(57)【要約】例えば、再フォールディング条件を最適化することによって、ＩＬ−１０などのサイトカインの生産を増進する方法が、記述される。当該方法は、商業規模における、効率的で、費用効果の高い、ＩＬ−１０製造の手段を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
再フォールドされた、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を生成する方法であって、
（ａ）フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーを含む混合物を得ること、
（ｂ）前記混合物を、再フォールド緩衝液と接触させ、再フォールドされたＩＬ−１０モノマーを含む混和物を生産すること
を含み、ここで前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．０５ｇ／ｍＬから０．３ｇ／ｍＬである、前記方法。
【請求項２】
前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．１ｇ／ｍＬから０．２５ｇ／ｍＬである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．１ｇ／ｍＬから０．２ｇ／ｍＬである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項４】
前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、約０．１５ｇ／ｍＬである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−１０が、組み換えによって産生されたヒトＩＬ−１０（ｒｈＩＬ−１０）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６】
前記ｒｈＩＬ−１０が、細菌内で発現される、請求項５に記載の前記方法。
【請求項７】
前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項６に記載の前記方法。
【請求項８】
前記混合物が、ＩＬ−１０を含む多数の封入体と、懸濁緩衝液の組み合わせによって生産される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項９】
酸化還元系を、前記再フォールド緩衝液へ添加することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１０】
前記酸化還元系が、酸化された及び還元されたグルタチオンを含む、請求項９に記載の前記方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの、天然由来のまたは非天然由来のアミノ酸が、前記再フォールド緩衝液に添加される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１２】
０．００５から０．３Ｍのアルギニンが、前記再フォールド緩衝液に添加される、請求項１１記載の前記方法。
【請求項１３】
０．００７５から０．２５Ｍのアルギニンが、前記再フォールド緩衝液に添加される、請求項１１に記載の前記方法。
【請求項１４】
０．０５Ｍから０．２Ｍのアルギニンが、前記再フォールド緩衝液に添加される、請求項１２に記載の前記方法。
【請求項１５】
０．０１Ｍから０．１５Ｍのアルギニンが、前記再フォールド緩衝液に添加される、請求項１３に記載の前記方法。
【請求項１６】
約０．１Ｍのアルギニン及び約０．１５ｇ／ｍＬのフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーが、前記再フォールド緩衝液に添加される、請求項１４に記載の前記方法。
【請求項１７】
洗浄浄化が、ステップ（ｂ）の前に、前記混合物に対して実施される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１８】
限外ろ過／透析（ＵＦＤＦ）が、前記混和物に対して実行される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１９】
前記再フォールド緩衝液のｐＨが、約８．３である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２０】
ＩＬ−１０再フォールド緩衝液であって、
（ａ）０．０５ｇ／ｍＬから０．３ｇ／ｍＬの濃度で、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーを含む混合物、および
（ｂ）モル数が、０．００５から０．３Ｍのアルギニン
を含む、前記再フォールド緩衝液。
【請求項２１】
フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．０５ｇ／ｍＬから０．２５ｇ／ｍＬである、請求項２０に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項２２】
フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．１ｇ／ｍＬから０．２ｇ／ｍＬである、請求項２０に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項２３】
フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、約０．１５ｇ／ｍＬである、請求項２０に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項２４】
前記ＩＬ−１０が、ｒｈＩＬ−１０である、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項２５】
前記ｒｈＩＬ−１０が、細菌内で発現される、請求項２４に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項２６】
前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項２５に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項２７】
前記フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーが、封入体の懸濁液から得られる、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項２８】
酸化還元系をさらに含む、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項２９】
前記酸化還元系が、酸化されたグルタチオン及び還元されたグルタチオンを含む、請求項２８に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項３０】
約０．４５ｍＭの酸化されたグルタチオン、及び約０．０５ｍＭの還元されたグルタチオンを含む、請求項２９に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項３１】
０．００７５から０．２５Ｍのアルギニンを含む、請求項２０に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項３２】
０．０５から０．２Ｍのアルギニンを含む、請求項３１に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項３３】
０．０１から０．１５Ｍのアルギニンを含む、請求項３２に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項３４】
約０．１Ｍのアルギニン、及び約０．１５ｇ／ｍＬのフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーを含む、請求項３３に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項３５】
前記混合物が、ＩＬ−１０を含む封入体の懸濁液の洗浄浄化から得られる、請求項２０〜３４のいずれか１項に記載の前記再フォールド緩衝液。
【請求項３６】
前記再フォールド緩衝液のｐＨが、約８．３である、請求項２０〜３５のいずれか１項に記載の前記再フォールド緩衝液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月２３日登録の、米国特許出願番号６２／０９６，３５９の優先利益を主張し、その全体を参照として、本明細書に組み入れる。
【０００２】
本開示は、タンパク質再フォールディングの最適化を含む、サイトカインの大規模生産を増進する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
組み換え生産は、治療及び研究目的に対応した相当量の対象タンパク質を生成するために、非常に重要になっている。通常利用されるタンパク質発現システムには、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ）、バキュロウイルス／昆虫（例えば、Ｓｆ９及びＳｆ２１）、及び哺乳類細胞を含む。細菌利用のタンパク質発現システムは、細菌は、培養が簡単である、成長が速い、及び組み換えタンパク質を高い収量で産生する点で、有利である。しかしながら、いくつかのタンパク質は、封入体となって不溶性になるため、過酷な変成及びその後の煩雑なタンパク質の再フォールディング手順を経ずに回収することが、しばしば困難である。
【０００４】
当該組み換えタンパク質生産工程において、培養条件、シャペロンの共発現などのパラメーター、及びフォールディング促進剤の使用は、その工程に極めて頻繁に持ち込まれる。特に、フォールディング促進剤の利用は、機能的な組み換えタンパク質の生産において、有益な手段となっている。残念ながら、封入体からタンパク質を回収するために利用する技術は、対象となる各タンパク質それぞれに対して、同定され及び最適化される必要がある［Ｆａｈｎｅｒｔ，Ｂ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８２４（“Ｕｓｉｎｇ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”（２０１２））を参照］。
【０００５】
一般に普及している再フォールディング技術には、基質支援再フォールディング、希釈再フォールディング、加圧駆動再フォールディング、及び連続再フォールディングを含む。特定のタンパク質に対しては、実験室において最適化された再フォールディング技術及び条件（例えば、基質支援再フォールディング工程でのヒスチジン−タグ化蛋白質の使用）が、大規模生産に対しては、例えば、そのコスト及び複雑性などのために、有用ではない可能性がある［Ｓｅｅ  Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｋａａｒ，Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ”（２００６））を参照］。タンパク質を効率よく、費用効果の高い方法で生産できなければ、有効な治療薬ではあっても、市場には決して出ないという結果になる。大規模生産において、封入体からタンパク質を回収することも含み、治療用タンパク質の収量を高めることの重要性は非常に高いので、この生産工程におけるキーパラメーターの最適化は、極めて有益である。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、例えば、再フォールディング条件を最適化することによって、ＩＬ−１０及び関連ＩＬ−１０物質などのサイトカインの生産を増進する方法を企図する。当該方法は、商業生産規模でＩＬ−１０を製造する、効率的で費用効果の高い方法を提供する。そのような最適に生産されたＩＬ−１０は、改変されて良く（例えば、ペグ化）、及び様々な疾患、障害及び症状、及び／またはそれら兆候の、治療及び／または予防のための組成物中に使用されて良い。
【０００７】
最も基本的なレベルで、タンパク質は、細胞機能の要求に基づいて合成され、及び制御される。ＤＮＡは、タンパク質の「ｂｌｕｅｐｒｉｎｔｓ（設計図）」を含み、及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の産生に対応して、高度に制御された転写プロセスによって解読される。ｍＲＮＡにコードされたメッセージは次いで、ポリペプチド鎖に翻訳される。翻訳後、ポリペプチドは、それらの構造を完成させ、それらの位置を決め、または細胞内でのそれらの活性を制御するために、多様な方法で修飾される。そのような転写後修飾の例示には、シャペロンタンパク質の助けを借りて、球状タンパク質へ巻き戻すポリペプチド、存在するアミノ酸の修飾（例えば、第１メチオニン残基の除去）、及びジスルフィド架橋の形成または還元を含む。
【０００８】
複数の機構が、例えば、治療及び研究目的に対応した相当量の対象タンパク質を生成するために利用されて良い。化学タンパク質合成（例えば、固相タンパク質合成（ＳＰＰＳ））は、高い純度のタンパク質を生産するが、しかし小さなタンパク質及びペプチドのみに適している。化学合成の収量は、一般に低く、及びその方法は、長鎖のポリペプチドに対しては、極めて高価である。
【０００９】
インビトロ（無細胞）のタンパク質発現、及びインビボのタンパク質発現においては、タンパク質生成の方法は互換的に与えられる。無細胞タンパク質発現は、細胞全体の翻訳−相溶抽出液を使用した、タンパク質のインビトロ合成である。補助因子、ヌクレオチド、及び特定遺伝子のテンプレートの補給を受けた場合、それらの抽出液は、数時間で、対象となるタンパク質を合成できる。大規模生産に対応した持続性はないが、無細胞タンパク質発現システムは、不便な細胞培養の必要が無く、組み換えタンパク質の迅速合成を可能にする。
【００１０】
細胞依存システムが、タンパク質生産に一般的に使用されるが、対象となるタンパク質を高い収量で生み出す、細胞の能力に大いに依存する。組み換えタンパク質の発現に対する古典的な戦略は、そのテンプレートを含む、ＤＮＡベクターを伴う細胞の形質転換、次いで細胞が、目的のタンパク質を転写及び翻訳するように、その細胞の培養を取り入れる。通常は、次いでその細胞が溶解され、その後の精製に対応して発現タンパク質が抽出される。
【００１１】
インビボのタンパク質発現システムにおいては、原核生物及び真核細胞の両方が、広く使用されている。当該システムの選択は、タンパク質の種類、機能活性及び目的の収量に依存する。原核生物細菌であるＥ．ｃｏｌｉは、その急速な成長、低生産コスト及び高い生産収量のために、タンパク質発現に最も頻繁に利用される宿主である。しばしば、タンパク質は、不溶性の封入体を蓄積させ、その後に、生物活性を達成するために再フォールディングが必要になる。誤ったフォールディング及び凝集の結果もたらされる、再フォールディングは、多数のタンパク質の生産においては、その収量を制約するステップである。Ｅ．ｃｏｌｉから誘導されるタンパク質は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の共有結合による再フォールディングの後、さらに修飾されることがある。
【００１２】
本開示は、大規模（例えば、商業規模）でのＩＬ−１０生産を最適化する手段と、部分的に関連する。本開示の１つの態様は、ＩＬ−１０の再フォールディングは、容積に依存してはいない（従来から報告されてきたように）が、むしろＩＬ−１０の濃度に依存していることを見出したことに由来している。ＧＭＰ生産において、再フォールドにおけるＩＬ−１０濃度を、０．７ｍｇ／ｍＬから約０．３ｍｇ／ｍＬに減らす事で、ＩＬ−１０収量が倍増するのが観察された。
【００１３】
いくつかの実施形態において、その再フォールド緩衝液内のフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度は、約０．０１ｇ／ｍＬから約０．５ｇ／ｍＬ、約０．０２ｇ／ｍＬから約０．４５ｇ／ｍＬ、約０．０３ｇ／ｍＬから約０．４ｇ／ｍＬ、約０．０４ｇ／ｍＬから約０．３５ｇ／ｍＬ、約０．０５ｇ／ｍＬから約０．３ｇ／ｍＬ、約０．０６ｇ／ｍＬから約０．２５ｇ／ｍＬ、約０．０７ｇ／ｍＬから約０．２５ｇ／ｍＬ、約０．０８ｇ／ｍＬから約０．２ｇ／ｍＬ、約０．０９ｇ／ｍＬから約０．２ｇ／ｍＬ、約０．１ｇ／ｍＬから約０．２ｇ／ｍＬ、または約０．１５ｇ／ｍＬである。その他の実施形態において、その再フォールド緩衝液内のフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度は、０．０１ｇ／ｍＬを上回って、０．０２ｇ／ｍＬを上回って、０．０３ｇ／ｍＬを上回って、０．０４ｇ／ｍＬを上回って、０．０５ｇ／ｍＬを上回って、０．０６ｇ／ｍＬを上回って、０．０７ｇ／ｍＬを上回って、０．０８ｇ／ｍＬを上回って、０．０９ｇ／ｍＬを上回って、０．１ｇ／ｍＬを上回って、０．１５ｇ／ｍＬを上回って、０．２ｇ／ｍＬを上回って、０．２５ｇ／ｍＬを上回って、または０．３ｇ／ｍＬを上回っている。さらなる実施形態において、その再フォールド緩衝液内のフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度は、０．５ｇ／ｍＬ未満、０．４５ｇ／ｍＬ未満、０．４ｇ／ｍＬ未満、０．３５ｇ／ｍＬ未満、０．３ｇ／ｍＬ未満、０．２５ｇ／ｍＬ未満、０．２ｇ／ｍＬ未満、または０．１ｇ／ｍＬ未満である。実施例の節で記述されるように、再フォールドに最適なＩＬ−１０濃度が、約０．１５ｍｇ／ｍＬであると決定され、約０．１５ｍｇ／ｍＬを超えた濃度では、ＩＬ−１０凝集のために材料が失われ、及び不溶性の沈殿物になる。
【００１４】
本開示のその他の態様は、当該再フォールド工程に使用されるアルギニンの存在及び量に関する。再フォールドへのＬ−アルギニンの添加は、２倍以上多量の、適切に折り畳まれたＩＬ−１０を生み出した。アルギニンのこの濃度は、本開示の特定の態様において、アルギニンの０．０１Ｍ〜０．１Ｍの範囲である。実施例の節で記述されるように、限外ろ過／透析（ＵＦＤＦ）緩衝液（例えば、２０ｍＭのビス−トリス緩衝液のｐＨ６．５）内における、約０．１Ｍのアルギニンの存在が、有益であることが判明し、推定の２倍まで収量を増加させた。
【００１５】
いくつかの実施形態において、アルギニンの当該濃度は、約０．００１Ｍから約１．０Ｍの範囲、約０．００２Ｍから約０．９Ｍの範囲、約０．００３Ｍから約０．８Ｍの範囲、約０．００４Ｍから約０．７Ｍの範囲、約０．００５Ｍから約０．６Ｍの範囲、約０．００６Ｍから約０．５Ｍの範囲、約０．００７Ｍから約０．４Ｍの範囲、約０．００８Ｍから約０．３Ｍの範囲、約０．００９Ｍから約０．２Ｍの範囲、約０．０１Ｍから約０．１Ｍの範囲、約０．０２Ｍから約０．０９Ｍの範囲、約０．０３Ｍから約０．０８Ｍの範囲、約０．０４Ｍから約０．０７Ｍの範囲、または約０．０５Ｍから約０．０６Ｍの範囲である。その他の実施形態において、アルギニンの当該濃度は、約０．００１Ｍを上回って、約０．００２Ｍを上回って、約０．００３Ｍを上回って、約０．００４Ｍを上回って、約０．００５Ｍを上回って、約０．００６Ｍを上回って、約０．００７Ｍを上回って、約０．００８Ｍを上回って、約０．００９Ｍを上回って、約０．０１Ｍを上回って、約０．０２Ｍを上回って、約０．０３Ｍを上回って、約０．０４Ｍを上回って、約０．０５Ｍを上回って、約０．０６Ｍを上回って、約０．０７Ｍを上回って、約０．０８Ｍを上回って、約０．０９Ｍを上回って、約０．１Ｍを上回って、約０．１５Ｍを上回って、約０．２Ｍを上回って、約０．３Ｍを上回って、約０．４Ｍを上回って、または約０．５Ｍを上回っている。さらにその他の実施形態において、アルギニンの当該濃度は、約１．０未満、約０．９未満、約０．８未満、約０．７未満、約０．６未満、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、約０．１５未満、約０．１未満、約０．０９５未満、約０．０９未満、約０．０８未満、約０．０７未満、約０．０６未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、約０．０２未満、または約０．０１未満である。
【００１６】
総じて、本明細書に開示の方法は、最適なＩＬ−１０再フォールド条件を生み出し、ここでｒＨｕＩＬ−１０濃度は、０．０１から０．１Ｍの間のアルギニン濃度を伴い、０．０５から０．３ｍｇ／ｍＬの間である。実際に、当該再フォールド緩衝液及びＵＦＤＦ緩衝液内の０．１Ｍのアルギニンの存在は、ＩＬ−１０の再フォールドの及び回収された総量を、２倍から４倍まで増加させた。１つの実施形態において、最終的な再フォールド環境が、２０％のショ糖、０．１ＭのＬ−アルギニン、５０ｍＭのトリス緩衝液、０．４５ｍＭの酸化グルタチオン、及び０．０５ｍＭの還元グルタチオンの存在下で、ｐＨ８．３で最適に維持された。
【００１７】
特定の実施形態において、本開示は、ａ）フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーを含む混合物を得ること、及びｂ）その混合物を再フォールド緩衝液と接触させて、再フォールドされたＩＬ−１０を含む混合物を生み出すことを含んで、再フォールドされたＩＬ−１０の生成法を企図し、ここでそのフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．０５ｇ／ｍｌ〜０．３ｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、当該再フォールド緩衝液内のフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの当該濃度は、０．１ｇ／ｍＬから０．２５ｇ／ｍＬ、０．１ｇ／ｍＬから０．２ｇ／ｍＬ、または約０．１５ｇ／ｍＬである。当該ＩＬ−１０は、特定の実施形態において、組み換え的に産生されるヒトＩＬ−１０（ｒｈＩＬ−１０）である。このｒｈＩＬ−１０は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現され得る。いくつかの実施形態において、前述の混合物は、懸濁緩衝液を伴うＩＬ−１０を含む、多数の封入体を含んで製造される。追加の実施形態はさらに、酸化及び還元されたグルタチオンを含む酸化還元系などの、酸化還元系を、その再フォールド緩衝液に添加することを含む。
【００１８】
本開示は、少なくとも１つの天然由来のまたは非天然由来のアミノ酸を、当該再フォールド緩衝液に添加する実施形態を企図する。いくつかの実施形態において、当該アミノ酸は、アルギニンである。特定の実施形態において、０．００５から０．３Ｍのアルギニンが、当該再フォールド緩衝液に添加され、０．００７５から０．２５Ｍのアルギニンが、当該再フォールド緩衝液に添加され、０．００５Ｍから０．２Ｍのアルギニンが、当該再フォールド緩衝液に添加され、または０．００１Ｍから０．１５Ｍのアルギニンが、当該再フォールド緩衝液に添加される。追加の実施形態において、本開示は、約０．１Ｍのアルギニン及び約０．１５ｇ／ｍＬのフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの、当該再フォールド緩衝液への添加を企図する。
【００１９】
特定の実施形態において、再フォールドのＩＬ−１０を含む混合物を生み出すために、当該混合物を再フォールド緩衝液と接触させるステップの前に、前述の混合物を洗浄浄化することを企図する。本開示は、当該混合物の限外ろ過／透析（ＵＦＤＦ）を実施する実施形態を企図する。
【００２０】
本開示は、本明細書で説明される開示の実践につながる、再フォールド緩衝液の任意のｐＨ値を企図する。特定の実施形態において、当該ｐＨは、約７．５未満、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、または約８，９を上回って良い。特定の実施形態において、当該再フォールド緩衝液のｐＨは、約８．３である。
【００２１】
本開示はまた、（ａ）０．０５ｇ／ｍＬ〜０．３ｇ／ｍＬの濃度で、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマー含む混合物、及び（ｂ）０．００５から０．３Ｍモル量のアルギニンを含む、ＩＬ−１０再フォールド緩衝液を企図する。いくつかの実施形態において、当該再フォールド緩衝液には、０．００７５から０．２５Ｍのアルギニン、０．０５から０．２Ｍのアルギニン、または約０．０１から０．１５Ｍのアルギニンを含む。その他の可能なアルギニン濃度を、本明細書に開示する。
【００２２】
特定の実施形態において、当該フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーは、約０．００１ｇ／ｍＬから約１．０ｇ／ｍＬ、約０．００２５ｇ／ｍＬから約０．９ｇ／ｍＬ、約０．００５ｇ／ｍＬから約０．８ｇ／ｍＬ、約０．００７５ｇ／ｍＬから約０．７ｇ／ｍＬ、約０．０１ｇ／ｍＬから約０．６ｇ／ｍＬ、約０．０２ｇ／ｍＬから約０．５ｇ／ｍＬ、約０．０３ｇ／ｍＬから約０．４ｇ／ｍＬ、約０．０４ｇ／ｍＬから約０．３５ｇ／ｍＬ、または約０．０５ｇ／ｍＬから約０．３ｇ／ｍＬの濃度で存在する。そのうえさらなる実施形態において、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの当該濃度は、約０．０５ｇ／ｍＬから約０．２５ｇ／ｍＬ、約０．１ｇ／ｍＬから約０．２ｇ／ｍＬ、または約０．１５ｇ／ｍＬである。特定の実施形態において、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの当該濃度は、約０．０５ｇ／ｍＬから約０．２５ｇ／ｍＬ、約０．１ｇ／ｍＬから約０．２ｇ／ｍＬ、または約０．１５ｇ／ｍＬである。
【００２３】
本開示は、当該フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーが、約０．００１ｇ／ｍＬを上回った、約０．００２５ｇ／ｍＬを上回った、約０．００５ｇ／ｍＬを上回った、約０．００７５ｇ／ｍＬを上回った、約０．０１ｇ／ｍＬを上回った、約０．０２ｇ／ｍＬを上回った、約０．０３ｇ／ｍＬを上回った、約０．０４ｇ／ｍＬを上回った、または約０．０５ｇ／ｍＬを上回った濃度で存在する、実施形態を企図する。いくつかの態様において、当該フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーが、約１．０ｇ／ｍＬ未満、約０．９ｇ／ｍＬ未満、約０．８ｇ／ｍＬ未満、約０．７ｇ／ｍＬ未満、約０．６ｇ／ｍＬ未満、約０．５ｇ／ｍＬ未満、約０．４ｇ／ｍＬ未満、約０．３５ｇ／ｍＬ未満、約０．３ｇ／ｍＬ未満、約０．２５ｇ／ｍＬ未満、約０．２ｇ／ｍＬ未満、約０．１５ｇ／ｍＬ未満、または約０．１ｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する、実施形態を企図する。
【００２４】
特定の実施形態では、約０．１Ｍのアルギニン及び約０．１５ｇ／ｍＬのフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーを含む、再フォールド緩衝液を企図する。
【００２５】
さらに後述するように、ヒトＩＬ−１０は、ホモダイマーであり、及び各モノマーは、１７８のアミノ酸を含み、その第１８番目が、シグナルペプチドを含む。本開示の特定の実施形態は、そのシグナルペプチドを欠いた、成熟したヒトＩＬ−１０ポリペプチドを含む（例えば、米国特許第６，２１７，８５７を参照）。さらに特定の実施形態において、当該ＩＬ−１０物質は、成熟したヒトＩＬ−１０の変異体である。この変異体は、成熟したヒトＩＬ−１０の活性を下回る、相当する、または上回る活性を示して良く、特定の実施形態において、その活性は、成熟したヒトＩＬ−１０の活性に相当する、または上回る。
【００２６】
用語「ＩＬ−１０」、「ＩＬ−１０  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ｓ）（ＩＬ−１０ポリペプチド（複数可））」、「ａｇｅｎｔ（ｓ）（物質（複数可））」などは、幅広く解釈されることを意図しており、及び、例えば、同族体、変異体（突然変異タンパク質を含む）、及びそれらの断片を含む、ヒト及び非ヒトＩＬ−１０関連ポリペプチド、ならびに、例えば、リーダー配列（例えば、シグナルペプチド）を有するＩＬ−１０ポリペプチド、及び前述の修飾されたバージョンを含む。さらなる実施形態において、用語「ＩＬ−１０」、「ＩＬ−１０  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ｓ）（ＩＬ−１０ポリペプチド（複数可））」、「ａｇｅｎｔ（ｓ）（物質（複数可））」は、作動物質である。特定の実施形態は、ペグ化ＩＬ−１０に関して、本明細書ではまた、「ＰＥＧ−ＩＬ−１０」を指す。
【００２７】
本開示に記述されるＩＬ−１０物質は、修飾されたＩＬ−１０を形成する少なくとも１つの修飾を含んで良く、ここでその修飾は、そのＩＬ−１０物質のアミノ酸配列を変化させない。本開示の特定の実施形態は、１つ以上の特性（例えば、薬物動態パラメータ、薬効等）を増進するための修飾などを企図する。いくつかの実施形態において、その修飾されたＩＬ−１０物質は、ＰＥＧ−ＩＬ−１０物質である。当該ＰＥＧ−ＩＬ−１０物質は、少なくとも１つのＩＬ−１０の二次単位の、少なくとも１つのアミノ酸残基と共有結合した、少なくとも１つのＰＥＧ分子を含み、またはその他の実施形態において、モノ−ペグ化とジ−ペグ化の混合物を含んで良い。当該ＰＥＧ−ＩＬ−１０物質のＰＥＧ成分は、約５ｋＤＡを上回る、約１０ｋＤＡを上回る、約１５ｋＤＡを上回る、約２０ｋＤＡを上回る、約３０ｋＤＡを上回る、約４０ｋＤＡを上回る、または約５０ｋＤＡを上回る分子量を有して良い。いくつかの実施形態において、当該分子量は、約５ｋＤａから約１０ｋＤａ、約５ｋＤａから約１５ｋＤａ、約５ｋＤａから約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約１５ｋＤａ、約１０ｋＤａから約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約２５ｋＤａ、または約１０ｋＤａから約３０ｋＤａである。特定の実施形態において、前述の修飾は、部位特異であり、及びさらにその他の実施形態において、それは、リンカーを含む。
【００２８】
本開示は、前述の物質及び薬学的に許容される希釈剤、キャリアーまたは賦形剤の１つ以上の、薬学的な有効量を含む、医薬組成物を企図する。一般に、そのような組成物は、ヒトへの投与に適している。これらの医薬組成物は、１つ以上の予防または治療薬を含んで良く、それらの例示が、本明細書に記述される。
【００２９】
本開示はまた、ＩＬ−１０物質の治療に効果的な量の、その対象者への投与（例えば、皮下を含む非経口の）を含む、対象者（例えば、ヒト）におけるＩＬ−１０関連疾患、障害または症状を治療しまたは予防する方法を企図する。
【００３０】
