(57)【要約】  本発明は、哺乳動物における呼吸器感作を誘導することができる薬剤を特定する方法、ならびにかかる方法で使用するためのアレイ及び診断キットに関する。具体的には、本方法は、試験薬に曝露される細胞における、表Ａ（ｉ）、表Ａ（ｉｉ）、及び／または表Ａ（ｉｉｉ）に列記されるバイオマーカーの発現量の測定を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における呼吸器感作を誘導することができる薬剤を特定する方法であって、
ａ）樹状細胞のある集団または樹状様細胞のある集団を試験薬に曝露するステップと、
ｂ）前記細胞において、表Ａ（ｉ）及び／または表Ａ（ｉｉ）に定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現量を測定するステップと、を含むか、またはそれからなり、
ステップ（ｂ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記細胞における発現量が、前記試験薬の呼吸器感作効果を示す、前記方法。
【請求項２】
ｃ）前記樹状細胞または前記樹状様細胞の別個の集団を、哺乳動物において呼吸器感作物質ではない１つ以上の陰性対照薬に曝露することと、
ｄ）前記細胞において、ステップ（ｂ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの発現量を測定することと、をさらに含み、
ステップ（ｄ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記試験試料中の存在及び／または量が、ステップ（ｂ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記対照試料中の存在及び／または量とは異なる場合に、前記試験薬が呼吸器感作物質と特定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｅ）前記樹状細胞または前記樹状様細胞の別個の集団を、哺乳動物において呼吸器感作物質である１つ以上の陽性対照薬に曝露することと、
ｆ）前記細胞において、ステップ（ｂ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの発現量を測定することと、をさらに含み、
ステップ（ｆ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記試験試料中の存在及び／または量が、ステップ（ｂ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記陽性対照試料中の存在及び／または量に相当する場合に、前記試験薬が呼吸器感作物質と特定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、表Ａ（ｉｉ）に定義される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表１Ａに定義されるバイオマーカーのうちの少なくとも２つまたは３つの発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）が、ＴＮＦＲＳＦ１９の発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）が、ＳＮＯＲＡ７４Ａの発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、ＳＰＡＭ１の発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）が、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＳＮＯＲＡ７４Ａ、及びＳＰＡＭ１の発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）が、ステップ（ｂ）で、表Ａ（ｉｉ）に定義される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉ）に定義されるバイオマーカーのうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、または３４２個の発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）が、表Ａ（ｉｉ）に定義されるバイオマーカーのすべての発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）が、表Ａ（ｉｉｉ）に定義されるバイオマーカーのうちの１つ以上、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に定義されるバイオマーカーのうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４個の発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）が、表Ａ（ｉｉｉ）に定義されるバイオマーカーのすべての発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）が、表Ａに定義されるバイオマーカーのすべての発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）が、前記１つ以上のバイオマーカーをコードする核酸分子の発現量を測定することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子が、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡ分子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸分子が、ｃＤＮＡ分子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）での前記１つ以上のバイオマーカーの発現量の測定が、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィー、及びインサイツハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を使用して行われる、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）での前記１つ以上のバイオマーカーの発現量の測定が、ＤＮＡマイクロアレイを使用して決定される、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）での前記１つ以上のバイオマーカーの発現量の測定が、１つ以上の結合部分を使用して行われ、前記１つ以上の結合部分の各々が、表Ａに特定されるバイオマーカーのうちの１つをコードする核酸分子に選択的に結合することができる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の結合部分が各々、核酸分子を含むか、またはそれからなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の結合部分が各々、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＰＭＯを含むか、またはそれからなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の結合部分が各々、ＤＮＡを含むか、またはそれからなる、請求項２０または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上の結合部分が、５〜１００ヌクレオチド長である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ以上の核酸分子が、１５〜３５ヌクレオチド長である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記結合部分が、検出可能な部分を含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分（例えば、放射性原子）、または酵素部分からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出可能な部分が、放射性原子を含むか、またはそれからなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記放射性原子が、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、三重水素、レニウム−１８６、レニウム−１８８、及びイットリウム−９０からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記結合部分の前記検出可能な部分が、蛍光部分である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）が、ステップ（ｂ）に定義される前記１つ以上のバイオマーカーのタンパク質の発現量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）での前記１つ以上のバイオマーカーの発現量の測定が、各々表Ａに特定されるバイオマーカーのうちの１つに選択的に結合することができる１つ以上の結合部分を使用して行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上の結合部分が、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはそれからなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体またはその断片が、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体または前記抗原結合断片が、インタクトな抗体、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ）２断片）、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン）、ならびにドメイン抗体（ｄＡｂ、単一形式及び二重形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群から選択される、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体または前記抗原結合断片が、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上の結合部分が、抗体様結合剤、例えば、アフィボディまたはアプタマーを含むか、またはそれからなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上の結合部分が、検出可能な部分を含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、及び酵素部分からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｂ）が、アレイを使用して行われる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記アレイが、ビーズベースのアレイである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アレイが、表面ベースのアレイである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アレイが、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択される、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法で使用するためのアレイであって、請求項２０〜３０及び３２〜３９のいずれか一項に定義される１つ以上の第１の結合剤を含む、前記アレイ。
【請求項４５】
表１に定義されるバイオマーカーのすべてに集合的に結合することができる結合剤を含む、請求項４４に記載のアレイ。
【請求項４６】
前記第１の結合剤が固定化される、請求項４４または４５に記載のアレイ。
【請求項４７】
呼吸器過敏性応答を誘導することができる薬剤を特定するための、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記過敏性応答が、体液性過敏性応答である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記過敏性応答が、Ｉ型過敏性応答である、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
呼吸器アレルギーを誘導することができる薬剤を特定するための、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記樹状細胞集団または前記樹状様細胞集団が、樹状様細胞集団である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記樹状様細胞が、骨髄樹状様細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記骨髄樹状様細胞が、骨髄樹状細胞に由来する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
骨髄樹状細胞に由来する前記細胞が、骨髄性白血病由来の細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記骨髄性白血病由来の細胞が、ＫＧ−１、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、ＨＬ−６０、Ｍｏｎｏｍａｃ−６、ＡＭＬ−１９３、及びＭＵＴＺ−３からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記樹状様細胞が、ＭＵＴＺ−３細胞である、請求項１〜４３及び４７〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ステップ（ｃ）で提供される前記１つ以上の陰性対照薬が、１−ブタノール、２−アミノフェノール、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ニトロ−１，４−フェニレンジアミン、４−アミノ安息香酸、クロロベンゼン、ジメチルホルムアミド、エチルバニリン、ホルムアルデヒド、ゲラニオール、ヘキシルシンナムアルデヒド、イソプロパノール、カトンＣＧ＊、サリチル酸メチル、ペニシリンＧ、プロピレングリコール、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム、Ｔｗｅｅｎ  ８０、及び硫酸亜鉛からなる群から選択される、請求項２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも２つの対照非感作薬、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または少なくとも２０個の対照非感作薬が提供される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ステップ（ｅ）で提供される前記１つ以上の陽性対照薬が、ヘキサクロロ白金酸アンモニウム、過硫酸アンモニウム、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、無水マレイン酸、メチレンジフェノールジイソシアネート、無水フタル酸、トルエンジイソシアネート、及び無水トリメリット酸からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含むか、またはそれからなる、請求項３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも２つの対照感作薬、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または少なくとも１０個の対照感作薬が提供される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記方法が、試験される前記試料の感作効力を示す、請求項１〜４４及び４７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１〜４４及び４７〜６１のいずれか一項に記載の方法で使用するためのアレイであって、請求項２０〜３０及び３２〜３９のいずれか一項に定義される１つ以上の結合部分を含む、前記アレイ。
【請求項６３】
前記結合部分が、表Ａ（ｉ）に定義されるバイオマーカーのすべてに結合することができる、請求項６２に記載のアレイ。
【請求項６４】
前記結合部分が、表Ａ（ｉｉ）に定義されるバイオマーカーのすべてに結合することができる、請求項６２または６３に記載のアレイ。
【請求項６５】
前記結合部分が、表Ａ（ｉｉｉ）に定義されるバイオマーカーのすべてに結合することができる、請求項６２、６３、または６４に記載のアレイ。
【請求項６６】
前記結合部分が、表Ａに定義されるバイオマーカーのすべてに結合することができる、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項６７】
前記結合部分が固定化される、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項６８】
呼吸器過敏性応答感作薬を特定するための、表Ａに定義される群から選択される２つ以上のバイオマーカーの併用。
【請求項６９】
表Ａに定義されるバイオマーカーのすべてが、過敏性応答感作薬を特定するために集合的に使用される、請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
呼吸器過敏性応答感作薬を特定するための、請求項２０〜３０または３２〜３９のいずれか一項に定義される１つ以上の結合部分の使用。
【請求項７１】
表Ａに定義されるバイオマーカーのすべてが、過敏性応答感作薬を特定するために集合的に使用される、請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法で使用するための分析キットであって、
Ａ）請求項６２〜６７のいずれか一項に記載のアレイ及び／または請求項２０〜３０もしくは３２〜３９のいずれか一項に定義される１つ以上の結合部分と、
Ｂ）任意に、請求項１〜６０のいずれか一項に定義される方法を行うための指示と、を含む、前記キット。
【請求項７３】
１つ以上の対照試料をさらに含む、請求項７２に記載の分析キット。
【請求項７４】
１つ以上の非感作薬を含む、請求項７３に記載の分析キット。
【請求項７５】
１つ以上の感作薬を含む、請求項７２、７３、または７４に記載の分析キット。
【請求項７６】
患者における呼吸器Ｉ型過敏性反応（呼吸器喘息等）を治療または予防する方法であって、
（ａ）前記患者が曝露されるか、または曝露されている１つ以上の試験薬を提供するステップと、
（ｂ）本発明の第１の態様に提供される方法を使用して、ステップ（ａ）で提供された前記１つ以上の試験薬が呼吸器感作物質であるかを決定するステップと、
（ｃ）１つ以上の試験薬が呼吸器感作物質と特定された場合、前記患者の、呼吸器感作物質と特定された前記１つ以上の試験薬への曝露を低減もしくは予防し、かつ／または感作症状に適切な治療を提供するステップと、を含む、前記方法。
【請求項７７】
感作症状の前記治療が、短時間作用型ベータ２−アドレナリン受容体作動薬（ＳＡＢＡ）（サルブタモール等）、抗コリン薬（臭化イプラトロピウム等）、他のアドレナリン作動薬（吸入エピネフリン等）、コルチコステロイド（ベクロメタゾン等）、長時間作用型ベータ−アドレナリン受容体作動薬（ＬＡＢＡ）（サルメテロール及びフォルモテロール等）、ロイコトリエン拮抗薬（モンテルカスト及びザフィルルカスト等）、ならびに／またはマスト細胞安定剤（クロモリンナトリウム等）からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
本発明の第１の態様に定義される方法を行うためのコンピュータプログラム。
【請求項７９】
前記コンピュータプログラムが、コンピュータ可読担体に記録される、請求項７８に記載のコンピュータプログラム。
【請求項８０】
本明細書に実質的に記載される方法または使用。
【請求項８１】
本明細書に実質的に記載されるアレイ、キット、またはコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器感作を誘導することができる薬剤を特定するための方法、ならびにかかる方法で使用するためのアレイ及び分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器感作は、環境タンパク質またはある特定の低分子量（ＬＭＷ）化学化合物に対する免疫応答によって引き起こされる上部呼吸管及び下部呼吸管のアレルギー性Ｉ型過敏性反応である。喘鳴、気管支収縮、及び喘息発作等の呼吸器感作の臨床症状は、同じ化合物への繰り返しの曝露時に影響を受けやすい以前に感作されている個体に発症する［１］。機構的に、呼吸器感作は、ＣＤ４＋Ｔｈ２細胞の活性化により開始され、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の産生の増加によるＢリンパ球の分化により媒介される［１〜３］。
【０００３】
呼吸器アレルギーが一般にタンパク質アレルゲンによって誘導される一方で、ＬＭＷ化学化合物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔｈ１細胞を伴うＩＶ型過敏性反応の誘導、ならびにアレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）等の皮膚状態の発病に主に関連している。しかしながら、ある特定のクラスのＬＭＷ化学化合物、例えば、ジイソシアネート［４］、無水酸［５］、白金塩［６］、反応染料［７］、及びクロラミンＴ［８］は、呼吸管を感作させる場合もある。これらのＬＭＷ化学化合物への曝露は、一般に職業環境に限定されており、長期間の曝露の繰り返しにより、最終的には職業性喘息（ＯＡ）の発症という結果になり得る［３、９］。接触皮膚炎を引き起こすものと比較して、より少ない数の化学物質しか呼吸器アレルギーを引き起こすものとして知られていない（１００未満の物質しか知られていない）［１０］が、健康への影響は、依然として悲惨的であり得る。例えば、後天性ＯＡにより、慢性炎症、気道過応答性［１１］、大規模な気道リモデリング［１２］がもたらされ、それ故に、罹患した個体の生活の質に重大な影響を及ぼし得る。ＯＡに関連した重大な健康への影響、ならびに作業環境への新たな化合物（例えば、清浄剤及び健康管理製品［９、１３〜１５］）の導入により、潜在的な呼吸器感作物質の危険分類のための正確かつ信頼できる試験戦略の必要性が強調されている。したがって、これらの化合物の積極的な特定及び特徴付けは、依然として非常に重要な分野である。
【０００４】
しかしながら、この点における課題は、呼吸器感作を誘導する化学物質のリスクを評価するための方法が十分に開発されていないことである［１６］。現在のアプローチは、インビボ試験戦略もインビトロ試験戦略もいずれも必要とする。最近まで、本分野は、動物ベースのインビボモデルに依存していた。これらの動物ベースのアプローチのうち、モルモット試験［１７］、マウスＩｇＥ試験［１８、１９］、ラットＩｇＥ試験［２０、２１］、及びマウスサイトカインフィンガープリンティング［２２、２３］が、最も注目を集めている。加えて、呼吸器感作物質を皮膚感作物質と区別するために、いくつかの化学的に誘導された喘息のマウスモデルについて、文献に記載されている［２４、２５］。これらのアプローチが現在の呼吸器感作の発症に関連した免疫生物学的機構及び細胞過程の理解に明らかに貢献しているが、これらの方法のいずれも規制目的で日常的なアッセイとして使用するのに十分に信頼できるものと証明されていない。さらに、スクリーニング手段としての動物ベースの方法の使用に関連したかなりの経済的及び倫理的欠点が存在する。
【０００５】
したがって、Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ２０１／６３／ＥＵに述べられている動物実験の減少、改良、及び代用という３大Ｒの原理と相関する呼吸管感作のための細胞ベースのインビトロアッセイの開発に相当な努力がなされている［２６］。最近の細胞ベースのアプローチは、感作過程の異なる段階のモデルとして、樹状細胞株ＴＨＰ−１［２７］ならびに上皮細胞株ＢＥＡＳ−２Ｂ［２８］及びＡ５４９等の単一細胞株の使用を必要としている［２９］。呼吸器感作物質への曝露のインビボ経路を模倣するより高度な試みも、ヒト気道上皮の三次元細胞モデルとしてＥｐｉｔｈｅｌｉｘによって開発された市販のＭｕｃｉｌＡｉｒ（商標）を使用して行われている［３０］。加えて、化学反応性に基づく非細胞ベースのインシリコ予測モデルが呼吸器感作において探索されている［３１］。
【０００６】
呼吸器感作アッセイの欠如とは対照的に、文献は、皮膚感作化学物質の特定のためのいくつかの予測モデル（［３４］に概説されている）について記載しており、動物ベースの局所リンパ節アッセイ（ＬＬＮＡ）［３５］が歴史的に好ましい方法である。いくつかのインビトロモデルは、ヒト細胞株活性化試験（ｈ−ＣＬＡＴ）［３６、３７］、直接ペプチド活性化試験（ＤＲＰＡ）［３８］、及びＫｅｒａｔｉｎｏＳｅｎｓ（登録商標）試験等の皮膚感作の終点についても記載されている［３９、４０］。近年、我々は、これらの方法に代わる正確な代替物として、社内で開発されたゲノムアレルゲン迅速検出（ＧＡＲＤ）［４１、４２］インビトロアッセイも公開した。ＧＡＲＤアッセイは、トランスクリプトーム規模でのＤＮＡマイクロアレイ技術を使用したヒト骨髄細胞株ＭＵＴＺ−３［４３〜４５］中の２００個の遺伝子を含むゲノムバイオマーカーシグネチャー（ＧＡＲＤ予測シグネチャーまたはＧＰＳ）の転写レベルの測定に基づく。２６個の盲検化合物及び１１個の非盲検化合物を含むコホートを使用して、予測性能の観点でのＧＡＲＤアッセイの機能性を最近の研究で評価した。このアッセイの精度は８９％［４６］と推定され、ＬＬＮＡの場合の７２％［４７］と比較することができる。ＬＬＮＡ等の皮膚感作アッセイが呼吸器感作物質を分類するためにも適用されることが提案されているため、皮膚感作モデルは興味深いものである［４８、４９］。ＬＬＮＡアッセイにおける終点は、マウスの試験化学物質への局所曝露時の排出リンパ節で測定された誘発された増殖応答である［５０、５１］。しかしながら、この増殖応答は、呼吸器感作物質及び皮膚感作物質の両方によって誘導される。その結果として、感作物質を非感作物質と層別するためにＬＬＮＡが使用され得る一方で、ＬＬＮＡは、皮膚感作物質と呼吸器感作物質を正確に区別することができない［１］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、呼吸器感作物質を明確に特定するための正確かつ信頼できるインビトロアッセイの確立が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、動物試験に代わる新規の代替物としての、ゲノムバイオマーカーシグネチャーに基づく呼吸器感作物質の評価のための細胞ベースの試験戦略に関する。我々は、細胞の完全なトランスクリプトームの分析によってもたらされる多用途性を大いに利用し、ＧＡＲＤアッセイの概念を拡大適用して、ＧＡＲＤ呼吸器予測シグネチャー（ＧＲＰＳ）と呼ばれる別個のゲノムバイオマーカーシグネチャーの特定による呼吸器感作物質の予測を含んだ。その使用により、呼吸器感作物質を分類することができる。特定されたバイオマーカーシグネチャーの目的とする用途は、皮膚感作化学物質の分類のためにＧＰＳと併用される。それ故に、ＧＡＲＤ概念は、未知の化学物質の皮膚吸器感作特性及び呼吸器感作特性の両方のリスク評価及び危険分類のために同時に使用され得る試験プラットフォームの極めてまれな機会を示す。
【０００９】
したがって、本発明の第１の態様は、哺乳動物における呼吸器感作を誘導することができる薬剤を特定するための方法であって、
ａ）樹状細胞のある集団または樹状様細胞のある集団を試験薬に曝露するステップと、
ｂ）それらの細胞において、表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現量を測定するステップと、を含むか、またはそれからなり、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーのそれらの細胞における発現量が、試験薬の呼吸器感作効果を示す、方法を提供する。
【００１０】
「試験薬の呼吸器感作効果を示す」とは、その試験薬が呼吸器感作物質であるか否かを決定し、かつ／またはその試験薬の呼吸器感作物質としての効力を決定することを含む。
【００１１】
