(57)【要約】本明細書は、ヒトＣＤ４０に結合する、アゴニスト抗体またはその抗原結合部分を提供する。このような抗体は、場合により、ＦｃγＲＩＩｂに対する特異性が増強したＦｃ領域を含む。本発明はまた、本発明の抗体を、それを必要とする対象に投与することによって、がんまたは慢性感染症を処置する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１２Ｄ６（配列番号３および４）、５Ｆ１１（配列番号２３および２４）、８Ｅ８（配列番号４０および４１）、５Ｇ７（配列番号５２および５３）および１９Ｇ３（配列番号５８および５９）からなる群から選択される１以上の抗体との交差遮断アッセイにおいて、ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、ヒトＣＤ４０との結合に競合する、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
交差遮断アッセイにおける競合が、選択された抗体を等モル濃度で用いる場合に、競合ＥＬＩＳＡにおける選択された抗体とヒトＣＤ４０との結合を、少なくとも２０％減少させる能力を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
ａ．配列ＥＰＰＴＡＣＲＥＫＱＹＬＩＮＳ（配列番号１の２１−３５残基）（抗体１２Ｄ６、５Ｇ７および１９Ｇ３）を含む、または、からなるエピトープ；または
ｂ．配列ＥＣＬＰＣＧＥＳＥ（配列番号１の５８−６６残基）（抗体５Ｆ１１）を含む、または、からなるエピトープ
において、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
ヒトＣＤ４０に特異的に結合し：
ａ）マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−３９＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ４に少なくとも部分的に由来する、重鎖ＣＤＲ配列ならびに、
マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ１（１２Ｄ６）に少なくとも部分的に由来する、軽鎖ＣＤＲ配列；
ｂ）マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−４＿０２およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ３に少なくとも部分的に由来する、重鎖ＣＤＲ配列ならびに、
マウスＶ領域生殖系列ＶＫ３−５＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ５（５Ｆ１１）に少なくとも部分的に由来する、軽鎖ＣＤＲ配列；
ｃ）マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−８０＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ２に少なくとも部分的に由来する、重鎖ＣＤＲ配列ならびに、
マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ２（８Ｅ８）に少なくとも部分的に由来する、軽鎖ＣＤＲ配列；
ｄ）マウスＶ領域生殖系列ＶＨ１−１８＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ４に少なくとも部分的に由来する、重鎖ＣＤＲ配列ならびに、
マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１０−９６＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ２（５Ｇ７）に少なくとも部分的に由来する、軽鎖ＣＤＲ配列；または
ｅ）マウスＶ領域生殖系列ＶＨ５−９−４＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＨＪ３に少なくとも部分的に由来する、重鎖ＣＤＲ配列ならびに、
マウスＶ領域生殖系列ＶＫ１−１１７＿０１およびＪ領域生殖系列ＩＧＫＪ２（１９Ｇ３）に少なくとも部分的に由来する、軽鎖ＣＤＲ配列；
を含む、単離した抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
重鎖および軽鎖を含み、ここで重鎖がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含み、軽鎖がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含み、それらが：
ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号５のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０８残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号６のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体１２Ｄ６−０３のＣＤＲ；
ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号７のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０８残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号９のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体１２Ｄ６−２２のＣＤＲ；
ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号１０のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０８残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号１１のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体１２Ｄ６−２３のＣＤＲ；
ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号１２のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０８残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号９のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体１２Ｄ６−２４のＣＤＲ；
ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号２５のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０６残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号２６のそれぞれ、２４〜３８残基、５４〜６０残基および９３〜１０１残基を含む、抗体５Ｆ１１−１７のＣＤＲ；
ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号２７のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０６残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号２８のそれぞれ、２４〜３８残基、５４〜６０残基および９３〜１０１残基を含む、抗体５Ｆ１１−２３のＣＤＲ；
ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号２９のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０６残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号３０のそれぞれ、２４〜３８残基、５４〜６０残基および９３〜１０１残基を含む、抗体５Ｆ１１−４５のＣＤＲ；
ｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号４２のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１１１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号４３のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体８Ｅ８−５６のＣＤＲ；
ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号４４のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１１１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号４５のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体８Ｅ８−６２のＣＤＲ；
ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号４６のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１１１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号４７のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体８Ｅ８−６７のＣＤＲ；
ｋ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号４８のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１１１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号４９のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体８Ｅ８−７０のＣＤＲ；
ｌ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号５０のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１１１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号５１のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体８Ｅ８−７１のＣＤＲ；
ｍ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号５４のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０２残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号５５のそれぞれ、２４〜３４残基、５０〜５６残基および８９〜９７残基を含む、抗体５Ｇ７−２２のＣＤＲ；
ｎ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号５６のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０２残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号５７のそれぞれ、２４〜３４残基、５０〜５６残基および８９〜９７残基を含む、抗体５Ｇ７−２５のＣＤＲ；
ｏ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号６０のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号６２のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体１９Ｇ３−１１のＣＤＲ；および
ｐ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号６３のそれぞれ、３１〜３５残基、５０〜６６残基および９９〜１０１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号６４のそれぞれ、２４〜３９残基、５５〜６１残基および９４〜１０２残基を含む、抗体１９Ｇ３−２２のＣＤＲ；
からなる群から選択される、請求項１に記載の単離した抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
ａ）それぞれ、配列番号５および配列番号６の、１〜１１９残基および１〜１１２残基を含む、抗体１２Ｄ６−０３の重鎖および軽鎖可変領域；
ｂ）それぞれ、配列番号７および配列番号９の、１〜１１９残基および１〜１１２残基を含む、抗体１２Ｄ６−２２の重鎖および軽鎖可変領域；
ｃ）それぞれ、配列番号１０および配列番号１１の、１〜１１９残基および１〜１１２残基を含む、抗体１２Ｄ６−２３の重鎖および軽鎖可変領域；
ｄ）それぞれ、配列番号１２および配列番号９の、１〜１１９残基および１〜１１２残基を含む、抗体１２Ｄ６−２４の重鎖および軽鎖可変領域；
ｅ）それぞれ、配列番号２５および配列番号２６の、１〜１１７残基および１〜１１１残基を含む、抗体５Ｆ１１−１７の重鎖および軽鎖可変領域；
ｆ）それぞれ、配列番号２７および配列番号２８の、１〜１１７残基および１〜１１１残基を含む、抗体５Ｆ１１−２３の重鎖および軽鎖可変領域；
ｇ）それぞれ、配列番号２９および配列番号３０の、１〜１１７残基および１〜１１１残基を含む、抗体５Ｆ１１−４５の重鎖および軽鎖可変領域；
ｈ）それぞれ、配列番号４２および配列番号４３の、１〜１２２残基および１〜１１２残基を含む、抗体８Ｅ８−５６の重鎖および軽鎖可変領域；
ｉ）それぞれ、配列番号４４および配列番号４５の、１〜１２２残基および１〜１１２残基を含む、抗体８Ｅ８−６２の重鎖および軽鎖可変領域；
ｊ）それぞれ、配列番号４６および配列番号４７の、１〜１２２残基および１〜１１２残基を含む、抗体８Ｅ８−６７の重鎖および軽鎖可変領域；
ｋ）それぞれ、配列番号４５および配列番号４９の、１〜１２２残基および１〜１１２残基を含む、抗体８Ｅ８−７０の重鎖および軽鎖可変領域；
ｌ）それぞれ、配列番号５０および配列番号５１の、１〜１２２残基および１〜１１２残基を含む、抗体８Ｅ８−７１の重鎖および軽鎖可変領域；
ｍ）それぞれ、配列番号５４および配列番号５５の、１〜１１３残基および１〜１０７残基を含む、抗体５Ｇ７−２２の重鎖および軽鎖可変領域；
ｎ）それぞれ、配列番号５６および配列番号５７の、１〜１１３残基および１〜１０７残基を含む、抗体５Ｇ７−２５の重鎖および軽鎖可変領域；
ｏ）それぞれ、配列番号６０および配列番号６２の、１〜１１２残基および１〜１１２残基を含む、抗体１９Ｇ３−１１の重鎖および軽鎖可変領域；ならびに、
ｐ）それぞれ、配列番号６３および配列番号６４の、１〜１１２残基および１〜１１２残基を含む、抗体１９Ｇ３−２２の重鎖および軽鎖可変領域；
からなる群から選択される、重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の、抗体またはその抗原結合部分の、重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする、核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターで形質転換した、細胞。
【請求項１０】
抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を調製する方法であって：
ａ）請求項９に記載の細胞中に、抗体またはその抗原結合部分を発現すること；および
ｂ）細胞から、抗体またはその抗原結合部分を単離すること、
を含む、方法。
【請求項１１】
ａ）請求項１〜６のいずれかに記載の、抗体またはその抗原結合部分；および
ｂ）担体、
を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む、対象の免疫応答を刺激する方法。
【請求項１３】
対象が腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対象が慢性ウイルス感染症を患っており、ウイルス感染症に対する免疫応答が刺激される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
治療上有効な量の請求項１１に記載の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、がんの処置方法。
【請求項１６】
がんが、膀胱がん、乳がん、子宮／子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃腸がん、膵がん、大腸がん、結腸がん、腎がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、生殖細胞がん、骨がん、肝がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連がんからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
治療上有効な量の請求項１１に記載の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、慢性ウイルス感染症の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第62/252,615号（2015年11月9日に出願）および同第62/186,076号（2015年6月29日に出願）の優先権を主張し、これらの開示は、参照によって本明細書に取り込まれる。
【０００２】
背景
最近の研究は、ヒトのがんおよび慢性感染症を、悪性細胞または感染細胞に対する患者の免疫応答を調節する薬剤で処置できる場合があることを明らかにしてきた。例えば、Reck & Paz-Ares (2015) Semin. Oncol. 42:402参照。アゴニスト抗ＣＤ４０抗体（ＣＰ−８７０８９３およびダセツズマブ（ＳＧＮ−４０）など）について、それらがそのような免疫応答を増強し得るという信念に基づいて、がんの処置が試みられてきた。例えば、Kirkwood et al. (2012) CA Cancer J. Clin. 62:309; Vanderheide & Glennie (2013) Clin. Cancer Res. 19:1035参照。最近のマウスの実験は、阻害性Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩＩｂに対する特異性が増強した抗ＣＤ４０抗体が、抗腫瘍の効力を増加させたことを明らかにした。例えば、WO 2012/087928; Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Li & Ravetch (2012) Proc. Nat’l Acad. Sci USA 109:10966;Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754参照。
【０００３】
ヒト対象のがんおよび慢性感染症の処置について、アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体を改善する必要性が存在する。そのような抗体は、好ましくは、活性化Ｆｃ受容体と比較して、阻害性Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩＩｂに対する特異性が増強しており、抗腫瘍活性および／または抗感染症活性の増強を示す。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書は、ヒトＣＤ４０（配列番号１の成熟配列）に特異的に結合し、場合により、ＦｃγＲＩＩｂ受容体との結合における特異性が増強した、改変したＦｃ領域を有する、単離したヒト化マウスモノクローナル抗体を提供する。特定の実施態様において、本発明は、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体を含む、１２Ｄ６（配列番号３および４）、５Ｆ１１（配列番号２３および２４）、８Ｅ８（配列番号４０および４１）、５Ｇ７（配列番号５２および５３）および１９Ｇ３（配列番号５８および５９）のうち１つまたはそれ以上の抗体と、同一のエピトープとの結合に競合し、同一のエピトープと交差遮断し、または結合する、抗ヒトＣＤ抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０００５】
特定の実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＷＧＣＬＬＴＡＶＨＰＥＰＰＴＡＣＲＥ（配列番号１の１１〜２８残基）（抗体１２Ｄ６）、ＥＰＰＴＡＣＲＥＫＱＹＬＩＮＳ（配列番号１の２１〜３５残基）（抗体１２Ｄ６、５Ｇ７および１９Ｇ３）、およびＥＣＬＰＣＧＥＳＥ（配列番号１の５８〜６６残基）（抗体５Ｆ１１）からなる群から選択される１以上の配列を含む、またはからなるエピトープで、結合する。
【０００６】
いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで重鎖はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含み、軽鎖はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含み、これらの配列は、表３に開示されるように、抗ヒトＣＤ４０抗体１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７または１９Ｇ３と、同一のマウスの生殖系列(germline)Ｖ領域の遺伝子セグメントおよびＪ領域の遺伝子セグメントに、少なくとも部分的に由来する。具体的には、抗体は、抗体１２Ｄ６（重鎖ＣＤＲ配列がマウスＶ領域の生殖系列ＶＨ１−３９およびＪ領域の生殖系列ＩＧＨＪ４に少なくとも部分的に由来し、軽鎖ＣＤＲ配列が、マウスＶ領域の生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＪ領域の生殖系列ＩＧＫＪ１に少なくとも部分的に由来する）、抗体５Ｆ１１（重鎖ＣＤＲ配列がマウスＶ領域の生殖系列ＶＨ１−４＿０２およびＪ領域の生殖系列ＩＧＨＪ３に少なくとも部分的に由来し、軽鎖ＣＤＲ配列が、マウスＶ領域の生殖系列ＶＫ３−５＿０１およびＪ領域の生殖系列ＩＧＫＪ５に少なくとも部分的に由来する）、抗体８Ｅ８（重鎖ＣＤＲ配列がマウスＶ領域の生殖系列ＶＨ１−８０＿０１およびＪ領域の生殖系列ＩＧＨＪ２に少なくとも部分的に由来し、軽鎖ＣＤＲ配列が、マウスＶ領域の生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＪ領域の生殖系列ＩＧＫＪ２に少なくとも部分的に由来する）、抗体５Ｇ７（重鎖ＣＤＲ配列がマウスＶ領域の生殖系列ＶＨ１−１８＿０１およびＪ領域の生殖系列ＩＧＨＪ４に少なくとも部分的に由来し、軽鎖ＣＤＲ配列が、マウスＶ領域の生殖系列ＶＫ１０−９６＿０１およびＪ領域の生殖系列ＩＧＫＪ２に少なくとも部分的に由来する）、または抗体１９Ｇ３（重鎖ＣＤＲ配列がマウスＶ領域の生殖系列ＶＨ５−９−４＿０１およびＪ領域の生殖系列ＩＧＨＪ３に少なくとも部分的に由来し、軽鎖ＣＤＲ配列が、マウスＶ領域の生殖系列ＶＫ１−１１７＿０１およびＪ領域の生殖系列ＩＧＫＪ２に少なくとも部分的に由来する）と、同一のマウス生殖系列に由来するＣＤＲ配列を、含み得る。
【０００７】
様々な実施態様において、本発明の抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで重鎖はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含み、軽鎖はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含み、これらの配列は：抗体１２Ｄ６−０３のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号５の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号６の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）；抗体１２Ｄ６−２２のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号７の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号９の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）；抗体１２Ｄ６−２３のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号１０の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号１１の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）；抗体１２Ｄ６−２４のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号１２の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０８残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号９の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）；抗体５Ｆ１１−１７のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号２５の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０６残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号２６の２４〜３８、５４〜６０および９３〜１０１残基を含む）；抗体５Ｆ１１−２３のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号２７の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０６残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号２８の２４〜３８、５４〜６０および９３〜１０１残基を含む）；抗体５Ｆ１１−４５のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号２９の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０６残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号３０の２４〜３８、５４〜６０および９３〜１０１残基を含む）；抗体８Ｅ８−５６のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号４２の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号４３の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）；抗体８Ｅ８−６２のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号４４の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号４５の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）；抗体８Ｅ８−６７のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号４６の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号４７の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）；抗体８Ｅ８−７０のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号４８の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号４９の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）；抗体８Ｅ８−７１のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号５０の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１１１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号５１の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）；抗体５Ｇ７−２２のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号５４の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０２残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号５５の２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７残基を含む）；抗体５Ｇ７−２５のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号５６の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０２残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号５７の２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７残基を含む）；抗体１９Ｇ３−１１のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号６０の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号６２の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）；および、抗体１９Ｇ３−２２のＣＤＲ（ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ、配列番号６３の３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０１残基を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はそれぞれ、配列番号６４の２４〜３９、５５〜６１および９４〜１０２残基を含む）からなる群から選択される。
【０００８】
様々な実施態様において、本発明の抗体は、１２Ｄ６（配列番号３の１〜１１９残基）、５Ｆ１１（配列番号２３の１〜１１７残基）、８Ｅ８（配列番号４０の１〜１２２残基）、５Ｇ７（配列番号５２の１〜１１３残基）および１９Ｇ３（配列番号５８の１〜１１２残基）からなる群から選択される可変ドメインを含み、ＩｇＧ１ｆ（配列番号６５）、ＳＥ（配列番号６６）、ＳＥＬＦ（配列番号６７）、Ｐ２３８Ｄ（配列番号６８）、Ｖ４（配列番号６９）、Ｖ４ Ｄ２７０Ｅ（配列番号７０）、Ｖ７（配列番号７１）、Ｖ８（配列番号７２）、Ｖ９（配列番号７３）、Ｖ９ Ｄ２７０Ｅ（配列番号７４）、Ｖ１１（配列番号７５）、およびＶ１２（配列番号７６）からなる群から選択される、ＦｃγＲＩＩｂ特異的Ｆｃ領域を含む定常領域を有する、重鎖を含む。
【０００９】
いくつかの実施態様において、抗体は、１２Ｄ６−０３（それぞれ配列番号５および配列番号６の、１〜１１９および１〜１１２残基）、１２Ｄ６−２２（それぞれ配列番号７および配列番号９の、１〜１１９および１〜１１２残基）、１２Ｄ６−２３（それぞれ配列番号１０および配列番号１１の、１〜１１９および１〜１１２残基）、１２Ｄ６−２４（それぞれ配列番号１２および配列番号９の、１〜１１９および１〜１１２残基）、５Ｆ１１−１７（それぞれ配列番号２５および配列番号２６の、１〜１１７および１〜１１１残基）、５Ｆ１１−２３（それぞれ配列番号２７および配列番号２８の、１〜１１７および１〜１１１残基）、５Ｆ１１−４５（それぞれ配列番号２９および配列番号３０の、１〜１１７および１〜１１１残基）、８Ｅ８−５６（それぞれ配列番号４２および配列番号４３の、１〜１２２および１〜１１２残基）、８Ｅ８−６２（それぞれ配列番号４４および配列番号４５の、１〜１２２および１〜１１２残基）、８Ｅ８−６７（それぞれ配列番号４６および配列番号４７の、１〜１２２および１〜１１２残基）、８Ｅ８−７０（それぞれ配列番号４８および配列番号４９の、１〜１２２および１〜１１２残基）、８Ｅ８−７１（それぞれ配列番号５０および配列番号５１の、１〜１２２および１〜１１２残基）、５Ｇ７−２２（それぞれ配列番号５４および配列番号５５の、１〜１１３および１〜１０７残基）、５Ｇ７−２５（それぞれ配列番号５６および配列番号５７の、１〜１１３および１〜１０７残基）、１９Ｇ３−１１（それぞれ配列番号６０および配列番号６２の、１〜１１２および１〜１１２残基）、および９Ｇ３−２２（それぞれ配列番号６３および配列番号６４の、１〜１１２および１〜１１２残基）からなる群から選択される、特異的な重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。任意のこれらの抗体は、ＦｃγＲＩＩｂ特異的Ｆｃ領域を含む、重鎖定常領域をさらに含み得、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１ｆ（配列番号６５）、ＳＥ（配列番号６６）、ＳＥＬＦ（配列番号６７）、Ｐ２３８Ｄ（配列番号６８）、Ｖ４（配列番号６９）、Ｖ４ Ｄ２７０Ｅ（配列番号７０）、Ｖ７（配列番号７１）、Ｖ８（配列番号７２）、Ｖ９（配列番号７３）、Ｖ９ Ｄ２７０Ｅ（配列番号７４）、Ｖ１１（配列番号７５）、およびＶ１２（配列番号７６）からなる群から選択される。任意のこれらの抗体は、配列番号７７の軽鎖κ定常領域をさらに含み得る。
【００１０】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号９の軽鎖および、配列番号１３〜２２のいずれかからなる群から選択される重鎖を含む、ヒト化１２Ｄ６−２４抗体、または配列番号３０の軽鎖および、配列番号３１〜３９のいずれかからなる群から選択される重鎖を含む、ヒト化５Ｆ１１−４５抗体を含む。具体的な抗体は、１２Ｄ６−２４ ＳＥ（配列番号９および１４）、１２Ｄ６−２４ ＳＥＬＦ（配列番号９および１５）、１２Ｄ６−２４ Ｐ２３８Ｄ（配列番号９および１３）、１２Ｄ６−２４ Ｖ４（配列番号９および１６）、１２Ｄ６−２４ Ｖ４ Ｄ２７０Ｅ（配列番号９および１７）、１２Ｄ６−２４ Ｖ８（配列番号９および１８）、１２Ｄ６−２４ Ｖ９（配列番号９および１９）、１２Ｄ６−２４ Ｖ９ Ｄ２７０Ｅ（配列番号９および２０）、１２Ｄ６−２４ Ｖ１１（配列番号９および２１）、１２Ｄ６−２４ Ｖ１２（配列番号９および２２）、５Ｆ１１−４５ ＳＥ（配列番号３０および３１）、５Ｆ１１−４５ ＳＥＬＦ（配列番号３０および３２）、５Ｆ１１−４５ Ｖ４（配列番号３０および３３）、５Ｆ１１−４５ Ｖ４ Ｄ２７０Ｅ（配列番号３０および３４）、５Ｆ１１−４５ Ｖ８（配列番号３０および３５）、５Ｆ１１−４５ Ｖ９（配列番号３０および３６）、５Ｆ１１−４５ Ｖ９ Ｄ２７０Ｅ（配列番号３０および３７）、５Ｆ１１−４５ Ｖ１１（配列番号３０および３８）、および５Ｆ１１−４５ Ｖ１２（配列番号３０および３９）を含み、ここで配列はそれぞれ、軽鎖および重鎖を与える。
【００１１】
さらなる実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ４０抗体は、１２Ｄ６−２４ ＳＥ（配列番号９および１４）、１２Ｄ６−２４ ＳＥＬＦ（配列番号９および１５）、１２Ｄ６−２４ Ｐ２３８Ｄ（配列番号９および１３）、１２Ｄ６−２４ Ｖ４（配列番号９および１６）、１２Ｄ６−２４ Ｖ４ Ｄ２７０Ｅ（配列番号９および１７）、１２Ｄ６−２４ Ｖ８（配列番号９および１８）、１２Ｄ６−２４ Ｖ９（配列番号９および１９）、１２Ｄ６−２４ Ｖ９ Ｄ２７０Ｅ（配列番号９および２０）、１２Ｄ６−２４ Ｖ１１（配列番号９および２１）、１２Ｄ６−２４ Ｖ１２（配列番号９および２２）、５Ｆ１１−４５ ＳＥ（配列番号３０および３１）、５Ｆ１１−４５ ＳＥＬＦ（配列番号３０および３２）、５Ｆ１１−４５ Ｖ４（配列番号３０および３３）、５Ｆ１１−４５ Ｖ４ Ｄ２７０Ｅ（配列番号３０および３４）、５Ｆ１１−４５ Ｖ８（配列番号３０および３５）、５Ｆ１１−４５ Ｖ９（配列番号３０および３６）、５Ｆ１１−４５ Ｖ９ Ｄ２７０Ｅ（配列番号３０および３７）、５Ｆ１１−４５ Ｖ１１（配列番号３０および３８）、および５Ｆ１１−４５ Ｖ１２（配列番号３０および３９）の重鎖および軽鎖の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％および９５％の配列同一性を共有する、重鎖および軽鎖を含む。
【００１２】
さらなる実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ４０抗体は、１２Ｄ６−２４ ＳＥ（配列番号９および１４）、１２Ｄ６−２４ ＳＥＬＦ（配列番号９および１５）、１２Ｄ６−２４ Ｐ２３８Ｄ（配列番号９および１３）、１２Ｄ６−２４ Ｖ４（配列番号９および１６）、１２Ｄ６−２４ Ｖ４ Ｄ２７０Ｅ（配列番号９および１７）、１２Ｄ６−２４ Ｖ８（配列番号９および１８）、１２Ｄ６−２４ Ｖ９（配列番号９および１９）、１２Ｄ６−２４ Ｖ９ Ｄ２７０Ｅ（配列番号９および２０）、１２Ｄ６−２４ Ｖ１１（配列番号９および２１）、１２Ｄ６−２４ Ｖ１２（配列番号９および２２）、５Ｆ１１−４５ ＳＥ（配列番号３０および３１）、５Ｆ１１−４５ ＳＥＬＦ（配列番号３０および３２）、５Ｆ１１−４５ Ｖ４（配列番号３０および３３）、５Ｆ１１−４５ Ｖ４ Ｄ２７０Ｅ（配列番号３０および３４）、５Ｆ１１−４５ Ｖ８（配列番号３０および３５）、５Ｆ１１−４５ Ｖ９（配列番号３０および３６）、５Ｆ１１−４５ Ｖ９ Ｄ２７０Ｅ（配列番号３０および３７）、５Ｆ１１−４５ Ｖ１１（配列番号３０および３８）、および５Ｆ１１−４５ Ｖ１２（配列番号３０および３９）の重鎖および軽鎖の配列から本質的になる、重鎖および軽鎖を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様において、Ｖ４またはＶ９ Ｆｃ配列バリアントを含む、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、Ｄ２７０Ｅ配列バリアントをさらに含む。そのような抗体は、ヒト化１２Ｄ６−２４ Ｖ４ Ｄ２７０Ｅ（配列番号９および１７）、１２Ｄ６−２４ Ｖ９ Ｄ２７０Ｅ（配列番号９および２０）、５Ｆ１１−４５ Ｖ４ Ｄ２７０Ｅ（配列番号３０および３４）および５Ｆ１１−４５ Ｖ９ Ｄ２７０Ｅ（配列番号３０および３７）を含み、ここで配列はそれぞれ、軽鎖および重鎖を与える。代替の実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ４０抗体は、これらの重鎖および軽鎖の配列から本質的になる、重鎖および軽鎖を含む抗体を含み、またはこれらの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％および９５％の配列同一性を共有する、重鎖および軽鎖を含む抗体を含む。いくつかの実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、天然に生じるＦｃ領域を有する抗体よりも、活性化受容体との結合ではなく、ＦｃγＲＩＩｂとの結合の特異性を増した、改変したＦｃ領域を含む。ある実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体におけるＡ／Ｉ比は、５未満であり、好ましい実施態様において１未満である。
【００１４】
いくつかの実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、１以上の重鎖および１以上の軽鎖（２つの重鎖および２つの軽鎖など）を含む。
【００１５】
本発明は、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの、重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸、核酸分子を含む発現ベクター、発現ベクターで形質転換した細胞、および発現ベクターで形質転換した細胞から抗体を発現し、抗体を回収することにより、抗体を産生する方法、をさらに提供する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体、またはその抗原結合フラグメント、および担体を含む、医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、有効な量の本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、対象の免疫応答が増強するように、対象に投与することを含む、対象の免疫応答を増強する方法を提供する。ある実施態様において、対象は腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答を増強する。別の実施態様において、対象はウイルス感染症（例えば、慢性ウイルス感染症）を患っており、抗ウイルスの免疫応答を増強する。
【００１８】
本発明はまた、対象の腫瘍の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、対象に、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、腫瘍の増殖を阻害するように、投与することを含む。
【００１９】
本発明は、がんの処置方法（例えば、免疫療法による）をさらに提供し、この方法は、治療上有効な量の本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを（例えば、医薬組成物として）、それを必要とする対象に投与し、それによってがんを処置することを含む。ある実施態様において、がんは、膀胱がん、乳がん、子宮がん／子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃腸がん、膵がん、大腸がん、結腸がん、腎がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、生殖細胞がん、骨がん、肝がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、およびウイルス関連がんである。ある実施態様において、がんは、転移がん、難治性がん、または再発がんである。
【００２０】
ある実施態様において、免疫機能を調節する方法および、本明細書で記述される処置の方法は、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体を、１以上のさらなる治療薬（例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＴＬＲアゴニストまたはＩＤＯもしくはＴＧＦβの低分子アンタゴニスト）と併用して、または二重特異性薬剤として共に、投与することを含む。特定の実施態様において、抗ｈｕＣＤ４０治療を、抗ＰＤ１治療および／または抗ＰＤ−Ｌ１治療（例えば、ヒトＰＤ１に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント）と併用する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本明細書で開示される（表４）Ｆｃ配列バリアントをよりよく説明するため、１１８〜４４６の番号を付け直した、ヒトＩｇＧ１ｆの定常ドメイン（配列番号６５）の配列を示す。変異を受けた残基は太字になっており、変更されたアミノ酸を残基の下に太字で示す。Ｄ２７０Ｅ置換に下線を引いた。Ｃ末端リジン（Ｋ）残基を図１および配列番号６５ならびに配列表に開示される他の全ての重鎖および重鎖定常ドメイン配列において、除去した。しかしながら、他の実施態様において、特に本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体における重鎖および重鎖定常ドメインをコードする核酸コンストラクトにおいて、これらの配列は、タンパク質のＣ末端に追加のリジン残基または、核酸の３’末端に余分なリジンをコードするヌクレオチドを含む。
