(57)【要約】  本発明は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質を有する核酸構築物、この核酸構築物を含む発現ベクター及びウイルス粒子、ならびに、ウィルソン病及びＡＴＰ７Ｂタンパク質の欠損又は機能不全に起因する他の状態を処置するためのそれらの使用に関する。本発明に従って発明されたＡＡＶベクターは、このベクターで処置されたウィルソン病マウスにおける尿中Ｃｕ排泄及び肝臓Ｃｕ含量を顕著に減少させた。一方で、セルロプラスミン活性は、顕著に回復された。一方、ベクターの投与により、炎症性浸潤の顕著な減少を伴って、血清トランスアミナーゼレベル及び肝臓の組織学の正常化がもたらされた。
2018505663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）α１−アンチトリプシン遺伝子（ＡＡＴ）プロモータのヌクレオチド配列と、
ｂ）銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列と、
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列と、
ｄ）アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列と
を含む、核酸構築物。
【請求項２】
α１−アンチトリプシン遺伝子（ＡＡＴ）プロモータのヌクレオチド配列が、配列番号：１の塩基１５６．．４６０により範囲設定された配列である、請求項１記載の核酸構築物。
【請求項３】
銅輸送ＡＴＰａｓｅ２のアミノ酸配列が、配列番号：３である、請求項１又は２記載の核酸構築物。
【請求項４】
銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号：１の塩基４７３．．４８７０により範囲設定されたコード配列、
ｂ）配列番号：２の塩基４７３．．４８７０により範囲設定されたコード配列、及び
ｃ）銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードする少なくとも１１７０のコドンが、配列番号：２の塩基４７３．．４８７０により範囲設定されたコード配列のコドンと同一である配列からなる群より選択される、請求項３記載の核酸構築物。
【請求項５】
ＡＡＶの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及びＡＡＶ４からなる群より選択される血清型のものであり、好ましくは、ＡＡＶ２血清型のものである、請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸構築物。
【請求項６】
ＡＡＴプロモータが、真核生物レギュラトリーエレメントの配列のみである、請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸構築物。
【請求項７】
構築物のヌクレオチド配列が、配列番号：１又は配列番号：２である、請求項１〜６のいずれか一項記載の核酸構築物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物を含む、発現ベクター。
【請求項９】
ベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物、又は、請求項８もしくは９記載の発現ベクターを含む、ホスト細胞。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物、又は、請求項８もしくは９記載の発現ベクターを含む、ウイルス粒子。
【請求項１２】
ウイルス粒子が、ＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、請求項１１記載のウイルス粒子。
【請求項１３】
ウイルス粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０からなる１つ以上の群より選択される血清型、好ましくは、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９の血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、請求項１２記載のウイルス粒子。
【請求項１４】
核酸構築物の５’及び３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２血清型のものであり、カプシドタンパク質が、ＡＡＶ８血清型のものである、請求項１３記載のウイルス粒子。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項８もしくは９記載の発現ベクター、請求項１０記載のホスト細胞、請求項１２〜１４のいずれか一項記載のウイルス粒子と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項８もしくは９記載の発現ベクター、請求項１０記載のホスト細胞、又は請求項１１〜１４のいずれか一項記載のウイルス粒子、又は請求項１５記載の医薬組成物を、１つ以上の容器に含み、場合により、核酸構築物、ベクター、ホスト細胞、ウイルス粒子、又は医薬組成物を患者に投与する方法を説明する説明書又は包装材を更に含む、キット。
【請求項１７】
医薬として使用するための、請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項８もしくは９記載の発現ベクター、請求項１０記載のホスト細胞、又は請求項１１〜１４のいずれか一項記載のウイルス粒子。
【請求項１８】
銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、好ましくは、ウィルソン病の処置に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項８もしくは９記載の発現ベクター、請求項１０記載のホスト細胞、又は請求項１１〜１４のいずれか一項記載のウイルス粒子、又は請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１９】
銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、好ましくは、ウィルソン病の処置に使用するための医薬の調製における、請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項８もしくは９記載の発現ベクター、請求項１０記載のホスト細胞、又は請求項１１〜１４のいずれか一項記載のウイルス粒子の使用。
【請求項２０】
患者における銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、好ましくは、ウィルソン病の処置のための方法であって、
治療的に有効な量の、請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物、請求項８もしくは９記載の発現ベクター、請求項１０記載のホスト細胞、請求項１１〜１４のいずれか一項記載のウイルス粒子、又は請求項１５記載の医薬組成物を、患者に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
ａ）請求項１０記載のホスト細胞を培養培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞培養上清及び／又は細胞内からウイルス粒子を収集する工程とを含み、
そしてここで、ホスト細胞が、
ｉ）ＩＴＲ配列を有さない、ＡＡＶ  ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ遺伝子をコードする核酸構築物、及び／又は
ｉｉ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物を更に含む、
請求項１１〜１４のいずれか一項記載のウイルス粒子を製造する方法。
【請求項２２】
ウイルス粒子を製造するための、請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物、又は、請求項８もしくは９記載の発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルソン病及び他の状態の処置に使用するための核酸構築物及び遺伝子治療ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルソン病の遺伝子治療に関する技術水準は、Merle et al.（Current Gene Therapy 2007; 7: 217-220）にレビューされており、そこで概説されており、その後に開示された参考文献と共に完成されている。
【０００３】
ウィルソン病（ＷＤ）は、平均有病率１：３０，０００の、銅代謝の常染色体性劣性遺伝障害である。ＷＤは、Ｐ型銅輸送ＡＴＰａｓｅをコードするＡＴＰ７Ｂ遺伝子の変異により生じる。同ＡＴＰ７Ｂ遺伝子は、１３番染色体に位置している。ＡＴＰ７Ｂは、肝細胞において主に発現され、銅の膜透過輸送において機能する。ＡＴＰ７Ｂタンパク質の機能欠如又は同機能の低下により、銅の胆汁への低下した肝細胞排泄がもたらされる結果、主に肝臓に銅蓄積がもたらされ、その後、神経系及び他の組織に蓄積がもたらされる。銅をセルロプラスミンに包含させるのを失敗することは、機能的なＡＴＰ７Ｂタンパク質の損失の更なる結果である。
【０００４】
ＷＤは、肝臓疾患として、進行性の神経障害として、又は精神疾患として、臨床的に表れ得る。肝臓ＷＤを患う患者は、通常、小児期後期又は青年期に表れ、急性肝炎、劇症型肝不全、又は進行性慢性肝疾患の特徴を示す。ＷＤの神経兆候は、典型的には、肝疾患より遅く、典型的には、２０代又は３０代に表れ、錐体外路、小脳、及び大脳関連兆候を含む。
【０００５】
ＷＤの医療処置の目的は、銅の毒性堆積物を身体から除去し、その再蓄積を予防することである。３つの抗銅薬剤：Ｄ−ペニシラミン、トリエンチン、及び亜鉛塩が、ＷＤについて現在認可されている。医学療法は、総じて有効であるが、ＷＤを患う全ての患者に有効であるとは限らない。肝臓移植は、劇症型肝不全又は進行性肝不全を表わしているＷＤ患者の治療選択肢である。肝臓移植は、ＷＤの表現型を修正するのが示されており、優れた長期生存を提供する。
【０００６】
しかしながら、治療の中断又は不適切な処置により、数か月以内に死に至るおそれがある。ＷＤの薬物治療は定期的に行われる必要があるため、一部の患者、特に、青年期のＷＤ患者における処置に対するアドヒアランスは乏しい。
【０００７】
治療下において、神経兆候が残るのが、比較的普通であり、進行性兆候も生じるおそれがある。現在の医療処置の選択肢は、ＷＤ患者の全てに有効なわけではなく、治療へのアドヒアランスの問題があるため、より包括的な解決策には、遺伝子治療を必要とする場合がある。
【０００８】
理論的には、肝細胞中での野生型ＡＴＰ７Ｂの発現は、全ての疾患に関連する異常を逆転させ、肝臓及び神経の兆候を救済するであろう。ＷＤに理想的な遺伝子治療の究極の目的は、ＡＴＰ７Ｂを十分な量で、生存している間に肝細胞に特異的に送達することであろう。
【０００９】
ＷＤについてのアデノウイルス遺伝子導入の全ての公表された研究は、一過性の導入遺伝子発現のみを生じる、初期世代のアデノウイルスベクターを使用している。Terada et al.［Terada et al. J. Biol. Chem. 1998; 273:1815-1820；Terada et al. FEBS Lett. 1999; 448: 53-56］には、ＬＥＣラットモデルにおけるアデノウイルス媒介性遺伝子送達による遺伝子導入の成功が示されている。ホロセルロプラスミン合成の回復、血清セルロプラスミンオキシダーゼ活性の回復、及び胆汁への銅排泄の回復が示された。これらは、遺伝子導入の治療的効果を示す。これらの効果は、非常に限られた期間のものであり、３日目に最大レベルとなり、その後低下した。Ha-Hao et al.［Z. Gastroenterol. 2002; 40: 209-216］にも、アデノウイルス媒介性ＡＴＰ７Ｂ遺伝子導入後に、ＬＥＣラットの糞中の銅含量の増大が示された。これは、胆汁への銅排泄の増大を示す。加えて、治療効果は、ホロセルロプラスミン及びそのフェロオキシダーゼ活性の回復により示された。しかしながら、再度、これらの実験における治療効果の持続性は、数日の限られた期間での一過性でしかなかった。
【００１０】
ガットレスアデノウイルスベクターは、従来、この用途には試験されてこなかった。
【００１１】
他の一般的に使用される非組込み型ウイルスベクター系であるアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）も、従来、ＷＤに試験されてこなかった。主には、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子（約４．４kbの大きさ）により、ＡＡＶベクター内に、必要な配列（例えば、プロモータ、ポリＡシグナル配列等）の残り部分を割り当てるための最小空間しか残らないためである。同ＡＡＶベクターのパッケージング能は、４．４〜４．７kbである。ドイツ国特許出願公開公報第１００１５６１２１号（２００３年に公開）では、短縮された金属感受性プロモータ（メタロチオネイン−Ｉプロモータ）を有し、ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子の銅又は亜鉛誘導性発現を生じる、ＷＤの遺伝子治療用のリコンビナントアデノ関連ウイルスベクターが提案された。それにも関わらず、この文献では、治療効率及びベクターの性能に関する情報が何ら提供されておらず、その後に開示されてもいない。
【００１２】
