(57)【要約】  本発明は、オキシトシンアンタゴニスト活性を呈する類似体、具体的にはバルシバン及びその中間体を合成するための新規の固相ペプチド法に関する。具体的には、本発明は、式c[AA1〜AA6]-AA7-ol(式中、AA1はプロピオン酸であり、AA2は好ましくはD-Trpであり、AA3はIleであり、AA4は好ましくはAlloIleであり、AA5はAsnであり、AA6はhCyであり、AA7は好ましくはN-Me-Orn-olである)を有する化合物、又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物を調製するための固相方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2018535946.tif 000019
を有する化合物、又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物を調製するための固相方法であって、以下の工程:
a)保護された(P5P3P4)AA7を樹脂と反応させて、(P5P3P4)AA7-樹脂を提供する工程であり、工程a)の合成中に樹脂に添加される保護された(P5P3P4)AA7は、(P5)NR-CHQ'-CH2OHである工程;
b)(P5P3P4)AA7-樹脂を段階的に長くして、(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3P4)AA7-樹脂を提供する工程であり、式中、AA2はAAbであり、AA3はIleであり、AA4はAAdであり、AA5はAsnであり、AA6はHcyである工程;
c)X-AA1(式中、AA1はプロピオン酸である)を(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3P4)AA7-樹脂と反応させて、X-AA1(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3P4)AA7-樹脂を提供する工程、;
d)切断及び脱保護の工程を実施して、X-AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7-olを提供する工程;及び
e)X-AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7-olを環化し、環状ペプチドである
【化２】
2018535946.tif 000020
を得る工程
(式中、
P1、P5及びP7は、保護基であり、
AAbは、D-芳香族α-アミノ酸であり、
AAdは、脂肪族α-アミノ酸であり、
Xは、ハロゲン残基であり、
Rは、CH3又はC2H5であり、
Qは、(CH2)n-NH2であり、
Q'は、(CH2)n-NP3P4であり、
nは、2、3又は4であり、
P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、互いに同じでも又は異なってもよく、P1と同じでも又は異なってもよい)
を含む、方法。
【請求項２】
樹脂が2-CTCである、請求項1に記載の固相方法。
【請求項３】
P5がNBSであり、並びに/又は、P3及びP7が両方ともBocであり、並びに/又は、P1がTrtである、請求項1又は2の一項若しくは複数項に記載の固相方法。
【請求項４】
XがBr又はCl、好ましくはBrである、請求項1から3の一項又は複数項に記載の固相方法。
【請求項５】
nが3であり、及び/又は、RがCH3であり、及び/又は、好ましくはP4がHであり、及び/又は、好ましくはP3がBocである、請求項1から4の一項又は複数項に記載の固相方法。
【請求項６】
反応工程c)を、DCM存在下で、カップリング剤としてDICを用いて実施する、請求項1から5の一項又は複数項に記載の固相方法。
【請求項７】
AA2(AAb)がD-Trpであり、及び/又は、AA4(AAd)がAlloIleであり、及び/又は、AA7がN-Me-Orn-olである、請求項1から6の一項又は複数項に記載の固相方法。
【請求項８】
場合により、1つ又は複数の精製工程、好ましくは工程i)後の(すなわち、切断及び脱保護の工程後の)1つ又は複数の精製工程、並びに/又は、工程j)後の(すなわち、環化工程後の)1つ若しくは複数の精製工程を含む、請求項1から7の一項又は複数項に記載の固相方法。
【請求項９】
薬学的性質を有するペプチドを形成するのに適切な中間体であって、式:
X-(CH2)2-CO-NH-AAb-Ile-AAd-Asn(P1)-hCy(P2)-NR-CHQ'-CH2OW
(式中、
AAbは、D-芳香族α-アミノ酸であり、
AAdは、脂肪族α-アミノ酸であり、
Xは、ハロゲン残基であり、
P1は、保護基であり
P2は、Trtであり
Rは、CH3又はC2H5であり、
Q'は、(CH2)n-NP3P4であり、
nは、2、3又は4であり、
P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、互いに同じでも又は異なってもよく、P1及び/又はP2と同じでも又は異なってもよく、
Wは、H、保護基又は樹脂である)
を有する、中間体。
【請求項１０】
Wが樹脂であり、好ましくは樹脂がCTCである、請求項9に記載の中間体。
【請求項１１】
nが3であり、及び/又はRがCH3である、請求項9又は10に記載の中間体。
【請求項１２】
P1がTrtである、請求項9から11のいずれか一項に記載の中間体。
【請求項１３】
P4がHであり、及び/又はP3がBocである、請求項9から12のいずれか一項に記載の中間体。
【請求項１４】
AAbがD-Trpであり、及び/又はAAdがalloIleである、請求項9から13のいずれか一項に記載の中間体。
【請求項１５】
XがBr又はCl、好ましくはBrである、請求項9から14のいずれか一項に記載の中間体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキシトシンアンタゴニスト活性を呈し、とりわけ子宮の筋収縮を軽減する又は妨げるのに有効である類似体、具体的にはバルシバン及びその中間体を合成するための新規の固相ペプチド法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オキシトシンは、子宮筋の収縮を刺激するペプチドホルモンであり、早産及び月経困難症の病因に関与すると考えられている。オキシトシンアンタゴニストは、こうした状態を制御するのに有用であることが証明されており、治療用途に対する良好な効果及び選択性のオキシトシンアンタゴニストペプチドは、1995年1月26日公開のWO 95/02609に開示されている。オキシトシンアンタゴニストは、しばしば、水溶液での投与を意図されており、使用可能な用量でのこのようなアンタゴニストの製造には、このような溶液が長期間、安定である必要があるが、常にそうとは限らない。使用直前にこうした医薬を調製する潜在的な必要性は、不便で、改良の余地があると考えられた。
【０００３】
バルシバンは、5つの非天然アミノ酸を含有し、その1つが、D-アミノ酸である合成環状ヘプタペプチドである。そのCAS登録番号は、(遊離塩基の)285571-64-4である。原薬は、C4,6,S1-シクロ(N-(3-スルファニルプロパノイル)-D-トリプトフィル-L-イソロイシル-L-アロイソロイシル-L-アスパラギニル-L-2-アミノブタノイル-N-メチル-L-オルニチノール)として化学的に命名されており、以下の化学構造によって表される:
【０００４】
【化１】
2018535946.tif 000002
【０００５】
バルシバンの構造はまた、以下:
c[Pra-D-Trp-Ile-AlloIle-Asn-hCy]-N-Me-Orn-ol
(式中、Praはプロピオン酸であり、Trpはトリプトファンであり、Ileはイソロイシンであり、AlloIleはアロイソロイシンであり、Asnはアスパラギンであり、hCyはホモシステインであり、Ornはオルニチンである)のように表すこともできる。「c」は、角括弧で囲まれた配列([Pra-D-Trp-Ile-AlloIle-Asn-hCy])が環状の形態で表されることを意味する。
【０００６】
本発明を記載するために、バルシバン中の各アミノ酸は、以下の通りの簡易表記:
c[AA1〜AA6]-AA7-ol
(式中、AA1はプロピオン酸(pra)であり、AA2はD-Trpであり、AA3はIleであり、AA4はAlloIleであり、AA5はAsnであり、AA6はhCyであり、AA7はN-Me-Orn-olである)で示される。
【０００７】
米国特許第6,143,722号(EP 938,496、WO 98/23636)は、オキシトシンアンタゴニスト活性を呈する、等価のヘプタペプチド類似体を開示し、これは先のWO 95/02609出願で開示されたものと類似しているが、ペプチドのC-末端がアルコールに還元されている。
【０００８】
このようなオキシトシンアンタゴニストペプチドは、米国特許第6,143,722号で開示された合成法により合成され得る。これには、一斉にペプチド合成をカウントし、改変されたホモシステイン(hCy)残基の合成をカウントしない、約7つの別々の工程が必要である。
【０００９】
完全なSPPS法を行う試みは、WO2003072597で略述された。本文献は、オキシトシンアンタゴニスト活性を有し、ヘキサペプチド部分A、及び、部分Aとアミド結合により結合するC-末端β-アミノアルコール残基Bからなる、ヘプタペプチド類似体、又は薬学的に許容されるその塩を調製するための方法であって、(1)β-アミノアルコールBが、
【００１０】
【化２】
2018535946.tif 000003
【００１１】
(式中、Qは(CH2)n-NH2(式中、nは2、3又は4であり、RはCH3又はC2H5である)であり、 (2)部分Aが、
Mpa-AAb-Ile-AAd-Asn-Abu-
(式中、AAbはD-芳香族α-アミノ酸であり、これは場合によりその保護された側鎖を有し得、AAdは脂肪族α-アミノ酸である)である、
方法を開示する。
【００１２】
これらの合成は、一般に、このようなアルキル化ジアミノアルコール、及び、Fmoc-carba-6、すなわち、
【００１３】
【化３】
2018535946.tif 000004
【００１４】
と称される保護化アミノ酸を使用する。
【００１５】
本方法において、環化は、アミド結合(Fmoc-hCy((CH2)2-COOBu)-OH)とAAb(AAbはD-Trp-OHであり得る)とのカップリング)を介して溶液中で行われる。したがって、本手順は、直交保護されたホモシステイン誘導体(例えば、Fmoc-hCy((CH2)2-COOBu)-OH))の合成を必要とし、これは大規模な製造には冗長的であり得る。
【００１６】
文献CN2012-1036484は、SPPSを使用したバルシバンの調製のための方法を開示する。本方法は、(1)Fmoc-N-Me-Orn(Boc)-olをカルボキシ樹脂と反応させて、Fmoc-N-Me-Orn(Boc)-樹脂を得る工程、(2)Fmoc-hCy(mmt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-AlloIle-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH及び3-ハロゲン化プロパン酸を連続してカップリングして、X-CH2CH2CO-D-Trp(Boc)-Ile-AlloIle-Asn(Trt)-hCy(mmt)-N-Me-Orn(Boc)-樹脂を得る工程、並びに(3)樹脂上に得られた直鎖状ペプチドを環化するためにmmt側鎖保護基を除去し、次いで樹脂を切断して、バルシバンを得る工程を含む。
【００１７】
このようなオキシトシンアンタゴニストペプチドが、例えば、米国特許第6,143,722号、WO2003072597、CN102875650及びCN2012-1036484に開示された合成法により合成され得るが、大規模な適用が可能で、改善された収率、より良好な純度プロファイル及び/又はより堅牢な方法を有する、より経済的な合成法が、潜在的で商業的な関心のある化学化合物に対して頻繁に求められている。本発明は、この必要性を扱う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】WO 95/02609
【特許文献２】米国特許第6,143,722号(EP 938,496、WO 98/23636)
【特許文献３】WO2003072597
【特許文献４】CN2012-1036484
【特許文献５】CN102875650
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Chem. Rev. 2009年、109号、2465〜2504頁(Albert Isidro-Llobet等による)
【非特許文献２】E. Kaiser、R. L. Colescott、C. D. Bossinger、P. I. Cook、Analytical Biochemistry 34号、595頁(1970年)
【非特許文献３】T Christensen、Acts Chemica Scandinavica B 33号(1979年)763〜766頁
【非特許文献４】Barany, G.; Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1977年、99号、7363頁
【非特許文献５】Barany, G.; Albericio, F. J. Am. Chem. Soc. 1985年、107号、4936頁
【非特許文献６】Kaiser等、Analytical Biochem.、39号、305頁(1975年)
【非特許文献７】E. Kaiser、R.L. Colescott、C.D. Bossinger、P.I. Cook、Analytical Biochem.、34号(2刷)、595〜598頁(1970年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
概して、本発明は、ヘプタペプチドであるバルシバンの固相合成に関する。そのCAS登録番号は、(遊離塩基の)285571-64-4である。それは、C4,6,S1-シクロ(N-(3-スルファニルプロパノイル)-D-トリプトフィル-L-イソロイシル-L-アロイソロイシル-L-アスパラギニル-L-2-アミノブタノイル-N-メチル-L-オルニチノール)として化学的に命名されている。
【００２１】