【００２２】
【図２】図２は、本発明の抗体が結合し、ＣＤ４０Ｌ結合を遮断する、ヒトＣＤ４０上のエピトープ群（「ビン」）を示すベン図である。長円または円が重なる抗体は、ヒトＣＤ４０との結合において競合し、四角形内に入る抗体は、ヒトＣＤ４０と結合するＣＤ４０Ｌを遮断する。
【００２３】
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、ＩＬ−６分泌によって測定した、Ｆｃ配列の機能としてのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体による、樹状細胞の活性化を示す。実施例７参照。一連の抗体を、ｍＡｂ １２Ｄ６−２４可変ドメインおよび様々なヒトＩｇＧ１ｆ定常領域（ＩｇＧ１ｆ、ＳＥ、ＳＥＬＦ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２バリアントを含む）を含むように、構築した。図３Ａは、あるドナー由来の細胞を用いて得たデータを示し、図３Ｂは異なるドナー由来の細胞を用いて得たデータを示す。
【００２４】
【図４】図４は、細胞表面のＣＤ５４によって測定した、可変ドメイン配列の機能としてのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体による、細胞の活性化を示す。実施例７参照。一連の抗体を、親の（マウス）抗ＣＤ４０ ｍＡｂ １２Ｄ６、５Ｇ７、８Ｅ８、１９Ｇ３および５Ｆ１１由来の、ヒトＩｇＧ１ｆ−Ｖ１２定常領域および可変ドメインを含むように、構築した。結果を、抗体濃度の関数としての蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として、プロットする。
【００２５】
【図５】図５は、本発明の様々な抗体（Ｄ２７０置換を有する抗体を含む）による、ＦｃγＲの結合の割合を示す。実施例８参照。「−ｓｕｐ」を含む抗体名は、抗体産生細胞由来の上清を示し、他の抗体は、精製した抗体である。データを、ForteBio Octet systemにおいて測定し、抗体と受容体の各組合せにおける、受容体結合の最大値の割合として示す。例えば、実施例３参照。３種のバーの各集団は、左から右に、ｈＣＤ３２ａ／ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ１３１（１０μＭ）（斜線のバー）との結合、ｈＣＤ３２ｂ／ＦｃγＲＩＩａ−Ｒ１３１（１０μＭ）（黒色のバー）との結合、およびｈＣＤ３２ｂ／ＦｃγＲＩＩｂ（１μＭ）（白色のバー）との結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
本発明は、単離した抗体、特にモノクローナル抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体）を提供し、これはヒトＣＤ４０（「ｈｕＣＤ４０」）と特異的に結合し、アゴニスト活性を有する。様々なヒト化マウス抗ｈｕＣＤ４０モノクローナル抗体における配列を提供する。ある実施態様において、本明細書に記述される抗体は、特定のマウスの重鎖および軽鎖の生殖系列配列に由来し、かつ／または、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの、特定の構造的特徴を含む。他の実施態様において、抗体は、本明細書で与えられる配列における抗ＣＤ４０抗体と、ＣＤ４０結合において競合し、または同一のエピトープに結合する。いくつかの実施態様において、重鎖Ｆｃ領域の配列を、ＦｃγＲＩＩｂとの結合を特異的に増強するように改変する。
【００２７】
本明細書はさらに、そのような抗体、イムノコンジュゲート、およびそのような抗体またはその抗原結合フラグメントを含む二重特異性分子、ならびに抗体またはフラグメントを含むように処方された医薬組成物を作成する方法を提供する。本明細書はまた、免疫応答の増強において、抗体を、単独で、または他の免疫賦活剤（例えば、抗体）および／またはがん治療または抗感染症治療と組み合わせて用いる方法を提供する。したがって、本明細書で記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体を、多様な治療応用（例えば、腫瘍増殖の阻害および慢性ウイルス感染症の処置を含む）における処置に用いてもよい。
【００２８】
定義
本記述をより簡単に理解できるよう、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義を詳細な説明のあらゆる箇所で説明する。
【００２９】
ＣＤ４０は、「ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５」（ＴＮＦＲＳＦ５）を指す。他の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書におけるＣＤ４０の言及は、ヒトＣＤ４０（「ｈｕＣＤ４０」）を指し、抗ＣＤ４０抗体は、抗ヒトＣＤ４０抗体を指す。ヒトＣＤ４０はさらに、遺伝子ＩＤ番号９５８およびＭＩＭ（ヒトにおけるメンデル遺伝(Mendelian Inheritance in Man)）：１０９５３５に記述される。２０アミノ酸シグナル配列を含む、ヒトＣＤ４０の配列（ＮＰ＿００１２４１．１）を配列番号１に示す。
【００３０】
ＣＤ４０は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）と相互作用し、このリガンドはまた、ＴＮＦＳＦ５、ｇｐ３９およびＣＤ１５４とも呼ばれる。他の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書におけるＣＤ４０Ｌの言及は、ヒトＣＤ４０Ｌ（「ｈｕＣＤ４０Ｌ」）を指す。ヒトＣＤ４０Ｌはさらに、遺伝子ＩＤ番号９５９およびＭＩＭ：３００３８６に記述される。ヒトＣＤ４０Ｌの配列（ＮＰ＿００００６５．１）を配列番号２に示す。
【００３１】
他の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書における用語「抗体」は、全ての抗体およびあらゆる抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）またはその単鎖を含み得る。ある実施態様において、「抗体」は、ジスルフィド結合で相互に連結した、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む、糖タンパク質、またはその抗原結合フラグメントを指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと省略する）および重鎖定常領域から構成される。ある天然に生じるＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体において、重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される。ある天然に生じる抗体において、各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略する）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域を、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）が分散している、超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに細分化できる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲ領域および４つのフレームワーク領域から構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２，ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと宿主組織または因子（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一の成分（Ｃｌｑ）を含む）との結合を媒介し得る。
【００３２】
抗体は典型的に、それらの同族の抗原に、高い親和性で特異的に結合し、これは、１０−７から１０−１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって反映される。約１０−６Ｍよりも大きい、任意のＫＤが、非特異的な結合を示すと一般的に考えられる。本明細書において、抗原に「特異的に結合する」抗体は、抗原および実質的に同一の抗原に、高い親和性（これは、１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０−９Ｍ以下、最も好ましくは１０−８Ｍないし１０−１０Ｍ以下のＫＤを有することを意味する）で結合するが、無関係の抗原には高い親和性で結合しない、抗体を指す。抗原は、所定の抗原との高度な配列同一性を示す場合（例えば、所定の抗原の配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す場合）、所定の抗原と「実質的に同一」である。例示の目的で、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する抗体はまた、ある非ヒト霊長類種（例えば、カニクイザル）由来のＣＤ４０と交差反応し得るが、他の種由来のＣＤ４０、またはＣＤ４０以外の抗原とは交差反応しない場合がある。
【００３３】
他の指示がない限り、免疫グロブリンは、任意の一般的に知られているアイソタイプ由来でよく、これは限定されないが、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種において、サブクラスに分けられる：ヒトにおいて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ならびにマウスにおいて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。免疫グロブリン（例えば、ヒトＩｇＧ１）は、数種のアロタイプが存在し、互いに最大で数個のアミノ酸が異なる。他の指示がない限り、本発明の抗体は、ＩｇＧ１ｆ定常ドメインを含む（配列番号６５）。他の指示がない限り、「抗体」は、例として、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体；キメラ抗体およびヒト化抗体；ヒト抗体および非ヒト抗体；全体的に合成された抗体；ならびに単鎖抗体を含み得る。
【００３４】
抗体における、用語「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」は、本明細書において、抗原（例えば、ヒトＣＤ４０）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１以上のフラグメントを指す。抗体における用語「抗原結合部分／フラグメント」に包含される、結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域がジスルフィド架橋で連結した、２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント）；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる、Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖフラグメント、ならびに（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、を含む。単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）、または合成リンカーで連結した、２以上の単離したＣＤＲの組合せは、抗原に結合できる場合、抗体の抗原結合ドメインを含み得る。
【００３５】
単鎖抗体コンストラクトもまた、本発明に含まれる。Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、別個の遺伝子にコードされているが、それらは遺伝子組換えの手法を用いて、それらを単一のタンパク質鎖として作成できる合成リンカーによって連結でき、ＶＬおよびＶＨ領域は対となり、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている１価の分子を形成する；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)参照。そのような単鎖抗体もまた、抗体における用語「抗原結合部分／フラグメント」に包含されることが意図される。これらおよび他の潜在的なコンストラクトは、Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記述される。これらの抗体フラグメントを、当業者に公知の従来技術を用いて得、フラグメントを、無傷の抗体と同様の様式で、有用性についてスクリーニングする。抗原結合部分／フラグメントを、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の免疫グロブリンの酵素的切断または化学的切断によって、生成できる。
【００３６】
他の指示がない限り、単語「フラグメント」は、抗体に対して用いる場合（請求項など）、「抗体またはフラグメント」が「抗体またはその抗原結合フラグメント」と同一の意味を持つように、抗体の抗原結合フラグメントを指す。
【００３７】
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、人工的なハイブリッド抗体であり、これは２つの異なる重鎖／軽鎖対を有し、異なる抗原に対して特異性を有する２つの抗原結合部位を生じる。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む、多様な方法で生成できる。例えば、Songsivilai & Lachmann (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553参照。
【００３８】
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体、または、全ての抗体が特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す、抗体の組成物を指す。典型的に、そのようなモノクローナル抗体は、単一細胞または抗体をコードする核酸由来であり、任意の配列の変化を意図的に導入せずに、増殖する。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および場合により、定常領域を有するモノクローナル抗体を指す。ある実施態様において、ヒトモノクローナル抗体を、ハイブリドーマによって生成し、例えば、遺伝子導入非ヒト動物または染色体導入(transchromosomal)非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウス）から得たＢ細胞を、不死化細胞と融合することによって得る。
【００３９】
本明細書において、用語「組換えヒト抗体」は、遺伝子組換え手法によって、調製し、発現し、作製し、または単離した全てのヒト抗体（（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそこから調製したハイブリドーマについて、遺伝子導入または染色体導入した動物（例えば、マウス）から単離した抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換した宿主細胞（例えばトランスフェクトーマ）から単離した抗体、（ｃ）遺伝子組換えのヒト抗体コンビナトリアルライブラリーから単離した抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関する、あらゆる他の方法によって調製し、発現し、作製し、または単離した抗体）を含む。そのような組換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によってコードされた、特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する、可変領域および定常領域を含むが、例えば抗体の成熟化の間に生じる、続く再編成および変異を含む。当分野で公知のように（例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125参照）、可変領域は、抗原結合ドメインを含み、これは、外来の抗原に特異的な抗体を形成するように再編成する様々な遺伝子によってコードされている。再編成に加えて、可変領域を複数の単一アミノ酸交換（体細胞変異または高頻度変異とも呼ばれる）でさらに改変し、外来の抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。定常領域は、さらに抗原と反応して変化する（すなわち、アイソタイプスイッチ）。したがって、抗原と反応する軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする、再編成され、体細胞変異した核酸配列は、元の生殖系列配列と同一でなくてもよいが、実質的に同一または類似している（すなわち、少なくとも８０％の同一性）。
【００４０】
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が共にヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロ(in vitro)でのランダム変異もしくは部位特異的変異によって、またはインビボ(in vivo)での体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳類種（マウスなど）の生殖系列由来のＣＤＲ配列を、ヒトフレームワーク配列上に移植した抗体を含むことを意図しない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体を同意語として用いる。
【００４１】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）のＣＤＲドメイン以外の、いくつか、ほとんどまたは全てのアミノ酸を、ヒト免疫グロブリン由来の、対応するアミノ酸に置換した、抗体を指す。ヒト化型抗体のある実施態様において、ＣＤＲドメイン以外のいくつか、ほとんど、または全てのアミノ酸を、ヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸に置換するが、１以上のＣＤＲ領域中のいくつか、ほとんど、または全てのアミノ酸は変化しない。抗体が特定の抗原に結合する能力を抑制しない限り、アミノ酸の少数の付加、挿入、置換または改変を許容できる。「ヒト化」抗体は、元の抗体に類似した抗原特異性を保持する。
【００４２】
「キメラ抗体」は、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来する、抗体（可変領域がマウス抗体由来で、定常領域がヒト抗体由来である、抗体など）を指す。「ハイブリッド」抗体は、異なる型の重鎖および軽鎖を有する抗体（マウス（親）重鎖およびヒト化軽鎖またはその逆、など）を指す。
【００４３】
本明細書において、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子にコードされる抗体のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体）を指す。
【００４４】
「アロタイプ」は、特定のアイソタイプ群における天然に生じるバリアントであって、１個または数個のアミノ酸が異なるバリアントを指す。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照。
【００４５】
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書において、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に用いられる。
【００４６】
本明細書における「単離した抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＣＤ４０に特異的に結合する単離した抗体は、ＣＤ４０以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＣＤ４０のエピトープに特異的に結合する、単離した抗体は、様々な種由来の他のＣＤ４０タンパク質との交差反応性を有し得る。
【００４７】
抗体のＦｃ領域と特定のＦｃ受容体との相互作用に由来する、「エフェクター機能」は、必ずしも限定されないが、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＦｃγＲ介在性エフェクター機能（ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）など）、および細胞表面受容体の下方制御（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）を含む。このようなエフェクター機能は、抗原結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合するためのＦｃ領域を、通常必要とする。
【００４８】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する受容体である。ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲは、ＦｃγＲファミリーの受容体を含み、これらの受容体は、その対立遺伝子のバリアントおよび選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲファミリーは、３つの活性化受容体（マウスにおいて、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶ；ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）および１つの阻害性受容体（ＦｃγＲＩＩｂまたは同等のＦｃγＲＩＩＢ）からなる。ヒトＦｃγＲの様々な性質を表１にまとめた。自然エフェクター細胞型(innate effector cell type)の大部分は、１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲＩＩｂを共発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、１つの活性化Ｆｃ受容体（マウスにおけるＦｃγＲＩＩＩおよびヒトにおけるＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現し、マウスおよびヒトにおける阻害性ＦｃγＲＩＩｂを発現しない。ヒトＩｇＧ１はほとんどのヒトＦｃ受容体に結合し、結合する活性化受容体の型に関して、マウスＩｇＧ２ａに相当すると考えられる。
表１：ヒトＦｃγＲの性質
【表１】
2018526978.tif 000002
【００４９】
「Ｆｃ領域」（フラグメント結晶化可能領域）または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫グロブリンと宿主組織または因子との結合（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）上に位置するＦｃ受容体との結合、または古典的補体系の第一の成分（Ｃ１ｑ）との結合を含む）を媒介する抗体の重鎖のＣ末端領域を指す。したがって、Ｆｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）を除く抗体の定常領域を含む。抗体のアイソタイプのＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの各重鎖において、ＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む；ＩｇＭおよびＩｇＥのＦｃ領域は、各ポリペプチド鎖において、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２〜４）を含む。ＩｇＧにおいて、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３ならびにＣγ１およびＣγ２の間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃ２２６またはＰ２３０位置のアミノ酸残基（またはこれら２つのアミノ酸の間のアミノ酸）から、重鎖のＣ末端までの区間として、通常定義され、ここでこの番号付けは、Kabat(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD)と同様に、ＥＵの指標に従う；U.S. Pat. App. Pub. No. 2008/0248028の図３ｃ〜３ｆも参照。ヒトＩｇＧのＦｃ領域におけるＣＨ２ドメインは、アミノ酸約２３１からアミノ酸約３４０までに及び、ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置する（すなわち、ＩｇＧのアミノ酸約３４１からアミノ酸約４４７（Ｃ末端のリジンを含む）に及ぶ）。本明細書において、Ｆｃ領域は、あらゆるアロタイプのバリアントを含む、天然配列のＦｃ、またはバリアントのＦｃ（例えば、非天然に生じるＦｃ）であり得る。Ｆｃはまた、単離されたこの領域、または「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」（Ｆｃ融合タンパク質とも呼ばれる；例えば抗体またはイムノアドヘシン）などのＦｃを含むタンパク質ポリペプチドにおけるこの領域を指す。
【００５０】
「天然配列のＦｃ領域」または「天然配列のＦｃ」は、天然に見出されたＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１のＦｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ２のＦｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３のＦｃ領域；および天然配列のヒトＩｇＧ４のＦｃ領域ならびに天然に生じるそれらのバリアントを含む。天然配列のＦｃは、Ｆｃの様々なアロタイプを含む。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照。
【００５１】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する、抗原（例えばｈｕＣＤ４０）上の部位を指す。タンパク質抗原におけるエピトープは、連続するアミノ酸（通常、直線状エピトープ）またはタンパク質の３次のフォールディングによって並列する不連続のアミノ酸（通常、立体構造エピトープ）の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、常にではないが典型的に、変性溶媒への曝露に対して保持されるが、３次のフォールディングによって形成するエピトープは、変性溶媒の処理によって典型的に失われる。エピトープは、典型的に、特有の空間的構造において、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。
【００５２】
用語「エピトープマッピング」は、抗体−抗原認識に関与する抗原上の分子決定基を同定する方法を指す。エピトープが所定の抗体と結合することを決定する方法は、当分野で周知であり、例えば、抗原由来（例えばＣＤ４０由来）の重複するペプチドまたは連続的なペプチドを、所定の抗体（例えば、抗ＣＤ４０抗体）との反応性について検定する、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイ；Ｘ線結晶構造解析；２次元核磁気共鳴；酵母ディスプレイ（実施例６参照）；およびＨＤＸ−ＭＳ（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照）（実施例５参照）を含む。
【００５３】
２以上の抗体に関する用語「同一のエピトープに結合する」は、抗体がアミノ酸残基の同一のセグメントに結合することを意味し、これは所定の方法で決定される。抗体が、本明細書で記述される抗体と「ＣＤ４０上の同一のエピトープ」に結合するか否かを決定する技術は、例えば、エピトープの原子分解能を与える、エピトープマッピング法（抗原：抗体複合体の結晶のＸ線解析など）および水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）を含む。他の方法は、抗体と抗原フラグメント（例えば、タンパク質分解性フラグメント）または抗原の変異による変種との結合をモニターし、抗原配列中のアミノ酸残基の改変による結合の損失は通常、エピトープ成分の指標であると考えられる（アラニンスキャニング変異導入法(Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081)または変異標的配列バリアントの酵母ディスプレイ（実施例６参照）など）。さらに、エピトープマッピングにおいて、コンビナトリアル計算法(computational combinatorial method)を用いてもよい。これらの方法は、対象の抗体が、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリー由来の特異的な短いペプチドをアフィニティ単離する能力に依存する。同一または密接に関連するＶＨおよびＶＬまたは同一のＣＤＲ配列を有する抗体は、同一のエピトープに結合すると想定される。
【００５４】
「標的との結合において、別の抗体と競合する」抗体は、他の抗体と標的との結合を（部分的または完全に）阻害する抗体を指す。２つの抗体が、標的との結合において、互いに競合するか否か（すなわち、ある抗体が他の抗体と標的との結合を阻害するか否か、およびどの程度阻害するか）は、公知の競合実験で決定できる。ある実施態様において、抗体は、別の抗体と標的との結合と、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％競合し、阻害する。阻害または競合のレベルは、酵素が「ブロッキング抗体」（すなわち、最初に標的とインキュベートした冷式抗体）であることに依存して異なる。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb. Protoc.; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277またはEd HarlowおよびDavid Laneによる"Using Antibodies"の１１章, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記述されるように行われ得る。競合する抗体は、同一のエピトープ、重複するペプチドまたは隣接するエピトープ（例えば、立体障害によって明らかなように）に結合する。
【００５５】
他の競合的結合のアッセイは：固相直接的または間接的(solid phase direct or indirect)放射免疫測定法（ＲＩＡ）、固相直接的または間接的酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ(sandwich competition assay)（Stahli et al. (1983) Methods in Enzymology 9:242参照）；固相直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al. (1986) J. Immunol. 137:3614参照）；固相直接的標識化アッセイ、固相直接的標識化サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane (1988) Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press参照）；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接的標識化ＲＩＡ（Morel et al. (1988) Mol. Immunol. 25(1):7参照）；固相直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al. (1990) Virology 176:546）；および直接的標識化ＲＩＡ（Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77）を含む。
【００５６】
本明細書において、用語「特異的な結合」、「選択的な結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープに結合し、他の抗原には結合しない抗体を指す。典型的に、抗体は、（ｉ）例えば、所定の抗原（例えば、組換えヒトＣＤ４０）を分析物として、かつ抗体をリガンドとして用いる、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴装置における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって、または抗体と抗原陽性細胞との結合のスキャッチャード解析によって決定される場合、約１０−７Ｍ未満の平衡解離定数（約１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ以下など）で結合し、（ｉｉ）所定の抗原と、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）との結合における親和性よりも、少なくとも２倍以上高い親和性で結合する。したがって、「ヒトＣＤ４０に特異的に結合する」抗体は、可溶性または細胞に結合したヒトＣＤ４０と、１０−７Ｍ以下（約１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ以下など）のＫＤで結合する抗体を指す。「カニクイザルＣＤ４０と交差反応する」抗体は、カニクイザルＣＤ４０と、１０−７Ｍ以下（約１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ以下など）のＫＤで結合する抗体を指す。
【００５７】
本明細書における用語「ｋａｓｓｏｃ」または「ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数を指し、本明細書における用語「ｋｄｉｓ」または「ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指す。本明細書における用語「ＫＤ」は、平衡解離定数を指し、これはｋｄとｋａの比（すなわち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表現される。抗体におけるＫＤ値を、当分野でよく確立した方法で決定できる。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、好ましくはＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤデバイスを用いる、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）解析（実施例３参照）、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴システムなどのバイオセンサーシステムを用いる、表面プラズモン共鳴（実施例４参照）、またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード解析である。
【００５８】
抗体またはその抗原結合フラグメントを用いるインビトロアッセイまたはインビボアッセイに関する用語「ＥＣ５０」は、最大値の５０％の応答（すなわち、最大の応答とベースラインの中間）を誘導する、抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度を指す。
【００５９】
用語「固定化されたＣＤ４０に結合する」は、本明細書に記述される抗体が、ＣＤ４０（例えば、細胞表面上に発現したＣＤ４０または固体担体に結合したＣＤ４０）に結合する能力を指す。
【００６０】
本明細書における用語「交差反応する」は、本明細書で記述される抗体が、様々な種由来のＣＤ４０と結合する能力を指す。例えば、本明細書で記述される、ヒトＣＤ４０に結合する抗体は、別の種由来のＣＤ４０（例えば、カニクイザルＣＤ４０）とも結合し得る。本明細書において、交差反応性を、結合アッセイ（例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ）における精製した抗原との特異的な反応性を検出することによって、または、ＣＤ４０を生理的に発現する細胞との結合、もしくは他の機能的な相互作用によって、測定できる。交差反応性を決定する方法は、本明細書で記述される標準的な結合アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を用いるＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ解析、またはフローサイトメトリー技術）を含む。
【００６１】
物体に対して適用される、本明細書における用語「天然に生じる」は、物体が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、天然源から単離できる生物（ウイルスを含む）中に存在し、かつ研究室で人間によって意図的に改変されていない、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に生じる。
【００６２】
「ポリペプチド」は、少なくとも２つの連続して結合するアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質における１以上のアミノ酸残基は、限定されないが、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合などの改変を含み得る。「タンパク質」は、１以上のポリペプチドを含み得る。
【００６３】
本明細書における用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得、ｃＤＮＡであり得る。
【００６４】
本明細書で提供される抗体配列の「保存的な配列改変」（すなわち、ヌクレオチド配列によってコードされる抗体、またはアミノ酸配列を含む抗体と、抗原との結合を抑制しない、ヌクレオチド配列の改変およびアミノ酸配列の改変）をまた、提供する。例えば、改変を当分野で公知の標準的な技術（部位特異的変異およびＰＣＲを介する変異など）で導入できる。保存的な配列改変は、保存的なアミノ酸置換を含み、このアミノ酸残基は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換される。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含む。したがって、抗ＣＤ４０抗体において必須ではないと予測されるアミノ酸残基を、好ましくは、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基に置換する。抗原との結合を排除しない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的な置換を同定する方法は、当分野でよく知られている。例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)参照。
【００６５】
あるいは別の実施態様において、変異を、抗ＣＤ４０抗体をコードする配列の全部または一部に沿って、（飽和変異導入などによって）ランダムに導入でき、得られた、改変された抗ＣＤ４０抗体を、改善された結合活性についてスクリーニングできる。
【００６６】
核酸において、用語「実質的な相同性」は、２つの核酸またはその指定された配列が、最適に整列および比較された場合に、少なくとも約８０％のヌクレオチド、通常少なくとも約９０〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％のヌクレオチドが、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って、同一であることを示す。あるいは、実質的な相同性は、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下で、相補鎖とハイブリダイズする場合に、存在する。
【００６７】
ポリペプチドにおいて、用語「実質的な相同性」は、２つのポリペプチドまたはその指定された配列が、最適に整列および比較された場合に、少なくとも約８０％のアミノ酸、通常少なくとも約９０〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％のアミノ酸が、適切なアミノ酸の挿入または欠失を伴って同一であることを示す。
【００６８】
２つの配列間の同一性の割合は、配列が最適に整列した場合における、配列が共有する同一の位置の数の関数（すなわち、％相同性＝同一の位置の数／全ての位置の数 ｘ １００）であり、これは、２つの配列の最適なアライメントにおいて導入される必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して決定される、最適なアライメントを伴う。２つの配列間の配列比較および同一性の割合の決定を、以下の限定されない例において記述されるように、数学アルゴリズムを用いて達成できる。
【００６９】
２つのヌクレオチド配列間の同一性の割合を、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップ加重(gap weight)、および１、２、３、４、５または６の長さ加重(length weight)を用いて、決定できる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性の割合は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、E. MeyersおよびW. Miller(CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０加重残基表(weight residue table)、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いても決定できる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）のアルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用い、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重、および１、２、３、４、５または６の長さ加重を用いて、決定できる。
【００７０】
本明細書に記述される核酸およびタンパク質の配列を「クエリー配列」として用いて、公開データベースに対する検索を行い、例えば関連する配列を同定できる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行い、本明細書に記述される核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行い、本明細書に記述されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的とするギャップのあるアライメントを得るために、Gapped BLAST をAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402で記述されるように利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、各プログラムの（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを利用できる。
