(57)【要約】  本発明は、癌または転移性疾患の治療または予防における使用のためのアセチルコリンエステラーゼのＣ末端に由来する環状ポリペプチドに関する。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌または転移性疾患の治療、寛解、または予防における使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項２】
前記癌が白血病である、請求項１に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項３】
前記癌がリンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、骨髄性白血病、または急性骨髄性白血病である、請求項２に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項４】
前記癌が多発性骨髄腫または乳癌である、請求項１に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項５】
転移性疾患の治療、寛解、または予防における、請求項１に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項６】
前記環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列またはそのトランケーションを含むかまたはそれからなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項７】
前記環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、末端付加（ｔａｉｌｅｄ）前記アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列またはそのトランケーションを含むかまたはそれからなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項８】
前記環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、前記アセチルコリンエステラーゼのＣ末端を形成する最後の３００、２００、１００または５０個のアミノ酸に由来するアミノ酸配列またはそのトランケーションを含むかまたはそれからなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項９】
前記環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、前記アセチルコリンエステラーゼのＣ末端を形成する最後の４０個のアミノ酸に由来するアミノ酸配列またはそのトランケーションを含むかまたはそれからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項１０】
前記アセチルコリンエステラーゼは、配列番号１で実質的に定義されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項５〜８のいずれか１項に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項１１】
前記環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、８〜４０個のアミノ酸残基、または１０〜３０個のアミノ酸、または１２〜２０個のアミノ酸を含むかまたはそれからなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項１２】
前記ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、環状の配列番号２、３、もしくは４、またはその機能性変異体もしくはフラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項１３】
前記ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、環状の配列番号３、またはその機能性変異体もしくはフラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項１４】
治療上有効な量の請求項１〜１３のいずれか１項に記載の環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体と、任意に、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、抗癌または抗転移薬剤組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の抗癌または抗転移薬剤組成物の製造方法であって、治療上有効な量の請求項１〜１３のいずれか１項に記載の環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体と、薬学的に許容される賦形剤と、を組み合わせることを含む、方法。
【請求項１６】
前記環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、配列番号３を含むかまたはそれからなる、請求項１４に記載の薬剤組成物、または請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌に関し、具体的には癌または転移性疾患を治療、予防、または寛解するための新規な組成物、療法、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌及び悪性腫瘍は、身体の他の部分に侵入または拡散、すなわち転移する可能性を有する異常な細胞増殖を伴う疾患群を形成する。２０１２年には、世界中で約１，４００万人の新たな癌の症例が発生した。したがって、癌及び転移の治療のための改善された医薬品を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、種々の癌細胞株、ならびに患者由来の初代腫瘍細胞及び健常な同年齢の個体由来のリンパ球におけるアセチルコリンエステラーゼのＣ末端に由来する環状ペプチド（「ＮＢＰ−１４」として知られている）の効果を研究し、そしてそれが、試験したそれぞれの癌細胞株において中程度のアポトーシス活性及び抗増殖活性を示したことを見出した。加えて、それらはまた、環状ペプチドが正常細胞では無毒であることも示している。したがって、本発明者らは、環状ペプチドが、癌、腫瘍及び転移性疾患の治療において治療上の利益を有すると考えている。
【０００４】
したがって、本発明の第１の態様では、癌または転移性疾患の治療、寛解、または予防における使用のための、環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体が提供される。
【０００５】
第２の態様では、被験体の癌または転移性疾患を治療、寛解、または予防する方法であって、そのような治療を必要とする被験体に、治療上有効な量の環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与することを含む方法が提供される。
【０００６】
実施例に記載されているように、本発明者らは、（ｉ）種々の予後マーカーを含む慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者由来の初代ＣＬＬのサンプル（ＭＥＣ−１細胞）において、（ｉｉ）ＫＧ１ａ（急性骨髄性白血病細胞株）及びＨ９２９及びＪＪＮ３（多発性骨髄腫細胞株）において、及び（ｉｉｉ）ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌細胞株）において、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端に由来する環状ペプチド（「ＮＢＰ−１４」として知られている）のインビトロ細胞傷害試験を行った。本発明者らは、驚くべきことに、環状ペプチドＮＢＰ−１４が、濃度＞０．１μＭで試験した各細胞株においてアポトーシス効果を示したことを示した。さらに、ＭＣＦ７細胞は、ＮＢＰ−１４に対する感受性の増加を示した。環状ペプチドＮＢＰ−１４は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において抗増殖活性の証拠を示し、そして＞０．１μＭのペプチド濃度でＪＪＮ３細胞、ＫＧ１ａ細胞、ＭＥＣ−１細胞及びＨ９２９細胞においても同様の効果が観察された。好都合なことに、それらはまた、環状ペプチドが正常細胞では同じ濃度で無毒性であることを示した。
【０００７】
治療される癌は白血病であってよい。例えば、癌は、リンパ球性白血病または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）であってよい。癌は、骨髄性白血病または急性骨髄性白血病であってよい。癌は多発性骨髄腫であってよい。癌は乳癌であってよい。