「呼吸器感作を誘導することができる薬剤」とは、哺乳動物の呼吸管におけるＩ型即時型過敏性反応を誘導及び誘発することができる任意の薬剤を含む。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。好ましくは、Ｉ型即時型過敏性反応は、ＤＣ媒介型であり、かつ／またはＴ細胞のＴｈ２細胞への分化を伴う。好ましくは、Ｉ型即時型過敏性反応は、体液性免疫及び／または呼吸器アレルギーをもたらす。
【００１２】
哺乳類肺の誘導区域は、気管、気管支、細気管支、及び終末細気管支を含む。呼吸器区域は、呼吸細気管支、肺胞管、及び肺胞を含む。誘導区域は、気道で構成されており、血液とのガス交換がなく、気道を開いた状態で保持するために軟骨で補強されている。誘導区域は、吸入空気を加湿し、それを３７℃（９９°Ｆ）まで加温する。誘導区域はまた、すべての通路の壁上に位置する繊毛により粒子を除去することによって吸入空気を浄化する。呼吸器区域は、血液とのガス交換の部位である。
【００１３】
一実施形態では、「哺乳類皮膚の感作を誘導することができる薬剤」とは、哺乳動物における肺上皮のある部位でＩ型即時型過敏性反応を誘導及び誘発することができる薬剤である。好ましくは、肺上皮のその部位は、肺の呼吸器区域内にあるが、代わりにまたは加えて、肺の誘導区域内にあってもよい。
【００１４】
好ましくは、本方法は、インビトロ方法またはエクスビボ方法である。
【００１５】
哺乳動物は、任意のペットまたは家畜であってもよい。好ましくは、哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、または霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００１６】
樹状細胞（ＤＣ）は、哺乳類免疫系の一部を形成する免疫細胞である。それらの主な機能は、抗原物質を処理し、それを、その表面上で、先天性免疫系と適応性免疫系をつなぐ免疫系の他の細胞に提示する（すなわち、それらは、抗原提示細胞として機能する）ことである。
【００１７】
樹状細胞は、（ランゲルハンス細胞と呼ばれる特殊の樹状細胞型が存在する）皮膚等の外部環境と接触している組織、ならびに鼻、肺、胃、及び腸の内層に存在する。それらは、血液中の未熟状態の細胞でも見つけることができる。活性化されると、それらは、それらがＴ細胞及びＢ細胞と相互作用するリンパ節に移動して、適応性免疫応答を開始し、形作る。ある特定の発達段階で、それらは、分岐状の突起である樹状突起を生育する。外観は似ているが、これらは、神経細胞の樹状突起とははっきり異なる構造である。未熟な樹状細胞は、それらが樹状突起ではなく大きな細胞質「ベール」を処理するため、ベール細胞とも呼ばれる。
【００１８】
「樹状様細胞」とは、樹状細胞に特異的な機能的特性及び表現型特性、例えば、形態学的特徴、共刺激分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子の発現、巨大分子を飲作用する能力、ならびに静止しているＴ細胞を活性化する能力を呈する非樹状細胞を意味する。
【００１９】
一実施形態では、樹状様細胞は、ＣＤ３４＋樹状細胞前駆体である。任意に、ＣＤ３４＋樹状細胞前駆体は、サイトカイン刺激時に、ＣＤ１ｄを介して抗原を提示する表現型ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ（すなわち、未熟な樹状細胞またはランゲルハンス様樹状細胞と同様の表現型）を獲得し、特異的Ｔ細胞増殖を誘導し、かつ／または炎症性メディエーターでの刺激時に成熟した転写プロファイル及び表現型プロファイルを呈することができる。
【００２０】
樹状細胞は、機能、表現型、及び／または遺伝子発現パターン、具体的には細胞表面表現型によって認識され得る。これらの細胞は、それらの特有の形態、高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ発現、ならびに抗原をＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、具体的にはナイーブＴ細胞に提示する能力を特徴とする（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１）。
【００２１】
特徴的なベール様突起を有する樹状細胞の細胞表面は独特であり、細胞表面マーカーＣＤ１１ｃ及びＭＨＣクラスｌＩの発現を特徴とする。大半のＤＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、及び顆粒球等の他の白血球系統のマーカーには陰性である。樹状細胞の下位集団は、３３Ｄ１、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ−ｄ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８アルファ、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３（ＩＬ３Ｒａ）、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１６２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＥＣ２０５、Ｅ−カドヘリン、ランゲリン、マンノース受容体、ＭＡＲＣＯ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ、及びいくつかのレクチンからなる群から選択されるさらなるマーカーも発現し得る。
【００２２】
これらの細胞表面マーカーの発現パターンは、樹状細胞の成熟度、それらの組織起源、及び／またはそれらの種起源によって異なり得る。未熟な樹状細胞は、低レベルのＭＨＣクラスＩＩしか発現しないが、抗原タンパク質をエンドサイトーシスにより取り込み、かつそれらを処理してＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体に提示することができる。活性化された樹状細胞は、高レベルのＭＨＣクラス１１、ＩＣＡＭ−１、及びＣＤ８６を発現し、同種異系ナイーブＴ細胞の増殖を、例えば、混合白血球反応（ＭＬＲ）において刺激することができる。
【００２３】
機能的には、樹状細胞または樹状様細胞は、抗原提示を決定するための任意の簡便なアッセイによって特定され得る。かかるアッセイは、試験抗原の提示による抗原刺激Ｔ細胞及び／またはナイーブＴ細胞を刺激する能力の試験、続いて、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２放出等の決定を含み得る。
【００２４】
一実施形態では、樹状様細胞は、上皮細胞及び／または上皮様細胞、例えば、ＢＥＡＳ−２Ｂ［２８］、ＷＴ９−７、及びＡ５４９を含む［２９］。好ましくは、上皮細胞は、肺上皮細胞である。好ましくは、上皮様細胞は、肺上皮様細胞である。代替の実施形態では、樹状様細胞は、上皮細胞及び／または上皮様細胞を含む。
【００２５】
「発現量」とは、ｍＲＮＡまたはタンパク質等の遺伝子産物のレベルまたは量を意味する。
【００２６】
タンパク質及び／または核酸の濃度を検出及び／または測定する方法が当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００２７】
タンパク質検出及び／または測定の好ましい方法としては、ウエスタンブロット、ノース−ウエスタンブロット、免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）、免疫沈降、インサイツハイブリダイゼーション及び他の免疫組織化学技法、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量アッセイ（ＩＲＭＡ）、ならびに免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）、例えば、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体を使用したサンドイッチアッセイが挙げられる。例示のサンドイッチアッセイは、Ｄａｖｉｄらにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，３７６，１１０号及び同第４，４８６，５３０号に説明されている。スライド上での細胞の抗体染色は、細胞学研究室診断試験においてよく知られており、当業者にもよく知られている方法で使用され得る。
【００２８】
典型的には、ＥＬＩＳＡは、通常固相アッセイにおいて着色された反応生成物をもたらす酵素の使用を必要とする。西洋ワサビペルオキシダーゼ及びホスファターゼ等の酵素が広く用いられている。ホスファターゼ反応の増幅法は、基質としてＮＡＤＰを使用してＮＡＤを生成することであり、これは、第２の酵素系の補酵素としての役割を果たすようになる。大腸菌由来のピロホスファターゼは、この酵素が組織中に存在せず、安定しており、かつ良好な反応色をもたらすため、良好な接合体を提供する。ルシフェラーゼ等の酵素に基づく化学発光系も使用することができる。
【００２９】
ビタミンであるビオチンとの接合が頻繁に使用されており、ビオチンとの接合が、それが高度の特異性及び親和性で結合する酵素結合アビジンまたはストレプトアビジンとのその反応によって容易に検出され得るためである。
【００３０】
核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の好ましい検出及び／または測定方法としては、サザンブロット、ノーザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィー、及びインサイツハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００３１】
一実施形態では、本方法は、
ｃ）樹状細胞または樹状様細胞の別個の集団を、哺乳動物において呼吸器感作物質ではない１つ以上の陰性対照薬に曝露するステップと、
ｄ）それらの細胞において、ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現量を測定するステップと、をさらに含み、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在及び／または量が、ステップ（ｄ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在及び／または量とは異なる場合に、試験薬が呼吸器感作物質と特定される。
【００３２】
「ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のタンパク質の対照試料中の存在及び／または量とは異なる」とは、試験試料中の存在及び／または量が、統計的に有意な様式で、１つ以上の陰性対照試料中の存在及び／または量とは異なることを意味する。好ましくは、試験薬に曝露された細胞集団における１つ以上のバイオマーカーの発現量は、
陰性対照薬に曝露された細胞集団の発現量の８０％以下、例えば、陰性対照薬に曝露された細胞集団の発現量の７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、もしくは０％、または
陰性対照薬に曝露された細胞集団の発現量の少なくとも１２０％、例えば、陰性対照薬に曝露された細胞集団の発現量の少なくとも１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４２５％、４５０％、４７５％、もしくは少なくとも５００％である。
【００３３】
「ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のタンパク質の対照試料中の存在及び／または量とは異なる」とは、代わりにまたは加えて、試験試料が１つ以上の陰性対照試料とは異なる群に属するものに分類されることを含む。例えば、ＳＶＭが使用される場合、試験試料は、１つ以上の陰性対照試料として決定値閾値の反対側にある（例えば、１つ以上の試験物（またはその複製物）が０以下のＳＶＭ決定値を有する場合に試験薬が呼吸器感作物質に分類された場合、１つ以上の陽性対照試料（またはそれらの大半）も０以下のＳＶＭ決定値を有するべきである）。
【００３４】
１つ以上の陰性対照薬は、１−ブタノール、２−アミノフェノール、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ニトロ−１，４−フェニレンジアミン、４−アミノ安息香酸、クロロベンゼン、ジメチルホルムアミド、エチルバニリン、ホルムアルデヒド、ゲラニオール、ヘキシルシンナムアルデヒド、イソプロパノール、カトンＣＧ＊、サリチル酸メチル、ペニシリンＧ、プロピレングリコール、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム、Ｔｗｅｅｎ  ８０、及び硫酸亜鉛（すなわち、表１に定義される呼吸器非感作物質の群）からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含み得るか、またはそれからなり得る。１つ以上の陰性対照薬は、表１に定義される陰性対照薬の群から選択される１つ以上の薬剤を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００３５】
陰性対照薬は、本発明の試験薬または対照薬とともに使用するための溶媒であり得る。したがって、陰性対照は、ＤＭＳＯ及び／または蒸留水であり得る。
【００３６】
本方法は、少なくとも２つの陰性対照薬（すなわち、非感作薬）、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または少なくとも１００個の陰性対照薬の使用を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００３７】
あるいはまたは加えて、試験薬への曝露前の樹状細胞または樹状様細胞のステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現量は、陰性対照として使用される。
【００３８】
さらなる実施形態は、
ｅ）樹状細胞または樹状様細胞の別個の集団を、哺乳動物において吸器感作物質である１つ以上の陽性対照薬に曝露するステップと、
ｆ）それらの細胞において、ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現量を測定するステップと、を含み、
ステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在及び／または量が、ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの１つ以上の陽性対照試料中の存在及び／または量に相当する場合に、試験薬が呼吸器感作物質と特定される。
【００３９】
「１つ以上の陽性対照試料における発現量に相当する」とは、試験薬に曝露された細胞集団における１つ以上のバイオマーカーの発現量が、もう１つの陽性対照薬に曝露された細胞集団における発現量と同一であるか、またはそれとは著しく異ならないことを意味する。好ましくは、試験薬に曝露された細胞集団における１つ以上のバイオマーカーの発現量は、もう１つの陽性対照薬に曝露された細胞集団における発現量の８１％〜１１９％であり、例えば、もう１つの陽性対照薬に曝露された細胞集団における発現量の８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上であり、もう１つの陽性対照薬に曝露された細胞集団における発現量の１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、または１１９％以下である。
【００４０】
「１つ以上の陽性対照試料における発現量に相当する」とは、代わりにまたは加えて、試験試料が１つ以上の陽性対照試料と同じ群に属するものに分類されることを含む。例えば、ＳＶＭが使用される場合、試験試料は、１つ以上の陽性対照試料として決定値閾値の反対側にある（例えば、試験薬が呼吸器感作物質に分類された場合に、１つ以上の試験物（またはその複製物）が０を超えるＳＶＭ決定値を有する場合、１つ以上の陽性対照試料（またはその大半）も０を超えるＳＶＭ決定値を有するはずである）。
【００４１】
１つ以上の陽性対照薬は、ヘキサクロロ白金酸アンモニウム、過硫酸アンモニウム、エチレンジアミン、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、無水マレイン酸、メチレンジフェノールジイソシアネート、無水フタル酸、トルエンジイソシアネート、及び無水トリメリット酸（すなわち、表１に定義される呼吸器感作物質の群）からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含み得るか、またはそれからなり得る。１つ以上の陽性対照薬は、表１に定義される陽性対照薬の群から選択される１つ以上の薬剤を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００４２】
本方法は、少なくとも２つの陽性対照（すなわち、感作薬）、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または少なくとも１００個の陽性対照薬の使用を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００４３】
本発明の第１の態様による方法は、ＴＮＦＲＳＦ１９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよい。本方法は、ＳＮＯＲＡ７４Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよい。本方法は、ＳＰＡＭ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよい。
【００４４】
本方法は、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物識別番号（ＥＴＩＤ）：ＥＮＳＴ０００００３６４６２１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＨＯＭＥＲ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＤ１Ｃの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＩＧＨＤ／／／ＩＧＨＭの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＮＲＰＮ／／／ＳＮＯＲＤ１１６−２６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６４６７８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＴＲＡＰの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＤＩＡＢＬＯの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００４１１３４９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８５４９７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ５１Ａ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＲＰＬ２１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＤＥＦＢ１２７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ９ｏｒｆ１３０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＲＯ２０１２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ３９９８９８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８７７０１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＷＤＲ６８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＮＥＵ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８６６７７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＰＡＲＣの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３９０３４２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＲＮＮの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＭＰ１２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＣＶＲＬ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＩＦ４Ｅ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、
【００４５】
本方法は、ＲＰ１１−１９１Ｌ９．１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＤＣＤ６／／／ＡＨＲＲの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＲＲＤＣ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＶＷＤＥの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＺＢＴＢ３４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＩＴＧＢ１ＢＰ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ１０Ｋ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＬＪ２２５９６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３０６５１５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＣＶＲ２Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８５６９０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８６０１８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ６ｏｒｆ２０１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８５５８３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８５７１９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＧＰＲ２０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６４３５７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＺＣＣＨＣ１３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＧＰＲ６４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＤ１Ｄの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＤＵＳＰ１２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＫＬＨＬ３３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＳＭＢ６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＭＥＭ９５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ１ＱＢＰの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＭＩＬＩＮ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＤ８Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ２０ｏｒｆ１５２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＫＣＮＪ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６４１６３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＡＭ１９Ａ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８４６０１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＯＬＲ２Ｈの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＫ０００４２０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６３３５４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、
【００４６】
本方法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセット識別番号（ＡＰＩＤ）：８１２１４８３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＧＦＬ６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＯＵ３Ｆ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８５８４１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ５２Ａ５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＩＭＭ８Ｂの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＥＢＰ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ４Ｆ６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＤＨ１５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＭＥＭ１９９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＢＩ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＬＪ４２８４２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＣ４Ｒの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００４１０６７３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＩＳＭ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ４４０９５７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＫＬＢの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＧＭ２Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＮＸＡ６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＡＳ２Ｒ４０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＩＤ：８１４２８８０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＲＡＲＲＥＳ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＨ２Ｄ４Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＬＰ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＴＰ１Ａ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８６８００の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＡＴ１Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＳＧＡ１０ＩＰの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＲＤＭ７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３９０８４７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００２５５１８３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＲＰＬ３９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８６３２７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＩＰＡＲＰの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、
