(57)【要約】  本発明は、微生物株ならびに低分子量物質およびタンパク質の抗生物質を含まない発酵製造方法に関する。低分子量物質またはタンパク質の製造のための微生物株は、そのゲノム内に株中に栄養要求性を引き起こす遺伝子の変異を含む。これは、低分子量物質または組換えタンパク質の製造用の酵素をコードする産生プラスミドおよびその染色体不活化が栄養要求性を引き起こす遺伝子の機能性コピーをさらに含み、該栄養要求性は供給不能な栄養要求性である。
2018536423.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
株の栄養要求性を引き起こす遺伝子変異をそのゲノム内に含み、かつ低分子量物質または少なくとも１つの組換えタンパク質の生産のための少なくとも１つの酵素をコードする産生プラスミドも含み、かつ前記遺伝子の機能性コピーも含み、その染色体不活性化が前記栄養要求性を引き起こす、低分子量物質またはタンパク質の生産のための微生物株であって、前記栄養要求性が供給不能な栄養要求性であることを特徴とする、微生物株。
【請求項２】
前記供給不能な栄養要求性が、ｍａｐ、ｐｙｒＨ、ｆｔｓＬ、ｒｐｓＢ、ｔｓｆ、ｐｌｓＣおよびその相同遺伝子からなる群から選択される遺伝子変異により引き起こされることを特徴とする、請求項１に記載の微生物株。
【請求項３】
前記遺伝子がｐｙｒＨ遺伝子もしくはｐｌｓＣ遺伝子またはその相同遺伝子であることを特徴とする、請求項２に記載の微生物株。
【請求項４】
前記株の供給不能な栄養要求性を引き起こす遺伝子の変異が前記遺伝子の不活化をもたらすことを特徴とする、請求項１、２または３に記載の微生物株。
【請求項５】
前記株の供給不能な栄養要求性を引き起こす遺伝子の変異が前記遺伝子によりコードされる遺伝子産物の活性の不活化をもたらすことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物株。
【請求項６】
変異または欠失により前記株の供給不能な栄養要求性を引き起こす遺伝子に変換することができる遺伝子を有する微生物株に、温度感受性プラスミドを導入することを特徴とし、前記温度感受性プラスミドが変異または欠失する前記遺伝子の機能性コピーを有し、その上、前記株が遺伝子内に前記株の供給不能な栄養要求性をもたらす変異を有し、かつ前記遺伝子の前記機能性コピーが前記温度感受性プラスミド上に存在するように前記株のゲノムは変異し、かつその上、前記温度感受性プラスミドが前記株内で非許容温度において産生プラスミドに交換され、ここで前記産生プラスミドは低分子量物質または組換えタンパク質の製造のための酵素をコードする遺伝子を含み、かつ前記栄養要求性を引き起こす前記遺伝子の機能性コピーも含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の株の製造方法。
【請求項７】
前記プラスミドが温度感受性複製開始点を有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記産生プラスミドを用いた形質転換直後に、細胞を３０〜９０分間４７〜５５℃で温度ショックに暴露し、その後に３７〜４５℃の非許容温度においてさらなるインキュベーションを行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
発酵培地中の微生物株を用いた低分子量物質またはタンパク質の製造方法であって、該方法が、請求項１〜５の一項以上に記載の微生物株を使用し、かつ、抗生物質を含まない発酵培地を使用することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、微生物株に関し、かつ低分子量物質およびタンパク質の抗生物質を含まない発酵製造方法に関する。
【０００２】
原理的に、微生物を用いた低分子量物質の自然生産は増大し、組換えタンパク質医薬品（「生物製剤」）市場も近年急速に成長している。発酵生産の高コスト圧力により、特にタンパク質ベースの活性医薬品成分のため、その製造のためのより効率的、従ってよりコスト効率的方法およびシステムが継続的研究されている。細菌、酵母、様々な微生物、糸状菌類または他の植物細胞もしくは動物細胞などの様々な微生物を産生株として使用することができる。ここで、経済的観点から重要であるものは、コスト効率的発酵、高生産収率および、タンパク質の場合、機能性タンパク質をもたらす正しいフォールディングおよび／または修飾である。その非常に広く研究されている遺伝学および生理学のおかげで、グラム陰性腸内細菌、大腸菌（エシェリキア・コリ（Escherichia coli））（E. coli）は、現在、低分子量物質およびタンパク質の製造のために最も頻繁に使用される生物である。
【０００３】
基本的に、２つの異なる微生物を使用する：天然で物質を産生する微生物および遺伝子改変された微生物。遺伝子改変に必要とする技術方法は、長い間、従来技術で知られている。ここでの目的は、標的タンパク質または低分子量物質の合成に必要な遺伝子を宿主細胞に導入することである。前記遺伝子は、宿主細胞により転写、必要ならば改変し、できる限り外向きに培地に移動する。
【０００４】
バイオテクノロジーの方法の経済的実行可能性は、達成される生産収率に極めて依存する。前記収率を、発現系（宿主細胞、遺伝因子など）、発酵パラメーターおよび培養培地により最適化することができる。
【０００５】
基本的に、宿主細胞を２つの異なる方法で改変することができる。従って、新規遺伝情報をゲノムに組込むことができ（糸状菌類、酵母など）、および／または染色体外要素（例えば、プラスミド）上に導入することができる（原核生物、酵母など）。遺伝子のゲノムへの遺伝子組込みの場合、前記遺伝子は選択圧の非存在下でさえ宿主細胞中で充分に維持される。しかしながら、原核生物の場合、不都合は、宿主中に１つしか遺伝子コピーが存在しないこと、かつ、遺伝子量効果による産物形成を増加させるための同遺伝子のさらなるコピーの組込みは配列特異的組換えイベントにより非常に魅力的である（欧州特許第０２８４１２６（Ｂ１）号）。
【０００６】
染色体外ＤＮＡを使用する場合、プラスミドの形態の標的タンパク質の遺伝情報は、概して、大腸菌（E. coli）生産菌株に形質転換する。遺伝子用量効果はこの場合も効果を有するので、細胞当たりの最も大きな可能性ある数のプラスミドコピーを得ようと努力する。このような遺伝因子はストレスにより細胞から容易に消失するので、プラスミドの複製および標的タンパク質の産生の両方の理由で、全培養にわたって選択圧を与える必要がある。選択マーカーとして、抗生物質耐性遺伝子を使用し、従って、このような因子を含んでなる細胞が抗生物質の存在下で増殖することを可能とすることは標準的である。従って、プラスミド担持細胞のみ増殖することができる。標的物質または標的タンパク質を産生する能力はプラスミドの消失の結果としても消失するので、これは、発酵において達成することができる収率に対する直接的効果を有する。
【０００７】
近年、選択マーカーとしての抗生物質耐性の使用は極めて評価されるようになってきた。第一に、特に、耐性が抗生物質分解性酵素に基づく場合に、追加量の抗生物質を絶えず提供する必要があるので、抗生物質の使用はかなり高価である。第二に、医薬および他の分野における広範な使用は、他の株、場合によっては病原性のものに対する耐性遺伝子の蔓延に寄与している。これは、疾病の治療にとってマイナスの結果である。
【０００８】
一方、抗生物質を含まない選択システムも従来技術で開発された。複数の異なる抗生物質を含まないシステムが開発された。これらは、３つの異なる基本システムに区別することができる。栄養素要求性の使用、毒素抗毒素混合物系および他の方法。
【０００９】
他の方法のカテゴリーは、一般的原理、例えば、サプレッサーｔＲＮＡ、ｆａｂ  Ｉ／トリクロサン（ＦＡ合成）、オペレーターリプレッサータイトレーションに従わない機構を包含する（Peubez et al. Microbial Cell Fac, 2010, 9:65）。しかしながら、これらの方法は、概して、遺伝子治療のためのＤＮＡおよびＤＮＡフラグメントの合成に使用され、標的物質の高収率の製造に最適化されていない。場合によっては、抗生物質の代わりに、選択に使用するものは、他の物質、例えば、トリクロサン、除草剤および重金属であるが、これらも健康上の懸念がある。例えば、Ｈｅｒｒｅｒｏら（1990, J. Bacteriol. 172, 6557-6567）は、選択マーカーとしての除草剤および重金属に対する耐性遺伝子について記載している。
【００１０】
毒素抗毒素混合物（Ｈｏｋ−Ｓｏｋ、ｃｃｄＡ／Ｂなど）は、２つの遺伝因子からなり、双方がプラスミド上でコードされる、またはそれらが染色体およびプラスミド上でコードされることが可能である（Gerdes et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83:3116-20）。ここで、抗毒素は毒素に対する中和効果を有する。プラスミドの消失のイベントでは、この機構は失い、染色体でコードされ、かつ、長寿命毒素のせいでプラスミドを含まない細胞は死ぬ。
【００１１】
さらに公知の選択方法は、栄養要求性株の相補である。この場合、代謝において必須の機能を有する生産菌株のゲノム中の遺伝子を取り出すかまたは不活化する。従って、このような遺伝子は、必須遺伝子と呼ぶ。代謝機能を回避または再確立する場合、得られた栄養要求性株は成長、増殖または生存のみできる。代謝の適切な前駆体または最終産物（アミノ酸、塩基など）の供給あるいは宿主ゲノム内で不活化された遺伝子の導入によりこれを達成することができる。欧州特許第０２８４１２６（Ｂ１）号は、アミノ酸代謝の栄養要求性マーカーと命名されている。培地への必要な代謝産物の添加により栄養要求性を容易に補うことができるので、これらの株を容易に作成することができる。これは、プラスミドの非存在下でさえ代謝産物の存在で細胞を培養することができるからである。形質転換によって、アミノ酸／塩基の合成のための情報を細胞内に再導入し、細胞は栄養補充なしでさえ増殖することができる。従って、栄養補充のない最少培地上で選択を行わなければならない。
【００１２】
実際に、複合組成物を含む培地を工業発酵において通常使用するので、選択マーカーとしてこのような栄養要求性の使用を実行することは従来可能ではなかった。コスト面の理由で、老廃物は、概して、例えば、穀類（エタノール製造）、トウモロコシ（デンプン製造）、ジャガイモ（デンプン回収）または酵母抽出物の残渣などの発酵培地の成分である。これらは、炭素源および窒素源として両方の役割を果たす。場合によっては、これらの成分は正確には分からないが、アミノ酸、塩基、ビタミン類などを含有し、これらを培地から取り出すことができる。従って、不可能でない場合、栄養要求性株を用いて充分な選択圧を増大することは、工業発酵において困難である。
【００１３】
国際公開第２００８／１３５１１３（Ａ１）号に記載されているように、グルコース代謝における栄養要求性の使用は、工業的に使用される培地において不十分な選択性も有する。微生物はグルコース上で特によく増殖し、他の炭素源を含有する培地における場合であるよりも速く増殖することができるが、プラスミドまたは標的物質の生産が原因のより高いストレスが理由でこの利点は無効になる。他の炭素源は複合培地で利用可能であり、細胞により使用される。
【００１４】
これは、国際公開第０７／０３９６３２（Ａ１）号に記載されているように、栄養要求性マーカーとしてｐｙｒＣ遺伝子（ジヒドロオロターゼ）の使用にも当てはまる。この酵素はピリミジン）塩基の合成開始時に存在し、不活化は新たな合成の阻害をもたらす。しかしながら、塩基を培地から取り出し利用することができ、適切な選択圧を工業培地において増大することはできない。
【００１５】
例外は必須チミジンおよびＤ−アラニンに対する栄養要求性であり、複合成分においてさえ、発酵培地中、微量しか、または全く生じない（欧州特許出願公開第０２５１５７９（Ａ１）号；欧州特許第０１８５５１２（Ｂ１）号）。しかし、これらの系は、概して努力を要する高密度細胞培養法における効率的生産にあまり適切でない。前記方法では、いくつかの細胞は死んで、溶解するので、従って、チミジンおよびＤ−アラニンまたは他のアミノ酸などが遊離し、これにより次々に栄養要求性を補うことができる。
【００１６】
