(57)【要約】本発明は、RNA干渉を用いてヒトGST-πの発現を調節する化合物、組成物及び方法を提供する。RNA干渉分子は、悪性腫瘍などの疾患を予防又は治療するための方法に使用することができる。核酸分子は、a）ポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖; b）分子の各鎖は15〜30ヌクレオチドの長さであり; c）アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域がGST-πをコードするmRNAの配列に相補的であり; d）センス鎖の少なくとも一部は、アンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的とすることができ、分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する。【選択図】図４
2018513669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子であって、
a）分子は、ポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し;
b）分子の各鎖は15〜30ヌクレオチドの長さであり;
c）アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、GST-πをコードするmRNA配列に相補的であり;
d）センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する。
【請求項２】
上記アンチセンス鎖が配列番号1341であり、上記センス鎖が配列番号1276であり、又はこれらの鎖は化学的に修飾された鎖である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
上記アンチセンス鎖が配列番号1305であり、上記センス鎖が配列番号1240であるか、又はこれらの鎖は化学的に修飾された鎖である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
GST-πをコードするmRNA配列に相補的であるアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、分子の二本鎖領域に位置する、請求項１記載の核酸分子。
【請求項５】
GST-πをコードするmRNA配列に相補的なアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域が、ヒトGSTP1配列から選択され、ここで、ヒトGSTP1 mRNA 配列番号1である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項６】
GST-πをコードするmRNAの配列が、配列番号1の5'UTR位置1〜249、配列番号1のCDS位置250〜882及び配列番号１の3'UTR位置883〜986から選ばれる、請求項１記載の核酸分子。
【請求項７】
上記アンチセンス鎖が、配列番号609〜1215のいずれか1つから選択される配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項８】
上記アンチセンス鎖が、配列番号1281〜1345のいずれか1つから選択される配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項９】
上記分子が、配列番号1240及び1305、配列番号1265及び1330、配列番号1267及び1332、配列番号1269及び1334、配列番号1276及び1341からなる群から選択されるアンチセンス及びセンス鎖対からなる、請求項１記載の核酸分子。
【請求項１０】
分子の各鎖が18〜22ヌクレオチドの長さである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項１１】
上記二重鎖領域が19ヌクレオチド長である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項１２】
上記ポリヌクレオチドセンス鎖及び上記ポリヌクレオチドアンチセンス鎖が一本鎖として連結され、一端においてループで連結されることで二重鎖領域を形成する、請求項１記載の核酸分子。
【請求項１３】
分子が平滑末端を有する、請求項１記載の核酸分子。
【請求項１４】
分子が1つ以上の3'オーバーハングを有する、請求項１記載の核酸分子。
【請求項１５】
分子が遺伝子サイレンシングに活性なRNAi分子である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項１６】
分子が、遺伝子サイレンシングに活性な、dsRNA、siRNA、マイクロRNA又はshRNAである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項１７】
分子がGST-πの発現阻害に活性である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項１８】
分子が、100pM未満のGST-πのノックダウンに関するIC50を有する、請求項１記載の核酸分子。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか1項記載の1つ以上の核酸分子及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２０】
担体が脂質分子又はリポソームである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１９記載の組成物を必要とする被験体に投与する工程を含む、GST-π発現に関連する疾患の治療方法。
【請求項２２】
疾患が悪性腫瘍である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
上記悪性腫瘍は、GST-π発現に関連する癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、癌腫、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、結腸癌、肝癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、骨癌、白血病、悪性リンパ腫、上皮悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍からなる群から選択される疾患に表れる、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を基礎とする分子からなる生物医薬品及び治療剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒトGST-πの発現を調節するためのRNA干渉（RNAi）を利用する化合物及び組成物に関する。
【０００２】
この出願は、442,955バイトのサイズであるND5123202WO_SL.txtと名付けられた2015年12月23日に作成されたASCIIファイルとして電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
様々なヒト癌組織が突然変異KRAS遺伝子の出現と相関することが見出されている。場合によっては、組織はまた、グルタチオンS-トランスフェラーゼPi（GST-π）発現レベルの上昇を示している（Miyanishiら、Gastroenterology、2001、Vol. 112：865-874、要約）。例えば、様々な消化器系悪性腫瘍を有する患者において、血清GST-πレベルの上昇が観察されている（Niitsuら、Cancer、1989、Vol.63、No.2、pp.317-323、要約）。
【０００４】
GST-πは、疎水性化合物と還元型グルタチオンを有する求電子性化合物との結合を触媒することにより解毒において役割を果たす酵素であるGSTファミリーのメンバーである。GST-π発現は、インビトロにおいてsiRNAで減少させることができる（Niitsuら、US 2014/0315975 A1）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
GST-π発現を阻害する治療剤は、非常に強力なsiRNA配列及び構造を必要とする。
【０００６】
GST-π発現を阻害するためのsiRNA配列、化合物及び構造が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、RNA干渉を用いてヒトGST-πの発現を調節するための化合物、組成物及び方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、GST-πをサイレンシングするRNA干渉遺伝子のための分子を提供する。