本発明はまた、オキシトシンアンタゴニスト活性を有するヘプタペプチド類似体、又は薬学的に許容されるそれらの塩、及び、これらを調製するための新規の固相ペプチド合成方法も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、式c[AA1〜AA6]-AA7-ol(式中、AA1はプロピオン酸、AA2はAAbであり、AA3はIleであり、AA4はAAdであり、AA5はAsnであり、AA6はhCyであり、AA7は-NR-CHQ-CH2OH(式中、RはCH3又はC2H5であり、好ましくはCH3、Qは(CH2)n-NH2(式中、nは2、3又は4、好ましくは3である))を有する化合物、又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物を調製するための固相方法であって、以下の工程:
a)保護された(P5;P3)AA7を樹脂と反応させて、(P5;P3)AA7-樹脂を提供する工程であり、工程a)の合成中に樹脂に添加されるAA7は、(P5)NR-CHQ'-CH2OH(式中、RはCH3又はC2H5であり、Q'は(CH2)n-NP3P4である)である工程;
b)(P5;P3)AA7-樹脂を段階的に長くして、(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(P2)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
c)X-AA1(式中、XはF、Cl、Br及びIから選択されるハロゲン原子である)を(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(P2)AA6-(P3)AA7-樹脂と反応させて、X-AA1(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(P2)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
d)切断及び脱保護の工程を実施して、X-AA1AA2AA3AA4AA5AA6-AA7-olを提供する工程;並びに
e)X-AA1AA2AA3AA4AA5AA6-AA7-olを環化し、環状ペプチドであるc[AA1〜AA6]-AA7-olを得る工程であり、AA1及びAA6は、AA6ホモシステインからチオールを介して連結する工程
(式中、
P1、P5及びP7は、保護基であり、
AAbは、D-芳香族α-アミノ酸であり、
AAdは、脂肪族α-アミノ酸であり、
Xは、ハロゲン残基であり、
P2は、Trtであり
Rは、CH3又はC2H5であり、
Q'は、(CH2)n-NP3P4であり、
nは、2、3又は4であり、
P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、互いに同じでも又は異なってもよく、P1及び/又はP2と同じでも又は異なってもよい)を含む、方法に関する。
【００２３】
特に、本発明は、式c[AA1〜AA6]-AA7-ol(式中、AA1はプロピオン酸であり、AA2はAAb、好ましくはD-Trpであり、AA3はIleであり、AA4はAAd、好ましくはAlloIleであり、AA5はAsnであり、AA6はhCyである;AA7は-NR-CHQ-CH2OH(式中、RはCH3又はC2H5であり、Qは(CH2)n-NH2である(式中、nは2、3又は4であり、好ましくはRはCH3であり、nは3である)であり、好ましくはAA7はN-Me-Orn-olである)を有する化合物、又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物を調製するための固相方法であって、以下の工程:
ステージ1a
a)保護された(P5;P3)AA7を樹脂と反応させて、(P5;P3)AA7-樹脂を提供する工程であり、合成中に樹脂に添加するAA7は、(P5)NR-CHQ'-CH2OH(式中、RはCH3又はC2H5であり、Q'は(CH2)n-NP3P4である)である工程;
b)P5を(P5;P3)AA7-樹脂から除去して、(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
ステージ1b
c)保護された(P6;Trt)AA6を(P3)AA7-樹脂と反応させて、(P6;Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
d)P6を(P6;Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂から除去して、(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
e)保護された(P6;P1)AA5を(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂と反応させて、(P6;P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
f)P6を(P6;P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂から除去して、(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
g)保護された(P6)AA4を(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂と反応させて、(P6)AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
h)P6を(P6)AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂から除去して、AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
i)保護された(P6)AA3をAA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂と反応させて、(P6)AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
j)P6を(P6)AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂から除去して、AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
k)保護された(P6;P7)AA2をAA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂と反応させて、(P6;P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
ステージ1c
l)P6を(P6;P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂から除去して、(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
m)X-AA1(式中、XはF、Cl、Br及びIから選択されるハロゲン原子である)を(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂と反応させて、X-AA1(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
ステージ2
n)切断及び脱保護の工程を実施して、X-AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7-olを提供する工程;並びに
ステージ3
o)ハロゲンXの分子内置換を介したAA6(ホモシステイン)チオールとのチオエーテル連結を介して、X-AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7-olを環化し、環状ペプチド:
c[AA1〜AA6]-AA7-ol
を得る工程
(式中、P1、P5、P6及びP7は、保護基であり、P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、これらは互いに同じでも又は異なってもよく、P1と同じでも又は異なってもよく、nは、2、3又は4である)
を含む、方法に関する。
【００２４】
本発明は、薬学的性質を有するペプチドを形成するのに適切な中間体であって、以下の式:
X-CH2CH2CO-AAb-Ile-AAd-Asn(P1)-hCy(P2)-NR-CHQ'-CH2OW
【００２５】
(式中、
AAbは、D-芳香族α-アミノ酸であり、
AAdは、脂肪族α-アミノ酸であり、
Xは、ハロゲン残基(F、Cl、Br、I)であり、
P1は、保護基であり
P2は、保護基(Trt)であり
Rは、CH3又はC2H5であり、
Q'は、(CH2)n-NP3P4であり、
nは、2、3又は4であり、
P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、互いに同じでも又は異なってもよく、P1及び/又はP2と同じでも又は異なってもよく、
Wは、H(すなわち、C-末端はアルコールである)、保護基又は樹脂である)
を有する中間体に更に関する。
【００２６】
一実施形態において、Xは、P5がFmocである場合、Clではない。
【００２７】
P5は、好ましくはo-NBS(NBS)である。
【００２８】
以下の略語を使用する:
-  Abu    2-アミノ酪酸
-  AcOH    酢酸
-  Ac2O    無水酢酸
-  AlloIle/aIle    アロイソロイシン
-  Asn    アスパラギン
-  BH3THF    ボラン-テトラヒドロフラン錯体
-  Boc    tert-ブチルオキシカルボニル
-  Br    臭素
-  Br-(CH2)2-COOH    3-ブロモプロピオン酸
-  CH3CN    アセトニトリル
-  Cl    塩素
-  Cl-(CH2)2-COOH    3-クロロプロピオン酸
-  CTC    塩化クロロトリチル
-  DBU    1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エンMeCNアセトニトリル
-  DCM    ジクロロメタン
-  DIAD    アゾジカルボン酸ジイソプロピル
-  DIC    1,3-ジイソプロピルカルボジイミド
-  DIEA    N,N-ジイソプロピルエチルアミン
-  DIPEA    N,N-ジイソプロピルエチルアミン
-  DME    1,2-ジメトキシエタン
-  DMF    N,N-ジメチルホルムアミド
-  DMAP    4-ジメチルアミノピリジン
-  DTT    ジチオスレイトール
-  EDT    エタンジチオール
-  Et2O    エチルエーテル
-  EtOAc    酢酸エチル
-  Fmoc    9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
-  Fmoc-N-MeOrn(Boc)-ol    メチル-N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-N-δ-Boc-L-オルニトール(ornithol)
-  Fmoc-hCy(Trt)-OH    N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-S-トリチル-L-ホモシステイン
-  Fmoc-hCy(mmt)-OH    N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-S-メトキシトリチル-L-ホモシステイン
-  Fmoc-Asn(Trt)-OH    N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-N-β-トリチル-L-アスパラギン
-  Fmoc-aIle-OH    N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-N-L-アロイソロイシン
-  Fmoc-Ile-OH    N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-N-L-イソロイシン
-  Fmoc-D-Trp(Boc)-OH    N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-N(in)-Boc-D-トリプトファン
-  FmocONSu    N-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)スクシンイミド
-  hCy/hCys/Hcy    ホモシステイン
-  HOBt    1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
-  HPLC    高速液体クロマトグラフィー
-  H2O    脱イオン水
-  IPA    イソプロピルアルコール
-  LC/MS    液体クロマトグラフィー-質量分析
-  MeOH    メタノール
-  Mpa    3-メルカプトプロピオン酸
-  MTBD    7-メチル-1,5,7-トリアザビシクロ[4,4,0]デカ-5-エン
-  MTBE    メチルtert-ブチルエーテル
-  Na2CO3    炭酸ナトリウム
-  NMM    N-メチルモルホリン
-  NMP    1-メチルピロリジン-2-オン
-  Orn    オルニチン
-  o-NBS(NBS)    o-ニトロベンゼンスルホニル
-  o-NBS-Cl    o-ニトロベンゼンスルホニルクロリド
-  PhOH    フェノール
-  PyBOP    ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
-  RRT    相対保持時間
-  SPPS    固相ペプチド合成法
-  TBTU    2-(1-H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチル-ウロニウムテトラフルオロボレート
-  TEAP    リン酸トリエチルアンモニウム
-  TFE    トリフルオロエタノール
-  TFA    トリフルオロ酢酸
-  THF    テトラヒドロフラン
-  TIS    トリイソプロピルシラン
-  TNBS    2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸
-  TMSBr    臭化トリメチルシリル
-  TPP    トリフェニルホスフィン
-  Trp    トリプトファン
-  Trt    トリチル
-  Z    ベンジルオキシカルボニル
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】アミノ酸2〜7のカップリングを示す図である。
【図２】アミノ酸1のカップリングを示す図である。
