(57)【要約】  ここには、サンプル中に抗菌剤抵抗性メカニズムが存在するか不在であるかを決定するための方法と組成物が開示されている。
2018515076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の抗菌剤非感受性微生物に抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法であって、
- 注目の微生物を含むサンプルを提供し；
- 前記サンプルの少なくとも一部を、前記微生物内で非感受性を与えるメカニズムを抑制する阻害剤と接触させ；
- 前記サンプルで前記阻害剤を含む部分を、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、あるいはその生存可能性を損なう化合物である抗菌剤と接触させ；
- 前記サンプルの部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；
- 前記サンプルの部分からの信号の存在または不在を検出することを含み、前記信号の存在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在していないことを示し、前記信号の不在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在していることを示す、方法。
【請求項２】
サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性メカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法であって、
- 注目の微生物を含むサンプルを提供し；
- 前記サンプルの第1の部分を、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、あるいはその生存可能性を損なう化合物である抗菌剤と接触させ；
- 前記サンプルのその第1の部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；
- 前記サンプルで前記抗菌剤と前記生存細胞レポーターを含むその第1の部分からの信号の存在または不在を検出し（前記信号の不在は、前記微生物が前記抗菌剤に感受性であることを示し、前記信号の存在は、前記微生物が前記抗菌剤に非感受性であることを示す）；
- 前記サンプルの第2の部分を、前記微生物内で前記抗菌剤に対する非感受性を与えるメカニズムを抑制する阻害剤と接触させ；
- 前記サンプルで前記阻害剤を含むその第2の部分を前記抗菌剤と接触させ；
- 前記サンプルのその第2の部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；
- 前記サンプルのその第2の部分からの信号の存在または不在を検出することを含み、前記信号の存在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在しないことを示し、前記信号の不在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在することを示す、方法。
【請求項３】
サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性メカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法であって、
- 注目の微生物を含むサンプルを提供し；
- 前記サンプルの第1の部分を、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、あるいはその生存可能性を損なう化合物である抗菌剤と、ある基質が存在しているときに検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターとに接触させ；
- 前記サンプルの第2の部分を、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関係するメカニズムによって非ケージ化されるケージ化基質と、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターとに接触させ；
- 前記第1の部分と前記第2の部分からの信号の存在または不在を検出することを含み、前記第1の部分からの前記信号の不在が、前記微生物が前記抗菌剤に対して感受性であることを示し、前記第1の部分からの前記信号の存在が、前記微生物が前記抗菌剤に対して非感受性であることを示し、前記第2の部分からの前記信号の存在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムの存在を示し、前記第2の部分からの前記信号の不在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムの不在を示す、方法。
【請求項４】
- 前記サンプルの第3の部分を、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関係するメカニズムによって非ケージ化されるケージ化基質が存在しているときに検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；
- 前記サンプルのその第3の部分からの信号の存在または不在を検出することをさらに含み、前記信号の存在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムが前記微生物に存在することを示し、前記信号の不在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムが前記微生物に不在であることを示す、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害剤が金属キレート剤またはβ-ラクタマーゼ阻害剤を含む、請求項1と2のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記金属キレート剤がEDTAであり、前記β-ラクタマーゼ阻害剤がボロン酸である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記ケージ化基質が脂肪アルデヒドを含む、請求項3及び4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記ケージ化基質が、抗菌剤をベースとした分子によってケージ化にされる脂肪アルデヒドを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記脂肪アルデヒドが、前記ケージ化分子と反応する酵素と接触したときに非ケージ化されることで前記レポーター分子と相互作用することが可能になり、前記信号が発生する、請求項7及び8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルを前記生存細胞レポーターに接触させる工程が、
- 前記サンプルに、レポーター分子をコードしているレポーター遺伝子を含むとともにバクテリオファージゲノムが欠けている非複製形質導入粒子を、前記非複製形質導入粒子が前記微生物に形質導入をすることが可能で、前記レポーター遺伝子を前記微生物の中で発現させることができる条件下で導入し；
- 前記レポーター分子を活性化する条件を用意することを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーター遺伝子が、ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子、比色反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子、蛍光タンパク質をコードしている遺伝子、選択可能なマーカーをコードしている遺伝子、アフィニティペプチドをコードしている核酸分子からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている前記遺伝子が、1種類以上のルシフェラーゼをコードしている遺伝子を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗菌剤が、β-ラクタム、基質特異性拡張型β-ラクタム、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、任意の世代のセファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリドノン、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、フルオロキノロン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、テトラサイクリン、リファムピシン、マイコバクテリア抗生剤、クロラムフェニコール、ムピロシンからなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が原核生物または真核生物である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記原核生物がグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、ブドウ球菌属、腸内細菌、エンテロコッカス属、レンサ球菌属、アシネトバクター属、シュードモナス属、ステノトロフォモナス属、マイコバクテリウム属、カンジダ属のいずれかである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
抗菌剤抵抗性の前記メカニズムが、β-ラクタマーゼ活性またはカルバペネマーゼ活性を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記カルバペネマーゼ活性が、クラスAのカルバペネマーゼ、クラスBのカルバペネマーゼ、クラスDのカルバペネマーゼ、またはこれらの組み合わせに由来する、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗菌剤抵抗性がカルバペネムに対する抵抗性を含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素がカルバペネマーゼである、請求項9及び19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
抗菌剤に対する微生物の抗菌剤抵抗性のメカニズムを決定するためのキットであって、
- 1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、あるいはその生存可能性を損なう化合物である抗菌剤と；
- レポーター分子をコードしているレポーター核酸分子を含む非複製形質導入粒子（NRTP）と；
- 前記微生物の中に入ることができて、前記抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素の存在下で非ケージ化基質になるケージ化基質と（前記非ケージ化基質は前記レポーター分子と反応して検出可能な信号を発生させ、その検出可能な信号の検出により、サンプル中に前記微生物が存在することが確認される）；
- 前記微生物が、前記抗菌剤、前記NRTP、前記ケージ化基質と接触しているとき、前記微生物に関係する生存可能性の検出可能な印の存在または不在に基づいて前記抗菌剤に対する前記微生物の抗菌剤抵抗性のメカニズムを明らかにすることを目的として、前記抗菌剤、前記NRTP、前記ケージ化基質を使用するための指示を含み、生存可能性の検出可能な印の存在が、前記微生物が生存していて、前記抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素を前記微生物が発現していることを示し、生存可能性の検出可能な印の不在が、前記微生物が生存していなくて、前記抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素を前記微生物が発現していないことを示す、キット。
【請求項２２】
インビトロ細胞培養物であって、前記細胞培養物中の複数の細胞が、
- レポーター分子をコードしているレポーター核酸分子を含む非複製形質導入粒子（NRTP）と；
- 抗菌剤抵抗性のメカニズムに関係する酵素活性の存在下で非ケージ化になることができるケージ化基質を含み、非ケージ化基質が前記レポーター分子と反応し、検出可能な信号を発生させることができる、インビトロ細胞培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の抗菌剤感受性表現型を与えるメカニズムを決定するための方法と組成物に関する。微生物の抗菌剤感受性表現型は、例えば興味の対象である抗菌剤を脱活性化するさまざまな酵素の発現や、抗菌剤の侵入を阻止する細胞表面の変化など、多彩なメカニズムが原因となっている可能性がある。
【背景技術】
【０００２】
抗菌剤感受性表現型に関係する具体的なメカニズムを明らかにすることは、疫学分析や、適切な治療法を決定する上で重要である可能性がある。例えばβ-ラクタマーゼ酵素の発現が原因で、ある細菌がβ-ラクタムに対して非感受性であることが判明した場合、この情報を用いて、β-ラクタマーゼ阻害剤を含む治療薬を投与できる可能があることを医師に知らせることができる。逆に前記微生物がβ-ラクタムに対して非感受性で、しかも前記微生物がβ-ラクタマーゼを発現していないことが判明した場合、この情報を用いて、β-ラクタマーゼが適切な治療薬とならない可能性があると判断することができる。
【０００３】
本分野におけるさまざまな技術を利用して、抗菌剤感受性表現型に関与する具体的なメカニズムを明らかにすることができる。例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの核酸増幅技術（NAA）を利用して遺伝子（種特異的遺伝子やβ-ラクタマーゼ遺伝子）の存在を検出することができる。しかしそのようなNAA技術は、ある微生物がその遺伝子を発現している可能性があるという推測を可能にしてくれるだけである。そのためNAA技術では、微生物の同定用核酸配列または抗菌剤抵抗性遺伝子の存在は同定できるが、遺伝子が発現しているかどうかは明らかにできず、抗菌剤に対する前記微生物の感受性も明らかにできない。
【０００４】
