(57)【要約】  本発明は、患者における膀胱がんを診断する方法に関し、患者に由来するDNAにおけるメチル化可変部位（MVP）のメチル化状態を決定すること、及びメチル化状態データに基づく診断を提供することを含む。本発明はまた、本明細書において定義される診断方法によって膀胱がんの診断を提供すること、続けて患者に１以上の抗がん剤を投与することを含む、膀胱がんを治療する方法に関する。本発明はまた、本明細書において定義されるMVPを対象とするプローブを含むメチル化判別アレイ及び該アレイを含むキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における膀胱がんを診断する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からDNAを提供すること；
(b)  配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；及び
(c)  (b)のグループのMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、
を含む、方法。
【請求項２】
MVPのグループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも40を含み、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、膀胱がんが診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
MVPのグループが、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも50を含む、又は配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも100を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
MVPのグループが、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの150全てを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも40がメチル化されているとき、又は配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも50がメチル化されているとき、又は該MVPの少なくとも100がメチル化されているとき、又は全150MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんが診断される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
メチル化されていると決定した前記MVPが、配列番号1〜3において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、又は配列番号1〜5において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、又は配列番号1〜10において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、又は配列番号1〜40において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記MVPのグループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの150全てを含み、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも40がメチル化されているとき、個体における膀胱がんが診断され、メチル化されていると決定したMVPが、配列番号1〜10において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記MVPの各1がメチル化されているかを決定する工程が、重亜硫酸塩でDNAを変換することを含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記MVPの各1がメチル化されているかを決定する工程が、以下：
１）MVPの配列を決定するために、シーケンシング工程を実施すること；
２）MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるプローブを含むアレイにDNAをハイブリダイズし、及びMVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別するためのアレイに検出システムを適用すること；又は
３）メチル化特異的プライマーを使用する増幅工程を実施することであって、メチル化されているか又はメチル化されていないかのMVPの状態が、増幅産物の存在又は非存在によって決定されること、
を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
シーケンシング又はハイブリダイゼーション工程の前に、増幅工程が実施され、各MVPを含むローカスが増幅される、請求項９（ａ）又は９（ｂ）に記載の方法。
【請求項１１】
増幅工程がPCRによって実施される、請求項９（ｃ）又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
シーケンシング又はハイブリダイゼーション工程の前に、キャプチャリング工程が実施され、該キャプチャリング工程が、MVPローカスを含むポリヌクレオチドを、MVPローカスに特異的な結合分子に結合させること、並びにMVPローカス及び結合分子を含む複合体を回収することを含み；及びここで：
i  重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の前に、前記キャプチャリング工程が存在する；
ii  重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の後であるが、増幅又はハイブリダイゼーション工程の前に、前記キャプチャリング工程が存在する；又は
iii  重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の後であって、増幅工程の後に、キャプチャリング工程が存在する；
請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合分子が、各MVPに特異的なオリゴヌクレオチド、好ましくは対応するMVPに相補的である配列を各々有するDNA又はRNA分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合分子が、精製のための成分に結合している、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記精製のための成分が、第一の精製のための成分を含み、MVPローカス及び結合分子を含む複合体を回収する前記工程が、前記第一の精製のための成分を、第二の精製のための成分を含む基質に結合することを含み、第一及び第二の精製のための成分が相互作用複合体を形成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一の精製のための成分がビオチンであり、前記第二の精製のための成分がストレプトアビジンである；又は前記第一の精製のための成分がストレプトアビジンであり、前記第二の精製のための成分がビオチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
MVPを含むローカスを増幅する前記工程が、MVPのメチル化状態に依存しないプライマーの使用を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
MVPを含むローカスを増幅する前記工程が、マイクロドロップレットPCR増幅により実施される、請求項３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
個体から採取された前記生体試料が、尿、血液、血清、血漿又は無細胞DNAの試料である、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、95%以上のROC感度及び90%以上のROC特異度；好ましくは96%のROC感度及び97%のROC特異度を達成する、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、95%以上、好ましくは98%のROC AUCを達成する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、95%以上、好ましくは97%の陰性的中率 (NPV)を達成する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
個体における膀胱がんを診断する前記工程が、更に以下：
I.  腫瘍の悪性度を階層化すること；及び／又は
II.  腫瘍の再発リスクを決定すること；及び／又は
III.  非筋肉浸潤性疾患の進行リスクを決定すること；及び／又は
治療療法に対し予想される応答を決定すること、
を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からDNAを採取し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；及び
(c)  前記個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法。
【請求項２５】
個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からDNAを提供し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；及び
(c)  前記個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法。
【請求項２６】
個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からのDNAにおいて、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；及び
(c)  前記個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法。
【請求項２７】
個体における膀胱がんを治療する方法であって、個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すことを含み、以下：
(a)  個体に由来する試料からのDNAを提供し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；及び
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、
を含む工程によって、個体が膀胱がんであると診断されている、方法。
【請求項２８】
個体における膀胱がんを診断する方法であって、以下：
(a)  配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを特定するデータを得ること；及び
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；を含み、
ここで、前記データが以下：
ｉ  試料に由来するDNAを採取すること；及び
ii  前記DNAにおいて、MVPがメチル化されているかを決定すること、
を含む方法によって得られた、方法。
【請求項２９】
前記がんが、非筋肉浸潤性膀胱がん (NMIBC)である、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記がんが、筋肉浸潤性膀胱がん (MIBC)である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるアレイであって；MVPパネルにおける各MVPのメチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブ、及び前記パネルにおいて各MVPの非メチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブを含み；前記パネルが、配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される少なくとも25MVPからなる、アレイ。
【請求項３２】
請求項３１に記載のアレイであって、前記アレイがInfinium Human Methylation450 BeadChipアレイでない場合、及び／又は前記アレイのMVP特異的であるオリゴヌクレオチドプローブの数が、482,421より少なく、好ましくは482,000以下、480,000以下、450,000以下、440,000以下、430,000以下、420,000以下、410,000以下又は400,000以下である、アレイ。
【請求項３３】
請求項３１又は請求項３２に記載のアレイであって、前記パネルが配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される少なくとも40MVP、好ましくは少なくとも50MVP、少なくとも60MVP、少なくとも70MVP、少なくとも80MVP、少なくとも90MVP、少なくとも100MVP、少なくとも110MVP、少なくとも120MVP、少なくとも130MVP、少なくとも140MVP、少なくとも145MVP、又は配列番号1〜150において特定される150MVP全てからなる、アレイ。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のアレイであって、前記パネルが配列番号1〜3で定義されるMVP、又は配列番号1〜5で定義されるMVP、又は配列番号1〜10で定義されるMVP、又は配列番号1〜20で定義されるMVP、又は配列番号1〜30で定義されるMVP、又は配列番号1〜40で定義されるMVP、又は配列番号1〜50で定義されるMVP、又は配列番号1〜60で定義されるMVP、又は配列番号1〜70で定義されるMVP、又は配列番号1〜80で定義されるMVP、又は配列番号1〜90で定義されるMVP、又は配列番号1〜100で定義されるMVP、又は配列番号1〜100で定義されるMVP、又は配列番号1〜120で定義されるMVP、又は配列番号1〜130で定義されるMVP、又は配列番号1〜140で定義されるMVP、又は配列番号1〜150で定義されるMVPを含む、アレイ。
【請求項３５】
請求項３４に記載のアレイであって、前記パネルが配列番号1〜150で定義されるMVP全てを含む、アレイ。
【請求項３６】
請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のアレイであって、配列番号1〜150で定義されるMVPのいずれかから選択されるMVPを含む１以上のオリゴヌクレオチドを更に含み、前記１以上のオリゴヌクレオチドが前記アレイの対応するオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする、アレイ。
【請求項３７】
請求項３６に記載のアレイであって、前記１以上のオリゴヌクレオチドが配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される少なくとも25MVP；好ましくは少なくとも50MVP、少なくとも60MVP、少なくとも70MVP、少なくとも80MVP、少なくとも90MVP、少なくとも100MVP、少なくとも110MVP、少なくとも120MVP、少なくとも130MVP、少なくとも140MVP、少なくとも145MVP、又は配列番号1〜150において特定される150MVP全てを含む、アレイ。
【請求項３８】
