(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの領域において、顕微鏡（６）によって捕捉可能な少なくとも１つの観察ビーム（９）に対して透明なナノ多孔質材料から成る、試料区画化要素（１）に関し、ナノ多孔質材料は、平均孔径が前記観察ビーム（９）の波長よりも小さい孔（２）を有し、ナノ多孔質材料の少なくとも部分において、孔（２）によって、ナノ多孔質材料の体積の少なくとも５％の比率が占められる。材料は、開口多孔性を有し、平均孔径は最高１０００ｎｍであり、ナノ多孔質材料の単位体積当たりの前記孔（２）の数、及び／又は、平均孔径は、試料区画化要素（１）の少なくとも１つの広がりに沿って変化し、それにより試料区画化要素（１）において孔勾配（１１）が形成され、孔勾配（１１）は、多孔性を有しない少なくとも１つの勾配部分（１１．１）を備え、それにより、試料区画化要素（１）を用いて、試料区画化要素（１）の表面（１．１，１．２）上の試料媒体（３）と、試料区画化要素（１）の対向する表面（１．１，１．２）上の浸漬媒体（４）と、の分離が行われる。本発明はさらに、試料区画化要素（１）を用いた顕微鏡検査方法、及び、顕微鏡（６）に関する。さらに本発明は、試料区画化要素（１）を製造するための可能な材料に関する。
2018535449.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの領域において、顕微鏡によって捕捉可能な少なくとも１つの観察ビームに対して透明なナノ多孔質材料から成る、試料区画化要素であって、
前記ナノ多孔質材料は、平均孔径が前記観察ビームの波長よりも小さい孔を有し、
前記ナノ多孔質材料の少なくとも部分において、前記孔によって、前記ナノ多孔質材料の体積の少なくとも５％の比率が占められ、
前記ナノ多孔質材料は、開口多孔性を有し、
前記平均孔径は最高１０００ｎｍであり、
前記ナノ多孔質材料の単位体積当たりの前記孔の数、及び／又は、前記平均孔径は、前記試料区画化要素の少なくとも１つの広がりに沿って変化し、従って前記試料区画化要素において孔勾配が形成され、
前記孔勾配は、多孔性を有しない少なくとも１つの勾配部分を備え、従って、前記試料区画化要素を用いて、前記試料区画化要素の表面上の試料媒体と、前記試料区画化要素の反対側の表面上の浸漬媒体と、が分離される、
試料区画化要素。
【請求項２】
前記平均孔径は０．５ｎｍ〜１００ｎｍの値範囲にある、
請求項１記載の試料区画化要素。
【請求項３】
前記平均孔径は１ｎｍ〜１０ｎｍの値範囲にある、
請求項１記載の試料区画化要素。
【請求項４】
前記観察ビームの波長は、２００〜２０００ｎｍの波長範囲から選択される、
請求項１乃至３いずれか１項記載の試料区画化要素。
【請求項５】
前記試料区画化要素の２つの相対向する前記表面から出発するそれぞれ１つの孔勾配が構成され、
前記孔勾配は前記孔の数に関して前記材料の及び／又は平均孔径の単位体積ごとに相互に反対向きに構成される、
請求項４記載の試料区画化要素。
【請求項６】
既知の光学特性を有する硬化又は液状媒体によって前記孔を充填し、
前記硬化又は液状媒体は前記試料区画化要素内に留まる、
請求項１乃至５いずれか１項記載の試料区画化要素。
【請求項７】
前記ナノ多孔質材料は、ガラス、プラスチック、又はプラスチック混合体である、
請求項１乃至６いずれか１項記載の試料区画化要素。
【請求項８】
請求項１乃至５いずれか１項記載の試料区画化要素を準備するステップと、
試料を準備するステップと、
前記試料を前記試料区画化要素で覆うステップと、
請求項１乃至５いずれか１項気記載の前記試料区画化要素の前記孔を浸漬媒体及び／又は試料媒体で充填するステップと、
前記試料区画化要素を浸漬媒体で濡らすステップと、
浸漬対物レンズを前記浸漬媒体と接触させるステップと、
前記観察ビームの少なくとも１つの光線が前記浸漬対物レンズを介して、かつ前記試料区画化要素を介して検出されることにより、前記試料を観察するステップと、
を含む、顕微鏡検査方法。
【請求項９】
試料として埋設媒体に埋設された試料が準備される、
請求項８記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１０】
請求項８記載の方法を実行するための顕微鏡であって、
対物担体を保持するための対物担体ホルダを備え、
請求項１乃至７いずれか１項記載の試料区画化要素が設けられた対物担体が存在することを特徴とする、
顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１乃至７いずれか１項記載の試料区画化要素に浸漬媒体を供給するための浸漬媒体供給部と、
前記浸漬媒体を、前記浸漬媒体供給部を介してコンテナ容器から前記試料区画化要素へ制御して移送するためのポンプユニットと、
前記ポンプユニットを駆動制御するための制御ユニットと、
を備える浸漬媒体交換装置によって特徴づけられる、
請求項１０記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は請求項１の前文に記載の試料区画化要素に関する。本発明はさらに、顕微鏡検査方法に、及び、顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡検査において、浸漬対物レンズの使用は多くの利点をもたらす。その利点は全て、浸漬対物レンズのより高い達成可能な開口数から最終的に生じる。これらの利点は、例えば、より高い空間分解能、より高い集光効率、より良好な信号・雑音比若しくはより良好な信号・バックグラウンド比、より短い照射時間、及びより良好な時間分解能、並びに生物学的試料に対する低減された光毒性作用である。後者の利点は、特に、生物学的試料の顕微鏡検査、例えば生細胞及び／又は生物学的活性分子の顕微鏡検査において、非常に有意である。
