(57)【要約】【課題】多発性硬化症の影響を治療、予防、又は改善する代替法を提供すること。【解決手段】ＩＴＧＡ４遺伝子転写物における選択された標的に結合してＩＴＧＡ４遺伝子転写物又はその一部においてプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾し得るアンチセンスオリゴマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＴＧＡ４遺伝子転写物における選択された標的に結合してＩＴＧＡ４遺伝子転写物又はその一部においてプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾し得る、アンチセンスオリゴマー。
【請求項２】
配列番号１〜２０２を含む群から選択される請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項３】
配列番号１〜２２を含む群から選択される請求項２に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項４】
表３〜７に列挙されたアンチセンスオリゴマーから選択される請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項５】
表３に列挙されたアンチセンスオリゴマーから選択される請求項４に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴマーが、（ｉ）修飾された主鎖構造、（ｉｉ）修飾された糖部分、（ｉｉｉ）リボヌクレアーゼＨに対する耐性、（ｉｖ）オリゴマー模倣体の化学構造、（ｖ）部分への化学的結合、（ｖｉ）細胞浸透性ペプチドによるタグ付けを含む群から選択される代替の化学構造又は修飾の対象となる１以上のヌクレオチドの位置を含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項７】
前記アンチセンスオリゴマーのウラシル（Ｕ）がチミン（Ｔ）によって置き換えられる請求項６に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項８】
プレｍＲＮＡのスプライシングの前記修飾がＩＴＧＡ４のＲＮＡの１以上のエクソンのスキッピングを生じる請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項９】
ＩＴＧＡ４遺伝子転写物におけるスプライシングを操作する方法であって、前記方法が
（ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーの１以上を提供し、前記オリゴマーを標的核酸の部位に結合させる工程を含む、方法。
【請求項１０】
患者にてＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善するための医薬組成物、予防用組成物、又は治療用組成物であって、前記組成物が
（ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の１以上のアンチセンスオリゴマーと
（ｂ）１以上の薬学上許容できるキャリア及び／又は希釈剤とを含む、組成物。
【請求項１１】
ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善する方法であって、
（ａ）有効量の、請求項１〜７のいずれか１項に記載の１以上のアンチセンスオリゴマー、又は１以上のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１２】
ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善する薬物を製造するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の精製かつ単離されたアンチセンスオリゴマーの使用。
【請求項１３】
患者におけるＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善するためのキットであって、前記キットが、適切な容器に包装されている請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアンチセンスオリゴマー及びその組み合わせまたは混合物、並びにその使用のための指示書を含む、キット。
【請求項１４】
前記ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患が多発性硬化症である、請求項９に記載の組成物、請求項１０に記載の方法、請求項１１に記載の使用、又は請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリンα４（ＩＴＧＡ４）遺伝子におけるスプライス修飾を促進し、エクソンスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーに関する。本発明はさらに、インテグリンα４（ＩＴＧＡ４）遺伝子に対するアンチセンスオリゴマー及びアンチセンスオリゴマーを含む治療用組成物の投与によって多発性硬化症の影響を治療、予防、又は改善する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術の以下の議論は本発明のみの理解を円滑にするように意図されている。議論は、言及される事項のいずれかが本出願の優先日の時点で技術常識の一部である又は一部であったという認識又は承認ではない。
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）は世界中でおよそ２５０万人の人々を冒している神経変性疾患であり、リスクは女性の方が高い。それは、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるニューロンの保護ミエリン鞘を攻撃し、結果的に炎症及び病変を生じる自己免疫疾患である。ＭＳの患者は知覚、運動及び筋力、感覚及び思考を冒す１以上の症状を示す。症状は様々であり、一部は診断される前に長年にわたって隠され得る。ＭＳは再発性形態又は進行性形態のいずれかである可能性があり、患者の８５％は前者の状態である。
【０００４】
疾患の発症は未だに明瞭ではなく、ＭＳの治癒は未だにない。免疫系を調節し、攻撃又は再発の頻度及び重症度を減らすための幾つかの認可された疾患修飾薬がある。今日まで、神経変性を止める又は覆すのに利用できる治療薬はない。抗炎症薬すべてのなかでも、接着分子であるインテグリンα４（ＩＴＧＡ４）を標的とするヒト化モノクローナル抗体が再発／寛解性のＭＳ（ＲＲＭＳ）を治療するのに有効であることを示している。しかしながら、たとえば、注入反応、過敏症及び中和抗体の存在のようなモノクローナル抗体の使用に関連する副作用が患者において依然として持続している。
【０００５】
本発明は、多発性硬化症の影響を治療、予防、又は改善する代替法を提供しようとするものである。
【発明の概要】
【０００６】
大まかには、本発明の態様の１つによれば、インテグリンα４（ＩＴＧＡ４）遺伝子転写物又はその一部にてプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾するための単離された又は精製されたアンチセンスオリゴマーが提供される。好ましくは、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物又はその一部におけるエクソン除去を誘導するための単離された又は精製されたアンチセンスオリゴマーが提供される。
【０００７】
たとえば、本発明の態様の１つでは、ＩＴＧＡ４遺伝子プレｍＲＮＡのイントロンの近傍又はその中での領域に対して相補性の標的配列を含む１０〜５０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが提供される。
【０００８】
好ましくは、アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーである。
【０００９】
好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、表３〜表７で示される配列を含む群から選択される。
【００１０】
好ましくは、アンチセンスオリゴマーは配列番号１〜２０２を含む群から選択される。
【００１１】
アンチセンスオリゴマーは、好ましくは、ＩＴＧＡ４遺伝子のエクソンの１以上のスキッピングを誘導するように作動する。
【００１２】
本発明のアンチセンスオリゴマーは、選択されたＩＴＧＡ４標的部位に結合することができるアンチセンスオリゴマーであるように選択されてもよく、その際、標的部位は、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、又はエクソンスプライシングエレメントから選択されるｍＲＮＡスプライシング部位である。標的部位には、ドナー又はアクセプターのスプライス部位が標的とされる場合、一部の隣接するイントロン配列も含まれてもよい。
【００１３】
さらに具体的には、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜２０２のいずれか１以上及び／又は表３〜表７で示される配列及びそれらの組み合わせ又は混合物を含む群から選択されてもよい。これには、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でそのような配列とハイブリッド形成することができる配列、それに対して相補性の配列、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物にてプレｍＲＮＡのプロセッシング活性を持つ又は調節する、修飾された塩基、修飾された主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）及びその機能的な短縮又は伸長を含有する配列が含まれる。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは標的配列に対して１００％相補性であってもよく、又はオリゴヌクレオチドと標的配列との間で形成されるヘテロ二本鎖が細胞性ヌクレアーゼの作用及びインビボで生じ得る他の様式の分解に耐えるのに十分安定である限り、ミスマッチを含んいてもよい（（たとえば、変異体を提供してもよい）。従って、特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で約又は少なくとも約７０％の配列相補性、たとえば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相補性を有してもよい。
【００１４】
本発明は、２以上のそのようなアンチセンスオリゴマーを含む構築物を含む、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物におけるエクソン除去を誘導するように選択される標的に結合することができる２以上のアンチセンスオリゴマーの組み合わせにまでも及ぶ。構築物はアンチセンスオリゴマーに基づく治療法に使用されてもよい。
【００１５】
本発明はそのもっとさらなる態様によれば、本発明のアンチセンスオリゴマー配列のｃＤＮＡ又はクローニングされたコピー、と同様に本発明のアンチセンスオリゴマー配列を含有するベクターに及ぶ。本発明はさらにそのような配列及び／又はベクターを含有する細胞にまでも及ぶ。
【００１６】
ＩＴＧＡ４遺伝子転写物におけるスプライシングを操作する方法が提供され、該方法は、
（ａ）本明細書に記載されているようなアンチセンスオリゴマーの１以上を提供し、オリゴマーを標的核酸部位に結合させる工程を含む。
【００１７】
患者にてＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善するための医薬組成物、予防用組成物又は治療用組成物も提供され、該組成物は
（ａ）本明細書に記載されているような１以上のアンチセンスオリゴマーと
（ｂ）１以上の薬学上許容できるキャリア及び／又は希釈剤とを含む。
【００１８】
組成物は約１ｎＭ〜１０００ｎＭの本発明の所望のアンチセンスオリゴマーのそれぞれを含んでもよい。好ましくは、組成物は約１０ｎＭ〜５００ｎＭ、最も好ましくは１ｎＭ〜１０ｎＭの本発明の所望のアンチセンスオリゴマーのそれぞれを含んでもよい。
【００１９】
（ａ）有効量の本明細書に記載されているような１以上のアンチセンスオリゴマー又は１以上のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を患者に投与する工程を含む、ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善する方法も提供される。
【００２０】
ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善する薬物の製造のための、本明細書に記載されているような精製かつ単離されたアンチセンスオリゴマーの使用も提供される。
【００２１】
患者にてＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善するためのキットも提供され、キットは、適切な容器に包装されている、本明細書に記載されているような少なくとも１つのアンチセンスオリゴマー及びその組み合わせ又は混合物、並びにその使用のための指示書を含む。
【００２２】
好ましくは、患者におけるＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患は多発性硬化症（ＭＳ）である。ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の対象はヒトを含む哺乳類であってもよい。
【００２３】
本発明のさらなる態様は今や、添付の非限定の実施例及び図面を参照して記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、１００、５０及び５ｎＭにてエクソン３（アンチセンスオリゴマー配列番号１）、エクソン４（アンチセンスオリゴマー配列番号２１）及びエクソン１９（アンチセンスオリゴマー配列番号４７）に向けたオリゴマーで形質移入したのちの正常ヒト線維芽細胞におけるＩＴＧＡ４−ＦＬとＩＴＧＡ４Δ３及び４のＲＮＡの量（矢印で示す）（一番上のパネル）、ＩＴＧＡ４−ＦＬとＩＴＧＡ４Δ４のＲＮＡの量（真ん中のパネル）、ならびにＩＴＧＡ４−ＦＬとＩＴＧＡ４Δ１９のＲＮＡの量（下のパネル）の変化を示すＲＴ−ＰＣＲ試験を示す図である。アンチセンスオリゴマー配列番号１、２１及び４７で明瞭な用量依存性の反応が見られる。スクランブル配列のオリゴマーを非特異的なエクソンスキッピングの対照（スクランブルアンチセンスオリゴマー）として使用した。
【図２】図２は、エクソン３（Ｈ３Ａ）、４（Ｈ４Ａ）及び１９（Ｈ１９Ａ）を標的とするエクソンスキッピングアンチセンスオリゴマーならびにスクランブル配列のオリゴマーで処理したのちの正常線維芽細胞におけるＩＴＧＡ４タンパク質のノックダウンを示すウエスタンブロットのデータ及びグラフを示す図である。アンチセンスオリゴマーは１００ｎＭで調べた。ＩＴＧＡ４の発現レベルはβ−チューブリンの発現に対して基準化した。
【図３】図３は、正常線維芽細胞における細胞接着特性に対するエクソン３（ＡＯ１）、４（ＨＡＯ２１）及び１９（ＡＯ４７）を標的とするエクソンスキッピングアンチセンスオリゴマーならびにスクランブル配列のオリゴマー（１００ｎＭ）による処理の効果を示すグラフを示す図である。結果は独立して行った３回の実験の平均であり、データはスクランブルオリゴマーで処理した試料に対して基準化した。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。ＶＣＡＭ−１で事前にコーティングしたマイクロプレートへの細胞接着の低下はエクソン４（ＡＯ２１）に向けられたアンチセンスオリゴマーで事前に処理した細胞について観察された。スクランブルオリゴマーで処理した試料に比べてｐ＜０．００５。
【図４】図４は、正常線維芽細胞における細胞移動特性に対するエクソン３（ＡＯ１）、４（ＨＡＯ２１）及び１９（ＡＯ４７）を標的とするエクソンスキッピングアンチセンスオリゴマーならびにスクランブル配列のオリゴマー（１００ｎＭ）による処理の効果を示す棒グラフである。棒グラフは独立して行った３回の実験に由来する創傷の８時間後の平均の細胞移動を示す。データはすべてスクランブルオリゴマーで処理した試料に対して基準化した。エラーバーはＳＥＭを表す。エクソン４を標的とするアンチセンスオリゴマー（ＡＯ２１）で処理した細胞は残りの試料よりも遅い移動を示す。スクランブルオリゴマーで処理した試料に比べてｐ＜０．０５。
