(57)【要約】  ＰＡＰ１をコードする外因性核酸配列を含むシュッコンカスミソウ植物が提供される。代替的に又は追加的に、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を含むシュッコンカスミソウ植物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＰ１をコードする外因性核酸配列を含むシュッコンカスミソウ植物。
【請求項２】
熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を含むシュッコンカスミソウ植物。
【請求項３】
ＰＡＰ１をコードする外因性核酸配列を含む、請求項２に記載の植物。
【請求項４】
ＰＡＰ１をコードする前記外因性核酸配列は前記植物のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項１又は３に記載の植物。
【請求項５】
ＰＡＰ１をコードする前記外因性核酸配列は多数コピーで前記ゲノムに含まれている、請求項４に記載の植物。
【請求項６】
多倍数体である、請求項１〜３のいずれかに記載の植物。
【請求項７】
４倍体である、請求項１〜６のいずれかに記載の植物。
【請求項８】
Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）多倍数体を含む系統を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の植物。
【請求項９】
Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）を含む系統を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の植物。
【請求項１０】
前記ＰＡＰ１は、配列番号２に示される通りのアミノ酸配列を含む、請求項１，３及び６〜９のいずれかに記載の植物。
【請求項１１】
シアニジンを主要アントシアニンとして含有する花弁を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の植物。
【請求項１２】
前記花弁はさらに、ペオニジンおよびペラルゴニジン誘導体を含む、請求項１１に記載の植物。
【請求項１３】
前記シアニジンはシアニジンマリルグルコシドおよびシアニジンヘキソースを含む、請求項１１に記載の植物。
【請求項１４】
前記シアニジンマリルグルコシドおよび前記シアニジンヘキソースは、ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦ−ＭＳによってアッセイされる場合、前記花弁の総アントシアニン含有量の約８０〜９０％および１０〜２０％でそれぞれ存在する、請求項１３に記載の植物。
【請求項１５】
下記の少なくとも１つを含有する花弁を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載の植物：
（ｉ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるシアニジンマリルグルコシドよりも、シアニジンマリルグルコシドにおける少なくとも１０、２０、５０、１００または１５０倍の増大；
（ｉｉ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）において見出されるシアニジンマリルグルコシドよりも、シアニジンマリルグルコシドにおける少なくとも１０００、２０００、３０００、５０００、８０００または１００００倍の増大；
（ｉｉｉ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるシアニジンヘキソースよりも、シアニジンヘキソースにおける少なくとも１０、２０、５０、１００または１５０倍の増大；
（ｉｖ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるペオニジンクマロイルペントースよりも、ペオニジンクマロイルペントースにおける少なくとも１００、２００、３００、５００または１０００倍の増大；
（ｖ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるシアニジンペントースデオキシヘキソースよりも、シアニジンペントースデオキシヘキソースにおける少なくとも５０、１００、２００または５００倍の増大。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかに記載の植物の一部分。
【請求項１７】
葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織、根、根端、めしべ、葯、花、茎、胚珠、種子および葉柄からなる群から選択される、請求項１６に記載の植物の一部分。
【請求項１８】
前記植物の一部分は、葉、葯、茎、萼片およびめしべからなる群から選択され、かつ、前記植物の一部分は、同じ発達段階および生育条件であるシュッコンカスミソウ品種Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）において見出されるシアニジンレベルよりも高いシアニジンレベルを示す、請求項１７に記載の植物の一部分。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれかに記載の植物の花。
【請求項２０】
切り花である、請求項１９に記載の花。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれかに記載の植物の花粉。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれかに記載の植物の種子。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれかに記載の植物の胚珠。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれかに記載の植物の切断体。
【請求項２５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の植物の細胞を含む組織培養物。
【請求項２６】
前記植物はハイブリッド植物である、請求項１〜２３のいずれかに記載の植物又は植物の一部分。
【請求項２７】
前記植物は同系交配植物である、請求項１〜２３のいずれかに記載の植物又は植物の一部分。
【請求項２８】
前記ハイブリッド植物または同系交配植物は多倍数性である、請求項２６又は２７に記載の植物又は植物の一部分。
【請求項２９】
シュッコンカスミソウ植物を作成する方法であって、
（ａ）請求項１〜２７のいずれかに記載の植物または植物の一部分を別のカスミソウ属植物と交雑させること；
（ｂ）種子を前記交雑の後で回収すること；
（ｃ）前記種子を植え、当該種子を植物に成長させること；および
（ｄ）ハイブリッド植物を選抜すること
を含む方法。
【請求項３０】
前記選抜することが色素形成に従っている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法に従って作成されるハイブリッド植物またはその一部分。
【請求項３２】
植物育種技術を使用して栽培植物を開発する方法であって、請求項１〜２７のいずれかに記載の植物または植物の一部分を自家育種および／または交雑育種のための育種材料の供給源として使用することを含む方法。
【請求項３３】
請求項１〜２７のいずれかに記載の植物を開発する方法であって、
（ａ）シュッコンカスミソウ植物を、ハイブリッド種子を得るために別のシュッコンカスミソウ植物と交雑させること；
（ｂ）前記ハイブリッド種子の植物を成長させること；および
（ｃ）前記植物のうちで、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を示す植物を選抜すること
を含む方法。
【請求項３４】
遺伝子組換えシュッコンカスミソウを作成する方法であって、植物細胞において活性であるシス作用調節要素に機能的に連結される、ＰＡＰ１をコードする核酸配列をシュッコンカスミソウ植物に導入し、それにより、遺伝子組換えシュッコンカスミソウを作成することを含む方法。
【請求項３５】
前記シュッコンカスミソウ植物を多倍数体化プロトコルに供することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記シュッコンカスミソウ植物は、Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）多倍数体の遺伝的背景を有する、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＡＰ１は、配列番号２または配列番号２のホモログにおいて示される通りである、請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、シュッコンカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）植物に関連する。
【０００２】
色は花卉産業における最も重要な形質の１つである。花の色は最も重要な形質であるが、茎および葉の色、パターンおよび色相も重要である；すべてが、商用の切り花、園芸植物および鉢植え植物の品質および望ましさに寄与している。植物の花、茎、葉および他の地上部における色は、２つの主要な群の色素群（カロテノイドおよびアントシアニン）の産生に由来する。生物学的には、カロテノイドが有色体に蓄積し、一方、アントシアニンが液胞に蓄積する。アントシアニンはその色を酸性度により変化させており、したがって、黄色から青色および赤色を経て深い紫色に及ぶ広範囲の様々な色および色相を生じさせる。植物細胞におけるアントシアニン産生は、酵素の大きなネットワークをコードする多数の遺伝子によって組織化されている。種々の植物種におけるアントシアニン産生経路の複雑性および商業的に重要な観賞用植物種のその包括的マークアップに関する知識の不足は、観賞用植物種が合理的に品種改良され、その花、茎、葉および他の地上部における様々なアントシアニンの産生が制御され得ることを妨げている。
【０００３】
ナデシコ科の植物、中でもカスミソウ属の植物は、アントシアニンをその花色素として含有することが知られている。最も一般的な商用品種のＧ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（シュッコンカスミソウ）は主に白色の花を有しており、希な場合には、Ｍｙ  Ｐｉｎｋ（これは、環境条件に依存する色安定性によって特徴づけられる）のように、薄いピンク色からピンク色の花を有する品種が存在する。カスミソウ属の多くの種の中で、Ｇ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａが、切り花として使用される唯一の種であり、そのようなものとして、Ｇ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａは、世界中で最も重要な花卉作物の１つである。このため、カスミソウは、新規な特徴を有する新しい品種を育種するための重要な標的となっている。商用品種の花は通常の場合には不稔性であるので、一般には新規な園芸形質を有する、特に新規な花色を有するカスミソウ属植物を目的とする育種はかなり面倒であり、どちらかといえば不可能である。
【０００４】
追加の背景技術文献は、以下のものを含む：
ｗｗｗ（ｄｏｔ）ａｐｈｉｓ（ｄｏｔ）ｕｓｄａ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｒｅｇ＿ｌｏｉ／Ｄａｎｚｉｇｅｒ＿ＵＳＤＡ＿０１２０１２（ｄｏｔ）ｐｄｆ
ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ（ｄｏｔ）ａｇｒｉ（ｄｏｔ）ｈｕｊｉ（ｄｏｔ）ａｃ（ｄｏｔ）ｉｌ／ｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ／ｐｅｏｐｌｅ／Ａｌｅｘａｎｄｅｒ＿Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ／
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００３／００８８８８８；
Ｍｏｙａｌ  Ｂｅｎ  Ｚｖｉ，Ｍ．，Ｚｕｋｅｒ，Ａ．，Ｏｖａｄｉｓ，Ｍ．，Ｓｈｋｌａｒｍａｎ，Ｅ．，Ｂｅｎ−Ｍｅｉｒ，Ｈ．，Ｚｅｎｖｉｒｔ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．（２００８）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ  Ｌ．）Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ２２：５４３−５５３．
Ｚｕｋｅｒ  Ａ，Ａｈｒｏｎｉ  Ａ，Ｓｈｅｊｔｍａｎ  Ｈ，Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ  Ａ  （１９９７）．Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  ｓｈｏｏｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｌｅａｆ  ｅｘｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ  Ｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１６，７７５−７７８．
Ｍｉｎｔｚ−Ｏｒｏｎ，Ｓ．，Ｍａｎｄｅｌ，Ｔ．，Ｒｏｇａｃｈｅｖ，Ｉ．，Ｆｅｌｄｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｌｏｔａｎ，Ｏ．，Ｙａｔｉｖ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｊｅｔｔｅｒ，Ｒ．，Ｖｅｎｇｅｒ，Ｉ．，Ａｄａｔｏ，Ａ．，ａｎｄ  Ａｈａｒｏｎｉ，Ａ．（２００８）．Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ  ｆｒｕｉｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４７，８２３−８５１。
【発明の概要】
【０００５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＰＡＰ１をコードする外因性核酸配列を含むシュッコンカスミソウ植物が提供される。