【０００８】
最も好ましくは、環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、転移性疾患の治療、寛解、または予防における使用のためのものである。
【０００９】
環状ポリペプチドは、図８Ｂに示すように、そのＮ末端及びＣ末端自体が、アミノ酸の環状鎖を形成するペプチド結合で連結されたペプチド鎖である。
【００１０】
「その誘導体もしくは類似体」という用語は、そのうちのアミノ酸残基が、類似する側鎖またはペプチド骨格の特性を有する残基（天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはアミノ酸模倣体を問わず）によって置換されるポリペプチドを意味する。さらにそのようなペプチド末端は、アセチル基またはアミド基と同様の性質を有するＮ−及びＣ−末端保護基によって保護され得る。
【００１１】
本発明によるペプチドの誘導体及び類似体はまた、インビボでペプチドの半減期を増加させるものを含み得る。例えば、本発明のペプチドの誘導体もしくは類似体は、ペプチドのペプトイド及びレトロペプトイド誘導体、ペプチド−ペプトイドハイブリッド及びペプチドのＤ−アミノ酸誘導体を含み得る。
【００１２】
ペプトイド、すなわちポリ−Ｎ−置換グリシンはペプチド模倣体の一種であり、その側鎖は、アミノ酸中にあるような、α−炭素にではなくむしろペプチド骨格の窒素原子に付加される。本発明のペプチドのペプトイド誘導体は、ペプチドの構造の知識から容易に設計することができる。レトロペプトイド（すべてのアミノ酸が逆の順序でペプトイド残基によって置換されている）も、本発明による適切な誘導体である。レトロペプトイドは、１つのペプトイド残基を含むペプチドまたはペプトイド−ペプチドハイブリッドと比較して、リガンド結合溝において反対方向に結合することが予想される。その結果、ペプトイド残基の側鎖は元のペプチドの側鎖と同じ方向を向くことができる。
【００１３】
好ましくは、環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含むかまたはそれからなる。
【００１４】
実施例に記載されているように、本発明者らは、非常に驚くべきことに本発明の環状ＡＣｈＥ由来ポリペプチドが正常組織ではなく腫瘍細胞を選択的に標的とすることを観察した。
【００１５】
したがって、「に由来する」という用語は、ＡＣｈＥのＣ末端内またはその一部に存在するかそれを形成するアミノ酸配列の誘導体または改変体であるアミノ酸配列を意味する。
【００１６】
「そのトランケーション」という用語は、ＡＣｈＥに由来する環状ポリペプチドは、アミノ酸の除去によりサイズが減少することを意味する。アミノ酸の減少は、本発明の環状ポリペプチドへの環化前にペプチドのＣ末端またはＮ末端からの残基の除去によってなされるか、あるいは環化前にペプチドのコア内からの１つ以上のアミノ酸の欠失によってなされる。
【００１７】
アセチルコリンエステラーゼは、アセチルコリンを加水分解するセリンプロテアーゼであり、当業者にとって周知である。脳で発見されるアセチルコリンエステラーゼの主要な形態は、末端付加（ｔａｉｌｅｄ）アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）として知られている。環状ポリペプチドまたはこれらの誘導体もしくは類似体は、末端付加アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含むことが特に好ましい。
【００１８】
ヒト末端付加アセチルコリンエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６８１５１．１）の一実施態様のタンパク質配列は、長さが６１４アミノ酸であり、本明細書では配列番号１として以下のように提供される。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
配列番号１の最初の３１個のアミノ酸残基は、タンパク質が放出されることによって除去され、それによって５８３個のアミノ酸配列が残ると理解される。したがって、環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含むかまたはそれからなり、この際、アセチルコリンエステラーゼは、配列番号１で実質的に定義されるアミノ酸配列を含み、好ましくはＮ末端の３１個のアミノ酸が除かれる。
【００２１】
好ましくは、環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端を形成する最後の３００、２００、１００または５０個のアミノ酸、またはそのトランケーションを含むかそれからなり、この際、特に好ましくはアセチルコリンエステラーゼは配列番号１で実質的に定義されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、好ましくは、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端を形成する最後の４０個のアミノ酸に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含むかまたはそれからなる。
【００２２】
環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、好ましくは８〜４０個のアミノ酸残基、より好ましくは１０〜３０個のアミノ酸、特に好ましくは１２〜２０個のアミノ酸を含むかまたはそれからなる。本発明者は、ＡＣｈＥのＣ末端に由来する３種類のペプチド配列であって、本明細書中、Ｔ３０、Ｔ１４、及びＴ１５と称され、その数がアミノ酸の数に相当するものを調製した。
【００２３】
Ｔ３０のアミノ酸配列（配列番号１の最後の３０個のアミノ酸残基に相当する）は、本明細書では配列番号２として以下に提供される。
【００２４】
【化２】
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【００２５】
Ｔ１４のアミノ酸配列（配列番号１の端部に向かって位置する１４個のアミノ酸残基に相当し、かつＴ３０に見られる最後の１５個のアミノ酸を欠く）は、本明細書では配列番号３として以下に提供される。
【００２６】
【化３】
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【００２７】
Ｔ１５のアミノ酸配列（配列番号１の最後の１５個のアミノ酸残基に相当する）は、本明細書では配列番号４として以下に提供される。
【００２８】
【化４】
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【００２９】
配列番号２〜４として表されるいずれかの配列も、容易に環化もしくは環状化して、第１の態様の環状ポリペプチドを形成することができることが理解される。例えば、ペプチドの環化は、側鎖−側鎖、側鎖−骨格、またはヘッドトゥテール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）（Ｃ末端からＮ末端へ）環化技術によって達成できる。好ましい一実施形態において、ヘッドトゥテール環化は、環状ポリペプチドを製造するのに好ましい方法である。環状ポリペプチドは、古典的な溶液相での直鎖状ペプチドの環化、または樹脂ベースの（ｒｅｓｉｎ−ｂａｓｅｄ）環化のいずれかを用いて合成することができる。環化のための好ましい方法は、実施例に記載されている。他の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、環化切断アプローチを用いて製造され、この際、段階的な直鎖状ペプチド合成後の環化によって環状ポリペプチドを合成する。この方法の利点は、側鎖が固定される必要が無いことであり、それをより一般的なアプローチにする。好ましくは、使用前に、環状ペプチドの合成サンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析してもよい。
【００３０】
したがって、本発明による好ましいポリペプチドは、環状の配列番号２、３、または４、またはその機能的変異体もしくはフラグメントを含むかまたはそれからなる。
【００３１】
本発明者は、環化した配列番号３（すなわち、本明細書中、「環化Ｔ１４」、「ＣＴ１４」、または「ＮＢＰ−１４」と称される）が、驚くべきことに、健常細胞と比較して試験した癌細胞株の各々において選択的アポトーシス活性及び抗増殖活性を示し、正常な非癌細胞において無毒であることを見出した。
【００３２】
したがって、第１の態様のもっとも好ましい環状ポリペプチドは、環状の配列番号３またはその機能的変異体もしくはフラグメントを含むかまたはそれからなる。
【００３３】
