(57)【要約】  遺伝子操作したペイロード送達システムは、孔形成ユニットに共有結合した標的細胞結合ユニット、および孔形成ユニットに非共有結合しうる領域を用いて適合させたペイロード部分を含む。孔形成ユニットはクロストリジウム毒素の特定の血清亜型由来であり、他方、ペイロード領域はクロストリジウム毒素の別の血清亜型由来である。本開示のキメラタンパク質ベースの組成物は、ペイロードを神経細胞に特異的に送達することができる。
2018515542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤を標的細胞に送達するための組成物であって、
標的細胞結合ユニット、
孔形成ユニット、および
該薬剤を含むペイロードユニットであって、該孔形成ユニットに非共有結合している前記ペイロードユニット
を含み、該孔形成ユニットは非神経毒性の二成分毒素の第１のＡＢ型由来のポリペプチドであり、該標的細胞結合ユニットは毒素の第２の型由来のポリペプチドであり、前記第２の型は該第１の型とは異なる、前記組成物。
【請求項２】
孔形成ユニットは、ボツリヌス菌毒素Ｃ２の孔形成ユニットの重鎖由来のポリペプチドまたはポリペプチドオリゴマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
孔形成ユニットは、ボツリヌス菌毒素Ｃ２以外の毒素由来の天然のまたは改変された重鎖結合ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
孔形成ユニットは、ウエルシュ菌のアルファ、ベータ、イプシロンおよびイオタ毒素、スピロフォルム菌のイオタ様毒素ならびに炭疽毒素からなる群から選択される毒素由来の天然のまたは改変された孔形成ドメインを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
標的細胞結合ユニットは、ボツリヌス菌毒素Ｃ２以外の毒素由来の天然のまたは改変された重鎖結合ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
標的細胞結合ユニットは、ボツリヌス菌神経毒、ウエルシュ菌の毒素アルファ、ベータ、イプシロンおよびイオタ毒素、スピロフォルム菌のイオタ様毒素、コレラ毒素、炭疽毒素、志賀毒素、志賀様毒素、ジフテリア毒素、リシンならびに外毒素Ａからなる群から選択される毒素由来の天然のまたは改変された重鎖結合ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
標的細胞結合ユニットは、神経細胞に優先的に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
薬剤を神経細胞に優先的に送達する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
標的細胞結合ユニットは、ボツリヌス菌神経毒Ｃ１の重鎖結合ドメイン（Ｃ１  Ｈｃｃ）由来である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
標的細胞結合ユニットは、孔形成ユニットに共有結合する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ペイロードユニットは、標的細胞結合ユニットまたは孔形成ユニットに共有結合していない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
薬剤は、治療薬、診断薬およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
薬剤は、毒素、細胞周期阻害物質、アポトーシス誘導剤、ＤＮＡ複製阻害物質、ＲＮＡ合成阻害物質、タンパク質合成阻害物質、酵素、タンパク質結合薬剤、抗体、中和抗体、標識剤、磁気ビーズおよびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
薬剤は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
薬剤は、ボツリヌス菌毒素Ｃ２からのＣ２Ｉを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
薬剤は、蛍光性薬剤を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
標的細胞結合ユニットはボツリヌス菌神経毒Ｃ１からの重鎖結合ドメイン（Ｃ１  Ｈｃｃ）であり、孔形成ユニットはボツリヌス菌毒素Ｃ２の孔形成ユニットの重鎖であり、ペイロードユニットはボツリヌス菌毒素Ｃ２からのＣ２Ｉを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
標的細胞結合ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、孔形成ユニットは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ペイロードユニットは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
標的細胞結合ユニットおよび孔形成ユニットは共有結合で連結して、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを形成し、ペイロードユニットは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
薬剤を標的細胞へ送達する方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物を標的細胞へ投与することを含む前記方法。
【請求項２１】
組成物が対象へ注射により投与され、該対象が標的細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
標的細胞は、脳腫瘍の細胞、神経芽細胞腫の細胞および網膜芽細胞腫の細胞、末梢ニューロン；運動ニューロン、感覚ニューロンならびにそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーである、請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１〜６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／１６２，５８２号の優先権を主張するものであり、これはまたあらゆる目的のために全体を参照によって本出願に組み入れる。
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国国防総省国防脅威削減局の授与による助成第ＨＤＴＲＡ−１０−Ｃ−００５５号の下、政府支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）は、芽胞を形成する耐熱性の嫌気性細菌であり、Ａ〜Ｇ血清型として知られる数種の血清型をもつタンパク質ベースの毒素（ボツリヌス毒素）を生産し、その血清型のうちのＣには３つの亜型があり、血清型Ｃ１、Ｃ２およびＣ３として知られる。Ｃ１神経毒は、ニューロンによるアセチルコリン放出を阻害することにより、低用量で人間や動物を麻痺させ、回復は遅く、人が再び呼吸できるようになるまで数週間にわたる換気が治療に必要となることがある。Ｃ２毒素は神経刺激性ではなく、壊死と出血を引き起こす。Ｃ３毒素は、これらのＣ血清亜型の中で特性の決定が最も進んでいない。
【０００４】