【００４７】
本方法は、ＨＥＳ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６３５０２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＲＤＭ９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３９０９１７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＫＩＡＡ１６８８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３９１２１９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８７９７３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ１００１２９５３４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＬＣ２Ａ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＦ１１６７１４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＰＳ８Ｌ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＧＣ３１９６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、７９５２７３３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８４３９１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＭＥ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＮＥＴＯ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＮＰＨＳ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８４１０９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６４１４３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＩＳＸの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＩＬ１７ＲＢの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＣＯＬＣＥ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＲＩＴ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３３０１１０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＺＮＦ３５４Ｃの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８６４４４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ２Ｇ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＧＬＵＬの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＣＫＢＲの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ１Ｓ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＤＣＵＮ１Ｄ５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８８２９１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＭＧ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＴＨＬＨの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、
【００４８】
ＰＴＧＥＳ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＩＤＥＢの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８３８６３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＴＰ１０Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＹＯ５Ｃの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８００７８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＬＡ２Ｇ１０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＨＳＰＥ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８８３２４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＹＯ６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ７ｏｒｆ３０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３４０７７９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ４４１２４５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＲＩＭ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＸＫＲ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＡＭ１１０Ｂの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＥＢＰ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ６４４７１４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＡＰＰＡＳの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＢＥＸ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＨＭＧＢ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＢＣ０２８４１３／／／ＢＣ１２８５１６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６３９１９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３３５６２１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＯＸ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＴＳＧの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６２３４４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＬＪ３７４６４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＲＡＸの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＩＬ２９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＥＡＣＡＭ２０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６５５５７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＥＣ１４Ｌ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ３ｏｒｆ５２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＥＴＵＢの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、
【００４９】
本方法は、ＰＩＧＹの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＤＨ１２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＧＳＮの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３９１０３１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＨＧＣ６．３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ｔｃａｇ７．８７３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｔ１５６０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＸＯＳＣ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＲＡＭ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＩＤ：８１５９３７１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ１３Ｃ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＬＳ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＭＥＭ５３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＤ１Ｂの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＯＲＣＳ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ５２Ｅ８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＡＭ１６０Ａ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ６４９９４６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＡＭ１５８Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＩＤ：７９８６６３７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＹＯ１Ｅの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＮＵＰＲ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＩＤ：８００５４３３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＩＧＬＥＣ１５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、２−Ｍａｒの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ１００１３１５５４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＧＧＴＬＣ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＳＭＡ７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＬＣ２５Ａ１８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ３ｏｒｆ１４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＤＸ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８６４３３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＲＲＡＧＤの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＤＫ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ１６８４７４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８４１２５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＲＨＲの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、
【００５０】
本方法は、ＩＬ１１ＲＡの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＧＣ２１８８１／／／ＬＯＣ５５４２４９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＺＮＦ４８３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ９ｏｒｆ１６９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＧＣ２１８８１／／／ＬＯＣ５５４２４９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６４５０７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８７００３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８８０８３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６５０８４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＲＧ２／／／ＦＲＧ２Ｂ／／／ＦＲＧ２Ｃの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ１４ｏｒｆ５３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＤＦ３Ｌ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＡＭ１８Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＲＴＮ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＦＤの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＭＥＤ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８７１５０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＢＯＫの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６５６０９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＮＲＰＢの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＰＨＡ６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＣＡＲＮＡ２２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＬＪ３５４２４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８７５５５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８８６６４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６３３６５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６２８６１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６３１８１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＧＲＭ６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ６４６０９３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＩＡＭ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、
【００５１】
本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６３０７４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８５７７７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＴＵＳ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＵＣ２１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＷＤＲ８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ１００１３１１９５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ４Ｄ１０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ１２ｏｒｆ６３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＬＡ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＤＮＡＪＣ１４／／／ＣＩＰ２９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＬＪ４０１７６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００４１０２０７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＳＭＥ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００４０５６５６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＨＮ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３３５５２３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＹＰ２Ａ７／／／ＣＹＰ２Ａ７Ｐ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＴＸＮ１０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＺＭＡＴ５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６２４９３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＨＩＴの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＲＧ２／／／ＦＲＧ２Ｂ／／／ＦＲＧ２Ｃの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＮＸ１８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６２４３３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＤＴＸ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＳＢ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６５２４２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６４２０４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＯＬ５Ａ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＣＡＰの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＯＯの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＴＰＲＵの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＩＬ２８ＲＡの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＮＥＵＲＯＧ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＶＡＸ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、
【００５２】
本方法は、ＬＯＣ４４０１３１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ１３ｏｒｆ３１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＤＡＭＴＳ７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＭＴＮＬ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ２８４１１２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＶ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＵＴ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ２ｏｒｆ３９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ２００３８３／／／ＤＮＡＨ６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８５６７６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＣＤＣ１０８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＩＤ：８０６５０１１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ２２ｏｒｆ２７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６４４４４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＤＬＩＭ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３３０１１０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８４５３９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３９０２１４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＧＣ７２０８０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ９ｏｒｆ１２８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＲＧＡＧ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＩＰ５Ｋ１Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＧＰＲ１６１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８５３５３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ５６Ａ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ５Ａ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＷＮＴ１１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＩＤ：７９６０２５９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＲＡＢ３７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＡＩＲ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８８３８５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＨＡＣ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８７５７４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、
【００５３】