本開示のその他の実施形態が、本明細書に記述されるが、一方でこの開示の検討後に、当業者によって、さらにその他の形態が想定されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示をさらに記述する前に、この開示が、本明細書で説明される特定の実施形態に限定されないことを理解され、及び本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記述する目的だけのためであり、限定を意図していないことを理解されたい。
【００３２】
値の範囲が与えられる場合、各中間に在る値、その文脈が明確に指示しない限り下限単位の１０倍まで、その範囲の上限と下限の間、及びその記載範囲において示された任意のその他の値または中間値が、本発明に包含される。これら小範囲の上限及び下限は、その小範囲に独立して含まれて良いし、及びまた本発明に包含され、その記載範囲における任意の特別な除外制限を受ける。その記載範囲が、限定の１つまたは両方を含んでいる場合、それらの包含された限定のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者による一般的な理解と同じ意味を有する。
【００３３】
本明細書及び付帯の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その文脈が明確に指示しない限り複数指示対象をも含むことに、留意する必要がある。本請求項は、いかなる任意要素をも除外するように起草されていることに留意されたい。このように、本明細書は、「ｓｏｌｅｌｙ（もっぱら）」、「ｏｎｌｙ（のみ）」及び請求項要素の記述に関連したものなどの、排他的な用語の使用、または「ｎｅｇａｔｉｖｅ（否定的）」限定の使用が、先行詞としての役割を果たすことを意図している。
【００３４】
本明細書で考察される出版物は、本出願の出願日前の開示に対して、もっぱら提供される。さらに、出版物の公開日は、実際の公開日と異なっている可能性があり、個別に確認する必要がある場合がある。
【００３５】
要旨
本開示は、タンパク質の再フォールディングの最適化を含む、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の大規模生産（例えば、商業規模）を増進する方法を企図する。このサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）は、がん及び免疫性の、炎症性の、及びウイルス関連の障害を含む、広い範囲の疾患、障害ならびに症状、及び／またはそれらの兆候の治療及び／または予防での使用が見出されている。
【００３６】
本明細書で説明される実施形態及び記述のいくつかは、ＩＬ−１０物質（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０物質）との関連で記述される。それが使用される状況が、適切に考慮される場合、ＩＬ−１０物質の記述は、サイトカイン物質に対するより、より広範囲に参照されて良い。
【００３７】
本開示のポリペプチド及び核酸分子が関連する「ｈｕｍａｎ（ヒト）」の任意の参照は、そのポリペプチドまたは核酸を取得する方法またはその供給源に対しての限定を意味せず、むしろ天然由来のヒトのポリペプチドまたは核酸分子の配列に対応する、配列のみに関連している。それらをコードするヒトのポリペプチド及び核酸分子に加えて、本開示は、その他の種からのＩＬ−１０関連ポリペプチド及び対応する核酸分子（ならびに、特定の例では、サイトカイン・ポリペプチド及び対応する核酸分子）を企図する。
【００３８】
定義
特に指示が無い限り、以下の用語は、以下に説明される意味を有することを意図している。その他の用語は、本明細書の全体を通してその他の場所で定められる。
【００３９】
用語「ｐａｔｉｅｎｔ（患者）」または「ｓｕｂｊｅｃｔ（対象者）」は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳類）を指して、互換的に使用される。
【００４０】
用語「ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（投与）」、「ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ（投与する）」などの、例えば、対象者、細胞、組織、臓器、または生体液への適用は、例えば、ＩＬ−１０またはＰＥＧ−ＩＬ−１０、核酸（例えば、天然のヒトＩＬ−１０をコードする核酸）、前述のものを含む薬学的に許容される組成物または診断用薬剤の、その対象者、細胞、組織、臓器、または生体液への接触を指す。細胞との関連において、投与は、その細胞への試薬の接触（例えば、インビトロまたは生体外）、同様にその液体が細胞と接触している場合、液体への試薬の接触を含む。
【００４１】
用語「ｔｒｅａｔ（治療する）」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療している）」、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」などは、疾患、障害、または症状、もしくはそれらの兆候が、診断され、観察された後で開始される、及び一時的であれ恒久的であれ、対象者を苦しめている疾患、障害、または症状の背後にある要因の少なくとも１つ、または対象者を苦しめている疾患、障害、または症状に関連する兆候の少なくとも１つを、排除、低減、抑制、軽減するためなどの、一連の行為（ＩＬ−１０またはＩＬ−１０を含む医薬組成物の投与など）を指す。したがって、治療には、活性疾患を阻害すること（例えば、病気、傷害または症状もしくは臨床兆候との関連の発達またはさらなる発達を阻止する）を含む。当該用語はまた、ＩＬ−１０またはＰＥＧ−ＩＬ−１０が、例えば、液相またはコロイダル相内のＩＬ−１０受容体に接触する場合の状況などの、その他の関連性において使用されて良い。
【００４２】
本明細書で使用する用語「ｉｎ  ｎｅｅｄ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療を必要として）」は、対象者が必要とする、または治療の恩恵を受けることができる医師またはその他の介護者によって行われる判断を指す。この判断は、その医師または介護者の専門知識の領域における、多様な要因に基づいて行われる。
【００４３】
用語「ｐｒｅｖｅｎｔ（予防する）」、「ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ（予防している）」、「ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（予防）」などは、疾患、障害、症状などを発達させるなどの、対象者のリスク（例えば、臨床兆候の欠乏によって決定されるなど）を、一時的であれ恒久的であれ、予防し、抑制し、阻害または低減するための、または一般的には特定の疾患、障害または症状を有する傾向がある対象者に関連して、それらの発症を遅らせる方法（例えば、疾患、障害、症状またはそれらの兆候の発症前に）で開始される、一連の行為（ＩＬ−１０またはＩＬ−１０を含む医薬組成物の投与など）を指す。特定の例示において、当該用語はまた、その疾患、障害または症状の進行を遅らせ、または有害な、さもなければ望ましくない状況へのそれらの進行を阻害することを指す。
【００４４】
本明細書で使用する用語「ｉｎ  ｎｅｅｄ  ｏｆ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（予防を必要として）」は、対象者が必要とする、または予防手当の恩恵を受けることができる医師またはその他の介護者によって行われる判断を指す。この判断は、その医師または介護者の専門知識の領域における、多様な要因に基づいて行われる。
【００４５】
語句「ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ（治療に効果的な量）」は、医薬組成物の単独または一部分のいずれかで、及び単一用量または連続用量の一部のいずれかで、任意に検出可能で、その対象者へ投与された場合の疾患、障害または症状の任意の兆候、容体、または特徴における、肯定的な効果を有することが可能な量での、対象者への物質の投与を指す。この治療に効果的な量は、関連する生理学的効果を測定することによって確認でき、及びその投薬計画ならびにその対象者の症状の診断分析などとの関連で、調整できる。例を挙げると、以下の投与によって産生される炎症性サイトカインの量の測定は、治療に効果的な量が使用されたかどうかを示すものであってもよい。
【００４６】
語句「ｉｎ  ａ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｍｏｕｎｔ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔ  ａ  ｃｈａｎｇｅ（変化をもたらすのに十分な量で）」は、特定治療の投与前（例えば、基準レベル）と後で測定された指標レベルの間に、検出可能な差異があることを意味する。指標には、任意の客観的なパラメーター（例えば、ＩＬ−１０の血清濃度）、または主観的なパラメーター（例えば、良好であるとの対象者の感覚）を含む。
【００４７】
用語「ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（小分子）」は、１０ｋＤａ未満の、２ｋＤａ未満の、または１ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を指す。小分子には、非限定的に、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、及び合成分子を含む。治療上、小分子は、大分子に比べて、細胞への浸透性がより高く、分解の影響を受けにくく、及び免疫応答を誘発する可能性が低い。
【００４８】
用語「ｌｉｇａｎｄ（配位子）」は、例えば、受容体の作動物質または拮抗物質として作用できる、ペプチド、ポリペプチド、膜関連または膜結合分子、もしくはそれらの複合体を指す。「ｌｉｇａｎｄ（配位子）」は、天然及び合成の配位子、例えば、サイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、突然変異タンパク質、及び抗体から誘導される結合成分を包含する。「ｌｉｇａｎｄ（配位子）」はまた、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣薬、及び抗体のペプチド模倣薬を包含する。この用語はまた、作動物質もしくは拮抗物質でもなく、その生物学的特性（例えば、シグナル伝達性または接着性）に著しい影響を与えずに、受容体と結合できる物質を包含する。さらに、当該用語は、例えば、化学的にまたは組換えによる方法で、その膜結合配位子の可溶性版へと変化させ得る、膜結合配位子を含む。配位子または受容体は、完全に細胞内にあって良く、すなわち、細胞質ゾル、核、またはその他の細胞内コンパートメントに存在して良い。配位子と受容体の複合体は、「ｌｉｇａｎｄ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ（配位子−受容体複合体）」と呼ばれる。
【００４９】
用語「ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（阻害剤）」及び「ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ（拮抗物質）」、または「ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ（活性剤）」ならびに「ａｇｏｎｉｓｔｓ（作動物質）」は、例えば、配位子、受容体、補因子、遺伝子、細胞、組織、または臓器などの活性化に対応して、阻害化するまたは活性化する分子の各々を指す。阻害剤は、例えば、遺伝子、タンパク質、配位子、受容体、または細胞などを減らし、ブロックし、防ぎ、活性化を遅らせ、不活性化し、感度を下げ、または下方調整する分子である。活性剤は、例えば、遺伝子、タンパク質、配位子、受容体、または細胞などを増加させ、活性化し、促進させ、活性化を強化し、感度を上げ、または上方調整する分子である。阻害剤はまた、恒常活性を減らし、ブロックし、または不活性化する分子であると定義される。「ａｇｏｎｉｓｔｓ（作動物質）」は、その標的活性の増加を引き出しまたは促進するために、標的と相互作用する分子である。「ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ（拮抗物質）」は、作動物質の作用を押しとどめる分子である。拮抗物質は、作動物質の活性を予防し、減らし、阻害し、または中和し、及び拮抗物質はまた、たとえ該当する作動物質がなくとも、標的の、例えば、標的受容体の恒常活性を予防し、阻害し、または減らすことができる。
【００５０】
用語「ｍｏｄｕｌａｔｅ（調節する）」、「ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ（調節）」などは、物質（例えば、ＩＬ−１０物質）（またはそれらをコードする核酸分子）の官能性または活性を、直接的または間接的のいずれかで、増加させるもしくは減少させる分子（例えば、活性剤または阻害剤）の能力、または物質（例えば、ＩＬ−１０物質）の活性に匹敵する効果を生み出す分子の能力を、高めることを指す。用語「ｍｏｄｕｌａｔｏｒ（調節因子）」は、前述の活性に効果を及ぼし得る分子に対する、広い意味を指す。例を挙げると、遺伝子、受容体、配位子、または細胞などの分子は、遺伝子、受容体、配位子、または細胞の活性を変化させる分子であり、ここで活性は、その調節特性によって、活性化され、阻害され、または変化させられる。調節因子は、単独で作用して良く、または例えば、タンパク質、金属イオン、または小分子などの補因子を利用しても良い。用語「ｍｏｄｕｌａｔｏｒ（調節因子）」には、物質（例えば、ＩＬ−１０物質）（すなわち、それらへの類似体としてやり方で、物質（例えば、ＩＬ−１０物質）と同じシグナル伝達経路を調節する物質）と、同じ機構の作用を通して作動し、及び物質（例えば、ＩＬ−１０物質）の生体反応に匹敵する（またはより大きい）、生体反応を誘発することができる物質を含む。
【００５１】
調節因子の例示には、小分子化合物及びその他の生体有機分子を含む。小分子化合物の多数のライブラリー（例えば、組合せライブラリー）が、市販されており、及び調節因子を識別するための出発点として使用することができる。当業者は、そのような化合物ライブラリーが、望ましい特性を持つ１つ以上の化合物を、識別するために選別され得るような、１つ以上のアッセイ（例えば、生化学または細胞依存アッセイ）を開発でき、その後、専門の医薬品化学者が、例えば、それらの類似体及び誘導体を合成しならびに評価することによって、そのような１つ以上の化合物を最適化できる。合成及び／または分子モデリング研究がまた、活性剤の識別に利用可能である。
【００５２】
分子の「ａｃｔｉｖｉｔｙ（活性）」は、配位子へ、または受容体へ、触媒活性へ、遺伝子発現または細胞のシグナル伝達、分化、もしくは成熟を刺激する能力へ、抗原活性へ、その他の分子の活性調節などへ、分子を結合することを記述しまたはそれらを指してよい。当該用語はまた、細胞と細胞の相互作用（例えば、接着）を調節しまたは維持する活性、もしくは細胞の構造（例えば、細胞膜）を維持する活性を指して良い。「Ａｃｔｉｖｉｔｙ（活性）」はまた、特定の活性、例えば［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、生体コンパートメントにおける濃度などを意味することができる。用語「ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ（増殖活性）」は、例えば、正常な細胞分裂、同様にがん、腫瘍、異形成、細胞の形質転換、転移、及び血管新生などを促進し、それらに対して不可欠であり、またはそれらと特に関連する活性を包含する。
【００５３】
本明細書で使用する、「ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ（匹敵する）」、「ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ（匹敵する活性）」、「ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｔｏ（に匹敵する活性）」、「ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｅｆｆｅｃｔ（匹敵する効果）」、「ｅｆｆｅｃｔ  ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｔｏ（に匹敵する効果）」などは、定量的及び／または定性的と見なすことができる相対的用語である。当該用語の意味は、それらが使用される状況に、たびたび依存する。例を挙げると、両者が受容体を活性化する２つの物質は、定性的な見方からは、匹敵する効果を有するとみなされるが、しかし、仮に１つの物質が、当技術分野で認知されたアッセイ（例えば、用量−応答アッセイ）または当技術分野で認知された動物試験において決定される、その他の物質の活性の２０％しか達成できない場合、定量的な見方からは、その２つの物質は、匹敵する効果を欠いている、とみることができる。１つの結果を他の結果と比較する場合（例えば、１つの結果を参照標準と比較）、「ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ（匹敵する）」は、しばしば１つの結果が、参照標準から３５％未満で、３０％未満で、２５％未満で、２０％未満で、１５％未満で、１０％未満で、７％未満で、５％未満で、４％未満で、３％未満で、２％未満で、または１％未満で逸脱することを意味する。特定の実施形態において、１つの結果は、仮にそれが、参照標準から１５％未満で、１０％未満で、または５％未満で逸脱する場合、参照標準に匹敵する。例を挙げると、非限定的に、当該活性または効果は、有効性、安定性、溶解性、または免疫原性を指して良い。
【００５４】
用語の、例えば、細胞、組織、臓器、または有機体の「ｒｅｓｐｏｎｓｅ（応答）」は、生化学的または生理的挙動、例えば、濃度、密度、接着、または生物コンパートメント内の移行、遺伝子発現率、もしくは分化の状態における変化を包含し、ここでその変化は、活性化、刺激、または治療、もしくは遺伝的プログラミングなどの内部メカニズムと相関関係がある。特定の文脈において、用語「ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（活性化）」、「ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（刺激）」などは、内部メカニズム、ならびに外部のまたは環境要因によって制御される細胞の活性化を指し、一方で用語「ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（阻害）」、「ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（下方制御）」などは、その反対の効果を指す。
【００５５】
本明細書で互換的に使用する用語「ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ポリペプチド）」、「ｐｅｐｔｉｄｅ（ペプチド）」、及び「ｐｒｏｔｅｉｎ（タンパク質）」は、任意鎖長のアミノ酸のポリマー形態を指し、遺伝子的にコード化された及び非遺伝子的にコード化されたアミノ酸、化学的または生化学に修飾または誘導されたアミノ酸、及び修飾されたポリペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。当該用語は、非限定的に、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種及び相同のリーダー配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基の有無にかかわらない融合タンパク質、免疫的にタグ化されたタンパク質を有する融合タンパク質などを含む、融合タンパク質を含む。
【００５６】
この開示の全体を通して、１文字または３文字で表記されるアミノ酸が参照されることは理解されよう。読み手への便宜上、１文字及び３文字表記のアミノ酸を、以下に提供する。
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【００５７】
本明細書で使用する用語「ｖａｒｉａｎｔ（変異体）」は、天然由来の変異体及び非天然由来の変異体を包含する。天然由来の変異体には、同族体（アミノ酸またはヌクレオチド配列のそれぞれで、１種から他種へと異なる、ポリペプチド及び核酸）、及び対立変異体（アミノ酸ヌクレオチド配列のそれぞれで、種内の１固体から他個体へと異なる、ポリペプチドおよび核酸）を含む。非天然由来の変異体には、アミノ酸またはヌクレオチド配列のそれぞれでの変化を含む、ポリペプチドおよび核酸を含み、ここでその配列の変化が、人為的に導入され（例えば、突然変異タンパク質）、例えば、その変化が、ヒトの介在（「ｈａｎｄ  ｏｆ  ｍａｎ（人間の手）」）によって実験室で生み出される。したがって、本明細書の「ｍｕｔｅｉｎ（突然変異タンパク質）」は、通常は、単一または複数のアミノ酸置換が行われ、及びサイト指向またはランダム変異誘発に供せられたクローン遺伝子から、もしくは完全に合成遺伝子から誘導される、幅広い突然変異を起こした組み換えタンパク質を指す。
【００５８】
用語「ＤＮＡ」、「ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（核酸）」、「ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（核酸分子）」、「ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ポリヌクレオチド）」などは、任意鎖長のヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、もしくはそれらの類似体を指して、本明細書では互換的に使用される。ポリヌクレオチドの非限定的な例示には、直鎖状及び環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマーなどを含む。
【００５９】
ポリペプチドの構造に関連して本明細書で使用する「Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ（ｏｒ「ａｍｉｎｏ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ」）（Ｎ終末端（または「アミノ終末端」））」及び「Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ（または「ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ」）（Ｃ終末端（または「カルボキシ終末端」））」は、各々ポリペプチドの、完全に端のアミノ及びカルボキシ末端を指し、一方で用語「Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ（Ｎ末端）」及び「Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ（Ｃ末端）」は、各々そのＮ終末端及びＣ終末端方向のポリペプチドのアミノ酸配列における相対位置を指し、及び各々そのＮ終末端及びＣ終末端での残基を含む。「Ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ（直Ｎ末端）」または「Ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ（直Ｃ末端）」は、第二アミノ酸残基と比べた第一アミノ酸残基の位置を指し、ここでその第一及び第二アミノ酸残基は、連続したアミノ酸配列を与えるために共有結合している。
【００６０】
アミノ酸配列またはポリペプチド配列（例えば、ＩＬ−１０ポリペプチド「Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ（から誘導された）」アミノ酸配列）との関連における、「Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ（から誘導された）」は、そのポリペプチドまたは核酸が、参照されるポリペプチドまたは核酸（例えば、天然由来のＩＬ−１０ポリペプチドまたはＩＬ−１０をコードする核酸）に基づく配列を有することを示す意味であり、及びそのタンパク質または核酸が作られた供給源または方法を限定することを意味してはいない。例を挙げると、用語「Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ（から誘導された）」には、参照されるアミノ酸またはＤＮＡ配列の同族体もしくは変異体を含む。
【００６１】
ポリペプチドとの関連において、用語「ｉｓｏｌａｔｅｄ（単離された）」は、仮に天然由来であれば、それが天然に由来する可能性のある環境とは異なる環境にある、対象となるポリペプチドを指す。「ｉｓｏｌａｔｅｄ（単離された）」には、その対象となるポリペプチドが、実質的に濃縮された、及び／またはその対象となるポリペプチドが、部分的にまたは実質的に精製されているサンプル内のポリペプチドを含む。当該ポリペプチドが、天然由来では無い場合、「ｉｓｏｌａｔｅｄ（単離された）」には、そのポリペプチドが、それが合成または組み換え手段のいずれかで作られた際の環境から、分離されていることを示す。
【００６２】
「Ｅｎｒｉｃｈｅｄ（濃縮された）」は、サンプルが、非天然由来的に操作され（例えば、科学的に）、そのため対象のポリペプチドが、ａ）生体サンプル（例えば、そのポリペプチドが、天然に由来した状態の、またはそれが、投与後に存在するサンプル）などの、開始サンプル内のポリペプチド濃度に比べ、より高い濃度（例えば、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも６４倍高い、またはそれ以上）、またはｂ）そのポリペプチドが作られた（例えば、細菌細胞内で）環境での濃度に比べて、より高い濃度で存在することを意味する。
【００６３】
「Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｅ（実質的に純粋）」は、ある成分（例えば、ポリペプチド）が、その組成物の総含有量の約５０％を上回り、及び通常はその総ポリペプチド含有量の約６０％を上回って構成されていることを示す。より一般的には、「Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｅ（実質的に純粋）」は、その総組成物の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれ以上が、その対象となる成分である組成物を指す。いくつかのケースにおいて、当該ポリペプチドは、その組成物の総含有量の約９０％を超えて、または約９５％を超えて構成される。
【００６４】
配位子／受容体、抗体／抗原、またはその他の結合対を指す場合の、用語「ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ（特異的に結合する）」、または「ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄｓ（選択的に結合する）」は、タンパク質及びその他の生物製剤の不均一な集団における、そのタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。したがって、指定された条件下では、特異的な配位子は、特定の受容体に結合し、及びそのサンプルに存在するその他タンパク質へは、多量には結合はしない。予定した方法の抗体、または抗体の抗原結合部位から誘導された結合成分は、任意のその他の抗体、またはそれから誘導された結合成分の親和性と比べて、少なくとも２倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも２０倍高い、または少なくとも１００倍高い親和性を伴って、その抗原、またはその変異体もしくは突然変異タンパク質に結合する。特定の実施形態において、当該抗体は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ（スキャッチャード分析）（Ｍｕｎｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．１９８０  Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）によって決定されるように、約１０９リッター／モルを上回る親和性を有するであろう。
【００６５】
ＩＬ−１０及びＰＥＧ−ＩＬ−１０
ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）として知られる、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０は、２型（クラス）サイトカインとして分類され、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４（Ｍｄａ−７）、及びＩＬ−２６、インターフェロン（ＩＦＮ−α、−β、−γ、−δ、−ε、−κ、−Ω、及び−τ）、及びインターフェロン様分子（リミチン、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、及びＩＬ−２９）を含む、一連のサイトカインである。
【００６６】
ＩＬ−１０は、免疫調整及び炎症において、多面的な効果を持つサイトカインである。主としてマクロファージに発現するが、ＩＬ−１０発現はまた、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、及び単球においても検出されている。これは、肥満細胞によって産生され、これら細胞が、アレルギー反応の部位に有する炎症作用を弱める。ＩＬ−１０は主に、ｔｏｌｌ様受容体の作動物質に応答して、炎症性サイトカインの産生及び分泌を制限する一方で、それはまた、特定のＴ細胞及び肥満細胞に対して刺激性であり、及びＢ細胞の成熟、増殖、及び抗体の産生を刺激する。ＩＬ−１０は、ＮＦ−κＢ活性をブロックでき、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴのシグナル伝達経路の調節に関与する。それはまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性、及びＢ細胞の抗体産生を誘発し、及びマクロファージ活性ならびに腫瘍が促進する炎症を抑制する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の調節は、用量依存であり、より高い用量がより強い細胞毒性応答を誘発する。
【００６７】
