(57)【要約】本開示は、ポルフィリン（そこにキレート化されているコバルトを有する）を含むナノ構造体（例えば、単層又は二重層のナノ構造体）であって、ポルフィリンの大員環内の前記コバルト金属が単層又は二重層内に存在しているナノ構造体を提供する。前記ナノ構造体は、ヒスチジンタグが付着した提示分子を有することができ、このＨｉｓタグの少なくとも１部は、前記単層又は二重層内にあり、コバルト金属コアに配位しており、前記提示分子はナノ構造体の外側に露出している。前記ナノ構造体は、さらにカーゴを含むことができる。個体に前記カーゴを送達するために前記ナノ構造体を使用することができる。【選択図】図１
2018513156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームであって、
ａ）以下のｉ）及びii)を有する二重層；
ｉ）リン脂質、
ii）コバルトに配位して、コバルトポルフィリンを形成しているポルフィリン
及び
ｂ）ポリヒスチジン-タグ化提示分子、ここで、当該ポリヒスチジン-タグの少なくとも一部は、単層又は二重層の疎水性部分に存在し、ポリヒスチジン-タグの一以上のヒスチジンは、前記コバルトポルフィリンのコバルトに配位している；
を含み、
前記ポリヒスチジン-タグ化提示分子の少なくとも一部が、リポソームの外側に露出しており、且つ、当該リポソームが水性区画を取り囲んでいる、リポソーム。
【請求項２】
前記コバルトポルフィリンがリン脂質にコンジュゲートして、コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートを形成している、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートが、単層又は二重層の１〜２５モル％を構成する、請求項２に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートが、単層又は二重層の５〜１０モル％を構成する、請求項３に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記二重層が、コレステロールをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記二重層が、ホスファチジルセリン、及び、任意でコレステロールをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記ポリヒスチジン-タグが、６〜１０のヒスチジン残基を含む、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記リポソームの大きさが５０ｎｍ〜２００ｎｍである、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記リポソームがカーゴを含み、カーゴの少なくとも一部が水性区画内に存在する、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１０】
前記提示分子が、４〜５０のアミノ酸からなるペプチドである（前記アミノ酸の数には、Ｈｉｓタグのヒスチジンは含まれない）、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記提示分子が、４〜５００ｋＤａのタンパク質である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１２】
前記提示分子が抗原分子であり、及び、前記二重層がそこに取り込まれているアジュバントをさらに含む、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記アジュバントが、弱毒化リピドＡ誘導体である、請求項１２に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記弱毒化リピドＡ誘導体が、モノホスホリルリピドＡ又は３-脱アシル化モノホスホリルリピドＡである、請求項１３に記載のリポソーム。
【請求項１５】
ナノ構造体であって、
ａ）コア；及び
ｂ）以下のｉ）及びii）を有する、前記コア上の単層又は二重層；
ｉ）リン脂質モノマー、
ii）コバルトに配位して、コバルトポルフィリンを形成しているポルフィリン
及び
ｃ）ポリヒスチジン-タグ化提示分子、ここで、当該ポリヒスチジン-タグの少なくとも一部は、単層又は二重層の疎水性部分に存在し、ポリヒスチジン-タグの一以上のヒスチジンは、前記コバルトポルフィリンのコバルトに配位しており、ポリヒスチジン-タグ化提示分子の少なくとも一部は、ナノ構造体の外側に露出している；
を含むナノ構造体。
【請求項１６】
前記コアが金ナノ粒子である、請求項１５に記載のナノ構造体。
【請求項１７】
カーゴの標的化送達方法であって、
ａ）医薬キャリア中に請求項９に記載のリポソームを含む組成物を、個体に投与すること；
ｂ）前記リポソームを前記個体の所望の位置に到達させるために適切な時間の経過後、前記リポソームを、波長６５０〜１０００ｎｍの近赤外線にさらして、リポソームからカーゴを放出させること
を含む、方法。
【請求項１８】
前記個体が、ヒト又は非ヒト動物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
宿主個体において免疫応答を生じさせる方法であって、医薬キャリア中に請求項１に記載のリポソームを含む組成物を個体に投与することを含み、前記提示分子が免疫原性エピトープを含むものである、方法。
【請求項２０】
前記提示分子が、病原微生物由来のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記個体が、ヒト又は非ヒト動物である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、2015年4月16日に提出された米国特許仮出願62/148,292号に基づく優先権を主張し、その開示は参照により本明細書に包含される。
【０００２】
この発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号DP5OD017898及びR21AI122964の下で政府支援を受けて完成された。政府は本発明に所定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本開示は、一般的には機能性ナノ構造体の分野に関する。より具体的には、本開示は、コバルトポルフィリンを含むナノ構造体に関する。
【背景技術】
【０００４】
機能性ナノ粒子の分野において、課題の一つは、ペプチド及びタンパク質をより大きなスキャフォールドに容易に且つ確実に付着させることである。標的ナノ粒子は、有効なリガンドを必要とし、非コンジュゲート型ペプチドそれ自体は、弱免疫原性である。生体共役反応の化学は、広範な戦略を提供してきたが、ほとんどのナノ粒子コンジュゲーションは、以下の一以上に関連する制限に悩まされている：１）低コンジュゲーション率及び必須の精製工程；２）無処置のナノ粒子の標識を不可能にする、生理的緩衝液との不適合性、；３）有効性の異なる不均質な粒子集団を生成する、変化しやすい標識サイト及びコンジュゲートポリペプチド構造；４）複雑で外因的な化学アプローチの必要性。
【０００５】
水性ナノ粒子へリガンドを付着するための標準的なアプローチは、マレイミド、サクシニミジルエステル、及びカルボジイミド-活性化カルボン酸を使用する。これらは、共有結合的にポリペプチドのアミン基及びチオール基と反応し得る。抗体-コンジュゲート型免疫リポソームのために、マレイミド-脂質の使用が広く探究されてきた。コンジュゲーション率は、一晩の反応で９０％に達する可能性があるが、その後に遊離マレイミド基のクエンチング及びさらなる精製が必要となる。タンパク質は、コンジュゲーション前にチオール化び精製の準備工程を要求し得る。抗体の配向は、コンジュゲート型抗体標的結合の有効性に影響を与える主要な因子であるが、これらのアプローチは、多数の抗体標識サイト及び無差別配向をもたらす。近年、クリック反応などの双直行合成戦略が、あらかじめ形成されたリポソームに応用されているが、これらは外来性の触媒及び非在来型のアミノ酸の使用を必要とする。
【０００６】
有機溶媒中で永続的変性を起こしにくいより小さなペプチドに適切な別のアプローチは、脂質アンカーにペプチドをコンジュゲートすることである。得られたリポペプチドは、その後、リポソーム形成プロセス中に他の脂質とともに取り込まれることができる。このアプローチは、非免疫原性ペプチドに対して抗体産生を誘起する合成ワクチンを産生するために使用されてきた。しかしながら、その両親媒性の性質に起因して、リポペプチドの精製が困難な場合、収率は５〜１０％であった。リポぺプチドがリポソ−ム形成プロセス中にリポソーム内に完全に取り込まれず、凝集をもたらすことも明らかになっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、機能性ナノ構造体を提供する。前記ナノ構造体は、カーゴ(積荷)の送達、標的化送達及び／又は提示分子の送達のために使用できる。前記ナノ構造体は、水性区画をその中に囲い込む単層又は二重層であってもよい。水性区画を囲い込む二重層構造は、本明細書においてリポソームと称される。前記ナノ構造体は、ナノ粒子状の単層又は二重層コーティングであってもよい。前記単層又は二重層は、コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲート、任意でポルフィリンにコンジュゲートしていないリン脂質、任意でステロール、及び任意でポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。ポリヒスチジン-タグを有する一以上の標的指向性ペプチド又はポリペプチド(本明細書において提示分子と称される)が、ポリヒスチジン-タグの一部が単層又は二重層に存在し、提示分子が単層又は二重層の外側に露出するようにして、単層又は二重層内に取り込まれる。コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの代わりに、又はコバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートに加えて、コバルトポルフィリンを使用することができる。
【０００８】
本開示のナノ構造体は、ポリヒスチジン-タグ化提示分子によって標的とされる部位へ送達するために、カーゴを積むことができる。例えば、リポソームは、ポリヒスチジン-タグ化提示分子を使用することによって所望の部位に送達するために、カーゴを積むことができる。
【０００９】
本明細書で提示されるデータは、コバルトポルフィリン-リン脂質(ＣｏＰｏＰ)のようなコバルトポルフィリンを含む二重層が、ポリヒスチジン-タグ化(本明細書において「Ｈｉｓタグ化」とも称される)ポリペプチドに安定に結合できることを実証する（図１ａ）。亜鉛、ニッケル及び銅などの他のメタロポルフィリンは、Ｈｉｓタグ化ポリペプチドに安定に結合できない。ポルフィリン自体は、二重層の疎水性部分を形成し、外部の水性環境にアクセス可能ではないため、このことは、膜相に埋め込まれた少なくともいくつかのポリヒスチジンを用いた、新しい結合パラダイムを表す（図１ｂ）。これは、より安定な結合をもたらし、ナノ粒子形成後に有意にシンプルな非共有結合性の後標識パラダイムを可能にし、リガンド配向に関する多義性を除去する。
【００１０】
我々は、他の金属ではなく、コバルトでキレート化したポルフィリン-リン脂質を含む脂質二重層が、Ｈｉｓタグ化タンパク質及びペプチドを効率的に捕獲できることを示す。結合がＣｏ(II)−Ｃｏ(III)遷移の後に続いて保護された疎水性二重層内で生じ、例えば、血清中で又は百万倍過剰の競合イミダゾール中で、本質的に不可逆性の付着をもたらす。このアプローチを使用して、我々は、あらかじめ形成された空のリポソーム及びカーゴを含むリポソームの二重層内にホーミングペプチドを挿入し、二重層の完全性を損なうことなく、部位ターゲティング(例えば、腫瘍を標的とする)を可能にした。ペプチド又は合成ペプチドは、非抗原性ペプチド用の抗体を産生するためのアジュバント(例えば、脂質モノホスホリルリピドＡ)を含むリポソームに結合できる。
【００１１】
本開示は、単層又は二重層構造を提供し、ここで当該単層又は二重層は、ポルフィリンとそれにキレート化したコバルトを含み、コバルト金属は単層又は二重層及びポルフィリン大環状分子内に存在し、さらに、そこに非共有結合的に付着したヒスチジンタグを有する分子を有し、このＨｉｓタグの少なくとも１部は単層又は二重層内にあり、コバルト金属コアに配位している。前記提示分子は、ターゲティング及び免疫応答の発生を含む様々な用途に使用可能である。この層で形成されたリポソーム又はミセルは、所望の位置で放出されるカーゴを有していてもよい。前記コバルトポルフィリンは、コバルトポルフィリン-リン脂質(ＣｏＰｏＰ)であってもよい。この層は、金属ナノ粒子、ナノチューブなどの他のナノ構造体のための、コーティングとして使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
［図１］ＰｏＰ-二重層へのＨｉｓタグの結合
（ａ）Ｈｉｓタグ(緑色)を有するペプチドが、水溶液中で、あらかじめ形成されたＣｏＰｏＰリポソームに結合することを示す図。（ｂ）ＣｏＰｏＰを含む二重層内への、Ｈｉｓタグ化ポリペプチドの挿入。二重層の一片のみが示されている。（ｃ）本研究で使用された金属-ＰｏＰの化学構造。
【００１３】
［図２］Ｃｏ(III)-ＰｏＰリポソームに結合するＨｉｓタグ化タンパク質
