(57)【要約】  少なくとも１種のラムノ脂質の製造方法であって、（ａ）組換え細胞を炭素源を含む培地と接触させるステップを含み、前記組換え細胞は、その細胞の野生型と比較して、該細胞が酵素Ｅ1、Ｅ2およびＥ3の少なくとも１つの増大された活性を有し、ここで、酵素Ｅ1は、α／βヒドロラーゼ（ＲＨｌＡ）であり、酵素Ｅ2は、ラムノシルトランスフェラーゼＩ（ＲＨｌＢ）であり、かつ酵素Ｅ3は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩ（ＲＨｌＣ）であり、かつ前記炭素源は、６個〜１０個の炭素原子を含むアルカンおよび／またはアルカン酸である、製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のラムノ脂質の製造方法であって、
（ａ）組換え細胞を炭素源を含む培地と接触させるステップを含み、前記組換え細胞は、その細胞の野生型と比較して、該細胞が酵素Ｅ1、Ｅ2およびＥ3の増大された活性を有するように遺伝子改変されており、ここで、酵素Ｅ1は、α／βヒドロラーゼ（ＲＨｌＡ）であり、酵素Ｅ2は、ラムノシルトランスフェラーゼＩ（ＲＨｌＢ）であり、かつ酵素Ｅ3は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩ（ＲＨｌＣ）であり、かつ前記炭素源は、６個〜１０個の炭素原子を含むアルカンおよび／またはアルカン酸であり、かつ前記ラムノ脂質は、一般式（Ｉ）
【化１】
2018505690.tif 000005
［式中、
ｍは、２、１または０、特に１または０であり、
ｎは、１であり、
Ｒ1およびＲ2は、互いに独立して、２個〜２４個の炭素原子を有する同一もしくは異なる有機基、任意に分枝鎖状の、任意に置換された、ヒドロキシ置換された、任意に不飽和の、または任意に一価不飽和、二価不飽和もしくは三価不飽和のアルキル基である］を含む、製造方法。
【請求項２】
−  前記アルカンは、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナンおよびデカンからなる群から選択することができ、かつ／または
−  前記アルカン酸は、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸およびデカン酸からなる群から選択することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、その細胞の野生型と比較して、該細胞が酵素Ｅ4のオキシドレダクターゼの増大された活性を有するように遺伝子改変されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記オキシドレダクターゼは、ａｌｋＢ型のオキシドレダクターゼ、モノオキシゲナーゼおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組換え細胞は、該細胞の野生型と比較して酵素Ｅ1、Ｅ2およびＥ3ならびにオキシドレダクターゼの増大された活性を有し、かつ前記炭素源は、ヘキサンおよび／またはデカンである、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
培地中の全炭素含量の４０質量％が、ヘキサン、デカン、ヘキサン酸および／またはデカン酸である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
−  酵素Ｅ1は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰの３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸−ＡＣＰを介したヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸への変換を触媒することが可能であり、
−  酵素Ｅ2は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートのα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒することが可能であり、かつ
−  酵素Ｅ3は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートのα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒することが可能である、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
−  前記酵素Ｅ1は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列およびそれらの断片を含み、
−  前記酵素Ｅ2は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの断片からなる群から選択され、かつ
−  前記酵素Ｅ3は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５およびそれらの断片からなる群から選択され、その際、
前記断片は、アミノ酸基の２５％以下が、それぞれの酵素の配列と比較して、欠失、挿入、置換またはそれらの組合せによって改変されているポリペプチド配列を含み、かつ該断片は、それぞれの酵素の酵素活性の少なくとも１０％を含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およびカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）からなる群の属から選択される、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞は、シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＧＰｐ１２１、シュードモナス・プチダＧＰｐ１２２、シュードモナス・プチダＧＰｐ１２３、シュードモナス・プチダＧＰｐ１２４およびシュードモナス・プチダＧＰｐ１０４、シュードモナス・プチダＫＴ４２Ｃ１、シュードモナス・プチダＫＴＯＹ０１またはシュードモナス・プチダＫＴＯＹ０２からなる群から選択される、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラムノ脂質は、２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０、２ＲＬ−Ｃ８−Ｃ１０、２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０および２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１２：１からなる群から選択されるジラムノシル脂質であってよい、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種のラムノ脂質を炭素源から製造する方法および細胞に関する。特に、前記炭素源は、少なくとも６個の炭素原子を含む有機化合物であってよく、かつ前記ラムノ脂質は、ジラムノシル脂質であってよい。
【０００２】
発明の背景
石油化学的原材料から得られる現在入手可能な界面活性剤の適切な代替物としての、再生可能な原材料から製造される生分解性界面活性剤については、市場で一般的な需要が存在する。この需要は、予想され得る石油化学的原材料の枯渇と界面活性剤の需要増加に伴い一段と強まっている。ラムノ脂質は、そのような界面活性剤の少なくとも１つの例である。ラムノ脂質は、石油またはその生成物から製造される従来の界面活性剤と置き換わり得る潜在性を有しているため、得られた配合物の環境性能を必ず改善するので、ラムノ脂質は、経済的に関心が持たれる１つのクラスである。
【０００３】
これらのラムノ脂質は、少なくとも１種のモノラムノシル脂質を含むか、または２個のラムノース基（ジラムノシル脂質）と１個もしくは２個の３−ヒドロキシ脂肪酸残基を含む（炭化水素および脂質の微生物学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），２０１０）。それらのラムノ脂質は、あらゆる種類の用途において界面活性剤として使用するために必要とされる界面活性特性を有する（Ｌｅｉｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９を参照）。特に、ラムノ脂質は、家事、洗浄、化粧品、食品加工、医薬品、植物保護およびその他の用途において広い範囲で界面活性剤として使用することができる。
【０００４】
これらのラムノ脂質を生産するために現在使用される方法は、様々なヒトおよび動物の病原性細菌、特にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の一員の野生型分離株を使用している（炭化水素および脂質の微生物学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），２０１０）。これらの病原性生物が顧客に疾患を引き起こすことが考えられるという事実は、従来のように産生されたこれらのラムノ脂質に対する顧客の許容性をかなり低下させる。さらにまた、より高い安全性要求は、設備投資の増大、そして可能性のある追加の生産ステップのため生産コストを高める。これらのラムノ脂質が使用される製品のほとんどは、非常に低コストで生産することができる大容量の化学薬品であるので、ラムノ脂質は、顧客に対する健康リスクがないとともに、できる限り規定の特性をもって、できる限り低いコストで生産できねばならない。
【０００５】
ラムノ脂質の生産のために利用できる最近の方法は、これらの病原性生物および単独基質または補助基質としての植物油の使用を含む（炭化水素および脂質の微生物学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），２０１０）。しかしながら、植物油は、その他の炭素源、例えばグルコース、スクロースまたは多糖類、例えばデンプン、セルロースおよびヘミセルロース、グリセロール、ＣＯ、ＣＯ2またはＣＨ4と比べて比較的高価な原材料である。ラムノ脂質はまた、国際公開第２０１２０１３５５４号パンフレット（ＷＯ２０１２０１３５５４Ａ１）に教示されるように、非病原性生物によって、炭素源、例えばグルコース、スクロースまたは多糖類を使用して産生される。そのような短い炭素鎖からラムノ脂質を構築するには多量の資源が必要とされる。
【０００６】
しかしながら、依然として、ラムノ脂質（特に、モノラムノシル脂質および／またはジラムノシル脂質）を効果的に（すなわち、廉価に、かつ健康の観点から安全に）、そして十分すぎる量で、非病原性生物および代替となる再生可能な原材料を使用して生産することが求められている。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、従来技術に存在する課題を解決可能であり得る方法に関する。特に、本発明は、組換え細胞を、少なくとも１種の炭素源の存在下に接触させることによる、少なくとも１種のラムノ脂質の製造方法であって、前記炭素源が、６個より多くの炭素原子を含む少なくとも１種のアルカンである製造方法に関する。該組換え細胞は、酵素α／βヒドロラーゼ、ラムノシルトランスフェラーゼＩまたはラムノシルトランスフェラーゼＩＩの少なくとも１つの、該細胞の野生型と比較して増大された活性を有する。この方法は、モノラムノシル脂質および／またはジラムノシル脂質の高い選択性の生産を、不所望な副生成物および産生される中間体の量を減らして可能にし得るので、特に有利であり得る。例えば、本発明のいずれかの態様により形成されるβ−ヒドロキシ脂肪酸の二量体（脂肪酸二量体）のような中間体は、現在利用可能な方法と比較して少なくともより少なくなり得る。
【０００８】
本発明のいずれかの態様による方法の更なる利点は、制限されるものではないが、非病原性であり、かつ培養が簡単な生物を利用することができるということを含む。更なる利点は、本発明のいずれかの態様による方法では、油および単純な炭水化物基質（例えば、グルコース、フルクトースまたはスクロース）が唯一の基質または補助基質であることを必要とし得ないことを含む。本発明のいずれかの態様によれば、もう一つの利点は、規定の変更可能な特性を有するラムノ脂質を製造することができることであり得る。また具体的には、ジラムノシル脂質を製造することができる。更なる利点は、ラムノ脂質を、これらの活性の増強がなされていない細胞を用いるよりも高い空時収量および炭素収量で製造することができることであってよい。
【０００９】
さらに、本発明のいずれかの態様による方法は、より高級の炭素アルカン（Ｃ６以上）を、より小さい炭素鎖にまずは分解してからラムノ脂質へと再構築することなく、直接的にラムノ脂質へと変換することを可能にする。
【００１０】
本発明のいずれかの態様によれば、本発明のいずれかの態様を使用して製造することができるラムノ脂質および／またはそれらのラムノ脂質混合物は、同様に本発明の主題であってよい。本発明のいずれかの態様により製造することができるラムノ脂質および混合物は、少なくとも洗浄剤または手入れ剤、化粧品、外皮用製剤または医薬製剤ならびに植物保護製剤、界面活性剤濃縮物等において有利に使用することができる。
【００１１】
用語「手入れ剤」は、本明細書では、物品のその本来の形を維持する、外的影響（例えば、時間、光、温度、圧力、汚染、該物品と接触するその他の反応性化合物との化学反応等）および劣化、汚染、材料疲労の作用を減らすまたは避ける目的を満たし、かつ／またはさらに物品の所望の良い特性を改善するための製剤を意味するものと理解される。物品の所望な良い特性の一例には、髪艶の改善または物品の可塑性の増加等のような特性が含まれ得る。
【００１２】
「植物保護製剤」は、本明細書では、調製物の特性によって植物保護のために使用される製剤を意味するものと理解されるべきである。それは、特に、除草剤、防かび剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、鳥害に対する保護物質、植物栄養および土壌構造改善剤からなる群からの少なくとも１種の化合物が、該製剤中に含まれる場合である。
【００１３】
本発明のいずれかの態様により製造されるラムノ脂質は、家事、産業において、特に硬質表面、皮革および／またはテキスタイルに対して使用される手入れ剤および洗浄剤の成分として使用することができる。
【００１４】
本発明の一態様によれば、少なくとも１種のラムノ脂質を製造する少なくとも１種の方法であって、