【０００３】
開口数は、浸漬媒体との協働における浸漬対物レンズの使用により、最大化される。ここで、各浸漬媒体は可能な限り高い屈折率を有する。その際、観察されるべき試料は薄いカバーガラスで覆われているか、又は、試料はカバーガラスに塗布され、浸漬媒体がカバーガラスの試料と反対側の表面にもたらされる。カバーガラスは、浸漬媒体と試料媒体との混合を防止し、浸漬媒体による試料の汚染を防止する。
【０００４】
浸漬媒体としては、例えばＤＥ  １４  ７２  ２９４  Ａ１に記載されているように、例えば、油、油性材料、変形可能な透明プラスチックが知られている。
【０００５】
浸漬レンズの屈折率の有意な上限は、カバーガラスの屈折率によって与えられる。浸漬媒体とカバーガラスの屈折率が同一である場合、カバーガラスはもはや光学的な作用を生じず、試料の観察の際に結像誤差を引き起こさない。
【０００６】
典型的には、かかる屈折率の適合は、油浸対物レンズと浸漬媒体としての油によって達成可能である。
【０００７】
特に生物学的試料は、少なくとも一時的に試料又はその構成要素の自然な特性を維持するために、通常試料媒体の中に置かれる。
【０００８】
生物学的試料においてしばしばそうであるように、試料媒体の屈折率が、カバーガラス及び／又は浸漬媒体の屈折率と相違する場合、油浸対物レンズによれば、カバーガラスの非常に近傍の焦点面においてしか、最適に働くことができない。なぜなら屈折率ギャップによって、収差、主に球面収差が生じ、これが試料内の焦点面の深さとともに増加するからである。
【０００９】
従って、特に、生細胞における、顕微鏡検査のためには、水浸対物レンズがより適している。細胞が水性試料媒体内にあるので、浸漬媒体と試料媒体の屈折率が非常に類似する。カバーガラスの屈折率だけが相違する。カバーガラスの光学的作用が除去されるように補正されていれば（auskorrigiert ist）、焦点面が試料内により深く侵入する際に球面収差は発生しない。
【００１０】
しかしながら、かかる補正は、所定の厚さ、平坦さ及びガラス種類の１枚のカバーガラスに対して特有であり、そのため、特に水浸対物レンズは、通常、補正機能性（Korrekturfunktionalitaet）を備え、それを用いて、水浸対物レンズにおけるレンズ又はレンズ群をシフトさせることで、カバーガラスの製造に起因する不可避のばらつきを補正することができる。
【００１１】
細胞も、純粋に水性の溶液内で顕微鏡検査されるわけではなく、さらに細胞は試料媒体と異なる屈折率を有するので、多種多様な浸漬媒体が入手可能である。生細胞の顕微鏡検査のために典型的な浸漬媒体は、水、水代替媒体、グリセリン、ＴＤＥ及びシリコンオイルのような特定の浸漬油である。
【００１２】
全ての浸漬媒体は、一般的に使用される温度において液状である。浸漬媒体が試料媒体と正確に同一の光学的パラメータを有する場合だけ、最適な画像品質並びに最大の信号強度及び侵入深さが達成される。
【００１３】
そのため、浸漬対物レンズの使用において、及び浸漬媒体を用いた顕微鏡検査において、限界及び不利な点が生じる。カバーガラスは通常、浸漬媒体とは異なる光学特性を有するので、特別な対物レンズ（Spezialobjektive）、特に浸漬対物レンズが必要になる。浸漬媒体は通常、試料媒体とは異なる光学特性を有するので、特別な対物レンズであっても性能が低下する。これは、主に球面収差となり、より深い焦点面の侵入深さにおいて色収差となる。
【００１４】
しかしながら、完全に補正された（auskorrigierte）特別な対物レンズでさえ、カバーガラスによって誘発される誤差に非常に敏感である。かかる誤差は、例えば、顕微鏡のビーム路において傾いて配置されたカバーガラスに基づいて発生する収差である。収差は、カバーガラスが光学平面に対して傾いている場合、又は、表面（Seitenflaeche）が互いに平行でない場合にも発生する。同様に、カバーガラスの厚さのばらつきも誤差につながり、収差の強さは、カバーガラスと浸漬媒体の屈折率の差異にほぼ比例したスケールになる。
【００１５】
適切な顕微鏡の実施形態によれば、上述の理由から各浸漬媒体（又は試料媒体）に対して特別な対物レンズがレパートリー内に（im Portfolio）存在しなければならない。かかる特別な対物レンズは、例えば、油浸対物レンズ、シリコンオイル浸漬対物レンズ、グリセリン浸漬対物レンズ及び水浸対物レンズである。技術的及び経済的に妥当なコスト（vertretbarem Aufwand）は、特別な対物レンズあたり、それぞれ１つの補正機能性だけが実装可能である。例えば、カバーガラスの厚さ補正、又は屈折率・浸漬媒体補正、例えばマルチ浸漬対物レンズ、が設けられる。
【００１６】
あるいは、多数の特別な対物レンズに代えて、例えばＤＥ  ２６  ５５  ０４１  Ｃ２から公知の、１つの特別に構成された浸漬対物レンズが用いられることができる。そこに開示される浸漬対物レンズは、光軸に沿ってシフト可能な、透明材料からなるプレートを、フロントレンズの前に（vor der Frontlinse）有している。プレートとカバーガラスとの間の浸漬媒体によって充填された空間の厚さは、異なる浸漬媒体の屈折率の補正及びカバーガラスの厚さの補正の目的で設定可能である。