抗菌剤を不活性化する酵素の発現を検出するための比色アッセイが開発されている。Carba NP試験がその一例であり、この試験を通じ、発現したカルバペネマーゼの存在を溶液の色彩変化によって検出することができる（Nordmann, P.、L. Poirel、L. Dortet、「カルバペネマーゼを産生する腸内細菌科の迅速な検出」、Emerging Infectious Diseases、2012年、第18巻(9)：1503〜1507ページ）。この試験により、発現したカルバペネマーゼの存在を検出し、ある微生物のカルバペネム感受性と相関させる。しかしこのアッセイでは前記微生物が何であるかを明らかにすることができないため、前記微生物をあらかじめ単離する必要がある。また中心となるメカニズムが酵素でない場合には、感受性を明らかにすることができない。
【０００５】
統合されたシステムの中で同定と感受性の情報を提供する自動化システムが存在している。微生物を同定するためのペプチド核酸（PNA）蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）と、抗生剤の存在下における前記微生物の増殖速度をモニタするための自動化顕微鏡の組み合わせが、そのようなシステムの一例である（Metzger, S.、R.A. Frobel、W.M. Dunne Jr、「自動化顕微鏡を用いた気管支肺胞洗浄液試料からの直接的な黄色ブドウ球菌と緑膿菌の迅速な同時同定と定量」、Diagnostic Microbiology and Infectious Disease、2014年、第79巻(2)：160〜165ページ）。しかしこのシステムには、観察された感受性表現型に関与するメカニズムを明らかにする能力がない。
【０００６】
最後に、伝統的な培養技術を利用して、微生物を同定するとともに、感受性表現型の付与に関与するメカニズムを明らかにすることができる。そのようなアッセイの一例が、カルバペネマーゼの存在を決定するために用いられる改変ホッジ試験である（Lee, K.他、「シュードモナス属とアシネトバクター属の種のメタロ-β-ラクタマーゼ産生株をスクリーニングするためのホッジとEDTAディスク相乗試験改変版」、Clinical Microbiology and Infection、2001年、第7巻(2)：88〜91ページ）。しかしこれらの技術は、微生物の抗菌剤感受性表現型からの観察結果に依存しているため、その表現型が発現しない場合には、その表現型に関与するメカニズムの存在を検出することができない。
【０００７】
このように既存の技術には制約があるため、微生物を同定し、感受性表現型を明らかにし、感受性表現型の付与に関与するメカニズムを明らかにするには、複数のアッセイとシステムからの情報が必要とされる。それが理由で、ヘルスケア提供者は、この情報を得るためにさまざまなシステムを購入して稼働させる必要がある。それはコストがかかる上、厄介な作業である。こうした制約が理由で、微生物を同定し、感受性表現型を明らかにし、感受性表現型の付与に関与するメカニズムを明らかにする単一のアッセイが必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
ここには、サンプル中に抗菌剤抵抗性メカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法と組成物が開示されている。一実施態様では、本発明は、サンプル中の抗菌剤非感受性微生物に抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法に関するものであり、この方法は、注目の微生物を含むサンプルを提供し；前記サンプルの少なくとも一部を、前記微生物内で非感受性を与えるメカニズムを抑制する阻害剤と接触させ；前記サンプルで前記阻害剤を含む部分を、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、その生存可能性を別のやり方で損なう化合物である抗菌剤と接触させ；前記サンプルの部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；前記サンプルの部分からの信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の存在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在していないことを示し、その信号の不在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在していることを示している。
【０００９】
別の一実施態様では、本発明は、サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性メカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法に関するものであり、この方法は、注目の微生物を含むサンプルを提供し；前記サンプルの第1の部分を、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、その生存可能性を別のやり方で損なう化合物である抗菌剤と接触させ；前記サンプルのその第1の部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；前記サンプルで前記抗菌剤と前記生存細胞レポーターを含むその第1の部分からの信号の存在または不在を検出し（その信号の不在は、前記微生物が前記抗菌剤に感受性であることを示し、その信号の存在は、前記微生物が前記抗菌剤に非感受性であることを示す）；前記サンプルの第2の部分を、前記微生物内で前記抗菌剤に対する非感受性を与えるメカニズムを抑制する阻害剤と接触させ；前記サンプルで前記阻害剤を含むその第2の部分を前記抗菌剤と接触させ；前記サンプルのその第2の部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；前記サンプルのその第2の部分からの信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の存在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在しないことを示し、その信号の不在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在することを示している。
【００１０】
さらに別の一実施態様では、本発明は、サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性メカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法に関するものであり、この方法は、注目の微生物を含むサンプルを提供し；前記サンプルの第1の部分を、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、その生存可能性を別のやり方で損なう化合物である抗菌剤と、ある基質が存在しているときに検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターとに接触させ；前記サンプルの第2の部分を、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関係するメカニズムによって非ケージ化(un-caged)にされるケージ化(caged)基質と、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターとに接触させ；前記第1の部分と前記第2の部分からの信号の存在または不在を検出することを含んでいて、前記第1の部分からのその信号の不在が、前記微生物が前記抗菌剤に対して感受性であることを示し、前記第1の部分からのその信号の存在が、前記微生物が前記抗菌剤に対して非感受性であることを示し、前記第2の部分からのその信号の存在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムの存在を示し、前記第2の部分からのその信号の不在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムの不在を示している。
【００１１】
別の一実施態様では、本発明は、抗菌剤に対する微生物の抗菌剤抵抗性のメカニズムを決定するためのキットに関するものであり、このキットは、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、その生存可能性を別のやり方で損なう化合物である抗菌剤と；レポーター分子をコードしているレポーター核酸分子を含む非複製形質導入粒子（NRTP）と；前記微生物の中に入ることができて、前記抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素の存在下で非ケージ化基質になるケージ化基質と（前記非ケージ化基質は前記レポーター分子と反応して検出可能な信号を発生させ、その検出可能な信号の検出により、サンプル中に前記微生物が存在することが確認される）；前記微生物が、前記抗菌剤、前記NRTP、前記ケージ化基質と接触しているとき、前記微生物に関係する生存可能性の検出可能な印の存在または不在に基づいて前記抗菌剤に対する前記微生物の抗菌剤抵抗性のメカニズムを明らかにすることを目的として、前記抗菌剤、前記NRTP、前記ケージ化基質を使用するための指示を備えていて、生存可能性の検出可能な印の存在が、前記微生物が生存していて、前記抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素を前記微生物が発現していることを示し、生存可能性の検出可能な印の不在が、前記微生物が生存していなくて、前記抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素を前記微生物が発現していないことを示す。
【００１２】
別の一実施態様では、本発明は、インビトロ細胞培養物に関するものであり、その細胞培養物中の複数の細胞は、レポーター分子をコードしているレポーター核酸分子を含む非複製形質導入粒子（NRTP）と；抗菌剤抵抗性のメカニズムに関係する酵素活性の存在下で非ケージ化になることができるケージ化基質を含んでいて、非ケージ化基質が前記レポーター分子と反応することができて検出可能な信号を発生させる。
【００１３】
本発明のこれらの特徴、側面、利点と、他の特徴、側面、利点は、以下の説明と添付の図面からよりよく理解できるようになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、標的細胞内酵素によってケージを外すことのできるケージ化基質分子を用いて生存細胞内の細胞内酵素を検出するためのレポーター系の一実施態様を示している。
【００１５】
【図２】図2は、さまざまな添加剤の存在下におけるNDM-1発現大腸菌のNRTP検出からの％RLU信号を、基準となる抗生剤なしの信号で規格化して示してある。
【００１６】
【図３】図3は、さまざまな添加剤の存在下におけるKPC発現大腸菌のNRTP検出からの％RLU信号を、基準となる抗生剤なしの信号で規格化して示してある。
【００１７】
【図４】図4は、細菌ルシフェラーゼを媒介としたルミネセンス反応の一実施態様を示している。
【００１８】
【図５】図5は、メロペネム-ケージ化デカナールの合成の一実施態様を示している。
【００１９】
【図６】図6は別の一実施態様であり、メロペネム-ケージ化デカナールを合成する別のメカニズムを示している。
【００２０】
I．定義
【００２１】
請求項と明細書で用いる用語は、特に断わらない限り、以下に示すように定義する。
【００２２】
本明細書で用いる「レポーター核酸分子」は、DNA分子またはRNA分子を含むヌクレオチド配列を意味する。レポーター核酸分子は、天然のものでも、人工分子または合成分子でもよい。いくつかの実施態様では、レポーター核酸分子は宿主細胞の外部にあり、外来性核酸分子（例えばプラスミドやベクター）の一部として宿主細胞に導入することができる。いくつかの実施態様では、レポーター核酸分子は、細胞内の標的遺伝子と相補的にすることができる。別の実施態様では、レポーター核酸分子は、レポーター分子（例えばレポーター酵素、レポータータンパク質）をコードしているレポーター遺伝子を含んでいる。いくつかの実施態様では、レポーター核酸分子は、「レポーターコンストラクト」または「核酸レポーターコンストラクト」と呼ばれる。
【００２３】
「レポーター分子」または「レポーター」は、微生物に検出可能な表現型または選択可能な表現型を付与する分子（例えば核酸またはタンパク質）を意味する。検出可能な表現型として、例えば比色、蛍光、ルミネセンスが可能である。レポーター分子は、ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしているレポーター遺伝子（luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc）、比色反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子（lacZ, HRP）、蛍光タンパク質をコードしている遺伝子（GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry、近赤外蛍光タンパク質）、アフィニティペプチドをコードしている核酸分子（His-タグ、3X-FLAG）、選択可能なマーカーをコードしている遺伝子（ampC, tet(M), CAT, erm）から発現させることができる。レポーター分子は、核酸分子または外来配列（プラスミド）を細胞内にうまく取り込むためのマーカーとして使用することができる。レポーター分子は、本明細書に記載したように、標的遺伝子、標的核酸分子、標的細胞内分子、細胞のいずれかが存在することを示すのにも用いることもできる。あるいはレポーター分子として、アプタマーやリボザイムなどの核酸が可能である。
【００２４】
本発明のいくつかの側面では、レポーター核酸分子は、プロモータに機能可能に連結される。本発明の別の側面では、プロモータは、特定の細胞（例えば特定の種）内（であって他の細胞内ではない）におけるそのプロモータの活性に基づき、レポーター系の反応性と交差反応性に寄与するように選択または設計することができる。いくつかの側面では、レポーター核酸分子は、複製起点を含んでいる。別の側面では、標的細胞内のレポーター核酸分子の複製が、特定の細胞（例えば特定の種）内（であって他の細胞内ではない）の複製起点の活性に基づくレポーター信号の発生に寄与するか必要とされるとき、複製起点の選択が、レポーター系の反応性と交差反応性に同様に寄与する可能性がある。いくつかの実施態様では、レポーター核酸分子は、ウイルス複製中にコンカテマー状DNAとして子孫ウイルスの中にパッケージすることのできるレプリコンを形成する。
【００２５】
