(57)【要約】  本発明は、バクテリオファージ粒子およびそのコレクションの表面上に環状ペプチドを提示する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示する方法において、
（ａ）前駆体環状ペプチドをコードする核酸配列を保有する宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）前記前駆体環状ペプチドの発現を引き起こすかまたは可能にするステップと；
（ｃ）前記前駆体環状ペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸残基を酵素により脱水するステップと；
（ｄ）システインまたはリジンへの前記１つまたは複数の脱水された残基の結合によって１つまたは複数の分子内結合を形成し、それにより環状ペプチドを形成するステップと；
（ｅ）前記宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生させるステップと
を含み、前記バクテリオファージ粒子は、前記表面上に前記環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着していることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記核酸配列は、バクテリオファージ粒子のコートタンパク質と、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列とをさらにコードすることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、前記宿主細胞は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに保有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２または３に記載の方法において、前記翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素は、ランチペプチドシンセターゼであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項２乃至４の何れか１項に記載の方法において、前記翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素は、ＬａｎＢ型デヒドラターゼ、ＬａｎＣ型シクラーゼ、および／あるいは二機能性ＬａｎＭ型酵素または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項２乃至５の何れか１項に記載の方法において、前記リーダー配列は、ＬａｎＡ前駆体ペプチドのリーダー配列であるか、ＬａｎＡ前駆体ペプチドに由来するリーダー配列であるか、またはＬａｎＡ前駆体ペプチドのコンセンサスモチーフを有するリーダー配列であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記リーダー配列は、ＬａｎＢ型デヒドラターゼ、ＬａｎＣ型シクラーゼ、二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素によって認識されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、前記１つまたは複数の脱水されたアミノ酸残基は、デヒドロアラニン（Ｄｈａ）またはデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の方法において、前記分子内結合は、チオエーテル架橋またはリジノアラニン架橋であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる核酸配列において、核酸は、
（ａ）前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質と；
（ｂ）翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列と；
（ｃ）前駆体環状ペプチドと
をコードし、
前記前駆体環状ペプチドをコードする前記核酸は、前記バクテリオファージ粒子の前記コートタンパク質のＣ末端に位置決めされ、
前記前駆体環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって分子内結合を形成することができることを特徴とする核酸配列。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸配列において、前記リーダー配列は、ＬａｎＡ前駆体ペプチドのリーダー配列であるか、ＬａｎＡ前駆体ペプチドに由来するリーダー配列であるか、またはＬａｎＡ前駆体ペプチドのコンセンサスモチーフを有するリーダー配列であることを特徴とする核酸配列。
【請求項１２】
ベクターにおいて、請求項１０または１１に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１３】
バクテリオファージ粒子において、請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法によって得られる、環状ペプチドをその表面上に提示することを特徴とするバクテリオファージ粒子。
【請求項１４】
請求項２１乃至２４の何れか１項に記載のバクテリオファージ粒子の多様なコレクションにおいて、前記バクテリオファージ粒子のそれぞれは、環状ペプチドの多様なコレクションから環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含むことを特徴とする多様なコレクション。
【請求項１５】
所望の特性を有する環状ペプチドを得る方法において、
（ａ）請求項２５に記載のバクテリオファージ粒子の多様なコレクションを提供するステップと；
（ｂ）前記多様なコレクションをスクリーニングし、かつ／または前記多様なコレクションから選択して、前記所望の特性を有する環状ペプチドを提示する少なくとも１つのバクテリオファージ粒子を得るステップと
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファージコートタンパク質のＣ末端においてバクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ペプチドは、環状環構造をとるポリペプチド鎖であり、複数の生物学的活性、例えば抗菌活性、免疫抑制活性、または抗腫瘍活性を有することが知られている。自然界に見出されるいくつかの環状ペプチドが診療所で用いられており、例えば抗細菌グラミシジンＳ、チロシジン、およびバンコマイシン、またはシクロスポリンＡが免疫抑制活性を有する。生物学的活性を有する天然の環状ペプチドによって促されて、遺伝的方法および合成方法の両方による人工環状ペプチドの開発に向けた努力がなされてきた。
【０００３】
環状構造を有する生体分子の新興クラスは、リボソーム合成されるペプチドである。これは、生物学的に活性なペプチドを形成するために、広範囲にわたる翻訳後修飾を必要とする。リボソーム合成されるほとんどの天然ペプチドは、リーダーペプチドおよびコアペプチドで構成される前駆体として翻訳される。リーダーは、認識配列として機能し、かつ酵素機構を動員して、コアペプチドの特定の残基に翻訳後修飾（ＰＴＭ）を導入する。
【０００４】
これにより、ヘテロ環化またはマクロ環化、脱水、アセチル化、グリコシル化、ハロゲン化、プレニル化、およびエピマー化等の翻訳後修飾は、そのようなペプチドの生物学的活性を出現させるだけでなく、このペプチドクラスの多くの典型的なメンバーに見出される優れた安定性に直接寄与するため、そのペプチドを薬物開発にとって魅力的な候補としている。
【０００５】
グラム陽性菌によって産生されて主にグラム陽性菌に作用する、リボソーム合成されて翻訳後修飾される固有の抗生ペプチドの群をランチペプチドおよびランチビオティックが形成する（総説について、Ｋｎｅｒｒ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｎｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２．８１：４７９−５０５参照）。天然のランチビオティック、例えばナイシンまたはサブチリンが十分に研究されており、食品業界において、乳製品、例えばチーズを製造して保存するのに商業的に用いられている。
【０００６】
抗菌活性を有するペプチドのサブクラスとしてのランチペプチドおよびランチビオティックは、チオエーテルアミノ酸、ランチオニン（Ｌａｎ）および３−メチルランチオニン（ＭｅＬａｎ）によって形成される分子内チオエーテル架橋または環を含有し、これらは、そのようなペプチドをタンパク質分解から保護して、耐熱性の増大を付与する。チオエーテル架橋の導入は、セリンまたはトレオニンの酵素による脱水で始まり、それぞれ不飽和デヒドロアラニン（Ｄｈａ）およびデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）に至った後、システインチオールの分子内マイケル付加が続き、ランチペプチドシンセターゼ（クラスＩについて、ＬａｎＢおよびＬａｎＣ、クラスＩＩについてＬａｎＭ、クラスＩＩＩについてＬａｎＫＣ、およびクラスＩＶについてＬａｎＬ）によって媒介される。クラスＩランチペプチドにおいて、セリン／トレオニンの脱水および以降の環化がそれぞれＬａｎＢ型デヒドラターゼおよびＬａｎＣ型シクラーゼによって実行される一方、クラスＩＩランチペプチドにおいて、単一の二機能性ＬａｎＭ型酵素は、両方の反応を実行する。興味深いことに、不飽和Ｄｈａは、化学反応性が高く、低刺激性の塩基性条件下でシステインまたはリジンの側鎖と容易に反応して、非立体選択的チオエーテル架橋およびリジノアラニン架橋がそれぞれ生じ得る。クラスＩＩＩおよびクラスＩＶのランチペプチドの生合成は、それぞれ多機能性ＬａｎＫＣおよびＬａｎＬ型酵素によって支持され、これらは、アミノ末端ホスホＳｅｒ／ホスホＴｈｒリアーゼドメイン、キナーゼ様中央ドメイン、およびカルボキシ末端ＬａｎＣ様ドメイン（シクラーゼ）によって特徴付けられる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１４，２９：５８−６６）。
【０００７】
ここ数年にわたり、ランチペプチド生合成の原則は、環状構造を有する人工生物活性ペプチドの発見および生成にますます適応した。
【０００８】
最初に、２００４年に、ランチペプチド合成酵素は、ＰＴＭ、例えばチオエーテル架橋を通常未修飾のペプチド中に導入して、ペプチドの安定性を向上させ、かつ／またはその活性を変えるのに有利に用いられ得ると提唱された（Ｋｕｉｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２２１７６−２２１８２）。国際公開第２００６／０６２３９８号パンフレットにおいて、従来のランチビオティック酵素複合体の一部ではない単離されたランチビオティックデヒドラターゼ、例えばＬａｎＢにより、注目するペプチドが宿主細胞中で脱水され得ることが示された。さらに、修飾チオエーテル架橋含有ペプチドが、その天然の宿主における専用のランチビオティックトランスポータ以外のタンパク質輸出系によって分泌され得ることが実証された。
【０００９】
後に、国際公開第２０１２／００５５７８号パンフレットにおいて、チオエーテル架橋含有ペプチドが、ランチビオティックの生合成および輸出機構を発現する宿主細胞（例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ））の表面によって容易に産生され、かつ表面上に提示され得ることが実証された。
【００１０】
より詳細には、国際公開第２０１２／００５５７８号パンフレットは、Ｎ末端ランチビオティックリーダー配列、デヒドロ残基含有ポリペプチドまたはチオエーテル含有ポリペプチドに翻訳後修飾されることになる注目するアミノ酸配列、およびＣ末端荷電膜アンカリングドメインを含む融合ペプチドをコードする発現ベクターを提供する。また、所望の活性を有する環化ペプチドについてスクリーニングするための提示ライブラリが示唆された。しかしながら、本来、ランチビオティックを産生することができるグラム陽性宿主細胞、特に乳酸菌上での提示のみが可能であった。
【００１１】
タンパク質輸出機構が異なるグラム陰性菌を必要とする、ファージディスプレイ等の当該技術分野において知られている他の提示系は、選択肢として考えられなかったため、先行技術において可能でなかった。
【００１２】
ファージディスプレイのストーリーは、繊維状ファージが、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）中に挿入される外来タンパク質フラグメントを許容し、およびまたファージ表面上にタンパク質フラグメントを示すという実証に基づいて、１９８５年に始められた（Ｓｍｉｔｈ，１９８５）。Ｌａｄｎｅｒは、その概念を、ファージの表面上に提示される（ポリ）ペプチドおよび／またはタンパク質のレパートリのスクリーニングに拡張し（国際公開第１９８８／０６６３０号パンフレット；国際公開第１９９０／０２８０９号パンフレット）、それ以来、ファージディスプレイは劇的な進歩を経て実質的な業績をもたらした。（ポリ）ペプチド／タンパク質ファージディスプレイライブラリを構築し、かつスクリーニングする種々のフォーマットが開発されており、多数の総説記事および学術論文がこれらの開発を包含および要約している（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｄｕｎｎ，１９９６；ＭｃＧｒｅｇｏｒ，１９９６）。ペプチドまたはタンパク質を繊維状バクテリオファージ表面に固定するために、ほとんどの場合、ファージコートタンパク質への遺伝的融合が使用される。好ましいのは、遺伝子ＩＩＩタンパク質（Ｐａｒｍｌｅｙ＆Ｓｍｉｔｈ，１９８８）またはそのフラグメント（Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、および遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）への融合である。ある場合において、遺伝子ＶＩが用いられ（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、最近では、遺伝子ＶＩＩおよび遺伝子ＩＸの組合せがＦｖフラグメントの提示に用いられた（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００１３】
これまで、ジスルフィド結合を介して安定化した線状（ポリ）ペプチドおよび環状ペプチドのみがファージ上で良好に提示された（国際公開第２０００／０７７１９４号パンフレット、国際公開第２００９／０９８４５０号パンフレット参照）。より最近では、国際公開第２０１２／０１９９２８号パンフレットにおいて、ｐＩＩＩのＮ末端に融合したＭｉｃｒｏｖｉｖｉｄｒｉｎ  Ｋの線状前駆体がファージ上に提示された。提示された線状前駆体の翻訳後修飾は、同起源の修飾酵素を含有する細胞溶解物とのファージのその後のインキュベーションによって達成された。しかしながら、国際公開第２０１２／０１９９２８号パンフレットは、ランチペプチドの提示が可能な開示を提供しておらず、また、ファージアセンブリ前に翻訳後修飾を受けたペプチドの提示を教示していない。
【００１４】
したがって、古典的なファージディスプレイに対して、細菌からの環状の翻訳後修飾ペプチドの提示を翻訳する必要がある。
【発明の概要】
【００１５】
先行技術において、細菌上でのチオエーテル架橋含有ペプチドの提示が成功することが実証された。しかしながら、提示用の細菌の使用に重大な不利点が付随する。例えば、グラム陽性菌、例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）は、エレクトロポーレーションに関して、形質転換効率が引き下げられ、かつ凝集する傾向がある。これにより、その取扱いは困難なものとなり、結果は不安定なものとなる。したがって、典型的なファージディスプレイライブラリは、１０１２個を超える異なるクローンを有することが知られているが、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）を介して提示されるライブラリは、約１０６個を越える多様性を上回ることができない。
【００１６】
したがって、本開示の基礎となる技術的課題は、ファージ粒子上での環状ペプチドの提示を可能にする単純で信頼性が高い系を開発することである。この技術的課題の解決策は、本明細書中で特徴が描写される実施形態を提供することによって達成される。本開示は、環状ペプチドをファージコートタンパク質のＣ末端に付着させて、ファージ表面上での前記環状ペプチドの提示を可能にする。したがって、Ｃ末端ファージディスプレイは、ｐＶＩＩＩコートタンパク質上の（Ｈｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４＆Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、およびまたｐＩＩＩコートタンパク質上の（Ｆｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）線状ペプチドについて示されたが、ファージコートタンパク質のＣ末端を介した環状ペプチドまたは翻訳後修飾ペプチドの提示は言及または示唆されなかった。通常、従来のファージディスプレイは、提示用のファージコートタンパク質のＮ末端を用いており、環状ペプチドがファージコートタンパク質のＣ末端を介してのみ効果的に提示され得ることは予想されなかった。
【００１７】
より詳細には、本開示は、バクテリオファージ粒子上に環状ペプチドを提示する方法であって、
（ａ）前駆体環状ペプチドをコードする核酸配列を保有する宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）前記前駆体環状ペプチドの発現を引き起こすかまたは可能にするステップと；
