(57)【要約】  本開示は、一般に、キトサン、親水性ポリマー、ゲル化剤、及び任意に追加の成分を適切な媒体中に含むゾル−ゲルポリマー複合体に関する。有利には、ゾル−ゲルポリマー複合体は、１つ以上の生理学的刺激に応答して耐久性のあるシールまたは強固な固体を形成することができる。本開示はさらに、酪農動物における乳房障害の発症を低減または防止するための、複合体の医学的及び獣医学的使用、特に方法及び送達システムに関する。さらに特に、本開示は、乳腺炎等の乳房障害の予防的治療のために、非ヒト動物の乳頭表面上または乳頭管もしくは乳頭槽において、物理的バリヤを作り出すための方法及びゾル−ゲルポリマー複合体組成物を含み、ゾル−ゲルポリマーは１つ以上の生理学的刺激に応答してシールを作り出す。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
雌の非ヒト動物における乳房障害を予防または治療するための製品であって、有効量のゾル−ゲルポリマー複合体を含む、製品。
【請求項２】
前記ゾル−ゲルポリマー複合体が、キトサン、親水性ポリマー、ゲル化剤、及び適切な媒体を含む、請求項１に記載の製品。
【請求項３】
前記媒体が、酢酸水溶液である、請求項２に記載の製品。
【請求項４】
前記キトサンが、アシル化されている、請求項２に記載の製品。
【請求項５】
前記アシル化キトサンが、カルボキシメチルキトサンである、請求項４に記載の製品。
【請求項６】
前記親水性ポリマーが、水溶性多糖類である、請求項２に記載の製品。
【請求項７】
前記親水性ポリマーが、メチルセルロース、ポリビニルアセテート、ポリビニルアセテートアシレート、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ヒアルロン酸、非イオン性トリブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、及びアルギン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項２に記載の製品。
【請求項８】
前記親水性ポリマーが、非イオン性トリブロックコポリマーであり、前記非イオン性トリブロックコポリマーが、ポロキサマーである、請求項７に記載の製品。
【請求項９】
前記ゲル化剤が、熱ゲル化要素である、請求項２に記載の製品。
【請求項１０】
前記ゲル化剤が、β−グリセロリン酸二ナトリウム水和物、β−グリセロリン酸二ナトリウム五水和物、四塩基性ピロリン酸ナトリウム、二塩基性リン酸カリウム三水和物、及びそれらの混合物からなる群から選択される塩である、請求項２に記載の製品。
【請求項１１】
前記ゾル−ゲルポリマー複合体が、強化剤をさらに含む、請求項２に記載の製品。
【請求項１２】
前記強化剤が、ナノ結晶セルロース、無機クレー、有機クレー、カーボンブラック、ヒュームドシリカ、グラフェン、グラファイト、ナノ結晶デンプン、ナノクレー、グラフェン、カーボンナノチューブ、有機ナノクレー、オルガノクレー、モンモリロナイト、ベントナイト、カオリナイト、ヘクトライト、ハロイサイト、及びリン酸カルシウムからなる群から選択される、請求項１１に記載の製品。
【請求項１３】
前記ゾル−ゲルポリマー複合体が、１つ以上の抗菌剤をさらに含む、請求項２に記載の製品。
【請求項１４】
前記抗菌剤が、マクロライド、セファロスポリン、リンコサミニド抗生物質、フルオロキノロン、テトラサイクリン、ペニシリン、スペクチノマイシン、スルホンアミド、クロラムフェニコール、チアンフェニコールのフッ化合成類似体、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１３に記載の製品。
【請求項１５】
前記抗菌剤が、セファロスポリンであり、前記セファロスポリンが、セフチオフル塩酸塩である、請求項１４に記載の製品。
【請求項１６】
雌非ヒト動物における乳房障害を予防または治療する方法であって、有効量のゾル−ゲルポリマー複合体を、前記動物の乳頭、乳頭管、または乳頭槽に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
乳房障害の予防または治療のために非ヒト動物の乳頭管または乳頭槽中に物理的バリヤを形成するためのシステムであって、ゾル−ゲルポリマー複合体を含有する送達デバイスを含む、システム。
【請求項１８】
前記送達デバイスが、シリンジである、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記シリンジが、単位用量または複数用量を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記乳房障害が、乳腺炎である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２１】
前記動物が、酪農家畜動物である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２２】
前記家畜動物が、幼雌ウシ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、またはスイギュウである、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記ゾル−ゲルポリマー複合体が、キトサン、親水性ポリマー、ゲル化剤、及び適切な媒体を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２４】
非ヒト動物における乳房障害の予防または治療のための医薬品の製造におけるゾル−ゲルポリマー複合体の使用。
【請求項２５】
前記乳房障害が、乳腺炎である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記医薬品が、乳頭浸漬のために用いられる、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
前記医薬品が、乳房内注入のために用いられる、請求項２４に記載の使用。
【請求項２８】
前記動物が、酪農家畜動物である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２９】
前記家畜動物が、幼雌ウシ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、またはスイギュウである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記ゾル−ゲルポリマー複合体が、キトサン、親水性ポリマー、ゲル化剤、及び適切な媒体を含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項３１】
ゾル−ゲル複合体が、強化剤をさらに含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記ゾル−ゲル複合体が、１つ以上の抗菌剤をさらに含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
酸性水性媒体中にキトサン、親水性ポリマー、及びゲル化剤を含むゾル−ゲルポリマー複合体であって、１つ以上の生理学的刺激に応答して強固な固体を形成する、ゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項３４】
前記１つ以上の生理学的刺激が、約３７℃の温度である、請求項３３に記載のゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項３５】
前記ゾル−ゲルポリマー複合体が、任意の他の薬剤を添加せずに、１つ以上の生理学的刺激に応答して固体を形成することができる、請求項３３に記載のゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項３６】
ゾル−ゲルポリマーが、前記１つ以上の生理学的刺激に応答して急速に凝固する、請求項３５に記載のゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項３７】
前記キトサンが、カルボキシメチルキトサンである、請求項３３に記載のゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項３８】
前記親水性ポリマーが、メチルセルロース、ポリビニルアセテート、ＰＶＡ−アシレート、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、及びアルギン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項３３に記載のゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項３９】
前記ゲル化剤が、塩である、請求項３３に記載のゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項４０】
前記塩が、β−グリセロリン酸二ナトリウム塩または四塩基性ピロリン酸ナトリウムである、請求項３９に記載のゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項４１】
前記酸性水性媒体が、０．１Ｍ酢酸水溶液を含む、請求項３３に記載のゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項４２】
前記複合体が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をさらに含む、請求項３３に記載のゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項４３】
前記キトサンが、少なくとも約７７％の脱アセチル化度（％ＤＤＡ）を有する、請求項３３に記載のゾル−ゲルポリマー複合体。
【請求項４４】
ヒトの予防または治療のための医薬品の製造におけるゾル−ゲルポリマー複合体の使用。
【請求項４５】
有効量のゾル−ゲルポリマー複合体を、それを必要とするヒトに投与することを含む、ヒトにおける疾患または障害を予防または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、独特なゾル−ゲルポリマー複合体及びそれらの新規な使用に関する。より具体的には、本開示は、生理学的刺激に応答して強固な固体を形成するゾル−ゲルポリマー複合体に関するものであり、その強固な固体は、生理的刺激に応答して所定の透過性及び機械的特性を有する。その複合体は、容易に注射可能であって、剪断減粘性特性を有し、そのために、対象への注射後急速に凝固する液体を注射することが望ましい、ヒト及び動物の健康用途において広範囲で有用である。本開示はまた、複合体を乳頭シーラントとして利用して動物における乳腺炎の発症を低減または防止することにより、酪農動物の乳腺を病原性負荷から保護する新しい方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書で引用されるすべての特許及び刊行物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
ヒドロゲルは、水または他の体液中に分散された高度に水和した高分子網目構造である。温度上昇に伴って粘度が増加するという特定の特性を示すヒドロゲルは、熱可逆性の感熱性（または熱硬化性）ヒドロゲルとして知られている。感熱性ヒドロゲルは、β−１，４−グリコシド結合を介して連結されたＮ−アセチルグルコサミン単位から作られる線状多糖類であるキチンの部分的から実質的なアルカリ性のＮ−脱アセチル化によって得られる市販の安価なポリマーであるキトサン等の、天然に存在するポリマーから調製できることが知られている。脱アセチル化プロセスは、一般に、熱い濃縮水酸化物溶液、通常は水酸化ナトリウムを用いて行われる。
【０００４】
キトサンは、生体適合性で毒性がなく、非免疫原性であり、医療、医薬品、化粧品、及び組織構築分野での使用が可能である。例えば、局所眼内用途及び眼内注射または網膜近傍における移植で使用されている。さらに、キトサンは、ある特定の酵素、例えばリゾチームによって代謝−切断されるため、生分解性であるとみなすことができる。さらに、キトサンは上皮タイトジャンクションを開放することによって浸透増強剤として作用することが報告されている。キトサンはまた、創傷治癒を促進し、抗菌、抗真菌、及び抗腫瘍の特性を示す。
【０００５】
天然組織等の生物学的構造の複雑さを鑑み、液体として対象の皮膚または体内に導入され、単純な適用または注射によって固体または固体様に変化する生体材料及び医用デバイスの使用を研究者は探索してきた。例えば、キトサンヒドロゲルは、軟骨の再生及び急性ならびに慢性の軟骨欠損に関連する膝痛の予防に有用であることが示されている。キトサン系ゲルはまた、大量の新たに合成されたアニオン性プロテオグリカンを捕捉することによって、椎間板（ＩＶＤ）細胞のカプセル化のための足場になり、足場として役立つことも示されている。キトサンは、リン酸誘導体等のいくつかの多価アニオンの存在下で熱可逆性ゲルを形成することが知られている。キトサン／有機ホスフェート水性系等のイオン性多糖類ゲルの温度制御されたｐＨ依存性の形成は、例えばＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／０７４１６号及び米国特許第６，３４４，４８８号に記載されている。しかしながら、キトサン等のイオン性多糖類から作られるヒドロゲルは、弱く、通常は、ポリマー及び塩溶液を混合した後、比較的長い待ち時間後にしか形成されない。これは、主として、乏しい溶解性のために、高濃度のキトサン、特に高分子量のキトサンを有する均一で完全に水和したキトサン溶液を得ることが困難であるという事実に起因している。さらに、いくつかの医療用途では、単純なゾル−ゲル転移だけでなく、所望のマクロポロシティ及び機械的特性を有する固体構造の提供が必要である。さらに、温度は、非特異的な刺激であり、暑い天候または経口適用のために単純に高温飲料を飲む等の人体の外部の要素によって誘発されることがある。したがって、特定の生理学的刺激によって誘発されたときにのみ、所望の機械的及び／または透過性の特性に達し得る刺激応答性のインプラント及びパッチに関するニーズが存在する。
【０００６】
米国特許第９，０３４，３４８号は、ヒドロゲルを形成する注射可能なキトサン混合物を開示している。約３０％〜約６０％の範囲のアセチル化度を有する少なくとも１つのタイプのキトサンと、少なくとも約７０％の脱アセチル化度を有するキトサンの少なくとも１つのタイプとを含む、生理学的ｐＨ及び３７℃付近でヒドロゲルを形成するキトサン組成物が記載されている。少なくとも約７０％の脱アセチル化度及び１０〜４０００ｋＤａの分子量を有する少なくとも１つのタイプのキトサンと、２００〜２００００Ｄａの分子量を有する少なくとも１つのタイプのキトサンとを含む、生理学的ｐＨ及び３７℃付近でヒドロゲルを形成するキトサン組成物もさらに開示されている。また、キトサン組成物の調製及び使用方法も開示されている。
【０００７】
米国特許出願公開第２０１０／００２８４３４号は、温度制御及びｐＨ依存性の自己ゲル化バイオポリマー水溶液を開示している。自己ゲル化系及びゲルを製造するためのバイオポリマー液体水性組成物が開示されており、その組成物は、酸性水系媒体、０．１〜１０重量％のｐＨゲル化酸可溶性バイオポリマー、及び基本特性及びｐＫａが６．０〜８．４を有する０．１〜１０重量％の水溶性分子、または基本特性及び６．０〜８．４のｐＫａを有する分子の水溶性の残基もしくは配列を含む。その液体組成物は、５．８〜７．４の範囲の最終ｐＨを有し、１０〜７０℃の温度範囲内で安定な固体でかつ均一なゲルを形成する。その組成物を調製するための方法及びその使用もまた記載されている。
【０００８】
米国特許出願公開第２０１０／０２８５１１３号は、向上した安定性を有する逆熱ゲル化複合ヒドロゲルを開示している。複合ヒドロゲルは、アニオン性多糖類またはその誘導体、例えばヒアルロナン（ヒアルロン酸とも称される）またはその誘導体の水溶液と、分散ポリマー粒子を有するメチルセルロースまたはその別の水溶性セルロース誘導体、例えば微粒子及びナノ粒子から選択されるポリマー疎水性粒子の水溶液とのブレンドを含む複合ヒドロゲルが記載されており、そのヒドロゲルの安定性は、ヒドロゲル単独の安定性と比較して向上している。ポリマー粒子は、少なくとも１つの治療剤を含有することができ、その場合、各治療剤は、微粒子及び／またはナノ粒子の適切なポリマー製剤を選択することによって、調整または変更することができる線形持続放出速度を示す。複合体は、注射することができ、治療剤の非存在下では、再建及び美容手術のための増量剤として使用することができるか、または治療剤のその後の送達のためのプラットフォームとして機能し得る。
【０００９】
