(57)【要約】本発明は、増殖条件下で株のβ−ガラクトシダーゼ活性を評価することおよび活性が、ａ）連鎖球菌もしくは乳酸杆菌株について約６０以上であるミラー単位、またはｂ）プロピオン酸菌株について約３以上であるミラー単位を有するかどうかを特定することを含む高収量のガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を産生する能力および／または産生について１種または複数の連鎖球菌、乳酸杆菌またはプロピオン酸菌細菌株をスクリーニングするための発見プラットフォームに関する。本発明は、スクリーニングプロセスによって特定された細菌株から産生されたＧＯＳを組み込んでいる組成物にも関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖条件下で株のβ−ガラクトシダーゼ活性を評価するステップと、
前記活性が
ａ）連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）もしくは乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株について約６０以上であるミラー単位（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｕｎｉｔｓ）、または
ｂ）プロピオン酸菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株について約３以上であるミラー単位
を有するかどうかを特定するステップと
を含む、高収量のガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を産生する能力および／または産生について１種または複数の連鎖球菌、乳酸杆菌またはプロピオン酸菌細菌株をスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記方法が、１種または複数の株を標準増殖条件下で所与のインキュベーション時間増殖させるステップと、次いで細胞を溶解するステップと、溶解物におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を評価するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、
ｉ）１種または複数の株を約３７℃で最大４０時間インキュベートするステップと、
ｉｉ）インキュベーション中より低い温度で細胞を遠心分離するステップと、
ｉｉｉ）前記細胞を溶解して前記溶解した細胞から上清を取り出すステップと、
ｉｖ）前記上清における、ミラー単位で表わされる、β−ガラクトシダーゼ活性を評価するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２種以上の株が前記方法によって、必要とされる前記β−ガラクトシダーゼ活性を有すると特定される場合に、前記方法が、
ｃ）どの株がＧＯＳの最高収量を有するか評価するためにいくつかの時点において、より高いおよびより低い温度で前記株をスクリーニングするステップ
をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記より高い温度が約５０℃でありかつ前記より低い温度が約３０℃である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌株が、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、プロピオニバクテリウム・イエンセニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、あるいはそれらの亜種または突然変異株から選択される株を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１種または複数の連鎖球菌、乳酸杆菌またはプロピオン酸菌細菌株から産生されたガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むプレバイオティクス組成物であって、前記ＧＯＳが前記連鎖球菌、乳酸杆菌またはプロピオン酸菌細菌株のための選択的増殖培地として作用し、前記ＧＯＳが前記細菌株における逆β−ガラクトシダーゼ反応によって産生されたものと実質的に同じ形態であり、前記連鎖球菌、乳酸杆菌またはプロピオン酸菌細菌株のβ−ガラクトシダーゼ活性が、
ａ）連鎖球菌または乳酸杆菌株について約６０以上であるミラー単位、あるいは
ｂ）プロピオン酸菌株について約３以上であるミラー単位
を有する、組成物。
【請求項８】