【００１７】
ＤＥ  １０  ２０１３  １０７  ２９７  Ａ１には試料のカバーが開示されており、カバーは開口多孔性（offener Porositaet）のナノ多孔質材料からなり、顕微鏡によって捕捉可能な観察ビームに対して透明である。材料の平均孔径は、観察ビームの波長より小さい。
【００１８】
ＵＳ  ２００７／０１２８０６９  Ａ１は多孔質カバーガラスを開示し、その孔は一方の表面から他方の表面まで延在する。カバーガラスは、全体的に同様な多孔質である膜を備えている。細胞及び細胞構成要素のためのフィルタ機能を有する非常に類似の膜は、ＤＥ  １０  ２０１  １  ０７６  ２３８  Ａ１から公知である。例えばＵＳ  ２０１３／０１７００４４Ａ１及びＵＳ  ２０１４／０３３４００６Ａ１に記載されているように、ナノ多孔質材料は、さらに他の技術分野、例えば耐傷性光学フィルタにおいても使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】独国特許公開第１０  ２０１３  １０７  ２９７号公報
【特許文献２】米国特許公開第２００７／０１２８０６９号公報
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、浸漬媒体の使用の下での顕微鏡検査において、従来技術からり公知の欠点及び制限を少なくとも低減する可能性を提案することを課題とする。
【００２１】
課題は、独立請求項１による試料区画化要素、請求項８による顕微鏡検査方法によって及び請求項１０による顕微鏡によって解決される。
有利な構成は、従属請求項において提供されている。
【００２２】
課題は、試料区画化要素によって解決され、試料区画化要素は、少なくとも１つの領域において、顕微鏡によって捕捉可能な少なくとも１つの観察ビームに対して透明なナノ多孔質材料から成り、その平均孔径は、観察ビームの波長より小さい。本発明による試料区画化要素について特徴的なのは、ナノ多孔性材料が、開口多孔性を有するナノ多孔質材料であり、最高１０００ｎｍの平均孔径を有する孔を備えることである。孔によって材料の体積のうちの少なくとも５％の比率が占められる。ナノ多孔質材料の単位体積当たりの孔数、及び／又は、平均孔径は、試料区画化要素の少なくとも１つの広がりに沿って変化し、従って試料区画化要素において孔勾配が形成される。孔勾配は、孔の無い層（eine porenfreie Schicht）を備える。
【００２３】
材料の体積に対する全ての孔の体積の比率は、体積比（Volumenfraktion）とも称される。
【００２４】
開口多孔性の場合、孔は、少なくともその大部分は、相互に連通した（miteinander in Verbindung）状態にある。
【００２５】
平均孔径は、試料区画化要素の可能な実施形態において、分布関数に基づいて特定される。全ての孔のうちの９５％が有する直径は、その標準偏差を差し引いて又は加えて、平均粒径として特定される。
【００２６】
本発明のコアは、試料区画化要素上に塗布される浸漬媒体の光学特性を少なくとも部分的に引き継ぎ、同時にカバーガラスの従来の機能、詳しくは試料媒体と浸漬媒体との分離を満たす、試料区画化要素である。
【００２７】
試料媒体と浸漬媒体との分離を確実にするために、孔勾配は、多孔性がない（keine Porositaet vorliegt）少なくとも１つの勾配部分を有する。このようにして、試料区画化要素を用いて試料区画化要素の一方の表面上の試料媒体と、試料区画化要素の対向する表面上の浸漬媒体と、の分離が可能になる。
【００２８】
本発明による試料区画化要素は、例えば通常市販されているカバーガラスの寸法、例えば、例えば１８×１８ｍｍ、２２×２２ｍｍ又は２４×４０ｍｍと、０．０２〜０．２１ｍｍの厚さを有する。試料区画化要素は、個々の外形寸法、形状構成及び／又は厚さによって実現されることもできる。試料区画化要素は、さらなる実施態様において、マルチウェルプレートのため、又は、例えばペトリ皿（シャーレ）のような容器のために設計されることができる。
【００２９】
さらなる可能な実施形態において、試料区画化要素は、中空シリンダとして実施される。この実施形態は、例えば、試料区画化要素の内部に試料を配置することを可能にし、その試料を顕微鏡検査することを可能にする。試料区画化要素のこの形状構成は、光ブレード顕微鏡法（Lichtblattmikroskopierverfahren)及び／又はレーザー走査顕微鏡法において好適に用いられることができる。
【００３０】
試料区画化要素の光学特性は、異なる浸漬媒体に好適に適応可能である。そのために、試料区画化要素は、少なくとも領域的にナノ多孔質材料からなる。多孔質材料によって試料区画化要素の領域が形成され、顕微鏡における多孔質材料の使用の際に観察ビームがそこを介して通り抜ける（hindurchtritt）。
【００３１】
ナノ多孔質材料の高い有効内部表面積に基づいて、試料区画化要素は、それぞれの浸漬媒体及び／又は試料媒体を受け入れる。その際、多孔質材料の孔の平均孔径は、観察ビームの波長と比べて小さくなければならない。従って、媒体、特に浸漬媒体及び／又は試料媒体によって充填される試料区画化要素は、実効屈折率を有する光学的に均質な対象物であり、屈折率は、材料の屈折率と浸漬媒体の屈折率の間にある。その際、正確な値はそれぞれの体積比、