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を含むシュッコンカスミソウ植物が提供される。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は、ＰＡＰ１をコードする外因性核酸配列を含む。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＡＰ１をコードする前記外因性核酸配列は前記植物のゲノムに安定的に組み込まれている。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＡＰ１をコードする前記外因性核酸配列は多数コピーで前記ゲノムに含まれている。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は多倍数体である。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は４倍体である。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）多倍数体を含む系統。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は、Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）を含む系統を有する。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は遺伝子組換え植物である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ＰＡＰ１は、配列番号２に示される通りのアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は、シアニジンを主要アントシアニンとして含有する花弁を有する。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記花弁はさらに、ペオニジンおよびペラルゴニジン誘導体を含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記シアニジンはシアニジンマリルグルコシドおよびシアニジンヘキソースを含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記シアニジンマリルグルコシドおよび前記シアニジンヘキソースは、ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦ−ＭＳによってアッセイされる場合、前記花弁の総アントシアニン含有量の約８０〜９０％および１０〜２０％でそれぞれ存在する。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は、下記の少なくとも１つを含有する花弁を有する：
（ｉ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるシアニジンマリルグルコシドよりも、シアニジンマリルグルコシドにおける少なくとも１０、２０、５０、１００または１５０倍の増大；
（ｉｉ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）において見出されるシアニジンマリルグルコシドよりも、シアニジンマリルグルコシドにおける少なくとも１０００、２０００、３０００、５０００、８０００または１００００倍の増大；
（ｉｉｉ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるシアニジンヘキソースよりも、シアニジンヘキソースにおける少なくとも１０、２０、５０、１００または１５０倍の増大；
（ｉｖ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるペオニジンクマロイルペントースよりも、ペオニジンクマロイルペントースにおける少なくとも１００、２００、３００、５００または１０００倍の増大；
（ｖ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるシアニジンペントースデオキシヘキソースよりも、シアニジンペントースデオキシヘキソースにおける少なくとも５０、１００、２００または５００倍の増大。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、前記植物の一部分が提供される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物の前記一部分は、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織、根、根端、めしべ、葯、花、茎、胚珠、種子および葉柄からなる群から選択される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物の一部分は、葉、葯、茎、萼片およびめしべからなる群から選択され、かつ、前記植物の一部分は、同じ発達段階および生育条件であるシュッコンカスミソウ品種Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）において見出されるシアニジンレベルよりも高いシアニジンレベルを示す。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、前記植物の花が提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記花は切り花である。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、前記植物の花粉が提供される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、前記植物の種子が提供される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、前記植物の胚珠が提供される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、前記植物の切断体が提供される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、前記植物の細胞を含む組織培養物が提供される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物はハイブリッド植物である。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は同系交配植物である。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ハイブリッド植物または同系交配植物は多倍数性である。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、シュッコンカスミソウ植物を作成する方法であって、
（ａ）前記植物または植物の一部分を別のカスミソウ属植物（例えば、シュッコンカスミソウ植物）と交雑させること；
（ｂ）種子を前記交雑の後で回収すること；
（ｃ）前記種子を植え、当該種子を植物に成長させること；および
（ｄ）ハイブリッド植物を選抜すること
を含む方法が提供される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記選抜することが色素形成に従っている。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、前記方法に従って作成されるハイブリッド植物またはその一部分が提供される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、植物育種技術を使用して栽培植物を開発する方法であって、前記植物または植物の一部分を自家育種および／または交雑育種のための育種材料の供給源として使用することを含む方法が提供される。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、前記植物を開発する方法であって
（ａ）シュッコンカスミソウ植物を、ハイブリッド種子を得るために別のシュッコンカスミソウ植物と交雑させること；
（ｂ）前記ハイブリッド種子の植物を成長させること；および
（ｃ）前記植物のうちで、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を示す植物を選抜すること
を含む方法が提供される。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、遺伝子組換えシュッコンカスミソウを作成する方法であって、植物細胞において活性であるシス作用調節要素に機能的に連結される、ＰＡＰ１をコードする核酸配列をシュッコンカスミソウ植物に導入し、それにより、遺伝子組換えシュッコンカスミソウを作成することを含む方法が提供される。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、前記シュッコンカスミソウ植物を多倍数体化プロトコルに供することを含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記シュッコンカスミソウ植物は、Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）多倍数体の遺伝的背景を有する。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ＰＡＰ１は、配列番号２または配列番号２のホモログにおいて示される通りである。
【００４３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００４５】
【図１】図１は、Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｓｔａｒｓ（商標）（Ｍ．Ｓ．）の葉から採取される細胞のＤＮＡ含有量を示すグラフである。
【００４６】
【図２】図２は、Ｍ．Ｓ．多倍数体の葉から採取される細胞のＤＮＡ含有量を示すグラフである。
【００４７】
【図３】図３は、ｐＨＡＰＡＰ（２０３５ｂｐ）にクローニングされるシロイヌナズナｐａｐＩ遺伝子（配列番号１）の概略図である。
【００４８】
【図４】図４は、カスミソウ形質転換ベクターｐＨＡＰＡＰの概略図である。
【００４９】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、遺伝子組換え小植物（ＲＰ−１およびＲＰ−４）から採取される細胞のＤＮＡ含有量を示すグラフである（図５Ａ：ＲＰ−１、図５Ｂ：ＲＰ−４）。
【図５Ｃ】図５Ｃは、遺伝子組換え小植物（ＲＰ−１０）から採取される細胞のＤＮＡ含有量を示すグラフである（図５Ｃ：ＲＰ−１０）。
【００５０】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、遺伝子組換えハイブリッド小植物から採取される細胞のＤＮＡ含有量を示すグラフである（図６Ａ：Ｔ．Ｇ−５９、図６Ｂ：Ｔ．Ｇ−  ５０５）。
【図６Ｃ−６Ｄ】図６Ｃ−６Ｄは、遺伝子組換えハイブリッド小植物から採取される細胞のＤＮＡ含有量を示すグラフである（図６Ｃ：Ｔ．Ｇ−３６５、図６Ｄ：Ｔ．Ｇ−４５０）。
【図６Ｅ】図６Ｅは、遺伝子組換えハイブリッド小植物から採取される細胞のＤＮＡ含有量を示すグラフである（図６Ｅ：Ｔ．Ｇ−２７２）。
【００５１】
【図７】図７は、様々なＧ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ品種（遺伝子組換え体および遺伝子非組換え体）のアントシアニン分析のグラフ表示である。
【００５２】
【図８】図８は、遺伝子組換えカスミソウのＰＣＲ分析の結果を示す顕微鏡写真である。対照には、分子量マーカー（Ｌ）、陰性対照（遺伝子非組換えカスミソウの抽出物；−ＣＯＮ）および陽性対照（＋ＣＯＮ）が含まれる。５つの異なる遺伝子組換え事象体からの抽出物が、ＴＧ５９、ＴＧ２７２、ＴＧ５０５、ＴＧ３６５およびＴＧ４５０のレーンに示される。
【００５３】
【図９】図９は、サザン分析の結果を示す顕微鏡写真である。示されるレーンは、遺伝子非組換え対照（ＭＳおよびサンプル７）および８つの遺伝子組換えカスミソウ株（（ＴＧ）１、４、１０、５９、２７２、３６５、４５０および５０５の株）である。ｐＨＡＰＡＰプラスミドＤＮＡの陽性対照が、右端レーンにおける分子量ラダーと一緒に含まれる（＋ＣＯＮ）。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、シュッコンカスミソウ植物に関連する。
【００５５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
【００５６】
シュッコンカスミソウ（これはまた、Ｂａｂｙ’ｓ  Ｂｒｅａｔｈとして知られている）は、多年生の境界庭園における充填植物として、そして、長持ちする切り花としてもまた、長い間評価されている。シュッコンカスミソウはまた、優れたドライフラワーをもたらす。その装飾的価値のために、様々な試みが、新規かつ改善された形質を組み込むシュッコンカスミソウの品種を花卉産業に生じさせるために行われている。
【００５７】
そのように本発明を実施に移すとき、本発明者らは、安定な、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を含むシュッコンカスミソウを初めて作成することができた。
【００５８】
本発明者らは、Ｍ．Ｓ．品種の多倍数体化に依拠する新規な形質転換法を用いており、また、多倍数体植物を、異種ＰＡＰ−１ポリペプチドを首尾よく発現させるための遺伝子形質転換に供している。
【００５９】
得られた形質転換体は、同じ背景の非形質転換植物と比較して、独特な色素プロフィルを示した。したがって、形質転換された植物の花弁は、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成を示す。これらの植物をハイブリッド株の生成のために使用した。ハイブリッド作成により、花の色素形成範囲が、図７および表４に示されるように一層広がった。
【００６０】
本発明の１つの局面によれば、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を含むシュッコンカスミソウ植物が提供される。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「植物」は、植物体全体またはその一部分を示す。
【００６２】
表現「植物の一部分」は、例えば、植物を（再）生成させることができる単離された植物細胞または単離された植物の一部分（組織）を示し、これらには、植物プロトプラスト、植物カルス、植物凝集塊ならびに植物において無傷である植物細胞または植物の一部分、例えば、種子、葉、茎、花粉、根、根端、葯、胚珠、花弁、花、実生、胚およびさくなどが含まれる。
【００６３】
具体的な実施形態によれば、植物の一部分は、花である。
【００６４】
具体的な実施形態によれば、花は、切断された花である。
【００６５】
具体的な実施形態によれば、植物の一部分は、花粉である。
【００６６】
具体的な実施形態によれば、植物の一部分は、胚珠である。
【００６７】
具体的な実施形態によれば、植物の一部分は、種子である。
【００６８】
植物の切断体もまた、提供される（例えば出根している切断体または出根していない切断体）。
【００６９】
植物は、（下記で記載されるように）カスミソウ属のいずれであってもよい。
【００７０】