【０００９】
さらなる実施形態において、本発明の構造、分子及び組成物は、悪性腫瘍を含む、GST-πに関連する疾患を予防又は治療するための方法、若しくはGST-πに関連する状態又は障害の症状を改善するための方法に使用することができる。
【００１０】
本発明の実施形態は、以下を含む：
核酸分子であって、
a）分子は、ポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し;
b）分子の各鎖は15〜30ヌクレオチドの長さであり;
c）アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、GST-πをコードするmRNA配列に相補的であり;
d）センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、分子は15〜30ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、GST-πをコードするmRNA配列に相補的な、分子の二重鎖領域に位置するアンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【００１２】
さらなる実施形態では、核酸分子は、GST-πをコードするmRNA配列に相補的な、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【００１３】
本発明の化合物は、配列番号1の5'UTR位置1〜249、配列番号1のCDS位置250〜882及び配列番号１の3'UTR位置883〜986からなる群から選ばれるGST-πをコードするmRNA配列を含むことができる。
【００１４】
特定の実施形態では、核酸分子の各鎖は、18〜22ヌクレオチドの長さとすることができる。核酸分子の二重鎖領域は、19ヌクレオチド長とすることができる。
【００１５】
別の形態では、核酸分子は、一本鎖として連結されたポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、一端においてループで連結されることで二重鎖領域を形成することができる。
【００１６】
本開示の核酸分子のいくつかの実施形態は、平滑末端を有することができる。特定の実施形態では、核酸分子は、1つ以上の3'オーバーハングを有することができる。
【００１７】
本発明は、遺伝子サイレンシングに有効なRNAi分子である一連の核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、DNAサイレンシングに活性なdsRNA、siRNA、マイクロRNA又はshRNA、並びにDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用性RNA（piRNA）又は反復配列関連siRNA（rasiRNA）とすることができる。核酸分子は、GST-πの発現を阻害するために活性とすることができる。
【００１８】
本発明の実施形態はさらに、GST-πのノックダウンに関するIC50が100pM未満の核酸分子を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、薬学的に許容される担体と共に、本発明の核酸分子の1つ以上を含む組成物を企図する。特定の実施形態では、担体は、脂質分子又はリポソームとすることができる。
【００２０】
本発明の化合物及び組成物は、化合物又は組成物を必要とする被験体に投与することによって、GST-π関連疾患を予防又は治療するための方法において有用である。
【００２１】
本発明の方法は、本発明の化合物を悪性腫瘍の予防又は治療に利用することができる。悪性腫瘍は、GST-π発現に関連する癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、癌腫、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、上皮悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍を挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は配列番号１を示している。この配列番号１は、標的となるヒトグルタチオンS-トランスフェラーゼpi（ヒトGST-π）mRNAの核酸配列であり、長さ986ヌクレオチドであってGenBankアクセッション番号NM_000852.3（hGSTP1）にて開示されている。
【図２】図2は、GST-πsiRNAについてインビボノックダウン効果を示している。図２に示すように、GST-πを標的とするsiRNAによって、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンがインビボで観察された。
【図３】図３は、GST-πsiRNAによる増殖阻害を示している。図３に示すように、GST-πを標的とするsiRNAによって、インビトロで用量依存的な増殖の阻害がA549細胞系で観察された。
【図４】図４は、GST-πsiRNAに関して腫瘍阻害効力を示している。膵癌異種移植モデルを、GST-πを標的とするsiRNAの0.75mg/kgで比較的低用量で使用した。GST-πsiRNAは有意な腫瘍阻害効力を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、GST-πの発現を調節するための核酸に基づく治療剤のための化合物、組成物及び方法に関する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、RNA干渉において活性な分子、ならびにGST-πの発現をサイレンシングすることができる構造及び組成物を提供する。
【００２５】
本開示の構造及び組成物は、悪性腫瘍などの様々な疾患の予防又は治療に使用することができる。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の1つ以上の治療用RNAi分子の送達及び摂取のための組成物、ならびにその使用方法を提供する。本発明のRNAに基づく組成物は、悪性腫瘍、例えば癌を予防又は治療するための方法において使用することができる。
【００２７】
本発明の治療用組成物は、RNA干渉において活性である核酸分子を含む。治療用核酸分子は、遺伝子サイレンシングのためにGSTP1（GST-π）を標的とすることができる。
【００２８】
種々の実施形態において、本発明は、低分子干渉RNA（siRNA）として活性であり、GST-π遺伝子発現を調節又はサイレンシングすることができる一連の分子を提供する。
【００２９】
本発明のsiRNAは、悪性腫瘍を予防又は治療するために使用することができる。
【００３０】
本発明の実施形態はさらに、悪性腫瘍の予防又は治療を必要とする被験体に本発明のsiRNAを送達するためのビヒクル、製剤又は脂質ナノ粒子製剤を提供する。本発明はさらに、siRNAを治療剤として哺乳動物に投与するための方法を企図している。
【００３１】
本発明の治療分子及び組成物は、化合物又は組成物を必要とする被験体に投与することによって、GST-π関連疾患の予防又は治療を目的とするRNA干渉に使用することができる。
【００３２】
本発明の方法は、悪性腫瘍を予防又は治療するための本発明の化合物を利用することができる。悪性腫瘍は、様々な疾患に存在するものとすることができる。他例えば、GST-πを高度に発現する癌、変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、癌腫、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、上皮悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍が挙げられる。
【００３３】
特定の実施形態において、本発明の治療用分子の組み合わせは、GST-π遺伝子発現をサイレンシング又は阻害するために使用することができる。
【００３４】
本発明は、一連のRNAi分子を提供する。ここで各分子はポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、分子の各鎖は15〜30ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、GST-πをコードするmRNAの配列に相補的であり、センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、分子は15〜30ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有している。
【００３５】