【図３】直鎖状ペプチドを得るための、ヘプタペプチドの樹脂からの脱保護及び切断を示す図である。
【図４】バルシバンを得るための、ペプチドの溶液中の環化を示す図である。
【図５】環状ペプチドの精製を示す図である。
【図６】異なる保管温度での粉末としてのFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの安定性研究を示すグラフである。
【図７】異なる温度でのFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olのDMF中溶液の安定性研究を示すグラフである。
【図８】室温でのFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+DMAP、DMF中溶液の安定性研究を示すグラフである。
【図９】60℃でのFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+ピリジン、DMF中溶液の安定性研究を示すグラフである。
【図１０】60℃でのo-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+ピリジンのDMF中溶液の安定性研究を示すグラフである。
【図１１】室温でのo-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+DMAPのDMF中溶液の安定性研究を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、オキシトシンアンタゴニスト活性を有する、環状ヘプタペプチド類似体、好ましくはバルシバン、又は薬学的に許容されるその塩を調製するための固相方法であって、以下の工程を含む方法を提供する:
【００３１】
ステージ1a
1. P5NR-CHQ'-CH2OH(第1のアミノ酸、AA7)(式中、P5はアミノ酸保護基、好ましくはNBSである)の樹脂への付着。Rは、CH3又はC2H5である。Q'は、(CH2)n-NP3P4である(式中、nは、2、3又は4であり、P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、互いに同じでも又は異なってもよい)。好ましくは、RはCH3であり、nは3であり、P4はHであり、P3はBocであり、P5はo-NBS(NBS)である。
【００３２】
固体支持体
本発明の方法で使用され得る固体支持体は、特に限定されず、基本的に、固相ペプチド合成法で使用される全ての固体支持体が、本方法で使用され得る。本出願において、固体支持体はまた、「-樹脂」と称される。例示的な固体支持体は、クロロメチル化樹脂、ヒドロメチル化樹脂、MBHA樹脂、BHA樹脂、NAMM樹脂、RinkアミドAM樹脂、RinkアミドMBHA樹脂、RinkアミドMBHA樹脂、SASRIN樹脂、Sieber樹脂、Wang樹脂、クロロトリチル樹脂等の超酸不安定樹脂である。特に好ましいのは、脂肪族アルコールとエーテル結合を形成できる樹脂で、例えば、トリチル樹脂、クロロトリチル樹脂(CTC)及び/又は2-CTC樹脂等である。好ましくは、樹脂は、クロロトリチル樹脂であり、更により好ましくは2-CTC樹脂である。
【００３３】
好ましくは、樹脂に付着される第1のアミノ酸(AA7)は、NBS-N-Me-Orn(P3)-olである。好ましくは、P3はBocである。使用され得る他のアミノ酸(例えば、Fmoc-N-Me-Orn(Boc)-ol)からの本アミノ酸の選択は、本明細書の実験の部で理解できるように、その高い安定性プロファイルに起因する。
【００３４】
第1のアミノ酸の添加前、樹脂は、必要に応じて脱保護される。
【００３５】
第1のアミノ酸は、好ましくは、およそ0.5〜1.5当量、例えば、0.5当量、0.6当量、0.7当量、1当量、1.3当量又は1.5当量の量で、(好ましくは脱保護された)樹脂に投入される。好ましくは、(好ましくはNBS-N-Me-Orn(Boc)-olである)第1のアミノ酸は、およそ0.7当量の量で、(好ましくは脱保護された)樹脂に投入される。当量はモル当量である。
【００３６】
好ましくは、第1のアミノ酸(好ましくはNBS-N-Me-Orn(Boc)-ol)は、DMF中の(好ましくは脱保護された)樹脂に投入される。好ましくは、ピリジンは、反応混合物(樹脂+アミノ酸+DMF)に更に添加される。例えば、反応は、高温で、例として30〜80℃の間、好ましくは約60℃で、行い得る。反応時間は変化し得るが、2〜30時間の間、例えば10〜25時間の間、例として15〜18時間の間であり得る。好ましくは、反応時間は、およそ17時間(例えば17時間±15分)、又はおよそ18時間である。反応時間は、およそ24時間であり得る。
【００３７】
第1のアミノ酸が樹脂にローディングされた後、残りの活性部位は、例えば、室温でおよそ1時間、DIEA/MeOHを使用してキャッピングされ得る。当業者は、更なるキャッピング方法を認識している。
【００３８】
2. 樹脂に付着した第1のアミノ酸のα-アミノ基から保護基(好ましくは、o-NBS(NBS)であるP5)の除去。当業者は、各保護基に対する脱保護の条件を認識している。例えば、Chem. Rev. 2009年、109号、2465〜2504頁(Albert Isidro-Llobet等による)は、アミノ酸の保護についての総説を提供する。好ましい実施形態において、第1のアミノ酸がα-アミノ保護基としてNBSを有する場合、NBSの除去は、NMP中のβ-メルカプトエタノール及びDBU(メルカプトエタノール、DBU、NMP)を使用して実行される。
【００３９】
ステージ1b
3. この順で一般的なFmoc固相ペプチド合成プロトコールを使用する以下のアミノ酸の添加。
P6-hCy(Trt)(AA6)、P6-Asn(AA5)、P6-AAd(AA4)、P6-Ile(AA3)、最後にP6-AAb(AA2)
AAbは、D-芳香族α-アミノ酸であり、これは、場合により、P7で保護されたその側鎖を有し得る。P7は、保護基(好ましくはBoc)である。AAdは、脂肪族α-アミノ酸である。好ましくは、AAbはD-Trpであり、AAdはAlloIleである。
【００４０】
これらアミノ酸(AA6〜AA2)を樹脂に、遊離カルボキシル基及び保護されたα-アミノ基(P6)と共に添加するが、これは同じでも又は異なってもよく、好ましい保護基P6はFmocである。遊離カルボキシル基は、好ましくは、α-アミノ保護されたアミノ酸を、有機溶媒中のペプチドカップリング剤及びペプチドカップリング添加剤に供することで、予備活性化される。これら保護されたアミノ酸は、好ましくは、およそ1〜3当量、例えば、およそ1当量、およそ1.5当量、およそ2当量又はおよそ3当量の量で投入される。例えば、保護されたアミノ酸AA6、AA5、AA3及びAA2は、およそ2当量の量で樹脂に投入される。例えば、保護されたアミノ酸AA4は、およそ1.5当量の量で樹脂に投入される。例えば、カップリング剤(例えばDIC/HOBt)は、アミノ酸として同じ当量(例えばAA6、AA5、AA3及びAA2のカップリング用のおよそ2当量、並びに、AA4のカップリング用のおよそ1.5当量)で樹脂に投入される。
【００４１】
当業者に公知であるように、各アミノ酸のカップリング及び/又は脱保護の後、カップリング試験は、カップリング/脱保護が完了していることを確認するために実施され得る。カップリング/脱保護が完了されていない場合、反応を(カップリング又は脱保護のどちらかを)繰り返し得る。これらの試験の例として、「カイザー試験」(「ニンヒドリン試験」としても公知)(E. Kaiser、R. L. Colescott、C. D. Bossinger、P. I. Cook、Analytical Biochemistry 34号、595頁(1970年))、又は、「クロラニル試験」(遊離第二級アミンを試験する、T Christensen、Acts Chemica Scandinavica B 33号(1979年)763〜766頁)がある。
【００４２】
有機溶媒、ペプチドカップリング試薬、及びペプチドカップリング添加剤は、固相ペプチド合成法の分野で公知のもののいずれかであり得る。
【００４３】
典型的な有機溶媒は、THF、NMP、DCM、DMF、DMSO、IPA及びそれらの混合物である。好ましい溶媒は、NMP、DCM及びDMF、又はそれらの混合物である。例えば、カップリング反応用に選択される溶媒は、DMFである。例えば、脱保護反応用に選択される溶媒は、DMFである。
【００４４】
典型的なペプチドカップリング試薬は、o-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)、o-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、o-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、N,N-ビス-(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスホン酸ジクロリド(BOP-Cl)、ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBroP)、イソ-ブチルクロロホルメート(IBCF)、1,3ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1,3-ジイソプロピル-カルボジイミド(DIC)、1-(ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドヒドロクロリド(WSCDI)、N-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)、イソプロピルクロロホルメート(IPCF)、2-(5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TNTU)、無水プロパンホスホン酸(PPAA)、ピリジン、及び、2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TSTU)の1種又は複数である。好ましいカップリング剤は、DIC、PyBOP及びHBTUである。
【００４５】
典型的なペプチドカップリング添加剤は、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール(HOBt)及び1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)であり、好ましくはHOBtである。特に好ましい実施形態において、DIC及びHOBtは、組み合わせて使用される。別の実施形態において、PyBOP及びHOBtは、組み合わせて使用され得る。
【００４６】
好ましくは、第2のアミノ酸(P6-hCy(P2)-OH、好ましくはP6-hCy(trt)-OH、より好ましくはFmoc-hCy(Trt)-OH)は、およそ1.5当量又はおよそ2当量の量で投入される。好ましくは、本カップリングは、PyBOPの存在下で実行される。例えば、本カップリングは、DMF中のPyBOP/HOBt/DIEAの存在下で実行される。
【００４７】
好ましくは、第3のカップリング(P6-Asn(P1)-OH、好ましくはP6-Asn(Trt)-OH、更により好ましくはFmoc-Asn(Trt)-OH)は、およそ2当量の量で投入される。好ましくは、本カップリングは、DIC/HOBtの存在下で、好ましくはDMF中で、好ましくは挿入するアミノ酸に対しておよそ2当量の量で実行される。
【００４８】
好ましくは、第4のカップリング(P6-AAd-OH、好ましくはP6-AlloIle-OH、更により好ましくはFmoc-AlloIle-OH)は、およそ1.5当量の量で投入される。好ましくは、本カップリングは、DIC/HOBtの存在下で、好ましくはDMF中で、好ましくは挿入するアミノ酸に対しておよそ1.5当量の量で実行される。
【００４９】
好ましくは、第5のカップリング(P6-Ile-OH、好ましくはFmoc-Ile-OH)は、およそ2当量の量で投入される。好ましくは、本カップリングは、DIC/HOBtの存在下で、好ましくはDMF中で、好ましくはおよそ2当量の量で実行される。
【００５０】
好ましくは、第6のカップリング(P6-AAb(P7)-OH、好ましくはP6-D-Trp(Boc)-OH、更により好ましくはFmoc-D-Trp(Boc)-OH)は、およそ2当量の量で投入される。好ましくは、本カップリングは、DIC/HOBtの存在下で、好ましくはDMF中で、好ましくは挿入するアミノ酸に対しておよそ2当量の量で実行される。
【００５１】
ペプチドカップリング剤は、一般に、およそ1.5〜4当量、例えば、およそ1.5当量、およそ2当量、およそ3当量又はおよそ4当量、好ましくは挿入するアミノ酸に対しておよそ1.5当量は又はおよそ2当量の量で添加される(当量はモル当量である)。
【００５２】
各カップリング工程後、α-アミノ保護基(第2から第6までのカップリングに対するP6で、好ましくはFmoc)は、次のカップリング工程の前に除去する必要がある。このような工程は、当該分野で公知である。α-アミノ保護基P6がFmocである場合、これが上で記載した通り好ましい場合であるが、除去は、好ましくは、ピペリジン、DBU(1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-ウンデカ-7-エン)、又はDEA(ジエチルアミン)との反応によって達成される。好ましい溶媒はDMFである。好ましくは、Fmoc基の除去は、ピペリジン/DMFの混合物と、好ましくはDMF中、およそ35%のピペリジン(ピペリジン/DMF 35/65)と実行される。
【００５３】
以下のペプチド-樹脂が創出される:
P6-AAb-Ile-AAd-Asn(P1)-hCy(Trt)-NR-CHQ'-CH2-O-樹脂
【００５４】
AAbは、D-芳香族α-アミノ酸、好ましくはトリプトファン(D-Trp)である。
【００５５】
AAdは、脂肪族α-アミノ酸、好ましくはアロイソロイシン(alloIle)である。
【００５６】