具体的な実施形態によれば、植物は、シュッコンカスミソウ植物またはシュッコンカスミソウを含む系統を有するハイブリッドである。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、“シュッコンカスミソウ”はまた、“Ｂａｂｙ’ｓ  Ｂｒｅａｔｈ”とも呼ばれる（これはカスミソウ属の栽培植物である）。
【００７２】
植物界  植物
維管束植物亜界  維管束植物
種子植物上門−種子植物
被子植物門  顕花植物
モクレン綱  双子葉植物
ナデシコ亜綱
ナデシコ目
ナデシコ科
カスミソウ属Ｌ．ｂａｂｙ’ｓ−ｂｒｅａｔｈ；
植物は、望ましい習性、高さおよび花形態学のいずれかを有する場合がある。
【００７３】
したがって、草高が２０ｃｍ〜１メートルである場合がある。生育習性が、こぢんまりとし、直立起立し、狭いまたは密集している場合がある。
【００７４】
花のタイプが、本明細書中下記でさらに記載されるように、一重、半八重（ＳＤ）または八重である場合がある。
【００７５】
半八重：２列以上の花弁と、見ることができる明確に規定された中心部とを有する花。
【００７６】
八重：数列の花弁と、見ることができない中心部とを有する花。
【００７７】
八重の多花：数列の花弁と、見ることができない中心部と、花の中心部に見られる発達途中の若い芽とを有する花。
【００７８】
花のサイズ：小型−５ｍｍ未満、中型−６〜９ｍｍ、大型−９〜３０ｍｍ。
【００７９】
具体的な実施形態によれば、花は非着色フラワーである。
【００８０】
シュッコンカスミソウのいかなる公知の品種または絶えず開発されている品種が、本発明において想定される。これらは、以下のものを含むが、これらに限定されない。Ａｒｂｅｌ（商標）、Ｂｏｄｇｅｒｉ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｆａｉｒｙ（商標）、Ｃｏｍｐａｃｔａ（商標）、Ｃｏｍｐａｃｔａ  Ｐｌｅｎａ（商標）、Ｄａｎｇｙｐｍｉｎｉ（商標）、Ｄａｎｇｙｓｈａ（商標）、Ｄａｎｓｆｅｒｏｙ（商標）、Ｄａｎｔｚｉｇｅｒ（商標）、Ｓｎｏｗｆｌａｋｅ（商標）、Ｅａｒｌｙ  ｓｎｏｗｂａｌｌ（商標）、Ｅｈｒｌｅｉ（商標）、Ｆａｉｒｙ  Ｐｅｒｆｅｃｔ（商標）、Ｈａｐｐｙ  Ｆｅｓｔｉｖａｌ（商標）、Ｆｅｓｔｉｖａｌ  Ｐｉｎｋ（商標）、Ｆｅｓｔｉｖａｌ  Ｗｈｉｔｅ（商標）、Ｆｌａｍｉｎｇｏ（商標）、Ｆｌｏｒｅｐｌｅｎａ（商標）、Ｇｉｌｂｏａ（商標）、Ｇｏｌａｎ（商標）、Ｌｕｃｋｙ  Ｓｔａｒｔｓ（商標）、Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）（Ｄａｎｇｙｐｍｉｎｉ）、Ｎａｎａ（商標）、Ｎｅｗ  Ｈｏｐｅ（商標）、Ｎｅｗ  Ｌｏｖｅ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃａ（商標）、Ｐｅｒｆｅｃｔａ（商標）、Ｐｅｒｆｅｃｔａ  ５３（商標）、Ｐｅｒｆｅｃｔａ  Ｒｏｙａｌ（商標）、Ｐｉｎｋ  Ｆａｉｒｙ（商標）、Ｐｉｎｋ  Ｓｔａｒ（商標）、Ｐｌｅｎａ（商標）、Ｒａｈａｎ  １１（商標）、Ｒａｈａｎ  １４（商標）、Ｒｅｄ  Ｓｅａ（商標）、Ｒｏｍａｎｏ  ４（商標）、Ｓｎｏｗｂａｌｌ（商標）、Ｓｎｏｗｆｌａｋｅ（商標）、Ｓｎｏｗ  Ｗｈｉｔｅ（商標）、Ｔａｖｏｒ（商標）、Ｖｉｅｔｔｅ’ｓ  Ｄｗａｒｆ（商標）、Ｖｉｒｇｏ（商標）およびＹｕｋｉｎｋ（商標）。
【００８１】
具体的な実施形態によれば、植物は、Ａｒｂｅｌ（商標）、Ｐｅｓｔｉｖａｌ（商標）またはＦｌａｍｉｎｇｏ（商標）の系統（すなわち、遺伝的背景）を有しない。
【００８２】
具体的な実施形態によれば、植物は、Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）またはＭｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）（Ｍ．Ｓ．）の遺伝的背景を含む系統を有する。
【００８３】
述べられたように、本発明の植物の花は、赤色、ピンク色、紫色または緑色の色を有する。
【００８４】
具体的な実施形態によれば、「赤色」は、ＲＨＳ（２００７）：５９Ａ，６０Ａ，３０Ａ，３３Ａ，３４Ａ，Ｎ３４Ａ−Ｃ，３５Ａ，３７Ａ−Ｂ，３９Ａ−Ｂ，４０Ａ−４１Ｃ，４２Ａ−４３Ｃ，４４Ａ−４７Ｂ，５０Ａ，５３Ａ−Ｃ，１７８Ａ−１７９Ｃ，１８０Ａ−Ｃ，１８１Ａ−Ｂ，１８２Ａ−Ｂを意味する。
【００８５】
具体的な実施形態によれば、「ピンク色」は、ＲＨＳ（２００７）：５７Ａ−Ｄ，５８Ｂ−Ｄ，６１Ｃ−６２Ｄ，６３Ｂ−Ｄ，６４Ｃ−６９Ｄ，７０Ｃ−Ｄ，７３Ａ−Ｄ，７５Ｃ−Ｄ３６Ａ−Ｄ，３７Ｃ−３８Ｄ，３９Ｃ−Ｄ，４１Ｄ，４３Ｄ，４７Ｃ−４９Ｄ，５０Ｂ−５２Ｄ，５３Ｄ−５６Ｄ，１７９Ｄ，１８０Ｄ，１８１Ｃ−Ｄ，１８２Ｃ−Ｄ，１８４Ｃ−Ｄ，１８５Ｃ−Ｄ，白グループ：Ｎ１５５Ｂ−Ｄを意味する。
【００８６】
具体的な実施形態によれば、ピンク色は、７５Ｂより暗い。
【００８７】
具体的な実施形態によれば、「紫色」は、ＲＨＳ（２００７）：５８Ａ，５９Ｂ−Ｄ，６０Ｂ−６１Ｂ，６３Ａ，６４Ａ−Ｂ，７０Ａ−Ｂ，７１Ａ−７２Ｄ，７４Ａ−７５Ｂ，７６Ａ−８８Ｄ，１８３Ａ−１８４Ｂ，１８５Ａ−Ｂ，１８６Ａ−Ｎ１８７Ｄ，白グループ：Ｎ１５５Ａを意味する。
【００８８】
具体的な実施形態によれば、「緑色」は、ＲＨＳ（２００７）：１５７Ａ−Ｄ，灰黄色グループ：１６０Ｃ−Ｄ，灰緑色グループ：１８８Ａ−Ｎ１８９Ｂ，１９０Ａ−１９６Ｄ，青緑色グループ：１２３Ｄ，１２４Ｃ−Ｄ，緑色グループ：１２５Ａ−１４３Ｄ，黄緑色グループ：１４４Ａ−１５１Ｄ，１５４Ａ−Ｄ，黄色グループ：１Ａ−Ｃを意味する。
【００８９】
具体的な実施形態によれば、本発明の植物の花は、ピンク色、赤色または紫色の色を有する。
【００９０】
具体的な実施形態によれば、本発明の植物の花は、赤色または紫色の色を有する。
【００９１】
具体的な実施形態によれば、色素形成は花弁において均一であり、すなわち、特定のパターン（例えば、縞、ドットらせん状）が人の目および／または拡大レーンによって見えない。
【００９２】
代替において、色パターンが、不均質で、斑状である場合があり、および／または異なった中心を含む場合があり、また２つ以上の色（例えば、２つ、３つまたは４つの色）を含む場合がある。
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、植物のハイブリッドは、必ずしもその祖先の色または色パターンであるとは限らない色または色パターンを有する場合があることが理解される。例えば、祖先が、ピンク色、赤色、緑色または紫色の色を含むとき、そのハイブリッドはオレンジ色または黄色を有する場合がある。
【００９４】
具体的な実施形態によれば、色素形成は温度非依存性であり、このことはまた、本明細書中では「熱的に誘導されない」として示され、すなわち、上述の値の色素が、圃場にあるときには２６℃を超える温度でさえ、または切り花として、基礎的レベルで存在する。
【００９５】
具体的な実施形態によれば、前記植物は、シアニジンを主要アントシアニンとして含有する花弁を有する（例えば、５０％以上）。
【００９６】
具体的な実施形態によれば、前記植物はさらに、ペオニジンおよびペラルゴニジン誘導体を含む花弁を有する。
【００９７】
具体的な実施形態によれば、前記シアニジンはシアニジンマリルグルコシドおよびシアニジンヘキソースを含む。
【００９８】
具体的な実施形態によれば、前記シアニジンマリルグルコシドおよび前記シアニジンヘキソースは、ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦ−ＭＳによってアッセイされる場合、前記花弁の総アントシアニン含有量の約８０〜９０％および１０〜２０％でそれぞれ存在する。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記植物は、下記の少なくとも１つを含有する花弁を有する：
（ｉ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるシアニジンマリルグルコシドよりも、シアニジンマリルグルコシドにおける少なくとも１０、２０、５０、１００または１５０倍の増大；
（ｉｉ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）において見出されるシアニジンマリルグルコシドよりも、シアニジンマリルグルコシドにおける少なくとも１０００、２０００、３０００、５０００、８０００または１００００倍の増大；
（ｉｉｉ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるシアニジンヘキソースよりも、シアニジンヘキソースにおける少なくとも１０、２０、５０、１００または１５０倍の増大；
（ｉｖ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるペオニジンクマロイルペントースよりも、ペオニジンクマロイルペントースにおける少なくとも１００、２００、３００、５００または１０００倍の増大；
（ｖ）同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるシアニジンペントースデオキシヘキソースよりも、シアニジンペントースデオキシヘキソースにおける少なくとも５０、１００、２００または５００倍の増大。
【０１００】
具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の花の花弁は、（１）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）および（ｖ）において反映される色素プロフィルによって特徴づけられる。
【０１０１】
具体的な実施形態によれば、緑色の花は、同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）において見出されるクロロフィルＡよりも増大したレベルのクロロフィルＡ（例えば、少なくとも１．２倍、２倍、３倍または４倍）によって特徴づけられる。代替において、または加えて、緑色の花は、同じ発達段階およびアッセイ条件でのＭｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）において見出されるクロロフィルＢよりも増大したレベルのクロロフィルＢ（例えば、少なくとも１．１倍、２倍、３倍または４倍）によって特徴づけられる。
【０１０２】
実際、図７に示されるように、本教示に従って生じたカスミソウ花弁において特定されるアントシアニンは、シアニジンおよびペオニジンの種々の誘導体ならびに不明なペラルゴニジン誘導体であった。主要アントシアニンがシアニジンであり、これには、試験された遺伝子組換え品種の花弁における総アントシアニン含有量の約８１〜８６％および１０〜１４％をそれぞれ構成するシアニジンマリルグルコシドおよびシアニジンヘキソースを伴っていた。微少量のペオニジンクマロイル−ペントースおよびシアニジンペントースデオキシヘキソースならびに不明なシアニジン誘導体もまた特定され、これらは遺伝子組換え体の花弁における総アントシアニン含有量の約０．１〜４％を構成していた。
【０１０３】
Ｍｙ  Ｐｉｎｋ（商標）Ｍ．Ｐ、すなわち、遺伝子非組換えの薄ピンク色のカスミソウにおいて特定された主要なアントシアニンもまた、シアニジンマリルグルコシドおよびシアニジンヘキソースであり、これらは花弁における総アントシアニン含有量の約８２％および１４％をそれぞれ構成した。Ｍ．Ｓ、すなわち、遺伝子非組換えの白色のカスミソウにおいて特定された主要なアントシアニンが、シアニジンマリルグルコシドおよびシアニジンペントースデオキシヘキソースであり、これらは花弁における総アントシアニン含有量の約４４％および５５％をそれぞれ構成した。
【０１０４】
色素分析では、新しい品種におけるある範囲のアントシアニン量が示され、品種１７０におけるシアニジンマリルグルコシドの比率が、品種５９および品種１００と比較して、１．７倍および２．４倍それぞれ大きかった。品種１７０におけるシアニジンヘキソースの比率が、品種５９および品種１００と比較して、０．９倍および１．７倍それぞれ大きかった。品種１７０におけるペオニジンクマロイル−ペントースの比率が、品種５９および品種１００と比較して、５４．７倍および２．２倍それぞれ大きかった。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態の植物を生じさせる様々な方法には、様々な遺伝子改変、例えば、ＰＡＰ１をコードする導入遺伝子の導入、サイレンシングされた遺伝子を、例えば、キメラなヌクレアーゼ（例えば、Ｇａｊ他、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，３１（７）：３９７〜４０５および同様に国際公開第２００９／１３０６９５号（これらのそれぞれがその全体において参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンク・フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼなど）の使用などによって上方調節することなど、同様にまた、古典的な育種、またはこれらの組合せが含まれる。
【０１０６】
遺伝子形質転換／感染に集中するが、本教示は、遺伝子組換え手法に限定されることを意図していない。
【０１０７】
したがって、本発明の１つの局面によれば、遺伝子組換えシュッコンカスミソウを作成する方法であって、植物細胞において活性であるシス作用調節要素に機能的に連結される、ＰＡＰ１をコードする核酸配列をシュッコンカスミソウ植物に導入し、それにより、遺伝子組換えシュッコンカスミソウを作成することを含む方法が提供される。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子組換え」は、導入遺伝子、すなわち、植物または植物細胞に対して内因性でない発現産物（この場合にはＰＡＰ１、例えば、配列番号２に示されるようなＰＡＰ１）をコードする核酸配列を発現する植物を示す。
【０１０９】
具体的な実施形態によれば、シュッコンカスミソウ植物は多倍数体化プロトコルに供される。
【０１１０】
したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、多倍数体シュッコンカスミソウは、野生型シュッコンカスミソウよりも大きい染色体数（例えば、少なくとも１つの染色体セットまたはその一部）を有し、例えば、野生型植物（例えば、Ｍ．Ｓ）と比較して、また、下記の実施例の節の表１に記載されるように、２倍多い量の遺伝物質（すなわち、染色体）などを有する。多倍数性の誘導は典型的には、植物組織をＧ２／Ｍ周期阻害剤に供することによって行われる。
【０１１１】
典型的には、Ｇ２／Ｍ周期阻害剤は微小管重合阻害剤を含む。
【０１１２】
微小管周期阻害剤の例には、オリザリン、コルヒチン、コルセミド、トリフルラリン、ベンゾイミダゾールカルバマート類（例えば、ノコダゾール、オンコダゾール、メベンダゾール、Ｒ１７９３４、ＭＢＣ）、ｏ−イソプロピルＮ−フェニルカルバマート、クロロイソプロピルＮ−フェニルカルバマート、アミプロホスメチル、タキソール、ビンブラスチン、グリセオフルビン、カフェイン、ビス−ＡＮＳ、メイタンシン、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチンおよびポドフィロトキシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
