(57)【要約】  本発明は、Ｃ／ＥＢＰβのホスホアクセプタードメイン内のアミノ酸のリン酸化を阻害するペプチドならびに炎症および線維症の治療へのその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐを含み、少なくとも１つのアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−β（Ｃ／ＥＢＰβ）のトレオニン２６６（Ｔｈｒ２６６）のリン酸化を阻害することが可能である、単離ペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ内のＡｌａおよび／またはＶａｌがＤ−アミノ酸である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−β（Ｃ／ＥＢＰβ）のトレオニン２６６（Ｔｈｒ２６６）のリン酸化の阻害を選択的に阻害することが可能である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
筋線維芽細胞および／またはマクロファージインフラマソームの活性化を阻害することが可能である、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項５】
長さが４アミノ〜８アミノ酸である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−ＡｓｐおよびＬｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−ＡｓｐおよびＬｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（配列番号３）、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（配列番号４）およびＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ（配列番号５）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチオード（ｐｅｐｔｉｏｄｅ）。
【請求項１１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２】
酸（Ａｃ）またはメルカプトプロピオン酸（Ｍｐｒ）のリンカーをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドのカルボキシ末端基が、ＯＨ基、ＯＣＨ３基またはＮＨ２基である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４】
環状ペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５】
Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ａｃ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐおよび
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ
からなる群より選択され、
前記ペプチドのカルボキシ末端基が、ＯＨ基、ＯＣＨ３基またはＮＨ２基である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１６】
Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−ＡｓｐおよびＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる群より選択され、前記ペプチドのカルボキシ末端基が、ＯＨ基、ＯＣＨ３基またはＮＨ２基である、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２およびＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２からなる群より選択される、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
式（Ｉ）：
【化１】
2018520999.tif 000012
で示される構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の１つまたは複数のペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
前記ペプチド（１つまたは複数）が、筋線維芽細胞および／またはマクロファージインフラマソームの活性化を阻害するのに有効な量で存在する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
必要とする対象の組織線維症を抑制する方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載の１つもしくは複数のペプチドまたは請求項１９または２０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記組織線維症が、肝損傷または肝炎症によるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組織線維症が、肺損傷または肺炎症によるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記組織線維症が、腎損傷または腎炎症によるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織が、肝臓内、肺内または腎臓のものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
必要とする対象のマクロファージ性炎症および／またはＴ細胞性炎症を抑制する方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載の１つもしくは複数のペプチドまたは請求項１９もしくは２０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
必要とする対象の組織線維性疾患を治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載の１つもしくは複数のペプチドまたは請求項１９もしくは２０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記疾患が、肝損傷、肝炎症および／または肝線維症に関連するものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患が、任意の病因の肝硬変または肝線維症である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪性肝炎、肝脂肪症、自己免疫性肝炎、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、続発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、α１アンチトリプシン欠損症、ウィルソン病および胆道閉鎖からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患が、肺損傷、肺炎症および／または肺線維症に関連するものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患が、特発性肺線維症、放射線誘発性間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患および肺気腫からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患が、腎損傷、腎炎症および／または腎線維症に関連するものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患が、糸球体腎炎または間質性尿細管線維症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が、熱傷に続発する皮膚線維症、ケロイド、肥厚性術後創傷、強皮症、腐蝕性物質に続発する食道線維症または胃腸線維症、炎症性疾患に続発する食道線維症または胃腸線維症、虚血性疾患に続発する線維症、腹膜線維症、膵線維症、放射線照射後線維症、梗塞に続発する心線維症、虚血または梗塞に続発する脳線維症、外傷後脳線維症、外傷後筋線維症および滑膜／関節線維症からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
必要とする対象の炎症性疾患を治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載の１つもしくは複数のペプチドまたは請求項１９もしくは２０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３７】
前記疾患が、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、自己免疫性肝炎、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、続発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、α１アンチトリプシン欠損症、ウィルソン病、胆道閉鎖、特発性肺線維症、放射線誘発性間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、肺の慢性感染症および／または炎症、糸球体腎炎、間質性尿細管線維症、熱傷に続発する皮膚炎、強皮症、乾癬、炎症性腸疾患、食道の損傷および／または炎症、放射線照射後の食道炎症または胃腸炎症、炎症性心筋症、外傷後脳炎症、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、筋炎ならびに関節炎からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドまたは前記医薬組成物を全身投与する、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドまたは前記医薬組成物を、吸入、局所、舌下、経口または鼻腔内からなる群より選択される経路によって投与する、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ペプチドまたは前記医薬組成物を、組織または器官への直接的点滴注入によって投与する、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象がヒトである、請求項２１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１５年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／１６０，１７３号の優先権を主張するものであり、上記出願の内容および物質は、以下に完全に記載された場合と同様に参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦支援による研究に関する記述）
本発明は、米国国立衛生試験所により授与された助成３００６５５（ＤＫ０８７０３１）およびＤＫ１００１８９の下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（配列表）
本願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に出願された配列表が含まれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１６年４月１１日に作成され、名称２４７１０６．００００３４＿ＳＬ．ｔｘｔ、大きさ１，９１７バイトである。
【０００４】
本発明は、Ｃ／ＥＢＰβのリン酸化を阻害する治療用ペプチドならびにその炎症および線維症の治療への使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
慢性肝疾患の肝線維症の発現には（様々な起源の）肝筋線維芽細胞の活性化が関与しており、アポトーシスによる筋線維芽細胞のクリアランスによって肝損傷から回復し肝線維症が正常に戻る可能性があることは注目に値する。肝臓の専門家の間では、肝線維症の治療には様々な細胞起源の筋線維芽細胞の活性化を阻害したり正常に戻したりすることが極めて重要であることで意見が一致している。肝細胞癌の大部分が硬変肝に発生することから、最終的には、肝線維症の進行を阻止することによって原発性肝癌の発現が抑えられるものと考えられる。
【０００６】
ＮＩＨおよびＷＨＯ（３２；３３）によれば、年間の肝疾患による影響は以下のようにまとめられる：ｉ）肝硬変：死亡率は世界で約８００，０００人（３２）、米国で約２７，０００人である；ｉｉ）慢性肝疾患：米国では慢性肝疾患による入院が４２１，０００件である。さらに、肝線維症の進行を防ぎ肝炎症を軽減する薬剤があれば、非アルコール性脂肪性肝炎（米国では約１，０００万人が罹患しており、世界的に流行している）；Ｃ型肝炎（米国では約３００万人が罹患しており、世界では１億７，０００万人が慢性的に感染している）、Ｂ型肝炎（米国では約１００万人、世界では３億５，０００万人が慢性的に感染している）の患者のほかにも、成人（原発性胆汁性肝硬変；硬化性胆管炎；自己免疫性肝炎；遺伝性ヘモクロマトーシス）および小児（胆道閉鎖；α−１アンチトリプシン欠損症をはじめとするまれな遺伝性障害を含む）が罹患し現時点で治療法のない低頻度の慢性肝疾患の患者の管理に影響を及ぼす可能性がある。
【０００７】
現時点で、肝線維症を直接阻害したり正常に戻したりする薬剤で認可を受けているものはない。現在用いられている治療法は、肝炎症および線維症によって生じる合併症の管理に主眼を置くものである。この分野で臨床開発中の薬剤候補としては以下のものが挙げられる：ａ）ＧＲ−ＭＤ−０２（Ｇａｌｅｃｔｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社−適応−線維症が進行したＮＡＳＨ（脂肪肝疾患）患者−第２相）。同薬はリポソームの形で送達され、アポトーシスのためのマクロファージを標的とし、線維形成経路に関与する肝筋線維芽細胞は標的としない。マクロファージの殺作用によって免疫のバランスが変化する可能性があるため、重大なオフターゲット有害作用が予想される；ｂ）リジルオキシダーゼ様２（ＬＯＸＬ２）酵素に対する抗線維化モノクローナル抗体であるシムツズマブ（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社−適用：肝線維症；原発性硬化性胆管炎；非アルコール性脂肪性肝炎−第２相）。同薬は活発な線維形成の進行を妨げると考えられるが、既存の架橋コラーゲン線維を正常に戻すことはない。さらに、免疫原反応を誘導する可能性がある。ほかにも、大きいタンパク質（抗体）が到達できない可能性のある硬変肝の細胞外マトリックス内でＬＯＸＬ２と相互作用する必要があるため、その効果の面で懸念がある；ｃ）オベチコール酸（ＯＣＡ）は、胆汁酸アナログであるとともにファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のアゴニストである（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社−ＯＣＡは原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を含めた様々な慢性肝疾患に対して開発段階にある−第３相）。ＦＸＲの遮断によって、胆汁酸受容体であるファルネソイドＸ受容体の不在下で自発的に肝腫瘍が発生することが主な懸念事項の１つとなっている（２６）；ならびにｄ）エムリカサン（Ｃｏｎａｔｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社−炎症性および／または線維性の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の患者の非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）亜集団−第２相）。同薬は活性なカスパーゼプロテアーゼ阻害剤である。肝細胞カスパーゼを長期間阻害すると、極めて重要な抗腫瘍チェックポイントが排除されることによって肝細胞癌をはじめとする臓器腫瘍の発生が促進され得ることが主な懸念事項の１つとなっている（２２）。
【０００８】
肺線維症の進行を抑えたり妨げたりする薬剤があれば、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の患者の健康管理に影響を及ぼすものと考えられる。ＩＰＦは、世界で５００万人、米国で２００，０００人が罹患している（１１）。ＩＰＦ患者の健康面に関する生活の質および生存率を改善する治療法は明らかにされておらず、ＩＰＦと診断された患者の余命はわずか３〜５年である。
【０００９】
この分野で臨床開発中の薬剤候補としては以下のものが挙げられる：ａ）Ｅｓｂｒｉｅｔ（ピルフェニドン）は、最近ＩＰＦの治療にＦＤＡによる承認を受けたものである。ただし、製品説明には「Ｅｓｂｒｉｅｔを軽度ないし中等度（チャイルド・ピュー分類のＡおよびＢ）の肝損傷のある患者に使用するには注意を要する」と記載されており、軽度、中等度または重度の腎障害のある患者についても同様である。このほか、同薬によって肝酵素の増大；光過敏反応または発疹；胃腸障害のほかにも強力なＣＹＰ１Ａ２阻害剤（例えば、フルボキサミン）との併用投与による薬物反応を来たすことがある；ｂ）ＩＰＦの治療にはこのほか、ＯＦＥＶ（ニンテダニブ）がＦＤＡによる承認を受けている。ただし、ＯＦＥＶの安全性に関する報告書（Ｓａｆｅｔｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｈｅｅｔ）には、この治療薬が胎児の先天異常または死亡、肝臓の問題、出血および胃腸障害のほか、さらに重篤な例では脳卒中および心臓発作を引き起こす可能性があることが記載されている；ｃ）経口プレドニゾン（またはその他の形態の副腎皮質ステロイド剤）によって肺炎症が軽減し、その症状が大幅に改善し得る。ステロイド剤はほかの薬物と併用してもよい。しかし、（結果が確認できるという点で）患者に利益がもたらされる過程は緩徐なもの（１〜３か月）であり得るほか、副腎皮質ステロイド剤には重大な副作用のリスクがある；ｄ）Ｆｌｕｉｍｕｃｉｌ（Ｎ−アセチルシステイン）は主にとしてＩＰＦの症状緩和に用いられているが、補助的な緩和療法に費用が掛かることがある；ｅ）Ｃｙｔｏｘａｎ（シクロホスファミド）は、ステロイド療法で効果が得られなかった患者またはステロイド療法が不可能な患者に使用され得るほか、副腎皮質ステロイド剤との併用療法剤としても使用され得る。同薬は免疫抑制性であり、治療が奏効するには時間が掛かる（６か月以上）ことがあり、数例を挙げれば骨髄抑制、血液障害および膀胱炎を含めた重大な副作用がみられることがある；ｆ）プレドニゾンとアザチオプリンとＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の組合せがＩＰＦ患者の治療に用いられている。ただし、ＮＡＣによってＩＰＦ患者の死亡および入院のリスクが高くなることがわかっている。
【００１０】
炎症は、急性肝疾患および慢性肝疾患の大部分の発病の一因となっている１。ウイルス疾患、中毒性疾患、免疫疾患および代謝疾患によって引き起こされる肝疾患に伴う過剰な肝損傷および肝炎症２によって、肝機能障害のほか瘢痕組織が沈着し肝硬変が発症する可能性のある慢性病態が生じ、次いでこれが、慢性肝疾患に罹患した患者の有病率および死亡率の主たる原因となる２，３。ＴＬＲ−４ノックアウトマウスが肝毒素に耐性を示すことから、中毒性肝損傷の増幅がマクロファージによって媒介されること、および骨髄に放射線照射したＴＬＲ−４ノックアウトマウスをＴＬＲ−４＋／＋マクロファージで再構築すると、同マウスに肝毒素に対する感受性がもたらされることが報告されている４。中毒性肝損傷の肝炎症に果たすマクロファージの役割は、マクロファージ除去を用いて確認されており５、さらに、ＩＬ−１受容体アンタゴニストを用いた実験的アルコール性肝損傷モデル６およびアデノシン−２Ａ（Ａ２Ａ）受容体ノックアウトマウスを用いたＬＰＳ／Ｄ−ガラクトサミン誘導性肝損傷７でその特徴が明らかにされている。マウスでは、マクロファージからＦａｓを介してＩＬ−１８が分泌されると急性肝損傷が起こり８、肝細胞損傷時にマクロファージの食作用によって肝細胞の残骸が除去される９。しかし、肝損傷の増幅に不可欠な肝マクロファージのシグナル伝達機序については、その特徴が一部明らかにされているにすぎない１。
【００１１】
インフラマソームは、マクロファージにおける炎症性反応の活性化およびそれに続くマクロファージ活性化に不可欠なタンパク質複合体の１つである１，１０，１１。Ｃ／ＥＢＰβ  ＤＮＡ結合部位の優性阻害因子の発現１５またはＣ／ＥＢＰβの標的欠損によってマクロファージ分化の障害が起こる１６ことから、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）１２，１３，１４がマクロファージに極めて重要なシグナル伝達分子であることが明らかにされている。
【００１２】
さらに、Ｃ／ＥＢＰβ発現は、マクロファージが分化する際に大幅に増大し、マクロファージモジュレーター（ＬＰＳ、ＩＬ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ビタミンＤ、レチノイン酸）によって誘導される１３，１７。これに関連して、細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）−１／２のリン酸化によって直接活性化されるリボソームＳ−キナーゼ２（ＲＳＫ−２）によるＣ／ＥＢＰβのリン酸化が、細胞生存を調節しているＥＲＫ／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路に重要な役割を果たしていることが研究者によって明らかにされている１８，１９，２０，２１。このほか、マクロファージの活性化および生存に関連して、炭疽致死毒素によって誘導されるマクロファージの機能および活性の障害をレスキューするには、生物学的アッセイでリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７を模倣する２２ドミナントポジティブなリン酸化変異体Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７が発現すれば十分であることが報告されている２３。
【発明の概要】
【００１３】
上の「背景技術」に詳述した通り、特にヒトの肝臓、肺、腎臓をはじめとする組織および／または器官の炎症および線維症に効果的な治療法が必要とされている。本発明は、新規な治療用ペプチドならびにそれに関連する組成物および方法を提供することによって、上記のものをはじめとする必要性に取り組むものである。
【００１４】
一態様では、本発明は、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐを含み、少なくとも１つのアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）のトレオニン２６６（Ｔｈｒ２６６）またはマウスＣ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７のリン酸化を阻害することが可能である、単離ペプチドを提供する。
【００１５】
一実施形態では、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ内のＡｌａおよび／またはＶａｌはＤ−アミノ酸（ＤＡｌａ、ＤＶａｌ）である。一実施形態では、ペプチドは、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）のトレオニン２６６（Ｔｈｒ２６６）のリン酸化を選択的に阻害することが可能である。一実施形態では、ペプチドは、筋線維芽細胞および／またはマクロファージインフラマソームの活性化を阻害することが可能である。一実施形態では、ペプチドは、長さが４アミノ酸〜８アミノ酸である。一実施形態では、ペプチドは、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−ＡｓｐおよびＬｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ペプチドは、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−ＡｓｐおよびＬｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、ペプチドはアミノ酸配列Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドはアミノ酸配列Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる。一実施形態では、ペプチドは、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（配列番号３）、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（配列番号４）およびＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ（配列番号５）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる（例えば、アミノ酸モチーフＬｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ内のＡｌａおよび／またはＶａｌがＤ−アミノ酸であるペプチド）。一実施形態では、本発明のペプチドはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む。一実施形態では、本発明のペプチドは、酸（Ａｃ）、メルカプトプロピオン酸（Ｍｐｒ）またはトリメチルロック（ＴＭＬ）ラクトン化のリンカーをさらに含む（例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．７４，２００１，１５９−１７１を参照されたい）。一実施形態では、本発明のペプチドのカルボキシ末端基は、ＯＨ基、ＯＣＨ３基またはＮＨ２基である。一実施形態では、本発明のペプチドは環状ペプチドである。
【００１６】
一実施形態では、ペプチドは、
Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ａｃ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐおよび
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ
からなる群より選択され、ペプチドのカルボキシ末端基は、ＯＨ基、ＯＣＨ３基またはＮＨ２基である。
【００１７】
一実施形態では、ペプチドは、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−ＡｓｐおよびＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる群より選択され、ペプチドのカルボキシ末端基は、ＯＨ基、ＯＣＨ３基またはＮＨ２基である。
【００１８】
一実施形態では、ペプチドは、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２およびＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２からなる群より選択される。
【００１９】
一実施形態では、ペプチドは式（Ｉ）：
【化１】
2018520999.tif 000002
で示される構造を有する。
【００２０】
本発明は、本発明のペプチドとともに、１つまたは複数の本発明のペプチドを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、ペプチド（１つまたは複数）は、筋線維芽細胞および／またはマクロファージインフラマソームの活性化を阻害するのに有効な量で組成物中に存在する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、必要とする対象の組織線維症を抑制する方法であって、対象に有効量の１つもしくは複数の本発明のペプチドまたはそのような１つもしくは複数の含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、組織は、肝臓内、肺内または腎臓内のものである。一実施形態では、組織線維症は肝損傷または肝炎症によるものである。一実施形態では、組織線維症は肺損傷または肺炎症によるものである。一実施形態では、組織線維症は腎損傷または腎炎症によるものである。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、必要とする対象のマクロファージ性炎症および／またはＴ細胞性炎症を抑制する方法であって、対象に有効量の１つもしくは複数の本発明のペプチドまたはそのような１つもしくは複数のペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、必要とする対象の組織線維性疾患を治療する方法であって、対象に有効量の１つもしくは複数の本発明のペプチドまたはそのような１つもしくは複数のペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、疾患は、肝損傷、肝炎症および／または肝線維症に関連するものである。一実施形態では、疾患は、任意の病因の肝硬変または肝線維症である。一実施形態では、疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪性肝炎、肝脂肪症、自己免疫性肝炎、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、続発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、α１アンチトリプシン欠損症、ウィルソン病および胆道閉鎖からなる群より選択される。一実施形態では、疾患は、肺損傷、肺炎症および／または肺線維症に関連するものである。一実施形態では、疾患は、特発性肺線維症、放射線誘発性間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患および肺気腫からなる群より選択される。一実施形態では、疾患は、腎損傷、腎炎症および／または腎線維症に関連するものである。一実施形態では、疾患は糸球体腎炎または間質性尿細管線維症である。一実施形態では、疾患は、熱傷に続発する皮膚線維症、ケロイド、肥厚性術後創傷、強皮症、腐蝕性物質に続発する食道線維症または胃腸線維症、炎症性疾患に続発する食道線維症または胃腸線維症、虚血性疾患に続発する線維症、腹膜線維症、膵線維症、放射線照射後線維症、梗塞に続発する心線維症、虚血または梗塞に続発する脳線維症、外傷後脳線維症、外傷後筋線維症および滑膜／関節線維症からなる群より選択される。
【００２４】
別の態様では、本発明は、必要とする対象の炎症性疾患を治療する方法であって、対象に有効量の１つもしくは複数の本発明のペプチドまたはそのような１つもしくは複数のペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、疾患は、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、自己免疫性肝炎、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、続発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、α１アンチトリプシン欠損症、ウィルソン病、胆道閉鎖、特発性肺線維症、放射線誘発性間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、肺の慢性感染症および／または炎症、糸球体腎炎、間質性尿細管線維症、熱傷に続発する皮膚炎、強皮症、乾癬、炎症性腸疾患、食道の損傷および／または炎症、放射線照射後の食道炎症または胃腸炎症、炎症性心筋症、外傷後脳炎症、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、筋炎ならびに関節炎からなる群より選択される。
【００２５】
上記の本発明の方法ではいずれも、ペプチドまたは医薬組成物を例えば、全身に、吸入により、局所的に、舌下に、経口的に、鼻腔内に、または組織もしくは器官への直接点滴注入により投与することができる。
【００２６】
上記の本発明の方法ではいずれも、対象は例えば、ヒト、獣医学動物または実験動物モデルであり得る。
【００２７】
当業者には、以下の説明、請求項および図面で本発明の上記のものをはじめとする態様が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】治療用リードペプチドが、ヒト肝毒素ＣＣ１４への曝露後の肝筋線維芽細胞の活性化および線維症を誘導する肝損傷を抑制することを示す図である。Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスにＣＣ１４の単回投与を実施した（４）。８時間後、マウスに治療用リードペプチドのＩＰ注射（ＰＥＧ結合ペプチド５μｇ）を実施した。ＣＣ１４投与から３０時間後、マウスを屠殺した。ＣＣ１４のみを投与したマウスには筋線維芽細胞の強い活性化（α−ＳＭＡによって判定される）（最上行）および重度の肝損傷（屠殺直前の標準的臨床検査によって評価される）がみられ；リードペプチドによって重度の肝損傷の変色および顆粒状の外観が抑えられた。処置マウスの肝臓は対照のものと類似していた（２段目の行）。ＣＣｌ４によって誘導される組織病理は、筋線維芽細胞（α−ＳＭＡ）の活性化、構造の崩壊（レティキュリン染色）を伴う重度の肝損傷（Ｈ＆Ｅ染色）であった。治療用ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドによって、筋線維芽細胞の活性化および肝臓の損傷の両方が抑えられた。
【図２Ａ】肝線維症の慢性マウスモデルにおける治療用ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドの高い有効性を示す図である。マウスの全グループ（対照以外）にＣＣ１４投与を１６週間実施した（ｎ＝６／グループ）。ＣＣ１４処理群には肝毒素のみを投与し、それ以外のグループには、第８週から図示される治療用ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドの投与も実施した（４２０μｇのＰＥＧ−３０ｋＤａと結合したペプチド７μｇを週１回）。図２Ａは、記載されている通りに（７；２５）シリウス染色の定量化（面積当たりの線維症の割合）によって肝線維症を判定したものを示している：対照（０．０２＋／−０．０１）；リードペプチド（０．８＋／−０．７）；代替ペプチド１（２．１＋／−１．０）；代替ペプチド２（３．５＋／−１．２）およびＣＣｌ４（６．７＋／−１．６％）。リードペプチド１はＰ＜０．０００１、代替ペプチド１および２はＰ＜０．００１である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、臨床基準である肝線維症のトリクローム染色によって組織学的に肝線維症を検出したものを示している。対照マウス（溶媒対照のみを投与）にはごくわずかな線維症（段階０〜１／ＶＩ）が認められ；ＣＣｌ４を１６週間投与したマウスには重度の線維症が認められ（段階５／ＶＩまたは６／ＶＩ；患者であれば臨床的に有意である）；ＣＣｌ４を１６週間投与し、第８週からリードＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチド１も開始したマウスには軽度の線維症が認められた（段階１〜２／ＶＩ；患者であれば臨床的に有意である）。
【図３】Ｃ／ＥＢＰＰ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化はブレオマイシンに対して誘導されＴｈ１／Ｔｈ１７応答に必要なものであることを示す図である。ブレオマイシンで７日間処置したＣ／ＥＢＰβｗｔマウスに肺炎症が誘導された。表２および図５に記載される通りに精製肺Ｔ細胞（ＣＤ４＋）；ホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２１７；ＩＬ−１２Ｒβ；ＩＬ−２３Ｒ；およびＩＬ−４Ｒαを同定した。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マウスはＴ細胞のリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７を阻止し、ブレオマイシンによるＴｈ１／Ｔｈ２表現型の誘導に抵抗性を示した。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マウスでは、ブレオマイシンによってＴ細胞のＩＬ−４Ｒα発現（Ｔｈ２表現型）が誘導された。