（ｃ）前駆体環状ペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸残基を酵素により脱水するステップと；
（ｄ）システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって１つまたは複数の分子内結合の形成し、それにより環状ペプチドを形成するステップと；
（ｅ）前記宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生させるステップと
を含み、前記バクテリオファージ粒子は、表面上に前記環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している、方法を含む。
【００１８】
一態様において、環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む。別の態様において、環状ペプチドは、システイン残基またはリジン残基への１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む。別の態様において、環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水されたアミノ酸残基の結合によって形成される分子内結合を含む。
【００１９】
したがって、本開示は、ファージ上に環状ペプチドを示すことができる。本開示の技術的なアプローチ、すなわちファージコートタンパク質のＣ末端への環状ペプチドの付着は、先行技術によって記載または示唆されていない。
【００２０】
したがって、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示する方法であって、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している、方法に関する。さらに、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に提示される環状ペプチドの大きいライブラリを作成し、かつそれをスクリーニングすることを可能にする。
【００２１】
多くの場合、そのような方法を用いて環状ペプチドを示すことが有利である。環状ペプチドを含むライブラリを提示する、特許請求される方法に有用性がある。
【００２２】
さらに、特許請求される方法を用いることにより提示される環状ペプチドを含むライブラリに有用性がある。そのようなライブラリは、注目する標的に対してスクリーニングされ得る、広範囲にわたる環状ペプチドを含む。
【００２３】
開示される方法の利用により、ペプチド中の本質的にあらゆる所望の位置に分子内結合を導入することが可能となる。特に関心がもたれるのは、生物学的活性を有するペプチド、例えば治療用途が意図されるペプチドである。なぜなら、１つまたは複数の分子内結合の導入は、一般に、ペプチドの生物安定性を増大させるからである。さらに、環状構造体が用いられて、ペプチドの生物学的活性、例えば抗原特異性、受容体結合親和性、抗菌活性、または酵素特異性を変えることができる。注目するペプチドは、例えば、アゴニストペプチド、アンタゴニストペプチド、アミド化ペプチド、ホルモン、酵素阻害物質、酵素活性化因子、受容体リガンド、抑制ペプチド、ランチビオティックタンパク質、ウイルスタンパク質、真核生物タンパク質、それらの突然変異体（例えば、特定の位置での修飾を可能にするように特異的に設計されている）、それらの模倣体、相同体、または機能的フラグメント均等物である。そのような方法は、環状ペプチドに基づいて、治療的に関連がありかつ治療的に活性がある分子を同定するのに用いることもでき、またはそのような分子を特徴付けるために用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現された環状ペプチドの修飾状態を確認することを示す。ＮｉｓＡリーダー配列を収容する、発現された可溶性ペプチドの修飾状態が、ＥＬＩＳＡベースのＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイを用いて、修飾ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ酵素の共発現の存在下または不在下において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解物中で評価された。ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ共発現の不在下（Ｌａｎ酵素なし）で産生される、ＡＳＷＩＥＧＲＷＣＮ−モチーフ（配列番号１；Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ認識配列に下線を引いている）を含有するペプチドがほぼＦａｃｔｏｒ  Ｘａによって完全に切断されている一方、ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣの共発現は、デヒドロアラニン（脱水されたセリン）からシステインへのチオエーテル架橋の酵素的導入およびＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断耐性の原因となる（左のパネル）。セリン（真ん中のパネル）残基またはシステイン（右のパネル）残基のアラニンへの突然変異は、ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ共発現の存在下ですら酵素によるチオエーテル架橋形成を妨げて、ペプチドをＦａｃｔｏｒ  Ｘａ感受性にする。Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ耐性（残ったシグナル［％］）は、独立して産生された３つの細胞溶解物由来の未処理サンプル（Ｘａなし）と比較して算出された。
【図２】図２は、ｐＩＩＩのＣ末端に対するＮｉｓＡリーダー含有前駆体ペプチドの融合体が、酵素による環化（チオエーテル架橋形成）のための基質であり、その後、ファージ粒子上に提示されることを示す。（Ａ）ｐＩＩＩのＣ末端またはＮ末端に、ＡＳＷＩＥＧＲＷＣＮモチーフ（配列番号１）を有する同じＮｉｓＡリーダー含有ペプチドを融合させたファージミドを用いてファージ粒子が産生され、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイにかけられた。ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ共発現の存在下で産生され、ファージ上に提示されるＣ末端融合体は、大部分がＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断に耐性であり、これは、プロデューサ細胞中での酵素による修飾およびその後のファージ粒子中への組込みを示している（左のパネル）。対照的に、ファージ上に提示された同じペプチドのＮ末端融合体は、ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ共発現の存在下で産生された場合ですらＦａｃｔｏｒ  Ｘａ感受性である（右のパネル）。（Ｂ）Ｃ末端ｐＩＩＩ融合体のコアペプチドにおけるセリン（左のパネル）残基またはシステイン（右のパネル）残基のアラニンへの突然変異は、ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ共発現の存在下ですら酵素によるチオエーテル架橋形成を妨げて、提示されるペプチドをＦａｃｔｏｒ  Ｘａ感受性にする。Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ耐性（残ったシグナル［％］）は、独立して産生された３つのファージサンプル由来の未処理サンプル（Ｘａなし）と比較して算出された。（Ｃ）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のＣ末端またはＮ末端に融合させた、（Ａ）に示される同じＮｉｓＡリーダー含有前駆体ペプチドを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の細胞溶解物が産生され、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイにかけられた。ＭＢＰのＣ末端への前駆体ペプチドの融合は、ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ共発現の存在下で産生される場合、大部分がＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断耐性であり、これにより、酵素による修飾が確認される。ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ共発現の不在下で同じペプチド融合体は検出され得ず（ｎ．ｄ．）、迅速なターンオーバーを示している可能性がある（左のパネル）。ＭＢＰに対する前駆体ペプチドのＮ末端融合体は、ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ共発現に関係なく高いレベルで蓄積したが、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断アッセイによって判断されるように、酵素により修飾されなかった（右のパネル）。結果は、キャリアタンパク質のＣ末端に対する前駆体ペプチドの融合体が広く適用可能であり、およびＮ末端融合と対照的に、酵素機構による効率的な修飾を支持することを示唆している。
【図３】図３は、ｐＩＩＩのＣ末端に対するＰｒｏｃＡリーダー含有前駆体ペプチドの融合体が、酵素による環化（チオエーテル架橋形成）のための基質であり、その後、ファージ粒子上に提示されることを示す。ｐＩＩＩのＣ末端に、ＡＳＷＩＥＧＲＷＣＮモチーフ（配列番号１；Ｓ／Ｃ；または同起源のＴ／ＣおよびＳ／Ａ誘導体）を有するＰｒｏｃＡリーダー含有ペプチドを融合させたファージミドを用いてファージ粒子が産生され、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイにかけられた。ＰｒｏｃＭ酵素共発現の存在下で産生されるＳ／Ｃ（左のパネル）残基またはＴ／Ｃ（真ん中のパネル）残基を含有するＣ末端ペプチド融合体は、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断に対する耐性を示し、これにより、それぞれデヒドロアラニン（Ｓ／Ｃ）およびデヒドロブチリン（Ｔ／Ｃ）由来の酵素によるチオエーテル架橋形成およびその後のファージ粒子中への組込みが示される。対照的に、Ｓ／Ａ残基を有する融合体は、チオエーテル形成のための基質でなく、ＰｒｏｃＭの存在下で産生される場合ですらＸａ感受性のままである（右のパネル）。Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ耐性（残ったシグナル［％］）は、独立して産生された３つのファージサンプル由来の未処理サンプル（Ｘａなし）と比較して算出された。
【図４】図４は、腸内細菌ファージＭ１３  ｇ３ｐ（ｐＩＩＩ）およびｇ８ｐ（ｐＶＩＩＩ）タンパク質の野生型アミノ酸配列を示す。ｐＩＩＩタンパク質の配列（配列番号２；ＵｎｉＰｒｏｔ−ＩＤ：Ｐ６９１６８）およびｐＶＩＩＩタンパク質の配列（配列番号３；ＵｎｉＰｒｏｔ−ＩＤ：Ｐ６９５４１）においてシグナルペプチド（ボールド体）および膜貫通ドメイン配列（ボールド体、下線）が強調されている。
【図５】図５は、ＮｉｓＡリーダー配列およびＰｒｏｃＡリーダー配列を含有するペプチド融合体の酵素による環化（チオエーテル架橋形成）およびファージディスプレイ、ならびにｐＩＩＩのＣ末端上での可変的な環サイズを示す。（Ａ）ファージ粒子は、ｐＩＩＩのＣ末端に、ＡＳＷＩＥＧＲＥＣＮ−モチーフ（配列番号１１）、ＡＳＷＡＡＩＥＧＲＡＥＣＮ−モチーフ（配列番号１２）、ＡＳＷＡＡＡＩＥＧＲＡＡＡＥＣＮ−モチーフ（配列番号１３）、またはＡＳＷＡＡＧＡＡＩＥＧＲＡＡＧＡＡＥＣＮ−モチーフ（配列番号：１４）（それぞれ構築体ｉ，ｉ＋７、ｉ，ｉ＋１０、ｉ，ｉ＋１３、およびｉ，ｉ＋１７；Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断部位に下線を引いている）を有するＮｉｓＡリーダー含有ペプチドを融合させたファージミドを用いて産生され、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイにかけられた。ＮｉｓＢ／Ｃ酵素共発現の存在下で産生されたＣ末端ペプチド融合体は、セリン／システイン間隔によって決定される環サイズから独立して、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断に対する耐性を示す。Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ耐性（残ったシグナル［％］）は、独立して産生された３つのファージサンプル由来の未処理サンプル（Ｘａなし）と比較して算出された。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、ＰｒｏｃＡリーダー配列を含有し、かつＰｒｏｃＭ酵素共発現の存在下または不在下で産生されたｐＩＩＩペプチド融合体である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
用語「バクテリオファージ」は、ファージの複製に必要とされる核酸を含有するタンパク質コートからなるパッケージを形成する細菌ウイルスを指す。核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、線状であっても環状であってもよい。バクテリオファージ、例えばラムダファージまたは繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３、ｆｄ、またはｆ１）は、当業者に周知である。用語「バクテリオファージ粒子」は、本開示に従う粒子、すなわち環状ペプチドを提示する粒子を指す。コートタンパク質は、バクテリオファージのアセンブリ中に様々な核酸配列をパッケージし得、但し、パッケージングシグナルを含むことを条件とする。
【００２６】
用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらのポリマーを指す。この用語は、既知のヌクレオチド類似体、または修飾バックボーン残基もしくは連結体（ｌｉｎｋａｇｅ）を含有する核酸を包含し、これらは、合成され、天然に存在し、非天然に存在し、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと同様に代謝される。特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、暗黙的に、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を明示的に示される配列と同様に包含する。具体的には、以下に詳述されるように、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することにより、縮重コドン置換が達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。本明細書中に開示される特定の核酸配列またはベクターは、バクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子のアセンブリ中に、バクテリオファージコートタンパク質によってパッケージされる能力を有する。好ましくは、前記核酸配列または前記ベクターは、バクテリオファージの天然に存在するゲノムに由来し、例えば、繊維状ファージの場合、ファージベクターおよびファージミドベクターを含む。後者は、プラスミドの特徴に加えて、パッケージングシグナル、およびファージの複製起点を含有するプラスミドである。
【００２７】
用語「ペプチド」は、５０個以下のアミノ酸を有する分子を意味する。
【００２８】
用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチド結合を介して連結する複数の、すなわち２個以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖からなる、５０個を超えるアミノ酸を有する分子を意味する。
【００２９】
用語「タンパク質」は、（ポリ）ペプチドの少なくとも一部が、その（ポリ）ペプチド鎖内かつ／またはその間に二次構造、三次構造、または四次構造を形成することによって定義される立体配置を有するかまたは得ることができる（ポリ）ペプチドを指す。この定義は、天然に存在するタンパク質、または少なくとも部分的に人工のタンパク質等のタンパク質、および全タンパク質のフラグメントまたはドメインを含み、但し、これらのフラグメントまたはドメインが、先に記載されるように定義される立体配置を得ることができることを条件とする。
【００３０】
用語「チオエーテル」または「チオエーテル架橋」は、各分子にある２つの異なる炭素またはヘテロ原子に結合する硫黄原子を指す。一実施形態において、チオエーテル架橋は、１つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基の翻訳後脱水および前記脱水された残基のシステインへの結合後に形成される。一実施形態において、チオエーテル架橋は、ランチオニン架橋またはメチルランチオニン架橋である。ランチオニンは、化学式（ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＯＨ）である非タンパク質構成アミノ酸であり、チオエーテル架橋によってβ炭素原子上に架橋される２つのアラニン残基で構成される。メチルランチオニンは、化学式（ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＯＨ）である非タンパク質構成アミノ酸である。
【００３１】
用語「リジノアラニン架橋」は、デヒドロアラニンのリジン残基との相互作用を指す。本明細書では、リジノアラニン架橋は、例えばｐＨの調整により、酵素的にまたは非酵素的に誘導される。「リジノアラニン」は、修飾アミノ酸Ｎ６−（ＤＬ−２−アミノ−２−カルボキシエチル）−Ｌ−リジンを指す。