一方、野生型ＡＴＰ７Ｂを有する複数のレンチウイルスベクターが、ＷＤの動物モデルに試験されている。Merle et al.［Scan. J. Gastroenterol. 2006; 41: 974-982］により、ホスホグリセロキナーゼプロモータの制御下においてＡＴＰ７Ｂを発現しているレンチウイルスベクターによるＬＥＣラットにおける全身性遺伝子治療が報告された。遺伝子導入後２４週間で、未処置対照と比較して、処置ラットにおいて、肝臓銅含量が、顕著に低下し、肝臓の組織学が改善したが、その効果は、部分的でしかなかった。血清セルロプラスミンオキシダーゼ活性は、対照と比較して、遺伝子導入後２週間で増大した。しかしながら、処置後２４週間で、より低いレベルに低下した。ごく最近、Roybal et al.［Gene Therapy 2012; 19: 1085-1094］により、アポリポタンパク質Ｅ及びアルファ−１アンチトリプシンのエレメントを含有した肝臓特異的プロモータの転写制御下においてヒトＡＴＰ７Ｂを有するレンチウイルスによるＡＴＰ７Ｂ−／−マウスにおける妊娠初期遺伝子導入が報告されている。子宮へのベクター投与により、肝臓銅レベルの低下、正常な肝臓組織学の維持、セルロプラスミンへの銅取込みの回復、及び改善されたコレステロール生合成が提供された。しかしながら、処置の効率は、マウス間で非常に変動があり、時間と共に低下した。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、最初に、アデノ関連ウイルスベクターを操作した。同ベクターは、ＡＴＰ７Ｂノックアウトマウス（ウィルソン病の認識された動物モデル）に投与され、主なウィルソン病の病的な特徴を、処置後少なくとも２４週間修正した。このＡＡＶベクター（本明細書において、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂとも呼ばれる）は、α１−アンチトリプシン遺伝子（ＡＡＴ）のコアプロモータ配列のみを含有する肝臓特異的プロモータの転写制御下において、ヒトＡＴＰ７Ｂをコードする遺伝子を有する。Ｃｕ排泄（Ｃｕ尿中含量）及び肝臓Ｃｕ含量は、このベクターで処置されたウィルソン病マウスにおいて、顕著に低下し、一方、セルロプラスミン活性は、顕著に回復した。さらに、前記ＡＡＶベクターにより、生理学的な胆汁銅排泄が回復された。一方、このベクターの投与により、血清トランスアミナーゼレベル及び肝臓の組織学の回復がもたらされ、これらと共に、炎症性浸潤、胆管増生、及び線維症の顕著な減少がもたらされた。これらの観察から、核酸構築物（ＡＴＰ７Ｂをコードする配列に連結されたＡＡＴプロモータ）及びそれを有する長さ５．１kbのＡＡＶベクターの両方により、ＡＴＰ７Ｂの欠損又は機能不全に関連する銅の蓄積の最も関連する病的な影響を克服することができるため、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態、例えば、ウィルソン病、又は、ＡＴＰ７Ｂ依存性リソソームエキソサイトーシスの低下及び銅蓄積に関連する疾患及び／もしくは状態の処置における遺伝子治療に非常に適し得ることが示された。
【００１４】
したがって、第１の態様では、本発明は、ａ）α１−アンチトリプシン遺伝子（ＡＡＴ）プロモータのヌクレオチド配列と、ｂ）銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードするヌクレオチド配列と、ｃ）ポリアデニル化シグナル配列とを含む、核酸構築物（以下、「本発明の核酸構築物」とも呼ばれる）に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸構築物を含む、発現ベクター（以下、「本発明の発現ベクター」とも呼ばれる）に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含む、ホスト細胞に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含む、ウイルス粒子（以下、「本発明のウイルス粒子」とも呼ばれる）に関する。好ましくは、核酸構築物は、ウイルスベクターのゲノム配列を構成している。
【００１８】
別の態様では、本発明は、本発明の製品、すなわち、本発明の核酸構築物を含む製品と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物に関する。本明細書で使用する場合、「本発明の製品」という用語は、ａ）本発明の核酸構築物、ｂ）本発明の発現ベクター、ｃ）本発明のホスト細胞、及びｄ）本発明のウイルス粒子のいずれかを意味し、区別なく包含する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、更に、本発明の核酸構築物、ベクター、ホスト細胞、ウイルス粒子、又は医薬組成物を、１つ以上の容器に含む、キットに関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、医薬に使用するための（医薬又は医薬組成物としての）、本発明の製品に関する。医薬におけるこの使用は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置を含む。すなわち、本発明は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置に使用するための医薬の調製における、本発明の製品の使用、及び、対象又は患者における銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置のための方法に関する。同方法は、対象又は患者に、治療的に有効な量の本発明の製品を投与することを含む。より特定の態様では、本発明の製品は、ウィルソン病の処置に使用される。
【００２１】
別の態様では、本発明は、更に、本明細書で記載された医薬及び治療方法において提案された使用のための、上記された本発明の製品を含む、医薬組成物に関する。
【００２２】
更なる態様では、本発明は、
ａ）本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含有するホスト細胞を培養培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞培養上清及び／又は細胞内からウイルス粒子を収集する工程とを含む、
本発明のウイルス粒子を製造する方法に関する。
【００２３】
関連する態様では、本発明は、ウイルス粒子の製造のための、本発明の核酸構築物又は本発明の発現ベクターの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１：ヒトＡＴＰ７Ｂを発現するベクターＡＡＶ２−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂの核酸構築物の概略図。構築物のエレメントは、ａ）アルファ−１−アンチトリプシン遺伝子プロモータ（ＡＡＴ）、ｂ）ヒトＡＴＰ７Ｂをコードするヌクレオチド配列、ｃ）ポリアデニル化シグナル配列（ｐＡ）と隣接するベクターゲノムと、ｄ）ＡＡＶ２の末端逆位配列（ＩＴＲ）とである。
【図２】図２：野生型マウス（ＷＴ）、ＡＴＰ７Ｂ欠損マウス（ウィルソン病マウス、ＷＤ）、ならびに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを１×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  １×１０１０）及び３×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  ３×１０１０）で処置されたＷＤマウスにおける血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベル。ベクターを、動物が６週齢になった時点で投与した。ＡＬＴレベルを、処置後４、９、１４、及び２４週間［週数］で測定し、IU/L（IU：国際単位）として表現する。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図３】図３：野生型マウス（ＷＴ）、ＡＴＰ７Ｂ欠損マウス（ウィルソン病マウス、ＷＤ）、ならびに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを１×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  １×１０１０）及び３×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  ３×１０１０）で処置されたＷＤマウス（各群ｎ＝５）における尿中総銅含量。銅含量を、処置後４、９、１４、及び２４週間［週数］で測定し、Ｃｕのナノグラムとして表現した（ngr）。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図４】図４：野生型マウス（ＷＴ）、ＡＴＰ７Ｂ欠損マウス（ウィルソン病マウス、ＷＤ）、ならびに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを１×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  １×１０１０）及び３×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  ３×１０１０）で処置されたＷＤマウス（各群ｎ＝５）における血清セルロプラスミン活性。セルロプラスミン活性を、処置後４週間で測定し、波長５７０nmで測定した吸光度［Ａｂｓ（５７０nm）］として表現した。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図５Ａ】図５Ａ：野生型マウス（ＷＴ）、ＡＴＰ７Ｂ欠損マウス（ウィルソン病マウス、ＷＤ）、ならびに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを１×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  １×１０１０）及び３×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  ３×１０１０）で処置されたＷＤマウス（各群ｎ＝５）における肝臓Ｃｕ含量。銅含量を、処置後２４週間の動物（３０週齢）を殺処分した後に、原子吸光分光法により決定し、μg/gとして表現した（Ｃｕμg/乾燥肝臓組織g）。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図５Ｂ】図５Ｂ：図５Ａについて記載されたように、ＷＴマウス（ｎ＝１５）、ＷＤマウス（ｎ＝２５）、ならびに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを１×１０１０vg/マウス（ｎ＝５）及び３×１０１０vg/マウス（ｎ＝５）で処置されたＷＤマウスにおける肝臓Ｃｕ含量。そしてここで、肝臓Ｃｕ含量を、個別化された形式で表現し、ＷＤ及びＷＴ群において、より多くの動物を含ませる。
【図６】図６：野生型動物（ＷＴ）、ＡＴＰ７Ｂ欠損マウス（ウィルソン病マウス、ＷＤ）、ならびに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを１×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  １×１０１０）及び３×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  ３×１０１０）で処置されたＷＤマウス（各群ｎ＝５）の肝臓の組織学画像。画像を、動物（３０週齢）を殺処分した後に撮影した。Ａ：ヘマトキシリン及びエオシンで染色された肝臓断片の画像。Ｂ：銅の堆積を検出するためにＴｉｍｍ’ｓ硫化銀技術で染色された組織学サンプルの画像。
【図７】図７：肝臓の炎症、胆管増生、及び線維症の分析。野生型動物（ＷＴ）、ＡＴＰ７Ｂ欠損マウス（ウィルソン病マウス、ＷＤ）、ならびに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを１×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  １×１０１０）及び３×１０１０vg/マウス（ＷＤ  ＡＡＶ  ３×１０１０）で処置されたＷＤマウス（各群ｎ＝５）の肝臓の画像。分析を、動物（３０週齢）を殺処分した後に行った。ＣＤ４５：肝臓の炎症性浸潤を検出するために抗ＣＤ４５で免疫染色された肝臓断片の画像。ＰＡＮＣＫ：胆管増生を検出するために抗ＰＡＮＣＫで免疫染色された肝臓断片の画像。ＳＲ：線維症を検出するためにSirius redで染色された肝臓断片の画像。
【図８】図８：抗ＣＤ４５（ＣＤ４５；炎症性マーカーとして）もしくは抗ＰａｎＣｋ（ＰＡＮＣＫ；胆管増生マーカーとして）で免疫染色され、又は、Sirius Red（ＳＲ；線維症マーカーとして）で染色された肝臓断片のデジタル画像上で行われた、肝臓の炎症、胆管増生、及び線維症の定量分析のグラフ表現。測定値を、総面積に対する、免疫組織化学染色面積の比、線維症の場合にはSirius Redで染色された面積の比（％ＩＨＱ  染色面積）として表現する。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【図９】図９：ＷＤマウス（ＷＤ）（ｎ＝５）、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを３×１０１０vg/マウスで処置されたＷＤマウス（ＷＤ  ＡＡＶ）（ｎ＝５）、及びヘテロ接合性同腹子群（対照）における、糞中銅濃度（Ａ）及び尿中銅濃度（Ｂ）。処置後２週間で、各群の半分のマウスに、腹腔内投与１００μgで、過負荷の銅（＋ＣｕＳＯ４）を受けさせた。もう一方の半分は処置しないままとした（−ＣｕＳＯ４）。銅濃度を、次の２４時間の間に収集された糞（Ａ）及び尿（Ｂ）において分析した。