毒素ベースの送達システムのほとんどは、標的細胞に結合して、脂質二重層を通って標的細胞の細胞質ゾルへ物質（ペイロード）を移送する（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅ）マルチドメインタンパク質である。これらのシステムは、改造したＡＢ型毒素であり、ペイロードドメイン（Ａ）および結合／トランスロケーション（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）ドメイン（Ｂ）からなる。このＡおよびＢドメインは、ポリペプチドによるまたはジスルフィド結合による共有結合で連結させることができ、後にトランスロケーションのステップで切断される。非共有結合で連結した（二成分の）ＡおよびＢ毒素ドメインは、独立して転写、翻訳されて、毒性を発揮する前に会合する。ボツリヌス菌Ｃ２毒素（Ｃ２）は神経毒ではないが、二成分ＡＢ毒素の設計を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、ペイロード（または薬剤）を標的細胞へ送達するためのキメラ毒素ベースの送達組成物（またはシステム）を提供することにより当技術分野を前進させるものである。一実施形態において、組成物は、他のさらなる成分を追加してまたは追加することなく、標的細胞結合ユニット、孔形成ユニットおよびペイロードユニットを含んでもよい。
【０００６】
一実施形態において、孔形成ユニットは、既知の毒素、例えばボツリヌス菌からの毒素の孔形成ユニットと同じであってもよい。別の実施形態において、孔形成ユニットは改変を有する既知の毒素の孔形成ユニット由来であってもよい。別の実施形態において、孔形成ユニットは、孔形成ユニットとして機能しうる任意のタンパク質であってもよい。
【０００７】
ペイロードユニットは、標的細胞に送達する薬剤を含んでもよい。一態様において、ペイロードユニットは、孔形成ユニット、または連結した孔形成ユニットおよび標的細胞結合ユニットと非共有結合していてもよい。別の態様において、孔形成ユニットと標的細胞結合ユニットは共有結合で連結する。
【０００８】
一実施形態において、ペイロードユニットは、既知の毒素、例えばボツリヌス菌からの毒素のペイロードユニットと同じであってもよい。別の実施形態において、ペイロードユニットは、改変を有する既知の毒素のペイロードユニット由来であってもよい。別の実施形態において、ペイロードユニットは、薬剤の送達のためのペイロードユニットとして機能しうる任意のタンパク質であってもよい。
【０００９】
別の実施形態において、標的細胞結合ユニットは、抗体、抗体断片、アフィボディ、成長因子、受容体結合リガンドまたはそれらの組合せからなる群から選択される、特定の標的細胞に結合するリガンドを含んでもよい。別の実施形態において、標的細胞結合ユニットは、Ｃ２以外のボツリヌス菌毒素由来の天然のまたは改変された重鎖結合ドメインを含んでもよい。
【００１０】
別の実施形態において、標的細胞結合ユニットは、神経細胞に優先的に結合する。別の実施形態において、組成物は、薬剤を神経細胞に優先的に送達する。別の実施形態において、標的細胞結合ユニットは、ボツリヌス菌神経毒Ｃ１の重鎖結合ドメイン（Ｃ１  Ｈｃｃ）（図２ｃ、配列番号１を参照）である。
【００１１】
別の実施形態において、孔形成ユニットは非神経毒性（すなわちニューロンを特異的に標的としない）毒素の第１の型由来のポリペプチドであってもよく、標的細胞結合ユニットは毒素の第２の型由来のポリペプチドであってもよく、ここで第２の型は、毒素の第１の型とは異なる。別の実施形態において、非神経毒性毒素の第１の型は、二成分毒素であってもよい。
【００１２】
別の実施形態において、孔形成ユニットは第１のクロストリジウム毒素血清亜型由来のポリペプチドであってもよく、他方、標的細胞結合ユニットは第２のクロストリジウム毒素血清亜型由来のポリペプチドであり、ここで第２の血清亜型は、第１の血清亜型とは異なる。別の実施形態において、孔形成ユニットはボツリヌス菌毒素Ｃ２の孔形成ユニットの重鎖由来のポリペプチド（図２ｃ、配列番号２を参照）である。
【００１３】
別の実施形態において、孔形成ユニットは、ボツリヌス菌毒素Ｃ２以外の毒素由来の天然のまたは改変された重鎖結合ドメインを含んでもよい。一態様において、孔形成ユニットは、ウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のアルファ、ベータ、イプシロンおよびイオタ毒素、スピロフォルム菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ）のイオタ様毒素、炭疽毒素ならびにそれらの組合せからなる群から選択される毒素由来の天然のまたは改変された孔形成ドメインを含んでもよい。
【００１４】
一実施形態において、孔形成ユニットはボツリヌス菌毒素Ｃ２の孔形成ユニットの重鎖由来のポリペプチドであり、他方、標的細胞結合ユニットはボツリヌス菌毒素Ｃ２以外の毒素由来の天然のまたは改変された重鎖結合ドメインを含んでもよい。一態様において、標的細胞結合ユニットは、ボツリヌス菌神経毒、ウエルシュ菌の毒素アルファ、ベータ、イプシロンおよびイオタ毒素、スピロフォルム菌のイオタ様毒素、コレラ毒素、炭疽毒素、志賀毒素、志賀様毒素、ジフテリア毒素、リシン、外毒素Ａならびにそれらの組合せからなる群から選択される毒素由来の天然のまたは改変された重鎖結合ドメインを含んでもよい。
【００１５】
別の実施形態において、ペイロードユニットは、標的細胞結合ユニットまたは孔形成ユニットに共有結合していない。別の実施形態において、ペイロードユニットはボツリヌス菌毒素Ｃ２由来のポリペプチド（図２ｄ、配列番号３を参照）である。
【００１６】
別の実施形態において、薬剤は、治療薬、診断薬、造影剤およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。別の態様において、薬剤は、毒素、細胞周期阻害物質、アポトーシス誘導剤、ＤＮＡ複製阻害物質、ＲＮＡ合成阻害物質、タンパク質合成阻害物質、酵素、タンパク質結合薬剤、抗体、中和抗体、標識剤、磁気ビーズおよびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含んでもよい。
【００１７】
別の実施形態において、薬剤は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼを含む。別の実施形態において、薬剤は、ボツリヌス菌毒素Ｃ２からのＣ２Ｉを含む。別の実施形態において、薬剤は、標的細胞を標識するまたはモニタリングするための蛍光性薬剤を含む。
【００１８】
一実施形態において、標的細胞はがん細胞であってもよい。別の実施形態において、標的細胞はニューロンであってもよい。別の実施形態において、標的細胞は、脳腫瘍の細胞、神経芽細胞腫の細胞、網膜芽細胞腫の細胞、末梢ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロンまたはそれらの組合せであってもよい。
【００１９】
別の実施形態において、遺伝子操作したペイロード送達組成物は、孔形成ユニットに共有結合した標的細胞結合ユニット、および孔形成ユニットに非共有結合しうる領域を用いて適合させたペイロード部分を含んでもよい。別の実施形態において、リンカー、（ＥＰ）１０で連結した孔形成ユニットに共有結合した標的細胞結合ユニットを含むことができるポリペプチド（配列番号４）を開示する。ここで標的細胞結合ユニットはボツリヌス菌神経毒Ｃ１の重鎖結合ドメイン（Ｃ１  Ｈｃｃ）であり、孔形成ユニットはボツリヌス菌毒素Ｃ２の孔形成ユニットの重鎖由来のポリペプチドである。
【００２０】
別の実施形態において、活性のあるペイロード領域は、ボツリヌス毒素Ｃ２の軽鎖ペイロード部分由来の連結領域を介して孔形成ユニットに結合している。別の態様において、標的細胞結合ユニットは、ボツリヌス毒素Ｃ１の標的細胞結合ユニット由来である。
【００２１】
別の実施形態において、標的細胞結合ユニットはボツリヌス菌神経毒Ｃ１からの重鎖結合ドメイン（Ｃ１  Ｈｃｃ）であり、孔形成ユニットはボツリヌス菌毒素Ｃ２の孔形成ユニットの重鎖であり、ペイロードユニットはボツリヌス菌毒素Ｃ２からのＣ２Ｉを含む。
【００２２】
