(57)【要約】本発明は、ＦＤＣＡを生産するための真菌細胞に関する。真菌細胞は、ａ）５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸を５−ホルミル−２−フロ酸に酸化させる能力を細胞に付与する又は細胞において増大させる遺伝的修飾、及びｂ）細胞における２，５−フランジカルボン酸の異化を低減させる遺伝的修飾、のうちの少なくとも１つを有するように遺伝的に修飾されている。真菌細胞は、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させる細胞の能力を増大させるようにさらに遺伝的に修飾することができる。本発明はまた、本発明の細胞が、ＦＤＣＡのフラン前駆体を酸化させるために使用される、２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）の生産のための方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）遺伝的修飾を欠損している対応する野生型細胞と比べ、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化させる能力を真菌細胞に付与する、又はＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる酵素の比活性を前記細胞において増大させる、遺伝的修飾；及び
ｂ）遺伝的修飾を欠損している対応する野生型細胞と比べ、２，５−フランジカルボン酸の異化に関係する酵素の比活性を低減又は除去する遺伝的修飾
のうちの少なくとも１つである遺伝的修飾を含む真菌細胞。
【請求項２】
ｃ）前記遺伝的修飾を欠損している対応する野生型細胞と比べ、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させる能力を真菌細胞に付与する、又はフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させる酵素の比活性を前記細胞において増大させる、遺伝的修飾
をさらに含む、請求項１に記載の真菌細胞。
【請求項３】
ａ）ａ）における前記遺伝的修飾が、
ｉ）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１〜４のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現を増大させる修飾、及び
ｉｉ）フランオキシダーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号７〜９のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現を増大させる修飾、
のうちの少なくとも１つであり；
ｂ）ｂ）における前記遺伝的修飾が、
ｉ）ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードしている遺伝子であって、配列番号１０及び１１のうちの少なくとも１つと少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であることが好ましい遺伝子、
ｉｉ）ＦＤＣＡデカルボキシラーゼをコードしている遺伝子であって、配列番号１２と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であることが好ましい遺伝子、
ｉｉｉ）ＦＤＣＡ脱炭酸デカルボキシラーゼをコードしている遺伝子であって、配列番号１３と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であることが好ましい遺伝子、及び
ｉｖ）ＦＤＣＡ脱炭酸に起因するラクトンを加水分解するラクトナーゼをコードしている遺伝子であって、配列番号１４と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であることが好ましい遺伝子
のうちの少なくとも１つの発現を低減又は除去する修飾である、
請求項１又は２に記載の真菌細胞。
【請求項４】
ｃ）における前記遺伝子修飾が、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させる能力、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させる能力、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させる能力のうちの少なくとも１つを有するフランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号５及び６のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現を増大させる修飾である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の真菌細胞。
【請求項５】
ａ）ＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡを対応するアルコールに還元する短鎖デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子であって、配列番号１５と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている遺伝子、及び配列番号６９と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている遺伝子のうちの少なくとも１つであることが好ましい遺伝子の発現を低減又は除去する遺伝的修飾；
ｂ）少なくとも１つのフラン化合物を輸送するポリペプチドであって、配列番号１６〜１８のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましいポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現を増大させる遺伝的修飾；及び
ｃ）フランの異化に関係する遺伝子の転写アクチベーターをコードしている遺伝子であって、配列番号１９と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている遺伝子であることが好ましい遺伝子の発現を変化させる遺伝的修飾
から選択される遺伝的修飾をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、及びウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群の属から選択される糸状菌細胞であり、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）及びペニシリウム・ブラジリアヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ）からなる群の種から選択される糸状菌細胞であることが好ましく、又は
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｏｐｓｉｓ）、サッカロミコデス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）、ウィッカーハミア（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）、クライシア（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ）、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、メチニコビア（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、ナカザワエア（Ｎａｋａｚａｗａｅａ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、及びスポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）からなる群の属から選択される酵母細胞であり、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、及びピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からなる群の種から選択される酵母細胞であることが好ましい、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
ポリペプチドの発現を誘導する条件下で請求項１〜６のいずれか一項で定義した細胞を培養するステップと、任意選択でポリペプチドを回収するステップとを含む、請求項１〜５のいずれか一項で定義したポリペプチドを調製する方法であって、前記ポリペプチドが、
ａ）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ；
ｂ）フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ；
ｃ）フランアルコール／アルデヒドオキシダーゼ；
ｄ）ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ；
ｅ）ＦＤＣＡデカルボキシラーゼ；
ｆ）ＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼ；
ｇ）ＦＤＣＡ脱炭酸に起因するラクトンを加水分解するラクトナーゼ；
ｈ）ＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡを対応するアルコールに還元する短鎖デヒドロゲナーゼ；
ｉ）少なくとも１つのフラン化合物のトランスポーター；又は
ｊ）フランの異化に関係する遺伝子の転写アクチベーター
である、方法。
【請求項８】
ＨＭＦＣＡの存在下で、細胞によるＨＭＦＣＡの酸化を誘導する条件下で、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞であることが好ましい、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有する酵素を発現する真菌細胞をインキュベートするステップを含む、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる方法。
【請求項９】
ＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体を含む培地中で、好ましくは細胞によるＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化を誘導する条件下で、請求項１〜６のいずれか一項に記載の真菌細胞をインキュベートするステップと、任意選択でＦＤＣＡを回収するステップとを含む、ＦＤＣＡを生産する方法であって、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ）、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）からなる群から選択されることが好ましく、このうちＨＭＦが最も好ましく、
前記ＦＤＣＡのフラン前駆体が、好ましくは酸触媒による脱水によって、１つ又は複数のヘキソース糖、好ましくはリグノセルロースバイオマスから得られる１つ又は複数のヘキソース糖から得られ、
前記ＦＤＣＡが、酸沈殿後の冷却結晶化及び／又は溶媒抽出を含む方法によって培地から回収される、
ＦＤＣＡを生産する方法。
【請求項１０】
ＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体を含む、ｐＨ２．０〜３．０の範囲の培地中で、好ましくは細胞によるＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化を誘導する条件下で、ＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する１つ又は複数の酵素を発現する真菌細胞をインキュベートするステップを含む、ＦＤＣＡを生産する方法であって、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ）、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）からなる群から選択されることが好ましく、そのうちＨＭＦが最も好ましく、
前記ＦＤＣＡのフラン前駆体が、好ましくは酸触媒による脱水によって、１つ又は複数のヘキソース糖、好ましくは、リグノセルロースバイオマスから得られる１つ又は複数のヘキソース糖から得られ、
前記ＦＤＣＡが、それが生産される酸性培地から沈殿し、酸沈殿の後に冷却結晶化を含む方法によって培地から回収されることが好ましい、
ＦＤＣＡを生産する方法。
【請求項１１】
前記真菌細胞が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞、又はＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する１つ又は複数の細菌酵素を発現する真菌細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法においてＦＤＣＡモノマーを調製するステップと、
ｂ）ａ）で得られたＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産するステップと
を含む、少なくとも２つのＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産する方法。
【請求項１３】
フラン前駆体のうちの１つ又は複数をＦＤＣＡに生物変換するための真菌細胞、好ましくは請求項１〜６のいずれか一項に記載の真菌細胞、又はＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する１つ又は複数の細菌酵素を発現する真菌細胞の使用であって、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及びＤＦＦからなる群から選択されることが好ましく、このうちＨＭＦが最も好ましい、真菌細胞の使用。
【請求項１４】
ａ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有し、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７３．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６９．４％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８４．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及び
ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
のうちの少なくとも１つであるアミノ酸配列を含む、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ；
ｂ）ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの酸化させる能力を有し、
ｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及び
ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列
のうちの少なくとも１つであるアミノ酸配列を含む、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ；
ｃ）ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＨＭＦをＤＦＦに酸化させること、ｉｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること、ｉｖ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させること、及びｖ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの酸化させる能力を有し、
ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも６２．７％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも４９．３％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及び
ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも６６．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
のうちの少なくとも１つであるアミノ酸配列を含む、フランオキシダーゼ活性；
ｄ）
ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８２．３％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも４３．４％の配列同一性を有するアミノ酸配列
のうちの少なくとも１つであるアミノ酸配列を含むＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ；
ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６２．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＤＣＡデカルボキシラーゼ；及び
ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５．４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼ；
ｇ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも６７．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＦＤＣＡの脱炭酸に起因するラクトンを加水分解する能力を有するラクトナーゼ；
ｈ）ＨＭＦ及びＦＦＣＡのうちの少なくとも１つを対応するアルコールに還元することができ、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７３．６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、短鎖デヒドロゲナーゼ；
ｉ）
ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８５．２％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも６９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８４．１％の配列同一性を有するアミノ酸配列
のうちの少なくとも１つであるアミノ酸配列を含むフラン化合物のトランスポーター；
ｊ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも５２．４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、フランの異化に関係する遺伝子の転写アクチベーター
からなる群から選択されるポリペプチド。
【請求項１５】
ａ）請求項１０で定義したポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２０〜３５に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０、又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び
ｅ）ａ）〜ｄ）に記載のヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子であって、
ベクターであることが好ましい核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子遺伝学、代謝工学、生体内変換及び発酵工学の分野に関する。特に、本発明は、ヒドロキシメチルフルフラールから２，５−フランジカルボン酸を生産するように遺伝的に修飾されている真菌に関する。本発明はさらに、ヒドロキシメチルフルフラールを２，５−フランジカルボン酸に生体内変換する方法におけるこのような真菌の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）は、極めて経済的影響のあるポリエステルの生産に適用し得るモノマー化合物である。この分野における非常に重要な化合物は、テレフタル酸（ＰＴＡ）及びエチレングリコールから生産されるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）である。ＦＤＣＡはポリエステルＰＥＴ中のＰＴＡに置き換えることができ、その場合には、ポリエチレンフランジカルボキシラート（ＰＥＦ）が得られる。ＰＥＦは、大きなポリエステル市場においてＰＥＴに代わる有効な可能性を有している。ＰＥＦは、ＰＥＴと比べた場合に優れた特性があるだけでなく、再生可能な供給原料から得ることができるからである。ＦＤＣＡは、糖から、化学的に（Ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｉｎ：  Ｂｉｏｂａｓｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒｓ，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ；  Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．；  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ；  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）、又は化学的−生物学的な併用経路（Ｗｉｅｒｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９２：１０９５−１１０５）のいずれかで生産することができる。後者の場合には、グルコース又はフルクトースなどのモノマー糖は、５−（ヒドロキシメチル）−２−フルアルデヒド（ＨＭＦ）に化学的に変換され、これは続いて酵素によってＦＤＣＡに酸化され得る。
【０００３】
ＦＤＣＡをＨＭＦから生産する生物学的経路は、カプリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４のＨＭＦ分解株の単離に基づいて開発されている（Ｗｉｅｒｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：３３６−３４３）。カプリアビダス・バシレンシス  ＨＭＦ１４におけるＨＭＦ分解経路に関与する酵素をコードしている遺伝子のクラスターは同定され、関連遺伝子がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２株において異種発現されており（Ｋｏｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．ＰＮＡＳ  １０７：４９１９−４９２４）、それにより、ＨＭＦを代謝する能力を獲得された。主としてＨＭＦ−酸（ＨＭＦＣＡ）でオキシダーゼとして作用するが、ＨＭＦ又はＦＦＣＡも酸化させることができるＨＭＦオキシドレダクターゼをコードしているｈｍｆＨ遺伝子のみの異種発現によって、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２は、ＨＭＦからＦＤＣＡを生産することができる（Ｋｏｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０１：６２９１−６２９６；及び国際公開第２０１１／０２６９１３号）。さらなる最適化の研究において（Ｗｉｅｒｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、前掲；及び国際公開第２０１２／０６４１９５号）、それぞれ未知の特性を有するＨＭＦＣＡトランスポーター及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、２種の追加の遺伝子がシュードモナス・プチダＳ１２において発現された。
【０００４】
酵母は、ＨＭＦ（Ｐａｒａｗｉｒａ  ａｎｄ  Ｔｅｋｅｒｅ，２０１１，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：２０−３１）を、エタノール生産方法の対応する死細胞産物である５−ヒドロキシメチルフルフリルアルコール（ＨＭＦ−アルコール）に還元するその能力に関して広く研究されている。ＨＭＦを完全に酸化して増殖のために化合物を利用することができる酵母に関する報告はこれまで発表されていない。
【０００５】
米国特許第７，０６７，３０３号は、真菌のコニオカエタ・リグニアリア（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｌｉｇｎｉａｒｉａ）（テレオモルフ）又はそのレシトフォラ（Ｌｅｃｙｔｈｏｐｈｏｒａ）アナモルフ状態が、農業用バイオマス加水分解物中のフラン、特にフルフラール及びＨＭＦの毒性レベルを有意に激減させることができることを開示している。糖含有加水分解物の解毒化における生物物質としてのＣ．リグニアリア（Ｃ．ｌｉｇｎｉａｒｉａ）の使用は、その後の多数の論文においてさらに証明されている（Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６４：１２５−１３１；Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｐｒｉｎｇ；１２１−１２４：３７９−９０；Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４２：６２４−６３０；Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １９：７５４５−５０；Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  ６７：７９−８８）。ＨＭＦをより毒性の低い化合物に解毒化することとは別に、この生物はまた、増殖のためにＨＭＦも代謝することができた。
【０００６】
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ３：２６）は、そのトウモロコシ茎葉加水分解物を解毒化する２つのＨＭＦ代謝真菌の単離を記載し、それぞれアモルフォセカ・レジナエ（Ａｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ  ｒｅｓｉｎａｅ）及びエウペニシリウム・バーネンセ（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂａａｒｎｅｎｓｅ）として同定した。その後の論文（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ７：５１）において、ＺＮ１と呼ばれるＡ．レジナエ株の増殖は、ＨＭＦを含む多くの化合物によって支えられることが報告された。ＨＭＦは分解され、ＨＭＦアルコール及びＨＭＦＣＡは、時間と共に蓄積するが、ＦＤＣＡの蓄積は報告されなかった。
【０００７】
Ｇｏｖｉｎｄａ  Ｒａｊｕｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４，Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  １３：１０４９−１０５６）も同様に、フルフラール及び／又はＨＭＦを唯一の炭素源として利用する能力を有する多数の真菌を単離したが、この場合もＦＤＣＡの蓄積は報告されなかった。
【０００８】
