(57)【要約】本発明は、一本鎖ポリヌクレオチドを通過させるが、二本鎖ポリヌクレオチドを通過させないナノポアを使用して、ポリヌクレオチドを分析するための方法を提供する。一部の実施形態に従って、一本鎖テイルまたはオーバーハングを有する標識された鎖を含む二本鎖産物が産生される。一本鎖テイルが捕捉され、標識された鎖が二本鎖産物から開かれることによって移動され得るように、二本鎖産物は、１個または複数のナノポアを横切る電界の存在下で、１個または複数のナノポアに曝露される。反応混合物のイオン組成および電界強度は、ヌクレオチドが、毎秒１０００ヌクレオチド未満の速度でナノポアを移動できるように選択される。
2018536416.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を分析する方法であって、
反応混合物中の鋳型上で５’非相補的テイルを有するプライマーを伸長するステップであって、標識された伸長鎖および一本鎖オーバーハングとしての前記５’非相補的テイルを含む二本鎖産物を産生するステップと、
第１のチャンバおよび第２のチャンバの間に流体連通を提供する少なくとも１個のナノポアを提供するステップであって、前記少なくとも１個のナノポアの各ナノポアが、一本鎖核酸を通過させることができるが、二本鎖核酸を通過させることはできない、ステップと、
前記第１のチャンバに前記二本鎖産物を配置するステップと、
前記ナノポアを横切って電場を印加することにより、前記少なくとも１個のナノポアによって、前記二本鎖産物の前記５’非相補的テイルを捕捉するステップと、
印加された電場によって、毎秒１０００ヌクレオチド（ｎｔ／秒）未満の速度で、前記捕捉された二本鎖産物の前記標識された伸長鎖を、前記ナノポアを通して移動させるステップであって、前記二本鎖産物の移動する鎖が、前記ナノポアに進入するにつれて開かれる、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記第１のチャンバに前記二本鎖産物を配置するステップの前に、前記二本鎖産物を単離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記伸長された鎖が標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標識が光学的標識である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１個のナノポアが、複数のナノポアのアレイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数が、少なくとも１００である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のチャンバに、既知の二本鎖部分および一本鎖オーバーハングとしての５’非相補的テイルを含む予め決定された標準を配置するステップと、毎秒１０００ヌクレオチド未満の移動速度に対応する、前記少なくとも１個のナノポアを横切って印加するための電界強度を選択するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖産物が、前記二本鎖産物の、前記５’非相補的テイルと同じ末端に、３’オーバーハングをさらに含み、前記３’オーバーハングが、前記５’非相補的テイルよりも長さが短い、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖産物が、前記二本鎖産物の、前記５’非相補的テイルと同じ末端に、３’オーバーハングをさらに含み、前記方法が、前記捕捉するステップの前に、前記二本鎖産物を３’一本鎖エキソヌクレアーゼで処理するステップであって、前記３’オーバーハングを除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識された伸長鎖の標識が、光学的標識であり、前記光学的標識はそれぞれ、それが付着されたヌクレオチドを示す光学的シグナルを生成することができ、前記方法が、前記標識された伸長鎖が前記ナノポアを通過する際に、前記光学的標識からの光学的シグナルを検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
核酸を分析する方法であって、
反応混合物中の鋳型上でプライマーを伸長するステップであって、遊離３’−ヒドロキシルを有する標識された伸長鎖を含む二本鎖産物を産生するステップと、
鋳型なしで、末端転移酵素活性により前記伸長された鎖をさらに伸長するステップであって、前記二本鎖産物において３’一本鎖テイルを産生するステップと、
第１のチャンバおよび第２のチャンバを分離し、それらの間に流体連通を提供する、少なくとも１個のナノポアを提供するステップであって、前記少なくとも１個のナノポアの各ナノポアが、一本鎖核酸を通過させることができるが、二本鎖核酸を通過させることはできない、ステップと、
前記第１のチャンバに前記３’一本鎖テイルを有する二本鎖産物を配置するステップと、
前記ナノポアを横切って電場を印加することにより、前記少なくとも１個のナノポアによって二本鎖産物の３’一本鎖テイルを捕捉するステップと、
印加された電場によって、毎秒１０００ヌクレオチド（ｎｔ／秒）未満の速度で、前記捕捉された二本鎖産物の前記標識された伸長鎖を、前記ナノポアを通して移動させるステップであって、前記二本鎖産物の移動する鎖が、前記ナノポアに進入するにつれて開かれる、ステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記標識された伸長鎖の前記標識が、光学的標識であり、前記光学的標識はそれぞれ、それが付着されたヌクレオチドを示す光学的シグナルを生成することができ、前記方法が、前記標識された伸長鎖が、前記ナノポアを通過する際に、前記光学的標識からの光学的シグナルを検出するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
標的ポリヌクレオチドの標識された二本鎖産物を提供するステップであって、各標識された二本鎖産物の標識された鎖が、一本鎖オーバーハングを含み、前記標識された鎖の異なる種類のヌクレオチドが、別個の光学的シグナルを生成する異なる光学的標識を有する、ステップと、
第１のチャンバおよび第２のチャンバの間に流体連通を提供する少なくとも１個のナノポアを提供するステップであって、各ナノポアが、一本鎖核酸を通過させることができるが、二本鎖核酸を通過させることはできない、ステップと、
前記第１のチャンバに前記標識された二本鎖産物を配置するステップと、
前記ナノポアを横切って電場を印加することにより、前記少なくとも１個のナノポアによって、標識された二本鎖産物の一本鎖オーバーハングを捕捉するステップと、
前記標識された鎖の前記ヌクレオチドが、毎秒１０００ヌクレオチド（ｎｔ／秒）未満の速度で励起ゾーンを１列縦隊で通過できるように、前記ナノポアを通して前記標識された鎖を移動させるステップであって、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成し、前記二本鎖産物の移動する標識された鎖が、前記ナノポアに進入するにつれて開かれる、ステップと、
前記標識された鎖が前記ナノポアを通して移動するときの前記光学的標識からの光学的シグナルの時系列を検出するステップであって、鎖光学的シグネチャーを産生するステップと、
前記鎖光学的シグネチャーから前記標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記一本鎖オーバーハングが、３’オーバーハングである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記一本鎖オーバーハングが、５’オーバーハングである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１２月８日に出願された米国仮出願番号第６２／２６４，７２７号、および２０１６年８月１０日に出願された同第６２／３７２，９２８号に基づく優先権を主張しており、これら両出願はそれら全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
この１０年間にわたって開発されてきたＤＮＡ配列決定技術は、生物科学を変革した；例えば、van  Dijkら、Trends  in  Genetics、３０巻（９号）：４１８〜４２６頁（２０１４年）。しかし、１ラン当たりの配列決定にかかる費用の低下、試料調製の単純化、ランタイムの低下、配列読み取りデータの長さの増加、データ分析の改善その他を含む、本技術の最大限の可能性を達成することに対する多くの課題が残っている。ナノポアに基づく配列決定等、単一分子配列決定技法は、これらの課題のいくつかに取り組むことができる；しかし、このようなアプローチは、信頼できるナノ構造製作、ＤＮＡ移動速度（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）の制御、ヌクレオチド識別、大規模アレイのナノポアセンサ由来の電気的シグナルの検出等々、それ自体の一連の技術的困難を有する；例えば、Brantonら、Nature  Biotechnology、２６巻（１０号）：１１４６〜１１５３頁（２００８年）。特に、粘性増加から、ナノポアへの分子モーターおよび／またはＤＮＡ「ラチェット型」構造の付加に及ぶ、ＤＮＡ移動速度を制御するための多種多様な解決法が提案された。残念ながら、移動問題に対するこれらのアプローチは、試料調製の単純さ、デバイス製作の容易さ、検出感度その他との重大なトレードオフを呈する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】van  Dijkら、Trends  in  Genetics、３０巻（９号）：４１８〜４２６頁（２０１４年）
【非特許文献２】Brantonら、Nature  Biotechnology、２６巻（１０号）：１１４６〜１１５３頁（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の要旨
上述を考慮すると、ナノポアを使用した移動および分析のための核酸標的分子を簡便にかつ効率的に調製するための方法が利用できれば、光学に基づくナノポア配列決定等、ナノポアセンサ技術全般およびその特定の用途にとって有利であると予想される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ナノポアによる移動および分析のためのポリヌクレオチド標的分子の調製のための方法を対象にする。
一態様では、本発明は、移動を開始するためにナノポアによって捕捉され得る一本鎖オーバーハングを含む標識された鎖を含む、二本鎖ＤＮＡ産物の調製を対象にする。
【０００６】
別の態様では、本発明は、核酸を分析する方法であって、（ａ）反応混合物中の鋳型上で５’非相補的テイルを有するプライマーを伸長するステップであって、伸長された鎖および一本鎖オーバーハングとしての５’非相補的テイルを含む二本鎖産物を産生するステップと、（ｂ）第１のチャンバおよび第２のチャンバを分離し、それらの間に流体連通を提供するナノポアを提供するステップであって、ナノポアが、一本鎖核酸を通過させることができるが、二本鎖核酸を通過させることはできない、ステップと、（ｃ）第１のチャンバに二本鎖産物を配置するステップと、（ｄ）ナノポアを横切って電場を印加することにより、ナノポアにより二本鎖産物の５’非相補的テイルを捕捉するステップと、（ｄ）印加された電場によって、検出可能速度で、捕捉された二本鎖産物の標識された伸長鎖を、ナノポアを通して移動させるステップであって、二本鎖産物の移動する鎖が、ナノポアに進入するにつれて開かれるか、または一本鎖にされる、ステップとを含む方法を対象にする。一部の実施形態では、本発明の方法は、第１のチャンバにおける二本鎖産物の配置の前に、伸長反応混合物から二本鎖産物を単離するステップをさらに含む。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明は、核酸を分析する方法であって、（ａ）反応混合物中の鋳型上でプライマーを伸長するステップであって、遊離３’−ヒドロキシルを有する標識された伸長鎖を含む二本鎖産物を産生するステップと、（ｂ）鋳型なしで、末端転移酵素活性により伸長された鎖をさらに伸長するステップであって、二本鎖産物における３’一本鎖テイルを産生するステップと、（ｃ）第１のチャンバおよび第２のチャンバを分離し、それらの間に流体連通を提供する少なくとも１個のナノポアを提供するステップであって、少なくとも１個のナノポアの各ナノポアが、一本鎖核酸を通過させることができるが、二本鎖核酸を通過させることはできない、ステップと、（ｄ）第１のチャンバにおいて３’一本鎖テイルを有する二本鎖産物を配置するステップと、（ｅ）ナノポアを横切って電場を印加することによって、少なくとも１個のナノポアにより二本鎖産物の３’一本鎖テイルを捕捉するステップと、（ｆ）印加された電場によって、毎秒１０００ヌクレオチド（ｎｔ／秒）未満の速度で、捕捉された二本鎖産物の標識された伸長鎖を、ナノポアを通して移動させるステップであって、二本鎖産物の移動する鎖が、ナノポアに進入するにつれて開かれる、ステップとを含む方法を対象にする。
【０００８】
本発明は、試料調製ステップを複雑にすることなく分析を改善するための移動スピードの低減、分析のために鋳型鎖を除去する必要または核酸変性条件（例えば、４Ｍ尿素）を提供する必要の排除、単純化されたデータ分析のための標的核酸の同じ５’から３’への移動配向性の提供、その他が挙げられるがこれらに限定されない、核酸のナノポアに基づく分析に関するいくつかの問題を解決する。本発明の上述および他の利点は、多数の実行および適用において例証されており、その一部は、後述および本明細書を通して要約される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態のステップを図解する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態のステップを図解する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態のステップを図解する。
【図１Ｄ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態のステップを図解する。
【図１Ｅ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態のステップを図解する。
【図１Ｆ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態のステップを図解する。
【００１０】
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、光学に基づく核酸分析のためのハイブリッドナノポア構成を図解する。
【００１１】
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｃは、本発明を用いた二色ナノポア配列決定方法を図解する。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｃは、本発明を用いた二色ナノポア配列決定方法を図解する。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃは、本発明を用いた二色ナノポア配列決定方法を図解する。
【００１２】
【図４】図４は、本発明を用いた核酸の光学に基づくナノポア分析のための方法を図解する。
【００１３】