【００３２】
【数１】
2018535449.tif 000003
に依存し、ここでＶＭａｔｅｒｉａｌは材料の体積であり、ＶＰｏｒｅｎは孔の体積である。
【００３３】
誘電媒体について、実効屈折率ｎｅｆｆは良好な近似値となる：
【００３４】
【数２】
2018535449.tif 000004
ここで、ｎ１及びｎ２は、それぞれの媒体の屈折率（屈折数（Brechzahlen））である。
【００３５】
実効屈折率ｎｅｆｆの他に、試料区画化要素の散乱特性にも留意すべきである。なぜなら、孔は散乱中心（Streuzentren）として作用するからである。その散乱特性は、ミー散乱理論（Mie’schen Streutheorie）によって推定されることができ、同様に、ナノ多孔質材料の散乱及び吸光係数は体積比φ及び平均孔サイズによって推定されることができる。
【００３６】
平均孔径の分散（eine
Varianz）が±１０％以下であると有利である。小さい分散は、実効屈折率ｎｅｆｆのより正確な調整を可能にし、実効屈折率ｎeffの局所的な不均一性が低減される。
【００３７】
実効屈折率ｎｅｆｆの適合は、特に体積比の選択により、及び／又は、孔の平均孔径を用いて実現される。その際、付加的に、試料区画化要素の材料及びその光学特性が考慮される。
【００３８】
観察ビームは、検出ユニットを用いて検出可能である電磁ビーム、特に光である。検出ユニットは、例えば、人の眼、カメラ、赤外線カメラ（ＩＲカメラ、ＵＶ感受性カメラ（ＵＶ＝紫外線光）、ＣＣＤカメラ（電荷結合素子）、レーザー走査顕微鏡の検出器及び／又はＣＭＯＳチップ（相補型金属酸化物半導体）である。
【００３９】
観察ビームの波長は、２００〜２０００ｎｍの波長範囲から選択され、それにより、試料区画化要素が顕微鏡検査における広範な分野に対して使用可能である。
【００４０】
観察ビームの波長は、試料区画化要素のさらなる実施形態において、２００〜８５０ｎｍの波長範囲から、例えば３８０〜７８０ｎｍの波長範囲から選択される。
【００４１】
平均孔径は、０．５ｎｍ〜１０ｎｍの値範囲にある。さらに、発生しうる散乱作用をさらに低減するために、平均孔径は、有利には１ｎｍ〜１０ｎｍの値範囲から選択されている。
【００４２】
試料区画化要素の光学特性は、孔勾配に沿って、孔勾配の具体的構成に依存して調節可能である。さらにまた、媒体、例えば浸漬媒体の分布は、試料区画化要素の内部における孔勾配の構成又は孔勾配を用いて調節可能である。
【００４３】
試料区画化要素の１つの特別な実施形態において、２つの孔勾配が形成されており、２つの孔勾配はそれぞれ、試料区画化要素の１つの表面から（die jeweils von einer Seitenflaeche）出発する。２つの表面は相互に対向し、従って、孔勾配は相互に向かい合うように進む（aufeinander zu laufen）。孔勾配は、材料の体積単位ごとの孔の数及び／又は平均孔径に関して、相互に反対向きに形成されている（einander gegensaetzlich ausgebildet）。特に、各孔勾配は、材料の単位体積当たり高い孔数（孔密度）及び／又は大きい平均孔径を備える。孔密度及び／又は平均孔径は、対向する表面への方向に向かって減少する。
【００４４】
この実施形態によって、各表面での浸漬媒体及び／又は試料媒体の侵入がサポートされる。しかしながら両媒体は、試料区画化要素の内部において非常に少ないか全くない孔密度及び／又は非常に小さい平均孔径の結果として、例えば試料区画化要素の内部における平面又は孔の無い層において、相互に分離されたままになる。試料区画化要素、特にその孔は、さらなる可能な実施形態において、既知の光学特性を有する硬化された又は液状の媒体で充填されており、硬化された又は液状の媒体は試料区画化要素内に残る。
【００４５】
かかる試料区画化要素は、水浸対物レンズに対して、又は所謂「生細胞浸漬対物レンズ（LiveCell-lmmersionsobjektive）」に対して適合された実効屈折率を有するように実装され、又は実装可能である。したがって、従来技術と比べると、バッファ溶液又は埋設媒体のような試料媒体中の試料に対して、試料区画化要素が存在しない光学的に最適な状況（die optisch optimale Situation des nichtexistenten
Probenbegrenzungselements）が有利に実現される。
【００４６】
この実施形態は、準備された、硬化された又は液状の媒体で充填された、すぐに使用可能な試料区画化要素の形態の、所望の光学特性を有する試料区画化要素を提供することを可能にする。例えば、試料区画化要素を浸漬媒体で濡らし、浸漬媒体を試料区画化要素内に侵入させる、プロセスステップがなくなり、従って、より少しの取扱いエラーが発生することができ、より少ない時間が実際の顕微鏡検査プロセスの準備のために必要とされる。
【００４７】
ナノ多孔質材料は、ガラス、プラスチック又はプラスチック混合物であることができる。例えば、ナノ多孔質材料の製造は、ＵＳ  ２００３１０２２９１  ８９  Ａ  １から公知である。例えば、試料区画化要素は、ＵＳ  ２００３１０２２９１  ８９  Ａ  １において、及び／又は論文”Porous and reconstructed Glasses”(T. H: Elmer, 1992, Engineered Materials