（ａ）組換え細胞を炭素源を含む培地と接触させるステップを含み、前記組換え細胞は、その細胞の野生型と比較して、該細胞が酵素Ｅ1、Ｅ2およびＥ3の少なくとも１種の増大された活性を有するように遺伝子改変されており、ここで、酵素Ｅ1は、α／βヒドロラーゼ（ＲＨｌＡ）であり、酵素Ｅ2は、ラムノシルトランスフェラーゼＩ（ＲＨｌＢ）であり、かつ酵素Ｅ3は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩ（ＲＨｌＣ）であり、かつ前記炭素源は、少なくとも６個またはそれより多くの炭素原子を含むアルカンである、方法が提供される。特に、該細胞は、３種の酵素Ｅ1、Ｅ2およびＥ3の全ての増大された活性を含んでよい。より具体的には、本発明のいずれかの態様による細胞は、酵素Ｅ1のα／βヒドロラーゼ（ＲＨｌＡ）、酵素Ｅ2のラムノシルトランスフェラーゼＩ（ＲＨｌＢ）、および酵素Ｅ3のラムノシルトランスフェラーゼＩＩ（ＲＨｌＣ）の、野生型に対して増大された活性を含み、かつ産生されたラムノ脂質は、少なくとも１種のジラムノシル脂質である。
【００１５】
本発明のもう一つの態様によれば、１種のＣ6〜Ｃ10−アルカンおよび／またはアルカン酸から少なくとも１種のラムノ脂質を形成することが可能な細胞であって、該細胞は、その細胞の野生型と比較して、酵素オキシドレダクターゼならびに酵素Ｅ1、Ｅ2およびＥ3の少なくとも１種の増大された活性を有するように遺伝子改変されており、ここで、酵素Ｅ1は、α／βヒドロラーゼであり、酵素Ｅ2は、ラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつ酵素Ｅ3は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩである、細胞が提供される。具体的には、本発明のいずれかの態様による細胞は、酵素Ｅ1のα／βヒドロラーゼ（ＲＨｌＡ）、酵素Ｅ2のラムノシルトランスフェラーゼＩ（ＲＨｌＢ）、および酵素Ｅ3のラムノシルトランスフェラーゼＩＩ（ＲＨｌＣ）の、野生型細胞に対して増大された活性を含み、かつ産生されたラムノ脂質は、少なくとも１種のジラムノシル脂質である。
【００１６】
より具体的には、本発明のいずれかの態様による細胞は、ラムノ脂質を形成することが可能であってよく、かつ該細胞の野生型と比較して増大された、遺伝子産物ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢおよびｒｈｌＣの少なくとも１種の遺伝子産物またはホモログの活性を有してよい。少なくとも一例においては、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢおよびｒｈｌＣは、ＧＲＡＳ生物（（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｇａｒｄｅｄ  ａｓ  ｓａｖｅ）（一般に安全と認められる））（国際公開第２０１２０１３５５４号パンフレット（ＷＯ２０１２０１３５５４Ａ１）に記載される）中に導入することで、少なくとも６個またはそれより多くの炭素原子を含むアルカンである炭素源からラムノ脂質を産生させることができる。具体的な一例においては、本発明のいずれかの態様による細胞は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）の菌株ＫＴ２４４０であってよい。
【００１７】
特に、本発明のいずれかの態様による方法で使用される炭素源は、少なくとも６個またはそれより多くの炭素原子を含むアルカンである。該アルカンは、化学式ＣnＨ2n+2を有してよく、式中、「ｎ」は、６より大きくてよい。より具体的には、「ｎ」は、６、７、８、９または１０であってよい。さらにより具体的には、該アルカンは、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナンおよびデカンからなる群から選択することができる。
【００１８】
もう一つの例においては、炭素源は、アルカン酸であってよい。特に、該アルカン酸は、６個またはそれより多くの炭素原子を有してよい。より具体的には、本発明のいずれかの態様による方法で使用されるアルカン酸は、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸等からなる群から選択することができる。
【００１９】
一例においては、該炭素源は、６個〜１０個の炭素原子を有するアルカンおよび／またはアルカン酸の組合せを含んでよい。例えば、該炭素源は、ヘキサン酸およびヘキサン、ヘキサン酸およびデカン、ヘキサン酸およびデカン酸、デカン酸およびヘキサン、デカン酸およびデカン等を含み得る。
【００２０】
本発明のいずれかの態様により使用される培地は、少なくとも１種の炭素源を含む。培地中の炭素源は、少なくとも、６個またはそれより多くの炭素原子を含むアルカンおよび／またはアルカン酸であってよい。特に、培地中の炭素源は、本質的にヘキサンおよび／もしくはヘキサン酸からなるか、または主にヘキサンおよび／もしくはヘキサン酸を含んでよい。特に、Ｃ6分子の全量は、培地中の全炭素含分の質量に対して、少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％または７０％であるか、またはそれらに等しい。より具体的には、Ｃ6分子の全量は、培地中の炭素源の質量に対して、少なくとも５０％、７０％または８０％であるか、またはそれらに等しい。さらにより具体的には、Ｃ6分子は、培地中の炭素源の質量に対して、少なくとも９０％もしくはそれと等しくてよく、または約１００％であってよい。この例では、Ｃ6分子とは、ヘキサンおよび／またはヘキサン酸を指してよい。
【００２１】
もう一つの例においては、培地中の炭素原子は、本質的にデカンおよび／もしくはデカン酸からなるか、または主にデカンおよび／もしくはデカン酸を含んでよい。特に、Ｃ10分子の全量は、培地中の全炭素含分の質量に対して、少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％または７０％であるか、またはそれらに等しい。より具体的には、Ｃ10分子の全量は、培地中の炭素源の質量に対して、少なくとも５０％、７０％または８０％であるか、またはそれらに等しい。さらにより具体的には、Ｃ10分子は、培地中の炭素源の質量に対して、少なくとも９０％もしくはそれと等しくてよく、または約１００％であってよい。この例では、Ｃ10分子とは、デカンおよび／またはデカン酸を指してよい。
【００２２】
一例においては、該培地は、２つ目の炭素源を含んでよい。特に、炭素源は、炭水化物、例えばグルコース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースおよびヘミセルロース、植物油および動物油ならびに脂肪、例えばダイズ油、ベニバナ油、落花生油、麻実油、ジャトロファ油、ココナツ脂、カラバッシュ油、アマニ油、トウモロコシ油、けし油、メマツヨイグサ油、オリーブ油、パーム核油、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマワリ油、グレープシード油、クルミ油、小麦胚芽油およびヤシ油、脂肪酸、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、γ−リノレン酸およびそのメチルエステルまたはエチルエステルならびに脂肪酸混合物、前記のいずれかの脂肪酸を含むモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド、アルコール類、例えばグリセロール、エタノールおよびメタノール、炭化水素、例えばメタン、炭素含有ガスおよびガス混合物、例えばＣＯ、ＣＯ2、合成ガスまたは煙道ガス、アミノ酸、例えばＬ−グルタメートまたはＬ−バリンまたは有機酸、例えば酢酸であってよい。これらの物質は、個別にまたは混合物として使用することができる。米国特許第６，０１，４９４号明細書（ＵＳ６，０１，４９４）および米国特許第６，１３６，５７６号明細書（ＵＳ６，１３６，５７６）に記載される炭素源としての炭水化物、特に単糖類、オリゴ糖類または多糖類、ならびに炭化水素、特にアルカン、アルケンおよびアルキン、ならびにそれらから誘導されるモノカルボン酸、およびこれらのモノカルボン酸から誘導されるモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド、ならびにグリセロールおよびアセテートを使用することができる。グリセロールとカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸および／またはγ−リノレン酸のエステル化生成物を含むモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドを使用することができる。
【００２３】
本発明のいずれかの態様によれば、該細胞が、長鎖炭素源、例えばヘキサン、ヘキサン酸、デカン、デカン酸等からラムノ脂質を形成可能となり得ることは、大きな利点である。この理由は、これらの長鎖炭素鎖は、形成されるラムノ脂質の骨格中で直接使用できるからである。これにより、資源が節減されるとともに、これらの長鎖分子をＣ２分子構成単位に分解してから、複雑なラムノ脂質を構築するために使用するのに必要とされるエネルギーも削減される。したがって、本発明のいずれかの態様による方法は、よりエネルギー効率的であり、廃棄物を減らす。特に、製造されるラムノ脂質は、少なくとも１種のジラムノシル脂質である。
【００２４】
塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水または酸性化合物、例えばリン酸または硫酸は、培養のｐＨ制御のために培地中で適宜使用することができる。消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルは、気泡発生の制御のために使用することができる。選択作用を奏する適切な物質、例えば抗生物質は、プラスミドの安定性を維持するために培地に添加することができる。好気的条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を、培養中に導入することができる。
【００２５】
培養の温度は、通常は、２０℃、２５℃より高いかまたはそれらと等しく、その温度は、４０℃より高いかまたはそれと等しくてもよく、ここで、有利には、少なくとも９５℃またはそれと等しい、特に少なくとも９０℃またはそれと等しい、より具体的には少なくとも８０℃またはそれと等しい培養温度を使用してよい。
【００２６】
当業者であれば、炭素源からラムノ脂質を製造するのに適した条件を成すものを理解していると考えられる。本発明のいずれかの態様による細胞は、炭素源中で培養および／または増殖させることで、ラムノ脂質を産生することができる。もう一つの例においては、本発明のいずれかの態様による組換え細胞は、さらに一切増殖することなく、該炭素源と接触しているだけであってもよい。本発明のいずれかの態様による組換え細胞は、６個〜１０個の炭素原子を含む少なくとも１種のアルカンおよび／またはアルカン酸からラムノ脂質を産生することができる。当該技術分野で公知の基本的な方法を使用して、当業者であれば、本発明のいずれかの態様により使用される関連細胞に合わせるために、培地中の条件を変化させることが可能であると考えられる。
【００２７】
本発明のいずれかの態様による方法においては、該細胞によって形成されるラムノ脂質は、任意に、該細胞および／または培地から単離することができる。低分子量物質を複雑な組成物から単離するための当該技術分野で公知のあらゆる方法を適用してよい。例えば、濾過、抽出、吸着（クロマトグラフィー）結晶化等のような方法を、生成物段階で使用してよい。
【００２８】
生成物段階において単離された生成物は、その他の不所望なバイオマスの残分および様々な不純物、例えば油、脂肪酸およびその他の栄養培地成分を含んでもよい。これらの不純物等の分離は、無溶剤法で行うことができる。したがって、例えば、単離された生成物は、ｐＨの調整を容易にするために、まずは水で希釈することができる。生成物および水相は、次いで、それぞれ酸またはアルカリでｐＨを低下または上昇させることによってラムノ脂質を水溶性形に変換することによって均質化することができる。水相中でのラムノ脂質の可溶性は、反応混合物をより高い温度で、例えば６０℃〜９０℃で、かつ／または混合し続けながらインキュベートすることによって促すことができる。アルカリまたは酸によるｐＨの引き続いての上昇または低下によって、次いでラムノ脂質は、それらが水相から容易に分離できるように、水不溶性形へと再び変換することができる。次いで、生成物段階を、一回または数回、水で洗浄することで、水溶性の不純物を除去することができる。
【００２９】
油の残分は、例えば適切な溶剤による、有利には有機溶剤による抽出によって分離除去することができる。溶剤としては、アルカン、例えばｎ−ヘキサン等を使用することができる。
【００３０】
生成物の水相からの分離は、前記の無溶剤法に代えて、適切な溶剤、例えばエステル、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル等を使用して実施することができる。これらの抽出ステップは、任意の所望の順序で実施することができる。当業者は、ステップの順序ならびに／または細胞および抽出されるべきラムノ脂質のために適切に使用される溶剤を簡単に変更することができると考えられる。
【００３１】
もう一つの例においては、溶剤は、本発明のいずれかの態様により製造されるラムノ脂質の抽出において使用することができる。特に、有機溶剤を使用することができる。より具体的には、ｎ−ペンタノールを溶剤として使用することができる。蒸留は、例えば溶剤の除去のために行われる。引き続き、凍結乾燥された生成物を、例えばクロマトグラフィー法によってさらに精製することができる。例としては、適切な溶剤による沈殿、適切な溶剤による抽出、錯形成、例えばシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体による錯形成、結晶化、クロマトグラフィー法による精製もしくは単離またはラムノ脂質の容易に分離可能な誘導体への変換を使用することができる。
【００３２】
本発明のいずれかの態様により使用される組換え細胞は、その細胞の野生型と比較して、該細胞が酵素Ｅ1、Ｅ2およびＥ3の少なくとも１種の増大された活性を有するように遺伝子改変されており、ここで、酵素Ｅ1は、α／βヒドロラーゼであり、酵素Ｅ2は、ラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつ酵素Ｅ3は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩである。本発明によるいずれかの態様により使用される組換え細胞は、国際公開第２０１２０１３５５４号パンフレット（ＷＯ２０１２０１３５５４Ａ１）に開示される方法に従って製造することができる。具体的には、本発明のいずれかの態様による細胞は、酵素Ｅ1のα／βヒドロラーゼ（ＲＨｌＡ）、酵素Ｅ2のラムノシルトランスフェラーゼＩ（ＲＨｌＢ）、および酵素Ｅ3のラムノシルトランスフェラーゼＩＩ（ＲＨｌＣ）の、野生型細胞に対して増大された活性を含む。
【００３３】