【図５】図５は、本発明の一実施形態に関するトランス−ナノポア電流データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、様々な改変および代替形態を受容するが、これらの詳細については、図面に例として示し詳しくに説明される。しかし、その意図するところは、本発明を、記載されている特定の実施形態に限定することではないことを理解されたい。それどころか、その意図するところは、本発明の思想および範囲内に収まるあらゆる改変、均等物および代替物を網羅することである。例えば、本発明の特定のナノポアの種類および数、特定の標識、ＦＲＥＴペア、検出スキーム、製作アプローチが、説明目的で示されている。しかし、他の種類のナノポア、ナノポアのアレイおよび他の製作技術を利用して、本明細書に記述されているシステムの様々な態様を実行することができるため、本開示が、この点における限定を意図しないことを認められたい。本発明の態様に関するガイダンスは、当業者に周知の多くの利用できる参考文献および専門書に見出すことができ、そのようなものとして、例えば、Cao、Nanostructures  &  Nanomaterials（Imperial  College  Press、２００４年）；Levinson、Principles  of  Lithography、第２版（SPIE  Press、２００５年）；DoeringおよびNishi編、Handbook  of  Semiconductor  Manufacturing  Technology、第２版（CRC  Press、２００７年）；Sawyerら、Electrochemistry  for  Chemists、第２版（Wiley  Interscience、１９９５年）；BardおよびFaulkner、Electrochemical  Methods:  Fundamentals  and  Applications、第２版（Wiley、２０００年）；Lakowicz、Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）；Hermanson、Bioconjugate  Techniques、第２版（Academic  Press、２００８年）；その他が挙げられ、これらの関連部分は、参照により本明細書に組み込む。
【００１５】
本発明は、ナノポア移動スピードを制御するために調製された核酸分析物のデュプレックス結合エネルギーを使用する、核酸のナノポアに基づく分析の方法を対象にする。一部の実施形態では、本発明の特色は、（ｉ）一本鎖核酸の通過を許すが、二本鎖核酸の通過を許さないことにより、一本鎖核酸および二本鎖核酸の間を（操作条件下で）識別し得る、穿孔または開口部を有するナノポアの使用、ならびに（ｉｉ）操作条件下でナノポアによる捕捉を可能にする、一本鎖テイルまたはオーバーハングを有する二本鎖産物の形態の核酸分析物の調製を含む。一部の実施形態では、一本鎖テイルは、一本鎖ポリヌクレオチド等、荷電ポリマーであってもよく、操作条件は、電解質溶液におけるナノポアへの二本鎖産物の曝露と、荷電ポリマーテイルが、捕捉後にナノポアを通った電界によって駆動されるような、ナノポアを横切る電場または電圧勾配の確立とを含む。一本鎖テイルがポリヌクレオチドである実施形態では、ナノポアによって捕捉された二本鎖産物の一本鎖テイルは、二本鎖産物の３’オーバーハングまたは二本鎖産物の５’オーバーハングであってもよい。
【００１６】
本発明の一部の実施形態は、図１Ａによって図解されている。プライマー（１０２）の鋳型特異的部分（１０６）が鋳型（１００）にアニールすることを可能にする、プライマーアニーリング条件下で、鋳型核酸（１００）は、プライマー（１０２）と組み合わされる。プライマー（１０２）は、ＤＮＡポリメラーゼ等、核酸ポリメラーゼによって伸長され得る鋳型特異的部分（１０６）と、操作条件下で荷電ポリマーであるテイル（１０４）とを含む。鋳型特異的部分（１０６）は、プライマー（１０２）の３’末端に存在し、核酸ポリメラーゼによって伸長可能である。テイル（１０４）は、プライマー（１０２）の５’末端に存在する。一部の実施形態では、図１Ａに示す通り、鋳型特異的部分（１０６）の結合部位は、３’オーバーハングが存在しないように、鋳型（１００）の３’末端を含むことができる。他の実施形態では、鋳型特異的部分（１０６）の結合部位は、小さな３’オーバーハング（すなわち、他方の鎖の５’オーバーハングのサイズと比べて「小さい」）が存在するように、鋳型（１００）の３’末端から挿入されることができる（図示せず）。一部の実施形態では、鋳型鎖のこのような３’オーバーハング（１０６）は、１〜５ヌクレオチドまたは１〜３ヌクレオチドの範囲内であってもよい。理論による制約を意図するものではないが、鋳型鎖の小さな３’オーバーハングは、二本鎖産物の５’テイルがナノポアによって捕捉された後に、二本鎖を開く（ｕｎｚｉｐｐｉｎｇ）事象の開始を容易にすることができると考えられる。鋳型特異的部分（１０６）の長さは、従来的であり、「プライマー」定義セクションにおいて指定された範囲内で選択することができる。他の実施形態では、鋳型特異的部分（１０６）の結合部位は、後述する通り、鋳型（１００）の内部位置に存在することができる。一部の実施形態では、例えば、鋳型（１００）は、鋳型特異的部分（１０６）のためのプライマー結合部位を含有するアダプタ配列を使用して先に増幅されたため、鋳型特異的部分（１０６）の配列は、予め決定されている。他の実施形態では、それぞれ予め決定され、それぞれ別々の鋳型配列（１０６）に特異的な、複数の鋳型特異的部分が存在し得る。斯かる後者の実施形態では、異なる鋳型特異的部分を有する複数のプライマーは、広く変動し得る；例えば、斯かる複数は、２〜１０００の範囲内または２〜５００の範囲内または１０〜１０００の範囲内であり得る。
【００１７】
一部の実施形態では、例えば、プライマー（１０２）の配列が、式：３’−ＮＮＮ．．．ＮＮ−ｎｎｎ．．．ｎｎ−５’（式中、各Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴであり、各ｎは、Ｔ等のテイルモノマーである）を有するように、鋳型特異的部分（１０６）の配列は、ランダム配列であってもよい。一部の実施形態では、プライマー（１０２）の配列は、式：３’−ＮＮＮ．．．ＮＮ−αｎｎｎ．．．ｎｎ−５’（式中、各Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴであり、αは、脱塩基ヌクレオチド等の１個または複数の伸長遮断モノマーであり、ｎは、Ｔ等のテイルモノマーである）を有する。一部の実施形態では、αは、１〜６個の伸長遮断モノマーを含む。
【００１８】
テイル（１０４）は、好ましくは、他方の鋳型配列と相補的でないか、または自己相補的である、一本鎖ヌクレオチド鎖を含むことができる。あるいは、テイル（１０２）は、ホスホジエステル連結によって接続された脱塩基リボースモノマー等、全体的にまたは部分的に、非ヌクレオシドモノマーの鎖である、荷電ポリマーを含むことができる。一部の実施形態では、テイル（１０４）の正味電荷は、負である。一部の実施形態では、テイル（１０４）の正味電荷は、一本鎖移動に対するナノポアによる抵抗を克服するため、また、二本鎖産物（１１０）の二本鎖部分を開くために十分に高い。テイル（１０４）が、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチドまたはモノマーを含む場合は常に、テイル（１０４）の長さは、広く変動することができ、一方では（より短い長さで）、移動および二本鎖を開くのに必要な電荷の量によって、また、他方では（長い方の長さでは）、合成の便利さおよび費用によって制約される。一部の実施形態では、テイル（１０４）は、少なくとも１０個のモノマーの長さを有する；他の実施形態では、テイル（１０４）は、１０〜１２０個のモノマーの範囲内の長さを有する。プライマー（１０２）が、鋳型（１００）にアニールした後に、鋳型（１００）に相補的な伸長された鎖（１０８）が合成され、二本鎖産物（１１０）が作製されるように、プライマー伸長条件が確立される（アニーリングの際に既に存在していない場合）。一部の実施形態では、プライマー伸長条件は、従来のポリメラーゼ反応条件を含む；すなわち、プライマー（１０２）の鋳型特異的部分（１０６）から開始する伸長された鎖（１０８）の鋳型に基づく合成のための、妥当なｐＨ、塩濃度その他における、核酸ポリメラーゼおよび適切なヌクレオシド三リン酸モノマーの存在である。斯かる合成は、伸長された鎖（１０８）および鋳型特異的部分（１０６）とデュプレックス形成した当初の鋳型鎖（１００）を含むデュプレックス部分ならびに一本鎖テイル（１０４）を含む二本鎖産物（１１０）をもたらす。
【００１９】
図１Ｂに示される通り、伸長された鎖（１０８）は、直接的に、例えば、前駆物質に既に付着された蛍光部分によって、または間接的に、例えば、相補基を有する標識を付着するために後に使用される（例えば、プライマー伸長反応後に）反応基によって、標識（１２０）をもたらす改変されたヌクレオチド前駆物質の取り込みにより標識され得る。一部の実施形態では、改変されたヌクレオチド前駆物質は、伸長された鎖（stand）（１０８）のあらゆる取り込まれたヌクレオチドが、直接的にまたは間接的に標識されるように用いられる。一部の実施形態では、少なくとも２種の直接的または間接的標識が使用される。さらに他の実施形態では、平均して４セットの伸長された鎖（１０８）が産生されるように、少なくとも４種の標識反応が行われ、それによると、第１のセットにおいて、標識は、「Ａ」または「非Ａ」の存在を表し、第２のセットにおいて、標識は、「Ｃ」または「非Ｃ」の存在を表し、第３のセットにおいて、標識は、「Ｇ」または「非Ｇ」の存在を表し、第４のセットにおいて、標識は、「Ｔ」または「非Ｔ」の存在を表す。一部の実施形態では、４つの異なる種類のヌクレオチドのうち３つが標識されていてよく；一部の実施形態では、ピリミジンであるＴおよびＣの全てまたは実質的に全て（そして実質的に全プリンが標識されていない）等、４つの異なる種類のヌクレオチドのうち２つが標識されていてよい。
【００２０】
鋳型（１００）は、試料から直接的に得られた後に、本発明の方法において使用され得る；または、一部の実施形態では、本方法のステップは、ｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができ、その後、二本鎖産物が分析のために抽出される。他の実施形態では、鋳型（１００）は、試料からの核酸の抽出、試料からの核酸の増幅その他等、本発明のステップの実行前に行われる追加的な手順の産物であってもよい。一部の実施形態では、鋳型（１００）は、複数の選択された標的核酸のマルチプレックスＰＣＲによって産生される；他の実施形態では、鋳型（１００）は、全ゲノム増幅によって産生される。
【００２１】
図１Ａまたは図１Ｂに図解される伸長反応が完了した後に、二本鎖産物（１１０）は、ナノポア配列決定デバイス内で、移動反応混合物において、１個または複数のナノポアに曝露される。一部の実施形態では、斯かる移動反応混合物は、ナノポアを通した核酸鎖の移動に使用される従来の電解質であり、第１のチャンバにおけるイオン強度（一価および／または二価カチオン濃度）は、標的ポリヌクレオチドが、その中に置かれた後に二本鎖のままであり、選択された電場強度下で移動の際に開かれるように（ナノポアを横切る電場強度と共に）選択される。簡潔に説明するのであって、限定を意図するものではないが、斯かるデバイスは、第１のチャンバと第２のチャンバとの間の流体連通が、１個または複数のナノポアだけを通して為されるように、１個または複数のナノポアを含有する不透過性膜によって分離された第１のチャンバおよび第２のチャンバを含む。斯かるデバイスは典型的に、膜およびナノポア（単数または複数）を横切る電界を確立するための１セットの電極も含む。電界は、ナノポアを通した第１のチャンバから第２のチャンバへのポリヌクレオチド（これは、選択された電解質反応混合物において負に荷電している）を動かすか、または移動するために使用される。一部の実施形態では、膜は、アレイとして配置された複数のナノポアを含む。例えば、図１Ｃにおいて、タンパク質ナノポア（１３４）は、膜（１３０）の表面に配置された脂質二重層（１３２）における開口部（１３１）に位置する。二本鎖産物（１１０）は、チャンバに負電極（図示せず）を置くことにより膜（１３０）の「シス」側として構成された第１のチャンバ（１３５）における電解質中に置くことにより、ナノポア（１３４）に曝露される。電界を印加することにより、ナノポア（１３４）によって捕捉された負に荷電したテイル（１０４）は、ナノポア（１３４）を通して、チャンバに正電極を置くことにより膜（１３０）の「トランス」側として構成された第２のチャンバ（１３７）に移動（１３６）する。移動が続けられ、移動しているテイル（１０４）によって発揮された力は、伸長された鎖（１０８）から鋳型鎖（１００）を開くこと（１３８）を開始する。移動のスピードは、第１および第２のチャンバ中の電解質のイオン強度、ならびにナノポアを横切って印加された電圧に部分的に依存する。光学に基づく検出において、移動スピードは、例えば、異なる電圧に対してナノポアにつき異なる予想速度でシグナルを生成する二本鎖産物の予め決定された標準を使用した、予備的較正測定によって選択され得る。よって、ＤＮＡ配列決定適用のため、移動スピードは、斯かる較正測定からのシグナル速度に基づき選択され得る。結果的に、斯かる測定から、例えば、ナノポアのアレイに対する、信頼できるヌクレオチド識別を可能にするか、または最大化する、電圧および／またはイオン強度が選択され得る。一部の実施形態では、斯かる較正は、分析されている鋳型の試料由来の二本鎖産物を使用して為すことができる（予め決定された標準配列の代わりにまたはこれに加えて）。一部の実施形態では、斯かる較正は、配列決定ランの際にリアルタイムで行うことができ、印加された電圧は、斯かる測定に基づき、例えば、ヌクレオチド特異的シグナルの取得を最大化するように、リアルタイムで改変することができる。
【００２２】
上に記す通り、一部の実施形態では、図１Ｄに図解されている通り、プライマー（１０２）の鋳型特異的部分（１０６）の結合部位は、鋳型（１００）の内部に存在することができる。よって、アニールされたプライマー（１０２）が伸長して伸長された鎖（１０８）を形成した後に、一本鎖５’テイル（１０４）および一本鎖３’テイル（１４２）を有する初期二本鎖産物（１４０）が形成される。一部の実施形態では、斯かる初期二本鎖産物（１４０）は、本発明に従って使用することができる；すなわち、これは、その５’テイル（１０４）またはその３’テイル（１４２）のいずれかを介した、ナノポアによる捕捉のために第１のチャンバに配置されてよく、その後、移動および二本鎖を開くことが起こる。他の実施形態では、３’テイル（１４２）は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ等、一本鎖３’エキソヌクレアーゼで消化（１４４）されて、その単独のオーバーハングが５’テイル（１０４）である二本鎖産物（１４６）を産生してもよい。
【００２３】
一部の実施形態では、図１Ｅに図解される通り、伸長された鎖（１０８）は、鋳型（１５２）の末端まで伸長せず、鋳型（１５２）の５’一本鎖オーバーハング（１５０）を残してもよい。そのような場合、鋳型の望まれない５’末端（１５０）は、マングビーンヌクレアーゼ等、５’一本鎖エキソヌクレアーゼで処理されて、二本鎖産物（１４６）を産生してもよい。伸長された鎖（１０８）の所望の５’テイルは、ホスホロチオエート等、ヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドアナログを取り込むことにより、消化から保護され得る。
【００２４】
