９ｃ】図９ａにおけるＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞全てのマスクの非限定例を示す。
【図９ｄ】図９ａにおけるＰＤ−Ｌ１陽性非腫瘍細胞全てのマスクの非限定例を示す。
【図１０ａ】Ｃｙ（登録商標）３．５で検出されたＰＤ−１の画像の非限定例を示す。
【図１０ｂ】図１０ａにおける全ＰＤ−１陽性非腫瘍細胞のバイナリマスクの非限定例を示す。
【図１１ａ】全ＰＤ−Ｌ１陽性細胞とそれと最も近接した細胞の相互作用マスクの非限定例を示す。
【図１１ｂ】ＰＤ−Ｌ１陽性細胞と極接近したＰＤ−１陽性細胞の相互作用区画の非限定例を示す。
【図１２ａ】２６人の黒色腫患者から得た相互作用スコアの非限定例を示す。
【図１２ｂ】図１２ａの２６人の黒色腫患者から得た相互作用スコア最大値の非限定例を示す。
【図１３】強化アルゴリズムの代わりにホールスライドイメージング法に基づいた解析結果を示す。
【図１４】２６人の患者の相互作用スコアと無増悪生存期間との比較を示す。注）＊は未修正ログランク検定を示す。
【図１５】前記患者のＰＤ−Ｌ１発現と無増悪生存期間との比較を示す。
【図１６】免疫療法に対して積極的な応答者におけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）、ＰＤ−１陽性細胞（黄）、全腫瘍細胞（緑）、及び全細胞（青）に対応する蛍光信号のマスクの非限定例を示す。
【図１７】免疫療法に対して消極的な応答者におけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）、ＰＤ−１陽性細胞（黄）、全腫瘍細胞（緑）、及び全細胞（青）に対応する蛍光信号のマスクの非限定例を示す。
【図１８】３８人の非小細胞肺がん患者から得たＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１における典型的なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコア及びバイオマーカー陽性％（ＰＢＰ）値を示す。
【図１９】前記患者の、２３Ｃ３ＦＤＡ認可ＩＨＣアッセイを用いたＰＤ−Ｌ１発現と無増悪生存期間との比較を示す。注）＊は、未修正ログランク検定を用いてｐ値を求めたことを示す。
【図２０ａ】３４人の追加の黒色腫患者から得た相互作用スコアの非限定例を示す。
【図２０ｂ】図２０ａの患者の相互作用スコアと無増悪生存期間との比較を示す。
【図２０ｃ】図１２ａ及び図１２ｂの患者並びに図２０ａの患者から得た相互作用スコアを示す。
【図２０ｄ】図２０ｃの患者の相互作用スコアと無増悪生存期間との比較を示す。注）＊は、未修正ログランク検定を用いてｐ値を求めたことを示す。
【図２０ｅ】図２０ｃの患者の相互作用スコアと全生存期間（ＯＳ）との比較を示す。注）＊は、未修正ログランク検定を用いてｐ値を計算したことを示す。
【図２１】２９人の転移性黒色腫患者から得たＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０相互作用スコアの非限定例を示す。
【図２２】２９人の精巣がん患者から得たＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアの非限定例を示す。
【図２３】典型的な実施形態による、バイオマーカー陽性値を導き出すように設定されたコントローラのブロック図である。
【図２４】典型的な実施形態による、バイオマーカー陽性値を導き出すためのプロセスのフローチャートを示す。
【図２５】第２の典型的な実施形態による、バイオマーカー陽性値を導き出すためのプロセスのフローチャートを示す。
【図２６】典型的な実施形態による、バイオマーカー陽性値を導き出すのに使用される画像処理工程の作業工程図である。
【図２７ａ】ＰＤ−Ｌ１発現を増大することによって分類された、２１人の黒色腫患者から得た組織試料においてＰＤ−Ｌ１を発現する全細胞に対するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）の非限定例を示す。
【図２７ｂ】ＰＤ−Ｌ１発現を増大することによって分類された、図２７ａの２１人の黒色腫患者から得た組織試料においてＰＤ−１を発現する非腫瘍細胞全てに対するＰＢＰ値の非限定例を示す。
【図２８】本明細書に記載の方法と対比して自動細胞計数法によって確認された、ＰＤ−Ｌ１陽性（％）の比較を示す。
【図２９ａ】画像内のＤＡＰＩで検出された全ての核の非限定例を示す。
【図２９ｂ】図２９ａにおける全細胞の拡張されたバイナリマスクの非限定例を示す。
【図３０ａ】Ｃｙ（登録商標）５で検出されたＰＤ−１の画像の非限定例を示す。
【図３０ｂ】図３０ａにおける全ＰＤ−１陽性細胞のバイナリマスクの非限定例を示す。
【図３１ａ】Ｃｙ（登録商標）３で検出されたＣＤ３の画像の非限定例を示す。
【図３１ｂ】図３１ａにおける全ＣＤ３陽性細胞のバイナリマスクの非限定例を示す。
【図３２】ＰＤ−１及びＣＤ３に対して二重陽性である全細胞のバイナリマスクの非限定例を示すものである。
【図３３ａ】ＤＬＢＣＬ患者（ｎ＝４３）から得た組織試料においてＣＤ３＋Ｔ細胞の定量的評価の非限定例を示す。
【図３３ｂ】ＤＬＢＣＬ患者（ｎ＝４３）から得た組織試料においてＣＤ３＋／ＰＤ１＋Ｔ細胞の定量的評価の非限定例を示す。
【図３４ａ】ＮＳＣＬＣ組織、胃組織及び黒色腫組織におけるＣＤ２５の定量的評価の非限定例を示す。
【図３４ｂ】ＮＳＣＬＣ組織、胃組織及び黒色腫組織におけるＦｏｘＰ３の定量的評価の非限定例を示す。
【図３５】ＮＳＣＬＣ組織、胃組織及び黒色腫組織におけるＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の定量的評価の非限定例を示す。
【図３６ａ】ＮＳＣＬＣ組織、胃組織及び黒色腫組織におけるＣＤ４の定量的評価の非限定例を示す。
【図３６ｂ】ＮＳＣＬＣ組織、胃組織及び黒色腫組織におけるＣＤ８の定量的評価の非限定例を示す。
【図３７ａ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型の定量的評価の非限定例を示す。
【図３７ｂ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＩＤＯ−１＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型の定量的評価の非限定例を示す。
【図３８ａ】転移性黒色腫組織におけるＩＤＯ−１＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋表現型の定量的評価の非限定例を示す。
【図３８ｂ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＩＤＯ−１＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋表現型の定量的評価の非限定例を示す。
【図３９ａ】ＮＳＣＬＣ組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３３＋／ＡＲＧ１＋表現型の定量的評価の非限定例を示す。
【図３９ｂ】ＮＳＣＬＣ組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＩＤＯ−１＋表現型の定量的評価の非限定例を示す。
【図４０】ＮＳＣＬＣ組織におけるＣＤ１１ｂ＋／ＨＬＡ−ＤＲ−／ＩＤＯ−１＋表現型の定量的評価の非限定例を示す。
【図４１】転移性黒色腫組織におけるＣＤ８＋Ｋｉ６７＋Ｔ細胞の定量的評価の非限定例を示す。
【図４２ａ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ１６３＋細胞の定量的評価の非限定例を示す。
【図４２ｂ】転移性黒色腫組織におけるＣＤ６８＋細胞の定量的評価の非限定例を示す。
【図４２ｃ】転移性黒色組織におけるＣＤ１６８＋ＣＤ６８＋細胞の定量的評価の非限定例を示す。
【図４３ａ】ＤＬＢＣＬ組織及びＮＥＴ組織におけるＬＡＧ−３陽性Ｔ細胞の定量的評価の非限定例を示す。
【図４３ｂ】ＤＬＢＣＬ組織及びＮＥＴ組織におけるＴＩＭ−３陽性Ｔ細胞の定量的評価の非限定例を示す。
【図４４ａ】黒色腫組織におけるＴ細胞中のＣＴＬＡ−４の定量的評価の非限定例を示す。
【図４４ｂ】黒色腫組織におけるＣＤ８０の定量的評価の非限定例を示す。
【図４５】前記免疫構造に基づく典型的な腫瘍分類を示す。
【発明の詳細な説明】
【００４２】
以降、様々な実施形態について説明する。ここで注目すべきなのは、具体的な実施形態が包括的な記述を目的とするものではなく、つまり本明細書において説明される更に広い態様への限定を目的とするものではないことである。具体的な実施形態と併せて説明されるある態様は、前記実施形態に限定すべきではなくかつそれ以外の実施形態（複数可）とともに実行することが可能である。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「約」は、当業者に理解できるものであり、しかも使用される文脈に応じてある程度の幅がある。当業者に不明な用語が使用されている場合、使用されている文脈を考慮すれば、「約」は特定条件の最大±１０％を意味する。
【００４４】
要素を説明する文脈における（特に、以下の請求項の文脈における）「一つの（ａ、ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で特に指示がない限り又は文脈から明白に矛盾するものでない限り、単数と複数の両方を網羅するものとする。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において特に指示がない限り、単にその範囲内の個々の数値それぞれに独立して言及する簡潔な方法として用いることを目的とするものであり、また、個々の値はそれぞれ、本明細書に独立して列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法はすべて、本明細書において特に指示がない限り又は文脈から明白に矛盾するものではない限り、任意の好適な順序で実行することができる。任意の及びすべての実施例並びに本明細書において規定される典型的な言葉遣い（例えば、「など」）の使用は、単に実施例をより明確に説明することを目的とするものであって、特に断りのない限り、請求項の範囲に制限するものではない。本明細書中の言葉遣いはいずれも、クレームされていない要素を本質的要素として示すものと解釈されるべきではない。
【００４５】
「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、障害に関する状態、症状若しくはパラメータを改善するか又は障害の進行を遅らせるのに有効な量、様式又はモードで、統計的に有意な程度又は当業者が検出可能な程度まで治療を施すことを意味する。有効な量、様式又はモードは、対象によって変わる可能性があり、また、患者に合わせてもよい。
【００４６】
一態様において、本明細書には、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料の採点方法を実行するためのシステム及び方法が提示されている。別の態様において、本明細書には、組織試料のバイオマーカー陽性値を導き出すためのシステム及び方法が提示されている。
【００４７】
本明細書に開示の方法において、がん患者は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトではない。さらなる実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ又はウマである。
【００４８】
本明細書に開示の方法において、腫瘍組織は、がん患者から採取される。がんの種類としては、限定されるものではないが、循環器系のがん、例えば、心臓のがん（肉腫［血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫］、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫及び奇形腫）、縦隔及び胸膜、並びに他の胸腔内蔵器のがん、血管腫瘍及び腫瘍が関連する維管束組織；気道のがん、例えば鼻腔及び中耳、副鼻腔、咽頭、気管、気管支、及び肺のがん、例えば小細胞骨肉腫（ＳＣＬＣ）、非小細胞骨肉腫（ＮＳＣＬＣ）、気管支がん（扁平上皮がん、未分化小脂肪がん、未分化大細胞がん、腺がん）、細気管支肺胞上皮（細気管支）がん、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；消化器系のがん、例えば、食道がん（扁平上皮がん、腺がん、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃がん（細胞腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、胃がん、すい臓がん（導管腺がん、インスリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸がん（腺がん、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸がん（腺がん、管状腺腫、絨毛構造、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖路、例えば、腎臓がん（腺がん、腎芽細胞腫［腎芽腫］）、リンパ腫、白血病）、胆のうがん及び／又は尿道がん（扁平上皮がん、移行上皮がん、腺がん）、前立腺がん（腺がん、肉腫）、精巣がん（セミノーマ、奇形腫、胎生期がん、奇形がん、絨毛腫、肉腫、間質細胞腫、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、リンパ腫）；肝臓がん、例えば、肝がん（肝細胞がん）、胆管がん、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、膵内分泌腫瘍（褐色細胞腫、インスリノーマ、血管作動性腸管ペプチド腫瘍、島細胞腫及びグルカゴン産生腫瘍など）；骨のがん、例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性骨巨細胞腫、骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ、ｏｓｔｅｏｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ  ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ）、良性性交時頭痛、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫；神経系のがん、例えば、中枢神経系の腫瘍（ＣＮＣ）、原発性中枢神経リンパ腫、頭蓋骨のがん（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜のがん（髄膜腫、血管肉腫、神経膠腫症）、脳のがん（星状細胞腫、髄芽腫、グリオーマ、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、グリノーマ、肉腫）；生殖器系のがん、例えば、婦人科がん、子宮がん（子宮内膜がん）、頸部がん（子宮頸がん、前腫瘍性子宮頸部異形成）、卵巣がん（卵巣がん［漿液性嚢胞腺がん、ムチン性嚢胞腺がん、分類不能大腸炎］、顆粒膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部のがん（扁平上皮癌、上皮内がん、腺がん、線維肉腫、黒色腫）、膣がん（澄明細胞汗腺腫、扁平上皮がん、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管がん（上皮性悪性腫瘍）及び女性生殖器に関する他の部位のがん；胎盤、ペニス、前立腺、睾丸、及び男性生殖器に関する他の部位のがん；血液学的系統のがん、例え���、血液（骨髄性白血病［急性及び慢性］、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；口腔のがん、例えば、唇、舌、歯茎、口腔底部、口蓋、及び口の他の部位、耳下腺、及び唾液腺の他の部位、扁桃腺、中咽頭、鼻咽頭、梨状陥凹、下咽頭、並びに唇、口腔及び咽頭の他の部位のがん；皮膚、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、基底細胞がん、扁平上皮がん、カポジ肉腫、異形成母斑、リンパ腫、血管腫、皮膚線維腫、及びケロイド；副腎のがん；神経芽細胞腫；また、結合組織及び軟組織、後腹膜及び腹膜、目を包含する他の組織のがん、眼球内黒色腫、及び付属器、胸部、頭及び／又は首、肛門部、甲状腺、副甲状腺、副腎並びに他の内分泌腺及び関連構造のがん、リンパ節の続発性及び詳細不明の悪性腫、呼吸器系及び消化器官の続発性悪性新生物並びに他の部位の続発性悪性新生物、又はそれらの１つ以上の組み合わせがあげられる。
【００４９】
免疫療法の例としては、モノクローナル抗体（例えば、アレムツズマブ又はトラスツズマブ）、抱合型モノクローナル抗体（例えば、イブリツモマブ・チウキセタン、ブレンツキシマブ・ベドチン、又はトラスツズマブ・エムタンシン）、二重特異性モノクローナル抗体（ブリナツモマブ）、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、イピリムマブ、ペメトレキセド、ニボルマブ、アテゾリズマブ又はデュルバルマブ）、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、及びイミキモド、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む。
【００５０】
腫瘍は、その免疫組織に基づいて「ｈｏｔ（炎症性）」又は「ｃｏｌｄ」に分類することができる（図４５参照）。ｈｏｔ腫瘍を有する患者は特定の免疫療法に応答すると期待され、また、潜在的にｃｏｌｄ腫瘍を有する患者よりも長く生存する可能性があるが、バイオマーカーが応答と生存と関連があることに関しては、以前は当業者には不明であった。
【００５１】
この組織に対処するために、本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態は、免疫疲弊バイオマーカー（例えば、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１）の発現による１つ以上の免疫療法に応答するがん患者の同定、及び免疫抑制を生じさせることが分かっている細胞腫（例えば、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１）又はＭＨＣクラス１発現を生じさせない高増殖性腫瘍細胞（例えば、Ｋｉ６７＋、Ｂ２Ｍ−）の存在による応答しないがん患者（すなわち、非応答者）の同定に有用である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、特異的免疫抑制又は活性化シグネチャーに基づいた多重免疫組織化学染色検査（例えば、多重ＦＩＨＣ検査）の使用を含む。特異的免疫抑制又は活性化シグネチャーに基づく多重ＦＩＨＣ検査の非限定例を以下の表に示す。
【００５２】
【表１】
2018536852.tif 000004
【００５３】
図１は、試料の分光分解された多重画像を獲得するためのイメージング装置１００を示す回路図である。電磁放射線（ＥＭＲ）源１０２は、電磁放射線を調整用光学系部品１０４へ供給する。いくつかの実施形態において、電磁放射線は可視光である。ＥＭＲ源１０２は、白熱ランプ、蛍光ランプ、又はダイオードなどのインコヒーレント光であり得る。ＥＭＲ源１０２は、レーザ光源などのコヒーレント光源でもあり得、また、コヒーレント光源は、連続波（ＣＷ）又はパルス光を提供することができる。ＥＭＲ光源１０２は、ある波長域を有する光を発生するための多光源部品（例えば、多重ダイオード）を収容していてよい。光は、連続波（ＣＷ）又は時間ゲート式（すなわち、パルス式）光のいずれであってもよい。さらに、光は、電磁分光の選択された部分に供給されることもある。例えば、光は、紫外線、可視光、赤外線、又は他の分光領域に存する中心波長及び／又は波長分布を有することができる。いくつかの実施形態において、光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲に存する波長を有する。ＥＭＲ光源１０２はさらに、様々な光学部品、例えば、レンズ、鏡、波長板、及び非線形結晶を備えることも可能であり、それらはいずれも、選択された特徴を有する光を発生するために使用できる。一般に、ＥＭＲ光源１０２は、所望の分光、空間及び、いくつかの実施形態では時間特性を有する光を提供するように設定された光学部品及び光学素子を備えている。
【００５４】
調整用光学系部品１０４は、可視光などの電磁波を様々な形で変換するように設定され得る。例えば、調整用光学系部品１０４は、光を分光して、選択された分光波長域の出力光を提供することができる。あるいは、又はさらに、調整用光学系部品は、光の空間分布と光の時間特性を調節することができる。入射電磁放射線、すなわち入射光は、ＥＭＲ上の調整用光学系部品１０４の素子の作用によって生成される。
【００５５】
入射光は、照明ステージ１０６に取り付けられた試料１０８に入射するように向けられる。ステージ１０６は、取り付けクリップ又は他の固定装置のように試料１０８を保護する手段を提供することができる。あるいは、ステージ１０６は、複数の試料１０８が取り付けられる可動トラック又はベルトを含むことができる。ドライバー機構は、複数の試料を一つずつステージ上の照明領域１０６からうまく移動させて、そのときに入射光が試料に衝突するようにトラックを動かすように設定され得る。ステージ１０６はさらに、移動軸と、照明ステージ１０６の固定位置に関連して試料１０８を移動させるための機構と、を含むこともできる。移動機構は、手動操作可能である（例えば、ねじ棒）か、又は電動作動によって自動で移動可能である（例えば、電動ドライバー、圧電式アクチュエータ）。
【００５６】
可視光などの入射電磁放射線に応答して、発光された電磁放射線が試料１０８から出現する。発光光は、様々な形で生成され得る。例えば、いくつかの実施形態において、発光光は、試料１０８を通過した入射光の一部と一致する。他の実施形態において、発光光は、試料から反射した入射光の一部と一致する。さらなる実施形態において、入射光は、試料１０８によって吸収される可能性があり、発光光は、入射光に応答して試料１０８から蛍光発光に対応している。なおさらなる実施形態において試料１０８は発光性でもあり得、入射光がなくても発光光を生成する可能性もある。いくつかの実施形態において、発光光としては、前述の機構のうち２つ以上によって生成された光をあげることができる。
【００５７】
集光光学系部品１１０は、試料１０８からの発光光などの発光された電磁放射線を受容するように配置される。集光光学系部品１１０は、例えば、光が発散する場合に、発光光に視準を合わせるように設定することができる。集光光学系部品１１０はまた、発光光を分光するように設定することもできる。フィルタリング操作は、例えば、上述の機構のうち一つから発生する発光光の一部を、他の処理から発生する光から分離するために有用であり得る。さらに、集光光学系部品１１０は、実施形態における特定の目的のために発光光の空間特性及び／又は時間特性を変更するようにも設定され得る。光集光光学系部品１１０は、発光光を、検出器１１２に入射する出力光へ変換する。
【００５８】
調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０は、対象である試料へ入射する光の特性及び対象である試料から発光される光の特性をコントロールするために光様々な光学部品を包含することができる。例えば、調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０はそれぞれ、入射光及び発光光から特定の波長帯域を選択するために分光フィルター素子を包含することができる。分光フィルター素子は、例えば、フィルターに取り付けられた干渉フィルターを包含することができる。いくつかの実施形態において、液晶マスクに準拠した調節可能なフィルター素子を使用することによって、入射光又は発光光の分光特性を変えることができる。液晶系装置は、通信用インターフェース１５２を介してコントローラ１５０によって制御され得る。
【００５９】
調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０はさらに、試料への入射光又は試料からの発光光の空間分布をコントロールするために空間光マスク、空間光変調器及び光学パルス整形器などの素子も包含することができる。空間光変調器及び他の適応装置もまた、通信用インターフェース１５２を介してコントローラ１５０によって制御され得る。
【００６０】
最後に、調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０は、入射光又は発光光に選択された特徴を付与することを目的として設定された他の一般的な光学素子、例えば、鏡、レンズ、ビームスプリッター、波長板なども包含することができる。
【００６１】
一般に、検出器１１２は、試料によって発光された光を試料の多重画像として検出及び捕獲するように設定された１つ以上の測定装置を包含する。実施形態において、検出器１１２は、光の空間的特性及び／又は時間特性及び／又は分光特性を測定するように設定され得る。検出器１１２は、画像を獲得するためにＣＣＤ配列及び光電子増倍管などの装置をそれらの各コントロールシステムとともに包含することができる。検出器１１２は、出力光に対応する電気信号を発生させてコントローラ１５０に伝達する。検出器１１２内の適した光学装置は、一般に、通信用インターフェース１５２を介してコントローラ１５０によって制御され得る。
【００６２】
コントローラ１５０は、通信用インターフェース１５２及び処理回路１５６を備えている。コントローラ１５０は、検出器１１２によって検出される出力光に対応する信号を受信することに加えて、電気信号を検出器１１２に送ることによって、通信用インターフェース１５２を通じて検出器１１２の様々な特性を調整する。例えば、検出器１１２がＣＣＤセンサーを備えている場合、コントローラ１５０は、電気信号を検出器１１２へ送ることによって、ＣＣＤセンサーの露光時間、活動領域、利得設定、及び他の特性を制御することができる。
【００６３】
コントローラ１５０はまた、通信用インターフェース１５２を介してＥＭＲ源１０２、調整用光学系部品１０４、ステージ１０６、及び集光光学系部品１１０ともつながっている。コントロールシステム１１４は、システム１００の各素子へ電気信号を供給することによって、素子の様々な特性を調整する。例えば、光源１０２へ供給される電気信号を用いて、光１２２の強度、波長、繰り返し周波数、又はその他の特性を調整することができる。ＥＭＲ光源１０２によって生成される光がパルス式（すなわち、時間ゲート式）である場合、光の様々な特性は、コントローラ１５０から通信用インターフェース１５２を介してＥＭＲ光源１０２へ供給されるコントロール信号にしたがって操作され得る。光調整用光学系部品１０４及び光集光光学系部品１１０へ供給される信号としては、例えば、光の空間的特性を調節する装置（例えば、空間光変調器）の特性を設定するための信号、及び特定の分光フィルタ装置の特性を設定するための信号をあげることができる。照明ステージ１０６へ供給される信号は、例えば、ステージ１０６と関連して試料１０８を位置付けるために及び／又は試料をステージ１０６上の照明位置まで移動するために供給することができる。
【００６４】
通信用インターフェース１５２は、様々なシステム、装置又はネットワークとデータ通信を行うために有線インターフェース又は無線インターフェース（例えば、ジャック、アンテナ、送信機、受信機、トランシーバ、ワイヤー端子など）を包含していてもよい。例えば、通信用インターフェース１５２としては、イーサネット系通信ネットワークを介してデータを送受信するためのイーサネットカード及びポート、並びに／又は無線通信ネットワークを介して通信するためのＷｉ−Ｆｉトランシーバをあげることができる。通信用インターフェース１５２は、ローカルエリアネットワーク又は広域ネットワーク（例えば、インターネット、構築ＷＡＮなど）を介して通信するように設定されてもよく、また、様々な通信プロトコル（例えば、ＢＡＣｎｅｔ、ＩＰ、ＬＯＮなど）を使用することもできる。
【００６５】
コントローラ１５０もまた、通信用インターフェース１５２を介してユーザインターフェース１５４とつながっていてもよい。ユーザインターフェース１５４は、システム特性及びパラメータを表示するため及び試料１０８の取り込み画像を表示するためのデバイス装置であってよい。ユーザインターフェース１５４は、イメージング装置１００とのオペレータ相互作用を手助けてかつコントロールするために提供される。処理回路１５６は、検出器１１２を使用して取り込んだ画像データを保存するための記憶装置、例えばメモリ１６０を含み、さらには、例えば、上述の及びさらに以降に記載するようなプロセッサ１５８に制御機能を実行させるプロセッサ１５８への指示を組み込むコンピュータソフトウェアも包含する。さらに、ソフトウェアの指示は、検出器１１２によって取り込まれた画像をプロセッサ１５８に数学的に操作させる。画像の処理及び計算については、本明細書にさらに詳細に記載するが、イメージング装置１００のプロセッサ１１６、又は図２に示しかつ以降に説明されるコントローラ２００などのイメージング装置１００と関連する外部のコンピュータシステムのいずれかによって実行される。
【００６６】
多くの実施形態において、システム１００は、試料１０８の多重分光画像を獲得するように設定されている。多重分光画像は、光の様々な選択された波長における試料１０８の照明に対応しており、そして試料１０８を透過する光又は試料１０８によって反射される光の強度を検出することが可能である。あるいは、多重分光画像は、同じ分光特性を有する光によって試料１０８を照明して、試料１０８の多重画像を収集することに対応している可能性もあり、画像はそれぞれ発光光の様々な波長と対応している。調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０における分光フィルター素子は、一般に、分光分解された画像を得るために使用される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、試料１０８の画像は、連続した取り込み画像間で光学系部品（例えば、光学フィルター）の設定調整を行いながら順番に収集され得る。他の実施形態において、多重画像は、多重試料ビューを検出するように設定された検出システムを使用して同時に取り込むことができる。例えば、検出システムは、検出器、例えばＣＣＤカメラなどに対する様々な照明又は発光波長に応じて試料の様々なビューを提示するように設定でき、また、多重ビューも同時に取り込むことができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、調整用光学系部品１０４は、フィルターホイール又は液晶分光フィルターなどの調節可能な分光フィルター素子を包含する。フィルター素子は、様々な光波長帯域を使用して試料１０８に照明を施すように設定され得る。ＥＭＲ源１０２は、広い分光波長成分分布を有する光を提供することができる。選択された広い波長分布領域は、調整用光学系部品１０４内のフィルター素子によって入射光として通過させて、試料１０８へ入射するように向けられる。試料１０８を透過した光の画像は、検出器１１２によって記録される。その後、調整用光学系部品１０４におけるフィルター通過帯域の波長を変化させて様々な波長の入射光を提供し、そして試料１０８を透過し（かつ入射光の新たな波長に対応する）光の画像が記録される。同様の一連の分光分解画像はまた、様々な波長の光を発生する多重光源素子を有するＥＭＲ源１０２を用いることによって、あるいは様々な供給源素子のスイッチを入れたり切ったりすることによって、様々な波長の入射光を提供することによっても記録され得る。