本発明による環状ポリペプチドは、単独療法（すなわち、環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくはその類似体単独の使用）として、癌または転移性疾患を治療、寛解、または予防するために使用できる医薬に使用することができると理解される。あるいは、本発明による環状ポリペプチドは、癌を治療、寛解、または予防するための既知の治療法の補助剤として、またはそれと組み合わせて使用することができる。
【００３４】
本発明に係る環状ポリペプチドは、特に、組成物の使用する方法に応じて、多くの異なる形態を有する組成物と組み合わせてもよい。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または治療を必要とするヒトまたは動物に投与してもよいいずれかの他の適切な形状の形態であってもよい。本発明に係る薬剤の賦形剤は、投与される被験体が十分に耐えうるものであるべきであり、ならびに好ましくは、脳腫瘍を治療する際に、血液脳関門を横切る環状ポリペプチドの送達を可能にするものであると理解される。
【００３５】
本発明による環状ポリペプチドはまた、徐放性または遅延放出性デバイス内に組み込むこともできる。このようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入することができ、薬剤は、数週間または数ヶ月にわたって放出され得る。デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して配置されてもよい。そのようなデバイスは、本発明により使用される環状ポリペプチドによる長期治療が必要であって、かつ頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を通常必要とする場合に、特に有利であり得る。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明による薬剤は、血流への注射または治療を必要とする部位への直接的な注射によって、被験体に投与され得る。例えば、薬剤は、少なくとも脳に隣接して注射されてもよい。注射は、静脈内（ボーラスまたは点滴）または皮下（ボーラスまたは点滴）または皮内（ボーラスまたは点滴）であり得る。
【００３７】
必要とされる環状ポリペプチドの量は、その生物学的活性及び生物学的利用能によって決定され、次にそれは投与様式、環状ポリペプチドの物理化学的性質、及びそれが単独療法または併用療法のいずれで使用されるのかに依存すると理解されよう。また、投与頻度は、治療される被験体内の環状ポリペプチドの半減期に影響される。投与される最適用量は、当業者によって決定され、使用における特定の環状ポリペプチド、薬剤組成物の強度、投与様式、及び癌または転移性疾患の進行によって異なる。治療される特定の被験体に依存する追加因子は、被験体の年齢、体重、性別、食事及び投与時間を含んで、用量を調整する必要性が生じる。
【００３８】
一般的に、癌または転移性疾患を治療、寛解、または予防するために、本発明による環状ポリペプチドを、使用する環状ポリペプチドに依存して、０．００１μｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の、または０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重の一日用量で使用してよい。
【００３９】
環状ポリペプチドは、癌の発症前、発症中または発症後に投与してもよい。毎日の用量は、単回投与（例えば、１日１回の注射または鼻腔スプレーの吸入）として与えられてもよい。あるいは、環状ポリペプチドは、１日２回以上の投与を必要としてもよい。一例として、環状ポリペプチドは、（すなわち、体重７０ｋｇを仮定して）０．０７μｇ〜７００ｍｇの量で、１日２回（または、治療される癌または転移性疾患の重症度によってはそれ以上）投与してもよい。治療を受ける患者は、起床時に１回目の投与を、夕方（２回投与の場合）またはそれから３〜４時間空けて２回目の投与を受けてもよい。あるいは、複数回投与を必要とせずに患者に対して、最適な用量の本発明による環状ポリペプチドを提供するために、徐放デバイスを用いてもよい。
【００４０】
本発明よる環状ポリペプチドの特定の配合、及び（薬剤の一日用量や投与頻度などの）正確な治療計画を形成するのに、製薬業界で従来採用されているものなど既知の方法（例えば、インビボ実験、臨床試験等）を用いてもよい。本発明者らは、本発明による環状ポリペプチドの使用に基づいて、抗癌治療組成物を提案した最初のものであると考えている。
【００４１】
したがって、本発明の第３の態様において、治療上有効な量の第１の態様による環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体と、任意に、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、抗癌または抗転移薬剤組成物が提供される。
【００４２】
また、本発明は、第４の態様において、第３の態様による抗癌または抗転移薬剤組成物の製造方法であって、治療上有効な量の第１の態様による環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体と、薬学的に許容される賦形剤と、を組み合わせることを含む、方法を提供する。
【００４３】
環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、好ましくは本明細書で開示されている環状Ｔ１４（すなわち、ＮＢＰ−１４）、すなわち配列番号３を含むかまたはそれからなる。
【００４４】
「被験体」は、脊椎動物、哺乳類または家畜動物であってよい。したがって、本発明による薬剤は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えば馬）、ペットを治療するのに使用してもよく、または他の獣医学的適用において使用してもよい。しかしながら、最も好ましくは、被験体はヒトである。
【００４５】
環状ポリペプチドの「治療上有効な量」は、被験体に投与した際、癌または転移性疾患を治療するか、または所望の効果を生じるのに必要とされる活性剤量である任意の量である。環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体は、固形腫瘍または転移性腫瘍の治療のためのアジュバントとして、例えば化学療法または放射線療法で使用することができる。これは、化学療法及び／または放射線療法の、より低い用量及び暴露時間を要することを意味する。
【００４６】
例えば、使用される環状ポリペプチドの治療上有効な量は、約０．００１ｍｇ〜約８００ｍｇ、及び好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇであってもよい。
【００４７】
本明細書で称される、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者にとって薬剤組成物を処方するのに有用であると知られている、いずれかの既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【００４８】
一実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤は、固体であってもよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってもよい。しかしながら、薬学的賦形剤は液体であってもよく、薬剤組成物は溶液の形態であってもよい。滅菌された溶液または懸濁液である液体薬剤組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、特に皮下注射によって利用することができる。
【００４９】
本発明の環状ポリペプチド及び組成物は、他の溶質や懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステル及びエチレンオキシドと共重合したその無水物）などを含む、滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与されてもよい。また、本発明により使用される環状ポリペプチドは、液体または固体の組成物形態で経口投与することができる。経口投与に好適な組成物は、ピル、カプセル剤、顆粒剤、錠剤及び粉末などの固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル及び懸濁液などの液体形態を含む。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、エマルジョン及び懸濁液が含まれる。
【００５０】
本発明は、いずれかの核酸もしくはペプチドまたはその変異体、誘導体、もしくは類似体にまで拡張するものであり、その機能性変異体または機能性フラグメントを含む、本明細書で言及される配列のいずれかのアミノ酸または核酸配列を実質的に含むことと理解されよう。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「機能性変異体」及び「機能性フラグメント」は、例えば配列番号１〜４で定義される配列と４０％の同一性であるなど、本明細書で言及されるいずれかの１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列であってよい。
