(57)【要約】ヒトＤｋｋ−３遺伝子およびその発現産物に基づいて設計される薬物と診断技術は、ヒトの筋萎縮の診断と治療に有用である。本発明は、筋萎縮に関連するタンパク質分子マーカーであるＤｋｋ−３タンパク質、及び筋萎縮疾患の診断におけるその使用を開示し、筋萎縮を治療する薬物をスクリーニングする方法を提供する。正常筋細胞に比べて、筋萎縮細胞におけるＤｋｋ−３タンパク質は明らかに高発現されているので、筋萎縮を検出するための有効なマーカーとして有用である。本発明にかかる方法は、検出の感度、正確性がいずれも従来の診断方法より顕著に優れ、分子診断法による筋萎縮検出の盲点を埋めるだけでなく、操作も便利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋萎縮を検出する試薬を製造するための、Ｄｋｋ−３タンパク質、その抗体、そのコーディング遺伝子またはその転写物の使用。
【請求項２】
受試筋細胞におけるＤｋｋ−３遺伝子発現量の異常をインビトロで確定する方法であって、
（１）前記受試筋細胞のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写する工程と、
（２）Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマーを用いて、工程（１）の前記ｃＤＮＡを鋳型として、定量ＰＣＲ法によって増幅することで、Ｄｋｋ−３増幅産物を得る工程と、
（３）工程（２）の前記した受試筋細胞のＤｋｋ−３増幅産物の数を、正常筋細胞のＤｋｋ−３増幅産物の数と比較し、前記した正常筋細胞のＤｋｋ−３増幅産物の数より高いとき、前記した受試筋細胞におけるＤｋｋ−３遺伝子発現量は異常であることを示す工程と、を含む方法。
【請求項３】
受試筋細胞におけるＤｋｋ−３タンパク質発現量の異常をインビトロで確定する方法であって、
（１）特異的な抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体で前記受試筋細胞におけるＤｋｋ−３タンパク質の数を計測する工程と、
（２）工程（１）の前記した受試筋細胞のＤｋｋ−３タンパク質の数を、正常筋細胞のＤｋｋ−３タンパク質の数と比較し、前記した正常筋細胞のＤｋｋ−３タンパク質の数より高いとき、前記した受試筋細胞におけるＤｋｋ−３タンパク質発現量は異常であることを示す工程と、を含む方法。
【請求項４】
Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマー及び／または特異的な抗Ｄｋｋ−３抗体を含むことを特徴とする、筋萎縮を検出するキット。
【請求項５】
前記キットはさらに、
（１）陽性対照と、
（２）陰性対照と、
の群から選ばれる試薬を含むことを特徴とする、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
筋萎縮を検出するためのマーカーとしての、Ｄｋｋ−３タンパク質、そのコーディング遺伝子またはその転写物的使用。
【請求項７】
筋萎縮または筋萎縮感受性を検出する方法であって、
（１）Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマーを用いて、受試個体筋細胞のｃＤＮＡを鋳型として、定量ＰＣＲ法によって増幅することで、Ｄｋｋ−３の増幅産物を得て、形成される増幅産物の数が正常対照より高いか否かを検出する工程、または、
抗体複合体の形成に適切な条件下で、特異的な抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体を受試個体のサンプルと接触させ、且つ形成される抗体複合体の数が前記正常対照より高いか否かを検出する工程と、
（２）前記した形成される増幅産物の数、または前記した抗体複合体の数が前記した正常対照より高いとき、前記受試個体が筋萎縮を起している、若しくは筋萎縮感受性が健常人より高いことを示す工程と、を含む検出方法。
【請求項８】
筋萎縮を治療する薬物をスクリーニングする方法であって、
（１）Ｄｋｋ−３遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞株にトランスフェクトし、Ｄｋｋ−３タンパク質を発現する細胞株を調製する工程と、
（２）工程（１）における前記したＤｋｋ−３タンパク質を発現する細胞株の培養液にテスト化合物を加え、投与後に筋萎縮症状の改善または治癒を起したテスト化合物は筋萎縮を治療する候補薬物であることを示す工程と、を含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー分野に関し、具体的に、筋萎縮関連タンパク質分子マーカーＤｋｋ−３のスクリーニング及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮の従来の診断方法は主に、病歴を問診し、筋肉の外観検査を行い、線維束性収縮の有無を観察し、患者に明らかな筋肉量減少があるかを観察すると共に、筋電図によって神経伝導速度および誘発電位も考慮して診断を行う。現在、分子診断方法はまだ無い。
Ｄｋｋ−３はＤｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリーのメンバーであり、細胞外分泌タンパク質に属する。しかし、従来の研究では、Ｄｋｋ−３の発現量の高さが筋萎縮の発生に関連するかどうかまだ解明されていない。
そのため、治療と診断の目的で、筋萎縮において高発現される遺伝子及び／またはタンパク質を研究・開発することには、重要な意味がある。本分野では、筋萎縮において高発現される遺伝子及び／またはタンパク質が切望されている。
【発明の概要】
【発明を解決しようとする課題】
【０００３】
従来技術に存在する課題を克服するために、本発明の目的は、筋萎縮に関連するタンパク質分子マーカーＤｋｋ−３のスクリーニング及びその使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は以下の技術方案によって実現される。
本発明の第一の態様は、筋萎縮を検出する試薬を製造するための、Ｄｋｋ−３タンパク質、その抗体、そのコーディング遺伝子またはその転写物の使用を提供する。
本発明の第二の態様は、下記工程を含む、受試筋細胞におけるＤｋｋ−３遺伝子発現量の異常をインビトロで確定する方法を提供する。
（１）受試筋細胞のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写する；
（２）Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマーを用いて、工程（１）のｃＤＮＡを鋳型として、定量ＰＣＲ法によって増幅することで、Ｄｋｋ−３の増幅産物を得る；
（３）工程（２）の受試筋細胞のＤｋｋ−３増幅産物の数を比較し、正常筋細胞のＤｋｋ−３増幅産物の数より高いことは、受試筋細胞におけるＤｋｋ−３遺伝子発現量の異常を示す。
上記方法は疾患診断を目的としない方法であってもよく、例えば関連のメカニズムの研究のみに用いられてもよい。
【０００５】
本発明の第三の態様は、下記工程を含む、受試筋細胞におけるＤｋｋ−３タンパク質発現量の異常をインビトロで確定する方法を提供する。
（１）特異的な抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体で受試筋細胞におけるＤｋｋ−３タンパク質の数を計測する；
（２）工程（１）の受試筋細胞のＤｋｋ−３タンパク質の数を正常筋細胞のＤｋｋ−３タンパク質の数と比較し、正常筋細胞のＤｋｋ−３タンパク質の数より高いことは、受試筋細胞におけるＤｋｋ−３タンパク質発現量の異常を示す。
上記方法は疾患診断を目的としない方法であってもよく、例えば関連のメカニズムの研究のみに用いられてもよい。
本発明の第四の態様は、Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマー及び／または特異的な抗Ｄｋｋ−３抗体を含む、筋萎縮を検出するキットを提供する。
本発明の一つの好ましい例において、前記キットはさらに下記の群から選ばれる試薬を含む。
（１）陽性対照；
（２）陰性対照。
【０００６】
本発明の第五の態様は、筋萎縮を検出するためのマーカーとしての、Ｄｋｋ−３タンパク質、そのコーディング遺伝子またはその転写物的使用を提供する。
本発明の第六の態様はは、下記工程を含む、筋萎縮または筋萎縮感受性を検出する方法を提供する。
（１）Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマーを用いて、受試個体筋細胞のｃＤＮＡを鋳型として、定量ＰＣＲ法によって増幅することで、Ｄｋｋ−３の増幅産物を得て、形成される増幅産物の数が正常対照より高いかを検出する；或いは、抗体複合体の形成に適切な条件下で、特異的な抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体を受試個体のサンプルと接触させ、且つ形成される抗体複合体の数が正常対照より高いかを検出する；
（２）形成される増幅産物の数または抗体複合体の数が正常対照より高いことは、該個体が筋萎縮を起しており、若しくは筋萎縮感受性が健常人より高いことを示す。
上記方法は疾患診断を目的としない方法であってもよく、例えば関連のメカニズムの研究のみに用いられてもよい。
【０００７】
本発明の第七の態様はは、下記工程を含む、筋萎縮を治療する薬物をスクリーニングする方法を提供する。
（１）Ｄｋｋ−３遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞株にトランスフェクトし、Ｄｋｋ−３タンパク質を発現する細胞株を調製する；
（２）工程（１）におけるＤｋｋ−３タンパク質を発現する細胞株の培養液にテスト化合物を加え、投与後に筋萎縮症状の改善または治癒を起したテスト化合物は筋萎縮を治療する候補薬物である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の有利な効果は、
（１）本発明は初めて、Ｄｋｋ−３と筋萎縮の関連性、即ち９０％以上の筋萎縮症例において高発現され、筋萎縮細胞における発現量：正常筋細胞における発現量≧３．０：１であることを判明し、本発明にかかる方法は、検出の感度、正確性がいずれも従来の診断方法より顕著に優れ、分子診断法による筋萎縮検出の盲点を埋めるだけでなく、操作も便利である。
【０００９】
（２）ＰＣＲなどの分子診断方法によって筋肉におけるＤｋｋ−３の発現レベルを検出することで、老人性筋萎縮症を診断し、筋萎縮の早期で診断を行うことができる。伝統的な診断方法は主に、筋肉形態を観察し、筋力測定も組み合わせることで行う。筋萎縮が相当程度に進んだ場合のみに、筋肉形態および筋力に変化が発生し、筋萎縮を早期で発見して介入することができない。また、筋力検出は一般的に一組の筋肉の収縮力を検出するものであり、筋群における一つの筋肉が萎縮したかを確定する感度は高くない。しかし、分子診断によっては、サンプリング箇所を正確に固定化し、各筋肉の萎縮状況を一つずつ検出することができる。分子診断は、定量的検出を行うことができ、標準化した検出手順を構築し、伝統的な観察診断方法における人為的・主観的な誤差要因を解消できる。また、ＰＣＲ検出に必要なサンプルは極めて少なく、検出は便利で迅速である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｄｋｋ−３発現レベルは老人の筋肉において顕著に増加し、筋萎縮特異的遺伝子Ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＭｕｒｆ−１の発現レベルも老人の筋肉において顕著に向上したことを示す。
【図２】Ｌａｍｍｉｎ  Ｂ免疫蛍光染色により、老人の筋線維の面積が若者の筋線維より明らかに小さいことを示した。スケールバー: 20μｍ。
【図３】統計学的解析により、老人の筋線維の面積が若者の筋線維より明らかに小さいことを示す。
【図４Ａ】インビトロで培養されたマウス筋管において過剰発現されるＤｋｋ−３は筋萎縮を起したことを示す。対照群に比べて、Ｆｌａｇタグ付きＤｋｋ−３を過剰発現させた後、筋管の直径は顕著に減少したことを示す。
【図４Ｂ】統計学的解析により、Ｄｋｋ−３を過剰発現させた後、筋管の直径は顕著に減少したことを示す。
【図４Ｃ】ウェスタンブロットによって筋管におけるＦｌａｇタグ付きＤｋｋ−３の過剰発現レベルを検出しことを示すた。
【図５】インビトロで培養された筋管において過剰発現されるＤｋｋ−３は、筋萎縮特異的遺伝子Ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＭｕｒｆ−１の発現量の増加を起したことを示す。
【図６Ａ】マウス筋肉において過剰発現されるＧＦＰタグ付きＤｋｋ−３は、注射箇所の筋線維面積の顕著な減少を起したことを示す。
【図６Ｂ】Ｄｋｋ−３が過剰発現される筋線維面積の統計学的解析。過剰発現されるＧＦＰタグ付きＤｋｋ−３は、注射箇所の筋線維面積の顕著な減少を起したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは幅広く深く研究したところ、ヒトのＤｋｋ−３遺伝子配列をクローニングしただけでなく、異なるモデルを用いて、筋萎縮過程におけるＤｋｋ−３遺伝子の機能について研究した。この結果、意外なことに、Ｄｋｋ−３が筋萎縮に関連することを見出した。
ヒト筋肉におけるＤｋｋ−３遺伝子のｃＤＮＡ保存領域を参考にして一対のプライマーを設計し、ＰＣＲによって老人の筋肉ｃＤＮＡライブラリーから一つのＤＮＡ配列をクローニングした。シーケンシングの結果から分かるように、該配列の長さは１０５３ｂｐであり、ラットおよびマウスＤｋｋ−３のｃＤＮＡ対応領域とそれぞれ９２％および９３％の相同性を有する。
【００１２】
マウスを実験動物として、実験モデルによってＤｋｋ−３遺伝子について機能検出を行った。筋肉にＤｋｋ−３遺伝子を発現できるウイルスを注射した結果、Ｄｋｋ−３遺伝子の発現は、筋萎縮特異的遺伝子Ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＭｕｒｆ−１遺伝子の発現を顕著に向上させることで、筋萎縮を起すことができることを見出した。
Ｄｋｋ−３  ｍＲＮＡの筋肉組織における特異的な高発現を鑑み、Ｄｋｋ−３タンパク質が筋萎縮に関連することは示唆される。ヒトＤｋｋ−３遺伝子およびその発現産物に基づいて設計される薬物と診断技術は、ヒトの筋萎縮の診断と治療に有用である。
【００１３】
［定義］
本文に用いられるように、「核酸」とは、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボ核酸の重合体を指す。特に断らない限り、該用語には、天然ヌクレオチドと類似の方式で機能できる天然ヌクレオチド類縁体が含まれている。
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的塩基対の形成によって二本の一本鎖核酸を結合させることを指す。
【００１４】
「実質的に結合する」または「特異的に結合する」または「選択的に結合する」または「特異的にハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチドと標的配列の間の相補的なハイブリダイゼーション反応を指し、且つハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを下げることで所望の標的ポリヌクレオチド配列の検出を達成できる小数のミスマッチを含む。該用語は、ストリンジェンシー条件下で、１つの分子が特定のヌクレオチド配列に結合、複合若しくはハイブリダイズすることも意味し、当該配列が複合混合物(例えば全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ)に存在する場合、用語「ストリンジェンシー条件」とは、プローブが標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェンシー条件は配列に依存するものであり、且つ状況によって異なっている。長い配列ほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズできる。
【００１５】