請求項３６又は３７に記載のアレイであって、前記１以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号1〜10で定義されるMVP、又は配列番号1〜20で定義されるMVP、又は配列番号1〜30で定義されるMVP、又は配列番号1〜40で定義されるMVP、又は配列番号1〜50で定義されるMVP、又は配列番号1〜60で定義されるMVP、又は配列番号1〜70で定義されるMVP、又は配列番号1〜80で定義されるMVP、又は配列番号1〜90で定義されるMVP、又は配列番号1〜100で定義されるMVP、又は配列番号1〜110で定義されるMVP、又は配列番号1〜120で定義されるMVP、又は配列番号1〜130で定義されるMVP、又は配列番号1〜140で定義されるMVP、又は配列番号1〜150で定義されるMVPを含む、アレイ。
【請求項３９】
請求項３８に記載のアレイであって、前記１以上のオリゴヌクレオチドが配列番号1〜150で定義されるMVP全てを含む、アレイ。
【請求項４０】
ハイブリダイズしたアレイであって、前記アレイが、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のアレイを、配列番号1〜150で定義されるMVPのいずれかから選択される様々なMVPを各々含むオリゴヌクレオチドのグループとハイブリダイズすることによって得られ、前記グループが少なくとも25オリゴヌクレオチドを含む、アレイ。
【請求項４１】
請求項４０に記載のハイブリダイズしたアレイであって、前記グループが、少なくとも40オリゴヌクレオチドを含み；任意で前記グループが少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも145、又は少なくとも150オリゴヌクレオチドを含む、アレイ。
【請求項４２】
請求項４０又は請求項４１に記載のハイブリダイズしたアレイであって、前記グループが配列番号1〜25で定義されるMVPを含む少なくとも25オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜40で定義されるMVPを含む少なくとも40オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜50で定義されるMVPを含む少なくとも50オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜60で定義されるMVPを含む少なくとも60オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜70で定義されるMVPを含む少なくとも70オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜80で定義されるMVPを含む少なくとも80オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜90で定義されるMVPを含む少なくとも90オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜100で定義されるMVPを含む少なくとも100オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜110で定義されるMVPを含む少なくとも110オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜120で定義されるMVPを含む少なくとも120オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜130で定義されるMVPを含む少なくとも130オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜140で定義されるMVPを含む少なくとも140オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜145で定義されるMVPを含む少なくとも145オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜150で定義されるMVPを含む少なくとも150オリゴヌクレオチドを含む、アレイ。
【請求項４３】
請求項４２に記載のハイブリダイズしたアレイであって、前記グループが配列番号1〜150で定義されるMVPを含む少なくとも150オリゴヌクレオチドを含む、アレイ。
【請求項４４】
請求項４０に記載のハイブリダイズしたアレイを作製するための方法であって、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のアレイを、配列番号1〜150で定義されるMVPのいずれかから選択される様々なMVPを各々含むオリゴヌクレオチドのグループと接触させることを含み、前記グループが少なくとも25オリゴヌクレオチドを含む、方法。
【請求項４５】
請求項４１に記載のハイブリダイズしたアレイを作製するための方法であって、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のアレイと、請求項４１により定義されるオリゴヌクレオチドのグループを接触させることを含む、方法；又は請求項４２又は４３に記載のハイブリダイズしたアレイを作製するための方法であって、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のアレイと、請求項４２又は請求項４３のいずれかにより定義されるオリゴヌクレオチドのグループを接触させることを含む、方法。
【請求項４６】
請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のアレイを含むキット。
【請求項４７】
MVPジヌクレオチドにおける非メチル化シトシンを修飾することができるが、MVPジヌクレオチドにおけるメチル化シトシンを修飾することができないDNA修飾剤を更に含み、任意で前記ジヌクレオチドがCpGである、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記DNA修飾剤が重亜硫酸塩剤である、請求項４６又は４７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、患者における膀胱がんを診断する方法であって、患者に由来するDNAにおけるメチル化可変部位（Methylation Variable Positions：MVP）のメチル化状態を決定すること、及びメチル化状態のデータに基づく診断を提供することを含む、方法に関する。本発明はまた、本明細書において定義される診断方法によって膀胱がんの診断を提供すること、続けて患者に１以上の抗がん剤を投与することを含む、膀胱がんを治療する方法に関する。本発明はまた、本明細書において定義されるMVPを対象とするプローブを含むメチル化判別アレイ、及びアレイを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
膀胱がんは、西洋世界において最もよく見られる悪性腫瘍の一つであり、米国において５番目によく見られるがんとして位置づけられており、全てのがん関連死の約3%を引き起こしている[1, 2]。診察時に最初に見られる臨床兆候は尿であり、調査した全てのそのような症例のうち約10%で、膀胱がんが検出される[3]。膀胱がんは、より高齢な男性患者、現在又は過去の喫煙者、及び工業的な発がん物質に曝された患者がよりなりやすい[4]。可視的でない血尿がみられるより若い女性は、膀胱がんが隠れている可能性はより低く、これらの患者では、血尿の誤診によって、膀胱がんの検出が遅れることが良くある出来事である[5]。膀胱鏡検査は、膀胱がんを検出するための現在の代表的な基準であり、診療所又は病院に通院する必要があり、小さいが有意な感染リスクを課す、侵襲的で不快な処置である[6‐9]。
【０００３】
英国では、毎年約10,300人が膀胱がんと診断され、5,000人が該疾患によって死亡する。しかし、毎年100,000例より多くが、初期診療から、膀胱鏡検査及び撮像のために泌尿器科の血尿診療所に照会されている。膀胱がんは、照会された患者のたった10%でしか検出されない。
【０００４】
確定した疾患を有する患者の３分の２が、非筋肉浸潤性膀胱がん（NMIBC）であり、その70%が再発し、15%が筋肉浸潤性膀胱がん（MIBC）に進行する。膀胱鏡検査での観察は、再発を検出するためには必要であり、２年間は３ヶ月毎に行われ、その後、再発の高いリスクのある症例については、６ヶ月毎及び毎年行われる。血尿の調査及びそれに続く再発の観察は、5539万ポンドと見積もられ、かなりの保健医療経済コストがかかる。それにより、管理するために、最も費用が掛かるがんの一つとして膀胱がランク付けされる[10, 11]。それゆえ、疾患が隠れている患者をより特定でき、不必要な膀胱鏡検査のニーズを減らすことができる、改良された検査についての多大なニーズがある。
【０００５】
尿ベースのバイオマーカーでは、膀胱がんの検出のための独立型の検査として、FDAの承認を受けているものはなく、結果としてガイドラインは、可視的な血尿及び可視的ではないが持続的である血尿がある、全患者に膀胱鏡検査を勧めている[10, 11]。尿細胞診は、膀胱鏡検査と一緒に、診断の補助として頻繁に用いられているが、悪性度の高い疾患やin situにおけるがん腫ではない、がんを検出するための感度が低く、膀胱鏡検査の代わりにはならない[12, 13]。同様に、単一の標的又は標的の小さいパネルに基づく、市販されている検査では、十分な感度で膀胱がんを検出することができず、膀胱鏡検査と一緒であるときの使用のみが承認される[14]。
【０００６】
幾つかの研究によって、がんを非侵襲的に検出するために、尿[15-23]、血漿/血清[24-26]、及び喀痰[27, 28]を含む体液における、DNAメチル化バイオマーカーの潜在的な有用性が、今、示されている。DNAメチル化における変化が、腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングや、がん遺伝子の過剰発現に繋がる、悪性形質転換において鍵となる役割を果たす[29]。がん遺伝子の柔軟性及びDNAメチル化の相対的な安定性によって、エピジェネティックな変化が、診断のための理想的なバイオマーカーとなる。
【０００７】
排出尿中の特異的なタンパク質の存在が関与する、検出するための検査が、開発されており、商業化されている。これらのケースにおいては、検査ごとに検出されるタンパク質数が少なく、特異度及び感度は不満足なままである[14]。検出されるタンパク質バイオマーカーとしては、ヒト補体H因子関連タンパク質、がん胎児性抗原（CEA）、膀胱腫瘍細胞関連ムチン及び核有糸分裂装置タンパク質22（NMP22）が挙げられる。
【０００８】
あるタンパク質の発現を評価する検査の観点から、国際特許出願公開第2014042763号は、尿試料におけるタンパク質の検出のための、IL-8、MMP9、SDC1、CCL18、SERPINE1、CD44、VEGF-A、CA9及びANGからなる９つのバイオマーカー・パネル；CA9、CCL18、MMP12、TMEM45A、MMP9、SEMA3D、ERBB2、CRH及びMXRA8からなる更に９つのバイオマーカー・パネル；並びにCCL18、CD44及びVEGF-Aからなる３つのバイオマーカー・パネルについて記載している。
【０００９】
これまでは、膀胱がんの検出のためのDNAメチル化バイオマーカー検査は、少ない数のローカスのみの分析に集中しており、一つには技術的な制限や、がん特異性がある標的の派生が原因である[11-19]。一般的に、報告されている感度及び特異度は、確立された検査と比べて高いが、膀胱鏡検査によって達成されるパフォーマンス特性を得ることができない。以前に研究された膀胱がんのメチル化マーカーとしては、DAPK、BCL2、TERT、TWIST1、NID2、RARbeta、E-cadherin及びp16が挙げられる。国際特許出願公開第2013/144362号は、ECRG4及び／又はITIH5遺伝子のプロモーターのメチル化を検出することを含む膀胱がんの診断検査を記載している。米国特許出願公開第2013224738号には、BCL2、CDKN2A及びNID2からなる遺伝子のメチル化状態を評価することを含む膀胱がんの診断検査を記載している。
【００１０】
膀胱がんの正確な診断のための改善された検査が探索され、特に非侵襲的な検査は有意な臨床的及び経済的な利点がある。
【発明の概要】
【００１１】
発明の概要
安定し、高い感度及び特異度をもって、生体試料、特に排尿試料から膀胱がんを検出し得る、診断方法が提供される。該方法は、血尿で照会された患者、及び疾患の再発についての観察を受けている患者における膀胱鏡検査のニーズを低減する可能性がある。膀胱鏡検査を回避することで、膀胱がんの管理費用が低減され、患者の幸福においてポジティブな影響があり、通院数や侵襲的な検査の不都合の両方が低減される。それゆえ、本発明は以下を提供する：
本発明は、個体における膀胱がんを診断する方法であって、
以下：
(a)  個体由来の試料からDNAを提供すること；
(b)  配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；及び
(c)  (b)のグループのMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、を含む方法を提供する。
【００１２】
任意のそのような方法において、MVPのグループは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも40を含み得、及び配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、膀胱がんが診断される。
【００１３】
MVPのグループは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも50を含み得る、又は配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも100を含み得る。
MVPのグループは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの150全てを含み得る。
【００１４】
上記方法において、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも40がメチル化されているとき、又は配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも50がメチル化されているとき、又は該MVPの少なくとも100がメチル化されているとき、又は150MVPの全てがメチル化されているとき、個体においてがんが、診断され得る。
【００１５】
上記方法において、メチル化されていると決定したMVPは、配列番号1〜3において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得るか、又は配列番号1〜5において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得るか、又は配列番号1〜10において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得るか、又は配列番号1〜40において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得る。
【００１６】
上記方法において、MVPのグループは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの150全てを含み得、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも40がメチル化されているとき、個体における膀胱がんが診断され、メチル化されていると決定したMVPが、配列番号1〜10において特定され[CG]で表示されるMVPを含む。
【００１７】
上記のいずれかの方法において、MVPの各1がメチル化されているかを決定する工程は、重亜硫酸塩でDNAを変換することを含み得る。
上記のいずれかの方法において、MVPの各1がメチル化されているかを決定する工程は、以下：
１）MVPの配列を決定するために、シーケンシング工程を実施すること；
２）MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるプローブを含むアレイにDNAをハイブリダイズし、及びMVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別するためのアレイに、検出システムを適用すること；又は