獣医学的健康問題が懸念される限りにおいて、乳腺炎は、ほとんどの場合乳頭開口部を介して腺に入る細菌によって典型的に引き起こされる乳房の炎症である。腺において非乳汁分泌期間または「乾乳期」の間、乳頭口（ｔｅａｔ  ｏｒｉｆｉｃｅ）及び線条管（ｓｔｒｅａｋ  ｃａｎａｌ）におけるケラチンの沈着物が主要な一次防御機構を形成する。動物の乳頭に形成されるケラチンプラグは保護バリヤを形成し、乳頭内のＦｕｒｓｔｅｎｂｕｒｇ’ｓ  Ｒｏｓｅｔｔｅの免疫富化組織（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｉｃｈ  ｔｉｓｓｕｅ）ならびに乾乳ウシ分泌物の天然保護因子は、高レベルの天然抗細菌物質（カチオン性タンパク質）を含み、それは、乳頭口から乳頭槽（乳頭洞）及び乳腺槽への細菌の通過を阻害する。しかしながら、このケラチンプラグ及びこれらの自然免疫防御機構は、動物が、乳汁分泌期間が終わって動物の乾乳期に入るとき、動物の乾乳期中、及び／または出産中に、細菌の侵入によって克服される場合がある。その結果、細菌は乳腺に侵入し、乾乳期中、より具体的には出産直後に乳腺炎を引き起こす。
【００１０】
乳腺炎を引き起こす主要な病原体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ種、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ等、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、大腸菌群、例えばＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、環境性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ種、例えばＳｔｒｅｐ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐ．ｕｂｅｒｉｓ、及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．等である。乳腺炎は、主に細菌によって引き起こされるが、炎症はまた、ウイルス感染（例えば、ウシヘルペスウイルスＩＩ及びＩＶ、パラバクシニアウイルス、例えばＰｓｅｕｄｏ  Ｃｏｗｐｏｘ等）の結果として、または真菌（例えばＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）のような異型病原体または（及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．））または藻類の微生物（例えばＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｐｐ．）による感染の結果として、二次細菌感染の発症を伴ってもしくは伴わずに、引き起こされる。
【００１１】
病原体の存在に起因する乳腺炎は、酪農場の領域内で高度に伝染性が高い状態になり、酪農産業にとって莫大な生産損失をもたらす可能性がある。次いで、飲用可能なミルクを人間が消費するのに適合しないものに変えてしまう有害な病原体の効果または様々な処置により飲用可能なミルクが減少する。重篤な症例は死に至り得る一方で、規制を免れた流行は動物の乳房に永久的な損傷を引き起こす可能性もある。酪農動物の主要な風土病として、乳腺炎は、動物の繁栄を危険にさらし、しばしば費用のかかる獣医学的治療を必要とする。乾乳期から永続する既存及び新たな感染から早期の乳汁分泌期間を保護することの価値は、業界にとってなお非常に有益である。乳腺炎の治療及びコントロールは、動物の健康を維持し、乳業におけるミルク生産の高コストを下げる重要な目標であることは明らかである。
【００１２】
その目的のために、乳腺炎及び他の状態を予防するために動物の乳頭をシールする試みにおいて製品が開発されており、例えば、搾乳期中に乳頭の外面及び線条管をシールするためのバリヤ乳頭浸漬液、及び、特に、以前に１回以上の妊娠を経験した幼雌ウシ及び雌ウシのために、乾乳期中に乳頭管をブロックまたはシールするための、または乳頭槽を塞ぐための内部乳頭シーラントが開発されている。
【００１３】
これらの製品に加えて、乳線炎の発症を低減するいくつかの方法が当該技術分野で記載されており、例えば、単一の送達デバイスから非ヒト動物の乳頭管中へと抗菌製剤及びシール製剤を順次に送達することを含む方法であって、そのシール製剤はヒゼスマス等の非毒性重金属塩である、方法（米国特許第８，３５３，８７７号）、乳頭管及び／または乳頭洞（ｔｅａｔ  ｓｉｎｕｓ）に外因性ケラチンを含む組成物を適用する方法（米国特許第８，２２６，９６９号）、ある量の乳頭シール製剤を動物の乳頭管中に注入することによって動物の乾乳期中の予防のために乳頭管に物理的バリヤを形成する方法であって、その乳頭シール製剤は、ビスマスを含まない無毒の、チタン、亜鉛、バリウムの重金属塩またはそれらの組み合わせを含み、その物理的バリヤは、動物由来のミルクで作られた乳製品における黒点欠陥を生じさせない、方法（米国特許第７，９０６，１３８号）、抗感染剤を用いずに動物の乳頭管にシール製剤を注入するステップを含む、乾乳期中に乳線炎の予防的処置のために動物の乳頭管に抗感染剤を含んでいない物理的バリヤを形成する方法であって、そのシール製剤は、流動パラフィンまたはポリエチレンゲルを含むゲル基剤等のビヒクルと共に、ステアリン酸アルミニウムのゲル基剤中ビスマス等の非毒性重金属塩を含む、方法（米国特許第６，２５４，８８１号）等が記載されている。
【００１４】
しかしながら、既存のシール製剤または外用浸漬液製品のいずれもが、乳線炎、特に、幼雌ウシのような動物で致命的及び／または非常に感染性であり得る形態を予防するのに十分な時間、酪農動物の乳頭を外部からシールしない。さらに、乳頭シーラントは、抗生物質の選択または投与にかかわらずより高いレベルの保護を提供する実行可能な方法として確立されているが、市場の現在の製品は、使いやすさ及び長期持続の組織接着、除去のし易さ、ミルク汚染の回避、及び熟成チーズにおける黒点欠陥の防止に関する要求を満たしていない。したがって、必要とされているものは、動物ハンドラーが投与し易くかつ安全であり、好ましくは組織上において直接適所に（すなわち「その場」）効果的で長期持続的なシールを形成する、非毒性製剤である。さらに、ミルクから作り出される酪農動物のミルク、ヨーグルトまたはチーズ製品の品質を損なわないことが必要であり、特に、そのシーラントが熟成チーズの黒点欠陥を回避することが必要である。実際に、好ましくは動物のミルクの一般消費のために保留期間を要求する抗生物質または他の医薬剤を使用せずに、病原体によって引き起こされる乳腺炎の発症を有意に防止または低減するために動物の乳頭に適切なバリヤを形成する、長期持続性で無毒の非刺激性シール製剤を見出すことは、獣医学分野において明確に認識されているニーズである。また、乳線炎の有効な治療または予防のために抗生物質等を含有できる長期持続的なシール製剤を見出すことも明確なニーズとして存在する。
【００１５】
したがって、本技術の目的は、既知のヒドロゲルの不都合な点を改善するゾル−ゲルポリマー複合体を提供することにある。
【発明の概要】
【００１６】
本開示は、キトサン、親水性ポリマー、及びゲル化剤を適切な媒体中に含む新たなゾル−ゲルポリマー複合体に関する。有利には、ゾル−ゲルポリマー複合体は、１つ以上の生理学的刺激に応答して耐久性のあるシールまたは強固な固体を形成することができる。この開示はさらにゾル−ゲルポリマー複合体の様々な医学的及び獣医学的使用に関する。具体的には、本開示は、主として動物が乾乳期に入るときまたは乾乳期中に生じる乳房障害の予防的処置または予防のために、酪農動物の乳頭管に物理的バリヤを形成する新規な方法を含み、その方法は、ゾル−ゲルポリマー複合体を、動物の乳頭に外用として適用するか、または乳頭管もしくは乳頭槽内に複合体を注入する基本ステップを含む。好ましくは、組成物は、１つ以上の生理学的刺激に応答して急速にゲル化または凝固して強固な固体を形成する。この開示はまた、乳房障害の治療のための酪農動物の乳頭管中に物理的バリヤを形成するためのシステムも提供し、該システムは、ゾル−ゲルポリマー複合体と、動物の乳頭槽中に組成物を注入するための注入デバイスと、を備える。そのようなシステムは、乳頭シーラントが、乳腺炎を引き起こす微生物による乳腺の浸潤をブロックするか、または感染の発生または再発を低減することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
開示の背景及び当該技術分野からの変更を添付の図面を参照しつつ以下、本明細書でさらに説明する。
【００１８】
【図１Ａ】（Ａ）Ｆ１−２０１４１２１０製剤及び（Ｂ）Ｆ４−２０１４１２１０製剤に関する、ｆ＝０．１Ｈｚ及びτ＝１Ｐａの振動応力で記録した、２５〜３７℃までの温度上昇時における弾性率（Ｇ’）及び損失正接（ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’）の時間依存性のグラフである。
【図１Ｂ】（Ａ）Ｆ１−２０１４１２１０製剤及び（Ｂ）Ｆ４−２０１４１２１０製剤に関する、ｆ＝０．１Ｈｚ及びτ＝１Ｐａの振動応力で記録した、２５〜３７℃までの温度上昇時における弾性率（Ｇ’）及び損失正接（ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’）の時間依存性のグラフである。
【図２】Ｆ１−２０１４１２１０製剤に関して、ｆ＝０．１Ｈｚ及びτ＝１Ｐａの振動応力で滅菌後０時間及び１２週で記録した、２５〜３７℃までの温度上昇時における弾性率（Ｇ’）と損失正接（ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’）の時間依存性のグラフである。
【図３】振動周波数ｆ＝０．１Ｈｚ及び温度Ｔ＝２５℃で記録された、製剤Ｆ１−２０１４０８２５（非滅菌）及びＦ１−２０１４１２１０（室温で１２週間無菌保存した）に関する応力掃引結果のグラフである。矢印は、両方の試料について同様であった剪断減粘性領域の出現を示している。
【図４】１％ｗ／ｗキトサン（ＣＨ）（ｐＨ約６）中１７％ｗ／ｗ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７製剤に関する、ナノ結晶セルロース（ＮＣＣ）の量に対するゲル化温度の依存性のグラフである。
【図５】時間及び温度の関数としての６ｓ−１におけるＰＶＡ−アシレートの粘度を示すグラフである。
【図６】振動周波数ｆ＝０．１Ｈｚ及び温度Ｔ＝２５℃におけるゾル−ゲルポリマー複合体製剤Ｆ１〜Ｆ４の応力掃引結果を示すグラフである。矢印は剪断減粘性領域の始まりを示す。
【図７】ｆ＝１Ｈｚ及びτ＝１Ｐａの振動応力で記録した、２５〜３７℃までの温度上昇時における弾性率Ｇ’及び損失正接ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’の時間依存性のグラフである。
【図８】Ｔ＝２５℃及びＴ＝３７℃におけるゾル−ゲルポリマー複合体製剤Ｆ２から得られたアモキシシリンの平均放出速度を示しているグラフである。誤差棒は標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示に従って、キトサン、親水性ポリマー、及びゲル化剤を、適切な媒体中に、望ましくは水性媒体中に、より望ましくは弱酸性の水性媒体中に含む新規なゾル−ゲルポリマー複合体を提供する。ゾル−ゲルポリマー複合体は、室温のシリンジ中で複合体が変形され得るような剪断減粘性特性を有する。ゾル−ゲルポリマー複合体はまた、シングルバレルシリンジ等を用いて注射することもできる。有益なことには、複合体は、任意の他の薬剤を添加せずに、１つ以上の生理学的刺激に応答して、固体、しばしば特に強固な固体を形成することができる。刺激に対する応答において、ゾル−ゲルポリマー複合体はしばしば急速に凝固する。別の利点は、複合体が、生理学的状態における機械的または液圧的な圧力に耐えることができる即時ゲル化の強固な固体を提供する点である。さらに、複合体は、哺乳類対象への注射後に、漏れが無く滴らないプラグを形成することができる。
【００２０】
さらに、本開示は、特別に設計された製剤から利益を得るゾル−ゲルポリマー複合体のための多数の医学的及び獣医学的使用を提供する。ヒトへの適用は開示から明らかになろうが、好ましい使用は、酪農動物が乾乳し始めるときかまたは乾乳期中に典型的に発生する乳房障害の予防的治療のために物理的バリヤを酪農動物の乳頭管に形成する独特な方法に関するものであって、その方法は、ゾル−ゲルポリマー複合体を、酪農動物の乳頭または乳頭管内に投与するステップを含み、好ましくは、１つ以上の生理学的刺激に応答して急速にゲル化または凝固して耐久性のあるシールまたは強固な固体を形成する組成物を包含する。また、本開示は、乳腺炎を引き起こす微生物による乳腺の浸潤をブロックし、新たな感染または再感染の発症を低減または防止する新しい治療法も提供する。
【００２１】
この開示は、乳房障害を防止するために、または感染の有害な影響を低減するために、好ましくは酪農動物の乳頭管内に内部バリヤである物理的バリヤを形成するためのシステムを含み、該システムは、ゾル−ゲルポリマー複合体と、酪農動物の乳頭槽中に組成物を注入するための送達デバイスと、を含む。係るシステムは、その処置が、乳腺炎を引き起こす微生物による乳腺の浸潤をブロックするか、または感染の発生または再発のリスクを低減することができる。特に、本開示は、酪農動物が乾乳し始めるときかまたは酪農家畜動物の乾乳期中に、好ましくは幼雌ウシまたは雌ウシ（ヤギ、ヒツジ、スイギュウ等の他の動物も含むことができる）の乾乳期中にゾル−ゲルポリマー複合体が主に注入される方法及びシステムを提供する。ゾル−ゲルポリマー複合体は、乾乳期中の乳線炎の予防及びコントロールにおける補助剤として作用し、したがって、乾乳期中及び乳汁分泌期間の第１段階（出産後）における臨床例及び準臨床例を減らす。乾乳期全体を通して乳頭管に留まることにより、ゾル−ゲルポリマー複合体は、前乳汁分泌の酪農動物における高リスク期間中に乳頭管への微生物の侵入を排除または低減する。
【００２２】
一態様では、本開示は、酪農動物における微生物による乳房乳腺炎と戦うための方法を提供し、その方法は、動物から得られたミルクを乳製品の製造に使用することを可能にし、その方法は、酪農動物の関連の乳房組織上または乳頭管内に直接にゾル−ゲルポリマー複合体を局所的に適用するか、または注入して、乳頭シールを形成することを含む。この乳頭シーラントは、典型的には、乾乳時に各乳頭に対して乳房内投与によって投与されることになる。好ましくは、ゾル−ゲルポリマー複合体は、健康な動物の感染前に、適用または注入される。別の態様では、本開示は、一般消費が乳製品の製造で許される前の、乳腺炎で治療されている動物から得られたミルクの保留時間を、短縮するための方法を提供し、そこでゾル−ゲルポリマー複合体は、動物の乳頭管に局所的に適用されるか、または乳頭管内に注入される。本開示はまた、乳製品の製造を改善するために、乳腺炎を予防するかまたは乳腺炎の頻度を減らすために予防的に処置されている動物から得られたミルクの保留時間を短縮するための方法も提供し、そこでゾル−ゲルポリマー複合体は、動物の乳頭管に局所的に適用されるか、または乳頭管内に注入される。
【００２３】
さらにより具体的には、本開示は、乳製品が、ミルク、ヨーグルト、またはチーズである上記方法を提供する。乳製品がミルクである場合、その方法は乾燥ミルクまたは飲料乳を包含する。また、開示は、乳房内注入によって、または乳頭を浸漬することによってゾル−ゲルポリマー複合体が投与される方法も提供する。すべての実施形態において、本開示の関連する獣医学的使用を必要とする非ヒト動物は、好ましくは幼雌ウシまたは雌ウシであるが、別の酪農家畜動物であることもでき、投与は、その動物が乾乳し始めるときか、または乾乳期中に、乳房内注入によって、優先的に達成される。さらに、開示は、ゾル−ゲルポリマー複合体が非乳汁分泌期間動物の産後期間中に投与される方法か、またはゾル−ゲルポリマー複合体が動物の分娩前の期間中に投与される方法を提供する。
【００２４】
本開示の乳頭シーラントは、使い易さの向上（投与と除去の両方）によって、ならびに、その新規な品質プロファイルの総和において、例えば、ゾル−ゲルポリマー複合体の無毒性、生体適合性、生分解性、弾性（柔軟性）、長期持続性の組織接着性、シリンジ性、室温での流動性、体温に応答して凝固する能力、３７℃での速いゲル化時間、及び不活性等の新規な品質プロファイルの総和において、市場に出回っている現在のシーラントを超える多くの利点を提供する。注目すべきことに、不融性で水性の熱転移ゾル−ゲルヒドロゲルは室温でユニークなことに流体であるが、乳頭管では体温でゲルを形成する。ゾル−ゲルポリマー製剤は、広い温度範囲にわたって注入が容易であり、ならびに、乳頭管から手動ストリッピングによって容易に除去できるという調整可能な剪断減粘性特性を示す。体腔から取り出されると、ゾル−ゲルポリマー複合体は、室温で液相へと戻り、乳製品に実質的な利益をもたらす。さらに、本開示の乳首シーラントは、現在市販されているシーラントとは異なり、ミルクの初期加工段階中にステンレス鋼パイプ（ミルクライン）またはバルクタンクに固着せず、標準的な冷水または温水洗浄中に、掃除可能であり（すなわち、工業用表面を容易にクリーンオフする）、最終的にはミルク汚染を回避し、それにより熟成チーズにおいてしばしば見られ、かつ既知の従来の乳頭シーラントによって引き起こされる黒点欠陥が防止される。