通常、選択されるストリンジェンシー条件は、限定されたイオン強度およびｐＨで推定される配列の融解温度（Ｔｍ）より約５℃低いものである。該Ｔｍは、バランスになった時、標的配列と相補的なプローブの約５０％が標的配列にハイブリダイズした場合の（限定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度での）温度である。通常、短いプローブにとって、ストリンジェンシー条件とは、塩濃度が少なくとも約０．０２ｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ＋イオン濃度・０．００１５ｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ２＋（若しくは他の塩）で、ｐＨ７．０〜８．３で、且つ温度が少なくとも約６０℃の条件である。さらに、ストリンジェンシー条件は例えばホルムアミド、ＤＭＳＯなどの不安定化剤の添加によっても実現できる。
当業者に理解できるように、ここに記載の具体的なプライマーとプローブの確定の配列は、開示されたプライマーやプローブと「実質的に同様」にするが、標的配列と実質的に結合する能力を保留するように、ある程度に修飾されてもよい。
【００１６】
（Ｄｋｋ−３タンパク質および遺伝子）
本発明によって判明されたＤｋｋ−３と筋萎縮の関連性およびＤｋｋ−３の配列情報に基づき、当業者は本分野で常用の技術によってＤｋｋ−３遺伝子、タンパク質またはそれらの断片を調製できる。
本発明において、用語「Ｄｋｋ−３タンパク質」、「Ｄｋｋ−３ポリペプチド」、「筋萎縮における高発現タンパク質Ｄｋｋ−３」または「本発明にかかるタンパク質」等は互いに交換して使用することができ、いずれもヒトまたは他の哺乳動物のＤｋｋ−３タンパク質（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号はＡＡＱ８８７４４．１；ＮＣＢＩ登録番号はＡＹ３５８３７８．１）を指す。
【００１７】
一つの特に好ましいＤｋｋ−３タンパク質はヒトのＤｋｋ−３タンパク質であり、そのアミノ酸配列は配列番号１に示され、具体的には以下のようである。
MQRLGATLLCLLLAAAVPTAPAPAPTATSAPVKPGPALSYPQEE                  ATLNEMFREVEELMEDTQHKLRSAVEEMEAEEAAAKASSEVNLANLPPSYHNETNTDT                     KVGNNTIHVHREIHKITNNQTGQMVFSETVITSVGDEEGRRSHECIIDEDCGPSMYCQ                     FASFQYTCQPCRGQRMLCTRDSECCGDQLCVWGHCTKMATRGSNGTICDNQRDCQPGL                     CCAFQRGLLFPVCTPLPVEGELCHDPASRLLDLITWELEPDGALDRCPCASGLLCQPH                     SHSLVYVCKPTFVGSRDQDGEILLPREVPDEYEVGSFMEEVRQELEDLERSLTEEMAL                     GEPAAAAAALLGGEEI。
【００１８】
前記Ｄｋｋ−３タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号２に示され、具体的には以下のようである。
atgcagcg  gcttggggcc  accctgctgtgcctgctgct ggcggcggcg gtccccacgg cccccgcgcc  cgctccgacg  gcgacctcggctccagtcaa  gcccggcccg  gctctcagct acccgcagga  ggaggccacc  ctcaatgagatgttccgcga  ggttgaggaa  ctgatggagg acacgcagca  caaattgcgc  agcgcggtggaagagatgga  ggcagaagaa  gctgctgcta aagcatcatc  agaagtgaac  ctggcaaacttacctcccag  ctatcacaat  gagaccaaca cagacacgaa  ggttggaaat  aataccatccatgtgcaccg  agaaattcac  aagataacca acaaccagac  tggacaaatg  gtcttttcagagacagttat  cacatctgtg  ggagacgaag aaggcagaag  gagccacgag  tgcatcatcgacgaggactg  tgggcccagc  atgtactgcc agtttgccag  cttccagtac  acctgccagccatgccgggg  ccagaggatg  ctctgcaccc gggacagtga  gtgctgtgga  gaccagctgtgtgtctgggg  tcactgcacc  aaaatggcca ccaggggcag  caatgggacc  atctgtgacaaccagaggga  ctgccagccg  gggctgtgct gtgccttcca  gagaggcctg  ctgttccctgtgtgcacacc  cctgcccgtg  gagggcgagc tttgccatga  ccccgccagc  cggcttctggacctcatcac  ctgggagcta  gagcctgatg gagccttgga  ccgatgccct  tgtgccagtggcctcctctg  ccagccccac  agccacagcc tggtgtatgt  gtgcaagccg  accttcgtggggagccgtga  ccaagatggg  gagatcctgc tgcccagaga  ggtccccgat  gagtatgaagttggcagctt  catggaggag  gtgcgccagg agctggagga  cctggagagg  agcctgactgaagagatggc  gctgggggag  cctgcggctg ccgccgctgc  actgctggga  ggggaagagatttag
【００１９】
Ｄｋｋ−３ヌクレオチド完全長配列またはその断片は通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成の方法によって獲得できる。ＰＣＲ増幅法の場合、既知のヒトＤｋｋ−３、マウスＤｋｋ−３またはラットＤｋｋ−３のヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列に基づいてプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリーまたは当業者に既知の常法で調製されたｃＤＮＡ配列を鋳型として増幅し、相応の配列を獲得することができる。配列が長い場合、２回または複数回のＰＣＲ増幅を行い、その後に各回で増幅された断片を正確な順序でライゲートすることが多い。
相応の配列を獲得すると、組換え法で相応の配列を大量に獲得することができる。通常、それをベクターにクローニングし、次に細胞にトランスフェクトし、その後に常法によって増殖された宿主細胞から相応の配列を分離して獲得する。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法によって相応の配列を合成することもできる。通常、複数の小さな断片を合成しておき、その後にライゲーションを行うことにより、配列が非常に長い断片を獲得できる。
【００２０】
現在、化学的合成の方法によって本発明にかかるタンパク質（またはその断片、またはそれらの誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることは既に可能になっている。その後、該ＤＮＡ配列を本分野で既知の各種の従来のＤＮＡ分子（例えばベクター）や細胞に導入することができる。さらに、化学的合成によって本発明にかかるタンパク質配列中に突然変異を導入することもできる。
本発明に用いられるＤｋｋ−３タンパク質は、相応のコーディング配列を宿主細胞に導入し（直接に導入するまたはＤｋｋ−３コーディング配列含有ベクターを導入する）、適切な条件下で形質転換された宿主細胞を培養してＤｋｋ−３タンパク質を発現させ、その後にＤｋｋ−３タンパク質を分離・精製することができる。
【００２１】
（抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体）
一方、本発明は更に、Ｄｋｋ−３  ＤＮＡまたはその断片によってコードされるポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、特にモノクローナル抗体を含む。ここで、「特異的な」とは、抗体がＤｋｋ−３遺伝子産物またはその断片に結合できることを指す。好ましくは、Ｄｋｋ−３遺伝子産物またはその断片に結合できるが、他の非関連抗原分子を認識・結合しない抗体を指す。本発明において、抗体には、Ｄｋｋ−３タンパク質に結合してそれを阻害できる分子も含まれるし、Ｄｋｋ−３タンパク質の機能に影響しない抗体も含まれる。
本発明は、完全なモノクローナル抗体だけでなく、免疫原性を有する抗体断片、例えばＦａｂ１やＦａｂ２断片；抗体重鎖；抗体軽鎖；またはマウス抗体との結合特異性を有しながらもヒト由来の抗体部分も保留した抗体のようなキメラ抗体なども含む。
【００２２】
本発明にかかる抗体は、当業者に既知の各種の技術によって調製できる。
抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体は、免疫組織化学技術に用いて、生検検体におけるＤｋｋ−３タンパク質を検出することができる。また、ヒトＤｋｋ−３タンパク質に結合するモノクローナル抗体は、放射性同位体や蛍光で標識してもよく、生体内に注射されると、その位置と分布が追跡できる。このような放射性または蛍光標識抗体は、非侵襲的な診断方法として筋萎縮細胞の位置決めに用いることができる。
本発明にかかる抗体は、例えば筋萎縮のようなヒトＤｋｋ−３タンパク質関連疾患の検出に用いることができる。抗体は生体内の一つの特殊な部位に対する阻害剤に設計することもできる。例えば、ヒトＤｋｋ−３タンパク質と高い親和性を持つモノクローナル抗体は、阻害剤と共有結合することができる。本発明にかかるＤｋｋ−３タンパク質は筋細胞に特異的に高発現しているため、このようなキメラ抗体はヒトＤｋｋ−３タンパク質レベルの低減に用いることができる。
ポリクローナル抗体の生産では、ヒトＤｋｋ−３タンパク質またはポリペプチドでウサギ、マウス、ラットなどの動物を免疫することができる。フロインドアジュバントを含む多種のアジュバントは、免疫反応の増強に用いることができるが、それに限定されない。
【００２３】
（医薬組成物）
本発明にかかるタンパク質の拮抗剤（例えば抗体）は、治療で施用（投与）されると、治療効果を提供できる。通常、これらの物質は無毒で、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体に配合され、ただし、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患によって変化できるが、通常は約５〜８であり、好ましいｐＨは約６〜８である。配合された医薬組成物は、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、皮内または局所を含む通常の経路で投与することができるが、それらに限定されない。
本発明にかかるポリペプチドの拮抗剤は筋萎縮の治療に用いることができる。本発明にかかるＤｋｋ−３タンパク質を用いる際に、他の治療剤も同時に使用できる。
【００２４】
本発明は更に、安全で有効な量（例えば０．０１〜９９ｗｔ％）の本発明にかかるＤｋｋ−３タンパク質の拮抗剤、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される佐剤は、薬学的に許容される担体、希釈剤、充填剤、結合剤およびその他の賦形剤を含むが、それらに限定されない。当業者に既知の治療用の不活性の無機または有機担体は、乳糖、コーンスターチまたはその誘導体、タルク、植物油、ワックス、脂肪、例えばポリエチレングリコール、水、蔗糖、エタノール、グリセリンのようなポリヒドロキシ化合物、各種の防腐剤、滑沢剤、分散剤、矯味剤を含むが、それらに限定されない。保湿剤、酸化防止剤、甘味剤、着色剤、安定化剤、塩、緩衝液なども加えることができ、それらの物質は必要に応じて、処方の安定化のために用いられ、或いは活性やバイオアベイラビリティの向上、若しくは経口投与の場合に許容される食感や匂の産生に関与する。
【００２５】
本発明にかかる医薬組成物は、例えばカプセル、錠剤、分散錠、バッカル錠、チュアブル錠、発泡錠、徐放錠、顆粒剤などの経口投与製剤であってもよい。これで、外見が悪く、携帯に不便で、飲みにくく、投与量が大きいという伝統的な煎剤の欠点を有効に改善することができ、慢性腎炎を治療するための投与量が小さく、薬効が強く、安定性がいい新規剤型の開発に新たな経路を提供する。
本発明にかかる医薬組成物は常法で調製することができ、例えば、各有効成分を均一に混合して、或いは各種の製剤の通常の調製方法により薬効成分と相応の佐剤を配合して調製する。本発明にかかる医薬組成物は、他の治療剤と併用することもできる。
本発明にかかる医薬組成物は筋萎縮の治療に用いることができる。
本発明にかかる医薬組成物の有効な治療投与量は勿論、投与経路や患者の健康状況等の要素を考慮すべきであり、それらは熟練した医者の技術の範囲内にある。
【００２６】
ヒトＤｋｋ−３タンパク質のポリヌクレオチドは多種の治療目的に用いることもできる。遺伝子治療技術は、Ｄｋｋ−３タンパク質の異常発現によって起きる・代表される細胞の増殖、発育または代謝の異常（例えば筋萎縮）の治療に用いることができる。
ヒトＤｋｋ−３  ｍＲＮＡを阻害するオリゴヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡを含む）およびヌクレアーゼも本発明の範囲内にある。ヌクレアーゼは特定のＲＮＡを特異的に分解できる酵素であり、そのメカニズムは、ヌクレアーゼ分子が相補的な標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズして核酸内部切断作用を発揮する。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ並びにヌクレアーゼは、従来のいずれかのＲＮＡまたはＤＮＡ合成技術によって獲得できる。
ポリヌクレオチドを組織または細胞内に導入する方法は、ポリヌクレオチドを生体内の組織に直接に注入すること、或いは生体外でベクター（例えばウイルス、ファージやプラスミドなど）によりポリヌクレオチドを細胞に導入しておき、次に細胞を生体内に移植すること、或いはＴＡＬＥＮ、ＣＲＳＰ／Ｃａｓ９または他の遺伝子編集方法によってゲノム配列を変更させてノックアウトや競合的突然変異体などを産生することを含む。
【００２７】
本タンパク質によれば、各種の通常のスクリーニング方法により、例えば阻害剤、作動薬や拮抗剤など、Ｄｋｋ−３タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングすることができる。スクリーニングの際に、Ｄｋｋ−３タンパク質をバイオアナリシスアッセイに加え、Ｄｋｋ−３タンパク質とその受容体の間の相互作用に対する化合物の影響を測定することで、化合物が拮抗剤であるかを確定することができる。また、テスト化合物をＤｋｋ−３タンパク質と共に実験動物に投与することもでき、対照に比べて動物の筋萎縮変化が存在すると、該化合物がＤｋｋ−３タンパク質の作動薬または拮抗剤であることは判明される。
また、Ｄｋｋ−３遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞株にトランスフェクトし、Ｄｋｋ−３タンパク質を高発現する細胞株を調製し、且つ該細胞株におけるＤｋｋ−３タンパク質を標的として、Ｄｋｋ−３タンパク質に作動または阻害作用を持つ薬物をスクリーニングすることもできる。且つ、前記Ｄｋｋ−３タンパク質を発現する細胞株の培養液にテスト化合物を加え、Ｄｋｋ−３タンパク質発現量の変化を計測する。Ｄｋｋ−３タンパク質の発現を阻害する化合物は筋萎縮の治療に用いることができる。
【００２８】
（検出方法）
本発明は更に、ヒトＤｋｋ−３タンパク質レベルを定量的に位置決め・検出する診断試験方法に関する。それらの試験は本分野でよく知られるもので、免疫蛍光測定、免疫組織化学および放射免疫測定を含む。試験で検出されるＤｋｋ−３タンパク質レベルは、検出される個体が筋萎縮感受性を有する確率は健常人より高いかを確定するための指標の一つとして用いることができる。
サンプルにＤｋｋ−３タンパク質が存在するかを検出する一つの方法は、Ｄｋｋ−３タンパク質の特異性による検出であり、サンプルをＤｋｋ−３タンパク質特異的抗体と接触させることと、抗体複合体が形成されるかを観察することと、を含み、抗体複合体が形成されたことは、サンプルにＤｋｋ−３タンパク質が存在することを示す。
【００２９】