この多面的な活性の結果として、ＩＬ−１０は、炎症症状、免疫関連疾患、線維障害、コレステロールの調節を含む代謝障害、及びがんを含む、幅広い疾患、障害及び症状に関係している。多数のそのような疾患、障害及び症状に対する、ＩＬ−１０を伴う臨床及び前臨床評価が、その治療薬として潜在性を確固たるものにしている。
【００６８】
ヒトＩＬ−１０は、３７ｋＤａの分子量をもつホモダイマーであり、１８．５ｋＤａの各モノマーは、１７８のアミノ酸を含み、その第１８アミノ酸が、シグナルペプチドを含む。各モノマーは、２つの分子内ジスルフィド結合を形成する４つのシステイン残基を含む。このＩＬ−１０ダイマーは、２つのモノマーの二次単位間の非共有相互作用の崩壊により、生物学的に不活性となる。ＩＬ−１０の、公開されているシステイン構造から得たデータは、その官能性ダイマーが、ＩＦＮ−γに対し特定の類似性を表わすことを示している（Ｚｄａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ）３：５９１−６０１）。本明細書での記述は一般に、そのホモダイマーを指すが、しかしながら、本考察の特定のケースでは、モノマーへの適用も可能であり、その文脈から明確になるであろう。
【００６９】
本開示の多様な実施形態では、ヒトＩＬ−１０（ＮＰ＿０００５６３）及び、８０％の相同を示す、マウスＩＬ−１０（ＮＰ＿０３４６７８）を企図し、及びそれらを使用する。さらに、本開示範囲には、ラット（登録ＮＰ＿０３６９８６．２、ＧＩ  １４８７４７３８２）、牛（登録ＮＰ＿７７６５１３．１、ＧＩ  ４１３８６７７２）、羊（登録ＮＰ＿００１００９３２７．１、ＧＩ  ５７１６４３４７）、犬（登録ＡＢＹ８６６１９．１、ＧＩ  １６６２４４５９８）、及びウサギ（登録ＡＡＣ２３８３９．１、ＧＩ  ３２４２８９６）を含む、その他の哺乳類種からの、ＩＬ−１０相同体、及びそれらの変成形態を含む。
【００７０】
前述のように、用語「ＩＬ−１０」、「ＩＬ−１０  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ｓ）（ＩＬ−１０ポリペプチド（複数可））」、「ＩＬ−１０  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ｓ）（ＩＬ−１０分子（複数可））」、「ＩＬ−１０  ａｇｅｎｔ（ｓ）（ＩＬ−１０物質（複数可））」などは、幅広く構成されることを意図しており、及び、例えば、同族体、変異体（突然変異タンパク質を含む）、ならびにそれらの断片を含む、ヒト及び非ヒトＩＬ−１０関連ポリペプチド、同様に、例えば、リーダー配列（例えば、シグナルペプチド）、及び上記の変成版を有するＩＬ−１０ポリペプチドを含む。さらに特定の実施形態において、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０ポリペプチド（複数可）、及びＩＬ−１０物質（複数可）は、作動物質である。
【００７１】
当該ＩＬ−１０受容体、ＩＩ型サイトカイン受容体は、アルファ及びベータの二次単位から構成され、また各々Ｒ１及びＲ２と呼ばれる。受容体の活性化には、アルファ及びベータの両方への結合が必要である。ＩＬ−１０ポリペプチドの１つのホモダイマーは、アルファに結合し、及び同じＩＬ−１０ポリペプチドのその他のホモダイマーは、ベータに結合する。
【００７２】
組み換えヒトＩＬ−１０の有用性は、しばしば、例えば、腎臓のクリアランス、血流内でのタンパク質分解及びモノマー化に起因している可能性がある、その比較的短い血清半減期によって制約される。その結果として、ダイマー構造を破壊し、及びその活性に悪影響を及ぼすこと無しに、ＩＬ−１０の薬物動態プロファイルを改善する、種々のアプローチが検討されている。ＩＬ−１０のペグ化は、特定の薬物動態パラメーター（例えば、血清半減期）の改善及び／または活性増進をもたらす。
【００７３】
本明細書で使用する用語「ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ＩＬ−１０（ペグ化ＩＬ−１０）」及び「ＰＥＧ−ＩＬ−１０」は、そのＩＬ−１０タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基に、一般的にはその結合が安定しているリンカーを介して、共有結合した１つ以上のポリエチレングリコール分子を有するＩＬ−１０分子を指す。用語「ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ＩＬ−１０（モノペグ化ＩＬ−１０）」及び「ｍｏｎｏ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０（モノＰＥＧ−ＩＬ−１０）」は、１つのポリエチレングリコール分子が、そのＩＬ−１０ダイマーの１つの二次単位上の単一アミノ酸残基へ、一般的にはリンカーを介して、共有結合していることを示す。用語「ｄｉｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ＩＬ−１０（ジペグ化ＩＬ−１０）」及び「ｄｉ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０（ジＰＥＧ−ＩＬ−１０）」は、１つのポリエチレングリコール分子が、そのＩＬ−１０ダイマーの各々の二次単位上の単一残基へ、一般的にはリンカーを介して、結合していることを示す。
【００７４】
特定の実施形態において、本開示に使用されるＰＥＧ−ＩＬ−１０は、１つから９つのＰＥＧ分子が、そのＩＬ−１０ダイマーの１つの二次単位のＮ終末端で、そのアミノ酸残基のアルファアミノ基へ、リンカーを介して共有結合している、モノＰＥＧ−ＩＬ−１０である。１つのＩＬ−１０二次単位上のモノペグ化は一般に、二次単位のシャッフルに起因する、非ペグ化、モノペグ化及びジペグ化ＩＬ−１０の非相同混合物をもたらす。さらに、ペグ化反応が完了に進むに従い、一般的に、非特異的かつ多ペグ化ＩＬ−１０をもたらす結果となり、したがって、その活性を低下させる。したがって、本開示の特定の実施形態には、本明細書で記述される方法によって生産されるモノ及びジペグ化ＩＬ−１０の混合物の投与を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、Ｎ末端ペグ化の化学戦略は、定められた時間（例えば、１８時間未満）において、約９９％同一であるＮ終末端のペグ化をもたらす場合に、利用可能である。その時間を超えて継続する化学反応を可能にすると、リシン側鎖のペグ化が増加する結果となる。複数のペグ化のアプローチが、実施例の節で記述される。
【００７６】
特定の実施形態において、当該ＰＥＧモイエティーの平均分子量は、約５ｋＤａから約５０ｋＤａの間である。ＩＬ−１０へのＰＥＧ結合の方法または部位は、重要ではないが、特定の実施形態において、そのペグ化は、ＩＬ−１０物質の活性を変化させず、または最小限に変化させるのみである。特定の実施形態において、半減期の増加は、生物活性の減少に比べてより大きい。ＰＥＧ−ＩＬ−１０の生物活性は、通常、米国特許第７，０５２，６８６号に記述されるように、細菌抗原（リポ多糖（ＬＰＳ））を投与され、及びＰＥＧ−ＩＬ−１０で治療された対象者の、血清中の炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γ）のレベルを評価することによって測定される。
【００７７】
ＩＬ−１０変異体（ペグ化などによって、修飾されていない）は、血清半減期を増加すること、ＩＬ−１０に対する免疫応答を減らすこと、精製または調合を促進させること、モノマー二次単位へのＩＬ−１０の変換を減少させること、治療効果を向上させること、及び治療中の副作用の重症度や発生を軽減することを含む、多様な目的を念頭に置いて調合され得る。アミノ酸配列の変異体は、通常自然には見出されない、予め考えられた変異体であり、あるものは、例えば、グリコシル化変異体などの、翻訳後変異体であり得る。ＩＬ−１０の任意の変異体は、もし適切なレベルのＩＬ−１０活性を保持していれば、利用可能である。野生型ＩＬ−１０と同様に、これらのＩＬ−１０変異体は、本明細書に記述されるように修飾（例えば、ペグ化またはＦｃ融合）され得る。
【００７８】
語句「ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（保護アミノ酸置換）」は、タンパク質のアミノ酸を、類似した酸性、塩基性、電荷、極性、または大きさの側鎖を持つアミノ酸で置き換えることによって、そのタンパク質の活性を保存する置換を指す。保護アミノ酸置換は一般に、１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、２）Ｒ、Ｋ、３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ、４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ、５）Ｑ、Ｎ、及び６）Ｄ、Ｅの基を持つアミノ酸残基の置換を必要とする。置換、挿入、または欠失の導入は、異なる変異体タンパク質、または異なる種からのタンパク質のアミノ酸配列の配置に基づいて可能になる。したがって、任意の天然由来のＩＬ−１０ポリペプチドに加えて、本開示は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の、通常は２０、１０、または５を超えたアミノ酸置換を有することを企図し、ここで通常は、その置換が、保護アミノ酸置換である。
【００７９】
本開示はまた、成熟したＩＬ−１０から誘導される連続したアミノ酸残基を含む、成熟ＩＬ−１０の活性断片（例えば、部分配列）を企図する。ペプチドまたはポリペプチド部分配列の連続したアミノ酸残基の鎖長は、その部分配列が誘導された、特定の天然由来のアミノ酸配列に依存して変動する。一般に、ペプチド及びポリペプチドは、約２０のアミノ酸から約４０のアミノ酸、約４０のアミノ酸から約６０のアミノ酸、約６０のアミノ酸から約８０のアミノ酸、約８０のアミノ酸から約１００のアミノ酸、約１００のアミノ酸から約１２０のアミノ酸、約１２０のアミノ酸から約１４０のアミノ酸、約１４０のアミノ酸から約１５０のアミノ酸、約１５０のアミノ酸から約１５５のアミノ酸、約１５５のアミノ酸から最大で完全長のそのペプチドまたはポリペプチドまであり得る。
【００８０】
さらに、ＩＬ−１０ポリペプチドは、特定の連続したアミノ酸鎖長の基準配列と同一の、特定配列を持つことができる（例えば、「ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｈｉｎｄｏｗ（比較一覧）」）。比較のための配列配置法は、当技術分野では公知である。最適な比較のための配列配置は、例えば、ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｏｆ  Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）によって、ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｏｆ  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）によって、ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）によって、ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅｓｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、または手動配置及び目視検査（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）によって、実施され得る。
【００８１】
例示として、適切なＩＬ−１０ポリペプチドには、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、約２０のアミノ酸から約４０のアミノ酸、約４０のアミノ酸から約６０のアミノ酸、約６０のアミノ酸から約８０のアミノ酸、約８０のアミノ酸から約１００のアミノ酸、約１００のアミノ酸から約１２０のアミノ酸、約１２０のアミノ酸から約１４０のアミノ酸、約１４０のアミノ酸から約１５０のアミノ酸、約１５０のアミノ酸から約１５５のアミノ酸、約１５５のアミノ酸から完全長のペプチドまたはポリペプチドまでの連続鎖と同一のアミノ酸を有する、アミノ酸配列を含むことができる。
【００８２】
さらに以下で考察するように、当該ＩＬ−１０ポリペプチドは、非天然由来の供給源（例えば、その天然由来環境以外の環境）から単離され得て、及びまた組み換えで作成でき（例えば、細菌、酵母、ピキア属、昆虫細胞などの、遺伝子的に変成された宿主細胞において）、ここでその遺伝子的に変成された宿主細胞は、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で修飾される。当該ＩＬ−１０ポリペプチドはまた、合成で製造され得る（例えば、無細胞の化学合成によって）。
【００８３】
当該ＩＬ−１０物質をコードする核酸分子が、それらの天然由来及び非天然由来のアイソフォーム、対立遺伝子多型及びスプライス変異体を含んで、本開示により企図される。本開示はまた、天然由来ＤＮＡ配列から１つ以上の塩基で変動し、しかし依然としてその遺伝子コードの縮退によって、ＩＬ−１０ポリペプチドに相当するアミノ酸配列に翻訳をする、核酸配列を包含する。
【００８４】
本開示はまた、本明細書での教示と併せて、遺伝子治療の利用を企図する。遺伝子治療は、新規遺伝子を導入するために、既存の遺伝子の追加複製を導入するために、既存遺伝子の機能を損なわせるために、または既存の、しかし非機能的遺伝子を修復するために、対象者の内因性細胞へ、普通はベクターと一体となった遺伝物質を送達することによって、効果を発揮する。一旦細胞内に入ると、その核酸が、その細胞機構によって発現し、対象となるタンパク質の産生をもたらす。本開示との関連において、遺伝子治療は、疾患、障害または症状の治療または予防における利用に対応した、ＩＬ−１０物質をコードする核酸を送達するための治療法として利用できる。
【００８５】
前述で言及したように、遺伝子治療の利用及び方法に対応して、対象者の細胞が、インビボで、本明細書で説明されるＩＬ−１０関連ポリペプチドをコードする核酸で、形質転換され得る。あるいは、細胞が、インビトロで、導入遺伝子またはポリヌクレオチドで形質転換され得て、及び次いで、治療効果を発揮するために、対象者の組織に移植され得る。さらに、初期の細胞単離体または形成された細胞株は、ＩＬ−１０関連ポリペプチドをコードする導入遺伝子またはポリヌクレオチドで形質転換され得て、及び次いで、任意で対象者の組織に移植され得る。
【００８６】
ＩＬ−１０の産出法
本開示のポリペプチドは、非組み換え（例えば、化学合成）及び組み換え法を含む、任意の適切な方法によって産出され得る。
【００８７】
Ａ．化学合成
ポリペプチドを化学的に合成する場合、その合成は、液相または固相を介して進められて良い。固相のポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、非天然アミノ酸の組み込み及び／またはペプチド／タンパク質の骨格の変成を可能にする。９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などの、ＳＰＰＳの多様な形態は、本開示のポリペプチドの合成を可能にする。当該化学合成の詳細は、当技術分野では公知である（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ  Ａ．（２００６）Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：３−１０、及びＣａｍａｒｅｒｏ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８）。
【００８８】
固相ペプチド合成は、以下のように実施されて良い。アルファ官能性（Ｎα）及び任意の反応性側鎖は、酸−不安定または塩基−不安定な基によって保護される。この保護基は、アミノ酸を結合する条件下では安定であるが、しかし形成されたそのペプチド鎖を損なわずに、容易に開裂され得る。α−アミノ官能性に対する適切な保護基には、非限定期に、Ｂｏｃ、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｏ−クロロベンジロキシカルボニル、ｂｉ−フェニルイソプロピロキシカルボニル、ｔｅｒｔ−アミロキシカルボニル（Ａｍｏｃ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシ−ベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブトキシ−カルボニル、Ｆｍｏｃ、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）などを含む。
【００８９】
適切な側鎖保護基には、非限定的に、アセチル、アリル（Ａｌｌ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジロキシメチル（Ｂｏｍ）、ｏ−ブロモベンジロキシカルボニル、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−クロロベンジル、２−クロロベンジロキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）、イソプロピル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンジルスルホニル（Ｍｔｒ）、２，３，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トシル（Ｔｏｓ）、２，４，６−トリメトキシベンジル、トリメチルシリル及びトリチル（Ｔｒｔ）を含む。
【００９０】
この固相合成において、Ｃ末端アミノ酸は、適切な支持物質に結合する。適切な支持物質とは、その合成過程の段階的縮合及び開裂反応に対する試薬及び反応条件に対して不活性化であり、及び使用されている反応媒体に溶解されないものである。市販の支持物質の例示には、反応基及び／またはポリエチレングリコールで修飾された、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、ヒロドキシメチル化またはアミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼン共重合体などを含む。ペプチド酸の調合が望まれる場合には、ポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼンまたは４−ベンジロキシベンジル−アルコール（Ｗａｎｇ−アンカー）もしくは２−クロロトリチルクロライドで誘導されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）が使用できる。ペプチドアミドのケースにおいて、ポリスチレン（１％）ジビニルベンゼンまたは５−（４′−アミノエチル）−３′，５′−ジメトキシフェノキシ）吉草酸（ＰＡＬ−アンカー）、またはｐ−（２，４−ジメトキシフェノキシ−アミノメチル）−フェノキシ基（Ｒｉｎｋ  アミドアンカー）で誘導されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）が使用できる。
【００９１】
ポリマー支持体への結合は、Ｃ末端のＦｍｏｃ保護アミノ酸と、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、または類似の溶剤に活性化剤を添加したその支持体との、室温または高温（例えば、４０℃から６０℃の間）での、例えば、２から７２時間の反応によって達成できる。
【００９２】
Ｎα保護アミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）とＰＡＬ、ＷａｎｇまたはＲｉｎｋアンカーとの結合は、例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、または１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの存在または不在の下で、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、もしくはその他のカルボジイミド、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロホウ酸塩（ＴＢＴＵ）またはその他のウロニウム塩、Ｏ−アシル−尿素、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス−ピロリジノ−ヘキサフルオロリン酸塩（ＰｙＢＯＰ）もしくはその他のリン酸塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、その他のＮ−ヒドロキシイミド又はオキシムなどのカップリング剤の手助けによって、例えば、ＨＯＢｔを加えたＴＢＴＵの助けを借りて、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＩＤＥＡ）、トリエチルアミンまたはＮ−メチルモルホリンなどの塩基の添加が有りまたは無しで、例えば、ジイソプロピルエチルアミンの２〜７２時間の反応で、（例えば、１．５〜３倍過剰のアミノ酸及びカップリング剤においては３時間で、例えば、２倍過剰及び温度が約１０℃から５０℃で、例えば、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンまたはジクロロメタンなどの溶剤の場合は２５℃で、例えばジメチルホルムアミドで）実行できる。
【００９３】
カップリング剤の代わりに、活性エステル（例えば、ペンタフルオロフェニル、ｐ−ニトロフェニルなど）Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸の対称無水物、その酸塩化物または酸フッ化物が、前述の条件下で使用できる。当該Ｎα保護アミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）は、ＤＩＥＡを添加したジクロロメタン中で、１０から１２０分、例えば２０分の反応時間で、しかしこの溶媒及びこの塩基の使用には限定されずに、２−クロロトリチルレジンと結合できる。
【００９４】
当該保護アミノ酸の連続カップリング反応は、従来からのペプチド合成法に従って、通常は自動化のペプチド合成装置で、実行できる。固相上での結合アミノ酸のＮα−Ｆｍｏｃ保護基の開裂後に、例えば、ジメチルホルムアミド中のピペリジン（１０％から５０％）で５から２０分間の、例えば、ＤＭＦ中に５０％のピペリジンで２分間を２回の、及びＤＭＦ中に２０％のピペリジンで１５分間を１回の処理によって、３倍から１０倍過剰の、例えば、１０倍過剰の次の保護アミノ酸を、ジクロロメタン、ＤＭＦまたはそれら２つの混合物などの不活性、非水系、極性溶媒中で、約１０℃から５０℃の間の温度、例えば２５℃で、前のアミノ酸と結合させる。そのＮα−Ｆｍｏｃアミノ酸のＰＡＬ、ＷａｎｇまたはＲｉｎｋアンカーへのカップリング反応に対する前述の試薬は、カップリング剤として適切である。この保護アミノ酸、または塩化物もしくはフッ化物、またはそれらの対称無水物の活性エステルもまた、互換的に使用できる。
【００９５】
固相合成の最後に、ペプチドを、支持物質から開裂させ、一方同時に側鎖の保護基を開裂させる。開裂は、硫化ジメチル、硫化エチルメチル、チオアニソール、チオクレゾール、ｍ−クレゾール、アニソールエタンジチオール、フェノールまたは水、などの５％〜２０％Ｖ／Ｖのスカベンジャー、例えば、１５％Ｖ／Ｖの硫化ジメチル／エタンジチオール／ｍ−クレゾールの１対１対１を伴う、トリフルオロ酢酸またはその他の強酸媒体で、０．５〜３時間、例えば２時間以内で実行できる。完全に保護された側鎖を持つペプチドは、２対２対６の氷酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタンで、その２−クロロトリチル・アンカーを開裂することによって取得する。この保護されたペプチドは、シリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製できる。仮に当該ペプチドが、Ｗａｎｇアンカーを介した固相上で結合されている場合には、及び仮に、Ｃ末端のアルキルアミド化を伴うペプチドを取得したいのであれば、開裂は、アルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンを伴ったアミノ分解によって、実行できる。このアミノ分解は、約−１０℃から５０℃の間の温度（例えば、約２５℃）で、及び約１２から２４時間（例えば、約１８時間）で実行する。さらに、このペプチドは、例えば、メタノールを伴った、再エステル化の支援によって開裂可能である。
【００９６】
当該ペプチドを沈殿させ、及びしたがってそのスカベンジャーを分離し、ならびにそのエーテルに残っている保護基を開裂させるためには、得られるその酸性溶液は、３から２０倍量の冷エーテルまたはｎ−ヘキサン、例えば、１０倍過剰のジエチルエーテルと混和されて良い。さらに精製は、そのペプチドを、氷酢酸から数回再沈殿させることによって、実行できる。得られる沈殿物は、水またはｔｅｒｔ−ブタノール、もしくはその２つの溶媒の混合物、例えば、ｔｅｒｔ−ブタノール／水の１対１混合物中に取り出し、及び凍結乾燥させる。
【００９７】
得られたペプチドは、酢酸形態での弱塩基性レジンによるイオン交換、非誘導体ポリスチレン／ジビニルベンゼン共重合体の疎水性吸着クロマトグラフィー（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ）、シリカゲル上での吸着クロマトグラフィー、例えば、カルボキシメチルセルロース上での、イオン交換クロマトグラフィー、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５上での、分配クロマトグラフィー、向流分配クロマトグラフィー、または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えば、オクチルまたは オクタデシルシリルシリカ（ＯＤＳ）相上での、逆相ＨＰＬＣを含む、多様なクロマトグラフィー法によって精製できる。
【００９８】
Ｂ．組み換え生産
ヒト及びマウスＩＬ−１０の調合を記述する方法は、例えば、米国特許第５，２３１，０１２号に見出され得て、そこでは、組み換え及びその他の合成技術を含む、ＩＬ−１０活性を有するタンパク質の合成法を教示している。ＩＬ−１０は、ウイルス由来であり得て、及びＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス（ＢＣＲＦ１タンパク質）からのウイルスＩＬ−１０のクローン化及び発現が、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１２３０に開示されている。ＩＬ−１０は、本明細書に記述されるものなどの、当技術分野で公知の標準的技術を利用した多数の方法で、取得され得る。組み換えヒトＩＬ−１０はまた、例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、Ｎ．Ｊ．から市販されている。
【００９９】
ポリペプチドが、組み換え技術を利用して産出される場合、そのポリペプチドは、それぞれ細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母宿主細胞などの原核生物または真核細胞であり得る、任意の適切な構成体及び任意の適切な宿主細胞を利用して、細胞内タンパク質または分泌タンパク質として産生されて良い。宿主細胞として使用されて良い真核細胞のその他の例示には、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び／または植物細胞を含む。哺乳類の宿主細胞を使用する場合、それらには、ヒト細胞 （例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞）、マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ 細胞、及びＣ１２７細胞）、霊長類細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７及びＣＶ１）、及びハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞）を含んで良い。
【０１００】
ポリペプチドの発現に適した、多様な宿主ベクター系は、当技術分野で公知の標準手順に従って取り入れられて良い。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓが参照される。遺伝子物質の宿主細胞への導入法には、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、接合、リン酸カルシウム法などを含む。導入されたポリペプチドをコードする核酸の安定発現を与えるために、転写の方法が選択され得る。このポリペプチドをコードする核酸は、遺伝性のエピゾーム要素（例えば、プラスミド）として与えられ得て、またはゲノム的に統合され得る。対象となるポリペプチドの産出に使用する多様な適切なベクターが、商業的に入手可能である。
【０１０１】
ベクターは、宿主細胞における染色体外維持に対して提供でき、またはその宿主細胞ゲノムへの統合に対して提供できる。発現ベクターは、転写及び翻訳制御配列を提供し、及びそのコード領域が、その転写開始領域、及び転写ならびに翻訳終了領域の転写制御条件の下で、動作可能に連結している場所での、誘導可能なまたは構成可能な発現を与える。一般に、転写及び翻訳制御配列には、非限定的に、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、及びエンハンサーまたは活性化因子配列を含んで良い。プロモーターは、構成可能または誘導可能のいずれかであり得て、及び強力な構成可能プロモーターであり得る（例えば、Ｔ７）。
【０１０２】
発現構造体は一般に、対象となるタンパク質をコードする、核酸配列の挿入をもたらすために、そのプロモーター配列の近くに位置する簡便な制限部位を有する。その発現宿主において動作可能な選択的マーカーが、そのベクターを含む細胞の選択を促進するために存在して良い。さらに、その発現構造体は、追加要素を含んで良い。例えば、当該発現ベクターは、１つまたは２つの複製システムを有して良く、したがって、それが、発現に対応して、有機体、例えば、哺乳類または昆虫細胞において、及びクローン化ならびに増幅に対応した原核生物宿主において、維持されることが可能になる。さらに、その発現構造体は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする、選択的マーカー遺伝子を含んで良い。選択的遺伝子は、当技術分野では公知であり、及び使用される宿主によって変化する。
【０１０３】
