(57)【要約】  本明細書において、有用な治療用薬剤、送達媒体およびヌクレオチドに対するトランスフェクション剤としてメトホルミン残基を含むポリマー（「ＰｏｌｙＭｅｔ」）が提供される。本明細書において、対象の疾患または望ましくない状態の処置のための方法であって、疾患または状態と戦うための治療用薬剤としてＰｏｌｙＭｅｔを投与するステップを含む方法も提供される。本明細書において、対象の疾患または望ましくない状態の処置のための方法であって、ＰｏｌｙＭｅｔを含む送達媒体中の治療用薬剤を投与するステップを含む方法も提供される。本明細書において、ＰｏｌｙＭｅｔを作製するための方法もさらに提供される。
2018513883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式Ｉ：
【化１】
2018513883.tif 000033
を有するポリマーであって、式中、ｐは１または２であり、ｎは２から１０，０００の整数であり、
Ｘは、水素または式：
【化２】
2018513883.tif 000034
を有するメトホルミンの残基であり、
前記ポリマー中のＸの少なくとも５％はメトホルミンの残基である、ポリマー。
【請求項２】
Ｘは、Ｘの出現数のうちの少なくとも５０％でメトホルミンの残基である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
Ｘは、Ｘの出現数のうちの少なくとも７５％でメトホルミンの残基である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項４】
Ｘは、Ｘの出現数のうちの少なくとも９５％でメトホルミンの残基である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項５】
Ｘは、Ｘの出現数のうちの約１００％でメトホルミンの残基である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項６】
ｎは、２から５，０００の整数である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項７】
ｎは、２から４，０００の整数である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項８】
ｎは、２から３，０００の整数である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項９】
ｎは、２から２，０００の整数である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１０】
ｎは、２から１，０００の整数である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１１】
ｎは、２から５００の整数である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１２】
ｎは、２から２５０の整数である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１３】
以下の化学式Ｉ：
【化３】
2018513883.tif 000035
を有するポリマーであって、式中、ｎは２から１０，０００の整数であり、
Ｘは、水素、式：
【化４】
2018513883.tif 000036
を有するメトホルミンの残基または以下の化学式：
【化５】
2018513883.tif 000037
を有するエチルアミンの残基であり、
それぞれの場合において、＊Ｎ上の０個、１個または両方の水素が
ａ）それぞれの場合において、同じ様式でさらに置換されてもよいエチルアミンのさらなる残基、および／または
ｂ）メトホルミンの残基
により置換され、
分岐ＰＥＩにもともと存在する第１級＊Ｎの少なくとも５％がメトホルミンの残基により置換されている、ポリマー。
【請求項１４】
前記分岐ＰＥＩにもともと存在する前記第１級＊Ｎのうちの少なくとも５０％は、メトホルミンの残基により置換されている、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１５】
前記分岐ＰＥＩにもともと存在する前記第１級＊Ｎのうちの少なくとも７５％は、メトホルミンの残基により置換されている、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１６】
前記分岐ＰＥＩにもともと存在する前記第１級＊Ｎのうちの少なくとも９５％は、メトホルミンの残基により置換されている、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１７】
前記分岐ＰＥＩにもともと存在する前記第１級＊Ｎのうちの約１００％は、メトホルミンの残基により置換されている、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１８】
ｎは、２から５，０００の整数である、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１９】
ｎは、２から４，０００の整数である、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項２０】
ｎは、２から３，０００の整数である、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項２１】
ｎは、２から２，０００の整数である、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項２２】
ｎは、２から１，０００の整数である、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項２３】
ｎは、２から５００の整数である、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項２４】
ｉ．脂質外膜、および
ｉｉ．前記脂質外膜によって包まれたＰｏｌｙＭｅｔ
を含むナノ粒子。
【請求項２５】
脂質外膜によって包まれたヒアルロン酸または核酸をさらに含むナノ粒子。
【請求項２６】
前記ＰｏｌｙＭｅｔと複合体を形成した積荷であって、治療用薬剤である積荷をさらに含む、請求項２４に記載のナノ粒子。
【請求項２７】
前記積荷は、生物製剤である、請求項２６に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
前記積荷は、抗がん薬である、請求項２７に記載のナノ粒子。
【請求項２９】
前記積荷は、ヌクレオチドである、請求項２７に記載のナノ粒子。
【請求項３０】
前記積荷は、ｓｉＲＮＡまたはｐＤＮＡである、請求項２７に記載のナノ粒子。
【請求項３１】
前記脂質外膜は、カチオン性脂質を含む、請求項２４に記載のナノ粒子。
【請求項３２】
前記脂質外膜は、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを含む、請求項２４に記載のナノ粒子。
【請求項３３】
前記脂質外膜は、標的化リガンドを含み、かつ／またはペグ化される、請求項２４に記載のナノ粒子。
【請求項３４】
約１，０００ｎｍ未満である少なくとも１つの寸法を有する、請求項２４に記載のナノ粒子。
【請求項３５】
直径が約１００ｎｍ未満の球の形状を有する、請求項２４に記載のナノ粒子。
【請求項３６】
ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔを対象に投与することによって疾患を処置する方法。
【請求項３７】
前記疾患は、がんである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患は、糖尿病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＰｏｌｙＭｅｔおよび前記ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔは、積荷を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記積荷は、治療用薬剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
積荷を標的に送達する方法であって、ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔと会合した積荷を対象に投与するステップを含み、前記積荷が、前記ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔによって前記対象の体内の標的に送達される、方法。
【請求項４２】
前記積荷は、治療用薬剤である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
細胞の遺伝物質を改変する方法であって、前記細胞を外来性の遺伝物質と複合体を形成したか、またはそれと会合したＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔと接触させるステップを含み、前記細胞の遺伝物質が改変される、方法。
【請求項４４】
前記細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または原核細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記外来性の遺伝物質は、核酸である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔトランスフェクション試薬と、積荷を前記ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔトランスフェクション試薬と複合体を形成させるための少なくとも１つの溶媒とを含むキット。
【請求項４７】
メトホルミンのポリマーを調製する方法であって、
ａ．溶媒中において直鎖または分岐ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミンをジシアンジアミドと接触させて、第１の混合物を調製するステップ、
ｂ．前記第１の混合物を酸と接触させて、第２の混合物を調製するステップ、および
ｃ．前記第２の混合物をある期間加熱するステップ、
を含み、メトホルミンのポリマーが調製される、方法。
【請求項４８】
前記溶媒は、水性溶媒である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記溶媒は、水である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記酸は、無機酸または有機酸である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記酸は、ＨＣｌである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記期間は、約２から約６時間である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記加熱するステップは、反応が少なくとも約１００℃の温度に達するまで熱を加えることを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
以下の化学式Ｉ：
【化６】
2018513883.tif 000038
を有するポリマーであって、式中、ｐは１または２であり、ｎは２から１０，０００の整数であり、
Ｘは、水素または式：
【化７】
2018513883.tif 000039
を有するメトホルミンの残基であり、前記ポリマー中のメトホルミン残基のｗｔ％は少なくとも０．００１％である、ポリマー。
【請求項５５】
以下の化学式Ｉ：
【化８】
2018513883.tif 000040
を有するポリマーであって、式中、ｐは１または２であり、ｎは２から１０，０００の整数であり、
Ｘは、水素、式：
【化９】
2018513883.tif 000041
を有するメトホルミンの残基または以下の化学式：
【化１０】
2018513883.tif 000042
を有するエチルアミンの残基または以下の化学式：
【化１１】
2018513883.tif 000043
を有するプロピルアミンであり、それぞれの場合において、＊Ｎ上の０個、１個または両方の水素が
ａ）それぞれの場合において、同じ様式でさらに置換されてもよいエチルアミンもしくはプロピルアミンのさらなる残基（複数可）、および／または
ｂ）メトホルミンの残基
により置換され、
前記ポリマー中のメトホルミン残基のｗｔ％は少なくとも０．００１％である、ポリマー。
【請求項５６】
式：
【化１２】
2018513883.tif 000044
を有するブロックコポリマーであって、
式中、ｘは約０．１から約０．９であり、ｙは約０．１から約０．９であり、ｘおよびｙは前記ポリマー中の各単位のモル分率を表し、ｘおよびｙの合計は１であり、ＧおよびＧ’はともに、同じであっても、または異なってもよく、それぞれの場合において、
【化１３】
2018513883.tif 000045
から成る群から選択され、式中ｐは、それぞれの場合において、１または２であり、＊Ｎはメトホルミンの残基またはエチルアミンもしくはプロピルアミンにより誘導体化されてもよい窒素であり、それらのいずれもそれら自体が＊Ｎを含み、Ｙ’およびＹ”は独立して水素、メトホルミンの残基、またはエチルアミンもしくはプロピルアミンであり、それらのいずれもそれら自体が＊Ｎを含み、前記ブロックコポリマーは、共有結合したメトホルミンの残基の％ｗｔが０．００１％ｗｔ／ｗｔから９０％ｗｔ／ｗｔ超である、ブロックコポリマー。
【請求項５７】
構造：
【化１４】
2018513883.tif 000046
を有するデンドリマーであって、前記デンドリマーの第１級窒素の出現数のうちの少なくとも０．０００１は、少なくとも１つのメトホルミンの残基との共有結合によって誘導体化されている、デンドリマー。
【請求項５８】
以下の化学式ＩＩＩ：
【化１５】
2018513883.tif 000047
を有するポリマーであって、式中、各ｐは独立して１または２であり、ｎは０．１から１．０であり、ｑは０．１から１．０であり、ｍは０．１から１．０であり、ｎ、ｑおよびｍは前記ポリマー中の各単位のモル分率を表し、ｎ、ｑおよびｍの合計は１であり、ｚは０から１，０００の整数であり、＊Ｎはメトホルミンの残基またはエチルアミンもしくはプロピルアミンにより誘導体化されてもよい窒素であり、それらのいずれもそれら自体が＊Ｎを含み、Ｘは水素またはメトホルミンの残基であり、Ｙ’およびＹ”は独立して水素、メトホルミンの残基、またはエチルアミンもしくはプロピルアミンであり、それらのいずれもそれら自体が＊Ｎを含む、ポリマー。
【請求項５９】
分子量は、約２００から約６，０００，０００である、請求項５８に記載のポリマー。
【請求項６０】
式Ｉ：
【化１６】
2018513883.tif 000048
の化合物であって、式中、Ｒは、
【化１７】
2018513883.tif 000049
から成る群から選択され、Ｒ１はステロールである、化合物。
【請求項６１】
Ｒ１は、
【化１８】
2018513883.tif 000050
である、請求項６０に記載の化合物。
【請求項６２】
脂質外膜および請求項６１に記載の化合物を含むナノ粒子。
【請求項６３】
ＤＯＰＥをさらに含む、請求項６２に記載のナノ粒子。
【請求項６４】
前記脂質外膜によって包まれたヒアルロン酸または核酸をさらに含む、請求項６３に記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第ＣＡ１５１６５２号、第ＣＡ１４９３６３号および第ＤＫ１００６６４号のもと政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、本明細書においてポリ−メトホルミン（ＰｏｌｙＭｅｔ）と呼ぶ共有結合したメトホルミン残基を含むポリマーおよび巨大分子に関し、これは、それ自体が治療用薬剤の特性を有し、その他の治療用薬剤のための送達媒体として、およびトランスフェクション剤としても使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
メトホルミンは、２型糖尿病の処置に経口で有効である。メトホルミンは、糖尿病の治療的処置用に米国食品医薬品局によって認可されている。メトホルミンの化学名は、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミドジカルボンイミド酸ジアミドである。これは、その塩酸塩の形態、１，１−ジメチルビグアニド塩酸塩として現在米国において販売されている血糖降下剤ビグアニドである。
【０００４】
メトホルミンは、細胞レベルでインスリンの作用を向上させるが、インスリン分泌には影響を及ぼさないことが知られている。メトホルミンは、体重増加を助長せず、いくつかの心血管リスク因子に対して有益な効果を有する。したがって、メトホルミンは、２型糖尿病の大半の患者に対し選択される薬物と一般に考えられている。
【０００５】
糖尿病の薬物としてのメトホルミンの有効性にもかかわらず、メトホルミンには、それでもなおいくつかの欠点がある。メトホルミンが糖尿病のための第一選択の治療法であるが、血漿からのその急速なクリアランスにより、有効な血漿中濃度を継続させるためには複数回の高用量が必要となる。特に、メトホルミンは小腸において効果的に吸収されるが、結腸ではあまりよく吸収されない（Ｍａｒａｔｈｅ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５０，３２５−３３２  （２０００））。結果として、メトホルミンの効果的な血漿中濃度に対する時間ウィンドウが制限される。この狭い吸収ウィンドウのため、メトホルミンは一般に１日に約２〜３回服用するように処方される。
【０００６】
この理由およびその他の理由のため、メトホルミンには完全に活用されていない潜在的な用途がある。本開示は、こうした弱点の多くに対処する。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書においてメトホルミン残基を含むポリマー（「ＰｏｌｙＭｅｔ」）が提供される。ＰｏｌｙＭｅｔは、有用な治療用薬剤、送達媒体および核酸などの遺伝物質のためのトランスフェクション剤である。
【０００８】
本明細書において、対象の疾患または望ましくない状態の処置のための方法であって、疾患または状態と戦うための治療用薬剤としてＰｏｌｙＭｅｔを投与するステップを含む方法も提供される。
【０００９】
本明細書において、対象の疾患または望ましくない状態の処置のための方法であって、ＰｏｌｙＭｅｔを含むナノ粒子などの送達媒体中の治療用薬剤を投与するステップを含む方法も提供される。
【００１０】
本明細書において、ＰｏｌｙＭｅｔを作製するための方法もさらに提供される。
【００１１】
これらの態様およびその他の態様は、下の完全な詳細において開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】２２０から３００ｎｍの範囲のメトホルミン、ＰＥＩおよびＰｏｌｙＭｅｔのＵＶスペクトルを示すグラフである。ＰｏｌｙＭｅｔおよびメトホルミンはともにおよそ２３０ｎｍの最大吸光度を有し、このことは、これらがともに類似の機能的構造を有するが、ＰＥＩは有さなかったことを示唆する。
【図１Ｂ】メトホルミン、ＰＥＩおよびＰｏｌｙＭｅｔの細胞毒性を示すグラフである。Ｈ４６０細胞の可用性は、メトホルミン、ＰｏｌｙＭｅｔおよびＰＥＩ溶液への曝露の２４時間後にＭＴＴアッセイを使用して判定した。データは平均±Ｓ．Ｄ．である（ｎ＝８）。
【図１Ｃ】ＰＥＩおよびＰｏｌｙＭｅｔの最大耐用量（ＭＴＤ）を示す表である。ＣＤ−１マウスに０．９％ＮａＣｌ溶液中のさまざまな濃度のポリマーをＩＶ注射した。ＩＶ注射の２４時間以内の＊ＭＴＤは、任意の致死量より０．５ｍｇ／ｋｇ低い。各用量において少なくとも３匹のマウスを試験した。
【図２】ＰＥＩおよびＰｏｌｙＭｅｔのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示すグラフである。ジトラノール（ＴＨＦ中２０ｍｇ／ｍｌ、ＮａＴＦＡ  １ｍｇ／ｍｌ）をサンプルと混合し、サンプル調製のためにα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を使用した。ＰＥＩに関して３０％を超える強度のシグナルが５１５．４から１２４４．１（ｍ／ｚ）の間の範囲の広範囲にわたって見出された。ＰｏｌｙＭｅｔのスペクトルの３０％を超える強度のシグナルが６７０．５から３８２０．２（ｍ／ｚ）に現れた。ＰＥＩのスペクトルのピークの位置と比較して、ＰｏｌｙＭｅｔのスペクトル分解のスペクトルのピークはより高い質量範囲の方にシフトした。そのようなシフトは、ＰｏｌｙＭｅｔの分子量がＰＥＩよりも大きいことを示し、このことは、ＰＥＩのジシアンジアミドによる修飾が成功したことを示唆した。
【図３】複合体の製剤化の最適化を示すグラフである。複合体の粒子サイズ（青）およびゼータ電位（赤）に関するＰＥＩ−ＨＡ（Ａ）およびＰｏｌｙＭｅｔ−ＨＡ（Ｂ）のＮ／Ｐ比の影響。
【図４Ａ】ＰｏｌｙＭｅｔ／ＨＡ複合体の略図である。
【図４Ｂ】ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔの略図である。
【図４Ｃ】ＰｏｌｙＭｅｔ／ＨＡ複合体の代表的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図４Ｄ】ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔの代表的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図４Ｅ】ナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）測定値を示す表である。
【図５Ａ】全血の血液学的試験を示す表である。データは平均±Ｓ．Ｄ．である（各群あたりｎ＝５）。
