(57)【要約】  本発明は、概して、Ｔ細活性化及び特定の標的細胞に対する再方向付けのための、新規の二重特異性抗原結合分子に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成する方法と、このような二重特異性抗原結合分子を疾患の治療に使用する方法とに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部分；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分；
を含み、第１の抗原がＴ細胞活性化抗原であり、第２の抗原がメソテリンであるか、又は第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原であり；且つ
メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
第１及び／又は第２の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項１又は２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
第２の抗原結合部分が、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられている、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原である、請求項１から４のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
Ｔ細胞活性化抗原がＣＤ３、特にＣＤ３エプシロンである、請求項１から５のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
（ａ）による第１の抗原結合部分が、第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子であり、（ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であり；
且つ
ｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；又は
ｉｉ）ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、
請求項１から８のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９又は１０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９から１１のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９から１２のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９から１２のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９又は１５に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９、１５及び１６のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９及び１５から１７のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項９及び１５から１７のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合部分
をさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
第３の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項２０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
第３の抗原結合部分が第１の抗原結合部分と同一である、請求項２０又は２１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
第１及び第３の抗原結合部分が標的細胞抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合部分がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンに特異的に結合する、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２４】
ｄ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を追加的に含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特性抗原結合分子。
【請求項２５】
第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項１から２４のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２６】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項１から２５のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項１から２５のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２８】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項２６又は２７に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２９】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３０】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３１】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合部分の各々がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３２】
第３の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している、請求項２４、２９、又は３０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
第１、第２及び第３の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合部分の各々がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
第１、第２及び第３の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分の各々がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３５】
第１及び第３の抗原結合部分とＦｃドメインとが、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧクラスの免疫グロブリンの一部である、請求項３４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３６】
ＦｃドメインがＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項２４から３５のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３７】
ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項２４から３６のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３８】
ＦｃドメインがＦｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾を含む、請求項２４から３７のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３９】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が形成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が形成される、請求項３８に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４０】
前記大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択され、前記小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群より選択される、請求項３９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４１】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基によって置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基によって置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に３６６位のスレオニン残基がセリン残基によって（Ｔ３６６Ｓ）、及び３６８位のロイシン残基がアラニン残基によって（Ｌ３６８Ａ）、それぞれ置き換えられている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項３９又は４０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４２】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に３４９位のチロシン残基がシステイン残基により置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項３９から４１のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４３】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項３９から４２のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４４】
Ｆｃドメインが、天然ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する、請求項２４から４３のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４５】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項２４から４４のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４６】
前記一又は複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）からなる群より選択される一又は複数の位置におけるものである、請求項４５に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４７】
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性化Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる三つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項２４から４６のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４８】
Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、請求項４４から４７のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４９】
エフェクター機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項４４から４８のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５０】
請求項１から４９のいずれか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする一又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項５０に記載のポリヌクレオチドを含む一又は複数のベクター、特に発現ベクター。
【請求項５２】
請求項５０に記載のポリヌクレオチド又は請求項５１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５３】
メソテリン及びＴ細胞活性化抗原に特異的に結合することができるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生成方法であって、ａ）請求項５２に記載の宿主細胞を、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）任意選択的にＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法により生成される、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５５】
請求項１から４９のいずれか一項又は請求項５４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項５６】
医薬としての使用のための、請求項１から４９のいずれか一項又は請求項５４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又は請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
それを必要とする個体の疾患の治療における使用のための、請求項１から４９のいずれか一項又は請求項５４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又は請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
疾患ががんである、請求項５７に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
【請求項５９】
それを必要とする個体の疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から４９のいずれか一項又は請求項５４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用。
【請求項６０】
個体に対し、請求項１から４９のいずれか一項又は請求項５４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記個体の疾患の治療方法。
【請求項６１】
前記疾患ががんである、請求項５９に記載の使用又は請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
標的細胞を、Ｔ細胞の存在下において、請求項１から４９のいずれか一項又は請求項５４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法。
【請求項６３】
上述の本発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、Ｔ細胞を活性化させるための二重特異性抗原結合分子に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞とに関する。本発明はさらに、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するための方法と、このような二重特異性抗原結合分子を疾患の治療に使用する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、種々の臨床背景において時に望ましい。例えば、健常な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残しながら、腫瘍細胞を特異的に破壊することががん治療の主要目的である。
【０００３】
これを達成する魅力的な方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のような免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃させて破壊させることである。ＣＴＬは、免疫系の最も強力なエフェクター細胞を構成するが、従来の治療抗体のＦｃドメインにより媒介されるエフェクター機構によって活性化することができない。
【０００４】
これに関し、標的細胞上の表面抗原に一の「アーム」で結合し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント成分に第２の「アーム」で結合するように設計された二重特異性抗体が、近年注目を浴びている。このような抗体がその標的の両方に同時結合することにより、標的細胞とＴ細胞の間に一時的な相互作用が生じ、いずれかの傷害性Ｔ細胞を活性化させ、続いて標的細胞を溶解させる。したがって、免疫応答は、標的細胞に再方向付けされ、ＣＴＬの正常なＭＨＣ制限活性化がそうであるように、標的細胞によるペプチド抗原の提示又はＴ細胞の特異性とは無関係である。このような観点から、標的細胞がそれに対して二重特異性抗体を提示するとき、即ち免疫シナプスが模倣されるときにのみ、ＣＴＬが活性化されることが重要である。特に望ましいのは、標的細胞の効率のよい溶解を引き起こすために、リンパ球のプレコンディショニング又は同時刺激を必要としない二重特異性抗体である。
【０００５】
複数の二重特異性抗体のフォーマットが開発されており、Ｔ細胞媒介性免疫療法に対するそれらの適性が調査されている。これらの中でも、いわゆるＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞結合体）分子は、きわめて詳細な特徴付けが済んでおり、臨床の分野で既に何らかの見通しを示している（Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 （2011）に掲載）。ＢｉＴＥは、二のｓｃＦｖ分子が可動性リンカーにより融合したタンデム型のｓｃＦｖ分子である。Ｔ細胞結合について評価されたさらなる二重特異性フォーマットには、ダイアボディ（Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 （1996））及びその誘導体、例えばタンデム型ダイアボディ（Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 （1999））が含まれる。さらに最近の開発は、ダイアボディフォーマットに基づくが、さらなる安定性のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする、いわゆるＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）分子である（Moore et al., Blood 117, 4542-51 （2011））。全部がハイブリッドマウス／ラットのＩｇＧ分子であり、やはり現在臨床治験において評価の対象である、いわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）は、さらに大きなフォーマットを表している（Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 （2010）に掲載）。
【０００６】
開発されている種々のフォーマットは、免疫療法におけるＴ細胞の再方向付け及び活性化に起因する大きな可能性を示すものである。しかしながら、そのために適した二重特異性抗体を生成するというタスクは決して簡単はなく、抗体の有効性、毒性、実現可能性、及び生産可能性に関して克服されなければならない複数の困難性を伴っている。
【０００７】
例えばＢｉＴＥ分子といった小さなコンストラクトは、エフェクターと標的細胞を効率的に架橋することができる一方、非常に短い血清半減期を有し、持続的注入により患者に投与されなければならない。一方、ＩｇＧ様フォーマットは、半減期が長いという大きな利点を有するが、ＩｇＧ分子に固有の天然エフェクター機能に関連付けられる毒性を欠点として有する。これらの免疫原性は、治療法開発の成功にとって、特に非ヒトフォーマットのＩｇＧ様二重特異性抗体の、別の好ましくない特徴を構成する。最後に、二重特異性抗体の一般的開発においてこれまで主に問題であったのは、臨床的に十分な量及び純度で二重特異性抗体コンストラクトを生産することで、これは、同時発現した際に異なる特異性の抗体重鎖と軽鎖とが誤対合してしまうことにより、正しく構築されたコンストラクトの収量が低減し、所望の二重特異性抗体の分離が困難な複数の非機能性副生成物が生じてしまう。
【０００８】
異なる手法が、二重特異性抗体の鎖会合問題を克服するために用いられている（例えばKlein et al., mAbs 6, 653-663 （2012）参照）。例えば「ノブ・イントゥ・ホール」戦略は、二つの異なる抗体重鎖を、ＣＨ３ドメインに突然変異を導入して接触面を修飾することにより、強制的にペアリングさせようと試みる。一の鎖において、嵩高なアミノ酸が短側鎖を有するアミノ酸によって置き換えられることにより、「ホール」がつくられる。逆に、大きな側鎖を有するアミノ酸が他のＣＨ３ドメインに導入されると、「ノブ」がつくられる。これら二の重鎖（及び両方の重鎖に適切でなければならない二の同一軽鎖）を共発現することにより、ヘテロダイマー（「ノブ−ホール」）対ホモダイマー（「ホール−ホール」又は「ノブ−ノブ」）が高い収率で観察される（Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 （1996） 617-621；及び国際公開第９６／０２７０１１）。ヘテロダイマーのパーセンテージは、二のＣＨ３ドメインの相互作用表面を、ファージディスプレイ手法を用いて再モデル化し、ジスルフィド架橋を導入してヘテロダイマーを安定させることにより、さらに上昇させることが可能であった（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 （1998） 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 （1997） 26-35）。ノブ・イントゥ・ホール技術の新しい手法は、例えばＥＰ１８７０４５９に記載されている。
【０００９】
しかしながら、「ノブ・イントゥ・ホール」戦略は、異なる標的抗原に結合するための異なる軽鎖を含む二重特異性抗体に起こる、重鎖−軽鎖の誤対合の問題を解決しない。
重鎖−軽鎖の誤対合を防ぐ一の戦略は、二重特異性抗体の結合アームの一つの重鎖と軽鎖間においてドメインを交換することである（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 （2011） 11187-11191参照。これらはドメインクロスオーバーを有する二重特異性ＩｇＧ抗体に関する。）。
【００１０】
二重特異性抗体の結合アームの一つにおいて重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬを交換すること（国際公開第２００９／０８０２５２号、さらにはSchaefer, W. et al, PNAS, 108 （2011） 11187-11191を参照）により、第１の抗原に対する軽鎖と第２の抗原に対する誤った重鎖との誤対合に起因して生じる副生成物が明らかに減少する（このようなドメイン交換を行わない手法と比較して）。それでも、これら抗体の調製は、副生成物をまったく伴わないというわけではない。主な副生成物は、Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型相互作用に基づいている（Schaefer, W. et al, PNAS, 108 （2011） 11187-11191；付録の図Ｓ１Ｉ）。したがって、このような副生成物をさらに減少させることは、例えばこのような二重特異性抗体の収率を向上させるために望ましい。
【００１１】
Ｔ細胞抗原及び標的細胞抗原の両方のための標的抗原及び適切な結合剤の選択は、治療的用途のためのＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の生成において、さらなる重要側面である。
【００１２】
メソテリンは、通常中皮（腹膜、心膜、及び肋膜）に限定された発現を有する細胞表面糖タンパク質である。しかしながら、メソテリンは、卵巣がん、中皮腫、非小細胞肺がん、肺腺癌、卵管がん、頭頚部がん、子宮頸がん、及び膵臓がんを含む様々な腫瘍型において有意に過剰発現する。メソテリンに対する抗体とそのイムノコンジュゲートは、例えば国際公開第２０１２／０８７９６２号及び同２０１５／０５１１９９号に報告されている。
【００１３】
本発明は、良好な有効性及び生産可能性を低い毒性及び好ましい薬物動態的特性と組み合わせた、メソテリン及びＣＤ３のようなＴ細胞活性化抗原を標的とする、Ｔ細胞の活性化と再方向付けのために設計された新規の改良型二重特異性抗原結合分子を提供する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者らは、メソテリンを標的とする、予想外の改善された特性を有する新規のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を開発した。
例えば、第１の態様において、本発明は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部分；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分；
を含み、第１の抗原がＴ細胞活性化抗原であり、第２の抗原がメソテリンであるか、又は第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原であり；且つ
メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１５】
一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００１６】
特定の実施態様では、第１及び／又は第２の抗原結合部分はＦａｂ分子である。特定の一実施態様では、第２の抗原結合部分は、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられている（即ちこのような実施態様によれば、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。
【００１７】
特定の実施態様では、第１の（及び存在する場合、第３の）Ｆａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。さらなる特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる一を超えないＦａｂ分子がＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子中に存在する（即ちＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＴ細胞活性化抗原に対して一価の結合を提供する）。
【００１８】
一実施態様では、第１の抗原はメソテリンであり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原である。さらに特異的な実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３、特にＣＤ３エプシロンである。
【００１９】
特定の一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって交換されている第２のＦａｂ分子；
を含み、
第１の抗原はメソテリンであり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり；
（ａ）による第１のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、望ましくない副生成物、特にそれらの結合アームの一つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗体に起こるＢｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型副生成物と比較した場合の所望の二重特異性抗体の比率は、ＣＨ１及びＣＬドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに（本明細書では時に「荷電修飾」という）より改善することができる。
【００２１】
例えば、いくつかの実施態様では、（ａ）による第１の抗原結合部分は、第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子であり、（ｂ）による第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられている第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であり；
且つ
ｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；又は
ｉｉ）ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００２２】
このような一実施態様では、ｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００２３】
さらなる一実施態様では、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００２４】
また別の実施態様では、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００２５】
特定の一実施態様では、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００２６】
別の特定の実施態様では、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００２７】
代替的な一実施態様では、ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００２８】
さらなる一実施態様では、ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
また別の実施態様では、ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００２９】
一実施態様では、ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００３０】
別の実施態様では、ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００３１】
特定の一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって交換されている第２のＦａｂ分子
を含み、
第１の抗原はメソテリンであり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり；
（ａ）による第１のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含み；且つ
ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００３２】
いくつかの実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合部分をさらに含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は第１の抗原結合部分と同一である。一実施態様では、第３の抗原結合部分はＦａｂ分子である。
【００３３】
特定の実施態様では、第３及び第１の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第３のＦａｂ分子は第１のＦａｂ分子と同一である。したがって、これら実施態様では、第３のＦａｂ分子は、存在する場合、第１のＦａｂ分子と同じアミノ酸置換を含む。第１のＦａｂ分子と同様に、第３のＦａｂ分子は特に、従来のＦａｂ分子である。