【００７１】
核酸は、全細胞中、細胞溶解物中、または部分的に精製した形状もしくは実質的に純粋な形状で存在できる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当分野で周知の他の技術を含む標準的な技術により、例えば、他の細胞性核酸（例えば、染色体の他の部分）またはタンパク質などの、他の細胞成分または他の混入物質を除去して精製した場合に、「単離された」こととなり、または「実質的に純粋な状態となる」。Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
【００７２】
本明細書における用語「ベクター」は、連結している別の核酸を輸送できる核酸分子を指すことを意図する。ベクターの一種が「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る、環状２本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結し得る。あるベクターは、導入された宿主細胞中で自律複製できる（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、あるベクターは、作動的に連結している遺伝子の発現を導くことができる。このようなベクターを、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般的に、組換えＤＮＡ技術に用いる発現ベクターは、プラスミドの形状であることが多い。プラスミドは最も一般的に用いられるベクターの形状であるため、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いられ得る。しかしながら、本明細書は、同等の機能を提供する、ウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの、他の形状の発現ベクターも含む。
【００７３】
本明細書における用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、細胞中に非天然に存在する核酸を含む細胞を指すことを意図し、組換え発現ベクターを導入した細胞であり得る。そのような用語は、特定の対象細胞およびそのような細胞の子孫をも指すことを意図することが理解されるはずである。突然変異または環境的な影響のいずれかによって、後代に特定の改変が生じ得るため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書における用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。
【００７４】
「免疫応答」は、外来の病原体に対する、脊椎動物内の生物学的な応答を指し、この応答は、これらの病原体およびそれらによって生じる疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞または好中球）および、これらの任意の細胞または肝臓によって産生する可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用を介し、これは、侵入した病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞もしくは他の異常細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合に、正常ヒト細胞もしくは組織の、選択的なターゲティング、結合、損傷、破壊および／または脊椎動物の身体からの除去をもたらす。免疫応答は、例えばＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞）の活性化もしくは阻害、またはＴｒｅｇ細胞の阻害もしくは除去を含む。「Ｔエフェクター」（「Ｔｅｆｆ」）細胞は、細胞溶解活性を有するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）およびＴヘルパー（Ｔｈ）細胞を指し、これらはサイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化し、導くが、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を含まない。
【００７５】
本明細書において、用語「Ｔ細胞を介する応答」は、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）およびヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）を含む、Ｔ細胞が介在する応答を指す。Ｔ細胞を介する応答は、例えば、Ｔ細胞の細胞傷害性および増殖を含む。
【００７６】
本明細書において、用語「細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答」は、細胞傷害性Ｔ細胞によって誘導される免疫応答を指す。ＣＴＬ応答は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞を介する。
【００７７】
「免疫調節物質」または「免疫修飾物質」は、免疫応答の修飾、制御または改変に関与する物質（例えば、シグナル伝達経路の構成要素）を指す。免疫応答の「修飾」、「調節」、または「改変」は、免疫系の細胞またはそのような細胞（例えば、エフェクターＴ細胞）の活性の任意の変更を指す。そのような調節は、種々の細胞型の数の増加もしくは減少、これらの細胞の活性の増加もしくは減少、または免疫系において生じ得る他の任意の変化によって現れ得る、免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性免疫調節物質および刺激性免疫調節物質は共に同定されており、それらのいくつかは、腫瘍の微小環境中で機能を増強し得る。好ましい実施態様において、免疫調節物質は、Ｔ細胞の表面上に位置する。「免疫調節の標的」または「免疫修飾の標的」は、物質、化学物質、部分、化合物または分子による結合において標的とされ、それらの結合によって活性が変化する、免疫調節物質である。免疫調節の標的は、例えば、細胞表面上の受容体（「免疫調節受容体」）および受容体リガンド（「免疫調節リガンド」）を含む。
【００７８】
「免疫療法」は、免疫応答の誘導、増強、抑制または他の改変を含む方法による、疾患に苦しむ対象、または疾患の再発にかかり、もしくは苦しむ可能性のある対象の処置を指す。
【００７９】
「免疫賦活療法」または「免疫刺激療法」は、例えばがんの処置における、対象の免疫応答の増加（誘導または増強）をもたらす療法を指す。
【００８０】
「内因性免疫応答を増強すること」は、対象の既存の免疫応答の有効性または能力を増加することを意味する。この有効性および能力の増加は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機構を克服することによって、または内因性宿主免疫応答を増強する機構を刺激することによって、達成され得る。
【００８１】
本明細書において、用語「連結した」は、２以上の分子の会合を指す。結合は、共有結合または非共有結合であり得る。結合はまた、遺伝子的（すなわち、遺伝子組換えによる融合）であり得る。そのような結合は、当分野で認知された多様な技術（化学的結合および組換えタンパク質生成など）を用いて達成できる。
【００８２】
本明細書において、「投与する」は、当業者に公知の、様々な任意の方法および送達システムを用いる、治療薬を含む組成物の、対象への物理的導入を指す。本明細書で記述される抗体を投与する好ましい経路は、例えば注射または注入による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経口的な投与経路を含む。本明細書における語句「非経口的投与」は、通常、注射による、腸内および局所投与以外の投与方法を意味し、限定されないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入、ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。あるいは、本明細書で記述される抗体は、局所、表皮または粘膜の投与経路などの、非経口的でない経路（例えば、鼻腔内、経口的、経膣的、直腸内、舌下または局所的）を介して投与され得る。投与はまた、例えば、１回、複数回、および／または１以上の長期間にわたって、行われ得る。
【００８３】
本明細書において、用語「阻害する」または「遮断する」は、互換的に用いられ、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％）による、部分的および完全な阻害／遮断の両方を包含する。
【００８４】
本明細書において、「がん」は、体内の異常細胞の制御されない増殖によって特徴付けられる疾患の広い群を指す。未制御の細胞分裂は、隣接する組織に侵入する悪性の腫瘍または細胞の形成をもたらし得、リンパ系または血流を通って、身体の離れた部位に転移し得る。
【００８５】
本明細書における用語「処置する」、「処置すること」、「処置」は、症状、合併症、状態または疾患に関連する生化学的徴候の、進行、発生、重症度、または再発を、元に戻し、軽減し、改善し、阻害し、または遅延もしくは予防する目的で、対象に行う任意の種類の介入もしくは方法、または対象に活性薬剤を投与すること、を指す。予防は、疾患を患っていない対象への投与を指し、その疾患が起こるのを予防し、または起こった場合に、その効果を最小化する。
【００８６】
用語「有効な用量」または「有効な投与量」は、所望の効果を達成または部分的に達成するのに十分な量として定義される。薬剤または治療薬の「治療上有効な量」または「治療上有効な投与量」は、単独または別の治療薬と併用して用いる場合に、疾患の症状の重症度を減少させ、疾患の症状のない期間の頻度および持続時間を増加させ、または疾患の苦痛による機能障害もしくは身体障害を予防することによって証明される、疾患の退縮を促進する、薬剤の任意の量である。薬剤の「予防に有効な量」または「予防に有効な投与量」は、疾患が起こる、または疾患の再発が起こる可能性のある対象に、単独または別の治療薬と併用して投与する場合に、疾患の発生または再発を阻害する薬剤の量である。治療薬または予防薬が、疾患の退縮を促進し、または疾患の発生もしくは再発を阻害する能力は、例えば、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、または、インビトロアッセイにおける薬剤の活性をアッセイすることによって、技術を持つ実行者に知られている多様な方法を用いて評価できる。
【００８７】
例として、抗がん剤は、がんの進行を遅延し、または対象のがんの退縮を促進する薬剤である。好ましい実施態様において、治療上有効な量の薬剤は、がんを除去するまで、がんの退縮を促進する。「がんの退縮を促進すること」は、有効な量の薬剤を、単独または抗腫瘍薬と併用して、投与することを意味し、腫瘍の増殖もしくはサイズの減少、腫瘍の壊死、少なくとも１つの症状の重症度の減少、症状のない期間の頻度および持続時間の増加、疾患の苦痛による機能障害もしくは身体障害の予防、または患者の症状の他の改善をもたらす。薬理学的有効性は、薬剤が、患者のがんの退縮を促進する能力を指す。生理学的安全性は、薬剤の投与に起因する、許容される低いレベルの毒性または、細胞、臓器および／もしくは生物のレベルにおける他の有害な生理学的効果（有害効果）を指す。
【００８８】
腫瘍の処置における例として、治療上有効な量または投与量の薬剤は、細胞増殖または腫瘍増殖を、未処置の対象と比較して、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらになお好ましくは少なくとも約８０％、阻害する。最も好ましい実施態様において、治療上有効な量または投与量の薬剤は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する（すなわち、好ましくは、細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する）。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、後述のアッセイを用いて評価できる。腫瘍増殖の阻害は、処置直後でなくてもよく、一定期間後または、反復投与後にのみ生じてもよい。あるいは、組成物のこの性質を、化合物が細胞増殖を阻害する能力を調べることにより、評価でき、そのような阻害は、技術を持つ実行者に公知のアッセイによって、インビトロで測定できる。本明細書における他の好ましい実施態様において、腫瘍の退縮を、少なくとも約２０日間、より好ましくは少なくとも約４０日間、またはさらにより好ましくは少なくとも約６０日間、観察および継続できる。
【００８９】
本明細書における「併用」療法は、他の文脈から明らかな場合を除き、状況に応じた方法で、２以上の治療薬の投与を包含することを意味し、限定されないが、同時投薬を含む。具体的には、併用療法は、ある治療薬の投与が、別の治療薬の投与によりいくつかの方法で調節される限り、同時投与（合剤(co-formulation)の投与または別個の治療組成物の同時投与）および連続投与または連続的投与の両方を包含する。例えば、ある治療薬を、異なる治療薬を投与した後にのみ投与し、所定期間作用することを可能にし得る。例えば、Kohrt et al. (2011) Blood 117:2423参照。
【００９０】
用語「患者」および「対象」は、予防または治療の処置のいずれかを受ける任意のヒトを指す。例えば、本明細書に記述される方法および組成物を用いて、がんを患う対象を処置できる。
【００９１】
本明細書に記述される様々な態様を、以下の小区分でさらに詳細に記述する。
【００９２】
Ｉ．抗ＣＤ４０抗体
本出願は、がんなどの疾患の処置での、治療薬としての使用において、所望の性質を有する、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を開示する。これらの性質は、ヒトＣＤ４０に高い親和性で結合する能力、ヒト対象において許容される低い免疫原性、ＦｃγＲＩＩｂと優先的に結合する能力、および抗体の化学的安定性を減少させ得る配列傾向の欠如、のうち１つまたはそれ以上を含む。
【００９３】
配列によって本明細書に開示される抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＣＤ４０上の特異的なエピトープに結合し、これは実施例５および６に記述されるように決定され得る。同一または密接に関連するエピトープに結合する他の抗体は、これらの所望の性質を共有する可能性があり、競合実験を行うことで発見され得る。
【００９４】
本明細書に開示される抗ｈｕＣＤ４０抗体と競合する抗ｈｕＣＤ４０抗体
ｈｕＣＤ４０との結合において、本発明の抗体と競合する抗ｈｕＣＤ４０抗体を、本明細書に記述される免疫化プロトコル（実施例１および２）に類似するプロトコルを用いて、産生し得る。配列によって本明細書に開示される抗ｈｕＣＤ４０抗体との結合に競合する抗体を、マウスまたは他の非ヒト動物をヒトＣＤ４０またはその細胞外ドメインを含むコンストラクト（配列番号１の２１−１９３残基）で免疫化することにより、または本明細書に開示される抗ｈｕＣＤ４０抗体が結合するエピトープを含むヒトＣＤ４０フラグメントで免疫化することにより、産生してもよい。得られた抗体を、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７および／または１９Ｇ３の、ヒトＣＤ４０との結合を遮断する能力について、当分野で周知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡにおける、ＣＤ４０の細胞外ドメインの融合タンパク質および免疫グロブリンＦｃドメインの結合の遮断、または例えばＦＡＣＳによる、細胞表面上にｈｕＣＤ４０を発現する細胞との結合の遮断）で、スクリーニングできる。様々な実施態様において、テスト抗体を、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７もしくは１９Ｇ３の添加前、添加と同時、または添加後に、ＣＤ４０−Ｆｃ融合タンパク質（または、細胞表面上にｈｕＣＤ４０を発現する細胞）と接触させる。例えば、「ビニング」実験を行い（実施例４）、配列によって本明細書に開示される抗体を「参照」として用い、かつテストする抗体を「テスト」抗体として用いて、テスト抗体が配列によって本明細書に開示される抗体と同じ「ビン」に分類されるか否かを決定してもよい。配列によって本明細書に開示される抗体の、ヒトＣＤ４０（Ｆｃ融合体として、または細胞上のいずれか）との結合を減少させる抗体（特に、おおよそ化学量論的な濃度で）、は、同一の、重複する、または隣接するエピトープと結合する可能性があり、したがって、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７もしくは１９Ｇ３の所望の機能的性質を共有し得る。
【００９５】
したがって、本明細書は、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体と細胞上のｈｕＣＤ４０との結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％阻害し、かつ／または、細胞上のｈｕＣＤ４０との結合が、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体によって、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％阻害される、抗ｈｕＣＤ４０抗体を提供し、これは例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによって（例えば、以下の段落に記述されるアッセイを用いて）測定される。
【００９６】
テスト抗体が参照抗体の結合を遮断する（すなわち、参照の抗体と「競合」する）か否かを決定する、代表的な競合実験は、以下のように行われ得る：ＣＤ４０を発現する細胞を、９６ウェルプレートに試料ウェル当たり１０５細胞ずつ播種する。プレートを氷上に配置し、次いで、非結合テスト抗体を０〜５０μｇ／ｍＬの濃度で添加する（最高濃度の５０μｇ／ｍＬから開始する３倍滴定）。無関係のＩｇＧを、第一の抗体のアイソタイプ対照として使用し、同一濃度で（最高濃度の５０μｇ／ｍＬから開始する３倍滴定）添加してもよい。５０μｇ／ｍＬの非標識参照抗体とともにプレインキュベートした試料を、競合遮断の陽性対照（１００％阻害）として含んでもよく、最初のインキュベーションにおいて抗体を含まない試料を、陰性対照(競合なし；０％阻害)として使用してもよい。３０分のインキュベーション後、標識化（例えばビオチン化）した参照抗体を、洗浄せずに、ウェル当たり２μｇ／ｍＬの濃度で添加する。試料を氷上でさらに３０分間インキュベートする。非結合の抗体を、ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄することによって、除去する。細胞が結合した、標識化参照抗体を、標識を検出する試薬（例えば、ビオチンの検出における、ＰＥ共役ストレプトアビジン（Invitrogen、カタログ番号Ｓ２１３８８））で検出する。試料を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター(BD, San Jose)で取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)を用いて分析する。結果を、％阻害として表してもよい。
【００９７】
通常、同一の実験を次に、反対にして行う（すなわち、テスト抗体を参照抗体とし、参照抗体をテスト抗体とする）。ある実施態様において、抗体は、他の抗体の、標的（例えば、ヒトＣＤ４０またはそのフラグメント）との結合を、少なくとも部分的に（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％）または完全に（１００％）遮断し、これは一方または他方の抗体が参照抗体である場合に、阻害が生じるか否かに関係しない。参照抗体およびテスト抗体は、抗体が互いに両方向に（すなわち、参照抗体が最初に添加される競合実験、およびテスト抗体が最初に添加される競合実験において）競合する場合、互いの標的との結合を「交差遮断(cross-block)」する。
【００９８】
抗ｈｕＣＤ４０抗体が、例えば実施例４に記述されるような競合実験において、およそ等濃度で存在し、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７および／または１９Ｇ３とヒトＣＤ４０との結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する場合に、本明細書に開示される抗ｈｕＣＤ４０抗体と競合すると考えられる。他に示されない限り、抗体が、上述の２段落において概説されるような競合ＥＬＩＳＡ実験で測定され、本発明の抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択された抗体とおよそ等モル濃度で使用され、選択された抗体とヒトＣＤ４０（配列番号１）との結合を少なくとも２０％減少させる場合、選択された抗体と競合すると考えられる。
【００９９】
同一のエピトープと結合する抗ｈｕＣＤ４０抗体
本明細書に開示される抗体と同一または類似のエピトープと結合する、抗ｈｕＣＤ４０抗体を、本明細書に記述される免疫化プロトコル（実施例１および２）と類似のプロトコルを用いて作製してもよい。得られた抗体を、ヒトＣＤ４０との高い親和性結合についてスクリーニングしてもよい（実施例３）。次いで、選択された抗体を、ｈｕＣＤ４０の配列バリアントを酵母細胞の表面上に提示する酵母ディスプレイアッセイ（実施例６）、または水素−重水素交換実験（実施例５）で調べ、抗体が結合する正確なエピトープを決定してもよい。
【０１００】
エピトープの決定は、当分野で公知の任意の方法で行われ得る。様々な実施態様において、抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ｈｕＣＤ４０の少なくとも１つの領域内の１以上の同一の残基と接触する場合；ｈｕＣＤ４０の少なくとも１つの領域内の大部分の残基と接触する場合；ｈｕＣＤ４０の各領域内の大部分の残基と接触する場合；ｈｕＣＤ４０の全長に沿う接触の大部分と接触する場合；ヒトＣＤ４０の全ての同一の区別される領域において接触する場合；ヒトＣＤ４０上の任意の１つの領域における全ての残基と接触する場合；または全ての同一の領域で全ての同一の残基と接触する場合、本明細書に開示される抗ｈｕＣＤ４０ ｍＡｂと同一のエピトープに結合すると考えられる。エピトープ「領域」は、一次配列に沿った残基のクラスターである。
【０１０１】
本明細書に記述される抗体を用いて「ｈｕＣＤ４０上の同一のエピトープ」と結合する抗体を決定する技術は、抗原：抗体複合体の結晶のＸ線解析を含み、これは、エピトープの原子分解能を提供する。他の方法は、抗体と抗原フラグメントまたは抗原の変異による変種との結合をモニターし、抗原配列のアミノ酸残基の改変による結合の損失が、エピトープの成分を示すと考えられることが多い。方法はまた、対象の抗体が、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリー由来、または標的タンパク質のプロテアーゼ消化物由来の、特異的な短ペプチド（天然の３次元形状または変性した形状のいずれか）を親和性単離する能力に依存し得る。そこでペプチドを、ペプチドライブラリーをスクリーニングするのに用いる抗体に対応するエピトープの決定におけるリードと見なす。エピトープマッピングにおいて、立体構造的に不連続なエピトープをマッピングするのに示されている計算アルゴリズムも開発されている。
【０１０２】
エピトープまたはエピトープを含む領域をまた、ＣＤ４０に広がる一連の重複するペプチドとの結合についてスクリーニングすることによって同定できる。あるいは、Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899の方法を使用して、同一のエピトープを有し、したがって本明細書に記述される抗ＣＤ４０抗体に類似する性質を有する抗体の選択を導いてもよい。ファージディスプレイを用いて、まず、抗ＣＤ４０抗体の重鎖を、（好ましくはヒトの）軽鎖のレパートリーと対形成し、ＣＤ４０結合性抗体を選択し、次いで、新規の軽鎖を（好ましくはヒトの）重鎖のレパートリーと対形成し、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体と同一のエピトープまたはエピトープ領域を有する(好ましくはヒトの) ＣＤ４０結合性抗体を選択する。あるいは、本明細書に記述される抗体のバリアントを、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異誘発によって、得ることができる。
【０１０３】
Cunningham & Wells (1989) Science 244: 1081によって記述されるようなアラニンスキャニング変異導入法、またはＣＤ４０中のアミノ酸残基の点変異のいくつかの他の形式（実施例６で提供する酵母ディスプレイ法など)を用いて、抗ＣＤ４０抗体における機能的なエピトープを決定してもよい。
【０１０４】
特異的な抗体が結合するエピトープまたはエピトープ領域（「エピトープ領域」は、エピトープを含む領域、またはエピトープと重複する領域である）を、抗体と、ＣＤ４０のフラグメントを含むペプチドとの結合を評価することによって決定してもよい。ＣＤ４０（例えば、ヒトＣＤ４０）の配列を包含する一連の重複するペプチドを合成し、例えば、直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ（ペプチドが、抗体と、マイクロタイタープレートのウェルに結合するＣＤ４０との結合を防ぐその能力について、評価する)において、またはチップ上で、結合についてスクリーニングしてもよい。このようなペプチドスクリーニング法は、いくつかの不連続な機能的なエピトープ（すなわち、ＣＤ４０ポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続しないアミノ酸残基を含む、機能的なエピトープ）を検出できない場合がある。
【０１０５】
エピトープはまた、水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）およびタンパク質の高速光化学的酸化(Fast Photochemical Oxidation)（ＦＰＯＰ）などの、ＭＳに基づくタンパク質フットプリント法によって同定してもよい。ＨＤＸ−ＭＳは、例えばWei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95でさらに記述されるように実施でき、この方法は、参照によって本明細書に具体的に組み込まれる。実施例５も参照。ＦＰＯＰは、例えばHambley & Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057に記述されるように実施でき、この方法は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１０６】
抗ＣＤ４０抗体が結合するエピトープを、Ｘ線結晶構造決定（例えば、WO2005/044853）、分子モデリングおよび核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（遊離の場合および対象の抗体との複合体中に結合する場合の、ＣＤ４０中の不安定なアミド水素のＨ−Ｄ交換速度のＮＭＲ決定を含む）などの構造的方法によって決定してもよい（Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884）。
【０１０７】
Ｘ線結晶学に関して、結晶化は、当分野で公知の任意の方法で達成され得（例えば、Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339;McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1）、これは、マイクロバッチ（例えば、Chayen (1997) Structure5:1269）、ハンギングドロップ蒸気拡散（例えば、McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300）、シーディングおよび透析を含む。少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、タンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、約１０％〜約３０％（ｗ／ｖ）の濃度を有する、ポリエチレングリコール１０００〜２０,０００（ＰＥＧ；約１０００〜約２０,０００Ｄａの平均分子量）、好ましくは、約５０００〜約７０００Ｄａ、より好ましくは、約６０００Ｄａを含有する沈殿剤溶液中で最もよく達成され得る。タンパク質安定化剤（例えば、約０.５％〜約２０％の濃度のグリセロール）を含むことが望ましい場合もある。適切な塩（塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムなど）が、沈殿剤溶液中に、好ましくは約１ｍＭ〜約１０００ｍＭの濃度であることが望ましい場合もある。沈殿剤を、好ましくは、約３.０〜約５.０、好ましくは、約４.０のｐＨに緩衝する。沈殿剤溶液に有用な特定のバッファーは様々であり得、当分野で周知である（Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York）。有用なバッファーの例として、限定されないが、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸が挙げられる。結晶は２℃、４℃、８℃および２６℃を含む、多様な温度で成長し得る。
【０１０８】
抗体：抗原結晶を、周知のＸ線回折技術で調べてもよく、Ｘ−ＰＬＯＲ（Yale University、1992、Molecular Simulations、Inc.によって配布された；例えば、Blundell &Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press；米国特許出願公開第２００４／００１４１９４号を参照）およびＢＵＳＴＥＲ（Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.;Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323）などのコンピュータソフトウェアを用いて精密化され得、これらの開示内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
他の指示がない限り、請求項に関して、抗体が結合するエピトープは、実施例５に実質的に記述されるように、ＨＤＸ−ＭＳ法で決定されるエピトープである。
【０１０９】
高い親和性で結合する抗ＣＤ４０抗体
いくつかの実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、本明細書に開示される抗ｈｕＣＤ４０抗体と同様に、ｈｕＣＤ４０と高い親和性で結合し、有効な治療薬である可能性を高める。様々な実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ｈｕＣＤ４０と、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤで結合する。他の実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ｈｕＣＤ４０と、２ｎＭないし１００ｐＭのＫＤで結合する。抗体がｈｕＣＤ４０に結合する能力を評価する標準的なアッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）（実施例３参照）およびＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ分析（実施例４参照）を含む。
【０１１０】
抗ＣＤ４０抗体配列バリアント
本明細書に開示される抗体配列において、いくつかの変異性が許容され、抗体の所望の性質を維持し得る。ＣＤＲ領域を、カバットシステム（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を用いて描写する。したがって、本発明は、本明細書に開示される抗体（すなわち、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７および１９Ｇ３ならびにそのヒト化誘導体）のＣＤＲ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣＤＲ配列を含む、抗ｈｕＣＤ４０抗体をさらに提供する。本発明はまた、本明細書に開示される抗体（すなわち、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７および１９Ｇ３ならびにそのヒト化誘導体）の重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗ｈｕＣＤ４０抗体を提供する。
【０１１１】
ＣＤＲ配列を共有する抗ＣＤ４０抗体または同一のマウス生殖系列に由来する抗ＣＤ４０抗体
抗原結合特異性が、主にＣＤＲによって決定されることを考慮すると、本明細書に開示される抗体（すなわち、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７および１９Ｇ３）とＣＤＲ配列を共有する抗体は、その所望の性質を共有する可能性がある。いくつかの実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、抗体１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７または１９Ｇ３と、同一のマウスＶ領域およびＪ領域の生殖系列配列に由来する重鎖および軽鎖可変領域を含む。抗体１２Ｄ６は、マウス生殖系列ＶＨ１−３９＿０１およびＩＧＨＪ４に由来する重鎖ならびに生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＩＧＫＪ１に由来する軽鎖を持つ。抗体５Ｆ１１は、マウス生殖系列ＶＨ１−４＿０２およびＩＧＨＪ３に由来する重鎖ならびに生殖系列ＶＫ３−５＿０１およびＩＧＫＪ５に由来する軽鎖を持つ。抗体８Ｅ８は、マウス生殖系列ＶＨ１−８０＿０１およびＩＧＨＪ２に由来する重鎖ならびに生殖系列ＶＫ１−１１０＿０１およびＩＧＫＪ２に由来する軽鎖を持つ。抗体５Ｇ７は、マウス生殖系列ＶＨ１−１８＿０１およびＩＧＨＪ４に由来する重鎖ならびに生殖系列ＶＫ１０−９６＿０１およびＩＧＫＪ２に由来する軽鎖を持つ。抗体１９Ｇ３は、マウス生殖系列ＶＨ５−９−４＿０１およびＩＧＨＪ３に由来する重鎖ならびに生殖系列ＶＫ１−１１７＿０１およびＩＧＫＪ２に由来する軽鎖を持つ。重鎖Ｄ領域の生殖系列配列（ＣＤＲＨ３の一部を構成）は、所定の高い変異性を帰属するのがしばしば困難であるため、明記しておらず、したがって本発明の抗体は、記述したＶおよびＪ領域の生殖系列ならびに任意のＤ領域の生殖系列由来の重鎖を含み得る。ヒトＣＤ４０と結合し、これらの生殖系列配列の一部または全部に由来する、他の抗体は、配列（特に、同の一Ｖ領域遺伝子に由来する配列）において密接に関連している可能性があり、したがって、同一の所望の性質を共有すると想定される。
【０１１２】
本明細書において、抗体の可変領域が、マウス生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られ、抗体配列が、他の任意の生殖系列よりも、特定の生殖系列に由来する可能性が高いように、生殖系列と十分に関連している場合、マウス抗体は、所定の生殖系列配列に「由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。このような系は、マウスを対象の抗原で免疫化することを含む。抗体の配列が「由来する」マウス生殖系列免疫グロブリン配列を、抗体のアミノ酸配列と、マウス生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列とを比較すること、および抗体の配列と配列が最も近い（すなわち、最大の％同一性）生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、同定できる。特定の生殖系列免疫グロブリン配列に「由来する」マウス抗体は、生殖系列配列と比較して、例えば天然に生じる体細胞変異または部位特異的変異の意図的な導入による、アミノ酸の相違を含み得る。しかし、選択されたマウス抗体は通常、生殖系列免疫グロブリン遺伝子（例えばＶ領域）によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９０％同一である。特定の場合には、マウス抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子（例えばＶ領域）によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。通常、特定のマウス生殖系列配列に由来する抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子（例えばＶ領域）によってコードされるアミノ酸配列と、１０個以下のアミノ酸の相違を示す。特定の場合、マウス抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子（例えばＶ領域）によってコードされるアミノ酸配列と５個以下、またはさらに４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の相違を含み得る。
【０１１３】
ＩＩ．遺伝子操作および改変した抗体
ＶＨおよびＶＬ領域
改変した抗体を遺伝子操作するために、本明細書に開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１つまたはそれ以上を有する抗体を出発物質として用いて調製され得る、遺伝子操作および改変した抗体をまた提供し、この改変した抗体は、出発抗体から変化した性質を有し得る。抗体を、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内（例えば、１以上のＣＤＲ領域内、および／または１以上のフレームワーク領域内）の１以上の残基を改変することによって、遺伝子操作してもよい。さらに、またはあるいは、抗体を、定常領域内の残基を改変することで遺伝子操作し、例えば、抗体のエフェクター機能を変えてもよい。
【０１１４】
ある種の可変領域の実施可能な遺伝子操作は、ＣＤＲグラフティングである。このようなグラフティングは、本明細書に開示される抗ｈｕＣＤ４０抗体との結合について競合し、かつ／または、本明細書に開示される抗ｈｕＣＤ４０抗体と同一のエピトープに結合する、非ヒト抗ＣＤ４０抗体のヒト化において特に役立つ。抗体は主に、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも、個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体抗原相互作用に関与するため、種々の性質を持つ種々の抗体由来のフレームワーク配列上に移植した、特定の参照抗体由来のＣＤＲ配列を含む、発現ベクターを構築することによって、特定の参照抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現できる（例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033;Winterの米国特許第５,２２５,５３９号およびQueen et alの米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号参照）。
【０１１５】
このようなフレームワーク配列を、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは発表された参考文献から得てもよい。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖系列ＤＮＡ配列を、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース、ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different HypervariableLoops" J. Mol. Biol. 227:776-798;およびCox, J. P. L. et al. (1994) "A Directoryof Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836において見出すことができ、これらの各々の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１１６】
本明細書に記述される抗体に用いる、好ましいフレームワーク配列は、本明細書に記述される抗体によって用いられるフレームワーク配列と構造的に類似した配列である。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植してもよく、またはＣＤＲ配列を、生殖系列配列と比較して、最大２０個の、好ましくは保存的な、アミノ酸置換を含むフレームワーク領域上に移植してもよい。例えば、特定の場合、フレームワーク領域内の残基を変異させることが、抗体の抗原結合能力を維持または増強するのに有益であることがわかっている（例えば、Queen et alの米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号を参照）。
【０１１７】
本明細書に記述される遺伝子操作した抗体は、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に改変を行い、例えば抗体の性質を改善した、抗体を含む。このようなフレームワークの改変は、抗体の免疫原性を低下させるように行われることが多い。例えば、１つの手法は、１以上のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異(backmutate)」させることである。より具体的には、体細胞変異を起こした抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体のフレームワーク配列と、抗体が由来する生殖系列配列とを比較することで同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列配置に戻すため、例えば、部位特異的変異導入またはＰＣＲを介する変異導入によって、体細胞変異を生殖系列配列に「復帰変異させる」ことができる。このような「復帰変異させた」抗体も包含することを意図する。
【０１１８】
別の種類のフレームワークの改変は、フレームワーク領域内、または１以上のＣＤＲ領域内における、１以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を減少させることに関する。この手法は、「脱免疫化」とも呼ばれ、Carr et alによる米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号にさらに詳細に記述される。
【０１１９】
別の種類の可変領域の改変は、ＣＤＲ領域内のアミノ酸残基を変異させ、対象の抗体の１以上の結合の性質（例えば、親和性）を改善することである。部位特異的変異導入またはＰＣＲを介する変異導入を行い、変異および抗体結合の効果または対象の他の機能的な性質を導入してもよい。保存的な改変を導入することが好ましい。変異は、アミノ酸付加、欠失、または好ましくは置換であり得る。さらに通常、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５個以下の残基が変更される。
【０１２０】
抗体のＣＤＲ内のメチオニン残基を酸化し、潜在的な化学的分解および結果として、抗体の効力の低下をもたらしてもよい。したがって、酸化分解を受けないアミノ酸残基と置換した、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ内の１以上のメチオニン残基を有する抗ＣＤ４０抗体も提供する。同様に、特にＣＤＲにおいて、脱アミド化部位を抗ＣＤ４０抗体から除去してもよい。抗原結合ドメイン内の潜在的なグリコシル化部位を排除し、抗原結合に干渉し得るグリコシル化を防ぐことが好ましい。例えば、米国特許第５,７１４,３５０号参照。
【０１２１】
標的抗原結合
