(57)【要約】粒子計数装置であって、当該粒子計数装置は、検知器を含み、該検知器は、一つ以上の粒子の通過に応答して電気測定信号を生成するように配置されており、かつ、当該粒子計数装置は、比較器を含み、該比較器は、測定信号を閾値信号と比較し、かつ、測定信号が閾値信号を超えると計数値を増加させるように配置されており、当該粒子計数装置の特徴は、さらに閾値調節回路を含むことであり、該閾値調節回路は、測定値に対して低域通過フィルタを適用し、かつ、結果として生じる信号を閾値信号として用いるために比較器に接続されている、前記粒子計数装置。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子計数装置であって、当該粒子計数装置は、検知器（１２）を含み、該検知器（１２）は、一つ以上の粒子の通過に応答して電気測定信号を生成するように配置されており、かつ、当該粒子計数装置は、比較器（５６）を含み、該比較器（５６）は、前記測定信号を閾値信号と比較し、かつ、前記測定信号が前記閾値信号を超えると計数値を増加させるように配置されており、当該粒子計数装置の特徴は、さらに閾値調節回路（５０）を含むことであり、該閾値調節回路（５０）は、前記測定信号に対して低域通過フィルタ（５２、５４）を適用し、かつ、結果として生じる信号を閾値信号として用いるために前記比較器（５６）に接続されている、前記粒子計数装置。
【請求項２】
前記比較器（５６）と前記調節回路（５０）とがアナログ的に製造されており、前記調節回路（５０）が直列に取り付けられる抵抗器（５２）とキャパシタ（５４）とを含んでおり、かつ、前記比較器（５６）が比較器モードとなっている演算増幅器であり、その一方の入力は、前記測定信号を受信し、かつ、その他方の入力は、前記抵抗器（５２）と前記キャパシタ（５４）との間で前記調節回路（５０）に接続されている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記比較器（５６）が少なくとも二つのヒステリシス抵抗器（５８、６０）の間に取り付けられる、先行する請求項のうちの一項に記載の装置。
【請求項４】
前記測定信号をデジタル化するためのアナログ−デジタル変換器をさらに含んでおり、かつ、前記比較器（５６）と前記閾値調節回路（５０）とがデジタル形式で製造されている、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記閾値調節回路（５０）が次数１の有限インパルス応答フィルタである、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記閾値信号が最小値を有することを確実にする回路（６８、７０、７２）をさらに含んでいる、先行する請求項のうちの一項に記載の装置。
【請求項７】
その出力とその正の入力との間にフォロアモードで取り付けられる演算増幅器（６８）と、その負の入力の接続される電圧源（７２）と、前記演算増幅器（６８）の出力と前記閾値調節回路（５０）との間のダイオード（７０）とを含んでいる、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
トリガ回路をさらに含んでおり、該トリガ回路は、比較器モードで取り付けられる演算増幅器（６２）を含んでおり、その一方の入力は、前記測定信号を受信し、その他方の入力は、前記電圧源に接続される、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
次の工程を含む粒子計数方法：
ａ）検知器（１２）による一つ以上の粒子の通過の検知に応答して測定信号を生成すること；
ｂ）工程ａ）で生成される前記信号に対して選択される周波数の低域通過フィルタを適用することにより移動閾値信号を生成すること；および
ｃ）前記測定信号と前記移動閾値信号とを比較し、前記測定信号が選択される量だけ前記移動閾値信号を超えると粒子の検知を示す信号を放出すること。
【請求項１０】