一部の実施形態では、図１Ｆに図解される通り、二本鎖産物は、３’一本鎖オーバーハングを有することができる。３’一本鎖オーバーハングを有する二本鎖産物は、標識された鎖が、その３’末端によって捕捉され、３’が最初の配向性でナノポアを移動することを可能にし、これは、使用されているナノポアに応じて、５’が最初の配向性での移動とは異なるスピードで進行する。例えば、一部の実施形態では、α−ヘモリジンナノポアを用いると、３’が最初の移動スピードは、５’が最初の移動スピードの５０パーセント未満であるか、またはこれに等しくなることができる。簡潔に説明すると、この実施形態では、３’一本鎖オーバーハングは、末端転移酵素（ＴｄＴ）活性を使用した鋳型なしでの伸長によって作製される。一実行では、アダプタ（１７４）は、平滑末端の標的ポリヌクレオチド（１７０）にライゲート（１７２）されて、二本鎖産物（１７６）を産生する。アダプタ（１７４）は、平滑末端ライゲーション反応に関与することができる一端と、ライゲーションも末端転移酵素による伸長もできない別の一端とを含む。一部の実施形態では、これらの能力は、５’リン酸基（図１Ｆにおいて「ｐ」で示す）をアダプタ（１７４）の同じ鎖の一端に、３’リン酸基（図１Ｆにおいて「ｐ」で示す）を他端に提供することにより実行される。３’および５’リン酸の両方を有する鎖は、市販のホスホラミダイト化学を使用して容易に合成される。任意選択で、サイズ分離のステップが、自己ライゲートしたアダプタ−アダプタ副生物から産物（１７６）を分離するために含まれてよい。ライゲーション反応の大型の二本鎖産物が変性され、プライマー（１８０）が、３’−ブロック端を有するアダプタ鎖に位置付けられたプライマー結合部位にアニール（１７８）する。斯かるアニーリングの後に、プライマー（１８０）は、選択され標識された、そして／または標識されていないｄＮＴＰアナログ（１８２）の存在下で伸長されて、標識された（例えば、１８６）二本鎖産物を形成する。別々の反応または同じ反応のいずれかにおいて、標識された二本鎖産物の遊離（ブロックされていない）３’末端は、末端転移酵素によってさらに伸長される。二色配列決定が使用される一部の実施形態では（後述を参照）、３’一本鎖オーバーハングのヌクレオチドが標識されないように、末端転移酵素伸長は、別々の反応において起こることができる。末端転移酵素伸長は、一本鎖オーバーハング（それぞれ１８４ａおよび１８４ｂ）を有する標識された二本鎖産物（１８８ａ）および（１８８ｂ）を産生する。一本鎖伸長（１８４ａおよび１８４ｂ）の長さは、広く変動し得る。一部の実施形態では、一本鎖伸長（１８４ａおよび／または１８４ｂ）の長さはそれぞれ、少なくとも１０ヌクレオチドであり；他の実施形態では、一本鎖伸長（１８４ａおよび／または１８４ｂ）の長さはそれぞれ、少なくとも２０ヌクレオチドであり；他の実施形態では、一本鎖伸長（１８４ａおよび／または１８４ｂ）の長さはそれぞれ、１０〜１２０ヌクレオチドの範囲内である。
【００２５】
上述の通り、上述の実施形態のいずれかは、ナノポアまたはナノポアのアレイに曝露する前に、二本鎖産物を単離または精製または分離する（伸長反応混合物から）さらに別のステップを含むことができる。斯かる単離または分離は、ＰＣＲ産物の単離に用いられるもの、例えば、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）等、従来の二本鎖ＤＮＡ単離技法またはキットを使用して行うことができる。
【００２６】
上述の通り、移動スピードは、ナノポアを横切る電圧差（または電場強度）、および二本鎖産物がナノポアに曝露される第１のチャンバの反応混合物における条件に部分的に依存する。二本鎖産物捕捉速度は、斯かる産物の濃度に依存する。一部の実施形態では、ナノポア配列決定のための従来の反応混合物条件、例えば、１Ｍ  ＫＣｌ（またはＮａＣｌ、ＬｉＣｌ２その他等、均等な塩）およびｐＨ緩衝系（これは例えば、使用されているタンパク質、例えば、タンパク質ナノポア、ヌクレアーゼその他が変性されないことを確実にする）を、本発明により用いることができる。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝系を使用して、６．８〜８．８の範囲内の値に実質的に一定にｐＨを維持することができる。一部の実施形態では、ナノポアを横切る電圧差は、７０〜２００ｍＶの範囲内であってもよい。他の実施形態では、ナノポアを横切る電圧差は、８０〜１５０ｍＶの範囲内であってもよい。操作に適切な電圧は、図５に図解されている通り、従来の測定技法を使用して選択することができる。ナノポアを横切る電流（または電圧）は、市販の機器を使用して容易に測定することができる。チャート（５７９）は、二本鎖産物（５８６）が捕捉されて開かれ、伸長された鎖がナノポアを通して移動されたときの、ナノポアを横切る電流の電流値、対、時間を示す。検査二本鎖産物を使用して、示されているデータを作成し、これは、ほとんど等しい比率のＡ、Ｃ、ＧおよびＴのおよそ５１０塩基対の二本鎖部分、ならびに４０ヌクレオチドの５’ポリＴテイルからなった（二本鎖産物の鋳型鎖は、参照により本明細書に組み込む国際特許公開ＷＯ２０１４／１９０３２２に開示されているものと同じであった）。電流降下（５８０）の突発（Blow-up）（５８１）は、その関連する電流レベルと共に、捕捉および移動の異なる相（ａ、ｂ、ｃおよびｄ）であると考えられるものを示す。電流レベルまたは相（ａ）は、非占有ナノポア（５８２）に対応する。電流レベルまたは相（ｂ）は、鎖によって捕捉された（５８８）が未だ鎖開きを行っていない二本鎖産物（５８６）によって占有されたナノポア（５８３）に対応する。電流レベルまたは相（ｃ）は、鎖の放出（５９０）により鎖開きを行っている二本鎖産物（５８６）に対応する。電流レベルまたは相（ｄ）は、非占有状態に戻るナノポア（５８２）に対応する。二本鎖産物の予め決定された標準によるもの等、測定を使用して、相（ｃ）に対応する時間間隔から、毎秒ヌクレオチド移動スピードを決定することができる。移動スピードが所望の範囲内となるように、電圧差を選択することができる。一部の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０００ヌクレオチド未満のスピードを含む。他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０〜８００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０〜６００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒２００〜８００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒２００〜５００ヌクレオチドである。
ナノポアおよびナノポアアレイ
【００２７】
本発明により使用されるナノポアは、固体状態（ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ）の膜または同様のフレームワークにおいて構成された、固体状態ナノポア、タンパク質ナノポア、またはタンパク質ナノポア、もしくはカーボンもしくはグラフェンナノチューブ等の有機ナノチューブを含むハイブリッドナノポアであってもよい。ナノポアの重要な特色は、（ｉ）そのモノマーが、順次検出ゾーンを通過するように（すなわち、ヌクレオチドが、一度に１つずつまたは１列縦隊で検出ゾーンを通過するような）、ポリヌクレオチド等のポリマー分析物を制約すること、および（ｉｉ）二本鎖核酸または等しくかさばった分子を通過させずに、一本鎖核酸を通過させることを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスに関連して使用されるナノポアは、平面状の表面に規則的に配置され得る、ナノポアのクラスターのアレイ等、アレイの形態で提供される。一部の実施形態では、異なるクラスターのナノポア由来の光学的シグナルが、用いられる光学的検出システムによって鑑別可能となるように、クラスターはそれぞれ、別々の分解能限界区域に存在するが、同じクラスター内のナノポア由来の光学的シグナルは、用いられる光学的検出システムによって斯かるクラスター内の特異的ナノポアに必ずしも割り当てられなくてもよい。
【００２９】
固体状態ナノポアは、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）その他が挙げられるがこれらに限定されない、種々の材料において製作することができる。ＤＮＡ配列決定等、分析的印加のためのナノポアの製作および操作は、参照により本明細書に組み込む次の例示的な参考文献に開示されている：Ling、米国特許第７，６７８，５６２号；Huら、米国特許第７，３９７，２３２号；Golovchenkoら、米国特許第６，４６４，８４２号；Chuら、米国特許第５，７９８，０４２号；Sauerら、米国特許第７，００１，７９２号；Suら、米国特許第７，７４４，８１６号；Churchら、米国特許第５，７９５，７８２号；Bayleyら、米国特許第６，４２６，２３１号；Akesonら、米国特許第７，１８９，５０３号；Bayleyら、米国特許第６，９１６，６６５号；Akesonら、米国特許第６，２６７，８７２号；Mellerら、米国特許出願公開第２００９／００２９４７７号；Howorkaら、国際特許公開ＷＯ２００９／００７７４３；Brownら、国際特許公開ＷＯ２０１１／０６７５５９；Mellerら、国際特許公開ＷＯ２００９／０２０６８２；Polonskyら、国際特許公開ＷＯ２００８／０９２７６０；Van  der  Zaagら、国際特許公開ＷＯ２０１０／００７５３７；Yanら、Nano  Letters、５巻（６号）：１１２９〜１１３４頁（２００５年）；Iqbalら、Nature  Nanotechnology、２巻：２４３〜２４８頁（２００７年）；Wanunuら、Nano  Letters、７巻（６号）：１５８０〜１５８５頁（２００７年）；Dekker、Nature  Nanotechnology、２巻：２０９〜２１５頁（２００７年）；Stormら、Nature  Materials、２巻：５３７〜５４０頁（２００３年）；Wuら、Electrophoresis、２９巻（１３号）：２７５４〜２７５９頁（２００８年）；Nakaneら、Electrophoresis、２３巻：２５９２〜２６０１頁（２００２年）；Zheら、J.  Micromech.  Microeng.、１７巻：３０４〜３１３頁（２００７年）；Henriquezら、The  Analyst、１２９巻：４７８〜４８２頁（２００４年）；Jagtianiら、J.  Micromech.  Microeng.、１６巻：１５３０〜１５３９頁（２００６年）；Nakaneら、J.  Phys.  Condens.  Matter、１５巻、Ｒ１３６５〜Ｒ１３９３頁（２００３年）；DeBloisら、Rev.  Sci.  Instruments、４１巻（７号）：９０９〜９１６頁（１９７０年）；Clarkeら、Nature  Nanotechnology、４巻（４号）：２６５〜２７０頁（２００９年）；Bayleyら、米国特許出願公開第２００３／０２１５８８１号；その他。
【００３０】
簡潔に説明すると、一部の実施形態では、１〜１００ｎｍチャネルまたは開口部が、膜等、基板、通常、平面状基板を通して形成され、これを通して、一本鎖ＤＮＡ等の分析物が、移動するように誘導される。他の実施形態では、２〜５０ｎｍチャネルまたは開口部が、基板を通して形成され；さらに他の実施形態では、２〜３０ｎｍまたは２〜２０ｎｍまたは３〜３０ｎｍまたは３〜２０ｎｍまたは３〜１０ｎｍチャネルまたは開口部が、基板を通して形成される。ナノポアを生成する固体状態アプローチは、頑強性および耐久性、ならびにナノポアのサイズおよび形状を調整する能力、ウエハスケールでナノポアの高密度アレイを製作する能力、脂質に基づくシステムと比較して優れた機械的、化学的および熱的特徴、ならびに電子的または光学的読み取り技法と統合する可能性を提案する。他方では、生物学的ナノポアは、特に、１〜１０ナノメートル範囲内の、再現性のある狭い穿孔または管腔を提供すると共に、ナノポアの物理的および／または化学的特性を仕立てるため、ならびに従来のタンパク質工学方法によってＦＲＥＴドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光標識等の基または要素を直接的にまたは間接的に付着するための技法を提供する。タンパク質ナノポアは典型的に、機械的支持のために繊細な脂質二重層に頼り、正確な寸法を有する固体状態ナノポアの製作は、依然として難易度が高い。一部の実施形態では、固体状態ナノポアは、生物学的ナノポアと組み合わせて、これらの弱点のいくつかを克服する、いわゆる「ハイブリッド」ナノポアを形成し、これにより、生物学的ポアタンパク質の正確さに、固体状態ナノポアの安定性を付与することができる。光学的読み取り技法のため、ハイブリッドナノポアは、ナノポアの正確な位置を提供し、これは、データ取得を大幅に単純化する。
【００３１】
一部の実施形態では、クラスターは、開口部のアレイを含有する固相膜によって支持された脂質二重層にタンパク質ナノポアを配置することによって形成することもできる。例えば、斯かるアレイは、固相支持体（図２Ａ中の２１０２）に製作された（例えば、穿孔された、エッチングされたその他）開口部を含むことができる。斯かる開口部の幾何学的形状は、用いられた製作技法に応じて変動し得る。一部の実施形態では、斯かる開口部のそれぞれは、別々の分解能限界区域に関連付けられるまたはこれによって包含される；しかし、他の実施形態では、複数の開口部が、同じ分解能限界区域内に存在してもよい。開口部の断面積は、広く変動することができ、異なるクラスター間と同じであっても同じでなくてもよいが、斯かる面積は通常、従来の製作アプローチの結果として実質的に同じである。一部の実施形態では、開口部は、１０〜２００ｎｍの範囲内の最小線寸法（２１０３）（例えば、円形開口部の場合は直径）を有するか、または約１００〜３×１０４ｎｍ２の範囲内の面積を有する。開口部を横切り、図２Ａ〜図２Ｄ中の断面に図解される脂質二重層が配置される。一部の実施形態では、斯かる脂質二重層（２１２０）は、固相膜（２１００）の一方の表面上に配置される。一部の実施形態では、タンパク質ナノポア（図２Ａ〜図２Ｄ中の２１０４）は、開口部に及ぶ脂質二重層（２１２０）の部分に挿入され、描写されているもの等、一部の実施形態では、タンパク質ナノポアは、例えば、ＦＲＥＴドナーで直接的に標識されていてよい（２１２７）。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアは、固相膜（２１００）の一方の側のチャンバ内の溶液から挿入され、これにより、０、１、２または３個のタンパク質ナノポアを有する開口部が示されている図２Ａ〜図２Ｄに図解されている通り、異なる開口部が、異なる数のタンパク質ナノポアを受け取ることができるように、開口部にタンパク質ナノポアがランダムに置かれる。開口部毎のタンパク質ナノポアの分布は、例えば、挿入ステップの際にタンパク質ナノポアの濃度を制御することにより変動され得る。斯かる実施形態では、ナノポアのクラスターは、ランダムな数のナノポアを含むことができる。タンパク質ナノポアが開口部にランダムに挿入される一部の実施形態では、平均して１個または複数の開口部を含有するクラスターは、ゼロを超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．２５を超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．５を超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．７５を超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、１．０を超える多数のタンパク質ナノポアを有する。
【００３２】