多倍数性の誘導を、実施例１に記載されるように野生型植物に対してまたは新しい花色を示す栽培植物に対して行うことができ、後者が、園芸形質を改善するために主に行われる。
【０１１４】
具体的な実施形態によれば、シュッコンカスミソウ植物は、Ｍ．Ｓ多倍数性の遺伝的背景を有する。別の言い方をすれば、ＰＡＰ１導入遺伝子を導入するための供給源材料が、Ｍ．Ｓ多倍数体シュッコンカスミソウ植物である。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、「ＰＡＰ１」は、遺伝子産物で、遺伝子記号ＰＡＰ１を有し、シュッコンカスミソウ植物におけるアントシアニン含有量を、例えば、花弁、茎、茎生葉、花粉、葯、めしべ、子房、萼片において増加させることができる転写因子ＭＹＢ７５を示す。
【０１１６】
具体的な実施形態によれば、アントシアニンの蓄積は少なくとも花においてである（すなわち、花に限定されない）。
【０１１７】
具体的な実施形態によれば、アントシアニンの蓄積は花においてではない。そのような場合、花は白色になる。
【０１１８】
この遺伝子は、ＡＴＭＹＢ７５；Ｆ２５Ｐ１２．９２；Ｆ２５Ｐ１２＿９２；ＭＹＢドメインタンパク質７５；ＭＹＢ７５；骨髄芽球症タンパク質７５；ＰＡＰ１；ホスファチジン酸ホスファターゼ１；アントシアニン色素１の産生；ＳＩＡＡ１；ＳＵＣ誘導アントシアニン蓄積１としてもまた知られており、アントシアニン代謝およびラジカル捕捉に関与する推定ＭＹＢドメイン含有転写因子をコードする。
【０１１９】
具体的な実施形態によれば、ＰＡＰ１はカスミソウ属にとって外因性であり、遺伝子組換え植物のゲノムに組み込まれている（これはまた、本明細書中では安定的形質転換として示される）。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、用語「外因性」は、同じ遺伝的背景の野生型カスミソウには存在しない核酸配列を示す。
【０１２１】
具体的な実施形態によれば、外因性ＰＡＰ１は多数コピーでカスミソウのゲノムに存在する（これはまた、「組み込み事象」として示される）。
【０１２２】
具体的な実施形態によれば、ＰＡＰ１は、少なくとも２コピーでカスミソウのゲノムに存在する。
【０１２３】
具体的な実施形態によれば、ＰＡＰ１は、少なくとも３コピーでカスミソウのゲノムに存在する。
【０１２４】
具体的な実施形態によれば、ＰＡＰ１は、少なくとも４コピーでカスミソウのゲノムに存在する。
【０１２５】
具体的な実施形態によれば、ＰＡＰ１は、少なくとも５コピーでカスミソウのゲノムに存在する。
【０１２６】
具体的な実施形態によれば、ＰＡＰ１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ３２５１２３のものである。
【０１２７】
具体的な実施形態によれば、ＰＡＰ１は、配列番号２、あるいは配列番号１またはそのホモログによってコードされる前記配列番号２のホモログにおいて示される通りである。
【０１２８】
ＰＡＰ１の活性化がシュッコンカスミソウの色を変化させ、この植物におけるアントシアニン蓄積を誘導し得るという理解により、そのような植物がまた、カスミソウ属のＰＡＰ１ホモログを選抜マーカーとして使用する古典的な育種によって得られ得ることが示唆される（他の選抜マーカーが色素形成であるかもしれない）。
【０１２９】
したがって、発現産物の機能（これにより、シュッコンカスミソウ植物の花弁におけるアントシアニン含有量が増大する）および場合によりその安定性が維持される限り、配列番号１または２に対して相同的であるポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列が意図される。
【０１３０】
したがって、具体的な実施形態によれば、ＰＡＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、発現産物の機能および場合によりその安定性が維持される限り、配列番号２に対する同一性または相同性が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。
【０１３１】
代替において、または加えて、ＰＡＰ１ポリヌクレオチドの核酸配列は、発現産物の機能および場合によりその安定性が維持される限り、配列番号１に対する同一性が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。
【０１３２】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および用語「核酸配列」（これらは交換可能に使用される）は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、前記の組合せ）の形態で単離される、また提供される一本鎖または二本鎖の核酸配列を示す。
【０１３３】
本明細書中で使用される場合、表現「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素またはどのような他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであってもそれを使用してメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を示す。そのような配列は続いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増幅することができる。
【０１３４】
本明細書中で使用される場合、表現「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体から得られる（単離される）配列を示し、したがって、染色体の連続した部分を表す。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、表現「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも一部が相補的であり、かつ、少なくとも一部がゲノム由来である配列を示す。複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするために要求されるいくつかのエクソン配列、同様にまた、エクソン配列間に介在するいくつかのイントロン配列を含むことができる。イントロン配列は、他の遺伝子のものを含めて、どのような供給源のものであってもよく、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列はさらに、下記でさらに詳しく記載されるように、シス作用の発現調節要素を含む場合がある。
【０１３６】
本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドの核酸配列は植物発現のために最適化される場合がある。そのような配列改変の例には、目的とする植物種において典型的に見出されるＧ／Ｃ含有量により近づけるための変更されたＧ／Ｃ含有量およびコドン最適化と一般には呼ばれる、植物種において非定型的に見出されるコドンの除去が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３７】
表現「コドン最適化」は、目的とする植物におけるコドン使用頻度に近づける、構造遺伝子またはそのフラグメントの内部での使用のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を示す。したがって、最適化された遺伝子または核酸配列は、生来的な遺伝子または自然界に存在する遺伝子のヌクレオチド配列が、植物内における統計学的に好まれるコドンまたは統計学的に好都合であるコドンを利用するために改変されている遺伝子を示す。ヌクレオチド配列は典型的には、ＤＮＡレベルで調べられ、植物種における発現のために最適化されたコード領域が、任意の適当な手法を使用して、例えば、Ｓａｒｄａｎａ他（１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１５：６７７〜６８１）に記載されるような手法を使用して決定される。この方法では、コドン使用頻度の標準偏差、すなわち、コドン使用頻度の偏りの大きさが、最初、高発現植物遺伝子の各コドンに対する生来的遺伝子の各コドンの使用の二乗比例偏差（ｓｑｕａｒｅｄ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を見出し、その後、平均二乗偏差（ａｖｅｒａｇｅ  ｓｑｕａｒｅｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を計算することによって計算される場合がある。使用される式は下記の式である：１ＳＤＣＵ＝ｎ＝１Ｎ［（Ｘｎ−Ｙｎ）／Ｙｎ］２／Ｎ、式中、Ｘｎは、高発現植物遺伝子におけるコドンｎの使用頻度を示し、Ｙｎは、目的とする遺伝子におけるコドンｎの使用頻度を示し、Ｎは、目的とする遺伝子におけるコドンの総数を示す。双子葉植物の高発現遺伝子から得られるコドン使用頻度の表が、Ｍｕｒｒａｙ他（１９８９、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１７：４７７〜４９８）のデータを使用してまとめられている。
【０１３８】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中前記の核酸配列、前記核酸配列のフラグメント、前記核酸配列とのハイブリダイゼーションが可能な配列、前記核酸配列に対して相同的な配列、前記核酸配列のオルソログである配列、類似するポリペプチドを異なるコドン使用頻度によりコードする配列、変異（例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入または置換など、これらは天然に存在するか、あるいは、ランダム様式または標的化様式のどちらであれ、人為的に導入されるかのどちらかである）によって特徴づけられる変化した配列を包含する。
【０１３９】
本発明による方法において有用である構築物が、当業者には広く知られている組換えＤＮＡ技術を使用して構築される場合がある。遺伝子構築物は、市販されている場合があるベクターで、例えば、植物への形質転換のために好適である、また形質転換された細胞における目的とする遺伝子の発現のために好適であるベクターに挿入される場合がある。遺伝子構築物は、述べられたように、異種核酸配列が、細胞における発現（例えば、植物細胞などにおける発現）を可能にするシス作用調節要素に機能的に連結される発現ベクターであることが可能である。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、表現「シス作用調節要素」は、トランス作用調節因子と結合し、その下流側に位置するコード配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列（好ましくは、プロモーター）を示す。
【０１４１】
具体的な実施形態によれば、シス作用調節要素はプロモーター配列を含む。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合、表現「機能的に連結される」は、シス調節要素（例えば、プロモーター）が、選択された核酸配列の発現を調節することを可能にするように機能的に配置されることを示す。例えば、プロモーター配列が、（例えば、ＰＡＰ１の）転写および翻訳の方向に関して、選択された核酸配列の上流に位置する場合がある。
【０１４３】
１つの実施形態によれば、本発明の核酸構築物におけるプロモーターは、植物細胞内における異種核酸分子の発現を導くために役立つ植物プロモーターである。
【０１４４】
本明細書中で使用される場合、表現「植物プロモーター」は、植物の細胞、組織または器官における発現、好ましくは、木本植物の細胞、組織または器官における発現を誘導すること、与えること、活性化すること、または強化することが少なくとも可能であるプロモーター配列（このプロモーター配列に加えられる、または含有されるどのようなさらなる調節要素を含めて）を示す。そのようなプロモーターは、植物起源、細菌起源、ウイルス起源、真菌起源または動物起源に由来することができる。そのようなプロモーターは、構成的（すなわち、高レベルの遺伝子発現を複数の植物組織において導くことが可能である）、組織特異的（すなわち、遺伝子発現を特定の１つまたは複数の植物組織（例えば、花弁）において導くことが可能である）、誘導性（すなわち、遺伝子発現を刺激のもとで導くことが可能である）またはキメラ（すなわち、少なくとも２つの異なるプロモーターの部分から形成される）であることが可能である。
【０１４５】
具体的な実施形態によれば、プロモーターは構成的プロモーターである。
【０１４６】
構成的な植物プロモーターの例には、限定されないが、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスのサブゲノム転写物（ｓｇＦｉＭＶ）プロモーター、イチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）プロモーター、ＦＭＶ３４Ｓプロモーター、サトウキビ桿状バドナウイルスプロモーター、ＣｓＶＭＶプロモーター、アラビドプシスＡＣＴ２／ＡＣＴ８アクチンプロモーター、アラビドプシスユビキチンＵＢＱ１プロモーター、オオムギ葉チオニンＢＴＨ６プロモーターおよびイネアクチンプロモーターが含まれる。
【０１４７】
具体的な実施形態によれば、構成的プロモーターはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターである。
【０１４８】
本発明のいくつかの実施形態の方法のために有用である他の例示的なプロモーターが、表Ｉ、表ＩＩおよび表ＩＩＩに示される。
【表１】
2018500943.tif 000002
【表２】
2018500943.tif 000003
2018500943.tif 000004
【表３】
2018500943.tif 000005
【０１４９】
植物細胞は、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物により安定的または一過性に形質転換される場合がある。安定的形質転換において、本発明のいくつかの実施形態の核酸分子は植物ゲノムに組み込まれ、そのようなものとして、この核酸分子は安定な遺伝形質を表す。一過性形質転換において、核酸分子は、形質転換された細胞によって発現され、しかし、ゲノムには組み込まれず、そのようなものとして、この核酸分子は一過性の形質を表す。
【０１５０】
外来遺伝子を単子葉植物および双子葉植物の両方に導入する様々な方法が存在する（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）、４２：２０５〜２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）、３３８：２７４〜２７６）。
【０１５１】
