(57)【要約】  本開示は、アミノ酸配列ＥＸ2Ｘ3ＹＸ5Ｘ6ＮＬＸ9ＡＸ11ＱＬＣＡＸ16ＩＸ18Ｘ19Ｘ20  ＥＤを含む、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド（以後、Ａβと称する）に対する結合親和性を有する操作されたポリペプチドのクラスに関する。本開示はまた、治療、予後及び／又は診断剤としての、そのようなＡβペプチド結合ポリペプチドの使用に関する。
2018513833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、以下、
−第１のＡβペプチド結合モチーフＢＭ１を含む第１の部分、
−第２のＡβペプチド結合モチーフＢＭ２を含む第２の部分、及び
−リンカー、
を含み、
ここで、当該モチーフは、同一又は異なってもよく、
ここで、当該結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２の各々が、以下、
ｉ）ＥＸ2Ｘ3ＹＸ5Ｘ6ＮＬＸ9Ａ  Ｘ11ＱＬＣＡＸ16ＩＸ18Ｘ19Ｘ20  ＥＤ
（式中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｔ及びＹから選択され；
Ｘ3は、Ｈ及びＶから選択され；
Ｘ5は、Ｆ、Ｉ及びＬから選択され；
Ｘ6は、Ｐ及びＴから選択され；
Ｘ9は、Ｎ及びＴから選択され；
Ｘ11は、Ｄ及びＨから選択され；
Ｘ16は、Ｆ及びＩから選択され；
Ｘ18は、Ｎ、Ｑ及びＲから選択され；
Ｘ19は、Ｋ及びＳから選択され；そして
Ｘ20は、Ｆ、Ｉ、Ｌ及びＲから選択される）
並びに、
ｉｉ）ｉ）で定義された配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【請求項２】
第１及び第２の部分の少なくとも１つが、以下、
ｉｉｉ）［ＢＭ］−ＤＸaＳＱＸbＸcＸdＬＬＸe  ＥＡＫＫＬＸfＸgＸhＱＡ  ＰＸi
（式中、ＢＭは、請求項１で定義されたＢＭ１又はＢＭ２であり、そして、互いに独立して、
Ｘaは、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘcは、Ａ及びＳから選択され；
Ｘdは、Ｋ、Ｎ及びＥから選択され；
Ｘeは、Ａ、Ｓ及びＣから選択され；
Ｘfは、Ｅ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘgは、Ｄ、Ｅ及びＳから選択され；
Ｘhは、Ａ及びＳから選択され；そして
Ｘiは、アミノ酸なし、Ａ及びＫから選択される）
並びに、
ｉｖ）ｉｉｉ）で定義された配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される結合モジュールアミノ酸配列、Ｂｍｏｄを含む、請求項１に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【請求項３】
配列ｉｉｉ）が、以下のアミノ酸配列、
［ＢＭ］−ＤＸaＳＱＸbＡＸdＬＬＡ  ＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡ  ＰＸi
（式中、ＢＭは、請求項１で定義されたＢＭ１又はＢＭ２であり、そして、互いに独立して、
Ｘaは、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘdは、Ｋ及びＮから選択され；そして
Ｘiは、アミノ酸なし、Ａ及びＫから選択される）
からなる、請求項２に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【請求項４】
−ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、そして
−ＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する、
請求項１から３のいずれか一項に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【請求項５】
−ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、そして
−ＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基６４〜８５に対応する、
請求項４に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【請求項６】
−第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、そして
−第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７に、又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２に対応する、
請求項２に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【請求項７】
−第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、そして
−第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基６４〜１０７に対応する、
請求項６に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【請求項８】
Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３からなる群から選択されるアミノ酸配列；例えば、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９からなる群から；例えば、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９からなる群から、例えば、配列番号１８、７０及び９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、例えばアミノ酸配列の配列番号９５を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【請求項９】
相互作用のＫD値が、多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8Ｍ、例えば多くとも１×１０-9Ｍ、例えば多くとも１×１０-10Ｍであるように、Ａβペプチドに結合することができる、請求項１から８のいずれか一項に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【請求項１０】
−請求項１から９のいずれか一項に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドからなる第１の部位；並びに、
−所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第２の部位、
を含む、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項１１】
前記所望の生物学的活性が、結合活性、例えば、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、ガンマ−セクレターゼ、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、補体因子Ｃ１ｓ、プレセニリン１、プレセニリン２、ニカストリン、アルファ−シヌクレイン及びＢｒｉからなる群から選択される標的への結合である、請求項１０に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項１２】
前記第２の部位が、抗体及びその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項１０又は１１に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、並びに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体を含有し、例えば少なくとも１つの追加の活性薬剤をさらに含有する、組成物であって、ここで、当該追加の活性薬剤が、例えば、神経伝達物質分解の阻害剤、神経伝達物質、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害剤、抗ヒスタミン剤、抗ウイルス剤、アルファ−セクレターゼ活性化剤、ベータ−又はガンマ−セクレターゼの阻害剤、α−シヌクレイン凝集の阻害剤、タウ凝集の阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、酸化ストレスに対して有効な化合物、抗アポトーシス化合物、金属キレート剤、ＤＮＡ修復の阻害剤、例えばピレンゼピン及び代謝産物、Ａβを除去／枯渇させる細胞成分のための誘引剤、ピログルタミン酸化された（pyroglutamated）Ａβ3~42を含むＮ−末端切断Ａβの阻害剤、抗炎症性分子、非定型抗精神病薬、例えばクロザピン、ジプラシドン、リスペリドン、アリピプラゾール及びオランザピン、コリンエステラーゼ阻害剤（ＣｈＥＩ）、例えばタクリン、リバスチグミン、ドネペジル及びガランタミン、Ｍ１アゴニスト及び任意のアミロイド又はタウ修飾薬（tau modifying drug）を含む他の薬剤及び栄養補助食品、例えばビタミンＢ１２、システイン、アセチルコリン前駆体、レシチン、コリン、イチョウ（Ginkgo biloba）、アセチル−Ｌ−カルニチン、イデベノン、プロペントフィリン、及びキサンチン誘導体、からなる群から選択されてもよい、組成物。
【請求項１４】
薬剤として、診断剤として、又は予後剤としての使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、あるいは請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
Ａβペプチド関連症状の治療、診断又は予後における使用のための、請求項１４に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物であって、当該Ａβペプチド関連症状は例としてアミロイドーシスからなる群から選択され、当該アミロイドーシスとは、続発性アミロイドーシス及び加齢に伴うアミロイドーシスを含む、アミロイドプラークの形成に関連する疾患及び障害の群を意味し、例としては、これらに限定されるものではないが、認知記憶能力（cognitive memory capacity）の喪失を特徴とする神経障害又は状態、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体認知症（Lewybody dementia）、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、グアムパーキンソン認知症複合（Guam Parkinson-dementia complex）；並びに、アミロイド様タンパク質に基づくか、又は関連する他の疾患、例えば脳アミロイド血管症、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー１、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeld Jacob disease）、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、ＩＩ型糖尿病、及び老人性心アミロイドーシス；並びに、緑内障、黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症（drusen-related optic neuropathy）、及びベータアミロイド沈着による白内障を含む、様々な眼疾患等が挙げられる、Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド（以後、Ａβと称する）に対する結合親和性を有する操作されたポリペプチドのクラスに関する。本開示はまた、治療、予後及び／又は診断剤としてのそのようなＡβペプチド結合ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
多くの異なる疾患、例えばアルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、並びに家族性アミロイドポリニューロパチー１は、アミロイド疾患の増加するファミリーに属するものとして認識されている。全てのアミロイド疾患は、原繊維であってもなくてもよい細胞外タンパク質凝集物の存在を共通して有する。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は世界中で痴呆症の主要な原因であり、約３，５００万人が罹患している。アルツハイマー病に対する現在の治療法は穏やかな症状の緩和しか提供せず、疾患の経過を遅らせ、並びに罹患しやすい個体において疾患を予防し又は遅らせる治療法に対する大きなニーズがある。過去数十年間の膨大な研究努力にもかかわらず、現在、疾患の経過を著しく変化させ、又はその進行を効率的に停止させる治療は存在しない（Citron(2010)Nat Rev Drug Discov 9(5):387~398）。ＡＤの病理学的特徴は、罹患した個体の脳における大きな細胞外アミロイドプラーク及び細胞内神経原線維変化を含む（Citron(2010)、上記参照）。アミロイドプラークの主成分は、４０及び４２アミノ酸のアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドである。これらのペプチドのオリゴマー、プロトフィブリル（protofibrils）及びフィブリルへの凝集プロセスは、ＡＤの神経病理学において中心的な役割を果たしているという仮説が立てられている。結果として、脳からのＡβの産生及び凝集、並びに除去を標的とする治療戦略が研究中である。
【０００４】
１つの有望な治療法は、脳内のＡβ凝集体に直接結合するか、又は血漿中の遊離Ａβペプチドに結合する、Ａβ特異的薬剤の投与に基づく（末梢シンク（peripheral sink）機構）（Citron(2010)、上記参照）。従来の抗体は、免疫療法の大きな可能性を示したが、重篤な副作用、例えばＦｃ媒介性炎症誘発性免疫反応（Fc-mediated pro-inflammatory immune responses）にも関連している。さらに、抗体は大きな分子であり、その大きさは脳への取り込みを含むイン・ビボでの生体内分布に悪影響を及ぼし得る。それゆえ、操作された抗体代替物及びエフェクター機能をもたない代替足場タンパク質を使用する代替アプローチが、より安全かつより効果的な治療法を提供することを示唆しており、そして、より小さな足場タンパク質は大きな抗体よりも速く、血液脳関門を介して移動することが推定される。
【０００５】
特定の標的に対して親和性を有するいくつかの分子及び異なる非抗体ベースの足場が、当該技術分野において記載されている。特に、ブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳＰＡ）のドメインＢに由来するタンパク質Ｚに関連する分子は（Nilsson Bら(1987)Protein Engineering 1:107~133）、異なる相互作用標的を使用してランダム化されたタンパク質Ｚ分子のライブラリーから選択されている（例えば、国際公開第９５／１９３７４号；国際公開第００／６３２４３号； Nord Kら(1995)Prot Eng 8:601~608; Nord Kら(1997)Nature Biotechnology 15:772~777参照）。
【０００６】
１７ｎＭの親和性を有する単量体Ａβを標的とする、ＺAβ3で示されるタンパク質Ｚ変異体（Gronwallら(2007)J Biotechnol 128(1):162~183; Hoyerら(2008)Proc Natl Acad Sci U S A 105(13):5099~5104）が、記載されている。構造解析により、ＺAβ3がジスルフィド結合ホモ二量体として（内部システインに起因して）Ａβペプチドに結合すること、並びにジスルフィド結合二量体Ｚ変異体とＡβペプチドとの両方が、結合時に折りたたまれることが示された。Ａβペプチドはβ−ヘアピン構造に折りたたまれ、ホモ二量体の両方のＺ変異体ユニット中の第１のα−へリックスに、非構造化Ｎ−末端を有するβ−シート構造をとらせる（Hoyer及びHard(2008)J. Mol. Biol. 378(2):398−411; Hoyerら(2008)、上記参照）。ＡＤのＡβトランスジェニックショウジョウバエ（fruit fly）モデルを用いた最近のイン・ビボでの研究において、ＺAβ3は、毒性アミロイド形成性オリゴマー及びプラークの形成を効果的に阻害し、それによって神経毒性作用を無効にし、ハエの寿命を回復させることが示された（Hoyerら(2008)、上記参照; Luheshiら(2010)PLoS Biol 8(3):e1000334）。
【０００７】
末梢投与されたＡβ特異的薬剤の親和性と、脳から血漿へのＡβの流出との間には相関があることが実証されている。血中のＡβペプチドのレベルは一般に低いので、そのような適用には高い親和性の捕捉剤を使用することが重要である。
【０００８】
したがって、Ａβに対する高い親和性を有する薬剤が引き続き必要とされており、当該薬剤は、そのような親和性が必要とされる、例えばＡＤの治療、診断及び予後において、様々なアッセイ及びプロセスにおいて試薬として使用することができる。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本開示の目的は、例えば治療、予後及び診断用途のために使用され得る、新規なＡβペプチド結合剤を提供することである。
【００１０】
本開示の目的は、上述及びその他の現行治療の欠点を軽減しながら、様々な形態のＡβペプチド関連病変を標的とする、効果的な治療を可能にする分子を提供することである。
【００１１】
さらに、本開示の目的は、予後及び診断用途に適した分子を提供することである。
【００１２】
これら、及び本開示から当業者に明らかなその他の目的は、添付の特許請求の範囲において請求され、一般に本明細書に開示された、本発明の異なる態様によって満たされる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−２】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−３】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−４】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−５】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−６】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−７】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−８】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−９】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−１０】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−１１】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−１２】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−１３】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−１４】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−１５】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−１６】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−１７】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−１８】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−１９】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−２０】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−２１】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−２２】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−２３】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図１−２４】図１は、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドの例のアミノ酸配列（配列番号１〜１０６、１１５及び１１８〜５５３）、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）；無関係な標的に対する親和性を有する対照ポリペプチド（ＺTaq；配列番号１０８）；ヒトＡβ1~42ペプチド（配列番号１０９）；ヒトＡβ1~40ペプチド（配列番号１１０）；並びに、本開示の結合ポリペプチドの選択、スクリーニング及び／又は特徴づけに使用される、対照ペプチドＺAβ3（配列番号１１１）、（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）、アルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）及びレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインＧＡ３、「ＡＢＤ」（配列番号１１７）についてのアミノ酸配列、のリストである。本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの推定Ａβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列では、残基４から残基２５まで、及び残基６４から残基８５まで、それぞれ伸びている。配列番号１８では、ＢＭ１及びＢＭ２は、残基４から残基２５まで、及び残基６９から残基９０まで、それぞれ伸びている。
【図２】図２は、Ａβ1~40ペプチド（白色メッシュリボン）との複合体で示された、ＺＡＳｌｉｂと称される、切断された頭−尾連結二量体非対称ライブラリー（Ａ）、及びＺＳＹＭｌｉｂと称される対称ライブラリーＺ（Ｂ）の設計の構造的概観である（タンパク質データバンクエントリ２ＯＴＫ）。それぞれのライブラリーにおけるランダム化された位置が示され、全長Ｚ変異体におけるそれぞれの位置を参照する番号が付けられている。
【図３Ａ】図３は、本明細書で（ＺAβ3）2（配列番号１１２）と称される第１世代ＡβペプチドＺAβ3の頭−尾二量体と、２つの親和性成熟ライブラリー（Ａ）ＺＡＳｌｉｂ及び（Ｂ）ＺＳＹＭｌｉｂとの間の概略的な比較である。ライブラリー中でランダム化されるアミノ酸配列位置をＸで示し、各ライブラリーについてこれらの位置で許容されるアミノ酸を示す。
【図３Ｂ】図３は、本明細書で（ＺAβ3）2（配列番号１１２）と称される第１世代ＡβペプチドＺAβ3の頭−尾二量体と、２つの親和性成熟ライブラリー（Ａ）ＺＡＳｌｉｂ及び（Ｂ）ＺＳＹＭｌｉｂとの間の概略的な比較である。ライブラリー中でランダム化されるアミノ酸配列位置をＸで示し、各ライブラリーについてこれらの位置で許容されるアミノ酸を示す。
【図４】図４は、（Ａ）ＺＡＳｌｉｂ及び（Ｂ）ＺＳＹＭｌｉｂのフローサイトメトリーソーティングの結果を示す散布図である。Ｘ軸上の蛍光強度が、表面露出タンパク質の不可欠な部分として発現されたアルブミン結合ポリペプチドＡＢＰ（配列番号１１４）へのＨＳＡ結合を介してモニターされた表面発現レベルに対応する。Ｙ軸上の蛍光強度が、Ａβ結合に対応する。当該散布図は、各プロットで輪郭を描いたゲーティング（gating）に使用した領域でサイクル１、２、３及び４それぞれにおけるフローサイトメトリーソーティング前のブドウ球菌ライブラリーを示す。ビオチン化Ａβペプチドの濃度が各選抜サイクルで減少し、かつ、オフ・レート（off-rate）選択が最後のサイクルで行われ、その後のラウンドにおける平均に対するシグナル強度の減少をもたらすことに留意されたい。
【図５Ａ】図５Ａ及び５Ｂは、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）とともに、非対称ライブラリー（配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９及び５０に、それぞれ対応する、ＡＢＰＰ００１、００５、００９、０１３、０１４、０１６、０１８、０２０、０２１、０２５、０２６、０２８、０３３、０３５、０３７、０４０、０４２、０４８、０４９及び０５０）から、並びに、対称ライブラリー（配列番号５３、５４、５９、６０、６１、６２、７０、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００及び１０４に、それぞれ対応する、ＡＢＰＰ０５３、０５４、０５９、０６０、０６１、０６２、０７０、０７５、０７８、０８４、０８９、０９０、０９５、０９６、０９７、１００及び１０４）からのＦＡＣＳによって単離された親和性成熟Ａβペプチド結合ポリペプチドの、アミノ酸配列を示す。（Ｓ4Ｇ）2リンカーが第１の部分と第２の部分との間に概略されている。ランダム化された位置がドットで示され、もとの足場で変異された位置が示される。各クローンが単離された回数が、各配列の右側に示されている。
【図５Ｂ】図５Ａ及び５Ｂは、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）とともに、非対称ライブラリー（配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９及び５０に、それぞれ対応する、ＡＢＰＰ００１、００５、００９、０１３、０１４、０１６、０１８、０２０、０２１、０２５、０２６、０２８、０３３、０３５、０３７、０４０、０４２、０４８、０４９及び０５０）から、並びに、対称ライブラリー（配列番号５３、５４、５９、６０、６１、６２、７０、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００及び１０４に、それぞれ対応する、ＡＢＰＰ０５３、０５４、０５９、０６０、０６１、０６２、０７０、０７５、０７８、０８４、０８９、０９０、０９５、０９６、０９７、１００及び１０４）からのＦＡＣＳによって単離された親和性成熟Ａβペプチド結合ポリペプチドの、アミノ酸配列を示す。（Ｓ4Ｇ）2リンカーが第１の部分と第２の部分との間に概略されている。ランダム化された位置がドットで示され、もとの足場で変異された位置が示される。各クローンが単離された回数が、各配列の右側に示されている。
【図６】図６は、（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）並びに３７個のＦＡＣＳによって単離されたユニークな親和性成熟Ａβペプチド結合ポリペプチド（ＡＢＰＰ００１、００５、００９、０１３、０１４、０１６、０１８、０２０、０２１、０２５、０２６、０２８、０３３、０３５、０３７、０４０、０４２、０４８、０４９、０５０、０５３、０５４、０５９、０６０、０６１、０６２、０７０、０７５、０７８、０８４、０８９、０９０、０９５、０９６、０９７、１００及び１０４）の、オン・セル（on-cell）オフ・レートランキングのフローサイトメトリー分析からの結果の棒グラフを示す。Ａβペプチド結合ポリペプチド変異体がＸ軸上に表され、そして、Ａβペプチド結合に対応する平均蛍光強度（ＭＦＩ）と、表面発現レベルに対応するＭＦＩとの間の比がＹ軸上に表される。矢印は、さらなる特性評価のために選択された８つのクローンを示す。
【図７】図７は、８つの選択されたＡβペプチド結合ポリペプチド（配列番号７０、８４及び９５にそれぞれ対応する、ＡＢＰＰ０７０、０８４及び０９５、並びに配列番号１８、２８、３５、４９及び５０にそれぞれ対応するＡＢＰＰ０１８、０２８、０３５、０４９及び０５０）の、並びに（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）の、ＳＥＣ精製後の細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。全ての精製されたＡβペプチド結合ポリペプチドは、ゲルから推定して約１４ｋＤａの正しいサイズを示した。Ｍは、サイズマーカーを有するレーンを示す。
【図８】図８は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を用いたニュートラアビジン（neutravidin）センサーチップ上のビオチン化Ａβ1~40に対するＡＢＰＰ０９５（配列番号９５）の親和性測定から得られたセンサーグラムを示す。
【図９】図９は、ＡＢＰＰ０９５（配列番号９５）の円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。図９Ａは、ＡＢＰＰ０９５を２０から９０℃まで加熱しながら、２２１ｎｍで得られた可変温度測定（ＶＴＭ）スペクトルのグラフを示す。図９Ｂは、可変温度測定（ＶＴＭ）前後の２０℃における１９５〜２５０ｎｍの範囲の波長でのＡＢＰＰ０９５のＣＤスペクトルを示す。
【図１０】図１０は、５０ｐｇ／ｍｌのＡβ1~42でスパイクしたＰＢＳからのＡβペプチドのＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３（配列番号１１５）媒介捕捉からのタンパク質画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。ゲルをタンパク質バンドの可視化のために銀染色した。レーンＭ、分子量マーカー；レーン１、Ａβ1~42ペプチドとインキュベートした［ＨＳＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ／ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３］からの溶出液；レーン２、参照ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３；レーン３、参照Ａβ1~42ペプチド。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、精製したＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３（配列番号１１５）及び（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）それぞれの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図１１Ａ：レーン１、分子量マーカー；レーン２、２０μｇの還元ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３タンパク質；レーン３、２０μｇの非還元ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３タンパク質。図１１Ｂ：レーン１、分子量マーカー；レーン２、１０μｇの還元（ＺTaq）2−ＰＰ０１３タンパク質。
【図１２Ａ】図１２は、実施例８に記載される行動試験の結果を示す。図１２Ａは、自発運動活性試験によって測定された、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３（配列番号１１５）で処置された１０匹の（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウス、並びに（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６；対照）で処置された１０匹の（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスから得られた、最大速度（Ｖｍａｘ）、平均速度（Ｖｍｅａｎ）、移動距離及び休止時間の棒グラフを示す。図１２Ｂは、ロータロッド試験で測定された、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３で処置された１０（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウス、並びに（ＺTaq）2−ＰＰ０１３で処置された１０（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスから得られた走行速度の棒グラフを示す。
【図１２Ｂ】図１２は、実施例８に記載される行動試験の結果を示す。図１２Ａは、自発運動活性試験によって測定された、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３（配列番号１１５）で処置された１０匹の（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウス、並びに（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６；対照）で処置された１０匹の（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスから得られた、最大速度（Ｖｍａｘ）、平均速度（Ｖｍｅａｎ）、移動距離及び休止時間の棒グラフを示す。図１２Ｂは、ロータロッド試験で測定された、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３で処置された１０（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウス、並びに（ＺTaq）2−ＰＰ０１３で処置された１０（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスから得られた走行速度の棒グラフを示す。
【図１３】図１３は、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３で処置された１０（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウス、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（対照）で処置された１０（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウス、並びに１０匹の野生型対照マウスから得られた、ラジアルアーム迷路試験の結果を示す。エラーの数がｙ軸上に示され、試験日がｘ軸上に示されている。