【００６９】
上述の通り、試料１０８からの発光光はまた、試料１０８から反射される入射光にも対応している。さらに、発光光は、試料が蛍光化学構造を包含する場合、試料１０８からの蛍光発光にも対応している可能性がある。いくつかの試料では、発光光は、多重光源からの寄与因子（すなわち、透過及び蛍光発光）を包含する可能性もあり、また、光調整用光学系部品１１０内の光フィルター素子は、これら信号寄与因子を分離するために使用される可能性もある。
【００７０】
一般に、調整用光学系部品１０４と集光光学系部品１１０はいずれも、設定可能な光フィルター素子を包含する。したがって、分光分解は、試料１０８の励起面で（例えば、調整用光学系部品１０４を介して）又は試料１０８の発光面で（例えば、調整用光学系部品１１０を介して）のいずれか一方あるいは両方で展開され得る。いずれにしても、試料１０８の多重分光分解画像の集光結果は、「画像スタック」であり、ここで、スタック中の各画像は、特定波長に対応する試料の２次元画像である。概念上、画像セットは、３次元マトリクスを形成すると視覚化でき、その場合、マトリクス次元のうちの２つは、各画像の空間長と空間幅であり、また、３つ目のマトリクス次元は、画像が対応する分光波長（発光又は励起）である。したがって、分光分解された画像セットは、画像の「スペクトラルキューブ」と称することができる。本明細書で使用するとき、このような画像セット（又は画像スタック若しくはスペクトラルキューブ）の「画素」は、各画像における一般的な空間的位置を指す。したがって、画像セットの画素は、画素に対応する空間的位置にある各画像に関する値を包含する。
【００７１】
当該分野において既知の分光画像を得るための他の配置が、手元にある試料の要件にしたがって使用されてもよい。
【００７２】
上述の各分光画像は典型的に特定の波長又は波長域（例えば、分光帯域）を意味するが、全般的に、各分光画像は、１つ以上の波長帯域を包含し得る分光指数、又はより複雑な分光分布に対応する可能性がある。例えば、このような画像は、分光くし形フィルターを使用して生成させることができる。一般に、画像キューブは、数個、例えば１０以上の分光画像を包含する。また一方、いくつかの実施形態において、画像キューブは、より少ない、例えば２つ又は３つの分光画像のみを包含する可能性もある。このような例の一つは、光の三原色（ＲＧＢ）カラー画像であって、その場合、各画素は、それぞれ赤色、緑色及び青色の強度に関する値を包含する。このような情報は、別個の画像のセットとしてよりも単色画像として表示され得るが、その情報量は、画像セットと同様であるため、両方の場合を意味する表現「分光画像」を用いるものとする。
【００７３】
イメージング装置１００は、試料の画像を取り込んで、本明細書に記載の後の試料分析アルゴリズム、例えばがん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するための方法及びアルゴリズムに使用される試料の画像データ１３０を生成するための様々な光学系部品及び装置を包含することができる。このようなイメージング装置は、特許文献１（発明の名称「Ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ」）で説明されており、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【００７４】
試料のイメージング処理前に、組織試料は、特定のバイオマーカーに対して親和性を持つ複数の蛍光タグを用いて染色されてよい。染色された試料のデジタル画像が取得でき、また、その画像はさらに、蛍光タグの位置に基づいて解析され得る。イメージング装置１００の処理回路１５６は、全画像解析よりもむしろ、コントローラ１５０に視野選択を実行させるソフトウェアを包含してもよい。その場合、視野は、対象である第１バイオマーカーを発現する細胞数に応じて優先順位を決めてよい。所定の数の視野はさらに、蛍光信号についても解析され得る。いくつかの実施形態において、４種の異なる蛍光タグの使用は、対象である第１バイオマーカーに対応する蛍光信号の画像及び対象である第２バイオマーカーに対応する蛍光信号の画像に加えて、全細胞によって発現されるバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像及び腫瘍細胞によって発現されるバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像も生成する。
【００７５】
蛍光色素分子の例としては、フルオレセイン、６ーＦＡＭ、ローダミン、ＴｅｘａｓＲｅｄ、カリフォルニアレッド、Ｆｏｕｒ５９４、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン６Ｆ、カルボキシロードル、カルボキシローダミン１１０、カスケードブルー、カスケードイエロー、クマリン、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ−クローム、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）３５０、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）４０５、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）４８８、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）５４９、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）５９４、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）６３３、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）６４９、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）７５０、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）８００、フィコエリトリン、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィル−プロテインａ）、ＰｅｒＣＰーＣｙ５．５、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＮＥＤ、ＲＯＸ（５−（及び−６−）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＨＥＸ、ルシファーイエロー、マリンブルー、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６８０、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＯＰＡＬ（商標）５２０、ＯＰＡＬ（商標）５４０、ＯＰＡＬ（商標）５７０、ＯＰＡＬ（商標）６２０、ＯＰＡＬ（商標）６５０、ＯＰＡＬ（商標）６９０、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、蛍光色素分子は、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３．５、Ｃｙ（登録商標）５、Ｃｙ（登録商標）７、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８染料、５５５染料、５９４染料、ＴｅｘａｓＲｅｄ、及びクマリンから成る群から選択される。４８８染料の例としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＯＰＡＬ（登録）５２０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８及びＣＦ（商標）４８８Ａが挙げられるが、これらに限定されない。５５５染料の例としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５が挙げられるが、これに限定されない。５９４染料の例としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４が挙げられるが、これに限定されない。
【００７６】
本明細書で使用するとき、「視野」は、組織試料のホールスライドデジタルイメージの一部分を意味する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、２〜２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０〜２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、３０〜２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０〜１５０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０〜１００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０〜５０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０〜４０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００（損増分を含む）の所定の視野を有する。
【００７７】
本明細書に記載の通り、組織試料を採点するためのイメージング装置１００から得た画像データのコントロールは、図２に図示しているコントローラ２００によって実行され得る。コントローラ２００は、通信用インターフェース２０２及び処理回路２０４を備えることが分かる。処理回路２０４は、組織試料を採点するための工程を実行するように設定される。コントローラ２００の素子及び機能は、イメージング装置１００のコントローラ１５０に包含されてもよく、又はイメージング装置１００とは別のコンピュータシステムに含まれていてもよいと想定される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、蛍光信号の画像は、画像内の細胞に対応する１つ以上の蛍光信号のマスクを生じさせるようにコントロールされる。いくつかの実施形態において、１つ以上の蛍光信号のマスクは、画像内の全細胞のマスク、画像内の、サブセットバイオマーカーを発現する全細胞（例えば、全腫瘍細胞）のマスク、画像内の、サブセットバイオマーカーを発現しない全細胞（例えば、非腫瘍細胞全て）のマスク、画像内の、対象である第１バイオマーカーを発現する全細胞のマスク、画像内の、対象である第２バイオマーカーを発現する全細胞のマスク、及び画像内の対象である第１バイオマーカーを発現する全細胞に加えて、対象である第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を表す相互作用マスクからなる群から選択される１つ以上を含む。なおさらなる実施形態において、相互作用マスクは、対象である第１バイオマーカーを発現する細胞に近接していた対象である第２バイオマーカーを発現する全ての選択された視野からの細胞の相互作用区画を生じさせるのに使用される。相互作用区画の総面積は、少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の空間的近接を表すスコアを生成するのに使用されてよい。いくつかの実施形態において、スコアは、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示す。いくつかの実施形態において、本システムは、対象である第１バイオマーカーの発現の定量化又は対象である第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【００７９】
図３は、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するための方法の一実施形態の工程を表すフローチャートである。工程３０１では、画像データ、例えば画像データ１３０が得られる。画像データは、イメージング装置、例えばイメージング装置１００によって得られてよい。工程３０２では、画像データは純粋であることから、様々な種類の蛍光信号に特異なデータが別個のチャネルに分類される。工程３０３では、第１チャネルからのデータは、第１バイオマーカーに陽性を示す全細胞のマスク（第１バイオマーカーマスク）を生成するのに使用される。全細胞のマスクは次に、拡張されて（工程３０４）、相互作用する細胞（第２バイオマーカーに陽性）がその中に含まれ得る所定の近接を表す拡張されたマスクを生成する。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーマスクは、１画素〜１００画素の間で拡張される。工程３０５では、第２チャネルからのデータは、第２バイオマーカーに陽性を示す全細胞のマスク（第２バイオマーカーマスク）を生成するのに使用される。工程３０６では、第１バイオマーカーマスクと第２バイオマーカーマスクを組み合わせることによって、第１バイオマーカーに陽性を示す細胞の所定の近接範囲内に存する第２バイオマーカーに陽性を示す細胞を同定する相互作用マスクを生成する。工程３０７では、相互作用マスクの面積に基づいて、空間的近接スコアが計算される。
【００８０】
図４は、がん患者から採取した腫瘍細胞を含む試料を採点するための方法の第２の実施形態の工程を示す、２つ目のフローチャートである。工程４０１では画像データが得られ、また、工程４０２では、その画像データは純粋であることから、様々な種類の蛍光信号に特異なデータが別個のチャネルに分類される。工程４０３では、第１チャネルからのデータを使用して視野内の全細胞のマスクを生成し、また、工程４０４では、第２チャネルからのデータを使用して、視野内の腫瘍面積などのサブセット面積のマスクを生成する。工程４０５では、全細胞のマスクをサブセット面積のマスクと組み合わせることによって、サブセット細胞のマスク及び非サブセット細胞のマスクを生成する。工程４０６では、第３チャネルからのデータを用いて、第１バイオマーカーに陽性を示す全陽性細胞のマスク（第１バイオマーカーマスク）を生成する。全細胞のマスクは次に、拡張されて（工程４０７）、相互作用する細胞（すなわち、第２バイオマーカーに陽性の細胞）がその中に含まれ得る所定の近接を表す拡張されたマスクを生成する。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーマスクは、１画素〜１００画素の間で拡張される。工程４０８において、第４チャネルからのデータを用いて、第２バイオマーカーに陽性を示す全細胞のマスク（第２バイオマーカーマスク）を生成する。工程４０９では、拡張された第１バイオマーカーマスクと第２バイオマーカーマスクを組み合わせることによって、第２バイオマーカーに陽性を示しかつ第１バイオマーカーに陽性を示す細胞の所定の近接範囲内に存する細胞を同定する、相互作用マスクを生成する。工程４１０において、空間的近接スコアは、相互作用マスクの面積を、全サブセット細胞又は全細胞の面積（どちらか一方の入力データの使用を表す図１５のフローチャートにおいて点線で示されるようなもの）で割ることによって計算される。いくつかの実施形態において、サブセット細胞は、第２バイオマーカーに陽性を示し得る細胞である。いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーに陽性を示し得る細胞は、腫瘍細胞又は非腫瘍細胞である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーで同定される細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーで同定される細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、生存細胞及び非生存細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーで同定される細胞のサブセットは、生存細胞のサブセットであり、また、細胞の非サブセットは、生存細胞のサブセットに包含されない生存細胞からなる。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーで同定される細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、Ｔ細胞及び非Ｔ細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーで同定される細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、骨髄性細胞及び非骨髄性細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、１対の細胞同士の近接を表す。いくつかの実施形態において、１対の細胞同士の近接は、１対の細胞の境界線間の近接であって、１対の細胞の質量中心間の近接によって求めること、１対の細胞の選択された第１細胞周辺の外周に基づいて境界線ロジックを用いること、１対の細胞の境界における相互作用を求めること、及び／又は１対の細胞の重なり領域を求めることによって求めることができる。
【００８３】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、試料の画像と関連したメタデータと関連しており、生成された報告に包含され、免疫療法計画を決定するためにオペレータに提供されて、データベースに記録され、患者の医療記録と関連させ、及び／又はディスプレイ装置に表示される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本システムは、対象である第１バイオマーカーの発現の定量化又は対象である第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【００８５】
本明細書に記載の方法において、デジタル画像のコントロールは、例えば、典型的な実施形態に従って図２のブロック図に例示されたコントローラなどのコントローラを備えたコンピュータシステムによって実行されてよい。コントローラ２００は、通信用インターフェース２０２及び処理回路２０４を備えることが分かる。通信用インターフェース２０２は、様々なシステム、装置又はネットワークとデータ通信を行うために有線インターフェース又は無線インターフェース（例えば、ジャック、アンテナ、送信機、受信機、トランシーバ、ワイヤー端子など）を包含していてもよい。例えば、通信用インターフェース２０２は、イーサネット系通信ネットワークを介してデータを送受信するためのイーサネットカード及びポート、並びに／又は無線通信ネットワークを介して通信するためのＷｉ−Ｆｉトランシーバを包含していてもよい。通信用インターフェース２０２は、ローカルエリアネットワーク又は広域ネットワーク（例えば、インターネット、構築ＷＡＮなど）を介して通信するように設定されてもよく、また、様々な通信プロトコル（例えば、ＢＡＣｎｅｔ、ＩＰ、ＬＯＮなど）を使用することができる。
【００８６】
通信用インターフェース２０２は、コントローラ２００と様々な外部システム又は外部装置（例えば、イメージング装置１０２）との間で電子データ通信を促進するように設定されたネットワークインターフェースであってもよい。例えば、コントローラ２００は、選択された視野に関する画像データをイメージング装置１０２から受信して、データを解析して空間的近接スコア（ＳＰＳ）を計算することができる。
【００８７】
さらに図２についていえば、処理回路２０４は、プロセッサ２０６及びメモリ２０８を包含することが分かる。プロセッサ２０６は、汎用のプロセッサ若しくは特定の目的のプロセッサ、特定用途向けＩＣ（ＡＳＩＣ）、１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、処理コンポーネントのグループ、又は他の好適な処理コンポーネントであってもよい。プロセッサ５０６は、メモリ５０８に記憶された又は他のコンピュータ可読媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ、ネットワーク記憶装置、リモートサーバ）から受信された計算機コードを実行するように設定されていてもよい。
【００８８】
メモリ２０８は、本開示において説明される様々な処理を計算及び／又は促進するためのデータ及び／又は計算機コードを記憶するための１つ以上の装置（例えば、記憶装置、メモリ素子、ストレージデバイスなど）を包含してもよい。メモリ２０８は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み込み専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブ記憶装置、一時記憶装置、不揮発性メモリ、フラッシュメモリ、光メモリ、又はソフトウェアオブジェクト及び／又はコンピュータ指示を記憶するための任意の他の好適なメモリを包含してもよい。メモリ２０８は、データベースコンポーネント、オブジェクトコードコンポーネント、スクリプトコンポーネント、又は本開示において説明される様々なアクティビティ及び情報構造を支援するための任意の他の種の情報構造を包含してもよい。メモリ５０８は、処理回路２０４を介してプロセッサ２０６と通信可能に接続されていてよく、また、本明細書に記載の１つ以上の処理を実行する（例えば、プロセッサ２０６によって）ためのコンピュータコードを包含してもよい。
【００８９】
さらに図２についていえば、コントローラ２００は、イメージング装置１０２から入力を受信することが分かる。イメージング装置は、画像データをすべて取得して、それを説明するメタデータの全てとともにそれを記録する。イメージング装置は、その後、コントローラ２００によって読み出すことができるストリームにデータをシリアル化する。データストリームは、任意のバイナリデータストリームタイプ、例えば、ファイルシステム、ＲＤＢＭ又はダイレクトＴＣＰ／ＩＰ通信などに対応し得る。データストリームを使用する場合、コントローラ２００は、分光分離装置２１０を包含することが分かる。分光分離装置２１０は、画像データをイメージング装置１０２から受信することができ、そこで分光分離を行って、各波長帯域に対して独立した個別のチャネルに様々な波長を表す画像を分離する。例えば、画像データは、組織試料において対象である細胞又はタンパク質を同定するのに使用される様々な蛍光色素分子ごとに別個のチャネルへ「分離」されてよい。蛍光色素分子は、ほんの一例として、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３．５、Ｃｙ（登録商標）５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８染料、５５５染料、５９４染料、及びＴｅｘａｓＲｅｄからなる群のうちの１つ以上であってよい。ある例では、チャネルのうちの１つは、画像中の核を同定するように、波長４６１ｎｍ（ＤＡＰＩに関する最高発光波長）周辺の所定の帯域内に存する画像データを包含していてもよい。その他のチャネルは、様々な波長に対する画像データを包含して、様々な蛍光色素分子を使用して組織試料の様々な部分を同定してもよい。
【００９０】
コントローラ２００は、様々なマスカー、例えば細胞マスカー２１２、サブセット領域マスカー２１６、第１バイオマーカーマスカー２２、及び第２バイオマーカーマスカー２２４などを包含することも分かっている。他の実施形態においてコントローラ２００に包含され得るこれらマスカー又は他のマスカーを使用して単純信号を分光分離装置２１０から受信して、組織試料において対象である特定の特徴を同定するのに使用される蛍光色素分子に応じて、対象である特定の細胞又は領域に対してマスクを作成する。マスクを作成するために、マスカー（例えば、細胞マスカー２１２、サブセット領域マスカー２１６、第１バイオマーカーマスカー２２、及び第２バイオマーカーマスカー２２４など）は、視野に内の各画素の強度に関連した画像データを受信する。画素強度は、試料によって発光される蛍光発光の量に正比例しており、その結果、（蛍光色素分子を使用して特有のバイオマーカーを同定する場合、）試料中のタンパク質バイオマーカーの量と正比例する。絶対閾値は、画像画素に認められる値に基づいて設定されてよい。閾値以上の画素はすべて、１．０又は「オン」にマッピングされ、また、それ以外の画素はすべて、０．０又は「オフ」にマッピングされる。この方法において、バイナリマスクは、視野内の対象である細胞部分又は組織部分を同定するために作成される。他の実施形態において、マスクは、下界を用いて作成され、その場合、下界以上の整数を有する画素はすべて認められて、マスクにおいて画素値として使用される。強度が下界未満の場合、画素値は０．０又は「オフ」に設定される。
【００９１】
図５に示すマスキングのための作業工程図例において、核領域及び腫瘍領域を特定する蛍光信号に関するチャネル（例えば、それぞれＤＡＰＩ及び４８８染料チャネル）は、下界プロトコル（工程５１０、５１２、５２０、５２２）を使用するが、バイオマーカーを同定するためのチャネル（例えば、それぞれＣｙ５およびＣｙ３．５チャネル）は、マスク出力を提供するために閾値プロトコル（工程５３０、５４０）を使用することが示される。下界プロトコルと関連して、下界を求めるためのヒストグラム工程もある。具体的には、ヒストグラムの閾値（工程５１２、５２２）は、出力画像の閾値をもたらすが、閾値化が生じるポイントを求めるためにスライディングスケールを使用する。入力データは、現在の画像とユーザが確定した閾値パーセンテージである。後者は、閾値レベルを設定すべき合計強度のパーセントを求めるのに使用される。先ず、各画素の強度を合計して合計強度とする。閾値パーセンテージにこの合計強度を掛けると、カットオフ合計が得られる。最後に、画素全てを、（ヒストグラム中の）強度で分類して、カットオフ合計に至るまで（ｂｉｎごとに）あらゆる前記強度を合計する。処理中に達した最後の最高画素強度が、現在の画像における閾値である。その値よりも大きな強度を有する全ての画素は、最大値に設定し、一方、それ以外はすべて最小値に設定される。
【００９２】
図５において工程５１４、５１６、５２４、５２６、５２８、５３２、５３４、５３６、５４２、５４４として特定される工程は、初期マスカー、例えば細胞マスカー２１２、サブセット領域マスカー２１６、第１バイオマーカーマスカー２２２及び第２バイオマーカーマスカー２２４中で生じる中間工程を表す。これら工程は、次のように定義される。
【００９３】
拡張は、画像中の最高輝度の領域の面積を拡大する。拡張には、２つの入力データが必要である。１つ目は、計算上の現在の画像であり、２つ目は、拡張反復回数である。１つ目の入力データには二値画像のみが使用されると考えられる。この手順は、連続画像で操作するが、出力は有効な拡張ではない。拡張処理は、先ず、画像中の最大画素強度を見つけることによって開始する。その後、画像中の各画素を一度試験する。調査中の画素が最大強度と等しい強度を有する場合、その画素が、反復半径を有しかつ元の画素を中心とした円として出力画像に書き込まれる。円内の画素はすべて、最大強度と等しい強度を有する。それ以外の画素はすべて、変更せずに出力画像へ複写される。
【００９４】
穴埋め手順は、画像の「空」領域を最高強度の画素で埋めるものである。これら空領域は、最小強度を有する領域であり、また、その画素領域（サイズ）はユーザによって指定される。現在の画像とサイズは、必要な２つの入力データである。拡張と同様に、この手順は、二値画像にのみ適用されるべきである。
【００９５】
エロ―ジョン処理は、拡張と同じ方法で画像形成する。第１工程が画像の最小強度を測定して、最低強度をマッピングする画素のみを変更して、獲得した最小強度の強度をブルームするのに使用した円を最低強度値で埋めること以外は、機能性はすべて拡張と同様である。拡散と同様に、この手順は、二値画像に適用されるのみのはずである。
【００９６】
オブジェクトの削除。２つの入力データ、すなわち、現在の画像とオブジェクトサイズが期待される。オブジェクトの削除は、穴埋め手順とは逆のものである。入力データであるオブジェクトサイズよりも小さな面積を埋める最大強度を有する画素のみを含む任意の領域は、最小強度と設定され、したがって「削除される」。この手順は二値画像にのみ適用されるべきであり、連続画像への適用は、予想外の結果をもたらす可能性がある。
【００９７】
最終工程５１８、５２９、５３８及び５４６における出力はそれぞれ、結果として得られた細胞マスク、サブセット領域マスク（又は、この特定の例では、腫瘍領域マスク）、バイオマーカー１細胞マスク、及びバイオマーカー２細胞マスクである。図５はさらに、空間的近接スコアを計算するための得られたマスクの組み合わせを示している。これらの組み合わせを、図２に示すコントローラ２００の組み合わせマスカーを参照して、以下に説明する。
【００９８】
コントローラ２００は、組み合わせマスカー、例えばサブセット細胞マスカー２１８、非サブセット細胞マスカー２２０、及び相互作用マスカー２３０を包含することも分かっている。サブセット細胞マスカーは、図５の工程５５２に示すようなａｎｄ演算を実行して、細胞マスカー２１２（画像中の全細胞を表す）の出力をサブセット領域マスカー２１６の出力と組み合わせる。したがって、サブセット細胞マスカーは、画像中の全サブセット細胞のマスクを生成する。いくつかの実施形態において、サブセット細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、サブセット細胞マスカー２１８は、腫瘍マスカーであり、また、非サブセット細胞マスカー２２０は、非腫瘍マスカーである。これと同じ組み合わせは、図５の工程５５４で示されるような非サブセット細胞マスカー２２０によって実行されるｏｕｔ演算を用いて、試料画像中に非サブセット細胞全てのマスクを生成する。いくつかの実施形態において、非サブセット細胞は、非腫瘍細胞である。
【００９９】
別のマスクと組み合わせ合わせる前に、第１バイオマーカーマスク（第１バイオマーカーマスカー２２２から得たもの）を、拡張装置２２６で拡張する。拡張されたマスクは、第２バイオマーカーを発現するセルが第１バイオマーカーを発現するセルと相互作用するのに適した近接な範囲内に存する空間を特定するために、第１バイオマーカーを発現する前記セルを取り囲む面積を表す。これは、図５の工程５５６及び５５８で表される。図５のフローチャートは、２つの工程５５６及び５５８において生じる拡張を表している。これは、各工程において最大反復回数に制限がある場合に必要とされる可能性がある。例えば、反復回数は最大１０回（１０画素増加に相当）であってよく、つまり、２０画素増加する必要がある場合は、拡張を２つの後続工程に分ける必要がある。