Handbook, Vol. 4, Ceramic and Glasses: 427 - 432)、において開示されている多孔質材料の少なくとも１つから成ることができる。
【００４８】
試料区画化要素を製造するために、最高１０００ｎｍの平均孔径を有し、孔によって形成される割合が材料の少なくとも５Ｖｏｌ％である多孔質材料が使用されることができる。
【００４９】
試料区画化要素を製造するためのナノ多孔質材料の使用のさらなる形態において、観察ビームに対して透明であり、その平均孔径が観察ビームの波長よりも小さいナノ多孔質材料が用いられる。
【００５０】
その際、観察ビームの波長は、２００〜２０００ｎｍの波長範囲内にあり、例えば２００〜７８０ｎｍの波長範囲内にあり、さらなる実施形態においては３８０〜７８０ｎｍの波長範囲内にある。
【００５１】
課題は、さらに、顕微鏡検査方法において、解決される。顕微鏡検査方法は、次のステップを備える。本発明による試料区画化要素を準備し、試料を準備するステップ。準備された試料区画化要素は、硬化した又は液状の媒体、特に浸漬媒体及び／又は試料媒体で既に充填されていることができる。試料は、試料区画化要素で区切られており、例えばカバーされ、又は包まれる。試料区画化要素の孔がまだ充填されていない場合、それらは浸漬媒体及び／又は試料媒体で充填される。
【００５２】
その後、浸漬媒体で試料区画化要素を濡らすステップと、浸漬対物レンズを浸漬媒体と接触させるステップとが続く。浸漬対物レンズを介して、試料区画化要素を通り抜けた観察ビームの少なくとも１つのビームが検出されることで、試料は観察される。
【００５３】
観察ビームの検出は、人の眼によって実施されることができる。さらなる実施形態において、任意で、上述の検出ユニットが使用され、観察ビームの検出に加えて、そのデータ技術的な捕捉、記憶及び／又は評価が実現されることができる。
【００５４】
顕微鏡検査方法の１つの構成において、試料として、埋設媒体内に埋設された試料が準備される。
【００５５】
顕微鏡検査方法のさらなる構成において、埋設試料は、試料区画化要素でカバーされ、埋設試料は、孔を有する、即ち多孔質の、試料区切り媒体の表面と接触させられる。
【００５６】
顕微鏡検査方法のこの構成は、例えば埋設試料の自動化された顕微鏡検査方法に対して適している。なぜなら、場合によっては試料区画化要素の下に残る空気が孔を介して取り除かれることができ、従って不所望な気泡の封入が回避されるからである。
【００５７】
浸漬媒体としては、例えば浸漬油、水、グリセリン、又は混合物、例えば水とグリセリンからなる混合物、を使用することができる。
【００５８】
顕微鏡検査方法を実施するためには、試料担体を保持するための試料担体ホルダを有する顕微鏡が適している。
【００５９】
試料担体は、試料区画化要素が設けられている。その際、試料担体は、特に試料担体ホルダにおいて保持され、試料担体上に、試料担体内に、試料担体に、又は試料担体の下にある試料は試料区画化要素によって区画されている。
【００６０】
本発明による顕微鏡の発展形態において、これは、浸漬媒体交換装置を有する。
【００６１】
浸漬媒体交換装置は、本発明による試料区画化要素に浸漬媒体を供給するための浸漬媒体供給部を備える。試料区画化要素は、対物担体ホルダに保持された対物担体上に提供されており、特に試料区画化要素で、試料担体上にある試料が区画されており、例えばカバーされている。
【００６２】
さらに、浸漬媒体交換装置は、浸漬媒体をコンテナ容器から浸漬媒体供給部を介して試料区画化要素に制御して移送するためのポンプユニットと、ポンプユニットの駆動制御のための制御ユニットを備える。
【００６３】
浸漬媒体交換装置は、試料及び／又は浸漬対物レンズをそのために交換する必要なく、浸漬媒体の交換を可能にする。
【００６４】
さらにまた、必要な場合に、現在使用されている浸漬媒体を、異なる屈折率を有する他の浸漬媒体交換することにより、有利には収差の補正が可能になり、従って特定の収差が補正されることができる。
【００６５】
さらなる実施形態において、浸漬媒体交換装置は例えば、浸漬媒体の、試料区画化要素の、及び／又は試料の温度制御を可能にし、従って現在使用されている浸漬媒体は連続的に又は所定の時点に交換可能であり、又は交換される。
【００６６】
本発明による試料区画化要素、本発明による顕微鏡検査方法及び本発明による顕微鏡並びに本発明による多孔質材料の製造のためにナノ多孔質材料を使用する方法は、それぞれ、有利には、試料区画化要素の屈折率が浸漬媒体の屈折率に近似され、又は近似可能である。例えば試料区画化要素の厚さのばらつき、ウェッジエラー（Keilfehler）及び／又は傾斜（Verkippungen）の結果によって誘導される、試料区画化要素の作用による収差は、有利に低減される。
【００６７】
本発明による顕微鏡のために、各浸漬媒体のための浸漬対物レンズを有する従来の対物レンズのレパートリーを保持することはもはや必要でない。顕微鏡ユーザのために、有利には、１つ以上の浸漬対物レンズの使用の、より大きなフレキシビリティが達成される。さらに、画像最適化は自動化可能であり、補正機能性は完全に省かれることができる。なぜなら本発明による試料区画化要素は低減された収差を引き起こすからである。従って、顕微鏡の光学設計は、品質を損なうことなく単純化されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
本発明は、例示的実施形態及び図面に基づいて、以下でさらに詳細に説明される。