本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８７８８４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＢＣＬ２Ｌ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＫＤＥＬＲ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＭＥＭ１０８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＰＡＴＡ１６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＢＴＣの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＵＰＴ３Ｈの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＩＦ４Ｂの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＨＭＰ４Ｃの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｈ２ＢＦＭの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＩＤ：８１８０３９２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＮＲ５Ａ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＲＩＭ４９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＳ４Ａ６Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ１１ｏｒｆ１０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＨＳＰＣ１５２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＲＡＳＡＬ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８７５３１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＬＤＮの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＥＲ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＬＳ２ＣＲ１２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ２０ｏｒｆ１４２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８６８４８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＯＣ１００１２９１１３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＥＲＫの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８５７８３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＲＯＳ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＣＤＨＧＡの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＵＣ３Ｂ／／／ＭＵＣ３Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６５３５５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＩＤ：８１５６９６９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３５８０４７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＡＭ４７Ｃの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＮＸＦ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＩＷＩＬ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８４７２７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＬＤＨ６Ａ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＴＭＥＭ６４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３６４８１６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよい。
【００５４】
本方法は、Ｃ１１ｏｒｆ７３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＲ５Ｂ２１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＮＯＸ５／／／ＳＰＥＳＰ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＭＩＣＡ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８７４２２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＥＲＰＩＮＢ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８７３９６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＤ１Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＲＡＢ９Ａの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、Ｃ１０ｏｒｆ９０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＬＰＸＮの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＧＧＴＬＣ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８４６８０の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＰＮＰＬＡ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＡＭＫ１Ｄの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００４１０７５４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＤＣ１２３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＷＤＦＹ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ｈＣＧ＿１７４９００５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＤ４８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＭＥＤ１９の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＤＲＤ５の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＩＤ：７９６７５８６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＶＡＰＡの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＡＭ７１Ｆ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＰＩＤ：８１４１４２１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＨＣＣＳの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＮＲ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＯＩＴ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＢＭＰ２Ｋの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＺＮＦ３６６の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＳＹＴ１７の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＡＬＭ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＸＫの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＲＴ４の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３３２４１８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＺＦＰ３６Ｌ２の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＧＳＴＡ３の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＣＯＬ２１Ａ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３３２４１８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＦＵＣＡ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＥＴＩＤ：ＥＮＳＴ０００００３８６６２８の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＡＺＵ１の発現量を測定することを含んでも含まなくてもよく、本方法は、ＩＬ７Ｒの発現量を測定することを含んでも含まなくてもよい。
【００５５】
本方法は、ステップ（ｂ）で、表Ａ（ｉ）に定義される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表１Ａに定義されるバイオマーカーのうちの少なくとも２つまたは３つの発現量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。したがって、本方法は、ＴＮＦＲＳＦ１９の発現量を測定することを含み得る。本方法は、ＳＮＯＲＡ７４Ａの発現量を測定することを含み得る。本方法は、ＳＰＡＭ１の発現量を測定することを含み得る。好ましい実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）で、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＳＮＯＲＡ７４Ａ、及びＳＰＡＭ１の発現量を測定することを含むか、またはそれからなる。
【００５６】
本方法は、代わりにまたは加えて、ステップ（ｂ）での表Ａ（ｉｉ）に定義される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉ）に定義されるバイオマーカーのうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、または３４２個の発現量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００５７】
本方法は、代わりにまたは加えて、ステップ（ｂ）で表１Ｃに定義される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に定義されるバイオマーカーのうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４個の発現量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００５８】
したがって、表Ａ（ｉ）に定義されるバイオマーカーのすべて及び／または表Ａ（ｉｉ）に定義されるバイオマーカーのすべて及び／または表Ａ（ｉｉｉ）に定義されるバイオマーカーのすべての発現量がステップ（ｂ）で測定され得る。したがって、本方法は、ステップ（ｂ）で表Ａに定義されるバイオマーカーのすべてを測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００５９】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）は、１つ以上のバイオマーカーをコードする核酸分子の発現量を測定することを含むか、またはそれからなる。核酸分子は、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子であり得る。好ましくは、核酸分子は、ｍＲＮＡ分子である。しかしながら、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子であってもよい。
【００６０】
一実施形態では、ステップ（ｂ）での１つ以上のバイオマーカーの発現は、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィー、及びインサイツハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を使用して行われる。好ましくは、１つ以上のバイオマーカーの発現量は、ＤＮＡマイクロアレイを使用して測定される。
【００６１】
本方法は、１つ以上の結合部分を使用してステップ（ｂ）で１つ以上のバイオマーカーの発現量を測定することを含み得、１つ以上の結合部分は各々、表Ａに特定されるバイオマーカーのうちの１つをコードする核酸分子に選択的に結合することができる。
【００６２】
一実施形態では、１つ以上の結合部分は各々、核酸分子を含むか、またはそれからなる。さらなる実施形態では、１つ以上の結合部分は各々、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＰＭＯを含むか、またはそれからなる。好ましくは、１つ以上の結合部分は各々、ＤＮＡを含むか、またはそれからなる。一実施形態では、１つ以上の結合部分は、５〜１００ヌクレオチド長である。しかしながら、代替の実施形態では、それらは、１５〜３５ヌクレオチド長である。
【００６３】
１つ以上の結合部分は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）の１つ以上のプローブを含み得るか、またはそれからなり得る。プローブ識別番号は、本明細書の表Ａに提供される。
【００６４】
好適な結合剤（結合分子とも称される）は、以下で論じられるように、所与の核酸、タンパク質、またはアミノ酸モチーフに結合するそれらの能力に基づいて、あるライブラリから選択またはスクリーニングされ得る。
【００６５】
好ましい実施形態では、結合部分は、検出可能な部分を含む。
【００６６】
「検出可能な部分」とは、その存在ならびに／または相対量及び／もしくは位置（例えば、アレイ上の位置）の直接または間接的な決定を許可する部分を含む。
【００６７】
好適な検出可能な部分は、当該技術分野で周知である。
【００６８】
例えば、検出可能な部分は、特定の条件に曝露されたときに検出され得る蛍光及び／または発光及び／または化学発光部分であり得る。かかる蛍光部分は、蛍光部分の励起を引き起こすために特定の波長及び強度で放射線（すなわち、光）に曝露されなければならず、それにより、その蛍光部分が検出され得る特定の波長で検出可能な蛍光を放出することができるようになり得る。
【００６９】
あるいは、検出可能な部分は、（好ましくは検出不能な）基質を、可視化及び／または検出され得る検出可能な生成物に変換することができる酵素であり得る。好適な酵素の例は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに関して、以下でより詳細に論じられている。
【００７０】
したがって、検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分（例えば、放射性原子）、または酵素部分からなる群から選択され得る。好ましくは、検出可能な部分は、放射性原子を含むか、またはそれからなる。放射性原子は、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、三重水素、レニウム−１８６、レニウム−１８８、及びイットリウム−９０からなる群から選択され得る。
【００７１】
明らかに、検出される薬剤（例えば、本明細書に記載の試験試料及び／もしくは対照試料中の１つ以上のバイオマーカーならびに／または選択されたタンパク質の検出に使用するための抗体分子等）は、検出可能な部分が容易に検出可能になるように、適切な原子同位体を十分に有するべきである。
【００７２】
代替の好ましい実施形態では、結合部分の検出可能な部分は、蛍光部分である。
【００７３】
放射性標識または他の標識が、本発明の方法の試料中に存在するバイオマーカー及び／または本発明の結合部分に既知の方法で組み込まれてもよい。例えば、結合剤がポリペプチドである場合、生合成され得るか、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を使用して化学的アミノ酸合成によって合成され得る。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、及び１１１Ｉｎ等の標識は、例えば、結合部分のシステイン残基を介して結合され得る。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合され得る。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０，４９−５７）を使用して、１２３Ｉを組み込むことができる。参考文献（“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”，Ｊ−Ｆ  Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）は、他の方法を詳細に説明している。他の検出可能な部分（酵素、蛍光、発光、化学発光、または放射性部分等）をタンパク質に接合するための方法が、当該技術分野で周知である。
【００７４】
当業者であれば、試験される試料（複数可）中のバイオマーカーが、前記タンパク質の存在、量、及び／または位置の決定を間接的に支援する部分で標識され得ることを理解するであろう。したがって、この部分は、多成分の検出可能な部分の１つの成分を構成し得る。例えば、試験される試料（複数可）中のバイオマーカーは、検出可能な標識に融合されるか、またはさもなければ連結されるストレプトアビジンを使用してそれらのその後の検出を可能にするビオチンで標識され得る。
【００７５】
本発明の第１の態様に提供される方法は、ステップ（ｂ）で、表Ａに定義される１つ以上のバイオマーカーのタンパク質の発現量を決定することを含み得るか、またはそれからなり得る。本方法は、ステップ（ｂ）で１つ以上の結合部分を使用して１つ以上のバイオマーカーの発現量を測定することを含み得、１つ以上の結合部分が各々、表Ａに特定されるバイオマーカーのうちの１つに選択的に結合することができる。１つ以上の結合部分は、抗体またはその抗原結合断片、例えば、モノクローナル抗体またはその断片を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００７６】
「抗体」という用語は、任意の合成抗体、組換え抗体、または抗体ハイブリッド（免疫グロブリン軽鎖及び／もしくは重鎖可変及び／もしくは定常領域のファージディスプレイによって産生される一本鎖抗体分子、または当業者に既知の免疫アッセイ形式で抗原に結合することができる他の免疫相互作用分子等であるが、これらに限定されない）を含む。
【００７７】
我々は、アフィボディ及びアプタマー等の抗体様結合剤の使用も含む。
【００７８】
それらの特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関わる技法の一般概説は、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９で見つかるであろう。
【００７９】
加えてまたはあるいは、第１の結合分子のうちの１つ以上は、アプタマーであり得る（Ｃｏｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７：４−１５を参照のこと）。
【００８０】
分子ライブラリ、例えば、抗体ライブラリ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，６２４−６２８、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２（３）：５８１−９７）、ペプチドライブラリ（Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８（４７０５）：１３１５−７）、発現ｃＤＮＡライブラリ（Ｓａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６（２）：４９７−５０８）、アフィボディ等の抗体フレームワーク以外の他の足場のライブラリ（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５（９）：４１３４−４０）、またはアプタマーベースのライブラリ（Ｋｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１８，２１７−３１）は、所与のモチーフに特異的な結合分子が本発明の方法で使用するために選択される源として使用され得る。
【００８１】
これらの分子ライブラリは、原核細胞（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１（前掲書）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１（前掲書））もしくは真核細胞（Ｋｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９６（１０）：５６５１−６）においてインビボで発現され得るか、または細胞の関与なしにインビトロで発現され得る（Ｈａｎｅｓ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（１０）：４９３７−４２、Ｈｅ  ＆  Ｔａｕｓｓｉｇ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５（２４）：５１３２−４、Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４１４（２）：４０５−８）。
【００８２】
タンパク質ベースのライブラリが使用される場合、可能性のある結合分子のライブラリをコードする遺伝子は、多くの場合、ウイルス中にパッケージングされ、可能性のある結合分子がウイルスの表面にディスプレイされる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１（上記参照）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１（上記参照）、Ｓｍｉｔｈ，１９８５（上記参照））。
【００８３】
恐らく、最も一般に使用されているディスプレイ系は、抗体断片をそれらの表面でディスプレイする繊維状バクテリオファージであり、それらの抗体断片がバクテリオファージの微量の外殻タンパク質への融合物として発現される（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１（上記参照）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１（上記参照））。しかしながら、ディスプレイに好適な他の系は、他のウイルス（欧州特許第３９５７８号）、細菌（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９（上記参照）、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１（９）：８２５−３２、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２（７）：６１３−２１）、及び酵母（Ｓｈｕｓｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９２（５）：９４９−５６）の使用を含む。
【００８４】
加えて、ディスプレイ系は、いわゆるリボソームディスプレイ系におけるポリペプチド生成物のそのコードｍＲＮＡへの連結（Ｈａｎｅｓ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７（上記参照）、Ｈｅ  ＆  Ｔａｕｓｓｉｇ，１９９７（上記参照）、Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９７（上記参照））、またはあるいはポリペプチド生成物のコードＤＮＡへの連結（米国特許第５，８５６，０９０号及び国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号を参照のこと）を利用して開発されている。
【００８５】
抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関与しており、このことは、初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された。齧歯類抗体の「ヒト化」によりさらに確信された。齧歯類起源の可変ドメインがヒト起源の定常ドメインに融合されて、結果として生じる抗体が齧歯類親抗体の抗原特異性を保持するようになる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８５１−６８５５）。
【００８６】
その抗原特異性は、可変ドメインによって付与され、定常ドメインとは無関係であり、抗体断片の細菌発現を伴う実験から知られており、これらの抗体断片はすべて１つ以上の可変ドメインを含む。これらの分子としては、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０４１）、Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０３８）、ＶＨパートナードメインとＶＬパートナードメインが可動性オリゴペプチドを介して連結されている一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５、５８７９）、及び単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４）。それらの特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関わる技法の一般概説は、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９で見つかるであろう。
【００８７】
抗体または抗原結合断片は、インタクトな抗体、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ）２断片）、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン）、ならびにドメイン抗体（ｄＡｂ、単一形式及び二重形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群から選択され得る。好ましくは、抗体または抗原結合断片は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
【００８８】
あるいは、１つ以上の結合部分は、抗体様結合剤、例えば、アフィボディまたはアプタマーを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００８９】
「ｓｃＦｖ分子」とは、ＶＨパートナードメインとＶＬパートナードメインが可動性オリゴペプチドを介して連結されている分子を意味する。
【００９０】
全抗体ではなく抗体断片を使用する利点は、いくつもある。より小さい断片が、改善された薬理学的特性、例えば、より良好な固形組織透過性につながり得る。補体結合等の全抗体のエフェクター機能が除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、及びｄＡｂ抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、かつそれから分泌されるため、大量の前記断片の容易な産生が可能になり得る。
【００９１】
全抗体及びＦ（ａｂ′）２断片は、「二価」である。「二価」とは、前記抗体及びＦ（ａｂ′）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、及びｄＡｂ断片は、抗原結合部位を１つのみ有する一価である。