（ａ）ビーナス(Ｖ)に融合したセルリアン(Ｃ)を含むＨｉｓタグ(７)化蛍光タンパク質は、ＰｏＰ二重層への結合を証明する。Ｃが励起すると、ＦＲＥＴが発生しＶが蛍光を発する(左)が、ＰｏＰ-二重層に結合すると、ＦＲＥＴがフォトニック二重層と競合するため、これは抑制される（中央）。タンパク質が二重層に結合したときでさえ、Ｃ蛍光は直接的に探索できる(右)。（ｂ）表示の金属-ＰｏＰリポソームとインキュベーションした後の、融合タンパク質電気泳動移動度シフトのマルチスペクトル蛍光画像。（ｃ）Ｃ−Ｖ ＦＲＥＴの減少に基づく、表示の金属-ＰｏＰリポソームへの融合タンパク質の結合キネティクス。（ｄ）ＣｏＰｏＰのビニル基の下線付きプロトンのＮＭＲピーク幅は、重水素化クロロホルム(ＣＤＣｌ3)中でＣｏ(II)の常磁性の幅広化を実証するが、重水中ではＣｏＰｏＰ-リポソーム形成後のＣｏ(III)の非常磁性のピークを実証する。棒グラフの各セットは、左から右に、ＣｏＰｏＰ、及び２Ｈ-ＰｏＰの棒グラフである。（ｅ）２Ｍの硫酸ナトリウムを添加した後の、ＣｏＰｏＰリポソームへのＨｉｓタグ化ペプチド結合の逆転。リポソームは１０モル％のＣｏＰｏＰ又はＮｉ-ＮＴＡリン脂質とともに形成された。棒グラフの各セットは、左から右に、水、及び＋２Ｍ亜硫酸塩の棒グラフである。
【００１４】
［図３］ＣｏＰｏＰリポソームへのＨｉｓタグ化タンパク質の頑強な結合
（ａ）表示した脂質を含むリポソームとインキュベートされた蛍光性レポータータンパク質のマルチスペクトル電気泳動移動度シフトの画像。（ｂ）表示のリポソームに結合したレポータータンパク質の結合安定性(１：１血清)。（ｃ）表示のリポソームに結合したレポータータンパク質の結合安定性(過剰の遊離イミダゾール中)。平均値±標準偏差(ｎ＝３)
【００１５】
［図４］ＣｏＰｏＰリポソームへの短Ｈｉｓタグ化ＲＧＤペプチドの結合
（ａ）ＦＡＭで標識された短ペプチドの、金属-ＰｏＰリポソームへの結合。（ｂ）ＣｏＰｏＰリポソームへの結合半減期に対する、Ｈｉｓタグ長の影響。結合なし(Ｎ.Ｂ.)は、Ｈｉｓタグ化されていないペプチドで観察された。ＰＢＳ中（ｃ）又は５ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ中（ｄ）でインキュベートした際の、表示組成のＣｏＰｏＰリポソームへの結合半減期に対するリポソーム組成の影響。三回の測定に関する平均値±標準偏差。（ｃ）及び（ｄ）において、棒グラフの各セットは、左から右に、５０及び０の棒グラフである。
【００１６】
［図５］カーゴを含むリポソームの、ＲＧＤ-Ｈｉｓターゲティング
（ａ）ペプチド結合の間の、ＰＯＰリポソーム中に封入されたスルホローダミンＢの放出。棒グラフの各セットは、左から右に、８時間及び２４時間の棒グラフである。（ｂ）スルホローダミンＢを含むリポソームの標的化取り込み。細胞を表示のコンディションでインキュベートし、スルホローダミンＢの蛍光を試験することによって取り込みを評価した。棒グラフの各セットは、左から右に、ＭＣＦ７細胞及びＵ８７細胞の棒グラフである。（ｃ）リポソームの取り込みを示す共焦点顕微鏡写真。細胞を、表示のリポソーム溶液と２時間インキュベートし、洗浄し、画像化した。全ての画像は同じ設定で取得した。（ｄ）皮下Ｕ８７腫瘍を有するヌードマウスへの注射後４５分目の、ＣｏＰｏＰリポソームに封入されたスルホローダミンＢの体内分布(Ｈｉｓタグ化環状ＲＧＤ標的指向性ペプチドの付着がある場合又は無い場合)。平均±標準偏差（ｎ＝３）。棒グラフの各セットは、左から右に、非標的化及び＋ｃＲＧＤ-Ｈｉｓの棒グラフである。
【００１７】
［図６］免疫原性ＣｏＰｏＰリポソームを用いたＨＩＶペプチドワクチン接種
（ａ）ＢＡＬＢ/ｃ又は胸腺欠損ヌードマウスを、ＭＰＬ２５μｇとＨＩＶ ｇｐ４１エンベロープタンパク質由来のＨｉｓタグ化ＭＰＥＲペプチド２５μｇを含むＣｏＰｏＰリポソームを用いて免疫化した。血清力価は、Ｈｉｓタグを有さないビオチン化ＭＰＥＲペプチドを使用するＥＬＩＳＡを用いて評価し、抗-ＩｇＧ二次抗体で探索した。矢印は、ワクチン接種の時間を示す。（ｂ）表示のようにワクチン接種したＢＡＬＢ/ｃマウスにおける抗-ＭＰＥＲ力価。０週目と２週目にマウスにワクチン接種を行い、４週目に血清を集めた。（ｃ）ＭＰＬを含むＣｏＰｏＰリポソームをワクチン接種したマウスにおける、持続性の抗-ＭＰＥＲ力価。平均値±標準偏差（グループあたりｎ＝４マウス）。左側の最初の２つの棒グラフ(連結している)は、ＣｏＰｏＰ及びＮｉ-ＮＴＡである。（ｄ）表示の抗体の存在下における２９３細胞のＨＩＶ感染の中和。プロテインＡを使用してマウス血清からＩｇＧを精製した。平均値±標準偏差（ｎ＝３）。
【００１８】
［図７］リポソームへのＲＧＤ-Ｈｉｓペプチド結合の安定性
（ａ）１０モル％のＮｉ-ＮＴＡ-脂質、Ｃｏ-ＮＴＡ-脂質又はＣｏＰｏＰを含むリポソームへのＦＡＭ-標識化ＲＧＤ-Ｈｉｓペプチド結合。（ｂ）ペプチド結合後のゲルろ過。ＣｏＰｏＰリポソームのみが、安定な結合を維持した。（ｃ）ウシ胎児血清による１：１希釈でインキュベーションした後のペプチド安定性。ＣｏＰｏＰリポソームのみが、安定な結合を維持した。
【００１９】
［図８］ＣｏＰｏＰを含むリポソームへのＨｉｓタグ化タンパク質の安定な結合
レポータータンパク質を、ＣｏＰｏＰ、遊離Ｃｏ-ポルフィリン又は２Ｈ-ＰｏＰを含むリポソームとともにインキュベートし、その後、血清中でインキュベートし、ＥＭＳＡにかけた。その後、前記タンパク質をＦＲＥＴチャネル(ex：430 nm、em：525 nm)を使用して画像化した。ＣｏＰｏＰレーンにシグナルが無いことは、リポソームへの安定な結合を実証する。Ｃｏ-ポルフィリンのレーンの減弱したシグナルは、Ｈｉｓタグ化タンパク質のリポソームへのいくらかの結合を実証する。
【００２０】
［図９］組成の異なるＣｏＰｏＰリポソームに対するＲＧＤ-Ｈｉｓの９０％ペプチド結合の時間
ＲＧＤ-ＨｉｓペプチドとともにＰＢＳ中でインキュベートした際の、表示した成分を含むＣｏＰｏＰリポソーム(１０モル％のＣｏＰｏＰ)への９０％ペプチド結合の時間に対するリポソーム組成の影響。棒グラフの各セットは、左から右に、(＋)コレステロールと(−)コレステロールの棒グラフである。
【００２１】
［図１０］血清又はアルブミンの存在下における、ＣｏＰｏＰリポソームへのＲＧＤ-Ｈｉｓ結合
表示の組成のリポソームを、５０％ウシ胎児血清又は５０ｍｇ/ｍＬのウシ血清アルブミンの存在下で、ＲＧＤ-Ｈｉｓペプチドとともにインキュベートした。ＦＡＭ-標識ペプチドの発光は、ＣｏＰｏＰリポソームへの結合時のぺプチド発光を、２Ｈ-ＰｏＰリポソームと比較することによって正規化した。
【００２２】
［図１１］リポペプチドによる膜透過処理
スルホローダミンＢを積んだリポソームを、表示のペプチド(５μｇ/ｍＬ)とともに、室温でインキュベートし、蛍光を使用して放出を評価した。棒グラフの各セットは、左から右に８時間及び２４時間の棒グラフである。
【００２３】
［図１２］１モル％のＣｏＰｏＰを含むリポソームへのＲＧＤ-Ｈｉｓペプチドの結合と細胞ターゲティング
（ａ）１モル％のＣｏＰｏＰを含むＣｏＰｏＰリポソームとともにインキュベートした際の正規化ペプチド蛍光。ＣｏＰｏＰサンプルと２Ｈ-ＰｏＰとを比較することによって発光を正規化した。（ｂ）表示のように細胞とインキュベートされた、１モル％のＣｏＰｏＰを含むスルホローダミンＢリポソームの細胞取り込み。棒グラフの各セットは、左から右に、ＭＣＦ７細胞及びＵ８７細胞の棒グラフである。
【００２４】
［図１３］ＣｏＰｏＰ Ｈｉｓタグ結合表面を有するコーティング金ナノ粒子
（ａ）金ナノ粒子を分散するコーティングプロトコルの写真。ＰＯＰコーティングが無い場合、クエン酸塩で安定化した金は、遠心ステップを繰り返した後に凝集する(矢印)。（ｂ）脂質コーティング前後のナノ粒子のサイズ。挿入図は、ＣｏＰｏＰ金の透過型電子顕微鏡写真を５０ｎｍのスケールバーとともに示す。（ｃ）ＲＧＤ-Ｈｉｓ結合後の、クエン酸塩で安定化した金とＣｏＰｏＰ金の吸収スペクトル。（ｄ）標的ナノ粒子の取り込みを示す共焦点反射画像。細胞を２時間、表示の金ナノ粒子とともにインキュベートし、洗浄し、その後画像化した。全ての画像は同じ設定で取得した。
【００２５】
［図１４］（Ａ）Ｐｓｆ２５(Ｐｆｓ２５_Ｂ)結合を、遠心ろ過分析によって測定した。これらのデータは、Ｃｏ-ＰｏＰリポソームに対するＰｓｆ２５タンパク質の１００％の結合を示す。（Ｂ）Ｐｓｆ２５タンパク質結合の前後におけるＣｏＰｏＰリポソームの粒子サイズ。
【００２６】
［図１５］ＣＤ-１マウスにおける抗-Ｐｓｆ２５ ＩｇＧレベル
マウスに、筋肉内注射の後、ＣｏＰｏＰ/ＭＰＬ又はＩＳＡ７０中のＰｓｆ２５をワクチン接種した。（Ａ）追加免疫前及び（Ｂ）追加免疫後(週三回の抗原刺激/週三回の追加免疫［一注射あたり、５、０．５、又は０．０５ｕｇのＰｆｓ２５)  ＣｏＰｏＰ(Ｐｓｆ２５)リポソーム、又は遊離Ｐｓｆ２５タンパク質(ＩＳＡ７０有り又は無し)をワクチン接種されたマウスから得た９６ウェルプレートでＥＬＩＳＡによってＩｇＧ力価を測定した。データは平均値±標準偏差を示す（グループあたりｎ＝５マウス）。
【００２７】
［図１６］抗-Ｐｓｆ２５ ＩｇＧ力価
力価は、バックグラウンドに比べて０．５より大きい吸光度を生じる血清希釈率の逆数として定義される。
【００２８】
［図１７］ＣｏＰｏＰリポソーム上の様々な長さのＮＡＮＰペプチドのコーティングの説明及び特徴
（Ａ）７×ヒスチジン(Ｈｉｓ)タグを含む、様々な数のＮＡＮＰ反復ペプチド。（Ｂ）様々な長さのＮＡＮＰペプチドとコンジュゲートしたＣｏＰｏＰリポソームの平均径及び多分散性(ＰＤＩ)を、動的光散乱で算出した（ｎ＝３）。エラーバー、標準偏差。（Ｃ）ＣｏＰｏＰリポソーム及び２ＨＣｏＰｏＰリポソームへのＮＡＮＰペプチドのペプチド結合を、微量遠心ろ過プロセス及びＢＣＡ分析で測定した（ｎ＝３）。
【００２９】
［図１８］Ｈｉｓタグ化ＭＰＥＲと結合したＣｏＰｏＰ/ホスファチジルセリン・リポソームで前処置したマウスにおける抗ＭＰＥＲ ＩｇＧ力価。ＭＰＥＲに対する抗体応答を誘発するために、ＣｏＰｏＰ/ＭＰＬＡリポソーム中のＭＰＥＲを注射する４週間前及び２週間前に、ＭＰＥＲ/ＣｏＰｏＰ/ＰＳリポソームでマウスを前処置した。
【００３０】
［図１９］様々なＨｉｓタグ化ＣＰＰに結合したＣｏＰｏＰリポソームとインキュベーションした後のＵ８７細胞の蛍光
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、少なくとも単層を含むナノ構造体を提供する。例えば、この構造は単層又は二重層を含むことができ、前記単層又は二重層はポルフィリン-リン脂質コンジュゲートを含み、コバルトが二重層内に存在するように、コバルトがそこにキレートされている。前記二重層構造はリポソームを形成することができる。前記構造は、２つの単層(二重層)を含むことができ、２つの単層の疎水性基が向い合せになり、親水性基が表面にさらされている。
【００３２】
二重層に関する本明細書中の開示は、単層にも当てはめることができる。前記二重層又は単層は、本明細書において「膜(メンブラン)」と呼ばれることもある。
【００３３】
本明細書で提供される全ての範囲は、別段の記載がない限り、小数第１０位までの範囲に含まれるすべての数値を含む。
【００３４】
単層又は二重層中のコバルトポルフィリンの一部又は全てが、ポリヒスチジン-タグ化分子に非共有結合的に結合することができ、ポリヒスチジン-タグの少なくとも１部は、二重層内に存在し、タグ化分子は、二重層の表面に提示される。本発明の二重層又は単層において、ポリヒスチジン-タグ中の一以上のヒスチジン残基は、二重層内のコバルト金属コアに配位し、それによって構造に安定性を提供していると考えられる。ポリヒスチジン-タグのヒスチジン残基は、膜内のポルフィリンのコア中のコバルト金属に配位していてもよい。ヒスチジンタグ全体が、二重層内に存在してもよい。そこにコンジュゲートしたコバルト金属を有するポルフィリン-リン脂質コンジュゲートは、本明細書中でＣｏＰｏＰと称される。その二重層がＣｏＰｏＰを含むリポソームは、本明細書中でＣｏＰｏＰリポソームと称される。ＣｏＰｏＰリポソームは、ヒスチジンタグ化分子で機能化されることができる。本明細書中で使用される「Ｈｉｓタグ化分子」という用語は、例えば、ヒスチジンテールを有するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質等の分子を意味する。例えば、ヒスチジンテールを有するペプチドは、Ｈｉｓタグ化分子である。このようなＨｉｓタグを含むＣｏＰｏＰリポソームは、本明細書中で、Ｈｉｓタグ化ＣｏＰｏＰリポソーム又はＨｉｓタグ化ＣｏＰｏＰと称される。
【００３５】
本開示のＨｉｓタグ化提示分子で機能化されたＣｏＰｏＰ単層又は二重層は、循環内で関心のある様々な分子を提示するため、又は所望の位置への送達のため、又はそれらのＨｉｓタグ化分子への特異的免疫応答を生じさせるためのプラットホームを提供する。これらの分子は、本明細書中で提示分子(ＰＭ：presentation molecule)と称される。Ｈｉｓタグ化ＣｏＰｏＰ二重層を含む構造であって、当該ヒスチジンタグに付着したＰＭを有するものは、望ましい安定性を示す。前記Ｈｉｓタグ化分子は、ＣｏＰｏＰに非共有結合的に結合し(配位し)、インキュベーションプロセスによって調製できる。それゆえ、このプロセスは、他の種類のコンジュゲーション化学で使用される反応性成分−例えば、マレイミドなど−又は外来性の触媒あるいは非天然アミノ酸の除去を必要としない。
【００３６】
コバルトポルフィリンは、内部に水性区画を有する自己会合性リポソームの二重層内に存在してもよい。あるいは、それは他のナノ粒子を被覆する単層又は二重層コーティング中に存在してもよい。コバルトポルフィリン-リン脂質(ＣｏＰｏＰ)は、両親媒性の性質に関しては、従来の脂質のように挙動する。それゆえ、ＣｏＰｏＰを含む単層又は二重層は、当業者に既知の方法によって、ナノ粒子をコーティングするために使用できる。一実施形態では、本開示の二重層又は単層は、他のナノ粒子上に存在してもよい(例えば、コーティングの形態で)。一実施形態では、コバルトポルフィリンを含む二重層又は単層(例えば、コバルトポルフィリン-リン脂質)は、金ナノ粒子又はシリカナノ粒子、あるいは親水性表面を有する他のナノ粒子上のコーティングとして存在する。一実施形態では、前記コーティングは単層の形態であってもよい。一実施形態では、コバルトポルフィリンを含む単層又は二重層は(例えば、コバルトポルフィリン-リン脂質)は、カーボンナノチューブのような疎水性表面上のコーティングとして存在する。一実施形態では、前記単層は、一以上の疎水性分子を取り囲むミセルを形成してもよい。