様々な実施態様において、本発明の抗体を改変し、抗原結合が有害である組織および環境において、抗原結合を選択的に遮断するが、抗原結合が有益である場合に、抗原結合を可能とする。ある実施態様において、抗体の抗原結合表面と特異的に結合し、抗原結合に干渉する、遮断ペプチド「マスク」を産生し、このマスクは、ペプチダーゼ切断可能リンカーによって抗体の各々の結合アームと連結している。例えば、CytomXの米国特許第８,５１８,４０４号参照。このようなコンストラクトは、プロテアーゼレベルが、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境において大幅に増加する、がんの処置に有用である。腫瘍微小環境における切断可能なリンカーの選択的切断は、マスキングペプチド／遮断ペプチドの解離を可能とし、これは、抗原結合が望ましくない副作用を生じ得る末梢組織ではなく、腫瘍において選択的な抗原結合を可能にする。
【０１２２】
あるいは、関連する実施態様において、（二価）抗体の両方の抗原結合表面と結合し、抗原結合に干渉する、２つの抗原結合ドメインを含む二価結合化合物（「マスキングリガンド」）を開発し、この２つの結合ドメインのマスクは、切断可能なリンカー（例えば、ペプチダーゼによって切断可能なリンカー）によって互いに（抗体にではなく）連結している。例えば、Tegopharm Corpの国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０７７６４３参照。マスキングリガンドは、抗体が結合することが意図される抗原を含み得、もしくはその抗原に由来し得、または独立に生成し得る。そのようなマスキングリガンドは、プロテアーゼレベルが、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境で大幅に増加する、がんの処置に有用である。腫瘍微小環境における切断可能なリンカーの選択的切断は、２つの結合ドメインの互いからの解離を可能とし、抗体の抗原結合表面の結合力を低下させる。結果としてのマスキングリガンドの抗体からの解離は、抗原結合が望ましくない副作用を生じ得る末梢組織ではなく、腫瘍において、選択的な抗原結合を可能にする。
【０１２３】
Ｆｃおよび改変したＦｃ
本発明の抗体は、使用が意図される抗体の（もしあるならば）生物活性に基づいて選択される、種々のＦｃ領域を含む定常ドメインと組み合わせた、本発明の可変ドメインを含み得る（Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369）。例えば、ヒトＩｇＧは、４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）に分類でき、これらの各々は、１以上のＦｃγ受容体（活性化受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２ａ、ｃ）；ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ａ、ｂ）ならびに阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ））との結合について、および補体の第１の成分（Ｃ１ｑ）について、特有のプロファイルを有するＦｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、すべてのＦｃγ受容体と結合し；ＩｇＧ２は、ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１と結合し、ＦｃγＲＩＩＡＲ１３１ ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８とより低い親和性で結合し；ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣおよびＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８と結合し；阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３について、他の全てのＦｃγ受容体よりも低い親和性を有する（Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716）。研究は、ＦｃγＲＩがＩｇＧ２と結合せず、ＦｃγＲＩＩＩＢがＩｇＧ２またはＩｇＧ４と結合しないことを示してきた（同上の文献）。一般に、ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２である。結果として、例えば、ＩｇＧ１定常ドメイン（ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく）を、ＡＤＣＣを望む薬物の使用において選択してもよく；ＩｇＧ３を、ＦｃγＲＩＩＩＡ発現ＮＫ細胞、マクロファージの単球の活性化において選択してもよく；ＩｇＧ４を、抗体がアレルギー患者を脱感作するのに使用される場合に、選択してもよい。ＩｇＧ４は、抗体が全てのエフェクター機能を持たないことが望まれる場合にも、選択され得る。
【０１２４】
本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０可変領域を、Ｆｃ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ）と連結（例えば、共有結合または融合）してもよく、これは任意のアロタイプまたはイソアロタイプ（例えば、ＩｇＧ１において：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１（ａ）、Ｇ１ｍ２（ｘ）、Ｇ１ｍ３（ｆ）、Ｇ１ｍ１７（ｚ）；ＩｇＧ２において：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３（ｎ）；ＩｇＧ３において：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１（ｇ１）、Ｇ３ｍ２８（ｇ５）、Ｇ３ｍ１１（ｂ０）、Ｇ３ｍ５（ｂ１）、Ｇ３ｍ１３（ｂ３）、Ｇ３ｍ１４（ｂ４）、Ｇ３ｍ１０（ｂ５）、Ｇ３ｍ１５（ｓ）、Ｇ３ｍ１６（ｔ）、Ｇ３ｍ６（ｃ３）、Ｇ３ｍ２４（ｃ５）、Ｇ３ｍ２６（ｕ）、Ｇ３ｍ２７（ｖ）；）であってもよい。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1)参照。アロタイプの選択は、潜在的な免疫原性の懸念に影響され得、例えば、抗薬物抗体の形成を最小限にする。
【０１２５】
好ましい実施態様において、本発明の抗ＣＤ４０抗体は、ＦｃγＲＩＩｂと結合するＦｃ、またはＦｃγＲＩＩｂとの結合を増強するＦｃを有し、これは、アゴニズムの増強を与え得る。例えば、WO 2012/087928; Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754参照。本明細書に記述される可変領域を、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂとの親和性を増強するＦｃバリアントと連結し、例えば、アポトーシス誘導活性またはアジュバント活性を増強してもよい（Li & Ravetch (2012) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 109:10966；米国特許出願公開第２０１４／００１０８１２号）。そのようなバリアントは、ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞に関連する免疫調節活性を有する抗体を提供し、この細胞は例えば、Ｂ細胞および単球を含む。ある実施態様において、Ｆｃバリアントは、１以上の活性化受容体と比較して、ＦｃγＲＩＩｂとの親和性の選択的な増強を与える。そのようなバリアントはまた、ＦｃＲを介する架橋結合の増強を示し、治療効果の増強をもたらす。ＦｃγＲＩＩｂとの結合を変更する改変は、ＥＵ指標に従って、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群から選択された位置における、１以上の改変を含む。ＦｃγＲＩＩｂ親和性を増強する、代表的な置換は、限定されないが、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅを含む。代表的な置換は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙを含む。ＦｃγＲＩＩｂとの結合を増強する、他のＦｃバリアントは、２３５Ｙ−２６７Ｅ、２３６Ｄ−２６７Ｅ、２３９Ｄ−２６８Ｄ、２３９Ｄ−２６７Ｅ、２６７Ｅ−２６８Ｄ、２６７Ｅ−２６８Ｅおよび２６７Ｅ−３２８Ｆを含む。具体的に、ヒトＩｇＧ１における、Ｓ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｌ３２８ＦおよびＩ３３２Ｅ変異体（Ｓ２６７Ｅ−Ｌ３２８Ｆ二重変異体を含む）は、阻害性ＦｃｙＲＩＩｂ受容体に対する親和性の特異的な増強において、特に価値がある（Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号；ＷＯ２０１２／０８７９２８）。ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩａＲ１３１とは区別される）に対する特異性の増強を、Ｐ２３８Ｄ置換および他の変異（Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. &Selection 26:589；ＷＯ２０１２／１１５２４１）、ならびにＶ２６２ＥおよびＶ２６４Ｅ（Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723およびＷＯ２０１４／１８４５４５）を加えることによって、得てもよい。表４参照。
【０１２６】
半減期延長
ある実施態様において、抗体を、その生物学的半減期が増加するように、改変する。様々な手法が可能である。例えばこれは、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を増加させることによって、なされ得る。ある実施態様において、Presta et alによって米国特許第５,８６９,０４６号および同６,１２１,０２２号に記述されるように、抗体を、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループに由来するサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変更する。ＦｃＲｎとの結合が増加し、かつ／または薬物動態の性質を向上する、他の代表的なＦｃバリアントは、２５９、３０８および４３４番目における置換を含み、これは例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍを含む。ＦｃのＦｃＲｎとの結合を増加させる、他のバリアントは：２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216、Hinton et al. (2006) Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al. (2001) Journal of Biological Chemistry 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ(Dall'Acqua et al. (2002) Journal of Immunology 169:5171-5180, Dall'Acqua et al. (2006) Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)を含む。米国特許第８,３６７,８０５号を参照。
【０１２７】
ＩｇＧ Ｆｃにおける特定の保存された残基(Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｈ４３３、Ｎ４３４)の改変（Ｎ４３４Ａバリアント(Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663)など）は、ＦｃＲｎ親和性を増加させ、したがって循環における抗体の半減期を増加させる方法として提案されている。ＷＯ９８／０２３２８９参照。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む組合せＦｃバリアントは、ＦｃＲｎ結合を増加させ、血清半減期を最大５倍に増大することが示されている（Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157）。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ改変を含む、組合せＦｃバリアントはまた、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長する（Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759）。さらに、Ｍ２５２Ｙ−Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４ＭおよびＭ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｓバリアントを含む、組合せＦｃ変異体はまた、半減期を延長することが示されている。ＷＯ２００９／０８６３２０参照。
【０１２８】
さらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む、組合せＦｃ変異体は、半減期を約４倍増加させる（Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514）。ＦｃＲｎ親和性が増加するが、ｐＨ依存性の低下を示す、関連するＩｇＧ１改変(Ｍ２５２Ｙ−Ｓ２５４Ｔ−Ｔ２５６Ｅ−Ｈ４３３Ｋ−Ｎ４３４Ｆ)を用いて、他の抗体とＦｃＲｎとの結合を防ぐ競合物質として使用する、ＩｇＧ１コンストラクト(「ＭＳＴ−ＨＮ Ａｂｄｅｇ」)が作製されており、これは、他の抗体（内因性ＩｇＧ(例えば、自己免疫状況における)または別の外因性(治療用)ｍＡｂのいずれか）のクリアランスの増加をもたらす（Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283；ＷＯ２００６／１３０８３４）。
【０１２９】
ＦｃＲｎ結合を増加させる、他の改変は、Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671；6,277,375；6,821,505；ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ２００２／０６０９１９に記述される。
【０１３０】
ある実施態様において、ハイブリッドＩｇＧアイソタイプを用いて、ＦｃＲｎ結合を増加させ、半減期を潜在的に増加させてもよい。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ１位置を、ＩｇＧ３由来のアミノ酸と、２種のアイソタイプで異なっている位置において置換することにより、構築してもよい。したがって、ハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体を、１以上の置換（例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆ）を含むように、構築してもよい。本明細書に記述される他の実施態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ２位置を、ＩｇＧ１に由来するアミノ酸と、２種のアイソタイプで異なっている位置において置換することにより、構築してもよい。したがって、ハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体を、１以上の置換（例えば、１以上の下記のアミノ酸置換：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（２３６番目におけるグリシンの挿入を指す）および３２７Ａ）を含むように、構築してもよい。米国特許第８,６２９,１１３号参照。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４配列のハイブリッドが、おそらく血清半減期を増大させ、発現を改善するように、作製されている（米国特許第７,８６７,４９１号（その配列番号１８））。
【０１３１】
本発明の抗体の血清半減期はまた、ペグ化によって増加し得る。抗体をペグ化し、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させてもよい。抗体をペグ化するため、通常、抗体またはそのフラグメントを、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに結合する条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）試薬（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させる。好ましくは、ペグ化を、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行う。本明細書において、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質の誘導体化に使用されるＰＥＧの任意の型（モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど）を包含することが意図される。ある実施態様において、ペグ化された抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野で公知であり、本明細書に記述される抗体に適用できる。例えば、Nishimura et al.によるＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.によるＥＰ０４０１３８４参照。
【０１３２】
あるいは、いくつかの状況下において、本発明の抗体の半減期を、増加ではなく、減少させることが望ましい場合がある。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＩ２５３Ａ(Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355)およびＨ４３５Ａ／Ｒ、Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ(Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819)などの改変は、ＦｃＲｎ結合を減少させ、したがって、医用画像などの迅速なクリアランスが好ましい状況における使用のために、半減期を減少（クリアランスを増大）させ得る。Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622も参照。クリアランスを増強する他の手段は、本発明の抗原結合ドメインを、ＦｃＲｎと結合する能力を持たない抗体フラグメント（Ｆａｂフラグメントなど）にフォーマットすることを含む。このような改変は、抗体の循環半減期を数週間から数時間に減少させ得る。次に、抗体フラグメントの選択的なペグ化を用いて、抗体フラグメントの半減期を、必要に応じて微調整（増加）してもよい（Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780）。抗体フラグメントを、ヒト血清アルブミンと融合（例えば、融合タンパク質コンストラクトにおいて）し、半減期を増加させてもよい（Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904）。あるいは、本発明の第１の抗原結合ドメインおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する第２の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体を構築してもよい。国際特許出願公開ＷＯ２００９／１２７６９１およびそれに引用される特許参考文献を参照。あるいは、特殊なポリペプチド配列（例えば、「ＸＴＥＮ」ポリペプチド配列）を抗体フラグメントに添加し、半減期を増加させてもよい（Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186;国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２）。
【０１３３】
さらなるＦｃバリアント
ＩｇＧ４定常ドメインを使用する場合、Ｓ２２８Ｐ置換を含むことが通常好ましく、これは、ＩｇＧ１のヒンジ配列を模倣し、それによって、ＩｇＧ４分子を安定化する（例えば、処置される患者において、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４との間のＦａｂアーム交換を減少させる）（Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767;Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925）。
【０１３４】
ＩｇＧ１コンストラクトのヒンジにおける潜在的なプロテアーゼ切断部位を、Ｄ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ改変で除去し、抗体の安定性を増加できる（ＷＯ２０１４／０４３３４４）。
【０１３５】
Ｆｃバリアントの、そのリガンド（Ｆｃ受容体）との親和性および結合の性質は、当分野で公知の様々なインビトロアッセイ法（生化学または免疫学に基づくアッセイ）によって決定でき、このアッセイ法は、限定されないが、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または放射免疫測定法（ＲＩＡ））または速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ分析）および他の方法（間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）など）を含む。これらおよび他の方法は、調査する１以上の成分上の標識を用いてもよく、かつ／または多様な検出方法を利用してもよく、これは限定されないが、発色標識、蛍光標識、発光標識または同位体標識を含む。結合親和性および速度論の詳細な説明を、抗体−免疫原相互作用に重点を置く、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見ることができる。
【０１３６】
さらに他の実施態様において、抗体のグリコシル化を改変し、エフェクター機能を増加または減少させる。例えば、脱グリコシル化抗体を、２９７番目の保存されたアスパラギン残基を変異し（例えば、Ｎ２９７Ａ）、したがって、補体およびＦｃγＲＩ結合を消失させることによって、全てのエフェクター機能を持たないように作製できる（Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403）。Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595（ＩｇＧ１中のＮ２９７Ｑを用いて、２９７番目でのグリコシル化を除去した）も参照。
【０１３７】
脱グリコシル化抗体は一般に、エフェクター機能を持たないが、変異を導入し、その機能を修復できる。脱グリコシル化抗体（例えば、Ｎ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／またはＨ変異に起因する抗体、またはタンパク質をグリコシル化しない系（例えば、大腸菌）で産生した抗体）を、さらに変異させ、ＦｃγＲ結合を修復してもよい（例えば、Ｓ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／もしくはＨ（ＷＯ２００９／０７９２４２）またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ(Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 107:604)）。
【０１３８】
糖鎖工学を用いて、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７に結合する糖鎖のα２,６シアリル含量を変更することによって、ＩｇＧコンストラクトの抗炎症性の性質を改変してもよく、ここで、α２,６シアリル化型の割合の増加は、抗炎症効果の増強をもたらす。Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513参照。逆に、α２,６シアリル化糖を有する抗体の割合の減少は、抗炎症性の性質が望まれない場合に有用であり得る。例えば、α２,６シアリル化型の選択的な精製、または酵素的改変によって、抗体のα２,６シアリル化含量を改変する方法は、米国特許出願公開第２００８／０２０６２４６号で提供される。他の実施態様において、Ｆｃ領域のアミノ酸配列を改変し、例えばＦ２４１Ａ改変の包含によって、α２,６シアリル化の効果を模倣し得る（ＷＯ２０１３／０９５９６６）。
【０１３９】
ＩＩＩ．抗体の物理学的性質
本明細書に記述される抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて、１以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増加または抗原結合の変化による抗体のｐＫの変更をもたらし得る（Marshall et al. (1972) Ann. Rev. Biochem. 41:673-702;Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172:5489-94;Wallick et al. (1988) J. Exp. Med. 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al. (1985) Nature 316:452-7;Mimura et al. (2000) Mol. Immunol. 37:697-706）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフで起こることが知られている。いくつかの場合には、可変領域のグリコシル化を含有しない抗ｈｕＣＤ４０抗体を有することが好ましい。これは、可変領域中にグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択すること、またはグリコシル化領域内の残基を変異させることのいずれかによって、達成され得る。
【０１４０】
ある実施態様において、本明細書に記述される抗体は、アスパラギン異性部位を含有しない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で起こり得、イソアスパラギン酸残基の生成をもたらし、これは、ポリペプチド鎖中にねじれを導入し、その安定性を減少させる（イソアスパラギン酸効果）。
【０１４１】
各抗体は、特有の等電点（ｐＩ）を有し、これは一般に、６ないし９.５のｐＨ範囲に該当する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは通常、７〜９.５のｐＨ範囲に該当し、ＩｇＧ４抗体のｐＩは通常、６〜８のｐＨ範囲に該当する。正常な範囲外のｐＩを有する抗体は、インビボ条件下でいくらかのアンフォールディングおよび不安定性を有し得ると推測されている。したがって、正常な範囲内に該当するｐＩ値を含む抗ＣＤ４０抗体を有することが好ましい。これは、正常な範囲のｐＩを有する抗体を選択すること、または帯電した表面の残基を変異させることのいずれかによって、達成され得る。
【０１４２】
各抗体は、特徴的な融解温度を有し、融解温度が高いほど、インビボにおける全体的な安定性が高いことを示す(Krishnamurthy & Manning (2002) Curr Pharm Biotechnol3:361-71)。一般に、ＴＭ１（最初のアンフォールディングの温度）は、６０℃超、好ましくは、６５℃超、さらにより好ましくは、７０℃超であることが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60;Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett. 68:47-52)または円偏光二色性(Murray et al. (2002) J. Chromatogr.Sci. 40:343-9)を用いて測定できる。好ましい実施態様において、迅速に分解しない抗体を選択する。抗体の分解を、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Alexander & Hughes (1995) Anal Chem. 67:3626-32）を用いて測定できる。
【０１４３】
別の好ましい実施態様において、最小限の凝集効果を有する抗体を選択し、この凝集効果は、望ましくない免疫応答のトリガーおよび／または変更された、もしくは不都合な薬物動態の性質を導き得る。一般に、抗体は、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下および、さらにより好ましくは、５％以下の凝集を許容する。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含む、いくつかの技術によって測定できる。
【０１４４】
ＩＶ．核酸分子
本明細書に記述される別の態様は、本明細書に記述される抗体をコードする核酸分子に
関する。核酸は、全細胞において、細胞溶解物において、または部分的に精製された形式もしくは実質的に純粋な形式で、存在し得る。核酸を、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動、および当分野で周知の他の技術を含む標準的な技術により、例えば、他の細胞性核酸（例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、自然界で単離されたＤＮＡと連結している染色体ＤＮＡ）またはタンパク質などの、他の細胞成分または他の混入物質を除去して精製した場合に、「単離された」こととなり、または「実質的に純粋な状態となる」。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。本明細書に記述される核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、イントロン配列を含んでも、含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１４５】
本明細書に記述される核酸を、標準的な分子生物学的技術で得てもよい。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記述されるようなヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体において、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得てもよい。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）得られる抗体について、抗体をコードする核酸を、ライブラリーから回収してもよい。
【０１４６】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られると、これらのＤＮＡフラグメントを、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するように、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作できる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または可動性リンカーなどの、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントと作動可能に連結している。この文脈において使用される、用語「作動可能に連結する」は、２種のＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２種のＤＮＡフラグメントが接続されることを意味するものとする。
【０１４７】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子において、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結され得る。
【０１４８】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。
【０１４９】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを、可動性リンカーをコードする（例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする）別のフラグメントに作動可能に連結し、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列が、可動性リンカーによって接続されたＶＬおよびＶＨ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554参照）。
【０１５０】
Ｖ. 抗体作製
本発明の様々の抗体、例えば、本明細書に開示される抗ヒトＣＤ４０抗体と同一エピトープと競合または結合する抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)によって記述される標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術などの、様々な公知の技術を使用して産生できる。体細胞ハイブリダイゼーションの手法は好ましいが、原理上、モノクローナル抗体を産生するためのその他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発がん性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技術も使用できる。
【０１５１】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系として、マウス系がある。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、極めて十分に確立された手法である。免疫化プロトコルおよび融合において免疫化した脾細胞を単離する技術は、当分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手法も公知である。
【０１５２】
本明細書に記述されるキメラ抗体またはヒト化抗体は、上記のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。標準的な分子生物学的技術を使用して、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、対象のマウスハイブリドーマから得、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように遺伝子操作できる。例えば、当分野で公知の方法を使用して、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域をヒト定常領域に連結できる（例えば、Cabilly et al.の米国特許第４,８１６,５６７号を参照）。ヒト化抗体を作製するために、当分野で公知の方法を使用して、ヒトフレームワーク中にマウスＣＤＲ領域を挿入できる（例えば、Winterの米国特許第５,２２５,５３９号およびQueen et al.の米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号参照）。
【０１５３】
ある実施態様において、本明細書に記述される抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトＣＤ４０に対して作られたヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を持つ、トランスジェニックまたはトランスクロモソミック(transchromosomic)マウスを使用して作製できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスは、本明細書において、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、本明細書において、まとめて「ヒトＩｇマウス」と呼ばれる。
【０１５４】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）(Medarex, Inc.)は、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異とともに含有する（例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の減少を示し、免疫化に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する(Lonberg, N. et al.(1994)、前掲; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101;Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding , F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546に概説)。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用ならびにこのようなマウスが持つゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295;Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656;Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記述されており、それら全ての内容は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。さらに、全てがLonbergおよびKayによる、米国特許第５,５４５,８０６号；同５,５６９,８２５号；同５,６２５,１２６号；同５,６３３,４２５号；同５,７８９,６５０号；同５,８７７,３９７号；同５,６６１,０１６号；同５,８１４,３１８号；同５,８７４,２９９号；および同５,７７０,４２９号；Surani et al.の米国特許第５,５４５,８０７号；全てがLonbergおよびKayによる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２ならびにKorman et al.のＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４を参照。
【０１５５】
ある実施態様において、本明細書に記述される抗体は、導入遺伝子および導入染色体(transchromosome)上にヒト免疫グロブリン配列を保持するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保持するマウスを使用して作製される。本明細書において「ＫＭマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記述されている。
【０１５６】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系が、当分野で利用可能であり、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体を作製するために使用できる。例えば、XENOMOUSE（登録商標）(Abgenix、Inc.)と呼ばれる代替のトランスジェニック系を使用でき；このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許第５,９３９,５９８号；同６,０７５,１８１号；同６,１１４,５９８号；同６、１５０,５８４号および同６,１６２,９６３号に記述されている。
【０１５７】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスクロモソミック(transchromosomic)動物系は、当分野で利用可能であり、本明細書に記述される抗ＣＤ４０抗体を作製するために使用できる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保持するマウスを使用でき；このようなマウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97:722-727に記述されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を保持するウシが、当分野で記述されており(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体を作製するために使用できる。
【０１５８】
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ｈｕＣＤ４０抗体を作製するための当分野において記述されるさらなるマウス系として、（ｉ）内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えによって、内因性マウス定常領域に作動可能に連結された、ヒト重鎖および軽鎖可変領域と置換されており、その結果、マウスにおいてキメラ抗体（ヒトＶ／マウスＣ）が作製され、次いで、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して完全ヒト抗体に変換される、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)ならびに（ｉｉ）マウスが、再編成されていないヒト重鎖可変領域を含むが、単一の再編成されたヒト共通軽鎖可変領域を含む、ＭｅＭｏ（登録商標）マウス(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)が挙げられる。このようなマウスおよび抗体を作製するためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記述されている。
【０１５９】
本明細書に記述されるヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当分野で確立されている。例えば、Ladner et al.の米国特許第５,２２３,４０９号；同５,４０３,４８４号；および同５,５７１,６９８号；Dower et al.の米国特許第５,４２７,９０８号および同５,５８０,７１７号； McCafferty et al.の米国特許第５,９６９,１０８号および同６,１７２,１９７号；ならびにGriffiths et al.の米国特許第５,８８５,７９３号；同６,５２１,４０４号；同６,５４４,７３１号；同６,５５５,３１３号；同６,５８２,９１５号および同６,５９３,０８１号を参照。
【０１６０】
本明細書に記述されるヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化の際にヒト抗体応答が生じ得るようヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et alの米国特許第５,４７６,９９６号および同５,６９８,７６７号に記述されている。
【０１６１】
免疫化
ヒトＣＤ４０に対する完全ヒト抗体を作製するために、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856−859;Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４によって、その他の抗原について記述されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウス（例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス）を、ＣＤ４０抗原および／またはＣＤ４０を発現する細胞の精製または濃縮された調製物を用いて、免疫化できる。あるいは、マウスを、ヒトＣＤ４０をコードするＤＮＡを用いて免疫化できる。好ましくは、マウスは、第１の注入の際に６〜１６週齢とする。例えば、マウスを腹腔内に免疫化するために、組換えヒトＣＤ４０抗原の精製または濃縮された調製物（５〜５０μｇ）を使用できる。ＣＤ４０抗原の精製または濃縮された調製物を使用する免疫化が抗体をもたらさない事象では、ＣＤ４０を発現する細胞、例えば、細胞系統を用いてマウスを免疫化し、免疫応答を促進することもできる。