前記ＧＯＳが、以下の細菌株：ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、プロピオニバクテリウム・イエンセニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、あるいはそれらの亜種または突然変異株のうちの１つまたは複数によって産生され、および／またはそれらに対して選択的である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、カプセル化される、請求項７または８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、体の胃腸環境の少なくとも一部を通り抜けかつその機能特性を維持することを可能にするために賦形剤または担体化合物をさらに含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、液体または粉末の形態でありかつ／あるいは固体または液体食料品と混合され得る、請求項７から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物の前記ＧＯＳが、請求項１から６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法において特定された１種の株または複数種の株によって産生される、請求項７から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ガラクトシダーゼの逆酵素反応によって、高収量のガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を産生する能力がある細菌株を予測および特定するためのスクリーニング方法に関する。結果として生じるＧＯＳは、選択された細菌株、種または属の増殖のための選択的プレバイオティクスとして配合され得る。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスは、宿主に健康上の利益を与える細菌である。典型的には、プロバイオティクスの細菌株の培養物は、天然に存在する腸の細菌の個体群を追加および増大するために個体に摂取または投与される。いくつかの健康上の利益は、いくつか例を挙げればがん、旅行者の下痢、過敏性腸症候群、および乳糖不耐症の発生率を減少することを含めて、プロバイオティクスと関連している。予備調査も、プロバイオティクスがコレステロールの血清中レベルおよび血圧の減少において有用かつ糖尿病の調節を助け得ることを示す。
【０００３】
プレバイオティクスは、乳酸杆菌またはビフィズス菌などの、有益な常在性腸内微生物叢の数および／または活性を選択的に向上し得る食事成分であり、かつ食品分野において非常に増加した利用が認められている。プレバイオティクスは、健康の改善に寄与する結腸細菌によって選択的に代謝される非消化性食品成分である。そのようなものとして、それらの使用は、常在性腸微生物環境内の有益な変化を促進することができかつしたがってそれらは、プロバイオティクスの生存性を助け得る。それらは、腸において選択的に代謝されない、ペクチン、セルロース、キシランのようなほとんどの食物繊維とは異なる。プレバイオティクスとしての分類の基準は、胃液酸度、哺乳類の酵素による加水分解および上部胃腸管における吸収に耐えなければならないこと、腸内細菌叢によって発酵することならびに健康および良好な状態（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）に関連した腸内細菌の増殖および／または活性を選択的に刺激することである。
【０００４】
フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ、イヌリンおよびオリゴフルクトース）およびガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、ヒト介入研究において繰り返しプレバイオティクスの分類の基準を満たすことが実証されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細菌株が相対的に高収量のプレバイオティクスを産生できる可能性を予測する方法を提供することが、本発明の目的である。産生する能力があるプロバイオティクス細菌株を迅速に特定するためならびに／あるいは次にその特定の株、種または属のための選択的増殖プレバイオティクスとして用いられ得る高収量のＧＯＳを産生するためのスクリーニング方法を提供することも、本発明の目的である。これはスクリーニング方法が高スループットであった場合に有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様に従って、増殖条件下で株のβ−ガラクトシダーゼ活性を評価するステップと、
活性が
ａ）連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）もしくは乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株について約６０以上であるミラー単位（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｕｎｉｔｓ）、または
ｂ）プロピオン酸菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株について約３以上であるミラー単位
を有するかどうかを特定するステップと