【００３２】
本明細書中で用いられる用語「分子内結合」は、分子外の（外生の）構造体を組み込まず、かつ化学的プロセシング、例えばジスルフィド架橋形成（例えば還元反応による）、付加環化、またはシュタウディンガー反応を除外しない、ペプチド配列内のアミノ酸の側鎖間の共有結合を指す。本明細書では、分子内結合は、１つまたは複数の脱水された残基のシステインまたはリジンへの結合により形成され得る。一実施形態において、前記１つまたは複数の脱水された残基は、デヒドロアラニン（Ｄｈａ）またはデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）である。本明細書では、分子内結合は、リジノアラニン架橋またはチオエーテル架橋によって形成され得る。本開示の一実施形態において、分子内結合は、ランチオニン架橋によって形成される。本開示の別の実施形態において、分子内結合は、メチルランチオニン架橋によって形成される。本開示の実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、ペプチド配列内に形成される。本開示の実施形態において、ペプチド配列内の分子内結合は、安定した環構造を形成する。一実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は、酵素により形成される。一実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は、ランチペプチドシンセターゼによって形成される。一実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は、シクラーゼによって形成される。一実施形態において、前記シクラーゼは、ＬａｎＣ型シクラーゼ、あるいは二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素である。別の実施形態において、前記ＬａｎＣ型シクラーゼは、ＮｉｓＣ（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｑ０３２０２）、ＳｐａＣ、ＭｉｂＣ、ＰｅｐＣ、ＥｐｉＣ、またはその機能的均等物である。別の実施形態において、前記二機能性ＬａｎＭ型酵素は、ＰｒｏｃＭ（登録番号ＮＰ＿８９４０８３）、ＬｃｔＭ、ＭｕｔＭ、ＢｏｖＭ、ＬａｎＭ１／２、ＣｉｎＭ、ＨａｌＭ１／２、ＣｙａｎＭ１〜４、またはその機能的均等物である。別の実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は非酵素的に形成される。さらなる実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は塩基性条件下で形成される。別の実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は穏やかな塩基性条件下で形成される。別の実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は塩基性条件下で形成される。別の実施形態において、前記塩基性条件は、ｐＨ７．５、ｐＨ８、ｐＨ８．５、ｐＨ９、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、ｐＨ１１、ｐＨ１１．５、ｐＨ１２、ｐＨ１２．５、ｐＨ１３、ｐＨ１３．５、またはｐＨ１４である。さらなる実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は、酵素により、例えばランチペプチドシンセターゼにより、かつ塩基性条件下で形成される。
【００３３】
本明細書では、用語「環状ペプチド」は、１つまたは複数の分子内結合によって形成される二次構造を有する、アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドのストレッチを指す。アミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドの完全なストレッチは、環状である必要はない。本開示の実施形態において、環状ペプチドは、単環ペプチドまたは多環ペプチドである。別の実施形態において、環状ペプチドは、天然に存在するペプチドまたは人工ペプチド、および全タンパク質のフラグメントまたはドメインであるペプチド等のペプチドを含む。さらなる実施形態において、環状ペプチドは、アミド化された環状ペプチドである。
【００３４】
用語「多環」または「多環構造」は、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの分子内結合を有する構造を指す。本開示に従って用いられるペプチドの長さに応じて、より複雑な二次ペプチド構造が達成され得る。
【００３５】
用語「前駆体環状ペプチド」は、本明細書中の本開示に従う環状ペプチドを形成する能力があるアミノ酸、ペプチド、またはポリペプチドのストレッチを指す。より詳細には、本開示に従う前駆体環状ペプチドは、分子内結合を形成するための少なくとも１つまたは複数のセリンまたはトレオニン、および１つまたは複数のシステインまたはリジンを含む。
【００３６】
用語「脱水された残基」は、反応分子からの水分子の損失に関与する化学反応を経た修飾アミノ酸残基を指す。一実施形態において、「脱水された残基」は、脱水されたセリンまたは脱水されたトレオニンである。別の実施形態において、「脱水された残基」は、デヒドロアラニン（Ｄｈａ）またはデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）である。一実施形態において、１つまたは複数のセリンまたはトレオニンの脱水は、ランチペプチドシンセターゼによって実行される。一実施形態において、１つまたは複数のセリンまたはトレオニンの脱水は、デヒドラターゼによって実行される。一実施形態において、酵素による前記脱水は、ＬａｎＢ型デヒドラターゼにより、あるいは二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素によって実行される。一実施形態において、前記ＬａｎＢ型デヒドラターゼは、ＮｉｓＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ２０１０３）、ＥｐｉＢ、ＳｐａＢ、ＭｉｂＢ、ＰｅｐＢ、またはそれらの機能的均等物である。別の実施形態において、前記二機能性ＬａｎＭ型酵素は、ＰｒｏｃＭ（登録番号ＮＰ＿８９４０８３）、ＬｃｔＭ、ＭｕｔＭ、ＢｏｖＭ、ＬａｎＭ１／２、ＣｉｎＭ、ＨａｌＭ１／２、ＣｙａｎＭ１〜４、またはそれらの機能的均等物である。
【００３７】
本明細書中で用いられる用語「リーダー」または「リーダー配列」は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素にとっての認識モチーフを指すものとする。本開示の実施形態において、リーダー配列は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識される。本開示の実施形態において、リーダー配列は、ランチペプチドシンセターゼによって認識される配列である。別の実施形態において、リーダー配列は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列に由来し得るコンセンサスモチーフを有する。本開示の別の実施形態において、リーダー配列は、ＬａｎＡ前駆体ペプチドに由来する配列である。本開示の別の実施形態において、リーダー配列は、ＬａｎＡ前駆体ペプチドに由来し得るコンセンサスモチーフを有する。本開示の別の実施形態において、リーダー配列は、ＬａｎＢ型デヒドラターゼ、ＬａｎＣ型シクラーゼ、および／あるいは二機能性ＬａｎＭ型酵素または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素によって認識される配列である。
【００３８】
本明細書中で用いられる用語「翻訳後修飾酵素」または「ＰＴＭ酵素」は、例えば、生物学的に活性なペプチドの生合成において、プロセシング機構の一部として、天然リボソームペプチドを特異的に修飾する、翻訳されたペプチドの構造的変更を誘導する酵素を指すものとする。このクラスは、複数の型の酵素を含み、カルボキシレートアミンリガーゼ、シクラーゼ、デヒドロゲナーゼ、シクロデヒドラターゼデカルボキシラーゼ、エピメラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ペプチダーゼ、デヒドラターゼ、リアーゼ、キナーゼ、トランスフェラーゼ、エステラーゼ、オキシゲナーゼ、およびイソメラーゼ、特にランチオニン結合形成酵素、細胞溶解素形成酵素、シアノバクチン形成酵素、チオペプチド形成酵素、コノペプチド形成酵素、ミクロビリジン形成酵素、シクロチド形成酵素、バクテリオシン形成酵素、およびサブチロシン形成酵素が挙げられる。好ましくは、本明細書中で用いられるＰＴＭ酵素は、ランチペプチドシンセターゼである。好ましくは、本明細書中で用いられるＰＴＭ酵素は、デヒドラターゼ、シクラーゼ、またはデヒドラターゼ活性もしくはリアーゼ活性／キナーゼ活性およびシクラーゼ活性を備える二機能性酵素もしくは多機能性酵素である。より好ましいのは、本明細書中で用いられるＰＴＭ酵素が、ＬａｎＢ型デヒドラターゼ、ＬａｎＣ型シクラーゼ、二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素、あるいはそれらの機能的均等物である。
【００３９】
ペプチドまたはタンパク質の用語「機能的均等物」は、ペプチドまたはタンパク質の機能の１つまたは複数、好ましくは実質的に全てを共有するものを意味する。好ましくは、そのような機能は、生物学的機能、好ましくは酵素的機能、例えばデヒドラターゼ活性および／またはシクラーゼ活性である。
【００４０】
用語「バクテリオファージ粒子の表面」は、バクテリオファージ粒子の一部を指し、これは、粒子が含有される培地と接触しており、かつアクセス可能である。表面は、適切な宿主細胞内でのファージ産生中にアセンブルされるファージコートの一部であるタンパク質（粒子のタンパク質コートのメンバー）によって判定される。
【００４１】
ファージディスプレイは、ペプチド変異体またはタンパク質変異体のライブラリがファージビリオンの外側に発現される一方で、各変異体をコードする遺伝的材料が内側に存在する選択技術を説明する。これは、各変異体タンパク質配列と、これをコードするＤＮＡとの物理的連結を生じさせ、これにより、所定の標的分子（抗体、酵素、細胞表面受容体等）への結合親和性に基づく、パニングと呼ばれるインビトロ選択プロセスによる迅速な分配（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）が可能となる。その最も単純な形態において、パニングは、ファージディスプレイされたペプチドのライブラリを、標的でコーティングされたプレート（またはビーズ）上でインキュベートし、結合していないファージを洗い流し、かつ特異的に結合したファージを溶出することによって実行される。次に、溶出されたファージは、さらなる結合／増幅サイクルを通して増幅されて取られて、結合配列に有利なようにプールが富化される。少数のラウンド後、個々のクローンがＤＮＡ配列決定およびＥＬＩＳＡによって特徴付けられる。
【００４２】
用語「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏＩＥ  １、およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターを指す。ファージミドは、繊維状バクテリオファージが挙げられる、知られているあらゆるバクテリオファージに基づいてよい。プラスミドはまた、一般に、抗生物質耐性の選択マーカーを含有することとなる。このベクター中にクローニングされるＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖することができる。このベクターを保有する細胞に、ファージ粒子の産生に必須の全遺伝子が提供されると、プラスミドの複製モードがプラスミドＤＮＡの一本鎖のコピーを生成して、ファージ粒子をパッケージするローリングサークル複製に変わる。ファージミドは、感染性ファージ粒子または非感染性ファージ粒子を形成し得る。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上に提示されるように、遺伝子融合体として異種ポリペプチド遺伝子に連結するファージコートタンパク質遺伝子、またはそのフラグメントを含有するファージミドを含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  ４１７）。
【００４３】
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含有し、かつ複製が可能なバクテリオファージの二本鎖反復可能形態を指す。ファージベクターは、ファージの複製およびファージ粒子の形成を可能にするファージの複製起点を有する。ファージは、好ましくは、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージ、またはそれらの誘導体、ラムドイドファージ、例えばラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１．８２、４２４．４３４等、またはそれらの誘導体、バキュロウイルスまたはその誘導体、Ｔ４ファージまたはその誘導体、Ｔ７ファージウイルスまたはその誘導体である。細胞からのＤＮＡの調製は、宿主細胞の培養体からプラスミドＤＮＡを単離することを意味する。ＤＮＡの調製に一般的に用いられる方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の第１２５〜１３３節に記載される大スケールおよび小スケールのプラスミド調製である。ＤＮＡの調製後、ＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の第１４０節に記載されるような、当該技術分野において周知の方法によって精製されてよい。
【００４４】
用語「コートタンパク質」は、バクテリオファージ粒子の表面上に存在するタンパク質、または少なくともその一部を意味する。機能的な観点から、コートタンパク質は、宿主細胞内でのファージアセンブリプロセス中にバクテリオファージ粒子を伴い、かつ別の宿主細胞に感染するまでアセンブルされたファージを伴ったままである、あらゆるタンパク質である。繊維状バクテリオファージの場合、前記野生型タンパク質は、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）、遺伝子ＶＩタンパク質（ｐＶＩ）、遺伝子ＶＩＩタンパク質（ｐＶＩＩ）、遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）、および遺伝子ＩＸタンパク質（ｐＩＸ）である。コートタンパク質は、主要なコートタンパク質であってもよく、またはマイナーなコートタンパク質であってもよい。「主要な」コートタンパク質は、ファージコート中にタンパク質が１０コピー以上存在するコートタンパク質、例えば主要なコートタンパク質ｐＶＩＩＩである。主要なコートタンパク質は、１ファージあたり何十コピー、何百コピー、またはさらに何千コピーも存在してよい。マイナーなコートタンパク質は、ファージコート中に１ファージあたり１０コピー未満存在し、例えばマイナーなコートタンパク質ｐＩＩＩである。
【００４５】
用語「野生型コートタンパク質」は、天然に存在するバクテリオファージのファージコートを形成するコートタンパク質を指す。繊維状バクテリオファージの近縁メンバー間、例えば、ｆ１、ｆｄ、Ｍ１３間の差異を含む配列が当業者に周知である（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）。繊維状バクテリオファージの場合、前記野生型タンパク質は、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）、遺伝子ＶＩタンパク質（ｐＶＩ）、遺伝子ＶＩＩタンパク質（ｐＶＩＩ）、遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）、および遺伝子ＩＸタンパク質（ｐＩＸ）である。一実施形態において、本開示は、前記コートタンパク質がバクテリオファージの野生型コートタンパク質である、方法に関する。
【００４６】
さらに好ましい実施形態において、前記コートタンパク質は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の切断型変異体であり、前記切断型変異体は、前記コートタンパク質の、バクテリオファージ粒子のタンパク質コート中への組込みを引き起こす前記野生型コートタンパク質の少なくとも一部を含む。
【００４７】
用語「切断型変異体」は、先で言及される野生型タンパク質に由来し、野生型配列の少なくとも一部の欠失によって修飾されているタンパク質を指す。これは、バクテリオファージ突然変異体において見出され（Ｃｒｉｓｓｍａｎ＆Ｓｍｉｔｈ，１９８４）、または標準的なファージディスプレイ法の過程で生じた（例えば、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｋｒｅｂｂｅｒ，１９９６）変異体、例えば切断型遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）の変異体を含む。例えば、前記切断型変異体は、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）のＣＴドメインからなってもよく、またはそれを含んでもよい。本開示に従う切断型変異体を同定するために、検出タグが変異体に融合されてもよく、または変異体の存在下で形成されるバクテリオファージ粒子のファージコート中に変異体が組み込まれているかを判定するアッセイがセットアップされてもよい。
【００４８】
さらに他の好ましい実施形態において、前記コートタンパク質は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体であり、前記修飾変異体は、バクテリオファージ粒子のタンパク質コート中に組み込まれる能力がある。