前記測定信号がコールター原理により生成され、かつ、前記低域通過フィルタのカットオフ周波数が２００Ｈｚより低い、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体中を流動および浮遊している粒子の計数に関するものであり、特にフローサイトメトリーおよび血液学（ヘマトロジー）のためのものである。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメトリーにおいて用いられる計数技術の一つは、測定ゾーンにおける、一つ以上の粒子が流動中それを通して導かれるときのインピーダンスの変動の測定に依拠し、この技術はコールター技術と呼ばれる。インピーダンスの変化の数は、粒子の数を示す一方で、測定されるインピーダンスの値は、粒子の体積に比例する。従来の装置においてサイトメトリーに現在用いられている計数方法は、閾値よりも高い振幅の事象の検知に基づく。各閾値横断は、一つの事象に対応する。コールター技術は、細胞、小胞、寄生生物、ビーズ、ウイルス、汚染物質または毒素でさえあるような内因性または外因性の粒子を計数するために用いられてもよい。
【０００３】
この計数技術の原理の主な欠点は、多数の事象の存在下における解像度の欠如である。この場合、二つ以上の事象が重なるかも知れず、かつ、互いに識別できないかも知れない。具体的には、二つ以上の粒子が多かれ少なかれ同時に測定ゾーンを通過し、したがって一緒になって相互作用するかも知れず、このことは、測定されるインピーダンスにも影響を与える。計数される粒子の数が大幅に増加すると、これらの同時計数は次第に頻繁になり、かつ、検知はセンサの分解能により制限されるかも知れない。
【０００４】
非常に多数の事象の存在下では、同時計数は、測定される信号がもはや閾値レベルをほとんど下回らなくなるようなものになる。したがって、特定の数を超えると、事象の頻度の増加は、計数の減少になる。戻されることに起因するこの飽和効果により完全に歪められる測定値を防止するために、センサの占有時間のような指標に基づく警報システムが、センサの飽和の存在を示すために提供される。
【０００５】
同時計数のために検知されない事象を補償するために、占有時間の測定に基づく計数の補正が可能である。
【０００６】
同時計数の補正または線形化は、計数される事象から実際の事象の数を外挿法により推定することからなる。この外挿法の影響は、事象の数とともに増大し、計数の不確実性を増大させる結果となる。
【０００７】
線形化の方法は、外挿法に基づく。それらはしたがって、実装するのが複雑であり、製造されるそれぞれの機械に特別な較正を必要とし、かつ、検証の問題をもたらす。
【０００８】
計数される事象の数を実質的に補正する必要性は、計数される粒子の数とともに増大し、この結果、実行される測定における不確実性を増大させる。センサが飽和している場合、結果における不確実性が高すぎて補正することができない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、状況の改善を目標とする。この目標を達成するために、本発明は、粒子計数装置を提供し、当該粒子計数装置は、検知器を含み、該検知器は、一つ以上の粒子の通過に応答して電気測定信号を生成するように配置されており、かつ、当該粒子計数装置は、比較器を含み、該比較器は、測定信号を閾値信号と比較し、かつ、測定信号が閾値信号を超えると計数値を増加させるように配置されている。この装置は、閾値調節回路を含み、該閾値調節回路は、測定信号に対して低域通過フィルタを適用し、かつ、結果として生じる信号を閾値信号として用いるために比較器に接続される。
【００１０】
この装置は、閾値信号が検知される信号の関数として移動することができるので、有利である。したがって、検知される信号が多くの通過の検知により増大すると、検知閾値もまた増大する。このことは、当該装置の分解能を改善し、かつ、数が分からなくなることを少なくする。
【００１１】
種々の特定の実施形態では、当該装置は、次の特徴のうちの一つまたは多数の組み合わせを有していてもよい：
−  比較器および調節回路は、アナログ的に製造され、調節回路は、直列に取り付けられる抵抗器とキャパシタとを含み、かつ、比較器は、比較器（コンパレータ）モードとなっている演算増幅器であり、その一方の入力は、測定信号を受信し、かつ、その他方の入力は、抵抗器とキャパシタとの間で調節回路に接続される；
−  比較器は、少なくとも二つのヒステリシス抵抗器の間に取り付けられる；