【００２５】
また、有益なことには、本開示の乳頭シーラントは、乳線炎に関して予防的に処置されている非ヒト動物から得られるミルクの保留期間を除外または有意に短縮し、それにより、動物に抗生物質が投与されるときに必要とされる標準的なミルク廃棄期間を回避または短縮させる。同様に実用的に、乳頭シーラントは、ゾル−ゲルポリマー複合体の塩成分を変化させることにより比較的中性のｐＨで調製されるとき、チーズスターターカルチャーと完全に適合するように優先的に設計することができる。処置された動物からの初乳も子ウシに安全に給餌することができる。
【００２６】
定義
本明細書で使用されるすべての科学的及び技術的用語は、当業者によって一般に理解される同じ意味を有すると理解すべきである。以下の定義は、本開示に関連して使用される主な用語の一般的な意味を単に例示するために記載してある。
【００２７】
用語「乳房（ｕｄｄｅｒ）」は、本明細書では、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、スイギュウ等の雌反芻動物の腺に関する乳房構造を指す。雌ウシでは、それは４つの独立した腺を含み、それぞれ１つの乳頭及び１つの出口管を含むが、ヒツジ及びヤギには２つの腺がある。用語「乳頭（ｔｅａｔ）」は、本明細書では、ミルクまたは乳頭洞の一部を含有する乳腺の突出部分を指す。
【００２８】
用語「乳頭シーラント」は、本明細書では、動物乳頭の表面または内部に物理的バリヤを形成するために使用される組成物及びデバイスを指す。乳頭シーラントは、乳頭表面上、乳頭線条管内、及び／または乳頭槽内に存在することができる。
【００２９】
用語「抗菌剤」は、本明細書では、細菌、ウイルス、真菌、酵母、または原生動物等の微生物の増殖または生殖を抑えるまたは阻害する物質を指す。
【００３０】
用語「溶液」は、特に明記しない限り、本明細書では溶液、懸濁液、または分散液を指す。本明細書で使用される用語「噴霧」は、組成物の広範な適用を送達するという意図された目的のために、エアロゾルアプリケーターまたはポンプスプレーアプリケーターを介して適用されるような小液滴または大液滴からなるような霧化組成物を指す。
【００３１】
用語「ストリーム（ｓｔｒｅａｍ）」は、本明細書では、組成物の連続的で直接的で、かつ集中的な適用を指す。用語「注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）」は、本明細書では、流体または溶液を、空洞、静脈、または槽に連続的に導入することを指す。
【００３２】
用語「哺乳動物」は、本明細書では、ヒト及び動物の両方を含み、皮膚に毛または毛皮、子に栄養を与えるための雌による乳汁分泌乳腺からのミルクの分泌、及び四心室心臓を有する哺乳綱の温血脊椎動物を指す。
【００３３】
乳腺炎に関する本開示の実施形態では、用語「動物」は、本明細書では、乳汁分泌期間を有する雌の非ヒト哺乳動物を指し、これには、家畜、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、スイギュウ等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、動物は乳牛である。「雌ウシ」及び「幼雌ウシ」の両方は雌ウシであるが、用語「雌ウシ」は、本明細書では、仔ウシを出産していない、典型的には、乳離れしていない、３歳未満の若い雌ウシを指す。用語「雌ウシ」は、しばしば、仔ウシを出産していないより年長の雌動物を指す。
【００３４】
用語「乾乳期」は、本明細書では、雌ウシまたは他の酪農動物の乳汁分泌期間サイクルの非乳汁分泌期間を指す。それは、１つの乳汁分泌期間サイクルの終わりと次の乳汁分泌期間の開始との間に起こる。各乳汁分泌期間サイクルの終わりに、動物は、動物の非乳汁分泌期間（乾乳期）のミルク生産の停止と関連がある通常の生理学的、代謝的、及び内分泌の変化を含む乾乳期に入ると「乾乳」の段階を開始する。
【００３５】
用語「乳製品」は、本明細書では、液体または粉末形態の任意の量のミルクを含有する製品を指す。それはチーズ及びヨーグルトも含む。
【００３６】
用語「分娩後」は、本明細書では、出産の直後に始まり、約６週間にわたる期間を指す。用語「分娩前」は、本明細書では、出産前の妊娠期間中の期間を指す。本明細書では、「周産期」という用語は、出産直前と出産後の期間を指す。
【００３７】
本明細書において、用語「退縮」は、雌ウシにおけるミルク生産の停止後最初の２〜３週間を指す。
【００３８】
「ケラチンプラグ」という用語は、本明細書では、乾乳期のためのミルク産生の停止後の、雌ウシの乳頭管／線条管のケラチンベースの閉塞を指す。
【００３９】
用語「微生物侵入」は、本明細書では、身体組織または体腔中と増殖し、感染症及び／または疾患へと進行し得る組織損傷をもたらす病原性微生物の移動、例えば細菌、特に膿形成性または壊死性の細菌、ウイルス、真菌、酵母、原生動物等の移動を指す。開示の目的のために、「微生物侵入」は、典型的には、本明細書では「細菌侵入」を指す。
【００４０】
用語「ゾル−ゲルポリマー複合体」は、本明細書では、本明細書に記載してあるように、ある特定の条件下でゾル−ゲル状態を形成するゾル−ゲルプロセスを受けることができるポリマー組成物を指す。用語「固体」及び「ゲル」及び「凝固」及び「ゲル化」は、ゾル−ゲル相転移が１つ以上の生理学的刺激に応答して起こった後に形成されるゲル／固体を指すために本明細書では互換的に使用される。
【００４１】
用語「ポリマー」は、本明細書では、一組の巨大分子を含む材料を指す。ポリマー中に含まれる巨大分子は、いくつかの形態において、互いに、同じであることができるか、または異なっていることができる。巨大分子は、様々な骨格構造のいずれかを有することができ、１つ以上のタイプのモノマー単位を含むことができる。特に、巨大分子は、線状または非線状の骨格構造を有することができる。非線状骨格構造の例には、分岐骨格構造、例えば星状分岐、櫛状分岐、または樹枝状分岐、及び網目骨格構造であるような構造である。ホモポリマー中に含まれる巨大分子は典型的には１つのタイプのモノマー単位を含み、コポリマー中に含まれる巨大分子は典型的には２つ以上のタイプのモノマー単位を含む。コポリマーの例としては、統計コポリマー、ランダムコポリマー、交互コポリマー、周期コポリマー、ブロックコポリマー、ラジアルコポリマー、及びグラフトコポリマーが挙げられる。
【００４２】
ポリマーに関して本明細書で使用される用語「分子量（ＭＷ）」は、ポリマーの数平均分子量、重量平均分子量、またはメルトインデックスを指す。
【００４３】
用語「弾性率」（「ヤング率」または貯蔵弾性率（Ｇ’）とも称される）は、本明細書では、材料における適用歪を伴う応力の変化（すなわち剪断応力（単位面積当たりの力）と剪断歪（比例変形）の比）として定義される。本質的には、弾性率は、試験された材料がその元の形状及びサイズに戻る能力の尺度となる、弾性材料の剛性の定量的測定値である。Ｇ’は、フックの法則から導き出された式を用いて計算することができ、弾性率は、応力と歪の比（すなわち、適用圧力の、サイズ分数変化率に対する割合）に等しい。弾性率の測定は、単位面積当たりの力として記録される（ニュートンの単位面積に対する標準メートル比（Ｎ／ｍ２）、またはパスカル（Ｐａ）、１パスカルは１平方メートル（１ｍ２）の面積に適用された１ニュートン（１Ｎ）の力に相当する）。このパスカル単位は、圧力、引張強度、応力、及び弾性の単位を定義するためにしばしば使用される当該技術分野で認められている用語である。
【００４４】
本明細書で使用する用語「剪断減粘性」は、流体粘度が剪断速度または剪断応力の増加と共に減少する非ニュートン流体の共通の特性を指す。剪断減粘性は、懸濁液、エマルション、ポリマー溶液、及びゲルにおいて観察される。剪断減粘性属性に起因して、ポリマーの粘度が低下するので、剪断速度を増加させることによって巨大分子またはゲルが可能になる。基本的に、剪断速度の増加時に粘度が減少する結果として、「剪断減粘性」特性は、シリンジのピストンからの穏やかな手動圧力の適用によって一時的に変形されるヒドロゲル網目構造の能力の目安である。この剪断減粘性現象は、例えば、そうでなければ硬い生体適合性ヒドロゲルを不融性にするために用いることができる。
【００４５】
用語「損失正接ｔａｎδ」または「ｔａｎδ」は、本明細書では、粘性弾性率（Ｇ”）と弾性率（Ｇ’）の比、及び流体における弾性の存在及び弾性度の有用な定量化である、位相角の正接を指す。１未満のｔａｎδ値は弾性優勢（すなわち固体様）挙動を示し、１より大きい値は粘性優勢（すなわち液体様）の挙動を示す。弾性固体ではｔａｎδ”＝０である。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「強固な」とは、生理学的温度において、一般に約４２０Ｐａ以上、約６００Ｐａ〜約１０，０００Ｐａ、または約６０００Ｐａ〜約１０，０００Ｐａ等の広い範囲であり得る弾性率Ｇ’を意味することを意図している。剛性のレベルに基づいて、固体は、例えば、荷重が適用されると変形する。材料が弾性の場合、荷重が取り除かれた後、材料は元の形状に復帰する。「強固な固体」は、一般に、ゾル−ゲル相転移後に形成されるゲルまたは固体であり、そのために、生理学的条件（例えば３７℃及び／または生理学的ｐＨ付近）でのＧ’は典型的には約５６０Ｐａを超えるが、強固な固体は、製剤を作り、滅菌し、または貯蔵するための処理ステップにおける他のファクターに応じて、約５６０Ｐａ未満で、または約１０，０００Ｐａを超えて形成することができる。
【００４７】
本明細書で使用する「生理学的温度」という用語は、哺乳動物の正常な体温範囲、例えば約３５℃〜約４０℃、約３６℃〜約４０℃、約３７℃、約３７．５℃等を意味することを意図している。
【００４８】
用語「１つ以上の生理学的刺激」は、本明細書では、温度（例えば、約３６℃〜約４０℃または約３７℃等の体温）、ｐＨ（例えば、生理学的ｐＨに近い、アルカリまたは酸性状態）、イオン強度（例えば、低張性または高張性の状態）等を包含するが、それらに限定されない１つ以上の刺激に関する選択を指す。他のタイプの生理学的刺激としては、例えば母乳または他の分泌物、血液等の体液への曝露が挙げられる。別のタイプの刺激は、限定するものではないが、イオン、電解質、カルシウム、ナトリウム、細胞毒、マクロファージ、酵素、抗原、グルコース、エストロゲン等の生体化学物質（ｂｏｄｉｌｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）または巨大分子との接触から生じ得る。
【００４９】
組成物の成分及び特性
一般に、本開示のゾル−ゲルポリマー複合体は、適切な酸性水性媒体中に、キトサン、親水性ポリマー、及びゲル化剤を含む。任意に、ゾル−ゲルポリマー複合体は、適切なナノ結晶充填剤等の強化剤及び／または１つ以上の抗菌剤をさらに含む。有利には、ゾル−ゲルポリマー複合体は、１つ以上の生理学的刺激に応答して耐久性のあるシールまたは強固な固体を形成する。製剤は、送達性、膨潤、及び接着性のユニークな組み合わせを示す。
【００５０】
新しいゾル−ゲルポリマー複合体の要素に関して、キトサンはいくつかの場合においてアシル化され、例えば、キトサンは、カルボキシメチルキトサン（ＣＭＣｈ）を含むがこれに限定されないアシルキトサンを含む。いくつかの実施形態において、キトサンは、少なくとも約７５％、少なくとも約７７％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の脱アセチル化度（％ＤＤＡ）を有する。いくつかの実施形態において、キトサンは、約７５％、約７７％、約８０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の％ＤＤＡを有する。親水性ポリマーとしては、メチルセルロース（ＭＣ）、例えばメチルセルロースエーテルまたはセルロースエーテル、ポリビニルアセテート（ＰＶＡ）、ＰＶＡ−アシレート、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポロキサマー（非イオン性トリブロックコポリマー）、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルギン酸ナトリウム、または高粘性の感熱性ゲルを形成できる別の水溶性多糖類が挙げられるが、それらに限定されない。親水性ポリマーはアシル化され得る。望ましくは、ゾル−ゲルポリマー複合体は、メチルセルロースまたはＰＶＡ−アシレートを含み、冷水中に溶解後に希薄混合物（スラリー）を形成し、生理学的温度では濃厚なゲルを形成する。
【００５１】
通常、ゲル化剤は、刺激、例えば温度に応答して物理的架橋を経験する熱ゲル化要素である。いくつかの実施形態において、ゲル化剤は、塩、例えばβ−グリセロホスフェート二ナトリウム水和物または五水和物、四塩基性ピロリン酸ナトリウム、二塩基性リン酸カリウム三水和物、それらの混合物等である。有利には、ゲル化剤は、四塩基性ピロリン酸ナトリウム塩と二塩基性リン酸カリウム三水和物塩との混合物である。用語「ゲル化剤」及び「ゲレーター（ｇｅｌａｔｏｒ）」は本明細書では互換的に使用される。
【００５２】
例えば０．１Ｍ酢酸水溶液等の弱酸性水性媒質中でゾル−ゲルポリマー複合体を調製することが好ましい。
【００５３】
ゾル−ゲルポリマー複合体の製剤は、ナノ結晶充填剤等の強化剤を任意に含むことができる。「ナノ結晶充填剤」と称される補強材料は、一般にナノ結晶材料、例えばナノ結晶粒子またはポリマーであり、非共有物理的相互作用を介して、例えば限定するものではないが水素結合または静電引力を介して、ゾル−ゲルポリマー複合体に機械的強化を提供することができる。例としては、ナノ結晶セルロース（ＮＣＣ）、無機クレー、有機クレー、カーボンブラック、ヒュームドシリカ、グラフェン、グラファイト等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、ナノ結晶充填剤はナノ結晶セルロース（ＮＣＣ）である。あるいは、ナノ結晶充填剤は、例えば、ナノ結晶デンプン、ナノクレー、グラフェン、カーボンナノチューブ、有機ナノクレー、または有機粘土を含む。別の例に関して、ナノ結晶充填剤は、モンモリロナイト、ベントナイト、カオリナイト、ヘクトライト、ハロイサイト等であってもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ゾル−ゲルポリマー複合体は、無機充填剤、例えば二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）等の強化剤を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ゾル−ゲルポリマー複合体は強化剤としてリン酸カルシウムをさらに含む。他の実施形態では、ゾル−ゲルポリマー複合体は、強固な固相の強化のためにダブルネットワークヒドロゲルを形成する。ダブルネットワークゲルは、２つのタイプのポリマー成分からなる特別な網目構造を特徴とし、高い含水率（約９０％ｗ／ｗ）と高い機械的強度の両方、ならびに靭性を有する。
【００５６】
組成物はまた、１つ以上の医薬品、特に、抗菌性、抗ウイルス性、抗真菌性、または抗寄生虫活性等を有する抗菌剤を任意に含むこともできる。１つまたは複数の医薬品は、その形成時に組成物中に閉じ込められ、直ちにまたはある期間にわたって、組成物から放出される。
【００５７】