別の実施形態において、標的細胞結合ユニット、孔形成ユニットおよびペイロードユニットを含む、薬剤を標的細胞に送達するための組成物において、標的細胞結合ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０、９０、９５、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、孔形成ユニットは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０、９０、９５、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ペイロードユニットは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０、９０、９５、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００２３】
別の実施形態において、標的細胞結合ユニット、孔形成ユニットおよびペイロードユニットを含む、薬剤を標的細胞に送達するための組成物において、標的細胞結合ユニットと孔形成ユニットは共有結合で連結して、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０、９０、９５、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを形成し、ペイロードユニットは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０、９０、９５、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００２４】
別の実施形態において、本開示の組成物を対象へ注射により投与してもよい。ここで対象は標的細胞を含む。
【００２５】
別の実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを開示するが、ここでポリペプチドは、配列番号１〜６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８０、９０、９５、９９％または１００％の同一性を有する。一態様において、ポリヌクレオチドはベクターで運んでもよい。一態様において、ベクターは自己複製することができる。
【００２６】
別の実施形態において、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞も開示する。宿主細胞は、薬剤を標的細胞に送達するための組成物を生産するのに使用してもよい。別の実施形態において、宿主細胞を薬剤の送達のために対象へ導入してもよい。別の実施形態において、本開示の目的のためには、宿主細胞は細菌またはウイルスであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】（ａ）天然のＣ２毒素による中毒の分子によるステップ、および（ｂ）Ｃ２ＩＩ−Ｃ１およびＣ２Ｉｔ輸送システムに基づく神経の送達のモデルを示す図である。
【図２】ボツリヌス菌Ｃ１、ボツリヌス菌Ｃ２ＩＩ、融合Ｃ２ＩＩ−Ｃ１およびＣ２Ｉのタンパク質ドメインを示す図である。数字は各タンパク質のアミノ酸残基に相当する。（ａ）ＢｏＮＴ  Ｃ１は、連結した酵素活性をもつ軽鎖ペイロードと結合／トランスロケーションドメインとを有する。（ｂ）Ｃ２ＩＩ結合／トランスロケーション成分は４つのドメインを有する。アミノ酸残基の１８２は、Ｃ２ＩＩのＣ２ＩＩａへの活性化のためのトリプシン切断位置を示す。ドメイン４（Ｄ４）を除去して、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１のトランスロケーションドメインとしてのＣ２ＩＩΔＤ４を生産した。（ｃ）融合Ｃ２ＩＩ−Ｃ１（配列番号４）は、グリシン−セリン残基ペアが両側に位置する（ＥＰ）１０リンカー（配列番号５）を用いてＣ２ＩＩΔＤ４（配列番号２）とＢｏＮＴ  Ｃ１  ＨＣＣ（配列番号１）を連結して作製した。アミノ酸１８２はＣ２ＩＩ−Ｃ１の活性化部位である。（ｄ）Ｃ２毒素の天然のＣ２Ｉの酵素活性をもつペイロードおよびトランケートされたＣ２Ｉｔドメイン。アミノ酸２９９、３４８、３８７および３８９はＣ２Ｉ（配列番号３）のＡＤＰ−リボシル化活性に必須であり、よって、Ｃ２Ｉｔ（配列番号６）には存在しない。
【図３】異なる程度に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）ＧＴ１ｂ富化した（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）細胞集団へのＣ２ＩＩ−Ｃ１が媒介したＣ２Ｉｔ−４８８の取込みを評価するフローサイトメトリーの図である。（ａ）クマシー染色した精製Ｃ２Ｉｔ（約２６ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン：Ｍ：分子定規、１：トロンビン切断後の可溶性溶出画分。（ｂ）示したＮ２Ａ細胞は、ＧＴ１ｂ富化した後、組換えタンパク質である活性化Ｃ２ＩＩ−Ｃ１（２μｇ／ｍＬ）およびＣ２Ｉｔ−４８８（４μｇ／ｍＬ）と共に２時間、インキュベートした。次に、細胞をプロナーゼ（１μｇ／ｍＬ）で処理して膜に結合したＣ２Ｉｔ−４８８を除去した。試料は、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエアを使用したＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターで分析した。（ｃ）フローサイトメトリーによる細胞内蛍光の定量的評価。百分率は平均±ＳＥＭ（ｎ=３）として表しており、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１が媒介したＣ２Ｉｔ−４８８のＧＴ１ｂ依存性の取込みの統計的有意性は、各対照の平均値との比較によるスチューデントのｔ検定を用いて算出した。ｐ＜０．００５。
【図４】（ａ）および（ｂ）は、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１およびＣ２Ｉ−５６８で処理した、異なる程度にＧＴ１ｂ富化したＮ２Ａ細胞のＣＬＳＭ画像である。画像はすべて、６０倍油浸レンズと２倍光学ズームレンズを使用して取得した。Ｎ２Ａ集団は、Ｒａｂ５ａ−ＧＦＰ初期エンドソームマーカー（緑）で２４時間処理した後、ＤＡＰＩで染色した。活性化Ｃ２ＩＩ−Ｃ１（２μｇ／ｍＬ）、Ｃ２Ｉｔ−５６８（赤、４μｇ／ｍＬ）およびＧＴ１ｂ（５０μｇ／ｍＬ）は２時間インキュベートした。（ａ）タンパク質添加前の４時間、細胞をＧＴ１ｂ富化した。（ｂ）タンパク質添加前の４時間、細胞はＧＴ１ｂ富化を行わなかった。
【図５】Ｃ２ＩＩ−Ｃ１が媒介したＣ２Ｉによる、異なる程度にＧＴ１ｂ富化した細胞集団の細胞円形化を示す図である。（ａ）クマシー染色した精製Ｃ２ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。予想質量：Ｃ２Ｉ−ＧＳＴ（約７５ｋＤａ）Ｃ２Ｉ（約４９ｋＤａ）、分子定規、１：溶解物上清、２：トロンビン切断前の精製樹脂、３：トロンビン切断後の可溶性溶出画分。（ｂ）Ａ１７２神経膠芽細胞種細胞を約６０％コンフルエントになるまで増殖させ、示すようにＧＴ１ｂ富化したまたは富化しなかった。（ｃ）チミジンブロックを解除しまたは解除することなく、ヨウ化プロピジウムで染色した同調ＨｅＬａ細胞の経時的なフローサイトメトリーを用いて、過剰チミジンの除去および解除用デオキシシチジン添加後のＳ期ＤＮＡ合成の進行を確認した。（ｄ）異なる程度にＧＴ１ｂ富化した同調ＨｅＬａ細胞の細胞円形化。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
分子ペイロードを標的細胞の細胞質ゾルへ送達するための組成物および方法を開示する。細菌は、細胞を標的に定めて、有毒なペイロードを標的細胞の細胞質ゾルへ送達する機構を進化させてきた。この機構を改変し、遺伝子操作して有益なペイロードを送達することができる。
【００２９】
一般的には、ＡＢ型細菌性毒素には連結型と非連結型（二成分）の２つのクラスがある。連結型毒素は、典型的には、毒素ドメインおよび結合／トランスロケーションドメインの両方を含む一本鎖タンパク質を有する。二成分毒素は、典型的には、別々に発現した２つのタンパク質分子を有し、結合／トランスロケーションドメインと毒素ドメインは非共有的相互作用を介して集合体をなす。
【００３０】