【図５Ｂ】血清の血液生化学的試験を示すグラフである。データは平均±Ｓ．Ｄ．である（各群あたりｎ＝５）。
【図５Ｃ】ＰＢＳ、メトホルミン、ＬＰＨ−ＰＥＩおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔの注射後に採取した主要な臓器のＨ＆Ｅ染色を示す図である。
【図６】図６Ａは、メトホルミンおよびＰｏｌｙＭｅｔがＨ４６０腫瘍増大を抑制することを示す図である。ＰＢＳ、メトホルミン、ＬＰＨ−ＰＥＩおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔを１日おきに静脈内投与し、最後の注射の２４時間後にマウスを屠殺した。図６Ａでは、毎日、腫瘍体積を測定した。図６Ｂは、最後の注射の翌日に腫瘍重量を測定し、腫瘍量の百分率を求めるために体重と比較した図である。図６Ｃは、最終時点における各処置群のＨ４６０腫瘍サイズの視覚的な観察結果を示す図である（各群あたりｎ＝５）。
【図７】図７Ａは、ＡＭＰＫの活性化、ｍＴＯＲ経路の阻害による腫瘍増大のメトホルミンおよびＰｏｌｙＭｅｔの抑制を示し、図７Ｂは、オートファジーおよびアポトーシスメカニズムの誘導を示す図である。Ｈ４６０腫瘍があるマウスに１日おきにＩＶ注射をし、２回目の注射の２４時間後に腫瘍タンパク質の分析の準備をした。オートファジーを受けた細胞を、ＬＣ３ｂ抗体（赤）によって着色し、細胞のアポトーシスはＴＵＮＥＬアッセイによって示した（緑）。核は青に着色される。パーセンテージは、それぞれＬＣ３ｂ陽性細胞（赤）の平均パーセンテージおよびＴＵＮＥＬ陽性細胞（緑）のパーセンテージを指す。ランダムに選択された５つの顕微鏡視野をＩｍａｇｅＪにより定量的に解析した。データは平均±Ｓ．Ｄ．である（各群あたりｎ＝５）。
【図８】さまざまなＬＰＨナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子サイレンシング効果を示す図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に関しては、図８Ａに示したとおり、Ｈ４６０／Ｌｕｃ細胞をさまざまな用量のｓｉＲＮＡを用いたさまざまなＬＰＨ製剤とともに３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞をＰＢＳで洗浄し、ｓｉＲＮＡを含まない培地中でさらに２４時間培養した。細胞のルシフェラーゼ活性を分析し、タンパク質によって正規化した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±Ｓ．Ｄ．である（各群あたりｎ＝８）。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に関しては、ＰｏｌｙＭｅｔから構成されるＬＰＨナノ粒子は、抗アポトーシス性ＢＣＬ２  ｓｉＲＮＡを腫瘍部位に全身的に送達し、腫瘍増大を抑制することができる。Ｈ４６０腫瘍をもつマウスに１日おきに静脈注射をした。図８Ｂは、ウエスタンブロット分析によって測定した、２回の注射後の腫瘍のＢＣＬ２タンパク質レベルを示す。図８Ｃは、毎日測定した腫瘍体積を示す。図８Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるさまざまな製剤中のｓｉＲＮＡによる処置後のＨ４６０腫瘍細胞におけるＴＵＮＥＬ染色を示す。パーセンテージは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（緑）の平均パーセンテージを指す。ランダムに選択された５つの顕微鏡視野をＩｍａｇｅＪにより定量的に解析した。データは平均±Ｓ．Ｄ．である（各群あたりｎ＝５）。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図９】ＰｏｌｙＭｅｔから構成されるＬＰＨナノ粒子は、抗アポトーシス性ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡを腫瘍部位に全身的に送達し、腫瘍増大を抑制したことを言及する図である。Ｈ４６０腫瘍をもつマウスに１日おきに静脈注射をした。図９Ａは、ウエスタンブロット分析によって測定した２回の注射後の腫瘍ＶＥＧＦタンパク質レベルを示す。図９Ｂは、毎日測定した腫瘍体積を示す。図９Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるさまざまな製剤中のｓｉＲＮＡによる処置後のＨ４６０腫瘍細胞におけるＴＵＮＥＬ染色を示す。パーセンテージは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（緑）の平均パーセンテージを指す。ランダムに選択された５つの顕微鏡視野をＩｍａｇｅＪにより定量的に解析した。データは平均±Ｓ．Ｄ．である（各群あたりｎ＝５）。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図９Ｄは、マウスにおけるＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ−ｓｉＶＥＧＦサイレンシングを示す。
【図１０】示したＮ／Ｐ比の（Ａ）Ｌ−ＰＥＩおよびＬ−ＰｏｌｙＭｅｔならびに（Ｂ）Ｂ−ＰＥＩおよびＢ−ＰｏｌｙＭｅｔのトランスフェクション効率を示すグラフである。ルシフェラーゼｐＤＮＡ濃度は、９６ウェルプレートにおいて０．５μｇ／ウェルであった。データは平均±Ｓ．Ｄ．である（各群あたりｎ＝６）。
【図１１】遺伝子送達特性の図である。
【図１２】ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔを使用したｓｉＲＮＡ送達の図である。
【図１３】ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔを使用したｐＤＮＡ送達の図である。
【図１４】Ｈ４６０細胞におけるルシフェラーゼプラスミド活性を示すデータである。
【図１５】Ｈ４６０細胞におけるＲＦＰプラスミド活性を示すデータである。
【図１６】Ｈ４６０異種移植片におけるさまざまなＬＰＨナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子サイレンシング効果を示すデータである。図１６Ａでは、Ｈ４６０腫瘍をもつマウスに１日おきに静脈注射をし、毎日、腫瘍体積を測定した。図１６Ｂは、最終時点における各処置群のＨ４６０腫瘍を示す。図１６Ｃでは、８回の注射後のＨ４６０腫瘍ＶＥＧＦタンパク質レベルをウエスタンブロット分析によって測定した。図１６Ｃの棒グラフは、Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用した正規化されたＶＥＧＦバンド強度の定量分析を表す。データは、チューキーの補正を伴う二元配置ＡＮＯＶＡによって分析された平均±ＳＥＭ（各群あたりｎ＝５）である。データは、３つの独立した実験を組み合わせたもの（Ａ）またはその代表的なもの（ＢおよびＣ）からされる。ｎ．ｓ＝有意でない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【図１７】Ｈ４６０腫瘍をもつマウスに、１日おきにメトホルミンおよびＰｏｌｙＭｅｔまたはＰＥＩから構成されるＬＰＨナノ粒子の静脈注射をした。毎日、腫瘍体積を測定した。データは、チューキーの補正を伴う二元配置ＡＮＯＶＡによって分析された平均±ＳＥＭである。データは、３つの独立した実験を組み合わせたものである。各実験の１群あたり５匹のマウス、ｎ．ｓ．＝有意でない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【図１８】異なる分子量のＰＥＩおよびＰｏｌｙＭｅｔ  ＬＰＨナノ粒子の腫瘍増大に対する効果を示すグラフである。Ｈ４６０腫瘍をもつマウスに１日おきに静脈注射をし、毎日、腫瘍体積を測定した。各実験の１群あたり５匹のマウス、ｎ．ｓ．＝有意でない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【図１９】Ｈ４６０異種移植片における異なる分子量のＰＥＩおよびＰｏｌｙＭｅｔ  ＬＰＨのｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子サイレンシング効果を示すグラフである。Ｈ４６０腫瘍をもつマウスに１日おきに静脈注射をし、毎日、腫瘍体積を測定した。各実験の１群あたり５匹のマウス、ｎ．ｓ．＝有意でない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【図２０Ａ】コレステリルクロロホルメートの１Ｈ  ＮＭＲ（１）および１３Ｃ  ＮＭＲ（２）スペクトルの図である。
【図２０Ｂ】コレステリルエチレンジアミンの１Ｈ  ＮＭＲ（１）および１３Ｃ  ＮＭＲ（２）スペクトルの図である。
【図２０Ｃ】コレステリルビグアニド（コレステリルメトホルミン）の１Ｈ  ＮＭＲ（１）および１３Ｃ  ＮＭＲ（２）スペクトルの図である。
【図２１Ａ】ＭＥＴ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥのリポソームのＴＥＭ形態を示す図である。
【図２１Ｂ】ＥＤＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥのリポソームのＴＥＭ形態を示す図である。
【図２２】異なるプロタミン／ＨＡ／ｓｉＲＮＡのＮ／Ｐモル比におけるＰＨのｓｉＲＮＡと結合する能力のゲル遅延度アッセイを示す図である。
【図２３】プロタミン／（ＨＡ＋ｓｉＲＮＡ）比のＰＨコアのサイズおよび封入効率に対する影響を示すグラフである。
【図２４】さまざまな製剤の特徴を示す表である。
【図２５】（図２５Ａ）ＰＨコアおよびＥＤＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（図２５Ｂ）およびＭＥＴ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（図２５Ｃ）からの対象のＬＰＨ−ＮＰのＴＥＭ形態を示す図である。本明細書中で使用される場合、ＰＨはプロタミン＋ヒアルロン酸複合体を指す。ＬＰＨ−ＮＰは、脂質・ポリカチオン・ヒアルロン酸ナノ粒子を指す。ＥＤＡ−Ｃｈｏｌは、エチレンジアミンコレステロールを指す。ＭＥＴ−Ｃｈｏｌは、メトホルミン修飾コレステロールを指す。ＤＯＰＥは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを指す。
【図２６Ａ】さまざまな製剤による処置後のＨ４６０異種移植片を有するマウスモデルの腫瘍増大の抑制を示すグラフである。
【図２６Ｂ】最後の注射後の日に腫瘍重量を測定し、腫瘍量の百分率を求めるために体重と比較したグラフである。
【図２７Ａ】さまざまなｓｉＲＮＡ製剤による処置後のＨ４６０異種移植片を有するマウスモデルの腫瘍増大の抑制を示すグラフである。
【図２７Ｂ】最後の注射後の日に腫瘍重量を測定し、腫瘍量の百分率を求めるために体重と比較したグラフである。
【図２８Ａ】最後の注射の２４時間後に分析した腫瘍におけるｐ−ＡＭＰＫおよびｐ−ｍＴＯＲタンパク質の発現を示す図である。
【図２８Ｂ】最後の注射の２４時間後に分析した腫瘍におけるＶＥＧＦタンパク質の発現を示す図である。
【図２９】さまざまな製剤によって誘導されたアポトーシスのＴＵＮＥＬアッセイを示す図である。
【図３０】さまざまなｓｉＲＮＡ製剤によって誘導されたアポトーシスのＴＵＮＥＬアッセイを示す図である。
【図３１】さまざまな製剤の処置後の主要な臓器のＨ＆Ｅ染色を示す図である。
【図３２】マウスにおけるＣｙ−３標識ｓｉＲＮＡを含むさまざまな製剤の体内分布を示す図である。
【図３３】Ｈ４６０異種移植片モデルの腫瘍におけるＣｙ−３標識ｓｉＲＮＡを含むさまざまな製剤の分布を示す図である。
【図３４】合成がスキーム３に記載されているＤＯＢＰのＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３５】さまざまな製剤の特徴的なパラメーターを示す表である（ＤＬＳ）。Ｌｉｐｏ−ＤＯＴＡＰは、プロタミン／ヒアルロン酸コアとＤＯＴＡ／コレステロール脂質コーティングから構成される。Ｌｉｐｏ−ＤＯＢＰは、プロタミン／ヒアルロン酸コアとＤＯＢＰ／コレステロール脂質コーティングから構成される。
【図３６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける空のリポソームの抗腫瘍活性を示すグラフである（ＭＴＴ）。空のリポソームとは、ＤＮＡを装填していないＬＰＨ−ＤＯＴＡＰおよびＬＰＨ−ＤＯＢＰを指す。
【図３７】空のリポソーム（５ｍｇ／ｋｇのメトホルミン）のｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を示す図である。
【図３８】さまざまなＬＰＨナノ粒子のアポトーシス（ＴＵＮＥＬアッセイ）を示す図である。
【図３９】さまざまなＬＰＨナノ粒子の血清の血液生化学的試験を示すグラフである。
【図４０】さまざまなＬＰＨナノ粒子の処置後のＨ＆Ｅ染色した臓器切片を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次に本開示の主題が、以降さらに十分に記載される。ただし、前述の説明において提示されている教示の利益を有する、本明細書中に記載されている本開示の主題の多くの改変形態および他の実施形態が、本開示の主題が属する分野の当業者には思い浮かぶであろう。したがって、本開示の主題は開示されている特定の実施形態に限定されるものではなく、改変形態および他の実施形態は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されると解釈されるべきである。
【００１４】
２型糖尿病を処置するために使用される最も有効な薬物の１つであるメトホルミン（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルビグアニド）は、さまざまなタイプのがんに対する治療用薬剤としての可能性も有する。（Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｄ．Ｒ．＆Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｄ．Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （２０１４））。この化合物およびその調製については、例えば、米国特許第３，１７４，９０１号に開示されている。メトホルミン塩酸塩も商業的に購入することができる。
【００１５】
薬物送達のための薬理学的活性を有する新規の材料を使用することは、治療有効性を相乗的に向上させる可能性があるであろう。本明細書において、まとめてＰｏｌｙＭｅｔと呼ぶポリマーメトホルミン、すなわち、メトホルミンの残基を含むポリマーの設計および合成が開示される。実施形態において、ポリマーは非活性炭素骨格を介してコンジュゲートするため、生物活性のグアニジン部分がメトホルミンとして本質的に利用可能であり、ＰｏｌｙＭｅｔはがんの処置に対する新しい機会をもたらす。さらに、ＰｏｌｙＭｅｔは、遺伝子送達を向上させることができる。グアニジウム基を含むポリマーは、そのアミンを含む対応物よりも高い遺伝子送達効率を有する（Ｚｈａｎｇ，Ｒ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｎ．，Ｓｏｎｇ，Ｚ．，Ｙｉｎ，Ｌ．＆Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３５，３４４３−３４５４  （２０１４）．Ｎｉｍｅｓｈ，Ｓ．＆Ｃｈａｎｄｒａ，Ｒ．Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−ｇｒａｆｔｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｒｂｅｉｔｓｇｅｍｅｉｎｓｃｈａｆｔ  ｆｕｒ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ  Ｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ  ｅ．Ｖ  ６８，６４７−６５５  （２００８）。
【００１６】
ＰｏｌｙＭｅｔは、それ自体が薬理学的活性および治療的活性を有する薬物送達媒体である。したがって、ＰｏｌｙＭｅｔは、治療有効性を相乗的に向上させることができる。ＰｏｌｙＭｅｔは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＥＩの細胞毒性を劇的に低下させた。そのポリカチオン活性があれば、ＰｏｌｙＭｅｔはまた、ＬＰＨ（リポソーム・ポリカチオン・ヒアルロン酸）ナノ粒子（「ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ」）に製剤化することもできる。本明細書中で示されるとおり、メトホルミンおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔナノ粒子はともに、がんの発症を著しく抑制する。これは、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化、ｍＴＯＲ経路の阻害、ならびに／またはオートファジーおよびアポトーシスの誘導に起因する可能性もある。ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔナノ粒子はまた、ｓｉＲＮＡ分子のための送達媒体として使用することもできるため、遺伝子送達を容易にする。したがって、ＰｏｌｙＭｅｔは、がんの治療において多くの用途を有する。さらに、ＰｏｌｙＭｅｔ自体、プラスミドＤＮＡなどの遺伝物質の細胞へのトランスフェクションを促進することができる。したがって、ＰｏｌｙＭｅｔは、それ自体が薬物であり、他の薬物を送達するための薬物担体およびトランスフェクション剤である。
【００１７】
ＰｏｌｙＭｅｔによって他の利点も提供される。特に、ＰｏｌｙＭｅｔは、ＰＥＩと比較して劇的に低い細胞毒性（図１Ｃ）および高い最大耐用量（ＭＴＤ、図１Ｄ）を有し、このことは、メトホルミンの残基を含むＰｏｌｙＭｅｔが第２級アミンを含むその対応物よりも毒性が低いことを示す。
【００１８】
本明細書に十分に記載されるとおり、ＰｏｌｙＭｅｔは、少なくとも以下を提供する。
１．抗糖尿病薬および抗腫瘍薬としての治療特性、
２．特に、抗がん薬およびｓｉＲＮＡ、ｐＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのヌクレオチド化合物のなどの治療用薬剤送達特性、および
３．特に、抗がん薬および巨大分子、例えば、ペプチド、タンパク質などの治療用薬剤送達特性。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「ＰｏｌｙＭｅｔ」という用語は、メトホルミンのポリマー、すなわち、メトホルミンの残基を含むポリマーまたは巨大分子を指し、その構造は本明細書中の別の場所に記載されている。このポリマーは、広い範囲の分子量を有することができる。ＰｏｌｙＭｅｔのこの態様および他の態様は、以下に十分に記載される。ＰｏｌｙＭｅｔは、
【化１】
2018513883.tif 000003
などの利用可能な第１級および／または第２級アミンを有する炭素鎖から調製することができ、式中、Ｘ、Ｙはｎ個の炭素を含有する直鎖または分岐のいずれかの炭化水素であり、ｎは、２から５０，０００、２から４０，０００、２から３０，０００、２から２０，０００、２から１０，０００、２から５，０００、２から４，０００、２から３，０００、２から２，０００２から８，０００、２から７，０００、２から６，０００、２から５，０００、２から４，０００、２から３，０００、２から２，０００、２から１，０００、２から５００、２から２００、２から１００、または２から５０の整数である。本明細書に記載されるとおり、ポリ−メトホルミン（ＰｏｌｙＭｅｔ）は、直鎖または分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、任意の既知のポリマー、デンドリマーおよびジシアンジアミドの反応によってメトホルミンの残基を含むよう合成することができる。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「ＰＥＩ」はポリエチレンイミンを指し、「ＰＰＩ」はポリプロピレンイミンを指す。以下の式は、ｐが１である場合のＰＥＩ、およびｐが２である場合のＰＰＩを表す。
【化２】
2018513883.tif 000004
【００２１】
ＰＥＩは、ＰｏｌｙＭｅｔの調製のための有用な出発材料である。ＰＥＩは、直鎖または分岐であってもよい。直鎖ＰＥＩは、以下の化学構造：
【化３】
2018513883.tif 000005
を有し、これは、当該技術分野において：
【化４】
2018513883.tif 000006
としても知られている。
上記構造において、ｎは、２から１０，０００以上の整数である。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ＰＰＩ」はポリプロピレンイミンを指す。これは、ＰｏｌｙＭｅｔの調製のための有用な出発材料である。ＰＰＩは、直鎖または分岐であってもよい。直鎖ＰＰＩは、以下の化学構造：
【化５】
2018513883.tif 000007
を有し、式中、ｎは、２から１０，０００の整数である。
【００２３】
ペグ化ＰＥＩまたはＰＰＩ誘導体の例は、構造：
【化６】
2018513883.tif 000008
を有し、式中、ｍは約０．１から約０．９であり、ｎは約０．１から約０．９であり、ｍおよびｎはポリマー中の各単位のモル分率を表し、ｍおよびｎの合計は１であり、ｐは１または２であり、ｘは１から約５００の整数である。ＰＥＩポリマーでは、ｐは１である。ＰＰＩポリマーでは、ｐは２である。
【００２４】
標的化修飾を有するペグ化ＰＥＩまたはＰＰＩ誘導体の例は、構造：
【化７】
2018513883.tif 000009
を有し、式中、ｍ、ｎ、ｐおよびｘは、上記のとおりである。