３）メチル化特異的プライマーを使用する増幅工程を実施することであって、メチル化されているか又はメチル化されていないかのMVPの状態が、増幅産物の存在又は非存在によって決定されること、
を含み得る。
【００１８】
シーケンシング又はハイブリダイゼーション工程の前に、各MVPを含むローカスが増幅される、増幅工程が実施され得る。増幅は、PCRによって実施され得る。
シーケンシング又はハイブリダイゼーション工程の前に、キャプチャリング（capturing）工程を実施し得る。該キャプチャリング工程は、MVPローカスに特異的である結合分子に、MVPローカスを含むポリヌクレオチドを結合すること、及びMVPローカス及び結合分子を含む複合体を回収することを含み得；及びここで：
i  重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の前に、該キャプチャリング工程が存在する；
ii  重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の後だが、増幅若しくはハイブリダイゼーション工程の前に、該キャプチャリング工程が存在する；又は
iii  重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の後で、増幅工程の後に、該キャプチャリング工程が存在する。
【００１９】
該結合分子は、各MVPに特異的なオリゴヌクレオチド、好ましくは、対応するMVPに相補的である配列を各々含むDNA又はRNA分子であり得る。
該結合分子は、精製のための成分（purification moiety）に結合し得る。
【００２０】
該精製のための成分は、第一の精製のための成分を含み得、MVPローカス及び結合分子を含む複合体を回収する工程は、第一の精製のための成分を、第二の精製のための成分を含む基質に結合することを含み得、第一及び第二の精製のための成分は、相互作用複合体を形成する。
該第一の精製のための成分は、ビオチンであり得、該第二の精製のための成分は、ストレプトアビジンであり得る；又は該第一の精製のための成分は、ストレプトアビジンであり得、該第二の精製のための成分は、ビオチンであり得る。
【００２１】
MVPを含むローカスを増幅する工程は、MVPのメチル化状態に依存しないプライマーの使用を含み得る。
MVPを含むローカスを増幅する工程は、マイクロドロップレットPCR増幅により実施し得る。
【００２２】
上記のいずれかの方法において、個体から採取した生体試料は、尿、血液、血清、血漿又は無細胞DNAの試料であり得る。
上記のいずれかの方法において、該方法は、95%以上のROC感度及び90%以上のROC特異度；好ましくは96%のROC感度及び97%のROC特異度、好ましくは95%以上、好ましくは98%のROC AUCを達成し得る。
上記のいずれかの方法において、該方法は、95%以上、好ましくは、97%の陰性的中率（NPV）を達成し得る。
【００２３】
上記のいずれかの方法において、個体における膀胱がんを診断する工程は、更に以下：
I．  腫瘍の悪性度を階層化すること；及び／又は
II．  腫瘍の再発のリスクを決定すること；及び／又は
III．  非筋肉浸潤性疾患の進行のリスクを決定すること；及び／又は
治療療法に対し予想される応答を決定することを含み得る。
【００２４】
本発明は、追加的に、個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からDNAを採取し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；及び
(c)  該個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む、方法を提供する。
【００２５】
本発明は、追加的に、個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からDNAを提供し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；及び
(c)  該個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む、方法を提供する。
【００２６】
本発明は、追加的に、個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からのDNAにおいて、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；及び
(c)  該個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む、方法を提供する。
【００２７】
本発明は、追加的に、個体における膀胱がんを治療する方法であって、個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すことを含み、以下：
(a)  個体に由来する試料からのDNAを提供し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；及び
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、
を含む工程によって、個体が膀胱がんであると診断されている、方法を提供する。
【００２８】
本発明は、追加的に、個体における膀胱がんを診断する方法であって、以下：
(a)  配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを特定するデータを得ること；及び
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；を含み、
ここで、該データが以下：
i  試料に由来するDNAを採取すること；及び
ii  該DNAにおいて、MVPがメチル化されているかを決定すること、
を含む方法によって得られた、方法を提供する。
【００２９】
上記のいずれかの方法において、該がんは非筋肉浸潤性膀胱がん(NMIBC)であり得る。該がんは、筋肉浸潤性膀胱がん (MIBC)であり得る。
【００３０】
本発明は、追加的に、MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるアレイであって；MVPパネルにおける各MVPのメチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブ、及び該パネルにおける各MVPの非メチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブを含み；ここで、該パネルが、配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される、少なくとも25MVPからなる、アレイを提供する。
【００３１】
ある実施形態においては、該アレイは、Infinium HumanMethylation450 BeadChipアレイではない。ある実施形態においては、該アレイのMVP特異的オリゴヌクレオチドプローブの数は、482,421より少なく、好ましくは、482,000以下、480,000以下、450,000以下、440,000以下、430,000以下、420,000以下、410,000以下又は400,000以下である。
【００３２】
上記のアレイにおいて、該パネルは、配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される、少なくとも40MVP；好ましくは、少なくとも50MVP、少なくとも60MVP、少なくとも70MVP、少なくとも80MVP、少なくとも90MVP、少なくとも100MVP、少なくとも110MVP、少なくとも120MVP、少なくとも130MVP、少なくとも140MVP、少なくとも145MVP、又は配列番号1〜150において特定される150MVP全てからなり得る。
【００３３】
上記のアレイにおいて、該パネルは、配列番号1〜3で定義されるMVP、又は配列番号1〜5で定義されるMVP、又は配列番号1〜10で定義されるMVP、又は配列番号1〜20で定義されるMVP、又は配列番号1〜30で定義されるMVP、又は配列番号1〜40で定義されるMVP、又は配列番号1〜50で定義されるMVP、又は配列番号1〜60で定義されるMVP、又は配列番号1〜70で定義されるMVP、又は配列番号1〜80で定義されるMVP、又は配列番号1〜90で定義されるMVP、又は配列番号1〜100で定義されるMVP、又は配列番号1〜100で定義されるMVP、又は配列番号1〜120で定義されるMVP、又は配列番号1〜130で定義されるMVP、又は配列番号1〜140で定義されるMVP、又は配列番号1〜150で定義されるMVPを含み得る。
該パネルは、配列番号1〜150で定義されるMVP全てを含み得る。
【００３４】
上記のアレイにおいて、該アレイは、配列番号1〜150で定義されるMVPのいずれかから選択されるMVPを含む１以上のオリゴヌクレオチドを更に含み得、該１以上のオリゴヌクレオチドが該アレイの対応するオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする。
【００３５】
該１以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される、少なくとも20MVP；好ましくは、少なくとも50MVP、少なくとも60MVP、少なくとも70MVP、少なくとも80MVP、少なくとも90MVP、少なくとも100MVP、少なくとも110MVP、少なくとも120MVP、少なくとも130MVP、少なくとも140MVP、少なくとも145MVP、又は配列番号1〜150において特定される150MVP全てを含み得る。
【００３６】
該1以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号1〜10で定義されるMVP、又は配列番号1〜20で定義されるMVP、又は配列番号1〜30で定義されるMVP、又は配列番号1〜40で定義されるMVP、又は配列番号1〜50で定義されるMVP、又は配列番号1〜60で定義されるMVP、又は配列番号1〜70で定義されるMVP、又は配列番号1〜80で定義されるMVP、又は配列番号1〜90で定義されるMVP、又は配列番号1〜100で定義されるMVP、又は配列番号1〜110で定義されるMVP、又は配列番号1〜120で定義されるMVP、又は配列番号1〜130で定義されるMVP、又は配列番号1〜140で定義されるMVP、又は配列番号1〜150で定義されるMVPを含み得る。
１以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号1〜150で定義されるMVP全てを含み得る。
【００３７】
上記アレイは、配列番号1〜150で定義されるMVPのいずれかから選択される様々なMVPを各々含むオリゴヌクレオチドのグループを、上記のようにアレイにハイブリダイズすることによって取得し得、ここで該グループは、少なくとも40オリゴヌクレオチドを含む。
【００３８】
そのようなハイブリダイズしたアレイにおいては、該グループは、少なくとも50オリゴヌクレオチドを含み得る。該グループは、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120,少なくとも130、少なくとも140、少なくとも145、又は少なくとも150オリゴヌクレオチドを含み得る。
【００３９】
ハイブリダイズしたアレイにおいては、該グループは配列番号1〜20で定義されるMVPを含む少なくとも40オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜50で定義されるMVPを含む少なくとも50オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜60で定義されるMVPを含む少なくとも60オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜70で定義されるMVPを含む少なくとも70オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜80で定義されるMVPを含む少なくとも80オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜90で定義されるMVPを含む少なくとも90オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜100で定義されるMVPを含む少なくとも100オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜110で定義されるMVPを含む少なくとも110オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜120で定義されるMVPを含む少なくとも120オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜130で定義されるMVPを含む少なくとも130オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜140で定義されるMVPを含む少なくとも140オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜145で定義されるMVPを含む少なくとも145オリゴヌクレオチドを含み得る、又は該グループは配列番号1〜150で定義されるMVPを含む少なくとも150オリゴヌクレオチドを含み得る。該グループは配列番号1〜150で定義されるMVPを含む少なくとも150オリゴヌクレオチドを含み得る。
【００４０】
本発明はまた、上記で定義されるハイブリダイズしたアレイを作製するための方法であって、上記で定義されるアレイを、配列番号1〜150で定義されるMVPのいずれかから選択される様々なMVPを各々含むオリゴヌクレオチドのグループと接触させることを含み、該グループが少なくとも25オリゴヌクレオチドを含む、方法を提供する。
【００４１】
本発明はまた、上記で定義されるハイブリダイズしたアレイを作製する方法であって、上記で定義されるアレイを、上記で定義されるオリゴヌクレオチドのグループと接触させることを含む、方法を提供する。
本発明はまた、上記アレイのいずれかを含むキットを提供する。
【００４２】
該キットは、更に、MVPジヌクレオチドにおける非メチル化シトシンを修飾することができるが、MVPジヌクレオチドにおけるメチル化シトシンを修飾することができないDNA修飾剤を含み得、任意で該ジヌクレオチドはCpGである。該DNA修飾剤は、重亜硫酸塩剤であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図1。膀胱がん（赤）及び30の健常な尿路上皮（青）の間での9786MVP (1746高メチル化MVP、8040低メチル化MVP)のヒートマップ。
【図２】図2。非がん尿 (n=10)、健常な尿路上皮 (n=30)、膀胱がん (n=81)及び血液 (n=489)についての150UroMarkローカスのヒートマップ。
【図３】図3。膀胱がんの予測された状態（明るい青/明るい赤）及び実際の状態（青/赤）と比較した、健常な尿路上皮（青）、膀胱がん（赤）についてのUroMarkアッセイに含まれる150ローカスのヒートマップ。
【図４】図4。UCL及びTCGA膀胱がんに由来する膀胱がん試料における150ローカスのメチル化状態に基づく、膀胱腫瘍及び健常な尿路上皮についてのMDSプロット。MDS（多次元スケーリング）プロットは、パネルと150ローカスのメチル化状態に基づく、表現型の異種性（dissimilarly）を表わし、150マーカーは、健常な膀胱から腫瘍を正確に区別し得ることを明確に示す。軸は、サンプル間のユークリッド距離を表わす。
【図５】図5。尿中の膀胱がんを検出するためのUroMarkモデルについてのROCプロット。
【図６】図6。成績上位の(A)3、(B)5及び(C)10マーカーパネルについてのROCプロット。上位3MVPが配列番号１〜３として列記され、上位5MVPが配列番号１〜５として列記され、上位10MVPが配列番号１〜１０として列記され、全てランク順である（表1参照）。
