(57)【要約】  本開示は、組織試料内のＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、及びＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞を同定するための、自動化方法を含む多重アッセイ、キット及び方法に関する。【選択図】図１Ａ
2018536163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の一次抗体；
（ｂ）少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な第二の一次抗体；
（ｃ）第一の検出試薬セットであって、
（ｃ１）第一の酵素；
（ｃ２）第一の一次抗体が組織試料に結合している間に、第一の一次抗体に近接して組織試料上に第一の酵素を沈着させるように適合された試薬セット；及び
（ｃ３）第一の酵素に近接して試料上に第一の色素を沈着させる、第一の酵素と反応性の基質
を含む試薬セット；及び
（ｄ）第二の検出試薬セットであって、
（ｄ１）第二の酵素；
（ｄ２）第二の一次抗体が組織試料に結合している間に、第二の一次抗体に近接して組織試料上に第二の酵素を沈着させるように適合された試薬セット；及び
（ｄ３）第一の酵素に近接して試料上に第二の色素を沈着させる、第二の酵素と反応性の基質
を含む試薬セットを含み、第一の色素と第二の色素が異なり、第一の色素と第二の色素がそれぞれ、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、及びローダミン１１０（ローダミン）からなる群から選択される、キット。
【請求項２】
（ａ）第一の一次抗体が第一のハプテンにコンジュゲートされ、かつ
（ｃ２）第一の酵素を沈着させるように適合された試薬セットが、第一のハプテンと反応性の抗体を含み、第一のハプテンと反応性の抗体が第一の酵素にコンジュゲートされ；
かつ／又は
（ｂ）第二の一次抗体が第二のハプテンにコンジュゲートされ、かつ
（ｃ２）第二の酵素を沈着させるように適合された試薬セットが、第二のハプテンと反応性の抗体を含み、第二のハプテンと反応性の抗体が第二の酵素にコンジュゲートされる、
請求項１に記載のキット。
【請求項３】
（ｃ２）第一の酵素を沈着させるように適合された試薬セットが、第一の一次抗体のＩｇ種に特異的な抗種抗体を含み、第一の一次抗体のＩｇ種に特異的な抗種抗体が第一の酵素にコンジュゲートされ；かつ／又は
（ｄ２）第二の酵素を沈着させるように適合された試薬セットが、第二の一次抗体のＩｇ種に特異的な抗種抗体を含み、第二の一次抗体のＩｇ種に特異的な抗種抗体が第二の酵素にコンジュゲートされる、
請求項１に記載のキット。
【請求項４】
（ｃ２）第一の酵素を沈着させるように適合された試薬セットが、第一の一次抗体に特異的な第一の二次抗体を含み、前記第一の二次抗体が第一の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、更に第一の酵素が第一の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートされ；かつ／又は
（ｄ２）第二の酵素を沈着させるように適合された試薬セットが、第二の一次抗体に特異的な第二の二次抗体を含み、前記第二の二次抗体が第二の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、更に第二の酵素が第二の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートされる、
請求項１に記載のキット。
【請求項５】
（ｃ２）第一の特異的結合対の第一のメンバーがビオチンであり、第一の特異的結合対の第二のメンバーがビオチン結合タンパク質であり；かつ／又は
（ｄ２）第二の特異的結合対の第一のメンバーがビオチンであり、第二の特異的結合対の第二のメンバーがビオチン結合タンパク質である、
請求項４に記載のキット。
【請求項６】
ビオチン結合タンパク質が、アビジン、アビジン誘導体、及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
（ｃ）第一の特異的結合対の第一のメンバーがハプテンであり、第一の特異的結合対の第二のメンバーが抗ハプテン抗体であり；かつ／又は
（ｄ）第二の特異的結合対の第一のメンバーがハプテンであり、第二の特異的結合対の第二のメンバーが抗ハプテン抗体である、
請求項４に記載のキット。
【請求項８】
（ｃ１）第一の酵素が第一の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、かつ
（ｃ２）第一の酵素を沈着させるように適合された試薬セットが、
（ｃ２ａ）第一の一次抗体に特異的な第一の二次抗体であって、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素にコンジュゲートされた第一の二次抗体；
（ｃ２ｂ）第一の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートされたチラミド；及び
（ｃ２ｃ）過酸化水素溶液
を含み；
かつ／又は
（ｄ１）第二の酵素が第二の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、かつ
（ｄ２）第二の酵素を沈着させるように適合された試薬セットが、
（ｄ２ａ）第二の一次抗体に特異的な第二の二次抗体であって、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素にコンジュゲートされた第二の二次抗体；
（ｄ２ｂ）第二の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートされたチラミド；及び
（ｄ２ｃ）過酸化水素溶液
を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
（ｃ１）第一の特異的結合対の第一のメンバーがビオチン結合タンパク質であり；かつ
（ｃ２ｂ）第一の特異的結合対の第二のメンバーがビオチンであり；
かつ／又は
（ｄ１）第二の特異的結合対の第一のメンバーがビオチン結合タンパク質であり；かつ
（ｄ２ｂ）第二の特異的結合対の第二のメンバーがビオチンである、
請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ビオチン結合タンパク質が、アビジン、アビジン誘導体（例えば、ニュートラアビジン）、及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
（ｃ１）第一の特異的結合対の第一のメンバーが抗ハプテン抗体であり、かつ
（ｃ２ｂ）第一の特異的結合対の第二のメンバーがハプテンであり；
かつ／又は
（ｄ１）第二の特異的結合対の第一のメンバーが抗ハプテン抗体であり、かつ
（ｃ２ｂ）第二の特異的結合対の第二のメンバーがハプテンである、
請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
第一の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルであり、第二の色素がＤＡＢであるか、又は第一の色素がＤＡＢであり、第二の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルである、請求項１から１１の何れかに記載のキット。
【請求項１３】
第一の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルであり、第二の色素がＤＡＢＳＹＬであるか、又は第一の色素がＤＡＢＳＹＬであり、第二の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルである、請求項１から１１の何れかに記載のキット。
【請求項１４】
少なくとも一つの免疫細胞マーカーが、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６３及びＣＤ４５ＬＣＡからなる群から選択される、請求項１から１３の何れかに記載のキット。
【請求項１５】
免疫細胞マーカーがＣＤ８又はＣＤ４５ＬＣＡである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の一次抗体がＳＰ１４２又はＳＰ２６３である、請求項１から１５の何れかに記載のキット。
【請求項１７】
第二の一次抗体が抗ＣＤ４５ＬＣＡ抗体（ＲＰ２／１８）又は抗ＣＤ８（ＳＰ２３９）である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
第二の一次抗体がＣＤ８に特異的であり、第一の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルであり、第二の色素がＤＡＢＳＹＬである、請求項１から１１の何れかに記載のキット。
【請求項１９】
ＰＤ−Ｌ１以外の腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの他の検出プローブと少なくとも一つの他の検出プローブを検出するための検出試薬とを更に含む、請求項１から１８の何れかに記載のキット。
【請求項２０】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも一つの他の検出プローブを更に含む、請求項１から１９の何れかに記載のキット。
【請求項２１】
第一の酵素及び／又は第二の酵素を不活性化する成分を更に含む、請求項１から２０の何れかに記載のキット。
【請求項２２】
第一の一次抗体及び／又は第二の一次抗体が結合している組織試料から第一の一次抗体及び／又は第二の一次抗体を溶出させるための成分を更に含む、請求項１から２１の何れかに記載のキット。
【請求項２３】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍における腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞を同定する方法であって、
組織試料によって発現されたＰＤ−Ｌ１タンパク質に近接して組織試料への抗体の結合をもたらすように、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的な第一の一次抗体に組織試料を接触させる工程；
組織試料に結合した第一の一次抗体に近接して第一の酵素を沈着させる工程；
第一の酵素を第一の基質と反応させて、第一の一次抗体に近接して組織試料上に第一の色素の沈着をもたらす工程であって、第一の色素が、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、及びローダミン１１０（ローダミン）からなる群から選択される工程；
組織試料によって発現された免疫細胞マーカータンパク質に近接して組織試料への抗体の結合をもたらすように、少なくとも一つの免疫細胞マーカータンパク質に特異的な第二の一次抗体に組織試料を接触させる工程；
組織試料に結合した第二の一次抗体に近接して第二の酵素を沈着させる工程；
第二の酵素を第二の基質と反応させて、第二の一次抗体に近接して組織試料上に第二の色素の沈着をもたらす工程であって、第二の色素は第一の色素とは異なり、更に第二の色素は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、及びローダミン１１０（ローダミン）からなる群から選択される工程
を含む、方法。
【請求項２４】
腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞が、ＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つの免疫細胞マーカーとを共発現する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第一の一次抗体がＳＰ１４２又はＳＰ２６３である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
免疫細胞マーカーが、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６３及びＣＤ４５ＬＣＡからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
免疫細胞マーカーがＣＤ４５ＬＣＡ又はＣＤ８である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第二の一次抗体が抗ＣＤ４５ＬＣＡ抗体（ＲＰ２／１８）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第一の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルであり、第二の色素がＤＡＢであるか、又は第一の色素がＤＡＢであり、第二の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
第一の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルであり、第二の色素がＤＡＢＳＹＬであるか、又は第一の色素がＤＡＢＳＹＬであり、第二の染料がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
第一の一次抗体が第一のハプテンにコンジュゲートされ、第一の酵素が第一の二次抗体にコンジュゲートされ、第一の二次抗体が第一のハプテンに特異的であり、第一の二次抗体の第一のハプテンへの結合をもたらすのに十分な条件下で組織試料を第一の二次抗体と接触させることにより、第一の酵素が組織試料に沈着され；
かつ／又は
第二の一次抗体が第二のハプテンにコンジュゲートされ、第二の酵素が第二の二次抗体にコンジュゲートされ、第二の二次抗体が第二のハプテンに特異的であり、第二の二次抗体の第二のハプテンへの結合をもたらすのに十分な条件下で組織試料を第二の二次抗体と接触させることにより、第二の酵素が組織試料に沈着される、
請求項２３から３０の何れかに記載の方法。
【請求項３２】
第一の酵素は、第一の一次抗体のＩｇ種に特異的な第一の二次抗体にコンジュゲートされ、第一の酵素は、第一の二次抗体の第一の一次抗体への結合をもたらすのに十分な条件下で第一の二次抗体に組織試料を接触させることにより組織試料上に沈着され；
かつ／又は
第二の酵素は、第二の一次抗体のＩｇ種に特異的な第二の二次抗体にコンジュゲートされ、第二の酵素は、第二の二次抗体の第一の一次抗体への結合をもたらすのに十分な条件下で第二の二次抗体に組織試料を接触させることにより組織試料上に沈着される、
請求項２３から３０の何れかに記載の方法。
【請求項３３】
第一の酵素が、
第一の一次抗体に特異的な第一の二次抗体に組織試料を接触させる工程であって、第一の二次抗体が第一の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされる工程、及び
第一の酵素に組織試料を接触させる工程であって、第一の酵素が第一の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートされ、組織試料は第一の結合対の第一のメンバーと第一の結合対の第二のメンバーとの間の結合をもたらすのに十分な条件下で第一の酵素に接触される工程
によって組織試料上に沈着され；
かつ／又は
第二の酵素が、
第二の一次抗体に特異的な第二の二次抗体に組織試料を接触させる工程であって、第二の二次抗体が第二の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされる工程、及び
第二の酵素に組織試料を接触させる工程であって、第二の酵素が第二の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートされ、組織試料は第二の結合対の第一のメンバーと第二の結合対の第二のメンバーとの間の結合をもたらすのに十分な条件下で第二の酵素に接触される工程
によって組織試料上に沈着される、
請求項２３から３０の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
第一の特異的結合対の第一のメンバーがビオチンであり、第一の特異的結合対の第二のメンバーがビオチン結合タンパク質であり；かつ／又は
第二の特異的結合対の第一のメンバーがビオチンであり、第二の特異的結合対の第二のメンバーがビオチン結合タンパク質である、
請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ビオチン結合タンパク質が、アビジン、アビジン誘導体（例えばニュートラアビジン）、及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
第一の特異的結合対の第一のメンバーがハプテンであり、第一の特異的結合対の第二のメンバーが抗ハプテン抗体であり；かつ／又は
第二の特異的結合対の第一のメンバーがハプテンであり、第二の特異的結合対の第二のメンバーが抗ハプテン抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
第一の酵素が第一の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、第一の酵素が、
第一の一次抗体に特異的な第一の二次抗体に組織試料を接触させる工程であって、第一の二次抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）にコンジュゲートされる工程；
第一の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートしたチラミドに組織試料を接触させ、第一の一次抗体に近接して組織試料上にチラミドを沈着させるのに十分な条件下でチラミドを第一の二次抗体のＨＲＰと反応させる工程；及び
第一の結合対の第一のメンバーと第一の結合対の第二のメンバーとの間に結合をもたらすのに十分な条件下で第一の酵素に組織試料を接触させる工程
によって組織試料上に沈着され；
かつ／又は
第二の酵素が第二の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、第二の酵素が、
第二の一次抗体に特異的な第二の二次抗体に組織試料を接触させる工程であって、第二の二次抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）にコンジュゲートされる工程；
第二の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートしたチラミドに組織試料を接触させ、第一の一次抗体に近接して組織試料上にチラミドを沈着させるのに十分な条件下でチラミドを第二の二次抗体のＨＲＰと反応させる工程；及び
第二の結合対の第一のメンバーと第二の結合対の第二のメンバーとの間に結合をもたらすのに十分な条件下で第二の酵素に組織試料を接触させる工程
によって組織試料上に沈着される、
請求項２３から３０の何れかに記載の方法。
【請求項３８】
第一の特異的結合対の第一のメンバーがビオチン結合タンパク質であり、第一の特異的結合対の第二のメンバーがビオチンであり；かつ／又は
第二の特異的結合対の第一のメンバーがビオチン結合タンパク質であり、第二の特異的結合対の第二のメンバーがビオチンである、
請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ビオチン結合タンパク質が、アビジン、アビジン誘導体（例えばニュートラアビジン）、及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第一の特異的結合対の第一のメンバーが抗ハプテン抗体であり、第一の特異的結合対の第二のメンバーがハプテンであり；かつ／又は
第二の特異的結合対の第一のメンバーが抗ハプテン抗体であり、第二の特異的結合対の第二のメンバーがハプテンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ＰＤ−Ｌ１以外の腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの他の検出プローブに組織試料を接触させる工程を更に含む、請求項２３から３０の何れかに記載の方法。
【請求項４２】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも一つの他の検出プローブに組織試料を接触させる工程を更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２２から４１の何れかに記載の方法に従って、腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞を検出する工程；
腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数を定量する工程；及び
腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数を、ＰＤ−１軸標的療法に対する腫瘍の応答と相関させる工程
によって、ＰＤ−１軸標的療法に対する応答を予測する方法。
【請求項４４】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数を定量し、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数と腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数を相関させることを更に含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍を有する患者を治療する方法であって、
請求項２３から４２の何れかに記載の方法に従って、ＰＤ−１軸標的療法に対する腫瘍の応答を予測する工程；及び
腫瘍がＰＤ−１標的療法に応答すると予測される場合、ＰＤ−１軸標的療法を患者に施す工程を含む、方法。
【請求項４６】
ＰＤ−１軸標的療法が、アテゾリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びピディリズマブ、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４３から４５の何れかに記載の方法。
【請求項４７】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍における腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞を同定するためのシステムにおいて、
（ａ）組織試料によって発現されるＰＤ−Ｌ１タンパク質に近接して組織試料上に第一の色素を沈着させるための手段であって、第一の色素がジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、及びローダミン１１０（ローダミン）からなる群から選択される手段；及び
（ｂ）組織試料によって発現される免疫細胞マーカータンパク質に近接して組織試料上に第二の色素を沈着させるための手段であって、第二の色素が第一の色素とは異なり、かつ第二の色素がジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、及びローダミン１１０（ローダミン）からなる群から選択される手段
を備える、システム。
【請求項４８】
（ａ）第一の色素を沈着させるための手段が、
（ａ１）ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の一次抗体；及び
（ａ２）第一の検出試薬セットであって、
（ａ２ａ）第一の酵素；
（ａ２ｂ）第一の一次抗体が組織試料に結合している間に、第一の一次抗体に近接して組織試料上に第一の酵素を沈着させるように適合された試薬セット；及び
（ａ２ｃ）第一の酵素に近接して組織試料上に第一の色素を沈着させる第一の酵素と反応性の基質
を含む検出試薬セット
を含み；及び
（ｂ）第二の色素を沈着させるための手段が、
（ｂ１）免疫細胞マーカータンパク質に特異的な第二の一次抗体；及び
（ｂ２）第二の検出試薬セットであって、
（ｂ２ａ）第二の酵素；
（ｂ２ｂ）第一の一次抗体が組織試料に結合している間に、第二の一次抗体に近接して組織試料上に第二の酵素を沈着させるように適合された試薬セット；及び