Rは、CH3又はC2H5である。Q'は、(CH2)n-NP3P4(式中、nは、2、3又は4であり、P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、互いに同じでも又は異なってもよい)である。好ましくは、P4はHである。好ましくは、RはCH3であり、nは3であり、P4はHであり、及びP3はBocである。P1、P3及びP7は、同じでも又は異なってもよい。好ましくは、P3及びP7は、同じ保護基であり、好ましくはBocである。好ましくは、P1はTrtである。好ましくは、P5はNBSである。P6は、好ましくは、P1、P3及びP7に直交である。Barany等(Barany, G.; Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1977年、99号、7363頁、Barany, G.; Albericio, F. J. Am. Chem. Soc. 1985年、107号、4936頁)は、2つ以上の保護基が、独立したクラスに属し、明確な機構により除去されるという内容の、直交性の概念を記載した。したがって、これらの保護基(P1、P3及びP7)は、α-アミノ保護基(P5及びP6)を除去する工程で除去されないように、並びに、好ましくは、単一の反応工程で、最も好ましくは、樹脂からペプチドを切断する工程で、一緒に除去され得るように、選択される。P1で最も好ましいのはTrtであり、P3及びP7ではBocである。P6は、好ましくはFmocである。
【００５７】
以下の表に、好ましい切断試薬と一緒に、-NH2及び-OHに対して好ましい保護基を列挙する。
【００５８】
【表１】
2018535946.tif 000005
【００５９】
ステージ1c
4. アミノ酸保護基P6の除去、及び、ハロゲン-プロピオン酸(X-pra)(X-CH2CH2-COOH)のカップリング。Xは、F、Cl、Br及びIからなる群から選択されるハロゲン残基である。例えば、Xは、Cl又はBrであり得る。好ましくは、XはBrである。
【００６０】
好ましくは、この(第7の)カップリング(ハロゲン-プロピオン酸(X-pra)、好ましくは3-Br-プロピオン酸)は、およそ3当量の量で投入される。好ましくは、本カップリングは、DIC/DCMの存在下で、好ましくは挿入するアミノ酸に対しておよそ3当量の量で実行される。
【００６１】
上で記載した通り、ハロゲン-プロピオン酸(X-pra)(X-CH2CH2-COOH)(好ましくはBr-CH2CH2-COOH)のカップリング後、カップリング試験は、カップリングが完了していることを確認するために実施され得る。カップリングが完了されていない場合、反応は繰り返され得る。これらの試験の例として、「カイザー試験」(「ニンヒドリン試験」としても公知)又は「クロラニル試験」がある。例えば、ハロゲン-プロピオン酸(X-pra)(X-CH2CH2-COOH)(好ましくはBr-CH2CH2-COOH)のカップリング後、ニンヒドリン試験は、反応の完了を確認するために実行され得る。
【００６２】
ハロゲン-プロピオン酸(X-pra)(X-CH2CH2-COOH)(好ましくはBr-CH2CH2-COOH)のカップリング後、ペプチド-樹脂は、DCM及びIPAで洗浄され得る。
【００６３】
ペプチドカップリング剤は、一般に、挿入するアミノ酸に対しておよそ1.5〜4当量(例えば、およそ1.5当量、およそ2当量若しくはおよそ3当量又はおよそ4当量、好ましくは上記の第7のカップリングの場合、およそ3当量)の量で添加される(当量はモル当量である)。
【００６４】
ハロゲン-プロピオン酸(X-pra)(X-CH2CH2-COOH)(好ましくはBr-CH2CH2-COOH)のカップリング後、以下の保護されたペプチドは、樹脂に付着される:
X-AA1(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂
好ましくは:
X-(CH2)2-CO-AAb-Ile-AAd-Asn(P1)-hCy(Trt)-NR-CHQ'-CH2O-樹脂、
更により好ましくは、
Br-(CH2)2-CO-D-Trp(Boc)-Ile-alloIle-Asn(trt)-hCy(Trt)-N-Me-Orn(Boc)-O-樹脂
【００６５】
Rは、CH3又はC2H5、Q'は、(CH2)n-NP3P4(式中、nは、2、3又は4であり、P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、互いに同じでも又は異なってもよい)である。Xは、ハロゲン残基、例えば、F、Cl、Br又はI、好ましくはBrである。AAbは、D-芳香族α-アミノ酸、好ましくはトリプトファン(D-trp)である。AAdは、脂肪族α-アミノ酸、好ましくはアロイソロイシン(alloIle)である。好ましくは、RはCH3であり、nは3であり、P4はHであり、及びP3はBocである。好ましくは、P7はBocである。好ましくは、P1はTrtである。
【００６６】
一実施形態において、Xは、P5がFmocである場合、Clではない。
【００６７】
ステージ2
5.側鎖保護基(P1、P3、P4及びP7、これら全てが存在する場合)のペプチドからの除去、並びに、樹脂からのペプチドの切断、脱保護された直鎖状ペプチド:
X-AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7-ol、好ましくは
X-(CH2)2-CO-AAb-Ile-AAd-Asn-hCy-NR-CHQ-CH2OH、更により好ましくは
Br-(CH2)2-CO-D-Trp-Ile-alloIle-Asn-hCy-N-Me-Orn-ol
(式中、RはCH3又はC2H5であり、Qは、(CH2)n-NH2であり、nは、2、3、又は4である。好ましくは、RはCH3であり、nは3である)の獲得。
【００６８】
Xは、ハロゲン残基、例えば、Cl又はBr、好ましくはBrである。
【００６９】
AAbは、D-芳香族α-アミノ酸、好ましくはトリプトファン(D-trp)である。
【００７０】
AAdは、脂肪族α-アミノ酸、好ましくはアロイソロイシン(alloIle)である。
【００７１】
切断条件は特に、使用される樹脂及び保護基の種類に依存する。しかし、本発明にしたがって、切断は、好ましくはTFAを伴う酸性条件下で実施される。
【００７２】
本発明にしたがって、これら2つの工程(側鎖保護基(P1、P3、P4及びP7、これら全てが存在する場合)の切断及び除去)は、好ましくは単一の脱保護及び切断の工程で合わせられる。
【００７３】
好ましくは、切断及び脱保護は、およそ1〜5時間、好ましくはおよそ3時間、TFA、H2O及びDTTを含む(又は、或いは、からなる)切断カクテルの存在下で、好ましくは、およそ86/5/9(TFA/H2O/DTT)の比で、好ましくは、(ペプチド樹脂の切断カクテル/gの)およそ5mLの量で、単一の工程で実行される。
【００７４】
例えば、切断は、室温で、例えばおよそ25℃で実行され得る。切断は、15〜30℃、例えばおよそ15℃、およそ20℃若しくはおよそ25℃、又はおよそ30℃の温度で実行され得る。好ましくは、切断は室温(RT)で実行される。
【００７５】
切断後、脱保護されたペプチド及び樹脂は、例えば、TFAの冷却(例えば、-5〜8℃、例として、2〜8℃、好ましくは0℃±5℃の温度で)、及び、例えばMBTE/n-ヘプタンの、好ましくは80:20の比、又は好ましくは70:30の比(MBTE:n-ヘプタン)での添加により沈殿され得る。好ましくは、温度は、およそ20℃未満に維持するように制御される。
【００７６】
切断後、脱保護されたペプチドは、ペプチド-樹脂から、例えば水/CH3CN:7/3、1.6g/Lで抽出され得る。切断後、粗直鎖状ペプチド及び樹脂は、例えばMTBEで濾別及び洗浄され(例えば、ペプチド-樹脂の1グラム当たりおよそ3mLの量で3回)、真空下で乾燥され得る。
【００７７】
6.場合による直鎖状ペプチドの精製。精製は、クロマトグラフ技術、例えば、分取逆相クロマトグラフィー(RPC)により実行され得る。
【００７８】
したがって、(場合により精製された)脱保護された直鎖状ペプチドが得られる:
X-AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7-ol、
好ましくは
X-(CH2)2-CO-AAb-Ile-AAd-Asn-hCy-NR-CHQ-CH2-OH、
より好ましくは
Br-(CH2)2-CO-D-Trp-Ile-alloIle-Asn-hCy-N-Me-Orn-ol。
【００７９】
RはCH3又はC2H5であり、Qは、(CH2)n-NH2であり、nは、2、3、又は4である。好ましくは、RはCH3であり、好ましくは、nは3である。Xは、ハロゲン残基、例えば、F、Cl、Br又はI、好ましくはBrである。AAbは、D-芳香族α-アミノ酸、好ましくはトリプトファン(D-Trp)である。AAdは、脂肪族α-アミノ酸、好ましくはアロイソロイシン(alloIle)である。
【００８０】
ステージ3
7.ハロゲンX(好ましくはBr)の、ホモシステイン(hCy)チオールでの分子内置換を介した溶液中のペプチドの環化の実行。好ましくは、環化は、炭酸塩(例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム)等の適切な塩基、又はDIEA等の有機塩基の存在中で、次いで、適切な酸(例えば、酢酸)での酸性化(例えば、pH5.5又はpH6)により起こる。好ましくは、環化は、炭酸ナトリウム(Na2CO3)の存在下で起こる。
【００８１】
溶液1L当たり1及び2gのペプチド、好ましくは溶液1L当たりおよそ1gのペプチドの濃度になるように、Na2CO3(例えば、およそ10g/Lの量で)を添加する。環化反応は、当業者に公知であるように、HPLCによりモニタリングされ得る。
【００８２】
環化が完了されると、溶液のpHは、適切な塩基、例えばAcOHの添加により、例えば5.5又はpH6に調節され得る。次いで、環状ペプチドは、濾過され、水/CH3CN(7/3)で洗浄され得る。
【００８３】
このようにして得られる、オキシトシンアンタゴニスト活性を有する、環状ヘプタペプチド類似体、好ましくはバルシバン、又は薬学的に許容されるその塩は:c[(CH2)2-CO-AAb-Ile-AAd-Asn-hCy]-NR-CHQ-CH2OH、好ましくは、c[(CH2)2-CO-D-Trp-Ile-AlloIle-Asn-hCy]-N-MeOrn-olは、
【００８４】
【化４】
2018535946.tif 000006
【００８５】
としても表される。
【００８６】
Rは、CH3又はC2H5であり、Qは、(CH2)n-NH2であり、nは、2、3、又は4である。好ましくは、RはCH3であり、好ましくは、nは3である。Xは、ハロゲン残基、例えば、F、Cl、Br又はI、好ましくはBrである。AAbは、D-芳香族α-アミノ酸、好ましくはトリプトファン(D-Trp)である。AAdは、脂肪族α-アミノ酸、好ましくはアロイソロイシン(alloIle)である。
【００８７】
場合により、環状ペプチドは、精製され得る。精製は、クロマトグラフ技術、例えば、分取逆相クロマトグラフィー(RPC)により実行され得る。精製に続いて、ペプチドは凍結乾燥され得る。
【００８８】
加えて、本発明は、以下の式:
X-(CH2)2-CO-AAb-Ile-AAd-Asn(P1)-hCy(P2)-NR-CHQ'-CH2OW
(式中、AAbは、D-芳香族α-アミノ酸(好ましくはD-Trp)であり、これは、場合により、その側鎖を保護され得、AAdは、脂肪族α-アミノ酸(好ましくはalloIle)であり、Xは、F、Cl、Br及びIからなる群から選択される、好ましくはBrであるハロゲン残基であり、P1は、保護基(好ましくはTrt)であり、P2は、Trtであり、Rは、CH3又はC2H5であり、Q'は、(CH2)n-NP3P4(式中、nは、2、3又は4であり、P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、互いに同じでも又は異なってもよく、P1及び/又はP2と同じでも又は異なってもよい)であり、Wは、H(すなわち、C-末端はアルコールである)、保護基又は樹脂である。好ましくは、P4はHであり、P3はBocである。好ましくは、RはCH3であり、nは3であり、P4はHであり、P3はBocである)
を有する中間体ペプチドを提供する。
【００８９】
好ましくは、AAbはD-Trpであり、好ましくは、保護基P7で保護されたその側鎖を有する。好ましくは、P7はBocである。好ましくは、AAdは、AlloIleである。
【００９０】
加えて、本発明は、以下の式:
X-(CH2)2-CO-D-Trp(Boc)-Ile-AlloIle-Asn(Trt)-hCy(Trt)-N-Me-Orn(Boc)-OW
(式中、Xは、F、Cl、Br及びIからなる群から選択される、好ましくはBrであるハロゲン残基であり、Wは、H(すなわち、C-末端はアルコールである)、保護基又は樹脂である)
を有する中間体ペプチドを提供する。好ましくは、本発明は、以下の式:
X-(CH2)2-CO-D-Trp-Ile-AlloIle-Asn-hCy-N-Me-Orn-ol
(式中、Xは、F、Cl、Br及びIからなる群から選択される、好ましくはBrであるハロゲン残基である)
を有する中間体ペプチドを提供する。
【００９１】
加えて、本発明は、以下の式:
Br-(CH2)2-CO-D-Trp-Ile-AlloIle-Asn-hCy-N-Me-Orn-ol
を有する中間体ペプチドを提供する。
【００９２】
本明細書で使用する場合、用語「約(about)」及び「およそ(approx.)」は、指示された値のその値±1%を意味し、又は用語「約」及び「およそ」は、指示された値のその値±2%を意味し、又は用語「約」及び「およそ」は、指示された値のその値±5%を意味し、用語「約」及び「およそ」は、指示された値のその値±10%を意味し、又は用語「約」及び「およそ」は、指示された値のその値±20%を意味し、又は用語「約」及び「およそ」は、指示された値のその値±30%を意味し、好ましくは、用語「約」及び「およそ」は、正確に指示された値(±0%)を意味する。
【実施例】
【００９３】
1.(実施例1)
バルシバンの合成  合成フローチャート
【００９４】
【表２Ａ】
2018535946.tif 000007
【００９５】
【表２Ｂ】
2018535946.tif 000008
【００９６】
【表２Ｃ】
2018535946.tif 000009
【００９７】
1.2. 製造方法の説明
アセンブリ
保護されたo-NBS-N-MeOrn(Boc)-olは、ピリジンの存在下で、60℃で17時間、DMF中のクロロ-2-クロロトリチル樹脂(CTC樹脂)上に直接カップリングする。樹脂のキャッピング後、NBS基は、DBU/メルカプトエタノール/NMP混合物での洗浄により脱保護する。NBS保護基の除去後、第2の保護されたアミノ酸(Fmoc-hCy(Trt)-OH)は、DMF中のPyBOP/HOBt/DIEAとカップリングする。反応の完了は、カップリング試験(クロラニル試験)により確認する。4つの他の残基(Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-AlloIle-OH、Fmoc-Ile-OH及びFmoc-D-Trp(Boc)-OH)は、Fmoc脱保護及びアミノ酸カップリングサイクルの連続により組み込まれる。