【図５Ａ】図５Ａは、５００ｎＭでの様々なＰＭＯ［Ｈ３Ａ（＋４１＋６５）、Ｈ３Ａ（＋３０＋４９）、Ｈ４Ａ（＋５１＋７５）、Ｈ１９Ａ（＋３０＋４９）及びＨ２７Ａ（＋２０＋４４）］及びスクランブルＰＭＯ（スクランブル）による３日間のヌクレオフェクションののちのＪｕｒｋａｔ細胞におけるＩＴＧＡ４の発現を示す図である。図５Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによって解析したＩＴＧＡ４転写物における変化のゲルである。ＩＴＧＡ４転写物の完全長（ＦＬ）及びエクソン欠失（Δ）の産物が示される；未処理（ＵＴ）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、５００ｎＭでの様々なＰＭＯ［Ｈ３Ａ（＋４１＋６５）、Ｈ３Ａ（＋３０＋４９）、Ｈ４Ａ（＋５１＋７５）、Ｈ１９Ａ（＋３０＋４９）及びＨ２７Ａ（＋２０＋４４）］及びスクランブルＰＭＯ（スクランブル）による３日間のヌクレオフェクションののちのＪｕｒｋａｔ細胞におけるＩＴＧＡ４の発現を示す図である。図５Ｂは、ＩＴＧＡ４の発現のウエスタンブロットである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、５００ｎＭでの様々なＰＭＯ［Ｈ３Ａ（＋４１＋６５）、Ｈ３Ａ（＋３０＋４９）、Ｈ４Ａ（＋５１＋７５）、Ｈ１９Ａ（＋３０＋４９）及びＨ２７Ａ（＋２０＋４４）］及びスクランブルＰＭＯ（スクランブル）による３日間のヌクレオフェクションののちのＪｕｒｋａｔ細胞におけるＩＴＧＡ４の発現を示す図である。図５Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリーである。調べたＰＭＯの間で、エクソン３、４及び２７標的とするＰＭＯ、Ｈ３Ａ（＋４１＋６５）、Ｈ４Ａ（＋５１＋７５）及びＨ２７Ａ（＋２０＋４４）は、標的エクソンのスキッピングによって＞５０％の転写物を生じた。ＩＴＧＡ４タンパク質の有意なノックダウンは、Ｈ３Ａ（＋４１＋６５）及びＨ４Ａ（＋５１＋７５）による処理に続いてウエスタンブロット及びフローサイトメトリーの解析で観察された。これらの結果は転写物の解析に相関する。ＰＭＯ、Ｈ２７Ａ（＋２０＋４４）で処理した細胞については、ＩＴＧＡ４発現を下方調節する代わりに、短縮ＩＴＧＡ４の高い発現がウエスタンブロットで観察された。しかしながら、フローサイトメトリー解析は、これらの細胞でＩＴＧＡ４の細胞表面発現が低下したことを示す。このことは、短縮ＩＴＧＡ４が細胞内に蓄積していることを示している。
【図６Ａ】図６Ａは、移動試験の設定の模式図を示す図である。上のパネルは移動アッセイのための実験設定を示し、ＰＭＯでヌクレオフェクションしたＪｕｒｋａｔ細胞を５時間移動させた。アッセイは２つ組で行った。ＰＭＯ、Ｈ４Ａ（＋５１＋７５）及びＨ２７Ａ（＋２０＋４４）で処理したＪｕｒｋａｔ細胞はスクランブルで処理した細胞に比べて下のチャンバーへの遅い移動を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、５００ｎＭでの様々なＰＭＯ［Ｈ３Ａ（＋４１＋６５）、Ｈ４Ａ（＋５１＋７５）、Ｈ１９Ａ（＋３０＋４９）及びＨ２７Ａ（＋２０＋４４）］及びスクランブルＰＭＯ（スクランブル）で２日間処理したＪｕｒｋａｔ細胞の移動を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
インテグリンα４は、ヘテロ二量体の膜タンパク質であるインテグリン受容体のα鎖である。インテグリンβ−１と一緒に、それらはフィブロネクチン、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）及び粘膜血管接着細胞接着分子１（ＭＡＤＣＡＭ−１）の選択的にスプライシングされたＣＳ−１及びＣＳ−５の領域を認識する。α−４／β−１インテグリン（最晩期（Ｖｅｒｙ  Ｌａｔｅ）抗原（ＶＬＡ４）としても知られる）はＶＣＡＭ−１との相互作用を介して血管脳関門を横切る白血球の移動を促す。インテグリンα４（ＩＴＧＡ４）の発現レベルはＭＳ患者で上昇していることが見いだされており、ＩＴＧＡ４は有効な治療標的であることが示されている。
【００２６】
本発明は、インテグリンα４（ＩＴＧＡ４）遺伝子転写物又はその一部においてプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾することを介して転写物のレベルを低下させることによりＩＴＧＡ４の活性を変化させるアンチセンスオリゴマーを開発することによってＭＳの影響を治療、予防、又は改善する代替方法を提供する。
【００２７】
ＩＴＧＡ４は第２染色体上に位置するＩＴＧＡ４遺伝子によってコードされている。それは２８のエクソンから成り、ＲＮＡの成熟とプロセッシングの間に１１の転写変異体を生成する。これらのうち、転写物の１つが完全長のタンパク質をコードし、他の２つの転写物が短縮タンパク質をコードする。機能的な完全長のタンパク質は、エクソン１〜２６によってコードされる細胞外ドメインと、それぞれエクソン２７及びエクソン２８によってコードされる膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを含有する（表１）。
【００２８】
【表１】
2018515110.tif 000002
【００２９】
他のアンチセンスオリゴマーに基づく治療法とは対照的に、本発明にはリボヌクレアーゼＨの動員を介したＲＮＡの分解の向上を誘導せず、その際、リボヌクレアーゼＨはＩＴＧＡ４遺伝子のＤＮＡに二本鎖で結合されたＲＮＡを優先的に結合し、分解する。それは、アンチセンスオリゴマーのＩＴＧＡ４ゲノムＤＮＡとのハイブリッド形成に依拠していないし、また、たとえば、複製、転写、転座及び翻訳のような正常の機能を妨害することによって生じるＩＴＧＡ４タンパク質の量を調節するためのアンチセンスオリゴマーのｍＲＮＡとの結合にも依拠していない。
【００３０】
むしろ、アンチセンスオリゴマーは、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物又はその一部においてプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾し、エクソン「スキッピング」を誘導するのに使用される。戦略は好ましくは総タンパク質の発現を減らし、又は細胞の移動に関与する機能的ドメインを欠くタンパク質を生成する。
【００３１】
本発明の第１の態様によれば、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物の選択された標的に結合してＩＴＧＡ４遺伝子転写物又はその一部においてプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾することができるアンチセンスオリゴマーが提供される。大まかには、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物又はその一部における標的とされるエクソンの除去を誘導するための単離された又は精製されたアンチセンスオリゴマーが提供される。
【００３２】
「単離された」によって、ネイティブな状態では正常にはそれを伴っている成分を実質的に又は本質的に含まない物質を意味する。たとえば、「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたオリゴヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されている又は取り外されているポリヌクレオチド、たとえば、ゲノムにおけるＤＮＡ断片に隣接する配列から取り外されるその断片を指す。用語「単離する」はそれが細胞に関するとき、供給源対象（たとえば、ポリヌクレオチド反復疾患の対象）からの細胞（たとえば、線維芽細胞、リンパ芽球）の精製を指す。ｍＲＮＡ又はタンパク質の文脈では、「単離する」は供給源、たとえば、細胞からのｍＲＮＡ又はタンパク質の回収を指す。
【００３３】
アンチセンスオリゴマーはそれがハイブリッド形成する標的配列に「対して向けられる」又は「対して標的とされる」と言われ得る。特定の実施形態では、標的配列はプロセッシングを受ける前のｍＲＮＡの３’又は５’スプライス部位、分岐点を含む領域、又はスプライシングの調節に関与する他の配列を含む。標的配列はエクソンの範囲内又はイントロンの範囲内にあってもよく、又はイントロン／エクソンの接合部を橋渡してもよい。
【００３４】
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは標的ＲＮＡ（すなわち、スプライス部位の選択が調節されるＲＮＡ）に対して十分な配列相補性を有して、有効な方法で標的ＲＮＡの領域（たとえば、プレｍＲＮＡ）を遮断する。例となる実施形態では、ＩＴＧＡ４のプレｍＲＮＡのそのような遮断は、さもなければスプライシングを調節することになるネイティブのタンパク質についての結合部位を覆い隠すことによって、及び／又は標的とされるＲＮＡの構造を変えることによってスプライシングを調節するのに役立つ。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは標的プレｍＲＮＡ（たとえば、ＩＴＧＡ４遺伝子のプレｍＲＮＡ）である。
【００３５】
標的ＲＮＡ配列に対して十分な配列相補性を有して標的ＲＮＡのスプライシングを調節するアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが、さもなければスプライシングを調節することになるネイティブのタンパク質についての結合部位の覆い隠しをもたらすのに、及び／又は標的とされるＲＮＡの三次元構造を変えるのに十分な配列を有することを意味する。
【００３６】
選択されたアンチセンスオリゴマーは、短くすることができ、たとえば、約１２塩基以上長く、たとえば、約５０塩基にすることができ、配列が標的配列とのハイブリッド形成の際、スプライス調節を達成するのに十分に相補性であり、且つ任意で４５℃以上のＴｍを有するヘテロ二本鎖をＲＮＡと共に形成する限り、少数のミスマッチを含むことができる。
【００３７】
好ましくは、アンチセンスオリゴマーは表３〜表７で示されている配列を含む群から選択される。
【００３８】
特定の実施形態では、標的配列とアンチセンスオリゴマーとの間の相補性の程度は安定な二本鎖を形成するのに十分である。アンチセンスオリゴマーの標的ＲＮＡ配列との相補性の領域は、８〜１１塩基ほど短くてもよいが、１２〜１５塩基以上、たとえば、１０〜５０塩基、１０〜４０塩基、１２〜３０塩基、１２〜２５塩基、１５〜２５塩基、１２〜２０塩基、又は１５〜２０塩基であることができる（これらの範囲の間の整数すべてを含む）。約１６〜１７塩基のアンチセンスオリゴマーは一般に、独特の相補性配列を有するのに十分長い。特定の実施形態では、本明細書で議論されているような、必要な結合Ｔｍを達成するのに最小の長さの相補性塩基が必要とされてもよい。
【００３９】
特定の実施形態では、５０塩基ほどの長いオリゴヌクレオチドが好適であってもよく、その際、少なくとも最小数の塩基、たとえば、１０〜１２の塩基が標的配列に対して相補性である。しかしながら一般に、細胞における促進された又は活性のある取り込みは、約３０塩基未満のオリゴヌクレオチドの長さで最適化される。本明細書にさらに記載されているホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）のアンチセンスオリゴマーについては、結合安定性と取り込みの最適な均衡は一般に１８〜２５塩基の長さで生じる。含まれるのは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０の塩基からなるアンチセンスオリゴマー（たとえば、ＰＭＯ、ＰＭＯ−Ｘ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、２’−ＯＭｅ）である。
【００４０】
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは標的配列に対して１００％相補性であってもよいし、又はオリゴヌクレオチドと標的配列との間で形成されるヘテロ二本鎖が細胞性ヌクレアーゼの作用及びインビボで生じてもよい他の様式の分解に耐えるのに十分に安定である限り、ミスマッチを含んでいてもよい（たとえば、変異体を提供してもよい）。従って、特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で約又は少なくとも約７０％の配列相補性、たとえば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列相補性を有してもよい。
【００４１】
ミスマッチは存在するならば、通常、真ん中よりもハイブリッド二本鎖の末端領域に向かっての方が不安定でない。許されるミスマッチの数は、二本鎖の安定性のよく理解されている原理に従ってオリゴヌクレオチドの長さ、二本鎖におけるＧ：Ｃ塩基対の比率、及び二本鎖におけるミスマッチの位置に左右されるであろう。そのようなアンチセンスオリゴマーは標的配列に対して必ずしも１００％相補性ではないが、それは安定に且つ特異的に標的配列に結合するのに有効なので、標的プレｍＲＮＡのスプライシングが調節される。
【００４２】
アンチセンスオリゴマーと標的配列との間で形成される二本鎖の安定性は、結合Ｔｍと細胞性の酵素切断への二本鎖の感受性の関数である。相補性配列ＲＮＡに関するオリゴヌクレオチドのＴｍは、Ｈａｍｅｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５，ｐｐ．１０７−１０８によって記載されたもののような、又はＭｉｙａｄａ，Ｃ．Ｇ．及びＷａｌｌａｃｅ，Ｒ．ＥＬ，１９８７，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４，ｐｐ．９４−１０７にて記載されたような従来の方法によって測定されてもよい。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、相補性配列ＲＮＡに関して、体温よりも高い、好ましくは約４０℃又は５０℃より高い結合Ｔｍを有してもよい。６０〜８０℃以上の範囲でのＴｍも含まれる。
【００４３】
変異体のさらなる例には、配列番号１〜２０２のいずれかの全長にわたって約又は少なくとも約７０％の配列同一性又は相同性、たとえば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性又は相同性を有するアンチセンスオリゴマーが挙げられる。
【００４４】
さらに具体的には、選択された標的部位に結合してＩＴＧＡ４遺伝子転写物又はその一部におけるプレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるアンチセンスオリゴマーが提供される。アンチセンスオリゴマーは好ましくは表３〜表７で提供されるものから選択される。
【００４５】
プレｍＲＮＡのスプライシングの調節には好ましくは、ｍＲＮＡの１以上のエクソン又はイントロンの「スキッピング」又は除去が含まれる。得られるタンパク質は好ましくは、内部の短縮又は早期の終結のために親の完全長ＩＴＧＡ４タンパク質に比べると短い長さのものである。これらの短縮ＩＴＧＡ４タンパク質は完全長ＩＴＧＡ４タンパク質のアイソフォームと呼ばれてもよい。
【００４６】
生成されるｍＲＮＡの残りのエクソンはインフレームであってもよく、それが元々の３’末端と５’末端の間の領域で内部短縮を有することを除いて、親の完全長タンパク質に類似する配列を持つ短いタンパク質を生じてもよい。別の可能性では、エクソンスキッピングは、タンパク質の第１の部分が親の完全長タンパク質と実質的に同一であるが、タンパク質の第２の部分がフレームシフトのために異なる配列（たとえば、ナンセンス配列）を有するタンパク質を生じるフレームシフトを誘導してもよい。或いは、エクソンスキッピングは、リーディングフレームの崩壊及び翻訳の早期終結の存在による早期に終結したタンパク質の作出を誘導してもよい。
【００４７】
エクソン３〜７、１０〜１５、１７、１８、２０及び２２の個々のエクソンをスキッピングすることは好ましくはＩＴＧＡ４転写物のリーディングフレームを破壊するであろう。このことはナンセンスが介在する減衰を介したＲＮＡの分解の増加につながるであろう。
【００４８】
エクソン２、８、９、１６、１９、２１及び２３〜１７の個々のエクソンをスキッピングすることは好ましくはリーディングフレームを未変化で保持するであろう。エクソン３と４の組み合わせをスキッピングすることもリーディングフレームをインタクトに保持するであろう。このことは好ましくは内部短縮タンパク質への翻訳につながるであろう。短縮タンパク質又はＩＴＧＡ４アイソフォームは完全に機能が取り除かれてもよいし、又は低下した機能を有してもよい。
【００４９】
【表２】
2018515110.tif 000003
【００５０】