具体的な実施形態によれば、導入遺伝子が、（下記の実施例の節で記載されるように）種子形質転換によって植物に導入され、それにもかかわらず、切断物への導入もまた、Ｍｏｙａｌ  Ｂｅｎ  Ｚｖｉ，Ｍ．，Ｚｕｋｅｒ，Ａ．，Ｏｖａｄｉｓ，Ｍ．，Ｓｈｋｌａｒｍａｎ，Ｅ．，Ｂｅｎ−Ｍｅｉｒ，Ｈ．，Ｚｅｎｖｉｒｔ，Ｓ．およびＶａｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．（２００８），Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ  Ｌ．），Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、２２：５４３〜５５３に記載されるように可能である。
【０１５２】
外因性ＤＮＡの植物ゲノムＤＮＡ内への安定的組み込みを生じさせる根源的方法には、下記の２つの主要な取り組みが含まれる：
（ｉ）アグロバクテリウム媒介遺伝子移入：Ｋｌｅｅ他（１９８７）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３８：４６７〜４８６；ＫｌｅｅおよびＲｏｇｅｒｓ、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、第６巻、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ（編者：Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）、ｐ．２〜２５；Ｇａｔｅｎｂｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（編者：Ｋｕｎｇ，Ｓ．およびＡｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．）、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．（１９８９）、ｐ．９３〜１１２。
（ｉｉ）直接的ＤＮＡ取り込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ他、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、第６巻、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ（編者：Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）、ｐ．５２〜６８；これには、下記の方法が含まれる：ＤＮＡのプロトプラスト内への直接的取り込みのための方法、Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．他（１９８８）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１０７２〜１０７４；植物細胞の短時間電気ショックによって誘発されるＤＮＡ取り込み：Ｚｈａｎｇ他、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．（１９８８）、７：３７９〜３８４；Ｆｒｏｍｍ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）、３１９：７９１〜７９３、粒子衝撃による植物細胞または植物組織へのＤＮＡ注入、Ｋｌｅｉｎ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）、６：５５９〜５６３；ＭｃＣａｂｅ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）、６：９２３〜９２６；Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）、７９：２０６〜２０９；マイクロピペットシステムの使用による植物細胞または植物組織へのＤＮＡ注入、Ｎｅｕｈａｕｓ他、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）、７５：３０〜３６；ＮｅｕｈａｕｓおよびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）、７９：２１３〜２１７；細胞培養物、胚またはカルス組織のガラスファイバーまたは炭化ケイ素ウイスカー形質転換、米国特許第５４６４７６５号；またはＤＮＡを発芽中の花粉と直接にインキュベーションすることによる方法、ＤｅＷｅｔ他、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ、編者：Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．およびＭａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．およびＤａｎｉｅｌｓ，Ｗ．Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８５）、ｐ．１９７〜２０９；ならびにＯｈｔａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）、８３：７１５〜７１９。
【０１５３】
アグロバクテリウムシステムには、植物ゲノムＤＮＡに一体化する規定されたＤＮＡセグメントを含有するプラスミドベクターの使用が含まれる。植物組織への接種方法は、植物種およびアグロバクテリウム送達システムに依存して変化する。広く使用されている取り組みが、どのような組織外植片であれ、完全な植物体への分化を開始させるための良好な供給源を提供する組織外植片を用いて実施することができるリーフディスク法である。Ｈｏｒｓｃｈ他、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ５、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）、ｐ．１〜９。補完的な取り組みでは、アグロバクテリウム送達システムが減圧浸潤との組合せで用いられる。アグロバクテリウムシステムは、遺伝子組換え双子葉植物の作出においてとりわけ実行可能である。
【０１５４】
植物細胞内への直接的ＤＮＡ移入の様々な方法が存在する。エレクトロポレーションでは、プロトプラストが、強い電場に短時間さらされる。顕微注入では、ＤＮＡが、非常に小さいマイクロピペットを使用して細胞内に直接、機械的に注入される。微小粒子衝撃では、ＤＮＡが微小発射体（例えば、硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子など）に吸着させられ、この微小発射体が物理的に加速されて、細胞または植物組織中に入れられる。
【０１５５】
安定的形質転換の後、植物の繁殖が行われる。植物繁殖の最も一般的な方法が種子によるものである。しかしながら、種子繁殖による再生では、ヘテロ接合性のために、作物に均一性がないという不完全さがある。これは、種子が、メンデル則によって支配される遺伝的変動に従って植物によって産生されるからである。基本的に、それぞれの種子が遺伝的に異なっており、それぞれがそれ自身の特定の形質を伴って成長する。したがって、再生植物が親の遺伝子組換え植物の同一の形質および特徴を有するように形質転換植物を生じさせることが好ましい。したがって、形質転換された植物は、形質転換植物の迅速かつ一貫した再生産をもたらす微細繁殖によって再生されることが好ましい。
【０１５６】
微細繁殖は、選抜された親植物または栽培品種から切り出された一片の組織から新しい世代の植物を成長させるプロセスである。このプロセスは、融合タンパク質を発現する好ましい組織を有する植物の大量再生産を可能にする。作成される新しい世代の植物は元の植物と遺伝的に同一であり、元の植物の特徴のすべてを有する。微細繁殖では、短期間での高品質の植物材料の大量生産が可能であり、また選択された栽培品種の迅速な増殖が、元の遺伝子組換え植物または形質転換植物の特徴を保った状態でもたらされる。植物をクローニングすることの長所が、植物増殖の速さならびに生じる植物の品質および均一性である。
【０１５７】
微細繁殖は、培養培地または生育条件の変更を段階間で必要とする多段階法である。したがって、微細繁殖プロセスでは、４つの基本的な段階、すなわち、第１段階：最初の組織培養、第２段階：組織培養増殖、第３段階：分化および植物形成、そして、第４段階：温室栽培および硬化が伴う。第１段階（最初の組織培養）の期間中において、組織培養物が確立され、組織培養物は、混入がないことが確認される。第２段階の期間中において、十分な数の組織サンプルが生じて、生産目標を満たすまで、最初の組織培養物が増やされる。第３段階の期間中において、第２段階で成長させた組織サンプルが分割され、個々の小植物に成長させられる。第４段階において、形質転換された小植物が硬化のために温室に移され、温室において、光に対する植物の耐性が徐々に増大させられ、その結果、形質転換植物が自然環境で生育できるようにされる。
【０１５８】
安定的形質転換が現時点では好ましいが、葉細胞、分裂組織細胞または植物体全体の一過性形質転換もまた、本発明のいくつかの実施形態によって想定される。
【０１５９】
一過性形質転換を、前記で記載される直接的ＤＮＡ移入法のいずれかによってまたは改変された植物ウイルスを使用するウイルス感染によって行うことができる。
【０１６０】
植物宿主の形質転換のために有用であることが示されているウイルスには、ＣａＭＶ、ＴＭＶおよびＢＶが含まれる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換が下記に記載される：米国特許第４８５５２３７号（ＢＧＶ）、欧州特許出願公開第６７５５３号（ＴＭＶ）、特開昭６３−１４６９３（ＴＭＶ）、欧州特許出願公開第１９４８０９号（ＢＶ）、欧州特許出願公開第２７８６６７号（ＢＶ）およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．他、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１７２〜１８９（１９８８）。植物を含む多くの宿主において外来ＤＮＡを発現させる際に使用される偽ウイルス粒子が国際公開第８７／０６２６１号に記載される。
【０１６１】
植物における非ウイルス性外因性核酸配列の導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築が、前記の参考文献によって、同様にまた、Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）、１７２：２８５〜２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）、６：３０７〜３１１；Ｆｒｅｎｃｈ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）、２３１：１２９４〜１２９７；およびＴａｋａｍａｔｓｕ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）、２６９：７３〜７６によって明らかにされる。
【０１６２】
ウイルスがＤＮＡウイルスであるとき、好適な改変をウイルス自体に対して行うことができる。代替において、ウイルスは最初、外来ＤＮＡとの所望のウイルスベクターを構築することの容易さのために細菌プラスミドにクローン化することができる。その後、ウイルスをプラスミドから切り出すことができる。ウイルスがＤＮＡウイルスであるならば、細菌の複製起点をウイルスＤＮＡに付け加えることができ、これにより、ウイルスＤＮＡはその後、細菌によって複製される。このＤＮＡの転写および翻訳により、ウイルスＤＮＡをキャプシド化するコートタンパク質が産生されることになる。ウイルスがＲＮＡウイルスであるならば、ウイルスは一般に、ｃＤＮＡとしてクローン化され、プラスミドに挿入される。その後、このプラスミドが、構築物のすべてを作成するために使用される。その後、ＲＮＡウイルスが、プラスミドのウイルス配列を転写させ、ウイルス遺伝子を、ウイルスＲＮＡをキャプシド化するコートタンパク質を生じさせるために翻訳させることによって産生される。
【０１６３】
非ウイルス性外因性核酸配列（例えば、本発明のいくつかの実施形態の構築物に含まれる非ウイルス性外因性核酸配列など）の植物における導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築が、前記の参考文献によって、同様にまた、米国特許第５３１６９３１号において明らかにされる。
【０１６４】
１つの実施形態において、生来的コートタンパク質をコードする配列がウイルス核酸から欠失させられている植物ウイルス核酸、非生来的植物ウイルスコートタンパク質をコードする配列と、植物宿主における発現が可能であり、組換え植物ウイルス核酸のパッケージングが可能であり、かつ、組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身的感染を保証することが可能である非生来的プロモーター（好ましくは、非生来的コートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーター）とが挿入されている植物ウイルス核酸が提供される。代替において、コートタンパク質遺伝子は、非生来的核酸配列をその中に挿入し、その結果、タンパク質が産生されるようにすることによって不活性化される場合がある。組換え植物ウイルス核酸は１つまたは複数のさらなる非生来的サブゲノムプロモーターを含有する場合がある。それぞれの非生来的サブゲノムプロモーターは隣接の遺伝子または核酸配列を植物宿主において転写または発現させることができ、かつ、相互の組換えおよび生来的サブゲノムプロモーターとの組換えを行うことができない。非生来的（外来）核酸配列が、生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接してまたは２つ以上の核酸配列が含まれるならば、生来的および非生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入される場合がある。非生来的核酸配列は、所望の生成物を産生させるためにサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写され、または発現させられる。
【０１６５】
第２の実施形態において、組換え植物ウイルス核酸が、生来的コートタンパク質コード配列が非生来的コートタンパク質コード配列の代わりに非生来的コートタンパク質サブゲノムプロモーターの１つに隣接して配置されることを除いて第１の実施形態でのように提供される。
【０１６６】
第３の実施形態において、生来的コートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接しており、かつ、１つまたは複数の非生来的サブゲノムプロモーターがウイルス核酸内に挿入されている組換え植物ウイルス核酸が提供される。挿入された非生来的サブゲノムプロモーターは隣接遺伝子を植物宿主において転写または発現させることができ、かつ、相互の組換えおよび生来的サブゲノムプロモーターとの組換えを行うことができない。非生来的核酸配列が非生来的サブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入される場合があり、その結果、前記配列が、所望の生成物を産生させるためにサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写されるように、または発現させられるようにされる。