特に、本発明のいずれかの態様による細胞において、酵素Ｅ1は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰの３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸−ＡＣＰを介したヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸への変換を触媒することが可能であってよく、酵素Ｅ2は、ラムノシルトランスフェラーゼＩであってよく、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートのα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒することが可能であってよく、かつ酵素Ｅ3は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩであってよく、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートのα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒することが可能であってよく、ここで、これらの酵素Ｅ1、Ｅ2およびＥ3は、
−  配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１種の酵素Ｅ1およびそれらの断片、
−  配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１種の酵素Ｅ2およびそれらの断片、ならびに
−  配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１種の酵素Ｅ3およびそれらの断片、
からなる群から選択することができる。酵素Ｅ1、Ｅ2またはＥ3のいずれか１つに関する断片は、アミノ酸基の２５％以下が、それぞれの酵素の配列と比較して、欠失、挿入、置換またはそれらの組合せによって改変されているポリペプチド配列を含んでよく、かつ該断片は、それぞれの酵素の酵素活性の少なくとも１０％を含む。
【００３４】
特に、本発明のいずれかの態様による細胞中の酵素Ｅ1は、
−  配列番号２のポリペプチド配列を含む、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号２の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号２の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ1a（ここで、酵素Ｅ1aについての酵素活性は、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを介してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
−  配列番号３のポリペプチド配列を含む、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号３の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号３の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ1b（ここで、酵素Ｅ1bについての酵素活性は、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを介してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
−  配列番号４のポリペプチド配列を含む、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号４の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号４の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ1c（ここで、酵素Ｅ1cについての酵素活性は、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを介してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
−  配列番号５のポリペプチド配列を含む、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号５の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号５の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ1d（ここで、酵素Ｅ1dについての酵素活性は、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを介してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、ならびに
−  配列番号６のポリペプチド配列を含む、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号６の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号６の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ1e（ここで、酵素Ｅ1eについての酵素活性は、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを介してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
からなる群から選択することができる。
【００３５】
特に、本発明のいずれかの態様による細胞中で使用される酵素Ｅ2は、
−  配列番号７のポリペプチド配列を有する、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号７の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号７の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ2a（ここで、酵素Ｅ2aについての酵素活性は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
−  配列番号８のポリペプチド配列を有する、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号８の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号８の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ2b（ここで、酵素Ｅ2bについての酵素活性は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
−  配列番号９のポリペプチド配列を有する、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号９の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号９の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ2c（ここで、酵素Ｅ2cについての酵素活性は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
−  配列番号１０のポリペプチド配列を有する、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号１０の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号１０の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ2d（ここで、酵素Ｅ2dについての酵素活性は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、ならびに
−  配列番号１１のポリペプチド配列を有する、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号１１の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号１１の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ2e（ここで、酵素Ｅ2eについての酵素活性は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
からなる群から選択することができる。
【００３６】
特に、本発明のいずれかの態様による細胞中で使用される酵素Ｅ3は、
−  配列番号１２のポリペプチド配列を有する、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号１２の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号１２の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ3a（ここで、酵素Ｅ3aについての酵素活性は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
−  配列番号１３のポリペプチド配列を有する、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号１３の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号１３の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ3b（ここで、酵素Ｅ3bについての酵素活性は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
−  配列番号１４のポリペプチド配列を有する、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号１４の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号１４の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ3c（ここで、酵素Ｅ3cについての酵素活性は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、ならびに
−  配列番号１５のポリペプチド配列を有する、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号１５の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号１５の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ3d（ここで、酵素Ｅ3dについての酵素活性は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）、
からなる群から選択することができる。
【００３７】
当業者は、酵素Ｅ1a〜Ｅ3bについて先に指示された活性が、これらの酵素のより広い範囲の活性の単なる特定の例示的選択であるにすぎないと理解すると考えられる。上述のそれぞれの活性は、所定の酵素の場合に確実な測定法を利用することができるものである。このように、非分枝鎖状の飽和Ｃ10−アルキル基を有する基質に関する酵素が、任意に分枝鎖状であってもまたは不飽和であってもよいＣ6−アルキル基またはＣ16−アルキル基を含むそれらの基質をも変換可能であり得ることは明らかである。
【００３８】
また、本発明のいずれかの態様による組換え細胞は、その細胞の野生型と比較して、該細胞が酵素オキシドレダクターゼの増大された活性を有するように遺伝子改変されていてもよい。特に、該細胞は、その細胞が、Ｅ1、Ｅ2もしくはＥ3またはそれらの組合せおよびオキシドレダクターゼの増大された活性を有するように遺伝子改変されていてよい。より具体的には、該細胞は、Ｅ1、Ｅ2、Ｅ3およびオキシドレダクターゼの増大された活性を有してよい。一例においては、該細胞は、Ｅ1およびＥ2ならびにオキシドレダクターゼの増大された活性、またはＥ1およびＥ3ならびにオキシドレダクターゼの増大された活性、またはＥ2およびＥ3ならびにオキシドレダクターゼの増大された活性を有する。
【００３９】
オキシドレダクターゼは、ａｌｋＢ型のオキシドレダクターゼであってよい。このオキシドレダクターゼのクラスａｌｋＢは、２種の補助ポリペプチドａｌｋＧおよびａｌｋＴに依存する、シュードモナス・プチダのＡｌｋＢＧＴ系からのレドックスタンパク質である。ａｌｋＴは、電子をＮＡＤＨからａｌｋＧへと伝達するＦＡＤ依存型ルブレドキシンレダクターゼである。ａｌｋＧは、ルブレドキシン、つまりａｌｋＢへの直接的な電子供与体として機能する鉄含有のレドックスタンパク質である。具体的な一例においては、ａｌｋＢ型のオキシドレダクターゼは、シュードモナス・プチダＧｐｏ１からのａｌｋＢである（アクセッション番号：ＣＡＢ５４０５０．１（バージョン１）、配列番号１、本出願で使用されるあらゆるアクセッション番号は、ＮＣＢＩによって運用されるＧｅｎｂａｎｋデータベースからのそれぞれの配列を指し、ここで、参照されるリリースは、２０１４年４月４日にオンラインで利用可能なものである）。
【００４０】
酵素ａｌｋＢ型のオキシドレダクターゼは、配列番号１のポリペプチド配列を有するか、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号１の参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号１の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、８０％、特に９２％超を依然として有するポリペプチド配列を有する（ここで、酵素ａｌｋＢ型のオキシドレダクターゼについての酵素活性は、６個またはそれより多くの炭素原子を有する少なくとも１種のアルカンを本発明のいずれかの態様によるそれぞれのアルカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る）。
【００４１】
