(57)【要約】  本開示は、多価エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）ワクチン組成物およびそれに関連する使用に関する。特定の実施形態では、本開示は、多価の、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）（例えば、ＨＲＶ）血清型の混合物または組換え産生変異体または組換え産生ウイルスキャプシドタンパク質を含むワクチン組成物に関する。特定の実施形態では、本開示は、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）感染と診断されたか、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）感染の症状を示すか、またはエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）感染の危険性がある対象に、本明細書に開示される組成物の有効量を投与することを含む免疫化方法に関する。【選択図】図６Ａ
2018517722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０を超える血清型のエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）の不活性化ウイルス、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）、またはそれらの混合物を含むアジュバントを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、各血清型が１ｍＬあたり１×１０３ＴＣＩＤ５０を超える濃度であることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、ＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ３６、ＨＲＶ−Ａ７８、ＨＲＶ−Ａ３８、ＨＲＶ−Ａ２、ＨＲＶ−Ｂ１４、ＨＲＶ−Ａ９、ＨＲＶ−Ａ１３、ＨＲＶ−Ａ２９、ＨＲＶ−Ａ７６、ＨＲＶ−Ａ６０、ＨＲＶ−Ａ４９、ＨＲＶ−Ａ４１、ＨＲＶ−Ａ３２、ＨＲＶ−Ａ５８およびＨＲＶ−Ａ１１の血清型を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、ライノウイルスがホルマリン不活性化されたものであり、
前記ウイルスが細胞内で複製するような条件下で前記細胞と血清型を混合する工程であって、培地中で前記細胞を培養し、最終的に１ｍＬあたり１×１０６ＴＣＩＤ５０以上の濃度となるよう、任意選択により前記ウイルスを精製および／または濃縮する工程、および
前記ウイルスを不活性化ウイルスが得られるような条件下でホルムアルデヒドと混合する工程
によって製造されることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物において、前記細胞がヒト不死細胞または他の細胞株であることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物において、前記製造工程が、複製されたウイルスをサイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製することをさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含むヒトライノウイルス感染を処置または予防することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、ヒトライノウイルスが不活性化され、１用量あたり１×１０３ＴＣＩＤ５０を超える濃度で投与されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、ワクチンの１用量が投与され、一回目の投与の３日より後に二回目の投与が行われることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法において、前記対象が５歳未満であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法において、前記対象が６０歳を超えることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の方法において、前記対象が喘息、ＣＯＰＤ、肺気腫、慢性気管支炎または嚢胞性線維症と診断されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／１７５，８３２号明細書の優先権を主張するものであり、あらゆる目的のためにその内容全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）は、風邪の最も一般的な原因であり、ヒトにおける感染症の最も一般的な原因である、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属のプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＲＶは、小児における地域性肺炎の主要原因である。一般的な風邪は社会経済的負担であり、ライノウイルス感染は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの慢性呼吸器疾患の患者だけでなく、免疫不全、高齢および若年の集団にも深刻な合併症をもたらしうる。ＨＲＶチャレンジおよびＨＲＶワクチンを用いたヒトボランティアでの研究によって、ウイルス中和抗体（ｎＡｂ）が予防と相関することが実証された。ＨＲＶのためのワクチンの開発は、１００を超える血清型が同定されているという事実によって妨げられてきた。Ｈａｍｏｒｙらは、２種の１０価ライノウイルスワクチンに対するヒトの反応が不十分であることを報告した（Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９７５，１３２（６）：６２３−９）。したがって、改善されたワクチン接種へのアプローチを見出す必要がある。
【０００３】
Ｍａｔｚは、喘息の成人における自然感染によるライノウイルス感染の治療のためのバペンダビル（ｖａｐｅｎｄａｖｉｒ）の使用を報告している。Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２０１３，１８７：Ａ５４９７。
【０００４】
Ｅｄｌｍａｙｒらは、ヒトライノウイルスから組換えＶＰ１で誘導された抗体が交差中和を示すことを報告している。Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ，２０１１，３７：４４−５２。
【０００５】
Ｇｌａｎｖｉｌｌｅらは、保存されたライノウイルスキャプシドタンパク質を用いた免疫化によって誘導された、交差血清型Ｔ細胞免疫を報告している。ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２０１３，９：ｅ１００３６６９。米国特許出願公開第２０１６／００９５９１６号明細書および同第２００６／００８８５４９号明細書も参照されたい。
【０００６】
本明細書に引用される参考文献は、従来技術を承認するものではない。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、多価エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）ワクチン組成物およびそれに関連する使用に関する。特定の実施形態では、本開示は、多価、すなわちヒトライノウイルス（ＨＲＶ）血清型の混合物、複数の血清型を表す多価組換え産生ＨＲＶ株または複数の血清型を表す多価組換え産生ＨＲＶキャプシドタンパク質を含むワクチン組成物に関する。特定の実施形態では、本開示は、ＨＲＶ感染と診断されたか、ＨＲＶ感染の症状を示すか、またはＨＲＶ感染の危険性がある対象に、本明細書に開示される組成物の有効量を投与することを含む免疫化方法に関する。
【０００８】
特定の実施形態では、本開示は、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属の１０を超える血清型の不活性化または弱毒化ウイルス、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）またはそれらの混合物を含む組成物、例えば、ヒトライノウイルスの１０を超える血清型の不活性化ウイルス、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）またはそれらの混合物を含むアジュバントを含む組成物に関する。
【０００９】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は液状であり、各血清型は１用量あたり１×１０３または１０４ＴＣＩＤ５０を超える濃度である。
【００１０】
特定の実施形態では、有効量は、免疫学的に有効な量であり、例えば、複数の血清型に対する防御免疫応答を６、１２、１８または２４ヶ月を超える期間にわたって誘導する量である。
【００１１】
特定の実施形態では、ワクチン組成物は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００を超えるＨＲＶ血清型、血清型を示す組換え変異体、または血清型を表す組換えキャプシドタンパク質を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、本開示は、以下の血清型の不活性化ＨＲＶを含む組成物に関する：ＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ３６、ＨＲＶ−Ａ７８、ＨＲＶ−Ａ３８、ＨＲＶ−Ａ２、ＨＲＶ−Ｂ１４、ＨＲＶ−Ａ９、ＨＲＶ−Ａ２９、ＨＲＶ−Ａ１３およびＨＲＶ−Ａ７６。特定の実施形態では、上記組成物は、ＨＲＶ−Ａ１１、ＨＲＶ−Ａ４４、ＨＲＶ−Ａ６０、ＨＲＶ−Ａ４９、ＨＲＶ−Ａ４１、ＨＲＶ−Ａ３２およびＨＲＶ−Ａ５８の１以上の血清型をさらに含む。特定の実施形態では、上記組成物は、ＨＲＶ−Ａ３３、ＨＲＶ−Ａ５０、ＨＲＶ−Ａ３９、ＨＲＶ−Ｂ２６、ＨＲＶ−Ａ２１、ＨＲＶ−Ａ９４、ＨＲＶ−Ａ５１、ＨＲＶ−Ａ５５、ＨＲＶ−Ａ４５およびＨＲＶ−Ａ１Ｂの１以上の血清型をさらに含む。特定の実施形態では、上記組成物は、ＨＲＶ−Ａ１００、ＨＲＶ−Ａ１０、ＨＲＶ−Ａ６６、ＨＲＶ−Ａ７７、ＨＲＶ−Ａ４０、ＨＲＶ−Ａ８５、ＨＲＶ−Ａ５４、ＨＲＶ−Ａ３４、ＨＲＶ−Ａ２４、ＨＲＶ−Ａ３０、ＨＲＶ−Ａ７５、ＨＲＶ−Ａ９６、ＨＲＶ−Ａ１９、ＨＲＶ−Ａ８８、ＨＲＶ−Ａ７、ＨＲＶ−Ａ８０、ＨＲＶ−Ａ６８、ＨＲＶ−Ａ５３、ＨＲＶ−Ａ８９、ＨＲＶ−Ａ３１、ＨＲＶ−Ａ５６、ＨＲＶ−Ａ５９、ＨＲＶ−Ａ６４およびＨＲＶ−Ａ８１の１以上の血清型をさらに含む。
【００１３】
特定の実施形態では、本開示は、以下の血清型の不活性化ＨＲＶを含む組成物に関する：ＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ３６、ＨＲＶ−Ａ７８、ＨＲＶ−Ａ３８、ＨＲＶ−Ａ２、ＨＲＶ−Ｂ１４、ＨＲＶ−Ａ９、ＨＲＶ−Ａ１３、ＨＲＶ−Ａ２９、ＨＲＶ−Ａ７６、ＨＲＶ−Ａ６０、ＨＲＶ−Ａ４９、ＨＲＶ−Ａ４１、ＨＲＶ−Ａ３２、ＨＲＶ−Ａ５８およびＨＲＶ−Ａ１１。
【００１４】
特定の実施形態では、この組成物は、ＨＲＶ−Ａ１Ｂ、ＨＲＶ−Ａ２、ＨＲＶ−Ａ９、ＨＲＶ−Ａ１１、ＨＲＶ−Ｂ１４、ＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ２１、ＨＲＶ−Ｂ２６、ＨＲＶ−Ａ２９、ＨＲＶ−Ａ３２、ＨＲＶ−Ａ３３、ＨＲＶ−Ａ３６、ＨＲＶ−Ａ３８、ＨＲＶ−Ａ３９、ＨＲＶ−Ａ４１、ＨＲＶ−Ａ４５、ＨＲＶ−Ａ４９、ＨＲＶ−Ａ５０、ＨＲＶ−Ａ５１、ＨＲＶ−Ａ５５、ＨＲＶ−Ａ５８、ＨＲＶ−Ａ６０、ＨＲＶ−Ａ７６、ＨＲＶ−Ａ７８、ＨＲＶ−Ａ９４、ＨＲＶ−Ａ７、ＨＲＶ−Ａ１０、ＨＲＶ−Ａ１３、ＨＲＶ−Ａ１９、ＨＲＶ−Ａ２４、ＨＲＶ−Ａ３０、ＨＲＶ−Ａ３１、ＨＲＶ−Ａ３４、ＨＲＶ−Ａ４０、ＨＲＶ−Ａ５３、ＨＲＶ−Ａ５４、ＨＲＶ−Ａ５６、ＨＲＶ−Ａ５９、ＨＲＶ−Ａ６４、ＨＲＶ−Ａ６６、ＨＲＶ−Ａ６８、ＨＲＶ−Ａ７５、ＨＲＶ−Ａ７７、ＨＲＶ−Ａ８０、ＨＲＶ−Ａ８１、ＨＲＶ−Ａ８５、ＨＲＶ−Ａ８８、ＨＲＶ−Ａ８９、ＨＲＶ−Ａ９６およびＨＲＶ−Ａ１００の１もしくは１０を超える、または１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０もしくはそれを超える血清型をさらに含む。