【図１０】図１０．野生型マウス（ＷＴ）（ｎ＝１５）、ＷＤマウス（ｎ＝２５）、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ（ＡＴＰ７Ｂ）を１×１０１０vg/マウス（最適以下用量）で処置されたＷＤマウス（ｎ＝８）、及び、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（ｃｏＡＴＰ７Ｂ）を１×１０１０vg/マウスで処置されたＷＤマウス（ｎ＝８）における肝臓Ｃｕ含量。銅含量を、処置後２４週間で動物を殺処分した後に、原子吸光分光法により決定し、μg/gとして表現する（Ｃｕμg/乾燥肝臓組織g）。ｎｓ：有意差無し；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１［Mann-Whitney独立試験］。
【００２５】
［発明の詳細な説明］
本明細書で使用する場合、本願における全ての用語は、特に断りない限り、当技術分野において公知のその通常の意味を有すると理解されたい。本願に使用される特定の用語についての他のより特別な定義は、以下で説明された通りであり、他の方法で明確に述べられた定義がより広い定義を提供しない限り、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して一様に適用することを意図している。
【００２６】
「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」という用語は、単量体ヌクレオチドから構成されるか、又は、同ヌクレオチドを含む任意の分子を意味するのに、互換的に使用することができる。核酸は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであることができる。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。ヌクレオチド配列は、化学的に修飾され、又は、人工的であることができる。ヌクレオチド配列は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む。これらの配列はそれぞれ、天然のＤＮＡ又はＲＮＡとは、分子の骨格に対する変化により区別される。また、ホスホロチオアートヌクレオチドも使用することができる。他のデオキシヌクレオチド類似物は、メチルホスホナート、ホスホラミダート、ホスホロジチオアート、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホラミダート、ならびにオリゴリボヌクレオチドホスホロチオアート及びその２’−０−アリル類似物及び２’−０−メチルリボヌクレオチドメチルホスホナートを含む。これらは、本発明のヌクレオチドに使用することができる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「核酸構築物」という用語は、リコンビナントＤＮＡ技術の使用により生じる人工の核酸分子を意味する。核酸構築物は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子であり、他の方法で天然には存在しないであろう方法において組み合わせられ、並べられた核酸配列のセグメントを含有するように修飾されている。核酸構築物は、通常、「ベクター」、すなわち、外因的に作製されたＤＮＡをホスト細胞内に送達するのに使用される核酸分子である。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「発現ベクター」又は「ベクター」という用語は、このような配列に適合したホスト細胞又はホスト生物中で遺伝子（導入遺伝子）を発現させることができる、リコンビナントヌクレオチド配列を意味する。導入遺伝子と共に、発現ベクターは、典型的には、少なくとも適切な転写レギュラトリー配列を含み、場合により、３’転写終了シグナルを含む。発現を達成するのに必須であるか、又は、同達成に有用な更なる因子、例えば、的確な誘導性シグナル（外因性又はキメラ転写因子）に応答可能であるか、又は、特定の細胞、臓器、もしくは組織に特異的な発現エンハンサーエレメントも存在することができる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「対象」又は「患者」という用語は、哺乳類を意味する。開示された処置方法により利益を得ることができる哺乳類種は、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、類人猿；チンパンジー；サル、及びオランウータン、飼育動物（イヌ及びネコを含む）、ならびに家畜、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヤギ、又は、他のほ乳類種（マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターを含むが、これらに限定されない）等を含むが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「パッケージング細胞」という用語は、ヘルパーベクターもしくはウイルス又はＤＮＡ構築物によりトランスフェクションすることができる細胞又は細胞株を意味し、ウイルスベクターの完全な複製及びパッケージングに必要な失われた機能を全てトランスに提供する。典型的には、パッケージング細胞は、構成的又は誘導性の方法において、１つ以上の前記失われたウイルス機能を発現する。
【００３１】
本発明の核酸構築物
α１−アンチトリプシン遺伝子（ＡＡＴ）プロモータのヌクレオチド配列
本明細書で使用する場合、「真核生物プロモータ」という用語は、真核生物細胞における、特定の遺伝子又は１つ以上のコード配列の転写を開始するＤＮＡ配列領域を意味する。プロモータは、遺伝子又はコード配列の転写レベルを指示するために、他のレギュラトリー領域又はエレメントと共同して作用することができる。これらのレギュラトリーエレメントは、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータタンパク質結合部位、ならびに、プロモータからの転写量をレギュレーションするのに直接的又は間接的に作用することが当業者に公知の任意の他のヌクレオチド配列（例えば、アテニュエータ、エンハンサ、及びサイレンサを含む）を含むが、これらに限定されない。プロモータは、同じ鎖上のＤＮＡ配列上流（センス鎖の５’領域に向かう）に操作可能に連結された遺伝子又はコード配列の転写開始部位近くに位置している。プロモータは、長さが約１００〜１０００塩基対であることができる。プロモータにおける位置は、特定の遺伝子についての転写開始部位に対して指定される（すなわち、位置上流は、−１から逆に数える負の数字であり、例えば、−１００は、１００塩基対上流の位置である）。
【００３２】
「コアプロモータ」又は「ミニマルプロモータ」という用語は、転写を適切に開始するのに必要なプロモータ配列の最小部分を意味する。コアプロモータ又はミニマルプロモータは、直接上流の転写開始部位（ＴＳＳ）及びエレメント；ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）に対する結合部位、及び一般的な転写因子結合部位を含む。一般的に、プロモータは、他の一次レギュラトリーエレメント（例えば、エンハンサ、サイレンサ、バウンダリーエレメント／インシュレータ）を含有する近位プロモータ配列（コアプロモータの上流）、及び、更なるレギュラトリーエレメントを含有する場合があり、通常、遺伝子の転写レベルに、より弱い影響を有する遠位プロモータ配列（コアプロモータの下流）も含む。
【００３３】
本発明の核酸構築物は、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）遺伝子プロモータのヌクレオチド配列を含む。すなわち、同ヌクレオチドは、この遺伝子のコアプロモータの配列を含む。一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の核酸は、真核生物レギュラトリーエレメントの配列のみとして、ＡＡＴ遺伝子のコアプロモータの配列を含む。
【００３４】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ＡＡＴプロモータの配列は、配列番号：１の塩基１５６．．４６０により範囲設定された部分配列である。
【００３５】
本発明によれば、ＡＡＴプロモータの配列は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される。本明細書で使用する場合、「操作可能に連結され」という用語は、機能的な関係における、ポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメントの連結を意味する。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係にある場合に、「操作可能に連結され」ている。例えば、プロモータ又は転写レギュラトリー配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に操作可能に連結されている。操作可能に連結され、は、連結されているＤＮＡ配列が典型的には連続的であることを意味する。この場合、２つのタンパク質コード領域を連結させる必要がある。それらは連続的であり、リーディングフレーム内にある。
【００３６】
銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）
銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）は、銅を細胞外に排出するのに機能するＰ型カチオン輸送ＡＴＰａｓｅである。
【００３７】
ヒト酵素をコードする遺伝子は、１３番染色体に位置している（染色体位置１３ｑ１４．３；遺伝子名ＡＴＰ７Ｂ）。ヒトＡＴＰ７Ｂポリペプチドの情報（アミノ酸配列、構造、ドメイン、及び他の特徴）は、例えば、Uniprotにおいて、アクセッションナンバー：Ｐ３５６７０（http://www.uniprot.org/uniprot/P35670；エントリーバージョン１６８（２０１４年９月３日）、配列バージョン４（２００９年６月１６日））で利用可能である。この酵素をコードするＡＴＰ７Ｂ遺伝子の情報は、Entrezにおいて、アクセッションナンバー遺伝子ＩＤ：５４０（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/540；２０１４年９月１９日に更新）で利用可能である。選択的スプライシングにより生成される４つのアイソフォームが、ＡＴＰ７Ｂについて記載されている。アイソフォーム１（識別子Ｐ３５６７０−１、１４６５個のアミノ酸長）が、正準配列として選択される。
【００３８】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の核酸構築物は、ヒトＡＴＰ７Ｂ、好ましくは、アミノ酸配列が正準配列（配列番号：３）であるヒトＡＴＰ７Ｂ（本明細書において、ｗｔＡＴＰ７Ｂとも呼ばれる）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
コドン重複性のために、同じアミノ酸配列を有するＡＴＰ７Ｂポリペプチドをコードして生成することができる数多くのヌクレオチド配列が存在する。
【００４０】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１のコード配列ＣＤＳ、塩基４７３．．４８７０である。
【００４１】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列は、同じｗｔＡＴＰ７Ｂをコードする、ヒト細胞に最適化されたコドン利用バイアスを有する配列である配列番号：２のコード配列ＣＤＳ、塩基４７３．．４８７０である。
【００４２】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするコドンの内の少なくとも１１７０、少なくとも１２４５、少なくとも１３１５、又は少なくとも１３９０がコード配列である配列番号：２のＣＤＳ４７３．．４８７０と同一である、配列である。
【００４３】
ポリアデニル化シグナル配列
本明細書で使用する場合、「ポリアデニル化シグナル」又は「ポリ（Ａ）シグナル」という用語は、遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の特異的認識配列を意味する。ポリアデニル化シグナル又はポリ（Ａ）シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体分子に転写され、遺伝子転写の終了をガイドする。ポリ（Ａ）シグナルは、新たに形成されたｍＲＮＡ前駆体のその３’−端におけるヌクレオチド鎖開裂用のシグナル、及び、アデニン塩基のみからなるＲＮＡストレッチのこの３’−端への付加（ポリアデニル化プロセス；ポリ（Ａ）テイル）用のシグナルとして機能する。ポリ（Ａ）テイルは、ｍＲＮＡの核外移行、翻訳、及び安定性に重要である。本発明の文脈において、ポリアデニル化シグナルは、哺乳類細胞において、哺乳類遺伝子及び／又はウイルス遺伝子のポリアデニル化を指示することができる認識配列である。
【００４４】
ポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、ａ）プレメッセンジャーＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ）の３’−端開裂及びポリアデニル化の両方に必要であり、下流での転写終了を促進することが示されているコンセンサス配列ＡＡＵＡＡＡと、ｂ）ポリ（Ａ）シグナルとしてＡＡＵＡＡＡの利用効率を制御するＡＡＵＡＡＡの上流及び下流の更なるエレメントとからなる。哺乳類遺伝子のこれらのモチーフにおいて、かなりの変異性が存在する。