本発明のRNAi分子は、分子の二重鎖領域に位置するGST-πをコードするmRNAの配列に相補的な、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、RNAi分子は、GST-πをコードするmRNAの配列に相補的な、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。  
【００３７】
本発明の実施形態は、悪性腫瘍の1つ以上の症状を予防、治療又は改善する方法、又は悪性腫瘍を発症するリスクを低減する方法、又はそれを必要とする哺乳動物の悪性腫瘍の発症を遅延させる方法をさらに提供することができる。
【００３８】
GST-π及びRNAi分子
図１は、GenBankアクセッション番号NM_000852.3（hGSTP1）に開示され、長さが986ヌクレオチドである標的ヒトグルタチオンS-トランスフェラーゼπ（ヒトGST-π）mRNAの核酸配列の例である（配列番号１）。
【００３９】
当業者は、報告された配列が経時的に変化することがあり、それに応じて本明細書中の核酸分子に必要な変化を組み込むことができることを理解するであろう。
【００４０】
本発明の実施形態は、小さい核酸分子を用いたGST-π発現の遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。核酸分子の例としては、RNA干渉（RNAi分子）、短鎖干渉RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、マイクロRNA（miRNA）、及び短鎖ヘアピンRNA（shRNA）分子において活性な分子、同様に、DNA指向性RNA（ddRNA）、PiWi相互作用性RNA（piRNA）及びリピート関連性siRNA（rasiRNA）において活性な分子を含む。そのような分子は、GST-π遺伝子発現に対するRNA干渉を媒介することができる。
【００４１】
本明細書に開示される組成物及び方法はまた、被験体における様々な種類の悪性腫瘍の治療において使用することができる。
【００４２】
本発明の核酸分子及び方法を用いて、GST-πをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる。
【００４３】
本発明の組成物及び方法は、独立して又は組み合わせて、GST-πタンパク質及び/又はGST-πタンパク質をコードする遺伝子、悪性腫瘍などのGST-πに関連する疾患、状態又は障害の維持及び/又は発症に関連するタンパク質及び/又は当該タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節又は制御することができる１つ又は複数の核酸分子を含むことができる。
【００４４】
本発明の組成物及び方法は、GST-πの例示的な配列を参照して記載される。当業者は、本発明の様々な態様及び実施形態が、関連するGST-π遺伝子、配列、又はホモログ遺伝子及び転写変異体といった変異体、並びにGST-π遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）を含む多型を対象とすることを理解するであろう。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、GST-π遺伝子、例えばヒトGST-πの発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（siRNA）分子を提供することができる。
【００４６】
本発明のRNAi分子は、GST-πを標的とすることができ、及び、例えば相補的配列を用いて、又は非標準塩基対、例えばミスマッチ及び/又はウォブル塩基対を組み込むことによって更なる標的配列を提供できる任意の相同配列を標的とすることができる。
【００４７】
ミスマッチが同定される場合、非標準的な塩基対、例えば、ミスマッチ及び/又はウォブル塩基を用いて、2つ以上の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。
【００４８】
例えば、UU及びCC塩基対などの非標準塩基対を使用して、配列相同性を有する異なるGST-π標的のための配列を標的にできる核酸分子を生成できる。したがって、RNAi分子は、相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列を標的とすることができ、単一のRNAi分子を用いて2つ以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
【００４９】
いくつかの局面では、本発明の組成物及び方法は、GST-πmRNAに対して活性なRNAi分子を含み、RNAi分子は、GST-π配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含む。
【００５０】
ある実施形態において、本開示のRNAi分子は、GST-πRNAに対して活性を有することができる。ここで、RNAi分子は、変異体GST-πをコードする配列を有するRNA、例えば、悪性腫瘍に関連することが当該分野で公知である変異GST-π遺伝子に相補的な配列を含む。
【００５１】
さらなる実施形態では、本発明のRNAi分子は、GST-π遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用し、GST-π遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００５２】
GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表1及び表2に示す。
【００５３】
【表１】
2018513669.tif 000003
2018513669.tif 000004
2018513669.tif 000005
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2018513669.tif 000018
2018513669.tif 000019
【００５４】
表1の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを指す。小文字a、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びチミジンを意味する。
【００５５】
【表２】
2018513669.tif 000020
2018513669.tif 000021
【００５６】
表2の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを指す。小文字a、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びチミジンを意味する。
【００５７】
例えば、本発明のsiRNAは、配列番号1341のアンチセンス鎖及び配列番号1276のセンス鎖、又はそれらの化学的に修飾された鎖を有するものであってもよい。
【００５８】
例えば、本発明のsiRNAは、配列番号1305のアンチセンス鎖及び配列番号1240のセンス鎖、又はそれらの化学修飾された鎖を有するものであってもよい。
【００５９】
化学修飾は、鎖中の任意の位置の任意のヌクレオチド上における2'-OMe置換基、ならびに当該分野で公知の他の修飾を含むことができる。
【００６０】
GST-πの調節方法及び悪性腫瘍の治療方法
本発明の実施形態は、GST-π及び/又はGST-πタンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するために用いることができるRNAi分子を提供することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本発明のRNAi分子は、悪性腫瘍など疾患又は状態に関連し得るGST-πハプロタイプ多型から生じるGST-π及び/又はGST-πタンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するために使用することができる。
【００６２】
GST-πタンパク質又はmRNAレベルのモニタリングは、遺伝子サイレンシングを特徴づけるため、及び本発明の化合物及び組成物の有効性を決定するために使用することができる。
【００６３】
本開示のRNAi分子は、1つ以上の遺伝子の発現を調節するために、単独で又は他のsiRNAと組み合わせて使用することができる。
【００６４】
本開示のRNAi分子は、GST-πに関連する疾患（悪性腫瘍を含む）の予防又は治療、又は症状もしくは症状の改善のために、単独で又は組み合わせて、又は他の既知の薬物と組み合わせて使用することができる。
【００６５】
本発明のRNAi分子は、配列特異的様式でGST-πの発現を調節又は阻害するために使用することができる。
【００６６】