本明細書で用いる「標的転写産物」は、DNA配列のヌクレオチド配列の一部、または標的細胞によって自然に形成されるmRNA分子を意味し、その中には、標的遺伝子の転写中に形成されるものと、一次転写産物のRNAプロセッシングの産物であるmRNAが含まれる。標的転写産物は、細胞転写産物または天然の転写産物と呼ぶこともできる。
【００２６】
本明細書で用いる「転写産物」という用語は、DNA鋳型配列、またはRNA鋳型配列、または遺伝子から転写されたある長さのヌクレオチド配列（DNAまたはRNA）を意味する。転写産物として、RNA鋳型から転写されたcDNA配列、またはDNA鋳型から転写されたmRNA配列が可能である。転写産物は、タンパク質をコードしていてもいなくてもよい。転写産物は、操作した核酸コンストラクトから転写することもできる。
【００２７】
レポーター核酸分子に由来する転写産物は、「レポーター転写産物」と呼ぶことができる。レポーター転写産物は、レポーター配列とシス抑制配列を含むことができる。レポーター転写産物は、相補性領域を形成する配列を含むことができるため、転写産物は、二重鎖（例えば分子間二重鎖領域）を形成する2つの領域を含んでいる。1つの領域は、「シス抑制配列」と呼ぶことができ、標的転写産物および／またはレポーター配列の一部または全部に対する相補性を持つ。転写産物の第2の領域は「レポーター配列」と呼ばれ、シス抑制配列に対する相補性を持つことができる。相補性として、完全な相補性、または実質的な相補性が可能である。シス抑制配列の存在および／またはシス抑制配列のレポーター配列との結合は、レポーター転写産物の中にあるコンホメーションを形成することができ、それが、レポーター分子のさらなる発現を阻止することができる。レポーター転写産物は、ヘアピン構造などの二次構造を形成することができるため、レポーター転写産物内の互いに相補的な領域は互いにハイブリダイズすることができる。
【００２８】
「細胞に導入する」は、核酸分子または外来配列（例えばプラスミド、ベクター、コンストラクト）に言及する場合には、当業者に理解されているように、細胞への取り込みまたは吸収を容易にすることを意味する。核酸コンストラクトまたは核酸転写産物の吸収または取り込みは、助力なしの拡散プロセス、または活性な細胞プロセスを通じて、または補助媒体または補助装置によって、例えばバクテリオファージ、ウイルス、形質導入粒子の利用を通じて起こることができる。この用語の意味がインビトロの細胞に限定されることはなく、核酸分子も「細胞に導入する」ことができる。その場合、細胞は生きている生物の一部である。そのような場合、細胞への導入には、生物への送達が含まれるであろう。例えば生体内送達では、本発明の核酸分子、コンストラクト、ベクターを組織部位に注入すること、または全身投与することができる。インビトロでの細胞への導入には、電気穿孔やリポフェクションなどの本分野で知られている方法が含まれる。さらに別の方法は、本明細書に記載されているか、本分野で知られている。
【００２９】
「抗菌剤感受性表現型」は、抗菌剤に対する感受性または抵抗性を微生物に与えることに関与するメカニズムを意味する。
【００３０】
「抗菌剤」は、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、あるいはその生存可能性を損なう化合物を意味する。抗菌剤には、抗生剤、抗真菌剤、抗原生動物剤、抗ウイルス剤や、それ以外の化合物が含まれる。
【００３１】
「抗菌剤感受性」または「抗菌剤敏感性」は、抗菌剤に対する微生物の感受性である。「非感受性」または「抗菌剤非感受性」は、微生物が、以前は前記微生物を処理することができた抗菌剤に対してより抵抗性に、または完全に抵抗性になるときに生じる。いくつかの側面では、抗菌剤非感受性は抗生剤抵抗性であり、それは細菌と抗生剤に当てはまる。抗菌剤非感受性は、さまざまなやり方で、すなわち、ある種の微生物における天然の抵抗性によって、または遺伝子突然変異によって、または1つの種が別の種とは異なる抵抗性を獲得することによって生じる可能性がある。本明細書では、抗菌剤非感受性は、ランダムな突然変異が原因で、あるいはより一般には時間経過とともに徐々に形成されていくことによって、さらには抗生剤または抗菌剤の間違った使用が理由で、自発的に出現する可能性がある。さらに、すべてのクラスの微生物が抗菌剤非感受性（例えば真菌、抗真菌剤抵抗性；ウイルス、抗ウイルス剤抵抗性；原生動物、抗原生動物剤抵抗性；細菌、抗生剤抵抗性）を発達させる可能性がある。
【００３２】
「形質導入粒子」は、非ウイルス核酸分子を細胞内に送達することのできるウイルスを意味する。ウイルスとして、バクテリオファージ、アデノウイルスなどが可能である。
【００３３】
「非複製形質導入粒子」（NRTP）は、非ウイルス核酸分子を細胞内に送達することのできるウイルスを意味するが、自らの複製されたウイルスゲノムを形質導入粒子の中にパッケージすることはない。ウイルスとして、バクテリオファージ、アデノウイルスなどが可能である。NRTPとその製造方法は、WO 2014/160418に詳述されている。
【００３４】
「プラスミド」は、細胞内の染色体DNAとは物理的に別の小さなDNA分子であり、染色体DNAとは独立に複製することができる。プラスミドは、細菌内で小さな環状の二本鎖DNA分子として見いだされることが最も一般的だが、ときには古細菌や真核生物にも存在している。プラスミドは、適切な宿主内で自律的に複製することのできるレプリコンと見なされる。
【００３５】
「ベクター」は、外部遺伝材料を人工的に別の細胞内に運び込む乗り物として使用される核酸分子である。外部遺伝材料は、その細胞の中で複製すること、および／または発現させることができる。
【００３６】
「ウイルス」は、他の生物の生きている細胞の中だけで複製される小さな感染性媒体である。ウイルス粒子（ビリオンとして知られる）は、2つまたは3つの部分を含んでいる。すなわち、i）遺伝情報を有するDNA分子またはRNA分子から作られる遺伝材料、ii）これら遺伝子を保護するコートタンパク質、そしていくつかの場合には、iii）コートタンパク質を取り囲む脂質のエンベロープである。細菌に感染するウイルスに言及するとき、「ウイルス」、「ファージ」、「バクテリオファージ」という用語は、本明細書では入れ換えて使用することができる。
【００３７】
「改善している」という用語は、ある疾患状態の治療における治療上好ましいあらゆる結果を意味し、疾患状態には、例えば疾患の予防、疾患の重篤度の低下や、疾患の進行、寛解、治癒が含まれる。
【００３８】
「インサイチュ」という用語は、生きている生物とは別に増殖中の（例えば組織培養物の中で増殖している）生きている細胞の中で起こるプロセスを意味する。
【００３９】
「生体内」という用語は、生きている生物の内部で起こるプロセスを意味する。
【００４０】
本明細書で用いる「哺乳動物」という用語にはヒトと非ヒトの両方が含まれ、その中には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、ブタが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
「G」、「C」、「A」、「U」のそれぞれは、一般に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、ウラシルを含むヌクレオチドを表わす。「T」と「dT」は、本明細書では入れ換えて使用することができ、ヌクレオ塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド（例えばデオキシリボチミン）を意味する。しかし「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、修飾されたヌクレオチド（以下に詳述する）や代理置換部分も意味することができることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、ウラシルを他の部分で置換することが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対特性を実質的に変化させることなしに可能であることをよく知っている。例えば非限定的な例だが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、ウラシルのいずれかを含むヌクレオチドと塩基対になることができる。したがってウラシル、グアニン、アデニンのいずれかを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列の中で、例えばイノシンを含むヌクレオチドで置き換えることができる。そのような置換部分を含む配列は本発明の実施態様である。
【００４２】
本明細書で用いる「相補的な」という用語は、第1のヌクレオチド配列を第2のヌクレオチド配列との関係で記述するのに用いるときには、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが所定の条件下で第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖構造を形成する能力を意味すると当業者には理解されるであろう。相補的な配列は、互いに結合するとか、結合親和性を特徴とするとも記述される。
【００４３】
例えば第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列が厳しいハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ（例えばアニール）するとき、第1のヌクレオチド配列は第2のヌクレオチド配列と相補的であると記述することができる。ハイブリダイゼーション条件には、アニーリング工程および／または洗浄工程のための温度、イオン強度、pH、有機溶媒の濃度が含まれる。厳しいハイブリダイゼーション条件という用語は、第1のヌクレオチド配列が対応する標的配列（例えば第2のヌクレオチド配列）に優先的にハイブリダイズする一方で、他の配列にはより少ない割合でハイブリダイズするか、まったくハイブリダイズしない条件を意味する。厳しいハイブリダイゼーション条件は配列に依存しており、環境パラメータが異なると違ってくる。一般に、厳しいハイブリダイゼーション条件は、所定のイオン強度とpHにおいて、ヌクレオチド配列の融点（Tm）よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、（所定のイオン強度とpHにおいて）第1のヌクレオチド配列の50％が、完全に一致した標的配列とハイブリダイズする温度である。核酸のハイブリダイゼーションに関する包括的なガイドは、例えばTijssen（1993年）、『生化学と分子微生物学における実験室の技術 - 核酸プローブとのハイブリダイゼーション』の第I部、第2章の「ハイブリダイゼーションの原理の概説と核酸プローブアッセイの戦略」（Elsevier社、ニューヨーク）（「Tijssen」）に見いだされる。微生物の体内で遭遇する可能性のあるような他の条件、例えば生理学的に重要な条件が当てはまる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な用途に合わせ、2つの配列の相補性を調べるための最適な条件群を決めることができよう。
【００４４】
これには、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第1と第2のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対にすることが含まれる。そのような配列は、本明細書では互いに「完全に相補的」であると呼ぶことができる。しかし第1の配列が第2の配列と「実質的に相補的」であると言われる場合、これら2つの配列は、ハイブリダイゼーションのとき、完全に相補的であってもよいし、最終的な用途にとって最も重要な条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、1個以上、しかしより一般的には4個以下、または3個以下、または2個以下のミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかしハイブリダイゼーションのとき2つのオリゴヌクレオチドが1つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、そのようなオーバーハングは、相補性の判断に関してミスマッチとは見なされない。例えば長さが21ヌクレオチドの1つのオリゴヌクレオチドと長さが23ヌクレオチドの別のオリゴヌクレオチドを含むdsRNAは、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な21個のヌクレオチドの配列を含んでいる場合には、それでも本明細書に記載した目的にとって「完全に相補的」であると呼ぶことができる。
【００４５】
本明細書で用いる「相補的な」配列は、ハイブリダイズする能力に関する上記の条件が満たされる限り、非ワトソン-クリック塩基対および／または非天然かつ修飾されたヌクレオチドから形成される塩基対も含むこと、または全体をそれらから形成することもできる。そのような非ワトソン-クリック塩基対には、G：Uゆらぎまたはフーグスティーン塩基対が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
「相補的な」、「完全に相補的な」、「実質的に相補的な」という用語は、本明細書では、dsRNAの2本の鎖の間、またはdsRNAのアンチセンス鎖と標的配列の間、または一本鎖RNA配列の相補的な鎖の間、または一本鎖DNA配列の相補的な鎖の間の塩基の一致に関して用いられることが、これらが使用される文脈から理解されよう。
【００４７】