【図１４】図１４は、（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスの運動皮質におけるアミロイドプラークの蓄積を示す。図１４Ａ及び１４Ｂは、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（対照）及びＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３でそれぞれ処置されたマウスからの、代表的なＡβ−免疫染色された（６Ｅ１０／４Ｇ８）脳切片を示す。図１４Ｃは、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３処置マウス及び対照処置マウスにおける、皮質アミロイドプラーク負荷の組織学的定量化の棒グラフを示す。
【図１５】図１５は、（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬の歯状回における、アミロイドプラークの蓄積を示す。図１５Ａ及び１５Ｂは、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（対照）及びＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３でそれぞれ処置されたマウスからの、代表的なＡβ−免疫染色された（６Ｅ１０／４Ｇ８）脳切片を示す。図１５Ｃは、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３処置マウス及び対照処置マウスにおける、海馬アミロイドプラーク負荷の組織学的定量化の棒グラフを示す。
【図１６】図１６は、（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬におけるアストログリオーシス（astrogliosis）を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（対照）及びＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３でそれぞれ処置されたマウスからの代表的なＧＦＡＰ−免疫染色された脳切片を示す。図１６Ｃは、対照処置マウスと比較した、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３処置マウスにおけるアストロサイトの半定量的分析の棒グラフを示す。
【図１７】図１７は、蛍光相関分光法による拡散時間分析を示す。拡散時間（τＤ）が、分析成分の大きさを反映して、ＡＢＰＰ０９５の非存在（黒丸）及び存在下（灰色環）でのＡｌｅｘａ４６７−標識されたＡβ1~40ペプチドについて経時的に提示される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
したがって、本開示の第１の態様では、Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、以下、−第１のＡβペプチド結合モチーフＢＭ１を含む第１の部分、
−第２のＡβペプチド結合モチーフＢＭ２を含む第２の部分、及び
−リンカー、
を含み、
ここで、当該モチーフは、同一又は異なってもよく、
ここで、当該結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２の各々が、以下、
ｉ）ＥＸ2Ｘ3ＹＸ5Ｘ6ＮＬＸ9Ａ    Ｘ11ＱＬＣＡＸ16ＩＸ18Ｘ19Ｘ20    ＥＤ
（式中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｔ及びＹから選択され；
Ｘ3は、Ｈ及びＶから選択され；
Ｘ5は、Ｆ、Ｉ及びＬから選択され；
Ｘ6は、Ｐ及びＴから選択され；
Ｘ9は、Ｎ及びＴから選択され；
Ｘ11は、Ｄ及びＨから選択され；
Ｘ16は、Ｆ及びＩから選択され；
Ｘ18は、Ｎ、Ｑ及びＲから選択され；
Ｘ19は、Ｋ及びＳから選択され；そして
Ｘ20は、Ｆ、Ｉ、Ｌ及びＲから選択される）
並びに、
ｉｉ）ｉ）で定義された配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
【００１５】
配列関連の、Ａβペプチド結合ポリペプチドのクラスの上記の定義は、第１世代のＡβペプチド結合ポリペプチドＺAβ3の切断された二量体（（ＺAβ3A12）2；配列番号１１３）のランダムポリペプチド変異体の多数の統計分析に基づく。背景技術の項で詳述したように、この第１世代のＡβペプチド結合ポリペプチドは、最初に選抜実験においてＡβペプチドとのその相互作用に基づいて同定され、そして現在、その結合表面が改変されて、本明細書に定義された変異体が作り出された。同定されたＡβペプチド結合モチーフ（ＢＭ１及びＢＭ２）は、親足場（parent scaffold）の標的結合領域に対応し、ペプチドに結合する際にβシート及び２つのαへリックスを構成する。
【００１６】
当業者が理解することになるように、任意のポリペプチドの機能、例えば本開示のポリペプチドのＡβペプチド結合能力は、ポリペプチドの三次構造に依存する。それゆえ、その機能に影響を与えることなく、ポリペプチド中のアミノ酸の配列にわずかに変更を加えることが可能である。したがって、本開示は、Ａβペプチド結合特性を保持している、Ａβペプチド結合ポリペプチドの修飾された変異体を包含する。このようにして、本開示により包含されるのは、ｉ）に定義されたポリペプチドと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドである。例えば、特定の官能基のアミノ酸残基（例えば疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基は、同じ官能基からの別のアミノ酸残基に交換されることが可能である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、そのような変更は、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの配列の任意の位置で行われてもよい。他の実施形態では、そのような変更は、足場アミノ酸残基としても示される非可変位置においてのみ行われてもよい。そのような場合には、可変位置、すなわち配列ｉ）において“Ｘ”で示された位置では変更が許されない。
【００１８】
用語「％の同一性」は、本明細書を通じて使用される場合、例えば以下のように計算され得る。クエリー配列はＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用して標的配列にアラインメントされる（Thompsonら(1994)Nucleic Acids Research、22:4673~4680）。整列された配列の最短に対応するウインドウにわたって比較が行われる。整列された配列の最短は、場合によっては、標的配列であってもよい。他の場合には、整列された配列の最短はクエリー配列であってもよい。各位置のアミノ酸残基が比較され、そして、標的配列中の同一の対応を有するクエリー配列中の位置のパーセンテージが、％の同一性として報告される。
【００１９】
第１の態様の一実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、前記結合モチーフの配列ｉ）において、
Ｘ2は、Ｉ、Ｑ、及びＲからさらに選択され；
Ｘ5は、Ｆ及びＬからさらに選択され；
Ｘ16は、Ｆであり；そして
Ｘ20は、Ｉ及びＬからさらに選択される、
Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
【００２０】
第１の態様の一実施形態では、上記で定義されたＡβペプチド結合ポリペプチドであって、ＢＭ１における配列ｉ）が、以下のアミノ酸配列、
ＥＸ2Ｘ3ＹＸ5Ｘ6ＮＬＸ9Ａ    Ｘ11ＱＬＣＡＦＩＸ18Ｘ19Ｌ    ＥＤ
（式中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｒ及びＹから選択され；
Ｘ3は、Ｈ及びＶから選択され；
Ｘ5は、Ｆ、Ｉ及びＬから選択され；
Ｘ6は、Ｐ及びＴから選択され；
Ｘ9は、Ｎ及びＴから選択され；
Ｘ11は、Ｄ及びＨから選択され；
Ｘ18は、Ｎ、Ｑ及びＲから選択され；そして
Ｘ19は、Ｋ及びＳから選択される）
からなる、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
【００２１】
一実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）において、Ｘ2は、Ｉ及びＲからさらに選択され；そしてＸ5は、Ｆ及びＬからさらに選択される。
【００２２】
別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）において、Ｘ2は、Ｉ、Ｑ、Ｒ及びＹからさらに選択され；そしてＸ5は、Ｆ及びＬからさらに選択される。
【００２３】
さらに別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）において、Ｘ2は、Ｉ及びＲからさらに選択され；そしてＸ18は、Ｑ及びＲからさらに選択される。
【００２４】
なおも別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）において、Ｘ2は、Ｉ、Ｍ及びＲからさらに選択される。
【００２５】
さらなる実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）において、Ｘ2は、Ｉ及びＲからさらに選択され；Ｘ3はＶであり；そしてＸ5は、Ｆ及びＬからさらに選択される。
【００２６】
一実施形態では、ＢＭ１における配列ｉ）は、以下のアミノ酸配列、
ＥＸ2ＶＹＸ5Ｘ6ＮＬＮＡ    Ｘ11ＱＬＣＡＦＩＸ18ＳＬ    ＥＤ
（式中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ｉ、Ｍ及びＲから選択され；
Ｘ5は、Ｆ、Ｉ及びＬから選択され；
Ｘ6は、Ｐ及びＴから選択され；
Ｘ11は、Ｄ及びＨから選択され；そして
Ｘ18は、Ｎ、Ｑ及びＲから選択される）
からなる。
【００２７】
第１の態様の一実施形態では、上記で定義されたＡβペプチド結合ポリペプチドであって、ＢＭ２における配列ｉ）が、以下のアミノ酸配列、
ＥＸ2ＶＹＸ5ＰＮＬＸ9Ａ    Ｘ11ＱＬＣＡＸ16ＩＸ18Ｘ19Ｘ20    ＥＤ
（式中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｒ及びＴから選択され；
Ｘ5は、Ｆ及びＬから選択され；
Ｘ9は、Ｎ及びＴから選択され；
Ｘ11は、Ｄ及びＨから選択され；
Ｘ16は、Ｆ及びＩから選択され；
Ｘ18は、Ｎ、Ｑ及びＲから選択され；
Ｘ19は、Ｋ及びＳから選択され；そして
Ｘ20は、Ｆ、Ｉ、Ｌ及びＲから選択される）
からなる、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
【００２８】
一実施形態では、ＢＭ２の配列ｉ）において、Ｘ2は、Ｉ、Ｑ及びＲからさらに選択され；Ｘ16は、Ｆであり；そしてＸ20は、Ｉ及びＬからさらに選択される。
【００２９】
別の実施形態では、ＢＭ２の配列ｉ）において、Ｘ2は、Ｒ及びＴからさらに選択され；そしてＸ5は、Ｌである。
【００３０】
さらに別の実施形態では、ＢＭ２の配列ｉ）において、Ｘ2は、Ｒであり；Ｘ5は、Ｌであり；Ｘ16は、Ｆであり；そしてＸ20は、Ｉ及びＬからさらに選択される。
【００３１】
なおも別の実施形態では、ＢＭ２の配列ｉ）において、Ｘ2は、Ｉ、Ｍ、Ｑ及びＲからさらに選択され；Ｘ16は、Ｆであり；そしてＸ20は、Ｌである。
【００３２】
さらなる実施形態では、ＢＭ２の配列ｉ）において、Ｘ2は、Ｉ、Ｑ及びＲからさらに選択され；Ｘ16は、Ｆであり；そしてＸ20は、Ｌである。
【００３３】
一実施形態では、ＢＭ２における配列ｉ）は、以下のアミノ酸配列、
ＥＸ2ＶＹＸ5Ｘ6ＮＬＮＡ    Ｘ11ＱＬＣＡＦＩＸ18ＳＸ20    ＥＤ
（式中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ｉ、Ｍ及びＲから選択され；
Ｘ5は、Ｆ、Ｉ及びＬから選択され；
Ｘ6は、Ｐ及びＴから選択され；
Ｘ11は、Ｄ及びＨから選択され；
Ｘ18は、Ｎ、Ｑ及びＲから選択され；そして
Ｘ20は、Ｉ及びＬから選択される）
からなる。
【００３４】
上記で定義されたＢＭ１及びＢＭ２のいずれか１つの追加の実施形態では、Ｘ6は代わりに、Ｐ、Ｔ、Ｒ及びＹから選択されてもよい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、名称「第１の結合モチーフ」又は「ＢＭ１」及び「第２の結合モチーフ」又は「ＢＭ２」、並びに名称「第１の部分」及び「第２の部分」は、Ａβペプチド結合モチーフと部分とを区別する明確性の理由のために作られている。これらの名称は、ポリペプチド中の異なるドメインの実際の順序を指すことを意図するものではない。したがって、例えば、前記ＢＭ２又は第２の部分は、制限なく、Ａβペプチド結合ポリペプチド中の前記ＢＭ１又は第１の部分のＮ−末端に又はＣ−末端に現れ得る。
【００３６】
本明細書において、「Ｘn」及び「Ｘm」は、上記で定義された配列ｉ）におけるｎ及びｍ位のアミノ酸残基を示すために使用され、ここで、ｎ及びｍは、前記配列のＮ−末端から数えた前記配列内のアミノ酸残基の位置を示す整数である。例えば、Ｘ3及びＸ6は、配列ｉ）のＮ−末端から３位及び６位のアミノ酸残基をそれぞれ示す。
【００３７】
第１の態様の実施形態では、配列ｉ）のＸnが、表１に記載された可能性のある残基の群から独立して選択される、ポリペプチドが提供される。当業者は、Ｘnが可能性のある残基の列挙された群のいずれか１つから選択されてもよいこと、並びに、その選択がＸm（ここでｎ≠ｍ）におけるアミノ酸残基の選択から独立していることを理解するであろう。したがって、表１の位置Ｘnに列挙された可能性のある残基のいずれかは、表１の任意の他の可変位置に列挙された可能性のある残基のいずれかと独立して組み合わされてもよい。
【００３８】
当業者は、表１を以下のように読むべきであることを理解するであろう：
第１の態様による一実施形態では、配列ｉ）のアミノ酸残基「Ｘn」が、「可能性のある残基」から選択される、ポリペプチドが提供される。したがって、表１は、本開示の第１の態様のいくつかの特定の個別化された実施形態を開示する。例えば、第１の態様による一実施形態では、配列ｉ）のＸ2がＩ、Ｍ、Ｑ、Ｒ及びＹから選択されるポリペプチドが提供され、そして第１の態様による別の実施形態では、配列ｉ）のＸ2が、Ｍ、Ｑ、Ｒ及びＴから選択されるポリペプチドが提供される。疑義を避けるために、列挙された実施形態は、さらに他の実施形態において自由に組み合わせることができる。例えば、そのような組み合わせ実施形態の１つは、Ｘ2が、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｒ及びＹから選択され、一方でＸ6がＴであり、そしてＸ18が、Ｑ及びＲから選択される、ポリペプチドである。
【００３９】
【表１】
2018513833.tif 000003
【００４０】
第１の態様の一実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、前記第１及び第２の部分の少なくとも１つが、以下のアミノ酸配列、
ＸAＧＸB−［ＢＭ］
（式中、ＢＭは、本明細書で定義されたＢＭ１又はＢＭ２であり、そして、互いに独立して、
ＸAは、Ａ及びＳから選択され；そして
ＸBは、Ｇ及びＲから選択される）
を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
【００４１】
別の実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、前記第１及び第２の部分の少なくとも１つが、以下、
ｉｉｉ）［ＢＭ］−ＤＸaＳＱＸbＸcＸdＬＬＸe    ＥＡＫＫＬＸfＸgＸhＱＡ    ＰＸi
（式中、ＢＭは、上記で定義されたＢＭ１又はＢＭ２であり、そして、互いに独立して、
Ｘaは、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘcは、Ａ及びＳから選択され；
Ｘdは、Ｋ、Ｎ及びＥから選択され；
Ｘeは、Ａ、Ｓ及びＣから選択され；
Ｘfは、Ｅ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘgは、Ｄ、Ｅ及びＳから選択され；
Ｘhは、Ａ及びＳから選択され；そして
Ｘiは、アミノ酸なし、Ａ及びＫから選択される）
並びに、
ｉｖ）ｉｉｉ）で定義された配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される結合モジュールアミノ酸配列、Ｂｍｏｄを含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
【００４２】
一実施形態では、Ｂｍｏｄの配列ｉｉｉ）は、以下のアミノ酸配列、
［ＢＭ］−ＤＸaＳＱＸbＡＸdＬＬＡ    ＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡ    ＰＸi
（式中、［ＢＭ］は、上記で定義された［ＢＭ１］又は［ＢＭ２］であり、そして
Ｘaは、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘdは、Ｋ及びＮから選択され；そして
Ｘiは、アミノ酸なし、Ａ及びＫから選択される）
からなる。
【００４３】
一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、以下、
［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＰＳＱＱＡＫＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＲＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＱＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＱＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＲＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＲＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；及び
［ＢＭ］−ＤＲＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ、
から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００４４】
より特定の実施形態では、前記第１の部分は、配列ｉｉｉ）が、以下、
［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
［ＢＭ１］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＱＡＫＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；及び
［ＢＭ１］−ＤＲＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ、
から選択されるアミノ酸配列である、Ｂｍｏｄを含む。
【００４５】
別の特定の実施形態では、前記第２の部分は、配列ｉｉｉ）が、以下、
［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＱＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＱＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；及び
［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ、
から選択されるアミノ酸配列である、Ｂｍｏｄを含む。
【００４６】
本開示の第１の態様はまた、上述されたＡβペプチド結合ポリペプチドであって、前記第１及び第２の部分の少なくとも１つが、以下のアミノ酸配列、
ＸAＧＸB−［ＢＭｏｄ］
（式中、Ｂｍｏｄは上記で定義したとおりであり、そして、互いに独立して、
ＸAは、Ａ及びＳから選択され；そして
ＸBは、Ｇ及びＲから選択される）
を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドを提供する。
【００４７】
一実施形態では、前記第１及び第２の部分の少なくとも１つが、以下、
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＱＡＫＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＲＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＱＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＱＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＲＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＳＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＲＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；及び
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＲＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
一実施形態では、前記第１の部分が、以下、
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＲ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＱＡＫＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；及び
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＲ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ１］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；及び
ＡＧＲ−［ＢＭ１］−ＤＲＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
一実施形態では、前記第２の部分が、以下、
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＱＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＱＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＧ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＳＧＧ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＧ−［ＢＭ２］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；及び
ＡＧＧ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
配列ｉ）に関連した上記の議論と同様に、「Ｘy」及び「Ｘz」は、本明細において、上記で定義した配列のｙ及びｚ位におけるアミノ酸残基を示すために使用され、ここで、ｙ及びｚは、前記配列のＮ−末端から数えた前記配列内の可変アミノ酸残基の位置を示す、文字Ａ、Ｂ及びａ〜ｉを表す。例えば、Ｘa及びＸbは、配列ｉｉｉ）のＮ−末端から数えて第１及び第２の可変アミノ酸残基をそれぞれ示すが、アミノ酸配列中の１位及び２位にある必要はない。
【００５１】
第１の態様による実施形態では、可変アミノ酸残基Ｘyは、表２に記載された可能性のある残基の群から独立して選択される、ポリペプチドが提供される。当業者は、Ｘyが可能性のある残基の列挙された群のいずれか１つから選択されてもよいこと、並びにその選択がＸz（ここでｙ≠ｚ）におけるアミノ酸の選択から独立していることを理解するであろう。したがって、表２の位置Ｘyに列挙された可能性のある残基のいずれかは、表２の任意の他の可変位置に列挙された可能性のある残基のいずれかと独立して組み合わされてもよい。
【００５２】
当業者は、表２を以下のように読むべきであることを理解するであろう：
第１の態様による一実施形態では、アミノ酸残基「Ｘy」が、「可能性のある残基」から選択される、ポリペプチドが提供される。したがって、表２は、本開示の第１の態様のいくつかの特定の個別化された実施形態を開示する。
【００５３】
【表２】
2018513833.tif 000004
【００５４】
さらに、表３は、ＸA-B及びＸa-iの２、３又は６つの可能な組み合わせを列挙する。当業者は、これらの組み合わせが、表２の任意の他の可変位置に列挙された可能性のある残基のいずれかと独立して組み合わされてもよいことを理解するであろう。
【００５５】
【表３】
2018513833.tif 000005
【００５６】
上記で論じたように、ポリペプチドの三次構造又は機能にほとんど影響を与えない、上記アミノ酸配列と比較してわずかな変更を含むポリペプチドも、本開示の範囲内である。したがって、配列ｉｖ）は、ｉｉｉ）によって定義された配列と少なくとも９７％の同一性を有する。
【００５７】
本開示の第１の態様によるＡβペプチド結合ポリペプチドの一実施形態では、上記定義は、ポリペプチドの第１及び第２の部分の少なくとも１つが、以下、
ＶＤＮＫＦＮＫＥＧＫ  ＧＡＰＧＥＩＨＹＬＰ  ＮＬＮＡＤＱＬＣＡＦ  ＩＲＳＬＥＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号５５４）
及び
ＶＤＮＫＦＮＫＥＩＥ  ＶＡＴＧＥＩＶＹＬＰ  ＮＬＮＡＤＱＬＣＡＦ  ＩＮＳＬＥＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号５５５）
から選択されるアミノ酸配列を含まないことを条件とする。
【００５８】
上記のように、第１の態様によるＡβペプチド結合ポリペプチドは、リンカーを含む。一実施形態では、前記リンカーは、本明細書で定義された前記第１の部分と前記第２の部分との間に配置される。
【００５９】
当業者は、異なる特性を有する異なる種類のリンカー、例えば柔軟性アミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカー及び切断可能なアミノ酸リンカーを認識している。リンカーは、例えば融合タンパク質の安定性を増加させ、又は融合タンパク質のフォールディングを改善するため、融合タンパク質の発現を増大し、生物学的活性を向上させ、標的化を可能にし、及び薬物動態を変化させるために使用されている。
【００６０】
柔軟性リンカーは、接合されたドメインがある程度の運動又は相互作用を必要とする場合にしばしば使用され、本明細書で定義されたＡβペプチド結合ポリペプチドのいくつかの実施形態で特に有用であり得る。そのようなリンカーは一般に、小さい、非極性（例えばＧ）又は極性（例えばＳ又はＴ）アミノ酸からなる。いくつかの柔軟性リンカーは主に、Ｇ及びＳ残基のストレッチ、例えば（ＧＧＧＧＳ）p及び（ＳＳＳＳＧ）pからなる。コピー数「ｐ」を調整することにより、機能的部分間の適切な分離を達成するため、又は必要な部分間の相互作用を維持するための、リンカーの最適化が可能になる。Ｇ及びＳリンカーとは別に、他の柔軟性リンカーが当該技術分野で知られており、例えば柔軟性を維持するための付加的なアミノ酸残基、例えばＴ、Ａ、Ｋ及びＥ、並びに溶解性を改善するための極性アミノ酸残基を含む、Ｇ及びＳリンカーである。
【００６１】
本明細書に開示された第１の態様の一実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、柔軟性リンカーである。一実施形態では、前記リンカーは、（ＧnＳm）p及び（ＳnＧm）pから選択される一般式（式中、独立して、ｎ＝１〜７、ｍ＝０〜７、ｎ＋ｍ≦８及びｐ＝１〜１０である）を有する。一実施形態では、ｎ＝１〜５である。一実施形態では、ｍ＝０〜５である。一実施形態では、ｐ＝１〜５である。一実施形態では、前記リンカーは、Ｓ4Ｇ、（Ｓ4Ｇ）3、（Ｓ4Ｇ）4及び（Ｓ4Ｇ）8からなる群から選択される。一実施形態では、前記リンカーは、Ｓ4Ｇ、（Ｓ4Ｇ）2、（Ｓ4Ｇ）3及び（Ｓ4Ｇ）4からなる群から選択される。より特定の実施形態では、ｎ＝４、ｍ＝１及びｐ＝２〜３である。一実施形態では、前記リンカーは、（Ｓ4Ｇ）2及び（Ｓ4Ｇ）3からなる群から選択される。一実施形態では、前記リンカーは（Ｓ4Ｇ）2である。一実施形態では、前記リンカーは（Ｓ4Ｇ）3である。
【００６２】
本開示の第１の態様の別の実施形態では、本明細書で定義されたＡβペプチド結合ポリペプチドであって、前記リンカーが、以下、ＶＥＶＤＮＫＦＮＫＥＭＡＳ、ＶＤＮＫＦＮＫＥＭＡＳ、ＶＥＶＤＮＫＦＮＫＥ、ＶＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＥＡＫＹＡＫＥ、ＡＤＮＮＦＮＫ、ＡＤＮＫＦＮＫ、ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ、ＡＱＨＤＥ、ＶＤＮＫＦＮＫ、ＡＥＡＫＹＡＫ、ＶＤＡＫＹＡＫ及びＡＤＡＫＹＡＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。一実施形態では、前記配列が、ＶＥＶＤＮＫＦＮＫＥＭＡＳ及びＶＤＮＫＦＮＫＥＭＡＳから選択される。一実施形態では、前記配列が、ＶＥＶＤＮＫＦＮＫＥ及びＶＤＮＫＦＮＫＥから選択される。一実施形態では、前記配列はＶＥＶＤＮＫＦＮＫＥＭＡＳである。別の実施形態では、前記配列はＶＥＶＤＮＫＦＮＫＥである。
【００６３】
当業者は、リンカーの特性が、一般に、そのＮ−又はＣ−末端への少数のアミノ酸残基の付加によって変化するものではないことを理解するであろう。したがって、さらなる実施形態では、前記リンカーは、前記リンカーのＮ−又はＣ−末端に１〜５個の付加的なアミノ酸残基、例えば１〜４個の付加的なアミノ酸残基、例えば１〜３個の付加的なアミノ酸残基、例えば３個の付加的なアミノ酸残基をさらに含む。一実施形態では、前記付加的なアミノ酸残基は、ＡＳ、ＭＡＳ及びＲＡＳからなる群から選択される。一実施形態では、前記付加的なアミノ酸残基はＲＡＳである。一実施形態では、前記付加的なアミノ酸残基はＭＡＳである。
【００６４】
当業者は、上述した文脈のいずれかに配置されたリンカーの存在は、同じ又は任意の他の文脈における付加的なリンカーの存在を排除しないことを理解するであろう。したがって、一実施形態では、本明細書で定義されたＡβペプチド結合ポリペプチドは、少なくとも１つの付加的なリンカー、例えば柔軟性アミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカー及び切断可能なアミノ酸リンカーからなる群から選択されるリンカーをさらに含む。一実施形態では、前記リンカーは、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドと、所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第２の又はさらなる部位との間に配置される。さらに、そのような第２の部位についての代替案の一般的な議論を以下に示す。
【００６５】
当業者は、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドは、任意の第１の部分を、任意の第２の部分と組み合わせて含み得ることを理解するであろう。したがって、本明細書に開示された１つの特定の第１の部分の存在は、第２の部分の選択も、本明細書に開示されたリンカーの選択も制限せず、逆もまた同様である。当業者は、本明細書に開示された第１の部分、第２の部分及びリンカーは独立して組み合わされ得ることを理解するであろう。
【００６６】