本開示のRNAi分子は、一連の連続したヌクレオチドがGST-πmRNAに少なくとも部分的に相補的であるガイド鎖を含むことができる。
【００６７】
特定の意味において、悪性腫瘍は、本発明のRNAi分子を用いたRNA干渉によって治療されてもよい。
【００６８】
悪性腫瘍の治療は、適切な細胞ベースのモデル、ならびにエクスビボ又はインビボの動物モデルにおいて特徴づけることができる。
【００６９】
悪性腫瘍の治療は、冒された組織の細胞におけるGST-πmRNAのレベル又はGST-πタンパク質のレベルを決定することによって特徴づけることができる。
【００７０】
悪性腫瘍の治療は、冒された臓器又は組織の非侵襲的な医学的走査によって特徴付けることができる。
【００７１】
本発明の実施形態は、それを必要とする被験体におけるGST-π関連疾患又は状態の症状を予防、治療又は改善するための方法を含むことができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、被験体における悪性腫瘍の症状を予防、治療又は改善するための方法は、被験体又は生物におけるGST-π遺伝子の発現を調節する本発明のRNAi分子を被験体に投与することを含むことができる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞又は生物を本発明のRNAi分子と接触させることによって、細胞又は生物におけるGST-π遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を企図する。
【００７４】
RNA干渉
RNA干渉（RNAi）は、短い干渉RNA（siRNA）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを意味する。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Fireら、Nature、1998、Vol. 391、806811頁; Sharp、Genes＆Development、1999、Vol. 13、pp. 139-141参照。
【００７５】
細胞内のRNAi応答は、二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発することができるが、メカニズムはまだ完全には理解されていない。細胞内の特定のdsRNAは、ダイサー酵素、リボヌクレアーゼIII酵素の作用を受けることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Hammondら、Nature、2000、Vol. 404、pp.293-296参照。ダイサーは、dsRNAをsiRNAであるdsRNAのより短い断片に加工することができる。
【００７６】
一般に、siRNAは、約21〜約23ヌクレオチドの長さとすることができ、約19ヌクレオチド長の塩基対二重鎖領域を含むことができる。
【００７７】
RNAiは、RNA誘発サイレンシング複合体（RISC）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体に関与する。siRNAは、RISC複合体に入るアンチセンス又はガイド鎖であって、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNA標的の切断を媒介するアンチセンス又はガイド鎖を有する。siRNAの他方の鎖はパッセンジャー鎖である。標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（例えば、Elbashirら、Genes＆Development、2001、Vol. 15、188〜200頁参照）。
【００７８】
本明細書で使用する「センス鎖」という用語は、siRNA分子の対応するアンチセンス鎖の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のセンス鎖は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
【００７９】
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」という用語は、標的核酸配列の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のアンチセンス鎖は、siRNA分子の対応するセンス鎖の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含むことができる。
【００８０】
RNAi分子は、配列特異的様式でRNA干渉を媒介することによって遺伝子発現をダウンレギュレート又はノックダウンすることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Elbashirら、Nature、2001、Vol. 411、494〜498頁; Kreutzerら、WO2000/044895; Zernicka-Goetzら、WO2001/36646; Fireら、WO1999/032619; Plaetinckら、WO2000/01846; Melloら、国際公開第2001/029058号パンフレット参照。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、遺伝子発現に関して「阻害する」、「ダウンレギュレートする」又は「縮小する」という用語は、遺伝子の発現又は1つ以上のタンパク質をコードするmRNA分子のレベル、若しくは1つ又は複数のコードされたタンパク質の活性が、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも低下することを意味している。例えば、発現のレベル、mRNAのレベル又はコードされたタンパク質活性のレベルが、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも、少なくとも1％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも50％、又は少なくとも90％、又はそれ以上で低下すれば良い。
【００８２】
RNAi分子はまた、ウイルス遺伝子発現をノックダウンするために使用することができ、よってウイルス複製に影響を及ぼす。
【００８３】
RNAi分子は、別個のポリヌクレオチド鎖：センス鎖又はパッセンジャー鎖と、アンチセンス鎖又はガイド鎖とから作製することができる。ガイド鎖とパッセンジャー鎖とは、少なくとも部分的に相補的である。ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、約15〜約49塩基対を有する二本鎖領域を形成することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、siRNAの二重鎖領域は、17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,又は49個の塩基対を含むことができる。
【００８５】
特定の実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であり、RISCに対して活性な二重鎖領域の長さを有することができる。
【００８６】
さらなる実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であるRNAi分子に変換されるダイサー基質として活性とすることができる。
【００８７】
いくつかの態様では、RNAi分子は、長い分子の対向する末端に相補的なガイドとパッセンジャー配列部分とを有することができ、その結果、分子は相補配列部分において二重鎖領域を形成することができ、各鎖はヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのいずれかによって当該二重鎖領域の一端で結合する。例えば、ヘアピン配列ステム及びループ配列である。各鎖とリンカー相互作用は、共有結合又は非共有相互作用とすることができる。
【００８８】