オキシドレダクターゼは、モノオキシゲナーゼであってよい。特に、モノオキシゲナーゼは、Ｐ４５０型のモノオキシゲナーゼ、例えばカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）またはヒヨコマメからのシトクロムＰ４５０であってよい。より具体的には、ＣＹＰ１５３モノオキシゲナーゼ、例えばアルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）ＳＫ２からのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼ（ＹＰ＿６９１９２１）である。モノオキシゲナーゼは、ブタンのアルコールへの最初の酸化において使用することができる。
【００４２】
もう一つの例においては、オキシドレダクターゼは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）であってよい。特に、ＡＤＨは、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＳ  １８７−１（ＺＰ＿０７１４５０２３）由来、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｐ４２３２８）由来、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＡＣＢ７８１９１．１）由来、ラクトバシラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（ＹＰ＿７９５１８３．１）由来、ラクトバシラス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）（ＡＣＦ９５８３２．１）由来、ウマ肝臓由来、パラコッカス・パントトロファス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈｕｓ）（ＡＣＢ７８１８２．１）由来、またはスフィンゴビウム・ヤノイクヤエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）（ＥＵ４２７５２３．１）由来であってよい。一例においては、ＡＤＨは、フラビン依存型ＡＤＨ、例えばカンジダ・トロピカリス由来のフラビン依存型ＡＤＨ（ＡＡＳ４６８７８．１）であってよい。
【００４３】
一例においては、オキシドレダクターゼは、グルコース−メタノール−コリン−オキシドレダクターゼファミリー由来、特にカウロバクター属種（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）のＫ３１株（ＡＢＺ７４５５７．１）由来であってよい。この特定のオキシドレダクターゼは、炭素源が、それぞれのアルカンから直接的にまたはインサイチューで製造された、本発明のいずれかの態様による、６個〜１０個の炭素原子を含むアルカン酸である場合に使用することもできる。
【００４４】
用語「酵素の増大された活性」とは、増大された細胞内活性を意味するものと理解される。
【００４５】
細胞における酵素活性の増大に関する以下の説明および定義は、酵素Ｅ1〜Ｅ3およびオキシドレダクターゼの活性の増大だけでなく、本開示において引き続き述べられる、活性を任意に増大することができる全ての酵素の両方について当てはまる。特に、本明細書全体を通じて酵素Ｅ1、Ｅ2およびＥ3に関して記載された全ての方法は、本発明のいずれかの態様による組換え細胞中に任意に存在し得る酵素オキシドレダクターゼについて当てはまり得る。
【００４６】
原則的に、酵素活性の増大は、酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列のコピー数を強力なプロモーターもしくは改善されたリボソーム結合部位を使用して増加させることによって、遺伝子発現の負の調節を、例えば転写調節因子により減衰させることによって、または遺伝子発現の正の調節を増幅することによって、遺伝子のコドン利用を変更することによって、様々な様式で、ｍＲＮＡもしくは酵素の半減期を増加させることによって、遺伝子の発現の調節を変更することによって、あるいは増大された活性を有する適切な酵素をコードする遺伝子もしくはアレルを利用することによって、および任意にこれらの措置を組み合わせることによって達成することができる。本発明のいずれかの態様によれば、遺伝子改変された細胞は、例えば形質転換、形質導入、接合またはこれらの方法の組合せによって、所望の遺伝子、この遺伝子のアレルまたはその部分を含み、任意に該遺伝子の発現を可能にするプロモーターを含むベクターを使用して製造することができる。異種間発現は、特に、該遺伝子またはアレルを該細胞の染色体に組み込むことによるか、または染色体外で複製するベクターによって達成される。
【００４７】
独国特許出願公開第１００３１９９９号明細書（ＤＥ−Ａ−１００３１９９９）は、ピルビン酸カルボキシラーゼによって例示されるように、細胞中の酵素活性を増大するための幾つかの方式の例を示している。当業者であれば、独国特許出願公開第１００３１９９９号明細書（ＤＥ−Ａ−１００３１９９９）に開示される方法を、本発明のいずれかの態様による細胞中の酵素活性の増大のために容易に使用することができると考えられる。
【００４８】
前記の、および全ての後続で述べられる酵素または遺伝子の発現は、１次元および／または２次元タンパク質ゲル分離と、引き続いての該ゲル中のタンパク質濃度の適切な分析ソフトウェアを使用した光学的同定を用いて検出することが可能である。酵素活性の増大が、相応の遺伝子の発現における増大のみを基礎としているのであれば、酵素活性の増大の定量化は、簡単に、野生型細胞と遺伝子改変された細胞との間の１次元または２次元タンパク質分離の比較によって測定することができる。コリネバクテリウム属（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の場合のタンパク質の分離のための、および該タンパク質の同定のための慣用の方法は、Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１によって記載される方法である。タンパク質濃度は、検出されるべきタンパク質に特異的な抗体を用いるウェスタンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）に続いて、濃度測定に適切なソフトウェアを使用する光学的分析（Ｌｏｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，１９８９）によって分析することができる。ＤＮＡ結合タンパク質の活性は、ＤＮＡバンドシフトアッセイ（ゲルシフト法とも呼ばれる）（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）によって測定することができる。ＤＮＡ結合タンパク質の、その他の遺伝子の発現に対する作用は、リポーター遺伝子アッセイの様々な良く知られた方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）によって検出することができる。また、細胞内酵素活性は、様々な確立された方法（Ｄｏｎａｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）に従って測定することもできる。以下の例において、厳密な酵素の活性の測定のために具体的な方法が示されていないのであれば、酵素活性の増大の測定または酵素活性の減少の測定は、Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｌｏｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，１９９９およびＷｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に記載される方法によって行ってよい。
【００４９】
酵素活性の増大が、内在性遺伝子の突然変異によってなされる場合に、そのような突然変異は、例えば紫外線照射もしくは変異原性化学物質のような従来の方法によって無作為に、または１つ以上の欠失、挿入および／もしくはヌクレオチド交換のような遺伝子工学法によって選択的にいずれかによって生成させることができる。改変された細胞は、これらの突然変異によって得られる。また、酵素の突然変異体は、特に、もはやフィードバック阻害、生産物阻害もしくは基質阻害し得ない酵素であるか、またはそれを野生型酵素と比較して低減された程度でしか示さない酵素である。
【００５０】
酵素活性の増大が、酵素の合成の増大によってなされる場合に、相応の遺伝子のコピー数が増加され得るか、または構造遺伝子の上流に位置するプロモーターおよび調節領域またはリボソーム結合部位が、突然変異されてもよい。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットは、同様に作用する。少なくとも誘導性のプロモーターによって、遺伝子の発現を任意の所望の時点で増大させることも可能である。また「エンハンサー」を、調節配列として対象となる酵素の遺伝子に付与することもでき、それは同様に、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの間の改善された相互作用によって遺伝子発現の増大をもたらす。ｍＲＮＡの寿命の延長のための手段の結果として、発現は同様に改善される。また、酵素タンパク質の分解を防ぐことによって、酵素活性を増大させることもできる。遺伝子または遺伝子構築物は、本明細書では、種々のコピー数を有するプラスミド中に存在するか、または染色体中に組み込まれ、かつ増幅されるかのいずれかである。もう一つの例においては、関連遺伝子の過剰発現は、培地組成および培養管理の調節によって達成することができる。当業者は、このための説明書きを、とりわけＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｎａｇａ，１９８８、Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、欧州特許出願公開第０４７２８６９号明細書（ＥＰ−Ａ−０４７２８６９）、米国特許第４，６０１，８９３号明細書（ＵＳ４，６０１，８９３）、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ  ａｎｄ  Ｐｕｅｈｌｅｒ，１９９１、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、ＬａＢａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、国際公開第９６／１５２４６号パンフレット（ＷＯ９６／１５２４６Ａ）、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、特開平１０２２９８９１号公報（ＪＰ１０２２９８９１Ａ）、Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒ，１９９８ならびに遺伝学および分子生物学の公知の教科書に見出す。同様に前記の措置は、突然変異と同様に、本発明のいずれかの態様で使用され得る遺伝子改変細胞をもたらす。
【００５１】
例えばエピソーマルプラスミドは、それぞれの遺伝子の発現を増大させるために使用される。適切なプラスミドまたはベクターは、原則的に、当業者にこの目的のために理論上利用可能なあらゆるものである。そのようなプラスミドおよびベクターは、例えばＮｏｖａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＣｌｏｎｔｅｃｈまたはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬといった企業のパンフレットから取得することができる。特に、プラスミドおよびベクターは、Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．，１９８５、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ，１９８８、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，１９９０、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９８９に見出すことができる。
【００５２】
増幅されるべき遺伝子を含むプラスミドベクターを、所望の菌株へと接合または形質転換によって変換する。接合の方法は、例えばＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４に記載されている。形質転換のための方法は、例えば少なくともＴｈｉｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｄｕｎｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｖｎａｎ，１９８９およびＴａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４に記載されている。「交差」を起こすことによる相同組み換え後に、得られた菌株は、関連遺伝子の少なくとも２コピーを含む。この方法を用いて、少なくともその遺伝子のコピー数を、菌株中で所望のコピー数まで増大することができる。
【００５３】
前記および以下の実施例で使用される表現において、「その野生型と比較して増大された酵素（Ｅx）の活性」とは、常に、それぞれの酵素Ｅxの活性が、少なくとも２倍だけ、特に少なくとも１０倍だけ、より具体的には少なくとも１００倍だけ、さらにより具体的には少なくとも１０００倍だけ、最も具体的には少なくとも１００００倍だけ増大されることを意味するものと理解されるべきである。また「その野生型と比較して増大された酵素（Ｅx）の活性」を有する本発明のいずれかの態様による細胞は、特に、この酵素Ｅxの活性を有さない、または少なくとも検出可能な活性を有さない細胞であって、例えば過剰発現による酵素活性の増大後にのみ、この酵素Ｅxの検出可能な活性を示す細胞を含む。この関連において、用語「過剰発現」または以下の実施例で使用される表現「発現の増大」は、また、出発細胞、例えば野生型細胞が、発現を有さない、または少なくとも検出可能な発現を有さないとともに、酵素Ｅxの検出可能な合成が、組換え法によってのみ誘導される場合を含む。Ｅxは、オキシドレダクターゼを指してもよい。
【００５４】
細胞の「野生型」は、本明細書では、ゲノムが、進化により自然に形成された状態で存在する細胞を表す。その用語は、細胞全体と個々の遺伝子の両方について使用される。したがって、用語「野生型」には、特に、遺伝子配列が、少なくとも部分的に人為的に組換え法によって改変されたこれらの細胞またはこれらの遺伝子は含まれない。用語「野生型」には、その他の態様において（すなわち１つ以上の遺伝子に関して）遺伝子改変されているが、対象遺伝子に対しては遺伝子改変されていない細胞も含まれ得る。したがって、用語「野生型」には、対象の特定の遺伝子の遺伝子配列が、少なくとも部分的に人為的に組換え法を用いて改変されたそのような細胞も含まれない。したがって、一例においては、酵素Ｅ1に関する野生型細胞とは、細胞中で酵素Ｅ1の天然の／改変されていない発現を有する細胞を指し得る。酵素Ｅ2、Ｅ3等に関する野生型細胞とは、同様に解釈することができ、細胞中で酵素Ｅ2、Ｅ3等それぞれの天然の／改変されていない発現を有する細胞を指し得る。