本明細書で用いる「二重鎖構造」は、逆平行で実質的に相補的な2つの核酸配列を含む。核酸コンストラクトの中の相補的な配列、または2つの転写産物の間の相補的な配列、または1つの転写産物内の2つの領域の間の相補的な配列、または1つの転写産物と1つの標的配列の間の相補的な配列は、「二重鎖構造」を形成することができる。一般に、各鎖の大半のヌクレオチドはリボヌクレオチドだが、本明細書に詳細に記載してあるように、各鎖または両方の鎖は、少なくとも1つの非リボヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド）も含むことができる。二重鎖構造を形成するこれら2本の鎖は、1つのより大きなRNA分子の異なる部分でもよいし、別々のRNA分子でもよい。2本の鎖が1つのより大きな分子の部分であり、したがって1本の鎖の3'末端と、二重鎖構造を形成するそれぞれの他方の鎖の5'末端の間でヌクレオチドの中断されていない鎖によって接続されている場合、接続に用いられるRNA鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。2本の鎖が、1本の鎖の3'末端と、二重鎖構造を形成するそれぞれの他方の鎖の5'末端の間でヌクレオチドの中断されていない鎖以外の手段によって共有結合されている場合、接続に用いられる構造は「リンカー」と呼ばれる。RNAの鎖は、同数のヌクレオチドまたは異なる数のヌクレオチドを含むことができる。塩基対の最大数は、二重鎖構造の最も短い鎖の中のヌクレオチドの数から、二重鎖構造に存在するあらゆるオーバーハングを引いた数である。一般に、二重鎖構造は、塩基対の長さが15〜30、または25〜30、または18〜25、または19〜24、または19〜21、または19、または20、または21である。一実施態様では、二重鎖構造は長さが19塩基対である。別の一実施態様では、二重鎖構造は長さが21塩基対である。2つの異なるsiRNAを組み合わせて用いるとき、二重鎖構造の長さは同じでも異なっていてもよい。
【００４８】
本明細書で用いる「相補性の領域」という用語は、本明細書に規定した1つの配列（例えば標的配列）と実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を意味する。相補性の領域が標的配列と完全に相補的ではない場合、ミスマッチは、末端領域で最もよく許容され、存在する場合には、末端領域にあること、例えば5'末端および／または3'末端の6個、5個、4個、3個、2個のヌクレオチドの中にあることが一般的である。
【００４９】
2つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈におけるパーセント「一致」という用語は、最大の対応を探して比較し、アラインメントするとき、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合が特定の値である2つ以上の配列または部分配列を意味し、それは、以下に示す配列比較アルゴリズムの1つ（例えばBLASTP、BLASTNや、当業者が入手できる他のアルゴリズム）を用いて、または目視によって測定される。用途に応じ、パーセント「一致」は、比較する配列の1つの領域全体（例えば機能ドメイン全体）に、または比較する2つの配列の全長に存在することができる。
【００５０】
配列を比較するには、典型的には1つの配列が参照配列として機能し、試験配列をその配列と比較する。配列比較アルゴリズムを利用するときには、試験配列と参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。すると配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列一致を計算する。
【００５１】
比較する配列の最適なアラインメントは、例えばSmithとWaterman、Adv. Appl. Math. 第2巻：482ページ（1981年）の局所的ホモロジーアルゴリズムによって、またはNeedlemanとWunsch、J. Mol. Biol. 第48巻：443ページ（1970年）のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、またはPearsonとLipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA第85巻：2444ページ（1988年）の類似性検索法によって、またはこれらアルゴリズムのコンピュータ版（ウィスコンシン遺伝学ソフトウエアパッケージの中のGAP、BESTFIT、FASTA、TFASTA、遺伝学コンピュータグループ、575 サイエンスDr.、マディソン、ウィスコンシン州）によって、または目視検査（一般にはAusbel他、上記文献を参照）によって実施することができる。
【００５２】
パーセント配列一致と配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムの一例は、BLASTアルゴリズムである。これは、Altschul他、J. Mol. Biol. 第215巻：403〜410ページ（1990年）に記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウエアは公開されていて、国立バイオテクノロジー情報センター（www.ncbi.nlm.nih.gov/）から入手することができる。
【００５３】
「十分な量」という用語は、望む効果を生じさせるのに十分な量を意味し、例えば、検出可能な信号を細胞から発生させるのに十分な量が挙げられる。
【００５４】
「治療に有効な量」という用語は、ある疾患の症状を改善するのに有効な量である。治療に有効な量は、「予防に有効な量」が可能である。なぜなら予防は治療と見なすことができるからである。
【００５５】
単数形の「1つの」、「その」は、本明細書と添付の請求項で用いるとき、文脈でそうでないことが明らかに述べられている場合を除き、複数形も含んでいることに注意されたい。
【００５６】
II．NRTPとレポーターアッセイ
【００５７】
非複製形質導入粒子（NRTP）と、NRTPの作製方法は、WO 2014/160418とアメリカ合衆国特許出願公開2015-0104787に記載されている。いくつかの実施態様では、NRTPは、細菌細胞パッケージング系の中で破壊／相補性に基づく方法を利用して作製される。この非複製形質導入粒子パッケージング系は、ウイルス／ファージ作製中にゲノムパッケージングを開始させる要素であるとウイルス／ファージパッケージング機構によって認識されるウイルス／バクテリオファージのゲノムの構成要素にサイレント突然変異または欠失を導入することに基づいている。そのような要素の例には、pac型バクテリオファージのpac部位配列と、cos型バクテリオファージのcos部位配列が含まれる。
【００５８】
これらパッケージング開始部位は、ウイルス／バクテリオファージの作製に不可欠な遺伝子のコード領域の中に見られることがしばしばあるため、サイレント突然変異または欠失は、pac部位がウイルス／ファージパッケージング機構によってもはやパッケージング開始部位と見なされることがないように導入される。それと同時に、突然変異または欠失は、その部位がコードされている遺伝子を破壊しない。パッケージング部位配列を機能しなくすることにより、突然変異したウイルス／バクテリオファージは溶解サイクルを実施することができるが、自らのゲノムDNAを自らのパッケージングユニットにパッケージすることはできない。
【００５９】
外来レポーター核酸分子（例えばプラスミドDNA）を、機能しないパッケージ開始部位配列を有するウイルス／ファージのゲノムで溶原化された宿主の細菌に導入することができる。外来レポーター核酸分子は、本来の機能するパッケージ開始部位配列を含むことができる。外来レポーター核酸分子を宿主細菌細胞に導入し、その細胞内で複製させることができる。突然変異したウイルス／バクテリオファージに溶解サイクルを実施するとき、発現したウイルス／ファージパッケージング機構は、機能するパッケージ開始部位配列を有する外来レポーター核酸分子をウイルスパッケージングユニットにパッケージする。ウイルス／ファージのゲノムは、パッケージ開始部位配列が突然変異しているためパッケージングユニットにパッケージされない。
【００６０】
したがって本発明では、NRTPの中にレポーター核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージング系を利用して、宿主細菌細胞を含む細胞の中に、宿主細菌細胞内の第1の核酸コンストラクト（機能しないパッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージのゲノムを含んでいて、その機能しないパッケージング開始部位配列が、バクテリオファージのゲノムがNRTPにパッケージングされるのを阻止する）と、宿主細菌細胞内にあって第1の核酸コンストラクトとは別の第2の核酸コンストラクト（レポーター遺伝子と機能するパッケージング開始部位配列を有するレポーター核酸分子を含んでいて、レポーター核酸分子のレプリコンをNRTPにパッケージングするのを容易にする）を導入し、第2の核酸コンストラクト上の機能する第2のパッケージング開始部位配列により、第1の核酸コンストラクト上のバクテリオファージゲノム内の機能しないパッケージング開始部位配列を補足することを考える。その結果、レポーター遺伝子をコードしているレポーター核酸分子を含むがバクテリオファージのゲノムは欠けたNRTPとなる。
【００６１】
いくつかの実施態様では、（NRTPを含む）本発明のコンストラクトは、レポーター遺伝子を含むレポーター核酸分子を含んでいる。レポーター遺伝子は、レポーター分子をコードすることができる。レポーター分子として、検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーが可能である。いくつかの実施態様では、レポーター遺伝子は、細胞内で発現したときに検出可能な信号を発生するレポーター分子をコードしている。
【００６２】
いくつかの実施態様では、レポーター分子として、蛍光レポーター分子、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）、増強GFP、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、青色蛍光タンパク質（BFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、mCherry、近赤外蛍光タンパク質が可能だが、これらに限定されない。
【００６３】
別の実施態様では、レポーター分子として、ルミネセンス反応を媒介する酵素（luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nlucなど）が可能である。レポーター分子は、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、比色検出に適した酵素（lacZ、HRP）、免疫検出に適したタンパク質（例えばアフィニティペプチド（His-タグ、3X-FLAG））、アプタマーとして機能するか、酵素活性を示す核酸（例えばアプタザイム、DNAザイム、リボザイム）、選択可能なマーカー（抗生剤抵抗性遺伝子（ampC、tet(M)、CAT、erm））を含むことができる。標的核酸または細胞を検出するため、本分野で知られている他のレポーター分子を用いて信号を発生させることができる。
【００６４】
本明細書に開示されているのは、生存細胞の中の細胞内酵素を検出するためのシステムであり、本発明の一実施態様に従って標的細胞内酵素によってケージを外すことのできるケージ化基質分子を使用する。
【００６５】
図1は、細胞内酵素検出システムの一般的な設計と機能を示している。レポーター分子発現ベクター101が、NRTP（図示せず）を有する標的細胞102に送達される。レポーター分子発現ベクター101は、NRTPを通じて標的細胞102に侵入し、レポーター分子遺伝子103を標的細胞102に送達することができる。するとレポーター分子104がレポーター分子遺伝子103から発現することができる。ケージ化基質105も標的細胞102に添加され、標的細胞102に侵入することができる。標的細胞内酵素107が標的細胞102の中に存在している場合、その酵素107はケージ化基質105のケージ成分を除去することができるため、非ケージ化基質108が生じる。すると非ケージ化基質108は、細胞102の内部にあるレポーター分子104と反応することができ、この反応の生成物が検出可能な信号109となる。
【００６６】
標的細胞と酵素：標的細胞は、真核細胞標的および原核細胞標的と、関係する酵素（例えば腸内細菌科の中のカルバペネマーゼ、黄色ブドウ球菌の中のβ-ラクタマーゼ）を含むことができる。
【００６７】
ベクター送達系：組み換えDNAを含むベクターの送達は、非微生物系または微生物系によって実施することができる。そうした系には、リポソーム、ウイルス様粒子、ファージまたはウイルスに由来する形質導入粒子、接合が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
レポーター分子とケージ化基質：Daniel Sobek, J.R.、『ケージ化基質を有する酵素検出系』、2007年、Zymera社に記載されているように、さまざまなレポーター分子とケージ化基質を用いることができる。
【００６９】
III．抗菌剤感受性表現型の決定
【００７０】
本明細書に開示されているのは、同定し、感受性表現型を明らかにし、微生物に感受性表現型を与えることに関与するメカニズムを明らかにする、統合された系である。この系は、感受性表現型を与えることに関与するメカニズムの活性を抑制する試薬、ならびに活性が感受性表現型を与えることに関与するメカニズムに依存する試薬と組み合わせた、生存細胞レポーター系に基づいている。
【００７１】
一実施態様では、標的細胞に特異的な生存細胞レポーターアッセイを利用して標的微生物の存在を調べる。このレポーターアッセイでは、検出可能な信号を発生させるための試薬を使用する。そのため信号の検出は、標的微生物が存在していることを示す。このレポーターアッセイを抗菌剤と組み合わせて実施し、微生物が抗菌剤に非感受性であるかどうかを明らかにすることもできる。それに加え、このレポーターアッセイは、感受性表現型を与えることに関与するメカニズムに活性が依存する試薬のバリアントを用いて実施することができる。一実施態様では、試薬は、感受性表現型を与えることに関与するメカニズムの阻害剤である。このレポーターアッセイは、感受性表現型を与えることに関与するメカニズムを抑制する第2の試薬を抗菌剤と組み合わせた状態でも実施される。
【００７２】
この生存細胞レポーターアッセイを用いて生じた結果の一例を以下の表1に掲載してある。この表で「×」は、レポーターアッセイがプラスの結果を生じさせたことを示す。これらの結果に基づくと、この方法は、サンプル1が、抗菌剤に対して非感受性である標的微生物を含むことを示している。サンプル2は標的微生物を含んでいて、前記微生物は抗菌剤に対して非感受性であり、阻害剤は、感受性表現型の付与に関与するメカニズムを抑制する。サンプル3は、抗菌剤に対して非感受性である標的微生物を含んでいて、前記微生物は、抗菌剤表現型の原因である可能性のあるメカニズムを発現している。サンプル4は、抗菌剤に対して非感受性である標的微生物を含んでいて、前記微生物は、抗菌剤表現型の原因である可能性のあるメカニズムを発現していない。サンプル5は、抗菌剤に対して感受性である標的微生物を含んでいる。サンプル6は標的微生物を含んでいて、前記微生物は抗菌剤に対して感受性であり、抗菌剤表現型の原因である可能性のあるメカニズムを発現している。そのためこの系は、微生物が感受性表現型を示すときに非感受性表現型に関与するメカニズムを発現するかどうかを明らかにすることができる。最後に、サンプル7は標的微生物を含んでいない。
