(57)【要約】  （−）−アンブロックスならびに化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含む反応混合物から、（−）−アンブロックスを単離および精製する方法。
2018513198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）
【化１】
2018513198.tif 000009
の１種以上を含む反応混合物から、（−）−アンブロックスを単離および精製する方法。
【請求項２】
化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の１種以上を含む反応混合物から、（−）−アンブロックスを選択的に結晶化するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分離後に（−）−アンブロックスが化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）を含有しないか、あるいは、嗅覚的に許容可能な量のみの化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）を含有するように、混合物からの（−）−アンブロックスの選択的結晶化によって、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の１種以上を含む混合物から、（−）−アンブロックスを分離するステップを含む、（−）−アンブロックスの匂いを改善または増強する方法。
【請求項４】
混合物が、ホモファルネソールを含まない、または実質的に含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
結晶化溶媒が、水、メタノール、アセトン、石油エーテル、ヘキサン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ＴＨＦおよび酢酸エチルエタノール、トルエンならびにその混合物からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
結晶化溶媒が、エタノール水混合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
混合物が、ホモファルネソールの７Ｅ，３Ｅおよび７Ｅ，３Ｚホモファルネソール幾何異性体の混合物を含むホモファルネソールの酵素触媒環化反応の結果として形成され、反応が、酵素をコードする遺伝子を発現する組み換え微生物の存在下で行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
７Ｅ，３Ｅおよび７Ｅ，３Ｚホモファルネソールの混合物が、７Ｅ，３Ｅ幾何異性体が豊富である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
７Ｅ，３Ｅおよび７Ｅ，３Ｚホモファルネソールの混合物が、７Ｅ，３Ｅおよび７Ｅ，３Ｚホモファルネソールからなり、他のホモファルネソール幾何異性体を含まない、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
７Ｅ，３Ｅ異性体の７Ｅ，３Ｚ異性体に対する重量比が、少なくとも８０：２０、より具体的には少なくとも９０：１０、より具体的にはさらに少なくとも９５：５である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
酵素が、野生型スクアレンホペン環化酵素または野生型スクアレンホペン環化酵素の変異型である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（−）−アンブロックスおよび嗅覚的に許容可能な量の１種以上の化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）からなる、香料成分。
【請求項１３】
結晶の（−）−アンブロックスを含む、請求項１２に記載の香料成分。
【請求項１４】
（−）−アンブロックスおよび少なくとも１種の他の香料成分を含む香料組成物であって、前記香料組成物は、嗅覚的に許容可能な量の１種以上の化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）を含有する、前記香料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異性体（−）−アンブロックス（Ａｍｂｒｏｘ）を調製、単離および精製する方法に関する。より具体的には、本発明は、生物変換によって、（−）−アンブロックスを調製する方法、ならびに反応混合物からそれを回収および精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＭＢＲＯＦＩＸ（商標）は、一般式（Ｉ）
【化１】
2018513198.tif 000003
を有する、鏡像異性体的に純粋な化合物（−）−アンブロックスの、所有者であるジボダン（Ｇｉｖａｕｄａｎ）の商品名である。
ＡＭＢＲＯＦＩＸ（商標）は、パーフューマーのパレット成分において非常に重要な分子である。これは、あらゆる香料製品における使用のための、極めて強力で、極めて実質的で、かつ極めて安定なアンバー様（ambery）ノートを出す。ＡＭＢＲＯＦＩＸ（商標）は、ジボダンから入手可能であり、本格的なアンバーグリス（ambergris）匂いノートを得るのに最も好適な材料である。
【０００３】
現在、ＡＭＢＲＯＦＩＸ（商標）は、自然由来の出発物質から合成により生産されている。特定の出発物質の供給と質は、気候条件ならびに社会経済的要因に依存している。さらに、出発物質が天然資源から少量の産生量で抽出されることもあり得るため、ほぼ確実に、工業規模ではそれらの使用をますます不経済なものにしていくであろう価格で市販されている。したがって、ＡＭＢＲＯＦＩＸ（商標）の大量生産的な工業的供給を、合理的費用で利用し続けていこうとするならば、工業化可能な、より費用対効果の高いプロセスに対する必要性が存在する。
【０００４】
ＡＭＢＲＯＦＩＸ（商標）への工業的に拡張可能なバイオ技術的経路は、完全に合成的な手順よりも、潜在的により複雑でなく、より汚染が少ないことから、魅力的であろう。
（−）−アンブロックスを供給するための生物変換を試みるのに潜在的に使用可能な基質は、ホモファルネソールである。影響力のあるその論文において、Neumannら (Biol. Chem. Hoppe-Seyler Vol. 367 pp 723-726 (1986))は、酵素スクアレンホペン環化酵素（ＳＨＣ）を用いた酵素的触媒下での、ホモファルネソールの（−）−アンブロックスへの転換の実現性について議論した。用いられたホモファルネソールは、この分子の４種の幾何異性体混合物であった。４種の異性体のうち、７Ｅ，３Ｅ幾何異性体（通常の命名法を用いた）だけを環化することができるので、所望の（−）−アンブロックスの非常に低い収量が得られるに過ぎない。
【０００５】
JP 2009-60799(花王)は、それによりＳＨＣが（−）−アンブロックスを産生するためのホモファルネソール基質に作用する合成を開示している。基質は、４種の幾何異性体（３Ｚ，７Ｚ；３Ｅ，７Ｚ；３Ｚ，７Ｅ；および３Ｅ，７Ｅ）全ての混合物である。同文献は、ＳＨＣを含有するホモファルネソール抽出物からの（−）−アンブロックスの調製を開示するのみである。ホモファルネソール混合物は、（−）−アンブロックスとその９−エピ立体異性体に変換され、精製は、蒸留またはカラムクロマトグラフィーにより行うことができる。花王は、ＳＨＣを産生するそのままの微生物を用いてホモファルネソールを（−）−アンブロックスに変換するプロセスについては記載しておらず、さらに、（−）−アンブロックスを嗅覚的に純粋な形態で得ることができるそのようなプロセスにより得られる複雑な混合物の下流のプロセシングに関して、全く技術的な教示を提供していない。
【０００６】
出願人の知る限り、従来技術は、ホモファルネソールのＳＨＣ触媒生物変換を含む、（−）−アンブロックスを嗅覚的に純粋な形態で提供するための、実行可能で工業的に拡張可能なプロセスについて全く記載していない。
さらに、ホモファルネソールの生物変換が工業的規模で実現されるようになっても、極めて純度の高い３Ｅ，７Ｅ−ホモファルネソールの費用効率の高いソースが入手可能でなければならない。しかしながら、ホモファルネソールの合成経路は文献（例えば、US 2013/0273619を参照）に記載されているが、出願人の知る限り、費用対効果の高い、現在入手可能な純粋な７Ｅ，３Ｅ−ホモファルネソールの工業的規模のソースは存在しない。
【０００７】
価値ある香料成分（−）−アンブロックスへの、経済的に実現可能でありかつ工業的に拡張可能な経路を提供する必要がある。
同時係属中の特許出願PCT/EP2014/072891（WO2015/059293として公開）およびPCT2014/EP/072882（WO2015/059290として公開）において、出願人は、７Ｅ，３Ｅ幾何異性体が豊富な７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソール混合物を調製する効率的方法について記載している。７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソール混合物は、ベータ−ファルネセンから調製され、この出発物質に含有されている異性体情報は、７位のホモファルネソール二重結合がＥ−配置で固定されるというように、保存されている。しかしながら、この洗練された化学も、まだ３Ｅ／Ｚ異性体混合物をもたらす。純粋な７Ｅ，３Ｅ−ホモファルネソールは、合成的には難易度が高いままであり、異性体混合物の経済的に不利な精製という手段によってのみ達成され得る。
【０００８】
驚くべきことに、出願人は、７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソール混合物が、生物変換プロセスを受けることができ、それによりホモファルネソール混合物が、酵素、特にホモファルネソールを（−）−アンブロックスに生物変換することができるスクアレンホペン環化酵素（ＳＨＣ）生物触媒、を発現する組み換え微生物の存在下で酵素的に環化されて、（−）−アンブロックスを驚くほど容易な下流プロセシングにより嗅覚的に純粋な形態で単離し得る反応混合物を産生することを見出した。
【０００９】
本発明の一つの側面において、（−）−アンブロックスを含む反応混合物を提供するための、ホモファルネソールの酵素触媒環化が提供され、ここで、ホモファルネソールは、ホモファルネソールの７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−幾何異性体の混合物を含み、反応は、酵素を産生する組み換え微生物、より具体的には酵素を産生する無傷の（intact）組み換え微生物の存在下で行われる。