乳腺炎における典型的な問題となる病原体は細菌であるため、ゾル−ゲルポリマー複合体は望ましくは抗菌剤を含有することができる。動物に使用できる様々な抗菌剤が存在する。それらの抗菌剤としては、マクロライド、例えばツラスロマイシン（Ｄｒａｘｘｉｎ（登録商標））、チルジピロシン（Ｚｕｐｒｅｖｏ（登録商標））、チルミコシン（Ｍｉｃｏｔｉｌ（登録商標））、チロシンホスフェート（Ｔｙｌａｎ（登録商標））、及びガミスロマイシン（Ｚａｃｔｒａｎ（登録商標））；セファロスポリン、例えばセフチオフルナトリウム（例えばＮａｘｃｅｌ（登録商標）及びＥｘｃｅｎｅｌ（登録商標））、セフチオフル塩酸塩（例えばＥｘｃｅｎｅｌ  ＲＴＵ（登録商標）、Ｅｘｃｅｎｅｌ  ＲＴＵ  ＥＺ（登録商標）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｓｔ（登録商標））、セフチオフル結晶性遊離酸（Ｅｘｃｅｄｅ（登録商標））、セフォベシンナトリウム（Ｃｏｎｖｅｎｉａ（登録商標））、及びセフポドキシムプロキセチル（Ｓｉｍｐｌｉｃｅｆ（登録商標））；リンコサミニド抗生物質、例えばリンコマイシン（Ｌｉｎｃｏｍｉｘ（登録商標））、ピルリマイシン塩酸塩（Ｐｉｒｓｕｅ（登録商標））、及びクリンダマイシン塩酸塩（Ａｎｔｉｒｏｂｅ（登録商標））；フルオロキノロン、例えばダノフロキサシン（Ａｄｖｏｃｉｎ（登録商標））、エンロフロキサシン（Ｂａｙｔｒｉｌ（登録商標））、及びマルボフロキサシン（Ｚｅｎｉｑｕｉｎ（登録商標））；ならびにテトラサイクリン、例えばクロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、及びドキシサイクリンが挙げられるが、それらに限定されない。他の抗菌剤としては、ペニシリン誘導体、例えばアモキシシリン三水和物単独またはクラブロン酸（Ｃｌａｖａｍｏｘ（登録商標））と共に、スペクチノマイシン（Ａｄｓｐｅｃ（登録商標））、増強スルホンアミド、例えばトリメトプリム／スルファジアジン（Ｔｕｃｏｐｒｉｍ（登録商標））及びスルファジメトキシン／オルメトプリム（Ｐｒｉｍｏｒ（登録商標））；クロラムフェニコール及びその誘導体、例えばチアンフェニコール及びチアンフェニコールのフッ化合成類似体、例えばフロルフェニコール（例えばＮｕｆｌｏｒ（登録商標）及びＮｕｆｌｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ））が挙げられるが、それらに限定されない。抗菌剤は、本開示の組成物と同時にまたは順次に連続して投与され得る。
【００５８】
本開示のゾル−ゲルポリマー複合体は、典型的には約３７℃の温度で、１つ以上の生理学的刺激に応答して、耐久性のあるシールまたは強固な固体を形成することができる。理想的には、「強固な」固体ゾル−ゲルポリマーとは、弾性率Ｇ’（貯蔵弾性率（Ｇ’）とも称される）が生理学的温度で少なくとも約４２０Ｐａ以上であることを意味する。「強固な固体」は、一般に、生理学的条件（例えば、３７℃及び／または生理学的ｐＨ付近）でのＧ’が一般に約５６０Ｐａ超、しばしば約６００Ｐａ以上であるゾル−ゲル相転移後に形成されるゲルまたは固体であるが、約４５０Ｐａ〜約１０，０００Ｐａも包含し、例えば約４９０Ｐａ、約５６０Ｐａ、約６５０Ｐａ、約８００Ｐａ、約１７００Ｐａ、約１９００Ｐａ、約２５００Ｐａ、約５５００Ｐａ、約６０００Ｐａ、約６５００Ｐａ、約７０００Ｐａ、約７５００Ｐａ、約８０００Ｐａ、約８５００Ｐａ、約９８００、約９０００Ｐａ、約９５００Ｐａ、約１０，０００Ｐａ以上の値等が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｇ’は、約４５０Ｐａ〜約６００Ｐａ、約５００Ｐａ〜約１０００Ｐａ、約１０００Ｐａ〜約６０００Ｐａ、約５０００Ｐａ〜約９８００Ｐａ、約７０００Ｐａ〜約１０，０００Ｐａ、約８５００Ｐａ〜１００００Ｐａ等である。本開示の「強固な」固体ゾル−ゲルポリマー複合体は、一般に、脆弱であることが知られている既知のキトサンヒドロゲルよりも強固である（すなわち、強固な固体ゾル−ゲルポリマー複合体は、既知のキトサンヒドロゲルよりも強固なまたは高い機械的特性を有する）。他の実施形態において、乳頭シーラントとして有用なゾル−ゲルポリマー複合体のＧ’は約４２０Ｐａ〜９，８００Ｐａ以上であることができ、漏れが無く不融性であり、本明細書に記載のより強固なポリマー複合体と同様な生理学的刺激に対する反応において耐久性のあるシールを形成することを予想外に見出した。
【００５９】
有利には、ゾル−ゲルポリマー複合体は、生理学的温度等の１つ以上の生理学的刺激に応答して急速にゲル化または凝固できるようにする熱増粘特性を有していて、任意の他の薬剤を添加することなく長期間持続するシールまたは強固な固体を形成する。さらに、ゾル−ゲルポリマー複合体は、１つ以上の生理学的刺激に応答して非常に急速にゲル化または凝固し、本明細書で考察される機械的特性または粘弾性特性を有するシールまたは固体塊を形成し、その固体は、動物の生理学的条件下で機械的または液圧的圧力に耐えることをユニークに可能にするのに十分な強度を有する。いくつかの例では、ゾル−ゲルポリマー複合体は、生理学的刺激への曝露後、例えば酪農動物への注入後、数秒で、すなわち直ちにまたはほぼ直ちにゲル化または凝固することができる。本明細書で提供されるゾル−ゲルポリマー複合体は、生理的刺激に応答して非常に速く液−固相転移し、プラグが注射部位で急速に形成される。ゾル−ゲルポリマー複合体は、有利な剪断減粘性特性を示し、すなわち、それらの粘度は、剪断速度の増加に伴って低下し、有益なことには、ゾル−ゲルポリマー複合体は、凝固が既に起こっていても、容易に注入することができるか、または注入前に室温のシリンジ中で変形させることができる。有益な剪断減粘性特性のためにより、ゾル−ゲルポリマー複合体は、乳頭領域をシールし、乳腺炎の治療に必要な医薬品の放出を可能にするために、材料のより良好な操作のための高い多孔性及び／または弾性を有する固体構造を包含することができる。
【００６０】
動的生理学的環境において広がりかつ漏れる傾向がある当該技術分野で知られている脆弱なゲルを使用することの欠点とは対照的に、急速に凝固する能力は本発明のゾル−ゲルポリマー複合体のさらなる利点であり、その結果として、その複合体は、漏れる、または滴ること無く、シリンジを通して容易に注入することができ、かつ、酪農動物の乳頭管または乳頭洞中への注入後に、漏れが無く滴らないゾル−ゲルプラグを急速に形成することができる、即時ゲル化する弾性シールまたは強固な固体を提供することができる。いくつかの例では、ゾル−ゲルポリマー複合体は、シングルバレルシリンジで投与することができる。
【００６１】
温度、ｐＨ、及びイオン強度の変化に応答するゾル−ゲルポリマー製剤の特性に起因して、ゾル−ゲルポリマー製剤は、力が適用されていない場合には長期間持続のシールまたは強固なゲル／固体を形成することができるが、例えばシリンジにおいて外力を適用すると、流動することができ、注入可能である。複合体はまた、注入後に、耐久性のある、弾性ゲルの、発泡体または多孔性固体を形成することもできる。
【００６２】
特別に設計されたゾル−ゲルポリマー複合体に見られる他の有益な技術的効果は、粘度を増加させるためのポリマー中の疎水性置換と、生理学的流体中で架橋することができるミクロゲル粒子と、薬物放出に使用することができるミクロゲル粒子とを形成する能力、ならびに、動物における分解速度を制御する能力、対象において特定の細孔径と、生理学的温度において所望の粘弾性特性とを有する多孔性固体を形成する能力である。
【００６３】
有益なことには、水性ゾル−ゲルポリマー製剤は、乳汁分泌動物の乳頭管中に直接注入することができ、乾乳期中に堅固なシーラントを形成する。製剤は、ミルクの存在下で、また通常は乳腺の乾乳の際に見られる高いイオン含量下で、３７℃において、この不透過性のシールを作り出すことができる。
【００６４】
ゾル−ゲルポリマー複合体を作製するための方法
ゾル−ゲルプロセスは、材料科学及び工学の分野で広く使用されている湿式化学技法である。係る方法は、主に、離散粒子またはネットワークポリマーの統合されたネットワーク（またはゲル）のための前駆体として作用するコロイド溶液（ゾル）から出発する材料の二次加工に使用される。ゾル−ゲルプロセスにおいて、コロイド状固体（ゾル）の流体懸濁液は徐々に、個別の粒子から連続したポリマーネットワークの範囲の形態となる、液相及び固相の両方を含有するゲル様二相系の形成に発展する（概要に関しては、Ｃ．Ｊ．Ｂｒｉｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．Ｗ．Ｓｃｈｅｒｅｒ，１９９０，Ｓｏｌ−Ｇｅｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌ−Ｇｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０１２１３４９７０５；Ｌ．Ｌ．Ｈｅｎｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｋ．Ｗｅｓｔ，１９９０，Ｔｈｅ  Ｓｏｌ−Ｇｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：３３を参照されたい）。
【００６５】
いくつかの例では、ポリマーの反応性及び官能性は、限定するものではないが、酸無水物、アミノもしくは塩、Ｎ−置換アミノ、アミド、カルボニル、カルボキシもしくは塩、シクロヘキシルエポキシ、エポキシ、グリシジル、ヒドロキシ、イソシアネート、尿素、アルデヒド、エステル、エーテル、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオール、ジスルフィド、シリルもしくはシランを含むか、または、グリオキサール、アジリジン、活性メチレン化合物もしくは他のβ−ジカルボニル化合物（例えば、２，４−ペンタンジオン、マロン酸、アセチルアセトン、エチルアセトンアセテート、マロンアミド、アセトアセトアミド及びそのメチル類似体、エチルアセトアセテート、及びイソプロピルアセトアセテート）、ハロ、水素化物、または他の極性もしくはＨ結合基、及びそれらの組み合わせから選択される基を含む、一連の官能基の付加によって変化させることができる。係る官能基は、ポリマーに沿った様々な位置で、例えば、ポリマーの末端において、結晶化可能な側鎖上の側面、末端、または任意の位置において、ポリマーに沿って無作為または規則的に分散させて、添加することができ、ポリマーの別個のダングリング側基として結合されているか、またはポリマーの主鎖に直接結合されている。また、ポリマーは、周囲条件または加工条件下で、その機械的強度またはその耐崩壊性を増加させるために、架橋、絡み合い、または水素結合させることができる。
【００６６】
理解できるように、ポリマーの分子量（ＭＷ）は、ポリマーを形成するために使用される加工条件に依存性であり得るため、異なる分子量を有する様々な形態でポリマーを提供することができる。したがって、ポリマーは、特定の分子量またはある範囲の分子量を有するものと、本明細書で言及することができる。
【００６７】
ゾル−ゲルポリマー複合体は、高度に粘性の感熱性ゲルを作り出す親水性ポリマー（例えば水溶性多糖類）とキトサンとを混合することによって形成されるキトサンをベースとする、堅牢で塩誘導の熱可逆性ゲル化系に基づく。これらの水膨潤性ポリマー複合体製剤は、温度、ｐＨ、及びイオン強度の増加に伴って急速にゲル化する。複合体は、典型的には、２つの親水性ポリマー及びイオン性ゲレーターを含有する。第１のポリマーは、温度誘導性ゲル化を受け、生理学的温度、例えば約３７℃で、乳頭管に弾性ゲルを形成することができる。第２のポリマーは、製剤に導入されたイオン性ゲレーター（ゲル化剤）と接触するとゲルを形成する。ゲル化剤（すなわち、熱ゲル化要素）の添加により、系は物理的架橋を作り出す。ゲル化は、基本的には、生成物中の主要成分であるポリマーの物理的構造変化に起因し、ポリマー間の共有架橋結合は形成されない。第２のポリマーのゲルの強度は、添加されるゲレーターの量、ならびに製剤のｐＨ及びイオン強度に依存し、典型的には約５．１〜６．８のｐＨ及び約５ｇ／Ｌのイオン強度を有する。２つの親水性ポリマーは、キトサンのゲル化に大きく影響し、塩の添加及び体温等の刺激に対する急速な応答をもたらす。結果として、ゲルは、乾乳する乳頭管におけるｐＨ及びイオン含量の変化に基づいて強化される。
【００６８】
系におけるポリマー、塩、及びゲル化剤の濃度を注意深く調整することによって、ゲル化閾値未満とゲル化閾値を超える両方において、系のゲル化温度及び機械的特性または完全性を、例えば、生理学的条件（例えば温度）下でのゲル形成の速度及び可逆性、ならびに、生体適合性、粘弾性特性（例えばＧ’）、系の透過性／多孔性、及びゲル化後に形成されるシールまたは強固な固体の耐久性を、微調整することができる。例えば、ポリマー、塩の添加、及びゲル化剤を操作して、特定の細孔径を有し、かつ耐久性のある弾性特性を有するマクロ多孔性固体を必要とする特別に設計されたヒトもしくは獣医学的用途にとって適切な、または、抗生物質等の生体分子の自由な通過を可能にするために高度の多孔性を有するかもしくは特定の細孔径を有する固体である構造を必要とする用途において適切な、ゾルゲルポリマー複合体を作製することができる。
【００６９】
さらに、ゾル−ゲルポリマー製剤は、チーズスターターカルチャー、例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等との適合性のために、かつそれらと一緒に使用するために、優先的に設計することができる。生菌スターターカルチャーは、チーズを発酵させるプロセスのための適当な酸性化を達成することを必要とするため、塩成分を変更して培養活性及び増殖を妨害しないことによって、ポリマー製剤の酸性度を適切に調節することができる。したがって、ゾル−ゲルポリマー製剤をチーズスターターカルチャーと有益に適合させるために、塩成分を容易に変化させて最終製品の酸性を中和する。典型的には、例えば、ｐＨ約６．８（比較的中性）の製剤は、標準的な細菌培養を阻害せず、チーズスターターカルチャーと共に使用することができる。
【００７０】
本開示のある特定の製剤を例示するために、ゾル−ゲルポリマー複合体は、約７．３％ｗ／ｗのメチルセルロース、約１．８％ｗ／ｗのキトサン、約９．４％ｗ／ｗの四塩基性ピロリン酸ナトリウム（溶液塩として）、約０．０５％ｗ／ｗの四塩基性ピロリン酸ナトリウム（固体塩として）、及び約８２％ｗ／ｗの０．１Ｍ酢酸水溶液を含む。この複合体は、本明細書では、「Ｆ１」または「Ｆ１−２０１４１２１０」製剤と称する。第二の実施形態において、ゾル−ゲルポリマー複合体は、約７．３％ｗ／ｗのメチルセルロース、約１．８％ｗ／ｗのキトサン、約９．１％ｗ／ｗのβ−グリセロリン酸二ナトリウム（溶液塩として）、約３．０％ｗ／ｗのβ−グリセロリン酸二ナトリウム（固体塩として）、及び約８２％ｗ／ｗの０．１Ｍ酢酸水溶液を含む。この複合体は、本明細書では、「Ｆ４」または「Ｆ４−２０１４１２１０」製剤と称する。比較のために、以下の表Ｂ及びＣに示したＦ２またはＦ３製剤等の他のゾル−ゲルポリマー複合体を調製した。さらなる例において、ゾル−ゲルポリマー複合体は、酢酸中０．５％ｗ／ｗ、１％ｗ／ｗ、または２％ｗ／ｗキトサン溶液中約１６％ｗ／ｗ、１７％ｗ／ｗ、または１８％ｗ／ｗ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を含む。別の実施形態では、ゾル−ゲルポリマー複合体は、以下の表４に記載したキトサン−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７溶液のうちの１つを含む。
【００７１】
一般的な規則として、本開示のゾル−ゲルポリマー複合体製剤中の成分の量は、幾分変化し得る。Ｆ１〜Ｆ４製剤の上記の実例において、例えば、メチルセルロースの量は約４％ｗ／ｗ〜約１２％ｗ／ｗの範囲であることができ、キトサンは約０．５％ｗ／ｗ〜約４％ｗ／ｗの範囲であることができ、溶液塩またはゲル化剤は、約６％ｗ／ｗ〜約１２％ｗ／ｗの範囲であることができ、固体塩は約０．０１％ｗ／ｗ〜約４％ｗ／ｗの範囲であることができ、０．１Ｍの酢酸水溶液よりも高濃度を用いてもよい。にもかかわらず、本明細書に記載の所望の特性を有するゲルまたはヒドロゲルを形成するために、記載した範囲よりも高いまたは低い量を含むある特定の組み合わせの範囲を容易に調整することができる。
【００７２】
ゾル−ゲルポリマー複合体の使用
本明細書で提供されるゾル−ゲルポリマー複合体は、１つ以上の生理学的刺激に応答して液−固相転移する。したがって、それらは、対象における注射後急速に凝固する液体を注射することが望ましい広範囲の動物及びヒトの健康用途で用いることができる。特に、ゾル−ゲルポリマー複合体は、対象の生理学的条件下での機械的圧力または水圧に耐える高度の多孔性、弾性、または十分な強度を有する固体構造を供給することが望ましい用途で用いることができる。
【００７３】
特定の用途のためのゾル−ゲルポリマー複合体の適合性は、多くのファクターによって、例えば、それらの生体適合性、機械的完全性、生理的条件（例えば温度）下でのゲル形成の速度及び可逆性、機械的特性または粘弾性特性（例えばＧ’）、多孔性／透過性、及び耐久性等のファクターによって、影響されることを理解すべきである。本技術によれば、係る特性は、本明細書に記載されるように、システム中のポリマー及びゲル化剤濃度を調整することによって決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ゾル−ゲルポリマー複合体は、特定の細孔径を有し、かつ耐久性のある弾性特性を有するマクロ多孔性固体を必要とする用途における、または、グルコース、酸素、もしくはインスリン等の生体分子の自由な通過を可能にする高度に多孔性もしくは特定の細孔径を有する固体である構造を必要とする用途における、使用に適する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ゾル−ゲルポリマー複合体は、対象の開口部内に、漏れが無く滴らないプラグの形成を必要とする用途での使用に適する。例えば、それらは、人工の椎間板及び軟骨のように、漏れが無く滴らないプラグを必要としている、粘膜接着インプラント、点眼剤、経皮パッチ、歯科用インプラント、膣坐剤等としての使用が見出される。