【０１６７】
第４の実施形態において、組換え植物ウイルス核酸が、生来的コートタンパク質コード配列が非生来的コートタンパク質コード配列によって置き換えられることを除いて第３の実施形態でのように提供される。
【０１６８】
ウイルスベクターは、組換え植物ウイルスを産生するために、組換え植物ウイルス核酸によりコードされるコートタンパク質によってキャプシド化される。組換え植物ウイルス核酸または組換え植物ウイルスが、適切な宿主植物に感染させるために使用される。組換え植物ウイルス核酸は、宿主における複製、宿主における全身的拡大および所望のタンパク質を産生させるために宿主における外来遺伝子（単離された核酸）の転写または発現が可能である。
【０１６９】
前記に加えて、本発明のいくつかの実施形態の核酸分子はまた、葉緑体ゲノムに導入することができ、それにより、葉緑体での発現を可能にする。
【０１７０】
外因性核酸配列を葉緑体のゲノムに導入するための１つの技術が知られている。この技術は、以下の手順が伴う。最初、植物細胞が、細胞あたりの葉緑体の数を約１個に減らすように化学的に処理される。その後、外因性核酸が、少なくとも１つの外因性核酸分子を葉緑体に導入することを目指して粒子衝撃により細胞内に導入される。外因性核酸は、葉緑体に固有の酵素によって容易に達成される相同的組換えにより葉緑体のゲノムに組み込み可能であるように選択される。この目的を達成するために、外因性核酸は、目的とする遺伝子に加えて、葉緑体のゲノムに由来する少なくとも１つの核酸領域を含む。加えて、外因性核酸は選択マーカーを含み、この場合、この選択マーカーは、逐次的選抜手法によって、葉緑体ゲノムのコピー体のすべてまたは実質的にすべてがそのような選抜の後では外因性核酸を含むであろうことを確認するために役立つ。この技術に関するさらなる詳細が米国特許第４９４５０５０号および同第５６９３５０７号に見出される（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）。したがって、ポリペプチドを葉緑体のタンパク質発現系によって産生させることができ、葉緑体の内膜に一体化させることができる。
【０１７１】
このような産生方法にもかかわらず、（本明細書中に記載されるように、安定な、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を有する、例えば、外因性ＰＡＰ１を発現する）（遺伝子組換え）植物が、前記で定義されるように花の色に従って選択される。
【０１７２】
したがって、ＰＡＰ１をコードする外因性核酸配列を含むシュッコンカスミソウ植物が提供される。
【０１７３】
本発明のいくつかの実施形態の植物は多倍数性である場合があり、例えば、実施例１において教示されるように、例えば、４倍体である場合がある。
【０１７４】
本発明ではまた、前記植物を他のカスミソウ属種（例えば、シュッコンカスミソウ）と交雑してハイブリッド株または同系交配株を生じさせることが意図される。
【０１７５】
本明細書中で使用される場合、「カスミソウ属（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）」は、カーネーション科（ナデシコ科）における顕花植物の属を示す。約１５０の種がこの属には存在しており、いくつかが本明細書中下記に示される。
【０１７６】
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ａｃｕｔｉｆｏｌｉａ−ｓｈａｒｐｌｅａｆ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ａｒｅｔｉｏｉｄｅｓ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ａｒｒｏｓｔｉｉ−Ａｒｒｏｓｔ‘ｓ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｂｉｃｏｌｏｒ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｃａｐｉｔｕｌｉｆｌｏｒａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｃｅｐｈａｌｏｔｅｓ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｃｅｒａｓｔｉｏｉｄｅｓ−ｃｈｉｃｋｗｅｅｄ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｄａｖｕｒｉｃａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｄｅｓｅｒｔｏｒｕｍ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ−ｓｈｏｗｙ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｆａｓｔｉｇｉａｔａ−ｆａｓｔｉｇｉａｔｅ  ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｈｕａｓｈａｎｅｎｓｉｓ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｌｉｂａｎｏｔｉｃａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｌｉｃｅｎｔｉａｎａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｍｕｒａｌｉｓ−ａｎｎｕａｌ  ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ，ｃｕｓｈｉｏｎ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ，ｌｏｗ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｎａｎａ−ｄｗａｒｆ  ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｏｌｄｈａｍｉａｎａ−Ｍａｎｃｈｕｒｉａｎ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ，Ｏｌｄｈａｍ‘ｓ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐａｃｉｆｉｃａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ−ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ，ｃｏｍｍｏｎ  ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ，ｐａｎｉｃｌｅｄ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐａｔｒｉｎｉｉ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐｅｒｆｏｌｉａｔａ−ｐｅｒｆｏｌｉａｔｅ  ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐｅｔｒａｅａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐｉｌｏｓａ−Ｔｕｒｋｉｓｈ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｒｅｐｅｎｓ−ａｌｐｉｎｅ  ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ，ｃｒｅｅｐｉｎｇ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｒｏｋｅｊｅｋａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｒｕｓｃｉｆｏｌｉａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｓｃｏｒｚｏｎｅｒｉｆｏｌｉａ−ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ，ｇａｒｄｅｎ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｓｅｒｉｃｅａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｓｉｌｅｎｏｉｄｅｓ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐｉｎｏｓａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｓｔｅｖｅｎｉｉ−Ｓｔｅｖｅｎ‘ｓ  ｂａｂｙ‘ｓ−ｂｒｅａｔｈ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｓｔｒｕｔｈｉｕｍ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｔｓｃｈｉｌｉｅｎｓｉｓ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｖｅｎｕｓｔａ
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｖｉｓｃｏｓａ
確立されると、シュッコンカスミソウ植物およびシュッコンカスミソウ株を、組織培養技術を使用することによって繁殖させることができる。
【０１７７】
本明細書中で使用される場合、表現「組織培養物」は、シュッコンカスミソウ植物を生じさせることができる植物細胞または植物の一部分を示し、これには、植物プロトプラスト、植物カルス、植物凝集塊ならびに植物において無傷である植物細胞、または植物の一部分、例えば、種子、葉、茎、花粉、根、根端、葯、胚珠、花弁、花および胚などが含まれる。
【０１７８】
植物の組織培養物を作成する技術および組織培養物から植物を再生する技術は、当該技術分野で周知である。例えば、かかる技術は、Ｖａｓｉｌ（１９８４）［Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）［Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８９）［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ］；Ｇｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）［Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ］；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）［Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］；ａｎｄ  Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）［Ａｎｎ．Ｒｅｖ．  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．３８：４６７−４８６］によって規定されている。
【０１７９】
述べられたように、独特の色素形成を有する植物はまた、花弁に限定されない植物の一部分（例えば、葉および茎、葯、めしべ、子房、萼片）における独特の色素形成を含む場合がある。
【０１８０】
したがって、具体的な実施形態によれば、植物の一部分が、葉、葯、茎、萼片およびめしべからなる群から選択され、かつ、植物の一部分は、同じ発達段階および生育条件であるシュッコンカスミソウ品種のＭｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（商標）またはＭｙ  Ｐｉｎｋ（商標）において見出されるシアニジンレベルよりも高いシアニジンレベルを示す。
【０１８１】
本発明のいくつかの実施形態の植物はさらに、園芸用の有利な形質（例えば、花瓶での寿命、耐病性、花形状、植物習性、鉢植えカスミソウおよびデイ・ナチュラライズ（ｄａｙ−ｎａｔｕｒａｌｉｚｅ）植物など）を含むために品種改良される場合がある。
【０１８２】
したがって、植物育種技術を使用して栽培植物を開発する方法であって、（本明細書中に記載されるように、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を有する、例えば、外因性ＰＡＰ１を発現する）本明細書中に記載されるような植物または植物の一部分を自家育種および／または交雑育種のための育種材料の供給源として使用することを含む方法が提供される。
【０１８３】
より具体的には、シュッコンカスミソウ植物を作成する方法であって、
（ａ）（本明細書中に記載されるように、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を有する、例えば、外因性ＰＡＰ１を発現する）本明細書中に記載されるような植物または植物の一部分を別のカスミソウ属植物（例えば、シュッコンカスミソウ植物）と交雑させること；
（ｂ）種子を前記交雑の後で回収すること；
（ｃ）前記種子を植え、前記種子を植物に成長させること；および
（ｄ）ハイブリッド植物を選抜すること
を含む方法が提供される。
【０１８４】
具体的な実施形態によれば、選抜することが、色素形成に従って行われる。
【０１８５】
したがって、（本明細書中に記載されるように、安定な、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を有する、例えば、外因性ＰＡＰ１を発現する）本明細書中に記載されるような植物または植物の一部分は、最終的な子孫作成のために最も適している特異な子孫株または親株を生じさせるために、反復選抜、系統育種および／または戻し交雑に供される場合がある。
【０１８６】
制限断片長多型選抜または遺伝的マーカー選抜（例えば、ＰＡＰ１）を含むさらなるスクリーニング技術もまた、子孫選抜をさらに容易にするために使用することができる。
【０１８７】
したがって、本教示はまた、ハイブリッド植物、ハイブリッド種子、同系交配植物、同系交配種子（これらのそれぞれが多倍数性である場合があり、または野生型の倍数性を有する場合がある）を提供する。
【０１８８】
本発明のいくつかの実施形態の教示を用いて、本発明では、数多くのシュッコンカスミソウ株（例えば、１７０、１００および５９、同様にまた、Ｔ．Ｇ−５９、Ｔ．Ｇ−５０５、Ｔ．Ｇ−３６５、Ｔ．Ｇ−４５０、Ｔ．Ｇ−２７２など）が生じている。
【０１８９】
具体的な実施形態によれば、植物はＴ．Ｇ−５０５の特徴の本質的にすべてを有する。
【０１９０】
具体的な実施形態によれば、植物はＴ．Ｇ−５９の特徴の本質的にすべてを有する。