第３の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施態様では、第１及び第３の抗原部分は特異的にメソテリンに結合し、第２の抗原結合部分は、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンに、特異的に結合する。
【００３４】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかの実施態様では、ａ）による第１の抗原結合部分とｂ）による第２の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。特定の実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子である。このような特定の一実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合する。代替的なこのような一実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合する。（ｉ）第２のＦａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している実施態様では、さらにＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。
【００３５】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む。
【００３６】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる構成を有することができる、即ち第１、第２の（及び任意選択的に第３の）抗原結合部分は、互いに、及びＦｃドメインに、異なる方法で融合していてよい。これらは互いに直接、又は、好ましくは一又は複数の適切なペプチドリンカーを介して、融合することができる。Ｆａｂ分子の融合先がＦｃドメインのサブユニットのＦａｂ分子のＮ末端である場合、典型的には免疫グロブリンのヒンジ領域を介している。
【００３７】
一実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端又はＦｃドメインのサブユニットの他方のＮ末端に融合している。
【００３８】
一実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している。この実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に免疫グロブリン分子を含み、Ｆａｂアームの一つにおいて重鎖と軽鎖の可変領域ＶＨとＶＬ（又は本明細書に記載される荷電修飾がＣＨ１及びＣＬドメインに導入されない実施態様では定常領域ＣＨ１とＣＬ）が交換されている／互いによって置き換えられている（図１Ａ、Ｄ参照）。
【００３９】
代替的実施態様では、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子、が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。この実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に免疫グロブリン分子を含み、Ｆａｂアームの一つにおいて重鎖と軽鎖の可変領域ＶＨとＶＬ（又は本明細書に記載される荷電修飾がＣＨ１及びＣＬドメインに導入されない実施態様では定常領域ＣＨ１とＣＬ）が交換されている／互いによって置き換えられており、追加の（従来の）Ｆａｂ分子は前記ＦａｂアームにＮ末端融合している（図１Ｂ、Ｅ参照）。別のこのような実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。この実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、免疫グロブリンのＦａｂアームの一つにＮ末端融合した追加のＦａｂ分子と共に免疫グロブリン分子を本質的に含み、前記追加のＦａｂ分子では、重鎖と軽鎖の可変領域ＶＨとＶＬ（又は本明細書に記載される荷電修飾がＣＨ１及びＣＬドメインに導入されない実施態様では定常領域ＣＨ１とＣＬ）が交換されている／互いによって置き換えられている（図１Ｃ、Ｆ参照）。
【００４０】
特定の一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらに詳細な実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。
【００４１】
特定の一実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又はＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって交換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンであり；
ｃ）による第３のＦａｂ分子がａ）による第１のＦａｂ分子と同一であり；
（ｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）による第２のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており、且つ
ａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子が、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４２】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって交換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンであり；
（ｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）による第２のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており、且つ
（ａ）による第１のＦａｂ分子が、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４３】
さらなる実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって交換されている第２のＦａｂ分子；及び
ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンであるか；又は
（ｉｉ）第２の抗原がメソテリンであり、第１の抗原がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンであり；
ａ）による第１のＦａｂ分子及びｂ）による第２のＦａｂ分子が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており；且つ
メソテリンに特異的に結合するＦａｂ分子が、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４４】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の様々な構成のすべてにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換は、存在する場合、第１及び（存在する場合）第３のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第２のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに存在しうる。好ましくは、そのような置換は、第１及び（存在する場合）第３のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに存在する。本発明の概念によれば、本発明に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換はいずれも第２のＦａｂ分子では行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２のＦａｂ分子で行われる場合、そのようなアミノ酸置換はいずれも第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子では行われない。Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子では、アミノ酸置換は行われない。
【００４５】
特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子において行われる、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様では、第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプである。特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２のＦａｂ分子で行われる、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の他の実施態様では、第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプである。いくつかの実施態様では、第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプである。
【００４６】
特定の一実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって交換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンであり；
ｃ）による第３のＦａｂ分子がａ）による第１のＦａｂ分子と同一であり；
ａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
（ｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）による第２のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており、且つ
ａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子が、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４７】
さらに詳細な一実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって交換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンであり；
ｃ）による第３のＦａｂ分子がａ）による第１のＦａｂ分子と同一であり；
ａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）による第１のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており；且つ
ａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子が、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４８】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって交換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンであり；
ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
（ｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）による第２のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており、且つ
ａ）による第１のＦａｂ分子が、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４９】
さらなる実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって交換されている第２のＦａｂ分子；及び
ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンであるか；又は
（ｉｉ）第２の抗原がメソテリンであり、第１の抗原がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンであり；
ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）による第１のＦａｂ分子及びｂ）による第２のＦａｂ分子が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており；且つ
メソテリンに特異的に結合するＦａｂ分子が、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００５０】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。さらに詳細な実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。特定の実施態様ではＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
【００５１】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、第１及び第２のＦｃドメインサブユニットの会合を促進する修飾を含んでいる。このような特定の一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を収容可能な空洞が生成される。
【００５２】
特定の一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して小さな、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を呈する。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、非改変型Ｆｃドメインと比較して小さな、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を有するように改変される。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。一実施態様では、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン内の一又は複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９の群から選択される一又は複数の位置にある（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる三つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。他の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換はＬ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメインであり、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ（ＳＰＬＥ）を含んでいる（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００５３】
一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
【００５４】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号５のＨＣＤＲ２、配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。さらに詳細な実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分はＦａｂ分子である。特定の一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる第２の抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、ＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンに特異的に結合し、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。さらに詳細な実施態様では、前記第２の抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００５５】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の具体的な実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。さらに具体的な一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。特定の一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、第１（及び存在する場合第３）の抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、メソテリンに特異的に結合し、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。さらに詳細な実施態様では、前記第１（及び存在する場合前記第３）の抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００５６】
特定の態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって交換されている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定に結合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＣＤ３、特にＣＤ３エプシロンであり；
（ｉｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子が、それぞれ配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ｂ）による第２のＦａｂ分子が、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含み；且つ
（ｉｉｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子が、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している、
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００５７】
一実施態様では、ｂ）による第２のＦａｂ分子において、可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられており、さらに（ｉｖ）ａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、特にアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子及びｃ）による第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００５８】
本発明の別の態様によれば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする一又は複数の単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、本発明の単離されたポリヌクレオチド含む一又は複数の発現ベクター、及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物の細胞である。
【００５９】
別の態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、ａ）本発明の宿主細胞を、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む。本発明は、本発明の方法によって生成されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子も包含する。
【００６０】
本発明はさらに、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００６１】
本発明には、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的組成物を使用する方法も包含される。本発明の一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。一態様では、治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。
【００６２】
さらに、治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用と；薬学的に許容される形態の、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を、個体に対して投与することを含む、前記個体の疾患の治療方法とが提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【００６３】
本発明は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞に本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を接触させることを含む、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ−Ｆ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的構造である。（Ａ、Ｄ）は、「１＋１のＣｒｏｓｓＭａｂ」分子を示しており、（Ｂ、Ｅ）は、別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分を有する（「反転型」）「２＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｃ、Ｆ）は、「２＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示している。黒い点：ヘテロダイマー化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、−−：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。図示のＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含んでいるが、−ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では−代替的にＣＨ１とＣＬドメインの交換を含んでいる場合がある。
【図１Ｇ−Ｎ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的構造である。（Ｇ、Ｋ）は、別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分を有する（「反転型」）「１＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｈ、Ｌ）は、「１＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｉ、Ｍ）は、二つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｊ、Ｎ）は、二つのＣｒｏｓｓＦａｂを有し、且つ別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分を有する（「反転型」）「２＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示している。黒い点：ヘテロダイマー化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、−−：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。図示のＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含んでいるが、−ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では−代替的にＣＨ１とＣＬドメインの交換を含んでいる場合がある。
【図１Ｏ−Ｖ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的構造である。（Ｏ、Ｓ）は、「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｐ、Ｔ）は、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ」分子を示しており、（Ｑ、Ｕ）は、「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｒ、Ｖ）は、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−（Ｆａｂ）２」分子を示している。黒い点：ヘテロダイマー化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、−−：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。図示のＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含んでいるが、−ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では−代替的にＣＨ１とＣＬドメインの交換を含んでいる場合がある。
【図１Ｗ−Ｚ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的構造である。（Ｗ、Ｙ）は、「Ｆａｂ−（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子を示しており、（Ｘ、Ｚ）は、「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２−Ｆａｂ」分子を示している。黒い点：ヘテロダイマー化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、−−：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。図示のＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含んでいるが、−ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では−代替的にＣＨ１とＣＬドメインの交換を含んでいる場合がある。
【図２Ａ−Ｂ】実施例１において調製されたＴＣＢ分子を示している。（Ａ）は、荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）を有する「２＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」である。（Ｂ）は、荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾、代替的メソテリンバインダー、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）を有する「２＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」である。
【図２Ｃ−Ｄ】実施例１において調製されたＴＣＢ分子を示している。（Ｃ）は、荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換）を有さない「２＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」である。（Ｄ）は、荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、代替的メソテリンバインダー）を有さない「２＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」である。
【図２Ｅ−Ｆ】実施例１において調製されたＴＣＢ分子を示している。（Ｅ）は、荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）を有する「１＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」である。（Ｆ）は、荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）を有する「１＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」である。
【図３Ａ−Ｂ】実施例１において調製されたＴＣＢ分子のＣＥ−ＳＤＳ分析を示している（最終的な精製済み調製物、電気泳動図、レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元）。（Ａ）は分子Ａ，（Ｂ）は分子Ｂを、それぞれ示している。
【図３Ｃ−Ｄ】実施例１において調製されたＴＣＢ分子のＣＥ−ＳＤＳ分析を示している（最終的な精製済み調製物、ｖ、レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元）。（Ｃ）は分子Ｃを，（Ｄ）は分子Ｄを、それぞれ示している。
【図３Ｅ−Ｆ】実施例１において調製されたＴＣＢ分子のＣＥ−ＳＤＳ分析を示している（最終的な精製済み調製物、ｖ、レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元）。（Ｅ）は分子Ｅを，（Ｆ）は分子Ｆを、それぞれ示している。
【図４Ａ−Ｂ】実施例１において調製されたＴＣＢ分子のプロテインＡクロマトグラフィーから得られた画分の非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥを示している（４〜１２％のＢｉｓ／Ｔｒｉｓ、ＮｕＰａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；クーマシー染色；レーン１＝サイズマーカー  Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。（Ａ）のレーン２から１１は、分子Ａの画分Ｄ６からＦ３であり、（Ｂ）のレーン３から１２は、分子Ｂの画分Ｄ８からＦ３である。
【図４Ｃ−Ｄ】実施例１において調製されたＴＣＢ分子のプロテインＡクロマトグラフィーから得られた画分の非変換型ＳＤＳ  ＰＡＧＥを示している（４〜１２％のＢｉｓ／Ｔｒｉｓ、ＮｕＰａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；クーマシー染色；レーン１＝サイズマーカー  Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。（Ｃ）のレーン２から１２は、分子Ｃの画分Ｄ９からＦ５であり、（Ｄ）のレーン２から１２は、分子Ｄの画分Ｄ９からＦ５である。
【図４Ｅ−Ｆ】実施例１において調製されたＴＣＢ分子のプロテインＡクロマトグラフィーから得られた画分の非変換型ＳＤＳ  ＰＡＧＥを示している（４〜１２％のＢｉｓ／Ｔｒｉｓ、ＮｕＰａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；クーマシー染色；レーン１＝サイズマーカー  Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。  （Ｅ）のレーン２から９は、分子Ｅの画分２から９であり、（Ｆ）のレーン２から１４は、分子Ｆの画分４２から６２である。
