(57)【要約】  本発明は、癌の治療において用いるためのVEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含む少なくとも1コピーのDNA分子を含むサルモネラ菌の弱毒化株に関連し、ここで、前記治療は、少なくとも1つのさらなる抗癌剤の投与をさらに含む。本発明は、さらにVEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含む少なくとも1コピーのDNA分子を含むサルモネラ菌の弱毒化株を含む医薬組成物に関連し、ここで、前記医薬組成物は、さらに腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードする発現カセットをさらに含む少なくとも１コピーのさらなるDNA分子を含む少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株を含む。
2018517419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に用いるための、VEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含むDNA分子の少なくとも1つのコピーを含むサルモネラ菌の弱毒化株であり、ここで
i) 腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするさらなる発現カセットを含む少なくとも1コピーのさらなるDNA分子を含む少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株から特に選択さる、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードする少なくとも1つのDNAワクチン、又は
ii) 特に、PD-1、PD-L1及びCTLA4に対する抗体から選択される、少なくとも1つチェックポイント阻害剤、又は
iii) その細胞表面に少なくとも1つの腫瘍抗原結合タンパク質及び/又は少なくとも1つの腫瘍間質抗原結合タンパク質を含む、少なくとも1つの設計T細胞、又は
iv) 1つのT細胞表面タンパク質及び腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原に特異的結合性を示す、少なくとも1つの二重特異性抗体、又は
v) 又はそれらの任意の組み合わせ
の投与をさらに含む治療に用いる、サルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項２】
サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株が、サルモネラ・エンテリカ種であり、特に、サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株が、サルモネラ・チフィTy21aである、請求項1に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項３】
発現カセット及びさらなる発現カセットが、真核生物の発現カセットであり、特に、発現カセット及びさらなる発現カセットが、CMVプロモーターを含む、請求項1又は2に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項４】
前記VEGF受容体タンパク質が、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するヒトVEGFR-2及びその80%の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選ばれ、特に、ヒトVEGFR-2が、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する、請求項1〜3の何れか1項に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項５】
前記DNA分子及び前記さらなるDNA分子が、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、pMB1 ori及びCMVプロモーターを含み、特に、前記DNA分子及び前記さらなるDNA分子が、配列番号2に示されるDNA配列を含む、請求項1〜4の何れか1項に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項６】
前記さらなるサルモネラ菌の弱毒化株によってコードされる前記腫瘍抗原が、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）及びその80%の配列同一性を有するタンパク質、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するヒトメソテリン（MSLN）及びその80%の配列同一性を有するタンパク質、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有するヒトCEA及びその80%の配列同一性を有するタンパク質、配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するCMV pp65及びその80%の配列同一性を有するタンパク質、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有するCMV pp65及びその80%の配列同一性を有するタンパク質、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するCMV pp65及びその80%の配列同一性を有するタンパク質、からなる群から選択され、特に、ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有し、ヒトメソテリン（MSLN）は、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有し、ヒトCEAは、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有し、及びCMV pp65は、配列番号6、配列番号7又は配列番号8に示されるアミノ酸配列を有し、及び前記さらなるサルモネラ菌の弱毒化株によってコードされる前記腫瘍間質抗原が、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）からなる群より選択される、請求項1〜5の何れか1項に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項７】
サルモネラ菌の弱毒化株を、少なくとも1つの前記腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするDNAワクチン、少なくとも1つの前記チェックポイント阻害剤、少なくとも1つの前記設計T細胞及び/又は少なくとも1つの前記二重特異性抗体と同時またはその前に投与する、請求項1〜6の何れか1項に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項８】
前記治療が、化学療法、放射線療法又は生物学的癌療法を伴い、特に、化学療法又は放射線療法の治療サイクル又は生物学的癌療法の前又は間に、又は化学療法又は放射線療法の治療サイクル又は生物学的癌療法の前及び間に、サルモネラ菌の弱毒化株を投与する、請求項1〜7の何れか1項に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項９】
前記サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つの前記さらなるサルモネラ菌の弱毒化株は、経口投与される、請求項1〜8の何れか1項に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項１０】
前記癌が、大腸癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、中皮腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、グリア芽細胞腫、胃癌、肝細胞癌、腎細胞癌、前立腺癌、及び子宮頸癌から選択される、請求項1〜9の何れか1項に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項１１】
サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株の単一用量が、約105〜約1011、詳しくは約106〜約1010、より詳しくは約106〜約109、より詳しくは約106〜約108、最も詳しくは約106〜約107のコロニー形成率(CFU)を含む、請求項1〜10の何れか1項に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項１２】
前記治療が、患者における前記腫瘍抗原に対する発現パターン及び/または前記免疫応答の前兆を評価する工程を含む、個別化された癌免疫療法である、請求項1〜11の何れか1項に記載の使用のためのサルモネラ菌の弱毒化株。
【請求項１３】
VEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含むDNA分子の少なくとも1コピーを含む、サルモネラ菌の弱毒化株を含む医薬組成物であって、ここで、医薬組成物は、腫瘍抗原又は腫瘍乾漆抗原をコードするさらなる発現カセットを含む少なくとも1つのさらなるDNA分子を含む少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株をさらに含む医薬組成物。
【請求項１４】
前記サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株は、サルモネラ・チフィTy21aであり、ここで、発現カセット及びさらなる発現カセットは、特にCMVプロモーターを含む真核生物発現カセットであり、前記VEGF受容体タンパク質は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するヒトVEGFR-2及びその80%の配列同一性を有するタンパク質、特にヒトVEGFR-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
特に癌の治療に用いるための医薬としての使用に用いる、請求項13又は14に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療に使用するためのVEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含む少なくとも1コピーのDNA分子を含むサルモネラ菌の弱毒化株に関し、ここで、前記治療は、さらに少なくとも1つのさらなる抗癌剤の投与を含む。本発明は、さらにVEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含む少なくとも1コピーのDNA分子を含む、サルモネラ菌の弱毒化株を含む医薬組成物に関し、ここで、前記医薬組成物は、さらに腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするさらなる発現カセットを含む少なくとも1コピーのDNA分子をさらに含む少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株を含む。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍が免疫原性であり得るという知見は、免疫システムを用いて悪性細胞を選択的に排除し、正常組織を温存するように設計された多数の癌免疫療法の開発につながった。しかしながら、腫瘍抗原に対するワクチン接種による生存利益は、低いままである。抗癌ワクチンは、多くの課題に直面しており、その中の一つが、免疫抑制微小環境である。異常な腫瘍脈管構造は、炎症細胞を免疫抑制に分極させる低酸素微小環境を作り出す。さらに、腫瘍は、成長因子及びサイトカインの分泌を介して、免疫細胞の増殖、分化及び機能を全身的に変化させる。