【０１９１】
従って、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を含むシュッコンカスミソウ植物もまた提供され、ただし、この場合、熱的に誘導されない、赤色、ピンク色、紫色もしくは緑色の色素形成またはこれらの組合せをもたらす花を含むシュッコンカスミソウ植物の代表的種子のサンプルが寄託される。
【０１９２】
本発明の植物の種子は播種されてもよく、したがって、本発明では、種がまかれた圃場が意図される。本発明の植物の栄養繁殖性部分を植えることができる。したがって、本発明ではまた、植えられた圃場および鉢植えされた植物が意図される。
【０１９３】
植物切断物を、植物切断物を含有する入れ物（例えば、生育セル、プラグなど）に配置することができ、したがって、本発明ではまた、切断物を含む保持容器が意図される。植物切断物は根付いている場合があり、または根付いていない場合がある。
【０１９４】
切り花を、切り花を含有する入れ物（例えば、花瓶、バケツもしくは手桶または他の保持装置など）に配置することができ、したがって、本発明ではまた、切断物を含む保持容器が意図される。
【０１９５】
本発明の植物はまた、多数種の組み合わせ（これはまた、この技術分野ではコンボとして示される；Ｍｉｘｉｅｓ（商標）、Ｔｒｉｘｉｅｓ（商標）など）の陳列のために他の植物種（例えば、少なくとも１つの生育特徴（例えば、発根時間、成長速度）を有する植物種など）とともに容器において根付かせることができ、成長させることができ、または保持させることができる。そのような構成が、例えば、米国特許第８１３６２９４号において教示される（これは本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）。
【０１９６】
本出願から成熟する特許の存続期間の期間中には、多くの関連するシュッコンカスミソウが開発されることが予想され、シュッコンカスミソウの用語の範囲は、すべてのそのような新しい技術を先験的に包含することが意図される。
【０１９７】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１９８】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１９９】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２００】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０２０１】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０２０２】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０２０３】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０２０４】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０２０６】
参照が特定の配列表に対してなされる場合、そのような参照は、例えば、塩基置換、塩基欠失または塩基付加をもたらす配列決定時の誤り、クローニング時の誤りまたは他の変化から生じるわずかな配列変化を含むとして（ただし、そのような変化の頻度は５０ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では１００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では２００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では５００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では１０００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では５０００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満であり、代替では１００００ヌクレオチド中１ヌクレオチド未満である）、その相補的配列に実質的に対応する様々な配列もまた包含するものと理解すべきである。
【０２０７】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２０８】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０２０９】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０２１０】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａ��ｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２１１】
実施例１
Ｇ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａにおける多倍数性のインビトロ誘導
本発明には、Ｇ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａにおける誘導された多倍数性、すなわち、Ｍ．Ｓ多倍数性として示される遺伝的背景の発達が含まれる。植物組織における倍数性の操作が、稔性をハイブリッドに導入するためにおよび改善された園芸形質または農業経済学的形質を有する植物を作成するために使用されている（Ｋｅｈｒ，Ａ．Ｅ．、１９９６、Ｗｏｏｄｙ  ｐｌａｎｔ  ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎｕｒｓｅｒｙｍａｎ、１８３：３８〜４７）。市販品種のＭｉｌｌｉｏｎ  ｓｔａｒｓ（これはＭ．Ｓとして示される）からの種子を得るために、本発明者らは、培養されたＧ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａの外植片を抗有糸分裂性除草剤のオリザリンにより処理するための取り組みを用いた。
【０２１２】
材料および方法
Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｓｔａｒｓ（商標）と称される栽培されたＧ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａの節間セグメント（２〜４ｃｍの長さ）を、３％のスクロースおよび１％の寒天が補充される半強度のムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）基礎培地において培養した。培地をオートクレーブによって殺菌し（１２１℃、２０分間）、その後、培地に、シュート増殖のための成長調節因子（ジベレリンおよびベンジルアミノプリン）を補充した。オリザリン水溶液を、０．２５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を伴って０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭの最終濃度で加えた。培養物を、１６時間の明期のもと、２３±２℃でインキュベーションした。セグメントを２週間後に再び切断し、新鮮な半強度ＭＳ基礎培地に入れた。２〜３週間後、再生シュートを切断し、発根のためにＭＳ基礎固体培地に入れ、その後、順化のために温室に順次移した。再生させた小植物の倍数性レベルを、未処理の品種と比較して、すべてのオリザリン処理物についてフローサイトメトリー（Ｐｌａｎｔ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ−Ｌａａｇｅｉｎｄｅ  ６  ４０１６  ＣＶ  Ｋａｐｅｌ  Ａｖｅｚａａｔｈ  Ｂｕｒｅｎ、オランダ）によって評価した。
【０２１３】
この取り組みの概略が表ＩＶならびに図１および図２に示される。Ｇ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｓｔａｒｓのオリザリン処理により、Ｍ．Ｓ多倍数性と称される多倍数体株の生成がもたらされた。ＤＮＡヒストグラムにおいて、内部標準（ツルニチニチソウ）のピークがＲＮ１として表される。
【０２１４】
（倍数性レベルを表す）カスミソウサンプルのピークがＲＮ２により表される。
【表４】
2018500943.tif 000006
【０２１５】
実施例２
Ｇ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａにおける遺伝的背景
種々の遺伝的背景体を、ＰＡＰ１の成功した発現を得るためにカスミソウの遺伝子形質転換のために使用した。種子を２００４〜２００９年の間に異なる放任受粉圃場から集めた。また、下記の種々のカスミソウ属種を、ＰａＰ１の成功した発現が達成され得る遺伝的背景体についてスクリーニングしながら、使用した（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｓｃｏｒｚｏｎｅｒｉｆｏｌｉａ、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ａｒｂｏｒｅａ、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐｅｔｒａｅｕｓおよびＧｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ａｒａｂｉｃａ）。シュッコンカスミソウの範囲内において、形質転換のために使用される遺伝的背景体が、Ｐｉｎｋｏｌｉｎａ、Ｍｉｙａｂｉ、およびＭ．Ｓ  Ｐｏｌｙｐｌｏｉｄであった。
【０２１６】
実施例３
Ｇ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａの遺伝子形質転換
ＰａｐＩ（アントシアニン色素生成１）は、アントシアニンを含むフェニルプロパノイドの生成を調節することが知られているＭｙｂ転写因子である（Ｂｏｒｅｖｉｔｚ  ＪＯ、Ｘｉａ  Ｙ、Ｂｌｏｕｎｔ  Ｊ、Ｄｉｘｏｎ  ＲＡ、Ｌａｍｂ  Ｃ（２０００）、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＭＹＢ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１２、２３８３〜２３９３）。
【０２１７】
形質転換構築物ｐＨＡＰＡＰ（これはバイナリーベクターｐＣＧＮ１５５９に基づく）（図４）において、ｐａｐＩ遺伝子（配列番号１）は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓプロモーター（配列番号４）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ３’）遺伝子の転写終結シグナル（配列番号３）の転写制御を受けている。バイナリーベクターｐＨＡＰＡＰはまた、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの転写制御を受けている大腸菌Ｔｎ５由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）と、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のｔｍｌ３’ターミネーターとを含有しており、そのため、このベクターにより、アミノグリコシド系抗生物質に対する抵抗性が与えられる（Ｃｏｍａｉ  Ｌ、Ｍｏｒａｎ  Ｐ、Ｍａｓｌｙａｒ  Ｄ（１９９０）、Ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ａｎｄ  ＭＡＳ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１５（３）、３７３〜３８１；ＭｃＢｒｉｄｅ  ＫＥおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ  ＫＲ（１９９０）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１４、２６９〜２７６）。
【０２１８】
材料および方法
形質転換方法
植物材料
カスミソウ（シュッコンカスミソウ）種子を、年間を通して自然の屋外条件のもとにおいてＮｉｒ−Ｚｖｉ（イスラエル）で行われた異なる放任受粉交配から集めた。種子を母植物から単離し、清浄化し、通常の室温条件のもとにおいて紙袋で保存した。それぞれの袋には、種子の遺伝的背景を含む特定のコードをつけた。形質転換実験のために使用された種子のすべてが、６ヶ月までの通常の室温貯蔵であった。種子を７０％エタノールによりすすぎ、１．５％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムにおいて１０分間殺菌し、滅菌水において３回すすいだ。
【０２１９】
培地組成および組織培養条件
スクロース（３０ｇ／ｌ）を伴い、寒天（８ｇ／ｌ）により固化させられるムラシゲ・スクーグ基礎培地（ＭＳ；ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２）（基礎培地）には、成長調節因子および抗生物質を、（下記で記載されるような形質転換のための）アグロバクテリウムとの共培養、不定芽の再生および選抜、遺伝子組換え植物の伸長および発根のために補充した。すべての培地をオートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）の前にｐＨ５．８に調節した。
【０２２０】
発芽のために、種子を暗室において、５ｍｇ／ｌのジベレリン酸（ＧＡ）を含有する基本培地に置き、約５日後、幼若胚の胚軸を単離した。アグロバクテリウムとの共培養のために、基本培地には、０．１ｍｇ／ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．５ｍｇ／ｌの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）および１００μｍのアセトシリンゴンを補充した（共培養培地）。シュート再生および形質転換体の選抜を、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび２ｍｇ／ｌの１−フェニル−３（１，２，３−チアジアゾール−５−イル）ウレア（ＴＤＺ）が補充される基礎培地（「ＳＲ−Ｔ」として示される培地）で行った。
【０２２１】
若い葉を再生組織から分離し、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび１ｍｇ／ｌの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）が補充される新しい再生培地（「ＳＲ−Ｂ」として示される／称される培地）に置いた。再生培地にはまた、３００ｍｇ／ｌのカルベニシリンと、別途言及される場合は除き、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンとを補充した。遺伝子組換えシュートの伸長および発根を２回目の選抜の後で、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．１ｍｇ／ｌ（ＧＡ）、２００ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する基礎培地で行った。すべての培養物を、別途言及される場合は除き、冷白色光（６０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１）を使用して１６時間の明期のもと、２５±１℃で生育室において維持した。