好ましくは、これらの短縮の、ナンセンスの又は早期に終結したタンパク質は細胞の移動過程に関与する１以上の機能的なドメインを欠いている。たとえば、エクソン１６は細胞接着モチーフをコードし、このドメインを欠く翻訳されたタンパク質は細胞移動が遅い、又は細胞移動が破壊されている可能性がある。エクソン２７は膜貫通ドメインをコードし、このエクソンを取り除くことは可溶性のＩＴＧＡ４タンパク質を生成してもよく、それはデコイとして作用する可能性があり得る。短縮された、ナンセンスの又は早期に終結したタンパク質はさらに、他の因子についての連結部位又は結合部位を欠いてもよく、その除去はＩＴＧＡ４タンパク質の関連する経路との相互作用の低下につながってもよい。たとえば、エクソン１〜２６は細胞外性であり、エクソン２８は細胞質性である。これらエクソンの１以上の除去は結合部位を取り除いてもよい。
【００５１】
或いは、１以上のエクソンの除去は、ＩＴＧＡ４タンパク質の折り畳みミス及び膜を介して上手く輸送されるタンパク質の能力の低下につながってもよい。
【００５２】
内部短縮タンパク質（すなわち、１以上のエクソンによってコードされるアミノ酸を欠いているタンパク質）の存在が好ましい。ＩＴＧＡ４タンパク質がノックアウトされるのであれば、生体はＩＴＧＡ４タンパク質の総量の低下を補おうとするのでＩＴＧＡ４の転写の上昇を伴う問題があり得る。対照的に、内部短縮タンパク質（好ましくは、完全なＩＴＧＡ４タンパク質の特徴の１以上を欠いている）の存在は転写の上昇を防ぐのに十分であるべきであるが、機能的なＩＴＧＡ４タンパク質の総量の低下による治療上の利点を依然として提供すべきである。
【００５３】
アンチセンスオリゴマーが誘導する本発明のエクソンスキッピングは、ＩＴＧＡ４タンパク質の機能を完全に又はさらに実質的に除去する必要はない。好ましくは、エクソンスキッピングの過程はＩＴＧＡ４タンパク質の低下した又は損なわれた機能性を生じる。
【００５４】
様々なスキッピング戦略を用いて作出されたＩＴＧＡ４の様々なアイソフォームは、ＭＳの様々な形態を治療する又は予防するのに使用され得る、活性が除去又は低減されたタンパク質を生じ得る。たとえば、ＭＳは、再発／寛解性ＭＳ（ＲＲＭＳ）、二次進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）、原発進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）又は進行型再発性ＭＳの形態であってもよい。ＭＳ及びその進行型に関連する多数の異なる症状及び症候群もある。選択的スプライシング戦略は、疾患の特定の態様、形態又は進行型のための治療として好ましくは使用することができる短縮タンパク質又は機能低下タンパク質を形成してもよい。
【００５５】
アンチセンスオリゴマーを用いる本発明のスキッピング過程は、個々のエクソンを読み飛ばしてもよく、又は２以上のエクソンを同時に読み飛ばすことを生じてもよい。
【００５６】
本発明のアンチセンスオリゴマーは、選択された標的に結合してＩＴＧＡ４遺伝子転写物にてエクソン除去を誘導することができる２以上のアンチセンスオリゴマーの組み合わせであってもよい。組み合わせは２以上のアンチセンスオリゴマーの混合物及び／又は２以上のアンチセンスオリゴマーを含む構築物又は一緒に連結された２以上のアンチセンスオリゴマーであってもよい。
【００５７】
【表３−１】
2018515110.tif 000004
【００５８】
【表３−２】
2018515110.tif 000005
【００５９】
【表４−１】
2018515110.tif 000006
【００６０】
【表４−２】
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【００６１】
【表５】
2018515110.tif 000008
【００６２】
【表６−１】
2018515110.tif 000009
【００６３】
【表６−２】
2018515110.tif 000010
【００６４】
【表７】
2018515110.tif 000011
【００６５】
本発明はさらに、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物におけるスプライシングを操作する方法を提供し、該方法は、
（ａ）本明細書に記載されているようなアンチセンスオリゴマーの１以上を提供し、該オリゴマーを標的核酸部位に結合させる工程を含む。
【００６６】
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１〜２０２からなる群から選択される核酸配列及びそれに相補性の配列のＤＮＡ同等物を含むＩＴＧＡ４のための標的核酸配列のスプライス操作が提供される。
【００６７】
コンセンサススプライス部位を完全に覆い隠すようにアンチセンスオリゴマーを設計することは標的とされるエクソンのスプライシングでの変化を必ずしも生成しなくてもよい。さらに、本発明者らは、アンチセンスオリゴマーを設計する場合、アンチセンスオリゴマー自体のサイズ又は長さは常に主要な因子であるわけではないことを発見した。ＩＴＧＡ４のエクソン３のような一部の標的と共に、２０塩基という短いアンチセンスオリゴマーは、特定の場合、同じエクソンに向けられるさらに長い（たとえば、２５塩基）オリゴマーよりも効率的に一部のエクソン包含を誘導することができた。
【００６８】
本発明者らはまた、アンチセンスオリゴマーによって遮断されて又は覆い隠されてスプライシングを再指示することができる標準のモチーフが無いようであることを発見した。アンチセンスオリゴマーは設計され、その個々の有効性は経験的に評価されなければならないことが見いだされている。
【００６９】
さらに具体的には、アンチセンスオリゴマーは表３〜表７にて示されているものから選択されてもよい。配列は好ましくは、配列番号１〜２０２、さらに具体的には配列番号１〜１３２及びそれらの組み合わせ又は混合物の任意の１以上の任意の１以上からなる群から選択される。これには、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でそのような配列とハイブリッド形成することができる配列、それに相補性の配列、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物にてプレｍＲＮＡのプロセッシング活性を持つ又は調節する、修飾された塩基、修飾された主鎖及びその機能的な短縮又は伸長を含有する配列が含まれる。
【００７０】
各分子における十分な数の対応する位置が互いに水素結合することができるヌクレオチドで占められる場合、オリゴマーとＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡは互いに相補性である。従って、「特異的にハイブリッド形成できる」及び「相補性」は、オリゴマーとＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡの標的との間で安定で且つ特異的な結合が生じるように十分な程度の相補性又は対合を示すのに使用される用語である。アンチセンスオリゴマーの配列は特異的にハイブリッド形成できるその標的配列のそれに対して１００％相補性である必要はないことが当該技術で理解される。標的のＤＮＡ又はＲＮＡ分子への化合物の結合が標的のＤＮＡ又はＲＮＡの産物の正常な機能を妨害する場合、アンチセンスオリゴマーは特異的にハイブリッド形成することができ、特異的な結合が所望される条件下、すなわち、インビボアッセイ又は治療上の処置の場合、生理的条件下、及びインビトロアッセイの場合、アッセイが実施される条件下でアンチセンスオリゴマーの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある。
【００７１】
選択的なハイブリッド形成は低い、中程度の、又は高いストリンジェンシーの条件下であってもよいが、好ましくは高いストリンジェンシーのもとである。当業者は、ハイブリッド形成のストリンジェンシーは、塩基の組成、相補性の鎖の長さ及びハイブリッド形成する核酸間でのヌクレオチド塩基のミスマッチの数に加えて塩濃度、温度、又は有機溶媒のような条件に影響されることを認識するであろう。ストリンジェントな温度条件には一般に３０℃を超える、通常３７℃を超える、好ましくは４５℃を超える、好ましくは少なくとも５０℃、及び通常６０℃〜８０℃以上の温度が挙げられる。ストリンジェントな塩条件は普通、１０００ｍＭ未満、通常５００ｍＭ未満、及び好ましくは２００ｍＭ未満である。しかしながら、パラメータの組み合わせは単一パラメータの手段よりもはるかに重要である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の例は、６５℃及び０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）である。従って、本発明のアンチセンスオリゴマーには、表３〜表７又は配列番号１〜２０２で提供されている配列と選択的にハイブリッド形成するオリゴマーが含まれてもよい。
【００７２】
構造タンパク質におけるエクソンの末端でのコドンの配置はコドンの末端で必ずしも切れると限らなくてもよく、その結果、プレｍＲＮＡから１を超えるエクソンを欠失させてｍＲＮＡのインフレームでの読み取りを確保する必要性があってもよい。そのような状況では、それぞれが所望のエクソン及び／又はイントロンの包含を誘導するのに関与する様々な領域に向けられる複数のアンチセンスオリゴマーが本発明の方法によって選択される必要があってもよい。所与のイオン強度及びｐＨでは、Ｔｍは標的配列の５０％が相補性のポリヌクレオチドとハイブリッド形成する温度である。そのようなハイブリッド形成は、標的配列に対するアンチセンスオリゴマーの正確な相補性と同様に「おおよその（ｎｅａｒ）」又は「実質的な」相補性で生じてもよい。
【００７３】
通常、少なくとも約１４ヌクレオチドの区間にわたってアンチセンスオリゴマーのヌクレオチドとの少なくとも約５５％の同一性、好ましくは少なくとも約６５％、さらに好ましくは少なくとも約７５％及び最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性がある場合、選択的ハイブリッド形成が生じるであろう。記載されているような相同性比較の長さはさらに長い区間にわたってもよく、特定の実施形態では、少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約１２ヌクレオチド、さらに通常少なくとも約２０、多くは少なくとも約２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド、少なくとも約２５、２６、２７又は２８ヌクレオチド、少なくとも約２９、３０、３１又は３２ヌクレオチド、少なくとも約３６以上のヌクレオチドの区間にわたることが多いであろう。
【００７４】
従って、本発明のアンチセンスオリゴマーの配列は好ましくは、本明細書の配列群に示される配列に対して少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも８６、８７、８８、８９又は９０％の相同性を有する。さらに好ましくは、少なくとも９１、９２、９３、９４又は９５％、さらに好ましくは少なくとも９６、９７、９８、又は９９％の相同性がある。一般に、アンチセンスオリゴマーの長さが短ければ短いほど、選択的ハイブリッド形成を得るのに要する相同性は大きい。その結果、本発明のアンチセンスオリゴマーが約３０未満のヌクレオチドからなる場合、同一性比率は、本明細書の配列群で設定されているアンチセンスオリゴマーと比べて７５％を超える、好ましくは８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５％、９６、９７、９８％又は９９％を超えることが好ましい。ヌクレオチドの相同性の比較は、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム又はＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，３８７−３９５）のような配列比較プログラムによって実施されてもよい。この方法で、本明細書にて引用されているものに類似する又は実質的に異なる長さの配列は、配列比較にギャップを挿入することによって比較されてもよく、そのようなギャップは、たとえば、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって決定される。
【００７５】
本発明のアンチセンスオリゴマーは標的配列との低下した相同性の領域及び正確な相同性の領域を有してもよい。オリゴマーが全長について正確な相同性を有することは必要ではない。たとえば、オリゴマーは、標的配列と同一である少なくとも４又は５塩基の連続区間、好ましくは標的配列と同一である少なくとも６又は７塩基の連続区間、さらに好ましくは標的配列と同一である少なくとも８又は９塩基の連続区間を有してもよい。オリゴマーは、標的配列と同一である少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６塩基の区間を有してもよい。オリゴマー配列の残りの区間は標的配列と断続的に同一であってもよく、たとえば、残りの配列は同一の塩基、その後に同一ではない塩基、その後に同一の塩基を有してもよい。或いは（又は同様に）、オリゴマー配列は、完全な相同性に満たない区間がときどき混ざっている同一配列（たとえば、３、４、５又は６塩基）の幾つかの区間を有してもよい。そのような配列ミスマッチは好ましくはスプライススイッチング活性を全く喪失しない又はほとんど喪失しないであろう。
【００７６】
用語「調節する」又は「調節する」には、任意で、定義された量及び／又は統計的に有意な量によって１以上の定量できるパラメータを「増やす」こと又は「減らす」ことが含まれる。用語「増やす」又は「増やすこと」又は「高める」又は「高めること」又は「刺激する」又は「刺激すること」は一般に、アンチセンスオリゴマーがないこと又は対照化合物によって引き起こされる反応に比べて細胞又は対象にてさらに大きな生理的反応（すなわち、下流効果）を生じる又は引き起こすもの又はアンチセンスオリゴマー又は組成物の能力を指す。用語「減らすこと」又は「減らす」は一般に、アンチセンスオリゴマーがないこと又は対照化合物によって引き起こされる反応に比べて細胞又は対象にて低下した生理的反応（すなわち、下流効果）を生じる又は引き起こすもの又はアンチセンスオリゴマー又は組成物の能力を指す。
【００７７】
関連する生理的な又は細胞性の反応（インビボ又はインビトロ）は当業者に明らかであり、そしてそれには、それを必要とする細胞、組織若しくは対象におけるＩＧＴＡ４をコードするプレｍＲＮＡにおける特定のエクソンの除去の増加、ＩＧＴＡ４をコードするプレｍＲＮＡの量の低下又は機能的なＩＧＴＡ４タンパク質の発現の低下が含まれてもよい。「増加した」又は「高められた」量は通常、統計的に有意な量であり、アンチセンスオリゴマーがないこと（作用物質の非存在）又は対照化合物によって産生された量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍以上（たとえば、５００倍、１０００倍）（１との間の及び１を上回るあらゆる整数及び小数点を含む、たとえば、１．５、１．６、１．７、１．８）である増加を含んでもよい。用語「低下する」又は「抑制する」は一般に、診断技術の日常技法によって測定されるとき、たとえば、本明細書に記載されている疾患又は状態の症状のような関連する生理的な又は細胞性の反応を「低下させる」１以上のアンチセンスオリゴマー又は組成物の能力に関連してもよい。関連する生理的な又は細胞性の反応（インビボ又はインビトロ）は当業者に明らかであり、そしてそれには、ＭＳのような疾患の症状又は病状の軽減が含まれてもよい。反応における「低下」は、アンチセンスオリゴマーがないこと又は対照化合物によって生じる反応に比べて統計的に有意であってもよく、それには、その間の整数すべてを含めて１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の低下が含まれてもよい。
【００７８】