【００２５】
分岐ＰＥＩまたはＰＰＩは、骨格ＰＥＩ／ＰＰＩに対するペンダントエチルアミン単位もしくはＰＥＩ部分またはペンダントプロピルアミン単位もしくはＰＰＩ部分をさらに含むＰＥＩあるいはＰＰＩモノマー単位を指す。非限定例は、
【化８】
2018513883.tif 000010
であり、式中、ＰＥＩポリマーでは、ｐは１であり、ＰＰＩポリマーでは、ｐは２であり、
【化９】
2018513883.tif 000011
式中、ｎは、ｐは１である分岐ＰＥＩ構造またはｐが２であるＰＰＩ構造中の繰り返し単位の数である。ｎの有用な値は、２から約１，０００，０００、２から約５００，０００、２から約１００，０００、２から約５０，０００、２から約２５，０００、２から約１０，０００、２から約５，０００、２から約１，０００以下である。分岐ＰＥＩまたはＰＰＩは、利用可能な任意の窒素と共有結合したさらなるエチルアミン単位もしくはＰＥＩ部分またはさらなるプロピルアミン単位もしくはＰＰＩ部分を含んでもよい。そのような直鎖または分岐ＰＥＩ／ＰＰＩは、商業的に入手可能であるか、または既知の方法を使用して容易に得られる。それぞれの場合において、ＰＥＩのサイズまたは分子量（ＭＷ）は、整数「ｎ」によって示すことができ、本明細書中の別の場所に記載されている。上記の構造において、任意の水素がメトホルミンの残基によって置換されてもよい。
【００２６】
ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）の具体的な例としては、ＰＰＩ世代１：
【化１０】
2018513883.tif 000012
ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、世代２：
【化１１】
2018513883.tif 000013
が挙げられ、これらはこの分野で知られ、本明細書中の別の場所で述べられており、さらなる世代が調製されてもよく、それによりそれぞれの後に続く世代において、最も外側の第１級窒素がさらに分岐してデンドリマーを形成し、それは下で述べられる。
【００２７】
デンドリマーは、多くの反応基を有する密集した分岐構造を有するポリマーであり、この反応基は本開示においては第１級および第２級窒素を指す。樹状ポリマーは、繰り返し単位のいくつかの層または世代を含み、このすべてが１つ以上の分岐点を含む。樹状超分岐ポリマーを含むデンドリマーは、少なくとも２つの反応基を有するモノマー単位の縮合反応によって調製される。デンドリマーは、一般に末端表面基、２つ以上の分岐官能基を有する内部分岐連結点、および近くの分岐した連結点に共有結合した二価の連結部から成る。
【００２８】
デンジマーおよびデンドロンの例、ならびにそれらを合成する方法は、米国特許第４，５０７，４６６号、同第４，５５８，１２０号、同第４，５６８，７３７号、同第４，５８７，３２９号、同第４，６３１，３３７号、同第４，６９４，０６４号、同第４，７１３，９７５号、同第４，７３７，５５０号、同第４，８７１，７７９号および同第４，８５７，５９９号に記載されている。超分岐ポリマーの例およびそれを調製する方法は、例えば、米国特許第５，４１８，３０１号に記載されている。ＰｏｌｙＭｅｔ巨大分子を調製するための誘導体化に適したデンドリマーの非限定例は、ポリプロピレンイミンデンドリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリアリールエーテルデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、ポリエステルデンドリマー、ポリアミドデンドリマー、樹状ポリグリセロール、およびトリアジンデンドリマーである。デンドリマーは、デンドリマーを構成するポリマーによって、デンドリマーに存在する化学的部分および／またはデンドリマーの分子量によって定義することができる。本明細書において提供されるとおり、デンドリマーのサイズおよび表面官能基は、アミンのパーセント誘導体化に影響を及ぼす可能性がある。
【００２９】
デンドリマーは、収束的合成または分岐的合成によって調製することができる。デンドリマーの分岐的合成は、規則正しい配置を作り出すために、放射状に外側に向かう、連続的な一連の幾何学的に進行する段階的な、分枝への分枝の付加により行われる分子の成長プロセスを含む。したがって、それぞれの樹状巨大分子は、セルのそれぞれが１つの分岐連結点を含む、コアセル、内部セルの１つ以上の層、および表面セルの外層を含むといってよい。このセルは、化学構造および分岐官能基が同じであってもよく、または異なってもよい。表面分岐セルは、化学的に反応性の官能基または不活性の官能基のいずれかを含んでもよく、化学的に反応性の表面基は、樹状成長のさらなる延長のため、または樹状分子表面の修飾のために使用することができる。樹状表面を物理的修飾のため、例えば、親水性末端に対する疎水性末端の割合を調節し、かつ／または特定の溶媒に対する樹状ポリマーの溶解度を向上させるために化学的に不活性な基が使用されてもよい。
【００３０】
デンドリマーの収束的合成は、デンドロンまたはデンドリマーの表面になるものから開始し、焦点またはコアに向かって放射状に進行する成長プロセスを含む。樹状ポリマーは、理想的なものである場合もあり、または非理想的、すなわち、不完全なものもしくは欠陥があるものである場合もある。不完全状態は、通常、不完全な化学反応または不可避の競合する副反応のいずれかの結果である。実際には、実際の樹状ポリマーは、一般に非理想的、すなわち、一定量の構造的不完全状態を含む。
【００３１】
超分岐樹状ネットワークとは、非理想的で不規則な分岐を高いレベルで含む樹状ポリマーのクラスを指す。具体的には、超分岐ポリマーは、すべての繰り返し単位が分岐連結点を含む訳ではない比較的多い数の不規則な分岐領域を含む。デンドリマー、デンドロン、超分岐ランダムポリマー、制御された超分岐ポリマー、およびデンドリグラフトの調製および特徴づけについてはよく知られている。
【００３２】
上記のとおり、デンドリマーは、繰り返して分岐した巨大分子である。デンドリマーは、一般に対称的な巨大分子である。本明細書中で使用される場合、デンドリマーは、外部または表面第１級アミノ基を含む。デンドリマーの非限定例は、以下のものである。
【化１２】
2018513883.tif 000014
【００３３】
さらに別の実施形態において、構造（遊離塩基）：
【化１３】
2018513883.tif 000015
を有するジヘキサデシルアミン（ＨＣｌ）、これは、誘導体化されてもよく、この場合、窒素上の水素が置換され、窒素がメトホルミンの残基と共有結合して、ビグアニド頭部基を有する二本鎖の両親媒性物質になる。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「メトホルミンの残基」は、ポリマー骨格中または巨大分子足場中の窒素がメトホルミンの残基と一緒になり本明細書に記載されるとおりポリマー鎖として共有結合したメトホルミン分子を形成することを意味する。ポリマー鎖中のそれぞれのメトホルミンは、任意の他の付近のメトホルミンと炭素を共有する場合がある。メトホルミンの残基の化学構造を以下に示す。
【００３５】
ＰｏｌｙＭｅｔの特有の特性を考慮して、本主題は、ＰｏｌｙＭｅｔの有用性を活用する以下の実施形態を対象とする。
【００３６】
メトホルミンのポリマー
一実施形態において、本主題は、以下の化学式Ｉ：
【化１４】
2018513883.tif 000016
を有するメトホルミンのポリマー、Ｐｏｌｙ−ＭＥＴを対象とし、式中、ｎは、２から１００，０００または特に２から１０，０００以下の整数であり、ｐは１または２であり、Ｘは、水素または式：
【化１５】
2018513883.tif 000017
を有するメトホルミンの残基であり、ＰｏｌｙＭｅｔ中のＸのうちの少なくとも５％はメトホルミンの残基である。ただし、有用なＰｏｌｙＭｅｔは、Ｘが、Ｘの出現数のうちの少なくとも０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％でメトホルミンの残基である。
【００３７】
メトホルミンの残基がポリマーまたはデンドリマー上の第１級および第２級アミンと結合している場合、Ａ上の窒素とともにこの残基はモノメチルビグアニドであってもよく、以下の一般構造：
【化１６】
2018513883.tif 000018
を有し、式中、Ａは、ポリマー、特定の実施形態においては、デンドリマーを表す。
【００３８】
上記ＰｏｌｙＭｅｔは、ＰｏｌｙＭｅｔ中のメトホルミン残基の％ｗｔが０．００１％ｗｔ／ｗｔから９０％ｗｔ／ｗｔ超であってもよい。
【００３９】
ｎの有用な値としては、２から約１０，０００、２から約５，０００、２から約４，０００、２から約３，０００、２から約２，０００、２から約１，０００、２から約５００、２から約２５０、５０から約１０，０００、１００から約９，０００、５００から約８，０００、１，０００から約７，０００、１，５００から約６，０００、２，０００から約５，０００、および２，５００から約４，５００が挙げられる。
【００４０】
一実施形態において、本主題は、以下の化学式ＩＩ
【化１７】
2018513883.tif 000019
を有するメトホルミンのポリマー、Ｐｏｌｙ−ＭＥＴを対象とし、式中、ｐは１または２であり、ｎは２から１００，０００、特に２から１０，０００の整数である。
【００４１】
一実施形態において、本主題は、上記のとおりの化学式Ｉを有するメトホルミンの分岐ポリマー、Ｐｏｌｙ−ＭＥＴを対象とし、式中、Ｘは、水素、メトホルミンの残基、以下の化学式：
【化１８】
2018513883.tif 000020
を有するエチルアミンの残基、または以下の化学式：
【化１９】
2018513883.tif 000021
を有するプロピルアミンの残基であり、それぞれの場合において、＊Ｎ上の０個、１個または両方の水素は、ａ）エチルアミンもしくはプロピルアミンのさらなる残基（複数可）により置換され、それは、それぞれの場合において、同じ様式でさらに置換されてもよく、それにより（樹状である場合もある）ますます分岐した構造を形成し、かつ／またはｂ）メトホルミンの残基により置換されてもよく、その場合、分岐ＰＥＩ／ＰＰＩ中の第１級＊Ｎの少なくとも５％がメトホルミンの残基により置換されている。特に有用なＰｏｌｙＭｅｔは、分岐した骨格を有するＰｏｌｙＭｅｔであって、＊Ｎが、＊Ｎの出現数のうちの少なくとも約０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または約１００％でメトホルミンの残基と共有結合している、ＰｏｌｙＭｅｔである。
【００４２】
分岐ＰｏｌｙＭｅｔは、分岐ＰｏｌｙＭｅｔ中のメトホルミン残基の％ｗｔが０．００１％ｗｔ／ｗｔから約９０％ｗｔ／ｗｔであってもよい。
【００４３】
分岐ＰｏｌｙＭｅｔは、一般式ＩＩＩ：
【化２０】
2018513883.tif 000022
のものを含み、式中、各ｐは独立して１または２であり、ｎは０．１から１．０であり、ｑは０．１から１．０であり、ｍは０．１から１．０であり、ｎ、ｑおよびｍはポリマー中の各単位のモル分率を表し、ｎ、ｑおよびｍの合計は１であり、ｚは０から１，０００の整数であり、＊Ｎはメトホルミンの残基またはエチルアミンもしくはプロピルアミンにより誘導体化されてもよい窒素であり、それらのいずれもそれら自体が＊Ｎを含み、Ｘは水素またはメトホルミンの残基であり、Ｙ’およびＹ”は独立して水素、メトホルミンの残基、またはエチルアミンもしくはプロピルアミンであり、それらのいずれもそれら自体が＊Ｎを含む。
【００４４】
式ＩＩＩのポリマーおよびデンドリマーは、約１００から約６，０００，０００、約１００から約５００，０００、約２００から約２５０，０００、約２００から約２００，０００、約２００から約１００，０００、約２００から約５０，０００、約２００から約１０，０００、約２００から約５，０００、約２００から約１，０００、約２００から約８００、約２００から約７００、約２００から約６００、および約２００から約５００の分子量を有してもよい。
【００４５】
分岐ＰｏｌｙＭｅｔの非限定例としては、以下のものが挙げられ、
【化２１】
2018513883.tif 000023
式中、ｐは１または２であり、
【化２２】
2018513883.tif 000024
式中、ｐは１または２であり、それぞれの場合において、ｎは本明細書中の別の場所で記載されているとおりの整数であってもよく、Ｙは、式：
【化２３】
2018513883.tif 000025
を有するメトホルミンの残基であり、ここでは、１つの＊Ｎにおいて、Ｙ”はエチルアミンの残基またはプロピルアミンとして示されており、これは、さらに置換されてもよく、
【化２４】
2018513883.tif 000026
ここでは、１つの＊Ｎにおいて、Ｙ”はメトホルミンの残基として示されている。
【００４６】
＊Ｎのそれぞれの出現は、他のいかなる＊Ｎの出現とも無関係である。
【００４７】
たいてい、それはメトホルミン部分に誘導体化されることになる分岐ＰＥＩ中に初めに存在する第１級＊Ｎであり、これは、モノメチルビグアニドを含むことが意図される。また、分岐鎖ＰＥＩは主に表面第１級アミンを含み、第２級および第３級アミンは内部であるため、ＰｏｌｙＭｅｔは主に表面モノメチルビグアニド基を含むことができる。したがって、直鎖および分岐鎖ＰｏｌｙＭｅｔの物理的および化学的特性は、ＰＥＩ、ＰＰＩ、ポリマーまたはデンドリマーに対して利用可能な化学反応を利用して調整することができる。
【００４８】
したがって、ポリマー中に存在するメトホルミン残基の量は、骨格炭素を除外して、ポリマー全体の重量に対するメトホルミンの％ｗｔとして示すこともできる。ＰｏｌｙＭｅｔ中のメトホルミンの％ｗｔは、０．０００１％ｗｔ／ｗｔから９０％ｗｔ／ｗｔ超、少なくとも０．１％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも０．５％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも１％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも２％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも３％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも４％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも５％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも１０％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも１５％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも２０％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも２５％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも３０％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも３５％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも４０％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも４５％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも５０％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも５５％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも６０％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも６５％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも７０％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも７５％ｗｔ／ｗｔ、少なくとも８０％ｗｔ／ｗｔ、および少なくとも８５％ｗｔ／ｗｔであってもよい。
【００４９】
実施形態において、ＰｏｌｙＭｅｔは、ブロックコポリマー、例えば、ＰＥＩ−ＰＰＩ、およびペグ化ブロックコポリマーを含む。
【００５０】
実施形態において、このブロックコポリマーは、一般式：
【化２５】
2018513883.tif 000027
を有し、式中、ｘは約０．１から約０．９であり、ｙは約０．１から約０．９であり、ｘおよびｙは、ポリマー中の各単位のモル分率を表し、ｘおよびｙの合計は１であり、ＧおよびＧ’はともに、同じであっても、または異なってもよく、それぞれの場合において、
【化２６】
2018513883.tif 000028
から成る群から選択され、式中、ｐ、＊Ｎ、Ｙ’およびＹ”は上で示されるとおりであり、水素、残基またはメトホルミン、エチルアミンもしくはプロピルアミンの残基のそれぞれはエチルもしくはプロピルアミンによりさらに置換されてもよく、それは、さらに置換されてもよく、メトホルミンの残基を含んでもよく、ブロックコポリマーは、共有結合したメトホルミンの残基の％ｗｔが０．００１％ｗｔ／ｗｔから９０％ｗｔ／ｗｔ超、０．０１％ｗｔ／ｗｔから約８０％ｗｔ／ｗｔ、１．０％ｗｔ／ｗｔから約７０％ｗｔ／ｗｔ、２．０％ｗｔ／ｗｔから約６０％ｗｔ／ｗｔ、３．０％ｗｔ／ｗｔから約５０％ｗｔ／ｗｔ、４．０％ｗｔ／ｗｔから約４０％ｗｔ／ｗｔ、５．０％ｗｔ／ｗｔから約３０％ｗｔ／ｗｔ、または０．００１％を超えるが約６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％もしくは５％ｗｔ／ｗｔ未満の量である。
【００５１】
実施形態において、ＰｏｌｙＭｅｔは、誘導体化デンドリマーである。デンドリマーの表面に第１級アミノ基がある。これらの第１級アミノ基、および場合によっては第２級アミノ基も、ＰｏｌｙＭｅｔのあるタイプを調製するための上記のとおりのメトホルミンの残基によるデンドリマーの誘導体化の部位である。実施形態において、本明細書に記載されている主題は、メトホルミンの残基と共有結合したデンドリマーに窒素を含むＰｏｌｙＭｅｔを対象とする。誘導体化デンドリマーは、以下の構造：
【化２７】
2018513883.tif 000029
を有し、デンドリマーの第１級窒素の出現数のうちの少なくとも０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または約１００％で、メトホルミンの少なくとも１残基との共有結合によって誘導体化されている。上記の構造では、実施形態において、デンドリマー上のいくつかまたはすべての利用可能な第２級窒素（複数可）もメトホルミンの残基により誘導体化されてもよい。
【００５２】
一部の実施形態において、本開示の主題は、外部または表面第１級アミンを含むポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマーを提供する。これらの表面第１級アミン、およびある程度、外部の任意の第２級アミンおよび内部または表面下の任意の第１級および第２級アミンは、メトホルミン残基に誘導体化されてもよい。
【００５３】
本明細書に記載されているいずれのＰｏｌｙＭｅｔもペグ化されてよく、標的化リガンドを含んでもよい。パーセントペグ化は、ＰｏｌｙＭｅｔの約０．００１％から約５０％ｗｔ／ｗｔであってもよい。
【００５４】
ＰｏｌｙＭｅｔの特徴を試験するために、３つの製剤化を実施することができる。第１は、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）などの負に帯電した脂質を使用して（脂質・ポリカチオン・ＤＮＡ）ＬＰＤを調製することである。ＬＰＤは、過剰な正電荷を有する、すなわち、ＰｏｌｙＭｅｔからの電荷がＤＮＡまたはヒアルロン酸を超える高分子電解質コア複合体から調製されることになる。コアの周囲を包むためにＤＯＰＳリポソームがその後、添加されることになる。ただし、分岐鎖ＰｏｌｙＭｅｔは、さまざまな化学的性質を提供することができる。第２の製剤は、１，２−ジパルミトイル３−トリメチル−アンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）などの正に帯電した脂質を使用して（リポソーム・ポリカチオン・ヒアルロン酸）ＬＰＨを調製することである。ＬＰＨは、過剰な負電荷を有する、すなわち、ＤＮＡ／ｓｉＲＮＡまたはヒアルロン酸からの電荷がＰｏｌｙＭｅｔを超える高分子電解質コア複合体の最初の形成によって調製されることになる。コアの周囲を包むためにＤＯＴＡＰリポソームがその後、添加されることになる。第３の製剤、いかなる脂質コーティングもない分岐鎖ＰｏｌｙＭｅｔ／ｐＤＮＡ複合体が調製され、ポリプレックスのトランスフェクション能力を判定するために試験されてもよい。これは、分岐鎖ＰｏｌｙＭｅｔのプロトンスポンジ作用がエンドソームを溶解させ、ＤＮＡを細胞質に送達するのに十分であるかどうかを判定することができる。
【００５５】
ＰｏｌｙＭｅｔに対する有用な分子量としては、約２００から約６，０００，０００が挙げられる。ＰｏｌｙＭｅｔのサイズは、ポリマーを調製するために使用されるポリマー、ＰＥＩ、ＰＰＩなどの分子量によって特定することができる。例えば、４ｋのＭＷまたは繰り返し単位ｎ＝９３を有するＰＥＩが「ＰｏｌｙＭｅｔ９３」を調製するために使用され、これは、１２ＫのＭＷを有する。有用なＰｏｌｙＭｅｔは、約１００（０．１ｋ）から約６，０００，０００（１０００ｋ）の間のＭＷを有する。これらはまた、約０．１ｋから約５００ｋ、約０．１ｋから約３００ｋ、約１ｋから約２５０ｋ、約１ｋから約２００ｋ、約５０ｋから約１５０ｋ、約１ｋから約１２０ｋ、約１ｋから約１００ｋ、約１ｋから約８０ｋ、約１ｋから約６０ｋ、約１ｋから約５０ｋ、約１ｋから約４０ｋ、約１ｋから約３０ｋ、約１ｋから約２０ｋ  約１ｋから約１０ｋ、または約１ｋから約５ｋの特定のＭＷを含む。ポリマーの長さは、ポリマー、ＰＥＩ、ＰＰＩなどの出発材料のサイズを操作することによって、本明細書に記載される方法を使用して容易に調整することができる。出発材料としてさまざまなＭＷ（４ｋから１００ｋ）のＰＥＩを使用することによって、さまざまなＭＷのＰｏｌｙＭｅｔを系統的に合成した。