Ｄｋｋ−３タンパク質をコードするポリヌクレオチドはＤｋｋ−３タンパク質関連疾患の診断と治療に用いることができる。診断について、Ｄｋｋ−３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｄｋｋ−３転写物の発現の有無、或いは疾患状態におけるＤｋｋ−３転写物の異常発現の検出に用いることができる。例えば、Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ配列は、生検検体にハイブリダイズすることで、Ｄｋｋ−３タンパク質の異常発現の判断に用いることができる。ハイブリダイゼーション技術はサザンブロット法、ノーザンブロット法、インシチュ・ハイブリダイゼーションなどを含む。それらの技術・方法はいずれも公開されている既成技術であり、関連するキットはいずれも市販されている。本発明にかかるポリヌクレオチドの一部または全部は、プローブとしてマイクロアレイやジーンチップに固定し、組織における遺伝子の発現差異解析および遺伝子診断に用いることができる。Ｄｋｋ−３タンパク質特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲインビトロ増幅を行うことによっても、Ｄｋｋ−３遺伝子の転写産物を検出できる。
【００３０】
Ｄｋｋ−３タンパク質の筋萎縮における高い発現率により、Ｄｋｋ−３ポリヌクレオチド、Ｄｋｋ−３タンパク質およびその抗体、並びにＤｋｋ−３タンパク質に関連する拮抗剤、作動薬などは、筋萎縮の治療に新たな治療経路を提供することができるので、それらの応用は前途有望である。
【００３１】
（キット）
本発明は更に、Ｄｋｋ−３の発現が異常であるかを診断する診断キットを提供する。好ましい例において、キットは、Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマー及び／または特異的な抗Ｄｋｋ−３抗体を含む。前記キットは、どうやってキットを用いてＤｋｋ−３を検出するかを記述する説明書類をさらに含んでもよい。さらに、前記キットは、検出を助力するための各種のマーカーや標識試薬、ＰＣＲ用試薬（緩衝液を含む）、免疫ハイブリダイゼーション用試薬、および陽性と陰性対照などからなる群から選ばれるいずれか１種または多種をさらに含んでもよい。
本発明によってＤｋｋ−３遺伝子の異常発現と筋萎縮の関連性が初めて判明された以上、当業者はＤｋｋ−３を特異的に増幅できるプライマーを便利に設計し、その後に定量的検出などの方法によってその発現量を確定することができる、ということは理解すべきである。通常、プライマーの長さは１５〜５０ｂｐ、好ましくは１８〜３０ｂｐである。プライマーと鋳型が完全に相補的であるほうは好ましいからといって、当業者によく知られるように、プライマーと鋳型がある程度に（特にプライマーの５’末端で）非相補的である場合にも、特異的な増幅（即ち所望の断片のみを増幅すること）が可能である。それらのプライマーを含むキット、およびそれらのプライマーを使用する方法はいずれも本発明の範囲内にある。
【００３２】
増幅産物の長さは特に限定されないが、通常、増幅産物の長さは１００〜３０００ｂｐ、好ましくは１５０〜２０００ｂｐ、より好ましくは２００〜１０００ｂｐである。
従来の筋萎縮を診断するための他の方法に比べて、本発明の利点は主に、Ｄｋｋ−３と筋萎縮の関連性、即ち９０％以上の筋萎縮症例において高発現され、筋萎縮細胞における発現量：正常筋細胞における発現量≧３．０：１であることを判明したことにあり、本発明にかかる方法は、検出の感度、正確性がいずれも従来の診断方法より顕著に優れ、分子診断法による筋萎縮検出の盲点を埋めるだけでなく、操作も便利である。
【００３３】
以下、特定の具体的な実施例により本発明の実施形態を説明するが、当業者は本明細書で開示された内容により本発明の他の利点と効果を簡単に了解できる。本発明は他の異なる具体的な実施形態により実施または応用することもでき、本明細書における各ディテールも、異なる観点と応用に基づいて本発明の精神を逸脱しない範囲内で各種の修飾や変更を行うことができる。
本発明の具体的な実施形態をさらに記述する前に、本発明の保護範囲は下記特定の具体的な実施形態に制限されないことを理解すべきであり、且つ、本発明の実施例で使用される用語は特定の具体的な実施形態を説明するためのものであり、本発明の保護範囲を制限するためのものではなく、本発明の明細書および特許請求の範囲において、特に断らない限り、単数形の「一つ」、「１つ」および「この」は複数形も含む、ということも理解すべきである。
実施例で数値範囲がある場合、本発明で特に断らない限り、各数値範囲ごとに、２つの端点および２つの端点の間の任意の数値はいずれも適用できる、ということを理解すべきである。別途に定義しない限り、本発明で使用される全ての技術と科学的用語は本発明の所属分野の当業者が通常に理解する意味と一致する。実施例で使用される具体的な方法、装置、材料以外に、本発明の所属分野の当業者の従来技術に対する把握および本発明の記載に基づき、本発明の実施例に記載の方法、装置、材料と相似または均等の従来技術のいずれかの方法、装置、材料を用いて本発明を実現することもできる。
【００３４】
特に断らない限り、本発明において開示された実験方法、検出方法、調製方法はいずれも、本分野で常用の分子生物学、生化学、クロマチンの構造と解析、分析化学、細胞培養、ＤＮＡ組換え技術および関連する分野で常用の技術を採用する。それらの技術は従来の文献において既に完全に説明されており、具体的には、SambrookらMOLECULAR CLONING ：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001 ；Aμsμbelら，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodic μpdates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego ；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998 ；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999 ；およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999などを参照できる。
【実施例１】
【００３５】
（筋萎縮におけるＤｋｋ−３の高発現）
（１）ＲＴ−ｑＰＣＲによってＤｋｋ−３が老人の筋肉に高発現しているかを検出した。老人の筋肉を取り、全ＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってＤｋｋ−３  ｍＲＮＡのレベルを検出し、若者の筋肉におけるＤｋｋ−３レベルと比較した。発現レベルが３倍以上向上したと、Ｄｋｋ−３発現レベルが増加したことを示す。
具体的な実験方法：老人（＞６５歳）の筋肉サンプルを４０つ、成年（１８〜３０歳）の筋肉サンプルを１０つ（＜５０ｍｇ）取り、１．５ｍｌ  ＥＰチューブに入れ、１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌを加え、組織ホモジナイザーで２分間ホモジナイズした。１３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ・４℃で１０分間遠心し，上澄をもう一つの清浄ＥＰチューブに転移した。フェノール：クロロホルム（２４：１）２００μｌを加え、渦巻き振盪で充分に混合し、１３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ・４℃で１５分間遠心した。上澄を清浄ＥＰチューブに転移し、イソプロパノール５００μｌを加え、充分に混合し、１３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ・４℃で１５分間遠心した。上澄を捨て、７５％エタノールで二回洗浄し、毎回につき１３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ・４℃で５分間遠心した。上澄を捨て、室温で５〜１０分間放置して乾かし、３０〜５０μｌのＤＥＰＣ水に入れて溶解させ、全ＲＮＡとした。 
【００３６】
その後、全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＲＮＡ  １μｇを取り、ＮＥＢ社のＭｕＬＶ逆転写酵素およびその１ｘ反応緩衝液１μｌ（２００ユニット）、ｄＮＴＰ混合物０．５ｍＭ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ４μＭ、ＲＮａｓｅインヒビター１μｌを加え、４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを９０℃で１０分間不活性化させ、ＰＣＲ鋳型とした。配列番号３と４に示されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより標的遺伝子の発現量を検出した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、第２と第３ステップのサイクルは４０回繰り返した。
フォワードプライマー：tgaggcagtggctacacaag   配列番号3
リバースプライマー：gctggtatggggttgagaga     配列番号4
ＧＡＰＤＨを内部標準として、用いられるプライマー配列は
GAPDHフォワード：ACCCAGAAGACTGTGGATGG  配列番号5
GAPDHリバース：ACACATTGGGGGTAGGAACA    配列番号6
であった。
【００３７】
筋肉における筋萎縮特異的遺伝子ａｔｒｏｇｉｎの発現を同時に検出して、筋萎縮の標識とした。用いられるプライマーは
Atrogin-1フォワ：AGAGAGGCAGATTCGCAAGCGT   配列番号7
Atrogin-1リバース：TGCAAAGCTGCAGGGTGACCC   配列番号8
であった。
ＲＴ−ｑＰＣＲ結果は図１に示すように、Ｄｋｋ−３発現レベルは老人の筋肉において顕著に増加し（即ち、筋萎縮が発生した筋肉におけるＤｋｋ−３発現レベルは正常筋肉におけるＤｋｋ−３発現レベルの１１．８３倍であった）、筋萎縮特異的遺伝子ａｔｒｏｇｉｎ−１の発現レベルも老人の筋肉において顕著に向上した。
【００３８】
（２）免疫蛍光染色によってＤｋｋ−３発現レベルと筋肉直径の間の関係を確定した。老人（６５歳）の筋肉を取り、ＯＣＴ埋め込みで凍結切片を作製した。Ｄｋｋ−３抗体およびＬａｍｍｉｎ  Ｂ抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。Ｄｋｋ−３抗体染色はＤｋｋ−３の発現レベルを表し、Ｌａｍｍｉｎ  Ｂは筋線維輪郭を表した。筋線維面積の大きさを統計することにより、Ｄｋｋ−３発現レベルと筋線維面積の関係を確定した。
１００ｍｇ未満の老人または成年の筋肉をＯＣＴに埋め込み、液体窒素中において３０秒凍結し、凍結サンプルを作製し、凍結切片の作製に適用し、厚さを８μｍとした。切片をｌａｍｍｉｎ  Ｂ免疫蛍光染色に用いて、筋線維輪郭を確定し、筋線維の大きさを統計した。染色方法は以下の通りであった：凍結切片をＰＢＳで３回洗浄した。４％ホルムアルデヒドを用いて、室温で１５分間固定した。
【００３９】
ＰＢＳで３回洗浄し、１％  Ｔｗｅｅｎ２０を加え、室温で１０分間置いた。ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２００倍希釈したラミニン抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回につき５分間、３回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で１：１０００で希釈した蛍光標識ロバ抗ウサギ二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄し、２０μＭ  ＤＡＰＩ含有ＰＢＳを加え、室温で５分間置き、ＰＢＳで１回につき５分間、３回洗浄した。消光防止剤を加えてから封着した。ツァイスレーザー共焦点顕微鏡で観察して写真を撮った。図２に示すように、老人の筋線維のほうは明らかに小さかった。統計学的解析を行った結果、図３に示すように、老人のマウスの筋線維のほうは明らかに小さかった。
【実施例２】
【００４０】
（Ｄｋｋ−３と筋萎縮の関連性）
成年（＜６０歳）の筋肉におけるＤｋｋ−３の発現量は低いが、老人（＞６５歳）の筋肉におけるＤｋｋ−３の発現量は成年の筋肉より明らかに増加したことは見出された。細胞実験において、生体内から直接に分離した初代筋線維、および生体外で筋肉幹細胞の分化を誘導して得られる最終分化筋管におけるＤｋｋ−３の発現量はいずれも低かった。最終分化筋管において過剰発現されるＤｋｋ−３は筋萎縮を起した。インビボ実験により分かるように、マウス筋肉においてアデノウイルスベクターによって過剰発現されるＤｋｋ−３も筋萎縮を起した。
【００４１】
（細胞実験）：
（１）生長培地を調製する：ＤＭＥＭ高グルコース培地に１０％ウシ胎児血清を加えてから、均一に混合し、使用に備えた。
（２）分化培地を調製する：ＤＭＥＭ高グルコース培地に２％ウマ血清を加えてから、均一に混合し、使用に備えた。
（３）Ｄｋｋ−３を発現できるアデノウイルス（力価：１．３ｘ１０１０  Ｔｕ／ｍｌ）をパッケージングし、具体的な方法は以下のようであった：
まず、ＮＣＢＩからＤｋｋ−３  ＣＤＳ配列（ＮＭ＿０１５８１４）を入手し、且つＰＣＲプライマーを設計した：
プライマー-F：GGGGTACCATGGACTACAAAGACCATGAC  (配列番号9)；
プライマー-R：GCTCTAGACTAAATCTCCTCCTCTCCGCC  (配列番号10)；
１つの１０ｃｍ培養ディッシュにおけるＣ２Ｃ１２細胞を取り、培養液を吸って捨て、１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌを加えて細胞を溶解させた；クロロホルム２００ｕｌを加え、充分に振盪して混合し、１２０００回転／分・４℃で１５分間遠心し、上層の清澄液体を取り、新しいＥＰチューブに転移した；イソプロパノール５００ｕｌを加え、充分に混合し、１２０００回転／分・４℃で１５分間遠心し、上澄を捨て、沈殿に７５％エタノール１ｍｌを加えて一回洗浄し、上澄を捨てた後、室温で１０分間乾かした；ＲＮａｓｅフリー水４０ｕｌを加えて溶解させ、全ｍＲＮＡを得た。
【００４２】
分光光度法でｍＲＮＡ濃度を測定した後、全ＲＮＡ  １μｇを取り、ＮＥＢ社のＭｕＬＶ逆転写酵素およびその１ｘ反応緩衝液１μｌ（２００ユニット）、ｄＮＴＰ混合物０．５ｍＭ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ４μＭ、ＲＮａｓｅインヒビター１μｌを加え、４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを７５℃で１０分間不活性化させ、ＰＣＲ鋳型とした。設計したＰＣＲプライマーを用いて、ＫＯＤポリメラーゼ１ｕｌとｄＮＴＰ  １ｕｌ（１０ｍＭ）を加え、ＰＣＲでＤｋｋ−３を発現する遺伝子を得た。（１．９５℃で５ｍｉｎ；２．９５℃で３０ｓ変性；３．５８℃で３０ｓアニーリング；４．６８℃で２ｍｉｎ伸長；５．６８℃で１０ｍｉｎ；第２〜４ステップのサイクルは３０回とした）
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で回収した後、ＮＥＢのＫｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼ１ｕｌを用いて３７℃で２時間切断し、１ｕｇのベクターｐａｄＴｒａｃｋ−ＧＦＰもＮＥＢのＫｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼ１ｕｌを用いて３７℃で２時間切断し、アガロースゲル電気泳動で回収した後、ＮＥＢのＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｌを用いて室温で５時間ライゲーションした後、コンピテント細胞ＢＪ５１８３を形質転換し、Ｋｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼで切断して同定した後、ＤＨ５αコンピテント細胞にトランスフェクトしてプラスミドを増幅し、プラスミドを抽出した後、Ｐａｃ１制限エンドヌクレアーゼで線形化し、ゲルから回収した後、ウイルスをパッケージングするための細胞２９３Ａへのトランスフェクションに用いた。
【００４３】