【図１】試料区画化要素の第１の例示的実施形態を、試料、浸漬媒体、顕微鏡の浸漬対物レンズとともに模式的に示す図である。
【図２】試料区画化要素の第２の例示的実施形態を、試料、浸漬媒体、顕微鏡の浸漬対物レンズとともに模式的に示す図である。
【図３】試料区画化要素の第３の例示的実施形態を、試料、浸漬媒体、顕微鏡の浸漬対物レンズとともに模式的に示す図である。
【図４】試料区画化要素の第４の例示的実施形態を、試料、浸漬媒体、顕微鏡の浸漬対物レンズとともに模式的に示す図である。
【図５】試料区画化要素の第５の例示的実施形態を、試料、浸漬媒体、顕微鏡の浸漬対物レンズとともに模式的に示す図である。
【図６】浸漬媒体交換装置を有する顕微鏡の例示的実施形態を示す図である。
【図７ａ】第１の方法状態における顕微鏡検査方法の構成を模式的に示す図である。
【図７ｂ】第２の方法状態における顕微鏡検査方法の構成を模式的に示す図である。
【図７ｃ】第３の方法状態における顕微鏡検査方法の構成を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
例示的実施形態は、模式的図面を参照して説明される。同一の参照符号は、同一の技術的な要素を特定する。
【００７０】
図１乃至５に部分的に示された顕微鏡６は、浸漬対物レンズ５の使用の下での顕微鏡検査に適した顕微鏡６である。見やすさの理由から、顕微鏡６は模式的にのみ図示されており、顕微鏡６の、説明に関連する部品だけが示されている。
【００７１】
試料カバー要素１の第１の例示的実施形態は、図１において、試料３、浸漬媒体４及び顕微鏡６の浸漬対物レンズ５とともに図示される。
【００７２】
試料区画化要素１は、試料側表面１．１と称される一つの表面で試料３上に載置され、これを上方に向かって覆う（deckt diese nach oben hin ab）。
【００７３】
試料３は、生物学的材料、例えば組織、からなり、生物学的材料を構造変化、例えば組織の細胞の浸透圧の不足に続く崩壊を阻止し、生物学的材料の変質に反対に作用するために、試料媒体内にもたらされる。試料媒体によって、試料３の自然な特性が少なくとも部分的に維持される。
【００７４】
試料３の用語は、一般化して観察されるべき材料、例えば生物学的材料、に対して用いられ、存在する試料媒体を含む。
【００７５】
試料区画化要素１の対物側表面１．２上に、浸漬オイルの形態の浸漬媒体４が塗布され、対物側表面１．２と、油浸対物レンズとして形成された浸漬対物レンズ５との間の空間を充填する。さらに、浸漬媒体４の一部が孔２に侵入し、それによって、試料区画化要素１は浸漬媒体４で充填される。
【００７６】
試料３は、対物担体７（図６及び図ａ乃至７ｃ参照）上にあり、対物担体７は、顕微鏡６の対物担体ホルダ８によって顕微鏡６の光軸６．１に対して相対的に保持される。
【００７７】
浸漬対物レンズ５は、顕微鏡６において、光軸６．１に沿ってＺ方向Ｚに調節可能に配置される。
【００７８】
観察ビーム９は焦点面１０から試料区画化要素１、浸漬媒体４、浸漬対物レンズ５、及び、図示されていない顕微鏡６のさらなる光学要素を介して検出可能なように、浸漬対物レンズ５がＺ方向Ｚにおいてセットされ、焦点面１０に焦点合わせされる。
【００７９】
観察ビーム９は、観察ビーム９のビーム束の周縁ビーム（der Randstrahlen eines Strahlenbuendels）の経過によって実線で表される。周縁ビームの経過は、試料３から試料区画化要素１への及び試料区画化要素１から浸漬媒体４への移行における観察状況９の屈折態様を模式的に示す。
【００８０】
比較のためだけに、図１において、従来のカバーガラスを使用した場合に表されるはずの観察ビーム９のビーム束の周縁ビームの経過が、破線で図示されている。
【００８１】
特に浸漬媒体４と試料区画化要素１と間の境界線で観察ビーム９は、従来のカバーガラスを使用した場合に、本発明の試料区切り要１を使用した場合よりも、より強く屈曲することが見て取れる。
【００８２】
試料区切り素子１は、開口多孔性を有するナノ多孔質材料からなり、ナノ多孔質材料には、孔勾配１１（三角形によってシンボル化されている）に沿って孔２が入り混じっている。孔２は対物側表面１．２から出発して対向する試料側表面１．１の方向に減少する孔密度で、かつ減少する孔２の数で、ナノ多孔質材料の単位体積ごとに分配される。試料側表面１．１には、ナノ多孔質材料内で孔の無い層１２が形成され、それを介して孔２を充填する浸漬媒体４の試料３との又は試料媒体との混合が回避される。
【００８３】
孔２は、５ｎｍの平均孔径を有する。試料区画化要素１のナノ多孔質材料に対する孔の体積の、体積比φと称される（平均）割合は、例示的実施形態において、０．２又は２０％である。
【００８４】
５ｎｍの平均孔径及び０．２の体積比φに基づいて、ミー散乱理論に従って０．００２８／ｍｍの散乱係数が得られた。０．１７ｍｍの厚さｄの試料区画化要素１において、得られた散乱係数はほとんど不利ではない。
【００８５】
本発明による試料区画化要素１の第２の例示的実施形態は、２つの相互に反対に形成された孔勾配１１を有する図２の第２の例示的実施形態において図示される。それぞれの孔勾配１１は、試料側表面１．１から出発して、及び対物側表面１．２から出発して、Ｚ方向Ｚにおいて形成される。その際、各孔勾配１１において、孔密度は試料区画化要素１の中心に向かって低下し、従って、試料区画化要素１の中心において、孔の無い層１２がある。孔の無い層１２を介して、試料３又は試料媒体と浸漬媒体４との混合又は汚染は防止される。