を含む、高収量のガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を産生する能力および／または産生について１種もしくは複数の連鎖球菌、乳酸杆菌もしくはプロピオン酸菌細菌株をスクリーニングする方法が提供される。
【０００７】
方法は、１種または複数の株を標準増殖条件下で所与のインキュベーション時間増殖させるステップと、次いで細胞を溶解するステップと、溶解物におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を評価するステップとを含み得る。
【０００８】
方法は、
ｉ）１種または複数の株を約３７℃で最大４０時間インキュベートするステップと、
ｉｉ）インキュベーション中より低い温度で細胞を遠心分離するステップと、
ｉｉｉ）細胞を溶解して溶解した細胞から上清を取り出すステップと、
ｉｖ）上清における、ミラー単位で表わされる、β−ガラクトシダーゼ活性を評価するステップと
をさらに含み得る。
【０００９】
２種以上の株が方法によって、必要とされるβ−ガラクトシダーゼ活性を有すると特定される場合に、方法は、
ｃ）どの株がＧＯＳの最高収量を有するか評価するためにいくつかの時点において、より高いおよびより低い（少なくともその内の１つが増殖温度と異なることになる）温度で株をスクリーニングするステップ
をさらに含み得る。より高い温度は、約５０℃であってよくかつより低い温度は約３０℃であってよい。
【００１０】
細菌株は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、プロピオニバクテリウム・イエンセニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、あるいはそれらの亜種または突然変異株から選択される株を含み得る。
【００１１】
別の関連した態様に従って、方法が、増殖率、それぞれの株について細菌株によってプレバイオティクス組成物の発生のために利用された酵素の酵素産生および酵素活性を評価することならびに最高増殖率、酵素産生および酵素活性を示すそれらの株を選択することを含む、プレバイオティクス組成物の高収量産生に適するであろう、細菌株または株を特定するために細菌株の多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）をスクリーニングする方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらなる態様に従って、１種または複数の連鎖球菌、乳酸杆菌またはプロピオン酸菌細菌株から産生されたガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むプレバイオティクス組成物であって、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）が連鎖球菌、乳酸杆菌またはプロピオン酸菌細菌株のための選択的増殖培地として作用し、ＧＯＳが細菌株における逆β−ガラクトシダーゼ反応によって産生されたものと実質的に同じ形態であり、連鎖球菌、乳酸杆菌またはプロピオン酸菌細菌株のβ−ガラクトシダーゼ活性が、
ａ）連鎖球菌または乳酸杆菌株について約６０以上であるミラー単位、あるいは
ｂ）プロピオン酸菌株について約３以上であるミラー単位
を有する、プレバイオティクス組成物が提供される。
【００１３】
ＧＯＳは、以下の細菌株：ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、プロピオニバクテリウム・イエンセニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、あるいはそれらの亜種または突然変異株のうちの１つまたは複数によって産生され、および／またはそれらに対して選択的であり得る。
【００１４】
プレバイオティクス組成物は、好ましくは腸内の乳酸杆菌またはプロピオン酸菌プロバイオティクス細菌株の割合のポジティブなおよび段階的な変化を誘発するような有効量で組成物中に存在するであろう。より多くの量は、微生物叢における変化がすぐに必要とされる場合または組成物が現在存在しない新しい細菌株を腸に植え付けることを助けるために使用されている場合に利用され得る。
【００１５】
プレバイオティクス組成物は、カプセル化され得る。多数のカプセル化技法が当業者には明らかでありかつ採用された技法は消化推移中にプレバイオティクスの増殖培地の必要とされる安定性に適応されるであろう。
【００１６】
プレバイオティクス組成物は、それが体の胃腸環境の少なくとも一部を通り抜けかつ効率的に送達され、かつ下部腸（ｌｏｗｅｒ  ｇｕｔ）において放出されることを可能にするために賦形剤または担体化合物をさらに含み得る。プレバイオティクスは、濃縮および／または凍結乾燥され得る。組成物は、液体（飲用可能であってよい）および／または固体または液体食料品と混合され得る粉末の形態などの、いくつかの形式であってよい。
【００１７】
プレバイオティクス組成物は、ビタミン、ミネラル、植物性化学物質、酸化防止剤、プロバイオティクス細菌株およびそれらの組み合わせなどの、１種または複数の活性成分と組み合わされ得る。