線形化した発現プラスミド１０ｕｇを取り、リン酸カルシウム共沈殿法によって２９３Ａ細胞にトランスフェクトし（プラスミド１０ｕｇを水２５０ｕｌに加え、塩化カルシウム溶液２５０ｕｌを加え、充分に混合して使用に備えた；５０ｍｌ遠心チューブを取り、２ｘＨＢＳ溶液５００ｕｌを入れ、調製したプラスミド−カルシウム溶液をＨＢＳ溶液に１滴ずつ滴下しながら、充分に振盪した；滴下が終わった後、室温で２０分間放置して使用に備えた。
約６０％のディッシュ面積まで生長した２９３Ａ細胞を取り、旧培養液を吸って捨て、生長培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）１０ｍｌを加え、調製しておいたプラスミドのカルシウム沈殿懸濁液を培地にゆっくり加え、軽くて均一に振盪した後、３７度・５％二酸化炭素インキュベーターにおいて培養した；トランスフェクションの１６時間後、新しい生長培地を交換し、培養を続けた。４８時間後から、顕微鏡で全ての細胞が緑色蛍光を発するまで、毎日に蛍光顕微鏡で観察した（一般的には７〜１０日間が必要である）。
【００４４】
細胞および細胞培養液を全て収集し、１５００回転／分で室温で５分間遠心し、上澄を捨て、細胞沈殿を保留した。ＰＢＳで二回洗浄した後、５００ｕｌ  ＰＢＳで再懸濁させ、液体窒素−３７度の反復凍結融解法によって細胞を溶解させ（３回の凍結・融解）、２０００回転／分で室温で５分間遠心し、上澄を新しいチューブに転移し、使用に備えた（即ちＰ１ウイルス）。
４０ディッシュ（１０ｃｍ培養ディッシュ）の２９３Ａ細胞を６０％のディッシュ面積に生長したまで培養し、ディッシュごとにＰ１ウイルス１０ｕｌを加えて感染させ、２４時間後に、全ての細胞が緑色蛍光を発するまで（一般的には２〜３日間が必要である）、毎日顕微鏡で観察し、その後、Ｐ１ウイルスの回収と同様な方法で回収して溶解させ、ウイルスを放出させ（一般的には２ｍｌ  ＰＢＳを加えて細胞を溶解させ、ウイルスを獲得する）、これによりＰ２ウイルスを得た。力価を測定した後で使用できた（今後で更なるウイルスが必要であったら、Ｐ２ウイルスの獲得方法に従って増幅すればよい）。
【００４５】
（４）細胞系培養：Ｃ２Ｃ１２細胞を液体窒素から取り出した後、速やかに３７℃水浴ポットで溶解させ、生長培地９ｍｌに入れ、１５００ｒｐｍ／ｍｉｎで室温で５分間遠心した後、上澄を捨て、生長培地１ｍｌを加えて再懸濁させた後、１０ｃｍ培養ディッシュに転移し、生長培地９ｍｌを追加し、在３７oＣ・５％二酸化炭素の条件下で培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞系の筋管への分化：Ｃ２Ｃ１２細胞は全培養ディッシュがそれで満ちたまで成長した後、ＰＢＳで３回洗浄し、分化培地１０ｍｌを加え、３７oＣ・５％二酸化炭素の条件下で分化を３日間誘導した。
（５）過剰発現されるＤｋｋ−３によって、Ｃ２Ｃ１２から分化した筋管において筋萎縮の発生を誘導した：新鮮な分化培地１０ｍｌを交換し、対照群に１０μｌ  ＰＢＳを加え、実験群にＤｋｋ−３アデノウイルス（力価：１．３ｘ１０１０ＴＵ／ｍｌ、ＭＯＩ：  １：５）を加え、３７℃・５％二酸化炭素の条件下で７２時間培養した。ツァイス蛍光顕微鏡で観察して写真を撮り、且つ筋管の直径を計測した（図４Ａ、Ｂ）。それと共に、細胞を収集し、全タンパク質を抽出し、全タンパク質４０μｇを取ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、膜に転写した後、Ｆｌａｇ抗体でハイブリダイズし（１：２０００希釈、室温で１時間）、過剰発現されるＦｌａｇタグ付きＤｋｋ−３を検出した。
ＰＢＳで３回洗浄した（１０分／回）後、１：１０００で希釈されたロバ抗マウス二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した（１０分／回）後、発色させ、過剰発現されるＦｌａｇタグ付きＤｋｋ−３の発現を検出した（図４Ｃ）。
【００４６】
その結果は図４Ａに示すように、空白対照群に比べて、Ｆｌａｇタグ付きＤｋｋ−３を過剰発現させた後、筋管の直径は顕著に減少した。図４Ｂに示すように、統計学的解析により、Ｄｋｋ−３を過剰発現させた後、筋管の直径は顕著に減少した。図４Ｃに示すように、ウェスタンブロットによって、筋管におけるＦｌａｇタグ付きＤｋｋ−３の過剰発現レベルを確実に検出した。
（６）Ｄｋｋ−３アデノウイルスを加えた実験群と対照群の細胞をそれぞれ１ディッシュ取り、１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌを加えた後、全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡをそれぞれ１μｇ取り、ＮＥＢ社のＭｕＬＶ逆転写酵素およびその１ｘ反応緩衝液１μｌ（２００ユニット）、ｄＮＴＰ混合物０．５ｍＭ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ４μＭ、ＲＮａｓｅインヒビター１μｌを加え、４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを９０℃で１０分間不活性化させ、ＰＣＲ鋳型とした。上記のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより標的遺伝子の発現量を検出した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、第２と第３ステップのサイクルは４０回繰り返した。
ＧＡＰＤＨを内部標準として、用いられるプライマーの配列は
GAPDHフォワード: ACCCAGAAGACTGTGGATGG (配列番号5)
GAPDHリバース: ACACATTGGGGGTAGGAACA   (配列番号6)
であった。
【００４７】
筋肉における筋萎縮特異的遺伝子Ａｔｒｏｇｉｎ１（ＮＭ＿０２６３４６．３）およびＡｔｒｏｇｉｎ１（ＮＭ＿０２６３４６．３）の発現を同時に検出して、筋萎縮の標識とした。
用いられるプライマーの配列は
Atrogin-1フォワード: AGAGAGGCAGATTCGCAAGCGT(配列番号7)
Atrogin-1リバース: TGCAAAGCTGCAGGGTGACCC(配列番号8)
であった。
ＮＥＢのＭｕＬＶ逆転写酵素でｃＤＮＡに逆転写し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより筋萎縮マーカーであるＡｔｒｏｉｇｎ１のｍＲＮＡ発現レベルを検出した。結果は図５に示すように、過剰発現されるＤｋｋ−３はＡｔｒｏｇｉｎ１の発現レベルを向上させ、筋萎縮を起すことができる。
【００４８】
（動物実験）：
ＧＦＰタグ付きＤｋｋ−３アデノウイルスを発現させ、力価を１．３ｘ１０１０ＴＵ／ｍｌとした。
Ｄｋｋ−３を発現できるアデノウイルス（力価：１．３ｘ１０１０  Ｔｕ／ｍｌ）をパッケージングする具体的な方法は以下のようであった：
まず、ＮＣＢＩからＤｋｋ−３  ＣＤＳ配列（ＮＭ＿０１５８１４）を入手し、ＰＣＲプライマーを設計した：
プライマー-F：GGGGTACCATGGACTACAAAGACCATGAC(配列番号7)；
プライマー-R:GCTCTAGACTAAATCTCCTCCTCTCCGCC(配列番号7)。
１つの１０ｃｍ培養ディッシュにおけるＣ２Ｃ１２細胞を取り、培養液を吸って捨て、１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌを加えて細胞を溶解させた；クロロホルム２００ｕｌを加え、充分に振盪して混合し、１２０００回転／分・４度で１５分間遠心し、上層の清澄液体を取り、新しいＥＰチューブに転移した；イソプロパノール５００ｕｌを加え、充分に混合し、１２０００回転／分・４度で１５分間遠心し、上澄を捨て、沈殿に７５％エタノール１ｍｌを加えて一回洗浄し、上澄を捨てた後、室温で１０分間乾かした；ＲＮａｓｅフリー水４０ｕｌを加えて溶解させ、全ｍＲＮＡを得た。
【００４９】
濃度を測定した後、全ＲＮＡ  １μｇを取り、ＮＥＢ社のＭｕＬＶ逆転写酵素およびその１ｘ反応緩衝液１μｌ（２００ユニット）、ｄＮＴＰ混合物０．５ｍＭ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ４μＭ、ＲＮａｓｅインヒビター１μｌを加え、４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを７５℃で１０分間不活性化させ、ＰＣＲ鋳型とした。
設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｄｋｋ−３を発現する遺伝子を得、Ｋｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で２時間切断し、ベクターｐａｄＴｒａｃｋ−ＧＦＰもＫｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で２時間切断し、アガロースゲル電気泳動で回収した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて室温で５時間ライゲーションした後、コンピテント細胞ＢＪ５１８３を形質転換し、Ｋｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼで切断して同定した後、ＤＨ５αコンピテント細胞にトランスフェクトしてプラスミドを増幅し、プラスミドを抽出した後、Ｐａｃ１制限エンドヌクレアーゼで線形化し、ゲルから回収した後、ウイルスをパッケージングするための細胞２９３Ａへのトランスフェクションに用いた。
【００５０】
線形化した発現プラスミド１０ｕｇを取り、リン酸カルシウム共沈殿法によって２９３Ａ細胞にトランスフェクトし（プラスミド１０ｕｇを水２５０ｕｌに加え、塩化カルシウム溶液２５０ｕｌを加え、充分に混合して使用に備えた；５０ｍｌ遠心チューブを取り、２ｘＨＢＳ溶液５００ｕｌを入れ、調製したプラスミド−カルシウム溶液をＨＢＳ溶液に１滴ずつ滴下しながら、充分に振盪した；滴下が終わった後、室温で２０分間放置して使用に備えた。
約６０％のディッシュ面積まで生長した２９３Ａ細胞を取り、旧培養液を吸って捨て、生長培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）１０ｍｌを加え、調製しておいたプラスミドのカルシウム沈殿懸濁液を培地にゆっくり加え、軽くて均一に振盪した後、３７度・５％二酸化炭素インキュベーターにおいて培養した；トランスフェクションの１６時間後、新しい生長培地を交換し、培養を続けた。４８時間後から、顕微鏡で全ての細胞が緑色蛍光を発するまで、毎日に蛍光顕微鏡で観察した（一般的には７〜１０日間が必要である）。
【００５１】
細胞および細胞培養液を全て収集し、１５００回転／分で室温で５分間遠心し、上澄を捨て、細胞沈殿を保留した。ＰＢＳで二回洗浄した後、５００ｕｌ  ＰＢＳで再懸濁させ、液体窒素−３７度の反復凍結融解法によって細胞を溶解させ（３回の凍結・融解）、２０００回転／分で室温で５分間遠心し、上澄を新しいチューブに転移し、使用に備えた（即ちＰ１ウイルス）。
４０ディッシュ（１０ｃｍ培養ディッシュ）の２９３Ａ細胞を６０％のディッシュ面積に生長したまで培養し、ディッシュごとにＰ１ウイルス１０ｕｌを加えて感染させ、２４時間後に、全ての細胞が緑色蛍光を発するまで（一般的には２〜３日間が必要である）、毎日顕微鏡で観察し、その後、Ｐ１ウイルスの回収と同様な方法で回収して溶解させ、ウイルスを放出させ（一般的には２ｍｌ  ＰＢＳを加えて細胞を溶解させ、ウイルスを獲得する）、これによりＰ２ウイルスを得た。力価を測定した後で使用できた（今後で更なるウイルスが必要であったら、Ｐ２ウイルスの獲得方法に従って増幅すればよい）。
【００５２】
（方法）：
力価が１．３ｘ１０１０  ＴＵ／ｍｌであるＤｋｋ−３を発現するアデノウイルス５０μｌを、筋肉内注射によってマウスの左足の前脛骨筋に注射し、力価が１．３ｘ１０１０  ＴＵ／ｍｌである空ベクターアデノウイルス５０μｌを、対照として右足の前脛骨筋に注射し、１日に一回注射し、７日間連続に注射した後、１０日間待った。その後、マウスの前脛骨筋を取り、埋め込み剤ＯＣＴに埋め込み、凍結切片を作製した。
ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）によって筋線維輪郭を示し、筋線維直径の大きさを比較した。染色方法は以下の通りであった：凍結切片をＰＢＳで５分／回で二回洗浄した；ヘマトキシリンで１分間染色し、水道水で２０分間リンスした；３０％エタノールで５分間インキュベートした；５０％エタノールで５分間インキュベートした；７０％エタノールで５ｍｉｎインキュベートした；９５％エタノールで５ｍｉｎインキュベートした；エオジン染料で１０秒染色した；９５％エタノールで５分間インキュベートした；１００％エタノールで５分間インキュベートした；１００％エタノールで５分間インキュベートした；キシレン：ＥｔＯＨ＝１：１溶液で１０分間インキュベートした；キシレンで１０分間インキュベートした；乾かしてからバルサムで封入した。
【００５３】
顕微鏡で写真を撮り、筋線維の直径を統計した（図６）。具体的には、図６Ａに示すように、マウス筋肉において過剰発現されるＧＦＰタグ付きＤｋｋ−３は、筋萎縮を起した；図６Ｂに示すように、統計学的解析により、ＧＦＰタグ付きＤｋｋ−３を過剰発現する筋肉は、ＧＦＰのみを発現する筋肉に比べて、直径が明らかに小さかった。
【実施例３】
【００５４】
（キットの製造）
実施例１と２に記載されたように、Ｄｋｋ−３タンパク質の異常発現は筋萎縮と密切に関連する。よって、それに基づいてＤｋｋ−３遺伝子特異的プライマーを設計し、患者のＤＮＡを鋳型として増幅し、検出を行うことができる。
下記のものを含むキット（延べ１００人）を製造した。
名称                          配列                      濃度
フォワードプライマー           配列番号3                100μM 
リバースプライマー             配列番号4                100μM
受試患者の筋肉組織を取り、常法または特定の抽出キットでそれからｍＲＮＡを抽出しｃＤＮＡに逆転写した。筋萎縮キットにおけるＰＣＲプライマーを希釈し、Ｄｋｋ−３発現量を検出し、正常対照と比較することで、Ｄｋｋ−３タンパク質の発現量の高さを確定した。
検出の結果、Ｄｋｋ−３タンパク質の発現量が正常対照より高い（発現量が３倍高い）検出対象は、筋萎縮感受性が健常人より高かった。
【実施例４】
【００５５】
（キットの製造）
検出キットの製造
本実施例において、抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体を用いて、以下の検出キットを製造した：
実施例１と２に記載されたように、Ｄｋｋ−３タンパク質の異常発現は筋萎縮と密切に関連する。よって、それに基づいて市販または自力で調製したＤｋｋ−３抗体を用いて、免疫組織化学方法によって筋肉組織におけるＤｋｋ−３タンパク質の発現を検出することができる。
下記のものを含むキット（延べ１００人）を製造した。
成分                                                       数量      
ヒツジ抗ヒトＤｋｋ−３ポリクローナル抗体(R&D社から購入)  0.5mL、濃度200μg/ml  使用前に1：1000希釈した。
使用前、臨床の新鮮筋肉検体から凍結切片を常法で調製し、ヒツジ抗ヒトＤｋｋ−３ポリクローナル抗体を加え、室温でインキュベートし、陽性シグナルを検出し、顕微鏡で陽性細胞の比率を算出して採点し、点数が正常筋肉組織の３倍を超えると、有意差があると評価した。
その結果、８５％以上（検出を受けた筋萎縮症例２８例のうちの２５例）の筋萎縮症例におけるＤｋｋ−３は高発現され、筋萎縮組織における発現量：正常筋肉組織における発現量≧３．０。
【００５６】
以上の実施例は本発明で開示される実施形態を説明するためのものであり、本発明に対する限定であると理解されるべきではない。また、本文で挙げられる各種の変更および発明にかかる方法、組成物の変化は、本発明の範囲と精神を逸脱しない限り、当業者にとって自明なものである。本発明の多種の具体的な好ましい実施例により本発明を具体的に説明したが、本発明はそれらの具体的な実施例に限定されるものではないと理解すべきである。実際、当業者にとって自明な上記各種の変更により得られる発明は全て本発明の範囲内に含まれる。
【図１】
2018515080.tif 000002
【図２】
2018515080.tif 000003
【図３】
2018515080.tif 000004
【図４Ａ】
2018515080.tif 000005
【図４Ｂ】
2018515080.tif 000006
【図４Ｃ】
2018515080.tif 000007
【図５】