以下の実験の節で詳述するように、Ａβペプチド結合ポリペプチドの選択は、多数の個々のＡβペプチド結合モチーフ（ＢＭ１及びＢＭ２）の同定をもたらした。これらのモチーフは、本態様による配列ｉ）の個々の実施形態を構成する。ＡβペプチドのＡβペプチド結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２は、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３を有する配列における、アミノ酸残基４〜２５及び６４〜８５にそれぞれ対応し、並びに、配列番号１８におけるアミノ酸残基４〜２５及び６９〜９０にそれぞれ対応し、全て図１に示されたとおりである。したがって、本明細書で定義されたＡβペプチド結合ポリペプチドの一実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、一方でＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する。別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１〜１０６のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、一方でＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号１〜１７及び１９〜１０６のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する。別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、一方でＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する。別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５３、５４、５９、６０、６１、６２、７０、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００及び１０４のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、一方でＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５３、５４、５９、６０、６１、６２、７０、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００及び１０４のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する。別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５��のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、一方でＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する。別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１８、５１、５５、５９、６４、７０、７８、９５及び１１８〜１４２のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、一方でＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号５１、５５、５９、６４、７０、７８、９５及び１１８〜１４２のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する。別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１８、５５、７０、９５、１２４〜１２７、１３０〜１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、一方でＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号５５、７０、９５、１２４〜１２７、１３０〜１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する。別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１８、５５、７０、９５、１２４、１２５、１３２、１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、一方でＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号５５、７０、９５、１２４、１２５、１３２、１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する。別の実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、７０、８４及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、一方でＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号２８、３５、４９、５０、７０、８４及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する。一実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１８、７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、一方でＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する。特定の一実施形態では、ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、そしてＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基６４〜８５に対応する。
【００６７】
別の実施形態では、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドであって、第１の部分が、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並びに、第２の部分が、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドであって、第１の部分が、配列番号１〜１０６のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並びに、第２の部分が、配列番号１〜１７及び１９〜１０６のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、第１の部分が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並びに、第２の部分が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む。別の実施形態では、第１の部分が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５３、５４、５９、６０、６１、６２、７０、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００及び１０４のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並びに、第２の部分が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５３、５４、５９、６０、６１、６２、７０、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００及び１０４のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む。別の実施形態では、第１の部分が、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並びに、第２の部分が、配列番号２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む。別の実施形態では、第１の部分が、配列番号１８、５１、５５、５９、６４、７０、７８、９５及び１１８〜１４２のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並び���、第２の部分が、配列番号５１、５５、５９、６４、７０、７８、９５及び１１８〜１４２のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む。別の実施形態では、第１の部分が、配列番号１８、５５、７０、９５、１２４〜１２７、１３０〜１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並びに、第２の部分が、配列番号５５、７０、９５、１２４〜１２７、１３０〜１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む。別の実施形態では、第１の部分が、配列番号１８、５５、７０、９５、１２４、１２５、１３２、１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並びに、第２の部分が、配列番号５５、７０、９５、１２４、１２５、１３２、１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む。さらに別の実施形態では、第１の部分が、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、７０、８４及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並びに、第２の部分が、配列番号２８、３５、４９、５０、７０、８４及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む。一実施形態では、第１の部分が、配列番号１８、７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並びに、第２の部分が、配列番号７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む。特定の一実施形態では、第１の部分が、配列番号９５におけるアミノ酸残基１〜２５を含み、並びに、第２の部分が、配列番号９５におけるアミノ酸残基６１〜８５を含む。
【００６８】
別の実施形態では、上記で定義された結合モジュール、Ｂｍｏｄ、を有する、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドであって、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、一方で第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１０６のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、一方で第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１７及び１９〜１０６のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２を含む。別の実施形態では、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、一方で第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２を含む。別の実施形態では、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５３、５４、５９、６０、６１、６２、７０、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００及び１０４のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、一方で第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５３、５４、５９、６０、６１、６２、７０、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００及び１０４のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２を含む。別の実施形態では、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、一方で第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜��５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２を含む。別の実施形態では、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１８、５１、５５、５９、６４、７０、７８、９５及び１１８〜１４２のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、一方で第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号５１、５５、５９、６４、７０、７８、９５及び１１８〜１４２のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２を含む。別の実施形態では、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１８、５５、７０、９５、１２４〜１２７、１３０〜１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、一方で第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号５５、７０、９５、１２４〜１２７、１３０〜１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２を含む。別の実施形態では、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１８、５５、７０、９５、１２４、１２５、１３２、１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、一方で第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号５５、７０、９５、１２４、１２５、１３２、１３３、１３９及び１４０のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２を含む。さらに別の実施形態では、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、７０、８４及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、一方で第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号２８、３５、４９、５０、７０、８４及び９５におけるアミノ酸残基６４〜１０７又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２を含む。一実施形態では、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１８、７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、一方で第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２を含む。特定の一実施形態では、第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、並びに、第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基６４〜１０７を含む。
【００６９】
上記で論じたように、当業者は、２２アミノ酸残基の結合モチーフＢＭ、並びに、本明細書で定義され、全てＢＭを含む２５、４４又は４７アミノ酸残基の様々なストレッチは、全て独立して組み合わされ得ることを理解するであろう。例えば、ＢＭ又は、ＢＭを含む２５アミノ酸残基ストレッチは、新しい環境がもとの環境の三次元構造を実質的に保持する、もとのポリペプチドの環境よりも、別のアミノ酸環境に移植することができる。したがって、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、第１の部分が、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つからのアミノ酸残基４〜２５、１〜２５、４〜４７又は１〜４７に対応するアミノ酸配列を含み；並びに、第２の部分が、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つからのアミノ酸残基６４〜８５、６１〜８５、６４〜１０７又は６１〜１０７に、あるいは配列番号１８からのアミノ酸残基６９〜９０、６６〜９０、６９〜１１２又は６６〜１１２に対応するアミノ酸配列を含み、ここで、第１及び第２の部分のそれぞれに含まれる両方のアミノ酸配列が同一の配列番号に由来する、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。また、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、第１の部分が、配列番号１〜１０６のいずれか１つからのアミノ酸残基４〜２５、１〜２５、４〜４７又は１〜４７に対応するアミノ酸配列を含み；並びに、第２の部分が、配列番号１〜１７及び１９〜１０６のいずれか１つからのアミノ酸残基６４〜８５、６１〜８５、６４〜１０７又は６１〜１０７に；あるいは配列番号１８からのアミノ酸残基６９〜９０、６６〜９０、６９〜１１２又は６６〜１１２に対応するアミノ酸配列を含み、ここで、第１及び第２の部分のそれぞれに含まれる両方のアミノ酸配列が、同一の配列番号に由来する、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
【００７０】
本開示の本態様による別の実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３からなる群から選択されるアミノ酸配列；例えば、配列番号１〜１０６からなる群から；例えば、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９からなる群から；例えば、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５３、５４、５９、６０、６１、６２、７０、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００及び１０４からなる群から；例えば、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９からなる群から；例えば、配列番号１８、５１、５５、５９、６４、７０、７８、９５及び１１８〜１４２からなる群から；例えば、配列番号１８、５５、７０、９５、１２４〜１２７、１３０〜１３３、１３９及び１４０からなる群から；例えば、配列番号１８、５５、７０、９５、１２４、１２５、１３２、１３３、１３９及び１４０からなる群から；例えば、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、７０、８４及び９５からなる群から；例えば配列番号１８、７０及び９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。一実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチドは、配列番号９５を含む。
【００７１】
「アミロイドβ」、「Ａβ」又は「β−アミロイド」は、本明細書で使用される場合、アミロイドβタンパク質及びペプチド、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、並びにその修飾物、フラグメント及び機能的等価物をいう。特に、「アミロイドβペプチド」又は「Ａβペプチド」によって、ＡＰＰのタンパク質分解切断によって産生される任意のフラグメント、特にアミロイド病理に関与し又は関連するフラグメントを意味する。そのようなフラグメントには、Ａβ1~38、Ａβ1~39、Ａβ1~40、Ａβ1~41、Ａβ1~42及びＡβ1~43が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
用語「Ａβペプチド結合」及び「Ａβペプチドに対する結合親和性」は、本明細書中で使用される場合、例えばＥＬＩＳＡにより、又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術の使用によって試験され得るポリペプチドの特性を指す。
【００７３】
例えば以下の実施例に記載されるように、Ａβペプチド結合親和性は、ポリペプチドの試料を抗体コーティングしたＥＬＩＳＡプレート上に捕捉し、ビオチン化Ａβペプチドを添加し、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰに続く、実験において試験され得る。ＴＭＢ基質を添加し、４５０ｎｍでの吸光度をマルチ−ウェルプレートリーダー、例えばVictor3(Perkin Elmer)を使用して測定する。次に、当業者はそのような実験によって得られた結果を解釈して、Ａβペプチドに対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的な測定を確立し得る。定量的測定が望まれる場合、例えば相互作用についてのＥＣ５０値（半数最大効果濃度）を決定するために、ＥＬＩＳＡも使用され得る。ビオチン化Ａβペプチドの希釈系列に対するポリペプチドの反応を、上述したＥＬＩＳＡを用いて測定する。次に、当業者はそのような実験によって得られた結果を解釈し、ＥＣ５０値をその結果から、例えばGraphPad Prism 5及び非線形回帰を用いて計算することができる。
【００７４】
Ａβペプチド結合親和性は、Ａβペプチド又はそのフラグメントを表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置のセンサーチップ上に固定化し、試験すべきポリペプチドを含む試料をチップ上を通過させる、実験で試験することもできる。あるいは、試験すべきポリペプチドを装置のセンサーチップ上に固定化し、Ａβペプチド又はそのフラグメントを含む試料をチップ上を通過させる。次に、当業者はそのような実験から得られた結果を解釈して、Ａβペプチドに対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的測定を確立し得る。定量的測定が望まれる場合、例えば相互作用についてのＫD値を決定するために、表面プラズモン共鳴法を使用することができる。結合値は、例えばBiacore(GE Healthcare)又はProteOn XPR 36(Bio-Rad)装置で定義されてもよい。Ａβペプチドを装置のセンサーチップ上に適切に固定化し、親和性が決定されるべきポリペプチドの試料を連続希釈によって調製し、ランダムな順序で注入する。次に、例えば、装置の製造業者から提供される、BIAevaluation 4.1ソフトウェア、又は他の好適なソフトウェアの、１：１ラングミュア（Langmuir）結合モデルを用いて、ＫD値を結果から計算し得る。
【００７５】
一実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチドは、相互作用のＥＣ５０値が、多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8Ｍ、例えば多くとも１×１０-9Ｍ、例えば多くとも１×１０-10Ｍであるように、Ａβペプチドに結合することができる。
【００７６】
一実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチドは、相互作用のＫD値が、多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8Ｍ、例えば多くとも１×１０-9Ｍ、例えば多くとも１×１０-10Ｍであるように、Ａβペプチドに結合することができる。
【００７７】
当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく、ポリペプチドを特定の用途に合わせるために、本明細書に開示された第１の態様によるＡβペプチド結合ポリペプチドに様々な修飾及び／又は付加が成され得ることを理解するであろう。
【００７８】
例えば、一実施形態では、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドのフラグメントを提供し、当該フラグメントはＡβペプチドに対する結合親和性を保持する。
【００７９】
本開示により包含されるＡβペプチド結合ポリペプチドは、多数の付加的なアミノ酸残基を含んでもよい。例えば、一実施形態では、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチドであって、当該ポリペプチドがＮ末端及びＣ末端の少なくとも一方に、少なくとも１つの付加的なアミノ酸により伸長されている、及び／又は、少なくとも１つの付加的なアミノ酸を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。そのようなポリペプチドは、ポリペプチド鎖中のまさに最初及び／又はまさに最後の位置に、１又は数個の付加的なアミノ酸残基を有するポリペプチドとして理解されるべきである。したがって、Ａβペプチド結合ポリペプチドは、任意の適切な数の付加的なアミノ酸残基、例えば少なくとも１つの付加的なアミノ酸残基を含んでもよい。適切には、付加的なアミノ酸を有するＡβペプチド結合ポリペプチドは、Ａβペプチドに対する結合親和性を保持するであろう。
【００８０】
各付加的なアミノ酸残基は、例えば、ポリペプチドの生成、精製、イン・ビボで又はイン・ビトロでの安定化、カップリングあるいは検出を改善し又は単純化するために、個々に又は集合的に追加されてもよい。そのような付加的なアミノ酸残基は、例えば化学的カップリングの目的で追加された１又は数個のアミノ酸残基を含んでもよい。一例としてはシステイン残基の付加が挙げられる。付加的なアミノ酸残基はまた、ポリペプチドの精製又は検出のための「タグ」、例えばタグに特異的な抗体との相互作用のための、あるいはＨｉｓ6−タグの場合の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のための、Ｈｉｓ6タグ、（ＨｉｓＧｌｕ）3タグ（「ＨＥＨＥＨＥ」タグ）又は「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグ又は「ＦＬＡＧ」タグを提供し得る。
【００８１】
上述のさらなるアミノ酸は、化学的結合によって（既知の有機化学の方法を使用して）、又は任意の他の手段、例えば融合タンパク質としてのＡβペプチド結合ポリペプチドの発現によって、Ａβペプチド結合ポリペプチドに結合することができ、あるいは、直接に又はリンカー、例えば上述のアミノ酸リンカーを介してのいずれかで、任意の他の方法で接合することができる。
【００８２】
本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチドが第１のドメイン（本明細書において第１の部位と呼ぶ）を構成し、そして第２の及び任意にさらなるドメイン（本明細書において第２の及びさらなる部位と呼ぶ）も含む、融合タンパク質又はコンジュゲートも企図され、本開示の範囲内に入る。融合ポリペプチド又はコンジュゲートの第２の及び任意のさらなる部位は、適切には所望の生物学的活性を有する。
【００８３】
例えば、そのような所望の生物学的活性は、第１の部位と同一の標的、Ａβペプチドへの結合で有り得る。一実施形態では、この第２の及び任意のさらなるＡβペプチド結合部位は、上記第１の態様に開示された１又は数個の付加的なポリペプチドを含むことができ、融合タンパク質又はコンジュゲート、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの多量体（例えば二量体、三量体、四量体等）を形成する。個々の「単量体」ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、同一又は異なってもよい。また、第１の部位が第１の態様に開示されたとおりである一方で、第２の及び任意のさらなる部位は第１の態様に開示されたものとは異なる、コンストラクトも企図される。
【００８４】
したがって、本開示の第２の態様では、融合タンパク質又はコンジュゲートであって、第１の態様によるＡβペプチド結合ポリペプチドからなる第１の部位、並びに所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第２の部位を含む、融合タンパク質又はコンジュゲートが提供される。一実施形態では、前記融合タンパク質又はコンジュゲートは、第１及び／又は第２の部位の生物学的活性と同一又は異なり得る、所望の生物学的活性を含むさらなる部位を追加的に含んでもよい。明確にするために、前記第２の部位に関して以下に続く議論は、本明細書で定義された融合又はコンジュゲートに存在してもよい、任意のさらなる部位に同様に関連している。
【００８５】
所望の生物学的活性の非限定的な例は、治療活性、結合活性及び酵素活性を含む。
【００８６】
一実施形態では、所望の生物学的活性を有する第２の部位は、治療的に活性なポリペプチドである。
【００８７】
治療的に活性なポリペプチドの非限定的な例は、生体分子、例えばヒト内在性酵素、ホルモン、成長因子、ケモカイン、サイトカイン及びリンホカインからなる群から選択される分子である。
【００８８】
結合活性の非限定的な例は、融合タンパク質又はコンジュゲートのイン・ビボでの半減期を増大させる結合活性である。特定の一実施形態では、融合タンパク質又はコンジュゲートのイン・ビボでの半減期を増大させる前記結合活性は、アルブミン結合活性である。一実施形態では、前記アルブミン結合活性は、例えばアミノ酸配列の配列番号１０７又はその誘導体を含む、レンサ球菌タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン又はその誘導体によって提供される。別の特定の実施形態では、融合タンパク質又はコンジュゲートのイン・ビボでの半減期を増大させる前記結合活性は、ＦｃＲｎ結合活性である。ＦｃＲｎ結合は、例えば、ＦｃＲｎ親和性を有する抗体又はそのフラグメントによって（Roopenian及びAkilesh（2007）、Nat Rev Immunol 7:715~725に概説）、あるいはＦｃＲｎに対する操作された親和性を有するＺ変異体によって（Seijsingら(2014)、Proc Natl Acad Sci USA 111:17110~5）、提供され得る。
【００８９】
上述の結合活性は、生物学的活性を遮断するように作用する結合活性又は、生物学的活性を刺激するように作用する結合活性で有り得る。第２の又は任意のさらなる部位の結合に特異的な、企図される標的は、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、ガンマ−セクレターゼ、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、補体因子Ｃ１ｓ、プレセニリン１、プレセニリン２、ニカストリン、アルファ−シヌクレイン及びＢｒｉからなる群から選択される。
【００９０】
特定の一実施形態では、前記融合タンパク質又はコンジュゲート第２の部位は、抗体又はその抗原結合フラグメントを含み得る。よく知られているように、抗体は、標的（抗原）、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド又はその他に、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、特異的結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、用語「抗体又はその抗原結合フラグメント」は、全長又はインタクトなポリクローナル又はモノクローナル抗体だけでなく、その抗原−結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆａｂ3、Ｆｖ及びその変異体、１又は複数の抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、線状抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、並びに、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、及び共有結合的に修飾された抗体を含む、必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成も、包含する。修飾された抗体及びその抗原結合フラグメントのさらなる例には、ナノボディ、ＡｌｂｕｄＡｂ、ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（engager））、ＴａｎｄＡｂ（タンデムダイアボディ）、ＤＡＦ（二重作用性Ｆａｂ）、ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ抗体、ＳＭＩＰ（小モジュラー免疫薬）、ＦｙｎｏｍＡｂ（抗体に縮合したフィノマー（fynomer））、ＤＶＤ−Ｉｇ（デュアル可変ドメイン免疫グロブリン）、ＣｏｖＸ−ｂｏｄｉｅｓ（ペプチド修飾抗体）、デュオボディ及びｔｒｉｏｍＡｂが挙げられる。抗体及びその抗原結合フラグメントの変異体のこのリストは限定的なものと見られることなく、当業者は他の好適な変異体を認識している。
【００９１】
全長抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）及び第１、第２及び第３の定常領域（ＣH１、ＣH２及びＣH３）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶL）及び軽鎖定常領域（ＣL）を含む。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は異なるクラスに割り当てられる。抗体の６つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＹがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに細分され得る。用語「全長抗体」は、本明細書で使用される場合、任意のクラス、例えばＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＹ（又はその任意のサブクラス）の抗体を指す。抗体の異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構造はよく知られている。
【００９２】
「抗原結合フラグメント」は、対応する全長抗体の抗原結合の全て又は重要な部位を保持している、抗体分子又はその誘導体の一部分又は領域である。抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＶH）、軽鎖可変領域（ＶL）、又は両方を含み得る。ＶH及びＶLのそれぞれは、典型的に、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。ＶH又はＶL中の３つのＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に隣接している。上記に簡潔に列挙されたように、抗原結合フラグメントの例には：（１）ＶL−ＣL鎖及びＶH−ＣH１鎖を有する一価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（２）重鎖ヒンジ領域を有するＦａｂフラグメントである、Ｆａｂ’フラグメント（３）重鎖ヒンジ領域によって接合された、例えばヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された、Ｆａｂ’フラグメントの二量体である、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント；（４）Ｆｃフラグメント；（５）抗体のシングルアーム（single arm）のＶL及びＶHドメインを有する最小抗体フラグメントである、Ｆｖフラグメント；（６）ｓｃＦｖのＶH及びＶLドメインがペプチドリンカーによって連結されている単一のポリペプチド鎖である、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント；（７）ジスルフィド架橋を介して２つのＶHドメインにわたって関連している２つのＶHドメイン及び２つのＶLドメインを含む、（ｓｃＦｖ）2、並びに（８）抗原に特異的に結合する抗体の単一可変ドメイン（ＶH又はＶL）ポリペプチドで有り得る、ドメイン抗体、が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