したがって、ＨＭＦを使用して増殖するか、又はＨＭＦ含有供給原料を解毒化する、いくつかの真菌が記載されている。酵母に関して、供給原料を解毒化する目的でＨＭＦをＨＭＦ−アルコールに還元する観点からこの生物を試験した。しかし、酵母又は糸状菌によるＦＤＣＡの生産は記載されていない。それにもかかわらず、真菌によるＨＭＦからＦＤＣＡの生産は、当技術分野における細菌による方法と比べ、いくつかの固有の利点を提供するであろう。例えば、多くの真菌は、増殖に関してｐＨ＝３又はそれより下の低いｐＨ値に耐えるが、ほとんどの細菌は中性のｐＨ環境を好む。ＦＤＣＡの大規模生産の特定の状況において、低いｐＨ値で細胞全体による生産方法論が利用できれば、後工程（ＤＳＰ）において及び感染症と闘うために有利であることから、大いに有利であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ＨＭＦからＦＤＣＡを生産する方法における真菌細胞及びその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様において、本発明は、ａ）遺伝的修飾を欠損している対応する野生型細胞と比べ、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化させる能力を真菌細胞に付与する、又はＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる酵素の比活性を上記細胞において増大させる、遺伝的修飾；及びｂ）遺伝的修飾を欠損している対応する野生型細胞と比べ、２，５−フランジカルボン酸の異化に関係する酵素の比活性を低減又は除去する遺伝的修飾、のうちの少なくとも１つである遺伝的修飾を含む真菌細胞に関する。真菌細胞は、ｃ）遺伝的修飾を欠損している対応する野生型細胞と比べ、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させる能力を真菌細胞に付与する遺伝的修飾、又はフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させる酵素の比活性を上記細胞において増大させる遺伝的修飾、をさらに含むことが好ましい。本発明による真菌細胞において、ａ）ａ）の遺伝的修飾は、ｉ）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１〜４のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現を増大させる修飾；及びｉｉ）フランオキシダーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号７〜９のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現を増大させる修飾のうちの少なくとも１つであり；ｂ）ｂ）の遺伝的修飾は、ｉ）ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子であって、配列番号１０及び１１のうちの少なくとも１つと少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であることが好ましい遺伝子；ｉｉ）ＦＤＣＡデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であって、配列番号１２と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であることが好ましい遺伝子；ｉｉｉ）ＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であって、配列番号１３と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であることが好ましい遺伝子；及びｉｖ）ＦＤＣＡ脱炭酸に起因するラクトンを加水分解するラクトナーゼをコードする遺伝子であって、配列番号１４と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であることが好ましい遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低減又は除去する修飾であり；ｃ）ｃ）の遺伝的修飾は、アルデヒドデヒドロゲナーゼが、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させる能力、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させる能力、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させる能力のうちの少なくとも１つを有する、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号５及び６のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現を増大させる修飾である。本発明による真菌細胞は、ａ）配列番号１５と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている遺伝子であることが好ましい、ＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡを対応するアルコールに還元する短鎖デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子の発現を低減又は除去する遺伝的修飾；ｂ）配列番号１６〜１８のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい、少なくとも１つのフラン化合物を輸送するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現を増大させる遺伝的修飾；並びにｃ）配列番号１９と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている遺伝子であることが好ましい、フランの異化に関係する遺伝子の転写アクチベーターをコードしている遺伝子の発現を変化させる遺伝的修飾、から選択される遺伝的修飾をさらに含むことが好ましい。本発明による好ましい真菌細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、及びウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群の属から選択される糸状菌細胞であり、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）及びペニシリウム・ブラジリアヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ）からなる群の種から選択される糸状菌細胞であることがより好ましく、又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｏｐｓｉｓ）、サッカロミコデス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）、ウィッカーハミア（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）、クライシア（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ）、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、メチニコビア（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、ナカザワエア（Ｎａｋａｚａｗａｅａ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、及びスポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）からなる群の属から選択される酵母細胞であり、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、及びピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からなる群の種から選択される酵母細胞であることがより好ましい。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、ポリペプチドの発現を誘導する条件で本発明の第１の態様において上記で定義した真菌細胞を培養するステップと、任意選択でポリペプチドを回収するステップとを含む、本発明の第１の態様において上記で定義したポリペプチドを調製する方法であって、上記ポリペプチドが、ａ）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ；ｂ）フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ；ｃ）フランアルコール／アルデヒドオキシダーゼ；ｄ）ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ；ｅ）ＦＤＣＡデカルボキシラーゼ；ｆ）ＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼ；ｇ）ＦＤＣＡ脱炭酸に起因するラクトンを加水分解するラクトナーゼ；ｈ）ＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡを対応するアルコールに還元する短鎖デヒドロゲナーゼ；ｉ）少なくとも１つのフラン化合物のトランスポーター；又はｊ）フランの異化に関係する遺伝子の転写アクチベーターである、方法に関する。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、ＨＭＦＣＡの存在下で、細胞によるＨＭＦＣＡの酸化を誘導する条件下で、本発明の第１の態様において上記で定義した真菌細胞であることが好ましい、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有する酵素を発現する真菌細胞をインキュベートするステップを含む、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる方法に関する。
【００１３】
第４の態様において、本発明は、ＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体を含む培地中で、好ましくは細胞によるＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化を誘導する条件下で、本発明の第１の態様において上記で定義した真菌細胞をインキュベートするステップと、任意選択でＦＤＣＡを回収するステップとを含む、ＦＤＣＡを生産する方法であって、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ）、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）からなる群から選択されることが好ましく、そのうちＨＭＦが最も好ましく、ＦＤＣＡのフラン前駆体が、好ましくは酸触媒による脱水によって、１つ又は複数のヘキソース糖、好ましくはリグノセルロースバイオマスから得られる１つ又は複数のヘキソース糖から得られ、ＦＤＣＡが酸沈殿、続いて冷却結晶化及び／又は溶媒抽出を含む方法によって培地から回収されることが好ましい、ＦＤＣＡを生産する方法に関する。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、ＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体を含むｐＨ２．０〜３．０の範囲の培地中で、好ましくは細胞によるＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化を誘導する条件下で、ＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する１つ又は複数の酵素を発現する真菌細胞をインキュベートするステップを含む、ＦＤＣＡを生産する方法であって、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ）、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）からなる群から選択されることが好ましく、そのうちＨＭＦが最も好ましく、ＦＤＣＡのフラン前駆体が、好ましくは酸触媒による脱水によって、１つ又は複数のヘキソース糖、好ましくはリグノセルロースバイオマスから得られる１つ又は複数のヘキソース糖から得られ、ＦＤＣＡが、それが生産される酸性培地中で沈殿し、酸沈殿に続いて冷却結晶化を含む方法によって培地から回収されることが好ましい、ＦＤＣＡを生産する方法に関する。本発明の第５の態様による方法において、真菌細胞は、本発明の第１の態様において上記で定義した真菌細胞、又はＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する１つ又は複数の細菌酵素を発現する真菌細胞であることが好ましい。
【００１５】
第６の態様において、本発明は、本発明の第４又は第５の態様による方法においてＦＤＣＡモノマーを調製するステップと、ａ）で得られたＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産するステップとを含む、１つ若しくは複数、又は少なくとも２つのＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産する方法に関する。
【００１６】
第７の態様において、本発明は、フラン前駆体のうちの１つ又は複数をＦＤＣＡに生物変換するための真菌細胞、好ましくは本発明の第１の態様において上記で定義された真菌細胞、又はＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する１つ又は複数の細菌酵素を発現する真菌細胞の使用であって、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、及びＤＦＦからなる群から選択されることが好ましく、そのうちＨＭＦが最も好ましい、使用に関する。
【００１７】
第８の態様において、本発明は、ａ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有し、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７３．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６９．４％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８４．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、のうちの少なくとも１つであるアミノ酸配列を含む、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ；ｂ）ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること；ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること；及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの酸化させる能力を有し、ｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、のうちの少なくとも１つであるアミノ酸配列を含む、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ；ｃ）ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること；ｉｉ）ＨＭＦをＤＦＦに酸化させること；ｉｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること；ｉｖ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させること；及びｖ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの酸化させる能力を有し、ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも６２．７％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも４９．３％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも６６．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、のうちの少なくとも１つであるアミノ酸配列を含む、フランオキシダーゼ活性；ｄ）ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８２．３％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも４３．４％の配列同一性を有するアミノ酸配列、のうちの少なくとも１つであるアミノ酸配列を含む、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ；ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６２．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＤＣＡデカルボキシラーゼ；及びｆ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５．４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼ；ｇ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも６７．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＦＤＣＡの脱炭酸に起因するラクトンを加水分解する能力を有するラクトナーゼ；ｈ）ＨＭＦ及びＦＦＣＡの少なくとも１つを対応するアルコールに還元することができ、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７３．６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、短鎖デヒドロゲナーゼ；ｉ）ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８５．２％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも６９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及びｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８４．１％の配列同一性を有するアミノ酸配列、のうちの少なくとも１つであるアミノ酸配列を含む、フラン化合物のトランスポーター；並びにｊ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも５２．４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、フランの異化に関係する遺伝子の転写アクチベーター、からなる群から選択されるポリペプチドに関する。
【００１８】
第９の態様において、本発明は、ａ）本発明の第８の態様において定義したポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；ｂ）配列番号２０〜３５に示されているヌクレオチド配列；ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０、又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；ｄ）遺伝子コードの縮重により、ｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及びｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、のうちの少なくとも１つを含む核酸分子であって、ベクターであることが好ましい核酸分子に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】参考図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書では同義的に使用される。配列同一性は、本明細書において、配列を比較することにより決定する場合、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」はまた、場合によっては、こうした配列のストリング間のマッチによって決定する場合、アミノ酸配列又は核酸配列間の配列相関性の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。
「配列同一性」及び「配列類似性」は、グローバルアラインメントアルゴリズム又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用し、２つの配列の長さに基づいて、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。類似の長さの配列は、全長にわたって配列を最適に配列比較する、グローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を使用し配列比較するのが好ましいが、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用し配列決定するのが好ましい。次いで、配列が（例えば、デフォルトパラメーターを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に配列比較した場合）、配列同一性（下記で定義したとおりである）の少なくともある特定の最小パーセンテージを共有する場合、配列は、「実質的に同一の」又は「本質的に類似した」と称することができる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列をそれらの全長（完全長）にわたって配列比較し、マッチの数を最大限にし、ギャップの数を最小限にする。グローバルアラインメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合の配列同一性を決定するために適切に使用される。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメーターは、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）で使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、またタンパク質の場合、デフォルトスコアマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９，９１５−９１９）。配列同一性パーセントに関する配列アラインメント及びスコアは、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能な、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３コンピュータプログラムを使用し、又はオープンソースのソフトウェア、例えば、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０においてプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）又は「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）を使用し、上記ＧＡＰと同じパラメーターを使用し、或いはデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方、並びにタンパク質アラインメント及びＤＮＡアラインメントの両方について、デフォルトＧａｐ開始ペナルティーは１０．０であり、デフォルトｇａｐ伸長ペナルティーは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてはＢｌｏｓｓｕｍ６２であり、ＤＮＡについてはＤＮＡＦｕｌｌである）を使用することにより決定することができる。配列が実質的に異なる全長を有する場合、ローカルアラインメント、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するのが好ましい。
【００２１】
或いは、類似性又は相同性パーセンテージは、アルゴリズム、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどを使用し、公的データベースに対して検索することにより決定することができる。したがって、本発明の核酸配列及びタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連の配列を同定するための公的データベースに対して検索を実施する「照会配列」としてさらに使用することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のオキシドレダクターゼ核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により実施することができる。比較目的でギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：  ３３８９−３４０２に開示されているようにして、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の米国バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照されたい。
【００２２】
任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者はまた、当業者には明らかな、いわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮に入れることができる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の基は、セリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の基は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の基は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の基は、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の基は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されているアミノ酸配列の置換変異体は、開示されている配列の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。アミノ酸変化は保存的であるのが好ましい。それぞれの天然のアミノ酸に対する好ましい保存的置換は以下のとおりである：Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕ。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「選択的にハイブリダイズする（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「選択的にハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」及び同類の用語は、相互に少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％相同であるヌクレオチド配列が、相互にハイブリダイズされた状態を典型的に維持するハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記載することを意図している。言い換えると、このようなハイブリダイズする配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。
【００２４】
こうしたハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定例では、約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションを行い、続いて約５０℃、好ましくは約５５℃、好ましくは約６０℃、さらにより好ましくは約６５℃で、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄する。
【００２５】
高ストリンジェント条件としては、例えば、約６８℃で、５×ＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液／１．０％ＳＤＳ中でハイブリダイズし、室温で、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄することが含まれる。或いは、洗浄は４２℃で実施することができる。
【００２６】
当業者は、ストリンジェント条件及び高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件に関してどのような条件を適用するべきかがわかっている。こうした条件に関するさらなる手引きは、当技術分野においては容易に入手可能であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  （２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）がある。
【００２７】
もちろん、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）又はＴ（若しくはＵ）残基の相補的ストレッチに対してのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチ又はその相補体（例えば、実際には任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含有する任意の核酸分子にもハイブリダイズするため、本発明の核酸の一部に特異的にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。
【００２８】
「核酸構築物」又は「核酸ベクター」は、本明細書においては、組換えＤＮＡ技術を使用することによって得られる人工の核酸分子を意味すると理解されたい。したがって、用語「核酸構築物」は、天然の核酸分子を含まないが、核酸構築物は、天然の核酸分子（の一部）を含み得る。用語「発現ベクター」又は「発現構築物」とは、こうした配列と適合する宿主細胞又は宿主生物中の遺伝子の発現を達成することができるヌクレオチド配列を意味する。これらの発現ベクターは、典型的には、少なくとも適切な転写制御配列を含み、任意選択で、３’転写終止シグナルを含む。発現の達成に必要な、又は有用であるさらなる因子、例えば、発現エンハンサーエレメントなども存在し得る。発現ベクターは適切な宿主細胞に導入され、宿主細胞のインビトロ細胞培養においてコード配列の発現を達成することができる。発現ベクターは、本発明の宿主細胞又は生物における複製に適している。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」又は「転写制御配列」とは、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置している核酸断片を意味し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに関する結合部位、転写開始部位、並びに限定するものではないが、転写因子結合部位、抑制因子及びアクチベータータンパク質結合部位を含む別の任意のＤＮＡ配列、並びに、プロモーターからの転写量を制御するために直接的又は間接的に作用することが当業者に知られているヌクレオチドの別の任意の配列の存在によって構造的に同定される。「構成性」プロモーターは、ほとんどの生理学的及び発生的条件下で、ほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば、化学誘導物質を適用することによって、生理学的又は発生的に制御されるプロモーターである。
【００３０】
用語「選択可能マーカー」は、当業者によく知られている用語であり、本明細書においては、発現された場合に、選択可能マーカーを含有している１個又は複数の細胞を選択するために使用することができる、任意の遺伝子実体を記載するために使用されている。用語「リポーター」とは、可視マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などを意味するために主として使用されるが、マーカーと同義的に使用され得る。選択可能マーカーは、優性又は劣性又は双方向であってよい。
【００３１】
本明細書において使用する場合、用語「作動可能に連結されている」とは、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を意味する。核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結されている」。例えば、転写制御配列は、コード配列の転写に作用する場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結しているＤＮＡ配列が典型的には連続的であり、必要な場合、２つのタンパク質コード領域に、連続的にリーディングフレーム内で結合されていることを意味する。
【００３２】
用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」は同義的に使用され、特定の作用機序、サイズ、３次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸鎖からなる分子を意味する。
【００３３】
用語「遺伝子」は、適切な制御領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結されている、細胞においてＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、通常、数種類の作動可能に連結されている断片、例えば、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域及びポリアデニル化部位を含む３’−非翻訳配列（３’−末端）を含む。「遺伝子の発現」とは、適切な制御領域、特にプロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ領域が、生物学的に活性である、すなわち、生物学的に活性であるタンパク質又はペプチドに翻訳され得る、ＲＮＡに転写されるプロセスを意味する。用語「相同体」とは、所定の（組換え）核酸又はポリペプチド分子と所定の宿主生物又は宿主細胞との間の関係を示すために使用される場合、本質的に、核酸又はポリペプチド分子が宿主細胞又は同種の生物、好ましくは同一系統又は同一株の生物によって産生されることを意味するものと理解されたい。宿主細胞に対して相同体である場合、ポリペプチドをコードしている核酸配列は、典型的には（しかし必須ではない）、別の（異種性）プロモーター配列に作動可能に連結され、適用可能な場合、その天然環境の場合よりも別の（異種性）分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に連結される。制御配列、シグナル配列、ターミネーター配列などもまた、宿主細胞に対して相同体であり得ることを理解されたい。これに関連して、「相同体」配列エレメントのみの使用は、「自己クローン化」遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）を構築することができる（自己クローニングは、本明細書においてはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ９８／８１／ＥＣ  Ａｎｎｅｘ  ＩＩ）のとおり定義する）。２つの核酸配列の相関性を示すために使用する場合、用語「相同体」とは、１つの一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズし得ることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量、並びにハイブリダイゼーション条件、例えば、後で論じるような温度及び塩濃度などを含む多数の要因に依存し得る。