【図７】図7。176の固有の尿試料 (98非がん尿及び78がん尿)に由来する膀胱がんの検出のためのUroMarkモデルについてのROCプロット。
【図８】図8。患者尿に由来するDNAの質(濃度、純度及び完全性)の比較。A) 自宅で採取した試料(n=41)と比べた、診療所で採取した試料(n=123)の濃度及び純度であり、赤色は低い収量又は純度を示し、琥珀色は中程度の収量及び中程度の純度を示し、及び緑色は高い収量及び純度である。B) 低い、中程度又は高い収量及び純度を示す試料のパーセンテージ。C) 分光測光法で定量できる濃度を有する試料における、高分子量DNAの回収を実証する代表的なBioanalyzerエレクトロフェログラム。D) 製造業者の標準的なプロトコール（56℃、1時間）と比べ、21℃での延長した分解工程を用いた尿中DNAの、増加した中央値収量及び改善した純度。E) 尿を保存する2つの方法の比較：UCLが確立した標準的な操作手順と、Norgen尿保存管との比較。細菌数を、rpoB遺伝子について、qPCRによって定量し、ヒトYWHAZのコピーに対するrpoBコピーとして表した。データは、平均+/-標準偏差である。
【図９】図9。検証コホート2の96の固有の尿試料(64非がん尿及び32がん尿)に由来する膀胱がんの検出のためのUroMarkモデルについてのROCプロット。
【図１０】図10。検証コホート3の92の尿試料 (65非がん尿及び27がん尿)に由来する膀胱がんの検出のためのUroMarkモデルについてのROCプロット。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
膀胱がん
上記で検討したように、膀胱がんは、西洋世界において、がんの最も一般的であるグループの一つである。移行細胞がんは、最も一般的な型であり、膀胱がんの約90%を占める。移行細胞がんは、膀胱の内側表面を裏打ちする組織である、移行上皮から生じる。膀胱がんの残りの10%は、主に、扁平上皮がん、腺がん、肉腫及び小細胞がんからなる。扁平上皮がんはまた、上皮組織、扁平上皮細胞から生じる。これらは、最も浅い上皮層に見られる薄い平らな細胞である。腺がんは、腺の特徴及び／又は起源を有する上皮細胞から生じる。肉腫は、例えば膀胱の脂肪層及び筋肉層の細胞等の間葉起源の細胞に由来する。小細胞がんは、速い倍増時間を有し、早期転移が可能であり、それによって特に攻撃的になる。
【００４５】
膀胱がんはまた、非筋肉浸潤性膀胱がん(NMIBC)及び筋肉浸潤性膀胱がん (MIBC)に分類され得る。
本明細書に記載された診断及び治療方法は、膀胱がんの全ての分類の悪性細胞を陽性として検出することができる。それゆえ、本明細書に記載されたいずれかの方法は、膀胱の移行細胞がん、膀胱の扁平上皮がん、膀胱の腺がん、膀胱の肉腫、膀胱の小細胞がん、転移性膀胱がん、平滑筋肉腫（平滑筋から生じる腫瘍）、リンパ腫（通常、リンパ節に生じる腫瘍）、悪性メラノーマ（通常、皮膚から生じる腫瘍）及び大細胞神経内分泌がんを診断するために使用し得る。膀胱がんの原発形態及び再発形態が含まれる。本明細書に記載されるように、診断され又は治療される該がんは、尿路上皮細胞がんであり得る。それゆえ、該がんは、尿管、尿道又は腎盂のがんであり得る。
【００４６】
本明細書に記載された診断検査が適用できる、最も好ましい患者のタイプはヒトである。本明細書に記載された診断検査はまた、非ヒト動物における、膀胱がんを検出するために使用し得る。例えば、非ヒト動物は、ヒトに由来する組織、例えば異種移植片を含有し得る。それゆえ、診断検査は、ヒト膀胱がんの動物モデルにおける、ヒト膀胱がんを診断するために使用し得る。本明細書に記載された診断検査を適用できる、典型的な非ヒト動物は、例えばラット又はマウス等のげっ歯類である。
【００４７】
メチル化可変部位（MVP）
DNAのメチル化は、例えば遺伝子及びmicroRNA等の他の要素の発現を改変することができるエピジェネティックな修飾の広く認められている形式である[51]。がんの発症及び進行において、メチル化は、例えば腫瘍サプレッー遺伝子をサイレンシングする及び／又はがん遺伝子の発現を増大させる効果を有し得る。調節異常の他の形式は、メチル化の結果として生じ得る。DNAのメチル化は、CpGモチーフからなる主にジヌクレオチドである、別々のローカスで起こるが、CHHモチーフ（ここでHは、A、C又はTである）においてもまた起こりうる。メチル化の間、メチル基が、シトシン塩基の5位の炭素に付加され、メチルシトシンとなる。
【００４８】
メチル化は、ゲノム全体で起こり得、例えば遺伝子等の発現される配列に関する領域に限定されない。メチル化は、典型的には、発現される配列のプロモーター又は他の調節領域において生じるが、必ずではない。
本明細書において定義されるメチル化可変部位（MVP）は、表現型間、すなわち、腫瘍と正常な組織の間での、メチル化状態における違いを示し得る、任意のジヌクレオチド部位である。MVPは、好ましくは、CpG又はCHHジヌクレオチドモチーフである。本明細書において定義されるMVPは、対応する発現される配列に関するローカスの部位に限定されない。
【００４９】
典型的には、DNAメチル化状態の評価は、DNAにおけるメチル基、例えば１以上のシトシンヌクレオチドの5位におけるメチル基の存在又は非存在を分析することを含む。好ましくは、CpGジヌクレオチド（ここで、Cはシトシン、Gはグアニン、及びpはその2つを連結するリン酸基を表わす）として存在する１以上のシトシンヌクレオチドのメチル化状態が、評価される。
MVPのメチル化状態を評価すること、又はMVPがメチル化されるかを決定することによって、その後の処理の前に、個体から採取したDNAの開始試料において、MVPがメチル化されたか又はメチル化されなかったかどうかについて決定することを意味する。
【００５０】
患者に由来するゲノムDNAの試料におけるMVPの１以上のアレルが、１以上のメチル化CpGジヌクレオチドローカスを有すると決定される場合、本明細書において、そのMVPはメチル化されたものとして定義される。
本明細書に記載されたいずれかの方法において、メチル化されていると決定したMVPは、健常な尿路上皮対照及び／又は全血対照に比べてメチル化されている。
診断目的として有用である特異的なMVPは、表1に記載されており、配列番号及びIllumina ID番号（Ilmn ID）で特定される。定義されたMVPを増幅するための例示的なプライマーは、表2に記載されており、配列番号によってもまた特定される。
【００５１】
メチル化可変部位（MVP）状態の特定及び評価
多様な技術が、メチル化可変部位 (MVP)の特定及び評価のために利用することができ、以下で簡易に概説される通りである。本明細書に記載された診断方法は、MVPの状態を決定するための任意の好適な技術を包含する。
例えばPCR等の従来のin vitroでの操作工程の間に、開始DNA分子からメチル基が失われる。このことを避けるために、メチル基を検出する技術は、一般的に、その後の処理に先立って、元のDNA分子のメチル化状態の情報を保存する方法での、DNAの予備的な処理を含む。そのような予備的な技術は、処理の3つの主なカテゴリー、すなわち重亜硫酸塩修飾、制限酵素分解及び親和性に基づく分析を含む。次いで、これらの技術の産物は、MVPメチル化状態のその後の特定又は定性的評価のための、シーケンシング又はアレイベースのプラットフォームと一体となり得る。
【００５２】
DNAの重亜硫酸塩修飾を含む技術は、CpGジヌクレオチドのメチル化状態の検出及び評価のための最も一般的な方法となっている。重亜硫酸塩、例えば重亜硫酸ナトリウムでのDNAの処理は、シトシン塩基はウラシル塩基に変換するが、５−メチルシトシンには影響がない。それゆえ、重亜硫酸塩処理したDNAにおけるシトシンの存在が、開始DNA分子において以前にメチル化シトシン塩基の存在を示す。そのようなシトシン塩基は、多様な技術によって検出され得る。例えば、非メチル化DNA対メチル化DNAに特異的なプライマーが、メチル化CpGジヌクレオチドのPCRによる特定のために生成され、使用され得る。分離／キャプチャ（capture）工程は、例えば相補的なオリゴヌクレオチド配列等の結合分子を用いることで実施され得る。標準及び次世代DNAシーケンシングプロトコールがまた、使用され得る。
他のアプローチにおいては、メチル化DNAが存在するときのみ、消化又は切断するメチル化感受性酵素が、用いられ得る。結果として生じる断片の分析は、一般的にマイクロアレイを用いて実行される。
【００５３】
親和性に基づく技術は、濃縮の目的で、メチル化DNAの断片をキャプチャするよう結合相互作用を利用する。例えば抗５−メチルシトシン抗体等の結合分子は、一般的に、例えばPCR及びシーケンシング等のその後の処理工程に先立って利用される。
【００５４】
Olkhov-Mitsel and Bapat (2012)[51]は、メチルシトシンを含むMVPベースのバイオマーカーの特定及び評価のために利用できる技術の包括的なレビューを提供する。
性状が調べられ本明細書に記載された、MVPベースのバイオマーカーのメチル化状態を評価する目的で、任意の好適な方法が利用され得る。
好ましい方法は、メチル化特異的PCRのために特定されたMVPローカスの増幅及び／又はシーケンシング及び／又はメチル化判別マイクロアレイを用いた標的ローカスのメチル化状態の評価を含む、DNAの重亜硫酸塩処理を含む。
【００５５】
MVPローカスの増幅は、多様なアプローチで達成され得る。好ましくは、MVPローカスは、PCRを用いて増幅される。MVPはまた、例えばマルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（MLPA）等の他の技術によって増幅され得る。多様なPCRベースのアプローチが使用され得る。例えば、メチル化特異的プライマーは、目的のMVP配列を含有するDNAにハイブリダイズし得る。そのようなプライマーは、メチル化又は非メチル化MVPローカスのいずれかに由来する配列にアニールするよう設計し得る。アニーリング後、PCR反応が実行され、それにより生じるPCR産物の存在が、特定し得る配列のアニールしたMVPの存在を示す。そのような方法において、DNAは、増幅に先立って、重亜硫酸塩で変換される。そのような技術は、一般的に、メチル化特異的PCR (MSP)として参照される[53]。
【００５６】
他の技術においては、PCRプライマーは、目的のメチル化状態とは無関係にMVP配列にアニールし得、更なる処理工程を該MVPの状態を決定するために使用し得る。MVP部位（複数可）が、プライマーアニーリング部位の間に位置するよう、アッセイが設計される。この方法スキームは、例えば重亜硫酸塩ゲノムシーケンシング[54]、COBRA[55]、Ms-SNuPE[56]等の技術において用いられる。そのような方法においては、DNAは、増幅の前又は後に、重亜硫酸塩で変換され得る。
【００５７】
好ましくは、スモールスケールPCRアプローチが用いられる。そのようなアプローチは、一般的に、試料を大規模に分割することを含む（例えばデジタルPCR）。これらの技術は、高度に小型化されたシステム（ピコリットル・サイズの液滴）の観点から、堅固な正確性及び感度を提供し、生体試料、特に尿試料に存在する、潜在的に少量の細胞材料から採取することができる少量のDNAを、その後、操作するためには理想的である。多様である、そのようなスモールスケールPCR技術は、広く利用することができる。例えば、マイクロドロップレットベースのPCR装置は、RainDance Technologies, Inc. (Billerica, MA; http://raindancetech.com/)及びBio-Rad, Inc. (http://www.bio-rad.com/)を含む多様なサプライヤーから入手することができる。マイクロアレイ・プラットフォームもまた、スモールスケールPCRを実行するために使用され得る。そのようなプラットフォームは、マイクロ流体ネットワークベースのアレイを含み得、例えばFluidigm Corp. (www.fluidigm.com)から入手できる。
【００５８】
MVPローカスの増幅に続いて、増幅されたPCR産物は、目的のMVPのメチル化状態を決定するために、その後の分析的プラットフォームに連結し得る。例えば、該PCR産物は、標的MVPにおけるメチルシトシンの存在又は非存在を決定するために、ダイレクトにシーケンスされ得、又はアレイベースの技術によって分析され得る。
任意の好適なシーケンシング技術は、標的DNAの配列を決定するために利用され得る。本発明の方法においては、重亜硫酸塩処理したDNAをシーケンシングするためのハイスループット、いわゆる「第二世代」、「第三世代」及び「次世代」技術の使用が好ましい。
【００５９】
第二世代技術においては、多数のDNA分子が、並行してシーケンシングされる。典型的には、数万の分子が、高密度に所定の部位にアンカーされ、DNA合成に依存する工程において配列が決定される。一般的には、反応は、例えば可逆的に標識されたターミネーター塩基の取り込みを可能にするための、連続した試薬の送達及び洗浄工程、並びに塩基の取り込みの順序を決定するためのスキャニング工程からなる。この型のアレイベースのシステムは、例えばIllumina, Inc. (San Diego, CA; http://www.illumina.com/)から市販されている。
【００６０】
第三世代技術は、典型的には、検出工程の間にシーケンシング処理を停止する必要性がないことによって定義され、それゆえ、リアルタイムなシステムと考え得る。例えば、取り込み工程の間に生じる、水素イオンの塩基特異的な放出は、マイクロウェルシステムの中で検出され得る（例えば、Life Technologiesから入手できる、Ion Torrentシステム；http://www.lifetechnologies.com/参照）。同様に、パイロシーケンシングにおいては、ピロリン酸塩 (PPi)の塩基特異的な放出が検出され、分析される。ナノポア技術においては、DNA分子は、通過するか又はナノポアの付近に位置し、ナノポアに対して相対的であるDNA分子の移動に続いて、個々の塩基の正体が決定される。この型のシステムは、例えばOxford Nanopore (https://www.nanoporetech.com/)から市販されている。代替的な方法においては、DNAポリメラーゼ酵素が、「ゼロモード導波路」に閉じ込められ、取り込まれた塩基の正体を、γ標識したリンヌクレオチドの蛍光検出で決定する（例えば、Pacific Biosciences参照；http://www.pacificbiosciences.com/）。
【００６１】
本発明に伴う他の方法においては、シーケンシング工程は省略され得る。例えば、増幅されたPCR産物は、2本の相補的な核酸鎖がアニーリングして、二重鎖分子を形成する原理に基づき、直接ハイブリダイゼーションアレイに適用され得る。ハイブリダイゼーションアレイは、MVPの増幅産物にハイブリダイズすることができるプローブを含むよう設計し得、メチル化及び非メチル化ローカス間を判別できるよう設計し得る。例えば、チミンを含有するMVPローカスに選択的にハイブリダイズできるプローブが設計され得る。このことは、開始鋳型DNAにおける非メチル化シトシンの重亜硫酸塩による変換に続き、ウラシルが生成することを示している。逆に、シトシンを含有するMVPローカスに選択的にハイブリダイズできるプローブが設計され得る。このことは、重亜硫酸塩処理に続き、ウラシル変換がないことを示している。これは、開始鋳型DNAにおける、メチル化MVPローカスに対応する。
【００６２】
アレイに好適な検出システムを適用した後、MVPのメチル化状態を決定するために、コンピュータベースの分析技術を使用し得る。検出システムは、例えばメチル化状態特異的なプローブ伸長反応に続き、蛍光分子の添加を含み得る。そのような技術は、特にMVP増幅産物のシーケンシングの必要なしで、MVP状態の決定を可能にする。そのようなアレイベースの判別プローブは、メチル化特異的プローブと称し得る。