抗原結合フラグメントは日常的な方法によって調製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ′）2フラグメントは、全長抗体分子のペプシン消化によって生成することができ、Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ′）2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成することができる。あるいは、フラグメントは、好適な宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、哺乳動物、植物又は昆虫細胞）中で、重鎖及び軽鎖フラグメントを発現し、それらを組み立てて、イン・ビボ又はイン・ビトロのいずれかで所望の抗原−結合フラグメントを形成することによって、組換え技術を介して調製することができる。一本鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列と、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列とを連結することによって、組換え技術を介して調製することができる。例えば、柔軟性リンカーが２つの可変領域の間に組み込まれ得る。当業者は、全長抗体及びその抗原結合フラグメント両方の調製方法を認識している。
【００９４】
したがって、一実施形態では、本明細書で定義された融合タンパク質又はコンジュゲートであって、前記少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントが、全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、（ｓｃＦｖ）2及びドメイン抗体、からなる群から選択される、融合タンパク質又はコンジュゲートが提供される。一実施形態では、前記少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントが、全長抗体、Ｆａｂフラグメント及びｓｃＦｖフラグメントから選択される。特定の一実施形態では、前記少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントは、全長抗体である。
【００９５】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びその抗原−結合フラグメントからなる群から選択される。
【００９６】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体の試料中の各抗体分子が抗原上の同じエピトープに結合することを意味する、一価の親和性を有する抗体を指す一方で、用語「ポリクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、特定の抗原に対して反応する抗体の集合を指すが、その集合には、例えば抗原上の異なるエピトープを同定する、異なる抗体分子が存在し得る。ポリクローナル抗体は、典型的には好適な哺乳動物の接種により生成され、哺乳動物の血清から精製される。モノクローナル抗体は、唯一の親細胞（例えばハイブリドーマ細胞株）のクローンである同一の免疫細胞から作られる。用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト対象から得られた抗体に実質的に対応するか、又は由来する、可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。用語「キメラ抗体」は、本明細書で使用される場合、組換え又は遺伝子操作された抗体、例えば、抗体の免疫原性を減少させるために導入される、異なる種、例えばヒト由来のポリペプチド又はドメインを含むマウスモノクローナル抗体を指す。用語「ヒト化抗体」は、免疫原性を減少させるために、そのタンパク質配列が、ヒトで自然に産生された抗体変異体との類似性を増大するように改変されている、非ヒト種由来の抗体を指す。
【００９７】
一実施形態では、本明細書に開示された融合タンパク質又はコンジュゲートであって、抗体又はその抗原結合フラグメントが、以下、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、ベータ−セクレターゼ１（BACE1; Atwalら(2011)、Sci Transl Med 3:84ra43）、ガンマ−セクレターゼ、トランスフェリン受容体（TfR; Yuら,(2014)Sci Transl Med 6:261ra154）、補体因子Ｃ１ｓ、プレセニリン１、プレセニリン２、ニカストリン、アルファ−シヌクレイン及びＢｒｉ、からなる群から選択される標的に対する親和性を有する、融合タンパク質又はコンジュゲートが提供される。
【００９８】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物の送達に対する主要な障害を表す。ＢＢＢは、中枢神経系における脳細胞外液から循環血液を分離する高度に選択的な透過障壁であり、その重要な機能の１つはＣＮＳへの出入りから循環物質を遮断することであって、脳への薬物送達を困難にしている。それゆえ、ＢＢＢを横切る輸送を促進する第２の部位との融合によって、融合タンパク質又はコンジュゲートを脳に標的化することは有益であり得る。ＣＮＳへの物質の送達のための主要なメカニズムは膜透過拡散（transmembrane diffusion）及び飽和輸送である。ほとんどのＣＮＳ治療薬は、ＢＢＢを横切るために膜透過拡散に依存している可能性がある、小さな脂溶性分子である。ペプチド、さらにはいくつかの小さなタンパク質は、測定可能な膜透過拡散を有するが、飽和輸送体（saturable transporters）は、ＣＮＳへのこれら分子の送達のために最も効果的なメカニズムであると考えられている。飽和輸送体は、典型的には、膜透過拡散で生じることになるものよりも、１０〜１００倍多くそれらの主なリガンドをＣＮＳに送達する。Ａβ標的に結合した後にＣＮＳから出られるように、融合タンパク質又はコンジュゲートを適合させることも興味深く、したがって例えばＡβペプチドをより効率的に除去又は捕捉し得る。
【００９９】
したがって、一実施形態では、第２の部位が、脳脊髄液及び／又は脳への融合タンパク質又はコンジュゲートの輸送を媒介する、本明細書に開示された融合タンパク質又はコンジュゲートが提供される。一実施形態では、前記第２の部位が、トランスフェリン、グレリン、インスリン及びレプチンからなる群から選択され；例えばトランスフェリン及びグレリンから選択される。
【０１００】
別の実施形態では、第２の部位が、脳脊髄液及び／又は脳から離れる輸送を媒介する、開示された融合タンパク質又はコンジュゲートが提供される。かかる一実施形態では、前記第２の部位が、上記の半減期延長の文脈に開示された抗ＦｃＲｎ抗体（Roopenian及びAkilesh(2007)、上記参照）及びＦｃＲｎ−結合Ｚ変異体（Seijsingら(2014)、上記参照）からなる群から選択される。
【０１０１】
本開示はさらに、第１の態様による、及び第２の態様による融合タンパク質又はコンジュゲートに含まれる、Ａβペプチド結合ポリペプチドが、標識、例えば蛍光色素及び金属、発色団色素、化学発光化合物及び生物発光タンパク質、酵素、放射性核種及び放射性粒子からなる群から選択される標識をさらに含む、ポリペプチドを包含する。他の実施形態では、標識されたＡβペプチド結合ポリペプチドは、所望の生物学的活性を有する第２の及び任意のさらなる部位も含む、融合タンパク質又はコンジュゲート中の部分として存在する。標識は場合によっては、Ａβペプチド結合ポリペプチドのみに結合してもよく、そして場合によっては、Ａβペプチド結合ポリペプチドと、融合タンパク質又はコンジュゲートの第２の部位との両方に結合してもよい。さらに、標識は、Ａβペプチド結合部位にではなく、第２の部位に結合させることも可能である。したがって、さらに別の実施形態では、前記標識が第２の部位のみに結合している、第２の部位を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチドが提供される。そのような標識は、例えばイン・ビボで又はイン・ビトロでのポリペプチドの検出に使用され、診断及び治療モニタリングに有用で有り得る。当業者は、Ａβ及びそのプラークを検出するための、例えば陽電子放射断層撮影法（positron emission tomography）に有用で有り得る、放射性核種を認識している。
【０１０２】
一実施形態では、本明細書に記載された前記Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートは、システイン残基のチオール基又はリシン残基のアミノ基を介してＡβペプチド結合ポリペプチドにコンジュゲートしたポリアミノポリカルボキシレートキレート剤によって提供されるキレート環境を含む。
【０１０３】
Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートが放射性標識されている実施形態では、そのような放射性標識されたポリペプチドは放射性核種を含み得る。大多数の放射性核種は金属性を有し、金属は典型的に、タンパク質及びペプチドに存在する元素と安定した共有結合を形成することができない。この理由から、放射性金属によるタンパク質及びペプチドの標識は、キレート剤、すなわち金属イオンとキレートと呼ばれる非共有結合化合物を形成する多座配位子の使用によって行われる。Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの一実施形態では、放射性核種がポリペプチドに配位、キレート化又は複合体化され得る、キレート化環境の提供によって放射性核種の取り込みが可能になる。
【０１０４】
キレート剤の一例は、ポリアミノポリカルボキシレート型のキレート剤である。そのようなポリアミノポリカルボキシレートキレート剤の２つのクラスは、大環状と非環状キレート剤とに区別することができる。
【０１０５】
一実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートは、システイン残基のチオール基又はリシン残基のイプシロンアミノ基を介して、Ａβペプチド結合ポリペプチドにコンジュゲートしたポリアミノポリカルボキシレートキレート剤によって提供されるキレート化環境を含む。
【０１０６】
インジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマス、放射性アクチニド（radioactinides）及び放射性ランタニドの放射性同位体のために最も一般的に使用される大環状キレート剤は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）の異なる誘導体である。一実施形態では、Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートのキレート化環境は、ＤＯＴＡ又はその誘導体によって提供される。より具体的に、一実施形態では、本開示により包含されるキレート化ポリペプチドは、前記ポリペプチドと、ＤＯＴＡ誘導体１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミド（マレイミドモノアミド−ＤＯＴＡ）とを反応させることによって得られる。
【０１０７】
さらに、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）及びその誘導体がキレート剤として使用され得る。したがって、一実施形態では、ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤が、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸又はその誘導体である、Ａβ結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートが提供される。
【０１０８】
最も一般的に使用される非環状ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン−五酢酸）の異なる誘導体である。したがって、ジエチレントリアミン五酢酸又はその誘導体によって提供されるキレート化環境を有するポリペプチドも本開示に包含される。
【０１０９】
本開示の第３の態様では、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；及び当該発現ベクターを含む宿主細胞、が提供される。
【０１１０】
また、本開示によって包含されるのは、上述されたポリペプチド又は融合タンパク質の産生方法であって、その発現ベクターからの前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で前記宿主細胞を培養し、そしてポリペプチドを単離すること、を含む、方法である。
【０１１１】
あるいは、本開示のＡβペプチド結合ポリペプチドは、保護された反応性側鎖を有するアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体を用いる、非生物学的ペプチド合成によって生成することができ、当該非生物学的ペプチド合成は、以下、
−保護された反応性側鎖を有する第１の態様によるポリペプチドを形成するための、アミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体の段階的カップリング、
−ポリペプチドの反応性側鎖からの保護基の除去、並びに
−水溶液中でのポリペプチドのフォールディング、
を含む。
【０１１２】
別の態様では、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体を含有する、組成物が提供される。一実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの追加の活性薬剤、例えば少なくとも２つの追加の活性薬剤、例えば少なくとも３つの追加の活性薬剤をさらに含有する。そのような組成物に有用であると判明し得る追加の活性薬剤の非限定的な例は、以下、神経伝達物質分解の阻害剤、神経伝達物質、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害剤、抗ヒスタミン剤、抗ウイルス剤、アルファ−セクレターゼ活性化剤、ベータ−又はガンマ−セクレターゼの阻害剤、α−シヌクレイン凝集の阻害剤、タウ凝集の阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、酸化ストレスに対して有効な化合物、抗アポトーシス化合物、金属キレート剤、ＤＮＡ修復の阻害剤、例えばピレンゼピン及び代謝産物、Ａβを除去／枯渇させる細胞成分のための誘引剤、ピログルタミン酸化された（pyroglutamated）Ａβ3~42を含むＮ−末端切断Ａβの阻害剤、抗炎症性分子、非定型抗精神病薬、例えばクロザピン、ジプラシドン、リスペリドン、アリピプラゾール及びオランザピン、コリンエステラーゼ阻害剤（ＣｈＥＩｓ）、例えばタクリン、リバスチグミン、ドネペジル及びガランタミン、Ｍ１アゴニスト及び任意のアミロイド又はタウ修飾薬（tau modifying drug）を含む他の薬剤及び栄養補助食品、例えばビタミンＢ１２、システイン、アセチルコリン前駆体、レシチン、コリン、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、アセチル−Ｌ−カルニチン、イデベノン、プロペントフィリン、及びキサンチン誘導体からなる群から選択される薬剤である。一実施形態では、追加の活性薬剤（複数）は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害剤、抗ヒスタミン剤及び抗ウイルス剤からなる群から選択される。
【０１１３】
当業者は、前記Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、あるいは、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートを含有する組成物が、対象に、標準的な投与技術を用いて投与することができ、例えば経口、静脈内、腹腔内、皮下、くも膜下腔内（例えばオンマイヤリザーバー（Ommaya reservoir）を介して）、肺内、経皮的、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下又は坐剤投与が挙げられることを理解するであろう。したがって、一実施形態では、経口、静脈内、腹腔内、皮下、くも膜下腔内、肺内、経皮的、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下又は坐剤投与からなる群から選択される経路、例えば経口、くも膜下腔内、静脈内及び鼻腔内投与からなる群から選択される経路、特に鼻腔内投与を介した投与のための、本明細書に開示された組成物又はＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートが提供される。
【０１１４】
Ａβペプチドは、Ａβペプチド関連障害の診断及び予後のためのマーカーとしても機能し得る。ここでＡβペプチド関連障害としては、アミロイドーシスが挙げられる。アミロイドーシスとは、続発性アミロイドーシス及び加齢に伴うアミロイドーシスを含む、アミロイドプラークの形成に関連する疾患及び障害の群を意味する。例としては、これらに限定されるものではないが、認知記憶能力（cognitive memory capacity）の喪失を特徴とする神経障害又は状態、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体認知症（Lewybody dementia）、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、グアムパーキンソン認知症複合（Guam Parkinson-dementia complex）；並びに、アミロイド様タンパク質に基づくか、又は関連する他の疾患、例えば脳アミロイド血管症、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー１、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeld Jacob disease）、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、ＩＩ型糖尿病、及び老人性心アミロイドーシス；並びに、緑内障、黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症（drusen-related optic neuropathy）、及びベータアミロイド沈着による白内障を含む、様々な眼疾患等が挙げられる。
【０１１５】
本開示によるＡβペプチド結合ポリペプチドは、治療、診断又は予後剤として有用であり得る。したがって、本開示の別の態様では、薬剤、診断剤又は予後剤としての使用のための、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物が提供される。
【０１１６】
Ａβの過剰発現、又はＡβ凝集若しくはＡβ沈着を特徴とする疾患に罹患した対象への、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の投与は、おそらくＡβ毒性を低下させ、対象におけるＡβ分解を促進するであろうことが想定される（Luheshiら(2010)PLOS Biology、March、Vol 8、Issue 3、e1000334）。これは次に、アミロイドベータペプチドの可溶性形態と凝集形態との間の平衡のシフトによって、体内の不溶性Ａβの量も減少させるであろう。このようにして、Ａβの量を減少させ、及び／又はＡβを封鎖することは、疾患そのもののまさに根源を減少させ、及び恐らく排除するのに役立つ。
【０１１７】
したがって、一実施形態では、血液中の遊離Ａβペプチドの量を減少させる薬剤としての使用のための、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物が提供される。一実施形態では、Ａβ単量体−凝集体平衡を減速させ、停止し又は逆転させる薬剤としての使用のための、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物が提供される。一実施形態では、Ａβ凝集体形成を予防し又は逆進させる薬剤としての使用のための、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物が提供される。当業者は、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の機能の上述された３つの様式が、互いに排他的でないことを理解するであろう。代わりに、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物は、例えば、治療される患者における前記Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の有効濃度、並びに疾患の段階に応じて、同時に、若しくは異なる時点で、いずれか１つ、２つ又は３つ全ての効果を発揮し得る。
【０１１８】
一実施形態では、Ａβペプチド関連症状の治療、診断又は予後における使用のための、Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物であって、ここでＡβペプチド関連症状はアミロイドーシスからなる群から選択され、アミロイドーシスとは、続発性アミロイドーシス及び加齢に伴うアミロイドーシスを含む、アミロイドプラークの形成に関連する疾患及び障害の群を意味し、例としては、これらに限定されるものではないが、認知記憶能力の喪失を特徴とする神経障害又は状態、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、グアムパーキンソン認知症複合；並びに、アミロイド様タンパク質に基づくか、又は関連する他の疾患、例えば脳アミロイド血管症、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー１、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeld Jacob disease）、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、ＩＩ型糖尿病、及び老人性心アミロイドーシス；並びに、緑内障、黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症、及びベータアミロイド沈着による白内障を含む、様々な眼疾患等が挙げられる、Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物が提供される。一実施形態では、前記Ａβペプチド関連症状は、認知症、認知機能障害、アルツハイマー病、脳アミロイド血管症、ダウン症候群、ＩＩ型糖尿病、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー１、緑内障及び加齢黄斑変性からなる群から選択される。特定の一実施形態では、前記症状はアルツハイマー病である。
【０１１９】
関連態様では、Ａβペプチドの検出方法であって、Ａβペプチドを含むことが疑われる試料を提供し、前記試料を、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物と接触させ、そして試料中のＡβペプチドの存在を示すための、Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の結合を検出すること、を含む、方法が提供される。一実施形態では、前記方法は、試料を接触させた後に、非結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物を除去するための、中間洗浄ステップをさらに含む。
【０１２０】
一実施形態では、前記方法は、対象におけるＡβペプチドの存在を決定するための診断又は予後方法であって、当該方法は、以下のステップ：
−対象、又は対象から単離した試料を、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物と接触させ、そして
−前記対象又は前記試料に結合した、Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の量に対応する値を得ること、
を含む。
【０１２１】
一実施形態では、前記方法は、対象又は試料を接触させた後で、かつ値を得る前に、非結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物を除去するための、中間洗浄ステップをさらに含む。
【０１２２】
一実施形態では、前記方法は、前記値を参照と比較するステップをさらに含む。前記参照は、数値、閾値又は視覚的指標、例えば呈色反応に基づいて評価され得る。当業者は、参照との比較の異なる方法が当該技術分野で知られており、使用に適している可能性があることを理解するであろう。
【０１２３】
そのような方法の一実施形態では、前記対象は哺乳動物対象、例えばヒト対象である。
【０１２４】
そのような方法の一実施形態では、前記試料は、生体液試料、例えば全血試料、血漿試料及び血清試料からなる群から選択される試料である。
【０１２５】
そのような別の実施形態では、前記試料は組織試料である。
【０１２６】
一実施形態では、前記方法はイン・ビボで行われる。
【０１２７】
一実施形態では、前記方法はイン・ビトロで行われる。
【０１２８】
関連態様では、Ａβペプチド関連症状の治療方法であって、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。前記方法のより特定の実施形態では、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物は、血液中の遊離Ａβペプチドの量を減少させ；Ａβ単量体−凝集体平衡を減速させ、停止し又は逆転させ；Ａβ凝集体形成を予防し又は逆進させ；あるいはそれらの組み合わせである。
【０１２９】
一実施形態では、前記Ａβペプチド関連症状は、アミロイドーシスからなる群から選択され、アミロイドーシスとは、続発性アミロイドーシス及び加齢に伴うアミロイドーシスを含む、アミロイドプラークの形成に関連する疾患及び障害の群を意味し、例としては、これらに限定されるものではないが、認知記憶能力の喪失を特徴とする神経障害又は状態、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、グアムパーキンソン認知症複合；並びに、アミロイド様タンパク質に基づくか、又は関連する他の疾患、例えば脳アミロイド血管症、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー１、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeld Jacob disease）、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、ＩＩ型糖尿病、及び老人性心アミロイドーシス；並びに、緑内障、黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症、及びベータアミロイド沈着による白内障を含む、様々な眼疾患等が挙げられる。一実施形態では、Ａβペプチド関連症状は、認知症、認知機能障害、アルツハイマー病、脳アミロイド血管症、ダウン症候群、ＩＩ型糖尿病、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー１、緑内障及び加齢黄斑変性からなる群から選択される。前記態様の特定の一実施形態では、Ａβペプチド関連症状は、アルツハイマー病である。
【０１３０】
本明細書に記載されたＡβペプチドポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物、及び少なくとも１つの第２の原薬の治療上有効量を投与することは有益であり得、当該原薬は、例えば神経伝達物質分解の阻害剤、神経伝達物質、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害剤、抗ヒスタミン剤、抗ウイルス剤、アルファ−セクレターゼ活性化剤、ベータ−又はガンマ−セクレターゼの阻害剤、α−シヌクレイン凝集の阻害剤、タウ凝集の阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、酸化ストレスに対して有効な化合物、抗アポトーシス化合物、金属キレート剤、ＤＮＡ修復の阻害剤、例えばピレンゼピン及び代謝産物、Ａβを除去／枯渇させる細胞成分のための誘引剤、ピログルタミン酸化されたＡβ3~42を含むＮ−末端切断Ａβの阻害剤、抗炎症性分子、非定型抗精神病薬、例えばクロザピン、ジプラシドン、リスペリドン、アリピプラゾール及びオランザピン、コリンエステラーゼ阻害剤（ＣｈＥＩｓ）、例えばタクリン、リバスチグミン、ドネペジル及びガランタミン、Ｍ１アゴニスト及び任意のアミロイド又はタウ修飾薬（tau modifying drug）を含む他の薬剤及び栄養補助食品、例えばビタミンＢ１２、システイン、アセチルコリン前駆体、レシチン、コリン、イチョウ（Ginkgo biloba）、アセチル−Ｌ−カルニチン、イデベノン、プロペントフィリン、及びキサンチン誘導体からなる群から選択される薬剤である。一実施形態では、少なくとも１つの第２の原薬は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害剤、抗ヒスタミン剤及び抗ウイルス剤からなる群から選択される。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、用語「共投与（co-adminstration）」は、同時投与及び順次投与を包含する。したがって、一実施形態では、上述の薬剤の少なくとも１つの共投与をさらに含む、上記で定義された方法が提供される。
【０１３２】
本発明の別の態様によれば、Ａβペプチドの分離、除去及び／又は精製の方法が提供される。適切には、そのような方法は、例えばクロマトグラフィー媒体、膜、セルロース、シリカ、アガロース、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、２相系、及び分離に一般的に使用される他のこのような材料から選択される、分離デバイスを含む。一実施形態では、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートは、分離デバイスに結合される。したがって得られた分離デバイスは、それに結合した前記Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートを有し、親和性マトリックスと呼ばれる。したがって、本開示の一態様では、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートを含む、親和性マトリックスが提供される。
【０１３３】
当該方法は親和性分離ステップを含み、当該ステップにおいて、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートを含む親和性マトリックスが使用される。
【０１３４】
試料からのＡβペプチドの精製の目的のために、精製すべきＡβ含有試料は、マトリックスへのＡβペプチドの結合を許容する条件下で、そのような親和性マトリックスに適切に適用される。その後、親和性マトリックスは、マトリックスへのＡβペプチドの結合が維持されるが、大半の、理想的には全ての、マトリックスに結合した他のタンパク質及び夾雑物が洗い流されるような条件下で洗浄される。溶出ステップでは、マトリックスは、Ａβペプチドがマトリックスから、回収され得る「Ａβペプチド画分」と称されるＡβペプチド富化画分に放出されるように処理される。
【０１３５】
逆に、分離の目的がＡβペプチドの除去である場合、いくつかの例外を除いて、本質的には上記と同じステップが適切に行われる。除去すべきＡβペプチドを含有する試料は、マトリックスへのＡβペプチドの結合を許容する条件下で、親和性マトリックスに適切に適用される。その後、親和性マトリックスは、マトリックスへのＡβペプチドの結合が維持されるが、大半の、理想的には全ての、他のタンパク質がフロースルーで回収されるような条件下で洗浄され、したがって回収されるＡβペプチド含量が実質的に減少した「枯渇（depleted）画分」が得られる。試料の非Ａβ成分は、保持され及び使用され及び／又はさらに処理され得る。
【０１３６】
本開示の別の関連態様は、ヒトの体液の一部分におけるＡβペプチドの含量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
ａ）ヒト由来の体液の一部分を提供し；
ｂ）当該一部分を本明細書に記載された親和性マトリックスに、当該親和性マトリックスへのＡβペプチドの結合を許容する環境下で適用し、それによって体液の一部分におけるＡβペプチドの含量の減少を引き起こし；そして
ｃ）当該ヒトに、体液の当該一部分の少なくとも一部を戻すこと、
を含む、方法である。
【０１３７】
本開示による方法は、以下、認知症、認知機能障害、アルツハイマー病、脳アミロイド血管症、ダウン症候群、ＩＩ型糖尿病、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー１、緑内障及び加齢黄斑変性、例えばアルツハイマー病からなる群から選択される、Ａβペプチド関連症状に罹患している対象の体液におけるＡβペプチドの含量を減少させることに関し得る。当該体液は例えば全血、血漿又は血清で有り得る。したがって、本発明による方法を使用することによって、前記Ａβペプチド関連症状に罹患した対象は、Ａβの体外除去によって治療され得る。
【０１３８】
本発明は、様々な例示的態様及び実施形態を参照して説明されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更が成されてもよく、等価物がその要素に代えられてもよいことが当業者に理解されるであろう。さらに、その本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況又は分子を本発明の教示に適合させるために、多くの改変が成され得る。それゆえ、本発明は企図される特定の実施形態に限定されるものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲に含まれる全ての実施形態を含むことになることが意図される。
【実施例】
【０１３９】
実施例
概要
以下の実施例は、ブドウ球菌ディスプレイ技術に基づく新規なＡβペプチド結合ポリペプチドの開発を開示する。本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチドをコードする遺伝子を配列決定し、そして対応するアミノ酸配列を図１に列挙し、識別子配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３で示している。本実施例はまた、Ａβペプチド結合ポリペプチドの生成、特性評価及び機能性を記載する。
【０１４０】
明確性のために、用語「Ｚ変異体」は、本明細書で使用される場合、タンパク質Ｚに由来する標的結合ポリペプチドを称する。したがって、本明細書に記載されたＡβペプチド結合ポリペプチドは、第１のＺ変異体ユニット及び第２のＺ変異体ユニットの二量体を含み、ここで、前記ユニットはＮ−末端で切断されているＺ変異体であってもよい。