【０１００】
第２バイオマーカーマスカー２２４内では、バイオマーカーマスクを、図５の工程５６０に示すように、ａｎｄ演算を使用して前記非サブセット細胞マスクと組み合わせて、第１バイオマーカーに陽性を示す非サブセット細胞全てのマスクを生成することができる。このマスクは、その後、相互作用マスカー２３０において、拡張装置２２６からの拡張されたマスクと組み合わせて（工程５６２）、相互作用マスクを生成する。相互作用マスクは、第２バイオマーカーに陽性を示しかつ相互作用面積内にも存するか又は拡張されたマスクと重なる、非腫瘍細胞を特定した。前記特定された細胞は、その後、第１バイオマーカーに陽性を示す細胞と相互作用する細胞を表すため、さらに大きな治療反応をもたらす。
【０１０１】
空間的近接スコア（ＳＰＳ）を計算するために、相互作用マスクの面積を面積評価装置２３２において画素で求める。いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーを発現できる全細胞の面積は、面積評価装置２３４において画素で求められる。第２バイオマーカーを発現できる細胞は、腫瘍細胞又は非腫瘍細胞であってよい。いくつかの実施形態において、視野内の全細胞の面積は、面積評価装置２３４において画素で求められる。相互作用スコア、すなわち空間的近接スコアは、相互作用計算機２３６において、面積評価装置２３２から得た面積を面積評価装置２３４から得た面積で割り、それに所定の係数を掛けることによって、求められる。先に説明したように、一実施形態において、相互作用計算機２３６で実行される式は次の通りである。
【数２】
2018536852.tif 000005
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた細胞の総面積）であり、また、Ａｃは、正規化因子である。ここで、正規化因子は、第２特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積である。いくつかの実施形態において、正規化因子は、全腫瘍細胞又は非腫瘍細胞全ての総面積である。いくつかの実施形態において、正規化因子は、全細胞の総面積である。
【０１０２】
ＡＮＤ手順は、２進ａｎｄ演算を手本にしているが、有意手段が異なる。ＡＮＤ手順は、現在の画像及びユーザ選択結果を受け入れる。出力は、２つの出力画像からの画素と合致する正規化強度を掛け合わせることによって生じた画像である。いくつかの応用では、画像強度データは、すでに正規化されている。したがって、ＡＮＤ手順は、単に、２つの画像の画素的な掛け算である。ＯＵＴ手順に必要な２つの入力データは、現在の画像とユーザ選択結果である。ＯＵＴ手順は、式：Ａ×（１−Ｂ／Ｂｍａｘ）に従って第１の画像から第２の画像を削除するものであり、ここで、Ａは、現在の画像であり、Ｂは、削除すべきユーザ選択画像であり、また、Ｂｍａｘは、Ｂの最大強度である。ここで留意すべきは、ＢのＢｍａｘによる割り算がＢを正規化することである。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本明細書には、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するためのイメージングシステムであって、イメージング領域内で試料の位置決めをするためのステージを備えたイメージング装置と、試料に電磁放射線を向けるための電磁放射線源と、試料からの電磁放射線を検出するように設定された検出器と、コントローラと、を備える、前記イメージングシステムが提示されている。コントローラは、オペレータと電子制御システムとの間で情報を変換するためのユーザインターフェースと、コンピュータ可読媒体に記憶された指示を実行するように設定された処理回路とを備えている。指示は、画像システムの電子制御システムに、（ｉ）イメージング装置からの検出された電磁放射線についての情報を受信させ、（ｉｉ）検出された電磁放射線に基づいて画像データを生成させ、（ｉｉｉ）画像データを解析して少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めさせ、そして（ｉｖ）スコアを記録させるものであるが、前記スコアは、閾値と比較したとき、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞間の近接を表すスコアは、１対の細胞同士が所定の近接の範囲内にあるという程度を表している。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、腫瘍細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、非腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、非腫瘍細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、非腫瘍細胞は、間質細胞である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバー及び第２メンバーは、免疫細胞を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、腫瘍細胞、骨髄性細胞、又は間質細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞、骨髄性細胞、又は間質細胞は、ＰＤ−Ｌ１を発現し、また、免疫細胞は、ＰＤ−１を発現する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、腫瘍細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、骨髄性細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、間質細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーはＰＤ−Ｌ１を発現し、また、免疫細胞はＰＤ−１を発現する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第１バイオマーカーを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される第２バイオマーカーを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第１バイオマーカーを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される第２バイオマーカーを発現する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ１を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＰＤ−１を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ１を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＣＤ８０を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＣＴＬＡ−４を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＣＤ８０を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ２を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＰＤ−１を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＣＴＬＡ−４を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＣＤ８６を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＬＡＧ−３を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＨＬＡ−ＤＲを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＴＩＭ−３を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、４１ＢＢを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、４．１ＢＢＬを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＯＸ４０を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＯＸ４０Ｌを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＣＤ４０を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＣＤ４０Ｌを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＩＣＯＳを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＩＣＯＳＬを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＧＩＴＲを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＧＩＴＲＬを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＨＬＡ−ＤＲを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＴＣＲを発現する。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーによって発現される第１バイオマーカーと少なくとも１対の細胞の第２メンバーによって発現される第２バイオマーカーは、互いに相互作用する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーによって発現される第１バイオマーカーと少なくとも１対の細胞の第２メンバーによって発現される第２バイオマーカーは、互いに相互作用しない。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞間の空間的近接は、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約４５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約４０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約３５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約３０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約２５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約１５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約４５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約４０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約３５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約３０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約２５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約１５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍ、約１４μｍ、約１５μｍ、約１６μｍ、約１７μｍ、約１８μｍ、約１９μｍ、約２０μｍ、約２１μｍ、約２２μｍ、約２３μｍ、約２４μｍ、約２５μｍ、約２６μｍ、約２７μｍ、約２８μｍ、約２９μｍ、約３０μｍ、約３１μｍ、約３２μｍ、約３３μｍ、約３４μｍ、約３５μｍ、約３６μｍ、約３７μｍ、約３８μｍ、約３９μｍ、約４０μｍ、約４１μｍ、約４２μｍ、約４３μｍ、約４４μｍ、約４５μｍ、約４６μｍ、約４７μｍ、約４８μｍ、約４９μｍ、又は約５０μｍである。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞間の空間的近接は、約１画素〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約９０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約８０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約７０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約６０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約５０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約３０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約９０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約８０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約７０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約６０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約５０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約３０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１画素、約２画素、約３画素、約４画素、約５画素、約６画素、約７画素、約８画素、約９画素、約１０画素、約１１画素、約１２画素、約１３画素、約１４画素、約１５画素、約１６画素、約１７画素、約１８画素、約１９画素、約２０画素、約２１画素、約２２画素、約２３画素、約２４画素、約２５画素、約２６画素、約２７画素、約２８画素、約２９画素、約３０画素、約３１画素、約３２画素、約３３画素、約３４画素、約３５画素、約３６画素、約３７画素、約３８画素、約３９画素、約４０画素、約４１画素、約４２画素、約４３画素、約４４画素、約４５画素、約４６画素、約４７画素、約４８画素、約４９画素、約５０画素、約５１画素、約５２画素、約５３画素、約５４画素、約５５画素、約５６画素、約５７画素、約５８画素、約５９画素、約６０画素、約６１画素、約６２画素、約６３画素、約６４画素、約６５画素、約６６画素、約６７画素、約６８画素、約６９画素、約７０画素、約７１画素、約７２画素、約７３画素、約７４画素、約７５画素、約７６画素、約７７画素、約７８画素、約７９画素、約８０画素、約８１画素、約８２画素、約８３画素、約８４画素、約８５画素、約８６画素、約８７画素、約８８画素、約８９画素、約９０画素、約９１画素、約９２画素、約９３画素、約９４画素、約９５画素、約９６画素、約９７画素、約９８画素、約９９画素、又は約１００画素である。いくつかの実施形態において、画素は、幅０．５μｍである。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、画像データを生成することは、（ｉ）検出された電磁放射線についての情報を単純画像データに分けることと、（ｉｉ）前記データを複数のデータチャネルから提供することを含み、その場合、第１データチャネル内の単純画像データは、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の単純画像データは、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、データを解析することには、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択は、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むのに十分なマージン単位で拡張することと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれた前記全細胞に関する第１の総面積を正規化因子で割り、その結果得られた商に所定の係数を掛けることによって、空間的近接に至ることと、を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、データを解析することには、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張して、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５μｍ〜約５０μｍ内に取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内で取り囲まれた前記全細胞に関する第１の総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間的近接に至ることを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、データを解析することには、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞の数をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むために約１〜約１００画素までの範囲のマージン単位で拡張することと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号で取り囲まれている前記全細胞に関して、画素単位で測定される第１の総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数と掛け合わせて空間的近接に至ることを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、データを解析することには、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号約１画素〜約１００画素の範囲のマージン単位で拡張して、第２バイオマーカーを発現する細胞を第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５μｍ〜約５０μｍの範囲内に取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内で取り囲まれている前記全細胞に関する第１の総面積を正規化因子で割って、その結果得られる定量化を所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、次の式にしたがって計算される。
【数３】
2018536852.tif 000006
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、Ａｃは、第２特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積（正規化因子）である。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコア（ＳＰＳ）は、次の式にしたがって計算される。
【数４】
2018536852.tif 000007
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、ＡＮＴは、非腫瘍細胞の総面積である。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、次の式にしたがって計算される。
【数５】
2018536852.tif 000008
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、ＡＴは、全細胞の総面積である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、４つの蛍光タグは、それぞれ異なるバイオマーカーに特異のものであり、測定工程で使用される。さらなる実施形態において、第１蛍光タグは第１バイオマーカーと関連しており、第２蛍光タグは第２バイオマーカーと関連しており、第３蛍光タグは第３バイオマーカーと関連しており、また、第４蛍光タグは第４バイオマーカーと関連している。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーは、腫瘍及び非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーは、非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーは、腫瘍及び非腫瘍マーカーを含み、また、第２バイオマーカーは、非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態において、第３バイオマーカーは、全細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、第４バイオマーカーは、腫瘍細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、第３バイオマーカーは全細胞によって発現され、また、第４バイオマーカーは腫瘍細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、１つ以上の蛍光タグは、特定のバイオマーカー又は別の抗体に対して結合親和性を示す抗体と共役した蛍光色素分子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の蛍光タグは、特定のバイオマーカーに対して親和性を示す蛍光色素分子である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号は、約１〜約１００画素までの範囲のマージン単位で拡張される。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約９０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約８０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約７０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約６０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約５０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約３０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約９０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約８０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約７０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約６０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約５０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約３０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１画素、約２画素、約３画素、約４画素、約５画素、約６画素、約７画素、約８画素、約９画素、約１０画素、約１１画素、約１２画素、約１３画素、約１４画素、約１５画素、約１６画素、約１７画素、約１８画素、約１９画素、約２０画素、約２１画素、約２２画素、約２３画素、約２４画素、約２５画素、約２６画素、約２７画素、約２８画素、約２９画素、約３０画素、約３１画素、約３２画素、約３３画素、約３４画素、約３５画素、約３６画素、約３７画素、約３８画素、約３９画素、約４０画素、約４１画素、約４２画素、約４３画素、約４４画素、約４５画素、約４６画素、約４７画素、約４８画素、約４９画素、約５０画素、約５１画素、約５２画素、約５３画素、約５４画素、約５５画素、約５６画素、約５７画素、約５８画素、約５９画素、約６０画素、約６１画素、約６２画素、約６３画素、約６４画素、約６５画素、約６６画素、約６７画素、約６８画素、約６９画素、約７０画素、約７１画素、約７２画素、約７３画素、約７４画素、約７５画素、約７６画素、約７７画素、約７８画素、約７９画素、約８０画素、約８１画素、約８２画素、約８３画素、約８４画素、約８５画素、約８６画素、約８７画素、約８８画素、約８９画素、約９０画素、約９１画素、約９２画素、約９３画素、約９４画素、約９５画素、約９６画素、約９７画素、約９８画素、約９９画素、又は約１００画素である。いくつかの実施形態において、画素は、幅０．５μｍである。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５μｍ〜約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約４５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約４０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約３５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約３０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約２５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約２０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約１５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ〜約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ〜約４５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の約５μｍ〜約４０μｍの細胞膜で第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の約５μｍ〜約３５μｍの細胞膜で第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、��１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ〜約３０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の約５μｍ〜約２５μｍの細胞膜で第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ〜約２０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ〜約１５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍ、約１４μｍ、約１５μｍ、約１６μｍ、約１７μｍ、約１８μｍ、約１９μｍ、約２０μｍ、約２１μｍ、約２２μｍ、約２３μｍ、約２４μｍ、約２５μｍ、約２６μｍ、約２７μｍ、約２８μｍ、約２９μｍ、約３０μｍ、約３１μｍ、約３２μｍ、約３３μｍ、約３４μｍ、約３５μｍ、約３６μｍ、約３７μｍ、約３８μｍ、約３９μｍ、約４０μｍ、約４１μｍ、約４２μｍ、約４３μｍ、約４４μｍ、約４５μｍ、約４６μｍ、約４７μｍ、約４８μｍ、約４９μｍ、又は約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、近接する細胞に関する第２バイオマーカーは、第１バイオマーカーと直接接触している。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、選択された各視野からの、第２バイオマーカーを発現する全細胞の第１総面積は、画素単位で測定される。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、正規化因子は、選択された各視野からの非腫瘍細胞全ての第２総面積である。いくつかの実施形態において、第２総面積は、画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第１総面積と第２総面積はともに画素単位で測定される。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、正規化因子は、第２バイオマーカーを発現する能力を有する選択された各視野からの全細胞の第２総面積である。いくつかの実施形態において、第２総面積は、画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第１総面積と第２総面積はともに画素単位で測定される。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、正規化因子は、選択された各視野からの全細胞の第２総面積である。いくつかの実施形態において、第２総面積は、画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第１総面積と第２総面積はともに画素単位で測定される。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約５０００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約４５００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約４０００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約３５００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約３０００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約２５００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約２０００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約１５００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約１０００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３１００、約３２００、約３３００、約３４００、約３５００、約３６００、約３７００、約３８００、約３９００、約４０００、約４１００、約４２００、約４３００、約４４００、約４５００、約４６００、約４７００、約４８００、約４９００、又は約５０００であり、それぞれの増分も包含する。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３１００、約３２００、約３３００、約３４００、約３５００、約３６００、約３７００、約３８００、約３９００、約４０００、約４１００、約４２００、約４３００、約４４００、約４５００、約４６００、約４７００、約４８００、約４９００、又は約５０００であり、それぞれの増分も包含し、±１００である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、所定の係数は、約１０〜約１０５である。いくつかの実施形態において、所定の係数は、約１０２〜約１０５である。いくつかの実施形態において、所定の係数は、約１０３〜約１０５である。いくつかの実施形態において、所定の係数は、約１０４〜約１０５である。いくつかの実施形態において、所定の係数は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、又は１０５であり、それぞれの増分も含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。陽性予測値は、閾値を超えるスコアで治療に反応する患者の人数を、治療に反応する患者の総人数で割ることによって計算される。陰性予測値は、閾値未満のスコアで治療に反応しない患者の人数を、治療に反応しない患者の総人数で割ることによって計算される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６０％超である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、８０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％であり、それぞれの増分も包含する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６０％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％であり、それぞれの増分も包含する。