【０００３】
癌の治癒のためには、癌幹細胞の完全な根絶が極めて重要である。ヒト腫瘍の多数の免疫逃避機構は、癌免疫療法において依然として大きな課題である。したがって、これまでに満たされていない改善された癌治療アプローチが、大いに求められている。
【０００４】
WO2014/005683は、癌免疫療法、特に膵臓癌の治療に用いるVEGF受容体タンパク質をコードする組換えDNA分子を含む、弱毒化サルモネラ菌株を開示する。
【０００５】
WO2014/173542は、癌免疫療法に用いるウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）をコードする組換えDNA分子を含む弱毒化サルモネラ菌株を開示する。
【０００６】
WO 2013/09189は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠き、組換えDNA分子を保有する弱毒化変異サルモネラ・チフィ菌株を増殖させる方法を開示する。
【発明の概要】
【０００７】
研究の目的
先行技術を考慮して、本発明の目的は、新規の癌療法を提供することである。そのような新規療法は、癌患者の治療選択肢を改善するために大きな強みを提供するであろう。
【０００８】
一態様において本発明は、癌の治療に用いるための、VEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含むDNA分子の少なくとも1コピーを含むサルモネラ菌の弱毒化株に関し、ここで、前記治療は、さらにさらなる抗癌剤の投与を含む。
【０００９】
驚くべきことに、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒株は、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードする癌ワクチンでの治療、腫瘍細胞を標的とするように設計された設計T細胞による治療、免疫細胞の腫瘍細胞への付着を媒介するように設計された二重特異性抗体による治療、及びT細胞増殖の腫瘍誘発性阻害を予防することを目的とするチェックポイント阻害剤による治療、などの患者の免疫系の使用に基づく癌治療の効力を強く増加させることが見出された。
【００１０】
驚くべきことに、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の投与が、CD8+及びCD4+ T細胞による腫瘍の有意な浸潤をもたらすことが観察された。さらに、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の投与は、活性化CD8+及びCD4+ T細胞数の増加及び/又はTreg細胞のような免疫抑制性リンパ系細胞の数の減少をもたらし得る。理論に縛られることを望むものではないが、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の投与は、腫瘍の根絶においてT細胞の関与を増強することによって癌免疫療法の有効性を改善すると考えられる。VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株と、他の抗癌剤、例えば設計T細胞、チェックポイント阻害剤、二重特異性抗体、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするDNAワクチンとの組み合わせは、腫瘍特異的なT細胞応答及び全生存率に相乗効果を持つことを示す。
【００１１】
特定の実施形態において、治療は、さらに、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードする少なくとも1つのDNAワクチン、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤、少なくとも1つの設計T細胞、1つのT細胞表面タンパク質及び腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原のための少なくとも1つの結合特異性を示す二重特異性抗体、又はそれらの任意の組み合わせの投与を含む。
【００１２】
特定の実施形態において、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードする少なくとも1つのDNAワクチンは、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするさらなる発現カセットを含むさらなるDNA分子の少なくとも1コピーを含む少なくとも1つのさらなる弱毒化サルモネラ菌株から選択される。
【００１３】
特定の実施形態において、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤は、PD-1、PD-L1及びCTLA4に対する抗体から選択される。
【００１４】
特定の実施形態において、サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのサルモネラ菌の弱毒化株は、サルモネラ・エンテリカ種である。
【００１５】
特定の実施形態において、サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのサルモネラ菌の弱毒化株は、サルモネラ・チフィTy21aである。
【００１６】
特定の実施形態において、発現カセット及びさらなる発現カセットは、特にCMVプロモーターを含む真核生物発現カセットである。
【００１７】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するヒトVEGFR-2、及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質からなる群より選択される。
【００１８】
特定の実施形態において、ヒトVEGFR-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
特定の実施形態において、DNA分子及びさらなるDNA分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、pMB1 ori及びCMVプロモーターを含む。
【００２０】
特定の実施形態において、DNA分子及びさらなるDNA分子は、配列番号2に示されるDNA配列を含む。
【００２１】
特定の実施形態において、前記さらなる弱毒化サルモネラ菌株によってコードされる腫瘍抗原は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するヒトメソテリン（MSLN）及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有するヒトCEA及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号6に示されるようなアミノ酸配列を有するCMV pp65及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号7で示されるアミノ酸配列を有するCMV pp65及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質及び配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するCMV pp65及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質、からなる群から選択され、前記さらなるサルモネラ菌の弱毒化株によってコードされる腫瘍間質抗原は、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）からなる群より選択される。
【００２２】
特定の実施形態において、ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有し、ヒトメソテリン（MSLN）は、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有し、ヒトCEAは、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有し、CMV pp65は、配列番号6、配列番号7又は配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２３】
特定の実施形態において、サルモネラ菌の弱毒化株は、前記さらなる抗癌剤と同時に又はその前に、すなわち、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードする少なくとも1つの前記DNAワクチン、少なくとも1つの前記チェックポイント阻害剤、少なくとも1つの前記設計T細胞及び/又は少なくとも1つの前記二重特異性抗体と同時に又はその前に投与される。
【００２４】
特定の実施形態において、治療は化学療法、放射線療法又は生物学的癌療法を伴う。特に、化学療法又は放射線療法の治療サイクル又は生物学的癌療法の前又は間に、サルモネラ菌の弱毒化株を投与する。特定の実施形態において、化学療法又は放射線療法の治療サイクル又は生物学的癌療法の前及び間に、サルモネラ菌の弱毒化株を投与する。
【００２５】
特定の実施形態において、サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなる弱毒化サルモネラ菌株を経口投与する。
【００２６】
特定の実施形態において、癌は、大腸癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、中皮腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、グリア芽細胞腫、胃癌、肝細胞癌、腎細胞癌、前立腺癌、及び子宮頸癌から選択される。
【００２７】
特定の実施形態において、サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株の単一用量は、約105〜約1011、詳しくは約106〜約1010、より詳しくは約106〜約109、より詳しくは約106〜約108、最も詳しくは約106〜約107のコロニー形成率(CFU)を含む。
【００２８】
特定の実施形態において、治療は、患者における前記腫瘍抗原に対する発現パターン及び/又は前記免疫応答の前兆を評価する工程を含む、個別化された癌免疫療法である。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、VEGFレセプタータンパク質をコードする発現カセットを含むDNA分子の少なくとも1コピーを含む、サルモネラの弱毒化株を含む医薬組成物であって、ここで、該医薬組成物は、さらに腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするさらなる発現カセットを含む少なくとも1コピーのさらなるDNA分子を含む少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株は、サルモネラ・チフィTy21aである。
【００３１】
特定の実施形態において、発現カセット及びさらなる発現カセットは、特にCMVプロモーターを含む真核生物発現カセットである。
【００３２】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するヒトVEGFR-2及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質からなる群より選択される。
【００３３】
特定の実施形態において、ヒトVEGFR-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する。
【００３４】