タンパク質の単離及び精製は、当技術分野で公知の方法に従って達成できる。例えば、タンパク質は、恒常的に及び／または誘導時にタンパク質を発現するように、一般には修飾された細胞の溶解液から、または一般に、サンプルの抗原−タンパク質抗体との接触、非特異的結合物質の洗浄、及び特異的結合タンパク質の溶出を取り込む、合成反応の混合物から免疫親和性精製によって単離できる。この単離されたタンパク質をさらに、透析及びタンパク質の精製に通常採用されるその他の方法によって、精製できる。１つの実施形態において、当該タンパク質は、金属キレート・クロマトグラフィー法を利用して単離されて良い。タンパク質には、単離を促進する修飾を含んで良い。
【０１０４】
当該ポリペプチドは、実質的に純粋なまたは単離された形態（例えば、その他のポリペプチドを含まない）で調合されて良い。当該ポリペプチドは、存在する可能性があるその他成分（例えば、その他ポリペプチドまたはその他宿主細胞成分）と関連するポリペプチドを濃縮した組成物中に、存在して良い。例えば、精製されたポリペプチドは、そのポリペプチドが、実質的にその他の発現タンパク質が無い、例えば、約９０％未満で、約６０％未満で、約５０％未満で、約４０％未満で、約３０％未満で、約２０％未満で、約１０％未満で、約５％未満で、または約１％未満である組成物中に存在するように提供されて良い。
【０１０５】
ＩＬ−１０ポリペプチドは、そのＩＬ−１０ポリペプチドをコードできる構造体を提供するための、当技術分野で公知の異なるＩＬ−１０関連核酸を操作する、組み換え技術を使用して生成されて良い。特定のアミノ酸配列が与えられる場合、当業者は、例えば、分子生物学における背景及び経験を考慮して、そのようなアミノ酸配列をコードする多様な異なる核酸分子を認識していることは、理解されよう。
【０１０６】
アミド結合置換
いくつかのケースにおいて、ＩＬ−１０には、ペプチド結合以外の１つ以上の結合を含み、例えば、少なくとも２つの隣接するアミノ酸が、アミド結合以外の結合を介して、接合している。例えば、望ましくないタンパク質分解またはその他の分解手段を減らす、もしくは排除するために、及び／または結成の安定性を増加させるために、及び／または構造の柔軟性を制限または減らすために、ＩＬ−１０の骨格内の１つ以上のアミド結合が、置換され得る。
【０１０７】
他の例示において、ＩＬ−１０における１つ以上のアミド連結（−ＣＯ−ＮＨ−）が、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−または−ＣＨ２ＳＯ−などの、アミド連結の等量式である連結で置き換えられる。ＩＬ−１０における１つ以上のアミド連結はまた、例えば、還元された等量式の擬ペプチド結合で、置き換えられる。Ｃｏｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：１８１−１８４が参照される。そのような置換及びそれがどのように影響するのかについては、当業者には公知である。
【０１０８】
アミノ酸置換
ＩＬ−１０ポリペプチドにおいて、１つ以上のアミノ酸置換が行われる。以下は、非限定的な例示である。
【０１０９】
ａ）アルキル置換疎水性アミノ酸の置換であり、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、（Ｓ）−２−アミノ酪酸、（Ｓ）−シクロヘキシルアラニン、または分岐状、環状及び直鎖状アルキル、アルケニルもしくはアルキニル置換を含む、Ｃ１−Ｃ１０炭素からの脂肪族側鎖によって置換されたその他の単純なアルファアミノ酸を含む。
【０１１０】
ｂ）芳香族置換疎水性アミノ酸の置換であり、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾチエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンを含み、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）もしくはアルコキシ（Ｃ１−Ｃ４から）―上記の芳香族アミノ酸の置換形態を含み、実例としては、２−，３−または４−アミノフェニルアラニン、２−，３−または４−クロロフェニルアラニン、２−，３−または４−メチルフェニルアラニン、２−，３−または４−メトキシフェニルアラニン、５−アミ−、５−クロロ−、５−メチル−または５−メトキシトリプトファン、２′−，３′−，または４′−アミノ−、２′−，３′−，または４′−クロロ−、２，３，または４−ビフェニルアラニン、２′−，３′−，または４′−メチル−、２−，３−または４−ビフェニルアラニン、及び２−または３−ピリジルアラニンである。
【０１１１】
ｃ）塩基性側鎖を含むアミノ酸の置換であり、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニンを含み、前述のアミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール置換（Ｃ１−Ｃ１０分岐、直鎖、または環状）誘導体を含み、その置換が、例えば、プロＲ位における、ヘテロ原子（アルファ窒素、または遠位窒素もしくは複数窒素など）上にあるか、またはアルファ炭素上にある。実例として役立つ化合物には、Ｎ−イプシロン−イソプロピルリジン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ，Ｎ−ガンマ、ガンマ′−ジエチル−ホモアルギニンを含む。アルファ−メチル−アルギニン、アルファ−２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファ−メチル−ヒスチジン、アルファ−メチル−オルニチンなどの化合物もまた含まれ、ここで、そのアルキル基は、そのアルファ炭素のプロＲ位を占める。アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ここでそのヘテロ芳香族基が、１つ以上の窒素、酸素または硫黄原子を単独または組み合わせで有する）、カルボン酸または酸塩化物、活性エステル、活性アザライド、及び関連誘導体、ならびにリジン、オルニチン、または ２，３−ジアミノプロピオン酸などの、多数の公知の活性化誘導体のいずれかから形成される、アミドもまた含まれる。
【０１１２】
ｄ）酸性アミノ酸の置換であり、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、２，４−ジアミノプロピオン酸のチロシン、アルキル、アリール、アリールアルキル、及びヘテロアリール・スルホンアミド、オルニチンまたはリジン及びテトラゾール置換アルキルアミノ酸を含む。
【０１１３】
ｅ）側鎖のアミノ酸残基の置換であり、アスパラギンまたはグルタミン酸の、アスパラギン、グルタミン、及びアルキル又は芳香族置換誘導体を含む。
【０１１４】
及び、ｆ）ヒドロキシル含有アミノ酸の置換であり、セリン又はスレオニンの、セリン、スレオニン、ホモセリン、２，３−ジアミノプロピオン酸、及びアルキル又は芳香族置換誘導体である。
【０１１５】
いくつかのケースにおいて、ＩＬ−１０は、１つ以上の天然由来の非遺伝子的にコードされたＬ−アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸、またはアミノ酸のＤ−光学異性体を含む。例えば、ＩＬ−１０は、Ｄ−アミノ酸だけを含むことができる。例えば、ＩＬ−１０は、ヒドロキシプロリン、β−アラニン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノメチル安息香酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブシルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリジン、２，４−ジアミノ酪酸、ｒｈｏ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘプタン酸、ω−アミノオクタン酸、ω−アミノデカン酸、ω−アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α,γ−ジアミノ酪酸、α,β−ジアミノプロピオン酸、δ−アミノ吉草酸、及び２，３−ジアミノ酪酸の残基の１つ以上を含むことができる。
【０１１６】
追加の修飾
システイン残基またはシステイン類似体は、ジスルフィド連結を介した、他のペプチドへの連結を提供するために、またはＩＬ−１０ポリペプチドの環化を提供するために、ＩＬ−１０ポリペプチドに導入され得る。システインまたはシステイン類似体の導入法は、当技術分野で公知であり、米国特許第８，０６７，５３２号が参照される。
【０１１７】
ＩＬ−１０ポリペプチドは、環化され得る。１つ以上のシステインまたはシステイン類似体は、ＩＬ−１０ポリペプチドに導入され得て、ここでその導入されたシステインまたはシステイン類似体は、２番目に導入されたシステインまたはシステイン類似体と、ジスルフィド結合を形成できる。環化のその他の手段には、オキシムリンカーまたはランチオニンリンカーの導入を含み、米国特許第８，０４４，１７５号が参照される。環化結合を形成できるアミノ酸（または非アミノ酸モイエティー）の任意の組み合わせが、使用され及び／または導入され得る。環化結合は、架橋の導入を可能にする官能基を持つ、アミノ酸（または（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−もしくは−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ−を持つアミノ酸）の任意の組み合わせを伴って生成され得る。いくつかの例示は、ジスルフィド、−（ＣＨ２）ｎ−カルバ架橋などのジスルフィド模倣体、チオアセタール、チオエーテル架橋（シスタチオニンまたはランチオニン）及びエステルならびにエーテルを含む架橋である。これらの例示において、ｎは任意の整数であり得るが、しばしば１０未満である。
【０１１８】
その他の修飾には、例えば、Ｎ−アルキル（またはアリール）置換（Ψ［ＣＯＮＲ］）、またはラクタム及びその他の環状構造を構築するためのバックボーン架橋を含む。その他の誘導体には、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、ｏ−変成誘導体（例えば、Ｃ末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）、アルキルアミド及びヒドラジドなどの置換アミドを含むＮ末端変成誘導体を含む。
【０１１９】
いくつかのケースにおいて、ＩＬ−１０ポリペプチドにおける１つ以上のＬ−アミノ酸が、１つ以上のＤアミノ酸に置き換えられる。
【０１２０】
いくつかのケースにおいて、ＩＬ−１０ポリペプチドは、レトロインベルソ類似体である（Ｓｅｌａ  ａｎｄ  Ｚｉｓｍａｎ（１９９７）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：４４９を参照）。レトロ−インベルソペプチド類似体は、そのアミノ酸配列の方向が逆転して（逆になって）おり、及びその場所の１つ以上のアミノ酸のキラリティー、Ｄ−またはＬ−が、例えば、Ｌ−アミノ酸よりむしろＤ−アミノ酸を使用して、反転（上下がさかさま）している。Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：７４４、及びＢｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：６９２が参照される。
【０１２１】
ＩＬ−１０ポリペプチドには、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二分子、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を容易にする有機または無機分子を指す、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ（タンパク質形質導入ドメイン）」（ＰＴＤ）を含む。他の分子に結合したＰＴＤは、その分子が膜を横断する、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、細胞質ゾルから細胞小器官へ移動することを容易にする。いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、ＩＬ−１０ポリペプチドのアミノ末端へ共有結合する一方で、いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、ＩＬ−１０ポリペプチドのカルボキシ末端へ共有結合する。例示的なタンパク質形質導入ドメインには、非限定的に、最小ウンデカペプチド・タンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含む、ＨＩＶ−１  ＴＡＴの４７〜５７残基に相当する。ＳＥＱ  ＩＤ番号１）、細胞に直接侵入するのに十分な数のアルギニン残基を含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０のアルギニン）、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（ショウジョウバエ属アンテナペディア）のタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（７）：１７３２−１７３７）、切り捨てられたヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１２４８−１２５６）、ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３−１３００８）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２）、トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ番号３）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ番号４）、及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ番号５）を含む。例示的なＰＴＤｓには、非限定的に、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ番号６）、３アルギニン残基から５０アルギニン残基までのアルギニンホモポリマーを含み、例示的なＰＴＤドメインのアミノ酸配列には、非限定的に、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ番号７）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ番号８）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ番号９）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１０）のいずれかを含む。
【０１２２】
ＩＬ−１０ポリペプチドのＣ末端アミノ酸のカルボキシ基ＣＯＲ３は、遊離形態（Ｒ３＝ＯＨ）、または生理的に容認されるアルカリまたはアルカリ土類塩、例えば、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩の形態で、存在できる。このカルボキシ基はまた、例えば、メタノール、分岐または非分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキルアルコール、例えば、エチルアルコールまたはｔｅｒｔ−ブチルアルコールなどの、第一級、第二級または第三級アルコールでエステル化され得る。このカルボキシ基はまた、アンモニア、分岐または非分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキルアミンまたはＣ１−Ｃ６ジアルキルアミン、例えば、メチルアミンまたはジメチルアミンなどの、第一級または第二級アミンでアミド化され得る。
【０１２３】
ＩＬ−１０ポリペプチドのＮ末端アミノ酸ＮＲ１Ｒ２のアミノ基は、遊離形態（Ｒ１＝Ｈ、及びＲ２＝Ｈ）、または例えば、塩化物または酢酸塩などの生理的に容認される塩の形態で存在できる。このアミノ基はまた、Ｒ１＝Ｈ及びＲ２＝アセチル、トリフルオロアセチル、またはアダマンチルなどの酸で、アセチル化され得る。このアミノ基は、前述したものなど（例えば、Ｆｍｏｃ、ベンジロキシ−アルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、及びＡｌｌｏｃ）の、ペプチド合成に慣例的に使用されるアミノ保護基によって保護される形態で存在できる。このアミノ基は、Ｒ１及び／またはＲ２＝Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ２−Ｃ８アルケニルもしくはＣ７−Ｃ９アラルキルで、Ｎ−アルキル化され得る。アルキル残基は、直鎖状、分岐状または環状（例えば、各々エチル、イソプロピル及びシクロヘキシル）であり得る。
【０１２４】
ＩＬ−１０生産の考察
仮に、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）発現システムにおいて、封入体を産生するならば、それは、変成され、フォールドを解かれ、及び混入物質から精製される必要がある。そのような混入物質には、宿主タンパク質、ＩＬ−１０の修飾された変異体（例えば、１つ以上のリジン残基でアセチル化されたＩＬ−１０モノマー）、変異体を持つヘテロダイマー（例えば、非アセチル化ＩＬ−１０モノマーに結合したアセチル化ＩＬ−１０モノマー）、及び共有結合したＩＬ−１０ホモダイマーを含む。したがって、アセチル化ホモダイマー、ヘテロダイマー変異体及び共有結合ダイマーを含まない、実質的に純粋な非共有結合ダイマーのＩＬ−１０を取得するには、ＩＬ−１０の精製が必要である。米国特許第５，７１０，２５１号は、細菌発現システムにおいて、封入体を産生したＩＬ−１０を、変成及び再フォールドの後で取り入れて良い、精製プロセスを記述している。
【０１２５】
首尾よく目的を達成するためには、精製プロセスが、生物活性及び／または可溶性タンパク質の回収を、部分的に、高収量にするはずである。これは、その封入体中のタンパク質を投入した、可溶化及び／または再フォールディングプロセスを最適化することによって達成される。封入体からのタンパク質の再フォールディングは、変成による封入体の可溶化、変成体の除去、及び特定小分子の添加物による再フォールディングの支援を含む、複数の要因に影響される。当該可溶化及び再フォールディングプロセスに関連する多様な方法論を、例えば、Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ｒ．ａｎｄ  Ｌｉｌｉｅ，Ｈ．（１９９６）ＦＡＳＥＢ  １０：４９−５６、Ｌｉｌｉｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４９７−５０１、Ｍｉｄｄｅｌｂｅｒｇ，Ａ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１０）：４３７−４４３、Ｈｅｖｅｈａｎ，Ｄ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，Ｅ．Ｄ．Ｂ．（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５４（３）：２２１−３０、Ｄｅ  Ｂｅｒｎａｒｄｅｚ  Ｃｌａｒｋ，Ｅ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７−６３、Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２８：１−８に見出すことができる。
【０１２６】
当該可溶化及び再フォールディングプロセスは、３段階で実施されて良い。
【０１２７】
１）封入体の単離。封入体は、比較的高密度であり、そのため遠心分離によってペレット化できる。細胞は通常、高圧均質化（任意で、リゾチーム処理に続く）によって破壊される。細胞溶解は、堆積物の形態で共に蓄積したものから、無傷細胞が、封入体を含有することを防ぐために、完全に行う必要がある。遠心分離に続いて、ペレットからの混入物を除去するために、低濃度のカオトロピック剤（例えば、０．５〜１Ｍのグアニジン−ＨＣｌまたは尿素）または洗浄剤（例えば、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または１ｍｇ／ｍＬのナトリウムデオキシコール）のいずれかを含む、緩衝液で洗浄して良い。
【０１２８】
２）凝集したタンパク質の可溶化。可溶化は、単分子分散をもたらし及び非天然由来の鎖内または鎖間相互作用を最小にする必要がある。可溶化剤、例えば、尿素、グアニジンＨＣｌ、または洗浄剤の選択は、可溶化効果において、変成状態のそのタンパク質構造において、及びその後の再フォールディングにおいて、鍵となる役割を果たす。
【０１２９】
１つの実施形態において、前述の洗浄された封入体は、再懸濁され、及び強力な変成剤及び還元剤（例えば、２０ｍＭのＤＴＴまたはｂ−メルカプトエタノール）を含む緩衝液内で培養されて良い。その還元剤は、全てのシステインを還元状態に保ち、及びその調合時に形成されたジスルフィド結合を開裂する。通常、３０℃を上回る培養温度が、その可溶化プロセスを促進するために使用される。可溶化の最適条件は、タンパク質に特異的であり、及びしたがって、例えば、異なる変異体を選別するための小規模実験（１〜２ｍＬ）を実施することによって、各タンパク質に対応して決定される必要がある。潜在的な開始量（カッコ内に網羅）を持つ、可溶化に対する特別変数には、ａ）ｐＨ及びイオン強度などの緩衝組成（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）、ｂ）培養温度（３０℃）、ｃ）培養時間（６０分）、ｄ）可溶化剤の濃度（６Ｍのグアニジン−ＨＣｌまたは８Ｍの尿素）、ｅ）総タンパク質濃度（１〜２ｍｇ／ｍＬ）、及びｆ）多様化剤対対象タンパク質の比率を含む。
【０１３０】
可溶化に続いて、再フォールディング時の凝集をもたらす核として作用する、残った凝集物を除去するために、その溶液を遠心分離（例えば、＞１００，０００ｇで３０分）して良い。通常、超遠心分離法が、最良の結果を与える。
【０１３１】
３）可溶化されたタンパク質の再フォールディング。タンパク質の再フォールディングは、単一反応ではなく、及び誤フォールディング、凝集などの、不活性タンパク質へと導くその他の反応と競合する。再フォールディングとその他反応との割合は、変成濃度を減らすための手順及びその溶媒条件の両方によって決定される。複数のタンパク質の再フォールディング・キット及び関連技術が、市販されており（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  Ｋｉｔ（ピアス・タンパク質再フォールディング・キット）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）及び  ＦｏｌｄＩｔ（商標登録）タンパク質フォールディング・スクリーン（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ））、及び当業者には公知である。
【０１３２】
可溶化されたタンパク質の再フォールディングが、その変成剤を除去することによって開始される。再フォールディングの効率は、正しいフォールディングと凝集の間の競合に依存する。その凝集プロセスを減速するために、再フォールディングは通常、低いタンパク質濃度で行われる（例えば、１０〜１００ｍｇ／ｍＬ）。緩衝液組成（例えば、ｐＨ及びイオン強度）、温度、及び添加成分を含む、再フォールディングに使用する条件には、個別のタンパク質に対して最適化される必要がある。特定の小分子添加剤は、フォールディングの促進及びタンパク質の安定化、またはインビトロならびにインビボの両方での可溶性の増加に効果的である。したがって、小分子の添加は、しばしば化学シャペロンと呼ばれるが、活性タンパク質の回収及びタンパク質フォールディングの効率を増加させ得る。
【０１３３】
仮にタンパク質が、ジスルフィド結合を含む場合、その再フォールディング緩衝液を、酸化還元系で補強する必要がある。例を挙げると、低分子量のチオール試薬の還元及び酸化形態（１〜３ｍＭの還元チオール及び５対１から１対１の還元対酸化チオール比率）の混合物の添加が、ジスルフィド結合の形成及びリシャッフルを可能にする適切な酸化還元の潜在性を与える。最も一般的に使用される酸化還元シャッフル剤は、グルタチオンを還元及び酸化し、その他には、システイン及びシステアミンを含む。あるいは、タンパク質は、大過剰の酸化グルタチオンの存在下では、完全に酸化され得て、次いで還元グルタチオンの触媒量を含む再フォールディング緩衝液に希釈される。
【０１３４】
当業者は、以下を含む、タンパク質の再フォールディングに対応する異なる方法に精通している。
【０１３５】
（ａ）透析：透析の間、可溶化剤の除去に最も一般的に利用される方法は、その可溶化剤濃度を、ゆっくりと減らすことであり、タンパク質の、適切な再フォールドを可能にする。サンプルと透析緩衝液の容積比は、その可溶化剤の平衡濃度において、タンパク質が完全に再フォールドされるようにする必要がある。
【０１３６】
（ｂ）緩慢希釈：このプロセスに伴って、可溶化剤の濃度は、希釈によって減らされ、タンパク質の再フォールド可能になる。この希釈プロセスは通常、緩衝液の段階的な添加で、またはポンプを使用した連続的な添加で、ゆっくりと実施される。
【０１３７】
（ｃ）急速希釈：一般に、透析及び緩慢希釈プロセスの間は、タンパク質が、まだ折り畳まれず、しかしもはや変成しない、その可溶化剤の中間濃度に長時間暴露され（例えば、２〜４Ｍの尿素またはグアニジン−ＨＣｌ）、及びしたがって、非常に凝集する傾向にある。この凝集傾向はしばしば、その再フォールディング緩衝液への、可溶化タンパク質溶液の急速希釈によって防ぐことができる。凝集はまた、再フォールディング緩衝液への緩慢な可溶化剤、非洗浄スルホベタインなどの添加によって限定され得る。
【０１３８】
（ｄ）パルス再生：フォールドを解かれたタンパク質を低濃度に維持し、及びしたがって凝集を制約するには、変成タンパク質の一定分量（「ｐｕｌｓｅｓ（パルス）」）が、その再フォールディング緩衝液に、定められた時間で添加され得る。２つのパルス間の時間は、個別のタンパク質によって最適化される必要がある。このプロセスは、変成濃度が、その特定タンパク質の再フォールディングを予想させる臨界値に到達したら、停止され得る。
【０１３９】
（ｅ）クロマトグラフィー：この方法の利用は、その可溶化剤を、クロマトグラフィー法のステップを利用して除去することである。サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び親和性クロマトグラフィーを含む、異なるクロマトグラフィー法が利用されて良い。この変成体は、当該タンパク質が、そのカラムを通してゆっくりと移行している間に除去され、またはその基材に結合される。この方法は通常、たとえタンパク質濃度がｍｇ／ｍＬの領域であったとしても、高収量の活性タンパク質を与える。もしくは、クロマトグラフィーは、タンパク質の再フォールディング前の変成条件下で、実施され得る。
【０１４０】
アミノ酸
当該再フォールディング緩衝液への特定アミノ酸の添加が、その再フォールディングプロセス中に、タンパク質の相溶性を改善すること、及びタンパク質の凝集を抑制することを含む、複数の有益な効果を持つことが観察されている。例示的なアミノ酸は、プロリン、アルギニン塩酸塩（ＡｒｇＨＣｌ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アルギニンアミド、及びグリシンアミドを含む。一方、これらの効果を生むアミノ酸による作用の背後にある機構は、全体が明らかにはなってはいないが、その機構の理解は、本開示の実践に必要ではない［Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１４，４：２３５−５１を参照］。
【０１４１】
封入体から多数のタンパク質を再フォールディングするために、カゼインキナーゼＩＩ、ガンマインターフェロン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質、及びインターロイキン−２１を含む、アルギニンが応用されてきた。一般的には、増量剤と考えられているアルギニンは、タンパク質へのその適度な結合のために、凝集を抑制することによって効果を発揮できる。アルギニンアミド及びグリシンアミドは、アルギニン以上に異なる部位へ結合する、適度なカオトロピック剤であると報告されており、異なる阻害能力へと導く。対照的に、プロリンは、タンパク質の、プロリンを伴った超分子集合体における、そのフォールディング中間体への結合、及びフォールディング中間体の捕捉を介して、タンパク質の凝集を抑制することによって、それら本来の構造に再フォールドすることを可能にする、と提案されている（Ｓａｍｕｅｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２０００，９：３４４−５２）。
【０１４２】
実施例の節で詳述するが、アルギニンは、透析または希釈によってタンパク質を再フォールディングする際の溶媒に、しばしば使用されるという事実にもかかわらず、ＩＬ−１０の生産で使用される再フォールド緩衝液へのアルギニンの添加に関しては、科学及び特許文献にほとんど考察が無い（Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：１３０１−０８が参照される）。実施例２のデータは、低濃度のＬ−アルギニンが、ＩＬ−１０の収量に良い影響を与えることを見出したことを示す。特に、０．１５ｍｇ／ｍＬのフォールドを解かれたｒＨｕＩＬ−１０を含む、再フォールド緩衝液への、０．０１〜０．１Ｍのアルギニンの添加は、適切に折り畳まれた、ダイマーのＩＬ−１０を少なくとも２倍増加に導いた。
【０１４３】
ＩＬ−１０機能を強化及び／または模倣するための特定変成
本明細書に開示する治療様式（例えば、ＩＬ−１０）の１つ以上の物理的特徴及び／またはそれらが投与される方法を改善することは、しばしば有益であり、及び時には必須である。物理的特徴の改善には、例えば、免疫性を調節すること、水溶性、生物学的利用能、血清半減期、及び／または治療の半減期を増加させる方法、及び／または生物活性を調節することを含む。特定の変成もまた、例えば、検出アッセイ（例えば、エピトープタグ）に使用する抗体を活性化すること、及びタンパク質精製の簡便性を与えるために、有用なことがある。そのような改善は、その治療様式の生物活性に悪影響を与えずに、及び／またはその免疫性を高まるように付与される必要がある。
【０１４４】