【図５】メソテリン発現ＮＣＩ−Ｈ３２２腫瘍細胞（Ａ）及びヒトＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｂ）に対するＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａの結合を示している。
【図６Ａ−Ｄ】２４時間のインキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクター細胞＝ヒトＰＢＭＣ）の後にＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａによって誘導されたＮＣＩ−Ｈ５９６（Ａ）、ＡｓＰＣ−１（Ｂ）、ＢｘＰＣ−３（Ｃ）及びＮＣＩ−Ｈ３５８（Ｄ）ヒト腫瘍細胞のＴ細胞死滅を示している。
【図６Ｅ−Ｈ】４８時間のインキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクター細胞＝ヒトＰＢＭＣ）の後にＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａによって誘導されたＮＣＩ−Ｈ５９６（Ｅ）、ＡｓＰＣ−１（Ｆ）、ＢｘＰＣ−３（Ｇ）及びＮＣＩ−Ｈ３５８（Ｈ）ヒト腫瘍細胞のＴ細胞死滅を示している。
【図７Ａ−Ｅ】ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａによって誘導された、ＮＣＩ−Ｈ５９６（Ａ）、ＡｓＰＣ−１（Ｂ）、ＢｘＰＣ−３（Ｃ）及びＮＣＩ−Ｈ３５８（Ｄ）腫瘍細胞株のＴ細胞媒介性溶解後の（Ｅ：Ｔ＝１０：１、４８時間のインキュベーション）、又は標的細胞なしでの（Ｅ）、ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御を示している。
【図７Ｆ−Ｊ】ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａによって誘導された、ＮＣＩ−Ｈ５９６（Ｆ）、ＡｓＰＣ−１（Ｇ）、ＢｘＰＣ−３（Ｈ）及びＮＣＩ−Ｈ３５８（Ｉ）腫瘍細胞株のＴ細胞媒介性溶解後の（Ｅ：Ｔ＝１０：１、４８時間のインキュベーション）、又は標的細胞なしでの（Ｊ）、ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御を示している。
【図７Ｋ−Ｏ】ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａによって誘導された、ＮＣＩ−Ｈ５９６（Ｋ）、ＡｓＰＣ−１（Ｌ）、ＢｘＰＣ−３（Ｍ）及びＮＣＩ−Ｈ３５８（Ｎ）腫瘍細胞株のＴ細胞媒介性溶解後の（Ｅ：Ｔ＝１０：１、４８時間のインキュベーション）、又は標的細胞なしでの（Ｏ）、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御を示している。
【図７Ｐ−Ｔ】ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａによって誘導された、ＮＣＩ−Ｈ５９６（Ｐ）、ＡｓＰＣ−１（Ｑ）、ＢｘＰＣ−３（Ｒ）及びＮＣＩ−Ｈ３５８（Ｓ）腫瘍細胞株のＴ細胞媒介性溶解後の（Ｅ：Ｔ＝１０：１、４８時間のインキュベーション）、又は標的細胞なしでの（Ｔ）、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御を示している。
【図８】ヒトＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔｓ細胞（Ａ）及びヒトＭＳＬＮ発現ＡｓＰＣ−１（Ｂ）に対する異なるＭＳＬＮ  ＴＣＢの結合を示している。ヒトＭＳＬＮ発現細胞への結合のＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍによって計算された。ＳＤと共に三つ重ねて示している。
【図９】異なるＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞）によって誘導された、２４時間後（Ａ−Ｃ）又は４８時間後（Ｄ−Ｆ）の、ＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ５９６（Ａ、Ｄ）、ＡｓＰＣ−１（Ｂ、Ｅ）、ＢｘＰＣ−３（Ｃ、Ｆ）細胞のＴ細胞媒介性の溶解を示している。ＳＤと共に三つ重ねて示している。
【図１０】ＣＤ４（Ａ−Ｃ）又はＣＤ８Ｔ細胞（Ｄ−Ｆ）上の早期活性化マーカーＣＤ６９の上方制御によって測定した場合の、４８時間後の、Ｔ細胞上のヒトＣＤ３と、ＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ５９６（Ａ、Ｄ）、ＡｓＰＣ−１（Ｂ、Ｅ）又はＢｘＰＣ３（Ｃ、Ｆ）細胞上のヒトＭＳＬＮとに対する異なるＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の同時結合時のＴ細胞活性化を示している。ＳＤと共に三つ重ねて示している。
【図１１】図示の時点後の、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞上のヒトＣＤ３と、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＡｓＰＣ−１又はＢｘＰＣ３細胞上のヒトＭＳＬＮとに対する異なるＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の同時結合時の、発光によって決定されたＪｕｒｋａｔ活性化を示している。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６によって計算されたＥＣ５０値が示されている。
【図１２Ａ−Ｆ】４８時間後の、Ｔ細胞上のヒトＣＤ３と、ＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ５９６（Ａ、Ｄ）、ＡｓＰＣ−１（Ｂ、Ｅ）又はＢｘＰＣ３（Ｃ、Ｆ）細胞上のヒトＭＳＬＮとに対する異なるＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の同時結合時の、Ｔ細胞活性化を示している。Ｔ細胞活性化は、ＣＤ４（Ａ−Ｃ）又はＣＤ８Ｔ細胞（Ｄ−Ｆ）上の早期活性化マーカーＣＤ６９の上方制御によって測定された。ＳＤと共に三つ重ねて示している。
【図１２Ｇ−Ｉ】４８時間後の、Ｔ細胞上のヒトＣＤ３と、ＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ５９６（Ｇ）、ＡｓＰＣ−１（Ｈ）又はＢｘＰＣ３（Ｉ）細胞上のヒトＭＳＬＮとに対する異なるＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の同時結合時の腫瘍溶解を示している。ＳＤと共に三つ重ねて示している。腫瘍細胞の溶解は、アポトーシス／壊死腫瘍細胞から放出されたＬＤＨの定量化によって決定された。ＳＤと共に三つ重ねて示している。
【図１３】４８時間にわたるＭＳＬＮ  ＴＣＢ、ＭＳＬＮ陽性ＮＣＩ−Ｈ５９６標的細胞及びヒトＰＢＭＣエフェクター細胞の共インキュベーション（１０：１のＥ：Ｔ）時の、活性化されたＴ細胞からのサイトカイン放出が示されている。ＳＤと共に三つ重ねて示している。（Ａ）はＴＮＦαを、（Ｂ）はグランザイムＢを、（Ｃ）はＩＦＮ−γを、（Ｄ）はＩＬ−６を、（Ｅ）はＩＬ−１０を、それぞれ示している。
【図１４】ＭＳＬＮ陽性腫瘍標的細胞の存在下で観察されるが、ＭＳＬＮ陰性腫瘍標的細胞の存在下では観察されない抗原依存性のＴ細胞活性化及び腫瘍溶解を示している。Ｔ細胞活性化は、ＣＤ４（Ａ）又はＣＤ８Ｔ細胞（Ｂ）上の早期活性化マーカーＣＤ６９の上方制御のＦＡＣＳ測定によって決定された。腫瘍細胞の溶解は、アポトーシス／壊死腫瘍細胞から放出されたＬＤＨの定量化によって決定された（Ｃ）。ＳＤと共に三つ重ねて示している。
【図１５】ヒトＣＤ３発現ＰＢＭＣ（Ａ）、カニクイザルＣＤ３発現ＰＢＭＣ（Ｂ）、ヒトＭＳＬＮ発現一過性ＣＨＯトランスフェクタント（Ｃ）及びカニクイザルＭＳＬＮ発現一過性ＣＨＯトランスフェクタント（Ｄ）に対するＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａの結合を示している。ヒトＭＳＬＮ発現細胞への結合のＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍによって計算された。ＳＤと共に三つ重ねて示している。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
定義
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
【００６６】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えば、その断片である。
【００６７】
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な二つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの別個の細胞上に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００６８】
本明細書において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の抗原結合部位の存在を意味する。したがって、「抗原に対する一価の結合」という表現は、抗原結合分子内において、抗原に特異的な一つの（且つ一つを超えない）抗原結合部位の存在を意味する。
【００６９】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、即ち、一又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、一般に二つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は一般に単一の抗原結合部位を有する。
【００７０】
本明細書で使用される「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えば、第２の抗原結合部分）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと方向付けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、抗体及びその断片が含まれる。これについては後述する。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書でさらに定義し、且つ当技術分野において既知であるように、抗体定常領域を含むことができる。有用な重鎖定常領域は、五つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、二つのアイソタイプ：κ及びλのいずれかを含む。
【００７１】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質（例えばＣＤ３）は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質は、ＣＤ３、特にＣＤ３のエプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．  Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ｎｏ．  ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１を；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．  Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．  ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号２を参照）、又はメソテリン（ＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．  Ｑ１３４２１参照）である。メソテリンは、７１  ｋＤａの前駆体タンパク質として合成され、その成熟部分は細胞表面に発現される。その前駆体タンパク質は、フューリンによって、３１  ｋＤａのｓｈｅｄ成分（巨核球増強因子又はＭＰＦと呼ばれる）と４０  ｋＤａのメソテリン成分にタンパク質分解性に切断される。例示的なヒトメソテリン前駆体タンパク質のアミノ酸配列は配列番号３６に示され、例示的なヒトメソテリンは配列番号３７に示される。特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、様々な種由来のＣＤ３又はメソテリン抗原の中でも保存されたＣＤ３又はメソテリンのエピトープに結合する。
【００７２】
「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合部分の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 （2000））、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 （2002））により測定することができる。一実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００７３】
「親和性」は、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表され、この解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００７４】
例えばＦｃ受容体への結合減少といった「結合減少」は、例えばＳＰＲによって測定される、各相互作用に対する親和性の減少を指す。明確に示すために、用語はゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る値）への親和性の減少、即ち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合増大」は、各相互作用に対する親和性の増大を指す。
【００７５】
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指し、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞の活性化を誘導することができる。具体的には、抗原結合分子とＴ細胞活性化抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを引き起こすことによりＴ細胞活性化を誘導することができる。特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３のエプシロンサブユニット（ヒト配列についてＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．  Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ｎｏ．  ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１を；カニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．  Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．  ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号２を参照）。
【００７６】
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化」は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の一又は複数の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するために適切なアッセイは、本明細書において記載される技術分野で既知である。
【００７７】
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の一実施態様では、標的細胞抗原は、メソテリン、特にヒトメソテリンである。
【００７８】
本明細書において、Ｆａｂ分子などに関して使用される用語「第１」、「第２」又は「第３」は、各種の部分が複数存在するときに区別を簡便にするために使用される。このような用語の使用は、明瞭に述べているのでない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は方向を付与することを意図しているのではない。
【００７９】
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの、重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
【００８０】
「融合した」とは、複数の成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインのサブユニット）が、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により結合していることを意味する。
【００８１】
本明細書において使用される用語「単鎖」は、ペプチド結合により線形に結合したアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定の実施態様では、抗原結合部分の一つは、単鎖Ｆａｂ分子、即ちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖がペプチドリンカーにより接続されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の一実施態様では、単鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に接続している。
【００８２】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）は、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（即ち互いによって置き換えられている）Ｆａｂ分子を意味し、即ちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１（ＮからＣ末端の方向に、ＶＬ−ＣＨ１）からなるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＮからＣ末端の方向に、ＶＨ−ＣＬ）からなるペプチド鎖とを含む。明瞭には、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１を含むペプチド鎖を、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバー分子では、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
【００８３】
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットにおけるＦａｂ分子、即ち重鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン（ＮからＣ末端の方向に、ＶＨ−ＣＨ１）からなる重鎖と、軽鎖の可変ドメイン及び定常領域（ＮからＣ末端の方向に、ＶＬ−ＣＬ）からなる軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。
【００８４】
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常ドメインとも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常ドメイン（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる五種類のうちの一つに割当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、基本的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された二つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
【００８５】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む。
【００８６】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 （2003）を参照されたい。scFv断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., （Springer-Verlag, New York）, pp. 269-315 （1994）を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び  第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 （2003）; 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 （1993）参照。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 （2003）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部、或いは軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００８７】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供されうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００８８】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 （2007）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【００８９】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計六つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991） and by Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 （1987）に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及していずれかの定義が適用される場合、本明細書において定義及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Ａに明記される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。本明細書に提供されるＣＤＲ配列は、概してＫａｂａｔの定義によるものである。
【００９０】
表Ａ：ＣＤＲの定義１
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１  表ＡのすべてのＣＤＲの定義の番号付けは、Ｋａｂａｔら（以下参照）によって規定された番号付けの慣習に従っている。
２  表Ａにおいて使用されている小文字の「ｂ」を含む「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるＣＤＲを指す。
【００９１】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムをあらゆる可変領域配列に明確に割り当てることができる。可変領域配列に関連して本明細書において使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００９２】
本明細書において使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）に記載された、本明細書において「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ぶ、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））の頁６４７〜６６０参照）が、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付けシステム（頁６６１〜７２３参照）が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用され、この場合本明細書でこれはさらに「Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け」と呼ぶことにより分類される。
配列リストのポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、配列リストの番号付けをＫａｂａｔ番号付けに変換することは、当技術分野のいｐｐ端的技術範囲内である。
【００９３】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲのドメイン、即ちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００９４】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、 非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。このような可変ドメインを、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ぶ。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を産むように定常領域が追加的に修飾されているもの又は元の抗体から変更されているものである。
【００９５】
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の五つの主要なクラス、即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００９６】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異型Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化しうるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びると定義される。しかしながら、宿主細胞によって生成される抗体には、重鎖のＣ末端から、一又は複数の、特に一又は二のアミノ酸の翻訳後切断が生じうる。したがって、完全長重鎖をコードする特異的な核酸分子の発現により、宿主細胞によって生成される抗体は、完全長重鎖を含みうるか、又は完全長重鎖の切断された変異体（本明細書では「切断された変異型重鎖」とも呼ぶ）を含みうる。これは、重鎖の最後の二のＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）とリジン（Ｋ４４７）は、存在してもしなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書において定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、本明細書では、特に断らない限りＣ末端グリシン−リジンジペプチドを有さないものとして示される。本発明の一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に記載される薬学的組成物といった本発明の組成物は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と、切断された変異型重鎖とを含みうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と切断された変異型重鎖を有する分子との混合物からなることができ、この場合Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が切断された変異型重鎖を有する。本発明の一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むＴ細胞活性化二���特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様では、このような組成物は、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子からなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団；追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；及び追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子を含む。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991（上記も参照）に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する二つのポリペプチドの一方、即ち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００９７】
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾」とは、Ｆｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドの、同一のポリペプチドとの会合によるホモダイマーの形成を低減又は抑制する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促す修飾には、特に、会合することが望ましい二つのＦｃドメインサブユニット（即ち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾が含まれ、これらの修飾は、二つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させることにより、それらの会合を、それぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにすることができる。このように、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらのポリペプチドは、サブユニットの各々に融合したさらなる成分（例えば、抗原結合部分）が同じでないという意味で非同一でありうる。いくつかの実施態様では、会合を促す修飾は、Ｆｃドメイン内におけるアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
【００９８】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因しうる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００９９】
本明細書において使用される「改変する、改変された、改変」などの用語は、ペプチド骨格のいずれかの操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組み換えポリペプチド若しくはその断片の翻訳後修飾を含むと考慮される。改変には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、このような手法の組合せが含まれる。
【０１００】
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意図している。置換、欠失、挿入、及び修飾のあらゆる組み合わせは、最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増大を保持することを前提に、最終的なコンストラクトに到達するために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。Ｆｃ領域の結合特性などを変更する目的で、非保存的アミノ酸置換、即ち、一のアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸で置換することは、特に好ましい。アミノ酸置換には、２０の標準のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体又は天然に存在しないアミノ酸による置き換えが含まれる。アミノ酸変異体は、当技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異原性、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。遺伝学的改変以外の方法、例えば化学的修飾によるアミノ酸の側鎖基の変更方法も有用でありうると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、種々の表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示される。