【図４】Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化はブレオマイシンに対して誘導されＴｈ１／Ｔｈ１７応答に必要なものであることを示す図である。ブレオマイシンで７日間処置したＣ／ＥＢＰβｗｔマウスに肺炎症が誘導された。表２および図５に記載される通りに精製肺Ｔ細胞（ＣＤ４＋−）；ホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２１７；ＩＬ−１２Ｒβ；ＩＬ−２３Ｒ；およびＩＬ−４Ｒαを同定した。Ｃ／ＥＢＰβペプチドはＴ細胞のリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７、Ｔｈ１／Ｔｈ１７表現型を阻止し、Ｔ細胞のＩＬ−４Ｒα発現（Ｔｈ２表現型）を誘導する。
【図５】ブレオマイシン処置に応答してＴｈ１／Ｔｈ１７細胞が誘導され肺筋線維芽細胞の活性化を引き起こしたことを示す図である。Ｍ１マクロファージ除去実験から得られた証拠。ブレオマイシン処置第７日、精製ＣＤ４＋マウス肺Ｔ細胞にＩＬ−１２ＲまたはＩＬ−２３Ｒ（Ｔｈ１／Ｔｈ１７表現型）およびαＳＭＡ（活性化筋線維芽細胞）の発現がみられた。マウスにブレオマイシンおよびクロドロン酸（ＡＴＰ産生遮断剤）リポソームを（気管内およびＩＰ）投与したところ、第７日に貪食Ｍ１マクロファージ（ＴＮＦαＲ２が検出されなかった）およびＴｈ１（ＩＬ−１２Ｒ−赤）／Ｔｈ１７（ＩＬ−２３Ｒ−緑）細胞が優先的に除去されてＩＬ−４Ｒα（淡緑青色）（Ｔｈ２表現型）が誘導され、αＳＭＡ（活性化筋線維芽細胞）（赤紫色）が著明に減少した。２１日間のＭ１マクロファージ除去によりＴｈ１／Ｔｈ１７細胞が遮断されることによってブレオマイシン誘導性肺線維症（トリクローム）が著明に抑制され、この作用はＴｈ２表現型ではなくＴｈ１／Ｔｈ１７表現型によるものであることが示唆された。
【図６】Ｔｈ２刺激およびＣ／ＥＢＰβペプチドによって、ブレオマイシン処置マウスから単離した初代マウス肺Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞のアポトーシスが誘導されることを示す図である。ＣＤ４＋親和性によってＴ細胞を単離し、１０μｇ／ｍｌのＩＬ−１０もしくはＩＬ−４または１００ｐＭのＣ／ＥＢＰβペプチドで処置した。記載されている通りに（１２）アポトーシスを検出した。Ｔｈ２誘導物質およびＣ／ＥＢＰβペプチド（Ｐ＜０．０５）によって、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴｈ−１肺細胞およびＴｈ−１７肺細胞のアポトーシスが刺激された。
【図７Ａ】ヒトＴｈ１細胞およびＴｈ１７細胞が共培養系のヒト肺筋線維芽細胞の増殖が誘導したことを示す図である。図７Ａでは、ＬＭＦを誘導されたＴｈ１、Ｔｈ１７またはＴｈ２、未誘導の対照およびペプチドで処置したＴｈ１またはＴｈ１７と共培養した。Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞の細胞について１試料当たり少なくとも１００個の細胞のＰＣＮＡ（Ｎ：３）Ｐ＜０．０１（ほかの共培養系についてはＮＳ）をカウントした。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｔｈ１／Ｔｈ１７−ＬＭＦ；Ｔｈ２−ＬＭＦ；およびペプチド−ＬＭＦで処置したＴｈ１／Ｔｈ１７の略図である。
【図８】ＩＰＦ患者の肺にＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６のリン酸化が誘導されＴｈ１応答を引き起こしたことを示す図である。代表的なＩＰＦ患者および代表的な対照被験者を試験した。共焦点レーザー走査顕微鏡法によってＤＮＡ；ホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２６６；Ｔ−Ｂｅｔ；およびＧＡＴＡ−３を同定した。
【図９】ＩＰＦ患者の肺にＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６のリン酸化が誘導されＴｈ１／Ｔｈ１７応答が引き起こされたことを示す図である。代表的なＩＰＦ患者および代表的な対照被験者を試験した。共焦点レーザー走査顕微鏡法によってホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２６６；ＩＬ−１２Ｒ；ＩＬ−２３Ｒ；ＩＬ−４Ｒα；およびαＳＭＡを同定した。
【図１０】Ｃ／ＥＢＰβのＴｈｒ２６６のリン酸化は炎症誘導物質に対して誘導されヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１／Ｔｈ１７応答に必要なものであることを示す図である。ヒト血液前駆Ｔ細胞を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ実験。正常ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をヒト組換えＩＬ−１２（Ｔｈ１誘導物質）で１６時間処置したところ、ＩＬ−１２ＲβおよびＴ−Ｂｅｔを発現した（Ｔｈ１表現型）。ｅｘ  ｖｉｖｏで正常ヒト血液ＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−２３（Ｔｈ１７誘導物質）で処置したところ、ＩＬ−２３ＲおよびＧＡＴＡ−３（データ不掲載）を発現した（Ｔｈ１７表現型）。
【図１１】ＩＰＦ肺組織の肺にＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６のリン酸化が誘導されＴｈ１／Ｔｈ１７応答を引き起こしたことを示す図である。のちに記載する通りに、新たに単離したＴ細胞を精製し特徴を明らかにした。共焦点レーザー走査顕微鏡法によってホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２６６；ＩＬ−１２Ｒ；ＩＬ−２３Ｒ；およびＩＬ−４Ｒαを同定した。
【図１２】Ｔｈ２刺激およびＣ／ＥＢＰβペプチドによって、ＩＰＦ患者から単離した初代ヒト肺Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞にアポトーシスが誘導されたことを示す図である。ＣＤ４＋親和性によってＴ細胞を単離し、１０μｇ／ｍｌのＩＬ−１０もしくはＩＬ−４または１００ｐＭのＣ／ＥＢＰβペプチドで１６時間処置した。記載されている通りに（１２）アポトーシスを検出した。Ｔｈ２誘導物質およびＣ／ＥＢＰβペプチド（Ｐ＜０．０５）によって、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴｈ−１肺細胞およびＴｈ−１７肺細胞のアポトーシスが刺激された。
【図１３Ａ】マウスにおけるリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７によるＦａｓ−Ｌ誘導性肝損傷および肝炎症の調節を示す図である。図１３ａは、Ｊｏ−２Ａｂ（ＦａｓＬ）の単回ＩＰ投与から１２時間後に血清中ＡＬＴ（ＩＵ／ｍｌ）レベルを求めたものである。血清中ＡＬＴレベルから判断すると、リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７導入遺伝子を発現するマウスは、Ｊｏ−２Ａｂによって誘導される肝損傷に対する感受性が対照Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスよりも高かった（Ｐ＜０．０００１）。リン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子を発現するマウスは、Ｆａｓ−Ｌによる肝損傷誘導に対して高い耐性を示した（Ｐ＜０．０１）；１グループ当たりのマウスはｎ＝２０である。
【図１３Ｂ】図１３ｂは、アポトーシスアネキシンＶアッセイから判断すると、リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７トランスジェニックマウスから単離した初代肝細胞（黒丸）にＪｏ−２Ａｂが誘導する損傷は、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス由来の肝細胞（白丸）と比較して最小限のものであった（Ｐ＜０．００１）ことを示している。Ｊｏ−２未処置のＣ／ＥＢＰβ−ｗｔ由来の対照培養初代肝細胞はベースラインのアポトーシスが５％未満であった。
【図１３Ｃ】図１３ｃは、Ｊｏ−２Ａｂによって、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスの肝臓の方がＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの肝臓よりもＦ４／８０＋マクロファージ炎症細胞の浸潤が大きく刺激された（Ｐ＜０．０１）ことを示している。
【図１３Ｄ】図１３ｄは、Ｊｏ−２Ａｂが誘導する肝細胞のアポトーシス性損傷の領域はＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスの肝臓の方がＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの肝臓よりも大きい（Ｐ＜０．００５）ことを示している。数値は、１グループ当たり少なくとも６個体の平均値（ＳＤ）であり、３回の実験の代表的なものである。
【図１４Ａ】ＴＧＦ−αによる培養初代肝マクロファージの活性化がＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化を引き起こすことを示す図である。１０％ウシ胎児血清を含みＬ−グルタミン、２５μＭ  ＨＥＰＥＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０で培養した肝マクロファージをＴＧＦα（１０μＭ）で８時間処置した。図１４ａは、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから新たに単離し培養した肝マクロファージをＴＧＦ−αで処置したところ、活性化ＲＳＫ−ホスホ−Ｓｅｒ３８０および内因性Ｃ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７のリン酸化を発現した（Ｐ＜０．００１）ことを示している。３回の実験の３つ組の代表的な例。
【図１４Ｂ】図１４ｂは、ＴＧＦ−αによって培養肝マクロファージのＮＯＳ−２発現も誘導された（Ｐ＜０．０１）ことを示している。ＴＯ−ＰＲＯ３を用いて細胞内ＤＮＡを染色した。３回の実験の３つ組の代表的な例。Ｋｅｙｅｎｃｅ顕微鏡ＢＺ９０００分析ソフトウェアプログラムを用いて蛍光画像および明視野画像を定量化した。
【図１５Ａ】Ｃ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７のリン酸化はマウスを肝毒素で処置すると誘導され肝マクロファージ活性化に必要なものであることを示す図である。図１５ａは、顕微鏡観察によるＦ４／８０の発現が確認されたことから、リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスの肝臓では、ＣＣｌ４の急性投与によってＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスよりも高い程度のマクロファージ浸潤が刺激された（Ｐ＜０．０００１）ことを示している。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子によって、ＣＣｌ４誘導性マクロファージ肝浸潤がＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスと比較して約９０％抑制された（Ｐ＜０．０００１）。ＣＣｌ４誘導性マクロファージ肝浸潤は、ＴＧＦαトランスジェニックマウスとＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスとで同程度であった（ＮＳ）。
【図１５Ｂ】図１５ｂは、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウス（Ｐ＜０．００５）およびＴＧＦαマウス（Ｐ＜０．０５）ではＣＣｌ４が誘導する肝細胞アポトーシスの程度が増大したが、Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マウス（Ｐ＜０．０１）ではＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスと比較して改善されたことを示している。
【図１５Ｃ】図１５ｃは、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスではＣＣｌ４によって血清中ＡＬＴがＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスと比較して高く刺激された（Ｐ＜０．０１）ことを示している。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子によって、ＣＣｌ４誘導性血清中ＡＬＴがＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスと比較して約５０％抑制された（Ｐ＜０．００１）。ＣＣｌ４誘導性血清ＡＬＴは、ＴＧＦαトランスジェニックマウスとＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスとで同程度であった（ＮＳ）。
【図１５Ｄ】図１５ｄは、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化を阻止するドミナントネガティブなペプチドによってほかにも、ＣＣｌ４による肝マクロファージ浸潤の誘導が約６０％阻害された（Ｐ＜０．０１）ことを示している。
【図１５Ｅ】図１５ｅは、ペプチドによってＣＣｌ４による肝細胞アポトーシスが約４５％抑制された（Ｐ＜０．００１）ことを示している。数値は、１グループ当たり少なくとも６個体の平均値（ＳＤ）であり、２回の実験の代表的なものである。
【図１６Ａ−Ｃ】マクロファージはマウスの肝毒素処置に応答して誘導され肝損傷に必要なものであることを示す図である。図１６ａは、クロドロン酸リポソームを投与してマクロファージを枯渇させ、２４時間後にＣＣｌ４を投与したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスに、ＣＣｌ４処置から３０時間後に肝マクロファージの著明な減少がみられた（約９０％；Ｐ＜０．００５）ことを示している。図１６ｂは、クロドロン酸リポソームによりＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスのマクロファージを枯渇させ、肝生検のアポトーシス肝細胞数のカウントにより評価したところ、ＣＣｌ４処置から３０時間後に肝損傷の軽減がみられた（Ｐ＜０．０１）ことを示している。図１６ｃは、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスをクロドロン酸リポソームで前処置しても、ＣＣｌ４治療から３０時間後に血清中ＡＬＴレベルが約７５％減少した（Ｐ＜０．００５）ことを示している。
【図１６Ｄ−Ｆ】図１６ｄ、１６ｅおよび１６ｆは、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから単離した肝マクロファージには、クロドロン酸リポソームによって、ＣＣｌ４処置から３０時間後に、クロドロン酸リポソームを投与していないＣＣｌ４処置Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから単離した肝マクロファージと比較してＴＬＲ５、ＭｙＤ８８およびＴＬＲ４の発現抑制の誘導がみられた（Ｐ＜０．００１）ことを示している。数値は、１グループ当たり少なくとも６個体の平均値（ＳＤ）であり、２回の実験の代表的なものである。
【図１７Ａ】リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７によってマウス肝マクロファージのインフラマソームシグナル１複合体が刺激されることを示す図である。図１７ａは、ＣＣｌ４処置から３０時間後、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから単離したＣＤ１１／ＣＤ６８初代肝マクロファージにリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７ならびにインフラマソームシグナル１複合体遺伝子産物であるＴＬＲ４、ＮＦκＢ、ＩＲＦ８およびＭｙＤ８８の発現がみられたことを示している。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７トランスジェニックマウスではリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７、ＴＬＲ４、ＮＦκＢ、ＩＲＦ８およびＭｙＤ８８の発現が阻止された。Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７トランスジェニックマウスから単離した肝マクロファージには、ＣＣｌ４処置の不在下でインフラマソームシグナル１複合体の発現がみられ、ＴＧＦαマウスから単離した肝マクロファージには、ＣＣｌ４の不在下でリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７、ＴＬＲ４、ＮＦκＢ、ＩＲＦ８およびＭｙＤ８８の発現がみられた（ＣＣｌ４で処置したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス；Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウス；およびＴＧＦαマウスについてＰ＜０．０５）。Ｋｅｙｅｎｃｅ顕微鏡ＢＺ９０００分析ソフトウェアプログラムを用いて蛍光画像および明視野画像を定量化した。図１５ａ〜１５ｅに記載される独立した３回の実験の代表的な例。
【図１７Ｂ】図１７ｂは、Ｃ／ＥＢＰβを免疫沈降させ、マウスを溶媒またはＣＣｌ４で処置してから３０時間後に新たに単離した初代肝マクロファージ由来のその結合タンパク質を分析したものを示している。リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７（またはＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７）は、非リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７（またはＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７）とは異なり、ＴＬＲ４、ＮＦκＢ、ＩＲＦ８およびＭｙＤ８８と結合していた。ＣＣｌ４による処置（およびマクロファージ活性化）によって、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７とインフラマソームシグナル１タンパク質との間の結合が増大した。試料負荷の内部対照にはβアクチンを用いた。図１５ａ〜１５ｅに記載される独立した３回の実験の代表的な例。
【図１８Ａ】リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７によってマウス肝マクロファージのインフラマソーム複合体シグナル２の発現が刺激されることを示す図である。図１８ａは、ＣＣｌ４処置から３０時間後、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから精製したＣＤ１１／ＣＤ６８初代肝マクロファージにリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７ならびにインフラマソームシグナル２複合体遺伝子産物であるＮＡＬＰ３、ＴＬＲ５、ＩＬ−１Ｒ１およびアダプタータンパク質ＡＳＣの発現がみられた。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７トランスジェニックマウスではリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７、ＮＡＬＰ３、ＴＬＲ５、ＩＬ−１Ｒ１およびアダプタータンパク質ＡＳＣの発現が阻止された。Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７トランスジェニックマウスから単離した肝マクロファージには、ＣＣｌ４処置の不在下でインフラマソームシグナル２複合体の発現がみられ、ＴＧＦαマウスから単離した肝マクロファージには、ＣＣｌ４処置の不在下でリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７、ＮＡＬＰ３、ＴＬＲ５、ＩＬ−１Ｒ１およびアダプタータンパク質ＡＳＣの発現がみられた（ＣＣｌ４で処置したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス；Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウス；およびＴＧＦαマウスについてＰ＜０．０１）。顕微鏡ＢＺ９０００分析ソフトウェアプログラムを用いて蛍光画像および明視野画像を定量化した。図１５ａ〜１５ｅに記載される独立した３回の実験の代表的な例。
【図１８Ｂ】図１８ｂは、Ｃ／ＥＢＰβを免疫沈降させ、マウスを溶媒またはＣＣｌ４で処置してから３０時間後に新たに単離した初代肝マクロファージ由来のその結合タンパク質を分析したものを示している。リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７（またはＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７）は、非リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７（またはＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７）とは異なり、ＮＡＬＰ３、ＴＬＲ５、ＩＬ−１Ｒ１およびアダプタータンパク質ＡＳＣと結合していた。ＣＣｌ４で処置すること（およびマクロファージ活性化）によって、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７とインフラマソームシグナル２タンパク質との間の結合が増大した。試料負荷の内部対照にはβアクチンを用いた。図１５ａ〜１５ｅに記載される独立した３回の実験の代表的な例。
【図１９Ａ】リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７によってマウス肝マクロファージの構造遺伝子および副生成物遺伝子の発現が刺激されることを示す図である。図１９ａは、リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスから新たに単離した肝マクロファージが、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスと比較してインフラマソームに関連する活性化トランスクリプトソームを発現することを示している。これには、インフラマソーム遺伝子（ＡＳＣ、ＩＲＦ−１、ＩＲＦ−４、ＩＲＦ−５、ＴＣＡＭ−２、ＴＬＲ−６、ＴＲＡＦ−６、ＭｙＤ−８８、Ｎｏｄ−１およびＲｅｌ）の発現増大のほか、直接的および間接的なサイトカイン副生成物（ＩＬ−Ｉβ、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＴＮＦα）の発現増大が含まれていた。
【図１９Ｂ】図１９ｂは、ＣＣｌ４で処置したマウスから新たに単離したＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７肝マクロファージが、ＣＣｌ４で処置したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから新たに単離した肝マクロファージと比較して、抑制されたインフラマソームトランスクリプトソームを発現することを示している。これには、インフラマソーム遺伝子（ＩＲＦ−４、ＮＡＬＰ−α、ＮＡＬＰ−３、ＴＣＡＭ−２、ＴＬＲ−１、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＴＬＲ−９、Ｎｏｄ−１および）の発現減少のほか、直接的および間接的なサイトカインインフラマソーム副生成物（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３αおよびＣＸＣＬ−３）の遺伝子発現の減少が含まれていた。
【図１９Ｃ】図１９ｃは、ＣＣｌ４で処置することにより、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスおよびＴＧＦαマウスの肝臓にＩＬ−１８、活性カスパーゼ１およびＩＬ−１βインフラマソームタンパク質の発現が誘導されたことを示している。数値は３つ組の平均値（ＳＤ）であり、３回の実験の代表的なものである。
【図２０Ａ−Ｃ】有毒油症候群の患者の肝マクロファージのインフラマソーム複合体と結合したＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６に関する図である。スペイン、マドリードのコンプルテンセ大学医療センターで現時点でも入手可能なＴＯＳ患者全１６例の肝生検試料を分析した。これらの患者には中等度の急性肝損傷が認められた。図２０ａおよび２０ｃは、ＴＯＳ患者に正常被験者と比較して肝臓のマクロファージ浸潤（約２０倍；１，００４，６８３＋／−１４０，４８５対４１，１６０＋／−３，３５３；Ｐ＜０．００１）（図２０ａ）および肝細胞アポトーシスの程度（約３０倍；３２．０＋／−４．７％対１．０＋／−０．２％；Ｐ＜０．００１）（図２０ｃ）の両方の著明な増大がみられた（図２０ｂおよび２０ｄ）ことを示している。図２０ｆ、２０ｈおよび２０ｊは、ＴＯＳ患者の肝臓の肝マクロファージに正常な肝臓のマクロファージと比較してＭｙＤ−８８、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６およびＴＬＲ−５がみられた（図２０ｅ、２０ｇおよび２０ｉ）（いずれもＰ＜０．００１）ことを示している。
【図２０Ｄ−Ｆ】有毒油症候群の患者の肝マクロファージのインフラマソーム複合体と結合したＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６に関する図である。スペイン、マドリードのコンプルテンセ大学医療センターで現時点でも入手可能なＴＯＳ患者全１６例の肝生検試料を分析した。これらの患者には中等度の急性肝損傷が認められた。図２０ａおよび２０ｃは、ＴＯＳ患者に正常被験者と比較して肝臓のマクロファージ浸潤（約２０倍；１，００４，６８３＋／−１４０，４８５対４１，１６０＋／−３，３５３；Ｐ＜０．００１）（図２０ａ）および肝細胞アポトーシスの程度（約３０倍；３２．０＋／−４．７％対１．０＋／−０．２％；Ｐ＜０．００１）（図２０ｃ）の両方の著明な増大がみられた（図２０ｂおよび２０ｄ）ことを示している。図２０ｆ、２０ｈおよび２０ｊは、ＴＯＳ患者の肝臓の肝マクロファージに正常な肝臓のマクロファージと比較してＭｙＤ−８８、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６およびＴＬＲ−５がみられた（図２０ｅ、２０ｇおよび２０ｉ）（いずれもＰ＜０．００１）ことを示している。
【図２０Ｇ−Ｊ】有毒油症候群の患者の肝マクロファージのインフラマソーム複合体と結合したＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６に関する図である。スペイン、マドリードのコンプルテンセ大学医療センターで現時点でも入手可能なＴＯＳ患者全１６例の肝生検試料を分析した。これらの患者には中等度の急性肝損傷が認められた。図２０ａおよび２０ｃは、ＴＯＳ患者に正常被験者と比較して肝臓のマクロファージ浸潤（約２０倍；１，００４，６８３＋／−１４０，４８５対４１，１６０＋／−３，３５３；Ｐ＜０．００１）（図２０ａ）および肝細胞アポトーシスの程度（約３０倍；３２．０＋／−４．７％対１．０＋／−０．２％；Ｐ＜０．００１）（図２０ｃ）の両方の著明な増大がみられた（図２０ｂおよび２０ｄ）ことを示している。図２０ｆ、２０ｈおよび２０ｊは、ＴＯＳ患者の肝臓の肝マクロファージに正常な肝臓のマクロファージと比較してＭｙＤ−８８、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６およびＴＬＲ−５がみられた（図２０ｅ、２０ｇおよび２０ｉ）（いずれもＰ＜０．００１）ことを示している。
【図２１】リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７トランスジェニックマウスは、ＦＡＳ−Ｒ活性化によって誘導される肝損傷に対する感受性が対照Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスよりも高いことを示す図である。溶媒またはＣＣｌ４で処置してから３０時間後のＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスおよびＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７（Ｅ）マウスの代表的な組織的学試料。ホルマリンで固定した肝試料をレティキュリン組織化学法またはＦ４／８０免疫組織化学法で染色した。Ｊｏ−Ａｂ（ＦＡＳ）によって肝損傷（レティキュリン染色）および肝マクロファージ浸潤（Ｆ４／８０）が誘導されるが、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスの肝組織の方が誘導がはるかに顕著である。上の図１３ａ〜１３ｄに記載される実験の代表的な例。
【図２２】Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７トランスジェニックマウスから単離した初代肝細胞にラクタシスチンが誘導する損傷が最小限のものであることを示す図である。アポトーシスアネキシンＶアッセイから判断すると、リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７トランスジェニックマウスから単離し培養した初代肝細胞（黒丸）にラクタシスチンが誘導する損傷は、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス由来の肝細胞（白丸）と比較して最小限のものであった（Ｐ＜０．０００１）。ラクタシスチン未処置のＣ／ＥＢＰβ−ｗｔ由来の対照培養初代肝細胞はベースラインのアポトーシスが５％未満であった。数値は３つ組試料の平均値（ＳＤ）であり、２回の実験の代表的なものである。
【図２３Ａ】リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７トランスジェニックマウスは、ＣＣｌ４によって誘導される肝損傷に対する感受性が対照マウスよりも高いことを示す図である。図２３ａは、溶媒またはＣＣｌ４で処置してから３０時間後のＣ／ＥＢＰβ−ｗｔ、ＴＧＦα、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７（Ｅ）およびＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７（Ａ）の代表的な組織学的試料を示している。ホルマリンで固定した肝試料をレティキュリン組織化学法またはＦ４／８０免疫組織化学法で染色した。ＣＣ１４によって肝損傷（レティキュリン染色）および肝マクロファージ浸潤（Ｆ４／８０）が誘導されるが、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスの肝組織の方が誘導がはるかに顕著である。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マウスは、ＣＣＬ４刺激による肝損傷および肝マクロファージ浸潤の両方に抵抗性を示した。
【図２３Ｂ】図２３ｂは、溶媒またはＣＣＬ４で処置してから３０時間後のＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの代表的な組織学的試料を示している。ホルマリンで固定した肝組織をレティキュリンまたはＦ４／８０免疫組織化学法で染色した。Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化を阻止するドミナントネガティブなペプチド（８時間後に１００ｐｇ  ＩＰ）によって、ＣＣｌ４による肝損傷（レティキュリン染色）が約９０％（Ｐ＜０．００１）、肝マクロファージ浸潤（Ｆ４／８０）が約６０％（Ｐ＜０．０１）抑制された。上の図１５ａ〜１５ｅに記載される実験の代表的な例。
【図２４】マクロファージ除去によってＣＣｌ４誘導性の肝損傷およびマクロファージ浸潤が抑えられることを示す図である。クロンドロネート（Ｃｌｏｎｄｒｏｎａｔｅ）リポソームを投与してマクロファージを枯渇させ、２４時間後に溶媒またはＣＣｌ４を投与したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの組織学的試料。Ｃｌｌ４処置から３０時間後、マクロファージ枯渇マウスに肝損傷（レティキュリン染色）および肝マクロファージ浸潤（Ｆ４／８０）の著明な減少がみられた。上の図１６ａ〜１６ｆに記載される実験の代表的な例。
【図２５Ａ】ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドＩＰ、ペプチドの気管内点滴注入（陽性対照）またはペプチド吸入による処置によって、肺線維症の程度；Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化と共局在するα−ＳＭＡ（活性化筋線維芽細胞のマーカー）の発現の著明な減少がみられたことを示す図である。さらに、いずれの処置でも、ＩＬ−２３Ｒ（Ｔｈ−１７細胞のマーカー）の発現によって判定される肺炎症の軽減が認められた。ブレオマイシンによって肺線維症が対照マウスの５倍超増大した。これに対し、ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドまたは吸入ペプチドを投与したマウスは、３回の投与（第１０日、第１７日および第２４日）で１４日間処置しただけで肺線維症が約６０％軽減された（Ｐ＜０．００１）。予想通り、気管内点滴注入（処置陽性対照）では際立った効果が認められ、対照マウスとの差はごくわずかであった（Ｐ＜０．００１）。このペプチドによってほかにも、ＩＬ−２３Ｒの発現減少から判断されるＴｈ−１７炎症（ＩＰＦ炎症の重要な構成要素であると推測される）の軽減が認められた。定量的ＩＭＨによる実質的に正常なサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＦＰＣ）の発現（Ｐ＜０．００１）（図２５ａ）から判断して、ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドまたは吸入ペプチドを投与したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの方が、対照Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスよりもブレオマイシン処置後の肺損傷が少なかった。ＲＴ−ＰＣＲによる判定では、コラーゲンα１（主要なＥＣＭ遺伝子）およびＴＧＦβ１（線維症性サイトカイン）がともに減少し、定量的ＩＭＨとの一致がみられた。
【図２５Ｂ】ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドＩＰ、ペプチドの気管内点滴注入（陽性対照）またはペプチド吸入による処置によって、肺線維症の程度；Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化と共局在するα−ＳＭＡ（活性化筋線維芽細胞のマーカー）の発現の著明な減少がみられたことを示す図である。さらに、いずれの処置でも、ＩＬ−２３Ｒ（Ｔｈ−１７細胞のマーカー）の発現によって判定される肺炎症の軽減が認められた。ブレオマイシンによって肺線維症が対照マウスの５倍超増大した。これに対し、ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドまたは吸入ペプチドを投与したマウスは、３回の投与（第１０日、第１７日および第２４日）で１４日間処置しただけで肺線維症が約６０％軽減された（Ｐ＜０．００１）。予想通り、気管内点滴注入（処置陽性対照）では際立った効果が認められ、対照マウスとの差はごくわずかであった（Ｐ＜０．００１）。このペプチドによってほかにも、ＩＬ−２３Ｒの発現減少から判断されるＴｈ−１７炎症（ＩＰＦ炎症の重要な構成要素であると推測される）の軽減が認められた。定量的ＩＭＨによる実質的に正常なサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＦＰＣ）の発現（Ｐ＜０．００１）（図２５ａ）から判断して、ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドまたは吸入ペプチドを投与したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの方が、対照Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスよりもブレオマイシン処置後の肺損傷が少なかった。ＲＴ−ＰＣＲによる判定では、コラーゲンα１（主要なＥＣＭ遺伝子）およびＴＧＦβ１（線維症性サイトカイン）がともに減少し、定量的ＩＭＨとの一致がみられた。