（ｂ２ｃ）第二の酵素に近接して組織試料上に第二の色素を沈着させる第二の酵素と反応性の基質
を含む検出試薬セット
を含む、請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
（ａ１）第一の一次抗体が第一のハプテンにコンジュゲートされ、かつ
（ａ２ｂ）第一の酵素を沈着させるように適合した試薬セットが、第一のハプテンと反応性の抗体を含み、第一のハプテンと反応性の抗体が第一の酵素にコンジュゲートされ；
かつ／又は
（ｂ１）第二の一次抗体が第二のハプテンにコンジュゲートされ、かつ
（ｂ２ｂ）第二の酵素を沈着させるように適合した試薬セットが、第二のハプテンと反応性の抗体を含み、第二のハプテンと反応性の抗体が第二の酵素にコンジュゲートされる、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５０】
（ａ２ｂ）第一の酵素を沈着させるように適合した試薬セットが、第一の一次抗体のＩｇ種に特異的な抗種抗体を含み、第一の一次抗体のＩｇ種に特異的な抗種抗体は第一の酵素にコンジュゲートされ；かつ／又は
（ｂ２ｂ）第二の酵素を沈着させるように適合した試薬セットが、第二の一次抗体のＩｇ種に特異的な抗種抗体を含み、第二の一次抗体のＩｇ種に特異的な抗種抗体は第二の酵素にコンジュゲートされる、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５１】
（ａ２ｂ）第一の酵素を沈着させるように適合した試薬セットが、第一の一次抗体に特異的な第一の二次抗体を含み、前記第一の二次抗体は第一の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、更に第一の酵素は第一の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートされ；かつ／又は
（ｂ２ｂ）第二の酵素を沈着させるように適合た試薬セットが、第二の一次抗体に特異的な第二の二次抗体を含み、前記第二の二次抗体は第二の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、更に第二の酵素は第二の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートされる、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５２】
（ａ２ｂ）第一の特異的結合対の第一のメンバーがビオチンであり、第一の特異的結合対の第二のメンバーがビオチン結合タンパク質であり；かつ／又は
（ｂ２ｂ）第二の特異的結合対の第一のメンバーがビオチンであり、第二の特異的結合対の第二のメンバーがビオチン結合タンパク質である、
請求項５１に記載のシステム。
【請求項５３】
ビオチン結合タンパク質が、アビジン、アビジン誘導体（例えばニュートラアビジン）、及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５４】
（ａ２ｂ）第一の特異的結合対の第一のメンバーがハプテンであり、第一の特異的結合対の第二のメンバーが抗ハプテン抗体であり；かつ／又は
（ｂ２ｂ）第二の特異的結合対の第一のメンバーがハプテンであり、第二の特異的結合対の第二のメンバーが抗ハプテン抗体である、請求項５１に記載のシステム。
【請求項５５】
（ａ２ａ）第一の酵素が第一の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、かつ
（ａ２ｂ）第一の酵素を沈着させるように適合した試薬セットが、
（ａ２ｂ１）第一の一次抗体に特異的な第一の二次抗体であって、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素にコンジュゲートした第一の二次抗体；
（ａ２ｂ２）第一の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートしたチラミド；及び
（ａ２ｂ３）過酸化水素溶液
を含み；
かつ／又は
（ｂ２ａ）第二の酵素が第二の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、かつ
（ｂ２ｂ）第二の酵素を沈着させるように適合した試薬セットが、
（ｂ２ｂ１）第二の一次抗体に特異的な第二の二次抗体であって、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素にコンジュゲートした第二の二次抗体；
（ｂ２ｂ２）第二の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートしたチラミド；
及び
（ｂ２ｂ３）過酸化水素溶液
を含む、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５６】
（ａ２ａ）第一の特異的結合対の第一のメンバーがビオチン結合タンパク質であり、
（ａ２ｂ２）第一の特異的結合対の第二のメンバーがビオチンであり；
かつ／又は
（ｂ２ａ）第二の特異的結合対の第一のメンバーがビオチン結合タンパク質であり、
（ｂ２ｂ２）第二の特異的結合対の第二のメンバーがビオチンである、
請求項５５に記載のシステム。
【請求項５７】
ビオチン結合タンパク質が、アビジン、アビジン誘導体（例えばニュートラアビジン）、及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項５６に記載のシステム。
【請求項５８】
（ａ２ａ）第一の特異的結合対の第一のメンバーが抗ハプテン抗体であり、
（ａ２ｂ２）第一の特異的結合対の第二のメンバーがハプテンであり；
かつ／又は
（ｂ２ａ）第二の特異的結合対の第一のメンバーが抗ハプテン抗体であり、
（ｂ２ｂ２）第二の特異的結合対の第二のメンバーがハプテンである、
請求項５６に記載のシステム。
【請求項５９】
第一の色素及び第二の色素を沈着させるための手段が、自動スライド染色装置を含む、請求項４７に記載のシステム。
【請求項６０】
自動スライド染色装置が、
組織試料によって発現されたＰＤ−Ｌ１タンパク質に近接して組織試料への抗体の結合をもたらすように、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的な第一の一次抗体に組織試料を接触させ；
組織試料に結合した第一の一次抗体に近接して第一の酵素を沈着させ；
第一の酵素を第一の基質と反応させて、第一の一次抗体に近接して組織試料上に第一の色素の沈着をもたらすのに十分な条件下で、組織試料上に第一の基質を沈着させ；
組織試料によって発現された免疫細胞マーカータンパク質に近接して組織試料への抗体の結合をもたらすように、免疫細胞マーカータンパク質に特異的な第二の一次抗体に組織試料を接触させ；
組織試料に結合した第二の一次抗体に近接して第二の酵素を沈着させ；
第二の酵素を第二の基質と反応させて、第二の一次抗体に近接して組織試料上に第二の色素の沈着をもたらすのに十分な条件下で、組織試料上に第二の基質を沈着させる
ようにプログラムされた、請求項５９に記載のシステム。
【請求項６１】
第一の一次抗体が第一のハプテンにコンジュゲートされ、第一の酵素が第一の二次抗体にコンジュゲートされ、第一の二次抗体は第一のハプテンに特異的であり、自動スライド染色装置が、第一のハプテンへの第一の二次抗体の結合をもたらすのに十分な条件下で組織試料を第一の二次抗体に接触させることによって組織試料上に第一の酵素を沈着させるようにプログラムされ；
かつ／又は
第二の一次抗体が第二のハプテンにコンジュゲートされ、第二の酵素が第二の二次抗体にコンジュゲートされ、第二の二次抗体は第二のハプテンに特異的であり、自動スライド染色装置が、第二のハプテンへの第二の二次抗体の結合をもたらすのに十分な条件下で組織試料を第二の二次抗体に接触させることによって組織試料上に第二の酵素を沈着させるようにプログラムされた、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６２】
第一の酵素が第一の一次抗体のＩｇ種に特異的な第一の二次抗体にコンジュゲートされ、自動スライド染色装置が、第一の二次抗体の第一の一次抗体への結合をもたらすのに十分な条件下で組織試料を第一の二次抗体と接触させることによって、組織試料上に第一の酵素を沈着させるようにプログラムされ；
かつ／又は
第二の酵素が第二の一次抗体のＩｇ種に特異的な第二の二次抗体にコンジュゲートされ、自動スライド染色装置が、第二の二次抗体の第一の一次抗体への結合をもたらすのに十分な条件下で組織試料を第二の二次抗体と接触させることによって、組織試料上に第二の酵素を沈着させるようにプログラムされた、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６３】
自動スライド染色装置が、
第一の一次抗体に特異的な第一の二次抗体に組織試料を接触させる工程であって、前記第一の二次抗体が第一の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされる工程、及び
第一の酵素に組織試料を接触させる工程であって、第一の酵素が第一の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートされ、第一の結合対の第一のメンバーと第一の結合対の第二のメンバーとの間の結合をもたらすのに十分な条件下で組織試料が第一の酵素と接触される工程
によって、第一の酵素を組織試料上に沈着させるようにプログラムされ、
かつ／又は
自動スライド染色装置が、
第二の一次抗体に特異的な第二の二次抗体に組織試料を接触させる工程であって、前記第二の二次抗体が第二の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされる工程、及び
第二の酵素に組織試料を接触させる工程であって、第二の酵素が第二の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートされ、第二の結合対の第一のメンバーと第二の結合対の第二のメンバーとの間の結合をもたらすのに十分な条件下で組織試料が第二の酵素と接触される工程
によって、第一の酵素を組織試料上に沈着させるようにプログラムされた、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６４】
第一の特異的結合対の第一のメンバーがビオチンであり、第一の特異的結合対の第二のメンバーがビオチン結合タンパク質であり；かつ／又は
第二の特異的結合対の第一のメンバーがビオチンであり、第二の特異的結合対の第二のメンバーがビオチン結合タンパク質である、
請求項６３に記載のシステム。
【請求項６５】
ビオチン結合タンパク質が、アビジン、アビジン誘導体（例えばニュートラアビジン）、及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６６】
第一の特異的結合対の第一のメンバーがハプテンであり、第一の特異的結合対の第二のメンバーが抗ハプテン抗体であり；かつ／又は
第二の特異的結合対の第一のメンバーがハプテンであり、第二の特異的結合対の第二のメンバーが抗ハプテン抗体である、請求項６３に記載のシステム。
【請求項６７】
第一の酵素が第一の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、自動スライド染色装置が、
第一の一次抗体に特異的な第一の二次抗体に組織試料を接触させる工程であって、第一の二次抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）にコンジュゲートされる工程；
第一の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートしたチラミドに組織試料を接触させ、第一の一次抗体に近接して組織試料上にチラミドを沈着させるのに十分な条件下でチラミドを第一の二次抗体のＨＲＰと反応させる工程；及び
第一の結合対の第一のメンバーと第一の結合対の第二のメンバーとの間に結合をもたらすのに十分な条件下で第一の酵素に組織試料を接触させる工程
によって第一の酵素を組織試料上に沈着させるようにプログラムされ；
かつ／又は
第二の酵素が第二の特異的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートされ、自動スライド染色装置が、
第二の一次抗体に特異的な第二の二次抗体に組織試料を接触させる工程であって、第二の二次抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）にコンジュゲートされる工程；
第二の特異的結合対の第二のメンバーにコンジュゲートしたチラミドに組織試料を接触させ、第一の一次抗体に近接して組織試料上にチラミドを沈着させるのに十分な条件下でチラミドを第二の二次抗体のＨＲＰと反応させる工程；及び
第二の結合対の第一のメンバーと第二の結合対の第二のメンバーとの間に結合をもたらすのに十分な条件下で第二の酵素に組織試料を接触させる工程
によって第二の酵素を組織試料上に沈着させるようにプログラムされた、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６８】
第一の特異的結合対の第一のメンバーがビオチン結合タンパク質であり、第一の特異的結合対の第二のメンバーがビオチンであり；
かつ／又は
第二の特異的結合対の第一のメンバーがビオチン結合タンパク質であり、第二の特異的結合対の第二のメンバーがビオチンである、
請求項６７に記載のシステム。
【請求項６９】
ビオチン結合タンパク質が、アビジン、アビジン誘導体（例えばニュートラアビジン）、及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項６８に記載のシステム。
【請求項７０】
第一の特異的結合対の第一のメンバーが抗ハプテン抗体であり、第一の特異的結合対の第二のメンバーがハプテンであり；
かつ／又は
第二の特異的結合対の第一のメンバーが抗ハプテン抗体であり、第二の特異的結合対の第二のメンバーがハプテンである、請求項６７に記載のシステム。
【請求項７１】
組織試料を画像化するための手段を更に備える、請求項４７から７０の何れかに記載のシステム。
【請求項７２】
組織試料を画像化するための手段が撮像装置を含む、請求項７１に記載のシステム。
【請求項７３】
撮像装置が、明視野イメージャスライドスキャナである、請求項７２に記載のシステム。
【請求項７４】
プロセッサとコンピュータ可読媒体と出力手段とを備えるコンピュータを更に備え、
撮像装置が、プロセッサに作動可能に接続され、第一の検出試薬からの第一のシグナルを検出し、第二の検出剤からの第二のシグナルを検出し、第一のシグナルを第一のシグナルデータに変換し、第二のシグナルを第二のシグナルデータに変換し、第一のシグナルデータ及び第二のシグナルデータをプロセッサに送信するように構成され、
コンピュータ可読媒体が、第一のシグナルデータ及び第二のシグナルデータに基づいて組織試料内の第一のシグナル及び第二のシグナルを定量し位置特定するためのプロセッサ実行可能命令を含む、請求項７３に記載のシステム。
【請求項７５】
プロセッサ実行可能命令が、第一及び第二のシグナルの数と位置を出力手段に出力するための命令を更に含む、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７６】
第一及び第二のシグナルの数及び位置に基づいて、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍における腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の（ｉ）存在もしくは非存在又は（ｉｉ）数を決定するスコア化手段を更に備える、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７７】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍における腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の存在又は非存在を同定する、出力手段へのレポートを作成することを更に含む、請求項７５に記載のシステム。
【請求項７８】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍における腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数を同定する、出力手段へのレポートを作成することを更に含む、請求項７５に記載のシステム。
【請求項７９】
第一の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルであり、第二の色素がＤＡＢであるか、又は第一の色素がＤＡＢであり、第二の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルである、請求項４７から７８の何れかに記載のシステム。
【請求項８０】
第一の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルであり、第二の色素がＤＡＢＳＹＬであるか、又は第一の色素がＤＡＢＳＹＬであり、第二の色素がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルである、請求項４７から７８の何れかに記載のシステム。
【請求項８１】
少なくとも一つの免疫細胞マーカーが、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６３及びＣＤ４５ＬＣＡからなる群から選択される、請求項４７から８０の何れかに記載のシステム。
【請求項８２】
腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の存在又は非存在についてＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織試料を分析することによってＰＤ−Ｌ１標的療法に対する応答を予測するためのシステムであって、
ＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つのＣＤマーカーとを共発現する免疫細胞を同定するための手段を備えるシステム。
【請求項８３】
ＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つのＣＤマーカーとを共発現する免疫細胞を同定するための手段が、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の一次抗体に腫瘍組織試料を接触させ；少なくとも一つのＣＤマーカーに特異的な第二の一次抗体に腫瘍組織試料を接触させるように構成された自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置を備える、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８４】
第一の一次抗体及び第二の一次抗体の腫瘍組織試料への結合を検出するための手段を更に備える、請求項８３に記載のシステム。
【請求項８５】
第一の一次抗体及び第二の一次抗体の腫瘍組織試料への結合を検出するための手段が、第一の一次抗体に結合することができる第一の検出プローブと第二の一次抗体に結合することができる第二の検出プローブとを含み、
第一の検出プローブが第一の基質を含み、第二の検出プローブが第二の基質を含む、請求項８４に記載のシステム。
【請求項８６】
腫瘍組織試料を画像化するための手段を更に備える、請求項８５に記載のシステム。
【請求項８７】
腫瘍組織試料を画像化するための手段が撮像装置を備える、請求項８５に記載のシステム。
【請求項８８】
撮像装置が明視野イメージャスライドスキャナである、請求項８６に記載のシステム。
【請求項８９】
第一の検出プローブ及び第二の検出プローブの存在又は数及び位置を決定するために、撮像装置からのデータをスコア化するための手段を更に備える、請求項８６に記載のシステム。
【請求項９０】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍における腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の存在又は非存在を同定するために、データをスコア化するための手段からレポートを受け取るように構成された出力手段を更に備える、請求項８９に記載のシステム。
【請求項９１】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍における腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の存在又は非存在からＰＤ−Ｌ１標的療法に対する応答を予測するレポートを作成することを更に含み、存在が正の応答の可能性を示し、非存在が負の応答を示す、請求項９０に記載のシステム。
【請求項９２】
ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞からＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞を区別するためのシステムであって、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の検出プローブに生物学的試料を接触させ；
（ｂ）第一の検出プローブに特異的に結合する第一の標識用コンジュゲートであって、第一の酵素を含む第一の標識用コンジュゲートに生物学的試料を接触させ；
（ｃ）第一の潜在的反応性部分と第一の検出可能部分とを含む第一のシグナル伝達コンジュゲートに生物学的試料を接触させ；
（ｄ）第一の酵素を不活性化し；
（ｅ）第二の検出プローブであって少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的である第二の検出プローブに生物学的試料を接触させ；
（ｆ）第二の検出プローブに特異的に結合する第二の標識用コンジュゲートであって第二の酵素を含む第二の標識用コンジュゲートに生物学的試料を接触させ；かつ
（ｇ）第二の潜在的反応性部分と第二の検出可能部分とを含む第二のシグナル伝達コンジュゲートに生物学的試料を接触させる
ための手段と；
第一及び第二の検出可能部分からのシグナルを検出するための手段であって、第一及び第二の検出可能部分が異なり、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞がＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つの免疫細胞マーカーとを共発現する手段と
を備えるシステム。
【請求項９３】
シグナルを検出するための手段が、生物学的試料を画像化して出力画像を作成するためのイメージャを備える、請求項９２に記載のシステム。
【請求項９４】
出力画像に基づいてＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞及びＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞をスコア化してスコア化データを作成するための手段を更に備える、請求項９３に記載のシステム。
【請求項９５】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、及び／又はＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞を同定するためのシステムであって、
（ａ）第一の検出プローブであって、ＰＤ−Ｌ１又は免疫細胞マーカーの一つに特異的な第一の一次抗体を含む第一の検出プローブに生物学的試料を接触させ；
（ｂ）第一の酵素と第一の基質とを含む第一の検出試薬に、酵素を基質と反応させてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、及びローダミン１１０（ローダミン）からなる群から選択される第一の色素を試料上に沈着させるのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させ；
（ｃ）第一の酵素を不活性化し、場合によっては第一の検出プローブを組織試料から除去し；