本開示の目的のために、用語「由来の」は、分子が別の分子に基づき構築され、該別の分子に対し、構造上、同一、実質的に同一または実質的に類似であることを意味する。別の態様において、由来した分子は、典型的には、別の分子と同一、実質的に同一または実質的に類似の機能性を発揮する。
【００３１】
用語「配列同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列における類似度を表すために使用する。より小さい分子をより大きい分子と比較する場合、より小さい分子をより大きい分子の全長または部分断片に対して比較してよい。
【００３２】
天然のＣ２毒素は２つの別個のタンパク質から構成される。Ｂドメインタンパク質（Ｃ２ＩＩ）は、標的細胞に結合してＡドメイン（Ｃ２Ｉ、ペイロード）を移送する。Ａドメインは、細胞質アクチンのＡＤＰ−リボシル化により細胞円形化およびアポトーシスを開始させるＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼである（図１ａ）。Ｃ２ＩＩモノマーは、タンパク質分解性のプロセシングを受けてＮ末端から２０ｋＤａセグメントが除去されることにより、結合／トランスロケーションドメインがＣ２ＩＩａへと活性化される。Ｃ２ＩＩａモノマーはその後、自発的にオリゴマーを形成し、細胞膜上のアスパラギン連結グリカンとの相互作用を介して細胞表面に結合する。ＡドメインであるＣ２Ｉは、Ｃ２ＩＩａオリゴマーと結合し、そのＣ２ＩＩａ／Ｃ２Ｉ複合体はクラスリンおよびＲｈｏ依存性の機構により内在化する。初期エンドソームの酸性化によってＣ２ＩＩａオリゴマーによる膜孔形成が起こり、これを通ってＣ２Ｉは細胞質へ輸送される。
【００３３】
治療用の開発のために、二成分毒素の遺伝子操作は、これにより結合／トランスロケーションドメインおよびペイロードドメインを個別に発現させて精製することができるため、有益であることは確かである。ボツリヌス菌からのＣ２毒素は二成分構造であるが、種々の細胞と結合し、中毒にはＮ連結型グリカンを必要とする（すなわち、特異的神経毒ではない）ため、非特異性の毒素である。本明細書では、Ｃ２毒素結合ドメインを神経細胞へ再標的化させるように遺伝子操作する方法を開示する。より具体的には、Ｃ１ボツリヌス神経毒からの標的結合ドメインを使用してもよい。Ｃ１ボツリヌス神経毒からの結合ドメインは、連結型毒素の設計において末梢神経組織への薬物送達のための標的化成分として、またリポソーム表面への修飾として既に利用されている。
【００３４】
一実施形態において、Ｃ２毒素の結合ドメインの置換には、再標的化した結合／トランスロケーション成分が、活性化されるとオリゴマーを形成し、細胞表面の新しい標的部分へ結合し、そしてペイロードを標的細胞の細胞質ゾルへ移送する能力を保持することが必要である。Ｃ２毒素の天然の結合ドメインは分子のＣ末端部に位置し、Ｄ４と呼ばれる（図２ｂを参照）。一態様において、Ｄ４がなくても人工膜ではトランスロケーションの孔は形成できるため、Ｄ４はオリゴマー形成に必要ではない。別の態様において、Ｄ４をＣ２ＩＩから削除して末梢ニューロンに分子を標的化すると考えられるＢｏＮＴ  Ｃ１結合ドメインで置換する。ＢｏＮＴ  Ｃ１  ＨＣＣ（図２ａ）は、ガングリオシドＧＴ１ｂおよびＧＤ１ｂに優先的に結合する。
【００３５】
別の実施形態において、ＢｏＮＴ／ＡのＮ末端の重鎖ドメイン（ＨＣＮ）はキメラＣ２ＩＩ−Ｃ１には含めない。ＨＣＮは、フォスファチジルイノシトール−リン酸との相互作用により膜と会合するように毒素を配向させる可能性があることがわかっている。ＨＣＮは、天然のＢｏＮＴのトランスロケーションでは作用することができるものの、キメラＣ２ＩＩ−Ｃ１のトランスロケーション事象では必要でないことがわかっている。
【００３６】
別の実施形態において、連結型毒素から結合ドメインを取り出して、二成分毒素の結合／トランスロケーションドメイン中に挿入する。この構成によって、得られた分子は、Ｃ２毒素の活性化およびトランスロケーションの機構を維持しながらニューロンへ再標的化される。ＢｏＮＴおよびＣ２のエンドサイトーシスおよびトランスロケーション機構では、いずれの毒素についても、ｐＨ依存性タンパク質立体構造変化を特徴とする、クラスリン／ｒｈｏ／ダイナミン媒介性エンドサイトーシスのエンドソーム進入経路が関わるという点で類似性があることを留意されたい。
【００３７】
別の実施形態において、トリプシンで活性化するとオリゴマー形成すると考えられる可溶性Ｃ２ＩＩ−Ｃ１融合タンパク質の発現を試みてきた。Ｃ１  ＨＣＣドメインの直接融合は溶解度に問題があり成功しなかった。この制約を修正するために、柔軟性のあるグリシン−セリンリンカー（Ｇ４Ｓ）ｎを使用したが、同様の問題に遭遇した。最終的に、強固な（ＥＰ）１０リンカーを使用することにより、活性化とオリゴマー形成を両立しうる可溶性融合タンパク質が得られた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、限定的なトリプシン消化によりＣ２ＩＩ−Ｃ１融合タンパク質が活性化され、その後、オリゴマー形成したことを確認した。ウエスタンブロッティングを用いて、Ｃ１  ＨＣＣドメインがオリゴマー類（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ）に組み込まれることを確認した。Ｃ２ＩＩ−Ｃ１オリゴマーに特異的なＢｏＮＴ  Ｃ１抗原性、およびＣ２ＩＩΔＤ４と比べた電気泳動移動度の減少が認められたことから、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１のＣ末端のＣ１  ＨＣＣは、オリゴマー形成を阻害することなく、限定的なトリプシン消化に適合しうることが明らかである。
【００３８】
Ｃ２ＩＩ−Ｃ１によるペイロードの結合および内在化を定量化および可視化するために、フローサイトメトリーおよび顕微鏡実験に使用する、蛍光標識したＣ末端をトランケートされたＣ２ＩベースペイロードであるＣ２Ｉｔ（図２ｄ）を構築した。Ｃ２Ｉのアミノ酸１〜２２６から構成されたＣ２Ｉｔ（ＡＤＰ−リボシル化活性部位残基は含まない）を、２つの異なるバージョンとして、アミン反応性化学反応によってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８および５６８を用いて蛍光標識した（Ｃ２Ｉｔ−４８８およびＣ２Ｉｔ−５６８）。既に、人為的にＧＴ１ｂ富化したＮ２Ａ細胞においてＢｏＮＴ  Ｃ１  ＨＣの進入がＧＴ１ｂ依存性であることが示されており３０、この戦略を適用して、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１融合タンパク質による標的化の研究を行った。遺伝子操作したＢ成分であるＣ２ＩＩ−Ｃ１が活性化されてオリゴマー形成し、蛍光標識したＡ成分であるＣ２Ｉｔと会合すると、蛍光標識したＣ２ＩｔのＧＴ１ｂ依存性の取込みが観察されるはずである。融合体の非神経特異性のＣ２成分がトランスロケーション活性を促進するには進入だけ十分であると推測されたため、この細胞モデルでは、既述されたＢｏＮＴ  Ｃ１中毒を増強するために電気刺激は採用しなかった。フローサイトメトリーのために、Ｎ２Ａ細胞の培養物をＧＴ１ｂ富化して、他方、別の培養物は富化せず、両培養物を活性化Ｃ２ＩＩ−Ｃ１およびＣ２Ｉｔ−４８８と共にインキュベートし、その後、分析前に、両培養物ともプロナーゼで処理して細胞外タンパク質を除去した。細胞内蛍光が１０３吸光度単位を上回る細胞をフローサイトメトリーでカウントし、これを繰り返して得られた結果から、結合ドメイン受容体ＧＴ１ｂ富化したＮ２Ａ細胞集団は、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１で送達された蛍光Ｃ２Ｉｔを優先的に取り込んだことが示された（図３）。ここで示した結果は、ＢｏＮＴ  Ｃ１  ＨＣＣを使用して、別の毒素結合ドメインを置換することができ、ＧＴ１ｂ依存性の進入特異性が得られることを示している。この取込みがＧＴ１ｂ依存性であることを確認するために、また、Ｎ２Ａ細胞内における細胞内局在を決定するために、共焦点顕微鏡法を採用した（図４）。Ｃ２Ｉｔ−５６８は、ＧＴ１ｂ富化細胞に優先的に進入しており、蛍光標識した初期エンドソームと共局在していなかった。トランスロケーションドメインが作り出した孔を通してＣ２Ｉｔが輸送されることによる初期エンドソームからの脱出（ｅｓｃａｐｅ）は、細胞質ゾルへのペイロード送達の決定要因である。これらの結果は、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１がＣ２ＩｔをＧＴ１ｂ特異的送達したことから、遺伝子操作したペイロードと結合／トランスロケーションドメインが会合するという予想と一致する。初期エンドソームとＣ２Ｉｔ−５６８が共局在しなかった（図４（ａ））ことは、細胞質体を操作するために細胞質ゾルへ送達させたい他のペイロードを探求するための根拠となる。