【００１０】
本発明の態様において、環化反応は、ホモファルネソールを（−）−アンブロックスに生物変換することができるＳＨＣ生物触媒の存在下で行われる。
ＳＨＣ生物触媒は、野生型もしくは変異型酵素であるか、またはＳＨＣ酵素をコードする遺伝子を発現する微生物、好ましくは組み換え大腸菌微生物である。ＳＨＣ生物触媒は、これらに限定されないが、精製されたＳＨＣ酵素、ＳＨＣ酵素を含有する粗（crude）抽出物、または（例えば、担体上に）固定化されたＳＨＣ酵素などのあらゆる形態で用いることができ、あるいは、生物触媒は、ＳＨＣ酵素を含有する、無傷の組み換え全細胞および／または断片化細胞または膜分画などの、ＳＨＣを産生したもしくは産生する微生物であってもよい。
【００１１】
本発明の具体的態様においては、ホモファルネソール混合物は、７Ｅ，３Ｅ−幾何異性体が豊富である。
より具体的な態様においては、ホモファルネソール混合物は、少なくとも７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚの重量で５５／４５である。
より具体的な態様においては、ホモファルネソール混合物は、少なくとも７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚの重量で７０／３０である。
さらにより具体的な態様において、ホモファルネソール混合物は、少なくとも７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚの重量で８０／２０である。
さらにより具体的な態様において、ホモファルネソール混合物は、少なくとも７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚの重量で９０／１０である。
さらにより具体的な態様において、ホモファルネソール混合物は、少なくとも７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚの重量で９５／５である。
本発明の具体的態様においては、ホモファルネソール混合物は、ホモファルネソールの７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−幾何異性体からなり、他の幾何異性体を含まない。
【００１２】
当業者は、ホモファルネソールに関連して用いられる用語７Ｅ、７Ｚ、３Ｅまたは３Ｚが、それぞれ、ホモファルネソールの７位および３位における二重結合の配向性について言及することを理解する。７Ｅ，３Ｅ−ホモファルネソール化合物はCAS No. 459-89-2を有するのに対し、７Ｅ，３Ｚ−ホモファルネソール化合物はCAS No. 138152-06-4を有する。用語７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソールの使用は、その化合物の混合物について言及する。
【００１３】
本発明の方法にしたがって、環化反応における基質として有用なホモファルネソール混合物を得る方法は、上記で言及した同時係属中の出願PCT/EP2014/072891（WO2015/059293として公開）およびPCT2014/EP/072882（WO2015/059290として公開）において記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。一般論として、これらは、Ｎ−アルキル−Ｎ−ニトロソ尿素の有機溶液を用いて、ファルネセン、より具体的には、アルファ―ファルネセンおよび／またはベータ−ファルネセンを、それに対応するシクロプロパン化されたファルネセン誘導体に変換することによって進行するホモファルネソール混合物の合成について記載している。次いで、シクロプロパン化された誘導体は、７Ｅ，３Ｅ幾何異性体に選択的なホモファルネソール混合物を提供する、ブロンステッド酸の存在下での開環および転位反応を受ける。出発物質としてファルネセンを用いることは、ホモファルネソールの７位における二重結合のＥ−構造が固定されるのを確保するため、特に好ましい。
【００１４】
本発明の特定の態様を形成する特別な反応条件は、同時係属中の出願ならびに本明細書の下記における例に記載されており、ここではこれ以上詳述しない。
（−）−アンブロックスを含有する反応混合物を提供するホモファルネソールの環化は、スクアレンホペン環化酵素（ＳＨＣ）により触媒され得る。ＳＨＣは、野生型酵素（例えば、配列番号１）またはその変異型（例えば、配列番号２または配列番号４）であってもよい。ＳＨＣは、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius（バシラス・アシドカルダリウス）（Bacillus acidocaldarius）））、ジモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、または（US20120135477A1の例３ｂに記載されているように）ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）から得ることができる。
【００１５】
しかしながら、酵素はまた、当該分野において通常知られている技術を用いて、組み換え手段により産生することもできる。
酵素に関して用いられる用語「組み換え」は、組み換えＤＮＡ技術によって産生される、すなわち所望の酵素をコードする外来性ＤＮＡコンストラクトによって形質転換された細胞から産生される、酵素を言うものとする。したがって、用語「組み換えＤＮＡ」は、ベクターに、自己複製プラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ（もしくは、天然の染色体上の部位以外の位置において、相同な細胞のゲノム）に組み込まれた組み換えＤＮＡを包含する。
【００１６】
核酸分子は、原核生物および／または真核生物宿主細胞における発現を可能にする発現制御配列に動作可能に連結される。本明細書において用いられる「動作可能に連結される」は、発現制御配列が、目的のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝子コンストラクトに組み込まれていることを意味する。上で言及した転写／翻訳制御エレメントは、誘導性および非誘導性、構成的、細胞周期により制御される、代謝により制御されるプロモーター、エンハンサー、オペレーター、サイレンサー、リプレッサー、ならびに当業者に公知であり、遺伝子発現を駆動または別様に制御する他のエレメントを包含するが、これらに限定されない。かかる制御エレメントは、構成的発現に向かわせるかあるいは、例えばCUP-1プロモーター、例えばｔｅｔオンまたはｔｅｔオフシステムに採用されるｔｅｔリプレッサー、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム制御エレメントのように誘導性発現を可能にする、制御エレメントを包含するが、これらに限定されない。例として、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は１００μＭから１．０ｍＭの濃度範囲内においてタンパク質発現の効果的な誘導因子である。この化合物は、ｌａｃオペロンの転写を惹起するラクトース代謝物質であるアロラクトースの分子模倣体であり、それゆえに、遺伝子がｌａｃオペレーターの制御下にあるときにタンパク質発現を誘導するために用いられる。
【００１７】
同様に、核酸分子は、追加のポリペプチド配列、例えばマーカーまたはレポーターとして機能する配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成し得る。マーカーおよびレポーター遺伝子の例には、ベータ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、（ベータ−ガラクトシダーゼをコードする）ｌａｃＺ、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が含まれる。本開示の実施に関係する標準的手順の多くと同じく、当業者は追加の有用な試薬、例えばマーカーまたはレポーターの機能を果たし得る追加の配列を知っているであろう。
【００１８】
組み換えポリヌクレオチドは、野生型ＳＨＣまたはその変異型などのＳＨＣ酵素をコードすることができ、これは発現および任意の精製のためにベクター中に挿入され得る。ある種のベクターは、その中に追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされている環状二本鎖ＤＮＡループを代表するプラスミドである。あるベクターは、それらが機能的に連結された遺伝子の発現を制御することができる。これらのベクターは「発現ベクター」と呼ばれる。通常は、ＤＮＡ組み換え技術に好適な発現ベクターはプラスミド型である。典型的には、発現ベクターは、野生型ＳＨＣまたはその変異型などの遺伝子を含む。プラスミドは最も多くの場合に用いられるベクター型であるので、本明細書において、用語「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。
【００１９】
かかるベクターは、宿主細胞中に天然には存在しないＤＮＡ配列、通常はＲＮＡに転写またはタンパク質に翻訳（「発現」）されないＤＮＡ配列、および非組み換え宿主に導入したい他の遺伝子またはＤＮＡ配列を包含するが、これらに限定されないＤＮＡ配列を包含し得る。典型的には、組み換え宿主のゲノムは、１種以上の組み換え遺伝子の安定な導入によって拡張されるということが理解されるであろう。しかしながら、自己または複製プラスミドもしくはベクターもまた、本開示の範囲内において用いられ得る。さらに、本開示は、低コピー数、例えば単一コピー、または高コピー数であるプラスミドまたはベクターを用いて実施され得る。
【００２０】
好ましい態様において、本開示のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、人工細菌および人工酵母染色体、ノックアウトまたはノックインコンストラクト、合成核酸配列、あるいはカセットを含み、一部は直鎖状ポリヌクレオチド、プラスミド、メガプラスミド、植物、細菌、哺乳類、もしくは酵母人工染色体などの合成または人工染色体の形態で産生され得る。
【００２１】
導入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、ベクターの導入時に細胞内で産生されることが好ましい。多様な遺伝子基質がプラスミド中に組み込まれ得る。プラスミドは多くの場合、標準的なクローニングベクター、例えば細菌マルチコピープラスミドである。基質同士は同じかまたは異なるプラスミド中に組み込まれ得る。多くの場合、異なる型の選択可能なマーカーを有するプラスミドの少なくとも２つの異なる型が用いられ、少なくとも２つの型のベクターを含有する細胞の選択を可能にする。