【００５１】
また、言及される配列のいずれかと６５％超、より好ましくは７０％超、より好ましくは７５％超、さらにより好ましくは８０％超である配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列についても想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書に言及される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有し、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００５２】
当業者であれば、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性率（ｐｅｒｓｅｎｔａｇｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の計算方法を理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性率を計算するためには、まず２つの配列のアラインメントを準備し、配列同一性値を計算する。２つの配列の同一性率は、（ｉ）配列をアラインするために使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実施される）、または３Ｄ比較による構造的アラインメント、及び（ｉｉ）アライメント方法によって使用されるパラメータ（例えば、ローカル対グローバルアライメント、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔ等）、ギャップペナルティ（例えば、関数形式や定数）に依存して、異なる値をとる。
【００５３】
アラインメント後、２つの配列間の同一性率を計算する方法は多数ある。その一つとして、例えば、一致数（ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を（ｉ）最短配列長さ、（ｉｉ）アラインメント長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）非ギャップ位置数、または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置数で、除してもよい。さらに、同一性率は、長さにも大きく依存すると理解されよう。ゆえに、配列の短いペアでは、より高い配列同一性が偶然に起こることが予想される。
【００５４】
したがって、当タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは複雑なプロセスであることが理解されよう。有名な多重アラインメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４８７６−４８８２）は、本発明によるタンパク質またはＤＮＡの多重アラインメントを生成する上で好適な方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷに好適なパラメータは下記のとおりである：ＤＮＡアラインメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、及びマトリックス＝アイデンティティ。タンパク質アライメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、及びマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡ及びタンパク質のアラインメントの場合：ＥＮＤＧＡＰ＝−１及びＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アラインメントのためにこれら及び他のパラメータを変更することが必要なことに気づくであろう。
【００５５】
好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性率の計算は、その結果（Ｎ／Ｔ）＊１００などのアラインメントから計算してもよく、式中、Ｎは、同一の残基を共有する配列における位置の数であり、Ｔは、ギャップを含みオーバーハングを除いて比較した位置の総数である。したがって、２つの配列間の同一性率を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば、上記のように、好適な一連のパラメータを用いてＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて配列アラインメントを調製することと、（ｉｉ）Ｎ及びＴの値を次式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することとを含む。
【００５６】
類似する配列を特定するための他の方法は、当業者にとって既知である。例えば、実質的に類似するヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でＤＮＡ配列またはその相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件では、ヌクレオチドを約４５℃で３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合したＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズさせた後、約２０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは、実質的に類似するポリペプチドは、配列番号１〜４で示される配列とは、少なくとも１個のアミノ酸、しかし５、１０、２０、５０または１００個の未満のアミノ酸が異なっていてもよい。
【００５７】
遺伝コードの縮退により、本明細書に記載される任意の核酸配列は、これによってコードされるタンパク質配列に実質的に影響を及ぼすことなく、変異または変化して、その機能性変異体を提供できることは明らかである。好適なヌクレオチド変異体は、配列内で同一のアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化した配列を有するものであり、このためサイレントな変化を生じる。他の好適な変異体は、対応するヌクレオチド配列を有するが、置換されるアミノ酸と同様の生物物理学的性質の側鎖を有するアミノ酸をコードする、異なるコドンの置換によって変更されて控えめな変化を生じる、配列の全部または一部を含むものである。例えば、小さい非極性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンが含まれる。大きい非極性の疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。極性の中性アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、リジン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。ゆえに、いずれのアミノ酸が同様の生物物理学的性質を有するアミノ酸で置換できるかが理解され、当業者であればこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が分かるであろう。
【００５８】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）で記載された特徴のすべて、及び／または開示されたいずれかの方法またはプロセスの過程のすべては、少なくともこのような特徴及び／または過程の幾つかが相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせてもよい。
【００５９】
本発明のより良い理解のため、及び本発明の実施形態を有効に実施することができる方法を示すために、例として以下に示される添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、乳癌細胞株（Ａ）ＭＣＦ７及び（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における、Ｔ１５（配列番号４）、Ｔ３０（配列番号２）、及び本発明による環状ポリペプチドの１つの実施形態、すなわちＮＢＰ−１４（配列番号３）の細胞傷害効果の比較である。すべてのアッセイを二重に実施して、３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示している。