【００８６】
試料側表面１．１から、試料３は、試料側表面１．１から出発する孔勾配１１の孔２内へ侵入し、又は、試料３は孔２内に侵入することができる。
【００８７】
浸漬媒体４は、対物側表面１．２から出発する孔勾配１１の孔２内に侵入し、又は、浸漬媒体４は孔２に侵入することができる。
【００８８】
試料区画化要素１のさらなる実施形態において、複数の孔勾配１１のうちの少なくとも１つが形成され、そこで、変化する高密度に加えて、又は代えて、孔２の平均孔径が変化する。
【００８９】
さらに、試料区画化要素１のさらなる実施形態において、孔勾配１１及び／又は複数の孔勾配１１は、試料区画化要素の広がりにおいて、Ｘ方向Ｘ及び／又はＹ方向Ｙにおいて形成される。
【００９０】
試料区画化要素１において、複数の孔勾配１１が形成される場合、これらは、試料区画化要素１のさらなる実施形態において、相互に同じく形成されることができる。例えば、孔密度及び／又は孔勾配１１の平均孔径は、同じＸ方向、Ｙ方向及び／又はＺ方向において増加又は減少する。
【００９１】
さらに、図３において試料区画化要素１の第３実施形態が図示されるように、本発明による試料区画化要素１は１つ以上のシーリング層１３を有する。試料区画化要素１は、液体密封シーリング層１３を対物側表面１．２に有する。
【００９２】
シーリング層１３は、試料３が孔２内に侵入することができる間、又は侵入する間、孔の無い層１２に加えて、浸漬媒体４の孔２内への侵入を防止する。シーリング層１３は、孔の無い層１２とともに、浸漬媒体４と試料３を相互に分離して保つ。
【００９３】
さらなる実施形態において、シーリング層１３は、膜によって及び／又はコーティングによって形成される。シーリング層１３は、さらに、機能性コーティングであってもよく、細胞増殖を可能にすることができる。
【００９４】
試料区画化要素１のさらなる実施形態において、シーリング層１３は、試料側表面１．１に、又は試料側表面１．１上に形成される。
【００９５】
表面１．１，１．２のうちの１つにおけるシーリング層１３は、短い加熱により、それとともに同時のナノ多孔質材料の組織変化（eine damit einhergehende Gefuegeveraenderung）によって製造される。さらなる実施形態において、シーリング層１３は、例えばプリント、塗布、スパッタ、接着、スピンコーティング及び／又はラミネート加工を用いて表面１．２，１．２上で製造される。
【００９６】
試料側表面１．１上と対物レンズ側表面１．２上とにそれぞれシーリング層１３を有する試料区画化要素１が図４に図示される。
【００９７】
孔２は、既知の光学特性を有する硬化された又は液状の媒体１４を充填される。かかる試料区画化要素１の屈折率は、所望の実効屈折率ｎｅｆｆ、例えば水の屈折率に、最適に調節可能である。このようにして調整された試料区画化要素１は、顕微鏡検査のために直接適用可能であり、既に予め製造されて準備されることができ、又は準備できている。孔勾配１１内のそれぞれの媒体１４は、異なる光学特性を有することができ、例えば、試料媒体に及び／又は浸漬媒体４に適合することができる。
【００９８】
さらなる可能な実施形態において、全ての表面は、シーリング層１３を備えている。孔２は、既知の光学特性を有する硬化された又は液状の媒体１４で充填されており、試料区画化要素１内に留まる。
【００９９】
図５に図示された、試料区画化要素１の第５の例示的実施形態において、これは、中空シリンダとして形成され、その内部シリンダ面は、試料側表面１．１であり、その外側シリンダ面は対物側表面１．２である。
【０１００】
顕微鏡６の浸漬対物レンズ５は、その光軸６．１で試料区画化要素１のシリンダ長手軸１．３に対して直交するように調整されており、浸漬媒体４を介して対物側表面１．２と接触している。
【０１０１】
さらに、顕微鏡２５の照射対物レンズ２５は、シリンダ長手軸１．３に対してかつ、光軸６．１に対して直交するように調整されて存在する。
【０１０２】
試料区画化要素１内に、簡略化して図示された試料３があり、表面１．１，１．２によって取り囲まれる。
試料３は、照射対物レンズ２５によって照射される、又は、照射されることができる。
【０１０３】
浸漬対物レンズ５の光軸６．１と照射対物レンズ２５を介して生じる照射とが、試料区画化要素１の内部で同じ空間に導かれる場合、このようにして照射される試料３は浸漬対物レンズ５を介して観察されることができる。
【０１０４】
照射が、狭い区切られた体積、例えば所謂光シート（light sheet）において生じる場合、焦点外領域からの試料３の不所望な散乱ビームを回避するために有利である。
【０１０５】
孔２は試料区画化要素１内で、既に第１乃至第４実施形態の１つについて述べられたように分配され、構成されることができる。
【０１０６】
図５に示される構成において、試料区画化要素１の第５実施形態の他に、光ブレード顕微鏡及び／又はレーザー走査顕微鏡の形態の、顕微鏡６が模式的に図示されている。
【０１０７】
試料区画化要素１を効果的に使用することができるように、図６に示されるように、変更された顕微鏡６が有利である。
【０１０８】
顕微鏡６は、試料担体７を保持するための試料担体ホルダ８を備える。さらにまた、浸漬媒体交換装置１８が設けられている。これは、試料区画化要素１に浸漬媒体４を供給するための浸漬媒体供給部２０を備える。浸漬媒体供給部２０は、浸漬媒体４を図示しないコンテナ容器から浸漬媒体供給部２０を介して試料区画化要素１へと制御して移送するためのポンプユニット１９と接続されている。ポンプユニット１９は、制御ユニット２１によって駆動制御可能である。