【図２６】図２５ａ〜２５ｂに記載されるＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドＩＰ、ペプチドの気管内点滴注入（陽性対照）またはペプチド吸入による処置に関する図である。１４日間という短期間の処置にもかかわらず、いずれの処置でも一回換気量が３５％超改善した（Ｐ＜０．０１）。
【図２７】肺胞上皮細胞アポトーシスの著明な抑制（約６０％）（Ｐ＜０．００５）から判断して、ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドまたは吸入ペプチドを投与したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの方が、対照Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスよりもブレオマイシン処置後の肺損傷が少なかったことを示す図である。
【図２８】半月体形成性糸球体腎炎患者の腎生検組織の代表的な免疫組織化学を示す図である。肝臓および肺の炎症および線維症に関する報告と同じく、腎糸球体腎炎に活性化筋線維芽細胞（α−ＳＭＡ）の著明な増加およびマクロファージ炎症性反応（Ｆ４／８０）の著明な増大が認められた。これらの細胞はＣ／ＥＢＰβ−２６６陽性であり、ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドで腎炎症および腎線維症を標的化することが実現される可能性が高いことが示された。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、別途定義されない限り、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。それ以外の具体的に定義される用語は、本明細書に記載される定義と一致するものとして解釈されるべきである。本発明の検証を実施する際には、本明細書に記載されるものと類似するか、これと同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。本発明の説明および特許請求には、以下に挙げる用語を使用する。
【００３０】
本明細書および添付の「特許請求の範囲」で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容からそうでないことが明らかでない限り、複数形の指示対象を包含する。したがって、例えば「構築物（ａ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」と言う場合、２つ以上の核酸構築物などの組合せがこれに包含される。
【００３１】
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト、哺乳動物および／または獣医学動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど）のほか、実験動物モデルを指す。ある特定の実施形態では、対象は、成人集団および小児集団の男女を含めたヒト患者を指す。
【００３２】
本発明と関連して本明細書に記載されるいずれかの疾患状態に関連する限り、治療する」、「治療」などの用語は、そのような状態に付随する少なくとも１つの症状を軽減もしくは緩和すること、またはそのような状態の進行を遅延もしくは逆転させることを意味する。本発明の意味においては、「治療」という用語はほかにも、発症を停止および／または遅延（すなわち、疾患の臨床症状の前の期間）させること、ならびに／あるいは疾患が進展または増悪するリスクを軽減することを表す。状態、障害または病態に関する「治療する」、「治療」などの用語はほかにも、（１）その状態、障害もしくは病態に罹患する可能性があるか、罹患しやすい傾向があるが、未だその状態、障害もしくは病態の臨床症状もしくは亜臨床症状を経験しても呈してもいない対象に発症しつつある状態、障害もしくは病態の少なくとも１つの臨床症状もしくは亜臨床症状の発現を予防するか遅延させること；あるいは（２）その状態、障害または病態を抑制すること、すなわち、疾患の発症もしくはその再発（維持療法の場合）またはその少なくとも１つの臨床症状もしくは亜臨床症状を停止させるか、軽減するか、遅延させること；あるいは（３）疾患を軽減すること、すなわち、状態、障害もしくは病態または少なくとも１つのその臨床症状もしくは亜臨床症状を消退させることを包含する。
【００３３】
本発明の実施には、特に明示されない限り、当業者の技能範囲内にある統計解析、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の従来の技術を用いる。そのようなツールおよび技術については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第３版．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｃｏｌｉｇａｎら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｃｏｉｃｏら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｃｏｌｉｇａｎら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；およびＥｎｎａら編（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪに詳細に記載されている。そのほかの技術については、例えば、米国特許第７，９１２，６９８号、米国特許出願公開第２０１１／０２０２３２２号および同第２０１１／０３０７４３７号で説明されている。
【００３４】
本発明のペプチド、組成物および投与
本発明は、肝臓、肺、腎臓および／またはその他の瘢痕組織の１つの分子タンパク質標的の１つのリン酸化を阻止して筋線維芽細胞および／またはマクロファージの活性化および産生を阻害および／または抑制し、肝臓、肺および／またはその他の瘢痕組織の炎症および／または線維症を抑制するよう設計された治療用ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、ほかの機序過程には不必要なものであるため、高い特異性および効果を示すと同時に、オフターゲット中毒が起こる可能性を最小限に抑える。
【００３５】
ある特定の実施形態では、本発明は、分子標的に対して高い効果を発揮して、筋線維芽細胞の活性化を阻害し、肝線維症、肺線維症および腎線維症を抑制する治療用ペプチドを提供する。他の実施形態では、本発明はさらに、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−ホスホ−Ｔｈｒ２６６（マウスＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のヒト相同体）が、炎症性マクロファージのインフラマソームの活性化を調節し、筋線維芽細胞を活性化することによって肝臓、肺および腎臓の炎症および損傷に主要な役割を果たすという事実を提供する。進化的に保存された（ヒトＣ／ＥＢＰβ−ホスホ−Ｔｈｒ２６６でも同じである）Ｃ／ＥＢＰβ−ホスホ−Ｔｈｒ２１７シグナル伝達は、様々な肝毒素によって誘導されるマクロファージインフラマソーム活性および肝損傷を調節する。ある特定の実施形態では、治療用ペプチドはほかにも、アポトーシス機序を介して筋線維芽細胞の活性化を阻止して、瘢痕組織の線維症の進行を抑え消退させる。
【００３６】
本発明は、肝臓、肺、腎臓および／またはその他の瘢痕組織の産生には極めて重要であるが、ほかの機序過程には不必要な単一の事象である、１つのタンパク質のリン酸化を阻止するよう設計された治療用ペプチドを提供する。したがって、この候補薬物は高い特異性および効果を示すと同時に、オフターゲット中毒が起こる可能性を最小限に抑える。ある特定の実施形態では、本発明は、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７が、肝臓、肺および／または腎臓のマクロファージのインフラマソーム活性化を調節することによって肝臓、肺および／または腎臓の炎症および損傷に主要な役割を果たすという事実を提供する。進化的に保存された（ヒトＣ／ＥＢＰβ−ホスホ−Ｔｈｒ２６６でも同じである）Ｃ／ＥＢＰβ−ホスホ−Ｔｈｒ２１７シグナル伝達は、様々な肝毒素、腎毒素および／または肺毒素によって誘導されるマクロファージインフラマソーム活性ならびに肝損傷、肺損傷および／または腎損傷を調節する。
【００３７】
ある特定の実施形態では、本発明のペプチドがアポトーシスを刺激して線維形成を阻止し、肝臓、肺、腎臓および／またはその他の組織の炎症および／または線維症の進行を抑え、その消退を誘導することが明らかにされている。ある特定の実施形態では、本発明のペプチドはほかにも、分子標的、例えば活性化された肝臓、肺および／または腎臓の筋線維芽細胞および／またはマクロファージのＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化に対して高い効果を示して、筋線維芽細胞および／またはマクロファージの活性化を阻害し、肝臓、肺および／または腎臓の炎症および線維形成を抑える。
【００３８】
一態様では、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐを含み、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）のトレオニン２６６（Ｔｈｒ２６６）またはマウスＣ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７のリン酸化を阻害することが可能である、単離ペプチドを提供する。ヒトおよびマウスのＣ／ＥＢＰβ配列の例については、例えば、ヒト：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １０５１；マウス：ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １２６０８を参照されたい。
【００３９】
一実施形態では、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ内のＡｌａおよび／またはＶａｌはＤ−アミノ酸である。一実施形態では、ペプチドは、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（Ｃ／ＥＢＰβ）のトレオニン２６６（Ｔｈｒ２６６）のリン酸化を選択的に阻害することが可能である。一実施形態では、ペプチドは、筋線維芽細胞および／またはマクロファージインフラマソームの活性化を阻害することが可能である。一実施形態では、ペプチドは、長さが４アミノ酸〜８アミノ酸である。一実施形態では、ペプチドは、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−ＡｓｐおよびＬｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ペプチドは、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−ＡｓｐおよびＬｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。一実施形態では、ペプチドはアミノ酸配列Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐを含む。一実施形態では、ペプチドはアミノ酸配列Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる。一実施形態では、ペプチドは、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（配列番号３）、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（配列番号４）およびＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ（配列番号５）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる（例えば、アミノ酸モチーフＬｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ内のＡｌａおよび／またはＶａｌがＤ−アミノ酸であるペプチド）。一実施形態では、ペプチドはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む。一実施形態では、ペプチドは、酸（Ａｃ）、メルカプトプロピオン酸（Ｍｐｒ）またはトリメチルロック（ＴＭＬ）ラクトン化のリンカーをさらに含む（例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．７４、２００１、１５９−１７１を参照されたい）。一実施形態では、ペプチドのカルボキシ末端基は、ＯＨ基、ＯＣＨ３基またはＮＨ２基である。一実施形態では、ペプチドは環状ペプチドである。
【００４０】
一実施形態では、ペプチドは、
Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ａｃ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐおよび
ＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ
からなる群より選択され、ペプチドのカルボキシ末端基は、ＯＨ基、ＯＣＨ３基またはＮＨ２基である。
【００４１】
一実施形態では、ペプチドは、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ、ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−ＡｓｐおよびＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐからなる群より選択され、ペプチドのカルボキシ末端基は、ＯＨ基、ＯＣＨ３基またはＮＨ２基である。
【００４２】
一実施形態では、ペプチドは、Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２、ＰＥＧ−Ａｃ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２およびＰＥＧ−Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２からなる群より選択される。
【００４３】
一実施形態では、ペプチドは式（Ｉ）：
【化２】
2018520999.tif 000003
で示される構造を有する。
【００４４】
上に開示されるペプチドに加え、本発明はほかにも、Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ−２１７のアミノ酸１〜２９６（マウス）、Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ−２１７フラグメントのアミノ酸２１６〜２５３（マウス）およびＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ−２１７のアミノ酸１〜２８５（マウス）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １２６０８に土台とし２１７位をＡｌａにして得られる）を包含する。これに対応するヒト配列およびフラグメントも包含され、これはヒトＣ／ＥＢＰβ配列を土台とし２６６位をＡｌａにして（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １０５１を土台とし２６６位をＡｌａにして）得ることができる。
【００４５】
本発明のペプチドは、例えばヘテロ二官能性リンカーの使用によって、修飾することができる。ヘテロ二官能性ＰＥＧの末端基の非限定的な例には、マレイミド，ビニルスルホン，ピリジルジスルフィド，アミン，カルボン酸およびＮＨＳエステルがある（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｍ．“ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．”Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２．５（２００１）：４０５−４１７を参照されたい）。本発明のペプチドに第三世代ＰＥＧ化剤、例えば分岐状、Ｙ字型または櫛状のＰＥＧ化剤を用いてもよい（例えば、Ｒｙａｎ，Ｓｉｎｅａｄ  Ｍ；Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ｇｉｕｓｅｐｐｅ；Ｗａｎｇ，Ｘｕｅｘｕａｎ；Ｈａｄｄｌｅｔｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｍ；Ｂｒａｙｄｅｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ（２００８）．“Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｓｐｅｃｔｓ”．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ５（４）：３７１−８３を参照されたい）。本発明のペプチドは多量体化および／または環状化されたものであってもよい（例えば、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｕｐ社）。
【００４６】
本発明のペプチドに有用な送達技術としては、例えば、ＬＡＲ−デポマイクロスフェアポリマーマトリックス（Ｍｉｄａｔｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａ社）およびＰｒｏｔｅｃｔｅｄ  Ｇｒａｆｔ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ（ＰＧＣ（商標））技術（ＰｈａｒｍａＩＮ社）が挙げられる。
【００４７】
本発明のペプチドを様々な方法で修飾して、その薬物動態をはじめとする特性を改善することができる。ペプチドのアミノ（Ｎ−）末端および／またはカルボキシ（Ｃ−）末端を修飾し、かつ／あるいは１つまたは複数の天然の遺伝的にコードされるアミノ酸の非在来型のアミノ酸による置換、１つまたは複数のアミノ酸残基の側鎖の修飾、ペプチドのリン酸化などによってペプチドを修飾することができる。
【００４８】
アミノ末端修飾としては、メチル化（例えば、−−ＮＨＣＨ３または−−Ｎ（ＣＨ３）２）、アセチル化（例えば、酢酸またはそのハロゲン化誘導体、例えばα−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸もしくはα−ヨード酢酸などによるもの）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基の付加またはＲＣＯＯ−−によって定義されるカルボン酸官能基もしくはＲ−−ＳＯ２−−によって定義されるスルホニル官能基（式中、Ｒはアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールなどから選択される）を含む任意のブロッキング基およびこれに類似した基によるアミノ末端のブロッキングが挙げられる。このほか、（Ｎ末端アミノ基がなくなるように）Ｎ末端にデスアミノ酸を組み込んで、ペプチド化合物のプロテアーゼに対する感受性を低下させたり、コンホメーションに制約を加えたりすることができる。
【００４９】
カルボキシ末端修飾としては、遊離酸をカルボキサミド基で置換すること、またはカルボキシ末端に環状ラクタムを導入して構造的制約を導入することが挙げられる。このほか、本発明のペプチドを環状化したり、ペプチドの末端のアミノ基またはカルボキシル基がなくなるように、その末端にデスアミノ残基またはデスカルボキシ残基を組み込んだりして、ペプチドのプロテアーゼに対する感受性を低下させたり、ペプチドのコンホメーションに制約を加えたりすることができる。本発明の化合物のＣ末端官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシおよびカルボキシならびにその低級エステル誘導体のほか、その薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００５０】
遺伝的にコードされる２０種類のアミノ酸（または立体異性Ｄ−アミノ酸）の天然の側鎖を他の側鎖、例えば、アルキル、低級アルキル、環状４員、５員、６員〜７員アルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびその低級エステル誘導体などの基ならびに４員、５員、６員〜７員複素環などで置換してもよい。例えば、プロリン残基の環の大きさが５員から４員、６員または７員に変化したプロリン類似体を用いることができる。環状基は飽和であっても不飽和であってもよく、不飽和である場合、芳香族であっても非芳香族であってもよい。複素環基は、１つまたは複数の窒素、酸素および／または硫黄ヘテロ原子を含むものが好ましい。このような基の例としては、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、モルホリニル（例えば、モルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば、１−ピペラジニル）、ピペリジル（例えば、１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば、１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えば、チオモルホリノ）およびトリアゾリルが挙げられる。これらの複素環基は、置換されていても置換されていなくてもよい。基が置換されている場合、置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素または置換フェニルもしくは非置換フェニルであり得る。
【００５１】
従来のアミノ酸置換の一般的な例としては、立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）および非天然アミノ酸、例えばＬ−オルニチン、Ｌ−ホモシステイン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−シトルリン、３−スルフィノ−Ｌ−アラニン、Ｎ−（Ｌ−アルギニノ）コハク酸、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン、トリヨードチロニン、Ｌ−チロキシン、Ｌ−セレノシステイン、Ｎ−（Ｌ−アルギニノ）タウリン、４−アミノブチレート（ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｔｅ）、（Ｒ，Ｓ）−３−アミノ−２−メチルプロパノアート、ａ，ａ−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、β−アラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ノル−ロイシンなどのほか、これに類似した他のアミノ酸およびイミノ酸が挙げられる。タンパク質およびペプチドに非天然アミノ酸を部位特異的に組み込む一般的方法については、Ｎｏｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（Ａｐｒｉｌ  １９８９）に記載されている。
【００５２】
ほかにも、（例えば、Ｈｒｕｂｙら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２６８：２４９−２６２に記載されているように）リン酸化をはじめとする方法によって容易にペプチドを修飾することができる。
【００５３】
本発明のペプチド化合物は、これに類似した生物活性を有する非ペプチド性化合物の構造モデルとしての役割も果たし得る。当業者には、リードペプチド化合物と同じまたは類似した所望の生物活性を有するが、溶解性、安定性ならびに加水分解およびタンパク質分解に対する感受性の点でリードペプチド化合物よりも好ましい活性を有する化合物を構築するのに様々な技術が利用可能であることが理解される（例えば、ＭｏｒｇａｎおよびＧａｉｎｏｒ（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：２４３−２５２を参照されたい）。このような技術としては、ペプチド骨格をホスホナート、アミダート、カルバマート、スルホンアミド、第二級アミンおよびＮ−メチルアミノ酸からなる骨格に置換することが挙げられる。
【００５４】
本発明はほかにも、本開示のペプチド単量体のコンジュゲートを提供する。したがって、好ましい実施形態では、本発明の単量体ペプチドを二量体化または多量体化することによって、その生物活性を増強する。
【００５５】
一実施形態では、ビオチン／ストレプトアビジン系を用いて、本発明のペプチド単量体を多量体化し得る。標準的な技術によってペプチド単量体のビオチン化類似体を合成し得る。例えば、ペプチド単量体のＣ末端をビオチン化し得る。次いで、このようにビオチン化した単量体をストレプトアビジンとのインキュベーション［例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中、４：１のモル比で１時間、室温にて実施する］によって多量体化する。この実施形態の変形形態では、多数ある市販の抗ビオチン抗体［例えば、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ワシントンＤＣ）のヤギ抗ビオチンＩｇＧ］のいずれか１つとのインキュベーションによってビオチン化ペプチド単量体を多量体化し得る。
【００５６】
リンカー。他の実施形態では、本発明のペプチド単量体を少なくとも１つリンカー部分と共有結合させることによって二量体化することができる。リンカー（ＬＫ）部分は、任意選択で１つまたは２つの−ＮＨ−結合を末端とし、かつ任意選択で１つまたは複数の利用可能な炭素原子が低級アルキル置換基（例えば、Ｒが、カルボキシル基またはアミノ基、例えばリジン残基もしくはリジンアミドなどの官能基で置換された低級（Ｃ１〜６）アルキレンである、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−）で置換されたＣ１〜１２連結部分であり得る。
【００５７】
ほかの実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が２つのペプチド単量体を二量体化するリンカーＬＫとしての役割を果たし得る。例えば、単一のＰＥＧ部分がペプチド二量体の両方のペプチド鎖のＮ末端に同時に結合していてよい。
【００５８】
また別の実施形態では、リンカー（ＬＫ）部分は、カルボン酸を２つ含むぶんしであって、任意選択で、１つまたは複数の利用可能な原子が、追加の官能基、例えば１つまたは複数のＰＥＧ分子と結合することが可能なアミンなどで置換されている分子であるのが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。このような分子は、
−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−
のように表すことができ、式中、ｎは０〜１０の整数であり、ｍは１〜１０の整数であり、ＸはＯ、Ｓ、Ｎ（ＣＨ２）ｐＮＲ１、ＮＣＯ（ＣＨ２）ｐＮＲ１およびＣＨＮＲ１から選択され、Ｒ１はＨ、Ｂｏｃ、Ｃｂｚなどから選択され、ｐは１〜１０の整数である。
【００５９】
リンカーは、ペプチド合成時にペプチドに組み込むことができる。例えば、リンカーＬＫ部分が、ペプチド合成の開始部位としての役割を果たすことが可能な２つの官能基と、別の分子部分との結合を可能にする第三の官能基（例えば、カルボキシル基またはアミノ基）とを含む場合、リンカーを固体担体とコンジュゲートさせ得る。そののち、固相合成技術の変形形態を用いて、リンカーＬＫ部分の２つの活性窒素基上に直接２つのペプチド単量体を合成し得る。
【００６０】
リンカーＬＫ部分によってペプチド二量体を二量体化する別の実施形態では、ペプチド合成後、前記リンカーをペプチド二量体の２つのペプチド単量体にコンジュゲートさせ得る。このようなコンジュゲーションは、当該技術分野で十分に確立された方法によって達成し得る。一実施形態では、リンカーは、合成されたペプチド単量体の標的官能基と結合させるのに適した官能基を少なくとも２つ含む。例えば、２つの遊離アミン基を有するリンカーを２つのペプチド単量体それぞれのＣ末端カルボキシル基と反応させ得る。別の例では、２つのカルボキシル基を含むリンカーを、予め活性化した状態で、または適切なカップリング試薬の存在下で、２つのペプチド単量体それぞれのＮ末端もしくは側鎖のアミン基またはＣ末端のリジンアミドと反応させ得る。
【００６１】
スペーサー。ペプチド単量体またはペプチド二量体は、１つまたは複数のスペーサー部分をさらに含み得る。このようなスペーサー部分をペプチド単量体またはペプチド二量体に結合させ得る（例えば、ペプチド二量体のモノマー同士を連結するリンカーＬＫ部分にこのようなスペーサー部分を結合させ得る）。例えば、リジンリンカーのカルボニル炭素またはイミノ二酢酸リンカーの窒素原子を介して、このようなスペーサー部分をペプチドに結合させ得る。このようなスペーサーは、ペプチドと、結合した水溶性ポリマー部分または保護基とを連結し得る。
【００６２】
一実施形態では、スペーサー部分は、任意選択で−ＮＨ−結合またはカルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を末端とし、任意選択で１つまたは複数の利用可能な炭素原子が低級アルキル置換基で置換されている、Ｃ１〜１２連結部分である。一実施形態では、スペーサーはＲ−ＣＯＯＨであり、式中、Ｒは、任意選択で別の分子部分との結合を可能にするカルボキシル基またはアミノ基などの官能基で置換された低級（Ｃ１〜６）アルキレンである。例えば、スペーサーはグリシン（Ｇ）残基またはアミノヘキサン酸であり得る。
【００６３】
他の実施形態では、スペーサーは−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−であり、式中、Ｒは、別の分子部分との結合を可能にするカルボキシル基またはアミノ基などの官能基で置換された低級（Ｃ１〜６）アルキレンである。例えば、スペーサーは、リジン（Ｋ）残基またはリジンアミド（Ｋ−ＮＨ２、カルボキシル基がアミド部分−ＣＯＮＨ２に変換されているリジン残基）であり得る。
【００６４】
スペーサーは、ペプチド合成時にペプチドに組み込むことができる。例えば、スペーサーが、遊離アミノ基と、別の分子部分との結合を可能にする第二の官能基（例えば、カルボキシル基またはアミノ基）とを含む場合、スペーサーを固体担体とコンジュゲートさせ得る。そののち、標準的な固相技術によってスペーサーの遊離アミノ基上に直接ペプチドを合成し得る。
【００６５】
例えば、最初に、２つの官能基を含むスペーサーを、第一の官能基を介して固体担体に結合させる。次いで、ペプチド合成の開始部位としての役割を果たすことが可能な２つの官能基と、別の分子部分との結合を可能にする第三の官能基（例えば、カルボキシル基またはアミノ基）とを有するリンカーＬＫ部分を、スペーサーの第二の官能基およびリンカーの第三の官能基を介してスペーサーとコンジュゲートさせる。そののち、固相合成技術の変形形態を用いて、リンカーＬＫ部分の２つの活性窒素基上に直接２つペプチド単量体を合成し得る。例えば、遊離アミン基を有し固体担体と結合したスペーサーを、リンカーの遊離カルボキシル基を介してリジンリンカーと反応させ得る。
【００６６】
ペプチド化合物がスペーサー部分を含む別の実施形態では、ペプチド合成後に前記スペーサーをペプチドにコンジュゲートさせ得る。このようなコンジュゲーションは、当該技術分野で十分に確立された方法によって達成し得る。一実施形態では、リンカーは、合成されたペプチドの標的官能基と結合させるのに適した官能基を少なくとも１つ含む。例えば、遊離アミン基を有するスペーサーをペプチドのＣ末端カルボキシル基と反応させ得る。別の例では、遊離カルボキシル基を有するリンカーをペプチドのＮ末端またはリジン残基の遊離アミン基と反応させ得る。また別の例では、遊離スルフィドリル基を含むスペーサーを酸化によってペプチドのシステイン残基とコンジュゲートさせてジスルフィド結合を形成させ得る。
【００６７】
水溶性ポリマー部分。本発明のペプチド単量体、ペプチド二量体またはペプチド多量体は、１つまたは複数の水溶性ポリマー部分をさらに含み得る。これらのポリマーは、本発明のペプチドと共有結合しているのが好ましい。２００４年５月１２日に出願された米国特許出願第１０／８４４，９３３号および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／１４８８７号が、以下の記載を含めその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
近年、治療および予防に重要なペプチドの共有結合修飾にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性可溶性ポリマーが用いられている。このようなポリマーを結合させることにより、生物活性が増強され、血中循環時間が長くなり、免疫原性が低下し、水溶解度が増大するほか、プロテアーゼ消化に対する耐性が増大すると考えられている（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編，“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｋｎａｕｆら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３；１５０６４；Ｔｓｕｔｓｕｍｉら（１９９５）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ３３：４４７；Ｋｉｔａら（１９９０）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ６：１５７；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：５８２；Ｂｅａｕｃｈａｍｐら（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５；Ｃｈｅｎら（１９８１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ  ６６０：２９３を参照されたい）。
【００６９】
本発明のペプチド化合物に有用な水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコール（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマーおよびポリオキシエチル化ポリオールであり得る。
【００７０】
水溶性ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分岐状であっても非分岐状であってもよい。本発明に使用するのに好ましいＰＥＧは、低分子量の直鎖状で非分岐状のＰＥＧを含むものである。所与のＰＥＧの調製物では、分子量は通常、個々の分子の間で異なることが理解される。分子によって、記載の分子量よりも分子量が大きいものも小さいものもある。このような差は一般に、ＰＥＧ分子の分子量を記載するのに「約」という語を用いることによって表される。
【００７１】