【０１０１】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により線形に結合したモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、二以上のアミノ酸の任意の鎖を指すのであって、特異的な長さの生成物を指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は二以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語も「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語のいずれかの代わりに、又はいずれかと交換可能に、使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の成果を指すことも意図しており、このような成果には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解的切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるか、又は組み換え技術により生成されるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、化学合成を含むあらゆる手法で生成されてよい。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上の大きさのアミノ酸からなってよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有するものではない。既定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると言われ、既定の三次元構造を有さず、多数の異なる形態をとりうるポリペプチドは折り畳まれていないと言われる。
【０１０２】
「単離された」ポリペプチド若しくは変異体、又はその誘導体は、その自然の環境にない目的のポリペプチドである。特定のレベルのどのような精製も必要でない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から除去することができる。宿主細胞に発現される、組み換えにより生成されたポリペプチド及びタンパク質を、任意の適切な技術により分離、画分化、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組み換えポリペプチドのように、本発明のために単離することが考慮される。
【０１０３】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００  ×  分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同マッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。
【０１０４】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１０５】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
【０１０６】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドと言うとき、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５ポイントの変異を含んでよいという点以外は同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除されるか又は別のヌクレオチドで置換されてよいか、或いは参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はこれら末端の間のいずれかで、参照配列に含まれる残基中において個々に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において、発生してよい。特定の事項として、いずれか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
【０１０７】
用語「発現カセット」は、組み換えにより又は合成により、標的細胞内の特定の核酸の転写を許可する一連の特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１０８】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機械により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１０９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができるいずれかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞を含む。
【０１１０】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
【０１１１】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞により抗体でコートされた標的細胞の溶解を招く免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの低下」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞の数、及び／又は、ＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の上昇のいずれかと定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な生成、精製、製剤化、及び貯蔵方法（当業者に既知の）を用いて、但し改変されていない、同じ型の宿主細胞により生成される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと相対的なものである。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低下は、このアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。
【０１１２】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１１３】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１１４】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１１５】
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【０１１６】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物中の有効成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれる。
【０１１７】
本明細書で用いられる場合、「治療」（及びその文法上の変形）は、治療されている個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１１８】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１１９】
実施態様の詳細な説明
本発明は、特に有効性及び安全性、並びに生産可能性に関し（例えば純度、収率に関して）、治療的用途に好ましい特性を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１２０】
荷電修飾
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その中に含まれるＦａｂ分子に、特にそれらの結合アームの一つ（又は三つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合、二つ以上）にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの二重／多重特異性抗原結合分子の生成において生じうる、マッチしない重鎖との軽鎖の誤対合（Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ型副生成物）を減少させるうえで有効なアミノ酸置換を含むことができる（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５７１６５、特にその実施例も参照されたい。この特許文献を、参照によりその全体を本明細書に包含する）。
【０１２１】
したがって、特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている第２のＦａｂ分子
を含み、第１の抗原がＴ細胞活性化抗原であり、第２の抗原がメソテリンであるか、又は第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原であり；且つ
ｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）か；又は
ｉｉ）ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１２２】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ｉ）及びｉｉ）に記載の修飾の両方を含むことはない。第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬとＣＨ１は、互いによって置き換えられない（即ち変化しない）。
【０１２３】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様では、ｉ）ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１２４】
さらなる一実施態様では、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１２５】
特定の一実施態様では、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１２６】
さらに詳細な一実施態様では、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１２７】
さらに詳細な実施態様では、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１２８】
特定の実施態様では、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
【０１２９】
代替的に、上記実施態様によるアミノ酸置換は、ａ）による第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われてもよい。このような特定の実施態様では、ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
【０１３０】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子をさらに含んでもよい。特定の実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は、ａ）による第１のＦａｂ分子と同一である。これら実施態様では、上記実施態様によるアミノ酸置換は、第１のＦａｂ分子及び第３のＦａｂ分子の各々の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。代替的に、上記実施態様によるアミノ酸置換は、ｂ）による第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われてもよいが、第１のＦａｂ分子及び第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１では行われない。
【０１３１】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む。
【０１３２】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のフォーマット
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構造で互いに融合することができる。例示的構成を図１に示す。
【０１３３】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分はＦａｂ分子である。このような実施態様では、第１、第２、第３（など）の抗原結合部分は、本明細書において、それぞれ第１、第２、第３（など）のＦａｂ分子と呼ばれことがある。さらに、特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
【０１３４】
いくつかの実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０１３５】
このような一実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しいている。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｇ及び１Ｋに模式的に示されている。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
【０１３６】
別のこのような実施態様では、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ａ及び１Ｄに模式的に示されている。第１及び第２のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の一実施態様では、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の一実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【０１３７】
他の実施態様では、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０１３８】
このような一実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｈ及び１Ｌに模式的に示されている。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
【０１３９】
Ｆａｂ分子は、Ｆｃドメインに対して、又は互いに、直接又はペプチドリンカーを介して融合していてよく、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ，（Ｇ４Ｓ）ｎ  又は４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の整数である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５のアミノ酸長を、一実施態様では５から１００、さらなる実施態様では１０から５０のアミノ酸長を有する。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ［式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）］であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３であり、さらなる実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特定の適切なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖を接続するために適切な例示的ペプチドリンカーは、配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１１及び１２）を含む。別の適切なこのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特にＦａｂ分子がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合には、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合することができる。
【０１４０】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分（例えばＦａｂ分子）を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（例えば、図１Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌに示すような）は、特に高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な一を超える抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を亢進し、それによりその利用可能性を低下させる。
しかしながら、他の多くの場合、標的細胞抗原に特異的な二以上の抗原結合部分（例えばＦａｂ分子）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｍ又は１Ｎに示される実施例参照）を有することは、例えば標的部位へのターゲティングを最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために有利であろう。
【０１４１】
したがって、特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子をさらに含む。第１の抗原は、好ましくは、標的細胞抗原、即ちメソテリンである。一実施態様では、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。一実施態様では、第３のＦａｂ分子は第１のＦａｂ分子と同一である（即ち、第１及び第３のＦａｂ分子は、同じ重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を含み、同じドメイン構成（即ち従来の又はクロスオーバー）を有する）。特定の一実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３に特異的に結合し、第１及び第３のＦａｂ分子はメソテリンに特異的に結合する。
【０１４２】
代替的実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子をさらに含む。これら実施態様では、第２の抗原は、好ましくは標的細胞抗原である。このような一実施態様では、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子（Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子）である。このような一実施態様では、第３のＦａｂ分子は第２のＦａｂ分子と同一である（即ち第２及び第３のＦａｂ分子は、同じ重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有し、同じドメイン構成（即ち従来の又はクロスオーバー）を有する）。このような一実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３に特異的に結合し、第２及び第３のＦａｂ分子は標的細胞抗原に特異的に結合する。
【０１４３】
一実施態様では、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０１４４】
特定の実施態様では、第２及び第３のＦａｂ分子は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｂ及び１Ｅ（第３のＦａｂ分子が従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である特定の実施態様）と、図１Ｉ及び１Ｍ（第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第２のＦａｂ分子と同一である代替的実施態様）に模式的に示されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の一実施態様では、第２及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の一実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
【０１４５】
別の一実施態様では、第１及び第３のＦａｂ分子は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｃ及び１Ｆ（第３のＦａｂ分子が従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である特定の実施態様）と、図１Ｊ及び１Ｎ（第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第２のＦａｂ分子と同一である代替的実施態様）に模式的に示されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の一実施態様では、第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の一実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
【０１４６】
Ｆａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端において免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのサブユニットの各々のＮ末端に融合しているＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の構成においては、二つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは、本質的に免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらに詳細な実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。さらに詳細な実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０１４７】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかでは、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の構成に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合しうるか、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合しうる。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合はさらに、マッチしないＦａｂ重鎖とＦａｂ軽鎖の誤対合を低減し、また本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかの発現に必要なプラスミドの数を低減する。
【０１４８】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含んでいる）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第１のＦａｂ部分のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とを含んでいる。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
【０１４９】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とを含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
【０１５０】
いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、Ｆｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。
【０１５１】
これら実施態様のいくつかでは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。これら実施態様のその他では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、必要に応じて、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））をさらに含む。
【０１５２】
これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はさらに、（ｉ）Ｆｃドメインのサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインのサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））とを含みうる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
【０１５３】
いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ端末ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、Ｆｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。
【０１５４】
これら実施態様のいくつかでは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。これら実施態様のその他では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、必要に応じて、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））をさらに含む。
【０１５５】
これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はさらに、（ｉ）Ｆｃドメインのサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインのサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））とを含みうる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
【０１５６】
いくつかの実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＦｃドメインを含まない。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に第１及び第２のＦａｂ分子から、任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合する。このような構成は、図１Ｏ及び１Ｓに模式的に示されている。
【０１５７】
他の実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合する。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＦｃドメインを含まない。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に第１及び第２のＦａｂ分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合する。このような構成は、図１Ｐ及び１Ｔに模式的に示されている。
【０１５８】
いくつかの実施態様では、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合する。特定のこのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２、及び第３のＦａｂ分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｑ及び１Ｕに模式的に示されている（第３のＦａｂ分子が、従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である特定の実施態様）。
【０１５９】
いくつかの実施態様では、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＮ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合する。特定のこのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２、及び第３のＦａｂ分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＮ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。このような構成は、図１Ｗ及び１Ｙに模式的に示されている（第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第２のＦａｂ分子と同一である特定の実施態様）。
【０１６０】
いくつかの実施態様では、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＮ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合する。特定のこのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２、及び第３のＦａｂ分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＮ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。このような構成は、図１Ｒ及び１Ｖに模式的に示されている（第３のＦａｂ分子が、従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である特定の実施態様）。
【０１６１】
いくつかの実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２、及び第３のＦａｂ分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｘ及び１Ｚに模式的に示されている（第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である特定の実施態様）。
【０１６２】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。
【０１６３】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。
【０１６４】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。