アンチセンスオリゴマーの長さは、それがプレｍＲＮＡ分子の中での意図された位置に選択的に結合することができる限り、変化してもよい。そのような配列の長さは本明細書に記載されている選択手順に従って決定することができる。一般に、アンチセンスオリゴマーは長さ約１０ヌクレオチドから長さ約５０ヌクレオチドまでであろう。しかしながら、この範囲内での任意の長さのヌクレオチドが方法にて使用されてもよいことが十分に理解されるであろう。好ましくは、アンチセンスオリゴマーの長さは、長さ１０〜４０、１０〜３５、１５〜３０ヌクレオチド、又は長さ２０〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは長さ約２５〜３０ヌクレオチドの間である。たとえば、オリゴマーは、長さ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０のヌクレオチドであってもよい。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、「アンチセンスオリゴマー」は、ワトソン・クリックの塩基対合によってＲＮＡにおける標的配列と核酸塩基をハイブリッド形成させて標的配列内でオリゴヌクレオチド：ＲＮＡのヘテロ二本鎖を形成するヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の直鎖配列を指す。用語「アンチセンスオリゴマー」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」及び「アンチセンス化合物」はオリゴヌクレオチドを指すのに相互交換可能に使用されてもよい。環状サブユニットはリボース糖若しくは別のペントース糖、又は特定の実施形態では、モルフォリノ基（以下のモルフォリノオリゴヌクレオチドの記載を参照のこと）に基づいてもよい。熟考されるのはまた、当該技術で既知の他のアンチセンス作用物質の中でも、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）及び２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドである。
【００８０】
含まれるのは、（ｉ）修飾された主鎖構造、たとえば、天然に存在するオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドで見いだされる標準のホスホジエステル結合以外の主鎖、及び／又は（ｉｉ）修飾された糖部分、たとえば、リボース部分又はデオキシリボース部分ではなくモルフォリノ部分を有するアンチセンスオリゴマー又はオリゴヌクレオチドを含む天然に存在しないアンチセンスオリゴマー又は「オリゴヌクレオチド類似体」である。オリゴヌクレオチド類似体は標準のポリヌクレオチド塩基に対するワトソン・クリック塩基対合による水素結合が可能である塩基を支え、その際、類似体の主鎖は、オリゴヌクレオチド類似体分子と標準のポリヌクレオチド（たとえば、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）における塩基との間で配列に特異的な方法でそのような水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。好ましい類似体は、実質的に非荷電性のリン含有主鎖を有するものである。
【００８１】
本発明の当業者は本発明の目的で使用できてもよい好適な主鎖の他の形態に気付くであろうが、アンチセンスオリゴマーを作出する方法の１つは２’ヒドロキシリボース位のメチル化であり、ホスホロチオエート主鎖の組込みは一見ＲＮＡに類似するが、ヌクレアーゼ分解にはるかに耐性である分子を生じる。
【００８２】
アンチセンスオリゴマーとの二本鎖形成の間でのプレｍＲＮＡの分解を回避するために、方法で使用されるアンチセンスオリゴマーは内在性のリボヌクレアーゼＨによる切断を出来るだけ抑える又は防ぐように適合させてもよい。リボヌクレアーゼＨを含有する細胞内の又は粗抽出物におけるメチル化されていないオリゴマーによるＲＮＡの処理はプレｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴマー二本鎖の分解につながるので、この特性は高度に好ましい。そのような分解を迂回することができる又は誘導しない任意の形態の修飾されたアンチセンスオリゴマーが本方法で使用されてもよい。ヌクレアーゼ耐性は、それが部分不飽和の脂肪族炭化水素鎖と、カルボン酸基、エステル基及びアルコール基を含む１以上の極性基又は荷電基とを含むように本発明のアンチセンスオリゴマーを修飾することによって達成されてもよい。
【００８３】
ＲＮＡと二本鎖形成する場合、細胞性のリボヌクレアーゼＨによって切断されないアンチセンスオリゴマーの例は２’−Ｏ−メチル誘導体である。そのような２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチドは細胞環境及び動物組織において安定であり、ＲＮＡとのその二本鎖はリボ−又はデオキシリボ−対応物よりも高いＴｍ値を有する。代わりに、本発明のヌクレアーゼ耐性のアンチセンスオリゴマーはフッ素化された最終３’末端ヌクレオチドの少なくとも１つを有してもよい。さらに代わりに、本発明のヌクレアーゼ耐性のアンチセンスオリゴマーは最終３’末端ヌクレオチド塩基の少なくとも２つの間を連結するホスホロチオエート結合を有し、好ましくは４つの最終３’末端ヌクレオチド塩基間を連結するホスホロチオエート結合を有する。
【００８４】
スプライススイッチングの増加は代替のオリゴヌクレオチドの化学構造によっても達成されてもよい。たとえば、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロアミデート又はホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）；ＰＭＯ−Ｘ；ＰＰＭＯ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；ロック核酸（ＬＮＡ）及びα−Ｌ−ＬＮＡ、２’−アミノＬＮＡ、４’−メチルＬＮＡ及び４’−Ｏ−メチルＬＮＡを含む誘導体；エチレン架橋の核酸（ＥＮＡ）及びその誘導体；ホスホロチオエートオリゴマー；トリシクロ−ＤＮＡオリゴマー（ｔｃＤＮＡ）；トリシクロホスホロチオエートオリゴマー；２’−Ｏ−メチル修飾オリゴマー（２’−ＯＭｅ）；２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）；２’−フルオロ，２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）；非ロック核酸（ＵＮＡ）；ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）；２’−アミノ（２’−ＮＨ２）；２’−Ｏ−エチレンアミン、又はミックスマーとしての若しくはギャップマーとしての前述の任意の組み合わせを含む群から選択されてもよい。送達有効性をさらに改善するために、上述の修飾されたヌクレオチドは、糖部分又は核酸塩基部分に対して脂肪酸／脂質／コレステロール／アミノ酸／炭水化物／多糖類／ナノ粒子等によってコンジュゲートされることが多い。これらのコンジュゲートされたヌクレオチド誘導体を用いてエクソンスキッピング用のアンチセンスオリゴマーを構築することもできる。ヒトＩＴＧＡ４遺伝子転写物のアンチセンスオリゴマーが誘導するスプライス修飾は一般にホスホロチオエート主鎖にてオリゴリボヌクレオチド、ＰＮＡ、２ＯＭｅ又はＭＯＥのいずれかで修飾された塩基を使用している。２ＯＭｅＡＯはオリゴの設計に使用されるが、カチオン性リポプレックスとして送達される場合のそのインビトロでの効率的な取り込みのために、これらの化合物はヌクレアーゼ分解に感受性であり、インビボ又は臨床での応用には理想的とは考慮されない。代替の化学構造を用いて本発明のアンチセンスオリゴマーを生成する場合、本明細書で提供される配列のウラシル（Ｕ）はチミン（Ｔ）によって置き換えられてもよい。
【００８５】
本発明のアンチセンスオリゴマーの範囲内に含まれるのは、（ｉ）修飾された主鎖構造、たとえば、天然に存在するオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドで見いだされる標準のホスホジエステル結合以外の主鎖、及び／又は（ｉｉ）修飾された糖部分、たとえば、リボース部分又はデオキシリボース部分ではなくモルフォリノ部分を有するオリゴマーを含む天然に存在しないオリゴマー又は「オリゴヌクレオチド類似体」である。オリゴマー類似体は、標準のポリヌクレオチド塩基に対するワトソン・クリック塩基対合による水素結合が可能である塩基を支え、その際、類似体の主鎖は、オリゴマー類似体分子と標準のポリヌクレオチド（たとえば、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）における塩基との間で配列に特異的な方法でそのような水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。好ましい類似体は実質的に非荷電性のリン含有主鎖を有するものである。
【００８６】
リボヌクレアーゼＨを活性化しないアンチセンスオリゴマーは既知の技法（たとえば、米国特許第５，１４９，７９７号を参照のこと）に従って作製することができる。デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの配列であってもよいそのようなアンチセンスオリゴマーは、そのメンバーの１つとしてオリゴマーを含有する二本鎖分子へのリボヌクレアーゼＨの結合を立体的に妨害する又は防止する構造的修飾を単に含有し、その構造的修飾は二本鎖形成を実質的に妨害しない又は破壊しない。二本鎖形成に関与するオリゴマーの部分がそれへのリボヌクレアーゼＨの結合に関与する部分と実質的に異なるので、リボヌクレアーゼＨを活性化しない多数のアンチセンスオリゴマーが利用可能である。たとえば、そのようなアンチセンスオリゴマーは、ヌクレオチド間を架橋するリン酸残基の少なくとも１つ又はすべてが、たとえば、ホスホン酸メチル、メチルホスホロチオエート、ホスホロモルフォリデート、ホスホロピペラジデート、ボラノホスフェート、アミド結合及びホスホロアミデートのような修飾されたリン酸であるオリゴマーであってもよい。たとえば、ヌクレオチド間を架橋するリン酸残基が１つおきに、記載されているように修飾されてもよい。別の非限定例では、そのようなアンチセンスオリゴマーは、ヌクレオチドの少なくとも１つ又はすべてが２’低級アルキル部分（たとえば、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖又は分岐鎖の飽和又は不飽和のアルキル、たとえば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニル及びイソプロピル）を含有する分子である。たとえば、ヌクレオチドが１つおきに、記載されているように修飾されてもよい。
【００８７】
上述のアンチセンスオリゴマーは本発明のアンチセンスオリゴマーの好ましい形態である一方で、本発明は、以下に記載されているようなオリゴマー模倣体を含むが、これらに限定されない他のオリゴマーアンチセンス分子を含む。
【００８８】
本発明で有用な好ましいアンチセンスオリゴマーの具体例には、修飾された主鎖又は非天然のヌクレオシド間結合を含有するオリゴマーが挙げられる。本明細書で定義されているように、修飾された主鎖を有するオリゴマーには、主鎖にリン原子を保持するもの及び主鎖にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的では、及び当該技術で参照されることがあるように、そのヌクレオシド間の主鎖にリン原子を有さない修飾されたオリゴマーもアンチセンスオリゴマーであると考慮することができる。
【００８９】
他の好ましいオリゴマー模倣体では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の双方、すなわち、主鎖が新規の基で置き換えられる。適当な核酸標的化合物とのハイブリッド形成のために塩基単位は維持される。優れたハイブリッド形成特性を有することが示されているオリゴマー模倣体であるそのようなオリゴマー化合物の１つはペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴマーの糖主鎖はアミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置き換えられる。核酸塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合される。
【００９０】
別の好ましい化学構造はホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）オリゴマー化合物であり、それは既知のヌクレアーゼ又はプロテアーゼによって分解されない。これらの化合物は非荷電性であり、ＲＮＡ鎖に結合した場合にリボヌクレアーゼＨを活性化しないが、インビボでの投与ののち持続したスプライス調節を発揮することが示されている（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｔｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７，１８７−１９７）。
【００９１】
修飾されたオリゴマーは１以上の置換された糖部分も含有してもよい。オリゴマーは核酸塩基（当該技術では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾又は置換も含んでもよい。特定の核酸塩基は本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、５−置換されたピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換されたプリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、さらに一層詳しくは２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせると、０．６〜１．２℃で核酸二本鎖の安定性を高めることが示されている。
【００９２】
本発明のオリゴマーの別の修飾には、オリゴマーの活性、細胞分布又は細胞への取り込みを高める１以上の部分又はコンジュゲートをオリゴマーに化学的に連結することが関与する。そのような部分には、たとえば、コレステロール部分、コール酸のような脂質部分、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１,２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、ミリスチル、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
細胞浸透性ペプチドをホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーに加えて細胞の取り込み及び核局在化を高めている。Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎら．（２００８），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６９，１６２４−１６２９にて示されたように様々なペプチドタグが取り込みの効率及び標的組織の特異性に影響を与えることが示されている。
【００９４】
所与の化合物におけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、１を超える前述の修飾が単一の化合物に、又はオリゴマー内の単一ヌクレオシドでも組み込まれてもよい。本発明はキメラ化合物であるアンチセンスオリゴマーも含む。本発明の文脈における「キメラアンチセンスオリゴマー」又は「キメラ」は、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、オリゴマー化合物の場合ヌクレオチドで構成される２以上の化学的に異なる領域を含有するアンチセンスオリゴマー、特にオリゴマーである。これらのオリゴマーは通常、オリゴマー又はアンチセンスオリゴマーにヌクレアーゼ分解に対する高い耐性、高い細胞取り込み、及び標的核酸についての高い結合親和性のための追加の領域を付与するようにオリゴマーが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。
【００９５】
当該技術における日常の技法に従ってアンチセンスオリゴマー及びその変異体の活性をアッセイすることができる。たとえば、調査されるＲＮＡ及びタンパク質のスプライス形態及び発現レベルは、転写された核酸及びタンパク質のスプライス形態及び／又は発現を検出するための多種多様な周知の方法によって評価されてもよい。そのような方法の非限定例には、ＲＮＡのスプライス形態のＲＴ−ＰＣＲとその後のＰＣＲ産物のサイズ分離、核酸のハイブリッド形成法、たとえば、ノーザンブロット及び／又は核酸アレイの使用；核酸増幅法；タンパク質の検出のための免疫法；タンパク質の精製法；及びタンパク質の機能と活性のアッセイが挙げられる。
【００９６】
ＲＮＡの発現レベルは、細胞、組織又は生物からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写されたポリヌクレオチド）を調製することによって、及びアッセイされる核酸又はその断片の相補鎖である参照ポリヌクレオチドとｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをハイブリッド形成させることによって評価するこができる。相補性のポリヌクレオチドとのハイブリッド形成に先立って種々のポリメラーゼ鎖反応のいずれか又はインビトロ転写法を用いてｃＤＮＡを任意で増幅することができる；好ましくはそれは増幅されない。１以上の転写物の発現は、転写物の発現レベルを評価するための定量ＰＣＲを用いて検出することもできる。