任意の好適なメチル化判別マイクロアレイは、本明細書に記載されたMVPのメチル化状態を評価するために利用し得る。好ましいメチル化判別マイクロアレイシステムは、Illumina, Inc. (San Diego, CA；http://www.illumina.com/)によって提供される。特に、Infinium HumanMethylation450 BeadChipアレイシステムは、本明細書に記載されたように膀胱がんの診断に用いるMVPのメチル化状態を評価するために使用され得る。そのようなシステムは、開始DNA分子の重亜硫酸塩処理を経たDNAになされた化学修飾を利用する。簡易には、該アレイは、MVPの非メチル化形態に対応するDNA配列に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブと結合するビーズ、及びMVPのメチル化形態に対応するDNA配列に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブと結合する、別のビーズを含む。候補DNA分子は、アレイに適用され、関連するエピジェネティックな形態に対応するオリゴヌクレオチドプローブに、好適な条件下で、選択的にハイブリダイズする。それゆえ、対応するゲノムDNAにおけるメチル化MVPに由来するDNA分子は、メチル化特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むビーズに選択的に、付着（attach）するが、非メチル化特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むビーズに付着しない。ハイブリダイズしたプローブのみの1塩基伸長は、その後蛍光試薬で染色され、撮像される、標識ddNTPを取り込む。メチル化部位及び非メチル化部位に由来する蛍光シグナルの比を計算することによって、該MVPのメチル化状態を決定し得る。
【００６３】
本明細書において定義される膀胱がん特異的で診断に用いるMVPバイオマーカーは、Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChipアレイシステムを用いて、最初に特定されたので、本明細書に記載された診断検査においては、同じMVPを調べるために、同じチップシステムを使用し得る。しかしながら、本明細書において定義されるように、所定の方法のために全てのMVPを調べるための方法を含むのであれば、代替の又はカスタマイズされたアレイは、本明細書において定義される膀胱がん特異的で診断に用いるMVPバイオマーカーを調べるために利用しても良い。
【００６４】
上記方法の組合せを含む技術をまた、使用し得る。例えば、上記のように、目的のMVP配列を含有するDNAは、マイクロアレイにハイブリダイズされ得、次いで、該MVPの状態を決定するために、DNAシーケンシングに供し得る。
上記方法において、MVPローカスに対応する配列はまた、濃縮工程に供し得る。目的のMVP配列を含有するDNAは、例えば目的のMVP標的配列に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブ等の結合分子によってキャプチャし得る。重亜硫酸塩による変換の前若しくは後、又は増幅の前若しくは後に、MVPローカスに対応する配列は、キャプチャし得る。プローブは、重亜硫酸塩で変換したDNAに相補的であるよう設計され得る。次いで、キャプチャされたDNAは、例えばDNAシーケンシング工程等、該MVPの状態を決定するための、更なる処理工程に供し得る。
【００６５】
キャプチャ／分離工程は、特注設計し得る。代替的に、多様なそのような技術は、市販されており、例えばAgilent Technologies (http://www.agilent.com/home)からSureSelect標的濃縮システムを入手できる。このシステムにおいては、目的のMVP配列を含有するDNAに相補的である、ビオチン化された「ベイト」又は「プローブ」配列（例えばRNA）が、試料の核酸にハイブリダイズする。次いで、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズが、ベイト配列にハイブリダイズした目的の配列をキャプチャするために用いられる。未結合画分は廃棄される。次いで、ベイト配列は除かれ(例えばRNAの分解によって)、それゆえ、非MVP配列から分離されたMVP標的配列の濃縮されたプールが提供される。本発明の好ましい方法においては、鋳型DNAは、重亜硫酸塩による変換に供され、次いで、標的ローカスは、例えばMVPのメチル化状態に依存しないプライマーを用いたマイクロドロップレットPCR等のスモールスケールPCRによって増幅される。増幅に続き、上記のように、例えば磁気ビーズを用いてキャプチャされた及び精製された、標的MVPを含有するPCR産物を濃縮するために、試料がキャプチャ工程に供される。キャプチャに続き、標準的なPCR反応が実行され、DNAシーケンシング・バーコードが、MVP含有単位複製配列に取り込まれる。PCR産物は再度精製され、次いで、DNAシーケンシング及び標的ゲノムMVPにおけるメチルシトシンの存在又は非存在を決定するための分析に供される[31]。
【００６６】
本明細書において定義されるMVPバイオマーカーローカスは、例えばIllumina（登録商標）識別子（identifier）(IlmnID)によって特定される。これらのMVPローカス識別子は、市販されているIllumina（登録商標）Infinium Human Methylation450 BeadChipキットにおいて用いられる、個々のMVP部位を参照する。各MVPローカス識別子によって表わされる各MVP部位の正体は、Infinium Human Methylation450 BeadChipキットで用いられるMVP部位を参照して、Illumina, Inc.ウェブサイトから公に入手できる。
【００６７】
Illumina, Inc製品で用いられるMVPローカスの特定に関する、更なる情報は、2010年に公開された「技術注記：エピジェネティックス。CpGローカスの特定。Golden Gate（登録商標）及びInfinium（登録商標）Assay for Methylationに関する、明らかなCpGローカスの特定及び追跡のためのIlluminaの手法のガイド。」という題の技術注記で見られ、以下：http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_cpg_loci_identification.pdfで見られる。
【００６８】
Illumina（登録商標）Infinium Human Methylation450 BeadChipシステムに関する更なる情報は、以下：http://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/datasheets/datasheet_humanmethylation450.pdf；及び
http://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/technote_hm450_data_analysis_optimization.pdfで見ることができる。
【００６９】
正確なMVP/CpGローカス識別子及びストランド（strand）の配向性を提供するよう、進化している公的なデータベースを補完するために、Illumina（登録商標）は、各個体のMVP/CpGローカスの実際の又は文脈上の配列に基づいて、MVP/CpGローカスを一貫して指名する方法を開発している。各種におけるMVP/CpGローカスを明白に参照するために、Illumina（登録商標）は、メチル化データの報告における均一性を確認するために、一貫性及び決定性のあるMVPローカスデータベースを開発している。Illumina（登録商標）の方法は、固有のMVPローカスクラスターIDを生成するために、MVPローカスに隣接する配列を活用する。この番号は、配列情報のみに基づき、ゲノムの型によって影響を受けない。Illuminaの標準化された命名法はまた、一塩基多型（SNP）の記号表示のために、一般的に用いられるTOP/BOTストランド命名法（ストランドの配向性を示す）と同等である。
【００７０】
Infinium Human Methylation450 BeadChipシステムのためのIllumina（登録商標）Identifiersはまた、例えばGene Expression Omnibus (GEO)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）等の公的な保管場所から入手できる。
それゆえ、本明細書において定義されるMVPは、表１に列記された各配列番号及びIllumina Identifier (Ilmn ID)に関連して特定されるCGジヌクレオチドモチーフを参照する。そこでは、ジヌクレオチドのシトシン塩基（表１に列記される配列において太字及び大括弧で強調されている）は、修飾されても良い（又はされなくても良い）。それゆえ、所定の配列番号によって定義されるか若しくは特定されるCpGのメチル化状態を決定することによって、又はそのようなCpGがメチル化されているかを決定することによって、個体に由来するDNAの試料における１以上のローカスにおいて、表１に示される配列における太字及び大括弧で特定されるCGジヌクレオチドモチーフのシトシンが、メチル化されているか又はメチル化されていないかについての決定がなされることを意味する。それにより、シーケンシングのエラー又は個体間の多様性によって、任意の所定のCpGの上流及び下流の配列における多様性が存在し得ることを許容する。
【００７１】
本発明は、個体における膀胱がんを診断する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からDNAを提供すること；
(b)  配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；及び
(c)  (b)のグループのMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、
を含む方法を提供する。
【００７２】
本明細書に記載された任意のそのような方法においては、MVPのグループ（すなわち、そのメチル化状態が決定されるMVP）は、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの26以上を含み得る；又は、該グループは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの27以上、28以上、29以上、30以上、31以上、32以上、33以上、34以上、35以上、36以上、37以上、38以上、39以上、40以上、41以上、42以上、43以上、44以上、45以上、46以上、47以上、48以上、49以上、50以上、51以上、52以上、53以上、54以上、55以上、56以上、57以上、58以上、59以上、60以上、61以上、62以上、63以上、64以上、65以上、66以上、67以上、68以上、69以上、70以上、71以上、72以上、73以上、74以上、75以上、76以上、77以上、78以上、79以上、80以上、81以上、82以上、83以上、84以上、85以上、86以上、87以上、88以上、89以上、90以上、91以上、92以上、93以上、94以上、95以上、96以上、97以上、98以上、99以上、100以上、101以上、102以上、103以上、104以上、105以上、106以上、107以上、108以上、109以上、110以上、111以上、112以上、113以上、114以上、115以上、116以上、117以上、118以上、119以上、120以上、121以上、122以上、123以上、124以上、125以上、126以上、127以上、128以上、129以上、130以上、131以上、132以上、133以上、134以上、135以上、136以上、137以上、138以上、139以上、140以上、141以上、142以上、143以上、144以上、145以上、146以上、147以上又は148以上を含み得る。該グループは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの149又は150を含み得る。
【００７３】
上記のいずれかの方法において、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、膀胱がんが診断され得る。配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの26以上がメチル化されているとき、膀胱がんが診断され得る；又は、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの27以上、28以上、29以上、30以上、31以上、32以上、33以上、34以上、35以上、36以上、37以上、38以上、39以上、40以上、41以上、42以上、43以上、44以上、45以上、46以上、47以上、48以上、49以上、50以上、51以上、52以上、53以上、54以上、55以上、56以上、57以上、58以上、59以上、60以上、61以上、62以上、63以上、64以上、65以上、66以上、67以上、68以上、69以上、70以上、71以上、72以上、73以上、74以上、75以上、76以上、77以上、78以上、79以上、80以上、81以上、82以上、83以上、84以上、85以上、86以上、87以上、88以上、89以上、90以上、91以上、92以上、93以上、94以上、95以上、96以上、97以上、98以上、99以上、100以上、101以上、102以上、103以上、104以上、105以上、106以上、107以上、108以上、109以上、110以上、111以上、112以上、113以上、114以上、115以上、116以上、117以上、118以上、119以上、120以上、121以上、122以上、123以上、124以上、125以上、126以上、127以上、128以上、129以上、130以上、131以上、132以上、133以上、134以上、135以上、136以上、137以上、138以上、139以上、140以上、141以上、142以上、143以上、144以上、145以上、146以上、147以上、又は148以上がメチル化されているとき、膀胱がんが診断され得る。配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの149又は150がメチル化されているとき、膀胱がんが診断され得る。
好ましくは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの40以上がメチル化されているとき、膀胱がんが診断され得る。
【００７４】
配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの50以上、60以上、70以上又は80以上、90以上又は100以上がメチル化されているときもまた、膀胱がんが診断され得る。
【００７５】
上記のいずれかの方法において、メチル化されていると決定したMVPは、配列番号1〜3において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜5において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜10において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜20において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜30において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜40において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜50において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜60において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜70において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜80において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜90において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得、又は配列番号1〜100において特定され[CG]で表示されるMVPを含み得る。
【００７６】