【図２】図２は、ＫＧ１ａ細胞株におけるＴ１５、Ｔ３０、ＮＢＰ−１４及びＡｒａ−Ｃの細胞傷害効果の比較を示す。すべてのアッセイを二重に実施して、３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図３】図３は、（Ａ）Ｈ９２９及び（Ｂ）ＭＥＣ−１細胞株におけるＴ１５、Ｔ３０、ＮＢＰ−１４及びフルダラビンの細胞傷害効果の比較を示す。すべてのアッセイを二重に実施して、３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図４Ａ】図４Ａは、初代ＣＬＬ細胞におけるＴ１５、Ｔ３０、ＮＢＰ−１４の細胞傷害効果の比較を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、比較のために抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるリツキシマブの効果を示す。すべてのアッセイを二重に実施して、５回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示した。
【図５】図５は、正常Ｂリンパ球及びＴリンパ球におけるＴ１５、Ｔ３０、及びＮＢＰ−１４ペプチドの効果の比較を示す。すべてのアッセイを二重に実施し、データを３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図６】図６は、（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び（Ｂ）ＭＣＦ７細胞におけるＴ１５、Ｔ３０及びＮＢＰ−１４の抗増殖効果の比較を示す。すべてのアッセイを二重に実施して、データを３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図７】図７は、（Ａ）ＫＧ１ａ細胞及び（Ｂ）ＭＥＣ−１細胞及び（Ｃ）Ｈ９２９細胞におけるＴ１５、Ｔ３０及びＮＢＰ−１４の抗増殖効果の比較を示す。すべてのアッセイを二重に実施して、データを３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図８Ａ】図８Ａは、環化部位を形成するアラニン（Ａ）及びリジン（Ｋ）残基を有するＮＢＰ−１４の配列を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、末端のアラニン残基とリジン残基とが連結している環状ＮＢＰ−１４ペプチドを示す。
【図９】図９は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７、ＪＪＮ３及びＫＧ１ａ癌細胞株におけるＮＢＰ−１４ペプチドによって誘発される抗遊走性（ａｎｔｉ−ｍｉｇｒａｔｏｒｙ）用量反応の比較を示す。全てのデータを、３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。＊；Ｐ＜０．０５。
【図１０】図１０は、乳癌細胞株（Ａ）ＭＣＦ７及び（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＴ１５、Ｔ３０、ＮＢＰ−１４の抗遊走効果の比較を示す。すべてのデータを、５回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図１１】図１１は、ＫＧ１ａ細胞株におけるＴ１５、Ｔ３０、ＮＢＰ−１４の抗遊走効果の比較を示す。すべてのデータを、５回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図１２】図１２は、ＪＪＮ３細胞株におけるＴ１５、Ｔ３０、ＮＢＰ−１４の抗遊走効果の比較を示す。すべてのデータを、５回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図１３】図１３は、初代ＣＬＬ細胞におけるＴ１５、Ｔ３０、ＮＢＰ−１４の細胞傷害効果の比較を示す。すべてのアッセイを二重に実施して、データを１０回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図１４】図１４は、正常Ｂ細胞に対するＴ１５、Ｔ３０及びＮＢＰ−１４ペプチドの抗遊走効果の比較を示す。すべてのアッセイを二重に実施して、データを５回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図１５】図１５は、初代ＣＬＬ細胞及び正常Ｂリンパ球におけるＮＢＰ−１４ペプチドの効果の比較を示す。すべてのアッセイを二重に実施して、データを３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）として示す。
【図１６】図１６は、ベースライン遊走とＮＢＰ−１４によって誘導される遊走の減少率との相関を示す。
【図１７】図１７は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＣＬＬ細胞、正常Ｂ細胞、ＭＥＣ−１、ＪＪＮ３、ＫＧ１ａ、ＭＣＦ７及びＨ９２９細胞を含む様々な細胞株におけるＮＢＰ−１４不在下でのベースライン遊走量を示す。
【図１８】図１８は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＣＬＬ細胞、正常Ｂ細胞、ＭＥＣ−１、ＪＪＮ３、ＫＧ１ａ、ＭＣＦ７及びＨ９２９細胞を含む様々な細胞株において、１μＭのＮＢＰ−１４によって誘導された遊走の減少率を示す。
【実施例】
【００６１】
理論的根拠
本発明者らは、Ｔ１５、Ｔ３０及びＮＢＰ−１４ペプチドとして知られているアセチルコリンエステラーゼのＣ末端に基づいて多数の線状及び環状ペプチドを生成し、そして多数の細胞株及び患者由来の初代白血病細胞におけるそれらの効果を評価した。配列番号３は、本明細書において「環化Ｔ１４」、「ＣＴ１４」または「ＮＢＰ−１４」と呼ばれ、ＴａｉｌｅｄアセチルコリンエステラーゼのＣ末端に由来するアミノ酸配列を有する環状ペプチドであることに留意すべきである。
【００６２】
目標
１．ある範囲のインビトロヒト癌モデルにおけるＮＢＰ−１４の細胞傷害性及び細胞増殖抑制性プロフィールを決定すること；及び
２．正常Ｂリンパ球及びＴリンパ球におけるＮＢＰ−１４の効果を評価すること。
【００６３】
材料及び方法
ペプチドの環化
直鎖状ペプチドの環化を達成するために、ここで記載される３つの技術、すなわち側鎖−側鎖、側鎖−主鎖及びヘッドトゥテール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）（Ｃ末端からＮ末端へ）環化を用いた。ヘッドトゥテール環化は、広く研究されており、（１分子あたり２つ以下の）定方向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド環化に関与できる。反応を注視することで、１００％環化を確実にする。合成には、（１）高希釈濃度下での古典的な溶液相での直鎖状ペプチド環化及び（２）樹脂ベースの（ｒｅｓｉｎ−ｂａｓｅｄ）環化の２つの主要なアプローチが用いられる。固相合成（１）において、２つの異なるプロトコールを採用した：
（ａ）イミダゾール、３酸、４アミン’またはアルコールなどの側鎖官能基を介して固定されたペプチドの担体上環化を行った。ペプチドをＣ末端でエステルとしてオルトゴナルに（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ）保護した後、通常のＢｏｃまたはＦｍｏｃ合成により構築し、続いてケン化し、環化し及び切断した。
【００６４】
（ｂ）用いた他のプロトコールは、環化切断アプローチであり、段階的な直鎖状ペプチド合成を行った後、環化により環状ペプチドを合成した。この方法の１つの利点は、側鎖を固定する必要が無いことであり、（ａ）より汎用的なアプローチとなっている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｊ．Ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ａｎｄｒｅｉ  Ｋ．Ｙｕｄｉｎ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３、Ｖａｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．５３，７６−６７、Ｌｉｈｕ  Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｇｒｅｇ  Ｍｏｒｒｉｅｌｌｏ（１９９９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０，８１９７−８２００、Ｐａｒｖｅｓｈ  Ｗａｄｈｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７１，５５−６１）。
【００６５】
ＫＧ１ａ、Ｈ９２９、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＥＣ−１及び初代ＣＬＬ細胞培養条件