本発明のペプチド、ペプチド二量体をはじめとするペプチド系分子は、水溶性ポリマー（１つまたは複数）と分子の受容体結合部分とを連結する様々な化学反応（例えば、ペプチド＋スペーサー）のいずれかを用いることによって、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と結合させることができる。典型的な実施形態では、水溶性ポリマー（１つまたは複数）と受容体結合部分との共有結合に単一の結合点を用いるが、別の実施形態では、複数の結合点を用いてよく、スペーサーおよび／または一方もしくは両方のペプチド鎖との共有結合点（１つまたは複数）を含み得る異なる結合点で様々な種の水溶性ポリマーと受容体結合部分とを結合させるさらなる変形形態がこれに含まれる。いくつかの実施形態では、二量体またはそれ以上の多量体は、異なる種のペプチド鎖を含む（すなわち、ヘテロ二量体をはじめとするヘテロ多量体）。特に限定されないが例を挙げれば、二量体は、ＰＥＧ結合点を有する第一のペプチド鎖と、ＰＥＧ結合点を欠くか第一のペプチド鎖とは異なる連結化学反応を用い得る第二のペプチド鎖とを含むものであり得、いくつかの変形形態では、スペーサーはＰＥＧ結合点を含んでも含まなくてもよく、ペグ化されている場合、前記スペーサーは、第一および／または第二のペプチド鎖のものとな異なる連結化学反応を用いるものであり得る。別の実施形態では、受容体結合部分のスペーサー部分と結合したＰＥＧと、分子のペプチド部分の１つのアミノ酸の側鎖とコンジュゲートした異なる水溶性ポリマー（例えば、炭水化物）とを用いる。
【００７２】
受容体結合部分（ペプチド＋スペーサー）のＰＥＧ化には多種多様なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）種を用い得る。実質的に任意の適切な反応性ＰＥＧ試薬を用いることができる。好ましい実施形態では、反応性ＰＥＧ試薬は、受容体結合部分とコンジュゲートするとカルバマート結合またはアミド結合が生じるものである。適切な反応性ＰＥＧ種としては、特に限定されないが、ＮＯＦ社（恵比寿ガーデンプレイスタワー、恵比寿４丁目２０−３、渋谷区、東京、１５０−６０１９）のＤｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍカタログ（２００３）およびＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（ディスカバリードライブ４９０、ハンツビル、アラバマ州、３５８０６）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇカタログ（２００３）で販売されているものが挙げられる。例えば、特に限定されないが、様々な実施形態には多くの場合、以下に挙げるＰＥＧ試薬が好ましい：ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、ｍＰＥＧ２−ＡＬＤ、ｍｕｌｔｉ−Ａｒｍ  ＰＥＧ、ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２、ｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）、ｍＰＥＧ−ＮＨ２、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ、ｍＰＥＧ−チオエステル、ｍＰＥＧ−Ｄｏｕｂｌｅ  Ｅｓｔｅｒｓ、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ、ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ、ｍＰＥＧ−ＡＣＥＴ、ヘテロ官能性ＰＥＧ（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、ＰＥＧアクリル酸（ＡＣＲＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、ＰＥＧ−リン脂質（例えば、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、当業者が選択する化学反応によって活性化されるグリセリン系ＰＥＧのＧＬシリーズを含めたＳＵＮＢＲＩＴＥシリーズの分岐ＰＥＧ、いずれかのＳＵＮＢＲＩＴＥ活性化ＰＥＧ（特に限定されないが、カルボキシル−ＰＥＧ、ｐ−ＮＰ−ＰＥＧ、Ｔｒｅｓｙｌ−ＰＥＧ、アルデヒドＰＥＧ、アセタール−ＰＥＧ、アミノ−ＰＥＧ、チオール−ＰＥＧ、マレイミド−ＰＥＧ、ヒドロキシル−ＰＥＧ−アミン、アミノ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ヒドロキシル−ＰＥＧ−アルデヒド、カルボン酸無水物型ＰＥＧ、官能基化ＰＥＧ−リン脂質をはじめとする類似のＰＥＧを含む）ならびに／あるいは当業者がその具体的な用途および使用法に応じて選択する適切な反応性ＰＥＧ。
【００７３】
結合させるポリマー分子の数は様々なものであり得、例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の水溶性ポリマーを本発明のペプチドに結合させ得る。結合させる複数のポリマーは、同じ化学的部分であっても異なる化学的部分（例えば、分子量の異なるＰＥＧ）であってもよい。いくつかの場合には、ポリマー結合の程度（ペプチドに結合させるポリマー部分の数および／またはポリマーを結合させるペプチドの総数）は、結合反応するポリマー分子とペプチド分子の割合および反応混合物中のそれぞれの総濃度に影響され得る。一般に、（余分な未反応のペプチドおよび／またはポリマー部分が生じない反応効率の観点からみて）最適なポリマーとペプチドの比は、所望のポリマー結合の程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−など）、選択するポリマーの分子量、ポリマーの分岐の有無および具体的な結合法のための反応条件などの因子によって決まる。
【００７４】
当業者が用いることができるＰＥＧ結合法は多数存在する（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３；欧州特許第０  ４０１  ３８４号；Ｍａｌｉｋら（１９９２）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５；国際公開第９０／１２８７４号；米国特許第５，７５７，０７８号；および米国特許第６，０７７，９３９号を参照されたい）。例えば、Ｎ末端アミノ酸残基およびリジン（Ｋ）残基の遊離アミノ基またはＣ末端アミノ酸残基の遊離カルボキシル基などの反応基を介して、活性化ＰＥＧをアミノ酸残基と共有結合させ得る。ＰＥＧを結合させる反応基としてほかにも、スルフィドリル基（例えば、システイン残基上の存在するもの）を用い得る。さらに、活性化基（例えば、ヒドラジド基、アルデヒド基および芳香族アミノ基）をポリペプチドのＣ末端に特異的に導入する酵素法が記載されている（Ｓｃｈｗａｒｚら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４：１６０；Ｒｏｓｅら（１９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２：１５４；Ｇａｅｒｔｎｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４）。
【００７５】
例えば、様々な反応性部分を有するメトキシル化ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）を用いて、ＰＥＧ分子をペプチドアミノ基に結合させ得る。このようなポリマーとしては、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシナート、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカルボナート、ｍＰＥＧ−イミダート、ｍＰＥＧ−４−ニトロフェニルカルボナートおよびｍＰＥＧ−塩化シアヌルが挙げられる。同様に、遊離アミン基を有するメトキシル化ＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＮＨ２）を用いて、ＰＥＧ分子をペプチドのカルボキシル基に結合させ得る。
【００７６】
ＰＥＧの結合が非特異的なものであり、特異的ＰＥＧ結合を含むペプチドが望まれる場合、ペグ化化合物の混合物から所望のペグ化化合物を精製し得る。例えば、Ｎ末端ペグ化ペプチドが望まれる場合、ランダムにペグ化されたペプチドの集団からＮ末端がペグ化されたものを精製し得る（すなわち、この部分をほかのモノＰＥＧ化部分から分離する）。
【００７７】
（ｉ）固相合成（例えば、Ｆｅｌｉｘら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４６：２５３を参照されたい）または（ｉｉ）トレオニンのＮ末端の過ヨウ素酸ナトリウム酸化によって生じたＮ末端の反応性アルデヒド基を介してリポソーム表面グラフトＰＥＧ鎖の末端に部位特異的にペプチドを結合させること（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙら（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．６：７０５を参照されたい；この方法はＮ末端セリン残基またはトレオニン残基を有するポリペプチドに限られる）によって、あるいは（ｉｉｉ）米国特許第６，０７７，９３９号に記載されているヒドラゾン結合、還元ヒドラゾン結合、オキシム結合または還元オキシム結合を介して、Ｎ末端、側鎖およびＣ末端に部位特異的ＰＥＧ化を実施することができる。
【００７８】
１つの方法では、特定のタンパク質の誘導体化に利用可能な異なる種類の第一級アミノ基の反応性の差を利用する還元的アルキル化（リジン対Ｎ末端）によって、選択的Ｎ末端ＰＥＧ化を実施し得る。しかるべき反応条件下では、ＰＥＧを含むカルボニル基がペプチドのＮ末端と選択的に結合する。例えば、リジン残基のε−アミノ基とペプチドのＮ末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａの差を利用するｐＨで反応を実施することによって、タンパク質のＮ末端を選択的にＰＥＧ化し得る。このような選択的結合によって、ＰＥＧ化が主としてタンパク質のＮ末端で起こり、ほかの反応基（例えば、リジン側鎖アミノ基）はほとんど修飾されない。還元的アルキル化を用いる場合、ＰＥＧは、タンパク質とカップリングする単一の反応性アルデヒドを有するべきである（例えば、ＰＥＧプロプリオンアルデヒド（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ）を用い得る）。
【００７９】
部位特異的変異誘発は、部位特異的ポリマー結合のためのペプチドを調製するのに用い得るさらなる方法の１つである。この方法によって、ペプチド内の所望の位置にしかるべき反応基が組み込まれるようペプチドのアミノ酸配列を設計する。例えば、国際公開第９０／１２８７４号には、システイン残基の挿入またはほかの残基によるシステイン残基の置換によって修飾したタンパク質の部位特異的ＰＥＧ化が記載されている。
【００８０】
ＰＥＧをスペーサー部分またはリンカー部分と結合させる場合も同様の結合法を用い得る。この場合、リンカーまたはスペーサーは反応基を含むものであり、しかるべき相補的反応基を含む活性化ＰＥＧ分子を用いて共有結合させる。好ましい実施形態では、リンカーまたはスペーサーの反応基は末端アミノ基（すなわち、リンカーまたはスペーサーの末端に位置するもの）を含み、これを適切に活性化したＰＥＧ分子と反応させてアミドまたはカルバマートなどの安定な共有結合を生じさせる。適切な活性化ＰＥＧ種としては、特に限定されないが、ｍＰＥＧ−パラ−ニトロフェニルカルバマート（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ），ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカルボナート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）およびｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）が挙げられる。他の好ましい実施形態では、リンカーまたはスペーサーの反応基は、適切な反応条件下で活性化させてアミン含有ＰＥＧ分子と共有結合を形成させることが可能なカルボキシル基を含む。適切なＰＥＧ分子としてはｍＰＥＧ−ＮＨ２が挙げられ、適切な反応条件としてはカルボジイミド媒介性アミド形成などが挙げられる。
【００８１】
本発明のペプチドは、当該技術分野で公知の古典的方法によって調製し得る。このような標準的方法としては、排他的固相合成法、自動化固相合成法、部分的固相合成法、フラグメント濃縮、古典的溶液合成および組換えＤＮＡ技術が挙げられる（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３  ８５：２１４９およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，１９８２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１：５０２を参照されたい）。
【００８２】
ペプチド合成に好ましい方法は固相合成である。固相ペプチド合成法は当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．：Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９；２００２／２００３  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ；Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ，Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  ２００２を参照されたい）。固相合成では通常、α−アミノ保護樹脂を用いてペプチドのＣ末端から合成を開始する。適切な出発物質は、例えば、必要なα−アミノ酸をクロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ポリスチレン樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂などに結合させることによって調製することができる。上記のクロロメチル化樹脂の１つがＢｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（リッチモンド、カリフォルニア州）によって商標名ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ  ＳＸ−１で販売されている。ヒドロキシメチル樹脂の調製については既に記載されている（Ｂｏｄｏｎｓｚｋｙら（１９６６）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．Ｌｏｎｄｏｎ  ３８：１５９７）。ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂については既に記載されており（ＰｉｅｔｔａおよびＭａｒｓｈａｌｌ，１９７０，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６５０）、塩酸塩形態のものがＢｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（パロアルト、カリフォルニア州）から市販されている。例えば、Ｇｉｓｉｎによって記載されている方法（１９７３，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ５６：１４６７）に従い、炭酸水素セシウム触媒を用いてα−アミノ保護アミノ酸とクロロメチル化樹脂とをカップリングさせ得る。
【００８３】
最初のカップリングの後、例えば、有機溶媒に溶かしたトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または塩酸（ＨＣｌ）溶液を室温で用いてα−アミノ保護基を除去する。そののち、α−アミノ保護アミノ酸を連続的にカップリングさせて、担体に結合したペプチド鎖を伸長させる。α−アミノ保護基はペプチドの段階的合成の分野で有用であることが知られているものであり、アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基［例えば、ベンジルオキシカルボイル（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｙｌ）（Ｃｂｚ）および置換Ｃｂｚ］、脂肪族ウレタン保護基［例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］およびアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）および１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ））がこれに含まれる。
【００８４】
側鎖保護基（通常、エーテル、エステル、トリチル、ＰＭＣ（２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル）など）は、カップリング時にインタクトのままであり、アミノ末端保護基の脱保護のときもカップリングのときも分離することはない。側鎖保護基は、最終ペプチドの合成が完了したとき、目的ペプチドを変化させない条件下で除去可能なものでなければならない。Ｔｙｒの側鎖保護基としては、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、Ｚ−Ｂｒ−Ｃｂｚおよび２，５−ジクロロベンジルが挙げられる。Ａｓｐの側鎖保護基としては、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。ＴｈｒおよびＳｅｒの側鎖保護基としては、アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジルおよびＣｂｚが挙げられる。Ａｒｇの側鎖保護基としては、ニトロ、トシル（Ｔｏｓ）、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニル、メシトイルスルホニル（Ｍｔｓ）、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、４−ムトキシ（ｍｔｈｏｘｙ）−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）またはＢｏｃが挙げられる。Ｌｙｓの側鎖保護基としては、Ｃｂｚ、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｃｂｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｃｂｚ）、ＴｏｓまたはＢｏｃが挙げられる。
【００８５】
α−アミノ保護基を除去した後、残った保護アミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングさせる。一般に、保護アミノ酸をそれぞれ、溶液中、例えば塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはその混合物中、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などのしかるべきカルボキシル基活性化物質を用いて約３倍過剰量で反応させる。
【００８６】
所望のアミノ酸配列が完成した後、樹脂からペプチドを切断するのみならず、残りの側鎖保護基もすべて切断するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはフッ化水素（ＨＦ）などの試薬で処理することによって、所望のペプチドを樹脂から切り離す。クロロメチル化樹脂を使用する場合、フッ化水素処理によって遊離ペプチド酸が形成される。ベンズヒドリルアミン樹脂を使用する場合、フッ化水素処理によって遊離ペプチドアミドが直接生じる。あるいは、クロロメチル化樹脂を用いる場合、ペプチド樹脂をアンモニアで処理することによって側鎖保護ペプチドを切り離し、所望の側鎖保護アミドを得るか、アルキルアミンで処理することによって、側鎖が保護されたアルキルアミドまたはジアルキルアミドを得ることができる。次いで、フッ化水素で処理することにより通常の方法で側鎖保護を除去し、遊離のアミド、アルキルアミドまたはジアルキルアミドを得る。本発明のエステルを調製する際には、ペプチド酸の調製に使用する樹脂を用い、塩基およびしかるべきアルコール（例えば、メタノール）で側鎖保護ペプチドを切断する。次いで、フッ化水素で処理することにより通常の方法で側鎖保護基を除去し、所望のエステルを得る。得られたペプチドは、ＨＰＬＣを用いてさらに精製することができる。
【００８７】
上記の手順はほかにも、本発明のいずれかの化合物の１つ、２つまたはそれ以上の位置にある遺伝的にコードされる２０種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸が置換されたペプチドを合成するのに用いることができる。本発明のペプチドの中に置換することができる合成アミノ酸としては、特に限定されないが、Ｎ−メチル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３、４−ジヒドロキシフェニルアラニル、δアミノ酸、例えばＬ−δ−ヒドロキシリシルおよびＤ−δ−メチルアラニル、Ｌ−δ−メチルアラニルなど、βアミノ酸およびイソキノリルが挙げられる。
【００８８】
化学合成に加えて、組換えＤＮＡ技術を用い、ペプチドコード領域を含む１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現させることによって本発明のペプチドを合成してもよい。したがって、本明細書には、本発明のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドならびに組換えベクターおよび本発明のペプチドを発現または過剰発現するよう遺伝子を改変した宿主細胞（真核細胞および原核細胞の両方）が提供される。
【００８９】
一実施形態では、本発明は、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００９０】
発現は、目的のペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを単離し発現ベクターにクローン化することによって、当該技術分野で公知の任意の従来の発現系で達成し得る。
【００９１】
本発明の有用な化合物は、天然および／または非天然のアミノ酸を組み込んだペプチドに限定されない。本発明はほかにも、様々なペプチド模倣物、例えばペプトイド（側鎖をペプチド骨格のα−炭素ではなく窒素原子に付加したペプチド模倣物の一種）などを包含する。本発明のペプチドと同様の機能的特性を有する非ペプチド分子であって、単一分子内に異なる化学官能基を組み込むよう開発することができる非ペプチド分子は多数存在する。これらの分子は、広範囲にわたる化学反応性に適応することができるほか、空間内に化学官能基を様々な幾何学的配置で提示するよう設計することができることから、足場分子または足場と呼ばれることが多い。分子足場系としては、特に限定されないが、炭水化物（例えば、Ｔａｍａｒｕｙａら，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２００４，４３（２１）：２８３４−７を参照されたい）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版，Ｐｅｔｅｒ  Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ編，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４を参照されたい）および生物学的前駆物質に由来しない分子（例えば、ＳａｖｉｎｏｖおよびＡｕｓｔｉｎ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００２，４（９）：１４１９−２２を参照されたい）が挙げられる。この多様な一連の化学的性質を組み込むには、合成時に反応性官能基を化学的に保護することが必要とされ得る。このような技術は当該技術分野で周知であり、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９などの参考文献に記載されている。
【００９２】
本明細書に開示されるペプチドおよびその誘導体は、薬学的に許容される担体（補助剤または賦形剤など）および／または補形剤ならびに／あるいは希釈剤とともに組成物として製剤化し得る。本発明の組成物は、その成分の薬学的に許容される塩を含み得る。薬学的に許容される塩としては、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来するものであり得る。
【００９３】
薬学的に許容される担体は当業者によく知られているものであり、このようなものとして、無菌の液体、例えば水および油などが挙げられ、石油、動物油、植物油または合成油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などがこれに含まれる。特に注射用液剤に好ましい担体として、水または生理食塩水のほか、ブドウ糖溶液およびグリセロール溶液を用いるのが好ましい。Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎの「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に適切な医薬担体が記載されている。液体溶液として製剤化する組成物では、許容される担体および希釈剤は生理食塩水および滅菌水を含み、任意選択で抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤をはじめとする一般的な添加剤を含み得る。組成物はこのほか、本発明のペプチドに加えて希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑沢剤を含有し得る丸剤、カプセル剤、顆粒剤または錠剤として製剤化することができる。適切な製剤は選択する投与経路によって決まる。
【００９４】
本発明の化合物または組成物の至適な治療有効量は、正確な投与様式、薬物を投与する形態、投与の対象となる適応症、罹患している対象（例えば、体重、健康状態、年齢、性別など）ならびに担当する医師または獣医の選好および経験を考慮に入れて実験により決定され得る。
【００９５】
本発明のペプチドおよび組成物の有効性は、のちの実施例の節に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイを用いて判定することができる。
【００９６】
当該技術分野で十分に確立されている方法論に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で優れた成績が得られた本発明のペプチドおよび組成物の有効量および毒性を、それらが治療効果を示すことが明らかにされており、これらの薬物をヒト試験に提案されるものと同じ経路によって投与することができる小動物モデル（例えば、マウス、ラットまたはイヌ）を用いた試験で判定することができる。
【００９７】
本発明の方法に用いる任意の医薬組成物について、動物系で求めた用量反応曲線を用いて、ヒトに投与する試験用量を決定することができる。各組成物の安全性の判定では、投与する用量および頻度は、任意の臨床試験に使用することが予想されるものを満たすか上回るべきである。
【００９８】
本明細書に開示されるように、試験動物での結果および患者の個々の状態を考慮に入れてから、投与量が決定した量を継続的にも断続的にも上回らないよう本発明の組成物中の化合物の用量を決定する。当然のことながら、具体的な用量は、投与方法、患者または対象動物の状態、例えば年齢、体重、性別、感受性、食事、投与期間、併用薬物、疾患の重症度などによって異なる（最終的には実施者の判断および各患者の状況によって決まる）。
【００９９】
本発明の組成物の毒性および治療効果は、実験動物を用いる標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療効果がみられる用量）を求めることによって判定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比が治療指数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比で表すことができる。
【０１００】
本発明のペプチドを標的組織への送達には、あらゆる既知のペプチド送達法を用いることができる。所与のペプチドに有用な具体的な送達の種類は、その具体的な大きさ、柔軟性、コンホメーション、構成アミノ酸の生化学的特性およびアミノ酸の配置によって決まる。このほか、ペプチド組成がタンパク質結合の程度、酵素に対する安定性、細胞による捕捉、非標的組織内への取込み、クリアランス速度およびタンパク質担体に対する親和性を部分的に左右する。ほかにも、ペプチド組成とは無関係な他の側面、例えば脳血流量、食事、年齢、性別、種（実験的試験に関して）、投与経路および既存の病的状態の影響などを考慮に入れなければならない。
【０１０１】
本発明のペプチドおよび／または本発明のペプチドを含む医薬組成物は、特に限定されないが、全身投与、吸入、局所投与、舌下投与、経口投与、鼻腔内投与および／または直接的な点滴注入（例えば、肺治療のための気管内点滴注入）を含めた様々な投与経路を介して、必要とする対象（例えば、ヒトまたは動物）に投与することができる。さらに、本発明のペプチドは、任意の薬学的に許容される担体、補形剤、溶媒および／または溶液の有無を問わず、特定の適切な用量で、任意の適切な投与に合わせて製剤化することができる。
【０１０２】
本発明のペプチドを組織に効果的に送達する（脳組織の場合、血液脳関門［ＢＢＢ］を効果的に通過させる）のに有用な送達法の例としては、特に限定されないが（例えば、ＷｉｔｔおよびＤａｖｉｓ，ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００６；８（１）：Ｅ７６−Ｅ８８で概説されている）：
（ｉ）侵襲的方法（例えば、直接注射［例えば、外部ポンプまたはｉ．ｖ．ラインを用いる］、一過性オスモティックオープニング、シャントおよび生分解性埋植物）；
（ｉｉ）ペプチド分子自体の化学修飾あるいは透過性、安定性、バイオアベイラビリティおよび／または受容体親和性を増大させる物質にペプチドを結合または封入させることによって組織送達を増大させる薬理学的方法；さらに、ペプチド構造の修飾および／または構成要素（例えば、脂溶性促進物質、ポリマー、抗体）の付加によって標的組織中の局所ペプチド濃度を増大させ得る；
（ｉｉｉ）様々な担体機序を利用する生理学的戦略；所与のペプチドの性質に応じてこれらの戦略を組み合わせて「ハイブリッド」ペプチドを作製し、相乗的送達および末端効果をもたらすことができる。
【０１０３】
本発明のペプチドの送達を向上させるのに有用なペプチド修飾および方法の具体例としては、特に限定されないが、脂質修飾（例えば、構成アミノ酸のメチル化、ジメチル化もしくはハロゲン化またはＮ末端アミノ酸のアシル化もしくはアルキル化）、安定性を増大させる構造修飾（例えば、Ｄ−アミノ酸の使用、Ｎ−アシル化または例えばジスルフィド架橋もしくはヒドラジド架橋を介する環化）、グリコシル化（例えば、単純糖、例えばグルコースまたはキシロースなどの付加）、栄養素輸送体に対する親和性の増大（例えば、脳への基質の送達を促進するヘキソースまたは大きい中性アミノ酸担体の付加）、ペプチドと、作用部位またはその付近で切断される、既知の輸送体活性を有する分子または脂溶性促進物質とのコンジュゲーション（例えば、［例えば、芳香族ベンゾイルエステルまたは分岐鎖第三級ブチルエステルによる］エステル化またはアミノ、ヒドロキシルもしくはカルボン酸を含有するペプチドのアミド化を用いるもの；このほか、メチルヒドロピリジン担体とのコンジュゲーションおよびそれに続く脳内のＮＡＤＨ結合デヒドロゲナーゼによる酸化を用いて、酸化還元系を介する脳への送達を促進してもよく、これにより、ＢＢＢ内皮を横断して戻ることのない第四級アンモニウム塩が生じる）によるプロドラッグの形成、媒介物による送達（例えば、生体膜に対する親和性および受容体介在型エンドサイトーシスまたは吸収によるエンドサイトーシスを介して生体膜を横断する輸送とそれに続く酵素的切断によるペプチド放出を増大させる物質とペプチドとのカップリング［例えば、脳内取込みを増大させるペプチドとトランスフェリンに対するマウスモノクローナル抗体（ＯＸ２６）とのコンジュゲーションまたはペプチドとカチオン化アルブミンとのコンジュゲーション］によるもの）、吸収によるエンドサイトーシスを介する膜侵入を増大させるカチオン化ならびにポリマーコンジュゲーション／封入（例えば、ポリ（エチレングリコール）［ＰＥＧ］もしくはポリ（スチレンマレイン酸）とのコンジュゲーションまたは微粒子もしくはナノ粒子［例えば、大きさが１０〜１０００ｎｍの範囲であり、ポリソルベート−８０などのポリソルベートオーバーコーティングを有するポリマーナノ粒子］、リポソーム［例えば、例えばＰＥＧなどの柔軟な親水性ポリマーおよび／またはリン脂質二重層からなり親水性ペプチドおよび疎水性ペプチドの両方の担体として作用するリポソーム、例えばプルロニックコポリマーＰ８５などをグラフトとして表面を修飾した長時間循環リポソーム］、ミセル［例えば、両親媒性ＰＥＧ−リン脂質コンジュゲートから調製した安定なポリマーミセル］または細胞ゴーストを介する封入）が挙げられる。ＴｏｒｃｈｉｌｉｎおよびＬｕｋｙａｎｏｖ，ＤＤＴ，２００３，８（６）：２５９−２６６；ＥｇｌｅｔｏｎおよびＤａｖｉｓ，ＮｅｕｒｏＲｘ，２００５，２：４４−５３；ＷｉｔｔおよびＤａｖｉｓ，ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００６；８（１）：Ｅ７６−Ｅ８８で概説されている。
【０１０４】
用いる送達法に関係なく、本発明の１つの重要な点は、得られる送達ペプチドの大きさを（例えば、切断可能なコンジュゲートを用いて）十分に小さく保つことである。
【０１０５】
経口送達。ここで使用が企図されるものには、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ  １８０４２）の第８９章（参照により本明細書に組み込まれる）に概略的に記載されている経口固形剤形がある。固形剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅまたはｌｏｚｅｎｇｅ）、カシェ剤、ペレット剤、散剤または顆粒剤が挙げられる。このほか、リポソームカプセル化または（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されているプロテイノイドマイクロスフェアのように）プロテイノイドカプセル化を用いて本発明の組成物を製剤化してもよい。リポソームカプセル化を用いてもよく、リポソームは様々なポリマーを用いて誘導体化され得る（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療剤として可能な固形剤形については、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．により「Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」（Ｇ．Ｓ．ＢａｎｋｅｒおよびＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編，第１０章，１９７９；参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。製剤は一般に、本発明のペプチド（またはその化学修飾形態）と、生物学的に活性な物質を胃内環境から保護し腸内で放出させる不活性成分とを含む。
【０１０６】
ここで使用が企図されるものにはほかにも、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤およびシロップ剤を含めた経口投与用の液体剤形があり、これらは、不活性希釈剤；湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤などの補助剤；ならびに甘味剤、香味剤および着香剤を含めたほかの成分を含有し得る。
【０１０７】
上記の通り、誘導体の経口送達を効果的なものにするようペプチドを化学修飾し得る。企図される化学修飾は一般に、成分分子そのものに少なくとも１つの部分を結合させることであり、この場合、前記部分は、（ａ）（例えば、タンパク質分解を阻害することによって）ペプチドの安定性の増大および（ｂ）胃または腸から血流中への効率的な取込みを可能にするものである。上記の通り、送達を向上させるペプチド修飾として一般的なものには、ＰＥＧ化または部分、例えばプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）などの付加がある（例えば、ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉおよびＤａｖｉｓ（１９８１）“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ，”ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，ＨｏｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）ｐｐ．３６７−３８３；ならびにＮｅｗｍａｒｋら（１９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９を参照されたい）。