1.Fmoc除去
2.DMF洗浄
3.DMF中のFmoc-AA-OHとDIC/HOBtとのカップリング
4.カップリング試験(ニンヒドリン試験又はクロラニル試験)
5.DMF洗浄
【００９８】
反応物の体積は、ペプチド-樹脂5mL/gに基づいて計算する。Fmoc保護基の脱保護は、ピペリジン(DMF中35%)で、3回繰り返すサイクルで(3分、3分及び10分)起こる。洗浄は、Fmoc保護基の脱保護後に7回繰り返すサイクルで、及びカップリング工程後に3回繰り返すサイクルで、DMFで実行する。全てのカップリング反応を、DMF中の2当量のFmoc保護されたアミノ酸及び2当量のDIC/HOBtで実施するが、Fmoc-alloIle-OHカップリングは除く(2当量の代わりに1.5当量)。各アミノ酸カップリング反応後、完了は、未反応のアミンが明らかとなることに基づく、半定量比色試験により制御する。第一級アミンは、ニンヒドリン試験(カイザー試験)(Kaiser等、Analytical Biochem.、39号、305頁(1975年)、E. Kaiser、R.L. Colescott、C.D. Bossinger、P.I. Cook、Analytical Biochem.、34号(2刷)、595〜598頁(1970年))で試験し、第二級アミンは、クロラニル試験(Kaiser等、Analytical Biochem.、39号、305頁(1975年))で試験する。最終カップリング反応は、DCM中溶液の3当量の3-ブロモプロピオン酸と3当量のDICで行って、保護された直鎖状ペプチドを得る。
【００９９】
切断:
アセンブリ工程後、樹脂からの切断及び付随する側鎖の脱保護は、TFA混合物中で実行し、粗直鎖状ペプチドをもたらす。ペプチドを、樹脂から切断し、室温で3時間00分、ペプチド-樹脂1グラム当たり5mLの濃度で、TFA/H2O/DTT混合物(86/5/9 v/v/w)で脱保護する。ペプチド-樹脂は、温度を制御しながら(T≦20℃)、少量ずつ添加する。反応混合物を0℃±5℃に冷却し、混合物MTBE/n-ヘプタン(7/3、ペプチド-樹脂1グラム当たり50mL)を反応混合物に注ぎ入れ、温度制御下(T<20℃)で樹脂内の切断された直鎖状ペプチドが沈殿する。粗直鎖状ペプチド+樹脂は、濾別し、MTBEで洗浄(ペプチド-樹脂の1グラム当たり3×3mL)、真空下で乾燥する。
【０１００】
環化:
直鎖状ペプチドは、水/CH3CN(7/3)の溶液に、1.6g/Lの濃度で溶解する。次いで、溶液を1g/Lの濃度に調節し、ペプチドの脱炭酸を完了するために終夜、撹拌する。環化の前、溶液中の直鎖状ペプチドの量を、1g/Lの濃度で、直鎖状ペプチドの標準試料を介して、HPLCで推定する。ペプチドは、ペプチド1g/Lの濃度で、炭酸ナトリウムの存在下(10g/L)で、樹脂と環化する。環化の完了は、HPLCでモニタリングする。環化が完了すると(1%未満の直鎖状ペプチド)、反応混合物のpHは、酢酸の添加により約5.5に低下する。樹脂は、濾別し、水/CH3CN(7/3 v/v)で洗浄する。次いで、濾液は、水により半分に希釈し、2〜8℃で保管する。
【０１０１】
2.(実施例2)
3ブロモプロピオン酸の代わりに3クロロプロピオン酸を使用する、粗バルシバンの合成
実験は、上記の方法(実施例1を参照のこと)にしたがって、3-ブロモプロピオン酸を3-クロロプロピオン酸に置き換えて実行した。
【０１０２】
2.1. アセンブリ
樹脂のローディング
アセンブリは、5ミリモルスケールで(クロロ-2-クロロトリチル樹脂(CTC樹脂)7.14gを0.7meq/gの置換で)実行した。DMF(7mL)中で15分間の樹脂の膨張後、o-NBS-N-MeOrn(Boc)-ol(1当量、2.92g)を、DMF 9mLに溶解し、樹脂に添加した。ピリジン(2当量、0.81mL)を添加し、反応混合物を60℃に加熱し、17時間撹拌した。1時間後、6mLのDMFを、反応混合物をホモジナイズするために添加した。ローディング反応の間、o-NBS-N-MeOrn(Boc)-olの濃度は、0.22mol/Lであった。17時間後、15mLのDMFを、キャッピング前に反応混合物をホモジナイズするために、樹脂上に添加した。これらの条件下で、o-NBS-NMeOrn(Boc)-olの安定性を確認している。研究は、実施例5に記載する。材料は、これらのローディング条件下で、いかなる分解もすることなく安定であることは明らかである。
【０１０３】
樹脂キャッピング
DIEA(5.7当量、4.96mL)及びMeOH(4.96mL、v/v)は、樹脂上に添加し、樹脂の未反応部位を中和するために室温で1時間撹拌した。次いで、樹脂を排出し、DMF(3×45mL)で洗浄する。
【０１０４】
NBS脱保護及びFmoc-hCy(Trt)-OHカップリング
NBS保護基を、2回繰り返すサイクル(2×10分)で、NMP(30mL)中の、DBU/メルカプトエタノール(5当量/10当量、3.74mL/3.51mL)の混合物で除去した。第2のアミノ酸(Fmoc-hCy(Trt)-OH)は、DMF(23mL)中の、PyBOP/HOBt/DIEA(1.5当量/1.5当量/3.75当量、1.15g/3.90g/3.26mL)でカップリングした。16時間後、反応の完了は、クロラニル試験により確認し、樹脂はDMF(3×51mL)で洗浄した。
【０１０５】
Fmoc脱保護:
以下のアミノ酸(Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-alloIle-OH、Fmoc-Ile-OH及びFmoc-D-Trp(Boc)-OH)は、上記の製造方法(実施例1)にしたがって、Fmoc脱保護及びアミノ酸カップリングサイクルの連続により組み込んだ。Fmoc保護基は、DMF中のピペリジン35%の混合物で、3回繰り返すサイクルで(3分、3分及び10分)除去した。Fmoc脱保護後、7回繰り返すサイクルでDMFで、及びカップリング工程後、3回繰り返すサイクルでDMFで、洗浄を実行した。Fmoc脱保護の体積は、ペプチド-樹脂5mL/gに基づいて計算する。
【０１０６】
Fmoc-AA-OHカップリング:
Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH及びFmoc-D-Trp(Boc)-OHに対して、2当量のアミノ酸を、DMF(25mL)中の2当量のDIC/HOBtの存在下でカップリングした。Fmoc-alloIle-OHに対して、1.5当量のアミノ酸を、DMF(25mL)中の1.5当量のDIC/HOBtの存在下でカップリングした。全てのカップリングに対して、反応の完了は、ニンヒドリン試験により確認し、樹脂はDMFで3回繰り返すサイクルで洗浄した。
【０１０７】
3クロロプロピオン酸カップリング:
最終カップリングは、3-クロロプロピオン酸(3当量)1.63g及び2.34mLのDICをDCM(42.5mL)に溶解することで実行した。反応の完了は、ニンヒドリン試験により確認した(カップリング時間=2時間)。アセンブリの最後に、樹脂をDCM(3×77mL)、IPA(5×77mL)で洗浄し、真空下で乾燥した。保護されたペプチド-樹脂12gが得られ、回収率は92.4%を示す。
【０１０８】
切断及び脱保護
保護されたペプチド-樹脂12gを、温度を制御しながら(T≦20℃)、TFA/H2O/DTT混合物(86/5/9 v/v/w)(60mL)上に少量ずつ添加した。反応混合物を室温で3時間00分、撹拌した。次いで、反応混合物を2.7℃まで冷却し、混合物MTBE/n-ヘプタン(7/3 v/v)(600mL)を、20℃未満に温度を維持しつつ、反応器に注ぎ入れた。粗直鎖状ペプチド+樹脂は、濾別し、MTBEで洗浄(3×36mL)、真空下で終夜、乾燥した。13gの粗クロロ直鎖状ペプチド+樹脂を得た。HPLC純度は、76.6%である。
【０１０９】
2.2. 環化
クロロ直鎖状ペプチド+樹脂の総量を、2分割し、環化を約6.5gで2回実行する。
【０１１０】
2.2.1. 第1の環化
第1の環化は、上の実施例1に記載された方法にしたがって、6.5gで実行した。環化は、HPLCで分析したところ、完了には至らなかった。その結果、第2の環化は、クロロ直鎖状ペプチドをおよそ6.5g残したまま開始した。
【０１１１】
2.2.2. 第2の環化
第2の環化は、6.44gのクロロ直鎖状ペプチド+樹脂で実行した。クロロ直鎖状ペプチド+樹脂を、水/CH3CN(7/3 v/v)溶液595mLに溶解し、濃度1g/Lで溶液中にペプチドを得た。固体の炭酸ナトリウム5.95gを添加した(pH11.3)。反応は、定期的にHPLCによりモニタリングした。25時間後、HPLCモニタリングは、直鎖状ペプチドが1%未満であることを示した。酢酸8.35mLを添加して、反応混合物を中和した;溶液の得られたpHは、5.6であった。酸性化後、樹脂を濾過により除去し、水/CH3CN(7/3)混合物30mLで2回洗浄した。次いで、濾液を水660mLで希釈し、2〜8℃で保管した。溶液中の粗ペプチドの最終濃度は、HPLCによる86.4%の純度で、0.45g/Lであった。2つのアセンブリから得られた結果は、実施例1及び2に記載されたバルシバンの合成方法において、3-ブロモプロピオン酸(実施例1)の使用、及び、3-クロロプロピオン酸(実施例2)の使用の間の差を評価するために比較する。
【０１１２】
アセンブリ結果
以下の表(Table 2(表3))では、実施例2の実験及び実施例1の生成で得られるアセンブリデータを要約し、比較する。
【０１１３】
【表３】
2018535946.tif 000010
【０１１４】
3-ハロプロピオン酸のカップリングまで、両アセンブリは、同じ条件にしたがって実行した;結果、同様のカップリング時間を観察しても驚くほどではない。更に、最終試薬を変化させても、カップリング時間の有意差を観察しない;3-クロロプロピオン酸(実施例2の実験)は、3-ブロモプロピオン酸(実施例1)より同様のカップリング時間を示し、両反応とも2時間未満で完了する。樹脂のローディングを考慮して、両アセンブリは、同等の収率(ほぼ90%)を示す。主な違いは、環化に必要な反応時間にある;実際に、環化は、ブロモ誘導体(実施例1)を使用した方法で1時間後に完了するのに対して、クロロ誘導体(実施例2)を使用すると25時間を要する。ブロモ直鎖状ペプチドは、クロロ直鎖状ペプチドと比較してより良好な反応性を示す。
【０１１５】
環状粗製物のHPLC純度は類似しており、3-クロロプロピオン酸は86.36%であり、3-ブロモプロピオン酸は85.24%である。
【０１１６】
これらアセンブリ結果は、実施例1及び2に示す通り、バルシバンが3-クロロプロピオン酸から合成され得るが、環化時間は3-ブロモプロピオン酸を使用する場合より長くなることを示す。
【０１１７】
粗バルシバンのHPLC純度プロファイル
3-クロロプロピオン酸又は3-ブロモプロピオン酸から合成される粗バルシバン溶液を、不純度を同定し、不純度プロファイルを比較するために、HPLC及びLC/MSにより分析した。
【０１１８】
主な不純度は、以下のTable 3(表4)に列挙する。
【０１１９】
【表４Ａ】
2018535946.tif 000011
【０１２０】
【表４Ｂ】
2018535946.tif 000012
【０１２１】
3-ブロモプロピオン酸を使用する本発明の製造方法(例えば実施例1)は、環化反応がより早く、副反応がより少なく起こるので、より適当である。
【０１２２】
実施例1及び2の結論
実施例2の実験の目的は、実施例1に記載されたバルシバンの合成方法で、3-ブロモプロピオン酸の、3-クロロプロピオン酸による置き換えを評価することであった。これら試験後に得られた全ての結果(Table 2(表3)及びTable 3(表4)を参照のこと)に基づいて、3-クロロプロピオン酸の使用は可能であるが、それでも、環化反応は、クロロ直鎖状ペプチドの低反応性のため、より時間がかかる。延長した反応時間は、塩基水溶液中のペプチドの部分脱アミドを含む。形成された不純物は、精製工程では分離が困難であり得る。
【０１２３】
3.(実施例3)
異なる合成法によるバルシバンの合成
3.1.合成フローチャート
実施例3の方法によるバルシバンの製造のフローチャートを、下記に表す。
【０１２４】
【表５Ａ】
2018535946.tif 000013
【０１２５】
【表５Ｂ】
2018535946.tif 000014
【０１２６】
3.2. 製造方法の説明
3.2.1. アセンブリ
保護されたFmoc-N-MeOrn(Boc)-olは、DMPAの存在下で、室温で2時間、DMF中のカルボン酸樹脂上に直接カップリングする。樹脂のキャッピング後、Fmoc基は、ピペリジン溶液(DMF中20%)での洗浄により脱保護する。5つの他の残基(Fmoc-hCy(mmt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-alloIle-OH、Fmoc-Ile-OH及びFmoc-D-Trp(Boc)-OH)は、Fmoc脱保護及びアミノ酸カップリングサイクルの連続により組み込まれる。
1.Fmoc除去
2.DMF洗浄
3.アミノ酸の予備活性化による、DMF中のFmoc-AA-OHとDIC/HOBtとのカップリング
4.カップリング試験(ニンヒドリン試験又はクロラニル試験)
5.DMF洗浄
【０１２７】
反応物の体積は、ペプチド-樹脂5mL/gに基づいて計算する。Fmoc保護基の脱保護は、ピペリジン(DMF中20%)で、2回繰り返すサイクルで(10分及び20分)起こる。洗浄は、Fmoc脱保護後に7回繰り返すサイクルで、及びカップリング工程後に3回繰り返すサイクルで、DMFで実行する。予備活性化は、0℃で5分間、撹拌することで、DMF中の3当量のFmoc-AA-OH及び3.3当量のDIC/HOBtで実行する。予備活性化後、全てのカップリング反応を、室温で2時間、実施する。これは重要な工程であるので、各アミノ酸カップリング反応後、完了は、未反応のアミンが明らかとなることに基づく、半定量比色試験により制御する。第一級アミンは、ニンヒドリン試験(カイザー試験)で試験し、第二級アミンは、クロラニル試験で試験する。最終カップリングは、DMF中溶液の3-ハロプロピオン酸で行って、保護された直鎖状ペプチドを得る。
【０１２８】
3.2.2. ホモシステインの脱保護及び環化
アセンブリ工程後、ホモシステイン(hCy)のmmt保護基は、脱保護され、ペプチド-樹脂は樹脂に環化する。反応物の体積は、ペプチド-樹脂5mL/gに基づいて計算する。ペプチド-樹脂は、DCMで3回繰り返すサイクルで洗浄し、mmt基は、TFA/EDT/DCM(2/3/95 v/v/v)の混合物で、5回繰り返すサイクルで除去する。脱保護後、3回繰り返すサイクルで、DCM及びDMFで、洗浄を実行する。ペプチドは、室温で8時間、テトラメチルグアニジンの溶液(DMF中1%)で樹脂上に環化する。環化後、環状ペプチド-樹脂は、真空下で乾燥する前に、DMF、DCM及びMeOHで洗浄する。