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）ＫＧ１ａ細胞株を、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株Ｈ９２９、２つの乳癌細胞株（ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、ＭＥＣ−１細胞及び初代慢性リンパ球性白血病細胞を、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ培地中で維持した。使用した培地にはアセチルコリンが含まれていたが、最初の実験の後にさらに１００μＭのアセチルコリンを培地に加えた。続いて、細胞を２４ウェルプレートに分注し（１０６細胞／ｍｌ）、０．１ｎＭ〜１μＭの濃度のペプチド（Ｔ１５、Ｔ３０、ＮＢＰ−１４及びＴ３０＋ＮＢＰ−１４の組み合わせ）の存在下で加湿５％二酸化炭素雰囲気中、３７℃で７２時間インキュベートした。さらに、ペプチドを加えなかった対照培養を行った。続いて、細胞を遠心分離によって収集し、アネキシンＶアッセイを用いたフローサイトメトリーにより分析するか、またはＶｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲセルバイアビリティカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて計数した。
【００６６】
インビトロアポトーシスの測定
培養細胞を遠心分離により収集し、次いでカルシウムリッチな緩衝液１９５μｌ中に再懸濁させた。続いて、５μｌのアネキシンＶ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を細胞懸濁液に加え、細胞を暗所で１０分間インキュベートした後、洗浄した。最後に、細胞を、ヨウ化プロピジウム１０μｌを含むカルシウムリッチな緩衝液１９０μｌに再懸濁した。Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いた二色免疫蛍光フローサイトメトリーによりアポトーシスを評価し、データをＣＦｌｏｗソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【００６７】
インビトロ増殖の測定
培養細胞を遠心分離により収集し、次いでＶｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲセルバイアビリティカウンター用いて計数した。次いで、各培養物中の生存細胞の数を、対照培養（ペプチドなし）中の生存細胞のパーセンテージとして表した。
【００６８】
統計分析
すべての統計解析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【００６９】
インビトロ細胞傷害アッセイ
インビトロ薬物感受性は、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウムアッセイを用いて測定した。種々の細胞株及び初代細胞における単独または組合せにおける各ペプチドの効果の比較を以下に示す。
【００７０】
実施例１−環状Ｔ１４（すなわち、「ＮＢＰ−１４」）
「末端付加（ｔａｉｌｅｄ）」アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）はシナプスにおいて発現され、本発明者らは以前に、そのＣ末端から切断することができる２つのペプチドを特定し、一方は「Ｔ１４」（１４アミノ酸長）と称され、他方の「Ｔ３０」（３０アミノ酸長）として知られているもの中に含まれ、そして両者はβ−アミロイド相当領域に対して強い配列相同性を有する。
【００７１】
線状ペプチドのアミノ酸配列、Ｔ１４は、ＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ［配列番号３］である。
【００７２】
線状ペプチドのアミノ酸配列Ｔ３０は、ＫＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ［配列番号２］である。
【００７３】
「Ｔ１５」と呼ばれる別のペプチドは、配列番号１の最後の１５個のアミノ酸残基、すなわちＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ［配列番号４］に対応する。
【００７４】
ＡＣｈＥのＣ末端ペプチド「Ｔ１４」は、非加水分解作用の領域を担うＡＣｈＥ分子の際立った部分として特定されている。合成の１４個のアミノ酸のペプチド類似体（すなわち「Ｔ１４」）、続いてそれが埋め込まれたより大きく、より安定で、より強力なアミノ酸配列（すなわち「Ｔ３０」）は、「非コリン作動性（ｎｏｎ−ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ）」ＡＣｈＥとして報告されているものに匹敵する作用を示す。
【００７５】
最初に図８Ａを参照すると、１４アミノ酸長の環状Ｔ１４ペプチド（すなわち、「ＮＢＰ−１４」）が示されている。環状ペプチドＮＢＰ−１４は、末端アラニン（Ａ）及びリシン（Ｋ）残基を介して環化され、及び図８Ｂに示されている。環化は、いくつかの異なる手段によって達成することができる。例えば、Ｇｅｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（フランス）は、線状ペプチドをＮ末端からＣ末端のラクタムに変換することによってＴ１４の環化を行った。環状ＮＢＰ−１４を作製するためのＴ１４の環化は、両端すなわちＨＷＫ−ＡＥＦを一緒に結合する。
【００７６】
実施例２−ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果
本発明者らは、２つの乳癌細胞株においてアポトーシスを誘導するアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチド（ＮＢＰ−１４及び／またはＴ３０）の能力を調べ、そしてその結果を図１Ａ及び１Ｂに示す。ＭＣＦ７細胞は、０．１μＭを超えるペプチド濃度でアポトーシスの証拠を示した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、同じ条件下でのペプチドの影響に対して感受性が低かった。
【００７７】
実施例３−ＫＧ１ａ  ＡＭＬ細胞株におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果
ＫＧ１ａ細胞を７２時間培養し、そのアポトーシス効果を評価し、その結果を図２に示す。比較のため、ＫＧ１ａ細胞を、ＡＭＬの治療に使用される一般的に使用される細胞傷害剤であるＡｒａ−Ｃと共に培養した。アセチルコリンエステラーゼ由来のペプチドはＫＧ１ａ細胞にいくらかの傷害性を示し、Ａｒａ−Ｃは０．１μＭを超える濃度で用量反応を示した。
【００７８】
実施例４−Ｈ９２９及びＭＥＣ−１  Ｂ細胞株におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果
アセチルコリンエステラーゼ由来のペプチドは、Ｈ９２９細胞及びＭＥＣ−１細胞においてわずかな細胞傷害効果を示し、その結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。ヌクレオシド類似体フルダラビンは、両方の細胞株において用量反応を誘導した。
【００７９】
実施例５−初代ＣＬＬ細胞におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果
次に、本発明者らは、患者由来の初代ＣＬＬ細胞におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果を調べ、その結果を図４Ａ及び４Ｂに示す。ＮＢＰ−１４は０．１μＭを超える濃度で用量反応の証拠を示した。初代ＣＬＬ細胞生存率への効果は控えめであった（１μＭで〜２０％のアポトーシス）。本発明者らは次に、この反応を非遺伝毒性抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（リツキシマブ）と比較した。リツキシマブは、ＮＢＰ−１４と比較して、薬剤の臨床的に使用される濃度でより顕著な用量反応を誘導した。
【００８０】
実施例６−正常Ｂリンパ球及びＴリンパ球におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドのアポトーシス効果
正常（非悪性）細胞におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの影響を評価するために、健常なボランティアからＢリンパ球及びＴリンパ球を単離した（ｎ＝３）。結果を図５に示す。試験したペプチドは、Ｂリンパ球及びＴリンパ球においてわずかな傷害性しか示さなかった。
【００８１】