【００５６】
ＰｏｌｙＭｅｔの長さは、ＰｏｌｙＭｅｔが薬物、薬物担体（例えば、積荷送達媒体（cargo delivery vehicle））またはその両方の所望の特性を有するかどうかに対する決定要因である可能性がある。所望の用途が積荷送達媒体としてである場合、ＰｏｌｙＭｅｔの長さは積荷の任意の特定のタイプに適合させることができる。例えば、積荷がｐＤＮＡである場合、ＰｏｌｙＭｅｔのサイズをそれに応じて調整することができる。ｐＤＮＡトランスフェクションに関するさまざまなＰｏｌｙＭｅｔの能力は、ルシフェラーゼプラスミドを使用してアッセイされる。
【００５７】
実施形態において、本明細書中で開示されている主題は、共有結合したメトホルミンの残基を有するコレステロール類似体を対象とする。
【００５８】
ナノ粒子
上述のとおり、メトホルミンは、糖尿病のための第一選択の治療法である。しかしながら、その強い親水性カチオン特性が血漿からの急速なクリアランスの原因となり、有効な血漿中濃度を継続させるためには複数回の高用量が必要となる。さらに、本明細書に記載されているＰｏｌｙＭｅｔナノ粒子は、メトホルミンと比較した場合に比較的長期間、体の中を循環することができ、それにより長期間にわたって複数用量を投与する不都合を低減する。
【００５９】
しかしながら、ポリカチオン複合体は血液循環中で安定でないことが知られている（Ｃｈｏｎｏ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｓ．Ｄ．，Ｃｏｎｗｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．＆Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｌｏｗ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３１，６４−６９  （２００８））。本明細書中の別の場所に記載されているとおり、ポリ複合体の安定性を向上させるためにリポソーム外層を含むＬＰＨナノ粒子を調製した。
【００６０】
ナノ粒子は、受動的および能動的標的化の両方により、正常な細胞における毒性を防ぎながらがん細胞における薬物の細胞内濃度を高めることができる。表面がペグ化されたナノ粒子は、核酸、化学療法薬およびタンパク質を固形腫瘍および転移部位に効率的に送達することができる。ナノ粒子の表面がペグ化された実施形態において、これは、循環中におけるコロイド安定性を高め、単核食細胞系（ＭＰＳ）による非特異的取り込みを低減することができる。一部の実施形態において、これらのナノ粒子はまた、細胞取り込みを容易にするために腫瘍細胞において過剰発現するシグマ受容体を標的とするようアニスアミド（ＡＡ）により官能化される。これらのナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける性能は、生物活性化合物の腫瘍標的送達に関して特徴づけることができる。さらに、これらのナノ粒子の安全性を立証するために全身毒性を調べることができる。
【００６１】
一実施形態において、ＰｏｌｙＭｅｔは、凝集ナノ粒子として形成される。凝集ナノ粒子のサイズは、１，０００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、約５０ｎｍから約２００ｎｍ、または約１００ｎｍである。ＰｏｌｙＭｅｔ凝集ナノ粒子は、治療用薬剤または生物学的薬剤などの積荷と複合体を形成することができる。特に有用なＰｏｌｙＭｅｔナノ粒子は、ＰｏｌｙＭｅｔ／ヌクレオチド複合体、例えば、ＰｏｌｙＭｅｔ／ｐＤＮＡ複合体を含む。
【００６２】
一実施形態において、ＰｏｌｙＭｅｔは、リポソーム・ポリカチオン・ヒアルロン酸（ＬＰＨ）ナノ粒子の一部である。これらのナノ粒子は、本明細書では「ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ」と呼ぶ。この実施形態において、本明細書に記載されている主題は、
ｉ．脂質外膜、および
ｉｉ．脂質外膜によって包まれたＰｏｌｙＭｅｔ
を含むナノ粒子を対象とする。
【００６３】
ＰｏｌｙＭｅｔは、治療用薬剤または生物学的薬剤などの積荷と複合体を形成するか、またはそれと会合することができる。本明細書中で使用される場合、「複合体を形成する」または「会合する」という用語は、積荷とＰｏｌｙＭｅｔが互いに密接に接触することを意味する。
【００６４】
ＰｏｌｙＭｅｔと複合体を形成するか、またはそれと会合する特定の積荷としては、抗がん薬および生物製剤などの治療用薬剤、生物活性化合物ならびに同種のものが挙げられる。治療用薬剤としては、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリサッカライド、有機小分子および無機小分子などの生物活性化合物が挙げられる。「生物活性化合物」という用語は、天然に生じる生物活性化合物および合成の生物活性化合物の両方を包含する。「生物活性化合物」という用語は、生体分子と相互作用して、特定の生理的または病理学的事象を反映する検出可能な表示をもたらす検出または診断用薬剤を指すことができる。治療用薬剤としては、化学療法剤が挙げられる。他の実施形態において、治療用薬剤は、サイレンシング因子（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの目的とするポリヌクレオチドまたは目的とするポリペプチドである。
【００６５】
治療用薬剤が薬物である場合、以下に限定されるものではないが、抗菌剤、抗生物質、抗ミコバクテリア剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、新生物剤、免疫応答に影響を及ぼす薬剤、血中カルシウム調節因子、グルコース調節に有用な薬剤、抗凝固剤、抗血栓剤、抗高脂血症薬、心臓病の薬物、甲状腺ホルモン薬、抗甲状腺薬、アドレナリン作用薬、降圧薬、コリン作動薬、抗コリン薬、鎮痙薬、抗潰瘍薬、骨格筋および平滑筋弛緩剤、プロスタグランジン、アレルギー反応の一般的阻害剤、抗ヒスタミン剤、局所麻酔薬、鎮静剤、麻薬拮抗剤、鎮咳剤、催眠鎮静剤、抗痙攣薬、抗精神病薬、抗不安剤、抗うつ剤、食欲抑制剤、非ステロイド系抗炎症剤、ステロイド系抗炎症剤、酸化防止剤、血管作用薬、骨活性剤、抗関節炎剤、ならびに診断用薬剤が挙げられる。好ましい抗ウイルス薬としては、テノホビル、アデホビル、アシクロビルモノホスフェートおよびＬ−チミジンモノホスフェートが挙げられる。好適な実施形態において、生物活性化合物は、抗がん剤である。
【００６６】
抗がん剤または「化学療法剤」は、がんの処置において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、イソプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（trietylenephosphoramide）、トリエチイレンチオホスホルアミドおよびトリメチロロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトセシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；ペメトレキセド；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；ＴＬＫ−２８６；ＣＤＰ３２３、経口アルファ−４インテグリン阻害剤；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロスレアス、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンガンマ１ＩおよびカリケアミシンオメガＩ１（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６  （１９９４）を参照）；ジネミシンＡを含むジネミシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモホアおよび関連クロモタンパク質エンジイン抗生物質クロモホア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビ��ン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾトシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジン；抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フロリニック酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルニチン；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ユージーン、オレゴン州）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特にＴ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（アブラキサン（商標））、およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボヴィン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメトルヒルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例え��、レチノイン酸；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、および、５−ＦＵおよびロイコボヴィンと併用したオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））による処置計画の略語であるＦＯＬＦＯＸなどの上記の２つ以上の組み合わせが挙げられる。
【００６７】
化学療法剤のさらなる例としては、がんの増大を助長する可能性のあるホルモンの影響を調節、低減、阻止または阻害するよう働く抗ホルモン剤が挙げられ、全身的処置または全身処置の形態である場合が多い。それら自体がホルモンである場合もある。例としては、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））を含む抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；エストロゲン受容体アンタゴニスト、例えば、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））；卵巣を抑制または機能停止させるよう働く薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えば、ロイプロリドアセテート（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプテレリン；抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；および副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、ホルメスタニエ、ファドロゾール、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、およびアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））が挙げられる。さらに、化学療法剤のそのような定義としては、ビスホスホネート、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）もしくはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、粘着細胞増殖に関わるシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；抗エストロゲン、例えば、フルベストラント；ＥＧＦＲ阻害剤、例えば、エルロチニブもしくはセツキシマブ；抗ＶＥＧＦ阻害剤、例えば、ベバシズマブ；アリノテカン；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；１７ＡＡＧ（熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）９０毒であるゲルダナマイシン誘導体）、および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【００６８】
特定の抗がん剤としては、ラパマイシン、シスプラチンおよびその類似体、エトポシドモノホスフェート、アレンドロネート、パミドロネート、およびゲムシタビンモノホスフェートならびにそれらの塩、エステル、配座異性体およびプロドラッグが挙げられる。
【００６９】
本ナノ粒子は、リポソーム中に包まれたヒアルロン酸および／または核酸をさらに含んでもよく、任意にその中のＰｏｌｙＭｅｔと複合体を形成する。
【００７０】
「脂質外膜」は、脂質、特に、カチオン性脂質を含むほとんど連続的な層である。脂質外膜は、標的化リガンドおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含んでもよい。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、「脂質」という用語は、親油性または両親媒性の特性を有する有機化合物のグループのメンバーを指し、脂肪、脂肪油、精油、ワックス、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、硫脂質、アミノ脂質、色素脂質（リポクローム）、および脂肪酸を含むが、それらに限定されるものではない。「脂質」という用語は、天然に生じる脂質および合成的に生成される脂質の両方を包含する。特定の脂質としては、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＳおよびコレステロールが挙げられる。
【００７２】
脂質としては、カチオン性脂質を挙げることができる。本明細書中で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、生理的なｐＨにおいて正味の正電荷をもつ多くの任意の脂質化学種を包含し、これは、当業者に既知の任意の方法を使用して判定することができる。そのような脂質としては、２００９年５月１日に出願され、その全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ」という名称の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４２４７６号に開示されている式（Ｉ）のカチオン性脂質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらとしては、Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（アルギノイルアミノ）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミニウムクロリドまたはジステアロイルアルギニルアンモニウムクロリド］（ＤＳＡＡ）、Ｎ，Ｎ−ジミリストイル−Ｎ−メチル−Ｎ−２［Ｎ’−（Ｎ６−グアニジノ−Ｌ−リジニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド（ＤＭＧＬＡ）、Ｎ，Ｎ−ジ−ミリストイル−Ｎ−メチル−Ｎ−２［Ｎ２−グアニジノ−Ｌ−リジニル］アミノエチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジミリストイル−Ｎ−メチル−Ｎ−２［Ｎ’−（Ｎ２，Ｎ６−ジ−グアニジノ−Ｌ−リジニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド、およびＮ，Ｎ−ジ−ステアロイル−Ｎ−メチル−Ｎ−２［Ｎ’−（Ｎ６−グアニジノ−Ｌ−リジニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド（ＤＳＧＬＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。存在してもよいカチオン性脂質のその他の非限定例としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）またはその他のＮ−（Ｎ，Ｎ−１−ジアルコキシ）−アルキル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−三置換アンモニウム界面活性剤；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；１，３−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ；ＤＭＤＨＰ；３−β［４Ｎ−（１Ｎ，８Ｎ−ジグアニジノスペルミジン）−カルバモイル］コレステロール（ＢＧＳＣ）；３−β［Ｎ，Ｎ−ジグアニジノエチル−アミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＢＧＴＣ）；Ｎ，Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３テトラ−メチルテトラパルミチルスペルミン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）；Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシル−アミノプロピオン−アミジン（ＣＬＯＮ��ｅｃｔｉｎ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；４−（２，３−ビス−パルミトイルオキシ−プロピル）−１−メチル−１Ｈ−イミダゾール（ＤＰＩＭ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムヨージド）（Ｔｆｘ−５０）；トリメチルアンモニウム基がブタノールスペーサーアームを介して二本鎖（ＤＯＴＢに関して）またはコレステリル基（ＣｈＯＴＢに関して）のいずれかに連結される１，２ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノール−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＢＴ）またはコレステリル（４’トリメチルアンモニア）ブタノエート（ＣｈＯＴＢ）；その全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする国際出願公開第ＷＯ９３／０３７０９号に開示されているＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩ）もしくはＤＬ−１，２−Ｏ−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩＥ）またはその類似体；１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）；コレステリルヘミスクシネートエステル（ＣｈＯＳＣ）；リポポリアミン、例えば、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）またはその全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする米国特許第５，２８３，１８５号に開示されているカチオン性脂質；コレステリル−３β−カルボキシル−アミド−エチレントリメチルアンモニウムヨージド；１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリルカルボキシレートヨージド；コレステリル−３−β−カルボキシアミドエチレンアミン；コレステリル−３−β−オキシスクシンアミド−エチレントリメチルアンモニウムヨージド；１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリル−３−β−オキシスクシネートヨージド；２−（２−トリメチルアンモニオ）−エチルメチルアミノエチル−コレステリル−３−β−オキシスクシネートヨージド；および３−β−Ｎ−（ポリエチレンイミン）−カルバモイルコレステロールが挙げられる。
【００７３】
脂質は、負に帯電した、または中性の共脂質を含んでもよい。本明細書中で使用される場合、「共脂質」とは、中性脂質（荷電していない）またはアニオン性脂質を含む非カチオン性脂質を指す。「中性脂質」という用語は、生理的なｐＨにおいて無荷電、または中性の双性イオンのいずれかの形態で存在する多くの脂質化学種のうちのいずれかを指す。「アニオン性脂質」という用語は、生理的なｐＨにおいて正味の負電荷をもつ多くの脂質化学種のいずれかを包含する。共脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロール、リン脂質関連材料、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、ホスファチジン酸、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレエート、ヘキサデシルステレエート、イソプロピルミリステート、両性アクリル系ポリマー、トリエタノールアミン−ラウリルスルフェート、アルキル−アリールスルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、リゾホスファチジルコリン、およびジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミドならびに同種のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。共脂質としては、その全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする米国特許第５，８２０，８７３号に記載されているとおりのリン脂質またはセラミドとコンジュゲートしたＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００およびポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコールベースのポリマーも挙げることができる。