【０１４１】
実施例１
親和性成熟ライブラリーの設計及びクローニング
概要
本実施例は、先に同定された第１世代Ａβペプチド結合ポリペプチド変異体ＺAβ3（配列番号１１１）の二量体に基づく、２つの親和性成熟ライブラリー、ＺＡＳｌｉｂ及びＺＳＹＭｌｉｂの設計及びクローニングを記載する。
【０１４２】
材料及び方法
二本鎖ＤＮＡの２つのＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）頭−尾二量体ライブラリーを、Sloning BioTechnology GmbH（プッフハイム（Pucheim）、ドイツ）から購入した。ライブラリーオリゴヌクレオチドは、Ａβペプチド結合ポリペプチドの第１及び第２の部分を構成する、第１のＺ変異体ユニットの切断されたヘリックス１プラスヘリックス２及び３、並びに第２のＺ変異体ユニットのヘリックス１及び２をコードした（非対称ライブラリー：５’−ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＴＡＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＧＣＧ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＣＧＣ  ＧＡＧ  ＮＮＮ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＮＮＮ  ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＮＮＮ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＧＴ  ＮＮＮ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＮＮＮ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＴＴ  −３’（配列番号５５６；ランダム化コドンはＮＮＮで示す）；対称ライブラリー：  ５’−ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＮＮＮ  ＧＡＧ  ＮＮＮ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＮＮＮ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＧＣＧ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＮＮＮ  ＧＡＧ  ＮＮＮ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＮＮＮ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＴＴ  −３’（配列番号５５７；ランダム化コドンはＮＮＮで示す）。当該遺伝子を、ブドウ球菌ベクターへのサブクローニングのためのＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ制限部位に隣接させた。ライブラリーをPhusion DNAポリメラーゼ(Finnzymes、エスポー、フィンランド）を用いて８サイクルでＰＣＲ増幅し、最終ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Qiagen GmbH）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ−ＨＦ（New England Biolabs）制限酵素によって消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen GmbH）を用いて調製用ゲル電気泳動（２％アガロースゲル）によって精製した。Ｓ．カルノーサス（S.carnosus）発現ベクターｐＳＣＺ１（Lofblomら(2007)J Appl Microbiol 102(3):736~747）を同じ酵素で消化し、上述の調製用ゲル電気泳動によって精製した。精製したライブラリーフラグメントを、ベクターとインサートとの１：５モル比でＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を用いてベクターに連結し、ＤＮＡフラグメントの精製及び濃縮のためのフェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱に続く。次に、ライブラリーをコードするプラスミドを、エレクトロポレーションによってエレクトロコンピテント大腸菌ＳＳ３２０細胞（Lucigen Corporation、ミドルトン、ＵＳＡ）に形質転換した。個々のクローンを、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｙｃｌｅ  シークエンシング反応及びＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００装置（Applied Biosystems、フォスターシティ、ＣＡ）を用いて後続のライブラリー配列検証のためにＰＣＲ増幅した。その後ライブラリープラスミドをＪｅｔｓｔａｒ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Genomed）を用いて調製し、フェノール−クロロホルム抽出により精製し、イソプロパノール沈澱によって濃縮した。最後に、当該ライブラリー（以後、Ｓｃ：ＺＡＳｌｉｂ及びＳｃ：ＺＳＹＭｌｉｂと称する）を前述のようにエレクトロコンピテントＳ．カルノーサスに形質転換した（Lofblomら（２００７）、上記参照）。
【０１４３】
ライブラリーがブドウ球菌表面に機能的に表示されたことを確認するために、細胞を蛍光標識されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Kabi Pharmacia）とインキュベートし、フローサイトメトリーを用いて分析した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７スクシンイミジルエステル（Invitrogen）でのＨＳＡの標識を、供給業者の推奨に従って行った。
【０１４４】
結果
Ａβペプチドに対する親和性を向上するために、Ａβペプチド結合ポリペプチドの親和性成熟を行った。２つの親和性成熟ライブラリーを、第１世代Ａβペプチド結合ポリペプチドＺAβ3（配列番号１１１）の頭−尾二量体に基づいて設計した。当該ライブラリーを、各ドメインの独立した操作を可能にし、並びに還元条件の影響をより受けにくくするために、一本鎖二量体として設計した。先のデータは、第１世代Ａβペプチド結合ポリペプチドＺAβ3の二量体のＮ末端から最初の構造化されていない１１アミノ酸残基を切断することが、Ａβペプチドに対する親和性に有利な効果を有することを示している（Lindgrenら(2010)Protein Sci 19(12):2319~2329; Lindbergら(2013)Biotechnol J 8(1):139~145）。それゆえ、第１のＺ変異体ユニットのこの一部分は、ライブラリーから除外した。第２のＺ変異体ユニットにおいて、二量体コンストラクトの正しいフォールディングを可能にするために、対応する一部分は代わりに柔軟性（Ｓ4Ｇ）2リンカーによって置換された。両方のライブラリーにおけるランダム化の設計は、第１世代Ａβペプチド結合ポリペプチドのＡβペプチドとの相互作用の構造解析に基づき、並びに第１世代Ａβペプチド結合ポリペプチドの選択からの配列出力に基づく（Gronwallら（２００７）、上記参照；Hoyerら（２００８）、上記参照）。
【０１４５】
ライブラリーのランダム化のために異なるアプローチを使用した。１つのライブラリーでは、２つのＺ変異体ユニット上の異なる位置をランダム化（非対称ランダム化）のための標的とする一方で、他のライブラリーでは、両方のＺ変異体ユニットにおける同じ位置をランダム化した（対称ランダム化）。第１のアプローチでは、両方のＺ変異体ユニットにおける１５の非対称に分布した位置を部分的にランダム化した（ＺＡＳｌｉｂと称されるライブラリー；図２Ａ）。第２のアプローチでは、１６の対称に分布した位置（各Ｚ変異体ユニットにつき８つ）を部分的にランダム化した（ＺＳＹＭｌｉｂと称されるライブラリー；図２Ｂ）。各ランダム化された位置を、当初のアミノ酸のためのコドンに１〜４個の他のアミノ酸のためのコドンの混合と組み合わせて５０〜７５％にスパイクしたところ、比較的低い突然変異頻度をもたらした。複雑なランダム化されたＤＮＡオリゴの構築を可能にするために、トリヌクレオチドビルディングブロックのセットを生成中に組み合わせた（Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術）。この方法は、ライブラリーのためのコドンを選択する際に完全な自由を提供し、縮重コドン及びエラープローン（error-prone）ＰＣＲアプローチと比較して最小のバイアスを有するランダム化を可能にする。当該設計は、８．１×１０7（ＺＡＳｌｉｂ）及び２．３３×１０7（ＺＳＹＭｌｉｂ）の個々のオリゴヌクレオチドの、理論的なライブラリーの複雑性をもたらした。当該ライブラリー設計は図３に概説されている。
【０１４６】
２つのライブラリーをコードするオリゴヌクレオチド混合物を、アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＰ；配列番号１１４）に融合したブドウ球菌ディスプレイベクターｐＳＣＺ１にサブクローニングし（Lofblom（２００７）、上記参照）、そしてＳ．カルノーサスに形質転換して、約１×１０8（ＺＡＳｌｉｂ）及び１．３×１０7（ＺＳＹＭｌｉｂ）の多様性を有する、細菌上に表示されたライブラリーを生成した。個々のライブラリーメンバーの配列分析は理論的な設計に従ったコドンの分布を明らかにし、望ましくないコドンの発生は認められなかった。しかしながら、ＺＳＹＭｌｉｂの約１０％は完全な（Ｓ4Ｇ）2リンカーを有していなかった。ライブラリーがブドウ球菌表面上に機能的に表示されたことを確認するために、細胞を蛍光標識されたＨＳＡとインキュベートし、フローサイトメトリーを用いて分析した。集団の約６０〜６７％が、機能性アルブミン結合受容体タンパク質によって評価されるように、表面露出組換えタンパク質を表示した。標識されたＡβ1-40とインキュベートした場合、両方のライブラリーは標的結合を保持しているクローンの画分を示した（図４、サイクル１）。
【０１４７】
実施例２
親和性成熟ライブラリーのフローサイトメトリーソーティング及び単離されたポリペプチドのシークエンシング
概要
本実施例は、ブドウ球菌ディスプレイのためのベクターへの実施例１の親和性成熟ライブラリーのクローニング、並びに、各ソーティングサイクルで増加したストリンジェンシー条件（increased stringency conditions）を用いるフローサイトメトリーによるその後のＡβペプチド結合ポリペプチドのソーティング及び選択を記載する。単離された変異体のシークエンシングは、非対称ライブラリーからの５１個のユニークな変異体（配列番号１〜５１）、及び対称ライブラリーからの５５個のユニークな変異体（配列番号５２〜１０６）の同定につながる。
【０１４８】
材料及び方法
いずれかのライブラリーの少なくとも１０倍のライブラリーサイズを、酵母抽出物（TSB+Y; Merck、ダルムシュタット、ドイツ）及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで補充したトリプシン大豆ブロスに接種し、３７℃及び１５０ｒｐｍで一晩増殖させた。翌日、細胞を遠心分離（６０００ｒｐｍ、６分、４℃）によって回収し、Ｃ−末端ビオチン化Ａβ1~40ペプチド（配列番号１１０；AnaSpec）の添加前に、０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８  ＮＦ界面活性剤（ＰＢＳＰ；ｐＨ７．４；BASF Corporation）で補充したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。細胞を、平衡に達するまで、穏やかに混合しながら室温で４５分間インキュベートした。その後、細胞を氷冷ＰＢＳＰで洗浄し、そしてフィコエリトリンとコンジュゲートしたストレプトアビジン（ＳＡＰＥ；Invitrogen）並びにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７とコンジュゲートしたＨＳＡで、３０分間氷上でそれぞれ５μｇ／ｍｌ及び１５０ｎＭの濃度で標識した。氷冷ＰＢＳＰでの最終洗浄ステップ後、細胞をソーティング前に氷冷ＰＢＳＰに再懸濁した。細胞を、ＭｏＦｌｏ（登録商標）Ａｓｔｒｉｏｓフローサイトメーター（Beckman Coulter）を使用して、各サイクルで増加したストリンジェンシーにより４サイクルでソートした。選択の第１サイクルでは、ライブラリー細胞を、５０ｎＭのＣ−末端ビオチン化Ａβ1~40ペプチドと、そして第２及び第３サイクルではそれぞれ２０ｎＭ及び１０ｎＭとインキュベートした。最後のサイクルでは、細胞をオフ・レート（off-rate）選択手順に供した。
【０１４９】
最後のオフ・レート選択サイクルでは、富化されたライブラリー細胞を２５ｎＭのＣ−末端ビオチン化Ａβ1~40ペプチドと４５分間平衡結合に達するまでインキュベートし、氷冷ＰＢＳＰ中で洗浄し、１００ｎＭ非標識Ａβ1~40ペプチドと６時間インキュベートし、次にＦＡＣＳソーティングの前にＨＳＡ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７及びＳＡＰＥで標識した。各ソーティングサイクルでは、約１０倍のライブラリーサイズがフローサイトメーターで分析され、及び細胞表面発現蛍光に対するＡβ1~40結合の最も高い比を有する細胞のトップ画分（約０．３５％）がゲーティングされそしてＴＳＢ＋Ｙに直接ソートされた。ソートされた細胞を、ＦＡＣＳの次のサイクルの前に、１５０ｒｐｍの振とうで３７℃で一晩増幅のために、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）で補充されたＴＳＢ＋Ｙに接種した。
【０１５０】
ソーティングの最終サイクル後に、細胞を１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する寒天プレート上に広げた。それぞれのソートされたライブラリーから９６個ランダムに選択したコロニーを、BigDye Thermo Cycle Sequencing反応及びＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００（Applied Biosystems）を使用して、配列決定した。
【０１５１】
結果
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）と組み合わせたブドウ球菌ディスプレイ技術は、個々のライブラリーメンバー間での微細な親和性の差別化が可能であるため、親和性成熟目的に十分適している（Lofblom（２００７）上記参照；Kronqvist(2008)Protein Eng Des Sel 21(4):247~255; Malmら(2013)PLoS One 8(5):e62791）。高親和性Ａβペプチド結合ポリペプチドを単離するために、２つの表示されたライブラリーをＦＡＣＳの４サイクルに供した。ブドウ球菌細胞を、ビオチン化Ａβ1~40ペプチドと、４５分間室温で結合平衡に達するまで、インキュベートした。その後細胞を、以前に記載された細胞表面発現レベルでの標的結合の検出及び正規化のために、洗浄し、蛍光標識されたＨＳＡ及びストレプトアビジン−コンジュゲートフィコエリトリンと氷上でインキュベートした（Kronqvistら（２００８）上記参照）。追加の洗浄後、フローサイトメーターにおける表面−発現比に最も高い標的−結合を示すライブラリー細胞をゲーティングし（図４に概説されるように）、増幅及びその後のソーティングのラウンドのために単離した。各サイクルでは、ソーティングパラメーター及びゲートを変更することによって、並びに標的濃度をサイクル１、２及び３においてそれぞれ５０ｎＭ、２０ｎＭ及び１０ｎＭに低下させることによって、選択ストリンジェンシーが増加した。第４及び最終サイクルでは、最も遅い解離を有する結合剤に有利なように、オフ・レート選択アプローチを使用した。選択の各サイクル後のフローサイトメトリー分析によって示されたように、ソーティングはＡβ結合クローンの富化をもたらした（図４Ａ及び４Ｂ）。ソーティングの４サイクル後に、個々のコロニーを同定のために配列決定した。１９２個の配列の合計のうち（ライブラリーあたり９６個）、５１個のユニークなポリペプチド変異体（配列番号１〜５１）が非対称ライブラリーからの出力において同定され、及び５５個のユニークなポリペプチド変異体（配列番号５２〜１０６）が対称ライブラリーからの出力において同定された（図１）。興味深いことに、非対称ライブラリーから単離された１つのクローン（ＡＢＰＰ０１８、配列番号１８）は、設計により意図された２つの代わりに、３つのＳ4Ｇリピートからなるリンカーを含んだ。
【０１５２】
実施例３
Ａβ結合のためのオン・セルスクリーニング
概要
本実施例では、Ａβペプチドに対する３７個の単離されたポリペプチド変異体の親和性をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１５３】
材料及び方法
実施例２の選択結果において各々２回以上出現した３７個のクローン（配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９及び５０にそれぞれ対応する、ＡＢＰＰ００１、００５、００９、０１３、０１４、０１６、０１８、０２０、０２１、０２５、０２６、０２８、０３３、０３５、０３７、０４０、０４２、０４８、０４９及び０５０；並びに配列番号５３、５４、５９、６０、６１、６２、７０、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００及び１０４にそれぞれ対応する、ＡＢＰＰ０５３、０５４、０５９、０６０、０６１、０６２、０７０、０７５、０７８、０８４、０８９、０９０、０９５、０９６、０９７、１００及び１０４）を、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）を含むＴＳＢ＋Ｙに個々に接種し、３７℃及び１５０ｒｐｍで一晩増殖させた。１０6の一晩培養細胞を遠心分離によってペレット化し、そして、１ｎＭのビオチン化Ａβ1~40（AnaSpec）に再懸濁する前に、ＰＢＳＰ中で洗浄した。室温で穏やかに混合しながら４５分のインキュベーション後に、細胞を氷冷ＰＢＳＰで洗浄し、３０分間氷上でＳＡＰＥ及びＨＳＡ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識した。次に、細胞を洗浄し、氷冷ＰＢＳＰに再懸濁し、そしてフローサイトメトリー分析に供した。Ａβ1~40結合及び細胞表面発現からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（Beckman Coulter）で測定した。第１世代結合剤の頭−尾ホモ二量体（ＺAβ3）2（配列番号１１２）、並びに１１個のＮ−末端アミノ酸残基が切断された頭−尾ホモ二量体（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）を、比較のために分析に含めた。実験を、異なる日に新たに調製された溶液を用いて二連で実施した。
【０１５４】
結果
実施例２に記載されたようにライブラリーから単離された３７個の候補を、最も高いＡβ結合シグナルをスクリーニングするために、個々にフローサイトメトリー分析に供した。合計で、配列分析において複数回出現する、ＺＡＳｌｉｂからの１９個の変異体（それぞれＡＢＰＰ００１、００５、００９、０１３、０１４、０１６、０２０、０２１、０２５、０２６、０２８、０３３、０３５、０３７、０４０、０４２、０４８、０４９及び０５０）、並びにＺＳＹＭｌｉｂからの１７個（それぞれＡＢＰＰ０５３、０５４、０５９、０６０、０６１、０６２、０７０、０７５、０７８、０８４、０８９、０９０、０９５、０９６、０９７、１００及び１０４）、並びに、より長いリンカーを含む非対称ライブラリーからの変異体ＡＢＰＰ０１８（配列番号１８）が、アッセイに含まれた。組換え細菌を１ｎＭのビオチン化Ａβ1~40及び上述された二次試薬とインキュベートした。その後試料をフローサイトメーターでＡβペプチド結合について分析し、そして、表面発現レベルからのシグナルに対するＡβペプチド結合からのシグナルの比（ＦＬ−２／ＦＬ−６）を決定した。Ｎ−末端切断を有するＺAβ3の頭−尾ホモ二量体（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）を比較のために分析に含めた。全ての変異体は対照よりも高い結合−シグナルを示し、Ａβペプチドに対する向上された親和性を示した。
【０１５５】
実施例４
オン・セル、オフ・レートランキング及び結合の決定
概要
本実施例では、ブドウ球菌細胞表面上に発現され、実施例３で試験された、３７個のポリペプチド変異体を、それらのオフ・レートによって測定された、Ａβペプチドに対するそれらの親和性に基づいてランク付けした。
【０１５６】
材料及び方法
個々のブドウ球菌クローン（ＡＢＰＰ００１、００５、００９、０１３、０１４、０１６、０１８、０２０、０２１、０２５、０２６、０２８、０３３、０３５、０３７、０４０、０４２、０４８、０４９、０５０、０５３、０５４、０５９、０６０、０６１、０６２、０７０、０７５、０７８、０８４、０８９、０９０、０９５、０９６、０９７、１００及び１０４）を、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）を含むＴＳＢ＋Ｙに接種し、３７℃及び１５０ｒｐｍで一晩増殖させた。１０6個の細胞を一晩培養し、遠心分離によってペレット化し、そして、ＰＢＳＰ中の１００ｎＭの非標識Ａβ1~40に再懸濁する前に、ＰＢＳＰ中で洗浄した。室温で穏やかに混合しながら６時間のインキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳＰで洗浄し、室温で４５分間ＰＢＳＰ中の２５ｎＭのＣ−末端ビオチン化Ａβ1~40ペプチド（AnaSpec）とインキュベートした。その後、細胞を氷冷ＰＢＳＰで洗浄し、そして３０分間氷上でＳＡＰＥ及びＨＳＡ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に氷冷ＰＢＳＰに再懸濁した。Ａβ1~40結合及び細胞表面発現からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（Beckman Coulter）で測定した。頭−尾ホモ二量体（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）を比較のために分析に含めた。実験を、異なる日に新たに調製された溶液を用いて二連で実施した。
【０１５７】
結果
さらなる分析に向けてＡβペプチド結合変異体の数を制限するために、３７個のユニークなクローンがオフ・レート測定によってランク付けされ、ブドウ球菌細胞表面上に発現された。ビオチン化Ａβ1~40との結合変異体のインキュベーション後、非標識Ａβペプチドを４倍過剰で加え、解離させた。次に、Ａβペプチド結合と表面発現レベルとの間の比を決定した（ＦＬ−２／ＦＬ−６）。全てのクローンは（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）と比較して、Ａβペプチドからのかなり遅い解離を示した（図６）。
【０１５８】
８個の変異体をさらなる試験のために選択した（配列番号７０、８４、９５、１８、２８、３５、４９及び５０にそれぞれ対応する、ＡＢＰＰ０７０、０８４、０９５、０１８、０２８、０３５、０４９及び０５０）。これらのうち４個が親和性スクリーニングから最も高いＡβ結合を示した一方で、他の４個は最もよいオフ・レートを示した。選択されたクローンは図６に矢印で示されている。
【０１５９】
実施例５
可溶性Ａβペプチド結合ポリペプチドの発現及び精製
概要
本実施例では、実施例４で選択された８つのポリペプチド、すなわちＡＢＰＰ０７０、０８４、０９５、０１８、０２８、０３５、０４９及び０５０、を発現し、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。
【０１６０】
材料及び方法
８つの親和性成熟Ａβ結合ポリペプチド及び（ＺAβ3A12）2（配列番号１１３）を生成し、さらなる特性評価のために精製した。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、上流ＮｄｅＩ及び下流ＸｈｏＩ制限部位を導入するプライマーを用いて、ＰＣＲによってコロニーから増幅した。その後ＤＮＡ配列をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ消化した発現ベクターｐＥＴ２６ｂ＋（Novagen）にサブクローニングし、Ｃ−末端Ｈｉｓ6タグを有するコンストラクトを生成した。プラスミドをヒートショックによってＢＬ２１大腸菌細胞に形質転換した。細胞を３７℃でＴＳＢ中で培養し、ＯＤ600が約１に達したら、１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧの添加によって発現を誘導した。２５℃での一晩のインキュベーション後、細胞を遠心分離によって回収した（４０００ｒｐｍ、８分、４℃）。次に細胞を超音波処理によって溶解させ、細胞残屑を遠心分離によって除去した（１６，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）。Ａβペプチド結合ポリペプチドを、ネイティブ条件下（洗浄緩衝液：２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４、０．４５μｍ濾過；溶出緩衝液：２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４、０．４５μｍ濾過）で、ＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｃｏｂａｌｔ  ｒｅｓｉｎ（Thermo Scientific）を用いてＩＭＡＣによって精製した。次に、潜在的な多量体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲル濾過カラム（GE Healthcare）及びランニング緩衝液としてＰＢＳを使用してＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０上で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって除去した。その後Ａβペプチド結合ポリペプチドの分子量及び純度を、ＬＣ／ＭＳ（Agilent Technologies 6520 ESI-Q-TOF）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、還元及び非還元条件下の両方で、確認した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定した。
【０１６１】
結果
オン・セルランキングからの８つのＡβペプチド結合ポリペプチド（配列番号７０、８４、９５、１８、２８、３５、４９及び５０にそれぞれ対応する、ＡＢＰＰ０７０、０８４、０９５、０１８、０２８、０３５、０４９及び０５０）を発現ベクターにサブクローニングし、Ｃ−末端Ｈｉｓ6タグ化ポリペプチドとして大腸菌で産生した。ポリペプチドをＩＭＡＣにより精製し、続くＳＥＣによって潜在的な多量体複合体を除去した。還元及び酸化条件両方の下での溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、約１４ｋＤａの正確なサイズを有する純粋なタンパク質を示した（図７）。
【０１６２】
実施例６
Ａβペプチド結合ポリペプチドの特性評価
概要
本実施例では、実施例５で発現されたポリペプチド、すなわちＡＢＰＰ０７０、０８４、０９５、０１８、０２８、０３５、０４９及び０５０のＡβペプチドに対する親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて分析し、そしてＡＢＰＰ０９５をさらに円二色性（ＣＤ）分光法によって特性評価した。
【０１６３】
材料及び方法
オフ・レート及び親和性のバイオセンサー分析：精製されたＡβペプチド結合ポリペプチドの親和性をＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置（Bio Rad Laboratories、CA、USA）でＳＰＲ−ベースのバイオセンサーアッセイを用いて決定した。Ｎ−末端ビオチン化Ａβ1~40ペプチド（AnaSpec）を、固定化（固定化レベルは約５０ＲＵであった）のためにニュートラアビジンセンサーチップ（Bio Rad Laboratories）上に注入した。各ポリペプチドの二連の試料を、固定化されたＡβペプチド上に、６．２５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲の濃度で注入した。流速は５０μｌ／分であり、会合及び解離をそれぞれ３００秒間及び２時間続けた。ＨＢＳ−ＥＰをランニング緩衝液として使用し、０．５％のＳＤＳを再生に使用した。全ての実験において、ブランク表面上の各試料からの応答を差し引いて、緩衝液の寄与を最小化した。オン及びオフ・レートを、Ｐｒｏｔｅｏｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（BioRad Laboratories）を使用して、ラングミュア１：１モデルに対する非線形回帰によって決定した。
【０１６４】
円二色性分光法：親和性成熟Ａβペプチド結合ポリペプチドＡＢＰＰ０９５（配列番号９５）の二次構造含量を、１ｍｍの光路長を有するセルでＪａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Jasco Scandinavia AB、Molndal、Sweden）を使用してＣＤ分光法によって０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で分析した。ＡＢＰＰ０９５を２０から９０℃まで（５℃／分）加熱しながら、熱安定性を２２１ｎｍで測定した。２５０〜１９５ｎｍでのＣＤスペクトルを９０℃に加熱する前後に２０℃で得た。
【０１６５】
結果
オフ・レート及び親和性のバイオセンサー分析：８つの精製したＡβペプチド結合ポリペプチドをＳＰＲ−ベースのバイオセンサーアッセイを用いる親和性及びオフ・レート決定に供した（表４）。各結合剤の４つの異なる濃度の希釈系列を、固定化されたビオチン化Ａβペプチドを有するニュートラアビジンチップ表面上に注入した。相互作用の速度定数を、１サイト（one-site）結合モデルを使用し非線形回帰によって全ての候補について決定し、次にＫD値の計算のために使用した。ＡＢＰＰ０９５はＡβ1~40に対して最も高い親和性を示し、３４０ｐＭの近似解離定数ＫDを示し、第１世代結合剤について報告された１７ｎＭの親和性と比較して５０倍改善された親和性に対応する（Ｈｏｙｅｒ、２００８、上記参照）。解離を２時間続け、ＡＢＰＰ０９５についてのオフ・レートを３．２×１０-5秒-1と決定した（図８）。
【０１６６】
【表４】
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【０１６７】
円二色性分光法：最も高い親和性を有するＡβペプチド結合ポリペプチド（ＡＢＰＰ０９５）をさらに特性評価するために、その熱安定性及び二次構造含量を円二色性分光法で分析した。当該分析は、Ａβペプチド結合ポリペプチドが第１世代結合剤と同様の二次構造を保持していることを示した（Ｈｏｙｅｒら（２００８）、上記参照）。ポリペプチドの熱安定性を決定するために、ヘリックス含量をモニターしながら試料を２０から９０℃まで加熱し、約４３℃のＴｍ値をもたらし（図９Ａ）、当該値は元の変異体ＺAβ3と同様であった（Hoyerら（２００８）、上記参照）。さらに、熱処理後のアンフォールディングの可逆性を評価するために、可変温度測定後にＣＤスペクトルを得た。当該スペクトルは非加熱試料からのスペクトルと完全な重なりを示し、ＡＢＰＰ０９５が９０℃への加熱後に完全にリフォールディングしたことを示唆している（図９Ｂ）。
【０１６８】
実施例７
スパイクされた大腸菌溶解物からのＡβペプチドの捕捉
概要
本実施例では、複合体溶液中のＡβペプチドを捕捉するＡＢＰＰ０９５（配列番号９５）の能力を、親和性分析を用いて試験した。
【０１６９】
材料及び方法
ＡＢＰＰ０９５は、ＰＰ０１３（配列番号１０７）と称される４６アミノ酸のアルブミン結合ドメインに、１０アミノ酸の柔軟性リンカーを介してＣ−末端で遺伝的に融合された。遺伝子をＴ７プロモーターの制御下でカナマイシン耐性の遺伝子を含むＰＥＴベースの発現ベクターに連結した。ＤＮＡ配列の確認、プラスミド調製及び培養は基本的に上述のとおりに行った。タンパク質精製を基本的に以前に記載されたとおり行ったが（Jonssonら(2008)Prot Eng Des Sel 21(8):515~527）、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスにはヒト血清アルブミンの代わりに抗［アルブミン結合ドメイン］リガンド（社内で作製）を使用した。
【０１７０】
７００μｇのＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３（配列番号１１５）を、室温で２０分間穏やかに混合しながらバッチ結合によって、１ｍｌのＨＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ（GE Healthcare、ウプサラ、スウェーデン）に非共有結合させた。次いで、結合したポリペプチドを有するＨＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ試料を１．５時間穏やかに混合しながら５０ｐｇ／ｍｌのＡβ1-42ペプチドでスパイクしたＰＢＳとインキュベートした。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを遠心分離によってペレット化し、ＨＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅからの補足されたＡβ1~42ペプチドの溶出（０．３ＭのＨＡｃ、ｐＨ２．８）の前に、５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。溶出液をＳｐｅｅｄＶａｃ（Savant Instruments、ミルフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して凍結乾燥し、還元試料緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、２．５％のＳＤＳ、５％のβ−メルカプトエタノール、０．０１％のＢＦＢ）に溶解した。試料を９６℃で１０分間加熱し、ＭＥＳランニング緩衝液（５０ｍＭのＭＥＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、０．１ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）を使用して、１２％のｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Invitrogen、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）上にロードした。分子量を、ＳｅａＢｌｕｅ２  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄマーカー（Invitrogen）を使用して推定した。ゲルを銀染色（SilverXpress（登録商標） Silver Staining Kit、Invitrogen）によって、製造業者の指示に従って染色した。