【０１３４】
別の態様において、本明細書には、イメージング装置と、腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野に含まれる複数の細胞から選択される少なくとも１対の細胞間の空間的近接をあらわすスコアを求めるためのコントローラとを備えたシステムを利用する方法が開示されており、ここで、前記試料は、がん患者から採取されたものであり、前記方法は、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞の数をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１特異的バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張して、第２特異的バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号で取り囲まれた前記全細胞に関する第１の総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商を所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１３５】
別の態様において、本明細書には、イメージング装置と、腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野に含まれる複数の細胞から選択される少なくとも１対の細胞間の空間的近接をあらわすスコアを求めるためのコントローラとを備えたシステムを利用する方法が開示されており、ここで、前記試料は、がん患者から採取されたものであり、前記方法は、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞の数をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張して、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５μｍ〜約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する細胞を取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内で取り囲まれた前記全細胞に関する第１の総面積を、正規化因子で割って、その結果得られる商を所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１３６】
別の態様において、本明細書には、イメージング装置と、腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野に含まれる複数の細胞から選択される少なくとも１対の細胞間の空間的近接をあらわすスコアを求めるためのコントローラとを備えたシステムを利用する方法が開示されており、ここで、前記試料は、がん患者から採取されたものであり、前記方法は、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞の数をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、約１〜約１００画素までの範囲のマージン単位で拡張して、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内に取り囲まれている前記全細胞に関して、画素単位で測定される第１の総面積を、正規化因子で割って、その結果得られる商を所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１３７】
別の態様において、本明細書には、イメージング装置と、腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野に含まれる複数の細胞から選択される少なくとも１対の細胞間の空間的近接をあらわすスコアを求めるためのコントローラとを備えたシステムを利用する方法が開示されており、ここで、前記試料は、がん患者から採取されたものであり、前記方法は、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料が複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞の数をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を約１〜約１００画素までの範囲のマージン単位で拡張して、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５μｍ〜約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する細胞を取り囲むことと、（ｉｉｉ）画素単位で測定される、選択された視野それぞれから全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内で取り囲まれている前記細胞に関する第１の総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商を所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコア（ＳＰＳ）は、次の式にしたがって計算される。
【数６】
2018536852.tif 000009
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、ＡＮＴは、非腫瘍細胞の総面積である。
【０１３９】
別の実施形態において、空間的近接スコアは、次の式にしたがって計算される。
【数７】
2018536852.tif 000010
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、Ａｃは、第２特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積である。
【０１４０】
別の態様において、イメージング装置と、がん患者から得た腫瘍組織を含む試料を採点するためのコントローラであって、患者のがんを治療する方法に使用される前記コントローラとを備えたシステムを利用する方法が開示されている。いくつかの実施形態において、がん患者から得た腫瘍組織を含む試料を採点する方法は、免疫療法を施す前に実行される。いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、次の式によって求められる。
【数８】
2018536852.tif 000011
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、ＡＴは、全細胞の総面積である。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本明細書には、イメージング装置と、治療する必要のある患者のがんを治療するためのコントローラとを備えたシステムを利用する方法であって、（ａ）患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点することであって、（ｉ）患者から採取した腫瘍組織を含む試料を使用して、少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の空間的近接を表すスコアを求める、ことと、（ｉｉ）スコアを記録することを含むことと、（ｂ）スコアを閾値と比較することと、（ｂ）閾値と比較したときにスコアが、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示す場合に、患者に免疫療法を施すことを含む、前記方法が開示されている。いくつかの実施形態において、測定工程は、本明細書に説明した通りである。いくつかの実施形態において、本方法は、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、本明細書には、組織試料を採点する方法であって、（ｉ）イメージングシステムを使用してがん患者から採取した組織試料についての画像データを得ることであって、イメージングシステムが、試料をイメージング領域において位置付けるためのステージを備えたハウジングと、電磁放射線を試料に向けるための電磁放射線源と、電磁放射線出力を収集するための検出器と、メモリと画像処理モジュールを有する処理回路とを備えた電子制御システムを含む、ことと、（ｉｉ）画像処理モジュールを用いて画像データを解析して、１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めることと、（ｉｉｉ）スコアをメモリに記録することであって、閾値と比較したときにスコアが、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示す、ことを含む、前記方法が開示されている。いくつかの実施形態において、本方法は、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、本明細書には、がん患者から採取した組織試料の画像データを獲得するイメージング装置と、イメージング装置から画像データを受信してデータを解析することによって、１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めるコントローラと、を備えた組織試料採点システムであって、その場合、閾値と比較したときにスコアが、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示す、前記システムが開示されている。いくつかの実施形態において、本方法は、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【実施例】
【０１４５】
実施例１．ヒト患者から得た黒色腫組織試料についての試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
試料の調製：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料を脱脂した。次に、スライドは、キシレンからアルコールまでの一連の洗浄を経て再水和してから、蒸留水中でインキュベートした。その後、加熱抗原賦活化法を、高圧高温条件を用いて行い、冷却させて、トリス緩衝生理食塩水へ移した。次いで、染色を行ったが、そこでは、以降の工程を実行した。先ず、内在性ペルオキシダーゼを遮断した後、タンパク質ブロッキング溶液でインキュベートして非特異性抗体染色を抑えた。次にスライドを、マウス抗ＰＤ１一次抗体で染色した。スライドをその後洗浄してから、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＰＤ−１染色を、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３．５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。次に、残留ＨＲＰをすべて、新たなベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭの２回の洗浄を用いてクエンチした。スライドを再度洗浄してから、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、４８８染料と４’，６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で直接標識化した抗ウサギＨＲＰ二次抗体とマウス抗Ｓ１００の混合液でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＰＤ−１染色を、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。スライドをもう一度洗浄してから、封入剤を用いてカバーグラスで覆って、室温で一晩乾燥させた。抗体と検出試薬の概観図を図６に示す。別法として、スライドは、抗ＰＤ１一次抗体の代わりに抗ＣＤ８一次抗体で染色した。
【０１４６】
試料イメージング及び解析：次に、Ｖｅｃｔｒａソフトｖｅｒｓｉｏｎ２．０．８（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用したＶｅｃｔｒａ２Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて蛍光画像を得た。先ず、スライドの白黒イメージングは、ＤＡＰＩを用いて４倍で行った。自動化アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発されたもの）を用いて組織を含むスライドの領域を特定した。
【０１４７】
組織を含むと特定されたスライドの領域を、ＤＡＰＩ（青）、ＦＩＴＣ（緑）及びＣｙ（登録商標）５（赤）に関するチャネルにおいて４倍で画像化してＲＧＢ画像を作成した。これらの４倍画像は、自動化強化アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発されたもの）を用いて視野選択装置１０１で処理することによって、Ｃｙ（登録商標）５最高発現に従って、考えられる２０倍視野を特定して順位付けした。
【０１４８】
上位４０の視野を、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、及びＣｙ（登録商標）５の波長全域において２０倍で画像化した。現画像の利用可能性について再調査して、ピンぼけ、腫瘍細胞不在、壊死が非常に進んでいるか、又は予測される抗体局在に関係のない高濃度の蛍光信号（すなわち、背景染色）を含む画像は、解析前に不採用とした。容認された画像は、ＡＱＵＡｄｕｃｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて処理し、その場合、蛍光色素分子はそれぞれ、分光分離装置２１０によって個別のチャネルへ分光分離して、別ファイルとして保存した。
【０１４９】
処理後のファイルをさらに、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を用いて又はＡＱＵＡｓｅｒｖｅ（商標）を用いた全自動処理によって解析した。以下に詳細を記す。
【０１５０】
ＤＡＰＩ画像はそれぞれ細胞マスカー２１２で処理して、画像内の全細胞核を特定し（図７ａ）、また、その後、３画素ずつ拡張して細胞全体のおおよそのサイズを表した。この結果得られたマスクは、画像内の全細胞を表していた（図７ｂ）。
【０１５１】
４８８染料で検出されたＳ１００（黒色腫に対する腫瘍細胞マスカー）（図８ａ）は、サブセットマスカー２１６で処理して、画像内の全腫瘍面積のバイナリマスクを作成した（図８ｂ）。前記バイナリマスクと全細胞のマスクとの重なりが、腫瘍細胞マスカー２１８を用いて腫瘍細胞に対する新たなマスクを作成した（図８ｃ）。
【０１５２】
同様に、非腫瘍細胞に対する新たなマスクを作成した核全てのマスクとの組み合わせに腫瘍細胞マスカーを含まないもの（図８ｄ）も、非腫瘍細胞マスカー２２０を用いて行った。
【０１５３】
各Ｃｙ（登録商標）５画像（図９ａ）は、第１バイオマーカーマスカー２２２によって処理し、全細胞のマスクと重ねて、ＰＤ−Ｌ１陽性の全細胞のバイナリマスクを作成した（図９ｂ）。バイオマーカーマスクと全細胞のマスクとを重ねることによって、バイオマーカー陽性細胞としてマスク内で偽って特定される可能性のあるノイズ画素を消去した。
【０１５４】
各Ｃｙ（登録商標）３．５画像（図１０ａ）は、第２バイオマーカーマスカー２２４によって処理してＰＤ−１陽性細胞に対するバイナリマスクを作成して、非腫瘍細胞全てのマスクと重ねて、ＰＤ−Ｌ１陽性の非腫瘍細胞全てのバイナリマスクを作成した（図１０ｂ）。バイオマーカーマスクと非腫瘍細胞全てのマスクとを重ねることによって、バイオマーカー陽性細胞としてマスク内で偽って特定される可能性のあるノイズ画素を消去した。
【０１５５】
ＰＤ−Ｌ１陽性細胞全てのバイナリマスクは、第２拡張装置２２６を用いて拡張して、近接した細胞（例えば、ＰＤ−１を有する細胞）を取り囲む相互作用マスクを作成した（図１１ａ）。この相互作用マスクは、相互作用マスカー２３０を用いてＰＤ−１陽性非腫瘍細胞全てのバイナリマスクと、組み合わせることによって、ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１と相互作用し得るほど十分にＰＤ−Ｌ１と近接させてＰＤ−１陽性細胞の相互作用区画を作成した（図１１ｂ）
【０１５６】
相互作用区画に対する容認された領域（最大４０の視野）に由来する総面積と非腫瘍細胞の総面積をそれぞれ、面積評価装置２３２、２３４で計算した。相互作用区画に対する容認された視野全てに由来する総面積を非腫瘍細胞の総面積で割り、相互作用計算機２３６を用いて計数１０，０００を掛けることによって、試料ごとの相互作用スコアを表す整数がもたらされた。ＰＤ−Ｌ１測定値及びＰＤ−１測定値は、再現性が高かった（それぞれＲ２＝０．９８及び０．９７）。広域のＰＤ−Ｌ１発現及びＰＤ−１発現並びに相互作用スコアは、保存臨床標本（ｎ＝５３）で観察された。ニボルマブ（ｎ＝５）又はペンブロリズマブ（ｎ＝２１）で処置した進行性黒色腫患者２６人のコホートでは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアからは、応答者と非応答者を容易に識別できる（ｐ＝０．０１）が、ＰＤ−Ｌ１単独（ｐ＝０．０７）又はＣＤ８単独（ｐ＝０．２３）ではできないことが分かった。さらに、高いＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアを発現する患者は、優れた奏効率を示した（８２％対２０％、ｐ＝０．０１）。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアの高い患者は、より大きな無増悪期間中央値（ｐ＝０．０５９）が認められ、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアの低い患者と比べて死亡率も低かった（２２％対５８％）。これらの結果から、組織試料を採点してＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアを得る本方法は、ＰＤ−Ｌ１発現単独と比べて優れた予測力を提供する（８２％陽性予測値、８０％陰性予測値）ことが分かる。
【０１５７】
患者２６人からの典型的なスコアを図１２ａに示す。データに応じて、閾値８００〜９００を選択して処置への応答の可能性を示した。
【０１５８】
別法として、個々の視野についての相互作用スコアを計算した。その患者ごとのスコア最大値を図１２ｂに示す。スコア最大値に応じて、閾値１９００を選択して処置への応答の可能性を示した。
【０１５９】
相互作用スコアに対する強化アルゴリズムの効果を評価するために、前記手順を、強化アルゴリズムの代わりにホールスライドイメージイング法を用いて行った（図１３参照）。ホールスライドイメージ解析を行ったときに、抗ＰＤ１治療に反応した患者と反応しなかった患者との間に統計学的有意差はもはや無かった。そのため、この解析では閾値を求めることができなかった。
【０１６０】
相互作用スコアを患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）と比較した（図１４）。少なくとも８０３の相互作用スコアが生存期間とうまく相関していた。特に、ＰＤ−Ｌ１発現は、ＰＦＳの向上と相関を示さなかった（図１５）。
【０１６１】
図１６及び図１７は、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）、ＰＤ−Ｌ陽性細胞（黄）、腫瘍細胞（Ｓ１００、緑）、及び全細胞（ＤＡＰＩ、青）を示すオーバーレイマスクの代表的な例を示している。免疫療法に対して陽性応答者の場合、図１６のマスクは、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）、ＰＤ−１陽性細胞（黄）、及び全腫瘍細胞（緑）の存在を簡単に示している。一方、免疫療法に対して陰性応答者の場合、図１７のマスクは、腫瘍細胞（Ｓ１００、緑）及び全細胞（ＤＡＰＩ、青）の存在を示すが、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）又はＰＤ−１陽性細胞（黄）にはほとんどないし全く示さない。図１６は、２１７６の相互作用スコアを表している（免疫療法に対して完全反応）。図１７は、８つの相互作用スコアを表している（免疫療法に無反応）。
【０１６２】
組織試料をさらにＦＤＡ承認方法を用いて評価して、現在は黒色腫組織試料に使用されていない抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン２２Ｃ３を用いて非小細胞肺がんにおけるＰＤ−Ｌ１を測定した。ＰＤ−Ｌ１発現を、患者のＰＦＳと比較した。これを図１９に示す。この方法は、相互作用スコアを使用する本明細書に記載の方法と比べると、統計学的に関連性のある診断値を示さない。
【０１６３】
さらに３４人の転移性黒色腫患者の照合コホートを検査して、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアを獲得した（図２０ａ参照）。相互作用スコアはまた、患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）とも比較した（図２０ｂ）。統計的に有意ではないが（ｐ＝０．１９）、この比較からは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアが高い患者ほどＰＦＳが長いという傾向が分かる。統計的有意性は、クリニックでのこの治療が比較的最近であったために制限されており、そのため、前記患者の追跡機関が制限されている可能性がある。
【０１６４】
患者２６人からなる初期コホートと患者３４人からなる検証コホートとの組み合わせにおけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコア並びに前記スコアと患者のＰＦＳ又は患者の全生存期間（ＯＳ）との比較を、図２０ｃ〜図２０ｅに示す。複合解析からは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の高い患者が抗ＰＤ−１治療に対して改善された反応を示すことがはっきりと分かる。
【０１６５】
実施例２．ヒト患者から得た非小細胞肺がん組織試料についての試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
上皮性腫瘍細胞に関し、４８８染料で直接標識化したマウス抗Ｓ１００を４８８染料で直接標識化したマウス抗パンサイトケラチンと置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。３８の試料についての相互作用スコアを図１８に示す。
【０１６６】
実施例３。ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞及びＣＤ８０を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
試料の調製；ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料を脱脂し、再水和して、高温条件で抗原修復を行った。次いで、染色を行ったが、そこでは、以降の工程を実行した。先ず、組織は、ＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して１ｋｂのＣＲＬＡ−４ｍＲＮＡに及ぶ２０個のハイブリッド形成プローブ対を用いてＣＴＬＡ−４発現検出に付した。Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成は、ＴＳＡ−Ｃｙ（登録商標）３を用いて視覚化した。スライドを洗浄し、残留ＨＲＰはすべて、新たなベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭの２回の洗浄を用いてクエンチした。スライドを再度洗浄してから、マウス抗ＣＤ８０一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＣＤ８０染色を、ＴＳＡーＣｙ（登録商標）５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。残留ＨＲＰはすべて、新たなベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭの２回の洗浄を用いてクエンチした。スライドを再度洗浄してから、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’、６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合液でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＣＤ３染色を、ＴＳＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）５（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出した。スライドをもう一度洗浄してから、封入剤を用いてカバーグラスで覆って、室温で一晩乾燥させた。
【０１６７】
実施例１と類似のイメージング及び解析手順を行ってＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３及びＣｙ（登録商標）５の波長全域を画像化した。ＣＴＬＡ−４及びＣＤ８０の発現を用いて、２０倍画像獲得用強化アルゴリズムを展開した。解析を実行して、ＣＤ８０陽性細胞の近接範囲内にあるＣＴｌＡ−４陽性細胞及びＣＤ３陽性細胞の総面積（画素）を測定し、それをＣＤ３陽性細胞の総面積（画素）で割り、計数１０，０００を掛け合わせることにより、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０相互作用スコアを求めた。結果を図２１に示す。
【０１６８】
実施例４．ＣＴＬＡ−４を発現する細胞及びＣＤ８０を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＣＴＬＡ−４及びＣＤ８０の染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１６９】
実施例５．ＰＤ−Ｌ２を発現する細胞及びＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１の染色及び解析をＰＤ−Ｌ２の染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１７０】
実施例６．ＣＴＬＡ−４を発現する細胞及びＣＤ８６を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＣＴＬＡ−４及びＣＤ８６の染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１７１】
実施例７．ＬＡＧ−３を発現する細胞及びＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＬＡＧ−３及びＨＬＡ−ＤＲの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１７２】
実施例８．ＴＩＭ−３を発現する細胞及びＧａｌｅｃｔｉｎ９を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＴＩＭ−３及びＧａｌｅｃｔｉｎ９の染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１７３】
実施例９．４１ＢＢを発現する細胞及び４．１ＢＢＬを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析を４１ＢＢ及び４．１ＢＢＬの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１７４】
実施例１０．ＯＸ４０を発現する細胞及びＯＸ４０Ｌを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＯＸ４０及びＯＸ４０Ｌの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１７５】
実施例１１．ＣＤ４０を発現する細胞及びＣＤ４０Ｌを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１７６】