【００４５】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の核酸構築物のポリアデニル化シグナル配列は、哺乳類遺伝子又はウイルス遺伝子のポリアデニル化シグナル配列である。適切なポリアデニル化シグナルは、中でも、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ＥＩｂポリアデニル化シグナル、成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＰＢＧＤポリアデニル化シグナル等を含む。
【００４６】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物のポリアデニル化シグナル配列は、ＡＴＰ７Ｂをコードするヌクレオチド配列の転写から生じたｍＲＮＡ前駆体のヌクレオチド鎖開裂及びポリアデニル化を指示し、達成することもできる合成ポリ（Ａ）シグナル配列である。
【００４７】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物のポリアデニル化シグナル配列は、配列番号：１の塩基４８７７．．４９３２により範囲設定された合成ポリ（Ａ）シグナル配列である。
【００４８】
他のヌクレオチドエレメント
一実施態様において、本発明の核酸構築物は、遺伝子治療用の発現ベクターである本発明の発現ベクター、とりわけ、遺伝子治療用のウイルスベクターのリコンビナントゲノムを構成する。
【００４９】
このため、一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の核酸構築物は、ウイルスの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを更に含む。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「末端逆位配列（ＩＴＲ）」という用語は、パリンドローム配列を含有し、ＤＮＡ複製の開始中にプライマーとして機能するＴ型ヘアピン構造を形成するように折り畳むことができる、ウイルスの５’−端に位置しているヌクレオチド配列（５’ＩＴＲ）及び３’−端に位置しているヌクレオチド配列（３’ＩＴＲ）を意味する。また、ホストゲノムへのウイルスゲノムの組込み、ホストゲノムからのレスキュー、及び成熟ビリオン内でのウイルス核酸のカプシド形成にも必要である。ＩＴＲは、ベクターゲノムの複製及びウイルス粒子内へのそのパッケージングにシスで必要である。
【００５１】
一実施態様において、本核酸構築物は、ウイルスの５’ＩＴＲ、Ψパッケージングシグナル、及び３’ＩＴＲを含む。「Ψパッケージングシグナル」は、ウイルスゲノムのシス作用型ヌクレオチド配列である。同配列は、一部のウイルス（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス．．．）において、複製中にウイルスゲノムをウイルスカプシド内にパッケージングするプロセスに必須である。
【００５２】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物は、パルボウイルス（特に、アデノ関連ウイルス）、アデノウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス（特に、ガンマレトロウイルス及びレンチウイルス）、ヘルペスウイルス、及びＳＶ４０からなる群より選択されるウイルスの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含む。好ましい実施態様では、ウイルスは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）、又はレンチウイルスである。
【００５３】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物は、ＡＡＶの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含む。
【００５４】
ＡＡＶゲノムは、４６８１個の塩基を含有する、直線状の一本鎖ＤＮＡ分子から構成される（Berns and Bohenzky, (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307）。このゲノムは、ＤＮＡ複製起点及びウイルスについてのパッケージングシグナルとしてシスに機能する末端逆位配列（ＩＴＲ）を各端部に含む。ＩＴＲは、長さが約１４５bpである。このゲノムの内部非繰返し部分は、それぞれＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子として公知の２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。これらの遺伝子は、ビリオンの複製及びパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。特に、少なくとも４つのウイルスタンパク質は、その見掛けの分子量に従って命名された、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０から合成される。ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、少なくとも３つのタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ＡＡＶゲノムの詳細な説明については、例えば、Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129を参照のこと。
【００５５】
リコンビナントＡＡＶビリオンの構築は、当技術分野において一般的に公知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び同第５，１３９，９４１号；国際公開公報第９２／０１０７０号、同第９３／０３７６９号に記載されている（Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996；Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129；及びKotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801）。
【００５６】
好ましい実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の核酸構築物又は発現ベクターは、
ａ）α１−アンチトリプシン遺伝子（ＡＡＴ）プロモータのヌクレオチド配列と、
ｂ）銅輸送ＡＴＰａｓｅ２をコードするヌクレオチド配列と、
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列と、
ｄ）アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列と
を含むか、又は、これらからなる。
【００５７】
本発明は、任意のＡＡＶ血清型のＩＴＲを使用することにより行うことができる。同血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、鳥類のＡＡＶ、ウシのＡＡＶ、イヌ科のＡＡＶ、ウマのＡＡＶ、ヒツジのＡＡＶ、及び、現在公知又は後に発見される任意の他のＡＡＶ血清型を含む。
【００５８】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及びＡＡＶ４からなる群より選択される血清型のＡＡＶの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含む。好ましい実施態様では、本核酸構築物は、配列番号：１の塩基１．．１４１及び塩基４９６８．．５１０７により範囲設定されたＩＴＲ配列を含む。同ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２のＩＴＲ配列である。
【００５９】
ＩＴＲは、ＡＡＶゲノム複製及びウイルス粒子内へのそのパッケージングにシスで必要とされるＡＡＶウイルスエレメントのみである。
【００６０】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本核酸構築物は、分類サブクラス（Ａ〜Ｆ）いずれかの中のいずれかの血清型のアデノウイルスの５’ＩＴＲ、Ψパッケージングシグナル、及び３’ＩＴＲを含む。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、これらの５’ＩＴＲ、Ψシグナル、及び３’ＩＴＲ配列は、サブクラスＣのアデノウイルスに由来し、より好ましくは、血清型２（Ａｄ２）又は血清型５（Ａｄ５）のアデノウイルスに由来する。
【００６１】
一方、他の実施態様では、本発明は、合成の５’ＩＴＲ及び／又は３’ＩＴＲを使用することにより、また、種々の血清型のウイルスに由来する５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを使用することによっても行うことができる。
【００６２】
ウイルスベクター複製に必要な全ての他のウイルス遺伝子は、以下に記載されたウイルス産生細胞（パッケージング細胞）内にトランスに提供することができる。したがって、本発明のウイルスベクターゲノムの核酸構築物中へのその包含は任意である。一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発現ベクターは、ＡＡＶベクターである。
【００６３】
特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、ヌクレオチド配列が配列番号：１又は配列番号２である、ＡＡＶベクターを構成する。
【００６４】
別の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、発現ベクターは、アデノウイルスベクターである。本発明のこのアデノウイルスベクターは、特に、第１世代、第２世代、又は第３世代のアデノウイルス［Adenovirus. Methods and Protocols. Chillon M. and Bosch A. (Eds); third Edition; 2014 Springerを参照のこと］又は既知もしくは後に記載される任意の他のアデノウイルスベクター系であることができる。
【００６５】
特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明のウイルスベクターは、「第３世代のアデノウイルス」である。同アデノウイルスは、「ガットレスアデノウイルス」、「ヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤ−Ａｄ）」、又は「高性能アデノウイルス（ＨＣ−Ａｄ）」と呼ぶこともできる。第３世代のアデノウイルスは、全てのウイルスコード領域が除去されており（ガットレス）、複製をヘルパーアデノウイルスに依存し（ヘルパー依存性）、最大３６kbpインサートの外来性の遺伝子材料を、ホスト細胞内に輸送し、送達することができる（高容量）。ガットレスアデノウイルスは、末端逆位配列ＩＴＲ（５’及び３’）及びパッケージングシグナル（Ψ）を維持している。
【００６６】
本明細書で記載された本発明の核酸構築物及び発現ベクターは、当業者に公知の従来法：Sambrook and Russell (Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Third Edition; 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press)；及びGreen and Sambrook (Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Fourth Edition; 2012 Cold Spring Harbor Laboratory Press)により調製し、得ることができる。
【００６７】
遺伝子治療用の本発明のウイルス粒子
「ウイルス粒子」及び「ビリオン」という用語は、本明細書において、互換的に使用され、カプシド、場合により、カプシドを囲う脂質エンベロープ内にパッケージングされたウイルスゲノム（すなわち、発現ウイルスベクターの核酸構築物）を含む感染性で、典型的には、複製欠損のウイルス粒子に関する。
【００６８】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明のビリオンは、本発明のＡＡＶベクターの核酸構築物をタンパク質シェル中にパッケージングすることにより得られる「リコンビナントＡＡＶビリオン」又は「ｒＡＡＶビリオン」である。
【００６９】
アデノ関連ウイルスのウイルスカプシドのタンパク質（カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）は、１つのウイルス遺伝子（ｃａｐ遺伝子）から生成される。種々のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質配列間の差異により、細胞内侵入のために種々の細胞表面レセプターを使用することになる。別の細胞内処理経路との組み合わせで、これは、各ＡＡＶ血清型について別箇の組織向性を生じさせる。
【００７０】