【０１０８】
経口製剤では、放出される場所は胃、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸であり得る。当業者には、胃では溶けないが十二指腸をはじめとする腸で物質を放出する製剤が利用可能である。ペプチド（または誘導体）の保護によって、または胃内環境を通過し腸内などでペプチド（または誘導体）を放出することによって、放出が胃内環境の有害な作用を回避するのが好ましい。
【０１０９】
胃液に対する耐性を完全にするため、少なくともｐＨ５．０で不透過性のコーティング剤が不可欠である。腸溶性コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例には、酢酸トリメリット酸セルロース（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセタートフタラート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＳおよびＳｅｌｌａｃがある。これらのコーティングを混合フィルムとして使用し得る。
【０１１０】
コーティングまたはコーティングの混合物は、胃に対する保護を目的としない錠剤にも使用することができる。これには、糖コーティングまたは錠剤を飲み込みやすくするコーティングが含まれ得る。乾燥治療剤（すなわち、粉末）の送達には、カプセル剤は硬殻（ゼラチンなど）からなるものであり得、液体形態には軟ゼラチンを使用し得る。カシェ剤の殻材料は、濃デンプンをはじめとする可食紙であり得る。丸剤、トローチ剤、成形錠剤または湿製錠剤には、湿式塊化（ｍｏｉｓｔ  ｍａｓｓｉｎｇ）技術を用いることができる。
【０１１１】
ペプチド（または誘導体）は、粒子径が約１ｍｍの顆粒剤またはペレット剤の形態の微小な多微粒子として製剤中に含ませることができる。カプセル投与にはほかにも、材料を粉末、軽く圧縮した詰め物または場合によっては錠剤として製剤化し得る。このような治療剤は圧縮によって調製することができる。
【０１１２】
ほかにも、着色剤および／または香味剤を含ませ得る。例えば、（リポソームカプセル化またはマイクロスフェアカプセル化などによって）ペプチド（または誘導体）を製剤化した後さらに、着色剤および香味剤を含有する冷蔵飲料などの食用製品中に含ませ得る。
【０１１３】
不活性物質でペプチド（または誘導体）を希釈したり、体積を増大させたりしてもよい。このような希釈剤としては、炭水化物、特にマンニトール、ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンが挙げられる。。このほか、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含めた特定の無機塩を充填剤として使用してもよい。いくつかの市販の希釈剤には、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌがある。
【０１１４】
治療薬の製剤中に崩壊剤を含ませて固形剤形にしてもよい。崩壊剤として使用される物質としては、特に限定されないが、市販のデンプン系崩壊剤であるＥｘｐｌｏｔａｂを含めたデンプンが挙げられる。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、海綿およびベントナイトはいずれも使用してよい。崩壊剤は不溶性カチオン交換樹脂であってもよい。ゴム末を崩壊剤および結合剤として使用してもよく、このようなものとして、寒天、カラヤまたはトラガントなどのゴム末が挙げられる。崩壊剤としてほかにも、アルギン酸およびそのナトリウムが有用である。
【０１１５】
ペプチド（または誘導体）薬剤をまとめて硬い錠剤にするために結合剤を使用してよく、このようなものとして、天然物由来の物質、例えばアラビアゴム、トラガント、デンプンおよびゼラチンなどが挙げられる。ほかにも、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はともに、ペプチド（または誘導体）を粒状化するのにアルコール溶液の形で使用することができる。
【０１１６】
製剤工程での粘着を防止するため、ペプチド（または誘導体）の製剤中に減摩剤を含ませてもよい。ペプチド（または誘導体）とダイ壁との間の層として滑沢剤を使用してもよく、このようなものとして、特に限定されないが、マグネシウム塩およびカルシウムを含めたステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびロウが挙げられる。可溶性滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス４０００およびカーボワックス６０００などを使用してもよい。
【０１１７】
製剤時の薬物の流動性を向上させ、圧縮時の再構成を補助する流動促進剤を添加してもよい。流動促進剤としては、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和ケイアルミン酸塩が挙げられる。
【０１１８】
ペプチド（または誘導体）を水性環境中に溶解しやすくするため、湿潤剤として界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムが挙げられる。陽イオン性界面活性剤を使用してもよく、このようなものとして、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトミウム（ｂｅｎｚｅｔｈｏｍｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）が挙げられる。界面活性剤として製剤中に含ませることができると考えられる非イオン性界面活性剤のリストとして、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、グリセロールモノステアラート、ポリソルベート２０、４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースならびにカルボキシメチルセルロースがある。上記の界面活性剤は、タンパク質または誘導体の製剤中に単独で、または様々な比の混合物として存在し得る。
【０１１９】
ペプチド（または誘導体）の取込みを増大させる可能性のある添加剤には、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸がある。
【０１２０】
放出制御経口製剤が望ましい場合がある。拡散機序または浸出機序による放出が可能な不活性マトリックス、例えばゴムにペプチド（または誘導体）を組み込むことができる。緩徐に変性するマトリックスを製剤中に組み込んでもよい。腸溶性コーティングにも遅延放出作用を示すものがある。別の放出制御形態として、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ社）に基づく方法によるもの、すなわち、浸透圧効果によって水を侵入させ薬物を単一の小孔から押し出す半透膜に薬物を封入するものがある。
【０１２１】
その他のコーティング剤を製剤に使用してもよい。このようなものとして、コーティングパンに用いることができる様々な糖が挙げられる。ほかにも、ペプチド（または誘導体）をフィルムコーティング錠剤の形で投与することが可能であり、この場合に使用する物質は２つのグループに分けられる。１つは非腸溶性物質であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロースナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコールがこれに含まれる。もう１つのグループは、フタル酸のエステルが一般的な腸溶性物質からなるものである。
【０１２２】
最適なフィルムコーティングを得るため諸物質の混合物を使用してもよい。フィルムコーティングは、パンコーターもしくは流動床で、または圧縮コーティングによって実施し得る。
【０１２３】
非経口送達。非経口投与用の本発明による製剤としては、無菌の水溶液もしくは非水溶液、懸濁剤または乳剤が挙げられる。非水性の溶媒または賦形剤の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油などの植物油、ゼラチンのほか、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。このような剤形はほかにも、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含有し得る。これらを例えば、細菌保持フィルターによるろ過、組成物中への滅菌剤の組込み、組成物の放射線照射または組成物の加熱によって滅菌し得る。このほか、使用直前に滅菌水またはほかの無菌注射用媒体を用いてこれらを製造することができる。
【０１２４】
吸入による投与および鼻腔内投与。本発明は、本発明の組成物の吸入による投与および鼻腔内投与に適した任意の送達装置を包含する。このような手段は、好ましくは定量された組成物を投与するものである。本発明の組成物は、ある手段が組成物を口腔、肺または鼻粘膜に送達するよう提供されるものである限り、任意のしかるべき形態または容器に充填してよい。有用な装置の非限定的な例としては、例えば、点滴注入カテーテル、点滴器、単位用量容器、スクイーズボトル、ポンプスプレー、無気スプレーおよび保存剤を含まないスプレー、圧縮空気噴霧器、定量吸入器、吹入器および加圧噴霧式定量吸入器が挙げられる。小滴形態で液体を投与するには、例えばピペットなどを含む従来の点滴器／遮断装置を備えた容器に本発明の組成物を入れ、好ましくは実質的に固定された量の組成物／小滴を送達することができる。水溶液をスプレーとして投与するには、当業者に公知の様々な方法によって、水溶液をスプレー形態で投与し得る。例えば、このような組成物をしかるべき噴霧装置、例えばポンプ式噴霧器などに入れる。その噴霧装置に、水性スプレーを鼻孔に送達するスプレーアダプタなどのしかるべき手段を取り付ける。噴霧装置には、実質的に固定された量の組成物／作動（すなわち、スプレー単位当たり）を確実に送達する手段を取り付けるのが好ましい。点鼻スプレーの例としては、Ｉｎｇ．Ｅｒｉｃｈ  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ社（ラドルフツェル、ドイツ）製の点鼻アクチュエータが挙げられる（米国特許第４，５１１，０６９号、同第４，７７８，８１０号、同第５，２０３，８４０号、同第５，８６０，５６７号、同第５，８９３，４８４号、同第６，２２７，４１５号および同第６，３６４，１６６号を参照されたい）。ほかのエアゾール送達形態としては、例えば、圧縮空気噴霧器、ジェット噴霧器、超音波噴霧器および圧電噴霧器が挙げられる。あるいは、スプレーを加圧下でエアゾール装置に詰めてもよい。噴射剤は気体または液体（例えば、フッ素化炭化水素および／または塩素化炭化水素）であり得る。スプレー組成物は、液体の噴射剤に懸濁させても溶解させてもよい。安定剤、懸濁化剤および／または共溶媒が存在してもよい。乾燥粉末であれば、米国特許第６，５１４，４９６号およびＧａｒｃｉａ−Ａｒｉｅｔａら，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００１；２４：１４１１−１４１６に記載されているように吸入装置中で容易に分散し得る。必要に応じて、粉末または液体を経鼻投与に適した軟カプセルもしくは硬カプセルまたは単回投与装置に充填してもよい。粉末をゼラチンカプセルなどのカプセルに充填する前にふるいにかけてもよい。送達装置は、カプセルを割って開ける手段を有するものであり得る。粉末経鼻組成物を単位投与剤形に粉末として直接使用することができる。カプセルまたは単回投与装置の内容物は、例えば吹入器を用いて投与し得る。吹入器には、実質的に固定された量の組成物を確実に投与する手段を取り付けるのが好ましい。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明の組成物を、本発明のペプチド（１つまたは複数）を有する鼻内挿入物として提供することができる。挿入物は、鼻孔内に保持されるが鼻粘液によって洗い流され得るものであり、鼻孔内の同じ場所で本発明のペプチド、フラグメントまたは誘導体を放出するよう設計され得るものである。適切な鼻内挿入物の種類としては、鼻用の詰め物、タンポンなどが挙げられる。欧州特許第４９０８０６号には、鼻内挿入物のさらなる例、その特徴および調製が記載されている。
【０１２６】
送達装置は本発明のペプチドの送達のみならず、保管に適した環境をもたらすのにも重要なものである。これには、微生物汚染および化学的劣化からの保護が含まれる。装置および製剤は、滲出または吸着の可能性を回避するのに適したものであるべきである。送達装置（またはその包装）には、任意選択でラベルおよび／または使用説明書を備え付けることができる。
【０１２７】
本発明のペプチドは、任意の標準的な投与経路および当該技術分野で公知の技術を用いて投与することができる。このほか、本発明のペプチドを発現する能力を有するベクター（ウイルスベクターなど）を用いてペプチドを送達することができる。
【０１２８】
本発明のペプチドの治療応用
本発明のペプチドによって治療され得る線維性疾患としては、任意の病因の肝硬変および肝線維症（アルコール性脂肪性肝炎；非アルコール性脂肪性肝炎；自己免疫性肝炎；慢性Ｃ型肝炎；慢性Ｂ型肝炎；原発性胆汁性肝硬変；続発性胆汁性肝硬変；硬化性胆管炎；α１アンチトリプシン欠損症；ウィルソン病；胆道閉鎖）を含めた肝疾患；特に限定されないが、特発性肺線維症；放射線誘発性間質性肺炎；慢性閉塞性肺疾患；肺気腫；慢性感染症および慢性炎症に続発する肺疾患を含めた肺疾患；特に限定されないが、糸球体腎炎および間質性尿細管線維症を含めた腎疾患；特に限定されないが、熱傷に続発する皮膚疾患；ケロイド；肥厚性術後創傷；強皮症を含めた皮膚疾患；特に限定されないが、腐蝕性物質に続発するもの；炎症性疾患に続発するもの（炎症性腸疾患；食道の損傷および炎症）；虚血性疾患に続発するものを含めた食道−胃−腸の線維性疾患；腹膜線維症；膵線維症；放射線照射後の線維性疾患；梗塞に続発する心血管疾患；虚血／梗塞に続発する脳疾患；外傷後の線維性疾患；ならびに特に限定されないが、外傷後の筋線維症および滑膜／関節線維症を含めた筋骨格疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
本発明のペプチドによって治療され得る炎症性疾患としては、特に限定されないがアルコール性肝疾患；非アルコール性脂肪性肝炎；自己免疫性肝炎；慢性Ｃ型肝炎；慢性Ｂ型肝炎；原発性胆汁性肝硬変；続発性胆汁性肝硬変；硬化性胆管炎；α１アンチトリプシン欠損症；ウィルソン病；胆道閉鎖を含めた肝炎症疾患を含めた肝疾患；特発性肺線維症；放射線誘発性間質性肺炎；慢性閉塞性肺疾患；肺気腫に伴う肺炎症；慢性感染症および慢性炎症に続発する肺炎症；糸球体腎炎；間質性尿細管線維症に伴う腎炎症；熱傷に続発する皮膚炎；強皮症；乾癬；炎症性疾患（炎症性腸疾患；食道の損傷および炎症）に続発する食道−胃−腸の炎症性疾患；放射線照射後の炎症性疾患；炎症性心筋症；脳炎症（外傷後；アルツハイマー病；脳炎；髄膜炎）；筋炎および関節炎による筋骨格炎症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
本発明のペプチドは、目的とする特定の疾患に対するほかの様々な既知の治療法との併用療法の一部として使用することができる。
【０１３１】
肝線維症の治療標的およびその臨床的意義の可能性
慢性肝疾患の肝線維症の発現には（様々な起源の）肝筋線維芽細胞の活性化が関与しており（１３；１５；１９；２０）、アポトーシスによる筋線維芽細胞のクリアランスによって肝損傷から回復し肝線維症が正常に戻る可能性がある（７；２０；２４）ことは注目に値する。肝臓の専門家の間では、肝線維症の治療には様々な細胞起源の筋線維芽細胞の活性化を阻害したり正常に戻したりすることが極めて重要であることで意見が一致している（７；１５；１９；２０；２４）。肝細胞癌の大部分が硬変肝に発生することから、最終的には、肝線維症の進行を阻止することによって原発性肝癌の発現が抑えられるものと考えられる（３４）。
【０１３２】
本発明の治療用ペプチドを開発する理論的根拠は以下の通りである：ａ）筋線維芽細胞の活性化が原因を問わず慢性肝疾患の肝線維症の発現に関与している（１３；１５；１９；２０）；ｂ）アポトーシスによる筋線維芽細胞活性化の阻害によって肝損傷から回復し肝線維症が正常に戻る可能性がある（７；２０；２４）；ｃ）活性化肝筋線維芽細胞の生存には、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７が不活性プロカスパーゼ８複合体と結合しその自己切断および活性化を阻害することによって不可欠なものとなっている（４）；ｄ）肝線維症の進行には活性化肝筋線維芽細胞のＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化が重要である。このことは、古典的なヒト肝毒素誘導性肝損傷および線維症のマウスモデル（１５；２４；３８）ならびにマウスおよびヒトの初代肝筋線維芽細胞（４；６；７；２３；２７）を用いて明らかにされている；ｅ）ヒト肝損傷−線維症維症のほかの原因を模倣する他の動物モデル（急性Ｆａｓ誘導性および慢性ジメチルニトロソアミン誘導性の肝損傷および線維形成）でも活性化肝筋線維芽細胞のＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化が重要である；ｆ）ヒト肝線維症（７）および活性化初代ヒト培養筋線維芽細胞（７）では活性化肝筋線維芽細胞のヒトＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６（相同ヒトホスホアクセプター）のリン酸化もみられる；ｇ）リン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子を発現するマウスは、様々な肝毒素による筋線維芽細胞の活性化および増殖の誘導に抵抗性を示す（４；７）；ｈ）トランスジェニックマウスでは、リン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７は細胞死受容体複合体ＩＩ内に活性カスパーゼ８とともに存在し、活性化肝筋線維芽細胞のアポトーシスと関係がある（４；７；９）；ｉ）Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子によって、またはＣ／ＥＢＰβ遺伝子ノックアウトによってＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化を阻止すると、肝臓の急性損傷および慢性損傷に対する線維性反応が減少する（４；７）；ｊ）Ｃ／ＥＢＰβノックアウトマウスにおける肝臓の肝毒素に対する線維性反応の減少は、活性化肝筋線維芽細胞のＲＳＫリン酸化の重要な標的が、ＣＲＥＢ、ＣＢＰをはじめとするタンパク質の他のホスホアクセプターではなくＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７であることを示唆している（４；４４；４５；４６；５２）；ｋ）本発明のペプチドは、培養してコラーゲン１型マトリックスによりまたはマウスの肝損傷によって刺激される筋線維芽細胞のＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化（分子標的）を阻害し（４）；ｌ）治療用リードペプチドおよび２種類の代替ペプチドは、培養しコラーゲン１型マトリックスによって、またはマウスの肝損傷によって活性化される肝筋線維芽細胞のアポトーシスを刺激し、活性な線維形成を阻止し、肝線維症の進行を抑え、その消退を誘導する；ｍ）本発明のペプチドは、肝硬変の慢性動物モデルの活性化肝筋線維芽細胞のアポトーシスおよび線維症の逆転を刺激する（７）；ならびにｎ）治療用リード化合物はほかにも、分子標的に対して極めて高い効果を示し、筋線維芽細胞の活性化を阻害し、肝線維症を抑制する。
【０１３３】
肝炎症の治療標的およびその臨床的意義の可能性
急性肝疾患および慢性肝疾患の肝炎症の発現には肝マクロファージ（様々な起源の）の活性化が関与している。ウイルス疾患、中毒性疾患および代謝疾患によって引き起こされる肝疾患に伴う過剰な肝損傷および肝炎症（１３）によって、肝機能障害のほか瘢痕組織が沈着して肝硬変が発症する可能性のある慢性病態が生じる（１５）。肝損傷の増幅はマクロファージによって媒介される可能性がある（１４，４０）。
【０１３４】
インフラマソーム活性化に必要な遺伝子の発現は、マクロファージの活性化およびインフラマソームの機能に不可欠なものである。Ｃ／ＥＢＰβは、マクロファージが分化する際にその発現が大幅に増大し、マクロファージモジュレーター（ＬＰＳ、ＩＬ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ビタミンＤ、レチノイン酸）によって誘導される（Ａｋｉｒａら，１９９０）｛Ｆｒｉｅｄｍａｎ，２００７  ２０７５／同上｝ことから、マクロファージに重要なシグナル伝達分子であると思われる。マクロファージの活性化および分化の際には、Ｃ／ＥＢＰβがインフラマソーム活性化に関係のある炎症性サイトカインおよびケモカインの発現を調節している可能性がある｛Ｆｒｉｅｄｍａｎ，２００７  ２０７５／同上｝。さらに、Ｃ／ＥＢＰ  ＤＮＡ結合部位の優性阻害因子の発現｛Ｉｗａｍａ，２００２  ２０７７／同上｝またはＣ／ＥＢＰβの標的欠損によってマクロファージ分化の障害が起こる｛Ｓｅｂａｓｔｉａｎ，２００６  ２０７９／同上｝。
【０１３５】
細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）−１／２のリン酸化によって直接活性化させるリボソームＳ−キナーゼ（ＲＳＫ）によるＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）−βのリン酸化は、細胞生存を調節しているＥＲＫ／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路に重要な役割を果たしている（Ｂｕｃｋら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４：１０８７，１９９９；Ｂｕｃｋら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ８：８０７−１６，２００１；ＢｕｃｋおよびＣｈｏｊｋｉｅｒ，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ２：ｅ１３７２，２００７）。炭疽致死毒素によって誘導されるマクロファージ損傷をレスキューするには、生物学的アッセイでリン酸化  Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７を模倣するリン酸化変異体Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７（Ｔｒａｕｔｗｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５４４−５４７，１９９３）が発現すれば十分である（ＢｕｃｋおよびＣｈｏｊｋｉｅｒ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９３：Ｃ１７８８−９６，２００７）。
【０１３６】
肺炎症および肺線維症の治療標的およびその臨床的意義の可能性
ＩＰＦの肺線維症の発現にはＬＭＦの活性化が関与している（１１；１４；１５）。リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７は、不活性なプロカスパーゼ８複合体に結合してその自己切断および活性化を阻害することによって、活性化ＬＭＦの生存を促進する（６）。活性化ＬＭＦのＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化は肺線維症の進行に極めて重要なものである。このことは、古典的なブレオマイシン誘導性肺線維症マウスモデル、組織培養したマウスおよびヒトの初代ＬＭＦならびに無細胞系を用いることによって明らかにされている（５；６）。ヒトのＩＰＦの肺線維症では、活性化ＬＭＦにヒトＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６のリン酸化が起こる（５）。リン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子を発現するマウスは、ブレオマイシンによるＬＭＦの活性化および増殖の誘導に対して抵抗性を示す（５）。リン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７は、不活性なプロカスパーゼと結合しその自己切断および活性化を誘導することによって、活性化ＬＭＦの死を促進する（５）。トランスジェニックマウスでは、リン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７のドミナントネガティブな導入遺伝子は細胞死受容体複合体ＩＩ内に活性なカスパーゼ８とともに存在し、活性化ＬＭＦのアポトーシスと関係があることがわかっている（３；５；６）。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子によって、またはＣ／ＥＢＰβ遺伝子ノックアウトによってＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化を阻止すると、肺の線維性反応が減少する（５；２５）。Ｃ／ＥＢＰβノックアウトマウスにおける肺のブレオマイシンに対する線維性反応の減少（２５）は、活性化ＬＭＦのＲＳＫの重要な標的が、ｃ−Ｆｏｓ、ＣＲＥＢ、ＣＢＰをはじめとするタンパク質の他のＲＳＫホスホアクセプターではなくＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７であることを示唆している。阻害性の親ペプチドは、培養しコラーゲン１型マトリックスによって、または肺損傷によってｉｎ  ｖｉｖｏで活性化されるＬＭＦのＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化を阻害する（５）。
【０１３７】
非天然アミノ酸を含有する本発明治療用ペプチドの合成および分析についてＮ末端ＰＥＧ−３０ｋＤａの有無を問わず以下に記載する。
【０１３８】
上記のペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する：
【表１】
2018520999.tif 000004
【０１３９】
【表２】
2018520999.tif 000005
【０１４０】
Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７の重要な下流特異的ＭＡＰＫ経路リン酸化の発見に基づいて親ペプチドを開発した。これにより、広範囲にわたるシグナル伝達ネットワークの最後の段階である標的をより少ない副作用で遮断することができた。実際、ドミナントネガティブな完全長Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７を発現するマウスは正常な表現型を有し、繁殖可能である。
【０１４１】
本発明は、治療用ペプチドの有効性および安全性を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、選択した３種類のＰＥＧ−ペプチドがヒトおよびマウスの初代培養肝筋線維芽細胞の活性化の阻害に極めて高い効果を示したという事実を提供する（表１を参照されたい）。その効果は親ペプチドのものと同程度のものであった。親ペプチドおよび選択した３種類のペプチドはともに（治療用量の１００倍で）、培養したヒトまたはマウス初代肝細胞にもｉｎ  ｖｉｖｏのマウスにも肝細胞損傷を誘導することはなかった（表１）。
【０１４２】
マウスに親化合物を用いても毒性の問題は観察されていないが、ヒトにおいて免疫原性を示す可能性がある、半減期が短い、バイオアベイラビリティが低いといった予測可能な危険性を改善するため、類似体合成を用いて類縁ペプチドを開発した（２９；３９；４２）。親ペプチドを土台としてライブラリーを作製した後、複数のアミノ酸置換を生じさせた（合成することができた７６種類のペプチドのうち全５６種類を試験した）。本発明の選択したＰＥＧ−ペプチドは、このライブラリー内の全化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験して得られたものである。
【０１４３】
複数のアッセイ（活性化初代ヒト肝筋線維芽細胞を用いたアポトーシスアッセイ；無細胞カスパーゼ８活性化アッセイ；急性肝損傷／肝線維形成モデル；高度に分化した初代ヒト肝細胞培養物およびマウスを用いた毒物学アッセイを含む）を段階的に用いて最も安全で効率的なペプチドを選択した。
【０１４４】
本発明を以下の実施例によっても説明および実証する。ただし、これらの実施例および本明細書の任意の箇所の他の実施例の使用は単に例示的なものであり、本発明についても任意の例示される項目についても、その範囲および意味を決して限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態のいずれにも限定されるものではない。実際、本明細書を読めば、本発明の多数の修正および変形が当業者に明らかになり、本発明の趣旨も範囲も逸脱することなく、そのような変形を施すことが可能である。したがって、本発明は、本発明の真の趣旨および範囲に含まれるそのような等価の変形の範囲全体を完全に包含する添付の「特許請求の範囲」の諸項目によってのみ限定されるものとする。
【０１４５】
本明細書全体を通じて、様々な引用が参照され、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明するために記載するものである。その目的は本発明を説明することであって、本発明を限定することではない。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：急性肝損傷および肝筋線維芽細胞活性化におけるリード治療用ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性および安全性に関するパイロット試験
急性肝損傷を誘導するため、正常マウスにヒト肝毒素である四塩化炭素（ＣＣｌ４）を単回投与した（４）。８時間後、マウスにリード治療用ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチド（ＰＥＧ−３０ｋＤａ結合ペプチド［ペプチド：ＰＥＧの比１：６０］５μｇ）をＩＰ注射した。ＡＬＴ（ヒト薬物試験で肝毒性を評価するのに臨床現場でおよびＦＤＡによって日常的に用いられる臨床評価項目）によって測定される肝細胞死のピークである３０時間後にマウスを屠殺した（１６）。ＣＣｌ４のみを投与したマウスには、活性化肝筋線維芽細胞の主な指標であるα−ＳＭＡ（４；７）の強い発現がみられたのに対し、ＣＣｌ４とリード治療用ＰＥＧ−ペプチドの両方を投与したマウスでの発現はわずかなものであった。ＣＣｌ４を投与したマウスには重度の急性肝損傷が認められたが、ＣＣｌ４とリード治療用化合物の両方を投与したマウス軽度ないし中等度の損傷が認められた（図１）。
【０１４７】
治療用リードＰＥＧペプチドは、肝毒素ＣＣｌ４によって誘導される重度の肝損傷に典型的な肝変色および顆粒状の外観を抑え、これらの治療マウスの肝臓は対照の肝臓と類似していた（図１）。ＣＣｌ４によって誘導された組織病理は、標準的な臨床染色（Ｈ＆Ｅおよびレティキュリン）に反映されるように、重度の肝損傷および構造の崩壊のうちの一方であった（図１）。
【０１４８】
リードＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドによって急性肝損傷が軽減された（図１）。肝毒素ＣＣｌ４によって血清中ＡＬＴが著明に誘導された（１０，５５４＋／−８６７ＩＵ／ｄＬ）が、損傷が確立されてから８時間後、わずか１回の治療用リードペプチドによる治療でも改善がみられた（６，７５４＋／−９０５ＩＵ／ｄＬ）。ＣＣｌ４により、アルブミンｍＲＮＡ（正常な肝臓に特異的な遺伝子発現の主な指標）（１４）が対照値の１６分の１に低下し、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αのｍＲＮＡ（肝炎症の主な指標）がそれぞれ対照値の３倍および８５倍増大した。治療用リードＰＥＧペプチドによって上記の値が著明に改善された（アルブミンｍＲＮＡは対照値の２分の１の低下にとどまり、ＩＬ−６  ｍＲＮＡは正常値を示し、ＴＮＦ−αは対照値の４倍の増大にとどまった）。
【０１４９】
ほかの２種類の代替ＰＥＧペプチド１および代替ＰＥＧペプチド２でも、急性肝損傷の最小化および筋線維芽細胞の活性化にリードＰＥＧペプチドと同程度の成績が得られた。したがって、肝損傷の急性マウスモデルおよび肝筋線維芽細胞の活性化における治療用ペプチドの初期安全性プロファイルは極めて優れたものであると言える。
【０１５０】
実施例２：肝線維症の慢性マウスモデルにおけるリード治療用ペプチドの高い有効性
古典的慢性肝線維症モデルにおける治療用リードＰＥＧ−ペプチドの有効性および安全性の系統的分析を実施した（７；１５；２４；３８）。肝線維症の古典的モデルとして、マウスにＣＣｌ４（ヒト肝毒素）を１６週間投与した（７）。第８週、重度の肝線維症が既に確立されてから、３種類の選択した治療用ＰＥＧ−ペプチドを週１回、ＩＰ投与した（ＰＥＧ結合ペプチド７μｇ）。３種類の選択したＰＥＧペプチドの有効性には肝線維症の定量分析を含めた（７）。ＣＣｌ４をマウスに１６週間投与したところ、肝硬変が誘導された（図２Ａおよび２Ｂ）。リードＰＥＧ−３０ｋＤａペプチド（第８週、肝線維症が既に重度になってから週１回投与）によって肝線維症が８分の１に減少していることがわかった。これ以外のＰＥＧ−３０ｋＤａペプチド１およびＰＥＧ−３０ｋＤａペプチド２の２種類でも肝線維症が効率的に減少した（それぞれ約３分の１および約２分の１）（図２Ａ）。これは、重度の肝線維症が確立された患者に治療を数年間実施したのと同じ効果である。
【０１５１】
したがって、この実施例から、アミノ酸配列Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２を有するリード治療用ペプチドは、ＣＣｌ４を８週間投与して肝硬変が確立された後、肝線維症の進行を抑え消退を誘導するのに高い効果を示したことがわかる。Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２を週１回、さらに４週間または８週間ＩＰ投与した（ＰＥＧ−３０ｋＤａ結合ペプチド７μｇ）。ＣＣｌ４投与を４週間または８週間継続した。Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２ペプチドによって肝線維症が８分の１に抑制された。
【０１５２】
これに対し、第８週に肝硬変が確立された後、ＣＣｌ４による肝損傷および肝線維症の誘導を継続しながら、Ｄ−アミノ酸を一切含まないアミノ酸配列Ａｃ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＣＨＯ（配列番号７）を有する親ペプチドによる治療をさらに４週間または８週間実施した（５μｇ  ＩＰ、週３回を９週間、次いで１μｇ  ＩＰ、週３回を１０〜１２週間または１０〜１６週間）。親ペプチドによる肝線維症の抑制は２分の１〜３分の１にとどまった。
【０１５３】
実施例３：ブレオマイシン処置に対してマウスＴ細胞のＣ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７にリン酸化が誘導され炎症性Ｔｈ１／Ｔｈ１７応答を引き起こす−Ｃ／ＥＢＰβペプチドの抑制作用
新たに単離したＣＤ４＋マウス肺Ｔ細胞を用いて、マウスＣ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７のリン酸化がＴｈ１／Ｔｈ１７表現型をもたらすことを裏付ける結果が得られた。ブレオマイシン処置から７日後、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから精製した肺Ｔ細胞にＩＬ−１２Ｒβ（Ｔｈ１表現型）またはＩＬ−２３Ｒ（Ｔｈ１７表現型）ならびに内因性Ｃ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７のリン酸化（このエピトープに対して発生させた特異的抗体を用いて検出）が発現した（図３および４）。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マウスをブレオマイシンで処置する（図３）か、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスをブレオマイシンおよびＣ／ＥＢＰβペプチドで処置すると、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７およびＴｈ１／Ｔｈ１７表現型が阻止され、Ｔ細胞のＩＬ−４Ｒα発現（Ｔｈ２表現型）が誘導される（図４）。