全体的に、低分子量物質およびタンパク質の発酵生産における長年の経験にもかかわらず、抗生物質などの、高価または健康および／または環境にリスクがある物質によるものは別として、現在までに広く使用可能なシステムは開発されていない。工業で使用される複合増殖培地のために、栄養要求性マーカーによる選択のための様々なアプローチも、現在まで、不十分な結果しかもたらしていない。
【００１７】
これは、原理的に、微生物に当てはまるが、特に、例えば、その特殊な特性（培地にタンパク質を遊離）故に使用されるリーキー株などのあまり頑強でない生産菌株に当てはまる。工業的規模での前記株の工業的使用の場合、培地中の複合成分を通常使用する。
【００１８】
工業的に使用される生成物の製造のため、精製した成分からなる規定された培地の使用はコスト面の理由で経済的でない。
【００１９】
低分子量物質またはタンパク質の製造のための微生物株であって、該株が複合成分を含有する培地中でさえ安定なままであり、該株中、産生プラスミドは抗生物質／耐性マーカー系により細胞内で安定化されない前記微生物株を提供することが本発明の目的である。
【００２０】
そのゲノム内に変異が株の栄養要求性を引き起こす遺伝子の変異を含み、低分子量物質または少なくとも１つの組換えタンパク質の産生のための少なくとも１つの酵素をコードする産生プラスミドも含み、かつ遺伝子の機能性コピーも含み、その染色体不活性化が栄養要求性を引き起こす、微生物株であって、該栄養要求性が供給不能な栄養要求性(nonfeedable auxotrophy)であることを特徴とする微生物株によって、この目的を達成する。
【００２１】
本発明に関連して、供給不能な栄養要求性とは、栄養要求性が微生物細胞の増殖を減少するかまたは微生物細胞の死を引き起こし、成長培地への代謝特異的前駆体、中間体および／または最終産物の添加により補うことができないことを意味すると理解されるものとする。
【００２２】
本発明に関連して、遺伝子変異前の株の増殖速度と比較して、遺伝子変異後の発酵における株の増殖速度が≦１０％まで低下する場合、好ましくはそれ以上増殖しない場合、減少した増殖である。
【００２３】
特に好ましくは、変異は遺伝子の不活化をもたらし、このように、供給不能な栄養要求性を引き起こし、従って、微生物細胞は死ぬ。
【００２４】
従って、本発明に従った微生物株細胞のゲノム内では、細胞の増殖または生存に必要な同化代謝経路にとって必須である遺伝子の不活化があり、細胞の増殖または生存が成長培地への代謝特異的前駆体、中間体および／または最終産物の添加により再び得られることは不可能である。
【００２５】
本発明に関連した供給不能な栄養要求性遺伝子は、微生物細胞のゲノム内の遺伝子であり、この不活化は、成長培地への代謝特異的前駆体、中間体および／または最終産物の添加により相補することができず、この不活化は微生物細胞の増殖速度低下または死をもたらす。
【００２６】
好ましくは、変異が株の供給不能な栄養要求性を引き起こす遺伝子変異は、前記遺伝子の不活化または前記遺伝子によりコードされた遺伝子産物の活性の不活化をもたらす。
【００２７】
供給不能な栄養要求性遺伝子（致死遺伝子）の例は、Ｂａｂａら（2006, Mol. Syst. Biol. 2:2006.0008）に記載されている。好ましくは、遺伝子は、遺伝子ｍａｐ、ｐｙｒＨ、ｆｔｓＬ、ｒｐｓＢ、ｔｓｆ、ｐｌｓＣまたはその相同遺伝子である。
【００２８】
特に好ましくは、遺伝子は、ｐｙｒＨ遺伝子もしくはｐｌｓＣ遺伝子または同じ機能または活性を有する相同遺伝子である。
【００２９】
本発明に関連した遺伝子は、転写されるＤＮＡセグメントだけでなく、この複製プロセスの調節に関与するＤＮＡセグメント、すなわち、好ましくはプロモーターおよびターミネーターなどの遺伝子の調節エレメントも含んでなる。
【００３０】
相同遺伝子は、好ましくは、指定した遺伝子によりコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードし、かつ、問題の微生物の指定した遺伝子の配列に対して３０％超、特に好ましくは７０％超の配列同一性を有する遺伝子を意味すると理解されるものとし、各場合に、指定した遺伝子の配列はデータベースから公知である。
【００３１】
ｐｙｒＨ遺伝子は、酵素ＵＭＰキナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２２；ＵＫ、ウリジン・モノリン酸キナーゼ、ウリジル酸キナーゼ、ウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）キナーゼ）をコードする。前記酵素はＵＭＰを活性化してＡＴＰを用いてＵＤＰを生成する。次工程では、ＵＤＰはさらなるキナーゼ（ＵＤＰキナーゼ）により活性化してＵＴＰを生成し、これはＲＮＡ合成ならびにＣＴＰ（シトシン三リン酸）およびＴＴＰ（チミジン三リン酸）の合成の両方のために使用され得る。ＣＴＰおよびＴＴＰは、順に、ＲＮＡ（ＣＴＰ）およびＤＮＡ（ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の構成成分となる。従って、ＵＭＰは、ＲＮＡおよびＤＮＡのピリミジンビルディングブロック（building blocks）の起源である。ウラシルからシトシンまたはチミジンへの転化はトリホスフェートレベルで起こるので、ＵＭＰキナーゼの不活化はこの合成経路の完全な遮断をもたらす。
【００３２】
基本的に、細胞は培地から３つの塩基のモノホスフェートのみを消費することができる。ＵＭＰからＵＴＰへの転化のため、ＵＭＰキナーゼは必須である。これは、供給によりこの栄養要求性は補うことができず、従って培地組成物に依存しないことを意味する。
【００３３】
ｐｙｒＨ遺伝子は、配列番号１を特徴とする。ｐｙｒＨ遺伝子産物（ＰｙｒＨ）は配列番号２を特徴とする。
【００３４】
本発明に関連して、ｐｙｒＨホモログは、ＰｙｒＨ活性を有するタンパク質をコードし、かつ、配列番号１に対して３０％超の配列同一性を有する遺伝子である。配列番号１に対して７０％超の配列同一性が特に好ましい。ｐｙｒＨ遺伝子が特に好ましい。
【００３５】
ｐｙｒＨホモログは、配列番号２に対して３０％超の配列同一性を有するタンパク質であり、該タンパク質は酵素番号２．７．４．２２に従ったＵＭＰキナーゼ活性を有する。特に好ましくは、ＰｙｒＨホモログは、酵素番号２．７．４．２２に従ったＵＭＰキナーゼ活性および配列番号２に対して７０％超の配列同一性を有する。ＰｙｒＨタンパク質は特に好ましい。
【００３６】
細胞内のＰｙｒＨ活性を、Ｂｕｃｕｒｅｎｃｉら（1998, J. Bact. 180: 473-77）により記載されたアッセイに従って決定することができる。
【００３７】
ｐｌｓＣ遺伝子は、酵素１−アシルグリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．５１）をコードする。前記酵素は、１つの脂肪酸をアシルＣｏＡから１つのＣｏＡ−ＳＨを遊離して１つのアシルグリセロール−３−リン酸に転移する。得られたジアシルグリセロール−３−リン酸は、トリグリセリドおよびグリセロリン脂質などの必須膜成分の合成に使用される。これは、このステップが大腸菌（E. coli）の膜系の産生に必要であることを意味する。大腸菌（E. coli）において、脂肪酸の摂取は可能であるが、トリグリセリドおよびグリセロリン脂質は細胞内または膜内で合成されなければならない。
【００３８】
ｐｌｓＣ遺伝子は配列番号３を特徴とする。ｐｌｓＣ遺伝子産物（ＰｌｓＣ）は配列番号４を特徴とする。
【００３９】
本発明に関連して、ｐｌｓＣホモログは、ＰｌｓＣ活性を有するタンパク質をコードし、かつ、配列番号３に対して３０％超の配列同一性を有する遺伝子である。配列番号３に対して７０％超の配列同一性が特に好ましい。ｐｌｓＣ遺伝子が特に好ましい。
【００４０】
ｐｌｓＣホモログは、配列番号４に対して３０％超の配列同一性を有するタンパク質であり、該タンパク質は酵素番号２．３．１．５１に従った１−アシルグリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ活性を有する。特に好ましくは、ＰｌｓＣホモログは、酵素番号２．３．１．５１に従った１−アシルグリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ活性および配列番号４に対して７０％超の配列同一性を有する。ＰｌｓＣタンパク質は特に好ましい。
【００４１】
細胞内のＰｌｓＣ活性を、Ｍｏｎｒａｎｄら（1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 79-84）により記載されたアッセイに従って決定することができる。
【００４２】
ＤＮＡ同一性の程度を、ウェブページhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/で見つけることができ、ｂｌａｓｔｎアルゴリズムに基づいたプログラム「ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｌａｓｔ」により決定する。２つ以上のヌクレオチド配列のアライメント用アルゴリズムパラメーターとして初期設定パラメーターを使用した。初期設定の一般パラメーターは：Ｍａｘ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＝１００；Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ＝「Ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｄｊｕｓｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」；Ｅｘｐｅｃｔ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１０；Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝２８；Ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｄｊｕｓｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＝０である。対応する初期設定スコアリングパラメーターは：Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ＝１、−２；Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ＝Ｌｉｎｅａｒである。
【００４３】
タンパク質配列の比較のため、ウェブページhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/のプログラム「ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌａｓｔ」を使用する。前記プログラムはｂｌａｓｔｐアルゴリズムを利用している。２つ以上のタンパク質配列のアライメント用アルゴリズムパラメーターとして初期設定パラメーターを使用した。初期設定の一般パラメーターは：Ｍａｘ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＝１００；Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ＝「Ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｄｊｕｓｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」；Ｅｘｐｅｃｔ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１０；Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝３；Ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｄｊｕｓｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＝０である。初期設定スコアリングパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ＝Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ＝Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔである。