特定の実施形態において、前記医薬組成物は、特に癌の治療に用いるための医薬として用いるためのものである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、本発明の以下の詳細な説明及び本明細書に含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解され得る。
【００３６】
一態様において本発明は、癌の治療に用いるための、VEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含むDNA分子の少なくとも1コピーを含むサルモネラ菌の弱毒化株に関し、ここで、前記治療は、さらにさらなる抗癌剤の投与を含む。
【００３７】
VEGF受容体タンパク質は、それらを二量体化させ、トランスリン酸化により活性化させるリガンド血管内皮増殖因子(VEGF)によって結合され得る内皮細胞特異的受容体-チロシンキナーゼである。増殖因子のVEGFファミリー(Kd 75-760 pM)は、VEGF-E及びPLGF(胎盤増殖因子、PGF又はPIGF-2としても知られる)を介したVEGF-A(VEGFとしても知られる)の6ファミリーメンバーを包含する。VEGF増殖因子は、特に血液やリンパ管などの血管系の複数の要素の増殖及び分化を制御する。VEGFR、VEGFR-1（又はFLT1）、VEGFR-2（又はKDR、FLK1）及びVEGFR-3（又はFLT4）の3つの主なサブタイプが存在する。膜結合型VEGF受容体は、7個の免疫グロブリン様ドメインからなる細胞外部分、単一の膜貫通領域及びスプリットチロシンキナーゼドメインを含む細胞内部分を有する。VEGFR転写産物は、可溶性VEGF受容体タンパク質をコードする選択的スプライシングバリアントを生じさせる。
【００３８】
本発明によれば、生存サルモネラ菌の弱毒化株は、前記組み換えDNA分子を標的細胞に運ぶためVEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含む、組み換えDNA分子のバクテリアキャリアーとして機能を果たす。VEGF受容体タンパク質（腫瘍間質抗原）などの異種抗原をコードするDNA分子を含むこのような送達ベクターは、DNAワクチンと呼ばれる。
【００３９】
本発明の明細書において、「ワクチン」という用語は、投与の際に被験者において免疫応答を誘導することができる薬剤を指す。ワクチンは、好ましくは、疾患を予防、改善又は治療することができる。
【００４０】
本発明におけるサルモネラ菌の弱毒化株は、VEGF受容体タンパク質をコードする組み換えDNA分子を安定的に運ぶ。この組換えDNA分子の経口デリバリーのためのビヒクルとして用いることができる。
【００４１】
遺伝子免疫は、従来のワクチン接種より有利であり得る。前記標的DNAは、かなりの期間検出することが出来、故に抗原の貯蔵所として作用する。GpCアイランドのようないくつかのプラスミドにおける配列モチーフは、免疫賦活性であり、LPS及び他のバクテリア成分に起因する免疫刺激によって促進されるアジュバントとして機能することができる。
【００４２】
生存型弱毒化サルモネラ菌ベクターは、例えば、in situリポ多糖(LPS)などの自身の免疫調節性の因子を産生し、マイクロカプセル化のような他の投与形態よりも利点を構成し得る。加えて、本明細書による粘膜ワクチンは、リンパ管内作用様式を有し、これは有益であることが明らかになっている。本発明による弱毒化ワクチンの摂取後、腸のパイエル板におけるマクロファージと他の細胞は、改変されたバクテリアによって充満される。バクテリアは、これらの食細胞によって取り込まれる。弱毒化突然変異のために、サルモネラ・チフィTy21a株のバクテリアは、これら食細胞にて生存することができず、この時点で死滅する。組み換えDNA分子は、放出され、続いて、特定の輸送系又はエンドソームリーケージのいずれかを介して、食免疫細胞のサイトゾルに移される。最終的に、組み換えDNA分子は核に入り、そこで転写され、食細胞のサイトゾルにおいて大量のVEGF受容体タンパク質の発現に繋がる。感染細胞はアポトーシスを受け、VEGF受容体抗原を搭載し、腸免疫系によって、取り込まれ処理される。バクテリア感染の危険信号は、この工程において強力なアジュバントとして役立ち、全身及び粘膜区画のレベルで強力な標的抗原特異的CD8+T細胞及び抗体応答をもたらす。免疫応答は、ワクチン接種後約10日でピークに達する。抗キャリアー応答の欠如は、同じワクチンを何度も追加免疫することを可能にする。
【００４３】
本明細書において、「弱毒化」という用語は、弱毒化突然変異を保有していないバクテリア親株と比較して、低減された毒性のバクテリア株を指す。弱毒化バクテリア株は、それらの毒性を欠くが、防御免疫を誘導する能力は保持する。弱毒化は、毒性、制御、代謝遺伝子を含む、様々な遺伝子の欠失によって達成することができる。弱毒化バクテリアは、自然界で発見され得、又は例えば、新しい培地又は細胞培養物に適応させることによって実験室内で人工的に生産され得、又はDNA組み換え技術によって生産され得る。本発明によるサルモネラ菌の弱毒化株の約1011CFUの投与は、好ましくは、被験者の5%未満のサルモネラ菌、より好ましくは1%未満、最も好ましくは1%未満でサルモネラ症を引き起こす。
【００４４】
本明細書において、「含む(comprises)」又は「含む(comprising)」という用語は、「限定されないが、含む(including)」を意味する。前記用語は、オープンエンドであることを意図しており、記載された特徴、要素、整数、工程又は構成要素の何れかの存在を明示し、1つ又は複数の他の特徴、要素、整数、工程、構成要素又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。故に前記用語「含む（comprising）」は、より限定的な用語「からなる(consisting of)」及び「本質的にからなる(essentially consisting of)」を包含する。一実施形態において、本出願を通して、特に特許請求の範囲内で使用される「含む(comprising)」という用語は、「からなる(consisting of)」という用語によって置き換えられてもよい。
【００４５】
VEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含むDNA分子は、組み換えDNA分子、すなわち、好ましくは異なる起源のDNA断片から構成された遺伝子操作された遺伝子構築物が適している。前記DNA分子は、VEGF受容体タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを発現ベクタープラスミドに導入することによって線状核酸、又は好ましくは生成された環状DNAプラスミドであり得る。
【００４６】
本明細書において、「発現カセット」という用語は、その発現を制御する調節配列の制御下にある少なくとも1つのオープンリーディングフレーム(ORF)を含む、核酸単位を指す。発現カセットは、好ましくは、標的細胞において、例えばVEGF受容体タンパク質などの腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む転写を介し得る。発現カセットは、典型的に、少なくとも1つのオープンリーディングフレームと転写終結シグナルを含む。
【００４７】
特定の実施形態において、治療は、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードする少なくとも1つのDNAワクチン、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤、少なくとも設計T細胞、1つのT細胞表面タンパク質及び腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原に結合特異性を示す少なくとも1つの二重特異性抗体、又はそれら任意の組み合わせのさらなる投与を含む。
【００４８】
特定の実施形態において、少なくとも1つの二重特異性抗体は、CD19、EpCAM、HER2、EGFR、CEA、CD33、EphA2及びMCSPから選択される腫瘍抗原に対して特異的結合性を示す。
【００４９】
特定の実施形態において、少なくとも1つの設計T細胞は、その細胞表面上に少なくとも1つの腫瘍抗原結合タンパク質を含み、ここで、腫瘍抗原は、CEA、FBP、GD2、GD3、Her2-neu、MAGE-A1、MSLN、PSCA、PSMAから選択される。
【００５０】
特定の実施形態において、前記治療は、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするさらなるDNAワクチンの一つ、特に、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードする発現カセットをさらに含む少なくとも1コピーのさらなるDNA分子を含むサルモネラ菌の弱毒化株の一つの投与、さらに含む。
【００５１】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の投与は、腫瘍抗原をそれぞれコードする二つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株の投与と組み合わせられる。
【００５２】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の投与は、1つのチェックポイント阻害剤の投与と組み合わせられる。
【００５３】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の投与は、さらなる1つの腫瘍抗原をコードするサルモネラ菌の弱毒化株及び1つのチェックポイント阻害剤の投与と組み合わせられる。
【００５４】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の投与は、1つの設計T細胞の投与と組み合わせられる。
【００５５】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の投与は、1つの設計T細胞及び1つのチェックポイント阻害剤の投与と組み合わせられる。
【００５６】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の投与は、1つの二重特異性抗体の投与と組み合わせられる。
【００５７】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の投与は、1つの二重特異性抗体及び1つのチェックポイント阻害剤の投与と組み合わせられる。
【００５８】
特定の実施形態において、少なくとも1つの腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするDNAワクチンは、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするさらなる発現カセットを含む、少なくとも1つのさらなるDNA分子のコピーを含む、少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株から選択される。
【００５９】
特定の実施形態において、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤は、PD-1、PD-L1及びCTLA4に対する抗体から選択される。
【００６０】
特定の実施形態において、サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株は、サルモネラ・エンテリカ種である。サルモネラ・エンテリカの弱毒化株は、サルモネラ・エンテリカ種が、潜在的に免疫の粘膜経路すなわち、経口又は経鼻を介して送達されることができ、非経口投与と比較して、簡単かつ安全であるという利点を提供するため、哺乳類の免疫系への異種抗原の送達のための魅力的なビヒクルである。さらに、サルモネラ菌株は、全身及び粘膜区画のレベルで強い体液性及び細胞性の免疫応答を誘発する。1回の準備費用は安く、生存型バクテリアワクチンの製剤は、非常に安定である。弱毒化は、毒性、制御及び代謝遺伝子を含む様々な遺伝子の欠失によって達成することができる。