【００９２】
これらの抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。好適なモノクローナル抗体は、既知の技法、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）及び“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ  Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に開示される技法によって調製することができ、これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
可能性のある結合分子がライブラリから選択されると、定義されたモチーフを有する１つ以上のセレクターペプチドが通常用いられる。ペプチド中での可動性を低減する構造を提供するアミノ酸残基、または結合分子との相互作用を可能にする荷電、極性、もしくは疎水性側鎖が、セレクターペプチドのモチーフ設計に使用され得る。例えば、
（ｉ）プロリンは、その側鎖がアルファ炭素にも窒素にも結合されるため、ペプチド構造を安定させ得る。
（ｉｉ）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンが芳香族側鎖を有し、高度に疎水性である一方で、ロイシン及びイソロイシンは、脂肪族側鎖を有し、同様に疎水性である。
（Ｉｉｉ）リジン、アルギニン、及びヒスチジンが塩基性側鎖を有し、中性ｐＨで正に帯電される一方で、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩は、酸性側鎖を有し、中性ｐＨで負に帯電される。
（ｉｖ）アスパラギン及びグルタミンは、中性ｐＨで中性であるが、水素結合に関与し得るアミド基を含有する。
（ｖ）セリン、トレオニン、及びチロシン側鎖は、水素結合に関与し得るヒドロキシル基を含有する。
【００９４】
典型的には、結合分子の選択は、結合分子の種類に対応するスポットへの結合を分析するためのアレイ技術及びシステムの使用を必要とし得る。
【００９５】
１つ以上のタンパク質結合部分は、検出可能な部分を含み得る。検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、及び酵素部分からなる群から選択され得る。
【００９６】
本発明の方法のさらなる実施形態では、ステップ（ｂ）は、１つ以上のタンパク質に結合することができる第２の結合剤を含むアッセイを使用して行うことができ、第２の結合剤は、検出可能な部分も含む。好適な第２の結合剤は、第１の結合剤に関して上で詳述されている。
【００９７】
したがって、試験される試料中の目的とするタンパク質は、第１の結合剤を使用して最初に単離及び／または固定化され得、その後、前記バイオマーカーの存在及び／または相対量が第２の結合剤を使用して決定され得る。
【００９８】
一実施形態では、第２の結合剤は、抗体またはその抗原結合断片、典型的には、組換え抗体またはその断片である。好都合に、抗体またはその断片は、免疫グロブリン分子のｓｃＦｖ、Ｆａｂ、結合ドメインからなる群から選択される。好適な抗体及び断片、ならびにそれらを作製するための方法は、上で詳述されている。
【００９９】
あるいは、第２の結合剤は、アフィボディまたはアプタマー等の抗体様結合剤であり得る。
【０１００】
あるいは、試験される試料中のタンパク質の検出可能な部分は、特異的結合対のあるメンバー（例えば、ビオチン）を含むか、またはそれからなる場合、第２の結合剤は、特異的結合対の称賛メンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含み得るか、またはそれからなり得る。
【０１０１】
検出アッセイが使用される場合、検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、酵素部分からなる群から選択されることが好ましい。本発明の方法での使用に好適な検出可能な部分の例は、上述されている。
【０１０２】
血清または血漿タンパク質を検出するための好ましいアッセイとしては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量アッセイ（ＩＲＭＡ）、ならびに免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）、例えば、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体を使用したサンドイッチアッセイが挙げられる。例示のサンドイッチアッセイは、参照により本明細書に組み込まれるＤａｖｉｄらにより米国特許第４，３７６，１１０号及び同第４，４８６，５３０号に説明されている。スライド上での細胞の抗体染色は、細胞学研究室診断試験において知られており、当業者にも知られている方法で使用され得る。
【０１０３】
したがって、一実施形態では、このアッセイは、通常固相アッセイにおいて着色された反応生成物をもたらす酵素の使用を典型的に必要とするＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着剤アッセイ）である。西洋ワサビペルオキシダーゼ及びホスファターゼ等の酵素が広く用いられている。ホスファターゼ反応の増幅法は、基質としてＮＡＤＰを使用してＮＡＤを生成することであり、これは、第２の酵素系の補酵素としての役割を果たすようになる。大腸菌由来のピロホスファターゼは、この酵素が組織中に存在せず、安定しており、かつ良好な反応色をもたらすため、良好な接合体を提供する。ルシフェラーゼ等の酵素に基づく化学発光系も使用することができる。
【０１０４】
ビタミンであるビオチンとの接合が頻繁に使用されており、ビオチンとの接合が、それが高度の特異性及び親和性で結合する酵素結合アビジンまたはストレプトアビジンとのその反応によって容易に検出され得るためである。
【０１０５】
代替の実施形態では、タンパク質検出に使用されるアッセイは、好都合に、蛍光定量アッセイである。したがって、第２の結合剤の検出可能な部分は、Ａｌｅｘａフルオロフォア（例えば、Ａｌｅｘａ−６４７）等の蛍光部分であり得る。
【０１０６】
好ましくは、ステップ（ｂ）、（ｄ）、及び／または（ｆ）は、アレイを使用して行われる。アレイは、ビーズベースのアレイまたは表面ベースのアレイであり得る。アレイは、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択され得る。
【０１０７】
一実施形態では、本方法は、呼吸器過敏性応答を誘導することができる薬剤を特定するためのものである。好ましくは、過敏性応答は、体液性過敏性応答、例えば、Ｉ型過敏性応答である。好ましくは、本方法は、呼吸器アレルギーを誘導することができる薬剤を特定するためのものである。
【０１０８】
一実施形態では、樹状細胞集団または樹状様細胞集団は、樹状細胞集団である。好ましくは、樹状細胞は、初代樹状細胞である。好ましくは、樹状細胞は、骨髄樹状細胞である。
【０１０９】
樹状細胞集団または樹状様細胞は、好ましくは、哺乳類起源のものである。好ましくは、哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、または霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【０１１０】
一実施形態では、樹状細胞集団または樹状様細胞集団は、樹状様細胞集団、好ましくは、骨髄樹状様細胞集団である。
【０１１１】
一実施形態では、樹状様細胞は、ＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ１ａからなる群から選択されるマーカーのうちの少なくとも１つ、例えば、それらのマーカーのうちの２、３、４、５、６、または７つを発現する。さらなる実施形態では、樹状様細胞は、マーカーＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ１ａを発現する。
【０１１２】
さらなる実施形態では、樹状様細胞は、骨髄樹状細胞に由来し得る。好ましくは、樹状様細胞は、骨髄性白血病由来の細胞である。好ましくは、骨髄性白血病由来の細胞は、ＫＧ−１、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、ＨＬ−６０、Ｍｏｎｏｍａｃ−６、ＡＭＬ−１９３、単球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）、及びＭＵＴＺ−３からなる群から選択される。最も好ましくは、樹状様細胞は、ＭＵＴＺ−３細胞である。ＭＵＴＺ−３細胞は、預入番号ＡＣＣ２９５で１９９５年５月１５日よりＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆuｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ  ７Ｂ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ）から入手可能なヒト急性骨髄単球性白血病細胞である。
【０１１３】
一実施形態では、樹状様細胞は、サイトカインでの刺激後、ＣＤ１ｄ、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩにより抗原を提示し、かつ／または特異的Ｔ細胞増殖を誘導する。
【０１１４】
したがって、一実施形態では、本方法は、試験薬が呼吸器感作薬であるか否かを示す。代替のまたはさらなる実施形態では、本方法は、試験される試料の呼吸器感作効力を示す。
【０１１５】
したがって、一実施形態では、本方法は、試験薬の感作物質効力（すなわち、試験薬が、非感作物質、弱い感作物質、中程度の感作物質、強い感作物質、または極度の感作物質のいずれかであること）を示す。ＰＣＡにおける決定値及び距離は、感作物質効力と相関する。
【０１１６】
あるいはまたは加えて、試験薬効力は、ステップ（ｅ）で、
（ｉ）１つ以上の極度の呼吸器感作物質陽性対照薬、
（ｉｉ）１つ以上の強い呼吸器感作物質陽性対照薬、
（ｉｉｉ）１つ以上の中程度の呼吸器感作物質陽性対照薬、及び／または
（ｉｖ）１つ以上の弱い呼吸器感作物質陽性対照薬を提供することによって決定することができ、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在及び／もしくは量が、ステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの極度の陽性対照試料（存在する場合）中の存在及び／もしくは量に相当する場合に、かつ／またはステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの強い、中程度の、弱い、及び／もしくは陰性対照試料（存在する場合）中の存在及び／もしくは量とは異なる場合に、試験薬が極度の呼吸器感作物質と特定され、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在及び／もしくは量が、ステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの強い陽性対照試料（存在する場合）中の存在及び／もしくは量に相当する場合に、かつ／またはステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの極度の、中程度の、弱い、及び／もしくは陰性対照試料（存在する場合）中の存在及び／もしくは量とは異なる場合に、試験薬が強い呼吸器感作物質と特定され、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在及び／もしくは量が、ステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの中程度の陽性対照試料（存在する場合）中の存在及び／もしくは量に相当する場合に、かつ／またはステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの極度の、強い、弱い、及び／もしくは陰性対照試料（存在する場合）中の存在及び／もしくは量とは異なる場合に、試験薬が中程度の呼吸器感作物質と特定され、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在及び／もしくは量が、ステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの弱い陽性対照試料（存在する場合）中の存在及び／もしくは量に相当する場合に、かつ／またはステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの極度の、強い、中程度の、及び／もしくは陰性対照試料（存在する場合）中の存在及び／もしくは量とは異なる場合に、試験薬が弱い呼吸器感作物質と特定される。
【０１１７】
したがって、ステップ（ｅ）は、以下の呼吸器感作物質陽性対照カテゴリーを提供することを含み得るか、またはそれからなり得る。
（ａ）極度、強い、中程度、及び弱い
（ｂ）強い、中程度、及び弱い
（ｃ）極度、中程度、及び弱い
（ｄ）極度、強い、及び中程度
（ｅ）極度及び強い
（ｆ）強い及び中程度
（ｇ）中程度及び弱い
（ｈ）強い及び弱い
（ｉ）極度及び中程度
（ｊ）極度及び弱い
（ｋ）極度
（ｌ）強い
（ｍ）中程度
（ｎ）弱い
【０１１８】
陰性対照及び陽性対照は、ヒトにおける臨床的観察に基づいて、それぞれ、呼吸器非感作物質または呼吸器感作物質に分類され得る。
【０１１９】
あるいはまたは加えて、本方法は、ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現量を、ステップ（ｃ）及び／またはステップ（ｅ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現量を表す１つ以上の所定の基準値と比較することを含み得る。
【０１２０】
概して、呼吸器感作薬は、少なくとも０．５５のＲＯＣ  ＡＵＣ、例えば、少なくとも０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９のＲＯＣ  ＡＵＣ、または１．００のＲＯＣ  ＡＵＣで決定される。好ましくは、皮膚感作薬は、少なくとも０．８５のＲＯＣ  ＡＵＣ、最も好ましくは、１のＲＯＣ  ＡＵＣで決定される。
【０１２１】
典型的には、呼吸器感作を誘導することができる薬剤は、ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｅ１０７１／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌから入手可能なもの（例えば、ｅ１０７１  １．５−２４）等のサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して特定される。しかしながら、任意の他の好適な手段も使用することができる。ＳＶＭを使用して、本明細書に定義される表１の１つ以上のバイオマーカーを含むか、またはそれからなるバイオマーカーシグネチャーのＲＯＣ  ＡＵＣを決定することもできる。
【０１２２】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類及び回帰に使用される一組の関連教師あり学習法である。各々が２つのカテゴリーのうちの１つに属するとマークされている一組の訓練例を考慮して、ＳＶＭ訓練アルゴリズムは、新たな例が一方のカテゴリーまたは他方のカテゴリーに分類されるかを予測するモデルを構築する。直感的に、ＳＶＭモデルは、マッピングされる空間内の点としての例の表示であり、別個のカテゴリーの例が可能な限り広い明らかなギャップによって分けられるようになる。その後、新たな例が同じ空間にマッピングされ、それらがギャップのどちら側に分類されるかに基づいてあるカテゴリーに属すると予測される。
【０１２３】
より形式的には、サポートベクターマシンは、高次元または無限次元空間内に超平面または一組の超平面を構築し、それらは、分類、回帰、または他のタスクに使用され得る。直感的に、良好な分離が、任意のクラスの最短訓練データ点に対して最大距離（いわゆる機能的マージン）を有する超平面によって達成され、これは、一般にマージンが大きいほど、分類子の一般化誤差が少なくなるためである。ＳＶＭのさらなる情報については、例えば、Ｂｕｒｇｅｓ，１９９８，Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２：１２１−１６７を参照されたい。
【０１２４】
本発明の一実施形態では、ＳＶＭは、既知の薬剤（すなわち、既知の感作薬または非感作薬）のバイオマーカープロファイルを使用して本発明の方法を行う前に「訓練される」。かかる訓練試料を走行することにより、ＳＶＭは、どのバイオマーカープロファイルが感作を誘導することができる薬剤に関連しているかを学習することができる。訓練過程が完了した時点で、ＳＶＭは、試験されたバイオマーカー試料が感作薬または非感作薬由来のものであるか否かを予測することができる。
【０１２５】
当業者であれば、個々のＳＶＭの決定値を個別に決定することができる。一実施形態では、１つ以上の試験物（またはその複製物）が０を超えるＳＶＭ決定値を有する場合、試験薬は呼吸器感作物質に分類される。一実施形態では、１つ以上の試験物（またはその複製物）が０以下のＳＶＭ決定値を有する場合、試験薬は呼吸器非感作物質に分類される。
【０１２６】
一実施形態では、本方法は、皮膚感作物質であるかにかかわらず呼吸器感作物質である薬剤を特定するためのものである。一実施形態では、本方法は、呼吸器感作物質であるが、皮膚感作物質ではない薬剤を特定するためのものである。別の実施形態では、本方法は、呼吸器感作物質及び皮膚感作物質である薬剤を特定するためのものである。
【０１２７】
これにより、試験薬を感作薬または非感作薬に分類することが可能になる。さらに、一実施形態では、既知の効力の感作薬（すなわち、非感作、弱い、中程度の、強い、または極度の感作薬）でＳＶＭを訓練することにより、試験薬の効力も比較して特定することができる。
【０１２８】
しかしながら、この訓練手順は、必要な訓練パラメータでＳＶＭを事前にプログラミングすることにより回避され得る。例えば、感作を誘導することができる薬剤は、表Ａに列記されるすべてのバイオマーカーの測定及び／または表Ｂに列記される発現データに基づいて、表５に詳述されるＳＶＭアルゴリズムを使用して既知のＳＶＭパラメータに従って特定することができる。
【０１２９】
当業者であれば、適切に選択されたデータ（すなわち、既知の感作薬及び／または非感作薬に曝露された細胞由来のバイオマーカー測定値）でＳＶＭマシンを訓練することにより、表Ａに列記されるバイオマーカーの任意の組み合わせに好適なＳＶＭパラメータを決定することができることを理解するであろう。あるいは、表Ａのバイオマーカーを使用して、当該技術分野で既知の任意の他の好適な統計的方法に従って呼吸器感作を誘導することができる薬剤を特定することができる。
【０１３０】
あるいは、表Ａのデータ及び／または表Ｂのデータを使用して、当該技術分野で既知の任意の他の好適な統計的方法（例えば、ＡＮＯＶＡ、ＡＮＣＯＶＡ、ＭＡＮＯＶＡ、ＭＡＮＣＯＶＡ、多変量回帰分析、主成分分析（ＰＣＡ）、因子分析、正準相関分析、正準相関分析、冗長分析、対応分析（ＣＡ、交互平均化）、多次元尺度構成法、判別分析、線形判別分析（ＬＤＡ）、クラスタリングシステム、再帰分割、及び人工ニューラルネットワーク）に従って呼吸器感作を誘導することができる薬剤を特定することができる。
【０１３１】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６５％の精度、例えば、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の精度を有する。
【０１３２】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６５％の感度、例えば、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感度を有する。
【０１３３】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６５％の特異度、例えば、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の特異性を有する。
【０１３４】
「精度」とは、方法の正しい結果の割合を意味し、「感度」とは、陽性と正しく分類されたすべての陽性化学物質の割合を意味し、「特異度」とは、陰性と正しく分類されたすべての陰性化学物質の割合を意味する。
【０１３５】
一実施形態では、本発明の第１の態様の方法は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０５６２３６号（具体的には、その発明の態様及び実施形態、ならびに特許請求の範囲）に記載の哺乳類皮膚の感作を誘導することができる薬剤を特定するための方法を同時にまたは連続して行うことを含む。好ましくは、哺乳類皮膚の感作を誘導することができる薬剤を特定するための方法は、本発明の第１の態様の方法（すなわち、試験薬に曝露された同じ細胞試料（複数可）における関連マーカーの発現量を測定することにより、試験化合物が皮膚及び／または呼吸器感作物質であるかを決定する方法）と同時に行われる。
【０１３６】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様（または任意の実施形態またはそれらの実施形態の組み合わせ）の方法に使用するためのアレイを提供し、このアレイは、上に定義される１つ以上の結合部分を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、結合部分は、表Ａ（ｉ）に定義されるバイオマーカーのすべてに（集合的に）結合することができる。さらなる実施形態では、結合部分は、表Ａ（ｉｉ）に定義されるバイオマーカーのすべてに（集合的に）結合することができる。なおさらなる実施形態では、結合部分は、表Ａ（ｉｉｉ）に定義されるバイオマーカーのすべてに（集合的に）結合することができる。好ましくは、結合部分は、表Ａに定義されるバイオマーカーのすべてに（集合的に）結合することができる。
【０１３７】
結合部分は、固定化され得る。
【０１３８】
アレイはそれ自体、当該技術分野で周知である。典型的には、アレイは、離間した（すなわち、分離した）領域（「スポット」）を有する線形または二次元構造で形成されており、これらの領域は各々、固体支持体の表面上に形成された有限エリアを有する。アレイは、ビーズ構造である場合もあり、各ビーズは、分子コードもしくは色コードによって特定され得るか、または連続流において特定され得る。分析は、試料が一連のスポットに通される場合、連続して行われる場合もあり、これらのスポットは各々、そのクラスの分子を溶液から吸着させる。固体支持体は、典型的には、ガラスまたはポリマーであり、最も一般に使用されているポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンである。固体支持体は、管、ビーズ、ディスク、シリコンチップ、マイクロプレート、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、他の多孔質膜、非多孔質膜（例えば、特に、プラスチック、ポリマー、パースペクス、シリコン）、複数のポリマーピン、もしくは複数のマイクロタイターウェル、またはタンパク質、ポリヌクレオチド、及び他の好適な分子の固定化に好適であり、かつ／または免疫アッセイの実施に好適な任意の他の表面の形態であり得る。結合プロセスは、当該技術分野で周知であり、一般に、タンパク質分子、ポリヌクレオチド等の固体支持体への架橋共有結合または物理的吸着からなる。あるいは、親和性タグまたは同様の構築物によるプローブの親和性カップリングが用いられ得る。接触もしくは非接触印刷、マスキング、またはフォトリソグラフィー等の周知の技法を使用することにより、各スポットの位置を規定することができる。概説については、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．（２００１，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２，１３−２９）及びＬａｌ  ｅｔ  ａｌ（２００２，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １５；７（１８  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１４３−９）を参照されたい。
【０１３９】
典型的には、アレイは、マイクロアレイである。「マイクロアレイ」とは、別個の領域が少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の密度を有する領域のアレイという意味を含む。マイクロアレイ中の領域は、典型的な寸法、例えば、約１０〜２５０μｍの範囲の直径を有し、そのアレイ内の他の領域から約同じ距離だけ離れている。アレイは、代わりに、マクロアレイまたはナノアレイであってもよい。
【０１４０】
好適な（上述の）結合分子が特定及び単離された時点で、当業者は、分子生物学の分野で周知の方法を使用してアレイを製造することができる。
【０１４１】
好ましくは、アレイは、本発明の第１の態様に記載の方法、及びそこに記載される実施形態のうちの１つ以上と一致する。
【０１４２】
本発明の第３の態様は、過敏性応答感作薬を特定するために、表Ａ（ｉ）、表Ａ（ｉｉ）、及び／または表Ａ（ｉｉｉ）に定義される群から選択される１つ以上の（好ましくは２つ以上の）バイオマーカーの併用を提供する。好ましくは、過敏性応答感作薬を特定するために、表Ａ（ｉ）及び表Ａ（ｉｉ）に定義されるバイオマーカーのすべてが集合的に使用される。好ましくは、この使用は、本発明の第１の態様に記載の方法、及びそこに記載される実施形態のうちの１つ以上と一致する。
【０１４３】
本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様に定義される１つ以上の（好ましくは、２つ以上の）結合部分の使用を提供する。好ましくは、過敏性応答感作薬を特定するために、表Ａ（ｉ）及び表Ａ（ｉｉ）に定義されるバイオマーカーのすべての結合部分が集合的に使用される。好ましくは、この使用は、本発明の第１の態様に記載の方法、及びそこに記載される実施形態のうちの１つ以上と一致する。
【０１４４】
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様に従う方法で使用するための分析キットであって、
Ａ）本発明の第２の態様に従うアレイ及び／または本発明の第１の態様に定義される１つ以上の結合部分と、
Ｂ）任意に、本発明の第１の態様に従う方法を行うための指示と、を含むか、またはそれからなるキットを提供する。
【０１４５】
分析キットは、１つ以上の対照薬を含み得る。好ましくは、分析キットは、本発明の第１の態様に定義される１つ以上の陰性対照薬及び／または１つ以上の陽性対照薬とともに上記の特徴を含むか、またはそれからなる。好ましくは、分析キットは、本発明の第１の態様に記載の方法、及びそこに記載される実施形態のうちの１つ以上と一致する。
【０１４６】
本発明の第６の態様は、患者における呼吸器Ｉ型過敏性反応（呼吸器喘息等）を治療または予防する方法であって、
（ａ）患者が曝露されるか、または曝露されている１つ以上の試験薬を提供するステップと、
（ｂ）本発明の第１の態様に提供される方法を使用して、ステップ（ａ）で提供された１つ以上の試験薬が呼吸器感作物質であるかを決定するステップと、
（ｃ）１つ以上の試験薬が呼吸器感作物質と特定された場合、その患者の、呼吸器感作物質と特定された１つ以上の試験薬への曝露を低減または予防し、かつ／または感作症状に適切な治療を提供するステップと、を含む、方法を提供する。
【０１４７】
好ましくは、患者が曝露されるか、または曝露されている１つ以上の試験薬は、患者が現在少なくとも月に１回、例えば、少なくとも２週間に１回、少なくとも週に１回、または少なくとも１日１回に曝露されている薬剤である。
【０１４８】
感作症状の治療は、短時間作用型ベータ２−アドレナリン受容体作動薬（ＳＡＢＡ）（サルブタモール等）、抗コリン薬（臭化イプラトロピウム等）、他のアドレナリン作動薬（吸入エピネフリン等）、コルチコステロイド（ベクロメタゾン等）、長時間作用型ベータ−アドレナリン受容体作動薬（ＬＡＢＡ）（サルメテロール及びフォルモテロール等）、ロイコトリエン拮抗薬（モンテルカスト及びザフィルルカスト等）、ならびに／またはコルチコステロイドに代わる別の好ましくない代替物であるマスト細胞安定剤（クロモリンナトリウム等）を含み得る。
【０１４９】
好ましくは、治療方法は、本発明の第１の態様に記載の方法、及びそこに記載される実施形態のうちの１つ以上と一致する。
【０１５０】