【００７３】
【表１】
2018515076.tif 000003
【００７４】
このレポーターアッセイでは、複数の異なる生存細胞レポーター系と、複数の異なる抗菌剤と、複数の異なるメカニズム依存試薬を、個別に、または組み合わせて使用することができる。この方法の要素の一連の組み合わせでサンプルを評価することにより、サンプルの中に存在する微生物のタイプに関する情報と、さまざまな抗菌剤に対する抗菌剤感受性と、感受性表現型に関与する可能性のあるさまざな抵抗性メカニズムを導出することができる。
【００７５】
いくつかの実施態様では、この方法は、アッセイが有効である上で微生物の単離を必要としない。別の実施態様では、この方法は、微生物の培養を必要としない。一実施態様では、この方法は、臨床サンプル、環境サンプル、産業サンプルから直接利用される。一実施態様では、アッセイの結果は、アッセイを実施してから8時間以内に明らかになる。
【００７６】
さまざまな生存細胞レポーター遺伝子と生存細胞レポータータンパク質が本分野で知られている。例えば、吸光度、蛍光、生物発光を明らかにすることに基づく生存細胞レポーター遺伝子と生存細胞レポータータンパク質が、細胞の生存と増殖をモニタするために開発されている。いくつかの側面では、レポーター遺伝子を1つ以上の調節要素（例えばプロモータまたはエンハンサ）に融合して、発現したレポータータンパク質の量を測定することができる。レポーター系の選択は、分析する標的細胞、必要な感度、利用できる検出戦略（例えば吸光度、蛍光、生物発光）に依存する。生存細胞レポーターとして伝統的に利用されてきたタンパク質には、β-ガラクトシダーゼ（lacZ）、クロラムフェニルアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-グルクロニダーゼ（GUS）、蛍光タンパク質（それぞれ、緑色、黄色、赤色の蛍光タンパク質［GFP、YFP、RFP］）、分泌性アルカリホスファターゼ（SEAP）が含まれる。さらに、多彩なルシフェラーゼを、高感度の検出能力と広いダイナミックレンジが理由で、生存細胞レポータータンパク質として用いることができる。そのような生存細胞レポーター遺伝子コンストラクトでは、遺伝子調節要素をルシフェラーゼ遺伝子の上流に位置させた後、その結果得られるレポーターコンストラクトを例えばトランスフェクション、形質転換、形質導入、注入を通じて動物細胞、植物細胞、細菌や、他の微生物に移す。次にルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を測定して調節要素の活性を定量する、および／または細胞の生存を明らかにする。所与の実験で1つの微生物学的イベントを研究するにはルシフェラーゼ酵素を単一のレポーターとして使用できるが、基質特異性特性および／または基質がさまざまであるため、多重ルシフェラーゼ実験では複数のルシフェラーゼ酵素を組み合わせることができる。いくつかの側面では、レポーター遺伝子の選択は、ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子（luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc）、比色検出を媒介する酵素をコードしている遺伝子（lacZ、HRP）、蛍光タンパク質をコードしている遺伝子（GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry、近赤外蛍光タンパク質）、アフィニティペプチドをコードしている核酸分子（His-タグ、3X-FLAG）、選択可能なマーカーをコードしている遺伝子（ampC, tet(M), CAT, erm）からなる群からなすことができる。
【００７７】
いくつかの側面では、レポーター分子をコードしているレポーター核酸分子は、標的細胞（例えば微生物細胞または細菌細胞）に導入するため、非複製形質導入粒子（NRTP）の中にパッケージすることができる。ここでは、生存細胞レポーターは、レポーター分子をコードしているレポーター核酸分子を含む非複製形質導入粒子（NRTP）を含んでいる。より具体的には、NRTPは、標的細胞内での標的遺伝子の発現を制御する誘導性プロモータに機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含んでいる。したがってレポーター核酸分子は、NRTPを通じて標的細胞に導入することができる。レポーター遺伝子を含むNRTPが標的細胞に導入されると、レポーター核酸分子の中で標的遺伝子プロモータが誘導されることによりそのレポーター遺伝子の発現が可能になる。いくつかの側面では、生存細胞レポーターは、発光タンパク質をコードしている遺伝子を含む核酸分子を含んでいる。いくつかの側面では、発光タンパク質をコードしている遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。非複製形質導入粒子パッケージング系の適切な例は、ウイルス作製中にゲノムパッケージングを開始させる要素であるとウイルスパッケージング機構によって認識されるウイルスのゲノムの要素の破壊に基づいたものにできる。いくつかの側面では、この破壊によってバクテリオファージからのパッケージング開始部位が破壊され、テルミナーゼ機能も破壊される。破壊される要素の例に、pac型バクテリオファージのpac部位配列と、cos型バクテリオファージのcos部位配列が含まれる。ファージ内のパッケージング開始部位配列が破壊されると、ファージは機能するテルミナーゼを産生することができない。一例では、pac部位は、pacA遺伝子配列の中にコードされ、テルミナーゼ機能は、機能するPacAとPacBの両方を必要とする。ここでは、プラスミドDNAが、破壊されたテルミナーゼを補足してそのプラスミドDNA上に認識可能なパッケージング開始部位を含めることにより、ファージキャプシドにパッケージされる。バクテリオファージとして、任意のバクテリオファージ、例えば腸内細菌科のバクテリオファージPI、黄色ブドウ球菌のバクテリオファージφ80αまたはバクテリオファージφ11が可能である。
【００７８】
IV．抗菌剤抵抗性のメカニズムを決定する方法
【００７９】
一実施態様では、サンプル中の抗菌剤非感受性微生物に抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法として、注目の微生物を含むサンプルを提供し；前記サンプルの少なくとも一部を、前記微生物内で非感受性を与えるメカニズムを抑制する阻害剤と接触させ；前記サンプルで前記阻害剤を含む部分を、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、その生存可能性を別のやり方で損なう化合物である抗菌剤と接触させ；前記サンプルの部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；前記サンプルの部分からの信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の存在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在していないことを示し、その信号の不在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在していることを示している方法が提供される。
【００８０】
別の一実施態様では、サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性メカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法として、注目の微生物を含むサンプルを提供し；前記サンプルの第1の部分を、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、その生存可能性を別のやり方で損なう化合物である抗菌剤と接触させ；前記サンプルのその第1の部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；前記サンプルで前記抗菌剤と前記生存細胞レポーターを含むその第1の部分からの信号の存在または不在を検出し（その信号の不在は、前記微生物が前記抗菌剤に感受性であることを示し、その信号の存在は、前記微生物が前記抗菌剤に非感受性であることを示す）；前記サンプルの第2の部分を、前記微生物内で前記抗菌剤に対する非感受性を与えるメカニズムを抑制する阻害剤と接触させ；前記サンプルで前記阻害剤を含むその第2の部分を前記抗菌剤と接触させ；前記サンプルのその第2の部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；前記サンプルのその第2の部分からの信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の存在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在しないことを示し、その信号の不在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在することを示している方法が提供される。いくつかの実施態様では、この方法はさらに、前記サンプルの第3の部分を、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関係するメカニズムによって非ケージ化されるケージ化基質が存在しているときに検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；前記サンプルのその第3の部分からの信号の存在または不在を検出することをさらに含んでいて、その信号の存在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムが前記微生物に存在することを示し、その信号の不在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムが前記微生物に不在であることを示している。
【００８１】
これらの方法のいくつかの実施態様では、阻害剤は、金属キレート剤またはβ-ラクタマーゼ阻害剤を含んでいる。いくつかの実施態様では、金属キレート剤はEDTAである。いくつかの実施態様では、β-ラクタマーゼ阻害剤はボロン酸である。いくつかの実施態様では、金属キレート剤はEDTAであり、β-ラクタマーゼ阻害剤はボロン酸である。
【００８２】
別の一実施態様では、サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性メカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法として、注目の微生物を含むサンプルを提供し；前記サンプルの第1の部分を、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、その生存可能性を別のやり方で損なう化合物である抗菌剤と、ある基質が存在しているときに検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターとに接触させ；前記サンプルの第2の部分を、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関係するメカニズムによって非ケージ化されるケージ化基質と、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターとに接触させ； 前記第1の部分と前記第2の部分からの信号の存在または不在を検出することを含んでいて、前記第1の部分からのその信号の不在が、前記微生物が前記抗菌剤に対して感受性であることを示し、前記第1の部分からのその信号の存在が、前記微生物が前記抗菌剤に対して非感受性であることを示し、前記第2の部分からのその信号の存在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムの存在を示し、前記第2の部分からのその信号の不在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムの不在を示している方法が提供される。
【００８３】
いくつかの実施態様では、ケージ化基質は脂肪アルデヒドを含んでいる。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は、抗菌剤をベースとした分子によってケージ化になる脂肪アルデヒドを含んでいる。いくつかの実施態様では、脂肪アルデヒドは、ケージ化分子と反応する酵素と接触したときにケージが外れることでレポーター分子と相互作用することが可能になり、信号を発生させる。特別な実施態様では、酵素はカルバペネマーゼである。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は、メロペネムをベースとした分子によってケージ化になる脂肪アルデヒドを含んでいる。いくつかの実施態様では、脂肪アルデヒドはデカナールである。いくつかの実施態様では、脂肪アルデヒドは、カルバペネマーゼと接触したときにケージが外れることでレポーター分子と相互作用することが可能になり、信号を発生させる。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は、リポソームの中に封止される。
【００８４】