【０１６５】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０１６６】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０１６７】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０１６８】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０１６９】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む），第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（即ち第３のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０１７０】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（即ち第３のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（３）−ＣＬ（３））ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））ポリペプチドをさらに含む。
【０１７１】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第３のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０１７２】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第３のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＨ（３）−ＣＬ（３）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））ポリペプチドをさらに含む。
【０１７３】
上記実施態様のいずれによっても、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接融合するか、又は、本明細書に記載されるか若しくは当技術分野で既知である様々なリンカー、特に一又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されうる。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ，（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここでｎは通常１から１０、典型的には２から４の整数である。
【０１７４】
Ｆｃドメイン
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリン  Ｇ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一を超えないＦｃドメインを含む。
【０１７５】
本発明による一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＩｇＧ  Ｆｃドメインである。特定の一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。さらに詳細な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（カバット番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４のＦｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch et al.、Drug Metabolism and Disposition 38、84-91（2010）参照）。さらに詳細な実施態様では、Ｆｃドメインはヒトである。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の例示的配列は、配列番号１３に提示されている。
【０１７６】
ヘテロダイマー化を促すＦｃドメインの修飾
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した複数の異なるＦａｂ分子を含み、したがってＦｃドメインの二つのサブユニットは、通常二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらのポリペプチドの組み換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組み換え生成におけるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
【０１７７】
即ち、特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾を含んでいる。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。したがって、一実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
【０１７８】
ヘテロダイマー化を実施するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおける修飾のための複数の手法が存在し、それらについては例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に詳細な記載がある。典型的には、そのような手法のすべてにおいて、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは共に、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）がそれ自体ともはやホモダイマー化することがなく、相補的に改変された他のＣＨ３ドメインとヘテロダイマー化するように、（よって第１と第２のＣＨ３ドメインがヘテロダイマー化し、二つの第１のＣＨ３ドメイン又は二つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモダイマーが形成されないように）共に相補的に改変される。重鎖ヘテロダイマー化の改善のためのこれら異なる手法は、軽鎖誤対合及びＢｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型副生成物を低減する本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子における、重鎖−軽鎖修飾（一の結合アームにおけるＶＨとＶＬの交換／置き換えと、ＣＨ１／ＣＬ接触面における、反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた異なる代替法として考慮される。
【０１７９】
特定の一実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する前記修飾は、いわゆる「ノブ−イントゥ−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を、それぞれ含んでいる。
【０１８０】
ノブ−イントゥ−ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996） and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、この方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロダイマー形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１８１】
このように、特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
【０１８２】
好ましくは、大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。
【０１８３】
好ましくは、小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群より選択される。
【０１８４】
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。
【０１８５】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１８６】
さらなる実施態様ではＦｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、さらにダイマーを安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 （2001））。
【０１８７】
特定の一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１８８】
特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、（任意選択的に標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子を介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に融合する。理論に縛られることを望まないが、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合するＦａｂ分子の、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットに対する融合は、（さらに）Ｔ細胞活性化抗原に結合する二つのＦａｂ分子を含む抗原結合分子の生成を最小化する（二つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突）。
【０１８９】
ヘテロダイマー化を実施するためのＣＨ３修飾の他の技術が、本発明による代替法として考慮され、例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
【０１９０】
一実施態様では、ＥＰ１８７０４５９に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン接触面内の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づいている。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一の好ましい実施態様は、（Ｆｃドメインの）二つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異体Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異体Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９１】
別の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、さらにはＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９２】
別の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖと、さらにＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（すべてＫａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９３】
一実施態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはさらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅより選択されるアミノ酸変異（好ましくはＬ３６８Ｅ）をさらに含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９４】
一実施態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる一実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２の位置に、例えばａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択される、さらなるアミノ酸変異を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる一実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９５】
一実施態様では、例えば３６８及び４０９からなる群より選択される位置にアミノ酸修飾を用いる、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されたヘテロダイマー化の手法が代替的に使用される（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９６】
一実施態様では、上述のノブ・イントゥ・ホール技術をやはり使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９７】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はそのＦｃドメインはＩｇＧ２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。
【０１９８】
代替的な一実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロダイマー化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による二つのＦｃドメインサブユニットの接触面における一又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。このような一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負の電荷を有するアミノ酸（例えばグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）でのＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正の電荷を有するアミノ酸（例えばリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ、さらに好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）でのＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、又はＥ３５７アミノ酸の置換を含む。さらなる一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負の電荷を有するアミノ酸（例えばグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）でのＫ４０９又はＲ４０９のアミノ酸置換をさらに含む。さらなる一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負の電荷を有するアミノ酸（例えばグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ））でのＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換を、さらに又は代替的に含む（すべてＫａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９９】
またさらなる一実施態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２００】
また別の実施態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されたヘテロダイマー化手法を代替的に使用することができる。
【０２０１】
一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２０２】
Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低減するＦｃドメインの修飾
Ｆｃドメインは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞へのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の望ましくないターゲティングの原因となりうる。さらには、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出の原因となりえ、サイトカイン放出は、Ｔ細胞活性化特性及び抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化を招き、全身投与されると重い副作用性をを引き起こしうる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性により、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性をさらに低下させることすらある。
【０２０３】
したがって、特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。このような一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を呈する、及び／又は、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、エフェクター機能を呈する。一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、さらに具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の群から選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然  ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。実質的に同様のＦｃＲｎに対する結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％、特に約８０％、さらには特に約９０％を上回る、ＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。
【０２０４】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、非改変型Ｆｃドメインと比較して小さな、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を有するように改変される。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低下させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらアミノ酸変異の組合せにより、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性が、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は少なくとも５０分の１まで低下する。一実施態様では、改変されたＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、非改変型Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較して、２０％未満、特に１０％未満、さらには５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、さらに具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、即ち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、Ｆｃドメインの非改変型形態（又はＦｃドメインの前記非改変型形態を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％を上回る親和性を呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％、及び場合によっては約９０％を上回る親和性を呈しうる。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、非改変型Ｆｃドメインと比較してエフェクター機能が低下するように改変される。エフェクター機能の低下は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、及びサイトカイン分泌の低減からなる群より選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、低減したＡＤＣＣは、非改変型Ｆｃドメイン（又は非改変型Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０２０５】
一実施態様では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施態様では、ＦｃドメインはＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置にアミノ酸置換を、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５の位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに詳細な実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組合せは、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に無効にする。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定する方法も記載されている。
【０２０６】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。よって、いくつかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能をさらに低下させるために、一実施態様では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメインの変異及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【０２０７】
特定の実施態様では、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインであるか、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２０８】
特定の実施態様ではＦｃドメインのＮグリコシル化は排除されている。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＮ２９７位におけるアミノ酸置換、特にアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）酸によりアスパラギンを置き換えるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２０９】
本明細書及び国際公開第２０１２／１３０８３１号において記載されるＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下を有するＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの二以上に置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０２１０】
変異Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０２１１】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組み換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載される。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【０２１２】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 （1986） and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 （1985）；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 （1987）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。或いは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al.、PNAS USA 95:652-656（1998）に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０２１３】
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように改変されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイが、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合できるかどうか、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行されうる。例えば国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 （1996）; Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 （2003）;及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 （2004）を参照）。
【０２１４】
抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、即ち二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも二つの抗原結合部分を含む。本発明の特定の実施態様によれば、抗原結合部分はＦａｂ分子（即ち、各々が可変及び定常領域を含む重鎖と軽鎖とからなる抗原結合ドメイン）である。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒトである。別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。また別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
【０２１５】
好ましくは、抗原結合部分の少なくとも一つはクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖との誤対合を減少させ、それにより組み換え生成において本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を向上させる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれＶＬ及びＶＨ）が交換されている。しかしながら、このようなドメイン交換によっても、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製は、誤対合した重鎖と軽鎖間のいわゆるＢｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ型相互作用に起因する特定の副生成物を含みうる（Schaefer et al, PNAS, 108 （2011） 11187-11191参照）。異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖の誤対合をさらに減少させ、したがって所望のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度及び収率を向上させるために、本発明により、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子（複数可）又はＴ細胞活性化抗原に特異的に結合するＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン中の特定のアミノ酸位置に導入することができる。荷電修飾は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（例えば図１Ａ−Ｃ、Ｇ−Ｊに示すような）、又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（複数可）（例えば図１Ｄ−Ｆ、Ｋ−Ｎに示すような）において行われる（但し両方で行われることはない）。特定の実施態様では、荷電修飾は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（特定の実施態様においては標的細胞抗原に特異的に結合するもの）において行われる。
【０２１６】
本発明による特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原とＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３に同時結合することができる。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原とＴ細胞活性化抗原に同時結合することにより、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。さらに詳細な実施態様では、このような同時結合は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を引き起こす。一実施態様では、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。他の実施態様では、このような同時結合は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び発現の群から選択される、Ｔ  リンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を引き起こす。一実施態様では、標的細胞への同時結合を含まないＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３に対する結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こさない。
【０２１７】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞へ再方向付けすることができる。特定の一実施態様では、前記再方向付けは、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原の提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。
【０２１８】
特に、本発明の実施態様のいずれかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞、特にＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【０２１９】
Ｔ細胞活性化抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合する少なくとも一の抗原結合部分、特にＦａｂ分子（本明細書では「Ｔ細胞活性化抗原結合部分又はＴ細胞活性化抗原結合Ｆａｂ分子」とも呼ぶ）を含む。特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原に対する特異的結合能を有する一を超えない抗原結合部分を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原に対する一価の結合を提供する。
【０２２０】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。このような実施態様では、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分（複数可）は、好ましくは従来のＦａｂ分子である。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合する一を超える抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分は好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