【００９７】
本発明は、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物のアンチセンスオリゴマーが誘導するスプライススイッチング、臨床的に関連するオリゴマー化学構造及び送達系を提供してＩＴＧＡ４のスプライス操作を治療レベルに向ける。ＩＴＧＡ４遺伝子の転写からの完全長のＩＴＧＡ４ｍＲＮＡの量、従ってＩＴＧＡ４タンパク質の量の実質的な低下は、
（１）（ｉ）イントロンのエンハンサ標的モチーフ、（ｉｉ）アンチセンスオリゴマーの長さとオリゴマー混合物の開発、（ｉｉｉ）化学構造の選択及び（ｉｖ）オリゴマーの送達を高めるための細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）の添加という実験的な評価を介した、線維芽細胞細胞株を用いたインビトロでのオリゴマーの改良と、
（２）１以上のエクソンが欠けているＩＴＧＡ４転写物を生成するための新規のアプローチの詳細な評価とによって達成される。
【００９８】
そのようなものとして本明細書では、特定のアンチセンスオリゴマーによってＩＴＧＡ４プレｍＲＮＡのプロセッシングを操作することができることが実証される。この方法では、ＩＴＧＡ４タンパク質の量での機能的に有意な低下が得られ、それによってＭＳに関連する深刻な病状を軽減することができる。
【００９９】
本発明に従って使用されるアンチセンスオリゴマーは、固相合成の周知の技法を介して従来どおり作製されてもよい。そのような合成のための機器は、たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を含む幾つかの供給業者によって販売されている。修飾された固形支持体上でオリゴマーを合成する方法の１つは米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
【０１００】
当該技術で既知のそのような合成のための多の手段が追加的に又は代わりに採用されてもよい。類似の技法を用いてホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のようなオリゴマーを調製することは周知である。そのような自動化された一実施形態では、ジエチル−ホスホルアミダイトが出発物質として使用され、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９−１８８２によって記載されたように合成されてもよい。
【０１０１】
本発明のアンチセンスオリゴマーはインビトロで合成され、生物起源のアンチセンス組成物、又はアンチセンスオリゴマーのインビボ合成を指図するように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。本発明の分子は、取り込み、分布及び／又は吸収に役立つ他の分子、分子構造又は化合物の混合物、例としては、リポソーム、受容体が標的とする分子、経口製剤、直腸製剤、局所製剤又は他の製剤と混合されてもよく、それに被包されてもよく、コンジュゲートされてもよく、又はさもなければそれに付随してもよい。
【０１０２】
本発明のアンチセンスオリゴマーは予防剤又は治療剤として使用することもでき、それは疾患の治療の目的で利用されてもよい。従って、一実施形態では、本発明は、治療上有効な量にて、薬学上許容できるキャリア、希釈剤又は賦形剤と混合される、ＩＴＧＡ４のプレｍＲＮＡにて選択された標的に結合して本明細書に記載されているような効率的で且つ一貫したエクソンスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーを提供する。
【０１０３】
従って本発明は、患者におけるＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善するための医薬組成物、予防用組成物又は治療用組成物を提供し、該組成物は、
（ａ）本明細書に記載されているような１以上のアンチセンスオリゴマーと、
（ｂ）１以上の薬学上許容できるキャリア及び／又は希釈剤とを含む。
【０１０４】
好ましくは、ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患はＭＳである。
【０１０５】
組成物は、それぞれ約１ｎＭ〜１０００ｎＭの本発明の所望のアンチセンスオリゴマーを含んでもよい。好ましくは、組成物は、約１ｎＭ〜５００ｎＭ、１０ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜７５０ｎＭ、１０ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜１００ｎＭ、１ｎＭ〜５０ｎＭ、１ｎＭ〜４０ｎＭ、１ｎＭ〜３０ｎＭ、１ｎＭ〜２０ｎＭ、最も好ましくは１ｎＭ〜１０ｎＭの間での本発明のアンチセンスオリゴマーのそれぞれを含んでもよい。
【０１０６】
組成物は、約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍ又は１０００ｎｍの本発明のアンチセンスオリゴマーのそれぞれを含んでもよい。
【０１０７】
本発明はさらに、ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患又は病状のような疾患の症状の予防上若しくは治療上の処置、予防又は改善に役立つように適合させた１以上のアンチセンスオリゴマーを患者への送達に好適な形態で提供する。
【０１０８】
語句「薬学上許容できる」は、生理的に忍容性であり、且つ患者に投与された際、たとえば、急性胃蠕動等のようなアレルギー反応又は類似の望ましくない反応を通常生じない分子実体及び組成物を指す。用語「キャリア」は化合物が共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤又はビヒクルを指す。そのような医薬キャリアは、たとえば、水、及び石油、動物、植物又は合成の起源のものを含む油、たとえば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等のような無菌の液体であることができる。水又は生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロールの溶液は好ましくは、特に注射溶液のためのキャリアとして採用される。好適な医薬キャリアは、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，（１９９０）にて記載されている。
【０１０９】
本発明のさらに特定の形態では、薬学上許容できる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤及び／又はキャリアと一緒に治療上有効な量の本発明の１以上のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物が提供される。そのような組成物には、種々の緩衝液内容物（たとえば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、及びたとえば、界面活性剤及び可溶化剤（たとえば、ツイーン８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（たとえば、チメルソール、ベンジルアルコール）及び増量物質（たとえば、ラクトース、マンニトール）のような添加剤が含まれる。材料は、たとえば、ポリ酢酸、ポリグリコール酸等のようなポリマー化合物の微粒子状調製物又はリポソームに組み込まれてもよい。ヒアルロン酸も使用されてもよい。そのような組成物は本タンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、及びインビボクリアランスの速度に影響を与えてもよい。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＭａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１８０４２）、１４３５−１７１２ページを参照のこと。組成物は液体形態で調製されてもよく、又は、たとえば、凍結乾燥形態のような乾燥粉末であってもよい。
【０１１０】
本発明に従って提供される医薬組成物は当該技術で既知の手段によって投与されてもよいことが十分に理解されるであろう。好ましくは、投与のための医薬組成物は、注射によって、経口で、局所で、又は肺若しくは鼻の経路によって投与される。アンチセンスオリゴマーはさらに好ましくは投与の静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内又は皮下の経路によって送達される。適当な経路は、治療のもとでの対象の状態に対して必要に応じて当業者によって決定されてもよい。血管循環又は血管外循環、血液系又はリンパ系、及び脳脊髄液はアンチセンスオリゴマーが導入されてもよい一部の非限定部位である。ＣＮＳへの直接送達、たとえば、大脳内脳室への直接送達が採用されてもよく、またはクモ膜下投与は投与の経路として使用されてもよい。
【０１１１】
局所投与用の製剤には、本開示のオリゴマーが、たとえば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面活性剤のような局所送達剤との混合物であるものが挙げられる。脂質及びリポソームには、中性（たとえば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、アニオン性（たとえば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及びカチオン性（たとえば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれる。局所投与又は他の投与については、本開示のオリゴマーはリポソーム内に被包されてもよく、又はそれとの、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成してもよい。或いは、オリゴマーは脂質、特にカチオン性脂質に対して複合体化してもよい。脂肪酸及びエステル、薬学上許容できるその塩、及びそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号及び／又は１９９９年５月２０日に出願された米国特許出願番号０９／３１５，２９８にてさらに記載されている。
【０１１２】
特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、経皮法（たとえば、任意でリポソームにパッケージされたアンチセンスオリゴマーによる、そのようなアンチセンスオリゴマーの、たとえば、エマルションへの組込みを介した）によって送達することができる。送達のそのような経皮法及びエマルション／リポソームが介在する方法は、当該技術におけるアンチセンスオリゴマーの送達について、たとえば、米国特許第６，９６５，０２５号にて記載されている。
【０１１３】
本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーは埋め込み可能なデバイスを介して送達されてもよい。そのようなデバイスの設計は当該技術にて認識されている工程であり、たとえば、合成埋没物の設計は、たとえば、米国特許第６，９６９，４００号に記載されている。
【０１１４】
経口投与用の組成物及び製剤には、粉末又は顆粒、微粒子状物質、ナノ微粒子状物質、水又は非水性媒体における懸濁液又は溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ、錠剤又はミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましくてもよい。経口製剤は、本開示のオリゴマーが１以上の浸透増強剤、界面活性剤及びキレート剤と併せて投与されるものである。界面活性剤には、脂肪酸及び／又はそのエステル又は塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。胆汁酸／塩及び脂肪酸及びその使用は米国特許第６，２８７，８６０号にてさらに記載されている。一部の実施形態では、本開示は浸透増強剤の組み合わせ、たとえば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩を提供する。例となる組み合わせは、ラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸及びＵＤＣＡである。さらなる浸透増強剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本開示のオリゴマーは、噴霧される乾燥粒子を含む顆粒形態にて経口で送達されてもよく、又は複合体化されて微粒子又はナノ粒子を形成してもよい。オリゴマーを複合体化する作用物質及びそれらの使用は米国特許第６，２８７，８６０号にてさらに記載されている。オリゴマーのための経口製剤及びその調製物はＵＳ６，８８７，９０６、１９９９年５月２０日に出願された０９／３１５，２９８及び／又はＵＳ２００３００２７７８０にて詳細に記載されている。
【０１１５】
非経口、クモ膜下又は脳室内の投与のための組成物及び製剤には、たとえば、浸透増強剤、キャリア化合物及び他の薬学上許容できるキャリア又は賦形剤のような、しかし、これらに限定されない緩衝液、希釈剤及び他の好適な添加剤を含有してもよい無菌の水溶液が挙げられてもよい。
【０１１６】
治療上有用な量のアンチセンスオリゴマーの送達は以前公開された方法によって達成されてもよい。たとえば、アンチセンスオリゴマーの細胞内送達は、アンチセンスオリゴマーと有効量のブロックコポリマーの混合物を含む組成物を介してもよい。この方法の例は米国特許出願ＵＳ２００４０２４８８３３にて記載されている。アンチセンスオリゴマーの核への送達の他の方法は、Ｍａｎｎ  ＣＪら．（２００１），Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，９８（１）  ４２−４７，及びＧｅｂｓｋｉら．（２００３），Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２（１５）：１８０１−１８１にて記載されている。発現ベクターによって裸のＤＮＡ又は脂質キャリアと複合体化したＤＮＡとして核酸分子を細胞に導入する方法はＵＳ６，８０６，０８４にて記載されている。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴマー及びそれを含む治療用組成物は、経皮法（たとえば、任意でリポソームにパッケージされたアンチセンスオリゴマーによる、そのようなアンチセンスオリゴマーの、たとえば、エマルションへの組込みを介した）によって送達することができる。送達のそのような経皮法及びエマルション／リポソームが介在する方法は、当該技術でのアンチセンスオリゴマーの送達について、たとえば、米国特許第６，９６５，０２５号に記載されている。
【０１１８】
コロイド状分散系にてアンチセンスオリゴマーを送達することが望ましくてもよい。コロイド状分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油エマルションを含む脂質に基づく系、ミセル、混合ミセル、及びリポソーム又はリポソーム製剤が含まれる。これらのコロイド状分散系は治療用医薬組成物の製造に使用することができる。
【０１１９】
リポソームは人工膜の小胞であり、それはインビトロ及びインビボでの送達小胞として有用である。これらの製剤は正味のカチオン、アニオン又は中性の電荷特性を有してもよく、インビトロ、インビボ、生体外の送達法について有用な特徴を有してもよい。大きな単層の小胞が大きな高分子を含有する水性緩衝液の実質的な比率を被包できることが示されている。ＲＮＡ及びＤＮＡは水性内部の中に被包することができ、生物学的に活性のある形態で細胞に送達することができる（Ｆｒａｌｅｙら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．６：７７，１９８１）。
【０１２０】