【００３４】
用語「異種性」及び「外因性」とは、核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又はタンパク質に関して使用する場合、存在する生物、細胞、ゲノム又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列の一部として天然には生じない核酸又はタンパク質を意味するか、或いは、細胞又はゲノム若しくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列における１つ又は複数の位置で天然に確認されるものとは異なることが確認される核酸又はタンパク質を意味する。異種性及び外因性の核酸又はタンパク質は、導入される細胞に対して内因性ではないが、別の細胞から取得されたか、又は合成的に若しくは組換えにより産生された。一般的には、必ずしもそうではないが、こうした核酸は、通常、ＤＮＡが転写又は発現される細胞によって産生されないタンパク質、すなわち、外因性タンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは、外因性ＲＮＡが存在する細胞において通常発現されないタンパク質をコードする。異種性／外因性の核酸及びタンパク質はまた、外来核酸又はタンパク質と呼ぶこともできる。発現される細胞に対して外来性として当業者が認識する任意の核酸又はタンパク質は、異種性又は外因性の核酸又はタンパク質という用語によって本明細書に包含される。異種性及び外因性という用語はまた、核酸配列又はアミノ酸配列の非天然の組合せ、すなわち、少なくとも２つの組み合わせた配列が相互に外来である組合せにも適用される。
【００３５】
酵素の「比活性」とは、本明細書では、通常、全宿主細胞タンパク質のｍｇ当たりの酵素単位活性で表される、全宿主細胞タンパク質の量当たりの特定酵素の活性量を意味するものと理解されたい。本発明の関連において、特定酵素の比活性は、（さもなければ同一の）野性型宿主細胞におけるその酵素の比活性と比べ、増加又は低減され得る。
【００３６】
「フラン化合物」は、本明細書において２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）並びにＦＤＣＡに酸化され得るフラン基を有する任意の化合物であると理解するものとし、後者は、本明細書において「ＦＤＣＡの前駆体」又は「ＦＤＣＡのフラン前駆体」として言及されている。ＦＤＣＡの前駆体としては、少なくとも、５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ）、又はＨＭＦ−ＯＨとして言及される２，５−ビス（ヒドロキシメチル）フラン（ＢＨＦ）、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸、又は５−ヒドロキシメチル−２−フロ酸（ＨＭＦＣＡ）、５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）、及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）が挙げられる。「フラン化合物」において、フラン環又は任意の若しくはその置換可能な側鎖基は、フラン環における任意の利用可能な位置で、例えば、環状基を含む、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルキル、アリル、アリール、又はＲＯ−エーテル部分で置換され得ることをさらに理解されたい。
【００３７】
「好気性条件」、「酸素条件」、又は好気性若しくは酸素発酵方法は、本明細書において酸素の存在下で行われ、酸素が少なくとも０．５、１、２、５、１０、２０、又は５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の速度で消費されることが好ましい条件又は発酵方法であって、有機分子が電子ドナーとして作用し、酸素が電子アクセプターとして作用する、条件又は発酵方法として定義される。
【００３８】
「嫌気性若しくは無酸素条件」又は「嫌気性若しくは無酸素発酵方法」は、本明細書において酸素の非存在下で実質的に行われる条件又は発酵方法であって、有機分子が電子ドナー及び電子アクセプターの両方として作用する条件又は発酵方法として定義される。無酸素条件では、酸素は実質的に消費されず、５、２、１、若しくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間未満で消費されることが好ましく、０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間で消費される（すなわち、酸素消費は検出不能である）ことがより好ましく、又は実質的に溶存酸素が発酵培地中に検出できず、培地中の溶存酸素濃度は、空気飽和の２％、１、０．５、０．２、０．１％未満、すなわち市販の酸素プローブの検出限界未満であることが好ましい。
【００３９】
本明細書における公開配列データベースにアクセス可能なヌクレオチド又はアミノ酸配列へのいかなる言及も、この文書の出願日に入手可能な配列のエントリーバージョンを意味する。
【００４０】
発明の詳細な説明
親宿主細胞
本発明は、宿主細胞に、適切なフラン前駆体から２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）を生産させるための、宿主細胞の遺伝的修飾に関する。この目的のため、多数の遺伝的修飾を、本発明に従って親宿主細胞に導入することができる。これらの修飾は、多数の異種遺伝子の発現の導入、並びに一部の内因性遺伝子を低減若しくは除去することによる、及び／又は他の内因性遺伝子の発現を増大させる、すなわち過剰発現させることによる、親宿主細胞に既に存在する多数の内因性遺伝子の発現の修飾を含む。これらの遺伝的修飾を、本明細書において以下に詳しく記載する。したがって、親宿主細胞は、本発明による遺伝的修飾のいずれかが宿主細胞に導入される前の宿主細胞であると理解されたい。
【００４１】
本発明の親宿主細胞は、例えば哺乳動物、昆虫、植物、真菌、又は藻類細胞などの真核細胞を含む任意の適切な宿主細胞でありうる。好ましい哺乳動物細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、及びハイブリドーマが挙げられる。好ましい昆虫細胞には、例えばＳｆ９及びＳｆ２１細胞、並びにその誘導体が挙げられる。
【００４２】
しかし、宿主細胞は微生物細胞であることが好ましい。また微生物宿主細胞は原核細胞であってよく、細菌細胞が好ましい。用語「細菌細胞」には、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物の両方が含まれる。適切な細菌は、エシェリヒア、アナベーナ、エアリバチルス、アネウリニバチルス、バークホルデリア、ブラジリゾビウム、コーロバクター、カプリアビダス、デスルホトマクルム、デスルフリスポラ、グルコノバクター、ロドバクター、ペロトマクルム、シュードモナス、パラコッカス、バチルス、ゲオバチルス、ブレビバチルス、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、リゾビウム（シノリゾビウム）、フラボバクテリウム、クレブシェラ、エンテロバクター、ラクトバチルス、ラクトコッカス、メチロバクテリウム、ラルストニア、ロドシュードモナス、スタフィロコッカス、及びストレプトミセスの属から選択することができる。細菌細胞は、エアリバチルス・パリダス、アネウリニバチルス・テラノベンシス、バチルス・スブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・クリベンシス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プンチス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ハロデュランス、バチルス・プミルス、バチルス・サーモルーバー、バチルス・パナチフミ、カプリアビダス・バシレンシス、デスルホトマクルム・クズネツォビイ、デスルフリスポラ・サーモフィラ、ゲオバチルス・カウストフィルス、グルコノバクター・オキシダンス、コーロバクター・クレセンタスＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、ロドバクター・スフェロイデス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス、シュードモナス・プチダ、パラコッカス・デニトリフィカンス、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、スタフィロコッカス・カルノーサス、ストレプトミセス・リビダンス、シノリゾビウム・メリオティ、及びリゾビウム・ラジオバクターからなる群の種から選択されるのが好ましい。シュードモナス・プチダ種のうち、シュードモナス・プチダＳ１２株及びシュードモナス・プチダＫＴ２４４０株が好ましい。
【００４３】
しかし、本発明の親宿主細胞は、例えば真菌宿主細胞などの真核微生物宿主細胞であるであることがより好ましい。本発明に従って修飾される最も好ましい親宿主細胞は、酵母又は糸状菌宿主細胞である。
【００４４】
「真菌」は、本明細書において、真核微生物として定義され、亜界真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎｉａ）（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の全ての種を含む。したがって、用語「真菌」及び「真菌の」は、糸状菌及び酵母の両方を含む又は指す。
【００４５】
「糸状菌」は、本明細書において亜界真菌（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）及び卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（“Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ”，１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８，ＣＡＢＩ，ＵＫ，ｗｗｗ．ｃａｂｉ．ｏｒｇでの定義）の全ての糸状菌型を含む真核微生物として定義される。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合糖質で構成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養増殖は、菌糸の伸長によって起こり、炭素の異化は偏性好気性である。糸状菌株としては、限定するものではないが、アクレモニウム、アスペルギルス、アウレオバシディウム、クリプトコッカス、フィリバシジウム、フザリウム、フミコラ、マグナポルテ、ムコール、ミセリオフトーラ、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、ペシロミセス、ペニシリウム、ピロミセス、シゾフィラム、タラロミセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポクラジウム、トリコデルマ、及びウスチラゴの株が挙げられる。
【００４６】
本発明の親宿主細胞として好ましい糸状菌種は、アスペルギルス、ミセリオフトーラ、ペニシリウム、タラロミセス、又はトリコデルマ属の種に属し、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・フミガーツス、タラロミセス・エメルソニ、アスペルギルス・オリゼ、ミセリオフトーラ・サーモフィラ、トリコデルマ・リーゼイ、ペニシリウム・クリソゲヌム、ペニシリウム・シンプリシシマム及びペニシリウム・ブラジリアヌムから選択される種に属することがより好ましい。
【００４７】
「酵母」は、本明細書において真核微生物として定義され、単細胞型で主に増殖する亜界真菌（Ｙｅａｓｔｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｗ．Ｐａｙｎｅ，Ｄ．Ｙａｒｒｏｗ，２０００，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫ；ａｎｄ，Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ，ＣＰ．Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｆｅｌｌ（ｅｄｓ）１９９８，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌ．Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の全ての種を含む。酵母は、単細胞葉状体の出芽によって増殖するか、又は生物の分裂のいずれかによって増殖し得る。本発明において使用するために好ましい酵母細胞は、サッカロミセス、クルイベロミセス、カンジダ、ピチア、シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、クロエケラ、シュワニオミセス、ヤロウィア、クリプトコッカス、デバロミセス、サッカロミセコプシス、サッカロミコデス、ウィッカーハミア、デバリオミセス、ハンゼニアスポラ、オガタエア、クライシア、コマガタエラ、メチニコビア、ウィリオプシス、ナカザワエア、トルラスポラ、ブレラ、ロドトルラ、及びスポロボロミセス属に属する。親酵母宿主細胞は、嫌気性発酵、より好ましくはアルコール発酵、及び最も好ましくは嫌気性アルコール発酵を自然に行うことができる細胞であり得る。クルイベロミセス・ラクチス、Ｓ．セレビジエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ（新規名称：オガタエア・ヘンリシ（Ｏｇａｔａｅａ  ｈｅｎｒｉｃｉｉ））、ヤロウィア・リポリチカ、カンジダ・トロピカリス、及びピチア・パストリス（新規名称：コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））などの種の酵母がより好ましい。
【００４８】
特に細菌と比べ、真菌は、例えば酸、エタノール及び他の有害な化合物に対する高い耐性、その高い耐浸透性、その高い発酵能力、及び一部の酵母に関してその嫌気性増殖能力を含む、工業発酵方法にとって多くの魅力的な特徴を有する。
【００４９】
宿主細胞はさらに、低いｐＨに対して高い耐性を有する、すなわち５．０、４．０、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５又は２．４に等しいｐＨ又はそれより低いｐＨで増殖することができ、乳酸、酢酸、又はギ酸及びフラン酸などの有機酸に対して高い耐性、並びに上昇温度に対して高い耐性を有することが好ましい。宿主細胞のこれらの特徴又は活性はいずれも、宿主細胞に天然に存在し得るか、又は好ましくは自己クローニング若しくは以下に記載されている本発明の方法によって、遺伝的修飾によって導入若しくは修飾され得る。
【００５０】
適切な細胞は培養細胞、例えば深部発酵又は固相発酵での発酵方法で培養され得る細胞である。
【００５１】
本発明による真菌宿主細胞において生産される化合物の特定の使用において、宿主細胞の選択はこうした使用に従って行われ得る。例えば本発明による宿主細胞において生産される化合物が、食品用途において使用される場合、宿主細胞は、例えばサッカロミセス種、例えばＳ．セレビジエ、食品等級のペニシリウム種又はヤロウィア・リポリチカなどの食品等級の生物から選択され得る。特定の使用としては、限定するものではないが、食品、（動物用）飼料、医薬品、作物防除などの農薬、及び／又はパーソナルケアでの使用が挙げられる。
【００５２】
遺伝的修飾細胞
第１の態様において、本発明は、遺伝的修飾を含む細胞、好ましくは真菌細胞に関する。細胞の遺伝的修飾は、ａ）遺伝的修飾を欠損している対応する野生型細胞と比べ、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化させる能力を真菌細胞に付与する、又はＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる酵素の比活性を上記細胞において増大させる、遺伝的修飾；及びｂ）遺伝的修飾を欠損している対応する野生型細胞と比べ、２，５−フランジカルボン酸の分解を触媒する酵素の比活性を低減又は除去する遺伝的修飾、のうちの少なくとも１つであることが好ましい。ａ）及びｂ）の遺伝的修飾を有する好ましい細胞を、本明細書において以下に詳述する。
【００５３】
本発明の細胞は、ｃ）遺伝的修飾を欠損している対応する野生型細胞と比べ、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させる能力を細胞に付与する、又はフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させる酵素の比活性を細胞において増大させる、遺伝的修飾をさらに含むことが好ましい。ｃ）の遺伝的修飾を有する好ましい細胞もまた、本明細書において以下に詳述する。
【００５４】
ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性の導入又は増大
本発明の細胞は、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミルフロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化させる能力を有する細胞であることが好ましい。細胞がＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力は、細胞の内因性の活性であり得るか、又は細胞に付与される外因性の活性であり得る。ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力は、細胞の遺伝的修飾によって、例えばＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有するデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸構築物による細胞の形質転換によって、細胞に付与されるか、又は細胞において増大させることが好ましい。デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼ（すなわち、ＥＣ１．１活性を有する）であることが好ましい。したがって、細胞は、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有するデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であることが好ましい。本発明の好ましい細胞において、発現構築物は細胞において発現可能であり、デヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼの発現は、発現構築物を欠損している対応する細胞、例えば野生型細胞と比べ、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を細胞に付与する、又はＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる酵素の比活性を細胞において増大させることが好ましい。ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる酵素の比活性は、発現構築物を欠損している対応する細胞と比べて、細胞において少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０、又は１００倍増大していることが好ましい。
【００５５】
ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有する酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼであり得るか、又は酵素は、本明細書において以下に記載されているオキシダーゼであり得る。ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有する好ましい酵素は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するアルコールデヒドロゲナーゼである。ポリペプチドがＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するか否かは、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させることができない適切な宿主細胞でポリペプチドを発現させ、ポリペプチドの発現がＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を細胞に付与するか否かを検出することによってアッセイすることができる。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性は、例えば、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、ｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈにおけるＣ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ｈｍｆＨ遺伝子と置き換わり（国際公開第２０１２／０６４１９５号に記載される）、その後、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドのコード配列を含むプラスミドが、ｐＪＮＮｈｍｆＴ１（ｔ）を含むＰ．プチダＫＴ２４４０Δｇｃｄに導入される（同様に国際公開第２０１２／０６４１９５号を参照されたい）、発現構築物を使用してアッセイすることができる。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドを発現するＰ．プチダ形質転換体をＨＭＦとインキュベートし、ＦＤＣＡを分析するため試料を一定間隔で得る。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性（及びＣ．バシレンシスｈｍｆＨ遺伝子）についてアッセイされるポリペプチドを欠損している対応するＰ．プチダ形質転換体と比べた場合のＦＤＣＡの生産の増加は、ポリペプチドがＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有することを示唆しているものと考えられる。或いは、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、真菌宿主細胞、好ましくは本明細書において実施例７に記載されるようにＳ．セレビジエ宿主細胞において発現させて、ポリペプチドの発現が、ＨＭＦからＦＦＣＡ及び／又はＦＤＣＡの両方を生産する能力を真菌宿主細胞に付与するか否かを検出することができる。
【００５６】
本発明の細胞において発現されるＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼは、アデニンジヌクレオチドから選択される補因子に依存するデヒドロゲナーゼ、例えば、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、及びピロロキノリンキノロン（ＰＱＱ）などであるのが好ましい。本発明の細胞において発現されるＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼは、二価カチオンに結合することが好ましく、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼはＺｎ結合デヒドロゲナーゼであることがより好ましい。
【００５７】
本発明の細胞において発現されるＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼは、別のフランアルコール、好ましくは２位にヒドロキシ基を有するフランアルコールを対応するアルデヒドに酸化させる能力を（さらにまた）有するアルコールデヒドロゲナーゼであるのがさらに好ましい。したがって、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼは、５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）を２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）に酸化させる能力を有するのが好ましい。
【００５８】
一態様において、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列は、
（ａ）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１〜４（それぞれ、ｈｍｆＬ１、ｈｍｆＬ２、ｈｍｆＬ３、及びｈｍｆＬ４）のうちの少なくとも１つ、より好ましくは配列番号１及び２のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
（ｂ）その相補鎖が（ａ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｃ）遺伝子コードの縮重により（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
【００５９】
したがって、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、アスペルギルス、ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）、コクシジオイデス、ケトミウム、ユーティパ（Ｅｕｔｙｐａ）、エンドカルポン（Ｅｎｄｏｃａｒｐｏｎ）、フザリウム、ミクロスポルム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）、ペニシリウム、スポロトリクス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、及びトリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）からなる群から選択される属の真菌、より好ましくはコクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、コクシジオイデス・ポサダシイ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、エンドカルポン・プシルム（Ｅｎｄｏｃａｒｐｏｎ  ｐｕｓｉｌｌｕｍ）、ミクロスポルム・ギプセウム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｅｕｍ）、ペニシリウム・ブラジリアヌム及びスポロトリクス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）からなる群から選択される種の真菌、より好ましくは株Ｐ．ブラジリアヌムＣ１（Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ  Ｃ１）である真菌から得られる（又は天然に存在する）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードする。
【００６０】
一実施形態において、本ヌクレオチド配列は、天然に存在するような、例えば、野性型供給源生物から単離され得るような、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。或いは、本ヌクレオチド配列は、上記で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼのいずれかの操作された形態をコードし、対応する天然のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼと比べて１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むが、本明細書において定義した相同性又は類似性の範囲内にあり得る。したがって、一実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードし、そのアミノ酸配列がそれぞれの不変位置（表１〜４において「＊」で示される）に、不変位置に存在するアミノ酸を少なくとも含む。アミノ酸配列はまた、高度に保存された位置（表１〜４において「：」で示される）に、強度に保存された位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのが好ましい。アミノ酸配列はさらにまた、それほど高度に保存されていない位置（表１〜４において「．」で示される）に、それほど高度に保存されていない位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのがより好ましい。これらの不変位置及び保存位置の外側のアミノ酸置換は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性に影響する可能性は低い。表１〜４はそれぞれ、ペニシリウム・ブラジリアヌムｈｍｆＬ１、ｈｍｆＬ２、ｈｍｆＬ３、及びｈｍｆＬ４のそれぞれのアミノ酸配列アライメントを、公的データベースで利用可能なその１０の近縁のオルトログと共に表す。表１Ａ〜４Ａは、Ｐ．ブラジリアヌム配列とそのオルトログとの間のアミノ酸同一性パーセンテージ、並びにオルトログの受託番号を提供する。
【００６１】
ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている本発明のヌクレオチド配列は、当技術分野でそれ自体が周知であるヌクレオチド配列の単離方法を利用して、真菌、酵母又は細菌のゲノム及び／又はｃＤＮＡ、例えば、上述の供給源生物と同じ門、クラス又は属に属するものから得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存アミノ酸配列に基づいて設計された）縮重ＰＣＲプライマーを適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに使用して、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成する；ｂ）ａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用し、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングする；並びに、ｃ）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを産生する、方法で得ることができる。