【００１５】
特定の実施形態では、本開示は、あるＨＲＶ血清型を、ＨＲＶが細胞に感染するような条件下で細胞と混合する工程であって、ＨＲＶが複製するような条件下で培地中で細胞を培養し、ウイルスを採取し、任意選択によりこのウイルスを精製および／または濃縮して、最終的に１ｍＬあたり１×１０６５０％組織培養感染価（ＴＣＩＤ５０）を超える濃度のＨＲＶを得る工程、ならびに不活性化ＨＲＶを提供するための条件下でＨＲＶをＨＲＶ不活性化剤と混合する工程によって作製された不活性化ＨＲＶに関する。
【００１６】
特定の実施形態では、細胞はヒト不死細胞または他の細胞株である。特定の実施形態では、培地はタンパク質アルブミンを含む。
【００１７】
特定の実施形態では、本開示は、ＨＲＶ非翻訳領域の５’および３’に隣接するＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄを含むポリタンパク質をコードする感染性ＨＲＶのＲＮＡをコードする組換え核酸において、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１タンパク質配列のうち１つ、２つ、３つ、または全てが第１のＨＲＶ血清型由来であり、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄタンパク質配列のうち少なくとも１つが第２のＨＲＶ血清型由来であって、第１のＨＲＶ血清型および第２のＨＲＶ血清型は、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１タンパク質のうち１つ、２つ、３つまたは全てについて同一の血清型配列を有しない、組換え核酸に関する。
【００１８】
特定の実施形態では、第２のＨＲＶ血清型は、ＨＲＶ−Ａ１６またはＨＲＶ−Ａ８０である。
【００１９】
特定の実施形態では、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１および２Ａは、ＨＲＶ−Ａ３６、ＨＲＶ−Ａ７８、ＨＲＶ−Ａ３８、ＨＲＶ−Ａ２、ＨＲＶ−Ｂ１４、ＨＲＶ−Ａ９、ＨＲＶ−Ａ１３、ＨＲＶ−Ａ２９、またはＨＲＶ−Ａ７６由来であり、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄタンパク質配列は、ＨＲＶ−Ａ１６またはＨＲＶ−Ａ８０由来である。
【００２０】
特定の実施形態では、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１および２Ａは、ＨＲＶ−Ａ１１、ＨＲＶ−Ａ４４、ＨＲＶ−Ａ６０、ＨＲＶ−Ａ４９、ＨＲＶ−Ａ４１、ＨＲＶ−Ａ３２、およびＨＲＶ−Ａ５８、ＨＲＶ−Ａ３３、ＨＲＶ−Ａ５０、ＨＲＶ−Ａ３９、ＨＲＶ−２６、ＨＲＶ−Ａ２１、ＨＲＶ−Ａ９４、ＨＲＶ−Ａ５１、ＨＲＶ−Ａ５５、ＨＲＶ−Ａ４５、およびＨＲＶ−Ａ１Ｂ、ＨＲＶ−Ａ１００、ＨＲＶ−Ａ１０、ＨＲＶ−Ａ６６、ＨＲＶ−Ａ７７、ＨＲＶ−Ａ４０、ＨＲＶ−Ａ８５、ＨＲＶ−Ａ５４、ＨＲＶ−Ａ３４、ＨＲＶ−Ａ２４、ＨＲＶ−Ａ３０、ＨＲＶ−Ａ７５、ＨＲＶ−Ａ９６、ＨＲＶ−Ａ１９、ＨＲＶ−Ａ８８、ＨＲＶ−Ａ７、ＨＲＶ−Ａ８０、ＨＲＶ−Ａ６８、ＨＲＶ−Ａ５３、ＨＲＶ−Ａ８９、ＨＲＶ−Ａ３１、ＨＲＶ−Ａ５６、ＨＲＶ−Ａ５９、ＨＲＶ−Ａ６４またはＨＲＶ−Ａ８１由来であり、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄタンパク質配列はＨＲＶ−Ａ１６またはＨＲＶ−Ａ８０由来である。
【００２１】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるユニークな核酸を含むベクターを含む組成物であって、ユニークな核酸がＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１および２Ａについてそれぞれ異なる配列をコードする組成物に関する。特定の実施形態では、上記組成物は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００を超える異なるユニークな核酸ベクターを含む。
【００２２】
特定の実施形態では、上記組成物は単一の血清型のＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ１、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄタンパク質配列をコードする核酸をさらに含む。
【００２３】
特定の実施形態では、本開示は、不活性化された天然もしくは非天然のＨＲＶ血清型または本明細書に開示される核酸配列を任意選択によりアジュバントと組み合わせて含むワクチン組成物に関する。
【００２４】
特定の実施形態では、上記組成物は、さらに、組換えによって作製されたＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３および／またはＶＰ１タンパク質を、任意選択によりアジュバントと組み合わせて含む。特定の実施形態では、上記組成物は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００を超える異なる血清型を表すユニークなキャプシドタンパク質を含む。
【００２５】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示される組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）（例えば、ＨＲＶ）感染を処置または予防する方法に関する。
【００２６】
特定の実施形態では、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）は、不活性化され、１用量あたり約１０３または１０４ＴＣＩＤ５０以上の濃度で投与される複数のヒトライノウイルスである。
【００２７】
特定の実施形態では、ワクチンの１用量が投与され、一回目の投与の３日、５日、７日、９日、１１日、または１３日を超える期間の後に二回目の投与が行われる。
【００２８】
特定の実施形態では、対象は、１才未満、２才未満、３才未満または５才未満である。特定の実施形態では、上記対象は、６０歳、６５歳、または７０歳を超える。特定の実施形態では、上記対象は、喘息、ＣＯＰＤ、肺気腫、慢性気管支炎、嚢胞性線維症と診断されているか、または１型糖尿病の遺伝的素因がある。
【００２９】
特定の実施形態では、本開示は、複数のエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）種のようなエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属の他のウイルスの多価ワクチン組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、１０の混合された不活性化ＨＲＶ血清型によるワクチン接種後にマウスで産生された、１０のＨＲＶ血清型に対するウイルス中和抗体のデータを表す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり２０匹）に不活性化ＨＲＶＶ−１０を筋肉内経路でワクチン接種した。ワクチン接種の１８日後に血清を収集し、ＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ３６、ＨＲＶ−Ａ７８、ＨＲＶ−Ａ３８、ＨＲＶ−Ａ２、ＨＲＶ−Ｂ１４、ＨＲＶ−Ａ９、ＨＲＶ−Ａ１３、ＨＲＶ−Ａ２９、ＨＲＶ−Ａ７６およびＨＲＶ−Ａ４９（ｘ軸上、左から右）に対する血清ｎＡｂ力価（各群についてプールした）を、ＨｅＬａ細胞におけるＴＣＩＤ５０還元アッセイによって定量した。ワクチンに含まれる血清型は、黒線でグラフに示される。ＨＲＶＶ−１０は、１０種のインプット血清型のうち９種（ＨＲＶ−Ａ１３でないもの）に対してｎＡｂを誘導し、ＨＲＶＶ−１０は、ワクチンには含まれないがＨＲＶ−Ａ２と同じ抗原性グループの血清型であるＨＲＶ−Ａ４９に対してｎＡｂを誘導した。
【図２】図２は、感染性ＨＲＶを産生するＨＲＶ核酸を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターを表す。図は、ＢＡＣベクターにクローニングされたＨＲＶ−Ａ１６構築物を示す。このＨＲＶ−Ａ１６核酸は、直ちに５’および３’リボザイムに隣接し、発現は５’Ｔ７プロモーターによって駆動される。ＨＲＶ−Ａ１６  ＢＡＣは、キャプシドキメラＨＲＶの設計および回収を可能にする、キャプシド遺伝子に隣接する制限酵素部位ＳａｃＩおよびＣｌａＩを設計した。ベクターは、インビトロＴ７転写のための鋳型として働く。産生されたＲＮＡはＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされ、容易に感染性ＨＲＶが産生される。
【図３Ａ】図３Ａは、不活性化ＨＲＶ−Ａ１６の免疫原性が１から１０までの価数の増加によって影響されないことを示すデータを表す。マウスに、ミョウバンアジュバントを有するもしくは有しない１価不活性化ＨＲＶ−Ａ１６（１群あたり５匹のマウス）、またはミョウバンを有する３価、５価、７価もしくは１０価の不活性化ＨＲＶ（１群あたり２０匹のマウス）で筋肉内注射によりワクチン接種した。ＨＲＶタイプおよび不活性化ＴＣＩＤ５０用量は、補足表１に規定されている。血清をワクチン接種の１８日後に採取し、各群についてプールした。ＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ３６およびＨＲＶ−Ａ７８に対して血清ｎＡｂ力価を測定した。破線は検出限界（ＬＯＤ）を表す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＨＲＶ−Ａ３６のデータを表す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＨＲＶ−Ａ７８のデータを表す。
【図４Ａ】図４Ａは、不活性化された多価ＨＲＶの免疫原性が用量に関連することを示すデータを表す。マウス（２群、１群あたり２０匹）に、１９７５年のＨａｍｏｒｙらのｓｔｕｄｙ１０と同様に、１用量あたりの不活性化ＴＣＩＤ５０インプット力価（ｘ軸）が低いものからなる１０価ＨＲＶワクチンにミョウバンを加えたもの（グレーの記号）または１用量あたりの不活性化ＴＣＩＤ５０インプット力価が高い１０価ＨＲＶワクチンにミョウバンを加えたもの（黒の記号）でワクチン接種した。血清を初回免疫の１８日後に収集し、各群についてプールし、ワクチン中の示された型に対してｎＡｂ力価（ｙ軸）を測定した。破線はＬＯＤを表す。検出不可能なｎＡｂはＬＯＤ／２に割り当て、ＬＯＤ以下のいくつかの記号は視覚化のために微調整した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、追加免疫の１８日後のデータを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、マウスにおける１０価および２５価不活性化ＨＲＶに対する広範なｎＡｂ反応を示すデータを表す。１用量あたりの不活性化ＴＣＩＤ５０インプット力価は、表５に記載される。２０匹のマウスに１０価ＨＲＶでワクチン接種を行い、５０日で追加免疫した。１８日目（初回免疫）および６８日目（追加免疫）に血清を採取した。ワクチン中の示された型に対するｎＡｂレベルを、プールした血清で測定した。破線はＬＯＤを表す。検出不能なｎＡｂはＬＯＤ／２に割り当てた。
【図５Ｂ】図５Ｂは、２５価のＨＲＶで免疫し、５０日で追加免疫した３０匹のマウスのデータを表す。
【図６Ａ】図６Ａは、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）における初回免疫および追加免疫後の２５価不活性化ＨＲＶに対する広範なｎＡｂ反応を示すデータを表す。１用量あたりの不活性化ＴＣＩＤ５０インプット力価は表６に記載される。２匹のアカゲザル（ＲＭ  ＡおよびＲＭ  Ｂ）を２５価ＨＲＶ＋ミョウバンで筋肉内注射によりワクチン接種した。ＲＭは２８日目に同一の追加免疫ワクチン接種を受け、追加免疫ワクチン接種後のｎＡｂ力価を決定するために４６日目に血清が採取された。破線はＬＯＤを表す。検出不能なｎＡｂはＬＯＤ／２に割り当てた。