【００４９】
本開示に従う、野生型タンパク質の修飾を達成する方法は、当業者に周知であり、標準的なクローニング技術および／または突然変異誘発技術を含む。本開示に従う方法で用いられる野生型タンパク質の修飾変異体をコードする核酸分子の構築法、ファージベクターおよび／またはファージミドベクターの構築が挙げられる、前記核酸分子を含むベクターの構築法、前記修飾タンパク質の発現を引き起こすかまたは可能にする、適切に選択された宿主細胞中への前記ベクターの導入法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）。本開示に従う修飾変異体を同定するために、検出タグが変異体に融合されてもよく、または変異体の存在下で形成されるバクテリオファージ粒子のファージコート中に変異体が組み込まれる能力があるかを判定するアッセイがセットアップされてもよい。
【００５０】
さらに他に好ましいのは、前記バクテリオファージが繊維状バクテリオファージである方法である。繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆｄ、またはｆ１が当業者に周知である。
【００５１】
繊維状バクテリオファージの場合、バクテリオファージ粒子の前記コートタンパク質が野生型コートタンパク質ｐＩＩＩであるか、またはそれに由来する方法が特に好ましい。
【００５２】
さらに好ましいのは、バクテリオファージ粒子の前記コートタンパク質が野生型コートタンパク質ｐＩＩＩであるか、またはそれに由来する方法である。好ましくは、野生型タンパク質に対応する修飾タンパク質の一部は、対応する野生型配列と比較して、約４０％、好ましくは約５０％、好ましくは約６０％、好ましくは約７０％、好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％を超えるアミノ酸同一性を示す。
【００５３】
所定のポリペプチド配列の用語「Ｎ末端」は、所定のポリペプチド配列のＮ末端残基から、またはその近くで始まる、所定のポリペプチド配列の連続した長さである。所定のポリペプチドのＮ末端が長さによって定義され得る。同様に、所定のポリペプチド配列の用語「Ｃ末端」は、所定のポリペプチド配列のＣ末端残基においてまたはその近くで終わる、所定のポリペプチド配列の連続した長さである。所定のポリペプチドのＣ末端が長さによって定義され得る。一実施形態において、本開示は、コートタンパク質のＣ末端に言及する。好ましい実施形態において、コートタンパク質のＣ末端は、前記コートタンパク質の膜貫通ドメインのＣ末端に位置決めされるアミノ酸またはアミノ酸配列である。別の実施形態において、コートタンパク質のＣ末端は、前記コートタンパク質の膜貫通ドメインのＣ末端に位置決めされるアミノ酸またはアミノ酸配列であり、前記コートタンパク質は、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ、配列番号２；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６９１６８）または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ；配列番号３；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６９５４１）である。一実施形態において、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）のＣ末端は、アミノ酸配列ＬＲＮＫＥＳ（配列番号４）またはその誘導体もしくは修飾変異体である。別の実施形態において、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）のＣ末端は、膜貫通ドメインのＣ末端に位置決めされ、アミノ酸配列ＬＲＮＫＥＳ（配列番号４）の１つまたは複数のアミノ酸を含む。別の実施形態において、遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）のＣ末端は、アミノ酸配列ＴＳＫＡＳ（配列番号５）、またはその誘導体もしくは修飾変異体である。別の実施形態において、遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）のＣ末端は、膜貫通ドメインのＣ末端に位置決めされ、アミノ酸配列ＴＳＫＡＳ（配列番号５）の１つまたは複数のアミノ酸を含む。遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）および遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）の概観スキームが図４に示される。
【００５４】
本開示の一実施形態において、タンパク質コートメンバーのＣ末端は、環状ペプチドに付着しており、前記環状ペプチドをバクテリオファージ粒子の表面上に提示する。
【００５５】
好ましい実施形態において、（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示するバクテリオファージ粒子は、（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を含有する。
【００５６】
本開示に関連して、用語「発現を引き起こすかまたは可能にする」は、核酸配列が発現されるような条件下で宿主細胞を培養することを説明する。本開示に従う（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸分子の構築法、前記核酸分子を含むベクターの構築法、前記ベクターの適切に選択された宿主細胞中への導入法、（ポリ）ペプチド／タンパク質の発現を引き起こすかまたは可能にする方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９参照）。さらに、周知であるのは、適切な宿主細胞内での後代バクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子の生成に必要とされる遺伝的材料の導入法、および前記後代バクテリオファージまたは前記バクテリオファージ粒子の生成を引き起こすかまたは可能にする方法である（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）。バクテリオファージ粒子の産生を引き起こすかまたは可能にするステップは、例えばファージミドを利用する場合、適切なヘルパーファージの使用を必要としてよい。
【００５７】
別の実施形態において、本開示は、本開示に従う核酸配列を含むベクターに関する。
【００５８】
さらなる実施形態において、本開示は、本開示に従う核酸配列または本開示に従うベクターを含有する宿主細胞に関する。
【００５９】
本開示に関連して、用語「宿主細胞」は、異種タンパク質の生産に一般的に用いられる多数のもののうちの任意のものであってよく、以下に限定されないが、細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、菌類、例えば酵母（Ｈｏｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｒｉｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）もしくは糸状菌（Ｎｙｙｓｓｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、植物細胞（Ｈｉａｔｔ＆Ｍａ，１９９３；Ｗｈｉｔｅｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、昆虫細胞（Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、または哺乳類細胞（Ｔｒｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が挙げられる。
【００６０】
さらに他の好ましい実施形態において、本開示は、本開示に従う核酸配列、本開示に従うベクターによってコードされる、または本開示に従う宿主細胞によって産生される、野生型バクテリオファージのコートタンパク質の修飾変異体に関する。修飾変異体は、クローニング、発現、またはタンパク質輸送に必要とされるアミノ酸残基をさらに含んでよい。クローニングに必要とされるアミノ酸残基は、適切なベクター中への核酸配列のクローニングを可能にするように組み込まれる、制限エンドヌクレアーゼ用の認識配列を含む核酸配列によってコードされる残基を含んでよい。発現に必要とされるアミノ酸残基は、（ポリ）ペプチド／タンパク質の溶解度または安定性の増大をもたらす残基を含んでよい。タンパク質輸送に必要とされるアミノ酸残基は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムへの修飾変異体の輸送を担うシグナル配列、および／または前記シグナル配列の効率的な切断を促進するアミノ酸残基を含んでよい。先で言及されるクローニング、発現、タンパク質輸送、精製、および／または検出目的に必要とされるさらなるアミノ酸残基が当業者に多数周知である。
【００６１】
「バクテリオファージ粒子の多様なコレクション」は、「ライブラリ」または「複数」と呼ばれてもよい。本開示に関連して、そのようなライブラリのメンバーは、それぞれライブラリの異なるメンバーを提示する。本開示に関連して、用語「多様なコレクション」は、組成、特性、および／または配列の少なくとも一部が異なる少なくとも２つの粒子または分子のコレクションを指す。例えば、環状ペプチドの多様なコレクションは、配列の少なくとも１つのアミノ酸位置が異なる環状ペプチドのセットである。そのような多様なコレクションは、種々の方法で、例えば、出発（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１つのコドンのランダム突然変異誘発により、エラープローンＰＣＲを用いて、出発（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を増幅することにより、または本開示に従う方法において、宿主細胞として突然変異誘発株を用いることにより得られ得る。ペプチドの多様なコレクションの生成のためのこれらの方法、およびさらなるまたは代わりの方法が当業者に周知である。
【００６２】
本開示に関連して、用語「所望の特性」は、多様なコレクションの１つのメンバーが有するべき、および多様なコレクションをスクリーニングかつ／または選択するための基礎を形成する所定の特性を指す。そのような特性は、標的への結合、標的のブロッキング、標的媒介反応の活性化、酵素活性等の特性、および当業者に知られているさらなる特性を含む。所望の特性のタイプに応じて、当業者であれば、スクリーニングおよび／または選択を実行するためのフォーマットおよび必須のステップを同定することができるであろう。
【００６３】
最も好ましいのは、前記所望の特性が注目する標的への結合である、方法である。
【００６４】
当業者に周知の種々の方法でバクテリオファージ粒子上に提示される、例えば、固相バイオパニング用の表面上にコーティングされる、溶液中のバイオパニング用の磁気ビーズ等の粒子に結合される、または細胞全体バイオパニングもしくは組織切片上でのバイオパニングのために細胞表面上に提示される、環状ペプチドの前記多様なコレクションに注目する前記標的が示されてよい。前記標的に結合したバクテリオファージ粒子は、当業者に周知の種々の方法により、例えば適切なバッファによる溶出により、ｐＨ勾配もしくは塩勾配を用いることにより、または可溶性の標的を用いた特異的な溶出により回収され得る。
【００６５】
用語「の近くに」は、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質のＮ末端またはＣ末端からの、両方の場合を考慮に入れた最大１５個、より好ましくは最大１０個のアミノ酸のストレッチを指す。
【００６６】
詳細な説明および実施形態
本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示する方法に関し、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着しており、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む。
【００６７】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示する方法であって、
（ａ）前駆体環状ペプチドをコードする核酸配列を含む核酸配列を保有する宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）前記前駆体環状ペプチドの発現を引き起こすかまたは可能にするステップと；
（ｃ）前駆体環状ペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸残基を酵素により脱水するステップと；
（ｄ）システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって１つまたは複数の分子内結合を形成し、それにより環状ペプチドを形成するステップと；
（ｅ）前記宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生させるステップと
を含み、前記バクテリオファージ粒子は、表面上に前記環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している、方法に関する。
【００６８】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示する方法であって、
（ａ）前駆体環状ペプチドをコードする核酸配列を保有する宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）前記前駆体環状ペプチドの発現を引き起こすかまたは可能にするステップと；
（ｃ）前駆体環状ペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸残基の酵素による脱水を引き起こすかまたは可能にするステップと；
（ｄ）システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合による１つまたは複数の分子内結合の形成を引き起こすかまたは可能にすることにより、環状ペプチドを形成するステップと；
（ｅ）前記宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生させるステップと
を含み、前記バクテリオファージ粒子は、表面上に前記環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している、方法に関する。
【００６９】
本開示の一実施形態において、前記核酸配列は、バクテリオファージ粒子のコートタンパク質と、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列とをさらにコードする。
【００７０】
本開示の一実施形態において、宿主細胞は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに保有する。本開示の別の実施形態において、宿主細胞は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに保有し、前記１つまたは複数の核酸配列は、細胞中に人工的に導入されたものである。
【００７１】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示する方法であって、
（ａ）前駆体環状ペプチドをコードする核酸配列を保有し、かつ翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列を保有する宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）前記前駆体環状ペプチドおよび前記１つまたは複数の翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素の発現を引き起こすかまたは可能にするステップと；
（ｃ）前駆体環状ペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸残基を酵素により脱水するステップと；
（ｄ）システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって１つまたは複数の分子内結合を形成し、それにより環状ペプチドを形成するステップと；
（ｅ）前記宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生させるステップと
を含み、前記バクテリオファージ粒子は、前記環状ペプチドを表面上に提示し、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している、方法に関する。
【００７２】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示する方法であって、
（ａ）前駆体環状ペプチドをコードする核酸配列を保有し、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列を保有する宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）前記前駆体環状ペプチドおよび前記１つまたは複数の翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素の発現を引き起こすかまたは可能にするステップと；
（ｃ）前駆体環状ペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸残基の酵素による脱水を引き起こすかまたは可能にするステップと；