【００４４】
本発明に従った株を製造するため、変異または欠失する供給不能な栄養要求性遺伝子の機能性コピーを有する温度感受性プラスミドを適切な微生物株に導入する。その後、株のゲノム内の対応する供給不能な栄養要求性遺伝子を不活化する。その後、温度感受性プラスミドを、非許容温度において前記株内で産生プラスミドに交換するが、低分子量物質を産生する少なくとも１つの酵素または少なくとも１つの組換えタンパク質をコードする産生プラスミドは、供給不能な栄養要求性遺伝子の機能性コピーを含む。
【００４５】
この方法は、低分子量化合物または組換えタンパク質の製造のための発酵プロセス中の産生プラスミドが複合培地中でさえ細胞内で安定に維持されることを保証する。従って、本発明に従った株を、添加した選択的薬物または栄養要求性補償添加物の非存在下、プラスミドの損失なく培養することができる。
【００４６】
基本的に、その不活化が株の供給不能な栄養要求性をもたらす遺伝子を有するいずれもの微生物株は、本発明に従った株の製造における出発株として好適である。
【００４７】
好ましくは、本発明に従った株の発生のための出発株は、腸内細菌科（エンテロバクター科（Enterobacteriaceae））株、特に好ましくは大腸菌（エシェリキア・コリ（Escherichia coli））種の株である。
【００４８】
好ましい大腸菌（E. coli）株は、「リーキー」変異を有するものである。「リーキー変異」は、ｏｍｐ遺伝子、ｔｏｌ遺伝子、ｅｘｃＤ遺伝子、ｅｘｃＣ遺伝子、ｌｐｐ遺伝子、ｐａｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子およびｌｋｙ遺伝子から選択される、外側細胞膜または細胞壁の構造要素のための遺伝子の変異を意味すると理解されるものとし、この変異は増加する程度まで培地中に周辺タンパク質を遊離する細胞をもたらす（Shokri et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 (2003), 654-664）。好ましくは、「リーキー」変異は、ｌｐｐ遺伝子の変異であり、特に好ましくはｌｐｐ１変異、ｌｐｐ欠失変異および、例えば、ｌｐｐ−３変異などのＬｐｐタンパク質の位置１４（シグナルペプチドを含む番号方式）におけるグリシン残基の変異からなる群から選択される変異である。ｌｐｐ１変異は位置７７のアルギニン残基のシステイン残基による置換をもたらすｌｐｐ遺伝子中の変異であり、ｌｐｐ３変異は位置１４のグリシン残基のアスパラギン酸（apartic acid）残基による置換をもたらすｌｐｐ遺伝子中の変異である。これらの変異は、米国特許出願公開第２００８／２５４５１１号に詳細に記載されている。ｌｐｐ欠失変異は、好ましくは、ｌｐｐ遺伝子それ自体または周辺タンパク質の増大した漏れやすさを示す細胞をもたらすｌｐｐ遺伝子のプロモーター領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの欠失である。
【００４９】
本発明に関連して、増大した漏れやすさは、細胞の発酵後に、例えば、同条件下の大腸菌（E. coli）株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）の発酵の場合より、培養培地中のアルカリホスファターゼの周辺タンパク質濃度が高いことを意味すると理解されるものとする。
【００５０】
微生物株の遺伝子の不活化方法は、従来技術において公知である。これらについては、２つの好ましい遺伝子（ｐｙｒＨ遺伝子およびｐｌｓＣ遺伝子）の変異およびその遺伝子産物について以下に詳細に記載する。これらの方法を他の遺伝子に対して同様に適用することもでき、この不活化は微生物株の供給不能な栄養要求性を引き起こす。
【００５１】
温度感受性プラスミドは、温度感受性複製開始点および供給不能な栄養要求性遺伝子の機能性コピーを含む。加えて、前記プラスミドは、形質転換体の選択のための選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカーは、例えば、抗生物質耐性である。
【００５２】
温度感受性複製開始点の好ましい例は、「ｏｒｉＲ１０１  ＆  ｒｅｐＡ１０１−ｔｓ」、プラスミドｐＳＣ１０１（Hashimoto-Gotoh et al.; Gene, 2000, 241:1:185-191）の複製開始点の誘導体であり、これは、とりわけ、プラスミドｐＫＤ２０およびｐＫＤ４６（Datsenko and Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645）上に位置する。
【００５３】
当業者に公知の形質転換技術、例えば、ＴＳＳ法、ＣａＣｌ／ＲｂＣｌ法、エレクトロポレーション法を用いて、温度感受性プラスミドを細胞内に導入する。
【００５４】
温度感受性プラスミド上に存在する選択マーカーによって温度感受性プラスミドを含む細胞について選択を行うが、プラスミドに許容される温度で細胞をインキュベートする。
【００５５】
温度感受性プラスミドに許容されない温度において産生プラスミドを用いて形質転換した後に微生物株を培養することにより、このような温度感受性プラスミドを産生プラスミドに交換することができる。好ましい非許容温度範囲は、３７〜４５℃、特に好ましくは３９〜４３℃である。
【００５６】
当業者に公知の形質転換技術、例えば、ＴＳＳ法、ＣａＣｌ／ＲｂＣｌ法、エレクトロポレーション法を用いて、産生プラスミドを細胞内に導入する。
【００５７】
形質転換体を寒天プレート上および液体培養液中の両方で培養することができる。好ましい実施形態では、産生プラスミドを用いた形質転換直後に、３０〜９０分間、好ましくは６０分間、４７〜５５℃、好ましくは５２℃の温度ショックに微生物株を暴露する。その後に、上記非許容温度において、さらなるインキュベーションを行う。結果として、１段階で温度感受性プラスミドを産生プラスミドに交換し、低分子量物質または組換えタンパク質の抗生物質を含まない製造のための、本発明に従った生産菌株を作成する。
【００５８】
例えば、次の公知の発現ベクターの１つを産生プラスミドとして使用する：ｐＪＦ１１８ＥＨ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３またはｐＥＴ。
【００５９】
供給不能な栄養要求性遺伝子の機能性コピー以外には、産生プラスミドは、１つ以上の標的遺伝子を含み、例えば、プロモーター配列、オペレーター配列およびターミネーター配列などの前記標的遺伝子の発現に必要な発現シグナルも含む。標的遺伝子は、低分子量物質または少なくとも１つの組換えタンパク質の製造のための少なくとも１つの酵素をコードする。
【００６０】
低分子量物質は、基本的ビルディングブロック（塩基、アミノ酸、脂肪酸など）および生物が合成することができる第二代謝産物（ビタミン、抗酸化物質など）である。アミノ酸が好ましく、アミノ酸Ｌ−システインおよびそれから誘導される化合物が特に好ましい。
【００６１】
組換えタンパク質は、好ましくは異種タンパク質である。
【００６２】
異種タンパク質は、プロテオーム、すなわち、宿主生物の全天然タンパク質構成に属さないタンパク質を意味すると理解されるものとする。
【００６３】
好ましくは、異種タンパク質は、真核生物タンパク質、特に好ましくは１つ以上のジスルフィド結合を含むかまたは二量体もしくは多量体としてその機能性形態で存在するタンパク質であり、すなわち、該タンパク質は四次構造を有し、複数の同じ（同族）もしくは同じでない（異種）サブユニットから構成される。
【００６４】
複数のタンパク質サブユニットからなるタンパク質の好ましい分類は抗体または抗体フラグメントである。機能性Ｆａｂ抗体フラグメントが特に好ましい。
【００６５】
この後、供給不能な栄養要求性遺伝子ｐｙｒＨが変異した本発明に従った微生物株の製造について記載する。
【００６６】
基本的に、ＵＭＰキナーゼＰｙｒＨのための遺伝子を有するいずれもの宿主生物は、ゲノムｐｙｒＨ不活化を有する本発明に従った微生物株の製造のための出発株として適切である。
【００６７】
微生物株のｐｙｒＨ遺伝子の不活化方法は、従来技術において公知である。例えば、ｐｙｒＨ遺伝子のリーディングフレームに変異（個々のまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入または欠失）を導入することにより、ｐｙｒＨ遺伝子を不活化することができ、この変異は不活化されているＰｙｒＨの特異的活性をもたらす。当業者は、このようなｐｙｒＨアレルの作成方法を知っている。例えば、Ｌｉｎｋら（1997, J. Bacteriol. 179: 6228-37）に記載の方法を用いて、相同遺伝子組換え機構により染色体変異を遺伝子に挿入することが可能である。全ｐｙｒＨ遺伝子またはその部分の染色体欠失は、例えば、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-5）により記載された方法に従って、λレッドリコンビナーゼ系を活用して可能である。ｐｙｒＨ変異を有する株からのＰ１変化または結合によって、対応するｐｙｒＨアレルにより置換された染色体中のｐｙｒＨ野生型遺伝子を有するｐｙｒＨ野生型株に形質導入することにより、ｐｙｒＨアレルも移動することができる。
【００６８】
さらに、個々のまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入または欠失により、発現の調節に必要な少なくとも１つの要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位）の変異により、細胞のｐｙｒＨ遺伝子を不活化することもできる。変異前の細胞と比較して、発酵中の細胞の増殖速度が遺伝子の不活化により≦１０％まで低下する場合、好ましくはそれ以上増殖しない場合、本発明に関連した不活化である。
【００６９】
特に好ましくは、変異は微生物細胞の死をもたらす。
【００７０】
ｐｙｒＨ遺伝子の不活化が供給不能な栄養要求性をもたらすので、ｐｙｒＨ遺伝子の機能性コピーは、染色体不活性化前に細胞内に既に存在しなければならない。ｐｙｒＨ遺伝子の機能性コピーを含む温度感受性プラスミドの一過性の導入によりこれを達成することができる。
【００７１】
それから、温度感受性プラスミドを含むこのような細胞では、指定した方法によって、ゲノム内のｐｙｒＨ遺伝子を不活化することが可能である。
【００７２】
さらなるステップでは、前記温度感受性プラスミドを、ｐｙｒＨ遺伝子の機能性コピーも含む産生プラスミドに交換する。これは、既に記載した様に行うのが好ましい。
【００７３】
不活化したｐｌｓＣ遺伝子またはいくつかの他の変異した供給不能な栄養要求性遺伝子を有する本発明に従った微生物株を、同様に製造することができる。
【００７４】
組換えタンパク質の製造では、細胞質生産および分泌生産を区別する。細胞質生産の場合、標的タンパク質を細胞の細胞質内に蓄積するが、分泌生産の場合、標的タンパク質を周辺質または培養培地中に移動する。本発明に関連して、分泌生産が好ましい。標的タンパク質の培養培地への分泌生産が特に好ましい。
【００７５】
タンパク質の分泌生産のため、すなわち、細胞質から周辺質または培養培地へのタンパク質の転移のため、製造するタンパク質の遺伝子の５’末端を、タンパク質排出のためのシグナル配列の３’末端とインフレームで結合する必要がある。原理的に、大腸菌（E. coli）において、標的タンパク質の周辺質への転移をもたらす全てのシグナル配列の遺伝子は、この目的に好適である。大腸菌（E. coli）では、３つの主要移動経路が公知である：ＳＥＣ経路、ＴＡＴ経路およびＳＲＰ経路。ＳＥＣ装置による転移を可能とするシグナル配列が好ましい。この種の様々なシグナル配列は従来技術に記載されており、例えば、次の遺伝子のシグナル配列：ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、ｄｓｂＡ、ブドウ球菌プロテイＡ、ＳｔＩＩおよびその他（Choi and Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64 (2004), 625-635）。
【００７６】