本開示のRNAi分子は、核酸のセンス領域を核酸のアンチセンス領域に結合するヌクレオチド、非ヌクレオチド又はヌクレオチド/非ヌクレオチド混合リンカーを含んでいてもよい。ヌクレオチドリンカーは、長さが2ヌクレオチド以上、例えば約3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10ヌクレオチドのリンカーとすることができる。ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーとしても良い。本明細書で使用する「アプタマー」又は「核酸アプタマー」は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、ここで核酸分子はその天然の状況において標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子に結合する核酸分子であってもよく、ここで標的分子は核酸に天然に結合しなくてよい。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合し、それにより天然に存在するリガンドとタンパク質との相互作用を防止するために使用することができる。例えば、Goldら、Annu Rev Biochem、1995、Vol. 64、763-797頁; Brodyら、J.Biotechnol., 2000、Vol. 74、5〜13頁; Hermannら、Science、2000、Vol. 287、pp. 820-825参照。
【００８９】
非ヌクレオチドリンカーの例は、無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素又は他の高分子化合物、例えば2〜100個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールなどの高分子化合物を挙げることができる。いくつかの例は、Seelaら、Nucleic Acids Research、1987、Vol. 15、3113〜3129頁; Cloadら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、6324-6326頁; Jaeschkeら、Tetrahedron Lett.,1993、Vol. 34、301頁; Arnoldら、WO1989/002439; Usmanら、WO1995/006731; Dudyczら、WO1995/011910; 及びFerentzら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、pp. 4000-4002に記載されている。
【００９０】
RNAi分子は、二重鎖領域から1つ以上のオーバーハングを有することができる。オーバーハングは、塩基対形成されていない一本鎖領域であり、長さが1〜8ヌクレオチド又はそれ以上としても良い。オーバーハングは、鎖の3'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する3'末端オーバーハングとしても良い。オーバーハングは、鎖の5'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する5'末端オーバーハングとしても良い。
【００９１】
RNAi分子のオーバーハングは、同じ長さを有していても良いし、異なる長さとしても良い。
【００９２】
RNAi分子は、二重鎖領域がオーバーハングなしで終わり、鎖が二重鎖領域の末端まで塩基対合する、一つ以上の平滑末端を有するものとすることができる。
【００９３】
本開示のRNAi分子は、1つ以上の平滑末端を有することができ、又は1つ以上のオーバーハングを有することができ、若しくは平滑末端とオーバーハングとの組み合わせを有することができる。
【００９４】
RNAi分子の鎖の5'末端は、平滑末端にあってもよく又はオーバーハングにあってもよい。RNAi分子の鎖の3'末端は、平滑末端にあってもよく又はオーバーハングにあってもよい。
【００９５】
RNAi分子の鎖の5'末端は平滑末端にあり、3'末端はオーバーハングにあってもよい。RNAi分子鎖の3'末端は平滑末端にあり、5'末端はオーバーハングにあってもよい。
【００９６】
いくつかの実施形態では、RNAi分子の両端は平滑末端である。
【００９７】
さらなる実施形態において、RNAi分子の両端はオーバーハングを有している。
【００９８】
5'-及び3'-末端のオーバーハングは、異なる長さであってもよい。
【００９９】
特定の実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の5'末端及びセンス鎖の3'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
【０１００】
さらなる実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の3'末端及びセンス鎖の5'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
【０１０１】
RNAi分子は、二重鎖領域における塩基対合においてミスマッチを有していてもよい。
【０１０２】
RNAi分子のオーバーハングにおける任意のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドとすることができる。
【０１０３】
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは5'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他方の鎖の3'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。
【０１０４】
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは3'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他の鎖の5'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、RNAi分子のオーバーハングヌクレオチドの1つ以上又は全てを2'-デオキシリボヌクレオチドとしてもよい。
【０１０６】
ダイサー基質RNAi分子
いくつかの態様において、RNAi分子は、RISC活性RNAi分子を生成するようにプロセシングされるダイサー基質として適した長さにすることができる。例えば、Rossiら、US2005/0244858参照。
【０１０７】
ダイサー基質である二本鎖RNA（dsRNA）は、活性RNAi分子を生成するためにダイサーによって処理されるのに十分な長さとすることができ、さらに以下の特性の1つ以上を含んでいてもよい：（i）ダイサー基質dsRNAは、例えば、アンチセンス鎖上に3'オーバーハングを有するような非対称とすることができ、（ii）ダイサー基質dsRNAは、ダイサー結合の配向を指示し、dsRNAを処理して活性なRNAi分子とするためにセンス鎖上に改変された3'末端を有していてもよい。
【０１０８】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNA中の最も長い鎖を24〜30ヌクレオチドの長さとすることができる。
【０１０９】
ダイサー基質dsRNAは、対称又は非対称とすることができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、22〜28ヌクレオチドのセンス鎖及び24〜30ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有することができる。
【０１１１】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有していてもよい。
【０１１２】
さらなる実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが25ヌクレオチドのセンス鎖及び2塩基の3’-オーバーハングを含む長さが27ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有することができる。オーバーハングは、1、2又は3ヌクレオチドの長さとすることができる。センス鎖はまた5’リン酸を有していてもよい。
【０１１３】
非対称ダイサー基質dsRNAは、2つのリボヌクレオチドの代わりにセンス鎖の3’末端に2つのデオキシリボヌクレオチドを有することができる。
【０１１４】
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、約22〜約30、又は約22〜約28、又は約24〜約30、又は約25〜約30、又は約26〜約30、又は約26及び29、又は約27〜約28ヌクレオチドの長さとすることができる。
【０１１５】
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチドの長さとすることができる。
【０１１６】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが少なくとも約25ヌクレオチドであり、長さが約30ヌクレオチドを超えないセンス及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