【００１８】
ビタミンには、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミンならびにそれらの組み合わせなどの脂溶性ビタミンが含まれ得る。一部の実施形態において、ビタミンには、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、Ｂビタミン（チアミンまたはＢ１、リボフラビンまたはＢ２５ナイアシンまたはＢ３、ピリドキシンまたはＢ６、葉酸またはＢ９、シアノコバラミンまたはＢ１２、パントテン酸、ビオチン）、およびそれらの組み合わせなどの水溶性ビタミンが含まれ得る。
【００１９】
ミネラルには、これに限定されないがナトリウム、マグネシウム、クロム、ヨウ素、鉄、マンガン、カルシウム、銅、フッ化物、カリウム、亜リン酸、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。
【００２０】
酸化防止剤には、これに限定されないがアスコルビン酸、クエン酸、ローズマリー油、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＥホスファート、トコフェロール、ジ−アルファ−トコフェリルホスファート、トコトリエノール、アルファリポ酸、ジヒドロリポ酸、キサントフィル、ベータクリプトキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ベータ−カロテン、カロテン、混合カロテノイド、ポリフェノール、フラボノイド、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。
【００２１】
植物性化学物質には、これに限定されないがカロテノイド（ｃａｒｔｏｔｅｎｏｉｄ）、クロロフィル、クロロフィリン、繊維質、フラバノイド、アントシアニン、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、フラバノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン、テアフラビン、テアルビジン、プロアントシアニン、フラボノール、クエルセチン、ケンペロール、ミリセチン、イソラムネチン、ヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、タンゲレチン、フラボン、アピゲニン、ルテオリン、リグナン、植物エストロゲン、レスベラトロル、イソフラボン、ダイドゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、大豆イソフラボン、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。
【００２２】
組成物は、薬物および／または栄養補助食品および／または栄養補給食品または機能性食品としての使用のためであってよい。
【００２３】
好ましくは、組成物のＧＯＳは、本明細書において上述されたようなスクリーニング方法において特定された株（１つまたは複数を含む）によって産生される。
【００２４】
本発明の実施形態は、ここで例としてのみかつ以下の図への参照と共に記述される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】異なる温度および時点で合成されたＰ．イエンセニーの最も優勢なＧＯＳ種間の比率を示すグラフである。
【図２】選択された乳酸杆菌および２種のプロピオン酸菌株の３０℃および５０℃における２つのＧＯＳ形成率を示すグラフである。
【図３】選択された株についての３０℃および５０℃における理論上のＧＯＳ形成率に対する実際のＧＯＳ形成率の比率を示すグラフである。
【図４】選択された株における初期スクリーニング実験および後のＧＯＳ合成実験からのβ−ガラクトシダーゼ活性の差の分析を示すグラフである。
【図５】選択された株のβ−ガラクトシダーゼの発現の（対数期／静止期（Ｌｏｇ／Ｓｔａｔ）比による）依存関係の分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
機構的にグリコシダーゼは、それらの好ましい受容体分子として水を使用する全てのトランスフェラーゼである。しかし、高濃度の基質炭水化物など、適切な環境下では、これらの酵素は、基質（グリコシル供与体として働く）から単糖部位を他の基質または非基質炭水化物（グリコシル受容体として働く）へ変換させるであろう。典型的には、これらの反応の産生物は、全ての可能なグリコシド結合を含有するが異なる量の複合混合物である。反応が動力学的に制御されるので、合成された結合プロファイルは、産生酵素によるそれらの結合の加水分解の速度定数にマッピングされるはずである。その結果としてオリゴ糖は、産生生物によって胃腸の生態系における他のものによるよりも容易に代謝され得る。このアプローチは、臨床試験において有望性が示されている。
【００２７】
しかしながら、多くの酵素合成反応においてラクトースに加えて受容体として作用するであろう他の炭水化物を含むことは可能である。このようにして、新規の構造を含有する新規の混合物が形成され得る。