本発明に従って好ましいものは、大腸菌（E. coli）のｐｈｏＡ遺伝子もしくはｏｍｐＡ遺伝子またはクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）Ｍ５ａ１由来のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列、または米国特許出願公開２００８／０７６１５７号に開示されたこのシグナル配列由来の配列である。
【００７７】
産生プラスミドを含む細胞の培養（発酵）を、抗生物質の添加なく、バイオリアクター（発酵槽）内で当業者に公知の通例の発酵方法に従って行う。
【００７８】
本発明は、微生物株を用いて低分子量物質または組換えタンパク質の製造方法も提供し、該方法は本発明に従った微生物株を使用し、かつ、抗生物質を含まない発酵培地を使用することを特徴とする。
【００７９】
発酵は、通例のバイオリアクター、例えば、撹拌槽、気泡塔型発酵槽またはエアリフト型発酵槽内で行う。工業規模、従って＞１００ｌ（リットル）の大きさでは撹拌槽型発酵槽が好ましい。
【００８０】
発酵では、本発明に従った株の細胞を、液体培地中、継続的にモニタリングならびに、例えば、栄養素供給、酸素分圧、ｐＨおよび培養液温度などの様々なパラメーターを精密制御しながら培養する。培養期間は、好ましくは１６〜１５０時間、特に好ましくは２４〜７２時間である。
【００８１】
可能な発酵培地は、微生物培養のために当業者に公知の全ての一般的培地である。しかしながら、前記発酵培地は、全く抗生物質を含まない。
【００８２】
例えば、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物、糖蜜またはトウモロコシ浸出液などの複合成分の規定割合を添加する複合培地または最小塩培地を使用することができる。複合培地成分を含む培地が好ましい。
【００８３】
発酵のための一次炭素源として、全ての細胞に利用可能な糖類、糖アルコール類または有機酸類もしくはその塩を使用することができる。グルコース、ラクトースまたはグリセロールが好ましい。グルコースおよびラクトースが特に好ましい。複数の異なる炭素源を組み合わせて与えることも可能である。発酵の開始時に発酵培地中に炭素源を全部最初に投入することができ、または開始時に最初に全く投入しないかもしくは炭素源の一部のみを最初に投入して、発酵過程にわたって炭素源を供給する。炭素源の一部を最初に投入して、一部を供給する実施形態が特に好ましい。特に好ましくは、炭素源を１０〜３０ｇ／ｌの濃度で最初に投入し、濃度が５ｇ／ｌ未満になった場合に供給を開始し、濃度が５ｇ／ｌより低く維持するように調整する。
【００８４】
培養液中の酸素分圧（ｐＯ２）は好ましくは１０％〜７０％飽和である。２０％〜６０％のｐＯ２が好ましく；ｐＯ２は特に好ましくは４５％〜５５％飽和である。
【００８５】
培養液のｐＨは、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８である。６．５〜７．５のｐＨが好ましく；培養液のｐＨは特に好ましくは６．８〜７．２である。
【００８６】
培養液温度は１５℃〜４５℃である。１８℃〜４０℃の温度範囲が好ましく、２５℃〜３５℃の温度範囲が特に好ましく、３０℃が非常に特に好ましい。
【００８７】
好ましい構成では、発酵は、高密度細胞発酵である。高密度細胞発酵は、発酵過程中、５０ｇ／ｌより高い細胞乾燥重量を得る発酵を意味すると理解されるものとする。７０ｇ／ｌより高い細胞乾燥重量が特に好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】実施例２からのプラスミドｐＫＤ４６の制限酵素および機能マップを示す。
【図２】実施例２で製造したプラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨの制限酵素および機能マップを示す。
【図３】実施例２で製造したプラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣの制限酵素および機能マップを示す。
【図４】実施例５で使用したプラスミドｐＭＴ１の制限酵素および機能マップを示す。
【図５】実施例５で製造した発現プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｔｅｔＲの制限酵素および機能マップを示す。
【図６】実施例６で製造した発現プラスミドｐＣＧＴ＿ｔｅｔＲの制限酵素および機能マップを示す。
【図７】実施例７で製造した発現プラスミドｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｔｅｔＲの制限酵素および機能マップを示す。
【図８】実施例８で製造した発現プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲの制限酵素および機能マップを示す。
【図９】実施例８で製造した発現プラスミドｐＣＧＴ＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲの制限酵素および機能マップを示す。
【図１０】実施例８で製造した発現プラスミドｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲの制限酵素および機能マップを示す。
【図１１】実施例８で製造した発現プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲの制限酵素および機能マップを示す。
【図１２】実施例８で製造した発現プラスミドｐＣＧＴ＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲの制限酵素および機能マップを示す。
【図１３】実施例８で製造した発現プラスミドｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲの制限酵素および機能マップを示す。
【図１４】実施例９で製造した本発明に従った産生プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｙｒＨの制限酵素および機能マップを示す。
【図１５】実施例９で製造した本発明に従った産生プラスミドｐＣＧＴ＿ｐｙｒＨの制限酵素および機能マップを示す。
【図１６】実施例９で製造した本発明に従った産生プラスミドｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨの制限酵素および機能マップを示す。
【図１７】実施例９で製造した本発明に従った産生プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｌｓＣの制限酵素および機能マップを示す。
【図１８】実施例９で製造した本発明に従った産生プラスミドｐＣＧＴ＿ｐｌｓＣの制限酵素および機能マップを示す。
【図１９】実施例９で製造した本発明に従った産生プラスミドｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣの制限酵素および機能マップを示す。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例は本発明をさらに説明することに役立つ。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、ＤＮＡの単離および精製、制限酵素によるＤＮＡ改変、クレノウ断片および合成酵素、形質転換、Ｐ１形質導入、他など、使用した全ての分子生物学および微生物学の方法を、文献に記載またはそれぞれの製造者により推奨された当業者に公知の方法で行った。
【００９０】
実施例１：その独自のプロモーターを有するマーカー遺伝子（ｐｙｒＨまたはｐｌｓＣ）の増幅
天然プロモーター領域を含むｐｙｒＨ遺伝子をコードする大きさ約１．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを、プライマーｐｙｒＨ−ＮｃｏＩ−ｆｗ（配列番号５）およびｐｙｒＨ−ＮｃｏＩ−ｒｅｖ（配列番号６）を用いて増幅した。ＰＣＲ反応に使用した鋳型は、大腸菌（E. coli）株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）由来の染色体ＤＮＡであった。
【００９１】
大きさ約１．０ｋｂのＰＣＲフラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製し、製造者からの情報に従って「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ、ヒルデン）を用いてアガロースゲルから単離した。その後、精製したＰＣＲフラグメントを、制限酵素ＮｃｏＩを用いて消化し、−２０℃で貯蔵した。同様にして、天然プロモーター領域を含むｐｌｓＣ遺伝子をコードする大きさ約１．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅、精製、消化し貯蔵した。増幅のため、プライマーｐｌｓＣ−ＮｃｏＩ−ｆｗ（配列番号７）およびｐｌｓＣ−ＮｃｏＩ−ｒｅｖ（配列番号８）を使用した。
【００９２】
実施例２：温度感受性複製開始点を含むプラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨおよびｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣの作成
温度感受性複製開始点を有するプラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨおよびｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣの構築に使用した出発プラスミドは、プラスミドｐＫＤ４６（Datsenko and Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645）であった。プラスミドｐＫＤ４６の制限酵素および機能マップを図１に示す。ＰＣＲ産物がそれ独自のプロモーターを有するｐｙｒＨ遺伝子またはｐｌｓＣ遺伝子をコードする実施例１に記載およびＮｃｏＩを用いて消化した該ＰＣＲ産物をｐＫＤ４６のＮｃｏＩ制限酵素部位にクローニングした。「ＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Life Technologies GmbH）にライゲーション試料を形質転換し、前記細胞内で増殖し、単離したプラスミドのＤＮＡ配列をシークエンシングによって検証した。この様に作成した全部で４つの可能性あるコンストラクトの２つは、ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨおよびｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣという記号表示を有する（図２および３参照）。
【００９３】
実施例３：ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨまたはｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣを用いた選択した大腸菌（E. coli）株の形質転換
実施例２に記載した温度感受性複製開始点を有するプラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨおよびｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣを、当業者に公知のＣａＣｌ２法を用いて、２つの大腸菌（E. coli）株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）およびＷ３１１０ｌｐｐ３（「リーキー」株として米国特許出願公開第２００８／０７６１５８（Ａ１）号に記載）に形質転換した。形質転換した細胞を１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で選択した。この様に作成した株は、Ｗ３１１０／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨ、Ｗ３１１０ｌｐｐ３／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨ、Ｗ３１１０／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣおよびＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣという記号表示を有する。