ＩＬ−１０のペグ化は、本開示によって意図された、１つの特徴的な変成であり、一方その他の変成には、非限定的に、グリコシル化（Ｎ−及びＯ−連結）、ポリシアル化、血清アルブミンを含むアルブミン融合分子（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、犬血清アルブミン、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、例えば、共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合（アシル化）、及びＦｃ−融合タンパク質を含む。
【０１４５】
ペグ化：タンパク質治療の臨床効果は、短い血漿半減期、及びプロテアーゼ分解に対する脆弱性のために、しばしば制約される。多数の治療用タンパク質（例えば、好中球）の研究は、そのような困難は、ポリペプチド配列を、多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのいずれかへ共役または連結させることを含む、多様な変成によって克服される可能性があることを示している。これは、連結モイエティーを、タンパク質及び非タンパク質性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、の両方へ、共有結合させることによって、しばしば効果を発揮する。そのようなＰＥＧ共役生体分子は、良好な物理的及び熱安定性、酵素分解に対する脆弱性からの保護、溶解性の向上、より長いインビボ循環半減期及び減少したクリアランス、低下した免疫原性及び抗原性、ならびに低下した毒性を含む、臨床的に有益な特徴を保持することが示されている。
【０１４６】
薬物動態パラメーターにおける、ペグ化の有益な効果に加えて、ペグ化それ自身が、活性を高める可能性がある。例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、非ペグ化ＩＬ−１０に比べて、特定のがんに対してより効果的であることが示されている（欧州特許第２０６６３６Ａ２号、を参照）。本開示の特定の実施形態は、厄介な副作用を引き起こすこと無く、当該ＩＬ−１０分子の薬物動態プロファイルを改善する、相対的に小さなＰＥＧ（例えば、５ｋＤａ）の使用を意図しており、例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０分子が、慢性使用に対して、特に効果がある。
【０１４７】
ポリペプチド配列への共役に適しているＰＥＧｓは一般に、室温の水に可溶性であり、及び一般式Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、ここでＲは、水素またはアルキルもしくはアルカノール基などの保護基であり、及びここでｎは、１から１０００の整数である。Ｒが保護基の場合、一般に１から８の炭素を有する。このポリペプチド配列に共役したＰＥＧは、直鎖状または分岐状であり得る。分岐状ＰＥＧ誘導体、「ｓｔａｒ−ＰＥＧｓ」及び複数アームＰＥＧｓが、本開示により企図される。本開示に使用されるＰＥＧの分子量は、いかなる特定範囲にも制約されず、及び例示は、本明細書の他の場所で説明されるが、例を挙げれば、特定の実施形態は、５ｋＤａから２０ｋＤａの間の分子量を有し、一方その他の実施形態は、４ｋＤａから１０ｋＤａの間の分子量を有する。
【０１４８】
本開示はまた、当該ＰＥＧｓが、異なるｎ値を持し、及び多様に異なったＰＥＧｓが、特定の比率で存在する、共役体の組成物を意図している。例えば、いくつかの組成物は、ｎ＝１、２、３及び４の共役体の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｎ＝１である共役体のパーセンテージは、１８〜２５％、ｎ＝２である共役体のパーセンテーは、５０〜６６％、ｎ＝３である共役体のパーセンテージは、１２〜１６％、及びｎ＝４である共役体のパーセンテーは、最大で５％である。そのような組成物は、当技術分野で公知の反応条件及び精製法によって、生産され得る。例示的な反応条件は、本明細書全体で記述される。陽イオン交換クロマトグラフィーが、共役体の分離に使用可能であり、及び次いで留分が、例えば、結合した望ましい数のＰＥＧｓを有する共役体を含むことが特定されて、非変成タンパク質配列、及び結合したその他の数のＰＥＧｓを有する共役体が無いように精製される。
【０１４９】
ペグ化は、ポリペプチドのＮ終末端のアルファアミノ基、リジン残基の側鎖のイプシロンアミノ基、及びヒスチジン残基の側鎖のイミダゾール基において最も頻繁に起こる。ほとんどの組み換えポリペプチドは、単一のアルファ及び多数のイプシロンアミノ及びイミダゾール基を保有するので、多数の位置異性体が、そのリンカー化学に依存して生成され得る。当技術分野で公知の一般的なペグ化戦略が、本明細書では適用され得る。ＰＥＧは、当該ポリペプチド配列の１つ以上の遊離アミノまたはカルボキシ基と、ポリエチレングリコール間の結合を調節する末端反応基（「ｓｐａｃｅｒ（スペーサー）」）を介して、本開示のポリペプチドに結合される。その遊離アミノ基へ結合されるスペーサーを有するＰＥＧには、ポリエチレングリコールのコハク酸エステルを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化することによって調合され得る、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・ポリエチレングリコールを含む。他の、遊離アミノ基と結合する活性化ポリエチレングリコールは、２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンであり、ポリエチレングリコール・モノメチルエステルと塩化シアヌルを反応させることによって調合され得る。当該遊離アミノ基と結合する活性化ポリエチレングリコールには、ポリオキシエチレンジアミンを含む。
【０１５０】
スペーサーを有するＰＥＧへの、本開示のポリペプチド配列の１つ以上の共役は、多様な従来の方法によって実行されて良い。例えば、当該共役反応は、ｐＨ５から１０の溶液内で、４℃から室温までの温度で、３０分から２０時間で、４対１から３０対１の試薬とタンパク質の比率を活用して、実施され得る。反応条件は、支配的に望ましい度合いの置換が生成される反応を指向して、選択されて良い。一般に、低温、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝５）、及び短い反応時間は、ＰＥＧｓ結合の数を減らす傾向にある一方で、高温、中性から高ｐＨ（例えば、ｐＨ≧７）、及び長い反応時間は、ＰＥＧｓ結合の数を増やす傾向にある。当技術分野で公知の多様な手段が、当該反応を終結させるために使用されて良い。いくつかの実施形態において、当該反応を、その反応混合物を酸性化し、及び例えば、−２０℃で凍結することによって、終結させる。多様な分子のペグ化は、例えば、米国特許第５，２５２，７１４号、第５，６４３，５７５号、第５，９１９，４５５号、第５，９３２，４６２号、及び第５，９８５，２６３号で考察されている。ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、例えば、米国特許第７，０５２，６８６号に記述されている。本明細書で使用する特定の反応条件は、実施例の節で説明される。
【０１５１】
本開示はまた、ＰＥＧ模倣剤の使用を意図している。組み換えのＰＥＧ模倣剤は、いくつかの追加の有益な特徴を与えながら、ＰＥＧの属性（例えば、強化された血清半減期）を保持するように開発されている。例を挙げると、ＰＥＧと類似した拡張構成を形成することができる、単純なポリペプチド鎖（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒを含む）は、対象となるペプチドまたはタンパク質へ、事前に組み換え的に融合されて、生産され得る（例えば、Ａｍｕｎｉｘ′ＸＴＥＮ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。これは、その製造工程での追加の共役ステップの必要性を取り除く。さらに、確立された分子生物学の技術は、そのポリペプチド鎖の側鎖組成物の制御を可能にし、免疫性及び製造特性の最適化を可能にする。
【０１５２】
グリコシル化：本開示の目的に対して、「ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ（グリコシル化）」は、タンパク質、脂質またはその他の有機分子に糖鎖を結合する酵素プロセスを、幅広く指すことを意味する。本開示に連動した用語「ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ（グリコシル化）」の使用は一般に、１つ以上の炭水化物部分を追加または削除することを意味する(基になるグリコシル化部位を除去するか、または化学的及び／また酵素的手段によってグリコシル化を削除するかのいずれかで)、及び／または天然配列には存在しないかもしれない、１つ以上のグリコシル化を追加することを意味することを意図している。さらに、この語句には、存在する多様な炭水化物モイエティーの性質及び特徴における変化を取り込む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的な変化を含む。
【０１５３】
グリコシル化は、ＩＬ−１０などのポリペプチドの物理的特徴（例えば、溶解性）に劇的に影響を与えることができ、及びまたタンパク質の安定性、分泌、ならびに細胞内局在化にとって重要であり得る。グリコシル化されたポリペプチドはまた、高められた安定性を示す可能性があり、または半減期などの、１つ以上の薬物動態特性を改善することもある。さらに、溶解性改善は、例えば、非グリコシル化ポリペプチドを含む処方物に比べて、医薬品投与に対してより適切な処方物の生成を可能とする。
【０１５４】
グリコシル化部位の追加は、そのアミノ酸配列を変更して達成され得る。当該ポリペプチドの変成は、例えば、１つ以上のセリンまたはスレオニン残基（Ｏ−連結のグリコシル化部位に対して）、もしくはアスパラギン残基（Ｎ−連結のグリコシル化部位に対して）の添加のよって、またはそれらによる置換で、行われて良い。Ｎ−連結及びＯ−連結オリゴ糖及び各タイプに見出される糖残基の構造は、異なっていてよい。両方に通常見出される糖の１つのタイプは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（以降、シアル酸と呼ぶ）である。シアル酸は通常、Ｎ−連結及びＯ−連結オリゴ糖の両方の末端残基であり、及びその負電荷のおかげで、その糖タンパク質に酸性の特徴を与えることがある。本開示の特定の実施形態は、Ｎ−グリコシル化変異体の生成及び利用を含む。
【０１５５】
本開示のポリペプチド配列は、その核酸レベルにおける変化を介して、特に、コドンが、その望ましいアミノ酸に翻訳されて生成されるように、予め選択された塩基で、そのポリペプチドをコードする核酸を変異させることによって、任意で変更されて良い。
【０１５６】
ポリシアル化：本開示はまた、ポリペプチドの安定性及びインビボ薬物動態を改善するために、天然由来の、生分解性α−（２→８）連結のポリシアル酸（「ＰＳＡ」）へのポリペプチドの共役である、ポリシアル化の利用を企図する。
【０１５７】
アルブミン融合：さらに、共役に対応した適切な成分及び分子には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、犬血清アルブミン、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミンを含む。
【０１５８】
本開示において、アルブミンは、薬剤分子（例えば、本明細書で記述のポリペプチド）と、そのカルボキシ終末端、そのアミノ終末端、そのカルボキシ及びアミノの両終末端で、及び互換的に、共役結合されて良い（米国特許第５，８７６，９６９号、及び米国特許第７，０５６，７０１号を参照）。
【０１５９】
本開示によって企図される、ＨＳＡ−薬剤分子共役体において、アルブミン分泌プレ配列及びその変異体、断片及びその変異体、ならびにＨＳＡ変異体などの、アルブミンの多様な形態が使用されて良い。そのような形態は一般に、１つ以上の望ましいアルブミン活性を保持する。さらなる実施形態において、本開示は、アルブミン、アルブミン断片、及びアルブミン変異体などへ、直接的または間接的に融合されたポリペプチドの薬剤分子を含む、融合タンパク質を取り込み、ここでその融合タンパク質が、非融合薬剤分子より高い血漿安定性を有し、及び／またはその融合タンパク質が、非融合薬剤分子の治療活性を保有している。いくつかの実施形態において、間接的融合は、ペプチドリンカー、またはそれらの改変版などの、リンカーによって効果的になる。
【０１６０】
前述のように、アルブミンの、本開示の１つ以上のポリペプチドへの融合は、例えば、遺伝子的操作によって達成され得て、そのためＨＳＡ、またはその断片をコードする核酸が、１つ以上のポリペプチド配列をコードする核酸と結合する。
【０１６１】
互換的な、アルブミン結合戦略：複数のアルブミン結合戦略が、直接的融合と互換的に開発され、及び本明細書に記述のＩＬ−１０と共に使用されて良い。例を挙げると、本開示は、共役結合した脂肪酸鎖（アシル化）、及びアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）のペプチド配列、及び本明細書に記述のポリペプチドの１つ以上の配列を含む、融合タンパク質を介して結合している、アルブミンを企図する。
【０１６２】
その他分子との共役：共役に対して適切な追加の成分及び分子には、例えば、チログロブリン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ポリ（Ｄ−リジン、Ｄ−グルタミン酸）などのポリアミノ酸、ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン、インフルエンザウイルス核タンパク質、Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））、及びＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質ならびに表面抗原、または上記の任意の組み合わせを含む。
【０１６３】
したがって、本開示は、他のポリペプチド（例えば、対象となるポリペプチドに非相同なアミノ酸配列を有するポリペプチド）またはキャリアー分子などの、ポリペプチド配列のＮ−及び／またはＣ終末端での１つ以上の追加の成分または分子の共役を企図する。したがって、例示的なポリペプチド配列は、他の成分または分子との共役体として提供され得る。
【０１６４】
ＩＬ−１０ポリペプチドはまた、タンパク質、セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどの多糖類、ポリグルタミン酸、またはポリリジンなどの高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、不活化ウイルス粒子、ジフテリア、破傷風、コレラ、または白血球毒素分子からの毒素などの不活化細菌毒素、不活化細菌、及び樹状細胞などの、大きな、ゆっくり代謝されるマクロ分子と共役結合して良い。そのような共役結合形態が、仮に望ましいなら、本開示のポリペプチドに対する抗体を産生するために使用され得る。
【０１６５】
共役に対する追加の候補成分及び分子には、単離または精製に適したものを含む。特定の非限定的な例示には、ビオチン（ビオチン−アビジン特異の結合対）、抗体、受容体、配位子、レクチン、または、例えば、プラスチックまたはポリスチレンビーズ、プレートまたはビーズ、磁気ビーズ、試験紙、及び膜を含む、固体支持体を構成する分子などの、結合分子を含む。
【０１６６】
Ｆｃ融合分子：特定の実施形態において、本開示のポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ終末端は、融合共役体（または融合分子）を形成するために、免疫グロブリンのＦｃ領域（例えば、ヒトＦｃ）と融合され得る。Ｆｃ融合共役体は、生物薬剤の体内半減期を増加することが示されており、及びしたがってこの生物薬剤産物は、頻繁な投与を控える必要がある。
【０１６７】
Ｆｃは、血管を並べた内皮細胞で、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、及び結合によって、そのＦｃ融合分子は、分解及びその循環への再放出から保護され、その細胞を、循環に長く保持する。このＦｃ結合は、内因性ＩｇＧを、その長い血漿半減期に留める機構であると考えられている。より最近のＦｃ融合技術は、生物薬剤の単一複製を抗体のＦｃ領域に連結し、その薬物動態、及び古典的なＦｃ融合共役体に比べて、生物薬剤の薬理学的特性を最適化する。
【０１６８】
その他の変成：本開示は、最近公知になった、または将来開発される、１つ以上の特徴を改善するための、ＩＬ−１０のその他の変成の利用を企図する。そのような１つの方法は、ｈｅｓ化によるポリペプチド配列の変成を取り込み、そのポリペプチド配列の性質を改変するために、その他分子に連結させたヒドロキシル澱粉誘導体を活用する。Ｈｅｓ化の多様な態様が、例えば、米国特許出願番号２００７／０１３４１９７及び２００６／０２５８６０７に記述されている。
【０１６９】
本開示はまた、融合タグとしてのＳｍａｌｌ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ（小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ））（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）を含む融合分子を企図する。本明細書に記述のポリペプチドのＳＵＭＯへの融合は、発現の増進、溶解性の向上、及び／または精製法の開発支援を含む、複数の有益な効果を媒介することが可能である。ＳＵＭＯプロテアーゼは、ＳＵＭＯの第三構造を認識し、及びＳＵＭＯのＣ終末端における融合タンパク質を開裂し、したがって望ましいＮ末端アミノ酸を伴った、本明細書に記述のポリペプチドを放出する。
【０１７０】
本開示はまた、ＰＡＳ化（商標）（ＸＬ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧｍｂＨ（Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））の利用を企図する。この技術は、そのタンパク質治療の生物活性に悪影響を与えること無しに、腎臓の糸球体の細孔サイズを超えて、対象となるタンパク質の見掛けの分子サイズを拡大し、その結果そのタンパク質の腎臓のクリアランスを減少させる。
【０１７１】
リンカー：本開示のポリペプチド配列を、変成をするために使用される、前述の成分及び分子のいずれも、任意でリンカーを介して共役結合されて良い。適切なリンカーには、一般的に、変成されたポリペプチド配列と連結された成分及び分子の間での動きを可能にするのに十分な鎖長である、「ｆｌｅｌｉｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒｓ（可動性リンカー）」を含む。このリンカー分子は一般に、約６〜５０原子の鎖長である。このリンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、２〜１０モノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二塩基酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであって良い。適切なリンカーは、容易に選択され得て、及び１つのアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、またはそれ以上のアミノ酸などの、任意の適切な鎖長であり得る。
【０１７２】
可動性リンカーの例示には、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧｍＳｏ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１１）、（ＧｍＳｏＧｍ）ｎ、（ＧｍＳｏＧｍＳｏＧｍ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１２）、（ＧＳＧＧＳｍ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１３）、（ＧＳＧＳｍＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１４）、及び（ＧＧＧＳｍ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１５）、ならびにそれらの組み合わせを含み、ここで、ｍ、ｎ及びｏは、それぞれ独立して、少なくとも１から２０、例えば、１〜１８、２〜１６、３〜１４、４〜１２、５〜１０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の整数から選ばれ）、及びその他の可動性リンカーを含む。グリシン、及びグリシン−セリンポリマーは、相対的に非構造性であり、及びそれ故、成分間の中間的な鎖としての役割を果たすことがある。可動性リンカーの例示には、非限定的に、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１６）、ＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１７）、ＧＳＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１４）、ＧＳＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１８）、ＧＧＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１９）、及びＧＳＳＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２０）を含む。
【０１７３】
可動性リンカーの追加の例示には、グリシンポリマー（Ｇ）ｎまたはグリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１１）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２１）、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２２）を含み、ここでｎ＝１から５０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０である）。例示的な可動性リンカーには、非限定的に、ＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２１）、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２２）、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１６）、ＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１７）、ＧＳＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１２）、ＧＳＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１８）、ＧＧＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１９）、及びＧＳＳＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ番号２０）を含む。これらリンカー配列のマルチマー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、または３０〜５０）は、本明細書に記述のポリペプチドへ、非相同のアミノ酸を共役結合させるために使用される可動性リンカーを与えるために、一緒に連結されて良い。本明細書で記述のように、非相同のアミノ酸配列は、単一配列及び／またはアルブミン、Ｆｃ配列などの、融合パートナーであって良い。
【０１７４】
治療及び予防の用途
本開示は、広範囲の疾患、障害及び／または症状、及び／またはそれらの兆候の治療または予防において、本明細書に記述の当該ＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の利用を企図する。特定の利用が、本明細書で記述される一方で、本開示が、制約を受けないことは、理解されよう。さらに、特定の疾患、障害及び症状の一般的な分類が、これ以降に説明されるが、疾患、障害及び症状のいくつかは、１つ以上の分類の構成体（例えば、がんならびに線維性関連疾患）であって良く、及びその他が、公開されている分類のいずれの構成体でなくても良い。
【０１７５】
線維性疾患及びがん。本開示において、ＩＬ−１０分子は、例えば、子宮、子宮頸部、胸部、前立腺、精巣、消化管（例えば、食道、咽頭、胃、小腸、大腸、または直腸）、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭部または頸部、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳（例えば、神経膠腫）、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）のがん、及び造血系ならびに免疫系(例えば脾臓や胸腺)のがんを含む、増殖性の症状または障害を治療または予防するために、使用され得る。本開示はまた、例えば、免疫腫瘍、非免疫腫瘍、休眠腫瘍、ウイルスによるがん(例えば、上皮細胞がん、内皮細胞がん、扁平上皮がんおよび乳頭腫)、腺がん、リンパ腫、上皮性悪性腫瘍、黒色腫、白血病、骨髄腫、肉腫、奇形がん、化学的誘発のがん、転移がん、及び血管新生を含む、その他のがん関連疾患、障害または症状を治療しもしくは予防する方法を提供する。この開示は、例えば、制御性Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を調節することによって、腫瘍細胞またはがん細胞の耐性を低下させることを企図する（例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｍｏｎｔａｇｕｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１８０−８７、及びＳａｗａｙａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：１５０１−０９が参照される）。特定の実施形態において、当該腫瘍またはがんは、大腸がん、卵巣がん、乳がん、黒色腫、肺がん、膠芽細胞腫、または白血病である。用語（複数可）のがん関連疾患、障害及び症状の使用は、例えば、血管新生及び形成異常などの前がん症状を含む、がんに直接的または間接的に関連する、広範囲の症状を指すことを意味している。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、本開示は、増殖的な症状、がん、腫瘍、または前がん的症状を、ＩＬ−１０分子、及び本明細書の他の場所で説明される例示にある、少なくとも1つの追加の治療用また診断用薬剤で、治療する方法を提供する。
【０１７７】
循環器疾患。特定の実施形態において、本開示は、高コレステロール血症及び異常脂質プロファイルに起因する、循環器疾患、障害及び症状、ならびにそれらに付随する障害を治療し及び／または予防するために、本明細書に記述のＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の使用を企図する。
【０１７８】
本明細書で使用する用語「ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ（循環器疾患）」、「ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ（心疾患）」などは、循環器系、主に心疾患、脳及び腎臓の血管疾患、ならびに末梢動脈疾患に影響を及ぼす、任意の疾患を指す。循環器疾患は、冠状動脈性心疾患（例えば、虚血性心疾患または冠血管疾患）、アテローム性動脈硬化症、心筋症、高血圧症、高血圧性心疾患、肺性心、不整脈、心内膜炎、脳血管疾患、及び末梢動脈疾患を含む、一連の疾患である。循環器疾患は、世界的に死亡の主原因であり、及び一方で、それは通常、高齢者、循環器疾患の前歴者、若年期に始まる、特にアテローム性動脈硬化症に影響を与える。
【０１７９】
本開示で特に企図されるのは、当該循環器疾患が、高脂血症（または高リポタンパク血症）、血液内の異常に上昇したレベルの脂質及び／またはリポタンパク質によって特徴付けられる症状を含む場合の実施形態である。高脂血症の非限定的な例示には、脂質異常症、高コレステロール血症（例えば、家族性高コレステロール血症）、高グリセリド血症、高トリグリセリド血症、高リポタンパク血症、高カイロミクロン血症、及び高脂血症との組み合わせを含む。高リポタンパク血症には、例えば、高リポタンパク血症Ｉａ型、高リポタンパク血症Ｉｂ型、高リポタンパク血症Ｉｃ型、高リポタンパク血症ＩＩａ型、高リポタンパク血症ＩＩｂ型、高リポタンパク血症タイプＩＩＩ型、高リポタンパク血症タイプＩＶ型、及び高リポタンパク血症タイプＶ型を含む。
【０１８０】
血栓症及び血栓症状。その他の実施形態において、本開示は、高コレステロール血症及び異常脂質プロファイルに起因する、血栓症及び血栓症疾患、障害ならびに症状、同時にそれらに付随する障害を治療し及び／または予防するために、本明細書に記述のＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の使用を企図する。
【０１８１】
血栓症は一般に、静脈または動脈によって分類され、その各々は、複数の亜類型で示され得る。静脈血栓症には、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、門脈血栓症、腎静脈血栓症、頚静脈血栓症、バッド−キアリ症候群、パジェット−シュロッター病、及び脳静脈洞血栓症を含む。動脈血栓症には、脳卒中及び心筋梗塞を含む。
【０１８２】
免疫性及び炎症性症状。本明細書で使用する用語「ｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ（免疫性疾患）」、「ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（免疫性症状）」、「ｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ（免疫性障害）」、「ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ（炎症性疾患）」、「ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（炎症性症状）」、「ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ（炎症性障害）」などは、任意の免疫または炎症関連症状（例えば、病理学的炎症及び自己免疫疾患）を幅広く含むことを意味する。そのような症状はしばしば、その他の疾患、障害及び症状と密接に絡み合っている。例を挙げると、「ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（免疫性症状）」が、感染症（急性および慢性）、腫瘍、及び免疫系による根絶に抵抗するがんを含む、がん、腫瘍、及び血管新生などの、増殖的症状を指して良い。