リポソームが効率的な遺伝子導入媒体であるためには、以下の特徴：（１）その生物活性を損なわないようにしつつ高い効率での目的のアンチセンスオリゴマーの被包；（２）非標的細胞に比べて優先的で且つ実質的な標的細胞への結合；（３）標的細胞の細胞質への小胞の水性内容物の高い効率での送達；及び（４）遺伝情報の正確で且つ効果的な発現が存在すべきである（Ｍａｎｎｉｎｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：８８２，１９８８）。リポソームの組成は普通、リン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質の組み合わせであり、普通ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質又は他の脂質も使用されてもよい。リポソームの物理的特徴はｐＨ、イオン強度及び二価のカチオンの存在に左右される。カチオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられている正に荷電したリポソームである。ｐＨに感受性である又は負に荷電しているリポソームは、それと複合体形成するのではなく、ＤＮＡを捕捉すると考えれている。カチオン性及び非カチオン性のリポソーム双方がＤＮＡを細胞に送達するのに使用されている。
【０１２１】
リポソームには、本明細書で使用されるとき、リポソームに組み込まれると、特殊化された脂質を欠いているリポソームに比べて長い循環寿命を生じる１以上のそのように特殊化された脂質を含むリポソームを指す用語である「立体的に安定化された」リポソームが含まれる。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が１以上の糖脂質を含む、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１以上の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。リポソーム及びその使用は、ＵＳ６，２８７，８６０にさらに記載されている。
【０１２２】
本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーは埋め込み可能なデバイスを介して送達されてもよい。そのようなデバイスの設計は当該技術にて認識されている工程であり、たとえば、合成インプラントの設計は、たとえば、その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，９６９，４００号に記載されている。
【０１２３】
アンチセンスオリゴマーは当該技術にて認識されている技法（たとえば、形質移入、エレクトロポレーション、融合、リポソーム、コロイド状ポリマー粒子及びウイルスベクター及び非ウイルスベクターと同様に当該技術で既知の他の手段）を用いて細胞に導入することができる。選択される送達の方法は処理される細胞及び細胞の位置に少なくとも左右され、技量のある熟練者には明らかであろう。たとえば、局在化は、リポソームを指向する表面上の特異的なマーカーを持つリポソーム、標的細胞を含有する組織への直接注入、特異的な受容体介在性の取り込み等によって達成することができる。
【０１２４】
当該技術で知られるように、アンチセンスオリゴマーは、たとえば、リポソーム介在性の取り込み、脂質コンジュゲート、ポリリジン介在性の取り込み、ナノ粒子介在性の取り込み、及び受容体介在性のエンドサイトーシスを含む方法、と同様に送達の追加の非エンドサイトーシス方式、たとえば、微量注入、透過化（たとえば、ストレプトリジン−Ｏ透過化、アニオン性ペプチド透過化）、エレクトロポレーション、及び当該技術で既知である種々の非侵襲性非エンドサイトーシスの方法（その全体が参照によって組み入れられるＤｏｋｋａ及びＲｏｊａｎａｓａｋｕｌ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，４４，３５−４９を参照のこと）を用いて送達されてもよい。
【０１２５】
アンチセンスオリゴマーを他の薬学上許容できるキャリア又は希釈剤と組み合わせて医薬組成物を製造してもよい。好適なキャリア及び希釈剤には等張の生理食塩水溶液、たとえば、リン酸緩衝化生理食塩水が挙げられる。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口又は経皮の投与のために製剤化されてもよい。
【０１２６】
技量のある実行者は投与の最適な経路及び特定の動物及び状態のための投与量を容易に決定することができるので、記載されている投与の経路は指針としてのみ意図される。
【０１２７】
インビトロ及びインビボの双方にて細胞に機能的な新しい遺伝物質を導入する複数のアプローチが試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８０）。これらのアプローチには、発現される遺伝子の改変レトロウイルスへの組込み（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，（１９８９），上記；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９１），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１（１８），ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ−５０７９Ｓ）；非レトロウイルスベクターへの組込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｉｄら，（１９９２），Ｃｅｌｌ，８８：１４３−１５５；Ｒｏｓｅｎｆｅｉｄら．（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１−４３４）；又はリポソームを介した異種のプロモータ／エンハンサエレメントに連結された導入遺伝子の送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，（１９８９），上記；Ｂｒｉｇｈａｍら，（１９８９）Ａｍ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ，２９８：２７８−２８１；Ｎａｂｅｌら，（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉら，（１９９１），Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ，４：２０６−２０９；ならびにＷａｎｇ及びＨｕａｎｇ，（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：７８５１−７８５５）；リガンド特異的なカチオン系輸送システムへの結合（Ｗｕ及びＷｕ，（１９８８），Ｊ，Ｂｉｏｉ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１−１４６２４）又は裸のＤＮＡ、発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌら．（１９９０），上記）；Ｗｏｌｆｆら．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８）が挙げられる。組織への導入遺伝子の直接注入は局在化された発現のみを生じる（Ｒｏｓｅｎｆｅｉｄ，（１９９２），上記）；Ｒｏｓｅｎｆｅｆｄら．（１９９１），上記；Ｂｒｉｇｈａｍら．（１９８９），上記；Ｍａｂｅｌ，（１９９０），上記；及びＨａｚｉｎｓｋｊら．（１９９１），上記）。Ｂｒｉｇｈａｍらのグループ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）２９８：２７８−２８１及びＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９９１），３９（ａｂｓｔｒａｃｔ））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内又は気管内の投与に続くマウスの肺のみのインビボ形質移入を報告している。ヒトの遺伝子療法の手順の総説の例は：Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９２），２５６：８０８−８１３；Ｂａｒｔｅａｕら，（２００８），Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈａｒ；８（５）：３１３−２３；Ｍｕｅｌｌｅｒら．（２００８）．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．；３５（３）：１６４−７８；Ｌｉら．（２００６），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１３（１８）：１３１３−９；Ｓｉｍｏｅｓら．（２００５），Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．；２（２）：２３７−５４である。
【０１２８】
本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトを含む動物への投与の際、生物学的に活性のあるその代謝産物又は残基を（直接又は間接的に）提供することができる薬学上許容できる塩、エステル、又はそのようなエステルの塩、又は任意の他の化合物を包含する。従って、一例として、本開示はまた本発明の化合物のプロドラッグ及び薬学上許容できる塩、そのようなプロドラッグの薬学上許容できる塩、及び他の生物学的同等物にも引き付けられる。
【０１２９】
用語「薬学上許容できる塩」は、本発明の化合物の生理的に且つ薬学上許容できる塩、すなわち、親化合物の望ましい生物活性を保持し、且つ望ましくない毒性効果をそれ付与しない塩を指す。オリゴマーについては、薬学上許容できる塩の好ましい例には、（ａ）たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムのようなカチオン、たとえば、スペルミン及びスペルミジンのようなポリアミン、等と共に形成される塩；（ｂ）無機酸、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等と共に形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、たとえば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、等のような有機酸と共に形成される塩、ならびに（ｄ）たとえば、塩素、臭素及びヨウ素のような元素アニオンから形成される塩が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、局所の治療又は全身性の治療が所望かどうかに応じて及び治療される領域に応じて多数の方法で投与されてもよい。投与は局所（眼科及び粘膜、と同様に直腸送達を含む）、粉末若しくはエアロゾルの吸入若しくは吹き込み（ネブライザ、気管内、鼻内、表皮及び経皮によることを含む）による肺、経口又は非経口であってもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内の注射又は点滴、又は頭蓋内、たとえば、クモ膜下又は脳室内の投与が挙げられる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を伴うオリゴマーは経口投与に特に有用であると考えられている。好ましくは、アンチセンスオリゴマーは皮下又は静脈内の経路を介して送達される。
【０１３０】
従来どおり単位用量で提示されてもよい本発明の医薬製剤は製薬業界で周知の従来の技法に従って調製されてもよい。そのような技法には、有効成分を医薬キャリア又は医薬賦形剤と組み合わせる工程が含まれる。一般に製剤は、有効成分を液体キャリア又は微細に分割した固体キャリア又はその双方と均一に且つ密接に組み合わせ、次いで必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【０１３１】
一実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーのピーク血中濃度を生じるのに有効な量及び方法で投与される。通常、１以上の用量のアンチセンスオリゴマーが一般に定期的な間隔で約１〜２週間の期間投与される。経口投与に好ましい用量は７０ｋｇ当たり約１ｍｇ〜１０００ｍｇである。場合によっては、患者当たり１０００ｍｇを超える用量が必要であってもよい。ｉ．ｖ．投与については、好ましい用量は７０ｋｇ当たり約０．５ｍｇ〜１０００ｍｇである。静脈内又は皮下の投与については、アンチセンスオリゴマーは約１２０ｍｇ／ｋｇの投与量で毎日又は毎週投与されてもよい。
【０１３２】
アンチセンスオリゴマーは定期的な間隔でさらに短い期間、たとえば、毎日２週間以下で投与されてもよい。しかしながら、場合によっては、オリゴマーは長期間にわたって断続的に投与される。投与には抗生剤の投与又は他の治療処置が続いてもよく、又はそれと同時であってもよい。治療計画は、治療中の対象の免疫アッセイ、他の生化学検査及び生理的検査の結果に基づいて、示されるように調整されてもよい（用量、頻度、経路等）。
【０１３３】
投薬は、治療される病態の重症度及び応答性に依存し、治療の経過は、数日から数カ月まで、又は治癒が達成されるまで、又は病態の縮小が達成されるまで続く。最適な投薬スケジュールは患者の体内での薬剤の蓄積の測定から算出することができる。当業者は最適な投与量、投薬方法及び繰り返し率を容易に決定することができる。最適な投与量は個々のオリゴマーの相対的な能力に応じて変化してもよく、一般にインビトロ及びインビボの動物モデルにて有効であると見いだされたＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般に、投与量は体重のｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇであり、日に、週に、月に又は年に１回以上、又はさらに２〜２０年ごとに１回与えられてもよい。当業者は、体液又は組織における薬剤の測定された滞留時間及び濃度に基づいて投薬のための繰り返し率を容易に推定することができる。治療の成功に続いて、病態の再発を防ぐために患者に維持療法を受けさせることが望ましくてもよく、その際、オリゴマーは、体重のｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇに及ぶ維持用量で１日１回以上から２０年ごとに１回までで投与される。
【０１３４】
本発明のアンチセンスオリゴマーを用いた有効なインビボの治療計画は、投与の持続時間、用量、頻度及び経路、と同様に治療中の対象の状態（すなわち、局在化した又は全身性の感染に対応した投与に対比した予防的投与）に従って変化してもよい。従って、そのようなインビボの治療法は、最適な治療結果を達成するために、治療中の特定の型の疾病に適する検査によるモニタリング及び用量又は治療計画の対応する調整を必要とすることが多いであろう。
【０１３５】
治療は、たとえば、当該技術で既知の疾患の一般的な指標によってモニターされてもよい。インビボで投与された本発明のアンチセンスオリゴマーの有効性は、アンチセンスオリゴマーの投与に先立って、その間に及びその後で、対象から採取された生体試料（組織、血液、尿等）から判定されてもよい。そのような試料のアッセイには、（１）当業者に既知の手順、たとえば、電気泳動ゲル移動アッセイを用いた標的配列及び非標的配列とのヘテロ二本鎖形成の存在下又は非存在下でのモニタリング；（２）たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのような標準の技法によって測定されるような参照の正常ｍＲＮＡ又はタンパク質に比べた変異体ｍＲＮＡの量のモニタリングが挙げられる。
【０１３６】
核内のオリゴマー送達はアンチセンスオリゴマーにとって主要な難題である。様々な細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）は様々な条件及び細胞株で種々の程度にＰＭＯを局在化し、新規のＣＰＰは標的細胞にＰＭＯを送達するその能力について本発明者らによって評価されている。用語ＣＰＰ又は「細胞の取り込みを高めるペプチド部分」は相互交換可能に使用され、「輸送ペプチド」、「キャリアペプチド」又は「ペプチド形質導入ドメイン」とも呼ばれるカチオン性細胞浸透ペプチドを指す。本明細書で示されるようなペプチドは所与の細胞培養集団の細胞の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の範囲内で細胞浸透を誘導する能力を有し、全身性投与の際、インビボの複数の組織内で高分子の位置変えを可能にする。ＣＰＰは当該技術で周知であり、たとえば、その全体が参照によって組み入れられる米国特許出願番号２０１０／００１６２１５にて開示されている。
【０１３７】
従って、本発明は、治療用医薬組成物を製造するために細胞浸透性ペプチドと組み合わせた本発明のアンチセンスオリゴマーを提供する。
【０１３８】
本発明のその上さらなる態様によれば、アンチセンスオリゴマーに基づいた治療法での使用のために本明細書に記載されているような１以上のアンチセンスオリゴマーが提供される。好ましくは、治療法はＩＴＧＡ４の発現に関連する状態のためのものである。さらに好ましくは、ＩＴＧＡ４の発現に関連する状態のための治療法はＭＳのための治療法である。