【００３７】
この開示は、単層又は二重層を含むナノ構造体を提供し、前記単層又は二重層は、ｉ）任意でリン脂質、及びii）コバルトに配位して、コバルトポルフィリンを形成しているポルフィリン、を含む。任意で、前記ナノ構造体は、一以上のポリヒスチジン-タグ化提示分子も有する。当該ポリヒスチジン-タグの少なくとも一部は、前記単層又は二重層の疎水性部分に存在し、ポリヒスチジン-タグの一以上のヒスチジンは、コバルトポルフィリン中のコバルトに配位している。ポリヒスチジン-タグ化提示分子の少なくとも一部は、前記ナノ構造体の外側に露出している。前記ナノ構造体は、水性区画を取り囲むリポソームの形態をとることができる。しかしながら、前記ナノ構造体は、金又はシリカナノ粒子のような親水性又は疎水性物質を被覆していてもよい。前記コバルトポルフィリンは、リン脂質にコンジュゲートして、コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートを形成してもよい。前記コバルトポルフィリンは、前記単層又は二重層の１〜１００モル％を構成することができ、前記範囲は、その間の０．１モル％の値及び範囲を含む。例えば、前記コバルトポルフィリンは、前記単層又は二重層の１〜２０モル％、あるいは５〜１０モル％を構成することができる。コバルトポルフィリンが、前記単層又は二重層の１００％を構成する場合、コバルトポルフィリンにコンジュゲートしていないリン脂質は存在しない。前記二重層又は単層は、ステロール及び／又はポリエチレングリコールを含んでもよい。前記ステロールはコレステロールであってもよい。
【００３８】
前記単層又は二重層中のポリヒスチジン-タグにおけるヒスチジンの数は、２〜２０であってもよい。例えば、ポリヒスチジン-タグにおけるヒスチジンの数は、６〜１０であってもよい。例えば、ヒスチジンの数は、３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９、又は２０であってもよい。
【００３９】
前記リポソームは、球形であっても、非球形であってもよい。リポソームの大きさは、５０〜１０００ｎｍ以上とすることができる。一実施形態では、前記リポソームは、５０〜１０００ｎｍ(その間の全ての整数値のｎｍ値及び範囲を含む)の大きさ(例えば、最大寸法、例えば、直径など)を有する。例えば、その大きさは、５０〜２００ｎｍ、あるいは２０〜１０００ｎｍであってもよい。リポソームが球形ではない場合、その最大寸法が５０〜１０００ｎｍであってもよい。これらの寸法は、単層又は二重層のナノ構造幅を保ちながら達成することが可能である。前記リポソームは、その水性区画中にカーゴを保有することができる。前記カーゴあるいはその一部は、さらに又は代わりに、前記単層又は二重層内に取り込まれてもよい。
【００４０】
一実施形態では、本開示は、単層又は二重層を含むリポソームを提供し、ここで当該単層又は二重層は、コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲート、任意でコバルトポルフィリンにコンジュゲートしていないリン脂質、及びポリヒスチジン-タグ化提示分子を含み、ここで、当該ポリヒスチジン-タグの少なくとも一部は前記単層又は二重層の疎水性部分に存在し、且つ、ポリヒスチジン-タグの一以上のヒスチジンは、コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのコバルトに配位している。前記ポリヒスチジン-タグ化提示分子の少なくとも一部は、ナノ構造体の外側に露出している。前記ナノ構造体(例えば、リポソーム)は、水性区画を囲い込むことができる。前記単層又は二重層は、コバルトポルフィリンにコンジュゲートしていないリン脂質を含む必要はなく、この場合、コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのみを有する。カーゴは水性区画中に存在できる。前記カーゴは、水性区画だけに存在する必要はなく、その一部は単層又は二重層に存在してもよい。
【００４１】
本開示は、単層又は二重層も提供し、当該単層又は二重層は、リン脂質モノマー及びコバルトに配位しているポルフィリン(コバルトポルフィリンを形成している)を含む。前記単層又は二重層は、そこに会合した一以上のポリヒスチジン-タグ化提示分子を有し、当該ポリヒスチジン-タグの少なくとも一部は、前記単層又は二重層の疎水性部分に存在する。前記ポリヒスチジン-タグの一以上のヒスチジンは、コバルトポルフィリンのコバルトに配位しており、ポリヒスチジン-タグ化提示分子の少なくとも一部は、前記二重層又は単層の外側に存在する。様々な例において、前記単層又は二重層は水性区画を取り囲むか、あるいはナノ粒子(例えば、金ナノ粒子又はシリカナノ粒子)上のコーティングを形成する。
【００４２】
本開示は、コア、及び当該コア上の単層又は二重層コーティングを含むナノ構造体を提供し、ここで、前記単層又は二重層は、リン脂質、及びコバルトに配位してコバルトポルフィリンを形成しているポルフィリンを含む。前記ナノ構造体は、一以上のポリヒスチジン-タグ化提示分子を有することができ、ここで、当該ポリヒスチジン-タグの少なくとも一部は、単層又は二重層の疎水性部分に存在し、且つ、当該ポリヒスチジン-タグの一以上のヒスチジンは、コバルトポルフィリンのコバルトに配位している。前記ポリヒスチジン-タグ化提示分子の少なくとも一部は、前記ナノ粒子の外側に露出している。前記ナノ構造体のコアは、金ナノ粒子又はシリカナノ粒子等のナノ粒子であってもよい。
【００４３】
前記リポソーム、あるいは単層又は二重層のコーティングを有するナノ粒子は、本明細書に記載されるように、提示分子を有することができ、これは抗原分子及び／又は標的指向性分子(ターゲティング分子)であってもよい。前記提示分子は、ターゲティング能力及び／又はイメージング機能又は他の機能を提供することもできる。
【００４４】
Ｈｉｓタグ化ポリペプチド及びＣｏＰｏＰ組成を含むリポソーム又は他のナノ構造体は、Ｈｉｓタグ化ポリペプチドのリポソームへの結合に関して、高い血清安定性を示す。一実施形態では、室温で血清(例えば希釈血清)とインキュベートした際、Ｈｉｓタグ化ペプチドの６０％より多くが、２４時間のインキュベーション後に、ＣｏＰｏＰ含有二重層に結合したままである。一実施形態では、Ｈｉｓタグ化ペプチドの８５％より多くが、血清と２４時間インキュベーションした後に、ＣｏＰｏＰ層に結合したままである。
【００４５】
ＣｏＰｏＰリポソーム又はＨｉｓタグ化ＣｏＰｏＰリポソームは、カーゴを積み込むことができる。カーゴは典型的には水性区画に存在するが、それが疎水性であるか疎水性成分を有する場合は、完全に又は部分的に二重層中に埋め込まれた状態で存在してもよい。表面に提示分子を有することに加えて、これらの構造体は、当該構造の中の水性区画中に、あるいは二重層中にカーゴを積むために使用することができる。ＣｏＰｏＰリポソームからのカーゴの放出は、近赤外線(ＮＩＲ)光線によって誘発することができる。前記カーゴは所望の位置で放出することが可能である(例えば、標的細胞中に内部移行させることによって、又は光誘発放出によって)。
【００４６】
単層又は二重層のコバルトポルフィリンは、ポルフィリンにコンジュゲートしたコバルト(Ｃｏ)カチオンを有するポルフィリンである。前記ポルフィリンは、リン脂質にコンジュゲートできる(本明細書において、コバルトポルフィリン-リン脂質又はコバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートと称する)。
【００４７】
リポソームの二重層又は他の構造の少なくとも一部を構成しているコバルトポルフィリン又はコバルトポルフィリンコンジュゲートのポルフィリン部分は、ポルフィリン、ポルフィリン誘導体、ポルフィリン類似体、又はそれらの組み合わせであってもよい。代表的なポルフィリンには、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、及びテトラフェニルポルフィリンが含まれる。代表的なポルフィリン誘導体には、ピロフェオホルビド類、バクテリオクロロフィル類、クロロフィルＡ、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン類、プルプリン類、ベンゾクロリン類、ナフトクロリン類、ベルジン(verdin)類、ロジン(rhodin)類、ケトクロリン類、アザクロリン類、バクテリオクロリン類、トリポルフィリン類、及びベンゾバクテリオクロリン類が含まれる。代表的なポルフィリン類似体には、拡張ポルフィリン・ファミリーメンバー(例えば、テキサフィリン類、サフィリン類及びヘキサフィリン類)及びポルフィリン異性体(例えば、ポルフィセン類、反転ポルフィリン類、フタロシアニン類、及びナフタロシアニン類)が含まれる。例えば、コバルトポルフィリンは、ビタミンＢ12(コバラミン)又はその誘導体であってもよい。
【００４８】
一実施形態では、前記ＰＯＰはピロフェオホルビド(pyropheophorbide)-リン脂質である。ピロフェオホルビド-リン脂質の構造を以下に示す。
【化１】
2018513156.tif 000003
【００４９】
一実施形態では、前記層(単層あるいは二重層)は、ＣｏＰｏＰのみを有し、その中に組み込まれたＨｉｓタグ化提示分子を有する。この実施形態では、前記層中の唯一のリン脂質はＣｏＰｏＰである(すなわち、ＣｏＰｏＰ１００モル％)。一実施形態では、前記層(単層あるいは二重層)は、ＣｏＰｏＰ及びポルフィリンコンジュゲート型リン脂質(ＰＯＰ)のみを含み、ここで、ＣｏＰｏＰはその中に組み込まれたヒスチジンを有し、当該ヒスチジンはそこに付着したペプチドあるいは他の提示分子を有する。ある実施形態では、他のリン脂質は存在しないが、前記層(単層あるいは二重層)は、任意でステロール及び／又はＰＤＧ-脂質を含んでもよい。
【００５０】
一実施形態では、前記ＣｏＰｏＰに加えて、前記二重層又は単層は、ポルフィリンにコンジュゲートしていない、それゆえＣｏに配位していないリン脂質も含む。そのようなリン脂質は、本明細書中で「さらなるリン脂質」とも呼ばれる。前記二重層又は単層は、ステロール及びＰＥＧ-脂質を含んでもよい。一実施形態では、前記二重層又は単層は、本質的に、ＣｏＰｏＰ、ポルフィリンにコンジュゲートしていないリン脂質、及び任意でステロール及び／又はＰＥＧからなるか、又はＣｏＰｏＰ、ポルフィリンにコンジュゲートしていないリン脂質、及び任意でステロール及び／又はＰＥＧのみからなり、この際、ＰＥＧは脂質にコンジュゲートしていてもよい。一実施形態では、二重層中の唯一の金属-ＰｏＰはＣｏＰｏＰであり、そこに取り込まれたＨｉｓタグ化提示分子を有する。一実施形態では、二重層中の唯一の金属はＣｏである。
【００５１】
一実施形態では、前記リポソームの二重層は、ＣｏＰｏＰ及びＰｏＰを含む。ＣｏＰｏＰとＰｏＰに加えて、前記二重層はさらなるリン脂質を含むことができる。前記二重層又は単層は、さらにステロール及び／又はＰＥＧを含んでもよい。前記ＰＥＧは、脂質にコンジュゲートしていてもよい。一実施形態では、前記二重層は、本質的に、ＣｏＰｏＰ、ＰｏＰ、さらなるリン脂質、及び任意でステロール及び／又はＰＥＧからなるか、あるいはＣｏＰｏＰ、ＰｏＰ、さらなるリン脂質、及び任意でステロール及び／又はＰＥＧのみからなり、この際、ＰＥＧは脂質にコンジュゲートしていてもよい。一実施形態では、前記二重層中の唯一の金属-ＰｏＰはＣｏＰｏＰである。一実施形態では、前記二重層中の唯一の金属はＣｏである。
【００５２】
一実施形態では、前記ＣｏＰｏＰは、ナノ粒子中に０．１〜１０モル％存在し、残りの９９．９〜９０モル％は、さらなる脂質によって構成されている(前記％は二重層の全脂質に対するものである)。例えば、ＣｏＰｏＰの組み合わせは、０．１〜１０モル％で存在でき、ステロールは０．１〜５０モル％で存在でき、任意で、弱毒化リピドＡ誘導体(例えば、モノホスホリルリピドＡ、あるいは３-脱アシル化モノホスホリルリピドＡ)又は関連する類似体は０〜２０モル％又は０．１〜２０モル％存在でき、残りはさらなるリン脂質で構成されることができる。前記リン脂質は、ＤＯＰＣ，ＤＳＰＣ，ＤＭＰＣ又はそれらの組み合わせ、及びステロールである(ステロールが存在する場合、それはコレステロールであってもよい)。
【００５３】
一実施形態では、ＣｏＰｏＰとＰｏＰの組み合わせは、ナノ粒子中に０．１〜１０モル％存在してもよく、残りの９９．９〜９０モル％は、さらなるリン脂質によって構成される。例えば、ＣｏＰｏＰとＰｏＰの組み合わせは０．１〜１０モル％存在でき、ステロールは０〜５０モル％又は０．１〜５０モル％存在でき、任意でＰＥＧが０〜２０モル％又は０．１〜２０モル％存在でき、残りはリン脂質によって構成されることができる。前記リン脂質は、ＤＯＰＣ，ＤＳＰＣ，ＤＭＰＣ又はそれらの組み合わせ、及びステロールであってもよい(ステロールが存在する場合、それはコレステロールであってもよい)。
【００５４】
本明細書中で使用される「リン脂質」は、グリセロール骨格を経て疎水性の脂質テールに連結されたリン酸基を有する、親水性頭部を持つ脂質である。前記リン脂質は、炭素数６〜２２のアシル側鎖を含み、前記数値はその間の全ての整数値の炭素及びその間の範囲を含む。ある実施形態では、前記ポルフィリンコンジュゲート中のリン脂質は、１-パルミトイル-２-ヒドロキシ-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリンである。ポルフィリンコンジュゲートのリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン及び／又はホスファチジルイノシトールを含んでもよく、あるいは、本質的にそれ又はそれらからなってもよい。
【００５５】
ある実施形態では、前記ポルフィリンは、炭素数１〜２０(その間の全ての整数値の炭素を含む)の炭素鎖リンカーによって、前記リン脂質のグリセロール基にコンジュゲートしている。