【０１１７】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、26〜29ヌクレオチドの長さのセンス及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
【０１１８】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが27ヌクレオチドであるセンス鎖及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
【０１１９】
ダイサー基質dsRNAのセンス及びアンチセンス鎖は、平滑末端であって同じ長さとすることができ、又はオーバーハングを有するように異なる長さであってもよく、又は平滑末端と突出とを有していてもよい。
【０１２０】
ダイサー基質dsRNAは、長さが19、20、21、22、23、24、25、26又は27ヌクレオチドの二重鎖領域を有していてもよい。
【０１２１】
ダイサー基質dsRNAのアンチセンス鎖は、真核細胞の細胞質内などの生物学的条件下でセンス鎖の配列の少なくとも一部にアニールする任意の配列を有することができる。
【０１２２】
センス鎖及びアンチセンス鎖を有するダイサー基質は、リンカー基又はリンカーオリゴヌクレオチドのような第3の構造によって連結することができる。リンカーは、例えばdsRNAの2つの鎖を連結し、アニーリングの際にヘアピンを形成することができる。
【０１２３】
ダイサー基質のセンス及びアンチセンス鎖は一般に相補的であるが、塩基対形成においてミスマッチを有していてもよい。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、センス鎖が22〜28ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が24〜30ヌクレオチドを有するように非対称であってもよい。
【０１２５】
ダイサー基質dsRNAの鎖の1つ、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも19ヌクレオチドの配列長を有してもよく、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’末端に隣接している21塩基領域内であり、標的遺伝子から産生されたRNAのヌクレオチド配列と十分に相補的となる。
【０１２６】
ダイサー基質dsRNAのアンチセンス鎖は、22〜28ヌクレオチドの長さとなるように、5’末端に1〜9個のリボヌクレオチドを有することができる。アンチセンス鎖の長さが21ヌクレオチドである場合、1〜7個のリボヌクレオチド、又は2〜5個のリボヌクレオチド、又は4個のリボヌクレオチドを3’末端に付加することができる。付加されるリボヌクレオチドは、任意の配列とすることができる。
【０１２７】
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、24〜30ヌクレオチドを有していてもよい。センス鎖は、アンチセンス鎖と実質的に相補的であってもよく、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニールする。
【０１２８】
RNAi分子の使用方法
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、分子の直接的な適用によって、又は担体若しくは希釈剤と組み合わせた分子を用いて、細胞又は組織に送達することができる。
【０１２９】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、担体又は希釈剤若しくは、ウイルス配列、ウイルス物質又は脂質若しくはリポソーム製剤などの細胞への侵入を補助又は促進するように機能する他の送達ビヒクルを用いた分子の直接的な適用によって、細胞、組織、器官又は被験体に送達又は投与することができる。
【０１３０】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、カチオン性脂質と複合体を形成するか、リポソーム内にパッケージするか、或いは標的細胞又は組織に送達することができる。核酸又は核酸複合体は、直接皮膚適用、経皮適用又は注射によって生体外又は生体内の関連する組織に局所投与することができる。
【０１３１】
送達系は、例えば、水性及び非水性ゲル、クリーム、エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性及び非水性溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベース及び粉末を含んでいても良く、そして可溶化剤及び浸透増強剤等の添加物を含んでいても良い。
【０１３２】
本開示の組成物及び方法は、核酸分子の発現を可能にするように、少なくとも1つの本発明のRNAi分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
【０１３３】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、DNA又はRNAベクターに挿入された転写単位から発現させることができる。組換えベクターは、DNAプラスミド又はウイルスベクターとすることができる。核酸分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。
【０１３４】
例えば、ベクターは、二重鎖のRNAi分子の両方の鎖をコードする配列、又は自己相補的であってRNAi分子を形成する単一の核酸分子を含んでいても良い。発現ベクターは、2つ以上の核酸分子をコードする核酸配列を含んでいても良い。
【０１３５】
核酸分子は、真核生物のプロモーターから細胞内で発現することができる。当業者は、任意の核酸が、適切なDNA/RNAベクターから真核細胞において発現できることを理解している。
【０１３６】
いくつかの態様では、発現コンストラクトを細胞に導入するためにウイルスコンストラクトを使用することができ、これは当該発現コンストラクトによりコードされるdsRNA構築物の転写のためである。
【０１３７】
脂質製剤は、静脈内、筋肉内又は腹腔内注射によって、若しくは経口的に又は吸入によって、若しくは当該分野で公知の他の方法によって動物に投与することができる。
【０１３８】
オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は公知であり、使用することができる。
【実施例】
【０１３９】
実施例１：インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、siRNAノックダウン効力を測定した。表３に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンがsiRNAで観察された。
【０１４０】
【表３】
2018513669.tif 000022
【０１４１】
実施例２：インビトロノックダウンのためのプロトコル。
トランスフェクションの1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプレートに2×103細胞/ウェルでプレートし、5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュベーターで培養する。トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μlのOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に変更する。0.2μlのLipofectamine RNAiMax（Life Technologies Cat。＃13778-100）を4.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合する。1μlのsiRNAと4μlのOpti-MEM Iを混合し、LF2000溶液と混合し、ボルテックスせずに静かに混合する。室温で5分間待ち、混合物を室温で10分間インキュベートし、RNA-RNAiMax複合体を形成させる。さらに、10μlのRNA-RNAiMax複合体をウェルに添加し、プレートを手で静かに振盪する。細胞を5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃のインキュベーター中で2時間インキュベートする。2％FBSを含む培地を新鮮な-MEM I Reduced Serum Medium（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に交換する。トランスフェクションの24時間後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄する。室温で5〜30分間、50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液（Life Technologiesカタログ番号4391851C）で細胞を溶解する。停止液5μlを加え、室温で2分間インキュベートする。直ちにTAQMANを用いてRT-qPCRによりmRNAレベルを測定する。あるいは、サンプルを-80℃で凍結させ、後でアッセイすることもできる。