【０１２９】
3.2.3. 切断
環化後、樹脂からの切断及び付随する側鎖の脱保護は、TFA混合物中で実行し、粗バルシバンをもたらす。ペプチドを、樹脂から切断し、室温で2時間、ペプチド-樹脂1グラム当たり10.6mLの濃度で、TFA/TIS/EDT/PhOH/H2O混合物(90/3/2/1/4 v/v/v/v/v)で脱保護する。反応混合物は濾別し、樹脂はTFAで洗浄する。反応混合物を乾燥Et2O(ペプチド-樹脂1g当たり106mL)に注ぎ入れ、粗環状ペプチドが沈殿する。沈殿物は、濾別し、乾燥Et2Oで洗浄(ペプチド-樹脂の1グラム当たり3×3.3mL)、真空下で乾燥する。
【０１３０】
3.3. 実験計画
異なるカップリング時間によるバルシバンの合成の比較のために、実験を2つの経路に分割することを決定した。
-  仮にカップリング試験が陽性であっても(実施例3.1)、2時間後にカップリングを停止する、第1の経路。
-  カップリングは最低2時間、実行し、カイザー試験による完了後のみ停止する(この場合、カップリング時間は異なり得る(IPC)(実施例3.2))、第2の経路。
【０１３１】
加えて、各実験(3.1及び3.2)に対して、更なる変数を導入した、すなわち、カップリングした最終アミノ酸は、3-ブロモプロピオン酸又は3-クロロプロピオン酸であった(以下のスキームを参照のこと)。トータルで4つの合成法がある:
実験3.1.1:カップリングを2時間後に停止;3-クロロプロピオン酸
実験3.1.2:カップリングを2時間後に停止;3-ブロモプロピオン酸
実験3.2.1:カップリングは最低2時間実行、カイザー試験による完了後のみ停止;3-クロロプロピオン酸
実験3.2.2:カップリングは最低2時間実行、カイザー試験による完了後のみ停止;3-ブロモプロピオン酸
【０１３２】
以下のスキーム(スキーム1)は、実験計画と、続く実施例3(3.1.1、3.1.2、3.2.1及び3.2.2)による粗バルシバンの合成を要約する:
【０１３３】
【化５】
2018535946.tif 000015
【０１３４】
樹脂のローディングは、2ミリモルのカルボン酸樹脂で、1.9mmol/gの置換で実行する。ローディング工程後、量を2等分し(それぞれ1ミリモル)、アセンブリは、第1の経路(実験3.1)又は第2の経路(実験3.2)のいずれかを使用することにより継続する。Fmoc-D-Trp(Boc)-OHのカップリング後、量を2等分し(それぞれ0.5ミリモル)、アセンブリは、3-クロロプロピオン酸(実験3.1.1及び3.2.1)又は3-ブロモプロピオン酸(実験3.1.2又は3.2.2)のいずれかを使用することにより各経路で継続する。
【０１３５】
3.4. Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olの合成
Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olを、実施例3に記載された方法の出発物質として使用する。本誘導体は、実施例1及び2に記載された方法で使用されたものと同じではなく、したがってアセンブリの前に合成した。Fmoc誘導体を、以下に記載された2つの工程の手順で、実施例1及び2で使用された物質o-NBS-N-MeOrn(Boc)-olから得た。
【０１３６】
3.4.1.反応スキーム
Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olは、以下に記載された反応スキーム(スキーム2)にしたがって、2つの工程でo-NBS-N-MeOrn(Boc)-olから合成する。
【０１３７】
【化６】
2018535946.tif 000016
【０１３８】
3.4.2. 工程1:PhSHによるo-NBS基の脱保護
o-NBS基は、塩基溶液中のチオフェノールでの処理により脱保護する。アセトニトリルの濃縮及び酸性水の添加後、主な有機不純物はIPEでの洗浄により除去される。
【０１３９】
実験:
o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-ol(50g、1当量、119.8mmol)を、3Lのネック付きフラスコ中で、CH3CN(16V)に溶解した。K2CO3(54.6g、3.5当量、395.3mmol)及びPhSH(30.5mL/33g、2.5当量、299.4mmol)を、反応混合物に添加し、室温で撹拌した。反応の完了は、TLC(AcOEt/シクロヘキサン/AcOH、5/5/0.5及びCHCl3/メタノール/AcOH、60/10/5)により確認した。19時間後、溶媒を、ロータリーエバポレータで濃縮して除去し、水(800mL)を添加した。水性相をIPEで2回(2×300mL)洗浄し、溶液を次の工程でそのまま使用した。
【０１４０】
3.4.3. 工程2:Fmoc-OSuでのFmoc保護
水性相はそのまま使用して、Fmoc保護は、アセトン/水中でFmoc-OSuを使用して実行する。反応混合物の酸性化後、溶液はAcOEtにより抽出し、塩基及び酸の溶液で洗浄する。
【０１４１】
実験:
アセトン(800mL)中のFmoc-OSu(36.4g、0.9当量、107.8mmol)を、H-N-Me-L-Orn(Boc)-olを含有する反応混合物に添加し、室温で終夜、撹拌した。反応の完了は、TLC(AcOEt/シクロヘキサン/AcOH、5/5/0.5及びCHCl3/メタノール/AcOH、60/10/5)により確認した。終夜後、AcOEt(800mL)を添加し、水性相は処分した。有機相を、NaHCO3溶液(水中5%)で2回(2×400mL)、KHSO4 1N溶液で2回(2×400mL)、並びに水(400mL)及びブライン(400mL)で1回洗浄した。次いで、有機相をNa2SO4で脱水した。化合物は、シリカゲル及び溶離液としてAcOEt/シクロヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。純粋な画分の濃縮後、Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olを白色泡状物として単離する。
【０１４２】
実験:
濾過及びロータリーエバポレータでの濃縮後、粗製物を、シリカゲル(溶離液:AcOEt/シクロヘキサン3/7(5L)、次いで7/3(10L))でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。純粋な画分を濃縮し、シクロヘキサン(300mL)で共蒸発し、真空下(≦100mmHg)で20時間、乾燥して、白色ワックス状物を得た。冷たいペンタン(-20℃)を添加し、スラリー混合物を、-20℃で1時間、撹拌した。Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olが固体を形成しなかったので、濾過は不可能だった。ペンタンを、ロータリーエバポレータで濃縮して除去し、白色泡状物を真空下(≦100mmHg)で20時間、乾燥した。34.1gのFmoc-N-MeOrn(Boc)-olを、2つの工程で70%の収率に対応して得た。Fmoc誘導体のHPLC純度は、99.10%である。Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olの安定性は、様々な条件で確認し、実施例5に記載する。
【０１４３】
3.5. 実施例3の方法による粗バルシバンの合成
3.5.1.ローディング及びキャッピング
樹脂のローディング:
ローディングは、カルボン酸樹脂2mmolで、1.9meq/gの置換で実行した。
カルボン酸樹脂(1当量、1.05g)を、DMF(5.26mL)中で30分、膨張し、排出した。同時に、Fmoc-N-MeOrn(Boc)-ol(2当量、1.82g)を、DMF(3.4mL)に溶解し、0℃で5分間、DIC(1当量、0.31mL)で予備活性化した。予備活性化後、Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olを樹脂に添加した。DMAP(0.22当量、54mg)を添加し、混合物を室温で2時間、撹拌した。2時間後、樹脂を排出し、DMF(3×7.6mL)で洗浄した。これらの条件下でのFmoc-N-MeOrn(Boc)-olの安定性を、上で記載した通り、実施例5に記載する。部分的な分解が既に室温で2時間後に観察されていること;物質が潜在的にローディング反応中に分解し得ることは明らかである。
【０１４４】
樹脂キャッピング:
DMF(3.4mL)を反応器に添加し、次いで、DIEA(0.83当量、290μL)及びMeOH(1.7mL)を添加した。反応混合物を、樹脂の未反応部位を中和するために室温で1時間30分、撹拌した。次いで、樹脂を排出し、DMF(3×7.6mL)で洗浄した。上記の実験計画(スキーム1)にしたがって、ペプチド-樹脂の総量を、2つの部分に分割した。第1の部分は、経路1(第1の経路、カップリング時間2時間、実施例3.1)を介した合成に使用し、第2の部分は、経路2(第2の経路、カイザー試験による完了に応じて可変のカップリング時間(最低2時間)、実施例3.2)を介した合成に使用した。
【０１４５】
3.5.2. 第1の経路:実施例3.1による実験
第1の経路において、以下の5つのアミノ酸は、ペプチドFmoc-D-Trp(Boc)-Ile-alloIle-Asn(Trt)-hCy(mmt)-N-MeOrn(Boc)-O-樹脂に至るまで1ミリモルスケールで集合した。
【０１４６】
Fmoc脱保護:
以下のアミノ酸(Fmoc-hCy(mmt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-alloIle-OH、Fmoc-Ile-OH及びFmoc-D-Trp(Boc)-OH)は、上記の実施例3の製造方法(第3.2節を参照のこと)にしたがって、Fmoc脱保護及びアミノ酸カップリングサイクルの連続により組み込んだ。Fmoc保護基は、DMF中のピペリジン20%の混合物で、2回繰り返すサイクルで(10分及び20分)除去した。脱保護後、7回繰り返すサイクルでDMFで、及びカップリング工程後、3回繰り返すサイクルでDMFで、洗浄を実行した。Fmoc脱保護反応の体積は、ペプチド-樹脂5mL/gに基づいて計算する。
【０１４７】
Fmoc-AA-OHカップリング:
3当量の以下のアミノ酸(Fmoc-hCy(mmt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-alloIle-OH、Fmoc-Ile-OH及びFmoc-D-Trp(Boc)-OH)を、0℃で5分間、反応器中の樹脂に添加する前にDMF中の3.3当量のDIC/HOBtで予備活性化した。全てのカップリングを2時間実行し、クロラニル又はニンヒドリン試験により確認した。カップリング試験は、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-alloIle-OH、Fmoc-Ile-OH及びFmoc-D-Trp(Boc)-OHに対して陰性であった。Fmoc-hCy(mmt)-OHカップリングでの陽性試験にもかかわらず、反応を(2時間後に)停止した。カップリング試験後、樹脂を3回繰り返すサイクルでDMFで洗浄した。Fmoc-D-Trp(Boc)-OHのカップリング後、ペプチド-樹脂の総量を、2つの部分に分割し、3-ハロプロピオン酸のカップリング(実施例3.1.1のCl又は実施例3.1.2のBrのいずれか)を0.5ミリモルスケールで実行した。
【０１４８】
3ハロプロピオン酸カップリング:実施例3.1.1及び3.1.2による実験
2つの実験を、最終カップリングのために並行して実施した。一実験を3-クロロプロピオン酸(実施例3.1.1)で実行し、別の実験を3-ブロモプロピオン酸(実施例3.1.2)で行った。これらのカップリングを、0℃で5分間、DMF中のDIC/HOBt(3.3当量)で3-ハロプロピオン酸(3当量)を予備活性化することにより室温で2時間、実行した。2時間後、反応の完了は、ニンヒドリン及びTNBS試験により確認した:
・ブロモ誘導体に対して、両試験は陽性だった
・クロロ誘導体に対して、ニンヒドリン試験は淡青色ビーズ及び陽性TNBS試験を示した。
【０１４９】
これら陽性カップリングにもかかわらず、カップリング反応は、停止した。次いで、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した。
【０１５０】
ホモシステインの脱保護及び環化
ペプチド-樹脂は、DCM(3×5mL)で洗浄し、mmt基は、4mLのTFA/EDT/DCM(2/3/95 v/v/v)の混合物で、5回繰り返すサイクル(5×10分)で脱保護した。脱保護後、洗浄を、DCM(3×5mL)及びDMF(3×5mL)で実行した。環化を、5mLのテトラメチルグアニジン溶液(DMF中の1%)を添加し、室温で8時間、撹拌することで、樹脂に実行した。環化後、環状ペプチド-樹脂は、DMF(3×6mL)、DCM(3×6mL)及びMeOH(5×6mL)で洗浄し、真空下で乾燥した。環状ペプチド-樹脂は、3-クロロプロピオン酸を使用した実施例3.1.1による実験により278mgを、3-ブロモプロピオン酸を使用した実施例3.1.2による実験により292mgを得るが、ローディングを考慮して、アセンブリ収率はそれぞれ8.3%及び13.3%に対応する。
【０１５１】
切断
樹脂からの切断を、第3.1節に記載の一般的な条件にしたがって各ペプチドに対して実行した。
【０１５２】
(実施例3.1.1)
3-クロロプロピオン酸による実験
保護された環状ペプチド-樹脂278mgを、TFA/TIS/EDT/PhOH/H2O(90/3/2/1/4)(v/v/v/v/v)混合物(2.95mL)中に懸濁し、反応混合物を室温で2時間、撹拌した。次いで、反応混合物は濾別し、樹脂はTFA(195μL)で洗浄した。TFA混合物を乾燥Et2O(29.5mL)に注ぎ入れた;予想に反して、粗ペプチドの沈殿は得られなかった。粗ペプチドを含有する混合物を、ロータリーエバポレータで濃縮乾固した。濃縮残基を、H2O/CH3CN(50/50 v/v)に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、非常に少量の粉末(およそ1〜3mg)を、純度11.8%で得た。
【０１５３】
(実施例3.1.2)
3-ブロモプロピオン酸による実験