【００３９】
Ｃ２ＩＩ−Ｃ１融合体により活性酵素を細胞質ゾルへ送達するために、天然のＣ２毒素Ａ成分、Ｃ２Ｉを作製してもよい。Ｃ２Ｉ酵素は、細胞質ゾルのアクチンをＡＤＰ−リボシル化して真核細胞では細胞円形化を起こすことが知られている。ガングリオシドＧＴ１ｂ富化したヒト神経膠芽細胞種Ａ１７２およびＨｅＬａ細胞株へ、Ｃ２ＩをＣ２ＩＩ−Ｃ１によって送達した後、その影響を調べた。いずれの細胞株も、ＧＴ１ｂ富化していない対照と比較した場合、ＧＴ１ｂ富化細胞集団の細胞円形化は２倍超の増加であった。比較すると、融合トランスロケーター、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１の存在下でペイロードが誘発した同調ＨｅＬａ細胞の細胞円形化は、Ｂａｒｔｈらが報告している天然のＣ２ＩＩトランスロケーションドメインの存在下での細胞円形化効率より低い。発現中に特徴付けられたＣ２ＩＩ−Ｃ１のトランケート型は、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１オリゴマーに組み込まれていた可能性があり、これは結合効率の低下をもたらす可能性がある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは最終精製画分にモノマーのＣ２ＩＩ−Ｃ１がみられないことが示されたものの、解離したまたはオリゴマーに組み込まれていないモノマーのＣ２ＩＩ−Ｃ１が、オリゴマーの送達システムの機能型と結合に関して競合している可能性がある。これらの知見は、ＧＴ１ｂ依存性の様式でＣ２ＩＩ−Ｃ１により特異的に送達されたＣ２Ｉ酵素が本来もっている細胞質ゾルでの活性を確認するものである。
【００４０】
別の実施形態において、ＢｏＮＴの本来の標的に作用するＣ２ＩＩ−Ｃ１融合タンパク質の送達利用に、改変したＣ２Ｉｔに基づく代替ペイロードを使用してもよい（図１ｂ）。天然のＣ２ＩＩトランスロケーションドメインとの補完的な活性のためには、Ｃ２Ｉ成分の中のアミノ酸残基１〜８７の最少領域が必要である。最近行われた炭疽致死因子を使ったペイロード開発作業と同じように、非正準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ポリペプチドのトランスロケーションは改変したＣ２Ｉを用いても可能であると考えられる。本開示は、さらなる出願のために、他の結合特異性およびペイロードドメイン探索の基礎を提供するものである。
【００４１】
以下の実施例は本開示を例示するために提供するが、限定することを意図してはいない。化学物質および物理的パラメーターは典型的な試薬またはパラメーターとして提示しており、当業者は本発明の原理と精神から逸脱することなく、本開示に照らして様々な置換または改変を行ってもよい。
【実施例１】
【００４２】
キメラ構築物、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１、Ｃ１  ＨＣＣ、Ｃ２ΔＤ４、Ｃ２ＩｔおよびＣ２Ｉの構築および発現。
プラスミドｐＵＣ５７−Ｃ２ＩＩ−Ｃ１  ＨＣＣは、コドン最適化遺伝子合成品として購入した。これは、ＢｏＮＴ  Ｃ１のアミノ酸Ｙ１０９４〜Ｅ１２９１に相当するＣ１  ＨＣＣ配列の上流にある、Ｃ末端の７個のアミノ酸をトランケートしたＣ２ＩＩ遺伝子からなる。プライマーＣ２ＩＩΔＤ４ＦおよびＣ２ＩＩΔＤ４−ＧＳ（ＥＰ）ＲでＣ２ＩＩのアミノ酸Ｍ１〜Ｔ５９２に相当する遺伝子を増幅し、Ｃ１  ＨＣＣドメインとのオーバーラッピングＰＣＲに使用する５’ＢａｍＨＩ突出部および３’グリシン−セリン（ＥＰ）連結領域を加えた。ＢｏＮＴ  Ｃ１  ＨＣＣ遺伝子は、３’ＥｃｏＲＩ制限部位を含むようにプライマー（ＥＰ）ＧＳ−Ｃ１  ＨＣＣＦおよびＣ１  ＨＣＣＲを使用してＰＣＲで増幅した。二巡目のＰＣＲは、ＧＳ（ＥＰ）１０ＧＳＦおよびＣ１  ＨＣＣＲを用いて行い、Ｃ２ＩＩΔＤ４−ＧＳ（ＥＰ）配列の３’を相補するように、Ｃ１  ＨＣＣの５’増幅産物を伸長させた。得られた２つの断片をオーバーラッピングＰＣＲにより融合し、Ｃ２ＩＩΔＤ４−ＧＳ（ＥＰ）１０ＧＳ−Ｃ１  ＨＣＣ（Ｃ２ＩＩ−Ｃ１）を得た。Ｃ１
ＨＣＣの生成には、プライマーＣ１  ＨＣＣＦおよびＣ１  ＨＣＣＲを使用してｐＵＣ５７−Ｃ２ＩＩ−Ｃ１  ＨＣＣテンプレート上でＰＣＲ増幅を行った。Ｃ２ＩＩΔＤ４の生成には、プライマーＣ２ΔＤ４ＦおよびＣ２ΔＤ４Ｒを使用して、ドメイン４をもたないＣ２ＩＩ遺伝子を増幅した。プラスミドｐＵＣ５７−Ｃ２Ｉｔは、コドン最適化遺伝子合成品として購入した。Ｃ２Ｉｔ（Ｃ２Ｉアミノ酸１〜２２６に相当、ＰＤＢ  ２Ｊ３Ｖ）は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いてｐＧｅｘ−２Ｔで直接サブクローニングした。全長のＣ２Ｉ（Ｃ２Ｉアミノ酸１〜４３１に相当）は、隣接プライマーとしてＣ２ＩＦとＣ２ＩＲ、オーバーラッピングプライマーとしてＣ２ＩＯＦとＣ２ＩＯＲとを用いて、Ｃ２Ｉｔを合成ＤＮＡから増幅したＤＮＡへ融合するオーバーラッピングＰＣＲにより生成した。最終的なＰＣＲ産物はすべて、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化してｐＧｅｘ−２Ｔにライゲートした。ＤＨ５αを電気穿孔法により形質転換して、Ｎ末端ＧＳＴ融合体としてＣ２ＩＩ−Ｃ１、Ｃ１  ＨＣＣ、Ｃ２ＩＩΔＤ４、Ｃ２ＩｔおよびＣ２Ｉを増産した。ＤＮＡ構築物の同一性は配列決定して確認した。プライマー配列を表１に列記する。
【００４３】
【表１】
2018515542.tif 000003
【００４４】
融合タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）内で過剰生産した。細胞株はすべて、４００ｍＬの１００μｇ／ｍＬアンピシリン添加ＬＢで３７℃で増殖させ、ＯＤ６００が約０．５になった時点で０．５ｍＭのＩＰＴＧを加えて２５℃で１６時間、誘導した。細胞を１００ｍＬずつ分取して回収し、ペレットを−２０℃で保存した。細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ、ｐＨ７．４のＰＢＳに再懸濁し、分取した細胞をフレンチプレスを使用して１０，０００ｐｓｉで３回通して溶解した。４℃で、８０，０００×ｇで２０分間の超遠心分離により細胞破片を除去した。バッチ内のＧＳＴ融合タンパク質上清のアフィニティ精製には、グルタチオン固定化アガロース（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用い、培養物上清１５ｍＬ当たり洗浄済み樹脂１５０μＬを使用して、４℃で１時間、インキュベートした。樹脂をｐＨ７．４のＰＢＳで洗浄して、結合していないタンパク質を除去した。製造業者の推奨に従い、ウシトロンビンを使用してタンパク質をＧＳＴタグから切り離し、グラスウールを入れたシリンジでろ過を行って精製樹脂から分離した。さらに、記載の通りに、酵素：基質比が１：５で、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１をトリプシンと３０分間インキュベートし、最後にトリプシン阻害剤でトリプシンを失活させる処理を行って、組換えＣ２ＩＩを活性化した。
【００４５】