【図６Ｂ】図６Ｂは、２匹のアカゲザル（ＲＭ  ＣおよびＲＭ  Ｄ）が初回免疫および追加免疫の後に、５０価のＨＲＶ＋ミョウバンで筋肉内注射によりワクチン接種されたデータを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示がより詳細に説明される前に、本開示は、記載された特定の実施形態に限定されず、当然に変化し得るものと理解されるべきである。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであって、限定することを意図するものではないことも理解されたい。なぜなら、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
【００３２】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料も、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。
【００３３】
本明細書に引用される全ての刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、また、引用される刊行物に関連する方法および／または材料を開示し記載するために参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためのものであり、本開示が先の開示のためにその刊行物より先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、記載された公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、個別の確認を必要とし得る。
【００３４】
本開示を読むと当業者には明らかなように、本明細書に記載され説明された個々の実施形態はそれぞれ、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他の複数の実施形態のうちいずれの特徴からも容易に分離されまたは組み合わせてもよい、個別の構成要素および特徴を有する。記載された方法は全て、詳述された事象の順序で、または論理的に可能ないずれかの順序で実施することができる。
【００３５】
本開示の実施形態には、特に明記しない限り、当技術分野の範囲内である医学、有機化学、生化学、分子生物学、薬理学などの技術を使用する。このような技術は、文献において十分に説明されている。
【００３６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことを留意しなければならない。
【００３７】
「ライノウイルス」または「ＨＲＶ」（ヒトライノウイルス）という用語は、最近の分類学に従って、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属のいずれかの種を指す。タイプＡライノウイルスとも呼ばれるヒトライノウイルスＡ（ＨＲＶ−Ａ）、タイプＢライノウイルスとも呼ばれるヒトライノウイルスＢ（ＨＲＶ−Ｂ）およびタイプＣライノウイルスとも呼ばれるヒトライノウイルスＣ（ＨＲＶ−Ｃ）の３種類のライノウイルスが存在する。
【００３８】
ＨＲＶはさらに、それらの血清型に従って分類され、そのうち１５０を超える数が報告されている。
【００３９】
本明細書で使用される「血清型」という用語は、ライノウイルスのグループ内の細分を指し、ライノウイルスのＶＰ１遺伝子配列に依存する。所定の血清型のライノウイルスは、二次的特性によって区別される１つまたは複数の株を含み得る。ＨＲＶは、受容体特異性、抗ウイルス感受性およびヌクレオチド配列相同性を含むいくつかの他のパラメータに従って分類されている。前記ＨＲＶ−Ａ種は、特に以下の８３の血清型：ＨＲＶ−Ａ１Ａ、ＨＲＶ−Ａ１Ｂ、ＨＲＶ−Ａ２、ＨＲＶ−Ａ７、ＨＲＶ−Ａ８、ＨＲＶ−Ａ９、ＨＲＶ−Ａ１０、ＨＲＶ−Ａ１１、ＨＲＶ−Ａ１２、ＨＲＶ−Ａ１３、ＨＲＶ−Ａ１５、ＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ１８、ＨＲＶ−Ａ１９、ＨＲＶ−Ａ２０、ＨＲＶ−Ａ２１、ＨＲＶ−Ａ２２、ＨＲＶ−Ａ２３、ＨＲＶ−Ａ２４、ＨＲＶ−Ａ２５、ＨＲＶ−Ａ２７、ＨＲＶ−Ａ２８、ＨＲＶ−Ａ２９、ＨＲＶ−Ａ３０、ＨＲＶ−Ａ３１、ＨＲＶ−Ａ３２、ＨＲＶ−Ａ３３、ＨＲＶ−Ａ３４、ＨＲＶ−Ａ３６、ＨＲＶ−Ａ３８、ＨＲＶ−Ａ３９、ＨＲＶ−Ａ４０、ＨＲＶ−Ａ４１、ＨＲＶ−Ａ４３、ＨＲＶ−Ａ４４、ＨＲＶ−Ａ４５、ＨＲＶ−Ａ４６、ＨＲＶ−Ａ４７、ＨＲＶ−Ａ４９、ＨＲＶ−Ａ５０、ＨＲＶ−Ａ５１、ＨＲＶ−Ａ５３、ＨＲＶ−Ａ５４、ＨＲＶ−Ａ５５、ＨＲＶ−Ａ５６、ＨＲＶ−Ａ５７、ＨＲＶ−Ａ５８、ＨＲＶ−Ａ５９、ＨＲＶ−Ａ６０、ＨＲＶ−Ａ６１、ＨＲＶ−Ａ６２、ＨＲＶ−Ａ６３、ＨＲＶ−Ａ６４、ＨＲＶ−Ａ６５、ＨＲＶ−Ａ６６、ＨＲＶ−Ａ６７、ＨＲＶ−Ａ６８、ＨＲＶ−Ａ７１、ＨＲＶ−Ａ７３、ＨＲＶ−Ａ７４、ＨＲＶ−Ａ７５、ＨＲＶ−Ａ７６、ＨＲＶ−Ａ７７、ＨＲＶ−Ａ７８、ＨＲＶ−Ａ８０、ＨＲＶ−Ａ８１、ＨＲＶ−Ａ８２、ＨＲＶ−Ａ８５、ＨＲＶ−Ａ８８、ＨＲＶ−Ａ８９、ＨＲＶ−Ａ９０、ＨＲＶ−Ａ９４、ＨＲＶ−Ａ９６、ＨＲＶ−Ａ１００、ＨＲＶ−Ａ１０１、ＨＲＶ−Ａ１０２、ＨＲＶ−Ａ１０３、ＨＲＶ−Ａ１０４、ＨＲＶ−Ａ１０５、ＨＲＶ−Ａ１０６、ＨＲＶ−Ａ１０７、ＨＲＶ−Ａ１０８およびＨＲＶ−Ａ１０９を含み、ＨＲＶ−Ｂ種は、特に以下の３２の血清型：ＨＲＶ−Ｂ３、ＨＲＶ−Ｂ４、ＨＲＶ−Ｂ５、ＨＲＶ−Ｂ６、ＨＲＶ−Ｂ１４、ＨＲＶ−Ｂ１７、ＨＲＶ−Ｂ２６、ＨＲＶ−Ｂ２７、ＨＲＶ−Ｂ３５、ＨＲＶ−Ｂ３７、ＨＲＶ−Ｂ４２、ＨＲＶ−Ｂ４８、ＨＲＶ−Ｂ５２、ＨＲＶ−Ｂ６９、ＨＲＶ−Ｂ７０、ＨＲＶ−Ｂ７２、ＨＲＶ−Ｂ７９、ＨＲＶ−Ｂ８３、ＨＲＶ−Ｂ８４、ＨＲＶ−Ｂ８６、ＨＲＶ−Ｂ９１、ＨＲＶ−Ｂ９２、ＨＲＶ−Ｂ９３、ＨＲＶ−Ｂ９７、ＨＲＶ−Ｂ９９、ＨＲＶ−Ｂ１００、ＨＲＶ−Ｂ１０１、ＨＲＶ−Ｂ１０２、ＨＲＶ−Ｂ１０３、ＨＲＶ−Ｂ１０４、ＨＲＶ−Ｂ１０５およびＨＲＶ−Ｂ１０６を含み、ＨＲＶ−Ｃ種は、特に以下の５５の血清型：ＨＲＶ−Ｃ１、ＨＲＶ−Ｃ２、ＨＲＶ−Ｃ３、ＨＲＶ−Ｃ４、ＨＲＶ−Ｃ５、ＨＲＶ−Ｃ６、ＨＲＶ−Ｃ７、ＨＲＶ−Ｃ８、ＨＲＶ−Ｃ９、ＨＲＶ−Ｃ１０、ＨＲＶ−Ｃ１１、ＨＲＶ−Ｃ１２、ＨＲＶ−Ｃ１３、ＨＲＶ−Ｃ１４、ＨＲＶ−Ｃ１５、ＨＲＶ−Ｃ１６、ＨＲＶ−Ｃ１７、ＨＲＶ−Ｃ１８、ＨＲＶ−Ｃ１９、ＨＲＶ−Ｃ２０、ＨＲＶ−Ｃ２１、ＨＲＶ−Ｃ２２、ＨＲＶ−Ｃ２３、ＨＲＶ−Ｃ２４、ＨＲＶ−Ｃ２５、ＨＲＶ−Ｃ２６、ＨＲＶ−Ｃ２７、ＨＲＶ−Ｃ２８、ＨＲＶ−Ｃ２９、ＨＲＶ−Ｃ３０、ＨＲＶ−Ｃ３１、ＨＲＶ−Ｃ３２、ＨＲＶ−Ｃ３３、ＨＲＶ−Ｃ３４、ＨＲＶ−Ｃ３５、ＨＲＶ−Ｃ３６、ＨＲＶ−Ｃ３７、ＨＲＶ−Ｃ３８、ＨＲＶ−Ｃ３９、ＨＲＶ−Ｃ４０、ＨＲＶ−Ｃ４１、ＨＲＶ−Ｃ４２、ＨＲＶ−Ｃ４３、ＨＲＶ−Ｃ４４、ＨＲＶ−Ｃ４５、ＨＲＶ−Ｃ４６、ＨＲＶ−Ｃ４７、ＨＲＶ−Ｃ４８、ＨＲＶ−Ｃ４９、ＨＲＶ−Ｃ５０、ＨＲＶ−Ｃ５１、ＨＲＶ−Ｃ５２、ＨＲＶ−Ｃ５３、ＨＲＶ−Ｃ５４およびＨＲＶ−Ｃ５５を含む。
【００４０】
ＨＲＶ血清型は、受容体の用途に従って、マイナーグループウイルスおよびメジャーグループウイルスに分類することもできる。
【００４１】
ＨＲＶ−Ａ２のようなマイナーグループウイルスは、低密度リポタンパク質受容体ファミリーを受容体として使用する。それらは酸に不安定であり、脱外被について低ｐＨにおける絶対的依存性を有する。ＨＲＶ−Ｂ１４およびＨＲＶ−Ａ１６などのメジャーグループウイルスは、受容体として細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）を使用する。それらもまた一般に酸に不安定であるが、マイナーグループウイルスとは異なり、脱外被について低ｐＨにおける絶対的依存性を有しない。
【００４２】
本明細書で使用される「対象」は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、または家庭用ペットを指す。
【００４３】
本明細書で使用される「予防する」および「予防」という用語は、再発、蔓延または発症の予防を含む。本開示は完全な予防に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、発症が遅延されるか、または重症度が軽減される。
【００４４】
本明細書で使用される「処置する」および「処置」という用語は、対象（例えば患者）が治癒され、疾患が根絶される場合に限定されない。むしろ、本開示の実施形態では、単に症状を軽減する、および／または疾患の進行を遅延させる処置も考えられる。
【００４５】
「核酸」という用語は、ヌクレオチドのポリマー、すなわちポリヌクレオチドを指す。この用語は、一分子または分子の集合を指定するために使用される。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、以下に記載するように、コード領域および種々の制御エレメントの領域を含み得る。
【００４６】
特定のポリペプチドを「コードする核酸配列」という用語は、遺伝子のコード領域、言い換えれば遺伝子産物をコードする核酸配列を含む核酸配列を指す。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態で存在し得る。ＤＮＡの形態で存在する場合、そのオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であり得る。一次ＲＮＡ転写物の適切な転写の開始および／または正確なプロセシングを可能にするために必要であれば、エンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、ポリアデニル化シグナルなどの適切な制御エレメントを遺伝子のコーディング領域に近接して配置することができる。あるいは、本開示の発現ベクターに利用されるコード領域は、内因性エンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性および外因性制御エレメントの両方の組み合わせを含み得る。
【００４７】
「組換え」という用語は、核酸分子に関して用いられる場合、分子生物学的技術によって一緒に連結された核酸のセグメントを含む核酸分子を指す。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、組換え核酸分子を用いて発現されるタンパク質分子を指す。
【００４８】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、特定の宿主生物または発現系、例えば細胞または無細胞において、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な、所望のコード配列および適切な核酸配列を含む組換え核酸を指す。原核生物における発現に必要な核酸配列は、通常、プロモーター、オペレーター（任意選択）、およびリボソーム結合部位を含み、しばしば他の配列を一緒に含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーならびに終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。典型的な組換えベクターは選択マーカーを含む。
【００４９】