【００５６】
様々な実施形態において、リポソームの二重層は、本明細書に開示されているポルフィリンコンジュゲートに加えて、他のリン脂質も含む。これらのリン脂質の脂肪酸鎖は、二重層を形成するために適切な数の炭素原子を含んでもよい。例えば、脂肪酸鎖は、１２，１４，１６，１８又は２０の炭素原子を含んでもよい。様々な実施形態において、前記二重層は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン及び／又はホスファチジルイノシトールを含む。
【００５７】
本発明の二重層及び単層は、ステロールを含んでもよい。前記ステロールは、動物性ステロール又は植物性ステロールであってもよい。ステロールの例には、コレステロール、シトステロール、スチグマステロール、及びコレステロールが含まれる。一実施形態では、コレステロールは、０モル％〜５０モル％、又は０．１〜５０モル％であってもよい。他の実施形態では、コレステロールは１〜５０モル％、５〜４５モル％、１０〜３０モル％存在し得る。
【００５８】
ある実施形態では、前記二重層又は単層は、さらに、ＰＥＧ-脂質を含む。ＰＥＧ-脂質は、ＤＳＰＥ-ＰＥＧ(例えば、ＤＳＰＥ-ＰＥＧ-２０００、ＤＳＰＥ-ＰＥＧ-５０００又は他のサイズのＤＳＰＥ-ＰＥＧ)であってもよい。前記ＰＥＧ-脂質は、０〜２０モル％の量(少数第１０位までのその間の全ての％量を含む)で存在する。ＰＥＧ成分の平均分子量は５００〜５０００ダルトンの間及びその間の全ての整数値及び範囲であってもよい。
【００５９】
ある実施形態では、前記二重層又は単層は、さらにアジュバント、例えばモノホスホリルリピドＡあるいは３-脱アシル化モノホスホリルリピドＡのような弱毒化リピドＡ誘導体を含む。
【００６０】
前記ヒスチジンタグ(Ｈｉｓタグ)は、様々な用途のために、関心のある多様な提示分子を保有してもよい。Ｈｉｓタグの少なくとも一端又は両端は、リポソームの外表面近くに存在してもよい。一実施形態では、ポリヒスチジン-タグの少なくとも一端が、提示分子に共有結合的に付着している。一実施形態では、前記Ｈｉｓタグは、少なくとも２つのヒスチジンからなる鎖である。一実施形態では、前記Ｈｉｓタグは、２〜２０のヒスチジン鎖である。一実施形態では、前記Ｈｉｓタグは、４〜１２のヒスチジン及びその間の全ての整数値のヒスチジンからなる鎖である。一実施形態では、それは６〜１０のヒスチジンからなる。一実施形態では、それは６，７，８，９又は１０のヒスチジンである。一実施形態では、Ｈｉｓタグの一端はフリーであり、他端にペプチドあるいは他の分子が付着している。Ｈｉｓタグの少なくとも一部は、コバルト金属コアに配位できるように、二重層内に位置していると考えられる。
【００６１】
本開示のリポソーム(Ｈｉｓタグ化分子を有さないもの)は、実質的に球形であってもよく、３０ｎｍ〜２５０ｎｍ(その間のｎｍまでの全ての整数値及び範囲を含む)の大きさ(例えば、最大寸法、例えば直径など)を有し得る。一実施形態では、前記リポソームの大きさは１００〜１７５ｎｍである。一実施形態では、組成物中のリポソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％が３０〜２５０ｎｍ又は１００〜１７５ｎｍの大きさを有する。前記リポソーム又はナノ構造体は、２００ｎｍより大きくてもよい。一実施形態では、前記ナノ構造体は１０００ｎｍより大きい。一実施形態では前記ナノ構造体は２００〜１０００ｎｍである。前記リポソーム又はナノ構造体は、球形であっても、非球形であってもよい。一実施形態では、単層又は二重層のナノ構造幅を保ちつつ、前記ナノ構造体の最大寸法は２００ｎｍ未満である。一実施形態では、単層又は二重層のナノ構造幅を保ちつつ、ナノ構造体の大きさは、ある寸法では２００ｎｍを超える。一実施形態では、単層又は二重層のナノ構造幅を保ちつつ、ナノ構造体の大きさは、ある寸法では１０００ｎｍを超える。
【００６２】
一面では、本開示は、本開示のリポソーム又は他の構造体、あるいは異なるリポソーム又は他の構造体の混合物を含む組成物を提供する。前記組成物は、ヒトを含む個体に投与するための、無菌の適切なキャリア、例えば、生理学的バッファー(例えば、ショ糖、ブドウ糖、生理食塩水)、例えばｐＨを５〜９、ｐＨを７〜８、ｐＨを７．２〜７．６(例えば７．４)にするためのｐＨバッファリング成分(例えば、ヒスチジン、クエン酸塩、又はリン酸塩)等も含むことができる。一実施形態では、前記組成物は、少なくとも０．１％(ｗ/ｖ)の、ＣｏＰｏＰリポソーム又はＨｉｓタグ化-ＣｏＰｏＰリポソーム又は他の構造体を含む。様々な実施形態において、前記組成物は、０．１〜１００モル％の、ＣｏＰｏＰリポソーム又はＨｉｓタグ化-ＣｏＰｏＰリポソーム又は他の構造体(例えば、二重層で被覆されたナノ粒子)を含む。一実施形態では、前記組成物は、ＣｏＰｏＰリポソーム(それに会合しているＨｉｓタグ化提示分子を有する)を０．１〜９９モル％含む。
【００６３】
一実施形態では、本開示の組成物は、マレイミド又はサクシニミジルエステル反応基を有さない。一実施形態では、膜に付着するタグ化分子は、非天然アミノ酸を有さない。
【００６４】
Ｈｉｓタグを有する提示分子は、低分子であっても高分子であってもよい。一実施形態では、前記分子はペプチド又はペプチド誘導体である。一実施形態では、前記分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物又はポリマーである。Ｈｉｓタグは、関心のある分子に化学的にコンジュゲートしていてもよい。Ｈｉｓタグは、ポリペプチドの一次アミノ酸配列内に取り込まれていてもよい。一実施形態では、前記分子は抗原、例えばペプチド(２〜５０のアミノ酸、及び２と５０の間のアミノ酸長からなる全てのペプチド)又はポリペプチド(５０〜１０００のアミノ酸及び５０と１０００の間のアミノ酸長からなる全てのポリペプチド)又はタンパク質(１０００アミノ酸より大きい)である。前記ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、天然に存在するアミノ酸のみを有してもよく、あるいは天然に存在するアミノ酸と天然に存在しないアミノ酸の混合からなってもよく、あるいは天然に存在しないアミノ酸のみを有してもよい。
【００６５】
Ｈｉｓタグに付着される提示分子は、抗原分子、標的指向性分子、治療用分子、診断用分子、又は他の種類の機能を提供する分子であってもよい。タグ化分子は、標的指向化のため、すなわち、単層又は二重層を有する構造体を、その標的部位に導くために使用されてもよい。例えば、ペプチドリガンドは、リポソーム(又は他の構造体)を、当該リガンドのための受容体又は認識分子を有する細胞に導くために、Ｈｉｓタグに付着されてもよい。一実施形態では、付着ペプチドは、代わりの又は更なる機能を提供することができる。例えば、付着ペプチドは、治療、診断、又は免疫原性に関する機能を提供することができる。
【００６６】
特定の実施形態では、前記提示分子は、標的指向性分子(例えば、抗体、ペプチド、アプタマー、又は葉酸等の他の分子)であってもよい。用語「標的指向性分子」は、特定の標的に、リポソーム等の二重層を有する構造体を向かわせることができる分子を指すために用いられる(例えば、標的細胞の表面上の受容体又は他の分子に結合することによって)。標的指向性分子は、タンパク質、ペプチド、核酸分子、糖類あるいは多糖類、受容体リガンド又は他の低分子であってもよい。特異性の程度は、標的指向性分子の選択を通じて調節することができる。例えば、抗体は通常高い特異性を示す。これらは、ポリクローナル、モノクローナル、フラグメント、組換体、単鎖、又はナノボディであってもよく、これらの多くは市場で入手可能であるか、標準技術を使用して容易に得ることができる。
【００６７】
提示分子は、抗原分子(すなわち、抗原エピトープを有する分子)であってもよい。一実施形態では、前記分子はペプチドである。一実施形態では、前記ペプチドはＲＧＤ保有ペプチド配列である。このような配列は、エピトープを有する７〜２０アミノ酸又はより長いアミノ酸であり得る。前記ペプチドは、病原微生物のような微生物の一部であるポリペプチド又はタンパク質のエピトープのフラグメントであってもよく、又はそのようなエピトープを含んでもよい。ペプチドは、一般的に免疫原性ではないポリペプチド又はタンパク質(例えば、事実上免疫原性があることは知られていないウイルスタンパク質など)のフラグメントであってもよい。ペプチドは、例えばＨＩＶ外包膜タンパク質等のＨＩＶ抗原のエピトープのフラグメントであってもよく、又はそのようなエピトープを含んでもよい。一実施形態では、ＨＩＶ抗原はｇｐ４１である。例えば、ペプチドはｇｐ４１エンベロープの膜近位外部領域(ＭＰＥＲ)であってもよい。
【００６８】
一実施形態では、本開示は抗原性組成物を提供する。前記組成物は、二重層を有する構造体を含み、ここで、ヒスチジンテールを有する抗原が、コバルトポルフィリン(又はコバルトポルフィリン・リン脂質)に非共有結合的にコンジュゲートして、Ｈｉｓタグが二重層に埋め込まれており、抗原の一以上のエピトープが、表面に露出している。前記組成物は、当該分野で既知のアジュバント及び他のキャリアを含んでもよい。アジュバントの例には、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン又はサポニンが含まれる。湿潤剤、乳化剤、フィラーなどの他のキャリアも使用可能である。
【００６９】
多種多様のカーゴを、本開示のリポソーム又は他の構造体に積み込むことが可能である。前記カーゴは、近赤外光を使用して所望の位置に送達可能である。例えば、生理活性物質又は治療用物質、医薬物質、又は薬物を、ＣｏＰｏＰリポソームの内部に被包することができる。これには、前記リポソームの水性コア内に、化学勾配により又は濃縮して積み込むことができる水浴性薬物及び弱い酸性又は塩基性の薬物が含まれる。このように、様々な実施形態において、前記リポソームは、その中に被包された活性物質(例えば、治療用物質及び／又は診断用物質、ドキソルビシンのような化学療法剤であってもよい)を含む。化学療法剤であるドキソルビシンは、能動的に積み込まれて、ＮＩＲ照射で放出されることができ、ＣｏＰｏＰリポソームを用いた、強く直接的な光誘発性放出を提供する。
【００７０】
一実施形態では、脂質と薬物(あるいは他の任意のカーゴ物質)の比は、１０：１〜５：１である。様々な実施形態において、脂質と薬物/カーゴの比は、１０：１、９：１、８：１、７：１．６：１、又は５：１である。前記比を計算するために使用される脂質は、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの一部であるリン脂質、さらなるリン脂質、又はステロール、及びＰＥＧにコンジュゲートした脂質(存在する場合)を含む、全ての脂質を含む。時には、本開示においてカーゴは薬物として記載されるが、その記載は、治療のため及び／又は所望の部位へ送達するために含まれるいかなる物質にも同じように当てはめることができ、用語「薬物」は、任意の物質を指すものである。前記物質は、その全体又は一部が、ＰｏＰ-リポソームの内部又は中に含まれてもよく、それは水性区画、二重層又はその両方に存在してもよい。
【００７１】
一実施形態では、前記リポソーム内又は他のキャリアに積み込まれたカーゴは、治療剤である。用語「治療剤」は、当該分野において承認されている用語であり、生物学的、生理学的、又は薬理学的に活性な物質である任意の化学成分を指す。「薬物」とも称される治療剤の例は、「Merck Index」、「Physicians Desk Reference」、及び「Pharmacological Basis of Therapeutics」のような周知の参考文献に記載されており、それらには、医薬；ビタミン；ミネラルサプリメント；疾患又は病気の治療、予防、診断、治癒、緩和のために使用される物質；体の構造又は機能に影響を与える物質；又は生理環境に置かれた後、生物学的に活性又はより活性になるプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。被験者に投与された際、当該組成物から、隣接する組織や体液の中に放出される能力がある、様々な形態の治療剤を使用することができる。活性勾配によって積み込まれる既知の薬物には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ゲムシタビン、エピルビシン、トポテカン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、シプロフロキサシン及びシスプラチンが含まれる。治療的カーゴには、様々な抗生物質(例えば、ゲンタマイシン)又は細菌、真菌、寄生虫、あるいは他の生物によって引き起こされる感染に対して効果的な他の物質も含まれる。これらの薬物は、ＣｏＰｏＰリポソームに積み込まれることができ、且つ、放出されることができる。
【００７２】
一実施形態では、リポソームに積み込まれるカーゴは診断用薬である。「診断薬」又は「診断用薬」は、診断のために使用できる任意の化学成分である。例えば、診断用薬には、造影剤、例えば、インジウムやテクネチウムなどの放射性同位元素を含むもの等；ヨウ素やガドリニウムを含むコントラスト剤；酵素、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、ＧＦＰ、アルカリホスファターゼ、又はβガラクトシダーゼ等；蛍光物質、例えばユーロピウム誘導体等；発光性物質、例えばＮ-メチルアクリジウム誘導体等；が含まれる。
【００７３】
前記カーゴは２以上の物質であってもよい。例えば、カーゴは、診断用薬、治療用剤、免疫原性物質、及び／又は造影剤、及び／又は他の種類の物質の組み合わせを含んでもよい。同じ物質が複数の機能を有することも可能である。例えば、物質は診断用且つ治療用であってもよく、又は、物質は画像処理用であり且つ免疫原性を有するもの等であってもよい。
【００７４】