−  当該装置はさらに、測定信号をデジタル化するためのアナログ−デジタル変換器を含み、かつ、比較器および閾値調節回路は、デジタル形式で製造される；
−  閾値調節回路は、次数１の有限インパルス応答フィルタである；
−  当該装置はさらに、閾値信号が最小値であることを確実にする回路を含む；
−  当該装置は、その出力とその正の入力との間にフォロアモードで取り付けられる演算増幅器と、その負の入力に接続される電圧源と、演算増幅器の出力と閾値調節回路との間のダイオードとを含む；
−  当該装置はさらに、トリガ回路を含み、該トリガ回路は、比較器モードで取り付けられる演算増幅器を含み、その一方の入力は、測定信号を受信し、かつ、その他方の入力は、電圧源に接続される；ならびに
−  測定信号は、コールター原理により生成され、かつ、低域通過フィルタのカットオフ周波数は、２００Ｈｚより低い。
【００１２】
本発明はまた、次の工程を含む粒子計数方法を提案する：
ａ）検知器による一つ以上の粒子の通過の検知に応答して測定信号を生成すること；
ｂ）工程ａ）において生成される信号に対して選択される周波数の低域通過フィルタを適用することにより移動閾値信号を生成すること；および
ｃ）測定信号と移動閾値信号とを比較し、かつ、測定信号が選択される量だけ移動閾値信号を超えると粒子の検知を示す信号を放出すること。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点は、図面から引き出される、説明のために与えられる非限定的な実施例から引き出される次の説明を読めば、より明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明による装置の一部の模式図を示す。
【図２】図２は、図１の要素の回路図を示す。
【図３】図３は、図２の変形の回路図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の図面および説明は、大部分について、特定の特徴の要素を含む。それらはしたがって、本発明をよりよく理解するのに役立つだけでなく、適切な場合にはその定義に貢献することもあるであろう。
【００１６】
図１は、本発明による計数装置２を示す。当該装置２は、以下において、血液細胞を計数するために、血液学的試料の形をとる流体の検査（または分析）用に設けられたものと考えられる。しかしながら、本発明は、このタイプの流体にも、インピーダンスに基づく計数にも限定されない。具体的には、それはあらゆるタイプの流体に関し、あらゆるタイプのフローカウンターに関し、特にフローサイトメータに関する。それはまた、ビーズまたはあらゆる他の粒子を計数するために用いられることもあるであろう。
【００１７】
図１で説明されるように、本発明の装置２はまず、例えば特許文献ＦＲ  ２  ６５３  ８８５において説明される測定キュベットのような、流体力学的に集束するタイプの測定キュベット４を含む。当該装置が流体力学的に集束するタイプのものでなくてもよいことは、理解されるであろう。
【００１８】
簡略化のために、そのようなキュベット４は、内壁を含み、該内壁内には集束ノズル６が配置され、該集束ノズル６は、概してサファイアでできており、かつ、較正されるオリフィスを規定し、本明細書で説明される実施例では６０μｍの直径である。壁は内部ハウジング８を規定し、該内部ハウジング８内には毛細管（図示せず）が配置され、かつ、その端部はノズル６に直面してそこから少し距離を置いて配置される。この毛細管は、ノズル６の上流に検査される流体を移動させることを意図しており、それがそこに毛細管の周囲の前記内部ハウジング８を通って流れる二次的なシース流体によりプライマリーフロー（主流）１０の形で運ばれることを許容する。
【００１９】
この実施形態は、いわゆる測定領域またはゾーンに注入される血液細胞を含む試料が流体力学的にシースされることを許容する。ノズル６を有する図１は、この測定ゾーンと同じ高さにある当該装置のクローズアップである。本明細書で説明される実施例では、分析されるプライマリーフロー１０は、準備された血液であり、該準備された血液は、図１において矢印により示される方向にチャネル２を通って流れる。
【００２０】