特定の実施態様では、本発明のリコンビナントＡＡＶビリオンは、特定のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムの核酸構築物を、同じ特定の血清型のＡＡＶに対応する天然のＣａｐタンパク質により形成されたウイルス粒子にカプシド形成させることにより調製することができる。それにも関わらず、複数の技術が、天然のＡＡＶウイルス粒子の構造的及び機能的特性を修飾し、改善するのに開発されてきた（Bunning H et al. J Gene Med 2008; 10: 717-733）。このため、本発明の別のＡＡＶウイルス粒子では、所定のＡＡＶ血清型のＩＴＲに隣接するウイルスベクターのヌクレオチド構築物は、例えば、ａ）同じかもしくは異なるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質［例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質；ＡＡＶ２  ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質等］から構成されるウイルス粒子；ｂ）種々のＡＡＶ血清型もしくは変異体由来のカプシドタンパク質［例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲとＡＡＶ１及びＡＡＶ５カプシドタンパク質］の混合物から構成されるモザイクウイルス粒子；ｃ）種々のＡＡＶ血清型又は変異間でドメインスワッピングによりトランケートされているカプシドタンパク質［例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲとＡＡＶ３ドメインを有するＡＡＶ５カプシドタンパク質］から構成されるキメラウイルス粒子；又はｄ）ターゲット細胞特異的レセプターとのストリンジェントな相互作用を可能にする選択性結合ドメイン［例えば、ＡＡＶ４  ＩＴＲとペプチドリガンドの挿入により遺伝的にトランケートされたＡＡＶ２カプシドタンパク質；又はカプシド表面にペプチドリガンドをカップリングさせることにより非遺伝的に修飾されたＡＡＶ２カプシドタンパク質］を提示するように操作されたターゲット化ウイルス粒子内にパッケージングすることができる。
【００７１】
当業者であれば、本発明のＡＡＶビリオンが任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含むことができることを理解するであろう。一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ウイルス粒子は、ＡＡＶのカプシドタンパク質を含む。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ＡＡＶウイルス粒子は、肝臓細胞への送達により適したＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９からなる群より選択される血清型由来のカプシドタンパク質（Nathwani et al. Blood 2007; 109: 1414-1421；Kitajima et al. Atherosclerosis 2006; 186:65-73）を含む。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本ウイルス粒子は、本核酸構築物の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列がＡＡＶ２血清型のものであり、カプシドタンパク質がＡＡＶ８血清型のものである、本発明の核酸構築物を含む。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ＡＡＶウイルス粒子は、肝臓、筋肉、及び網膜をターゲット化するのに非常に強力な遺伝子治療ベクターとして挙動する、ウイルスＡＡＶ血清型１、２、８、及び９の予想される祖先であるＡｎｃ８０由来のカプシドタンパク質（Zinn et al. Cell Reports 2015; 12:1-13）を少なくとも含む。より特定の実施態様では、ウイルス粒子は、Ａｎｃ８０Ｌ６５  ＶＰ３カプシドタンパク質（Genbankアクセッションナンバー：KT235804）を含む。
【００７２】
ウイルスグリカン相互作用は、ホスト細胞侵入の重要な決定因子である。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ＡＡＶウイルス粒子は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、そしてここで、この置換は、新たなグリカン結合部位又は新たなヘパランサルファート（ＨＳ）結合部位をＡＡＶカプシドタンパク質に導入する、カプシドタンパク質を含む。より特定の実施態様では、アミノ酸置換は、ＡＡＶ２におけるアミノ酸２６６、アミノ酸４６３〜４７５、及びアミノ酸４９９〜５０２、又は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくは任意の他のＡＡＶ血清型（Ａｎｃ８０及びＡｎｃ８０Ｌ６５も含む）において対応するアミノ酸位置においてである。
【００７３】
導入された新たなグリカン結合部位は、ヘキソース結合部位［例えば、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）、又はフコース（ｆｕｃ）結合部位］；シアル酸（Ｓｉａ）結合部位［例えば、Ｓｉａ残基は、例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＳＡｃ）又はＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＳＧｃ）］；又は二糖類結合部位であることができる。この場合、二糖類は、例えば、Ｓｉａ（アルファ２，３）Ｇａｌ又はＳｉａ（アルファ２，６）Ｇａｌの形態において、ガラクトースに結合しているシアル酸である。別の血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質におけるＡＡＶ血清型由来の新たな結合部位を導入するための詳細なガイダンスは、国際公開公報第２０１４１４４２２９号及びShen et al. (J. Biol. Chem. 2013; 288(40):28814-28823)に与えられる。特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ＡＡＶ９由来のＧａｌ結合部位は、ＡＡＶ２  ＶＰ３骨格内に導入され、細胞内侵入のためにＨＳ及びＧａｌレセプターの両方を使用することができる二重グリカン結合ＡＡＶ株を生じる。好ましくは、前記二重グリカン結合ＡＡＶ株は、ＡＡＶ２Ｇ９である。Shen et al.は、ＡＡＶ９  ＶＰ３カプシドタンパク質サブユニットのＧａｌ認識部位に直接関与し、同部位のすぐ隣りのアミノ酸残基を、ＡＡＶ２  ＶＰ３サブユニットコード領域における対応する残基上に置換することにより、ＡＡＶ２Ｇ９を生成した（ＡＡＶ２  ＶＰ３ナンバリング、Ｑ４６４Ｖ、Ａ４６７Ｐ、Ｄ４６９Ｎ、Ｉ４７０Ｍ、Ｒ４７１Ａ、Ｄ４７２Ｖ、Ｓ４７４Ｇ、Ｙ５００Ｆ、及びＳ５０１Ａ）。
【００７４】
別の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明のビリオンは、アデノウイルスビリオン、例えば、Ａｄ５ビリオンである。ＡＡＶビリオンの場合、Ａｄビリオンのカプシドタンパク質は、その向性及び細胞ターゲット化特性を改変するのにも操作することができる。
【００７５】
ウイルス粒子の製造
本発明の発現ウイルスベクターの核酸構築物を有するウイルス粒子の製造は、従来の方法及びプロトコールにより行うことができる。同方法及びプロトコールは、製造される核酸構築物及びベクターのウイルス粒子の実際の実施態様に選択される構造的特徴を考慮して選択される。
【００７６】
簡潔に、ウイルス粒子は、ヘルパーベクターもしくはウイルス又は他のＤＮＡ構築物の存在下において、パッケージングされるベクターの核酸構築物によりトランスフェクションされる、特異的なウイルス産生細胞（パッケージング細胞）中で製造することができる。
【００７７】
したがって、一態様において、本発明は、ウイルス粒子を製造するための、本発明の核酸構築物又は発現ベクターの使用に関する。
【００７８】
関連する態様では、本発明は、
ａ）本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含むホスト細胞を、培養培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞培養上清及び／又は細胞内からウイルス粒子を収集する工程とを含む、本発明のウイルス粒子を製造する方法に関する。
【００７９】
好ましくは、前記ホスト細胞は、以下に記載されたパッケージング細胞である。適切な培養培地は、当業者に公知であろう。このような培地を構成する成分は、培養される細胞種に応じて変化させることができる。栄養組成に加えて、浸透圧及びｐＨが、培養培地の考慮される重要なパラメータである。細胞増殖培地は、当業者に周知の数多くの成分を含む。同成分は、アミノ酸、ビタミン、有機塩及び無機塩、炭水化物の供給源、脂質、微量元素（ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＺｎＳＯ４．．．）を含む。各成分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞の培養（すなわち、細胞の生存及び増殖）を支援する量で存在する。また、成分は、種々の補助物質、例えば、緩衝物質（例えば、炭酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、Ｔｒｉｓ．．．）、酸化安定剤、機械的応力を打ち消す安定剤、プロテアーゼ阻害剤、動物成長因子、植物加水分解物、抗凝集剤、消泡剤を含むこともできる。細胞増殖培地の特徴及び組成は、具体的な細胞要求に応じて変化する。市販の細胞増殖培地の例は、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）ＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s Medium）、Ｉｓｃｏｖｅｓ  ＤＭＥＭ（Iscove’s modification of Dulbecco’s Medium）、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５、ＣＨＯ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、ＨＥＫ２９３、Ｈａｍ（Ham’s Media）Ｆ１０及び派生品であるＨａｍ  Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等である。
【００８０】
本発明のホスト細胞
別の態様では、本発明は、本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含む、ホスト細胞に関する。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「ホスト細胞」という用語は、対象となるウイルスによる感染に感受性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養に適している、任意の細胞株を意味する。
【００８２】
本発明のホスト細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療目的で使用することができる。このような実施態様では、細胞は、本発明の核酸構築物又はウイルスベクターによりトランスフェクションされ、その後に、患者又は対象に移植される。移植される細胞は、自家、同種、又は異種起源を有することができる。臨床使用のために、細胞の単離は、一般的には、医薬品の製造及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の条件下において行われるであろう。移植前に、典型的には、細胞の品質及び微生物又は他の汚染物質が存在しないことが確認され、例えば、放射線及び／又は免疫サプレッション処理による肝臓の前処理が行われる場合がある。さらに、ホスト細胞は、細胞増殖及び／又は分化を刺激する成長因子、例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）と共に移植することができる。
【００８３】
特定の実施態様では、ホスト細胞は、肝臓におけるｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療に使用される。好ましくは、前記細胞は、真核生物細胞、例えば、哺乳類細胞である。これらは、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、類人猿；チンパンジー；サル及びオランウータン、飼育動物（イヌ及びネコを含む）、ならびに家畜、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヤギ、又は、他のほ乳類種（マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターを含むが、これらに限定されない）等を含むが、これらに限定されない。当業者であれば、移植される患者又は対象に応じて、より適切な細胞を選択するであろう。
【００８４】