【００９４】
実施例４：大腸菌（E. coli）の遺伝子ｐｙｒＨの欠失（ウリジル酸キナーゼの不活化）または遺伝子ｐｌｓＣの欠失（１−アシルグリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼの不活化）
Ａ）遺伝子ｐｙｒＨの欠失
ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Datsenko and Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645）により開発された「λ赤法」に従って、大腸菌（E. coli）の酵素ウリジル酸キナーゼ（ｐｙｒＨ）をコードする遺伝子ｐｙｒＨを、大腸菌（E. coli）株Ｗ３１１０／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨおよびＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨで欠失した。プライマーｐｙｒＨ−ｆｗ（配列番号９）およびｐｙｒＨ−ｒｅｖ（配列番号１０）を用いて、カナマイシン耐性マーカー遺伝子（ｋａｎＲ）をコードするＤＮＡフラグメントを増幅した。プライマーｐｙｒＨ−ｆｗは、ｐｙｒＨ遺伝子の５’末端と相同である３０ヌクレオチドからなる配列およびプラスミドｐＫＤ１３（大腸菌遺伝子ストックセンター（ＣＧＳＣ）番号７６３３）上の２つのＦＲＴ部位（ＦＬＰ認識標的）の１つをコードするＤＮＡ配列と相補である２０ヌクレオチドを含んでなる配列をコードする。プライマーｐｙｒＨ−ｒｅｖは、ｐｙｒＨ遺伝子の３’末端と相同である３０ヌクレオチドからなる配列およびプラスミドｐＫＤ１３上の第二ＦＲＴ部位をコードするＤＮＡ配列と相補である２０ヌクレオチドを含んでなる配列をコードする。
【００９５】
増幅されたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーション法によって大腸菌（E. coli）株Ｗ３１１０／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨおよびＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨに導入した（実施例３参照）。カナマイシン耐性マーカー遺伝子（ｋａｎＲ）を染色体に組み込んだ細胞の選択を、５０ｍｇ／ｌカナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で行った。染色体に導入したカナマイシン耐性マーカー遺伝子（ｋａｎＲ）の取り出しを、プラスミドｐＣＰ２０（ＣＧＳＣ番号７６２９）上でコードされる酵素ＦＬＰリコンビナーゼを用いて行った。ｐＣＰ２０含有細胞の選択を、１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨの選択）および３４ｍｇ／ｌクロラムフェニコール（ｐＣＰ２０の選択）を含有するＬＢ寒天プレート上で行った。温度感受性複製開始点（ｏｒｉ）のおかげで、形質転換を行った後、プラスミドｐＣＰ２０を、非許容、すなわち、高温、例えば、４２℃において大腸菌（E. coli）細胞の培養により取り除くことができる。
【００９６】
温度感受性プラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨを同時に保持する温度感受性プラスミドｐＣＰ２０の消失の第一選択を、１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨの選択）を含有するＬＢ寒天プレート上で行った。その後、カナマイシン感受性、すなわち、染色体に導入されたカナマイシンマーカー遺伝子の消失、およびクロラムフェニコール感受性、すなわち、温度感受性プラスミドｐＣＰ２０の消失について、事前に選択したアンピシリン耐性細菌クローンをチェックした。
【００９７】
プライマーｐｙｒＨ−ｃｈｅｃｋ−ｆｏｒ（配列番号１１）およびｐｙｒＨ−ｃｈｅｃｋ−ｒｅｖ（配列番号１２）を用いて、ｐｙｒＨ遺伝子の染色体欠失について、カナマイシン感受性およびクロラムフェニコール感受性だけでなく、アンピシリン耐性クローンも最終的にチェックした。ＰＣＲによって、染色体ｐｙｒＨ欠失のチェック用に使用した鋳型は、選択したアンピシリン耐性、クロラムフェニコール感受性およびカナマイシン感受性クローン由来の染色体ＤＮＡであった。
【００９８】
染色体ｐｙｒＨ欠失およびプラスミドがコードしたｐｙｒＨ発現を有するこのように作成してチェックしたアンピシリン耐性大腸菌（E. coli）株は、Ｗ３１１０ΔｐｙｒＨ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨおよびＷ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｙｒＨ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨという記号表示を有する。
【００９９】
Ｂ）ｐｌｓＣ遺伝子の欠失
ｐｙｒＨ遺伝子と同様に、大腸菌（E. coli）内で酵素１−アシルグリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＰｌｓＣ）をコードする遺伝子ｐｌｓＣを、大腸菌（E. coli）株Ｗ３１１０／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣおよびＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣにおいて欠失した（Datsenko and Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645）。プライマーｐｌｓＣ−ｆｗ（配列番号１３）およびｐｌｓＣ−ｒｅｖ（配列番号１４）を用いて、カナマイシン耐性マーカー遺伝子（ｋａｎＲ）をコードするＤＮＡフラグメントを増幅した。プライマーｐｌｓＣ−ｆｗは、ｐｌｓＣ遺伝子の５’末端と相同である３０ヌクレオチドからなる配列およびプラスミドｐＫＤ１３（大腸菌遺伝子ストックセンター（ＣＧＳＣ）番号７６３３）上の２つのＦＲＴ部位（ＦＬＰ認識標的）の１つをコードするＤＮＡ配列と相補である２０ヌクレオチドを含んでなる配列をコードする。プライマーｐｌｓＣ−ｒｅｖは、ｐｌｓＣ遺伝子の３’末端と相同である３０ヌクレオチドからなる配列およびプラスミドｐＫＤ１３上の第二ＦＲＴ部位をコードするＤＮＡ配列と相補である２０ヌクレオチドを含んでなる配列をコードする。
【０１００】
増幅されたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーション法によって大腸菌（E. coli）株Ｗ３１１０／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣおよびＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣに導入した（実施例３参照）。染色体に導入したカナマイシン耐性マーカー遺伝子（ｋａｎＲ）の取り出しを、酵素ＦＬＰリコンビナーゼ（プラスミドｐＣＰ２０上でコードされた）を用いて再度行った。ｐＣＰ２０含有細胞の選択を、１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣの選択）および３４ｍｇ／ｌクロラムフェニコール（ｐＣＰ２０の選択）を含有するＬＢ寒天プレート上で同様に行った。温度感受性プラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣを同時に保持する温度感受性プラスミドｐＣＰ２０の消失の第一選択を、１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣの選択）を含有するＬＢ寒天プレート上で行った。あとで、カナマイシン感受性、すなわち、染色体に導入されたカナマイシンマーカー遺伝子の消失、およびクロラムフェニコール感受性、すなわち、温度感受性プラスミドｐＣＰ２０の消失について、事前に選択したアンピシリン耐性細菌クローンをチェックした。
【０１０１】
プライマーｐｌｓＣ−ｃｈｅｃｋ−ｆｏｒ（配列番号１５）およびｐｌｓＣ−ｃｈｅｃｋ−ｒｅｖ（配列番号１６）を用いて、ｐｌｓＣ遺伝子の染色体欠失について、これらのクローンを最終的にチェックした。ＰＣＲによって染色体ｐｌｓＣ欠失のチェック用に使用した鋳型は、選択したアンピシリン耐性、クロラムフェニコール感受性およびカナマイシン感受性クローン由来の染色体ＤＮＡであった。
【０１０２】
染色体ｐｌｓＣ欠失およびプラスミドがコードしたｐｌｓＣ発現を有するこのように作成してチェックしたアンピシリン耐性大腸菌（E. coli）株は、Ｗ３１１０ΔｐｌｓＣ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣおよびＷ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｌｓＣ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣという記号表示を有する。
【０１０３】
実施例５：システイン製造のための抗生物質耐性遺伝子含有産生プラスミドの作成
遺伝子ｃｙｓＥＸ（セリンアシルトランスフェラーゼのフィードバック耐性多様体をコードする：ＣｙｓＥ）およびｏｒｆ３０６（Ｏ−アセチルセリン／システインエキスポーターをコードする：ＥａｍＡ）のクローニングおよび発現用に使用した出発プラスミドは、欧州特許第０８８５９６２（Ｂ１）号に記載の基本プラスミドｐＭＴ１および産生プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ−ｃｙｓＥＸ−ｏｒｆ３０６であった。
【０１０４】
ｐＭＴ１は、テトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔＲ）だけでなく、ＬａｃＩｑ遺伝子産物により抑制されるｔａｃプロモーターも含み、この遺伝子がプラスミド上に同様に存在し、例えば、Ｄ−ラクトースまたはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などの誘導因子により活性化され得る。
【０１０５】
プラスミドｐＭＴ１の制限酵素および機能マップを図４に示す。プラスミドｐＭＴ１の配列は、配列表にある（配列番号１７）。
【０１０６】
システイン製造のための新規産生プラスミド作成のため、ｐＭＴ１をベースとして、遺伝子ｃｙｓＥＸおよびｏｒｆ３０６をコードするプラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ−ｃｙｓＥＸ−ｏｒｆ３０６由来のＮｃｏＩ−ＢｓａＢＩフラグメント（欧州特許第０８８５９６２（Ｂ１）号に記載）を、プラスミドｐＭＴ１由来の２４５８ｂｐ  ＮｃｏＩ−ＰｖｕＩＩフラグメント（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ  およびテトラサイクリン耐性、ｔｅｔＲをコードする）でライゲートした。
【０１０７】
「ＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Life Technologies GmbH）にライゲーション試料を形質転換し、前記細胞内で増殖し、単離したプラスミドのＤＮＡ配列をシークエンシングによって検証した。得られた発現プラスミドは、ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｔｅｔＲという記号表示を有する（図５参照）。
【０１０８】
実施例６：ＣＧＴアーゼ製造のための抗生物質耐性遺伝子含有産生プラスミドの作成
クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）Ｍ５ａ１（ジーンバンク番号Ｍ１５２６４）由来のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＴＧアーゼ）遺伝子のクローニングおよび発現用に使用した出発プラスミドは、再び、米国特許出願公開第２００８／０７６１５８（Ａ１）号に記載のプラスミドｐＭＴ１およびプラスミドｐＣＧＴであった。