【００２８】
本実験の基本は、新規のＧＯＳを産生するように微生物においてβ−ガラクトシダーゼを可逆的に使用することであった。通常、β−ガラクトシダーゼは、ラクトースを加水分解するであろう。しかしながら、基質および温度に関して、反応条件を変更することによって、酵素は可逆的に作用しかつラクトースのオリゴ糖版（ＧＯＳ）を生成する。
【実施例】
【００２９】
実験
実験を２つの段階において実行した。第１の段階は、オルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）の分解に基づくβ−ガラクトシダーゼ加水分解活性の検出のために３６０細菌株をスクリーニングした。細菌株を、３種の細菌属（連鎖球菌、乳酸杆菌、プロピオン酸菌）から選択してそれぞれの属の増殖全体を改善することを試みるために増殖条件をそれぞれの属について調整した。ミラー単位で表わされる、β−ガラクトシダーゼ活性を評価し次いで必要とされる活性に適合する株を第２の段階に進めた。第２の段階の間、それらの実際のＧＯＳを合成する能力について選択された株をスクリーニングするために実行可能性調査段階を実行した。
【００３０】
実験１
３６０の連鎖球菌、乳酸杆菌およびプロピオン酸菌株のスクリーニングを、ＯＮＰＧの分解に基づくβ−ガラクトシダーゼ加水分解活性の検出のために実行した。増殖条件を、それぞれの属およびミラー単位で評価される総β−ガラクトシダーゼ活性のために調整した。
【００３１】
ストレプトコッカス・サーモフィルスにおけるβ−ガラクトシダーゼ活性
Ｓ．サーモフィルス株を、−８０℃ストックから標準の９６ウェルプレート内の１％グルコースを添加した２００μｌ  ＧＭ１７培地において３７℃で２２時間予備増殖させた。培養物を、深型ウェルプレート内の１％グルコースを補給した１６００μｌ  ＧＭ１７に１００倍再希釈した。増殖を、３７℃の嫌気条件で２２時間実行した。ＯＤ６００を、培養物の１０倍希釈後に決定した。β−ガラクトシダーゼ活性のために、細胞を、４℃において５０００ｘｇで遠心分離し続いてペレットを８００μｌ  ０．０５Ｍ  ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ＝７．０において０．５グラムのシリカビーズ（０．１ｍｍ）を用いて溶解した。上清を、ミラー単位を評価するための標準のＯＮＰＧ試験プロトコルを用いて３０℃においてβ−ガラクトシダーゼ活性の決定に用いた。下表１は、上記のプロトコルを用いてスクリーニングしたそれらのＳ．サーモフィルス株の結果を例示する。
【００３２】
【表１−１】
2018515120.tif 000003
【００３３】
【表１−２】
2018515120.tif 000004
【００３４】
【表１−３】
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【００３５】
プロピオン酸菌におけるβ−ガラクトシダーゼ活性
様々なプロピオン酸菌株（異なる種および亜種を含む）を、−８０℃ストックから標準の９６ウェルプレート内の１％グルコースを添加した２００μｌ  ＬＢ培地において３０℃で７２時間予備増殖させた。培養物を、深型ウェルプレートの１％グルコースを補給した１６００μｌ  ＬＢに１００倍再希釈した。増殖を、３７℃の嫌気条件で９６時間実行しＯＤ６００を、培養物の１０倍希釈後に決定した。β−ガラクトシダーゼ活性を評価するために、細胞を、４℃において５０００ｘｇで最初に遠心分離した。次いでペレットを、８００μｌ  ０．０５Ｍ  ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ＝７．０において０．５グラムのシリカビーズ（０．１ｍｍ）を用いて溶解した。上清を、標準のプロトコルを用いる３０℃におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の決定に用いた。
【００３６】
下表２は、上記のプロトコルを用いてスクリーニングしたそれらのプロピオン酸菌株の結果を例示する。
【００３７】
【表２−１】
2018515120.tif 000006
【００３８】
【表２−２】
2018515120.tif 000007
【００３９】
【表２−３】
2018515120.tif 000008
【００４０】
【表２−４】
2018515120.tif 000009
【００４１】
【表２−５】
2018515120.tif 000010
【００４２】
乳酸杆菌におけるβ−ガラクトシダーゼ活性
様々な乳酸杆菌株（異なる種および亜種を含む）を、−８０℃ストックから適切な嫌気条件において標準の９６ウェルプレート内の２００μｌ  ＭＲＳ培地において３０℃または３７℃のいずれかで４８時間予備増殖させた。培養物を、深型ウェルプレート内の１６００μｌ  ＭＲＳ培地に１００倍再希釈した。増殖を、３７℃の嫌気条件で４０時間実行した。ＯＤ６００を、培養物の１０倍希釈後に決定した。β−ガラクトシダーゼ活性のために、細胞を、４℃において５０００ｘｇで遠心分離した。続いてペレットを、８００μｌ  ０．０５Ｍ  ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ＝７．０において０．５グラムのシリカビーズ（０．１ｍｍ）を用いて溶解した。上清を、次いで標準のプロトコルを用いる３０℃におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の決定に用いた。