実施例１２．ＩＣＯＳを発現する細胞及びＩＣＯＳＬを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＩＣＯＳ及びＩＣＯＳＬの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１７７】
実施例１３．ＧＩＴＲを発現する細胞及びＧＩＴＲＬを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＧＩＴＲ及びＧＩＴＲＬの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１７８】
実施例１４．ＨＬＡーＤＲを発現する細胞及びＴＣＲを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＨＬＡ−ＤＲ及びＴＣＲの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
【０１７９】
実施例１５．ＰＤ−１を発現する細胞、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞及びＣＤ３を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
実施例１と同様の手順を、マウス抗Ｓ１００抗体を用いずに行った。その代わりに、ＰＤ−Ｌ１検出後、一次抗体及び二次抗体をマイクロ波で除去した。次に、スライドを、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’、６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合液でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＣＤ３染色は、ＴＳＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出した。イメージング及び解析は、実施例１と同様であったが、空間的近接（例えば、相互作用スコア）は、画素単位で測定したＰＤ−Ｌ１領域内のＰＤ−１陽性細胞の面積を、画素単位で測定した全有核細胞の面積で割って、計数１０，０００を掛け合わせることにより計算した。２９の試料についての相互作用スコアを図２２に示す。
【０１８０】
本明細書に記載されているような、組織試料のバイオマーカー陽性値（％）を導き出すためのイメージング装置１００から得た画像データのコントロールは、図２３に図示したコントローラ１９００によって実行することができる。コントローラ１９００は、通信用インターフェース１９０２及び処理回路１９０４を含むことが分かる。処理回路１９０４は、バイオマーカー陽性値（％）を求めるための工程を実行するように設定されている。コントローラ１９００の素子及び機能は、イメージング装置１００のコントローラ１５０に包含されていてもよく、又はイメージング装置１００とは別のコンピュータシステムに含まれていてもよいと考えられる。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、試料は、特定のバイオマーカーに対して親和性を持つ複数の蛍光タグを使用して染色されてよい。染色された試料のデジタル画像が取得でき、また、その画像はさらに、蛍光タグの位置に基づいて解析することもできる。視野は、ホールイメージ解析よりも、対象である第１バイオマーカーを発現する細胞の数に基づいて優先順位を決めてよい。所定の数の視野はさらに、蛍光信号についても分析することができる。いくつかの実施形態において、蛍光信号の画像は、画像内の細胞に対応する１つ以上の蛍光信号のマスクを生じさせるようにコントロールされる。いくつかの実施形態において、１つ以上の蛍光信号のマスクは、画像内の全細胞のマスク、画像内のサブセットバイオマーカーを発現する全細胞（例えば、全腫瘍細胞）のマスク、画像内のサブセットバイオマーカーを発現しない全細胞（例えば、非腫瘍細胞全て）のマスク、画像内の対象である第１バイオマーカーを発現する全細胞のマスク、及びバイオマーカーを発現する、対象である全細胞を表すバイオマーカー陽性マスクからなる群から選択される１つ以上を含む。前記マスクの面積を用いて、要望通りにＰＢＰに対する値を導き出すことができる。バイオマーカーマスクの総面積を用いて、対象の細胞腫に関するバイオマーカーマスクの面積を、対象の区画内の全細胞の面積で割ることによって、バイオマーカー陽性値（％）を計算することができる。
【０１８２】
図２４は、バイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）を導き出すための方法の一実施形態の工程を表すフローチャートである。工程２００１では、画像データが得られ、工程２００２では、その画像データを分離することによって、その結果、様々な種類の蛍光信号に特異なデータが別個のチャネルに分類される。工程２００３では、第１チャネルからのデータを使用して全細胞のマスクを生成する。工程２００４では、第２チャネルからのデータを使用して、視野内にサブセットバイオマーカーを発現する領域のマスクを生成するが、例えば、このサブセットマスクは、視野内に含まれる腫瘍領域のマスクであり得る。工程２００５では、全細胞マスク及びサブセットマスク（例えば、腫瘍領域マスク）を組み合わせて、全サブセット細胞のマスクを生成する。ある実施形態において、全細胞マスクとサブセットマスクを組み合わせることによって、全腫瘍細胞及び／又は非腫瘍細胞全てを同定することができる。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーで特定される細胞のサブセット、及び細胞の非サブセットはそれぞれ、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーで特定される細胞のサブセット、及び細胞の非サブセットはそれぞれ、生存細胞及び非生存細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーで特定される細胞のサブセットは、生存細胞のサブセットであり、また、細胞の非サブセットは、生存細胞のサブセットに包含されない生存細胞からなる。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーで特定される細胞のサブセット、及び細胞の非サブセットはそれぞれ、Ｔ細胞及び非Ｔ細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーで特定される細胞のサブセット、及び細胞の非サブセットはそれぞれ、骨髄性細胞及び非骨髄性細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。
【０１８４】
プロセスは、対象である細胞の選択された種類のみ、例えば、腫瘍細胞又は非腫瘍細胞のみについて行うことができる。プロセスはまた、両者の解析を目的としてもよい。工程２００６では、第３チャネルからのデータを用いて、バイオマーカーに陽性を示す全細胞のマスクを（対象である特定のバイオマーカーとの結合に親和性を示す蛍光タグの存在を表す蛍光信号に基づいて）生成する。工程２００７及び２００８では、工程２００６で生成されたバイオマーカーマスクを、工程２００５で生成されたサブセット細胞マスクと組み合わせる。工程２００７では、バイオマーカーマスクとサブセット細胞マスクを最初の方法で組み合わせて、バイオマーカーに陽性を示す全サブセット細胞のマスクを生成する。工程２００８では、バイオマーカーマスクとサブセット細胞マスクを２つ目の方法で組み合わせて、バイオマーカーに陽性を示さない全サブセット細胞のマスクを生成する。工程２００７と工程２００８のうち一方又は両方は、本方法の様々な実施形態にしたがって行われてよい。工程２００９／２０１０において、対象であるサブセット細胞（例えば、工程２００７で生成されたマスクによって特定されるバイオマーカーに陽性を示すサブセット細胞、又は工程２００８で作成されたマスクによって特定されるバイオマーカーに陽性を示さないサブセット細胞）の面積を、対象である全細胞の総面積で割ることによって、ＰＢＰスコアが計算される。工程２００９は、バイオマーカーに陽性を示すサブセット細胞に関するＰＢＰが計算される。工程２０１０では、バイオマーカーに陽性を示さないサブセット細胞に関するＰＢＰが計算される。工程２００９と工程２０１０のうち一方又は両方は、本方法の様々な実施形態にしたがって行われてよい。
【０１８５】
図２５は、バイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）を導き出すための方法のもう一つの実施形態の工程を表すフローチャートである。工程２１０１では、画像データが得られ、工程２１０２では、その画像データを分離することによって、その結果、様々な種類の蛍光信号に特異なデータを別個のチャネルに分ける。工程２１０３では、第１チャネルからのデータを使用して全細胞のマスクを生成する。工程２１０４では、第２チャネルからのデータを用いて、バイオマーカーに陽性を示す全細胞のマスクを（対象である特定のバイオマーカーとの結合に親和性を示す蛍光タグの存在を表す蛍光信号に基づいて）生成する。工程２１０５では、（工程２１０４で作成されたマスクによって特定される）バイオマーカーに陽性を示す全細胞の面積を、（工程２１０３からの）対象である全細胞の総面積で割ることによって、ＰＢＰスコアが計算される。図２５のプロセスは、図２４に示した方法と別々に又は同時に実行することができる。言い換えると、ＰＢＰスコアは、全細胞、全腫瘍細胞、及び非腫瘍細胞全て、又はそれらの組み合わせについて計算することができ、図２４の方法と図２５の方法を組み合わせてもよい。
【０１８６】
図２３において、コントローラ１９００は、通信用インターフェース１９０２と処理回路１９０４を備えることが分かる。通信用インターフェース１９０２は、様々なシステム、装置又はネットワークとデータ通信を行うために有線インターフェース又は無線インターフェース（例えば、ジャック、アンテナ、送信機、受信機、トランシーバ、ワイヤー端子など）を包含していてもよい。例えば、通信用インターフェース１９０２は、イーサネット系通信ネットワークを介してデータを送受信するためのイーサネットカード及びポート、及び／又は無線通信ネットワークを介して通信するためのＷｉ−Ｆｉトランシーバを包含していてもよい。通信用インターフェース１９０２は、ローカルエリアネットワーク又は広域ネットワーク（例えば、インターネット、構築ＷＡＮなど）を介して通信するように設定されてもよく、また、様々な通信プロトコル（例えば、ＢＡＣｎｅｔ、ＩＰ、ＬＯＮなど）を使用することもできる。通信用インターフェース１９０２は、コントローラ１９００と様々な外部システム又は外部装置（例えば、イメージング装置１００）との間で電子データ通信を促進するように設定されたネットワークインターフェースであってもよい。例えば、コントローラ１９００は、選択された視野に関する画像データをイメージング装置１００から受信して、そのデータを解析してバイオマーカー陽性値（％）を計算することができる。
【０１８７】
処理回路１９０４は、プロセッサ１９０６及びメモリ１９０８を包含することが分かる。プロセッサ１９０６は、汎用のプロセッサ若しくは特定の目的のプロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、処理コンポーネントのグループ、又は他の好適な処理コンポーネントであってよい。プロセッサ５０６は、メモリ５０８に記憶された若しくは他のコンピュータ可読媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ、ネットワーク記憶装置、リモートサーバ）から受信された計算機コード又は指示を実行するように設定されていてよい。
【０１８８】
メモリ１９０８は、本開示において説明される様々なプロセスを計算及び／又は促進するためのデータ及び／又は計算機コード記憶用の１つ以上の装置（例えば、記憶装置、メモリ素子、ストレージデバイスなど）を包含してもよい。メモリ１９０８は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み込み専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブ記憶装置、一時記憶装置、不揮発性メモリ、フラッシュメモリ、光メモリ、又はソフトウェアオブジェクト及び／又はコンピュータ指示を記憶するための任意の他の好適なメモリを包含してもよい。メモリ１９０８は、データベースコンポーネント、オブジェクトコードコンポーネント、スクリプトコンポーネント、又は本開示において説明される様々なアクティビティ及び情報構造を支援するための任意の他の種の情報構造を包含してもよい。メモリ５０８は、処理回路１９０４を介してプロセッサ１９０６と通信可能に接続されていてよく、また、本明細書に記載の１つ以上のプロセスを（例えば、プロセッサ１９０６によって）実行するためのコンピュータコードを包含してもよい。
【０１８９】
さらに図２３についていえば、コントローラ１９００は、イメージング装置１００からの入力を受信することが分かる。イメージング装置は、画像データをすべて取得して、それを表現するメタデータのすべてとともにそれを記録する。イメージング装置は、その後、コントローラ１９００によって読み出すことができるストリームにデータをシリアル化する。データストリームは、任意のバイナリデータストリームタイプ、例えば、ファイルシステム、ＲＤＢＭ又はダイレクトＴＣＰ／ＩＰ通信などに対応し得る。データストリームを使用する場合、コントローラ１９００は、分光分離装置１９１０を含むことが分かる。分光分離装置１９１０は、画像データをイメージング装置１００から受信することができ、そこで分光分離を行うことによって、様々な波長を表す画像を、各波長帯域に対して独立した個別のチャネルに分離する。例えば、画像データは、組織試料において対象である細胞又はタンパク質を特定するのに使用される様々な蛍光色素分子ごとに別個のチャネルに「分離」されてよい。蛍光色素分子は、ほんの一例として、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３．５、Ｃｙ（登録商標）５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８染料、５５５染料、５９４染料、及びＴｅｘａｓＲｅｄからなる群のうちの１つ以上であってよい。ある例では、チャネルのうちの１つは、画像において核を特定するために波長４６１ｎｍ（ＤＡＰＩに関する最高発光波長）周辺の所定の帯域に存する画像データを含んでいてもよい。それ以外のチャネルは、様々な波長に対する画像データを包含して、様々な蛍光色素分子を使用して組織試料の様々な部分を特定してもよい。
【０１９０】
コントローラ１９００は、様々なマスカー、例えば細胞マスカー１９１２、サブセット領域マスカー１９１６、及び第２バイオマーカーマスカー１９２２などを包含することも分かっている。これらマスカー、又は他の実施形態においてコントローラ１９００に包含され得る他のマスカーを使用して、分光分離装置からの分離された信号を受信して、組織試料において対象である一定の特徴を特定するのに使用される蛍光色素分子に応じて、対象である特有の細胞又は領域に対してマスクを作成する。マスクを作成するために、マスカー（例えば、細胞マスカー１９１２、サブセット領域マスカー１９１６、及びバイオマーカーマスカー１９２２など）は、視野において各画素の強度に関連した画像データを受信する。画素強度は、試料によって発光される蛍光発光の量に正比例しており、その結果、（蛍光色素分子を使用して特有のバイオマーカーを特定した場合に）試料中のタンパク質バイオマーカーの量と正比例する。絶対閾値は、画像画素に認められる値に基づいて設定されてよい。閾値以上の画素はすべて、１．０又は「オン」にマッピングされ、また、それ以外の画素はすべて、０．０又は「オフ」にマッピングされる。この方法において、バイナリマスクは、視野内の対象である細胞部分又は組織部分を特定するように作成される。他の実施形態において、マスクは、下界を用いて作成され、その場合、下界以上の整数を有する画素はすべて認められて、マスクにおける画素値として使用される。強度が下界未満の場合、画素値は０．０又は「オフ」に設定される。図２６に示すマスキングのための作業工程図例において、ＤＡＰＩ及び４８８染料チャネル（又は核及び腫瘍領域それぞれを特定するための他の蛍光色素分子）は、下界プロトコル（工程２２１０、２２１２、２２２０、２２２２）を使用するが、Ｃｙ５チャネル（又は対象であるバイオマーカーを特定するための他の蛍光色素分子）は、マスク出力を提供するために、閾値プロトコルを使用する（工程２２３０）ことが示されている。下界プロトコルと関連して、下界を求めるためのヒストグラム工程もある。具体的には、ヒストグラムの閾値（工程２２１２、２２２２）は、入力画像の閾値をもたらすが、スライディングスケールを用いて閾値化が生じるポイントを求める。入力データは、現在の画像とユーザ定義の閾値パーセンテージである。後者は、閾値レベルが設定される合計強度（％）を求めるのに使用される。先ず、各画素の強度を合計して合計強度とする。閾値（％）にこの合計強度を掛けると、カットオフ合計が得られる。最後に、画素全てを、（ヒストグラム中の）強度で分類して、カットオフ合計が得られるまで（ｂｉｎごとに）あらゆる前記強度を合計する。プロセス中に達した最後の最高画素強度が、現在の画像に対する閾値である。閾値よりも大きな強度を有する画素は全て、最大値に設定された強度を有するが、それ以外は全て最小値に設定される。
【０１９１】
図２６において工程２２１４、２２１６、２２２４、２２２６、２２２８、２２３２、２２３４、２２３６として特定される工程は、初期マスカー、例えば細胞マスカー１９１２（工程２２１４、２２１６）、サブセット領域マスカー１９１６（工程２２２４、２２２６、２２２８）、バイオマーカーマスカー１９２２（工程２２３２、２２３４、２２３６）中で生じる中間工程を表す。これら工程は、次のように定義される。
【０１９２】
拡張は、画像中の最高輝度領域の面積を増大する。拡張には、２つの入力データが必要である。１つ目は、計算上の現在の画像であり、２つ目は、拡張の反復回数である。１つ目の入力データには二値画像のみが使用されると考えられる。この手順は、連続画像に有効であるが、出力は有効な拡張ではない。拡張処理は、先ず、画像中の最大画素強度を見つけることによって開始する。その後、画像中の各画素を一度試験する。調査中の画素が最大強度に等しい強度を有する場合、その画素が、反復半径を有しかつ元の画素を中心とした円として出力画像に書き込まれる。円内の画素はすべて、最大強度と等しい強度を有する。それ以外の画素はすべて、修正せずに出力画像へ複写される。
【０１９３】
穴埋め手順は、画像の「空」領域を最大強度の画素で埋める。これら空領域は、最小強度を有する領域であり、また、その画素領域（サイズ）はユーザによって指定される。現在の画像とサイズは、必要な２つの入力データである。拡張と同様に、この手順は、二値画像に適用されるだけである。
【０１９４】
拡張と同様の形態での画像のエロ―ジョン処理
機能性はすべて、第１工程が画像の最小強度を測定し、最低強度をマッピングする画素のみが変更されて、試験値である最小強度の画素をブルームするのに用いた円が最低強度値で埋められること以外は、拡張と同様である。拡張と同様に、この手順は、二値画像に適用されるだけである。
【０１９５】
オブジェクトの削除
２つの入力データ、すなわち現在の画像とオブジェクトサイズが要求される。オブジェクトの削除は、穴埋め手順とは逆のものである。入力データであるオブジェクトサイズよりも小さな面積を埋める最大強度を有する画素のみを含む任意の領域が最小強度に設定され、こうして「削除される」。この手順は二値画像に適用されるだけであるが、連続画像への適用が、予想外の結果をもたらす可能性がある。
【０１９６】
工程２２１８、２２２９、及び２２３８における出力データはそれぞれ、結果として得られた細胞マスク、サブセット領域マスク（又は、この特定の例では、腫瘍領域マスク）、及びバイオマーカー細胞マスクである。図２６はさらに、ＰＢＰスコアについての関連領域情報を得るための前記結果としてのマスクの組み合わせを示している。これらの組み合わせを、図２３に示すコントローラ１９００の組み合わせマスカーを参照して、以下に説明する。
【０１９７】
コントローラ１９００は、組み合わせマスカー、例えばサブセット細胞マスカー１９１８、非サブセット細胞マスカー１９２０、及び組み合わせマスカー１９３０を包含することが分かる。いくつかの実施形態において、マスカー１９１８で特定されるサブセット細胞及びマスカー１９２０で特定される非サブセット細胞は、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、サブセット細胞マスカー１９１８は、腫瘍マスカーであり、また、非サブセット細胞マスカー１９２０は、非腫瘍マスカーである。サブセット細胞マスカーは、図２６の工程２２５２で示されるように、ａｎｄ演算を実行して、細胞マスカー１９１２（画像中の全細胞を表す）の出力をサブセット領域マスカー１９１６の出力と組み合わせる。したがって、サブセット細胞マスカーは、画像中の全サブセット細胞のマスクを生成する。これと同じ組み合わせは、図２６の工程２２５４で示されるような非サブセット細胞マスカー１９２０によって実行されるｏｕｔ演算を用いて、試料画像中に非サブセット細胞全てのマスクを生成する。
【０１９８】
組み合わせマスカー１９３０は、２つの入力データを組み合わせるように設定される。図２６に示されるように、組み合わせマスカー１９３０は、バイオマーカーマスクを、サブセット細胞マスク（サブセット細胞マスカー１９１８由来）又は非サブセット細胞マスク（非サブセット細胞マスカー１９２０由来）のうちの一方と組み合わせるか、又はバイオマーカーマスク＋サブセットマスクとバイオマーカーマスク＋非サブセットマスクの両方と組み合わせる。点線は、細胞マスクの一方又は両方が組み合わせマスカー１９３０においてバイオマーカーマスクと組み合わされ得ることを表す。組み合わせマスカー１９３０の結果は、バイオマーカーに陽性を示す全サブセット細胞及び／又はバイオマーカーに陽性を示す非サブセット細胞を表すマスクである。組み合わせマスカー１９３９は、組み合わせマスカー１９３０の結果が、バイオマスカーに陽性を示さない（すなわち、バイオマーカー陰性）サブセット細胞を表すマスクであるような別の方法で、マスクを組み合わせてもよい。対象である細胞がサブセット、例えば、腫瘍又は非腫瘍、いやむしろ全細胞と特に関連しない場合、バイオマーカー陽性マスクは、それ以上マスクと組み合わされることなく、修正せずに組み合わせマスカー１９３０を通過する。
【０１９９】
バイオマーカー陽性スコア（％、ＰＢＰ）を計算するために、選択されたサブセット細胞（例えば、全細胞、腫瘍細胞、又は非腫瘍細胞）バイオマーカー陽性マスク又はバイオマーカー陰性マスク（この場合、スコアはバイオマーカー陰性を表す）の面積を、面積評価装置１９３２において画素単位で求める。選択された全細胞（バイオマーカーに陽性を示すものと陽性を示さないもの）の総面積を面積評価装置１９３２において画素単位で求める。面積評価装置１９３２へとむけられた点線は、総面積入力データが全細胞マスク、サブセット細胞マスク、及び非サブセットマスクのうち１つ以上であり得ることを示しており、それらは別々に計算される。バイオマーカー陽性スコア（％）は、陽性計算装置１９３６において求められる。ある実施形態において、ＢＰＢスコアは、面積評価装置１９３２からの選択された細胞バイオマーカー陽性マスクの面積を、面積評価装置１９３２からの選択された全細胞マスクの面積で割って、１００を掛けることによって計算される。一実施形態において、相互作用計算機１９３６で実行される式は次の通りである。
【数９】
2018536852.tif 000012
前記式中、ＡＰは、選択されたタイプのサブセット細胞（例えば、全細胞、腫瘍細胞、又は非腫瘍細胞）に関するバイオマーカー陽性面積であり、また、ＡＡは、選択されたタイプの細胞の全細胞（全細胞、腫瘍細胞、非腫瘍細胞）の総面積である。いくつかの実施形態において、上記式中、ＡＰをＡＮに置き換えて（ここで、ＡＮは、選択される全種（例えば、全細胞、腫瘍細胞、又は非腫瘍細胞）に関するバイオマーカー陽性面積である）、サブセット細胞タイプに関するバイオマーカー陰性値（％）を表すスコアを求める。
【０２００】
ＡＮＤ手順は、２進ａｎｄ演算後を手本にしているが、有意手段が異なる。ＡＮＤ手順は、現在の画像及びユーザ選択結果を受け入れる。出力は、２つの入力画像からの画素と合致する正規化強度同士を掛け合わせることによって生じた画像である。いくつかの場合、画像強度データはすでに正規化されている。したがって、ＡＮＤ手順は、単に、２つの画像の画素上の掛け算である。
【０２０１】
ＯＵＴ手順に必要な２つの入力データは、現在の画像とユーザ選択結果である。ＯＵＴ手順は、
式：Ａ＊（１−Ｂ／Ｂｍａｘ）
に従って第１の画像から第２の画像を削除するものであり、前記式中、Ａは、現在の画像であり、Ｂは、削除すべきユーザ選択画像であり、また、Ｂｍａｘは、Ｂの最大強度である。ここで留意すべきは、ＢをＢｍａｘで割ることによって、Ｂを正規化することである。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、本明細書には、がん患者から採取した組織試料の視野に含まれる全細胞、又は場合により１つ以上のそのサブセットに関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）を導き出すためのイメージングシステムであって、イメージング領域内で試料の位置決めをするためのステージを備えたイメージング装置と、試料に電磁放射線を向けるための電磁放射線源と、試料からの電磁放射線を検出するように設定された検出器と、コントローラとを備えた、前記イメージングシステムが提示されている。コントローラは、オペレータと電子制御システムとの間で情報を変換するためのユーザインターフェースと、コンピュータ可読媒体に記憶された指示を実行するように設定された処理回路とを備えている。指示は、イメージングシステムの電子制御システムに、（ｉ）検出された電磁放射線についての情報をイメージング装置から受信させ、（ｉｉ）検出された電磁放射線に基づいて画像データを生成させて、（ｉｉｉ）画像データを解析して、視野に含まれる全細胞、又は場合により１つ以上のそのサブセットに関するＰＢＰ値を導き出させるものである。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、データの解析は、
（ｉ）視野に含まれる全細胞の核を表す第１蛍光信号の画像を生成すること、及び第１蛍光信号を細胞全体の直径まで拡張して視野に含まれる全細胞の第１マスクを構築することと、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す第２蛍光信号の第２マスクを構築することと、
（ｉｉｉ）場合により、対象である第１バイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す第３蛍光信号の第３マスクを構築することと、
（ｉｖ）第１マスクと第２マスクを、サブセットバイオマーカーをも発現する視野内に含まれる全細胞を表す蛍光信号を含む第４マスクを提供する形で組み合わせること、
（ｖ）場合により、第１マスクと第３マスクを、対象である第１バイオマーカーをも発現する視野内に含まれる全細胞の第１サブセットを表す蛍光信号を含む第５マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｖｉ）第４マスクの総面積を第１マスクの総面積で割ることによって、サブセットバイオマーカーを発現する全細胞に関するＰＢＰ値を導き出すことと、
（ｖｉｉ）場合により、第４マスクと第５マスクを、サブセットバイオマーカー及び対象である第１バイオマーカーを発現する視野内の全細胞の第１サブセットを表す蛍光信号を含む第６マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｖｉｉｉ）場合により、第６マスクの総面積を第５マスクの総面積で割ることによって、サブセットバイオマーカー及び対象である第１バイオマーカーを発現する全細胞の第１サブセットに関するＰＢＰ値を導き出すこと
を含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、データの解析は、
（ｉ）視野に含まれる全細胞の核を表す第１蛍光信号の画像を生成すること、及び第１蛍光信号を細胞全体の直径まで拡張させて視野に含まれる全細胞の第１マスクを構築することと、
（ｉｉ）サブセットバイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す第２蛍光信号の第２マスクを構築することと。
（ｉｉｉ）場合により、対象である第１バイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す第３蛍光信号の第３マスクを構築することと。
（ｉｖ）第１マスクと第２マスクを、サブセットバイオマーカーをも発現する視野内に含まれる全細胞を表す蛍光信号を含む第４マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｖ）場合により、第１マスクと第３マスクを、対象である第１バイオマーカーをも発現する視野内に含まれる全細胞を表す蛍光信号を含む第５マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｖｉ）第４マスクの総面積を第１マスクの総面積で割ることによって、サブセットバイオマーカーを発現する全細胞に関するＰＢＰ値を導き出すことと、
（ｖｉｉ）場合により、第４マスクと第５マスクを、
（ａ）サブセットバイオマーカー及び対象である第１バイオマーカーを発現する視野内の全細胞、又は
（ｂ）対象である第１バイオマーカーを含まないサブセットバイオマーカーを発現する視野内の全細胞
を表す蛍光信号を含む第６マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｖｉｉｉ）場合により、第６マスクの総面積を第４マスクの総面積で割ることによって、（ａ）サブセットバイオマーカー及び対象である第１バイオマーカーを発現するか、又は
（ｂ）対象である第１バイオマーカーを含まないサブセットバイオマーカーを発現する
のいずれか一方の全細胞の第１サブセットに関するＰＢＰ値を導き出すこと
を含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、前記任意の工程を行わない。いくつかの実施形態では、列挙された任意の工程を全て行う。いくつかの実施形態において、総面積は、画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第４マスクの総面積と第１マスクの総面積はそれぞれ画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第６マスクの総面積と第４マスクの総面積はそれぞれ画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第１マスクの総面積、第４マスクの総面積及び第６マスクの総面積はそれぞれ画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、画素は、幅０．５μｍである。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、データの解析はさらに、