【００６２】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼが本発明の細胞において十分なレベルで、活性形態で発現される可能性を高めるために、これらの酵素をコードしているヌクレオチド配列、並びに本発明の他の酵素（下記を参照）は、それらのコドン使用を当該宿主細胞の使用に最適化するように構成されるのが好ましい。ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の宿主細胞のコドン使用に対する適応構成性（ａｄａｐｔｉｖｅｎｅｓｓ）は、コドン適応構成指数（ＣＡＩ（ｃｏｄｏｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ））として表すことができる。コドン適応構成指数は、本明細書において、特定の宿主細胞又は生物における高度発現遺伝子のコドン使用に対する遺伝子のコドン使用の相対的な適応構成性の測定値として定義される。それぞれのコドンの相対的適応構成性（ｗ）は、同じアミノ酸に関する最も豊富なコドンの使用に対する、それぞれのコドンの使用比率である。ＣＡＩ指数は、これらの相対的な適応構成性値の幾何平均として定義される。非同義コドン及び終止コドン（遺伝子コードに依存する）は除外される。ＣＡＩ値は０〜１の範囲であり、高い値は最も豊富なコドンが高い割合であることを示す（Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｌｉ，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１２８１−１２９５を参照；また、Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（８）：２２４２−５１も参照）。適応構成されたヌクレオチド配列は、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８又は０．９のＣＡＩを有するのが好ましい。酵母細胞、好ましくはＳ．セレビジエ細胞における発現に対してコドン最適化されている、配列番号５７〜５９に記載されている配列が最も好ましい。
【００６３】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞は、原則として、本ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ発明が、好ましくは機能的に、すなわち活性型で適切に発現され得る、任意の真菌宿主細胞である。本発明の真菌宿主細胞は、フラン化合物の細胞内及び細胞外への能動輸送又は受動輸送が可能な宿主であるのが好ましい。本発明の好ましい宿主細胞は、カルボキシル化されたフラン化合物、例えば、特にＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ及びＦＤＣＡを分解（例えば、脱カルボキシル化）する検出可能な活性を欠損しているか、又は有していない。このような宿主細胞は、カルボキシル化されたフラン化合物を分解する能力を自然に欠損しているのが好ましい。或いは、真菌宿主細胞は、本発明において以下に記載するように、カルボキシル化されたフラン化合物の分解を触媒する１つ又は複数の酵素の比活性を低減又は除去するように遺伝的に修飾することができる。
【００６４】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物は、構築物で形質転換された宿主細胞に対して異種性又は外因性である発現構築物であるのが好ましい。構築物は、本明細書においては、構築物が宿主細胞中に天然に存在しない少なくとも１つの配列又は配列エレメントを含む場合、及び／又は構築物が組合せにおいて少なくとも２つの配列エレメントを含む場合、及び／又はエレメントがそれ自体宿主細胞中に天然に存在していても、宿主細胞中で天然に存在しない生じない命令を含む場合に、構築物を含む宿主細胞に対して異種性又は外因性であると理解されたい。
【００６５】
適切な宿主細胞における本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するためのベクター及び発現構築物は、以下の本明細書において、より詳細に記載する。
【００６６】
フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の導入又は増大
上述のように、本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する細胞は、さらにアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する（すなわち、ＥＣ１．２活性を有する）ことが好ましい。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、フランアルデヒドを変換することができることが好ましい。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させることができることがより好ましい。より詳細には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化すること、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化すること、のうちの少なくとも１つを可能にし得ることが好ましい。こうしたフランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、細胞の内因性活性であってもよく、又は細胞へ付与される外因性活性であってもよい。フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、発現構築物、例えば細胞がＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現するための第１の発現構築物を既に含む場合は第２の発現構築物による細胞の形質転換によって、細胞に付与される又は細胞において増大させることが好ましい。
【００６７】
本発明の好ましい細胞において、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現するための発現構築物は、細胞において発現可能であり、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現は、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの酸化させる能力を細胞に付与する、又は発現構築物を欠損している対応する細胞、例えば野生型細胞と比べ、これらの能力のうちの少なくとも１つを有するフランアルデヒドデヒドロゲナーゼの比活性を細胞において増大させるのが好ましい。フランアルデヒドデヒドロゲナーゼの比活性は、発現構築物を欠損する対応する細胞と比べ、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０又は１００倍、細胞において増大させるのが好ましい。
【００６８】
ｉ）ＨＭＦからＨＭＦＣＡ、ｉｉ）ＤＦＦからＦＦＣＡ、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡからＦＤＣＡのうちの少なくとも１つを酸化させるポリペプチドの能力は、例えば、国際公開第２０１２／０６４１９５号の実施例ＩＶに記載されているようにして、シュードモナス・プチダ宿主細胞、好ましくはシュードモナス・プチダＫＴ２４４０宿主細胞において、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨｍｆＨ及びＨｍｆＴ１遺伝子と一緒に共発現させ、１０ｍＭのＨＭＦ中でシュードモナス・プチダ細胞をインキュベートし、ポリペプチドを発現しない対応するシュードモナス・プチダ細胞と比較し、蓄積ＦＤＣＡの増大を検出することによってアッセイすることができる。ポリペプチドがＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させる能力はまた、Ｋｏｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０，  ＰＮＡＳ（前掲）によってアッセイすることもできる。Ｃ．バシレンシスＨＭＦ１４のＨｍｆＴ１遺伝子を発現する株は、本明細書において、配列番号５３のアミノ酸配列を有する遺伝子産物を発現すると理解されたい。或いは、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの酸化させる能力についてアッセイされるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、真菌宿主細胞、好ましくはＳ．セレビジエ宿主細胞において、例えば本明細書の実施例７に記載されるようにＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼと同時発現させ、ポリペプチドの発現が、ポリペプチドを発現していない対応する真菌宿主細胞と比べ、ＦＤＣＡの蓄積の増大を引き起こすか否かを検出することができる。
【００６９】
本発明の細胞において発現されるフランアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨなどのアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、及びピロロキノリンキノロン（ＰＱＱ）から選択される補因子に依存するデヒドロゲナーゼであるのが好ましい。
【００７０】
一実施形態において、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼをコードしているヌクレオチド配列は、
ａ）ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させる能力、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させる能力、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させる能力のうちの少なくとも１つを有し、配列番号５及び６（それぞれ、アルデヒドデヒドロゲナーゼｈｍｆＮ１及びｈｍｆＮ２）のうちの少なくとも１つ、そのうち配列番号５が好ましいアミノ酸配列と、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）その相補鎖が（ａ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；及び
ｃ）遺伝子コードの縮重により（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列、
からなる群から選択される。
【００７１】
したがって、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、アスペルギルス、ユーティパ、ネオサルトリア、ペニシリウム、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、スケドスポリウム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、及びスポロトリクスからなる群から選択される属の真菌、より好ましくはユーティパ・ラタ（Ｅｕｔｙｐａ  ｌａｔａ）、ペニシリウム・ブラジリアヌム、ポドスポラ・アンセリナ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａ）、スケドスポリウム・アピオスペルマム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ）、及びスポロトリクス・シェンキイからなる群から選択される種の真菌、最も好ましくは株Ｐ．ブラジリアヌムＣ１である真菌、から得ることができる（又は天然に存在する）フランアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。
【００７２】
一態様において、ヌクレオチド配列は、天然に存在する、例えば野生型供給源生物から単離され得る、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。或いは、本ヌクレオチド配列は、対応する天然のフランアルデヒドデヒドロゲナーゼと比べ、１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むが、本明細書において定義した同一性又は類似性の範囲内である、上記で定義したようなフランアルデヒドデヒドロゲナーゼのいずれかの操作された形態をコードすることができる。したがって、一実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列がそれぞれの不変位置（表５及び６において「＊」で示される）に、不変位置に存在するアミノ酸を少なくとも含む、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。アミノ酸配列はまた、高度に保存された位置（表５及び６において「：」で示される）に、高度に保存された位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのが好ましい。アミノ酸配列はさらにまた、それほど高度に保存されていない位置（表５及び６において「．」で示される）に、それほど高度に保存されていない位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのがより好ましい。これらの不変位置及び保存位置の外側のアミノ酸置換は、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に影響する可能性は低い。表５及び６は、ペニシリウム・ブラジリアヌムｈｍｆＮ１及びｈｍｆＮ２のそれぞれのアミノ酸配列アライメントを、公的データベースで利用可能なその１０の近縁のオルトログと共に表す。表５Ａ及び６Ａは、Ｐ．ブラジリアヌム配列とそのオルトログとの間のアミノ酸同一性パーセンテージ、並びにオルトログの受託番号を提供する。
【００７３】
フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている本発明のヌクレオチド配列は、当技術分野でそれ自体が周知であるヌクレオチド配列の単離方法を利用して、真菌、酵母又は細菌、例えば、上述の供給源生物と同じ門、綱又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存アミノ酸配列に基づいて設計された）縮重ＰＣＲプライマーを適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに使用して、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成する；ｂ）ａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用し、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングする；並びに、ｃ）フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生産する、方法で得ることができる。
【００７４】
本発明のフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための核酸構築物による形質転換に関して上述される真菌宿主細胞であることが好ましく、同様にフランアルデヒドデヒドロゲナーゼが、好ましくは機能的に、すなわち活性型で適切に発現され得る、真菌宿主細胞である。フランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞はまた、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現することが好ましく、細胞は、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を細胞に付与する又は細胞において増大させる、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼの発現構築物を含むことがより好ましい。上述のように、そのような真菌宿主細胞は、フラン化合物の細胞内及び細胞外への能動輸送又は受動輸送が可能な宿主であるのが好ましく、カルボキシル化されたフラン化合物を分解（例えば、脱カルボキシル化）する検出可能な活性を欠損しているか、又は有していないことが好ましい。
【００７５】
本発明のフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物は、構築物で形質転換される宿主細胞に対して異種又は外因性である発現構築物であるのが好ましい。本明細書において、構築物が宿主細胞に天然に存在しない少なくとも１つの配列又は配列エレメントを含む場合、及び／又はエレメントがそれ自体宿主細胞に天然に存在していても、構築物が、宿主細胞中で天然に存在しない組み合わせ及び／又は順序で少なくとも２つの配列エレメントを含む場合、構築物は、構築物を含む宿主細胞に対して異種又は外因性であると理解されたい。
【００７６】
適切な宿主細胞において本発明のフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するためのベクター及び発現構築物を、本明細書において以下により詳細に記載する。
【００７７】
フランアルコール／アルデヒドオキシダーゼ活性の導入又は増大
一実施形態において、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有する本発明の細胞は、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有するオキシダーゼを発現する細胞である。オキシダーゼは、そのような基を含む（すなわち、ＥＣ１．１及びＥＣ１．２活性を有する）フラン化合物のＣ２及びＣ５位置でアルコール及びアルデヒド基を酸化させることができることが好ましい。より詳細には、オキシダーゼ活性は、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＨＭＦを２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）に酸化させること、ｉｉｉ）ＤＦＦを５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化させること、ｉｖ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させること、及びｖ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つを可能にし得ることが好ましい。そのようなフランオキシダーゼ活性は、細胞の内因性の活性であり得るか、又は細胞に付与される外因性の活性であり得る。フランオキシダーゼは、発現構築物による細胞の形質転換によって細胞に付与されるか、又は細胞において増大することが好ましい。フランオキシダーゼを発現するための発現構築物は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現するための発現構築物及びフランアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現するための発現構築物のうちの少なくとも１つを既に含む細胞におけるさらなる発現構築物であり得る。
【００７８】
本発明の好ましい細胞において、フランオキシダーゼを発現するための発現構築物は細胞において発現可能であり、フランオキシダーゼの発現は、発現構築物を欠損している対応する細胞、例えば野生型細胞と比べ、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＨＭＦをＤＦＦに酸化させること、ｉｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること、ｉｖ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させること、及びｖ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの酸化させる能力を細胞に付与する、又はこれらの活性の少なくとも１つを有するフランオキシダーゼの比活性を細胞において増大させるのが好ましい。フランオキシダーゼの比活性は、発現構築物を欠損している対応する細胞と比べ、細胞において少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０、又は１００倍増大していることが好ましい。
【００７９】
ポリペプチドが、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＨＭＦをＤＦＦに酸化させること、ｉｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること、ｉｖ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させること、及びｖ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの能力は、例えば、フランオキシダーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、ｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈにおけるＣ．バシレンシスｈｍｆＨ遺伝子と置き換わり（国際公開第２０１２／０６４１９５号に記載されている）、その後オキシダーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドのコード配列を含むプラスミドが、ｐＪＮＮｈｍｆＴ１（ｔ）を含むＰ．プチダＫＴ２４４０Δｇｃｄに導入される（同様に国際公開第２０１２／０６４１９５号に記載されている）、発現構築物を使用してアッセイすることができる。フランオキシダーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドを発現するＰ．プチダ形質転換体をＨＭＦと共にインキュベートし、ＦＤＣＡを分析するため試料を一定間隔で得る。フランオキシダーゼ活性（及びＣ．バシレンシスｈｍｆＨ遺伝子）についてアッセイされるポリペプチドを欠損している対応するＰ．プチダ形質転換体と比べた場合のＦＤＣＡの生産の増加は、ポリペプチドがフランオキシゲナーゼ活性を有することを示唆しているものと考えられる。或いは、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＨＭＦをＤＦＦに酸化させること、ｉｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること、ｉｖ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させること、及びｖ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの酸化させる能力についてアッセイされるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、真菌宿主細胞、好ましくは本明細書において実施例７に記載されるようにＳ．セレビジエ宿主細胞において発現させて、ポリペプチドの発現が、ＨＭＦから両方のＦＤＣＡを生産する能力を真菌宿主細胞に付与するか否かを検出することができる。
【００８０】
本発明の細胞において発現されるフランオキシダーゼは、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨなどのアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、及びピロロキノリンキノロン（ＰＱＱ）から選択される補因子に依存するオキシダーゼであるのが好ましい。
【００８１】
一実施形態において、フランオキシダーゼをコードしているヌクレオチド配列は、
ａ）ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させる能力、ｉｉ）ＨＭＦをＤＦＦに酸化させる能力、ｉｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させる能力、ｉｖ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力、及びｖ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させる能力のうちの少なくとも１つを有し、配列番号７〜９（それぞれ、フランオキシダーゼｈｍｆＰ１、ｈｍｆＰ２、及びｈｍｆＰ３）のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、をコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）その相補鎖が（ａ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；及び
ｃ）遺伝子コードの縮重により（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列、
からなる群から選択される。
【００８２】
したがって、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、アスペルギルス、アルスロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）、ミクロスポルム、ネオサルトリア、ペニシリウム、タラロミセス、及びトリコフィトンからなる群から選択される属の真菌、より好ましくはアルスロデルマ・オタエ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ  ｏｔａｅ）、ミクロスポルム・ギプセウム、及びペニシリウム・ブラジリアヌムからなる群から選択される種の真菌、最も好ましくは株Ｐ．ブラジリアヌムＣ１である真菌、から得ることができる（又は天然に存在する）フランオキシダーゼのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するフランオキシダーゼをコードする。
【００８３】
一実施形態において、ヌクレオチド配列は、天然に存在する、例えば野生型供給源生物から単離され得る、フランオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。或いは、ヌクレオチド配列は、対応する天然のフランオキシダーゼと比べて１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むが、本明細書において定義した同一性又は類似性の範囲内であり得る、上記で定義したようなフランオキシダーゼのいずれかの操作された形態をコードすることができる。したがって、一実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列がそれぞれの不変位置（表７〜９において「＊」で示される）に、不変位置に存在するアミノ酸を少なくとも含む、フランオキシダーゼをコードする。アミノ酸配列はまた、高度に保存された位置（表７〜９において「：」で示される）に、高度に保存された位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのが好ましい。アミノ酸配列はさらにまた、それほど高度に保存されていない位置（表７〜９において「．」で示される）に、それほど高度に保存されていない位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのがより好ましい。これらの不変位置及び保存位置の外側のアミノ酸置換は、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼ活性に影響する可能性は低い。表７〜９は、ペニシリウム・ブラジリアヌムｈｍｆＰ１、ｈｍｆＰ２、及びｈｍｆＰ３のそれぞれのアミノ酸配列アライメントを、公的データベースで利用可能なその１０の近縁のオルトログと共に表す。表７Ａ〜９Ａは、Ｐ．ブラジリアヌム配列とそのオルトログとの間のアミノ酸同一性パーセンテージ、並びにオルトログの受託番号を提供する。
【００８４】
フランオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている本発明のヌクレオチド配列は、当技術分野でそれ自体が周知であるヌクレオチド配列の単離方法を利用して、真菌、酵母又は細菌、例えば、上述の供給源生物と同じ門、綱、又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存アミノ酸配列に基づいて設計された）縮重ＰＣＲプライマーを適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに使用して、フランオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成する；ｂ）ａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用し、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングする；並びに、ｃ）フランオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生産する、方法で得ることができる。
【００８５】
本発明のフランオキシダーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための核酸構築物での形質転換に関して上述される真菌宿主細胞であることが好ましく、フランオキシダーゼが、好ましくは機能的に、すなわち活性型で適切に発現され得る、真菌宿主細胞である。上述のように、そのような真菌宿主細胞は、フラン化合物の細胞内及び細胞外への能動輸送又は受動輸送が可能な宿主であるのが好ましく、カルボキシル化されたフラン化合物を分解（例えば、脱カルボキシル化）する検出可能な活性を欠損しているか、又は有していないことが好ましい。
【００８６】
本発明のフランオキシダーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物は、構築物で形質転換される宿主細胞に対して異種又は外因性である発現構築物であるのが好ましい。本明細書において、構築物が宿主細胞に天然に存在しない少なくとも１つの配列又は配列エレメントを含む場合、及び／又は構築物が、エレメントがそれ自体宿主細胞中に天然に存在していても、宿主細胞に天然に存在しない組み合わせ及び／又は順序で少なくとも２つの配列エレメントを含む場合、構築物は、構築物を含む宿主細胞に対して異種又は外因性であると理解されたい。
【００８７】
適切な宿主細胞において本発明のフランオキシダーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するためのベクター及び発現構築物を、本明細書において以下により詳細に記載する。
【００８８】
ＦＤＣＡの異化及び／又はＨＭＦ代謝の代替経路の非存在、低減、又は除去
本発明の細胞は、ＦＤＣＡを分解する能力を欠損している細胞であるのが好ましい。細胞は、ＦＤＣＡを分解する能力を天然に欠損している真菌種の細胞であり得る。或いは、細胞は、ＦＤＣＡを分解するその天然の能力を低減又は除去するように遺伝的に修飾されている、ＦＤＣＡを分解する能力を天然に有する真菌種の遺伝的修飾細胞であり得る。所定の真菌株が天然にＦＤＣＡを分解する能力を有するか否かは、例えば本明細書の実施例に記載されるように、唯一の炭素源としてＨＭＦ、ＨＭＦ−アルコール、ＨＭＦＣＡ、及びＦＤＣＡのうちの１つ又は複数を使用して株が増殖する能力を決定することによって試験することができる。ＦＤＣＡを分解する能力を天然に有する真菌種の例は、本明細書の実施例に示されるようにペニシリウム・ブラジリアヌムである。これに対し、サッカロミセス及びヤロウィア種などの酵母は、ＦＤＣＡを分解する能力を天然に欠損している真菌種の例である。
【００８９】
したがって、本発明の一実施形態において、細胞は、ＦＤＣＡを分解する細胞の天然の能力を低減又は除去するように遺伝的に修飾されている。ＦＤＣＡを分解する細胞の能力を低減又は除去するために修飾される遺伝子は、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードしている遺伝子、ＦＤＣＡデカルボキシラーゼをコードしている遺伝子、ＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子、及びラクトナーゼ（ＦＤＣＡ脱炭酸に起因するラクトンを加水分解することができる）をコードしている遺伝子のうちの少なくとも１つであり得る。