【００２２】
典型的には、細菌または酵母細胞が、当分野において周知であるように下記ヌクレオチド配列のいずれか１種以上によって形質転換され得る。インビボ組み換えのためには、ゲノムまたは他の遺伝子と組換えられるべき遺伝子が、標準的な形質転換技術を用いて宿主を形質転換するために用いられる。好適な態様においては、複製起点を提供するＤＮＡがコンストラクト中に包含される。複製起点は当業者によって適切に選択され得る。遺伝子の性質に応じて、配列が、それら自体で複製起点として作動可能である遺伝子またはゲノムに既に存在する場合には、補足的な複製起点は必要とされないこともある。
【００２３】
細菌または酵母細胞は、かかるＤＮＡが細胞内に導入されたときに、外来性または異種ＤＮＡによって形質転換され得る。形質転換ＤＮＡは統合され（integrated）、すなわち細胞のゲノム中に共有結合的に連結されてもよく、もしくは統合されなくてもよい。原核生物および酵母において、例えば、形質転換ＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメントとして維持され得る。真核生物細胞に関しては、安定にトランスフェクションされた細胞は、トランスフェクションされたＤＮＡが、それが染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるように染色体に統合されたものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団で構成される細胞株またはクローンを樹立する真核生物細胞の能力によって示される。
【００２４】
一般的に、導入されるＤＮＡは、ＤＮＡの受容者である宿主に元々内在してはいないが、所与の宿主からＤＮＡセグメントを単離し、引き続いてそのＤＮＡの１つ以上の追加コピーを同じ宿主に導入して、例えば遺伝子産物の産生を増強するかまたは遺伝子の発現パターンを変化させることは本開示の範囲内である。いくつかの場合には、導入されたＤＮＡは、内因性の遺伝子またはＤＮＡ配列を、例えば相同組み換えまたは部位特異的変異導入により、改変するかまたはさらには置換するであろう。好適な組み換え宿主には、微生物、植物細胞、および植物が含まれる。
【００２５】
本開示はまた、組み換え宿主をも特徴とする。用語「組み換え宿主」はまた、「遺伝子改変宿主細胞」または「トランスジェニック細胞」ともまた言われ、異種核酸を含むか、またはそのゲノムが少なくとも１つの組み込まれたＤＮＡ配列によって拡張された宿主細胞を指す。本開示の宿主細胞は、上で概説されているようにポリヌクレオチドまたはベクターによって遺伝子改変され得る。
【００２６】
本開示の目的のために用いられ得る宿主細胞には、例えば、本開示のポリヌクレオチド分子を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、細菌人工染色体、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換され得る細菌（例えば大腸菌および枯草菌）などの原核生物細胞；例えば本開示のポリヌクレオチド分子を含有する組み換え酵母発現ベクターによって、形質転換され得る酵母（例えばサッカロミセス（Saccharomyces）およびピキア（Pichia））のような単純な真核生物細胞、が包まれるが、それに限定されない。本開示のポリヌクレオチドを導入するために用いられる宿主細胞およびそれぞれのベクターに応じて、ポリヌクレオチドは例えば染色体もしくはミトコンドリアＤＮＡに統合し得るか、または例えばエピソームに、のように染色体外に、維持され得るか、または一過性にのみ細胞内に含まれ得る。
【００２７】
特に遺伝子工学、および１種以上の遺伝子または遺伝子の集合クラスターを細胞に導入することに言及して本明細書において用いられる用語「細胞」または産生細胞は、あらゆる原核生物または真核生物細胞を言うと理解される。原核生物および真核生物宿主細胞は両方とも、本開示に従った使用を企図され、大腸菌もしくはバシラス種のような細菌宿主細胞、Ｓ・セレビシエなどの酵母宿主細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptora frugiperda）などの昆虫宿主細胞、またはHeLaおよびJurkatなどのヒト宿主細胞を包含する。
【００２８】
具体的には、細胞は真核生物細胞、好ましくは真菌、哺乳類もしくは植物細胞、または原核生物細胞である。好適な真核細胞には、例えば限定なしに哺乳類細胞、酵母細胞、または（Sf9を包含する）昆虫細胞、（黒色素胞細胞を包含する）両生類細胞、または（カエノラブディティス・エレガンスを包含する）カエノラブディティスの細胞を包含する蠕虫細胞が含まれる。好適な哺乳類細胞には、例えば限定なしに（Cos-1およびCos-7を包含する）COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、HEK293 T-RexTM細胞、または他のトランスフェクション可能な真核細胞株が含まれる。好適な細菌細胞には、限定なしに大腸菌が含まれる。
【００２９】
好ましくは、大腸菌、バシラス、ストレプトミセス（Streptomyces）などの原核生物、またはHeLa細胞もしくはJurkat細胞のような哺乳類細胞、またはシロイヌナズナ（Arabidopsis）のような植物細胞が用いられ得る。
好ましくは、細胞はアスペルギルス種または真菌細胞であり、好ましくは、これは属サッカロミセス、カンジタ、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ハンゼヌラ（Hansenula）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、ヤロウィア（Yarrowia）、ピキア、およびアスペルギルスからなる群から選択され得る。
好ましくは、大腸菌宿主細胞は、産業界および規制当局によって認識されている大腸菌宿主細胞である（大腸菌 K12宿主細胞または例に示されている大腸菌 BL21宿主細胞を包含するが、これらに限定されない）。
【００３０】
本開示で用いるための１種の好ましい宿主細胞は大腸菌であり、これは本明細書に記載されているように組み換え的に調製され得る。それゆえに、組み換え宿主は、組み換え大腸菌宿主細胞であり得る。大腸菌については、利用可能な変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報のライブラリーがあり、生成物収率を増強するための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。サッカロミセスについて上で記載されているものと類似の方法が、組み換え大腸菌微生物を作るために用いられ得る。
１つの態様において、組み換え大腸菌微生物は、ＳＨＣ遺伝子をコードするヌクレオチド配列、またはそのバリアント、ホモログ、変異体、誘導体、または断片を包含するが、これらに限定されないその機能的同等物／相同物を含む。
【００３１】
本開示に使用するための別の好ましい宿主細胞はＳ・セレビシエであり、これは合成生物学においてシャシー生物として広く用いられている。それゆえに、組み換え宿主はＳ・セレビシエであり得る。Ｓ・セレビシエについては、利用可能な変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報のライブラリーがあり、生成物収率を増強するための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。組み換えＳ・セレビシエ微生物を作るための方法は既知である。
【００３２】
細胞の培養は従来の様式で行われる。培養培地は炭素源、少なくとも１つの窒素源、および無機塩を含有し、ビタミンがそれに追加される。この培地の構成成分は、当該微生物種を培養するために従来用いられているものであり得る。
本方法にいて用いられる炭素源には、組み換え宿主細胞によって代謝されて増殖および／または（−）−アンブロックスの産生を促進し得るあらゆる分子が含まれる。好適な炭素源の例には、（例えばモラセス中に見いだされる）スクロース、フルクトース、キシロース、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオース、または他のグルコース含有ポリマーを包含するが、これらに限定されない。
【００３３】
宿主として酵母を採用する態様においては、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、およびグルコースなどの炭素源が好適である。炭素源は、培養期間に渡って宿主生物に提供することができ、また代替的には、生物を別のエネルギー源、例えばタンパク質の存在下においてある期間増殖させ、それから流加相（fed-batch phase）の間のみ炭素源を提供することができる。
【００３４】
本開示の方法において使用するための組み換え宿主細胞微生物の好適性は、周知の方法を用いる単純な試験手順によって決定され得る。例えば、試験されるべき微生物は、微生物の増殖のために一般的に用いられるｐＨ、温度、および通気条件において富栄養培地（例えば、ＬＢ培地、バクトトリプトン酵母エキストラクト培地、栄養培地等）で増殖させ得る。一旦、所望の生物変換生成物を産生する組み換え微生物（すなわち組み換え宿主細胞）が選択されれば、生成物は、典型的には産生宿主細胞株によって大スケールで、好適な発現システムおよび発酵によって、例えば細胞培養物中の微生物産生によって、産生される。
【００３５】
本開示の１つの態様においては、Ｍ９Ａなどの限定最少培地が細胞培養に用いられる。Ｍ９Ａ培地の構成成分は、ＫＨ２ＰＯ４ １４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １６ｇ／Ｌ、クエン酸Ｎａ３．２Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ７．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ ０．０１５ｇ／Ｌ、グルコース ５ｇ／Ｌ、および酵母エキストラクト １．２５ｇ／Ｌを含む）。
本開示の別の態様においては、ＬＢなどの富栄養培地が用いられた。ＬＢ（Luria-Bertani）培地の構成成分は１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキストラクト、５ｇ／ＬのＮａＣｌを含む。
【００３６】
ミネラル培地およびＭ９ミネラル培地の他の例は、例えばUS6524831B2およびUS2003/0092143A1に開示されている。