１実施形態においては、MVPのグループ(すなわち、そのメチル化状態が決定されるMVP)は、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの150全てを含み得、及びこの方法においては、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択される少なくとも40がメチル化されているとき、個体における膀胱がんが診断され、並びにこの方法において、メチル化されていると決定したMVPが、配列番号1〜10において特定され[CG]で表示されるMVPを含む。
【００７７】
バイオインフォマティックスツール及び統計的指標
重亜硫酸塩で変換したDNA配列のin silico分析、及びメチル化特異的分析の目的のためのプライマー設計において助けとなるソフトウェアプログラムは、一般的に入手でき、以前に記載されている[57, 58, 59]。
本明細書に記載されたMVPメチル化状態アッセイに基づく膀胱がん診断のための感度及び特異度の指標は、標準的な受信者動作特性（ROC）統計分析を用いて定義し得る[52]。ROC分析においては、100%の感度は、偽陰性が見られないことに対応し、及び100%の特異度は、偽陽性が見られないことに対応する。
【００７８】
150MVPバイオマーカーのパネルを用いて実施された分析に基づけば、本明細書に記載された発明に従った膀胱がん診断検査は、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%のROC感度を達成し得る。該ROC感度は100%であり得る。
本発明に従った診断検査は、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%のROC特異度を達成し得る。該ROC特異度は100%であり得る。
【００７９】
該感度の値は該特異度の値と同等であるか、それより小さい場合、本発明に従った診断検査は、関連したROC感度及びROC特異度の値の組合せを有し得、そこで該組合せは、上で列記した感度の値のいずれか１つ、及び上で列記した特異度の値のいずれか１つである。
それゆえ、該ROC特異度は、100%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%又は100%であり得る。
該ROC特異度は、99%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%又は99%であり得る。
【００８０】
該ROC特異度は98%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%又は98%であり得る。
該ROC特異度は97%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%又は97%であり得る。
該ROC特異度は96%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%又は96%であり得る。
該ROC特異度は95%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%又は95%であり得る。
【００８１】
該ROC特異度は94%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%又は94%であり得る。
該ROC特異度は93%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%又は93%であり得る。
該ROC特異度は92%であり得、該ROC感度は90%以上、91%又は92%であり得る。
該ROC特異度は91%であり得、該ROC感度は90%又は91%であり得る。
該ROC特異度は90%であり得、該ROC感度は90%であり得る。
好ましくは、該検査は、95%以上のROC感度及び90%以上のROC特異度；好ましくは、96%のROC感度及び97%のROC特異度を達成し得る。
【００８２】
本明細書において定義される診断方法の代表的な例示的方法に対応するROCプロットが、図５及び７に表され、該MVPベース検査の優れた感度及び選択性を実証している。このことは、既に記載されている、バイオマーカーのより小さいパネルを用いて実施した検査とは対照的である。それゆえ、比較データは、本明細書において定義される検査の優れた予測能力を実証する。
MVPベース検査の正確性を分類するために利用され得る更なる指標は、ROC AUCである。ROC分析においては、ROCプロットの曲線下面積（AUC）は、二項分類のための指標である。ランダムな二項分類器においては、真陽性及び偽陽性の数は、およそ等しい。この状況において、ROCプロットについてのAUCスコアは0.5である。完全な二項分類器においては、真陽性の数が100%となり、偽陽性の数は0%である。この状況において、ROCプロットについてのAUCスコアは1である。
【００８３】
本明細書に記載されたバイオマーカーを用いて実施された分析に基づけば、本発明に従った膀胱がん診断検査は、0.90以上、0.91以上、0.92以上、0.93以上、0.94以上、0.95以上、0.96以上、0.97以上、0.98以上、0.99又は1のROC AUCを達成し得る。好ましくは、該診断検査は0.98以上のROC AUCを達成し得る。
【００８４】
本明細書に記載されたMVPメチル化状態のアッセイに基づく膀胱がん診断検査はまた、陰性的中率(NPV)指標を用いて特徴づけられ得る。該NPVは、真の陰性結果である、陰性結果の割合の尺度である。
150MVPバイオマーカーのパネルを用いて実施された分析に基づいて、本明細書に記載された、本発明に従った膀胱がん診断検査は、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%又は100%のNPVを達成し得る。
【００８５】
生体試料
本明細書に記載された膀胱がん診断検査は、患者から採取された任意の好適な生体物質で実施し得る。好ましい生体物質は尿である。しかしながら、膀胱組織の試料、例えば生検又は吸引によって採取されたか、又は保存されていた試料（例えば、凍結保存材料、組織切片等)から採取したものを用い得る。生体物質の試料としてはまた、固形の組織試料、吸引物、体液の試料、血液、血清、血漿、腹水、リンパ、末梢血、脳脊髄液、細針による吸引物、唾液、痰、骨髄、皮膚、上皮試料（口腔、頚部又は膣上皮を含む）、又は外胚葉に由来する他の組織、膣液、精液等が挙げられ得る。組織のスクレープス（scrape）としては、例えば口腔、食道、膀胱、膣、尿道又は頚部のスクレープスに由来する生体物質が挙げられ得る。該試料の細胞は、例えばリンパ球等の炎症細胞を含み得る。
【００８６】
本明細書に記載された検査及び方法のいずれかは、患者由来の生体試料を、メチル化分析のための患者DNAのソースとして提供することを含み得る。
本明細書に記載された検査及び方法のいずれかは、患者から以前に採取された生体試料から、患者DNAを採取することを含み得る。
本明細書に記載された検査及び方法のいずれかは、メチル化分析のための患者DNAのソースとして、患者由来の生体試料を採取することを含み得る。患者から生体試料を採取する手順は、例えば尿から細胞を回収する等、非侵襲的であり得る。代替的には、例えば生検等の侵襲的な手順を用い得る。
【００８７】
本明細書に記載された方法においては、検出のレベルは、150,000細胞以上を含む試料において、2腫瘍細胞を検出し得るようなものである。そのような方法においては、該試料は160,000細胞以上、170,000細胞以上、180,000細胞以上、190,000細胞以上、200,000細胞以上、210,000細胞以上、220,000細胞以上、230,000細胞以上、240,000細胞以上、250,000細胞以上、260,000細胞以上、270,000細胞以上、280,000細胞以上、280,000細胞以上又は300,000細胞以上を含み得る。
【００８８】
任意のそのような方法においては、検出され得る腫瘍細胞数は10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上、200以上、300以上、400以上、500以上、600以上、700以上、800以上、900以上、1000以上、2000以上、3000以上、4000以上、5000以上、6000以上、7000以上、8000以上、9000以上、10000以上、20000以上、30000以上、40000以上、50000以上、60000以上、70000以上、80000以上、90000以上又は100000以上である。
【００８９】
治療の方法
本発明はまた、本明細書に記載された診断方法によって、膀胱がんが陽性である診断に続き、１以上の治療工程の実行を包含する。
それゆえ、本発明はまた、個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からDNAを採取すること、及び配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること：
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；及び
(c)  該個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法を包含する。
【００９０】
本発明はまた、個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からDNAを提供すること、及び配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；及び
(c)  該個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法を包含する。
【００９１】
本発明はまた、個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からのDNAにおいて、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること；及び
(c)  該個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法を包含する。
【００９２】
本発明はまた、個体に対し、１以上の膀胱がん治療を施すことを含む、個体における膀胱がんを治療する方法であって、ここで該個体が以下の工程：
(a)  個体に由来する試料からDNAを提供すること、及び配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；及び
(b)  (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、
によって膀胱がんと診断されている、方法を包含する。
【００９３】
膀胱がんを治療する上記方法のいずれかにおいて、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループ（すなわち、メチル化状態が決定されるMVPのグループ）は、該グループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むという条件で、本明細書において記載され、定義されたように、任意のMVP数を含み得る。これらの方法のいずれかにおいては、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25がメチル化されていると決定されるという条件で、メチル化されていると決定されるグループのMVP数が、本明細書において記載され、定義された任意のMVP数であるとき、個体における膀胱がんが診断され得る。
それゆえ、本発明は、膀胱がん陽性の診断に続き、１以上の外科処置、１以上の化学療法剤、１以上の免疫治療剤、１以上の放射線治療剤、１以上のホルモン治療剤又は上記の任意の組合せを投与することを包含する。
外科処置としては、膀胱腫瘍の経尿道切除 (TURBT)、膀胱摘除術、開放性膀胱全摘除術 (ORC)、腹腔鏡膀胱全摘除術 (LRC)及びロボット支援膀胱全摘除術 (RARC)が挙げられる。
【００９４】
化学治療剤としては以下が挙げられる。ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、テトラジン、アジリジン、シスプラチン及び白金系誘導体、並びに非古典的アルキル化剤を含むアルキル化剤。抗葉酸塩、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似体及びチオプリンを含む代謝拮抗物質。ビンカアルカロイド及びタキサン、並びにドラスタチン10及びその誘導体を含む微小管破壊剤。カンプトテシン、イリノテカン及びトポテカンを含むトポイソメラーゼ阻害剤。エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン及びテニポシドを含むトポイソメラーゼII毒物。ノボビオシン、メルバロン、及びアクラルビシンを含むトポイソメラーゼII触媒阻害剤。アントラサイクリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、及びマイトマイシンを含む細胞傷害性抗生物質。
剤の組合せとしては、MVAC（メトトレキセート、ビンブラスチン、ビンブラスチン及びビンブラスチン）（Methotrexate, Vinblastine, Vinblastine and Vinblastine）、ジェムシス（GC）（ゲムシタビン及びシスプラチン）、ラパチニブ及びゲムシタビンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００９５】
免疫治療剤としては、バチルス・カルメット・ゲラン（bacilli Calmette-Guerin）（BCG）免疫療法、並びにモノクロナール抗体及び抗体医薬複合体が挙げられる。抗体医薬複合体としては、上記の微小管破壊剤及びDNA修飾剤に複合体化した抗体が挙げられる。
併用療法としては、膀胱内、逐次BCG、続いてMMCの電動投与（EMDA）（EMDA-MMC）、並びにマイクロ波誘発性膀胱壁温熱療法（HT）及び膀胱内MMCが挙げられる。
【００９６】
がん治療剤は、病気又は状態を既に患っている対象に、その状態又はその症状の1以上を治癒、緩和又は部分的に阻止するのに十分な量で投与される。そのような治療的処置は、疾患症状の重症度における軽減、又は症状がない期間の頻度若しくは継続における増加という結果をもたらし得る。これを達成する十分な量を、「治療有効量」として定義する。所定の目的のための有効量は、疾患の重症度、並びに対象の重量及び一般的状態に依存する。本明細書において使用される場合、用語「対象」は任意のヒトを含む。
【００９７】
アレイ
本発明はまた、本明細書において定義した、MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるアレイを包含する；該アレイは、本明細書において定義されるMVPのメチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブ及び本明細書において定義されるMVPの非メチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。
「特異的」とは、該プローブが、特にストリンジェントな状態において、ハイブリダイズし得るようMVPを含むオリゴヌクレオチドの配列に、相補的である配列を含むことを意味する。
幾つかの実施形態においては、該アレイは、Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChipアレイ (Infinium HumanMethylation450 BeadChip array)ではない。
【００９８】
別途又は追加的に、幾つかの実施形態においては、該アレイのMVP特異的であるオリゴヌクレオチドプローブ数は、482,421より少なく、好ましくは482,000以下、480,000以下、450,000以下、440,000以下、430,000以下、420,000以下、410,000以下、又は400,000以下、375,000以下、350,000以下、325,000以下、300,000以下、275,000以下、250,000以下、225,000以下、200,000以下、175,000以下、150,000以下、125,000以下、100,000以下、75,000以下、50,000以下、45,000以下、40,000以下、35,000以下、30,000以下、25,000以下、20,000以下、15,000以下、10,000以下、5,000以下、4,000以下、3,000以下又は2,000以下である。