【０１８３】
例えば、炎症性サイトカインによって引き起こされることがある、免疫及び炎症関連疾患、障害及び症状の非限定的な一覧には、関節炎（例えば、関節リウマチ）、腎不全、紅斑性狼瘡、エリテマトーデス、喘息、乾癬、大腸炎、膵炎、アレルギー、線維症、外科的合併症 （例えば、炎症性サイトカインが治癒を妨げる）、貧血、及び線維筋痛症を含む。慢性炎症と関連していることがあるその他の疾患及び障害には、うっ血性心不全、脳卒中、大動脈弁狭窄、動脈硬化症、骨粗鬆症、感染症、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍大腸炎）、アレルギー性接触皮膚炎及びその他の湿疹、全身性硬化症、移植手術、多発性硬化症及び神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病ならびにパーキンソン病）を含む。
【０１８４】
本開示には、本明細書に記述のＩＬ−１０物質（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）が、非限定的に、バージャー病（閉塞性血栓血管炎）、脳血管炎（中枢神経系血管炎）、チャーグ −シュトラウス動脈炎、クリオグロブリン血症、本態クリオグロブリン血管炎、巨大細胞（時間的）動脈炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、過敏性血管炎（アレルギー性血管炎）、川崎病、顕微鏡的多発動脈炎／血管炎、結節性多発動脈炎、多発リウマチ（ＰＭＲ）、リウマチ性血管炎、高安動脈炎、血栓性静脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、及び全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、再発軟骨、ベーチェット病、または他の結合組織傷害のような、結合組織障害に続発する血管炎、ならびにウイルス感染に続発する血管炎を含む、血管炎症の治療及び／または予防に使用される場合の実施形態を含む。
【０１８５】
その他の実施形態は、心内膜炎、炎症性心肥大、及び心筋炎を含む、炎症性心疾患を指向する。
【０１８６】
ウイルス疾患。本開示は、ＩＬ−１０を伴う治療が有益な可能性がある、任意のウイルス疾患、障害または症状の治療及び／または予防に、当該ＩＬ−１０ポリペプチドの使用を企図する。企図されるウイルス疾患、障害及び症状の例示には、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を含む。
【０１８７】
多数のウイルス疾患（例えば、ＨＩＶ）の治療には、異なる作用機構を介して作用する薬剤を含んで、薬剤の組み合わせの投与を含み、及び本開示は、そのような組み合わせ治療の成分として、当該ＩＬ−１０ポリペプチドの使用を企図する。
【０１８８】
線維性疾患：本開示はまた、線維性疾患、傷害及び症状を治療または予防する方法を提供する。本明細書で使用する語句「ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（線維性疾患、傷害及び症状）」、及び同様の用語（例えば、「ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（線維性障害）」及び語句は、それが線維状組織または瘢痕組織（例えば、１つ以上の組織における線維症）をもたらす可能性がある任意の症状を含むように、広範囲に構成される。例を挙げると、瘢痕組織になる可能性のある損傷（例えば、傷）には、皮膚、目、肺、腎臓、肝臓、中枢神経系、及び心血管系の傷を含む。この語句にはまた、脳卒中に起因する瘢痕組織形成、及び、例えば、傷害や手術の結果もたらされる組織密着を包含する。
【０１８９】
本明細書で使用する用語「ｆｉｂｒｏｓｉｓ（線維症）」は、臓器または組織の通常の構成要素としてではなく、修復または反応性プロセスとしての繊維状組織の形成を指す。線維症は、任意の特定組織における、通常の沈着を超えた、線維芽細胞の蓄積及びコラーゲン沈着によって、特徴付けられる。
【０１９０】
線維性疾患には、非限定的に、創傷治癒から生じる線維症、全身及び局所強皮症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺の炎症及び線維症、特発性肺線維症、間質性肺疾患、肝臓の肝硬変、慢性Ｂ型またはＣ型肝炎の感染結果としての線維症、腎臓病（例えば、糸球体腎炎）、瘢痕組織に起因する心臓病、ケロイド及び肥大傷跡、ならびに黄斑変性症などの眼病、及び網膜ならびにガラス質の網膜症を含む。追加の線維性疾患には、化学療法薬による線維症、放射線誘起線維症、及び怪我や火傷を含む。
【０１９１】
線維性疾患は、しばしば肝臓に関連し、及びしばしばこのような疾患間の結合体、ならびに肝細胞及びクッパー細胞内に、肝臓コレステロールおよびトリグリセリドの不適当な蓄積がある。この蓄積は、肝臓を線維症及び肝硬変に導く、プロ炎症反応をもたらすように思われる。線維状成分を有する肝疾患には、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む。ＮＡＦＬＤは、脂肪症（肝臓における脂肪蓄積）が、アルコールの過剰摂取によらないで、存在する場合に、引き起こされる。それは、インシュリン耐性及びメタボリック症候群に関連している。ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤの最も極端な形態であり、及び原因不明の肝臓の肝硬変の主要因であるとみなされている。
【０１９２】
医薬組成物
本開示のＩＬ−１０ポリペプチドは、対象者への投与に適した組成物の形態であって良い。一般に、そのような組成物は、ＩＬ−１０、及び１つ以上の薬学的に許容される、または生理的に許容される希釈剤、キャリアーもしくは賦形剤を含む、「ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ（医薬組成物）」である。特定の実施形態において、当該ＩＬ−１０ポリペプチドは、治療に許容される量で存在する。この医薬組成物は、本開示の方法に使用されて良く、したがって、例えば、当該医薬組成物は、本明細書に記述される治療及び予防法を実践するために、対象者へインビトロまたはインビボで投与され得る。
【０１９３】
本開示の医薬組成物は、意図する方法または投与経路に適合するように処方化され得て、投与の例示的な経路が、本明細書で説明される。さらに、当該医薬組成物は、本開示で企図される疾患、傷害及び症状を治療または予防するために、その他の治療用の活性薬剤または本明細書に記述の成分と組み合わせて使用されて良い。
【０１９４】
当該医薬組成物には、通常本開示で企図されるＩＬ−１０ポリペプチド、及び１つ以上の薬学的及び生理学的に許容される処方薬剤の、治療に効果的な量を含む。適切な薬学的に許容され及び生理学的に許容される希釈剤、キャリアーまたは賦形剤には、非限定的に、酸化防止剤（アスコルビン酸及び硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルまたはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸）、乳化剤、懸濁剤、分散剤、溶剤、充填剤、増量剤、洗浄剤、緩衝液、担持体、希釈剤、及び／または補助剤を含む。例えば、適切な担持体には、非経口投与のための医薬組成物に普通に使用される、その他材料で可能な限り補充された、生理食塩液またはクエン酸緩衝生理食塩水を含む。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンを混合した生理食塩水は、さらに模範的な担持体である。当業者は、当該医薬組成物及び本明細書で企図される投薬形態で使用が可能な、多様な緩衝剤を容易に認めるであろう。典型的な緩衝剤には、非限定的に、薬学的に許容される弱酸、弱塩基、またはそれらの混合物を含む。例示として、当該緩衝剤成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びそれらの塩などの、水溶性物質であり得る。許容される緩衝剤には、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、及びＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）を含む。
【０１９５】
医薬組成物が、処方化された後に、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、無菌のバイアル瓶内で保管されて良い。そのような処方物は、すぐに使える形態、使用前に再構成が必要な凍結乾燥形態、使用する前に希釈を必要とする液体形態、または他の許容される形態での、いずれかで保管されて良い。いくつかの実施形態において、当該医薬組成物は、１回使用の容器（例えば、１回使用のバイアル瓶、アンプル、注射器、または自己注射器（例えば、ＥｐｉＰｅｎ（登録商標）に類似のもの））で提供される一方で、複数回使用の容器（例えば、複数回使用のバイアル瓶）が、その他の実施形態において提供される。インプラント（例えば、埋込ポンプ）、及びカテーテルシステム、低速の注入ポンプおよび装置を含む、任意の薬剤送達装置が、ＩＬ−１０の送達に使用されて良く、それらの全ては、当業者には公知である。デポ注射は、一般的に皮下または筋肉投与されるが、一定期間にわたって、本明細書に開示されたポリペプチドを放出するために利用することも可能である。デポ注射は通常、固体またはオイルベースのいずれかであり、及び一般的には、本明細書で説明される処方成分の少なくとも１つを含む。当業者は、デポ注射に可能な処方物及び応用に精通している。
【０１９６】
当該医薬組成物は、無菌の注入可能な水性または油性懸濁液であって良い。この懸濁液は、本明細書に記載の、分散または湿潤剤及び懸濁剤として適切なものを使用して、公知の技術に従って処方化されて良い。無菌の注射可能な調合物はまた、無毒性の非経口用に許容される希釈剤または溶媒、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液内における、滅菌注射液または懸濁液であっても良い。取り入れられ可能性のある、許容される希釈剤、溶媒及び分散液媒体には、水、リンガー溶液、等張性ナトリウム塩化物溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール）、及びそれらの適切な混合物を含む。さらに、滅菌の固定油は、従来、溶剤又は懸濁媒体として採用されている。この目的に対しては、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意ブランドの固定油が、取り入れられて良い。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調合に適用されていることが見出せる。特定の注射処方物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含むことによって達成することができる。
【０１９７】
有効成分を含む当該医薬組成物は、経口利用、例えば、錠剤、カプセル、トローチ、のど飴、水性または油性懸濁液、分散性の粉または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、またはシロップ、溶液、微小粒子もしくはエリキシル剤に適した形態であって良い。特定の実施形態において、本明細書に記述のＩＬ−１０物質と一緒に投与される薬剤の有効成分は、経口利用に適した形態である。経口利用を意図した医薬組成物は、医薬組成物の製造に対応した、当技術分野で公知の任意の方法に従って調合されて良く、及びそのような組成物は、薬学的に洗練されていて、ならびに口当たりの良い調合物を提供するために、例えば、甘味料、香料、着色剤、及び保存料などの、１つ以上の薬剤を含んで良い。錠剤、カプセルなどは、錠剤の製造に適した、無毒の薬学的に許容される賦形剤との混和物内に、その有効成分を含む。これら賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム、例えば、トウモロコシ澱粉、またはアルギン酸などの造粒および崩壊剤、例えば、澱粉、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、及び例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑剤であって良い。
【０１９８】
経口投与に適した錠剤、カプセルなどは、消化管での崩壊と吸収を遅らせ、及びそれによって持続的な作用を提供するために、既存技術によって無被覆または被覆されて良い。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの遅延剤が、取り入れられて良い。それらはまた、制御された放出に対応した、浸透性の治療用錠剤を形成するために、当技術分野で公知の技術で被覆されて良い。追加の薬剤には、投与された組成物の送達を制御するために、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ無水物、グリコール酸、エチレン−ビニル酢酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、またはラクチド／グリコリド共重合体、乳酸／グリコリド共重合体、もしくはエチレンビニル酢酸共重合体などの、生分解性または生体適合性粒子もしくは高分子物質を含む。例えば、当該経口薬剤は、液滴形成技術によって、または界面重合により、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルもしくはポリ（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｏｌａｔｅ（メチルメタクロレート））マイクロカプセルをそれぞれ使用することによって、またはコロイド薬剤送達システムで調合されたマイクロカプセルに、封入することができる。コロイド分散系には、マクロ分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、マイクロビーズ、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質系を含む。上記処方物の調合法は、当業者には明確であろう。
【０１９９】
経口利用に対応した処方物はまた、その有効成分が、不活性な固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンまたは微結晶セルロースと混合されて、硬質ゼラチンカプセルとして、またはその有効成分が、水またはオイル媒体、例えば、ピーナッツオイル、流動パラフィン、またはオリーブオイルと混合されて、軟質ゼラチンカプセルとして存在して良い。
【０２００】
水性懸濁液は、その製造に適した賦形剤を伴った混和物内に、その有効成分を含む。そのような賦形剤には、懸濁剤として、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアカシアガムを、分散または湿潤剤として、例えば、天然由来するリン脂質（例えば、レシチン）、またはアルキレンオキシドの、脂肪酸との縮合物（例えば、ポリオキシエチレンステアリン酸）、またはエチレンオキサイドの、長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、もしくはエチレンオキサイドの、脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトール・モノオレート）、またはエチレンオキシドの、脂肪酸及びエキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合物（例えば、ポリエチレンソルビタン・モノオレート）を含む。この水性懸濁液はまた、１つ以上の防腐剤を含んで良い。
【０２０１】
油性懸濁液は、その有効成分を植物油中で、例えば、ラッカセイ油、オリーブオイル、ごま油またはココナッツオイル、もしくは液状パラフィンなどの鉱物油中で懸濁されて、処方化されて良い。当該油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、ハードパラフィン、またはセチルアルコールを含んで良い。前述で説明されたものなどの甘味料、及び香料は、口当たりの良い経口調合物を提供するために添加されて良い。
【０２０２】
水の添加による水性懸濁液の調合に適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤及び１つ以上の防腐剤を伴う混和物内に、有効成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤、及び懸濁剤が、本明細書に例示される。
【０２０３】
本開示の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であって良い。油性相は、植物油、例えばオリーブ油やラッカセイ油、又は鉱油、例えば、液状パラフィン、又はそれらの混合物であって良い。適切な乳化剤は、天然由来のガム、例えば、ガムアカシアやトラガントガム、天然由来のリン脂質、例えば、大豆、レシチン、及び脂肪酸から得られるエステルまたは部分エステル、ヘキシトール無水物、例えば、ソルビタンモノオレート、エチレンオキサイドと部分エステルの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートであって良い。
【０２０４】
処方物はまた、インプラント、リポソーム、ハイドロゲル、プロドラッグ及びマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御処方物などの、急速な分解または体内からの排除から、その組成物を保護するキャリアーを含むことができる。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質が、単独で、又はワックスと組み合わせて、採用されて良い。
【０２０５】
本開示は、直腸投与用座薬の形態における当該ＩＬ−１０ポリペプチドの投与を企図する。この座薬は、常温で固体であるが、直腸温度では液体であり、及びしたがって、薬を解放するために直腸で溶ける、適切な非刺激性の賦形剤と、この薬剤を混合することによって調合され得る。そのような物質には、非限定的に、ココアバター及びポリエチレングリコールを含む。
【０２０６】
本開示により企図される、当該ＩＬ−１０ポリペプチドは、現在公知の、または将来開発される、その他の適当な医薬組成物（例えば、鼻または吸入用スプレー）の形態であって良い。
【０２０７】
処方物内のポリペプチドまたはその断片の濃度は、幅広く（例えば、重量で約０．１％未満から、通常、少なくとも約２％より多く、２０％から５０％またはそれ以上）変動でき、通常、主に液体容積、粘度、及び、例えば、選択される特定の投与モードに従って、対象者に応じた要因に基づいて選択される。
【０２０８】
投与の経路
本開示は、任意の適切な方法で行う、ＩＬ−１０（例えば、ＩＬ−１０ポリペプチド）の投与、及びそれらの組成物を企図する。適切な投与経路には、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、皮下（例えば、注射またはインプラント）、腹腔内、嚢内、関節内、腹腔内、脳内（実質内）及び脳室内）、経口、鼻口、膣内、舌下、眼球内、直腸内、局所（例えば、経皮吸収）、舌下及び吸入を含む。デポ注射は、一般的に皮下または筋肉投与されるが、本明細書に開示される当該ＩＬ−１０ポリペプチドを、一定期間にわたって放出するために利用されて良い。
【０２０９】
本開示の特定の具体的な実施形態は、非経口投与を企図する。いくつかの特定の実施形態において、この非経口投与は、静脈内であり、及びその他の特定の実施形態において、当該非経口投与は、皮下である。
【０２１０】
併用療法
本開示は、１つ以上の活性治療薬剤（例えば、サイトカイン）またはその他の予防または治療用手段（例えば、放射線）との組み合わせで、ＩＬ−１０分子の使用を企図する。このような併用療法において、多様な活性薬剤は、しばしば相補的な作用機構を有する。このような併用療法は、１つ以上の薬剤の用量低減を可能にするために特に有利であり、その結果、１つ以上の薬剤に関連する悪影響を、低減または排除することができる。さらに、このような併用療法は、基礎疾患、障害、または病態に対する、相乗的な治療または予防効果を有することがある。
【０２１１】
本明細書で使用する「ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（併用）」とは、別々に投与することができる、例えば、分別投与（例えば、キットで与えられて良い）に対して、別々に処方化されたと治療、及び１つの処方物（すなわち、「ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（共処方物）」で一緒に投与することができる療法を含むこと意味する。
【０２１２】
特定の実施形態において、当該ＩＬ−１０ポリペプチド及び１つ以上の活性治療薬剤、またはその他の予防もしくは治療用手段が、順次に投与または適用され、例えば、ここで１つの薬剤が、１つ以上のその他の薬剤に先立って投与される。その他の実施形態において、当該ＩＬ−１０ポリペプチド及び１つ以上の活性治療薬剤、またはその他の予防または治療的手段が、同時に投与され、例えば、ここで２つ以上の薬剤が、同時にまたはほぼ同時に投与され、その２つ以上の薬剤が、２つ以上の別個の処方物に、または１つの処方物（すなわち、共消泡製剤）に組み合わされて、存在して良い。２つ以上の薬剤が順次又は同時に投与されるか否かにかかわらず、それらは、本開示の目的に対応して、併用での投与が考慮される。
【０２１３】
本開示の当該ＩＬ−１０ポリペプチドは、その状況に適した任意の方法で、少なくとも１つのその他の（活性）薬剤との併用で、使用されて良い。１つの実施態様において、少なくとも１つの活性薬剤、及び少なくとも１つの本開示のＩＬ−１０ポリペプチドによる治療が、一定期間にわたって維持される。別の実施形態において、少なくとも１つの活性薬剤を用いた治療が、減少または中止され（例えば、対象者が安定した場合）、一方で本開示の当該ＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療が、一定した投薬計画で維持される。さらなる実施形態において、少なくとも１つの活性薬剤を用いた治療が、低減または中止され（例えば、対象者が安定した場合）、一方で本開示の当該ＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療が、低減される（例えば、より低い用量、頻度の少ない投薬または短い治療計画）。さらに別の実施形態において、少なくとも１つの活性薬剤を用いた治療が、低減または中止され（例えば、対象者が安定した場合）、一方で本開示の当該ＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療が、増加される（例えば、より高い用量、より頻繁な投薬または長期の治療計画）。さらに別の実施形態において、少なくとも１つの活性薬剤を用いた治療が維持され、一方で本開示の当該ＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療が、低減または中止される（例えば、より低い用量、頻度の少ない投薬または短い治療計画）。さらに別の実施形態において、少なくとも１つの活性薬剤を用いた治療、及び少なくとも１つの本開示のＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療が、低減または中止される（例えば、より低い用量、頻度の少ない投薬または短い治療計画）。
【０２１４】
本明細書に開示された当該ＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）との併用で使用するのに適した特定の薬剤は、以下のとおりであるが、本開示は、それらに限定されないことは理解されよう。これ以降、特定の薬剤が、例示的な疾患、疾患および症状の特定分類で説明されるが、しかしならが、１つ以上の分類（例えば、特定の薬剤は、心血管と抗炎症作用の両方を持っている可能性がある）の間で、しばしば重複があることは、理解されよう。
【０２１５】
線維性疾患及びがん。本開示は、増殖症状、線維状疾患、障害、または症状、がん、腫瘍、または前がん疾患、障害または症状を、ＩＬ−１０分子、及び少なくとも１つの追加の治療または診断薬剤で、治療及び／または予防するための方法を提供する。
【０２１６】
化学療法薬の例示には、非限定的に、アルキル化剤、アルキルスルホン酸塩、アジリジン、エチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、窒素マスタード、ニトロソウレア、抗生物質、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、アンドロゲン、抗アドレナル、葉酸補充剤、ヒドロキシウレア、デシン、ダカルバジン、マンノムスチン、アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、プラチナおよびプラチナ調整錯体、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、ＣＰＴ１１、トポイソメラーゼ阻害剤、カペシタビン及び抗ホルモン剤、抗アンドロゲン、ホルモン及び関連したホルモン剤、及び上記のいずれかの、薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含む。
【０２１７】
当該ＩＬ−１０ポリペプチドとの併用で使用されて良い、追加の治療手段には、ＩＬ−１２などの、サイトカインまたはサイトカイン拮抗剤、ＩＮＦα、または抗表皮成長因子受容体、放射線治療、別の腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体と毒素の複合体、Ｔ細胞補助剤、骨髄移植、または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞療法）を含む。本明細書には、ワクチン（例えば、可溶性タンパク質として、またはそのタンパク質をコードする核酸として）も提供される。本開示は、上記のいずれかの、薬学的に許容される塩、酸又はその誘導体を包含する。
【０２１８】
コレステロール恒常性剤。本開示の特定の実施形態は、コレステロール恒常性に関連する薬剤とＩＬ−１０ポリペプチドとの併用を含む。これらの薬剤の多くは、吸収、合成、輸送、貯蔵、異化、及びコレステロールの排泄に関わる異なる経路を標的とし、及び併用療法に対して特に有用な候補である。
【０２１９】
高コレステロール血症（及びしたがって、例えば、しばしばアテローム性動脈硬化症）の治療に対応する、併用療法に有用な治療薬の例示には、スタチン、胆汁酸レジン（金属イオン封鎖剤）、エゼチミブ（ＺＥＴＩＡ）、フィブリン酸（例えば、ＴＲＩＣＯＲ）及びフィブラート系薬剤、ナイアシン（例えば、ＮＩＡＣＯＲ）、コレステロール吸収阻害剤、脂肪吸収阻害剤、ＰＣＳＫ９調整因子、及び／または前述したものの組み合わせ（例えば、ＶＹＴＯＲＩＮ（シンバスタチンを伴うエゼチミブ）を含む。本明細書に記述する当該ＩＬ−１０ポリペプチドとの併用で使用する、候補となる可能性のある代替コレステロール治療法には、様々な栄養補助食品及びハーブ（例えば、ニンニク、ポリコサノール、グックル）を含む。
【０２２０】
本開示は、前述の任意の、薬学的に許容される塩、酸または誘導体を包含する。
【０２２１】
免疫性及び炎症性症状。本開示は、免疫及び／または炎症関連疾患、傷害及び症状を治療、ならびにそれらに関連する障害を、ＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）及び免疫及び／または炎症関連特性を有する、少なくとも１つの追加の薬剤で、治療及び／または予防するための方法を提供する。例を挙げると、ＩＬ−１０ポリペプチドは、炎症性成分を有する心血管障害において、薬効を有する薬剤と共に、投与されて良い。
【０２２２】
併用療法に有用な治療薬の例示には、非限定的に、非ステロイド性抗炎症薬、酢酸誘導体、フェナム酸誘導体、ビフェニルカルボン酸誘導体、オキシカム、サリチル酸塩、及びピラゾロンを含む。その他の組み合わせには、選択的シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤、選択的シクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ１）阻害剤、および非選択的シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤を含む。
【０２２３】
併用に対応するその他の活性薬剤には、本ＩＬ−１０ポリペプチドとの併用で患者を治療する際に必要な用量の、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ベータメタゾン、デキサメタゾン、またはヒドロコルチゾンなどの、ステロイドを含む。
【０２２４】
例えば、リウマチ性関節炎の治療に対して併用される活性薬剤の追加の例示には、サイトカイン抑制抗炎症薬（複数可）（ＣＳＡＩＤｓ）、その他のヒトサイトカインまたは増殖因子への抗体またはその拮抗薬、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、またはＰＤＧＦを含む。
【０２２５】
活性薬剤の特定の組み合わせは、自己免疫及びその後の炎症カスケードにおいて、異なる時点で干渉して良く、及びＴＮＦ拮抗薬様キメラ、ヒト化またはヒトＴＮＦ抗体、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、抗ＴＮＦ抗体断片（例えば、ＣＤＰ８７０）、及び可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、それらの誘導体、ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥＮＢＲＥＬ．）またはｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（ＬＥＮＥＲＣＥＰＴ）、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）、及びまた、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤を含み、同様にＩＬ−１阻害剤（例えば、インターロイキン−１−変換酵素阻害剤）が有効である可能性がある。その他の組み合わせには、インターロイキン１１、抗−ｐ７ｓおよびＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）を含む。本明細書に記載の当該ＩＬ−１０ポリペプチドとの併用に有用な薬剤のその他の例示には、インターフェロン-β１ａ（ＡＶＯＮＥＸ）、インターフェロン−β１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ）、コパキソン、高圧酸素、静脈内免疫グロブリン、クラドリビン、及びその他のヒトサイトカインまたは増殖因子への抗体またはその拮抗薬（例えば、ｃｄ４０リガンド及びＣＤ８０への抗体）を含む。