本開示の層によって形成される構造は、血清に安定である。例えば、インビトロにおいて、ＣｏＰｏＰ二重層に対するＨｉｓタグの結合安定性は、室温で２４時間、５０％ウシ血清中でインキュベートしたときでも、安定である。このように、これらの構造は、血清又は濃縮血清又は希釈血清コンディション下でも安定である。
【００７５】
本開示は、本明細書に記載の二重層を有する構造体を使用する方法も提供する。一実施形態では、この開示は、ホストにおいて免疫応答を誘発する方法を提供する。前記方法は、ヒスチジンタグ抗原がコンジュゲートしたＣｏＰｏＰ二重層を有する構造体を含む組成物を、個体に投与することを含む。前記組成物は、皮下、皮内、筋肉内、腫瘍内又は任意の他のルートを含む、免疫化のための任意の標準的なルートによって投与することができる。前記組成物は、単回投与で投与されてもよく、あるいは、ブースターショットを含む複数回投与で投与されてもよい。抗体価は、免疫応答をモニターするために測定できる。
【００７６】
本発明のナノ構造体は、所望の抗原に対する抗体価を低下させるために使用できる。例えば、免疫原性を減らすことが望まれる場合、その中にＰＳ(又はそれ以外)を含むリン脂質が存在するナノ構造体を使用することができる。これらのナノ構造体を含む組成物は、免疫原性を減らすために投与できる。
【００７７】
一面では、本開示は、リポソームあるいは他のナノ構造体中にカーゴとして含まれる物質を、所望の位置に送達する方法を提供する。前記物質は、その全体又は一部が、ＣｏＰｏＰリポソームの内部又は中に含まれてもよく、それは水性区画、二重層又はその両方に存在してもよい。前記方法は、１）カーゴ(活性剤など)を任意で含む本開示の二重層を有するリポソーム又は他の構造体を含む組成物を準備する；２）選択された場所又は所望の場所に前記リポソームを到達させる；３）少なくとも一部のカーゴがリポソームから放出されるようなコンディション下で、リポソームに、近赤外波長を有する放射線を照射する；ことを含む。その代わりに、又はそれに加えて、前記カーゴは、リポソームが内部移行し、その後細胞内プロセスの作用を受けてカーゴを放出することによって、細胞の内部に到達してもよい。
【００７８】
前記リポソームは、波長６５０〜１０００ｎｍ(その間のｎｍまでの全ての整数値及び範囲を含む)・出力５０〜１０００ｍＷ/ｃｍ2(その間のｍＷ/ｃｍ2までの全ての整数値及び範囲を含む)のレーザーからの近赤外光を照射されることができる。別の実施形態では、波長は６５０〜８００ｎｍであり、これにはその間のｎｍまでの全ての整数値及び全ての範囲が含まれる。前記リポソームは、３０分まで又はそれ以下の時間照射されてもよい。様々な実施形態において、リポソームはインビトロ又はインビボで０．５〜３０分及びその間の小数点第１０位までの全ての数値の時間照射されてもよい。一実施形態では、前記リポソームは、６５８ｎｍのレーザーダイオードで、最大で１０分間照射される。他の実施形態では、前記リポソームは、６６５ｎｍ又は６７１ｎｍの波長で照射される。赤外線は、レーザー光線を所望のエリアにあてることによってそのエリアに直接送達されてもよく、又は光ファイバープローブが使用されてもよい。腫瘍の場合、局所に照射するために、光ファイバープローブを腫瘍内に挿入することができる(すなわち、カテーテル又は内視鏡装置によって)。
【００７９】
一面では、本開示は、ＣｏＰｏＰを含む二重層を調製する方法を提供する。遊離塩基のＰｏＰは、ピロフェオホルビド-ａのようなモノカルボン酸ポルフィリンを、２-パルミトイル-２-ヒドロキシ-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリン(ｌｙｓｏ-Ｃ１６-ＰＣ、Avanti #855675P)によって、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドと４-ジメチルアミノピリジンを使用して、クロロホルム中で、ｌｙｓｏ-Ｃ１６-ＰＣ：Ｐｙｒｏ：ＥＤＣ：ＤＭＡＰ＝１：１：２：２のモル比で、室温で一晩撹拌することによって、エステル化して製造することができる。ＰｏＰはその後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製される。ＣｏＰｏＰは、暗所にて、溶媒(例えば、メタノール)中で、モル過剰の(例えば、１０倍モル過剰)のコバルト塩(例えば、酢酸コバルト(II)四水和物)とポルフィリン-リン脂質コンジュゲートを接触させることによって作製できる。
【００８０】
一実施形態では本開示は、コバルトポルフィリン(例えば、ＣｏＰｏＰ)二重層又は単層で、ナノ粒子を被覆する方法を提供する。当該方法は、一般的に、水中に粒子を分散させるために、脂質の溶液でナノ粒子を水和させることを含む。
【００８１】
カーゴを所望の位置に送達するため、又は通常の投与のために、適切なキャリア中に前記リポソームを含む組成物を、任意の適切なルートによって、個体に投与することができる。一実施形態では、それが脈管構造(循環系)に入るように、静脈内注入によって投与する。前記組成物は、全身的に投与されてもよく、あるいは特定の器官又は組織又は腫瘍への血液供給中に直接投与されてもよい。ＮＩＲで照射された際、ＰｏＰリポソームの内容物は、循環系内で放出されてもよく、及び、その後周辺の組織に入ってもよい。
【００８２】
以下の記載において、本開示のナノ構造体、組成物及び方法の様々な例が開示される。
１．ナノ構造体(例えば、リポソーム)であって、
ａ）単層又は二重層であって、ｉ）任意でリン脂質、及びii）コバルトに配位して、コバルトポルフィリンを形成しているポルフィリン、を有する単層又は二重層；及び
ｂ）任意で、ポリヒスチジン-タグ化提示分子、ここで、当該ポリヒスチジン-タグの少なくとも一部は、単層又は二重層の疎水性部分に存在し、及びポリヒスチジン-タグの一以上のヒスチジンは、前記コバルトポルフィリンのコバルトに配位しており、ポリヒスチジン-タグ化提示分子の少なくとも一部は、ナノ構造体(例えば、リポソーム)の外側に露出しており、且つリポソームである場合、当該リポソームは水性区画を取り囲んでいる；
を含むナノ構造体。
２．前記コバルトポルフィリンがリン脂質にコンジュゲートして、コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートを形成している、上記１に記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
３．前記コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートが、単層又は二重層の１〜２５モル％を構成する、上記２に記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
４．前記コバルトポルフィリン-リン脂質コンジュゲートが、単層又は二重層の５〜１０モル％を構成する、上記３に記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
５．前記二重層が、ステロール（例えば、コレステロール）をさらに含む、上記１〜４のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
６．前記二重層が、ホスファチジルセリン、及び、任意でコレステロールをさらに含む、上記１〜４のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
７．前記ポリヒスチジン-タグが、６〜１０のヒスチジン残基を含む、上記１〜４のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
８．前記リポソームの大きさが５０ｎｍ〜２００ｎｍである、上記１〜４のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
９．前記ナノ構造体(例えば、リポソーム)がカーゴを含み、且つリポソームである場合、前記カーゴの少なくとも一部が、リポソームの水性区画内に存在する、上記１〜４のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
１０．前記提示分子が、４〜５０のアミノ酸からなるペプチドである（前記アミノ酸の数には、Ｈｉｓタグのヒスチジンは含まれない）、上記１〜９のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
１１．前記提示分子が、４〜５００ｋＤａのタンパク質である、上記１〜１０のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
１２．前記提示分子が抗原分子であり、及び、前記単層又は二重層が、そこに取り込まれているアジュバントをさらに含む、上記１〜１１のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
１３．前記アジュバントが、弱毒化リピドＡ誘導体である、上記１２に記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
１４．前記弱毒化リピドＡ誘導体が、モノホスホリルリピドＡ又は３-脱アシル化モノホスホリルリピドＡである、上記１３に記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)。
１５．ナノ構造体であって、
ａ）コア；及び
ｂ）前記コア上の単層又は二重層であって、ｉ）任意でリン脂質モノマー、及びii）コバルトに配位して、コバルトポルフィリンを形成しているポルフィリン(例えば、ＣｏＰｏＰ)、を有する単層又は二重層；及び
ｃ）任意で、ポリヒスチジン-タグ化提示分子、ここで、当該ポリヒスチジン-タグの少なくとも一部は、単層又は二重層の疎水性部分に存在し、ポリヒスチジン-タグの一以上のヒスチジンは、前記コバルトポルフィリンのコバルトに配位しており、ポリヒスチジン-タグ化提示分子の少なくとも一部は、ナノ構造体の外側に露出している；
を含むナノ構造体。
１６．前記コアが金ナノ粒子である、上記１５に記載のナノ構造体。
１７．カーゴの標的化送達方法であって、
ａ）医薬キャリア中に、上記９〜１６のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)、又は上記９〜１６のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)の組み合わせを含む組成物を、個体に投与すること；及び
ｂ）ナノ構造体(例えば、リポソーム)を前記個体の所望の位置に到達させるために適切な時間が経過した後、前記リポソームを、波長６５０〜１０００ｎｍの近赤外線にさらして、リポソームからカーゴを放出させる
ことを含む、方法。
１８．前記個体が、ヒト又は非ヒト動物である、上記１７に記載の方法。
１９．宿主個体において免疫応答を発生させる方法であって、医薬キャリア中に上記１〜１６のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)、又は上記１〜１６のいずれか１つに記載のナノ構造体(例えば、リポソーム)の組み合わせを含む組成物を個体に投与することを含み、前記提示分子が免疫原性エピトープを含むものである、方法。
２０．前記提示分子が、病原微生物由来のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である、上記１９に記載の方法。
２１．前記個体が、ヒト又は非ヒト動物である、上記１９又は２０に記載の方法。
【００８３】
以下の実施例は、本開示を説明するために提示され、それらはいかなる方法による限定も意図していない。
【実施例１】
【００８４】
本実施例は、ヒスチジンタグ化リガンドと抗原を用いたコバルトポルフィリン-リン脂質(ＣｏＰｏＰ)二重層の合成と機能付与を説明する。
【００８５】
材料と方法
材料は、特に断りの無い限り、Sigma社から入手した。ペプチドは商業ベンダーから入手し、HPLCで純度を測定し、質量分析で同一性を確認した。
【表１】
2018513156.tif 000004
【００８６】
タンパク質結合のために、組換えヘプタヒスチジン-タグ化セルリアン-ビーナス融合レポータータンパク質を、大腸菌中で産生し、精製し、前述したように特性を明らかにした。化学量論の概算は、各〜100 nmのリポソームが、80,000の脂質を含むという仮定に基づく。
【００８７】
PoP-脂質、PoP-リポソーム及びPoP-金の生成
遊離塩基(2H)PoP sn-1-パルミトイル sn-2-ピロフェオホルビド ホスファチジルコリンを、上述したように合成した。CoPoPは、100 mgの2H-PoPと、10倍モル過剰の酢酸コバルト(II)四水和物とを、4 mLのメタノール中で、17時間、暗所で撹拌することによって生成した。反応の完了と生成物の純度はTLCでモニターした(＞90％純度)。その後溶媒を、回転エバポレーターによって除去し、PoPを、クロロホルム：メタノール：水(1：1.8：1)で三回抽出した。クロロホルム層を集め、溶媒を回転エバポレーターによって除去し、tert-ブタノール中に20％の水を含む溶液中で生成物を凍結乾燥し、81.5 mgの生成物を得た(収率77％)(同一性は質量分析で確認した)。他の金属-PoPを、同じ方法を使用して合成した。Ni-PoPについては、酢酸Ni(II)四水和物を使用し、17時間インキュベートした。Zn-PoPについては、無水酢酸Zn(II)を使用し、17時間インキュベートした。Mn-PoPについては、酢酸Mn(II)を使用し、30時間インキュベートした。Cu-PoPについては、酢酸Cu(II)を使用し、テトラヒドロフラン中で、3時間インキュベートした。
【００８８】