【０１５４】
実施例４：ブレオマイシン処置に応答してＴｈ１／Ｔｈ１７細胞が誘導され肺筋線維芽細胞の活性化を引き起こす−Ｍ１マクロファージ除去実験から得られた証拠
ブレオマイシン処置の第７日、精製ＣＤ４＋マウス肺Ｔ細胞にＩＬ−１２ＲまたはＩＬ−２３Ｒ（Ｔｈ１／Ｔｈ１表現型）およびαＳＭＡ（活性化筋線維芽細胞）が発現した。マウスにブレオマイシンおよびクロドロン酸（ＡＴＰ産生遮断剤）リポソームを（気管内およびＩＰ）投与したところ、第７日に貪食Ｍ１マクロファージ（ＴＮＦαＲ２が検出されなかった）およびＴｈ１（ＩＬ−１２Ｒ）／Ｔｈ１７（ＩＬ−２３Ｒ）細胞が優先的に除去されてＩＬ−４Ｒα（Ｔｈ２表現型）が誘導され、αＳＭＡ（活性化筋線維芽細胞）が著明に減少した（図５）。２１日間のＭ１マクロファージ除去によりＴｈ１／Ｔｈ１７細胞が遮断されること（交絡因子）によってブレオマイシン誘導性肺線維症が著明に抑制され（図５、トリクローム）、この作用はＴｈ２表現型ではなくＴｈ１／Ｔｈ１７（Ｍ１）表現型によるものであることが示唆された。
【０１５５】
実施例５：ブレオマイシン処置マウスからのＴ細胞の単離および精製ならびにＣ／ＥＢＰβペプチドおよびＴｈ２誘導物質によるそのｅｘ  ｖｉｖｏ阻害
ブレオマイシン処置の第７日、表面受容体に特異的な抗体を用いて、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス肺１６５ｍｇからＣＤ４＋Ｔ細胞を約５００万個単離し精製した。Ｔ細胞の９５％超がＴｈ１またはＴｈ１７であった。このＴｈ１／Ｔｈ１７細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで４時間、１０μｇ／ｍｌのＩＬ−４、ＩＬ−１０（Ｔｈ２誘導物質）または１００ｐＭのＣ／ＥＢＰβペプチド（Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化の阻害物質）で処置した。Ｔｈ２誘導物質またはＣ／ＥＢＰβペプチドによる処置で５０％超のアポトーシスが刺激され、これが、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化の阻害によってＴｈ１／Ｔｈ１７誘導が阻止される機序として妥当なものであることが示唆された。この効果は、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７とプロカスパーゼ８との間のタンパク質間相互作用ならびにＣ／ＥＢＰβのＴｈｒ−２１７リン酸化によって生じるＸＥＶＤカスパーゼ阻害ボックスによるプロカスぺ（ｐｒｏｃａｓｐｅ）８の切断および自己活性化の阻害に関する報告（１２）と一致している。Ｔｈ２誘導物質によるＴｈ１／Ｔｈ１７細胞の刺激は予想外のことであり（ＩＬ−４シグナルおよびＩＬ−１０シグナル伝達経路のアップレギュレーションを示唆する）、Ｔｈ１／Ｔｈ１７調節を分析する刺激的なツールとなる（図６）。
【０１５６】
実施例６：ヒトＴｈ２細胞ではなくヒトＴｈ１およびＴｈ１７が共培養系のヒト肺筋線維芽細胞の増殖を誘導する−Ｃ／ＥＢＰ−β−Ｔｈｒ２６６リン酸化の阻害が肺炎症細胞を阻止することを示す証拠
ガラス上で培養した初代ヒト前駆ＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−１２（Ｔｈ１）、ＩＬ−２３（Ｔｈ１７）またはＩＬ−４（Ｔｈ２）で６時間誘導した。ほかにも、Ｔｈ１表現型およびＴｈ１７表現型を抑制するため、Ｔｈ１誘導物質およびＴｈ１７誘導物質で刺激した前駆Ｔ細胞をＣ／ＥＢＰβペプチド（１００ｐＭ）で６時間処置した。新鮮な培地でＴ細胞誘導物質を除去した後、コラーゲン１型カバーガラス上で血清を含まない既定の培地にて培養した初代肺筋線維芽細胞をＴ細胞培養物［同一のカバーガラスのスペース］に挿入した（図７Ｂ）。Ｓ期マーカーである増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ；ＤＮＡポリメラーゼδ補助タンパク質）（１２）の有無によってＬＭＦ増殖を分析した。Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞によって、ＬＭＦ細胞の増殖が対照ＬＭＦ（未誘導の前駆Ｔ細胞とともに培養したもの）の約４倍刺激された（図１２）（図７）（Ｐ＜０．０１）。ＬＭＦ細胞の増殖は、Ｔｈ２細胞（図１２）によっても、ＩＬ−１２またはＩＬ−２３＋Ｃ／ＥＢＰβペプチドで処置したＴ細胞（図７）によっても刺激されることはなかった。したがって、ヒトＬＭＦ細胞の活性化の重要な段階の１つである細胞増殖は、ヒトＴｈ１細胞およびＴｈ１７細胞によって刺激されることはない。この新規な系によってＴｈ細胞／ＬＭＦ相互作用の分析が可能になる。
【０１５７】
実施例７：ヒトＴｈ１／Ｔｈ１７細胞はＩＰＦで頻度の高い表現型である
ＩＰＦの肺Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞にリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６が存在することによって実験的所見の臨床的意義が裏付けられた（図８および９）。図１１および１２に示されるように、ＩＰＦ外植片中の肺ＣＤ４＋Ｔ細胞の９５％がＩＬ−１２ＲおよびＴ−ｂｅｔ（Ｔｈ１表現型（５５，８４））；ＩＬ−２３Ｒ（Ｔｈ１７表現型（４９，８０））；ならびにホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２６６を発現した。この試料では、Ｔ細胞の５％がＩＬ−４ＲおよびＧＡＴＡ−３（Ｔｈ２表現型（９５））を発現した。正常な肺ではＴ細胞が約１０分の１であり、Ｔｈ２細胞の頻度は中程度（約６０％）である。特定の実験では、ＩＰＦ患者の精製肺Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７の分子的および機能的プロファイルの特徴を系統的に明らかにする。
【０１５８】
実施例８：Ｃ／ＥＢＰβのＴｈｒ２６６のリン酸化は炎症誘導物質に対して誘導されヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１／Ｔｈ１７応答に必要なものである−Ｃ／ＥＢＰ−β−Ｔｈｒ２６６リン酸化によって肺炎症細胞が阻止されることを示す証拠
新たに単離したヒトＣＤ４＋ヒト血液Ｔ細胞を用いて、ヒトＣ／ＥＢＰβのＴｈｒ２６６のリン酸化がＴｈ１／Ｔｈ１７表現型をもたらすことを裏付ける結果が得られた。正常ヒト血液ＣＤ４＋Ｔ細胞をヒト組換えＩＬ−１２（Ｔｈ１誘導物質）で処置したところ、ＩＬ−１２ＲβおよびＴ−Ｂｅｔを発現した（Ｔｈ１表現型）。ｅｘ  ｖｉｖｏで正常ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−２３（Ｔｈ１７誘導物質）で処置したところ、ＩＬ−２３Ｒ（図１０）およびＧＡＴＡ−３（データ不掲載）を発現した（Ｔｈ１７表現型）。Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞の誘導と内因性Ｃ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７のリン酸化との間に何らかの関係があることがわかった。ドミナントネガティブなＣ／ＥＢＰβペプチドで内因性Ｃ／ＥＢＰβのリン酸化を阻止したところ、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１表現型（および集団のＴｈ２細胞へのシフト）への活性化もＴｈ１７表現型（アポトーシスが誘導され、Ｔｈ２細胞が存在しない）への活性化も阻害された（図１０）。ＩＬ−４によってＴｈ２表現型が誘導されたが、未処置ＣＤ４＋Ｔ細胞は拘束されないままであった。
【０１５９】
実施例９：新鮮なＩＰＦ肺組織からのＴ細胞の単離および精製ならびにそのｅｘ  ｖｉｖｏでのＣ／ＥＢＰβペプチドおよびＴｈ２誘導物質に対する応答
表面受容体に特異的な抗体を用いて、新鮮なＩＰＦ肺生検試料０．５ｍｇからＣＤ４＋Ｔ細胞を約１，０００万個単離し精製した。ＩＬ−１２ＲマーカーおよびＩＬ−２３Ｒマーカーから判断して、Ｔ細胞の９５％超がＴｈ１またはＴｈ１７であった（図１１）。Ｔ細胞の９０％超がＴｈ１７マーカーを発現した。このＴｈ１／Ｔｈ１７細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで１６時間、１０μｇ／ｍｌのＩＬ−４、ＩＬ−１０（Ｔｈ２誘導物質）または１００ｐＭのＣ／ＥＢＰβペプチド（ヒトＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６リン酸化の阻害物質）で処置した。Ｔｈ２誘導物質またはＣ／ＥＢＰβペプチドによる処置でベースラインから３５％超のアポトーシスが刺激され（図１２）、これが、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化の阻害がＴｈ１／Ｔｈ１７誘導の阻止に寄与する機序として妥当であるものであることが示唆された。この効果は、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７とプロカスパーゼ８との間のタンパク質間相互作用ならびにＣ／ＥＢＰβのＴｈｒ−２１７リン酸化によって生じるＸＥＶＤカスパーゼ阻害ボックスによるプロカスぺ（ｐｒｏｃａｓｐｅ）８の切断および自己活性化の阻害に関する報告（１２）と一致している。
【０１６０】
以上をまとめると、上の実施例３〜９から以下のことがわかる：ａ）ヒトおよびマウスの筋線維芽細胞の活性化にはＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化が必要である。本発明の新規なペプチドは筋線維芽細胞の活性化を阻害する；ｂ）肺のＴｈ１細胞およびＴｈ１７細胞のブレオマイシン誘導性活性化にはＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化が必要である；ｃ）貪食Ｍ１マクロファージの除去によってＴｈ２細胞ではなくＴｈ１細胞およびＴｈ１７細胞を枯渇させると、ＬＭＦおよび肺線維症のブレオマイシン誘導性活性化が阻害される；ｄ）ヒトでは、Ｔｈ２細胞ではなくＴｈ１細胞およびＴｈ１７細胞が、共培養したヒトＬＭＦの増殖／活性化を刺激する；ｅ）ＩＰＦ肺組織の肺Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞ならびにＩＰＦ肺組織から新たに単離したＴ細胞にリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６が存在することによって、上記の所見の臨床的意義が裏付けられた；ｆ）ＩＰＦの肺Ｔ細胞は９５％超がＴｈ１／Ｔｈ１７である；ｇ）Ｃ／ＥＢＰβペプチドおよびＴｈ２誘導物質は、ブレオマイシン処置マウスまたはＩＰＦ肺組織から新たに単離した肺Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞のアポトーシスをｅｘ  ｖｉｖｏで刺激する。
【０１６１】
実施例１０：Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化はマクロファージインフラマソーム活性化および肝損傷を刺激する
この実施例では、新規な治療標的として有力なＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化を介したシグナル伝達が、肝マクロファージのインフラマソームの活性化を介する肝炎症および肝損傷の原因となる主要な機序であるかどうかを検討する試験について記載する。マウスおよびヒトに肝毒素により誘導したマクロファージインフラマソーム活性および肝損傷に対して進化的に保存された（ヒトＣ／ＥＢＰβ−ホスホ−Ｔｈｒ２６６のものと同一である）Ｃ／ＥＢＰβ−ホスホ−Ｔｈｒ２１７シグナル伝達が及ぼす作用を試験した。
【０１６２】
方法
Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マウスおよびＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスの構築
動物プロトコルはＶＡ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍの獣医学部門によって承認されたものである。Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７ホスホアクセプターのドミナントネガティブでリン酸化不可能な変異であるＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７またはドミナントポジティブなリン酸化模倣変異であるＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７を発現するトランスジェニックマウスを既に記載されている通りに作製し２７、親の野生型近交ＦＶＢマウスと１０世代超にわたって戻し交配した。ＰＣＲによりｒｓｖ遺伝子の存在を用いて、このトランスジェニックマウスを同定した。ＲＳＶ  ＰＣＲのプライマー配列を特注で設計した（ＲＳＶ．２２７１センスＴＡＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＡＧＧＣＧＡＡＡ（配列番号１）およびＲＳＶ．２５１０アンチセンスＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＧ（配列番号２））。
【０１６３】
動物の処置
肝毒素への急性曝露では、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス、Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マウスおよびＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウス２７（２３〜２７ｇ）それぞれにＣＣｌ４（ＣＣｌ４  ７０μｌと鉱油３０μｌ）もしくは鉱油（生理食塩水７０μｌと鉱油３０μｌ）またはＪｏ−２Ａｂ（Ｆａｓ−Ｌ；０．２μｇ／ｇ体重）もしくは生理食塩水溶媒（５０μｌ）を１回のみ腹腔内注射した。別の実験では、各Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス（２５ｇ）にＣＣｌ４（ＣＣｌ４  ７０μｌと鉱油３０μｌ）または鉱油（生理食塩水７０μｌと鉱油３０μｌ）を１回腹腔内注射したが、８時間後、生理食塩水５０μｌ（溶媒）または細胞透過性Ａｃ−ＫＡｌａ２１７ＶＤ−ＣＨＯ２１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ社）（１００μｇ  ＩＰ）のいずれかを投与した。上記の実験では、ＣＣｌ４を最後に注射してから３０時間後またはＦａｓ−Ｌの注射から８時間後にマウスを屠殺した。
【０１６４】
マクロファージ精製
マクロファージを用いたｖｉｔｒｏ実験を報告されている標準法に従って実施した４２。ＦＶＢをバックグラウンドとする成体のＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス（肝臓１個当たりのマクロファージの収量は１．３×１０５個）、Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マウス（肝臓１個当たりのマクロファージの収量は２．２×１０５個）、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウス（肝臓１個当たりのマクロファージの収量は１．４×１０５個）およびＴＧＦαマウス（肝臓１個当たりのマクロファージの収量は１．６×１０５個）を初代肝マクロファージの単離に用いた。既に記載されている通りに４３、ｉｎ  ｓｉｔｕ灌流および１段階密度Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウエストベリー、ニューヨーク州）によって細胞を調製した。肝マクロファージを密度勾配１３％で単離した後、ＣＤ１１／ＣＤ６８抗体結合磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）によりアフィニティー精製した。ＣＳＦ−１も添加剤も一切使用しなかった。一定量をカバーガラスに載せ、３７℃で１時間静置した後、アセトン：メタノールで固定した。肝マクロファージは、その典型的な形態、ガラスへの付着のほか、Ｆ−４／８０およびＣＤ６８に対する抗体の使用により同定した。上記の調製物の純度は９５％を上回っていた。１０％ウシ胎児血清を含みＬ−グルタミン、２５μＭ  ＨＥＰＥＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０で一定量のマクロファージを培養した。一部の実験では、肝マクロファージをＴＧＦα（１０μＭ）で８時間処置した。
【０１６５】
顕微鏡観察
Ｃ／ＥＢＰβ、ＲＳＫＰｈｏｓｐｈｏＳｅｒ３８０、Ｆ４／８０、ＮＯＳ−２  ＴＬＲ４、ＮＦκＢ、ＩＲＦ８、ＭｙＤ８８、ＮＡＬＰ３、ＴＬＲ−５、ＩＬ−１Ｒ１およびＡＳＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、サンタクルーズ、カリフォルニア州）またはＣ／ＥＢＰβ−ＰｈｏｓｐｈｏＴｈｒ２１７に対する抗体を用いて、Ｋｅｙｅｎｃｅ蛍光顕微鏡で蛍光標識を観察し、用いた蛍光色素はＡｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ７５０、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ６４７および５９４Ａｌｅｘａであった。実験ポイント当たり少なくとも１００個の細胞を分析した１８，２１，２３，２７。ＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、オレゴン州）を用いて核の形態を分析した。顕微鏡ＢＺ９０００分析ソフトウェアプログラムを用いて蛍光画像および明視野画像を定量化した。観察者間の一致率は９０％超であった。
【０１６６】
炎症遺伝子
ＲＴ２  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙを製造業者（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；バレンシア、カリフォルニア州）による記載の通りに用いて、８６種類の炎症遺伝子について肝マクロファージでの発現を判定した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ５リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）２１を用いて、対照試料および新たに単離した実験用肝マクロファージ試料をＲＮＡの精製段階および増幅段階ならびにハウスキーピング遺伝子（βアクチン）に関する内部対照試料とともに分析した。製造業者の推奨に従い、ＲＴ−ＰＣＲについて記載されている通りに全ＲＮＡ  １μｇを用いて全ＲＮＡの単離、ＤＮアーゼによる処理、クロロホルムによる沈殿およびｃＤＮＡ合成を実施した。
【０１６７】
免疫沈降および免疫ブロット
新たに単離し予め清澄化した肝マクロファージ細胞溶解物を精製Ｃ／ＥＢＰβ抗体と２時間インキュベートし、次いでＡ／Ｇ＋アガロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を１２時間添加した。各免疫沈降反応物には総タンパク質５００μｇおよび抗体２μｇ（または陰性対照の精製ＩｇＧ免疫前血清）が含まれていた。免疫沈降物を細胞溶解緩衝液５００ｍｌで３回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、特異的抗体を用いた化学発光プロトコル（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、シェルトン、コネチカット州）１８，１９，２１，２７に従って、Ｃ／ＥＢＰβ−ＰｈｏｓｐｈｏＴｈｒ２１７、ＴＬＲ４、ＮＦκＢ、ＩＲＦ８、ＭｙＤ８８、ＮＡＬＰ３、ＴＬＲ−５、ＩＬ−１Ｒ１、ＡＳＣ  βアクチン、活性カスパーゼ３、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８をウエスタンブロットにより検出した。最初の抗体を省いて陰性試料を実施した。
【０１６８】
ヒト肝臓
有毒油症候群に続発する急性肝損傷および中等度の肝臓損傷の患者１６例３５および肝疾患を有さない対照被験者１０例（ＮＤＲＩ）から匿名の非特定化肝試料を入手した。プロトコルはサンディエゴ大学のＳａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍによって承認されたものである。上記の試料がいずれも標準治療を受けた余剰の保管試料であったため、免除を受け同意を伴わないＩＲＢ承認プロトコルであった。
【０１６９】
統計解析
結果は平均値（±ＳＤまたは±ＳＥ）で表す。パラメトリックな母集団およびノンパラメトリックな母集団のグループ間の平均値の差の評価には、それぞれスチューデントｔ検定またはウィルコクソン・マン・ホイトニーの検定を用い、Ｐ値０．０５未満を有意とした。
【０１７０】
結果
マウスにおけるリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７によるＦａｓ−Ｌ誘導性の肝損傷および肝炎症の調節
マウスを肝毒素（ＦａｓおよびＣＣｌ４）に曝露した後、定量的組織学検査および免疫組織化学検査２４、細胞死アッセイ２３のほか、患者管理および米国食品医薬品局の臨床薬物試験に日常的に用いられる肝損傷の指標２５である血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル２１の測定によって肝損傷の程度を判定した。
【０１７１】
マクロファージによるＦａｓ媒介性ＩＬ−１８分泌８およびＦａｓアゴニスト抗体（Ｊｏ−２Ａｂ）２６の注射によってマウスに重度の肝損傷が誘導される。最初に、血清中ＡＬＴレベル（Ｐ＜０．０００１）（図１３ａ）および組織学検査（図２１）のデータから判断すると、ドミナントポジティブなリン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７導入遺伝子を発現するマウスは、Ｊｏ−２Ａｂを用いたＦａｓ−Ｒ活性化により誘導される肝損傷に対する感受性が対照Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスよりも高いことがわかった。ドミナントネガティブでリン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子を発現するマウスは、Ｆａｓ−Ｌによる肝損傷誘導に対して高い耐性を示した（Ｐ＜０．０１）（図１３ａ）。これに対し、アポトーシスアネキシンＶアッセイから判断すると、リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７トランスジェニックマウスから単離し培養した初代肝細胞にＦａｓ−Ｌ（Ｊｏ−２Ａｂ）が誘導する損傷は、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス由来の肝細胞と比較して最小限のものであった（Ｐ＜０．００１）（図１３ｂ）。Ｊｏ−２未処置のＣ／ＥＢＰβ−ｗｔ由来の対照培養初代肝細胞はベースラインのアポトーシスが５％未満であった。Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７培養初代肝細胞は、Ｆａｓ誘導性細胞損傷に対する耐性と同じく、プロテアソーム阻害剤のラクタシスチン２７が誘導するアポトーシスに対してもＣ／ＥＢＰβ−ｗｔ培養初代肝細胞と比較して高い抵抗性を示した（図２２）。以上の実験をまとめると、Ｆａｓ−Ｌシグナル伝達が誘導する重度の肝損傷に対する感受性には、上記の組織培養試験に欠けていると思われる肝細胞以外の肝細胞のＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化が必要であることがわかる。ちなみに、Ｆａｓ誘導性およびラクタシスチン誘導性の損傷に対するＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７肝細胞の耐性は上記の試験の主眼ではない。
【０１７２】
肝細胞およびマクロファージを含めた非実質肝細胞はともに、受容体（ＣＤ９５）を発現する２８。これに関連して、Ｆａｓ−Ｌによってほかにも、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスの肝臓の方がＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの肝臓よりもＦ４／８０＋マクロファージ炎症細胞の浸潤が大きく刺激され（図１３ｃおよび図２１）、このことは、肝細胞のアポトーシス性損傷の領域が大きいことに対応している（図１３ｄおよび図２１）ことがわかった。
【０１７３】
培養初代肝マクロファージをＴＧＦ−αで活性化させることによりＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７がリン酸化される
以上の実験から、肝マクロファージは、Ｆａｓ−Ｌおよびほかの肝損傷の動物モデル４，５，６，７，８に関して報告されているように、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスにおいてＦａｓ−Ｌが誘導する肝損傷の増幅の一因となり、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスにおける損傷の一般的な機序であることが示唆された。マクロファージでのＣ／ＥＢＰβの発現は、これらの細胞の成熟および機能にきわめて重要なものである１３，１４，１５，１６，１７ことから、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７が、既に報告されている通りに２３単離した炎症性初代肝マクロファージの極性化を調節するかどうかを評価した。
【０１７４】
Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから新たに単離し培養した肝マクロファージをＭＡＰＫシグナル伝達の活性化因子１８および古典的な炎症性マクロファージ誘導物質１７であるＴＧＦ−αで処置したところ、活性化ＲＳＫ−ホスホ−Ｓｅｒ３８０および内因性Ｃ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７のリン酸化１８（図１４ａ）が発現し、活性化マクロファージでの発現がＣ／ＥＢＰβによって媒介されるＮＯＳ−２２９も発現した（図１４ｂ）。以上の結果をまとめると、マウスでｉｎ  ｖｉｖｏでも、培養細胞でも、肝マクロファージのＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化、マクロファージ活性化および肝損傷の間には、何らかの関係があることがわかる。
【０１７５】
Ｃ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７のリン酸化はマウスを肝毒素で処置すると誘導され肝マクロファージ活性化に必要なものである
Ｃ／ＥＢＰβのＴｈｒ２１７のリン酸化が化学的肝損傷によって誘導され肝マクロファージ活性化に必要なものであるかどうかを分析するため、げっ歯類およびヒトの肝臓に酸化ストレスを誘導する古典的で予測可能な肝毒素である２１，３０，３１ＣＣｌ４をＣ／ＥＢＰβ−ｗｔ、ＴＧＦ−α、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７およびＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７の各トランスジェニックマウスに単回投与した。８時間後、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスに細胞透過性のドミナントネガティブなＣ／ＥＢＰβペプチド（１００μｇ）または溶媒（生理食塩水５０μｌ）のいずれかを腹腔内注射した。それまでの試験で、マウスにはこのペプチド用量で十分な全身および肝臓のバイオアベイラビリティが得られ、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化が阻止されることがわかった２１，２７。肝損傷がピークとなる３０時間後にマウスを屠殺した。
【０１７６】
ＣＣｌ４処置により、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスには構造崩壊を伴う重度の急性肝損傷が誘導されたが、Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マウスには軽度ないし中等度の損傷が誘導された（図２３ａ、レティキュリン染色）。Ｆａｓの場合（図１３ａおよび図２１）と同じく、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスではＣＣｌ４によって誘導される肝損傷の方が重症度が高かった（図１５ａ〜１５ｅおよび図２３ａ）。上記の動物モデルの組織学的分析による肝損傷の程度には、肝臓の両マクロファージ浸潤（図１５ａおよび図２３ａ、Ｆ４／８０染色）、肝細胞アポトーシスの程度（図１５ｂ）および血清中ＡＬＴレベル（図１５ｃ）との相関がみられた。
【０１７７】
定量的顕微鏡観察２３によるＦ４／８０発現によって明らかなように、ＣＣｌ４の急性投与により、３０時間後にＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの肝臓のマクロファージ浸潤が約２０倍刺激された（Ｐ＜０．００５）（図１５ａ）。リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスの肝臓では、ＣＣｌ４投与によってさらに高い程度（約４０倍）のマクロファージ浸潤が誘導された（Ｐ＜０．０００１）（図１５ａ）。さらに、Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子によるＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化の阻止によって、ＣＣｌ４誘導性マクロファージ肝浸潤がＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスと比較して約９０％抑制された（Ｐ＜０．００１）（図１５ａ）。
【０１７８】
Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化を阻止するドミナントネガティブなペプチド２１によってほかにも、ＣＣｌ４による肝マクロファージ浸潤の誘導が約６０％（Ｐ＜０．０１）抑制された（図１５ｄおよび図２３ｂ、Ｆ４／８０染色）ほか、肝損傷が約４５％（Ｐ＜０．００１）抑制された（図１５ｅおよび図２３ｂ、レティキュリン染色）。
【０１７９】
マクロファージはマウスの肝毒素処置に応答して誘導され肝損傷に必要なものである
中毒性肝損傷でのマクロファージの役割を別の方法で確認するため、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスにクロドロン酸リポソームを投与してマクロファージを枯渇させ、２４時間後に肝毒素を投与した５。ＣＣｌ４処置から３０時間後、肝生検のアポトーシス肝細胞数のカウント（Ｐ＜０．０１）（図１６ｂおよび図２４）および血清中ＡＬＴの測定（約７５％；Ｐ＜０．００５）（図１６ｃ）により評価したところ、上記のマウスに肝マクロファージ浸潤の著明な減少（約９０％；Ｐ＜０．００５）（図１６ａおよび図２４）および肝損傷の著明な軽減がみられた。
【０１８０】
ＣＣｌ４処置の３０時間後、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの肝臓から精製したＣＤ１１／ＣＤ６８マウスマクロファージにインフラマソームに不可欠な成分であるＴＬＲ５、ＭｙＤ８８およびＴＬＲ４１の高レベルの発現がみられた（図１６ｄ、１６ｅおよび１６ｆ）。クロドロン酸リポソームによって、ＣＣｌ４処置マウスから単離した肝マクロファージのＴＬＲ５、ＭｙＤ８８およびＴＬＲ４の発現がクロドロン酸リポソームを投与していないＣＣｌ４処置マウスから単離した肝マクロファージと比較して抑制され（Ｐ＜０．００１）（図１６ｄ、１６ｅおよび１６ｆ）、肝毒素によって誘導される肝損傷には肝マクロファージのインフラマソームの活性化が重要であることが示唆された。リン酸化ドミナントポジティブなＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７トランスジェニックマウス、リン酸化ドミナントネガティブな同マウスおよび肝細胞ならびにマクロファージ除去を用いた実験から得られた結果をまとめると、マクロファージのＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７（またはＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７）のリン酸化は、肝毒素誘導性肝損傷に不可欠な段階の１つであることが示唆される。
【０１８１】
リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７はマウス肝マクロファージのインフラマソームシグナル１複合体を刺激する。
プロ−ＩＬ−１βおよびＮＡＬＰ３の発現のアップレギュレーションには、インフラマソーム複合体の集合に先立って、プライミング刺激（シグナル１）がＮＦκＢ経路を介して作用する。細胞質ゾル内でのリガンド感知または酵素的活性化（シグナル２）の際には、細胞質の感知物質がオリゴマー化してカスパーゼ１の活性化プラットフォームを形成する３２。
【０１８２】
ＣＣｌ４処置から３０時間後、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから精製したＣＤ１１／ＣＤ６８初代肝マクロファージにリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７の発現がみられ、同時にＴＬＲ４、ＮＦκＢ、ＩＲＦ８およびＭｙＤ８８を含めたインフラマソームシグナル１複合体遺伝子産物に不可欠な成分の共発現がみられた（図１７ａ）１。
【０１８３】
リン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７トランスジェニックマウスではＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化が阻止された（図１７ａ）ことから、肝毒素処置によって誘導される肝マクロファージのインフラマソームシグナル１複合体の発現にはＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化が必要である。これに対し、ドミナントポジティブなＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７トランスジェニックマウスから単離した肝マクロファージには、肝毒素処置の不在下でインフラマソームシグナル１複合体の発現がみられた（図１７ａ）。ＭＡＰＫシグナル伝達が刺激されるＴＧＦαトランスジェニックマウスから単離した肝マクロファージでも同じく、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７とＴＬＲ４、ＮＦκＢ、ＩＲＦ８およびＭｙＤ８８を含めたインフラマソームシグナル１複合体に不可欠なタンパク質成分の発現との間に相関がみられた（図１７ａ）。
【０１８４】
さらに、肝毒素処置後の精製肝マクロファージにおけるリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７とインフラマソームシグナル１複合体のメンバーとの物理的結合を明らかにするため、Ｃ／ＥＢＰβを免疫沈降させ、免疫ブロットにはβアクチンで正規化し、その結合タンパク質を分析した。新たに単離した初代肝マクロファージのリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７またはリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７は、非リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７または非リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７とは異なり、ＴＬＲ４、ＮＦκＢ、ＩＲＦ８およびＭｙＤ８８と物理的に結合していることがわかった（図１７ｂ）。ＣＣｌ４処置（およびそれに続くマクロファージ活性化）によって、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７またはリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７とインフラマソームシグナル１タンパク質との間の結合が増大した（図１７ｂ）。