検知器１２は、ノズル６と同じ高さにあるキュベット４に接続され、かつ、電流源を含み、電流がノズル６を通過するようになっている。細胞の不存在化では、プライマリーフロー１０およびシース流体は、ノズル６の両側に配置される二つの電極９により測定される負荷インピーダンスを規定する。プライマリーフロー１０が血液細胞を含むと、後者はインピーダンスの増大につながる。このインピーダンスの変動は、一方で細胞の体積が判定されることを許容し（定性測定）、かつ、他方で細胞計数がなされることを許容する（定量測定）。検知器１２はしたがって、一つ以上の粒子の通過に応答して電気信号を生成する検知器を形成する。検知器１２は、電子回路１４により利用可能な測定信号を生成するために、増幅器とフィルタとを含んでいてもよい。
【００２１】
検知器１２は、電子回路１４に対して、ノズル６と同じ高さで測定されるインピーダンスを反映する電気信号を送信する。電子回路１４の役割は、検知器１２により送信される信号に基づいて細胞測定を実行することである。
【００２２】
電子回路１４は、図２を参照してここで説明されるであろう。
【００２３】
電子回路１４は、二つの部分を含む：
−  抵抗器５２とキャパシタ５４とを含む閾値調節回路５０；および
−  比較器５６。
【００２４】
直列に配置される抵抗器５２とキャパシタ５４とからなる閾値調節回路５０は、低域通過フィルタを形成する。それは、抵抗器５２の側で検知器１２に、かつ、キャパシタ５４の側でグラウンドに、直接接続される。本明細書で説明される実施例では、抵抗器５２は、６ｋΩの抵抗を有し、かつ、キャパシタ５４は、１ｎＦの静電容量を有し、すなわち、カットオフ周波数は、１６６．６７Ｈｚである。カットオフ周波数の値は、同時通過の分解能およびノイズに対するイミュニティならびに流体力学的集束のないフロー測定の場合の縁の通過による変形のような他の影響の間の妥協点を取得するために計算される。出願人により実行された試験は、ＲＣの値の１０％の変動が計数される細胞の数の０．６％の変動という結果、したがって市販部品に対する高い耐性をもたらすことを示した。
【００２５】
本明細書で説明される実施例では、比較器５６は、Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（登録商標）により販売されるＴＬＥ２０７１演算増幅器である。比較器５６の負の入力は、抵抗器５２とキャパシタ５４との間で調節回路５０に接続される。閾値調節回路５０についての研究は、比較器５６の負の出力についての電圧Ｓ（ｔ）が次の関係性により検知器１２により生成される測定信号Ｍ（ｔ）に関連することを示した：
【００２６】
【化１】
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【００２７】
または、離散的に：
【００２８】
【化２】
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【００２９】
演算増幅器はしたがって、比較器モードで取り付けられ、検知器１２により生成される測定信号Ｍ（ｔ）が閾値調節回路５０により生成される閾値信号Ｓ（ｔ）より高ければ、それがその出力について正の電圧を放出し、そうでなければ０であるようになっている。
【００３０】
この電子配置のおかげで、移動閾値信号は、測定信号の値に「従う」。したがって、複数の細胞がノズル６の出口を同時に通過する場合、たとえ測定信号の増加が伴っても閾値信号は測定信号に近いままであるので、当該装置は、検知を妨げることなく優れた分解能を維持する。
【００３１】
上記では、定量測定がなされることを許容するフローサイトメトリー装置が説明された。図３は、図２の実施形態より洗練されており、かつ、例えばさらに定性測定が実行されることを許容する粒子計数装置において用いられてもよい変形の実施形態を示す。
【００３２】
電子回路１４は、この実施形態では、四つの部分を含む：
−  抵抗器５２とキャパシタ５４とを含む閾値調節回路５０；
−  移動閾値計数のための、二つの抵抗器５８および６０により囲まれる比較器５６；
−  定性測定のための、二つの抵抗器６４および６６により囲まれる比較器６２；ならびに
−  ダイオード７０と電圧源７２とに連結される比較器６８。
【００３３】