【００５５】
所定のポリペプチドの特性および機能に大きな変化をもたらさない、所定のポリペプチド配列のアミノ酸残基の変化は、当業者に公知である。このように、例えば「保存アミノ酸」は、互いに交換することができる。そのような適切なアミノ酸置換の例には、制限されるものではないが、ＡｌａからＳｅｒへ；ＡｒｇからＬｙｓへ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓへ；ＡｓｐからＧｌｕへ；ＣｙｓからＳｅｒへ；ＧｌｎからＡｓｎへ；ＧｌｕからＡｓｐへ；ＧｌｙからＰｒｏへ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎへ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌへ；ＬｅｕからＭｅｔまたはＶａｌへ；ＬｙｓからＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕへ；ＭｅｔからＬｅｕまたはＩｌｅへ；ＰｈｅからＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒへ；ＳｅｒからＴｈｒへ；ＴｈｒからＳｅｒへ；ＴｒｐからＴｙｒへ；ＴｙｒからＴｒｐまたはＰｈｅへ；ＶａｌからＩｌｅまたはＬｅｕへ、が含まれる。同様に、例えばアミノ酸挿入または欠失の形の、特にポリペプチドのＮ末端またはＣ末端での交換は、しばしばポリペプチドの機能に大きな影響を及ぼさないことが知られている。
【００５６】
酵素の活性は、この活性を有する細胞を、当業者に公知のように、例えばボールミル、フレンチプレスまたは超音波砕壊機を用いて破壊することによって測定することができる。引き続き、細胞、細胞デブリおよび例えばガラスビーズのような破壊補助の分離は、１３０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間にわたる遠心分離によって少なくとも行うことができる。
【００５７】
得られる細胞不含の粗製抽出物を使用して、次いで生成物の酵素アッセイに続いてＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ検出を行うことができる。その一方で、所望の酵素を、当業者に公知の手段によって、例えばクロマトグラフィー法（例えば、ニッケル−ニトリロ三酢酸親和性クロマトグラフィー、ストレプトアビジン親和性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー）によって濃縮することができ、または均質になるまで精製することができる。
【００５８】
酵素Ｅ1の活性は、前記のようにして得られる酵素試料を以下のように使用して測定することができる：標準的なアッセイは、１００μＭのＥ．コリのＡＣＰ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２００μＭのマロニル補酵素Ａ、４０μＭのオクタノイル補酵素Ａ（Ｅ1a用）またはドデカノイル補酵素Ａ（Ｅ1b用）、１００μＭのＮＡＤＰＨ、２μｇのＥ．コリのＦａｂＤ、２μｇのマイコバクテリウム・ツベルクロシスのＦａｂＨ、１μｇのＥ．コリのＦａｂＧ、０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）および５μｇの酵素Ｅ1を、最終容量１２０μＬで含有し得る。ＡＣＰ、β−メルカプトエタノールおよびリン酸ナトリウムバッファーを、３７℃で３０分間にわたってインキュベートすることで、ＡＣＰを十分に還元させる。次いで、反応を酵素Ｅ1の添加によって開始させることができる。該反応を、ＨＣｌでｐＨ２．０へと酸性化された２ｍｌの水を使用して停止させ、引き続き２ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１（容量：容量））で２回抽出することができる。次いで相分離を、遠心分離（１６１００ｇ、５分、室温）によって実施する。下部の有機相を取り出し、真空遠心分離器で完全に蒸発させ、沈殿物を５０μｌのメタノール中に取ることができる。未溶解の成分を遠心分離（１６１００ｇ、５分、室温）によって沈殿物として取り出し、その試料を、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって分析する。生成物の同定は、相応の質量トレースおよびＭＳ2スペクトルの分析によって行われる。
【００５９】
酵素Ｅ2の活性は、前記のようにして得られる酵素試料を以下のように使用して測定することができる：標準的なアッセイは、１８５μｌの１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０μｌの１２５ｍＭのｄＴＤＰ−ラムノースおよび５０μｌの粗製タンパク質抽出物（全タンパク質の約１ｍｇ）または精製されたタンパク質の溶液（５μｇの精製されたタンパク質）を含有し得る。その反応は、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（Ｅ2a用）または３−ヒドロキシ−テトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸（Ｅ2b用）の１０ｍＭエタノール溶液１０μｌの添加によって開始され、振り混ぜながら（６００ｒｐｍ）３０℃で１時間にわたりインキュベートする。引き続き、その反応物は、１ｍｌのアセトンで処理され得る。未溶解の成分を遠心分離（１６１００ｇ、５分、室温）によって沈殿物として取り出し、その試料を、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって分析する。生成物の同定は、相応の質量トレースおよびＭＳ2スペクトルの分析によって行われる。
【００６０】
酵素Ｅ3の活性は、前記のようにして得られる酵素試料を使用して測定することができる：標準的なアッセイは、１８５μｌの１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０μｌの１２５ｍＭのｄＴＤＰ−ラムノースおよび５０μｌの粗製タンパク質抽出物（全タンパク質の約１ｍｇ）または精製されたタンパク質の溶液（５μｇの精製されたタンパク質）を含有し得る。その反応は、α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（Ｅ3a用）またはα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸（Ｅ3b用）の１０ｍＭエタノール溶液１０μｌの添加によって開始され、振り混ぜながら（６００ｒｐｍ）３０℃で１時間にわたりインキュベートする。引き続き、その反応物を、１ｍｌのアセトンで処理する。未溶解の成分を遠心分離（１６１００ｇ、５分、室温）によって沈殿させ、その試料を、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって分析する。生成物の同定は、相応の質量トレースおよびＭＳ2スペクトルの分析によって行われる。
【００６１】
本発明のいずれかの態様による組換え細胞は、少なくともＥ1、Ｅ2および／またはＥ3の増大された活性を有し得る。特に、該細胞は、Ｅ1、Ｅ2もしくはＥ3またはそれらの組合せの増大された活性を有してよい。より具体的には、該細胞は、Ｅ1、Ｅ2およびＥ3の増大された活性を有してよい。一例においては、該細胞は、Ｅ1およびＥ2の増大された活性、またはＥ1およびＥ3の増大された活性、またはＥ2およびＥ3の増大された活性を有する。
【００６２】
酵素オキシドレダクターゼの活性は、当該技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。特に、ａｌｋＢ型のオキシドレダクターゼの活性は、国際公開第２００９／０７７４６１号パンフレット（ＷＯ２００９／０７７４６１Ａ１）に開示される方法を用いて測定することができ、Ｐ４５０型のモノオキシゲナーゼの活性は、Ｓｃｈｅｐｓ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１に示される方法を使用して測定することができ、かつＡＤＨの活性は、Ｂｅｎｓｏｎ，Ｓ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｊ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９７６，１２６，７９４−７９８に示される方法によって測定することができる。
【００６３】
本発明のいずれかの態様による遺伝子改変された細胞は、上述の生成物の製造の目的のために培地と連続的にまたは断続的に、回分法（回分培養）において、または流加法（供給法）もしくは反復流加法（反復供給法）において接触させ、こうして培養することができる。英国特許出願公開第１００９３７０号明細書（ＧＢ−Ａ−１００９３７０）に記載されるように半連続法を検討することもできる。公知の培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌの教科書またはＳｔｏｒｈａｓの教科書に記載されている。使用されるべき培養培地は、適切なように、それぞれの菌株の要求を満たさねばならない。種々の酵母菌株の培養培地の説明は、例えばＫｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ，１９９６に包含される。
【００６４】
本発明のいずれかの態様による細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。これらは、哺乳類細胞（例えば、ヒト由来の細胞）、植物細胞または微生物、例えば酵母、菌類もしくは細菌であってよく、ここで、微生物が特に好ましく、細菌および酵母が最も好ましい。
【００６５】
適切な細菌、酵母または菌類は、特に、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）ＧｍｂＨ  （ＤＳＭＺ）（ドイツ、ブラウンシュバイク）で細菌株、酵母株または菌類株として寄託されている細菌、酵母または菌類である。本発明により適切な細菌は、
−  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｂａｃｔｅｒｉａ．ｈｔｍ
に載っている属に属しており、本発明により適切な酵母は、
−  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｙｅａｓｔｓ．ｈｔｍ
に載っている属に属しており、かつ本発明により適切な菌類は、
−  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｆｕｎｇｉ．ｈｔｍ
に載っている属に属している。
【００６６】
特に、細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およびカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）の属から選択することができる。より具体的には、細胞は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）、バークホルデリア・ブラシレンシス（Ｂ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・カレドニカ（Ｂ．ｃａｌｅｄｏｎｉｃａ）、バークホルデリア・カリベンシス（Ｂ．ｃａｒｉｂｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・カリオフィリ（Ｂ．ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）、バークホルデリア・ファンゴルム（Ｂ．ｆｕｎｇｏｒｕｍ）、バークホルデリア・グラディオリ（Ｂ．ｇｌａｄｉｏｌｉ）、バークホルデリア・グラテイ（Ｂ．ｇｌａｔｈｅｉ）、バークホルデリア・グルマエ（Ｂ．ｇｌｕｍａｅ）、バークホルデリア・グラミニス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、バークホルデリア・ホスピタ（Ｂ．ｈｏｓｐｉｔａ）、バークホルデリア・クルリエンシス（Ｂ．ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・フェナジニウム（Ｂ．ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）、バークホルデリア・フィマツム（Ｂ．ｐｈｙｍａｔｕｍ）、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂ．ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂ．ｐｌａｎｔａｒｉｉ）、バークホルデリア・サッカリ（Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｉ）、バークホルデリア・シンガポレンシス（Ｂ．ｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ソルジジコーラ（��．ｓｏｒｄｉｄｉｃｏｌａ）、バークホルデリア・テリコーラ（Ｂ．ｔｅｒｒｉｃｏｌａ）、バークホルデリア・トロピカ（Ｂ．ｔｒｏｐｉｃａ）、バークホルデリア・ツベルム（Ｂ．ｔｕｂｅｒｕｍ）、バークホルデリア・ウボネンシス（Ｂ．ｕｂｏｎｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ウナマエ（Ｂ．ｕｎａｍａｅ）、バークホルデリア・キセノボランス（Ｂ．ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア・アンチナ（Ｂ．ａｎｔｈｉｎａ）、バークホルデリア・ピロシニア（Ｂ．ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂ．ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、カンディダ・ブランキイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｌａｎｋｉｉ）、カンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、エシェリキア・コリ、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、パラコッカス・ベルスタス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｒｓｕｔｕｓ）、シュードモナス・アルゼンチネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・ボルボリ（Ｐ．