【０１０９】
ＣＧＴアーゼ製造のための新規産生プラスミド作成のため、ｐＭＴ１をベースとして、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）Ｍ５ａ１由来のＣＴＧアーゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＣＧＴ由来のＭａｕＢＩ−ＢｓａＩフラグメントを、プラスミドｐＭＴ１由来の４００４ｂｐ  ＭａｕＢＩ−ＢｓａＩフラグメントでライゲートした。前記プラスミドｐＭＴ１由来の４００４ｂｐフラグメントは、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ、ｌａｃ／ｔａｃ作動遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔＲ）をコードする。
【０１１０】
「ＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Life Technologies GmbH）にライゲーション試料を形質転換し、前記細胞内で増殖し、単離したプラスミドのＤＮＡ配列をシークエンシングによって検証した。得られた発現プラスミドは、ｐＣＧＴ＿ｔｅｔＲという記号表示を有する（図６参照）。
【０１１１】
実施例７：Ｆａｂ−抗リゾチーム製造のための抗生物質耐性遺伝子含有産生プラスミドの作成
抗リゾチームＦａｂフラグメントのための遺伝子のクローニングおよび発現用に使用した出発プラスミドは、再び、米国特許出願公開第２００８／００７６１５８（Ａ１）号に記載のプラスミドｐＭＴ１およびｐＦａｂ−抗リゾチームであった。
【０１１２】
抗体フラグメントＦａｂ−抗リゾチームの製造のための新規産生プラスミド作成のため、ｐＭＴ１をベースとして、２つの鎖、すなわち、抗リゾチームＦａｂフラグメントの重鎖（ＶＨ〜ＣＨ１ドメイン）および軽鎖（ＶＬ〜ＣＬドメイン）をコードするプラスミドＦａｂ−抗リゾチーム由来のＭａｕＢＩ−ＢｓａＩフラグメントを、プラスミドｐＭＴ１由来の４００４ｂｐ  ＭａｕＢＩ−ＢｓａＩフラグメントでライゲートした。前記プラスミドｐＭＴ１由来の４００４ｂｐフラグメントは、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ、ｌａｃ／ｔａｃ作動遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔＲ）をコードする。
【０１１３】
「ＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Life Technologies GmbH）にライゲーション試料を形質転換し、前記細胞内で増殖し、単離したプラスミドのＤＮＡ配列をシークエンシングによって検証した。得られた発現プラスミドは、ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｔｅｔＲという記号表示を有する（図７参照）。
【０１１４】
実施例８：抗生物質耐性遺伝子のない本発明に従った産生プラスミドの作成をベースとしたマーカー遺伝子ｐｙｒＨまたはｐｌｓＣを含有する産生プラスミド作成
マーカー遺伝子として産生プラスミドｐｙｒＨまたはｐｌｓＣを含有する産生プラスミド作成用に使用した出発プラスミドは、実施例５〜７に記載されているように、プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｔｅｔＲ、ｐＣＧＴ＿ｔｅｔＲおよびｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｔｅｔＲであった。全てのこれらのプラスミドは、個々のＮｃｏＩ制限酵素部位を有する（図５〜７参照）。この汎用的ＮｃｏＩ制限酵素部位を、遺伝子ｐｙｒＨまたはｐｌｓＣのクローニングまたは組込みのために使用した。
【０１１５】
この目的のため、実施例１に記載のＰＣＲ産物および制限酵素ＮｃｏＩを使用する切断部を、ＮｃｏＩを用いて同様に切断した後に、プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｔｅｔＲ、ｐＣＧＴ＿ｔｅｔＲおよびｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｔｅｔＲでライゲートした。「ＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Life Technologies GmbH）に、個々のライゲーション試料を形質転換し、前記細胞内で増殖し、単離したプラスミドのＤＮＡ配列をシークエンシングによって検証した。得られたコンストラクトは、配向および使用したマーカー遺伝子に応じて、次の記号表示を有する：
ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲ  （図８参照）およびｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｙｒＨ２＿ｔｅｔＲ
ｐＣＧＴ＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲ  （図９参照）およびｐＣＧＴ＿ｐｙｒＨ２＿ｔｅｔＲ
ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲ  （図１０参照）およびｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨ２＿ｔｅｔＲ
ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲ（図１１参照）およびｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｌｓＣ２＿ｔｅｔＲ
ｐＣＧＴ＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲ  （図１２参照）およびｐＣＧＴ＿ｐｌｓＣ２＿ｔｅｔＲ
ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲ（図１３参照）およびｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣ２＿ｔｅｔＲ
【０１１６】
ｔｅｔＲ遺伝子の最終的取り出しのため、多様体ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲ、ｐＣＧＴ＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲ、ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲ、ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲ、ｐＣＧＴ＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲおよびｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲを用いてこの手順を続けた（図８〜１３参照）。
【０１１７】
実施例９：抗生物質耐性遺伝子ｔｅｔＲの取り出しおよび残存するマーカー遺伝子としてｐｙｒＨまたはｐｌｓＣを含有する産生プラスミドの、染色体ｐｙｒＨまたはｐｌｓＣ欠失を有する大腸菌（E. coli）株への形質転換
抗生物質耐性遺伝子ｔｅｔＲを含まず、マーカー遺伝子としてｐｙｒＨまたはｐｌｓＣを含む産生プラスミドの作成用に使用した出発プラスミドは、実施例８に記載されているように、プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲ、ｐＣＧＴ＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲ、ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲ、ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲ、ｐＣＧＴ＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲおよびｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲであった。実施例８に記載されているプラスミドｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲおよびｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲ由来の抗生物質耐性遺伝子ｔｅｔＲの取り出しを、制限酵素ＣｌａＩおよびその後の再ライゲーションを用いた消化により行った。
【０１１８】
プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲおよびｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲのため、２つのさらなるＣｌａＩ制限酵素部位が構造遺伝子ｃｙｓＥＸおよびｏｒｆ３０６中に位置しているので、ＣｌａＩを用いた部分的消化により遺伝子ｔｅｔＲを取り出したことを除いて同様な手順で行った（図８および１１参照）。
【０１１９】
ｐＣＧＴ＿ｐｌｓＣ１＿ｔｅｔＲの場合、酵素ＳｔｕＩ（切断してブラントエンドを残す）およびＦｓｐＩ（切断してブラントエンドを残す）を用いた消化により、ｔｅｔＲ遺伝子をプラスミドから取り出した。
【０１２０】
ｐＣＧＴ＿ｐｙｒＨ１＿ｔｅｔＲの場合、さらなるＦｓｐＩ制限酵素部位がｐｙｒＨ遺伝子に位置するので、酵素ＳｔｕＩ（切断してブラントエンドを残す）およびＦｓｐＩ（切断してブラントエンドを残す）を用いた部分的消化により、ｔｅｔＲ遺伝子をプラスミドから同様に取り出した（図９参照）。
【０１２１】
制限酵素消化後、ｔｅｔＲを含まないそれぞれの直鎖ベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により精製し、製造者からの情報に従って「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ、ヒルデン）を用いてアガロースゲルから単離した。その後、当該のｔｅｔＲを含まないベクターフラグメントを再ライゲートした。
【０１２２】
改良したＣａＣｌ２法を用いて、対応するライゲーション試料を、実施例４に記載されている株Ｗ３１１０ΔｐｙｒＨ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨおよびＷ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｙｒＨ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨまたはＷ３１１０ΔｐｙｒＨ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣおよびＷ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｙｒＨ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣに形質転換した。形質転換、すなわち、マーカー遺伝子としてｐｙｒＨまたはｐｌｓＣを含有する抗生物質耐性を含まない産生プラスミドの、対応する染色体欠失（ｐｙｒＨまたはｐｌｓＣ）を有する大腸菌（E. coli）株への導入のため、次の手順を行った：
【０１２３】