【００７５】
他の実施形態では、ゾル−ゲルポリマー複合体は、インプラントによって関節内の劣化あるいは損傷した軟骨を取り換えることができる組織工学における使用に適する。これに関して、その複合体は人工軟骨としての使用に適する。軟骨組織は正常な関節機能にとって重要であるため、外傷または老化により損傷した組織を取り換える治療的使用のための人工軟骨に関するニーズが存在する。人工軟骨で使用するための潜在的な材料は、本明細書で提供されるゾル−ゲルポリマー複合体のように、粘弾性、強靭性、及び耐久性であることが必要である。したがって、ゾル−ゲルポリマー複合体は、関節手術に使用でき、膝関節に移植でき、角膜修復材料として使用でき、または組織及び身体部分の修復、置換、もしくは治療するために使用することができる。ゾル−ゲルポリマー複合体は、注射後、滑液中のイオン及び骨の存在下で、耐久性のある弾性ゲルを形成することができ、人工軟骨、半月板または髄核を形成する。
【００７６】
複合体はまた、変形性関節症、関節リウマチ、他の炎症性疾患、全身性関節痛、または他の関節疾患を治療するための注射可能なインプラントとして、創傷治癒のために、または座剤として、有益に役立つ。いくつかの実施形態では、特に、液−固転移が生理学的刺激に応答して非常に急速に起こってプラグが注射部位で即座に形成される場合には、ゾル−ゲルポリマー複合体を注射して対象においてプラグを急速に形成することができる。ゾル−ゲルポリマー複合体を、例えば、膵臓のランゲルハンス島に注射して、島細胞を免疫単離し、グルコース及び酸素を自由に通過させることができる。
【００７７】
ある特定の実施形態において、ゾル−ゲルポリマー複合体は、例えば、動脈をブロックするために、または癌細胞を飢餓状態にするために、塞栓または閉塞剤として有用である。他の実施形態では、ゾル−ゲルポリマー複合体は超音波造影剤として有用である。さらに他の実施形態では、ゾル−ゲルポリマー複合体は、組織工学のために、マクロ多孔性またはミクロ多孔性の基質を形成することができる細胞と共に注射するのに適する。
【００７８】
代替の実施形態では、ゾル−ゲルポリマー複合体が、再建または美容手術のための増量剤として使用するのに、薬物送達系、例えば治療剤の徐放性送達のためのプラットフォームとして使用するのに、または、静脈瘤の治療、例えば注射可能な発泡体を形成するのに、適することが見出される。いくつかの実施形態では、ゾル−ゲルポリマー複合体は、子宮筋腫を治療するための増量剤として、または歯科インプラントとしての使用に適する。複合体は、創傷を止血する場合において、例えば、血流をブロックするため、例えば象牙細管をブロックするために役立つ、また、脳インプラントとして役立つ、ならびに歯上におけるフィルム形成ポリマーとして役立つ多孔性固体を注射後に形成する場合において、使用するのにさらに適する。
【００７９】
動物のための乳頭シーラントとしてのゾル−ゲルポリマー複合体
本開示のゾル−ゲルポリマー複合体を包含する乳頭シーラントの所望の特性は、シーラントの意図される使用法、例えば、シーラントが適用される場所（例えば、外部乳房組織または乳頭洞（ｔｅａｔ  ｃａｖｉｔｙ））、シーラントの配合及び他の要因に依存する、ことを理解すべきである。しかしながら、乳頭シーラントのいくつかの一般的な特性を述べることができる。シーラントが乳頭管中の乳腺内に配置される場合、例えば、調整可能な剪断減粘性特性により、注入の容易化ならびに乳頭管からの手動ストリッピングによる除去が可能になる。接着した乳頭シーラントが、乳頭から容易に取り外されることは有利である。乳頭シーラントの配合を調整することにより、ゾル−ゲルポリマー複合体は、シーラントを乳頭から容易に剥がすことができ、第１の剥離の１つの粘着単位で除去することができ、後に材料をほとんど残さないように十分に強固にすることができる。ゾル−ゲルポリマー複合体がマクロまたはミクロレベルでプラグとして使用されるとき、それらは、その場で形成された組成物が組織に接着し、必要な限り所定の場所に留まるが、その場所から手動で容易に除去することを可能にする適切な範囲の接着力を包含するように配合することができる。さらに、これらの組成物が、流体を保持または吸収するバリヤが必要である部位に栓をしている場合、その組成物は、それらの所望の位置に留まる間に流体を自然に吸収するように配合することができる。
【００８０】
本開示のその場で形成される乳頭シーラントが、乳頭または乳頭管の形状に適合することはさらに有利である。ゾル−ゲルポリマー複合材の可撓性により、シーラントは、良好な嵌合のために、乳頭表面または乳頭管のトポグラフィー、ならびに乳頭周囲の組織表面に適合することができる。係る順応性はまた、乳頭シーラントの寿命、快適性、及び有効性をも延長する。
【００８１】
本開示における乳頭シーラントとして有用なゾル−ゲルポリマー複合体もまた安全かつ安定である。シーラントの非毒性は、標的動物に対して、ならびに動物を取り扱う人に対して、また動物にシーラントを適用するハンドラーに対して安全性を提供する。乳頭シーラントは、乳腺または関連のパーラー装置内にシーラントの残留蓄積を引き起こさないので、シーラントの非毒性はまた、処置した動物から得られたミルクから作られたミルク及びミルク製品等のヒト用食品が消費するのに安全であることも保証する。すべての組成物成分は、本質的に非重金属であり、生物適合性であり、生分解性で組織接着性であり、最終的な乳頭シーラント製剤中に存在する量において動物に対して非刺激性である。ゾル−ゲルポリマー複合体は動物の乳腺への注入に適しているため、毒性材料、刺激剤等を含有しておらず、温度、ｐＨ、イオン強度等の生理学的条件下での使用に適している。さらに、ゾル−ゲルポリマー複合体は、標準的な蒸気、乾燥滅菌器（オートクレーブ）、ガンマ線照射、電子ビーム法（ｅビーム滅菌）等によって容易に滅菌することができる。防腐剤もまた、乳頭シーラントの有益な特性を変えることなく、組成物中に含ませることができる。
【００８２】
送達方法に依存して、粘度は、乳頭シーラントの製剤において、局所適用、注入等に適するように特別に設計される。したがって、ゾル−ゲルポリマー複合体の粘度は、組成物を、優れたバリヤが作り出されるような方法で、乳頭上または乳頭中に噴霧または流すことができるように、制御される。ゾル−ゲルポリマー複合体はまた、シリンジに容易に通され、動物ハンドラーが急速かつ容易に製品を使用するために室温のシリンジ中で複合体を成形するのに必要な優れた剪断減粘性特性を有する。特に、ゾル−ゲルポリマー複合体は、有益なことに、単一シリンジを用いて注入することができる。乳頭中に直接注入されるとき、製剤は、乳頭管を満たし、体温でゲルへと急速に移行する能力を有する。製剤の剪断減粘性特性により、注入の容易さ及び除去可能性の両方が可能になる。
【００８３】
乳頭上における組成物のゲル化は、好ましくは、適用部位からの組成物の流出または損失を避けるために急速である。ゲル化時間は、特にゾル−ゲルポリマーの外部適用に関しては、約５分以下、好ましくは約３分未満、より好ましくは約３０秒未満、いくつかの状況では約１０秒以下であり得る。
【００８４】
本開示で有用な乳頭シーラントの所望の前記特性のいくつかは、ゾル−ゲルポリマー複合体中のポリマー及びゲル化剤の濃度を調整して、耐久性のあるシールまたは強固な固体の機械的特性及び透過性／多孔性を改変することによって得られる。基本的に、乳頭シーラントの接着性及び膨潤性は、製剤を特別に設計することによって制御される。接着性及び膨潤性の特定の組み合わせを有するゾル−ゲルポリマー複合体は、動物の組織に長時間接着する等の比類の無いかつ新たな特性を示し、さらに、予防的処置が終了されるときには乳頭のバリヤとして容易に除去されるか、または動物の乳頭から一体的に剥離されるかもしくは半固体または液体として容易に除去されるほどに十分に強固であり、さらに、快適性のために動物の身体に適合し、かつ乳房障害の発症を予防または低減するのに有効なバリヤとして適所に留まるほど十分に柔軟である。
【００８５】
乳頭シーラント組成物の送達
適当な粘度は、用いられる送達手段によって左右される。一般に、組成物は、室温で、または使用条件（すなわち、動物においてではない）中に、約８００ｃｐｓ未満、好ましくは３００ｃｐｓ未満、より好ましくはエアロゾルを通して送達される２００ｃｐｓ未満の粘度を有しているべきである。ポンプスプレーによる送達は、通常は、約１５０ｃｐｓ未満等のより低い粘度を必要とする。エアロゾルを含まない噴霧では、約５０ｃｐｓ未満の粘度が必要である。
【００８６】
乳頭シーラント製剤は、従来の手段によって、例えば、シリンジ、ポンプ、スプレーノズル、エアロゾル、浸漬、または他のタイプのデバイスからの噴霧またはストリームによって乳頭に適用される。噴霧及びストリームの組み合わせは、シャワーヘッドと同様な方法で適用することができ、それによって、複数のストリームは、シミュレートされた広範囲をカバーする噴霧適用を提供する。ゾル−ゲルポリマー複合体は、乳頭組織の外側に噴霧されるか、または流され、そこでそれらはバリヤシールを形成する。
【００８７】
乳頭洞または乳頭槽におけるように乳頭内部への注入による適用に関しては、テーパ付きシリンジ端部を有する任意の獣医用シリンジ、特に乳頭管中に溶液を挿入するために作製された乳頭針または乳房内チップ（ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ  ｔｉｐ）を使用することができる。一例として、ゲルは、標準の５または６ｍＬシリンジを用いて、従来の注入カニューレまたは注入ノズルを通して挿入することができる。乳房障害を予防または治療するために、乳頭管に所望の物理的バリヤを形成する乳頭シーラントの有効量は、酪農動物の種及びその乳頭の大きさに依存する。典型的には、２〜３ｍＬの体積は、乳頭管を適切に充填するのに十分であるが、その量は変えることができ、乳頭中にシーラントを注入するハンドラーは容易に量を決めることができる。
【００８８】
一般に、約０．５〜５．０ｍＬの組成物が動物の乳頭に投与され、好ましくは約１．０〜４．０ｍＬ、より好ましくは約２．０ｍＬ以上、さらにより好ましくは約３．０ｍＬが投与される。単位用量を容易に投与するために、製剤をシリンジに予め充填することができる。望ましくは、組成物は、酪農動物が、乳汁分泌サイクルが終わって乾乳期に入ったとき、または酪農動物の乾乳期中、特にそれが幼雌ウシまたは雌ウシであるときに投与される。
【００８９】
組成物は、噴霧デバイスまたはストリームデバイスから乳頭に外部または局所に送達することもできる。噴霧デバイスは、液体組成物の噴霧送達のためのディスペンサーを有する容器を含むことができる。使用される容器のタイプは、組成物及び噴霧ディスペンサーとの適合性に応じて変えることができ、ガラス、プラスチック、または金属であり得る。溶液の粘度が十分に低い場合、適切に設計されたノズルを通して、シリンジのプランジャーを手で押すときに達成される単純な機械的力でスプレーの送達を達成することができる。乳頭の適切な被覆を確保するために、組成物のいくつかの層を乳頭に適用することが望ましい場合がある。いずれにしても、物理的バリヤを形成するための有効量は、乳頭上でのシーラントの視覚的外観によって容易に決定することができる。
【００９０】
組成物は、スプレーヘッドを備えたシリンジを用いて送達することもできる。一般に、容器からスプレーとして液体組成物を推進するための任意の化学的、機械的、または電子的方法が妥当である。一態様では、相溶性の液体または気体のエアロゾル推進剤が、組成物と共に適切な容器に入れられ、ディスペンサーは、液体組成物の霧化された噴霧送達を可能にする弁機構を含む。望ましくは、乳房内注入デバイスを用いて、乳頭シーラント組成物を乳頭に直接送達することができる。このデバイスは、Ｎｏｒｄｓｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｅｓｔｌａｋｅ，Ｏｈｉｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）からの噴霧チップ等の単一ディスペンサーを有することができる。デバイスは、組成物の量を制御できるように計器を含むことができる。
【００９１】
乳頭シーラントとして組成物を送達するために使用することができる、または使用のために改変することができるデバイスの例としては、ＷＯ２０１５／０３８２８１（Ｚｏｅｔｉｓ）、米国特許出願第２０１５／００８０８４１号（Ｃ．Ｂｒａｄｌｅｙら）、米国特許第５，９８９，２１５号（Ｙ．Ｄｅｌｍｏｔｔｅら）、米国特許第８，３５３，８７７号（Ｓ．Ｈａｌｌａｈａｎら）、ＷＯ２００３／０２２２４５（Ｂｉｍｅｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、及びＷＯ２０１３／０２１１８６（Ｎｏｒｂｒｏｏｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されているデバイスが挙げられる。
【００９２】
上記の記載は、新たなゾル−ゲルポリマー複合体製剤を作製する方法ならびに本開示における使用のためのそれらのユニークな特性を示している。以下の例は、本開示の他の態様を実証する。しかしながら、これらの実施例は例示のためのものであって、本開示の条件及び範囲を完全に限定するものであることを意味していないことを理解すべきである。化学薬品は、特に明記しない限り、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ゾル−ゲルポリマー複合体の調製における一連の工程は重要ではなく、実施例とは異なっていてもよいことを理解すべきである。例えば、成分がタンクに導入される順序は、最終生成物を損なうことなく（例えば、キトサンを最初に添加する代わりにメチルセルロースを最初に添加する等）変更することができる。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間等）が与えられているときは、指定された範囲を上回るか下回る条件も使用することができるが、一般的にはそれほど好都合ではないことをさらに理解すべきである。実施例は、室温（約２３℃〜約２８℃）及び大気圧で行う。本明細書で言及されるすべての部及びパーセンテージは、重量基準であり、すべての温度は、特に断らない限り、摂氏度で表される。
【００９３】
本開示のさらなる理解は、以下に続く非限定的な実施例から得ることができる。
【００９４】
実施例１
ゾル−ゲルポリマー複合体の調製及び特性
４つのポリマー複合体製剤（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、及びＦ４）を以下のように調製した。表Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤはそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、及びＦ４製剤を示す。製剤は、表に示したように、約３０ｇ、１１０ｇ、または１６５ｇのバッチで調製した。
【表Ａ−１】
2018536708.tif 000003
【表Ａ−２】
2018536708.tif 000004
【表Ａ−３】
2018536708.tif 000005
【表Ｂ−１】
2018536708.tif 000006
【表Ｂ−２】
2018536708.tif 000007
【表Ｃ−１】
2018536708.tif 000008
【表Ｃ−２】
2018536708.tif 000009
【表Ｄ−１】
2018536708.tif 000010
【表Ｄ−２】
2018536708.tif 000011
【表Ｄ−３】
2018536708.tif 000012
【００９５】
Ｆ１及びＦ４製剤を以下のように調製した：最初に、Ｆ１用に、１３５．５ｍＬの水に０．８１３ｇ（０．７７２ｍＬ）のＡｃＯＨを添加することにより、０．１ＭのＡｃＯＨを調製した。Ｆ４用に、０．８１ｇ（０．７７ｍＬ）のＡｃＯＨを１３５．０ｍＬの水に添加した。次に、０．１Ｎ（０．１Ｍ）ＡｃＯＨ（Ｆ１用に１３５．５ｍＬ及びＦ４用に１３５．０ｍＬ）中、メチルセルロース（１２ｇ）、キトサン（３ｇ）の溶液を調製した。その溶液は、激しく撹拌しながら、８５〜９０℃まで加熱された０．１Ｎ（０．１Ｍ）ＡｃＯＨにポリマー粉末を添加することによって調製した。均質な分散液が得られるまで加熱を続けた（約５分）。次いで、その溶液を撹拌しながら（３００ｒｐｍ）室温まで冷却した。冷却すると、その溶液は透明になり、非常に粘性になり、撹拌速度は６０〜１００ｒｐｍまで低下した。冷却及び清澄化に約１時間かかった。次いで、その溶液を将来の使用まで４℃で保存した。