【０１８５】
リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７はマウス肝マクロファージのインフラマソーム複合体シグナル２の発現を刺激する
いくつかの炎症性サイトカインの発現にはインフラマソームシグナル２経路の活性化が不可欠である１，１１，３３ことを考慮し、肝マクロファージのインフラマソームシグナル２経路に対するリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７の役割を分析した。Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスのＣＣｌ４処置によって肝マクロファージのインフラマソームシグナル２タンパク質の発現が刺激されることがわかった（図１８ａ）。ＣＣｌ４処置から３０時間後、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから新たに精製したＣＤ１１／ＣＤ６８肝マクロファージにリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７の発現がみられ、同時にＮＡＬＰ３、ＴＬＲ５、ＩＬ−１Ｒ１およびアダプタータンパク質ＡＳＣを含めたインフラマソーム複合体シグナル２に不可欠な成分の共発現がみられた（図１８ａ）１。リン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マウスではリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７および肝毒素処置がともに阻止されたことから、肝毒素処置によって刺激した肝マクロファージにインフラマソーム多タンパク質複合体シグナル２を誘導するには、ほかにもリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７の発現が必要である（図１８ｂ）。これに対し、リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスから単離した肝マクロファージは、肝毒素処置の不在下で、部分的に活性化した（プライムされた）インフラマソームシグナル２複合体を発現した（図１８ａ）。さらに、ＴＧＦαトランスジェニックマウスから単離した肝マクロファージでは、リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７と、ＮＡＬＰ３、ＴＬＲ５、ＩＬ−１Ｒ１およびＡＳＣを含めたインフラマソームシグナル２複合体に不可欠な成分の発現との間に相関がみられた（図１８ａ）。
【０１８６】
さらに、肝毒素処置後の精製初代肝マクロファージにおけるリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７とインフラマソームシグナル２複合体との物理的結合を明らかにするため、Ｃ／ＥＢＰβを免疫沈降させ、その結合タンパク質を分析した。肝損傷によって、肝マクロファージのインフラマソームシグナル２複合体タンパク質（ＮＡＬＰ３、ＴＬＲ−５、ＩＬ−１Ｒ１およびＡＳＣ）とリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７またはリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７との間の物理的結合は増大するが、非リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７または非リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７との間の物理的結合は増大しないことがわかった（図１８ｂ）。
【０１８７】
リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７はマウス肝マクロファージのインフラマソームの構造遺伝子および副生成物遺伝子の発現を刺激する
リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスから新たに単離した肝マクロファージは、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスと比較してインフラマソームに関連する活性化トランスクリプトソームを発現することがわかった。これには、インフラマソーム遺伝子（ＡＳＣ、ＩＲＦ−１、ＩＲＦ−４、ＩＲＦ−５、ＴＣＡＭ−２、ＴＲＬ−６、ＴＲＡＦ−６、Ｍｙｏ−Ｄ８８、Ｎｏｄ−１およびＲｅｌ）の発現増大のほか、直接的および間接的なサイトカイン遺伝子副生成物（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＴＮＦα）１，１１，３３の発現増大が含まれていた（図１９ａ）。以上のデータから、インフラマソームの構造タンパク質および副生成物の発現にはリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７（またはＣ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７）が必要であることが示唆される。さらに、ＣＣｌ４で処置したマウスから新たに単離したＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７肝マクロファージは、ＣＣｌ４で処置したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから新たに単離した肝マクロファージと比較して、抑制されたインフラマソームトランスクリプトソームを発現する。これには、インフラマソーム遺伝子（ＩＲＦ−４、ＮＡＬＰ−α、ＮＡＬＰ−３、ＴＣＡＭ−２、ＴＲＬ−１、ＴＲＬ−３、ＴＲＬ−５、ＴＲＬ−６、ＴＲＬ−７、ＴＲＬ−８、ＴＲＬ−９、Ｎｏｄ−１およびＲｅｌ）の発現減少のほか、直截的および間接的なサイトカインインフラマソーム遺伝子副生成物（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３αおよびＣＸＣＬ−３）１，１１，３３の発現減少が含まれていた（図１９ｂ）。さらに、ＣＣｌ４で処置することにより、Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウス、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスおよびＴＧＦαマウスの肝臓にＩＬ−１８、活性カスパーゼ１およびＩＬ−１βインフラマソームタンパク質の発現１が誘導された（図１９ｃ）。
【０１８８】
有毒油症候群によって誘導されるヒト肝損傷も肝マクロファージのインフラマソーム複合体と結合したリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７を特徴とする
１９８１年の夏にスペインの中部および北西部で発生した有毒油症候群（ＴＯＳ）には約２０，０００人が罹患し、急性肝損傷を来たした。オリーブ油の夾雑物である３−（Ｎ−フェニルアミノ）−１，２−プロパンジオールの１，２−ジオレオイルエステルによって、酸化ストレス肝損傷が用量反応性に誘導された３４，３５。スペイン、マドリードのコンプルテンセ大学医療センターで現時点でも入手可能なＴＯＳ患者全１６例の肝生検試料を分析した。これらの患者は、ＡＬＴおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇を特徴とし、アルカリホスファターゼおよび総ビリルビンが正常被験者と比較して増大していることから判断して胆汁うっ滞要素のある中等度の急性肝損傷を有していた（表３）。ＴＯＳ患者の組織学的分析による肝損傷の程度には、対照（図２０ａおよび２０ｃ）と比較した肝臓のマクロファージ浸潤（図２０ｂ）、肝細胞アポトーシスの程度（図２０ｄ）および血清中ＡＬＴレベル（表３）との間に相関がみられた。
【０１８９】
【表３】
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【０１９０】
ＴＯＳは急性炎症性肝損傷を引き起こす酸化ストレスを特徴とすることから、ＴＯＳ患者の肝臓が急性炎症性肝損傷を有するＣＣｌ４動物モデルと類似した特徴を有するかどうかを分析した。上記の特異的マーカーの発現を特徴とするＴＯＳ患者の肝臓の肝マクロファージには、正常な肝臓のマクロファージと比較してリン酸化Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２６６（マウスＴｈｒ２１７の正確な相同体）の発現がみられた（図２０ｇおよび２０ｈ）。ＴＯＳの肝臓は、正常な肝臓のマクロファージ（図２０ｅおよび２０ｉ）と比較して、活性化インフラマソームに特徴的なマーカーであるＭｙＤ−８８およびＴＬＲ−５が増大していることがわかった（図２０ｆおよび２０ｊ）。
【０１９１】
考察
以上の試験で本発明者らは、ＣＣｌ４またはＦａｓ−Ｌが誘導する肝損傷の増幅をもたらす肝マクロファージのインフラマソームの活性化にリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７が果たす新規な役割を明らかにした。Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化は、酸化ストレス肝毒素のＣＣｌ４またはＦａｓ−Ｌがマウスに肝損傷を誘導した後の肝臓のマクロファージ浸潤および初代肝マクロファージ培養物のマクロファージ活性化（Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化の誘導物質であるＴＧＦα１８によって刺激される）に必要なものである。
【０１９２】
マウスにドミナントネガティブでリン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子を発現させるか、Ｃ／ＥＢＰβリン酸化を阻害するペプチドをＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスに投与することによって、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化を阻止すると、ＣＣｌ４またはＦａｓ−Ｌが誘導する肝損傷が抑えられたことは注目すべきことである。Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化の阻害によってほかにも、マクロファージの肝浸潤、インフラマソーム多タンパク質複合体の発現および活性化ならびに炎症誘発性肝マクロファージの極性化が改善された。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７トランスジェニックマウスでは、対照マウスと比較してｉｎ  ｖｉｖｏの脾マクロファージがカスパーゼ３の発現を増大させる（活性化アポトーシス経路を示唆する）ことがこれまでに明らかにされている２８。しかし、本発明者らは、Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７トランスジェニックマウスの肝マクロファージ数が対照マウスと比較して減少していることは確認しておらず（図１５ａ）、肝臓では脾臓と異なり、Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７マクロファージのアポトーシスの増大は起こらないことが強く示唆される。
【０１９３】
特に、多タンパク質複合体インフラマソームシグナル１（ＮＦκＢ、ＩＲＦ８、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８およびＴＬＲ４）およびインフラマソームシグナル２経路（ＮＡＬＰ３、ＴＬＲ５、ＩＬ−１Ｒ１およびアダプタータンパク質ＡＳＣ）１，１１，３３の発現には肝マクロファージのＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化が必要であった。リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７は、非リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７とは異なり、インフラマソーム多タンパク質複合体シグナル１およびシグナル２と物理的に結合していることもわかった。
【０１９４】
インフラマソームの中心となる成分はＮＡＬＰファミリーのメンバーであり、このタンパク質はアダプタータンパク質アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）と結合し、これにより炎症誘発性カスパーゼ前駆体（プロカスパーゼ１など）を動員する３６。本発明者らが自らの肝マクロファージのインフラマソーム活性化モデルで確認したＮＡＬＰ３は、インフラマソームを形成することができるが、ＮＡＬＰ３をコードする遺伝子（ＣＩＡＳ１）に変異があるといくつかの自己炎症性障害を引き起こし、その生理学的重要性がうかがえる３６。
【０１９５】
リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７マウスでは、ＣＣｌ４による急性酸化ストレス肝損傷によって、肝マクロファージインフラマソーム遺伝子（ＡＳＣ、ＩＲＦ−１、ＩＲＦ−４、ＩＲＦ−５、ＴＣＡＭ−２、ＴＲＬ−６、ＴＲＡＦ−６、Ｍｙｏ−Ｄ８８、Ｎｏｄ−１およびＲｅｌ）の発現のほかにも、インフラマソーム活性化の顕著な特徴である１１，３３，３７肝マクロファージの直接的および間接的なサイトカインインフラマソーム副生成物（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３αおよびＣＸＣＬ−３）の遺伝子発現増大が誘導された。これに対し、ＣＣｌ４で処置したマウスから新たに単離したリン酸化不可能なＣ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７肝マクロファージには、ＣＣｌ４で処置したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスから新たに単離した肝マクロファージと比較して抑制されたインフラマソームトランスクリプトソームの発現がみられた。これには、インフラマソーム遺伝子（ＩＲＦ−４、ＮＡＬＰ−α、ＮＡＬＰ−３、ＴＣＡＭ−２、ＴＲＬ−１、ＴＲＬ−３、ＴＲＬ−５、ＴＲＬ−６、ＴＲＬ−７、ＴＲＬ−８、ＴＲＬ−９、Ｎｏｄ−１およびＲｅｌ）の発現減少および直接的および間接的なサイトカインインフラマソーム副生成物（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３αおよびＣＸＣＬ−３）の遺伝子の発現減少が含まれていた。
【０１９６】
Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７変異株はＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化のトランスドミナントネガティブとして機能する２１。これに対し、Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７変異体はＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化のトランスドミナントポジティブとして機能する１８。肝損傷では、マクロファージのＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７のリン酸化が、炭疽致死毒素に関して報告されているようにマクロファージの増殖／生存を刺激し２３、かつ／または損傷肝細胞への移動および損傷肝細胞の直接的な破壊もしくは食作用を促進すると思われる。ＣＣｌ４によって肝マクロファージ浸潤が約２０倍になったが、肝細胞損傷のないトランスジェニックマウスでは、マクロファージ刺激因子ＴＧＦαによってマクロファージの肝浸潤が増大することはなかった。マクロファージ浸潤はＦａｓ−Ｌで急性処置した個体の肝臓にも観察され、肝損傷の機序に関係なく、マクロファージのＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化の刺激がマクロファージによる肝浸潤を調節していることが示唆される。
【０１９７】
薬物誘導性肝損傷またはアルコール性肝疾患の患者に可溶性Ｆａｓ−Ｌの有意な増大がみられる３８，３９ことから、Ｆａｓ−Ｌの実験は生理学的に重要なものである。急性ＦａｓＬ投与（ＴＮＦスーパーファミリー受容体に作用する）によって、リン酸化模倣Ｃ／ＥＢＰβ−Ｇｌｕ２１７トランスジェニックマウスのマクロファージ浸潤の増大および肝損傷が誘導された。Ｃ／ＥＢＰβ−Ａｌａ２１７導入遺伝子を発現するマウスは、Ｆａｓ−Ｌによる肝損傷の発生に抵抗性を示した。
【０１９８】
ほかにも、除去によるマクロファージ活性の調節から、マクロファージのリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７が肝毒素曝露後の肝損傷の誘導に不可欠な役割を果たしていることがわかった。本発明者らは既に、ＴＬＲ−４ノックアウトマウスが肝毒素に耐性を示すことから、中毒性肝損傷の増幅がマクロファージによって媒介されること、および骨髄に放射線照射したＴＬＲ−４ノックアウトマウスをＴＬＲ−４＋／＋マクロファージで再構築すると、同マウスに肝毒素に対する感受性がもたらされることを報告している４。ごく最近では、マクロファージ除去を用いた中毒性肝損傷５、ＩＬ−１受容体アンタゴニストを用いた実験的アルコール性肝損傷モデル６およびアデノシン−２Ａ（Ａ２Ａ）受容体ノックアウトマウスを用いたＬＰＳ／Ｄ−ガラクトサミン誘導性肝損傷７でマクロファージの役割が確認されている。Ａ２Ａ受容体およびＨＩＦ−１α経路を介するインフラマソーム活性化を維持するにはアデノシンが必要である７。さらに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に曝露したマクロファージによるＩＬ−１０産生にはＡ２Ａアデノシン受容体およびＣ／ＥＢＰβの両方が必要であり４０、活性化肝マクロファージにリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７およびＡ２Ａシグナル伝達経路が収斂されている可能性が示唆される。
【０１９９】
したがって、本明細書に記載される諸試験では、肝毒素誘導性肝損傷の新規で主要なシグナル伝達経路としてのマクロファージのリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７の特徴を明らかにした。リン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７（ヒトＴｈｒ２６６）はほかにも、実験的脂肪性肝炎、ヒトアルコール性脂肪性肝炎および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）によって誘導される肝損傷のマクロファージインフラマソームで主要な役割を果たしているものと思われる１，４１。Ｃ／ＥＢＰβ  ＤＮＡ結合部位の優性阻害因子１５またはＣ／ＥＢＰβの標的欠損の発現によってマクロファージ分化が阻害される１６ことから、本明細書に記載される所見は、Ｃ／ＥＢＰβがマクロファージに不可欠なシグナル伝達タンパク質としての役割を果たしていることと一致する。
【０２００】
よく特徴付けられた急性ヒト酸化ストレス肝損傷の１つであり、毒性夾雑物によって誘導された有毒油症候群（ＴＯＳ）の特徴は、少なくとも部分的には、急性酸化ストレス炎症性肝損傷の動物モデルによる所見を模倣し、その妥当性を示すものである。ＴＯＳに起因する急性肝損傷の所見から、細胞モデルおよび動物モデルの所見がヒトの一部の種類の急性肝損傷に適用され得ることが示唆される。ヒト急性肝損傷のこれらの経路をさらに理解する試験によって、マクロファージのリン酸化Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６がこれらの損傷において病原性であるかどうかが明らかにあるものと思われる。
【０２０１】
以上をまとめると、この実施例に示した所見は、肝炎症および肝損傷の発現に不可欠な段階の１つとして、肝マクロファージのインフラマソーム多タンパク質複合体を活性化させるＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７（ヒトＴｈｒ２６６）を介した新規なシグナル伝達機序を提供するものである１。肝炎症および肝損傷は、ヒトの急性および慢性の肝疾患の有病率および死亡率の主たる原因である１，２，３，４１。したがって、ＩＬ−１β受容体アンタゴニスト６、Ａ２Ａ受容体アンタゴニスト７および小分子ペプチド模倣体は、肝マクロファージのヒトＣ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６リン酸化の標的化阻害剤として炎症性肝損傷の予防法および治療法の候補となる可能性を秘めている。
【０２０２】
実施例１１：治療用ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドは様々な投与経路でブレオマイシン肺線維症マウスモデルに高い効果を示す
Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスに上記の通りにブレオマイシン投与を実施した。第１０日、線維性反応が確認されてから、マウスにｉ）ＰＥＧ結合ペプチドであるＰＥＧ−３０ｋＤａ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２１０μｇを第１０、第１７日および第２４日に腹腔内（ＩＰ）投与した：またはｉｉ）ペプチドＰＥＧ−３０ｋＤａ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２を吸入により投与した（平均粒子径は肺胞に効率的に到達する１．３μｍであり、ペプチドは第１０日、第１７日および第２４日に８００μｇを投与し；具体的な吸入パラメータを表２に示す）。ペプチドは、名目濃度１．０ｍｇ／Ｌ［８００μｇ／用量］の被験物質のエアゾールを１日［第１０日、第１７日および第２１日］に１時間未満の間、鼻のみから吸入させて投与した；またはｉｉｉ）ペプチドＰＥＧ−３０ｋＤａ−Ｌｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−Ａｓｐ−ＮＨ２を気管内点滴注入により投与した（第１０日、第１７日および第２４日にペプチド４０μｇ）。
【０２０３】
【表４】
2018520999.tif 000007
【０２０４】
対照群には、ブレオマイシン投与；ペプチドＩＰ投与；吸入によるペプチド投与；または気管内点滴注入によるペプチドの代わりに滅菌水を投与した。第２７日、マウスを屠殺した。左肺を固定液で膨張させ、トリクローム染色により分析し、既に記載されている通りに（Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙら，２００９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２９７：ｅ３９２−４０１）Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ顕微鏡観察ソフトウェアプロトコルにより全体を定量化して分析誤差を最小限に抑えた。右肺は液体窒素で急速凍結させ、ＩＭＨ、免疫ブロットおよびｑＲＴ−ＰＣＲに用いた。ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドＩＰ、ペプチドの気管内点滴注入（陽性対照）またはペプチド吸入による処置では、肺線維症の程度；Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２１７リン酸化と共局在するα−ＳＭＡ（活性化筋線維芽細胞のマーカー）の発現の著明な減少がみられた。
【０２０５】
さらに、いずれの処置でも、ＩＬ−２３Ｒ（Ｔｈ−１７細胞のマーカー）の発現によって判定される肺炎症の軽減が認められた。ブレオマイシンによって肺線維症が対照マウスの５倍超増大した。これに対し、ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドまたは吸入ペプチドを投与したマウスは、３回の投与（第１０日、第１７日および第２４日）で１４日間処置しただけで肺線維症が約６０％軽減された（Ｐ＜０．００１）（図２５ａ）。気管内点滴注入（処置陽性対照）では際立った効果が認められ、対照マウスとの差はごくわずかであった（Ｐ＜０．００１）（図２５Ａ〜２５ｂ）。このペプチドによってほかにも、ＩＬ−２３Ｒの発現減少（６８）から判断されるＴｈ−１７炎症（ＩＰＦ炎症の重要な構成要素であると推測される（６９））の軽減が認められた（図２５ａ）。ＲＴ−ＰＣＲによる判定では、３種類のペプチド製剤によってコラーゲンα１（主要なＥＣＭ遺伝子（５））およびＴＧＦβ１（線維原性サイトカイン（５））がともに減少し、定量的ＩＨＣとの一致がみられた（図２５ｂ）。
【０２０６】
したがって、患者にさらに高用量で長期間にわたる投与（ＩＰＦの患者についてはＦＤＡの表および生理学的ＰＫ解析によって補正する）を実施すれば、さらに高い効果が得られるものと思われる。１４日間という短期間の処置にもかかわらず、いずれの処置でも一回換気量が３５％超改善した（Ｐ＜０．０１）（図２６）。定量的ＩＨＣによる実質的に正常なサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＦＰＣ）の発現（Ｐ＜０．００１）（図２５ａ）および肺胞上皮細胞アポトーシスの著明な抑制（約６０％）（Ｐ＜０．００５）（図２７）から判断して、ＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドまたは吸入ペプチドを投与したＣ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスの方が、対照Ｃ／ＥＢＰβ−ｗｔマウスよりもブレオマイシン処理後の肺損傷が少なかった。
【０２０７】
実施例１２：腎線維症における活性化筋線維芽細胞の数、ホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２６６（マウスホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２１７のヒト相同体）の発現および活性化マクロファージを伴う炎症の著明な減少
糸球体腎炎に続発する腎線維症を有する患者３例の腎生検試料を分析した。これらの生検試料には広範囲に及ぶ糸球体線維症が認められ、活性化筋線維芽細胞（α−ＳＭＡの発現によって示される）の数の増大のほかにも、ホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２６６（マウスホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２１７のヒト相同体）の著明な発現および活性化マクロファージを伴う炎症（Ｆ４／８０によって示される）（図２８）がみられた。
【０２０８】
以上の所見から、組織線維症を来たす機序は肝臓も肺も腎臓も同じであることがわかり、活性化筋線維芽細胞、炎症性マクロファージおよびホスホ−Ｃ／ＥＢＰβＴｈｒ２６６が関与しあらゆる組織線維性疾患に共通すると思われる機序の存在が示唆される。したがって、本発明のＰＥＧ−３０ｋＤａ−ペプチドでホスホ−Ｃ／ＥＢＰβ−Ｔｈｒ２６６を標的化することによって、腎線維症の治療も実現可能であると思われる。
【０２０９】
実施例１３：ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＥＧ３０ｋＤａ−Ｍｐｒ−ペプチドから放出される中間分子は薬学的に活性である
以下に示すのは被験ペプチドの構造であり、そのリード分子の１つはＭｐｒ結合ＰＥＧペプチド（別名ＰＥＧ−３０ｋＤａ−Ｍｐｒ−ペプチド）である。
【表５】
2018520999.tif 000008
【０２１０】
ペグ化−ペプチド３６１３３２の化学構造を以下に示す：
【化３】
2018520999.tif 000009
【０２１１】
ペグ化−ペプチド３６１３３２を用いる試験を示す
【表６】
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【０２１２】
血漿試料中のペプチドおよびＭＰＲ中間体のレベル
【表７】
2018520999.tif 000011
【０２１３】
Ｍｐｒ−ペプチドは活性なペプチドを放出することから、同ペプチドも別の製剤として治療薬となり得る。したがって、これを様々な組織線維性疾患の治療の代替的製剤として投与することが可能である。
【０２１４】
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２０．Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＬ  ａｎｄ  Ｂａｎｓａｌ  ＭＢ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ−−ｆａｃｔ  ｏｒ  ｆａｎｔａｓｙ？  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４３：Ｓ８２−Ｓ８８，２００６．ＰＭＩＤ：１６４４７２７５．
２１．Ｇｅｗｏｌｂ  Ｊ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆｒｏｍ  Ｉｔｓｅｌｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｏｗ  ４，２００１．
２２．Ｇｙｒｄ−Ｈａｎｓｅｎ  Ｍ  ＆  Ｐａｓｃａｌ  Ｍｅｉｅｒ．ＩＡＰｓ：ｆｒｏｍ  ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １０，５６１−５７４（Ａｕｇｕｓｔ  ２０１０）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃ２８８９
２３．Ｈｏｕｇｌｕｍ  Ｋ，Ｌｅｅ  ＫＳ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＥＢ  ｏｎ  Ｓｅｒｉｎｅ  １３３．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９９：１３２２，１９９７．
２４．Ｉｒｅｄａｌｅ  Ｊ．Ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖ  Ｄｉｓ  ２１：４２７−４３６，２００１．
２５．Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｗ，Ｐａｒｅｓ  Ａ，Ｃａｂａｌｌｅｒｉａ  Ｊ，Ｈｅｒｅｄｉａ  Ｄ，Ｂｒｕｇｕｅｒａ  Ｍ，Ｔｏｒｒｅｓ  Ｍ，Ｒｏｊｋｉｎｄ  Ｍ  ａｎｄ  Ｒｏｄｅｓ  Ｊ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｎｅｅｄｌｅ  ｌｉｖｅｒ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５：８１５−８１８，１９８５．ＰＭＩＤ：４０２９８９３
２６．Ｋｉｍ  Ｋ，Ｋｅｉｉｃｈｉｒｏｕ  Ｍｏｒｉｍｕｒａ，Ｙａｔｒｉｋ  Ｓｈａｈ，Ｑｉａｎ  Ｙａｎｇ，Ｊｅｒｒｏｌｄ  Ｍ．Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋ  Ｊ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（２００７）２８（５）：９４０−９４６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／ｂｇｌ２４９．
２７．Ｌｅｅ  ＫＳ，Ｂｕｃｋ  Ｍ，Ｈｏｕｇｌｕｍ  Ｋ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＴＧＦａ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃ−ｍｙｂ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９６：２４６１−２４６８，１９９５．ＰＭＩＤ  ＃７５９３６３５．
２８．ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ＳＬ．ＭｃＢｉｎｄａｌｌ−ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｎａｍｅ  ｆｏｒ  ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ？  Ｃｅｌｌ  １０７：２５９−２６１，２００１．
２９．Ｍａｇｚｏｕｂ，Ｍ．；Ｇｒａｓｌｕｎｄ，Ａ．Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｑ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３７；１４７−１９５；２００４．
３０．Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｔ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，Ａｋｉｒａ  Ｓ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−２３５  ｂｙ  ａ  ｒａｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＮＦ−ＩＬ６．ＰＮＡＳ．９０：２２０７−１１．１９９３
３１．Ｐａｔｓｃｈ  Ｗ，Ｔ  Ｔａｍａｉ，ａｎｄ  Ｇ  Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｌｉｐｉｄ  ａｎｄ  ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９８３；７２：３７１−８．
３２．Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｒｉｓｋｓ，Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｌｉｆｅ．Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２００２，Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２００２，ｐ．１−２３０．
３３．Ｒｅｐｏｒｔ  ０４−５４９１．Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｓｕｍｍａｒｙ．Ｉｎ：Ａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｎ  ｆｏｒ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＮＩＨ，２００４，ｐ．１−６．
３４．Ｒｅｐｏｒｔ  ０４−５４９１．Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ．Ａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｎ  ｆｏｒ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１３７−１４３．２００４．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ．
３５．Ｒｅｐｏｒｔ  ０４−５４９１．Ｃｈａｐｔｅｒ  ２．Ｉｎ：Ａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｎ  ｆｏｒ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＮＩＨ，２００４，ｐ．３９−４３．
３６．Ｒｏｊａｓ  Ｍ，Ｌｉｎ  ＹＺ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ＥＧＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１：２７４５６−６１．１９９６．