2018515080.tif 000008
【図６Ａ】
2018515080.tif 000009
【図６Ｂ】
2018515080.tif 000010
【配列表】
2018515080000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月21日(2017.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋萎縮を検出する試薬を製造するための、Ｄｋｋ−３タンパク質、その抗体、そのコーディング遺伝子またはその転写物の使用。
【請求項２】
受試筋細胞または組織におけるＤｋｋ−３遺伝子発現量の異常をインビトロで確定する方法であって、
（１）前記受試筋細胞または組織のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写する工程と、
（２）Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマーを用いて、工程（１）の前記ｃＤＮＡを鋳型として、定量ＰＣＲ法によって増幅することで、Ｄｋｋ−３増幅産物を得る工程と、
（３）工程（２）の前記した受試筋細胞または組織のＤｋｋ−３増幅産物の数を、正常筋細胞または組織のＤｋｋ−３増幅産物の数と比較し、前記した正常筋細胞または組織のＤｋｋ−３増幅産物の数より高いとき、前記した受試筋細胞または組織におけるＤｋｋ−３遺伝子発現量は異常であることを示す工程と、を含む方法。
【請求項３】
受試筋細胞または組織におけるＤｋｋ−３タンパク質発現量の異常をインビトロで確定する方法であって、
（１）特異的な抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体で前記受試筋細胞または組織におけるＤｋｋ−３タンパク質の数を計測する工程と、
（２）工程（１）の前記した受試筋細胞または組織のＤｋｋ−３タンパク質の数を、正常筋細胞または組織のＤｋｋ−３タンパク質の数と比較し、前記した正常筋細胞または組織のＤｋｋ−３タンパク質の数より高いとき、前記した受試筋細胞または組織におけるＤｋｋ−３タンパク質発現量は異常であることを示す工程と、を含む方法。
【請求項４】
Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマー及び／または特異的な抗Ｄｋｋ−３抗体を含むことを特徴とする、老人性筋萎縮を検出するキット。
【請求項５】
前記キットはさらに、
（１）陽性対照と、
（２）陰性対照と、
の群から選ばれる試薬を含むことを特徴とする、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
筋萎縮を検出するためのマーカーとしての、Ｄｋｋ−３タンパク質、そのコーディング遺伝子またはその転写物的使用。
【請求項７】
老人性筋萎縮または老人性筋萎縮感受性を検出する方法であって、
（１）Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマーを用いて、受試個体筋細胞または組織のｃＤＮＡを鋳型として、定量ＰＣＲ法によって増幅することで、Ｄｋｋ−３の増幅産物を得て、形成される増幅産物の数が正常対照より高いか否かを検出する工程、または、
抗体複合体の形成に適切な条件下で、特異的な抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体を受試個体のサンプルと接触させ、且つ形成される抗体複合体の数が前記正常対照より高いか否かを検出する工程と、
（２）前記した形成される増幅産物の数、または前記した抗体複合体の数が前記した正常対照より高いとき、前記受試個体が老人性筋萎縮を起している、若しくは老人性筋萎縮感受性が健常人より高いことを示す工程と、を含む検出方法。
【請求項８】
老人性筋萎縮を治療する薬物をスクリーニングする方法であって、
（１）Ｄｋｋ−３遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞株にトランスフェクトし、Ｄｋｋ−３タンパク質を発現する細胞株を調製する工程と、
（２）工程（１）における前記したＤｋｋ−３タンパク質を発現する細胞株の培養液にテスト化合物を加え、投与後に老人性筋萎縮症状の改善または治癒を起したテスト化合物は老人性筋萎縮を治療する候補薬物であることを示す工程と、を含むスクリーニング方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー分野に関し、具体的に、老人性筋萎縮関連タンパク質分子マーカーＤｋｋ−３のスクリーニング及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮の従来の診断方法は主に、病歴を問診し、筋肉の外観検査を行い、線維束性収縮の有無を観察し、患者に明らかな筋肉量減少があるかを観察すると共に、筋電図によって神経伝導速度および誘発電位も考慮して診断を行う。現在、分子診断方法はまだ無い。
Ｄｋｋ−３はＤｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリーのメンバーであり、細胞外分泌タンパク質に属する。しかし、従来の研究では、Ｄｋｋ−３の発現量の高さが筋萎縮の発生に関連するかどうかまだ解明されていない。
そのため、治療と診断の目的で、筋萎縮において高発現される遺伝子及び／またはタンパク質を研究・開発することには、重要な意味がある。本分野では、筋萎縮において高発現される遺伝子及び／またはタンパク質が切望されている。
【発明の概要】
【発明を解決しようとする課題】
【０００３】
従来技術に存在する課題を克服するために、本発明の目的は、老人性筋萎縮に関連するタンパク質分子マーカーＤｋｋ−３のスクリーニング及びその使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は以下の技術方案によって実現される。
本発明の第一の態様は、老人性筋萎縮を検出する試薬を製造するための、Ｄｋｋ−３タンパク質、その抗体、そのコーディング遺伝子またはその転写物の使用を提供する。
本発明の第二の態様は、下記工程を含む、受試筋細胞または組織におけるＤｋｋ−３遺伝子発現量の異常をインビトロで確定する方法を提供する。
（１）受試筋細胞または組織のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写する；
（２）Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマーを用いて、工程（１）のｃＤＮＡを鋳型として、定量ＰＣＲ法によって増幅することで、Ｄｋｋ−３の増幅産物を得る；
（３）工程（２）の受試筋細胞または組織のＤｋｋ−３増幅産物の数を比較し、正常筋細胞または組織のＤｋｋ−３増幅産物の数より高いことは、受試筋細胞または組織におけるＤｋｋ−３遺伝子発現量の異常を示す。
上記方法は疾患診断を目的としない方法であってもよく、例えば関連のメカニズムの研究のみに用いられてもよい。
【０００５】
本発明の第三の態様は、下記工程を含む、受試筋細胞または組織におけるＤｋｋ−３タンパク質発現量の異常をインビトロで確定する方法を提供する。
（１）特異的な抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体で受試筋細胞または組織におけるＤｋｋ−３タンパク質の数を計測する；
（２）工程（１）の受試筋細胞または組織のＤｋｋ−３タンパク質の数を正常筋細胞または組織のＤｋｋ−３タンパク質の数と比較し、正常筋細胞または組織のＤｋｋ−３タンパク質の数より高いことは、受試筋細胞または組織におけるＤｋｋ−３タンパク質発現量の異常を示す。
上記方法は疾患診断を目的としない方法であってもよく、例えば関連のメカニズムの研究のみに用いられてもよい。
本発明の第四の態様は、Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマー及び／または特異的な抗Ｄｋｋ−３抗体を含む、老人性筋萎縮を検出するキットを提供する。
本発明の一つの好ましい例において、前記キットはさらに下記の群から選ばれる試薬を含む。
（１）陽性対照；
（２）陰性対照。
【０００６】
本発明の第五の態様は、老人性筋萎縮を検出するためのマーカーとしての、Ｄｋｋ−３タンパク質、そのコーディング遺伝子またはその転写物的使用を提供する。
本発明の第六の態様はは、下記工程を含む、老人性筋萎縮または老人性筋萎縮感受性を検出する方法を提供する。
（１）Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマーを用いて、受試個体筋細胞または組織のｃＤＮＡを鋳型として、定量ＰＣＲ法によって増幅することで、Ｄｋｋ−３の増幅産物を得て、形成される増幅産物の数が正常対照より高いかを検出する；或いは、抗体複合体の形成に適切な条件下で、特異的な抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体を受試個体のサンプルと接触させ、且つ形成される抗体複合体の数が正常対照より高いかを検出する；
（２）形成される増幅産物の数または抗体複合体の数が正常対照より高いことは、該個体が老人性筋萎縮を起しており、若しくは老人性筋萎縮感受性が健常人より高いことを示す。
上記方法は疾患診断を目的としない方法であってもよく、例えば関連のメカニズムの研究のみに用いられてもよい。
【０００７】
本発明の第七の態様はは、下記工程を含む、老人性筋萎縮を治療する薬物をスクリーニングする方法を提供する。
（１）Ｄｋｋ−３遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞株にトランスフェクトし、Ｄｋｋ−３タンパク質を発現する細胞株を調製する；
（２）工程（１）におけるＤｋｋ−３タンパク質を発現する細胞株の培養液にテスト化合物を加え、投与後に老人性症状の改善または治癒を起したテスト化合物は老人性筋萎縮を治療する候補薬物である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の有利な効果は、
（１）本発明は初めて、Ｄｋｋ−３と老人性筋萎縮の関連性、即ち９０％以上の筋萎縮症例において高発現され、筋萎縮細胞における発現量：正常筋細胞における発現量≧３．０：１であることを判明し、本発明にかかる方法は、検出の感度、正確性がいずれも従来の診断方法より顕著に優れ、分子診断法による老人性筋萎縮検出の盲点を埋めるだけでなく、操作も便利である。
【０００９】
（２）ＰＣＲなどの分子診断方法によって筋肉におけるＤｋｋ−３の発現レベルを検出することで、老人性筋萎縮症を診断し、老人性筋萎縮の早期で診断を行うことができる。伝統的な診断方法は主に、筋肉形態を観察し、筋力測定も組み合わせることで行う。筋萎縮が相当程度に進んだ場合のみに、筋肉形態および筋力に変化が発生し、老人性筋萎縮を早期で発見して介入することができない。また、筋力検出は一般的に一組の筋肉の収縮力を検出するものであり、筋群における一つの筋肉が老人性萎縮したかを確定する感度は高くない。しかし、分子診断によっては、サンプリング箇所を正確に固定化し、各筋肉の萎縮状況を一つずつ検出することができる。分子診断は、定量的検出を行うことができ、標準化した検出手順を構築し、伝統的な観察診断方法における人為的・主観的な誤差要因を解消できる。また、ＰＣＲ検出に必要なサンプルは極めて少なく、検出は便利で迅速である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｄｋｋ−３発現レベルは老人の筋肉において顕著に増加し、筋萎縮特異的遺伝子Ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＭｕｒｆ−１の発現レベルも老人の筋肉において顕著に向上したことを示す。
【図２】Ｌａｍｍｉｎ  Ｂ免疫蛍光染色により、老人の筋線維の面積が若者の筋線維より明らかに小さいことを示した。スケールバー: 20μｍ。
【図３】統計学的解析により、老人の筋線維の面積が若者の筋線維より明らかに小さいことを示す。
【図４Ａ】インビトロで培養されたマウス筋管において過剰発現されるＤｋｋ−３は老人性筋萎縮を起したことを示す。対照群に比べて、Ｆｌａｇタグ付きＤｋｋ−３を過剰発現させた後、筋管の直径は顕著に減少したことを示す。
【図４Ｂ】統計学的解析により、Ｄｋｋ−３を過剰発現させた後、筋管の直径は顕著に減少したことを示す。
【図４Ｃ】ウェスタンブロットによって筋管におけるＦｌａｇタグ付きＤｋｋ−３の過剰発現レベルを検出したことを示す。
【図５】インビトロで培養された筋管において過剰発現されるＤｋｋ−３は、筋萎縮特異的遺伝子Ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＭｕｒｆ−１の発現量の増加を起したことを示す。
【図６Ａ】マウス筋肉において過剰発現されるＧＦＰタグ付きＤｋｋ−３は、注射箇所の筋線維面積の顕著な減少を起したことを示す。
【図６Ｂ】Ｄｋｋ−３が過剰発現される筋線維面積の統計学的解析。過剰発現されるＧＦＰタグ付きＤｋｋ−３は、注射箇所の筋線維面積の顕著な減少を起したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは幅広く深く研究したところ、ヒトのＤｋｋ−３遺伝子配列をクローニングしただけでなく、異なるモデルを用いて、筋萎縮過程におけるＤｋｋ−３遺伝子の機能について研究した。この結果、意外なことに、Ｄｋｋ−３が老人性筋萎縮に関連することを見出した。
ヒト筋肉におけるＤｋｋ−３遺伝子のｃＤＮＡ保存領域を参考にして一対のプライマーを設計し、ＰＣＲによって老人の筋肉ｃＤＮＡライブラリーから一つのＤＮＡ配列をクローニングした。シーケンシングの結果から分かるように、該配列の長さは１０５３ｂｐであり、ラットおよびマウスＤｋｋ−３のｃＤＮＡ対応領域とそれぞれ９２％および９３％の相同性を有する。
【００１２】
マウスを実験動物として、実験モデルによってＤｋｋ−３遺伝子について機能検出を行った。筋肉にＤｋｋ−３遺伝子を発現できるウイルスを注射した結果、Ｄｋｋ−３遺伝子の発現は、老人性筋萎縮特異的遺伝子Ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＭｕｒｆ−１遺伝子の発現を顕著に向上させることで、老人性筋萎縮を起すことができることを見出した。
Ｄｋｋ−３  ｍＲＮＡの筋肉組織における特異的な高発現を鑑み、Ｄｋｋ−３タンパク質が老人性筋萎縮に関連することは示唆される。ヒトＤｋｋ−３遺伝子およびその発現産物に基づいて設計される薬物と診断技術は、ヒトの老人性筋萎縮の診断と治療に有用である。
【００１３】
［定義］
本文に用いられるように、「核酸」とは、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボ核酸の重合体を指す。特に断らない限り、該用語には、天然ヌクレオチドと類似の方式で機能できる天然ヌクレオチド類縁体が含まれている。
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的塩基対の形成によって二本の一本鎖核酸を結合させることを指す。
【００１４】
「実質的に結合する」または「特異的に結合する」または「選択的に結合する」または「特異的にハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチドと標的配列の間の相補的なハイブリダイゼーション反応を指し、且つハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを下げることで所望の標的ポリヌクレオチド配列の検出を達成できる小数のミスマッチを含む。該用語は、ストリンジェンシー条件下で、１つの分子が特定のヌクレオチド配列に結合、複合若しくはハイブリダイズすることも意味し、当該配列が複合混合物(例えば全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ)に存在する場合、用語「ストリンジェンシー条件」とは、プローブが標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェンシー条件は配列に依存するものであり、且つ状況によって異なっている。長い配列ほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズできる。
【００１５】