【００７４】
遊離型リン酸基を有する両親媒性脂質は、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）であることが好ましい。
【００７５】
ナノ粒子の表面は、ペグ化されてもよい。「ポリマー・ＰＥＧコンジュゲート」という用語はまた、これらのポリマー・ＰＥＧ・標的化リガンドコンジュゲートおよびポリマー・ＰＥＧ・標的化リガンドコンジュゲートを含むナノ粒子も指す。ペグ化は、細網内皮系（ＲＥＳ）によるナノ粒子のクリアランスを低減することによって循環半減期を長くする。
【００７６】
そうした実施形態のいくつかにおいて、表面は、表面の約４ｍｏｌ％から約１５ｍｏｌ％の濃度でポリマー・ＰＥＧコンジュゲートを含み、約４ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、約９ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、約１１ｍｏｌ％、約１２ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％、約１４ｍｏｌ％、および約１５ｍｏｌ％のＰＥＧを含むが、それらに限定されるものではない。ＰＥＧのさらに高いパーセンテージ値（ｍｏｌ％で表される）も有用なことがわかった。有用なｍｏｌ％値としては、約１２ｍｏｌ％から約５０ｍｏｌ％のｍｏｌ％値が挙げられる。この値は、約１５ｍｏｌ％から約４０ｍｏｌ％であるのが好ましい。約１５ｍｏｌ％から約３５ｍｏｌ％の値も好ましい。最も好ましい値は、約２０ｍｏｌ％から約２５ｍｏｌ％、例えば、２３ｍｏｌ％である。
【００７７】
脂質・ＰＥＧコンジュゲートのポリエチレングリコール部分は、以下に限定されるものではないが約１００ｇ／ｍｏｌ、約２００ｇ／ｍｏｌ、約３００ｇ／ｍｏｌ、約４００ｇ／ｍｏｌ、約５００ｇ／ｍｏｌ、約６００ｇ／ｍｏｌ、約７００ｇ／ｍｏｌ、約８００ｇ／ｍｏｌ、約９００ｇ／ｍｏｌ、約１０００ｇ／ｍｏｌ、約５０００ｇ／ｍｏｌ、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ、約１５，０００ｇ／ｍｏｌ、および約２０，０００ｇ／ｍｏｌを含む約１００から約２０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有してもよい。一部の実施形態において、脂質・ＰＥＧコンジュゲートは、約２０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧ分子を含む。特定の実施形態において、脂質・ＰＥＧコンジュゲートは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む。
【００７８】
一部の実施形態において、表面は、標的化リガンドを含み、それにより標的化ナノ粒子を形成する。「標的化リガンド」とは、標的とする細胞または組織と物理的に会合した分子または複合体を標的とする分子を意図とする。本明細書中で使用される場合、「物理的に会合した」という用語は、２つの分子間の共有結合性、または非共有結合性相互作用のいずれかを指す。
【００７９】
標的化リガンドとしては、小分子、ペプチド、脂質、砂糖、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体またはそのフラグメント、特定の膜受容体リガンド、抗リガンドと反応することができるリガンド、融合ペプチド、核局在ペプチド、またはそのような化合物の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。標的化リガンドの非限定例としては、アシアロ糖タンパク質、インスリン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、葉酸、ベンズアミド誘導体、アルギニン−グリシン−アスパルテート（ＲＧＤ）配列を含むペプチド、および細胞表面分子に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が挙げられる。一部の実施形態において、小分子は、ベンズアミド誘導体を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ベンズアミド誘導体は、アニスアミドを含む。
【００８０】
一部の標的化リガンドは、表面と標的化リガンドとの間に介在分子を含み、これは、表面および標的化リガンドの両方に共有結合する。これらの実施形態のいくつかにおいて、介在分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００８１】
「標的とする細胞」とは、標的化リガンドが物理的に会合した分子または複合体をリクルートする細胞が意図される。標的化リガンドは、標的細胞の１つ以上の成分と相互作用することができる。標的とする細胞は、さまざまな表現型を示すいかなる細胞タイプまたはいかなる発生段階であってもよく、さまざまな病理学的状態（すなわち、異常な状態および正常な状態）であってもよい。例えば、標的化リガンドは、微生物（すなわち、原核細胞（細菌）、ウイルス、真菌、原虫もしくは寄生生物）上または真核細胞（例えば、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、知覚細胞、がん細胞、分泌細胞、悪性細胞、赤血球細胞、リンパ様細胞、幹細胞）上の正常な成分、異常な成分、および／または固有の成分と会合することができる。したがって、標的化リガンドは、例えば、腫瘍関連抗原および自己免疫疾患関連抗原を含む疾患関連抗原である標的細胞上の成分と会合することができる。そのような疾患関連抗原としては、例えば、増殖因子受容体、細胞周期制御因子、血管新生因子、およびシグナル伝達因子が挙げられる。
【００８２】
一部の実施形態において、標的化リガンドは、標的とする細胞上の細胞表面タンパク質と相互作用する。これらの実施形態のいくつかにおいて、標的化リガンドと結合することができる細胞表面タンパク質の発現レベルは、その他の細胞と比較して標的とする細胞においてより高い。例えば、がん細胞は、ＨＥＲ２受容体（乳がん）またはシグマ受容体などの特定の細胞表面分子を過剰発現する。標的化リガンドがアニスアミドなどのベンズアミド誘導体を含む特定の実施形態において、標的化リガンドは、会合したナノ粒子をシグマ受容体過剰発現細胞へと標的化する。シグマ受容体過剰発現細胞としては、これらに限定されるものではないが、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腎癌、結腸癌、肉腫、乳がん、メラノーマ、膠芽腫、神経芽腫、および前立腺がんなどのがん細胞を挙げることができる（Ａｙｄａｒ，Ｐａｌｍｅｒ，ａｎｄ  Ｄｊａｍｇｏｚ  （２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：５０２９−５０３５）。
【００８３】
ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔナノ粒子は、積荷を細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて）、生理的部位、または組織に送達することができる限り、いかなるサイズであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、約１０００ｎｍ未満の少なくとも１つの寸法を有する任意の形状の粒子を指す。一部の実施形態において、ナノ粒子は、１ｎｍから１０００ｎｍの間の任意の整数値を含む（約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、および１０００を含む）約１ｎｍから約１０００ｎｍの範囲の少なくとも１つの寸法を有する。特定の実施形態において、ナノ粒子は、約１５０ｎｍの少なくとも１つの寸法を有する。球状ナノ粒子は、以下に限定されるものではないが、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００ｎｍを含む約１００ｎｍ未満の直径を有してもよい。特定の実施形態において、ナノ粒子は、約５０ｎｍ未満の直径を有する。特定の実施形態において、ナノ粒子は、約４０ｎｍから約５０ｎｍの間の直径を有する。
【００８４】
特に、ナノ粒子の直径が１００ｎｍ未満である一部の実施形態において、ナノ粒子は、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて中枢神経系へ、または胎盤関門を越えて生物活性化合物を送達するために使用することができる。ＢＢＢを標的とするために使用することができる標的化リガンドの非限定例としては、運搬およびラクトフェリンが挙げられる（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９（２）：２３８−２４６、その全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする）。さらに、ナノ粒子は、血管内皮を越えて骨格筋細胞および心筋細胞の両方へ経細胞輸送することができる。例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するためにエクソン・スキッピングオリゴヌクレオチドを送達することができる（Ｍｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１７５：５５−６０、その全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする）。
【００８５】
粒子サイズは、以下に限定されるものではないが、沈降場流動分画法、光子相関分光法、ディスク型遠心分離、および動的光散乱（例えば、サンタバーバラ、カリフォルニア州のＡｕｔｏｄｉｌｕｔｅＰＡＴ  Ｍｏｄｅｌ  ３７０からのＮＩＣＯＭＰ粒度分布測定システムなどのサブミクロン粒子寸法測定器を使用する）を含む当該技術分野において既知の任意の方法を使用して測定することができる。
【００８６】
特定の実施形態において、本明細書に記載されているナノ粒子は、約−２０ｍＶから＋２０ｍＶのゼータ電位を有してもよい。一部の実施形態において、ナノ粒子は、−１０ｍＶ未満のゼータ電位を有し、特定の実施形態において、ゼータ電位は、以下に限定されるものではないが、約＋１４ｍＶ、約＋１５ｍＶ、約＋１６ｍＶ、約＋１７ｍＶ、約＋１８ｍＶ、約＋１９ｍＶ、および約＋２０ｍＶを含む約＋１０ｍＶから約＋２０ｍＶである。
【００８７】
本明細書に記載されているナノ粒子は、自己集合性、実質的に球状ベシクルであってもよい。ナノ粒子は、ＰｏｌｙＭｅｔに加えて１つ以上の異なるポリマーをさらに含んでもよい。有用なポリマーとしては、生体適合性の既知のポリマーが挙げられる。「生体適合性の」という用語は、本明細書中では当該技術分野において製薬的用途に適切であるポリマーを述べるために使用されるとおりに使用される。生体適合性ポリマーは、分解し、時間とともに体に吸収される生体吸収性ポリマーであってもよい。
【００８８】
ポリマーとは、重合によって形成される化学的化合物または化合物の混合物を指し、本質的に繰り返しの構造単位から成る。有用なポリマーは、ナノ粒子を形成することができるｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて使用される合成材料であってもよく、生物系と相互作用することが意図される。これらには、（参照によって本明細書に組み込んだものとする）米国特許第５，５１４，３７８号において教示されているものが含まれるが、それらに限定されるものではない。生分解性コポリマーも記載されており、脂肪族ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリアルファ−アミノ酸、ポリホスファゲン、およびポリアルキルシアノアクリレートを含む。脂肪族ポリエステルの中で、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）およびポリラクチドグリコリド（ＰＬＧＡ）。生分解性ポリマーとしては、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（ＤＬ−乳酸）（ＰＬＡ）、およびポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などの乳酸ポリマーが挙げられる。ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）のコモノマー（ラクチド：グリコリド）比は、好ましくは１００：０から５０：５０の間である。コモノマー比は、８５：１５（ＰＬＧＡ  ８５：１５）から５０：５０（ＰＬＧＡ  ５０：５０）の間が最も好ましい。好ましくは、ＰＬＧＡ  ８５：１５およびＰＬＧＡ  ５０：５０のＰＬＬＡのＰＬＧＡとのブレンドが使用されてもよい。特に有用なポリマーは、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）である。
【００８９】
メトホルミンは、抗腫瘍有効性を有する（Ｍｏｒａｌｅｓ；Ｋｉｓｆａｌｖｉ，Ｋ．，Ｍｏｒｏ，Ａ．，Ｓｉｎｎｅｔｔ−Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．，Ｅｉｂｌ，Ｇ．＆Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ，Ｅ．Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｐａｎｃｒｅａｓ  ４２，７８１−７８５  （２０１３））。ＰｏｌｙＭｅｔを含むＬＰＨナノ粒子（ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ）は、腫瘍増大を相乗的に抑制することができる。本明細書において、Ｈ４６０異種移植片におけるＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔおよびさまざまなナノ粒子の効果の研究が提示される。
【００９０】
図６に示されるとおり、メトホルミンまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔによる処置は、ＰＢＳ群およびＬＰＨ−ＰＥＩ群と比較してがん進行の大幅な抑制につながった。これは、主に遊離型またはポリマー型のいずれかのメトホルミンの抗腫瘍有効性によるものであった。重要なことに、ＩＶ注射のためのメトホルミンおよびＰｏｌｙＭｅｔの用量は０．４ｍｇ／ｋｇ体重であり、これはＩＶ投与経路により使用された以前の研究よりも実質的に少ない（Ｓｈｉ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ／ＡＭＰＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｖｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ３  （２０１２））。しかしながら、以前の報告は、低用量メトホルミンが腫瘍増大を十分に抑制することができることを示した（Ｈｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｖａｒｉａｎ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｎｏｎ−ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ｏｒ  ＳＮ−３８  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＦＯＸＯ３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ４  （２０１４）；Ｇｏｕ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｗ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  ＣＤ１３３（＋）  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｖｅ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８  （２０１３））。ＬＰＨ−ＰＥＩとＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔの間で腫瘍増大抑制の顕著な差が観察され（図６）、このことは、ＰｏｌｙＭｅｔが抗腫瘍活性を高めるのに重要な役割を果たすことを示唆する。最後の処置後、ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔで処置された異種移植片の腫瘍サイズは全体重の１％未満であり、これは、ＬＰＨ−ＰＥＩ群（４％）およびＰＢＳ（６％）群よりも大幅に小さかった（図６Ｂ）。
【００９１】
血液学、血清化学または主な組織（図５）において毒性は観察されなかった。メトホルミンの阻害が、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化することおよび哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）経路を阻害することによってがん生存能力に影響をもたらすことが以前に報告された（Ｄｏｗｌｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．，Ｚａｋｉｋｈａｎｉ，Ｍ．，Ｆａｎｔｕｓ，Ｉ．Ｇ．，Ｐｏｌｌａｋ，Ｍ．＆Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７，１０８０４−１０８１２  （２００７）；Ｙｕｅ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｓ．，ＤｉＰａｏｌａ，Ｒ．Ｓ．＆Ｔａｎ，Ｘ．Ｌ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ａｎｄ  ａｓｐｉｒｉｎ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＡＭＰＫ−ｍＴＯＲ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７，３８８−３９７  （２０１４））。ＰｏｌｙＭｅｔは、がん抑制に対して同じメカニズムを有する可能性がある。ＡＭＰＫは、グルコースおよび脂質代謝を制御する代謝性腫瘍抑制因子として働く（ＬｅＲｏｉｔｈ，Ｄ．Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：ｆｒｏｍ  ｂａｓｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；２０１２）。多くの場合、ＡＭＰＫのリン酸化のレベルが低いことが、処置後の不良な予後と相関関係にある（Ｚｕｌａｔｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ＡＭＰＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｔａｇｅ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｌｕｓ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  １１１，２５−３２  （２０１４）。
【００９２】
メトホルミンおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔによる処置後、ＡＭＰＫαのリン酸化レベルがそれぞれＰＢＳ群よりも約９倍および１２倍持続的に向上したことが観察され、これは、ＡＭＰＫ活性の刺激を示す（図７Ａ）。しかしながら、ＬＰＨ−ＰＥＩ群ではＡＭＰＫαの活性化が起こらなかった。これは、ナノ粒子中のＰｏｌｙＭｅｔが重要な因子であり、ＡＭＰＫα経路を活性化する可能性があることを示唆する。ｍＴＯＲは、ＡＭＰＫの下流エフェクターである（Ｋｉｍｕｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  （ＡＭＰＫ）  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  （ｍＴＯＲ）  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ８，６５−７９  （２００３）。ＡＭＰＫ活性化は、ｍＴＯＲおよびその下流エフェクターキナーゼを阻害する（Ｂｏｌｓｔｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｃｒｏｚｉｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｉｍｂａｌｌ，Ｓ．Ｒ．＆Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｓ．ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  （ｍＴＯＲ）  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，２３９７７−２３９８０  （２００２））。