【００６１】
いくつかのaro変異導入によって弱毒化されたサルモネラ・ティフィムリウム株は、動物モデルにおける異種抗原のための安全かつ、効果的な送達ビヒクルであることが示されている。
【００６２】
特定の実施形態において、前記サルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株は、サルモネラ・チフィTy21aである。生存型弱毒化サルモネラ・チフィTy21a株は、Typhoral L（登録商標）の有効成分であり、Vivotif（登録商標）(Berna Biotech Ltd、スイスのCrucell Company製)としても知られる。それは現在、腸チフスに対して唯一ライセンスされた生存型経口ワクチンである。このワクチンは、広範囲で試験されており、患者の毒性及び第三者への感染に関して安全であることが判明している(Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295)。前記ワクチンは、40を超える国でライセンスされており、腸チフスの予防接種のために数千人の子供を含む数百万人の人々に使用されてきている。それは、比類のない安全性の実績である。サルモネラ・チフィTy21aが全身の血流に入ることが出来るというデータは入手出来ない。故に、生存型弱毒化サルモネラ・チフィTy21aワクチン株は、腸における免疫系の特異的標的化を可能にする一方、安全で耐用性が高い。TyphoralL（登録商標）のマーケティング認証番号は、1996年12月16日PL 15747/0001である。ワクチンの1用量は、少なくとも2×109個の生存可能なサルモネラ・チフィTy21aコロニー形成単位及び少なくとも5x109個の生存不能なサルモネラ・チフィTy21a細胞を含む。
【００６３】
この腸チフスに対する高耐用性、生存型経口ワクチンは、野生型の毒性バクテリア分離株S.チフィTy2の化学的突然変異誘発によって誘導され、ガラクトースを代謝することができなくなるgalE遺伝子の機能喪失突然変異を有する。前記弱毒化バクテリア株はまた、硫酸塩を硫化物に還元することが出来ず、それにより、野生型サルモネラ・チフィTy2株と区別する。その血清学的特徴に関して、サルモネラ・チフィTy21a株は、バクテリアの外膜の多糖類であるO9抗原を含み、サルモネラ・ティフィムリウムの特徴的成分であるO5抗原を欠く。この血清学的特徴は、バッチリリースのための同定試験のパネルにそれぞれの試験を含める根拠を裏付けている。
【００６４】
特定の実施形態において、前記発現カセット及びさらなる発現カセットは、特にCMVプロモーターを含む真核生物の発現カセットである。本明細書において、「真核生物発現カセット」という用語は、真核生物細胞におけるオープンリーディングフレームの発現を可能にする発現カセットを指す。適切な免疫応答を誘導するのに必要とされる異種抗原の量は、バクテリアに対して毒性であり、細胞死、過剰な減弱又は異種抗原の発現の喪失をもたらし得ることが示されている。バクテリアベクターにおいて発現されず標的細胞においてのみ発現される真核生物の発現カセットを用いることは、この毒性の問題を克服することが出来、発現されるタンパク質は、典型的に、真核生物のグリコシル化パターンを示す。
【００６５】
真核生物発現カセットは、真核生物のオープンリーディングフレームの発現を制御することが可能な制御配列、好ましくは、プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む。本発明のサルモネラ菌の弱毒化株に含まれる組換えDNA分子に含まれるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、好ましくは、免疫される対象の細胞内で機能するように選択される。特にヒトのDNAワクチン製造のための適切なプロモーターの例は、限定されないが、例えば、強力なCMV即時初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40(SV40)、マウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）、HIVロングターミナルリピート（LTR）プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス（HIV）、モロニーウイルス、エプスタインバーウイルス（EBV）、及びラウス肉腫ウイルス（RSV）、並びにCMV初期エンハンサーエレメント、プロモーター、チキンβアクチン遺伝子の第1エキソン及び第1イントロン及びウサギβグロブリンのスプライスアクセプターからなる合成CAGプロモーター、並びにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターを含む。特定の実施形態において、真核生物発現カセットは、CMVプロモーターを含む。本明細書において、「CMVプロモーター」という用語は、強力な即時初期サイトメガロウイルスプロモーターを指す。
【００６６】
特にヒトのためのDNAワクチンの生産のための適切なポリアデニル化シグナルの例は、限定されないが、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化部位、SV40ポリアデニル化シグナル及びLTRポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施例において、本発明のサルモネラ菌の弱毒化株に含まれる組換えDNA分子に含まれる真核生物発現カセットは、BGHポリアデニル化部位を含む。
【００６７】
プロモーター及びポリアデニル化シグナルなどの異種腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原の発現のために要求される制御エレメントに加え、他の要素も組み換えDNA分子も含めることが出来る。そのような追加のエレメントは、エンハンサーを含む。前記エンハンサーは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンのエンハンサー、及びCMV、RSV及びEBV由来のものなどのウイルスエンハンサーの場合でもあり得る。
【００６８】
制御配列及びコドンは、一般に種に依存するため、タンパク質生産を最大化する目的で、制御配列及びコドンは、好ましくは免疫される種において有効であるように選択される。当業者は、所与の対象種において機能的である組換えDNA分子を産生することができる。
【００６９】
特定の実施形態において、前記VEGF受容体タンパク質は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するヒトVEGFR-2と、それと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。
【００７０】
キナーゼ挿入ドメイン含有受容体（KDR）としても知られているVEGFR-2は、VEGFに対する既知の細胞応答のほとんど全てを媒介すると思われる。例えば、血管新生におけるVEGFの役割は、このタンパク質とVEGFR-2との相互作用を介して媒介されると思われる。VEGFR-2は、VEGF並びにいVEGF-C及びVEGF-Dに対する1356アミノ酸長、200〜230kDa分子量の高親和性受容体である。ヒトにおいて、チロシンキナーゼ受容体のための内皮cDNAのスクリーニングを経て同定されたVEGFR-2は、以前に解明されたマウスfetal liverキナーゼ1(Flk-1)と85%の配列相同性を有する。VEGFR-2は、通常、内皮及び造血前駆細胞並びに内皮細胞、新生造血幹細胞及び臍帯間質において発現される。しかし、静止している成人の脈管構造では、VEGFR-2 mRNAはダウンレギュレートされていると思われる。
【００７１】
VEGFR-2の細胞外ドメインは、18の潜在的N-結合グリコシル化部位を含む。VEGFR-2は最初に150kDaのタンパク質として合成され、200kDaの中間体に急速にグリコシル化され、次いで細胞表面上に発現される230kDaの成熟タンパク質にさらに低速度でグリコシル化される。
【００７２】
本明細書において「約(about)」又は「おおよそ(approximately)」という用語は、所与の値又は範囲の95％〜105％、例えば、80％〜120％、あるいは90％〜110％の範囲内を意味する。
【００７３】
本発明において、「既定のタンパク質（リファレンスタンパク質）と少なくとも約80％の配列同一性を共有するタンパク質」という語句は、リファレンスタンパク質のアミノ酸配列及び/又はそのアミノ酸配列をコードする核酸配列が異なる可能性があるタンパク質をいう。タンパク質は天然起源、例えば、野生型タンパク質の変異体、例えば、野生型VEGF受容体タンパク質の突然変異型、又は異なる種の相同体、又は設計タンパク質、例えば、設計VEGF受容体タンパク質であってもよい。コドンの使用は種間で異なることが知られている。したがって、標的細胞に異種タンパク質を発現させる場合、核酸配列を標的細胞のコドン使用に適合させることが必要であるか、又は少なくとも有用であり得る。所与のタンパク質の誘導体を設計及び構築するための方法は、当業者に周知である。
【００７４】
所与のタンパク質と少なくとも80%の配列相同性を有するタンパク質は、規定のリファレンスタンパク質と比較して、1つ又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失及び/又は置換を含む1つ又はそれ以上の変異を含み得る。本発明の開示によると、前記欠失付加及び/又は置換アミノ酸は、連続したアミノ酸であってもよく、又は既定のリファレンスタンパク質と少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列にわたって点在し得る。本発明の開示によれば、リファレンスタンパク質とのアミノ酸配列同一性が少なくとも約80％であり、突然変異タンパク質が免疫原性である限り、任意の数のアミノ酸を付加、欠失及び/又は置換することができる。好ましくは、既定のアミノ酸配列のリファレンスタンパク質と少なくとも約80％の配列同一性を共有するタンパク質の免疫原性は、ELISAによる測定で既定のアミノ酸配列のリファレンスタンパク質と比較して、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10%未満、5%未満又は1%未満分減少させる。タンパク質相同体を設計及び構築するための方法及びその免疫原性の可能性についてそのような相同体を試験するための方法は、当業者に周知である。特定の実施形態において、リファレンスタンパク質との配列同一性は、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、又は最も具体的には少なくとも約95％である。親タンパク質と親配列に関し欠失、付加及び/又は置換を有するその誘導体との比較を含む配列同一性を決定するための方法及びアルゴリズムは、当業者に周知である。DNAレベルでは、VEGF受容体タンパク質と少なくとも約80％の配列同一性を共有するタンパク質をコードする核酸配列は、遺伝コードの縮重のためにより大きく異なる可能性がある。
【００７５】
特定の実施形態において、ヒトVEGFR-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する。
【００７６】
特定の実施形態において、DNA分子及びさらなるDNA分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、pMB1 ori及びCMVプロモーターを含む。特定の実施形態において、組換えDNA分子は、市販のpVAX1TM発現プラスミド（Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア）に由来する。この発現ベクターは、複製の高コピーpUC起点をpBR322の低コピーpMB1複製起点で置換することによって改変された。低コピー改変は、代謝負荷を軽減し、構築物をより安定にするために作製された。生成した発現ベクターバックボーンをpVAX10と命名した。