（ｄ）システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合による、１つまたは複数の分子内結合の形成を引き起こすかまたは可能にすることにより、環状ペプチドを形成するステップと；
（ｅ）前記宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生させるステップと
を含み、前記バクテリオファージ粒子は、前記環状ペプチドを表面上に提示し、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している、方法に関する。
【００７３】
一実施形態において、ステップｃ）における酵素による脱水は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって引き起こされる。一実施形態において、ステップｄ）における１つまたは複数の分子内結合の形成は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって引き起こされる。一実施形態において、ステップｃ）における酵素による脱水およびステップｄ）における１つまたは複数の分子内結合の形成は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって引き起こされる。一実施形態において、ステップｃ）における酵素による脱水およびステップｄ）における１つまたは複数の分子内結合の形成は、１つの翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって引き起こされる。別の実施形態において、ステップｃ）における酵素による脱水およびステップｄ）における１つまたは複数の分子内結合の形成は、様々な翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって引き起こされる。別の実施形態において、ステップｃ）における酵素による脱水は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって引き起こされ、およびステップｄ）における１つまたは複数の分子内結合は、塩基性条件下で形成される。さらに別の実施形態において、ステップｃ）における酵素による脱水は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって引き起こされ、および１つまたは複数の分子内結合は、宿主細胞内でのバクテリオファージ粒子の産生後に塩基性条件下で形成される。
【００７４】
本開示の一実施形態において、前記翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素は、ランチペプチドシンセターゼである。本開示の別の実施形態において、前記翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素は、デヒドラターゼ、シクラーゼ、またはデヒドラターゼ活性もしくはリアーゼ活性／キナーゼ活性およびシクラーゼ活性を備える二機能性酵素または多機能性酵素である。好ましい実施形態において、本明細書中で用いられるＰＴＭ酵素は、ＬａｎＢ型デヒドラターゼ、ＬａｎＣ型シクラーゼ、二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素、あるいはそれらの機能的均等物である。本開示の別の実施形態において、前記翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素は、デヒドラターゼ、またはリアーゼ／キナーゼ、および／またはシクラーゼである。
【００７５】
本開示の一実施形態において、前記１つまたは複数の脱水された残基は、デヒドロアラニン（Ｄｈａ）またはデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）である。
【００７６】
本開示の一実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、ランチペプチドシンセターゼにより、または穏やかな塩基性条件下で形成される。本開示の別の実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、ＬａｎＣ型シクラーゼ、二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素により、または穏やかな塩基性条件下で形成される。本開示の一実施形態において、アミノ酸残基の脱水および分子内結合の形成は、ランチオニン架橋形成酵素またはメチルランチオニン架橋形成酵素によって媒介される。
【００７７】
本開示の実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、ペプチド配列またはポリペプチド配列内に形成される。本開示の実施形態において、ペプチド配列またはポリペプチド配列内の分子内結合は、安定化した環構造を形成する。本開示の一実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、翻訳後修飾されたペプチドまたはポリペプチド内に形成される。本開示の一実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、１つまたは複数の脱水された残基を含むペプチドまたはポリペプチド内に形成される。別の実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、ランチペプチドシンセターゼによって修飾されたペプチドまたはポリペプチド内に形成される。別の実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、デヒドラターゼ、シクラーゼ、またはデヒドラターゼ活性もしくはリアーゼ活性／キナーゼ活性およびシクラーゼ活性を備える二機能性酵素もしくは多機能性酵素によって修飾されたペプチドまたはポリペプチド内に形成される。別の実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、ＬａｎＢ型デヒドラターゼ、ＬａｎＣ型シクラーゼ、二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素によって修飾されたペプチドまたはポリペプチド内に形成される。別の実施形態において、ＬａｎＢ型デヒドラターゼは、ＮｉｓＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ２０１０３）、ＥｐｉＢ、ＳｐａＢ、ＭｉｂＢ、ＰｅｐＢ、またはそれらの機能的均等物である。さらなる実施形態において、前記二機能性ＬａｎＭ型酵素は、プロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）属ＭＩＴ  ９３１３由来のＰｒｏｃＭ（登録番号ＮＰ＿８９４０８３）、もしくはそのプロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）属ＭＩＴ  ９３０３由来の近縁の類似体ＰｒｏｃＭ（登録番号ＹＰ＿００１０１８１０７）、ＣｙａｎＭ１〜４（登録番号ＹＰ＿００２４８５８９１、ＹＰ＿００２４８３６０１、ＹＰ＿００２４８４６５５、ＹＰ＿００２４８３７４２；シアノセイス（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）属種ＰＣＣ  ７４２５由来）、ＬｃｔＭ、ＭｕｔＭ、ＢｏｖＭ、ＬａｎＭ１／２、ＣｉｎＭ、ＨａｌＭ１／２、またはその機能的均等物である。
【００７８】
一実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は、ランチオニン架橋形成酵素またはメチルランチオニン架橋形成酵素によって形成される。一実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は、シクラーゼによって形成される。一実施形態において、前記シクラーゼは、ＬａｎＣ型シクラーゼ、二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素である。
【００７９】
別の実施形態において、ＬａｎＣ型シクラーゼは、ＮｉｓＣ（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｑ０３２０２）、ＳｐａＣ、ＭｉｂＣ、ＰｅｐＣ、ＥｐｉＣ、またはそれらの機能的均等物である。さらなる実施形態において、前記二機能性ＬａｎＭ型酵素は、プロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）属ＭＩＴ  ９３１３由来のＰｒｏｃＭ（登録番号ＮＰ＿８９４０８３）、もしくはそのプロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）属ＭＩＴ  ９３０３由来の近縁の類似体ＰｒｏｃＭ（登録番号ＹＰ＿００１０１８１０７）、ＣｙａｎＭ１〜４（登録番号ＹＰ＿００２４８５８９１、ＹＰ＿００２４８３６０１、ＹＰ＿００２４８４６５５、ＹＰ＿００２４８３７４２；シアノセイス（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）属種ＰＣＣ  ７４２５由来）、ＬｃｔＭ、ＭｕｔＭ、ＢｏｖＭ、ＬａｎＭ１／２、ＣｉｎＭ、ＨａｌＭ１／２、またはそれらの機能的均等物である。
【００８０】
別の実施形態において、前記１つまたは複数の分子内結合は、穏やかな塩基性条件下で形成される。別の実施形態において、前記穏やかな塩基性条件は、ｐＨが７．５〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、７．５〜９、８〜９、または９〜１０である。別の実施形態において、前記穏やかな塩基性条件は、ｐＨ７．５、ｐＨ８、ｐＨ８．５、ｐＨ９、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、もしくはｐＨ１１、またはそれぞれの間の範囲である。
【００８１】
本開示の別の実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、チオエーテル架橋である。本開示の別の実施形態において、１つまたは複数の分子内結合は、ランチオニン架橋またはメチルランチオニン架橋である。本開示の別の実施形態において、１つまたは複数の分子内結合はリジノアラニン架橋である。
【００８２】
本開示の一実施形態において、環状ペプチドは、翻訳後修飾されたペプチドまたはポリペプチドである。別の実施形態において、環状ペプチドは、チオエーテル架橋含有ペプチドまたはチオエーテル架橋含有ポリペプチドである。別の実施形態において、環状ペプチドは、ランチオニン架橋含有ペプチドもしくはランチオニン架橋含有ポリペプチド、メチルランチオニン架橋含有ペプチドもしくはメチルランチオニン架橋含有ポリペプチド、またはリジノアラニン架橋含有ペプチドもしくはリジノアラニン架橋含有ポリペプチドである。本開示の別の実施形態において、環状ペプチドは単環または多環である。
【００８３】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示する方法であって、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着しており、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含み、前記方法は、
（ａ）前駆体環状ペプチドをコードする核酸配列を含む核酸配列を保有する宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）前記前駆体環状ペプチドの発現を引き起こすかまたは可能にするステップと；
（ｃ）１つまたは複数の分子内結合を形成するステップと；
（ｄ）前記宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生させるステップと
を含む方法に言及する。
【００８４】
本開示の一実施形態において、前記コートタンパク質は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質である。別の実施形態において、バクテリオファージ粒子の前記コートタンパク質は、野生型コートタンパク質ｐＩＩＩもしくは野生型コートタンパク質ｐＶＩＩＩであるかまたはそれに由来する。
【００８５】
本開示の一実施形態において、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着する。別の実施形態において、前記環状ペプチドと、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端とは、物理的に結合する。別の実施形態において、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に、遺伝的融合を介してまたは１つもしくは複数の人工的に導入されたシステインによって形成されるジスルフィド結合を介して付着する。
【００８６】
本開示の一実施形態において、前記環状ペプチドは、遺伝的融合を介してまたは１つもしくは複数の人工的に導入されたシステインによって形成されるジスルフィド結合を介して、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着する。別の実施形態において、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に遺伝的融合を介して付着する。本開示の別の実施形態において、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に、１つまたは複数の人工的に導入されたシステインによって形成されるジスルフィド結合を介して付着する。
【００８７】
本開示の一実施形態において、前記バクテリオファージは、繊維状バクテリオファージである。
【００８８】
本開示の一実施形態において、前記環状ペプチドは、最大５００、最大４００、最大３００、最大２００、最大１００、最大９０、最大８０、最大７０、最大６０、最大５０、最大４０、最大３０、最大２０、または最大１０個のアミノ酸を含む。
【００８９】
本開示の別の実施形態において、前記環状ペプチドは、アミド化された環状ペプチドである。さらなる実施形態において、前記アミド化された環状ペプチドは、前記環状ペプチドのＣ末端にアミド部分を含む。本開示の別の実施形態において、前記環状ペプチドは、Ｃ末端アミド化によって翻訳後修飾される。別の実施形態において、アミド化のために修飾されることになるアミノ酸は、後ろにグリシンが続き、これがアミド基を提供する。アミド化は、例えば、グリシンが酸化されてアルファ−ヒドロキシ−グリシンを形成する第１の反応ステップを含む。酸化されたグリシンは、Ｃ末端がアミド化されたペプチドおよびＮ−グリオキシル化ペプチドに分割する。Ｃ末端アミド化は、多くのペプチド、例えばニューロペプチドおよびホルモンの生物学的活性に必須であり得る。
【００９０】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる核酸配列に言及し、核酸は、
（ａ）前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質と、
（ｂ）翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列と、
（ｃ）前駆体環状ペプチドと
をコードし、
前駆体環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に位置決めされ、
前記前駆体環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合による分子内結合を形成することができる。
【００９１】
本開示の一実施形態において、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる前記核酸配列は、シグナル配列をさらにコードする。
【００９２】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる核酸配列を含むベクターに言及し、核酸は、
（ａ）前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質と、
（ｂ）翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列と、
（ｃ）前駆体環状ペプチドと
をコードし、
前駆体環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に位置決めされ、
前記前駆体環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合による分子内結合を形成することができる。
【００９３】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる核酸配列に言及し、核酸は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｎ−（ファージコートタンパク質）−（翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列）−（前駆体環状ペプチド）−Ｃの配置を有する。
【００９４】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる核酸配列を含むベクターに言及し、核酸は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｎ−（ファージコートタンパク質）−（翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列）−（前駆体環状ペプチド）−Ｃの配置を有し、ＮはＮ末端であり、ＣはＣ末端である。
【００９５】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる核酸配列に言及し、核酸は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｎ−（シグナル配列）−（ファージコートタンパク質）−（翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列）−（前駆体環状ペプチド）−Ｃの配置を有する。