【００９３】
ｍＴＯＲのリン酸化は、がん細胞の増殖および生存において中心的な役割を果たす（Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ｍＴＯＲ  ｐｌａｙｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ３，３２３０  （２０１３））。ゆえに、ｍＴＯＲの活性に対するメトホルミンおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔの効果（図７Ａ）を評価した。メトホルミンおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ処置は、それぞれＰＢＳおよびＬＰＨ−ＰＥＩと比較してｐ−ｍＴＯＲ／ｍＴＯＲレベルの２．３倍および２．９倍の低下によって示されたｍＴＯＲ活性の大幅な阻害につながった。
【００９４】
がん増大の抑制をもたらすメトホルミンの潜在的毒性メカニズムとしてオートファジーが認識される（Ｔｏｍｉｃ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ２  （２０１１）；Ｆｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｓｔａｔ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ５  （２０１４））。ゆえに、本発明者らは、ＰｏｌｙＭｅｔの処置後にオートファジーも観察することができるかどうかを評価した。微小管結合タンパク質軽鎖３ｂ（ＬＣ３ｂ）は、オートファジー開始に特異的なマーカーである（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ，Ｔ．＆Ｌｅｖｉｎｅ，Ｂ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｅｌｌ  １４０，３１３−３２６  （２０１０））。図７Ｂに示されるとおり、メトホルミンおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ処置された腫瘍は、その他の群よりも高い、ＬＣ３ｂに付随する赤い蛍光を示し、このことは、メトホルミンおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔが、肺異種移植片においてオートファジーを誘導する可能性があることを示す。
【００９５】
次に、処置後の抗腫瘍効果のメカニズムをＴＵＮＥＬアッセイによりアッセイした（図７Ｂ）。メトホルミンおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ処置後のアポトーシス細胞のパーセントは、それぞれ１８．８％および３２．３％であった一方で、その他の群では顕著なアポトーシス誘導は観察されなかった。これは、遊離型またはポリマー型のメトホルミンが、細胞のアポトーシスを誘導する可能性があり、がん細胞生存を制御する際に重要な役割を果たすことを示唆する。要約すると、Ｈ４６０肺がん発症のメトホルミンおよびＰｏｌｙＭｅｔの両方の抑制には、オートファジーおよびアポトーシスメカニズムの両方が関係していた。
【００９６】
処置の方法
一実施形態において、本主題は、ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔを対象に投与することによって疾患を処置する方法を対象とする。これらの実施形態において、本方法は、所望の処置効果を達成するために処置を必要とする対象に有効量のＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔを投与するステップを含んでもよい。
【００９７】
処置される疾患または望ましくない状態は、治療的に処置され得るあらゆるタイプの状態または疾患を包含することができる。特に、これらの実施形態において、処置される疾患は、代謝障害、遺伝障害および／またはがんであってもよい。一部の実施形態において、処置される疾患または望ましくない状態は糖尿病である。一部の実施形態において、処置される疾患または望ましくない状態はがんである。
【００９８】
本明細書中の別の場所に記載されているとおり、「がん」という用語は、あらゆるタイプの未制御の細胞増殖を包含し、がんのすべての形態を含む。一部の実施形態において、処置されるがんは転移性がんである。特に、がんは、既知の療法に耐性のあるものであってもよい。がんの増大または進行の抑制を検出するための方法は当該技術分野において知られており、サイズの縮小を検出するための原発性腫瘍のサイズ、二次腫瘍の出現の遅延、二次腫瘍のゆっくりとした成長、二次腫瘍の生成の低減、および疾患の二次的影響の重症度の遅延または低減を測定することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
したがって、一部の実施形態において、ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔは、がん細胞を標的としている。「がん」または「がん性の」という用語は、未制御の細胞増殖によって一般に特徴づけられる哺乳動物における生理的状態を指すか、またはそれを述べる。がん性の細胞は、局所浸潤および／または非隣接部位への転移の可能性がある場合がある。「がん」という用語は、すべてタイプのがんを包含し、すべての形態の癌、メラノーマ、肉腫、リンパ腫および白血病を含むが、それらに限定されるものではなく、膀胱癌、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、子宮内膜がん、肝細胞癌、喉頭がん、肺がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、腎癌、甲状腺がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、上衣腫、ユーイング肉腫、膠芽腫、髄芽腫、神経芽腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、ラブドイドがん、および腎芽腫（ウィルムス腫瘍）を含むが、それらに限定されるものではない。
【０１００】
任意にさらなる治療用薬剤を含むＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔは、対象の疾患または望ましくない状態の処置に使用することができ、その生物活性化合物は、発現されるか、または細胞に導入されると疾患または望ましくない状態に対して治療活性を有する。生物活性化合物は、対象に治療有効量で投与される。生物活性化合物がポリヌクレオチドを含むそれらの実施形態において、目的とするポリヌクレオチドが対象に治療有効量で投与されると、目的とするポリヌクレオチドまたはそれによってコードされるポリペプチドは、疾患または望ましくない状態を処置することができる。
【０１０１】
当業者にＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔは、単独で、または外科的療法、放射線療法、もしくは薬物などのあらゆるタイプの治療用薬剤による処置を含むが、それらに限定されるものではないその他の治療的様式と併せて使用することができることが理解されるであろう。対象ががんに苦しめられているそれらの実施形態において、ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔは、当該技術分野において周知の任意の化学療法剤と組み合わせて送達されてもよい。
【０１０２】
生物活性化合物を言及する場合の「治療活性」とは、分子が、それを必要とする対象に投与されたとき、所望の薬理学的または生理的効果を引き出すことができることが意図される。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、「処置」または「予防」という用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、特定の感染症もしくは疾患またはその徴候もしくは症状を完全にまたは部分的に予防することに関して予防的であってもよく、かつ／あるいは感染症もしくは疾患および／または感染症もしくは疾患に起因する有害な影響の部分的または完全な回復に関して治療的であってもよい。それに応じて、本方法は、本発明の組成物を与えられる対象の疾患または障害の不利益な影響を「予防する」（すなわち、遅延させる、もしくは阻害する）かつ／または「低減する」（すなわち、減少させる、遅らせる、もしくは回復させる）。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、「対象」は、任意の動物であってよく、ヒトなどの哺乳動物を含み、以下に限定されるものではないが、ネコ科もしくはイヌ科対象などの飼育動物、以下に限定されないウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタ対象などの家畜、（野生の状態であろうが動物園においてであろうが）野生動物、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなど研究動物、ニワトリ、シチメンチョウ、鳴禽などの鳥類、すなわち、獣医学的医療用途のものを含む。疾患または望ましくない状態に対して処置を必要とする対象は、そのような疾患または状態の症状を示すヒト、疾患または状態と診断された対象、その寛解にある対象、またはそれを発症するリスクが高い対象（例えば、遺伝的素因、特定の食物または環境への曝露）であってもよい。
【０１０５】
「有効量」は、特定の障害の測定可能な改善または予防をもたらすために必要とされる少なくとも最小濃度である。本明細書において有効量は、疾患状態、患者の年齢、性別、および体重、ならびに対象において所望の応答を生じさせる抗体の能力などの要因により変化することもある。したがって、対象に投与される投与量は、投与の方法および部位、患者の年齢、体重および状態を含む多くの他の要因により決まることになる。当業者は、所与のタイプの投与のため、所与の患者および所与の治療的適用のための投与量を容易に調節することができる。
【０１０６】
有効量はまた、治療的に有益な効果が処置のあらゆる毒作用または不利益な影響より勝っている量である。予防的使用に有益な結果または所望の結果としては、疾患の生化学的、組織学的および／または行動学的症状、その合併症および疾患の発症中に示す中間の病理学的表現型を含む疾患の発症のリスクを排除もしくは低減すること、重症度を減じること、または遅延させることなどの結果が挙げられる。治療的使用に有益な結果または所望の結果としては、疾患の進行を標的とすること、遅延させること、および／または生存期間を延長することなどにより、疾患の結果として生じる１つ以上の症状を低減すること、疾患に悩まされている個体の生活の質を高めること、疾患を処置するために必要とされる他の薬物の用量を低減すること、別の薬物の効果を向上させることなどの臨床的結果が挙げられる。がんまたは腫瘍の場合、有効量の薬物は、がん細胞の数を低減すること、腫瘍サイズを低減すること、末梢器官へのがん細胞の浸潤を抑制する（すなわち、ある程度遅らせるか、または望ましくは止める）こと、腫瘍転移を抑制する（すなわち、ある程度遅らせ、望ましくは止める）こと、腫瘍増大をある程度抑制すること、および／または障害に関連する１つ以上の症状をある程度軽減することに効果を有してもよい。有効量は、１回以上の投与で投与されてもよい。薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、直接的または間接的のいずれかで予防的処置、または治療的処置を成し遂げるのに十分な量である。臨床的状況において理解されるとおり、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて達成されてもよく、またはそうでなくてもよい。したがって、「有効量」は、１つ以上の他の薬剤と併せて、望ましい結果が達成される可能性があるか、または達成される場合、１つ以上の治療用薬剤を投与することと関連して考慮されてもよく、単剤が有効量で投与されることが考慮されてもよい。
【０１０７】
一部の実施形態において、ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔは、以下に限定されるものではないが約０．００１μｇ／ｋｇ、０．０１μｇ／ｋｇ、０．０５μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ；５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、および２００ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇから０．９ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇから０．７ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇを含む約０．００１μｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの間の用量で対象に投与される。
【０１０８】
ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔが生物製剤の積荷を有する実施形態のいくつかにおいて、これらは、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの間の用量で対象に投与されてもよく、以下に限定されるものではないが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、および２５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇから０．９ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇから０．７ｍｇ／ｋｇ、および０．３ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇを含む。
【０１０９】
一実施形態において、本明細書に記載されている主題は、積荷を対象の体内の標的に送達する方法を対象とする。本方法は、ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔと会合した積荷を対象に投与するステップを含み、積荷は、ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔによって対象の体内の標的に送達される。積荷は、本明細書中の別の場所に記載されているとおりの治療用薬剤であってもよい。この実施形態において、本方法は、積荷と複合体を形成した、またはそれと会合したＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔを対象に投与するステップを含み、ＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔは、対象の体内の標的に積荷を提供する。
【０１１０】
トランスフェクションのための方法およびキット
本明細書に記載されているＰｏｌｙＭｅｔおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔは、細胞の遺伝物質を改変するためのトランスフェクション剤として使用することができる。遺伝物質を細胞に送達し、それにより、細胞の遺伝物質を改変することができるように、外来性の遺伝物質をＰｏｌｙＭｅｔおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔと複合体を形成させるか、またはそれと会合させてもよい。それゆえに、本明細書に記載されているＰｏｌｙＭｅｔおよびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔは、細胞にトランスフェクションするために有用である。
【０１１１】
一実施形態において、本明細書に記載されている主題は、細胞の遺伝物質を改変する方法であって、細胞を外来性の遺伝物質と複合体を形成したか、またはそれと会合したＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔと接触させるステップを含み、細胞の遺伝物質が改変される、方法を対象とする。「外来性の遺伝物質」という用語は、細胞の外から送達されるあらゆる遺伝物質を指す。
【０１１２】
この実施形態において、細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、植物細胞または原核細胞であってもよい。特定の細胞としては、初代細胞培養物、継代細胞培養物または細胞株、ヒト細胞株、動物細胞株、および線維芽細胞が挙げられる。
【０１１３】
遺伝物質は、核酸であってもよい。本発明は、真核細胞、特に、高等真核細胞に核酸をトランスフェクションするための組成物および方法を提供する。ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の核酸は、それらの生物学的機能を保持するように細胞に導入される。本発明の方法によってトランスフェクションすることができる核酸は、天然ベースまたは非天然ベースを含む任意の供給源からの任意のサイズのＤＮＡおよびＲＮＡを含み、細胞において治療タンパク質または別の有用なタンパク質をコードし、発現させることができるもの、細胞における核酸の望ましくない発現を阻害するもの、望ましくない酵素活性を阻害するか、または所望の酵素を活性化するもの、反応を触媒するもの（リボザイム）、および診断用アッセイにおいて機能するもの（例えば、診断用核酸）が挙げられる。治療効果のある核酸としては、治療上有用なタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドをコードするか、または細胞においてそれらを発現することができる核酸、細胞において核酸の望ましくない発現を阻害するもの、および細胞において望ましくない酵素活性を阻害するか、または所望の酵素を活性化するものが挙げられる。
【０１１４】
ＬＰＨ製剤におけるｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効果を判定した。Ｈ４６０／Ｌｕｃ細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を安定にトランスフェクションされた細胞である。ＬＰＨ−ＰＥＩ−ｓｉＬｕｃ製剤およびＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ−ｓｉＬｕｃ製剤として製剤化されたｓｉＲＮＡは、同様の粒子サイズ（およそ８０ｎｍ）およびゼータ電位（およそ＋２０ｍＶ）を有していた。図８に示したとおり、リポフェクタミンと同様に、ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ−ｓｉＬｕｃは、６０ｎＭと少ないｓｉＲＮＡでサイレンシングされた遺伝子発現が５０％に達したが、ＬＰＨ−ＰＥＩ−ｓｉＬｕｃは約１０％のサイレンスにしか達しなかった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰｏｌｙＭｅｔナノ粒子を用いたそのような効率的なｓｉＲＮＡサイレンシングは極めて望ましい。
【０１１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて遺伝子物質を送達するＰｏｌｙＭｅｔの性能を判定した。ＰｏｌｙＭｅｔは、場合によっては多くのｓｉＲＮＡを送達することができるが、この試験ではＢＣＬ−２  ｓｉＲＮＡを例示的遺伝子の１つとして選択した。抗アポトーシス性タンパク質であるＢＣＬ−２は細胞の生存を助長するため、ＢＣＬ−２の阻害は標準的な療法に対するがん細胞の感受性を高める（Ｔａｂｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｂｃｌ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ３４，３１３−３１９  （２００９））。処置後のＢＣＬ−２の生物学的活性のレベルを、ウエスタンブロットによって検出した（図８Ｂ）。ＬＰＨ−ＰｏｌｙＥＭＴ−ｓｉＢＣＬ２では、すべての他の群と比較して増強されたＢＣＬ−２レベルのダウンレギュレーションが起き、腫瘍増大の確固とした持続的抑制をもたらした（図８Ｃ）。ＴＵＮＥＬアッセイは、腫瘍においてアポトーシス細胞の誘導をさらに確認した。ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ−ｓｉＢＣＬ２処置後のＴＵＮＥＬ−陽性アポトーシス細胞の数は約７０％であり、これは、他のすべての群よりも著しく高かった（図８Ｄ）。これは、ＢＣＬ２発現のダウンレギュレーション後にアポトーシスが増大することを示す。
【０１１６】
重要なことに、ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ−ｓｉＣｔｒｌは、ＰＢＳまたはＬＰＨ−ＰＥＩ−ｓｉＣｔｒｌと比較して著しく高い腫瘍抑制を示したことも確認され、これは、ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔナノ粒子で観察された結果を確認するものであった（図６）。
【０１１７】
血管形成を引き起こす助けをする血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を抑制するよう設計したｓｉＲＮＡも調査した。ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ−ｓｉＶＥＧＦ処置時に腫瘍増大が著しく弱められ、ＶＥＧＦのレベルが劇的に低下した（図９）。
【０１１８】