【００４３】
下表３は、上記のプロトコルを用いてスクリーニングしたそれらの乳酸杆菌株の結果を例示する。
【００４４】
【表３−１】
2018515120.tif 000011
【００４５】
【表３−２】
2018515120.tif 000012
【００４６】
【表３−３】
2018515120.tif 000013
【００４７】
【表３−４】
2018515120.tif 000014
【００４８】
【表３−５】
2018515120.tif 000015
【００４９】
【表３−６】
2018515120.tif 000016
【００５０】
【表３−７】
2018515120.tif 000017
【００５１】
【表３−８】
2018515120.tif 000018
【００５２】
【表３−９】
2018515120.tif 000019
【００５３】
６０ミラー単位より大きいβ−ガラクトシダーゼ活性値を有する株を特定して可能性があるＧＯＳ合成についてのさらなる評価および初期の最適化検討に進めた。２種のＳ．サーモフィルス株を選択し、６０を超えるミラー単位出力を有する４種の乳酸杆菌（Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．デルブルッキー、Ｌ．ファーメンタム）および６０ミラー単位未満のβ−ガラクトシダーゼ活性を有する１種の乳酸杆菌（Ｌ．プランタルム２８３０）（対照用）を分析した。スクリーニングしたプロピオン酸菌のいずれも６０を超えるβ−ガラクトシダーゼレベルを与えなかったので、それぞれの種の最高のβ−ガラクトシダーゼレベル産生株を含むものも、調査の次の段階に含めた。
【００５４】
選択した株におけるＧＯＳ産生の分析
それぞれの種について以下の増殖プロトコルを用いた： 
Ｓ．サーモフィルス−Ｓ．サーモフィルス株を、−８０℃ストックから閉じた１００ｍｌびん内の１％グルコースを添加した１００ｍｌ  ＧＭ１７培地において３７℃で２２時間予備増殖させた。培養物を、次いで１％グルコースを添加したＧＭ１７培地で満たされた１リットルびんにおいて５０、２００、１０００および４０００倍希釈した。増殖を、対数培養および採取の目標時間における静止期培養を確実にするために計算した設定時間３７℃で実行した。
【００５５】
プロピオン酸菌−プロピオン酸菌株を、−８０℃ストックから１％グルコースを補給した１００ｍｌ  ＬＢ培地において３０℃で７２時間予備増殖させた。培養物を、１％グルコースを補給したＬＢ培地で満たされた１リットルびんにおいて５０、２００、１０００および４０００倍希釈した。増殖を、対数培養および採取の目標時間における静止期培養を確実にするために計算した設定計算時間３０℃で実行した。
【００５６】
乳酸杆菌−乳酸杆菌株を、−８０℃ストックから１００ｍｌ  ＭＲＳ培地において３７℃で４８時間予備増殖させた。培養物を、１％グルコースを添加したＭＲＳ培地で満たされた１リットルびんにおいて５０、２００、１０００および４０００倍希釈した。増殖を、対数培養および採取の目標時間における静止期培養を確実にするために計算した設定計算時間３７℃で実行した。
【００５７】
選択した株におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の分析
β−ガラクトシダーゼ活性を分析するために、細胞を、４℃において５０００ｘｇで１５分間遠心分離した。ペレットを、リン酸緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を用いて元の体積の１％に再溶解し次いでそれぞれの無細胞抽出物の８つの１２５０μｌアリコートを深型ウェルプレートに移した。
【００５８】
続いてペレットを、８００μｌ  ０．０５Ｍ  ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ＝７．０において０．５グラムのシリカビーズ（０．１ｍｍ）および細胞破壊器において３０秒バーストの４回の繰り返しを用いて溶解した。同じ無細胞抽出物の溶解したペレットを、次いで単一の１５ｍｌのグレイナー管（Ｇｅｉｎｅｒ−ｔｕｂｅ）において再結合した。培養物を、９６ウェルプレート遠心分離機を用いて示された時間後に５０００ｇで１０分間遠心分離した。細胞溶解物の上清の２０μｌを、１８０μｌリン酸緩衝液Ａ（８．９ｇｒ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、６．９ｇｒａｍ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４．Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に溶解した。
【００５９】