【００９６】
一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる核酸配列を含むベクターに言及し、核酸は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｎ−（シグナル配列）−（ファージコートタンパク質）−（翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列）−（前駆体環状ペプチド）−Ｃの配置を有し、ＮはＮ末端であり、ＣはＣ末端である。
【００９７】
本開示の別の実施形態において、ベクターは、輸出シグナルをコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに含む。本開示の別の実施形態において、ベクターは、誘導プロモータをコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに含む。一実施形態において、本開示は、本明細書中に開示される核酸配列またはベクターを含む宿主細胞に言及する。
【００９８】
別の実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる核酸配列を含むベクターに言及し、核酸は、ファージコートタンパク質をコードし、前記ファージコートタンパク質は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列の近くにコードされる。
【００９９】
別の実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる核酸配列を含むベクターに言及し、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列は、前駆体環状ペプチドの近くにコードされる。
【０１００】
さらなる実施形態において、本開示は、核酸配列を含むベクターに言及し、前記核酸配列上で、ファージコートタンパク質が、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列の近くにコードされ、前記リーダー配列は、前駆体環状ペプチドの近くにコードされる。本開示の実施形態において、近くに、核酸の対応するトリプレットによってコードされる１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を指す。
【０１０１】
別の実施形態において、前記前駆体環状ペプチドは、１つまたは複数の分子内結合を形成するための少なくとも１つまたは複数のセリンまたはトレオニン、および１つまたは複数のシステインまたはリジンを含む。別の実施形態において、核酸によってコードされるバクテリオファージ粒子の前記コートタンパク質は、野生型コートタンパク質ｐＩＩＩもしくは野生型コートタンパク質ｐＶＩＩＩであるか、またはそれに由来する。
【０１０２】
一実施形態において、本開示は、本明細書中に開示される方法によって得られる、表面上に環状ペプチドを提示するバクテリオファージ粒子に言及する。一実施形態において、本開示は、表面上に環状ペプチドを提示するバクテリオファージ粒子に言及し、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着しており、前記環状ペプチドは、分子内結合を含む。一実施形態において、本開示は、表面上に環状ペプチドを提示するバクテリオファージ粒子に言及し、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着しており、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む。
【０１０３】
別の実施形態において、前記バクテリオファージ粒子は、前記環状ペプチドを形成することができる、前駆体環状ペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列を含むベクターをさらに含む。別の実施形態において、前記バクテリオファージ粒子は、本明細書中に開示されるベクターを含む。
【０１０４】
一実施形態において、本開示は、本明細書中に開示されるバクテリオファージ粒子の多様なコレクションに言及する。一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の多様なコレクションに言及し、前記バクテリオファージ粒子は、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着する環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、分子内結合を含む。別の実施形態において、前記バクテリオファージ粒子は、それぞれ環状ペプチドの多様なコレクションから環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、分子内結合を含む。一実施形態において、本開示は、バクテリオファージ粒子の多様なコレクションに言及し、前記バクテリオファージ粒子は、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着する環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む。別の実施形態において、前記バクテリオファージ粒子は、それぞれ環状ペプチドの多様なコレクションから環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む。
【０１０５】
一実施形態において、本開示は、所望の特性を有する環状ペプチドを得る方法であって、
（ａ）本明細書中に開示されるバクテリオファージ粒子の多様なコレクションを提供するステップと；
（ｂ）前記多様なコレクションをスクリーニングし、かつ／または前記多様なコレクションから選択して、前記所望の特性を有する環状ペプチドを提示する少なくとも１つのバクテリオファージ粒子を得るステップと
を含む方法に言及する。
【０１０６】
一実施形態において、本開示は、所望の特性を有する環状ペプチドを得る方法であって、
（ａ）バクテリオファージ粒子の多様なコレクションを提供するステップであって、前記バクテリオファージ粒子は、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む、ステップと；
（ｂ）前記多様なコレクションをスクリーニングし、かつ／または前記多様なコレクションから選択して、前記所望の特性を有する環状ペプチドを提示する少なくとも１つのバクテリオファージ粒子を得るステップと
を含む方法に言及する。
【０１０７】
本開示の一実施形態において、前記所望の特性は、注目する標的への結合である。
【０１０８】
別の実施形態において、本開示は、所望の特性を有する環状ペプチドを得る方法であって、
（ａ）バクテリオファージ粒子の多様なコレクションを提供するステップであって、前記バクテリオファージ粒子は、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む、ステップと；
（ｂ）前記多様なコレクションをスクリーニングし、かつ／または前記多様なコレクションから選択して、前記所望の特性を有する環状ペプチドを提示する少なくとも１つのバクテリオファージ粒子を得るステップと
を含み、ステップ（ｂ）は、
（ｂａ）バクテリオファージ粒子の前記多様なコレクションを注目する標的と接触させるステップと；
（ｂｂ）注目する標的に結合していないバクテリオファージ粒子を溶出するステップと；
（ｂｃ）注目する標的に結合しているバクテリオファージ粒子を溶出するステップと
をさらに含む方法に言及する。
【０１０９】
一実施形態において、本開示は、所望の特性を有する環状ペプチドを得る方法であって、
（ａ）バクテリオファージ粒子の多様なコレクションを提供するステップであって、前記バクテリオファージ粒子は、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している環状ペプチドの多様なコレクションから環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む、ステップと；
（ｂ）前記多様なコレクションをスクリーニングし、かつ／または前記多様なコレクションから選択して、前記所望の特性を有する環状ペプチドを提示する少なくとも１つのバクテリオファージ粒子を得るステップと
を含む方法に言及する。
【０１１０】
本開示の一実施形態において、前記所望の特性は、注目する標的への結合である。
【０１１１】
別の実施形態において、本開示は、所望の特性を有する環状ペプチドを得る方法であって、
（ａ）バクテリオファージ粒子の多様なコレクションを提供するステップであって、前記バクテリオファージ粒子は、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している環状ペプチドの多様なコレクションから環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む、ステップと；
（ｂ）前記多様なコレクションをスクリーニングし、かつ／または前記多様なコレクションから選択して、前記所望の特性を有する環状ペプチドを提示する少なくとも１つのバクテリオファージ粒子を得るステップと
を含み、ステップ（ｂ）は、
（ｂａ）バクテリオファージ粒子の前記多様なコレクションを注目する標的と接触させるステップと；
（ｂｂ）注目する標的に結合していないバクテリオファージ粒子を溶出するステップと；
（ｂｃ）注目する標的に結合しているバクテリオファージ粒子を溶出するステップと
をさらに含む方法に言及する。
【０１１２】
Ｌａｎ酵素
現在、いくつかのランチオニン架橋形成酵素またはメチルランチオニン架橋形成酵素、およびそれらの遺伝子が知られている：
１．ＬａｎＢ型デヒドラターゼは、酵素のＣ末端を構成することが示されており、セリンおよびトレオニンの脱水ステップを触媒することが提唱されている。
２．ＬａｎＣ型シクラーゼは、システインチオールの付加を触媒する。シクラーゼ構成要素のＬａｎＣは、亜鉛金属タンパク質であり、その結合金属が求核付加のためにチオール基質を活性化することが提唱されている。
３．ＬａｎＭ型酵素は、二機能性のデヒドラターゼおよびシクラーゼである。これは、ランチビオティック合成の間、前駆体ペプチドの脱水および環化の両方を担う。
４．ＬａｎＤ酸化デカルボキシラーゼ型酵素は、エピデルミンのＣ末端メソランチオニンのシステイン残基からの２還元当量の除去を触媒して、〜Ｃ＝＝Ｃ〜二重結合を形成する。
５．ＬａｎＫＣ型多機能性酵素は、リアーゼドメイン、キナーゼドメイン、およびシクラーゼドメインを含有するが、シクラーゼドメインにおいて、典型的な亜鉛リガンドを欠いている。
６．ＬａｎＬ型多機能性酵素は、リアーゼドメイン、キナーゼドメイン、および金属リガンド含有シクラーゼドメインを含有する。
７．ＬａｎＰ型ペプチダーゼは、ランチビオティックからリーダーペプチドを隔離している。
８．ＡＢＣトランスポータに融合したＬａｎＴ型ペプチダーゼ；前駆体ペプチドの切断は、分泌プロセスの一部として、トランスポータによって媒介される。
９．デヒドラターゼおよびデヒドロゲナーゼのＬｔｎＭ型およびＬｔｎＪ型は、Ｄ−アラニンの形成に関与する。
１０．ＣｉｎＸは、シンナマイシン生合成の間、アスパラギンを水酸化する。
【０１１３】
例えば、ランチビオティック（ランチオニン架橋またはメチルランチオニン架橋を含む抗生ペプチド）の形成において、ランチビオティック合成酵素は、膜結合複合体において組織化されると記載されている（Ｓｉｅｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１２２９４−１２３０１；Ｋｉｅｓａｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９，１４７５−１４８１；Ｓａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：４１−７）。そのような複合体は、ランチビオティックトランスポータ（ＬａｎＴ）、脱水された酵素（ＬａｎＢ；デヒドラターゼとも呼ばれる）、およびシクラーゼ（ＬａｎＣ）で構成される。一部のランチビオティックの場合、二機能性酵素（ＬａｎＭ）が、脱水ステップおよび環化ステップの両方を実行する。リボソーム合成される前駆体ペプチド中のＮ末端ランチビオティックリーダーペプチドは、脱水された酵素、または脱水および環形成の両方を実行する酵素で始まるランチビオティック酵素の認識シグナルである。リーダーペプチドは、ランチビオティック複合体に結合して、前駆体ペプチドをランチビオティック酵素の付近に持ち込むと考えられている。先行技術（例えば国際公開第２００６／０６２３９８号パンフレット参照）は、例えば、デヒドラターゼによって翻訳後脱水されることになる注目するペプチドを生産するための融合タンパク質中の、いくつかのランチビオティックリーダーペプチドおよびその使用を開示している。国際公開第２００６／０６２３９８号パンフレットに従えば、リーダーペプチドおよび修飾されることになるペプチドは、ＳＥＣ輸出シグナルのような非ランチビオティック輸出シグナル後にある。輸出シグナルおよびリーダーペプチドは、細胞アンカー配列、例えばＬＰＴＸ−ソルターゼ認識モチーフによって分離されてよい。
【０１１４】
ゲノムマイニング戦略は、最近詳細に記載されたように、当業者により、新規のリーダーペプチドおよびその同起源の修飾Ｌａｎ酵素を同定するのに使用され得る（Ｑｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｘｉａｏ  Ｙａｎｇ，Ｈｕａｎ  Ｗａｎｇ，Ｗｉｌｆｒｅｄ  Ａ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｎｋ（２０１４）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１４，９，２６８６−２６９４）。Ｌａｎ酵素は、配列類似性、類似のドメイン構造、および非常に保存されたモチーフによって特徴付けられる。例えば、現在まで知られているいくつかのＬａｎ酵素は、活性部位の亜鉛イオンの結合を支持するシクラーゼドメイン中に「ＣＨＧ」モチーフを含有する。他に、Ｚｎ２＋配位を支持する「ＣＣＧ」モチーフを含有することが同定された。Ｌａｎ酵素配列および保存されたモチーフをクエリとして用いれば、新規のＬａｎ酵素が、ＢｌａｓｔＰサーチにより他の生物において同定され得る。新規のＬａｎ酵素が同定されると、その同起源の基質のＬａｎＡ前駆体ペプチドが容易に検出される。なぜなら、それらは、通常、同じゲノムクラスターにおいて直近にコードされており、短いオープンリーディングフレームおよび他のＬａｎＡに対する配列類似性によって特徴付けられるからである。
【０１１５】
リーダー配列
あらゆるタイプのリーダー配列が、本開示を実行するのに用いられ得、但し、デヒドラターゼによって認識され得ることを条件とする。別の実施形態において、そのようなリーダー配列はまた、ランチオニン架橋またはメチルランチオニン架橋を形成することができるシクラーゼによって認識される。リーダー配列のアミノ酸配列は、公開データベースおよび刊行物から入手可能であり、Ｐｌａｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．２０１３  Ｍａｒ；１４（２）：８５−９６およびＰｌａｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．；Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１  Ｊａｎ；７７（２）：６０４−１１に記載されるようなリーダー配列およびリーダーコンセンサス配列が挙げられる。
【０１１６】
一実施形態において、前記リーダー配列は、ＬａｎＢ型デヒドラターゼ、ＬａｎＣ型シクラーゼ、二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素によって認識されるリーダー配列であるか、またはそのコンセンサスモチーフを有する。
【０１１７】
別の実施形態において、本開示のリーダー配列は、ＬａｎＡ前駆体ペプチドのリーダー配列、またはＬａｎＡ前駆体ペプチドに由来する既知のリーダー配列のアミノ酸配列アラインメントに由来し得るコンセンサスモチーフを有する。さらなる実施形態において、前記リーダー配列は、ＬａｎＡ前駆体ペプチドのリーダー配列であり、ＬａｎＡ前駆体ペプチドに由来するリーダー配列であるか、またはＬａｎＡ前駆体ペプチドのコンセンサスモチーフを有するリーダー配列であり、前記リーダー配列は、ランチペプチドシンセターゼによって認識される。さらなる実施形態において、前記リーダー配列は、ＬａｎＡ前駆体ペプチドのリーダー配列であり、ＬａｎＡ前駆体ペプチドに由来するリーダー配列であるか、またはＬａｎＡ前駆体ペプチドのコンセンサスモチーフを有するリーダー配列であり、前記リーダー配列は、ＬａｎＢ型デヒドラターゼ、ＬａｎＣ型シクラーゼ、二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素によって認識される。
【０１１８】
ＬａｎＡ前駆体ペプチドのアミノ酸配列は、公開データベースから入手可能であり、以下のＬａｎＡ前駆体ペプチドが挙げられる。
ＮｉｓＡ（ナイシン、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ））
ＰｒｏｃＡ（プロクロロシン、プロクロロコッカス・マリナス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）ＭＩＴ９３１３；プロクロロコッカス・マリナス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）ＭＩＴ９３０３）
ＳｐａＳ（サブチリン；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ６６３３）