【０２２２】
細菌株
単一コロニーに由来する、バイナリーベクターｐＨＡＰＡＰ（ＭｃＢｒｉｄｇｅ  ＫＥおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ  ＫＲ、１９９０）を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬＯ（Ｌａｚｏ他、１９９１）を、液体ＬＢ培地（１０ｇ／ｌのバクトトリプトン、５ｇ／ｌのバクト酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌのグルコース、ｐＨ７．５）において２８℃で約２０時間、ロータリーシェーカーで成長させた（２５０ｒｐｍ）。培地には、１００μｍのアセトシリンゴン、５０ｍｇ／ｌのリファンピシンおよび２５ｍｇ／ｌのゲンタマイシンを補充した。細菌（ＡＧＬＯ／ｐＨＡＰＡＰ、Ｏ．Ｄ５５０＝０．５）を１００００×ｇでの２分間の遠心分離によって集めた；ペレットを液体共培養培地に再懸濁し（ＯＤ５５０＝０．５または１．０）、懸濁物を接種のために使用した。
【０２２３】
形質転換および遺伝子組換え植物の再生
胚軸外植片に細菌懸濁物（ＡＧＬＯ／ｐＨＡＰＡＰ、Ｏ．Ｄ５５０＝０．２）を接種した。共培養およびすべての連続する工程の期間中、外植片を直立位で培養した。共培養培地での５日間の培養（暗所で３日間、その後、明所で２日間）の後、外植片をシュート再生および１回目の選抜のためにＳＲ−Ｔ培地に移した。その後、外植片を横に二分割し、新鮮なＳＲ−Ｔ培地に移した。さらに約３週間の後、再生した不定芽の塊を最初の茎外植片から切り取った。それぞれの独立した塊のシュートのすべてに由来する葉を取り、不定芽の再生および導入遺伝子体の選抜（２回目の選抜）のためにＳＲ−Ｂ培地で培養した。１０〜１２日後、新しい不定芽が葉の基部領域から出現した。これらのシュートを伸長培地に移し、その後、発根培地に移し、ＰＣＲによるそれらの遺伝子導入性に関する評価を、Ｍｏｙａｌ  Ｂｅｎ  Ｚｖｉ，Ｍ．、Ｚｕｋｅｒ，Ａ．、Ｏｖａｄｉｓ，Ｍ．、Ｓｈｋｌａｒｍａｎ，Ｅ．、Ｂｅｎ−Ｍｅｉｒ，Ｈ．、Ｚｅｎｖｉｒｔ，Ｓ．およびＶａｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．（２００８）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ  Ｌ．）、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、２２：５４３〜５５３に記載されるように行った。硬化後、遺伝子組換え植物を温室に移した。温室において、遺伝子組換え植物は正常に発達し、開花した。
【０２２４】
実施例４
遺伝子組換えＧ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ品種
４つの遺伝子組換え株を、ＰＡＰ１の発現を伴う成功した形質転換によって得た（これらの株を、ＲＰ−１、ＲＰ−４およびＲＰ−１０と称した）。それらのすべてが、前記で記載されるようにＭ．Ｓ多倍数体の同じ遺伝的背景から樹立された。
この育種計画を、表Ｖ（下記）および図５Ａ〜Ｃに記載されるように、２×よりも大きい倍数性レベルによってもまた特徴づけられるそのような株を使用して続けた。
【表５】
2018500943.tif 000007
【０２２５】
この育種計画は、多様な表現型を有する新しい品種を作出するために、前記の遺伝子組換え株を用いて継続した。導入されたｐａｐＩ遺伝子は、葯、めしべ、子房、花弁、萼片、茎および葉を含む様々な植物組織におけるアントシアニン色素の蓄積をもたらした。その後の交配および選抜の期間中に、様々な花器官における異なる色素発現パターンおよび強度（例えば、緑色の茎、緑色の葉群（葉）、赤色の花；濃色の茎、濃色の葉群（葉）、赤色の花；および濃色の茎、濃色の葉群（葉）、白色の花など）を有するハイブリッドが得られた。それらの表現型についての様々な例が表ＶＩ（下記）に記載される。
【表６】
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【０２２６】
この育種計画は、色素発現のレベルおよびパターン、同様にまた、商用基準（例えば、植物の構造、花の形態学、農学的成績および経済的収量など）の達成を含む、植物の表現型および農学的成績に基づく進歩および商業化のために選抜された新しい遺伝子組換えカスミソウ品種を表す安定な株がもたらされた。
【０２２７】
ハイブリッド遺伝子組換え株のいくつかの細胞のＤＮＡ含有量が表ＶＩＩ（下記）および図６Ａ〜Ｅに記載される。
【表７】
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【０２２８】
実施例５
遺伝子組換えＧ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ品種における色素分析
本教示に従って作成されたいくつかの遺伝子組換えハイブリッドカスミソウ品種から得られる花を色素分析に供した。
【０２２９】
材料および方法
植物材料
アントシアニン抽出のための花を夏期（８月）の間にイスラエル国内の開花植物から採取した：それらの植物は、その年の３月に温室において植えられた。植物は下記のように成長させた：植え付け密度が１ｍ２の苗床あたり６個の植物であり、植物は、摘心が植え付け後４週間で行われ、４００ｐｐｍのジベレリン酸による噴霧が植え付け後６週間で行われた。
【０２３０】
ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦ−ＭＳによるアントシアニン決定
１００ｍｇの凍結されたカスミソウ微細粉末を１：３（ｗ／ｖ）（組織：抽出液）の比率で７０％メタノール＋２％ギ酸によって抽出し、その後、浴型超音波処理器での２０分、そして、１３０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離を行った。上清を０．２２μｍのＰＴＦＥメンブランフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）ＣＲ  １３ｍｍ；ＰＡＬＬ）でろ過し、その後、ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦ−ＭＳ装置に注入した。
【０２３１】
アントシアニンの質量スペクトル分析を、ＵＰＬＣカラムがオンラインでＰＤＡ検出器（１９０〜８００ｎｍ）に接続され、次いでＭＳ検出器に接続されるＵＰＬＣ−ＱＴＯＦ装置（Ｗａｔｅｒｓ  ＨＤＭＳ  Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓ）により行った。代謝物の分離を、１００×２．１ｍｍ（内径）、１．７μｍ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ）での勾配溶出（アセトニトリル−水、３％ギ酸含有）によって、０．１ｍｌ／分の流速で行った。その直線勾配は下記の通りであった：２５分かけて１００％から６５％への相Ａ、５分かけて６５％から０％への相Ａ、１００％の相Ｂでさらに１分間保持し、その後、初期条件（１００％の相Ａ）に０．２分で戻し、１００％の相Ａでの４分間のコンディショニング。注入体積が０．５μｌであった。溶出した化合物の質量（５０〜１２００Ｄａまでのｍ／ｚ範囲）を、ＭＳＥモードを使用してポジティブモードで行われるＥＳＩ源を備えるＱＴＯＦ−ＭＳにより検出した。衝突エネルギーを低エネルギー機能については４ｅＶに設定し、高エネルギー機能については１５ｅＶ〜５０ｅＶの傾斜に設定した。１５個の標準化合物の混合物（１０サンプル毎の後で注入される）をＱＣのために使用した。化合物を、観測されたＵＶスペクトル、ＭＳフラグメントおよび決定された元素組成を、文献に見出されるものと比較することによって推定的に特定した。
【０２３２】
結果
色素分析の結果が表ＩＩＩ（以下）にまとめられ、図７に示される。
【０２３３】
遺伝子組換えのカスミソウ品種は、遺伝子非組換えの白色開花カスミソウ（Ｍ．Ｓ）および薄ピンク色のカスミソウＭｙ  ｐｉｎｋ（商標）（Ｍ．Ｐ）と比較してアントシアニンのレベルにおける増大を示した。
【０２３４】
色素分析では、ある範囲のアントシアニン量が遺伝子組換え品種において示され、品種１７０におけるシアニジンマリルグルコシドの比率が、品種５９および品種１００と比較して、１．７倍および２．４倍それぞれ大きかった。品種１７０におけるシアニジンヘキソースの比率が、品種５９および品種１００と比較して、０．９倍および１．７倍それぞれ大きかった。品種１７０におけるペオニジンクマロイル−ペントースの比率が、品種５９および品種１００と比較して、５４．７倍および２．２倍それぞれ大きかった。
【０２３５】
色素分析では、遺伝子組換え品種およびＭ．Ｐにおいて特定されたシアニジンヘキソースおよびペオニジン誘導体がＭ．Ｓでは特定されなかったことが示された。品種１７０におけるシアニジンマリルグルコシドの比率が、Ｍ．ＰおよびＭ．Ｓの品種と比較して、１１６倍および７５４５倍それぞれ大きかった。品種１７０におけるシアニジンペントースデオキシヘキソースの比率が、Ｍ．ＰおよびＭ．Ｓの品種と比較して、９８倍および７５倍それぞれ大きかった。
【表８】
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【０２３６】
実施例６
カスミソウ遺伝子組換え株の分子的特徴づけ
材料および方法
ＤＮＡ  ＰＣＲ
遺伝子組換え株のＤＮＡ  ＰＣＲ分析を、Ｍｏｙａｌ−Ｂｅｎ  Ｚｖｉ他（２００８ｂ）に概略される方法を使用してＰＡＰ１プライマーにより行った。
【０２３７】
下記のプライマーを使用した：
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【０２３８】
サザン分析
ゲノム内への安定的組み込みを確認するために、ＰＣＲ陽性のＰＡＰ１カスミソウ植物において、９個のカスミソウ植物のＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡを、ＰＡＰ１遺伝子のためのプローブを使用してサザンブロット分析のために使用した。
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【０２３９】
ｇＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  ＩＩ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を製造者の説明書に従って使用して下記の遺伝子組換え株の１０個の組織サンプルから単離した：１、４、７、１０、５９、２７２、３６５、４５０、５０５（Ｍ．Ｓを陰性対照として使用した）。ｇＤＮＡの品質をゲルで調べ、濃度をＱｕｂｉｔ分析によって求めた。およそ５μｇのそれぞれのＤＮＡおよび約２５ｐｇのプローブプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１Ｋｂ＋マーカーとともに、３５０ｍｌの０．６５％ＴＢＥアガロースゲルに負荷した。ゲルを１７．５時間にわたって６０Ｖで電気泳動した。ゲルを染色し、写真撮影し、その後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ＋１．５Ｍ  ＮａＣｌにより２回、それぞれ２５分間処理し、その後、０．５Ｍ  ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋１．５Ｍ  ＮａＣｌにより２回、それぞれ２５分間処理した。ゲルを、‘ＴｕｒｂｏＢｌｏｔｔｅｒ’および１０×ＳＳＣを使用して、製造者の説明書に従って一晩、ナイロンメンブラン（Ｎｙｔｒａｎ  Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅ；Ｗｈａｔｍａｎ）に転写した。メンブランをＵＶ架橋し、風乾した。フィルターを、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液および０．５％ＳＤＳを使用して６８℃で７時間プレハイブリダイゼーションした。フィルターを、それらのそれぞれのランダム・プライムド・プローブ鋳型ＤＮＡ（ＰＡＰ１）を使用してハイブリダイゼーションした。プローブについての１×１０９ｄｐｍ／ｕｇを超える比活性が達成された。ハイブリダイゼーションのために、プローブ濃度がＨＹＢＥ緩衝液（プレハイブリダイゼーション緩衝液と同じ）において約３．５×１０６ｄｐｍ／ｍｌであった。ハイブリダイゼーションを６８℃で１６．５時間行った。フィルターを、６０分の期間にわたって３回の緩衝液交換を行いながら６８℃で、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにおいて洗浄した。フィルターを、増強スクリーンを−８０℃で用いた４日間のオートラジオグラフィーに供した。
【０２４０】
結果
ＰＡＰ１プライマーを用いて行われる遺伝子組換え株のＤＮＡ  ＰＣＲ分析では、遺伝子組換え植物における遺伝子の存在が確認された（図８）。
【０２４１】
サザン分析を、遺伝子組換え株のゲノムにおけるＰＡＰ１の安定的組み込みを示すために行った。結果が図９に示される。結果は、少なくとも１〜５つのハイブリダイゼーションバンドが８個の遺伝子組換え株では現れ、しかし、非形質転換植物のＭｉｌｌｉｏｎ  Ｓｔａｒｓ（レーン：Ｍ．Ｓ）では、また、ＲＰ−７として示される他の陰性対照植物では現れなかったことを示す。このことは、ＰＡＰ１遺伝子が、試験された植物のゲノムに組み込まれたことを示している。
【０２４２】
ＨｉｎｄＩＩＩはＴ−ＤＮＡ領域において一カ所でのみ切断し（図９）、したがって、サザンブロットハイブリダイゼーションにおいて生じるバンドの数は、それぞれの植物における導入遺伝子の組み込まれた部位の数を反映しているにちがいない。サザンブロットの結果は、少なくとも３カ所の組み込み部位が植物ＴＧ５０５およびＴＧ４５０のゲノムには存在し、少なくとも４コピーが植物５９のゲノムには存在することを示唆する。ＴＧ５０５、ＴＧ５９およびＴＧ４５０を、同じ遺伝子組換え事象体（ＲＰ−４）からの育種の後で得た。したがって、これらは、類似した組み込み部位を有する。
【０２４３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０２４４】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図６Ｃ−６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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