【０２２６】
本開示は、上記のいずれかの、薬学的に許容される塩、酸またはその誘導体を包含する。
【０２２７】
抗糖尿病及び抗肥満剤。コレステロール関連疾患（複数可）の薬理治療を必要とする一部の患者はまた、抗糖尿病及び／または抗肥満用の薬剤を服用している。本開示は、１）インスリン、インスリン模倣薬及びインスリン分泌の刺激を引き起こす薬剤、２）グルコース利用の促進、肝グルコース産生量の減少、及び／または腸でのブドウ糖出力の減少に作用する、ビグアニド及びその他の薬剤、３）腸から炭水化物の消化及びその結果吸収を遅くし、ならびに食後の高血糖を低減する、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤及びその他の薬剤、４）チアゾリジン、５）ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１作動薬ならびに類似体を含む、グルカゴン様ペプチド、及び６）ＤＰＰ−ＩＶ−耐性類似体（インクレチン模倣体）、ＰＰＡＲガンマ作動薬、二面作用ＰＰＡＲ作動薬、汎作用ＰＰＡＲ作動薬、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、ＳＧＬＴ阻害剤、インスリン分泌促進剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤、免疫調整因子、ベータ−３アドレナリン受容体作動薬、１１ベータ−ＨＳＤ１阻害剤、アミリン類似体、及び核受容体結合剤（例えば、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）結合剤、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）結合剤、肝臓 Ｘ受容体（ＬＸＲ）結合剤、及びビタミンＤ結合剤）を含む、多数の抗糖尿病剤 （及びそれらの分類）を伴う、併用療法を熟考する。
【０２２８】
さらに、本開示は、代謝を刺激し、または食欲を減退させる薬剤、及び減量を促進するための食事療法及び／または運動療法を改良した、減量促進のための薬剤及び方法を伴った併用療法を企図する。
【０２２９】
本開示は、上記のいずれかの、薬学的に許容される塩、酸又はその誘導体を包含する。
【０２３０】
投薬
本開示のＩＬ−１０ポリペプチドは、例えば、その投与の目的（例えば、望ましい解決の程度）、対象者の年齢、体重、性別、健康及び体調、投与経路、及びその疾患、障害、症状またはそれらの兆候の性質に応じた量で、対象者へ投与されて良い。この投薬計画はまた、その薬剤の投与に関連したいかなる悪影響の存在、性質、及び範囲をも考慮に入れて良い。効果的な投薬量及び投薬計画は、例えば、 安全性及び用量増加試験、インビボ研究（例えば、動物モデル）、ならびに当業者に公知のその他の方法から、容易に決定され得る。
【０２３１】
一般的に、投薬パラメーターは、その投薬量が、その対象者にとって不可逆的な毒性になる可能性がある量（すなわち、最大許容用量、「ＭＴＤ」）未満であって、及びその対象者における測定可能な効果を生み出すために必要な量よりも少なくない、投薬量であることを指示する。そのような量は、例えば、投与の経路及びその他の要因を考慮に入れている、ＡＤＭＥに関連する、薬物動態的及び薬学的パラメーターによって決定される。
【０２３２】
有効用量（ＥＤ）は、その投与を受けている対象者の一部において、治療応答または望ましい効果を生み出す薬剤の用量または分量である。薬剤の「ｍｅｄｉａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ（平均有効用量）」またはＥＤ５０は、それが投与されている対象者集団の５０％において、治療応答または望ましい効果を生み出す薬剤の用量または分量である。このＥＤ５０は、一般的に薬剤効果の合理的な予期値の尺度として使用されるが、それは必ずしも、臨床医が、すべての関連する要因を考慮して適切とみなす可能性のある用量ではない。したがって、いくつかの状況においては、その有効量は、算出されたＥＤ５０を上回り、その他の状況においては、その有効量は、算出されたＥＤ５０未満であり、及びさらにその他の状況においては、その有効量は、算出されたＥＤ５０と同じである。
【０２３３】
さらに、本開示のＩＬ−１０ポリペプチドの有効用量は、対照者に対して１回以上投与した場合、健常者と比べて望ましい結果を生じる量であって良い。例えば、特定の障害を経験している対象者に対しては、有効用量は、その障害の診断パラメーター、尺度、マーカーなどを、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または９０％以上、改善させるものであって良く、ここで１００％が、正常な対象者によって表される、診断パラメーター、尺度、マーカーなどとして定義される。
【０２３４】
ＩＬ−１０ポリペプチドがＰＥＧ−ＩＬ−１０である場合、本明細書に記載される疾患、障害または症状を治療するために必要なＰＥＧ−ＩＬ−１０の量は、共役タンパク質のＩＬ−１０活性に基づき、前述のように、当技術分野で公知のＩＬ−１０活性アッセイによって決定することができる。例を挙げると、腫瘍との関連においては、適切なＩＬ−１０活性には、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍部位への浸潤、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＲＡＮＫ−Ｌなど、これらの浸潤細胞からの炎症性サイトカインの発現、生体サンプル中のＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γの上昇したレベルを含む。
【０２３５】
多くの薬剤のように、静脈内へのＩＬ−１０投与は、２コンパートメント運動モデルと関連付けられる（Ｒａｃｈｍａｗａｔｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１（１１）：２０７２−７８を参照）。血漿中の薬物濃度は、多段階の指数関数的方法で減少する。静脈内投与直後は、薬剤は、急速に初期空間全体に分散し（最小血漿量として定義されている）、及び次いで、血管空間（例えば、特定組織）へのゆっくりとした、平衡的な分布が発生する。皮下での組み換えｈＩＬ−１０の薬物動態についてもまた、検討された（Ｒａｄｗａｎｓｋｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５（１２）：１８９５−１９０１）。適切なＩＬ−１０投薬関連パラメーターを評価する場合、体積分布及びその他の薬物動態学的な考慮が適している。さらに、ＩＬ−１０薬物動態及び投薬原則の活用は、特定の細胞種へのＩＬ−１０物質を標的とする効果の達成にとって、貴重な証明となることがある（例えば、Ｒａｃｈｍａｗａｔｉ，Ｈ．（Ｍａｙ  ２００７）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｔ．３５（５）：８１４−２１を参照）。
【０２３６】
本開示は、望ましい治療結果をもたらす、任意の用量および投薬計画の投与を企図する。例を挙げると、非限定的に、その対象者がヒトの場合、非ペグ化ｈＩＬ−１０は、０．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、１．０μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、２．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、７．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、１０．０μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、１２．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、１５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、１７．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、２０μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、２２．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、２５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、３０μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、または３５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、投与されて良い。さらに、例を挙げると、非限定的に、その対象者がヒトの場合、比較的小さなＰＥＧ（例えば、５ｋＤＡのモノ−ジ−ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０）を含む、非ペグ化ｈＩＬ−１０は、０．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、０．７５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、１．０μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、１．２５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、１．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、１．７５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、２．０μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、２．２５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、２．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、２．７５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、３．０μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、３．２５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、３．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、３．７５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、４．０μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、４．２５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、４．５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、４．７５μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、または５．０μｇ／ｋｇ／日を上回る用量で、投与されて良い。
【０２３７】
ＰＥＧ−ＩＬ−１０の治療に効果的な量は、約０．０１から約１００μｇのタンパク質／ｋｇ体重／日の、約０．１から約２０μｇのタンパク質／ｋｇ体重／日の、約０．５から約１０μｇのタンパク質／ｋｇ体重／日の、約１から約４μｇのタンパク質／ｋｇ体重／日の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、約５０から８００μｇのタンパク質／ｋｇ体重／日（例えば、約１から１６μｇのタンパク質／ｋｇ体重／日のＰＥＧ−ＩＬ−１０）を送り届ける、継続した点滴によって投与される。この点液速度は、例えば、悪影響や血球数の評価に基づいて変動して良い。
【０２３８】
経口剤の投与のため、当該組成物は、その有効成分の１．０から１０００ミリグラムを、特にその有効成分の１．０、３．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０、及び１０００．０ミリグラムを含む、錠剤、カプセルなどの形態で提供することができる。
【０２３９】
特定の実施形態において、開示されたＩＬ−１０ポリペプチドの投与量（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）は、「ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ（単位投与形態）」に含まれる。語句「ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ（単位投与形態）」は、物理的な離散単位であり、単独でまたは１つ以上の追加の薬剤と組み合わせて、望ましい効果を生み出すのに十分な、本開示の所定量のＩＬ−１０ポリペプチド含む各単位を指す。単位投与形態のパラメーターは、その特定薬剤及び達成される効果に依存するであろうことは、理解されよう。
【０２４０】
キット
本開示はまた、ＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）、及びその薬学的に許容される組成物を含むキットを企図する。このキットは一般に、以下の記述する各種成分を収容した物理的構造の形態であり、及び例えば、前述した方法（例えば、コレステロール恒常性の回復を必要とする対象者へのＩＬ−１０ポリペプチドの投与）を実施する際に利用されて良い。
【０２４１】
キットは、本明細書に開示された１つ以上のＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、無菌容器で提供される）を含むことができ、これは対象者への投与に適した医薬組成物の形態であって良い。当該ＩＬ−１０ポリペプチドは、使用の準備ができている形態で、または投与前に、例えば、再構成もしくは希釈などに必要な形態にして、提供され得る。当該ＩＬ−１０ポリペプチドが、ユーザーによって再構成される必要がある形態の場合には、キットには、当該ＩＬ−１０ポリペプチドと一緒にして、または分けて包装された、緩衝液、薬学的に許容される賦形剤などが含まれていて良い。併用療法が考慮される場合、当該キットには、複数の薬剤が別々に含まれて良く、またはそれらは、そのキットで事前に組み合わされて良い。当該キットの各成分は、個々の容器内に包含されて良く、及び多様な容器の全てが、１つの包装内にあって良い。本開示のキットは、そこに収容されている（例えば、冷蔵または凍結で）成分を、適切に維持するために必要な条件に対応して、設計されて良い。
【０２４２】
キットには、そこに入っている成分、及びその使用説明書（例えば、投薬パラメーター、作用機構、薬物動態及び薬理学、副作用、禁忌を含む、有効成分（複数可）の臨床薬理学など）に対して、識別された情報を含んだ、ラベルまたは添付文書が含まれていて良い。ラベルまたは添付文書には、ロット番号及び有効期限などのメーカー情報を含めることができる。ラベルまたは包装用の添付文書は、例えば、物理的な構造内に別々に含まれ、またはそのキットの成分（例えば、アンプル、試験管またはバイアル瓶）に貼られて、その成分を収容する物理的構造体に統合されていて良い。
【０２４３】
ラベルまたは添付文書は、さらにディスク（例えば、ハードディスク、カード、メモリディスクなど）、ＣＤまたはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤなどの光ディスク、ＭＰ３、磁気テープ、またはＲＡＭ及びＲＯＭなどの電子記憶媒体、もしくは磁気／光ストレージメディア、フラッシュメディアまたはメモリタイプカードなどのハイブリッド媒体などの、コンピュータ読み込み可能媒体を含むことができ、またはそれらに組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、実際の説明書が、そのキットには存在せずに、遠隔供給地からの指示を得るための手段が、例えば、インターネットを介して、提供される。
【０２４４】
実験用例示
以下の例示は、本開示をどのように実行及び使用するかの完全な開示ならびに記述を伴って、当業者にそれらを提供するための説明であり、及び発明者らが、かれらの発明であると見なすものの範囲を限定する意図はなく、以下の実験が、実施されたこと、及び実施される可能性のある全ての実験であるとして、それらを代表する意図はない。現在時制で書かれた例示的な記述が、必ずしも実行されたわけではなく、その記述が、そこに記載されたデータなどを生み出すために、実行され得ることを、理解される必要がある。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して、精度を確保するための努力がなされたが、しかしいくらかの実験誤差及び偏差を考慮する必要がある。
【０２４５】
特に示さない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は摂氏（℃）であり、気圧は、大気またはその近傍である。次に含まれる、標準的な略語を使用する。ｂｐ＝塩基対（複数可）、ｋｂ＝キロベース（複数可）、ｐｌ＝ピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃ＝秒（複数可）、ｍｉｎ＝分（複数可）、ｈまたはｈｒ＝時間（複数可）、ａａ＝アミノ酸（複数可）、ｋｂ＝キロベース（複数可）、ｎｔ＝ヌクレオチド（複数可）、ｐｇ＝ピコグラム、ｎｇ＝ナノグラム、μｇ＝マイクログラム、ｍｇ＝ミリグラム、ｇ＝グラム、ｋｇ＝キログラム、ｄｌまたはｄＬ＝デシリットル、μlまたはμＬ＝マイクロリットル、ｍｌまたはｍＬ＝ミリリットル、ｌまたはＬ＝リットル、μＭ＝マイクロモル、ｍＭ＝ミリモル、Ｍ＝モル、ｋＤａ＝キロダルトン、ＩＢ＝封入体、ＨＰＬＣ＝高性能液体クロマトグラフィー、ＢＷ＝体重、Ｕ＝単位、ｎｓ＝統計的に有意ではない、ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＩＨＣ＝免疫組織化学、ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＲＬＵ＝相対光単位、ｎｍ＝ナノメートル、ＬＯＤ＝検出限界、ＬＯＱ＝定量限界。
【０２４６】
材料及び方法
次の一般材料及び方法が、それが示された場所で使用され、または以下の実施例で使用される。
【０２４７】
分子生物学の手順。分子生物学における標準的な方法が、化学文献に記述されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．が参照され、それらは、細菌細胞及びＤＮＡ突然変異誘発のクローニング（第１巻）、哺乳類細胞及び酵母のクローニング（第２巻）、糖質及び蛋白質の発現（第３巻）、及び生物情報学（第４巻）に記述されている）。
【０２４８】
抗体関連プロセス。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造、精製、ならびに断片化が、記述されており（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、配位子／受容体相互作用を特徴付けるための標準技術が、利用可能であり（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹを参照）、蛍光活性化細胞ソーティングを含む、フローサイトメトリーに対応した方法が、利用可能であり（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照）、及び例えば、診断用試薬として使用するための、核酸プライマー及びプローブ、ポリペプチド、ならびに抗体を含む、核酸の改変に適した蛍光試薬が、利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）。抗体のさらなる考察は、本明細書の別の場所で示される。
【０２４９】
ソフトウェア。例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能性ドメイン、グリコシル化部位、及び配列アラインメントなどを決定するための、ソフトウェアパッケージ及びデータベースが利用可能である（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びＤｅＣｙｐｈｅｒ（商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．，ＣｒｙｓｔａｌＢａｙ，ＮＶ）を参照）。
【０２５０】
ペグ化。本明細書に記載のペグ化ＩＬ−１０は、当業者に公知の任意の手段により合成されて良い。モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０及びモノ−／ジ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０の混合物の生産に対応する、例示的な合成スキームが、記載されている（例えば、米国特許番号第７，０５２，６８６号、米国特許公開番号２０１１／０２５０１６３、ＷＯ  ２０１０／０７７８５３を参照）。本開示の特定の実施形態には、選択的にペグ化された、モノ及びジ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０の混合物を含む。本開示の実践に適したＰＥＧｓ（及びその他の薬物送達技術）の生産及び使用における当業者技能の活用に加えて、当業者は、ＰＥＧ関連技術の多くの商業サプライヤーに精通している（例えば、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）及びＰａｒｃｈｅｍ（Ｎｅｗ  Ｒｏｃｈｅｌｌｅ，ＮＹ）。
【０２５１】
インビトロアッセイにおけるＭＣ／９。本明細書に記載された当該ＩＬ−１０分子の相対効力（生物活性）は、ＭＣ／９生物検定などの、任意の当分野で認められたアッセイまたは方法論を用いて決定されて良い（一般論は、Ｇｏｍｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１６５（１１）：６５４５−５２（Ｄｅｃ．１，２０００）を参照）。ＭＣ／９は、内在性ＭｕＩＬ−１０受容体（Ｒ１及びＲ２）を発現するマウスの肥満細胞株である。ｒＭｕＩＬ−１０及びｒＨｕＩＬ−１０での刺激に応答して、ＭＣ／９細胞の増殖が起こる。アッセイ用試薬及び材料は、多くの供給元から販売されている（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、及びＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）。
【０２５２】
本明細書で使用されるＭＣ／９生物検定において、１×１０４細胞／ウェルを、ｒＨｕＩＬ−１０の標準及び試験サンプルの３倍希釈液に安置し及び培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、４０〜５６時間培養した。培養後、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ＧＬＯ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、全てのウェルに添加した後、プレートを、室温で２０〜４０分間、平衡化した。２０〜４０分間振とうしながら、室温で培養したプレートを、その後、３９５ｎｍ波長の発光プレートリーダーで読み取った。各群について、各濃度に対する平均ＲＬＵを決定した。対数濃度対平均ＲＬＵを用いて、一連の各サンプルに対する、適合−制約及び独立の４パラメーターのロジスティック応答曲線を生み出した。参照基準が、１００％の効力を有する場合の、％参照効力として、参照効力基準を比較した結果が得られた。報告された値は、少なくとも３つの測定（例えば、３プレート）の平均から得た。
【０２５３】
組換えｈＩＬ−１０のタンパク質活性はまた、ＭＣ／９細胞線を利用した短期増殖生物検定によって、評価されても良い。増殖は、代謝活性の検出に基づいて、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ、成長指標色素を用いた比色手法により測定されて良い。組換えのｈＩＬ−１０の生物活性は、ＥＣ５０値、または半極大刺激が、用量反応曲線において観察されるタンパク質の濃度によって、評価されて良い。
【０２５４】
文献に記述される、例示的なＩＬ−１０精製法。科学的文献には、免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化、同様に、化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、及びタンパク質のグリコシル化を含む、タンパク質の精製方法が、記述されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｓ．１−２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹを参照）。本開示の方法において使用される、または使用されて良い特定の方法が、本明細書で説明される。
【０２５５】
科学的及び特許文献は、ＩＬ−１０の精製方法を記述し、及びそのような方法は、当業者に公知である。例を挙げると、米国特許第５，７１０，２５１号は、ＣＨＯ細胞株培地からのｈＩｌ−１０の精製方法について記述する。簡潔に説明すると、この方法は、ＣＨＯ細胞培養上清を、カチオン交換クロマトグラフィー（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムを利用）、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムを利用）、ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィー、及びゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）カラムを利用）を含む、一連のクロマトグラフィー工程に供する。
【０２５６】
さらに、米国特許第５，７１０，２５１号は、Ｅ．ｃｏｌｉからのｈＩＬ−１０の精製を記述している。簡潔に説明すると、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｈＩＬ−１０が細胞内に産生されるような発現構造体で形質転換され、及び不溶性の封入体の１成分として存在している。発酵後、ＩＬ−１０を含む封入体ペレットは、遠心分離によって、細胞物質の残りの部分から単離される。その封入体ペレットは次いで、洗浄浄化及び変性タンパク質への可溶化に供される。ＩＬ−１０と同様の性質を有するタンパク質に対して一般的に用いられる手順を利用して、再フォールディングが行われる。その後、カチオン交換クロマトグラフィー（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カタムを利用）、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カタムを利用）、ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィー、及びゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）カタムを利用）を含む、一連のクロマトグラフィー工程（前述のＣＨＯ細胞培養上清から精製したＩＬ−１０に類似する）を実施する。以下に記述するように、本開示の実施形態は、前述の工程の一部の修正及び最適化を含む。
【０２５７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動。タンパク質のサンプルを、２００ボルトで３７分間、１倍ＭＥＳ  ＳＤＳ実行緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内の、１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で、電気泳動で、試験した。電気泳動のためのサンプルを準備するために、１６μＬの再フォールドされた物質を、６μＬの４倍ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、及び２．４μｌの１０倍ＮｕＰａｇｅサンプル還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合した。電気泳動のためのフォールドを解かれたサンプルを準備するために、１μＬのフォールドを解かれた物質を、１５μＬの水、６μＬの４倍ＬＤＳサンプル緩衝液、及び２．４μＬの１０倍ＮｕＰａｇｅサンプル還元剤と混合した。電気泳動後、分離したタンパク質を染色するために、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅを使用し、及び画像を、ＧＥ′ｓ  ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ５００撮像装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して、捉えた。光学濃度測定を、濃度基準として、１μｇ、０．５μｇ、及び０．２５μｇの市販ＩＬ−１０を用いて実施した。手順は、製造元のプロトコルに従った。
【実施例】
【０２５８】
実施例１：再フォールド緩衝液内のＩＬ−１０濃度
この実施例は、再フォールディングは、容量依存性であり、及びＩＬ−１０濃度は不定であるとする、従来から記述されてきた方法とは対照的に、実際にはタンパク質の再フォールディングは、ＩＬ−１０濃度に依存することを示す。
【０２５９】