【００９６】
次いで、水中ゲル化剤の溶液（塩はゲル化剤として製剤において働き、本明細書では「ゲレーター」とも称される）を、粉末状の塩を水と混合することによって調製した。塩溶液の濃度は以下の通りであった：Ｆ１用に、１００ｍｇの四塩基性ピロリン酸ナトリウムを２０ｍＬの水に加え、それを完全に溶解するまで撹拌することによって、四塩基性ピロリン酸ナトリウム（５ｇ／Ｌ）を調製した。Ｆ４用に、２２ｇのβ−グリセロリン酸二ナトリウム水和物（４４％ｗ／ｗ水溶液として）を３３ｍＬの水中に添加し、完全に溶解するまで撹拌しながら４５℃で加熱することによって、β−グリセロホスフェート二ナトリウム水和物（４４％ｗ／ｗ水溶液として）（水６６ｇ当たり４４ｇ）を調製した。
【００９７】
このようにして調製したゲレーター溶液を、冷たいポリマー溶液に添加し、均質になるまでゆっくりと機械的に撹拌（ミキサーを１００ｒｐｍで用いて）した。有意な粘度増強及び気泡形成が観察された。次いで、その溶液を４℃で一晩静置した。液体サイクルでオートクレーブすることにより製剤を滅菌した。
【００９８】
Ｆ２及びＦ３製剤を以下のように調製した。１００ｍＬの水に０．６ｇ（０．５７ｍＬ）のＡｃＯＨを添加することにより０．１ＭのＡｃＯＨを調製した。０．１Ｎ  ＡｃＯＨ（９０ｍＬ）中、メチルセルロース（８ｇ）、キトサン（２ｇ）、及びアジ化ナトリウム（０．０２５ｇ）の溶液を調製した。スターラーバーを備えたビーカーを秤量した。撹拌下で沸騰（８５〜９０℃）まで加熱した０．１Ｎ  ＡｃＯＨに粉末を添加（ワンショット）することによって溶液を調製した。加熱を停止し、スパチュラで約３分間撹拌することにより均質な分散液を得た。これは、最終重量（塩無し）が達成されるまで、ＡｃＯＨを添加して完了させた。次いで、その溶液を室温まで冷却した。冷却すると、溶液は透明になり非常に粘性になった。冷却及び清澄化に約１時間かかった。ビーカーをパラフィルムで覆い、４℃で２４時間（またはその後の使用まで）保存した。
【００９９】
次いで、ゲル化剤（ゲル化剤としての塩またはゲレーター）の溶液を、粉末形態の塩と水を所望の濃度まで混合することによって、水中で調製した。ゆっくりと機械的に（スパチュラまたは１００ｒｐｍのミキサーを用いて）撹拌しながら低温ポリマー溶液にゲル化溶液を添加した。有意な粘度増強及び気泡形成が観察された。その溶液を４℃で一晩静置した。その溶液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して気泡を除去した。
【０１００】
いくつかのポリマーを製剤中において様々な濃度で試験して、製剤性能にとって最も有利なポリマー及びその濃度を選択した。また、製剤の温度応答性、その注入性、及びその流動性を調整するために様々なゲル化剤も試験した。次いで、広範の流動性を有する４つのゾル−ゲルポリマー複合体製剤（Ｆ１〜Ｆ４）を、さらなる試験のために選択した。
【０１０１】
Ｆ１〜Ｆ４サンプルの予備的特徴付けを表Ｅに示す。ゲルのｐＨは約６〜７であったことに留意されたい。この実験では、６ｍＬシリンジを用いる標準の１６ゲージ針を通してゲルを注射することができ、乳頭シールとして使用するために乳頭針または乳頭ノズルを通して注入するそれらのユニークな能力を実証した。表Ｅのデータに関して、試験した製剤は、合計１１０ｇの表Ａ〜Ｄの成分と量を用いて調製した製剤であった。
【表Ｅ】
2018536708.tif 000013
【０１０２】
ミルクの存在下でのプラグ形成を、３７℃において０．５ｍＬのミルク（３．５％脂肪）を含有する試験管に製剤（１．５〜２ｍＬ）を添加することによって試験した。すべての製剤はミルクの表面にゲルプラグを形成した。ミルクとゲルとの間の界面の検査では、ミルクにゲルを添加すると、製剤とミルクとの間にある程度の混合が予想されたが、サンプルは、予想外に、プラグの形成時に、ミルクとの混和性が非常に限定されていることが分かった。その結果は、製剤が、ミルクの存在下でゲルを形成し、試験管からの漏れを防ぐことができることを示した。
【０１０３】
応力掃引試験（すなわち、固定周波数での応力の関数としての弾性率及び損失弾性率の測定）を行ってサンプルの剪断減粘性特性を確認した。結果を図６に示す。表６のデータに関して、試験した製剤は、合計１１０ｇの表Ａ〜Ｄの成分と量を用いて調製した製剤であった。
【０１０４】
低い適用応力では、弾性率Ｇ’の値は一定であった。サンプルの弾性は、Ｆ１の約１０ＰａからＦ４の約４４０Ｐａの範囲の広いスペクトルをカバーした。より高い応力値において、剪断減粘性挙動（すなわち、適用応力の関数としての弾性率Ｇ’の減少）が観察された。剪断減粘性領域は、Ｆ２製剤、続いてＦ１、Ｆ３、及びＦ４について最も低い応力で開始した。これらの結果により、サンプルが注入性であり、それらの注入が可能であることが確認される。製剤注入及び治療後乳頭ストリッピングの間に適用される力は３００Ｐａを十分に超えるため、すべての製剤は送達または回収の問題を経験しないことになる。
【０１０５】
次に、室温から体温への急激な温度上昇時に、製剤のレオロジーをモニターした。１Ｐａの一定応力（すなわちプラトー領域において）及び周波数（ｆ＝０．１Ｈｚ）における時間の関数としての弾性率及び貯蔵弾性率の値を追跡調査した。実験の第１のステップ（１０分）では、温度を２５℃に保った。実験の第２のステップ（１０分）では、温度を３７℃に固定した。両方のステップ間の加熱プロセスは約２０秒かかった。結果は表Ｆ及び図７に示してあり、それらは弾性率Ｇ’及び損失正接ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’として表され、弾性特性及び粘性特性の比はどちらが支配的であるかを示している。ｔａｎδ値が１の場合は、材料の弾性特性及び粘性特性は等しい。損失正接が小さいほど、材料はより弾性である。物理的ゲルに関して、Ｇ’＞Ｇ”及びｔａｎδ＜１である。物理的ゲルに関して、Ｇ”＞Ｇ’及びｔａｎδ＞１である。表Ｆ及び図７のデータに関して、試験した製剤は、合計１１０ｇの表Ａ〜Ｄの成分と量を用いて調製した製剤であった。値は、用いられる装置及びレオロジー方法に基づいて変化し得ること、さらに、これらの値は、特定の試験プロトコルに応じて互いに相対的である、ことが理解されよう。
【表Ｆ】
2018536708.tif 000014
【０１０６】
５３（Ｆ１）から２０（Ｆ４）へと変化したＧ’（３７℃）／Ｇ’（２５℃）（表Ｅ）比の値によって証明されるように、Ｆ１〜Ｆ４の弾性は温度と共に有意に増加した。室温では、Ｆ１は粘性液体のように挙動した（ｔａｎδ＞１）。３つの他の製剤は、固体様の挙動を示し、Ｆ３＜Ｆ２＜Ｆ４の順でより顕著になった。
【０１０７】
３７℃において、弾性率は有意に増加した。これは、損失正接の急速な低下を伴い、ゲル構造の強化を示していた。このプロセスはＦ２、Ｆ３、及びＦ４に関して約１〜２分かかった。Ｆ１製剤に関してはわずかにより長い時間（約５分）かかった。
【０１０８】
結論として、広範な流動特性をカバーする４つのゾル−ゲルポリマー複合体製剤を調製し、特性決定した。ポリマー複合体製剤は、温度、ｐＨ、及びイオン強度の増加に伴って急速にゲル化する。複合体は、２つの親水性ポリマー及びイオン性ゲレーターを含有する。記載したように、第１のポリマーは温度誘導性ゲル化を受け、約３７℃で弾性ゲルの形成することができる。第２のポリマーは、製剤に導入されたイオン性ゲレーターと接触するとゲルを形成する。第２のポリマーのゲルの強度は、添加されるゲレーターの量、ならびに製剤のｐＨ及びイオン強度に依存した。
【０１０９】
サンプルは、それらの剪断減粘性特性に起因して不融性であった。それらは温度誘導性増粘を示し、すなわち、それらのゲル構造は温度の上昇時により強固になった。結果は、製剤の弾性、剪断減粘性の開始、温度誘導性増粘の程度、ならびに、製剤において使用されるゲル化剤に依存するこれらのプロセスの時間スケールが、流動性の正確な調整を可能にする、ことを示した。
【０１１０】
実施例２
ゾル−ゲルポリマー複合体製剤に関する滅菌の効果
オートクレーブを滅菌方法として試験した。上記製剤で使用されるそれらと同様のポリマーは、電離放射線またはエチレンオキシドによる滅菌の際に有意に劣化することが知られている。この劣化は、サンプルを滅菌するために高温を用いることによって軽減することができる。
【０１１１】
滅菌は１２１℃で１０分間行った。加熱及び冷却パートを含むサイクルの全長は約４５分であった。表１は、２つの異なるゲル化剤（Ｆ１及びＦ４）を用いて調製された製剤に関する滅菌前後における特性比較を示している。表１のデータに関して、試験した製剤を、それぞれ合計１６５．５ｇ及び１６５ｇで表Ａ及びＤのレシピを用いて調製した。
【表１】
2018536708.tif 000015
【０１１２】
滅菌後、すべての製剤は、６ｍＬシリンジを用いて標準１６ゲージ針を通して注射することができ、製剤は、乳頭針またはノズルを通して乳頭シーラントとして注射できることを示している。製剤のｐＨは、滅菌の際に有意に変化しなかった。しかしながら、目視観察により、両方の製剤は、オートクレーブ後、より顕著な黄色／褐色を示し、それらの流動特性が変化した、ことが分かった。Ｆ１−２０１４１２１０の場合、２５℃で「ゲル」から「液体」へ変化した。
【０１１３】
次に、滅菌及び非滅菌製剤の流動性の変化を、２５℃〜３７℃までの温度上昇時にさらに詳細にモニターした。一定の応力（１Ｐａ）及び周波数（ｆ＝０．１Ｈｚ）において、時間の関数としての弾性率及び貯蔵弾性率の値を追跡した。実験の第１のステップ（１０分）では、温度を２５℃に保った。実験の第２のステップ（１０分）では、温度を３７℃に固定した。両方のステップ間の加熱プロセスは約２０秒かかった。結果を表２及び図１に示し、それらは、弾性率Ｇ’及び損失正接ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’として表され、弾性特性及び粘性特性の比はどちらが支配的であるかを示している。ｔａｎδ値が１である場合、材料の弾性特性及び粘性特性は等しい。損失正接が小さいほど、材料はより弾性である。物理的ゲルに関して、その値はＧ’＞Ｇ”及びｔａｎδ＜１である。粘性液体に関して、その値はＧ”＞Ｇ’及びｔａｎδ＜１である。表２及び図１のデータに関して、試験した製剤を、それぞれ合計１６５．５ｇ及び１６５ｇで表Ａ及びＤのレシピを用いて調製した。
【表２】
2018536708.tif 000016
【０１１４】
滅菌製剤は、それらの非滅菌対応物と比較してわずかにより小さい値の弾性率によって特徴付けられた。しかしながら、特にＦ４−２０１４１２１０の場合、この差は小さかった。３７℃において、弾性率は有意に増加した。これは、損失正接の急速な低下を伴い、ゲル構造の強化を示している。このプロセスは、製剤Ｆ４−２０１４１２１０については約１〜２分かかり、サンプルＦ１−２０１４１２１０についてはわずかに長かった（約５分）。サンプルの滅菌は、粘性増強のキネティクスと、３７℃でサンプルによって到達されたＧ’及びｔａｎδの最終値とに有意に影響を与えなかった（図１）。
【０１１５】
結局、２つの複合体ゲルを試験した。複合体は、それらの剪断減粘性特性に起因して不融性であった。それらは温度誘起増粘を示し、すなわち、それらのゲル構造は温度の上昇時により強固になった。サンプルの滅菌はサンプルの外観におけるいくつかのわずかな変化を引き起こしたが、製剤の弾性、温度誘導性増粘の程度、及びこのプロセスの時間スケールは、滅菌プロセスによって有意に影響を受けなかった。
【０１１６】
実施例３
ポリマー複合体製剤の滅菌に関するさらなる研究
Ｆ１及びＦ４製剤は、温度、ｐＨ、及び／またはイオン強度の増加に伴って急速にゲル化する水膨潤性ポリマー複合体である。複合体は、２つの親水性ポリマー及びイオン性ゲレーターを含有する。その第１のポリマーは温度誘導性ゲル化を受け、約３７℃で弾性ゲルを形成することができる。第２のポリマーは、製剤に導入されたイオン性ゲレーターと接触するとゲルを形成する。第２のポリマーのゲルの強度は、添加されるゲレーターの量、ならびに製剤のｐＨ及びイオン強度（典型的には約５．１〜６．８のｐＨ及び約５ｇ／Ｌのイオン強度）に依存する。
【０１１７】
実施例２では、製剤の流動性が滅菌によって有意に影響されないことが示された。このさらなる研究は、水膨潤性ポリマー複合体に関する滅菌の効果を示す。
【０１１８】
サンプルＦ１−２０１４１２１０について、レオロジー測定を滅菌後１２週間繰り返した。この期間中、サンプルを室温の密閉プラスチックバイアル中で暗所に保存した。目視観察により、サンプルの外観及びコンシステンシーは、１２週間の保存後に有意に変化していないことが確認された。さらに、微生物の増殖の視覚的徴候はサンプルにおいて検出されなかった。
【０１１９】
最初に、温度が２５℃〜３７℃まで上昇したときの流動性の変化をモニターした。一定の応力（１Ｐａ）及び周波数（ｆ＝０．１Ｈｚ）において、時間の関数としての弾性率及び貯蔵弾性率の値を追跡した。実験の第１ステップ（１０分）では、温度を２５℃に保った。第２のステップ（１０分）では、温度を３７℃に固定した。両方のステップ間の加熱プロセスは約２０秒かかった。結果は表３及び図２に示してあり、それらは弾性率Ｇ’及び損失正接ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’として表され、弾性及び粘性特性の比はどちらが支配的であるかを示している。ｔａｎδ値が１の場合は、材料の弾性特性及び粘性特性は等しい。損失正接が小さいほど、材料はより弾性である。物理的ゲルに関して、その値はＧ’＞Ｇ”及びｔａｎδ＜１である。粘性液体に関して、その値はＧ”＞Ｇ’及びｔａｎδ＞１である。表３及び図２のデータに関して、試験した製剤を、それぞれ合計１６５．５ｇ及び１６５ｇで表Ａ及びＤのレシピを用いて調製した。
【表３】
2018536708.tif 000017
【０１２０】
このデータは、Ｆ１−２０１４１２１０サンプルを１２週間保存することが、流動性または熱増粘効果の程度に有意に影響しなかったことを示している（図２）。２５℃において、サンプルは約１の損失正接を示した。３７℃への加熱は、損失正接の急速な低下を伴い、ゲル構造の増強を示していた。このプロセスのキネティクスは、新たに滅菌された１２週間古いサンプルと同様であった。
【０１２１】
応力掃引試験（すなわち、固定周波数での応力の関数としての弾性率及び損失弾性率の測定）を行って１２週間保存されたサンプルの剪断減粘性特性を確認した。その結果を図３に示す。低い適用応力では、弾性率Ｇ’の値は一定であり、Ｆ１−２０１４０８２５サンプル（合計１１０ｇで表Ａのレシピを用いて調製された）（すなわち、合計１６５．５ｇのバッチで調製されたＦ１−２０１４１２１０と同様の条件下で調製された非滅菌サンプル）について得られた値と同様であった。剪断減粘性挙動（すなわち、適用された応力の関数としての弾性率Ｇ’の減少）は、約８０Ｐａの同様の値において、両方の製剤について観察された。これらの結果により、サンプルの注入性は、室温で１２週間の保存の際に有意に影響されないことが確認される。
【０１２２】
結局、複合体ゲルサンプルのうちの１つの物理化学的安定性を、室温での１２週間の貯蔵（暗所で密閉容器内で）後に評価した。この結果は、１２週間の保存時間後に、サンプルの流動性及び注入性は有意な影響を受けないことを示している。
【０１２３】
実施例４
ナノ結晶セルロースで強化されたＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７ゲルの調製
（１）身体／皮膚温度（３２〜３５℃）に近い温度での製剤のゲル化の開始、（２）室温での製剤の注入性、及び（３）３５℃でゲルの形成を誘導するのに必要な時間に関して開発を行った。
【０１２４】
すべての製剤を以下の手順を用いて調製した：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７ポリマーを、２０ｍＬのガラスバイアル中において、加熱及び撹拌しながら溶融させた（１．６〜１．８ｇ）。必要に応じて、充填剤（ナノ結晶セルロース（ＮＣＣ））を添加した（１００または２００ｍｇ）。撹拌及び加熱を約５分間続けた。２％ＡｃＯＨ水溶液中キトサン溶液を、撹拌しながら、サンプルが最終重量１０ｇになるまで加えた。サンプルを一晩激しく撹拌しながら保持した（加熱無し）。
【０１２５】
ゲル化の開始は、サンプルを水浴中で所望の温度まで加熱することによって測定した。いくつかの製剤に関して、１０ｍＬのプラスチックシリンジから約３ｍＬの製剤を、１６ゲージ針を通すことによって注入性／流動能力を確認した。
【０１２６】
別の実験では、３７℃に加熱したプラスチック製のエッペンドルフ管の壁上に、室温に保ったサンプルを、１６ゲージ針を通して滴下することによってゲル化時間を評価した。溶液の流動が停止するのに要する時間を、ゲル化時間の近似値とみなした。
【０１２７】