通常、選択されるストリンジェンシー条件は、限定されたイオン強度およびｐＨで推定される配列の融解温度（Ｔｍ）より約５℃低いものである。該Ｔｍは、バランスになった時、標的配列と相補的なプローブの約５０％が標的配列にハイブリダイズした場合の（限定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度での）温度である。通常、短いプローブにとって、ストリンジェンシー条件とは、塩濃度が少なくとも約０．０２ｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ＋イオン濃度・０．００１５ｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ２＋（若しくは他の塩）で、ｐＨ７．０〜８．３で、且つ温度が少なくとも約６０℃の条件である。さらに、ストリンジェンシー条件は例えばホルムアミド、ＤＭＳＯなどの不安定化剤の添加によっても実現できる。
当業者に理解できるように、ここに記載の具体的なプライマーとプローブの確定の配列は、開示されたプライマーやプローブと「実質的に同様」にするが、標的配列と実質的に結合する能力を保留するように、ある程度に修飾されてもよい。
【００１６】
（Ｄｋｋ−３タンパク質および遺伝子）
本発明によって判明されたＤｋｋ−３と老人性筋萎縮の関連性およびＤｋｋ−３の配列情報に基づき、当業者は本分野で常用の技術によってＤｋｋ−３遺伝子、タンパク質またはそれらの断片を調製できる。
本発明において、用語「Ｄｋｋ−３タンパク質」、「Ｄｋｋ−３ポリペプチド」、「老人性筋萎縮における高発現タンパク質Ｄｋｋ−３」または「本発明にかかるタンパク質」等は互いに交換して使用することができ、いずれもヒトまたは他の哺乳動物のＤｋｋ−３タンパク質（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号はＡＡＱ８８７４４．１；ＮＣＢＩ登録番号はＡＹ３５８３７８．１）を指す。
【００１７】
一つの特に好ましいＤｋｋ−３タンパク質はヒトのＤｋｋ−３タンパク質であり、そのアミノ酸配列は配列番号１に示され、具体的には以下のようである。
MQRLGATLLCLLLAAAVPTAPAPAPTATSAPVKPGPALSYPQEE                  ATLNEMFREVEELMEDTQHKLRSAVEEMEAEEAAAKASSEVNLANLPPSYHNETNTDT                     KVGNNTIHVHREIHKITNNQTGQMVFSETVITSVGDEEGRRSHECIIDEDCGPSMYCQ                     FASFQYTCQPCRGQRMLCTRDSECCGDQLCVWGHCTKMATRGSNGTICDNQRDCQPGL                     CCAFQRGLLFPVCTPLPVEGELCHDPASRLLDLITWELEPDGALDRCPCASGLLCQPH                     SHSLVYVCKPTFVGSRDQDGEILLPREVPDEYEVGSFMEEVRQELEDLERSLTEEMAL                     GEPAAAAAALLGGEEI。
【００１８】
前記Ｄｋｋ−３タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号２に示され、具体的には以下のようである。
atgcagcg  gcttggggcc  accctgctgtgcctgctgct ggcggcggcg gtccccacgg cccccgcgcc  cgctccgacg  gcgacctcggctccagtcaa  gcccggcccg  gctctcagct acccgcagga  ggaggccacc  ctcaatgagatgttccgcga  ggttgaggaa  ctgatggagg acacgcagca  caaattgcgc  agcgcggtggaagagatgga  ggcagaagaa  gctgctgcta aagcatcatc  agaagtgaac  ctggcaaacttacctcccag  ctatcacaat  gagaccaaca cagacacgaa  ggttggaaat  aataccatccatgtgcaccg  agaaattcac  aagataacca acaaccagac  tggacaaatg  gtcttttcagagacagttat  cacatctgtg  ggagacgaag aaggcagaag  gagccacgag  tgcatcatcgacgaggactg  tgggcccagc  atgtactgcc agtttgccag  cttccagtac  acctgccagccatgccgggg  ccagaggatg  ctctgcaccc gggacagtga  gtgctgtgga  gaccagctgtgtgtctgggg  tcactgcacc  aaaatggcca ccaggggcag  caatgggacc  atctgtgacaaccagaggga  ctgccagccg  gggctgtgct gtgccttcca  gagaggcctg  ctgttccctgtgtgcacacc  cctgcccgtg  gagggcgagc tttgccatga  ccccgccagc  cggcttctggacctcatcac  ctgggagcta  gagcctgatg gagccttgga  ccgatgccct  tgtgccagtggcctcctctg  ccagccccac  agccacagcc tggtgtatgt  gtgcaagccg  accttcgtggggagccgtga  ccaagatggg  gagatcctgc tgcccagaga  ggtccccgat  gagtatgaagttggcagctt  catggaggag  gtgcgccagg agctggagga  cctggagagg  agcctgactgaagagatggc  gctgggggag  cctgcggctg ccgccgctgc  actgctggga  ggggaagagatttag
【００１９】
Ｄｋｋ−３ヌクレオチド完全長配列またはその断片は通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成の方法によって獲得できる。ＰＣＲ増幅法の場合、既知のヒトＤｋｋ−３、マウスＤｋｋ−３またはラットＤｋｋ−３のヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列に基づいてプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリーまたは当業者に既知の常法で調製されたｃＤＮＡ配列を鋳型として増幅し、相応の配列を獲得することができる。配列が長い場合、２回または複数回のＰＣＲ増幅を行い、その後に各回で増幅された断片を正確な順序でライゲートすることが多い。
相応の配列を獲得すると、組換え法で相応の配列を大量に獲得することができる。通常、それをベクターにクローニングし、次に細胞にトランスフェクトし、その後に常法によって増殖された宿主細胞から相応の配列を分離して獲得する。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法によって相応の配列を合成することもできる。通常、複数の小さな断片を合成しておき、その後にライゲーションを行うことにより、配列が非常に長い断片を獲得できる。
【００２０】
現在、化学的合成の方法によって本発明にかかるタンパク質（またはその断片、またはそれらの誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることは既に可能になっている。その後、該ＤＮＡ配列を本分野で既知の各種の従来のＤＮＡ分子（例えばベクター）や細胞に導入することができる。さらに、化学的合成によって本発明にかかるタンパク質配列中に突然変異を導入することもできる。
本発明に用いられるＤｋｋ−３タンパク質は、相応のコーディング配列を宿主細胞に導入し（直接に導入するまたはＤｋｋ−３コーディング配列含有ベクターを導入する）、適切な条件下で形質転換された宿主細胞を培養してＤｋｋ−３タンパク質を発現させ、その後にＤｋｋ−３タンパク質を分離・精製することができる。
【００２１】
（抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体）
一方、本発明は更に、Ｄｋｋ−３  ＤＮＡまたはその断片によってコードされるポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、特にモノクローナル抗体を含む。ここで、「特異的な」とは、抗体がＤｋｋ−３遺伝子産物またはその断片に結合できることを指す。好ましくは、Ｄｋｋ−３遺伝子産物またはその断片に結合できるが、他の非関連抗原分子を認識・結合しない抗体を指す。本発明において、抗体には、Ｄｋｋ−３タンパク質に結合してそれを阻害できる分子も含まれるし、Ｄｋｋ−３タンパク質の機能に影響しない抗体も含まれる。
本発明は、完全なモノクローナル抗体だけでなく、免疫原性を有する抗体断片、例えばＦａｂ１やＦａｂ２断片；抗体重鎖；抗体軽鎖；またはマウス抗体との結合特異性を有しながらもヒト由来の抗体部分も保留した抗体のようなキメラ抗体なども含む。
【００２２】
本発明にかかる抗体は、当業者に既知の各種の技術によって調製できる。
抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体は、免疫組織化学技術に用いて、生検検体におけるＤｋｋ−３タンパク質を検出することができる。また、ヒトＤｋｋ−３タンパク質に結合するモノクローナル抗体は、放射性同位体や蛍光で標識してもよく、生体内に注射されると、その位置と分布が追跡できる。このような放射性または蛍光標識抗体は、非侵襲的な診断方法として筋萎縮細胞の位置決めに用いることができる。
本発明にかかる抗体は、例えば老人性筋萎縮のようなヒトＤｋｋ−３タンパク質関連疾患の検出に用いることができる。抗体は生体内の一つの特殊な部位に対する阻害剤に設計することもできる。例えば、ヒトＤｋｋ−３タンパク質と高い親和性を持つモノクローナル抗体は、阻害剤と共有結合することができる。本発明にかかるＤｋｋ−３タンパク質は筋細胞または組織に特異的に高発現しているため、このようなキメラ抗体はヒトＤｋｋ−３タンパク質レベルの低減に用いることができる。
ポリクローナル抗体の生産では、ヒトＤｋｋ−３タンパク質またはポリペプチドでウサギ、マウス、ラットなどの動物を免疫することができる。フロインドアジュバントを含む多種のアジュバントは、免疫反応の増強に用いることができるが、それに限定されない。
【００２３】
（医薬組成物）
本発明にかかるタンパク質の拮抗剤（例えば抗体）は、治療で施用（投与）されると、治療効果を提供できる。通常、これらの物質は無毒で、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体に配合され、ただし、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患によって変化できるが、通常は約５〜８であり、好ましいｐＨは約６〜８である。配合された医薬組成物は、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、皮内または局所を含む通常の経路で投与することができるが、それらに限定されない。
本発明にかかるポリペプチドの拮抗剤は老人性筋萎縮の治療に用いることができる。本発明にかかるＤｋｋ−３タンパク質を用いる際に、他の治療剤も同時に使用できる。
【００２４】
本発明は更に、安全で有効な量（例えば０．０１〜９９ｗｔ％）の本発明にかかるＤｋｋ−３タンパク質の拮抗剤、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される佐剤は、薬学的に許容される担体、希釈剤、充填剤、結合剤およびその他の賦形剤を含むが、それらに限定されない。当業者に既知の治療用の不活性の無機または有機担体は、乳糖、コーンスターチまたはその誘導体、タルク、植物油、ワックス、脂肪、例えばポリエチレングリコール、水、蔗糖、エタノール、グリセリンのようなポリヒドロキシ化合物、各種の防腐剤、滑沢剤、分散剤、矯味剤を含むが、それらに限定されない。保湿剤、酸化防止剤、甘味剤、着色剤、安定化剤、塩、緩衝液なども加えることができ、それらの物質は必要に応じて、処方の安定化のために用いられ、或いは活性やバイオアベイラビリティの向上、若しくは経口投与の場合に許容される食感や匂の産生に関与する。
【００２５】
本発明にかかる医薬組成物は、例えばカプセル、錠剤、分散錠、バッカル錠、チュアブル錠、発泡錠、徐放錠、顆粒剤などの経口投与製剤であってもよい。これで、外見が悪く、携帯に不便で、飲みにくく、投与量が大きいという伝統的な煎剤の欠点を有効に改善することができ、慢性腎炎を治療するための投与量が小さく、薬効が強く、安定性がいい新規剤型の開発に新たな経路を提供する。
本発明にかかる医薬組成物は常法で調製することができ、例えば、各有効成分を均一に混合して、或いは各種の製剤の通常の調製方法により薬効成分と相応の佐剤を配合して調製する。本発明にかかる医薬組成物は、他の治療剤と併用することもできる。
本発明にかかる医薬組成物は老人性筋萎縮の治療に用いることができる。
本発明にかかる医薬組成物の有効な治療投与量は勿論、投与経路や患者の健康状況等の要素を考慮すべきであり、それらは熟練した医者の技術の範囲内にある。
【００２６】
ヒトＤｋｋ−３タンパク質のポリヌクレオチドは多種の治療目的に用いることもできる。遺伝子治療技術は、Ｄｋｋ−３タンパク質の異常発現によって起きる・代表される細胞の増殖、発育または代謝の異常（例えば老人性筋萎縮）の治療に用いることができる。
ヒトＤｋｋ−３  ｍＲＮＡを阻害するオリゴヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡを含む）およびヌクレアーゼも本発明の範囲内にある。ヌクレアーゼは特定のＲＮＡを特異的に分解できる酵素であり、そのメカニズムは、ヌクレアーゼ分子が相補的な標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズして核酸内部切断作用を発揮する。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ並びにヌクレアーゼは、従来のいずれかのＲＮＡまたはＤＮＡ合成技術によって獲得できる。
ポリヌクレオチドを組織または細胞内に導入する方法は、ポリヌクレオチドを生体内の組織に直接に注入すること、或いは生体外でベクター（例えばウイルス、ファージやプラスミドなど）によりポリヌクレオチドを細胞に導入しておき、次に細胞を生体内に移植すること、或いはＴＡＬＥＮ、ＣＲＳＰ／Ｃａｓ９または他の遺伝子編集方法によってゲノム配列を変更させてノックアウトや競合的突然変異体などを産生することを含む。
【００２７】
本タンパク質によれば、各種の通常のスクリーニング方法により、例えば阻害剤、作動薬や拮抗剤など、Ｄｋｋ−３タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングすることができる。スクリーニングの際に、Ｄｋｋ−３タンパク質をバイオアナリシスアッセイに加え、Ｄｋｋ−３タンパク質とその受容体の間の相互作用に対する化合物の影響を測定することで、化合物が拮抗剤であるかを確定することができる。また、テスト化合物をＤｋｋ−３タンパク質と共に実験動物に投与することもでき、対照に比べて動物の筋萎縮変化が存在すると、該化合物がＤｋｋ−３タンパク質の作動薬または拮抗剤であることは判明される。
また、Ｄｋｋ−３遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞株にトランスフェクトし、Ｄｋｋ−３タンパク質を高発現する細胞株を調製し、且つ該細胞株におけるＤｋｋ−３タンパク質を標的として、Ｄｋｋ−３タンパク質に作動または阻害作用を持つ薬物をスクリーニングすることもできる。且つ、前記Ｄｋｋ−３タンパク質を発現する細胞株の培養液にテスト化合物を加え、Ｄｋｋ−３タンパク質発現量の変化を計測する。Ｄｋｋ−３タンパク質の発現を阻害する化合物は老人性筋萎縮の治療に用いることができる。
【００２８】
（検出方法）
本発明は更に、ヒトＤｋｋ−３タンパク質レベルを定量的に位置決め・検出する診断試験方法に関する。それらの試験は本分野でよく知られるもので、免疫蛍光測定、免疫組織化学および放射免疫測定を含む。試験で検出されるＤｋｋ−３タンパク質レベルは、検出される個体が老人性筋萎縮感受性を有する確率は健常人より高いかを確定するための指標の一つとして用いることができる。
サンプルにＤｋｋ−３タンパク質が存在するかを検出する一つの方法は、Ｄｋｋ−３タンパク質の特異性による検出であり、サンプルをＤｋｋ−３タンパク質特異的抗体と接触させることと、抗体複合体が形成されるかを観察することと、を含み、抗体複合体が形成されたことは、サンプルにＤｋｋ−３タンパク質が存在することを示す。