組み換え微生物は、バッチ（batch）、流加（fed batch）、もしくは連続プロセス、またはその組み合わせによって増殖させることができる。典型的には、組み換え微生物は、発酵槽（fermentor）内で定められた温度で好適な栄養源、例えば炭素源、の存在下において所望の期間増殖させ、ホモファルネソールを所望の量で（−）−アンブロックスに生物変換する。
【００３７】
組み換え宿主細胞はいずれかの好適な様式で、例えばバッチ培養または流加培養によって、培養され得る。本明細書において用いられる用語「バッチ培養」は、培養培地が培養の間に追加も取り出しもされない培養方法である。本明細書において用いられる用語「流加」は、培養培地が培養の間に追加されるが、培養培地は取り出されない培養方法を意味する。
【００３８】
本開示の１つの態様は、細胞系システムにおいて（−）−アンブロックスを産生する方法を提供し、前記方法は、野生型ＳＨＣまたはその変異型を好適な条件下において細胞系システムにおいて産生すること、ホモファルネソールを細胞系システムに供給する（feed）こと、細胞系システムを用いて産生された野生型ＳＨＣまたはその変異型を用いてホモファルネソールを（−）−アンブロックスに変換することと、細胞系システムからアンブロックスを回収すること、およびシステムから（−）−アンブロックスを単離することを含む。他のヌクレオチド配列の発現は、（−）−アンブロックスを作る生物変換経路を増強するために役立つ。
【００３９】
本開示のさらなる態様は、（−）−アンブロックスを作る生物変換方法であり、前記方法は、野生型ＳＨＣまたはその変異型遺伝子を含む宿主細胞を増殖させること、野生型ＳＨＣまたはその変異型酵素を宿主細胞において産生すること、ホモファルネソール（例えばＥＥＨ）を宿主細胞に供給すること、ホモファルネソールのアンブロックスへの変換を促進するために適切なｐＨ、温度、および可溶化剤の条件下において宿主細胞をインキュベートすること、ならびに（−）−アンブロックスを回収することを含む。宿主細胞における野生型ＳＨＣまたはその変異型酵素の産生は、ホモファルネソールが好適な反応条件下において宿主細胞に添加されたときに（−）−アンブロックスを作る方法を提供する。達成される変換は、より多くの生体触媒およびＳＤＳを反応混合物に添加することによって増強され得る。
【００４０】
組み換え宿主細胞微生物は、引き続く生物変換ステップのための野生型ＳＨＣまたは変異型体酵素を発現する好適な量の細胞を提供するために、数多くのやり方で培養することができる。生物変換ステップのための適用可能な微生物は大幅に変わるので（例えば酵母、細菌、および真菌）、当然のことながら、培養条件はそれぞれの種の特定の要件に合わせて調整され、それらの条件は周知であり文書化されている。組み換え宿主細胞微生物の細胞を増殖させるための当分野において既知の方法はどれでも、本開示の引き続く生物変換ステップに利用可能な細胞を産生するために用いることができる。典型的には、細胞は、生物変換反応のための十分なバイオマスを産生するため（光学密度（ＯＤ）として測定可能であるように）特定の密度まで増殖させる。選ばれる培養条件は、得られる細胞（バイオマス）の量に影響を与えるのみならず、培養条件の質もまたどのようにバイオマスが生体触媒になるかに影響を与える。野生型ＳＨＣまたは変異型遺伝子を発現し野生型ＳＨＣまたは変異型酵素を産生する組み換え宿主細胞微生物は、生物変換反応における使用に好適である生体触媒と呼ばれる。いくつかの態様において、生体触媒は、野生型ＳＨＣまたは変異型を産生する組み換え全細胞であるか、またはそれは懸濁液もしくは固定されたフォーマットであり得る。
【００４１】
１つの態様においては、生体触媒は、（十分なバイオマスを作り出すために）十分量で産生され、収穫され、生物変換ステップの前に洗浄される（かつ、任意に保存される（例えば凍結または凍結乾燥される））。
さらなる態様においては、細胞は（十分な生体触媒を作り出すために）十分量で産生され、次いで、生物変換反応のために生体触媒を収穫および洗浄する必要なく、反応条件が調整される。このワンステップ（または「ワンポット」）方法は、それがコストを減じながらプロセスを単純化するので有利である。細胞を増殖させるために用いられる培養培地は、反応条件が生物変換反応を促進するように調整されている場合には、生物変換反応における使用にもまた好適である。
【００４２】
本開示の生物変換方法は、ホモファルネソール原料ストックの（−）−アンブロックスへの変換をもたらすための時間、温度、ｐＨ、および可溶化剤の条件下において行われる。反応混合物のｐＨは、ＳＨＣ変異型酵素では４〜８、好ましくは５から６．５、より好ましくは４．８〜６．０の範囲内、野生型ＳＨＣ酵素では約ｐＨ５．０から約ｐＨ７．０の範囲内であってもよく、反応混合物への緩衝液の添加によって維持することができる。この目的のための例示的な緩衝液はクエン酸緩衝液である。好ましい温度は約１５℃および約４５℃の間、好ましくは約２０℃および約４０℃の間であるが、これは好熱性生物では、特に好熱性微生物からの野生型酵素が用いられる場合にはより高く、５５℃までであり得る。温度は生物変換プロセスの間は一定に保たれてもよく、または変更されてもよい。
【００４３】
出願人は、可溶化剤（例えば界面活性剤、洗剤、可溶性増強剤、水混和性有機溶媒等）を生物変換反応中に包含することが有用であり得ることを示している。界面活性剤の例には、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、タウロデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および／またはラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
出願人は、他のより有用でない可溶化剤の長いリストから、特に有用な可溶化剤としてＳＤＳを選択および同定した。特に、出願人は、ホモファルネソールの（−）−アンブロックスへの生物変換反応について反応速度および収率の観点から、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００よりも顕著に優れた可溶化剤としてＳＤＳを同定した。
【００４４】
理論によって拘束されることを望むものではないが、組み換え微生物宿主細胞へのＳＤＳの使用は、ＳＤＳがＳＨＣ酵素（これは膜結合酵素である）をホモファルネソール基質に対してよりアクセス可能にするために、宿主細胞膜と有利に相互作用し得るので有利であり得る。加えて、反応混合物中における好適なレベルでのＳＤＳの包含は、エマルジョン（水中のホモファルネソール）の特性を改善し、および／または宿主細胞内のＳＨＣ酵素へのホモファルネソール基質のアクセスを改善し得る一方で、同時に破壊（例えば、野生型ＳＨＣまたは変異型酵素の変性／不活性化）を防ぐ。
【００４５】
生物変換反応に用いられる可溶化剤（例えばＳＤＳ）の濃度は、バイオマス量および基質（ＥＥＨ）濃度によって影響される。すなわち、可溶化剤（例えばＳＤＳ）濃度、バイオマス量、および基質（ＥＥＨ）濃度の間には、ある程度の相互依存性がある。例として、ホモファルネソール基質の濃度が増大すると、効率的な生物変換反応が起こるために十分量の生体触媒および可溶化剤（例えばＳＤＳ）が必要とされる。例えば可溶化剤（例えばＳＤＳ）濃度が低すぎる場合には、準至適な（suboptimal）ホモファルネソール変換が観察され得る。他方で、例えば可溶化剤（例えばＳＤＳ）濃度が高すぎる場合には、生体触媒が無傷の微生物細胞の破壊および／またはＳＨＣ／ＨＡＣ酵素の変性／不活性化のいずれかによって影響されるというリスクが存在し得る。
【００４６】
バイオマス量および基質（ＥＥＨ）濃度との関連では、ＳＤＳの好適な濃度の選択は、当業者の知識の範囲内である。例として、好適なＳＤＳ、基質（ＥＥＨ）、およびバイオマス濃度を決定するための予測モデルが当業者に利用可能である。
野生型ＳＨＣ酵素についての生物変換反応の温度は、約４５〜６０℃、好ましくは５５℃である。
野生型ＳＨＣ酵素についての生物変換反応のｐＨ範囲は、約５．０から７．０、より好ましくは約５．６から約６．２、さらにはより好ましくは約６．０である。
ＳＨＣ変異型酵素についての生物変換反応の温度は、約３４℃から約５０℃、好ましくは約３５℃である。
ＳＨＣ変異型酵素についての生物変換反応のｐＨは、約４．８〜６．４、好ましくは約５．２〜６．０である。
【００４７】
好ましくは、生物変換反応に用いられる可溶化剤は、ＳＤＳである。
［ＳＤＳ］／［細胞］比は、ＥＥＨホモファルネソールに対する生体触媒の比が約２：１であるときに、約１０：１〜２０：１の範囲内、好ましくは約１５：１〜１８：１、好ましくは約１６：１である
ＳＨＣ変異型酵素についての生物変換反応におけるＳＤＳ濃度は、ホモファルネソール濃度がＥＥＨ 約１２５ｇ／ｌであり、生体触媒濃度が２５０ｇ／ｌである（約１７５のＯＤ（６５０ｎｍ）に対応する）ときに、約１〜２％の範囲内、好ましくは約１．４〜１．７％の範囲内、さらにはより好ましくは約１．５％である。
ＥＥＨホモファルネソール基質に対する生体触媒の比は約０．５：１〜２：１の範囲内、いくつかの態様においては２：１、好ましくは約１：１または０．５：１である。
【００４８】
いくつかの態様において、（−）−アンブロックスは、ホモファルネソール基質が加えられる生体触媒を用いて産生される。既知の手段（例えばペリスタポンプ、注入シリンジ等）を用いて供給することによって基質を加えることが可能である。ホモファルネソールは油可溶性化合物であり、油フォーマットで提供される。生体触媒が水相に存在するということに鑑みて、生物変換反応は、ホモファルネソールが生物変換反応混合物に加えられるときには２相システムと見なすことができる。これは可溶化剤（例えばＳＤＳ）が存在するときでさえも当てはまる。
好適な生物変換プロセスのさらなる詳細は、本明細書下記の例において開示される。
【００４９】
本発明による生物変換プロセスは、所望の（−）−アンブロックス、およびまた多数の副生成物をも含有する反応混合物を産生する。より具体的には、反応混合物は、（−）−アンブロックスに加えて、式（ＩＩ）に記載の（−）−アンブロックスの新規構造異性体、ならびに式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）に記載の（−）−アンブロックスの既知の立体異性体を含む、副生成物の複雑な混合物を含有する。
【化２】
2018513198.tif 000004
【００５０】
出願人は、いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、式（ＩＩ）の化合物は、ホモファルネソールの７Ｅ，３Ｚ−幾何異性体の環化により形成されると考えている。これは、＞５００ｎｇ／ｌの検知閾値を有し、実際には無臭であると記載される。
上述の通り、出願人は、式（ＩＩ）の化合物は新規分子であると考えており、そのようにこの化合物は本発明のさらなる側面を形成する。
【００５１】
化合物（ＩＩ）からなるもしくはこれを含む香料成分(perfume ingredient)および香料組成物、ならびにこれを含有する芳香品は、本発明の付加的側面を形成する。