【０１７１】
結果
Ａβペプチドを捕捉するＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３（配列番号１１５）の能力を、親和性分析を用いて試験した。Ａβペプチド結合ポリペプチドの効力は長いイン・ビボでの半減期から利益を得る可能性があり、そして、アルブミン結合ドメインへの分子の融合が血清アルブミンへの結合によって循環における時間を劇的に改善することが以前に示されている（Andersenら(2011)J Biol Chem 286(7):5234~5241; Orlovaら(2013)J Nucl Med 54(6):961~968）。それゆえＡＢＰＰ０９５をＰＰ０１３に融合し、ポリペプチドが同時にアルブミンと相互作用しながら、Ａβを捕捉することができるかどうかを評価するためにアッセイを設計した。ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３を最初にＨＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させ、次いでＡβ1~42を含有するＰＢＳ（５０ｐｇ／ｍｌ）とインキュベートした。レベルは患者間で有意に変化することが報告されているが、Ａβ1~42ペプチドのこの濃度は血液中のＡβ1~42ペプチドの生理学的レベルを反映するように選択された（Kouら(2000)、上記参照;Duら(2005)、上記参照;Pesiniら(2012)、上記参照）。捕捉物からの溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＡＢＰＰ０９５がＡβ1~42ペプチドの効率的かつ選択的な捕捉が可能であることを示した（図１０）。溶出液中のより高い分子範囲のバンドはおそらく、ＨＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへのタンパク質の非特異的な結合によるものであった。それにもかかわらず、非特異的結合は、Ａβに結合するＡβペプチド結合ポリペプチドの能力に有意に影響しないようであった。
【０１７２】
実施例８
Ａβペプチド結合ポリペプチドで処置したアルツハイマー病モデルマウスの自発運動及び認知試験
概要
本実施例では、アルブミン結合ドメインに融合したＡＢＰＰ０９５（配列番号９５）で処置されたアルツハイマー病モデルマウスの感覚運動及び認知能力を、前記アルブミン結合ドメインに融合した対照ポリペプチドＺTaq（配列番号１０８）の二量体で処置したアルツハイマー病モデルマウスと比較する。
【０１７３】
材料及び方法
タンパク質生成：ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３（配列番号１１５）及び（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（配列番号１１６）を、実施例７に記載したように調製した。多量体を除去するために、追加の精製を、ＡＫＴＡシステムにおけるＨｉＬｏａｄ  １６／６０カラム（GE Healthcare）及びランニング緩衝液としてＰＢＳを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって行った。供給業者の推奨に従って、タンパク質を１ｍｌのＥｎｄｏＴｒａｐカラム（Hyglos）を通過させることによって、潜在的な残留エンドトキシンを除去した。タンパク質を１ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＰＢＳ（Gibco、Life Technologies）中に溶出させた。その後タンパク質の分子量及び純度を、還元及び非還元条件両方の下で、ＬＣ／ＭＳ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。潜在的な多量体を検出するために、還元並びに非還元形態の多量のタンパク質（２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定した。
【０１７４】
トランスジェニックマウスの処置：動物実験はNew York University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認され、アメリカ獣医学協会（American Veterinary Association）の勧告と一致していた。血管アミロイド沈着及びアミロイド関連病変をモデル化するために、よく特徴づけられたダブルトランスジェニック（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルを使用した。当該モデルはＡＰＰＫ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ突然変異（「スウェーデン突然変異」）並びにＰＳ１Ｍ１４６Ｖ突然変異の発現を可能にし、ＡＤ病変の早期発症を有する。２０匹の動物を２つの群に分け、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３タンパク質又は無関係な（ＺTaq）2−ＰＰ０１３タンパク質の１００μｇの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を（１００μｌの容量で）、週に３回、１３週間、３〜４ヶ月齢の初めに受けた。１０匹のマウスをＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３タンパク質で処置し、１０匹のマウスを陰性対照（ＺTaq）2−ＰＰ０１３タンパク質で処置した。処置中に、獣医スタッフが毒性の任意の兆候、例えば体重、身体的外観における変化、及び行動の変化について動物を監視した。６〜７ヶ月時に、マウスは広範囲の行動試験を受け、その後７〜８ヶ月齢で組織分析のために殺された。
【０１７５】
行動試験：認知試験の前に、運動協調及びバランスを測定するために、探索的な自発運動活性及び加速ロータロッド性能試験を行った。これは、認知課題の実施において観察された任意の効果が感覚運動能力の違いによるものであることを排除するために行われた。
【０１７６】
自発運動活性：Hamilton-Kinder Smart-frame Photobeam Systemを使用して、指定された期間にわたってマウスの活性を記録した。円形オープンフィールドチャンバー（直径７０ｃｍ）での１５分間の馴化後、各マウスに１５分間その環境を探索させた。マウスの水平方向の動きは、チャンバーの上に取り付けられたビデオカメラによって自動的に記録された。各セッションの後、フィールドを水及び３０％のエタノールで洗浄した。結果を各動物について移動距離（ｃｍ）、平均及び最大移動速度（ｃｍ／秒）並びに平均休止時間（秒）として報告した。
【０１７７】
ロータロッド性能：各動物を３．６ｃｍのロッド直径を有するロッド装置上に置き、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３タンパク質で処置されたマウスと、（ＺTaq）2−ＰＰ０１３タンパク質で処置されたマウスとの間の、運動協調及びバランスにおける違いを評価した（ロータロッド７６５０加速モデル；Ugo Basile）。動物を、ベースラインレベルの性能に達するために、２つの訓練試験のために装置に慣らした。その後動物を１５分の介在期間を有する３つの追加試験で試験した。ロータロッドを１．０ｒｐｍの初期速度に設定し、３０秒毎に０．５ｒｐｍずつ徐々に上げた。ソフトフォームクッションをロッドの下に置き、落下による怪我を防いだ。ロッドを各セッション後に水及び３０％のエタノールで洗浄した。性能を評価するために、回転バレルの頂部からマウスが落下したか、（しがみつくことによって）逆さまになったときに、ロッド上での合計時間及びロッドの速度を記録した。
【０１７８】
ラジアルアーム迷路：中央の空間から生じる８本の３０ｃｍの長さのアームを有する、８アーム放射状迷路を使用して、空間記憶を評価した。０．２５ｍｌの０．１％サッカリン水溶液を各アームの端に置いた。ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３で処置した（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウス、及び（ＺTaq）2−ＰＰ０１３で処置した（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスに加えて、同齢の対照群の野生型マウス（ｎ＝１０）を本実験に含めた。
【０１７９】
試験前に、マウスは２４時間水を与えられず、マウスの水の利用は試験期間中１日当たり１〜２時間に制限された。動物は中心区域を通って迷路に出入りした。リモートプーリーシステム（remote pulley system）によって操作される透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓギロチンドアが、中心区域からアームへのアクセスを制御した。迷路への適応の２日間後、水を制限されたマウスに１日あたり１回の訓練セッションを連続１０〜１１日間与えた。毎日の試験の前に、マウスを１５分間ライトを点灯させて部屋に適応させた。動物はまた、装置に適応され、８つの報酬（サッカリンを含む餌）が摂取されるまで全てのアームに入ることが許された。エラーの数（既に訪れたアームへの侵入）を記録した。
【０１８０】
統計分析：探索的自発運動活性試験、加速ロータロッド性能試験、及びラジアルアーム迷路試験からのデータを、２方向ＡＮＯＶＡ、反復測定及びＮｅｕｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ（Statistica）又はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ（GraphPad、サンディエゴ、ＣＡ）ポストホックテスト（post hoc test）を使用して分析した。
【０１８１】
結果
タンパク質生成：治療剤としてのＡβペプチド結合ポリペプチドの効力は長いイン・ビボでの半減期から利益を得るであろうことが期待された。他の非関連標的に対する親和性を有するＺ変異体分子を、親和性成熟アルブミン結合ドメインに融合させると、血清アルブミンへの結合によってイン・ビボでの半減期が有意に改善されることが以前に示されている。それゆえ、イン・ビボでの分析のための調製において、高親和性Ａβ特異的ＡＢＰＰ０９５ポリペプチド及び対照ポリペプチドＺTaqの二量体をサブクローニングし、Ｃ−末端脱免疫化（deimmunized）高親和性アルブミン結合ドメインＰＰ０１３との融合で発現させた。ポリペプチドとアルブミン結合ドメインとを区切る１０アミノ酸リンカーを使用した。ＺTaqをＡＢＰＰ０９５のフォーマットを模倣する頭−尾二量体としてクローニングした。約３００ｍｇの各タンパク質をイン・ビボでの試験のために生成し、精製した。多量体をサイズ排除クロマトグラフィーによって除去し、潜在的なエンドトキシンをＥｎｄｏＴｒａｐカラムを使用して除去した。タンパク質の分子量及び純度をＬＣ／ＭＳ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し（図１１）、タンパク質濃度を決定した。
【０１８２】
行動試験：ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３で又は（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（対照）で処置した（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスの群を、認知及び感覚運動試験の両方で評価した。移動距離、休止時間、最高速度、及び平均速度に関して、自発運動活性における群間で有意差は観察されなかった（図１２Ａ）。これと関連して、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３で処置されたトランスジェニックマウスと（ＺTaq）2−ＰＰ０１３（対照）でのトランスジェニックマウスとの間でのロータロッド性能試験において差異は観察されなかった（図１２Ｂ）。したがって、認知試験の性能は運動機能の差異又は異常によって混乱されなかった。
【０１８３】
ラジアルアーム迷路では、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３で処置した（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウス、並びに対照として使用された野生型マウスが、対照ポリペプチドを注射されたトランスジェニックマウスと比較して、有意に優れた性能を示した。野生型対照とＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３で処置されたトランスジェニックマウスとの間では、性能の差異は観察されなかった（図１３）。２方向反復測定ＡＮＯＶＡは、（ＺＴａｑ）2−ＰＰ０１３の注射と比較して、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３処置の有意な認知改善の利点を明らかにした。したがって、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３での処置は、ラジアルアーム迷路で評価されたように、トランスジェニックアルツハイマー病モデルマウスの認知能力を有意に改善した。
【０１８４】
実施例９
Ａβペプチド結合ポリペプチドで処置されたアルツハイマー病モデルマウスの組織学的分析
概要
本実施例は、Ａβペプチド結合ポリペプチドＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３又は対照ポリペプチドで処置され、実施例８に記載された行動試験後に屠殺した、（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスの組織学的分析について記載する。結果は、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３が脳アミロイド負荷を実質的に減少させ、この効果が処置された（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける行動改善と関連することを示した。
【０１８５】
材料及び方法
マウスをペントバルビタールナトリウム（１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔し、経皮的にかん流し、脳を直ちに取り出して処理した。右半球を過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒド中に一晩浸漬固定した。固定後、脳を２０％のグリセロール及び２％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するリン酸緩衝液に移し、切片化するまで４℃で保存した。連続冠状脳切片（４０μｍ）を切断し、エチレングリコール凍結保護剤に入れ、使用するまで−２０℃で保存した。切片を免疫組織化学分析のために、ｉ）抗Ａβモノクローナル抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８の混合物（Covagen Research Products Inc）、ｉｉ）アストロサイトを検出するためのポリクローナル抗グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体（ＤＡＫＯ）で、染色した。染色を以前に記載されたように行った（Boutajangoutら(2009)J Alzheimers Dis18:961~72; Scholzovaら(2009)J Neuroscience 29:1846~54; Liuら(2014)J Neurochem 128:577~91）。
【０１８６】
Ｂｉｏｑｕａｎｔステレオロジー画像分析システム（BIOQUANT Image Analysis Corporation）によって、ランダム不偏（random unbiased）サンプリングスキームを用いて、アミロイド負荷を定量した。総Ａβ負荷（Ａβ免疫反応性が占める試験範囲のパーセンテージとして定義される）を、抗Ａβモノクローナル抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８の混合物によって染色された冠状面切片上の皮質及び海馬について定量した。
【０１８７】
ＧＦＡＰ抗体で染色された切片の評価は、以前に公開された方法を用いて半定量的分析に基づいていた（Yangら(2011)J Alzheimers Dis 24:269~285; Scholtzovaら(2009)上記参照; Sadowskiら(2006)Proc Natl Acad Sci 103:18787~92）。分析前に、脳を顕微鏡を通して観察し、病変及び／又はグリア細胞の活性化段階の程度に応じて、０〜４の評点を、０．５ずつの増加で与えた。動物あたり、おおよそ５つの皮質切片及び６つの海馬切片を分析した。評点は、反応性ニューロンボディ（neuronal bodies）及びプロセスの数に基づいていた。アストログリオーシスを、皮質、海馬及び視床領域において１０倍の倍率で分析した。アストログリオーシスについての評点は、ＧＦＡＰ免疫反応性の程度に基づいていた（ＧＦＡＰ免疫反応性細胞の数及び星状細胞分岐の複雑さ）。評点はマウスの処置状態を知らない観察者によって行われた。
【０１８８】
総アミロイド負荷及びアストログリオーシスの全統計分析をＰｒｉｓｍ  ６．０（Graphpad、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１８９】
結果
アミロイド負荷の組織学的定量化：ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３処置マウス、対、（ＺＴａｑ）2−ＰＰ０１３（対照）処置マウスの皮質及び海馬の歯状回における総アミロイド負荷を、６Ｅ１０及び４Ｇ８抗体の混合物で免疫染色された連続切片に、ランダム不偏サンプリングを用いて立体解析学的技法によって定量した。Ａβ免疫染色は、対照群と比較してＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３処置マウスの皮質（図１４Ａ−Ｃ）及び海馬（図１５Ａ−Ｃ）切片両方におけるＡβ蓄積の有意な減少を示した（皮質及び海馬においてそれぞれｐ＝０．０３及びｐ＝０．０５）。
【０１９０】
処置後の神経炎症反応：Ａβ沈着を標的とする治療薬を投与する際の懸念は、脳の炎症の増加のリスクであり、最終的にはニューロンの機能不全又は死をもたらす。脳の炎症に対するＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３処置の影響を評価するために、海馬及び皮質におけるグリオーシスの程度を免疫組織化学染色によって定量的に調べた。観察された差異は有意ではなかったが、抗ＧＦＡＰ抗体で染色されたアストロサイトの組織学的観察は、対照処置群と比較してＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３処置マウスにおいてアストログリオーシスのわずかな減少があったことを明らかにした（図１６Ａ−Ｃ）。最も重要なことに、ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３処置と関連して、脳の炎症のリスクの増加は観察されなかった。
【０１９１】
実施例１０
Ａβペプチド結合ポリペプチドで処置したアルツハイマー病モデルマウスからの可溶性及び不溶性Ａβの抽出
概要
本実施例は、実施例８に記載された行動試験の後に屠殺され、実施例９に記載されたように組織学的に試験された、（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳における全可溶性Ａβ及びＡβ凝集体／オリゴマーの評価について記載する。
【０１９２】
材料及び方法
各脳の左半球を秤量し、均質化のすぐ前に加えた１００ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（phenylmethylsulphonyl fluoride）、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル及びＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche）を含む、組織均質化緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、ｐＨ７．４、２５０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ）にホモジナイズした（１０％ｗ／ｖ）。可溶性Ａβ及び全Ａβの抽出を以前に公開された方法に従って行った（Boutajangoutら(2009)上記参照; Scholtzovaら(2009)上記参照; Goniら(2010)PLoS One 5:e13391; Yangら 2011 上記参照; Liuら 2014、上記参照）。
【０１９３】
簡潔には、第１の脳ホモジネート（２００μｌ）を等量の冷０．４％ジエチルアミン（ＤＥＡ）／１００ｍＭのＮａＣｌと混合し、続いて１０００００ｇで１時間４℃で遠心分離した。得られた上清を１／１０容量の０．５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ６．８で中和し、ドライアイス上で急速凍結し、可溶性Ａβ画分として使用するまで−８０℃で保存した。
【０１９４】
第２のホモジネート（２００μｌ）を４４０μｌの冷ギ酸（ＦＡ）に添加し、１分間氷上で超音波処理した。その後、４００μｌのこの溶液を１０００００ｇで１時間４℃で遠心分離し、得られた上清の２１０μｌを４ｍｌのＦＡ中和溶液に希釈し（１ＭのＴｒｉｓ塩基、０．５ＭのＮａ2ＨＰＯ4、０．０５％のＮａＮ3）、ドライアイス上で急速凍結し、全Ａβ測定に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１９５】
ＤＥＡ及びＦＡ抽出物をそれぞれ用いた、可溶性及び全Ａβのレベルを、例えばScholtzovaらに記載されたように（２００９、上記参照）、サンドイッチ酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。
【０１９６】
試料の調製、並びに脳におけるＡβオリゴマー及びＡβ凝集体のレベルの測定を、製造業者の指示に従った、Ａβオリゴマー／凝集体に特異的な抗体（例えばＡ１１ポリクローナル抗体（Invitrogen））を用いるウェスタンブロット分析、並びにヒト凝集Ａβ ＥＬＩＳＡキット（Invitrogen）による分析を含む、例えばScholtzovaら(2014、Acta Neuropathologica Communications 2:101)及びLiuら 2014、上記参照）に記載されたように決定する。
【０１９７】
結果
結果は、対照ポリペプチド（ＺＴａｑ）2−ＰＰ０１３で処置されたマウスからの脳と比較したＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３処置マウスからの脳における全Ａβ及び可溶性Ａβのレベルの減少、並びにＡβ凝集体／オリゴマーのレベルの減少を示すことが期待される。
【０１９８】
実施例１１
Ａβペプチド結合ポリペプチドの血漿レベルの測定
概要
本実施例は、実施例８で試験された（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３及び（ＺＴａｑ）2−ＰＰ０１３の血漿レベルの評価を記載する。
【０１９９】
材料及び方法
マウスは、実施例８に記載された行動試験の開始の前に、並びに試験を通じて定期的に採血された。ＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３及び（ＺＴａｑ）2−ＰＰ０１３の血漿レベルを、０．５μｇ／ウェルのＡβ1-40ペプチド（Yale UniversityのKeck Foundationで合成された）でコーティングされたプレート（Immulon 2HB; Thermo Electron Corp）を用いてＥＬＩＳＡによって検出する。１／１０００の希釈度で一次ポリクローナルヤギ抗ＺＩｇＧ（社内で作製）を使用し、続いて標識された二次抗体、例えば抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Jackson）によって、検出を行う。プレートをＴＭＢ基質で展開し、反応を２ＭのＨ2ＳＯ4で停止させ、４５０ｎｍでの吸光度測定に続く。
【０２００】
結果
結果は、処置された（２ｘＴｇ）ｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスから得られた血漿試料中で経時的にＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３及び（ＺＴａｑ）2−ＰＰ０１３のレベルを示すことが期待される。
【０２０１】
実施例１２
チオフラビン蛍光アッセイによって試験されたＡβペプチド結合ポリペプチドによるＡβ凝集の阻害
概要
アルツハイマー病（ＡＤ）では、Ａβペプチドが凝集する傾向がある。事象の経過はイン・ビトロで、例えばチオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光アッセイなどの方法で試験することができる（Hellstrandら(2009)、ACS Chem. Neurosci. 1:13~18）。このアッセイは、アミロイドフィブリルへの結合時のＴｈＴの蛍光強度の変化を測定する。増強された蛍光は蛍光分光法によって観察することができる。Ａβペプチド凝集を阻害する本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの能力をＴｈＴアッセイで試験する。
【０２０２】
材料及び方法
様々な濃度の単量体Ａβ1~40又はＡβ1~42を、２００μＭのＥＤＴＡで補充した２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中の２０μＭのＴｈＴ（Sigma）と混合する。調製を、透明な底を有する黒色ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート中で、氷上で行う。９６ウェルプレートを３７℃に置き、１００ｒｐｍで振とうすることによって凝集が引き起こされる。ＴｈＴ蛍光を、Ｅｎｓｐｉｒｅプレートリーダー（Perkin Elmer）で、４４０及び４８０ｎｍの励起及び発光フィルターをそれぞれ使用して測定する。蛍光を最初に一定時間にわたって測定し、最適なＡβペプチド濃度及び最大凝集に達するのに必要な時間を見出す。凝集を阻害する本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドの能力は、最適化されたＡβ：ＴｈＴ比とともに様々な濃度でＡβペプチド結合ポリペプチドを混合し、次に上述された蛍光を読み取ることによって試験される。
【０２０３】
結果
結果は、本明細書に開示されたＡβペプチド結合ポリペプチドが、ＴｈＴ凝集アッセイによって測定されるように、イン・ビトロでのＡβペプチドの凝集を阻害することが示されると期待される。
【０２０４】
実施例１３
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって試験されたＡβペプチド結合ポリペプチドによるＡβ凝集の阻害
材料及び方法
試料調製：Ａβ40（AlexoTech AB、Umea、Sweden）を、ペプチド粉末を氷上で１０ｍＭのＮａＯＨに１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解することによって新たに調整し、必要に応じて２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０での希釈に続く。蛍光標識されたオピオイドペプチド（カスタム合成及び精製された＞９８％）（Biomatik）を、非標識Ａβ40の新たに調製した溶液に添加し、混合直後に濃度をＦＣＳによって確認した。２０μＭのＡβ結合ポリペプチドＡＢＰＰ０９５（配列番号９５）の存在又は非存在下で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、Ｔ＝２０℃中に、１０μＭの非標識Ａβ40、１００ｎＭのＡβ40−Ａｌｅｘａ４８８及び１００ｎＭのＡβ40−Ａｌｅｘａ６４７を含有する溶液中で、Ａβ40凝集の時間経過をモニターした。
【０２０５】
ＦＣＳ測定：ＦＣＳ測定を、透過光及び落射蛍光のための倒立顕微鏡（Axiovert 200 M）；Ａｒ／ＡｒＫｒ（４５８、４７７、４８８及び５１４ｎｍ）、ＨｅＮｅ  ５４３ｎｍ及びＨｅＮｅ  ６３３ｎｍのレーザーを含むＶＩＳ−レーザーモジュール；及び走査モジュールＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡからなる、独自に改変したＣｏｎｆｏＣｏｒ３装置（Carl Zeiss、Jena、Germany）で行った。当該装置はイメージング及びＦＣＳのために、シリコンＡｖａｌａｎｃｈｅ  Ｐｈｏｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ（SPCM-AQR-1X；PerkinElmer、ＵＳＡ）を用いた検出が可能となるように改変した（Vukojevicら(2008)、Proc Natl Acad Sci 105:18176~18181）。Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ４０×、ＮＡ＝１．２、水浸ＵＶ−ＶＩＳ−ＩＲ対物を終始使用した。Ａｌｅｘａ４８８はＡｒ／ＡｒＫｒレーザーの４８８ｎｍラインを使用して励起され、一方で、ＨｅＮｅ６３３レーザーをＡｌｅｘａ６４７を励起するために使用した。メインダイクロイックビームスプリッターＨＦＴ４８８／５４３／６３３を、入射光と蛍光とを分離するために使用した。蛍光シグナルを二次ダイクロイックビームスプリッター（ＮＦＴ  ６３５）を使用して分離し、検出前にＡｌｅｘａ４８８のためのバンドパスフィルター（ＢＰ５０５〜６１０）及びＡｌｅｘａ６４７のためのロングパスフィルター（ＬＰ６５０）を使用してさらにスペクトルを狭めた。
【０２０６】
蛍光強度の変動を、３０回の連続した測定のアレイで約１０分間隔で記録し、各測定は１０秒間持続し、そして時間的自己相関分析によって分析した。自己相関曲線をデータ分析のためのオンラインソフトウェアを用いて分析し、生成した自己相関曲線を１つの成分の自由３Ｄ拡散のためのモデルにフィットさせた。フィッティングは、実行中のソフトウェアの一部である専用ルーチンを使用して実行され、フィッティングの品質を残差分析によって評価した。
【０２０７】
結果
蛍光相関分光法を適用して、Ａβ結合ポリペプチドＡＢＰＰ０９５の存在下又は非存在下での経時的な溶液中におけるＡβ40凝集を調べた。結果は、凝集するＡβ40の傾向がＡＢＰＰ０９５の存在下で減少することを示した。拡散時間の分布の変化をモニタリングする拡散時間分析は、凝集サイズの変化を反映し、図１７に示されている。ＡＢＰＰ０９５の非存在下では、拡散時間（τD）のひろがりが約１時間後に現れたのに対し、ＡＢＰＰ０９５の存在下では拡散時間は低いままだった。
【０２０８】
実施例１４
Ａβペプチド結合ポリペプチドの鼻腔内投与
概要
鼻腔内薬物投与は、中枢神経系（ＣＮＳ）への化合物の送達に魅力的な経路である。鼻腔内投与されたタンパク質の有効性は様々なげっ歯類疾患モデル（Thorneら,(2004),Neuroscience、127:481~496; De Rosaら(2005)、Proc. Natl. Acad. Sci. 102:3811−3816; Topkuruら(2013)、Stroke、44:3189~3194; Lochheadら,(2015)、J Cereb. Blood Flow Met. 35:371~381)並びにヒト(reviewed in Lochhead及びThorne(2012)、Adv. Drug Deliv. Rev. 64:614~628）において実証されている。それゆえ鼻腔内投与は脳及び脳脊髄液（ＣＳＦ）へのＡβペプチド結合ポリペプチドの送達について評価される。さらに、全身注射とは対照的に、鼻腔内投与はまた、血液循環における高い曝露を回避し、したがって全身性の副作用の可能性を低下させる。
【０２０９】
材料及び方法
全ての動物、例えばＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（認可された業者からのもの）のプレブリード（Prebleeds）を、投薬の１０日前に採取する。鼻腔内投与をイソフルラン麻酔下で行う。動物を仰臥位に置き、合計６０μｌ（１０００μｇ）のＡβペプチド結合ポリペプチド（単独で、又はアルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１０７）とあわせて）を、ピペットにより１０μｌの滴下で投与し、各鼻腔を２．５分毎に合計１０分かけて処置する。３ｍＭのＰｚ−ペプチド（４−フェニルアゾベンゾキシ−カルボニル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＤＡｒｇ；Bachem）がＡβペプチド結合ポリペプチド製剤に浸透増強剤として含まれ得る。動物を麻酔し、第１の鼻腔内点滴の０．５、２、６、及び２４時間後に屠殺する。血液試料を採取し、次いでラットをＣＳＦの採取のためにケタミン＋キシラジン／メデトミジンを用いて麻酔する。安楽死させた後、ラットを氷冷ＰＢＳでかん流し、嗅球を慎重に採取する。組織を秤量し、ドライアイス上で凍結させ、分析まで−８０℃で保存した。脳組織を溶解緩衝液の添加によって調製し、超音波処理に続く。細胞残屑を遠心分離によって除去し、上清及びＣＳＦを、例えば実施例１１に記載されたように、Ａβペプチド結合ポリペプチド濃度のＥＬＩＳＡベースの測定に供する。同じＥＬＩＳＡ法を適用し、血液試料から回収された血清を分析して、全身曝露を評価する。
【０２１０】
結果