【０１３９】
さらに具体的には、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜２０２及びそれらの組み合わせ又は混合物の１以上からなる群から選択されてもよい。これには、ストリンジェントなハイブリッド形成の条件下でそのような配列とハイブリッド形成できる配列、それに相補性の配列、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物におけるプレｍＲＮＡのプロセッシング活性を持つ又は調節する修飾された塩基、修飾された主鎖及び機能的な短縮又は伸長を含有する配列が含まれる。
【０１４０】
本発明は、選択された標的に結合してＩＴＧＡ４遺伝子転写物にてエクソン除去を誘導することができる２以上のアンチセンスオリゴマーの組み合わせにまでも及ぶ。組み合わせは、アンチセンスオリゴマーに基づく治療法で使用するための２以上のアンチセンスオリゴマーの混合物、２以上のアンチセンスオリゴマーを含む構築物又は一緒に連結された２以上のアンチセンスオリゴマーであってもよい。
【０１４１】
本発明は、
（ａ）有効量の本明細書に記載されているような１以上のアンチセンスオリゴマー又は１以上のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を患者に投与する工程を含む、
ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善する方法を提供する。
【０１４２】
さらに、本発明は、
（ａ）有効量の本明細書に記載されているような１以上のアンチセンスオリゴマー又は１以上のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を患者に投与する工程を含む、
多発性硬化症の影響を治療、予防、又は改善する方法を提供する。
【０１４３】
好ましくは、治療法を用い、エクソンスキッピング戦略を介して機能的なＩＴＧＡ４タンパク質のレベルを低下させる。ＩＴＧＡ４のレベルの低下は好ましくは、インテグリンα４（ＩＴＧＡ４）の遺伝子転写物又はその一部にてプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾することを介して転写物のレベルを低下させることによって達成される。
【０１４４】
ＩＴＧＡ４の低下は好ましくは、たとえば、ＭＳのようなＩＴＧＡ４に関連する状態又は病状の症状の量、持続時間又は重症度の軽減につながる。
【０１４５】
本明細書で使用されるとき、対象（たとえば、ヒトのような哺乳類）又は細胞の治療は、個体又は細胞の自然経過を変更する試みで使用されるある種の医療介入である。治療には医薬組成物の投与が挙げられるが、これに限定されず、予防的に、又は病的事象の開始若しくは病原因子との接触に続いて実施されてもよい。含まれるのはまた、治療される疾患若しくは状態の進行の速度を減らすこと、その疾患若しくは状態の発症を遅らせること、又はその発症の重症度を軽減することに向けることができる「予防的治療」である。「治療」又は「予防」は必ずしも疾患又は状態又はそれらの関連する症状の完全な撲滅、治癒又は予防を示さない。
【０１４６】
本発明の別の態様によれば、ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の調節又は制御のための薬物の製造における本明細書に記載されているような１以上のアンチセンスオリゴマーの使用が提供される。
【０１４７】
本発明はまた、ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の治療のために薬物を製造するための本明細書に記載されているような精製かつ単離されたアンチセンスオリゴマーの使用も提供する。
【０１４８】
ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患の影響を治療、予防、又は改善する薬物を製造するための本明細書に記載されているような精製かつ単離されたアンチセンスオリゴマーの使用が提供される。
【０１４９】
好ましくは、ＩＴＧＡ４に関連する病態又は疾患はＭＳである。
【０１５０】
本発明は、その一層さらなる態様によれば、本発明のアンチセンスオリゴマー配列のｃＤＮＡ又はクローニングされたコピーと同様に本発明のアンチセンスオリゴマー配列を含有するベクターにまで及ぶ。本発明はさらにそのような配列及び／又はベクターを含有する細胞にまでも及ぶ。
【０１５１】
本発明はまた、患者におけるＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患又は状態を治療、予防、又は改善するためのキットも提供し、そのキットは、適切な容器に包装されている、ＩＴＧＡ４遺伝子転写物又はその一部にてプレｍＲＮＡのスプライシングを修飾するための少なくとも単離された又は精製されたアンチセンスオリゴマー、並びにその使用のための指示書を含む。
【０１５２】
好ましい実施形態では、キットは、本明細書に記載されているような若しくは表３〜表７にて示されているような少なくとも１つのアンチセンスオリゴマー、又は本明細書に記載されているようなアンチセンスオリゴマーの混合物を含有するであろう。キットは、たとえば、緩衝液、安定剤等のような周辺試薬も含有してもよい。
【０１５３】
従って、患者にてＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患又は状態を治療、予防、又は改善するためのキットが提供され、そのキットは、適切な容器に包装されている、本明細書に記載されている若しくは表３〜表７にて示されているような少なくとも１つのアンチセンスオリゴマー、及びその組み合わせ又は混合物、並びにその使用のための指示書を含む。
【０１５４】
患者にてＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患又は状態を治療、予防、又は改善するためのキットも提供され、そのキットは、適切な容器に包装されている、配列番号１〜２０２のいずれか１以上及びその組み合わせ又は混合物からなる群から選択される少なくとも１つのアンチセンスオリゴマー、並びにその使用のための指示書を含む。
【０１５５】
好ましくは、疾患又は状態は多発性硬化症である。
【０１５６】
キットの内容物を凍結乾燥することができ、キットはさらに凍結乾燥された成分の再構成のための好適な溶媒を含有することができる。キットの個々の成分は別々の容器に包装され、そのような容器に関連付けて、通知は、医薬品又は生物製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって指示された形態であることができ、その通知はヒトへの投与のための製造、使用又は販売の当局による認可を反映する。
【０１５７】
キットの成分が１以上の溶液で提供される場合、溶液は水溶液、たとえば、無菌の水溶液であることができる。インビボでの使用については、発現構築物を薬学上許容できる注射可能組成物に製剤化してもよい。この場合、容器手段はそれ自体、それから製剤が肺のような動物の冒された領域に適用されてもよい、動物に注射されてもよい、又はさらに適用され、キットの他の成分と混合されてもよい吸入器、注射器、ピペット、点眼器、又は他のそのようなデバイスであってもよい。
【０１５８】
キットの成分はまた乾燥した形態又は凍結乾燥した形態で提供されてもよい。試薬又は成分が乾燥した形態で提供される場合、再構成は一般に好適な溶媒の添加による。溶媒も別の容器手段で提供されてもよいことが想定される。容器の数又は種類に関わりなく、本発明のキットは、動物の体内での最終的な複合体組成物の注射／投与又は交換を手助けする器具を含んでもよく又はそれと共に包装されてもよい。そのような器具は、吸入器、注射器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器、又はそのような医療上認可された送達媒体であってもよい。
【０１５９】
当業者は、上記方法の適用が多数の他の疾患の治療での使用に好適であるアンチセンスオリゴマーを特定するための広い適用を有することを十分に理解すべきである。
【０１６０】
本発明のアンチセンスオリゴマーは、たとえば、薬物療法のような代替療法と併せても使用されてもよい。
【０１６１】
従って、本発明は、ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患又は状態の影響を治療、予防、又は改善する方法を提供し、その際、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ＩＴＧＡ４の発現に関連する疾患又は状態の影響を治療、予防、又は改善することに関連する別の代替療法と順次又は同時に投与される。好ましくは疾患又は状態はＭＳである。
【０１６２】
代替療法は、インターフェロンベータ１ａ，インターフェロンベータ１ｂ、グラティラマー（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ）酢酸、ミトキサントロン、ナタリズマブ、フィンゴリモド、テリフルノミド、フマル酸ジメチル及びアレムツズマブを含む群から選択されてもよい。
【０１６３】
一般
当業者は、本明細書に記載されている本発明が具体的に記載されているもの以外の多様性及び修飾の影響を受け易いことを十分に理解するであろう。本発明はそのような多様性及び修飾のすべてを含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書で言及されている又は示されている工程、特徴、組成物及び化合物すべてを個々に又はまとめて、ならびに組み合わせのいずれか及びすべて、又は２以上の工程若しくは特徴も含む。
【０１６４】
本発明は、本明細書に記載されている具体的な実施形態によって範囲にて限定されることはなく、それは例示のみの目的を対象とする。基本的に同等の生成物、組成物及び方法は明瞭に、本明細書に記載されているような本発明の範囲内にある。
【０１６５】
本明細書で引用されている出版物すべて（特許、特許出願、雑誌の論文、実験室マニュアル、書籍又は他の文書を含む）の開示全体が参照によって本明細書に組み入れられる。参考文献のいずれかが従来技術を構成する、又は本発明が関係する分野で働く者の共通の常識の一部であるという承認は為されない。
【０１６６】
この本文で引用されている各文書、参考文献、特許出願又は特許は参照によってその全体が明白に本明細書に組み入れられ、このことは、それがこの本文の一部として読者によって読まれ、考慮されるべきであることを意味する。この本文で引用されている文書、参考文献、特許出願又は特許がこの本文で反復されないということは単に簡潔さの理由のためである。
【０１６７】
本明細書で言及されている又は参照によって本明細書に組み入れられている文書における製品についての製造元の指示書、説明、製品仕様、及び製品シートは参照によって本明細書に組み入れられ、本発明の実践で採用されてもよい。
【０１６８】
本明細書で使用されるとき、用語「誘導される（ｄｅｒｉｖｅｄ）」及び「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」は、特定の整数が、必ずしも特定の供給源に直接由来しないにもかかわらず、その供給源から得られてもよいことを示すように解釈されるべきである。
【０１６９】
本明細書で使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に指示しない限り、複数の参照を含む。
【０１７０】
本明細書の全体を通して、文脈が必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、述べられた整数又は整数の群の包含を示すが、他の整数又は整数の群の排除を示さないように理解されるであろう。
【０１７１】
操作例における、又はさもなければ示される場合以外で、明細書及び特許請求の範囲で使用される成分、反応条件等の量を表す数はすべて、あらゆる場合、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。従って、反対に示されない限り、明細書及びクレームで示される数的パラメータは、本発明によって得られるように求められる所望の特性に応じて変化してもよい近似値である。従って、「約８０％」は「約８０％」と「８０％」も意味する。少なくとも、各数的パラメータは有意な数字の数及び普通の四捨五入法という観点で解釈されるべきである。
【０１７２】
本発明の広い範囲を示す数的範囲及びパラメータが近似値であることにもかかわらず、特定の例で示される数値は出来るだけ正確に報告される。しかしながら、数値はその各試験測定で見いだされる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を固有に含有する。
【０１７３】
本明細書で使用される選択された用語についての他の定義は本発明の詳細な説明の中で見いだされてもよく、全体にわたって適用されてもよい。定義されない限り、本明細書で使用されている他の科学用語及び専門用語はすべて本発明が属する技術の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１７４】
本明細書に含まれるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の情報を含有する配列識別番号（「配列番号」）は説明の最後に集められ、プログラムＰａｔｅｎｔｈバージョン３．０を用いて作成されている。各ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は数的識別子＜２１０＞に続く配列識別子（たとえば、＜２１０＞１、＜２１０＞２等）による配列群で特定される。各ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列についての配列の長さ、種類、及び由来動物は、それぞれ数的指標の領域＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞で提供される情報によって示される。本明細書で言及されているヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は数的指標の領域＜４００＞とその後の配列識別子（たとえば、＜４００＞１、＜４００＞２等）で提供される情報によって定義される。
【０１７５】
様々なアンチセンスオリゴマー間で区別するためにアンチセンスオリゴマーの命名方式が提案され、公開された（Ｍａｎｎら、（２００２）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｅｄ．４、６４４−６５４）。この命名法は、以下で示されるように、すべて同じ標的領域に向けられた幾つかのやや異なるアンチセンスオリゴマーを調べる場合に特に意味を持つようになる。
【０１７６】
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）
最初の文字は種を指定する（たとえば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス）。
【０１７７】
＃は標的のエクソン番号を指定する。
【０１７８】
「Ａ／Ｄ」はそれぞれエクソンの始まりと終わりでのアクセプター又はドナーのスプライス部位を示す。
【０１７９】
（ｘ：ｙ）はそれぞれ、「−」又は「＋」がそれぞれイントロン配列又はエクソン配列を示すアニーリング座標を表す。一例として、Ａ（−６＋１８）は、標的エクソンの前のイントロンの最後の６塩基と、標的エクソンの最初の１８塩基を示す。最も近接するスプライス部位は、アクセプターであるので、これら座標の前に「Ａ」と記載する。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標は、アンチセンスオリゴマーのアニーリング部位に対応する最後の２つのエクソン塩基と最初の１８個のイントロン塩基を表すＤ（＋２−１８）と記載することができる。Ａ（＋６５＋８５）によって表される全体がエクソンであるアニーリング座標は、すなわち、そのエクソンの最初から６５番目のヌクレオチドと８５番目のヌクレオチドとの間の部位である。
【０１８０】
以下の実施例は、上述の本発明を用いる方法をさらに完全に記載するのに役立つと共に本発明の種々の態様を実施するために熟考される最良の方法を示すのに役立つ。これらの方法は本発明の真の範囲を限定するのに決して役立たないが、むしろ、説明目的で提示されることが理解される。
【実施例】
【０１８１】
実施例１
（オリゴマーの命名）
命名方式は、種、エクソン番号、アクセプター又はドナーの標的化及びアニーリング座標を定義し、その際、本明細書に記載されているように「−」はスプライス部位からのイントロンの位置を示し、「＋」はエクソンの位置を特定する。一部の詳細なオリゴマーのアニーリング座標は表３〜７に示されている。