【００７７】
特定の実施形態において、DNA分子及びさらなるDNA分子は、配列番号2に示されるDNA配列を含む（ベクターバックボーンpVAX10）。
【００７８】
この発現ベクターバックボーンにNheI/XhoIを介して配列番号9で示される核酸配列のORFをコードするVEGF受容体タンパク質を挿入し、発現プラスミドpVAX10.VR2-1（WO 2013/091898）を得た。発現プラスミドpVAX10.VR2-1を図16に模式的に示す。発現プラスミドpVAX10.VR2-1を有するサルモネラ菌の弱毒化株Ty21aを含むDNAワクチンを、VXM01（WO 2013/091898）と命名した。
【００７９】
発現ベクターバックボーンにNheI/XhoIを介して配列番号10で示される核酸配列のヒト短縮型WT1をコードするORFを挿入し、発現プラスミドpVAX10.hWT1を得た。発現プラスミドpVAX10.hWT1を図17に模式的に示す。発現プラスミドpVAX10.hWT1を有するサルモネラ菌の弱毒化株Ty21aを含むDNAワクチンを、VXM06（WO2014 / 173542）と命名した。
【００８０】
発現ベクターバックボーンにNheI/XhoIを介して配列番号11で示される核酸配列のORFをコードするヒトMSLNを挿入し、発現プラスミドpVAX10.hMSLNを得た。発現プラスミドpVAX10.hMSLNを図18に模式的に示す。発現プラスミドpVAX10.hMSLNを有するサルモネラ菌の弱毒化株Ty21aを含むDNAワクチンをVXM04と命名した。
【００８１】
発現ベクターバックボーンにNheI/XhoIを介して配列番号12で示される核酸配列のORFをコードするヒトCEAを挿入し、発現プラスミドpVAX10.hCEAを得た。発現プラスミドpVAX10.hCEAを図19に模式的に示す。発現プラスミドpVAX10.hCEAを有するサルモネラ菌の弱毒化株Ty21aを含むDNAワクチンをVXM08と命名した。
【００８２】
発現ベクターバックボーンにNheI/XhoIを介して配列番号13で示される核酸配列のORFをコードするCMV pp65を挿入し、発現プラスミドpVAX10.CMVpp65_1を得た。発現プラスミドpVAX10.CMVpp65_1を図20に模式的に示す。発現プラスミドpVAX10.CMVpp65_1を有するサルモネラ菌の弱毒化株Ty21aを含むDNAワクチンをVXM65_1と命名した。
【００８３】
発現ベクターバックボーンにNheI/XhoIを介して配列番号14で示される核酸配列のORFをコードするCMVpp65を挿入し、発現プラスミドpVAX10.CMVpp65_2を得た。発現プラスミドpVAX10.CMVpp65_2を図21に模式的に示す。発現プラスミドpVAX10.CMVpp65_2を有するサルモネラ菌の弱毒化株Ty21aを含むDNAワクチンをVXM65_2と命名した。
【００８４】
発現ベクターバックボーンにNheI/XhoIを介して配列番号15で示される核酸配列のORFをコードするCMV pp65を挿入し、発現プラスミドpVAX10.CMVpp65_3を得た。発現プラスミドpVAX10.CMVpp65_3を図22に模式的に示す。発現プラスミドpVAX10.CMVpp65_3を有するサルモネラ菌の弱毒化株Ty21aを含むDNAワクチンをVXM65_3と命名した。
【００８５】
特定の実施形態において、前記さらなる弱毒化サルモネラ菌によってコードされる腫瘍抗原は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）及び少なくとも約80％の配列同一性を有するそのタンパク質、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するヒトメソテリン（MSLN）及び少なくとも約80％の配列同一性を有するそのタンパク質、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有するヒトCEA及び少なくとも約80％の配列同一性を有するそのタンパク質、配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するCMV pp65及び少なくとも約80％の配列同一性を有するそのタンパク質、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有するCMV pp65及び少なくとも約80％の配列同一性を有するそのタンパク質、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するCMV pp65及び少なくとも約80％の配列同一性を有するそのタンパク質からなる群から選択され、前記さらなる弱毒化サルモネラ株によってコードされる腫瘍間質抗原は、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）からなる群より選択される。
【００８６】
特定の実施形態において、ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有し、ヒトメソテリン（MSLN）は、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有し、ヒトCEAは、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有し、及びCMV pp65は、配列番号6、又は配列番号7、又は配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する。
【００８７】
メソテリンは、正常中皮細胞上に存在し、中皮腫及び卵巣及び膵臓腺癌を含むいくつかのヒト腫瘍において過剰発現する40kDaの細胞表面糖タンパク質である。メソテリン遺伝子は、巨核球増強因子（MPF）と名付けられた31kDaの脱落タンパク質及び40kDa細胞結合フラグメントメソテリンを生じるようにプロセッシングされる71kDaの前駆タンパク質をコードする。メソテリンは、インターロイキン-3の存在下で巨核球-コロニー形成活性を示すことが明らかにされた。メソテリンは、中皮などの正常な成人組織の制限されたセット上に低レベルで存在する腫瘍分化抗原であるが、中皮腫、卵巣癌及び膵臓癌、子宮頸部の扁平上皮癌、頭部及び首部、外陰、肺及び食道、肺腺癌、子宮内膜癌、二相性滑膜肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍及び胃腺癌を含む多種多様なヒト腫瘍において異常に過剰発現する。メソテリンの正常な生物学的機能は不明である。メソテリンノックアウトマウスの研究では、検出可能な表現型は見られず、雄及び雌のマウスの両方で健康な子孫が生じた。膵癌における研究において、メソテリンが、細胞増殖、遊走、及びS期細胞集団を増加させることによって腫瘍形成において役割を果たすことを示唆している。さらに、メソテリンが免疫原性タンパク質であるという証拠がある。その発現プロファイル、その発癌機能及びその免疫原性により、腫瘍抗原メソテリンは癌ワクチンの開発の有望な候補である。
【００８８】
ウィルムス腫瘍遺伝子1（WT1）は、細胞増殖及び分化に関与するジンクフィンガー転写因子をコードする。WT1タンパク質は、C末端に4つのジンクフィンガーモチーフ及びN末端にプロリン/グルタミンに富むDNA結合ドメインを含む。2つのコード化エキソンにおける選択的スプライシングから生じる複数の転写物バリアントは、十分に特徴付けられている。WT1は、泌尿生殖器系の発達に重要な役割を果たし、細胞増殖及び分化に関与している。WT1遺伝子は、小児腎新生物であるウィルムス腫瘍の原因遺伝子として単離された。WT1は、いくつかのタイプの血液悪性腫瘍及び様々な固形腫瘍を含む広範囲の悪性腫瘍において高度に発現される。対照的に、成人におけるWT1の正常組織発現は、生殖腺、子宮、腎臓、中皮及び種々のタイプの組織における前駆細胞に限定される。WT-1は分化に負に作用し、前駆細胞の増殖を促進する。さらに、WT1の過剰発現は、免疫原性である; WT1特異的T細胞ならびにIgG抗WT1抗体が癌患者において観察されている。その発現プロファイル、腫瘍形成機能及びその免疫原性により、腫瘍抗原WT1は癌ワクチンの開発の有望な候補である。
【００８９】
特定の実施形態において、WT1は、短縮される。特定の実施形態において、WT1のジンクフィンガードメインは、削除される。特定の実施形態において、短縮型WT1は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を持つ。
【００９０】
WT1のC末端のジンクフィンガードメインは、4つのジンクフィンガーモチーフを含む。配列番号3に示されるアミノ酸配列の短縮型WT1は、UniProt ref P19544-7のアミノ酸1〜371を表す。ジンクフィンガードメインの欠失は、他のジンクフィンガー含有転写因子との免疫学的交差反応性のリスクを最小限にする。さらに、ジンクフィンガードメインを欠く短縮型WT1は、全長WT1よりも高い免疫原性を有する。加えて、DNA結合に必須であるジンクフィンガーモチーフの欠失は、WT1の発癌能力を無効にし、したがって発癌のリスクを最小化する。
【００９１】
外皮タンパク質CMV pp65は、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）の主要免疫優性タンパク質である。CMV pp65の生物学的機能は不明であるが、細胞周期調節に関与していると考えられている。CMV pp65は、polo様キナーゼ1（PLK-1）に結合することができるタンパク質キナーゼ活性を示す核形成性タンパク質である。
【００９２】
HCMV pp65は、神経膠芽腫検体の90％以上で発現するが、周囲の正常脳では発現しない。したがって、このウイルスタンパク質は、癌免疫療法の新規開発のための腫瘍特異的標的として有望な候補である。
【００９３】
CMV pp65タンパク質は、カルボキシ末端近くのアミノ酸415〜438及びアミノ酸537〜561に2つの二分核局在化シグナル（NLS）を含み、リジン436にそのキナーゼ活性に関連するリン酸結合部位を含む。436位のリジンをアスパラギンに変異させ、537位〜561位のアミノ酸を欠失させると、キナーゼ活性を有さず、核局在が顕著に減少したタンパク質が得られる。この突然変異体タンパク質は、変わらない免疫原性を示す。
【００９４】
特定の実施形態において、CMV pp65は、配列番号6に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号6は、野生型ヒトCMV pp65のアミノ酸配列を表す。
【００９５】
特定の他の実施形態において、CMV pp65は、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号7は、配列番号6の野生型ヒトCMV pp65と比較して突然変異K436Nを有するヒトCMV pp65のアミノ酸配列を表す。
【００９６】
特定の他の実施形態において、CMV pp65は、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号8は、第2のよりC末端側のNLS（核局在配列）を欠く、配列番号7のCMV pp65の短縮型のアミノ酸配列を示す（すなわち、配列番号7のCMV pp65のアミノ酸537〜561）。
【００９７】
癌胎児性抗原（CEA）（CEACAM5及びCD66eとしても知られている）は、細胞接着に関与するグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）細胞表面の糖タンパク質の関連性が高いファミリーのメンバーである。CEAは、通常、胎児の発育中に胃腸組織で産生され; タンパク質発現は出生前に終わる。したがって、CEAは、通常、健康な成人の血液中に非常に低いレベルでのみ存在する。しかしながら、いくつかのタイプの癌、特に大腸癌において血清レベルが上昇するため、腫瘍マーカーとして働く。CEAレベルはまた、胃癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、及び甲状腺髄様癌、同様に潰瘍性大腸炎のような非新生物状態、膵炎、肝硬変、COPD、クローン病及び甲状腺機能低下症において惹起され得る。