Ｃ２ＩＩ−Ｃ１、Ｃ２ＩＩΔＤ４、Ｃ１  ＨＣＣ、Ｃ２ＩおよびＣ２Ｉｔを、１０％ポ
リアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは４〜１２％勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分離した。Ｃ２ＩＩ−Ｃ１を、抗ＢｏＮＴ  Ｃ１ポリクローナル抗体（Ｍｅｔａｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて同定し、陽性対照として精製Ｃ１  ＨＣＣを、また陰性対照としてＣ２ＩＩΔＤ４を用いた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｔｏｗｂｉｎ緩衝液中でニトロセルロース膜に転写し、５％粉乳ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ緩衝液中でブロッキングし、その後、１μｇ／ｕｌの抗ＢｏＮＴ  Ｃ１抗体を０．５％粉乳ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎで１：５，０００に希釈してプローブした。０．５％粉乳ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎで希釈した抗ウサギＨＲＰ二次抗体（１：５，０００）をＥＣＬブロッティング基質と共に使用してシグナル検出した。
【００４６】
Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞（Ｎ２Ａ）（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１３１）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したイーグル最少必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。Ａ１７２細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）を補充したＤＭＥＭで増殖させた。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２）は、１０％ＦＢＳおよびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＥＭＥＭで培養した。ＨｅＬａ細胞は、ガングリオシド富化に先立ち、解除にデオキシシチジンを用いるダブルチミジンブロック法により同調させた。ガングリオシド富化細胞は、５０μｇ／ｍＬ  ＧＴ１ｂ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）を低血清（０．５％ＦＢＳ）培養培地で、室温で２０分間、超音波処理することにより調製した。引き続き、細胞はＧＴ１ｂと共に４時間培養した。組換えタンパク質を加える前に、細胞をＰＢＳで３回洗浄して培養培地から遊離ガングリオシドを除去した。４８８ｎｍレーザー光と５８６／４２バンドパスフィルターを搭載したＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用したフローサイトメトリーにて、ヨウ化プロピジウムでＤＮＡ染色してＨｅＬａの同調を確認した。１０，０００細胞／イベントをカウントし、スチューデントのｔ検定（ｎ=３）で細胞当たりの蛍光の平均の統計的有意性を測定した。
【００４７】
アミン反応性のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素は、無水ＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解して分取物として−２０℃で保存した。精製タンパク質を５ｍｇ／ｍＬを超えるまで濃縮し、１Ｍ重炭酸ナトリウムを加えてｐＨ８．５〜９．０に調整した。タンパク質溶液にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ無水ＤＭＳＯ溶液を加えて、室温で１時間、連続的撹拌した。過剰なＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒおよびＤＭＳＯはゲルろ過（Ｇ−２５樹脂）で除去した。標識されたタンパク質を８０，０００×ｇで超遠心分離し、続いて、超遠心分離法の前後の分光光度測定を行い、標識強度を評価した。タンパク質の分子当たり蛍光分子１個を超えた標識強度を評価基準（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）のカットオフ値として設定し、超遠心分離後では、可視沈殿物または明らかな分光光度的性質上の変化は認められなかった。
【００４８】
Ｎ２Ａ細胞を２４穴培養プレートで約８０％コンフルエントになるまで増殖させた。細胞は図３ｃに示したようにＧＴ１ｂ富化した。作業容量（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）を０．５ｍＬとして活性化Ｃ２ＩＩ−Ｃ１を４μｇ／ｍＬ、またＣ２Ｉｔ−４８８を２μｇ／ｍＬで加えて、細胞と共に２時間、インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、トリプシン処理を行い、回収した。細胞を遠心分離し、プロナーゼ（１μｇ／ｍＬ）を添加したＰＢＳに再懸濁し、氷上で５分間、インキュベートした。次に、プロテアーゼ阻害剤反応混液を加え、細胞を遠心分離し、阻害剤反応混液を添加したＰＢＳに再懸濁した。次に、４８８レーザー光および５３０／３０発光バンドパスフィルターを用いたＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターで１０，０００イベント／細胞をカウントした。（吸光閾値１０３吸光度単位を超えた）Ｃ２Ｉｔ−４８８陽性細胞をカウントし、総細胞に対する百分率として評価した。実験を繰り返してスチューデントのｔ検定（ｎ=３）により評価した。
【００４９】
２４穴培養プレートにコラーゲンコートの１２ｍｍ厚ｎｏ．１カバースリップを敷き、Ｎ２Ａ細胞を播種した。Ｎ２Ａ細胞を約８０％コンフルエントになるまで増殖させた。初期エンドソームマーカーと区別できるように、精製Ｃ２Ｉｔは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８と代えてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８スクシンイミジルエステル（Ｃ２Ｉｔ−５６８）で標識した。ＧＴ１ｂ富化の約２４時間前、バキュロウイルス形質導入システムであるＢａｃＭａｍ２．０Ｃｅｌｌ  Ｌｉｇｈｔｓ  Ｒａｂ５ａ−ＧＦＰ初期エンドソームのマーカー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。次に、本発明者らの方法に記載のように、細胞をＧＴ１ｂ富化した。細胞を洗浄して遊離ガングリオシドを除去した後、組換えタンパク質を加えた。作業容量を０．５ｍＬとして活性化Ｃ２ＩＩ−Ｃ１を４μｇ／ｍＬで加え、Ｃ２Ｉｔ−５６８を２μｇ／ｍＬで加えて細胞と共に２時間、インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで染色した。加工後、オリンパスＩＸ−８１倒立顕微鏡と、レーザー光４０５ｎｍ（青）、４８８ｎｍ（緑）および５４３ｎｍ（赤）の連続モードにしたオリンパスＦＶ５００共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して蛍光画像を取得した。使用した対応発光遮断域（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒｓ）は、それぞれ４３０〜４６０ｎｍ、５０５〜５５０ｎｍおよび５６０〜６１０ｎｍとした。細胞形態については透過光を使用し、画像はすべて６０倍油浸レンズと２倍光学ズームレンズを使用して取得した。画像のコントラストはすべて２０％強めた。ヒト神経膠芽細胞種Ａ１７２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６２０）は２４穴培養プレートで、高いコンフルエントでみられる細胞円形化を抑えるために約６０％コンフルエントまで増殖させた。上記の項に記載のようにＨｅＬａ細胞を同調させた。両細胞株とも、本発明者らの方法に記載のように、５０μｇ／ｍＬのＧＴ１ｂ富化した。作業容量を０．５ｍＬとしてＣ２ＩＩ−Ｃ１を４０μｇ／ｍＬで加え、Ｃ２Ｉを２０μｇ／ｍＬで加え、細胞と共に７時間、インキュベートした。細胞の写真は、ＡｍｓｃｏｐｅＭＴｖ３．０．０．５ソフトウエアを使ったＡｍｓｃｏｐｅＩＮ３００ＴＣ倒立実体顕微鏡で４０倍で撮影した。円形化細胞をカウントし、フレーム内の総細胞に対する百分率として測定した。この実験を３回繰り返して、スチューデントのｔ検定（ｎ=３）で統計的有意性を評価した。Ｃ２ＩをＣ２ＩＩ−Ｃ１を組み合わせると毒性をもつことが想定されたため、バイオセーフティレベル２実験室におけるＣ２Ｉを使った実験の実施に先立ち、機関内のバイオセーフティ委員会の承認を得た。