結果は、嗅球においてＡβペプチド結合ポリペプチドの有意な濃度を示すと期待される。ＣＳＦ及び血液中の濃度は、Furrerら(2009、J Neuroimmunol 215:65−72)及びThorneら（上記参照）と一致して低いと予想される。嗅球は嗅覚系を介して鼻腔に接続され、脳幹は末梢三叉神経系を介して鼻孔に接続される。ＣＮＳへのＡβペプチド結合ポリペプチドの送達は、血液脳関門を越えた浸透が必要である用量調整された（例えば同じ系の曝露を得るように調整された）静脈内注射後よりも、鼻腔内投与後にさらに効率的であると期待される。
【０２１１】
実施例１５
代替足場を有するＡβペプチド結合ポリペプチドの特性評価
概要
本実施例は、代替足場配列におけるＡβペプチド結合ポリペプチドＡＢＰＰ０９５の結合部位の適合、並びに円二色性（ＣＤ）分光法及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるそのような代替配列の分析について記載する。
【０２１２】
材料及び方法
ＡＢＰＰ０９５の足場突然変異変異体のクローニング：Ｃ−末端Ｈｉｓ6タグを有するＡＢＰＰ０９５（実施例５及び６で使用された）を、両方の部分内で対称的に足場位置でさらに改変した。導入された突然変異を表５に列挙する。合成遺伝子をＤＮＡ２．０から注文した。送達されたプラスミドから、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を切断し、続いてＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を用いて発現ベクターｐＥＴ２６ｂ＋（Novagen）に連結した。Ｃ−末端Ｈｉｓ6タグを有する生成したコンストラクトは、一般的なフォーマットＡＢＰＰ０９５＃−ＬＥＨＨＨＨＨＨであった。
【０２１３】
【表５】
2018513833.tif 000007
【０２１４】
ＡＢＰＰ０９５の足場突然変異変異体の産生：大腸菌Ｔ７Ｅ２細胞（GeneBridges）をそれぞれのＡＢＰＰ０９５変異体の遺伝子フラグメントを含むプラスミドで形質転換し、発酵槽（GRETA4、Belach Bioteknik AB）で３７℃で、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンで補充した約９４０ｍｌのＴＳＢ−ＹＥ培地中で培養した。タンパク質発現を誘導するために、ＯＤ600＝２でＩＰＴＧを０．１７ｍＭの最終濃度まで添加し、培養物を３７℃でさらに５時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収した。
【０２１５】
約４ｇの各細胞ペレットを１３ｍｌの［２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４］に再懸濁し、及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Merck、cat. No.1.01654.0001）を約９０Ｕ／ｍｌの濃度まで添加した。細胞懸濁液を１０ｇのＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂ（MP Biomedicals、cat. No.116540429）に移し、細胞をＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４  装置（MP Biomedicals）を使用して破壊した。細胞残屑を遠心分離によって除去し、各上清を１ｍｌのＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ  ＩＭＡＣカラム（GE Healthcare、cat. No.11-0033-99）に適用した。夾雑物を洗浄緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄することによって除去し、その後ＡＢＰＰ０９５変異体を３ｍｌの溶出緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で溶出した。ジスルフィドの還元のために、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を２０ｍＭの最終濃度で添加し、ＲＴで１時間のインキュベーションに続く。［２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０］への緩衝液交換をＰＤ−１０脱塩カラム（GE Healthcare、cat. No.17-0851-01）を使用して行い、試料を同じ緩衝液で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。還元型グルタチオン（ＧＳＨ; Sigma、cat. No.G-4251）及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ; Sigma、cat. No.G-4376）をそれぞれ２ｍＭ及び０．４ｍＭの濃度まで加え、暗所で４℃での一晩のインキュベーションに続く。各試料を、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０システム（GE Healthcare）に接続された１ｍｌのＲｅｓｏｕｒｃｅ  ＲＰＣカラム（GE Healthcare、cat.no 17-1181-01）を使用して、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によってさらに精製した。アセトニトリル（ＡＣＮ）を１０％の最終濃度まで補充し、試料を溶媒Ａ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中の１０％のＡＣＮ、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  ＲＰＣカラムにロードした。カラムを、１８カラム容量にわたって、０〜６０％のリニアグラジエントの溶媒Ｂ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中の８０％のＡＣＮ、０．１％のＴＦＡ）による溶出の前に、５ＣＶの溶媒Ａで洗浄した。最後に、ＤＰＢＳ（Corning、cat.No.21-031-CVR）への緩衝液交換をＰＤ−１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを用いて行った。
【０２１６】
各タンパク質について、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計及びタンパク質の吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって濃度を決定した。純度をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、各精製されたＡＢＰＰ０９５変異体の同一性をＨＰＬＣ−ＭＳ分析（HPLC-MS 1100; Agilent Technologies）を用いて確認した。
【０２１７】
円二色性分光法：ＣＤ分析を、タンパク質濃度は０．５ｍｇ／ｍｌを使用した以外は、基本的に実施例６に記載されたように行った。
【０２１８】
Ｂｉａｃｏｒｅ動態分析：ヒトＡβ1~40（ｈＡβ1~40）、ヒトＡβ1~42（ｈＡβ1~42）及びマウスＡβ1~40（ｍＡβ1~40）に対する粗速度定数（ｋa及びｋd）及び親和性（ＫD）を、ＡＢＰＰ０９５（配列番号９５）、その足場突然変異誘導体ＡＢＰＰ０９５ａ（配列番号５５１）、ＡＢＰＰ０９５ｂ（配列番号５５２）及びＡＢＰＰ０９５ｃ（配列番号５５３）について、並びにＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３（配列番号１１５）について、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００装置（GE Healthcare）を使用して決定した。Ｎ−末端ビオチン化ｈＡβ1~40（AnaSpec、cat. No.AS-24648）、ｈＡβ1~42（AnaSpec、cat. No.AS-24641-01）及びｍＡβ1~40（AnaSpec、cat. No.AS-61717-01）をストレプトアビジン被覆チップ（Biacore Sensor Chip SA、cat. No.BR100032）上の別個のフローセルに固定化し、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０、GE Healthcare、cat. No.BR100188）を使用した。表面上へのリガンド固定化レベルは、ｈＡβ1~40について１７ＲＵ、ｈＡβ1-42について１６ＲＵ、そしてｍＡβ1~40について２２ＲＵであった。チップ上の１つのフローセル表面を分析物注入の間にブランクとして使用した。ＨＢＳ−ＥＰをランニング緩衝液として使用し、流速は３０μｌ／分であった。分析物、すなわちＡβペプチド結合ポリペプチドを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で６３０、２１０、７０、２３及び８ｎＭの濃度までそれぞれ希釈し、６分間注入し、ランニング緩衝液で４０分間の解離に続く。解離後、表面を１０ｍＭのグリシンｐＨ２．０で再生した。速度定数を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１（GE Healthcare）のラングミュア１：１モデルを使用して、センサーグラムから計算した。
【０２１９】
結果
ＡＢＰＰ０９５の足場突然変異変異体の生成：全ての変異体は、大腸菌で可溶性遺伝子産物として発現された。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は＞９８％の純度を示した。正確な酸化単量体の同一性をＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。
【０２２０】
ＣＤ分析：融解温度（Ｔｍ）を可変温度測定を用いて決定し、足場突然変異変異体のＴｍがＡＢＰＰ０９５のＴｍと同様であったことが示された（表６）。９０℃に加熱する前後に２０℃で測定したスペクトルを重ねた時に、可逆的なフォールディングを全ての突然変異した変異体について観察した。
【０２２１】
【表６】
2018513833.tif 000008
【０２２２】
ＳＰＲ動態分析：ＡＢＰＰ０９５、その足場突然変異誘導体ＡＢＰＰ０９５ａ、ＡＢＰＰ０９５ｂ及びＡＢＰＰ０９５ｃ並びにＡＢＰＰ０９５−ＰＰ０１３と、ｈＡβ1~40、ｈＡβ1~42及びｍＡβ1~40との相互作用を、各Ａβペプチドを含む表面上に様々な濃度のＡβペプチド結合ポリペプチドを注入することによってＢｉａｃｏｒｅ装置で分析した。試験された全てのＡβペプチド結合ポリペプチドは各Ａβペプチド変異体への結合を示した。１：１相互作用モデルを使用して得られた動態パラメータ（ＫD、ｋa及びｋd）の概要を表７に示す。
【０２２３】
【表７】
2018513833.tif 000009
【０２２４】
実施例１６
追加のＡβペプチド結合ポリペプチドの分析
材料及び方法
スクリーニングのためのＡβペプチド結合ポリペプチドのサブクローニング：実施例２に記載された細胞ソーティングの第３ラウンドから得られた各ライブラリー（すなわちそれぞれ対称及び非対称ライブラリー）からのクローンの別個の混合物を、ＰＣＲ増幅し、エンドヌクレアーゼＡｃｃＩ及びＸｈｏＩを用いて制限し、同じエンドヌクレアーゼを用いて制限したファージミドベクターｐＡＹ０２５９２に連結した（基本的にGronwallら、上記参照に記載されたとおり）。連結物の形質転換をエレクトロコンピテント大腸菌ＥＲ２７３８（Lucigen）に行った。
【０２２５】
シークエンシング：全ての個々のクローンを配列決定した。ＰＣＲフラグメントを単一コロニーから増幅し、基本的に国際公開第２００９／０７７１７５号に記載されたように、配列決定及び分析した。
【０２２６】
ＥＬＩＳＡのためのＡβペプチド結合ポリペプチドの生成：バルククローニングからの単一コロニーを、ディープウェルプレート（Nunc、cat. No.278752）中に１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０．１ｍＭのＩＰＴＧで補充した１．２ｍｌのＴＳＢ−ＹＥ培地中に接種することによって、配列決定したＡβペプチド結合ポリペプチドを産生した。プレートを２４時間３７℃でインキュベートした。細胞を遠心分離によってペレット化し、１５０μｌのＰＢＳＴ０．０５％（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で補充したＰＢＳ）に再懸濁し、８２℃で水浴中で２０分間インキュベートした。細胞懸濁液を９６ウェル濾過プレートに移し（MerckMillipore、cat.No.MSNANLY50）、遠心分離機で１５００ｘｇで４分間遠心し、そして透過物を新しい９６ウェルプレートに回収した。
【０２２７】
ペリプラズム抽出物の上清は、本明細書においてＡＢＤと称される、ストレプトコッカス（Streptococcus）株Ｇ１４８からのタンパク質ＧのＧＡ３に対応するアルブミン結合ドメインとの融合としてＡβペプチド結合ポリペプチドを含み、ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［ＡＢＰＰ＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［ＡＢＤ］−ＹＶＰＧとして表される（Gronwallら、上記参照）。ＡＢＰＰ＃＃＃は、個々に、１０７アミノ酸残基のＡβペプチド結合ポリペプチドを指す。
【０２２８】
Ａβペプチド結合ポリペプチドののＥＬＩＳＡ分析：Ａβ1~40へのＡβペプチド結合ポリペプチドの結合をサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Costar、cat.No.3690）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６；Sigma、cat. No.C3041）で希釈した２μｇ／ｍｌの抗ＡＢＤヤギ抗体（社内で作製）で４℃で一晩コーティングした。ウェルを１００μｌのＰＢＳＣ（０．５％カゼインで補充したＰＢＳ；Sigma、cat. No.C8654）でブロックし、５０μｌのペリプラズム溶液をウェルに加え、３０分間ＲＴでインキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ０．０５％で４回洗浄し、その後ＰＢＳＣ中で２ｎＭの濃度での５０μｌのＮ−末端ビオチン化ｈＡβ1~40（AnaSpec、cat. No.AS-24648）を各ウェルに加えた。プレートを７５分間ＲＴでインキュベートし、４回の洗浄及びＰＢＳＣで１：３００００希釈されたストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰの添加に続く（Thermo Scientific、cat. No.N100）。プレートを３０分間インキュベートし、その後それらを上述のように洗浄した。プレートを、製造業者の推奨に従って、５０μｌの１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ（Thermo Scientific、cat.No.34028）の添加によって展開した。
【０２２９】
Ａβペプチド結合ポリペプチドＡＢＰＰ０９５（配列番号９５）のペリプラズム画分を、各ＥＬＩＳＡプレート上に陽性対照として二連で使用した。陰性対照を、ビオチン化ｈＡβ1~40に対してアッセイされたＡＢＤペリプラズムを用いて作成した。４５０ｎｍでの吸光度をマルチウェルプレートリーダー（EnSpire; Perkin Elmer）を使用して測定した。
【０２３０】
Ａβペプチド結合ポリペプチドのＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０分析：Ａβペプチド結合ポリペプチドの選択を、基本的に上述されたように、ＥＬＩＳＡを用いてビオチン化ｈＡβ1~40の希釈系列に対する応答の分析に供した。アッセイを３８４ウェル高結合アッセイプレート（Greiner、cat. No.781061）で行った。ビオチン化タンパク質を１５０ｎＭの濃度で添加し、２４０ｐＭまで段階的に１：５希釈した。全てのＡβペプチド結合ポリペプチドをまた、バックグラウンドコントロールとして標的タンパク質を加えることなくアッセイした。Ａβペプチド結合ポリペプチドＡＢＰＰ０９５を含むペリプラズム試料を陽性対照として含め、分析した。陰性対照として、ＡＢＤのみを含むペリプラズムを同じ標的に対してアッセイした。得られた値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５及び非線形回帰を用いて分析し、ＥＣ５０値（半数最大効果濃度）を計算した。
【０２３１】
ペリプラズム試料のＳＰＲ分析：Ａβペプチド結合ポリペプチドの選択を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００装置（GE Healthcare）を使用して、ビオチン化ｈＡβ1~40に対する応答の分析に供した。ビオチン化抗ＡＢＤヤギ抗体（社内で作製）及びＮ−末端ビオチン化ｈＡβ1~40（AnaSpec cat. No.AS-24648）を、ストレプトアビジン被覆チップ（Biacore Sensor Chip SA、cat. No.BR100032）上の別個のフローセルに固定化し、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０、GE Healthcare、cat. No.BR100188）を使用した。表面上へのリガンド固定化レベルは抗ＡＢＤ抗体について約２０００ＲＵ及びｈＡβ1~40について２２５ＲＵであった。チップ上の１つのフローセル表面を分析物注入の間にブランクとして使用した。ＨＢＳ−ＥＰをランニング緩衝液として使用し、流速は２５μｌ／分であった。分析物、すなわち上述されたＡβペプチド結合ポリペプチドのペリプラズム調製物を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１５ｘにそれぞれ希釈し、１０分間注入し、ランニング緩衝液で５分間の解離に続く。解離後、表面を１０ｍＭのグリシンｐＨ２．０の２つのパルスで再生した。ＡＢＰＰ０９５は表面の安定性を確保するために分析の参照として、最初の試料として、中間に、及び最後の試料として含まれ、合計で６回流した。ＡＢＤの試料をｈＡβ1~40表面のためにブランク対照として含めた。
【０２３２】
結果
スクリーニングのためのＡβペプチド結合ポリペプチドのサブクローニング：実施例２に記載された細胞ソーティングの第３ラウンドから、クローンをバルクでベクターｐＡＹ０２５９２にサブクローニングした。２つの異なるライブラリーの結果を別々に保持し、クローンを大腸菌ＥＲ２７３８に形質転換した。
【０２３３】
シークエンシング：同定のために個々のコロニーのサブクローニング後にシークエンシングを行った。合計１１１６配列のうち（ライブラリーあたり５５８個）、１８５個の新しいユニークなポリペプチド変異体を非対称ライブラリーからの出力で同定し、及び２５４個のユニークなポリペプチド変異体を対称ライブラリーからの出力で同定した。これらのうち、５つの変異体を両方のライブラリーからの出力で同定した。加えて、実施例２に記載された第１のスクリーニングで既に同定された５１個のポリペプチド変異体（非対称ライブラリーから２１個及び対称ライブラリーから３０個）を再度ピックアップした。
【０２３４】
Ａβペプチド結合ポリペプチドのＥＬＩＳＡ分析：細胞ソーティングの３ラウンド後の結果のバルクでのサブクローニング後に得られたクローンを９６ウェルプレートで生成し、ＥＬＩＳＡでＡβ結合活性についてスクリーニングした。陰性対照の平均応答は０．０６３ＡＵであった。Ａβペプチド結合ポリペプチドの大半は、２ｎＭの濃度でのｈＡβ1~40に対して０．２ＡＵ以上の応答を与えることが見出された（少なくとも３ｘ陰性対照に相当）。新たに同定されたこれらのポリペプチドの間でそれらのアミノ酸配列（実施例２の第１のスクリーン後に含まれていない）を配列番号１１８〜５５０として図１に列挙している。非対称ライブラリーからの出力で同定されたポリペプチド変異体を図１に配列番号１３９〜１４２、１５５〜１５９及び３７６〜５５０として列挙し、並びに対称ライブラリーからの出力で同定されたポリペプチド変異体を図１に配列番号１１８〜１３８、１４３〜１５４及び１６０〜３７４として列挙している。配列番号２２９、２３３、２４８、３２１及び３３４を有するポリペプチドを両方のライブラリーからの出力で同定した。
【０２３５】
Ａβペプチド結合ポリペプチドのＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０分析：Ａβペプチド結合ポリペプチドのサブセットを上述のＥＬＩＳＡ実験の結果に基づいて選択し、ＥＬＩＳＡフォーマットにおける標的滴定に供した。ペリプラズム試料をビオチン化ｈＡβ1~40の連続希釈とインキュベートした。Ａβペプチド結合ポリペプチドＡＢＰＰ０９５（配列番号９５）を有するペリプラズム試料をまた、陽性対照としてアッセイした。得られた値を分析し、それらのそれぞれのＥＣ５０値を計算した（表８）。
【０２３６】
【表８】
2018513833.tif 000010
【０２３７】
ペリプラズム試料のＳＰＲ分析：抗ＡＢＤヤギ抗体及びｈＡβ1~40とＺ変異体のサブセットとの相互作用を、ペリプラズム試料の希釈液を注入することによってＢｉａｃｏｒｅ装置で分析した。２つの表面に対する応答をモニターしたものを、表９に示す。抗ＡＢＤヤギ抗体に対する応答はペリプラズム試料中のＺ変異体の相対量を示し、ｈＡβ1~40に対する応答はその相対的な希釈における各変異体の結合能力を示す。
【０２３８】
【表９】
2018513833.tif 000011
【０２３９】
実施形態の項目別リスト
１．Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、以下、
−第１のＡβペプチド結合モチーフＢＭ１を含む第１の部分、
−第２のＡβペプチド結合モチーフＢＭ２を含む第２の部分、及び
−リンカー、
を含み、
ここで、当該モチーフは、同一又は異なってもよく、
ここで、当該結合モチーフＢＭ１及びＢＭ２の各々が、以下、
ｉ）ＥＸ2Ｘ3ＹＸ5Ｘ6ＮＬＸ9Ａ    Ｘ11ＱＬＣＡＸ16ＩＸ18Ｘ19Ｘ20    ＥＤ
（式中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｔ及びＹから選択され；
Ｘ3は、Ｈ及びＶから選択され；
Ｘ5は、Ｆ、Ｉ及びＬから選択され；
Ｘ6は、Ｐ及びＴから選択され；
Ｘ9は、Ｎ及びＴから選択され；
Ｘ11は、Ｄ及びＨから選択され；
Ｘ16は、Ｆ及びＩから選択され；
Ｘ18は、Ｎ、Ｑ及びＲから選択され；
Ｘ19は、Ｋ及びＳから選択され；そして
Ｘ20は、Ｆ、Ｉ、Ｌ及びＲから選択される）
並びに、
ｉｉ）ｉ）で定義された配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２４０】
２．ＢＭ１における配列ｉ）が、以下のアミノ酸配列、
ＥＸ2Ｘ3ＹＸ5Ｘ6ＮＬＸ9Ａ    Ｘ11ＱＬＣＡＦＩＸ18Ｘ19Ｌ    ＥＤ
（式中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｒ及びＹから選択され；
Ｘ3は、Ｈ及びＶから選択され；
Ｘ5は、Ｆ、Ｉ及びＬから選択され；
Ｘ6は、Ｐ及びＴから選択され；
Ｘ9は、Ｎ及びＴから選択され；
Ｘ11は、Ｄ及びＨから選択され；
Ｘ18は、Ｎ、Ｑ及びＲから選択され；そして
Ｘ19は、Ｋ及びＳから選択される）
からなる、項目１に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２４１】
３．互いに独立して、Ｘ2が、Ｉ、Ｑ、Ｒ及びＹからさらに選択され；そしてＸ5が、Ｆ及びＬからさらに選択される、項目２に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２４２】
４．Ｘ2が、Ｉ、Ｍ及びＲからさらに選択される、項目２に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２４３】
５．ＢＭ２における配列ｉ）が、以下のアミノ酸配列、
ＥＸ2ＶＹＸ5ＰＮＬＸ9Ａ    Ｘ11ＱＬＣＡＸ16ＩＸ18Ｘ19Ｘ20    ＥＤ
（式中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｒ及びＴから選択され；
Ｘ5は、Ｆ及びＬから選択され；
Ｘ9は、Ｎ及びＴから選択され；
Ｘ11は、Ｄ及びＨから選択され；
Ｘ16は、Ｆ及びＩから選択され；
Ｘ18は、Ｎ、Ｑ及びＲから選択され；
Ｘ19は、Ｋ及びＳから選択され；そして
Ｘ20は、Ｆ、Ｉ、Ｌ及びＲから選択される）
からなる、項目１から４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２４４】
６．互いに独立して、Ｘ2が、Ｒ及びＴからさらに選択され；そしてＸ5がＬである、項目５に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２４５】
７．互いに独立して、Ｘ2が、Ｉ、Ｍ、Ｑ及びＲからさらに選択され；Ｘ16が、Ｆであり；そしてＸ20が、Ｌである、項目５に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２４６】
８．前記第１及び第２の部分の少なくとも１つが、以下のアミノ酸配列、
ＸAＧＸB−［ＢＭ］
（式中、ＢＭは、項目１〜７のいずれか１つで定義されたＢＭ１又はＢＭ２であり、そして、互いに独立して、
ＸAは、Ａ及びＳから選択され；そして
ＸBは、Ｇ及びＲから選択される）
を含む、項目１から７のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２４７】
９．第１及び第２の部分の少なくとも１つが、以下、
ｉｉｉ）［ＢＭ］−ＤＸaＳＱＸbＸcＸdＬＬＸe    ＥＡＫＫＬＸfＸgＸhＱＡ    ＰＸi
（式中、ＢＭは、項目１〜７のいずれか１つで定義されたＢＭ１又はＢＭ２であり、そして、互いに独立して、
Ｘaは、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘcは、Ａ及びＳから選択され；
Ｘdは、Ｋ、Ｎ及びＥから選択され；
Ｘeは、Ａ、Ｓ及びＣから選択され；
Ｘfは、Ｅ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘgは、Ｄ、Ｅ及びＳから選択され；
Ｘhは、Ａ及びＳから選択され；そして
Ｘiは、アミノ酸なし、Ａ及びＫから選択される）
並びに
ｉｖ）ｉｉｉ）で定義された配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される結合モジュールアミノ酸配列、Ｂｍｏｄを含む、項目１〜７のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２４８】
１０．配列ｉｉｉ）が以下のアミノ酸配列、
［ＢＭ］−ＤＸaＳＱＸbＡＸdＬＬＡ    ＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡ    ＰＸi
（式中、ＢＭは、項目１〜７のいずれか１つで定義されたＢＭ１又はＢＭ２であり、そして、互いに独立して、
Ｘaは、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ、Ｑ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘdは、Ｋ及びＮから選択され；そして
Ｘiは、アミノ酸なし、Ａ及びＫから選択される）
からなる、項目９に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２４９】
１１．配列ｉｉｉ）が以下、
［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＰＳＱＱＡＫＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＲＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＱＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＱＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＲＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
［ＢＭ］−ＤＲＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；及び
［ＢＭ］−ＤＲＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ、
から選択されるアミノ酸配列からなる、項目１０に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２５０】
１２．前記第１の部分が、配列ｉｉｉ）が以下、
［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
［ＢＭ１］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＱＡＫＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；及び
［ＢＭ１］−ＤＲＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ、
から選択されるアミノ酸配列である、Ｂｍｏｄを含む、項目１０に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２５１】
１３．前記第２の部分が、配列ｉｉｉ）が以下、
［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＱＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＱＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
［ＢＭ２］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；及び
［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ、
から選択されるアミノ酸配列である、Ｂｍｏｄを含む、項目１０に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２５２】
１４．第１及び第２の部分の少なくとも１つが、以下のアミノ酸配列、
ＸAＧＸB−［ＢＭｏｄ］
（式中、ＢＭｏｄは項目９〜１３のいずれか１つで定義したとおりであり、そして、互いに独立して、
ＸAは、Ａ及びＳから選択され；そして
ＸBは、Ｇ及びＲから選択される）
を含む、項目８〜１３のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２５３】
１５．前記第１及び第２の部分の少なくとも１つが、以下、
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＱＡＫＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＲＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＱＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＱＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＲＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＳＧＧ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＲＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；及び
ＡＧＲ−［ＢＭ］−ＤＲＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２５４】
１６．前記第１の部分が、以下、
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＲ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＱＡＫＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＧ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＡ；
ＡＧＲ−［ＢＭ１］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；
ＡＧＲ−［ＢＭ１］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ；及び
ＡＧＲ−［ＢＭ１］−ＤＲＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２５５】
１７．前記第２の部分が、以下、
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＱＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＱＳＱＱＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＧ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＳＧＧ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＲ−［ＢＭ２］−ＤＲＳＱＲＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＧＧ−［ＢＭ２］−ＤＳＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；及び
ＡＧＧ−［ＢＭ２］−ＤＰＳＱＮＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２５６】
１８．前記リンカーが、前記第１の部分と前記第２の部分との間に配置される、項目１〜１７のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２５７】
１９．前記リンカーが、グリシン、セリン及びスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む柔軟性リンカーである、項目１８に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２５８】
２０．前記リンカーが以下、
（ＧnＳm）p及び（ＳnＧm）p、
（式中、独立して、
ｎ＝１〜７、
ｍ＝０〜７、
ｎ＋ｍ≦８、そして
ｐ＝１〜１０である）
から選択される一般式を有する、項目１９に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２５９】