ｐＤＮＡトランスフェクションに関するさまざまなＰｏｌｙＭｅｔの能力を、ルシフェラーゼプラスミドを使用してアッセイし、図１０は、さまざまなＮ／Ｐ比のポリプレックスのトランスフェクション効率および細胞毒性を示す。０．５から１５のＮ／Ｐ範囲において、ＰｏｌｙＭｅｔの相対発光単位（ＲＬＵ）値は、８の最適なＮ／Ｐ比で一般的なベル状の外形を示した。この比では、ＰｏｌｙＭｅｔ１００ｋ／ｐＤＮＡ複合体が、他のすべての薬剤と比較して最も高いトランスフェクション能力を有し、従来のトランスフェクション剤であるリポフェクタミンよりも１．５倍も高かった。本発明者らの以前の研究では、ｓｉＲＮＡおよびｐＤＮＡのための薬物担体としてプロタミンを使用している。しかしながら、図１０に示されるとおり、プロタミンは、トランスフェクションの有効性を促進しなかった。
【０１１９】
本明細書中の別の場所に記載されているとおり、トランスフェクション剤およびトランスフェクション促進剤は、治療用途のためのさまざまな医薬組成物および剤形として提供することができる。一般に、医薬組成物は、核酸が標的細胞または標的組織で所望の治療効果を有するよう十分に高いレベルの核酸を標的細胞または標的組織に導入するために十分なトランスフェクション剤および任意の促進剤を含むべきである。治療効果があるであろう標的細胞または組織における核酸のレベルは、阻害の効率またはその他の生物学的機能、および核酸が影響を及ぼさなければならない部位の数により決まることになる。
【０１２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞と接触させられる、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて対象に投与されるトランスフェクション剤の投与量は、投与の方法および部位、患者の年齢、体重および状態を含む多くの他の要因により決まることになる。当業者は、所与のタイプの投与のため、所与の患者および所与の治療的適用のための投与量を容易に調整することができる。
【０１２１】
トランスフェクション組成物の構成成分は、試薬キットとして提供されてもよい。一般に、本キットは、トランスフェクション試薬としてＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔを含む。遺伝物質は、キットとともに供給されてもよく、またはエンドユーザーが遺伝物質をＰｏｌｙＭｅｔまたはＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔに加えてもよい。キット構成成分は、適した培地または溶媒を含んでもよい。
【０１２２】
コレステロールの新規のカチオン誘導体、コレステロール−メトホルミンも、遺伝子治療のためのリポソームを調製するために合成および使用した（スキーム２）。ビグアニン群は、処置細胞および臓器に対して低毒性であることが示されたと同時にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける効率的な核酸トランスフェクションを促進することができる。
【０１２３】
なお、「ステロール」という用語は、Ａ環の３位にヒドロキシル基があるステロイドのサブグループである化学物質のグループを指す。これらは、特定の４つの環状骨格を有し、これは、特定のステロールにより原子の立体化学および置換基が変化する。一般に、ステロールは、約２７から約３０個の炭素原子を含み、ときには１つの二重結合を含む。ステロールの例としては、コレステロール、カンプエステロール、シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ニカステロール、ラノステロール、オキシステロール、デスモステロール、ゴルゴステロール、およびジノステロールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
合成方法
一実施形態において、本明細書に記載されている主題は、酸の存在下においてＰＥＩをジシアンジアミドと接触させるステップを含むＰｏｌｙＭｅｔを調製する方法を対象とする。酸は、任意の無機酸または有機酸であってもよい。特に有用な酸としては、ＨＣｌが挙げられる。
【０１２５】
ＰｏｌｙＭｅｔは、直鎖または分岐ＰＥＩの存在下におけるＨＣｌなどの酸によるジシアンジアミドプロトン化時に合成される。スキーム１を参照。いかなる理論に縛られるものではないが、分子内水素結合が遮断されて、それがＰＥＩの中心の窒素に位置する非共有電子対の求核攻撃を可能にすると考えられる。ＰｏｌｙＭｅｔをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して特徴づけした。これは、ジシアンジアミドによるＰＥＩの修飾が達成されたことを示していた（図２）。
スキーム１．ポリ−メトホルミン（ＰｏｌｙＭｅｔ）を調製するための合成経路。
【化２８】
2018513883.tif 000030
【０１２６】
この実施形態において、本明細書に記載されている主題は、メトホルミンのポリマーを調製する方法であって、
ａ．溶媒中において直鎖または分岐ポリエチレンイミンをジシアンジアミドと接触させて、第１の混合物を調製するステップ、
ｂ．第１の混合物を酸と接触させて、第２の混合物を調製するステップ、および
ｃ．第２の混合物をある期間加熱するステップ
を含み、メトホルミンのポリマーが調製される
方法を対象とする。
【０１２７】
有用な溶媒としては、水、メタノール、エタノール、ＤＭＦ、クロロホルム、ＴＨＦ、ＤＭＳＯなどを含む水性溶媒が挙げられる。
【０１２８】
有用な酸としては、ＨＣｌ、硫酸、硝酸、ホウ酸を含む有機酸および無機酸が挙げられる。
【０１２９】
有用な触媒としては、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ａｌ３＋、Ｓｉ４＋、Ｔｉ４＋などを含む金属イオン触媒作用、または静電的触媒作用が挙げられる。
【０１３０】
有用な期間としては、数分から数時間まで、数日間まで、例えば、５分以上から２〜６時間またはさらに１〜６日間もしくは１週間が挙げられる。
【０１３１】
第２の混合物を加熱するステップは、選択した特定の溶媒により決まることもある所望の温度または温度の範囲に反応が達するまで熱を加えることを含む。有効な温度としては、約３０℃から約２００℃、約５０℃から約１５０℃、約７５℃から約１２５℃が挙げられる。
【０１３２】
ステップが実施される順序は、特に重要でない場合もあり、そのような場合には、ステップの順序を変更することができる。
【０１３３】
本方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。そのような精製は、サイズまたは他の特性に基づく場合がある。ポリマーを精製するための方法は、当該技術分野において知られている。
【０１３４】
別の実施形態において、本明細書に記載されている主題は、積荷を有するＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔを調製する方法を対象とする。この実施形態において、本方法は、積荷を、ＰｏｌｙＭｅｔを含むＬＰＨナノ粒子（「ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔ」）中に装填するステップを含む。
【０１３５】
ＬＰＨ−ＰｏｌｙＭｅｔナノ粒子を調製するために、最初にＰｏｌｙＭｅｔ／ＨＡ複合体のＮ／Ｐ比（核酸またはヒアルロン酸のリン酸基のモル比に対するカチオン性ポリマーのアミン基のモル比）を調節し、ナノ粒子のサイズ、多分散性およびζ−電位を比較した。Ｎ／Ｐ比およそ０．９において大きな凝集体が観察され、この場合、中性の複合体が形成された。より小さな粒子を形成するために、複合体が比較的小さなサイズ（約１００ｎｍ）で負に帯電（約−２０ｍＶ）したままであったため、約０．６の比を利用し、この比においては、ＰＥＩ−ＨＡ複合体はＰｏｌｙＭｅｔ−ＨＡ複合体と類似した電荷およびサイズを有した（図３）。
【０１３６】
次に、ＤＯＴＡＰ／コレステロール（１：１ｍｏｌ／ｍｏｌ）カチオン性リポソームを複合体に添加して、電荷−電荷相互作用により脂質コーティングを形成した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−アニスアミドを、その後、リポソーム中にポストインサーション法により添加した。Ｈ４６０ではシグマ受容体が過剰発現するという事実のため（Ｍｉａｏ，Ｌ．Ｇ．，Ｓ．；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．；Ｋｉｍ，Ｗ．；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ｃｏ−Ｌｏａｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏ−Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４，６６０１−６６１１  （２０１４））、ナノ粒子を腫瘍に特異的に送達するための標的化リガンドとしてアニスアミドが利用される。最終的なナノ粒子は７０〜８０ｎｍでおよそ２０ｍＶの正電荷を有する（図４）。
【０１３７】
【化２９】
2018513883.tif 000031
スキーム２は、コレステリル−メトホルミンの合成を示す。
【０１３８】
【化３０】
2018513883.tif 000032
スキーム３は、メトホルミン修飾ＤＯＴＡＰ（ＤＯＢＰ）カチオン性脂質の合成を示す。
【０１３９】
医薬製剤
本明細書中で使用される場合、「送達する」という用語は、物質または分子（例えば、ポリヌクレオチド、生物活性化合物、もしくは薬物）の生理的部位、組織、または細胞への運搬を指す。これは、細胞の細胞内部分または細胞外空間への送達を包含する。本明細書中で使用される場合、「細胞内の」または「細胞内に」という用語は、当該技術分野において理解されるとおりのその通常の意味を有する。一般に、膜によって取り囲まれている細胞の内部の空間が、「細胞内」空間と定義される。同様に、本明細書中で使用される場合、「細胞外の」または「細胞外に」という用語は、当該技術分野において理解されるとおりのその通常の意味を有する。一般に、細胞膜の外側の空間が、「細胞外」空間と定義される。
【０１４０】
本明細書において開示される方法は、治療用薬剤またはその薬剤の誘導体もしくは類似体を送達することを可能にする。用語「誘導体」または「類似体」とは、化学的に修飾された治療用薬剤を意味する。例えば、当該技術分野において既知の方法によってその疎水性を増加または低下させることによって、治療用薬剤の溶解度が変更される場合もある。
【０１４１】
本明細書に記載されているナノ粒子は、動物試験において、哺乳動物の組織培養系においておよび治療のために有用である。治療活性を有する生物活性化合物を含むナノ粒子は、発現されるか、または細胞中に導入される場合、治療用途に使用することができる。本ナノ粒子は、治療目的で投与することができるか、またはさらなる薬学的担体とともにナノ粒子を含む医薬組成物を、送達用に、すなわち、以下に限定されるものではないが、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口、経鼻、気管支、目、経皮（局所的）、経粘膜、直腸、および経膣経路を含む任意の利用可能な経路によって対象へ投与するために製剤化することができる。一部の実施形態において、送達の経路は、静脈内、非経口、経粘膜、経鼻、気管支、経膣、および経口である。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的な投与に適合した溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに同種のものを含む。追加の活性化合物も組成物中に組み込まれてよい。
【０１４３】
当業者が認識するであろうように、本開示の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するよう製剤化される。非経口（例えば、静脈内）、筋肉内、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液としては、以下の構成成分、滅菌した希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート；および浸透圧の調節のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースを挙げることができる。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸もしくは水酸化ナトリウムを用いて調節することができる。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。
【０１４４】
注入可能な使用に適した医薬組成物は、一般に本明細書中の別の場所に記載されているものなどの滅菌水溶液または分散液および無菌性の注射可能な溶液もしくは分散液の即席の調製のための滅菌された粉末を含む。静脈内投与に適した担体としては、生理的食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。本組成物は、無菌性でなければならず、容易な注射針通過性がある程度に流体でなければならない。一部の実施形態において、本医薬組成物は、製造および保管の条件下において安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。一般に、関連した担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエテイレングリコールなど）、ならびに適したそれらの混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、および同種のものによって達成することができる。一部の実施形態において、等張化剤、例えば、糖、マンニトールもしくはソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムが製剤に含まれる。注入可能な製剤の長期の吸収は、製剤中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらすことができる。
【０１４５】
無菌性の注射可能な溶液は、本明細書中の別の場所に記載されているとおり、ろ過滅菌によって調製することができる。特定の実施形態において、注射用溶液は、エンドトキシンがないものである。一般に、分散液は、ベースの分散媒および上に挙げられているものからの必要とされるその他の成分を含む無菌性ビヒクルにナノ粒子を組み込むことによって調製される。滅菌された粉末が無菌性の注射可能な溶液の調製に使用される実施形態において、溶液は、活性成分および予め滅菌ろ過したその溶液に由来する任意のさらなる所望の成分の粉末を生ずる真空乾燥およびフリーズドライによって調製することができる。
【０１４６】
経口用組成物は、不活性希釈剤または可食性担体を一般に含む。経口用組成物は、口内洗浄剤として使用するための流体担体を使用して調製することができる。組成物の一部として薬学的に適合した結合剤、および／または補助材料が含まれてもよい。経口用組成物は、甘味剤、例えば、スクロースもしくはサッカリン、または香料、例えば、ペパーミント、メチルサリチレート、もしくはオレンジ香料を含んでもよい。
【０１４７】
吸入による投与のための、本開示の組成物は、適した噴射剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含む加圧された容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレー、またはネブライザーの形態で送達することができる。液体エアゾル、乾燥粉末、および同種のものも使用することができる。
【０１４８】
本開示の組成物の全身投与も、経粘膜または経皮手段によってであってもよい。経粘膜または経皮投与のために、通過させる関門に適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野において一般に知られており、例えば、経粘膜投与のための、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは座剤の使用により成し遂げることができる。経皮投与のために、活性化合物は、当該技術分野において一般に知られている軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤化される。
【０１４９】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために経口または非経口組成物を単位剤形に製剤化することが有利である。本明細書中で使用される場合、単位剤形とは、処置される対象に対する単位用量として適切な物理的に個別の単位を指す。それぞれの単位は、必要とされる医薬または化粧用担体と関連して所望の治療効果をもたらすよう算出された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の処置のためのそのような活性化合物を調合する技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接左右される。投薬に関する指針は、本明細書中の別の場所で提供される。
【０１５０】
一実施形態において、本主題は、本明細書に記載されているナノ粒子を提供する製造品も含む。本製造品は、任意の担体とともに本方法に適した乾燥形態、もしくは液体形態のいずれかの組成物が入っているバイアルまたはその他の容器を含んでもよい。本製造品は、本発明の方法を行うための容器上のラベルの形態の指示書および／または容器を包装している箱に入れられた挿入物の形態の指示書をさらに含む。指示書は、バイアルを包装している箱の上に印刷されてもよい。指示書はまた、対象または当該分野の従事者が医薬組成物を投与することができるよう十分な投与量および投与情報をなどの情報を含む。当該分野の従事者は、組成物を投与する可能性があるであろうあらゆる医師、看護師、技術者、配偶者、またはその他の介護者を包含することが予想される。本医薬組成物はまた、対象によって自己投与されてもよい。
【０１５１】
生物活性化合物の細胞への送達は、生物活性化合物の細胞中への送達が対象の外で起こるｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチ、ｅｘ  ｖｉｖｏアプローチ（トランスフェクションした細胞をその後、対象中に移植することができる）、および送達が対象自体の内部で起こるｉｎ  ｖｉｖｏアプローチを含む場合がある。
【０１５２】
治療有効量のナノ粒子の送達は、治療有効用量の生物活性化合物またはナノ粒子を含む医薬組成物の投与により行われてもよい。「治療有効量」または「用量」とは、所望の治療効果を引き出すのに十分なそこに含まれる送達系または生物活性化合物の濃度を意味する。有効量は、１回以上投与されてもよい。
【０１５３】
有効性および投与量を判定するための方法は、当業者に知られている。参照によって本明細書に組み込んだものとする、例えば、Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３  ｅｄ．，１８１４−１８８２を参照のこと。当然のことながら、化合物の適切な用量はその効力に依存し、特定の受け手に対して、例えば、予め選択された所望の応答が達成されるまで用量を増加させる投与により任意に調整できることが理解される。当然のことながら、任意の特定の動物対象に対する特定の用量レベルは、利用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食餌、投与の時間、投与経路、排出の速度、あらゆる薬物併用、ならびに調節される発現または活性の程度を含むさまざまな要因によって決まる場合があることが理解される。
【０１５４】
そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療効果のある用量）を求めるための細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって判定することができる。毒性（例えば、免疫毒性）作用と治療効果との間の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用されてもよいが、そのような化合物を冒された組織の部位へと標的化して、感染していない細胞に対する損傷の可能性を最小限にし、それにより副作用を低減する送達系を設計するよう配慮すべきである。
【０１５５】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトに使用するための投与量の範囲を定式化する際に使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がわずかか、またはなく、ＥＤ５０を含む循環中濃度の範囲にある。投与量は、利用される剤形および利用される投与経路によりこの範囲内で変化してもよい。本開示の方法に使用されている任意の化合物に関する治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において求められたＩＣ５０（すなわち、症状の最大の阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するよう定式化されてもよい。そのような情報を使用して、ヒトで有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１５６】
本医薬製剤は、必要に応じて、例えば、１日に複数回、毎日、１日おき、約１から１０週間の間、２から８週間の間、約３から７週間の間、約４、５、または６週間の間の週１回などさまざまな間隔で、異なる期間にわたって投与することができる。当業者は、以下に限定されるものではないが、疾患、障害、もしくは望ましくない状態の重症度、以前の処置、全身の健康状態および／または対象の年齢、および存在している他の疾患もしくは望ましくない状態を含む特定の要因が、対象を効果的に処置するために必要とされる投与量およびタイミングに影響を与える可能性があることを認識するであろう。一般に、対象の処置は、１つの処置を含んでもよく、または、多くの場合、一連の処置を含んでもよい。さらに、対象の処置は、１つの美容のための適用を含んでもよく、または一部の実施形態において、一連の美容のための適用を含んでもよい。