【００９８】
特定の実施形態において、サルモネラ菌の弱毒化株は、さらなる前記抗癌剤と同時に又はその前に、すなわち、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードする少なくとも1つの前記DNAワクチン、少なくとも1つの前記チェックポイント阻害剤、少なくとも1つの前記設計T細胞及び/又は少なくとも1つの前記二重特異性抗体と同時に又はその前に投与される。
【００９９】
本発明において、「同時に用いる」という用語は、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなる抗癌剤を同日に、より詳細には12時間以内に、より詳細には2時間以内に投与することを意味する。
【０１００】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなる抗癌剤の投与は、8週間連続して、より詳細には3週間から6週間連続して行う。本発明によるサルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなる抗癌剤は、同じ経路又は異なる経路を介して投与することができる。
【０１０１】
特定の実施形態において、治療は化学療法、放射線療法又は生物学的癌療法を伴う。癌の治癒のためには、癌幹細胞の完全な根絶が不可欠である可能性がある。最大限の有効性のために、異なる治療アプローチの組み合わせが有益であり得る。
【０１０２】
本発明において、「生物学的癌療法」という用語は、生物由来の物質又はそのような物質の実験室で製造された物質の使用を伴う癌療法を指す。生物学的な癌治療アプローチには、免疫刺激性サイトカインの投与が含まれる。
【０１０３】
本発明のサルモネラ菌の弱毒化変異株と組み合わせて用いることができる化学療法剤は、例えば：ゲムシタビン、アミホスチン（エチオール）、カバジタキセル、シスプラチン、ダカルバジン（DTIC）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルヌスチン(BCNU)、ロムスチン（CCNU）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、フォリン酸、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノキソム(daunoxome)）、プロカルバジン、ケトコナゾール、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、CPT-11,10-ヒドロキシ-7-エチルカンプトテシン（SN38）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、オキサリプラチン、プリカマイシン、ミトタン、ペガススパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル及びそれらの組み合わせ、であり得る。
【０１０４】
本発明の最も好ましい化学療法剤は、カバジタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、パクリタキセル（タキソール）、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、フォリン酸、5-フルオロウラシル及びブレオマイシン、特にゲムシタビンである。
【０１０５】
特に、化学療法又は放射線療法の治療サイクル又は生物学的癌療法の前又は間に、サルモネラ菌の弱毒化株を投与する。他の特定の実施形態において、サルモネラ菌の弱毒化株は、化学療法又は放射線治療サイクル又は生物学的癌療法の前又は間に、サルモネラ菌の弱毒化株を投与する。
【０１０６】
特定の実施形態において、サルモネラ菌の弱毒化株及び、少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株は、経口投与される。経口投与は、非経口投与よりも簡単で、安全で、より楽である。しかし、本発明のサルモネラ菌の弱毒化株は、他の適切な経路によって投与することもできることを留意すべきである。好ましくは、治療上有効な用量が被験者に投与され、この用量は、特定の用途、悪性腫瘍の種類、被験者の体重、年齢、性別及び健康状態、投与方法及び処方などによって異なる。投与は、必要に応じて単回又は複数回でも良い。
【０１０７】
VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つの腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするさらなるサルモネラ菌の弱毒化株は、溶液、懸濁液、凍結乾燥物、腸溶コーティングされたカプセル、又は任意の他の適切な形態、の形態で提供され得る。典型的に、サルモネラ菌の弱毒化株は、飲用溶液として製剤化される。この実施形態は、改善された患者コンプライアンスの利点を提供する。好ましくは、飲用溶液は、胃酸を少なくともある程度中和する、すなわち胃液のpHをpH7に近づける手段を含む。好ましくは、飲用溶液は、本発明によるサルモネラ菌の弱毒化株を含む緩衝懸濁液である。特定の実施形態において、好ましくは、緩衝懸濁液は、2.6gの炭酸水素ナトリウム、1.7gのL-アスコルビン酸、0.2gのラクトース一水和物及び100mlの飲料水を含む適切な緩衝液中にサルモネラの弱毒化株を懸濁させることによって得られる。少なくとも1つのチェックポイント阻害剤、少なくとも1つの設計T細胞、及び少なくとも1つの、1つのT細胞表面タンパク質及び腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原に特異性を示す二重特異性抗体から選択された少なくとも1つのさらなる抗癌剤は、好ましくは、市販製品の認可された生薬製剤で投与される。
【０１０８】
特定の実施形態において、癌は、大腸癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、中皮腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、グリア芽細胞腫、胃癌、肝細胞癌、腎細胞癌、前立腺癌、及び子宮頸癌から選択される。
【０１０９】
VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株と共に、例えば、少なくとも1つのチェックポイント阻害剤、二重特異性抗体、設計T細胞及び腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするDNAワクチン等の抗癌剤は、驚くべきことに、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の比較的低用量でT細胞応答及び/又は全生存に相乗効果を示す。同様に、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするサルモネラ菌の弱毒化株を含む、DNAワクチンは、驚くべきことに、比較的低用量で効果がある。生存型バクテリアワクチンの低用量での投与は、排泄及び第三者への感染リスクを最小限に抑える。
【０１１０】
特定の実施形態において、単一用量のサルモネラ菌の弱毒化株及び少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株は、約105〜約1011、詳細には約106〜約1010、より詳細には約106〜109、より詳細には約106〜108、最も詳細には約106〜107のコロニー形成単位（CFU）を含む。
【０１１１】
特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株及び、少なくとも1つの腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするさらなるサルモネラ菌の弱毒化株の両方の単一用量は、本質的には同じであり、両方の単一用量は、約105〜約1011、詳細には約106〜約1010、より詳細には約106〜109、より詳細には約106〜108、最も詳細には約106〜107のコロニー形成単位（CFU）を含む。特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の単一用量は、少なくとも1つのさらなる腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の単一用量よりも約10〜100倍低い。特定の実施形態において、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の単一用量は、少なくとも1つのさらなる腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするサルモネラ菌の弱毒化株の単一用量よりも約10〜100倍高い。
【０１１２】
本明細書において、「約」又は「およそ」という用語は、所定の値又は範囲の3倍以内、あるいは2倍以内、1.5倍以内を意味する。
【０１１３】
特定の実施形態において、治療は、患者における前記腫瘍抗原に対する発現パターン及び/又は前記免疫応答の前兆を評価する工程を含む、個別化された癌免疫療法である。患者の腫瘍及び/又は間質抗原発現パターン及び/又は腫瘍及び/又は間質抗原に対する患者の免疫前応答は、例えば、患者の特定の腫瘍及び/又は間質抗原パターンを標的とする比較診断によって第1の工程で評価することができる。患者の腫瘍及び/又は間質抗原発現パターン又は腫瘍及び/又は間質抗原に対する患者の免疫前応答に依存して、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラ菌の弱毒化株は、真核細胞発現系を含む1つ又はそれ以上の適切なさらなるサルモネラ・チフィTy21aに基づく癌ワクチンと組み合わせて投与することができる。
【０１１４】
可能性のある副作用の発生に依存して、抗生物質又は抗炎症剤による治療を含むことが好ましい場合がある。
【０１１５】
ヒスタミン、ロイコトリエン又はサイトカインによって媒介される過敏反応に似た有害事象が生じた場合、発熱、アナフィラキシー、血圧不安定性、気管支痙攣及び呼吸困難の治療法の選択が可能である。望ましくないT細胞由来自己侵襲の治療法の選択は、幹細胞移植後に適用される急性及び慢性移植対宿主病における標準治療計画に由来する。シクロスポリン及びグルココルチコイドが、治療法の選択肢として提案されている。
【０１１６】
全身性のサルモネラ・チフィTy21a型感染の恐らく起こらないケースにおいては、例えば、シプロフロキサシン又はオフロキサシンを含むフルオロキノロンを用いて、適切な抗生物質療法が推奨される。胃腸管のバクテリア感染は、リファキシミンのようなそれぞれの薬剤で治療されるべきである。
【０１１７】
さらなる態様において、本発明は、VEGF受容体タンパク質をコードする発現カセットを含む少なくとも1コピーのDNA分子を含む、サルモネラ菌の弱毒化株を含む医薬組成物に関連し、ここで、前記医薬組成物は、さらに腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードする発現カセットをさらに含む少なくとも1コピーのさらなるDNA分子を含む少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株を含む。
【０１１８】
特定の実施形態において、医薬組成物は、DNAワクチンVXM01及びVXM06を含む。
【０１１９】
特定の実施形態において、医薬組成物は、DNAワクチンVXM01及びVXM04を含む。
【０１２０】
特定の実施形態において、医薬組成物は、DNAワクチンVXM01及びVXM08を含む。
【０１２１】
特定の実施形態において、医薬組成物は、DNAワクチンVXM01及びVXM65を含む。
【０１２２】