「選択マーカー」は、人工的選択または同定（レポーター遺伝子）に適した形質を付与するポリペプチドをコードする組換えベクターに導入された核酸である。例えば、β−ラクタマーゼは抗生物質耐性を付与し、β−ラクタマーゼを発現する生体が増殖培地中、抗生物質の存在下で生存することを可能にする。別の例は、宿主をガンシクロビル選択に感受性にするチミジンキナーゼである。それは、期待される色の有無に基づき、望ましい細胞と望ましくない細胞とを区別することを可能にするスクリーニング可能なマーカーであり得る。例えば、ｌａｃ−ｚ−遺伝子は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）の存在下で青色を付与するβ−ガラクトシダーゼ酵素を産生する。組換え挿入がｌａｃ−ｚ−遺伝子を不活性化する場合、得られるコロニーは無色である。例えば、発現生物がその成長に要する（栄養要求）特定の化合物を合成できないことを補うことができる酵素、およびある化合物を成長のために毒性である別の化合物に変換することができる酵素のような、１つ以上の選択マーカーがあってもよい。オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼであるＵＲＡ３は、ウラシル生合成に必要であり、ウラシルに対して栄養要求性であるｕｒａ３変異体を補完することができる。ＵＲＡ３はまた、５−フルオロオロチン酸を毒性化合物５−フルオロウラシルに変換する。さらに考えられる選択マーカーとしては、抗細菌耐性を付与するか、または蛍光タンパク質を発現する任意の遺伝子を含む。例としては、以下の遺伝子が含まれるが、これに限定されない：ａｍｐｒ、ｃａｍｒ、ｔｅｔｒ、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｒ、ｎｅｏｒ、ｈｙｇｒ、ａｂｘｒ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ｐ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）、ｅｇｆｐ、ｙｆｐ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ｌａｃＺａ、ｌａｃＺＡＭ１５、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）、細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）、ビアラフォス抵抗遺伝子（ｂａｒ）、ホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）、アラビトールデヒドロゲナーゼ（ａｔｌＤ）、ＵＤＰ−グルコース：ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼＩ（ｇａｌＴ）、アントラニル酸シンターゼのフィードバック非感受性αサブユニット（ＯＡＳＡ１Ｄ）、２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧＲ）、ベンジルアデニン−Ｎ−３−グルクロニド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トレオニンデアミナーゼ、グルタミン酸１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ（ＧＳＡ−ＡＴ）、Ｄ−アミノアシドオキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、塩耐性遺伝子（ｒｓｔＢ）、フェレドキシン様タンパク質（ｐｆｌｐ）、トレハロース−６−Ｐシンターゼ遺伝子（ＡｔＴＰＳ１）、リジンラセマーゼ（ｌｙｒ）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）、トリプトファンシンターゼβ１（ＡｔＴＳＢ１）、デハロゲナーゼ（ｄｈｌＡ）、マンノース−６−リン酸レダクターゼ遺伝子（Ｍ６ＰＲ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）およびＤ−セリンアンモニアリアーゼ（ｄｓｄＡ）。
【００５０】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＨＲＶポリタンパク質またはそのキメラタンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターに関する。「キメラ」という用語は、ポリペプチドに関して使用される場合、一緒にクローン化され、翻訳後に１つのポリペプチド配列として作用する、異なる遺伝子から得られる２つ以上のコード配列の発現産物を指す。キメラポリペプチドは、「ハイブリッド」ポリペプチドとも呼ばれる。コード配列は、同じまたは異なるウイルス血清型から得られた配列を含む。
【００５１】
「融合」という用語は、ポリペプチドに関して使用される場合、外因性タンパク質断片（融合パートナー）に連結された目的タンパク質を含むキメラタンパク質を指す。融合パートナーは、宿主細胞または上清または両方からの組換え融合ポリペプチド精製を可能にする「アフィニティータグ」を提供するだけでなく、目的ポリペプチドの溶解性の増強をも含む、様々な機能を果たし得る。必要に応じて、精製後または精製中に、目的タンパク質から融合パートナーを除去してもよい。
【００５２】
特定の実施形態では、組換えベクターは、任意選択により、遺伝子またはレトロウイルス遺伝子のような、哺乳動物、ヒト、昆虫、ウイルス、細菌、細菌プラスミド、酵母の関連複製起点もしくは遺伝子、またはレンチウイルスＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳおよびＩＮＳのｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｖｐｘから選択されるヌクレオチドセグメントもしくは遺伝子、またはｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖから選択される構造遺伝子を含む。
【００５３】
特定の実施形態では、組換えベクターは、任意選択により、選択マーカー領域、ｌａｃオペロン、ＣＭＶプロモーター、ハイブリッドニワトリＢ−アクチン／ＣＭＶエンハンサー（ＣＡＧ）プロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列、シス作用性ウッドチャック調節後エレメント（ＷＰＲＥ）、足場付着領域（ＳＡＲ）、逆位末端配列（ＩＴＲ）、ＦＬＡＧタグコード領域、ｃ−ｍｙｃタグコード領域、金属アフィニティータグコード領域、ストレプトアビジン結合ペプチドタグコード領域、ポリＨｉｓタグコード領域、ＨＡタグコード領域、ＭＢＰタグコード領域、ＧＳＴタグコード領域、ポリアデニル化コード領域、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０複製起点、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点、ｆ１起点、ｐＢＲ３２２起点、またはｐＵＣ起点、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位、ｌｏｘＰ部位、Ｃｒｅリコンビナーゼコード領域、または５０未満または６０未満のヌクレオチドの連続したセグメント内に５、６、７またはそれ以上の制限部位を有する、もしくは２０未満または３０未満のヌクレオチドの連続したセグメントを持つ３、４またはそれ以上の制限部位を有するような多重クローニング部位、のような遺伝子ベクターエレメント（核酸）を含む。
【００５４】
「遺伝子」という用語はまた、構造遺伝子のコード領域を包含し、５’末端および３’末端の両方のコード領域に各端に約１ｋｂの長さで隣接して配置され、その遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応する配列を含む。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡ形態およびゲノム形態の両方を包含する。ゲノム形態またはクローンの遺伝子は、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されたコード領域を含む。イントロンは核ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンはエンハンサーのような調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または一次転写産物から除去または「スプライスアウト」され、したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には存在しない。ｍＲＮＡは、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を特定する翻訳において機能する。
【００５５】
イントロンを含有することに加えて、ゲノム形態の遺伝子は、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’末端および３’末端の両方に位置する配列も含み得る。これらの配列は、「隣接する」配列または領域（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列の５’または３’に位置する）と呼ばれる。５’隣接領域は、遺伝子の転写を制御または影響するプロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列を含み得る。３’隣接領域は、転写の終結、転写後切断およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【００５６】
「異種遺伝子」という用語は、その自然環境にない（すなわち、ヒトの手によって改変された）因子をコードする遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子は、別の血清型に導入された１つのウイルス血清型に由来する遺伝子を含む。異種遺伝子はまた、何らかの方法で改変された（例えば、突然変異した、複数のコピーで付加された、非天然のプロモーターまたはエンハンサー配列に連結された、など）生物に固有の遺伝子を含む。異種遺伝子は、ウイルス遺伝子のｃＤＮＡ形態を含むウイルス遺伝子配列を含み得て、ｃＤＮＡ配列は、（ｍＲＮＡを産生するための）センスまたは（ｍＲＮＡ転写物に相補的なアンチセンスＲＮＡ転写産物を産生するための）アンチセンス方向のいずれかで発現され得る。異種遺伝子は、その異種遺伝子配列が、異種遺伝子によってコードされたタンパク質の遺伝子もしくは染色体中のウイルス遺伝子配列に天然には関連していない、または天然には存在しない染色体部分と関連する（例えば、遺伝子が正常に発現されていない遺伝子座で発現される遺伝子）プロモーターのような、調節エレメントを含むヌクレオチド配列に典型的に結合するという点で、内因性ウイルス遺伝子とは区別される。
【００５７】
「トランスフェクション」という用語は、外来核酸の細胞への導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、ガラスビーズ、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、ＤＮＡまたはＲＮＡのリポフェクション、プロトプラスト融合、ウイルス感染、バイオリスティック（すなわち、粒子衝撃）などを含む当業者に知られた様々な方法で行われ得る。
【００５８】
「精製された」という用語は、その天然の環境から取り出され、単離され、または分離された、核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかの分子を指す。したがって、「単離された核酸配列」は、精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、それらが天然に会合している他の成分を少なくとも６０％含まず、好ましくは少なくとも７５％含まず、より好ましくは少なくとも９０％含まない。本明細書中で使用される「精製された」または「精製する」という用語はまた、サンプルからの汚染物質の除去を指す。
【００５９】
「宿主細胞」という用語は、異種遺伝子を複製および／または転写および／または翻訳することができる任意の細胞を指す。したがって、「宿主細胞」とは、インビトロまたはインビボのどちらにあるかにかかわらず、任意の真核細胞または原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚細胞および昆虫細胞）を指す。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物中に存在し得る。
【００６０】