【０１０９】
光源２３を用いて照射ビーム及び／又は励起ビームを生成することができ、準備することができる。準備された照射ビーム及び／又は励起ビーム用いて試料３は、照射可能及び／又は励起可能である。
【０１１０】
観察ビーム９は、検出ユニット２２によって検出可能である。光源２３及び検出ユニット２２は、制御ユニット２１によってデータ交換に適した状態で接続されており、制御ユニット２１によって駆動制御可能である。検出された観察ビーム９のデータは、検出ユニット２２によって制御ユニット２１に伝送可能である。制御ユニット２１は、検出された観察ビーム９の伝送されたデータを保存するように及び／又は評価するように構成されている。
【０１１１】
検出された観察ビーム９のデータに依存して、及び／又はその評価において求められた結果に依存して、ポンプユニット１９、検出ユニット２２、光源２３、及び／又は、ＸＹ平面ＸＹにおける浸漬対物レンズ５の調節のための任意の駆動部２４、は駆動制御可能である。
【０１１２】
こ  の場合、観察ビーム９は、照射ビーム及び／又は励起ビームの反射された部分であることができる。顕微鏡６のさらなる実施態様において、及び、顕微鏡検査方法のさらなる構成において、観察ビーム９は、励起ビームによってもたらされるビーム、例えば蛍光ビームである。
【０１１３】
任意には、顕微鏡６のさらなる実施形態において、交換済の浸漬媒体を搬出するための浸漬媒体排出部が設けられている。
【０１１４】
さらにまた、顕微鏡６のさらなる実施態様において、試料区画化要素１の温度取得のために少なくとも１つのセンサが、試料３及び／又は浸漬媒体４に設けられている。
【０１１５】
試料区画化要素１の上述の実施態様は、任意に顕微鏡６の実施態様と共に、顕微鏡検査方法において使用可能である。さらに、試料区画化要素１及び観察されるべき試料３が提供される。試料３は対物担体７上方に塗布されるか又は載置され、試料区画化要素で区切られる。例えばカバーされ又は包含される。その後、対物側表面１．２は、浸漬媒体４で濡らされる。浸漬対物レンズ５は、浸漬媒体４と接触状態にもたらされる。観察ビーム９の発生、励起及び／又は提供するために、試料は、照射ビーム及び／又は励起ビームで照射される。
【０１１６】
試料３は観察される。そこで、観察ビーム９の少なくとも１つのビームが浸漬対物レンズを介して、かつ試料区画化要素１を通り抜けて検出される。
【０１１７】
１つの可能な形状において、顕微鏡検査方法は、埋め込み試料３を観察することに適している。観察の前に、図７ａに図示されるように、埋設媒体１５に埋設された試料３が提供される。そこで、埋設媒体１５は、望ましくない気泡１６を含む。
【０１１８】
試料区画化要素１は、その試料側表面１．１が多孔性であり、流体不透性のシーリング層を有さず、図７ｂに図示されるように、マニピュレータ１７を用いてＺ方向Ｚにおいて埋設試料３上に積み重ねられる。その際生じる埋設試料３にかかる力作用に続いて、いくつかの気泡１６が側方にＸ及び／又はＹ方向Ｘ，Ｙにおいて、埋設試料３から押し出される。
【０１１９】
気泡１６は側方から押し出されず、試料側表面１．１を介して試料区画化要素１内に入り、試料区画化要素１の孔２を介して（図１乃至４参照）、試料３の周囲において積み上げられ、このようにして埋設された試料３から取り除かれる（entfernt）。
【０１２０】
図７ｃにおいて、マニピュレータ１７は、Ｚ方向Ｚにおいて、試料区画化要素１から持上げられ、取り除かれている。埋設試料３は、試料区画化要素１によってカバーされる。
【０１２１】
試料区画化要素１は埋設媒体１５の屈折率を引き受ける（nimmt an）。さらなる顕微鏡検査方法において、浸漬媒体４が選択され、その上に試料区画化要素１上がもたらされ、その屈折率は埋設媒体の屈折率に適合し、従ってそれは類似しているか、同一である。
【０１２２】
埋設試料３のカバー及び浸漬媒体４の交換は、方法のさらなる構成において自動化される。
【符号の説明】
【０１２３】
１  試料区画化要素
１．１  試料側表面
１．２  対物レンズ側表面
１．３  シリンダ長手軸
２  孔
３  試料
４  浸漬媒体
５  浸漬対物レンズ
６  顕微鏡
６．１  光軸
７  対物担体
８  対物担体ホルダ
９  観察ビーム
１０  焦点面
１１  孔勾配
１２  孔の無い層
１３  シーリング層
１４  媒体
１５  埋設媒体
１６  気泡
１７  マニピュレータ
１８  浸漬媒体交換装置
１９  ポンプユニット
２０  浸漬媒体供給部
２１  制御ユニット
２２  検出ユニット
２３  光源
２４  ドライブ
２５  照明対物レンズ
ｄ  厚さ
【図１】
2018535449.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【国際調査報告】
2018535449.tif 000014
2018535449.tif 000015
2018535449.tif 000016
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2018535449.tif 000018
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