さらに細胞溶解物リン酸緩衝液混合物の１０、１００および１００倍希釈を調製し、これに１ｍＭの開始濃度でＯＮＰＧ原液（リン酸緩衝液中２０ｍＭ）を加えた。４２０ｎｍにおける吸光度を、Ｓｗｉｆｔ  ＩＩアプリケーションソフトウェアを用いてＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２０００  ＵＶ／可視分光光度計を用いて経時的に観察しミラー単位を上記に示した希釈を用いて計算した。
【００６０】
ＧＯＳ合成プロトコル
活性を、リン酸緩衝液Ｂ（ｐｈｓｏｐａｈｅ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ）を用いて希釈によって１０ｍｌの総容積中２ｍＭ／分に標準化した。１３．５ｍｌリン酸緩衝液Ｂを含有する１５ｍｌグレイナー管（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｔｕｂｅｓ）を、３０℃、５０℃、および６０℃で予熱した。反応を、予熱したグレイナー管への１．５ｍｌの無細胞抽出物（２ｍＭ／分β−ガラクトシダーゼ活性）の追加によって開始した。反応を、３０秒の時間間隔で進行した。１ｍｌの試料を、次いで０、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、および１４４０分間隔でエッペンドルフ管に移した。次いでＧＯＳ形成反応を、１００℃で５分間のインキュベーションによって停止して試料を直ちに−８０℃で貯蔵した。
【００６１】
見られたβ−ガラクトシダーゼの活性に基づいて、ＧＯＳ形成率についての実際の活性が予測され得る。変換係数を、それぞれの種について計算した。
【００６２】
下表４は、３０℃における予測されたＧＯＳ形成率を示す。
【００６３】
【表４−１】
2018515120.tif 000020
【００６４】
【表４−２】
2018515120.tif 000021
【００６５】
【表４−３】
2018515120.tif 000022
【００６６】
下表５は、５０℃における予測されたＧＯＳ形成率を示す。
【００６７】
【表５−１】
2018515120.tif 000023
【００６８】
【表５−２】
2018515120.tif 000024
【００６９】
【表５−３】
2018515120.tif 000025
【００７０】
ＧＯＳ分析プロトコル
パルスアンペロメトリック検出を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を、ＧＯＳ分析に着手するために用いた。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析は、ＰＡＤを備えたＤＸ−５００  ＢＩＯ−ＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ）上で実行した。ガラクトオリゴ糖画分を、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で２２℃で寸法２５０ｍｍ＊４ｍｍのＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラム上で分離した。寸法５０＊４ｍｍ内径（Ｄｉｏｎｅｘ）のＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１ガードカラムを、カラム保護のために用いた。分析のために用いた溶離液は、（Ａ）５００ｍＭ  ＮａＯＡｃ＋１００ｍＭＮａＯＨ、（Ｂ）１００ｍＭＮａＯＨおよび（Ｃ）ミリＱ水であった。
【００７１】
溶離液ＡおよびＢを、混合して以下の勾配を作った：０から５分間１００％Ｂの後に７３分の０〜２６％Ａ。それぞれの実施後、カラムを１００％Ａで６分間洗い１００％Ｂで１０分間再平衡させた。ピーク同定をＪ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００９，５７，８４８８−８４９５に記載されているＨＰＬＣクロマトグラムのピーク分布の比較に基づいて行った。ラクトースを溶出時間標準化のための標準として用いた。
【００７２】
結果
高度に形成されたＧＯＳ種間の比率を決定するためにＰ．イエンセニーの最も優勢なＧＯＳ種を定量化して異なる温度および時点における２つの種間の比率を計算した。下表６に示されかつ図１に例示されるように、種比率は強い温度依存性および小さい時間依存性を示したことが分かった。
【００７３】
【表６】
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【００７４】
標準の熱力学に基づいて５０℃においてβ−ガラクトシダーゼ反応は３０℃におけるよりも４〜８倍高い率で発生することが想定された。ＧＯＳ形成率が直線であると予想された段階の試験した試料についてＧＯＳ形成率をプロットした。下表７に示されかつ図２に例示されるように、両方のプロピオン酸菌株とも活性における有意の増加が検出されなかったのに対して、２種の乳酸杆菌株は、５０℃において３〜４倍のＧＯＳ形成率を示した。
【００７５】
【表７】
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【００７６】