【０１４２】
実施例３：図２は、GST-πsiRNAの生体内ノックダウン効率を示す。図２に示すように、GST-πを標的とするBU02 siRNAを使用することで、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンがインビボで観察された。
【０１４３】
実施例４：図３は、GST-π標的化siRNAによる細胞増殖の阻害を示している。図３に示すように、GST-πを標的とするsiRNAを使用することで、用量依存的な増殖阻害がインビトロにおけるA549細胞系で観察された。
【０１４４】
実施例５：図４は、GST-πsiRNA（BU02）に関して腫瘍阻害効力を示している。膵癌異種移植モデルを、GST-πを標的とするsiRNAの0.75mg/kgで比較的低用量で使用した。GST-πsiRNAは、28日目に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。
【０１４５】
この実験において、A549及びPANC-1細胞株をATCCから得た。細胞懸濁液を、氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用した。各マウス（無胸腺ヌード雌マウス、6〜8週、チャールズリバー（Charles River））に、マウス1匹につき1接種量の25G針及びシリンジを用いて、2.5×106個のA549細胞又は2.5×106個のPANC-1細胞の接種物0.1mlを右脇腹に皮下接種した。接種のためにマウスに麻酔をかけた。確立された腫瘍が約250〜350mm3（A549）又は150〜250mm3（PANC-1）に達した日に、動物に尾静脈を通してボーラス注射を施した。動物は、過剰のCO2によって犠牲にされ、腫瘍は、投与後の異なる時点で解剖された。腫瘍を最初に湿潤し、次いでGST-πノックダウンの測定、siRNAの生体内分布、及びバイオマーカー分析のために3つの部分に分けた。試料を液体窒素中で急速冷凍し、生物分析のために処理する準備ができるまで-80℃で保存した。
【０１４６】
実施例６：同所性A549肺癌マウスモデル。本発明のGST-πsiRNAは、インビボで同所性肺癌腫瘍の顕著な減少を示すことができる。本実施例では、GST-πsiRNAは、無胸腺ヌードマウスの同所性肺癌腫瘍にリポソーム製剤で投与された場合、in vivoにおいて遺伝子ノックダウンの有効性を示した。
【０１４７】
一般に、同所性腫瘍モデルは、薬効及び効力、ならびに改善された予測能力に関して直接の臨床的関連性を示すことができる。同所性腫瘍モデルにおいて、腫瘍細胞は、細胞が由来する同種の器官に直接移植される。
【０１４８】
ヒト肺癌A549に対するsiRNA製剤の抗腫瘍有効性を、処置群及びビヒクル対照群の剖検時に測定した最終原発腫瘍重量を比較することによって評価した。
【０１４９】
構造BU2（配列番号1276及び1341）に基づくGST-πsiRNAについて、同所性肺癌腫瘍阻害がインビボにおいて観察された。同所性A549肺癌マウスモデルを、GST-πを標的とするsiRNAの2mg/kgで比較的低用量で使用した。
【０１５０】
このGST-πsiRNAは、この6週間の研究において有意で予想外に有利な肺腫瘍阻害効力を示した。43日後、このGST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、最終腫瘍平均重量は対照と比較して2.8倍有意に減少した。
【０１５１】
この研究のために、5〜6週齢の雄NCr nu/nuマウスを使用した。実験期間中、実験動物をHEPA濾過環境に維持した。使用前にsiRNA製剤を4℃で保存し、マウスに注射する10分前に室温に温めた。
【０１５２】
外科的同所移植（SOI）の日に、このA549ヒト肺癌同所性モデルについて、ストック腫瘍を、A549腫瘍異種移植片を有する動物の皮下部位から採取し、RPMI-1640培地に入れた。壊死組織を除去し、生存組織を1.5〜2mm3に切断した。動物をイソフルラン吸入で麻酔し、手術領域をヨウ素及びアルコールで滅菌した。約1.5cmの横断切開を、マウスの左胸壁に、一対の外科用ハサミを用いて行った。3番目と4番目の肋間に肋間切開を行い、左肺を露出させた。1つのA549腫瘍断片を8-0の外科的縫合糸（ナイロン）で肺の表面に移植した。胸壁は6-0の外科用縫合糸（シルク）で閉じられた。肺は、胸腔内の残りの空気を引き出すために、25G×1/2針の3ccシリンジを使用して胸腔内穿刺により再膨張させた。胸壁は6-0の外科用絹縫合糸で閉じられた。上記操作の全ての手順は、HEPA濾過層流フードの下で7倍の倍率顕微鏡を用いて行った。
【０１５３】
腫瘍移植の3日後、モデル担癌マウスを、群当たり10匹のマウスの群に無作為に分けた。目的の群については、腫瘍移植の3日後に10匹のマウスの治療を開始した。
【０１５４】
目的の群について、処方物は、（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K：DSPE-PEG-2K）のリポソーム組成物とした。リポソームはGST-πsiRNAをカプセル化した。
【０１５５】
試験エンドポイントについては、処置開始後42日で実験マウスを屠殺した。原発腫瘍を切除し、その後の分析のために電子天秤で秤量した。
【０１５６】
化合物の毒性の評価について、処置群及び対照群におけるマウスの平均体重は、実験期間全体にわたって正常範囲内に維持された。毒性の他の症状はマウスにおいて観察されなかった。
【０１５７】
実施例７：ヌードマウスにおけるA549細胞増殖及び漿尿膜（CAM）における血管新生に対するGST-πを標的とする低分子干渉RNA（siRNA）の効果。3対のGST-πsiRNA-プラスミド及び非サイレンシング-プラスミドを構築し、それぞれLIPOFECTAMINE 2000を介してA549細胞にトランスフェクトした。GST-πsiRNA-プラスミドの最も有効な対をELISA及びリアルタイムRT-PCRにより選択した。選択されたGST-πsiRNA-プラスミドでトランスフェクトしたA549細胞、非サイレンシング-プラスミドでトランスフェクトしたA549細胞、トランスフェクションなしのA549細胞をそれぞれヌードマウスに接種した。ニワトリ胚を無作為に4つの群に分け、CAMを異なる溶液で48時間処理した。陰性対照群として培養培地DMEM、陽性対照群として非トランスフェクトA549細胞培養上清、GST-πsiRNA群としてGST-πsiRNA A549細胞培養上清、及び非サイレンシングsiRNA群として非サイレンシングsiRNA A549細胞培養上清を使用した。CAMは12日目に顕微鏡アッセイにより回収された。
【０１５８】
対照群と比較して、GST-πsiRNA-プラスミドは、GST-πmRNAの減少を伴ってA549細胞によるGST-π分泌の減少を誘導した。非サイレンシングsiRNA群と比較して、マウス異種移植片の平均腫瘍体積はGST-πsiRNA群で減少し；異種移植片が50mm3までに成長する時間が遅れた。異種移植におけるGST-π含量が減少した。CAMアッセイでは、GST-π含量は陰性群でゼロであり、GST-πsiRNA群では、非サイレンシングsiRNA群又は陽性群と比較して20〜70％減少した。GST-πsiRNA群又は非サイレンシングsiRNA群又は陽性群におけるCAMの血管分岐点は陰性群と比較して増加した。GST-πsiRNA群におけるCAMの全血管長は陰性群に比べて増加し、非サイレンシングsiRNA群又は陽性群では増加した。陰性対照群と比較して、GST-πsiRNA群にGST-πを添加した細胞培養上清を添加すると微小血管の増殖が増加し、非サイレンシングsiRNA群又は陽性群で有意な増殖血管が観察された。
【０１５９】
実施例８：細胞培養。ヒトの非小細胞肺癌細胞株であるA549を、10％FBS（FBS、Invitrogen）を添加したF-12K培地（ATCC）中、37℃、5％CO2の加湿雰囲気下で培養した。対照又はGSTπsiRNAを安定に発現する細胞は、A549TR細胞に、製造者の指示（Sigma-Aldrich）に従って、それぞれのレンチウイルス形質導入粒子を形質導入することによって作製した。2.5μg/mLピューロマイシン（Invivogen）中、12日間で耐性クローンを選択し、クローニングシリンダーを用いて単離し、続いてピューロマイシン含有培地で増殖させ維持した。
【０１６０】
実施例９：GST-π標的siRNAは、インビボでの腫瘍体積の著しい退行をもたらす。