封入体を、常温で解凍し、及び１０ｍＬの封入体懸濁緩衝液（５０ｍＭのトリス緩衝液、４ｍＭのＤＴＴ（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒａｎｃｈｏ  Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）、７Ｍのグアニジン、及びｐＨ８．２５）に対して、２ｇの封入体の密度で懸濁した。可溶化した封入体を、ロッキングプラットフォーム上で３〜２０時間、室温に保ち、及びＩＬ−１０を含むその可溶化物質を、常温で１５分間、最大速度（１６０００ｇ）の遠心分離によって、不溶性破片から分離した。その上清は、自然状態でフォールドを解かれたＩＬ−１０を含んでいた。再フォールディング処理を開始する前に、その可溶化封入体懸濁液の１μＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析し、その可溶化物質中の封入体の純度、及びＩＬ−１０の量を求めた（データは図示せず）。可溶化物質の吸光度を測定するために、波長２６０ｎｍ、２８０ｎｍ及び３２０ｎｍ（データは図示せず）で、分光光度計による測定を実施した。
【０２６０】
洗浄浄化後に、封入体を変性タンパク質に可溶化し、次いで再フォールディング処理を行った。簡潔に説明すると、Ｄｙｎａｍａｘ社の蠕動ポンプを使用し、そのフォールドを解かれたＩＬ−１０を、１７ｃｍの内径管を通して、約１／１５ｔｈの再循環速度の再フォールディング緩衝液に添加した。この再フォールディング装置を使用し、そのフォールドを解かれたＩＬ−１０中のグアニジン濃度を、７Ｍのグアニジンから０．４５Ｍのグアニジンへと徐々に希釈した。さらに、フォールドを解かれたＩＬ−１０を、それが、バルクの再フォールドチャンバーに完全に加えられた後の６秒間、中間のグアニジン濃度に置き、そのグアニジンの最終濃度を、０．４５Ｍとした。当該再フォールディング緩衝液を、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ社のＬ／Ｓ  Ｅａｓｙ−Ｌｏａｄ  ＩＩポンプで、１０分毎に１体積の割合で循環させた。この再フォールディング混合物を、Ｃｏｒｎｉｎｇ攪拌プレート上で、約６の速度で、攪拌棒でゆっくり攪拌した。
【０２６１】
マトリックスを形成する複数の実験を行い、及び条件を評価し、最適なＩＬ−１０再フォールディング環境を決定した。簡潔に説明すると、４℃、２５℃及び３７℃の温度を評価し、再フォールディング緩衝液内の、０．０５から１０ｍｇのＩＬ−１０／Ｌの濃度範囲を評価し、その再フォールディング緩衝液内の、酸化と還元グルタチオンとの異なる比率を試験することによって、酸化還元能を評価し、及び異なるアミノ酸の特定の範囲（０ｍＭ〜２Ｍ）を実験して、その再フォールディング緩衝成分を同定した。
【０２６２】
再フォールディング装置を使用して、フォールドを解かれたＩＬ−１０の適切な量を、ＩＬ−１０の適切なフォールディングを濃縮する、再フォールディング緩衝液及び酸化還元環境下で、逐次的にパルス希釈した。３５０ｍＬの再フォールディング緩衝液での、変成ＩＬ−１０の１ｍｇ、４ｍｇ、及び１１ｍｇの再フォールディングは、同じ量の適切にフォールドされた物質をもたらした。さらに、０．１５ｍｇ／ｍＬ濃度でのフォールドを解かれたｒＨｕＩＬ−１０モノマーの添加は、３ｍｇ／ｍＬまたはそれより高いＩＬ−１０濃度での再フォールディングに比べて、１．５から３倍に、適切にフォールドされたＩＬ−１０ダイマーの収量を増加させた、と判断した。特に、より高いＩＬ−１０濃度で再フォールディングを行った場合、ＩＬ−１０の大半は不溶性の凝集体として消失し、及びより低いＩＬ−１０濃度で再フォールディングを行った場合、適切にフォールドされたＩＬ−１０の最終的な収量が低下し、ならびに以降の処理時間が増加した。
【０２６３】
再フォールディング緩衝液内のＩＬ−１０濃度と総収量との関係は、表１に示すように、ｃＧＭＰの製造規模において、最も明らかである。
2018500341.tif 000003
【０２６４】
表１に示すように、再フォールディング緩衝液内のＩＬ−１０の高濃度が、最も低い収量につながり、一方で０．１５ｍｇ／ｍｌの近似濃度が、最大の回収量につながる。本実施例で記述した知見は、より大きな生産規模でも観察された（データは図示せず）。
【０２６５】
実施例２：再フォールド緩衝液へのアルギニンの添加
この事例は、再フォールド緩衝液へのＬ−アルギニンの添加が、適切にフォールドされたＩＬ−１０の収量に、好ましい効果を有することを示す。
【０２６６】
封入体から得られた組換えタンパク質の再フォールディングを容易にするために、０．１〜１Ｍのアルギニンを、透析または希釈によって、再フォールディングタンパク質の溶媒に、しばしば使用する（例えば、Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．２０：１３０１−０８を参照）。しかしながら、ＩＬ−１０の生産に使用する再フォールド緩衝液へのアルギニンの添加に関する、科学的及び特許文献での考察はほとんど無い。例えば、米国特許第５，７１０，２５１号に開示されるＩＬ−１０の製造工程は、再フォールド緩衝液にアルギニンを利用していない。ＩＬ−１０の再フォールド緩衝液の成分として、アルギニンの使用が考察される場合、０．５ＭのＬ−アルギニン及び１００ｍＭの尿素を、再フォールド緩衝液として使用することが示唆されている（Ａｒｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＥＦＯＬＤデータベース）。
【０２６７】
低濃度のＬ−アルギニンの添加は、ＩＬ−１０の収量に好ましい影響を与えることがわかった。表２に示すように、０．１５ｍｇ／ｍＬのフォールドを解かれたｒＨｕＩＬ−１０を含む、再フォールド緩衝液への、０．０１〜０．１Ｍのアルギニンの添加が、正常にフォールドされたＩＬ−１０ダイマーを、少なくとも２倍の増加に導いた。アルギニンのこの濃度は、Ａｒｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．によって報告されたよりもはるかに少ない。
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【０２６８】
したがって、０．１Ｍのアルギニン添加が、アルギニンの不在下で行われる再フォールドの収量に対して、再フォールドされたＩＬ−１０の収量を、約２倍に高めるのに有用であることが観察された。
【０２６９】
実施例３：ＵＦＤＦ緩衝液の最適化
製造工程中での、ＩＬ−１０タンパク質の実質的な損失は、再フォールディングの直後に発生することが見出され、ここで、フォールドされたものとフォールドされていないタンパク質の混合物が、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムを介して、精製を促す緩衝液内に濃縮され、及び交換される。このステップは、しばしば限外ろ過／透析（ＵＦＤＦ）と呼ばれる。
【０２７０】
タンパク質の溶解度を高め、及び濃度依存沈殿による、ＩＬ−１０の実質的な損失を防ぐために、ＵＦＤＦ緩衝液、またはその再フォールド緩衝液が交換された緩衝液に、アルギニン及び塩化ナトリウムを添加することによる影響を評価した。ＵＦＤＦ緩衝液内の０．１Ｍのアルギニンの存在（２０ｍＭのビス−トリス緩衝液、ｐＨ６．５）は、推定で２倍に収量を高めることがわかった。
【０２７１】
全体として、本明細書に記載の実験は、最適なＩＬ−１０の再フォールド条件をもたらし、ここでｒＨｕＩＬ−１０濃度は、０．０１から０．１Ｍの間のアルギニン濃度を伴って、０．０５〜０．３ｍｇ／ｍＬの間である。事実、再フォールド緩衝液及びＵＦＤＦ緩衝液内の０．１Ｍのアルギニンの存在が、再フォールドされ及び回収された総ＩＬ−１０を、２から４倍に、一貫して増加させた。最終的な再フォールド環境は、２０％ショ糖（Ａｍｅｓｃｏ社）、０．１ＭのＬ−アルギニン（Ｓｉｇｍａ社）、５０ｍＭのトリス緩衝液（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）、０．４５ｍＭの酸化グルタチオン（Ｓｉｇｍａ社）、及び０．０５ｍＭの還元グルタチオン（Ｓｉｇｍａ社）の存在下において、ｐＨ８．３で、最適に維持された。
【０２７２】
実施例４：商業生産工程からのＩＬ−１０の回収
この事例は、市販のｃＧＭＰ製造工程で回収される再フォールドされたＩＬ−１０の量が、そのＩＬ−１０の投入量の影響を受けることを示す。
【０２７３】
実施例１に記載の一般的な方法論を本明細書に利用した。簡潔に説明すると、懸濁緩衝液内で封入体を可溶化し、及び直鎖状で、フォールドを解かれたＩＬ−１０を含む可溶化物質を、遠心分離によって不溶性の破片から分離し、その結果、その自然な、フォールドを解かれた状態での、フォールドを解かれたＩＬ−１０を含む上清を得た。再フォールディング処理を開始する前に、その可溶化封入体の懸濁液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析し、その可溶物中のＩＬ−１０の量を求めた。また、２８０ｎｍを含む複数の波長で、可溶化物質の吸光度を測定するために、分光光度計による評価を実施した。その後、洗浄浄化工程を実施し、及びその封入体を変性タンパク質に可溶化し、次いで、再フォールディング処理を行った。
【０２７４】
実施例１に示すように、この製造工程の間で、ＩＬ−１０タンパク質の実質的な損失が、一般的にはその再フォールディング直後に発生し、ここで、フォールドされたもの及びフォールドされていないタンパク質の混合物が、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムを介して、精製を促す緩衝液内に濃縮され、及び交換される（前述のように、このステップは、限外ろ過／透析（ＵＦＤＦ）と呼ばれることがある）。前に示したように、ｒＨｕＩＬ−１０濃度が０．０５〜０．３ｍｇ／ｍＬの間にある場合、最適なＩＬ−１０の再フォールド条件が観察され、その再フォールディング緩衝液内のＩＬ−１０が高濃度の場合は、フォールドを解かれた及び凝集したモノマーＩＬ−１０の沈殿によって、低い収量が導かれる。
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【０２７５】
表３は、商業生産工程の各ステップにおけるＩＬ−１０の収量を説明する。表３を参照して、６ロットのＩＬ−１０物質を、フォールドの解消、再フォールド、ＵＦＤＦ−１のステップを実行し、及びＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム上で精製した。６ロットの各々を、別々の日に、本明細書に記述の処理ステップを実施し、及び６ロットの内の２ロットの収量を、さらに下流工程のために、組み合わせ、すなわち、ロット番号１５−０５４０−Ａと１５−０５４０−Ｂの収量を組み合わせ（結合再フォールド１）、ロット番号１５−０７５１−Ａと１５−０７５１−Ｂの収量を組み合わせ（結合再フォールド２）、ロット番号１５−１０６９−Ａと１５−１０６９−Ｂの収量を組み合わせた（結合再フォールド３）。
【０２７６】
表３において、「ＩＢ  Ｉｎｐｕｔ（ＩＢ投入量）」は、洗浄した封入体の総重量（キログラム単位）を表し、「ＩＬ−１０  Ｉｎｐｕｔ  ｆｒｏｍ  ＩＢｓ（ＩＢｓからのＩＬ−１０投入量）」は、ダイマーのｒＨｕＩＬ−１０を再フォールディングする目的で、約１０００リッターの再フォールディング緩衝液に添加した、非フォールディングステップから得たｒＨｕＩＬ−１０量（グラム単位）を表し、「“ＵＦＤＦ−１”Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（ＵＦＤＦ−１の回収）」は、第１ろ過及び濃縮ステップから回収されたｒＨｕＩＬ−１０量（グラム単位）を表し、「ＳＰ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（ＳＰ回収）」は、初期の捕捉カラムから回収されたｒＨｕＩＬ−１０量（グラム単位）を表す。
【０２７７】
ロット番号１５−０５４０−Ａを参照して、非再フォールディングステップから得た６４．４７ｇが、再フォールディングステップからの１７４．６３ｇを生み出した。その再フォールディングステップから回収されたＩＬ−１０の推定量が、その非フォールディングステップからのものより過剰であるのは、その再フォールディングステップからの推定量が、その封入体からの非ＩＬ−１０タンパク質、及びその精製ステップ中に除去されて得た、２８０ｎｍの吸収分子を含むからである。
【０２７８】
これらのデータは、当該ＩＬ−１０の投入量が、合計で約８０グラムまたは約０．０９ｍｇ／ｍＬを超える場合、沈殿のために、その回収が大幅に減少することを示している。この結果は、最後の列に示すことができ、９３．６８グラムのＩＬ−１０投入量は、その他のＩＬ−１０投入重量のいずれに比べても、より低いＳＰ回収量（１１．５４ｇ）を生み出した。これらのデータは、ｒＨｕＩＬ−１０濃度が、０．０５から０．３ｍｇ／ｍＬの間にある場合、最適なＩＬ−１０の再フォールド条件が観察された、との本明細書の他の場所（例えば、実施例３）で記述されたデータと一致している。
【０２７９】
本発明の特定の実施形態は、本発明を実施するために、発明者に公知の最良の態様を含んで、本明細書に記載されている。これまでの記載を読めば、本開示の実施形態の多様な変更が、当業者には明らかになるであろうし、及び当業者は、適宜そのような変更を取り入れることが可能である、と予期される。その結果、別段の記載がない限り、本発明は、本明細書に記載のように実践されるべきものであり、及び本発明が、適用法により認められるように、本明細書に付帯された請求項に記載される対象事項の、全ての変更及び同等物を含む、ことを意図している。さらに、本明細書に示されない限り、または文脈と明確に矛盾していない限り、すべての可能なそれらの変更における、先に記述された要素の任意の組み合わせが、包含される。
【０２８０】
本明細書に記載されているすべての出版物、特許出願、受入番号、及びその他の参照は、あたかも、個々の出版物または特許出願が、参照によって援用されたと、特別に及び個別に示されたかのように、参照により、本明細書に組み入れられる。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月22日(2017.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再フォールドされた、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を生成する方法であって、
（ａ）フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーを含む混合物を得ること、
（ｂ）前記混合物を、再フォールド緩衝液と接触させ、再フォールドされたＩＬ−１０モノマーを含む混和物を生産すること
を含み、ここで前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．０５ｇ／ｍＬから０．３ｇ／ｍＬである、前記方法。
【請求項２】
前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．１ｇ／ｍＬから０．２５ｇ／ｍＬである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．１ｇ／ｍＬから０．２ｇ／ｍＬである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項４】
前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、約０．１５ｇ／ｍＬである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−１０が、組み換えによって産生されたヒトＩＬ−１０（ｒｈＩＬ−１０）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６】
前記ｒｈＩＬ−１０が、細菌内で発現される、請求項５に記載の前記方法。
【請求項７】
前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項６に記載の前記方法。
【請求項８】
前記混合物が、ＩＬ−１０を含む多数の封入体と、懸濁緩衝液の組み合わせによって生産される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項９】
酸化還元系を、前記再フォールド緩衝液へ添加することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１０】
前記酸化還元系が、酸化された及び還元されたグルタチオンを含む、請求項９に記載の前記方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの、天然由来のまたは非天然由来のアミノ酸が、前記再フォールド緩衝液に添加される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１２】
洗浄浄化が、ステップ（ｂ）の前に、前記混合物に対して実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１３】
限外ろ過／透析（ＵＦＤＦ）が、前記混和物に対して実行される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１４】
前記再フォールド緩衝液のｐＨが、約８．３である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月9日(2017.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
いくつかの実施形態において、その再フォールド緩衝液内のフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．０２ｍｇ／ｍＬから約０．４５ｍｇ／ｍＬ、約０．０３ｍｇ／ｍＬから約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．０４ｍｇ／ｍＬから約０．３５ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．０６ｍｇ／ｍＬから約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．０７ｍｇ／ｍＬから約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．０８ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．０９ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬ、または約０．１５ｍｇ／ｍＬである。その他の実施形態において、その再フォールド緩衝液内のフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬを上回って、０．０２ｍｇ／ｍＬを上回って、０．０３ｍｇ／ｍＬを上回って、０．０４ｍｇ／ｍＬを上回って、０．０５ｍｇ／ｍＬを上回って、０．０６ｍｇ／ｍＬを上回って、０．０７ｍｇ／ｍＬを上回って、０．０８ｍｇ／ｍＬを上回って、０．０９ｍｇ／ｍＬを上回って、０．１ｍｇ／ｍＬを上回って、０．１５ｍｇ／ｍＬを上回って、０．２ｍｇ／ｍＬを上回って、０．２５ｍｇ／ｍＬを上回って、または０．３ｍｇ／ｍＬを上回っている。さらなる実施形態において、その再フォールド緩衝液内のフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ未満、０．４５ｍｇ／ｍＬ未満、０．４ｍｇ／ｍＬ未満、０．３５ｍｇ／ｍＬ未満、０．３ｍｇ／ｍＬ未満、０．２５ｍｇ／ｍＬ未満、０．２ｍｇ／ｍＬ未満、または０．１ｍｇ／ｍＬ未満である。実施例の節で記述されるように、再フォールドに最適なＩＬ−１０濃度が、約０．１５ｍｇ／ｍＬであると決定され、約０．１５ｍｇ／ｍＬを超えた濃度では、ＩＬ−１０凝集のために材料が失われ、及び不溶性の沈殿物になる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
特定の実施形態において、本開示は、ａ）フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーを含む混合物を得ること、及びｂ）その混合物を再フォールド緩衝液と接触させて、再フォールドされたＩＬ−１０を含む混合物を生み出すことを含んで、再フォールドされたＩＬ−１０の生成法を企図し、ここでそのフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、当該再フォールド緩衝液内のフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの当該濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬから０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬから０．２ｍｇ／ｍＬ、または約０．１５ｍｇ／ｍＬである。当該ＩＬ−１０は、特定の実施形態において、組み換え的に産生されるヒトＩＬ−１０（ｒｈＩＬ−１０）である。このｒｈＩＬ−１０は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現され得る。いくつかの実施形態において、前述の混合物は、懸濁緩衝液を伴うＩＬ−１０を含む、多数の封入体を含んで製造される。追加の実施形態はさらに、酸化及び還元されたグルタチオンを含む酸化還元系などの、酸化還元系を、その再フォールド緩衝液に添加することを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本開示は、少なくとも１つの天然由来のまたは非天然由来のアミノ酸を、当該再フォールド緩衝液に添加する実施形態を企図する。いくつかの実施形態において、当該アミノ酸は、アルギニンである。特定の実施形態において、０．００５から０．３Ｍのアルギニンが、当該再フォールド緩衝液に添加され、０．００７５から０．２５Ｍのアルギニンが、当該再フォールド緩衝液に添加され、０．００５Ｍから０．２Ｍのアルギニンが、当該再フォールド緩衝液に添加され、または０．００１Ｍから０．１５Ｍのアルギニンが、当該再フォールド緩衝液に添加される。追加の実施形態において、本開示は、約０．１Ｍのアルギニン及び約０．１５ｍｇ／ｍＬのフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの、当該再フォールド緩衝液への添加を企図する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本開示はまた、（ａ）０．０５ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマー含む混合物、及び（ｂ）０．００５から０．３Ｍモル量のアルギニンを含む、ＩＬ−１０再フォールド緩衝液を企図する。いくつかの実施形態において、当該再フォールド緩衝液には、０．００７５から０．２５Ｍのアルギニン、０．０５から０．２Ｍのアルギニン、または約０．０１から０．１５Ｍのアルギニンを含む。その他の可能なアルギニン濃度を、本明細書に開示する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
特定の実施形態において、当該フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーは、約０．００１ｍｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬ、約０．００２５ｍｇ／ｍＬから約０．９ｍｇ／ｍＬ、約０．００５ｍｇ／ｍＬから約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．００７５ｍｇ／ｍＬから約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．０２ｍｇ／ｍＬから約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．０３ｍｇ／ｍＬから約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．０４ｍｇ／ｍＬから約０．３５ｍｇ／ｍＬ、または約０．０５ｍｇ／ｍＬから約０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。そのうえさらなる実施形態において、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの当該濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬ、または約０．１５ｍｇ／ｍＬである。特定の実施形態において、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの当該濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬ、または約０．１５ｍｇ／ｍＬである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本開示は、当該フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーが、約０．００１ｍｇ／ｍＬを上回った、約０．００２５ｍｇ／ｍＬを上回った、約０．００５ｍｇ／ｍＬを上回った、約０．００７５ｍｇ／ｍＬを上回った、約０．０１ｍｇ／ｍＬを上回った、約０．０２ｍｇ／ｍＬを上回った、約０．０３ｍｇ／ｍＬを上回った、約０．０４ｍｇ／ｍＬを上回った、または約０．０５ｍｇ／ｍＬを上回った濃度で存在する、実施形態を企図する。いくつかの態様において、当該フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーが、約１．０ｍｇ／ｍＬ未満、約０．９ｍｇ／ｍＬ未満、約０．８ｍｇ／ｍＬ未満、約０．７ｍｇ／ｍＬ未満、約０．６ｍｇ／ｍＬ未満、約０．５ｍｇ／ｍＬ未満、約０．４ｍｇ／ｍＬ未満、約０．３５ｍｇ／ｍＬ未満、約０．３ｍｇ／ｍＬ未満、約０．２５ｍｇ／ｍＬ未満、約０．２ｍｇ／ｍＬ未満、約０．１５ｍｇ／ｍＬ未満、または約０．１ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する、実施形態を企図する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
特定の実施形態では、約０．１Ｍのアルギニン及び約０．１５ｍｇ／ｍＬのフォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーを含む、再フォールド緩衝液を企図する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６１】
マトリックスを形成する複数の実験を行い、及び条件を評価し、最適なＩＬ−１０再フォールディング環境を決定した。簡潔に説明すると、４℃、２５℃及び３７℃の温度を評価し、再フォールディング緩衝液内の、０．０５から１０ｇのＩＬ−１０／Ｌの濃度範囲を評価し、その再フォールディング緩衝液内の、酸化と還元グルタチオンとの異なる比率を試験することによって、酸化還元能を評価し、及び異なるアミノ酸の特定の範囲（０ｍＭ〜２Ｍ）を実験して、その再フォールディング緩衝成分を同定した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
再フォールディング緩衝液内のＩＬ−１０濃度と総収量との関係は、表１に示すように、ｃＧＭＰの製造規模において、最も明らかである。
2018500341.tif 000006
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再フォールドされた、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を生成する方法であって、
（ａ）フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーを含む混合物を得ること、
（ｂ）前記混合物を、再フォールド緩衝液と接触させ、再フォールドされたＩＬ−１０モノマーを含む混和物を生産すること
を含み、ここで前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．０５ｍｇ／ｍＬから０．３ｍｇ／ｍＬである、前記方法。
【請求項２】
前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．１ｍｇ／ｍＬから０．２５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、０．１ｍｇ／ｍＬから０．２ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項４】
前記再フォールド緩衝液内の、フォールドを解かれたＩＬ−１０モノマーの濃度が、約０．１５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−１０が、組み換えによって産生されたヒトＩＬ−１０（ｒｈＩＬ−１０）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６】
前記ｒｈＩＬ−１０が、細菌内で発現される、請求項５に記載の前記方法。
【請求項７】
前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項６に記載の前記方法。
【請求項８】
前記混合物が、ＩＬ−１０を含む多数の封入体と、懸濁緩衝液の組み合わせによって生産される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項９】
酸化還元系を、前記再フォールド緩衝液へ添加することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１０】
前記酸化還元系が、酸化された及び還元されたグルタチオンを含む、請求項９に記載の前記方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの、天然由来のまたは非天然由来のアミノ酸が、前記再フォールド緩衝液に添加される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１２】
洗浄浄化が、ステップ（ｂ）の前に、前記混合物に対して実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１３】
限外ろ過／透析（ＵＦＤＦ）が、前記混和物に対して実行される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１４】
前記再フォールド緩衝液のｐＨが、約８．３である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記方法。
【国際調査報告】
2018500341.tif 000007
2018500341.tif 000008
2018500341.tif 000009