【００９０】
本発明の細胞においてＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼの比活性を低減又は除去するために修飾されるＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードしている遺伝子は、配列番号１０及び１１（それぞれ、ｈｍｆＫ１及びｈｍｆＫ２）のうちの少なくとも１つ、そのうち配列番号１０が好ましい配列と、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であるのが好ましい。本発明の細胞において、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼの比活性は、活性の低減を引き起こす遺伝的修飾を除き、遺伝的に同一である株の細胞と比べ、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０、又は１００倍低減されることが好ましい。
【００９１】
本発明の細胞においてＦＤＣＡデカルボキシラーゼの比活性を低減又は除去するために修飾されるＦＤＣＡデカルボキシラーゼをコードしている遺伝子は、配列番号１２（ｈｍｆＱ）と、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であるのが好ましい。本発明の細胞において、ＦＤＣＡデカルボキシラーゼの比活性は、活性の低減を引き起こす遺伝的修飾を除き、遺伝的に同一である株の細胞と比べ、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０、又は１００倍低減されることが好ましい。
【００９２】
本発明の細胞においてＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼの比活性を低減又は除去するために修飾されるＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子は、配列番号１３（ｈｍｆＵ）と、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であるのが好ましい。本発明の細胞において、ＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼの比活性は、活性の低減を引き起こす遺伝的修飾を除き、遺伝的に同一である株の細胞と比べ、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０、又は１００倍低減されることが好ましい。
【００９３】
理論に拘束されることを望まないが、ＦＤＣＡ脱炭酸に起因するラクトンは、ＦＤＣＡカルボキシラーゼに対して産物阻害を発揮すると考えられる。したがって、ＦＤＣＡを分解する細胞の能力を低減又は除去するための代替手段は、本発明の細胞におけるＦＤＣＡ脱炭酸に起因するラクトンを加水分解することができるラクトナーゼの比活性を低減又は除去することである。ＦＤＣＡ脱炭酸に起因するラクトンを加水分解することができるラクトナーゼの比活性を低減又は除去するために修飾されるそのようなラクトナーゼをコードしている遺伝子は、配列番号１４（ｈｍｆＯ）と、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であるのが好ましい。本発明の細胞において、ラクトナーゼの比活性は、活性の低減を引き起こす遺伝的修飾を除き、遺伝的に同一である株の細胞と比べ、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０、又は１００倍低減されることが好ましい。
【００９４】
ＨＭＦ及びＦＤＣＡの他のフラン前駆体の代謝に関する内因性の代替経路もまた、本発明の細胞に存在し得る。そのような代替経路は、ＨＭＦ及びＦＤＣＡの他のフラン前駆体からのＦＤＣＡの生産と競合する。したがって、そのような代替経路における酵素の比活性も、本発明の細胞において低減又は除去されるのが好ましい。そのような１つの内因性の代替経路は、例えばデヒドロゲナーゼ、例えば短鎖デヒドロゲナーゼなどによるＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡの対応するアルコールへの還元である。ＨＭＦ及びＦＤＣＡの他のフラン前駆体を代謝する代替経路の比活性を低減又は除去するために修飾されるそのような短鎖デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子は、配列番号１５（ｈｍｆＭ）と、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であるのが好ましい。本発明の細胞において、短鎖デヒドロゲナーゼの比活性は、活性の低減を引き起こす遺伝的修飾を除き、遺伝的に同一である株の細胞と比べ、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０、又は１００倍低減されることが好ましい。
【００９５】
ＨＭＦをＨＭＦ−アルコールに還元することが知られている別の内因性のデヒドロゲナーゼは、Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｙｅａｓｔ，２３：４５５−４６４）によって記載されるように、Ｓ．セレビジエＡＤＨ６遺伝子によってコードされるＮＡＤＰＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼである。したがって、ＨＭＦを代謝する代替経路の比活性を低減又は除去するために修飾される遺伝子は、Ｓ．セレビジエＡＤＨ６遺伝子又は別の真菌宿主種におけるそのオルトログであることが好ましい。したがって、ＮＡＤＰＨ依存性ＨＭＦ還元デヒドロゲナーゼの比活性を低減又は除去するために修飾される遺伝子は、配列番号６９（Ｓ．セレビジエＡＤＨ６）と、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている遺伝子であるのが好ましい。本発明の細胞において、ＮＡＤＰＨ依存性ＨＭＦ還元デヒドロゲナーゼの比活性は、活性の低減を引き起こす遺伝的修飾を除き、遺伝的に同一である株の細胞と比べ、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０、又は１００倍低減されることが好ましい。
【００９６】
その比活性が、本発明の細胞において低減又は除去されることが好ましい酵素をコードしている本発明のヌクレオチド配列は、当技術分野でそれ自体が周知であるヌクレオチド配列の単離方法を利用して、真菌、酵母又は細菌、例えば、上述の供給源生物と同じ門、綱、又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから得ることができる、又は同定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存アミノ酸配列に基づいて設計された）縮重ＰＣＲプライマーを適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに使用して、その比活性が、本発明の細胞において低減又は除去されることが好ましい酵素をコードしているヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成する；ｂ）ａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用し、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングする；並びに、ｃ）その比活性が、本発明の細胞において低減又は除去されることが好ましい酵素をコードしているヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生産する、方法で得ることができる。そのような保存された配列は、不変位置が「＊」で示され、高度に保存された位置が「：」で示される、表１０〜１５に表される配列アライメントにおいて同定され得る。同様に、本発明の適切な宿主細胞は、宿主が、表１０〜１５に同定されるオルトログの供給源生物と同じ門、綱、目、科、又は属に属する非病原性の真菌又は酵母であることが好ましい、表１０〜１５に由来し得る。表１０〜１５はそれぞれ、ペニシリウム・ブラジリアヌムｈｍｆＫ１、ｈｍｆＫ２、ｈｍｆＱ、ｈｍｆＵ、及びｈｍｆＭのそれぞれのアミノ酸配列アライメントを、公的データベースで利用可能なその１０の近縁のオルトログと共に表す。表１０Ａ〜１５Ａは、Ｐ．ブラジリアヌム配列とそのオルトログとの間のアミノ酸同一性パーセンテージ、並びにオルトログの受託番号を提供する。
【００９７】
フラン化合物のトランスポーターを発現する細胞
上述のように本発明の細胞はさらに、フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドをコードしている１つ又は複数のヌクレオチド配列を発現することが好ましい。フラン化合物輸送能力を有するそのようなポリペプチドは、細胞の内因性の活性であり得るか、又は細胞に付与される外因性の活性であり得る。フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドの活性は、発現構築物、例えば細胞がＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼを発現するための第１の発現構築物と、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼを発現するための第２の発現構築物を既に含む場合は、第３の構築物による細胞の形質転換によって細胞に付与されるか、又は細胞において増大することが好ましい。
【００９８】
本細胞は、フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物で形質転換されるのが好ましい。フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドは、ＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を少なくとも含む、ＨＭＦＣＡ輸送能力を有するポリペプチドであるのが好ましい。細胞は、少なくともＨＭＦＣＡを細胞に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含むことが好ましく、ポリペプチドは、配列番号１６〜１８（それぞれ、ｈｍｆＴ３、ｈｍｆＴ４、及びｈｍｆＴ５）の少なくとも１つと、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、発現構築物は細胞において発現可能であり、ポリペプチドの発現は、発現構築物を欠損している対応する野生型細胞と比べて、細胞に少なくともＨＭＦＣＡを輸送する能力を細胞に付与する又は細胞において増大させる。
【００９９】
フラン化合物、特にＨＭＦＣＡを細胞に輸送するポリペプチドの能力は、酵母宿主細胞、好ましくはＳ．セレビジエＣＥＮ．ＰＫ宿主細胞においてトランスポーターポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列と、Ｃ．バシレンシスＨＭＦ１４のＨｍｆＨ遺伝子及びＣ．バシレンシスＨＭＦ１４からのＨＭＦ分解オペロン（国際公開第２０１２／００６４１９５号の配列番号１９のアミノ酸配列を有する）に関連するフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子と共に同時発現させ、形質転換Ｓ．セレビジエ細胞を４ｍＭ  ＨＭＦ中でインキュベートすること、及び本明細書の実施例６に記載されるようにトランスポーターポリペプチドを発現しない対応する（すなわち、それ以外は同一である）Ｓ．セレビジエ細胞と比べて、ＦＤＣＡの蓄積の増大を検出することによってアッセイされ得る。
【０１００】
したがって、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、アスペルギルス、フザリウム、ネクトリア（Ｎｅｃｔｒｉａ）、ペニシリウム、スポロトリクス、及びトグニニア（Ｔｏｇｎｉｎｉａ）からなる群から選択される属の真菌、より好ましくはアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、ペニシリウム・ブラジリアヌム、ペニシリウム・ディジタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）、ペニシリウム・ルベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｕｂｅｎｓ）、スポロトリクス・シェンキイ、及びトグニニア・ミニマ（Ｔｏｇｎｉｎｉａ  ｍｉｎｉｍａ）からなる群から選択される種の真菌、最も好ましくは、株Ｐ．ブラジリアヌムＣ１である真菌から得ることができる（又は天然に存在する）、フラン化合物トランスポーターポリペプチドのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するフラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードする。
【０１０１】
一実施形態において、ヌクレオチド配列は、天然に存在する、例えば野生型供給源生物から単離することができるフラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードする。或いは、ヌクレオチド配列は、対応する天然のフラン化合物トランスポーターポリペプチドと比べて１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むが、本明細書において定義した同一性又は類似性の範囲内であり得る、上記で定義したようなフラン化合物トランスポーターポリペプチドのいずれかの操作された形態をコードすることができる。したがって、一実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列がそれぞれの不変位置（表１６〜１８において「＊」で示される）に、不変位置に存在するアミノ酸を少なくとも含む、フラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードする。アミノ酸配列はまた、高度に保存された位置（表１６〜１８において「：」で示される）に、高度に保存された位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのが好ましい。アミノ酸配列はさらにまた、それほど高度に保存されていない位置（表１６〜１８において「．」で示される）に、それほど高度に保存されていない位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのがより好ましい。これらの不変位置及び保存位置の外側のアミノ酸置換は、フラン化合物トランスポーターポリペプチド活性に影響する可能性は低い。表１６〜１８は、ペニシリウム・ブラジリアヌムｈｍｆＴ３、ｈｍｆＴ４、及びｈｍｆＴ５のそれぞれのアミノ酸配列アライメントを、公的データベースで利用可能なその１０の近縁のオルトログと共に表す。表１６Ａ〜１８Ａは、Ｐ．ブラジリアヌム配列とそのオルトログとの間のアミノ酸同一性パーセンテージ、並びにオルトログの受託番号を提供する。
【０１０２】
フラン化合物トランスポーター活性を有するポリペプチドをコードしている本発明のヌクレオチド配列は、当技術分野でそれ自体が周知であるヌクレオチド配列の単離方法を利用して、真菌、酵母又は細菌、例えば、上述の供給源生物と同じ門、綱又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存アミノ酸配列に基づいて設計された）縮重ＰＣＲプライマーを適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに使用して、フラン化合物トランスポーター活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成する；ｂ）ａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用し、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングする；並びに、ｃ）フラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生産する、方法で得ることができる。
【０１０３】
フラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞は、上述のように本発明の真菌宿主細胞であることが好ましい。
【０１０４】
フラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物は、構築物で形質転換された宿主細胞に対して異種又は外因性である発現構築物であることが好ましい。構築物は、本明細書において、構築物が宿主細胞に天然に存在しない少なくとも１つの配列又は配列エレメントを含む場合、及び／又は構築物が、エレメントがそれ自体宿主細胞中に天然に存在していても、宿主細胞に天然に存在しない組み合わせ及び／又は順序で少なくとも２つの配列エレメントを含む場合、構築物を含む宿主細胞に対して異種又は外因性であると理解されたい。
【０１０５】
適切な宿主細胞において本発明のフラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するためのベクター及び発現構築物を、本明細書において以下により詳細に記載する。
【０１０６】
転写アクチベーターの発現の調節が変化した細胞
本発明の細胞の一実施形態において、フランの異化に関係する遺伝子の転写アクチベーターの発現の調節を変化させる。転写アクチベーターの発現は、ＦＤＣＡ分解に関する内因性の遺伝子を含む細胞において、好ましくは転写アクチベーターとは独立して発現される、ＨＭＦをＦＤＣＡに変換する酵素をコードしている遺伝子を含む細胞において、ＦＤＣＡの分解を防止するために低減又は除去することができる。或いは、ＨＭＦ及び／又は他のフラン前駆体をＦＤＣＡに変換するための内因性遺伝子の発現を増大させるために、転写アクチベーターの発現を増大させることができ、及び／又はＦＤＣＡ分解を防止するように遺伝的に修飾されている細胞において構成的にすることができる。
【０１０７】
本発明の細胞において、発現の調節が変化しているその転写アクチベーターは、好ましくは配列番号１９（ｈｍｆＲ）と少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列によってコードされ、ポリペプチドが、フランの異化に関係する少なくとも１つの遺伝子の転写を活性化する能力を有する。
【０１０８】
したがって、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、フザリウム、ペニシリウム、スケドスポリウム、スポロトリクス、及びスタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）からなる群から選択される属の真菌、より好ましくはフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ペニシリウム・ブラジリアヌム、スケドスポリウム・アピオスペルマム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ）、スポロトリクス・シェンキイ、及びスタキボトリス・クロロハロナタ（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈｌｏｒｏｈａｌｏｎａｔａ）からなる群から選択される種の真菌、最も好ましくは株Ｐ．ブラジリアヌムＣ１である真菌から得ることができる（又は天然に存在する）転写アクチベーターのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する転写アクチベーターをコードする。
【０１０９】
一実施形態において、ヌクレオチド配列は、天然に存在する、例えば野生型供給源生物から単離することができる、転写アクチベーターをコードする。或いは、ヌクレオチド配列は、対応する天然の転写アクチベーターポリペプチドと比べて１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むが、本明細書において定義した同一性又は類似性の範囲内にあり得る、上記で定義したような転写アクチベーターポリペプチドのいずれかの操作された形態をコードすることができる。したがって、一実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列がそれぞれの不変位置（表１９において「＊」で示される）に、不変位置に存在するアミノ酸を少なくとも含む、転写アクチベーターポリペプチドをコードする。アミノ酸配列はまた、高度に保存された位置（表１９において「：」で示される）に、高度に保存された位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのが好ましい。アミノ酸配列はさらにまた、それほど高度に保存されていない位置（表１９において「．」で示される）に、それほど高度に保存されていない位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのがより好ましい。これらの不変位置及び保存位置の外側のアミノ酸置換は、転写アクチベーター活性に影響する可能性は低い。表１９は、ペニシリウム・ブラジリアヌムｈｍｆＲのアミノ酸配列アライメントを、公的データベースで利用可能なその１０の近縁のオルトログと共に表す。表１９Ａは、Ｐ．ブラジリアヌム配列とそのオルトログとの間のアミノ酸同一性パーセンテージ、並びにオルトログの受託番号を提供する。
【０１１０】
転写アクチベーター活性を有するポリペプチドをコードしている本発明のヌクレオチド配列は、当技術分野でそれ自体が周知であるヌクレオチド配列の単離方法を利用して、真菌、酵母又は細菌、例えば、上述の供給源生物と同じ門、綱又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存アミノ酸配列に基づいて設計された）縮重ＰＣＲプライマーを適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに使用して、転写アクチベーター活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成する；ｂ）ａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用し、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングする；並びに、ｃ）フラン転写アクチベーターをコードしているヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生産する、方法で得ることができる。
【０１１１】
フラン転写アクチベーターポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞は、上述のような本発明の真菌宿主細胞であることが好ましい。
【０１１２】
フラン転写アクチベーターポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物は、構築物で形質転換される宿主細胞に対して異種又は外因性である発現構築物であるのが好ましい。構築物は、本明細書において、構築物が宿主細胞に天然に存在しない少なくとも１つの配列又は配列エレメントを含む場合、及び／又は構築物が、エレメントがそれ自体宿主細胞中に天然に存在していても、宿主細胞に天然に存在しない組み合わせ及び／又は順序で少なくとも２つの配列エレメントを含む場合、構築物を含む宿主細胞に対して異種又は外因性であると理解されたい。
【０１１３】
適切な宿主細胞において本発明のフラン転写アクチベーターポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するためのベクター及び発現構築物を、本明細書において以下により詳細に記載する。
【０１１４】
本発明の細胞の遺伝的修飾のためのベクター、遺伝子構築物、及び方法
本発明の親宿主細胞の遺伝的修飾のために、すなわち、本発明の修飾された宿主細胞を構築するために、当技術分野で一般的に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によって記載されている標準的な遺伝子技術及び分子生物学技術を使用する。
【０１１５】
より詳細には、酵母を遺伝的に修飾するための手段及び方法は、標準で当業者に公知であり、例えば遺伝子を（過剰）発現するためのプロモーター、エピソーム及び／又は組み込み発現構築物、並びにベクター、選択可能マーカー、内因性の酵母遺伝子又はその一部を破壊及び／又は枯渇させるための方法及び遺伝子構築物、並びに酵母を形質転換する方法を含む。そのような手段及び方法は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（１９７８）；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１９４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１）；Ｓｕｄｂｅｒｙ，Ｐ．Ｅ．（２００１）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｔ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ｅｄｓ  Ｈ．−Ｊ．Ｒｅｈｍ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒｅｅｄ），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ．ｄｏｉ：１０．１００２／９７８３５２７６２０９９９．ｃｈ１３ａ；ａｎｄ，Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｈｅｓｌｏｔ，Ｈ．（１９８８），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：１６１−１７４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｏｂｍ．３６２０２８０３０３に記載されている。
【０１１６】
同様に、糸状菌を遺伝的に修飾するための手段及び方法は、標準で当業者に公知であり、例えば遺伝子を（過剰）発現するためのプロモーター、エピソーム及び／又は組み込み発現構築物、並びにベクター、選択可能マーカー、内因性の真菌遺伝子又はその一部を破壊及び／又は枯渇させるための方法及び遺伝子構築物、並びに糸状菌を形質転換させる方法を含む。そのような手段及び方法は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．Ｍ．（２００７，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  ｃｅｌｌｓ”，Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．ＩＩＩ．（Ｅｄ．Ｈ．Ｗ．Ｄｏｅｌｌｅ  ａｎｄ  Ｅ．Ｊ．Ｄａｓｉｌｖａ），ＥＯＬＳＳ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ．ｐｐ．３６−６３；Ｌｕｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｄ．，＆Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．（２００９），“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｓ  ａ  ｈｏｓｔ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｄｖａｎｃｅｓ，２７（１），５３−７５；Ｍｅｙｅｒ，Ｖ．（２００８）“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ−−ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｏｂｓｔａｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｔｒｅｎｄｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，（２６），１７７−８５；Ｋｕｃｋ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆ（２０１０）“Ｎｅｗ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，８６（１），５１−６２；及び国際公開第２０１４／１４２６４７号に記載されている。
【０１１７】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、例えば本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ又はフランアルデヒドデヒドロゲナーゼ、又はその機能的同等物をコードしているヌクレオチド配列、を含むクローニングベクター及び発現ベクターを含むベクターなどの核酸構築物、並びに適切な宿主細胞にそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトする方法に関する。本明細書で使用する場合、用語「ベクター」及び「構築物」は同義的に使用され、本発明のポリヌクレオチドを含む、構築された核酸分子を意味する。
【０１１８】
本発明に記載のベクターは、自律複製ベクター、すなわち染色体外の実体として存在するベクターであってもよく、その複製は、染色体複製、例えばプラスミドから独立している。或いは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と共に複製されるものであってもよい。便宜上、ベクターは、操作及び生産を容易にするために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌において使用するための複製開始点及び選択可能マーカーを同様に含むシャトルベクターであり得る。
【０１１９】
一実施形態において、核酸構築物は、（過剰）発現される本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む発現構築物又は発現ベクターであり、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、当該宿主細胞におけるコードヌクレオチド配列の発現（速度）に影響を及ぼす及び制御することができる調節配列に作動可能に連結されている。そのような調節配列は典型的には少なくとも、通常、コード配列の上流に位置し、コード配列に作動可能に連結されることが好ましい、コード配列の転写を制御するように機能するプロモーターを含む。プロモーターに加えて、上流の転写調節配列は、エンハンサー、上流の活性化配列、転写因子結合部位、リプレッサー、及びアクチベータータンパク質結合部位等などのエレメントをさらに含み得る。プロモーター配列は通常、転写開始部位（複数可）を含む。酵母及び糸状菌においてコード配列を発現させるために適切なプロモーター及び転写調節配列は、上記で列挙した参考文献に記載されている。プロモーター及び転写開始部位（複数可）の下流で、発現構築物は、翻訳開始コドン、すなわちコード配列の最初のコドンの周囲に真核細胞コザックコンセンサス配列などの翻訳開始配列を含む。コード配列は、翻訳終止コドンで終了する。コード配列の下流で、発現構築物は、同様にポリアデニル化部位を含むことが好ましい１つ又は複数の転写終止部位、例えばターミネーターを含む３’非翻訳領域を含み得る。ターミネーターの起源はそれほど重要ではない。ターミネーターは、例えば、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列に天然であり得る。しかし、酵母ターミネーターは酵母宿主細胞において使用されるのが好ましく、糸状菌ターミネーターは糸状菌宿主細胞において使用されるのが好ましい。ターミネーターは宿主細胞（ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が発現される）に対し内因性であるのがより好ましい。適切な上流及び下流の調節配列に作動可能に連結されたコード配列を含む機能的発現単位は、発現カセットと呼ばれ得る。本発明の発現ベクター又は発現構築物は、任意選択で１つより多くの異なるコード配列を発現させるための１つより多くの発現カセットを含みうる。