当該のライゲーション試料５〜２０μｌを株Ｗ３１１０ΔｐｙｒＨ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨおよびＷ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｙｒＨ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨまたはＷ３１１０ΔｐｌｓＣ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣおよびＷ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｌｓＣ／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣのＣａＣｌ２コンピテント細胞１００μｌに添加後、細胞をさらに３０分間氷上でインキュベートした。４２℃で４５秒間の短時間の熱ショック後、細胞を２分間氷上で冷却した。その後、ＬＢ培地９００μｌを形質転換試料に添加し、細胞を、慣例の３７℃だけでなく、３０〜９０分間４７℃〜５５℃でインキュベート／再生した。それから、非許容な高温でのさらなるインキュベーションを、１５〜２４時間４０℃〜４５℃で抗生物質を含まない（例えば、テトラサイクリンを含まない）ＬＢ寒天プレート上または液体ＬＢ培地中で行った。
【０１２４】
４７℃〜５５℃での３０〜９０分再生フェーズおよび非許容な高温での１５〜２４時間の培養は、温度感受性プラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨまたはｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣを新規選択マーカー遺伝子としてｐｙｒＨまたはｐｌｓＣを含有する最終的な抗生物質耐性のない産生プラスミドと交換することを促進する。
【０１２５】
形質転換細胞を６０分間５２℃で再生してから、２０時間４２℃で、ＬＢ寒天プレート上でインキュベートした場合に最良の形質転換結果を得た。
【０１２６】
テトラサイクリン耐性遺伝子ｔｅｔＲを含まないそれぞれｐｙｒＨ含有またはｐｌｓＣ含有産生プラスミドとの同時交換した温度感受性プラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨまたはｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣの消失についての予備選択を、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレート上で第一に行った。
【０１２７】
その後、予備選択した細菌クローンを、アンピシリン感受性、すなわち、温度感受性プラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｙｒＨまたはｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣの消失についてチェックした。
【０１２８】
アンピシリン感受性クローン由来のｐｙｒＨまたはｐｌｓＣをコードする産生プラスミドを、制限酵素消化によって最終的にチェックした。各々抗生物質耐性遺伝子ｔｅｔＲを含まないｐｙｒＨをコードする産生プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｙｒＨ、ｐＣＧＴ＿ｐｙｒＨおよびｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨの制限酵素マップを、図１４〜１６に図示している。各々抗生物質耐性遺伝子ｔｅｔＲを含まないｐｌｓＣをコードする産生プラスミドｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｌｓＣ、ｐＣＧＴ＿ｐｌｓＣおよびｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣの制限酵素マップを、図１７〜１９に図示している。
ｐｙｒＨまたはｐｌｓＣをコードする産生プラスミドを含み、かつ、染色体ｐｙｒＨまたはｐｌｓＣ欠失を有するこのように作成しチェックした抗生物質耐性のない大腸菌（E. coli）株は、以下の記号表示を有する：
・Ｗ３１１０ΔｐｙｒＨ／ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｙｒＨ
・Ｗ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｙｒＨ／ｐＣＧＴ＿ｐｙｒＨ
・Ｗ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｙｒＨ／ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨ
・Ｗ３１１０ΔｐｌｓＣ／ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｌｓＣ
・Ｗ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｌｓＣ／ｐＣＧＴ＿ｐｌｓＣ
・Ｗ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｌｓＣ／ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣ
【０１２９】
実施例１０：システイン発酵
予備培養１：
エルレンマイヤーフラスコ（１００ｍｌ）内で、ＬＢ培地２０ｍｌを、特定の大腸菌（E. coli）株Ｗ３１１０／ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｔｅｔＲ、Ｗ３１１０ΔｐｙｒＨ／ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｙｒＨまたはＷ３１１０ΔｐｌｓＣ／ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｐｌｓＣと一緒にインキュベートし、７時間振盪機（１５０ｒｐｍ、３０℃）上でインキュベートした。従来技術、すなわち選択薬物として抗生物質を用いた従来技術と関連して、コンストラクトＷ３１１０／ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｔｅｔＲの培養のため、培地にテラサイクリン１５ｍｇ／Ｌを添加した。
【０１３０】
予備培養２：
その後、予備培養液１を、ＳＭ１培地（１２ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３ｇ／ｌのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ｌのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／ｌのＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌのクエン酸Ｎａ３ｘ２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．１５ｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、２．５ｇ／ｌのＨ３ＢＯ３、０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ４ｘ５Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ２ｘ４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏからなる１ｍｌ／ｌの微量元素溶液）１００ｍｌに完全に移動し、これに５ｇ／ｌのグルコースおよび５ｍｇ／ｌのビタミンＢ１を添加した。培養液を１５０ｒｐｍ、１７時間、３０℃でエルレンマイヤーフラスコ（１ｌ）ないで振盪した。このインキュベーション後、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）は、３〜５であった。従来技術、すなわち選択薬物として抗生物質を用いた従来技術と関連して、Ｗ３１１０／ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｔｅｔＲの培養のため、培地にテラサイクリン１５ｍｇ／Ｌを添加した。
【０１３１】
主要培養：
発酵槽、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ社のＢＩＯＳＴＡＴ  Ｂモデル内で発酵を行った。総容量２ｌの培養槽を使用した。発酵培地（９００ｍｌ）は、１５ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ｌの酵素抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．３ｇ／ｌのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ｌのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ、０．０７５ｇ／ｌのＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌのクエン酸Ｎａ３ｘ２Ｈ２Ｏおよび微量元素溶液（上記参照）１ｍｌおよび０．００５ｇ／ｌのビタミンＢ１を含有する。２５％ＮＨ４ＯＨ溶液をポンプで注入することにより、発光槽内のｐＨを最初６．５に調節した。発酵中、ｐＨを、２５％ＮＨ４ＯＨを用いて自動補正により６．５のレベルに維持した。接種のため、１００ｍｌの予備培養液２を発酵槽にポンプで注入した。従って、開始体積は、約１ｌであった。培養液を最初４００ｒｐｍで撹拌し、細菌ろ過器を通して滅菌した圧縮空気２ｖｖｍで曝気した。これらの開始条件下、接種前に、酸素プローブを１００％飽和に補正した。発酵中のＯ２飽和に対する基準値を５０％に設定した。Ｏ２飽和が基準値より下に落ちた後、Ｏ２飽和を基準値に戻すために制御カスケードを開始した。この関連で、先ず、気体供給を連続的に増加（最大５ｖｖｍまで）してから、撹拌速度を連続的に上昇（最大１５００ｒｐｍまで）させた。
【０１３２】
３０℃の温度で発酵を行った。２時間の発酵時間後、１．５ｍｌ／時の速度で滅菌した６０％チオ硫酸ナトリウムｘ５Ｈ２Ｏ原液の形態で硫黄源を供給した。一旦、初期に１５ｇ／ｌの発酵槽内のグルコース含有量が約２ｇ／ｌまで落ちると、５６％グルコース溶液を連続的に計量して注入した。それ以降、発酵槽内のグルコース濃度がもはや２ｇ／ｌを超えないように供給速度を設定した。
【０１３３】
ＹＳＩ（米国オハイオ州イエロースプリングス）のグルコースアナライザーを用いてグルコースを決定した。従来技術、すなわち選択薬物として抗生物質を用いた従来技術と関連して、コンストラクトＷ３１１０／ｐｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６＿ｔｅｔＲの発酵のため、培地にテラサイクリン１５ｍｇ／Ｌを添加した。
【０１３４】
発酵時間は４８時間であった。その後、サンプルを集め、培養液上澄み（特に、Ｌ−システインおよびチアゾリジン）および沈殿物（Ｌ−シスチン）中のＬ−システインおよびそれから誘導された誘導体を互いに分離して決定した。この目的のため、Ｇａｉｔｏｎｄｅ（Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633）による比色分析をいずれの場合にも使用した。同様に定量化する前に、沈殿物中に存在するＬ−シスチンを、先ず、８％塩酸中に溶解しなければならなかった。総システインのついての表１中に一覧した値は、培養液上澄み中のＬ−システインと沈殿物中のＬ−シスチンとの合計に相当する。この関連で、Ｌ−シスチンの各分子は、Ｌ−システインの２つの分子に相当する。
【０１３５】
【表１】
2018536423.tif 000003
【０１３６】
実施例１１：１０  ｌスケールでのシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの分泌生産（発酵）
大腸菌（E. coli）のｌｐｐ変異体を用いて、例えば、ＣＧＴアーゼなどのバイオテクノロジー的に関連ある酵素を産生し、培地に分泌することができる（米国特許出願公開第２００８／０７６１５８（Ａ１）号）。
【０１３７】
株Ｗ３１１０ｌｐｐ３／ｐＣＧＴ＿ｔｅｔＲ（コントロール）、Ｗ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｙｒＨ／ｐＣＧＴ＿ｐｙｒＨおよびＷ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｙｒＨ／ｐＣＧＴ＿ｐｌｓＣを用いて、１０Ｌ撹拌槽発酵槽内でＣＧＴアーゼの分泌生産を行った。