本発明の第７の態様は、本発明の第１の態様の方法を行う、例えば、ステップ（ｂ）、（ｄ）、及び／または（ｆ）の発現データを解釈し、それにより、１つ以上の試験薬が呼吸器感作物質であるかを決定するためのコンピュータプログラムを提供する。コンピュータプログラムは、プログラミングされたＳＶＭであり得る。コンピュータプログラムは、当業者に既知の好適なコンピュータ可読担体に記録され得る。好適なコンピュータ可読担体としては、コンパクトディスク（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ブルーレイ等）、フロッピーディスク、フラッシュメモリドライブ、ＲＯＭ、またはハードディスクドライブが挙げられ得る。コンピュータプログラムは、コンピュータプログラムの実行に好適なコンピュータにインストールされ得る。
【０１５１】
本発明のある特定の態様を具現する好ましい非限定的な例が以下の図を参照してこれから説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】化学的刺激後のＭＵＴＺ−３細胞のＣＤ８６発現。示されるデータは、化学的刺激（ｎ＝３）、４−アミノ安息香酸、ＤＭＳＯ、及び刺激されていない細胞（ｎ＝６）、及び過マンガン酸カリウム、２−アミノフェノール、ヘキシルシンナムアルデヒド、及び２−ヒドロキシエチルアクリレート（ｎ＝２）の平均であり、エラーバーは、標準偏差を示す。各刺激をその対応する媒体と比較するスチューデントｔ検定により統計的有意性を決定し、０．０５未満のｐを＊で示す。
【図２】呼吸器感作の予測のための予測バイオマーカーシグネチャーの確立。（Ａ）教師なし学習を使用して、データセットの表示を構築した。呼吸器感作物質（青色、ｎ＝２９）と呼吸器非感作物質（緑色、ｎ＝７４）との間の一方向ＡＮＯＶＡ  ｐ値フィルタリングによって特定された９９９個の転写物に基づいてＰＣＡを使用して、この方法を可視化した。（Ｂ）ｐ値フィルタリングによって特定されたこれらの９９９個の転写物を変数減少のためにアルゴリズムへの入力として使用した。６１０個の転写物を除去した後に、カルバック・ライブラー発散のブレークポイントを観察した。（Ｃ）残りの３８９個の転写物をＰＣＡへの入力変数として使用した。図に示されるように、訓練データでの呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質との完全な分離が達成された。
【図３】ＧＡＲＤ呼吸器予測シグネチャー（ＧＲＰＳ）を使用した独立した試験化合物の視覚的分類。（Ａ）非管理下の表示への入力としてＧＲＰＳの３８９個の遺伝子を使用して、バイオマーカーシグネチャー特定のために使用した基準化学物質（ｎ＝１０３）のパネルの３つの第１のＰＣＡ成分からＰＣＡ空間を構築した。これらの化合物がＰＣＡ成分に影響を及ぼすことを許容することなく、試験データセット（ｎ＝９２）の化学物質の各々をＰＣＡ空間にプロットした。（Ｂ）呼吸器感作物質（濃青色）または呼吸器非感作物質（濃緑色）のいずれかとして感作特性に従って試験データセット中の試料を着色した。訓練データ及び試験データの両方の第１のＰＣＡ成分に沿った呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質との分離を確認することができる。（Ｃ）訓練データセットをはっきりと見ることができるように、訓練データセットを取り除いた。
【図４】試験データセットのサポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類。教師ありマシン学習用のＳＶＭを使用してＧＲＰＳの予測子性能を検証した。ＳＶＭアルゴリズムを訓練データセット（ｎ＝１０３）の化合物に対する経験から誘導的に学習し、その後、それを適用して、試験データセット（ｎ＝７０、媒体対照を除く）の各個々の試料を予測した。ＲＯＣ曲線分析により予測性能を評価し、曲線下面積（ＡＵＣ）が０．９７であると推定した。
【図５】独立試験データセット中の呼吸器感作物質の分類及び遺伝子発現。ＳＶＭアルゴリズムを訓練データセット（ｎ＝１０３）の試料で再び訓練し、その後、それを適用して、独立試験データセット（ｎ＝７０、媒体対照を除く）の試料を分類した。独立試験データセット中の各個々の試料のＳＶＭ決定値を高いものから順にプロットし、感作能力（呼吸器感作物質＝紫色、呼吸器非感作物質＝濃緑色）に従って着色した。散布プロット内の点線は、呼吸器感作物質（ＳＶＭ決定値＝０未満）または呼吸器非感作物質（ＳＶＭ決定値＝０超）に分類するための閾値レベルを表す。ＧＲＰＳ内の転写物の相対発現量をヒートマップに示す。
【実施例】
【０１５３】
序文
背景：ある特定の低分子量（ＬＭＷ）化学化合物への曝露の繰り返しにより、皮膚または呼吸管におけるアレルギー反応の発症がもたらされ得る。多くの場合、ある特定のＬＭＷ化合物は、皮膚を選択的に感作させ、アレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）または呼吸管を引き起こし、職業性喘息（ＯＡ）を引き起こす。アレルギー疾患の発症を制限するために、現在、かかる反応を誘導することができる化学物質を正確に特定する予測アッセイの開発への努力が続けられている。しかしながら、わずかな数の有望な皮膚感作予測方法について説明されているが、現在のところ、化学物質を呼吸器感作物質として正確に分類することができる有効なインビトロまたはインビボ方法は存在しない。
【０１５４】
結果：最近、我々は、ゲノムバイオマーカーシグネチャーの測定に基づいて皮膚感作化学物質を分類するための新規の試験戦略としてインビトロベースのゲノムアレルゲン迅速検出（ＧＡＲＤ）アッセイを公開した。我々は、ＧＡＲＤアッセイの適用性ドメインを拡大して、呼吸器非感作物質と比較した呼吸器感作物質の３８９個の差次的に制御された遺伝子を含む別個のバイオマーカーシグネチャーの特定による呼吸器感作物質の分類も行っている。独立データセットを教師ありマシン学習と併用することにより、我々は、特定されたゲノムバイオマーカーが呼吸器感作物質を正確に分類することができることを示すアッセイを実証した。
【０１５５】
結論：我々は、呼吸器感作物質を分類するためのゲノムバイオマーカーシグネチャーを特定した。この新たに特定されたバイオマーカーシグネチャーを、皮膚感作物質を分類するための以前に特定された我々のバイオマーカーシグネチャーと組み合わせることにより、我々は、同じ試料で皮膚感作及び呼吸器感作の両方を予測する有力な能力を有する新規のインビトロ試験戦略を開発した。
【０１５６】
材料及び方法
化学物質
訓練データセットと集合的に名付けた選択された１０個の十分に特徴付けられた呼吸器感作物質及び２２個の呼吸器非感作物質を含む３２個の基準化学物質のパネルを使用して細胞を刺激し、予測ゲノムバイオマーカーシグネチャーを確立した。呼吸器感作物質は、ヘキサクロロ白金酸アンモニウム、過硫酸アンモニウム、エチレンジアミン、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、無水マレイン酸、メチレンジフェニルジイソシアネート、無水フタル酸、トルエンジイソシアネート、及び無水トリメリット酸であった。呼吸器非感作物質は、１−ブタノール、２−アミノフェノール、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ニトロ−１，４−フェニレンジアミン、４−アミノ安息香酸、クロロベンゼン、ジメチルホルムアミド、エチルバニリン、ホルムアルデヒド、ゲラニオール、ヘキシルシンナムアルデヒド、イソプロパノール、カトンＣＧ、サリチル酸メチル、ペニシリンＧ、二クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム、プロピレングリコール、Ｔｗｅｅｎ  ８０、硫酸亜鉛、ならびに媒体対照ジメチルスルホキシド及び水であった。さらに、独立試験データセットと集合的に名付けた６個の呼吸器感作物質及び１９個の呼吸器非感作物質を含む２５個の化学物質のパネルを使用して細胞を刺激し、特定された予測ゲノムバイオマーカーシグネチャーの検証のための独立試験セットを形成した。独立訓練データセットは、モデルの訓練中に含めた対照化学物質及びモデルの訓練中に見られなかった化学物質の両方から成った。呼吸器感作物質は、クロラミンＴ、エチレンジアミン、イソホロンジイソシアネート、無水フタル酸、ピペラジン、及び反応性オレンジであった。呼吸器非感作物質は、１−ブタノール、２，４−ジニトロクロロベンゼン、２−メルカプトベンゾチアゾール、ベンズアルデヒド、クロロベンゼン、シンナミルアルコール、フタル酸ジエチル、オイゲノール、グリセロール、グリオキサル、イソオイゲノール、乳酸、オクタン酸、フェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−フェニレンジアミン、レゾルシノール、サリチル酸、及びドデシル硫酸ナトリウムであった。すべての化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。細胞刺激前に、化学物質をＧＡＲＤ入力濃度になるまで水またはＤＭＳＯのいずれか中に溶解し、希釈した。ＤＭＳＯ中に溶解した化学物質の場合、ＤＭＳＯのウェル内濃度は、０．１％であった。各化学化合物の化学物質細胞毒性及びＧＡＲＤ入力濃度の確立の監視を前述のように［４１、４２］行った。手短に言えば、ＧＡＲＤ入力濃度を以下の決定スケジュールに従って決定した。非毒性可溶性化合物を５００ｕＭに相当する濃度で使用した。５００ｕＭでは不溶性の非毒性難溶性化合物を最も高い溶解濃度で使用した。毒性化合物を９０％の相対生存率（Ｒｖ９０）をもたらす濃度で使用した。最初に満たされた判断基準により、各化合物のＧＡＲＤ入力濃度が決定された。予測ゲノムバイオマーカーシグネチャーを確立するために使用した化合物のＧＡＲＤ入力濃度、感作効力、及び溶媒を表１に提示し、予測ゲノムバイオマーカーシグネチャーを検証するために使用した化合物については表２に提示す���。
【０１５７】
細胞培養物、表現型分析、化学物質への曝露、細胞回収、及びｍＲＮＡ単離
ヒト急性骨髄単球性白血病細胞株ＭＵＴＺ−３［６８、６９］をＬｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。細胞の維持、ＭＵＴＺ−３の化学的刺激、ならびにｍＲＮＡのその後の単離及びｃＤＮＡの調製のすべてを前述のように［４１、４２］行った。手短に言えば、化学的刺激前にフローサイトメトリーを使用してＭＵＴＺ−３の表現型制御を行い、細胞が未熟な状態であることを確認した。以下のＦＩＴＣ接合マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）：ＣＤ１ａ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＣＤ３４、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＧ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用した。以下のＰＥ接合マウスモノクローナル抗体：ＣＤ１４（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＩｇＧ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ヨウ化プロピジウム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）染色を使用して、細胞生存率を決定した。試料をＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ計器に走行させた。ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを取得し、ＦＣＳ発現Ｖ４（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を使用して分析した。前方散乱及び側方散乱特性に基づいてゲーティングを行って、細胞残屑及び生育不能細胞を排除し、アイソタイプ対照を使用して象限を確立した。化学物質への曝露中、細胞を２４ウェルプレート中に２００．０００細胞／ｍＬで播種し、ＧＡＲＤ入力濃度で化学化合物に曝露した。刺激した細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後に収集し、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により提供された標準化プロトコルを使用して、ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で単離した。並行して、ＣＤ８６のフローサイトメトリー分析により、これらの細胞の成熟状態の制御を行った。製造業者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）により提供された標準化プロトコルに従って、ｃＤＮＡの調製、ならびにＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のハイブリダイゼーション、洗浄、及び走査を行った。
【０１５８】
マイクロアレイデータ分析及び統計的方法
単一チャンネルアレイ正規化（ＳＣＡＮ）アルゴリズム［７０］を使用してＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイから得られた遺伝子発現データを正規化し、ＣｏｍＢａｔ［７１］経験ベイズ法を使用して異なる組の実験間の潜在的なバッチ効果を調整した。オープンソフトウェアＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｖ２．１４［７３］を追加のソフトウェアパッケージＳＣＡＮ．ＵＰＣ［７０］及びｓｖａ［７４］とともに使用して、正規化及びバッチ調整をＲ統計ソフトウェア［７２］で行った。正規化データをＱｌｕｃｏｒｅ  Ｏｍｉｃｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ３．０（Ｑｌｕｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）に取り込み、主成分分析（ＰＣＡ）［７５］を使用して可視化した。偽発見率（ＦＤＲ）［７６］を使用して予測子を一方向ＡＮＯＶＡ  ｐ値フィルタリングから選択して、呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質を比較する多重仮説試験を調整した。変数減少［４１，５２］のラッパーアルゴリズムを上位９９９個の予測子に適用して、バイオマーカーシグネチャーサイズをさらに低減及び精緻化した。変数減少アルゴリズムを修正して、受信者動作特性面積（ＡＵＣ  ＲＯＣ）［７７］を最大化するのではなく、カルバック・ライブラー誤差［５３］を最小限に抑えて、ＡＵＣ  ＲＯＣが１．０に到達した場合のシグネチャーの最適化を可能にした。変数減少後に選択された上位３８９個の予測子を「ＧＡＲＤ呼吸器予測シグネチャー」と集合的に指名した。変数減少のスクリプトを追加のパッケージｅ１０７１［７８］とともにＲにプログラミングした。前述の線形カーネル［４１］に基づいて、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）［７９］に基づく交差検証を使用して、予測ゲノムバイオマーカーシグネチャーを確立した方法を検証した。手短に言えば、訓練データセットを、刺激の７０％を含む新たな交差検証訓練データセットと刺激の３０％を含む交差検証試験データセットとに無作為に分けた。加えて、完全な訓練データセットにおいて見られるように呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質との間の割合を同じ割合に維持するように注意を払った。上述の一方向ＡＮＯＶＡ  ｐ値フィルタリングを使用して、新たな予測ゲノムバイオマーカーシグネチャーを交差検証訓練データセットから特定した。特定された予測バイオマーカーシグネチャーを使用して、交差検証訓練データセットの情報に基づいてＳＶＭを訓練した。ＳＶＭを追加のパッケージｅ１０７１を用いてＲ統計ソフトウェアにコンパイルした。その後、ＳＶＭモデルを使用して、交差検証試験データセット中の試料を予測した。バイオマーカー特定プロセスを２０回繰り返し、各個々の転写物が２０個の訓練データセットに含まれた頻度（検証コール頻度（ＶＣＦ）と称する）を計算することにより、特徴選択プロセスのロバスト性を評価した。［４６］に記載の独立試験データセットを使用して、未知の試料の予測の観点でのＧＲＰＳの予測性能を推定した。手短に言えば、可変入力としてＧＲＰＳを使用して、ＳＶＭを訓練データセットで訓練した。その後、ＳＶＭを使用して、訓練データセット中の試料を上述の交差検証について記載した方法と同じ方法で予測し、追加のパッケージＲＯＣＲ［８０］を使用してＲ統計環境下で決定されたＡＵＣ  ＲＯＣを使用して、モデルの予測性能を評価した。呼吸器感作物質または呼吸器非感作物質としての試料の分類は、複製レベルでのＳＶＭ決定値に基づいた。したがって、ある特定の化学的刺激の複製刺激のうちのいずれかが０を超えるＳＶＭ決定値を有する場合、化学物質を呼吸器感作物質に分類した。クーパー統計値［８１］を使用して、アッセイの精度、感度、及び選択性を決定した。ＭｅｔａＣｏｒｅ（商標）（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｒｅｕｔｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を使用して機能エンリッチメントを行うことにより、ＧＲＰＳの生物学的関連性を探索した。ｐ値フィルタリングからの上位９９９個の予測子をＭｅｔａＣｏｒｅ（商標）アルゴリズムへの入力として使用し、入力分子に関連した標準経路を探索することにより生物学的関連性を確立した。アレイデータは、受入番号Ｅ−ＭＥＸＰ−３７７３でＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ／）にアップロードされている。
【０１５９】
結果
刺激されていないＭＵＴＺ−３細胞及び化学的に刺激されたＭＵＴＺ−３細胞の表現型分析
化学物質で刺激する前に、フローサイトメトリーを使用して一般的な骨髄細胞マーカー及び樹状細胞マーカーの細胞発現量を測定することにより、細胞の品質を管理した。これらのマーカーは、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲを含んだ。結果は、以前に公開された表現型プロファイル［４１］と相関し、細胞の未熟な状態での維持に成功したことを確認した。化学的刺激後、１０個の呼吸器感作物質及び２０個の呼吸器非感作物質、ならびに媒体対照（表１）を含む基準化学物質のパネルを使用して、共刺激マーカーＣＤ８６の細胞表面発現レベルを測定することにより、細胞の一般的な成熟状態を再度検証し、結果を図１に提示する。刺激されていない細胞と比較した各刺激に対するＣＤ８６の化学的に誘導された上方制御は、数回の刺激後の細胞において明らかであった。しかしながら、複製刺激間の大きい標準偏差のため、呼吸器感作物質ヘキサクロロ白金酸アンモニウム及びグルタルアルデヒドにより誘導された制御のみが統計的に有意であると確認することができた（スチューデントｔ検定、ｐ＝０．０５未満）。その結果として、呼吸器感作の分類のための単一のバイオマーカーとしてＣＤ８６を使用したアッセイは、２０％の感度しかもたらさなかった。さらに、呼吸器非感作刺激物質２−アミノフェノール及びカトンＣＧにおいてＣＤ８６の上方制御も観察された。したがって、我々は、呼吸器化学感作物質を分類するためにＣＤ８６をＭＵＴＺ−３細胞株で単一のバイオマーカーとして使用することができないと結論付けた。しかしながら、呼吸器感作物質の多くが細胞培地中で難溶性であり、それ故に細胞毒性を誘導するのに十分な濃度で使用することができないため、ＣＤ８６の発現は、化学的刺激の生物学的利用能を確実なものにするために相補的品質管理の役割を果たすことができる。
【０１６０】
化学的に刺激されたＭＵＴＺ−３の転写プロファイリングによる予測ゲノムバイオマーカーシグネチャーの特定
ＭＵＴＺ−３細胞の化学的に誘導された変化を転写規模で調査して、呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質との間の最も差のある転写物を特定した。基準化学物質のパネルを使用して細胞を２４時間刺激した後、転写プロファイリングのためにｍＲＮＡを収集した。刺激は、１０個の異なる呼吸器感作物質、２０個の呼吸器非感作物質（陰性対照）、及び媒体対照（ＤＭＳＯ、蒸留水）を含んだ。４−アミノ安息香酸及び過マンガン酸カリウム以外、すべての刺激を生物学的に三連で行い、４−アミノ安息香酸は、内部制御のため６個の複製物で分析し、過マンガン酸カリウムは、欠陥アレイのため２個の複製物のみで分析した。加えて、媒体対照（ＤＭＳＯ及び蒸留水）を各々６個の複製物で分析した。試料の品質管理により、過硫酸アンモニウムの複製刺激のうちの１つが相当な外れ値であることが明らかになり、バイオマーカー発見を妨害しないようにそれを取り除く必要があった。要約すると、分析の準備が整ったデータセットは、１０３個のアレイからなり、各々、２９，１４１個の転写物の測定値を有した。
【０１６１】
遺伝子発現データをＱｌｕｃｏｒｅ  Ｏｍｉｃｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒに取り込み、主成分分析（ＰＣＡ）を使用して可視化した。我々は、データセットのノイズを低減し、かつ内在特性に基づいて予測子を選択するためにフィルタリング方法を組み合わせた特徴選択のための段階的アプローチと、各個々の予測子がどのように全体のシグネチャーと集合的に機能するかを考慮することによりシグネチャー中の遺伝子の数を低減するために変数減少に基づくラッパー方法とを適用した。フィルタリング方法は、呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質を比較する一方向ＡＮＯＶＡ分析によって決定されたｐ値に完全に基づいた。ラッパー方法は、繰り返し教師あり学習に基づいた。変数減少のアルゴリズムを社内で開発し［５２］、転写物のサブセットを反復的に抽出し、その後、一個抜き交差検証手順を使用してサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を訓練及び試験することよりこの転写物のサブセットを評価した。最も情報価値の低い変数を取り除き、分類モデルの最も高い性能が達成されるまでこのプロセスを繰り返した。計算的限界のため、およそ１０００個の遺伝子が、変数減少のアルゴリズムで入力として使用するのに適切な量の可能性のある予測子である。本データセットにおいて、予測子候補のこの事前選択により、９９９個の遺伝子がもたらされ、ｐ値は０．０２４以下であった。図２Ａに示されるように、これらの遺伝子は、呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質との間の区分を集合的に達成することができたが、これらの２つの群間にいくらかの重複が生じた。データが１０−６に至るｐ値を有する予測子候補を含んだにもかかわらず、それらのｐ値によりもたらされた順位で予測子の数をさらに低減しても、明らかな分離を達成しなかった。その後、社内で開発された変数減少のアルゴリズムを適用し、最も少ない情報しか提供しない予測子（遺伝子）を取り除いた。６１０個の予測子を除外したあときに、カルバック・ライブラー発散（ＫＬＤ）［５３］における極小値が観察された（図２Ｂ）。残りの３８９個の遺伝子を「ＧＡＲＤ呼吸器予測シグネチャー」（ＧＲＰＳ）と集合的に名付け、訓練データセットの呼吸器化学感作物質と呼吸器非感作物質とを区別するそれらの能力を図２Ｃに示す。これらの遺伝子のアイデンティティーを表Ａに列記する。バイオマーカーシグネチャーを確立した方法を検証するために、我々は、交差検証手順を行い、いくつかの方法に記載されるようにバイオマーカー発見中に使用した試料を訓練セットと試験セットとに無作為に分けた。このプロセスを２０回繰り返し、２０個の新たなバイオマーカーシグネチャーの各予測子転写物の頻度をロバスト性の尺度として使用した。この演習の結果を検証コール頻度（ＶＣＦ）として表にし、表Ａに要約する。
【０１６２】
予測性能の推定値としてＧＡＲＤ呼吸器予測シグネチャーを使用した独立試験化合物の視覚的分類
呼吸器感作物質の予測アッセイとしてのゲノムバイオマーカーシグネチャーの関連性を説明するために、呼吸器感作物質及び呼吸器非感作物質の両方を含む独立試験データセットを使用してＧＲＰＳの予測性能を検証した。独立試験データセットに含まれた化学化合物を表２に記載する。１−ブタノール、クロロベンゼン、エチレンジアミン、無水フタル酸、及び媒体対照（ＤＭＳＯ、蒸留水）等のモデル訓練中に使用した化合物のうちのいくつかを、対照として使用されるように独立試験データセットにも含めた。試料分類前に残りの化学物質をモデルで確認することができなかった。独立試験データセット中のすべての化学物質は、訓練データセットを含む刺激から時間的に分離されたさらなる刺激に基づいた。したがって、モデルを過剰適合するリスクを冒すことなく、ＧＲＰＳの特定中にモデルで確認されなかった化合物及び確認された化合物の両方を分類することができた。細胞を２４時間刺激した後、ｍＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡに変換し、マイクロアレイにハイブリダイズした。刺激は、６個の呼吸器感作物質、１９個の呼吸器非感作物質、及び媒体対照（ＤＭＳＯ、蒸留水）を含んだ。先の一組の実験［４１］の呼吸器非感作刺激を再使用し、生物学的に三連で行った。呼吸器非感作物質１−ブタノールと一緒に呼吸器感作物質で行った刺激は、新規のラウンドの刺激を含み、これを生物学的に二連で行った。化学物質クロロベンゼンを内部制御のために両セットに含め、それ故に合計５つの刺激を含んだ。加えて、媒体対照ＤＭＳＯ及び蒸留水を、それぞれ、１３個の複製物及び９個の複製物で分析した。要約すると、独立試験データセットは、９２個のアレイを構成した。方法論を強調するために試験データセットを使用して、未知の試料の可視化分類を行うプロセスを図３に連続的に示す。初期ステップで、訓練データセット、すなわち、予測ＧＲＰＳゲノムバイオマーカーシグネチャーを特定するために使用された基準化学物質のパネルを最初に使用して、ＰＣＡ空間を生成し、可変入力としてＧＲＰＳの３８９個の遺伝子を使用した。その後、ＰＣＡを空間内にフリーズさせ、これらの化合物がＰＣＡ成分に影響を及ぼすことを許容することなく、試験データセット中の化合物を各々この空間にプロットしたＰＣＡ成分（図３Ａ）。図３Ｂに示されるように、試験データセット中の試料の真のアイデンティティーの特定時に、訓練データ及び試験データの両方の第１のＰＣＡ成分に沿った呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質との明らかな分離を見ることができ、呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質との間のＧＰＲＳにおける遺伝子発現の類似性及びその構造の差異が試験データセットにも存在することを示す。図３Ｃは、訓練データセットにより生成されたフリーズしたＰＣＡ空間にプロットした試験データセットを示すが、解釈を助けるために訓練データセットを取り除いた。図に見られるように、呼吸器感作物質及び呼吸器非感作物質は、第２及び第３の主成分によって生成された超平面により分離されているように見え、ＧＲＰＳが独立試験データセットで見られなかった試料における呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質との区別を達成するための関連情報を明らかに含んでいることを示す。
【０１６３】
ＳＶＭの分類及びＧＲＰＳの予測性能
独立試験データセット中の試料を分類する連続的ステップで、教師ありマシン学習用のＳＶＭを使用して、視覚的分類物を二値分類モデルで刺激した。ＳＶＭを訓練データセットで訓練して、ＧＲＰＳ内での呼吸器感作物質と呼吸器非感作物質との間の遺伝子発現の構造の差異を認識した。訓練したＳＶＭモデルを適用して、呼吸器感作物質または呼吸器非感作物質のいずれかとして各個々の複製物レベルで独立試験データセット中の各試料を分類した。ＳＶＭからの出力であるＳＶＭ決定値を試験データセット中の試料の真のアイデンティティーと比較し、ＲＯＣ  ＡＵＣ分析を使用して予測子の性能を評価し、結果を図４に示す。ＳＶＭ分類は、線形カーネルに基づき、不偏最大マージン超平面がこれらの２つの群を分離し、それ故に、呼吸器感作物質としての分類の閾値は、０を超えるＳＶＭ決定値に相当する。図に示されるように、個々の刺激レベルでのＧＲＰＳの予測子性能がＲＯＣ曲線下面積０．９７であると推定した。試験データセット中の各化学化合物のＳＶＭ分類から得られた決定値を表３に提示する（ｎ＝７０、媒体対照を除く）。この表に提示されたデータを図５にさらに要約する。図５中、試料は、最も高いＳＶＭ値から最も低いＳＶＭ値の降順で分類されており、試験データセット中の各化合物のＳＶＭ決定値は、ＧＲＰＳ中の３８９個の転写物の個々の発現プロファイルと相関している。解釈を助けるために、図中の試料を感作能力（呼吸器感作物質＝紫色、呼吸器非感作物質＝濃緑色）に従って色付けし、分類の閾値を点線で示す。図に示されるように、いくらかの重複が観察されるが、呼吸器感作物質の大半は、呼吸器非感作物質に割り当てられた対応する値よりも高いＳＶＭ決定値に割り当てられ、これは、各群の大半の化合物間の発現プロファイルの差とも相関している。各化学物質の感作能力を決定及び分類するために、我々は、複製刺激のうちのいずれかが以前に公開されたプロトコル［４２］で決定された０を超えるＳＶＭ決定値を有する場合に、試験データセット中の任意の所与の試料が呼吸器感作物質に分類されるべきであることを提示するカットオフの使用を選択した。この判断基準に基づいて、クーパー統計値を使用して、ＧＲＰＳの精度、感度、及び特異度を、それぞれ、８４％、６７％、及び８９％と推定した。