更に、本発明は、個体における膀胱がん細胞を診断する目的のために、MVPのメチル化状態を決定することを要求する方法のいずれかにおいて、本明細書において定義されるアレイのいずれかの使用を包含する。
【００９９】
キット
本明細書において定義されるアレイのいずれかが、キットに含まれ得る。
該キットは、本明細書において定義される任意のアレイを含み得る。
該キットは、使用のための説明書と共に、本明細書において定義される任意のアレイを含み得る。
該キットは、追加的に、例えば重亜硫酸塩剤等のDNA修飾剤を含み得る。
該キットは、追加的に、例えば配列番号1〜150において特定される、本明細書において定義されるMVPのいずれかを対象とするプライマー（表２参照）等のDNAを増幅する試薬を含み得る。
【０１００】
試料のメチル化プロファイルを決定する方法
更に、本発明は、個体に由来する試料のメチル化プロファイルを決定する方法であって、以下：
i  個体に由来する試料からDNAを提供すること；
ii  配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；及び
iii  該グループのMVPのメチル化状態に基づき、試料のメチル化プロファイルを決定すること、
を含む、方法を包含する。
【０１０１】
試料のメチル化プロファイルを決定する上記方法のいずれかにおいて、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループ（すなわち、そのメチル化状態が決定されるMVPのグループ）は、該グループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むという条件で、本明細書において記載され、定義された任意のMVP数を含み得る。
更に、任意のそのような方法においては、本明細書に記載されたいずれかのアレイを使用して、MVPのメチル化状態が決定され得る。
【０１０２】
更なる方法
本明細書に記載された診断方法のいずれかにおいて、個体における膀胱がんを診断する工程は、更に以下：
Ｉ  腫瘍の悪性度を階層化すること；及び／又は
II  腫瘍の再発リスクを決定すること；及び／又は
III  非筋肉浸潤性疾患の進行リスクを決定すること；及び／又は
IV  治療療法に対し予想される応答を決定すること、
を含み得る。
【０１０３】
本発明はまた、個体における膀胱がんの発症のリスクを決定する方法であって、該方法が以下：
（ａ）個体に由来する試料からDNAを提供すること;
（ｂ）配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；及び
（ｃ）該グループのMVPのメチル化状態に基づき、個体における膀胱がんの発症のリスクを決定すること、
を含む方法を包含する。
【０１０４】
個体における膀胱がんの発症のリスクを決定する任意のそのような方法においては、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループ(すなわち、そのメチル化状態が決定されるMVPのグループ)は、該グループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むという条件で、本明細書において記載され、定義された任意のMVP数を含み得る。
更に、任意のそのような方法においては、MVPのメチル化状態は、本明細書に記載されたアレイのいずれかを用いて決定し得る。
【０１０５】
更なる使用
本発明はまた、個体における膀胱がんの診断において、又は個体における膀胱がんの発症のリスクを決定することにおいて、MVPのグループの使用を包含する。
任意のそのような使用において、MVPのグループは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択される。
任意のそのような使用において、MVPのグループは、該グループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むという条件で、本明細書において記載され、定義された任意のMVP数を含み得る。
上記使用のいずれかにおいて、個体における膀胱がんの診断又は個体における膀胱がんの発症リスクの決定は、本明細書において記載され、定義された各方法のいずれかによって実行され得る。更に、任意のそのような方法においては、MVPのメチル化状態は、本明細書に記載されたアレイのいずれかを使用することで決定され得る。
本発明は、以下の実施例によって例示される。
【実施例】
【０１０６】
材料と方法
序論
次世代DNAシーケンシングプラットフォームを利用する新興技術は、高感度エピジェネティックバイオマーカーパネルの開発のために、特に有望である。例えば、RainDance Technologiesによって開発された、重亜硫酸塩で変換したDNAのマイクロドロップレット・ベースのPCR増幅の後の、増幅された標的ローカスの次世代シーケンシング[30]によって、20,000までの重亜硫酸塩で変換された標的ローカスを、精度良く、特異的に、同時に増幅することができる。重亜硫酸塩で変換したDNAの高度に並列なマイクロドロップレット・ベースのPCR増幅は、様々な組織におけるエピジェネティックな変化の評価において有用性を示している[31‐33]。しかしながら、膀胱がんを検出するための非侵襲的診断バイオマーカーの開発には、まだ適用されていない。
膀胱がんを検出するための精度の良い検査を得るために、本発明者はこれまで、膀胱がんにおけるゲノムワイドなメチル化の最大の独立研究の一つを実施している。これにより、膀胱特異的エピジェネティックバイオマーカーのパネルが定義されており、尿中DNAにおいて、RainDrop‐BS[31]を用いて、150ローカスパネルの感度及び特異度が、高い程度の診断精度を伴う、膀胱がんの検出に関して検証されている。
【０１０７】
研究人口
ロンドン大学病院（UCLH）（ロンドン）泌尿器科及びエネルギー・環境・技術研究センター（CIEMAT）（マドリード）から回収された、81の膀胱がん及び30の年齢をマッチさせた健常な尿路上皮の試料に由来するDNAにおいて、ゲノムワイドのDNAメチル化プロファイリングが実施された。該コホートは、35の低悪性度の非筋肉浸潤性がんを含んでいた。80%超の腫瘍細胞充実性を有する切片を含めるよう、代表的なH&E切片の病理学的レビューが行われた。血中メチロームデータは、MARMAL-aid database (http:/marmal‐aid.org, [34])からダウンロードした。
独立した検証データは、MIBC膀胱がん及び20の健常な尿路上皮試料からなる、がんゲノムアトラスプロジェクト（Cancer Genome Atlas Project）(https://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/tcgaCancerDetails.jsp?diseaseType=BLCA&diseaseName=Bladder%20Urothelial%20Carcinoma)から入手した。
検証研究のために、UCLHワンストップ血尿及びサーベイランス膀胱鏡検査クリニック (UCLH one-stop haematuria and surveillance cystoscopy clinics)に通院している患者から、逐次的な尿試料を採取した（n=86：膀胱がん、n=96：非がん対照)。
【０１０８】
尿採取
大学病院において、血尿診療所に通院しているか、又は再発した膀胱がんのために膀胱鏡検査を受けている患者から、尿試料を採取した。診療所と自宅での尿試料を比較するために、患者には3試料：診療所での1試料及び自宅での2試料（内1つは、最初の排尿でなければならない）を供給するように依頼した。試料当たり40〜100mlが採取された。1試料のための自宅尿キットは、最大で4本の25ml滅菌チューブ、吸収パッドを備えた郵送用チューブ、及びロイヤルメールの郵便ポストを何とか通り抜けるよう設計した、予めあて名書きされた、パッド入りの封筒を含んでいた。
DNA抽出及び定量
製造業者の指示に従って、DNeasy血液・組織キット (Qiagen, UK)を用いて、尿中DNAを抽出した。分光測光法 (Nanodrop 1000)及び蛍光定量法 (Qubit ds DNA HS assay, Invitrogen, UK)によってDNAを定量した。
【０１０９】
RainDanceマイクロドロップレットPCR
マイクロドロップレットPCRのために、7.20μlの重亜硫酸塩で処理し（及び任意で、全ゲノムを増幅した）DNAを、4.70μlの10×High‐Fidelity Buffer (Invitrogen)、1.80μlの50 mM MgSO4 (Invitrogen)、1.62μlの10 mM dNTP solution mix (NEB)、3.60μlの4 Mベタイン溶液 (Sigma-Aldrich), 3.60μlの液滴安定剤 (RainDance Technologies)、1.80μlの100%ジメチルスルホキシド(Sigma-Aldrich)及び0.72μlの5U/μl Platinum Taq Polymerase High-Fidelity (Invitrogen)に添加し、総量を25μlにした。ALPS 50Vマイクロプレート・ヒートシーラー(Thermo Scientific)を用いて、試料プレートをシールした。
【０１１０】
次いで、重亜硫酸塩で処理したゲノムDNA鋳型ミックスを、製造業者の指示に従って、完全に自動化されたThunderStormシステム (RainDance Technologies)にアプライした。簡易には、プライマーパネルの液滴 (MethylSeq Solution, RainDance Technologies)をマイクロ流体チップに分注した。DNA鋳型ミックスは、マイクロ流体チップ内で、液滴に変換された。次いで、プライマーペア液滴及び鋳型液滴を、1:1比で対合した。組み合わされた液滴は、分離した液滴を単一のPCR液滴(26 pl)に融合するよう誘導する電場を通過させた；1試料当たり、約100万のPCR液滴が回収される。
【０１１１】
PCR液滴を、PTC‐225サーマルサイクラ― (MJ Research)において、以下：94℃で2分；94℃で30秒、54℃で45秒、68℃で80秒を55サイクル；続いて、68℃で10分；更なる処理を行うまで4℃、で処理した。傾斜率は、1秒当たり1℃にセットした。PCR増幅に続き、PCR液滴のエマルジョンを壊し、液滴内部に含有される単位複製配列を放出するように、70μlの液滴不安定化剤 (RainDance Technologies)を各試料に添加した。該溶液を良く混合し、室温で15分間インキュベートした。製造業者のプロトコールに従い、Agencourt AMPure XP磁気ビーズ (Beckman Coulter)を用いて、試料を精製した。各試料について、234μlのビーズを用いた。40μlのバッファー中で、試料を磁気ビーズから溶出した。2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)上で、High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies)を用いて、精製した単位複製配列DNAの完全性及び濃度（断片の範囲：120〜300 bp）を評価した。
【０１１２】
メチル化アレイ
500 ngのDNAを、重亜硫酸塩で変換し、Infinium 450K Humanメチル化アレイにハイブリダイズし、製造業者の推奨に従って処理した。製造業者の指示の通りに、EZ DNA Methylationキット (Zymo Research)を用いて、重亜硫酸塩によるDNAの変換を実施した。試料は単一バッチ内で処理した。それに続くデータ分析には、R統計ソフトウェア(version 2.14.0 [35])を用いた。iDatファイルからのデータを抽出及び分析するために、ChAMPパイプラインを用い、BMIQを用いて試料を標準化した[36, 37]。未加工のβ値（メチル化値）を以下のように、ストリンジェント品質管理分析に供した：カバレッジの低下を示した試料を除き、全試料に対してバックグラウンドを超える検出レベルのプローブのみを保持した（検出P値<0.01）。Lassoを用いて、DMR (Differentially Methylated Regions：差次的メチル化領域)を決定した[38, 39]。
【０１１３】
ハイスループットDNAシーケンシング
製造業者のプロトコールに従って、プールしたシーケンシングライブラリー(12 pM)及び特注のシーケンシングプライマー (0.5 μM)をMiSeq‐cycle PE consumable cartridge (Illumina)にアプライした。特注のシーケンシングプライマーのDNA配列は、以下の表２において提供される。MiSeq DNAシーケンサー(Illumina)において、75bpのペアエンドリードを用いて、シーケンシングを行った。
RainDance ThunderStorm（登録商標）Systemはまた、核酸のシーケンシングにも用いた (http://raindancetech.com/targeted-dna-sequencing/thunderstorm/).
【０１１４】
データ及び統計分析
ea‐utils v1.1.2‐537のfastq‐mcfツールを用いて、未加工のシーケンシングリードから、シーケンシングアダプターを切り取った[60]。Bismark v0.7.12を用いて、切り取られたシーケンシングデータを、in silico重亜硫酸塩変換ヒト・リファレンスゲノム(GRCh37)にマップした[40, 61]。Bismark v0.7.12のmethylation_extractorツールを用いて、メチル化情報を抽出した[61]。RパッケージTEQC v3.2.0.25を用いて、標的とされたDNAシーケンシング分析を実施した。
【０１１５】
実施例1：低悪性度及び高悪性度の膀胱がんのメチル化プロファイリング
まず、81人の高悪性度及び30人の健常な尿路上皮に由来するDNAにおいて、ゲノムワイドでのDNAメチル化プロファイリングを実施することによって、膀胱がんに関連するエピジェネティックな変化を定義した。
膀胱がん及び健常な組織の間でのMVP (メチル化可変部位)を特定するために、傾向を見出すためのWilcoxon順位和検定を使用する、教師あり分析を用いた。統計的有意性（Wilcoxon P値>0.001）に基づき、MVPを選択した。グループ間でのメチル化における絶対的な相違を考慮しないことを補償するために、Δβ>0.30(+/-)の追加的なフィルターを適用した。偽検出率（FDR）<2%となるように、及び最も大きいメチル化の相違を有し、それゆえ判別効果の可能性が最も大きいところまで、候補ローカスを減らすように、カットオフは実験的に定義される。合計9786MVPが、これらの要件を満たした(1746の高メチル化MVP、8040低メチル化MVP) (図1)。
【０１１６】
実施例2：膀胱がん特異的な尿バイオマーカー
DNAメチル化バイオマーカーパネルを定義するために、がんの少なくとも50%においてメチル化されていると決定され (β>50%)、健常な尿路上皮においてメチル化されていないと決定された (β<10%)、ローカスを特定した。この最初のDNAメチル化バイオマーカーパネルの開発に関連して、本明細書において検討されるように、「メチル化されている (β>50%)」は、任意の所定のローカスについて、患者試料における細胞の50%超が、MVPに関してメチル化されていると決定されることを意味する。潜在的な偽陽性バイオマーカーを除くため、及び膀胱がん特異的である変化をより良く定義するために、血尿診療所に通院しており、診断で非がんであることが確定した10人の患者由来の全血及び尿もまた、プロファイルされた。続いて、これらの非がんの対照尿及び血液に由来するDNAにおいて、任意のメチル化を示した任意のローカス(β>10%)を除去した。非がんにおいてメチル化されておらず、がん組織の大多数においてメチル化されている (β>50%)、最大で432ローカスが特定された。