（ｄ）第二の検出プローブであって、ＰＤ−Ｌ１又は免疫細胞マーカーの別のものに特異的な抗体の別のものから選択される第二の一次抗体を含む第二の検出プローブに生物学的試料を接触させ；かつ
（ｅ）第二の酵素と第二の基質とを含む第二の検出試薬に生物学的試料を接触させ、ここで、前記接触は、酵素を基質と反応させてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、及びローダミン１１０（ローダミン）からなる群から選択される第二の色素であって、第一の色素とは異なる第二の色素を試料上に沈着させるのに十分な条件下で実施する
ための手段と、
第一及び第二の色素からのシグナルを検出するための手段であって、前記シグナルが第一の色素によって生成される第一のシグナルと、第二の色素によって生成される第二のシグナルと、第一の色素と第二の色素の共存によって生成される第三のシグナルとを含み、第三のシグナルの存在が、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞を示す、手段
を備えるシステム。
【請求項９６】
第一及び第二の検出試薬からのシグナルを検出するための手段が、生物学的試料を画像化して出力画像を生成してスコア化データを生成するイメージャを備える、請求項９５に記載のシステム。
【請求項９７】
出力画像に基づいて、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、及びＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞の少なくとも一つにスコアをつけるための手段を更に備える、請求項９６に記載のシステム。
【請求項９８】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、又はＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞の少なくとも一つを同定するためのシステムであって、
（ａ）第一の検出プローブであってＰＤ−Ｌ１又は免疫細胞マーカーの一つに特異的な第一の一次抗体を含む第一の検出プローブに生物学的試料を接触させ；
（ｂ）第一の酵素を含む第一の検出試薬に生物学的試料を接触させ；
（ｃ）第一の酵素を不活性化し；
（ｄ）第二の検出プローブであってＰＤ−Ｌ１又は免疫細胞マーカーの別のものに特異的な抗体の別のものから選択される第二の一次抗体を含む第二の検出プローブに生物学的試料を接触させ；かつ
（ｅ）第二の酵素を含む第二の検出試薬に生物学的試料を接触させる
ための手段と；
第一及び第二の検出試薬からのシグナルを検出するための手段であって、第一及び第二の検出試薬が異なる検出可能部分を含み、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞がＰＤ−Ｌ１と免疫細胞マーカーとを共発現する、手段
を備えるシステム。
【請求項９９】
第一及び第二の検出試薬からのシグナルを検出する手段が、生物学的試料を画像化して出力画像を生成するイメージャを備える、請求項９８に記載のシステム。
【請求項１００】
出力画像に基づいてＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞及びＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞をスコア化してスコア化データを生成するための手段を更に備える、請求項９９に記載のシステム。
【請求項１０１】
プロセッサを備えるコンピュータを更に具備し、
第一及び第二の検出試薬からのシグナルを検出する手段が、プロセッサに作動可能に連結され、第一の検出試薬からの第一のシグナルを検出し、第二の検出試薬からの第二のシグナルを検出し、第一のシグナルを第一のシグナルデータに変換し、第二のシグナルを第二のシグナルデータに変換し、第一のシグナルデータと第二のシグナルデータをプロセッサに送信するように構成された、請求項９８に記載のシステム。
【請求項１０２】
第一のシグナルデータ及び第二のシグナルデータに基づいてＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、又はＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞の少なくとも一つをスコア化してスコア化データを作成するための手段を更に備える、請求項１０１に記載のシステム。
【請求項１０３】
コンピュータが、プロセッサに動作可能に接続され、第一のシグナルデータに基づいて生物学的試料内の第一のシグナルの位置を特定し、定量し；第二のシグナルデータに基づいて生物学的試料内の第二のシグナルの位置を特定し、定量する、命令を含むプロセッサ実行可能命令を保存するコンピュータ可読媒体を更に備える、請求項１０１に記載のシステム。
【請求項１０４】
コンピュータが、プロセッサに動作可能に接続された出力手段を更に備え、プロセッサ実行可能命令が、生物学的試料内の第一のシグナルの位置と量、並びに生物学的試料内の第二のシグナルの位置と量を出力手段に出力する命令を更に含む、請求項１０３に記載のシステム。
【請求項１０５】
プロセッサ実行可能命令が、第一のシグナルデータ及び第二のシグナルデータに基づいてＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、又はＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の少なくとも一つをスコア化してスコア化データを作成するための命令を更に含む、請求項１０３に記載のシステム。
【請求項１０６】
コンピュータが、プロセッサに動作可能に接続された出力手段を更に備え、プロセッサ実行可能命令がスコア化データを出力手段に出力する命令を更に含む、請求項１０５に記載のシステム。
【請求項１０７】
プロセッサ、入力、及びコンピュータ可読媒体を備えるコンピュータシステムであって、
入力は、プロセッサと、第一の色素によって生成された第一のシグナル、第二の色素によって生成された第二のシグナル、及び第一の色素及び第二の色素の共存によって生成された第三のシグナルを含むシグナルセットを検出するための手段とに動作可能に接続され、第一の色素及び第二の色素がジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、及びローダミン１１０（ローダミン）からなる群から選択され、第二の色素は第一の色素とは異なり、入力はシグナルセットを検出するための手段からのシグナルセットをプロセッサに送信するように構成され、
コンピュータ可読媒体は、シグナルをシグナルデータに変換する命令を含むプロセッサ実行可能命令を含み、
プロセッサは、コンピュータ可読媒体に作動可能に連結され、第一のシグナルを第一のシグナルデータに変換し、第二のシグナルを第二のシグナルデータに変換し、第三のシグナルを第三のシグナルデータに変換するようにプロセッサ実行可能命令によって構成可能である、コンピュータシステム。
【請求項１０８】
プロセッサ実行可能命令が、第一のシグナルデータをＰＤ−Ｌ１単一発現量に、第二のシグナルデータを免疫細胞マーカー単一発現量に、第三のシグナルデータをＰＤ−Ｌ１／免疫細胞マーカー共発現量に変換して試験結果を生成するための命令を更に含む、請求項１０７に記載のシステム。
【請求項１０９】
コンピュータが、プロセッサに動作可能に接続された出力装置を更に備え、プロセッサ実行可能命令が、試験結果を出力装置に出力する命令を更に含む、請求項１０８に記載のシステム。
【請求項１１０】
プロセッサ実行可能命令が、試験結果に基づく患者の治療のための命令を更に含む、請求項１０９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願との相互参照］
２０１５年１１月２２日に出願した米国仮特許出願第６２／２５８４９３号の利益をここに主張し、その内容の全体を出典明示により援用する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞及び単球上に発現されるＣＤ２８／ＣＴＬＡ４受容体ファミリーに属する免疫抑制性受容体である。ＰＤ−１は制御性Ｔ細胞上でもまた発現され、そこで、樹状細胞及びＮＫ Ｔ細胞と相互作用し、アネルギー及び腫瘍免疫回避と関連することが示されている。Ｔ細胞活性の負の制御因子としてのＰＤ−１の役割は、免疫細胞及び腫瘍細胞上に発現されるそのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２とのその相互作用を介して媒介される。
【０００３】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、メラノーマ、神経膠芽腫、非小細胞肺がん及び尿路上皮癌、卵巣癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、膵臓癌及び胃癌を含む多くのヒト腫瘍に発現される。ＰＤ−Ｌ１は、宿主免疫系からの腫瘍免疫回避及び腫瘍抗アポトーシス活性の媒介に関与している。更に、抗原提示細胞上に発現されるＰＤ−１リガンド１及び２（ＰＤ−Ｌ）は、Ｔ細胞上のＰＤ−１を介して間接的にＴ細胞アネルギー又は枯渇を誘導することが示される一方、末梢組織上に発現されるＰＤ−Ｌ１は自己反応性リンパ球を直接的に抑制する。腫瘍上に発現されるＰＤ−Ｌは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能の抑制を含む、腫瘍誘導免疫抑制をもたらす適応調節性Ｔ細胞の生成を調節すると考えられる。腫瘍上のＰＤ−Ｌ１のより高い発現レベルは、メラノーマ、食道、腎臓、肺、及び脳、膵臓、卵巣及び頭頸部を含む幾つかの悪性腫瘍における予後不良と相関することが示されていると考えられる。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１発現は、最も一般的には免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によって測定される。腫瘍性ＰＤ−Ｌ１発現状態は、メラノーマ、腎細胞癌、及び非小細胞肺がんを含む複数の腫瘍型における予後因子であると考えられる。予測バイオマーカーとしてのＰＤ−Ｌ１免疫組織化学的検査の使用は、不定の検出抗体、異なるＩＨＣカットオフ、組織調製、プロセシングの多様性、原発性対転移性生検、発がん性対ＰＤ−Ｌ１発現の誘導、及び腫瘍対免疫細胞の染色を含む、複数の未解決の問題によって混乱させられる。
【０００５】
国際公開第２０１４／１９４２９３号（「’２９３刊行物」）は、ＰＤ−Ｌ１及びＢ７−Ｈ４経路標的療法に受け入れられるであろう患者を選択する方法を開示する。’２９３刊行物は、ＣＤ６８＋／Ｂ７−Ｈ１＋マクロファージが検出されうるように、二重ＣＤ６８／Ｂ７０−Ｈ１染色で組織試料を共染色することを開示する。’２９３刊行物はまたＢ７−Ｈ１、ＰＤ−１、又はＣＤ８の一つで個々の組織試料を染色することを開示しており、多重アッセイにおける単一組織試料の染色は開示していない。また、’２９３刊行物は、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の検出試薬と免疫細胞マーカーに特異的な少なくとも第二の検出試薬とに組織試料を接触させることも開示していない。
【０００６】
国際公開第２０１５／０８８９３０号（「’９３０刊行物」）は、組織切片をＰＤ−１に特異的な抗体（抗ＰＤ−１Ａｂ）と所望のＰＤリガンドに特異的な抗体（抗ＰＤリガンドＡｂ）とに接触させることを含む多重ＩＨＣアッセイを開示している。また、’９３０刊行物は、ＰＤ−１を発現する細胞が、ＰＤ−１と広範囲に共存する分子の発現についてＩＨＣ染色によって検出され得、同様に、関心のあるＰＤリガンドを発現する細胞が、ＰＤリガンドと広範囲に共存する分子の発現についてＩＨＣ染色によって検出されうることを開示している。そのような実施態様では、共存する分子に特異的に結合する抗体が、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤリガンド抗体の代わりに一次抗体として使用される。’９３０刊行物は、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の検出試薬と免疫細胞マーカーに特異的な少なくとも第二の検出試薬とに組織試料を接触させることは開示していない。
【０００７】
Fent等“Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor infiltrating lymphocytes from melanoma” J. ImmunoTherapy of Cancer, (2015)3:47（「Ｆｅｎｇ」）は、メラノーマの患者由来の腫瘍の免疫環境を分析する７色の定量的マルチスペクトルＩＨＣアッセイを記載している。特に、開示されたアッセイは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、ＰＤ−Ｌ１を含む定量的マルチスペクトル蛍光免疫組織化学パネルである。研究は、自己腫瘍反応性腫瘍浸潤リンパ球の発生を妨げる可能性のある腫瘍微小環境における潜在的な抑制機構を研究することに向けられた。Ｆｅｎｇは、ＰＤ−Ｌ１標的療法に対する応答を予測する目的のためにＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の検出試薬と、ＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つの他の免疫細胞マーカーとを共発現する免疫細胞を同定する目的のための免疫細胞マーカーに特異的な少なくとも第二の検出試薬とに組織試料を接触させることは開示していない。Ｆｅｎｇは、検出試薬を使用する多重アッセイも何ら開示していない。更に、ＦｅｎｇはＣＤ４５に特異的な抗体を利用するアッセイを開示していない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一態様は、組織試料中のＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、及び／又はＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞の同定及び／又は区別を容易にするシステム又はキットである。幾つかの実施態様では、キットは、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の一次抗体；少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な第二の一次抗体；第一の一次抗体を検出するための第一の検出試薬；及び第二の一次抗体を検出するための第二の検出試薬を含む。幾つかの実施態様では、少なくとも一つの免疫細胞マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６３及びＣＤ４５ＬＣＡからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、免疫細胞マーカーはＣＤ４５ＬＣである。幾つかの実施態様では、第一の一次抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＳＰ１４２）又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＳＰ２６３）である。幾つかの実施態様では、第二の一次抗体は抗ＣＤ４５ＬＣＡ抗体（ＲＰ２／１８）である。
【０００９】
幾つかの実施態様では、第一及び第二の検出試薬のそれぞれが、（ｉ）酵素；（２）一次抗体が組織試料に結合したときに一次抗体に近接して酵素を沈着させるための試薬、及び（ｉｉｉ）試料上に沈着した酵素に近接して色素を沈着させる酵素と反応性の酵素基質を含み、第一及び第二の検出試薬は異なる色素を沈着させる基質を含む。幾つかの実施態様では、異なる色素は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、及びローダミン１１０（ローダミン）からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、第一の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢの一方を沈着させ、第二の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢの他方を沈着させる。幾つかの実施態様では、第一の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢＳＹＬの一方を沈着させ、第二の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢＳＹＬの他方を沈着させる。
【００１０】
幾つかの実施態様では、キットは、ＰＤ−Ｌ１以外の腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの他の検出プローブと、少なくとも一つの他の検出プローブを検出するための検出試薬とを更に含む。幾つかの実施態様では、キットは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも一つの他の検出プローブを更に含む。幾つかの実施態様では、キットは、少なくとも二つの免疫細胞マーカーに特異的な二つの一次抗体を更に含む。幾つかの実施態様では、キットは、酵素を不活性化する成分を更に含む。
【００１１】
本開示の別の態様は、組織試料中の免疫細胞を共染色する方法であって、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の検出プローブに組織試料を接触させる工程；少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な第二の検出プローブに組織試料を接触させる工程；及び第一及び第二の検出試薬に組織試料を接触させる工程を含み、第一及び第二の検出試薬が、異なる色素の沈着をもたらす基質を含む、方法である。幾つかの実施態様では、第二の検出プローブはＣＤ４５ＬＣＡに特異的である。
【００１２】
本開示の別の態様は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、及びＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞を同定する方法であって、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の検出プローブに組織試料を接触させる工程；少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な第二の検出プローブに組織試料を接触させる工程；及び第一及び第二の検出試薬に組織試料を接触させる工程を含み、第一及び第二の検出試薬が、異なる色素の沈着をもたらす異なる基質を含む、方法である。幾つかの実施態様では、第一及び第二の検出試薬は検出試薬である。幾つかの実施態様では、第二の検出プローブはＣＤ４５ＬＣＡに特異的である。
【００１３】
本開示の別の態様は、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞からＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞を区別する方法であって、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の検出プローブに組織試料を接触させる工程；少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な第二の検出プローブに組織試料を接触させる工程；及び第一及び第二の検出試薬に組織試料を接触させる工程を含み、第一及び第二の検出試薬が、異なる色素の沈着をもたらす異なる基質を含む、方法である。幾つかの実施態様では、第一及び第二の検出試薬は検出試薬である。幾つかの実施態様では、第二の検出プローブはＣＤ４５ＬＣＡに特異的である。
【００１４】
本開示の別の態様は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍における腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞を同定する方法であって、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の一次抗体に組織試料を接触させる工程；少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な第二の一次抗体に組織試料を接触させる工程；及び第一及び第二の検出試薬に組織試料を接触させる工程を含み、第一及び第二の検出試薬が、異なる色素の沈着をもたらす異なる基質を含む、方法である。幾つかの実施態様では、腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞は、ＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つの免疫細胞マーカーとを共発現する。幾つかの実施態様では、第一の一次抗体は抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＳＰ１４２である。幾つかの実施態様では、免疫細胞マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ１６３及びＣＤ４５ＬＣＡからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、免疫細胞マーカーはＣＤ４５ＬＣＡである。幾つかの実施態様では、第二の抗体は抗ＣＤ４５ＬＣＡ抗体ＲＰ２／１８である。
【００１５】
幾つかの実施態様では、第一及び第二の検出試薬のそれぞれは、（ｉ）酵素、（ｉｉ）一次抗体が組織試料に結合したときに一次抗体に近接して酵素を沈着させるための試薬、及び（ｉｉｉ）試料上に色素を沈着させる酵素と反応性の酵素を含み、第一及び第二の検出試薬は異なる基質を含む。幾つかの実施態様では、異なる基質は、ＤＡＢ、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル、Ｃｙ５、及びローダミンからなる群から選択される色素を付着させるように選択される。幾つかの実施態様では、第一の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢの一方を沈着させ、第二の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢの他方を沈着させる。幾つかの実施態様では、第一の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢＳＹＬの一方を沈着させ、第二の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢＳＹＬの他方を沈着させる。幾つかの実施態様では、本方法は、ＰＤ−Ｌ１以外の腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの他の検出プローブに組織試料を接触させる工程を更に含む。幾つかの実施態様では、本方法は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４の一つに特異的な少なくとも一つの他の検出プローブに組織試料を接触させる工程を更に含む。
【００１６】