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスは、第１のチャンバおよび第２のチャンバ（「シスチャンバ」および「トランスチャンバ」と称される場合もある）の間に連通を提供し、第２のまたはトランスチャンバに面する表面に脂質二重層を支持する、それを通る開口部のアレイを有するＳｉＮ膜等の固相膜を含む。一部の実施形態では、斯かる固相膜における開口部の直径は、１０〜２００ｎｍの範囲内または２０〜１００ｎｍの範囲内であってもよい。一部の実施形態では、斯かる固相膜は、斯かる二重層が、トランスチャンバに面する表面における開口部に及ぶ領域において脂質二重層に挿入されたタンパク質ナノポアをさらに含む。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアは、本明細書に記載されている技法を使用して、固相膜のシス側から挿入される。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアは、軸に沿ってバレルまたは穿孔を、一端に「キャップ」構造を、そして他端に「ステム」構造を含むという点において、α−ヘモリジンと同一または同様の構造を有する（Songら、Science、２７４巻：１８５９〜１８６６頁（１９９６年）の用語法を使用）。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアを使用すると、脂質二重層への挿入は、そのキャップ構造がシスチャンバに曝露され、そのステム構造がトランスチャンバに曝露されるように配向されたタンパク質ナノポアをもたらす。
【００３３】
一部の実施形態では、例えば、参照により本明細書に組み込むBayleyら、米国特許出願公開第２０１４／０３５６２８９号；Huangら、Nature  Nanotechnology、10.1038/nnano.2015.189.［印刷に先立つＥｐｕｂ公開］；または同様の参考文献に開示されている通り、本発明の方法およびデバイスは、単一の液滴または液滴のアレイのいずれかとして、液滴界面二重層を含む。簡潔に説明すると、タンパク質ナノポア（１．２ｎＭ）は、２００〜３５０ｎｌ液滴（例えば、１．３２Ｍ  ＫＣｌ、８．８ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０（αＨＬ）または８．０（ＭｓｐＡ））中に置かれ、例えば、ヘキサデカン中の３ｍＭ  １，２−ジフタノイル（diphytanoyl）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）中でインキュベートされて、脂質単層コーティングを形成する。次に、液滴は、ピペッティングによって、例えば、分析物移動のための電圧の印加、そして例えばＴＩＲＦによる光学的検出を可能にする測定チャンバ内のカバーガラス上に移されてよい。カバーガラスは、薄層（ほぼ２００ｎｍ）のアガロース（０．６６Ｍ  ＣａＣｌ２、８．８ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０（αＨＬ）／８．０（ＭｓｐＡ））でスピンコーティングされて（３，０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０秒）、その後、ヘキサデカン中３ｍＭ  ＤＰｈＰＣと共にインキュベートされてよい。アガロースにおける単層との接触の際に、脂質コーティングされた液滴は、液滴界面二重層を自発的に形成する。接地電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）は、基板アガロースにおける対応する活性電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）により液滴に挿入されてよい。パッチクランプ増幅器（例えば、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により電圧プロトコールが印加されてよい。液滴中に存在するナノポアは、液滴界面二重層に自発的に挿入し、イオンフラックスが、電気的におよび／または光学的に（例えば、Ｆｌｕｏ−８その他等、イオン感受性色素として）の両方で検出され得る。
【００３４】
一部の実施形態では、本発明は、特に、ポリヌクレオチドの光学に基づくナノポア配列決定のために、クラスターにおけるハイブリッドナノポアを用いることができる。斯かるナノポアは、タンパク質ナノポア等のタンパク質バイオセンサが安定的に挿入された、固体状態オリフィスまたは開口部を含む。荷電ポリマーは、従来のタンパク質工学技法によってタンパク質ナノポア（例えば、アルファヘモリジン）に付着することができ、その後、印加された電界を使用して、固体状態膜における開口部にタンパク質ナノポアをガイドすることができる。一部の実施形態では、固体状態基板における開口部は、タンパク質よりも僅かに小さくなるように選択され、これにより、これが開口部を通して移動することを防止する。その代わりに、タンパク質は、固体状態オリフィスに包埋され得る。
【００３５】
一部の実施形態では、ドナーフルオロフォアは、タンパク質ナノポアに付着される。次に、この複合体は、タンパク質ナノポアが固体状態ナノホールに輸送されてハイブリッドナノポアを形成するまで、固体状態ナノホールまたは開口部を横切って電界を印加することにより、固体状態開口部またはナノホール（例えば、３〜１０ｎｍの直径）に挿入される。ハイブリッドナノポアの形成は、（ａ）固体状態ナノホールの部分的遮断に基づく電流の降下を引き起こす挿入されたタンパク質ナノポア、および（ｂ）ドナーフルオロフォアの光学的検出によって検証することができる。
【００３６】
固体状態または合成のナノポアは、上に引用されている参考文献において例証される通り、種々の仕方で調製することができる。一部の実施形態では、ヘリウムイオン顕微鏡を使用して、例えば、参照により本明細書に組み込むYangら、Nanotechnolgy、２２巻：２８５３１０頁（２０１１年）によって開示される通り、種々の材料における合成ナノポアを穿孔することができる。独立した膜となるように加工された薄膜材料、例えば、窒化ケイ素の１個または複数の領域を支持するチップが、ヘリウムイオン顕微鏡（ＨＩＭ）チャンバに導入される。顕微鏡は、低拡大率のために設定されつつ、ＨＩＭモーター制御が使用されて、イオンビームの通路内に独立した膜を届ける。焦点および非点収差（stigmation）を含むビームパラメータが、独立した膜に隣接する領域において、ただし、固体基板上で調整される。パラメータが妥当に固定されたら、独立した膜領域がイオンビーム走査領域の中央に置かれ、ビームがブランクにされるように、チップ位置が移動される。ＨＩＭ視野は、予期されるナノポアパターン全体を含有するのに十分であり、将来的な光学的読み取りにおいて有用となるのに十分な（すなわち、光学的拡大率、カメラ分解能等に依存する）寸法（μｍ単位の）に設定される。次に、イオンビームは、ピクセル滞留時間において視野全体にわたって１回ラスターされ、これは、膜自己蛍光の全てまたは大部分の除去に十分な総イオン線量をもたらす。次に、視野は、単一のナノポアまたはナノポアのアレイのいずれかのリソグラフィーにより画定されたミリングの実行に妥当な値（上で使用されるものよりも小さい）に設定される。パターンのピクセル滞留時間は、試料加工に先立つ較正試料の使用により決定される、１個または複数の予め決定された直径のナノポアをもたらすように設定される。このプロセス全体は、単一のチップにおける所望の領域毎に、および／またはＨＩＭチャンバ内に導入されたチップ毎に反復される。
【００３７】
一部の実施形態では、ナノポアは、光学に基づくナノポア配列決定方法における使用のために付着された１個または複数の標識を有することができる。標識は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペアのメンバーであってもよい。斯かる標識は、有機フルオロフォア、化学発光標識、量子ドット、金属性ナノ粒子および／または蛍光タンパク質を含むことができる。標的核酸は、ヌクレオチドにつき１個の別個の標識を有することができる。ヌクレオチドに付着された標識は、有機フルオロフォアからなる群から選択され得る。ポアタンパク質における標識付着部位は、従来のタンパク質工学方法によって生成することができ、例えば、標識の特異的結合を可能にする突然変異体タンパク質を構築することができる。例として、タンパク質の所望の位置にシステイン残基を挿入することができ、これは、標識の付着に使用することができるチオール（ＳＨ）基を挿入する。システインは、天然に存在するアミノ酸を置き換えてもよく、または追加のアミノ酸として取り込まれてもよい。次に、マレイミド活性化標識は、タンパク質ナノポアのチオール残基に共有結合により付着される。好まれる実施形態では、タンパク質ナノポアへの標識の付着または核酸における標識は、可逆的である。切断可能クロスリンカーを実行することにより、容易に破壊できる化学結合（例えば、Ｓ−Ｓ結合またはｐＨに不安定な結合）が導入され、対応する条件が満たされたときに、標識を除去することができる。
【００３８】
一部の実施形態では、ナノポアアレイは、１個または複数の遮光層、すなわち、１個または複数の不透明層を含む。典型的には、ナノポアアレイは、ケイ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化アルミニウムその他等の材料の薄いシートにおいて製作され、これは特に、使用される厚さ、例えば、５０〜１００ｎｍ未満の厚さでは光を容易に透過する。分析物の電気的検出のため、これは問題とならない。しかし、ナノポアを移動する標識された分子の光学に基づく検出において、アレイを透過する光は、意図される反応部位の外側で材料を一定に励起し、これにより、例えば、非特異的バックグラウンド蛍光、ナノポアに未だ進入していない分子の標識由来の蛍光その他から光学的ノイズを生成する。一部の実施形態では、励起ビームからの光を反射および／または吸収する１個または複数の遮光層をナノポアアレイに与え、これにより、アレイのナノポア（例えば、トランスチャンバへのナノポア出口またはナノポアオリフィス開口における）に関連する意図される反応部位において生成された光学的シグナルのバックグラウンドノイズを低下させることにより、この問題に取り組むことができる。一部の実施形態では、これは、意図される反応部位における光学的標識が、直接的照射によって励起されることを可能にする。一部の実施形態では、不透明層は、金属層であってもよい。斯かる金属層は、Ｓｎ、Ａｌ、Ｖ、Ｔｉ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｔａ、Ｗ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含むことができる。一部の実施形態では、斯かる金属層は、Ａｌ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含むことができる。さらに他の実施形態では、斯かる金属層は、アルミニウムもしくは金を含むことができるか、またはアルミニウムを唯一含むことができる。不透明層の厚さは、広く変動することができ、層を構成する材料の物理的および化学的特性に依存する。一部の実施形態では、不透明層の厚さは、少なくとも５ｎｍまたは少なくとも１０ｎｍまたは少なくとも４０ｎｍであってもよい。他の実施形態では、不透明層の厚さは、５〜１００ｎｍの範囲内であってもよい；他の実施形態では、不透明層の厚さは、１０〜８０ｎｍの範囲内であってもよい。不透明層は、励起ビームからの光の１００パーセントを遮断（すなわち、反射または吸収）する必要はない。一部の実施形態では、不透明層は、励起ビームからの入射光の少なくとも１０パーセントを遮断することができ；他の実施形態では、不透明層は、励起ビームからの入射光の少なくとも５０パーセントを遮断することができる。
【００３９】
不透明層またはコーティングは、本技術分野で公知の種々の技法によって固体状態膜に製作することができる。化学的蒸着、電着、エピタキシー、熱酸化、蒸発およびスパッタリングを含む物理的蒸着、鋳造その他を含む、材料沈着技法を使用することができる。一部の実施形態では、原子層堆積を使用することができ、例えば、参照により組み込む、米国特許第６，４６４，８４２号；Weiら、Small、６巻（１３号）：１４０６〜１４１４頁（２０１０年）を参照。
ナノポアおよび分析物のための標識
【００４０】
一部の実施形態では、ナノポアは、１種または複数の量子ドットで標識することができる。特に、一部の実施形態では、１種または複数の量子ドットは、ナノポアに付着することができる、またはナノポアに隣接する（およびナノポアの入口または出口のＦＲＥＴ距離内の）固相支持体体に付着することができ、分析物におけるアクセプターとのＦＲＥＴ反応におけるドナーとして用いられる。量子ドットの斯かる使用は、周知であり、参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，２５２，３０３号；同第６，８５５，５５１号；同第７，２３５，３６１号；その他等、科学および特許文献に広く記載されている。
【００４１】
ポア標識として利用され得る量子ドットの一例は、水溶液において合成され得るＣｄＴｅ量子ドットである。ＣｄＴｅ量子ドットは、一級アミン、チオール等の求核基またはカルボン酸等の官能基を官能化され得る。ＣｄＴｅ量子ドットは、タンパク質ポアの外部における一級アミンへの量子ドットの共有結合による連結に利用され得るカルボン酸官能基を有するメルカプトプロピオン酸キャッピングリガンドを含むことができる。架橋反応は、バイオコンジュゲーション技術分野の当業者に公知の標準架橋試薬（ホモ二官能性およびヘテロ二官能性）を使用して達成することができる。改変が、ナノポアを通した核酸の移動を損なわないか、または実質的に損なわないことを確実にするためには注意を要する。これは、ナノポアへのドナー標識の付着に使用される、用いられているクロスリンカー分子の長さを変動させることにより達成することができる。
【００４２】
例えば、天然アルファヘモリジンタンパク質のリシン残基１３１の一級アミン（Song,  L.ら、Science  ２７４巻（１９９６年）：１８５９〜１８６６頁）を使用して、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスルホサクシニミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）カップリング化学により、カルボキシ改変ＣｄＴｅ量子ドットを共有結合により結合することができる。あるいは、アミノ酸１２９（スレオニン）を、システインへと交換することができる。天然アルファヘモリジンタンパク質には他のシステイン残基が存在しないため、新たに挿入されたシステインのチオール側鎖を使用して、他の化学部分を共有結合により付着することができる。
【００４３】
生物学的ポリマー、例えば、核酸分子またはポリマーは、１種または複数のアクセプター標識で標識することができる。核酸分子のため、核酸分子の４種のヌクレオチドまたは構成要素のそれぞれをアクセプター標識で標識し、これにより、各天然に存在するヌクレオチドに対する標識された（例えば、蛍光）対応物を作製することができる。アクセプター標識は、変換された核酸の部分または鎖全体における１個または複数のヌクレオチドに付着することができる、エネルギー受容分子の形態であってもよい。
【００４４】
種々の方法を利用して、核酸分子またはポリマーのモノマーまたはヌクレオチドを標識することができる。標識されたヌクレオチドは、鋳型として当初の試料を使用した新たな核酸の合成の際に核酸に取り込むことができる（「合成による標識」）。例えば、核酸の標識は、ＰＣＲ、全ゲノム増幅、ローリングサークル増幅、プライマー伸長その他により、または当業者に公知の上述の方法の様々な組合せおよび拡張により達成することができる。
【００４５】
標識は、求核剤（アミン、チオール等）等の反応基を含むことができる。次に、天然の核酸には存在しない斯かる求核剤を使用して、ＮＨＳエステル、マレイミド、エポキシ環、イソシアネート等、アミンまたはチオール反応性化学により蛍光標識を付着することができる。斯かる求核剤反応性蛍光色素（すなわち、ＮＨＳ−色素）は、異なる市販の供給源から容易に商業的に入手することができる。小さな求核剤で核酸を標識する利点は、「合成による標識」アプローチが使用される際の、斯かる標識されたヌクレオチドの取り込みの高い効率にある。かさばる蛍光標識された核酸構成要素は、新たに合成されたＤＮＡへの重合プロセスの際の標識の立体障害のために、ポリメラーゼによる取り込みが不十分な場合がある。