【０１６２】
種々の抗原を用いる累積的経験は、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスが、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる最初の腹腔内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）免疫化と、それに続く、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる隔週でのＩＰ／ＳＣ免疫化（最大で計１０回）の際に、最良に応答することを示した。免疫応答は、後眼窩出血によって得られている血漿試料を用いて、免疫化プロトコルの過程にわたってモニターできる。血漿は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってスクリーニングでき（以下に記述されるように）、抗ＣＤ４０ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために使用できる。マウスを、抗原を用いて静脈内に追加免疫し、３日後に、屠殺し、脾臓およびリンパ節を採取できる。各免疫化のために２〜３回の融合の実施を必要とし得ることが想定される。各抗原について、６ないし２４匹のマウスが、通常、免疫化される。普通、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子の両方は、２種の異なるヒト重鎖導入遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する単一のマウスに共に育種され得る。
【０１６３】
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本明細書に記述されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化されたマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系統などの適当な不死化細胞系統と融合できる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングできる。例えば、５０％ＰＥＧを用いて、免疫化マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）と融合できる。細胞を、およそ２×１０５で平底マイクロタイタープレートにプレーティングし、続いて、１０％胎児クローン血清、１８％「６５３」条件培地、５％オリゲン(origen)（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０.０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１Ｘ ＨＡＴ(Sigma)を含有する選択培地で２週間インキュベートする。およそ２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと置換されている培地で培養できる。次いで、個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングできる。広範なハイブリドーマ成長が起こると、通常１０〜１４日後に培地を観察できる。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再度スクリーニングでき、ヒトＩｇＧについて依然として陽性である場合に、制限希釈によってモノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングできる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特性決定のために組織培養培地において少量の抗体を作製できる。
【０１６４】
ＶＩ．抗体製造
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
配列が提供される特異的抗体およびその他の関連抗ＣＤ４０抗体の両方を含めた、本発明の抗体を、例えば当分野で周知であるような、組換えＤＮＡ技術および遺伝子導入法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生できる（Morrison, S. (1985) Science 229:1202）。
【０１６５】
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学の技術（例えば、ＰＣＲ増幅または対象の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、遺伝子が、転写および翻訳制御配列に作動可能に連結するように、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入することができる。これに関連して、用語「作動可能に連結された」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を果たすように、抗体遺伝子をベクター中に連結することを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター中に挿入されてもよく、または両遺伝子は、同一の発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメント上の相補的制限部位およびベクターの連結または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって、発現ベクター中に挿入される。本明細書に記述される抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用し、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントと作動可能に連結し、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントと作動可能に連結するように、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクター中に挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製できる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結するように、ベクター中にクローニングできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０１６６】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保持し得る。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press,San Diego, CA (1990))に記述されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存することは当業者には明らかである。哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用してもよい。なおさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーター由来の配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含有する、ＳＲαプロモーター系などの異なる供給源に由来する配列からなる(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
【０１６７】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）などのさらなる配列、および選択マーカー遺伝子を保持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、すべてAxel et al.による米国特許第４,３９９,２１６号、同４,６３４,６６５号および同５,１７９,０１７号参照）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子として、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞において使用される）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択において）が挙げられる。
【０１６８】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的な技術によって宿主細胞に遺伝子導入する。用語「遺伝子導入」の種々の形態は、原核または真核宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般的に使用される多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本明細書に記述される抗体を発現させることは理論上可能であるが、真核細胞、最も好ましくは、哺乳類宿主細胞における抗体の発現が、最も好ましいが、これは、このような真核細胞、特に、哺乳類細胞が、適切にフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が、原核細胞よりも高いからである。抗体遺伝子の原核発現は、活性な抗体の高効率の産生に有効でないことが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。本発明の抗体はまた、酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)の糖鎖操作された株においても産生できる（Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210）。
【０１６９】
本明細書に記述される組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳類宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記述されるように、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記述されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するためには、別の好ましい発現系として、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に開示されるＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞中に導入すると、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞が成長する培養培地への抗体の分泌、を可能にするのに十分な期間、培養することによって、産生する。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収できる。
【０１７０】
本発明の抗体ポリペプチド鎖のＮ末端およびＣ末端は、一般的に観察される翻訳後修飾によって予測される配列とは異なり得る。例えば、Ｃ末端リジン残基は、抗体重鎖から失われていることが多い（Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132）。Ｎ末端グルタミン残基およびより少ない程度であるが、グルタミン酸残基は、治療用抗体の軽鎖および重鎖の両方でピログルタミン酸残基に変換されることが頻繁にある（Dick et al. (2007)Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211）。
【０１７１】
本発明の種々のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体のアミノ酸配列は、表８にまとめられている配列表に提供されている。上記の理由のために、Ｃ末端リジンは、重鎖または重鎖定常ドメインの配列表中の配列のいずれにも含まれない。しかし、代替の実施態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体の各重鎖および／またはこのような抗体もしくはその重鎖もしくは軽鎖をコードする遺伝子コンストラクトは、このさらなるリジン残基を、一方または他方の重鎖のＣ末端に含む。
【０１７２】
ＶＩＩ．アッセイ
本明細書に記述される抗体は、ＣＤ４０との結合について、例えば、標準的なＥＬＩＳＡによって試験できる。手短には、マイクロタイタープレートを精製したＣＤ４０を、ＰＢＳ中１〜２μｇ／ｍＬで用いてコーティングし、次いで、ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングする。各ウェルに抗体の希釈物（例えば、ＣＤ４０免疫化マウスから得た血漿の希釈物）を添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしている二次試薬（例えば、ヒト抗体またはそうでなければヒト重鎖定常領域を有する抗体における、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄した後、プレートをＡＢＴＳ基質(Moss Inc、product:ABTS-1000)を用いて発色させ、ＯＤ４１５〜４９５で分光光度計によって分析する。次いで、免疫化されたマウスから得た血清を、ヒトＣＤ４０を発現する細胞株との結合について、かつヒトＣＤ４０を発現しない対照細胞株と結合しないことについて、フローサイトメトリーによってさらにスクリーニングする。手短には、抗ＣＤ４０抗体の結合を、ＣＤ４０発現ＣＨＯ細胞を１：２０希釈の抗ＣＤ４０抗体とともにインキュベートすることによって評価する。細胞を洗浄し、結合を、ＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて検出する。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して、フローサイトメトリー分析を実施する。好ましくは、最も高い力価を生じるマウスを融合に用いる。マウス抗ｈｕＣＤ４０抗体を検出する場合には、抗マウス検出抗体を使用して類似の実験を実施してもよい。
【０１７３】
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体、ひいては、ＣＤ４０免疫原と陽性の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマについて、スクリーニングできる。好ましくは高い親和性で、ＣＤ４０と結合する抗体を産生するハイブリドーマを、サブクローニングし、さらに特性決定できる。親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡによって）、各ハイブリドーマ由来の１つのクローンを、細胞バンクの作製、および抗体精製において、選択できる。
【０１７４】
抗ＣＤ４０抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で成長させることができる。プロテインＡ−セファロース(Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１.４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。モノクローナル抗体を分取し、−８０℃で保存できる。
【０１７５】
選択された抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が特有のエピトープと結合するか否かを調べるために、市販の試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用して各抗体をビオチン化できる。ビオチン化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジン標識されたプローブを用いて検出できる。上記のように、ＣＤ４０で被覆されたＥＬＩＳＡプレートを使用して、非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用する競合研究を実施できる。
【０１７６】
精製された抗体のアイソタイプを調べるために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を使用してアイソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを調べるために、１μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンを用いてマイクロタイタープレートのウェルを、４℃で一晩被覆できる。１％ ＢＳＡを用いてブロッキングした後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と常温で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼがコンジュゲートしているプローブのいずれかと反応させる。プレートを上記のように発色させ、分析する。
【０１７７】
モノクローナル抗体の、ＣＤ４０を発現する生細胞との結合を調べるために、フローサイトメトリーを使用できる。手短には、膜結合性ＣＤ４０を発現する細胞株（標準的な成長条件下で成長させた）を、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、種々の濃度のモノクローナル抗体と４℃で１時間混合する。洗浄した後、細胞を、一次抗体染色と同一条件下でフィコエリトリン（ＰＥ）標識された抗ＩｇＧ抗体と反応させる。試料を光および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ装置で分析し、単細胞でゲート開閉し、標識された抗体の結合を調べる。フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、または、の代わりに）、蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを使用してもよい。上記のように細胞を正確に染色し、蛍光顕微鏡によって調べることができる。この方法によって、個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の密度に依存して感度が減少し得る。
【０１７８】
抗ヒトＣＤ４０抗体は、ウエスタンブロッティングによってＣＤ４０抗原との反応性についてさらに試験できる。手短には、ＣＤ４０を発現する細胞から細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付すことができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロースメンブランに移し、２０％マウス血清を用いてブロッキングし、試験されるべきモノクローナル抗体を用いて探索する。抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用してＩｇＧ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤を用いて発色させることができる(Sigma Chem.Co., St.Louis, MO)。
【０１７９】
種々の抗ＣＤ４０抗体の結合親和性、交差反応性および結合速度論を解析する方法は、当分野で公知の標準的なアッセイ、例えば、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析およびＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００ＳＰＲ装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を含む。
【０１８０】
ある実施態様において、抗体は、ヒトＣＤ４０の細胞外領域と特異的に結合する。抗体は、ＣＤ４０の細胞外ドメイン内の特定のドメイン（例えば、機能的ドメイン）と特異的に結合し得る。ある実施態様において、抗体は、ヒトＣＤ４０の細胞外領域およびカニクイザルＣＤ４０の細胞外領域と特異的に結合する。好ましくは、抗体は、高い親和性でヒトＣＤ４０と結合する。
【０１８１】
ＶＩＩＩ．二重特異性分子
本明細書に記述される抗体は、二重特異性分子の形成のために使用され得る。抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、誘導体化、または別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体のリガンド））と連結し、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する、二重特異性分子を生成してもよい。実際、本明細書に記述される抗体を、誘導体化、または２以上の他の機能的分子と連結し、３種以上の異なる結合部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を生成してもよく；このような多重特異性分子はまた、本明細書における用語「二重特異性分子」に包含されるものとする。本明細書に記述される二重特異性分子を作製するために、本明細書に記述される抗体を、二重特異性分子が結果として生じるような別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物などの１以上の他の結合分子と機能的に連結することができる（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による結合または別の方法によって）。
【０１８２】
したがって、少なくとも１つの、ＣＤ４０に対する第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子が本明細書において提供される。二重特異性分子が多重特異性である本明細書に記述される実施態様において、分子は、第３の結合特異性をさらに含み得る。
【０１８３】
ある実施態様において、本明細書に記述される二重特異性分子は、結合特異性として少なくとも１種の抗体または例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは一本鎖Ｆｖを含めたその抗体フラグメントを含む。参照によりその内容が明示的に組み込まれるLadner et al.米国特許第４,９４６,７７８号に記述されるように、抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体またはその任意の最小フラグメント（Ｆｖもしくは一本鎖コンストラクトなど）であり得る。
【０１８４】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本明細書に記述される二重特異性分子において使用され得るその他の抗体として、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体がある。
【０１８５】
本明細書に記述される二重特異性分子は、当分野で公知の方法を使用して成分結合特異性をコンジュゲートすることによって調製できる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を、別個に作製し、次いで、互いにコンジュゲートできる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合には、共有結合コンジュゲーションのために種々のカップリングまたは架橋剤を使用できる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686;Liu、MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照）。その他の方法として、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132;Brennan et al. (1985) Science 229:81-83およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)に記述されるものが挙げられる。好ましいコンジュゲート剤として、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣがあり、両方とも、Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。
【０１８６】
結合特異性が抗体である場合には、それらを、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートできる。特に好ましい実施態様において、ヒンジ領域を、コンジュゲーションに先立って奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは１つ、を含むように改変する。
【０１８７】
あるいは、両結合特異性は、同一ベクター中にコードされ、同一宿主細胞において発現され、アセンブルされ得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本明細書に記述される二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５,２６０,２０３号；同５,４５５,０３０号；同４,８８１,１７５号；同５,１３２,４０５号；同５,０９１,５１３号；同５,４７６,７８６号；同５,０１３,６５３号；同５,２５８,４９８号および同５,４８２,８５８号に記述されている。
【０１８８】
二重特異性分子の、その特異的標的との結合は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物検定法（例えば、成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイなどの当分野で認識される方法を使用して確認され得る。これらのアッセイは各々、一般に、対象の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することによって、特に対象とされるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０１８９】
ＩＸ．組成物
医薬上許容される担体と共に製剤化される、本明細書に記述されるような抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントのうち１つまたはそれ以上を含有する組成物、例えば、医薬組成物がさらに提供される。このような組成物は、本明細書に記述される（例えば、２以上の異なる）抗体またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性分子のうち１種または組合せを含み得る。例えば、本明細書に記述される医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合し、または相補的活性を有する抗体（またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性）の組合せを含み得る。
【０１９０】
特定の実施態様において、組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌの濃度で、または１〜３００ｍｇ／ｍｌもしくは１００〜３００ｍｇ／ｍｌで、抗ＣＤ４０抗体を含む。
【０１９１】
本明細書に記述される医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち、その他の薬剤と組み合わせて投与できる。例えば、併用療法は、少なくとも１種のその他の抗がん剤および／またはＴ細胞刺激（例えば、活性化）剤と組み合わせた、本明細書に記述される抗ＣＤ４０抗体を含み得る。併用療法において使用され得る治療薬の例は、本明細書に記述される抗体の使用に関する節において以下により詳細に記述される。
【０１９２】
いくつかの実施態様において、本明細書において開示される治療用組成物は、がんの治療のために使用されるその他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤として、例えば、所定のがんに対する免疫応答を刺激する化学療法薬、小分子薬または抗体が挙げられる。いくつかの場合には、治療用組成物は、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる）抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、ＴＬＲアゴニストまたはＩＤＯもしくはＴＧＦβの小分子アンタゴニストのうち１つまたはそれ以上を含み得る。
【０１９３】
本明細書において、「医薬上許容される担体」として、生理学的に適合する、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に依存して、活性化合物（すなわち抗体、イムノコンジュゲートまたは二重特異性分子）を、その化合物を不活化し得る酸および他の天然条件の作用から保護するための材料で、被覆してもよい。
【０１９４】
本明細書に記述される医薬化合物は、１以上の医薬上許容される塩を含み得る。「医薬上許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、何らかの望ましくない毒性効果を付与しない塩を指す（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと）。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸に由来する塩ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来する塩が挙げられる。塩基付加塩として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来する塩ならびにＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来する塩が挙げられる。
【０１９５】
本明細書に記述される医薬組成物はまた、医薬上許容される抗酸化物質を含み得る。医薬上許容される抗酸化物質の例として：（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化物質；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化物質；および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が挙げられる。
【０１９６】
本明細書に記述される医薬組成物において使用され得る、適した水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物、オリーブオイルなどの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。
【０１９７】
これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌の手法（前掲）、または種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など）の包含の両方によって保証できる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含めることによって、注射用医薬品形態の長期の吸収を引き起こすことができる。
【０１９８】
医薬上許容される担体として、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。医薬上活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除いて、本明細書に記述される医薬組成物におけるその使用が想定される。補足の活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０１９９】
治療用組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下で無菌で、安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の秩序構造として製剤化できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。
【０２００】
滅菌注射用溶液は、上記で列挙された成分の１つまたは組合せとともに、適当な溶媒中に必要な量の活性化合物を組み込み、必要に応じて、それに続く滅菌精密濾過によって、調製できる。一般に、分散物は、基本分散媒および上記で列挙された成分からの必要な他の成分を含有する滅菌溶剤中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製の好ましい方法として、前もって滅菌濾過された溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）がある。
【０２０１】
単一投与形を生産する、担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、処置される対象および特定の投与様式に応じて様々である。単一投与形を生産する担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、この量は、医薬上許容される担体との組合せにおいて、１００パーセントのうち、約０.０１パーセント〜約９９パーセントの有効成分、好ましくは、約０.１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、約１パーセント〜約３０パーセントの有効成分の範囲となる。
【０２０２】
投与計画は、最適の所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するように調整される。例えば、単回のボーラス投与をしてもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性に応じて、用量を増減させてもよい。投与の容易性および投与量の均一性のための投与単位形に非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において、投与単位形とは、治療される対象の単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。本明細書に記述される投与単位形の仕様は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のために、このような活性化合物を配合する分野に固有の制限によって決定され、それらに直接的に依存する。
【０２０３】
抗体の投与のために、投与量は、宿主の体重に対して、約０.０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は、０.０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０.３ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇまたは１０ｍｇ／体重１ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的治療計画は、毎週、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、毎月、３ヶ月毎に１回または３〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。
【０２０４】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合には、投与される各抗体の投与量は、示される範囲内に入る。治療用抗体は、普通、複数の機会で投与される。単一投与毎の間隔は、例えば、毎週、毎月、３ヶ月毎または毎年であり得る。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血液レベルの測定に応じて、不規則であってもよい。いくつかの方法において、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するように調整され、いくつかの方法では、約２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するように調整される。
【０２０５】
抗体は、持続放出製剤として投与でき、この場合には、あまり頻繁ではない投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて様々である。一般に、ヒト抗体は、最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与の投与量および頻度は、処置が予防的であるか、治療的であるかに応じて変わり得る。予防的適用では、比較的少ない投与量が、比較的頻繁ではない間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、生涯、治療を受け続ける。治療的適用では、疾患の進行が低減または終結されるまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全寛解を示すまで、比較的短い間隔の比較的多い投与量が時には必要である。その後、患者は、場合により、予防的投与計画を投与されることがあるが、多くの免疫−腫瘍学適応症では、継続治療は必要ではない。
【０２０６】
本明細書に記述される医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性はなく、特定の患者、組成物および投与様式について、所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量を得るように、様々であり得る。選択される投与量レベルは、使用する、本明細書に記述される特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用する特定の化合物の排出速度、処置の持続時間、使用する特定の組成物と組み合わせて用いる他の薬物、化合物および／または材料、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および先の病歴ならびに医薬の分野で周知の同様の因子を含む、種々の薬物動態因子に依存する。
【０２０７】
本明細書に記述される抗ＣＤ４０抗体の「治療上有効な投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および持続時間の増大、または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の予防をもたらす。がんに関連して、治療上有効な用量は、好ましくは、がんと関連する身体症状のさらなる悪化を防ぐ。がんの症状は、当分野で周知であり、例えば、普通ではない黒子の特徴、非対称、境界、色および／または直径を含めた黒子の外観の変化、新規に着色した皮膚領域、異常な黒子、爪の下の黒くなった領域、乳房のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房疼痛、死亡、体重減少、脱力感、過度の疲労、摂食障害、食欲の喪失、慢性の咳、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹膜腔中の流体、膣出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、疼痛、吐血、多量の発汗、発熱、高血圧症、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などが挙げられる。治療効力は、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０ ｍＡｂの最初の投与の直後に観察可能であるか、または一定期間および／または一連の投与後にのみ観察され得る。このような遅延された有効性は、処置の数ヶ月、最大６、９または１２ヶ月後にのみ観察され得る。いくつかの免疫−腫瘍学薬剤によって示される遅延された有効性を考慮すると、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０ ｍＡｂが、治療上の有効性を欠くと早期に決定しないことが重要である。
【０２０８】
疾患の早期または先行する徴候が存在する場合に望まれ得るような、治療上有効な用量は、がんの発生を予防または遅延し得る。がんの診断において使用される実験室試験は、化学（水溶性ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌのレベルの測定を含む）(Hock et al. (2006)、血液学、血清学および放射線学を含む。したがって、前記のうちいずれかをモニターする任意の臨床または生化学アッセイを使用して、特定の処置が、がんを処置するための治療上有効な用量であるか否かを調べてもよい。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度および特定の組成物または選択された投与経路などの因子に基づいて、このような量を決定できる。
【０２０９】
本明細書に記述される組成物は、当分野で公知の種々の方法のうち１つまたはそれ以上を使用して、１以上の投与経路によって投与できる。当業者には明らかだが、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変わる。本明細書に記述される抗体の好ましい投与経路として、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、普通、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。
【０２１０】
あるいは、本明細書に記述される抗体は、局所、表皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口的、経膣的、直腸内、舌下にまたは局所など、非経口ではない経路によって投与できる。
【０２１１】
活性化合物を、化合物を迅速な放出から保護する担体を用いて調製できる（留置用剤、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含めた徐放性製剤など）。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を調製するための多数の方法は、特許権をとられているか、または一般的に、当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照。
【０２１２】
治療用組成物は、当分野で公知の医療装置を用いて投与できる。例えば、好ましい実施態様において、本明細書に記述される治療用組成物は、米国特許第５,３９９,１６３号；同５,３８３,８５１号；同５,３１２,３３５号；同５,０６４,４１３号；同４,９４１,８８０号；同４,７９０,８２４号；または同４,５９６,５５６号に開示される装置などの注射針無しの皮下注射装置を用いて投与できる。本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体とともに使用するための周知の留置用剤およびモジュールの例として：制御された速度で医薬を分配するための埋め込み可能な微量注入ポンプを開示する、米国特許第４,４８７,６０３号；皮膚を通って医薬を投与するための治療用装置を開示する、同４,４８６,１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する、同４,４４７,２３３号；連続薬物送達のための可変流動埋め込み可能注入器具を開示する同４,４４７,２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する同４,４３９,１９６号；および浸透圧薬物送達システムを開示する同４,４７５,１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多数のその他のこのような留置用剤、送達系およびモジュールが、当業者に公知である。