本開示の別の態様は、腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の存在又は非存在についてＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織試料を分析することによって、ＰＤ−Ｌ１標的療法に対する応答を予測する方法であって、ＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つのＣＤマーカーとを共発現する免疫細胞を同定する工程を含み、ＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つのＣＤマーカーとを共発現する免疫細胞を同定する工程が、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の一次抗体に腫瘍組織試料を接触させることと、少なくとも一つのＣＤマーカーに特異的な第二の一次抗体に腫瘍組織試料を接触させることを含む、方法である。幾つかの実施態様では、本方法は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数を定量し、及び腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数を定量し、及び場合によっては定量値又はそれから誘導される任意の値を、ここに記載された対照値又は予め決められたカットオフ値と比較することを更に含む。幾つかの実施態様では、ＣＤマーカーは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、及びＣＤ４５ＬＣＡからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、ＣＤマーカーはＣＤ４５ＬＣＡである。
【００１７】
幾つかの実施態様では、本方法は、第一及び第二の検出試薬に組織試料を接触させることを更に含み、第一及び第二の検出試薬は異なる色素の沈着をもたらす異なる基質を含む。幾つかの実施態様では、第一及び第二の検出試薬のそれぞれは、（ｉ）酵素、（ｉｉ）一次抗体が組織試料に結合したときに一次抗体に近接して酵素を沈着させるための試薬、及び（ｉｉｉ）色素を沈着させる酵素と反応性の基質を含み、第一及び第二の検出試薬は、異なる色素を沈着させる基質を含む。幾つかの実施態様では、異なる基質は、ＤＡＢ、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル、Ｃｙ５、及びローダミンからなる群から選択される色素を沈着させるように選択される。幾つかの実施態様では、第一の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢの一方を沈着させ、第二の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢの他方を沈着させる。幾つかの実施態様では、第一の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢＳＹＬの一方を沈着させ、第二の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢＳＹＬの他方を沈着させる。
【００１８】
幾つかの実施態様では、本方法は、ＰＤ−Ｌ１以外の腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの他の検出プローブと少なくとも一つの他の検出プローブを検出するための検出試薬とに組織試料を接触させることを更に含む。他の実施態様では、本方法は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも一つの他の検出プローブを導入することを含む。
【００１９】
本開示の別の態様では、患者のがんを治療する方法であって、患者のＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織試料が腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性リンパ球を含むかどうかを決定する分析の結果を提供する試験を要求し、患者の腫瘍組織試料がＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞及び腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性リンパ球を発現する場合に患者にＰＤ−Ｌ１標的療法を施すことを含み、前記試験が、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の一次抗体と少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な第二の一次抗体とに腫瘍組織試料が接触させられる多重アッセイを含み、腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性リンパ球がＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つの免疫細胞マーカーとを共発現する、方法を含む。幾つかの実施態様では、本方法は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数と腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数を定量し、場合によっては定量値又はそれに由来する任意の値を対照値と比較することを更に含む。幾つかの実施態様では、免疫細胞マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、及びＣＤ４５ＬＣＡからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、免疫細胞マーカーはＣＤ４５ＬＣＡである。
【００２０】
幾つかの実施態様では、本方法は、第一及び第二の検出試薬に組織試料を接触させることを更に含み、第一及び第二の検出試薬は異なる色素の沈着をもたらす異なる基質を含む。幾つかの実施態様では、第一及び第二の検出試薬のそれぞれは、（ｉ）酵素、（ｉｉ）一次抗体が組織試料に結合したときに一次抗体に近接して酵素を沈着させるための試薬、及び（ｉｉｉ）試料上に色素を沈着させる酵素と反応性の基質を含み、第一及び第二の検出試薬は、異なる色素の沈着を生じる基質／酵素の組み合わせを含む。幾つかの実施態様では、異なる基質は、ＤＡＢ、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル、Ｃｙ５、及びローダミンからなる群から選択される色素を沈着させるように選択される。幾つかの実施態様では、第一の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢの一方を沈着させ、第二の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢの他方を沈着させる。幾つかの実施態様では、第一の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢＳＹＬの一方を沈着させ、第二の基質は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル又はＤＡＢＳＹＬの他方を沈着させる。
【００２１】
幾つかの実施態様では、本方法は、ＰＤ−Ｌ１以外の腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの他の検出プローブと少なくとも一つの他の検出プローブを検出するための検出試薬とに組織試料を接触させることを更に含む。他の実施態様では、本方法は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも一つの他の検出プローブを導入することを含む。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１標的療法はアテゾリズマブである。
【００２２】
本開示の別の態様は、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞からＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞を区別する方法であって、（ａ）ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の検出プローブに生物学的試料を接触させる工程；（ｂ）第一の検出用プローブに特異的に結合する第一の標識用コンジュゲートに生物学的試料を接触させる工程であって、第一の標識用コンジュゲートが第一の酵素を含む工程；（ｃ）第一の潜在的反応性部分と第一の検出可能部分とを含む第一のシグナル伝達コンジュゲートに生物学的試料を接触させる工程；（ｄ）第一の酵素を不活性化し、二つの一次抗体が同じ二次抗体と反応性である場合には、一次抗体を変性及び／又は溶出させる工程；（ｅ）第二の検出プローブに生物学的試料を接触させる工程であって、第二の検出プローブが少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的である工程；（ｆ）第二の検出用プローブに特異的に結合する第二の標識用コンジュゲートに生物学的試料を接触させる工程であって、第二の標識用コンジュゲートが第二の酵素を含む工程；（ｇ）第二の潜在的反応性部分と第二の検出可能部分とを含む第二のシグナル伝達コンジュゲートに生物学的試料を接触させる工程；（ｈ）第一及び第二の検出可能部分からのシグナルを検出する工程であって、第一及び第二の検出可能部分の各々がそれぞれ異なる工程を含み、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞がＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つの免疫細胞マーカーとを共発現する、方法である。幾つかの実施態様では、第一の検出プローブは抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり；第二の検出プローブは抗ＣＤ４５ＬＣＡ抗体である。幾つかの実施態様では、第一の検出可能部分は、ジアミノベンジジン又はＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルの一方であり；第二の検出可能部分は、ジアミノベンジジン又はＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルの他方である。幾つかの実施態様では、本方法は、第二の酵素を不活性化する工程、ＰＤ−Ｌ１以外の腫瘍マーカーに特異的な第三の検出プローブに生物学的試料を接触させる工程、第三の検出プローブに特異的に結合する第三の標識用コンジュゲートに試料を接触させる工程であって、第三の標識用コンジュゲートが第三の酵素を含む工程；及び第三の潜在的反応性部分と第三の検出可能部分とを含む第三のシグナル伝達コンジュゲートに生物学的試料を接触させる工程であって、第三の検出可能部分が第一又は第二の検出可能部分の何れかとは異なる工程を更に含む。
【００２３】
本開示の別の態様は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、及び／又はＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞を同定する方法であって、（ａ）第一の検出プローブに生物学的試料を接触させる工程であって、第一の検出プローブが、ＰＤ−Ｌ１又は免疫細胞マーカーの一方に特異的な第一の一次抗体を含む工程；（ｂ）第一の酵素を含む第一の検出試薬に生物学的試料を接触させる工程；（ｃ）第一の酵素を不活性化する工程；（ｄ）第二の検出プローブに生物学的試料を接触させる工程であって、第二の検出プローブがＰＤ−Ｌ１又は免疫細胞マーカーの別のものに特異的な抗体の別のものから選択される第二の一次抗体を含む工程；（ｅ）第二の酵素を含む第二の検出試薬に生物学的試料を接触させる工程；（ｆ）第一及び第二の検出試薬からのシグナルを検出する工程であって、第一及び第二の検出試薬の各々が異なる検出可能部分を含む工程を含み、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞がＰＤ−Ｌ１と免疫細胞マーカーとを共発現する、方法である。幾つかの実施態様では、第二の検出プローブはリンパ球に特異的である。幾つかの実施態様では、第一の検出プローブは抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり；第二の検出プローブは抗ＣＤ４５ＬＣＡ抗体である。幾つかの実施態様では、第一の検出可能部分は、ジアミノベンジジン又はＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルの一方であり；第二の検出可能部分は、ジアミノベンジジン又はＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルの他方である。幾つかの実施態様では、本方法は、第二の酵素を不活性化し、ＰＤ−Ｌ１以外の腫瘍マーカーに特異的な第三の検出プローブに生物学的試料を接触させ、第三の検出試薬に試料を接触させることを更に含む。
【００２４】
本出願人は、ＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の検出プローブと免疫細胞マーカーに特異的な少なくとも第二の検出プローブとで組織試料を共染色するための多重アッセイ及び方法を開発した。従来技術の方法と比較して、本出願人が開発した多重アッセイ及び方法は、浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織のようなＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の改善された同定と、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞からのＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の区別とを可能にする。また、従来技術の方法と比較して、本出願人は、ここで開示された方法が優れており、より高いスループットでＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の同定を精確に可能にすることを立証した。更に、ここに開示された方法は、従来技術の方法と比較して、より迅速で、より精確であり、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞免疫細胞とＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞との間の微妙な形態学的相違の認識に依存しない。実際、ここに開示された方法は、異なったＰＤ−Ｌ１陽性細胞型の読み取り及び識別に関連した主観性の幾らかを除去し、改善されたスコア化及び臨床診断を可能にすると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
次の図面を参照して、非限定的で非網羅的な実施態様を説明する。
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、組織検体の例を提供し、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞がＤＡＢＳＹＬ（図１Ａ及び１Ｂでは黄色、図１Ｃでは「ａ」で示す）で染色され、腫瘍浸潤リンパ球がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル（図１Ａ及び１Ｂではフクシア色（鮮やかな赤紫色）、図１Ｃでは「ｂ」で示す）で染色され、ＰＤ−Ｌ１を共発現するリンパ球が、図１Ａ及び１Ｂではオレンジ色／赤色に見え、図１Ｃでは「ｃ」で示される。
【図１Ｂ】上記
【図１Ｃ】上記
【図２Ａ】図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、組織検体の例を提供し、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞がＣｙ５（図２Ａ及び２Ｂではシアン／ブルー；図２Ｃでは「ａ」で示す）で染色され、腫瘍浸潤リンパ球がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル（図２Ａ及び２Ｂではフクシア色、図２Ｃでは「ｂ」で示す）で染色され、ＰＤ−Ｌ１を共発現するリンパ球が、図２Ａ及び２Ｂでは暗紫色／ネービー色に見え、図２Ｃでは「ｃ」で示される。
【図２Ｂ】上記
【図２Ｃ】上記
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、組織検体の例を提供し、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞がローダミン（図３Ａ及び３Ｂではピンク；図３Ｃでは「ａ」で示す）で染色され、腫瘍浸潤リンパ球がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル（図３Ａ及び３Ｂではフクシア色、図３Ｃでは「ｂ」で示す）で染色され、ＰＤ−Ｌ１を共発現するリンパ球が、図３Ａ及び３Ｂでは赤色／ネービー色に見え、図３１Ｃでは「ｃ」で示される。
【図３Ｂ】上記
【図３Ｃ】上記
【図４Ａ】図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃは、組織検体の例を提供し、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞がＤＡＢ（図４Ａ及び４Ｂでは褐色、図４Ｃでは「ａ」で示す）で染色され、腫瘍浸潤リンパ球がＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル（図４Ａ及び４Ｂではフクシア色、図４Ｃでは「ｂ」で示す）で染色され、ＰＤ−Ｌ１を共発現するリンパ球が、図４Ａ及び４Ｂでは紫色及び褐色の斑点状であり、図４Ｃでは「ｃ」で示される。
【図４Ｂ】上記
【図４Ｃ】上記
【図５Ａ】図５Ａ及び５Ｂは、幾つかの色素原の吸収スペクトルを示すグラフを提供する。
【図５Ｂ】上記
【図６】本開示の非限定的な実施態様に係る多重アッセイを実施するための方法を例証するフローチャートである。
【図７】本開示の非限定的な実施態様に係る多重アッセイを実施するための方法を例証するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
一般に、本開示は、組織試料中のＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞及びＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞を同定するための、自動化方法を含む多重アッセイ、キット及び方法に関する。幾つかの実施態様では、ここに記載の多重アッセイ、キット、及び方法は、医療従事者がＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、及びＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞を区別することを可能にする。幾つかの実施態様では、ここに記載の多重アッセイ、キット及び方法は、例えばＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織試料内での腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の存在及び／又は量を検出することによって、患者がＰＤ−Ｌ１を標的とする治療法での治療から恩恵を受けうるかどうかを医療従事者が評価することを可能にしうる。幾つかの実施態様では、多重アッセイ、キット、及び方法は、当業者が（ｉ）リンパ球免疫応答、及び（ｉｉ）腫瘍及び浸潤免疫細胞のＰＤ−Ｌ１発現状態を明確に同定することを可能にする。これら実施態様及び他の実施態様がここに更に十分に記載される。
【００２７】
ここで使用される場合、「a」、「an」及び「the」という単数形の用語は、文脈が明らかに他の定義を示すものでない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「or」という単語は、文脈が明らかに他の定義を示すものでない限り、「and」を含むことが意図される。
【００２８】
「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する（having）」等の用語は交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む（comprises）」、「含む（includes）」、「有する（has）」等は交換可能に使用され、同じ意味を有する。詳細には、前記用語の各々は、「含む（comprising）」の共通の米国特許法の定義と一致するように定義され、従って、「少なくとも次のもの」を意味するオープンな用語であると解釈され、また更なる特徴、限定、態様等々を排除するものではないと解釈される。従って、例えば、「コンポーネントａ、ｂ、及びｃを有する装置」は、装置が少なくともコンポーネントａ、ｂ及びｃを含むことを意味する。同様に、「工程ａ、ｂ、及びｃを含む方法」という語句は、方法が少なくとも工程ａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。更に、工程及びプロセスは、ここでは特定の順序で概説されうるが、当業者は、順序付け工程及びプロセスが変わりうることを認識するであろう。
【００２９】
ここで使用される場合、「抗体」という用語は、例を挙げると、限定しないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、それらの組み合わせ、及び任意の脊椎動物（例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ及びマウスなどの哺乳類）において免疫応答中に産生される同様の分子、並びに抗体断片（例えば、当該分野で知られているＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片及びＦａｂ断片）、他の分子への結合を実質的に排除するまで対象の分子（又は対象の非常に類似した分子の群）に特異的に結合する組換え抗体断片（例えばｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ、及びトリアボディ（当該技術分野で知られている）、及びラクダ科抗体）を含む、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子を意味する。抗体は抗原のエピトープを特異的に認識して結合する少なくとも軽鎖又は重鎖の免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを更に意味する。抗体は、可変重鎖（ＶＨ）領域及び可変軽鎖（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域をそれぞれが有する、重鎖と軽鎖から構成されうる。併せて、ＶＨ領域とＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原の結合に関与する。抗体という用語はまたインタクトな免疫グロブリンと、当該技術分野でよく知られているそれらの変異体及び部分を含む。
【００３０】
「抗原」とは、抗体分子又はＴ細胞受容体のような特異的な体液性又は細胞性免疫の産物が特異的に結合しうる化合物、組成物、又は物質を意味する。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝物、糖（例えばオリゴ糖）、脂質、及びホルモン、並びに高分子、例えば複雑な炭水化物（例えば、多糖類）、リン脂質、核酸及びタンパク質を含む任意のタイプの分子でありうる。
【００３１】
「ハプテン」は、抗体と特異的に結合することができるが、典型的には、担体分子との組合わせ以外では免疫原性を実質的に有さない小分子である。幾つかの実施態様では、ハプテンには、限定されないが、ピラゾール（例えば、ニトロピラゾール）；ニトロフェニル化合物；ベンゾフラザン；トリテルペン；尿素（例えば、フェニル尿素）；チオ尿素（例えば、フェニルチオ尿素）；ロテノンとロテノン誘導体；オキサゾール（例えば、オキサゾールスルホンアミド）；チアゾール（例えば、チアゾールスルホンアミド）；クマリンとクマリン誘導体；及びシクロリグナンが含まれる。ハプテンの更なる非限定的な例には、チアゾール；ニトロアリール；ベンゾフラン；トリペルペン；及びシクロリグナンが含まれる。ハプテンの特定の例には、ジ−ニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びフルオレセイン、並びにそれらの任意の誘導体又はアナログが含まれる。他のハプテンは、その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第８８４６３２０号；第８６１８２６５号；第７６９５９２９号；第８４８１２７０号；及び第９０１７９５４号に記載されている。ハプテン自体は、直接的な検出に適している場合があり、すなわち、ハプテンは検出のための適切なシグナルを発しうる。