PoP-リポソームは1 mgスケールで処方した。試験管内のクロロホルム中に脂質を溶解した後、溶媒を蒸発し、フィルムを真空下で一晩さらに乾燥した。脂質を、1 mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)で再水和し、超音波処理し、10回の冷凍-解凍サイクルにかけ、その後、小型押出機を用いて(Avanti #610000)、100 nmのポリカーボネート膜(VWR #28157-790)を通して押し出した。タンパク質及びペプチドの結合分析のために、10モル％のPoP、85モル％のDOPC(Avanti #850375P)、及び5モル％のPEG-脂質(Avanti #880120P)を用いて、リポソームを形成した。Ni-NTAリポソームは、10モル％のNi-NTA脂質ジオレオイル-グリセロ-Ni-NTA(Avanti #790404P)及び10モル％の2H-PoPを含有した。遊離Co-ポルフィリンを取り込んだリポソームは、10モル％のCo-ピロフェオホルビド、85モル％のDOPC及び5モル％のPEG-脂質を含んだ。Co-NTA-リポソームは、10モル％のジオレオイル-グリセロ-NTA(Avanti #790528P)を含むリポソームを使用して調製した。リポソームを、20 mg/mLの塩化コバルト(II)とともに、2時間インキュベートし、その後PBSで透析した。スルホローダミンＢを含むリポソームは、表記の通り、10モル％のPoP、35モル％のコレステロール(Avanti #700000P)、55モル％のDOPCとPEG-脂質を含んだ。スルホローダミンＢ(VWR #89139-502)の溶液を、脂質フィルムを水和するために使用し、その後凍結-解凍し、その後超音波処理した。封入されなかった色素は、10 mLのSephadex G-75(VWR #95016-784)カラム、その後のPBS中での透析によって除去した。二重層の完全性と定量的細胞結合研究のために50 mMの色素を使用し、顕微鏡研究では10 mMの色素を使用した。
【００８９】
金コーティングのために、60 nmのクエン酸塩-安定化金ナノ粒子(Ted Pella #15709-20)を使用して、45モル％のジステアロイルホスホコリン(Avanti #850365P)、45モル％のジステアロイルホスホグリセロール(Avanti #840465X)及び10モル％のPoPからなる1 mgの脂質フィルムを水和した。短時間のボルテックス及び超音波処理の後、サンプルを15分間・相対遠心力1500(rcf)で繰り返し遠心分離した。上清を廃棄し、沈渣を二回以上、再懸濁及び再遠心分離した。さらなる分析のために、PoP金を水中で再懸濁した。
【００９０】
ポリペプチド結合
1μgの蛍光性レポータータンパク質を、96ウェルプレートで、200μLのPBS中のリポソーム20μgとともにインキュベートした。FRETチャネルの蛍光(ex：430 nm、em：525 nm)を、蛍光マイクロプレートリーダー(Tecan Infinite II)を用いて周期的に測定した。リポソームを添加していないタンパク質中のFRETシグナルを基準として、データを正規化した。50μgのリポソームとインキュベートした2.5μgのタンパク質を用いてEMSA実験を行い、続いて、50Vを90分間適用する0.75％アガロースゲル中での電気泳動、及び表示の励起及び発光フィルターを用いるIVIS Lumina IIシステムによって画像処理した。血清安定性試験のために、3 mgのタンパク質を、40ul PBS中のリポソーム60mgとともにプレインキュベートした。24時間のインキュベーション後、40uLのFBSを添加し、さらに8時間インキュベートした。イミダゾール置換実験のために、1μgのレポータータンパク質を、PBS中で20μgのリポソームに結合させた。その後イミダゾールを滴定し、蛍光により結合を評価した。血清安定性のために、1μgのレポータータンパク質を、100μLのPBS中で20μgのリポソームに結合させ、その後、等容積のウシ胎児血清(VWR #82013-602)を添加して、蛍光で結合をモニターした。20μgのリポソームとともに500 ngのペプチドをインキュベートした後、ペプチド結合を、RGD-His FAMフルオロフォア・クエンチングで評価した。
【００９１】
標的指向性実験
U-87及びMCF-7細胞株をATCCから入手し、供給者のプロトコルに従って培養した。2×104細胞を、96ウェルプレート中のウェルに一晩播種した。500 ngのRGD-Hisペプチドを、スルホローダミンＢを積んだリポソーム20μgと結合させ、リポソームを細胞とともに2時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をPBSで三回洗浄し、その後細胞とリポソームを、1％Triton X-100溶液で溶解した。リポソームの取り込みは、スルホローダミンＢの蛍光を測定することによって評価した。
【００９２】
共焦点画像解析のために、10％ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM中のNunc chamberスライド(Nunc #155411)に、104細胞を一晩播種した。20μgのリポソームを、血清を含む培地に添加して、2時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をPBSで三回洗浄した。新しい培地を添加し、Zeiss LSM 710共焦点蛍光顕微鏡を用いた顕微鏡検査で細胞を画像化した。金のイメージングは、後方散乱イメージング用の励起と発光の両方に633 nmの光を使用した以外は、同じ方法で実施した。ペプチド結合後、金を遠心して、未結合のRGDペプチドを除去した。
【００９３】
インビボ実験に関しては、バッファローにある大学の動物実験委員会(IACUC)のポリシーと承認に従って動物を処置した。5週齢のメスの胸腺欠損ヌードマウス(Jackson Labs)の側腹部に、U87細胞を接種し、腫瘍の成長が直径4〜5 mmに達したときに、マウスを処置した。マウスに、cRGD-Hisで標的化した、あるいはしていない200μLのスルホローダミンＢ-含有リポソーム(1 mg/mL脂質)を静脈注射した。注射後45分目にマウスを犠牲にし、臓器を抽出し、秤量し、0.2％Triton X-100溶液中で機械的に均質化し、体内分布を決定するために蛍光を評価した。
【００９４】
ワクチン接種
特に断わりのない限り、8週齢のメスのBALB/cマウス(Harlan Laboratories)に、0日目と14日目に、50μLの無菌PBS中に25μgのMPERペプチドを含む注射を、後方腹部の足蹠に注射した。表記されている場合、注射は、リポソーム中に、25μgのMPL(Avanti #699800P)又はTDB(Avanti #890808P)も含み、リポソームはDOPC：コレステロール：MPL：PoPを、50：30：5：5のモル比で含んだ。フロイントアジュバントのために、ペプチドを、フロイント完全アジュバント(Fisher #PI-77140)中で直接混合し、注射した。最初の注射から4週間、又は表記の期間後、血液を顎下の静脈から採取し、血液凝固と2000rcf・15分間の遠心分離後に血清を得て、−80℃で保存した。
【００９５】
抗-MPER力価を、96-ウェル・ストレプトアビジン-被覆プレート(GBiosciences #130804)中で、ELISAによって評価した。0.1％Tween 20を含む100μLのPBS（PBS-T)中に含まれる1μgのHisタグ-フリーMPERビオチンを、37℃にて2時間、ウェル中でインキュベートした。ウェルをその後PBS-Tで五回洗浄し、0.1％のカゼインを含むPBS（PBS-C)で、マウスの血清を連続希釈し、37℃で30分間インキュベートした。ウェルをPBS-Tで五回洗浄し、その後PBS-Cで希釈した100μLのヤギ抗-マウスIgG-HRP（GenScript #A00160)をウェルに添加して、1μg/mLの二次抗体を含む最終濃度に調節し、37℃で30分間インキュベートした。ウェルをPBS-Tで五回洗浄し、その後、100μLのテトラメチルベンジジン基質溶液(Amresco #J644)を各ウェルに添加し、37℃で20分間インキュベートした。反応を100μLの1M HClで停止し、450 nmで吸収を測定した。力価は、450 nmでの吸光度が、非血清バックグラウンドの同一希釈を、0.05吸光度単位より大きく超えたときの、希釈度の逆数と定義した。全てのサンプルは、二重測定して平均した。
【００９６】
ウイルス侵入実験
上述したようにして、ウイルス侵入実験を実施した。簡単に説明すると、HIV-1は、293T細胞にpHXB2-envとpNL4-3.HSA.R-Eを共トランスフェクションすることにより、産生した。トランスフェクションの2日後、細胞培地を、0.45μmのフィルターに通し、遠心した。ウイルスペレットを乾燥し、600μLのPBS中に再懸濁し、−80℃で貯蔵した。HIV-1ストックの感染力価を、上述したようにして、X-Gal染色によって決定した。
【００９７】
MPER及びCoPoPリポソームで免疫化した三匹のマウスの血清をプールし、固定化プロテインGビーズ(VWR #PI20398)を用いて、供給業者のプロトコルに従って、IgGを単離した。濃度はブラッドフォード分析による吸収から決定した。2F5を、フリーNIH AIDS試薬プログラムから入手した。ウェルあたり1×104 TZM-bl受容細胞を、感染の前日に、96ウェルプレートに蒔いた。HIV(感染効率0.1)を、抗体と共に37℃で30分間インキュベートし、細胞に添加し、ウイルスが接種された細胞を25℃で1時間、1000 rcfで遠心し、続いてさらに5％CO2インキュベーター中で、37℃で2日間インキュベートした。その後、細胞生存率をCellTiter-Fluor Assay（Promega)を使用して、製造者のプロトコルに従って測定した。その後、ウイルス侵入レベルを、ルシフェラーゼ分析システム(ONE-Glo, Promega)によって、製造者のプロトコルに従って測定し、ウイルスのみのサンプルを基準として正規化した。データをさらに、細胞生存率について正規化した(全てのグループが、コントロールの未処理細胞の10％内の生存率を示した)。
【００９８】
結果
【００９９】
CoPoPリポソームに結合しているHisタグ化タンパク質
遷移金属であるCo、Cu、Zn、Ni及びMnを用いて、一連のsn-1-パルミトイルsn-2-ピロフェオホルビド ホスファチジルコリンのキレートを作製した（図１ｃ）。その後、10モル％の金属PoPを用いて、85モル％のジオレオイルホスホコリン(DOPC)と5モル％のポリエチレングリコール-コンジュゲート型ジステアロイルホスホエタノールアミン(PEG-脂質)とともに、PoP二重層を形成し、押出により100 nmのリポソームとした。PoP二重層に結合しているHisタグ化タンパク質を、蛍光タンパク質レセプターを用いて評価した。図２ａに示すように、このシステムは、２つの連結された蛍光タンパク質であるセルリアン(青色発光)及びビーナス(緑色発光)からなる融合タンパク質を含んだ。それらが近接して連結しており、スペクトルが重複していることにより、セルリアンは、ビーナスのフェルスター共鳴エネルギー転移(FRET)ドナーとして働き、セルリアンの励起がビーナスからのFRET発光をもたらす。セルリアンのＣ末端をヘプタヒスチジンタグで標識した。しかしながら、PoP二重層に結合した場合、セルリアンからのエネルギー転移は、二重層それ自体に回され、セルリアン発光範囲で消滅し、それゆえビーナスへのFRETと競合する。他方では、ビーナスが、フォトニック二重層に直接付着していないため、それは、直接励起により完全には消光せず、結合融合タンパク質の追跡を可能にする。
【０１００】
様々なPoPリポソームに結合しているレポーター融合タンパク質を評価するために、三色電気泳動移動度シフト分析(EMSA)を開発した。2.5μgのタンパク質を、様々なPoPリポソーム50μgとともに、24時間インキュベートし、その後アガロースゲル電気泳動にかけた。図２ｂの上段の画像に示すように、PoPリポソームを遊離塩基(2H)のみで画像化した場合、リポソームは容易に可視化され、Zn-PoPリポソームの程度はより低かった。このことは、金属がPoPにクエンチング効果を有することを実証し、それらが二重層に安定にキレート化されていることを確認する。予期されたように、リポソームは、それらの相対的に大きいサイズのために、最も小さい電気泳動移動度を示した。次に、FRETの抑制を探るために、PoPリポソームに結合している融合タンパク質の指標となるであろうセルリアン励起とビーナス発光を使用して、同じゲルを画像化した。全てのサンプルが、同じ量のFRETを示し、遊離タンパク質と同じ距離を移動したが、CoPoPリポソームとインキュベートされたタンパク質は例外であり、この場合FRETは完全に消滅した（中段の画像）。タンパク質の存在を検証するために、ビーナスを直接励起し、画像化した。CoPoPリポソームを用いたときだけ、レポータータンパク質は、リポソームと共局在化した。あわせて、これらの画像は、タンパク質がCoPoPリポソームに定量的に結合したことを実証する。溶液ベースの研究は、この発見を裏付けた（図２ｃ）。試験した全ての種類のPoPリポソームのうち、CoPoPのみが、リポソームの結合に起因して、セルリアンとビーナス間のFRET効率に著しい減少をもたらした。この結合は、50％結合(ｔ1/2)に達する時間はわずか三時間であったが、完全に完了するのにほぼ一日を必要とした。2H-PoP二重層の分子動態シュミレーションによって、ポルフィリンの中央(金属キレート化が生じる場所)は、二重層を取り巻く水相にアクセスできないことが示された。それゆえ、この遅い結合はタンパク質の残りで部分的に覆い隠されており、且つ、保護された疎水性の二重層内に入らなければならないHisタグに起因し得る。
【０１０１】
ポリヒスチジンのCoPoPとの配位
固定化金属へのHisタグ結合の基礎となるメカニズムは、ヒスチジン残基の窒素含有イミダゾール基の金属配位を含む。Ni(II)、Cu(II)、Zn(II)及びMn(II)PoPを用いて形成されたリポソームへのHisタグ結合の欠損は、ポルフィリン内の軸配位子の結合親和性又は配位数に関与すると思われる。例えば、Ni(II)及びCu(II)ポルフィリンキレートは、軸配位子なしで、周囲の４つの大環状窒素原子に完全に配位できることが提唱されてきた。Zn(II)及びMn(III)ポルフィリンについては、配位子結合強度は、安定なポリヒスチジン結合を与えるのに不十分と思われる。