【０２１３】
特定の実施態様において、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするよう製剤化できる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多数の高親水性化合物を排除する。本明細書に記述される治療用化合物が、ＢＢＢを通過することを確実にするため（それが望まれる場合）に、それらを例えば、リポソーム中に製剤化できる。リポソームを作製する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同５，３７４，５４８号；および同５，３９９，３３１号を参照。リポソームは、特定の細胞または臓器中に選択的に輸送される１以上の部分を含み得、したがって、標的化された薬物送達を増強する（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照）。例示的標的化部分として、葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.の米国特許第５,４１６,０１６号を参照）；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M.Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)が挙げられ、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994)FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照。
【０２１４】
Ｘ. 使用および方法
本明細書に記述される抗体、抗体組成物および方法は、例えばＣＤ４０シグナル伝達を刺激することによる免疫応答の増強を含む、多数のインビトロおよびインビボの有用性を有する。好ましい実施態様において、本明細書に記述される抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。例えば、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体を、インビトロもしくはエキソビボで培養細胞に、または例えばインビボで、ヒト対象に投与し、種々の疾患における免疫性を増強できる。したがって、対象の免疫応答を増強、刺激、または上方制御するように、対象に本明細書に記述される抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象の免疫応答を改変する方法が、本明細書で提供される。
【０２１５】
好ましい対象として、免疫応答の増強が望ましいヒト患者が挙げられる。方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答）を増大することによって処置され得る障害を有するヒト患者を処置するために特に適している。特定の実施態様において、方法は、インビボでのがんの処置に特に適している。免疫性の抗原特異的増強を達成するために、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体を、対象の抗原と共に投与してもよく、または抗原は、処置する対象中にすでに存在してもよい（例えば、腫瘍またはウイルスを有する対象）。ＣＤ４０に対する抗体を別の薬剤と共に投与する場合、２種は、別個または同時に投与され得る。
【０２１６】
また、試料および対照試料を、ヒトＣＤ４０と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、抗体またはそのフラグメントとヒトＣＤ４０との複合体の形成を可能にする条件下で、接触させることを含む、試料におけるヒトＣＤ４０抗原の存在を検出し、またはヒトＣＤ４０抗原の量を測定するための方法も包含される。次いで、複合体の形成を検出し、対照試料と比較した、試料の複合体形成の相違が、試料におけるヒトＣＤ４０抗原の存在を示す。さらに、本明細書に記述される抗ＣＤ４０抗体は、イムノアフィニティー精製によってヒトＣＤ４０を精製するために使用できる。
【０２１７】
本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体における、Ｔ細胞応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）の同時刺激を増強する能力を前提として、本明細書は、本明細書に記述される抗体を用いて、抗原特異的Ｔ細胞応答（例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答）を刺激、増強または上方制御する、インビトロおよびインビボの方法を提供する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を、抗ＣＤ４０抗体を用いて増強してもよい。Ｔ細胞は、Ｔｅｆｆ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞およびＴ細胞傷害性（Ｔｃ）細胞）であってもよい。
【０２１８】
対象の免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を増強するように、対象に本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象の免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を増強する方法をさらに包含する。好ましい実施態様において、対象は、腫瘍を有する対象であり、腫瘍に対する免疫応答が増強される。腫瘍は、固形腫瘍または液体腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍であり得る。特定の実施態様において、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。特定の実施態様において、腫瘍は、非免疫原性である。特定の実施態様において、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陽性である。特定の実施態様において、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陰性である。対象はまた、ウイルスを有する対象であり得、ウイルスに対する免疫応答が増強される。
【０２１９】
対象において腫瘍の成長が阻害されるように、対象に、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の成長を阻害するための方法がさらに提供される。また、対象の慢性ウイルス感染症を処置するように、対象に、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象の慢性ウイルス感染症を処置する方法も提供される。
【０２２０】
特定の実施態様において、抗ｈｕＣＤ４０抗体は、補助的療法として対象に与えられる。がんを有する対象の、抗ｈｕＣＤ４０抗体を用いる治療は、現在の標準的な治療と比較して長期間耐久性のある応答（少なくとも１、２、３、４、５、１０年またはそれ以上の長期間の生存、少なくとも１、２、３、４、５または１０年またはそれ以上の再発のない生存）をもたらし得る。特定の実施態様において、がんを有する対象の、抗ｈｕＣＤ４０抗体を用いる処置は、がんの再発を予防し、またはがんの再発を、例えば、１、２、３、４、５、１０年もしくはそれ以上遅延する。抗ＣＤ４０処置は、第一次治療または第二次治療として使用できる。
本明細書に記述されるこれらおよびその他の方法は、以下にさらに詳述される。
【０２２１】
がん
対象を処置する（例えば、がん性腫瘍の成長が阻害もしくは低減され、かつ／または腫瘍が退縮する）ように、対象に、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体を投与することを含む、がんを有する対象を処置する方法を、本明細書で提供する。抗ｈｕＣＤ４０抗体は、がん性腫瘍の成長を阻害するために単独で使用できる。あるいは、抗ｈｕＣＤ４０抗体は、別の薬剤、例えば、以下に記述されるような、その他の免疫原、標準的ながん処置またはその他の抗体とともに使用できる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体などのＰＤ−１の阻害剤との組合せも提供される。例えば、Ellmark et al. (2015) OncoImmunology 4:7 e1011484参照。
【０２２２】
したがって、対象に、治療上有効な量の本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体（例えば、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７または１９Ｇ３のヒト化型またはその抗原結合フラグメント）を投与することを含む、対象において、例えば腫瘍細胞の成長を阻害することにより、がんを処置する方法が、本明細書において提供される。抗体は、ヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体（本明細書に記述される任意のヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体など）、ヒトキメラ抗ｈｕＣＤ４０抗体、またはヒト化非ヒト抗ｈｕＣＤ４０抗体（例えば、少なくとも１つの本明細書に具体的に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体と同一のエピトープと、結合し、またはそれとの結合において競合する、ヒト、キメラまたはヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体）であり得る。
【０２２３】
成長が本発明の抗体を使用して阻害され得るがんとして、典型的に免疫療法に対して応答性のがんが挙げられる。処置のためのがんの限定されない例として、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、扁平非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸がん、腎がん（例えば、明細胞がん）、卵巣がん、肝臓がん、大腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（例えば、腎細胞がん（ＲＣＣ））、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵がん、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫）、子宮頸がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がんおよび頭頸部がん（またはがん腫）、胃がん、胚細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔性ナチュラルキラー(sinonasal natural killer)、黒色腫（例えば、皮膚または眼球内悪性黒色腫などの転移性悪性黒色腫）、骨がん、皮膚がん、子宮がん、肛門領域のがん、精巣がん、卵管のがん腫、子宮内膜のがん腫、子宮頸部のがん腫、膣のがん腫、外陰部のがん腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、上皮小体腺のがん、副腎のがん、柔組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児の固形腫瘍、尿管のがん、腎盂のがん腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄の軸の腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるものを含めた環境誘導性がん、ウイルス関連がん（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍）および２種の主要な血液細胞系統のいずれか、すなわち、骨髄系細胞株（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよびマスト細胞を産生する）またはリンパ球系細胞株（Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する）に由来する血液悪性腫瘍、例えば、すべての種類の白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（Ｍ０）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３またはＭ３変種［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４変種［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、単離された顆粒球性肉腫および緑色腫などの急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病；ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えば、Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性およびリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ球系統の造血器腫瘍、急性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる）およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）などのリンパ腫；ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（低悪性度骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞リンパ腫などの骨髄腫；骨髄系統の造血器腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫(rhabdomyoscarcoma)を含めた間葉系起源の腫瘍；セミノーマ、奇形がん腫、星状細胞腫、シュワン腫を含めた中枢および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫(rhabdomyoscarcoma)および骨肉腫を含めた間葉系起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞性がんおよび奇形がん腫を含めたその他の腫瘍、リンパ系統の造血器腫瘍、例えば、それだけには限らないが、小細胞および大脳様細胞型を含めたＴ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）などのＴ細胞障害を含めたＴ細胞およびＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／成熟(post-thymic)Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性亜種）；血管中心性（鼻腔の）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部のがん、腎がん、直腸がん、甲状腺のがん；急性骨髄系リンパ腫ならびに前記のがんの任意の組合せが挙げられる。本明細書に記述される方法はまた、転移性がん、難治性がん（例えば、遮断性ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１抗体を用いる、例えば、これまでの免疫療法に対して難治性のがん）および再発性がんの処置のために使用してもよい。
【０２２４】
上記にもかかわらず、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０発現を伴う血液がんの処置における使用を見出さず、血液がんはＣＤ４０アゴニストでの処置によって悪化し得る。特定のがんは、ＣＤ４０を発現することが知られており、したがって、そのような悪化にさらされ得るため、分類上は除外され得る。他の実施態様において、特定の腫瘍試料を、ＣＤ４０の発現についてテストし、テスト結果に基づいて、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体での治療から除外する。
【０２２５】
抗ｈｕＣＤ４０抗体は、単剤治療として、または単に免疫賦活性療法として投与でき、または、がん性細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞、もしくは免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子を遺伝子導入された細胞などのがんワクチン戦略における免疫原と組み合わせることができる(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／もしくはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチド、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子導入された腫瘍細胞が挙げられる。腫瘍に対するワクチン接種のための多数の実験戦略が考案されている（Rosenberg, S.,2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62;Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302;Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738を参照; DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition中のRestifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043も参照）。これらの戦略の１つでは、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するよう形質導入される場合に最も有効であるとわかっている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクチベーターであるとわかっている(Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43)。
【０２２６】
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義につながった(Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7)。多くの場合には、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において、また腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主における腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であると示され得る。これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせるために、ＣＤ４０アゴニストは、腫瘍において発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの収集物とともに使用できる。これらのタンパク質は、正常には、自己抗原として免疫系によって見なされ、したがって、それらに対して寛容である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒトがんの８５％超において、および限定された数の体細胞組織のみにおいて発現される、タンパク質テロメラーゼを含み得る(Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013)。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変更し、または２種の無関係の配列間の融合タンパク質（すなわち、フィラデルフィア染色体中のｂｃｒ−ａｂｌ）もしくはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプを作製する体細胞変異のために、がん細胞において発現される「ネオ抗原」であり得る。
【０２２７】
その他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）などのヒトがんに関わるウイルスに由来するタンパク質を含み得る。ＣＤ４０阻害とともに使用できる腫瘍特異的抗原の別の形態として、腫瘍組織自体から単離された精製された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）がある。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞に由来するタンパク質フラグメントを含有し、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達に非常に有効である(Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588;Tamura et al. (1997)Science 278:117-120)。
【０２２８】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を刺激するために使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エキソビボで生産され、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を積載させることができる(Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4:328-332)。ＤＣはまた、同様にこれらの腫瘍抗原を発現するよう遺伝学的手法によって形質導入できる。ＤＣはまた、免疫化を目的として腫瘍細胞と直接融合されている(Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン化の方法として、より強力な抗腫瘍応答を活性化する（発揮する）よう、ＤＣ免疫化を、ＣＤ４０アゴニズムと効率的に組み合わせることができる。
【０２２９】
ＣＤ４０のアゴニズムはまた、標準的ながん処置（例えば、手術、放射線照射および化学療法）と組み合わせることができる。ＣＤ４０のアゴニズムは、化学療法治療計画と効率的に組み合わせることができる。これらの場合には、投与される化学療法試薬の用量を低減することが可能であり得る(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組合せの一例として、黒色腫の処置のためのダカルバジン(decarbazine)と組み合わせた抗ｈｕＣＤ４０抗体がある。このような組合せの別の例として、黒色腫の処置のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせた抗ｈｕＣＤ４０抗体がある。ＣＤ４０アゴニストおよび化学療法の組合せ使用の背後の科学的論拠は、ほとんどの化学療法薬化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増大をもたらすはずであるということである。細胞死による、ＣＤ４０アゴニズムとの相乗作用をもたらし得るその他の併用治療として、放射線照射、手術およびホルモン欠乏がある。これらのプロトコルの各々は、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管新生阻害剤もまた、ＣＤ４０アゴニストと組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死につながり、これが、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る。
【０２３０】
本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体はまた、ＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現する、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用できる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５号および同５，８３７，２４３号を参照）。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体が、腫瘍の部位に対するマクロファージを標的とするために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的応答をより効率的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、ＣＤ４０のアゴニズムによって増強される。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用によってＤＣに直接送達され得る。
【０２３１】
腫瘍は、多種多様な機序によって宿主免疫の監視を回避する。これらの機序のうち多くは、腫瘍によって発現される免疫抑制タンパク質の不活化によって克服され得る。これらは、特に、ＴＧＦ−β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの実体の各々に対する抗体は、免疫抑制剤の効果に対抗し、宿主による腫瘍免疫応答に有利に働くよう、抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせて使用できる。
【０２３２】
抗ＣＤ４０抗体は、効率的に、Ｔ細胞ヘルパー活性の代わりとなることができる(Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478)。ＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第５，８１１，０９７号）、ＯＸ−４０(Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169)、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ(Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997))およびＩＣＯＳ(Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)などのＴ細胞共刺激分子に対する抗体を活性化することはまた、Ｔ細胞活性化のレベルの増大を提供し得る。ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤もまた、抗ｈｕＣＤ４０抗体とともに使用してもよい。
【０２３３】
抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ活性化および増殖ならびに腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するための、これらの細胞のレシピエントへの養子移植を含む、いくつかの実験的な処置プロトコルもある(Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51)。これらの方法はまた、ＣＭＶなどの感染性因子に対するＴ細胞応答を活性化するために使用できる。抗ＣＤ４０抗体の存在下でのエキソビボ活性化は、養子導入されたＴ細胞の頻度および活性を増大し得る。
【０２３４】
慢性ウイルス感染症
別の態様において、本明細書に記述される本発明は、対象が感染性疾患について処置されるように、対象に抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象の感染性疾患を処置する方法を提供する。
【０２３５】
上記で論じられるような腫瘍へのその適用と同様に、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を増強するために、抗体媒介性ＣＤ４０アゴニズムを、単独で、またはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用できる。この治療的アプローチが特に有用であり得る病原体の例は、現在有効なワクチンがない病原体、または従来のワクチンでは完全な有効性には至らない病原体を含む。これらは、それだけには限らないが、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢおよびＣ)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ状球菌(staphylococcus aureus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)が挙げられる。ＣＤ４０アゴニズムは、感染の経過にわたって変更された抗原を示すＨＩＶなどの因子による確立された感染に対して特に有用である。これらの新規エピトープは、抗ヒトＣＤ４０抗体投与の時点で外来性として認識され、したがって、強力なＴ細胞応答を引き起こす。
【０２３６】
本明細書に記述される方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例として、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−IIおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。
【０２３７】
本明細書に記述される方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの例として、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌(pneumonococci)、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、テタヌス、ボツリヌス中毒、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌が挙げられる。
【０２３８】
本明細書に記述される方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例として、カンジダ(Candida)(アルビカンス(albicans)、クルゼイ(krusei)、グラブラータ(glabrata)、トロピカリス(tropicalis)など)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、アスペルギルス(Aspergillus)(フミガツス(fumigatus)、ニガー(niger)など)、ケカビ目(Mucorales)の属(ケカビ属(mucor)、ユミケカビ属(absidia)、クモノスカビ属(rhizopus))、スポロトリックス・シェンキイ(Sporothrix schenkii)、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、南アメリカ分芽菌(Paracoccidioides brasiliensis)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)およびヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)が挙げられる。
【０２３９】
本明細書に記述される方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性寄生生物のいくつかの例として、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、大腸バランチジウム(Balantidium coli)、フォーラーネグレリア(Naegleriafowleri)、アカントアメーバ属(Acanthamoeba)の種、ランブル鞭毛虫(Giardia lambia)、クリプトスポリジウム属(Cryptosporidium)の種、ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carinii)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、ネズミバベシア(Babesia microti)、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)、トリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)、ドノバンリーシュマニア(Leishmania donovani)、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)、ブラジル鉤虫(Nippostrongylus brasiliensis)が挙げられる。
【０２４０】
上記の方法のすべてにおいて、ＣＤ４０アゴニズムを、サイトカイン処置（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）または、腫瘍抗原の提示の増強を提供する二重特異性抗体療法などのその他の形態の免疫療法と組み合わせることができる。例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123を参照。
【０２４１】
ワクチンアジュバント
抗ｈｕＣＤ４０抗体の、対象の抗原(例えば、ワクチン)との同時投与によって、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体を使用して抗原特異的免疫応答を増強できる。したがって、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、対象に、(ｉ)抗原、および(ｉｉ)抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象において抗原に対する免疫応答を増強する方法が、本明細書において提供される。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体に由来する抗原であり得る。このような抗原の限定されない例として、上記で論じられた腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記のウイルス、細菌もしくはその他の病原体に由来する抗原などの、上記の節において論じられた抗原が挙げられる。
【０２４２】
インビボおよびインビトロにおける、本明細書に記述される、抗体組成物(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子およびイムノコンジュゲート)の適切な投与経路は、当分野で周知であり、当業者によって選択され得る。例えば、抗体組成物は、注射(例えば、静脈内または皮下)によって投与できる。使用される分子の適切な投与量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤化に依存する。
【０２４３】
これまでに記述したように、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体は、１以上の他の治療薬、例えば、細胞傷害性薬剤、放射性毒性薬剤(radiotoxic agent)または免疫抑制剤と同時投与できる。抗体は、薬剤と連結でき（イムノコンジュゲートとして）、または薬剤と別個に投与できる。後者の場合には（別個の投与）、抗体を、薬剤の前、後、もしくは同時に投与でき、またはその他の既知療法、例えば、抗がん療法、例えば、放射線照射と同時投与できる。このような治療薬として、特に、それ自体では、患者にとって毒性または準毒性であるレベルでのみ有効である、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素などの抗腫瘍薬剤が挙げられる。シスプラチンは、１００ｍｇ／ｍｌの用量で４週間に１回、静脈内に投与され、アドリアマイシンは、６０〜７５ｍｇ／ｍｌの用量で２１日に１回、静脈内に投与される。本明細書に記述される抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの、化学療法薬との同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞傷害性効果をもたらす異なる機序によって作動する２種の抗がん剤を提供する。このような同時投与は、薬物に対する抵抗性の発生または抗体と非反応性にする腫瘍細胞の抗原性の変化による問題を解決し得る。
【０２４４】
また、本明細書に記述される範囲内に、本明細書に記述される抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子またはイムノコンジュゲート）および使用のための説明書を含むキットがある。キットは、少なくとも１つのさらなる試薬または本明細書に記述される１以上のさらなるヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体とは別個のＣＤ４０抗原中のエピトープと結合する相補活性を有するヒト抗体）をさらに含有し得る。キットは、通常、キットの内容物の意図される使用を示す表示を含む。用語表示は、キット上にもしくはキットとともに供給された、またはそうでなければキットに添付されている任意の文書または記録物質を含む。
【０２４５】
併用療法
上記で提供された併用療法に加えて、本明細書に記述される抗ＣＤ４０抗体はまた、例えば、以下に記述されるように、がんを処置するための併用療法において使用できる。
【０２４６】
本発明は、抗ｈｕＣＤ４０抗体を、１以上のさらなる薬剤、例えば、免疫応答の刺激において有効である抗体と同時投与し、それによって、対象において免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御する併用療法の方法を提供する。
【０２４７】
一般に、本明細書に記述される抗ｈｕＣＤ４０抗体は、（ｉ）別の共刺激性受容体のアゴニストおよび／または（ｉｉ）Ｔ細胞での阻害シグナルのアンタゴニストと組み合わせることができ、そのうちいずれかが、抗原特異的Ｔ細胞応答（免疫チェックポイント制御因子）の増幅をもたらす。共刺激および共抑制分子のほとんどは、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーであり、本明細書に記述される抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とし、免疫応答を増大する薬剤とともに投与してもよい。共刺激または共抑制受容体と結合する膜結合リガンドの１つの重要なファミリーとして、Ｂ７ファミリーがあり、これは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳ−Ｌ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）およびＢ７−Ｈ６を含む。共刺激または共抑制受容体と結合する膜結合リガンドの別のファミリーとして、同族のＴＮＦ受容体ファミリーメンバーと結合する分子のＴＮＦファミリー分子があり、これは、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα１β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲを含む（例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1を参照）。
【０２４８】
別の態様において、抗ｈｕＣＤ４０抗体を、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ）；またはその他の「免疫抑制サイトカイン」、または免疫応答を刺激するための、例えばがんなどの増殖性疾患を処置するための、Ｔ細胞活性化を刺激するサイトカイン、のアゴニストと組み合わせて使用できる。
【０２４９】
ある態様において、Ｔ細胞応答は、本発明の抗ｈｕＣＤ４０ ｍＡｂと、（ｉ）ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４などのＴ細胞活性化を阻害するタンパク質（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）のアンタゴニストならびに（ｉｉ）Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８ＨなどのＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニストのうち１つまたはそれ以上との組合せによって刺激され得る。
【０２５０】
上記のタンパク質のうち１種を調節し、がんを治療するために、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体（例えば、本明細書に記述されるもの）と組み合わせてもよい例示的薬剤として、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）／イピリムマブまたはトレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４に対する）、ガリキシマブ（Ｂ７．１に対する）、ＢＭＳ−９３６５５８（ＰＤ−１に対する）、ピディリズマブ／ＣＴ−０１１（ＰＤ−１に対する）、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）／ペンブロリズマブ／ＭＫ−３４７５（ＰＤ−１に対する）、ＡＭＰ２２４（Ｂ７−ＤＣ／ＰＤ−Ｌ２に対する）、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂ７−Ｈ１に対する）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｂ７−Ｈ１に対する）、ＭＥＤＩ−５７０（ＩＣＯＳに対する）、ＡＭＧ５５７（Ｂ７Ｈ２に対する）、ＭＧＡ２７１（Ｂ７Ｈ３に対する−ＷＯ１１／１０９４００）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ−３に対する）、ウレルマブ／ＢＭＳ−６６３５１３およびＰＦ−０５０８２５６６（ＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する）、バルリルマブ(varlilumab)／ＣＤＸ−１１２７（ＣＤ２７に対する）、ＭＥＤＩ−６３８３およびＭＥＤＩ−６４６９（ＯＸ４０に対する）、ＲＧ−７８８８（ＯＸ４０Ｌに対する−ＷＯ０６／０２９８７９）、アタシセプト（ＴＡＣＩに対する）、ムロモナブ−ＣＤ３（ＣＤ３に対する）およびイピルムマブ(ipilumumab)（ＣＴＬＡ−４に対する）が挙げられる。
【０２５１】
がんの治療のためにアンタゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせることができるその他の分子として、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストが挙げられる。例えば、アンタゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト（例えば、リリルマブ(lirilumab)）と組み合わせることができる。
【０２５２】
併用療法のためのさらにその他の薬剤として、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇させる薬剤（限定されないが、ＲＧ７１５５（ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、ＷＯ１３／８７６９９、ＷＯ１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４）またはＦＰＡ−００８（ＷＯ１１／１４０２４９、ＷＯ１３／１６９２６４、ＷＯ１４／０３６３５７）を含めたＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体などのＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストを含む）が挙げられる。