【００４６】
２種またはそれよりも多い相互にクエンチする色素が使用される場合は常に、斯かる色素は、直交性付着化学を使用してＤＮＡに付着することができる。例えば、ＮＨＳエステルを使用して、一級アミンと非常に特異的に反応させることができるか、またはマレイミドは、チオール基と反応し得る。一級アミン（ＮＨ２）またはチオール（ＳＨ）改変ヌクレオチドのどちらも市販されている。これらの相対的に小さい改変は、ポリメラーゼ媒介性ＤＮＡ合成において容易に取り込まれ、ＮＨＳまたはマレイミド改変色素のいずれかを使用して、その後の標識反応に使用することができる。斯かる直交性リンカー化学を選択および使用するためのガイダンスは、Hermanson（上に引用）に見出すことができる。
【００４７】
典型的な付着位置のための追加的な直交性付着化学は、銅触媒反応および無触媒反応のためのヒュスゲン型環化付加；例えば、Gutsmiedlら、Org.  Lett.、１１巻：２４０５〜２４０８頁（２００９年）に開示されているアルケンプラスニトリル酸化物環化付加；例えば、Seeligら、Tetrahedron  Lett.、３８巻：７７２９〜７７３２頁（１９９７年）に開示されているディールスアルダー環化付加；例えば、Casiら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１３４巻：５８８７〜５８９２頁（２０１２年）；Shaoら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１１７巻：３８９３〜３８９９頁（１９９５年）；Rideout、Science、２３３巻：５６１〜５６３頁（１９８６年）に開示されているカルボニルライゲーション；例えば、Brinkley、Bioconjugate  Chemistry、３巻：２〜１３頁（１９９２年）に開示されているマイケル付加；例えば、Schulerら、Bioconjugate  Chemistry、１３巻：１０３９〜１０４３頁（２００２年）；Dawsonら、Science、２６６巻：７７６〜７７９頁（１９９４年）に開示されているネイティブ化学的ライゲーション；または例えば、Hermanson（上に引用）に開示されている活性エステルを介したアミド形成を含む。
【００４８】
核酸鎖における１、２、３または４種のヌクレオチドの組合せは、その標識された対応物と交換することができる。標識されたヌクレオチドの様々な組合せは、並行して配列決定することができ、例えば、供給源核酸またはＤＮＡを、４種の単一の標識された試料に加えて２種の標識されたヌクレオチドの組合せで標識すると、総計１０種の異なって標識された試料核酸分子またはＤＮＡ（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、ＡＴ、ＡＣ、ＴＣ）をもたらし得る。その結果得られる配列パターンは、冗長配列読み取りにおける重複するヌクレオチド位置に起因して、より的確な配列整列を可能にする場合がある。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド等、ポリマーは、単一の種類のモノマーに付着された単一の蛍光標識で標識することができ、例えば、ポリヌクレオチドの全Ｔ（または実質的に全Ｔ）は、蛍光標識、例えば、シアニン色素で標識される。斯かる実施形態では、ポリマー由来の蛍光シグナルの収集物または配列は、特定のポリマーのシグネチャーまたはフィンガープリントを形成することができる。一部の斯かる実施形態では、斯かるフィンガープリントは、決定されるべきモノマーの配列に十分な情報を提供しても提供しなくてもよい。
【００４９】
一部の実施形態では、本発明の特色は、相互にクエンチするセットのメンバーである蛍光色素または標識による、ポリマー分析物の実質的にあらゆるモノマーの標識である。ポリマー分析物の標識を参照した用語「実質的にあらゆる」の使用は、化学的および酵素的標識技法が、典型的に、１００パーセント未満の効率であることを了承する。一部の実施形態では、「実質的にあらゆる」は、あらゆるモノマーの少なくとも８０パーセントが蛍光標識を付着されていることを意味する。他の実施形態では、「実質的にあらゆる」は、あらゆるモノマーの少なくとも９０パーセントが蛍光標識を付着されていることを意味する。他の実施形態では、「実質的にあらゆる」は、あらゆるモノマーの少なくとも９５パーセントが蛍光標識を付着されていることを意味する。
【００５０】
核酸分子等、ポリマーを配列決定するための方法は、膜または膜様構造または他の基板に挿入されたナノポアまたはポアタンパク質（または合成ポア）を提供するステップを含む。ポアの底部または他の部分は、１種または複数のポア標識で改変されていてよい。底部は、ポアのトランス側を指すことができる。任意選択で、ポアのシスおよび／またはトランス側は、１種または複数のポア標識で改変されていてよい。分析または配列決定されるべき核酸ポリマーは、その結果得られるポリマーにおける４種のヌクレオチドのうち１種または最大全４種のヌクレオチドが、ヌクレオチドの標識アナログ（単数または複数）に置き換えられた、標識されたバージョンの核酸ポリマーを産生するための鋳型として使用することができる。電界がナノポアに印加され、これにより、標識された核酸ポリマーがナノポアを通るように押し進められつつ、外部の単色または他の光源を使用してナノポアを照射し、これにより、ポア標識を励起することができる。核酸の標識されたヌクレオチドが、ナノポアを通過、退出または進入する際に、その後にまたはその前に、エネルギーは、ポア標識からヌクレオチド標識に移動され、これにより、より低いエネルギー放射の放出がもたらされる。次に、ヌクレオチド標識放射が、当業者に公知の単一分子検出が可能な、共焦点顕微鏡装置または他の光学的検出システムもしくは光学顕微鏡システムによって検出される。斯かる検出システムの例として、共焦点顕微鏡、落射蛍光顕微鏡および全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載されている方法に従って、標識されたモノマーを有する他のポリマー（例えば、タンパク質、および核酸以外のポリマー）を配列決定することもできる。一部の実施形態では、蛍光標識またはドナー分子は、ＴＩＲＦシステムにおいてエバネセント波により励起され、これは本明細書において、「エバネセント波励起」と称されることがある。
【００５１】
標識されたモノマーが、ナノポアを退出、進入または通過する際に、その後にまたはその前に、ポリマーのアクセプター標識されたモノマー（例えば、ヌクレオチド）のアクセプター標識が、ドナー標識と相互作用すると、エネルギーは、ポアまたはナノポアドナー標識（例えば、量子ドット）からポリマー（例えば、核酸）におけるアクセプター標識へと移動され得る。例えば、標識されたモノマーがナノポアを退出し、ナノポアチャネルまたは開口の外側のドナー標識の近傍または近接に来るまで、ドナー標識およびアクセプター標識の間の相互作用またはエネルギー移動が起こらないように、ドナー標識は、シスもしくはトランス側におけるナノポアまたはナノポアの表面に位置付けるか、またはこれに付着することができる。結果として、標識間の相互作用、ドナー標識からアクセプター標識へのエネルギー移動、アクセプター標識からのエネルギーの放出、および／またはアクセプター標識からのエネルギーの放出の測定もしくは検出は、ナノポアを通って生じる通過、チャネルまたは開口の外側で、例えば、ナノポアのシスまたはトランス側におけるシスまたはトランスチャンバ内で起こることがある。モノマーのアクセプター標識から放出されたエネルギーの測定または検出を利用して、モノマーを識別することができる。
【００５２】
標識が可視化または露出されて、標識の励起または照射を容易にするように、ナノポア標識は、ナノポアの通路、チャネルまたは開口の外側に位置することができる。ドナー標識およびアクセプター標識間の相互作用およびエネルギー移動、ならびにエネルギー移動の結果としてのアクセプター標識からのエネルギーの放出は、ナノポアの通路、チャネルまたは開口の外側で起こることができる。これは、例えば、光学的検出または測定デバイスによる、アクセプター標識からのエネルギーまたは光放出の検出または測定の容易さおよび精度を容易にすることができる。
【００５３】
ドナー標識は、様々な様式でおよび／またはナノポアの様々な部位に付着することができる。例えば、ドナー標識は、ナノポアの部分または単位に直接的にまたは間接的に付着または接続することができる。あるいは、ドナー標識は、ナノポアに隣接して位置することができる。
【００５４】
ポリマー（例えば、核酸）の各アクセプターが標識されたモノマー（例えば、ヌクレオチド）は、それを通ってポリマーが移動されるナノポアまたはチャネルの出口に位置するか、またはその隣のまたはこれに直接的もしくは間接的に付着された、ドナー標識と逐次に相互作用することができる。例えば、アクセプターが標識されたモノマーがナノポアを退出した後に、またはモノマーがナノポアに進入する前に、ドナーおよびアクセプター標識の間の相互作用は、ナノポアチャネルまたは開口の外側で起こることができる。例えば、アクセプターが標識されたモノマーがナノポアを通過、進入または退出している間に、相互作用は、ナノポアチャネルまたは開口の中でまたは部分的にその中で起こることができる。
【００５５】
核酸の４種のヌクレオチドのうち１種が標識される場合、単一のヌクレオチド標識放出から生じる時間依存性シグナルは、核酸配列における標識されたヌクレオチドの位置に対応する配列に変換される。次に、別々の試料において４種のヌクレオチドのそれぞれについて、このプロセスが反復され、次いで４種の部分的配列が整列されて、核酸配列全体をアセンブルする。
【００５６】
多色標識された核酸（ＤＮＡ）配列が分析される場合、１個または複数のドナー標識から、核酸分子に存在し得る４種の別個のアクセプター標識のそれぞれへのエネルギー移動は、４種の別個の波長または色（それぞれ、４種のヌクレオチドのうちの１種に関連付けられる）での光放出をもたらすことができ、これは、直接的配列読み取りを可能にする。
【００５７】
ドナー標識（本明細書において、「ポア標識」と称されることもある）は、ナノポアを通した核酸の移動を損なう閉塞を引き起こすことなく、ナノポアの開口部（例えば、出口）に可能な限り近くに置くことができる。ポア標識は、種々の適した特性および／または特徴を有することができる。例えば、ポア標識は、特定の要件を満たすエネルギー吸収特性を有することができる。ポア標識は、例えば、約０〜１０００ｎｍまたは約２００〜５００ｎｍに及ぶ、大きい放射エネルギー吸収断面を有することができる。ポア標識は、アクセプター標識等、核酸標識のエネルギー吸収よりも高い特異的エネルギー範囲内の放射を吸収することができる。２種の標識の間でエネルギー移動が発生し得る距離を制御するために、ポア標識の吸収エネルギーは、核酸標識の吸収エネルギーに対して調整することができる。ポア標識は、少なくとも１０６〜１０９回の励起およびエネルギー移動サイクルの間、安定的かつ機能的であってもよい。
【００５８】
一部の実施形態では、モノマーの配列に付着された光学的標識をそれぞれ有するポリマーを分析するためのデバイスは、次の要素を含むことができる：（ａ）第１のチャンバおよび第２のチャンバを分離する固相膜におけるナノポアアレイであって、ナノポアアレイのナノポアがそれぞれ、第１のチャンバおよび第２のチャンバの間に流体連通をもたらし、ナノポアの各異なるクラスターが異なる分解能限界区域内に配置されるように、また、各クラスターが、１を超える、またはゼロを超える平均値を有するランダム変数である多数のナノポアを含むように、クラスターに配置される、ナノポアアレイ；（ｂ）ナノポアアレイのナノポアを通して、第１のチャンバにおけるポリマーを第２のチャンバに移動させるためのポリマー移動システム；ならびに（ｃ）光学的標識が分解能限界区域内のナノポアを退出するときは常に、ポリマーに付着された光学的標識によって生成される光学的シグナルを収集するための検出システム。
二色配列決定
【００５９】
一部の実施形態では、本発明は、二色の光学に基づくナノポア配列決定において使用される。光学に基づくナノポア配列決定は、異なる光学的標識で標識された僅か２種の異なる種類のヌクレオチドを用いて実行することができる。斯かるアプローチにおいて、２種の光学的標識は、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方において、選択された種類のヌクレオチドに対し鑑別可能な光学的シグナルを生成する。例えば、各標的ポリヌクレオチドの相補的な鎖のＣおよびＴは、標識されたアナログによって置き換えることができ、ＣおよびＴアナログの標識は、別個の光学的シグナルを生成することができる。次いで、ナノポアを通った標識された鎖の移動によって光学的シグネチャーが生成され、このナノポアにおいて、鎖のヌクレオチドは、その標識が光学的シグナルを生成する原因となる光学的検出領域を逐次に通過するように制約されている。センスおよびアンチセンス鎖の両方に由来する光学的シグネチャーからの情報が組み合わされて、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する。
【００６０】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの選択された種類のヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼを使用した伸長反応において、標識されたヌクレオチドアナログによって置き換えられる。標的ポリヌクレオチドの標識された鎖は、光学的検出領域を通って１列縦隊で移動するように鎖のヌクレオチドを制約するナノポアを通して移動され、この光学的検出領域において、標識された鎖は、光学的シグナルを産生できるように励起される。個々の鎖の光学的シグナルの収集物は、本明細書において、鎖の光学的シグネチャーと称される。例えば、ヘアピンアダプタを介して鎖およびその相補体（すなわち、センスおよびアンチセンス鎖）が連結された一部の実施形態では、単一の光学的シグネチャーは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方に由来するヌクレオチドにおける光学的標識からの光学的シグナルを含むことができる。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの異なる鎖は、上述の通り、分析のために組み合わせることができるか、または共に使用することができる、２種の異なる光学的シグネチャーを別々に生成することができる。斯かる別々に分析された鎖は、例えば、分子タグ（これは、例えば、迅速な関連付けを可能にする、公知の位置、長さならびに配列パターンおよび多様性の、標的ポリヌクレオチドに付着されたオリゴヌクレオチドセグメントであってもよい）を使用することにより、光学的シグネチャーの生成後に関連付けることができる。光学的シグネチャーは、各検出間隔で検出されたシグナルが、分解能限界区域または容量内で放出する複数の光学的標識からの寄与を含むことができるという点において、混合された光学的シグナルを含むことができる；すなわち、これは（例えば）、参照により本明細書に組み込むHuberら、米国特許出願公開ＵＳ２０１６００７６０９１によって記載されるような、混合されたＦＲＥＴシグナルであってもよい。
【００６１】