（ｉｘ）対象である第２バイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す第４蛍光信号の第７マスクを構築することと、
（ｘ）第１マスクと第７マスクを、対象である第２バイオマーカーをも発現する視野内の全細胞の第２サブセットを表す蛍光信号を含む第８マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｘｉ）第４マスクと第８マスクを、サブセットバイオマーカー及び対象である第２バイオマーカーを発現する視野内の全細胞の第２サブセットを表す蛍光信号を含む第９マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｘｉｉ）第９マスクの総面積を第４マスクの総面積で割ることによって、サブセットバイオマーカー及び対象である第２バイオマーカーを発現する全細胞の第２サブセットに関するＰＢＰ値を導き出すこと
も含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、総面積は、画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第９マスクの総面積と第４マスクの総面積はそれぞれ画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、画素は、幅０．５μｍである。
いくつかの実施形態において、データの解析はさらに、
（ｉｘ）対象である第２バイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す第４蛍光信号の第７マスクを構築することと、
（ｘ）視野内のサブセットバイオマーカーを発現しない全細胞を表す蛍光信号を含む第８マスクを提供する形で、第２マスクを第１マスクから差し引くことと、
（ｘｉ）第７マスクと第８マスクを、対象である第２バイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しない視野内の全細胞を表す蛍光信号を含む第９マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｘｉｉ）第９マスクの総面積を第８マスクの総面積で割ることによって、対象である第２バイオマーカーを発現するがサブセットバイオマーカーを発現しない全細胞に関するＰＢＰ値を導き出すこと
も含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、
（ｉｘ）対象である第２バイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す第４蛍光信号の第７マスクを構築することと、
（ｘ）第６マスクと第７マスクを、
（ａ）視野内のサブセットバイオマーカー、対象である第１バイオマーカー、及び対象である第２バイオマーカーを発現する全細胞か、
（ｂ）視野内の対象である第２バイオマーカーを含まずにサブセットバイオマーカー及び対象である第１バイオマーカーを発現する全細胞か、又は
（ｃ）視野内の第１サブセットバイオマーカーを含まずにサブセットバイオマーカー及び対象である第２バイオマーカーを発現する全細胞
を表す蛍光信号を含む第８マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｘｉｉ）第８マスクの総面積を第４マスクの総面積で割ることによって、対象である第１バイオマーカー若しくは対象である第２バイオマーカー、又はその組み合わせを発現し、さらにはサブセットバイオマーカーをも発現する全細胞に関するＰＢＰ値を導き出すこと
も含む。
いくつかの実施形態において、前記方法はさらに、１つ以上の対象である追加のバイオマーカー（例えば、対象である第３バイオマーカー）に対して、工程（ｉｘ）、（ｘ）及び（ｘｉｉ）と同様の工程のさらなるサイクルも含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、総面積は、画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第９マスクの総面積と第８マスクの総面積はそれぞれ画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、画素は、幅０．５μｍである。
【０２１０】
別の態様において、本明細書には、視野内に含まれる全腫瘍細胞に関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）を導き出す方法であって、
（ｉ）視野に含まれる全細胞の核を表す第１蛍光信号の画像を生成すること、及び第１蛍光信号を細胞全体の直径まで拡張させて視野に含まれる全細胞の第１マスクを構築することと、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す第２蛍光信号の第２マスクを構築することと。
（ｉｉｉ）第１マスクと第２マスクを、視野内の全腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第３マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｉｖ）対象であるバイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す第３蛍光信号の第４マスクを構築することと、
（ｖ）第３マスクと第４マスクを、対象であるバイオマーカーをも発現する視野内の全腫瘍細胞を表す蛍光信号を含む第５マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｖｉ）第５マスクの総面積を第３マスクの総面積で割ることによって、対象であるバイオマーカーを発現する全腫瘍細胞に関するＰＢＰ値を導き出すこと
を含む、前記方法が提示される。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、総面積は、画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第５マスクの総面積と第３マスクの総面積はそれぞれ画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、画素は、幅０．５μｍである。いくつかの実施形態において、対象であるバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、及びＭＨＣからなる群から選択されるバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、対象であるバイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含む。いくつかの実施形態において、対象であるバイオマーカーは、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９を含む。いくつかの実施形態において、対象であるバイオマーカーは、ＭＨＣを含む。いくつかの実施形態において、視野はさらに、非腫瘍細胞も含む。いくつかの実施形態において、非腫瘍細胞は、免疫細胞及び間質細胞を含む。
【０２１２】
別の態様において、本明細書には、視野内に含まれる非腫瘍細胞全てに関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）を導き出す方法であって、
（ｉ）視野に含まれる全細胞の核を表す第１蛍光信号の画像を生成すること、及び第１蛍光信号を細胞全体の直径まで拡張させて視野に含まれる全細胞の第１マスクを構築することと、
（ｉｉ）腫瘍バイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す第２蛍光信号の第２マスクを構築することと、
（ｉｉｉ）視野内の非腫瘍細胞全てを表す蛍光信号を含む第３マスクを提供する形で、第１マスクから第２マスクを差し引くことと、
（ｉｖ）対象であるバイオマーカーを発現する視野内に含まれる全面積を表す蛍光信号の第４マスクを構築することと。
（ｖ）第３マスクと第４マスクを、対象であるバイオマーカーも発現する視野内の非腫瘍細胞全てを表す蛍光信号を含む第５マスクを提供する形で組み合わせることと、
（ｖｉ）第５マスクの総面積を第３マスクの総面積で割ることによって、対象であるバイオマーカーを発現する非腫瘍細胞全てに関するＰＢＰ値を導き出すこと
を含む前記方法が提示される。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、視野内の全細胞の第１サブセットは、腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、視野内の全細胞の第１サブセットは、非腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、視野内の全細胞の第１サブセットは、非腫瘍細胞及び腫瘍細胞を含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、生存細胞及び非生存細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞のサブセットは、生存細胞のサブセットであり、また、細胞の非サブセットは、生存細胞のサブセットに包含されない生存細胞からなる。いくつかの実施形態において、細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、Ｔ細胞及び非Ｔ細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、骨髄性細胞及び非骨髄性細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、視野内の全細胞の第１サブセットは、Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ３を発現する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ８を発現する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４を発現する。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、視野内の全細胞の第１サブセットは、骨髄性細胞を含む。さらなる実施形態において、骨髄性細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞である。さらなる実施形態において、骨髄性細胞は、腫瘍関連マクロファージである。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１９を含む。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、骨髄性細胞で発現される。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、骨髄由来サプレッサー細胞で発現される。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、腫瘍関連マクロファージで発現される。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーはＫｉ６７を含み、また、視野内の全細胞の第１サブセットはＣＤ８陽性細胞を含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、ｇｒａｎｚｙｍｅＢ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から成る群から選択されるバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から成る群から選択されるバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において対象である第１バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬからなる群から選択されるバイオマーカーを発現する。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、及びＭＨＣからなる群から選択されるバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、対象である第２バイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及びＴＣＲから選択されるバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、対象である第２バイオマーカーは、ＰＤ−１を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカー及び対象である第２バイオマーカーは、互いに異なり、また、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から成る群から選択されるバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカー及び対象である第２バイオマーカーは、互いに異なり、また、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＤＯ−１、ＡＲＧ１、グランザイムＢ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から成る群から選択されるバイオマーカーを含む。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から成る群から選択されるバイオマーカーを含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３及びＴＣＲから選択されるバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＰＤ−１を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＣＤ８０を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＣＴＬＡ−４を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＣＤ８０を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ２を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＰＤ−１を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＣＴＬＡ−４を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＣＤ８６を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＬＡＤ−３を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＨＬＡ−ＤＲを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＴＩＭ−３を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、４１ＢＢを含み、また、対象である第２バイオマーカーは、４．１ＢＢＬを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＯＸ４０を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＯＸ４０Ｌを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＣＤ４０を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＣＤ４０Ｌを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＩＣＯＳを含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＩＣＯＳＬを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＧＩＴＲを含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＧＩＴＲＬを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＨＬＡ−ＤＲを含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＴＣＲを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＣＤ２５を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＦｏｘＰ３を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＣＤ４を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＣＤ８を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＣＤ３を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＰＤ−１を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＣＤ５６を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＣＤ１６を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＨＬＡ−ＤＲを含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＩＤＯ−１を含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、ＣＤ３３を含み、また、対象である第２バイオマーカーは、ＡＲＧ１を含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、腫瘍細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、非腫瘍細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、Ｔ細胞で発現される。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ３を含む。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１９を含む。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ４５を含む。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、骨髄性細胞で発現される。いくつかの実施形態において、サブセットバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂを含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーはＫｉ６７を含み、また、視野内の全細胞の第１サブセットはＣＤ８陽性細胞を含む。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、非腫瘍細胞は、免疫細胞及び間質細胞を含む。いくつかの実施形態において、非腫瘍細胞は、骨髄性細胞を含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、蛍光信号は、４つの蛍光タグに由来しており、それぞれ異なるバイオマーカーに特異的である。さらなる実施形態において、第１蛍光タグは対象である第１バイオマーカーと関連しており、第２蛍光タグは対象である第２バイオマーカーと関連しており、第３蛍光タグは対象である第３バイオマーカーと関連しており、また、第４蛍光タグは対象である第４バイオマーカーと関連している。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、腫瘍及び非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態において、対象である第２バイオマーカーは、非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態において、対象である第１バイオマーカーは、腫瘍及び非腫瘍マーカーを含み、また、対象である第２バイオマーカーは、非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態において、対象である第３バイオマーカーは、全細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、対象である第４バイオマーカーは、腫瘍細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、対象である第３バイオマーカーは全細胞によって発現され、また、対象である第４バイオマーカーは腫瘍細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、対象である第４バイオマーカーは、サブセットバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、対象である第３バイオマーカーは全細胞によって発現され、また、対象である第４バイオマーカーはサブセットバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、１つ以上の蛍光タグは、特有のバイオマーカー又は別の抗体に対して結合親和性を示す抗体と共役した蛍光色素分子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の蛍光タグは、特有のバイオマーカーに対して親和性を示す蛍光色素分子である。
【０２２５】
別の態様において、イメージング装置及びコントローラを備えたシステムであって、がん患者から得た組織試料の視野内に含まれる全細胞若しくは、場合により、１つ以上のそのサブセットに関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）を導き出すためのコントローラであって、患者のがんを治療する方法に使用される前記システムを利用する方法が開示されている。
いくつかの実施形態において、本明細書には、治療する必要のある患者のがんを治療するための、イメージング装置及びコントローラを備えたシステムを利用する方法であって、がん患者から得た組織試料の視野中に含まれる全細胞若しくは、場合により、１つ以上のそのサブセットに関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）を導き出すことを含む、前記方法が開示されている。いくつかの実施形態において、導き出す工程は、本明細書に説明した通りである。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、本明細書には、組織試料の視野内に含まれる全細胞若しくは、場合により、１つ以上のそのサブセットに関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）を導き出す方法であって、（ｉ）イメージングシステムを使用してがん患者から採取した組織試料についてのデータを得ることであって、イメージングシステムが、試料をイメージング領域において位置付けるためのステージ、電磁放射線を試料に向けるための電磁放射線源、及び電磁放射線出力を収集するための検出器を備えたハウジングと、メモリ及び画像処理モジュールを有する電子制御システムを有する処理回路を備えている、ことと、（ｉｉ）画像処理モジュールを用いて画像データを解析して、視野内に含まれる全細胞若しくは、場合により、１つ以上のそのサブセットに関するＰＢＰを導き出すことを含む、前記方法が開示されている。いくつかの実施形態において、組織試料の視野内に含まれる全細胞若しくは、場合により、１つ以上のそのサブセットに関するＰＢＰ値を導き出す方法は、がんと診断された患者の進捗及び受けている免疫療法をモニターする方法の一環として使用される。いくつかの実施形態において、組織試料の視野内に含まれる全細胞若しくは、場合により、１つ以上のそのサブセットに関するＰＢＰ値を導き出す方法は、がんと診断された患者の免疫細胞改変及び受けている免疫療法をモニターする方法の一環として使用される。
【０２２７】
実施例１６．ヒト患者から得た黒色腫組織試料についての試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
試料の調製：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料を脱脂した。次に、スライドは、キシレンからアルコールまでの一連の洗浄を経て再水和してから、蒸留水中でインキュベートした。その後、加熱抗原賦活化法を、高圧高温条件を用いて行い、冷却させて、トリス緩衝生理食塩水へ移した。次いで、染色を行ったが、そこでは、以降の工程を実行した。先ず、内在性ペルオキシダーゼを遮断した後、タンパク質ブロッキング溶液でインキュベートして非特異性抗体染色を抑えた。次にスライドを、マウス抗ＰＤ１一次抗体で染色した。スライドをその後洗浄してから、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＰＤ−１染色は、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３．５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。残留ＨＲＰはすべて、新たなベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭの２回の洗浄を用いてクエンチした。スライドを再度洗浄してから、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、４８８染料と４’、６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で直接標識化した抗ウサギＨＲＰ二次抗体とマウス抗Ｓ１００の混合液でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＰＤ−Ｌ１染色は、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。スライドをもう一度洗浄してから、封入剤を用いてカバーグラスで覆って、室温で一晩乾燥させた。抗体と検出試薬の略図解説を図２３に示す。
【０２２８】
試料のイメージング及び解析：次に、Ｖｅｃｔｒａソフトｖｅｒｓｉｏｎ２．０．８（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用したＶｅｃｔｒａ２  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて蛍光画像を獲得した。先ず、スライドの白黒イメージングは、ＤＡＰＩを用いて４倍で行った。自動化アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発されたもの）を用いて組織を含むスライドの領域を確認した。
【０２２９】
組織を含むと特定されたスライドの領域を、ＤＡＰＩ（青）、ＦＩＴＣ（緑）及びＣｙ（登録商標）５（赤）に関するチャネルにおいて４倍で画素化してＲＧＢ画像を作成した。これらの４倍画像は、自動化強化アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発されたもの）を用いて視野選択装置１０４で処理することによって、Ｃｙ（登録商標）５の最も高い発現に従って、考えられる２０倍視野を特定して順位付けした。
【０２３０】
上位４０の視野は、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、及びＣｙ（登録商標）５の波長全域において２０倍で画像化した。現画像の利用可能性について再調査して、ピンぼけ、腫瘍細胞不在、壊死が非常に進んでいるか、又は予測される抗体局在に関係のない高濃度の蛍光信号（すなわち、背景染色）を含む画像は、解析前に不採用とした。容認された画像は、ＡＱＵＡｄｕｃｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて処理し、その場合、蛍光色素分子はそれぞれ、分光分離装置１９１０によって個別のチャネルへ分光分離して、別ファイルとして保存した。
【０２３１】
処理後のファイルは、さらに、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を用いて又はＡＱＵＡｓｅｒｖｅ（商標）を用いた全自動処理によって解析した。詳細は以下の通りであった。
【０２３２】
ＤＡＰＩ画像はそれぞれ細胞マスカー１９１２で処理して、画像内の全細胞核を特定し（図７ａ）、そしてその後、３画素ずつ拡張して細胞全体のおおよそのサイズを表した。この結果得られたマスクは、画像内の全細胞を表していた（図７ｂ）。
【０２３３】
４８８染料で検出されたＳ１００（黒色腫腫瘍細胞マスカー）（図８ａ）は、サブセットマスカー１９１６で処理して、画像内の全腫瘍面積のバイナリマスクを作成した（図８ｂ）前記マスクと全細胞のマスクとの重なりは、腫瘍細胞に対する新たなマスクを作成した（図８ｃ）。
【０２３４】
同様に、腫瘍セルマスカーがないものは、核全てのマスクと組み合わせて、非腫瘍細胞全てに対する新たなマスクを作成し（図８ｄ）、非腫瘍細胞マスカー１９２０によって行った。
【０２３５】
各Ｃｙ（登録商標）５画像（図９ａ）は、バイオマーカーマスカー１９２２によって処理することによって、ＰＤ−Ｌ１陽性の全細胞のバイナリマスクを作成した（図９ｂ）。全腫瘍細胞のマスクとＰＤ−Ｌ１陽性細胞全てのマスクの重なりは、組み合わせマスカー１９３０を用いて、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞全ての新たなマスクを作成した（図９ｃ）。同様に、非腫瘍細胞全てのマスクとＰＤ−Ｌ１陽性細胞全てのマスクの重なりは、組み合わせマスカー１９３０を用いて、ＰＤ−Ｌ１陽性非腫瘍細胞全ての新たなマスクを作成した（図９ｄ）。
【０２３６】
Ｃｙ（登録商標）３．５画像（図１０ａ）をそれぞれ、非腫瘍細胞全てのマスクと重ねて、ＰＤ−１陽性の全細胞のバイナリマスクを作成した（図１０ｂ）。
【０２３７】