キトサン溶液を以下のようにして調製した。２％ＡｃＯＨ中に懸濁させたキトサン粉末を一晩激しく撹拌することにより、キトサン（ＣＨ、２％ｗ／ｗ）溶液を調製し、透明で均質な黄色がかった溶液を形成させた。この溶液を水で１％及び０．５％の濃度に希釈し、続いて約６のｐＨまで０．５％ＮａＯＨ溶液を添加した。その結果を表４に示す。
【表４】
2018536708.tif 000018
【０１２８】
１％のＣＨ（ｐＨ約６）中１７％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７製剤に関する、ナノ結晶セルロース（ＮＣＣ）の量に対するゲル化温度の依存性を示すグラフを図４に示す。
【０１２９】
製剤のゲル化温度は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７の濃度を調整することにより調節することができた。ＣＨの存在はゲル化に影響を及ぼさなかった。すべてのサンプルは室温で注入性であった。１％または２％ＣＨ溶液中１８％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を有する製剤について、ゲル化時間は、ほとんど即時であると評価された。ＮＣＣを添加するとゲル化温度が低下した。ＮＣＣはゲルを補強し、温度ヒステリシスを誘導した（すなわち、サンプルは、加熱時に測定されるゲル化点よりも低い温度まで冷却すると液体になる）。
【０１３０】
実施例５
修飾キトサンゲルの合成
カルボキシメチルキトサンを以下のように調製した。カルボキシメチル化を、キトサン（２ｇ）を２０％ＮａＯＨ（ｗ／ｖ１００ｍＬ）中で１５分間撹拌することによって行った。次いで、モノクロロ酢酸（１５ｇ）を反応混合物に滴加し、撹拌しながら反応を４０±２℃で２時間続けた。次いで、その反応混合物を１０％酢酸で中和し、次いで、過剰の７０％メタノール中に注いだ。生成したカルボキシメチルキトサンを、Ｇ２焼結漏斗を用いて濾過し、メタノールで洗浄した。その生成物を真空中で、８時間５５℃で乾燥させて６．５ｇの乾燥カルボキシメチルキトサンを得た。記載されている方法（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｖｏｌ．５，ｎｏ．２，２００４）を用いて、カルボキシメチルキトサン（ＣＭＣｈ）の置換度を測定すると０．７５であった。
【０１３１】
ポリビニルアセテート（ＰＶＡ）（１ｇ）を水（８５ｍＬ）に４５℃で溶解させた。ＰＶＡ水溶液を室温まで冷却した後、激しく撹拌されているＰＶＡ溶液に対してアセトン（１５ｍＬ）を１５分間滴下して約１％（ｗ／ｖ）のＰＶＡ溶液を形成した。次いで、ＰＶＡの長鎖がナノ粒子に収縮したことを示す淡黄色になるまで、その溶液を５℃で２４時間保持した。次いで、その溶液に異なる量のＣＭＣｈ（０．５、１、及び２重量％）を添加した。その溶液をＮ２で３０分間パージし、次いで４．０ｍｍｏｌのメチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）、０．４ｍｍｏｌの過硫酸カリウム（ＫＰＳ）、及び０．６７ｍｍｏｌのテトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を溶液に添加し、３０℃で１５時間重合させた。形成されたナノゲルは、直接使用するか、または凍結させて凍結乾燥粉末を形成させることができ、その粉末は水中に容易に予備分散され、使用前にナノ粒子分散液を形成する。
【０１３２】
アシルキトサンを以下のように調製した。キトサン分子のアミノ基をアシル化反応から保護するためにＭｅＳＯ３Ｈをキトサン用の溶媒として使用した。典型的には、キトサンを室温で１時間ＭｅＳＯ３Ｈに溶解し、次いで塩化オクタノイルを撹拌しながら滴下した。塩化オクタノイル対キトサンの繰り返し単位のモル比は０．６６：１に等しい。その反応を周囲温度で５時間継続させた後、砕氷を添加して反応を停止させた。得られた溶液を１日透析して大部分の酸を除去し、続いて残りの酸及びアンモニウム塩をＮａＨＣＯ３で中和した。最終混合物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に対して３日を超えて透析し、次いでアシルキトサン（ＡＣ）粉末として凍結乾燥した。
【０１３３】
実施例６
ＰＶＡ−アシレートの合成
材料：ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、１８６Ｋ、８７％〜８９％加水分解：１０ｇのＲ−ＣＯＣｌ（例えば塩化ラウロイル、塩化パルミトイル、塩化オクタノイル）：１．６８ｇのトリエチルアミン（ＥＴ３Ｎ）：２．２５ｍＬの１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）：１００ｇ。
【０１３４】
別の実験では、材料は以下の通りであった。１０ｇのＰＶＡ、１８６Ｋ、８７〜８９％加水分解；３．３６ｇのＲ−ＣＯＣｌ（塩化ラウロイル、塩化パルミトイル、または塩化オクタノイル）；４．５０ｍＬのＥＴ３Ｎ；及び１５０ｍＬのＮＭＰ。
【０１３５】
合成手順：熱ＮＭＰにＰＶＡを加え、粘度が高すぎる場合は、最終体積５０ｍＬまでさらにＮＭＰを添加した。完全に溶解した後、Ｒ−ＣＯＣｌを添加し、続いてＥＴ３Ｎを添加した。その混合物を撹拌しながら室温で一晩放置した。次いで、ＰＶＡ−アシレートを３倍の水を加えて希釈し、撹拌し、次いで５日間にわたって透析によって精製し、次いで凍結乾燥した。収率：９０％
【０１３６】
このようにして調製したＰＶＡ−アシレート６ｓ−１での粘度を図５に示す。
【０１３７】
実施例７
雌ウシに注入された乳頭シーラントの保持及び耐性の評価
この研究の目的は、乳牛の乾乳期中に乳房内乳頭シーラント（ＩＴＳ）としての、２つのゾル−ゲルポリマー複合体製剤（Ｆ１及びＦ４をそれぞれ表Ａ及びＤの配合を用いて合計１６５．０ｇで調製した）の新規な使用の保持及び耐性を評価することにあった。
【０１３８】
研究開始時に８匹の雌ウシ（成牛の乳汁分泌妊娠ホルスタイン乳牛）を乾乳させ、分房（ｑｕａｒｔｅｒ）それぞれに２つの処置群Ｔ０１及びＴ０２のうちの１つを割り付けた。群Ｔ０１はＦ１で処置し、群Ｔ０２はＦ４で処置した。シーラント注入の前に、ラベル指示に従って分房１つあたりにＳｐｅｃｔｒａｍａｓｔ（登録商標）ＤＣ（塩酸セフチオフルール）乾乳雌ウシ療法を施した。製剤は注入前に蒸気滅菌した。ＩＴＳのすべての用量を、割り付けた雌ウシのすべての利用可能な分房に対して乳房内注入として投与した。全８匹の動物を、研究期間中全体を通して定めた時間に一貫した超音波評価のために割り当てた。投与の約６０日後、出産時に、すべての試験ＩＴＳを手動ストリッピングによって除去した。一般的な健康観察及び視覚による乳房（ｕｄｄｅｒ）／分房（ｑｕａｒｔｅｒ）観察を実施し、研究全体を通して記録した。
【０１３９】
ＩＴＳ製剤を、シリンジ及び特殊な混合チップアタッチメントまたは即時使用できるプラステット（ｐｌａｓｔｅｔ）を介して、乳房内（ＩＭＡＭ）に２．０ｍＬ送達した。部分挿入投与法を用いた。Ｆ１及びＦ４を２．２ｇ＋／−０．５ｇで注入した。両方の製剤は容易に注入されたが、基材の剪断減粘性特性に起因して、開始するのに初期抵抗が認められた。Ｆ４は、Ｆ１と比較すると、注入するのにより多くの力を必要とした。しかしながら、いったん流動が開始されると、Ｆ４はより注入しやすくなった。すべてのシリンジは、注入前にオートクレーブ処理した。動物のすべての試験乳頭中への基材の注入は容易に達成された。シリンジに欠陥は認められなかった。シリンジによる注入は難しくなかった。
【０１４０】
子ウシは、出生時に直ちに離され、哺乳させなかったと理解された。基材は、投与約６０日後に、出産後の動物の最初の搾乳時に、すべての乳頭から手動によるストリッピングによって容易に除去された。いずれの基材も任意の動物の乳頭から除去する際に困難はなかった。
【０１４１】
シーラント基材の存在を分析するために、出産後最初のミルクのサンプルを捕集した。乳頭シーラント材料を初乳と区別できないため、除去後のサンプル重量は測定しなかった。剪断減粘性及び温度感受性の乳頭シーラントの特性の結果として、かつ、剪断力を製剤に及ぼして乳頭槽から製剤を除去するため、乳頭から除去する際に製剤は薄まった。さらに、これらの製剤は、より温かい温度でゲル化し、より冷たい温度では液体になるため、捕集された初乳ストリッピングサンプルを捕集直後に冷蔵庫に入れると製剤はさらに薄まった。製剤が冷蔵庫の低温で液体形態に戻ると、シーラント基材を初乳から分離して除去された全基材を測定するための正確な回収率を容易にするには従来の手段では困難になった。
【０１４２】
病理学者は、製剤の安全性のために乳頭管の内部を検査した。試験基材または試験製剤と関連のある肉眼的病変は同定されなかった。軽度の上皮下線維症及び単核細胞浸潤を有する１つの乳頭の１つの発症が認められた。この知見は、試験基材と相関があるものではなかった。検査した他のすべての乳頭は正常であり、有害な所見はなかった。任意の基材の懸念を除外するために肉眼的病理的懸念のある任意の領域が確認された場合は、セクショニングのために組織が送られたが、何も確認されなかった。この保持研究からの顕微鏡的組織評価は、基材関連の所見を何ももたらさなかった。
【０１４３】
製剤は、出産まで乳頭に残り、超音波採点によって保持期間全体を通して視覚的に評価した。超音波検査は、訓練されたスタッフによって行われ、その後、０日、１日、４日、その後、出産まで毎週、シーラントの存在を評価した。数値は、０（乳頭槽に明らかなシーラント無し）〜５（乳頭槽はシーラントで完全にブロックされているように見える）の視覚スケールで記録した。毎日の観察形式であらゆる異常な観察を記録した。すべての製剤は、乾乳雌ウシ期の全体を通して、発症せずに、乳頭中に留まった。
【０１４４】
超音波スコアリングの結果を、それぞれＦ１及びＦ２に関して以下の表５及び６に示す。
【表５】
2018536708.tif 000019
【表６】
2018536708.tif 000020
【０１４５】
要約すると、この研究は、ゾル−ゲルポリマー複合体製剤が、乳房内注入によって容易に投与され、かつ手動ストリッピングによって容易に除去されることを示した。この結果はまた、乳牛が有害な副作用無しに乳頭シーラントに対して耐性があることも示した。最後に、その結果は、研究終了時にシーラントが物理的に除去されるまで、乳牛の乾乳期中、乳頭シーラントが保持されることを実証した。
【０１４６】
実施例８
雌ウシに注入された乳頭シーラントの保持及び耐性の評価
この研究の目的は、乳牛の乾乳期中に乳房内乳頭シーラント（ＩＴＳ）としての、２つのゾル−ゲルポリマー複合体製剤（Ｆ１及びＦ４をそれぞれ表Ａ及びＤの配合を用いて合計１６５．０ｇで調製した）の新規な使用の保持及び耐性を評価することにあった。
【０１４７】
研究開始時に３０匹の雌ウシ（成牛の乳汁分泌妊娠ホルスタイン乳牛）を乾乳し、分房（ｑｕａｒｔｅｒ）それぞれに４つの処置群Ｔ０１〜Ｔ０４のうちの１つを割り付けた。製剤１つ当たり２．０及び３．０ｍＬの２つの用量体積を注入して、保持に関して影響を与えるかどうかを評価した。群Ｔ０１及び群Ｔ０２はそれぞれ、約２．０ｍＬの体積（実際の送達：平均１．９９±０．１９）及び約３．０ｍＬの体積（実際の送達：平均２．８８±０．１５）のＦ１による処置を受けた。群Ｔ０３及び群Ｔ０４はそれぞれ、約２．０ｍＬの体積（実際の送達：平均１．５４±０．３７）及び約３．０ｍＬの体積（実際の送達：平均２．２４±０．５５）のＦ４による処置を受けた。動物は、最初に、研究の開始前少なくとも１０日間、施設、食餌、及び水源に順応させた。研究日−１±２日で、朝の搾乳前、体細胞数分析及び細菌評価のためにミルク分房サンプルを採取した。
【０１４８】
シーラント注入の前に、ラベル指示に従って分房１つあたりにＳｐｅｃｔｒａｍａｓｔ（登録商標）ＤＣ（塩酸セフチオフルール）乾乳雌ウシ療法を施した。ＩＴＳのすべての用量を、割り付けた雌ウシのすべての利用可能な分房に対して乳房内注入として投与した。研究全体を通して定めた時間に全３０匹の動物の乳頭に関する週１回の超音波評価を完了して、物理的バリヤとしてのシーラントの保持及び評価を決定した。
【０１４９】
１５匹の動物の４つすべての分房の乳頭端を、乾乳期全体を通して、かつ乳頭シーラント及び乾乳雌ウシ療法の投与後に、細菌懸濁液に毎週曝露して乳牛において不良な衛生状態をシミュレートした。Ｅ．ｃｏｌｉの凍結保存株を用いて、トリプチカーゼ大豆ブロス中１×１０６コロニー形成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）の細菌懸濁液を調製した。動物の４つすべての乳頭端部を、７日目から開始して毎週１回、ディップカップにおける単一浸漬によってＥ．ｃｏｌｉ調製物に曝露した。Ｅ．ｃｏｌｉへの曝露は、出産後または乳頭シーラントの除去後に停止した。
【０１５０】
投与から約６０日後及び出産後最初の搾乳において、試験ＩＴＳを手動ストリッピングによって除去した。回収したシーラントサンプルを室温で保存した。出産後最初の搾乳の日に始めて、各雌ウシを、乳腺炎の臨床徴候について観察した。細菌学的培養のための滅菌分房サンプルを、出産後１、２、３、７、１０、及び１４日目に、各個々の乳頭の丁寧な洗浄及び予備ストリッピングの後に、乳房分房（ｕｄｄｅｒ  ｑｕａｒｔｅｒ）それぞれから採取した。潜在的な残留物または代謝産物を測定するために、実験全体を通して様々な時間でミルク及び初乳サンプルを捕集した。体細胞数及びミルク重量も記録して、乳房状態、乳腺炎の存在、及びミルクの品質を評価した。
【０１５１】
すべての基材についての超音波分析は、投与体積にかかわらず、乾乳期全体を通じて有意な量の材料の存在を示した。基材は、１４〜３５日の間に外観の変化が観察された。両方の製剤は、乳頭管に存在し続けるようであり、乳頭シーラントを物理的に除去するまで、乾乳期全体を通して保護バリヤとして残った。出産後、基材を、手動のストリッピングによって乳頭から除去した。
【０１５２】
乳汁分泌に戻った時点で、乳房の健康、ミルク外観、及び細菌の存在を、研究に残っているすべての動物について２週間にわたってモニターした。１４日間の期間にわたって、すべての処置群について少数の個体雌ウシにおいて異常（上昇した）な乳房健康スコアが認められたが、これらは乳頭シーラントの失敗に起因するものではなかった。乳房の健康またはミルク品質のスコアはいずれも、処置群間で統計的に異なっていなかった。
【０１５３】
適切に設計されかつモニターリングされたフィールド研究が、乳腺炎の予防を確認するために必要とされる。しかしながら、この保持研究に基づいて、ゾル−ゲルポリマー複合体は、健康な酪農動物を新たな感染または再感染から保護するこができるほど十分で長期間持続する物理的バリヤを提供すると結論付けることができる。
【０１５４】
要約すると、すべての処置は乾乳期全体を通して維持され、超音波評価を通じて乳頭を保護すると考えられた。すべての基材は容易に除去可能であり、組織の肉眼的及び顕微鏡的評価では処置関連の効果の影響は認められなかった。全体として、製剤Ｆ１及びＦ４の両方は、乾乳期全体を通して良好な保持によって十分に機能した。
【０１５５】
実施例９
薬物放出のためのゾル−ゲルポリマー複合体の使用に関する評価
この研究の目的は、ゾル−ゲルポリマー複合体製剤による抗菌剤の放出及び抗菌活性を評価することにあった。上記のようにして調製した製剤Ｆ２を使用し、それに、伸展によって試験シーリングのためのプラグ形成と関連があるレオロジー特性に影響を及ぼさずに製剤１グラム当たり２０ｍｇのアモキシシリンを充填した。
【０１５６】
アモキシシリン充填メチルセルロース（８．０ｍ％）、キトサン（２．０ｍ％）、アモキシシリン三水和物（２．０ｍ％）、及びリン酸一カリウム（０．７６ｍ％）を、０．１Ｍ酢酸中において、均質なオフホワイトのクリームが得られるまで完全に混合することによって、充填したＦ２ゾル−ゲルポリマー複合体製剤を調製した。
【０１５７】
充填されたＦ２ゾルゲルのレオロジーデータを、未充填のＦ２ゾルゲルポリマー複合体のそれと比較した（表７）。表７のデータは、未充填（ｎ＝６）または充填（ｎ＝３）ゾル−ゲルのうちのいくつかのバッチ（同じ原料由来）に関する平均特性を表している。剪断貯蔵弾性率Ｇ’及び剪断損失弾性率Ｇ”の値は、２つのゾル−ゲル製剤間では統計的に等しく、したがってｔａｎδ値もやはり等しかった。これは、ゾル−ゲルポリマー複合体のこれらの関連する物理的特性が、２ｍ％アモキシシリンの組み込みによって影響を受けなかったことを実証している。
【０１５８】
アモキシシリンの定量：充填されたゾル−ゲルポリマー複合体からのアモキシシリン放出をモニターするために、単純な分光光度法を用いて薬物を定量した。２７４ｎｍでの吸光度は、ε２７４＝１．２ｍＭ−１ｃｍ−１を用いてリン酸塩緩衝水溶液中のアモキシシリン濃度と相関していた。（Ｃａｒｙ  ６０  ＵＶ−Ｖは分光光度計である、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。この消光係数は、文献で見出される他の値と一致している（ε２７４、エタノール＝１．４ｍＭ−１ｃｍ−１及びε２７２、ＨＣｌ  ０．１Ｍ＝１．１ｍＭ−１ｃｍ−１；Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  Ｏｎｌｉｎｅ）。