一部の実施形態では、斯かる二色の光学に基づくナノポア配列決定は、次のステップにより実行することができる：（ａ）鎖において５’非相補的テイルを有するプライマーを伸長して、一本鎖オーバーハングとしての５’非相補的テイルを有する標識された鎖を含む二本鎖産物を産生することにより、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーするステップであって、別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログが、少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりになって、標識された鎖を形成する、ステップ；（ｂ）鎖の相補体において５’非相補的テイルを有するプライマーを伸長して、一本鎖オーバーハングとしての５’非相補的テイルを有する標識された相補体を含む二本鎖産物を産生することにより、鎖の相補体をコピーするステップであって、別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログが、少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりになって、標識された相補体を形成する、ステップ；（ｃ）ナノポアを横切って電場を印加することにより、標識された鎖を含む二本鎖産物の５’非相補的テイルをナノポアによって捕捉するステップ；（ｄ）標識された鎖のヌクレオチドが、毎秒１０００ヌクレオチド（ｎｔ／秒）未満の速度で励起ゾーンを１列縦隊で通過できるように、標識された鎖を、ナノポアを通して移動させるステップであって、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成し、二本鎖産物の移動する鎖が、ナノポアに進入するにつれて開かれる、ステップ；（ｅ）標識された鎖がナノポアを通して移動するときの光学的標識からの光学的シグナルの時系列を検出して、鎖光学的シグネチャーを産生するステップ；（ｆ）ナノポアを横切って電場を印加することにより、標識された相補体を含む二本鎖産物の５’非相補的テイルをナノポアによって捕捉するステップ；（ｇ）毎秒１０００ヌクレオチド（ｎｔ／秒）未満の速度で、標識された相補体を、ナノポアを通して移動させるステップであって、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成し、二本鎖産物の移動する鎖が、ナノポアに進入するにつれて開かれる、ステップ；（ｈ）標識された相補体がナノポアを通して移動する際に、光学的標識からの光学的シグナルの時系列を検出して、相補体光学的シグネチャーを産生するステップ；（ｉ）鎖光学的シグネチャーおよび相補体光学的シグネチャーから、二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ。
【００６２】
一部の実施形態では、２種類のヌクレオチドが標識されて、これは、ＣおよびＴ、ＣおよびＧ、ＣおよびＡ、ＴおよびＧ、ＴおよびＡ、またはＧおよびＡであってもよい。一部の実施形態では、ピリミジンヌクレオチドが標識される。他の実施形態では、プリンヌクレオチドが標識される。一部の実施形態では、核酸ポリメラーゼを使用したプライマー伸長反応において、選択された種類のヌクレオチドの標識されたアナログｄＮＴＰを取り込むことにより、鎖の選択された種類のヌクレオチドが標識される。他の実施形態では、伸長反応において選択された種類のヌクレオチドのアナログｄＮＴＰを取り込むことにより、鎖の選択された種類のヌクレオチドが標識され、アナログｄＮＴＰは、その後の反応において異なる種類のヌクレオチドへの異なる標識の付着を可能にする直交反応性の官能基により誘導体化される。この後者の標識アプローチは、参照により本明細書に組み込むJettら、米国特許第５，４０５，７４７号に開示されている。
【００６３】
一部の実施形態では、３種類のヌクレオチドが標識され、これは、Ｃを第１の光学的標識で、Ｔを第２の光学的標識で、ＧおよびＡを第３の光学的標識で標識することを含むことができる。他の実施形態では、次の群のヌクレオチドを、示されている通りに標識することができる：ＣおよびＧをそれぞれ第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＴおよびＡを第３の光学的標識で；ＣおよびＡをそれぞれ第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＴおよびＧを第３の光学的標識で；ＴおよびＧをそれぞれ第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＣおよびＡを第３の光学的標識で；ＡおよびＧをそれぞれ第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＴおよびＣを第３の光学的標識で標識。
【００６４】
一部の実施形態では、光学的標識は、ナノポアに会合したドナーからのエネルギー移動後に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）シグナルを生成する、蛍光アクセプター分子である。一部の実施形態では、さらに後述する通り、ドナーは、量子ドット、ナノダイアモンドその他等、光学的に活性なナノ粒子であってもよい。アクセプター分子およびドナーの特定の組合せの選択は、当業者の設計選択である。そのうちのいくつかについてより詳しく後述する一部の実施形態では、単一の量子ドットが、ナノポアに付着され、励起ビームを使用して蛍光を発するように励起され、この励起ビームの波長は、アクセプターによって生成されるＦＲＥＴシグナルに寄与しないように、十分に分離されており、通常、より短い（すなわち、より青色である（bluer））。同様に、その放出波長が、両方のアクセプター分子の吸収バンドに重複する量子ドットが選択されて、ＦＲＥＴ相互作用を容易にする。一部の実施形態では、ナノポアの励起ゾーン毎に２種のドナーを使用することができ、それぞれの放出波長は、アクセプター分子の異なる一方の吸収バンドに最適に重複するように選択される。
【００６５】
図３Ａにおいて、二本鎖標的ポリヌクレオチド（３００）は、センス鎖（３０１）および相補的アンチセンス鎖（３０２）からなり、これに、従来方法、例えば、参照により本明細書に組み込むWeissmanら、米国特許第６，２８７，８２５号；Schmittら、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／００４４６８を使用して、「Ｙ」アダプタ（３０４）および（３０６）がライゲートされる（３０３）。アダプタ（それぞれ３０４および３０６）のアーム（Arm）（３０８）および（３１０）は、プライマー（３１６）および（３１８）がアニールする（３０５）プライマー結合部位を含む。二本鎖部分（３１２）および（３１４）は、タグ配列を含むことができ、例えば、一方または両方が、予め決定された長さおよび組成のランダマー（randomer）を含むことができ、これを、鎖の後の再会合に使用して、例えば、鎖のそれぞれの光学的シグネチャーから配列情報を得ることができる。プライマー（３１６）および（３１８）がアニーリングした後に、（例えば、図解されている通り）標識されたｄＵＴＰアナログ（標識は、取り込まれたヌクレオチドにおける白丸として示す）および標識されたｄＣＴＰアナログ（標識は、取り込まれたヌクレオチドにおける黒丸として示す）ならびに天然の標識されていないｄＧＴＰおよびｄＡＴＰの存在下、核酸ポリメラーゼによってこれらを伸長させることができる（３０７）（伸長された鎖においてアナログが完全に置換されるように、標識されていないｄＴＴＰも標識されていないｄＣＴＰも存在しない）。ＧおよびＡにおける標識の非存在は、取り込まれたヌクレオチドの上のダッシュ記号として図解されている。ノイズがない理想的な検出システムにおいて、白丸、黒丸およびダッシュ記号の配列は、ナノポアの励起ゾーンを通過する際に示されているセンスおよびアンチセンス鎖によって生成された光学的シグネチャーの優れた表現であってもよい。
【００６６】
図３Ｂにおいて、３種の標識を用いる代替的な実施形態に関する、伸長産物（３２０）および（３２２）が図解されている。上述の通り、取り込まれた標識ｄＵＴＰアナログを白丸として示し、取り込まれた標識ｄＣＴＰアナログを黒丸として示す。取り込まれた標識ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰアナログを黒菱形として示す。
【００６７】
標識するためのヌクレオチドの種類、標識およびこれを塩基に付着するためのリンカーの種類、ならびにｄＮＴＰアナログの存在下での伸長反応のための核酸ポリメラーゼの選択におけるガイダンスは、参照により組み込む次の参考文献に見出すことができる：Goodmanら、米国特許第５，９４５，３１２号；Jettら、米国特許第５，４０５，７４７号；Muehleggerら、米国特許出願公開ＵＳ２００４／０２１４２２１；Gillerら、Nucleic  Acids  Research、３１巻（１０号）：２６３０〜２６３５頁（２００３年）；Tasaraら、Nucleic  Acids  Research、３１巻（１０号）：２６３６〜２６４６頁（２００３年）；Augustinら、J.  Biotechnology、８６巻：２８９〜３０１頁（２００１年）；Brakmann、Current  Pharmacuetical  Biotechnology、５巻（１号）：１１９〜１２６頁（２００４年）；その他。本発明による使用のための例示的な核酸ポリメラーゼとして、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−、Ｔａｑ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｏｌ  Ｉ、Ｔｇｏ  ｅｘｏ−、クレノウ断片ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−その他が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、例示的な核酸ポリメラーゼとして、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−およびクレノウ断片ｅｘｏ−が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＮＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｌｅｘａ  ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  １、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ２、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６３５、ＭＲ１２１、ローダミン、ローダミングリーン、オレゴングリーン（Oregon  Green）、ＴＡＭＲＡその他が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＵＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｌｅｘａ  ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６６５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ９０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  １、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ２、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、ＭＲ１２１、オレゴングリーン、ローダミン、ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡその他が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＣＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、ローダミン、ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡその他が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＡＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、ローダミングリーンその他が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＧＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、ローダミングリーンその他が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＵＴＰアナログおよびｄＣＴＰアナログのための蛍光標識の例示的なペアとして、（ＴＡＭＲＡ、ローダミングリーン）、（Ａｔｔｏ  ６５５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ａｔｔｏ  ６５５）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、ローダミングリーン）、（Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  １、ローダミングリーン）、（Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ２、Ａｔｔｏ  ６５５）、（Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、Ｃｙ５）その他が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
図３Ｃは、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０１５２４９２およびＵＳ２０１２／００５８４６８に教示されている通り、２種の標識が使用され、ヘアピンアダプタ（３３０）を用いてセンスおよびアンチセンス鎖が連結される実施形態を図解する。テイルアダプタ（３３２）およびヘアピンアダプタ（３３０）は、標的ポリヌクレオチド（３００）にライゲートされる。変性およびプライマー（３３４）のアニーリング後に、伸長反応は、鎖（３０１）の標識された相補体であるセグメント（３３６）と、鎖（３０１）の標識された逆相補体であるセグメント（３３８）とを含む伸長産物（３３５）を産生する。ナノポアを通した伸長産物（３３５）の移動および光学的シグネチャーの生成後に、標的ポリヌクレオチド（３００）の配列を決定することができる。任意選択で、ヘアピン（３３０）の配列は、伸長反応において標識の予め決定されたパターンが取り込まれるように選択することができ、これは、例えば、セグメント（３３６）が終わる場所およびセグメント（３３８）が始まる場所その他を示すことにより、光学的シグネチャーの分析に役立つように使用することができる。
【実施例】
【００６９】
光学に基づくナノポア配列決定方法における標的ポリヌクレオチドの移動