「免疫学的に有効な量」は、入力抗原に対する個体（例えば、ヒト）自身の免疫応答を増強し、および／またはその後の曝露に対する防御を行うのに十分な量である。誘発された免疫のレベルは、例えば、中和分泌および／または血清抗体の量を測定することによって、例えば、プラーク中和、補体固定、酵素結合免疫吸着剤または微量中和アッセイなどによって、観測することができる。
【００６１】
「防御免疫応答」は、その個体が後に曝露および／または感染した場合に、上気道疾患および／または下気道疾患（例えば、風邪および／または肺炎）に対して防御的である個体（例えば、ヒト）によって示される免疫応答を指す。
【００６２】
ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）およびワクチン
ＨＲＶはポジティブセンスＲＮＡゲノムを有する。ＲＮＡは１つのポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを持つ３’末端ポリ（Ａ）テールを有する５’および３’非翻訳領域（ＮＴＲ）を含む。組み換えｃＤＮＡクローンから誘導されたビリオンＲＮＡおよび合成ゲノム長ＲＮＡは、細胞にトランスフェクトされたときに感染性であり、ウイルス粒子を発生させ、続いてウイルス複製のラウンドを生じる。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００２，７６：７４８５］参照。５’−ＮＴＲは内部リボソーム進入部位を有するが、ｍＲＮＡの５’末端キャップ構造を欠き、したがって細胞翻訳は５’エンコードウイルスタンパク質（ＶＰｇ）をバイパスする。
【００６３】
ポリプロテインは、ウイルスプロテアーゼによる切断の順序に関連する３つのセグメントを含む。Ｎ末端セグメントＰ１は、４つのキャプシドタンパク質、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１を含有する。ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１はキャプシド外部に露出している。Ｐ２およびＰ３セグメントは、非構造タンパク質からなる。これらは、２Ａ（プロテアーゼ）、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ（ＶＰｇ）、３Ｃ（プロテアーゼ）および３Ｄ（ポリメラーゼ）を含む。前駆体には２ＢＣ、３ＡＢおよび３ＣＤが含まれる。
【００６４】
ＨＲＶはピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属に属し、番号の付いた血清型によって示される。ＨＲＶの３つの種類、Ａ、ＢおよびＣがある。Ｃｏｏｎｅｙらは、９０のライノウイルス血清型の抗原性グループを報告している。Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ３７，６４２−６４７（１９８２）。交差中和を示すＨＲＶ血清型の抗原性グループが存在し、いくつかの血清型の組み合わせは、動物で生成された高力価の抗血清を用いて相互中和を示す。ＨＲＶの分子疫学は、血清型が数多くあるが安定しており、インフルエンザで起こるような「抗原ドリフト」はＨＲＶでは起こらないことを示している。
【００６５】
米国特許出願公開第２０１０／０２３３６７７号明細書は、８０のヒトライノウイルス（ＨＲＶ）のゲノム配列を報告している。特定の血清型のゲノム配列は、以下の表１で参照される。
2018517722.tif 000003
【００６６】
不活性化されたＨＲＶ株または組み立てられたＨＲＶ株の空のキャプシドタンパク質を混合すると（例えば、代表的な１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の血清型）、相当数のＨＲＶ型に対し、保護中和抗体（ｎＡｂ）への応答を誘発し得る。本明細書では、任意選択により所望のアジュバントと任意に組み合わせた多価ＨＲＶワクチンが開示される。特定の実施形態では、ＨＲＶ組成物は、９を超える血清型の不活性化ＨＲＶを含み、考えられる方法としては、鼻腔内（ｉ．ｎ）または筋肉内（ｉ．ｍ）投与を含む。
【００６７】
感染症は、それがなければ健康な成人に、一般的な風邪の症状を引き起こす。したがって、特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示された組成物を周期的または定期的なスケジュールで、例えば６ヶ月毎、１年または２年またはそれ以上毎に、対象に投与することによってＨＲＶ感染を予防する方法に関する。呼吸器ウイルス感染症は、高い割合の喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の悪化と関連している。したがって、特定の実施形態において、本開示は、本明細書で開示される組成物を、喘息、ＣＯＰＤ、肺気腫、慢性気管支炎、または嚢胞性線維症（「ＣＦ」）の肺憎悪などの閉塞した気道状態であると診断されたか、その症状を示すか、その危険性がある対象に投与することを含む、閉塞した気道状態および疾患の悪化の管理または予防に関する。
【００６８】
ＨＲＶ  Ｃ感染は小児の重度の呼吸器疾患と関連している。したがって、特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される組成物、例えば、弱毒化もしくは不活化（死滅）ウイルスとしてのＨＲＶ  Ｃ血清型もしくは組換えウイルス、または組換えＨＲＶ  Ｃキャプシドタンパク質を含有する組成物を投与することを含む、ＨＲＶ感染の処置または予防に関する。
【００６９】
初期のＨＲＶ感染は、後の幼児期の喘息発症と関連している可能性がある。したがって、特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される組成物を２、３、４、５または６ヶ月未満の子供、または２ヶ月〜６ヶ月、６ヶ月〜１才または１歳を超える子供に投与することを含む、喘息の予防を企図する。
【００７０】
特定の実施形態では、本開示は、組換えにより産生されたキャプシドキメラＨＲＶ、すなわち異種タンパク質をコードするＨＲＶ  ＲＮＡから産生される、例えば、少なくとも１つのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３またはＶＰ１キャプシドタンパク質がＨＲＶの第１の血清型の配列であり、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび／または３Ｄなどの少なくとも１つの非キャプシドタンパク質が第２の血清型の配列であり、第１および第２の血清型は異なっていて、同じ血清型ではなく、例えばＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１および２ＡはＨＲＶ−Ａ２の血清型であり、残りのタンパク質はＨＲＶ−Ａ１６またはＨＲＶ−Ａ８０であるものが企図される。
【００７１】
特定の実施形態では、本明細書に開示された組成物のいずれかは、アバカビル、アシクロビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリジェン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビル、シドフォビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、フォスカーネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル（ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩ型、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル、オセルタミビル（タミフル）、ペグインターフェロンα−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン、サキナビル、スタブジン、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル（バルトレックス）、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジンザルシタビン（ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ  ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ザナミビル（リレンザ）、ジドブジンおよび／またはバペンダビル、その誘導体または塩のような他の抗ウイルス剤を含み得る。
【００７２】
Ｂｉｏｔａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、ヒトライノウイルス感染症の症候を有する喘息の成人におけるバペンダビルの使用を研究している。Ｍａｔｚ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１８７，２０１３：Ａ５４９７。バペンダビル（３−エトキシ−６−（２−（１−（６−メチルピリダジン−３−イル）ピペリジン−４−イル）エトキシ）ベンゾ［ｄ］イソオキサゾール）は、抗ウイルス活性を有するキャプシド結合剤である。その作用機序は感染サイクルの初期段階を妨げるものであると考えられている。
【００７３】
特定の実施形態では、本明細書に開示される任意の組成物は、本明細書に開示する任意の方法であって他の抗ウイルス剤、例えば、バペンダビル、その誘導体または塩を組み合わせて投与する方法に使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される、死滅、不活性化ウイルス、弱毒化ウイルス、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１タンパク質、ＨＲＶ血清型ならびに／または組換えＨＲＶを含む組成物を、バペンダビルまたはその誘導体または塩などの他の抗ウイルス剤と組み合わせて投与することによる、中等度から重度の喘息および慢性閉塞性肺疾患を含み、任意選択によりＨＲＶに感染した基礎呼吸器疾患を有する患者の予防または処置に関する。
【００７４】
ウイルスの定量
ＴＣＩＤ５０は５０％組織培養感染用量を指す。これは感染性ウイルス力価の標準的指標である。この終点希釈アッセイは、接種した組織培養細胞の５０％において細胞変性効果（ＣＰＥ）を生むのに必要なウイルスの量を定量する。組織培養との関連で使用する場合、宿主細胞をプレーティングし、段階希釈したウイルスを加える。インキュベーション後、細胞死（すなわち、感染細胞）の割合を手動で観察し、ウイルス希釈ごとに記録し、結果を用いて得られるＴＣＩＤ５０を数学的に計算する。リード・ミュンヒ（Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ）法［Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ，１９３８，２７：４９３］を用いてＴＣＩＤ５０終点力価を計算することができる。手短に言えば、ＴＣＩＤ５０法によると、段階希釈ウイルスによって感染させた組織培養細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）のプレートからウイルス陽性ウェルの総数を加えることができ、そのデータを終点（ここで組織培養感染用量は５０％）を表す力価に変換できる。計算には次の式を使用する。
ｉ．比例距離＝
（５０％を超える希釈時の％ＣＰＥ）−（５０％）
（５０％を超える希釈時の％ＣＰＥ）−（５０％未満の希釈時の％ＣＰＥ）
ｉｉ．−Ｌｏｇ＝５０％を超える希釈のＣＰＥ比（すなわち、１０−３は−３となる）
ｉｉｉ．（（ＰＤ）＋（−ｌｏｇ（希釈間隔））
ｉｖ．ＴＣＩＤ５０＝１０（ｉｉ＋ｉｉｉ）
【００７５】
用法および用量
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるように、予防的または治療的に有効な量の１または複数のＨＲＶワクチンを含む組成物に関する。ＨＲＶワクチンの混合物は、同じ医薬組成物（単一製剤）または別個の医薬組成物（別個の製剤）中に存在してもよく、それらは同時にまたは異なる時間に投与される。上記組成物は、様々な薬物送達系での使用のために処方することができる。１種以上の生理学的に許容される賦形剤または担体も、適切な製剤のために、組成物に含めることができる。ウイルスは、凍結乾燥された形態であっても、または生理学的に適合性のある溶液または緩衝液、例えば生理食塩水または水に溶解されていてもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに記載されているように、標準的な調製および製剤方法を使用することができる。