【０２５３】
一般に、本明細書に記述されるアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、陽性共刺激性受容体をライゲーションする１以上のアゴニスト剤、阻害性受容体によるシグナル伝達を減弱する遮断薬、ならびに抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増大する１以上の薬剤、腫瘍微小環境内のそれぞれの免疫抑制経路を克服する（例えば、阻害性受容体の関与（例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用）を遮断し、Ｔｒｅｇを枯渇または阻害し（例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ）を使用して、またはエキソビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって）、ＩＤＯなどの代謝酵素を阻害し、またはＴ細胞アネルギーもしくは消耗を元に戻す／防ぐ）薬剤、ならびに先天性免疫活性化および／または腫瘍部位での炎症のトリガーとなる薬剤と一緒に使用できる。
【０２５４】
対象に、ＣＤ４０アゴニスト（例えば抗体）および１以上のさらなる免疫賦活性抗体（ＰＤ−１アンタゴニスト（例えばアンタゴニスト抗体）、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト（例えばアンタゴニスト抗体）、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト（例えばアンタゴニスト抗体）および／またはＬＡＧ３アンタゴニスト抗体（例えばアンタゴニスト抗体）など）を、対象の免疫応答を刺激する（例えば、腫瘍成長を阻害し、または抗ウイルス応答を刺激する）ように、投与することを含む、対象の免疫応答を刺激する方法を、本明細書において提供する。ある実施態様において、対象に、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体を投与する。ある実施態様において、対象に、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する。ある実施態様において、対象に、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与する。ある実施態様において、少なくとも１つのさらなる免疫賦活性抗体（例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ−１、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４および／またはアンタゴニスト抗ＬＡＧ３）は、ヒト抗体である。あるいは、少なくとも１つのさらなる免疫賦活性抗体は、（例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＬＡＧ３抗体から調製された）例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。
【０２５５】
アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニストＰＤ−１抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、がん）を治療する方法を、本明細書において提供する。特定の実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を治療量以下の用量で投与し、抗ＰＤ−１抗体を治療量以下の用量で投与し、またはその両方を治療量以下の用量で投与し、ここで治療量以下の表記は、当該薬剤の単剤治療に関する。また、抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−１抗体を、対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の処置と関連する有害事象を変更する方法を、本明細書において提供する。特定の実施態様において、対象は、ヒトである。特定の実施態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、本明細書に開示される抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体などの、ヒト化モノクローナル抗体である。
【０２５６】
本明細書に記述される方法における使用に適したＰＤ−１アンタゴニストとして、限定されないが、リガンド、抗体（例えば、モノクローナル抗体および二重特異性抗体）および多価薬剤が挙げられる。ある実施態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ−２４４などのＦｃ融合タンパク質である。ある実施態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０２５７】
例示的な抗ＰＤ−１抗体として、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）／ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）またはＷＯ２００６／１２１１６８に記述される抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１のうち１種のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体がある。特定の実施態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ＷＯ２０１２／１４５４９３に記述されるＭＫ−３４７５（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）／ペンブロリズマブ／以前は、ランブロリズマブ）；ＷＯ２０１２／１４５４９３に記述されるＡＭＰ−５１４／ＭＥＤＩ−０６８０；およびＣＴ−０１１（ピディリズマブ；これまでは、ＣＴ−ＡｃＴｉｂｏｄｙまたはＢＡＴ；例えば、Rosenblatt et al. (2011) J. Immunotherapy 34:409参照）である。さらに公知のＰＤ−１抗体およびその他のＰＤ−１阻害剤として、ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ０３／０９９１９６、ＷＯ２００９／１１４３３５、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１１／１６１６９９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７，６３５，７５７号および同８，２１７，１４９号ならびに米国特許出願公開第２００９／０３１７３６８号に記述されるものが挙げられる。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される任意の抗ＰＤ−１抗体も使用できる。これらの抗体のうち１種と同様に、ＰＤ−１上の同一エピトープとの結合に競合する、および／またはＰＤ−１上の同一エピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体も、併用治療において使用してもよい。
【０２５８】
特定の実施態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１と５×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＰＤ−１と１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＰＤ−１と５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合し、または、ヒトＰＤ−１と１×１０−８Ｍないし１×１０−１０Ｍまたはそれ以下のＫＤで結合する。
【０２５９】
アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニストＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、がん）を処置する方法を、本明細書において提供する。特定の実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、治療量以下の用量で投与し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、治療量以下の用量で投与し、またはその両方を、治療量以下の用量で投与する。アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の処置に関連する有害事象を変更するための方法を、本明細書において提供する。特定の実施態様において、対象は、ヒトである。特定の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、本明細書で開示される抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体などの、ヒト化モノクローナル抗体である。
【０２６０】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９（ＷＯ２００７／００５８７４および米国特許第７，９４３，７４３号では１２Ａ４と呼ばれる）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ＷＯ２０１３／７９１７４）、またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４および米国特許第７，９４３，７４３号に記述される３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体である。特定の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（抗Ｂ７−Ｈ１としても知られる）またはＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６としても知られる）である。ＷＯ２０１３／１７３２２３、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７，６３５，７５７号および同８，２１７，１４９号および米国特許出願公開第２００９／１４５４９３号において開示される任意の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用してもよい。任意のこれらの抗体のエピトープと同一のエピトープと競合および／または結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、併用治療において使用してもよい。
【０２６１】
なおさらなる実施態様において、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、第３の免疫治療薬と組み合わせた、ＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−Ｌ１アンタゴニストなどの、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達のアンタゴニストと組み合わされる。ある実施態様において、第３の免疫治療薬は、本明細書に開示される抗ＧＩＴＲ抗体もしくは抗ＯＸ４０抗体などの、ＧＩＴＲアンタゴニストまたはＯＸ−４０アンタゴニストである。
【０２６２】
別の態様において、免疫−腫瘍学薬剤は、アゴニストＧＩＴＲ抗体などのＧＩＴＲアゴニストである。適したＧＩＴＲ抗体として、例えば、ＢＭＳ−９８６１５３、ＢＭＳ−９８６１５６、ＴＲＸ−５１８（ＷＯ０６／１０５０２１、ＷＯ０９／００９１１６）およびＭＫ−４１６６（ＷＯ１１／０２８６８３）が挙げられる。
【０２６３】
別の態様において、免疫−腫瘍学薬剤は、ＩＤＯアンタゴニストである。適したＩＤＯアンタゴニストとして、例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０（ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２）、インドキシモドまたはＮＬＧ−９１９（ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７）が挙げられる。
【０２６４】
本明細書に記述されるアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、がん）を処置するための方法を、本明細書において提供する。特定の実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、治療量以下の用量で投与し、抗ＣＴＬＡ−４抗体を、治療量以下の用量で投与し、またはその両方を、治療量以下の用量で投与し、ここで治療量以下の表記は、当該薬剤の単剤治療に関する。アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の処置と関連する有害事象を変更するための方法を、本明細書において提供する。特定の実施態様において、対象はヒトである。特定の実施態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）（ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記述されるイピリムマブまたは抗体１０Ｄ１）、トレメリムマブ（以前は、チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）および以下の刊行物：ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許第６，２０７，１５６号；Hurwitz etal. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071;Camacho et al. (2004)J. Clin. Oncology 22(145):Abstract No. 2505(antibody CP-675206);およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304に記述される抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される抗体である。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される任意の抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用してよい。
【０２６５】
アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および抗ＬＡＧ−３抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、がん）を処置するための方法を、本明細書において提供する。さらなる実施態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、治療量以下の用量で投与し、抗ＬＡＧ−３抗体を、治療量以下の用量で投与し、またはその両方を、治療量以下の用量で投与する。アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＬＡＧ−３抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の処置に関連する有害事象を変更するための方法を、本明細書において提供する。特定の実施態様において、対象はヒトである。特定の実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、本明細書に開示される抗体のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体などの、ヒト化モノクローナル抗体である。抗ＬＡＧ３抗体の例として、米国特許出願公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２およびＷＯ２０１４／００８２１８に記述されている、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体が挙げられる。ある実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＢＭＳ−９８６０１６である。使用できる、他の技術分野で認識される抗ＬＡＧ−３抗体として、ＵＳ２０１１／００７０２３に記述されるＩＭＰ７３１が挙げられる。ＩＭＰ−３２１もまた使用してもよい。任意のこれらの抗体のエピトープと同一のエピトープと競合および／または結合する抗ＬＡＧ−３抗体を、併用治療において使用してもよい。
【０２６６】
特定の実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒトＬＡＧ−３と５×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＬＡＧ−３と１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＬＡＧ−３と５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合し、または、ヒトＬＡＧ−３と１×１０−８Ｍないし１×１０−１０Ｍまたはそれ以下のＫＤで結合する。
【０２６７】
本明細書に記述されるアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体の、ＬＡＧ−３および／またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１などの１以上の第２の標的抗原への投与は、患者のがん性細胞に対する免疫応答を増強し得る。本開示の抗体を使用して成長が阻害され得るがんとして、免疫療法に典型的に応答するがんが挙げられる。本開示の併用療法を用いる処置のためのがんの代表例として、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を用いる単剤治療の考察において上記で具体的に列挙されたがんが挙げられる。
【０２６８】
特定の実施態様において、本明細書で論じられる治療用抗体の組合せを、医薬上許容される担体中の単一組成物として同時に、または医薬上許容される担体中の各抗体を有する別個の組成物として同時に、投与できる。別の実施態様において、治療用抗体の組合せを連続的に投与できる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、抗ＣＴＬＡ−４抗体を最初に投与し、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を２番目に投与し、またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に投与し、抗ＣＴＬＡ−４抗体を２番目に投与するなど、連続的に投与できる。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、抗ＰＤ−１抗体を最初に投与し、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を２番目に投与し、またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に投与し、抗ＰＤ−１抗体を２番目に投与するなど、連続的に投与できる。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を最初に投与し、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を２番目に投与し、またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に投与し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を２番目に投与するなど、連続的に投与できる。さらに、またはあるいは、抗ＬＡＧ−３抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、抗ＬＡＧ−３抗体を最初に投与し、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を２番目に投与し、またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に投与し、抗ＬＡＧ−３抗体を２番目に投与するなど、連続的に投与できる。
【０２６９】
さらに、併用療法の２回以上の服用が連続的に投与される場合、逐次投与の順序は、各投与時点で逆転させることができ、同一順序で維持することができ、逐次投与は、同時投与またはその任意の組合せと組み合わせることができる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の組合せの第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＣＴＬＡ−４抗体が最初およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が２番目で連続的であり得、第３の投与は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が最初および抗ＣＴＬＡ−４抗体が２番目で連続的であり得る、など。さらにまたはあるいは、抗ＰＤ−１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の組合せの第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＰＤ−１抗体が最初およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が２番目で連続的であり得、第３の投与は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が最初で、抗ＰＤ−１抗体が２番目で連続的であり得る、など。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の組合せの第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が最初およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が２番目で連続的であり得、第３の投与は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が最初および抗ＰＤ−Ｌ１抗体が２番目で連続的であり得る、など。さらに、またはあるいは、抗ＬＡＧ−３抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の組合せの第１の投与は同時であり得、第２の投与は、抗ＬＡＧ−３抗体が最初およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が２番目で連続的であり得、第３の投与は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が最初および抗ＬＡＧ−３抗体が２番目で連続的であり得る。別の代表的な投薬スキームは、抗ｈｕＣＤ４０が最初および抗ＣＴＬＡ−４抗体（および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体）が２番目で連続的である第１の投与を含み得、その後の投与は同時であってもよい。
【０２７０】
場合により、単一の免疫治療薬としてのアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０、またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および１以上のさらなる免疫治療用抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３）の組合せを、がん性細胞などの免疫原、精製した腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞および免疫刺激性サイトカイン(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)をコードする遺伝子を導入した細胞とさらに組み合わせることができる。使用できる腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチド、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子導入しれた腫瘍細胞が挙げられる（以下にさらに論じられる）。ＣＤ４０アゴニストおよび１以上のさらなる抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断）はまた、標準的ながん処置とさらに組み合わせることができる。例えば、ＣＤ４０アゴニストおよび１以上のさらなる抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断）を、化学療法治療計画と効率的に組み合わせることができる。これらの場合には、本開示の組合せとともに投与されるその他の化学療法試薬の用量を低減することが可能である(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組合せの例として、黒色腫の処置のためのダカルバジン(decarbazine)とさらに組み合わせた、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体などのさらなる抗体を伴う、または伴わない、ＣＤ４０アゴニスト抗体の組合せがある。別の例として、黒色腫の処置のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）とさらに組み合わせた、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３抗体を伴う、または伴わない、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の組合せがある。ＣＤ４０のアゴニズムおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の、化学療法との組合せ使用の背後の科学的論拠は、ほとんどの化学療法化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増大をもたらすはずであるということである。細胞死によるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を伴う、または伴わない、組み合わされたＣＤ４０のアゴニズムとの相乗作用をもたらし得るその他の併用療法として、放射線照射、手術またはホルモン欠乏がある。これらの各々のプロトコルは、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管新生阻害剤もまた、組み合わされたＣＤ４０のアゴニズムおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死をもたらし、これは、宿主の抗原提示経路に供給される腫瘍抗原の供給源であり得る。
【０２７１】
単一の免疫治療薬としてのアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体またはＣＤ４０アゴニストおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断抗体の組合せをまた、腫瘍細胞に対するＦｃαまたはＦｃγ受容体発現性エフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる（例えば、米国特許第５,９２２,８４５号および同５,８３７,２４３号参照）。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。これらの応答のＴ細胞アームは、組み合わされたＣＤ４０のアゴニズムおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の使用によって増強される。
【０２７２】
別の実施例では、単一の免疫治療薬としてのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体または抗ＣＤ４０抗体およびさらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体の組合せを、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、ヘルセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ベキサール（登録商標）（トシツモマブ）、ゼバリン（登録商標）（イブリツモマブ）、キャンパス（登録商標）（アレムツズマブ）、ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（登録商標）（エプラツズマブ(eprtuzumab)）、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）およびＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブ）などの抗腫瘍抗体とともに使用できる。例として、理論に拘束されることを意図しないが、抗がん抗体または毒素とコンジュゲートしている抗がん抗体を用いる処置は、がん細胞死（例えば、腫瘍細胞）につながり得、これは、免疫賦活性薬剤、例えば、ＣＤ４０、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体によって媒介される免疫応答を増強する。例示的実施態様において、過剰増殖性疾患（例えば、がん腫瘍）の処置は、抗がん剤（例えば、抗体）を、同時もしくは連続的に、またはそれらの任意の組合せで、抗ｈｕＣＤ４０抗体および場合により、さらなる免疫賦活性薬剤（例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤（例えば抗体））と組み合わせて含み得、これは、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
【０２７３】
アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体を伴って、または伴わずに、対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患（例えば、がん）の処置に関連する有害事象を変更するための方法を、本明細書において提供する。例えば、本明細書に記述される方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与することによって、免疫賦活性治療用抗体が誘導する大腸炎または下痢の罹患率を低減する方法を提供する。本明細書において、「非吸収性ステロイド」は、広範な初回通過代謝を示し、その結果、肝臓における代謝後に、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満である、グルココルチコイドである。本明細書に記述されるある実施態様において、非吸収性ステロイドは、ブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後に広範に、主に肝臓によって広く代謝される局所活性グルココルチコステロイドである。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）(Astra-Zeneca)は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発された、ブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、回腸および／または上行結腸に関与する軽度から中程度のクローン病の処置のために米国において承認されている。クローン病の処置のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）の通常の経口投与量は、６〜９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、腸管において放出され、その後、腸粘膜において吸収され、保持される。腸粘膜標的組織を通過すると、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、肝臓においてシトクロムＰ４５０系によって、無視できるほどのグルココルチコイド活性を有する代謝産物に広範に代謝される。したがって、バイオアベイラビリティは低い（約１０％）。ブデソニドの低いバイオアベイラビリティは、あまり広範ではない初回通過代謝を有するその他のグルココルチコイドと比較して改善された治療可能比をもたらす。ブデソニドは、全身活性化コルチコステロイドよりも少ない視床下部−下垂体抑制を含め、より少ない有害作用しかもたらさない。しかし、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）の慢性投与は、副腎皮質機能亢進症および副腎抑制などの全身グルココルチコイド作用をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610を参照。
【０２７４】
さらなる実施態様において、非吸収性ステロイドとともに、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断（すなわち、ＣＤ４０に対する免疫賦活性治療用抗体および場合により、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体）を伴う、または伴わない、ＣＤ４０アゴニストを、サリチル酸とさらに組み合わせることができる。サリチル酸として、例えば、スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標）、Pharmacia & UpJohn)；オルサラジン（ＤＩＰＥＮＴＵＭ（登録商標）、Pharmacia & UpJohn)；バルサラジド（ＣＯＬＡＺＡＬ（登録商標）、Salix Pharmaceuticals, Inc.）；およびメサラミン（ＡＳＡＣＯＬ（登録商標）、Procter & Gamble Pharmaceuticals；ＰＥＮＴＡＳＡ（登録商標）、Shire US；ＣＡＮＡＳＡ（登録商標）、Axcan Scandipharm, Inc.；ＲＯＷＡＳＡ（登録商標）、Solvay）などの５−ＡＳＡ薬剤が挙げられる。
【０２７５】
本明細書に記述される方法に従って、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３抗体および非吸収性ステロイドを伴う、または伴わない、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせて投与されるサリチル酸として、免疫賦活性抗体によって誘導される大腸炎の発生率の低減を目的とした、サリチル酸および非吸収性ステロイドの任意の重複または逐次投与を挙げることができる。したがって、例えば、本明細書に記述される免疫賦活性抗体によって誘導される大腸炎の発生率を低減するための方法は、サリチル酸および非吸収性を同時にまたは逐次投与すること（例えば、サリチル酸は、非吸収性ステロイドの６時間後に投与される）、またはその任意の組合せを包含する。さらに、サリチル酸および非吸収性ステロイドを、同一経路によって（例えば、両方を経口投与する）、または異なる経路によって（例えば、サリチル酸を経口投与し、非吸収性ステロイドを直腸に投与する）投与でき、これは、抗ｈｕＣＤ４０および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体の投与に用いる経路とは異なり得る。
【０２７６】
本明細書に記述されるアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および組合せ抗体療法を、治療されている適応症（例えば、がん）に対するその特定の有用性について選択されるその他の周知の療法とともに使用してもよい。本明細書に記述されるアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の組合せを、公知の医薬上許容される薬剤と連続的に使用してもよい。
【０２７７】
例えば、本明細書に記述されるアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および組合せ抗体療法を、放射線照射、化学療法（例えば、カンプトテシン（ＣＰＴ−１１）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル（タキソール）、ドキソルビシン、５−ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ（６Ｘ ｃｏｍｂｏ）の使用）、１以上のプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２）、１以上のＢｃｌ−２阻害剤（例えば、ＢＨ３Ｉ−２’（ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤）、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１（ＩＤＯ１）阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ２４３６０）、ＡＴ−１０１（Ｒ−（−）−ゴシポール誘導体）、ＡＢＴ−２６３（小分子）、ＧＸ−１５−０７０（オバトクラックス）またはＭＣＬ−１（骨髄系白血病細胞分化タンパク質−１）アンタゴニスト）、ｉＡＰ（アポトーシスタンパク質の阻害剤）アンタゴニスト（例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃミメティック、合成ｓｍａｃペプチド（Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15参照）、ＩＳＩＳ２３７２２（ＬＹ２１８１３０８）またはＡＥＧ−３５１５６（ＧＥＭ−６４０））、ＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ）阻害剤、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、血管新生阻害剤（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲを標的化する抗血管新生剤（例えば、アバスチン（登録商標））、合成トリテルペノイド（Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808を参照）、ｃ−ＦＬＩＰ（細胞性ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質）モジュレーター（例えば、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００）、キナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドマイド(Lenalildomide)、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物などのさらなる処置と組み合わせて（例えば、同時または別個に）使用できる。
【０２７８】
本明細書に記述されるアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および組合せ抗体療法は、１以上の抗増殖性細胞傷害性薬剤とさらに組み合わせて、使用できる。抗増殖性細胞傷害性薬剤として使用してもよい化合物のクラスとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる：
【０２７９】
アルキル化剤（制限するものではないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素およびトリアゼンを含む）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
【０２８０】
代謝拮抗剤（制限するものではないが、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む）：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン(Fludarabine phosphate)、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
【０２８１】
アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体との組合せに適した抗増殖性薬剤は、限定されないが、当分野で公知のその他のミクロチューブリン(microtubuline)安定化剤に加えて、タキサン、パクリタキセル（パクリタキセルは、ＴＡＸＯＬ（商標）として市販されている）、ドセタキセル、ディスコデルモリド（ＤＤＭ）、ジクチオスタチン（ＤＣＴ）、ペロルシドＡ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、［１７］−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、［１８］デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、トランス−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、シス−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモリド(discoderomolide)、パツピロン(patupilone)（ＥＰＯ−９０６）、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ（ディスコデルモリド）、ＴＺＴ−１０２７（ソブリドチン）、ＩＬＸ−６５１（タシドチン塩酸塩(tasidotin hydrochloride)）、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシル酸塩（Ｅ−７３８９）、ヘミアステリン（ＨＴＩ−２８６）、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、マイタンシノイドイムノコンジュゲート（ＤＭ−１）、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２（イスピネシブ）、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７β−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４，１６−ジデメチル−（＋）−ディスコデルモリドおよびクリプトチロン(cryptothilone)１を含む。
【０２８２】
本明細書に記述されるアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を用いる処置とともに、またはそれに先立って異常な増殖性の細胞を静止状態にすることが望ましい場合には、１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メゲストロールアセテート、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ＺＯＬＡＤＥＸ（商標）などのホルモンおよびステロイド（合成類似体を含む）も、患者に投与できる。本明細書に記述される方法または組成物を使用する場合には、鎮吐剤などの、臨床条件における腫瘍成長または転移の調節において使用されるその他の薬剤も、望ましいように投与できる。
【０２８３】
化学療法薬の安全および有効な投与のための方法は、当業者に公知である。さらに、その投与は標準的な文献に記述される。例えば、多数の化学療法薬の投与は、その開示内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Physicians' Desk Reference (PDR)、例えば、1996年版(Medical Economics Company、Montvale、N.J. 07645-1742、USA)に記述されている。