本実施例において、本発明は、例示的な光学に基づくナノポア配列決定方法と併せて使用される。例示的な光学に基づくナノポア配列決定方法において、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドは、少なくとも３種の状態が可能な蛍光標識で標識される：（ｉ）付着された蛍光標識の蛍光が、直接隣接するヌクレオチドにおける蛍光標識によってクエンチされる、クエンチされた状態；例えば、標識されたポリヌクレオチドが水溶液中で自由であると、ポリヌクレオチドに付着された蛍光標識は、クエンチされる。（ｉｉ）付着された蛍光標識の自由溶液移動または整列が撹乱または限定されて、蛍光標識からの検出可能シグナルがほとんどまたは全く生成されないように、標識されたポリヌクレオチドが、ナノポアを通って移動している、立体的に制約された状態。（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドがナノポアを通って移動する際に蛍光標識がナノポアを退出するにつれて（「遷移間隔」において）、ポリヌクレオチドに付着された蛍光標識が、立体的に制約された状態からクエンチされた状態へと遷移する、遷移状態。ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドがナノポアを移動する際に、一度に１つずつナノポアを退出するにつれて、付着された蛍光標識によって生成されたシグナルを記録することにより決定される。退出の際に、各付着された蛍光標識は、ナノポア中における制約された状態から自由溶液中のポリヌクレオチドにおけるクエンチされた状態へと、遷移間隔の間に遷移する。この遷移間隔の間に、蛍光標識は、これが付着されたヌクレオチドを示す検出可能蛍光シグナルを放出することができる。
【００７０】
一部の実施形態では、本発明は、次のステップを使用した斯かるナノポア配列決定方法とともに使用することができる：（ａ）反応混合物中の鋳型上で５’非相補的テイルを有するプライマーを伸長するステップであって、伸長された鎖および一本鎖オーバーハングとしての５’非相補的テイルを含む二本鎖産物を産生するステップ；（ｂ）第１のチャンバおよび第２のチャンバを分離し、それらの間に流体連通を提供する、ナノポア（またはナノポアのアレイ）を提供するステップであって、ナノポアが、一本鎖核酸を通過させることができるが、二本鎖核酸を通過させることはできない、ステップ；（ｃ）第１のチャンバに二本鎖産物を配置するステップ；（ｄ）ナノポアを横切って電場を印加することにより、単離された二本鎖産物の５’非相補的テイルをナノポアによって捕捉するステップ；（ｅ）穿孔および出口を有するナノポアを通してポリマー分析物を移動させるステップであって、ポリマー分析物が、モノマーの配列を含み、隣接するモノマーの蛍光標識が、ナノポアの外側では、互いに自己クエンチすることによりクエンチされた状態であり、蛍光標識が、ナノポアの内側では、立体的に制約された状態であり、検出可能蛍光シグナルを生成できないように、実質的に各モノマーが、蛍光標識で標識されているステップ；（ｆ）それが付着されたモノマーを示す蛍光シグナルが生成されるように、立体的に制約された状態からクエンチされた状態へと遷移する際に、ナノポアの出口において各蛍光標識を励起する、ステップ；（ｇ）蛍光シグナルを検出して、モノマーを識別するステップ。本明細書において、モノマー、特に、ヌクレオチドの標識を参照した「実質的に全ての」、「実質的にあらゆる」または同様の用語は、化学的標識手順が、全モノマーの完全標識をもたらさない場合があることを了承する；実行可能な程度まで、この用語は、本発明に関連した標識反応が、完了まで続けられることを包含する；一部の実施形態では、斯かる完了された標識反応は、モノマーの少なくとも５０パーセントの標識を含み；他の実施形態では、斯かる標識反応は、モノマーの少なくとも８０パーセントの標識を含み；他の実施形態では、斯かる標識反応は、モノマーの少なくとも９５パーセントの標識を含み；他の実施形態では、斯かる標識反応は、モノマーの少なくとも９９パーセントの標識を含む。
【００７１】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、４種の別々の反応を行うことにより決定され、この反応において、標的ポリヌクレオチドのコピーは、単一の蛍光標識で標識された、その４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）のそれぞれを有する。斯かる実施形態のバリアントでは、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、４種の別々の反応を行うことにより決定され、この反応において、標的ポリヌクレオチドのコピーは、１種の蛍光標識で標識された、その４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）のそれぞれを有するが、同時に、同じ標的ポリヌクレオチドにおける他のヌクレオチドは、第２の蛍光標識で標識されている。例えば、第１の蛍光標識が、第１の反応において標的ポリヌクレオチドのＡに付着される場合、第２の蛍光標識は、第１の反応において標的ポリヌクレオチドのＣ、ＧおよびＴ（すなわち、「非Ａ」ヌクレオチド）に付着される。同様に、この例を続けると、第２の反応において、第１の標識は、標的ポリヌクレオチドのＣに付着され、第２の蛍光標識は、標的ポリヌクレオチドのＡ、ＧおよびＴ（すなわち、「非Ｃ」ヌクレオチド）に付着される。ヌクレオチドＧおよびＴについても、同様である。
【００７２】
同じ標識スキームは、ヌクレオチド型のサブセットに関する従来の用語法の観点から表現することができる；よって、上述の例では、第１の反応において、第１の蛍光標識は、Ａに付着され、第２の蛍光標識は、Ｂに付着される；第２の反応において、第１の蛍光標識は、Ｃに付着され、第２の蛍光標識は、Ｄに付着される；第３の反応において、第１の蛍光標識は、Ｇに付着され、第２の蛍光標識は、Ｈに付着される；第４の反応において、第１の蛍光標識は、Ｔに付着され、第２の蛍光標識は、Ｖに付着される。
【００７３】
一部の実施形態では、配列決定方法の特色は、相互にクエンチするセットのメンバーである蛍光色素または標識による、ポリマー分析物の実質的にすべてのモノマーの標識である。蛍光色素の斯かるセットは、次の特性を有する：（ｉ）各メンバーは、全メンバーの蛍光をクエンチする（例えば、ＦＲＥＴまたは静的もしくは接触機構によって）、および（ｉｉ）各メンバーは、励起され、非クエンチ状態であると、別個の蛍光シグナルを生成する。すなわち、相互にクエンチするセットが、２種の色素、Ｄ１およびＤ２からなる場合、（ｉ）Ｄ１は、自己クエンチされ（例えば、別のＤ１分子との接触クエンチにより）、それは、Ｄ２によってクエンチされ（例えば、接触クエンチにより）、（ｉｉ）Ｄ２は、自己クエンチされ（例えば、別のＤ２分子との接触クエンチにより）、それは、Ｄ１によってクエンチされる（例えば、接触クエンチにより）。相互にクエンチするセットのための蛍光色素または標識を選択するためのガイダンスは、参照により本明細書に組み込む次の参考文献に見出すことができる：Johansson、Methods  in  Molecular  Biology、３３５巻：１７〜２９頁（２００６年）；Marrasら、Nucleic  Acids  Research、３０巻：ｅ１２２頁（２００２年）；その他。蛍光色素または標識の例示的な相互にクエンチするセットは、ローダミン色素、フルオレセイン色素およびシアニン色素から選択することができる。一実施形態では、相互にクエンチするセットは、ローダミン色素、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセイン色素、ＦＡＭを含むことができる。別の実施形態では、蛍光色素の相互にクエンチするセットは、オレゴングリーン４８８、フルオレセイン−ＥＸ、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンＲｅｄ−Ｘ、リサミンローダミンＢ、カルセイン、フルオレセイン、ローダミン、１種または複数のＢＯＤＩＰＹ色素、テキサスレッド、オレゴングリーン５１４、および１種または複数のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒからなる群から２種またはそれよりも多い色素を選択することにより形成することができる。代表的なＢＯＤＩＰＹ色素は、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０およびＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５を含む。代表的なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０および７９０を含む。
【００７４】
上述の方法の一部の実施形態では、蛍光標識は、ＦＲＥＴペアのメンバーである。ＦＲＥＴペアは一般に、１種または複数のＦＲＥＴドナーおよび１種または複数のＦＲＥＴアクセプターであり、各ドナーは、各アクセプターとのＦＲＥＴ反応が可能である。一態様では、これは、ＦＲＥＴペアのドナーが、アクセプターの吸収スペクトルと実質的に重複する放出スペクトルを有することを意味する。別の態様では、ドナーおよびアクセプターの遷移双極子は、効率的なエネルギー移動を可能にする仕方で整列される必要がある。一部の態様では、本発明は、部分的に、ナノポアの蛍光、特にＦＲＥＴ抑制特性、およびナノポアを通して移動する標識されたポリマーの検出を可能にするこの特性の用途の発見および認識に基づく。本発明は、これによって限定されることを意図しないが、ＦＲＥＴペア標識が、ナノポアを通って移動しながら、ＦＲＥＴ相互作用に携わるように配向できないような寸法の穿孔によりナノポアを選択することができると考えられる。ナノポアの穿孔におけるポリヌクレオチド（polynucleoide）の標識の双極子は、ナノポアの限定された直径に基づき、それらの回転自由が制約される。ナノポアに付着された対応するＦＲＥＴペアの整列による双極子整列のこのような低下は、ＦＲＥＴ効率を劇的に限定する。標識されたポリヌクレオチドは、ナノポア退出後にＦＲＥＴ相互作用に携わることができ、この時点で、ポリマー（例えば、ポリヌクレオチド）におけるＦＲＥＴアクセプターまたはドナーは、ＦＲＥＴ事象を可能にする回転自由を回復する。
【００７５】
上述の方法の上述の態様および実施形態の一部は、図４において図表を用いて説明されている。ポリヌクレオチド等、ポリマー分析物（４０００）は、ナノポア（４００２）によって捕捉され、次いでこれを通るよう例えば電気泳動的に駆動され、これにより、そのモノマー単位が、ポリマーにおけるその一次配列と同じ順序で、ナノポアを通して移動するように、ポリマー（４０００）の立体構造が制約される。図４において、蛍光標識は、ＦＲＥＴペアのメンバーであると仮定される；蛍光標識は、例えば、適切な波長で放出するレーザーにより直接的に励起されて、蛍光シグナルを生成する蛍光標識を含むこともできる。
【００７６】
上述の通り、アクセプター標識されたモノマー単位が、ナノポア（４００２）の穿孔内にあるときは常に、斯かるアクセプターおよびそのＦＲＥＴペアのドナーの間のＦＲＥＴ相互作用は、アクセプターが制約された状態（４０１４）であるため抑制される。斯かる抑制は典型的に、例えば、アクセプターおよびドナー双極子の好ましくない配向性により、斯かるアクセプターがドナーのＦＲＥＴ距離内にあったとしても、検出可能ＦＲＥＴシグナルが産生されないことを意味する。他方では、アクセプター標識されたモノマー単位が、ナノポアの穿孔から遷移ゾーン（４００８）へと出現するまたは退出するときに、ＦＲＥＴ相互作用（４０１０）が発生し、ＦＲＥＴ放出（４０１６）が産生され、アクセプターが、隣接するアクセプターとの自己クエンチ状態（４０１１）に入るまで、また、ＦＲＥＴ相互作用距離から抜け出るポリマー（４０００）の移動に伴いアクセプターおよびドナー間の距離が増加するまで、検出器（４０１８）によって検出される。シグナル（４０２２）は、遷移ゾーン（４００８）を通って移動する際に、単一のアクセプターによって産生される。ナノポア（４００２）の出口（４０１５）に直接隣接する空間的領域である、遷移ゾーン（４００８）は、ナノポア（４００２）を通るポリマー（４０００）の移動のスピード、蛍光標識の振動および回転移動度、蛍光標識の生理化学的性質その他を含むいくつかの因子によって画定される。図４において、黒色の丸（４００４）として図解される１種類のモノマー単位のみが、第１の蛍光標識（「ａ」と命名）を保有し；斑点のついた丸（４００６）として図解されるモノマー単位の残りは、第２の蛍光標識（「ｂ」と命名）を保有する。この実施形態では、第１の蛍光標識は、隣接する第１の蛍光標識および隣接する第２の蛍光標識をクエンチする；同様に、第２の蛍光標識は、隣接する第１の蛍光標識および隣接する第２の蛍光標識をクエンチする；さらに、検出器（４０１８）によって検出されたシグナルによって各蛍光標識（したがって、モノマー）を識別することができるように、第１および第２の蛍光標識は、互いに鑑別可能なＦＲＥＴシグナル、例えば、図４における標識「ａ」のための記録されたシグナル（４０２２）および標識「ｂ」のための記録されたシグナル（４０２３）を生成する。
定義
【００７７】
「ＦＲＥＴ」または「フェルスターまたは蛍光共鳴エネルギー移動」は、励起されたドナーフルオロフォアから基底状態のアクセプターフルオロフォアへの、無放射双極子−双極子エネルギー移動機構を意味する。ＦＲＥＴ相互作用におけるエネルギー移動の速度は、アクセプターの吸収スペクトルとドナーの放出スペクトルとのスペクトル重複の程度、ドナーの量子収量、ドナーおよびアクセプター遷移双極子の相対的配向性、ならびにドナーおよびアクセプター分子の間の距離に依存する；Lakowitz、Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）。特に興味深いＦＲＥＴ相互作用は、アクセプターに移動され、次いで、そのドナーを励起する光（すなわち、「ＦＲＥＴシグナル」）よりも低い周波数を有する光子としてアクセプターによって放出されるエネルギーの部分を生じる相互作用である。「ＦＲＥＴ距離」は、ＦＲＥＴ相互作用が起こり得、ＦＲＥＴアクセプターによって産生される検出可能ＦＲＥＴシグナルが生じ得る、ＦＲＥＴドナーおよびＦＲＥＴアクセプターの間の距離を意味する。
【００７８】
「キット」は、本発明の方法を行うための材料または試薬を送達するためのいずれかの送達システムを指す。反応アッセイの文脈において、斯かる送達システムは、ある位置から別の位置への、反応試薬（例えば、適切な容器内の、相互にクエンチする蛍光標識等の蛍光標識、蛍光標識連結剤、酵素等）および／または支持材料（例えば、バッファー、アッセイを行うための書面の説明書等）の貯蔵、輸送または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含有する１個または複数の同封物（例えば、箱）を含む。斯かる内容物は、一緒にまたは別々に、意図される受取人に送達することができる。例えば、第１の容器は、アッセイにおける使用のための酵素を含有することができ、一方、第２またはそれよりも多い容器は、相互にクエンチする蛍光標識を含有する。
【００７９】