高級香水または、パーソナルケア、家庭用ケアおよび繊維ケア組成物などの機能性香料組成物といった香料用途における、式（ＩＩ）の化合物の香料成分としての使用は、本発明のさらなる付加的側面を形成する。
（−）−アンブロックスと嗅覚的に許容可能な量の化合物（ＩＩ）との混合物は、本発明のまた他の側面を形成する。
【００５２】
式（ＩＩ）の化合物、または他の副生成物（ＩＩＩ）もしくは（ＩＶ）のいずれか、または実際に本発明の方法に従って形成された（−）−アンブロックスにおける不純物として存在するあらゆる物質との関連において、本明細書において用いられる用語「嗅覚的に許容可能な量」は、化合物または物質が、その匂い検知閾値未満の量で、または（−）−アンブロックスの嗅覚的特性に影響を及ぼすようにはその嗅覚的特徴に寄与しない量で、（−）−アンブロックスとの混合物中に存在することを意味するものと理解される。嗅覚的に許容可能な量のあらゆるそのような化合物または物質を含有する（−）−アンブロックスは、ｅｘ−スクラレオールの合成的手順により得られ、Ｇｉｖａｕｄａｎから入手できる、ＡＭＢＲＯＦＩＸ（商標）などの、（−）−アンブロックスの市販グレードの匂い特性を有するものとして、熟練したパーフューマーに同定可能であろう。
【００５３】
本発明の好ましい態様において、反応混合物は、未反応のホモファルネソールを全く含まないか、または実質的に含まない。
出願人は、ホモファルネソールが、（−）−アンブロックスに対して、ならびに生物変換プロセスの上記副生成物に対して、強力な溶媒であることを発見した。そのように、相当な量のホモファルネソールの存在下では、（−）−アンブロックスおよび副生成物が、扱いにくい粗混合物中で一緒に溶解されたままで残存し、そこから嗅覚的に純粋な形態で（−）−アンブロックスを分離して最終的に単離することは困難で、時間がかかる。（−）−アンブロックスと化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）との混合物中における未反応ホモファルネソールのレベルを減少させることにより、下流のプロセシングおよび（−）−アンブロックスの単離／精製がかなり容易になることが見出された。
【００５４】
下流のプロセシングは、当業者により理解される通り、生物変換プロセスにより形成される有用な化合物の製造において、重要な工程である。化合物合成の一部として、その化合物の物理的特性に影響を与え得る。バイオテクノロジー的方法による香料成分の調製の場合においては、標的化合物の所望の匂い特性が、発酵培地または生体触媒中に存在し得る不純物および副生成物の複雑な混合物の匂いの寄与によってゆがめられないように、標的化合物は、嗅覚的に純粋な形態で反応混合物から分離することができることが望ましい。
【００５５】
したがって、本発明は、別の側面において、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含む反応混合物から、（−）−アンブロックスを単離および精製する方法を提供する。
本発明のさらに別の側面においては、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含有する反応混合物から、（−）−アンブロックスを分離および精製するステップを含む、（−）−アンブロックスの匂いを改善または増強する方法が提供される。
【００５６】
単離および精製された形態においては、（−）−アンブロックスは、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）もしくは（ＩＶ）のいずれも含有せず、または、前記化合物のいずれかを含有するとしても、それぞれは、嗅覚的に許容可能な量で存在すべきである。
本明細書における上記のようなプロセスなどの生物変換プロセスから得られる反応混合物は、一般的に、粗（−）−アンブロックスならびに副生成物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上、ならびに細胞原料および／またはその断片を含有する固相；ならびに水および／またはいくらかの未反応ホモファルネソールを含む液相（単数）または液相（複数）、を含む。
【００５７】
固相は、液相（単数または複数）からろ過または遠心により分離してもよい。さらに、適切な孔サイズを有するフィルターを選択することによって、細胞原料および／または断片から粗（−）−アンブロックスの分離を達成することもまた可能である。一旦、細胞原料および／またはその断片から粗（−）−アンブロックスが分離されれば、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）から（−）−アンブロックスを単離するさらなる作業手順を経る前に、それは洗浄されてもよい。
【００５８】
あるいは、ろ過または遠心の代わりに、（−）−アンブロックスの融点を超える温度まで温め、そうすると、反応混合物は、（−）−アンブロックスが細胞原料および断片を含有する水相の上に油相を形成する。任意に、および（−）−アンブロックスの完全な回収を確実にするため、水性の細胞原料は、（トルエンなどの）水非混和性の有機溶媒により洗浄して、水相に混入している可能性がある残留（−）−アンブロックスを除去することができ、これら洗浄液は油相に合わせることができる。その後、油相は、蒸発により濃縮されて、（−）−アンブロックスならびに副生成物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含む粗混合物を提供することができ、この混合物は、次いで（−）−アンブロックスを単離および精製するためのさらなる作業手順を経ることができる。
【００５９】
別の態様においては、（−）−アンブロックスを含有する油相を形成するために反応混合物を温める代わりに、反応混合物は、好適な（トルエンなどの）水非混和性の有機溶媒により抽出して、（−）−アンブロックスならびに化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含有する有機相を形成させることができ、これは、細胞原料および断片を含有する水相から分離することができる。有機相は、蒸発により濃縮して、（−）−アンブロックスならびに化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含む粗混合物を提供することができ、これは、（−）−アンブロックスを単離および精製するためのさらなる作業手順を経ることができる。
【００６０】
さらに別の代替的方法においては、反応混合物は、細胞原料および断片から蒸留物を除去するために蒸気蒸留することができる。蒸留物は、（−）−アンブロックスならびに化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含む二相性混合物の油相を水相から分離し、次いで（−）−アンブロックスを単離および精製するためのさらなる作業手順を経る前に、二相性混合物として集めることができる。
【００６１】
本発明の具体的態様においては、（−）−アンブロックスを単離および精製する前記方法は、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の１種以上を含有する混合物から（−）−アンブロックスを選択的に結晶化するステップを含む。
用語「選択的に結晶化する」は、それによって（−）−アンブロックスは溶媒からの結晶化が生じる一方で、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）は、単離された結晶材料が（−）−アンブロックスのみを含有するか、またはそれが化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のいずれかを含有する場合には、それらは嗅覚的に許容可能な量でしか存在しない程度に、結晶化溶媒中に溶解して残留しているプロセスステップを言う。
【００６２】
結晶化は、好適な有機溶媒中において行われ得る。溶媒の選択は、室温および高温におけるまたは煮沸溶媒における溶解度の違いなどの考察；ならびに冷却溶媒における回収可能な結晶量の必要性についての考察に基づく。通常、分離されるべき化合物は、比較的極性である溶媒に溶解しており、次いで、比較的極性の弱い溶媒が添加されて溶解している化合物のその溶解性の限界をもたらすことができ、それにより結晶化が始まることになる。また、工業的プロセスにおいては、費用だけでなく取り扱いの安全性という問題にも関係する。好適な溶媒には、メタノール、アセトン、石油エーテル、ヘキサン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ＴＨＦおよび酢酸エチルが含まれるが、これらに限定されない。好ましい溶媒には、トルエンまたはエチルアルコールが含まれる。溶媒の組み合わせもまた、採用してよい。
【００６３】
本発明の特に好ましい態様においては、選択的結晶化は、温かいメタノールに、（−）−アンブロックスならびに化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含有する混合物を溶解して、水などの非溶媒を冷却エタノール溶媒にゆっくり加えることで（−）−アンブロックスを選択的に結晶化させることにより、行われる。
（−）−アンブロックスと、それぞれが構造異性体および（−）−アンブロックスの２種の立体異性体である副生成化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）との密接な構造的関係を考慮すると、（−）−アンブロックスがそのような混合物から選択的に結晶化され、高収率で嗅覚的に純粋な形態での（−）−アンブロックスをもたらし得ることは注目すべきことであった。当業者は、化合物が、（−）−アンブロックスと共結晶化して、下流のプロセシングが、実際に見出されるよりも、はるかにさらに複雑で、時間がかかり、かつ費用がかかるようになることを当然予期するはずである。
【００６４】
（−）−アンブロックスが、結晶化により化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）を含有する混合物から分離される、驚くべき容易な方法は、本発明の際立った優位性を示している。
（−）−アンブロックスが結晶化により分離され得る容易性は、（−）−アンブロックスならびに副生成物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の沸点が非常に近いために蒸留などの他の精製技術によって（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）を含有する混合物から、（−）−アンブロックスがかかる容易な方法およびかかる高い収率では回収され得ないという観察とは対照的である可能性があった。
【００６５】