【実施例２】
【００５０】
ボツリヌス菌Ｃ２毒素のニューロンの細胞質ゾルへの再標的化
ＢｏＮＴ血清亜型Ｃ１神経毒およびＡＤＰリボシル化を行うＣ２毒素ベースの多重組換えタンパク質構築物を、大腸菌を使用して発現させ、精製した。天然のＢｏＮＴ  Ｃ１を図２ａに示し、天然のＣ２ＩＩ結合／トランスロケーションドメインを図２ｂに示す。対照として使用するために、Ｃ末端のドメイン４を欠失するＣ２毒素（Ｃ２ＩＩΔＤ４）、およびＣ１神経毒結合ドメインＣ１  ＨＣＣを生産した。Ｃ２ＩＩΔＤ４とＢｏＮＴ  Ｃ１のＣ１  ＨＣＣ（１０９４〜１２９１）をグルタメート−プロリン１０回反復ペプチドリンカー、（ＥＰ）１０で連結させてＣ２ＩＩ−Ｃ１を生成した（図２ｃ）。これに加え、活性酵素部位を除いた非有毒性Ｃ２Ｉｔ（１〜２２６）を含むペイロード、全長のＣ２Ｉ（１〜４３１）を含むペイロードの２つのＣ２Ｉベースペイロードを構築した（図２ｄ）。
【００５１】
グルタチオンアフィニティタグ（ＧＳＴ）の切断、およびトリプシンによるＣ２ＩＩ−Ｃ１のオリゴマーへの活性化を確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を溶解し、超遠心分離して不溶性タンパク質を除去し、上清をアフィニティ樹脂に通した。次に、樹脂を大規模に洗浄し、タンパク質結合樹脂をロードし、全長の樹脂結合タンパク質の質量およびトロンビン切断の程度を調べた。次に、樹脂をトロンビンで処理してＧＳＴタグを切り離した。次に、樹脂からタンパク質を溶離してトリプシンで処理した。電気泳動の移動度で観察された質量が約９０ｋＤａからより大きな２５０ｋＤａ超へシフトしたことから示されるように、トリプシン活性化Ｃ２ＩＩ−Ｃ１モノマーはオリゴマーを形成した。活性化Ｃ２ＩＩΔＤ４も同じ方法で生産し、活性化Ｃ２ＩＩ−Ｃ１と比較した。Ｃ２ＩＩ−Ｃ１の七量体型の予想分子量は約４９７ｋＤａであり、七量体Ｃ２ΔＤ４は予想分子量としては約３５０ｋＤａであった。予想通り、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１オリゴマーの質量はＣ２ＩＩΔＤ４オリゴマーの質量より大きかった。Ｃ２ＩＩ−Ｃ１およびＣ２ΔＤ４のオリゴマー型は、電気泳動中のＳＤＳでは安定性を維持し、加熱すると部分的に解離した。抗ＢｏＮＴ  Ｃ１抗原性による精製の間にさらなるバンドが同定された。しかし、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１オリゴマーを徹底して加熱した後は、解離した組成物の大部分は全長のＣ２ＩＩ−Ｃ１モノマーであることがわかった。
【００５２】
オリゴマー形成したＣ２ＩＩ−Ｃ１およびＣ２ＩＩΔＤ４のウエスタンブロッティングを行った。次に、タンパク質を抗ＢｏＮＴ  Ｃ１抗体でプローブした。陽性対照としてＢｏＮＴ  Ｃ１  ＨＣＣ（ＭＷ約２３ｋＤａ）を使用した。Ｃ２ＩＩ−Ｃ１オリゴマーは抗ＢｏＮＴ  Ｃ１抗体と交差反応したが、オリゴマー形成したＣ２ＩＩΔＤ４は交差反応しなかった。これにより、ＢｏＮＴ  Ｃ１  ＨＣＣが、オリゴマーの状態で（ＥＰ）１０反復リンカーを介在してＣ２ＩＩΔＤ４とうまく融合できていたことが確認された。
【００５３】
Ｃ２ＩＩ−Ｃ１による蛍光標識Ｃ２Ｉｔペイロードの神経への標的化。Ｃ２ＩＩ−Ｃ１結合／トランスロケーション成分が媒介する結合およびペイロードの内在化を、蛍光標識したＣ２Ｉベースペイロード、Ｃ２Ｉｔ（図２ｄ）ＧをＧＴ１ｂガングリオシド受容体を有するまたは有しない細胞の集団に対して用いて調べた。マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ−２Ａ（Ｎ２Ａ）細胞は、本来、ＧＴ１ｂを細胞表面に提示しないが、人為的に富化することができる。ペイロードＣ２Ｉｔを精製した後（図３ａ）、タンパク質にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８スクシンイミジルエステル標識をコンジュゲートした（Ｃ２Ｉｔ−４８８）。異なる程度にＧＴ１ｂ富化したＮ２Ａ細胞と共に、Ｃ２Ｉｔおよび活性化Ｃ２ＩＩ−Ｃ１を異なる程度にインキュベートした。細胞外タンパク質を酵素消化により除去した後、フローサイトメトリーを使用して内在化Ｃ２Ｉｔ−４８８を定量した。蛍光上昇を伴う細胞数が最も高かったのは、ＧＴ１ｂ富化およびＣ２ＩＩ−Ｃ１の添加と対応していた（図３ｂパネル２）。ＧＴ１ｂの存在下および非存在下において、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１の非存在下でのＣ２Ｉｔのバックグラウンドの取込みは僅かであった。ＧＴ１ｂ富化のみでは、バックグラウンドの蛍光の有意な増加はみられなかった（図３ｂパネル１、４）。Ｃ２Ｉｔ−４８８ペイロードのみでの取込みも僅かであった（図３ｂパネル３、６）。標的化によらない取込みが最も高かったのは（約２％）、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１およびＣ２Ｉｔを加えた、ＧＴ１ｂを有さない集団であった（図３ｂパネル５）。Ｃ２Ｉｔ−４８８の取込みのＣ２ＩＩ−Ｃ１およびＧＴ１ｂへの依存度は、スチューデントのｔ検定により実験間ｐ値＜０．０５となり、有意性があることがわかった。全体として、細胞内Ｃ２Ｉｔ−４８８送達効率は、ＧＴ１ｂおよびＣ２ＩＩ−Ｃ１の存在下において約１８％（細胞集団の百分率）まで得ることができた（図３ｃ）。
【００５４】
フローサイトメトリーによる結合および内在化の定量化を行った後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて、活性化Ｃ２ＩＩ−Ｃ１により標的細胞へ送達されたＣ２Ｉｔを可視化して細胞内の局在化を特定した。Ｃ２ＩｔをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８蛍光色素にコンジュゲートした（Ｃ２Ｉｔ−５６８）。チャンネルを分けて、Ｃ２Ｉｔ−５６８（赤）、Ｒａｂ５ａ−ＧＦＰ初期エンドソームのマーカー（緑）およびＤＡＰＩ核（青）の画像化を行った。細胞をＧＴ１ｂ富化した場合、細胞内で初期エンドソームと共局在した、Ｃ２ＩＩ−Ｃ１で送達されたＣ２Ｉｔ−５６８は低レベルであったことが観察された（図４（ａ））。この結果は、活性のあるトランスロケーションドメインによりＣ２Ｉｔがエンドソームを脱出することと一致した。ＧＴ１ｂがない場合、Ｃ２Ｉｔ−５６８シグナルは概ね細胞の外側に限定され、初期エンドソームに会合したレポーターのシグナルは低レベルであった（図４（ｂ））。これらの知見は、結合／内在化に関するフローサイトメトリーのデータと一致する（図３ｂ、ｃ）。Ｃ２ＩＩ−Ｃ１、ＧＴ１ｂまたはＣ２Ｉｔ−５６８を欠くさらなる対照並べ替え（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）では、初期エンドソームの解離を伴うＣ２Ｉｔレポーターの細胞内送達は達成できなかった。
【００５５】