抵抗器５２とキャパシタ５４とを含む閾値調節回路５０（抵抗器とキャパシタは直列に配置される）は、低域通過フィルタを形成する。それは、抵抗器５２の側で検知器１２に、かつ、キャパシタ５４の側でグラウンドに、直接接続される。図２の実施形態では、抵抗器５２は、６ｋΩの抵抗を有し、かつ、キャパシタ５４は、１ｎＦの静電容量を有し、すなわち、カットオフ周波数は、１６６．６７Ｈｚである。
【００３４】
比較器５６の出力は、その正の出力にループバックし、かつ、抵抗器６４は、一方でこの正の出力に、かつ、他方で検知器１２に接続される。抵抗器６６は、ループ内で直列に接続される。比較器５６の負の入力は、抵抗器５２とキャパシタ５４との間で閾値調節回路５０に接続される。
【００３５】
本明細書で説明される実施例では、抵抗器６４は、２２ｋΩの抵抗を有し、かつ、抵抗器６６は、１ＭΩの抵抗を有する。抵抗器６４および６６は一緒になって、５Ｖに限定される出力電圧について本明細書で説明される実施例における比較器５６について１１０ｍＶのヒステリシスを設定する。信号が固定閾値または移動閾値を横断すると、このヒステリシスはノイズに対するイミュニティを許容する。
【００３６】
本明細書で説明される実施例では、比較器６２は、比較器５６と同一であり、かつ、抵抗器６４および６６は、抵抗器５８および６０と同一である。比較器６２の正の入力が検知器１２の測定信号を受信する一方で、負の入力は電圧源７２に接続される。比較器６２が比較器モードで取り付けられると、測定信号が電圧源７２の値より高ければ、それは正の出力電圧を放出し、そうでなければ０である。したがって、比較器６２の出力は、検知器１２が細胞の通過を検知するときに、検知器１２により放出される信号に基づく定性測定を実行するために用いられてもよく、または下流の測定のための光源のトリガを制御するためにさえ用いられてもよい。
【００３７】
本明細書で説明される実施例では、比較器６８は比較器５６と同一であり、かつ、その出力はダイオード７０に接続され、該ダイオード７０は比較器５６の正の入力に接続される一方で、電圧源６８は比較器６８の負の入力に接続される。ダイオード７０は、電流を比較器６８からのみ通過させるために取り付けられ、かつ、抵抗器５２とキャパシタ５４との間で閾値調節回路５０に接続される。したがって、この部分は、閾値信号Ｓ（ｔ）が電圧源７２により設定される値を下回ることができないことを確実にする。実施例では、この値は、従来の計数または定性測定をトリガするための固定閾値電圧のものである。
【００３８】
図２および３において説明される二つの実施形態は、組み合わせられ得る。したがって、閾値信号の値が固定閾値のものより高いことを補償することを意図した部分およびヒステリシス抵抗器はやはり、図２における実施形態において別々にまたは一緒に含まれ得；同様に、それらは図３の実施形態から一緒にまたは別々に除外され得る。
【００３９】
上記では、電子回路１４は、アナログ装置として説明された。変形として、当該装置は、検知器１２から測定信号を受信するアナログ−デジタル変換器を含んでいてもよく、調節回路５０はそのとき、次数１のデジタル有限インパルス応答フィルタと、測定信号とフィルタにより出力される閾値信号とのデジタル比較器とからなる。
【００４０】
このタイプのフィルタは、次の方程式に従う：
【００４１】
【化３】
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【００４２】
必要なリソースを減少させるために、デジタルフィルタの計数ｋは、２の累乗またはその逆数から選択される。したがって、掛け算は、左または右への論理シフトにより達成される。この方法は、フィルタのカットオフ周波数の可能な値を限定するが、実装が容易であるという利点を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
2018513373.tif 000009
2018513373.tif 000010
2018513373.tif 000011
2018513373.tif 000012
2018513373.tif 000013
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