【０１１７】
検出用の、膀胱がんDNAメチル化のシグネチャー（signature）を抽出するために、我々はRandom Forestフレームワークを使用し、150CpGローカスからなる分類のシグネチャーがもたらされた（図2、以下の表1参照）。150マーカーのこのコアセットを用いて、我々は、予測尤度値、すなわち、試料のグループの関係とは無関係に、各試料について、がん又は非がんの試料であるかの可能性、を伴った該識別子の内部相互検証を実施した。このことは、がんの検出にとって、相互検証された100%の感度及び100%の特異度がもたらされ、150のエピジェネティックなローカスが、膀胱がんから健常な尿路上皮を明確に階層化し得ることを示している（図3、図4）。
【０１１８】
膀胱がん検出のために、分類アルゴリズムを使用して、150CpG (MVP)マーカーパネルの感度を決定するために、我々は、更に179膀胱がん (144筋肉浸潤性及び35非筋肉浸潤性)及び20の健常ケースのメチル化プロファイルを評価した。パネルは、1の感度及び特異度をもたらして、正確に全ての膀胱がんを分類した。
【０１１９】
実施例3：検出パネルの検証
尿試料における膀胱がんの検出のための150ローカスパネル (エピ-シグネチャー)をテストするため、尿沈渣細胞由来DNAを、52人の膀胱がん患者(低悪性度：27、中/高悪性度：25)及び34人の非がん患者対照を含むコホート（n=86）から採取した。この検証コホートにエピ-シグネチャーを適用することで、この独立した検証コホートにおける膀胱がんの検出に対して、95％の感度及び96％の特異度及び97％のAUCが得られる（図5）。
【０１２０】
大きいマーカーパネルはまた、訓練コホート由来の最高のパフォーマンスを発揮する単一マーカーと比べられた。訓練コホートは、OTX1、COD1及びMEIS1を含む遺伝子における、潜在的な尿バイオマーカーとして既に公開されている領域由来のCpGローカスを含む。訓練コホートにおける非膀胱がん対照から得られる最高のβ値に基づき、各CpGについて、メチル化閾値が定義された。次いで、この値は、検証コホートにおいて、膀胱がんが存在する可能性が高いことを予測するために用いた。最高のパフォーマンスを発揮する単一のマーカーは組み合わされ、3、5又は10マーカーに基づく「オリゴパネル」についての可能性を探索するために、予測識別子を開発した。感度は、単一マーカーよりも改善するが（最良の単一マーカー：72%、最良の組合せマーカー：70%）、それらは未だに膀胱鏡検査にとって代わるための求められるレベルには到達していない。
【０１２１】
これらのデータは、単一マーカーは、単独で又は組合せで合理的に十分に性能を発揮するが（図4〜6、表1）、単一ローカス又はオリゴパネルアプローチを使用した、がんを検出するための感度は限定的なものであり、臨床的有用性のための望ましい検出レベルを下回っていることを示す。マーカーの大きいパネルの使用は、単一マーカーパネルの使用より優れており、表3は、成績上位ベスト10のマーカー及び組合された150ローカスシグネチャーについて、感度、特異度、AUC、PPV及びNPVを示す。
【０１２２】
実施例4：ハイスループット技術を用いた検出パネルの検証
RainDrop BS‐seq [31]は、並行して、多数の領域(最大20,00固有の単位複製配列)のラージスケールを標的とした重亜硫酸塩シーケンシングを可能にする。この技術は、既に検証され、450Kメチル化アレイと相関性が高いことが示されており、少ない鋳型のインプットの有用性もまた検証されている[31, 32]。重亜硫酸塩で変換したシーケンシングプライマーパネルは、150の選択されたゲノムのローカスのメチル化状態を測定するために設計された（以下の表2参照）。プライマーは、ワトソン・クリック鎖の両方を、可能であれば独立して調べるために設計された。尿エピ-シグネチャーの検証は、96症例の2番目の独立したコホートにおいて、RainDrop BS‐seqを用いて行われた。尿沈渣細胞由来のDNAを、26人の膀胱がん患者及び64人の非がん患者対照から採取した。150ローカス各々についてのメチル化スコアを、Bismarkアルゴリズムを用いて生成し、このデータを用いて、尿エピ-シグネチャーから、96％の感度、97％の特異度及び0.96のAUCで、膀胱がんが存在する可能性を予測した。
【０１２３】
全ての検証試料に由来するメチル化データを組み合わせることによって、テストされる試料の数を増やすことが可能になる。試料を組合せることで、176の固有の尿試料（98の非がん尿及び78のがん尿）の評価が可能であった。尿エピ-シグネチャーは、プロファイリング技術とは無関係に、AUC=0.98で膀胱がんの存在を予測した（図7）。
【０１２４】
結論
バイオマーカーによって早期に非侵襲的に膀胱がんを検出することは、この疾患の管理を劇的に改善する可能性を有する。感度及び特異度が高い検査は、血尿診療所に通院している患者における新たな疾患の検出、及びまた存在している膀胱がん集団における再発のスクリーニングの両方において、有用である可能性を有する。
【０１２５】
幾つかの非侵襲的検査は、市販されており、細胞診、FISH311分析及び突然変異の検出に基づく。FDAによって承認されているにも関わらず、該検査は、54%〜86%の感度及び61%〜90%の特異度を報告している[12, 13, 41]。パフォーマンス特性は、膀胱鏡検査にとって代わるためには十分でなく、それゆえ臨床的実務には取り入れられていない。それゆえ、改善には有意義な余地があり、新規のバイオマーカー、バイオマーカーパネルの組合せ及び新規技術の使用の開発は、この目的のために最も役に立ち得る。
【０１２６】
DNAメチル化のパターンは、高度に細胞特異的であり、これらのエピジェネティックイベントの固体発生的安定性が、DNAメチル化を、疾患の検出及び診断のための理想的なバイオマーカーとする。広範囲おけるDNAメチル化パターンの変化は、腫瘍性の形質転換の共通する特徴であり、膀胱がんにおいて頻繁に起こるイベントである。以前の研究は、非筋肉浸潤性膀胱がん (NMIBC)及び筋肉浸潤性膀胱がん (MIBC)の両方の膀胱がんと、健常な尿路上皮との間におけるメチル化の変化は、膀胱がん患者由来の尿沈渣細胞において反映されており、従って有用な診断マーカーになり得ることを示している。現在の幾つかの研究は、膀胱がんの診断における尿エピジェネティックマーカーの有用性を示している。しかしながら、これらの研究は、良好な感度及び特異度を示しているが、主にそれらが未だ膀胱鏡検査にとって代わるだけのパフォーマンス特性に値しないために、それらは臨床的実務に取り入れられていない。候補アプローチ若しくは精度の低いマイクロアレイベースのプラットフォームのいずれかを用いて、推定されるバイオマーカーを特定することにおける一次分析の精度が低いことによって、及び尿中の候補マーカーを分析するために利用できる技術における制約によってもまた、DNAメチル化バイオマーカーアッセイ（他のDNAベースのマーカー、例えば突然変異と一緒に）は限られている。これによって、最終的なバイオマーカーパネルにおいて、単一／小さいバイオマーカーパネルが調べられている[15-23]。しかしながら、小さいバイオマーカーパネルが、膀胱鏡検査に匹敵するだけの感度及び特異度を示すためには、それらは広い範囲に亘る疾患の状態の腫瘍内及び腫瘍間の低い異質性に、過度に依存する[42]。
【０１２７】
例えば次世代重亜硫酸塩シーケンシング及びラージスケールマルチプレックスPCR等の新規技術は、現在、エピジェネティックバイオマーカーのより大きいパネルを利用することを可能にする[31, 32]。膀胱がん発症に関与するエピジェネティック変化を定義するため、及びバイオマーカーパネルを定義するために、膀胱がんの偏りがなく、ゲノムワイドでのDNAメチル化スクリーンで最大であるものの一つを、これまでに実行した。膀胱がん発症を引き起こすエピジェネティック変化についての洞察が可能となる他に、これらのデータから、膀胱がんの検出について高い感度及び特異度を有するエピジェネティックバイオマーカーのパネルもまた特定された。
【０１２８】
膀胱がんの前兆である、150の単一なCpGローカスのバイオマーカーパネルが定義された。相対的に小さいコホート一つのみであるが、これらのデータは、単一マーカー及び小さいパネルのバイオマーカーパネルと比べて、エピジェネティックマーカーの大きいパネルを使用することの有用性を示す。96%の感度及び97%の特異度で、この検査の陰性的中率 (NPV)は97%である。これは、PSA (前立腺特異的抗原)テスト(PPV=30%〜43%)、マンモグラフィー(PPV=9%〜19%)、又は便潜血スクリーニング(PPV=6%〜11%；[43-48])によって達成され得るものよりも、1.2〜8.7倍優れており、及び膀胱鏡検査のそれ(PPV=66.7%〜98%)と同程度である[49]。
【０１２９】
本発明者等は、高感度であると共に定量的である、ラージスケールの高度にマルチプレックス化した次世代アッセイを適用することにより、尿中の膀胱がんの存在が、既に公開されているメチル化アッセイよりも高い感度及び特異度をもって検出し得、膀胱鏡検査に匹敵するPPVを有することを示した。
【０１３０】
本発明は、より大きいパネルを調べることを可能にする新規技術、及び膀胱がん特異的なエピジェネティックバイオマーカーの組合せが、膀胱がんを検出するために利用し得、それにより、膀胱鏡検査の回数を減らし、結果として患者の生活の質を改善するだけでなく、医療費も削減することができることを実証する。更に、大きいパネルアッセイの有用性によって、複数の臨床パラメーターの潜在性について、同じデータ内から検証することを可能にする。例えば、腫瘍悪性度の階層化、非筋肉浸潤性疾患の再発若しくは進行、筋肉浸潤性疾患についての治療への応答可能性、又は複数の状態の鑑別診断である。
【０１３１】
実施例5：DNA試料操作及び処理の最適化
患者尿の試料からのDNA収量を最大化するために、最適化研究を実施した。DNAを、プロテネースKで、56℃で1時間又は21℃で48時間のいずれかでインキュベートした。インキュベーションは、100 mg/mLのRNAse A存在下で行われた。延長したインキュベーション・プロトコールで、DNAの量及び純度の両方の増加が観察された（図8D）。
【０１３２】
UCL自宅尿採取キットを、市販されているキット (Norgen, Cat# 18124, https://norgenbiotek.com/display-product.php?ID=424)と比較した。標準的なUCL尿採取チューブは、70mg/mlのStabilurTM尿保存剤を含有する。本研究は、健常なボランティア由来の尿で実施された；各試料の半分をUCL標準法で処理し、残りの半分をNorgen保存剤で処理した。
【０１３３】
該2つの方法で保存した尿由来のDNAの完全性においては、殆んど違いが見られなかった。最初の排尿試料及び他の回（times）での排尿試料との間で、DNA純度又は収量においては違いが見られなかった(濃度と回については、c1(1)=0.255、p=0.614、及び純度と回については、c1(1)=1.046、p=0.306)。
【０１３４】
しかしながら、Norgen保存剤で処理した尿においては、8日を超えるとDNA収量において、明らかな増加が認められ、一方で、UCL標準プロトコールで処理した尿由来DNAは、時間に関係なく同様の量であった。
【０１３５】
Norgenシステムでの尿DNA収量における明らかな増加は、経時的な細菌増殖に起因し得ることが見られた一方で、UCLが確立したプロトコールを用いれば増殖は効果的に阻害されていた（図8E）。
【０１３６】
実施例6：ハイスループット技術を使用した検出パネルの追加的な検証
32の膀胱がんが確認された症例及び64の非がん症例に由来する96の尿試料(検証コホート2)を、上記のように分析した。RainDance ThunderStorm（登録商標）Systemを用いた重亜硫酸塩による変換に続き、上記150UroMarkローカスのシーケンシングを実施した。上記のように統計分析を実施し、得られるROCプロットを図9に示す(AUC=0.96、感度=0.97、特異度=0.97、NVP=0.98)。
【０１３７】
なお、更なる研究においては、血尿のコホート及び既知のがん試料に由来する92尿試料を上記のようにして分析した。このコホートは、27のがんが確認された症例及び65の非がん症例からなっていた。また、RainDance ThunderStorm（登録商標）Systemを用いた重亜硫酸塩による変換に続き、上記150UroMarkローカスのシーケンシングを実施した。上記のように統計分析を実施して、得られるROCプロットを図10に示す(AUC=0.955、感度=0.98、特異度=0.97、NVP=0.97)。
【０１３８】
以下の表1は、本明細書に記載された方法において使用された150MVP (CpG)のリストを提供する。各CpGには、Illumina Identifier (Ilmn ID)、ヒトゲノムにおけるCpGの位置を特定する染色体番号 (CHR)及び染色体配置 (MAPINFO)、遺伝子名（可能な場合）、各CpGを包含するフォワード配列、及び対応する配列番号が提供される。修飾を受けるCGジヌクレオチドモチーフのシトシンは、各配列において太字及び大括弧で特定される。CpGは、1〜150のランク順に列記される。該ランク順は、所定のローカスがメチル化されている腫瘍の数に関する。それゆえ、配列番号1に対応するMVPは、最も多くの数の腫瘍においてメチル化され、その一方で、配列番号150に対応するMVPは、最も少ない数の腫瘍においてメチル化される。
【０１３９】
【表１−１】
2018520672.tif 000002
【０１４０】
【表１−２】
2018520672.tif 000003
【０１４１】
【表１−３】
2018520672.tif 000004
【０１４２】
【表１−４】
2018520672.tif 000005
【０１４３】
【表１−５】
2018520672.tif 000006
【０１４４】
【表１−６】
2018520672.tif 000007
【０１４５】
【表１−７】
2018520672.tif 000008
【０１４６】
【表１−８】
2018520672.tif 000009
【０１４７】
以下の表2は、上記表1で定義されるMVPを増幅又はシーケンシングするために用い得る例示的なプライマーを提供する。
【０１４８】
【表２−１】
2018520672.tif 000010
【０１４９】
【表２−２】
2018520672.tif 000011
【０１５０】
【表２−３】
2018520672.tif 000012
【０１５１】
【表２−４】
2018520672.tif 000013
【０１５２】
【表２−５】
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【０１５３】
【表２−６】
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【０１５４】
【表２−７】
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【０１５５】
【表２−８】
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【０１５６】
【表２−９】
2018520672.tif 000018
【０１５７】
以下の表3は、上記表1に定義されたように、全150MVPを含む例示的なアッセイの統計情報、上位3に位置付けられたMVP (配列番号1〜3)、上位5に位置付けられたMVP (配列番号1〜5)及び上位10に位置付けられたMVPs (配列番号1〜10)を提供する。
【０１５８】
【表３】
2018520672.tif 000019
【０１５９】
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【図１】
2018520672.tif 000020
【図２】
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【図３】
2018520672.tif 000022
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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