ＰＤ−Ｌ１を発現する全腫瘍細胞に関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）は、陽性計算機１９３６を用いて、画素単位で測定されかつ面積評価装置１９３２で測定されたＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞全てのマスクの総面積（図９ｃ）を、画素単位で測定されかつ面積評価装置１９３２で測定された全腫瘍細胞のマスクの総面積（図８ｃ）で割ることによって、導き出した。ＰＤ−Ｌ１を発現する全細胞に関する典型的なＰＢＰ値を図２７ａに示す（発現増加に従って分類されたデータ）。
【０２３８】
ＰＤ−１を発現する非腫瘍細胞全てに関するＰＢＰは、画素単位で測定されたＰＤ−１陽性非腫瘍細胞全てのマスクの総面積（図１０ｂ）を、画素単位で測定された非腫瘍細胞全てのマスクの総面積（図８ｄ）で割ることによって、導き出した。ＰＤ−１を発現する非腫瘍細胞全てに関する典型的なＰＢＰ値を図２７ｂに示す（発現増加に従って分類されたデータ）。
【０２３９】
図１６及び図１７は、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）、ＰＤ−Ｌ陽性細胞（黄）、腫瘍細胞（Ｓ１００、緑）、及び全細胞（ＤＡＰＩ、青）を示すオーバーレイマスクの代表的な例を示している。図１６は、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）、ＰＤ−１陽性細胞（黄）、及び全腫瘍細胞（緑）の存在を簡単に示している。一方、免疫療法に対して陰性応答者の場合、図１７のマスクは、腫瘍細胞（Ｓ１００、緑）及び全細胞（ＤＡＰＩ、青）の存在を示すが、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）又はＰＤ−１陽性細胞（黄）はほとんど又は全く示さない。
【０２４０】
実施例１７．ヒト患者から得た非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）組織試料についての試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
上皮性腫瘍細胞試料に関し、４８８染料で直接標識化したマウス抗Ｓ１００を４８８染料で直接標識化したマウス抗パンサイトケラチンと置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。ＯＤ−１及びＰＤ−Ｌ１に関するＰＢＰ値を図１８に示す。前記患者のサブセットは、免疫抑制を暗示する高レベルの受容体リガンド相互作用を示した。
【０２４１】
実施例１８．解析技法の比較
対照試料を生成するために、予め立証されたＰＤ−Ｌ１発現（Ｋａｒｐａｓ２９９）又は発現の欠如（ＲａｍｏｓＲＡ＃１）を有するリンパ腫細胞株を製造業者の指示に従って培養した。次に、細胞を計数して、２つの細胞株を様々な割合で混合して、ＰＤ−Ｌ１発現が０〜１００％で変動する一連のＦＦＰＥ細胞株ペレットブロックを生成した。次に、細胞株混合物由来並びに正常なへんとう腺組織摘出由来のコア（６００μｍ）を用いて、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を作成した。次いで、前記ＴＭＡの断面を染色し、画像化して、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｔ（商標）（実施例１５で説明したような全工程）を用いてＰＤ−Ｌ１陽性値（％）を採点し、その結果を図３８のＹ軸に示す。ここで、各目盛りは、シングルコア（単一視野）を表す。
【０２４２】
別法として、同様の画像を、以下の通り、比較としてセル計数法式ソフトウェアを用いてＰＤ−Ｌ１発現（％）を定量化した。ＤＡＰＩを用いて先ず各細胞核を特定し、次に、マクロファージ原形質を、特定した細胞核の周辺に作成した。細胞の原形質内でＰＤ−Ｌ１発現する細胞を同定するために強度閾値を立証した。その後、閾値を超えると特定された細胞の総数を、画像中の細胞の総数で割ることによって、各コアにおけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞（％）を求め、その結果を図２８のＸ軸に示す。全体的にみて、２つのセル計数法間では高度に一致していた（Ｒ２＝０．８６、勾配１．１）が、図２８にはＡ、Ｂ、Ｃで表される顕著な異常値が３つ存在した。ここで、ＡＱＵＡ（登録商標）採点法によって求めたＰＤ−Ｌ１陽性値（％）は、細胞計数法よりもかなり高かった。Ａ点とＢ点は細胞核コアであって、細胞の１００％はＫａｒｐａｓ２９９であり、そのため、ＡＱＵＡ（登録商標）採点法によって求めた値は予測値に非常に近かったが、細胞計数法は、細胞の原形質をＰＤ−Ｌ１陽性と特定できなかった。同様に、Ｃ点では、細胞混合物はＫａｒｐａｓ２９９細胞を理論上４０％包含するが、ＡＱＵＡ（商標）採点法によって求めた値は、この場合もやはり細胞計数法よりもずっと予測値に近かった。これらの結果からは、細胞計数法式ソフトウェアよりも本明細書に開示している方法の方が優れていることが示された。
【０２４３】
実施例１９．ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞及びＣＤ８０を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−１の染色及び解析をＣＤ８０の染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２４４】
実施例２０．ＣＴＬＡ−４を発現する細胞及びＣＤ８０を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
試料の調製：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料を脱脂し、再水和して、高温条件により抗原修復を行った。次いで、染色を行ったが、そこでは、以降の工程を実行した。先ず、組織は、ＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して約１ｋｂのＣＲＬＡ−４ｍＲＮＡを測定する２０のハイブリッド形成プローブ対を用いてＣＴＬＡ−４発現の検出を行った。Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成は、ＴＳＡ−Ｃｙ（登録商標）３によって視覚化した。スライドを洗浄し、次に、残留ＨＲＰはすべて新たなベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭの２回の洗浄を用いてクエンチした。スライドを再度洗浄してから、マウス抗ＣＤ８０一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＣＤ８０染色は、ＴＳＡーＣｙ（登録商標）５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。その後、残留ＨＲＰはすべて、新たなベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭの２回の洗浄を用いてクエンチした。スライドを再度洗浄してから、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’、６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合液でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＣＤ３染色は、ＴＳＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出した。スライドをもう一度洗浄してから、封入剤を用いてカバーグラスで覆って、室温で一晩乾燥させた。
【０２４５】
ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３及びＣｙ（登録商標）５の波長全域を画像化して、実施例１と類似のイメージング及び解析手順を行った。ＣＴＬＡ−４及びＣＤ８０の発現を用いて、２０倍画像を獲得するために強化アルゴリズムを展開した。解析を行って、転移性黒色腫を患っている患者から採取した腫瘍試料におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞中のＣＴＬＡ−４の普及とＣＤ８０発現とを調べた。結果を図４４ａ及び４４ｂに示す。
【０２４６】
実施例２１．ＰＤ−Ｌ２を発現する細胞及びＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１の染色及び解析をＰＤ−Ｌ２の染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２４７】
実施例２２．ＣＴＬＡ−４を発現する細胞及びＣＤ８６を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＣＴＬＡ−４及びＣＤ８６の染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２４８】
実施例２３．ＬＡＧ−３を発現する細胞及びＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＬＡＧ−３及びＨＬＡ−ＤＲの染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２４９】
実施例２４．ＴＩＭ−３を発現する細胞及びＧａｌｅｃｔｉｎ９を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＴＩＭ−３及びＧａｌｅｃｔｉｎ９の染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２５０】
実施例２５．４１ＢＢを発現する細胞及び４．１ＢＢＬを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析を４１ＢＢ及び４．１ＢＢＬの染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２５１】
実施例２６．ＯＸ４０を発現する細胞及びＯＸ４０Ｌを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＯＸ４０及びＯＸ４０Ｌの染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２５２】
実施例２７．ＣＤ４０を発現する細胞及びＣＤ４０Ｌを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２５３】
実施例２８．ＩＣＯＳを発現する細胞及びＩＣＯＳＬを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＩＣＯＳ及びＩＣＯＳＬの染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２５４】
実施例２９．ＧＩＴＲを発現する細胞及びＧＩＴＲＬを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＧＩＴＲ及びＧＩＴＲＬの染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２５５】
実施例３０．ＨＬＡーＤＲを発現する細胞及びＴＣＲを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＨＬＡ−ＤＲ及びＴＣＲの染色及び解析と置き換えて、実施例１５と同様の手順を行った。
【０２５６】
実施例３１．様々な大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者から得た組織試料における、試料の調製、イメージング、そしてＣＤ３及びＰＤ−１の解析
試料の調製：ＤＬＢＣＬ患者（ｎ＝４３）から得たホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料を脱脂した。次に、スライドは、キシレンからアルコールまでの一連の洗浄を経て再水和してから、蒸留水中でインキュベートした。その後、加熱抗原賦活化法を、高温高圧条件を用いて行い、冷却させて、トリス緩衝生理食塩水へ移した。次いで、染色を行ったが、そこでは、以降の工程を実行した。先ず、内在性ペルオキシダーゼを遮断した後、タンパク質ブロッキング溶液でインキュベートして非特異性抗体染色を抑えた。次にスライドを、マウス抗ＰＤ１一次抗体で染色した。スライドをその後洗浄してから、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＰＤ−１染色は、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。次いで、一次抗体試薬及び二次抗体試薬をマイクロ波によって除去した。スライドを再度洗浄してから、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’、６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合液でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＣＤ３染色は、ＴＳＡーＣｙ（登録商標）５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。スライドをもう一度洗浄してから、封入剤を用いてカバーグラスで覆って、室温で一晩乾燥させた。抗体と検出試薬の略図解説を図３１に示す。
【０２５７】
試料のイメージング及び解析：次に、Ｖｅｃｔｒａソフトｖｅｒｓｉｏｎ２．０．８（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用したＶｅｃｔｒａ２  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて蛍光画像を得た。先ず、スライドの白黒イメージングは、ＤＡＰＩを用いて４倍で行った。自動化アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発されたもの）を用いて組織を含むスライドの領域を特定した。
【０２５８】
組織を含むと特定されたスライドの領域を、ＤＡＰＩ（青）、Ｃｙ（登録商標）３（緑）、及びＣｙ（登録商標）５（赤）に関するチャネルにおいて４倍で画素化してＲＧＢ画像を作成した。これらの４倍画像は、自動化強化アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発されたもの）を用いて視野選択装置１０４で処理することによって、Ｃｙ（登録商標）３の最高発現に従って、考えられる２０倍視野を特定して順位付けした。
【０２５９】
上位４０の視野は、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）３、及び、Ｃｙ（登録商標）の波長全域において２０倍で画像化した。現画像の利用可能性について再調査して、ピンぼけ、腫瘍細胞不在、壊死が非常に進んでいるか、又は予測される抗体局在に関係のない高濃度の蛍光信号（すなわち、背景染色）を含む画像は、解析前に不採用とした。容認された画像は、ＡＱＵＡｄｕｃｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて処理し、その場合、蛍光色素分子はそれぞれ、分光分離装置２１０によって個別のチャネルへ分光分離して、別ファイルとして保存した。
【０２６０】
処理後のファイルは、さらに、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を用いて又はＡＱＵＡｓｅｒｖｅ（商標）を用いた全自動処理によって解析した。詳細は以下の通りであった。
【０２６１】
ＤＡＰＩ画像はそれぞれ細胞マスカー１９１２で処理して、画像内の全細胞核を特定し（図２９ａ）、また、その後、２画素ずつ拡張して細胞全体のおおよそのサイズを表した。この結果得られたマスクは、画像内の全細胞を表していた（図２９ｂ）。
【０２６２】
各Ｃｙ（登録商標）５画像（図３０ａ）は、バイオマーカーマスカー１９２２によって処理することによって、ＰＤ−１陽性の全細胞のバイナリマスクを作成した（図３０ｂ）。
【０２６３】
各Ｃｙ（登録商標）３画像（図３１ａ）は、バイオマーカーマスカー１９２２によって処理することによって、ＣＤ３陽性の全細胞のバイナリマスクを作成した（図３１ｂ）。
【０２６４】
ＰＤ−１陽性の全細胞のバイナリマスクとＣＤ３陽性の全細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＰＤ−１及びＣＤ３に対して二重陽性を示す全細胞のバイナリマスクを作成した（図３２）。
【０２６５】
ＰＤ−Ｌ１を発現する全ＣＤ３細胞に関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）は、陽性計算機１９３６を用いて、画素単位で測定されかつ面積評価装置１９３２で測定された全ＰＤ−１陽性腫瘍細胞のマスクの総面積（図３０ｂ）を、画素単位で測定されかつ面積評価装置１９３２で測定された全ＣＤ３陽性細胞のマスク総面積（図３１ｂ）で割ることによって、導き出した。消耗したＴ細胞（ＣＤ３＋／ＰＤ１＋）の特異的分布は、二次部位（高レベル）と対比して原発部位（低レベル）で観察された。結果を図３３ａ及び３３ｂに示す。
【０２６６】
実施例３２．プラットフォーム比較法
実施例１５及び３０と同様の技術の精度は、フローサイトメトリーとの比較によって確認された。制御性Ｔ細胞の出現頻度（ＦｏｘＰ３及びＣＤ２５発現に基づくもの）は、ＣＤ３被覆プレート上のＩＬ−２、ＴＧＦβ及びＣＤ２８によって５日間刺激された全血において確認した。
【０２６７】
【表２】
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【０２６８】
実施例３３．複数腫瘍表示におけるＣＤ２５／ＦｏｘＰ３Ｔ細胞の評価
ＮＳＣＬＣ、胃及び黒色腫組織におけるＣＤ２５及びＦｏｘＰ３の定量評価のためにＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８二次抗体で検出されかつＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３及びＣｙ（登録商標）５の波長全域で画像化された抗Ｓ１００抗体又は抗サイトカイン抗体のいずれかによる腫瘍細胞のさらなる特定を用いて、実施例３０と同様の手順を行った。前記組織を、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３を認識する抗体で染色し、また、非腫瘍領域内でのその発現を、発現（％）として計算した。ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の普及は、保存用の肺、胃及び黒色腫組織試料では１％〜１０％までの範囲であった。結果を図３４及び図３５に示す。
【０２６９】
実施例３４．複数腫瘍表示におけるＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の評価
ＮＳＣＬＣ、胃及び黒色腫組織におけるＣＤ４及びＣＤ８の定量評価のためにＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８二次抗体で検出されかつＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３及びＣｙ（登録商標）５の波長全域で画像化された抗Ｓ１００抗体又は抗サイトカイン抗体のいずれかによる腫瘍細胞のさらなる特定を用いて、実施例３０と同様の手順を行った。前記組織を、ＣＤ４及びＣＤ８を認識する抗体で染色し、また、非腫瘍領域でのその発現を、発現（％）として計算した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞では、腫瘍試料の連続部分において広い発現範囲（１０％〜５０％）が観察された。結果を図３６ａ及び図３６ｂに示す。
【０２７０】
実施例３５．転異性黒色腫又は非小細胞肺がんと診断された患者から得た腫瘍試料における骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）様細胞の評価。
前記細胞に対して抑制機能を示す骨髄性細胞に特有の表現型マスカー（例えば、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、及びＨＬＡ−ＤＲ）及び生化学的マスカー（例えば、ＡＲＧ１及びＩＤＯ−１）を発現するＭＤＳＣ様細胞を同定するために、試料を、ＣＤ１１ｂとＨＬＡ−ＤＲとＩＤＯ、又はＣＤ１１ｂとＣＤ３３とＡＲＧ１のいずれかで染色した。
【０２７１】
ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ及びＩＤＯの特異的な発現を利用して、転移性黒色腫患者から得た腫瘍生検標本においてＴＡＭ（腫瘍関連マクロファージ）として既知の抑制性骨髄性細胞のサブセットの存在を調べた。がん免疫療法への反応を予測するのに適切であり得る典型的なサブ表現型を図３７ａ、図３７ｂ、図３８ａ及び図３８ｂに示す。
【０２７２】
ＣＤ１１ｂとＣＤ３３とＡＲＧ−１又はＣＤ１１ｂとＨＬＡ−ＤＲとＩＤＯ−１の特異的発現を利用して、進行性肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者から得た腫瘍試料においてＭＤＳＣ様細胞及びＴＡＭの存在を調べた。がん免疫療法への反応を予測するのに適切であり得る典型的なサブ表現型を図３９ａ、図３９ｂ及び図４０に示す。
【０２７３】
試料の調製：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料を脱脂した。次に、スライドは、キシレンからアルコールまでの一連の洗浄を経て再水和してから、蒸留水中でインキュベートした。その後、加熱抗原賦活化法を、高温高圧条件を用いて行い、冷却させて、トリス緩衝生理食塩水へ移した。次いで、染色を行ったが、そこでは、以降の工程を実行した。先ず、内在性ペルオキシダーゼを遮断した後、タンパク質ブロッキング溶液でインキュベートして非特異性抗体染色を抑えた。次にスライドを、ウサギ抗ＩＤＯ−１一次抗体又はマウス抗ＣＤ３３一次抗体のいずれかで染色した。スライドをその後洗浄してから、抗ウサギ二次抗体又は抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄した後、抗ＩＤＯ−１染色又は抗ＣＤ３３染色は、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。その後、残留ＨＲＰはすべて、新たなベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭの２回の洗浄を用いてクエンチした。スライドを再度洗浄してから、マウス抗ＨＬＡ−ＤＲ一次抗体又はウサギ抗ＡＲＧ１一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗マウス二次抗体又は抗ウサギＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄した後、抗ＨＬＡ−ＤＲ染色又は抗ＡＲＧ１染色は、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。次いで、一次抗体試薬及び二次抗体試薬をマイクロ波によって除去した。スライドを再度洗浄してから、ウサギ抗ＣＤ１１ｂ抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’、６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合液でインキュベートした。スライドを洗浄した後、抗ＣＤ１１ｂ染色は、ＴＳＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出した。スライドをもう一度洗浄してから、封入剤を用いてカバーグラスで覆って、室温で一晩乾燥させた。
【０２７４】
ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３、及びＣｙ（登録商標）５の波長全域での試料のイメージング及び解析のために、実施例１６と同様の手順を用いた。これらの４倍画像は、自動化強化アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発されたもの）を用いて視野選択装置１０４で処理することによって、Ｃｙ（登録商標）３及びＣｙ（登録商標）５の最高発現に従って、考えられる２０倍視野を特定して順位付けした。
【０２７５】
ＤＡＰＩ画像はそれぞれ細胞マスカー２１２で処理して、画像内の全細胞核を特定した後、拡張して、細胞全体のおおよそのサイズを表した。この結果得られたマスクは、画像内の全細胞を表していた。
【０２７６】
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）画像はそれぞれ、バイオマーカーマスカー２２２によって処理することによって、ＣＤ１１ｂ陽性の全細胞のバイナリマスクを作成した。
【０２７７】
Ｃｙ（登録商標）３画像はそれぞれ、バイオマーカーマスカー２２２によって処理することによって、ＨＬＡ−ＤＲ陽性又はＣＤ３３陽性の全細胞のバイナリマスクを作成した。
【０２７８】
Ｃｙ（登録商標）５画像はそれぞれ、バイオマーカーマスカー２２２によって処理することによって、ＩＤＯ−１陽性又はＡＲＧ１陽性の全細胞のバイナリマスクを作成した。
【０２７９】
ＣＤ１１ｂ陽性の全細胞のバイナリマスクとＨＬＡ−ＤＲ陽性の全細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに対して二重陽性を示すか又はＣＤ１１ｂ陽性でかつＨＬＡ−ＤＲ陰性である全細胞のバイナリマスクを作成した。
【０２８０】
ＨＬＡ−ＤＲを発現しない全ＣＤ１１ｂ細胞に関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）は、陽性計算機２３６を用いて、画素単位で測定されかつ面積評価装置２３２で測定されたＣＤ１１ｂ陽性でかつＨＬＡ−ＤＲ陰性の全細胞のマスクの総面積を、画素単位で測定されかつ面積評価装置２３２で測定された全ＣＤ１１ｂ陽性細胞のマスク総面積で割ることによって、導き出した。転移性黒色腫と診断された患者から得た腫瘍試料に関する結果を、図３７ａに示す。
【０２８１】
ＣＤ１１ｂ陽性の全細胞のバイナリマスクとＩＤＯ−１陽性の全細胞のバイナリマスクとＨＬＡ−ＤＲ陽性の全細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＣＤ１１ｂ陽性で、ＨＬＡ−ＤＲ陰性でかつＩＤＯ−１陽性である全細胞のバイナリマスクを作成した。
【０２８２】
ＩＤＯ−１を発現するがＨＬＡ−ＤＲを発現しない全ＣＤ１１ｂ細胞に関するＰＢＰは、画素単位で測定されたＣＤ１１ｂ陽性で、ＨＬＡ−ＤＲ陰性で、ＩＤＯ−１陽性でかつＩＤＯ−１陽性の全細胞のマスクの総面積を、画素単位で測定されたＣＤ１１ｂ陽性細胞全てのマスクの総面積で割ることによって、導き出した。転移性黒色腫と診断された患者から得た腫瘍試料に関する結果を図３７ａに示し、また、非小細胞肺がんと診断された患者から得た腫瘍試料に関する結果を図４０に示す。
【０２８３】
ＨＬＡ−ＤＲ陽性の全鎖のバイナリマスクとＩＤＯ−１陽性の全細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＨＬＡ−ＤＲ及びＩＤＯ−１に対して二重陽性を示す全細胞のバイナリマスクを作成した。
【０２８４】
ＩＤＯ−１を発現する全ＨＬＡ−ＤＲ細胞に関するバイオマーカー陽性値（％、ＰＢＰ）は、陽性計算機２３６を用いて、画素単位で測定されかつ面積評価装置２３２で測定されたＩＤＯ−１陽性でかつＨＬＡ−ＤＲ陽性の全細胞のマスクの総面積を、画素単位で測定されかつ面積評価装置２３２で測定されたＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞全てのマスク総面積で割ることによって、導き出した。転移性黒色腫と診断された患者から得た腫瘍試料に関する結果を、図３８ａに示す。
【０２８５】
ＣＤ１１ｂ陽性の全細胞のバイナリマスクとＩＤＯ−１陽性の全細胞のバイナリマスクとＨＬＡ−ＤＲ陽性の全細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＣＤ１１ｂ陽性で、ＨＬＡ−ＤＲ陽性でかつＩＤＯ−１陽性である全細胞のバイナリマスクを作成した。
【０２８６】
ＩＤＯ−１及びＨＬＡ−ＤＲを発現する全ＣＤ１１ｂ細胞に関するＰＢＰは、画素単位で測定されたＣＤ１１ｂ陽性で、ＨＬＡ−ＤＲ陽性でかつＩＤＯ−１陽性の全細胞のマスクの総面積を、画素単位で測定されたＣＤ１１ｂ陽性細胞全てのマスクの総面積で割ることによって、導き出した。転移性黒色腫と診断された患者から得た腫瘍試料に関する結果を図３８ｂに示し、また、非小細胞肺がんと診断された患者から得た腫瘍試料に関する結果を図３９ｂに示す。
【０２８７】
ＣＤ１１ｂ陽性の全細胞のバイナリマスクとＣＤ３３陽性の全細胞のバイナリマスクとＡＲＧ１陽性の全細胞のバイナリマスクを組み合わせて、ＣＤ１１ｂ陽性で、ＣＤ３３陽性でかつＡＲＧ１陽性である全細胞のバイナリマスクを作成した。
【０２８８】
ＣＤ３３及びＡＲＧ１を発現する全ＣＤ１１ｂ細胞に関するＰＢＰは、画素単位で測定されたＣＤ１１ｂ陽性で、ＣＤ３３陽性でかつＡＲＧ１陽性の全細胞のマスクの総面積を、画素単位で測定されたＣＤ１１ｂ陽性細胞全てのマスク総面積で割ることによって、導き出した。小細胞肺がんと診断された患者から得た腫瘍試料に関する結果を、図３９ａに示す。
【０２８９】
実施例３６．転移性黒色腫と診断された患者から得た腫瘍試料における活性化Ｔ細胞の評価
実施例２０と同様の手順を行って、各試料をＤＡＰＩ、ＣＤ３、ＣＤ８、及びＫｉ６７で染色して、活性化Ｔ細胞の亜母集団を特定した。ＣＤ８＋Ｋｉ６７＋の普及を、転移性黒色腫と診断された患者から得た腫瘍生検標本で調べた（図４１）。
実施例３７．転移性黒色腫と診断された患者から得た腫瘍試料におけるマクロファージ普及の評価
【０２９０】
黒色腫組織におけるＣＤ１６３及びＣＤ６８の定量評価のためにＡｅｘａＦｌｏｕｒ４８８二次抗体で検出されかつＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３及びＣｙ（登録商標）５の波長全域で画像化された抗Ｓ１００抗体による腫瘍細胞のさらなる特定を用いて、実施例１６と同様の手順を行った。前記組織を、ＣＤ１６３及びＣＤ６８を認識する抗体で染色し、また、非腫瘍領域でのその発現を、単ＰＢＰ発現又は二重ＰＢＰ発現として計算した。結果を図４２ａ、図４２ｂ及び図４２ｃに示す。
【０２９１】
実施例３８．びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）と診断された患者から得た腫瘍試料中でのＴ細胞抑制普及の評価