【０１２０】
少なくとも１つの発現カセットに加えて、本発明の発現ベクター又は発現構築物はまた、ベクター又は構築物によって形質転換された宿主細胞を選択するための選択可能マーカーを含むことが好ましい。好ましい実施形態において、発現ベクター又は発現構築物における選択可能マーカーは、宿主細胞において形質転換体の初回選択後、例えば欧州特許第０  ６３５  ５７４号に記載される相同的組換えを使用して、又はＧｕｌｄｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２５１９−２５２４）によって記載されるＣｒｅ−ｌｏｘ系を使用して、発現構築物／ベクターからのマーカーの切り出しを可能にする構成で存在する。
【０１２１】
本発明は、本発明のポリペプチド、例えばＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、及びその発現が本発明の細胞において低減／除去されるポリペプチドを含む、ポリペプチドを調製するための方法にさらに関する。方法は、ポリペプチドの発現を誘導する条件で本発明による細胞を培養するステップと、任意選択で、発現されたポリペプチドを回収するステップとを含む。本発明はまた、そのような方法によって得ることができるポリペプチドにも関する。
【０１２２】
したがって、別の態様において、本発明は、コードされる標的タンパク質の発現及び／又は活性を低減又は除去するために、本発明の細胞における内因性の標的遺伝子を修飾するための手段及び方法に関する。標的タンパク質の発現を低減又は除去するために使用され得る修飾は、限定するものではないが、標的タンパク質をコードしている遺伝子全体又は遺伝子の一部の欠失、タンパク質が発現されないように又は低レベルで発現されるように標的遺伝子への（プロモーター又はコード領域のいずれかへの）ＤＮＡ断片の挿入、機能的タンパク質が発現されないように終止コドン又はフレームシフトを付加する変異の標的コード領域への導入、及び非機能的標的タンパク質又は低減された酵素活性を有する標的タンパク質が発現されるようにアミノ酸を変化させるための１つ又は複数の変異の標的コード領域への導入が挙げられる、破壊である。さらに、標的遺伝子の発現を、アンチセンスＲＮＡ又は干渉ＲＮＡの発現によって遮断してもよく、共抑制をもたらす構築物を導入してもよい。その上、この準最適コード配列を対応する内因性の標的コード配列の代わりに置換すると、多くのコドンがまれなコドンで置換されるために、その発現が低い標的コード配列が合成され得る。このような準最適コード配列は、０．５、０．４、０．３、０．２、又は０．１未満のｃｏｄｏｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ（上記を参照されたい）を有することが好ましい。このような準最適コード配列は、同じポリペプチドを生産するが、翻訳が非効率的であるために生産速度は低い。さらに、転写物の合成又は安定性を、変異によって低減させてもよい。同様に、タンパク質がｍＲＮＡから翻訳される効率は、変異によって、例えば、準最適翻訳開始コドンを使用することによって調節することができる。これらの方法は全て、標的タンパク質をコードしている配列を利用する当業者が容易に実践することができる。
【０１２３】
特に、標的コード配列周囲のゲノムＤＮＡ配列は、相同組換えを使用する修飾方法にとって有用である。例えば、この方法において、標的遺伝子に隣接する配列を、相同組換えを媒介するために選択可能マーカー遺伝子のいずれかの部位に配置すると、それによってマーカー遺伝子が標的遺伝子と置き換わる。同様に、部分標的遺伝子配列及び選択可能マーカー遺伝子に結合している標的遺伝子隣接配列を使用して、相同組換えを媒介してもよく、それによってマーカー遺伝子が標的遺伝子の一部と置き換わる。さらに、不活化構築物における選択可能マーカーは、宿主細胞ゲノムに組み込まれた後、例えば欧州特許第０  ６３５  ５７４号に記載される相同組換えを使用して、又はＧｕｌｄｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２５１９−２５２４）によって記載されるＣｒｅ−ｌｏｘ系を使用して、不活化構築物発現構築物／ベクターからのマーカーの切り出しを可能にするように構成することができる。
【０１２４】
標的遺伝子の欠失はまた、Ｗａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４，Ｙｅａｓｔ  １０：１７９３−１８０８）に記載されるように体細胞分裂組換えを使用して行ってもよい。この方法は、２０ｂｐもの短さであり得て、標的ＤＮＡ配列に結合する、すなわち隣接する選択可能マーカーをゲノム領域の間に含むＤＮＡ断片を調製することを伴う。このＤＮＡ断片は、マーカー遺伝子の末端にハイブリダイズし、真菌ゲノムと組換えすることができるゲノム領域を含むオリゴヌクレオチドを、プライマーとして使用する、選択可能マーカー遺伝子のＰＣＲ増幅によって調製することができる。線状ＤＮＡ断片は、酵母又は糸状菌を効率よく形質転換することができ、ゲノムとの組換えによって、標的ＤＮＡ配列の欠失を含む遺伝子置換をもたらす（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９１，ｖ  １９４，ｐｐ  ２８１−３０１に記載されるように）。その上、プロモーター置換法を使用して、内因性の転写制御エレメントを交換してもよく、それによってＭｎａｉｍｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｃｅｌｌ  １１８（１）：３１−４４）及び本明細書の実施例に記載されるように、別の手段に発現を調節させることができる。
【０１２５】
さらに、任意の細胞における標的タンパク質又は遺伝子の活性を、ランダム変異誘発を使用して破壊してもよく、この後に標的タンパク質の活性が低減された株を同定するためにスクリーニングを行う。このタイプの方法を使用する場合、標的タンパク質をコードしているＤＮＡ配列又は標的タンパク質の発現に影響を及ぼすゲノムの他のいかなる領域も、全く知る必要はない。遺伝子変異を作製する方法は当技術分野で一般的で周知であり、変異体を作製する実践に応用され得る。一般的に使用されるランダム遺伝子修飾方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において論評されている）としては、自然突然変異誘発、突然変異誘発遺伝子によって引き起こされる突然変異誘発、化学的突然変異誘発、ＵＶ若しくはＸ線の照射、又はトランスポゾン突然変異誘発が挙げられる。
【０１２６】
真菌の化学的突然変異誘発は、一般的に以下のＤＮＡ変異原の１つによる細胞の処理を伴う：メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硝酸、硫酸ジエチル、又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジン（ＭＮＮＧ）。これらの突然変異誘発方法は、Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，１９９６，Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）において論評されている。ＥＭＳによる化学的突然変異誘発は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙに記載されるように実施され得る。紫外（ＵＶ）光又はＸ線の照射もまた、酵母細胞においてランダム突然変異誘発を生じるために使用することができる。ＵＶ照射による突然変異誘発の主な効果は、ＤＮＡ複製の忠実度を混乱させるピリミジン二量体の形成である。酵母のＵＶ突然変異誘発のプロトコールは、Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，１９９６，Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）において見出され得る。突然変異誘発遺伝子表現型の導入もまた、酵母におけるランダム染色体突然変異を生成するために使用することができる。一般的な突然変異誘発遺伝子の表現型は、以下の遺伝子：ＰＭＳ１、ＭＡＧ１、ＲＡＤ１８、又はＲＡＤ５１のうちの１つ又は複数の破壊を通して得ることができる。非突然変異誘発遺伝子表現型の回復は、野生型対立遺伝子の挿入により容易に得ることができる。これら又は他の公知のランダム突然変異誘発方法のいずれかから生産された修飾された細胞のコレクションを、標的タンパク質の低減された活性に関してスクリーニングしてもよい（米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号）。
【０１２７】
フラン化合物を酸化させる方法
さらなる態様において、本発明は、フラン化合物を酸化させる方法に関する。特に、本発明は、ＦＤＣＡのフラン前駆体を酸化させる方法に関する。本発明の方法は、生成物が得られる単一の酸化反応ステップ（例えば、ＨＭＦＣＡのＦＦＣＡへの酸化）を含み得る。或いは、本発明の方法は、複数の酸化反応ステップを含むことができ、それぞれのステップは中間体を生じ、最後の中間体は最終生成物である。ＨＭＦが連続する酸化ステップでＦＤＣＡに酸化される、このような一連のステップの例としては、例えば：１）ＨＭＦをまずＨＭＦＣＡに酸化させ、これを第２のステップでＦＦＣＡに酸化させ、次いで、これを最終的にＦＤＣＡに酸化させるか、或いは、Ｄｉｊｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．５３（２０１４）６５１５−８）によって記載されているとおりである、２）ＨＭＦをまずＤＦＦに酸化させ、これを第２のステップでＦＦＣＡに酸化させ、次いで、これを最終的にＦＤＣＡに酸化させる、ステップが挙げられる。したがって、本発明の好ましい方法において、ＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体は、一連のステップで最終的にＦＤＣＡに酸化される。
【０１２８】
一実施形態において、本発明は、少なくともＨＭＦＣＡのＦＦＣＡへの酸化を含む方法に関する。本方法は、細胞をＨＭＦＣＡの存在下でインキュベートするステップを含む、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる方法であるのが好ましい。細胞は、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有する酵素を発現する細胞であるのが好ましい。細胞は、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有するように遺伝的に修飾された細胞であり得る。好ましい実施形態において、細胞は、本明細書において上記又は下記で定義された真菌である。細胞は、例えば以下に明記されるように、ＨＭＦＣＡの存在下で、細胞によるＨＭＦＣＡの酸化を誘導する条件でインキュベートすることが好ましい。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明は、ＦＤＣＡを生産する方法に関する。ＦＤＣＡを生産する方法は、好ましくはＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体を含む培地で細胞をインキュベートするステップを含む。細胞は、ＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する１つ又は複数の酵素を発現する細胞であるのが好ましい。ＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する酵素は、例示された真菌酵素を含む、上記で記載される、アルコール及び／若しくはアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、並びに／又はアルコール及び／若しくはアルデヒドオキシダーゼ活性を有する酵素であり得る。したがって、好ましい実施形態において、細胞は、本明細書において上記で定義された細胞、好ましくは真菌細胞である。
【０１３０】
しかし、或いは、細胞、好ましくは真菌細胞は、ＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する細菌酵素を発現する。そのような細菌酵素は、例えばカプリアビダス・バシレンシス株ＨＭＦ１４のＨｍｆＨオキシダーゼ及び国際公開第２０１１／２６９１３号に記載される関連オキシダーゼを含む。したがって、好ましくは真菌細胞は、ＦＤＣＡのフラン前駆体に対するＥＣ１．１及びＥＣ１．２活性のうち少なくとも１つを有するオキシダーゼを発現し、オキシダーゼは、配列番号４４（Ｃ．バシレンシスＨＭＦ１４  ＨｍｆＨオキシダーゼのアミノ酸配列）に対して少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むのが好ましい。
【０１３１】
細胞、好ましくは真菌細胞は、例えばカプリアビダス・バシレンシス株ＨＭＦ１４のアルデヒドデヒドロゲナーゼ及び国際公開第２０１２／６４１９５号に記載される関連デヒドロゲナーゼなどの、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（すなわち、ＥＣ１．２活性）を有する細菌酵素をさらに発現することができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、フランアルデヒドを変換することができることが好ましい。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させることができることがより好ましい。より詳細には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化させること、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうち少なくとも１つを可能にし得ることが好ましい。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、及び５１のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０１３２】
細胞、好ましくは真菌細胞は、フラン化合物輸送能力を有する、好ましくはＨＭＦＣＡ輸送能力を有するポリペプチド、例えばカプリアビダス・バシレンシス株ＨＭＦ１４のＨｍｆＴトランスポーター及び国際公開第２０１２／６４１９５号に記載される関連トランスポーターをさらに発現することができる。ＨＭＦＣＡ輸送能力は、ＨＭＦＣＡを細胞に輸送する能力を少なくとも含むと理解されたい。フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドは、配列番号５２、５３、５４、５５及び５６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０１３３】
細胞は、例えば以下に明記されるように細胞によるＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化を誘導する条件下でＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体の存在下でインキュベートされることが好ましい。
【０１３４】
本方法において、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体は、ＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ及びＤＦＦからなる群から選択されるのが好ましく、そのうち、ＨＭＦが最も好ましい。ＦＤＣＡのフラン前駆体は、従来の方法において、好ましくは酸触媒脱水によって、例えば、酸の存在下で加熱することによって、１つ又は複数のヘキソース糖から得られるのが好ましい。フルクトースからＨＭＦを生成する技術は十分に確立されており、堅実である（例えば、ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１３，１４９９−１５９７を参照）。グルコース高含有の供給原料も利用することができるが、ＨＭＦの熱化学的形成は、フルクトースからより効率的に生じる。したがって、追加の酵素的ステップは、グルコースイソメラーゼを使用して、グルコースをフルクトースに変換するために含めることができる。後者の方法は、例えば、加水分解デンプンからの高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の生産に対し、食品産業において十分に確立されている。グルコースはまた、例えば、ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３、前掲）に開示されているように、触媒及び溶媒の組合せを使用して、化学的にフルクトースに異性化することができる。
【０１３５】
ヘキソース糖は、通常、バイオマスから得られる。用語「バイオマス」とは、農業（作物残留物などの植物物質及び動物物質を含む）、林業（木材資源など）並びに漁業及び水産養殖を含む関連産業などの生物学的起源由来の生物分解性画分の生成物、廃棄物及び残留物、並びに産業廃棄物及び自治体廃棄物、例えば、自治体ゴミ又は古紙などの生物分解性画分を意味するものと理解されたい。好ましい実施形態において、バイオマスは植物バイオマスであり、（発酵性）ヘキソース／グルコース／糖高含有バイオマス、例えば、サトウキビ、デンプン含有バイオマス、例えばコムギ穀粒若しくはトウモロコシ藁、又は穀類、例えばトウモロコシ、コムギ、オオムギ、又はそれらの混合物がより好ましい。フルクタンを天然に高含有する農業作物（例えばキクイモ又はチコリの根）が好ましい。
【０１３６】
ヘキソース糖は、このようなバイオマスの加水分解によって得ることができる。バイオマスを加水分解する方法は、それ自体は当技術分野において公知であり、例えば、蒸気及び／又はグルコアミラーゼなどのカルボヒドラーゼの使用を含む。
【０１３７】
本発明の方法において使用するための好ましいタイプのバイオマスは、いわゆる「第２世代」のリグノセルロース系供給原料であって、多量のＦＤＣＡをより持続可能な方法で生産しようとする場合に好ましい。リグノセルロース系供給原料は、例えば、耕作地周辺部で栽培される専用エネルギー作物から得ることができ、したがって、食用作物とは直接競合しない。又は、リグノセルロースの供給原料は、副生成物、例えば、自治体ゴミ、古紙、木材残留物（製材工場及び製紙工場の廃棄物を含む）として得ることができ、また作物残留物を考慮することができる。作物残留物の例としては、サトウキビからのバガス及び数種類のトウモロコシ及びコムギの廃棄物が挙げられる。トウモロコシ副生成物の場合、３つの廃棄物は繊維、穂軸及び茎葉である。さらに、林業バイオマスを供給原料として使用することができる。第二世代の供給原料を本発明の発酵産物に変換するには、単糖類としてセルロース及びヘミセルロースを遊離させる必要がある。ここには、熱化学的アプローチ（通常、前処理と呼ばれる）、酵素的アプローチのいずれか、又は２つの方法論の組合せが適用される。前処理は糖を完全に遊離させるために、又は高分子化合物をその後の酵素作用に対しより利用可能にするために役立ち得る。様々なタイプの前処理としては、液体温水、水蒸気爆発、酸前処理、アルカリ前処理及びイオン性液体前処理が挙げられる。様々な化合物の相対量は、使用される供給原料及び使用される前処理の両方に依存する。このようなリグノセルロース供給原料から単糖類の糖を遊離させるには、例えば、アラビナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼなどを含む、適切なカルボヒドラーゼが使用される。
【０１３８】
本発明の酸化方法は、細胞に対して最適な温度で実施されることが好ましく、及び／又は細胞がオキシドレダクターゼ酵素を含むことが好ましい。したがって、好熱性細胞及び／又は好熱性酵素の場合、温度は、４０〜６５℃の範囲、例えば少なくとも４０、４２、又は４５℃であり、及び／又は例えば６５、６０、５５、又は５０℃を超えないことが好ましい。しかし、中温細胞及び／又は中温菌由来の酵素の場合、酸化反応は比較的温和な温度、例えば１０〜４５℃の範囲で行われることが好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、例えば少なくとも１０、１５、１８、２０、２２、又は２５℃であり、及び／又は例えば４５、４２、４０、３８、３５、３２、又は３０℃を超えないことがより好ましい。
【０１３９】
本発明の酸化方法は、酸性ｐＨで行われることが好ましい。任意の生物工学方法において、特にポリマー生産のためのモノマー化合物の生産では、制御されたポリマー形成においてモノマーの純度が必須であることから、後処理プロセス（ＤＳＰ）、すなわち回収及び精製は、一般的な懸念である。ＦＤＣＡは、３より低いｐＨ値で非常に限定的な溶解度を有する（ｐＫａはおよそ２．２８）。方法を酸性ｐＨで実施すると、生産されたＦＤＣＡは、それが生産される培地から好ましくはその生産時に既に沈殿しており、それによってその回収が非常に容易となる。したがって、本発明のプロセスにおいて、細胞、好ましくは真菌細胞は、５．０、４．０、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、又は２．４に等しいか又はそれより低いｐＨで１つ又は複数のフランの存在下でインキュベートされることが好ましく、２．０、２．１、２．２、又は２．２５、２．２７、又は２．２８に等しいか又はそれより高いｐＨでインキュベートされることが好ましい。本発明の方法において、この範囲のｐＨに対して高い抵抗性を有する細胞、好ましくは真菌宿主細胞を選択することが好ましい。酸性ｐＨで方法を実施するさらなる利点は、ほぼ全ての細菌が低いｐＨでは有害な影響を受けることから、方法の微生物混入がそれほど問題ではないことである。酵母及び真菌は、感染症供給源としての細菌と比べるとそれほど問題ではなく、取り扱いが比較的容易である。
【０１４０】
反応時間は６〜１５０時間であってもよく、６〜１８時間がより好ましい。酸素は、酸素源、例えば純酸素として、若しくは空気中の分子酸素、又は水、或いはフラン酸化酵素の要件に依存する異なる酸素源から反応培地中の細胞に供給されるのが好ましい。空気は、分子酸素の供給源として都合よく使用することができる。
【０１４１】
リアクターは、任意の適切な（通気型）バイオリアクターであり得る。リアクターは、連続的にバッチで操作することができ、供給型バッチで操作することができるのが好ましい。
【０１４２】
本発明の方法は、ＦＤＣＡ又はＨＭＦＣＡなどの本方法で生産された酸化生成物（複数可）を回収するステップを含むのがさらに好ましい。酸化生成物は、酸化ステップを行なう細胞をインキュベートする培地から回収されるのが好ましい。ＦＤＣＡ、ＨＭＦＣＡなどの酸化生成物は、例えば、（酸）沈殿、その後の冷却結晶化、及び結晶化した酸化生成物、例えば、結晶化ＦＤＣＡの分離によって、反応混合物又は培地から回収され得る。しかし、他の回収方法、例えば、当技術分野で知られている、酸沈澱及び溶媒抽出も適切である。
【０１４３】
フラン化合物を酸化させる本発明の方法は、供給原料からフラン化合物を除去するために有利に適用することができるが、この場合、フラン化合物は、例えば、バイオ燃料及びバイオケミカルズの生産用の発酵用供給原料に対して不都合であると考えられる。フラン化合物を酸化させる方法は、ＦＤＣＡがポリエステルＰＥＴのＰＴＡに置き換えられ、その場合、ベイオベースのポリエチレンフランジカルボキシラート（ＰＥＦ）を得ることができる、ポリエステル（プラスチック）を生産するためのモノマー前駆体としてＦＤＣＡのバイオ生産に適用されるのがより好ましい。ＦＤＣＡはまた、例えば、コハク酸の生産用の基質として、２，５−ビス（アミノメチル）−テトラヒドロフラン、２，５−ジヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン、２，５−ジヒドロキシメチルフラン及び２，５−フランジカルバルデヒドを含む、基質として有用な様々な化合物に使用することができる。ＦＤＣＡは、コーティングの生産において、例えば、アルキド樹脂及び熱可塑性コーティングにおいて使用することができる。またこれは、バイオ燃料におけるキシレン等価物として、及び溶媒として使用することができる。ＦＤＣＡはエステル化されていてもよく、エステルは可塑剤として使用することができる。ＦＤＣＡは、ＰＥＴ様ポリエステル及びポリウレタンに使用され得るそのジオールに変換され得る。さらに、ＦＤＣＡはそのジアミンに変換させることができ、ジアミンは鎖延長剤として使用することができ、またジアミンは、ポリウレタンの生産に使用することができるジイソシアネートに変換させることができる。
【０１４４】
したがって、さらなる態様において、本発明は、ａ）上記の本発明の酸化方法においてＦＤＣＡモノマーを調製するステップ、及びｂ）ａ）で得られたＦＤＣＡモノマー（複数可）からポリマーを生産するステップとを含む、１つ若しくは複数、又は少なくとも２つのＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産する方法に関する。ポリマーは、ポリエチレンフランジカルボキシラート（ＰＥＦ）であることが好ましい。
【０１４５】
なお別の態様において、本発明は、ＦＤＣＡのフラン前駆体の１つ又は複数をＦＤＣＡに生物変換するための細胞、好ましくは本発明の細胞の使用であって、細胞が、本明細書において上記で定義されたＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する細胞であるか、又はフラン化合物輸送能力を有し、本明細書において上記で定義されたＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼ活性をさらに含むポリペプチドを発現する細胞である、細胞の使用に関する。ＦＤＣＡに生物変換されるＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体は、ＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及びＤＦＦからなる群から選択されることが好ましく、そのうちＨＭＦが最も好ましい。
【０１４６】
ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有するポリペプチド及びそのようなポリペプチドをコードしている核酸
さらなる態様において、本発明は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドに関する。ポリペプチドは、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させる能力を有するアルコールデヒドロゲナーゼであることが好ましい。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１〜４のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも６９、６９．４、７０、７１、７２、７３、７３．９、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８４．５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりである、アミノ酸配列を含む又は当該アミノ酸配列からなるのが好ましい。ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１４７】
本発明は、さらに
ａ）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１〜４のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも６９、６９．４、７０、７１、７２、７３、７３．９、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８４．５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２２、２３、５７、及び５８のうちの少なくとも１つに示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む、核酸分子に関する。
【０１４８】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含む、クローニングベクター及び発現ベクターを含むベクターに関し、さもなければ、それらのベクターは、本明細書において上述したとおりである。
【０１４９】
さらに別の態様において、本発明は、ｉ）本セクションにおいて上記で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、及びｉｉ）本セクションにおいて上記に定義した核酸分子、の少なくとも１つを含む細胞に関する。上記細胞は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含む細胞、又は当該ヌクレオチド配列で形質転換された細胞、又はこのようなヌクレオチド配列を含むベクターであるのが好ましい。細胞は、単離細胞又は培養細胞であるのが好ましく、さもなければ、細胞は、本明細書において上記で記載したとおりであるのが好ましく、本細胞は、本明細書において上記で記載した１つ又は複数の遺伝的修飾を含むのが好ましい。本細胞は、上記で記載した方法、過程及び使用のいずれかにおいて適用することができる。
【０１５０】
フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド及びそのようなポリペプチドをコードしている核酸
さらなる態様において、本発明は、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、すなわちフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドに関する。フランアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの酸化させる能力を有することが好ましく、配列番号５及び６のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７０．９、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりであるアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるのが好ましい。ポリペプチドは単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１５１】
本発明は、さらに
ａ）フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号５及び６のアミノ酸配列と少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７０．９、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２４、２５、及び５９のうちの少なくとも１つに示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子に関する。
【０１５２】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含むが、それ以外は本明細書において上述したとおりである、クローニングベクター及び発現ベクターを含む、ベクターに関する。
【０１５３】