【００２９】
Ｄｋｋ−３タンパク質をコードするポリヌクレオチドはＤｋｋ−３タンパク質関連疾患の診断と治療に用いることができる。診断について、Ｄｋｋ−３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｄｋｋ−３転写物の発現の有無、或いは疾患状態におけるＤｋｋ−３転写物の異常発現の検出に用いることができる。例えば、Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ配列は、生検検体にハイブリダイズすることで、Ｄｋｋ−３タンパク質の異常発現の判断に用いることができる。ハイブリダイゼーション技術はサザンブロット法、ノーザンブロット法、インシチュ・ハイブリダイゼーションなどを含む。それらの技術・方法はいずれも公開されている既成技術であり、関連するキットはいずれも市販されている。本発明にかかるポリヌクレオチドの一部または全部は、プローブとしてマイクロアレイやジーンチップに固定し、組織における遺伝子の発現差異解析および遺伝子診断に用いることができる。Ｄｋｋ−３タンパク質特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲインビトロ増幅を行うことによっても、Ｄｋｋ−３遺伝子の転写産物を検出できる。
【００３０】
Ｄｋｋ−３タンパク質の老人性筋萎縮における高い発現率により、Ｄｋｋ−３ポリヌクレオチド、Ｄｋｋ−３タンパク質およびその抗体、並びにＤｋｋ−３タンパク質に関連する拮抗剤、作動薬などは、老人性筋萎縮の治療に新たな治療経路を提供することができるので、それらの応用は前途有望である。
【００３１】
（キット）
本発明は更に、Ｄｋｋ−３の発現が異常であるかを診断する診断キットを提供する。好ましい例において、キットは、Ｄｋｋ−３転写物を特異的に増幅するプライマー及び／または特異的な抗Ｄｋｋ−３抗体を含む。前記キットは、どうやってキットを用いてＤｋｋ−３を検出するかを記述する説明書類をさらに含んでもよい。さらに、前記キットは、検出を助力するための各種のマーカーや標識試薬、ＰＣＲ用試薬（緩衝液を含む）、免疫ハイブリダイゼーション用試薬、および陽性と陰性対照などからなる群から選ばれるいずれか１種または多種をさらに含んでもよい。
本発明によってＤｋｋ−３遺伝子の異常発現と老人性筋萎縮の関連性が初めて判明された以上、当業者はＤｋｋ−３を特異的に増幅できるプライマーを便利に設計し、その後に定量的検出などの方法によってその発現量を確定することができる、ということは理解すべきである。通常、プライマーの長さは１５〜５０ｂｐ、好ましくは１８〜３０ｂｐである。プライマーと鋳型が完全に相補的であるほうは好ましいからといって、当業者によく知られるように、プライマーと鋳型がある程度に（特にプライマーの５’末端で）非相補的である場合にも、特異的な増幅（即ち所望の断片のみを増幅すること）が可能である。それらのプライマーを含むキット、およびそれらのプライマーを使用する方法はいずれも本発明の範囲内にある。
【００３２】
増幅産物の長さは特に限定されないが、通常、増幅産物の長さは１００〜３０００ｂｐ、好ましくは１５０〜２０００ｂｐ、より好ましくは２００〜１０００ｂｐである。
従来の筋萎縮を診断するための他の方法に比べて、本発明の利点は主に、Ｄｋｋ−３と老人性筋萎縮の関連性、即ち９０％以上の筋萎縮症例において高発現され、筋萎縮細胞における発現量：正常筋細胞における発現量≧３．０：１であることを判明したことにあり、本発明にかかる方法は、検出の感度、正確性がいずれも従来の診断方法より顕著に優れ、分子診断法による老人性筋萎縮検出の盲点を埋めるだけでなく、操作も便利である。
【００３３】
以下、特定の具体的な実施例により本発明の実施形態を説明するが、当業者は本明細書で開示された内容により本発明の他の利点と効果を簡単に了解できる。本発明は他の異なる具体的な実施形態により実施または応用することもでき、本明細書における各ディテールも、異なる観点と応用に基づいて本発明の精神を逸脱しない範囲内で各種の修飾や変更を行うことができる。
本発明の具体的な実施形態をさらに記述する前に、本発明の保護範囲は下記特定の具体的な実施形態に制限されないことを理解すべきであり、且つ、本発明の実施例で使用される用語は特定の具体的な実施形態を説明するためのものであり、本発明の保護範囲を制限するためのものではなく、本発明の明細書および特許請求の範囲において、特に断らない限り、単数形の「一つ」、「１つ」および「この」は複数形も含む、ということも理解すべきである。
実施例で数値範囲がある場合、本発明で特に断らない限り、各数値範囲ごとに、２つの端点および２つの端点の間の任意の数値はいずれも適用できる、ということを理解すべきである。別途に定義しない限り、本発明で使用される全ての技術と科学的用語は本発明の所属分野の当業者が通常に理解する意味と一致する。実施例で使用される具体的な方法、装置、材料以外に、本発明の所属分野の当業者の従来技術に対する把握および本発明の記載に基づき、本発明の実施例に記載の方法、装置、材料と相似または均等の従来技術のいずれかの方法、装置、材料を用いて本発明を実現することもできる。
【００３４】
特に断らない限り、本発明において開示された実験方法、検出方法、調製方法はいずれも、本分野で常用の分子生物学、生化学、クロマチンの構造と解析、分析化学、細胞培養、ＤＮＡ組換え技術および関連する分野で常用の技術を採用する。それらの技術は従来の文献において既に完全に説明されており、具体的には、SambrookらMOLECULAR CLONING ：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001 ；Aμsμbelら，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodic μpdates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego ；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998 ；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999 ；およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999などを参照できる。
【実施例１】
【００３５】
（老人性筋萎縮におけるＤｋｋ−３の高発現）
（１）ＲＴ−ｑＰＣＲによってＤｋｋ−３が老人の筋肉に高発現しているかを検出した。老人の筋肉を取り、全ＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってＤｋｋ−３  ｍＲＮＡのレベルを検出し、若者の筋肉におけるＤｋｋ−３レベルと比較した。発現レベルが３倍以上向上したと、Ｄｋｋ−３発現レベルが増加したことを示す。
具体的な実験方法：老人（＞６５歳）の筋肉サンプルを４０つ、成年（１８〜３０歳）の筋肉サンプルを１０つ（＜５０ｍｇ）取り、１．５ｍｌ  ＥＰチューブに入れ、１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌを加え、組織ホモジナイザーで２分間ホモジナイズした。１３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ・４℃で１０分間遠心し，上澄をもう一つの清浄ＥＰチューブに転移した。フェノール：クロロホルム（２４：１）２００μｌを加え、渦巻き振盪で充分に混合し、１３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ・４℃で１５分間遠心した。上澄を清浄ＥＰチューブに転移し、イソプロパノール５００μｌを加え、充分に混合し、１３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ・４℃で１５分間遠心した。上澄を捨て、７５％エタノールで二回洗浄し、毎回につき１３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ・４℃で５分間遠心した。上澄を捨て、室温で５〜１０分間放置して乾かし、３０〜５０μｌのＤＥＰＣ水に入れて溶解させ、全ＲＮＡとした。 
【００３６】
その後、全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＲＮＡ  １μｇを取り、ＮＥＢ社のＭｕＬＶ逆転写酵素およびその１ｘ反応緩衝液１μｌ（２００ユニット）、ｄＮＴＰ混合物０．５ｍＭ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ４μＭ、ＲＮａｓｅインヒビター１μｌを加え、４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを９０℃で１０分間不活性化させ、ＰＣＲ鋳型とした。配列番号３と４に示されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより標的遺伝子の発現量を検出した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、第２と第３ステップのサイクルは４０回繰り返した。
フォワードプライマー：tgaggcagtggctacacaag   配列番号3
リバースプライマー：gctggtatggggttgagaga     配列番号4
ＧＡＰＤＨを内部標準として、用いられるプライマー配列は
GAPDHフォワード：ACCCAGAAGACTGTGGATGG  配列番号5
GAPDHリバース：ACACATTGGGGGTAGGAACA    配列番号6
であった。
【００３７】
筋肉における筋萎縮特異的遺伝子ａｔｒｏｇｉｎの発現を同時に検出して、筋萎縮の標識とした。用いられるプライマーは
Atrogin-1フォワ：AGAGAGGCAGATTCGCAAGCGT   配列番号7
Atrogin-1リバース：TGCAAAGCTGCAGGGTGACCC   配列番号8
であった。
ＲＴ−ｑＰＣＲ結果は図１に示すように、Ｄｋｋ−３発現レベルは老人の筋肉において顕著に増加し（即ち、筋萎縮が発生した筋肉におけるＤｋｋ−３発現レベルは正常筋肉におけるＤｋｋ−３発現レベルの１１．８３倍であった）、筋萎縮特異的遺伝子ａｔｒｏｇｉｎ−１の発現レベルも老人の筋肉において顕著に向上した。
【００３８】
（２）免疫蛍光染色によってＤｋｋ−３発現レベルと筋肉直径の間の関係を確定した。老人（６５歳）の筋肉を取り、ＯＣＴ埋め込みで凍結切片を作製した。Ｄｋｋ−３抗体およびＬａｍｍｉｎ  Ｂ抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。Ｄｋｋ−３抗体染色はＤｋｋ−３の発現レベルを表し、Ｌａｍｍｉｎ  Ｂは筋線維輪郭を表した。筋線維面積の大きさを統計することにより、Ｄｋｋ−３発現レベルと筋線維面積の関係を確定した。
１００ｍｇ未満の老人または成年の筋肉をＯＣＴに埋め込み、液体窒素中において３０秒凍結し、凍結サンプルを作製し、凍結切片の作製に適用し、厚さを８μｍとした。切片をｌａｍｍｉｎ  Ｂ免疫蛍光染色に用いて、筋線維輪郭を確定し、筋線維の大きさを統計した。染色方法は以下の通りであった：凍結切片をＰＢＳで３回洗浄した。４％ホルムアルデヒドを用いて、室温で１５分間固定した。
【００３９】
ＰＢＳで３回洗浄し、１％  Ｔｗｅｅｎ２０を加え、室温で１０分間置いた。ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２００倍希釈したラミニン抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回につき５分間、３回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で１：１０００で希釈した蛍光標識ロバ抗ウサギ二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄し、２０μＭ  ＤＡＰＩ含有ＰＢＳを加え、室温で５分間置き、ＰＢＳで１回につき５分間、３回洗浄した。消光防止剤を加えてから封着した。ツァイスレーザー共焦点顕微鏡で観察して写真を撮った。図２に示すように、老人の筋線維のほうは明らかに小さかった。統計学的解析を行った結果、図３に示すように、老人のマウスの筋線維のほうは明らかに小さかった。
【実施例２】
【００４０】
（Ｄｋｋ−３と筋萎縮の関連性）
成年（＜６０歳）の筋肉におけるＤｋｋ−３の発現量は低いが、老人（＞６５歳）の筋肉におけるＤｋｋ−３の発現量は成年の筋肉より明らかに増加したことは見出された。細胞実験において、生体内から直接に分離した初代筋線維、および生体外で筋肉幹細胞の分化を誘導して得られる最終分化筋管におけるＤｋｋ−３の発現量はいずれも低かった。最終分化筋管において過剰発現されるＤｋｋ−３は筋萎縮を起した。インビボ実験により分かるように、マウス筋肉においてアデノウイルスベクターによって過剰発現されるＤｋｋ−３も筋萎縮を起した。
【００４１】
（細胞実験）：
（１）生長培地を調製する：ＤＭＥＭ高グルコース培地に１０％ウシ胎児血清を加えてから、均一に混合し、使用に備えた。
（２）分化培地を調製する：ＤＭＥＭ高グルコース培地に２％ウマ血清を加えてから、均一に混合し、使用に備えた。
（３）Ｄｋｋ−３を発現できるアデノウイルス（力価：１．３ｘ１０１０  Ｔｕ／ｍｌ）をパッケージングし、具体的な方法は以下のようであった：
まず、ＮＣＢＩからＤｋｋ−３  ＣＤＳ配列（ＮＭ＿０１５８１４）を入手し、且つＰＣＲプライマーを設計した：
プライマー-F：GGGGTACCATGGACTACAAAGACCATGAC  (配列番号9)；
プライマー-R：GCTCTAGACTAAATCTCCTCCTCTCCGCC  (配列番号10)；
１つの１０ｃｍ培養ディッシュにおけるＣ２Ｃ１２細胞を取り、培養液を吸って捨て、１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌを加えて細胞を溶解させた；クロロホルム２００ｕｌを加え、充分に振盪して混合し、１２０００回転／分・４℃で１５分間遠心し、上層の清澄液体を取り、新しいＥＰチューブに転移した；イソプロパノール５００ｕｌを加え、充分に混合し、１２０００回転／分・４℃で１５分間遠心し、上澄を捨て、沈殿に７５％エタノール１ｍｌを加えて一回洗浄し、上澄を捨てた後、室温で１０分間乾かした；ＲＮａｓｅフリー水４０ｕｌを加えて溶解させ、全ｍＲＮＡを得た。
【００４２】
分光光度法でｍＲＮＡ濃度を測定した後、全ＲＮＡ  １μｇを取り、ＮＥＢ社のＭｕＬＶ逆転写酵素およびその１ｘ反応緩衝液１μｌ（２００ユニット）、ｄＮＴＰ混合物０．５ｍＭ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ４μＭ、ＲＮａｓｅインヒビター１μｌを加え、４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを７５℃で１０分間不活性化させ、ＰＣＲ鋳型とした。設計したＰＣＲプライマーを用いて、ＫＯＤポリメラーゼ１ｕｌとｄＮＴＰ  １ｕｌ（１０ｍＭ）を加え、ＰＣＲでＤｋｋ−３を発現する遺伝子を得た。（１．９５℃で５ｍｉｎ；２．９５℃で３０ｓ変性；３．５８℃で３０ｓアニーリング；４．６８℃で２ｍｉｎ伸長；５．６８℃で１０ｍｉｎ；第２〜４ステップのサイクルは３０回とした）
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で回収した後、ＮＥＢのＫｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼ１ｕｌを用いて３７℃で２時間切断し、１ｕｇのベクターｐａｄＴｒａｃｋ−ＧＦＰもＮＥＢのＫｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼ１ｕｌを用いて３７℃で２時間切断し、アガロースゲル電気泳動で回収した後、ＮＥＢのＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｌを用いて室温で５時間ライゲーションした後、コンピテント細胞ＢＪ５１８３を形質転換し、Ｋｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼで切断して同定した後、ＤＨ５αコンピテント細胞にトランスフェクトしてプラスミドを増幅し、プラスミドを抽出した後、Ｐａｃ１制限エンドヌクレアーゼで線形化し、ゲルから回収した後、ウイルスをパッケージングするための細胞２９３Ａへのトランスフェクションに用いた。