【０２２１】
代替的な実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。このような実施態様では、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。
【０２２２】
特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号１）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号２）、さらに詳細にはヒトＣＤ３である。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルのＣＤ３に交差反応性である（即ち、特異的に結合する）。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３エプシロン）である。
【０２２３】
いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原結合部分は、ＣＤ３、特にＣＤ３エプシロンに特異的に結合し、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群よ要り選択される少なくとも一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０の群より選択される少なくとも一の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０２２４】
特定の実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２２５】
別の実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２２６】
特定の実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２２７】
一実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２２８】
一実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３の重鎖可変領域配列と、配列番号７の軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２２９】
他の実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号３５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２３０】
一実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２３１】
一実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３９の重鎖可変領域配列と、配列番号４０の軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２３２】
標的細胞抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリン（標的細胞抗原）に特異的に結合する少なくとも一の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリンに特異的に結合する二の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。このような特定の一実施態様では、これら抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。さらに詳細な実施態様では、これら抗原結合部分のすべては同一であり、即ちそれらは、本明細書に記載されるようにＣＨ１及びＣＬドメイン内に同じアミノ酸置換を含む（もしあれば）同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリンに特異的に結合する免疫グロブリン分子を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリンに特異的に結合する二を超えない抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
【０２３３】
特定の実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。このような実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。
【０２３４】
代替的実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。このような実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分（複数可）は従来のＦａｂ分子である。
【０２３５】
メソテリン結合部分は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を標的部位へと、例えばメソテリンを発現する特殊な腫瘍細胞へと方向付けることができる。
【０２３６】
特定の一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。さらなる特定の実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号２０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域と、配列番号２１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域とを含む。さらなる特定の実施態様では、メソテリンに特異的に結合する結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号２０の重鎖可変領域配列と、配列番号２１の軽鎖可変領域配列とを含む。特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号２３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号２４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号２５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドとを含む。さらなる特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、配列番号２４のポリペプチド配列及び配列番号２５のポリペプチド配列を含む。
【０２３７】
別の実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号２８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域と、配列番号２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域とを含む。さらなる一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号２８の重鎖可変領域配列と、配列番号２９の軽鎖可変領域配列とを含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号３９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号４０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２４のポリペプチド配列、配列番号３８のポリペプチド配列、配列番号３９のポリペプチド配列及び配列番号４０のポリペプチド配列を含む。
【０２３８】
またさらなる一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域と、配列番号３１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域とを含む。またさらなる一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３０の重鎖可変領域配列と、配列番号３１の軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２３９】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施態様において、前記断片は抗原結合断片である。
【０２４０】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、二以上）のポリヌクレオチドとして発現されうる。同時発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、Ｆａｂ分子の軽鎖は、Ｆａｂ分子の重鎖、Ｆｃドメインのサブユニット及び任意選択的に別のＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてよい。同時発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合してＦａｂ分子を形成する。別の例では、二つのＦｃドメインサブユニットの一方び任意選択的に一又は複数のＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分は、二つのＦｃドメインサブユニットの他方及び任意選択的にＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされうる。同時発現されるとき、Ｆｃドメインサブユニットは会合してＦｃドメインを形成する。
【０２４１】
いくつかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２４２】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは単鎖又は二本鎖である。
【０２４３】
組み換え法
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固体相合成）又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成のために、例えば上述したように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組み換え／遺伝子組み換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. （1989）; 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y （1989）に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチド（即ち、コード化領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよいし、二以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード化領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード化領域が、調節配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の調節配列と結合するときである。（ポリペプチドコード化領域及びそれに結合する��ロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるといえる。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２４４】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード化領域と結合させることができる。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれに作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２４５】
後の精製を容易にするために使用されうる（例えば、ヒスチジンタグ）又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列をコードするＤＮＡは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれうる。
【０２４６】
さらなる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。そのような一実施態様において、宿主細胞は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するよう改変できるいずれかの種類の細胞系を指す。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 （2004）,及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 （2006）を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 （1977））に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 （1980）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル��細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 （1982）に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 （1980））；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ）, pp. 255-268 （2003）を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞を含み、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０２４７】
これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方も発現するように改変することができる。
【０２４８】
一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、本明細書に与えられるように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、宿主細胞（又は宿主細胞培地）からＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収することとを含む。
【０２４９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、通常互いに融合している。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように、設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。必要に応じて、融合の個々の成分を分離するための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
【０２５０】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照）。非天然に存在する抗体は、固体相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組み換え的に生成されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
【０２５１】
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「覆い隠す（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 （2008）に総説があり、さらに、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 （1988）; Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 （1989）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Jones et al., Nature 321, 522-525 （1986）; Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 （1984）; Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 （1988）; Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 （1988）; Padlan, Molec Immun 31（3）, 169-217 （1994）; Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 （2005）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植術について記載）；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 （1991）（「リサーフェイシング」について記載）；Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 （2005）（「ＦＲシャフリング」について記載）；及びOsbourn et al., Methods 36, 61-68 （2005） and Klimka et al., Br J Cancer  83, 252-260 （2000）（ＦＲシャフリングに対する「ガイド付き選択」アプローチについて記載）に概説がある。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 （2001） 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 （2008）に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 （Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 （2005）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイラ���ブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 （O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001）;及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 （1991）参照）。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片として表示する。
【０２５２】
特定の実施態様では、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号（この全内容を参照によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように改変される。特定の抗原決定基に結合する本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329（2000））及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229（2002））によって測定することができる。競合アッセイを、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定するため、例えばＣＤ３への結合についてＶ９抗体と競合する抗体を同定するために使用することができる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための典型的な方法の詳細が、Morris （1996）“Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 （Humana Press, Totowa, NJ）に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化抗原（例えばＣＤ３）は、抗原に結合する第一の標識された抗体（例えばＶ９抗体、米国特許第６０５４２９７号に記載）、及び抗原への結合について第一の抗体と競合するその能力について試験される第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二の抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第一の標識された抗体を含むが第二の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗体が、抗原への結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane （1988） Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 （Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【０２５３】
本明細書で記載のように調製されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるようにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を単離するために使用されうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される重鎖融合タンパク質は、インタクトで、且つＳＤＳ−ＰＡＧＥの低減により実証されるように適切に構築されていることが示された（図３参照）。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖、重鎖、及び重鎖／軽鎖融合タンパク質の予測される分子量に対応する、概ねＭｒ２５０００、Ｍｒ５００００及びＭｒ７５０００における三つの帯域が分離された。
【０２５４】
アッセイ
本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされる。
【０２５５】
アフィニティーアッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性を、実施例に規定される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例示的な実施態様は、後述及び以下の実施例に記載されている。
【０２５６】
一実施態様によれば、ＫＤは、２５ ℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２５７】
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグを付した組み換えＦｃ受容体を、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）により捕捉し、二重特異性コンストラクトを被分析物として使用する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給業者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、結合したタンパク質のおよそ６５００反応単位（ＲＵ）を達成するために５μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。その後、Ｆｃ受容体を４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。反応速度測定のため、二重特異性コンストラクトの４倍の連続希釈物（５００ｎＭ〜４０００ｎＭの）を、２５ ℃のＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５ ％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ｐＨ ７．４）に流速３０μｌ／分で１２０秒間注入する。
【０２５８】
標的抗原に対する親和性を決定するため、二重特異性コンストラクトを、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体について記載したように、活性化されたＣＭ５−センサーチップ表面上に固定化された抗ヒトＦａｂ特異性抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により捕捉する。結合したタンパク質の最終的な量は、約１２０００ＲＵである。二重特異性コンストラクトは、３００ｎＭで９０秒間捕捉される。標的抗原は、流速３０μｌ／分且つ濃度範囲２５０〜１０００ｎＭでフローセルに１８０秒間通過させる。解離を１８０秒間モニタする。
【０２５９】
バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正される。定常応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線適合により解離定数ＫＤを得た。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによる単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 （1999）を参照のこと。
【０２６０】
活性のアッセイ
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍後退の誘導及び／又は生存率の改善が含まれる。
【０２６１】
投与の組成、製剤、及び経路
さらなる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも一の追加的治療剤を、例えば後述するように含む。
【０２６２】
さらには、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に適した形態の、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得ること、及び（ｂ）少なくとも一の薬学的に許容される担体を用いてＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を製剤化することであって、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製物が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与のために製剤化される、製剤化することを含む。
【０２６３】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解又は分散された一又は複数のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という表現は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、即ち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990（参照により本明細書に包含される）によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には既知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与のために、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する官庁によって必要とされる無菌状態、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たさねばならない。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」には、当技術者に既知のように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、分解剤、潤滑剤、甘味料、香料、染料、それらの類似物質及び組合せが含まれる（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照（参照により本明細書に包含される）。いずれの一般的な担体も、活性成分と不適合でない限り、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が考慮される。
【０２６４】
組成物は、それが固体、液体、又はエアロゾルの形態で投与されるかどうかに応じて、及びそれが注射のような投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含むことができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（及び任意の追加的治療剤）は、当業者に既知であるように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所内、局部内に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続的注入、標的細胞を直接浸す局所的かん流により、カテーテル経由で、洗浄により、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、又は他の方法、又は上記のいずれかの組合せで投与することができる。（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990参照（参照により本明細書に包含される）。非経口投与、特に静脈内注入が、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のようなポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使用される。
【０２６５】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に考案されたものが含まれる。注射の場合、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーといった生理的に適合性のバッファー中において製剤化されうる。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。代替的には、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌ピロゲンを含まない水を用いた組成に適した粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。通常、分散液は、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その直前の滅菌濾過された液体媒質から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生む真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な担体には、限定されないが；リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２６６】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（18th Ed. Mack Printing Company, 1990）に開示されている。持続放出性調製物が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
【０２６７】