「ナノポア」は、予め決定されたまたは識別できる順序での基板を通した分析物の通過を可能にする、あるいはポリマー分析物の場合は、予め決定されたまたは識別可能な順序での基板を通したそのモノマー単位の通過を可能にする、基板に位置するいずれかの開口を意味する。後者の場合、予め決定されたまたは識別可能な順序は、ポリマーにおけるモノマー単位の一次配列であってもよい。ナノポアの例として、タンパク質性またはタンパク質に基づくナノポア、合成または固体状態（ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅ）ナノポア、およびタンパク質ナノポアが包埋された固体状態ナノポアを含むハイブリッドナノポアが挙げられる。ナノポアは、１〜１０ｎｍまたは１〜５ｎｍまたは１〜３ｎｍの内径を有することができる。タンパク質ナノポアの例として、例えば、参照により本明細書に組み込むRhee,  M.ら、Trends  in  Biotechnology、２５巻（４号）（２００７年）：１７４〜１８１頁；Bayleyら（上に引用）；Gundlachら、米国特許出願公開第２０１２／００５５７９２号；その他に開示されている、アルファ−ヘモリジン、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、ＭｓｐＡおよびＬａｍＢ（マルトポリン）が挙げられるがこれらに限定されない。単一の核酸分子の移動を可能にするいずれかのタンパク質ポアを用いることができる。ナノポアタンパク質は、ポア外部の特異的部位において、またはポア形成タンパク質を構成する１個もしくは複数のモノマー単位外部の特異的部位において、標識することができる。ポアタンパク質は、アルファ−ヘモリジン、ＭｓｐＡ、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、炭疽ポリン、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣおよびＬａｍＢ（マルトポリン）等が挙げられるがこれらに限定されない、タンパク質の群から選択される。固体状態の孔へのポアタンパク質の統合は、荷電ポリマーをポアタンパク質に付着することにより達成される。電界を印加した後に、荷電複合体は、固体状態の孔内に電気泳動的に引き寄せられる。合成ナノポアまたは固体状態ナノポアは、様々な形態の固体基板に作製することができ、その例として、シリコーン（例えば、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＯ２）、金属、金属酸化物（例えば、Ａｌ２Ｏ３）、プラスチック、ガラス、半導体材料およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。合成ナノポアは、脂質二重層膜に位置する生物学的タンパク質ポアよりも安定的であってもよい。合成ナノポアは、重合エポキシ等が挙げられるがこれに限定されない、適した基板に包埋されたカーボンナノチューブを使用することにより作製することもできる。カーボンナノチューブは、均一かつ明確に定義された化学的および構造的特性を有することができる。１〜数百ナノメートルに及ぶ、様々なサイズのカーボンナノチューブを得ることができる。カーボンナノチューブの表面電荷は、約ゼロであることが公知であり、結果として、ナノポアを通した核酸の電気泳動的輸送は、単純かつ予測可能になる（Ito,  T.ら、Chem.  Commun.１２巻（２００３年）：１４８２〜８３頁）。合成ナノポアの基板表面は、タンパク質ポアの共有結合による付着を可能にするために、または表面特性を光学的ナノポア配列決定に適したものにするために化学的に改変されていてよい。斯かる表面改変は、共有結合または非共有結合であってもよい。大部分の共有結合による改変は、オルガノシラン沈着を含み、これに関する最も一般的なプロトコールについて記載する：１）水性アルコールからの沈着。これは、シリル化表面を調製するための最も手軽な方法である。９５％エタノール−５％水の溶液は、ｐＨ４．５〜５．５となるように酢酸で調整される。撹拌しつつシランを添加して、２％最終濃度を得る。加水分解およびシラノール基形成後に、基板を２〜５分間添加する。エタノールに短時間浸漬することにより過剰な材料をすすぎ出した。シラン層の硬化は、５〜１０分間、セ氏１１０度で為される。２）気相沈着。シランは、化学的蒸着方法によって乾燥非プロトン性条件下で基板に印加することができる。このような方法は、単層沈着を好む。閉鎖チャンバ設計において、基板は、５ｍｍ蒸気圧の達成に十分な温度まで加熱される。あるいは、シラン蒸発が観察されるまで真空状態にすることができる。３）スピンオン沈着。スピンオン印加は、最大の官能基付与および多層沈着を好む加水分解性条件下で、または単層沈着を好む乾燥条件下で為すことができる。一部の実施形態では、本発明の方法により単一のナノポアが用いられる。他の実施形態では、複数のナノポアが用いられる。後者の実施形態の一部では、複数のナノポアは、通常、固相膜等の平面状基板に配置された、ナノポアのアレイとして用いられる。ナノポアアレイのナノポアは、例えば、直線的パターンで、規則的に間隔をあけていてよい、またはランダムに間隔をあけていてよい。好まれる実施形態では、ナノポアは、平面状固相基板において直線的パターンで規則的に間隔をあける。
【００８０】
「ナノ構造」（「ナノスケール構造」および「ナノスケール特色」と互換的に使用される）は、数ナノメートル〜数百ナノメートル、例えば、１〜１０００ナノメートルの範囲内の少なくとも一寸法を有する構造を意味する。一部の印加では、斯かる範囲は、２〜５００ナノメートルであり；他の印加では、斯かる範囲は、３〜５００ナノメートルである。ナノ構造の形状および幾何学的配置は、広く変動することができ、ナノポア、ナノウェル、ナノ粒子、および一連の反応の実行に特に適した他のいずれかの簡便な形状が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ナノ構造は、固相膜と操作的に会合したタンパク質ナノポアであってもよい。ナノポアおよびナノウェル等、一部のナノ構造は、固相膜または他の固体等、より大型の一般的な基板に形成されて、ナノポアまたはナノウェルのアレイを形成することができる。特に興味深いナノ構造は、化学的、物理的（例えば、ＦＲＥＴ）、酵素的および／または結合反応、または一連の斯かる反応を支持または含有することができるナノ構造である。一部の実施形態では、ナノウェル等、ナノ構造は、１ナノリットル未満の（１０×−９リットル）、１ピコリットル未満のまたは１フェムトリットル未満の容量を封入する。他の実施形態では、個々のナノウェルのそれぞれは、１０００ゼプトリットル未満の、１００ゼプトリットル、８０ゼプトリットルまたは５０ゼプトリットル未満のまたは１ゼプトリットル未満の、またはさらには１００ヨクトリットル未満の容量を提供する。一部の実施形態では、ナノウェルは、ゼロモード導波を含む。
【００８１】
「ペプチド」、「ペプチド断片」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」またはペプチドを参照した「断片」は、本明細書において同義に使用されており、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の単一の分枝していない鎖で構成されている化合物を指す。ペプチドまたはポリペプチドにおけるアミノ酸は、ポリエチレングリコール、色素、ビオチン、ハプテンまたは同様の部分が挙げられるがこれらに限定されない、様々な部分により誘導体化されていてよい。タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドにおけるアミノ酸残基の数は、広く変動し得る；しかし、一部の実施形態では、本明細書で参照されているタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、２〜７０個のアミノ酸残基を有することができ；他の実施形態では、２〜５０個のアミノ酸残基を有することができる。他の実施形態では、本明細書で参照されているタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、数十個のアミノ酸残基、例えば、２０個から、最大で千個またはそれよりも多いアミノ酸残基、例えば、１２００個を有することができる。さらに他の実施形態では、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはこれらの断片は、１０〜１０００個のアミノ酸残基を有することができる；または２０〜５００個のアミノ酸残基を有することができる；または２０〜２００個のアミノ酸残基を有することができる。
【００８２】
「ポリマー」は、線状の鎖となるよう接続された複数のモノマーを意味する。通常、ポリマーは、例えば、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを含むポリヌクレオチドとして、または２種類以上のアミノ酸を含むポリペプチドとして、２型以上のモノマーを含む。モノマーは、ヌクレオシドおよびその誘導体またはアナログ、ならびにアミノ酸ならびにその誘導体およびアナログを限定することなく含むことができる。一部の実施形態では、ポリマーは、ホスホジエステル連結またはそのアナログによってヌクレオシドモノマーが接続されたポリヌクレオチドである。
【００８３】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用されており、それぞれ、ヌクレオチドモノマーの線状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、ワトソンクリック型の塩基対形成、塩基の積み重ね、フーグスティーンまたはリバースフーグスティーン型の塩基対形成その他等、モノマー対モノマーの相互作用の規則的パターンとして天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。斯かるモノマーおよびそのヌクレオシド間連結は、天然に存在するか、またはそのアナログ、例えば、天然に存在するか、または天然に存在しないアナログであってもよい。天然に存在しないアナログは、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、フルオロフォアまたはハプテン等の標識の付着を可能にする連結基を含有する塩基その他を含むことができる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションその他等、酵素による処理を要求する場合は常に、当業者は、これらの事例におけるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、いずれかまたは一部の位置に、ヌクレオシド間連結、糖部分または塩基のある特定のアナログを含有しないであろうことを理解し得る。ポリヌクレオチドは典型的に、「オリゴヌクレオチド」と通常称される場合の数個のモノマー単位、例えば、５〜４０個から、数千個のモノマー単位へと、サイズに幅がある。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」等、文字（大文字または小文字）配列によって表される場合は常に、ヌクレオチドが、左から右へ５’→３’順序であり、他に示されていなければ、または文脈から明らかでなければ、「Ａ」が、デオキシアデノシンを表示し、「Ｃ」が、デオキシシチジンを表示し、「Ｇ」が、デオキシグアノシンを表示し、「Ｔ」が、チミジンを表示し、「Ｉ」が、デオキシイノシンを表示し、「Ｕ」が、ウリジンを表示することが理解される。他に記されていなければ、用語法および原子番号付けの慣習は、StrachanおよびRead、Human  Molecular  Genetics  2（Wiley-Liss、New  York、１９９９年）に開示されているものに従うであろう。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル連結によって連結された４種の天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはＲＮＡはこれらのリボース対応物）を含む；しかし、これは、例えば、改変された塩基、糖またはヌクレオシド間連結を含む、非天然ヌクレオチドアナログを含むこともできる。当業者には、酵素が、活性のために特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件を有する場合（例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスその他）、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質に適切な組成の選択は、十分に、当業者の知識範囲内、特に、Sambrookら、Molecular  Cloning、第２版（Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  York、１９８９年）および同様の参考文献等、専門書からのガイダンス内であることが明らかである。同様に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖型または二本鎖型（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌ��レオチドおよびそれぞれの相補体のデュプレックス）のいずれかを指すことができる。当業者には、用語使用の文脈から、いずれの型が、または両方の型が意図されているか明らかになると予想される。
【００８４】
「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型とデュプレックスを形成した後に、核酸合成の開始点として作用することができ、伸長されたデュプレックスが形成されるように鋳型に沿ってその３’末端から伸長されることができる、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は通常、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ等、核酸ポリメラーゼにより行われる。伸長プロセスにおいて付加されたヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、１４〜４０ヌクレオチドの範囲内または１８〜３６ヌクレオチドの範囲内の長さを有する。プライマーは、種々の核酸増幅反応、例えば、単一のプライマーを使用した線状増幅反応、または２種またはそれよりも多いプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応において用いられる。特定の印加のためのプライマーの長さおよび配列を選択するためのガイダンスは、参照により組み込む次の参考文献によって証明される通り、当業者に周知のものである：Dieffenbach編、PCR  Primer:  A  Laboratory  Manual、第２版（Cold  Spring  Harbor  Press、New  York、２００３年）。
【００８５】
ポリヌクレオチドを参照した「配列の決定」、「配列決定」または「ヌクレオチド配列の決定」または同様の用語は、ポリヌクレオチドの部分的および完全配列情報の決定を含む。すなわち、この用語は、例えば、標的ポリヌクレオチドの単にＡおよびＣの配列等、４種の天然ヌクレオチド、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの完全セットのサブセットの配列を含む。すなわち、この用語は、標的ポリヌクレオチド内における４種類のヌクレオチドのうち１、２、３または全種の同一性、順序付けおよび位置の決定を含む。一部の実施形態では、この用語は、標的ポリヌクレオチド内における４種類のヌクレオチドのうち２、３または全種の同一性、順序付けおよび位置の決定を含む。一部の実施形態では、配列の決定は、その配列が、２進コード、例えば、「ｃ−（非ｃ）（非ｃ）ｃ−（非ｃ）−ｃ．．．」を表す「１００１０１．．．」その他として表されるような、標的ポリヌクレオチド「ｃａｔｃｇｃ．．．」内における単一の種類のヌクレオチド、例えば、シトシンの順序付けおよび位置を識別することにより達成することができる。一部の実施形態では、この用語は、標的ポリヌクレオチドのためのフィンガープリントとして機能する標的ポリヌクレオチドの部分列を含むこともできる；すなわち、ポリヌクレオチドのセット、例えば、細胞によって発現される全て異なるＲＮＡ配列内で、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドのクラスを独特に識別する部分列。
【００８６】
本開示は、明記されている特定の形態の範囲に限定されることを意図しないが、本明細書に記載されている変種の代替物、改変および均等物を網羅することを意図する。さらに、本開示の範囲は、本開示を考慮することにより当業者にとって明らかとなり得る他の変種を完全に包含する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2018536416.tif 000014
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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