２１．ｎ＝１〜５である、項目２０に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２６０】
２２．ｍ＝０〜５である、項目２０〜２１のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２６１】
２３．ｐ＝１〜５である、項目２０〜２２のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２６２】
２４．ｎ＝４、ｍ＝１及びｐ＝２〜３である、項目２０〜２３のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２６３】
２５．前記リンカーが、（Ｓ4Ｇ）2及び（Ｓ4Ｇ）3から選択される、項目２４に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２６４】
２６．前記リンカーが（Ｓ4Ｇ）2である、項目２５に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２６５】
２７．前記リンカーが（Ｓ4Ｇ）3である、項目２５に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２６６】
２８．前記リンカーが、以下、ＶＥＶＤＮＫＦＮＫＥＭＡＳ、ＶＤＮＫＦＮＫＥＭＡＳ、ＶＥＶＤＮＫＦＮＫＥ、ＶＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＥＡＫＹＡＫＥ、ＡＤＮＮＦＮＫ、ＡＤＮＫＦＮＫ、ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ、ＡＱＨＤＥ、ＶＤＮＫＦＮＫ、ＡＥＡＫＹＡＫ、ＶＤＡＫＹＡＫ、ＡＤＡＫＹＡＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２６７】
２９．前記リンカーが、前記リンカーのＮ−又はＣ−末端に１〜５個の付加的なアミノ酸残基、例えば１〜４個の付加的なアミノ酸残基、例えば１〜３個の付加的なアミノ酸残基、例えば３個の付加的なアミノ酸残基をさらに含む、項目２０〜２８のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２６８】
３０．前記付加的なアミノ酸残基が、ＡＳ、ＭＡＳ及びＲＡＳからなる群から選択される、項目２９に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２６９】
３１．項目１２で定義された第１の部分及び項目１３で定義された第２の部分を含む、項目１から３０のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２７０】
３２．項目１６で定義された第１の部分及び項目１７で定義された第２の部分を含む、項目１から３１のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２７１】
３３．項目１から３２のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、そして
−ＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２７２】
３４．項目３３に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、そして
−ＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２７３】
３５．項目３４に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、そして
−ＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜８５に、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２７４】
３６．項目３５に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号１８、７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、そして
−ＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号７０及び９５におけるアミノ酸残基６４〜８５のいずれか１つに、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜９０に対応する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２７５】
３７．項目３６に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−ＢＭ１の配列ｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基４〜２５に対応し、そして
−ＢＭ２の配列ｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基６４〜８５に対応する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２７６】
３８．項目１から３７のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分が、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、そして
−第２の部分が、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２７７】
３９．項目３８に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、そして
−第２の部分が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２７８】
４０．項目３９に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分が、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、そして
−第２の部分が、配列番号２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２７９】
４１．項目４０に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分が、配列番号１８、７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基１〜２５を含み、そして
−第２の部分が、配列番号７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６１〜８５、又は配列番号１８におけるアミノ酸残基６６〜９０を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２８０】
４２．項目４１に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分が、配列番号９５におけるアミノ酸残基１〜２５を含み、そして
−第２の部分が、配列番号９５におけるアミノ酸残基６１〜８５を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２８１】
４３．項目９〜１４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、そして
−第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７に、又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２に対応する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２８２】
４４．項目４３に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、そして
−第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７、又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２に対応する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２８３】
４５．項目４４に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１８、２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、そして
−第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７、又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２に対応する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２８４】
４６．項目４５に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号１８、７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、そして
−第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号７０及び９５のいずれか１つにおけるアミノ酸残基６４〜１０７、又は、配列番号１８におけるアミノ酸残基６９〜１１２に対応する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２８５】
４７．項目４６に記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基４〜４７に対応し、そして
−第２の部分のＢｍｏｄにおける配列ｉｉｉ）が、配列番号９５におけるアミノ酸残基６４〜１０７に対応する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２８６】
４８．項目３３〜４７のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチドであって、
−第１の部分が、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つからのアミノ酸残基４〜２５、１〜２５、４〜４７又は１〜４７に対応するアミノ酸配列を含み；及び
−第２の部分が、配列番号１〜１７、１９〜１０６及び１１８〜５５３のいずれか１つからのアミノ酸残基６４〜８５、６１〜８５、６４〜１０７又は６１〜１０７に、あるいは配列番号１８からのアミノ酸残基６９〜９０、６６〜９０、６９〜１１２又は６６〜１１２に対応するアミノ酸配列を含み；
ここで、第１及び第２の部分のそれぞれに含まれる両方の前記アミノ酸配列が同じ配列番号に由来する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２８７】
４９．Ａβペプチド結合ポリペプチドであって、配列番号１〜１０６及び１１８〜５５３からなる群から選択されるアミノ酸配列；例えば、配列番号１、５、９、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２６、２８、３３、３５、３７、４０、４２、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５９、６０、６１、６２、６４、６５、７０、７２、７５、７８、８４、８９、９０、９５、９６、９７、１００、１０４及び１１８〜１５９からなる群から；例えば配列番号１８、２８、３５、４９、５０、５１、５５、５９、６４、６５、７０、７２、７８、８４、９５及び１１８〜１５９からなる群から、例えば配列番号１８、７０及び９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２８８】
５０．アミノ酸配列の配列番号９５を含む、項目４９に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２８９】
５１．相互作用のＫD値が、多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8Ｍ、例えば多くとも１×１０-9Ｍ、例えば多くとも１×１０-10Ｍであるように、Ａβペプチドに結合することができる、項目１から５０のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２９０】
５２．項目１から５１のいずれか１つに記載のポリペプチドのフラグメントを構成し、当該フラグメントがＡβペプチドに対する結合親和性を保持する、Ａβペプチド結合ポリペプチド。
【０２９１】
５３．Ｎ末端及びＣ末端の少なくとも一方に少なくとも１つの付加的なアミノ酸残基を含む、項目１から５２のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２９２】
５４．Ｎ末端及びＣ末端の両方に付加的なアミノ酸残基を含む、項目５３に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２９３】
５５．前記少なくとも１つの付加的なアミノ酸残基が、ポリペプチドの生成、精製、イン・ビボで又はイン・ビトロでの安定化、カップリングあるいは検出を改善し又は単純化する、項目５３〜５４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド。
【０２９４】
５６．以下、
−項目１から５５のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチドからなる第１の部位；及び
−所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第２の部位、
を含む、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０２９５】
５７．前記所望の生物学的活性が、治療活性である、項目５６に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０２９６】
５８．前記所望の生物学的活性が、結合活性である、項目５６又は５７に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０２９７】
５９．前記第２の部位の前記結合活性が、Ａβペプチドへの結合である、項目５８に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０２９８】
６０．前記結合活性が、融合タンパク質又はコンジュゲートのイン・ビボでの半減期を増大させるアルブミン結合活性である、項目５８に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０２９９】
６１．前記第２の部位が、例えばアミノ酸配列の配列番号１０７、配列番号１１７又はその誘導体を含む、レンサ球菌タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン又はその誘導体を含む、項目６０に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３００】
６２．前記結合活性が生物学的活性を遮断するように作用する、項目５８又は５９に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３０１】
６３．前記結合活性が生物学的活性を刺激するように作用する、項目５８又は５９に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３０２】
６４．前記結合活性が、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、ガンマ−セクレターゼ、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、補体因子Ｃ１ｓ、プレセニリン１、プレセニリン２、ニカストリン、アルファ−シヌクレイン及びＢｒｉからなる群から選択される標的への結合である、項目５８に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３０３】
６５．前記所望の生物学的活性が酵素活性である、項目５６に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３０４】
６６．第２の部位が治療的に活性なポリペプチドである、項目５７に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３０５】
６７．第２の部位が、ヒト内在性酵素、ホルモン、成長因子、ケモカイン、サイトカイン及びリンホカインからなる群から選択される、項目５６〜５７及び６５〜６６のいずれか１つに記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３０６】
６８．第２の部位が、抗体及びその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、項目５６〜５７及び６５〜６６のいずれか１つに記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３０７】
６９．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、（ｓｃＦｖ）2及びドメイン抗体からなる群から選択される、項目６８に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３０８】
７０．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、ガンマ−セクレターゼ、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、補体因子Ｃ１ｓ、プレセニリン１、プレセニリン２、ニカストリン、アルファ−シヌクレイン及びＢｒｉからなる群から選択される標的に対する親和性を有する、項目６８又は６９に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３０９】
７１．第２の部位が、脳脊髄液又は脳への融合タンパク質又はコンジュゲートの輸送を媒介し、例えばトランスフェリン、グレリン、インスリン及びレプチンからなる群から選択される、項目５６〜７０のいずれか１つに記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３１０】
７２．標識をさらに含む、項目１から７１のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３１１】
７３．前記標識が、蛍光色素及び金属、発色団色素、化学発光化合物及び生物発光タンパク質、酵素、放射性核種及び放射性粒子から選択される、項目７２に記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３１２】
７４．システイン残基のチオール基又はリシン残基のアミノ基を介してＡβペプチド結合ポリペプチドにコンジュゲートしたポリアミノポリカルボキシレートキレート剤によって提供されるキレート化環境を含む、項目１から７３のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【０３１３】
７５．項目１〜７１のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０３１４】
７６．項目７５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【０３１５】
７７．項目７６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０３１６】
７８．項目１〜７１のいずれか１つに記載のポリペプチドの産生方法であって、以下、
−前記発現ベクターからの前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で項目７７に記載の宿主細胞を培養し、そして
−前記ポリペプチドを単離すること、
を含む、方法。
【０３１７】
７９．項目１〜７４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体を含有する、組成物。
【０３１８】
８０．少なくとも１つの追加の活性薬剤をさらに含有する、項目７９に記載の組成物。
【０３１９】
８１．前記追加の活性薬剤が、以下、神経伝達物質分解の阻害剤、神経伝達物質、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害剤、抗ヒスタミン剤、抗ウイルス剤、アルファ−セクレターゼ活性化剤、ベータ−又はガンマ−セクレターゼの阻害剤、α−シヌクレイン凝集の阻害剤、タウ凝集の阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、酸化ストレスに対して有効な化合物、抗アポトーシス化合物、金属キレート剤、ＤＮＡ修復の阻害剤、例えばピレンゼピン及び代謝産物、Ａβを除去／枯渇させる細胞成分のための誘引剤、ピログルタミン酸化されたＡβ3~42を含むＮ−末端切断Ａβの阻害剤、抗炎症性分子、非定型抗精神病薬、例えばクロザピン、ジプラシドン、リスペリドン、アリピプラゾール及びオランザピン、コリンエステラーゼ阻害剤（ＣｈＥＩｓ）、例えばタクリン、リバスチグミン、ドネペジル及びガランタミン、Ｍ１アゴニスト及び任意のアミロイド又はタウ修飾薬（tau modifying drug）を含む他の薬剤及び栄養補助食品、例えばビタミンＢ１２、システイン、アセチルコリン前駆体、レシチン、コリン、イチョウ（Ginkgo biloba）、アセチル−Ｌ−カルニチン、イデベノン、プロペントフィリン、及びキサンチン誘導体からなる群から選択される、項目８０に記載の組成物。
【０３２０】
８２．前記追加の活性薬剤が、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害剤、抗ヒスタミン剤及び抗ウイルス剤からなる群から選択される、項目８１に記載の組成物。
【０３２１】
８３．経口、静脈内、腹腔内、皮下、くも膜下腔内（例えばオンマイヤリザーバーを介して）、肺内、経皮的、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下又は坐剤投与からなる群から選択される経路、例えば経口、くも膜下腔内（intrathechal）、静脈内及び鼻腔内投与からなる群から選択される経路を介した投与のための、項目１〜７４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、あるいは項目８０〜８２のいずれか１つに記載の組成物。
【０３２２】
８４．薬剤として、診断剤として、又は予後剤としての使用のための、項目１〜７４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、あるいは項目８０〜８２のいずれか１つに記載の組成物。
【０３２３】
８５．前記ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物が血液中のＡβペプチドの量を減少させることによる、項目８４に記載の薬剤としての使用のためのＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
【０３２４】
８６．前記ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物がＡβ単量体とＡβ凝集体との間の平衡を減速させ、停止し又は逆転させることによる、項目８４に記載の薬剤としての使用のためのＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
【０３２５】
８７．前記ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物がＡβ凝集体形成を予防し又は逆進させることによる、項目８４に記載の薬剤としての使用のためのＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
【０３２６】
８８．Ａβペプチド関連症状の治療、診断又は予後における項目８４〜８７のいずれか１つに記載の使用のためのＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物であって、Ａβペプチド関連症状は例としてアミロイドーシスからなる群から選択され、アミロイドーシスとは、続発性アミロイドーシス及び加齢に伴うアミロイドーシスを含む、アミロイドプラークの形成に関連する疾患及び障害の群を意味し、例としては、これらに限定されるものではないが、認知記憶能力の喪失を特徴とする神経障害又は状態、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、グアムパーキンソン認知症複合；並びに、アミロイド様タンパク質に基づくか、又は関連する他の疾患、例えば脳アミロイド血管症、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー１、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeld Jacob disease）、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、ＩＩ型糖尿病、及び老人性心アミロイドーシス；並びに、緑内障、黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症、及びベータアミロイド沈着による白内障を含む、様々な眼疾患等が挙げられる、ＡＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
【０３２７】
８９．Ａβペプチド関連症状がアルツハイマー病である、項目８８に記載の使用のためのＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
【０３２８】
９０．試料中のＡβペプチドの検出方法であって、以下、
−Ａβペプチドを含むことが疑われる試料を提供し、
−前記試料を、項目１〜７４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、あるいは項目８０〜８２のいずれか１つに記載の組成物と、接触させ、そして
−Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の結合を検出すること、
を含み、
ここで、結合の検出が試料中のＡβペプチドの存在を示す、方法。
【０３２９】
９１．対象におけるＡβペプチドの存在を決定するための方法であって、以下のステップ：
−対象、又は対象から単離された試料を、項目１〜７４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、あるいは項目８０〜８２のいずれか１つに記載の組成物と接触させ、そして
−前記対象又は前記試料に結合した、Ａβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の量に対応する値を得ること、
を含む、方法。
【０３３０】
９２．前記値を参照と比較するステップをさらに含む、項目９１に記載の方法。
【０３３１】
９３．前記対象が哺乳動物対象、例えばヒト対象である、項目９１又は９２に記載の方法。
【０３３２】
９４．前記試料が生体液試料、例えば全血試料、血漿試料及び血清試料からなる群から選択される試料である、項目９１〜９３のいずれか１つに記載の方法。
【０３３３】
９５．前記試料が組織試料である、項目９１〜９４のいずれか１つに記載の方法。
【０３３４】
９６．イン・ビボで行われる、項目９１〜９５のいずれか１つに記載の方法。
【０３３５】
９７．イン・ビトロで行われる、項目９１〜９５のいずれか１つに記載の方法。
【０３３６】
９８．Ａβペプチド関連症状の治療方法であって、項目１〜７４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、あるいは項目８０〜８２のいずれか１つに記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【０３３７】
９９．前記Ａβペプチド関連症状がアミロイドーシスからなる群から選択され、アミロイドーシスとは、続発性アミロイドーシス及び加齢に伴うアミロイドーシスを含む、アミロイドプラークの形成に関連する疾患及び障害の群を意味し、例としては、これらに限定されるものではないが、認知記憶能力の喪失を特徴とする神経障害又は状態、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、グアムパーキンソン認知症複合；並びに、アミロイド様タンパク質に基づくか、又は関連する他の疾患、例えば脳アミロイド血管症、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー１、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeld Jacob disease）、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、ＩＩ型糖尿病、及び老人性心アミロイドーシス；並びに、緑内障、黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症、及びベータアミロイド沈着による白内障を含む、様々な眼疾患等が挙げられる、項目９８に記載の方法。
【０３３８】
１００．前記Ａβペプチド関連症状がアルツハイマー病である、項目９９に記載の方法。
【０３３９】
１０１．項目１〜７４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートを含む、親和性マトリックス。
【０３４０】
１０２．試料中の他の成分からの試料中に存在するＡβペプチドの分離方法であって、項目１〜７４のいずれか１つに記載のＡβペプチド結合ポリペプチドが使用される、親和性分離ステップを含む、方法。
【０３４１】
１０３．項目１０２に記載の方法であって、以下のステップ：
−親和性マトリックスへのＡβペプチドの結合を許容する条件下で、項目１０１に記載の親和性マトリックスに試料を適用し；
−親和性マトリックスに結合していない物質の除去のために親和性マトリックスを洗浄し；そして
−親和性マトリックスから結合Ａβペプチドを溶出させ、したがって富化Ａβペプチド含量を有するＡβペプチド画分を得て；そして
−前記Ａβペプチド画分を回収すること、
を含む、方法。
【０３４２】
１０４．項目１０２に記載の方法であって、以下のステップ：
−親和性マトリックスへのＡβペプチドの結合を許容する条件下で、項目１０１に記載の親和性マトリックスに試料を適用し；
−親和性マトリックスに結合していない物質の回収のために親和性マトリックスを洗浄し、したがって実質的に減少したＡβペプチド含量を有する枯渇画分を得て；そして
−前記枯渇画分を回収すること、
を含む、方法。
【０３４３】
１０５．ヒトの体液の一部分におけるＡβペプチドの含量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
−ヒト由来の体液の一部分を提供し；
−体液の一部分を項目１０１に記載の親和性マトリックスに、親和性マトリックスへのＡβペプチドの結合を許容する条件下で適用し、それによって体液の一部分におけるＡβペプチドの含量の減少を引き起こし；そして
−当該ヒトに、体液の当該一部分の少なくとも一部を戻すこと、
を含む、方法。
【０３４４】
１０６．前記体液が全血である、項目１０５に記載の方法。
【０３４５】
１０７．前記体液が血漿である、項目１０５に記載の方法。
【０３４６】
１０８．前記体液が血清である、項目１０５に記載の方法。
【０３４７】
１０９．体液の前記試料が、Ａβペプチド関連症状を患っている対象から得られる、項目１０５〜１０８のいずれか１つに記載の方法であって、Ａβペプチド関連症状はアミロイドーシスからなる群から選択され、アミロイドーシスとは、続発性アミロイドーシス及び加齢に伴うアミロイドーシスを含む、アミロイドプラークの形成に関連する疾患及び障害の群を意味し、例としては、これらに限定されるものではないが、認知記憶能力の喪失を特徴とする神経障害又は状態、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、グアムパーキンソン認知症複合；並びに、アミロイド様タンパク質に基づくか、又は関連する他の疾患、例えば脳アミロイド血管症、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー１、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeld Jacob disease）、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、ＩＩ型糖尿病、及び老人性心アミロイドーシス；並びに、緑内障、黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症、及びベータアミロイド沈着による白内障を含む、様々な眼疾患等が挙げられる、方法。
【図１−１】
2018513833.tif 000012
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図２】
2018513833.tif 000036
【図３Ａ】
2018513833.tif 000037
【図３Ｂ】
2018513833.tif 000038
【図４】
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【図５Ａ】
2018513833.tif 000040
【図５Ｂ】
2018513833.tif 000041
【図６】
2018513833.tif 000042
【図７】
2018513833.tif 000043
【図８】
2018513833.tif 000044
【図９】
2018513833.tif 000045
【図１０】
2018513833.tif 000046
【図１１】
2018513833.tif 000047
【図１２Ａ】
2018513833.tif 000048
【図１２Ｂ】
2018513833.tif 000049
【図１３】
2018513833.tif 000050
【図１４】
2018513833.tif 000051
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018513833.tif 000056
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