ｂｏｒｂｏｒｉ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐ．ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス・フラベセンス（Ｐ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・メンドシナ（Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）、シュードモナス・ニトロレデュセンス（Ｐ．ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・レシノボランス（Ｐ．ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・ストラミネア（Ｐ．ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、シュードモナス・オーランティアカ（Ｐ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、シュードモナス・オーレオファシエンス（Ｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐ．ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・フラギ（Ｐ．ｆｒａｇｉ）、シュードモナス・ルンデンシス（Ｐ．ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・タエトロレンス（Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）、シュードモナス・アンタルクティカ（Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードモナス・アゾトフォルマンス（Ｐ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、シュードモナス・ブラッチフォルダエ（Ｐ．ｂｌａｔｃｈｆｏｒｄａｅ）、シュードモナス・ブラシカセアラム（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス・ブレネリ（Ｐ．ｂｒｅｎｎｅｒｉ）、シュードモナス・セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）、シュードモナス・コルガータ（Ｐ．ｃｏｒｒｕｇａｔａ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ゲサルディ（Ｐ．ｇｅｓｓａｒｄｉｉ）、シュードモナス・リバネンシス（Ｐ．ｌｉｂａ��ｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・マンデリィ（Ｐ．ｍａｎｄｅｌｉｉ）、シュードモナス・マルギナリス（Ｐ．ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）、シュードモナス・メディテラネア（Ｐ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）、シュードモナス・メリディアナ（Ｐ．ｍｅｒｉｄｉａｎａ）、シュードモナス・ミグラエ（Ｐ．ｍｉｇｕｌａｅ）、シュードモナス・ムシドレンス（Ｐ．ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）、シュードモナス・オリエンタリス（Ｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、シュードモナス・パナシス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）、シュードモナス・プロテオリティカ（Ｐ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａ）、シュードモナス・ローデシアエ（Ｐ．ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）、シュードモナス・シンキサンタ（Ｐ．ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、シュードモナス・チベルバレンシス（Ｐ．ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・トラアシイ（Ｐ．ｔｏｌａａｓｉｉ）、シュードモナス・ベロニイ（Ｐ．ｖｅｒｏｎｉｉ）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、シュードモナス・ペルツシノゲナ（Ｐ．ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ）、シュードモナス・クレモリコロラタ（Ｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｃｏｌｏｒａｔａ）、シュードモナス・フルバ（Ｐ．ｆｕｌｖａ）、シュードモナス・モンテイリイ（Ｐ．ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）、シュードモナス・モセリイ（Ｐ．ｍｏｓｓｅｌｉｉ）、シュードモナス・パラフルバ（Ｐ．ｐａｒａｆｕｌｖａ）、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・バレアリカ（Ｐ．ｂａｌｅａｒｉｃａ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・アミグダリ（Ｐ．ａｍｙｇｄａｌｉ）、シュードモナス・アベラナエ（Ｐ．ａｖｅｌｌａｎａｅ）、シュードモナス・カリカパパイヤエ（Ｐ．ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ）、シュードモナス・チコリイ（Ｐ．ｃｉｃｈｏｒｉｉ）、シュードモナス・コロナファシエンス（Ｐ．ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・フィクセレクタエ（Ｐ．ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ）、シュードモナス・ヘリアンティ（Ｐ．ｈｅｌｉａｎｔｈｉ）、シュードモナス・マリアエ（Ｐ．ｍｅｌｉａｅ）、シュードモナス・サバスタニ（Ｐ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・トマト（Ｐ．ｔｏｍａｔｏ）、シュードモナス・ビリジフラバ（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）、シュードモナス・アビエタニフィラ（Ｐ．ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ）、シュードモナス・アシドフィラ（Ｐ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス・アガリシ（Ｐ．ａｇａｒｉｃｉ）、シュードモナス・アルカリフィラ（Ｐ．ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ）、シュードモナス・アルカノリティカ（Ｐ．ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃａ）、シュードモナス・アミロデラモサ（Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）、シュードモナス・アスプレニイ（Ｐ．ａｓｐｌｅｎｉｉ）、
シュードモナス・アゾチフィゲンス（Ｐ．ａｚｏｔｉｆｉｇｅｎｓ）、シュードモナス・カンナビア（Ｐ．ｃａｎｎａｂｉｎａ）、シュードモナス・コエノビオス（Ｐ．ｃｏｅｎｏｂｉｏｓ）、シュードモナス・コンゲランス（Ｐ．ｃｏｎｇｅｌａｎｓ）、シュードモナス・コンスタンティニイ（Ｐ．ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉｉ）、シュードモナス・クルシビアエ（Ｐ．ｃｒｕｃｉｖｉａｅ）、シュードモナス・デルヒエンシス（Ｐ．ｄｅｌｈｉｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・エクシビス（Ｐ．ｅｘｃｉｂｉｓ）、シュードモナス・エクストレモリエンタリス（Ｐ．ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、シュードモナス・フレドリックスベルゲンシス（Ｐ．ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・フスコバギナエ（Ｐ．ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ）、シュードモナス・ゲリディコーラ（Ｐ．ｇｅｌｉｄｉｃｏｌａ）、シュードモナス・グリモンティ（Ｐ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）、シュードモナス・インディカ（Ｐ．ｉｎｄｉｃａ）、シュードモナス・ジェセニイ（Ｐ．ｊｅｓｓｅｎｉｉ）、シュードモナス・ジンジュエンシス（Ｐ．ｊｉｎｊｕｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・キロネンシス（Ｐ．ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・ナックムッシイ（Ｐ．ｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉ）、シュードモナス・コレエンシス（Ｐ．ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・リニ（Ｐ．ｌｉｎｉ）、シュードモナス・ルテア（Ｐ．ｌｕｔｅａ）、シュードモナス・モラビエンシス（Ｐ．ｍｏｒａｖｉｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・オティティディス（Ｐ．ｏｔｉｔｉｄｉｓ）、シュードモナス・パチャストレラエ（Ｐ．ｐａｃｈａｓｔｒｅｌｌａｅ）、シュードモナス・パレロニアナ（Ｐ．ｐａｌｌｅｒｏｎｉａｎａ）、シュードモナス・パパベリス（Ｐ．ｐａｐａｖｅｒｉｓ）、シュードモナス・ペリ（Ｐ．ｐｅｌｉ）、シュードモナス・ペロレンス（Ｐ．ｐｅｒｏｌｅｎｓ）、シュードモナス・ポアエ（Ｐ．ｐｏａｅ）、シュードモナス・ポハンゲンシス（Ｐ．ｐｏｈａｎｇｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・サイクロフィラ（Ｐ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス・サイクロトレランス（Ｐ．ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、シュードモナス・ラトニス（Ｐ．ｒａｔｈｏｎｉｓ）、シュードモナス・レプチリボラ（Ｐ．ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ）、シュードモナス・レシニフィラ（Ｐ．ｒｅｓｉｎｉｐｈｉｌａ）、シュードモナス・リゾスファエラエ（Ｐ．ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）、シュードモナス・ルベセンス（Ｐ．ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・サロモニイ（Ｐ．ｓａｌｏｍｏｎｉｉ）、シュードモナス・セギティス（Ｐ．ｓｅｇｉｔｉｓ）、シュードモナス・セプティカ（Ｐ．ｓｅｐｔｉｃａ）、シュードモナス・シミアエ（Ｐ．ｓｉｍｉａｅ）、シュードモナス・スイス（Ｐ．ｓｕｉｓ）、シュードモナス・サーモトレランス（Ｐ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・トレマエ（Ｐ．ｔｒｅｍａｅ）、シュードモナス・トリビアリス（Ｐ．ｔｒｉｖｉａｌｉｓ）、シュードモナス・ツルビネラエ（Ｐ．ｔｕｒｂｉｎｅｌｌａｅ）、シュードモナス・ツチコリネンシス（Ｐ．ｔｕｔｉｃｏｒｉｎｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・ウムソンゲンシス（Ｐ．ｕｍｓｏｎｇｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・バンコウベレンシス（Ｐ．ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・ブラノベンシス（Ｐ．ｖｒａｎｏｖｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・キサントマリナ（Ｐ．ｘａｎｔｈｏｍａｒｉｎａ）、ラルストニア・ユートロファ、ロドスピリルム・ルブルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびザイモモナス・モビレ（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｅ）からなる群から選択することができる。さらにより具体的には、細胞は、シュードモナス・プチダ、エシェリキア・コリおよびバークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択することができる。
【００６７】
本発明のいずれかの態様によれば、該細胞の野生型は、検出可能な量のラムノ脂質を形成することができなくてよく、かつ／または酵素Ｅ1、Ｅ2、Ｅ3および／もしくはオキシドレダクターゼの活性を一切有さないか、もしくはその検出可能な活性を有さなくてよい。
【００６８】
本発明のいずれかの態様によれば、該細胞は、その野生型において、Ｃ6〜Ｃ16のモノアルカノエートの鎖長を有するポリヒドロキシアルカノエートを形成することができることが有利である。そのような細胞は、例えばバークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・アエルギノーサ、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス・レシノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）およびラルストニア・ユートロファである。この関連において、本発明のいずれかの態様による細胞は、その細胞の野生型と比較して、該細胞がより少ないポリヒドロキシアルカノエートしか形成することができないように遺伝子改変されていてもよい。そのような細胞は、例えば少なくともＤｅ  Ｅｕｇｅｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０およびＲｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に記載されている。野生型と比較してより少ないポリヒドロキシアルカノエートしか形成することができないそのような組換え細胞は、特に、その野生型と比較して、少なくとも１種の酵素Ｅ9またはＥ10の減少された活性を有することを特徴とする。