ＬｃｔＡ（ラクチシン４８１；ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ））
ＭｕｔＡ（ミュータシンＩＩ、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））
ＭｉｂＡ（ミクロビスポリシン、ミクロビスポラ・コラリナ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ））
ＢｏｖＡ（ボビシンＨＪ５０；ウシ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）ＨＪ５０）
ＬａｎＡ１／２（リケニシジン、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））
ＣｉｎＡ（シンナマイシン、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＤＳＭ  ４０００５）
ＨａｌＡ１／２（ハロデュラシン、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））
ＣｙａｎＡ（命名なし、シアノセイス（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）属種ＰＣＣ  ７４２５）
Ｐｅｐ５（表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））
ＥｐｉＡ（エピデルミン、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））
【０１１９】
国際公開第２００６／０６２３９８号パンフレットの表１Ａおよび表１Ｂは、そのようなリーダーペプチドの例示的なアラインメントを示している。当業者であれば、アラインされた配列から、例えば公開されているまたは市販のアラインメントソフトウェア、例えばＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩのＡｌｉｇｎＸを用いてコンセンサスモチーフを導くことができるであろう。リーダー配列コンセンサスモチーフが、少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１５個の知られているリーダーペプチド配列のアラインメントに由来することが好ましい。このように得られたコンセンサスモチーフは、その後、リーダーペプチド活性、すなわちデヒドラターゼおよびセリン脱水またはトレオニン脱水による認識について、当該技術分野において知られている方法を用いて確認され得る。所定の標的配列の脱水は、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて監視され得る。
【０１２０】
リーダーペプチドコンセンサス配列は、種々のコンセンサス配列、例えばコンセンサスモチーフＸ１−Ｄ／Ｅ−Ｅ−Ｖ／Ｌ−Ｓ／Ｔ−Ｄ／Ｅ−Ｘ２−Ｅ−Ｌ−Ｄ／Ｅを含んでよく、Ｘ１は、あらゆる疎水性アミノ酸であり、Ｘ２は、あらゆるアミノ酸である。例えば、配列ＬＥＥＶＳＥＱＥＬＤ（配列番号７）を含む。別の実施形態において、リーダー配列は、コンセンサスモチーフＦ−Ｄ／Ｅ／Ｎ−Ｌ−Ｄ／Ｅ／Ｎ−Ｘ３を含み、Ｘ３はＬ、Ｉ、またはＶである。例えば、配列ＬＦＤＬＤＬ（配列番号８）またはＦＮＬＤＶ（配列番号９）を含む。リーダーはまた、例えば、コンセンサスＩ／Ｌ−Ｌ／Ｆ−Ｄ／Ｅ／Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｄ／Ｎ／Ａ／Ｓ／Ｔ−Ｌ／Ｍ−Ｄ／Ｅを含有してもよく、ＩＬＥＬＱＮＬＤ（配列番号１０）を含む。リーダーペプチドは、コンセンサス配列、例えばＦＮＬＤＶ（配列番号９）に続く、コンセンサス配列と、修飾されることになる前駆体ペプチドとの間のスペーサー配列で構成されてよい。このスペーサー配列は、修飾されることになる部分を各酵素の触媒中心の圏内に持ち込む（Ａｎｎｅｃｈｉｅｎ  Ｐｌａｔ，Ｌｅｏｎ  Ｄ．Ｋｌｕｓｋｅｎｓ，Ａｎｎｅｋｅ  Ｋｕｉｐｅｒｓ，Ｒｉｃｋ  Ｒｉｎｋ，Ｇｅｒｔ  Ｎ．Ｍｏｌｌ（２０１０））。Ｎ末端ドメインおよびスペーサーは、ナイシンリーダーペプチドの機能性にとって十分である（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７，６０４−６１１）。
【０１２１】
多くのクラスＩＩ  ＬａｎＡリーダーペプチドは、配列類似性に基づいてＮ１１Ｐ、ＴＩＧＲ０３８９８およびＮ１１Ｐのファミリーに割り当てられる一方、他のメンバーは、現在、ファミリー割当てを欠いている。別の実施形態において、リーダー配列はＰｒｏｃＡリーダーに由来し、これは、現在、プロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）属ＭＩＴ  ９３１３においてコードされる２９個の非常に保存されたメンバー、およびプロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）属ＭＩＴ  ９３０３においてコードされる別の１５個のメンバーを含み、これらは全てリーダーペプチドのＮ１１Ｐファミリーに割り当てられ、および同起源の株においてコードされる単一の修飾ＰｒｏｃＭ酵素の基質である。ほとんどのＰｒｏｃＡリーダー配列は、注目すべきことに、長く（６０アミノ酸を超える）、および全体的に高い保存性に起因して明確な最小のコンセンサス配列を有していない。しかしながら、ＰｒｏｃＡ２．８の親の６３残基リーダー配列の２３残基バージョンへのＮ末端切断は、ＰｒｏｃＭにより媒介される酵素による前駆体ペプチド修飾を完全に支持しており、これは、リーダー配列の大部分が重要でないこと、および機能的な最小配列が容易に導かれ得ることを示している。
【０１２２】
別の実施形態において、リーダー配列は、ＮｉｓＡ（ナイシン、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ））もしくはＰｒｏｃＡ（プロクロロシン、プロクロロコッカス・マリナス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）ＭＩＴ９３１３またはプロクロロコッカス・マリナス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）ＭＩＴ９３０３）リーダー配列であるか、またはＮｉｓＡもしくはＰｒｏｃＡリーダー配列に由来し得るコンセンサスモチーフを有する。
【０１２３】
本明細書中に開示されるさらなる実施形態：
１．バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示する方法であって、
（ａ）前駆体環状ペプチドをコードする核酸配列を保有する宿主細胞を提供するステップと；
（ｂ）前記前駆体環状ペプチドの発現を引き起こすかまたは可能にするステップと；
（ｃ）前駆体環状ペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸残基を酵素により脱水するステップと；
（ｄ）システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された前記残基の結合によって１つまたは複数の分子内結合を形成し、それにより環状ペプチドを形成するステップと；
（ｅ）前記宿主細胞中でバクテリオファージ粒子を産生させるステップと
を含み、前記バクテリオファージ粒子は、表面上に前記環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している、方法。
２．前記核酸配列は、バクテリオファージ粒子のコートタンパク質と、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列とをさらにコードする、実施形態１の方法。
３．宿主細胞は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素をコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに保有する、先行する実施形態の１つの方法。
４．前記翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素は、ランチペプチドシンセターゼである、実施形態２〜３の１つの方法。
５．前記翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素は、ＬａｎＢ型デヒドラターゼ、ＬａｎＣ型シクラーゼ、および／あるいは二機能性ＬａｎＭ型酵素または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素である、実施形態２〜４の１つの方法。
６．前記リーダー配列は、ＬａｎＡ前駆体ペプチドのリーダー配列であるか、ＬａｎＡ前駆体ペプチドに由来するリーダー配列であるか、またはＬａｎＡ前駆体ペプチドのコンセンサスモチーフを有するリーダー配列である、実施形態２〜５の１つの方法。
７．前記リーダー配列は、ＬａｎＢ型デヒドラターゼ、ＬａｎＣ型シクラーゼ、二機能性ＬａｎＭ型酵素、または多機能性ＬａｎＫＣもしくはＬａｎＬ型酵素によって認識される、実施形態６の方法。
８．前記リーダー配列は、ＮｉｓＡリーダー配列もしくはＰｒｏｃＡリーダー配列であるか、またはそのコンセンサスモチーフを有する、実施形態２〜７の１つの方法。
９．１つまたは複数の分子内結合は、シクラーゼにより、または穏やかな塩基性条件下で形成される、先行する実施形態の１つの方法。
１０．脱水された残基は、デヒドロアラニン（Ｄｈａ）またはデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）である、先行する実施形態の１つの方法。
１１．分子内結合は、チオエーテル架橋またはリジノアラニン架橋である、先行する実施形態の１つの方法。
１２．前記コートタンパク質は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質である、先行する実施形態の１つの方法。
１３．バクテリオファージ粒子の前記コートタンパク質は、野生型コートタンパク質ｐＩＩＩもしくは野生型コートタンパク質ｐＶＩＩＩであるか、またはそれに由来する、実施形態１２の方法。
１４．前記環状ペプチドは、遺伝的融合を介してまたは１つもしくは複数の人工的に導入されたシステインによって形成されるジスルフィド結合を介して、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着している、先行する実施形態の１つの方法。
１５．バクテリオファージ粒子の表面上に環状ペプチドを提示することができる核酸配列であって、核酸は、
（ａ）前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質と；
（ｂ）翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列と；
（ｃ）前駆体環状ペプチドと
をコードし、
前駆体環状ペプチドをコードする核酸は、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に位置決めされ、
前記前駆体環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合により、分子内結合を形成することができる、核酸配列。
１６．Ｎ末端からＣ末端まで以下の配置：
Ｎ−（ファージコートタンパク質）−（翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって認識されるリーダー配列）−（前駆体環状ペプチド）−Ｃ
を有する、実施形態１５の核酸配列。
１７．前記リーダー配列は、ＬａｎＡ前駆体ペプチドのリーダー配列であるか、ＬａｎＡ前駆体ペプチドに由来するリーダー配列であるか、またはＬａｎＡ前駆体ペプチドのコンセンサスモチーフを有するリーダー配列である、実施形態１５〜１７の核酸配列。
１８．前駆体環状ペプチドは、少なくとも１つまたは複数のセリンまたはトレオニン、および１つまたは複数のシステインまたはリジンを含む、実施形態１５〜１７の１つの核酸配列。
１９．実施形態１５〜１８の核酸を含むベクター。
２０．実施形態１５〜１８の１つの核酸配列または実施形態１９のベクターを含む宿主細胞。
２１．実施形態１〜１４の１つに従う方法によって得られる、環状ペプチドを表面上に提示するバクテリオファージ粒子。
２２．環状ペプチドを表面上に提示するバクテリオファージ粒子であって、前記環状ペプチドは、前記バクテリオファージ粒子のコートタンパク質のＣ末端に付着しており、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む、バクテリオファージ粒子。
２３．前記環状ペプチドを形成することができる前駆体環状ペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列を含むベクターをさらに含む、実施形態２１または２２のバクテリオファージ粒子。
２４．前記ベクターは、実施形態１９のベクターである、実施形態２３のバクテリオファージ粒子。
２５．実施形態２１〜２４の何れか１つのバクテリオファージ粒子の多様なコレクションであって、前記バクテリオファージ粒子は、それぞれ環状ペプチドの多様なコレクションから環状ペプチドを提示し、前記環状ペプチドは、システインまたはリジンへの１つまたは複数の脱水された残基の結合によって形成される分子内結合を含む、多様なコレクション。
２６．所望の特性を有する環状ペプチドを得る方法であって、
（ａ）実施形態２５のバクテリオファージ粒子の多様なコレクションを提供するステップと；
（ｂ）前記多様なコレクションをスクリーニングし、かつ／または前記多様なコレクションから選択して、前記所望の特性を有する環状ペプチドを提示する少なくとも１つのバクテリオファージ粒子を得るステップと
を含む方法。
２７．実施形態２６の方法であって、前記所望の特性は、注目する標的への結合である、方法。
【実施例】
【０１２４】
実施例１：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での可溶性チオエーテル架橋ペプチドの異種発現およびＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイを用いた修飾状態の確認
以下の実施例において、全ての分子生物学的実験は、標準的なプロトコル（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）に従って実行する。
【０１２５】
ベクターの構築、およびモデルペプチド（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断部位を含むペプチド）の可溶性発現：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのチオエーテル架橋ランチビオティックの異種発現が最近記載され、これは、前駆体ペプチドおよび同起源の修飾酵素の共発現によって達成された（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１１  Ｍａｒ  ２；１３３（８）：２３３８−４１）。本発明者らは、複雑な生体サンプル中での修飾状態の迅速な評価を可能にし、かつ微量の材料のみを必要とするリポーターペプチドを開発した。これらのペプチドは、人工コアペプチドに融合されるリーダーペプチド（例えば、ＮｉｓＡ、ＰｒｏｃＡ等に由来する）で構成され、これは、酵素によるチオエーテル架橋の導入のための基質残基および検出のための２つの親和性タグ（例えばＨｉｓ６タグおよびＦＬＡＧタグ）がフランキングするＦａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ切断部位を備える。
【０１２６】
ＩＰＴＧ誘導Ｌａｃプロモータの制御下において、アンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミド中に、これらのペプチドをコードするＤＮＡ配列をクローニングした。生じたプラスミドを、ＩＰＴＧ誘導ＰＬｌａｃｏ１プロモータの制御下での翻訳後修飾（例えば、ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ、ＰｒｏｃＭ等）のための同起源の酵素（ランチペプチドシンセターゼ）をコードする、和合性の第２のプラスミド（クロラムフェニコール耐性、ＲＳＦ１０３０複製起点）と組み合わせて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の同細胞内で共維持した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中でのＩＰＴＧ共誘導と同時に、線状前駆体ペプチドが産生されてから、これを酵素媒介ＰＴＭ修飾にかけることで、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断部位にフランキングする基質残基の共有結合および安定したチオエーテル架橋の形成が導かれる。
【０１２７】
発現後、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼによるペプチドの処理により、認識部位のアルギニンと、隣接する残基との間のペプチド結合が加水分解する。しかしながら、２つの別々のポリペプチドが生じる代わりに、それぞれが切断部位にフランキングする親和性タグの１つを含有し、安定したチオエーテル架橋は、連結した親和性タグの両方を備える２つのポリペプチドを維持する。
【０１２８】
したがって、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）におけるＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断後の２つの親和性タグの共検出を用いて、モデルペプチドの所望の修飾（環化）を確認することができるが、非修飾ペプチド（線状）について、２つのタグのうちの１つのみを検出可能である。
【０１２９】