保護された環状ペプチド-樹脂272mgを、TFA/TIS/EDT/PhOH/H2O(90/3/2/1/4)(v/v/v/v/v)混合物(3.1mL)中に懸濁し、反応混合物を室温で2時間、撹拌した。次いで、反応混合物は濾別し、樹脂はTFA(204μL)で洗浄した。TFA混合物を乾燥Et2O(31mL)に注ぎ入れた;3-クロロプロピオン酸による実験と同様に、粗ペプチドの沈殿は得られなかった。粗ペプチドを含有する混合物を、ロータリーエバポレータで濃縮乾固した。濃縮残基を、H2O/CH3CN(50/50)(50/50 v/v)に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、非常に少量の粉末(およそ1〜3mg)を、純度1.8%で得た。
【０１５４】
3.5.3.第2の経路実験3.2
第3.3節で先に説明した通り、第2の経路は、全てのカップリング反応がIPCにより制御される実施例3の方法による合成に対応する。この場合、カップリングを最低2時間実行し、陰性カップリング試験に達した後のみ停止する。2つの実験を、第2の経路にしたがって実施した:3-クロロプロピオン酸での一実験(実施例3.2.1による実験)、及び3-ブロモプロピオン酸(実施例3.2.2による実験)での別の実験。
【０１５５】
樹脂のローディング:実験3
樹脂のローディングは、第3.5.1節に記載する(2つの経路に対する通常のローディング)。ローディング試験後、ペプチド-樹脂の総量を、2つの部分に分割した。第2の経路(実施例3.2)において、以下の5つのアミノ酸は、ペプチドFmoc-D-Trp(Boc)-Ile-alloIle-Asn(Trt)-hCy(mmt)-N-MeOrn(Boc)-O-樹脂に至るまで1ミリモルスケールで集合した(第3.2節による実験)。
【０１５６】
Fmoc脱保護:
以下のアミノ酸(Fmoc-hCy(mmt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-alloIle-OH、Fmoc-Ile-OH及びFmoc-D-Trp(Boc)-OH)は、上記の製造方法(第3.2節、実施例3を参照のこと)にしたがって、Fmoc脱保護及びアミノ酸カップリングサイクルの連続により組み込んだ。Fmoc保護基は、DMF中のピペリジン20%の混合物で、2回繰り返すサイクルで(10分及び20分)除去した。脱保護後、7回繰り返すサイクルでDMFで、及びカップリング工程後、3回繰り返すサイクルでDMFで、洗浄を実行した。Fmoc脱保護反応の体積は、ペプチド-樹脂5mL/gに基づいて計算する。
【０１５７】
Fmoc-AA-OHカップリング:
3当量の以下のアミノ酸(Fmoc-hCy(mmt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-alloIle-OH、Fmoc-Ile-OH及びFmoc-D-Trp(Boc)-OH)を、0℃で5分間、反応器中の樹脂に添加する前にDMF中の3.3当量のDIC/HOBtで予備活性化した。全てのカップリングに対して、反応の完了は、ニンヒドリン及びクロラニル試験により確認した。カップリング試験は、1時間後のFmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-alloIle-OH、Fmoc-Ile-OH及びFmoc-D-Trp(Boc)-OHに対して陰性であり、撹拌は、カップリング時間が2時間に達するように追加で1時間継続した。Fmoc-hCy(mmt)-OHカップリングには、陰性カップリング試験に達するために4時間を要した。カップリング試験後、樹脂を3回繰り返すサイクルでDMFで洗浄した。Fmoc-D-Trp(Boc)-OHのカップリング後、ペプチド-樹脂の総量を、2つの部分に分割し、3-ハロプロピオン酸のカップリングを0.5ミリモルスケールで実行した。
【０１５８】
3ハロプロピオン酸カップリング:実施例3.2.1及び実施例3.2.2による実験
2つの実験を、最終カップリングのために並行して実施した。一実験を3-クロロプロピオン酸(3.2.1)で実行し、別の実験を3-ブロモプロピオン酸(3.2.2)で行った。これらのカップリングを、0℃で5分間、DMF中のDIC/HOBt(3.3当量)で3-ハロプロピオン酸(3当量)を予備活性化することにより室温で実行した。反応の完了は、定期的にニンヒドリン試験及びTNBS試験により確認した。21時間15分後、カップリング試験は依然として陽性だったので、1.65当量のDIC(128μL)を添加し、反応混合物を追加で6時間撹拌した。本期間後、進展は観察されず、樹脂を排出した。
・二重カップリングを、1.65当量のDIC/HOBtの存在下で、1.5当量の3-ハロプロピオン酸(3-クロロプロピオン酸又は3-ブロモプロピオン酸)で予備活性化することにより実行した。19時間後、反応の完了は、ニンヒドリンにより確認した。陰性試験をクロロ誘導体で得た(反応の完了)。
・陽性試験をブロモ誘導体で得た(反応の未完了)。
【０１５９】
ブロモ誘導体での陽性カップリング試験にもかかわらず、カップリングは停止した。ペプチド-樹脂を両実験で、DMF(3×5mL)で洗浄した。
【０１６０】
3-ブロモプロピオン酸(実施例3.2.2)を使用する実験での陽性カップリング試験に続き、ミクロ切断を、直鎖状ペプチドのHPLC純度を決定するために実行した。
【０１６１】
ミクロ切断
ミクロ切断を、実施例3による方法に記載された条件にしたがって実施した(例えば第3.2.3節を参照のこと)。保護されたペプチド-樹脂40mgを、TFA/TIS/EDT/PhOH/H2O(90/3/2/1/4)(v/v/v/v/v)混合物(424μL)中に懸濁し、室温で2時間、撹拌した。次いで、反応混合物は濾別し、樹脂はTFAで洗浄した。TFA混合物を乾燥Et2O(4.24ml)に注ぎ入れた;粗ペプチドの沈殿は得られなかった。混合物を濃縮乾固し、残基を、濃度1mg/mLで、H2O/CH3CN(50/50)に溶解した。本溶液をHPLC及びLC/MSにより分析した。粗直鎖状ブロモペプチドに対応するピークは、クロマトグラム純度0%で存在しない。
【０１６２】
LC/MSで同定された主化合物は以下の通りであった:
・カップリングされていないブロモプロピオン酸、及び、N-MeOrnの欠失に対応する、H-D-Trp-Ile-alloIle-Asn-hCy-OH。
・カップリングされていないブロモプロピオン酸、及び、イソロイシン又はallo-イソロイシンのいずれかの添加に対応する、H-D-Trp-Ile-Ile-alloIle-Asn-hCy-N-MeOrn-OH又はH-DTrp-Ile-alloIle-alloIle-Asn-hCy-N-MeOrn-OH。
・カップリングされていないブロモプロピオン酸に対応する、H-D-Trp-Ile-alloIle-hCy-N-MeOrn-OH。
【０１６３】
これらの結果により、本実験に対して3-ブロモプロピオン酸のカップリングを達成しなかったことが実証される。本結果に続いて、3-クロロプロピオン酸(実施例3.2.1による実験)を使用する実験のみ、次の工程(システインの脱保護及び環化)に進んだ。
【０１６４】
ホモシステインの脱保護及び環化
ペプチド-樹脂は、DCM(3×5mL)で洗浄し、mmt基は、4mLのTFA/EDT/DCM(2/3/95 v/v/v)の混合物で、5回繰り返すサイクル(5×10分)で脱保護した。脱保護後、洗浄を、DCM(3×5mL)及びDMF(3×5mL)で実行した。環化を、5mLのテトラメチルグアニジン溶液(DMF中1%)を添加し、室温で8時間、撹拌することで、樹脂に実行した。環化後、環状ペプチド-樹脂は、DMF(3×6mL)、DCM(3×6mL)、 MeOH(5×6mL)で洗浄し、真空下で乾燥した。収率15.1%。
【０１６５】
切断
樹脂からの切断を、第3.2.3節に記載の一般的な条件にしたがって実行した。保護された環状ペプチド-樹脂297mgを、TFA/TIS/EDT/PhOH/H2O(90/3/2/1/4)(v/v/v/v/v)混合物(3.15mL)中に懸濁し、反応混合物を室温で2時間、撹拌した。次いで、反応混合物は濾別し、樹脂はTFA(210μL)で洗浄した。TFA混合物を乾燥Et2O(31.5mL)に注ぎ入れた;第1の経路を介した実験と同様に、粗ペプチドの沈殿は得られなかった。粗ペプチドを含有する混合物を、ロータリーエバポレータで濃縮乾固した。濃縮残基を、H2O/CH3CN(50/50 v/v)に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、非常に少量の粉末(およそ1〜3mg)を得た。純度10.4%。
【０１６６】
3.5.4. 実施例3の異なる方法による実験の概要
これらの実験の目的は、以下の異なる2つの経路を使用することにより、粗バルシバンを合成するための異なる製造方法を評価することである:全てのカップリング反応を2時間実行する一経路、及び、カップリング試験(完了に対するカイザー試験)を遂行することによる別の経路。以下の表(Table 4(表6))では、両経路で得られるアセンブリデータを要約する。
【０１６７】
【表６】
2018535946.tif 000017
【０１６８】
粗製物のHPLC純度は、両経路(実施例3.1及び3.2)ともに非常に低い。それでも、3-クロロプロピオン酸を使用する実験は、粗製物純度がほぼ10%であるのに対し、3-ブロモプロピオン酸の使用では、純度が2%だけである。また、カップリング反応を制御さえしても3-ブロモプロピオン酸を使用することによる実施例3.2.2による実験で、粗製物を得られなかったことを言及する。データにより、Fmoc-hCy(mmt)-OHのカップリングが2時間超を要することを示す。3-ハロプロピオン酸のカップリングもまた2時間超を要する。実際に、第2の経路で、カップリングが2時間後にも達成されず、クロロ誘導体での陰性カップリング試験に達するために二重カップリングが必要だったことが観察される。更に、ブロモ誘導体は、二重カップリングの後でさえ、組み込まれ得なかった。粗バルシバンは、低いアセンブリ収率(0〜15%の間)及び低いHPLC純度(0〜12%の間)での実施例3による方法にしたがって、得ることができた。
【０１６９】
4.(実施例4)
方法間(実施例1及び2、対、実施例3)の比較
上の節では、実施例1及び2による製造方法にしたがって、並びに、実施例3(3.1及び3.2)による方法にしたがって、粗バルシバンの合成を記載した。各方法(実施例1及び2、対、実施例3)に対して、3クロロプロピオン酸(実施例2、3.1.1及び3.2.1)又は3ブロモプロピオン酸(実施例1、3.1.2及び3.2.2)が、バルシバンの合成により適切かどうかを調べた。両方法(実施例1及び2、対、実施例3)で得られた結果は、どの方法が粗バルシバンを合成するのに最も適当/適切であるかをアセスメントするために比較する。
【０１７０】
4.1.一般データ
以下の表(Table 5(表7))では、実施例1及び2による方法、並びに実施例3による方法における実験で得られるアセンブリデータを要約し、比較する。
【０１７１】
【表７】
2018535946.tif 000018
【０１７２】
4.2.中間体の結論
概して、有意差は、Asn残基、alloIle残基、Ile残基及びD-Trp残基のカップリング時間に対して観察されなかった。3-ハロプロピオン酸のカップリングは、実施例3による方法では困難と思われ、二重カップリングが必要であった。反応は、3-クロロプロピオン酸に対しては完了したが、3-ブロモプロピオン酸に対しては二重カップリング後でさえ未完了であった。3-ハロプロピオン酸のカップリング時間は、実施例1による方法の場合で2時間未満だけであり、二重カップリングは必要としない。実施例3による製造方法にしたがうことにより、異なる粗製物が、0〜12%の間のHPLC純度及び0〜15%の間の収率で得られることは明らかである。これらの結果は、実施例1による方法からのデータより、更に小さい。
【０１７３】
5.(実施例5)
出発物質の安定性研究
5.1. Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olの安定性研究
原料Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olの不安定性は、DMSO中溶液で観察されている(NMR分析の条件)。24時間後、Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olは分解し、ジベンゾフルベンの存在を検出した。その結果、Fmoc-N-MeOrn(Boc)-olの安定性研究を行った。本研究の目的は、その最適な利用及び保管条件を規定するために、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの安定性を、様々な条件で確認することである。いくつかの実験を行って、多くの異なる保管条件において、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの分解をアセスメントした。
【０１７４】
安定性は、以下の通り調べる:
・Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol、粉末、2〜8℃、室温及び40℃で
・Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol、DMF中溶液(545g/L)、2〜8℃、室温及び40℃で
・Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+DMAP、DMF中溶液、室温で(実施例3による合成方法のローディング条件に対応する)
・Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+ピリジン、DMF中溶液、60℃で(実施例1及び2による方法のローディング条件に対応する)
【０１７５】
5.1.1. 粉末Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの安定性
図6は、2〜8℃、室温及び40℃での粉末Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの安定性で得られた結果を表す。Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olは、40℃では粉末として安定ではない。3日後、1.55%の純度の喪失を観察する(99.26%から97.84%への低下)。6日後、粉末は、難可溶化した糊状物質に変化し、HPLC分析が不可能となった。Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olは、少なくとも14日間、2〜8℃及び室温で固体として安定である。この期間後、わずかな分解が観察される。結論として、粉末Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olは、2〜8℃で、少なくとも14日間、分解のリスクなく保管できる。
【０１７６】