（−）−アンブロックスとの関連において用いられる、用語「嗅覚的に純粋な」は、（−）−アンブロックスが、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）もしくは（ＩＶ）、または反応混合物中において見出される他のあらゆる材料を含まないことを意味するか、あるいは、かかる化合物または材料が存在する場合には、本明細書においてその語が定義されている通り嗅覚的に許容可能な量でそれらが存在することを意味することが意図される。
本発明の態様において、嗅覚的に純粋な形態での（−）−アンブロックスは、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のいずれかを５重量％未満含有する。
【００６６】
より具体的な態様においては、嗅覚的に純粋な形態の（−）−アンブロックスは、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の各々を、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．９重量％未満、０．８重量％未満、０．７重量％未満、０．６重量％未満、０．５重量％未満、０．４重量％未満、０．３重量％未満、０．２重量％未満、０．１重量％未満もしくは、０．０５重量％未満含有する。
化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）を含有する混合物からの選択的結晶化による（−）−アンブロックスの分離の質は、それが分離される混合物の組成により影響され得る。より具体的には、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）の混合物からの結晶化による（−）−アンブロックスの分離の質は、（−）−アンブロックスの混合物中における他の化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）に対する重量比が、７０：３０、より具体的には８０：２０、より具体的には９０：１０、さらにより具体的には９５：５、およびさらにより具体的には９７：３より大きい場合に、改善された。
【００６７】
さらに、結晶化による（−）−アンブロックスの分離の質は、それが分離される混合物中に存在する未反応ホモファルネソールの量に影響され得る。より具体的には、分離の質は、（−）−アンブロックスが結晶化されて分離される混合物の重量に基づき、未反応ホモファルネソールのレベルが、３０重量％未満、より具体的には２０重量％未満、より具体的には１０重量％未満、より具体的にはさらに５重量％未満、およびより具体的にはさらに３重量％未満、より具体的にはさらに２重量％未満、およびより具体的にはさらに１重量％未満である場合に、改善される。
【００６８】
好ましくは、本発明の生物変換プロセスにおいて用いられる試薬および反応条件は、反応が、ホモファルネソールの１００％の変換を進めまたは実質的にそのように変換を進め、したがって、反応混合物においては未反応ホモファルネソールは残らないようにするものである。しかしながら、未反応ホモファルネソールが存在する場合には、経済的に不利ではあるが、例えば蒸留などによって（−）−アンブロックスおよび他の副生成物からそれを分離することができる。
【００６９】
したがって、本発明の具体的な態様においては、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含む混合物から（−）−アンブロックスを単離および精製する方法であって、この混合物がホモファルネソールを含まない、または実質的に含まない、前記方法が提供される。
より具体的な態様においては、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含み、ホモファルネソールを含まない、または実質的に含まない混合物からの（−）−アンブロックスの単離および精製は、（−）−アンブロックスの選択的結晶化により達成される。
【００７０】
本発明の方法により得られる（−）−アンブロックスは、嗅覚的に純粋な形態で得られる。嗅覚的に純粋な（−）−アンブロックスは、本発明の別の側面を形成する。
結晶形態の（−）−アンブロックスは、本発明のさらに別の側面を形成する。
本発明の方法にしたがって形成される（−）−アンブロックスは、１種以上のさらなる香料成分と混合して、高級香水における使用ならびに、パーソナルケア、繊維ケアおよび家庭用ケア製品などの消費者製品における使用を含む、香料製品における使用を満たす香料組成物を形成してもよい。
【００７１】
したがって、本発明は、別のその側面において、（−）−アンブロックスおよび少なくとも１種の他の香料成分を含む香料組成物を提供し、前記香料組成物は、嗅覚的に許容可能な量の、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の１種以上を含有する。
本発明は、下記例を参照してさらに説明されるであろう。
【００７２】
例
例１：
ホモファルネソールの調製
一般的な分析条件：
非極性ＧＣ／ＭＳ：５０℃／２分、２０℃／分２００℃、３５℃／分２７０℃。HP 7890AシリーズＧＣシステムを有するＧＣ／ＭＳアジレント5975C MSD。非極性カラム：SGEからのBPX5、５％フェニル９５％ジメチルポリシロキサン０．２２ｍｍ×０．２５ｍｍ×１２ｍ。キャリアガス：ヘリウム。インジェクター温度：２３０℃。スプリット１：５０。フロー：１．０ｍｌ／分。トランスファーライン：２５０℃。ＭＳ−四重極型：１０６℃。ＭＳソース：２３０℃。
【００７３】
Ａ）ＴＨＦ中のＭＮＵの調製
水（４００ｍｌ）中の尿素（１７５ｇ、２．９ｍｏｌ）およびメチルアミン塩酸塩（１９８ｇ、２．９ｍｏｌ）の溶液を撹拌下において３．５時間、加熱還流（１０５℃）する。４０℃で、水（２００ｍｌ）中に溶解したＮａＮＯ２（１０１ｇ、１．４５ｍｏｌ）を加える。１５分後に、ＴＨＦ（１０００ｍｌ）を加え、これは透明な二相性混合物をもたらす。濃Ｈ２ＳＯ４（１１０ｇ、１．１ｍｏｌ）を０〜５℃で加え、１．５時間以内で撹拌する。０〜５℃でのさらなる０．５時間後に、２つの透明な相が２５℃で分離する。有機相（Ａ）（１０６５ｍｌ、理論上は１．３５Ｍ）は０〜５℃で数日間保存するか、または直ちにシクロプロパン化反応容器に進む。
【００７４】
相分離の後に、水相をＴＨＦによって２回抽出する（２×１Ｌ）。これにより１１００ｍｌの相Ｂおよび１０７５の相Ｃが得られる。相Ａは、引き続くシクロプロパン化反応において末端アルケンのシクロプロパンへの５１％の変換を生じる一方で、相Ｂは＜０．５％のシクロプロパンを生じ、相Ｃは検出可能な変換を生じない。我々は、＞９９％のＭＮＵが最初の相分離の後に抽出されると結論づける。したがって、通常は、水相を、濃ＫＯＨ水溶液および酢酸による処理後の（有機相Ａからの）最初の相分離の後に捨てる。
【００７５】
Ｂ）ＴＨＦ中のＭＮＵを用いるＥ−Δファルネセンの調製
【化３】
2018513198.tif 000005
ＴＨＦ（１３６ｍｌ、１８４ｍｍｏｌ）中のＮ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア１．３５Ｍを、０℃において、０〜５℃のＥ−ベータ−ファルネセン（ＣＡＳ１８７９４−８４−８）（２５ｇ、１２２ｍｍｏｌ）およびＫＯＨ水溶液（５０ｍｌ、４０％）の激しく撹拌した混合物に滴下添加する。４ｍｌのＭＮＵ溶液を添加後に、０．５ｍｌジクロロメタン中に予め溶解したＰｄ（ａｃａｃ）２（７．４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、０．０２％）を添加する。残りのＭＮＵ溶液を０〜５℃で４時間かけて添加する。この段階におけるＧＣは、２８％の未変換Ｅ−ベータ−ファルネセン、６５％の所望のモノシクロプロパン（上に示されている）、および３％のビスシクロプロパン化された化合物５を示した。２５℃での１６時間後に、酢酸（１００ｍｌ）を０〜５℃で添加し、次いでｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２５０ｍｌ）を添加する。相分離の後に、有機相を２ＭのＨＣｌ（２５０ｍｌ）によって洗浄し、水相をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２５０ｍｌ）によって抽出する。組み合わせた有機層を水（２×１００ｍｌ）、１０％ＮａＯＨ水溶液（２×１００ｍｌ）、および水（２×１００ｍｌ）によって洗浄し、ＭｇＳＯ４によって乾燥して、濾過し、濃縮してやや黄色の液体２６．９ｇを得る。これは、９％のＥ−ベータ−ファルネセン、８２％の所望のモノシクロプロパン化合物、および６％のビスシクロプロパン化された副生成物を含有する。
【００７６】
所望の化合物は、蒸留精製によってさらに単離され得る。
１ｇのＫ２ＣＯ３（１ｇ）の添加および４０〜６０ｍｂａｒでの３０ｃｍスチールコイルカラムによる蒸留により、１４７ｇのモノシクロプロパン化合物（６８％ｃｏｒｒ）を１３５〜１４５℃で得る。画分をプールして、純度１００％のモノシクロプロパン化合物９２ｇを得る。
【００７７】
Ｅ−Δファルネセンの分析データ：
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): 5.1 (2 m, 2 H), 4.6 (2 H), 2.2 (2 H), 2.1 (4 H), 2.0 (2 H), 1.7 (s, 3 H), 1.6 (2 s, 6 H), 1.3 (1 H), 0.6 (2 H), 0.45 (2 H) ppm. 13C-NMR (CDCl3, 400 MHz): 150.9 (s), 135.1 (s), 131.2 (s), 124.4 (d), 124.1 (d), 106.0 (t), 39.7 (t), 35.9 (t), 26.7 (t), 25.7 (q), 17.7 (q), 16.0 (d), 6.0 (t) ppm. GC/MS: 218 (2％, M+), 203 (5％, [M - 15]+), 175 (11％), 147 (31％), 134 (15％), 133 (20％), 121 (12％), 107 (55％), 95 (16％), 93 (30％), 91 (20％), 82 (11％), 81 (33％), 79 (42％), 69 (100％), 67 (22％), 55 (20％), 53 (21％), 41 (75％). IR (フィルム): 3081 (w), 2967 (m), 2915 (m), 2854 (m), 1642 (m), 1439 (m), 1377 (m), 1107 (w), 1047 (w), 1018 (m), 875 (s), 819 (m), 629 (w). C16H26の分析計算値: C, 88.00; H, 12.00.結果: C, 87.80; H, 12.01.