上記の方法のいくつかの実施態様では、前記サンプルを前記生存細胞レポーターに接触させる工程は、前記サンプルに、レポーター分子をコードしているレポーター遺伝子を含むとともにバクテリオファージゲノムが欠けている非複製形質導入粒子を、その非複製形質導入粒子が前記微生物に形質導入をすることが可能で、前記レポーター遺伝子を前記微生物の中で発現させることができる条件下で導入し； 前記レポーター分子を活性化する条件を用意することを含んでいる。いくつかの実施態様では、レポーター遺伝子の選択は、ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子、比色反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子、蛍光タンパク質をコードしている遺伝子、選択可能なマーカーをコードしている遺伝子、アフィニティペプチドをコードしている核酸分子からなる群からなされる。いくつかの実施態様では、レポーター遺伝子は、構成的プロモータに機能可能に連結されている。いくつかの実施態様では、レポーター遺伝子の選択は、ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子（luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc）、比色検出を媒介する酵素をコードしている遺伝子（lacZ、HRP）、蛍光タンパク質をコードしている遺伝子（GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry、近赤外蛍光タンパク質）、アフィニティペプチドをコードしている核酸分子（His-タグ、3X-FLAG）、選択可能なマーカーをコードしている遺伝子（ampC, tet(M), CAT, erm）からなる群からなされる。いくつかの実施態様では、ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子は、1種類以上のルシフェラーゼをコードしている遺伝子を含んでいる。いくつかの実施態様では、生存細胞レポーターは、発光タンパク質をコードしている遺伝子を含む核酸分子を含んでいる。いくつかの実施態様では、発光タンパク質をコードしている遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。
【００８５】
いくつかの実施態様では、レポーター信号は、サンプルから1,000コロニー形成単位（CFU）未満の検出限界（LoD）で検出することができる。いくつかの実施態様では、レポーター信号は、サンプルから100コロニー形成単位（CFU）未満の検出限界（LoD）で検出することができる。いくつかの実施態様では、レポーター信号は、サンプルから10コロニー形成単位（CFU）未満の検出限界（LoD）で検出することができる。いくつかの実施態様では、レポーター信号は、レポーター信号は、サンプルから5 CFU未満のLoDで検出することができる。いくつかの実施態様では、レポーター信号は、サンプルから3 CFU以下のLoDで検出することができる。
【００８６】
上記の方法のいくつかの実施態様では、抗菌剤の選択は、β-ラクタム、基質特異性拡張型β-ラクタム、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、任意の世代のセファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリドノン、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、フルオロキノロン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、テトラサイクリン、リファムピシン、マイコバクテリア抗生剤、クロラムフェニコール、ムピロシンからなる群からなされる。
【００８７】
上記の方法のいくつかの実施態様では、微生物は、原核生物または真核生物である。いくつかの実施態様では、原核生物は、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌である。いくつかの実施態様では、微生物は、ブドウ球菌属の種、腸内細菌、エンテロコッカス属の種、レンサ球菌属の種、アシネトバクター属の種、シュードモナス属の種、ステノトロフォモナス属の種、マイコバクテリウム属の種、カンジダ属のいずれかである。
【００８８】
いくつかの実施態様では、抗菌剤抵抗性のメカニズムは、β-ラクタマーゼ活性またはカルバペネマーゼ活性を含んでいる。いくつかの実施態様では、カルバペネマーゼ活性は、クラスAのカルバペネマーゼ、クラスBのカルバペネマーゼ、クラスDのカルバペネマーゼ、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施態様では、抗菌剤抵抗性は、カルバペネマーゼに対する抵抗性を含んでいる。
【００８９】
別の一実施態様では、サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在するか不在であるかを求める方法として、注目の微生物を含むサンプルを提供し；前記サンプルを、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと、抗菌剤と、その抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムを抑制することのできる阻害剤とに接触させ；その信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の不在が、抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在することを示し、その信号の存在が、その抗菌剤抵抗性のメカニズムが不在であることを示している方法が提供される。
【００９０】
別の一実施態様では、サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在するか不在であるかを求める方法として、注目の微生物を含むサンプルを提供し；前記サンプルの第1の部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；前記サンプルのその第1の部分を抗菌剤と接触させ；その第1の部分にその信号が存在するか不在であるかを検出することを含んでいて、その信号の存在が、前記微生物が非感受性表現型を含むことを示し、その信号の不在が、前記微生物が感受性表現型を含むことを示している方法が提供される。いくつかの実施態様では、この方法はさらに、前記サンプルで前記生存細胞レポーターを含む前記第1の部分と、前記抗菌剤と、抵抗性表現型を含む前記微生物を、その抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムを抑制することのできる阻害剤と接触させ；前記第1の部分に前記信号が存在するか不在であるかを検出することを含んでいて、その信号の不在が、抵抗性表現型を含む前記微生物にある種の抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在することを示し、その信号の存在が、前記微生物にその種の抗菌剤抵抗性のメカニズムが不在であることを示している。いくつかの実施態様では、この方法はさらに、前記サンプルの第2の部分を、生存細胞レポーターとケージ化基質に、そのケージ化基質が微生物の中に入る条件下で接触させ（そのケージ化基質は、抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素活性の存在下で非ケージ化になることができて、その非ケージ化の基質は、前記生存細胞レポーターと反応して前記検出可能な信号を発生させることができ、その生存細胞レポーターは、その非ケージ化の基質が不在だとその検出可能な信号を発生させない）；その第2の部分のその信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の存在が、抗菌剤抵抗性の前記メカニズムが存在することを示し、その信号の不在が、抗菌剤抵抗性のそのメカニズムが不在であることを示している。いくつかの実施態様では、この方法はさらに、前記サンプルの第2の部分を、生存細胞レポーターとケージ化基質に、そのケージ化基質が微生物の中に入る条件下で接触させ（そのケージ化基質は、抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素活性の存在下で非ケージ化になることができて、その非ケージ化基質は、前記レポーター分子と反応して前記検出可能な信号を発生させることができ、その生存細胞レポーターは、非ケージ化基質が不在だとその検出可能な信号を発生させない）；その信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の存在が、抗菌剤抵抗性の前記メカニズムが存在することを示し、その信号の不在が、抗菌剤抵抗性のそのメカニズムが不在であることを示している。いくつかの実施態様では、この方法はさらに、前記サンプルの第2の部分を、生存細胞レポーターとケージ化基質に、そのケージ化基質が微生物の中に入る条件下で接触させ（そのケージ化基質は、抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素活性の存在下で非ケージ化になることができて、その非ケージ化基質は、前記レポーター分子と反応して前記検出可能な信号を発生させることができ、その生存細胞レポーターは、その非ケージ化基質が不在だとその検出可能な信号を発生させない）；その第2の部分を、前記抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムを抑制することのできる阻害剤と接触させ；前記信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の不在が、抵抗性表現型を含む前記微生物にある種の抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在することを示し、その信号の存在が、前記微生物にその種の抗菌剤抵抗性のメカニズムが不在であることを示している。
【００９１】
これらの方法のいくつかの実施態様では、抗菌剤の選択は、β-ラクタム、基質特異性拡張型β-ラクタム、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、任意の世代のセファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリドノン、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、フルオロキノロン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、テトラサイクリン、リファムピシン、マイコバクテリア抗生剤、クロラムフェニコール、ムピロシンからなる群からなされる。いくつかの実施態様では、阻害剤は、金属キレート剤またはβ-ラクタマーゼ阻害剤を含んでいる。いくつかの実施態様では、金属キレート剤はEDTAである。いくつかの実施態様では、β-ラクタマーゼ阻害剤はボロン酸である。いくつかの実施態様では、生存細胞レポーターは、発光タンパク質をコードしている遺伝子を含む核酸分子を含んでいる。いくつかの実施態様では、発光タンパク質をコードしている遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は脂肪アルデヒドを含んでいる。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は、メロペネムをベースとした分子によってケージ化された脂肪アルデヒドを含んでいる。いくつかの実施態様では、脂肪アルデヒドはデカナールである。いくつかの実施態様では、脂肪アルデヒドは、カルバペネマーゼと接触するとケージが外れてレポーター分子と相互作用することが可能になり、信号を発生させる。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は、リポソームの中に封止される。
【００９２】
別の一実施態様では、サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在するか不在であるかを求める方法として、注目の微生物を含むサンプルを提供し；前記サンプルを生存細胞レポーターと接触させ；前記サンプルを、ケージ化基質と、そのケージ化基質が微生物の中に入る条件下で接触させ（そのケージ化基質は、抗菌剤抵抗性のメカニズムに関係する酵素活性の存在下で非ケージ化になることができ、その非ケージ化基質は、前記レポーター分子と反応して検出可能な信号を発生させることができる）；その信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の存在が、興味の対象である前記微生物に抗菌剤抵抗性のメカニズムに関係する前記酵素活性が存在することを示し、その信号の不在が、興味の対象である前記微生物に抗菌剤抵抗性のメカニズムに関係するその酵素活性が不在であることを示している方法が提供される。
【００９３】
いくつかの実施態様では、生存細胞レポーターは、レポーター分子をコードしているレポーター核酸分子を含む非複製形質導入粒子（NRTP）を含んでいる。いくつかの実施態様では、上記の方法はさらに、前記サンプルを抗菌剤と接触させて、前記微生物がその抗菌剤に対して抵抗性であるかどうかを明らかにすることを含んでいる。いくつかの実施態様では、前記サンプルを生存細胞レポーターと接触させる前に前記サンプルを抗菌剤と接触させる。いくつかの実施態様では、前記サンプルを抗菌剤と接触させる前に前記サンプルを生存細胞レポーターと接触させる。いくつかの実施態様では、抗菌剤の選択は、β-ラクタム、基質特異性拡張型β-ラクタム、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、任意の世代のセファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリドノン、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、フルオロキノロン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、テトラサイクリン、リファムピシン、マイコバクテリア抗生剤、クロラムフェニコール、ムピロシンからなる群からなされる。いくつかの実施態様では、微生物は、原核生物または真核生物である。いくつかの実施態様では、微生物はグラム陰性細菌である。いくつかの実施態様では、微生物は、ブドウ球菌属の種、腸内細菌科、エンテロコッカス属の種、レンサ球菌属の種、アシネトバクター属の種、シュードモナス属の種、ステノトロフォモナスの種、マイコバクテリウム属の種、カンジダ属のいずれかである。いくつかの実施態様では、興味の対象となる微生物は、少なくとも1種類の抗菌剤に対して抵抗性である。いくつかの実施態様では、生存細胞レポーターは、発光タンパク質をコードしている遺伝子を含む核酸分子を含んでいる。いくつかの実施態様では、発光タンパク質をコードしている遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。いくつかの実施態様では、酵素活性は、β-ラクタマーゼ活性を含んでいる。いくつかの実施態様では、酵素活性は、カルバペネマーゼ活性を含んでいる。いくつかの実施態様では、カルバペネマーゼ活性は、クラスAのカルバペネマーゼ、クラスBのカルバペネマーゼ、クラスDのカルバペネマーゼ、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は、脂肪アルデヒドを含んでいる。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は、メロペネムをベースとした分子によってケージ化された脂肪アルデヒドを含んでいる。いくつかの実施態様では、脂肪アルデヒドはデカナールである。いくつかの実施態様では、脂肪アルデヒドは、カルバペネマーゼと接触するとケージが外れてレポーター分子と相互作用することが可能になり、信号を発生させる。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は、リポソームの中に封止される。いくつかの実施態様では、抗菌剤抵抗性は、カルバペネマーゼに対する抵抗性を含んでいる。いくつかの実施態様では、カルバペネマーゼは、エルタペネムを含んでいる。いくつかの実施態様では、上記の方法はさらに、サンプルを、酵素の活性を低下させることが疑われる阻害剤と接触させ；信号の存在または不在を検出することを含んでいて、前記阻害剤の添加���原因で、前記阻害剤の不在下での信号と比べて信号が低下していることは、注目の微生物の中に抗菌剤抵抗性のメカニズムと関係する前記酵素が存在していて活性であることを示している。いくつかの実施態様では、阻害剤は、金属キレート剤またはβ-ラクタマーゼ阻害剤を含んでいる。いくつかの実施態様では、金属キレート剤はEDTAである。いくつかの実施態様では、β-ラクタマーゼ阻害剤はボロン酸である。