理論上のＧＯＳ形成率を、調査の段階２において測定された、ミラー単位で表わされる、β−ガラクトシダーゼ活性に基づいて計算した。下表８は、理論上のＧＯＳ形成率に対する実際のＧＯＳ形成率の比率を示し、図３は、３０℃および５０℃の両方についてプロットされた比率を示す。意外にも、かつ有利には、ＧＯＳ形成率は、常に理論上のＧＯＳ形成率よりも高いことが分かった。
【００７７】
【表８】
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【００７８】
実験の初期段階において分析されたβ−ガラクトシダーゼ活性は、後の段階において決定されたそれらの活性よりも一般に高いと思われる。方法論に一貫した誤りがあるかどうかを調べるために段階１および２における活性の比率を計算して（下表９に示す）図４に示すグラフにプロットした。図４は、ほとんどの試料について５倍の差が検出されたことを示す。いくつかの試料はずっと高い差を明確に示し、かつこれはこれらの差が主に細胞の増殖段階における差に起因することが予想される。
【００７９】
【表９】
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【００８０】
β−ガラクトシダーゼの発現が生物の増殖段階に依存するかどうかを評価するために、全ての株について（ミラー単位で測定されるような）活性をプロットした。表１０および図５は、それぞれデータおよびプロットを示す。ほとんどの株について対数期：静止期比率≧１は、β−ガラクトシダーゼの活性が対数期において静止期におけるよりも高いことを示していることが見いだされたことが分かった。若干の例外はあるものの（株２１１および１９１）これらの差は限定的でありかつ静止期における高いバイオマス収量が低いβ−ガラクトシダーゼ活性を相殺している可能性がある。
【００８１】
【表１０】
2018515120.tif 000030
【００８２】
結論
ミラー単位値に基づいて選択された株のＧＯＳ形成率は、非最適化条件における増殖の場合でも良好なＧＯＳ産生を示しているそれらの株の良好な予測因子と思われた。段階１において６０ミラー単位を超えるβ−ガラクトシダーゼ活性を与えた全ての乳酸杆菌株が段階２実行可能性調査においてＧＯＳを産生したのに対して、６０ミラー単位限界未満であった１種の対照株はしなかったことが立証された。Ｓ．サーモフィルスのほとんどが６０ミラー単位よりも有意に高いＢｇａｌ活性を示しかつ最高であると思われたもののみをさらに段階２実行可能性調査を行うために選択した。プロピオン酸菌に関しては全てが６０ミラー単位限界未満であったが、選択された全ての株がＧＯＳを産生した。
【００８３】
一般にＧＯＳ形成率は、乳酸杆菌株について３０℃と比較して５０℃においては３〜４倍高かった。プロピオン酸菌無細胞抽出物は、３０℃および５０℃において概ね同様のＧＯＳ形成率を示した。全ての試料は、ニホンコウジカビ（Ａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚｅａ）酵素によって産生されたＧＯＳとは異なるＧＯＳプロファイルを示す。具体的には株３６４（Ｐ．イエンセニー）は、有意のＧＯＳ産生を示した。調査は、ミラー単位活性が潜在的なＧＯＳ活性に適切に変換されかつＧＯＳ産生の有用かつ正確な予測因子であると実証することを立証した。特有の場合についてＧＯＳ産生は、ＯＮＰＧ加水分解活性が当初示唆したよりも最大１５倍高かった。一般には、後のＧＯＳ合成段階は、初期スクリーニング段階と比較して５倍低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。
【００８４】
記述したスクリーニング方法、ならびに６０（連鎖球菌または乳酸杆菌の場合）および３（プロピオン酸菌の場合）のミラー単位限界を用いることは、細菌が精製およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのそのプレバイオティクス特性のさらなる試験を可能にするように十分な収量のＧＯＳを産生し得るかどうかの見込みの迅速かつ信頼できる予測を可能にする。これは、場合によっては任意の新規のＧＯＳ構造を特定することを助けるためにも用いられ得る。これは、有利にはＧＯＳを産生、新規のＧＯＳを特定する、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでの試験に拡大する可能性のために多数の細菌のスクリーニングを可能にする系統的方法論を提供する。さらに、ミラー単位は増殖率、酵素産生および活性の複合物であるので、したがってこのパラメーターは商業的に実現可能である可能性が最も高いそれらの株にのみ集中することを可能にする。
【００８５】
上述の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護の範囲を限定することは意図されず、むしろ本発明がどのように実現されるかの実施例を記述する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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