【０１３８】
発酵培地ＦＭ４（１．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４；５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ；０．１５ｇ／ｌのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ，０．０７５ｇ／ｌのＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ；１ｇ／ｌのクエン酸Ｎａ３ｘ２Ｈ２Ｏ；０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ；１ｍｌ／ｌの微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ；２．５ｇ／ｌのＮａ３ＢＯ３；０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ；０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ４ｘ５Ｈ２Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ２ｘ４Ｈ２Ｏ；０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ）；５ｍｇ／ｌのビタミンＢ１；３ｇ／ｌのファイトン；１．５ｇ／ｌの酵母抽出物；１０ｇ／ｌのグルコース）６ｌで満たした発酵槽を、予備培養液を１：１０の比で接種し、これを同じ培地中一夜培養した。発酵中、３０℃の温度を設定し、ｐＨを、ＮＨ４ＯＨまたはＨ３ＰＯ４を計量して注入することにより７．０のレベルを一定に維持した。発酵培地中の最大グルコース濃度が＜１０ｇ／ｌになるように、発酵の間中グルコースを計量して注入した。対数増殖期の最後にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭまで添加することにより発現を誘導した。
【０１３９】
従来技術、すなわち選択薬物として抗生物質を用いた従来技術と関連して、コンストラクトＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＣＧＴ＿ｔｅｔＲの発酵のため、培地にテラサイクリン１５ｍｇ／Ｌを添加した。
【０１４０】
発酵７２時間後、サンプルを集め、遠心分離により発酵培地から細胞を取り出し、発酵上澄み中のＣＧＴアーゼ含有量を、米国特許出願公開第２００８／０７６１５８（Ａ１）号の実施例４に記載の通り決定した。
【０１４１】
表２は、発酵上澄み中の機能性ＣＧＴアーゼの収量および活性を一覧にしている。
【０１４２】
【表２】
2018536423.tif 000004
【０１４３】
実施例１２：１０  ｌスケールでのＦａｂ抗体フラグメント抗リゾチーム−Ｆａｂの分泌発酵生産
大腸菌（E. coli）のｌｐｐ変異体を用いて、機能性Ｆａｂ抗体フラグメントも細胞外で製造することができる（米国特許出願公開第２００８／０７６１５８（Ａ１）号）。この場合、細胞は、ドメインＶＬおよびＣＬを含んでなる軽鎖、ならびにドメインＶＨおよびＣＨ１を含んでなる重鎖の対応するフラグメントを同時に合成し、それから、周辺質および最終的に発酵培地に分泌しなければならない。それから、細胞質の外側では、２つの鎖は会合して機能性Ｆａｂフラグメントを形成する。
【０１４４】
本実施例は、特徴がはっきりした抗リゾチーム抗体Ｄ１．３のＦａｂフラグメントの製造について記載している。
【０１４５】
プラスミドｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｔｅｔＲ、ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨおよびｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣは、それぞれ、マーカー遺伝子ｔｅｔＲ、ｐｙｒＨおよびｐｌｓＣだけでなく、とりわけ、オペロンの形態のＦａｂフラグメントのＨＣおよびＬＣの構造遺伝子を含む。この場合、ＨＣは、ｏｍｐＡシグナル配列（ｏｍｐＡＳＳ）の３’末端とインフレームで融合し、ＬＣは、ＣＧＴアーゼシグナル配列（ｃｇｔＳＳ）の３’末端とインフレームで融合する。ｏｍｐＡＳＳ−ＨＣ−ｃｇｔＳＳ−ＬＣオペロンの発現は、ｔａｃプロモーターの制御下にある。
【０１４６】
株Ｗ３１１０ｌｐｐ３／ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｔｅｔＲ、Ｗ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｙｒＨ／ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｙｒＨおよびＷ３１１０ｌｐｐ３ΔｐｌｓＣ／ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｐｌｓＣを用いて、ＣＧＴアーゼに基づいた実施例１１に記載した方法と同様に、１０ｌスケールでの抗リゾチームＦａｂフラグメントの製造を行った。従来技術、すなわち選択薬物として抗生物質を用いた従来技術と関連して、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０ｌｐｐ３／ｐＦａｂ−ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｔｅｔＲの発酵のため、培地にテラサイクリン１５ｍｇ／Ｌを添加した。
【０１４７】
発酵７２時間後、サンプルを集めてから、遠心分離により発酵培地から細胞を取り出した。
【０１４８】
Ｓｋｅｒｒａ（1994, Gene 141, 79-84）に記載されたように親和性クロマトグラフィーによって、発酵上澄みから抗リゾチームＦａｂフラグメントを精製した。
【０１４９】
精製した抗リゾチームＦａｂフラグメントを定量化し、抗原としてリゾチームを用いたＥＬＩＳＡアッセイによりその活性を決定した（Skerra, 1994, Gene 141, 79-84）。
【０１５０】
表２は、いずれの場合も、７２時間の発酵後の発酵上澄み２０ｍｌの単離された量に基づいて、発酵上澄み中の機能性抗リゾチームＦａｂフラグメントの推定収量を一覧にしている。
【０１５１】
【表３】
2018536423.tif 000005
【０１５２】
実施例１３：プラスミド安定性の決定
プラスミド試料を用いて、続く制限酵素消化でプラスミド安定性をチェックした。この目的のため、生産菌株の培養の完了（例えば、発酵７２時間後）後にＬＢ寒天プレート上に様々な希釈の培養液を蒔いた。プラスミド安定性のその後の確認、すなわち、プラスミド担持細胞（コロニー）の同定のため、個々のコロニーを含むＬＢプレートのみを評価に使用した。
【０１５３】
全部で、５０の個々のコロニーを１５〜２０時間液体ＬＢ培地中で培養してから、プラスミドＤＮＡを前記培養液から単離した。個々の産生プラスミドの特徴的制限酵素パターンを基礎にして使用して、単離されたプラスミドの精度を検証した。
【図１】
2018536423.tif 000006
【図２】
2018536423.tif 000007
【図３】
2018536423.tif 000008
【図４】
2018536423.tif 000009
【図５】
2018536423.tif 000010
【図６】
2018536423.tif 000011
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年11月7日(2016.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
株の栄養要求性を引き起こす遺伝子変異をそのゲノム内に含み、かつ低分子量物質または少なくとも１つの組換えタンパク質の生産のための少なくとも１つの酵素をコードする産生プラスミドも含み、かつ前記遺伝子の機能性コピーも含み、その染色体不活性化が前記栄養要求性を引き起こす、低分子量物質またはタンパク質の生産のための微生物株であって、前記栄養要求性が供給不能な栄養要求性であり、かつ前記遺伝子がｐｙｒＨ遺伝子もしくはｐｌｓＣ遺伝子またはその相同遺伝子であることを特徴とする、微生物株。
【請求項２】
前記株の供給不能な栄養要求性を引き起こす遺伝子の変異が、前記遺伝子の不活化をもたらすことを特徴とする、請求項１に記載の微生物株。
【請求項３】
前記株の供給不能な栄養要求性を引き起こす遺伝子の変異が前記遺伝子によりコードされる遺伝子産物の活性の不活化をもたらすことを特徴とする、請求項１または２に記載の微生物株。
【請求項４】
変異または欠失により前記株の供給不能な栄養要求性を引き起こす遺伝子に変換することができる遺伝子を有する微生物株に、温度感受性プラスミドを導入することを特徴とし、前記温度感受性プラスミドが変異または欠失する前記遺伝子の機能性コピーを有し、その上、前記株が遺伝子内に前記株の供給不能な栄養要求性をもたらす変異を有し、かつ前記遺伝子の機能性コピーが前記温度感受性プラスミド上に存在するように前記株のゲノムは変異し、かつその上、前記温度感受性プラスミドが前記株内で非許容温度において産生プラスミドに交換され、ここで前記産生プラスミドは低分子量物質または組換えタンパク質の製造のための酵素をコードする遺伝子を含み、かつ前記栄養要求性を引き起こす前記遺伝子の機能性コピーも含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の株の製造方法。
【請求項５】
前記温度感受性プラスミドが温度感受性複製開始点を有することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記産生プラスミドを用いた形質転換直後に、細胞を３０〜９０分間４７〜５５℃で温度ショックに暴露し、その後に３７〜４５℃の非許容温度においてさらなるインキュベーションを行うことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
発酵培地中の微生物株を用いた低分子量物質またはタンパク質の製造方法であって、該方法が、請求項１〜３の一項以上に記載の微生物株を使用し、かつ、抗生物質を含まない発酵培地を使用することを特徴とする、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月6日(2018.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
増幅されたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーション法によって大腸菌（E. coli）株Ｗ３１１０／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣおよびＷ３１１０ｌｐｐ３／ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣに導入した（実施例３参照）。染色体に導入したカナマイシン耐性マーカー遺伝子（ｋａｎＲ）の取り出しを、酵素ＦＬＰリコンビナーゼ（プラスミドｐＣＰ２０上でコードされた）を用いて再度行った。ｐＣＰ２０含有細胞の選択を、１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣの選択）および３４ｍｇ／ｌクロラムフェニコール（ｐＣＰ２０の選択）を含有するＬＢ寒天プレート上で同様に行った。温度感受性プラスミドｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣを同時に保持する温度感受性プラスミドｐＣＰ２０の消失の第一選択を、１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ｐＡＦ−ｔｓ−ｐｌｓＣの選択）を含有するＬＢ寒天プレート上で行った。あとで、カナマイシン感受性、すなわち、染色体に導入されたカナマイシンマーカー遺伝子の消失、およびクロラムフェニコール感受性、すなわち、温度感受性プラスミドｐＣＰ２０の消失について、事前に選択したアンピシリン耐性細菌クローンをチェックした。
【国際調査報告】
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