【００６９】
Ｅ9は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ（ＥＣ：２．３．１．）を表し、特に配列番号２０（Ｅ9a）もしくは配列番号２１（Ｅ9b）のポリペプチド配列を有するか、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号２０もしくは配列番号２１のそれぞれの参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号２０もしくは配列番号２１のそれぞれの参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、特に８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有し、ここで、酵素Ｅ9（Ｅ9aおよびＥ9b）についての酵素活性は、３−ヒドロキシアルカノイル補酵素Ａをポリ−３−ヒドロキシアルカン酸へと、特に３−ヒドロキシテトラデカノイル補酵素Ａをポリ−３−ヒドロキシテトラデカン酸へと変換する能力を意味するものと理解され得る。
【００７０】
Ｅ10は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰ：補酵素Ａトランスフェラーゼを表し、特に配列番号２２（Ｅ10a）もしくは配列番号２３（Ｅ10b）のポリペプチド配列を有するか、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、特に１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号２２もしくは配列番号２３のそれぞれの参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号２２（Ｅ10a）もしくは配列番号２３（Ｅ10b）のそれぞれの参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、５０％、特に８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有し、ここで、酵素Ｅ10（Ｅ10aおよびＥ10b）についての酵素活性は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシアルカノイル補酵素Ａへと、特に３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシテトラデカノイル補酵素Ａへと変換する能力を意味するものと理解され得る。
【００７１】
酵素Ｅ9（Ｅ9aおよびＥ9b）の活性は、例えば先に酵素Ｅ1〜Ｅ3について記載されるようにして得られる試料を使用することによって、まず５６０μｌの１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０μｌの３５ｍＭのＤＴＮＢ（ＤＭＳＯ中）および２０μｌの４１ｍＭの３−ヒドロキシデカノイル補酵素Ａを混合することによって測定することができる。引き続き、１００μｌのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の５μｇの精製された酵素Ｅ9を添加し、引き続き４１２ｎｍでの吸光度の経時的な増加（５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）の遊離ＳＨ基への付加によって引き起こされる）（ΔＥ／分）を、分光光度計中で１分間にわたって連続的に記録する。
【００７２】
酵素Ｅ10（Ｅ10aおよびＥ10b）の活性は、例えば先に酵素Ｅ1〜Ｅ3について記載されるようにして得られる試料を使用することによって測定することができる。標準的アッセイは、３ｍｍのＭｇＣｌ2、４０μｍのヒドロキシデカノイル補酵素Ａおよび２０μｍのＥ．コリのＡＣＰを５０ｍｍのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で全容量２００μｌで含有してよい。該反応は、５０μｌのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の５μｇの精製された酵素Ｅ10を添加することによって開始され、３０℃で１時間にわたってインキュベートする。その反応を、５０％（質量／容量）のトリクロロ酢酸および１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（３０μｌ）の添加によって停止する。放出された補酵素Ａは、分光光度測定的に、５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）の遊離ＳＨ基への付加によって引き起こされる、４１２ｎｍでの吸光度の経時的な増加を記録することによって測定することができる。
【００７３】
本発明のいずれかの態様に関して使用される文言「酵素Ｅxの減少された活性」とは、活性が、少なくとも０．５倍だけ、特に少なくとも０．１倍だけ、より具体的には少なくとも０．０１倍だけ、さらにより具体的には少なくとも０．００１倍だけ、最も具体的には少なくとも０．０００１倍だけ減少されることを意味するものと理解することができる。また文言「減少された活性」は、活性が検出できない（「ゼロの活性」）ことも含む。特定の酵素の活性の減少は、例えば選択的突然変異、または特定の酵素の活性の減少について当業者に公知のその他の措置によって行うことができる。
【００７４】
特に、当業者は、特にシュードモナス属およびバークホルデリア属について特定の遺伝子の中断による、タンパク質発現の変更および減少ならびに付随する酵素活性の低下についての指示を、例えば少なくともＤｕｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｓｉｎｇｈ  ＆  Ｒｏｅｈｍ．，２００８、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９等で見出す。
【００７５】
本発明のいずれかの態様による細胞は、酵素活性の減少が、核酸配列の１つを含む遺伝子の改変によって達成され、その際、該改変は、遺伝子中での外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列における点突然変異、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡまたは、例えばプロモーターおよびターミネーターまたはリボソーム結合部位のような遺伝子に隣接する調節配列の改変（挿入、欠失もしくは点突然変異）を含み、それらからなる群から選択される。
【００７６】
外来ＤＮＡは、この関連において、遺伝子に対して（生物に対してではない）「外来」である任意のＤＮＡ配列を意味するものと理解されるべきであり、すなわち、この関連においては、内因性ＤＮＡ配列も「外来ＤＮＡ」として機能し得る。この関連において、遺伝子が選択マーカー遺伝子の挿入により中断され、こうして外来ＤＮＡは選択マーカー遺伝子であり、ここで、好ましくはその挿入が、遺伝子座中への相同性組み換えにより実施されたものであることが特に好ましい。
【００７７】
特に、本発明のいずれかの態様により使用され得る細胞は、野生型と比較して減少されたポリヒドロキシアルカノエート合成を有するシュードモナス・プチダ細胞である。そのような細胞は、例えば少なくともＫＴＯＹ０１およびＫＴＯＹ０２として、Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｈｕｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｄｅ  Ｅｕｇｅｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０およびＯｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００７において記載されている。
【００７８】
本発明の方法により形成されるラムノ脂質は、少なくとも、一般式（Ｉ）
【化１】
2018505690.tif 000002
［式中、
ｍは、２、１または０、特に１または０であり、
ｎは、１または０、特に１であり、
Ｒ1およびＲ2は、互いに独立して、２個〜２４個の、好ましくは５個〜１３個の炭素原子を有する同一または異なる有機基、特に任意に分枝鎖状の、任意に置換された、特にヒドロキシ置換された、任意に不飽和の、特に任意に一価不飽和、二価不飽和もしくは三価不飽和のアルキル基であり、該基は、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニルならびに（ＣＨ2）o−ＣＨ3（ここで、ｏは、１〜２３であり、好ましくは４〜１２である）からなる群から選択することができる］のラムノ脂質またはその塩であってよい。
【００７９】
一例においては、本発明のいずれかの態様により形成されるラムノ脂質は、少なくとも、一般式（Ｉ）で示され、その式中、ｎが１であるラムノ脂質またはその塩であってよい。特に、該ラムノ脂質は、ジラムノシル脂質（ジラムノ脂質としても知られる）であってよい。より具体的には、ジラムノシル脂質は、以下の式（Ｉ）：
【化２】
2018505690.tif 000003
［式中、
ｍは、２、１または０、特に１または０であり、
ｎは、１であり、
Ｒ1およびＲ2は、互いに独立して、２個〜２４個の、好ましくは５個〜１３個の炭素原子を有する同一または異なる有機基、特に任意に分枝鎖状の、任意に置換された、特にヒドロキシ置換された、任意に不飽和の、特に任意に一価不飽和、二価不飽和もしくは三価不飽和のアルキル基であり、該基は、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニルならびに（ＣＨ2）o−ＣＨ3（ここで、ｏは、１〜２３であり、好ましくは４〜１２である）からなる群から選択することができる］を含んでよい。
【００８０】
本発明のいずれかの態様による細胞が、ｍが１のラムノ脂質を形成することができる場合については、その基は、Ｒ1およびＲ2によって定義される
【化３】
2018505690.tif 000004
であってよく、該基は、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸または３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸から誘導される。
【００８１】
本発明のいずれかの態様によれば、一般式（Ｉ）の種々のラムノ脂質の混合物が形成され得ることは、当業者には明らかである。一例においては、モノ脂質およびジラムノ脂質が形成され得る。特に、ラムノ脂質は、以下のラムノ脂質：２ＲＬ−Ｃ８−Ｃ１０、１ＲＬ−Ｃ８−Ｃ１０、２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０、１ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０、２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１２：１、１ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１２：１および１ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１２の少なくとも１つの混合物であってよい。特に、本発明のいずれかの態様によるラムノ脂質は、２ＲＬ−Ｃ８−Ｃ１０、２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１２：１、２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０からなる群から選択されるジラムノ脂質／ジラムノシル脂質、それらの組合せ等であってよい。
【００８２】
この関連においては、本発明のいずれかの態様による細胞は、一般式（Ｉ）のラムノ脂質の混合物であって、形成されるラムノ脂質の８０質量％超、９０質量％超、特に９５質量％超において、ｎが１であり、かつＲ1およびＲ2によって定義される基が、形成されるラムノ脂質の１０質量％未満、５質量％未満、特に２質量％未満において、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸または３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸から誘導される（ここで、示される質量％とは、形成される一般式（Ｉ）の全てのラムノ脂質の合計に対するものである）ことを特徴とする混合物を形成することが可能であり得る。
【００８３】
本発明のいずれかの態様による細胞は、有利にはラムノ脂質の製造のために使用することができ、かつこれらの脂質が、引き続き任意に精製されるので、本発明のいずれかの態様による細胞が、一般式（Ｉ）のラムノ脂質の細胞から周囲培地への排出を触媒する少なくとも酵素Ｅ8の野生型と比較して増大された活性を有するのであれば有利である。
【００８４】
この関連において、タンパク質Ｅ8は、配列番号１６（Ｅ8a）、配列番号１７（Ｅ8b）、配列番号１８（Ｅ8c）もしくは配列番号１９（Ｅ8d）のポリペプチド配列を有するか、またはアミノ酸残基の２５％以下、２０％以下、特に１５％以下、特に１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下が、配列番号１６（Ｅ8a）、配列番号１７（Ｅ8b）、配列番号１８（Ｅ8c）もしくは配列番号１９（Ｅ8d）のそれぞれの参照配列と比較して欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せによって改変されており、かつ配列番号１６（Ｅ8a）、配列番号１７（Ｅ8b）、配列番号１８（Ｅ8c）もしくは配列番号１９（Ｅ8d）のそれぞれの参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも５０％、６５％、特に８０％、特に９０％超を依然として有するポリペプチド配列を有する、酵素Ｅ8からなる群から選択され、ここで、酵素Ｅ8（Ｅ8a、Ｅ8b、Ｅ8cおよびＥ8d）についての酵素活性は、一般式（Ｉ）のラムノ脂質を細胞から周囲培地へと排出する能力を意味するものと理解される。
【００８５】
図面の簡単な説明
図面なし
実施例