特定の実施形態において、少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株は、少なくとも1つのコピーの、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するヒトウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するヒトメソテリン（MSLN）及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有するヒトCEA及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号6に示されるようなアミノ酸配列を有するCMV pp65及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号7で示されるアミノ酸配列を有するCMV pp65及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質及び配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するCMV pp65及びそれと少なくとも約80％の配列同一性を有するタンパク質、からなる群から選択される腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするさらなる発現カセットを含むさらなるDNA分子を含み、ここで、特にヒトウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)は、配列番号3に示されるアミノ酸を有し、ヒトメソテリン（MSLN）は、配列番号4に示されるアミノ酸を有し、ヒトCEAは、配列番号5に示されるアミノ酸を有し、及びCMV pp65は、配列番号6、配列番号7又は配列番号8を有し、ここで、前記腫瘍間質抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)から選択される。
【０１２３】
本発明の医薬組成物は、溶液、懸濁液、腸溶性カプセル、凍結乾燥粉末又は意図された用途に適した他の任意の形態であり得る。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、1つ又はそれ以上の医薬的に許容される賦形剤をさらに含み得る。
【０１２５】
本発明において、「賦形剤」という用語は、薬物の有効成分と一緒に製剤化された天然又は合成物質を指す。適切な賦形剤は、抗付着剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、フレーバー、染料、潤滑剤、滑剤、吸着剤、防腐剤及び甘味料を含む。
【０１２６】
本発明において、「医薬的に許容される」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に、生理学的に許容され、典型的な有害反応を生じない医薬組成物の分子実体及び他の成分を指す。「医薬的に許容される」という用語は、連邦政府又は州政府の規制機関によって承認されているか、若しくは米国薬局方又は他の一般に認められている薬局方に記載されて哺乳類、特にヒトにおいて用いることを意味することが出来る。
【０１２７】
特定の実施形態において、抗癌剤が、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原を有することを含む少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株から選択され、本発明による医薬組成物は、飲用溶液として適切に提供され得る。この実施形態は、改善された患者コンプライアンスの利点を提供し、特に貧しい地域において、迅速かつ実現可能で手頃な大量ワクチン接種プログラムを可能にする。
【０１２８】
特に、適した飲用溶液は、胃酸を少なくともある程度中和する、すなわち胃液のpHをpH7に近づける手段を含む。特定の実施形態において、飲用溶液は、本発明によるサルモネラ菌の弱毒化株を適切な緩衝液中に懸濁させることによって得られる緩衝化懸濁液であり、好ましくは胃酸を少なくともある程度中和する緩衝液中であり、好ましくは2.6gの炭酸水素ナトリウム、1.7gのL-アスコルビン酸、0.2gのラクトース一水和物及び100mlの飲料水を含有する緩衝液である。
【０１２９】
特定の実施形態において、前記サルモネラ菌の弱毒化株及び前記少なくとも1つのさらなるサルモネラ菌の弱毒化株は、サルモネラ・チフィTy21aである。
【０１３０】
特定の実施形態において、前記発現カセット及びさらなる発現カセットは、特にCMVプロモーターを含む真核生物の発現カセットである。
【０１３１】
特定の実施形態において、前記VEGF受容体タンパク質は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するヒトVEGFR-2及び、それと少なくても約80%の配列同一性を有するタンパク質である。
【０１３２】
特定の実施形態において、ヒトVEGFR-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１３３】
特定の実施形態において、医薬組成物は、特に癌の治療に用いる医薬としての使用のためのものである。
【０１３４】
特定の実施形態において、治療は、VEGF受容体タンパクをコードするサルモネラ菌の弱毒化株又は本発明による医薬組成物の単一又は複数投与を含む。投与の単一用量は、同じ又は異なり得る。特に、治療は、VEGF受容体タンパク質をコードするサルモネラの弱毒化株または本発明による医薬組成物の1、2、3、4、5または6回の投与を含み、好ましくは複数回の投与が3〜6ヶ月連続して起こる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】プラスミドpVAX10.VR2-1に含まれるVEGFR-2cDNAによりコードされるヒトVEGFR-2のアミノ酸配列（配列番号1に対応する）。
【図２】空の発現ベクターpVAX10（制限部位NheIとXhoIの間に位置する多重クローニング部位の部分を含まない発現ベクターpVAX10の配列）に含まれる核酸配列（配列番号2）。
【図３】プラスミドpVAX10.hWT1に含まれるWT-1 cDNAによりコードされる短縮型ヒトWT-1のアミノ酸配列（配列番号3）。
【図４】プラスミドpVAX10.hMSLNに含まれるMSLN cDNAによりコードされるヒトMSLNのアミノ酸配列（配列番号4）。
【図５】プラスミドpVAX10.hCEAに含まれるCEA cDNAによりコードされるヒトCEAのアミノ酸配列（配列番号5）。
【図６】プラスミドpVAX10.CMVpp65_1に含まれるCMV pp65 cDNAによりコードされるCMV pp65のアミノ酸配列（配列番号6）。
【図７】プラスミドpVAX10.CMVpp65_2に含まれるCMV pp65 cDNAにコードされるCMV pp65のアミノ酸配列（配列番号7）。
【図８】プラスミドpVAX10.CMVpp65_3に含まれるCMV pp65 cDNAにコードされるCMV pp65のアミノ酸配列（配列番号8）。
【図９】プラスミドpVAX10.VR2-1に含まれ、配列番号1のヒトVEGFR-2をコードする核酸配列。
【図１０】プラスミドpVAX10.hWT1に含まれ、配列番号3のヒトWT1をコードする核酸配列。
【図１１】プラスミドpVAX10.hMSLNに含まれ、配列番号4のヒトMSLNをコードする核酸配列。
【図１２】プラスミドpVAX10.hCEAに含まれ、配列番号5のヒトCEAをコードする核酸配列。
【図１３】プラスミドpVAX10.CMVpp65_1に含まれ、配列番号6のCMVをコードする核酸配列。
【図１４】プラスミドpVAX10.CMVpp65_2に含まれ、配列番号7のCMV pp65をコードする核酸配列。
【図１５】プラスミドpVAX10.CMVpp65_3に含まれ、配列番号8のCMV pp65をコードする核酸配列。
【図１６】pVAX10.VR2-1のプラスミドマップ。
【図１７】pVAX10.hWT1のプラスミドマップ。
【図１８】pVAX10.hMSLNのプラスミドマップ。
【図１９】pVAX10.hCEAのプラスミドマップ。
【図２０】pVAX10.CMVpp65_1のプラスミドマップ。
【図２１】pVAX10.CMVpp65_2のプラスミドマップ。
【図２２】pVAX10.CMVpp65_3のプラスミドマップ。
【図２３】MC38マウス腫瘍モデル-腫瘍増殖におけるVXM01及び抗CTLA4の併用投与の効果。
【図２４】MC38マウス腫瘍モデル-生存におけるVXM01及び抗CTLA4の併用投与の効果。
【図２５】B16マウス腫瘍モデル-生存におけるVXM01及び抗CTLA4の併用投与の効果。
【図２６】実施例3の治療スケジュール。
【図２７】30日目の腫瘍サイズ[mm3]に対するシクロホスファミドの有り又は無しのVXM01治療の効果。各ドットは1匹の動物の腫瘍の結果を表す。
【図２８】皮下CT26結腸腫瘍細胞を有するBALB / Cマウスの脾臓におけるVEGFR-2特異的CD8 +細胞のパーセント。各ドットは、1つの脾臓の結果を表す。結果は、3つのプールされたVEGFR2ペンタマーの合計％で得られる。
【図２９】空ベクター及びVXM01で処理した動物からの腫瘍試料の抗CD3免疫組織化学染色。CD3陽性細胞は茶色に見える（例えば矢印参照）;  x200の倍率。
【図３０】免疫細胞浸潤物及びPD-L1の定量化は、空のベクターコントロールで処理した動物と比較して、VXM01又はVXM01に加えてシクロホスファミドで処理した動物からの腫瘍サンプルにおける倍数誘導を意味する。データは、絶対細胞数/組織面積[mm 2]から得られる; x200の倍率。
【図３１】皮下CT26結腸腫瘍細胞を有するマウスで治療した健常マウスの脾臓におけるVEGFR-2及びCEA特異的CD8 +細胞のパーセント。各ドットは、1つの脾臓の結果を表す。結果は、プールされた2つのVEGFR2ペンタマーの合計％で得られる。
【実施例】
【０１３６】
実施例１：MC38結腸癌抗CTLA4併用試験
【０１３７】
試験の第0日に、5×105個のMC38腫瘍細胞を皮下投与して、4群のC57/Bl6/6Jマウス（それぞれn = 6）を試みた。
【０１３８】
動物を、1日目、1日目、4日目、及び6日目（n=6、それぞれ）に強制経口投与によって108CFUの用量を単独でVXM01mlow(ドイツ、ハノーバー、Richter-Helm BioLogics社製のマウスVEGFR-2をコードする真核発現カセットを保有するサルモネラ・ティフィムリウム)、又は同じ用量のVXM01mlow、強制経口投与、及び12、14、及び18日目（n=6、それぞれ）にマウス抗CTLA4抗体の投与スキームをプラス、又はマウス抗CTLA4-抗体の12、14、16及び18日目のみの投与（n=6）、又は治療無し(n=6、コントロール)、で治療した。
【０１３９】
腫瘍増殖は、マイクロキャリパーを用いて測定した。動物の福祉上の理由から、腫瘍体積が1500mm3に達した時点で動物を犠牲にした。
【０１４０】
試験動物の生存を1日1回記録した。
【０１４１】
腫瘍成長を、図23に図示した。
【０１４２】
試験動物の生存を、図24のカプラン-マイヤープロットに示した。
【０１４３】
実施例2：B16-F10メラノーマ抗CTLA4併用試験
【０１４４】
試験の第0日に、2×105個のB16-F10腫瘍細胞の静脈内投与により、4群のC57/Bl6/6Jマウス（n = 6、それぞれ）を試みた。
【０１４５】
動物を、-5日目、-3日目、0日目、及び2日目（n=6）に強制経口投与によって108CFUの用量を単独でVXM01mlow(ドイツ、ハノーバー、Richter-Helm BioLogics社製のマウスVEGFR-2をコードする真核発現カセットを保有するサルモネラ・ティフィムリウム)で治療し、又は同じ用量のVXM01mlow、強制経口投与、及び8、10、12及び14日目（n=6、それぞれ）にマウス抗CTLA4抗体の投与スキームをプラス、又はマウス抗CTLA4-抗体の8、10、12、14日目のみの投与（n=6）、又は治療無し(n=6、コントロール)、で治療した。