脂質製剤を使用して、scidマウス中のヒトA549肺癌細胞の異種移植片にナノ粒子中のsiRNAをカプセル化して送達した。異種移植片は、正常細胞と比較してKRAS突然変異の存在又は異常な発現レベルを同定するために試験された。腫瘍が確立されると（>100mm3）、GST-π標的siRNA又は対照（非特異的）siRNAのいずれかで2日ごとに2週間処置した。対照群を安楽死させなければならない場合、試験を中止した。
【０１６１】
結果：GST-π標的siRNAで処置した場合、腫瘍の拡大を防ぎ、劇的な腫瘍体積の減少をもたらした。
【０１６２】
回収された腫瘍を切片化し、TUNEL染色によって視覚化した。GST-π標的siRNAで処置された腫瘍は、有意により高いレベルのアポトーシスを示した。腫瘍からRNAを抽出し、リアルタイムPCRを行ってGST-πの特異的ノックダウンを調べた。
【０１６３】
結果：GST-π標的siRNAで処置した場合、in vivoにおけるGST-πの発現を劇的に減少させた。
【０１６４】
実施例１０：本発明のGST-πsiRNAは、増加した血清安定性を示した。
GST-πsiRNAをヒト血清中でインキュベートし、様々な時点において残存するsiRNAをHPLS/LCMSによって検出した。GST-πsiRNA（配列番号1276及び1341）のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に対する血清中の半減期（t1/2）は約100分であった。
【０１６５】
実施例１１：本発明のGST-πsiRNAは、血漿中での製剤化において高い安定性を示した。
GST-πsiRNAを血漿中の製剤中でインキュベートし、様々な時点において残存するsiRNAを検出した。GST-πsiRNA（配列番号1276及び1341）製剤の血漿中の半減期（t1/2）は100時間より有意に長かった。
【０１６６】
GST-πsiRNAは、組成物（イオン化脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤中で調製した。リポソームナノ粒子のz平均サイズは40.0nmであり、siRNAは91％カプセル化されていた。
【０１６７】
製剤をPBS中の50％ヒト血清中で40分、1.5時間、3時間、24時間及び96時間インキュベートした。GST-πsiRNAの量は、ELISAベースのアッセイによって決定した。
【０１６８】
実施例１２：本発明のGST-πsiRNAは、インビボにおいて癌異種移植腫瘍の顕著な減少を示すことができた。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植腫瘍に投与された場合、インビボで遺伝子ノックダウン効力を示すことができた。
【０１６９】
腫瘍抑制効果は、GST-πsiRNA（配列番号1276及び1341）について観察した。GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンは、GST-πを標的とするsiRNAでインビボで観察された。癌異種移植片モデルを、GST-πを標的とするsiRNAと共に使用した。
【０１７０】
GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。GST-πsiRNAで処理すると、脂質製剤に注射後4日目にGST-πmRNA発現が有意に減少した。4mg/kgの高用量では、注入後24時間で約40％の有意な減少が検出された。
【０１７１】
GST-πsiRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有する10mL/kgのリポソーム製剤として、単回注射で投与した。
【０１７２】
癌異種移植片モデルに関して、A549細胞株をATCCから得た。細胞を、10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI-1640中で維持した。接種の48時間前に細胞を分割して、回収時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプシン-EDTAで軽くトリプシン処理し、組織培養から回収した。生存細胞の数を計数し、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。血清を含まないRPMI培地中で細胞を4×107/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用した。
【０１７３】
マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリー胸腺ヌード（nu/nu）雌マウス、免疫不全、6〜8週齢、1群当たり3匹のマウスであった。
【０１７４】
腫瘍モデル調製のために、マウス1匹につき1接種量の25G針及び注射器を用いて、2×106のA549細胞の接種材料0.1mlを右脇腹に皮下接種した。マウスは接種のために麻酔をかけられなかった。
【０１７５】
腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmまで測定した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積=長さ×幅2/2を用いて計算した。腫瘍容積を週2回モニターした。確立された腫瘍が約350〜600mm3に達すると、マウスを様々な時点で群に割り当てた。同じ日に、試験品を投与レジメンに従って投与した。
【０１７６】
投薬投与のために、確立された腫瘍が約350〜600mm3に達した日に、試験品を4℃の冷蔵庫から取り出した。シリンジにアプライする前に、処方剤を含むボトルを手で数回戻して均一な溶液を作製した。
【０１７７】
体重については、マウスを最も近い0.1gまで秤量した。研究の終了日を含む残りの数週間、体重を数週間監視し、週2回記録した。
【０１７８】
腫瘍の収集のために、動物を過量のCO2で犠牲にし、投与後0、24、48、72及び96（任意）及び168時間で腫瘍を解剖した。腫瘍を最初に湿潤し、KD、分布及びバイオマーカー分析のために3つの部分に分けた。試料を液体窒素中で急速冷凍し、処理する準備が整うまで-80℃で保存した。
【０１７９】
本明細書に記載された実施形態は限定的ではなく、当業者は、本明細書に記載の修飾の特定の組み合わせを、改善されたRNAi活性を有する核酸分子を同定するための過度の実験なしに試験することができることを容易に理解することができる。
【０１８０】
本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物、特許及び文献は、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。
【０１８１】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、材料、及び試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。説明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示された説明に様々な置換及び変更を加えることができ、これらの実施形態はこの説明及び添付の特許請求の範囲内にあることは、当業者にとって極めて明らかである。
【０１８２】
単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。同様に、用語「a」（又は「an」）、「1つ以上」及び「少なくとも1つの」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」及び「有する」は、互換的に使用することができ、広範かつ制限なしに読まれるべきである。
【０１８３】
本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個々に参照する簡略方法として役立つことを意図しており、それぞれの個別値は個々に記載されているかのように組み入れられる。ここで、マーカッシュグループについては、当業者は、この説明が個々のメンバーならびにマーカッシュグループのメンバーのサブグループを含むことを認識するであろう。
【０１８４】
それ以上の詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。
【０１８５】
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同じ、等価の目的、又は同様の目的を果たす代替の特徴と置き換えることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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