【００３２】
ここで使用される場合、「試料」及び「生物学的試料」という用語は、バイオマーカーを含んでいるか、又は含むと推定される任意の組成物を意味するものである。本用語は、細胞、組織、又は血液の精製され又は分離された成分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、無細胞部分、又は細胞可溶化物を含む。試料は、例えば腫瘍又は転移性病変由来の、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞試料でありうる。試料はまた凍結又は新鮮組織、又は液体試料、例えば血液又は血液成分（血漿又は血清）、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、涙液、リンパ液、脳脊髄液、スワブ洗浄材料等々由来でありうる。試料はまた細胞株を含む個体から得られた細胞のインビトロ培養物の構成物及び成分を含みうる。試料は、例えば細胞可溶化物又は赤血球が枯渇した血液など、個体から直接得られた試料から部分的に処理することもできる。
【００３３】
ここで使用される場合、「細胞試料」という用語は、病理学的、組織学的、又は細胞学的解釈のために採取された細胞培養物、体液試料又は外科検体のような、インタクトな細胞を含む任意の試料を意味する。
【００３４】
ここで使用される場合、「組織試料」という用語は、試料が得られた被験体内に存在する細胞間の断面の空間的関係を保存する細胞試料を意味するものとする。「組織試料」は、一次組織試料（すなわち、被験体によって産生された細胞及び組織）及び異種移植片（すなわち、被験体に移植される外来細胞試料）の双方を包含するものとする。
【００３５】
ここで使用される場合、「細胞学的試料」という用語は、細胞試料が得られた被験体において存在していた細胞の空間的関係を試料がもはや反映しないように、試料の細胞が部分的に又は完全に脱凝集させられている細胞試料を意味する。細胞学的試料の例には、組織擦過物（例えば、頸部擦過物）、細針吸引物、被験体の洗浄によって得られる試料等々が含まれる。
【００３６】
ここで使用される場合、「組織化学的検出」とは、組織試料の構造間の断面関係の観点でバイオマーカー又は他の構造の顕微鏡検出を可能にするように検出試薬を用いて組織試料中のバイオマーカー又は他の構造を標識することを含むプロセスを意味する。例には、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、及びヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色が含まれる。
【００３７】
ここで使用される場合、「細胞化学的検出」とは、細胞学的試料の細胞の観点でバイオマーカー又は他の構造の顕微鏡検出を可能にするように検出試薬を用いて細胞学的試料中のバイオマーカー又は他の構造を標識することを含むプロセスを意味する。
【００３８】
ここで使用される場合、「切片」という用語は、典型的にはミクロトームを使用して切断された、顕微鏡分析に適した組織試料の薄片を意味するものとする。
【００３９】
ここで使用される場合、「連続切片」という用語は、組織試料から連続的に切断された一連の切片の何れか一つを意味するものとする。二つの切片が互いに「連続切片」と考えられるためには、必ずしも組織からの連続した切片を必要とするわけではないが、組織学的染色後に構造が互いに一致しうるように、同じ断面関係で同じ組織構造を一般に含むべきである。
【００４０】
ここで使用される場合、「特異的結合」、「特異的に結合する」又は「に特異的な」という語句は、標的とバイオマーカー特異的薬剤との間の結合などの測定可能で再現性のある相互作用を意味し、生物学的分子を含む分子の異種集団の存在下での標的の存在を決定するものである。例えば、標的に特異的に結合する結合体は、より高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はそれが他の標的に結合するよりも長い持続時間でこの標的に結合する抗体である。一実施態様では、結合体の非関連標的への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定して、抗体の標的への結合の約１０％未満である。所定の実施態様では、標的に特異的に結合する結合体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。別の実施態様では、特異的結合は排他的結合を含みうるが、それを必要とはしない。
【００４１】
ここで使用される場合、「検出プローブ」は、試料中の構造の検出を可能にする形で、試料内の特定の構造に結合する任意の化合物又は組成物を意味するものとする。例としては、
・特定のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブ；
・適切な増幅試薬と対になったときに特定のヌクレオチド配列又は配列セットを増幅することができる核酸プライマーセット；
・抗体及びその抗原結合断片；及び
・ＡＤＮＥＣＴＩＮ（第１０のＦＮ３フィブロネクチンに基づくスカフォールド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．）、ＡＦＦＩＢＯＤＹ（スタフィロコッカス・アウレウス由来のプロテインＡのＺドメインに基づくスカフォールド；Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＡＶＩＭＥＲ（ドメインＡ／ＬＤＬ受容体に基づくスカフォールド；Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ｄＡｂ（ＶＨ又はＶＬ抗体ドメインに基づくスカフォールド；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＰＬＣ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ＤＡＲＰｉｎ（Ａｎｋｙｒｉｎリピートタンパク質に基づくスカフォールド；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，ＣＨ）、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮ（リポカリンに基づくスカフォールド；Ｐｉｅｒｉｓ ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，ＤＥ）、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（ＶＨＨ（ラクダ科Ｉｇ）に基づくスカフォールド；Ａｂｌｙｎｘ Ｎ／Ｖ，Ｇｈｅｎｔ，ＢＥ）、ＴＲＡＮＳ−ＢＯＤＹ（トランスフェリンに基づくスカフォールド；Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＳＭＩＰ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、及びＴＥＴＲＡＮＥＣＴＩＮ（Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）に基づくスカフォールド，テトラネクチン；Ｂｏｒｅａｎ Ｐｈａｒｍａ Ａ／Ｓ，Ａａｒｈｕｓ，ＤＫ）を含む、操作された特異的結合構造（このような操作された特異的結合構造の説明は、その内容が出典明示により援用されるWurch等, Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging and Therapy: Status on Discovery Research and Clinical Validation, Current Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 9, pp. 502-509 (2008)に概説されている）
が含まれる。
【００４２】
検出プローブは、放射性同位元素、酵素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光又は蛍光剤、ハプテン（限定されないがＤＮＰを含む）、及び酵素などの直接検出用の標識を含みうる。あるいは、検出プローブは、標識又はタグを含んでいなくてもよく、間接的に（例えば、検出プローブを標識又はタグと特異的に関連付ける二次抗体又は他の分子を用いて）検出されてもよい。
【００４３】
「多重（マルチプレックス）」、「多重化（マルチプレックスト）」又は「多重化（マルチプレキシング）」は、試料中の複数の標的を同時発生的に、実質的に同時に、又は順次検出することを意味する。多重化は、個々に、また任意かつ全ての組み合わせで、複数の異なる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）及びポリペプチド（例えば、タンパク質）を同定及び／又は定量することを含みうる。
【００４４】
「一次検出プローブ」又は「一次抗体」という用語は、組織試料中の標的タンパク質抗原に特異的に結合する検出プローブ又は抗体を意味する。一次検出プローブは、一般に、組織化学的手順で使用される第一の検出である。
【００４５】
ここでの「二次検出プローブ」又は「二次抗体」という用語は、検出プローブ又はその一部（例えば、ハプテン又は一次抗体）に特異的に結合し、それにより検出プローブと、もしあればその後の試薬（例えば標識、酵素等々）との間に架橋を形成する抗体を意味する。二次抗体は検出プローブを間接的に検出するために使用することができる。
【００４６】
「ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞」は、ＰＤ−Ｌ１を発現又は過剰発現する、転移性細胞を含む腫瘍細胞を意味する。
【００４７】
「標的」とは、存在、位置及び／又は濃度が決定されるか又は決定されうる任意の分子を意味する。標的の例には、ここに開示されるような核酸配列及びタンパク質が含まれ、特にＰＤ−Ｌ１及び免疫細胞マーカー（表面抗原分類（「ＣＤ」）マーカー）が含まれる。
【００４８】
腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）は、腫瘍に見出される一種の免疫細胞であり、腫瘍細胞の「死滅」に関与する。
【００４９】
［一次検出プローブ］
本開示の多重アッセイ、キット及び方法は、少なくとも二つの検出プローブ、すなわち少なくとも（ｉ）ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞及び（ｉｉ）免疫細胞の検出を可能にする検出プローブを含む。もちろん、当業者であれば、更なる検出プローブを、他の腫瘍マーカーを含む他の標的の検出を達成するために最後の二つの検出プローブと組み合わせることができることを認識するであろう。ここでの所定の実施態様は、ＩＨＣにおける使用のための検出プローブとしての一次抗体を指すが、組織化学アッセイでの使用のための他のタンパク質特異的検出プローブ及びインサイツハイブリダイゼーションアッセイでの使用のための核酸プローブもまた等しく利用されうる。
【００５０】
幾つかの実施態様では、利用される検出プローブは一次抗体、すなわちＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞及び免疫細胞の検出を可能にする一次抗体である。幾つかの実施態様では、検出プローブは、ＰＤ−Ｌ１に特異的な一次抗体（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体）を含む。一実施態様では、ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号：１を含むポリペプチドに対して免疫特異的である。他の実施態様では、検出プローブは、少なくともＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞に特異的な一次抗体である。更に他の実施態様では、検出プローブは、ＰＤ−１に特異的な一次抗体である。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＺ，Ｔｕｃｓｏｎから入手可能であり、ＳＰ１４２（ウサギモノクローナルＩＨＣ抗体）及びＳＰ２６３（ウサギモノクローナルＩＨＣ抗体）を含む。他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｄａｋｏ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）から入手可能であり、ＰＤ−Ｌ１ ＩＨＣ ２２Ｃ３ ｐｈａｒｍＤｘ及びＰＤ−Ｌ１ ＩＨＣ ２８−８ ｐｈａｒｍＤｘを含む。ＳＰ１４２は米国特許出願公開第２０１６０００９８０５Ａ１号に詳細に記載されており、ＳＰ２６３は米国特許出願公開第２０１５０３４６２０８Ａ１号に詳細に記載されており、その各々の内容はその全体が出典明示により援用される。ＳＰ１４２及びＳＰ２６３は、次の重鎖及び軽鎖配列を含む：
2018536163.tif 000003
【００５１】
幾つかの実施態様では、利用される検出プローブは、免疫細胞マーカーに特異的である。幾つかの実施態様では、検出プローブは、Ｔリンパ球及びＢリンパ球を含むリンパ球のマーカーに特異的な一次抗体から選択される。他の実施態様では、検出プローブは、白血球、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞のマーカーに特異的な一次抗体から選択される。更に他の実施態様では、検出プローブは、広域スペクトルリンパ球二次バイオマーカーに特異的な一次抗体から選択される。
【００５２】
幾つかの実施態様では、検出プローブは、限定されないが、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＬＣＡ（ここで「ＬＣＡ」は白血球共通抗原を指す）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ１９及びＣＤ１６３（例えば、抗ＣＤ抗体）を含む、所定の受容体及び／又はリガンドに特異的な一次抗体から選択される。他の実施態様では、検出プローブは、ＣＤ４５ＬＣＡに特異的な一次抗体である。幾つかの実施態様では、検出プローブは、例えばＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺから入手可能であり、ＣＯＮＦＩＲＭ抗ＣＤ４５，ＬＣＡ（ＲＰ２／１８）とのブランド名で入手可能な抗ＣＤ４５ＬＣＡ一次抗体（白血球の膜上に位置する抗原に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１））である。
【００５３】
［検出試薬］
検出試薬は、組織試料に結合したときに検出試薬に近接して検出可能部分の沈着をもたらすように選択される。「検出可能部分」は、試料中の標的の存在（すなわち、定性分析）及び／又は濃度（すなわち、定量分析）を示す検出可能（例えば、視覚的、電子的又はその他）なシグナルをつくり出すことができる分子又は材料である。検出可能シグナルは、（ラジオ周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数及び紫外周波数光子を含む）光子の吸収、放出及び／又は散乱を含む、何らかの既知又は未発見のメカニズムによって生成されうる。幾つかの実施態様では、検出可能部分は、発色性、蛍光性、燐光性及び発光性分子及び物質、（例えば、無色物質を着色物質に変換するか、又は沈殿を生成するかもしくは試料の濁度を増加させることによって）ある物質を別の物質に変換して検出可能な差異をもたらす触媒（酵素など）を含む。幾つかの例では、検出可能部分は、クマリン、フルオレセイン（又はフルオレセイン誘導体及びアナログ）、ローダミン、レゾルフィン、発光団及びシアニンを含む幾つかの一般的な化学クラスに属するフルオロフォアである。蛍光分子の更なる例は、Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, OR, TheroFisher Scientific, 11版に見出すことができる。他の実施態様では、検出可能部分は、明視野顕微鏡によって検出可能である。特定の実施態様では、検出可能部分は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、及びローダミン１１０（ローダミン）からなる群から選択される色素を含む。
【００５４】
幾つかの実施態様では、検出可能部分は、検出プローブに直接コンジュゲートされ、よって、その標的への検出プローブの結合の際に試料上に沈着する。他の場合では、検出可能部分の沈着は、酵素反応によってなされる。幾つかの実施態様では、適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ラクタマーゼが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施態様では、酵素は、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、又はペルオキシダーゼ（例えば、ＨＲＰ又はＡＰ）を含む。酵素は、検出プローブに直接コンジュゲートされてもよく、又は標識用コンジュゲートによって検出プローブと間接的に関連付けられてもよい。ここで使用される場合、「標識用コンジュゲート」は、（ａ）一次特異的結合体又は一次抗体に結合又は関連した別の実体（例えば、一次抗体に結合した二次抗体又は一次抗体に結合したハプテン等）に特異的な特異的結合体；及び（ｂ）特異的結合体に関連した酵素で、その場での色素の生成及び／又は組織試料上への色素の沈着をもたらす適切な反応条件下で発色基質、シグナル伝達コンジュゲート、又は酵素反応性色素と反応性である酵素を含む。
【００５５】
場合によっては、酵素は発色性化合物／基質と反応する。発色性化合物／基質の特定の非限定的な例には、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、リン酸ブロモクロロインドリル（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、又はテトラゾリウムバイオレットが含まれる。
【００５６】
幾つかの実施態様では、酵素は、金属学的検出スキームで使用されうる。金属組織学的検出法には、酵素の水溶性金属イオン及び酸化還元不活性基質と組み合わせたアルカリホスファターゼなどの酵素の使用が含まれる。幾つかの実施態様では、基質は酵素によって酸化還元活性剤に変換され、酸化還元活性剤は金属イオンを還元して、検出可能な沈殿物を形成させる。（例えば、２００４年１２月２０日に出願された米国特許出願第１１／０１５６４６号、ＰＣＴ公開第２００５／００３７７７号及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照のこと；これらの各々は、出典明示によりその全体がここに援用される）。金属組織学的検出法には、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共にオキシド−レダクターゼ酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を使用して検出可能な沈殿物を形成することが含まれる。（例えば、出典明示によりその全体がここに援用される米国特許第６６７０１１３号を参照のこと）。
【００５７】
幾つかの実施態様では、酵素作用は酵素と色素自体との間で起こり、反応は色素を非結合種から試料上に沈着した種に変換する。例えば、ＤＡＢとペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）との反応は、ＤＡＢを酸化させて沈殿させる。
【００５８】
更に他の実施態様では、色素は、酵素と反応して試料又は他の検出成分に結合することができる反応種を形成するように構成された潜在反応性部分を含むシグナル伝達コンジュゲートを介して沈着される。これらの反応種は、それらの生成の近くで、すなわち酵素の近くで試料と反応することができるが、酵素が沈着する部位から遠位の部位にシグナル伝達コンジュゲートが沈着しないように、非反応性種に速やかに転換する。潜在的反応性部分の例には、その各々の全体が出典明示によりここに援用される、国際公開第２０１５１２４７０３Ａ１号に記載されているもののようなキノンメチド（ＱＭ）アナログ、及び国際公開第２０１２００３４７６Ａ２号に記載されているもののようなチラミドコンジュゲートが含まれる。幾つかの例では、シグナル伝達コンジュゲートは、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯパープル）、及びローダミン１１０（ローダミン）のような色素に直接コンジュゲートした潜在的反応性部分を含む。他の例では、潜在的反応性部分は、特異的結合対の一方のメンバーに結合し、色素は特異的結合対の他方のメンバーに結合する。他の例では、潜在的反応性部分は特異的結合対の一方のメンバーに結合し、酵素は特異的結合対の他のメンバーに結合し、ここで、酵素は（ａ）発色基質と反応して色素の生成をなすか、又は（ｂ）色素と反応して色素（ＤＡＢなど）の沈着をもたらす。特異的結合対の例には、
（１）潜在的反応性部分に結合したビオチン又はビオチン誘導体（例えばデスチオビオチン）と、色素又は発色基質と反応性であるかもしくは色素と反応性である酵素（例えば、色素がＤＡＢである場合、ビオチン結合タンパク質に結合したペルオキシダーゼ）に結合したビオチン結合体（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシル化されたアビジン（例えば、ニュートラアビジン）、そのビオチン結合部位にニトロ化チロシンを有するビオチン結合性タンパク質（例えば、ＣＡＰＴＡＶＩＤＩＮ））；及び
（２）潜在的反応性部分に結合したハプテンと、色素又は発色基質と反応性であるかもしくは色素と反応性である酵素（例えば、色素がＤＡＢである場合、ビオチン結合タンパク質に結合したペルオキシダーゼ）に結合した抗ハプテン抗体
が含まれる。
【００５９】
幾つかの実施態様では、多重アッセイ、キット、及び方法において利用される検出試薬は、色素と組織試料上への色素の沈着に有用な試薬とを含む。而して、幾つかの実施態様では、検出試薬は標識用コンジュゲートを含み、発色基質、シグナル伝達コンジュゲート、又は酵素反応性色素の一つを更に含む。他の実施態様では、検出試薬は標識用コンジュゲートを含み、発色基質、シグナル伝達コンジュゲート、又は酵素反応性色素の一つを更に含む。
【００６０】
一次検出プローブと検出試薬の特定の構成には、表２に示すものが含まれる。当業者には理解されるように、一次抗体の各々の検出は同じであってもよく、又は異なっていてもよい。
2018536163.tif 000004
2018536163.tif 000005
2018536163.tif 000006
2018536163.tif 000007
2018536163.tif 000008
2018536163.tif 000009
2018536163.tif 000010
特定の実施態様では、表２に示す検出プローブは抗体である。
【００６１】