さらに別の態様において、本発明は、ｉ）本セクションにおいて上記で定義したフランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、及びｉｉ）本セクションにおいて上記に定義した核酸分子、のうちの少なくとも１つを含む細胞に関する。本細胞は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列若しくはこのようなヌクレオチド配列を含むベクター、を含む細胞、又はそれらで形質転換された細胞であるのが好ましい。本細胞は、単離細胞又は培養細胞であるのが好ましく、本細胞は、それ以外は本明細書において上記で記載したとおりであるのが好ましく、本細胞は、本明細書において上記で記載した１つ又は複数の遺伝的修飾を含むのが好ましい。本細胞は、上記で記載した方法、過程及び使用のいずれかにおいて適用することができる。
【０１５４】
フランアルコール／アルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチド及びそのようなポリペプチドをコードしている核酸
さらなる態様において、本発明は、フランアルコール／アルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドに関する。ポリペプチドは、そのような基を含むフラン化合物のＣ２及びＣ５位置でアルコール及びアルデヒド基を酸化させることができるオキシダーゼ活性であることが好ましい。したがって、ポリペプチドは、ＥＣ１．１及びＥＣ１．２活性を有することが好ましい。フランオキシダーゼ活性を有するポリペプチドは、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること；ｉｉ）ＨＭＦをＤＦＦに酸化させること；ｉｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化させること；ｉｖ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化させること；及びｖ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化させることのうちの少なくとも１つの酸化させる能力を有することが好ましく、配列番号７〜９のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４９．３、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６２．７、６３、６４、６５、６６、６６．９、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりであるアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなることが好ましい。ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１５５】
本発明は、さらに
ａ）フランオキシダーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号７〜９のアミノ酸配列と少なくとも４９．３、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６２．７、６３、６４、６５、６６、６６．９、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２６〜２８に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子に関する。
【０１５６】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含むが、それ以外は本明細書において上述したとおりである、クローニングベクター及び発現ベクターを含む、ベクターに関する。
【０１５７】
さらに別の態様において、本発明は、ｉ）本セクションにおいて上記で定義したフランオキシダーゼ活性を有するポリペプチド、及びｉｉ）本セクションにおいて上記に定義した核酸分子、のうちの少なくとも１つを含む細胞に関する。本細胞は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列若しくはこのようなヌクレオチド配列を含むベクター、を含む細胞、又はそれらで形質転換された細胞であるのが好ましい。本細胞は、単離細胞又は培養細胞であるのが好ましく、本細胞は、それ以外は本明細書において上記で記載したとおりであるのが好ましく、本細胞は、本明細書において上記で記載した１つ又は複数の遺伝的修飾を含むのが好ましい。本細胞は、上記で記載した方法、過程及び使用のいずれかにおいて適用することができる。
【０１５８】
ＦＤＣＡの異化に関係するポリペプチド及び／又はＨＭＦ代謝の代替経路に関係するポリペプチド並びにそのようなポリペプチドをコードしている核酸
さらなる態様において、本発明は、ＦＤＣＡを分解する能力を有するポリペプチドに関する。ＦＤＣＡを分解する能力を有するポリペプチドは、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチド、ＦＤＣＡデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド、ＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、及びラクトナーゼ活性、すなわちＦＤＣＡ脱炭酸に起因するラクトンを加水分解する能力を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つである。
【０１５９】
一実施形態において、ポリペプチドは、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を有し、配列番号１０及び１１のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４３．４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８２．３、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりであるアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなることが好ましい。ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１６０】
本発明は、さらに
ａ）ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１０及び１１のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４３．４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８２．３、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２９及び３０のうちの少なくとも１つに示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子に関する。
【０１６１】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含むが、それ以外は本明細書において上述したとおりである、クローニングベクター及び発現ベクターを含む、ベクターに関する。
【０１６２】
一実施形態において、ポリペプチドは、ＦＤＣＡデカルボキシラーゼ活性を有し、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６２．９、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりであるアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなることが好ましい。ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１６３】
本発明は、さらに
ａ）ＦＤＣＡデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６２．９、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号３１に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子に関する。
【０１６４】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含むが、それ以外は本明細書において上述したとおりである、クローニングベクター及び発現ベクターを含む、ベクターに関する。
【０１６５】
一実施形態において、ポリペプチドは、ＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５、８５．４、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりであるアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなることが好ましい。ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１６６】
本発明は、さらに
ａ）ＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５、８５．４、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号３２に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子に関する。
【０１６７】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含むが、それ以外は本明細書において上述したとおりである、クローニングベクター及び発現ベクターを含む、ベクターに関する。
【０１６８】
一実施形態において、ポリペプチドは、ラクトナーゼ活性を有し、すなわちＦＤＣＡ脱炭酸に起因するラクトンを加水分解する能力を有し、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも６７．５、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりであるアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなることが好ましい。ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１６９】
本発明は、さらに
ａ）ラクトナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも６７．５、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号３３に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子に関する。
【０１７０】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含むが、それ以外は本明細書において上述したとおりである、クローニングベクター及び発現ベクターを含む、ベクターに関する。
【０１７１】
さらなる態様において、本発明は、代替経路がＨＭＦ及びＦＤＣＡの他のフラン前駆体からのＦＤＣＡの生産と競合する、ＨＭＦ及びＦＤＣＡの他のフラン前駆体の代謝の内因性の代替経路に関係するポリペプチドに関する。１つのそのようなポリペプチドは、ＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡを対応するアルコールに還元することができるデヒドロゲナーゼ、例えば短鎖デヒドロゲナーゼである。ポリペプチドは、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有することが好ましい。
【０１７２】
一実施形態において、ポリペプチドは、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有し、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７３．６、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりであるアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなることが好ましい。ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１７３】
本発明は、さらに
ａ）ＦＤＣＡ脱炭酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７３．６、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号３４に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子に関する。
【０１７４】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含むが、それ以外は本明細書において上述したとおりである、クローニングベクター及び発現ベクターを含む、ベクターに関する。
【０１７５】
詳細には、不活化構築物が、本明細書において上記の標的コード配列周囲に又は隣接するゲノムＤＮＡ配列を含むことが好ましい、このセクションに記載される標的コード配列を不活化するための不活化構築物が、本発明に含まれる。
【０１７６】
フラントランスポーターを有するポリペプチド及びそのようなポリペプチドをコードしている核酸
さらなる態様において、本発明は、本明細書において上記で定義したフラン化合物輸送能力を有するポリペプチドに関する。ポリペプチドは、フラン化合物を輸送する能力を有することが好ましく、配列番号１６〜１８のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８４．１、８５、８５．２、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりであるアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなることが好ましい。ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１７７】
本発明は、さらに
ａ）フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドであって、配列番号１６〜１８のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８４．１、８５、８５．２、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号３５〜３７に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子に関する。
【０１７８】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含む、クローニングベクター及び発現ベクターを含むベクターに関し、さもなければ、それらのベクターは、本明細書において上述したとおりである。
【０１７９】
さらに別の態様において、本発明は、ｉ）本セクションにおいて上記で定義したフラン化合物輸送能力を有するポリペプチド、及びｉｉ）本セクションにおいて上記に定義した核酸分子、の少なくとも１つを含む細胞に関する。本細胞は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含む細胞、又は当該ヌクレオチド配列で形質転換された細胞、又はこのようなヌクレオチド配列を含むベクターであるのが好ましい。本細胞は、単離細胞又は培養細胞であるのが好ましく、さもなければ、本細胞は、本明細書において上記で記載したとおりであるのが好ましく、本細胞は、本明細書において上記で記載した１つ又は複数の遺伝的修飾を含むのが好ましい。本細胞は、上記で記載した方法、過程及び使用のいずれかにおいて適用することができる。
【０１８０】
調節因子フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼ活性を有するポリペプチド並びにそのようなポリペプチドをコードしている核酸
さらなる態様において、本発明は、本明細書において上記で定義した、フランの異化に関係する遺伝子の転写アクチベーターであるポリペプチドに関する。転写アクチベーターは、フランの異化に関係する少なくとも１つの遺伝子の転写を活性化する能力を有することが好ましく、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも５２．４、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりであるアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなることが好ましい。ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１８１】
本発明は、さらに
ａ）フランの異化に関係する少なくとも１つの遺伝子の転写を活性化する能力を有するポリペプチドであって、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも５２．４、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号３８に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝子コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
【０１８２】
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子に関する。
【０１８３】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含むが、それ以外は本明細書において上述したとおりである、クローニングベクター及び発現ベクターを含む、ベクターに関する。
【０１８４】
さらに別の態様において、本発明は、ｉ）本セクションにおいて上記で定義したフランの異化に関係する少なくとも１つの遺伝子の転写を活性化する能力を有するポリペプチド、及びｉｉ）本セクションにおいて上記に定義した核酸分子、のうちの少なくとも１つを含む細胞に関する。本細胞は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列若しくはこのようなヌクレオチド配列を含むベクター、を含む細胞、又はそれらで形質転換された細胞であるのが好ましい。本細胞は、単離細胞又は培養細胞であるのが好ましく、本細胞は、それ以外は本明細書において上記で記載したとおりであるのが好ましく、本細胞は、本明細書において上記で記載した１つ又は複数の遺伝的修飾を含むのが好ましい。本細胞は、上記で記載した方法、過程及び使用のいずれかにおいて適用することができる。
【０１８５】
本明細書及びその特許請求の範囲において、動詞の「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその動詞の活用形は、その単語に続く項目が含まれるが、特に言及されていない項目も除外されないことを意味する、非限定的な意味で使用される。さらに、不定冠詞「１つの（「ａ」又は「ａｎ」）」の構成要素への言及は、構成要素の１つ、及び１つだけが存在することを状況が明白に要求しない限り、複数の構成要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞の「１つの（「ａ」）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【０１８６】
本明細書に引用されているすべての特許及び文献参照は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【０１８７】
以下の実施例は、単なる例示目的として提供されており、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【０１８８】
【表１】
2018526998.tif 000002
2018526998.tif 000003
【０１８９】
【表２】
2018526998.tif 000004
2018526998.tif 000005
2018526998.tif 000006
【０１９０】
【表３】
2018526998.tif 000007
2018526998.tif 000008
【０１９１】
【表４】
2018526998.tif 000009
2018526998.tif 000010
【０１９２】
【表５】
2018526998.tif 000011
2018526998.tif 000012
2018526998.tif 000013
【０１９３】
【表６】
2018526998.tif 000014
2018526998.tif 000015
2018526998.tif 000016
【０１９４】
【表７】
2018526998.tif 000017
2018526998.tif 000018
2018526998.tif 000019
【０１９５】
【表８】
2018526998.tif 000020
2018526998.tif 000021
2018526998.tif 000022
【０１９６】
【表９】
2018526998.tif 000023
2018526998.tif 000024
【０１９７】
【表１０】
2018526998.tif 000025
2018526998.tif 000026
2018526998.tif 000027
【０１９８】
【表１１】
2018526998.tif 000028
2018526998.tif 000029
【０１９９】
【表１２】
2018526998.tif 000030
2018526998.tif 000031
【０２００】
【表１３】
2018526998.tif 000032
2018526998.tif 000033
2018526998.tif 000034
【０２０１】
【表１４】
2018526998.tif 000035
2018526998.tif 000036
【０２０２】
【表１５】
2018526998.tif 000037
2018526998.tif 000038
【０２０３】
【表１６】
2018526998.tif 000039
2018526998.tif 000040
2018526998.tif 000041
【０２０４】
【表１７】
2018526998.tif 000042
2018526998.tif 000043
2018526998.tif 000044
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【０２０５】
【表１８】
2018526998.tif 000049
2018526998.tif 000050
2018526998.tif 000051
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2018526998.tif 000054
2018526998.tif 000055
【０２０６】
【表１９】
2018526998.tif 000056
2018526998.tif 000057
2018526998.tif 000058
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2018526998.tif 000060
【０２０７】
【表２０】
2018526998.tif 000061
【０２０８】
【表２１】
2018526998.tif 000062
【０２０９】
【表２２】
2018526998.tif 000063
【０２１０】
【表２３】
2018526998.tif 000064
【０２１１】
【表２４】
2018526998.tif 000065
【０２１２】
【表２５】
2018526998.tif 000066
【０２１３】
【表２６】
2018526998.tif 000067
【０２１４】
【表２７】
2018526998.tif 000068
【０２１５】
【表２８】
2018526998.tif 000069
【０２１６】
【表２９】
2018526998.tif 000070
【０２１７】
【表３０】
2018526998.tif 000071
【０２１８】
【表３１】
2018526998.tif 000072
【０２１９】
【表３２】
2018526998.tif 000073
【０２２０】
【表３３】
2018526998.tif 000074
【０２２１】
【表３４】
2018526998.tif 000075
【０２２２】
【表３５】
2018526998.tif 000076
【０２２３】
【表３６】
2018526998.tif 000077
【０２２４】
【表３７】
2018526998.tif 000078
【０２２５】
【表３８】
2018526998.tif 000079
【実施例】
【０２２６】
方法及び材料
培養技法
使用したミネラル塩培地は、以下の脱イオン水１Ｌ当たり（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、１．５５ｇ；ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．８５ｇ；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ；ＥＤＴＡ、１５ｍｇ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．５ｍｇ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１ｍｇ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、４．５ｍｇ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３ｍｇ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇ；Ｈ３ＢＯ３、１ｍｇ；ＫＩ、０．１ｍｇを含んでいた。１２０℃で加熱滅菌及び冷却後、滅菌炭素源を添加した。グルコース溶液を、１１０℃で２０分間個別に加熱滅菌し、他の炭素源は１２０℃で滅菌した。必要であれば、ミネラル塩培地にビタミンを補充した。
【０２２７】
プレート用の培地（１．５％寒天）は、炭素源を表記の濃度で添加したミネラル塩培地を含んだ。
【０２２８】
小規模回分培養を、１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中、３０℃で実施した。回分培養は、炭素源を補充した２０ｍｌミネラル塩培地を含んでいた。回分培養は、静止して、又は様々な実験に関して示される速度のロータリーシェーカーでインキュベートした。空気は、綿栓を介してフラスコ内に入ることができた。
【０２２９】
作業容積１Ｌでの発酵器での真菌の回分培養を３０℃で行い、攪拌速度を制御した。ミネラル塩培地からＫ２ＨＰＯ４を省略した。ｐＨは、４Ｍ  ＮａＯＨ又は４Ｍ  Ｈ２ＳＯ４のいずれかによる滴定によって、必要なｐＨ値で自動的に制御した。空気を１分間に最大１リットルの速度で供給した。
【０２３０】
Ｐ．ブラジリアヌムのケモスタット培養もまた、発酵器において１リットルの作業容積で行った。０．１ｇ／ｌの酵母抽出物を添加したことを除き、同じ培地を使用した。培養容器（１ｇ／ｌのＨＭＦ）に、小規模回分培養からのＰ．ブラジリアヌムの事前培養物を接種した。バッチ毎に一晩インキュベートした後、培地リザーバーから所望の速度でポンピングを開始した。培地リザーバーでの炭素基質の濃度は１ｇ／ｌであった。攪拌子の速度を調節することによって、液体中の酸素レベルを自動的に制御した。空気を１分間に最大１リットルの速度で供給した。
【０２３１】
酵母株のケモスタット培養を、発酵器において１リットルの作業容積で行った。培養容器に、小規模回分培養からの酵母の事前培養物を接種した。バッチ毎に一晩インキュベートした後、培地リザーバーから所望の速度でポンピングを開始した。攪拌子の速度を調節することによって、液体中の酸素レベルを自動的に制御した。空気を１分間に最大１リットルの速度で供給した。
株
【０２３２】
以下の株を使用した：サッカロミセス・セレビジエＣＥＮ．ＰＫ１１３−１Ａ（ＭＡＴａｌｐｈａ；ｈｉｓ３Ｄ１；ｌｅｕ２−３＿１１２；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−２８９；ＭＡＬ２−８ｃ；ＳＵＣ２；Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ  Ｎｏ．３００００Ｂ  Ｏｒｆ  ２４６３）；ヤロウィア・リポリチカＰｏ１ｇ（Ｙｅａｓｔｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｅｒｎ．ｃｏｍから購入）；クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）Ｋｙ−００３、ＤＳＭ７００７３（基準株、バターミルクからの単離体）；大腸菌ＮＥＢ  ５−アルファ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍから購入）；シュードモナス・プチダＳ１２（ＡＴＣＣ  ７００８０１）；カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４（Ｗｉｅｒｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３（３）：３３６−４３）；ペニシリウム・ブラジリアヌムＣ１（実施例１に記述されるようにオランダの土壌から単離）。
【０２３３】
分子クローニング
本明細書において使用した全ての分子クローニング技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ；Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｐｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２に記述される方法と類似又は同等である。
【０２３４】
代謝物分析
培養試料の遠心分離及び／又は濾過によって得た上清を、ＨＰＬＣによってフランに関して分析した。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００システムによって実施した。フラン化合物は、Ｚｏｒｂａｘ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ  Ｃ８カラム（孔径８０Å、１８０ｍ２／ｇ、２５℃で作動）を使用して測定した。化合物を、ダイオードアレイ検出器を備えたＴｈｅｒｍｏシステムで定量した。
【０２３５】
使用した２つの溶離液は、１２ｍＭ  ＰＯ４緩衝液ｐＨ７（１．２９３ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４及び０．５４３ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｌ）及びアセトニトリル（ＨＰＬＣ等級、Ｓｉｇｍａ  Ｅ  ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ）であった。流速を１．２ｍＬ／分に設定して、勾配の適用時間はスキームに従って８分であった：１）最初の３．５分間は５％アセトニトリル；２）アセトニトリルを４０％アセトニトリルに達するように２．５分間で線形に増加させる；３）４０％アセトニトリルの一定レベルで０．５分間；４）アセトニトリルを５％アセトニトリルに達するように０．５分間線形に減少させる；及び５）５％アセトニトリルの一定レベルで１分間。
【０２３６】
様々なフラン化合物の保持時間及び波長を、以下の表２０に示す。
【表３９】
2018526998.tif 000080
【０２３７】