【００７８】
Ｃ）（７Ｅ）−４，８，１２−トリメチルトリデカ−３，７，１１−トリエン−１−オール（（７Ｅ）−ホモファルネソール）の調製
圧力管内における（Ｅ）−（６，１０−ジメチルウンデカ−１，５，９−トリエン−２−イル）シクロプロパン（Ｅ−Δファルネセン）（１ｇ、４．６ｍｍｏｌ）、ドデカン（０．２ｇ、１．１５ｍｍｏｌ、内部標準）、およびＬ−（＋）−酒石酸（１ｇ、６．９ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌下において１５０℃で加熱する。１８時間および（ＧＣによる）完全な変換の後に、混合物を水（５０ｍｌ）およびトルエン（５０ｍｌ）に注ぐ。相を分離し、水相をトルエン（５０ｍｌ）で抽出する。組み合わせた有機層を濃Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍｌ）および濃ＮａＣｌ（２×５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４によって乾燥して、濾過し、減圧下で蒸発させることにより、茶色がかった樹脂（１．３５ｇ）を得る。これを３０％ＫＯＨ水溶液（４．３ｍｌ）と混合し、２５℃で２時間撹拌する。ＧＣ分析により、内部標準に従って９６％の（７Ｅ）−４，８，１２−トリメチルトリデカ−３，７，１１−トリエン−１−オールの形成が明らかになる。Ｅ／Ｚ比６８：２２。Ｅ異性体の分析データは文献からのものと一致している。例えばP. Kocienski, S. Wadman J. Org. Chem. 54, 1215 (1989)を参照。
【００７９】
例２
ＳＨＣプラスミド調製および生体触媒産生
ＳＨＣプラスミド調製
アリシクロバチルス・アシドカルダリウス  スクアレン−ホペン環化酵素（AacSHC）（GenBank M73834, Swissprot P33247）をコードする遺伝子を、プラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）に挿入した。そこでは、それは大腸菌によるタンパク質産生のためのＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの制御下にある。プラスミドを標準的なヒートショック形質転換プロトコールを用いて大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【００８０】
エルレンマイヤーフラスコ培養
タンパク質産生のためには、富栄養培地（ＬＢ培地）または最少培地いずれかを用いた。Ｍ９は最少培地の一例であり、これを用いて成功した。
【００８１】
培地調製
デフォルトとして選んだ最少培地は、３５０ｍｌ培養のために下記のように調製した：３５ｍｌクエン酸／リン酸ストック（ＫＨ２ＰＯ４ １３３ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４０ｇ／ｌ、クエン酸．Ｈ２Ｏ １７ｇ／ｇ、ｐＨは６．３に調整）にＨ２Ｏ ３０７ｍｌを加え、ｐＨは必要に応じて３２％ＮａＯＨで６．８に調整した。５０％ＭｇＳＯ４ ０．８５０ｍｌをオートクレーブした後に、微量元素溶液（次項の組成物）溶液 ０．０３５ｍｌ、チアミン溶液 ０．０３５ｍｌ、および２０％グルコース ７ｍｌを加えた。
【００８２】
ＳＨＣ生体触媒産生（生体触媒産生）
小スケールの生体触媒産生（野生型ＳＨＣまたはＳＨＣ変異型）、３５０ｍｌ培養（培地に５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補った）は、ＳＨＣ産生プラスミドを含有する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）の前培養から植菌した。細胞は、一定の撹拌（２５０ｒｐｍ）をしながら３７℃でおよそ０．５の光学密度（ＯＤ６５０ｎｍ）まで増殖させた。
次いで、３００μＭの濃度までＩＰＴＧを添加することによってタンパク質産生を誘導し、続いて一定の振盪をしながらさらなる５〜６時間のインキュベーションをした。得られたバイオマスは最終的に遠心によって集め、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５によって洗浄した。細胞はさらなる使用まで４℃または−２０℃でペレットとして保存した。一般的に、用いた培地とは関係なく、培養１リットルから、２．５から４グラムの細胞（湿重量）が得られた。
【００８３】
発酵を調製し、７５０ｍｌのInforsHT反応容器内で実施した。発酵容器に脱イオン水１６８ｍｌを加えた。反応容器には全ての必要なプローブ（ｐＯ２、ｐＨ、サンプリング、消泡剤）、Ｃ＋Ｎフィード（feed）および水酸化ナトリウムのボトルを装備し、オートクレーブした。オートクレーブ後、反応容器に下記成分を加える：
２０ｍｌ  １０×リン酸／クエン酸緩衝液
１４ｍｌ  ５０％グルコース
０．５３ｍｌ  ＭｇＳＯ４溶液
２ｍｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４溶液
０．０２０ｍｌ  微量元素溶液
０．４００ｍｌ  チアミン溶液
０．２００ｍｌ  カナマイシンストック。
【００８４】
反応条件は下記の通り設定する：ｐＨ＝６．９５、ｐＯ２＝４０％、Ｔ＝３０℃、３００ｒｐｍで撹拌。カスケード：３００でのｒｐｍセットポイント、最少３００、最大１０００、フローＬ／分セットポイント０．１、最少０、最大０．６。消泡剤コントロール：１：９。
種培養から、０．４〜０．５のＯＤ６５０ｎｍになるよう発酵槽に植菌した。この種培養をＬＢ培地（＋カナマイシン）中で３７℃、２２０ｒｐｍで８時間増殖させた。発酵は最初にバッチモードで１１．５時間実施し、その後にフィード溶液（滅菌グルコース溶液（１４３ｍｌ Ｈ２Ｏ＋３５ｇグルコース）、これには、滅菌後、（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液１７．５ｍｌ、ＭｇＳＯ４溶液１．８ｍｌ、微量元素溶液０．０１８ｍｌ、チアミン溶液０．３６０ｍｌ、カナマイシンストック０．１８０ｍｌが添加されていた）によるＣ＋Ｎフィードを開始した。およそ４．２ｍｌ／時間の一定の流速でフィードを実施した。グルコースおよびＮＨ４＋測定が外部からなされ、培養物中のＣおよびＮ源の利用可能性を評価した。通常は、グルコースレベルは非常に低いままである。
【００８５】
培養物は合計およそ２５時間増殖させ、そこでそれらは典型的には４０〜４５のＯＤ６５０ｎｍに達した。次いで、（ＩＰＴＧパルスとして、または注入シリンジを用いて３〜４時間かけて）発酵槽にＩＰＴＧをおよそ１ｍＭの最終濃度になるように添加し、温度を４０℃におよびｐＯ２を２０％に設定することによってＳＨＣ産生を開始した。ＳＨＣ産生の誘導は４０℃で１６時間続いた。誘導終了時、細胞は、遠心によって集め、０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．４で洗浄し、さらなる使用まで４℃または−２０℃でペレットとして保存した。
【００８６】
結果１ａ
一般的に、産生された生体触媒の特異的活性は、全ての他の条件が不変である状態では、富栄養培地と比較して最少培地を用いたときにより高かった。誘導は３０または３７℃で成功した。誘導が４０〜４３℃でなされたときには、より高い特異的活性の生体触媒が得られるということが着目された。
【００８７】
結果１ｂ
下記表１は、２つの例について、誘導開始および誘導終了の両方における培養体積、光学密度、および細胞の量と、集められたバイオマスの量（湿重量）とを示している。
【表１】
2018513198.tif 000006
【００８８】
野生型ＳＨＣアミノ酸配列（配列番号１） (GenBank M73834, Swissprot P33247)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
【００８９】
変異型Ｆ６０１Ｙ  ＳＨＣアミノ酸配列（配列番号２）−配列番号１に関しての変異型 
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGYPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
【００９０】
変異型Ｆ６０５Ｗ  ＳＨＣヌクレオチド配列（配列番号３）
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTGGTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
【００９１】
変異型Ｆ６０５Ｗ  ＳＨＣアミノ酸配列（配列番号４）−配列番号１に関しての変異型
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDWYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
【００９２】
例３
７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソール混合物の生物変換
下記反応条件を用いて生物変換を行った：