【０１６４】
呼吸器感作物質に関連した標準経路及びＧＡＲＤ予測シグネチャー
ＭＵＴＺ−３細胞における呼吸器化学感作物質によって引き起こされた生物学的応答を調査するために、Ｍｅｔａｃｏｒｅ（商標）における機能エンリッチメント分析を使用してデータを分析した。ｐ値フィルタリングから選択した上位９９９個の遺伝子を、Ｍｅｔａｃｏｒｅ（商標）への入力として使用した。Ｍｅｔａｃｏｒｅ（商標）は、これらの９９９個の遺伝子のうち９４８個を一意のＩＤにマッピングすることができた。著しく制御された経路（ｐ＝０．０１未満）を表４に列記し、−ｌｏｇ（ｐ値）で順位付けし、統計的有意性が高い順に分類した。ＧＲＰＳ中に存在する遺伝子を[ ]で示す。これらの特定された著しく制御された経路の過半数は、制限された組の分子によって主に駆動される。最も密集度の高い経路は、酸化的リン酸化（２６個の分子）及びユビキノン代謝（１９個の分子）を含んでおり、酸化還元プロセス及び呼吸器電子伝達系機能等の細胞事象がこれらの研究されている化学物質の影響を大いに受けていることを示す。加えて、Ｔ細胞における阻害ＰＤ−１シグナル伝達、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩによる抗原提示、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の生成、ＩＬ−３３シグナル伝達経路等のそれほど著しく制御されていない経路のうちのいくつかは、免疫学的観点から関連性がある。注目すべきことに、これらの経路の多くの中心が先天性免疫と適応性免疫との間の架け橋であり、先天性免疫応答の関与が外来物質の認識によって引き起こされ、樹状細胞成熟及び特異的Ｔ細胞応答の活性化につながる。ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ複合体等の抗原提示関連分子の上方制御、ＣＤ８０及びＣＤ８６等の共刺激分子の上方制御、ならびに免疫応答の駆動に関与する経路を引き起こし、かつ協調することによるＴ細胞等の中心的存在とのクロストークを含むこのプロセスの重要な態様は、ＭＵＴＺ−３細胞株において十分に監視され、著しく制御される。注目すべきことに、活性化された経路は、非常に限定的な程度にのみＭＵＴＺ−３における皮膚感作物質によって活性化された経路と重複し（グランザイムＢ及びグランザイムＡシグナル伝達）［５４］、呼吸器感作物質及び皮膚感作物質が異なるシグナル伝達経路の関与に関わることを示す。
【０１６５】
考察
様々な化学物質が、皮膚及び呼吸管の両方でアレルギー性過敏性反応を誘導することができ、最終的にはアレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）または職業性喘息（ＯＡ）の臨床症状を引き起こす。皮膚感作を引き起こす化学物質と比較して呼吸器感作を誘導することができる化学物質の数ははるかに少ないが、後天性ＯＡに関連した健康及び生活の質に深刻な影響を与えるため、呼吸器化学感作物質の特定及び危険分類は、依然として重大な分野である。呼吸器感作物質を正確に特定する信頼できるアッセイの開発、ならびにそれらの皮膚感作物質との区別は困難であると証明されている。過去の研究では、我々は、皮膚感作化学物質の特定及びリスク評価のための動物試験に代わるインビトロ代替物としてのゲノムアレルゲン迅速検出（ＧＡＲＤ）アッセイの開発及び適用について説明した。ＧＡＲＤアッセイでは、ゲノム規模での転写プロファイリングによって測定された所定のゲノムバイオマーカーシグネチャーからの読み出しに基づいて、未知の試験化学物質を分類する。完全なトランスクリプトームの分析をもたらす高い多用途性を利用して、我々は、ＧＡＲＤの適用性ドメインが広がって代替のゲノムバイオマーカーシグネチャーの特定により呼吸器感作物質の危険分類も網羅すると仮定した。
【０１６６】
現在の研究では、我々は、ＧＡＲＤ呼吸器予測シグネチャー（ＧＲＰＳ）と名付けた異なるバイオマーカーシグネチャーを使用して呼吸器感作化学物質の分類を可能にするＧＡＲＤのさらなる開発を提示する。したがって、定義されたＧＲＰＳは、ＭＵＴＺ−３細胞を分類される未知の化合物で刺激する新規の組み合わせインビトロアッセイにおける使用が意図されている。注目すべきことに、２つのはっきりと異なるバイオマーカーシグネチャーを使用して、化合物を、皮膚感作物質、呼吸器感作物質、または非感作物質のいずれかに分類することができる。呼吸器感作及び皮膚感作の両方を誘導することができる化学物質を、そのようなものとして明確に分類する。
【０１６７】
呼吸器感作物質または呼吸器非感作物質のいずれかとして既知の一組の基準化学物質を使用して、ＧＲＰＳを特定した。その後、これらの２つの群における差別的に制御された遺伝子をＡＮＯＶＡ  ｐ値フィルタリングにより特定し、社内で開発された変数減少のラッパーアルゴリズムを使用してさらに最適化した。我々は、ＧＲＰＳ中の３８９個の遺伝子がゲノムバイオマーカーシグネチャーとして機能して、呼吸器感作化学物質と呼吸器非感作化学物質とを区別することができることを示唆する。ＧＲＰＳの予測性能の評価は、呼吸器感作物質の特定のためのゲノムバイオマーカーシグネチャーの信頼性を確立するのに重要である。この研究では、我々は、教師ありマシン学習用のサポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムを使用した。我々は、このモデルを訓練して、特定されたＧＲＰＳゲノムバイオマーカーシグネチャーにおける遺伝子発現データの構造及び類似性を認識し、このモデルで確認されていない化学物質を含む独立試験セットでこのモデルを刺激した。その後、我々は、このモデルを使用して、この確認されていない化学化合物を呼吸器感作物質または呼吸器非感作物質のいずれかとして二値分類した。この演習を行うことにより、我々は、正確な予測を達成するＧＲＰＳの潜在能力を実証した。ＲＯＣ  ＡＵＣ分析及びクーパー統計値を使用してＧＲＰＳの予測性能を推定し、０．９７のＲＯＣ曲線下面積、ならびにそれぞれ、６７％、８９％、及び８４％の感度、特異度、及び精度を達成した。これは、呼吸器感作を誘導する化学物質の危険分類の報告された最も高い精度である。
【０１６８】
現在のところ、我々は、何故ＧＲＰＳが予測時に皮膚感作物質のＧＰＳと同じ高さの感度に到達しないのかの考えられる説明についての仮説を立てることしかできない［４６］。これは、一部には、ＧＰＳと比較してＧＲＰＳのアッセイ開発中により少ない数の基準化合物しか使用しなかったことに起因し得るが、恐らく、別の考えられる説明を分子レベルで見つけることができ、すなわち、皮膚感作物質がＭＵＴＺ−３細胞における遺伝子発現のより強力な制御因子であるという説明を見つけることができる。それとは無関係に、分類のための読み出しとしての全ゲノムアレイの使用は、ＧＲＰＳを依然として非常に柔軟性のあるものにする。より多くの試料が分析されると、さらなる情報がこのアッセイに容易に組み入れられて、感度、特異度、及び精度を改善し、利用可能な化学化合物の多様性を反映するための方法を微調整することができる。
【０１６９】
ＭＵＴＺ−３への感作化学物質の生物学的影響をさらに探索するために、エンリッチメント分析を行った。データにおいて十分な有意性を達成するために、ＧＲＰＳの上位３８９個の遺伝子ではなく、ｐ値フィルタリングからの上位９９９個の遺伝子をＭｅｔａｃｏｒｅ（商標）ソフトウェアにおける入力として使用した。紛れもなく、呼吸器感作物質によって引き起こされた最も密集度の高い経路は、酸化還元プロセス及び呼吸器電子伝達系等の細胞事象に関与した（表４を参照のこと）。これらの分子は、ｐ値フィルタリング手順からの上位の遺伝子であり、ＧＲＰＳシグネチャーには存在しない。この点において、機能性（この場合、転写物の生物学的関連性を説明することを目的とする）とＧＲＰＳ予測プロファイル（独立試料の正確な分類を行うことを目的とする）とを区別することが重要である。酸化的リン酸化及びユビキノン代謝経路に関与する分子のうちのいくつかは、タンパク質複合体のサブユニットであり、それ故に空間的かつ時間的に連結している。この研究の特徴選択中に適用した変数減少手順は、変数の直交選択に基づいており、それ故に、直交情報に寄与しない特徴をこのプロセス中に取り除いた。したがって、例えば、分子複合体のサブユニットが同様の発現パターンを有する可能性があるため、著しく制御された経路のうちのいくつかがＧＲＰＳシグネチャーからの転写物を含まなかったか、または数個しか含まなかったことは驚くべきことではなく、予想されていることである。あまり活性化されていない経路のうちのいくつかに基づいて、化学的呼吸器アレルゲンへのＭＵＴＺ−３における生物学的応答は、最終的に細胞成熟をもたらす先天性免疫応答シグナル伝達経路の制御も伴い、抗原提示の強化及び他の免疫細胞との相互作用につながる。さらに、タンパク質アレルゲンへの呼吸器感作と以前に関連付けられていたシグナル伝達経路の使用の新規の所見は、化学アレルゲンに応答して呼吸管感作をもたらす生物学的プロセスに光を当てるであろう。したがって、ＧＲＰＳは、実際に、免疫学的機構的視点から関連性があり、呼吸器感作をもたらす生物学的事象を監視する転写物の測定を提供する。
【０１７０】
さらに、エンリッチメント分析の結果は、ＧＡＲＤアッセイについて提示された結果とともに、ＭＵＴＺ−３が皮膚感作物質及び呼吸器感作物質の両方の予測に好適なモデルであることを示す。免疫生物学的機構のいくつかの類似性にもかかわらず、皮膚感作と呼吸器感作との間に重大な機構的相違が存在する。皮膚感作が、Ｔｈ１細胞の誘導に主に関連しており、細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答ならびにＩＬ−２及びインターフェロン（ＩＦＮ）−γの分泌を促進する一方で、呼吸器感作は、一般に、ＣＤ４＋Ｔｈ２細胞を伴い、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３を特徴とする。タンパク質抗原への呼吸器感作が特異的ＩｇＥ抗体の産生によって引き起こされるが、化学的アレルゲンへの呼吸器アレルギーの発症中にＩｇＥ抗体がどのような役割を果たし、ＩｇＥ抗体の産生とは無関係の呼吸器感作が達成され得る機構が存在するかは依然として不明である［５５、５６］。ＩｇＥを必要とすることなく、誘導されたＴｈ２応答が呼吸器感作の発症を支援するのに十分であり得ることが示唆されている［５７］。Ｔ細胞応答に明らかな差異があるが、樹状細胞（ＤＣ）活性化は、皮膚感作及び呼吸器感作の両方に共通している。その結果として、ＤＣは、生体異物化合物に応答した免疫応答の開始、調節、及び分極中のそれらの生理学的役割のため、皮膚感作及び呼吸器感作の両方の観点でアッセイの開発の天然標的である。ＭＵＴＺ−３細胞株は、発現プロファイル及び特異的Ｔ細胞応答を活性化する能力の観点で、初代樹状細胞（ＤＣ）と似ている［４５］。初代ＤＣと比較して、ＭＵＴＺ−３は、標準化プロトコルを使用して容易に成長し、持続可能な細胞源を提供し、このアッセイをハイスループット形式に高める機会を提供する。
【０１７１】
皮膚感作及び呼吸器感作の両方のアッセイの開発に即して、命名法の裏にある形式的意味を認識することが重要である。他［２４、５８〜６０］と同様に、我々は、この研究において、初期曝露の経路ではなく免疫学的応答の局所部位を示す専門用語を使用する。例えば、呼吸管の感作が関連化学物質への皮膚曝露後にも生じ得ることが示されている［６１〜６３］。一般に、ある特定の化学化合物は、皮膚または呼吸管を選択的に感作させる。しかしながら、ある特定の状況下で、かつ免疫学的に感染しやすい個体において、いくつかの化学物質は、両方の種類の感作を引き起こすことが示されている。例えば、化学物質トリグリシジルイソシアヌレート（ＴＧＩＣ）がＯＡ及びＡＣＤの両方を引き起こすことが示されている［６４］。
【０１７２】
最後に、ＧＡＲＤアッセイのアプローチは、他の代替方法と比較して、いくつかの利点を有する。我々のデータ駆動型方法論を使用して、我々は、呼吸器感作物質がどのように感染しやすい個体において免疫学的応答を誘発するかの正確な機構に関する現在の知識不足に関連した問題を回避することができた。第２に、トランスクリプトーム規模でのアプローチによって得られた大量の情報は、呼吸器感作プロセスに関与する特異的シグナル伝達または代謝経路等の分子機構を解明するさらなる機会を提供する。
【０１７３】
この研究の主な目的は、呼吸器感作の予測のために、動物実験の減少、改良、及び代用という３大Ｒの原理に従ってインビトロ方法を開発することであった。モデルを一組の基準化学物質で訓練することにより、我々は、未知の化学物質が呼吸器非感作物質または呼吸器感作物質として挙動する可能性があるかを決定するツールを提示する。将来的には、化学物質が呼吸管においてどのように感作を引き起こすかの現在の知識不足が補われ続けているため、皮膚感作の有害転帰経路（ＡＯＰ）の策定［６７］と同様の意見の一致が呼吸器感作物質の試験においても現実になり得る。その結果、ＧＲＰＳは、ＤＣ成熟の評価に有用な統合試験戦略（ＩＴＳ）の魅力的な部分になるであろう。
【０１７４】
結論として、この研究は、皮膚感作物質を評価するための前述のＧＡＲＤアッセイを補完するＭＵＴＺ−３細胞中の呼吸器化学感作物質の分類のための予測バイオマーカーシグネチャーを提示する。同じ試料における２つの異なる終点を試験する能力により、動物実験の減少、改良、及び代用という３大Ｒの原理に準拠するインビトロ試験戦略における化学物質の安全性を評価するための魅力的かつ現在に至るまで特有のアッセイが提供される。
【０１７５】
参考文献
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１１．Ｂｈａｒａｄｗａｊ  Ａ，Ａｇｒａｗａｌ  ＤＫ（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ：ａ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｄｒｅａｍ  ｏｒ  ａ  ｃｌｏｓｅ  ｒｅａｌｉｔｙ？  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４：４９５−５１１．
１２．Ｅｌｉａｓ  ＪＡ，Ｚｈｕ  Ｚ，Ｃｈｕｐｐ  Ｇ，Ｈｏｍｅｒ  ＲＪ（１９９９）Ａｉｒｗａｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４：１００１−１００６．
１３．Ｋｏｐｆｅｒｓｃｈｍｉｔｔ−Ｋｕｂｌｅｒ  ＭＣ，Ａｍｅｉｌｌｅ  Ｊ，Ｐｏｐｉｎ  Ｅ，Ｃａｌａｓｔｒｅｎｇ−Ｃｒｉｎｑｕａｎｄ  Ａ，Ｖｅｒｖｌｏｅｔ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ａｓｔｈｍａ  ｉｎ  Ｆｒａｎｃｅ：ａ  １−ｙｒ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｏｉｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ａｓｔｈｍｅｓ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｎｅｌｓ  ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ  １９：８４−８９．
１４．Ｍｕｎｏｚ  Ｘ，Ｃｒｕｚ  ＭＪ，Ｏｒｒｉｏｌｓ  Ｒ，Ｂｒａｖｏ  Ｃ，Ｅｓｐｕｇａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ａｓｔｈｍａ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ  ｓａｌｔｓ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ．Ｃｈｅｓｔ  １２３：２１２４−２１２９．
【０１７７】
１５．Ｏｒｒｉｏｌｓ  Ｒ，Ｃｏｓｔａ  Ｒ，Ａｌｂａｎｅｌｌ  Ｍ，Ａｌｂｅｒｔｉ  Ｃ，Ｃａｓｔｅｊｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｒｅｐｏｒｔｅｄ  ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ｃａｔａｌｏｎｉａ．Ｏｃｃｕｐ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｅｄ  ６３：２５５−２６０．
１６．Ｖｅｒｓｔｒａｅｌｅｎ  Ｓ，Ｂｌｏｅｍｅｎ  Ｋ，Ｎｅｌｉｓｓｅｎ  Ｉ，Ｗｉｔｔｅｒｓ  Ｈ，Ｓｃｈｏｅｔｅｒｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２２：１４１９−１４３１．
１７．Ｐａｕｌｕｈｎ  Ｊ，Ｅｉｄｍａｎｎ  Ｐ，Ｍｏｈｒ  Ｕ（２００２）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｔｏ  １，６−ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ（ＨＤＩ）：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｍｅｒ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｏｆ  ＨＤＩ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １７１：１４７−１６０．
１８．Ｈｉｌｔｏｎ  Ｊ，Ｄｅａｒｍａｎ  ＲＪ，Ｂｏｙｌｅｔｔ  ＭＳ，Ｆｉｅｌｄｉｎｇ  Ｉ，Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ：ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １６：１６５−１７０．
１９．Ｄｅａｒｍａｎ  ＲＪ，Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  ＤＡ，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ（１９９２）Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｏｎ  ｓｅｒｕｍ  ＩｇＥ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １２：３１７−３２３．
２０．Ａｒｔｓ  ＪＨ，Ｄｒｏｇｅ  ＳＣ，Ｓｐａｎｈａａｋ  Ｓ，Ｂｌｏｋｓｍａ  Ｎ，Ｐｅｎｎｉｎｋｓ  ＡＨ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＩｇＥ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ  ａｎｄ  Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｄｅｒｍａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １１７：２２９−２３４．
【０１７８】
２１．Ｗａｒｂｒｉｃｋ  ＥＶ，Ｄｅａｒｍａｎ  ＲＪ，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ（２００２）Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｏｔａｌ  ｓｅｒｕｍ  ＩｇＥ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ  ｒａｔ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２２：１−１１．
２２．Ｄｅａｒｍａｎ  ＲＪ，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｈａｚａｒｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｌｌｅｒｇｙ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  
２１：１５３−１６３．
２３．Ｄｅａｒｍａｎ  ＲＪ，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ（１９９９）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９：５６−６３．
２４．Ｖａｎｏｉｒｂｅｅｋ  ＪＡ，Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ  Ｍ，Ｖａｎｈｏｏｒｅｎ  ＨＭ，Ｄｅ  Ｖｏｏｇｈｔ  Ｖ，Ｎｅｍｅｒｙ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔｈｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒｉｍｅｌｌｉｔｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ，ａ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ，ａｎｄ  ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ，ａ  ｄｅｒｍａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７：１０９０−１０９７．
２５．Ｓｃｈｅｅｒｅｎｓ  Ｈ，Ｂｕｃｋｌｅｙ  ＴＬ，Ｄａｖｉｄｓｅ  ＥＭ，Ｇａｒｓｓｅｎ  Ｊ，Ｎｉｊｋａｍｐ  ＦＰ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｃｈｅａｌ  ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５４：８５８−８６５．
【０１７９】
２６．（ＥＵ）Ｄ（２０１０）ＤＩＲＥＣＴＩＶＥ  ２０１０／６３／ＥＵ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＰＡＲＬＩＡＭＥＮＴ  ＡＮＤ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＯＵＮＣＩＬ  ｏｆ  ２２  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１０  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ．
２７．Ｖｅｒｓｔｒａｅｌｅｎ  Ｓ，Ｎｅｌｉｓｓｅｎ  Ｉ，Ｈｏｏｙｂｅｒｇｈｓ  Ｊ，Ｗｉｔｔｅｒｓ  Ｈ，Ｓｃｈｏｅｔｅｒｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ＴＨＰ−１  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ（ｎｏｎ−）ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２３：１１５１−１１６２．
２８．Ｖｅｒｓｔｒａｅｌｅｎ  Ｓ，Ｎｅｌｉｓｓｅｎ  Ｉ，Ｈｏｏｙｂｅｒｇｈｓ  Ｊ，Ｗｉｔｔｅｒｓ  Ｈ，Ｓｃｈｏｅｔｅｒｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｆｔｅｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ（ｎｏｎ−）ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２５５：１５１−１５９．
２９．Ｖｅｒｓｔｒａｅｌｅｎ  Ｓ，Ｎｅｌｉｓｓｅｎ  Ｉ，Ｈｏｏｙｂｅｒｇｈｓ  Ｊ，Ｗｉｔｔｅｒｓ  Ｈ，Ｓｃｈｏｅｔｅｒｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｆｔｅｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ（ｎｏｎ−）ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ  １８５：１６−２２．
３０．Ｈｕａｎｇ  Ｓ，Ｗｉｓｚｎｉｅｗｓｋｉ  Ｌ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓ，Ｒｏｇｇｅｎ  Ｅ（２０１３）Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ３Ｄ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ（ＭｕｃｉｌＡｉｒ）ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２７：１１５１−１１５６．
【０１８０】
３１．Ｌａｌｋｏ  ＪＦ，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ，Ｄｅａｒｍａｎ  ＲＪ，Ｇｅｒｂｅｒｉｃｋ  ＧＦ，Ｓａｒｌｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２５：４３３−４４５．
３２．Ｉｓｏｌａ  Ｄ，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ，Ｓａｒｌｏ  Ｋ，Ｌａｌｋｏ  Ｊ，Ｓｉｐｅｓ  ＩＧ（２００８）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ａｓｔｈｍａ：ｗｈａｔ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｋｅｙ  ａｒｅａｓ  ｏｆ  ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ？  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２８：２４９−２５３．
３３．Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ，Ａｇｉｕｓ  Ｒ，Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  ＤＡ，Ｃｏｒｓｉｎｉ  Ｅ，Ｃｕｌｌｉｎａｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｌｌｅｒｇｙ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｈａｚａｒｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＥＣＶＡＭ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ６０．Ａｌｔｅｒｎ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  ３５：２４３−２６５．
３４．Ｍｅｈｌｉｎｇ  Ａ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  Ｔ，Ｅｌｔｚｅ  Ｔ，Ｋｏｌｌｅ  Ｓ，Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎｏｎ−ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ８６：１２７３−１２９５．
３５．Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  ＤＡ，Ｅｖａｎｓ  Ｐ，Ｆｉｅｌｄｅｒ  ＲＪ，Ｇｅｒｂｅｒｉｃｋ  ＧＦ，Ｄｅａｒｍａｎ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ｃｏｎｄｕｃｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ４０：５９３−５９８．
【０１８１】
３６．Ａｓｈｉｋａｇａ  Ｔ，Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙ，Ｈｉｒｏｔａ  Ｍ，Ｙｏｎｅｙａｍａ  Ｋ，Ｉｔａｇａｋｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ  ｕｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ：ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ（ｈ−ＣＬＡＴ）．Ｉ．  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈ−ＣＬＡＴ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２０：７６７−７７３．