本方法での使用に適した検出試薬を含む市販の検出試薬又はキットの非限定的な例には、ＶＥＮＴＡＮＡ ｕｌｔｒａＶｉｅｗ検出システム（ＨＲＰ及びＡＰを含む酵素にコンジュゲートした二次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ ｉＶＩＥＷ検出システム（ビオチン化抗種二次抗体及びストレプトアビジンコンジュゲート酵素）；ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ検出システム（ＯｐｔｉＶｉｅｗ）（ハプテンにコンジュゲートした抗種二次抗体及び酵素多量体にコンジュゲートした抗ハプテン三次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ増幅キット（一次抗体の結合部位に沈着した酵素の数を増大させるために上記ＶＥＮＴＡＮＡ検出システムの何れかと共に使用できる非コンジュゲート二次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ増幅システム（ハプテンにコンジュゲートした抗種二次抗体、酵素多量体にコンジュゲートした抗ハプテン三次抗体、及び同じハプテンにコンジュゲートしたチラミド。使用時に、二次抗体を試料と接触させて一次抗体へ結合させる。ついで、試料を抗ハプテン抗体と共にインキュベートして、酵素の二次抗体への会合を生じさせる。ついで、試料をチラミドと共にインキュベートして、更なるハプテン分子の沈着を生じさせる。ついで、試料を再び抗ハプテン抗体と共にインキュベートして更なる酵素分子の沈着をもたらす。ついで、試料を検出可能部分と共にインキュベートして色素沈着を生じさせる）；それぞれがＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）から入手可能な、ＶＥＮＴＡＮＡ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＯｍｎｉＭａｐ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＵｌｔｒａＭａｐ抗ハプテン抗体、二次抗体、色素原、フルオロフォア、及び色素キット；ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ及びＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ＋ＩＨＣ検出システム（抗体に対して高い比率の酵素を有するコンパクトポリマーにＨＲＰ又はＡＰと共に直接重合された二次抗体）；及びＤＡＫＯ ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ＋システム（二次抗体にコンジュゲートされた酵素標識ポリマー）が含まれる。
【００６２】
また更なる実施態様では、検出試薬は、組織検体に導入されたときに検出可能部分が異なる色（例えば、黄色、青色、フクシア色）を提供するように選択される。幾つかの実施態様では、検出可能部分は、互いの間の良好なコントラスト、すなわち光学的に認識可能であり及び／又は異なって染色された（例えば褐色と紫色）標的の検出を（手作業で又は自動化された方法によって）容易にする助けとなる色の分離をもたらすように選択される。例えば、図５は、幾つかの色素原の吸光度スペクトルを示すグラフを提供する。図示されているように、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルは、他の色素原の吸光度ピークと比較して、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルの狭い吸光度ピークのために、多重アッセイにおいてＤＡＢと組み合わせて使用される場合、図５に列挙された他の色素原よりも優れていると考えられる。図４Ａから４Ｃに示されるように、そのような色の組み合わせは、良好なコントラストとＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の明確な同定をもたらし、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞をＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞から区別することを可能にする。
【００６３】
他の実施態様では、基質又はシグナル伝達コンジュゲートは、任意の検出可能部分のピークの検出可能な波長が互いに重なり合わず、病理学者又は光検出器（例えば、スキャナ）によって容易に検出可能となるように選択される。幾つかの実施態様では、検出可能部分は、異なる検出可能部分のピーク波長が少なくとも約５０ｎｍ離れているように選択される。他の実施態様では、検出可能部分は、異なる検出可能部分のピーク波長が少なくとも約７０ｎｍ離れているように選択される。更に他の実施態様では、検出可能部分は、異なる検出可能部分のピーク波長が少なくとも約１００ｎｍ離れているように選択される。
【００６４】
幾つかの実施態様では、任意の多重アッセイにおける基質の適用の順序付けが重要である。例えば、特定の基質は、ある特定の標的を他の特定の標的と比較して検出するために使用される場合、それほど高感度ではない可能性がある。更に、適切な順序付けは、互いに近接したシグナルのマスキングを防止しうると考えられる。幾つかの実施態様では、適用される第一の検出試薬はＰＤ−Ｌ１に特異的であり、適用される第２の検出試薬は少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的である。
【００６５】
［多重検出方法］
幾つかの実施態様では、本開示は、組織試料内の標的（例えば、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞及び免疫細胞）の多重検出のための方法を提供する。ここに記載される所定の非限定的な実施態様及び実施例は、明視野顕微鏡法を利用する一次抗体の間接的検出を提供しうるが、当業者には、ここで使用される検出プローブが一次抗体に限定されるものではなく、利用される任意の検出プローブが直接的又は間接的に検出され得、検出は、当業者に知られているように、色素原、フルオロフォア、量子ドット等々を用いて容易にすることができることが分かるであろう。
【００６６】
従来技術の方法と比較して、本開示の多重アッセイ及び方法は、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の検出精度の改善とより効率的なワークフローを可能にする。実際、本開示の多重アッセイ及び方法は、組織試料の単一のスライド上で、かつ一次染色（例えば、ヘマトキシリン・エオシン染色（「Ｈ＆Ｅ」））で染色されたスライドとＰＤ−Ｌ１バイオマーカーのＩＨＣアッセイで染色されたスライド間で交換する必要なく、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の同定を可能にする。ここに開示される方法とは対照的に、従来技術の方法は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞及びＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の双方を染色するために単一の検出プローブを利用し、染色された組織試料の分析及びスコア化は、病理学者が一次染色で染色されたスライドとＩＨＣによって染色されたものを交互にすることが必要であった。例えば、従来技術の方法によれば、病理学者は先ずＨ＆Ｅ染色スライド中の腫瘍組織を同定し、ついでＩＨＣ染色スライドに切り替えてＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞を同定する。その後、病理学者はＨ＆Ｅ染色スライドに戻って、陽性領域内の免疫細胞を同定した後、再びＨＣ染色スライドに戻って免疫細胞ＰＤ−Ｌ１陽性を評価する。他方、開示された方法は、２工程のみ、すなわち、一次Ｈ＆Ｅ染色を伴う腫瘍の同定と、続く単一スライド上のＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つの免疫細胞マーカーとを共発現する陽性染色腫瘍細胞及び免疫細胞の同定を必要とする。本出願人が優れた結果を達成したのは二次バイオマーカーの取り込みによるものである。
【００６７】
幾つかの実施態様では、多重検出の方法は、（ｉ）ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、及び（ｉｉ）免疫細胞が検出されうるように（例えば、ＰＤ−Ｌ１陽性である免疫細胞とＰＤ−Ｌ１陰性である免疫細胞）、組織試料を少なくとも二つの異なる検出プローブ（例えば、一次抗体）と接触させることを含む。幾つかの実施態様では、組織試料への検出プローブの適用は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞をＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞（特に、浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織であるＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞）から区別することを可能にする。他の実施態様では、検出プローブの組織試料への導入は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、及び／又はＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞を同定及び／又は定量することを可能にする。他の実施態様では、組織試料への検出プローブ及び検出試薬の適用は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞を第一の色（第一の色素原）で識別し、免疫細胞を第二の色（第二の色素原）で識別し、及びＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞を、第一及び第二の色（第一及び第二の色素原）を共発現するとして識別することを可能にする。例えば、図４に示されるように、ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞は褐色（ＤＡＢ）で同定され、免疫細胞はフクシア色（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）で同定され、ＰＤ−Ｌ１陽性である免疫細胞、つまりＰＤ−Ｌ１と免疫細胞マーカーとを共発現する免疫細胞は、褐色及びフクシア色の両方を含むか又は共発現する。
【００６８】
幾つかの実施態様では、本開示の多重アッセイ及び方法は、ＰＤ−Ｌ１に特異的な検出プローブと少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な少なくとも一つの検出プローブとを導入することを含む。幾つかの実施態様では、少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な少なくとも一つの検出プローブは一次抗体である。少なくとも一つの免疫細胞マーカーを検出するための一次抗体に関して、当業者は、各一次抗体が異なる免疫細胞マーカーに特異的である複数の一次抗体を利用できることを認識するであろう。例えば、抗ＣＤ４抗体は、抗ＣＤ８抗体と一緒に（同時に又は逐次的に）導入することができ、ここで、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体の各々は、同じ又は異なる色素原（又は他の検出試薬）を用いて間接的に検出することができる。他の実施態様では、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、及び抗ＣＤ８抗体からなる群から選択される一次抗体と共に、抗ＣＤ４５ＬＣＡ抗体を（同時に又は逐次的に）導入することができ、再び、免疫細胞マーカーに特異的な抗体の各々は、同じ又は異なる色素原（又は他の検出試薬）を用いて検出することができる。他の実施態様では、少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な単一の検出プローブのみ（例えば、抗ＣＤ４５ＬＣＡ一次抗体）が利用される。
【００６９】
図６及び７は、本開示の方法の所定の実施態様の工程を描写するフローチャートを提供する。特に、本方法は、工程１において、試料が検出プローブ（例えば、ＰＤ−Ｌ１に特異的な一次抗体）と接触させられる多重検出スキームを記載する。検出プローブが試料中に導入されると、それが検出プローブ−標的複合体（例えば、一次抗体−標的複合体）を形成する。次の工程２は、試料を検出試薬と接触させることを含む。検出試薬は、図７の工程３ａ及び３ｂに示されるように、（ｉ）標識用コンジュゲートと、（ｉｉ）発色基質又はシグナル伝達コンジュゲートとを含みうる。更に続く工程４は、試料を酵素阻害組成物と接触させること（又は、検出試薬を含む酵素及び／又は抗体スタックが阻害又は変性される工程）を含む。ダッシュ線は、工程１から４のプロセスが一又は複数回反復されて、組織試料内の複数の異なる標的（例えば、免疫細胞マーク；他の腫瘍マーカー）の逐次的な多重検出を提供しうることを示している。本方法はまた試料を光で照らす工程５と、工程６で標的を検出することを含む。検出は、手作業でも自動化されてもよく、場合によってはコンピュータシステム及び／又は撮像システムに結びつけることができる。
【００７０】
図６及び７に提供された実施態様の代替態様として、異なる検出プローブのそれぞれを同時に又は逐次的に、また何らかの検出試薬が添加される前に、加えることができる。例えば、第一の検出プローブを加えた後、第二の検出プローブ（そして、アッセイによって必要とされる場合には「ｎ」個の更なる検出プローブ）を導入してもよい。続いて、第一の検出試薬を加えることができ、続いて、第一の検出試薬と共に含まれる任意の酵素及び／又は関連する抗体の変性、阻害、及び／又は溶出が続く。その工程に続いて、提供された「ｎ」個の検出プローブに基づいて、第二の検出試薬と任意の更なる「ｎ」個の指示試薬を添加することができる。その時点で、第一及び第二の検出試薬を同時に検出することができる。
【００７１】
本開示による多重アッセイの更なる例として、（例えば、ＰＤ−Ｌ１又は免疫細胞マーカーの一つに特異的な）第一の標的に特異的な第一の一次抗体を組織試料に導入する。幾つかの実施態様では、第一の一次抗体は、検出可能な第一の標的−抗体コンジュゲート複合体を形成する。同時に又はその後に、第二の標識を含む第二の標的（例えば、他のＰＤ−Ｌ１又は免疫細胞マーカー）に特異的な第二の一次抗体を試料に導入して、第二の標的−抗体コンジュゲートを形成する。他の標的に特異的な第三、第四及び第ｎの更なる検出プローブ（「ｎ」個の標的検出プローブ複合体を形成する）を、再び第一及び／又は第二の一次抗体と逐次的に又は同時に、更に導入してもよい。検出プローブは沈着後、もちろんそれらの構成に応じて、直接的又は間接的に検出されうる。幾つかの実施態様では、標的の検出を可能にするために更なる検出試薬が導入され、その更なる検出試薬はここに記載のものを含む。幾つかの実施態様では、第一、第二及び第ｎの検出試薬の各々が、（ｉ）検出プローブの各々に特異的な二次抗体であって、酵素にコンジュゲートされている二次抗体と；（ｉｉ）発色基質であって；第一、第二及び第ｎの発色基質の各々が異なるものを含む、第一、第二及び第ｎの検出試薬が導入される。
【００７２】
幾つかの実施態様では、多重検出法は、（ｉ）生物学的試料を第一の検出プローブ（例えば、ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ４５ＬＣＡに特異的な一次抗体の一つ）と接触させて第一の抗体−標的複合体を形成する工程；（ｉｉ）生物学的試料を、第一の標識用コンジュゲートであって第一の酵素を含む第一の標識用コンジュゲート（ここで第一の標識用コンジュゲートは第一の検出プローブに特異的に結合し、標的を酵素で標識するように構成された抗種抗体である）と接触させる工程；（ｉｉｉ）生物学的試料を、第一の潜在的反応性部分及び第一の検出可能部分を含む第一のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程；（ｉｖ）試料を第一の酵素不活性化組成物と接触させて、生物学的試料に含まれる第一の酵素を実質的に不活性化又は完全に不活性化させることなどにより、第一の酵素を不活性化する工程を含む。幾つかの実施態様では、加えられた第一の検出プローブは、ＰＤ−Ｌ１に特異的な一次抗体、例えば抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。幾つかの実施態様では、第一のシグナル伝達コンジュゲートは、適切な酵素と反応したとき、適切な条件下で、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル、Ｃｙ５、ローダミン及びＤＡＢＳＹＬからなる群から選択される色素を沈着させる化学部分に結合した色素を含む。他の実施態様では、第一のシグナル伝達コンジュゲートはＤＡＢを基質として含む。
【００７３】
第一の酵素の不活性化後（任意工程）、多重方法は、（ｖ）生物学的試料を第二の検出プローブ（例えば、ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ４５ＬＣＡに特異的な一次抗体の他方）と接触させて、第二抗体−標的複合体を形成する工程；（ｖｉ）生物学的試料を、第二の標識用コンジュゲートであって第二の酵素を含む第二の標識用コンジュゲート（ここで第二の標識用コンジュゲートは第二の検出プローブに特異的に結合し、標的を酵素で標識するように構成された抗種抗体である）と接触させる工程；（ｖｉｉ）生物学的試料を、第二の潜在的反応性部分及び第二の検出可能部分を含む第二のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程；（ｖｉｉｉ）試料を第一の酵素不活性化組成物と接触させて、生物学的試料に含まれる第一の酵素を実質的に不活性化又は完全に不活性化させることなどにより、第二の第二酵素を不活性化する工程を更に含む。幾つかの実施態様では、加えられる第二の検出プローブは、腫瘍細胞マーカーに特異的な一次抗体、例えば抗ＣＤ４５ＬＣ抗体である。幾つかの実施態様では、第二のシグナル伝達コンジュゲートは、第二の検出可能部分が第一の検出可能部分とは異なる、ＤＡＢ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル、Ｃｙ５、ローダミン及びＤＡＢＳＹＬからなる群から選択される検出可能部分を含む。他の実施態様では、第二のシグナル伝達コンジュゲートは、基質としてＱＭ−ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープルを含む。
【００７４】
第二の酵素の不活性化後、前記方法を、他の標的（例えば、他の免疫細胞受容体、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＰＶ、ＡＬＫ等々）の検出を達成するために、更なる検出プローブ（例えば、一次抗体又は核酸プローブ）が更なる検出試薬と共に導入されうるように繰り返すことができる。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１以外の腫瘍マーカーを検出するために第三の検出プローブを導入する。一次抗体（及び他の検出プローブ）及びそれぞれの検出試薬又はキットの全ての導入後、前記方法は、第一、第二、及び第ｎの検出可能部分から（手作業又は自動化方法を介して）シグナルを検出する工程を更に含み、第一、第二及び第ｎの検出可能部分の各々がそれぞれ異なる。あるいは、ここに記載されるように、検出プローブの各々は、同時又は逐次的に加えることができるが、任意の標識用コンジュゲートが添加される前である。別の例として、任意の検出試薬の導入前に、工程１において三つの検出プローブが逐次的に適用されうる。
【００７５】
複数の試薬が逐次的に検出される多重アッセイの場合、連続する検出工程間で任意の試薬又は内因性酵素を実質的に不活性化（例えば、９０％を超える不活性化）させることが望ましい。結果として、何れか一つの検出工程に存在する酵素は、後の検出工程における酵素と干渉しないと考えられる。これはひいては多重アッセイで使用される異なる色素原の視覚化及び検出を改善すると考えられる。当該技術分野で知られている任意の酵素不活性化組成物をこの目的のために使用することができる。幾つかの実施態様では、酵素不活性化組成物を適用して、各検出工程後に試薬又は内因性酵素を不活性化する。例示的な酵素不活性化組成物及び方法は、同時係属中の米国特許出願第６２／１５９２９７号に開示されており、その開示は、その全体が出典明示によりここに援用される。
【００７６】
幾つかの実施態様では、変性工程が、第一の検出試薬セットにおいて使用される酵素が第二の基質に作用するのを防止する。幾つかの実施態様では、変性剤は、第一の検出試薬セット中の酵素を変性させる物質である。幾つかの実施態様では、変性剤は、例えばホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、又はその誘導体である。アルキル置換アミドの例には、Ｎ−プロピルホルムアミド、Ｎ−ブチルホルムアミド、Ｎ−イソブチルホルムアミド、及びＮ，Ｎ−ジプロピルホルムアミドが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施態様では、変性剤はバッファー中に提供される。幾つかの実施態様では、第一の標的プローブ検出酵素、例えばアルカリホスファターゼを変性させるのに十分な時間及び条件下で、試料を変性剤で処理する。幾つかの実施態様では、試料は約３７℃で約１５から約３０分間、好ましくは約２０から２４分間変性剤で処理される。幾つかの実施態様では、試料は、第二の核酸プローブの標的へのハイブリダイゼーションを保存しながら標的酵素を変性させるのに十分な時間及び条件下で変性剤で処理される。
【００７７】
シグナル伝達コンジュゲート又は基質を生物学的試料と共に導入するのに適した条件が使用され、典型的には、過酸化物（例えば、過酸化水素）を含み、酵素がその所望の機能を実施するのを可能にするか又は容易にするのに適した塩濃度及びｐＨを有する反応バッファー又は溶液を提供することを含む。一般に、前記方法のこの工程は、約３５℃から約４０℃の範囲の温度で実施されるが、当業者は、選択された酵素及びシグナル伝達コンジュゲートに適した適当な温度範囲を選択することができるであろう。例えば、これらの条件は、酵素と過酸化物が反応して、シグナル伝達コンジュゲートの潜在的反応性部分上でのラジカル形成を促進することを可能にすると考えられる。潜在的な反応性部分、従ってシグナル伝達コンジュゲート全体は、生物学的試料上、特に固定化酵素コンジュゲートに近接する一又は複数のチロシン残基、酵素コンジュゲートの酵素部分のチロシン残基、及び／又は酵素コンジュゲートの抗体部分のチロシン残基に共有結合的に沈着するであろう。ついで、生物学的試料を光で照らし、標的は、シグナル伝達コンジュゲートの検出可能部分によって生成される光の吸光度によって検出されうる。
【００７８】
多重アッセイ、方法及びシステムは、完全に手作業であってもよく、又は自動化された工程を含んでいてもよい。幾つかの実施態様では、自動化された方法は、自動化されたＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置で実施されうる。自動化されたＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置は、典型的には、染色プロトコルをスライド上に実施するために試薬を分注するための少なくとも染色ユニットを含む。市販の染色ユニットは、典型的には次の原理の一つで動作する：（１）スライドを水平に配置し、組織試料を含むスライドの表面上に液たまりとして試薬を分配する開放された個々のスライド染色（例えば、ＤＡＫＯ ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ Ｌｉｎｋ４８（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｉｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）染色装置で実施）；（２）試薬を、試料上に沈着した不活性の流体層で覆うか、又は該層を通して分配する液体オーバーレイ技術（例えば、ＶＥＮＴＡＮＡ ＢｅｎｃｈＭａｒｋ及びＤＩＳＣＯＶＥＲＹ染色装置で実施）；（３）スライド表面を別の表面（別のスライドであるか又はカバープレートでもよい）に平行に近接して配置して狭い間隙をつくり、その間隙を通して毛細管力が液体試薬を吸い上げ試料と接触させるキャピラリー間隙染色（例えば、ＤＡＫＯ ＴＥＣＨＭＡＴＥ、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ、及びＤＡＫＯ ＯＭＮＩＳ染色装置によって使用される染色原理）。（例えばＤＡＫＯ ＴＥＣＨＭＡＴＥ及びＬｅｉｃａ ＢＯＮＤでは）キャピラリー間隙染色の幾らかの繰り返しは、間隙内の液体を混合しない。キャピラリー間隙染色の他の変形態様では、間隙がスライドと湾曲表面との間につくり出され、表面同士の互いの移動が混合をなす（米国特許第７８２０３８１号参照）平行移動間隙技術；及びキャピラリー間隙染色と同様の毛細管力を使用してスライドに試料を適用し、ついで平行表面を互いに平行移動させてインキュベーション中に試薬を攪拌して試薬混合を行う動的間隙染色におけるように、試薬が間隙内で混合される（例えば、ＤＡＫＯ ＯＭＮＩＳスライド染色装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）で実施される染色原理）。最近、インクジェット技術を使用して試薬をスライド上に沈着させることが提案されている。国際公開第２０１６−１７０００８Ａ１号を参照のこと。この染色原理のリストは網羅的なものではなく、本方法及びシステムは、適切な試薬を試料に適用するために使用することができる任意の染色技術（未知のもの及び将来開発されるもの）を含むものとする。