【００９４】
別の一実施態様では、サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在するか不在であるかを求める方法として、注目の微生物を含むサンプルを提供し；前記サンプルをケージ化基質と接触させ（そのケージ化基質は、抗菌剤抵抗性のメカニズムと関係する活性な酵素と接触すると非ケージ化になることができ、その非ケージ化基質は信号を発生させることができる）；前記サンプルを、その酵素を標的としていてその酵素の活性を低下させる阻害剤と接触させ；前記信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の不在または低下が、興味の対象である前記微生物において、抗菌剤抵抗性のメカニズムと関係するその酵素の活性が抑制されていることを示している方法が提供される。
【００９５】
別の一実施態様では、サンプル中に微生物が存在するか不在であるかを検出する方法として、前記サンプルをケージ化基質と接触させ（そのケージ化基質は、前記微生物と関係する酵素活性が原因で非ケージ化になることができ、その非ケージ化基質は信号を発生させることができる）；その信号の存在または不在を検出することを含んでいて、その信号の存在が、前記サンプルに前記微生物が存在することを示し、その信号の不在が、前記サンプルに前記微生物が不在であることを示している方法が提供される。
【００９６】
別の一実施態様では、抗菌剤抵抗性のメカニズムを決定する方法として、腸内細菌科を含むサンプルを提供し；前記サンプルを、ルシフェラーゼをコードしているルシフェラーゼ遺伝子を含む非複製形質導入粒子（NRTP）と接触させ；前記サンプルを、メロペネムをベースとする分子によってケージ化されたデカナール分子と、そのケージ化デカナールが腸内細菌科に入ってカルバペネマーゼの存在下で非ケージ化になる条件下で接触させることを含んでいて、その非ケージ化デカナールは、ルシフェラーゼと反応して検出可能な信号を発生させるため、その検出可能な信号を検出することにより、サンプル中の腸内細菌科にカルバペネマーゼをベースとした抵抗性メカニズムが存在することを確認する方法が提供される。いくつかの実施態様では、この方法はさらに、前記サンプルをボロン酸と接触させることを含んでいて、前記サンプルをボロン酸と接触させた後に検出可能な信号が低下すると、前記サンプル中の腸内細菌科にクラスAのカルバペネマーゼ抵抗性メカニズムが存在することが確認される。いくつかの実施態様では、この方法はさらに、前記サンプルをEDTAと接触させることを含んでいて、前記サンプルをEDTAと接触させた後にその検出可能な信号が低下すると、前記サンプル中の腸内細菌科にクラスBのカルバペネマーゼ抵抗性メカニズムが存在することが確認される。
【００９７】
V．組成物、微生物、キット
【００９８】
1つの側面では、メロペネムのケージが付いたデカナールを含む組成物が提供される。
【００９９】
別の1つの側面では、レポーター分子をコードしているレポーター核酸分子を含む非複製形質導入粒子（NRTP）と、抗菌剤抵抗性のメカニズムと関係する酵素活性の存在下で非ケージ化になることができるケージ化基質を含んでいて、その非ケージ化基質がそのレポーター分子と反応して検出可能な信号を発生させることができる微生物が提供される。いくつかの側面では、この微生物はさらに抗菌剤を含んでいる。いくつかの側面では、この微生物はさらに、抗菌剤抵抗性のメカニズムと関係するその酵素活性の阻害剤を含んでいる。
【０１００】
一実施態様では、インビトロ細胞培養物であって、その細胞培養物の中の複数の細胞が、レポーター分子をコードしているレポーター核酸分子を含む非複製形質導入粒子（NRTP）と；抗菌剤抵抗性のメカニズムに関係する酵素活性の存在下で非ケージ化になることができるケージ化基質を含んでいて、その非ケージ化基質が、そのレポーター分子と反応して検出可能な信号を発生させることができるインビトロ細胞培養物が提供される。いくつかの側面では、その複数の細胞はさらに、抗菌剤を含んでいる。いくつかの側面では、その複数の細胞はさらに、抗菌剤抵抗性のメカニズムに関係するその酵素活性の阻害剤を含んでいる。
【０１０１】
別の一実施態様では、抗菌剤に対する微生物の抗菌剤抵抗性のメカニズムを決定するためのキットであって、1種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、その生存可能性を別のやり方で損なう化合物である抗菌剤と；レポーター分子をコードしているレポーター核酸分子を含む非複製形質導入粒子（NRTP）と；前記微生物の中に入ることができて、前記抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素の存在下で非ケージ化基質になるケージ化基質と（前記非ケージ化基質は前記レポーター分子と反応して検出可能な信号を発生させ、その検出可能な信号の検出により、サンプル中に前記微生物が存在することが確認される）；前記微生物が、前記抗菌剤、前記NRTP、前記ケージ化基質と接触しているとき、前記微生物に関係する生存可能性の検出可能な印の存在または不在に基づいて前記抗菌剤に対する前記微生物の抗菌剤抵抗性のメカニズムを明らかにすることを目的として、前記抗菌剤、前記NRTP、前記ケージ化基質を使用するための指示を備えていて、生存可能性の検出可能な印の存在が、前記微生物が生存していて、前記抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素を前記微生物が発現していることを示し、生存可能性の検出可能な印の不在が、前記微生物が生存していなくて、前記抗菌剤に対する抵抗性のメカニズムに関係する酵素を前記微生物が発現していないことを示すキットが提供される。
【０１０２】
微生物、細胞培養物、キットのいくつかの側面と実施態様では、ケージ化基質は、脂肪アルデヒドを含んでいる。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は、抗菌剤をベースとした分子によってケージ化された脂肪アルデヒドを含んでいる。いくつかの実施態様では、脂肪アルデヒドは、ケージ化基質と反応する酵素と接触すると非ケージ化になり、レポーター分子と相互作用することが可能になって信号を発生させる。特別な実施態様では、酵素はカルバペネマーゼである。いくつかの実施態様では、ケージ化基質は、メロペネムをベースとした分子によってケージ化された脂肪アルデヒドを含んでいる。いくつかの実施態様では、脂肪アルデヒドはデカナールである。いくつかの実施態様では、脂肪アルデヒドは、カルバペネマーゼと接触すると非ケージ化になり、レポーター分子と相互作用することが可能になって信号を発生させる。いくつかの実施態様では、ケージ化基質はリポソームに封止される。いくつかの実施態様では、レポーター核酸分子の選択は、ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子、比色反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子、蛍光タンパク質をコードしている遺伝子、選択可能なマーカーをコードしている遺伝子、アフィニティペプチドをコードしている核酸分子からなる群からなされる。いくつかの実施態様では、レポーター核酸分子は、構成的プロモータに機能可能に連結している。いくつかの実施態様では、レポーター核酸分子の選択は、ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子（luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc）、比色検出を媒介する酵素をコードしている遺伝子（lacZ、HRP）、蛍光タンパク質をコードしている遺伝子（GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry、近赤外蛍光タンパク質）、アフィニティペプチドをコードしている核酸分子（His-タグ、3X-FLAG）、選択可能なマーカーをコードしている遺伝子（ampC, tet(M), CAT, erm）からなる群からなされる。いくつかの実施態様では、ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子は、1種類以上のルシフェラーゼをコードしている遺伝子を含んでいる。いくつかの実施態様では、生存細胞レポーターは、発光タンパク質をコードしている遺伝子を含む核酸分子を含んでいる。いくつかの実施態様では、発光タンパク質をコードしている遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。いくつかの実施態様では、抗菌剤の選択は、β-ラクタム、基質特異性拡張型β-ラクタム、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、任意の世代のセファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリドノン、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、フルオロキノロン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、テトラサイクリン、リファムピシン、マイコバクテリア抗生剤、クロラムフェニコール、ムピロシンからなる群からなされる。いくつかの実施態様では、微生物は、原核生物または真核生物である。いくつかの実施態様では、原核生物はグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌である。いくつかの実施態様では、微生物は、ブドウ球菌属の種、腸内細菌科、エンテロコッカス属の種、レンサ球菌属の種、アシネトバクター属の種、シュードモナス属の種、ステノトロフォモナスの種、マイコバクテリウム属の種、カンジダ属のいずれかである。いくつかの実施態様では、抗菌剤抵抗性のメカニズムは、β-ラクタマーゼ活性またはカルバペネマーゼ活性を含んでいる。いくつかの実施態様では、カルバペネマーゼ活性は、クラスAのカルバペネマーゼ、クラスBのカルバペネマーゼ、クラスDのカルバペネマーゼ、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施態様では、抗菌剤抵抗性は、カルバペネマーゼに対する抵抗性を含んでいる。
【実施例】
【０１０３】
実施例1：EDTA阻害剤を通じたNDM-1の検出
【０１０４】
カルバペネム非感受性は、カルバペネマーゼ酵素によってと、非カルバペネマーゼβ-ラクタマーゼ酵素の過剰発現やポリン突然変異などの他のメカニズムによって付与することができる。カルバペネマーゼは、A、B、Dを含むクラスに由来する。クラスAのカルバペネマーゼは、KPC（肺炎桿菌のカルバペネマーゼ）遺伝子によってコードされるカルバペネマーゼを含み、β-ラクタマーゼ阻害剤による抑制に対して感受性がある。クラスBのカルバペネマーゼは、IMP型（メタロ-β-ラクタマーゼ）遺伝子、ニューデリーメタロ-β-ラクタマーゼ（NDM-1）遺伝子、VIM（ヴェローナインテグロンによってコードされるメタロ-β-ラクタマーゼ）遺伝子を含み、機能するのにイオン性金属を必要とする。クラスDのカルバペネマーゼは、OXA（オキサシリアーゼ）遺伝子によってコードされるカルバペネマーゼを含み、β-ラクタマーゼ阻害剤による抑制に対する感受性がない。NDM-1検出アッセイを、腸内細菌科に特異的なルシフェラーゼ発現非複製形質導入粒子（WO 2014/160418、実施例1に記載）と、エルタペネムと、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いて作製する。
【０１０５】
NDM-1を発現する大腸菌の臨床単離物の培養物をLB培地の中に調製し、それを用いて、エルタペネム、EDTA、亜鉛の存在下におけるNRTPレポーターの応答を求めた。このアッセイは、OD600が0.02である50μlの細胞培養物を、マイクロウエルプレート内に調製した50μlのLB培地と100μlのNRTP試薬に混合することによって調製した。このアッセイを37℃で2時間インキュベートした。そのときの条件は、（1）添加剤なし、（2）0.25μg/mlのエルタペネムの添加、（3）750μg/mlのエルタペネムとEDTAの添加、（4）70μg/mlのエルタペネムと硫酸亜鉛の添加である。インキュベーションの後、Molecular Devices SpectraMax Lルミノメータを用い、生存細胞レポーターのための基質としてのノナナール試薬を注入してからサンプルでルミネセンスを調べた。
【０１０６】
次に、図2に示したように、ルミネセンス読み取り値をサンプル（1）から発生したルミネセンスで規格化し、サンプル（1）に対する割合としてプロットした。
【０１０７】
図2に示した結果から、NDM-1を発現する大腸菌はエルタペネムに対して非感受性であったことがわかる。なぜならルミネセンス信号はエルタペネムの存在下で有意に低下しなかったからである。信号は、EDTAの存在下で有意に低下した。これは、エルタペネム非感受性表現型（すなわちNDM-1）に関与するメカニズムがキレート剤の存在下で抑制されたことを示している。逆に、亜鉛をアッセイに添加すると、信号は有意に増加した。このことも、エルタペネム非感受性表現型の付与におけるNDM-1の役割を示している。