反応（合計体積１５０．１ｇ）は、合計ホモファルネソール１４６ｇ／ｌを含有するInforsHT７５０ｍｌ発酵槽において、０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．４中で、８６：１４の７Ｅ，３Ｅ：７Ｅ，３Ｚの混合物であるホモファルネソール基質、細胞２５０ｇ／ｌ（例２の方法に従って形成された、発酵）、およびＳＤＳ１．５５％を用いて実施した。反応は３５℃で一定の撹拌（９００ｒｐｍ）をしながら実施し、ｐＨコントロールは水中の１０から４０％クエン酸を用いて行った。
反応混合物は、下記の例４に記載の単離および精製ステップに処された。
【００９３】
例４
下流のプロセシング手順
７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソール（８６：１４  ３Ｅ：３Ｚ）の生物変換から形成された反応混合物は、蒸気蒸留に処された。蒸留物は、二相性混合物として集められた。有機相は保持し、水相は捨てた。有機相の組成物は、ＧＣにより分析し、結果は、下の表２に示す（「粗」参照）。
次いで、有機相を、乾燥により濃縮した。その後、エタノールを粗乾燥生成物に加え、生成物が溶解するまで混合物を温めた。室温の水をゆっくりと加え、ときおり撹拌し、氷浴で冷却しながら（−）−アンブロックスを結晶化させる。
【００９４】
表２は、結晶化された生成物についてのＧＣ分析結果を示す。データは、結晶化されたサンプルにおいて見出された副生成物（ａ）、（ｂ）または（ｃ）が実際に含まれない（−）−アンブロックスの濃い濃縮を示す。
表２における「ａ」、「ｂ」および「ｃ」は、それぞれ化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＶ）および化合物（ＩＩＩ）を言うことに着目すべきである。「ＥＺＨ」および「ＥＥＨ」は、それぞれ７Ｅ，３Ｚ−ホモファルネソールおよび７Ｅ，３Ｅ−ホモファルネソールを言う。
【表２】
2018513198.tif 000007
【００９５】
例５
反応ブロスの固相の抽出：
（−）−アンブロックスが水に可溶性ではなくかつおよそ７５℃未満の温度で液体ではないということを考慮すると、これらの特性は、水混和性溶媒（例えばエタノール）および水非混和性溶媒（例えばトルエン）のいずれかを用いて生体内変換の固相から生成物を抽出するための潜在的利点と考えられた。
【００９６】
２００ｍｌの反応ブロスを遠心して液体（水）相から固体を分離した（Sorvall GS3、５０００ｒｐｍ、１０分、１０℃）。これにより、およそ８０ｍｌの固体ペレットをおよそ１２０ｍｌの液相から分離した。ＭＴＢＥ抽出後の水相の分析（ガスクロマトグラフィー）は、それが初期に反応ブロス２００ｍｌ中に存在する（−）−アンブロックスのおよそ０．３％以下を含有するということを示した。トルエンおよびエタノール９９％を固相から（−）−アンブロックスを抽出するために用いた。
【００９７】
トルエン抽出：
固相８０ｍｌを、４５ｍｌトルエン（固相体積のおよそ１／２、３０秒の激しい振盪、遠心（Sorvall GS3、５０００ｒｐｍ、１０分、１０℃）によって６×抽出した。溶媒相をその（−）−アンブロックス含量についてＧＣにより分析した。反応ブロス中に初期に存在する（−）−アンブロックスの９９．５％超が、１．３５×初期全反応ブロス体積（２００ｍｌ）または３．４×固相体積という合計トルエン体積に相当する６回の抽出によって抽出された。
【００９８】
エタノール抽出：
固相８０ｍｌをおよそ１６０ｍｌ（２倍体積）の９９％エタノールによって抽出し（Infors Multifors HT、３５℃、１０００ｒｐｍ、３０分）、次に遠心をした。（−）−アンブロックスは抽出手順の間に結晶化しなかった。４回の洗浄（合計６４０ｍｌのエタノール、すなわち３．２×全初期反応ブロス体積または８×固相の体積）の後に、反応ブロス中に初期に存在したアンブロックスの約９９％が回収された。最初の抽出ステップにおいて（−）−アンブロックスの結晶化を防ぐために十分なエタノールが必要とされる（エタノールに可溶性）。固相の１または１／２倍体積のみを最初の抽出ステップに用いたときには、べたついたペーストが得られ、これは取り扱うことが困難であり、（−）−アンブロックスは遠心の間にペレット上の針状体として結晶化した。温度は、この結晶化の原因となる因子ではないようであった（抽出および遠心は室温およびおよそ３５℃〜４０℃で試験した）。
【００９９】
エタノール相中の（−）−アンブロックス濃度および液相のエタノール／水比（固相の残留水分）は、結晶形成の原因となるように見えた。しかしながら、エタノールの体積を固相の１倍体積まで減ずることが可能であるということが着目された。
【０１００】
（−）−アンブロックスは室温では液相に存在しないので、これはバイオマスと共に分離し、有機溶媒（例えば、水混和性溶媒（例えばエタノール）または水非混和性溶媒（例えばトルエン）で抽出することができる。（−）−アンブロックスを反応混合物の固相に分離する遠心ステップは、それが（−）−アンブロックスを抽出するために必要とされる溶媒の量を減ずるので有利である。
【０１０１】
例６
官能分析
目的：「粗」材料中および「結晶化された」材料中において形成された（−）−アンブロックスならびに化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の官能分析を行うこと。
Ｅ，Ｅ−ホモファルネソールの生体内変換は、（−）−アンブロックスおよび化合物（ＩＶ）をもたらす。
Ｅ，Ｚ−ホモファルネソールの生体内変換は、マクロ環エーテル化合物（ＩＩ）およびエピ−アンブロックス化合物（ＩＩＩ）をもたらす。
（−）−アンブロックスの粗混合物は、それぞれ８７．１重量％、２．８重量％、２．５重量％、および７．６重量％の量で存在する、所望の（−）−アンブロックス、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を含む。
【０１０２】
粗混合物が選択的に結晶化された場合（実験室規模）、結晶化された材料は、粗混合物と同じ構成成分を有するが、それぞれ９９．１重量％、０．１重量％、０．１重量％、および０．７重量％の量で存在する。
官能分析結果は下記の通りであった：
（−）−アンブロックス：匂い閾値  ０．２ｎｇ／ｌ。
化合物（ＩＶ）：弱い、ＩｓｏＥ、ウッディー、ＧＣ検出閾値  ５〜１０ｎｇ。
化合物（ＩＩ）：「無臭」（ＧＣ閾値  ＞５００ｎｇ）。
化合物（ＩＩＩ）：（−）−アンブロックスよりも約１０×高いＧＣ閾値（およそ２ｎｇ）。
【０１０３】
結論
３つの副生成物（化合物ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）の官能分析は、（−）−アンブロックスからのものよりも弱い匂いを示す。
事実、エピ−アンブロックス（化合物ＩＩＩ）の匂いは、（−）−アンブロックスよりも約１０倍弱く、それが本質的に無臭であるということを示唆している。
【０１０４】
例７
蒸気抽出によるアンブロックス回収
（蒸気抽出した）粗（−）−アンブロックスおよび結晶化した（−）−アンブロックスについて得られた純度
ＥＥ：ＥＺ−ホモファルネソール８６：１４の生体内変換は、水蒸気抽出する反応混合物をもたらした。蒸気蒸留物は、二相性混合物として集められた。有機相を保持し、水相を捨てた。有機相の組成をＧＣによって分析し、結果を下の表に示した（「粗」参照）。次いで、有機相を乾燥状態まで濃縮した。次に、粗乾燥生成物にエタノールを添加し、混合物を生成物が溶解するまで温めた。室温で水をゆっくり添加し、ときおり撹拌し、氷浴で冷却しながら（−）−アンブロックスを結晶化させる。
【０１０５】
表のデータはまた、蒸気抽出／蒸留ステップの後に得られた生成物（「粗」）および結晶化した生成物（（−）−アンブロックス）についてのＧＣ解析結果をも示している。表における「ＥＺＨ」および「ＥＥＨ」への言及は、それぞれ（３Ｚ，７Ｅ）ホモファルネソールおよび７Ｅ，３Ｅホモファルネソールを言う。
下の表データは、特定の出発材料（ＥＥＨ：ＥＺＨ８６：１４）が、ＷＴ  ＳＨＣまたはＳＨＣ誘導体を用いて所望の最終生成物（−）−アンブロックスおよび副生成物（ＩＩ、ＩＶ、およびＩＩＩ）の極めて特異的な混合物を産生するということを示している。選択的結晶化のデータは、実際に、副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）または（ＩＩＩ）が結晶化したサンプル中において見出されることがない状態で、（−）−アンブロックスの濃い濃縮を示している。従って、このＥＥ：ＥＺ混合物は、比較的単純明解で費用対効果の高いように選択的に結晶化される嗅覚的に純粋な（−）−アンブロックス生成物を提供する。
【０１０６】
【表３】
2018513198.tif 000008
【０１０７】
蒸気抽出／濾過は（−）−アンブロックスを単離するための環境親和性の方法である。なぜなら、これは、便利な、溶媒を含まない（−）−アンブロックスの単離を提供し、生体触媒の不活性化を伴うからである。
生物変換反応を用いて産生された（−）−アンブロックスは、溶媒を用いて全反応混合物から（例えば、水非混和性溶媒を用いて、または蒸気抽出／蒸留によって、または濾過によって）または固相から（例えば水混和性溶媒を用いて）、当業者に既知である方法を用いて抽出され得る。
【配列表】
2018513198000001.app
【国際調査報告】
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