5.1.2. 異なる温度での、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol、DMF中溶液の安定性
図7は、2〜8℃、室温及び40℃でのFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol、DMF中溶液(545g/L)の安定性で得られた結果を表す。DMF中で保管されたFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの純度は、室温及び40℃で、経時的に急速に低下する。生成物は、40℃では1日後に、室温では3日後に、完全に分解される。2〜8℃での保管では、分解は減速できる。純度は、3日間維持される。分解が50%と観察されるのは2週間後で、完全に分解されるのは1か月後である。化合物は、保護されていないH-N-Me-L-Orn(Boc)-ol及びジベンゾフルベンをもたらすFmoc脱保護により分解される。対照的に、2〜8℃の保管に対して、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの著しい分解は、3日目までDMF中で観察されない。Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの純度は、3日後に0.3%、8日後に3%、低下する。2週間後、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの純度は半分まで低下する。結論として、DMF中のFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olは、2〜8℃で3日間、保管できる。
【０１７７】
5.1.3. 室温でのFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+DMAP、DMF中溶液の安定性
図8は、2〜8℃、室温及び40℃でのFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+DMAPのDMF中溶液の安定性で得られた結果を表す(実施例3による方法のローディング条件)。HPLCプロファイルを得た。予想通り、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの分解は、DMAPの存在で増加する。2時間後、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olのHPLC純度は、7.5%低下し、3時間後、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olのHPLC純度は、88.24%である。24時間後、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olの純度は、非常に低い(17.71%)。結論として、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+DMAP、DMF中溶液は、実施例3の方法によるローディング条件では、長期間安定ではない。いくらかの分解は、既に室温で2時間後に観察されている;物質が潜在的に、ローディング反応中に部分的に分解し得る。
【０１７８】
5.1.4. 60℃でのFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+ピリジン、DMF中溶液の安定性
図9は、60℃でのFmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+ピリジン、DMF中溶液の安定性で得られた結果を表す(実施例1及び2の方法によるローディング条件)。実施例1及び2による製造方法を使用したローディング工程の条件で、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olは、非常に急速に分解する;50%の純度の喪失を1時間後に観察し、17時間で分解はほぼ完了する。結論として、Fmoc-N-Me-L-Orn(Boc)-olは、分解が既に1時間後に開始し、化合物はローディング時間全てにわたって(17時間)安定ではないので、実施例1及び2の方法によるローディング条件では安定ではない。
【０１７９】
5.2. o-NBS-N-Me-Orn(Boc)-olの安定性研究
o-NBS-N-Me-Orn(Boc)-olの安定性研究を行った。本研究の目的は、最適な使用を規定するために、o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-olの安定性を、様々な条件で確認することである。いくつかの実験を行って、様々なローディング条件において、o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-olの分解をアセスメントした。
【０１８０】
安定性は、以下の通り調べる:
・o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+DMAP、DMF中溶液、室温で(実施例3に記載された方法によるローディング条件に対応する)
・o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+ピリジン、DMF中溶液、60℃で(実施例1及び2に記載された方法のローディング条件に対応する)
【０１８１】
5.2.1. 60℃でのo-NBS-N-MeOrn(Boc)-ol+ピリジン、DMF中溶液の安定性
図10は、o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+ピリジンのDMF中溶液の安定性で得られた結果を表す(実施例1及び2による方法のローディング条件)。実施例1及び2による方法を使用したローディング工程の条件で、o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-olは安定である。24時間後、o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-olの純度は、99.68%である。結論として、o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-olは、実施例1及び2による方法のローディング条件で安定である。
【０１８２】
5.2.2. 室温でのo-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+DMAPのDMF中溶液の安定性
図11は、2〜8℃、室温及び40℃でのo-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-ol+DMAPのDMF中溶液の安定性で得られた結果を表す(実施例3による方法のローディング条件)。実施例3による方法を使用したローディング工程の条件で、o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-olは安定である。22時間後、o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-olの純度は、99.62%である。結論として、o-NBS-N-Me-L-Orn(Boc)-olは、実施例3による方法のローディング条件で安定である。
【０１８３】
5.2.3. 安定性研究の結論
実施例3による方法を使用したFmoc-N-Me-Orn(Boc)-olは、ローディン工程で使用した条件で急速に分解する、感光物質である。一方、o-NBS保護された物質は、ローディング条件(実施例1、2及び3による方法)が何であれ、安定のままである。
【０１８４】
6.全体の結論
実施例1及び2は、本発明によるバルシバンの製造の方法を記載する。本方法は、バルシバンの製造の異なる方法(実施例3)と比較する。
【０１８５】
全部で5つの実験を、3-クロロプロピオン酸又は3-ブロモプロピオン酸のいずれかを使用して実行した(実施例1、2、3.1.1、3.1.2、3.2.1及び3.2.2)。
-  実施例3による方法を使用したFmoc-N-Me-Orn(Boc)-olは、ローディン工程で使用した条件で急速に分解する、感光物質である。急速な分解は、ローディング収率に影響を与え得る。
-  一方、o-NBS保護された物質は、ローディング条件(実施例1、2又は3)が何であれ、安定のままである。本誘導体は、塩基性条件(ピリジン又はDMAP)でより安定であることを示す通り、より適当である。
-  実施例3(3-クロロ/3-ブロモプロピオン酸)による方法での最終カップリングで使用した試薬が何であれ、カップリングは困難であり、二重カップリングが、完了に達するために必要であった。反応は、3-クロロプロピオン酸では完了し、3-ブロモプロピオン酸では完了しなかった。3-クロロプロピオン酸の使用は、本発明(実施例2)による方法で可能である。
-  実施例3による製造方法での粗製物は、0〜12%のHPLC純度及び0〜15%の収率で得られる。これらの結果は、実施例1及び2による方法にしたがう現在のデータより、更に小さく、HPLC純度45%及び収率90%をもたらす。
【０１８６】
これらの結論に基づいて、最良の結果は、実施例1及び2による方法で、特に実施例1による方法で、確実に得られる。実施例1及び2によるバルシバンの製造方法は、より頑健性を示し、正確な純度及び収率を得るのにより適当である。
本発明の項目
1.式c[AA1〜AA6]-AA7-OH(式中、AA1はプロピオン酸であり、AA2はAAbであり、AA3はIleであり、AA4はAAdであり、AA5はAsnであり、AA6はhCyであり、AA7は-NR-CHQ-CH2OH(式中、RはCH3又はC2H5であり、Qは(CH2)n-NH2(式中、nは2、3又は4である)である)である)を有する化合物、又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物を調製するための固相方法であって、以下の工程:
a)保護された(P5;P3)AA7を樹脂と反応させて、(P5;P3)AA7-樹脂を提供する工程であり、工程a)の合成中に樹脂に添加されるAA7は、(P5)NR-CHQ'-CH2OHである工程;
b)(P5;P3)AA7-樹脂を段階的に長くして、(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
c)X-AA1(式中、XはF、Cl、Br及びIから選択されるハロゲン原子である)を(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂と反応させて、X-AA1(P7)AA2AA3AA4(P1)AA5(Trt)AA6-(P3)AA7-樹脂を提供する工程;
d)切断及び脱保護の工程を実施して、X-AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7-olを提供する工程;並びに
e)X-AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7-olを環化し、環状ペプチドであるc[AA1〜AA6]-AA7-olを得る工程であり、AA1及びAA6は、AA6ホモシステインからチオールを介して連結する工程
(式中、
P1、P5及びP7は、保護基であり、
AAbは、D-芳香族α-アミノ酸であり、
AAdは、脂肪族α-アミノ酸であり、
Xは、ハロゲン残基であり、
Rは、CH3又はC2H5であり、
Q'は、(CH2)n-NP3P4であり、
nは、2、3又は4であり、
P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、互いに同じでも又は異なってもよく、P1と同じでも又は異なってもよい)
を含む、方法。
【０１８７】
2.樹脂が2-CTCである、項目1に記載の固相方法。
【０１８８】
3.P5がNBSであり、並びに/又は、P3及びP7が両方ともBocであり、並びに/又は、P1がTrtである、項目1又は2の1つ又は複数に記載の固相方法。
【０１８９】
4.XがBr又はCl、好ましくはBrである、項目1から3の1つ又は複数に記載の固相方法。
【０１９０】
5.nが3であり、及び/又は、RがCH3であり、及び/又は、好ましくはP4がHであり、及び/又は、好ましくはP3がBocである、項目1から4の1つ又は複数に記載の固相方法。
【０１９１】
6.反応工程c)を、DCM存在下で、カップリング剤としてDICを用いて実施する、項目1から5の1つ又は複数に記載の固相方法。
【０１９２】
7.AA2(AAb)がD-Trpであり、及び/又は、AA4(AAd)がAlloIleであり、及び/又は、AA7がN-Me-Orn-olである、項目1から6の1つ又は複数に記載の固相方法。
【０１９３】
8.場合により、1つ又は複数の精製工程、好ましくは工程i)後の(すなわち、切断及び脱保護の工程後の)1つ又は複数の精製工程、並びに/又は、工程j)後の(すなわち、環化工程後の)1つ若しくは複数の精製工程を含む、項目1から7の1つ又は複数に記載の固相方法。
【０１９４】
9.薬学的性質を有するペプチドを形成するのに適切な中間体であって、式:
X-(CH2)2-CO-NH-AAb-Ile-AAd-Asn(P1)-hCy(P2)-NR-CHQ'-CH2OW
(式中、
AAbは、D-芳香族α-アミノ酸であり、
AAdは、脂肪族α-アミノ酸であり、
Xは、ハロゲン残基であり、
P1は、保護基であり
P2は、Trtであり
Rは、CH3又はC2H5であり、
Q'は、(CH2)n-NP3P4であり、
nは、2、3又は4であり、
P3及びP4は、独立して、H又はアミノ酸保護基であり、互いに同じでも又は異なってもよく、P1及び/又はP2と同じでも又は異なってもよく、
Wは、H、保護基又は樹脂である)
を有する中間体。
【０１９５】
10.Wが樹脂であり、好ましくは樹脂がCTCである、項目9に記載の中間体。
【０１９６】
11.nが3であり、及び/又はRがCH3である、項目9又は10に記載の中間体。
【０１９７】
12.P1がTrtである、項目9から11のいずれか一項に記載の中間体。
【０１９８】
13.P4がHであり、及び/又はP3がBocである、項目9から12のいずれか一項に記載の中間体。
【０１９９】
14.AAbがD-Trpであり、及び/又はAAdがalloIleである、項目9から13のいずれか一項に記載の中間体。
【０２００】
15.XがBr又はCl、好ましくはBrである、項目9から14のいずれか一項に記載の中間体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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