【００４３】
線形化した発現プラスミド１０ｕｇを取り、リン酸カルシウム共沈殿法によって２９３Ａ細胞にトランスフェクトし（プラスミド１０ｕｇを水２５０ｕｌに加え、塩化カルシウム溶液２５０ｕｌを加え、充分に混合して使用に備えた；５０ｍｌ遠心チューブを取り、２ｘＨＢＳ溶液５００ｕｌを入れ、調製したプラスミド−カルシウム溶液をＨＢＳ溶液に１滴ずつ滴下しながら、充分に振盪した；滴下が終わった後、室温で２０分間放置して使用に備えた。
約６０％のディッシュ面積まで生長した２９３Ａ細胞を取り、旧培養液を吸って捨て、生長培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）１０ｍｌを加え、調製しておいたプラスミドのカルシウム沈殿懸濁液を培地にゆっくり加え、軽くて均一に振盪した後、３７度・５％二酸化炭素インキュベーターにおいて培養した；トランスフェクションの１６時間後、新しい生長培地を交換し、培養を続けた。４８時間後から、顕微鏡で全ての細胞が緑色蛍光を発するまで、毎日に蛍光顕微鏡で観察した（一般的には７〜１０日間が必要である）。
【００４４】
細胞および細胞培養液を全て収集し、１５００回転／分で室温で５分間遠心し、上澄を捨て、細胞沈殿を保留した。ＰＢＳで二回洗浄した後、５００ｕｌ  ＰＢＳで再懸濁させ、液体窒素−３７度の反復凍結融解法によって細胞を溶解させ（３回の凍結・融解）、２０００回転／分で室温で５分間遠心し、上澄を新しいチューブに転移し、使用に備えた（即ちＰ１ウイルス）。
４０ディッシュ（１０ｃｍ培養ディッシュ）の２９３Ａ細胞を６０％のディッシュ面積に生長したまで培養し、ディッシュごとにＰ１ウイルス１０ｕｌを加えて感染させ、２４時間後に、全ての細胞が緑色蛍光を発するまで（一般的には２〜３日間が必要である）、毎日顕微鏡で観察し、その後、Ｐ１ウイルスの回収と同様な方法で回収して溶解させ、ウイルスを放出させ（一般的には２ｍｌ  ＰＢＳを加えて細胞を溶解させ、ウイルスを獲得する）、これによりＰ２ウイルスを得た。力価を測定した後で使用できた（今後で更なるウイルスが必要であったら、Ｐ２ウイルスの獲得方法に従って増幅すればよい）。
【００４５】
（４）細胞系培養：Ｃ２Ｃ１２細胞を液体窒素から取り出した後、速やかに３７℃水浴ポットで溶解させ、生長培地９ｍｌに入れ、１５００ｒｐｍ／ｍｉｎで室温で５分間遠心した後、上澄を捨て、生長培地１ｍｌを加えて再懸濁させた後、１０ｃｍ培養ディッシュに転移し、生長培地９ｍｌを追加し、在３７oＣ・５％二酸化炭素の条件下で培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞系の筋管への分化：Ｃ２Ｃ１２細胞は全培養ディッシュがそれで満ちたまで成長した後、ＰＢＳで３回洗浄し、分化培地１０ｍｌを加え、３７oＣ・５％二酸化炭素の条件下で分化を３日間誘導した。
（５）過剰発現されるＤｋｋ−３によって、Ｃ２Ｃ１２から分化した筋管において筋萎縮の発生を誘導した：新鮮な分化培地１０ｍｌを交換し、対照群に１０μｌ  ＰＢＳを加え、実験群にＤｋｋ−３アデノウイルス（力価：１．３ｘ１０１０ＴＵ／ｍｌ、ＭＯＩ：  １：５）を加え、３７℃・５％二酸化炭素の条件下で７２時間培養した。ツァイス蛍光顕微鏡で観察して写真を撮り、且つ筋管の直径を計測した（図４Ａ、Ｂ）。それと共に、細胞を収集し、全タンパク質を抽出し、全タンパク質４０μｇを取ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、膜に転写した後、Ｆｌａｇ抗体でハイブリダイズし（１：２０００希釈、室温で１時間）、過剰発現されるＦｌａｇタグ付きＤｋｋ−３を検出した。
ＰＢＳで３回洗浄した（１０分／回）後、１：１０００で希釈されたロバ抗マウス二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した（１０分／回）後、発色させ、過剰発現されるＦｌａｇタグ付きＤｋｋ−３の発現を検出した（図４Ｃ）。
【００４６】
その結果は図４Ａに示すように、空白対照群に比べて、Ｆｌａｇタグ付きＤｋｋ−３を過剰発現させた後、筋管の直径は顕著に減少した。図４Ｂに示すように、統計学的解析により、Ｄｋｋ−３を過剰発現させた後、筋管の直径は顕著に減少した。図４Ｃに示すように、ウェスタンブロットによって、筋管におけるＦｌａｇタグ付きＤｋｋ−３の過剰発現レベルを確実に検出した。
（６）Ｄｋｋ−３アデノウイルスを加えた実験群と対照群の細胞をそれぞれ１ディッシュ取り、１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌを加えた後、全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡをそれぞれ１μｇ取り、ＮＥＢ社のＭｕＬＶ逆転写酵素およびその１ｘ反応緩衝液１μｌ（２００ユニット）、ｄＮＴＰ混合物０．５ｍＭ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ４μＭ、ＲＮａｓｅインヒビター１μｌを加え、４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを９０℃で１０分間不活性化させ、ＰＣＲ鋳型とした。上記のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより標的遺伝子の発現量を検出した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、第２と第３ステップのサイクルは４０回繰り返した。
ＧＡＰＤＨを内部標準として、用いられるプライマーの配列は
GAPDHフォワード: ACCCAGAAGACTGTGGATGG (配列番号5)
GAPDHリバース: ACACATTGGGGGTAGGAACA   (配列番号6)
であった。
【００４７】
筋肉における筋萎縮特異的遺伝子Ａｔｒｏｇｉｎ１（ＮＭ＿０２６３４６．３）およびＡｔｒｏｇｉｎ１（ＮＭ＿０２６３４６．３）の発現を同時に検出して、筋萎縮の標識とした。
用いられるプライマーの配列は
Atrogin-1フォワード: AGAGAGGCAGATTCGCAAGCGT(配列番号7)
Atrogin-1リバース: TGCAAAGCTGCAGGGTGACCC(配列番号8)
であった。
ＮＥＢのＭｕＬＶ逆転写酵素でｃＤＮＡに逆転写し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより筋萎縮マーカーであるＡｔｒｏｉｇｎ１のｍＲＮＡ発現レベルを検出した。結果は図５に示すように、過剰発現されるＤｋｋ−３はＡｔｒｏｇｉｎ１の発現レベルを向上させ、筋萎縮を起すことができる。
【００４８】
（動物実験）：
ＧＦＰタグ付きＤｋｋ−３アデノウイルスを発現させ、力価を１．３ｘ１０１０ＴＵ／ｍｌとした。
Ｄｋｋ−３を発現できるアデノウイルス（力価：１．３ｘ１０１０  Ｔｕ／ｍｌ）をパッケージングする具体的な方法は以下のようであった：
まず、ＮＣＢＩからＤｋｋ−３  ＣＤＳ配列（ＮＭ＿０１５８１４）を入手し、ＰＣＲプライマーを設計した：
プライマー-F：GGGGTACCATGGACTACAAAGACCATGAC(配列番号7)；
プライマー-R:GCTCTAGACTAAATCTCCTCCTCTCCGCC(配列番号7)。
１つの１０ｃｍ培養ディッシュにおけるＣ２Ｃ１２細胞を取り、培養液を吸って捨て、１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌを加えて細胞を溶解させた；クロロホルム２００ｕｌを加え、充分に振盪して混合し、１２０００回転／分・４度で１５分間遠心し、上層の清澄液体を取り、新しいＥＰチューブに転移した；イソプロパノール５００ｕｌを加え、充分に混合し、１２０００回転／分・４度で１５分間遠心し、上澄を捨て、沈殿に７５％エタノール１ｍｌを加えて一回洗浄し、上澄を捨てた後、室温で１０分間乾かした；ＲＮａｓｅフリー水４０ｕｌを加えて溶解させ、全ｍＲＮＡを得た。
【００４９】
濃度を測定した後、全ＲＮＡ  １μｇを取り、ＮＥＢ社のＭｕＬＶ逆転写酵素およびその１ｘ反応緩衝液１μｌ（２００ユニット）、ｄＮＴＰ混合物０．５ｍＭ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ４μＭ、ＲＮａｓｅインヒビター１μｌを加え、４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを７５℃で１０分間不活性化させ、ＰＣＲ鋳型とした。
設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｄｋｋ−３を発現する遺伝子を得、Ｋｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で２時間切断し、ベクターｐａｄＴｒａｃｋ−ＧＦＰもＫｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で２時間切断し、アガロースゲル電気泳動で回収した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて室温で５時間ライゲーションした後、コンピテント細胞ＢＪ５１８３を形質転換し、Ｋｐｎ１およびＸｂａｌ１制限エンドヌクレアーゼで切断して同定した後、ＤＨ５αコンピテント細胞にトランスフェクトしてプラスミドを増幅し、プラスミドを抽出した後、Ｐａｃ１制限エンドヌクレアーゼで線形化し、ゲルから回収した後、ウイルスをパッケージングするための細胞２９３Ａへのトランスフェクションに用いた。
【００５０】
線形化した発現プラスミド１０ｕｇを取り、リン酸カルシウム共沈殿法によって２９３Ａ細胞にトランスフェクトし（プラスミド１０ｕｇを水２５０ｕｌに加え、塩化カルシウム溶液２５０ｕｌを加え、充分に混合して使用に備えた；５０ｍｌ遠心チューブを取り、２ｘＨＢＳ溶液５００ｕｌを入れ、調製したプラスミド−カルシウム溶液をＨＢＳ溶液に１滴ずつ滴下しながら、充分に振盪した；滴下が終わった後、室温で２０分間放置して使用に備えた。
約６０％のディッシュ面積まで生長した２９３Ａ細胞を取り、旧培養液を吸って捨て、生長培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）１０ｍｌを加え、調製しておいたプラスミドのカルシウム沈殿懸濁液を培地にゆっくり加え、軽くて均一に振盪した後、３７度・５％二酸化炭素インキュベーターにおいて培養した；トランスフェクションの１６時間後、新しい生長培地を交換し、培養を続けた。４８時間後から、顕微鏡で全ての細胞が緑色蛍光を発するまで、毎日に蛍光顕微鏡で観察した（一般的には７〜１０日間が必要である）。
【００５１】
細胞および細胞培養液を全て収集し、１５００回転／分で室温で５分間遠心し、上澄を捨て、細胞沈殿を保留した。ＰＢＳで二回洗浄した後、５００ｕｌ  ＰＢＳで再懸濁させ、液体窒素−３７度の反復凍結融解法によって細胞を溶解させ（３回の凍結・融解）、２０００回転／分で室温で５分間遠心し、上澄を新しいチューブに転移し、使用に備えた（即ちＰ１ウイルス）。
４０ディッシュ（１０ｃｍ培養ディッシュ）の２９３Ａ細胞を６０％のディッシュ面積に生長したまで培養し、ディッシュごとにＰ１ウイルス１０ｕｌを加えて感染させ、２４時間後に、全ての細胞が緑色蛍光を発するまで（一般的には２〜３日間が必要である）、毎日顕微鏡で観察し、その後、Ｐ１ウイルスの回収と同様な方法で回収して溶解させ、ウイルスを放出させ（一般的には２ｍｌ  ＰＢＳを加えて細胞を溶解させ、ウイルスを獲得する）、これによりＰ２ウイルスを得た。力価を測定した後で使用できた（今後で更なるウイルスが必要であったら、Ｐ２ウイルスの獲得方法に従って増幅すればよい）。
【００５２】
（方法）：
力価が１．３ｘ１０１０  ＴＵ／ｍｌであるＤｋｋ−３を発現するアデノウイルス５０μｌを、筋肉内注射によってマウスの左足の前脛骨筋に注射し、力価が１．３ｘ１０１０  ＴＵ／ｍｌである空ベクターアデノウイルス５０μｌを、対照として右足の前脛骨筋に注射し、１日に一回注射し、７日間連続に注射した後、１０日間待った。その後、マウスの前脛骨筋を取り、埋め込み剤ＯＣＴに埋め込み、凍結切片を作製した。
ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）によって筋線維輪郭を示し、筋線維直径の大きさを比較した。染色方法は以下の通りであった：凍結切片をＰＢＳで５分／回で二回洗浄した；ヘマトキシリンで１分間染色し、水道水で２０分間リンスした；３０％エタノールで５分間インキュベートした；５０％エタノールで５分間インキュベートした；７０％エタノールで５ｍｉｎインキュベートした；９５％エタノールで５ｍｉｎインキュベートした；エオジン染料で１０秒染色した；９５％エタノールで５分間インキュベートした；１００％エタノールで５分間インキュベートした；１００％エタノールで５分間インキュベートした；キシレン：ＥｔＯＨ＝１：１溶液で１０分間インキュベートした；キシレンで１０分間インキュベートした；乾かしてからバルサムで封入した。
【００５３】
顕微鏡で写真を撮り、筋線維の直径を統計した（図６）。具体的には、図６Ａに示すように、マウス筋肉において過剰発現されるＧＦＰタグ付きＤｋｋ−３は、筋萎縮を起した；図６Ｂに示すように、統計学的解析により、ＧＦＰタグ付きＤｋｋ−３を過剰発現する筋肉は、ＧＦＰのみを発現する筋肉に比べて、直径が明らかに小さかった。
【実施例３】
【００５４】
（キットの製造）
実施例１と２に記載されたように、Ｄｋｋ−３タンパク質の異常発現は筋萎縮と密切に関連する。よって、それに基づいてＤｋｋ−３遺伝子特異的プライマーを設計し、患者のＤＮＡを鋳型として増幅し、検出を行うことができる。
下記のものを含むキット（延べ１００人）を製造した。
名称                        配列                   濃度
フォワードプライマー           配列番号3                100μM 
リバースプライマー             配列番号4                100μM
受試患者の筋肉組織を取り、常法または特定の抽出キットでそれからｍＲＮＡを抽出しｃＤＮＡに逆転写した。筋萎縮キットにおけるＰＣＲプライマーを希釈し、Ｄｋｋ−３発現量を検出し、正常対照と比較することで、Ｄｋｋ−３タンパク質の発現量の高さを確定した。
検出の結果、Ｄｋｋ−３タンパク質の発現量が正常対照より高い（発現量が３倍高い）検出対象は、筋萎縮感受性が健常人より高かった。
【実施例４】
【００５５】
（キットの製造）
検出キットの製造
本実施例において、抗Ｄｋｋ−３タンパク質抗体を用いて、以下の検出キットを製造した：
実施例１と２に記載されたように、Ｄｋｋ−３タンパク質の異常発現は筋萎縮と密切に関連する。よって、それに基づいて市販または自力で調製したＤｋｋ−３抗体を用いて、免疫組織化学方法によって筋肉組織におけるＤｋｋ−３タンパク質の発現を検出することができる。
下記のものを含むキット（延べ１００人）を製造した。
成分                                                       数量      
ヒツジ抗ヒトＤｋｋ−３ポリクローナル抗体(R&D社から購入)  0.5mL、濃度200μg/ml  使用前に1：1000希釈した。
使用前、臨床の新鮮筋肉検体から凍結切片を常法で調製し、ヒツジ抗ヒトＤｋｋ−３ポリクローナル抗体を加え、室温でインキュベートし、陽性シグナルを検出し、顕微鏡で陽性細胞の比率を算出して採点し、点数が正常筋肉組織の３倍を超えると、有意差があると評価した。
その結果、８５％以上（検出を受けた筋萎縮症例２８例のうちの２５例）の筋萎縮症例におけるＤｋｋ−３は高発現され、筋萎縮組織における発現量：正常筋肉組織における発現量≧３．０。
【００５６】
以上の実施例は本発明で開示される実施形態を説明するためのものであり、本発明に対する限定であると理解されるべきではない。また、本文で挙げられる各種の変更および発明にかかる方法、組成物の変化は、本発明の範囲と精神を逸脱しない限り、当業者にとって自明なものである。本発明の多種の具体的な好ましい実施例により本発明を具体的に説明したが、本発明はそれらの具体的な実施例に限定されるものではないと理解すべきである。実際、当業者にとって自明な上記各種の変更により得られる発明は全て本発明の範囲内に含まれる。
【国際調査報告】
2018515080.tif 000011
2018515080.tif 000012
2018515080.tif 000013
2018515080.tif 000014
2018515080.tif 000015
2018515080.tif 000016
2018515080.tif 000017