【００７９】
検体がパラフィンに包埋された試料である場合、試料は適切な脱パラフィン流体を使用して手作業で又は自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置で脱パラフィンされうる。廃棄物除去剤が脱パラフィン流体を除去した後、任意の数の物質が検体に連続して適用されうる。物質は、前処理（例えば、タンパク質架橋、核酸曝露など）、変性、ハイブリダイゼーション、洗浄（例えば、ストリンジェンシー洗浄）、検出（例えば、視覚又はマーカー分子をプローブに関連付ける）、増幅（例えば、タンパク質、遺伝子などの増幅）、対比染色、カバースリッピング等々のためでありうる。
【００８０】
自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置は、検体に広範囲の物質を適用することができる。前記物質には、限定されないが、染色剤、プローブ、試薬、リンス、及び／又はコンディショナーが含まれる。物質は、流体（例えば、気体、液体、又は気／液混合物）などでありうる。流体は、溶媒（例えば、極性溶媒、非極性溶媒など）、溶液（例えば、水溶液又は他のタイプの溶液）などでありうる。試薬は、限定されないが、染色剤、湿潤剤、抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など）、抗原回収流体（例えば、水性又は非水性系の抗原回収溶液、抗原回収バッファーなど）等々を含みうる。プローブは、検出可能な標識又はレポーター分子に結合した、単離された核酸又は単離された合成オリゴヌクレオチドでありうる。標識は、放射性同位体、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光又は蛍光剤、ハプテン、及び酵素を含みうる。
【００８１】
ｉｔｅｌｌｉＰＡＴＨ（Ｂｉｏｓｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）、ＷＡＶＥ（Ｃｅｌｅｒｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＤＡＫＯ ＯＭＮＩＳ及びＤＡＫＯ ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ ＬＩＮＫ４８（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ、及びＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）自動スライド染色装置を含む自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置の特定の例は、その全体が出典明示によりここに援用されるPrichard, Overview of Automated Immunohistochemistry, Arch Pathol Lab Med., Vol. 138, pp. 1578-1582 (2014)に記載されている。加えて、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、その各々の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第５６５０３２７号、第５６５４２００号、第６２９６８０９号、第６３５２８６１号、第６８２７９０１号及び第６９４３０２９号、並びに米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び第２００４００５２６８５号を含む、自動分析を実施するためのシステム及び方法を開示する多くの米国特許の譲受人である。あるいは、検体は手作業で処理されうる。
【００８２】
検体が染色された後（手作業か又は自動スライド染色装置で）、染色されたスライドは、明視野イメージャスライドスキャナで画像化されうる。基本レベルでは、スライドスキャナは、染色された試料の代表的なデジタル画像を作成する。典型的な明視野スライドスキャナは、少なくとも、（１）対物レンズを有する顕微鏡、（２）光源（ハロゲン、発光ダイオード、白色光及び／又はマルチスペクトル光源など）、（３）ガラススライドを回りに移動させる（又はスライドの回りに光学素子を移動させる）ロボット、（４）画像キャプチャ用の一又は複数のデジタルカメラ、（５）ロボットを制御し、デジタルスライドを操作し、管理し、及び見るためのコンピュータ及び関連ソフトウェアを含む。スライド上の多くの異なるＸＹ位置（場合によっては複数のＺ面）のデジタルデータが、カメラの電荷結合素子（ＣＣＤ）によってキャプチャーされ、画像が互いに結合されてスキャン面全体の合成画像が形成される。達成する一般的方法は次を含む：
（１）スライドステージ又は光学素子を非常に小さな増分で移動させて、隣接する正方形と僅かに重なる正方形の画像フレームをキャプチャーする。ついで、キャプチャーされた正方形を自動的に互いにマッチさせて合成画像を構築する、タイルベーススキャニング；及び
（２）取得中にスライドステージが単一の軸で動いて多数の合成画像「ストリップ」をキャプチャーするラインベーススキャニング。次に、画像ストリップを互いにマッチさせて、より大きな合成画像を形成することができる。ある場合には、
【００８３】
様々な明視野スキャナの詳細な概説は、その内容の全体が出典明示によりここに援用されるFarahani等, Whole slide imaging in pathology: advantages, limitations, and emerging perspectives, Pathology and Laboratory Medicine Int’l, Vol. 7, p. 23-33 (June 2015)に見出すことができる。スライドスキャナの例には、３ＤＨｉｓｔｅｃｈ ＰＡＮＮＯＲＡＭＩＣ ＳＣＡＮ ＩＩ；ＤｉｇｉＰａｔｈ ＰＡＴＨＳＣＯＰＥ；Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＮＡＮＯＺＯＯＭＥＲ ＲＳ、ＨＴ、及びＸＲ；Ｈｕｒｏｎ ＴＩＳＳＵＥＳＣＯＰＥ ４０００、４０００ＸＴ、及びＨＳ；Ｌｅｉｃａ ＳＣＡＮＳＣＯＰＥ ＡＴ、ＡＴ２、ＣＳ、ＦＬ、及びＳＣＮ４００；Ｍｉｋｒｏｓｃａｎ Ｄ２；Ｏｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０−ＳＬ；Ｏｍｎｙｘ ＶＬ４、及びＶＬ１２０；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＭＩＮＡ；Ｐｈｉｌｉｐｓ ＵＬＴＲＡ−ＦＡＳＴ ＳＣＡＮＮＥＲ；Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＶＩＳＩＯＮＴＥＫ；Ｕｎｉｃ ＰＲＥＣＩＣＥ ５００、及びＰＲＥＣＩＣＥ ６００ｘ；ＶＥＮＴＡＮＡ ＩＳＣＡＮ ＣＯＲＥＯ及びＩＳＣＡＮ ＨＴ；及びＺｅｉｓｓ ＡＸＩＯ ＳＣＡＮ．Ｚ１が含まれる。他の例示的なシステム及び特徴は、例えば、ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳと題された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２号（特許公開番号：国際公開第２０１１／０４９６０８号）に見出すことができ、又はＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＡＳＳＥＴＴＥＳ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥと題された２０１１年９月９日出願の米国特許出願第６１／５３３１１４号に開示されている。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２号及び米国特許出願第６１／５３３１１４号は、それらの実体が出典明示により援用される。
【００８４】
スライドスキャナによって作成されたデジタル画像は、様々なデジタル病理ソフトウェアパッケージを使用して更に解析されうる。これらのコンピュータプログラムは、典型的には、デジタル画像の各ピクセルにおけるシグナルチャネルのシグナル強度を測定することによって動作する。ついで、例えばオブジェクトを識別し、平均シグナル強度、画像全体又は関心のある特定の領域における染色の面積等々を含む、様々な色素に相関するシグナルについての様々な統計を計算するために、様々なアルゴリズムをそれから生成されたシグナルデータに適用することができる。加えて、これらのソフトウェアパッケージは、多くの場合、ズームイン及びズームアウト、様々な関心領域を識別する、オブジェクト及び／又は領域に注釈を付ける等々を含む、ユーザが画像を操作することを可能にする機能を有する。これらのソフトウェアパッケージの例には、ＶＥＮＴＡＮＡ ＶＩＲＴＵＯＳＯ（Ｒｏｃｈｅ）；Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ ＴＩＳＳＵＥ ＳＴＵＤＩＯ、ＤＥＶＥＬＯＰＥＲ ＸＤ、及びＩＭＡＧＥ ＭＩＮＥＲ；並びにＶｉｓｏｐｈａｒｍ ＢＩＯＴＯＰＩＸ、ＯＮＣＯＴＯＰＩＸ、及びＳＴＥＲＥＯＴＯＰＩＸソフトウェアパッケージが含まれる。
【００８５】
［検出キット］
また開示されるのは、（ｉ）ＰＤ−Ｌ１に特異的な検出プローブと、（ｉｉ）少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な少なくとも一つの検出プローブとを含むシステム及びキットである。幾つかの実施態様では、キットは、ＰＤ−Ｌ１と免疫細胞マーカーとを発現する免疫細胞を共染色するために使用される。幾つかの実施態様では、キットは、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１免疫細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、及びＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞が同定され及び／又は互いに区別されるように、組織試料を染色するために使用される。幾つかの実施態様では、キットは、腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞を検出及び／又は定量することを可能にし、腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の検出及び／又は定量の結果は、ＰＤ−Ｌ１標的療法に対する応答を予測するために単独で又は他のデータ（例えば、組織試料スコア化の結果）と組み合わせて使用されうる。幾つかの実施態様では、開示されたキットを用いた組織染色の結果は、がんがＰＤ−Ｌ１を発現又は過剰発現する腫瘍細胞を含むがんの治療のような、治療の過程（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１療法又は抗ＰＤ−Ｌ１剤を用いた併用療法）を決定するために医療従事者によって使用されうる。
【００８６】
幾つかの実施態様では、キットに使用される検出プローブは一次抗体である。他の実施態様では、キットに使用される検出プローブは、核酸プローブである。他の実施態様では、キットに使用される検出プローブは、一次抗体と核酸プローブとの組み合わせを含む。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１に特異的な検出プローブは一次抗体、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。幾つかの実施態様では、少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な検出プローブは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、及びＣＤ４５ＬＣＡの少なくとも一つに特異的な一次抗体である。幾つかの実施態様では、第一の一次抗体は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＳＰ１４２）である。幾つかの実施態様では、第二の一次抗体は抗ＣＤ４５ＬＣＡ抗体（ＲＰ２／１８）である。
【００８７】
幾つかの実施態様では、キットは、一又は複数の検出試薬又は検出キットを更に含む。幾つかの実施態様では、キットは、第一の一次抗体に特異的な第一の標識用コンジュゲートと、第二の一次抗体に特異的な第二の標識用コンジュゲートを更に含む。幾つかの実施態様では、キットは、第一及び第二の基質又は第一及び第二のシグナル伝達コンジュゲートを更に含み、第一及び第二の基質又はシグナル伝達コンジュゲートは異なる。標識用コンジュゲート、シグナル伝達コンジュゲート、発色基質、及び／又は色素原は、ここに列挙されたもの又は当業者に知られている他のものの何れかを含みうる。幾つかの実施態様では、キットは、標識用コンジュゲートの酵素に特異的な一又は複数の酵素不活性化組成物を更に含む。
【００８８】
幾つかの実施態様では、キットは、マーカーの多重検出のための指示書又はＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍浸潤リンパ球の存在に基づいて治療の結果を予測するための指示書を含む。他の実施態様では、キットは、腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性リンパ球がＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織を含む組織試料の領域において検出されるかどうかに基づいて、適切な活性医薬成分の投与のための説明書を含む。幾つかの実施態様では、キットは一又は複数の治療剤を含む。キットは、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞（浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織であるＰＤ−Ｌ１陽性リンパ球を含む）の存在及び／又は量に基づいて、特定のがんのステージング又はグレードをスコア化するための指示又はプロトコル及び／又はこれを決定するための指示又はプロトコルを更に含みうる。
【００８９】
キットは、他の試薬、例えば、バッファー、一次染色剤、ブロッキング剤、顕微鏡カバースリップ等々を含みうる。
【００９０】
幾つかの実施態様では、キットは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも一つの他の検出プローブを含みうる。
【００９１】
［組織試料のスコア化］
本開示の別の態様は、ＰＤ−Ｌ１発現に対して腫瘍試料をスコア化する方法であって、組織試料中の腫瘍細胞及び免疫細胞を同定する工程（例えば、ここに記載の多重方法及びキットを利用することによって）；ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞の数及びＰＤ−Ｌ１を発現する免疫細胞の数及び／又は細胞中のＰＤ−Ｌ１発現の相対強度を決定する工程；及びＰＤ−Ｌ１発現に従って腫瘍を分類する工程を含む方法である。幾つかの実施態様では、腫瘍細胞をスコア化するために、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の割合を腫瘍細胞（すなわち、ＰＤ−Ｌ１陽性及びＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞）の総数で割る。幾つかの実施態様では、免疫細胞をスコア化するために、これらの細胞を含む画像内の面積を測定し、ＰＤ−Ｌ１陽性リンパ球（免疫細胞）を含む腫瘍面積の割合をスコア化する。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１の発現は、腫瘍中のＰＤ−Ｌ１タンパク質及び／又はＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡを特異的に検出することによって決定される。幾つかの実施態様では、細胞がＩＨＣによって検出されるＰＤ−Ｌ１タンパク質の少なくとも部分的な膜染色を有する場合、細胞はＰＤ−Ｌ１を発現すると考えられる。幾つかの実施態様では、腫瘍は、手順が当業者に知られているように、改変Ｈスコア（ＭＨＳ）又は改変比率スコア（ＭＰＳ）の一方又は両方に従って分類される。
【００９２】
本開示の更に別の態様は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色され、少なくとも一つの免疫細胞マーカーの存在について染色された腫瘍組織切片におけるＰＤ−Ｌ１発現をスコア化する方法である。幾つかの実施態様では、スコア化プロセスの結果は、抗ＰＤ−Ｌ１療法に対する被験体の応答を予測するために、またがんの患者を治療する方法において、例えば治験における登録基準として、抗ＰＤ−Ｌ１療法による治療のための患者を選択するために使用されうる。
【００９３】
他の実施態様では、試料は、次に従ってスコア化される：
腫瘍浸潤免疫細胞は、全腫瘍領域における任意の強度の任意の識別可能なＰＤ−Ｌ１（ＳＰ１４２）染色を示すＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞のパーセンテージとしてスコア化することができる（表３参照）。腫瘍領域は、腫瘍細胞と、リンパ球、マクロファージ、及び樹状又は網様形態を有する細胞を含む、関連した腫瘍内及び近接腫瘍周囲間質によって占められる領域として定義される。
2018536163.tif 000011
【００９４】
免疫細胞（ＩＣ）の染色強度：腫瘍浸潤免疫細胞のＰＤ−Ｌ１（ＳＰ１４２）染色の強度を、表４に記載の基準を使用して（通常は情報提供目的で）スコアシートに記録する。
2018536163.tif 000012
【００９５】
腫瘍細胞（ＴＣ）の染色強度：腫瘍細胞（ＴＣ）のＰＤ−Ｌ１（ＳＰ１４２）染色の強度を、表５に記載の基準を使用して（情報提供目的で）スコアシートに記録する。
2018536163.tif 000013
【００９６】
腫瘍細胞を、何らかの識別可能なＰＤ−Ｌ１（ＳＰ１４２）膜染色を示す生存腫瘍細胞のパーセンテージとしてスコア化する（表６）。
2018536163.tif 000014
【００９７】
非特異的な背景染色は、典型的な染色パターンから逸脱する予期しない染色である。非特異的染色は、表７の基準に従ってＰＤ−Ｌ１（ＳＰ１４２）抗体染色ＮＳＣＬＣ試験検体スライド上で評価し、許容可能又は許容不可能と記録する。
2018536163.tif 000015
【００９８】
［治療法に対する応答を予測する方法及び治療方法］
幾つかの実施態様では、ここに開示される多重アッセイ、キット及び方法は、治療法（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１療法又は抗ＰＤ−Ｌ１剤を用いた併用療法）に対する応答を予測するか、予測を補助するために利用でき、あるいはここに開示される任意のアッセイ又は方法の結果を使用して、抗ＰＤ−Ｌ１療法又は抗ＰＤ−Ｌ１剤を用いた併用療法での治療を容易にすることができる。何か特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織内の腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球の存在が、患者が抗ＰＤ−Ｌ１療法又は抗ＰＤ−Ｌ１剤を含む組み合わせ療法／併用療法での治療によく応答しうることの指標であると考えられる。また、腫瘍浸潤リンパ球が、腫瘍増殖を制御しようとして腫瘍内に補充されると考えられる。従って、一部の患者は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織におけるＴＩＬの発現に応じて抗ＰＤ−Ｌ１療法から恩恵を得ることができると考えられる。
【００９９】
従って、幾つかの実施態様は、腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の存在又は非存在についてＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織試料を分析することにより、ＰＤ−Ｌ１標的療法に対する応答を予測する方法であって、ＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つのＣＤマーカーとを共発現する免疫細胞を同定することを含む方法である。幾つかの実施態様では、腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の同定は、腫瘍組織試料をＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の検出プローブと接触させ（て第一の検出プローブ−標的複合体を形成し）、腫瘍組織試料を少なくとも一つのＣＤマーカーに特異的な少なくとも第二の検出プローブと接触させ（て第二の検出プローブ−標的複合体を形成す）ることを含む。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１に特異的な検出プローブは一次抗体、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのＣＤマーカーに特異的な検出プローブは、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、及びＣＤ４５ＬＣＡ抗体から選択される群から選択される抗体である。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１マーカーと少なくとも一つのＣＤマーカーとを共発現する免疫細胞の同定を可能にする検出試薬が導入される。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１マーカーと少なくとも一つの免疫細胞マーカーとを共発現する免疫細胞は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル及びＤＡＢで共染色される。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１標的療法は、アテゾリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びピディリズマブ並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、本方法は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも一つの他の検出プローブを導入することを更に含む。
【０１００】