前記ホスト細胞は、自己複製能及び多能性を有する細胞、例えば、幹細胞又は誘導多能性幹細胞であることができる、幹細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、又は筋細胞の内の少なくとも１つに分化可能であり、任意の種類の組織から単離することができる。一般的には、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯、又は末梢血から単離されるであろう。それを得るための方法は、当業者に周知である。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣとしても公知）は、成熟細胞から直接生じさせることができる種類の多能性幹細胞である。Yamanaka et al.は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子を、マウス及びヒト繊維芽細胞内に導入し、これらの細胞にこれらの遺伝子を発現させることにより、ｉＰＳ細胞を誘導した（国際公開公報第２００７／０６９６６６号）。Thomson et al.は、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃに代えてＮａｎｏｇ及びＬｉｎ２８を使用して、ヒトｉＰＳ細胞を後に生じさせた（国際公開公報第２００８／１１８８２０号）。
【００８５】
前記ホスト細胞は、肝細胞であることもできる。細胞単離及びヒト又はマウスレシピエントへのその後の移植を含む肝細胞移植法は、例えば、Filippi and Dhawan, Ann NY Acad Sci. 2014, 1315 50-55；Yoshida et al., Gastroenterology 1996, 111: 1654-1660；Irani et al. Molecular Therapy 2001, 3:3, 302-309；及びVogel et al. J Inherit Metab Dis 2014, 37:165-176に記載されている。ウイルスベクターを肝細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入するための方法は、例えば、Merle et al., Scandinavian Journal of Gastroenterology 2006, 41:8, 974-982に記載されている。
【００８６】
別の特定の実施態様では、ホスト細胞は、パッケージング細胞である。前記細胞は、付着細胞又は懸濁細胞であることができる。パッケージング細胞及びヘルパーベクター又はウイルス又はＤＮＡ構築物は共に、ウイルスベクターの完全な複製及びパッケージングに必要な全ての損なわれた機能をトランスに提供する。
【００８７】
好ましくは、前記パッケージング細胞は、真核生物細胞、例えば、哺乳類細胞であり、類人猿、ヒト、イヌ、及びげっ歯類の細胞を含む。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（国際公開公報第０１／３８３６２号）、ＭＲＣ−５（ATCC CCL-171）、ＷＩ−３８（ATCC CCL-75）、ＨＥＫ−２９３細胞（ATCC CRL-1573）、ＨｅＬａ細胞（ATCC CCL2）、及びアカゲザル胎児肺細胞（ATCC CL-160）である。非ヒト霊長類細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ATCC CCL81）、ＣＯＳ−１細胞（ATCC CRL-1650）、又はＣＯＳ−７細胞（ATCC CRL-1651）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ATCC CCL-34）である。げっ歯類細胞の例は、ハムスター細胞、例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、又はＣＨＯ細胞である。
【００８８】
哺乳類ソースの代替として、本発明の使用するための細胞株は、鳥類ソース、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、又はキジから得ることができる。鳥類細胞株の例は、鳥類胚性幹細胞（国際公開公報第０１／８５９３８号及び同第０３／０７６６０１号）、不死化アヒル網膜細胞（同第２００５／０４２７２８号）、鳥類胚性幹細胞由来の細胞（ニワトリ細胞（同第２００６／１０８８４６号）又はアヒル細胞、例えば、ＥＢ６６細胞株（同第２００８／１２９０５８号及び同第２００８／１４２１２４号）を含む）を含む。
【００８９】
別の実施態様では、前記ホスト細胞は、昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞（ATCC CRL-1711）、Ｓｆ２１細胞（IPLB-Sf21）、ＭＧ１細胞（BTI-TN-MG1）、又はHigh Five（商標）細胞（BTI-TN-5B1-4）である。
【００９０】
したがって、特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、ホスト細胞は、
ａ）一般的には、プラスミドとしての、本発明の核酸構築物もしくは発現ベクター（すなわち、リコンビナントＡＡＶゲノム）、
ｂ）ＩＴＲ配列を有さない、ＡＡＶ  ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ遺伝子をコードする、一般的には、プラスミドである核酸構築物、ならびに／又は
ｃ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む、一般的には、プラスミドもしくはウイルスである核酸構築物
を含む。
【００９１】
ＡＡＶ複製に必須のウイルス遺伝子は、本明細書において、ウイルスヘルパー遺伝子と呼ばれる。典型的には、ＡＡＶ複製に必須の前記遺伝子は、アデノウイルスヘルパー遺伝子、例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、又はＶＡ  ＲＮＡである。好ましくは、アデノウイルスヘルパー遺伝子は、Ａｄ５又はＡｄ２血清型のものである。
【００９２】
従来法は、ＡＡＶベクターのウイルス粒子を製造するのに使用することができる。同方法は、本発明のリコンビナントＡＡＶベクター／ゲノムを有する核酸構築物（例えば、プラスミド）；ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするが、ＩＴＲ配列を有さない核酸構築物（例えば、ＡＡＶヘルパープラスミド）；及び、ＡＡＶ複製に必須のアデノウイルス機能を提供する第３の核酸構築物（例えば、プラスミド）による一過性細胞共トランスフェクションからなる。
【００９３】
このため、特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、前記ホスト細胞は、
ｉ）本発明の核酸構築物又は発現ベクター（すなわち、リコンビナントＡＡＶゲノム）、
ｉｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードし、ＩＴＲ配列を有さない核酸構築物、ならびに
ｉｉｉ）アデノウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物
を含むことにより特徴付けられる。
【００９４】
あるいは、ｒｅｐ、ｃａｐ、及びアデノウイルスヘルパー遺伝子は、１つのプラスミド上で組み合わせることができる（Blouin Vet al. J Gene Med. 2004; 6(suppl): S223-S228；Grimm D. et al. Hum. Gene Ther. 2003; 7: 839-850）。このため、別の特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、前記ホスト細胞は、
ｉ）本発明の核酸構築物又は発現ベクター（すなわち、リコンビナントＡＡＶゲノム）、ならびに
ｉｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードし、ＩＴＲ配列を有さず、アデノウイルスヘルパー遺伝子を更に含むプラスミド
を含むことにより特徴付けられる。
【００９５】
更なる特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、前記ホスト細胞は、
ａ）本発明の核酸構築物又は発現ベクター（すなわち、リコンビナントＡＡＶゲノム）、
ｂ）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードし、ＩＴＲ配列を有さないプラスミド、ならびに
ｃ）アデノウイルスヘルパー遺伝子Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ  ＲＮＡを含むプラスミド
を含み、そしてここで、共トランスフェクションは、アデノウイルスＥ１遺伝子を構成的に発現しており、トランス相補している（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）細胞、好ましくは、哺乳類細胞、例えば、ＨＥＫ−２９３細胞（ATCC CRL-1573）中で行われる。
【００９６】
本発明のＡＡＶベクターの大規模生産は、例えば、リコンビナントバキュロウイルスの組み合わせによる、昆虫細胞の感染によっても行うことができる（Urabe et al. Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935-1943）。ＳＦ９細胞は、それぞれＡＡＶ  ｒｅｐ、ＡＡＶ  ｃａｐを発現するバキュロウイルスベクターと、パッケージングされるＡＡＶベクターとにより共感染される。リコンビナントバキュロウイルスベクターは、ウイルスの複製及び／又はパッケージングに必要なウイルスヘルパー遺伝子機能を提供するであろう。
【００９７】
ＡＡＶ血清型のｒｅｐ  ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）と、異なる血清型ＡＡＶのｃａｐ  ＯＲＦとをコードするヘルパープラスミドを使用することにより、所定のＡＡＶ血清型のＩＴＲに隣接するベクターを異なる血清型のカプシド構造タンパク質から構築されたビリオン内にパッケージングするのが可能である。この同じ手法により、モザイク、キメラ、又はターゲット化ベクターをパッケージングするのも可能である。
【００９８】
一方、本発明のＨＣ−Ａｄベクターの製造は、アデノウイルスＥ１遺伝子及びＣｒｅリコンビナーゼをも構成的に発現しており、トランス相補している哺乳類細胞（例えば、２９３Ｃｒｅ細胞）により行うことができる。これらの細胞は、ＨＣ−Ａｄベクターゲノムでトランスフェクションされ、第１世代のアデノウイルスヘルパーウイルス（Ｅ１欠失）により感染される。同ウイルスにおいて、パッケージングシグナルは、ｌｏｘＰ配列に隣接している［Parks RJ et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 13565-13570；２９３Ｃｒｅ細胞については、Palmer and Engel. Mol. Ther. 2003; 8:846-852を参照のこと］。ＨＣ−Ａｄベクター、例えば、ＡｄＡｄＬＣ８ｃｌｕｃをパッケージングするのに使用することができる複数のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系ヘルパーウイルス系又は最適化された自己不活性化ＡｄＴｅｔＣｒｅヘルパーウイルスが記載されている（欧州特許第２２９５５９１号；Gonzalez-Aparicio et al. Gene Therapy 2011; 18: 1025-1033）。
【００９９】
本発明の遺伝子治療用のウイルスベクターの構築及び製造のための更なるガイダンスは、以下に見出すことができる。
Viral Vectors for Gene Therapy, Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 737. Merten and Al-Rubeai (Eds.); 2011 Humana Press (Springer)
Gene Therapy. M. Giacca. 2010 Springer-Verlag
Heilbronn R. and Weger S. Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics. In: Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology 197; M. Schafer-Korting (Ed.). 2010 Springer-Verlag; pp. 143-170
Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols. R.O. Snyder and P. Moulllier (Eds). 2011 Humana Press (Springer)
Bunning H. et al. Recent developments in adeno-associated virus technology. J. Gene Med. 2008; 10:717-733
Adenovirus: Methods and Protocols. M. Chillon and A. Bosch (Eds.); Third Edition. 2014 Humana Press (Springer)
【０１００】
治療的使用
更なる態様では、本発明は、医薬として使用するための、発明の概要内で定義された本発明の製品に関する。
【０１０１】
更なる態様では、本発明は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、ならびに、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の発現及び活性のアップレギュレーションにより治療的利益又は改善が生じる可能性がある任意の他の状態及び疾患、特に、ＡＴＰ７Ｂ依存性リソソームエキソサイトーシスの低下及びリソソーム中の銅蓄積に関連する疾患又は状態、例えば、胆汁うっ滞性障害、アルツハイマー病、及び／又はガン（Polishchuck et al. Dev Cell. 2014, 29(6), 686-700；Gupta and Lutsenko, Future Med. Chem. 2009, 1, 1125-1142）の処置に使用するための、発明の概要内で定義された本発明の製品に関する。