実施例７−細胞株の増殖におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果
次に本発明者らは、アセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドが細胞静止を誘導する能力、すなわちこの研究で用いられる様々な細胞株における増殖を阻害する能力を調べた。結果を図６Ａ及び６Ｂに示す。２つの乳癌細胞株は、アセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドとのインキュベーション後に異なる反応を示した。より増殖性の細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、Ｔ１５対照ペプチドと比較した場合、ＮＢＰ−１４ペプチド濃度が０．１μＭを超えると、増殖の有意な減少を示した。この効果は、増殖性の低いＭＣＦ７細胞株ほど有意なものではなかった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株が、サブナノモル濃度のＴ３０及びＮＢＰ−１４＋Ｔ３０の存在下で増加した増殖を示したことは注目に値する。
【００８２】
図７Ａ〜Ｃを参照すると、ＫＧ１ａ細胞株、ＭＥＣ−１細胞株及びＨ９２９細胞株はすべて、０．１μＭを超えるＮＢＰ−１４濃度でのインキュベーション後の増殖の減少を示した。比較のために、Ａｒａ−Ｃ（ＫＧ１ａ細胞）及びフルダラビン（ＭＥＣ−１及びＨ９２９細胞）の効果を示す。
【００８３】
結論
１．ＮＢＰ−１４は、濃度＞０．１μＭで試験した各細胞株において中程度のアポトーシス効果を示した。ＭＣＦ７細胞は、ＮＢＰ−１４に対する感受性が相対的に高かったが、対照ペプチド（Ｔ１５）及び毒性ペプチド（Ｔ３０）と比較した場合、これらの細胞において優先的な細胞傷害性ではなかった。
【００８４】
２．試験されたペプチドのいずれも、正常Ｂリンパ球及びＴリンパ球において有意な細胞傷害効果を示さないようであった。
【００８５】
３．ＮＢＰ−１４は、遊走性細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において明らかな抗増殖活性を示した。ペプチドの濃度＞０．１μＭでのＫＧ１ａ細胞、ＭＥＣ−１細胞及びＨ９２９細胞においても同様の効果が観察された。ＭＣＦ７細胞おける抗増殖効果はそれほど顕著ではなかったが、これは本研究で使用された全ての細胞株のもっとも遅い増殖である。
【００８６】
４．ＮＢＰ−１４の正常細胞における毒性のないことは有望である。
【００８７】
５．ＮＢＰ−１４を含むアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドは、抗転移効果を示す。
【００８８】
上記の知見に基づいて、本発明者らは、末端付加アセチルコリンエステラーゼ、特にＮＢＰ−１４、すなわち配列番号３のＣ末端に由来する環状ペプチドが、癌を治療し、転移を予防するために使用できることを実証した。したがって、これらの環状ペプチドは、固形腫瘍または転移性腫瘍を化学療法／放射線療法で治療するためのアジュバントとして使用することができる。このことは、化学療法及び／または放射線療法のより低い用量及び暴露時間が必要とされることを意味する。
【００８９】
実施例８−癌細胞株及び初代ＣＬＬ試料における遊走に対するＮＢＰ−１４の効果
図８Ｂに示すＮＢＰ−１４の潜在的な抗遊走（抗転移）活性を評価するために、以下のアッセイを行った：
１．トランスウェルアッセイを用いたＫＧ１ａ（急性骨髄性白血病細胞株）、ＪＪＮ３（多発性骨髄腫細胞株）及び乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７）のインビトロ遊走に対するＮＢＰ−１４の効果を調べる。
【００９０】
２．トランスウェルアッセイを用いた初代ＣＬＬサンプルのインビトロでの遊走に対するＮＢＰ−１４の効果を調べる。
【００９１】
３．正常Ｂ細胞の遊走に対するＮＢＰ−１４の効果を評価する。
【００９２】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＫＧ１ａ、及びＭＥＣ−１細胞は、高遊走性の癌細胞株である。ＪＪＮ３、ＣＬＬ及びＭＣＦ−７は、低遊走性の癌細胞株である。Ｂリンパ球は正常な非癌性細胞である。
【００９３】
理論的根拠
先の実施例１〜７は、アセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドが、ヒト転移性乳癌細胞株におけるエンドサイトーシス活性を阻害することを示した。以下の実施例は、ＮＢＰ−１４ペプチドが、多数の細胞株及び患者由来の初代白血病細胞の遊走を阻害する可能性を有するかどうかを立証するために設計された。
【００９４】
目標
１．ＮＢＰ−１４がヒトのインビトロ癌モデルの範囲内で腫瘍細胞遊走を阻害できるかどうかを決定すること。
【００９５】
２．正常Ｂリンパ球の遊走に対するＮＢＰ−１４の効果を評価すること。
【００９６】
材料及び方法
ＫＧ１ａ、ＪＪＮ３、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び初代ＣＬＬ細胞及び正常Ｂ細胞培養条件
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）ＫＧ１ａ細胞株を、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び５％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＪＪＮ３、２つの乳癌細胞株（ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）初代慢性リンパ球性白血病細胞及び正常Ｂリンパ球を、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び５％のウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地で維持し、さらに、１００μＭのアセチルコリンを培養培地に添加して、アセチルコリンの利用可能性がこれらの実験における制限因子でないことを確実にした。
【００９７】
遊走アッセイ
６．０μｍの孔径のトランスウェル遊走プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎ．Ｙ．）を用いてインビトロ遊走アッセイを実施した。５００μｌのＲＰＭＩ培地中の合計１０６のＣＬＬ細胞をトランスウェル挿入体の上部チャンバーに加えた。１００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１２を、ＫＧ１ａ細胞とは別に試験した全ての細胞型について基底側部チャンバーに添加した。これらの細胞はＣＸＣＲ４を発現しないため、ＣＸＣＬ１２には反応しない。代わりに、これらの実験において、１０％ウシ胎仔血清を含有する培地を基底側部チャンバーに添加した。プレートを０．１ｎＭ〜１０μＭの濃度でペプチド（Ｔ１５、Ｔ３０、ＮＢＰ−１４及びＴ３０＋ＮＢＰ−１４の組み合わせ）の存在下、５％ＣＯ２中、３７℃、２４時間インキュベートした。さらに、ペプチドを加えなかった対照培養を行った。続いて細胞を遠心分離により収集し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。試験した条件のいずれも培養物中で有意な細胞死を誘導しなかった。ＣＬＬ細胞の遊走は、トランスウェルプレートの下部（基底側部）チャンバーに遊走した細胞を計数し、次に上部（頂端）チャンバーに最初に添加した細胞の総数のパーセンテージとして表した。
【００９８】
統計分析
すべての統計解析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【００９９】
結果
アセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドであるＮＢＰ−１４が、用量依存的に多数の癌細胞株の遊走を変化させたかどうかを決定するために、最初の実験を行った。図９を参照すると、試験した細胞株は、異なるベースラインレベルの遊走（ペプチド対照なし）を示したが、１μＭ以上の濃度でＮＢＰ−１４と培養した場合、４つの細胞株のうち３つは有意な遊走の減少を示した。ＭＣＦ７細胞のみが有意な遊走の減少を示さなかったが、これらの細胞はいずれの場合においても対照（ペプチドなし）条件下で最小の遊走能力を示した。
【０１００】
実施例９−ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果