Ｃ２ＩＩ−Ｃ１による天然Ｃ２Ｉ酵素の再標的化。天然のＣ２Ｉペイロードにより引き起こされる細胞円形化により、異なる程度にＧＴ１ｂ富化したヒト神経膠芽細胞種Ａ１７２および同調ＨｅＬａ細胞株の両細胞株における活性酵素の細胞質ゾルへの送達を測定した。全長Ｃ２Ｉを精製し（図５ａ）、活性化Ｃ２ＩＩ−Ｃ１と組み合わせた後、細胞株培養物に加えて７時間置いた。細胞円形化は、ＧＴ１ｂ富化していないＡ１７２細胞集団より２．８倍高いことが明らかとなった（図５ｂ）。Ｂａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７、５０８３−５０９０（１９９９）で既報のＧＴ１ｂ富化していない野生型Ｃ２ＩＩの過去のデータと比較するため、ＧＴ１ｂ富化した非神経細胞株として、同調ＨｅＬａ細胞の送達依存性の細胞円形化を調べた。フローサイトメトリー法により、初期Ｓ期のＨｅＬａ細胞の同調をＤＮＡ定量により確認した（図５ｃ）。同調ＨｅＬａ細胞では、円形化はＧＴ１ｂ富化していない集団を２．１倍上回っていた（図５ｄ）。スチューデントのｔ検定を用いて、実験間の実験的有意性を評価した。対照集団をＧＴ１ｂ富化集団と比較して、ｐ値＜０．０５が得られた。
【００５６】
配列番号１〜６の配列のリスト：
配列番号１−
NNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
配列番号２−
MLVSKFENSVKNSNKNYFTINGLMGYYFENDFFNLNIISPTLDGNLTFSKEDINSILGNKIIKSARWIGLIKPSITGEYILSTNSPNCRVELNGEIFNLSLNTSNTVNLIQGNVYDIRIEQLMSENQLLKNYEGIKLYWETSDIIKEIIPSEVLLKPNYSNTNEKSKFIPNNTLFSNAKLKANANRDTDRDGIPDEWEINGYTVMNQKAVAWDDKFAANGYKKYVSNPFKPCTANDPYTDFEKVSGQIDPSVSMVARDPMISAYPIVGVQMERLVVSKSETITGDSTKSMSKSTSHSSTNINTVGAEVSGSLQLAGGIFPVFSMSASANYSHTWQNTSTVDDTTGESFSQGLSINTAESAYINPNIRYYNTGTAPVYNVTPTTTIVIDKQSVATIKGQESLIGDYLNPGGTYPIIGEPPMALNTMDQFSSRLIPINYNQLKSIDNGGTVMLSTSQFTGNFAKYNSNGNLVTDGNNWGPYLGTIKSTTASLTLSLPDQTTQVAVVAPNFSDPEDKTPRLTLEQALVKAFRLEKKNGKFYFHGMEISANQKIQVFLDRNTNVDFENQLKNTANKDIMNCIIKRNMNILVKVITFKENISSINIINDTNFGVESMTGLSKRIKGNDGIYRASTKSFSFKSKEIKYPEGFYRMRFVIQSYEPFTCNFKLFNNLIYSNSFDIGYYDEFFYFYCNGSKSFFDISCDIINSINRLSGVFLI
配列番号３−
MPIIKEPIDFINKPESEAKEWGKEEEKRWFTKLNNLEEVAVNQLKNKEYKTKIDNFSTDILFSSLTAIEIMKEDENQNLFDVERIREALLKNTLDRDAIGYVNFTPKELGINFSIRDVELDRDISDETLDKVRQQIINQEYTKFSFISLGLNDNSINESVPVIVKTRVPTTFDYGVLNDKETVSLLLNQGFSIIPESAIITTIKGKDYILIEGSLSQELDFYNKGSEAWGAENYGDYISKLSHEQLGALEGYLHSDYKAINSYLRNNRVPNNDELNKKIELISSALSVKPIPQTLIAYRRVDGIPFDLPSDFSFDKKENGEIIADKQKLNEFIDKWTGKEIENLSFSSTSLKSTPSSFSKSRFIFRLRLSEGAIGAFIYGFSGFQDEQEILLNKNSTFKIFRITPITSIINRVTKMTQVVIDAEGIQNKEI
配列番号４−
MLVSKFENSVKNSNKNYFTINGLMGYYFENDFFNLNIISPTLDGNLTFSKEDINSILGNKIIKSARWIGLIKPSITGEYILSTNSPNCRVELNGEIFNLSLNTSNTVNLIQGNVYDIRIEQLMSENQLLKNYEGIKLYWETSDIIKEIIPSEVLLKPNYSNTNEKSKFIPNNTLFSNAKLKANANRDTDRDGIPDEWEINGYTVMNQKAVAWDDKFAANGYKKYVSNPFKPCTANDPYTDFEKVSGQIDPSVSMVARDPMISAYPIVGVQMERLVVSKSETITGDSTKSMSKSTSHSSTNINTVGAEVSGSLQLAGGIFPVFSMSASANYSHTWQNTSTVDDTTGESFSQGLSINTAESAYINPNIRYYNTGTAPVYNVTPTTTIVIDKQSVATIKGQESLIGDYLNPGGTYPIIGEPPMALNTMDQFSSRLIPINYNQLKSIDNGGTVMLSTSQFTGNFAKYNSNGNLVTDGNNWGPYLGTIKSTTASLTLSLPDQTTQVAVVAPNFSDPEDKTPRLTLEQALVKAFRLEKKNGKFYFHGMEISANQKIQVFLDRNTNVDFENQLKNTANKDIMNCIIKRNMNILVKVITGSEPEPEPEPEPEPEPEPEPEPGSTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
配列番号５−
GSEPEPEPEPEPEPEPEPEPEPGS
配列番号６−
MPIIKEPIDFINKPESEAKEWGKEEEKRWFTKLNNLEEVAVNQLKNKEYKTKIDNFSTDILFSSLTAIEIMKEDENQNLFDVERIREALLKNTLDRDAIGYVNFTPKELGINFSIRDVELDRDISDETLDKVRQQIINQEYTKFSFISLGLNDNSINESVPVIVKTRVPTTFDYGVLNDKETVSLLLNQGFSIIPESAIITTIKGKDYILIEGSLSQELDFYNKG
【００５７】
本開示をその特定の実施形態に関して詳細に示し説明してきたが、当業者は、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、形態および細部における様々な他の変更が可能であることを理解するであろう。本明細書において開示される、また続く請求項により理解される発明概念から逸脱することなく、本発明を様々な実施形態に適用するなかで様々な変更が可能であることを理解されたい。
【００５８】
参考文献
本出願または下記リスト全般にわたり引用可能な引用参考文献のすべて（参考文献、特許、特許出願およびウェブサイトを含む）の内容は、ここに、あらゆる目的のために全体を参照によって本開示に明確に組み入れる。本開示は、別段の指示がない限り、当技術分野で周知の免疫学、分子生物学および細胞生物学の従来技術を採用してもよい。
【００５９】
本開示にはまた、分子生物学の分野で周知の技術および方法を、参照によりその全体を組み入れる。これらの技術には以下の刊行物に記載の技術が含まれるが、それだけに限定されない。
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58.  WO2013126690 A1.
【図１】
2018515542.tif 000004
【図２】
2018515542.tif 000005
【図３】
2018515542.tif 000006
【図４】
2018515542.tif 000007
【図５】
2018515542.tif 000008
【配列表】
2018515542000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月9日(2018.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2018515542000001.app
【国際調査報告】
2018515542.tif 000009
2018515542.tif 000010
2018515542.tif 000011