【０１０２】
処置される対象は、哺乳類、及び特に、ヒトの患者であることができる。
【０１０３】
特定の実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、銅輸送ＡＴＰａｓｅの欠損又は機能不全に起因する状態は、ウィルソン病（ＷＤ、Online Mendelian Inheritance in Man catalog accession number OMIN 277900；http://www.omim.org/entry/277900）である。
【０１０４】
関連する態様では、本発明は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、ならびに、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の発現及び活性のアップレギュレーションにより治療的利益又は改善が生じる可能性がある任意の他の状態及び疾患の処置、好ましくは、ウィルソン病の処置に使用するための医薬の調製における、発明の概要内で定義された本発明の製品の使用に属する。
【０１０５】
更なる態様では、本発明は、治療的に有効な量の、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ホスト細胞、ウイルス粒子、又は医薬組成物を患者に投与することを含む、患者における、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の欠損又は機能不全に起因する状態の処置、ならびに、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の発現及び活性のアップレギュレーションにより治療的利益又は改善が生じる可能性がある任意の他の状態及び疾患の処置、好ましくは、ウィルソン病の処置における使用に関する。
【０１０６】
本発明の製品による処置は、ＷＤの１つ以上の兆候の重症度を、緩和し、改善し、又は低下させることができる。例えば、処置は、ホロセルプラスミン合成、セルロプラスミンオキシダーゼ活性、及び／又は胆汁中への銅排泄を増大させ、及び／又は、回復させ（これにより、血清、肝臓、脳、及び尿中の銅蓄積を減少させ）、その結果として、腹痛、疲労、黄疸の重症度、制御不能な運動、筋肉のこわばり、会話、嚥下、又は肉体的整合を伴う問題を緩和し、改善し、又は低下させることができる。
【０１０７】
本発明の製品は、典型的には、医薬組成物又は医薬中に、場合により、医薬担体、希釈剤、及び／又は補助剤との組み合わせで含まれるであろう。このような組成物又は医薬品は、本発明の製品を、所望の治療効果を提供するのに十分な有効量で含み、薬学的に許容し得る担体又は賦形剤を含む。
【０１０８】
したがって、更なる態様では、本発明は、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ホスト細胞、又はウイルス粒子と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物に関する。
【０１０９】
任意の適切な薬学的に許容し得る担体又は賦形剤が、本発明の医薬組成物を調製するのに使用することができる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, April 1997を参照のこと）。医薬組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下において無菌であり、安定している。医薬組成物は、液剤（例えば、生理食塩水、デキストロース溶液、もしくは緩衝溶液、又は、他の薬学的に許容し得る無菌流体）、微小エマルション剤、リポソーム剤、又は、高い製品濃度を収容するのに適した他の規則正しい構造体（例えば、微粒子又はナノ粒子）として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散剤の場合には、必要とされる粒径の維持により、及び、界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。注入用組成物の延長した吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含ませることによりもたらすことができる。本発明の製品は、例えば、組成物中に徐放性ポリマー又は急速な放出から本製品を保護する他の担体を含む放出制御製剤（インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む）において投与することができる。生分解性及び生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセタート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）を使用することができる。好ましくは、前記医薬組成物は、液剤として、より好ましくは、場合により緩衝生理食塩水溶液として製剤化される。
【０１１０】
補助的な活性化合物も、本発明の医薬組成物中に包含することができる。更なる治療剤の共投与のガイダンスは、例えば、the Compendium of Pharmaceutical and Specialties (CPS) of the Canadian Pharmacists Associationに見出すことができる。
【０１１１】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の医薬組成物は、非経口医薬組成物であり、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内投与に適した組成物を含む。これらの医薬組成物は、単なる例示であり、他の非経口及び経口投与経路に適した医薬組成物を制限するものではない。
【０１１２】
本発明の文脈において、「有効量」は、治療的に有効な量を意味する。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、「治療的に有効な量」は、所望の治療的結果、例えば、銅輸送活性の向上による、胆汁中の銅の増大ならびに血清、感情、脳、及び尿中の銅の減少を達成するのに必要とされる用量及び期間において有効な量を意味する。本発明の製品又はそれを含む医薬組成物の治療的に有効な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに製品又は医薬組成物が個体中で所望の応答を引き出す能力等の要因に応じて変動する場合がある。投与計画は、最適な治療応答を提供するのに調節することができる。治療的に有効な量は、典型的には、治療的に有益な効果が本製品又は医薬組成物の任意の毒性又は有害な作用を上回る量でもある。
【０１１４】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の製品を有する医薬組成物は、対象又は患者に非経口経路により投与される。
【０１１５】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内経路により投与される。
【０１１６】
一実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の製品を含む医薬組成物は、間質経路により、すなわち、組織の隙間への注入、又は、組織の隙間内への注入により投与される。組織ターゲットは、例えば、肝臓組織に特異的であることができ、又は、複数の組織の組み合わせ、例えば、筋肉及び肝臓組織であることができる。例示的な組織ターゲットは、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪堆積物、腎臓、肺、血管内皮、上皮及び／又は造血細胞を含むことができる。好ましい実施態様では、場合により、上記され又は以下に記載された種々の実施態様の１つ以上の特徴との組み合わせにおいて、本発明の製品を含む医薬組成物は、肝臓内注入、すなわち、肝臓組織の間質空間内への注入により投与される。
【０１１７】
対象又は患者に投与される本発明の製品量は、個々の対象／患者の特定の状態（個体の年齢、性別、及び体重を含む）；疾患の性質及びステージ、疾患の進行性；投与経路；ならびに／又は対象もしくは患者に処方された併用医薬に応じて変動する場合がある。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調節することができる。
【０１１８】
任意の特定の対象について、特別な投与計画が、個々の必要性及び、組成物を投与し、組成物の投与を管理する専門家の判断に従って、経時的に調節することができる。本明細書で説明された投与量範囲は、単なる例示であり、医療実務家が選択することができる投与量範囲を制限するものではない。
【０１１９】
一実施態様において、本発明のＡＡＶベクターは、患者に、ウィルソン病の処置のために、５×１０１１〜１×１０１４vg/kg（vg：ウイルスゲノム；kg：対象又は患者の体重）の範囲内に含まれる量又は用量で投与することができる。より特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは、１×１０１２〜１×１０１３vg/kgの範囲内に含まれる量で投与される。
【０１２０】
別の実施態様では、本発明のＨＣ−Ａｄベクターは、患者に、ウィルソン病の処置のために、１×１０９〜１×１０１１iu/kg（iu：ベクターの感染単位）の範囲内に含まれる量又は用量で投与することができる。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、更に、本発明の核酸構築物、ベクター、ホスト細胞、ウイルス粒子、又は医薬組成物を、１つ以上の容器中に含む、キットに関する。本発明のキットは、キット内に収容された本発明の核酸構築物、ベクター、ホスト細胞、又はウイルス粒子を患者に投与する方法を説明する説明書又は包装材を含むことができる。本キットの容器は、任意の適切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属等のものであることができ、任意の適切なサイズ、形状、又は構成のものであることができる。特定の実施態様では、本キットは、本発明の核酸構築物、ベクター、ホスト細胞、ウイルス粒子、又は医薬組成物を、適切な液状又は溶液状で収容する、１つ以上のアンプル又はシリンジを含むことができる。
【０１２２】
本説明及び特許請求の範囲の全体を通して、「含む」という語及びその変形例は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又は工程を除外することを意図していない。さらに、「含む」という語は、「からなる」の場合を包含する。本発明の更なる目的、利点、及び特徴は、本説明の検討に基づいて当業者に明らかになるであろう、又は、本発明の実施により知ることができる。下記実施例は、例示として提供され、本発明を限定することを意図するものではない。さらに、本発明は、本明細書に記載された特定の実施態様及び好ましい実施態様の全ての可能性のある組み合わせに及ぶ。
【実施例】
【０１２３】
実施例１．リコンビナント発現ベクターの構築
ヒトＡＴＰ７Ｂを有し、発現する２種類のＡＡＶベクター：ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂを、ウィルソン病（ＷＤ）の遺伝子治療用に、設計し、生成した。
【０１２４】
１．１  ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ
まず、プラスミドｐＵＣ−ＡＴＰ７Ｂを、核酸構築物をｐＵＣ５７プラスミド内にクローニングすることにより、要求に応じて構築した（GenScript）。核酸構築物は、ヒトＡＴＰ７Ｂ（導入遺伝子）をコードするｃＤＮＡ配列を、この導入遺伝子の下流の合成ポリアデニル化シグナル配列（Levitt N. et al. Genes & Development 1989; 3(7):1019-1025）と共に含有した。
【０１２５】
次に、アルファ１アンチトリプシン遺伝子（ＡＡＴ）のミニマルプロモータを、プラスミドｐＵＣ−ＡＴＰ７ＢのＡＴＰ７Ｂ遺伝子上流に導入した。ミニマルプロモータは、ＡＡＴプロモータのｃａｐ部位に対するヌクレオチド−２６１〜ヌクレオチド＋４４の配列からなり（Kramer M.G. et al. Mol. Therapy 2003; 7(3): 375-385）、肝臓機能に必要な組織特異的エレメント（ＴＳＥ）と、プロモータの全体活性に必要な遠位領域（ＤＲＩ）とを含有する。ＡＡＴプロモータは、（M.G. Kramerにより提供された）ｐＥｎｈＡｌｂＡＡＴ−ルシフェラーゼプラスミドをテンプレートとして使用し、下記プライマーを使用するＰＣＲ増幅により得られた。
【０１２６】
プライマーＡＡＴ−フォワード
5’ CTGGTCTAGAACGCGTCGCCACCCCCTCCACCTTGG 3’（配列番号：５）及び
プライマーＡＡＴ−リバース
5’ ATCATGATGCGGCCGCTTCACTGTCCCAGGTCAGTG 3’（配列番号：６）
【０１２７】
ＡＡＴ−フォワードプライマーは、ＸｂａＩ及びＭｌｕＩについての制限部位を有する。ＡＡＴ−リバースプライマーは、ＮｏｔＩについての制限部位を有する。
【０１２８】