【００７６】
ワクチンの使用のために、本開示に従って産生されたウイルスをワクチン製剤に直接、または必要に応じ、当業者に周知の凍結乾燥手順を用いて凍結乾燥して使用することができる。凍結乾燥されたウイルスは、典型的には約４℃で維持される。使用の準備ができれば、凍結乾燥されたウイルスは、以下にさらに記載するように、アジュバントを含むまたは含まない安定化溶液、例えば生理食塩水またはＳＰＧ、ＭｇおよびＨＥＰＥＳを含む溶液中で戻される。
【００７７】
改変された、弱毒化された、不活性化されたウイルス、または組換えウイルスキャプシドは、生理学的に許容される担体および／またはアジュバントとともに宿主に導入され得る。有用な担体は当該技術分野において周知であり、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが含まれる。得られた水溶液はそのまま使用するために容器へ封入してもよいし、または凍結乾燥し、上記のように当該凍結乾燥製剤を投与前に滅菌溶液と組み合わせてもよい。上記組成物は、ｐＨ調整および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤などの生理学的条件を近似させるのに必要な薬学的に許容される補助剤、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどを含み得る。許容されるアジュバントには、フロイント不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンが含まれる。
【００７８】
組成物は、予防的および／または治療的処置のための鼻腔内、非経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、経口または局所（ｌｏｃａｌ）投与を意図する。典型的には、組成物は、鼻腔内（例えば、エアロゾル吸入または点鼻薬）、非経口（例えば、筋肉内、皮下、または静脈内注射）、経口摂取、または局所適用または関節内注射によって投与される。追加の投与経路には、眼、脈管内、眼窩内、直腸または局所投与に加え、血管内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、脳室内、髄腔内投与が含まれる。持続放出投与はまた、蓄積注射または浸食性のインプラントならびにコンポーネントのような手段によって本開示に具体的に含まれる。したがって、本開示は、許容される担体、好ましくは水性担体、例えば水、緩衝化水、生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解または懸濁された上記薬剤を含む粘膜または非経口投与用の組成物を提供する。上記組成物は、生理学的条件を近似させるのに必要なｐＨ調整および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、界面活性剤などのような、薬学的に許容される補助剤を含み得る。
【００７９】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してもよく、滅菌濾過してもよい。得られた水溶液はそのままで使用するために容器へ封入してもよいし、または凍結乾燥し、当該凍結乾燥製剤を投与前に滅菌水性担体と組み合わせてもよい。上記製剤のｐＨは、典型的には３〜１１であり、例えば５〜９、６〜８、または７〜８、例えば７〜７．５である。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封パッケージなどの、上記の１つまたは複数の薬剤の一定量をそれぞれ含む複数の単回投与単位で包装することができる。組成物はまた、投与のために戻された１または複数の凍結乾燥形態の活性成分を含むことができる。
【００８０】
ワクチンの有効量を含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。予防的適用において、ＨＲＶ感染に対し感染性が高まっている対象（例えば、ヒト被験体）に組成物を投与することができる。本開示の組成物は、臨床的または準臨床的疾患の発症を遅らせる、軽減する、または予防するのに十分な量で対象（例えば、ヒト）に投与される。治療用途では、組成物は、既にＨＲＶ感染症に罹患している患者（例えば、ヒト）に対し、感染症およびその合併症の症状を治癒または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。この目的を達成するのに十分な量は、「治療的有効量」と定義される。適切な投薬量および投薬計画の決定は、当業者によって容易に決定され得る。この使用に有効な量は、疾患または状態の重症度および患者の体重および全身状態に依存し得るが、一般的に、患者１人１用量あたり約０．５ｍｇ〜約３０００ｍｇの範囲の薬剤である。
【００８１】
ワクチンは、１回のみまたは初回免疫／追加免疫レジメンで投与することができる。初回投与および追加投与のための適切なレジメンは、初回投与の後の１回または複数回の毎時間、毎日、毎週、または毎月の間隔での反復投与に代表される。本開示の組成物中に存在する薬剤の総有効量は、ボーラスとして、または比較的短期間にわたる注入によって、１用量として哺乳動物に投与することができ、または分割処置計画を用いて、複数用量をより長期間にわたって投与することができる（例えば、４〜６、８〜１２、１４〜１６または１８〜２４時間毎、または２〜４日、１〜２週間毎、１ヶ月に１回）。
【００８２】
本開示の組成物中に存在し、哺乳動物（例えば、ヒト）に適用される本開示の方法において使用される１以上の薬剤の治療上有効量は、当業者によって、当該哺乳動物の年齢、体重、免疫系の完全性および状態における個体差によって決定される。本開示の薬剤は、有効量の対象（例えば、ヒト、マウス、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、またはブタ）、家庭用ペット（例えば、ネコまたはイヌ）などの哺乳類）に有効量、すなわち処置対象に好ましい結果（例えば、感染性個体におけるＨＲＶ感染の予防または感染した個体における症状の軽減）をもたらす量で投与される。そのような治療上有効な量は、当業者によって経験的に決定され得る。
【００８３】
本開示のワクチンは、処置に対する他のアプローチ（例えば、小分子ベースのアプローチ）と同様、他のワクチン接種アプローチと組み合わせて使用することができる。例えば、ウイルスは、同じまたは異なる抗原を含む他の組換えワクチンと組み合わせて投与することができる。本開示の併用方法は、本開示のワクチンを他の形態の抗原と同時投与することを含み得る。あるいは、本開示のワクチンは、他のアプローチ（例えば、サブユニットまたはＨＢｃアプローチ（ＨＢｃ−Ｍ２ｅ；Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１０３：１７３−１７６，２００４；国際公開第２００５／０５５９５７号パンフレット；米国特許出願公開第２００３／０１３８７６９Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１４６５２４Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００７／００３６８２６Ａ１号明細書）と、プライム−ブースト手法において、本開示のワクチンまたは他のアプローチを初回免疫（プライム）として使用し、続いて他のアプローチを追加免疫（ブースト）として、またはその逆で、組み合わせて使用することができる。さらに、本開示は、本開示のワクチンを初回免疫（プライム）剤および追加免疫（ブースト）剤の両方として用いるプライム−ブースト手法を含む。
【００８４】
本開示のワクチンは、標準的な方法を用いて、哺乳動物（例えば、ヒト対象）などの対象に投与することができる。鼻腔内投与の場合、組成物は、点鼻薬の形態で、またはエアゾール化または噴霧化された製剤の吸入によって投与することができる。
【００８５】
本開示の組成物は、生ワクチンもしくは死滅ワクチンまたは組立てられたキャプシドタンパク質として、ヒトなどの対象に投与することができる。生弱毒化ワクチンは、当業者に公知の方法を用いて鼻腔内投与することができる（例えば、Ｇｒｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒ．Ｍｅｄ．１５６：６０９−６１６，１９９７を参照）。適切な投薬量および投薬計画は、当業者によって容易に決定され得る。一例としては、用量範囲は、例えば、１用量あたり１０４〜１０９ＴＣＩＤ５０であってもよい。ワクチンは、有利には、単回投与で投与することができるが、当業者が必要であると判断した場合には、追加免疫を行うこともできる。不活性化ワクチンに関して、そのウイルスは、例えば、ホルマリンまたはＵＶまたはβ−プロピオラクトン処理で死滅させることができ、１用量あたり約１０４〜９ＴＣＩＤ５０相当量で、任意選択により適切なアジュバント（例えば、アルミニウム）と共に、鼻腔内または筋肉内に投与することができる。そのようなアプローチにおいて、１より多い（例えば、２〜３）用量を投与することが有利であり得る。組換え産生キャプシドタンパク質は、任意選択により適切なアジュバントと共に、１回またはそれ以上の用量を用いて、鼻腔内または筋肉内に同様に投与することができる。
【００８６】
アジュバント
ワクチン使用のため、任意選択により、当業者に知られているアジュバントを使用することができる。鼻腔内投与の場合、キチン微粒子（ＣＭＰ）を使用することができる（Ａｓａｈｉ−Ｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ８：２７０６−２７１４，２００６；Ｏｚｄｅｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３６：９６０−９６８，２００６；Ｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３２：１７９４−１８００，２００２）。粘膜経路（例えば、鼻腔内または経口経路）を介する投与に使用するのに適した他のアジュバントには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＬＴ）の熱不安定性毒素またはその変異誘導体が含まれる。不活性化ウイルスおよびキャプシドタンパク質の場合、例えばアルミニウム化合物（例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはヒドロキシリン酸アルミニウム化合物）、リポソーム製剤、合成アジュバント（例えばＱＳ２１）、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡまたはポリホスファジンを含む非経口アジュバントを使用することができる。さらに、アジュバント活性を有するサイトカインをコードする遺伝子をベクターに挿入することができる。したがって、免疫応答を増強するワクチンを産生するため、または細胞、体液または粘膜の反応に対してより特異的に向けられた免疫を調節するため、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３またはＩＬ−５などのサイトカインをコードする遺伝子を、外来抗原遺伝子と一緒に挿入できる。あるいは、サイトカインは、同時にまたは逐次的に、周知の手段（例えば、直接接種、裸（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ、ウイルスベクター内など）によって組換えワクチンウイルスとは別に送達することができる。
【実施例】
【００８７】