【０１５７】
本発明は、本明細書に記載されているナノ粒子を提供する製造品も含む。本製造品は、任意の担体とともに本方法に適した乾燥形態、もしくは液体形態のいずれかの組成物を入れたバイアルまたはその他の容器を含んでもよい。本製造品は、本発明の方法を行うための容器上のラベルの形態の指示書および／または容器を包装している箱に入れられた挿入物の形態の指示書をさらに含む。指示書は、バイアルを包装している箱の上に印刷されてもよい。指示書は、対象または当該分野の従事者が医薬組成物を投与することができるよう十分な投与量および投与情報をなどの情報を含む。当該分野の従事者は、組成物を投与する可能性があるであろうあらゆる医師、看護師、技術者、配偶者、またはその他の介護者を包含することが予想される。本医薬組成物はまた、対象によって自己投与されてもよい。
【０１５８】
当業者は、本開示の主題の検査時に本開示のＰｏｌｙＭｅｔ化合物、そのナノ粒子および医薬組成物が、細胞、細胞培養物、細胞培養培地、組織、組織培養物、組織培養培地、および同種のものへ直接投与することができることを認識するであろう。本発明の送達系を言及する場合、「投与すること」という用語およびその派生物は、化合物を細胞と接触させる任意の方法を含む。本開示の化合物またはその医薬組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて細胞または組織に投与され（またはそれと接触させられ）てもよい。本開示のＰｏｌｙＭｅｔ化合物、そのナノ粒子および医薬組成物はまた、本明細書中の別の場所に記載されているとおり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞または組織に個々の対象、例えば、患者への投与、例えば、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内投与）または局所適用により投与され（またはそれと接触させられ）てもよい。
【０１５９】
以下の実施例は、説明のために提供され、限定の意図はない。
【実施例】
【０１６０】
材料および方法
化学薬品
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン塩化物塩（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジステアロリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール−２０００）アンモニウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（アラバスター、アラバマ州）から購入した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−アニスアミド（ＡＡ）を以前に記載されたとおりに本発明者らの研究室で合成した（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｒ．，Ｔｙａｇｉ，Ｐ．，Ｌｉ，Ｓ．＆Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ａｎｉｓａｍｉｄｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｔｅａｌｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｕ  ｃａｎｃｅｒ  １１２，６９３−７００  （２００４））。ＤｅａｄＥｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬアッセイキットおよびＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍアッセイ基質をＰｒｏｍｅｇａ（マディソン、ウィスコンシン州）から入手した。その他の化学薬品は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。ＢＣＬ２  ｓｉＲＮＡ（標的配列：５’−ＡＡＣ  ＡＵＣ  ＧＣＣ  ＣＵＧ  ＵＧＧ  ＡＵＧ  ＡＣＵ−３’）、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（標的配列：５’−ＡＣＣ  ＵＣＡ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  Ｃ−３’）および対照ｓｉＲＮＡ（標的配列：５’−ＡＡＵ  ＵＣＵ  ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＧＵＧ  ＵＣＡ  ＣＧＵ−３’）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）によって合成された。
【０１６１】
細胞培養
Ｈ４６０、Ｈ４６０／ＬｕｃヒトＮＳＣＬＣ細胞、Ｂ１６Ｆ１０、およびＢ１６Ｆ１０／Ｌｕｃマウスメラノーマがん細胞を初めはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）において培養した。細胞を、加湿したインキュベーター中において３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【０１６２】
実験用マウス
６〜８週齢の雌ヌード雌マウスおよび雌ＣＤ１マウスを研究に使用した。雌ヌードマウスはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ベセスダ、メリーランド州）から購入し、チャペルヒルにあるノースカロライナ大学のＤｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＤＬＡＭ）が繁殖させた。ＣＤ１マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（モリスビル、ノースカロライナ州）から購入した。異種移植モデルを確立するために、１００μＬのＰＢＳ中の５×１０６細胞をマウスの右脇腹に皮下注射した。
【０１６３】
実施例１：ＰｏｌｙＭｅｔの調製
ＰｏｌｙＭｅｔを調製するために、０．２ｇの直鎖ＰＥＩおよび２ｇのジシアンジアミドを１０ｍＬの水中で混合した。その後、２ｍＬのＨＣｌを溶液に添加した。その化合物を、その後、１００℃で約４時間反応させた。その後、ＰｏｌｙＭｅｔを３０００Ｄａのカットオフの限外ろ過チューブにより精製し、凍結乾燥した。ＰｏｌｙＭｅｔの溶液を、実験のために１ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬアリコートに維持した。
【０１６４】
実施例２：ＬＰＨナノ粒子の調製
ＤＯＴＡＰ（２０ｍＭ、１ｍＬ）およびコレステロール（２０ｍＭ、１ｍＬ）をクロロホルム中に溶解（１：１ｍｏｌ／ｍｏｌ）させ、減圧下で溶媒を除去した。脂質膜を２ｍＬの蒸留水で一晩水和して、カチオン性リポソーム（１０ｍＭ）を形成し、これを、ポリカーボネート膜（２００ｎｍ×２０回、１００ｎｍ×２０回および５０ｎｍ×２０回）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、マサチューセッツ州）を通して連続的に押し出した。
【０１６５】
異なる比率を有するいくつかの異なる複合体を調製した。ＰｏｌｙＭｅｔ−ＨＡ複合体またはＰＥＩ−ＨＡ複合体を調製するために、２００μＬのＨＡ（２５μｇのＨＡ、蒸留水中）および２００μＬのＰＥＩ溶液（蒸留水中に２〜３．９μｇのＰＥＩを含む）または２００μＬのＰｏｌｙＭｅｔ溶液（蒸留水中に５．８〜１１．６μｇのＰｏｌｙＭｅｔを含む）を１．５ｍＬのチューブ中で混合した。ピペットを１０回上下させることによって複合体を混合し、サイズおよびゼータ電位の分析の前に室温で１０分間そのままにした。複合体の比率は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  Ｎａｎｏシリーズ（ウェストバラ、マサチューセッツ州）を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した粒子サイズおよびゼータ電位の結果によって求めた。
【０１６６】
複合体の所望の比率を選択した後、複合体を６０μＬのカチオン性ＤＯＴＡＰ／コレステロールリポソーム（１０ｍＭ）と混合し、脂質コーティングのためにさらに１０分間インキュベートした。脂質コーティングされたナノ粒子を、４５μＬのＤＳＰＥ−ＰＥＧおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＡ（１０ｍｇ／ｍＬ  １：１ｖ／ｖ）を添加し、ナノ粒子を５０℃で１５分間インキュベートすることによってポストインサーションアプローチを使用してペグ化した。得られたＬＰＨナノ粒子を、以下の実験に２０分以内に使用した。
【０１６７】
ｓｉＲＮＡ試験のために、２００μＬのＨＡ（２５μｇのＨＡ、蒸留水中）溶液を使用する代わりに、２００μＬのＨＡ／ｓｉＲＮＡ（１２．５μｇのＨＡ、１２．５μｇのｓｉＲＮＡ、蒸留水中）溶液を使用し、１．５ｍＬのチューブ中でさまざまな量のＰｏｌｙＭｅｔ溶液またはＰＥＩ溶液を混合した後、所望の比率の製剤を選択した。
【０１６８】
実施例３：ＬＰＨ  ＮＰの特徴づけ
ＬＰＨの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像をＪＥＯＬ  １００ＣＸ  ＩＩ  ＴＥＭ（東京、日本）を使用することにより得た。手短に説明すると、新たに調製したＬＰＨナノ粒子（５μＬ）を注意深く３００メッシュの炭素コーティング銅グリッド（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．、レディング、カリフォルニア州）上に滴下し、室温で５分間そのままにした。グリッドを、その後、１％酢酸ウラニル（５μＬ）で着色し、短時間（１０秒間）インキュベートし、急速に乾燥した。すべての画像は１００ｋＶの加速電圧で得た。
【０１６９】
実施例４：動物腫瘍モデルおよび抗腫瘍活性
ヒトＮＳＣＬＣ細胞異種移植片を前に記載したとおりに使用した。Ｈ４６０ヒト肺がん細胞（５．０×１０６）を雌の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約０．１ｃｍ３のサイズに達したとき（移植の１０〜１５日後）、Ｈ４６０腫瘍をもつマウスに製剤の尾部静脈内（ＩＶ）注射を隔日で与えた。動物の体重および腫瘍体積を１日おきに測定した。腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を使用して、方程式：Ｖ＝１／２×Ｌ×Ｗ２によって体積（Ｖ）を算出した。
【０１７０】
実施例５：ウエスタンブロット分析
Ｈ４６０腫瘍をもつマウスに隔日でＩＶ注射を与え、３回目の注射の２４時間後にマウスを屠殺した。４％〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってレーン毎にタンパク質を分離した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。その膜を５％脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により室温で１時間ブロッキングした後、抗体とともに一晩、４℃でインキュベートした。その膜を３回洗浄した後、二次抗体（１：４，０００希釈、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌ  Ｉｎｃ．）とともに室温で１時間インキュベートした。最後に、その膜を４回洗浄し、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の説明書に従って増強化学発光システムを使用して現像した。
【０１７１】
実施例６：免疫染色
全身投与後のｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞のアポトーシスを、ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  Ｎｉｃｋ−Ｅｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって測定した。Ｈ４６０腫瘍をもつマウスに隔日で合計３回、製剤のＩＶ注射を与えた。最後の注射の２４時間後、マウスを屠殺し、腫瘍を１０％ホルマリン中で２４時間固定した後、パラフィンに包埋し、５μｍの厚さの切片を作った。
【０１７２】
製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）が推奨するようにＴＵＮＥＬ染色を行った。ＤＡＰＩ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を核染色のために切片に滴下した。ＴＵＮＥＬ染色腫瘍切片の画像を蛍光顕微鏡（株式会社ニコン、東京、日本）により取り込んだ。各顕微鏡視野のアポトーシス細胞の数を全細胞の数（ＤＡＰＩによって染色された青い核、図示せず）で割ることによってアポトーシス細胞のパーセンテージを得た。１０個の代表的な顕微鏡視野を、この分析のために各処置群（ｎ＝３）においてランダムに選択した。
【０１７３】
実施例７：血清生化学値分析および血液学的アッセイ
３回の注射後、全血を採取し、４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して血清を得た。腎機能および肝機能の指標として血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒｅａ）、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルをアッセイした。３回の反復処置後に健康なヌードマウスから全血を採取した。赤血球（ＲＢＣ）、白血球細胞（ＷＢＣ）、プレートレット（ＰＬＴ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）およびヘマトクリット（ＨＣＴ）を骨髄抑制の検出のためにカウントした。臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓）を固定し、Ｈ＆Ｅ染色のために切片を作って、臓器特異的毒性を評価した。
【０１７４】
実施例８：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるルシフェラーゼ遺伝子サイレンシング試験
Ｈ４６０／Ｌｕｃ細胞（１×１０４細胞／０．２ｍＬ／ウェル）を実験の１日前に９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、コーニング、ニューヨーク州）に播いた。１００μＬの無血清ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地中において６、６０、または１５０ｎＭのルシフェラーゼ−ｓｉＲＮＡを含むさまざまな製剤により、３７℃で４時間、細胞を処理した。細胞を、その後、ＰＢＳで３回洗浄した後、１００μＬの完全ＤＭＥＭ培地とともにさらに２４時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、６０μＬの溶解バッファー（０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中の２ｍＭのＥＤＴＡ）とともに３０分間インキュベートした。その後、４０μＬのライセートを新しい白い９６プレートに移し、１００μＬの基質（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．、マディソン、ウィスコンシン州）と混合し、発光強度をプレートリーダー（Ｐｌａｔｅ  Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｉｎｃ．、ワシントンＤＣ）によって測定した。タンパク質濃度をタンパク質アッセイキット（ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用することによって測定した。各サンプルのルシフェラーゼ活性をタンパク質レベルで正規化した。
【０１７５】
実施例９：コレステリルメトホルミンの合成
固体コレステリルクロロホルメート（１．０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させた。別個のフラスコにおいて０．２２ｍｏｌのエチレンジアミン（１３．２ｇ）を１０ｍＬのＤＣＭで希釈した。撹拌しながら、コレステリルクロロホルメート溶液をエチレンジアミン溶液に３０分の時間をかけて室温（Ｒ．Ｔ．）で滴加した。一晩Ｒ．Ｔ．で撹拌した後、残されるサンプル体積が最小になるまで有機溶媒を蒸発させた。およそ２０ｍＬのアセトニトリルを添加して粗生成物を沈殿させた。その後、その固体を回収し、アセトニトリルで数回すすいだ後、空気乾燥した。収率は９２％であった。等モルのコレステロールエチレンジアミン（１．０ｍｍｏｌ）、ジシアンジアミド（１．０ｍｍｏｌ）および塩化第二鉄（１．０ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのエタノールに溶解させた。その混合物を７８℃まで加温し、３時間撹拌した。エタノールの蒸発後、５ｍＬの希塩酸（２ｍｏｌ／Ｌ）を添加して、第二鉄イオンを置き換えた。その後、その生成物を単離し、数回アセトニトリルですすいだ後、空気乾燥した。収率は７１％であった。
【０１７６】
統計分析：各処置群間の差を群の組に関してはスチューデントｔ検定および複数の群に関しては一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用することによって分析した。０．０５未満のｐ値は統計学的に有意と見なされる。すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０、ＧｒａｐＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して行った。
【０１７７】
本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、同じ意味を有する。使用される数（例えば、量、温度など）に対して確実に正確になるよう努力したが、いくらかの実験的誤差およびずれを考慮すべきである。
【０１７８】
「１つの（ａまたはａｎ）」要素という用語は、１つ以上のその要素を指し、例えば、「１つのナノ粒子（ａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」は１つ以上のナノ粒子を表すと理解されることに留意されたい。したがって、「１つの（ａまたはａｎ）」、「１つ以上の」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において同義に使用することができる。
【０１７９】
本明細書および特許請求の範囲全体をとおして、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、文脈が別のことを要求する場合を除いて非排他的な意味で使用される。
【０１８０】
本明細書中で使用される場合、値を言及するときの「約」という用語は、明記されている量から一部の実施形態においては±２０％、一部の実施形態においては±１０％、一部の実施形態においては±５％、一部の実施形態においては±１％、一部の実施形態においては±０．５％、および一部の実施形態においては±０．１％の変動を包含することを意味し、したがってそのような変動は開示される本方法を実施するまたは開示される組成物を利用するのに適切である。
【０１８１】
さらに、量、濃度、またはその他の値もしくはパラメーターが範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値の一覧のいずれかとして示される場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の範囲上限または好ましい値および任意の範囲下限または好ましい値の任意の組から形成されるすべての範囲が具体的に開示されていると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が列挙されている場合、別に明記されない限り、この範囲は、その端点、ならびに範囲内のすべての整数および小数部を含むことが意図される。本開示の主題の範囲が、範囲を定義するときに列挙された具体的な値に限定されることは意図しない。
【０１８２】
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが参照により組み込まれることを明確におよび個別に示されたのと同じ程度まで参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１８３】
本明細書中に記載されている本発明の多くの改変形態および他の実施形態が、これらの発明が属する分野の当業者には、前述の説明および関連する図において提示されている教示の利益により、思い浮かぶであろう。したがって、本発明は、開示されている特定の実施形態に限定されるものではなく、改変形態および他の実施形態が実施形態の前述の一覧および添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されると理解されるべきである。本明細書において特定の用語が利用されるが、それらは、一般的および説明的な意味でのみ使用され、限定の目的で使用されるものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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