したがって、プラスミドｐＵＣ−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂを得るために、プラスミドｐＵＣ−ＡＴＰ７Ｂを、ＸｂａＩ及びＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で予め消化されたＡＡＴプロモータをライゲーションした。
【０１２９】
その後、発現カセットを、ＡＡＶ導入プラスミドｐＡＡＶ−ＭＣＳ（Agilent technologies）内に、制限酵素ＰｍｌＩ及びＭｌｕＩでの消化によりサブクローニングし、これにより、プラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ（図１；配列番号：１）を生成した。
【０１３０】
プラスミドを構築した後、ＡＡＶベクターを、プラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ＡＴＰ７Ｂ及びプラスミドｐＤＰ８（PlasmidFactory, Bielefeld, Germany；プラスミドｐＤＰ８は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ２  ｒｅｐタンパク質、ならびに、ＡＡＶの生成及びパッケージングに必要なアデノウイルス分子を発現する）の、２９３細胞内への二重トランスフェクションにより作製した。
【０１３１】
このベクターを、イオジキサノール勾配により最終的に精製し、定量ＰＣＲによりタイトレーションした。
【０１３２】
１．２  ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ
コドン最適化版のＡＴＰ７Ｂ遺伝子（ｃｏＡＴＰ７Ｂ）を発現するＡＡＶベクターを得るために、まず、プラスミドｐＵＣ−ｃｏＡＴＰ７Ｂを、核酸構築物をｐＵＣ５７プラスミド内にクローニングすることにより、要求に応じて構築した（GenScript）。次に、ｃｏＡＴＰ７Ｂを、制限酵素ＮｏｔＩ及びＫｐｎＩによる消化により、ｐＵＣ−ｃｏＡＴＰ７Ｂから切除し、同じ酵素であるＮｏｔＩ及びＫｐｎＩで予め消化されたｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂプラスミド内にサブクローニングして、プラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂ（配列番号：２）を得た。
【０１３３】
プラスミドを構築した後、その生成及びウイルス粒子のパッケージングについて、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂについて先に記載されたように、先に得られたプラスミドｐＡＡＶ２−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７ＢとプラスミドｐＤＰ８との二重トランスフェクション、精製（イオジキサノール勾配）、及びタイトレーションを行った。
【０１３４】
実施例２．ウィルソン病動物モデル：ＡＴＰ７Ｂ  ＫＯ
ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂの治療性能を、ＷＤの代表的な動物モデルである、ＡＴＰ７Ｂノックアウトマウス（ＡＴＰ７Ｂ  ＫＯ、ＡＴＰ７Ｂ−／−、又はＷＤマウス）において試験した。この動物モデルは、Buiakova et al.によって、対向する転写フレーム中に方向付けられたネオマイシンカセットによりＡＴＰ７Ｂ  エクソン２の一部の置換を操作することで、マウスＡＴＰ７Ｂ  ｍＲＮＡに早期終止コドンを導入することにより開発された（Buikova O.I. et al. Human Molecular Genetics 1999; 8(9): 1665-1671）。ＡＴＰ７Ｂノックアウトマウスは、肝臓におけるＡＴＰ７Ｂの発現を示さず、尿中の高いＣｕ排泄、血清中の低いホロセルロプラスミンレベル、高いトランスアミナーゼレベル、肝臓中の高いＣｕ濃度、及び病的な肝臓組織学を示す。これらのマウスは、神経病変（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｆｆｅｃｔａｔｉｏｎ）を除いて、ヒトのウィルソン病の典型的な生化学的特徴を示す（Lutsenko S. Biochemical Society Transactions 2008; 36(Pt 6): 1233-1238）。
【０１３５】
実施例３．ウィルソン病マウスにおけるウイルスベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂの治療効果
６週（６ｗ）齢のオスＡＴＰ７Ｂ−／−マウスを、各５匹のマウスの３つの群に分割した。これらの群の２つに、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを、生理食塩水で希釈された２種類の用量１×１０１０vg/マウス（vg：ウイルスゲノム）及び３×１０１０vg/マウスそれぞれで静脈内処置した。第３の群は、処置しないままとした。野生型マウスの追加群を、対照群として処置せずに維持した。動物を、ベクター投与後２４週（ｗ３０）で殺処分した。
【０１３６】
ベクター投与後４週間（ｗ１０）及び３０週まで５週間毎（ｗ１５、ｗ２０、ｗ２５、及びｗ３０）に、血清トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベル、血清セルロプラスミン活性、及び尿中Ｃｕ含量を、全ての群において決定した。
【０１３７】
血清トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルを、Hitachi 747 Clinical Analyzer（Hitachi, Tokyo, Japan）を使用するＤＧＫＣ法（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）により決定した。
【０１３８】
血清セルロプラスミン活性を、基質としてのｏ−ジアニシジン二塩酸（４，４’−ジアミノ−３，３’−ジメトキシ−ビフェニル）（Sigma-Aldrich, San Louis, MO, United States）により、Schosinsky and cols.（Clinical Chemistry 1974; 20(12): 1556-1563）に記載されたように決定した。吸光度を、分光計において５４０nmで測定した。
【０１３９】
尿中銅含量を、原子吸光分光法（SIMAA 6000, from Perkin-Elmer GmbH, Bodenseewerk）により決定した。
【０１４０】
殺処分後、肝臓を、組織学的分析ならびにＣｕ含量、炎症、胆管増生、及び線維症の分析のために切除した。
【０１４１】
肝臓銅含量を、乾燥肝臓組織中において、原子吸光分光法（SIMAA 6000、Perkin-Elmer GmbH, Bodenseewerk）及びＴｉｍｍ’ｓスルフィド銀染色（Danscher G. and Zimmer J. Histochemistry 1978; 55(1): 27-40）により決定した。
【０１４２】
肝臓の構造を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された切片において評価した。
【０１４３】
抗マウスＣＤ４５抗体（BioLegend, San Diego, USA；カタログナンバー１０３１０２）による免疫組織化学を、肝臓における炎症性浸潤を検出するのに行った。
【０１４４】
抗マウスＰａｎＣｋ抗体（Invitrogen/Life Technologies, 18-0132, clon AE1/AE3）による免疫組織化学も、胆管細胞を検出するのに行った。
【０１４５】
線維症を判定するために、コラーゲン定量用の方法として、従来のSirius Red染色を使用した。
【０１４６】
肝臓炎症、胆管増生、及び線維症を定量的に分析するために、デジタル画像を、AxioImager.MI顕微鏡（Zeiss, Germany）により、自社のMetamorph macro（Molecular Devices, USA）を使用して取得した。この機器により、ランダムに位置する画像を、２０×（０．５０NAを有するPlan-Neofluar対物レンズ）において、取得される画像毎に、自動フォーカス、ホワイトバランス、及びシャドー補正してキャプチャするのが可能となった。全ての画像を、非圧縮２４-bitカラーＴＩＦＦフォーマットで保存した。画像を、Fiji, ImageJ.41用の開発されたプラグインを使用して、自動的に分析した。
【０１４７】
図２に示されたように、トランスアミナーゼレベルは、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂの独立した投与を受けたマウスにおいて正常化された。処置後４週間の早さで、血清トランスアミナーゼレベルは、有意に低下した（図２）。さらに、尿中のＣｕ濃度は、遺伝子治療ベクターを受けた動物において有意に低下した（図３）。セルロプラスミン活性は、高い方の用量のベクター（３×１０１０vg/マウス）を受けた動物において、処置後４週間で回復したが、低い方の用量を受けた動物では回復しなかった（図４）。
【０１４８】
一方、ベクターの投与により、肝臓におけるＣｕ含量は有意に減少した（図５Ａ）。この結果は、Ｔｉｍｍ’ｓ染色後に得られた画像において確認された（図６Ａ）。肝臓銅含量は、高い方の用量のベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを受けた全ての動物において、全体的に正常化されたことは、注目に値する（図５Ｂ）。肝臓の組織学に関して、処置されなかった動物は、巨大な核を含有する巨大な肝細胞を伴う異常な肝臓アーキテクチャを示した。ベクターの投与により、肝臓の組織学の正常化がもたらされた（図６Ｂ）。さらに、ウィルソン病動物は、ＣＤ４５陽性細胞により主に構成される強力な肝臓浸潤を表わした。浸潤は、リコンビナントウイルスベクターによる処置後に消失した（図７Ａ）。胆管増生（図７Ｂ）及び肝臓線維症（図７Ｃ）も、顕著に減少した。定量的なデータ分析から、高用量及び低用量の治療ウイルスにより、胆管増生及び線維症が有意に減少したが、高用量のウイルスのみによって、肝臓の炎症が正常化されたことが示唆された（図８）。
【０１４９】
実施例４．ウィルソン病マウスの銅代謝におけるウイルスベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ処置の効果
本発明のベクターにより生理学的な胆汁銅排泄を回復させることができるかを調査するために、６週齢のＷＤマウス（各群ｎ＝５）を、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ（静脈内経路で３×１０１０vg/マウス）で処置したか、又は、処置しないままとした。そして、ヘテロ接合性同腹子群を、対照として使用した。処置後２週間で、半分の動物に、１００μg ＣｕＳＯ４の腹腔内投与により、過負荷の銅（＋ＣｕＳＯ４）を受けさせた。もう一方の半分は、対照として生理食塩水を受けさせた（−ＣｕＳＯ４）。これらの動物を、２４時間の間に尿及び糞を収集するために、代謝ケージに入れた。
【０１５０】
ついで、尿及び糞中の銅含量は、フレーム原子吸光分光法（Perkin Elmer AAnalyst 800, Norwalk, CT, USA）により決定した。
【０１５１】
ＷＴ対照動物及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ処置ＷＤマウスは、同様に、過剰の銅を糞中に排泄することができた（図９Ａ）。対照的に、銅の過負荷により、処置されなかったＷＤマウスにおいて、糞中銅排泄は変化しなかった。結果として、胆汁銅は、この群において、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ処置ＷＤマウスと比較して有意に高かった（図９Ｂ）。
【０１５２】
これらのデータは、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７ＢによりＷＤマウスにおける正常な銅代謝が回復したことを、明らかに説明している。
【０１５３】
実施例５．ウィルソン病マウスにおけるウイルスベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂの治療効果
６週（６ｗ）齢のオスＡＴＰ７Ｂ−／−マウスを、３つのマウス群に分割した。第１の群に、ベクターＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂを、生理食塩水で希釈された１×１０１０vg/マウスの最適以下用量で、静脈内処置した。第２の群に、同じ方法で、ＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂを処置した。第３の群は、処置しないままとした。野生型マウスの追加群を、対照群として処置せずに維持した。動物を、ベクター投与後２４週間（ｗ３０）で殺処分した。
【０１５４】
ベクター投与後４週間及び３０週まで５週間毎に、血清トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベル、血清セルロプラスミン活性、及び尿中Ｃｕ含量を、全ての群において決定した。動物の殺処分後、肝臓を、組織学的分析及びＣｕ含量分析のために切除した。
【０１５５】
図１０に示されたように、最適以下用量で与えられたＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｗｔＡＴＰ７Ｂ及びＡＡＶ２／８−ＡＡＴ−ｃｏＡＴＰ７Ｂの両方により、ＷＤマウスの肝臓における銅蓄積が減少した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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