ＨＲＶワクチンを開発する際の主要な障害は、血清型の数（＞１００）である。部分的には、本明細書中に開示される方法を使用して、ＨＲＶ血清型の数の問題が克服され得ることが発見された。ワクチンを組み合わせること（多価性）に関する一つの懸念は、ユニークな抗原が互いに競合するか、または相互に干渉することである。これは、１価、３価、５価、７価または１０価の組成物（図１および２）で与えられた場合、不活性化ＨＲＶ血清型がマウスにおいて等しく免疫原性であったため、そうではないということが判明した。さらに、１０のＨＲＶ高力価参照血清型株（表２）を共に混合してＨＲＶＶ−１０を生成する。ＨＲＶＶ−１０は、１０のＨＲＶ血清型に対してマウスの血清ｎＡｂを誘発する（図３）。
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【００８８】
ＨＲＶストック
ＨＲＶプロトタイプ株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中のＨ１−ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）で増殖させた。細胞変性効果のピーク時に、培地中で細胞を掻き取り、超音波処理し、細胞残渣を清澄化し、５０ｍＬの上清を分取し、液体窒素中で急速凍結した。感染性は、９６ウェルプレート中の感染したＨ１−ＨｅＬａ細胞のクリスタルバイオレット染色によって滴定した。継代＃１（Ｐ１）ストックのＴＣＩＤ５０力価は、リード・ミュンヒ（Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ）終点希釈を用いて計算した。
【００８９】
Ｐ１ストックを有する１０のＴ−１８２ｃｍ２フラスコ中でフェノールレッドを含まない培地中のＨ１−ＨｅＬａ細胞を感染させることにより、濃縮力価のＰ２ストックを生成する。感染のピーク前に、各フラスコから４５ｍＬの培地を捨て、残りの５ｍＬ中で細胞を掻き取り、超音波処理し、残渣を清澄化し、５ｍＬの上清を２つの２５ｍＬの分取したサンプル中にプールし、急速冷凍する。濃縮ＨＲＶ−Ａ１６  Ｐ２ストックをこの方法により生成し、Ｐ１ストックの１０倍に増加した力価が得られた。
【００９０】
１９６４年にＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓによって産生され、Ｃｈａｎｏｃｋによって試験された１価ＨＲＶワクチンは、ボランティアでの同種株チャレンジに対し効果を奏したが、これは１用量あたり約１０５．５ＴＣＩＤ５０相当量の不活性化ＨＲＶ−Ａ１３を含み、このワクチンはヒト被験者においてｎＡｂを誘導した［Ｂｕｓｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８：１６９］。失敗した２つの１０価不活性化ＨＲＶワクチンは、１０の血清型の１用量あたり１０３．３ＴＣＩＤ５０相当量の平均インプット力価を有していた［Ｈａｍｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９７５，１３２（６）：６２３−９］。一価または十価のヒトワクチンのいずれもアジュバント化されなかった。
【００９１】
ＨＲＶ  ＢＡＣ
ＨＲＶ−Ａ１６のｃＤＮＡクローン（図１）は、ｃＤＮＡおよび分子アセンブリの商業的合成によって生成された。ＨＲＶゲノムおよびポリ（Ａ）テールは、７１９９ｂｐのｃＤＮＡによってコードされる。転写は、Ｔ７プロモーター（５’Ｔ７プロモーター−リボザイム−ＨＲＶ−Ａ１６−リボザイム−−Ｔ７ターミネーター−３’）によって導かれる。インビトロＴ７転写は、リボザイム切断のために予測される内在性末端を有する７．２ｋｂのＲＮＡを生じる。ＨＲＶキャプシドタンパク質（ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１）は、コンストラクト中、ＳａｃＩおよびＣｌａＩ制限部位に隣接している（図１）。任意のＨＲＶ型に対して、このキャプシド領域を表す合成されたｃＤＮＡを有することができる。組換えキャプシドキメラＨＲＶ、例えばＨＲＶ−Ａ２のＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４および２Ａタンパク質ならびにＨＲＶ−Ａ１６またはＨＲＶ−Ａ８０の２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｃおよび３Ｄタンパク質をコードするＨＲＶ−ｃａｐ２／１６を生成し回収することができる。
【００９２】
インビボ試験
マウスの４つの群に、１つのＨＲＶ血清型＋ミョウバン、３つのＨＲＶ血清型＋ミョウバン、５つのＨＲＶ血清型＋ミョウバン、または７つのＨＲＶ血清型＋ミョウバン（表４）のいずれかを与えた。ミョウバンと混合する前に、ホルムアルデヒド（１：４０００比）を用いて３７℃で７２時間、ＨＲＶ株を完全に不活性化した。マウス１匹あたり１００マイクロリットルのワクチンを筋肉内注射した。ＨＲＶＶ−１０の各用量は、９マイクロリットルの不活性化された各ウイルスストック（表２）に加え、１０マイクロリットルのアルハイドロゲルすなわち２％水酸化アルミニウムコロイドアジュバントを含んでいた。
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【００９３】
０日目にすべてのマウスに不活性化ＨＲＶ＋ミョウバンを筋肉内経路で接種し、１８日目に血清を採取した。次に、終点中和抗体力価を、ｎＡｂアッセイにおいてＨＲＶを用いて血清中で測定した。全ての免疫されたＨＲＶ株（ＨＲＶ−Ａ１３を除く）に対し中和抗体力価が観測された。
【００９４】
５０価の不活性化されたライノウイルスワクチンはアカゲザルにおいて広く免疫原性である
免疫原性を試験するためにＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。ＨＲＶをＨ１−ＨｅＬａ細胞中で増殖させ、ホルマリンを使用して感染性を不活性化した。未処置マウス由来の血清は、ＨＲＶ−Ａ１６に対する検出可能なｎＡｂを有していなかった。ミョウバンアジュバントは、不活性化されたＨＲＶ−Ａ１６（図３）の筋肉内注射によって誘発されるｎＡｂ反応を増強した。不活性化ＨＲＶ−Ａ１６によってまたは３タイプの３価ワクチン（ＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ３６およびＨＲＶ−Ａ７８）に対して誘発されたｎＡｂ反応において、（１価、３価、５価、７価および１０価を比較して）価数の効果はなかった（図３）。不活性化前のインプットウイルスの５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）力価（不活性化ＴＣＩＤ５０）が提供される。
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【００９５】
Ｈａｍｏｒｙらは、２つの異なる１０価不活性化ＨＲＶ調製物が、ｎＡｂ力価を受容対象におけるインプットウイルス型の３０〜４０％だけ誘導することを報告した。Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １３２，６２３−６２９（１９７５）。しかしながら、不活性化前のウイルスのインプット力価は、１０１．５〜１０５．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬの範囲であり、次いでこれらを１０倍に希釈して１０価の１．０ｍｌ用量を複数作製し、初回免疫および追加免疫としてアジュバントなしで筋肉内投与した。インプット抗原投与量が低いと、１０価不活性化ＨＲＶに対するｎＡｂ反応不良の原因となる可能性がある。Ｈａｒｍｏｎｙの１０価ワクチンは、入手可能なＨＲＶ型を用い可能な限り近づけてワクチン１用量あたりの不活性化ＴＣＩＤ５０１０１〜１０５で再構成し、１用量あたりの不活性化ＴＣＩＤ５０＞１０５〜＞１０７のインプット力価の範囲を有する同じ型の１０価ワクチンと比較した。Ｈａｍｏｒｙのワクチンは、初回免疫ワクチン接種後に検出可能なｎＡｂが得られなかった。追加免疫ワクチン接種後、ｎＡｂは、最も高いインプット力価を有する５つの型に検出された（図３）。高い力価のワクチンは、初回免疫ワクチン接種後に１０タイプのうち５つに、追加免疫後に１０タイプすべてにｎＡｂが得られた（図４）。
【００９６】
追加免疫ワクチン接種後、このモデルにおけるｎＡｂ誘導について、ワクチン１用量あたり１０４不活性化ＴＣＩＤ５０の閾値が存在するようであった（図４ｂ）。この力価より上では、インプット負荷とｎＡｂ誘導との間に相関はなかった。
【００９７】
人に使用される注射可能なワクチンは、一般に０．５ｍｌの用量で投与される。マウスにおける筋肉内注射によるワクチン容量は０．１ｍＬであった。マウスにおいて、０．１ｍＬのＨＲＶワクチンあたり２５価が、スケーラブルプロトタイプとして試験された。２５価の不活性化ＨＲＶワクチンは、用量調整に対応するため、１０価組成物よりも１用量１タイプあたり７．４倍低い不活性化ＴＣＩＤ５０平均を有していた。
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【００９８】
１０価不活性化ＨＲＶワクチンは、初回免疫および追加免疫後、インプットタイプの１００％までｎＡｂを誘導した（図５ａ）。１０価不活性化ＨＲＶによって誘発されたｎＡｂは、追加免疫後２０３日で持続していた。２５価不活性化ＨＲＶの初回免疫ワクチン接種は、２５種のウイルス型のうち１８種（７２％）にｎＡｂを誘導し、２５価の追加免疫は、２５種のうち２４種（９６％）に対してｎＡｂを生じた（図８ｂ）。初回免疫＋追加免疫から生じる平均ｎＡｂ力価は、１０価で２７であり、２５価で２６．８であった。上記データは、簡単なワクチン接種法を用いて多様なＨＲＶ型の広範な中和を実証している。
【００９９】
ワクチンの価数を増加させるため、アカゲザル（ＲＭ：ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）および１．０ｍｌの筋肉注射ワクチン量が選択された。２匹のＲＭに２５価不活性化ＨＲＶをワクチン接種し、２匹のＲＭに５０価不活性化ＨＲＶをワクチン接種した。ＲＭ  ＡおよびＲＭ  Ｂの免疫前血清は、２５価ワクチンに含まれる２５のＨＲＶ型に対して検出可能なｎＡｂを有していなかった。１用量あたりの不活性化ＴＣＩＤ５０力価は、マウスよりもＲＭで高かった。
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【０１００】
２５価ワクチンは、初回免疫ワクチン接種後にｎＡｂをインプットウイルスの９６％（ＲＭ  Ａ）および１００％（ＲＭ  Ｂ）に誘導した。５０価ワクチンは、初回免疫ワクチン接種後にｎＡｂをインプットウイルスの９０％（ＲＭ  Ｃ）および８２％（ＲＭ  Ｄ）に誘導した。ＲＭにおける初回免疫ワクチン接種後のｎＡｂの幅は、マウスで観測されたものよりも優れていた。これは、動物種の差異および／またはＲＭワクチンにおける不活性化ＴＣＩＤ５０インプット力価がより高いことによる可能性がある。追加免疫ワクチン接種後、２５価ＨＲＶワクチン接種されたＲＭにおいて、ウイルス型の１００％に対し血清ｎＡｂ力価があり（図６Ａ）、５０価ＨＲＶワクチン接種されたＲＭにおいて、ウイルス型の９８％（５０のうち４９）に対し血清ｎＡｂ力価があった（図６Ｂ）。ＲＭにおける初回免疫＋追加免疫から得られた平均ｎＡｂ力価は、２５価については２９．３であり、５０価については２８．６であった。非ワクチン型の１０種に対して２５価ワクチンによって誘発されたｎＡｂが最小であったため、ｎＡｂ反応は型特異性であり、交差中和ではなかった。５０価不活性化ＨＲＶワクチンに対するｎＡｂ反応は、ＲＭにおいて広範かつ強力であった。
【０１０１】
これらの実験に基づき、１用量１タイプあたり１０４〜５不活性化ＴＣＩＤ５０が有用であると推定される。したがって、１ｍｌあたりのＨＲＶストック力価≧１０７ＴＣＩＤ５０が、ミョウバンアジュバントを含有する０．５ｍｌ用量の潜在的な８３価ＨＲＶ  Ａ製剤に有用であろう。ワクチン接種で使用されたＨＲＶストックは、Ｈ１−ＨｅＬａ細胞で産生された。
【０１０２】
Ｈ１−ＨｅＬａおよびＷＩ−３８において、１０のＨＲＶ型の感染性収量を比較したが、これはワクチン製造に適している可能性がある。ＷＩ−３８細胞からも十分な収量が得られた。
【０１０３】
原料および方法