上記事項は、好ましい実施形態を記載しており、それらは、当業者によって理解されるように、特許請求の範囲から逸脱しなければ、設計、構成または操作の点で変化または変更を行うことができる。これらの変化は、例えば特許請求の範囲によって包含されるものと意図される。
【００８６】
実施例１
酢酸塩からラムノ脂質を形成するシュードモナス・プチダ
酢酸塩からラムノ脂質への生体変換のために、プラスミドを有するシュードモナス・プチダＫＴ２４４０株を使用した。プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣは、独国特許出願公開第１０２０１００３２４８４号明細書（ＤＥ１０２０１００３２４８４Ａ１）の実施例２に記載されており、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のベクターによる形質転換は、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４．５８（５）：８５１−８５４に記載されている。組換えシュードモナス・プチダＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣを、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを有するＬＢアガープレート上で培養した。
【００８７】
前培養のために、１００ｍｌの振盪フラスコ中の５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを有する１０ｍｌのＬＢ培地に、インキュベートしたてのアガープレートからの単コロニーを接種し、それを３０℃および１２０ｒｐｍで１５時間にわたってＯＤ600nmが３．５を上回るまで培養した。次いで細胞懸濁液を遠心分離し、新たなＭ９＿ＢＳ＿Ａｃ培地で洗浄し、そして再び遠心分離した。
【００８８】
主培養のために、１００ｍｌの新たなＭ９＿ＢＳ＿Ａｃ培地（ｐＨ７．４；６．８１ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、２．４ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．４ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．４ｇ／ＬのＮＨ4Ｃｌ、２ｍｌ／Ｌの１ＭのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、１．６３ｇ／Ｌの13Ｃ2−Ｎａ−酢酸塩、０．１３ｍｌ／Ｌの２５％のＨＣｌ、１．９１ｍｇ／ＬのＭｎＣｌ2×７Ｈ2Ｏ、１．８７ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．８４ｍｇ／ＬのＮａ−ＥＤＴＡ×２Ｈ2Ｏ、０．３ｍｇ／ＬのＨ3ＢＯ3、０．２５ｍｇ／ＬのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ、４．７ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、１７．８ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．１５ｍｇ／ＬのＣｕＣｌ2×２Ｈ2Ｏ）に５００ｍｌの振盪フラスコ中で、前培養からの遠心分離し洗浄された細胞を０．１２のＯＤ600nmまで接種した。この培養を、３２℃および１４０ｒｐｍで１４２時間にわたってインキュベートした。６時間の培養の後に、２ｇ／Ｌのラムノースを誘導のために培養に添加した。培養の７．５時間後、２２．５時間後、３０．５時間後、４７．２５時間後、および５３時間後に、１ｇ／ｌの13Ｃ2−Ｎａ−酢酸塩を、それぞれ添加した。培養期間の開始とその間に、試料を採取した。これらを、光学密度、ｐＨおよび種々の分析物（ＮＭＲにより試験）について試験した。
【００８９】
その結果は、主培養中で、酢酸塩の量は、最初の１．６３ｇ／ｌから、７１．７５時間後の１．３ｇ／ｌまで連続的な減少を示した（５ｇ／Ｌの13Ｃ2−Ｎａ−酢酸塩の供給を含む）。また、ラムノ脂質（２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０）（ジラムノシル脂質）の濃度は、０．０ｍｇ／ｌから、培養７１．７５時間後に３３２ｍｇ／ｌにまで増大した。形成されたラムノ脂質は、13Ｃ−標識されていた（脂肪酸部分において９０％超）。13Ｃ−標識された２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０、つまりジラムノシル脂質についての炭素収率は、消費された酢酸塩に対して約１２．９６％であり、標識されていない２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０については、その収率は１．４４％であった。
【００９０】
実施例２
酢酸塩およびデカン酸からラムノ脂質を形成するシュードモナス・プチダ
酢酸塩およびデカン酸からラムノ脂質への生体変換のために、プラスミドを有するシュードモナス・プチダＫＴ２４４０株を使用した。プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣは、独国特許出願公開第１０２０１００３２４８４号明細書（ＤＥ１０２０１００３２４８４Ａ１）の実施例２に記載されており、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のベクターによる形質転換は、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４．５８（５）：８５１−８５４に記載されている。組換えシュードモナス・プチダＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣを、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを有するＬＢアガープレート上で培養した。
【００９１】
前培養のために、１００ｍｌの振盪フラスコ中の５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを有する１０ｍｌのＬＢ培地に、インキュベートしたてのアガープレートからの単コロニーを接種し、それを３０℃および１２０ｒｐｍで１５時間にわたってＯＤ600nmが３．５を上回るまで培養した。次いで細胞懸濁液を遠心分離し、新たなＭ９＿ＢＳ＿Ａｃ培地で洗浄し、そして再び遠心分離した。
【００９２】
主培養のために、１００ｍｌの新たなＭ９＿ＢＳ＿Ａｃ培地（ｐＨ７．４；６．８１ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、２．４ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．４ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．４ｇ／ＬのＮＨ4Ｃｌ、２ｍｌ／Ｌの１ＭのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、１．６３ｇ／Ｌの13Ｃ2−Ｎａ−酢酸塩、０．１３ｍｌ／Ｌの２５％のＨＣｌ、１．９１ｍｇ／ＬのＭｎＣｌ2×７Ｈ2Ｏ、１．８７ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．８４ｍｇ／ＬのＮａ−ＥＤＴＡ×２Ｈ2Ｏ、０．３ｍｇ／ＬのＨ3ＢＯ3、０．２５ｍｇ／ＬのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ、４．７ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、１７．８ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．１５ｍｇ／ＬのＣｕＣｌ2×２Ｈ2Ｏ）に５００ｍｌの振盪フラスコ中で、前培養からの遠心分離し洗浄された細胞を０．１２のＯＤ600nmまで接種した。この培養を、３２℃および１４０ｒｐｍで１４２時間にわたってインキュベートした。６時間の培養の後に、２ｇ／Ｌのラムノースを誘導のために培養に添加した。培養の２２．５時間後に、１ｇ／Ｌのデカン酸を培養に添加した。培養の７．５時間後、２２．５時間後、３０．５時間後、４７．２５時間後、および５３時間後に、１ｇ／ｌの13Ｃ2−Ｎａ−酢酸塩を、それぞれ添加した。培養期間の開始とその間に、試料を採取した。これらを、光学密度、ｐＨおよび種々の分析物（ＮＭＲにより試験）について試験した。
【００９３】
その結果は、主培養中で、酢酸塩の量は、最初の１．６３ｇ／ｌから、７１．７５時間後の０ｇ／ｌまで連続的に減少することを示した（５ｇ／Ｌの13Ｃ2−Ｎａ−酢酸塩の供給を含む）。デカン酸の濃度は、２２．５時間時点での１ｇ／ｌから７１．７５時間後の０ｇ／Ｌまで減少した。また、ラムノ脂質（２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０）、つまりジラムノシル脂質の濃度は、０．０ｍｇ／ｌから、培養７１．７５時間後に７７９ｍｇ／ｌにまで増大した。新たに形成されたラムノ脂質は、13Ｃ−標識されていた（脂肪酸部分において３４％）。13Ｃ−標識された２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０、つまりジラムノシル脂質についての炭素収率は、消費された酢酸塩およびデカン酸に対して約６．０５％であり、標識されていない２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０については、その収率は１１．７５％であった。これは、得られたラムノ脂質のより高い割合が、酢酸塩よりも標識されていないデカン酸から形成されることを示すものであった。
【００９４】
実施例３
酢酸塩およびヘキサン酸からラムノ脂質を形成するシュードモナス・プチダ
酢酸塩およびヘキサン酸からラムノ脂質への生体変換のために、プラスミドを有するシュードモナス・プチダＫＴ２４４０株を使用した。プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣは、独国特許出願公開第１０２０１００３２４８４号明細書（ＤＥ１０２０１００３２４８４Ａ１）の実施例２に記載されており、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のベクターによる形質転換は、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４．５８（５）：８５１−８５４に記載されている。組換えシュードモナス・プチダＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣを、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを有するＬＢアガープレート上で培養した。
【００９５】
前培養のために、１００ｍｌの振盪フラスコ中の５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを有する１０ｍｌのＬＢ培地に、インキュベートしたてのアガープレートからの単コロニーを接種し、それを３０℃および１２０ｒｐｍで１５時間にわたってＯＤ600nmが３．５を上回るまで培養する。次いで細胞懸濁液を遠心分離し、新たなＭ９＿ＢＳ＿Ａｃ培地で洗浄し、そして再び遠心分離する。
【００９６】
主培養のために、１００ｍｌの新たなＭ９＿ＢＳ＿Ａｃ培地（ｐＨ７．４；６．８１ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、２．４ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．４ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．４ｇ／ＬのＮＨ4Ｃｌ、２ｍｌ／Ｌの１ＭのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、１．６３ｇ／Ｌの13Ｃ2−Ｎａ−酢酸塩、０．１３ｍｌ／Ｌの２５％のＨＣｌ、１．９１ｍｇ／ＬのＭｎＣｌ2×７Ｈ2Ｏ、１．８７ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．８４ｍｇ／ＬのＮａ−ＥＤＴＡ×２Ｈ2Ｏ、０．３ｍｇ／ＬのＨ3ＢＯ3、０．２５ｍｇ／ＬのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ、４．７ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、１７．８ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．１５ｍｇ／ＬのＣｕＣｌ2×２Ｈ2Ｏ）に５００ｍｌの振盪フラスコ中で、前培養からの遠心分離し洗浄された細胞を０．１２のＯＤ600nmまで接種する。この培養を、３２℃および１４０ｒｐｍで１４２時間にわたってインキュベートする。６時間の培養の後に、２ｇ／Ｌのラムノースを誘導のために培養に添加する。培養の２２．５時間後に、１ｇ／Ｌのヘキサン酸を培養に添加する。培養の７．５時間後、２２．５時間後、３０．５時間後、４７．２５時間後、および５３時間後に、１ｇ／ｌの13Ｃ2−Ｎａ−酢酸塩を、それぞれ添加する。培養期間の開始とその間に、試料を採取する。これらを、光学密度、ｐＨおよび種々の分析物（ＮＭＲにより試験）について試験する。
【００９７】
主培養中で、酢酸塩の量は、７１．７５時間後に０ｇ／ｌまで連続的に減少した（５ｇ／Ｌの13Ｃ2−Ｎａ−酢酸塩の供給を含む）。ヘキサン酸の濃度も、７１．７５時間後に０ｇ／Ｌまで減少した。ラムノ脂質（２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０）も、培養の間に増大した。新たに形成されたラムノ脂質は、13Ｃ−標識されていた（脂肪酸部分において８０％未満）。13Ｃ−標識された２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０、つまりジラムノシル脂質についての、消費された酢酸塩およびヘキサン酸に対する炭素収率は、ヘキサン酸供給を行わない培養中よりも低く、標識されていない２ＲＬ−Ｃ１０−Ｃ１０については、その収率はヘキサン酸供給を行わない培養中よりも高かった。ここでも、得られたラムノ脂質のより高い割合が、酢酸塩よりも標識されていないヘキサン酸から形成されるという知見が確認された。
【配列表】
2018505690000001.app
【国際調査報告】
2018505690.tif 000006
2018505690.tif 000007
2018505690.tif 000008
2018505690.tif 000009
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