上清中のグルコース濃度を、Ｄ−グルコースがグルコース−６−リン酸に酸化される際に形成されるＮＡＤＰＨの吸収を測定することによって、酵素的に（Ｄ−グルコースＵＶ−試験、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ）決定した。上清を、分析前に最大１０２に希釈した。
【０２３８】
上清中のエタノール濃度を、エタノールがアセトアルデヒドに酸化され、その後酢酸に酸化される際に形成されるＮＡＤＨの吸収を測定することによって、酵素的に（エタノールＵＶ−試験、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ）決定した。上清を、分析前に最大１０３に希釈した。
【０２３９】
実施例１：ペニシリウム・ブラジリアヌム・バチスタの単離
低いｐＨ値でＨＭＦを使用して増殖する能力を有する真菌株を、オランダの土壌から濃縮して単離した。空気乾燥させた土壌１グラム量を、Ｋ２ＨＰＯ４が省かれている液体ミネラル塩培地２０ｍｌを含む１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。培地のｐＨを、ＨＣｌ溶液で滴定することによってｐＨ＝３に低下させた。最初のＨＭＦ濃度は１ｇ／ｌであった。細菌の増殖を抑制するために、ナリジクス酸（２０ｍｇ／ｌ）を培地に含めた。フラスコを３０℃で通気しながら静置してインキュベートした。２週間のインキュベーション後、濃縮培養物からの材料（１ｍｌ）を同じ初回組成を有する新しい培地に移した。この第２の培養物を、ミネラル塩培地及び０．５ｇ／ｌのＨＭＦを含む寒天プレートで画線培養した。プレートを３０℃の通気下で１０日間インキュベートした後に出現したコロニーを、生物が純粋になるまで同じ初回培地を有するプレートに再度画線培養した。ミネラル塩培地で生物を増殖させることによって、ＨＭＦを使用する増殖に関して単離体を試験した。液体２０ｍｌを含む１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコを使用して、単離体をこの培地中で１ｇ／ｌのＨＭＦの存在下又は非存在下のいずれかでインキュベートした。ＨＭＦを使用して良好な増殖を示す１つの特定の株をさらなる試験のために採取した。
【０２４０】
生物を、Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  ＣＢＳ−ＫＮＡＷで同定して特徴付けした。生物を麦芽エキス寒天中で、２５℃の暗所で３日間培養した。ＤＮＡを、ＭｏＢｉｏ−ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ（商標）微生物ＤＮＡ単離キットを使用してメーカーの使用説明書に従って抽出した。ＩＴＳ領域を含む断片を、プライマーＬＳ２６６（ＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡＡＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＣ；配列番号３９）及びＶ９Ｇ（ＴＴＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＴＧＴＡ；配列番号４０）を使用して増幅した（Ｇｅｒｒｉｔｓ  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｎｄｅ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｈｏｏｇ，１９９９，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，４３：１５１−１６２）。β−チューブリン遺伝子の一部の増幅は、プライマーＢｔ２ａ（ＧＧＴＡＡＣＣＡＡＡＴＣＧＧＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣ；配列番号４１）及びＢｔ２ｂ（ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＣ；配列番号４２）を使用して実施した（Ｇｌａｓｓ  ａｎｄ  Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，１９９５，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（４）：１３２３−１３３０）。ＰＣＲ断片の両方の鎖を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｂｉｇ  ＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ．３．０  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅシークエンシングキットを使用してシークエンシングした。試料をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して分析し、ＬａｓｅｒＧｅｎｅパッケージのプログラムＳｅｑＭａｎによってフォワード及びリバース配列を使用して、コンティグをアセンブルした。相同性検索をＮＣＢＩヌクレオチドデータベース及びＣＢＳ−ＫＮＡＷの内部データベースについて実施した。これは、単離体に関してペニシリウム・ブラジリアヌム・バチスタの基準株と１００％のマッチを生じた。生物をペニシリウム・ブラジリアヌムＣ１と命名して、本明細書に記載するさらなる試験のために使用した。
【０２４１】
ＨＭＦを別として、生物はまた、ＨＭＦ−アルコール、ＨＭＦＣＡ、ＦＤＣＡ、グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース。デンプン、及びクエン酸を利用してミネラル塩培地で増殖した。
【０２４２】
実施例２：低いｐＨ値でのＰ．ブラジリアヌムの増殖の制限
Ｐ．ブラジリアヌムＣ１株を、初回ｐＨ＝３の培地中で土壌をインキュベートすることによって単離した。しかし、増殖の間に、同様に純粋培養によるその後の回分実験の間にも培地のｐＨは変化する。増殖に関するｐＨの限界を確認するために、既定の増殖速度で一定の既定のｐＨを可能にするようにケモスタット培養を作動させた。増殖速度を０．０８ｈ−１に設定し、ｐＨをｐＨ＝２．９に維持した。３回の異なる実験において、ＨＭＦ、ＨＭＦＣＡ、又はＦＤＣＡのいずれかを炭素源として使用した。３つの条件のそれぞれで定常状態において、生物は、自己を確立することができ；失敗は起こらなかった。培養容器中の３つのフランの濃度はいずれも、３回の試行のいずれにおいても検出限界未満であった。結果は、３より低いｐＨ値で生物が増殖できることを示し、このことは低いｐＨ値でのＨＭＦからのＦＤＣＡの生産における望ましい特性である。さらに生物は、均一な懸濁液で増殖し、このことは株の有用性をさらに高めた。
【０２４３】
実施例３：ＨＭＦの異化に関係する酵素をコードしているＰ．ブラジリアヌムＣ１遺伝子の同定
Ｐ．ブラジリアヌムＣ１のゲノムのシークエンシング及びアノテーション
Ｐ．ブラジリアヌムＣ１からＤＮＡを単離して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００システムを使用するペアエンドシークエンシングのためにＢａｓｅ−Ｃｌｅａｒ社に送付した。品質チェック、フィルタリング及びアダプターの除去後、リード配列をコンティグにアセンブルして連結し、スキャホルドに入れた。
【０２４４】
ゲノムのアノテーションは、ＢａｓｅＣｌｅａｒアノテーションパイプラインを使用して実施し、これは構造のアノテーションに関するＡｕｇｕｓｔｕｓ（Ｓｔａｎｋｅ  ａｎｄ  Ｗａａｃｋ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１９  Ｓｕｐｐｌ  ２：ｉｉ２１５−２５）及び機能的アノテーションに関するＰｒｏｋｋａ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｖｉｃｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ）の組み合わせに基づいている。１組のペニシリウム種をアノテーションの参照として使用し、アノテーションは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、シグナルペプチド、Ｐｆａｍタンパク質ファミリー予測、細胞の局在、及び保存されたドメインに関する情報を含んだ。
【０２４５】
ＨＭＦ及びクエン酸で培養したＰ．ブラジリアヌムＣ１細胞のＲＮＡシークエンシング
比較可能なＲＮＡシークエンシングのための細胞を、２つの異なる炭素源でのケモスタット培養においてＰ．ブラジリアヌムＣ１細胞を増殖させることによって得た。増殖速度を０．１ｈ−１に設定し、ｐＨをｐＨ＝７に維持した。ＨＭＦ又はクエン酸のいずれかを２ｇ／ｌで炭素源として使用し、定常状態の状況を両方の場合について得た。ケモスタットに、Ｐ．ブラジリアヌムＣ１の事前培養物１００ｍｌを接種した。２４時間後に供給ポンプを開始し、３６時間後（定常状態）に、ＲＮＡアーゼフリーのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中、０℃、１５０００ｒｐｍで５０秒間の遠心分離によって、細胞６ｍｌを得た。上清を捨て、ＲＮＡ安定化及び保存のためにＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液１ｍｌを沈降物に添加した。試料を手短にボルテックスミキサーで攪拌して、４℃で一晩保存後、−８０℃のフリーザーに移した。
【０２４６】
ＲＮＡシークエンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００システムを使用するシングルエンドシークエンシングに基づいてＢａｓｅＣｌｅａｒ社が実施した。品質チェック、フィルタリング、及びトリミング後、リードを注釈付きゲノムに対して整列させた。このアライメントに基づいて、絶対発現値を計算し、次に遺伝子間及び試料間で正規化するために、正規化ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄ）発現測定を行った。２つの異なる試料を比較するために、統計学検定を実施して（ＫａｌのＺ検定及びＢａｇｇｅｒｌｙのβ−二項分布検定）、試料間の発現の差の有意性を割付した。
ＨＭＦの異化に関係する酵素をコードしているＰ．ブラジリアヌムＣ１遺伝子の同定
【０２４７】
ゲノムのアノテーション及び公的データベースに対する遺伝子のＢＬＡＳＴ検索、並びに差次的発現ＲＮＡシークエンシング結果に基づいて、Ｐ．ブラジリアヌムＣ１によるＨＭＦの分解に関係する酵素のコード化に関係する候補遺伝子のリストが編集されている。
【０２４８】
最初に、遺伝子（ＲＮＡｓｅｑデータからの）を、自動アノテーション（デヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ等）によって予想される機能毎に分類した。第２に、遺伝子を、ＨＭＦでの増殖の際の絶対的発現レベル（ＲＰＫＭ値；遺伝子の長さで補正した転写物の量）によって分類した。上位１００個の最も高度に発現された遺伝子にタグをつけた。第３に、遺伝子を、クエン酸での増殖と比較してＨＭＦでの増殖の際の倍率変化によって分類した。上位１００個の最も高度にアップレギュレートされた遺伝子にタグをつけた。第４に、絶対的発現レベル及び倍率変化の両方に関して高いスコアを有する遺伝子を選択した。第５に、機能（自動アノテーションによって予測される）に基づいてフィルターを適用した：予想されるＨＭＦ分解経路に関連し得る機能（表２１を参照されたい）を選択して、明確に指定されないヒットを棄却した。最後に、ＨＭＦ代謝に関係する実際の遺伝子であると予想される上位のヒット（ｈｍｆＫ１、ｈｍｆＬ１、ｈｍｆＭ、ｈｍｆＮ１、ｈｍｆＯ、ｈｍｆＬ２、ｈｍｆＰ１、及びｈｍｆＰ２；表２１を参照されたい）、及び中等度に高く発現若しくはアップレギュレートされたがＨＭＦ代謝の（おそらく代替）経路に関連する機能を予測している、さらに可能性がある関連ヒット（例えば、「古典的な」デカルボキシラーゼ及び脱炭酸デヒドロゲナーゼ；ｈｍｆＰ３、ｈｍｆＫ２、ｈｍｆＬ３、ｈｍｆＬ４、ｈｍｆＮ２、ｈｍｆＱ、及びｈｍｆＵ）に関してランキングを作成した。さらに、少数の「アクセサリ遺伝子」（輸送／調節）を選択した（ｈｍｆＲ、ｈｍｆＴ３、ｈｍｆＴ４、及びｈｍｆＴ５）。
【表４０】
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2018526998.tif 000082
【０２４９】
実施例４：Ｐ．ブラジリアヌムＣ１からの異種発現ｈｍｆＫ１を含むＰ．プチダＳ１２によるＦＤＣＡの分解
上記のＰ．ブラジリアヌムＣ１  ｈｍｆＫ１遺伝子（サリチル酸１−モノオキシゲナーゼｎａｈＧと相同性を示す）を、Ｐ．プチダＳ１２での発現のために選択した。この遺伝子によってコードされる酵素（ＥＣ１．１４．１３．１）は、ＦＤＣＡを介してのＨＭＦの分解において重要な役割を有し、ＦＤＣＡに対して脱炭酸モノオキシゲナーゼとして作用すると予想された。この仮説を調べるために、遺伝子をＰ．プチダＳ１２において発現させた。次に、ＦＤＣＡの分解をＰ．ブラジリアヌムｈｍｆＫ１遺伝子を含む株（Ｐ．プチダＳ１２  ΔＧＣＤ；ｐＢＴ’ｎａｈＧ＿ａｌｄＨ／ｐｊＮＮｈｍｆＴ１）並びに空のベクターを含む対照株（Ｐ．プチダＳ１２  ΔＧＣＤ；ｐＢＴ’ｈｍｆＨ＿ａｌｄＨ／ｐｊＮＮｈｍｆＴ１）によってモニターした。
【０２５０】
Ｐ．プチダ形質転換体を、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン及び３０ｍｇ／ｌゲンタマイシン及び１５６ｍｇ／ＬＦＤＣＡ（１ｍＭ）を補充した１０ｍｌのＭＭ＋１６０ｍＭグルコースを含む１００ｍｌ振盪フラスコで一晩増殖させた。開始ｐＨはおよそ７．０であると測定された。細胞を対数中期（ＯＤ６００＝約０．６）で採取して、洗浄し、１６０ｍＭグルコース及び５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを補充したＭＭに再懸濁させた。細胞懸濁液のアリコート（１０ｍｌ）（ＣＤＷの０．８４ｇに対応する）を、１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中、１ｍＭのＦＤＣＡと共にインキュベートし、ＦＤＣＡを分析するため試料を一定間隔で得た。表２２に示す結果は、Ｐ．ブラジリアヌムｈｍｆＫ１によってコードされる酵素がＦＤＣＡの分解に関与することを明らかに証明する。
【表４１】
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【０２５１】
実施例５：増殖中のＰ．ブラジリアヌム培養物及び緩衝溶液中の細胞懸濁液でのＨＭＦの代謝運命
Ｐ．ブラジリアヌムＣ１を、ミネラル塩培地及び０．５ｇ／ｌのＨＭＦと共に小規模回分培養で培養した。ＨＭＦの存在に対する初回反応として、生物は、ＨＭＦ−アルコール及びＨＭＦＣＡの両方を生産し、次いで３つ全ての化合物を分解した。この挙動は、いくつかの公知の生物によるＨＭＦの分解を想起させる。ＦＤＣＡは、そのような増殖中の培地において検出されなかった。
【０２５２】
細胞全体によるＨＭＦからのＦＤＣＡの形成を、確信を持って証明するために、緩衝溶液中の濃縮細胞懸濁液について実験を実施した。株を、０．５ｇ／ｌの初回ＨＭＦを含む１００ｍｌのミネラル塩培地を含む５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中で一晩培養した。培養物を遠心分離して、リン酸緩衝液（１．５５ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４及び０．８５ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）で２回洗浄した。得られた沈降物を、ＨＭＦを含む同じ緩衝液１０ｍｌ中に再懸濁させた。この緩衝液中のこれらの細胞を１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、ロータリーシェーカーにおいて４００ｒｐｍで振盪させた。１２０分後、試料をこのインキュベーションから取り出して、ＨＭＦ、ＨＭＦ−ＯＨ、ＨＭＦＣＡ、及びＦＤＣＡに関してＨＰＬＣによって分析した。
【０２５３】
表２３に示す結果は、ＨＭＦが経時的に分解され、ＨＭＦ−ＯＨ及びＨＭＦＣＡの両方が形成されたことを示す。最も重要なことに、ＦＤＣＡは０．２０ｍＭの濃度に蓄積したことが示され、このことは、真菌Ｐ．ブラジリアヌムＣ１が当初のＨＭＦからＦＤＣＡを生産できることを証明する。初回ＨＭＦを有しないブランクインキュベーションは、３つの中間化合物のいずれも蓄積しなかった。
【表４２】
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【０２５４】
実施例６：カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦＣＡオキシダーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の異種発現に及ぼすＳ．セレビジエ及びＫ．マルキシアヌスによるＨＭＦからのＦＤＣＡの生産
カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４からのｈｍｆＨ  ＨＭＦオキシダーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＨＭＦ／ＦＦＣＡデヒドロゲナーゼ）をコードしている遺伝子は、既にＰ．プチダＳ１２において機能的に発現されている（国際公開第２０１２／０６４１９５号）。しかし、Ｐ．プチダなどの細菌株は、低いｐＨ範囲、例えばｐＨ５より低い範囲では使用することができない。様々な理由から、ｐＨ５より遙かに低いｐＨ値でＦＤＣＡ生産のために微生物を使用することは有利であろう。したがって、本発明者らは、酵母Ｓ．セレビジエ及びＫ．マルキシアヌスを、ＨＭＦからＦＤＣＡを生産するように修飾して、低いｐＨで使用することができるか否かを調べた。この効果に対して、オキシダーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをそれぞれコードしている２つのＣ．バシレンシス遺伝子を、Ｓ．セレビジエＣＥＮ．ＰＫ１１３−１Ａ及びＫ．マルキシアヌスＫｙ−００３において発現させ、組換え株を、それらがＨＭＦからＦＤＣＡを生産する能力に関して試験した。初回試験は中性ｐＨ及び回分培養で実施した。次に、組換え株を、様々なｐＨ値のケモスタットで培養した。
【０２５５】
酵母Ｓ．セレビジエ及びＫ．マルキシアヌスにおいてＣ．バシレンシスｈｍｆＨ及びＨＭＦ／ＦＦＣＡアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現するための発現構築物を調製した。この発現構築物において、Ｃ．バシレンシスｈｍｆＨ遺伝子はＴＥＦ１プロモーターから発現され、転写はＣＹＣ１ターミネーターによって終止し、Ｃ．バシレンシスＨＭＦ／ＦＦＣＡアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＴＤＨ３プロモーターから発現され、転写はＴＤＨ３ターミネーターによって終止する（配列番号４３に記載のタンデム構築物）。発現構築物は、Ｇ４１８耐性マーカー、並びにＳ．セレビジエ及びＫ．マルキシアヌスＵＲＡ３遺伝子座への染色体組み込みのためのＵＲＡ３相同部位をさらに含む。
【０２５６】
酵母株Ｓ．セレビジエＣＥＮ．ＰＫ及びＫ．マルキシアヌスＫｙ−００３を、標準的なＧｉｅｔｚ及びＷｏｏｄｓの「酢酸リチウム／一本鎖担体ＤＮＡ／ポリエチレングリコール」法（２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３５０，ｐａｇｅｓ  ８７−９６）を使用してこの構築物で形質転換し、形質転換体を、３００μｇ／ｍｌジェネティシン（Ｇ４１８）を含むＹＥ寒天プレートで選択した。プレートのインキュベーションは、３０℃で少なくとも３日間行った。形質転換体をコロニーＰＣＲによってチェックした。酵素を発現するいくつかのクローンを得て、Ｓ．セレビジエＣＥＮ．ＰＫクローン２及びＫ．マルキシアヌスＫｙ−００３クローン３をさらなる試験のために使用した。
【０２５７】
親ＣＥＮ．ＰＫ株並びにクローン２の回分培養を、１ｇ／ｌのグルコース及び４ｍＭのＨＭＦを補充したミネラル塩培地中で実施した。タンデムクローン２の場合、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。インキュベーションを１５０ｒｐｍで振盪した。これらのインキュベーションから試料を採取して、ＨＭＦ、ＨＭＦ−ＯＨ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及びＦＤＣＡに関してＨＰＬＣによって分析した。実験開始時の酵母細胞密度は、クローン２及び親株に関してそれぞれ、ＯＤ２．２及びＯＤ４．１であった。表２４に示す結果は、ＨＭＦからＦＦＣＡ及びＦＤＣＡの両方を生産するクローン２の能力を明らかに証明する。
【表４３】
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【０２５８】
親Ｋｙ−００３株並びにクローン３のバッチ培養を、１ｇ／ｌのグルコース及び４ｍＭのＨＭＦを充填したミネラル塩培地で実施した。タンデムクローン３の場合、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。インキュベーションを１５０ｒｐｍで振盪した。これらのインキュベーションから試料を採取して、ＨＭＦ、ＨＭＦ−ＯＨ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及びＦＤＣＡに関してＨＰＬＣによって分析した。実験開始時の酵母細胞密度は、クローン３及び親株に関してそれぞれ、ＯＤ２及びＯＤ２．５であった。Ｓ．セレビジエＣＥＮ．ＰＫクローン２について得られた結果と類似の結果が、Ｋ．マルキシアヌスＫｙ−００３クローン３についても得られ（データは示していない）、Ｋ．マルキシアヌスも同様に、ＨＭＦからＦＦＣＡ及びＦＤＣＡの両方を生産することが可能であった。
【０２５９】
次に、Ｓ．セレビジエ株ＣＥＮ．ＰＫ及びＣＥＮ．ＰＫクローン２を、希釈率０．０８ｈ−１でケモスタット培養において培養した。Ｋ２ＨＰＯ４を０．３ｇ／ｌで使用し、０．２ｇ／ｌの酵母抽出物を添加したことを除き、ミネラル塩培地を使用した。発酵容器中のｐＨを、ＮａＯＨ（４Ｍ）及びＨ２ＳＯ４（４Ｍ）によってｐＨ＝４．０で自動的に制御し、液体中の酸素濃度を、これらの条件でのその最大溶解度の４５％〜５０％の間に維持した。必要であれば消泡剤（ストラクトール１０％）を使用した。培地リザーバーに添加したグルコースの量は各実験において２ｇ／ｌであった。第１の試行はグルコースを含んだがＨＭＦを含まなかった。他の実験はグルコースに加えて培地リザーバーに０．５ｇ／ｌのＨＭＦを含んだ。それぞれの実験に関して、４倍容積の交換後に定常状態の状況が確立された。培地リザーバー及び発酵容器の液体中の実際の濃度（細胞の分離後）の両方を、グルコース、エタノール、ＨＭＦ、ＨＭＦ−ＯＨ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及びＦＤＣＡに関して決定した。さらに、ＯＤ値を測定することによって、酵母バイオマスを推定した。結果を表２５に示し、ＣＥＮ．ＰＫクローン２が、ｐＨ＝４．０もの低いｐＨで増殖させた場合にＨＭＦからＦＤＣＡを生産することができることを確認する。
【表４４】
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【０２６０】
実施例７：Ｐ．ブラジリアヌムｈｍｆＬ１、ｈｍｆＬ２、及び／又はｈｍｆＮ１遺伝子を発現するＳ．セレビジエＣＥＮ．ＰＫによるＨＭＦからＦＤＣＡの生産
Ｐ．ブラジリアヌムアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ｈｍｆＬ１（配列番号５７）及び／又はｈｍｆＬ２（配列番号５８）、並びにＰ．ブラジリアヌムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子ｈｍｆＮ１（配列番号５９）をコードしているコドン最適化ヌクレオチド配列を、Ｓ．セレビジエＣＥＮ．ＰＫ１１３−１Ａにおいて発現させて、組換え株をＨＭＦからＦＤＣＡを生産する能力に関して試験した。初回試験を中性ｐＨ及び回分培養で実施した。配列を、酵母での発現に関してコドン最適化した。
【０２６１】
Ｐ．ブラジリアヌムｈｍｆＬ１、ｈｍｆＬ２、及び／又はｈｍｆＮ１遺伝子を発現するための発現ベクターを以下のように調製した。コドン最適化Ｐ．ブラジリアヌムｈｍｆＮ１コード配列（配列番号６０）を含む合成ＤＮＡ断片を制限酵素ＸｍａＩ及びＳｐｅＩによって処理して断片を生じ、これをＸｍａＩ及びＳｐｅＩによって処理した後、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）による脱リン酸化を行った酵母／大腸菌シャトルベクターｐＴＴ２（配列番号６１）においてクローニングした。コンピテント大腸菌のライゲーション及び形質転換後、得られた構築物（ｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１、配列番号６２）を、配列番号６３（ｈｍｆＬ１）によって表される合成ＤＮＡ断片のレシピエントとして使用した。このため、両方のＤＮＡ分子（ｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１及びｈｍｆＬ１コード配列を含む配列番号６３のＤＮＡ断片）を制限酵素Ａｓｃ１及びＭｌｕＩによって処理した。次に、プラスミドをＣＩＰで処理した。ライゲーション産物ｐＴＴ２−ｈｍｆＬＮ１−ｈｍｆＬ１（配列番号６４）で大腸菌を形質転換した。ｈｍｆＮ１及びｈｍｆＬ２を発現することができるプラスミドを生産するアプローチにおいて、プラスミドｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１（配列番号６２）及び配列番号６５で表される合成ＤＮＡ断片（ｈｍｆＬ２コード配列を含む）を、ＢｓｍＢＩ及びＡａｔＩＩと共にインキュベートした。次いで、プラスミドをＣＩＰと共にインキュベートして、消化したｈｍｆＬ２断片とライゲートして、ｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１−ｈｍｆＬ２（配列番号６６）を生じた。ｐＴＴ２−ｈｍｆＬＮ１−ｈｍｆＬ１（配列番号６４）及び合成ＤＮＡ断片（配列番号６５）を、ＢｓｍＢＩ及びＡａｔＩＩによって消化した。再度、プラスミドをＣＩＰの後に制限酵素によって処理し、２つのＤＮＡ断片をライゲートし、ｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１−ｈｍｆＬ１−ｈｍｆＬ２（配列番号６７）を生じた。ｐＴＴ２−ｈｍｆＬ１は、ｐＴＴ２−ｈｍｆＬＮ１−ｈｍｆＬ１（配列番号６４）を制限酵素ＳｍａＩ及びＰａｃＩによって消化し、ＴＤＨ３プロモーター及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子ｈｍｆＮ１を含む断片を切り出すことによって誘導された。得られた５’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）断片を使用して塞いだ。ＤＮＡ断片をライゲートしてコンピテント大腸菌に形質転換し、ｐＴＴ２−ｈｍｆＬ１（配列番号６８）を得た。このプラスミドは、Ｐ．ブラジリアヌムｈｍｆＬ１アルコールデヒドロゲナーゼのみの発現を可能にする。このプラスミドは、酵母において３つ全てのＨＭＦ形質転換Ｐ．プラジリアヌム酵素の同時発現を可能にする。Ｓ．セレビジエＣＥＮ．ＰＫを、ｐＴＴ２、ｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１−ｈｍｆＬ１−ｈｍｆＬ２、ｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１−ｈｍｆＬ１、及びｐＴＴ２−ｈｍｆＬ１によって形質転換した。各形質転換体についていくつかのクローンを得て、各形質転換体の１つのクローンをさらなる試験に使用した。
【０２６２】
形質転換体のバッチ培養を、１ｇ／ｌのグルコース及び３ｍＭのＨＭＦを補充したミネラル塩培地で実施した。ヒスチジン（１００ｍｇ／Ｌ）及びウラシル（１００ｍｇ／Ｌ）を培地に添加した。インキュベーションを１５０ｒｐｍで振盪した。試料をこれらのインキュベーションから採取して、ＨＭＦ、ＨＭＦ−ＯＨ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及びＦＤＣＡに関してＨＰＬＣによって分析した。表２６に示す結果は、ｐＴＴ２で形質転換したＣＥＮ．ＰＫがＨＭＦからＦＦＣＡ及びＦＤＣＡを生産することができないが、ｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１−ｈｍｆＬ１−ｈｍｆＬ２、ｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１−ｈｍｆＬ１、及びｐＴＴ２−ｈｍｆＬ１のそれぞれは、ＨＭＦからＦＦＣＡ及びＦＤＣＡの両方を生産する能力をＣＥＮ．ＰＫ宿主細胞に付与することを明らかに証明する。
【表４５】
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【０２６３】
次に、Ｓ．セレビジエＣＥＮ．ＰＫ形質転換体ＣＥＮ．ＰＫ／ｐＴＴ２及びＣＥＮ．ＰＫ／ｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１−ｈｍｆＬ１を、実施例６で上述した同じ条件でケモスタット培養で培養した。表２７に示す結果は、ｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１−ｈｍｆＬ１で形質転換したＣＥＮ．ＰＫが、十分な酸素を提供される場合、ＨＭＦからＦＤＣＡを効率よく生産する能力を有することを明らかに証明する。
【表４６】
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【０２６４】
実施例８：ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているＰ．ブラジリアヌムからの遺伝子の異種発現によるＹ．リポリチカによるＨＭＦからのＦＤＣＡの生産
ヤロウィア・リポリチカにおける発現に関して、Ｐ．ブラジリアヌムｈｍｆＬ１コドン最適化コドン配列を、ＰＣＲによって鋳型ＤＮＡとしてｐＴＴ２−ｈｍｆＮ１−ｈｍｆＬ１から増幅し、オリゴヌクレオチドの３’末端にＢａｍＨＩの制限部位及び５’末端に平滑末端を導入する。次に、ＰＣＲ断片を、クローニング部位としてＢａｍＨＩ及びＰｍｌＩを使用してｐＹＬＥＸ１発現ベクター（Ｙｅａｓｔｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｅｒｎ．ｃｏｍから得た）においてクローニングし、大腸菌を形質転換した。陽性大腸菌クローンの同定後、Ｐ．ブラジリアヌムｈｍｆＬ１遺伝子を担持するｐＹＬＥＸ１−ｈｍｆＬ１発現ベクターを、ＮｏｔＩによってベクターを直線化することによって、Ｙ．リポリチカＰｏｌｇ株（同様にＹｅａｓｔｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．から得た）に組み込むために調製する。直線化ベクターを、酢酸リチウム形質転換プロトコール及び栄養素要求性マーカーとしてロイシンを使用してＰｏｌｇに組み込む。形質転換体をｈｍｆＬ１遺伝子の存在に関してＰＣＲによってチェックする。
【０２６５】
形質転換体の回分培養を、１ｇ／ｌのグルコース及び４ｍＭのＨＭＦを補充したミネラル塩培地で実施した。インキュベーションを１５０ｒｐｍで振盪した。試料をこれらのインキュベーションから採取して、ＨＭＦ、ＨＭＦ−ＯＨ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ、及びＦＤＣＡに関してＨＰＬＣによって分析した。表２８に示す結果は、Ｙ．リポリチカＰｏｌｇ株におけるＰ．ブラジリアヌムｈｍｆＬ１の異種発現が、ＨＭＦからＦＤＣＡを生産する能力をこの酵母株に付与することを明らかに証明する。
【表４７】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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