【０１４６】
試験動物の生存を1日1回記録した。
【０１４７】
試験動物の生存を、図25のカプラン-マイヤープロットに示した。
【０１４８】
実施例3：CT26マウス腫瘍モデルにおけるVMX01ワクチンの抗腫瘍活性
【０１４９】
この実施例の目的は、皮下CT26結腸腫瘍を有するBALB/Cマウスにおけるシクロホスファミドを伴うまたは伴わないVXM01の抗腫瘍活性を評価し、脾臓及び腫瘍における治療によって誘発された免疫応答を特徴づけることである。
【０１５０】
コントロールVXM0m-空(発現プラスミドを有さないサルモネラ・チフィムリウムベクターコントロール)及びVXM01mlow(マウスVEGFR-2をコードする真核発現カセットを保有するサルモネラ・ティフィムリウム)を、強制管を介した強制経口投与により、108CFU/admで投与した。動物群にかかわらず、各動物は投与前の胃内の酸を中和するために投与前施用緩衝液POを受けた（100μl/動物/施用）。この緩衝液は、炭酸水素ナトリウム2.6g、L-アスコルビン酸1.7g及びラクトース一水和物0.2gを飲料水100mlに溶解することによって調整され、VXM0m-空またはVXM01mlowを投与する前30分以内に投与した。
【０１５１】
シクロホスファミドを100mg/kg/admでマウスの腹腔に注射した（腹腔内、IP）。IP注射量は10ml/kgを超えず、マウスの最新の体重に従って計算した。
【０１５２】
治療は、0日目（D0）に開始し、無作為化の1日後、-1日目（D-1）とみなした。Vivo manager（登録商標）ソフトウェア（Biosystemes、Couternon、France）を用いて、生後6週の健康なメスBALB/C（BALB/CByJ）マウスを体重に応じてそれぞれ11匹ずつ4群に無作為化した。群間の均質性を試験するために、統計的検定（分散分析）を行った。
【０１５３】
治療スケジュールは以下の通りである：
【０１５４】
第1群：第1群1の動物は、D1、D3、D5、D7、D14及びD21にVXM0m-空の合計6回のPO投与を受けた。
【０１５５】
第2群：第2群の動物は、D1、D3、D5、D7、D14及びD21にVXM01lowの合計6回のPO投与を受けた。
【０１５６】
第3群：第3群の動物は、D0上のシクロホスファミドの1回のIP注射及びD1、D3、D5、D7、D14及びD21上のVXM01lowの合計6回のPO投与を受けた。
【０１５７】
治療スケジュールを表1及び図26に要約した。
【表１】
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【０１５８】
*各動物は、投与前に胃内の酸を中和するために、経口（PO）投与前の施用緩衝液を受けた。
【０１５９】
腫瘍を、8日目（D8）に200μl RPMI 1640中の1×106個のCT26細胞を試験動物の右側腹部に皮下注射することによって誘導した。
【０１６０】
終了日（D30、すなわち腫瘍接種の22日後）に、全てのマウスからの腫瘍を収集し、腫瘍サイズを測定した。
【０１６１】
結果を図27にグラフで示した。腫瘍サイズは、空のベクターコントロールと比較して、VXM01単独またはVXM01+シクロホスファミドのいずれかで治療した動物で有意に減少した。腫瘍サイズの縮小は、シクロホスファミド及びVXM01ワクチンの両方で治療した動物において最も顕著であった。
【０１６２】
終了日に、全てのマウス（群当たり11サンプル）から脾臓を採取し、冷PBS（2〜8℃）を含む試験管に個々に入れた。ペンタマーによるフローサイトメトリーを用いたVEGFR-2特異的T細胞応答の免疫モニタリングを行った。
【０１６３】
そのため、脾臓試料をPBSで洗浄し、続いて100μmのナイロン細胞ストレーナーにそれらを沈めホモジナイズした。ホモジナイズ中、冷たい滅菌PBSでストレーナーを数回リンスした。試料を1500rpmで2〜8℃で10分間遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを2mlのACK赤血球溶解緩衝液（1つの脾臓あたり1ml緩衝液）に再懸濁した。細胞を溶解緩衝液中で室温1分間インキュベートした。次いで、PBSを40mlに加えて溶解を停止させ、細胞懸濁液を新鮮なストレーナー（40μm）で篩過し、新しい50mlチューブに流しを集めた。1500rpmで2〜8℃で10分間遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを5mlのIl-2添加DMEM培地に再懸濁した。
【０１６４】
5量体染色に先立ち、ネガティブ集団をゲーティング(gating)することによって死細胞を排除するために、製造元の指示に従って、Invitrogen社製のLive Dead（L/D）Fixable Yellow Dead Cell Stain Kitを用いたlive/dead(L/D)染色を行った。
【０１６５】
ペンタマー染色は、製造元、Proimmune社、Oxford、UKの指示に従って、Pro5（登録商標）Recombinant MHC Pentamersを用いて行った。
【０１６６】
以下のKDR（VEGFR-2）ペンタマーを使用した：
H-2Kd - SYQYGTMQTL    KDR-STL 
H-2Kd - KYLSYPAPDI    KDR-KDI 
H-2Kd - RFVPDGNRI    KDR-RRI 
H-2Kd - TYQSIMYIV    KDR-TIV 
H-2Kd - DFLTLEHLI    KDR-DLI
【０１６７】
ペンタマー染色の結果を図28に示す。
【０１６８】
VEGFR-2特異的CD8+細胞傷害性T細胞の数は、空のベクターコントロールと比較して、VXM01単独またはVXM01+シクロホスファミドのいずれかで治療した動物において有意に増加した。VXM01と一緒のシクロホスファミド治療は、ワクチンVXM01単独で得られた応答と比較して、KDRペンタマー応答を有意に増加させた。
【０１６９】
各群の5匹のマウスからの腫瘍を、免疫組織化学（IHC）によって分析した。
【０１７０】
そのため、腫瘍を10％中性緩衝ホルマリン中で24時間〜48時間固定し、エタノールに移し、次いでパラフィンに包埋した。埋め込まれたサンプルを免疫組織化学的染色に付した。結果を図29及び図30にグラフで示す。
【０１７１】
空のベクターコントロールと比較して、VXM01単独またはVXM01+シクロホスファミドのいずれかで治療したマウスの腫瘍において、組織単位当たりのT細胞の平均数が増加することが見出された。CD3+及びCD8+細胞集団は、VXM01 +シクロホスファミドで治療したマウスの腫瘍サンプルでは約3倍、VXM01単独で治療したマウスでは腫瘍サンプルで約2倍増加した。また、CD4+T細胞集団は、VXM01ワクチン治療動物において、シクロホスファミド前処理あり及びなしで増加し、空のベクターコントロールと比較して、両方のワクチン群におけるCD4+細胞/組織面積の平均数が1.7倍増加した。
【０１７２】
さらに、PDX-1陽性免疫細胞の数が2.0及び2.1倍に増加し、VXM01単独治療またはシクロホスファミド併用のいずれかで、PD-L1発現細胞に腫瘍が富化され、VXM01治療が明らかに抗PD-1及び抗PD-L1チェックポイント阻害剤での治療に対する腫瘍の感受性を増加させることを示唆する。
【０１７３】
実施例4：健康なC56BL/6JマウスにおけるVXM01/VXM08併用試験
【０１７４】
この試験の目的は、健常マウスにおいて免疫応答を引き起こすVXM01mlow及びVXM08hmの能力を評価することである。
【０１７５】
コントロールVXM0m-空（発現プラスミドを有さないS.チフィムリウムベクターコントロール）、ワクチンVXM01mlow（マウスVEGFR-2をコードする真核生物発現カセットを保有するサルモネラ・ティフィムリウム）及びワクチンVXM08hm（真核生物発現カセットをコードするヒトCEAを保有するサルモネラ・ティフィムリウム）を、強制管を介して強制経口投与（経口、PO）により1回の施用あたり50μlで108CFU/admで投与した。動物群にかかわらず、各動物は投与前に胃の酸を中和するために投与前施用緩衝液POを受けた（単一ワクチン投与前の50μl/動物/施用; VXM01とVXM08の併用投与前の100μl/動物/施用）。この緩衝液は、飲料水100ml中に炭酸水素ナトリウム2.6g、L-アスコルビン酸1.7g及びラクトース一水和物0.2gを溶解させて調製し、VXM0m空、VXM01mlow及び/またはVXM08hmを施用する30分以内に施用した。
【０１７６】
Vivo manager（登録商標）ソフトウェア（Biosystemes、Couternon、France）を用いて、6匹〜7週齢の40匹の健康なメスC57BL/6Jマウスを体重に従って0日目（D0）に無作為化して8匹の動物の5群にした。群間の均質性を試験するために、統計的検定（分散分析）を行った。
【０１７７】
治療スケジュールは以下の通りである：
【０１７８】
第1群：第1群の動物は、D1、D3、D5、D7、D14及びD21にVXM0m-空の合計6回のPO投与を受けた。
【０１７９】
第2群：第2群の動物は、D1、D3、D5、D7、D14及びD21にVXM01lowの合計6回のPO投与を受けた。
【０１８０】
第3群：第3群の動物は、D2、D4、D6、D8、D15及びD22にVXM08hmの合計6回のPO投与を受けた。
【０１８１】
第4群：第4群の動物は、D2、D4、D6、D8、D15及びD22上のVXM01lowの合計6回のPO投与及びD2、D4、D6、D8、D15及びD22上のVXM08hmの合計6回のPO投与を受けた。
【０１８２】
第5群：第5群の動物は、D1、D3、D5、D7、D14及びD21上のVXM01lowの合計6回のPO投与及びD2、D4、D6、D8、D15及びD22上のVXM08hmの合計6回のPO投与を受けた。
【０１８３】
治療スケジュールを表2に要約した。
【表２】
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【０１８４】
* VXM08はVMX01の直後に、施用の同じ日に投与された。
【０１８５】
終了日（すなわち、D29）に、全てのマウス（1群あたり8サンプル）から脾臓を採取し、冷PBS（2〜8℃）を含む試験管に個々に入れた。ペンタマーによるフローサイトメトリーを用いたVEGFR-2及びCEA特異的T細胞応答の免疫モニタリングを行った。実施例3に記載したように、前述のlive/dead染色を含むペンタマー解析を実施した。
【０１８６】
以下のKDR（VEGFR-2）ペンタマーを同じ比率でプールミックスとして使用した：
H-2Db-VILTNPISM    KDR2
H-2Db-FSNSTNDILI    KDR3
【０１８７】
以下のCEAペンタマーを同じ比率でプールミックスとして使用した：
H-2Db-CGIQNSVSA    CEA-CSA-Penta
H-2Db-LQLSNGNRTL    CEA-LTL-Penta
H-2Db-CGIQNKLSV    CEA-CSV-Penta
【０１８８】
ペンタマー染色の結果を図31に示す。VXM01low、VXM01mlow/VXM08hm（同時）及びVXM01mlow/VXM08hm（1日おき）で治療したマウスでは、コントロール群よりもVEGFR-2（KDR）特異的CD8+T細胞の平均頻度はそれぞれ1.71、4.26及び2.76倍高かった。VXM01mlow/VXM08hmで同時又は一日おきのいずれかで治療したマウスは、VXM08hm単独で治療したマウスと比較して、CEA特異的CD8+T細胞の頻度が高かった。統計学的に有意ではないが、VXM01mlow及びVXM08hmワクチンを併用した場合、すなわち1日おき摂取と比較して同じ日に、相乗効果がわずかに高かった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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