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）からＨ１−ＨｅＬａ（ＣＲＬ−１９５８）およびＷＩ３８（ＣＣＬ−７５）細胞を得、リヒター修飾（Ｒｉｃｈｔｅｒ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をした、フェノールレッド（ＭＥＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含まない、１０％ウシ胎児血清を添加した最小必須培地で培養した。ＨｅＬａ−Ｈ１細胞を、ＬｏｏｋＯｕｔ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ検出キット（Ｓｉｇｍａ）を用いて試験し、これらはマイコプラズマ陰性であった。ＨＲＶ−Ａ７（ＶＲ−１６０１）、ＨＲＶ−Ａ９（ＶＲ−１７４５）、ＨＲＶ−Ａ１１（ＶＲ−１５６７）、ＨＲＶ−Ａ１３（ＶＲ−２８６）、ＨＲＶ−Ｂ１４（ＶＲ−２８４）、ＨＲＶ−Ａ１６（ＶＲ−２８３）、ＨＲＶ−Ａ１９（Ｖ４−１１２９）、ＨＲＶ−Ａ２４（ＶＲ−１１３４）、ＨＲＶ−Ａ２９（ＶＲ−１８０９）、ＨＲＶ−Ａ３０（ＶＲ−１１４０）、ＨＲＶ−Ａ３１（ＶＲ−１７９５）、ＨＲＶ−Ａ３２（ＶＲ−３２９）、ＨＲＶ−Ａ３６（ＶＲ−５０９）、ＨＲＶ−Ａ３８（ＶＲ−５１１）、ＨＲＶ−Ａ４０（ＶＲ−３４１）、ＨＲＶ−Ａ４１（ＶＲ−１１５１）、ＨＲＶ−Ａ４９（ＶＲ−１６４４）、ＨＲＶ−Ａ５３（ＶＲ−１１６３）、ＨＲＶ−Ａ５６（ＶＲ−１１６６）、ＨＲＶ−Ａ５８（ＶＲ−１１６８）、ＨＲＶ−Ａ５９（ＶＲ−１１６９）、ＨＲＶ−Ａ６０（ＶＲ−１４７３）、ＨＲＶ−Ａ６４（ＶＲ−１１７４）、ＨＲＶ−Ａ６６（ＶＲ−１１７６）、ＨＲＶ−Ａ６８（ＶＲ−１１７８）、ＨＲＶ−Ａ７５（ＶＲ−１１８５）、ＨＲＶ−Ａ７６（ＶＲ−１１８６）、ＨＲＶ−Ａ７７（ＶＲ−１１８７）、ＨＲＶ−Ａ７８（ＶＲ−１１８８）、ＨＲＶ−Ａ８０（ＶＲ−１１９０）、ＨＲＶ−Ａ８１（ＶＲ−１１９１）、ＨＲＶ−Ａ８５（ＶＲ−１１９５）、ＨＲＶ−Ａ８８（ＶＲ−１１９８）、ＨＲＶ−Ａ８９（ＶＲ−１１９９）、ＨＲＶ−Ａ９６（ＶＲ−１２９６）およびＨＲＶ−Ａ１００（ＶＲ−１３００）プロトタイプ株は、ＡＴＣＣから購入した。ＨＲＶ−Ａ１Ｂ、ＨＲＶ−Ａ１０、ＨＲＶ−Ａ２１、ＨＲＶ−Ｂ２６、ＨＲＶ−Ａ３３、ＨＲＶ−Ａ３４、ＨＲＶ−Ａ３９、ＨＲＶ−Ａ４５、ＨＲＶ−Ａ５０、ＨＲＶ−Ａ５１、ＨＲＶ−Ａ５４、ＨＲＶ−Ａ５５、ＨＲＶ−Ａ９４株は、疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）から入手した。この研究におけるＨＲＶは、Ａ種であり、ＨＲＶ−Ｂ１４を除き、Ａ種を表す。
【０１０４】
ＨＲＶストックは、Ｈ１−ＨｅＬａ細胞において生成された。約０．５ｍｌのＨＲＶを、Ｔ−１８２フラスコ中のサブコンフルエントなＨ１−ＨｅＬａ単層細胞上に接種した。ロッキングしながら室温で１時間吸着させた後、ＨＲＶ感染培地（２％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、１Ｘ非必須アミノ酸［Ｇｉｂｃｏカタログ１１１４０−０５０］を添加したＭＥＭ）５０ｍｌを加え、感染後１〜３日で単層が細胞変性効果（ＣＰＥ）に完全に関与したと思われるまで、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内、３２℃で感染を進行させた。細胞を掻き取り、細胞および培地（約５０ｍｌ）を２つのあらかじめ冷却した５０ｍｌコニカルポリプロピレンチューブに移し、氷上に保ちながら、各懸濁液を、直径１／２インチのホーンディスラプター（ｈｏｒｎ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）とリングスタンドに固定された直径１／４インチのテーパーマイクロチップ（ｔａｐｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｔｉｐ）を備えたＳｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  ５００（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて超音波処理した。超音波処理は、耳保護をして、閉鎖空間で、１０％振幅、１秒オン／１秒オフ間隔、および物質１ｍｌあたり１パルスでオペレータにより行われた。超音波処理は、凍結融解より高い力価を生じた。９３１×ｇで１０分間の遠心分離により懸濁液を清澄化した。上清を冷結保存バイアルに移し、液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。Ｈ１−ＨｅＬａおよびＷＩ−３８細胞におけるＨＲＶ収率を比較するため、Ｔ−７５フラスコ中のサブコンフルエントな細胞を、０．１  ＴＣＩＤ５０／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、２０ｍｌの培地を破棄し、残りの５ｍｌ中の細胞を掻き取り、超音波処理した。ストックについては、連続希釈したサンプルで９６ウェルプレート中のサブコンフルエントなＨ１−ＨｅＬａ細胞を感染させ、感染後６日間、０．１％クリスタルバイオレット／２０％メタノールで細胞を染色し、ＣＰＥについてウェルを点数化し、次の文献で報告されたリード・ミュンヒの方法を用いて終点力価を算定して、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ力価が求められた：“Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒ  ｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．”Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｇ  ２７，４９３−４９７（１９３８）。
【０１０５】
ＨＲＶストックを上記のようにＨ１−ＨｅＬａ細胞単層から回収し、低速で短時間遠心分離して大きい細胞残渣を除去し（９３１×ｇ、１０分、４℃）、清澄化した。アフィニティークロマトグラフィーにより粗製ウイルスストックから過剰のアルブミンを除去するために、メーカー仕様に従ってＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＨｉＴｒａｐ  Ｂｌｕｅ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。続いて、ＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過画分を充填して通し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりウイルス調製物を精製した。ＨｉＴｒａｐ  Ｂｌｕｅ  ＨＰおよびＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００からの通過画分を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて捕捉した。ＳＥＣからの通過画分を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で一晩透析し、次いでＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＸＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填し、イオン交換クロマトグラフィーによって画分に分離した。ウイルス含有画分を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）および塩化ナトリウム勾配を用いるＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて溶出させた。２８０ｎＭで高い吸収ピークを示す画分を集め、ＴＣＩＤ５０終点希釈アッセイによってウイルス力価を分析し、画分純度を銀染色（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で可視化した。高ウイルス力価および高純度のＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ３６およびＨＲＶ−Ａ７８の画分を、以下に記載するようにホルマリン不活性化のために組み合わせた。
【０１０６】
若い成体（３〜５ｋｇ、２〜４歳、雌２匹、雄２匹）のインドアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ；ＲＭ）を２つのワクチン群（２５価および５０価）に、１群あたり雄１匹および雌１匹で、非盲検式に割り当てた。免疫化の前に、０．０２５％ホルマリンの添加、続いて３７℃で７２時間の攪拌下でのインキュベーションにより、全てのＨＲＶ型を不活性化した。感染性の完全な不活性化は、Ｈ１−ＨｅＬａ細胞における終点ＴＣＩＤ５０滴定によって確認された。この方法によるホルマリンの不活性化は、β−プロピオラクトンによる別の不活性化方法よりもマウスにおいてより大きな免疫原性をもたらし、ホルマリン不活性化が抗原決定因子を保持することを示唆した。マウスに、メーカーの説明書に従って１００μｇの２％アルヒドロゲルアジュバント（水酸化アルミニウム湿潤ゲル懸濁液、ミョウバン）（ＳｉｇｍａカタログＡ８２２２またはＩｎｖｉｖｏｇｅｎカタログｖａｃ−ａｌｕ）と混合した不活性化ＨＲＶ株で、筋肉内注射によりワクチン接種した。マウス１匹あたりの総用量は１００μＬであり、大腿にそれぞれ５０μＬ投与した。その時点でマウスに２回目の同一のワクチン接種を行った（追加免疫）。ＲＭに、５００μｇの２％アルヒドロゲルアジュバントと混合した不活性化ＨＲＶ株で、筋肉内注射によりワクチン接種した。ＲＭ１匹あたりの総容量は１ｍｌであり、片脚に投与した。ＲＭは４週間で同一のワクチン接種により追加免疫された。
【０１０７】
マウスでは、顎下静脈から末梢血をマイクロ遠心チューブに集めた。サンプルを室温で２０分間インキュベートして凝固させた。試験管を７５００×ｇで１０分間遠心分離して血清を分離した。各群のマウスから血清サンプルをプールし、使用するまで−８０℃で保存した。ＲＭに関する採血は、空腹時の個体に対しケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）またはテラゾール（４ｍｇ／ｋｇ）麻酔下で行った。ケタミンまたはテラゾールによる麻酔の後、ＲＭの大腿静脈から採血した。血清分離管（ＳＳＴ）に血液を集めた後、サンプルを室温で３０分間インキュベートした。試験管を２５００×ｇで１５分間遠心分離して血清を分離した。ＲＭ個体からの血清サンプルを、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１０８】
Ｈ１−ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間で８０〜９０％コンフルエンスに達した。熱不活性化（５６℃、３０分）血清サンプルをＭＥＭで連続的に２倍希釈し、試験する各タイプのＨＲＶ１ｍＬにつき、５００ＴＣＩＤ５０まで、等量で加えた。ウイルスおよび血清混合物を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、５０μＬの血清−ウイルス混合物を、９６ウェルプレート中のＨ１−ＨｅＬａ細胞単層上に三重に移し、プレートを２，０９５×ｇで４℃で３０分間スピノキュレートした。各タイプについて、インプット５００ＴＣＩＤ５０を試験するため、無血清対照を加えた。標準として、各アッセイにおいて、ＨＲＶ−Ａ１６に対するプールされたＨＲＶ−Ａ１６抗血清を試験した。スピノキュレーションの後、ＨＲＶ感染培地１５０μＬを各ウェルに添加した。９６ウェルプレートを３２℃および５％ＣＯ２で６日間インキュベートし、次いで上記のようにクリスタルバイオレットで染色した。ＣＰＥの存在または非存在についてウェルを点数化した。中和抗体終点力価および９５％信頼区間を、リード・ミュンヒの方法によって決定した。９５％信頼区間は、１回のｎＡｂ試験中での３回の技術的複製の変異性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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