（アンチセンスオリゴマー）
２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を伴うアンチセンスオリゴマーは手元で合成した、又はＴｒｉ  Ｌｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ［Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ］から入手した。
【０１８２】
（細胞の増殖及び形質移入）
十分に確立された技法［Ｖｉｌｌｅｇａｓ及びＭｃＰｈａｕｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｂｉｏｌ.（２００５），２８．３．１−２８．３．９］を用いて初代正常皮膚線維芽細胞を増殖させた。７５ｃｍ２の組織培養フラスコに細胞を播き、増殖させ、２４穴プレートにて２ＯＭｅＡＯによる形質移入を行った。形質移入の１日前、１５〜１７，０００個の細胞を２４穴プレートに播き、リポフェクチン（登録商標）形質移入試薬［Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ］（２：１のリポフェクチン：オリゴの比）を用い、製造元のプロトコールに従ってある範囲の濃度（５〜１００ｎＭ）の２ＯＭｅＡＯによって形質移入した。
【０１８３】
ＰＭＯの形質移入については、逆相補性配列を持つオリゴヌクレオチドに対してＰＭＯをアニーリングさせ、得られた二本鎖について、リポフェクチン（登録商標）（２：１のリポフェクチン：オリゴの比）との複合体を形成させた。
【０１８４】
形質移入した細胞は通常、特に指示されない限り、２４時間インキュベートした後、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）酸フェノール抽出［Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ］を用いて解析のためにＲＮＡを抽出した。軽微なＤＮＡの混入は問題にならないが、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を含まないデオキシリボヌクレアーゼ１（ＤＮＡｓｅ１）でＲＮＡ試料を処理した。
【０１８５】
（ＲＴ−ＰＣＲ解析）
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ［Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ］を用いた一工程ＲＴ−ＰＣＲ：約１００ｎｇの全ＲＮＡを鋳型として用い、５５℃で３０分間及び９４℃で２分間インキュベートし、その後、エクソン２〜９のスキッピングについてはエクソン１Ｆと１０Ｒのプライマーを、エクソン１０〜１９のスキッピングについてはエクソン９Ｆと２０Ｒのプライマーを、及びエクソン２０〜２７のスキッピングについてはエクソン１０Ｆと２８Ｒのプライマーを用いて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び６８℃で１分３０秒間を３０回行った。
【０１８６】
トリス−酢酸−ＥＤＴＡ緩衝液での２％アガロースゲルにてＰＣＲ産物を分画し、ゲル撮影装置で画像を捕捉し、Ｂｉｏ１Ｄソフトウエア［Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ，Ｅｂｅｒｈａｒｄｚｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ］によって解析し、バンド重量を定量し、完全長のＩＴＧＡ４とエクソンスキッピング産物の比を推定した。産物の同一性は必要に応じてバンドの精製及びＤＮＡの配列決定によって確認した。エクソンスキッピングの効率はＲＴ−ＰＣＲによって生成された総産物に比べたエクソンスキッピングのある転写物の比率を算出することによって決定した。
【０１８７】
調べたアンチセンスオリゴマーの中で、エクソン３、４及び１９を標的とするアンチセンスオリゴマーは、３０〜４０％のスキッピングされている標的化エクソンを持つ転写物を生じた（表３）。転写物のサイズに基づいて、エクソン３を標的とするアンチセンスオリゴマーはエクソン３及びエクソン４双方のスキッピングを誘導した。これは、リーディングフレームがインタクトのままであった。
【０１８８】
（ウエスタンブロット）
２日後、処理した培養物からタンパク質を抽出し、Ｃｏｏｐｅｒら，［Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，（２００３），６１，９３−９６］に従いつつも、１５％ＳＤＳで調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％のＢｉＳ  Ｔｒｉｓゲル［Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ］を用い、２００Ｖで５５分間泳動して行った。１８℃にて２９０ｍＡで一晩、タンパク質をＰａｌｌ  Ｆｌｕｏｒｏｔｒａｎｓ（登録商標）Ｗ  ＰＶＤＦ膜［Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ］に移した。エクソン１８によってコードされるＳｅｒ１０２７を取り囲む残基を認識するＩＴＧＡ４抗体［Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ、カタログ番号４８００］を１：１０００希釈で４℃にて一晩適用し、参照負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）タンパク質としてβ−チューブリンをウサギポリクローナル抗体（１：３０００希釈）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，カタログ番号ＰＩＥＰＡ１−４１３３１）によって４℃にて一晩検出し、負荷物をβ−チューブリンに対して基準化した。
【０１８９】
免疫検出については、１：１０，０００希釈のポリクローナルヤギ抗ウサギ免疫グロブリン／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ（登録商標），カタログ番号Ｐ０４４８）とＬｕｍｉｎａｔａ（商標）Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ基質（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｉｉｐｏｒｅ（登録商標），カタログ番号ＷＢＬＵＲ０１００）とを用いた。画像解析についてはＢｉｏ−１Ｄソフトウエア［Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ，Ｅｂｅｒｈａｒｄｚｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ］を用いて定量を行った。
【０１９０】
結果を図２にて提供する。結果は、エクソン３（ＡＯ１）、４（ＡＯ２１）及び１９（ＡＯ４７）を標的とするエクソンスキッピングのアンチセンスオリゴマーで処理した後の正常線維芽細胞におけるＩＴＧＡ４タンパク質のノックダウンを示す。
【０１９１】
（細胞接着アッセイ）
ＰＢＳ中３μｇ／ウェルのフィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、カタログ番号ＦＣ０１０）、ＰＢＳ中０．７５μｇ／ウェルのラミニン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、カタログ番号ＡＧ５６Ｐ）又はＰＢＳ中０．５μｇ／ウェルの組換えヒトＶＣＡＭ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標），カタログ番号ＡＤＰ５−０５０）によって９６穴マイクロプレートを被覆した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、無血清のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて２μＭのカルセインＡＭ蛍光色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号Ｃ１４３０）によって３０分間標識した。ＤＭＥＭで２回洗浄した後、細胞を無血清ＤＭＥＭに再浮遊させ、プレートに播き（３，０００個の細胞／ウェル）、３７℃で３０〜４５分間インキュベートした。マイクロプレートをＰＢＳで４回洗浄して非接着細胞を取り除き、４８８ｎｍの励起波長にて５１２ｎｍで放射を検出する蛍光プレートリーダーであるＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ−８８０多重モード検出器（ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて残った接着細胞を測定した。接着細胞の比率を計算するために、洗浄工程を省略して、別のマイクロプレートで総細胞の蛍光シグナルを解析した。すべての試料からバックグランドのシグナルを差し引き、実験対照として役立つスクランブルオリゴマーで処理した試料に対して結果を基準化した。実験は独立して３回繰り返し、スチューデントｔ検定を行ってｐ値を決定した。
【０１９２】
図３に示すように、エクソン４を標的とするオリゴマー（ＡＯ２１）による形質移入はＶＣＡＭ−１で事前に被覆したマイクロプレートに接着する細胞の減少を生じた。この結果は、ＩＴＧＡ４タンパク質発現の低下のほとんどがＡＯ２１で処理したのちに観察されたことを示すタンパク質発現のウエスタン解析と相関する。しかしながら、これらの細胞をフィブロネクチン又はラミニンで事前に被覆したプレートに接着させると細胞接着に変化は見られなかった。これらの結果は、ＩＴＧＡ４の発現低下がフィブロネクチン及びラミニンとの細胞の相互作用に対して効果を有さないことを示している。これらの結果は、ＩＴＧＡ４はラミニンとの相互作用に必要とされず、ＩＴＧＡ４を別にして、幾つかの他のインテグリン受容体はフィブロネクチンと相互作用することができるので予想どおりである。一方で、ＩＴＧＡ４はＶＣＡＭ−１との相互作用にとって主要なインテグリン受容体であり、ＩＴＧＡ４発現の低下はＶＣＡＭ−１との細胞の結合に有意に影響を与える。
【０１９３】
（細胞移動アッセイ及び創傷治癒アッセイ）
アンチセンスオリゴマーによる形質移入の４８時間後に細胞移動アッセイを行った。正常なヒト線維芽細胞にオリゴマーで形質移入し、単層を形成させた。次いでピペットの先端で単層をこすることによって「創傷」を作り出し、０時間と８時間の時点で顕微鏡（Ｎｉｋｋｏｎ  ＴＳ１００）を用いて創傷（ギャップ）の画像を撮った。ＩｍａｇｅＪを用いて０時間と８時間の画像でのギャップのサイズを比較することによって細胞の移動を解析した（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）。３回の独立した実験を行い、平均の細胞移動を算出した。スクランブルオリゴマーで処理した試料に対してデータを基準化し、ｐ値のためにスチューデントｔ検定を行った。
【０１９４】
図４にて示すように、エクソン４を標的とするＡＯ２１によって形質移入した細胞はスクランブルオリゴマーを含む他のオリゴマーで形質移入した細胞に比べて遅い細胞移動を示す。
【０１９５】
実施例２
（Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖及びヌクレオフェクション）
急性Ｔリンパ球性白血病細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞はＡＴＣＣの指示に従って１０％ウシ胎児血清で補完されたＲＰＭＩ−１６４０培地で維持された。製造元の指示書に従ってＰ２初代細胞４Ｄ−ヌクレオファクターＸキットＳ（３２  ＲＣＴ）（Ｌｏｎｚａ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて５００ｎＭにておよそ５００，０００個の細胞でヌクレオフェクションを行い、２〜３日インキュベートした後、ＲＮＡ転写解析、ウエスタンブロット及びフローサイトメトリーのために細胞を回収した。
【０１９６】
（フローサイトメトリー）
ヌクレオフェクションの３日後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を回収し、冷ＰＢＳで２回洗浄した後、製造元が推奨する濃度にてＰＥ蛍光色素で標識した抗ヒトＩＴＧＡ４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と共に氷上にて２０〜３０分間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃａｌｌｉｏｓフローサイトメータを用いて解析した。
【０１９７】
（免疫染色）
ポリＤを被覆したカバースリップに３７℃で３０分間Ｊｕｒｋａｔ細胞を結合させ、氷上にて氷冷メタノール：アセトン（１：１）で５分間固定した。トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）ｐＨ７．６における０．２％Ｔｒｉｔｏｎで固定細胞を伴ったカバースリップを１回洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ中１０％ヤギ血清で１０分間ブロックした。次いでＴＢＳ−Ｔ中１：２００希釈した抗ＩＴＧＡ４抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ、カタログ番号８４４０）と共に細胞を室温で１時間インキュベートした。次いでカバースリップをＴＢＳ−Ｔで５分間、３回洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ中１：４００希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を結合したヤギ抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号Ａ−１１００８）と共に室温で１時間インキュベートした。最後に、細胞をＴＢＳ−Ｔで各５分間２回洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ中５０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔと共に室温で５分間インキュベートした後、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で最後の洗浄を行った。
【０１９８】
（Ｊｕｒｋａｔ細胞の移動）
トランスウエル移動インサート（ポリエステル膜、３μｍの孔サイズ、６．５ｍｍの直径、Ｃｏｍｉｎｇ（登録商標））の上側を０．５μｇ／μｌのヒト組換えＶＣＡＭ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＤ−１０６）５０μｌで室温にて一晩被覆し、３７℃でＲＰＭＩ−１６４０によって１〜２時間事前に平衡化した。ＰＭＯで２日間ヌクレオフェクションしたＪｕｒｋａｔ細胞を１００μｌの無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に再浮遊させ、インサートの上部区画に加え、１０％ＦＢＳで補完したＲＰＭＩ−１６４０培地６００μｌを下部区画に加えた。３７℃で５時間細胞を移動させた。上と下のチャンバー双方から細胞を回収し、２μＭのカルセインＡＭ蛍光色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号Ｃ１４３０）によって３０分間染色し、４８８ｎｍの励起波長にて５１２ｎｍで放射を検出する蛍光プレートリーダーであるＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ−８８０多重モード検出器（ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて蛍光シグナルを測定した。移動した細胞の比率は上と下のチャンバーによって生成された合計の蛍光シグナルから算出した。
【０１９９】
本発明の種々の実施形態を実施する上述の方法の改変は開示された本発明に関連する上記の教示に基づいて当業者に明らかであろう。本発明の上記の実施形態は単に例示であって、限定であるとは決して解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2018515110.tif 000019
【図６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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