【０１５９】
アモキシシリン放出。ある量の充填されたゾル−ゲルポリマー複合体を、最初に、Ｔ＝３７℃またはＴ＝２５℃のいずれかに保持された石英キュベットの最下部に置いた。次いで、そのキュベットを既知量のリン酸塩緩衝液（１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝６．５）で満たした。この時点で、アモキシシリンはゾル−ゲルから拡散し始めた。この放出は、２７４ｎｍでのゾル−ゲルアリコート上の溶液の吸光度に従ってモニターされた。アモキシシリン放出（図８）は
放出％＝（Ａ／εｌ）・（ｎアモキリシン／Ｖ）
によって計算され、式中、Ａは２７４ｎｍでの吸光度であり、εは２７４ｎｍ（１．２ｍＭ−１ｃｍ−１）におけるアモキシシリンの吸光係数で、ｌはキュベットの経路長であり、ｎアモキシリンは、最初にキュベット底部に置かれた、ゾル−ゲル中に初期に含有されたアモキシシリンの量であり、Ｖはキュベットにおける全体積（すなわちＶ緩衝液＋Ｖゲル）である。図８の曲線は、３つのゾル−ゲルポリマー複合体バッチに関して実施された実験での平均放出を表す。３７℃曲線（すなわち生理学的温度）は、ゾル−ゲルによる初期放出挙動を示し、薬物の約５０％が約１時間にわたって放出され、続いて約６時間後にアモキシシリンの１００％が放出されるまで持続放出され、これは、抗菌剤の迅速かつ持続的な血中濃度を達成するのに有益となる。２５℃では、放出ははるかに遅く、アモキシシリンの約２０％のみが５時間後にゾル−ゲルポリマー複合体から放出された。これらの結果は、充填されたゾル−ゲル製剤が、生理学的温度でかなり緩やかな放出曲線に従ってその内容物を放出したことを実証している。さらに、放出速度はサンプル温度と正の相関があることが見出された。
【表７】
2018536708.tif 000021
【０１６０】
抗菌活性：アモキシシリン充填ゾル−ゲルポリマー複合体の抗菌活性を、Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒディスク感受性試験により評価した。その阻害ゾーンを評価し、無充填ゲルのそれと比較した。
【０１６１】
上記のようにして調製した１ｇのアモキシシリン充填Ｆ２ゾル−ゲルのアリコートを２５ｍｍセルロースディスク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に塗布した。次いで、そのディスクを、ブロス培養液中１００μＬのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２を接種され、０．５  ＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度標準に適合するように希釈されたＴＳＡ  ＩＩ血液寒天プレート（Ｏｘｏｉｄ）上に置いた。無充填Ｆ２ゾル−ゲルを用いて実施された対照実験にも同じ手順を用いた。
【０１６２】
２４時間のインキュベーション後に、ｄ＝４２ｍｍの阻止帯（表８）が、充填されたゲル用のセルロースディスクの周囲に見えたが、対照は阻止帯を示さなかった。ディスクサイズを超える１６ｍｍの阻止帯に関して、アモキシシリンのＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２に対する有効な抗菌作用が観察される。
【表８】
2018536708.tif 000022
【０１６３】
要約すると、アモキシシリンは、分光光度法によって、３７℃では６時間以内に完全にゾル−ゲルポリマー複合体から放出され、２５℃では２５％のみが放出されることが示された。最後に、アモキシシリンが充填されたゾル−ゲルポリマー複合体は、Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒの感受性ディスク法によって評価し未充填ゾル−ゲルと比較して、明らかな抗菌活性を示した。
【０１６４】
実施例１０
細菌移動に対するバリヤとしてのゾル−ゲルポリマー複合体の評価
この研究における２つの試験の目的は、模擬ガラス製雌ウシ乳頭における細菌移動に対するバリヤとして作用するゾル−ゲルポリマー複合体製剤の能力を例示することであった。
【０１６５】
表９に示したゾル−ゲルポリマー複合体製剤Ｆ１〜Ｆ４を、上記のようにして調製した。
【表９】
2018536708.tif 000023
【０１６６】
異なるゾル−ゲル製剤は、表１０に示すように、Ｔａｎδ、Ｇ’及びＧ”の形態のレオロジー特性それぞれによって定義することができる。
【表１０】
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【０１６７】
試験１−ゾル−ゲルポリマー複合体の細菌に対する不透過性の評価：試験１は、ゾル−ゲルポリマー複合体サンプルを含むゲル媒体を通って移動する細菌の能力を試験するための標準的な細菌運動性試験に基づいた。この目的のために、運動性細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２を、０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度標準に適合させるためにトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）中一晩培養物の１／１０希釈溶液として接種した。１５ｍＬのポリプロピレン試験管において、調べる１０ｍＬのゲルプラグを最初に入れ、次いで各試験製剤の上にトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ  ０．５ｇ／Ｌ）の層を添加した。ＴＴＣは、細菌感受性色素であり、細菌と接触して還元されると赤色沈殿物を形成する。
【０１６８】
ＴＳＢ中で一晩培養した細菌溶液を第３の層として添加した。この接種物１ｍＬをＴＴＣに添加し、試験管を３７℃で２４時間及び４８時間インキュベートした。
【０１６９】
ゾル−ゲルポリマー複合体製剤中を移動する細菌の能力を、試験管中の下部ゾル−ゲル層の上から下まで測定された赤色の深さによって評価する。試験管を色について検査し、色は、潜在的な細菌の移動に応じて上から下へと広がることができる。培地中に部分的に浸透することに起因する細菌−ゲル界面に見られる初期の赤色があった（ＴＴＣの還元）。表１１に示すように、本開示のＦ１〜Ｆ４ゾル−ゲルポリマー複合体製剤は細菌浸透を許さず、ＢＡＭ１０３対照は４８時間以内に細菌浸透を許した。硬い寒天対照の細菌浸透は、寒天の薄い界面水層が形成される、Ｆ１〜Ｆ４ゲルとチューブとの間の界面においてのみ観察された。
【表１１】
2018536708.tif 000025
【０１７０】
上記の実験は、ゾル−ゲルポリマー複合体製剤が運動性細菌に対して不透過性であることを実証した。
【０１７１】
試験２−人工ガラス製雌ウシ乳頭におけるゾル−ゲルポリマー複合体バリヤ特性の評価：試験２を用いて、２つの容器間の細菌移動を防止するゾル−ゲルポリマー複合体の能力を評価した。この実験のために、底部の第１の容器１を栄養ブロス及び細菌で満たした。上部の第２の容器２を滅菌栄養ブロスで満たした。２つの容器は、上記のようにして調製されたゾル−ゲルポリマー複合体製剤Ｆ３で満たされた模擬ガラス乳頭（Φ２６ｍｍ、長さ６ｃｍ、穴φ２．６ｍｍ）によって連結された。実験は、３７℃で経時的に容器２内へと上方に移動することができる細菌汚染の有無を追跡することからなっていた。
【０１７２】
表１２に示した細菌株を、ウシ乳腺炎の原因の代表であると考えられる混合培養物として試験のために選択した。
【表１２】
2018536708.tif 000026
【０１７３】
この実験において、ガラスとゾル−ゲルポリマー複合体プラグとの間の接着は、バリヤ性能にとって重要であるように思われた。気泡の存在、不均一な接着、または連続ゾル−ゲルポリマー複合体転移は、ガラス−ゲル接着を低下させることにより性能を低下させた。この現象は、実験の開始時に特に有意であり、２つの容器の直接の結合を引き起こした。ガラス−ゲル接着不良の追跡は、細菌と接触して還元される際に赤色の沈殿物を形成するバクテリア感受性色素であるトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ  ０．５ｇ／Ｌ）の添加によって行われた。
【０１７４】
経時的に細菌バリヤ特性を維持するＴＴＣ標識Ｆ３の能力に関する研究を評価した。０日目、２日目、５日目、６日目、９日目、１２日目、及び１８日目に、細菌汚染を、滅菌及び汚染培地区画の両方において評価した。観察は、０日、３日、６日、１４日、及び１５日に記録された。培養培地の交換及び新鮮な接種が、３日目、６日目、９日目、及び１３日目に、汚染区画に対して添加された。１２日目に、部分的接着不良の兆候がガラス−ゲル接着の低下を示し始めた。１２日目及び１７日目に、Ｆ１〜Ｆ４ゾル−ゲルポリマー複合体サンプルとのガラス製雌ウシ乳頭界面において接着不良が観察された。１５日目に、ゲルプラグの上の上部容器２において汚染が視覚的に検出された（すなわち、ＴＴＣ色素拡散は、０日目に十分に接着していたプラグがガラスへの接着を失ったときに初期には汚染されていなかった区画で赤色を示した）。１７日目に、プラグはガラスに対して完全に接着するのを停止した。１８日目までに、プレートカウントによる細菌汚染の定量化により、ガラスへの接着の喪失は、容器２の汚染をもたらすゲル−ガラス界面を通って細菌が移動するのを可能にするような無菌性違反を証明した。
【０１７５】
ゾル−ゲルのガラスに対する接着破壊の危険性が高いことを知っているため、この試験はゾル−ゲル性能に対して非常に不利である。接着不良が生じるまでに、実験の１〜１５日の間のいくつかの試験で報告された実際の性能は、表１３にまとめられているように、Ｆ３は細菌汚染を防止したことを示している。石油ゼリー／パラフィンワックス１：５の対照は、細菌に対して完全に不透過性であることが知られている疎水性プラグに基づいているが、対照はまた、ゾル−ゲル複合体について観察されたものと同様なガラスとの接着問題も経験した。結果は、この不透過性対照及び本開示のゾル−ゲルポリマー製剤について、同様の性能を示している。８〜１５日の間にＦ３について得られた性能は、すなわち、ガラスへの接着を維持し、かつ細菌に対するバリヤとして作用する能力は、２４時間後の細菌汚染を防止できない透過性対照ＢＡＭ１０３について観察された性能よりも有意に高い。したがって、試験２は、本開示のゾル−ゲル複合体製剤が、細菌移動に対する有効なバリヤである能力を有していた証拠を提供する。
【表１３】
2018536708.tif 000027
【０１７６】
要約すると、試験１は、運動性細菌の移動を許した対照ゲルＢＡＭ１０３と比較して、４８時間以内の細菌移動を防止するゾル−ゲルポリマー複合体製剤の能力を実証した。異なるゾル−ゲルポリマー複合体製剤の結果は、細菌に対する完全な不透過性を示し、したがってゲル中への細菌の浸透を防止した。試験２では、細菌移動に対する人工ガラス製雌ウシ乳頭におけるバリヤ特性は、ガラス（模擬基材）とゾル−ゲルプラグとの間の接着が維持される限り、持続することが示された。性能は、パラフィン／ワセリンの不透過性対照と同様であり、ＢＡＭ１０３の透過性対照よりも有意に長いことが示された。実施例７及び８に記載したｉｎ  ｖｉｖｏ研究では長期間の保持が観察されたことから、本開示のゾル−ゲルポリマー複合体製剤は、シーラントが物理的に除去されるまで、乳牛の乾乳期中に、運動性及び不動性両方の細菌移動に対する有効な乳頭シーラントバリヤとして作用することを理解することができる。
【０１７７】
実施例１１
ゾル−ゲルレオロジーに関する無機充填剤の影響の評価
ゾル−ゲルポリマー複合体製剤Ｆ２（１．５Ｌ）を、実施例１に上記したように調製し、次いで、様々な濃度（１重量％、５重量％、及び２０重量％）で、充填剤（二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）またはナノ結晶セルロース（ＮＣＣ））と混合した。ゾル−ゲルポリマー複合体製剤の密度及びレオロジー特性に関する充填剤の影響を評価した。結果は図１４に示してある。
【表１４】
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【０１７８】
結果は、ゾル−ゲルポリマー複合体製剤中の充填剤の量を増加させると貯蔵弾性率（Ｇ’）が増加したことを示しており、製剤中の固形分が高いほどゲルが３７℃でより硬くなることを示している。１及び５重量％のＳｉＯ２では、損失弾性率は、元の製剤（「無し」）と比較してほぼ同じままであった。主材料と比較して両方の温度でＧ”が増加した５重量％を除いて、ＮＣＣについて同じ観察を行うことができた。２５℃でのｔａｎδに関して、１重量％のＳｉＯ２では増加し、これは、元のバッチ（「無し」）と比較して、室温でより良好にゲルが流動していることを示している。それは、固形分について既に記載したのと同じ理由で、充填剤含量の増加と共に減少した。同じ挙動がＮＣＣで認められた。２０重量％のＮＣＣに関しては、ゲル転移は明確に観察されなかった。最後に、元のバッチは、ゾル−ゲル内に気泡が存在するため、水よりも低い密度（０．９６ｇ／ｍｌ）を有していた。充填剤をゾル−ゲル製剤に最大２０重量％添加すると、生成物は気泡の無いＦ２製剤の許容誤差内の約１．１０ｇ／ｍｌの密度に達することができた。要するに、この結果は、二酸化ケイ素無機充填剤を添加すると、製剤のゾルからゲルへの移行及び剪断減粘性に影響を及ぼすことなく、ゾル及びゲル状態の両方についてＧ’（約２倍まで）を有意に増加させ得ることを示している。
【０１７９】
実施例１２
ゾル−ゲル特性に対するキトサン脱アセチル化度（ＤＤＡ）の影響に関する評価
様々脱アセチル化度（％ＤＤＡ）を有するキトサンを用いて、実施例１に記載したようにゾル−ゲルポリマー複合体製剤Ｆ２を調製した。結果は図１５に示す。
【０１８０】
製剤Ｆ２中のキトサン％ＤＤＡが７６％未満に低下すると、製剤はそのゾル−ゲル特性を喪失し始めた。特に、２５℃及び３７℃で観察されるｔａｎδ値、とりわけｔａｎδ比（２５℃でのｔａｎδ／３７℃でのｔａｎδ）はゾル−ゲル転移の指標及びスケールを提供する。低い％ＤＤＡ源のキトサン（９０％〜７５．５％ＤＤＡ）への移行時に、Ｆ２性能の顕著な低下が観察され、以下の表１５に示すようにｔａｎδ比が３．３−６．４〜１．２に低下した。
【表１５】
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【０１８１】
ゾル−ゲル性能の低下を説明するために、二因子実験計画法（ＤＯＥ）が考案された。キトサンの２つのパラメーター、すなわち脱アセチル化度（％ＤＤＡ）及び分子量（ＭＷ）を考慮した。
【０１８２】
最適なＦ２製剤に関する最も重要な出力因子（ｏｕｔｐｕｔ  ｆａｃｔｏｒ）及びそれらの期待値は、３７℃での許容可能なｔａｎδ値を維持しながら、以下の、２５℃での複素粘性率、２５℃でのｔａｎδ、及びゲル化の振動応力である。
【０１８３】
Ｆ２製剤が可能な限りほとんど「液体」特性を示すためには、複素粘性率は低く、２５℃でのｔａｎδ値は高くなければならず、これにより、製剤に関するスケールアップ加工性が最大化されることが予想される。ゲル化の振動応力は、製品の「注入性」を増加させるために、最終的には最終使用者がシリンジを介して製品送達を繰り返すためには、低くなければならない。ＤＯＥ結果を表１６にまとめる。
【表１６】
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【０１８４】
表１６に示した結果は、％ＤＤＡが、複素粘性率の低下、２５℃でのｔａｎδの増加、及び製剤注入性の低下において最も重要な因子であったことを示している。このＤＯＥの結果はまた、高ＭＷ／高％ＤＤＡ（４０４５８０ｋＤａ、９７．６％ＤＤＡ）キトサンがこれらの特性に関して最適な製剤を生成させたことも示唆した。得られた製剤は、ゲル様性質とは対照的な、最低粘性（複素粘性率）、最高粘性の液体（２５℃でのｔａｎδ）と、３７℃において適切に粘性なゲル（３７℃でのｔａｎδ）を維持しながら試験されたすべてのサンプルのうちで最も注入性の製剤（振動応力）とを生成した。その結果は、いくつかの実施形態において、約７７％以上の％ＤＤＡを有するキトサンが、機能的ゾルゲルを得るために必要であることを示唆している。
【０１８５】
上記において、限定ではなく例示の目的のために、本開示の特定の実施形態に関する詳細な説明を提供した。この開示に基づいて当業者に明らかなすべての他の修正、派生、及び等価物は、特許請求される開示の範囲内に含まれることが意図されていることを理解すべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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