【０１０８】
実施例2：ボロン酸阻害剤を通じたKPCの検出
【０１０９】
本発明の別の一実施態様では、WO 2014/160418、実施例1に記載されているような腸内細菌科に対して特異的なルシフェラーゼ発現非複製形質導入粒子と、エルタペネムと、β-ラクタマーゼ阻害剤であるボロン酸とを用いてKPC検出アッセイを作製する。
【０１１０】
KPCを発現する大腸菌の臨床単離物の培養物をLB培地の中に調製し、それを用いて、エルタペネムとボロン酸の存在下におけるNRTPレポーターの応答を求めた。OD600が0.02である50μlの細胞培養物を, マイクロウエルプレート内に調製した50μlのLB培地と100μlのNRTP試薬に混合することによってアッセイの複製を用意した。このアッセイを37℃で2時間インキュベートした。そのときの条件は、（1）添加剤なし、（2）1μg/mlのエルタペネムの添加、（3）400μg/mlのエルタペネムとフェニルボロン酸の添加である。インキュベーションの後、Molecular Devices SpectraMax Lルミノメータを用い、生存細胞レポーターのための基質としてのノナナール試薬を注入してからサンプルでルミネセンスを調べた。
【０１１１】
次に、図3に示したように、ルミネセンスの読み取り値をサンプル（1）から生じた読み取り値で規格化し、サンプル（1）に対する平均％としてプロットした。
【０１１２】
図3に示した結果から、KPCを発現する大腸菌はエルタペネムに対して非感受性であったことがわかる。なぜならルミネセンス信号はエルタペネムの存在下で有意に低下せず、実際に平均信号はエルタペネムなしの場合よりも大きかったからである。信号は、ボロン酸の存在下で有意に低下した。これは、エルタペネム非感受性表現型（すなわちKPC）に関与するメカニズムがβ-ラクタマーゼ阻害剤の存在下で抑制されたことを示している。
【０１１３】
実施例3：カルバペネム感受性メカニズムの明確化
【０１１４】
（抗菌剤感受性表現型を決定するため）、腸内細菌科に対して特異的な細菌ルシフェラーゼ発現非複製形質導入粒子（NRTP）と、カルバペネマーゼ酵素によってケージを外すことができるケージ化ルシフェラーゼ基質とに基づき、カルバペネム感受性検出系を作製した。
【０１１５】
細菌ルシフェラーゼのルミネセンス反応は、細菌ルシフェラーゼ酵素LuxABと、還元されたフラビンモノヌクレオチドFMNH2と、脂肪アルデヒド（例えばデカナール）と、分子酸素を必要とする（図4）。この反応では、ルシフェラーゼ酵素が最初にFMNH2に結合し、FMNH2と分子酸素の間の反応を媒介する。次に、脂肪アルデヒド（例えばデカナール）がこの複合体と反応してFMNH2とデカナールの両方を酸化させる結果、フォトンが放出される。
【０１１６】
脂肪アルデヒド（例えばデカナール）は、ある分子（例えばメロペネムをベースとした分子）と連結させることによってケージ化することができる。脂肪アルデヒドは、ケージ化すると、ルミネセンス反応を媒介することができない。アルデヒドは、ケージが外れると、ルミネセンス反応を媒介することができる。ケージ化脂肪アルデヒドは、ケージ要素を加水分解する酵素の存在下で非ケージ化になる設計にすることができる。
【０１１７】
生存細胞の中にあって、（WO 2014/160418、段落196〜203に記載されている）1つ以上の標的脂肪内酵素によってケージ化分子のケージを外すことを媒介する少なくとも1つの細胞内酵素の存在を検出するため、レポーター系を設計する。要するに、レポーター分子発現核酸（例えばベクター）を、非複製形質導入粒子（NRTP）とともに標的細胞に送達することができる。本明細書では、レポーター分子発現核酸はNRTPを通じて標的細胞に侵入することができるため、レポーター分子遺伝子を標的細胞に送達すると、レポーター分子をレポーター分子遺伝子から発現させることができる。ケージ化基質も標的細胞に添加すると、ケージ化基質は標的細胞に侵入することができる。標的細胞内酵素が標的細胞の中に存在している場合には、その酵素はケージ化基質のケージ要素を除去することができるため、非ケージ化基質が生成する。するとその非ケージ化基質は細胞内のレポーター分子と反応することができ、この反応の生成物が検出可能な信号となる。本明細書では、標的細胞は、真核細胞と原核細胞という標的と、関係する酵素（例えば黄色ブドウ球菌のβ-ラクタマーゼが含まれる）を含むことができる。組み換えDNAを含むレポーター分子発現核酸の送達は、非微生物系または微生物系によって実現することができる。そのような系には、リポソーム、ウイルス様粒子、ファージまたはウイルスに由来する形質導入粒子、接合が含まれるが、これらに限定されない。さらに、Daniel Sobel, J.R.、『ケージ化基質を有する酵素検出系』、2007年、Zymera社に記載されているようなさまざまなレポーター分子とケージ化基質を用いることができる。いくつかの側面では、レポーター分子発現ベクターはNRTPによって運搬することができるため、そのベクターを細菌細胞の中に送達することが可能である。発現させるレポーター分子としてウミシイタケのルシフェラーゼが可能であり、ケージ化基質としてケージ化ウミシイタケのルシフェリンが可能であるため、標的細胞に内在するβ-ラクタマーゼ酵素が、ケージ化ルシフェリンからのケージ化合物を開裂させて、非ケージ化ルシフェリンを放出させることができる。このように、β-ラクタマーゼを含む標的細胞をNRTPとケージ化ルシフェリンに曝露するとき、その細胞は、その細胞の中にβ-ラクタマーゼが存在することを示すルミネセンス信号を示すであろう。
【０１１８】
細菌ルシフェラーゼを発現する細胞の中に標的酵素が存在していて、その細胞を含むサンプルにケージ化脂肪アルデヒドを適用する場合、その酵素はその脂肪酸のケージを外すことができるため、ルミネセンス反応が起こることが可能になり、検出可能なルミネセンス信号が発生する。標的酵素が細胞内に存在していない場合、この系は検出可能な信号を発生させない。
【０１１９】
ここで、細胞内にカルバペネマーゼが存在することを検出するためのレポーター系を開発する。デカナールは、メロペネムをベースとした分子によってケージ化分子にされ、カルバペネマーゼ-ケージ化デカナールとなる。メロペネムのデシルアセタール（すなわちカルバペネム-ケージ化デカナール）約100〜200 mgを、図5に示したスキームによって合成した。1-β-メチル基のないメロペネムのデシルアセタールを合成する別のメカニズムは図6に示したようにして実施する。
【０１２０】
カルバペネマーゼの存在を検出するため、（WO 2014/160418、実施例1に記載されているようにして）ルシフェラーゼレポーター系を含む腸内細菌科をベースとしたNRTPを作製する。NRTPとカルバペネム-ケージ化デカナールを、カルバペネマーゼを発現する腸内細菌科を含むことが疑われるサンプルに添加する。腸内細菌科がサンプルの中に存在している場合には、レポーター系は細胞内で細菌ルシフェラーゼの発現を引き起こす。その細胞がカルバペネマーゼも発現する場合には、カルバペネマーゼがデカナール分子のケージを外すことで、発現された細菌ルシフェラーゼを通じてルミネセンス反応を媒介することが可能になり、検出可能なルミネセンス信号が発生する。その細胞がカルバペネマーゼを含んでいない場合、系は検出可能な信号が発生させない。このようにして、系は腸内細菌科細胞の中のカルバペネマーゼの存在を知らせることができる。腸内細菌科がカルバペネムに対して感受性であるか非感受性であるかを決定するため、レポーターアッセイをカルバペネムとの組み合わせでも実施する。この系はさらに、カルバペネム感受性に関与するメカニズムを明らかにするのに用いられる。このアッセイでは、レポーターアッセイを実施して腸内細菌科が存在しているかどうかを明らかにする。微生物がカルバペネムに対して非感受性であるかどうかを決定するため、レポーターアッセイをカルバペネムとの組み合わせでも実施する。微生物がカルバペネマーゼを発現するかどうかを決定するため、カルバペネム-ケージ化基質も用いてレポーターアッセイを実施する。
【０１２１】
上記のレポーターアッセイにより、標的微生物が存在していて、カルバペネムに対して非感受性であることが判明した場合、そのレポーターアッセイをさまざまな試薬と組み合わせて再度実施する。このアッセイをカルバペネムおよびβ-ラクタマーゼ阻害剤（例えばボロン酸）を用いて実施し、非感受性微生物がβ-ラクタマーゼ阻害剤の存在下で感受性になるかどうかを調べる。レポーターアッセイをカルバペネムとキレート剤（例えばEDTA）を用いて実施し、非感受性微生物が金属の不在下で感受性になるかどうかも調べる。
【０１２２】
表2に、このアッセイで生じた結果を示してある。この表では、「×」は、レポーターアッセイがプラスの結果を生じさせたことを示す。サンプル1は標的微生物を含んでいない。サンプル2は、カルバペネムに対して感受性のある標的微生物を含んでいて、カルバペネマーゼを発現しない。サンプル3は標的微生物を含んでいて、カルバペネムに対する感受性がなく、β-ラクタマーゼ阻害剤が非感受性の結果を抑制し、キレート剤は非感受性の結果を抑制せず、微生物はカルバペネマーゼを発現している。これらの結果に基づくと、微生物はクラスAのカルバペネマーゼを発現している可能性が大きい。サンプル4は標的微生物を含んでいて、カルバペネムに対して非感受性であり、β-ラクタマーゼ阻害剤は非感受性の結果を抑制せず、キレート剤は非感受性の結果を抑制せず、微生物はカルバペネマーゼを発現している。これらの結果に基づくと、この微生物はクラスBのカルバペネマーゼを発現している可能性が大きい。サンプル5は標的微生物を含んでいて、カルバペネムに対して非感受性であり、β-ラクタマーゼ阻害剤は非感受性の結果を抑制せず、キレート剤は非感受性の結果を抑制せず、微生物はカルバペネマーゼを発現している。これらの結果に基づくと、この微生物はクラスDのカルバペネマーゼ、または複数のカルバペネマーゼ（例えばクラスDとクラスAまたはクラスB、またはクラスAとクラスB）を発現している可能性がある。サンプル6は標的微生物を含んでいて、カルバペネムに対して非感受性であり、β-ラクタマーゼ阻害剤は非感受性の結果を抑制せず、キレート剤は非感受性の結果を抑制せず、微生物はカルバペネマーゼを発現していない。これらの結果に基づくと、この微生物の非感受性表現型は、AmpC過剰発現やポリン突然変異などのメカニズムに起因する可能性がある。サンプル7は標的微生物を含んでいて、カルバペネムに対して感受性であり、カルバペネマーゼを発現している。これらの結果に基づくと、この微生物は、カルバペネム感受性でカルバペネマーゼを発現する微生物である。上記のアッセイを利用して、いくつかのサンプル1〜7の腸内細菌科のカルバペネム感受性表現型を明らかにした。
【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
追加の試験は、AmpCを媒介とする非感受性の阻害剤としてのクロキサシリンの添加を含んでいる。この場合、クロキサシリンの添加により、カルバペネマーゼが原因でサンプル6が非感受性の結果になったのではないことを確認できる。なぜならクロキサシリンの添加が、カルバペネムを添加した場合の非感受性の結果をサンプル6に示させると考えられるからである。
【０１２５】
実施例4：カルバペネム感受性の試験と抵抗性メカニズム明確化のための、新規な系に基づく分子診断
【０１２６】
背景：グラム陰性細菌におけるカルバペネム抵抗性が臨床で深刻な問題となってきているが、診断と治療の選択肢は限られている。新規な抗菌剤、例えば最近承認されたアビカズ（Actavis社）と、開発中のレレバクタム（Merck社）ならびにカルババンス（The Medicines Company社）は、クラスAのカルバペネマーゼ（例えばKPC）に対する活性を示しているが、クラスBのカルバペネマーゼ（例えばNDM-1）に対する活性は示していない。したがって、生きているグラム陰性細菌を迅速に検出し、カルバペネムに対する感受性を明らかにし、カルバペネム抵抗性メカニズムを識別する能力があれば、将来、医師がそのような治療の選択肢を検討する助けになる可能性がある。われわれはSmarticles（登録商標）技術を開発した。これは、本明細書の例えば少なくとも実施例1〜4と、詳細な説明の全体を通じて記載してあるように、臨床サンプルから検出して感受性を直接調べるための生存細胞ルミネセンスアッセイである。本研究では、Smarticles（登録商標）アッセイがカルバペネム抵抗性大腸菌を検出し、NDM-1発現微生物とKPC発現微生物を識別する能力を評価した。
【０１２７】
方法：大腸菌、クレブシエラ属の種、エンテロバクター属の種、シトロバクター属の種、プロテウス属の種、セラチア（霊菌）の26個の単離体を、Smarticles（登録商標）アッセイとエルタペネムディスク拡散を用いて評価した。CRE単離体は、blaKPCとblaNDM-1を発現する微生物を含んでいた。Smarticles（登録商標）アッセイを用い、キレート剤であるエデト酸（EDTA）とβ-ラクタマーゼ阻害剤であるボロン酸を添加して、NDM-1とKPCを発現している大腸菌の臨床単離体を詳細に調べた。
【０１２８】
結果：Smarticles（登録商標）アッセイは、エルタペネム感受性の腸内細菌科とエルタペネム非感受性の腸内細菌科を2時間で識別する能力を持つことが証明された。Smarticles（登録商標）アッセイは、EDTAの存在下でNDM-1発現大腸菌とKPC発現大腸菌を識別することもできる。アッセイ信号は、NDM-1発現大腸菌において抑制されたが、KPC発現大腸菌では抑制されなかった。ボロン酸の存在下では、アッセイ信号はKPC発現大腸菌で抑制され、NDM-1発現大腸菌では抑制されなかった。
【０１２９】
結論：Smarticles（登録商標）アッセイがカルバペネマーゼ抵抗性細菌を検出し、カルバペネマーゼ抵抗性のメカニズムを識別する性能は、標的とする一群の抵抗性メカニズムに対して活性を持つことが示された新規な抗生剤を治療で用いる際のガイドとして役立つ可能性がある。
【０１３０】
本発明を好ましい実施態様とさまざまな別の実施態様を参照して特に示して説明してきたが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、形と詳細をさまざまに変更できることが当業者には理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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