モデルペプチドの修飾状態を監視する際のこのＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイの信頼性を以下に示す（図１）。ＮｉｓＡリーダーペプチドに融合したｏｍｐＡシグナル配列、ならびにＡＳＷＩＥＧＲＷＣＮ（配列番号１）配列（ＳおよびＣは、酵素媒介チオエーテル架橋導入のための基質である；ＩＥＧＲ：Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａの認識モチーフ）にフランキングするＨｉｓ６タグおよびＦＬＡＧタグで構成されるコアペプチドを含有するモデルペプチドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１Ｆ’中で修飾酵素ＮｉｓＢおよびＮｉｓＣの共発現の不在下または存在下において発現させた。
【０１３０】
コントロールとして、突然変異がなければ配列が同じである修飾不能突然変異ペプチド（ＳからＡ、またはＣからＡへの突然変異）を、ＮｉｓＢおよびＮｉｓＣの不在下または存在下で発現させた。
【０１３１】
全ての株を３７℃、２２０ｒｐｍにおいて初期の対数増殖期まで増殖させて、０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧの付加によってペプチドおよび酵素の発現を誘導し、培養体の増殖を２２℃において一晩継続した。細胞溶解物を確立して、各株の可溶性タンパク質画分の４反復を、抗Ｈｉｓ  ＩｇＧコーティングした３８４ウェルプレートに移して、発現したモデルペプチドを、Ｈｉｓ６タグを介して捕捉した。洗浄（４×ＴＢＳ、１×Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ反応バッファ）後、各サンプルの一方の２反復を５００ｎＭ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼで一晩消化したが、他方の２反復を未処理のままにした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した後、ビオチン化抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧを加えて、無傷のペプチドを、ストレプトアビジン：ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ結合体を用いて検出した（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００を用いて電気化学発光を測定した）。Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ処理なしで得たシグナルを１００％（インプット）に設定して、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ処理後の同サンプルについてシグナル比を算出した（Ｘａ処理後に残ったシグナル［％］）。これについて得られた値は、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断耐性ペプチドのパーセンテージを反映しており、チオエーテル架橋形成有効性の直接的な尺度である。
【０１３２】
図１に示すように、約６０％の切断耐性ペプチドがＮｉｓＢ酵素およびＮｉｓＣ酵素の共発現直後に得られるが、修飾酵素の不在下で産生されたペプチドはほぼ完全に切断される（左のパネル）。対照的に、酵素によるチオエーテル架橋形成のための基質ではない、ＳからＡ（真ん中のパネル）またはＣからＡ（右のパネル）への突然変異を含有するペプチド変異体は、ＮｉｓＢおよびＮｉｓＣの共発現の存在下で産生される場合ですらＦａｃｔｏｒ  Ｘａによって完全に切断される。
【０１３３】
実施例２：前駆体ペプチドを含有するＮｉｓＡリーダーのｐＩＩＩへのＣ末端融合は、プロデューサ細胞中での酵素によるチオエーテル架橋形成およびファージ上での提示を支持する
ほとんどのファージディスプレイ用途において、注目するタンパク質またはペプチドは、ｇ３ｐ（マイナーなコートタンパク質ｐＩＩＩ）またはｇ８ｐ（主要なコートタンパク質ｐＶＩＩＩ）のＮ末端に遺伝的に融合して、それぞれ一価提示および多価提示をもたらす。ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩのＮ末端は、ファージ粒子体から離れる方に向けられて、これが、注目する推定のリガンドに結合するための提示されるタンパク質またはペプチドのアクセシビリティを支持すると考えられている。
【０１３４】
しかしながら、Ｎ末端上での注目するタンパク質の広く利用される提示に加えて、ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩの対応するＣ末端上でのファージ提示の稀な例が記載されてきた（Ｆｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２０００  Ｓｅｐ  １；４８０（２−３）：２３１−４；Ｈｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４  Ｊｕｌ  ９；３４０（３）：５８７−９７）。
【０１３５】
ファージ上の環化されたモデルペプチドの提示について、図１に示すモデル前駆体ペプチド配列を含有する同じＮｉｓＡリーダーを、ファージｇ３ｐ（Ｎ末端切断型変異体ｐＩＩＩ−ＣＴ）のＮ末端およびＣ末端の両方への遺伝的融合体としてファージミドベクター中にクローニングして、酵素によるペプチド修飾およびファージ粒子上の提示との適合性について試験した。
【０１３６】
本発明者らは、これらの融合体をコードするファージ粒子を同起源の修飾酵素の共発現の存在下または不在下で産生させて、これをＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイにかけた。
【０１３７】
まとめると、Ｎ末端またはＣ末端モデルの前駆体ペプチド（ＮｉｓＡリーダーを含有する）のｐＩＩＩへの融合のための発現プラスミドを収容する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１Ｆ’細胞を、修飾ＮｉｓＢ酵素およびＮｉｓＣ酵素をコードする第２の発現プラスミドの存在下または不在下で３反復増殖させた。培養体を２４ウェルプレート内で３７℃、２２０ｒｐｍにおいて初期の対数増殖期まで増殖させて、約１０の感染多重度においてＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを感染させた。感染細胞を遠心分離によって収穫した後、ｐＩＩＩ融合体および修飾酵素の発現をＩＰＴＧ含有培地によって誘導し、２２℃において１６時間にわたりファージ産生を進めた。遠心分離によるプロデューサ細胞の除去後、ファージ含有上澄みを、抗Ｍ１３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）ＩｇＧコーティングした３８４ウェルプレートに４反復移して、主要なコートタンパク質ｐＶＩＩＩを介してファージ粒子を捕捉した。
【０１３８】
洗浄（４×ＴＢＳ、１×Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ反応バッファ）後、一方の２反復サンプルを５００ｎＭ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼで一晩消化したが、他方の２反復を未処理のままにした。
【０１３９】
プレートをＴＢＳＴで洗浄した後、ビオチン化抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ；Ｎ末端ｐＩＩＩ融合体について）、またはビオチン化抗Ｈｉｓ  ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃ末端ｐＩＩＩ融合体について）を加えて、無傷のペプチドを、ストレプトアビジン：ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ結合体を用いて検出した（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００を用いて電気化学発光を測定した）。Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ処理なしで得たシグナルを１００％（インプット）に設定して、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ処理後の同サンプルについてシグナル比を算出した（Ｘａ処理後に残ったシグナル［％］）。これについて得られた値は、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断耐性ペプチドのパーセンテージを反映しており、チオエーテル架橋形成有効性の直接的な尺度である。
【０１４０】
図２Ａに示すように、ファージ産生中のＮｉｓＢ酵素およびＮｉｓＣ酵素の共発現は、ｐＩＩＩのＣ末端に融合した前駆体ペプチドの酵素によるチオエーテル架橋修飾、およびその後のファージ表面上での環状ペプチドの提示をもたらす（左のパネル）。対照的に、ｐＩＩＩのＮ末端への同前駆体ペプチドの融合は、ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ媒介修飾をもたらさず、環状ペプチドをファージ上で検出することはできなかった（右のパネル）。この発見は、前駆体ペプチド融合キャリアとして、発現された可溶性のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を用いて得た結果によってさらに支持され、Ｃ末端へのペプチド融合は、酵素で修飾されたが（図２Ｃ、左のパネル）、ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣは、Ｎ末端融合を修飾することができなかった（図２Ｃ、右のパネル；サンプル調製およびアッセイセットアップは、本質的に実施例１に記載したものである）。ｐＩＩＩへのＣ末端前駆体ペプチド融合の関連で、チオエーテル架橋形成に関与する残基の突然変異、例えば、セリンからアラニン（ｐＩＩＩ−ＮｉｓＡ−Ｐｅｐ＿Ａ／Ｃ；図２Ｂ、左のパネル）、またはシステインからアラニン（ｐＩＩＩ−ＮｉｓＡ−Ｐｅｐ＿Ｓ／Ａ；図２Ｂ、右のパネル）は、環状ペプチドの形成および提示を排除している。これは、ペプチド修飾の調整が正確に達成されたことをさらに強調するものである。
【０１４１】
実施例３：翻訳後修飾ペプチドのＣ末端ｐＩＩＩファージディスプレイは、広く適用可能であり、他の酵素系に移すことができる
ファージ構造タンパク質のＣ末端上での翻訳後修飾ペプチドの提示の記載したアプローチは、以下で概説するように、他の酵素修飾系または半酵素修飾系に容易に適応し得る。別の実施例において、モデル前駆体ペプチドは、プロクロロシン３．３（ＰｒｏｃＡ３．３）リーダーペプチドおよびコアペプチド配列
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（配列番号６；Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断部位ならびに翻訳後修飾用のフランキングするＳ残基およびＣ残基に下線を引いている）を含有するｐＩＩＩ（プラスミド：ｐＬ３Ｃ＿Ｐ３．３＿ｍｕｔ１０−Ｈｉｓ）のＣ末端に融合し、Ｈｉｓ６タグが続く。さらなるコントロール構築体において、親のコアペプチドのセリンをトレオニンに（デヒドロブチリンを介したメチルランチオニン形成について試験するために）突然変異させ、またはシステインをアラニンに（酵素によるチオエーテル架橋形成を防止するために）突然変異させた。
【０１４２】
天然に存在するいくつかのプロクロロシン（ＰｒｏｃＡ３．３が挙げられる）前駆体を修飾することが知られている二機能性デヒドラターゼ／シクラーゼをコードするプロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）属ＭＩＴ９３１３由来のｐｒｏｃＭ遺伝子を、染色体ＤＮＡから増幅して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミド中にクローニングした。モデル前駆体ペプチドを提示するファージを、先に記載したように、ＰｒｏｃＭ酵素共発現の存在下または不在下で産生させて、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイにかけた。Ｘａ切断耐性ペプチド融合体は、二重特異的修飾ＰｒｏｃＭ酵素の存在下で産生された場合、コア配列を含有するセリン／システイン（ＰｒｏｃＡ−Ｐｅｐ＿Ｓ／Ｃ−ｐＩＩＩ；図３、左のパネル）およびトレオニン／システイン（ＰｒｏｃＡ−Ｐｅｐ＿Ｔ／Ｃ−ｐＩＩＩ；図３、真ん中のパネル）の変異体について検出された。これは、ランチオニンおよびメチルランチオニンをそれぞれ含む環状ペプチドの形成および提示を示している。ここでも、チオエーテル架橋形成に関与するシステインがアラニンに突然変異した場合、環状ペプチドの形成／提示が無効にされた（ＰｒｏｃＡ−Ｐｅｐ＿Ｓ／Ａ−ｐＩＩＩ；図３、右のパネル）。
【０１４３】
実施例４：環のサイズが可変的な翻訳後修飾ペプチドのＣ末端ｐＩＩＩファージディスプレイ
環のサイズを調整したＣ末端ｐＩＩＩペプチド融合体を、酵素的修飾に必要とされるシステインに対して、セリン残基およびトレオニン残基の間隔を調整することによりファージ上に提示することができる。別の実施例において、セリンからシステインまでの間隔が増大したモデル前駆体ペプチドをコードする配列を確立して、ｐＩＩＩのＣ末端に融合させた。本明細書では、ＮｉｓＡリーダーペプチドに、ＦＬＡＧタグ、および
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モチーフ（配列番号１１）、
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モチーフ（配列番号１２）、
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モチーフ（配列番号１３）、または
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モチーフ（配列番号１４；ｉ，ｉ＋７、ｉ，ｉ＋１０、ｉ，ｉ＋１３、およびｉ，ｉ＋１７の環サイズをそれぞれ可能とする；Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断部位に下線を引いている）の何れかが続いて、Ｈｉｓ６タグが続き、ｐＩＩＩのＣ末端に融合した。同様に、ＰｒｏｃＡ３．３リーダーペプチドに、ＨＡタグ、および
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モチーフ（配列番号１１）、
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モチーフ（配列番号１２）、
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モチーフ（配列番号１３）、または
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モチーフ（配列番号１４）の何れかが続いて、Ｈｉｓ６タグが続き、ｐＩＩＩのＣ末端に融合した。ＮｉｓＡリーダー配列またはＰｒｏｃＡリーダー配列を有するモデル前駆体ペプチドを提示するファージをそれぞれ、先に記載したように同起源の修飾ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ酵素またはＰｒｏｃＭ酵素の存在下または不在下で産生させて、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断リポータアッセイにかけた。ファージ上に提示されたＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断耐性（チオエーテル架橋）ペプチド融合を、ＮｉｓＢ／ＮｉｓＣ（図５Ａ）およびＰｒｏｃＭ（図５Ｂ）の両方の酵素系を用いて観察した。切断耐性ペプチド融合体のパーセンテージによって判断されるように、試験したペプチドの修飾有効性は、大部分が環のサイズから独立している。
【０１４４】
実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのファージｐＩＩＩのＣ末端に融合したリーダー配列含有ペプチドの酵素による翻訳後修飾、およびその後のファージ粒子上での提示を実証している。類似した結果が、ファージの主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩへのＣ末端前駆体ペプチド融合について予想され得る。
【０１４５】
本明細書に記載したアプローチの広い適用性が容易に明らかである。なぜなら、かなり遠縁の種、例えば乳酸菌およびシアノバクテリアに由来する異なる酵素機構／リーダーペプチド対を、翻訳後修飾を導入するのに効果的に用いることができるからである。同様に、この概念は、機能的に均等である他の前駆体ペプチド／酵素系に拡張することができる。
【０１４６】
要約すると、ＮｉｓＢ等のデヒドラターゼまたはＰｒｏｃＭ等の二機能性酵素による、セリン残基およびトレオニン残基の非常に化学反応性のデヒドロアラニンおよびデヒドロブチリンそれぞれへの翻訳後脱水、ならびにＮｉｓＣ等のシクラーゼ、またはＰｒｏｃＭ等の二機能性酵素による環状ペプチドの形成は、ファージディスプレイに適合すると証明された。
【０１４７】
代わりとして、穏やかなアルカリ条件下において、ファージディスプレイされた、デヒドロアラニンを含有するペプチドは、隣接するシステイン残基およびリジン残基と容易に反応して、それぞれチオエーテル架橋およびリジノアラニン架橋を形成して、ファージ粒子上に提示される、拘束された種々のポリペプチド構築体を形成する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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