上記の組成物に加えて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、植込（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（例えば、皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー性又は疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２６８】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈材、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる一般的な方法で製剤化することができる。適当な製剤は、選択される投与経路によって決定する。
【０２６９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【０２７０】
治療的方法及び組成物
本明細書において提供されるいずれのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用することができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法薬剤として使用することができる。
【０２７１】
治療法において使用される場合、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、医学行動の規範に則って製剤化、投薬、及び投与される。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。
【０２７２】
一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、疾患の治療において使用される本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の実施態様では、治療法において使用される本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療に使用される、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、治療的有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、疾患を有する個体に投与することを含む、個体の治療法において使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患は、がんである。特定の実施態様では、方法はさらに、個体に対し、治療的有効量の少なくとも一の追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合抗がん剤を投与することを含む。さらなる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用される、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を投与することを含む、個体の標的細胞、特に細胞の溶解を誘導する方法に使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０２７３】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、それを必要とする個体の疾患の治療を目的とするものである。さらなる実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に対し、治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用を目的としている。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患は、がんである。一実施態様では、方法はさらに、個体に対し、治療的有効量の少なくとも一の追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合抗がん剤を投与することを含む。さらなる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。またさらなる実施態様では、医薬は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために有効量の医薬を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用を目的とする。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
【０２７４】
さらなる態様において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、そのような疾患を有する個体に対し、治療的有効量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患は、がんである。特定の実施態様では、方法はさらに、個体に対し、治療的有効量の少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合抗がん剤を投与することを含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
【０２７５】
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様では、方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞を、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む。さらなる態様において、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法が提供される。このような一実施態様では、方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、個体に対し、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
【０２７６】
特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的な例には、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、膀胱がん、子宮頸がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭頸部がん、中皮腫、及び卵巣がんからなる群より選択される。一実施態様において、がんは卵巣がんである。一実施態様では、がんは中皮腫である。当業者は、多くの場合Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらさず、部分的恩恵を提供するだけであることを認識する。いくつかの実施態様では、いくつかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化をもたらすＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする被検体、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【０２７７】
いくつかの実施態様では、有効量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。
【０２７８】
疾患の予防又は治療のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の適切な投与量は（単独で使用されるか、或いは一又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるときの）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が予防又は治療いずれの目的で投与されるか、直前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴及びＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定されるであろう。投与の責任を負う施術者は、いずれにしろ、組成物中の活性成分の濃度及び個別の対象に適切な用量を決定する。限定されないが、様々な時点にわたる、単一回又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考慮される。
【０２７９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数回の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となりうる。一つの典型的な一日あたり用量は、上記要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一つの例示的用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。他の非限定的実施例では、用量は、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約２００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１ミリグラム、、体重１ｋｇあたり約５ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約２００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ以上及びそこで導かれるあらゆる範囲を含む。本明細書に列挙される数字から導かれる範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム〜体重１ｋｇあたり約５００ミリグラムなどが投与されうる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらのいずれかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２〜約２０投与量、又は例えば約６投与量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、一又は複数の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量レジメンも有用でありうる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
【０２８０】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、通常、意図された目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２８１】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、まずは細胞培養アッセイのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに基づいて推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。
【０２８２】
初期投与量は、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０２８３】
投与の量及び間隔は、治療効果を維持するために十分なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０２８４】
局所投与又は選択的取り込みの場合、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０２８５】
本明細書に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的に有効な用量は、通常、実質的な毒性なしで治療的恩恵を提供する。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物の研究は、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために使用することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表現することができる。大きな治療指数を呈するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く有さないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択されうる（例えば、Ｆingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1参照。この文献は参照により本明細書に包含される）。
【０２８６】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療レベルを上げるように調整することも分かっているであろう。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。さらに、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答により変動するであろう。
【０２８７】
その他の薬剤及び治療
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与されうる。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一の追加的治療剤と共投与される。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療される特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
【０２８８】
このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上述した他の要因によって決まる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された投与量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量で任意の経路により使用される。
【０２８９】
上記のこうした併用療法は、併用投与（二以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こりうる分離投与を包含する。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０２９０】
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性な薬剤は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物を中に含む第一の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物を中に含む第２の容器を含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及びユーザーの立場から望まれる他の材料をさらに含んでもよい。
【実施例】
【０２９１】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることが理解される。
【０２９２】
一般的方法
組み換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A. et al., （1991） Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thed., NIH Publication No. 91-3242。
【０２９３】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２９４】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２９５】
実施例１
抗メソテリン（ＭＳＬＮ）／抗ＣＤ３Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子の調製
この実施例では以下の分子を調製した；その模式図を図２に示す：
Ａ．荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾）を有する「２＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（図２Ａ、配列番号２２〜２５）。
Ｂ．荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾、代替的メソテリンバインダー）を有する「２＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（図２Ｂ、配列番号２４、３８〜４０）。
Ｃ．荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾）を有さない「２＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（図２Ｃ、配列番号２４、４１〜４３）。
Ｄ．荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾、代替的メソテリンバインダー）を有さない「２＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（図２Ｄ、配列番号２４、４４〜４６）。
Ｅ．荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾）を有する「１＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」（図２Ｅ、配列番号２３〜２５、４７）。
Ｆ．荷電修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾）を有する「１＋１のＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」（図２Ｅ、配列番号２２、２４、２５、４８）。
【０２９６】
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。タンパク質発現はＭＰＳＶ又はＣＭＶプロモーターによりドライブされ、合成ポリＡシグナル配列がＣＤＳの３’末端に存在する。加えて、各ベクターはＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含有する。
【０２９７】
分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、懸濁液中において増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターとコトランスフェクトすることにより生成された。細胞は、１：２：１：１の比の対応する発現ベクター（分子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」）又は１：１：１：１の比の対応する発現ベクター（分子Ｅ：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」；分子Ｆ：「ベクター重鎖（ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」）を用いてトランスフェクトされる。
【０２９８】
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミン及び２５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含むＥｘｃｅｌｌ培地において、懸濁液無血清で培養した。６００ｍｌのチューブスピンフラスコ（最大作業体積４００ｍＬ）内での生成のために、６億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に４００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。１０８０μｌのＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのチューブスピンフラスコに移し、５％  ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭのＬ−グルタミン、５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ及び１．２５ｍＭのＶＰＡを含む３６０ｍｌのＥｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１２％のＦｅｅｄ  ７及び３ｇ／ｌのグルコースを加えた。７日後、培養物の上清を収集して４５分間２５００×ｇで遠心分離（Ｓｉｇｍａ  ８Ｋ遠心分離）することによって精製し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えた。溶液を４℃に保った。
【０２９９】
培地中の分子の濃度をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＨＰＬＣにより決定した。分離の基礎は、ｐＨ８．０のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａに対するＦｃ含有分子の結合及びｐＨ２．５からのステップ溶出であった。二の移動相が存在した。これらはＴｒｉｓ（１０ｍＭ）−グリシン（５０ｍＭ）−ＮａＣｌ（１００ｍＭ）バッファーであり、異なるｐＨ（８及び２．５）に調整したこと以外は同一であった。カラム本体は、ＰＯＲＯＳ  ２０Ａを充填した〜６３μｌの内部体積を有するＵｐｃｈｕｒｃｈ  ２×２０ｍｍのプレカラムであった。１００μｌの各試料を、平衡化した材料に０．５ｍｌ／分の流速で注入した。０．６７分後、試料を、ｐＨ２．５までのｐＨステップで溶出した。定量化は、２８０ｎｍの吸光度の決定及び１６から１６６ｍｇ／ｌのヒトＩｇＧ１の濃度範囲での標準曲線を用いる計算により行う。
【０３００】
分泌タンパク質を、細胞培養物の上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程を実施した。
アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２５ｍｌの２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）により平衡化したＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。未結合のタンパク質を、少なくとも１０カラム容積の２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去し、標的タンパク質を、６カラム容積の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１００ｍＭ  グリシン（ｐＨ３．０）において溶出した。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭ  ヒスチジン、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ＸＫ１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【０３０１】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィー後のインプロセス分析のために、単一の画分中の分子の純度及び分子量を、還元剤の非存在下において、クーマシー（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅＴＭ，Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って使用した。
【０３０２】
精製されタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
【０３０３】
最終的な精製工程後の分子の純度及び分子量を、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元の指示に従って使用した。
【０３０４】
分子の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７）の２５℃のランニングバッファー中において、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０３０５】
分子の質量分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ−ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）において実施した。クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６２２４  ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩデバイスに連結された。約５μｇの試料をＮＵＣＬＥＯＧＥＬ  ＲＰ１０００−８、２５０ｍｍ×４．６ｍｍカラム（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．  ＫＧ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、１ｍｌ／分の流速で４０℃で注入した。移動相は以下の通り、即ち、Ａ：５％のアセトニトリル、０．０５％のギ酸及びＢ：９５％のアセトニトリル、０．０５％のギ酸、であった。溶出勾配を適用するために、１０分以内に１５％Ｂを６０％Ｂに、次いで２．５分で１００％Ｂに上昇させた。質量分析計は、高解像度モード４  ＧＨｚポジティブで測定され、５００から３２００ｍ／ｚの範囲で記録された。ｍ／ｚスペクトルは、Ｒｏｃｈｅ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｌｔｄ）社のＭａｓｓＡｎａｌｙｚｅｒ  ２．４．１を用いて手動でデコンボリューションした。
【０３０６】
すべての分子は、同じ方法に従って生成及び精製された。最終的な純度は、フォーマットによって異なっていた。最良の品質は、分子Ａについて得られた。メソテリンバインダーから荷電修飾を除去すること、又は荷電修飾をＣＤ３バインダーにおけるＣＨ１／ＣＬ交換と組み合わせることは、共に低品質の分子をもたらした。
【０３０７】
ＬＣ−ＭＳ分析により、分子Ａの誤対合がないことが判明したが、対照的に分子Ｃは誤対合した軽鎖を有する分子を約３０％含んでいた。ＬＣ−ＭＳ分析により、分子Ｅ及び分子Ｆが共に約９０％純粋であることが示された。
【０３０８】
共に荷電修飾を欠く分子Ｃ及び分子Ｄは、一回目実行後の品質が満足のゆくものではなかったため、二つの追加的サイズ排除実行により精製された。
分子Ａの最終的品質は極めて良好であり、ＣＥ−ＳＤＳ上９８％を上回るモノマー含有量と９８％を上回る純度を有していた（表１及び２、図３）。二回の追加的サイズ排除の実行後、分子Ｃの最終的品質も良好であった（９６．２％のモノマー（表１）及び９３．５％の純度（表２））が、収率は損害を受けて低下していた。
【０３０９】
荷電修飾を有さない対応する分子と比較した場合の荷電修飾を有する分子の別の利点は、アフィニティー精製後のｇ補凝集物の含有量である。荷電修飾を有さない分子は約３０％の平均含有量を有し、それに対し荷電修飾を有する分子は約１０％の凝集物しか有していなかった（表３）。
【０３１０】
表１．荷電修飾を有する及び有さない抗メソテリン／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子の生成及び精製のまとめ
2018536389.tif 000003
【０３１１】
表２．荷電修飾を有する及び有さない抗メソテリン／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子のＣＥ−ＳＤＳ分析（非還元）
2018536389.tif 000004
【０３１２】
表３．アフィニティークロマトグラフィー後の凝集物含有量
2018536389.tif 000005
【０３１３】
実施例２
メソテリン及びＣＤ３発現細胞に対するメソテリン（ＭＳＬＮ）ＴＣＢ分子の結合
実施例１において調製されたＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａの結合を、メソテリン陽性腫瘍細胞（ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ細胞、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃９５１１１７３４）及びＣＤ３発現不死化Ｔリンパ球細胞（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ；Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃ＣＳ１７６５０１）において試験した。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、１ｍｌ当たり２百万個の細胞でＦＡＣＳバッファー（０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ）に再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（２０万個の細胞を含む）を、丸底９６ウェルプレートにおいて３０分間４℃で、ＭＳＬＮ  ＴＣＢの濃度を漸増させながら（示されるように、Ｈ３２２細胞に対する結合について４ｐＭ〜６０ｎＭ、又はＪｕｒｋａｔ細胞に対する結合について４ｐＭ〜３００ｎＭ）インキュベートし、細胞を冷たいＰＢＳ  ０．１％  ＢＳＡで二度洗浄し、さらに３０分間４℃でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  ＃１０９−６０６−００８）と共に再インキュベートし、冷たいＰＢＳ  ０．１％  ＢＳＡで二度洗浄した。染色を、１ウェル当たりＦＡＣＳバッファー中１５０μｌの２％  ＰＦＡを用いて、２０分間暗所において４℃で固定した。蛍光性を、ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を用いるＦＡＣＳにより分析した。結合曲線はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して得られた。
【０３１４】
結果は、ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａが、細胞上のヒトメソテリン及びヒトＣＤ３εの両方に、濃度依存性に結合できることを示すものである（図５Ａ、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ細胞に対する結合；図５Ｂ、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する結合）。ＣＤ３標的化部分の一価の結合は、コントロール分子、非標的化ＴＣＢ分子（ＣＤ３に結合するが標的細胞抗原には結合しない、配列番号２６、２７）の一つと同等であるが、飽和状態にはない。
【０３１５】
実施例３
ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子によって誘導される腫瘍細胞の溶解
ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａによって媒介されるＴ細胞の死滅を、メソテリン発現ＮＣＩ−Ｈ５９６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１７８）、ＡｓＰＣ−１（ＥＣＡＣＣ  ９６０２０９３０）及びＢｘＰＣ−３（ＥＣＡＣＣ  ９３１２０８１６）上において、メソテリン陰性ＮＣＩ−Ｈ３５８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−５８０７）ヒト腫瘍細胞との対比において評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体と共になされたインキュベーションの２４時間及び４８時間経過時に死滅を検出した。簡潔には、実験の一日前に、付着した標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５０００細胞／ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、バフィーコート（「Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ  Ｚｕｒｉｃｈ」）から取得したヘパリン化血の濃縮リンパ球調製物のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。血液を滅菌ＰＢＳで１：４に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含有する界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを、滅菌ＰＢＳを用いて二度洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ、１０分間）。その結果得られたＰＢＭＣ集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、加湿したインキュベーター内において、３７℃、２％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、アッセイ開始まで保管した。腫瘍細胞溶解アッセイのために、抗体を、示された濃度（２ｐＭ〜１００ｎＭの範囲で３通り）で加えた。非標的化ＴＣＢ分子をネガティブコントロールとして含めた。ＰＢＭＣを標的細胞に、最終的なＥ：Ｔ比が１０：１となるように加えた。標的細胞の死滅を、３７℃、５％  ＣＯ２での２４時間及び４８時間のインキュベーションの後に、アポトーシス／壊死細胞による細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１  ６４４  ７９３  ００１）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて計算した（表４参照）。
【０３１６】
結果は、ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａが、異なるメソテリン陽性標的細胞株の強力且つ標的特異的な死滅を誘導できることを示すものである（図６）。腫瘍細胞溶解の兆候は、２４時間後に既に観察可能であった（図６、Ａ−Ｄ）が、死滅した腫瘍細胞のパーセンテージは次の２４時間内で有意に上昇した（図６、Ｅ−Ｈ）。メソテリン陰性ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞の存在下では、４８時間後まで腫瘍細胞の溶解は観察されなかった。
【０３１７】
表４．ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａによって誘導されたＴ細胞媒介性メソテリン発現腫瘍細胞の死滅のＥＣ５０値（ｐＭ）
2018536389.tif 000006
＊  表は、製造者の指示に従い、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｙ５  ＭＥＳＦビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて決定された、異なる細胞株上のメソテリン結合部位を示す。腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍによって決定された。
【０３１８】
実施例４
標的細胞とエフェクター細胞に対するＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の同時結合時のＴ細胞上の活性化マーカーの上方制御
メソテリン発現標的細胞とヒトＣＤ３発現エフェクター細胞に対するＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａの同時結合時のＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９（早期活性化マーカー）及びＣＤ２５（後期活性化マーカー）を認識する抗体を用いてＦＡＣＳ分析により評価した。コントロールとして、Ｔ細胞活性化マーカーを、標的細胞の不在化においても評価した。抗体及び死滅アッセイ条件は、基本的に上記（実施例３）と同じであった。インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）で２度洗浄した。ＣＤ８（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃  ３４４７０４）、ＣＤ４（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃  ３４４６１２）、ＣＤ６９（ＰＥ抗ヒトＣＤ６９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３１０９０６）及びＣＤ２５（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３０２６１０）の表面染色を、供給者の指示に従って実行した。細胞を、０．１％  ＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて二度洗浄し、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファー（２％のＰＦＡを含む）を用いて４℃で３０分間固定した。遠心分離後、試料を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて分析した。
【０３１９】
結果は、ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子Ａが、メソテリン陽性標的細胞の存在下において、ＣＤ８＋上（それぞれ図７Ａ−Ｅ及びＦ−Ｊ，）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞上（それぞれ図７Ｋ−Ｏ及びＰ−Ｔ）において活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の強力且つ標的特異的な上方制御を誘導したが、メソテリン陰性腫瘍細胞の存在下又は標的細胞の非存在下では誘導しなかったことを示すものである。
【０３２０】
実施例５
メソテリン発現細胞及びＣＤ３発現細胞に対するＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の結合
異なるＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の結合を、ＣＤ３発現不死化Ｔリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ、ＤＳＭＺ  ＃ＡＣＣ  ２８２）及びＭＳＬＮ発現ＡｓＰＣ−１細胞（ＥＣＡＣＣ  ＃９６０２０９３０）を用いて試験した。
【０３２１】
簡潔には、Ｊｕｒｋａｔ懸濁細胞を、回収し、カウントし、生存率についてチェックした。付着したＡｓＰＣ−１細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ、＃１３１５１０１４）を用いて回収し、カウントし、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ  ＰＢＳ  ０．１％  ＢＳＡ）中０．９×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液（０．０９×１０６個の細胞を含む）を、丸底９６ウェルプレートにおいて３０分間４℃で、ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の濃度を漸増させながら（３．８ｐＭ〜３００ｎＭ）インキュベートし、次いで０．１％のＢＳＡを含む冷たいＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）で二度洗浄した。細胞を、さらに３０分間４℃で、１：１００に事前希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７  −  Ｆ（ａｂ’）２  断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ、ＦＩＴＣ  ＃１０９−０９６−００８）と共に再インキュベートし、その後冷たいＰＢＳ  ０．１％  ＢＳＡで二度洗浄した。
【０３２２】
染色した細胞を、１００μｌの２％パラホルムアルデヒド含有ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、３０分間室温でインキュベートし、染色を固定した。最後に、細胞を４分間３５０×ｇ及び４℃で遠心分離し、上清を棄て、細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。染色を、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を用いるＦＡＣＳにより分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて、結合曲線及びＥＣ５０値を取得した（図８Ａ：Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する結合、図８Ｂ：ＡｓＰＣ−１細胞に対する結合）。
【０３２３】
図８Ａに示すように、ＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子のいずれもが、ＣＤ３発現細胞に対する結合の飽和に到達していない。このことは、結合の親和性が低いことと、結合が一価性であることに起因している。結合シグナルの全体的な強度には、各分子フォーマット中のＣＤ３バインダーのアクセシビリティによってわずかな相違が存在する。ここで、分子Ｆは、最も高い全体の結合シグナルを示している。同様に、分子フォーマット並びにＭＳＬＮの結合価は、表５に示すように、メソテリン発現細胞に対する全体の結合シグナルと、結合のＥＣ５０とに影響している。分子ＣとＤ（異なるメソテリンバインダーを有する）の比較は、分子Ｃの結合の方が有意に良好であることを示す。
【０３２４】
表５．  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６によって決定されたＡｓＰＣ−１細胞上のヒトＭＳＬＮに対するＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の結合のＥＣ５０値（ｐＭ）
2018536389.tif 000007
【０３２５】
別の実験において（図１５）、ヒト又はカニクイザルのＣＤ３陽性ＰＢＭＣと、ヒト又はカニクイザルＭＳＬＮ陽性一過性ＣＨＯ  トランスフェクタントとに対する分子Ａの結合を、ＦＡＣＳによって評価した。
【０３２６】
ヒトＰＢＭＣの単離を、実施例６に記載のようにして実施した。カニクイザルＰＢＭＣの単離は以下のように実施された：末梢血単核（ＰＢＭＣ）を、健常なカニクイザルドナーから得られたヘパリン化血のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。血液を滅菌ＰＢＳで１＋１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）上に重ねた。遠心分離（５２０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分、４℃）、上清を棄てた。
【０３２７】
細胞ペレットをＡＣＫ溶解バッファー中において５分間室温でインキュベートし（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、赤血球を溶解させた。その後、カニクイザルＰＢＭＣを滅菌ＰＢＳで二度洗浄した（遠心分離工程、３５０×ｇ、１０分間）。その結果得られたＰＢＭＣ集団を、上述のように自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、ＰＢＳ、０．１％  ＢＳＡ（ＦＡＣＳバッファー）に再懸濁した。
【０３２８】
アッセイの設定は基本的に上述と同じであった。抗体範囲は３．８ｐＭ〜３００ｎＭであった。図１５に示すように、ヒトＣＤ３（図１５Ａ）又はカニクイザルＣＤ３（図１５Ｂ）に対する分子Ａの結合は、極めて類似している。いずれの場合も、ＣＤ３バインダーの低い親和性と、このフォーマットでのＣＤ３結合の一価性により、飽和には達しなかった。
【０３２９】
さらに、ヒト又はカニクイザルＭＳＬＮを発現するように一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を使用したとき、ヒト（図１５Ｃ）及びカニクイザルＭＳＬＮ（図１５Ｄ）に対する結合も、同様の範囲内である（ＥＣ５０は、ヒトＭＳＬＮについては７．７６ｎＭ、カニクイザルＭＳＬＮについては５．５ｎＭである）。
【０３３０】
実施例６
異なるＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子によって誘発されるＴ細胞媒介性腫瘍溶解
異なるＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子によって媒介されたＴ細胞死滅を、ＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ５９６（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ−１７８、〜１５００００のＭＳＬＮ結合部位）、ＡｓＰＣ−１（ＥＣＡＣＣ  ＃９６０２０９３０、〜４４０００のＭＳＬＮ結合部位）及びＢｘＰＣ３細胞（ＥＣＡＣＣ  ＃９３１２０８１６、〜１７００のＭＳＬＮ結合部位）において評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＴＣＢ分子と共になされた２４時間及び４８時間のインキュベーション後に死滅を検出した。付着した標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５０００細胞／ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得られたヘパリン化血の濃縮リンパ球調製物のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）上に重ねた。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含有する界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳを用いて二度洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ、１０分間）。その結果得られたＰＢＭＣ集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において、３７℃、５％  ＣＯ２で２％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、アッセイ開始まで保管した。
【０３３１】
腫瘍溶解アッセイのために、ＴＣＢ分子を、示された濃度（０．４ｐＭ〜２０ｎＭの範囲で３通り）で加えた。ＰＢＭＣを標的細胞に、最終的なＥ：Ｔ比が１０：１となるように加えた。標的細胞の死滅を、３７℃、５％  ＣＯ２での２４時間及び４８時間のインキュベーションの後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１  ６４４  ７９３  ００１）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。
【０３３２】
２４時間後（図９、Ａ−Ｃ）及び４８時間後（図９、Ｄ−Ｆ）の結果は、分子Ａが、異なるＭＳＬＮバインダーを含む分子Ｂと比較して、腫瘍溶解の誘導能が高いことを示すものである。非標的化ＴＣＢ分子は、ネガティブ標準分子の役割を担い、予想通り、腫瘍細胞の溶解を誘導することはできなかった。
【０３３３】
腫瘍細胞溶解の対応するＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて計算し、表６に示した。
【０３３４】
表６．示されるＭＳＬＮ  ＴＣＢ抗体によって誘導された、ＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＡｓＰＣ−１又はＢｘＰＣ３細胞のＴ細胞媒介性溶解のＥＣ５０値（ｐＭ）
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【０３３５】
別の実施態様において（図１２、Ｇ−Ｉ）、分子Ａ、分子Ｅ及び分子Ｆの力価を、上述と同じアッセイ設定と、ＭＳＬＮ陽性ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＡｓＰＣ−１及びＢｘＰＣ３腫瘍細胞を用いて比較した。ここで、抗体濃度の範囲は０．０７ｐＭ〜２０ｎＭであった。
図１２のＧ−Ｉは、分子Ａが４８時間後に誘導する異なるＭＳＬＮ陽性腫瘍細胞の溶解が、分子Ｅ、特に分子Ｆと比較して良好であることを示している。腫瘍細胞溶解の対応するＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて計算し、表７に示した。
【０３３６】
表７．示されるＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子によって４８時間後に誘発された、ＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＡｓＰＣ−１又はＢｘＰＣ３細胞のＴ細胞媒介性溶解のＥＣ５０値（ｐＭ）
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【０３３７】
別の実験において（図１４Ｃ）、標的細胞上のＭＳＬＮの発現に対する腫瘍細胞溶解の依存性を、分子Ａについて評価した。抗体濃度及びアッセイ条件は、上述のものと基本的に同じであった。図１４Ｃに示すように、分子Ａは、異なるＭＳＬＮ陽性標的細胞の腫瘍細胞溶解を誘発したが、ＭＳＬＮ陰性ＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍細胞の腫瘍細胞溶解は誘発しなかった。対応するＥＣ５０値を表８に示す。
【０３３８】
表８．分子Ａによって４８時間後に誘発された、ＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＡｓＰＣ−１又はＢｘＰＣ３細胞のＴ細胞媒介性溶解のＥＣ５０値（ｐＭ）
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【０３３９】
実施例７
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ活性化アッセイ
異なるＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の、細胞上でのＣＤ３及びヒトＭＳＬＮに対する同時結合時の、エフェクター細胞のＣＤ３媒介性活性化誘導能を、腫瘍抗原陽性標的細胞（ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＡｓＰＣ−１及びＢｘＰＣ−３）と、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞（ＮＦＡＴプロモーター、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃ＣＳ１７６５０１を有するＣＤ３発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株）の共培養物を用いて評価した。ＭＳＬＮ及びＣＤ３抗原に対するＴＣＢ分子の同時結合時、ＮＦＡＴプロモーターは活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現をもたらす。蛍光シグナルの強度（ルシフェラーゼ  基質の添加により得られる）は、ＣＤ３活性及びシグナル伝達の強度に比例する。
【０３４０】
アッセイのために、ヒト腫瘍細胞を回収し、生存率を、ＶｉＣｅｌｌを用いて決定した。２００００細胞／ウェルを、平底ホワイトウォール９６ウェルプレート（＃６５５０９８、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に蒔き、希釈した抗体又は培地（コントロールとして）を加えた（０．０７ｐＭ〜２０ｎＭの範囲）。
【０３４１】
その後、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを用いて生存率を評価した。細胞を、細胞培地に再懸濁し、２％のＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ１２９１）をＪｕｒｋａｔ細胞懸濁液に加えた。Ｊｕｒｋａｔ細胞懸濁液を腫瘍細胞に加えて、示されるように最終的なＥ：Ｔを２．５：１とし、１ウェル当たりの最終容積を２００μｌとした。
【０３４２】
細胞を、加湿したインキュベーター内において、２．５時間、４時間、１８．５時間及び２４時間にわたり、３７℃でインキュベートした。それぞれのインキュベーション時間の最後に、ＷＡＬＬＡＣ  Ｖｉｃｔｏｒ３  ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）を用いて、検出時間を１ウェル当たり１秒として発光を検出した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて決定された。
【０３４３】
図１１に示すように、評価されたすべてのＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子は、ＣＤ３を介したＴ細胞架橋とその後のＴ細胞活性化を誘導し、その際分子Ａが最も強力である。加えて、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞活性化のＥＣ５０は、通常、アッセイ中に存在する標的細胞上のＭＳＬＮ結合部位の数に逆相関する。
【０３４４】
実施例８
標的細胞とエフェクター細胞に対するＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の同時結合時のＴ細胞上の活性化マーカーの上方制御
ＮＳＬＮ発現標的細胞とヒトＣＤ３発現エフェクター細胞に対するＭＳＬＮ  ＴＣＢ分子の同時結合時のＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を用いてＦＡＣＳ分析により評価した。抗体範囲は０．４ｐＭ〜２０ｎＭであった。腫瘍溶解アッセイの条件は、上述（実施例６、図９）と基本的に同じであった。
【０３４５】
インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）で２度洗浄した。ＣＤ８（ＡＰＣ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３４４７１４）、ＣＤ４（ＰＥ抗ヒトＣＤ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３１７４１０）、ＣＤ６９（ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ６９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３１０９３０）の表面染色を、供給者の指示に従って３０分間暗所において４℃で実施した。細胞を、０．１％  ＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて２度洗浄し、２％のパラホルムアルデヒドを含むＦＡＣＳバッファー１５０μｌ／ウェルを用いて４℃で３０分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて分析した。
【０３４６】
７２時間後、Ｔ細胞活性化を、ＣＤ６９を発現するＣＤ４Ｔ細胞（図１０、Ａ−Ｃ）、又はＣＤ６９を発現するＣＤ８Ｔ細胞（図１０、Ｄ−Ｆ）のパーセントとして決定した。グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて得られた。
【０３４７】
図１０に示すように、分子Ａは、Ｔ細胞上のＣＤ３と、異なる標的細胞上のＭＳＬＮとに対する同時結合時に、異なるＭＳＬＮバインダーを含む分子Ｂと比較してより強いＴ細胞活性化を誘導する。対応するＥＣ５０値は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて計算されたものであり、表９に示される。
【０３４８】
表９．７２時間後に、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＡｓＰＣ−１又はＢｘＰＣ−３標的細胞の存在下におけるＣＤ６９の上方制御により決定された、一次ＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞のＭＳＬＮ  ＴＣＢ媒介性活性化のＥＣ５０値（ｐＭ）（ＦＡＣＳ）
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【０３４９】
別の実施態様において、４８時間後、Ｔ細胞活性化を、ＣＤ６９を発現するＣＤ４Ｔ細胞（図１２、Ａ−Ｃ）、及びＣＤ６９を発現するＣＤ８Ｔ細胞（図１２、Ｄ−Ｆ）のパーセントとして決定した。ここで、抗体濃度の範囲は０．０７ｐＭ〜２０ｎＭであった。図１２Ｄ−Ｆに示すように、分子Ａは、Ｔ細胞上のＣＤ３と標的細胞上のＭＳＬＮとに対する同時結合時に、分子Ｅ及びＦと比較してより強いＴ細胞活性化を誘導する。これは、ＮＣＩ−Ｈ５９６の存在下において、表１０に示されるように全体の蛍光シグナルがより高いことと、ＥＣ５０値がより低いこととに反映されている。
【０３５０】
表１０．ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＡｓＰＣ−１又はＢｘＰＣ−３標的細胞の存在下におけるＣＤ６９の上方制御により決定された、一次ＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞のＭＳＬＮ  ＴＣＢ媒介性活性化のＥＣ５０値（ｐＭ）（ＦＡＣＳ）
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【０３５１】
別の実験において（図１４Ａ及びＢ）、ＭＳＬＮ陽性又はＭＳＬＮ陰性標的細胞の存在下における分子Ａの同時結合時のＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を評価した。抗体及び腫瘍溶解アッセイの条件は、上述（実施例６、図５Ｇ−Ｉ）と基本的に同じであった。抗体範囲は０．０７ｐＭ〜２０ｎＭであった。図１４に示すように、分子Ａは、ＭＳＬＮ陽性ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＡｓＰＣ−１又はＢｘＰＣ−３の存在下においてＣＤ４（Ａ）及びＣＤ８（Ｂ）上のＣＤ６９の上方制御を誘発したが、ＭＳＬＮ陰性ＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍細胞の存在下においては誘発しなかった。
【０３５２】
表１１．ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＡｓＰＣ−１又はＢｘＰＣ−３標的細胞の存在下におけるＣＤ６９の上方制御により決定された、一次ＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞のＭＳＬＮ  ＴＣＢ媒介性活性化のＥＣ５０値（ｐＭ）（ＦＡＣＳ）
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【０３５３】
実施例９
ＭＳＬＮ  ＴＣＢ抗体によって誘導されたＭＳＬＮ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性の溶解後の、ヒトエフェクター細胞によるサイトカイン分泌
分子Ａによって誘導されたＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ５９６腫瘍細胞のＴ細胞媒介性溶解後の、ヒトＰＢＭＣによるサイトカイン分泌を、腫瘍細胞溶解アッセイ後の細胞上清のＦＡＣＳ分析により評価した。
【０３５４】
抗体及びアッセイ条件は、基本的に上述（実施例６、図１２）と同じであり、１０：１のＥ：Ｔ比と４８時間のインキュベーション時間が用いられた。抗体範囲は２ｐＭ〜１００ｎＭであった。
【０３５５】
インキュベーション時間の最後に、プレートを３５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を新しい９６ウェルプレートに移し、−２０℃でその後の分析まで保管した。細胞上清中に分泌されたグランザイムＢ、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０を、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩにおいて製造元の指示に従い、ＢＤ  ＣＢＡヒト可溶型タンパク質Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔを用いて検出した。以下のキットが使用された：ＢＤ  ＣＢＡヒトグランザイムＢ；ＢＤ  ＣＢＡヒトグランザイムＢ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ  ＃ＢＤ  ５６０３０４；ＢＤ  ＣＢＡヒトＴＮＦ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ  ＃ＢＤ  ５５８２７３；ＢＤ  ＣＢＡヒトＩＦＮ−γ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ  ＃ＢＤ  ５５８２６９；ＢＤ  ＣＢＡヒトＩＬ−６  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ  ＃ＢＤ  ５５８２７６；ＢＤ  ＣＢＡヒトＩＬ−１０  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ  ＃ＢＤ  ５５８２７４。サイトカイン放出のグラフ及びＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて得られた。
【０３５６】
図１３に示すように、分子Ａは濃度依存性に、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＴＮＦ、グランザイムＢ及びＩＬ−１０の分泌を誘導した。
【０３５７】
表１２．ＦＡＣＳによって決定された、一次Ｔ細胞のＭＳＬＮ  ＴＣＢ媒介性活性化とその後のサイトカイン及びグランザイム放出のＥＣ５０値（ｐＭ）
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【０３５８】
前述の発明は理解を明確にするために説明及び例示によってある程度詳細に記載されているが、これら記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
【図１Ａ−Ｆ】
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【図１Ｇ−Ｎ】
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【図１Ｏ−Ｖ】
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【図１Ｗ−Ｚ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｆ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｆ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｆ】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｄ】
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【図６Ｅ−Ｈ】
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【図７Ａ−Ｅ】
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【図７Ｆ−Ｊ】
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【図７Ｋ−Ｏ】
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【図７Ｐ−Ｔ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｆ】
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【図１２Ｇ−Ｉ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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