【０２８４】
化学療法薬および／または放射線療法を、当分野で周知の治療用プロトコルに従って処方できる。化学療法薬および／または放射線療法の処方は、処置される疾患およびその疾患に対する化学療法薬および／または放射線療法の公知の効果に依存して、様々であり得ることは、当業者には明らかである。また、治療プロトコル（例えば、投与量および投与時間）は、熟練した臨床医の知識に従って、患者に投与した治療薬の観察された効果、および投与した治療薬に対して観察された疾患の応答を考慮して、様々であり得る。
【０２８５】
ＸＩ．本発明の特定のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の特徴付け
本発明のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体を、実施例１で記述されるように得た。本発明の代表的な抗体の可変ドメインおよびＣＤＲ配列領域を、配列表に示し、表２にまとめた。可変ドメインおよびＣＤＲ領域の番号付けは、同一の元のクローンに由来する全ての抗体において、同一である（すなわち、本明細書で与えられるヒト化バリアントは、いかなる挿入または欠失も含まない）
表２：抗体可変ドメインおよびＣＤＲ
【表２】
2018526978.tif 000003
【０２８６】
本発明はまた、同一のマウス生殖系列配列（特に、Ｖ領域セグメントおよびＪ領域セグメント）に由来することによって、本明細書に配列によって開示される抗ｈｕＣＤ４０抗体に関連する、抗ｈｕＣＤ４０抗体を与える。本明細書に開示される各抗体における、マウス生殖系列配列を表３に示す。
表３：抗ｈｕＣＤ４０ ｍＡｂのマウス生殖系列配列
【表３】
2018526978.tif 000004
【０２８７】
本発明は、マウスフレームワーク配列を、さもないとヒト化において消失する抗原（ヒトＣＤ４０）親和性を修復し、または配列傾向を除去する、さらなる変異（「復帰変異」）を伴い、または伴わずに、ヒトフレームワーク配列に置換することによる、本明細書に開示されるマウス親抗体に由来する、ヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体を、さらに提供する。実施例３参照。
【０２８８】
本発明はまた、本明細書で開示される新規な可変ドメイン配列および、他のＦｃ受容体（すなわち、活性化受容体）に対する親和性と比較して、ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性が増強した、改変Ｆｃ領域を有する定常ドメインを含む、抗体コンストラクトを提供する。ＦｃγＲＩＩｂ特異性が増強した、そのようなアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、がんおよび慢性感染症の処置において、優れた有効性を示すことが想定される（Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754）。理論によって限定されることを意図しないが、そのようなＦｃγＲＩＩｂ特異的アゴニスト抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂは、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖および活性化を促進する樹状細胞の成熟化を増大させ、抗腫瘍応答の増強を導くことによって、アジュバント効果の増強を示し得る（同文献）。理論によって限定されることを意図しないが、受容体のクラスター形成または本発明の「架橋」を増加させるための、アゴニストＣＤ４０抗体の、ＦｃＲを介するシグナル伝達の増強は、治療効果の主要な要因であり得る。ＣＤ４０アゴニスト抗体の、抗体のＦｃ部におけるＦｃＲ会合による架橋は、シグナル強度を増加させ、したがって、細胞の活性化を増強し得る。
【０２８９】
抗体の、阻害性（Ｉ）Ｆｃ受容体に対する活性化（Ａ）Ｆｃ受容体との、相対的な結合親和性を、「Ａ／Ｉ」比で表してもよく、これは典型的に、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域の構造の関数である。ＷＯ２０１２／０８７９２８参照。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂとの結合の特異性が増強した抗体は、より低いＡ／Ｉ比を有する。本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体における好ましい抗体は、例えば、５、４、３、２、１、０．５、０．３、０．１、０．０５、０．０３または０．０１未満のＡ／Ｉ比を有する。
【０２９０】
ＦｃγＲＩＩｂ特異性を増強する変異を含む、ヒトＩｇＧ１定常ドメインを、配列表に示し、表４にまとめ、図１に示した。配列バリアントを、配列番号６５で示されるヒトＩｇＧ１ｆ定常ドメイン配列を基準として、明示した。Ｆｃ領域における変異の位置を考慮した命名法は、Kabat et al. (1981) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.と同様に、ＥＵの指標に従い、これは、可変ドメインの長さが異なる抗体における、対応する位置でのＦｃ配列の比較を促進する。Edelman et al. (1969) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 63:78;ＷＯ２０１２／１３０８３１も参照（同一の番号付け方式を使用）。これは、配列表における配列の番号付けとは一致しない。図１は、表４のＦｃ配列バリアントの図示を与え、当業者は、本明細書に開示される抗体配列の対応する位置が、容易に認識できる。ＳＥおよびＳＥＬＦバリアントは、Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926に記述される。Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９、Ｖ１１およびＶ１２バリアントは、Mimoto et al. (2013) Protein Engineering Design & Selection 26:589（例えば、その表１）に記述される。
表４：Ｆｃ配列バリアント
【表４】
2018526978.tif 000005
【０２９１】
ＦｃγＲＩＩｂとの親和性を増強させる、さらなるＦｃ配列バリアントが、Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723 (およびＷＯ２０１４／１８４５４５)に開示され、これは、（例えば、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆと組み合わせて使用する）Ｖ２６２ＥおよびＶ２６４Ｅを含む。
【０２９２】
Ｄ２７０Ｅ変異を伴うさらなるバリアントを、Ｖ４およびＶ９ Ｆｃ配列バリアントにおいて生じるＤ２７０異性化を減少させるために作製し、これらはさもなければ、加速分解の研究において、異性化速度の増強を示し、他のバリアントでの約５〜７％の異性化と比較して、ＰＢＳ中、４℃で２年後に約１２〜１６％の異性化を示唆した。表５参照（１回の実験でのデータを示すが、再現実験は同等の値を示した）。２７０番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換は、このようなＤＧ異性化の可能性を排除し、化学的により安定な抗体およびより均一な抗体の調製をもたらす。Ｖ９の他のＤ２７０置換（Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０ＳおよびＤ２７０Ｔなど）は、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂ受容体との結合を効果的に除去した（ＫＤは５μＭより大きかった）。Ｄ２７０Ｅ変異は、ＦｃγＲＩＩｂ受容体との結合を１桁減少させたが、Ｖ９−Ｄ２７０Ｅバリアントは、ＦｃγＲＩＩａとの比較における、ＦｃγＲＩＩｂ受容体に対する親和性の有利なバイアス、および許容できるＦｃγＲＩＩｂに対する絶対的な親和性を維持した。実施例８参照。
表５：Ｆｃ配列バリアントの、Ｆｃγ受容体に対する親和性（ｎＭ表示のＫＤ）
【表５】
2018526978.tif 000006
【０２９３】
本発明の様々な抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性を測定した。実施例７ならびに図３Ａ、３Ｂおよび４参照。アゴニスト活性が、抗原（ヒトＣＤ４０）結合を決定する可変ドメイン配列（ｍＡｂクローン番号）および、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩＩｂ）結合を決定するＦｃ領域の配列の両方に依存することがわかった。
【０２９４】
本開示を以下の実施例によってさらに説明するが、この実施例は、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願のあらゆる箇所で引用される、全ての図および全ての言及、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開された特許出願の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０２９５】
実施例１：ヒトＣＤ４０に対するマウスモノクローナル抗体の作製
以下の通りに、マウス抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体を、マウス抗体遺伝子を発現する野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス（Charles Rivers Labs）を用いて、作製した。
【０２９６】
抗原
ｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ可溶性組換えタンパク質を、免疫化のための抗原として使用した。可溶性融合タンパク質は、９１．６ｋＤのＭＷを有し、Ｃ末端においてマウスＩｇＧ２ｂ Ｆｃと連結している、ｈｕＣＤ４０の細胞外部分で構成される。この融合タンパク質を、本明細書において、「ｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ融合タンパク質」と呼ぶ。融合タンパク質を、標準的な組換えＤＮＡ法によって作製し、遺伝子導入したＣＨＯ細胞中に発現させ、このＣＨＯ細胞は、可溶性融合タンパク質を培養上清中に分泌した。遺伝子導入に用いたＣＨＯ宿主細胞は、Invitrogen（カタログ番号１１６１９−０１２）から得た。分泌された可溶性融合タンパク質を、免疫原として使用するために精製した。
【０２９７】
マウスの免疫化
ヒトＣＤ４０に対するマウスモノクローナル抗体を作製するため、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、精製したｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ融合タンパク質で免疫化した。マウスは、最初の抗原の注入時に、月齢約２〜４ヶ月であった。精製した組換えｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ抗原調製物（融合タンパク質を発現する、遺伝子導入した哺乳類細胞から１０μｇ精製した）を用いて、２つの免疫化プロトコル（ＡおよびＢ）でマウスを免疫化した。プロトコルＡは４回の毎週の足蹠（ＦＰ）免疫化からなり、プロトコルＢは７回の毎週の皮下（ＳＣ）／腹腔内（ＩＰ）／膝の免疫化からなる。両方の場合において、免疫原を、ＲＩＢＩアジュバント（シグマ カタログ番号Ｍ６５３６）と１：１で混合した。
【０２９８】
全てのマウスを、４回目の免疫化の１週間後に採血し、抗原特異性の力価を評価した。屠殺時に、各マウスから最後の採血を得た。免疫応答を、後眼窩の採血でモニターした。血漿を、免疫化に用いた組換えタンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡ分析でスクリーニングした。プロトコルＡのマウスは、融合の２日および３日前に、静脈内（ＩＶ）および足蹠（ＦＰ）に、可溶化抗原での２回の最終的な追加免疫を受けた。プロトコルＢのマウスは、融合の２日および３日前に、静脈内（ＩＶ）ならびにＩＰおよび膝に、可溶化抗原での２回の最終的な追加免疫を受けた。
【０２９９】
プロトコルＡの４匹全てのマウス（ＩＤ ２９１７６３、２９１７６４、２９１７６５、２９１７６６）を屠殺した。リンパ節および脾臓細胞を抽出し、融合（融合体３５８２および３５８３）のために混合した。プロトコルＢの２匹のマウス（ＩＤ ２９４２８６および２９４２８８）のみを屠殺した。各マウスの脾臓およびリンパ節を混合し、融合（融合体３７１６および３７１７）させた。
【０３００】
ヒトＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
力価の高いＢａｌｂ／ｃマウスから単離した、マウスの脾細胞およびリンパ節を、電場に基づく電気融合Ｈｙｂｒｉｍｕｎｅ装置および大型の０．９ｍｌ融合チャンバー(BTX Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA)を用いて、骨髄腫融合パートナーと融合させた。免疫化マウス由来のリンパ球の単細胞懸濁液を、同量のＰ３Ｘ６３ Ａｇ８．６．５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）非分泌性マウス骨髄腫細胞と融合させた。得られた細胞を、ハイブリドーマを選択するためにアミノプテリンを添加した、選択ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ培地Ｅ（カタログ番号０３８０５；STEMCELL Technologies Inc., Vancouver BC, Canada）を含む、平底マイクロタイタープレートに、２．０ｘ１０４細胞／ウェルでプレーティングした。約７日後、培地を、培地Ｅ（アミノプテリンなし）に交換した。
【０３０１】
１０〜１２日後、個々のウェルを、マウスＩｇＧ／マウスκ軽鎖抗体の存在について、均一性(homogenous)ＨＴＲＦアッセイでスクリーニングした。このアッセイでは、９６ウェル融合プレートからの上清を、カスタム標識されたテルビウム−クリプテートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ特異的）（(Cisbio US Inc. Bedford, MA）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ’２（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号１０９−６０５−０９８）と混合した。１時間インキュベートした。次いで、プレートをＲｕｂｙｓｔａｒリーダーで読み取った。次に、マウスＩｇＧ／マウスκ軽鎖抗体について、陽性であったウェルのハイブリドーマ細胞を、ヒトＣＤ４０を遺伝子導入したＣＨＯ細胞および対照として遺伝子導入していないＣＨＯ細胞（融合体３５８２／３５８３）を用いるＦＡＣＳ、または組換えタンパク質を用いるＥＬＩＳＡ後の、Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞および負の対照としてのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（融合体３７１６／３７１７）におけるＦＡＣＳのいずれかによって、スクリーニングした。ＦＡＣＳ陽性の親系統を、２４ウェルプレートに移行した。数日後、個々のウェルの細胞上清を、ＦＡＣＳで再スクリーニングし、ヒトＣＤ４０に対するＩｇＧ特異性を確認した。
【０３０２】
抗原特異的ハイブリドーマのパネルを、段階希釈によってクローン化し、ＣＨＯ形質転換体またはＤａｕｄｉ細胞のいずれかを用いて、ＦＡＣＳで再スクリーニングした。融合体３５８２／３５８３由来の１９種の抗体および融合体３７１６／３７１７由来の２０種の抗体を精製し、機能的活性をテストした。この抗体のパネルから、５種の強力なアゴニストを、第２のサブクローニングにおいて選択した。これら５種の抗体、すなわち１８０２．３５８２．１９Ｇ３．Ｆ１０．Ｅ１、１８０２．３５８３．５Ｇ７．Ｆ１２．Ｇ３、１８０２．３５８３．８Ｅ８．Ｃ１０．Ｇ２、１８０２．３７１６．１２Ｄ６．Ｂ１．Ｅ３および１８０２．３７１７．５Ｆ１１．Ａ１１．Ｅ７を配列決定し、さらに分析した。
【０３０３】
実施例２
完全ヒト抗ｈｕＣＤ４０抗体の作製
本明細書に開示されるヒト化抗ＣＤ４０抗体と同一のエピトープに結合し、かつ／または、ヒト化抗ＣＤ４０抗体の結合を交差遮断する、完全ヒト抗ｈｕＣＤ４０モノクローナル抗体について、本発明の方法における使用法を見出し得る。このような抗体を、以下のように、ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを用いて、作製してもよい。
【０３０４】
抗原
ｈｕＣＤ４０可溶性組換えタンパク質を、免疫化の抗原として用いる。可溶性融合タンパク質は、Ｃ末端においてマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃと連結している、ｈｕＣＤ４０の細胞外部分で構成される。この融合タンパク質を、本明細書では「ｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ融合タンパク質」と呼ぶ。融合タンパク質を、標準的な組換えＤＮＡ法によって作製し、遺伝子導入したＣＨＯ細胞中に発現させ、このＣＨＯ細胞は、可溶性融合タンパク質を培養上清中に分泌する。遺伝子導入に用いたＣＨＯ宿主細胞を、Invitrogen（カタログ番号１１６１９−０１２）から得る。分泌された可溶性融合タンパク質を、免疫原として使用するために精製した。シグナル配列を含む全長ヒトＣＤ４０の配列を、配列番号１に示す。
【０３０５】
トランスジェニックマウス
ヒトＣＤ４０に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、ＣＭＤ＋＋；ＪＫＤ＋＋；ＫＣｏ５（９２７２）＋＾；ＳＣ２０＋遺伝型からマウスを使用して調製した（以下、ＫＭ（登録商標）マウスと呼ばれる）。個々の導入遺伝子指定は、括弧内にあり、それに無作為に組み込まれた導入遺伝子の系統番号が続く。記号＋＋および＋は、同形接合性またはヘミ接合性を示すが、マウスは、無作為に組み込まれたヒトＩｇ導入遺伝子について、異型接合性および同型接合性間を区別できない、ＰＣＲに基づくアッセイを使用して日常的にスクリーニングされるため、＋指定は、これらの要素について実際に同形接合性であるマウスに与えられ得る。この株において、Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820に記述されるように、内因性マウスκ軽鎖遺伝子を、同型接合的に破壊し、内因性マウス重鎖遺伝子を、ＷＯ２００１／０９１８７の実施例１に記述されるように同型接合的に破壊する。さらに、このマウス株は、Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に記述されるように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５、ＷＯ２０００／０２６３７３に記述されるように、ヒトκ軽鎖遺伝子座のほとんどを保持する酵母人工染色体（ＹＡＣ）を保持する。
【０３０６】
マウスの免疫化
ヒトＣＤ４０に対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するために、ＫＭ（登録商標）マウスを、精製したｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ融合タンパク質で免疫化した。一般的な免疫化スキームは、Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859;Fishwild,D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４に記述されている。マウスは、抗原の第１の注入の際に、約４ヶ月齢であった。精製した組換えｈｕＣＤ４０−ｍｕＦｃ抗原調製物（融合タンパク質を発現する、遺伝子導入された哺乳類細胞から精製された１０μｇ）またはヒトＣＤ４０を遺伝子導入した３００−１９細胞のいずれかを使用して、マウスを腹腔内および皮下において免疫化した。免疫原を、ＲＩＢＩアジュバント（Sigmaカタログ番号Ｍ６５３６）と１：１で混合した。
【０３０７】
マウスを５〜７日の間隔で５回免疫化した。第１および第２の免疫化は、組換えタンパク質を用いて行った。第３の免疫化は、細胞を用い、第４の免疫化は、タンパク質を用い、第５の免疫化は、細胞を用いた。最後の免疫化の１週間後にマウスを出血させ、抗原特異的力価を評価した。免疫応答を、後眼窩出血によってモニターした。遺伝子導入した３００−１９細胞を使用するＦＡＣＳ分析によって血漿をスクリーニングし、抗ヒトＣＤ４０ヒトＩｇＧについて最も高い力価を有するマウスを融合に使用した。マウスは、屠殺と脾臓採取の２日前に可溶性抗原、および３日前に遺伝子導入された細胞を静脈内（ＩＶ）および腹腔内（ＩＰ）注射することによって、最後のブーストを受けた。
【０３０８】
ヒトＣＤ４０に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
高力価ＫＭ（登録商標）マウスから単離したマウス脾細胞およびマウス骨髄腫融合パートナーを、Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ大型チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)を使用して、電場に基づく電気融合で融合した。免疫化したマウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、同数のＰ３Ｘ６３ Ａｇ８.６.５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）非分泌性マウス骨髄腫細胞（融合数：２５４１）と融合する。得られた細胞を、β−メルカプトエタノール（１０００Ｘ、Gibco番号２１９８５−０２３）、７ｍＭ ＨＥＰＥＳ(Cellgro 25-060-Cl)、追加の２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Cellgro 25-005-Cl)、ＨＡＴ（５０Ｘ、Sigma番号Ｈ−０２６２）、５％ハイブリドーマクローニング因子(BioVeris番号２１０００１)、１０％ Ｐ３８８ＤＩ(ATCC番号ＣＲＬ ＴＩＢ−６３)コンディショニング培地およびペニシリン−ストレプトマイシン(１００ｘ、Ｃｅｌｌｇｒｏ番号３０−００２−ＣＩ)を添加した、高グルコース(Cellgro番号１０−０１３−ＣＭ)および１０％ウシ胎児血清(Hyclone番号ＳＨ３００７１.０３)を含有する選択ＤＭＥＭ培地を含む、平底マイクロタイタープレート中に２.０×１０４個細胞／ウェルでプレーティングする。約７日後、ＨＡＴを含有する培地の一部を、ＨＴ(Cellgro番号２５−０４７−ＣＩ)を含有する培地と交換する。
【０３０９】
１０〜１２日後、同種ＨＴＲＦアッセイを使用して、個々のウェルを、ヒトＩｇＧ／ヒトκ軽鎖抗体の存在についてスクリーニングする。このアッセイにおいて、９６ウェル融合プレートからの上清を、ユウロピウム−クリプテート標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）、ビオチン化ヤギ抗ヒトκ軽鎖(Bethyl番号Ａ８０−１１５Ｂ)、ストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔと混合し、１時間インキュベートする。次いで、プレートをＲＵＢＹｓｔａｒリーダーで読み取る。
【０３１０】
ヒトＩｇＧ／ヒトκ軽鎖またはヒトＩｇＧ／ヒトλ軽鎖抗体について陽性のウェルから得たハイブリドーマ細胞を、次いで、ヒトＣＤ４０を遺伝子導入した３００−１９細胞および対照としての遺伝子導入していない３００−１９細胞を用いて、ＦＡＣＳでスクリーニングする。ＦＡＣＳ陽性の親株を２４ウェルプレートに移す。数日後、個々のウェルから得た細胞上清を、ＦＡＣＳによって再スクリーニングし、ヒトＣＤ４０に対するＩｇＧ特異性を確認する。
ハイブリドーマを段階希釈によってクローン化し、ＦＡＣＳで再スクリーニングする。
【０３１１】
実施例３
抗ｈｕＣＤ４０抗体のヒト化
本発明の親（マウス）抗体を、ヒトの治療としての潜在的な使用のために、ヒト化した。最もよく適合するヒト生殖系列配列を、各マウス可変ドメインについて選択し、これらのヒトフレームワーク領域を用いて、マウスのフレームワークを抗体の「ＣＤＲ移植」型に置換した。次いで、追加のアミノ酸置換（フレームワーク復帰変異など）を、ヒト化抗体の結合親和性を回復する必要性に応じて、作製してもよい。さらなるアミノ酸置換によって、配列の傾向を除去した。本発明の抗体の様々な形態間の配列の関連性を、表６に示す。様々なアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と、可溶性ヒトＣＤ４０との結合を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ(Rapid system - Extended Detection)無標識相互作用分析装置を用いて、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）解析によって、決定した。全ての研究を、１０ ｍＭ ＮａｘＰＯ４、１３０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ｐＨ７．１）中、２５℃で行った。簡潔に述べると、抗ｈｕＣＤ４０抗体の上清（１０μｇ／ｍｌに希釈または、上清濃度が１０μｇ／ｍｌ未満の場合、原液を得た）を、９０秒のローディング時間と１０００ｒｐｍの振盪速度で、プロテインＡで被覆したバイオセンサー（Pall Fortebio #18-5010）上において得た。上清を、最初に、１μＭ組換えヒトＣＤ４０単量体（ｈｕＣＤ４０単量体）との結合について、１８０秒の会合および解離時間、１０００ｒｐｍで、結合サイクル間の１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を用いる２回の１５秒の条件付け(conditioning)の工程を伴って、スクリーニングした。１μＭのｈｕＣＤ４０単量体実験において、結合の信号を示した全ての上清を、次に、３倍希釈系列における７種の異なる濃度のｈｕＣＤ４０単量体との結合についてテストし、ここで最も高い濃度は、１μＭのスクリーニング実験での結合の信号強度に依存して、１０μＭのｈｕＣＤ４０単量体または１μＭのｈｕＣＤ４０単量体のいずれかである。選択した抗体およびその配列バリアントにおける結果を、表６に示す。
表６：抗ＣＤ４０抗体の結合親和性
【表６】
2018526978.tif 000007
*＝比較の目的のため、親の５Ｆ１１は、５Ｆ１１−４５抗体と並列して同一のアッセイを行った際、８．２ｎＭ（４．７ｎＭではなく）のＫＤを示した。
【０３１２】
ヒト化抗体において、ＶＨおよびＶＬカラムは、フレームワーク領域の基礎となるヒト可変ドメインの生殖系列を提供する。「ＣＤＲ移植」は、記載されたヒトフレームワーク配列上に直接移植された、改変されていない親（マウス）ＣＤＲを含む、可変ドメインを指す。表６における全ての配列バリアントの残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに従い、したがって、表６の配列変化の位置は、配列表における抗体配列の残基の番号付けと適合しない。下線を用いて、潜在的な配列の傾向（すなわち、化学修飾および潜在的な分解にさらされ、生成物の不均一性をもたらす、残基）を修正することを意図する配列の改変を示す。他の配列改変は、親和性を回復すること、典型的にはフレームワークの復帰変異（ヒト生殖系列フレームワーク配列から、元のマウスフレームワーク残基に戻すこと）を意図する。抗体５Ｇ７の重鎖におけるＭ６９Ｌ改変は、フレームワーク復帰変異および傾向の修正の両方である。
【０３１３】
実施例４
抗ＣＤ４０抗体のエピトープビニング実験
エピトープビニング実験を行い、抗ヒトＣＤ４０抗体が、ｈｕＣＤ４０との結合において、他の物質と競合し、したがって、類似のエピトープに結合することを決定してもよい。抗ｈｕＣＤ４０抗体間の対での競合を以下のように決定する。基準抗体は、センサーチップの表面に結合しており、テスト抗体を、ｈｕＣＤ４０ポリペプチドコンストラクトと共に、混合物中でプレインキュベートする。プレインキュベートした混合物を、センサーチップ上に流し、テスト抗体が、チップ表面上でのｈｕＣＤ４０ポリペプチドコンストラクトと基準抗体との結合に干渉する程度を決定する。このような競合実験を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標） ＳＰＲ装置を用いて行ってもよい。簡潔に述べると、基準の抗ｈｕＣＤ４０抗体を、センサーチップＣＭ５チップ（Series S, GE Healthcareカタログ番号ＢＲ−１００５−３０）表面、フローセル２、フローセル３およびフローセル４（５０００ＲＵ）上に固定化し、フローセル１を負の対照として用いる。テスト抗体を出発濃度１２０μｇ／ｍＬ（２Ｘ）に希釈する。テスト抗体の希釈系列を、７種の異なる濃度および対照試料（０μｇ／ｍＬ）について、バッファーで抗体の濃度を１：３希釈することによって作製し、滴定曲線を得る。各抗体の濃度系列を、半量で２つに分ける。第１の半量の濃度系列において、４０ｎＭ（２Ｘ）ヒトＣＤ４０抗原（例えば、ｈｕＣＤ４０／Ｆｃ）を加え、最終濃度系列（６０μｇ／ｍＬ〜０.０μｇ／ｍＬ）を作製し、各ウェルにおいて抗原の終濃度を２０ｎＭとした。第２の半量の濃度系列において、抗原の代わりにバッファーを加え、抗体を同一濃度に希釈し、この半量をブランクとして処理する。テスト抗ＣＤ４０抗体とｈｕＣＤ４０／Ｆｃとの複合体を２時間インキュベートした。４０μＬの複合体を、参照抗体を被覆する表面上に、３０μＬ／分で注入する。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００表面プラズモン共鳴装置を用い、ランニングバッファーはＨＢＥ−ＥＰ、GE Healthcareカタログ番号ＢＲ−１００１−８８、濾過および脱気した０.０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、０.１５ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０である。表面を、２５ｍＭ ＮａＯＨ（注文コード：ＢＲ−１００３−５８、GE Healthcare）を用いて、１００μＬ／分、５秒間で、再生する。データをマイクロソフトエクセルを用いて分析し、テスト抗体の濃度を、対応する応答ユニットに対してプロットし、滴定曲線を得る。
【０３１４】
本発明の抗ＣＤ４０抗体における、このようなエピトープビニング実験の結果を、図２に示す。抗体５Ｆ１１および８Ｅ８は、リガンド（ＣＤ４０Ｌ）結合を遮断する。５種の本発明の抗ＣＤ４０抗体を３つのエピトープ群に分類する（１２Ｄ６／５Ｇ７／１９Ｇ３、５Ｆ１１／５Ｇ７／１９Ｇ３、および８Ｅ８）。
【０３１５】
実施例５
ＨＤＸによるエピトープマッピング
本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体１２Ｄ６、５Ｇ７、１９Ｇ３および５Ｆ１１におけるエピトープを、水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）で決定した。ＨＤＸ−ＭＳは、アミド骨格の水素原子の重水素交換の速度および程度をモニターすることで、溶液中のタンパク質の立体構造および立体構造ダイナミクスを調査する（Huang & Chen (2014) Anal. Bioanalytical Chem. 406:6541; Wei et al. (2014) Drug Disc. Today 19:95）。ＨＤＸのレベルは、アミド骨格の水素原子の溶媒露出度およびタンパク質の水素結合に依存する。ＨＤＸによるタンパク質の質量の増加は、ＭＳで正確に測定できる。この技術を酵素消化と組み合わせると、ペプチドレベルでの構造上の特徴を決定でき、内部に折り畳まれたペプチドまたはタンパク質−タンパク質複合体の界面に隔離されたペプチドから、表面に露出したペプチドを区別できる。典型的に、重水素標識および続く反応停止実験を行い、その後、酵素消化、ペプチド分離およびＭＳ分析を行う。
【０３１６】
エピトープマッピング実験の前に、非重水素化実験を行い、組換えヒトＣＤ４０単量体（１０μＭ）ならびにｍＡｂ １２Ｄ６、５Ｇ７、１９Ｇ３および５Ｆ１１とＣＤ４０とのタンパク質複合体（モル比１：１）における、共通のペプチドの表を作成した。ＨＤＸ−ＭＳ実験において、５μＬの各試料（それぞれ、ｍＡｂ １２Ｄ６、５Ｇ７、１９Ｇ３および５Ｆ１１と、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ）を、５５μＬのＤ２Ｏバッファー（１０ｍＭリン酸バッファー、Ｄ２Ｏ、ｐＨ７．０）で希釈し、標識化反応を開始した。種々の時間、反応を行った：２０秒、１分、１０分および２４０分。各標識化反応時間が終わるまでに、クエンチングバッファー（４Ｍ ＧｄｎＣｌおよび０．４Ｍ ＴＣＥＰを含む１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ２．５、１：１、ｖ／ｖ）を添加して、反応を停止し、５０μＬの反応を停止した試料を分析するため、Ｗａｔｅｒｓ ＨＤＸ−ＭＳシステムに注入した。共通のペプチドの重水素の取り込みレベルを、ＣＤ４０ ｍＡｂが存在する／存在しない場合において、モニターした。得られた配列のカバー度は８２％であった。
【０３１７】
抗ＣＤ４０ ｍＡｂ １２Ｄ６、５Ｇ７、１９Ｇ３および５Ｆ１１におけるＨＤＸエピトープを、表７に示す。抗体１２Ｄ６は２つのペプチドを保護し、そのうち１つのペプチド（１１〜２８残基）は、シグナル配列の一部を含むため、それ自体が生理学的に関連する可能性は低いが、１２Ｄ６が、ｍＡｂ ５Ｇ７および１９Ｇ３が接触しない、２１〜２８領域において接触することを示す。
表７：ＨＤＸエピトープ
【表７】
2018526978.tif 000008
【０３１８】
実施例６
酵母ディスプレイによるエピトープマッピング
本発明の選択されたキメラまたはヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体のエピトープを、無作為に突然変異させたｈｕＣＤ４０細胞外領域バリアントを酵母上にディスプレイし、これらの酵母を、それらが特定の抗体と結合できないことに基づいて選別することによって決定する。結合できなかった、選択された酵母細胞を増幅し、それらが本発明の特定のキメラまたはヒト化型抗体と結合できないことに基づく、さらなる選択のラウンドを行う。例えば、Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342:539を参照。得られた酵母について、ｈｕＣＤ４０バリアントの配列を決定し、抗体結合に対する各残基の効果について分析する。本発明の抗体の結合エピトープを、単一アミノ酸突然変異が本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体との結合を破壊する、ｈｕＣＤ４０配列内の遺伝子座として、決定する。
【０３１９】
簡潔に述べると、エラープローンＰＣＲを使用して、ヒトＣＤ４０をコードするＤＮＡを、ｃ−ｍｙｃタグ配列および酵母細胞壁タンパク質Ａｇａ１ｐをさらに含む融合タンパク質のアミノ末端部分として、ｈｕＣＤ４０バリアントの発現を可能にするコンストラクト中にクローニングする。このようなコンストラクトは、酵母（サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)）中に発現すると、Ａｇａ１ｐポリペプチドによって細胞表面に固定されたバリアントｈｕＣＤ４０ポリペプチドを、酵母細胞の表面上にディスプレイする。場合により、ｃ−ｍｙｃタグを、所定の酵母細胞上のｈｕＣＤ４０融合タンパク質のディスプレイにおける陽性対照として使用できる。酵母細胞をＦＡＣＳによって選別し、適切にフォールディングしたｈｕＣＤ４０融合タンパク質として発現する（アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識されたヤギ抗マウスＩｇＧによって二次的に検出される、対照マウス抗ｈｕＣＤ４０抗体の結合によって決定されるように）が、本発明の抗体と結合しない（フィコエリトリン（ＰＥ）標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧを用いる二次的な検出によって決定されるように）酵母細胞をプールし、増幅し、その後の選択のラウンドにおいて使用する。数回の選択のラウンド後に残存する酵母から得たコンストラクトについて、ｈｕＣＤ４０配列を決定する。抗ｈｕＣＤ４０抗体選択を伴わない対照実験を行い、ｈｕＣＤ４０配列に沿った各位置での良好な変異の適用範囲を確認し、選択されたライブラリーを用いて得られた結果を正規化するためのベースラインを提供する。
【０３２０】
実施例７
抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性
本発明の選択された抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性におけるＦｃ配列の変異の効果を、未成熟樹状細胞（ＤＣ）の活性化を測定することにより、評価した。ヒトＩｇＧ１ｆ（対照）、ＳＥ、ＳＥＬＦ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４、Ｖ８およびＶ１２ Ｆｃ配列を有する、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ １２Ｄ６−２４コンストラクトで、実験を行った。ヒト単球（ＣＤ１４＋）を、プラスチック接着(plastic adherence)またはヒトＣＤ１４マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を用いて、健常で正常なドナーから単離した。単球を、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ(Miltenyi Biotec)および１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−４(Miltenyi Biotec)と共に培養した。２日目および５日目に、培地の半分を除去し、補充した。未成熟樹状細胞を６〜７日目に回収した。２つのドナー由来のＤＣを、表示した濃度の抗体と共に、一晩、３７℃でインキュベートした。細胞培養上清を回収し、ヒトＩＬ−６産生について、アッセイした(Cisbio)。図３Ａおよび３Ｂ参照。
【０３２１】
対照のヒトＩｇＧ１ｆ抗体は、１００ｎＭ以下での使用において、ＩＬ−６を分泌せず、Ｐ２３８Ｄバリアントはわずかに誘導した。対照的に、ＳＥ、ＳＥＬＦ、Ｖ９およびＶ１２バリアントは全て、ＩＬ−６分泌を劇的に誘導し、Ｖ８およびＶ４は中間の効果を示した。これらの結果は、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合親和性とおおよそ相関し、適切なＦｃ配列バリアントの使用が、アゴニスト活性の増強を伴う抗ＣＤ４０抗体をもたらし得ることを確認する。
【０３２２】
さらに、８Ｅ８、５Ｇ７、１２Ｄ６、１９Ｇ３および５Ｆ１１可変領域を有する抗体間のアゴニスト活性における違いを、共通のヒトＩｇＧ１ｆ Ｖ１２定常ドメインを有するキメラ抗ＣＤ４０ ｍＡｂコンストラクトを用いる実験において評価した。活性化を、細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、抗体を表示したように添加し、一晩３７℃でインキュベートすることによって、未成熟樹状細胞（前述の段落で記述されるように単離した）においてインビトロで測定した。その後、細胞を回収し、蛍光性抗ＣＤ５４抗体で染色し、これを、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）で検出した。図４参照。
【０３２３】
対照のヒトＩｇＧ１ｆ抗体はＣＤ５４の上方制御を有意に引き起こさず、１２Ｄ６はＣＤ５４の劇的な上方制御を引き起こした。抗体１９Ｇ３および８Ｇ８は、１２Ｄ６よりもやや効果的ではなく、抗体５Ｇ７および５Ｆ１１は互いに類似しており、相対的に弱い刺激を示した。抗体５Ｆ１１は、ほぼ最高の結合親和性を有するが、弱いアゴニストであり、抗体１９Ｇ３はその逆であるため、活性化の結果は、ＣＤ４０に対する結合親和性と必ずしも相関しない。この違いの理由に関係なく、これらの結果は、適切な抗原結合ドメイン配列の使用が、アゴニスト活性が増強した抗ＣＤ４０抗体を得るのに重要であることを確認する。
【０３２４】
実施例８
ＤＧ異性化の改善
Ｖ４およびＶ９ Ｆｃバリアント配列を有する、本発明の抗体は、Ｄ２７０の位置における、許容できないレベルのＤＧ異性化を示す。このような異性化は、生成物の不均一性および潜在的な効力の減少をもたらすため、望ましくない。このような異性化を減少させるため、Ｖ４ Ｆｃの２７０番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸（Ｄ２７０Ｅ）に交換し、Ｖ９ Ｆｃの２７０番目をアラニン、グルタミン酸、グルタミン、セリンおよびスレオニン（Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｓ、Ｄ２７０Ｔ）に交換した。これらの抗体を発現する細胞から上清を得て、ｈＣＤ３２／ＦｃγＲＩＩとの結合についてアッセイした。２７０番目における変異を伴わない、選択された精製した抗体を対照として用いた。これらの実験を、ｍＡｂ １２Ｄ６−２４および５Ｆ１１−４５由来の可変ドメインを有する抗体上で行った。結果を、図５に示す。
【０３２５】
Ｖ４およびＶ９ Ｆｃバリアント両方において、Ｄ２７０Ｅ置換は、受容体結合の中程度の減少をもたらした。テストした他のＶ９ Ｆｃバリアント（Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｓ、Ｄ２７０Ｔ）は、受容体結合の、より大きな減少をもたらした。結果は、抗体が１２Ｄ６または５Ｆ１１であることに依存しなかった。全ての場合において、テストした３つの受容体（ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩａ−Ｒ１３１およびＦｃγＲＩＩｂ）との相対的な結合（結合の順番）は、ＦｃγＲＩＩａ−Ｒ１３１およびＦｃγＲＩＩｂとのおおまかに相当する結合およびＦｃγＲＩＩａ−Ｈ１３１との有意に弱い結合と共に、類似したままであった。
【０３２６】
Ｖ４およびＶ９バリアントの両方において、Ｄ２７０Ｅ置換は、許容できるような高いＦｃγＲ親和性を保持し、本発明の抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性の増強において望まれる、ＦｃγＲＩＩｂに対する特異性を維持した。
表８：配列表の要約
【表８−１】
2018526978.tif 000009
【表８−２】
2018526978.tif 000010
【０３２７】
配列表は、成熟重鎖および軽鎖の配列を示す（すなわち、配列はシグナルペプチドを含まない）。本発明の抗体の産生におけるシグナル配列は、例えばヒト細胞において、配列番号７８に与えられる。
【０３２８】
相当する物
当業者は、本明細書に開示される具体的な実施形態の多くの等価物を認識し、または単なる慣例的な実験を使用して確認できる。このような等価物は、以下の請求項に包含されることが意図される。
【図１】
2018526978.tif 000011
【図２】
2018526978.tif 000012
【図３−１】
2018526978.tif 000013
【図３−２】
2018526978.tif 000014
【図４】
2018526978.tif 000015
【図５】
2018526978.tif 000016
【配列表】
2018526978000001.app
【国際調査報告】
2018526978.tif 000017
2018526978.tif 000018
2018526978.tif 000019
2018526978.tif 000020
2018526978.tif 000021
2018526978.tif 000022
2018526978.tif 000023