実施例１と同様の手順を行い、ＤＬＢＣＬ腫瘍試料及びＮＥＴ腫瘍試料をマウス抗ＬＡＧ−３一次抗体、抗マウスＨＲＰ二次抗体で染色してＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３．５で検出し、残留ＨＲＰはベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭでクエンチした。その後、スライドをウサギＴＩＭ−３一次抗体、抗ウサギＨＲＰ二次抗体で染色し、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）６で検出した。次いで、一次抗体及び二次抗体をマイクロ波によって除去した。その後、組織を、ウサギ抗ＣＤ３３一次抗体と、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’、６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合物とで染色してＯｐａｌ（商標）５２０で検出した。イメージングは、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴｅｘａｓＲｅｄ及びＣｙ（登録商標）５の波長全域で、実施例１と同様に行った。ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３それぞれに陽性を示すＴ細胞のＰＢＰ普及を求めるために、実施例１と同様に解析を行った。結果を図４２ａ及び図４３ｂに示す。
【０２９２】
類似例Ａ：画像処理システムは、コンピュータ可読媒体に記憶された指示を実行するように設定された処理回路を備えた画像処理コントローラを備えており、前記指示は、画像処理システムのコントローラに、がん患者から採取した腫瘍組織試料を表現する画像データをイメージング装置受信させ、そして画像データを用いて、腫瘍組織内の少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めさせるものであり、その場合、スコアは、がん患者が免疫療法に積極的に反応する可能性を示す、前記画像処理システム。
【０２９３】
類似例Ｂ：類似例Ａのシステムにおいて、１対の細胞間の近接を表すスコアが、１対の細胞が互いに所定の近接内に存する程度を表すもの。
【０２９４】
類似例Ｃ：類似例Ａのシステムにおいて、近接が、画素スケールで評価されるもの。
【０２９５】
類似例Ｄ：類似例Ｂのシステムにおいて、１対の細胞間の所定の近接が、約１画素〜約１００画素までの範囲であるもの。
【０２９６】
類似例Ｅ：類似例Ｂのシステムにおいて、１対の細胞間の所定の近接が、約５画素〜約４０画素までの範囲であるもの。
【０２９７】
類似例Ｆ：類似例Ｂのシステムにおいて、１対の細胞間の所定の近接が、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲であるもの。
【０２９８】
類似例Ｇ：類似例Ｂのシステムにおいて、１対の細胞間の所定の近接が、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲であるもの。
【０２９９】
類似例Ｈ：類似例Ａのシステムにおいて、スコアが、１対の細胞の境界線間の近接を獲得することによって計算されるもの。
【０３００】
類似例Ｉ：類似例Ａのシステムにおいて、スコアが、１対の細胞の質量中心間の近接を獲得することによって計算されるもの。
【０３０１】
類似例Ｊ：類似例Ａのシステムにおいて、スコアが、１対の細胞の選択された第１細胞周辺の外周に基づいて境界線ロジックを用いて求められるもの。
【０３０２】
類似例Ｋ：類似例Ａのシステムにおいて、スコアが、１対の細胞の境界線間の相互作用を求めることによって計算されるもの。
【０３０３】
類似例Ｌ：類似例Ａのシステムにおいて、スコアが、１対の細胞の重なり領域を求めることによって計算されるもの。
【０３０４】
類似例Ｍ：類似例Ａのシステムにおいて、処理回路がさらに、画像処理システムのコントローラに、
画像データを単純画像データに分け、そして
データを複数のデータチャネルから提供させる
指示を実行するように設定されており、その場合、第１データチャネル内の単純画像データはが、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の単純画像データが、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現するもの。
【０３０５】
類似例Ｎ：類似例Ｍのシステムにおいて、スコアを求めるために、処理回路がさらに、画像処理システムのコントローラに、
第１データチャネルからの第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むように選択された所定のマージン単位で拡張することによって、拡張された第１バイオマーカーマスクを生成させ、
相互作用面積を求めさせ（ここで、前記相互作用面積は、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれた全細胞に関する第１総面積である）、そして
相互作用面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせることによって、空間的近接スコアに至らせる
という指示を実行するようにも設定されているもの。
【０３０６】
類似例Ｏ：類似例Ｎのシステムにおいて、正規化因子が、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積であるもの。
【０３０７】
類似例Ｐ：類似例Ｎのシステムにおいて、相互作用面積が、拡張された第１バイオマーカーマスクを、第２データチャネルの信号から求められた第２バイオマーカーを発現する細胞を表すマスクと組み合わせることによって求められるもの。
【０３０８】
類似例Ｑ：類似例Ｍのシステムにおいて、第３データチャネルが、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、また、第４データチャネルが、試料内の腫瘍領域に起因する蛍光信号を表現するもの。
【０３０９】
類似例Ｒ：類似例Ｏのシステムにおいて、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積が、第３データチャネルからの信号に基づく、試料内の全細胞を表す細胞マスクと、第４データチャネルからの信号に基づく、試料上の腫瘍領域を表す腫瘍領域マスクとを組み合わせることによって求められるもの。
【０３１０】
類似例Ｓ：類似例Ｒのシステムにおいて、細胞マスクと腫瘍領域マスクとを組み合わせることが、腫瘍領域マスクを細胞マスクから除去することを含むもの。
【０３１１】
類似例Ｔ：類似例Ｎ〜Ｓのいずれかのシステムにおいて、マスクがそれぞれ、選択されたチャネルからの画像データの各画素に２進値を割り当てることによって生成されるもの。
【０３１２】
類似例Ｕ：類似例Ｔのシステムにおいて、２進値は、閾値関数によって各値に割り当てられるが、その場合、閾値関数は、所定の強度閾値以上の強度を有する各画素には値１を割り当てて、所定の強度閾値未満の強度を有する各画素には値０を割り当てるもの。
【０３１３】
類似例Ｖ：類似例Ｔのシステムにおいて、２進値が、ヒストグラム閾値関数によって各値に割り当てられ、その場合、ヒストグラム閾値関数が、画素強度のスライディングスケールを用いて閾値を求めて、強度閾値以上の強度を有する各画素には値１を割り当てて、強度閾値未満の強度を有する各画素には値０を割り当てるもの。
【０３１４】
類似例Ｗ；類似例Ｖのシステムにおいて、閾値が、
画素全ての強度を合計して合計強度とすることと、
閾値（％）にこの合計強度を掛け合わせてカットオフ合計を得ることと、
全画素をヒストグラムの強度によって分類することと、
カットオフ合計を獲得するまであらゆる画素強度を合計すること
によって求められ、
その場合、処理中に達した最後の最高画素強度が、閾値であるもの。
【０３１５】
類似例Ｘ：類似例Ｎ〜Ｗのいずれかのシステムにおいて、マスクを組み合わせることが、「ａｎｄ」演算を用いて行われ、その場合、「ａｎｄ」演算は、第１マスク内の画素の画素強度に第２マスク内の画素の画素強度を掛け合わせることであるもの。
【０３１６】
類似例Ｙ：類似例Ｎ〜Ｗのいずれかのシステムにおいて、マスクを組み合わせることが、「ｏｕｔ」演算を用いて行われ、その場合、「ｏｕｔ」演算は、第１マスクから第２マスクを除去するもの。
【０３１７】
類似例Ｚ；類似例Ａのシステムにおいて、処理回路がさらに、画像処理システムのコントローラに、
画像において第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーの濃度を表す画像データを低倍率で獲得させ、
第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーの最高濃度を含む領域を特定させ、
第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーの最高濃度を含む所定の数の領域を選択させ、
所定の数の領域に高倍率画像データを獲得させるようにイメージング装置へ指示を送信させる
指示を実行するようにも設定されており、その場合、高倍率画像データが、解析のためにコントローラに供給されて、スコアを求めるために使用されるもの。
【０３１８】
類似例ＡＡ：類似例Ｚのシステムにおいて、低倍率が１０倍以下であり、高倍率が１０倍超であるもの。
【０３１９】
類似例ＡＢ：類似例ＡＡのシステムにおいて、低倍率が１０倍であり、高倍率が４０倍であるもの。
【０３２０】
類似例ＡＣ：類似例ＡＡのシステムにおいて、低倍率が１０倍であり、高倍率が２０倍であるもの。
【０３２１】
類似例ＡＤ：類似例ＡＡのシステムにおいて、低倍率が４倍であり、高倍率が４０倍であるもの。
【０３２２】
類似例ＡＥ：類似例ＡＡのシステムにおいて、低倍率が４倍であり、高倍率が２０倍であるもの。
【０３２３】
類似例ＡＦ：類似例Ａのシステムにおいて、画像処理装置がさらに、スコアを試料の画像に関するメタデータと結びつけるようにも設定されているもの。
【０３２４】
類似例ＡＧ：類似例Ａのシステムにおいて、画像処理装置が、スコアを包含する報告を作成するものもの。
【０３２５】
類似例ＡＨ：類似例Ａのシステムにおいて、画像処理装置がさらに、免疫療法の方針を決定するためにオペレータにスコアを提供するようにも設定されているもの。
【０３２６】
類似例ＡＩ：類似例Ａのシステムにおいて、画像処理装置がさらに、データベースにスコアを記録するようにも設定されているもの。
【０３２７】
類似例ＡＪ；類似例Ａのシステムにおいて、画像処理装置がさらに、スコアを患者の医療記録と結びつけるようにも設定されているもの。
【０３２８】
類似例ＡＫ：類似例Ａのシステムにおいて、画像処理装置がさらに、ディスプレイ装置にスコアを表示するようにも設定されているもの。
【０３２９】
類似例ＡＬ；類似例Ａのシステムにおいて、少なくとも１対の細胞の第１メンバーが、腫瘍細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーが、非腫瘍細胞を含むもの。
【０３３０】
類似例ＡＭ：類似例ＡＬのシステムにおいて、非腫瘍細胞が免疫細胞を含むもの。
【０３３１】
類似例ＡＮ：類似例Ａのシステムにおいて、少なくとも１対の細胞の第１メンバー及び第２メンバーが、免疫細胞を含むもの。
【０３３２】
類似例ＡＯ：類似例Ａのシステムにおいて、少なくとも１対の細胞の第１メンバーが、腫瘍細胞、骨髄性細胞、又は間質細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーが、免疫細胞を含むもの。
【０３３３】
類似例ＡＰ：類似例ＡＯのシステムにおいて、腫瘍細胞、骨髄性細胞、又は間質細胞が、ＰＤ−Ｌ１を発現し、また、免疫細胞が、ＰＤ−１を発現するもの。
【０３３４】
類似例ＡＱ：類似例Ａのシステムにおいて、画像処理装置がさらに、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手できる所定の数の視野を選択して、各視野に関するデータからスコアを求めるようにも設定されているもの。
【０３３５】
類似例ＡＲ：類似例ＡＱのシステムにおいて、試料が、複数の蛍光タグで染色されており、そしてその場合、各蛍光タグが、特有のバイオマーカーを対象としているもの。
【０３３６】
類似例ＡＳ：類似例ＡＱのシステム又は類似例ＡＲのシステムにおいて、複数の蛍光タグが、第１バイオマーカーに関する第１蛍光タグと、第２バイオマーカーに関する第２蛍光タグを含むもの。
【０３３７】
類似例ＡＴ：類似例ＡＱ〜ＡＳのいずれか一つシステムにおいて、マージンが約１画素〜約１００画素までの範囲であるもの。
【０３３８】
類似例ＡＵ：類似例ＡＱ〜ＡＴのいずれか一つシステムにおいて、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞が、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５〜約５０μｍの範囲にあるもの。
【０３３９】
類似例ＡＶ：類似例Ｎ〜ＡＵのいずれか一つシステムにおいて、所定の係数が１０４であるもの。
【０３４０】
類似例ＡＷ：類似例Ａのシステムにおいて、少なくとも１対の細胞の第１メンバーが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第１バイオマーカーを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーが、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される第２バイオマーカーを発現するもの。
【０３４１】
類似例ＡＸ：類似例Ａ〜ＡＷのいずれか一つシステムにおいて、閾値が約５００〜約５０００までの範囲であるもの。
【０３４２】
類似例ＡＹ：類似例ＡＸのシステムにおいて、閾値が、約９００±１００であるもの。
【０３４３】
類似例ＡＺ：類似例Ａ〜ＡＹのいずれか一つシステムにおいて、免疫療法が、免疫チェックポイント療法を含むもの。
【０３４４】
類似例ＢＡ：腫瘍組織試料において少なくとも１対の細胞間の近接を表すスコアを求めるためのシステムであって、前記システムが、メモリを含む処理回路を備えており、前記メモリが、
画像データをイメージング装置から受信し、画像データを単純画像データへ分けて、データを複数のデータチャネルから供給するように設定された分光分離装置であって、第１データチャネル内の単純画像データが、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、第２データチャネル内の単純画像データが、腫瘍組織に起因する蛍光信号を表現し、第３データチャネル内の単純画像データが、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第４データチャネル内の単純画像データが、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する、前記分光分離装置と、
第１データチャネルから画像データを受信して、視野内に全核を表す画像を生成して画像を拡張することによって、細胞マスクを生成するように設定された、細胞マスカーと、
第２データチャネルから画像データを受信して、視野内に腫瘍領域のマスクを生成するように設定された、腫瘍領域マスカーと、
第３データチャネルから画像データを受信して、第１バイオマーカーを発現する全細胞の第１バイオマーカーマスクを視野内に生成する、第１バイオマーカーマスカーと、
第４データチャネルから画像データを受信して、第２バイオマーカーを発現する全細胞の第２バイオマーカーマスクを視野内に生成する、第２バイオマーカーマスカーと、
細胞マスクと腫瘍領域マスクを組み合わせて、非腫瘍細胞マスク及び腫瘍細胞マスクのうち少なくとも１つを生成するように設定された、腫瘍マスカーと、
第１バイオマーカーマスクを拡張して拡張された第１バイオマーカーマスクを生成するように設定された、拡張装置と、
拡張された第１バイオマーカーマスクと第２バイオマーカーマスクが相互作用マスクを生成するように設定された、相互作用マスカーと、
空間的近接スコアを計算するように設定された、相互作用計算機と
を含む、前記システム。
【０３４５】
類似例ＢＢ：類似例ＢＡのシステムにおいて、相互作用計算機が、相互作用マスクの面積を、非腫瘍細胞マスク、腫瘍細胞マスク及び細胞マスクのうち１つの面積で割るように設定されているもの。
【０３４６】
類似例ＢＣ：類似例ＢＡのシステムにおいて、空間的近接スコアが、次の式にしたがって計算され、
【数１０】
2018536852.tif 000014
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（相互作用マスクの面積）であり、ＡＣは、非腫瘍細胞マスク、腫瘍細胞マスク及び細胞マスクのうちの少なくとも１つの総面積であるもの。
【０３４７】
類似例ＢＤ：組織試料の画像を処理して組織内の少なくとも１対の細胞間の近接を表すスコアを求める方法であって、前記方法が、
がん患者から採取した腫瘍組織を含む組織試料と関連する画像データを受信することと、
複数の蛍光タグで染色された試料から少なくとも１つの視野を選択することであって、前記選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞をより多く含む少なくとも１つの視野を選択することに偏っている、ことと、
選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むのに十分なマージン単位で拡張することと、
第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれた選択された視野からの全細胞に対する第１総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間的近接に至ることと、
スコアを記録することと、
を含み、スコアが、閾値と比較したときに、がん患者が免疫療法に積極的に反応する可能性を示すものである、前記方法。
【０３４８】
類似例ＢＥ：類似例Ａのシステムにおいて、前記方法が、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供するもの。
【０３４９】
類似例ＢＦ：類似例ＢＡのシステムにおいて、前記方法が、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供するもの。
【０３５０】
類似例ＢＧ：類似例ＢＤの方法において、前記方法が、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供するもの。
【０３５１】
類似例ＢＨ：類似例ＢＧの方法又は類似例ＢＥ若しくは類似例ＢＦのシステムにおいて、予測力が、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量されるもの。
【０３５２】
類似例ＢＩ：類似例ＢＨの方法又はシステムにおいて、陽性予測値が６５％以上であるもの。
【０３５３】
類似例ＢＪ：類似例ＢＩの方法又はシステムにおいて、陽性予測値が７０％以上であるもの。
【０３５４】
類似例ＢＫ：類似例ＢＪの方法又はシステムにおいて、陽性予測値が７５％以上であるもの。
【０３５５】
類似例ＢＬ：類似例ＢＨの方法又はシステムにおいて、陰性予測値が６５％以上であるもの。
【０３５６】
類似例ＢＭ：類似例ＢＬの方法又はシステムにおいて、陰性予測値が８０％以上であるもの。
【０３５７】
類似例ＢＮ：腫瘍組織試料においてバイオマーカー陽性値を求めるためのシステムであって、前記システムが、メモリを含む処理回路を備えており、前記メモリが、
イメージング装置から画像データを受信して、画像データを単純画像データへ分けて、データを複数のデータチャネルから供給するように設定された、分光分離装置であって、第１データチャネル内の単純画像データが、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、第２データチャネル内の単純データが、対象であるサブセット組織に起因する蛍光信号を表現し、また、第３データチャネル内の単純データが、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現している、前記分光分離装置と、
第１データチャネルからの画像データを用いて、視野内に全核を表す画像を生成して画像を拡張することによって、細胞マスクを生成するように設定された、細胞マスカーと、
第２データチャネルからの画像データを用いて視野内に全サブセット組織領域のマスクを生成するように設定された、サブセット領域マスカーと、
第３データチャネルからの画像データを用いて第１バイオマーカーを発現する全細胞の第１バイオマーカーマスクを視野内に生成するように設定された、第１バイオマーカーマスカーと、
細胞マスクとサブセット組織領域マスクを組み合わせて非サブセット細胞マスク及びサブセット細胞マスクのうち少なくとも１つを生成するように設定された、サブセット細胞マスカーと、
バイオマーカーマスクと非サブセット細胞マスク及びサブセット細胞マスクのうち少なくとも１つとを組み合わせるように設定された、組み合わせマスカーと、
バイオマーカー陽性値を計算するように設定された、陽性計算装置と
を含む、前記システム。
【０３５８】
類似例ＢＯ：類似例ＢＮのシステムにおいて、計算機が、バイオマーカーマスクの面積を非サブセット細胞マスク及びサブセット細胞マスクのうち少なくとも一方の面積で割ることによって、バイオマーカー陽性値を計算するように設定されているもの。
【０３５９】
類似例ＢＰ：類似例ＢＮのシステムにおいて、第１バイオマーカーが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から選択されるバイオマーカーを含むもの。
【０３６０】
類似例ＢＱ：類似例ＢＮのシステムにおいて、第２バイオマーカーが第１バイオマーカーとは異なり、かつ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６から選択されるバイオマーカーを含むもの。
【０３６１】
類似例ＢＲ：類似例ＢＮのシステムにおいて、対象であるサブセット組織が腫瘍組織であり、サブセット細胞が腫瘍細胞であり、また、非サブセット細胞が非腫瘍細胞であるもの。
【０３６２】
類似例ＢＳ：患者から採取した組織試料を表現する画像データをイメージング装置から受信し、そして
対象であるバイオマーカーを発現するタイプの試料内の細胞の量を、試料中の前記タイプの細胞全量と比較して表すバイオマーカー陽性値を求める
ように設定された画像処理装置を備えた、システム。
【０３６３】
特定の実施形態について例示しかつ説明してきたが、当該技術分野における通常の知識により、以下の請求項で定義された広義の態様の技術から逸脱することなく、変更及び修正が可能であると解されるべきである。
【０３６４】
本明細書において例示的に説明される実施形態は、本明細書に具体的に開示されていない要素や限定を除外して、好適に実施することができる。したがって、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（包含する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」などの用語は、広義に解釈されるべきであって、限定されるものではない。その上、本明細書で使用される用語及び表現は、説明用語として使用されたものであって、限定用語として使用されたものではなく、しかも図示及び説明された特徴と同等のもの又はその一部以外のこのような用語及び表現の使用を意図するものではないが、請求項に記載の技術範囲内では様々な変更が可能であると考えられる。また、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」という言い回しには、具体的に列挙された要素と請求項に記載の技術の基本的な新規特徴に実質上影響を及ぼさない追加要素とが包含されることが分かるであろう。「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」という言い回しは、特定されていない要素を除外する。
【０３６５】
本開示内容は、本出願に記載の特定の実施形態について限定されるものではない。当業者には明白なように、その趣旨及び範囲を逸脱することなく多くの修正及び変更を行うことができる。本明細書に列挙されたものに加えて、本開示内容の範疇に含まれる機能的に同等の方法及び組成物も、前述の説明から当業者には明白であろう。このような修正及び変更は、添付の請求項の範疇にあるものとする。本開示内容は、添付の請求項が権利を受ける均等物のあらゆる範囲とともに、添付の請求項に関してのみ限定されるものである。本開示内容は、特定の方法、試薬、化合物、組成物又は生体系に限定されず、当然変更できるものと解されるべきである。また、本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的としており、これらに限定されるものではないと解されるべきである。
【０３６６】
その上、本開示内容の特徴又は態様がマーカッシュグループについて説明している場合、当業者には、本開示内容がそれによってマーカッシュグループの各構成員又は構成員のサブグループについても説明していることが分かるであろう。
【０３６７】
当業者には分かるように、ありとあらゆる目的のために、書面で説明するという観点からみれば、本明細書に開示された全範囲は、ありとあらゆる考えられる部分範囲及びその部分範囲の組み合わせをも網羅する。記載した範囲は、少なくとも二等分、三等分、四等分、五等分、十等分などまで分解された同様の範囲を十分に説明しかつ有効にするものと容易に認識することができる。非限定例として、本明細書に記載の範囲はそれぞれ、下側三分の一、中央三分の一そして上側三分の一などに容易に分けることも可能である。当業者にも分かるように、「ｕｐ  ｔｏ（最大で）」、「ａｔ  ｌｅａｓｔ（少なくとも）」、「ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ（を超える）」、「ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ（未満）」などのような言葉はいずれも、記載した数を包含し、しかも上述のように部分範囲に実質上分けることが可能な範囲を意味する。最後に、範囲が個別のメンバーをそれぞれ包含することも当業者には自明であろう。
【０３６８】
本明細書中で引用された刊行物、特許出願、発行された特許及び他の書類はいずれも、それぞれの刊行物、特許出願、発行された特許又は他の書類の全体が参照として組み込まれるように明確にかつ独立して表示されているかのように、本明細書に参照として組み込まれる。参照として組み込まれた原文に含まれる定義は、本開示内容における定義と矛盾する限りにおいて除外される。
【０３６９】
上記以外の実施形態は以下の請求項に明記する。
【図１】
2018536852.tif 000016
【図２】
2018536852.tif 000017
【図３】
2018536852.tif 000018
【図４】
2018536852.tif 000019
【図５】
2018536852.tif 000020
【図６】
2018536852.tif 000021
【図７ａ】
2018536852.tif 000022
【図７ｂ】
2018536852.tif 000023
【図８ａ】
2018536852.tif 000024
【図８ｂ】
2018536852.tif 000025
【図８ｃ】
2018536852.tif 000026
【図８ｄ】
2018536852.tif 000027
【図９ａ】
2018536852.tif 000028
【図９ｂ】
2018536852.tif 000029
【図９ｃ】
2018536852.tif 000030
【図９ｄ】
2018536852.tif 000031
【図１０ａ】
2018536852.tif 000032
【図１０ｂ】
2018536852.tif 000033
【図１１ａ】
2018536852.tif 000034
【図１１ｂ】
2018536852.tif 000035
【図１２ａ】
2018536852.tif 000036
【図１２ｂ】
2018536852.tif 000037
【図１３】
2018536852.tif 000038
【図１４】
2018536852.tif 000039
【図１５】
2018536852.tif 000040
【図１６】
2018536852.tif 000041
【図１７】
2018536852.tif 000042
【図１８】
2018536852.tif 000043
【図１９】
2018536852.tif 000044
【図２０ａ】
2018536852.tif 000045
【図２０ｂ】
2018536852.tif 000046
【図２０ｃ】
2018536852.tif 000047
【図２０ｄ】
2018536852.tif 000048
【図２０ｅ】
2018536852.tif 000049
【図２１】
2018536852.tif 000050
【図２２】
2018536852.tif 000051
【図２３】
2018536852.tif 000052
【図２４】
2018536852.tif 000053
【図２５】
2018536852.tif 000054
【図２６】
2018536852.tif 000055
【図２７ａ】
2018536852.tif 000056
【図２７ｂ】
2018536852.tif 000057
【図２８】
2018536852.tif 000058
【図２９ａ】
2018536852.tif 000059
【図２９ｂ】
2018536852.tif 000060
【図３０ａ】
2018536852.tif 000061
【図３０ｂ】
2018536852.tif 000062
【図３１ａ】
2018536852.tif 000063
【図３１ｂ】
2018536852.tif 000064
【図３２】
2018536852.tif 000065
【図３３ａ】
2018536852.tif 000066
【図３３ｂ】
2018536852.tif 000067
【図３４ａ】
2018536852.tif 000068
【図３４ｂ】
2018536852.tif 000069
【図３５】
2018536852.tif 000070
【図３６ａ】
2018536852.tif 000071
【図３６ｂ】
2018536852.tif 000072
【図３７ａ】
2018536852.tif 000073
【図３７ｂ】
2018536852.tif 000074
【図３８ａ】
2018536852.tif 000075
【図３８ｂ】
2018536852.tif 000076
【図３９ａ】
2018536852.tif 000077
【図３９ｂ】
2018536852.tif 000078
【図４０】
2018536852.tif 000079
【図４１】
2018536852.tif 000080
【図４２ａ】
2018536852.tif 000081
【図４２ｂ】
2018536852.tif 000082
【図４２ｃ】
2018536852.tif 000083
【図４３ａ】
2018536852.tif 000084
【図４３ｂ】
2018536852.tif 000085
【図４４ａ】
2018536852.tif 000086
【図４４ｂ】
2018536852.tif 000087
【図４５】
2018536852.tif 000088
【国際調査報告】
2018536852.tif 000089
2018536852.tif 000090
2018536852.tif 000091