３７．Ｎｕｋａｄａ  Ｙ，Ａｓｈｉｋａｇａ  Ｔ，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｈ，Ｓｏｎｏ  Ｓ，Ｍｕｇｉｔａ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ（ｈ−ＣＬＡＴ）．Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ６５：３４３−３５３．
３８．Ｇｅｒｂｅｒｉｃｋ  ＧＦ，Ｖａｓｓａｌｌｏ  ＪＤ，Ｂａｉｌｅｙ  ＲＥ，Ｃｈａｎｅｙ  ＪＧ，Ｍｏｒｒａｌｌ  ＳＷ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ８１：３３２−３４３．
３９．Ｎａｔｓｃｈ  Ａ（２０１０）Ｔｈｅ  Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｓ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ−−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ａｎｄ  ａ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  １１３：２８４−２９２．
４０．Ａｎｄｒｅａｓ  Ｎ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｂ，Ｌｅｓｌｉｅ  Ｆ，Ｆｒａｎｋ  Ｇ，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅ  ｉｎｔｒａ−ａｎｄ  ｉｎｔｅｒ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＫｅｒａｔｉｎｏＳｅｎｓ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｒｉｎｇ−ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｆｉｖｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２５：７３３−７４４．
【０１８２】
４１．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈ，Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔ  Ｍ，Ａｌｂｒｅｋｔ  ＡＳ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ（２０１１）Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １２：３９９．
４２．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈ，Ａｌｂｒｅｋｔ  ＡＳ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ，Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔ  Ｍ（２０１３）Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２７：１１６３−１１６９．
４３．Ｓａｎｔｅｇｏｅｔｓ  ＳＪ，Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ  ＡＪ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｕｉｓ  ＰＣ，Ｌｏｕｇｈｅｅｄ  ＳＭ，Ｆｌｕｉｔｓｍａ  ＤＭ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａ  ＣＤ３４（＋）ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ＣＤ１４（＋）ＣＤ１１ｂ（＋）Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ８０：１３３７−１３４４．
４４．Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ  ＡＪ，Ｓｏｍｂｒｏｅｋ  ＣＣ，Ｄｅ  Ｇｒｕｉｊｌ  ＴＤ，Ｇｒａｕｓ  ＹＭ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  ＨＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＭＵＴＺ−３，ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＣＤ３４＋  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  １００：７０１−７０３．
４５．Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｋ，Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔ  Ｍ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ（２００６）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ＭＵＴＺ−３，ａ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｃｔｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１７：１５６−１６６．
【０１８３】
４６．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈ，Ｒｙｄｎｅｒｔ  Ｆ，Ｋｕｈｎｌ  Ｊ，Ｓｃｈｅｐｋｙ  Ａ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ−−ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  １３９：３６２−３７０．
４７．Ｈａｎｅｋｅ  ＫＥ，Ｔｉｃｅ  ＲＲ，Ｃａｒｓｏｎ  ＢＬ，Ｍａｒｇｏｌｉｎ  ＢＨ，Ｓｔｏｋｅｓ  ＷＳ（２００１）ＩＣＣＶＡＭ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ．Ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｉｎｔｅｒａｇｅｎｃｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｒｅｇｕｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３４：２７４−２８６．
４８．Ｖａｎｏｉｒｂｅｅｋ  ＪＡ，Ｍａｎｄｅｒｖｅｌｔ  Ｃ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＡＲ，Ｈｏｅｔ  ＰＨ，Ｘｕ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｖａｌｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ：Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅｄ  ａｎ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｏｆ  ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ａｓｔｈｍａ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ７６：３３８−３４６．
４９．Ｈｏｌｓａｐｐｌｅ  ＭＰ，Ｊｏｎｅｓ  Ｄ，Ｋａｗａｂａｔａ  ＴＴ，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ，Ｓａｒｌｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ９１：４−１３．
５０．Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ，Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  ＤＡ，Ｂｕｔｌｅｒ  Ｍ，Ｇａｍｅｒ  Ａ，Ｇａｒｒｉｇｕｅ  ＪＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｏｔｅｎｃｙ：ｐｒｏｐｏｓａｌｓ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ４１：１７９９−１８０９．
【０１８４】
５１．ＯＥＣＤ（２００２）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ４２９：Ｓｋｉｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ：Ｌｏｃａｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ  Ａｓｓａｙ（２００２）．
５２．Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ａ，Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ，Ｋｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ  Ｍ，Ｒｏｓｅ  Ｃ，Ｆｅｒｎｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｒｕｍ  ｐｏｒｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８：１４２５２−１４２５７．
５３．Ｋｕｌｌｂａｃｋ  Ｓ，Ｌｅｉｂｌｅｒ  ＲＡ（１９５１）Ｏｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２２：７９−８６．
５４．Ａｌｂｒｅｋｔ  ＡＳ，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈ，Ｂｏｒｊｅ  Ａ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  Ｃ，Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔ  Ｍ（２０１４）Ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ＭＵＴＺ−３  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｏｔｅｎｃｙ．ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １５：５．
５５．Ｃａｒｔｉｅｒ  Ａ，Ｇｒａｍｍｅｒ  Ｌ，Ｍａｌｏ  ＪＬ，Ｌａｇｉｅｒ  Ｆ，Ｇｈｅｚｚｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ａｓｔｈｍａ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８４：５０７−５１４．
【０１８５】
５６．Ｃｕｌｌｉｎａｎ  Ｐ（１９９８）Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ａｓｔｈｍａ，ＩｇＥ  ａｎｄ  ＩｇＧ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２８：６６８−６７０．
５７．Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ，Ｄｅａｒｍａｎ  ＲＪ，Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  ＤＡ，Ｂｏｖｅｒｈｏｆ  ＤＲ（２０１４）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｌｌｅｒｇｙ：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ３１８：３２−３９．
５８．Ｖａｎｏｉｒｂｅｅｋ  ＪＡ，Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ  Ｍ，Ｃｅｕｐｐｅｎｓ  ＪＬ，Ｖｅｒｂｅｋｅｎ  ＥＫ，Ｎｅｍｅｒｙ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｐｒｉｏｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ８０：３１０−３２１．
５９．Ｓａｉｌｓｔａｄ  ＤＭ，Ｗａｒｄ  ＭＤ，Ｂｏｙｋｉｎ  ＥＨ，Ｓｅｌｇｒａｄｅ  ＭＫ（２００３）Ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ（ＴＭＡ）ｆｒｏｍ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ（ＤＮＦＢ）．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １９４：１４７−１６１．
６０．Ｐａｕｌｕｈｎ  Ｊ（２００３）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｔｒｉｍｅｌｌｉｔｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｉｎ  Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ  ｒａｔｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １９４：１−１７．
【０１８６】
６１．Ｋａｒｏｌ  ＭＨ，Ｈａｕｔｈ  ＢＡ，Ｒｉｌｅｙ  ＥＪ，Ｍａｇｒｅｎｉ  ＣＭ（１９８１）Ｄｅｒｍａｌ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＤＩ）ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５８：２２１−２３０．
６２．Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ，Ｄｅａｒｍａｎ  ＲＪ（２００２）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｌｌｅｒｇｙ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩｇＥ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １８１−１８２：３１１−３１５．
６３．Ｂｅｌｌｏ  Ｄ，Ｈｅｒｒｉｃｋ  ＣＡ，Ｓｍｉｔｈ  ＴＪ，Ｗｏｓｋｉｅ  ＳＲ，Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ  ＲＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｋｉｎ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ：ｒｅａｓｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｃｅｒｎ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  １１５：３２８−３３５．
６４．Ｍｅｕｌｅｍａｎ  Ｌ，Ｇｏｏｓｓｅｎｓ  Ａ，Ｌｉｎｄｅｒｓ  Ｃ，Ｒｏｃｈｅｔｔｅ  Ｆ，Ｎｅｍｅｒｙ  Ｂ（１９９９）Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｒｉｇｌｙｃｉｄｙｌｉｓｏｃｙａｎｕｒａｔｅ（ＴＧＩＣ）ｗｉｔｈ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ５４：７５２−７５６．
６５．Ｃａｒｙ  Ｒ，Ｄｏｂｓｏｎ  Ｓ，Ｄｅｌｉｃ  Ｊ（１９９９）Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  １５（ＣＩＣＡＤ）：１，２−ＤＩＡＭＩＮＯＥＴＨＡＮＥ（ＥＴＨＹＬＥＮＥＤＩＡＭＩＮＥ）Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．
【０１８７】
６６．Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅ（２００５）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  Ｒｉｓｋ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｂｕｒｅａｕ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｍｉｓｓｉｏｎ．１５９  ｐ．
６７．ＯＥＣＤ（２０１２）Ｔｈｅ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  Ｓｋｉｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐａｒｔ  １：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｎｏ．  １６８．
６８．Ｈｕ  ＺＢ，Ｍａ  Ｗ，Ｚａｂｏｒｓｋｉ  Ｍ，ＭａｃＬｅｏｄ  Ｒ，Ｑｕｅｎｔｍｅｉｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，ＭＵＴＺ−２  ａｎｄ  ＭＵＴＺ−３．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０：１０２５−１０４０．
６９．Ｑｕｅｎｔｍｅｉｅｒ  Ｈ，Ｄｕｓｃｈｌ  Ａ，Ｈｕ  ＺＢ，Ｓｃｈｎａｒｒ  Ｂ，Ｚａｂｏｒｓｋｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＭＵＴＺ−３，ａ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ａｎｄ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８９：６０６−６１２．
７０．Ｐｉｃｃｏｌｏ  ＳＲ，Ｓｕｎ  Ｙ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＪＤ，Ｌｅｎｂｕｒｇ  ＭＥ，Ｂｉｌｄ  ＡＨ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓａｍｐｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ−ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｗｏｒｋｆｌｏｗｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １００：３３７−３４４．
【０１８８】
７１．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＷＥ，Ｌｉ  Ｃ，Ｒａｂｉｎｏｖｉｃ  Ａ（２００７）Ａｄｊｕｓｔｉｎｇ  ｂａｔｃｈ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｂａｙｅｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ８：１１８−１２７．
７２．Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ（２０１４）Ｒ：Ａ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．
７３．Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ  ＲＣ，Ｃａｒｅｙ  ＶＪ，Ｂａｔｅｓ  ＤＭ，Ｂｏｌｓｔａｄ  Ｂ，Ｄｅｔｔｌｉｎｇ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ｏｐｅｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ５：Ｒ８０．
７４．Ｌｅｅｋ  ＪＴ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＷＥ，Ｐａｒｋｅｒ  ＨＳ，Ｊａｆｆｅ  ＡＥ，Ｓｔｏｒｅｙ  ＪＤ  ｓｖａ：Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．６．０．
７５．Ｒｉｎｇｎｅｒ  Ｍ（２００８）Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ？  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：３０３−３０４．
【０１８９】
７６．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｙ  ＨＹ（１９９５）Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ）５７：１２．
７７．Ｌａｓｋｏ  ＴＡ，Ｂｈａｇｗａｔ  ＪＧ，Ｚｏｕ  ＫＨ，Ｏｈｎｏ−Ｍａｃｈａｄｏ  Ｌ（２００５）Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｉｎｆｏｒｍ  ３８：４０４−４１５．
７８．Ｄｉｍｉｔｒｉａｄｏｕ  Ｅ，Ｈｏｒｎｉｋ，Ｋ．，Ｌｅｉｓｃｈ，Ｆ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｇｅｓｓｅｌ，Ａ．（２０１１）ｅ１０７１：Ｍｉｓｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（ｑ１０７１）．ＴＵ  Ｗｉｅｎ  Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １６  ｈｔｔｐ：／／ＣＲＡＮ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅ＝ｅ１０７１．
７９．Ｃｏｒｔｅｓ  ＣＶ，Ｖ．（１９９５）Ｓｕｐｐｏｒｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ２０：２７３−２９７．
８０．Ｓｉｎｇ  Ｔ，Ｓａｎｄｅｒ  Ｏ，Ｂｅｅｒｅｎｗｉｎｋｅｌ  Ｎ，Ｌｅｎｇａｕｅｒ  Ｔ（２００５）ＲＯＣＲ：ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  Ｒ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：３９４０−３９４１．
８１．Ｃｏｏｐｅｒ  ＪＡ，２ｎｄ，Ｓａｒａｃｃｉ  Ｒ，Ｃｏｌｅ  Ｐ（１９７９）Ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｖａｌｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｅｓｔｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３９：８７−８９．
【０１９０】
表Ａ．ＧＰＲＳ予測シグネチャーのバイオマーカー
【０１９１】
【表１】
2018505655.tif 000003
【０１９２】
【表２】
2018505655.tif 000004
【０１９３】
【表３】
2018505655.tif 000005
【０１９４】
【表４】
2018505655.tif 000006
【０１９５】
【表５】
2018505655.tif 000007
【０１９６】
【表６】
2018505655.tif 000008
【０１９７】
【表７】
2018505655.tif 000009
【０１９８】
【表８】
2018505655.tif 000010
【０１９９】
【表９】
2018505655.tif 000011
【０２００】
【表１０】
2018505655.tif 000012
【０２０１】
【表１１】
2018505655.tif 000013
【０２０２】
【表１２】
2018505655.tif 000014
【０２０３】
この表は、一方向ＡＮＯＶＡ  ｐ値フィルタリング及び変数減少によって特定されたＧＲＰＳにおける予測子遺伝子を示す。可能な場合、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤを遺伝子識別子として使用した。Ｈｕｍａｎ  ＳＴ  １．０アレイ用のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットＩＤを提供する。
１検証コール頻度（％）は、交差検証によって得られた２０個のバイオマーカーシグネチャー間での各予測子転写物の発生について説明する。
【０２０４】
【表１３】
2018505655.tif 000015
【０２０５】
【表１４】
2018505655.tif 000016
【０２０６】
【表１５】
2018505655.tif 000017
【０２０７】
この表は、呼吸器感作物質に曝露されたＭＵＴＺ−３細胞中のＧＲＰＳ予測子遺伝子の発現傾向（すなわち、上方制御または下方制御）を示す。Ｈｕｍａｎ  ＳＴ  １．０アレイ用のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットＩＤを提供する。
【０２０８】
【表１６】
2018505655.tif 000018
【０２０９】
＊化学物質カトンＣＧは、化合物ＭＣとＭＣＩの２つの混合物である。この混合物の濃度を％で示す。
【０２１０】
【表１７】
2018505655.tif 000019
【０２１１】
【表１８】
2018505655.tif 000020
【０２１２】
１各化学化合物の感作特性の分類は、複製刺激のうちのいずれかが０を超えるＳＶＭ決定値を有する場合に試験データセット中の任意の所与の試料が呼吸器感作物質に分類されるべきであることを提示する規則に基づいた。
【０２１３】
【表１９】
2018505655.tif 000021
【０２１４】
【表２０】
2018505655.tif 000022
【０２１５】
１[ ]で示した分子は、ＧＲＰＳ中に存在する。
【０２１６】
表５．サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム
１．未知のデータのＳＶＭ予測のＲスクリプト
＃提出したスクリプトは、ｔｒａｉｎｄａｔａ．ｔｘｔ、ｔｅｓｔｄａｔａ．ｔｘｔ、及びｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓｉｇｎａｔｕｒｅ．ｔｘｔに書かれており、ファイル例を提供する。
【０２１７】
【表２１】
2018505655.tif 000023
【０２１８】
【表２２】
2018505655.tif 000024
【０２１９】
２．変数減少を使用した予測シグネチャー確立のためのＲスクリプト
【０２２０】
【表２３】
2018505655.tif 000025
【０２２１】
【表２４】
2018505655.tif 000026
【０２２２】
【表２５】
2018505655.tif 000027
【０２２３】
３．スクリプト１及び２によって読み出される様々なＲ機能
【０２２４】
【表２６】
2018505655.tif 000028
【０２２５】
【表２７】
2018505655.tif 000029
【０２２６】
【表２８】
2018505655.tif 000030
【０２２７】
【表２９】
2018505655.tif 000031
【０２２８】
【表３０】
2018505655.tif 000032
【０２２９】
【表３１】
2018505655.tif 000033
【０２３０】
４．訓練データ、試験データ、及び予測シグネチャーのファイル例
【０２３１】
【表３２】
2018505655.tif 000034
【０２３２】
【表３３】
2018505655.tif 000035
【０２３３】
４．３．予測シグネチャー。この表をｔａｂ  ｄｅｌｉｍｉｔｅｄ．ｔｘｔ−ｆｉｌｅとして保存すべきである。
【０２３４】
【表３４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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