【０１０２】
CoPoPの電子状態を決定するために、常磁性を評価した。Co(II)は常磁性であるが、Co(III)ポルフィリンは低スピンで反磁性であるため、常磁性種によって誘発されるピーク広幅化を調べるためにNMRを使用した。図２ｄに示されるように、PoP内のビニル基の各炭素に結合した水素に基づいて、ピークの広幅化が、CoPoPについてのみ、及び有機溶媒中でのみ観察された。CoPoPが水性リポソーム内に形成された場合、ピークは狭くなり、二重層内での反磁性Co(III)への酸化の指標となった。このメカニズムをさらに検証するため、CoPoPリポソームが蛍光標識Hisタグ化ペプチドに定量的に結合した後、還元剤である亜硫酸ナトリウムをCoPoPリポソームに添加した。図２ｅに示すように、2 Mの亜硫酸塩は、CoPoPリポソームからのペプチド放出を誘発した。リポソームはまた、市場で入手できるNi-NTA脂質を用いて形成された。Hisタグ化ペプチドは、Ni-NTAリポソームに強く結合しなかった。容易に還元できないNi(II)から予測されるように、前記系への亜硫酸塩の添加により、ペプチドの放出は観察されなかった。さらに、これらのデータは、CoPoPリポソームが形成され、ポリヒスチジン・イミダゾール基が、二重層内でPoP中のキレート化Co(III)と配位すると、CoPoPがCo(II)からCo(III)へ遷移することを示唆する。
【０１０３】
CoPoPリポソームへの安定なHisタグ結合
その後、CoPoP又はNi-NTA-脂質のどちらかを包含するリポソームへのHisタグ化タンパク質の結合を比較するために、蛍光レポータータンパク質を使用した（図３ａ）。FRETに基づいてタンパク質の結合を定量可能にするために、Ni-NTAリポソームは10モル％の2H-PoPを含んだ。EMSAによると、リポソーム無しでインキュベートされたとき、又は2H-PoPリポソームとともにインキュベートされたとき、タンパク質はFRETチャネル及びタンパク質チャネルの両方で、妨げられずに移動した。Ni-NTAリポソームとともにインキュベートしたとき、タンパク質の移動は、わずかに阻害されただけであり、タンパク質の結合が、電気泳動のコンディションに抵抗しないことを示唆した。FRETチャネルは消光されず、Ni-NTAリポソームへの結合がないことを確認した。これに対して、CoPoPリポソームとともにインキュベートした場合、タンパク質は安定に結合し、FRETチャネルの完全な消滅と、電気泳動移動度の減少(これはリポソームに結合したままのタンパク質と一致する)を伴った。
【０１０４】
生物医学的応用のために、Ni-NTA-脂質を使用することの解決困難な障壁は、それが血清のような生体媒体中で、安定なHisタグ結合を維持しないことである。リポソームが血清の存在下で結合を維持できるかどうか試験するために、Hisタグ化タンパク質と結合させたリポソームの溶液に、ウシ胎児血清を1：1の容積比で添加した。図３ｂに示すように、Ni-NTAリポソームは、全てのタンパク質を完全には捕捉せず、これはEMSAの結果で示された弱い結合と一致する。さらに、血清の添加後、全ての結合が24時間かけて消滅した。同じコンディション下で、CoPoPリポソームは、実質的なタンパク質の放出無しに、Hisタグ化レポータータンパク質を安定に捕捉した。
【０１０５】
ヒスチジン側鎖がイミダゾール基を含むことから、Ni-NTAとCoPoPリポソームのHisタグ化ポリペプチドとの結合安定性を比較するために、イミダゾール拮抗分析を使用した。図３ｃに示すように、CoPoPリポソームは、1 Mに近いイミダゾール濃度でさえ、レポータータンパク質への75％を超える結合を維持した。これは、結合研究で使用した100 nMのタンパク質濃度より約1000万倍過剰なイミダゾールを意味する。これに対して、Ni-NTAリポソームは、たった30 mMのイミダゾールの存在下で、90％を超えるHisタグを放出した。HisタグへのCoPoPリポソームの非常に強い結合は、少なくとも２つの要因：イミダゾール基へのCo(III)の非常に安定なキレート化、及びCoPoP二重層の保護された疎水性環境(外部の分子と競合するためのアクセスを制限する)に起因する可能性がある。
【０１０６】
Ni-NTA-脂質、コバルト-キレート化Co-NTA-脂質、及びCoPoPを用いて形成されたリポソームは、溶液中で蛍光ペプチドに結合できた（図７ａ）。しかしながら、Co-NTA及びNi-NTAの結合は、ゲルろ過クロマトグラフィーの間に維持されなかった（図７ｂ）。Co-NTA及びNi-NTAを用いて形成されたリポソームは、血清中でインキュベートした際、ペプチドを放出したが、CoPoPはしなかった（図７ｃ）。このことは、二重層に閉じ込められたポリヒスチジン結合の有意性を実証する。我々は次に、CoPoPが血清中での安定な結合のために要求されるのか否か、あるいは、単純なリポソーム-に挿入されたコバルトポルフィリン(Co-pyro)で十分なのかを試験した。最初の結合後、血清とのインキュベーションは、ポリペプチドをリポソームから追い出した（図８）。この結果は、膜に挿入されたポルフィリンが血清成分と容易に交換され、リポソームの外に出たが、PoPはそうではなかったという最近の実証と一致する。これらの結果を総合すると、Hisタグ化ポリペプチドと安定に結合するための、CoPoPの重要な役割が示唆される。
【０１０７】
CoPoPリポソームへのペプチドの結合
【０１０８】
ペプチドの標的指向化は、疾患及び組織特異的な「郵便番号(zip codes)」としての使用のために、関心を持たれている。短いRGDトリペプチドは、フィブロネクチン及びビブロネクチン(vibronectin)に見られ、腫瘍血管内皮細胞上に発現したインテグリンαVβ3へのその効率的な結合のために、有望な標的指向性リガンドである。線状単鎖アミノ酸配列GRGDSPKGAGAKG-HHHHHHH（配列番号１)を用いるHisタグ化リガンドアプローチによって、CoPoPリポソームを標的細胞上の分子レセプターに送達できるかどうかを検証するために、CoPoPリポソームを試験した。FRETによりPoP-リポソームへの結合を検出可能にするために、カルボキシフルオレセイン(FAM)をＮ末端上に標識した。線状RGDペプチドが、インテグリン結合を妨害することなく、フルオロフォアで標識できることが証明された。図４ａに示すように、このペプチドを様々な金属-PoPリポソームとともにインキュベートすると、CoPoPのみが、このペプチドに結合した。タンパク質結合に比べて、ペプチド結合は約５倍速かった。おそらく、大きさが小さいほど、分子の動きが速く、ペプチドの低い立体障害が、二重層へのより速い嵌合を可能にし、CoPoPと相互作用し、不可逆的に結合する。各〜100 nmのリポソームが約80,000の脂質を含むという先の推定に基づくと、これはリポソームあたり、8000のCoPoP及び750のペプチドと同じである。各ペプチドが７つのヒスチジン残基を含むため、二重層におけるCoPoPとヒスチジンの比は1：0.66であった。Ni-NTAに結合する従来のHisタグでは、Hisタグの全ての残基のうち、i番目と、i＋2番目又はi＋5番目のヒスチジン残基のみが、金属との配位に関与すると考えられている。CoPoP二重層内のポルフィリンとポリヒスチジン密度はより高いと思われ、それゆえ配位メカニズムは異なるかもしれない。
【０１０９】
CoPoPリポソームへのペプチド結合に対するHisタグ長の影響を試験した。一連のＮ末端FAM標識ペプチドを、Ｃ末端に付着させるHisタグの長さを変えて合成した。図４ｂで実証されているように、Hisタグをペプチドから取り除いた場合、ペプチド結合は観察されなかった。二つのヒスチジン残基が付いている場合、結合は遅く、結合ｔ1/2はほぼ10時間になった。Hisタグが長くなると、結合速度は急速に増加した。一般的なヘキサヒスチジンタグに相当する六つの残基を用いると、結合ｔ1/2は1時間未満になった。Hisタグの長さを10残基まで増加することにより、結合ｔ1/2は20分まで減少した。
【０１１０】
次に、Hisタグ結合に対する膜流動性の影響を判定するために、脂質組成を変化させた。リポソームを、90モル％のDSPC、DMPC又はDOPCと、10モル％のCoPoPを用いて形成した。あるいは、50モル％のコレステロールを二重層に取り込み、それに応じて使用する標準脂質の量を減らした。DSPCが室温で、強固なゲル相の二重層を形成するのに対し、DMPC及びDOPCは、より低い転移温度を有し、液晶相内にある。コレステロールは二重層中のスペースを占め、膜流動性への緩和効果を有し得る。興味深いことに、コレステロールの有無に関わらず、組成の異なる膜について、ペプチド結合速度に大きな違いは観察されなかった（図４ｃ）。ペプチド結合プロセスは、多段階プロセスで発生する可能性があり、一旦ペプチドの二重層への挿入が始まると、ポリヒスチジンの協同作用は、脂質組成によって影響されない。しかしながら、5 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)中では、膜がコレステロールを有するか否かで、著しい違いが観察された（図４ｄ）。コレステロール無しのリポソーム中の遅い結合は、BSAとペプチド結合に干渉する膜との大きな相互作用に起因すると思われた。結合半減期は、50 mg/mLのBSAを用いると達成されず、血清は結合を完全に阻害した（図９、図１０）。
【０１１１】
カーゴを積んだリポソームのバイオターゲティング
リポソームへのHisタグ化ペプチドの結合活性を前提として、ペプチド結合が膜の不安定化を誘発するかどうかを判定するために、二重層の完全性を評価した。リポソームの水性コアに、フルオロフォアスルホローダミンＢ、水様性色素を自己消光濃度で積み込み、膜透過性を調べた。図５ａに示すように、色素を含むリポソームは、８時間にわたって相当量の色素を放出せず、ペプチドはリポソームに完全に結合していた。２４時間時点で、ペプチドと結合したCoPoPリポソームは、10％未満の色素を放出した。このように、Hisタグの挿入と結合プロセスは、二重層の完全性及び封入したカーゴを無傷に保つのに十分に穏やかで非破壊的であった。類似したパルミトイル化リポペプチドは、インキュベーションすると、カーゴ-含有リポソームの透過性をもたらし（図１１）、Hisタグアプローチの頑強さをさらに実証した。
【０１１２】
次に、U87膠芽腫細胞(RGD-結合)及びMCF7乳癌細胞(RGD非結合)の確立された細胞株ペアを用いて、RGD-装飾リポソームが、それらの分子標的に結合できるかどうかを評価した。スルホローダミンＢの封入後、まずリポソームをHisタグ化RGDペプチドと、その後、両方の細胞株とインキュベートした。約550のペプチドが、各リポソームに付着した。リポソームの取り込みは、洗浄及び溶解(カーゴ自己消光作用を除去するため)後、細胞内の蛍光を試験することによって評価した。図５ｂに示すように、標的化CoPoPリポソームとインキュベートされたU87細胞では、高いリポソーム取り込みが観察されたのに対し、MCF7細胞で生じた結合は無視できるほどであった。予想通り、RGD標的指向性リガンドがなければ、どの細胞株でも取り込みは生じなかった。リポソーム形成におけるPEG-脂質の封入は、どの細胞株も標的としないリポソームをもたらした。PEGの存在がペプチドを妨害する作用を有し、二重層表面に直接繋留されると思われる。結合は、過剰な遊離RGDペプチドの存在で阻害でき、このアプローチのターゲティング特異性が確認された。共焦点顕微鏡法は、これらの結合の結果を実証した（図５ｃ）。FAM標識ペプチドは、PoPリポソームによって消光したが、標的指向性ペプチドとリポソームカーゴの両方の結合を検証するのに十分なシグナルが残った。カーゴとペプチドの両方が、U87細胞に内部移行し、共存した状態となった。CoPoPリポソームと標的指向性ペプチドを、U87細胞とのインキュベーションの直前に添加混合すると、標的指向性ペプチド自体はU87細胞に結合したが、リポソームに付着する時間はなく、標的化されないままであった。同じ結果が、ペプチドと結合していない2H-PoPリポソームで観察された。ペプチド結合は、わずか1モル％のCoPoPとともにリポソームが形成されたときに維持され（図１２ａ）、U87細胞への選択的結合を維持した（図１２ｂ）。Hisタグ化cRGD成分とインキュベートしたカーゴ含有リポソームを、U87腫瘍を有するヌードマウスに静脈注射した。図５ｄに示すように、静脈注射後45分で、標的化リポソームが腫瘍内に蓄積し、非標的化リポソームと比べて2.5倍の活性を有した。これらのデータは、CoPoPリポソームは、リポソームのコアにカーゴを積み込むことができること、カーゴの漏出を引き起こすことなく、Hisタグ化標的指向性ペプチドで標識できること、インビトロ及びインビボで、特異的な表面タンパク質を発現している細胞に発現した分子レセプターに向かうことができることを示す。
【０１１３】
リポソームは、生物医学的用途において使用される全ての種類のナノ物質の一部を代表するにすぎない。CoPoPは、Hisタグのために選択的接着性を有する一般的な表面コーティングとして評価された。金ナノ粒子が、モデルナノ粒子として使用された。これは、金ナノ粒子が、多数の生物学的用途で使用されているためである。脂質-被覆金ナノ粒子のために確率されたプロトコルを使用して、PoP-脂質の薄膜を水和するために、クエン酸塩で安定化した60 nmの金分散系を使用した。遠心分離と再懸濁を繰り返すと、クエン酸塩が取り除かれ、ナノ粒子の凝集が生じた（図１３ａ）。しかしながら、PoP-脂質の存在下では、ナノ粒子は被覆され、分散性のままであった。クエン酸塩で安定化した金と比べて、PoP-被覆ナノ粒子は、金を覆う二重層コーティングに相当する、わずかに大きい流体力学的径を有した（図１３ｂ）。Hisタグ結合後のコーティングの存在は、540 nmでの金のプラズモンピークに影響を与えず、リガンド結合の温和な性質を実証した（図１３ｃ）。図１３ｄに示すように、RGD-His CoPoP-被覆金ナノ粒子だけが、U87細胞を標的とし、遊離RGDは、後方散乱顕微鏡によって測定される結合を阻害した。CoPoP金単独、及びRGD-Hisペプチドを伴う2H-PoP-被覆金は、U87細胞を標的とする効果を有さなかった。