本発明者らは次に、２４時間のトランスウェル実験において２つの乳癌細胞株における遊走を阻害するペプチド１μＭの能力を調べた。図１０を参照すると、ＭＣＦ７細胞は弱い転移性しか有さないが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は高い転移性である。したがって、ＭＣＦ７細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と比較して２４時間での遊走が少なかった。ＮＢＰ−１４はＭＣＦ７細胞遊走にほとんど効果がなかった（Ｐ＝０．１７）。対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の遊走をＮＢＰ−１４によって有意に阻害した（Ｐ＜０．０００１）。Ｔ１５ペプチドもＴ３０ペプチドもＭＣＦ７細胞の遊走に有意な効果を示さなかったが、１μＭのＴ３０ペプチドはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の遊走を有意に阻害した（Ｐ＝０．０３）。さらに、Ｔ３０ペプチドは、ＮＢＰ−１４よりも遊走を阻害する効果が有意に少なかった（Ｐ＝０．００１３）。
【０１０１】
実施例１０−ＫＧ１ａ急性骨髄性白血病細胞株におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果
ＫＧ１ａ細胞をペプチドとともに２４時間培養し、それらの遊走への影響を評価した。図１１を参照すると、ＮＢＰ−１４（１μＭ）は、未処置（ペプチドなし）対照と比較した場合、ＫＧ１ａ細胞の遊走を有意に阻害した（Ｐ＝０．００１７）。対照的に、Ｔ１５及びＴ３０ペプチドを含むＫＧ１ａ細胞の培養は、それらの遊走能を変化させなかった（それぞれＰ＝０．３０及びＰ＝０．１４）。
【０１０２】
実施例１１−ＪＪＮ３多発性骨髄腫細胞株におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果
図１２を参照すると、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株データと一致して、Ｔ１５ペプチドは遊走に有意な効果を示さなかった（Ｐ＝０．４３）が、Ｔ３０及びＮＢＰ−１４は有意にＪＪＮ３細胞の遊走を阻害した（それぞれＰ＝０．０５及びＰ＝０．０００１）。ＮＢＰ−１４は、Ｔ３０と比較して有意により大きい程度で遊走を阻害し（Ｐ＝０．０００３）及び試験した条件下のＮＢＰ−１４単独の場合と比較してＮＢＰ−１４とＴ３０ペプチドの組み合わせ（両方とも１μＭ）はＪＪＮ３細胞遊走を有意に変化させなかった（Ｐ＝０．１５）。
【０１０３】
実施例１２−初代ＣＬＬ細胞におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果
本発明者らは次に、１０人の患者由来の初代ＣＬＬ細胞の遊走活性に対するペプチドの効果を調べた。図１３を参照すると、２４時間で試験したＣＬＬ細胞の遊走能力にはかなりの患者間変動があった（範囲３．５％〜１２．４％）。１μＭのＴ１５またはＴ３０ペプチドでの処置は、これを有意に変化させなかった（それぞれＰ＝０．３６及びＰ＝０．１１）が、ＮＢＰ−１４は遊走の有意な減少を誘導した（Ｐ＝０．００４６）。Ｔ３０＋ＮＢＰ−１４の組み合わせは、ＮＢＰ−１４単独（Ｐ＝０．６５）に対しＣＬＬ細胞の遊走を阻害するのにそれほど効果的ではなかった。
【０１０４】
実施例１３−正常Ｂリンパ球におけるアセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの効果
正常（非悪性）細胞に対するペプチドの効果を評価するために、Ｂリンパ球を正常健常人ボランティアから単離した（ｎ＝５）。図１４を参照すると、ＮＢＰ−１４は正常Ｂ細胞遊走の有意な減少を誘導した（Ｐ＝０．０３７）が、Ｔ１５及びＴ３０ペプチドは有意な効果を示さなかった（それぞれＰ＝０．４３及びＰ＝０．０８６）。Ｔ３０＋ＮＢＰ−１４の組み合わせは、ＮＢＰ−１４単独（Ｐ＝０．５７）と比較した場合、正常Ｂ細胞の遊走を有意に変化させなかった。
【０１０５】
実施例１４−ＣＬＬ細胞及び正常Ｂ細胞におけるＮＢＰ−１４の抗遊走効果の比較
図１５を参照すると、ＮＢＰ−１４は、初代ＣＬＬ細胞及び正常Ｂ細胞の両方の遊走活性を有意に阻害した。正常及び悪性Ｂ細胞のベースライン遊走の分析は、２４時間で遊走した細胞のパーセンテージにおいて有意差を示さなかった（Ｐ＝０．４）。それらの同様の固有の遊走能にもかかわらず、初代ＣＬＬ細胞は、正常Ｂ細胞と比較した場合、ＮＢＰ−１４の抗遊走効果に対して有意に感受性が高かった（Ｐ＝０．０００２）。
【０１０６】
実施例１５−ベースライン遊走とＮＢＰ−１４に対する反応との関係
本発明者らは、１μＭのＮＢＰ−１４によって誘発された遊走の減少率に対して、試験した各細胞株及び初代細胞の平均遊走ベースラインパーセントをプロットした。図１６を参照すると、遊走ベースラインのレベルとＮＢＰ−１４に対する抗遊走反応との間に明確な関係があった。高い遊走ベースラインパーセントは、大きな遊走の減少パーセントと関連していた。この関係は、正常Ｂ細胞が分析から除かれたときにさらにより強まった。
【０１０７】
実施例１６−様々な細胞タイプ及びＮＢＰ−１４への暴露前の遊走ベースラインの比較
本発明者らは、試験下の様々な細胞株についての遊走ベースラインパーセンテージ（すなわち、対照）を調べ、その結果を図１７に示す。
【０１０８】
次に、これらの対照値を、１μＭ  ＮＢＰ−１４への曝露後の各細胞株と比較して、その結果を図１８に示す。全ての細胞型について、細胞遊走の有意な減少が見られる。言い換えれば、すべての細胞株において転移の明らかな減少がある。
【０１０９】
結論
１．ＮＢＰ−１４は、対照（ペプチドなし）条件下で最も低いベースの遊走を示したＭＣＦ７細胞を除いて、試験した全ての細胞株において有意な抗遊走効果を示し、これらの細胞の既知の低転移能を保持する観察を示した。用量反応分析は、ＮＢＰ−１４が≧１μＭの濃度で遊走を阻害するのに有効であることを明らかにした。したがって、続く対照ペプチド（Ｔ１５）及び毒性ペプチド（Ｔ３０）とのすべての比較は、１μＭで行った。
【０１１０】
２．試験した条件下で、いずれのペプチドも細胞株または初代悪性及び非悪性Ｂ細胞において有意な細胞傷害効果を誘導しなかった。したがって、観察された遊走の減少は、培養物中の増殖した細胞死によって引き起こされたものではなかった。
【０１１１】
３．毒性ペプチド（Ｔ３０）とＮＢＰ−１４との組み合わせは、評価した細胞株及び初代細胞のいずれにおいてもＮＢＰ−１４単独と比較した場合、遊走に対して有意な効果を有さなかった。
【０１１２】
４．初代ＣＬＬ細胞は、その遊走能力においてベースライン異質性を示した。しかしながら、ＮＢＰ−１４は、これらの初代腫瘍細胞における遊走を有意に減少させることができた。
【０１１３】
５．初代ＣＬＬ細胞は、正常Ｂ細胞よりもＮＢＰ−１４の抗遊走効果に対して感受性が高かった。これは、ＮＢＰ−１４が、特に転移が起こりやすい腫瘍において、抗癌治療剤としての有用性を有することを示唆している。
【０１１４】
６．試験した全ての細胞株において、細胞遊走または転移の有意な減少がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年10月10日(2016.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌または転移性疾患の治療、寛解、または予防における使用のための配列番号３の環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項２】
前記癌が白血病である、請求項１に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項３】
前記癌がリンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、骨髄性白血病、または急性骨髄性白血病である、請求項２に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項４】
前記癌が多発性骨髄腫または乳癌である、請求項１に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項５】
転移性疾患の治療、寛解、または予防における、請求項１に記載の使用のための環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項６】
治療上有効な量の配列番号３の環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体と、任意に、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、抗癌または抗転移薬剤組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の抗癌または抗転移薬剤組成物の製造方法であって、治療上有効な量の配列番号３の環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体と、薬学的に許容される賦形剤と、を組み合わせることを含む、方法。
【国際調査報告】
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