更に、幾つかの実施態様は、患者からのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織試料が腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性リンパ球を含むかどうかを決定するための分析結果を提供する試験を要求し、患者の腫瘍組織試料がＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞及び腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性リンパ球を発現する場合、患者にＰＤ−Ｌ１標的療法を施すことを含む、患者におけるがんの治療方法である。幾つかの実施態様では、試験は、腫瘍組織試料をＰＤ−Ｌ１に特異的な第一の一次抗体（例えばＳＰ１４２）と少なくとも一つの免疫細胞マーカーに特異的な第二の一次抗体（例えばＲＰ２／１８）とに接触させ、ここで、腫瘍浸潤ＰＤ−Ｌ１陽性リンパ球がＰＤ−Ｌ１と少なくとも一つの免疫細胞マーカーとを共発現する、多重アッセイを含む。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１マーカーと少なくとも一つの免疫細胞マーカーとを共発現する免疫細胞の同定を可能にする検出試薬が導入される。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１マーカーと少なくとも一つの免疫細胞マーカーとを共発現する免疫細胞は、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル及びＤＡＢで共染色される。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１標的療法は、アテゾリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びピディリズマブ、並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。他の実施態様では、ＰＤ−Ｌ１標的療法は、Ｔ細胞刺激療法又は活性医薬成分（生物学的薬剤を含む）と組み合わせられる。幾つかの実施態様では、本方法は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも一つの他の検出プローブを導入することを更に含む。
【０１０１】
幾つかの実施態様では、個体／患者由来の腫瘍組織試料中のＰＤ−Ｌ１発現レベルが予め決められたカットオフ値（例えば対照値）と比較され、この検出及び比較プロセスは自動化されうる（もちろん、検体分析装置及びコンピュータシステムを含みうる）。幾つかの実施態様では、カットオフを超える値は、ＰＤ−Ｌ１の過剰発現を表すと考えられ、カットオフ又はそれ以下の値は、ＰＤ−Ｌ１の発現低下と考えられる。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１の発現レベルが、対照群に確立された５０パーセンタイルと７５パーセンタイルの間のカットオフ値を上回る場合、ＰＤ−Ｌ１の過剰発現が認められる。他の実施態様では、ＰＤ−Ｌ１の発現レベルが対照群の５０パーセンタイルと７０パーセンタイルとの間のカットオフ値を上回る場合、ＰＤ−Ｌ１に対する過剰発現が認められる。更に他の実施態様では、ＰＤ−Ｌ１が過剰発現する（すなわち、定量されたＰＤ−Ｌ１発現レベルがＰＤ−Ｌ１カットオフ値を上回る）場合、個体／患者はＰＤ−Ｌ１療法又は抗ＰＤ−Ｌ１剤を含む併用療法を必要としていると判定される。幾つかの実施態様では、ある量のＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞がある予め決められたカットオフ値を超える場合、患者はＰＤ−Ｌ１標的療法での治療の恩恵を受けうる。
【０１０２】
幾つかの実施態様では、本方法は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも一つの他の検出プローブを導入することを含む。幾つかの実施態様では、本方法は、表８に提供される検出プローブを導入し、導入された検出プローブに対応する表８の活性剤を投与することを含む。
2018536163.tif 000016
【０１０３】
［プロトコル］
表９及び表１０は、多重検出のための二つのプロトコルの概要を示す。当業者には、表９及び１０に概説されたプロトコルは非限定的であり、異なる検出プローブ及び検出試薬が置換されうるように適合化されうることが分かるであろう。
【０１０４】
2018536163.tif 000017
2018536163.tif 000018
2018536163.tif 000019
2018536163.tif 000020
2018536163.tif 000021
2018536163.tif 000022
【０１０５】
2018536163.tif 000023
2018536163.tif 000024
2018536163.tif 000025
2018536163.tif 000026
2018536163.tif 000027
2018536163.tif 000028
【０１０６】
［更なる標的及び検出プローブ］
幾つかの実施態様では、ここに開示される多重アッセイ、キット、及び方法は、ＰＤ−Ｌ１及び免疫細胞マーカーに加えて他の標的を検出することを含む。従って、幾つかの実施態様では、ここでのアッセイ、キット、及び方法は、以下に記載された更なる標的のような、更なる標的を検出するための更なる検出プローブ（例えば、核酸プローブ又は一次抗体又はそれらの任意の組み合わせ）を含む。幾つかの実施態様では、他の標的は、ＰＤ−Ｌ１以外の腫瘍マーカーである。幾つかの実施態様では、アッセイ、キット、及び方法は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１、ＩＤＯ−１、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１６３、及びＣＴＬＡ−４の一又は複数に特異的な検出プローブを含みうる。当業者であれば、任意の数の更なる検出プローブを任意の多重アッセイ、キット又は方法に含めることができることが分かるであろう。当業者ならば、良好なコントラスト（ここで定義）をもたらすか又は色素原、フルオロフォアなどの任意の組み合わせを利用する検出試薬のような、更なる検出プローブを最もよく検出するための適切な検出試薬を選択することもできる。
【０１０７】
本開示全体を通して、標的タンパク質が参照される場合、そのタンパク質に関連する核酸配列もまた標的として使用できることが理解される。幾つかの例では、標的は、例えばウイルスゲノム由来のような、ウイルス、細菌、又は細胞内寄生体などの病原体に由来するタンパク質又は核酸分子である。例えば、標的タンパク質は、疾患に関連する（例えば、相関する、因果関係に関与する等々）標的核酸配列から産生されうる。
【０１０８】
幾つかの実施態様では、標的タンパク質は、新生物（例えば、がん）に関連する標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。新生物細胞、特にがん細胞、例えばＢ細胞及びＴ細胞白血病、リンパ腫、乳がん、結腸がん、神経学的がん等々において、多数の染色体異常（転座及び他の再構成、増幅又は欠失を含む）が同定されている。従って、幾つかの実施態様では、標的分子の少なくとも一部が、試料中の細胞の少なくともサブセットにおいて増幅又は欠失された核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。
【０１０９】
がん遺伝子は幾つかのヒト悪性腫瘍の原因であることが知られている。例えば、染色体１８ｑ１１．２の切断点領域に位置するＳＹＴ遺伝子を含む染色体再構成は、滑膜肉腫軟部組織腫瘍の間で共通である。ｔ（１８ｑ１１．２）転座は、例えば、異なる標識を有するプローブを使用して同定することができる：第一のプローブは、ＳＹＴ遺伝子から遠位に伸びる標的核酸配列から生成されたＦＰＣ核酸分子を含み、第二のプローブは３’又はＳＹＴ遺伝子の近位に伸びる標的核酸配列から生成されたＦＰＣ核酸を含む。これらの標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）に対応する検出プローブがインサイツハイブリダイゼーション手順において使用される場合、ＳＹＴ遺伝子領域にｔ（１８ｑ１１．２）を欠く正常細胞が、ＳＹＴの二つのインタクトなコピーを反映する、（近接した二つのラベルによって作製される）二つの融合を示す。ｔ（１８ｑ１１．２）を有する異常細胞は単一の融合シグナルを示す。
【０１１０】
他の実施態様では、悪性細胞において欠損（喪失）している腫瘍抑制遺伝子である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生された標的タンパク質が選択される。例えば、染色体９ｐ２１上に位置するｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）、及びＤ９Ｓ１７５２を含む）がある種の膀胱がんにおいて欠失される。１番染色体の短腕の遠位領域（例えば、ＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１、及びＳＨＧＣ−１３２２を包含する）及び１９番染色体の動原体周囲領域（例えば、１９ｐ１３−１９ｑ１３）（例えば、ＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２、及びＧＬＴＳＣＲ１を包含する）を含む染色体欠失は、中枢神経系のある種の固形腫瘍の特徴的な分子的特徴である。
【０１１１】
上述の例は、例証の目的のためにのみ提供されており、限定を意図するものではない。腫瘍性形質転換及び／又は増殖と相関する多数の他の細胞遺伝学的異常が当業者に知られている。腫瘍性形質転換と相関があり、開示された方法において有用である、核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される標的タンパク質には、また、ＥＧＦＲ遺伝子（７ｐ１２；ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００７、ヌクレオチド５５０５４２１９−５５２４２５２５）、Ｃ−ＭＹＣ遺伝子（８ｑ２４．２１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００８、ヌクレオチド１２８８１７４９８−１２８８２２８５６）、Ｄ５Ｓ２７１（５ｐ１５．２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子（８ｐ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００８、ヌクレオチド１９８４１０５８−１９８６９０４９）、ＲＢＩ（１３ｑ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１３、ヌクレオチド４７７７５９１２−４７９５４０２３）、ｐ５３（１７ｐ１３．１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１７、補体、ヌクレオチド７５１２４６４−７５３１６４２））、Ｎ−ＭＹＣ（２ｐ２４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００２、補体、ヌクレオチド１５１８３５２３１−１５１８５４６２０）、ＣＨＯＰ（１２ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１２、補体、ヌクレオチド５６１９６６３８−５６２００５６７）、ＦＵＳ（１６ｐ１１．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１６、ヌクレオチド３１０９８９５４−３１１１０６０１）、ＦＫＨＲ（１３ｐ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１３、補体、ヌクレオチド４００２７８１７−４０１３８７３４）、並びに、例えば：ＡＬＫ（２ｐ２３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００２、補体、ヌクレオチド２９２６９１４４−２９９９７９３６）、Ｉｇ重鎖、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１１、ヌクレオチド６９１６５０５４．６９１７８４２３）、ＢＣＬ２（１８ｑ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１８、補体、ヌクレオチド５８９４１５５９−５９１３７５９３）、ＢＣＬ６（３ｑ２７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００３、補体、ヌクレオチド１８８９２１８５９−１８８９４６１６９）、ＭＡＬＦ１、ＡＰ１（１ｐ３２−ｐ３１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００１、補体、ヌクレオチド５９０１９０５１−５９０２２３７３）、ＴＯＰ２Ａ（１７ｑ２１−ｑ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１７、補体、ヌクレオチド３５７９８３２１−３５８２７６９５）、ＴＭＰＲＳＳ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００２１、補体、ヌクレオチド４１７５８３５１−４１８０１９４８）、ＥＲＧ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００２１、補体、ヌクレオチド３８６７５６７１−３８９５５４８８）；ＥＴＶ１（７ｐ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００７、補体、ヌクレオチド１３８９７３７９−１３９９５２８９）、ＥＷＳ（２２ｑ１２．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００２２、ヌクレオチド２７９９４２７１−２８０２６５０５）；ＦＬＩ１（１１ｑ２４．１−ｑ２４．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１１、ヌクレオチド１２８０６９１９９−１２８１８７５２１）、ＰＡＸ３（２ｑ３５−ｑ３７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００２、補体、ヌクレオチド２２２７７２８５１−２２２８７１９４４）、ＰＡＸ７（１ｐ３６．２−ｐ３６．１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００１、ヌクレオチド１８８３００８７−１８９３５２１９）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１０、ヌクレオチド８９６１３１７５−８９７１６３８２）、ＡＫＴ２（１９ｑ１３．１−ｑ１３．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−００００１９、補体、ヌクレオチド４５４３１５５６−４５４８３０３６）、ＭＹＣＬ１（１ｐ３４．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００１、補体、ヌクレオチド４０１３３６８５−４０１４０２７４）、ＲＥＬ（２ｐ１３−ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００２、ヌクレオチド６０９６２２５６−６１００３６８２）及びＣＳＦ１Ｒ（５ｑ３３−ｑ３５；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受託番号ＮＣ−０００００５、補体、ヌクレオチド１４９４１３０５１−１４９４７３１２８）が含まれる。
【０１１２】
他の例では、標的タンパク質は、疾患又は状態に関連するウイルス又は他の微生物から選択される。細胞又は組織試料中のウイルス又は微生物由来標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）の検出は、生物の存在を示す。例えば、標的ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、発がん性又は病原性ウイルス、細菌又は細胞内寄生体（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及び他のプラスモジウム種、リーシュマニア（種）、クリプトスポリジウム・パルバム、エントアメーバ・ヒストリチカ、及び鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、並びにトキソプラズマ、エイメリア、タイレリア、及びバベシア種）のゲノムから選択されうる。
【０１１３】
幾つかの例では、標的タンパク質は、ウイルスゲノム由来の核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。例示的なウイルスと対応するゲノム配列（カッコ内にＧＥＮＢＡＮＫＴＭ−ＲｅｆＳｅｑ受託番号）は、ヒトアデノウイルスＡ（ＮＣ−００１４６０）、ヒトアデノウイルスＢ（ＮＣ−００４００１）、ヒトアデノウイルスＣ（ＮＣ−００１４０５）、ヒトアデノウイルスＤ（ＮＣ−００２０６７）、ヒトアデノウイルスＥ（ＮＣ−００３２６６）、ヒトアデノウイルスＦ（ＮＣ−００１４５４）、ヒトアストロウイルス（ＮＣ−００１９４３）、ヒトＢＫポリオーマウイルス（Ｖ０１１０９；ＧＩ：６０８５１）ヒトボカウイルス（ＮＣ−００７４５５）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＮＣ−００２６４５）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＮＣ−００６５７７）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＮＣ−００５８３１）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＮＣ−００５１４７）、ヒトエンテロウイルスＡ（ＮＣ−００１６１２）、ヒトエンテロウイルスＢ（ＮＣ−００１４７２）、ヒトエンテロウイルスＣ（ＮＣ−００１４２８）、ヒトエンテロウイルスＤ（ＮＣ−００１４３０）、ヒトエリスロウイルスＶ９（ＮＣ−００４２９５）、ヒト泡沫状ウイルス（ＮＣ−００１７３６）、ヒトヘルペスウイルス１（単純ヘルペスウイルス１型）（ＮＣ−００１８０６）、ヒトヘルペスウイルス２（単純ヘルペスウイルス２型）（ＮＣ−００１７９８）、ヒトヘルペスウイルス３（水痘帯状疱疹ウイルス）（ＮＣ−００１３４８）、ヒトヘルペスウイルス４ １型（エプスタイン−バーウイルス１型）（ＮＣ−００７６０５）、ヒトヘルペスウイルス４ ２型（エプスタイン−バーウイルス２型）（ＮＣ−００９３３４）、ヒトヘルペスウイルス５株ＡＤ１６９（ＮＣ−００１３４７）、ヒトヘルペスウイルス５株Ｍｅｒｌｉｎ Ｓｔｒａｉｎ（ＮＣ−００６２７３）、ヒトヘルペスウイルス６Ａ（ＮＣ−００１６６４）、ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（ＮＣ−０００８９８）、ヒトヘルペスウイルス７（ＮＣ−００１７１６）、ヒトヘルペスウイルス８ Ｍ型（ＮＣ−００３４０９）、ヒトヘルペスウイルス８ Ｐ型（ＮＣ−００９３３３）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＮＣ−００１８０２）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＮＣ−００１７２２）、ヒトメタニューモウイルス（ＮＣ−００４１４８）、ヒトパピローマウイルス−１（ＮＣ−００１３５６）、ヒトパピローマウイルス−１８（ＮＣ−００１３５７）、ヒトパピローマウイルス−２（ＮＣ−００１３５２）、ヒトパピローマウイルス−５４（ＮＣ−００１６７６）、ヒトパピローマウイルス−６１（ＮＣ−００１６９４）、ヒトパピローマウイルス−ｃａｎｄ９０（ＮＣ−００４１０４）、ヒトパピローマウィルスＲＴＲＸ７（ＮＣ−００４７６１）、ヒトパピローマウイルス１０型（ＮＣ−００１５７６）、ヒトパピローマウイルス１０１型（ＮＣ−００８１８９）、ヒトパピローマウイルス１０３型（ＮＣ−００８１８８）、ヒトパピローマウイルス１０７型（ＮＣ−００９２３９）、ヒトパピローマウイルス１６型（ＮＣ−００１５２６）、ヒトパピローマウイルス２４型（ＮＣ−００１６８３）、ヒトパピローマウイルス２６型（ＮＣ−００１５８３）、ヒ���パピローマウイルス３２型（ＮＣ−００１５８６）、ヒトパピローマウイルス３４型（ＮＣ−００１５８７）、ヒトパピローマウイルス４型（ＮＣ−００１４５７）、ヒトパピローマウイルス４１型（ＮＣ−００１３５４）、ヒトパピローマウイルス４８型（ＮＣ−００１６９０）、ヒトパピローマウイルス４９型（ＮＣ−００１５９１）、ヒトパピローマウイルス５型（ＮＣ−００１５３１）、ヒトパピローマウイルス５０型（ＮＣ−００１６９１）、ヒトパピローマウイルス５３型（ＮＣ−００１５９３）、ヒトパピローマウイルス６０型（ＮＣ−００１６９３）、ヒトパピローマウイルス６３型（ＮＣ−００１４５８）、ヒトパピローマウイルス６ｂ型（ＮＣ−００１３５５）、ヒトパピローマウイルス７型（ＮＣ−００１５９５）、ヒトパピローマウイルス７１型（ＮＣ−００２６４４）、ヒトパピローマウイルス９型（ＮＣ−００１５９６）、ヒトパピローマウイルス９２型（ＮＣ−００４５００）、ヒトパピローマウイルス９６型（ＮＣ−００５１３４）、ヒトパラインフルエンザウイルス１（ＮＣ−００３４６１）、ヒトパラインフルエンザウイルス２（ＮＣ−００３４４３）、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ＮＣ−００１７９６）、ヒトパレコウイルス（ＮＣ−００１８９７）、ヒトパルボウイルス４（ＮＣ−００７０１８）、ヒトパルボウイルスＢ１９（ＮＣ−０００８８３）、ヒト呼吸器多核体ウイルス（ＮＣ−００１７８１）、ヒトライノウイルスＡ（ＮＣ−００１６１７）、ヒトライノウイルスＢ（ＮＣ−００１４９０）、ヒトスプーマレトロウイルス（ＮＣ−００１７９５）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＮＣ−００１４３６）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス２（ＮＣ−００１４８８）を含む。
【０１１４】
所定の例では、標的タンパク質は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８）などの発がんウイルス由来の核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。他の例では、核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される標的タンパク質は、病原性ウイルス、例えば呼吸器多核体ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳウイルス）、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来である。
【０１１５】
［更なる特定の実施態様］
本発明を、特定の実施態様を参照して説明したが、これらの実施態様は、本発明の原理及び用途の単なる例示であることを理解されたい。従って、例示的な実施態様に多くの変更を加えることができ、添付の特許請求の範囲によって定まる本発明の精神及び範囲から逸脱することなく他の構成を案出しうることが理解される。
【図１Ａ】
2018536163.tif 000029
【図１Ｂ】
2018536163.tif 000030
【図１Ｃ】
2018536163.tif 000031
【図２Ａ】
2018536163.tif 000032
【図２Ｂ】
2018536163.tif 000033
【図２Ｃ】
2018536163.tif 000034
【図３Ａ】
2018536163.tif 000035
【図３Ｂ】
2018536163.tif 000036
【図３Ｃ】
2018536163.tif 000037
【図４Ａ】
2018536163.tif 000038
【図４Ｂ】
2018536163.tif 000039
【図４Ｃ】
2018536163.tif 000040
【図５Ａ】
2018536163.tif 000041
【図５Ｂ】
2018536163.tif 000042
【図６】
2018536163.tif 000043
【図７】
2018536163.tif 000044
【配列表】
2018536163000001.app
【国際調査報告】
2018536163.tif 000045
2018536163.tif 000046
2018536163.tif 000047
2018536163.tif 000048
2018536163.tif 000049
2018536163.tif 000050
2018536163.tif 000051