【０１１４】
抗原性リポソームの開発
HIVウイルス侵入を広域中和するモノクローナル抗体の多くが(例えば、2F5、Z13及び4E10)、gp41エンベロープタンパク質の膜近位外部領域(MPER)における保存線状エピトープを標的とし、MPERをHIVペプチドワクチンの主要ターゲットにしている。しかしながら、それはウイルス侵入中にのみ露出し、中和抗体を産生するためにMPERペプチドを使用する試みは課題に直面してきた。これは、ワクチン接種戦略はMPERが中に存在する脂質二重層と抗体の相互作用を考慮すべきだとするパラダイムを生じていた。我々は、リポソーム-結合MPERペプチド配列と組み合わせた、Toll様レセプター４(TLR-4)アゴニスト・モノホスホリルリピドＡ(MPL)を含むリポソームを使用した。しかしながら、Ni-NTAリポソームへのMPER Hisタグ化ポリペプチドの結合をベースとする単純なアンカー技術の使用は、低い抗体価を生じさせた。我々は、同じアプローチが、CoPoPリポソームを用いて強化できるかどうかを試験した。
【０１１５】
MPER-His配列であるNEQELLELDKWASLWNGGKGG-HHHHHHH（配列番号１1)を用いて、リポソーム-ペプチドのワクチン接種システムを使用した。MPER-Hisペプチドを、MPLを含むCoPoPリポソームに結合した。25μgのMPER-His及び25μgのMPLを含む単回注射を、BALB/cマウスと胸腺欠損ヌードマウスに投与した。これは、BALB/cマウスとヌードマウスの両方に、104オーダーの力価を誘発し、強い液性免疫応答を実証した（図６ａ）。HIVはヘルーパーＴ細胞集団に感染し、Ｂ細胞性応答を重要にするため、このことは重要かもしれない。ブースター注射の後、胸腺欠損ヌードマウスにおける抗-MPER力価は影響を受けず、しかし健康なマウスでは、力価は一桁増加し、Ｔ細胞性記憶効果を実証した。それゆえ、ワクチン接種プロトコルは、Ｂ細胞性及びＴ細胞性免疫の両方を生じさせた。
【０１１６】
次に、免疫応答の特異性をよりよく判定するために、各種のワクチン成分を試験した（図６ｂ）。MPER-Hisペプチドは、フロイント完全アジュバント中、又はMPLを含む2H-PoPリポソームとともに、それ自身が注射された際は、抗体を誘発しなかった。興味深いことに、ペプチドを、MPLを含まないCoPoPリポソームを用いて投与すると、抗体は全く産生されなかった。別の脂質アジュバントである、トレハロースジベヘネート(TDB)も、いかなる抗体産生も誘発しなかった。TDBはTLR-4に作用せず、このことは、リポソームワクチンシステムの免疫活性化におけるMPLの重要性を強調する。Ni-NTAリポソームに結合したMPER-Hisを使用した場合、以前の報告と一致する、103未満の弱い抗体価が確認された。しかしながら、CoPoPリポソームを使用すると、二桁強い応答が観察された。おそらく、インビボにおけるペプチドのリポソームへの安定な結合は、この効果に直接の原因がある。このCoPoP免疫化戦略は有効であり、少なくとも三か月間持続する抗体価を伴うのに対し、Ni-NTAリポソームでは一か月を過ぎて検出された抗体は無かった（図６ｃ）。
【０１１７】
マウスのワクチン接種後の血清をプールし、プロテインＧアガロースを使用して精製し、精製IgGを得た。その後、これをHIVによるウイルス侵入の阻害を評価するために使用した（図６ｄ）。ワクチン接種マウスの精製IgGを、最終濃度0.2 mg/mLで使用した場合、ウイルス侵入は75％以上阻害された。この阻害効果は、2μg/mLの濃度でインキュベートされた広域中和モノクローナル抗体2F5の効果より大きかったが、20μg/mLの濃度でインキュベートされた2F5の効果より小さかった。これらのデータは、ウイルスの侵入を防止できる抗体産生を誘導するために、HIV-由来ペプチドとともにCoPoPリポソームを使用するワクチン接種アプローチのポテンシャルを示す。
【実施例２】
【０１１８】
本実施例では、Hisタグ化Pfs25、熱帯熱マラリア原虫由来の組換えタンパク質、及びCoPoPとMPLAを含むリポソームを使用してワクチンを開発した。
【０１１９】
リポソームの調製
CoPoPと2H-PoPリポソームを生成するために、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、コレステロール(CHOL)、モノホスホリルリピドＡ(MPLA)、及びCoPoP(あるいは2H-PoP)を、表示のモル比でクロロホルム中に溶解した（表２）。一晩のＮ2流と減圧後、形成された乾燥脂質フィルムをPBS中で再水和し、最終脂質濃度を3 mg/mLとした。このリポソーム懸濁液を、氷冷CO2/アセトン及び水浴を使用して、11回の冷凍／解凍サイクルにかけ、続いて200 nmのポリカーボネート膜を通して、60℃で10回押し出した。
【０１２０】
Psf25昆虫タンパク質(super sf9細胞から精製した組換えサブユニットPfs25、BCA分析によって測定した濃度は1 mg/mL)を、4℃にて一晩(20時間)リポソームと併せた。H2O中でインキュベートしたPsf25をコントロールとした。ネガティブコントロールとして、BSAをリポソームと併せた。Psf25タンパク質とリポソームの結合は、微小遠心ろ過法で測定した。
【表２】
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【０１２１】
結合のための微小遠心ろ過
CoPoPとPsf25タンパク質、基準PoP(コバルト無し)とPsf25タンパク質、及び水とPsf25タンパク質を、Nanosep遠心装置(100K, OMEGA)内に置いた。使用前に装置をQH2Oですすぎ、1100 rpmで3分間遠心した。各サンプルを加え、1400 rpmで3分間回転した。装置をQH2Oで二回洗浄し、1400 rpmで3分間遠心した。底のろ液からサンプルを集め、562 nmで吸光度を測定するBCA分析(Thermo cat.23235)で、タンパク質濃度を分析した。
【０１２２】
ワクチン接種
0日目及び21日目に、CD-1マウス（8週齢のメス、Envigo）に、5、0.5、0.05μgのPsf25タンパク質を筋肉内注射(i.m.)した。表示がある場合、この注射は、リポソーム内に取り込まれた20μgのMPLAも含んだ(Avanti No.699800P)。ISA720も、5μgのPsf25タンパク質とインキュベートしたアジュバントとして使用した。処置グループ及びフローチャートを表３に示す。
【表３】
2018513156.tif 000006
【０１２３】
ELISAによる血清抗-Psf25 IgGレベル
抗-Psf25力価を、96-ウェルプレート(Thermo, Maxisorp)で、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって評価した。100μLのコーティングバッファー(3.03 g Na2CO3及び6.0 g NaHCO3/1L蒸留水、pH 9.6)中のHisタグ化Psf25（0.1μg)を、ウェル中で一晩4℃でインキュベートした。ウェルを0.1％のTweenを含むPBS（PBS-T)で三回洗浄し、0.1％のカゼインを含むPBS（PBS-C)でブロックし、その後2時間インキュベートした。ウェルをその後PBS-Tで三回洗浄し、ヤギ抗-マウスIgG-HRP（GenScript No.A00160)を1μg/mLになるまでPBS-Cで希釈し、各ウェルに添加した。テトラメチルベンジジン(Amresco No.J644)を添加する前に、ウェルを再度PBS-Tで六回洗浄した。
【０１２４】
結果
【０１２５】
Psf25タンパク質被覆後の、リポソームとタンパク質結合能の評価
動的光散乱によって測定した、Psf25タンパク質が結合する前後のCoPoPリポソームの平均径は、それぞれ122.9及び139 nmであり（図１４Ａ）、多分散指標は約0.05で同程度であり、結合後も望ましいリポソームのサイズを高い単分散度とともに示した。さらに、Psf25タンパク質が効率的及び特異的にCoPoPリポソームに結合するかどうかを調べるために、Pfs25をCoPoPリポソーム又は2H-PoPリポソームとともに4℃で一晩インキュベートし、続いて、リポソームへのタンパク質結合を微小遠心ろ過によって測定した。BCA分析によって検出されたろ液中のPfs25の量によると、Psf25の大部分がCoPoPリポソームに結合したが(99.27％)、2H-PoPリポソームには結合しなかった(12.33％)。CoPoPリポソームへのPfs25の結合は、〜99％であった（図１４Ａ）。
【０１２６】
抗-Pfs25 IgGレベル 
【０１２７】
CD-1マウスに、i.m.により、Psf25（5、0.5及び0.05μg濃度)とコンジュゲートしたCoPoP/MPLA/Pfs25リポソームもしくはPsf25とコンジュゲートしていないものを、又は遊離Psf25(ISA70有り又は無し)を、0日目(予備刺激)及び21日目(追加免疫)にワクチン接種した。20日及び42日目に、血清を採取し、抗-Psf25 IgG力価をELISAで測定した（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。CoPoP/MPLA/Psf25リポソームによる追加免疫前のマウスは、5μgと0.5μgのPsf25コンジュゲート型グループの両方で、同程度の血清IgGレベルを示した。各処置群について、希釈の異なる(1/1000から開始)抗-Psf25 IgG-血清サンプルを、Psf25(プラント)ELISAで試験した（表３）。ここで、カットオフポイントは、0.5に等しいO.D.に設定した。データは、G1及びG2（5又は0.5μgのPsf25タンパク質とコンジュゲートしたCoPoP/MPLA/Pfs25リポソームを表す。表３)において、追加免疫後にIgG力価が1/5000から1/45000まで変化したことを示す。他方、0.05μgのPsf25タンパク質とコンジュゲートしたCoPoP/MPLA/Pfs25リポソームのIgG力価は、追加免疫後に、1/1000から1/15000に切り替わり、同様の結果がG6（ISA70とインキュベートされた5μgのPsf25タンパク質を表す)で示された。このデータは図１６にも反映され、図１６は、CoPoP/MPLAリポソーム中の0.05 ugのPfs25の力価が、ISA720中の5μgのPfs25より高い力価を生じさせたことを示す。
【実施例３】
【０１２８】
本実施例では、熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク由来NANPの反復配列を含む合成Hisタグ化ペプチドを使用してリポソームワクチンを開発した。リポソームは実施例１と同じ組成を有したが、タンパク質の代わりにペプチドを使用した。試験したペプチドを図１７Ａに示す。動的光散乱によって測定した、異なるNANPが結合する前後のCoPoPリポソームの平均径は、それぞれ122.9及び139 nmであり（図１７Ｂ）、多分散指標は約0.05で同程度であり、結合後も望ましいリポソームのサイズを高い単分散度とともに示した。さらに、NANPペプチドが効率的及び特異的にCoPoPリポソームに結合するかどうかを調べるために、NANPペプチドをCoPoPリポソーム又は2H-PoPリポソームとともに4℃で一晩インキュベートし、続いて、リポソームへのペプチド結合を微小遠心ろ過によって測定した。BCA分析によって検出されたろ液中のペプチドの量によると、NANPの大部分がCoPoPリポソームに結合したが(〜80％、異なるペプチド長)、2H-PoPリポソームには結合しなかった(20％未満)。CoPoPリポソームへのNANPの結合は、様々なペプチド長のすべてにおいて〜80％であった(図１７Ｃ)。
【実施例４】
【０１２９】
本実施例では、Hisタグ化提示分子への抗体応答を低減するために、ホスファチジルセリン(PS)を含むCoPoPリポソームを使用した。薄膜水和と押出により、CoPoP：ホスファチジルセリン：DOPC：コレステロール＝10：30：30：30で、リポソームを形成した。その後Hisタグ化MPERをリポソームに結合した。これらのPSリポソームを、MPERで装飾したCoPoP/MPLAリポソームによるワクチン接種の4週間及び2週間前にマウスの足蹠から注射した。図１８に示すように、PSリポソームを用いた前処置は、MPERに対するIgG力価の減少をもたらした。
【実施例５】
【０１３０】
本実施例では、CoPoPのリポソームは、Hisタグ化細胞透過性ペプチドにより、細胞を標的とした。以下のHisタグ化細胞透過性ペプチドが得られた：
HHHHHHHGRKKRRQRRRPPQ（配列番号１３)(TATペプチド)；
HHHHHHHRRRRRRRR（配列番号１４)(R8ペプチド)：
HHHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１５)(PENペプチド)。
図１９に示すように、[PoP:CoP:CHOL:DMPC][2:5:30:63]を含むCoPoPリポソームと直接水性インキュベーションした後、これらのリポソームは、U87細胞との１時間のインキュベーション後に、結合し取り込まれることができた。
【０１３１】
本発明を、特定の実施例を通じて説明してきたが、通常の変更は当業者に自明であり、そのような変更は本開示の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７ＢＣ】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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