３７．Ｒｏｙ  ＳＫ，Ｈｕ  Ｊ，Ｍｅｎｇ  Ｑ，Ｓｈａｐｉｒｏ  ＰＳ，Ｒｅｄｄｙ  ＳＰ，Ｐｌａｔａｎｉａｓ  ＬＣ，Ｌｉｎｄｎｅｒ  ＤＪ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＰＦ，Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  Ｃ，Ｐａｇｅｓ  Ｇ，Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒ  Ｊ  ａｎｄ  Ｋａｌｖａｋｏｌａｎｕ  ＤＶ．ＭＥＫＫ１  ｐｌａｙｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ／ＥＢＰ−ｂｅｔａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ．Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ  ９９：７９４５−７９５０，２００２．ＰＭＩＤ：１２０４８２４５
３８．Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ｋ，Ｃｈａｎｇ  Ｓ，Ｍｉｌｌａｒｄ  Ｍ，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ−Ａｇｕｓ  Ｎ  ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ  Ｒ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１２５３−１２５８，２０００．ＰＭＩＤ：１０６７８８３０
３９．Ｓａｔｏ，Ａ．Ｋ．；Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｍ．；Ｋｅｎｔ，Ｒ．Ｂ．；Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７；６３８−４２；２００６．
４０．Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ  Ｃ，Ｃａｅｌｌｅｓ  Ｃ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｅｒ  Ｐ，Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ，Ｋａｒｉｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＦ−ＩＬ６／ＬＡＰ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５４４−５４７，１９９３．
４１．Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ  Ｃ，Ｋａｒｉｎ  Ｍ，Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．ＰＫＡ  ａｎｄ  Ｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＬＡＰ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ＤＮＡ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖ  ９３：２５５４−６１，１９９４．
４２．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｔｏｄａｙ１０；１４５１−８；２００５．
４３．Ｗｅｇｎｅｒ  Ｍ，Ｃａｏ  Ｚ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ＭＧ．Ｃａｌｃｉｕｍ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｏｆ  Ｃ／ＥＢＰ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：３７０−３７３，１９９２．ＰＭＩＤ：１３１４４２６
４４．Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＫＫ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＧＡ，Ｂｉｇｇｓ  ＷＨ，ＩＩＩ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｍｉｎｙ  ＭＲ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＲＥＢ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：４９４−４９８，１９８８．ＰＭＩＤ：２９００４７．
４５．Ｃｈｅｎ  ＲＨ，Ａｂａｔｅ  Ｃ，Ｂｌｅｎｉｓ  Ｊ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃ−Ｆｏｓ  ｔｒａｎｓｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｂｙ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ９０−ｋＤａ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３  Ｄｅｃ  １；９０（２３）：１０９５２−６．
４６．Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｇ，Ｗｈｙｔｅ  ＤＢ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｒ，Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ，Ｓｕｄａｒｓａｎａｍ  Ｓ．Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２；２９８：１９１２−３４．
４７．Ｊｈａｐｐａｎ  Ｃ，Ｃ．Ｓｔａｈｌｅ，Ｒ．Ｎ．Ｈａｒｋｉｎｓ，Ｎ．Ｆａｕｓｔｏ，Ｇ．Ｈ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｇ．Ｔ．Ｍｅｒｌｉｎｏ．１９９０．ＴＧＦ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｌｉｖｅｒ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｃｅｌｌ  ６１：１１３７−１１４６．
４８．Ｈｅｎｚｅｌ  ＷＪ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｃ，Ｓｔｕｌｔｓ  ＪＴ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００３；１４（９）：９３１−４２．
４９．Ｏｌｓｅｎ  ＪＶ，Ｏｎｇ  ＳＥ，Ｍａｎｎ  Ｍ．Ｔｒｙｐｓｉｎ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｏ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００４；３（６）：６０８−１４．
５０．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｅ．；Ｋｉｎｔｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ（２０００）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ．
５１．Ｗｉｂｌｅ  Ｂ．Ａ．，Ｐｅｔｅｒ  Ｈａｗｒｙｌｕｋ，Ｅｃｋｈａｒｄ  Ｆｉｃｋｅｒ，Ｙｕｒｉ  Ａ．Ｋｕｒｙｓｈｅｖ，Ｇｌｅｎｎ  Ｋｉｒｓｃｈ，Ａｒｔｈｕｒ  Ｍ．Ｂｒｏｗｎ．ＨＥＲＧ−Ｌｉｔｅ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈＥＲＧ  ｒｉｓｋ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５２（２００５）１３６−１４５．
５２．Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｓ．Ａ．，Ｔｏｎｙ  Ｈｕｎｔｅｒ．Ｋｉｎｏｍｉｃｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｋｉｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，１７−２５（２００５）．
５３．Ｓｉｎｚ  Ｍ，Ｇｉｌｌｉａｎ  Ｗａｌｌａｃｅ，ａｎｄ  Ｊａｓｍｉｎｄｅｒ  Ｓａｈｉ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｉｎ  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ＣＹＰ４５０  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ．ＡＡＰＳ  Ｊ．２００８；１０（２）：３９１−４００．
５４．Ｂｅｒｎａｒｄｉ  Ｍ，Ｃａｌａｎｄｒａ  Ｓ，Ｃｏｌａｎｔｏｎｉ  Ａ，Ｔｒｅｖｉｓａｎｉ  Ｆ，Ｒａｉｍｏｎｄｏ  ＭＬ，Ｓｉｃａ  Ｇ，Ｓｃｈｅｐｉｓ  Ｆ，Ｍａｎｄｉｎｉ  Ｍ，Ｓｉｍｏｎｉ  Ｐ，Ｃｏｎｔｉｎ  Ｍ，Ｒａｉｍｏｎｄｏ  Ｇ．Ｑ−Ｔ  ｉｎｔｅｒｖａｌ  ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ：ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ，ａｎｄ  ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９８；２７（１）：２８−３４．
５５．Ｂａｋｅｒ  ＭＰ，ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  ＴＤ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．（２００７）１０：２１９．
５６．Ｐｅｒｒｙ  ＬＣＡ，Ｊｏｎｅｓ  ＴＤ，ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  ＭＰ．Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｒｕｇｓ  Ｒ  Ｄ（２００８）９（６）：３８５．
【０２１５】
肺炎症および線維症に関して引用した参考文献
１．Ａｋｉｒａ  Ｓ，Ｉｓｓｈｉｋｉ  Ｈ，Ｓｕｇｉｔａ  Ｔ，Ｔａｎａｂｅ  Ｏ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｓ，Ｎｉｓｈｉｏ  Ｙ，Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｔ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｔ  ａｎｄ  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ．Ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ＩＬ−６  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＮＦ−ＩＬ６）  ｉｓ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  Ｃ／ＥＢＰ  ｆａｍｉｌｙ．ＥＭＢＯ  Ｊ９：１８９７−１９０６，１９９０．
２．Ｂａｒｒｏｎ  Ｌ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ  ＴＡ．Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｔｈ２  ａｎｄ  Ｔｈ１７  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｂｙ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ａｍ  Ｊ  ｏｆ  Ｐｈｙｓ−Ｇａｓｔｒｏｉｎｔ．ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３００：７２３−７２８，２０１１．
３．Ｂｅｄｏｓｓａ  Ｐ，Ｈｏｕｇｌｕｍ  Ｋ，Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ  Ｃ，Ｈｏｌｓｔｅｇｅ  Ａ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  １（Ｉ）ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ．Ａ  ｌｉｎｋ  ｔｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ？  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９：１２６２−１２７１，１９９４．
４．Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈ−Ｓｉｅｂｅｌｔ  Ｆ，Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈ  Ｉ，Ａｎｄｒｕｌｉｓ  Ｍ，Ｓａｎｔｎｅｒ−Ｎａｎａｎ  Ｂ，Ｊｈａ  ＭＫ，Ｋｌｅｉｎ−Ｈｅｓｓｌｉｎｇ  Ｓ，Ｓｃｈｉｍｐｌ  Ａ  ａｎｄ  Ｓｅｒｆｌｉｎｇ  Ｅ．ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃ−ｍｙｃ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＩＬ−４  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：４８５１，２００６．
５．Ｂｒａｖｏ  Ｒ，Ｆｒａｎｋ  Ｒ，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ＰＡ  ａｎｄ  ＭａｃＤｏｎａｌｄ−Ｂｒａｖｏ  Ｈ．Ｃｙｃｌｉｎ／ＰＣＮＡ  ｉｓ  ｔｈｅ  ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｄｅｌｔａ．Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：５１５−５１７，１９８７．
６．Ｂｕｃｋ  Ｍ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ−６  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  ２１：３０１−３０６，２００８．
７．Ｂｕｃｋ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ａ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ−６  ｋｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  Ｃ／ＥＢＰ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ２：ｅ１３７２，２００７．
８．Ｂｕｃｋ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｃ／ＥＢＰ（ｂｅｔａ）  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｈｒａｘ  ｌｅｔｈａｌ  ｔｏｘｉｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９３：Ｃ１７８８−Ｃ１７９６，２００７．
９．Ｂｕｃｋ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ：Ｃ／ＥＢＰ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７：７３１−７３８，２００３．
１０．Ｂｕｃｋ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｍｕｓｃｌｅ  ｗａｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃａｃｈｅｘｉａ  ｉｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ１５：１７５３−６５，１９９６．
１１．Ｂｕｃｋ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｃ／ＥＢＰ−Ｔｈｒ２１７  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ２０１１．
１２．Ｂｕｃｋ  Ｍ，Ｐｏｌｉ  Ｖ，Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｃ／ＥＢＰ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＳＫ  ｃｒｅａｔｅｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＸＥＸＤ  ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｂｏｘ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ８：８０７−８１６，２００１．
１３．Ｂｕｃｋ  Ｍ，Ｐｏｌｉ  Ｖ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｅｒ  Ｐ，Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｓｅｒｉｎｅ  １０５  ｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ２１７  ｉｎ  Ｃ／ＥＢＰ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＴＧＦ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４：１０８７−９２，１９９９．
１４．Ｂｕｃｋ  Ｍ，Ｔｕｒｌｅｒ  Ｈ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．ＬＡＰ（ＮＦ−ＩＬ６），ａ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｉｓ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ１３：８５１−８６０，１９９４．
１５．Ｂｕｃｋ  Ｍ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｃ／ＥＢＰ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ＴＮＦ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０：６７１２−６７２３，２００１．
１６．Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｅｒ  Ｊ．Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｌｙｍｐｈｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８８：１１５−１２１，１９８５．
１７．Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｒａｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｄｉｅｈｌ  Ａ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，１９９８，ｐ．４３０−４５０．
１８．Ｃｒｙｓｔａｌ  ＲＧ，Ｂｉｔｔｅｒｍａｎ  ＰＢ，Ｍｏｓｓｍａｎ  Ｂ，Ｓｃｈｗａｒｚ  ＭＩ，Ｓｈｅｐｐａｒｄ  Ｄ，Ａｌｍａｓｙ  Ｌ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＨＡ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＬ，Ｋｉｎｇ  ＴＥ，Ｊｒ．，Ｌｅｉｎｗａｎｄ  ＬＡ，Ｌｉｏｔｔａ  Ｌ，Ｍａｒｔｉｎ  ＧＲ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＤＡ，Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＧＳ，Ｗａｇｎｅｒ  ＣＲ  ａｎｄ  Ｍｕｓｓｏｎ  ＲＡ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＩＰＦ：Ａｍ  ＪＲｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６６：２３６−４６，２００２．
１９．Ｃｕｔｒｏｎｅｏ  ＫＲ，Ｗｈｉｔｅ  ＳＬ，Ｐｈａｎ  ＳＨ  ａｎｄ  Ｅｈｒｌｉｃｈ  ＨＰ．Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ１  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２１１：５８５−５８９，２００７．
２０．Ｄｅｇｒｙｓｅ  ＡＬ，Ｘｕ  ＸＣ，Ｔａｎｊｏｒｅ  Ｈ，Ｐｏｌｏｓｕｋｈｉｎ  ＶＶ，Ｊｏｎｅｓ  Ｂ，Ｍｃ  Ｍａｈｏｎ  ＦＢ，Ｏｒｔｉｚ  Ｃ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＴＳ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ  ＷＥ．ＴＧＦ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｌｖｅｏｌａｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ．Ａｍ  ＪＲｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １８３：Ａ６１４４，２０１１．
２１．Ｄｅｓｃｏｍｂｅｓ  Ｐ，Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ，Ｌｉｃｈｔｓｔｅｉｎｅｒ  Ｓ，Ｆａｌｖｅｙ  Ｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｂｌｅｒ  Ｕ．ＬＡＰ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ／ＥＢＰ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ，ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｌｉｖｅｒ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ４：１５４１−１５５１，１９９０．
２２．Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｉｅｇｌ  Ｓ，Ｓｔｒｏｂｅｒ  Ｗ，Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｋ，Ｐｕｒｉ  ＲＫ  ａｎｄ  Ｋｉｔａｎｉ  Ａ．ＩＬ−１３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ＩＬ−１３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−１  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２：９９−１０６，２００６．
２３．Ｆｒａｎｃｈｉ  Ｌ，Ｅｉｇｅｎｂｒｏｓ  Ｔ，Ｍｕｎｏｚ−Ｐｌａｎｉｌｌｏ  Ｒ  ａｎｄ  Ｎｕｎｅｚ  Ｇ．Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ：Ａ  ｃａｓｐａｓｅ−１  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：２４１，２００９．
２４．Ｇａｒａｎｔｚｉｏｔｉｓ  Ｓ，Ｓｔｅｅｌｅ  ＭＰ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＤＡ．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｔｈｉｎｋｉｎｇ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１４：３１９−３２１，２００４．
２５．Ｇｒｅｅｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  Ｊ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９−１３１２，１９９８．
２６．Ｈａｒｄｉｅ  ＷＤ，Ｇｌａｓｓｅｒ  ＳＷ  ａｎｄ  Ｈａｇｏｏｄ  ＪＳ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １７５：３−１６，２００９．
２７．Ｈｅ  Ｗ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｎｉ  Ａ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｍｉｒｏｔｓｏｕ  Ｍ，Ｍａｏ  Ｌ，Ｐｒａｔｔ  ＲＥ  ａｎｄ  Ｄｚａｕ  ＶＪ．Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（Ｓｆｒｐ２）  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．ＰＮＡＳ  ２０１０．
２８．Ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｆ  Ａ，Ｄｏｅｒｎｅｒ  Ｍ，Ｒａｗｅｒ  Ｄ，Ｌｅｉｃｋ  Ｊ，Ｔｒｏｔｔｅｒ  Ａ，Ｅｂｓｅｎ  Ｍ，Ｒｕｐｐｅｒｔ  Ｃ，Ｇｕｎｔｈｅｒ  Ａ，Ｇｏｒｔｎｅｒ  Ｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｓ  Ｉ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃ−ｂａｓｅｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｏｎ  ｌｕｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｅｃｏｎｉｕｍ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １３４：２０３−２１０，２００６．
２９．Ｈｏｍｅｒ  ＲＪ，Ｅｌｉａｓ  ＪＡ，Ｌｅｅ  ＣＧ  ａｎｄ  Ｈｅｒｚｏｇ  Ｅ．Ｍｏｄｅｒｎ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３５：７８０−７８８，２０１１．
３０．Ｈｏｕｇｌｕｍ  Ｋ，Ｌｅｅ  ＫＳ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＥＢ  ｏｎ  Ｓｅｒｉｎｅ  １３３．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９９：１３２２−１３８９，１９９７．
３１．Ｈｕ  Ｂ，Ｕｌｌｅｎｂｒｕｃｈ  ＭＲ，Ｊｉｎ  Ｈ，Ｇｈａｒａｅｅ−Ｋｅｒｍａｎｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｐｈａｎ  ＳＨ．Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅｔａ  ｉｎ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１１：４５５−４６２，２００７．
３２．Ｈｕｈ  ＪＲ，Ｌｅｕｎｇ  ＭＷＬ，Ｈｕａｎｇ  Ｐ，Ｒｙａｎ  ＤＡ，Ｋｒｏｕｔ  ＭＲ，Ｍａｌａｐａｋａ  Ｒ，Ｃｈｏｗ  Ｊ，Ｍａｎｅｌ  Ｎ，Ｃｉｏｆａｎｉ  Ｍ，Ｋｉｍ  ＳＶ，Ｃｕｅｓｔａ  Ａ，Ｓａｎｔｏｒｉ  ＦＲ，Ｌａｆａｉｌｌｅ  ＪＪ，Ｘｕ  ＨＥ，Ｇｉｎ  ＤＹ，Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄ  Ｆ  ａｎｄ  Ｌｉｔｔｍａｎ  ＤＲ．Ｄｉｇｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ  ＲＯＲｙｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７２：４８６−４９０，２０１１．
３３．Ｊａｋｕｂｚｉｃｋ  Ｃ，Ｃｈｏｉ  ＥＳ，Ｊｏｓｈｉ  ＢＨ，Ｋｅａｎｅ  ＭＰ，Ｋｕｎｋｅｌ  ＳＬ，Ｐｕｒｉ  ＲＫ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｂｏａｍ  ＣＭ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｖｉａ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＩＬ−４−ａｎｄ  ＩＬ−１３−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：２６８４−２６９３，２００３．
３４．Ｊｅｎｎｅｒ  ＲＧ，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ＭＪ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉ，Ｓｕｎ  Ｋ，Ｂｏｕｗｍａｎ  ＲＤ，Ｙｏｕｎｇ  ＲＡ，Ｇｌｉｍｃｈｅｒ  ＬＨ  ａｎｄ  Ｌｏｒｄ  ＧＭ．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  Ｔ−ｂｅｔ  ａｎｄ  ＧＡＴＡ−３  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｓｈａｒｅｄ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：１７８７６−１７８８１，２００９．
３５．Ｋａｂｅｌｉｔｚ  Ｄ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍ１９：３９−４５，２００７．
３６．Ｋａｍｅｉ  Ｙ，Ｘｕ  Ｌ，Ｈｅｉｎｚｅｌ  Ｔ，Ｔｏｒｃｈｉａ  Ｊ，Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｒ，Ｇｌｏｓｓ  Ｂ，Ｌｉｎ  ＳＣ，Ｈｅｙｍａｎ  ＲＡ，Ｒｏｓｅ  ＤＷ，Ｇｌａｓｓ  ＣＫ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ＭＧ．Ａ  ＣＢＰ  ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＡＰ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  ８５：４０３−４１４，１９９６．
３７．Ｋａｒｐｅｌ  ＪＰ，Ａｌｄｒｉｃｈ  ＴＫ，Ｍｉｔｓｕｄｏ  Ｓ  ａｎｄ  Ｎｏｒｉｎ  ＡＪ．Ｌｕｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌｕｎｇ  １６７：１６３−１７２，１９８９．
３８．Ｋｅｌｌｅｙ  Ｊ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｒｅｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  １４１：７６５−７８８，１９９０．
３９．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ＳＭ  ａｎｄ  Ｔａｇｕｃｈｉ  Ｓ．ＮＦ−ＩＬ６（Ｃ／ＥＢＰｂｅｔａ）  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＨＩＶ−１  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ．Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ  １０５：１５０２２−１５０２７，２００８．
４０．Ｋｏｎｉｇｓｈｏｆｆ  Ｍ，Ｋｒａｍｅｒ  Ｍ，Ｂａｌｓａｒａ  Ｎ，Ｗｉｌｈｅｌｍ  Ｊ，Ａｍａｒｉｅ  ＯＶ，Ｊａｈｎ  Ａ，Ｒｏｓｅ  Ｆ，Ｆｉｎｋ  Ｌ，Ｓｅｅｇｅｒ  Ｗ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ  Ｌ，Ｇｕｎｔｈｅｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｅｉｃｋｅｌｂｅｒｇ  Ｏ．ＷＮＴ  １−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１９：７７２−７８７，２００９．
４１．Ｋｏｗｅｎｚ−Ｌｅｕｔｚ  Ｅ，Ｔｗａｍｌｅｙ  Ｇ，Ａｎｓｉｅａｕ  Ｓ  ａｎｄ  Ｌｅｕｔｚ  Ａ．Ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｃ／ＥＢＰ  ｂｅｔａ（ＮＦ−Ｍ）  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ：ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ８：２７８１−２７９１，１９９４．
４２．Ｌｅｅ  Ｆ，Ｈａｇｌｅｒ  Ｊ，Ｃｈｅｎ  Ｚ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉ  ｋａｐｐａ  Ｂ  ａｌｐｈａ  ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｙ  ＭＥＫＫ１，ａ  ｋｉｎａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＪＮＫ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ  ８８：２１３−２２２，１９９７．
４３．Ｌｉ  Ｂ，Ｔｏｕｒｎｉｅｒ  Ｃ，Ｄａｖｉｓ  ＲＪ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ  ＲＡ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＪｕｎＢ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １８：４２０−４３２，１９９９．
４４．Ｌｉ  Ｍ，Ｋｒｉｓｈｎａｖｅｎｉ  ＭＳ，Ｌｉ  Ｃ，Ｚｈｏｕ  Ｂ，Ｘｉｎｇ  Ｙ，Ｂａｎｆａｌｖｉ  Ａ，Ｌｉ  Ａ，Ｌｏｍｂａｒｄｉ  Ｖ，Ａｋｂａｒｉ  Ｏ，Ｂｏｒｏｋ  Ｚ  ａｎｄ  Ｍｉｎｏｏ  Ｐ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−Ｂ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２１：２７７−２８７，２０１１．
４５．Ｍａｇｚｏｕｂ  Ｍ  ａｎｄ  Ｇｒａｓｌｕｎｄ  Ａ．Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：［ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ］  ｆｒｏｍ  ｉｎｃｅｐｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｑ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３７：１４７−１９５，２００４．
４６．Ｍａｉｔｒａ  Ａ，Ｓｈｅｎ  Ｆ，Ｈａｎｅｌ  Ｗ，Ｍｏｓｓｍａｎ  Ｋ，Ｔｏｃｋｅｒ  Ｊ，Ｓｗａｒｔ  Ｄ  ａｎｄ  Ｇａｆｆｅｎ  ＳＬ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｔｉｆｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ＩＬ−１７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４：７５０６−７５１１，２００７．
４７．Ｍａｒｔｉｎｏｎ  Ｆ，Ｂｕｒｎｓ  Ｋ  ａｎｄ  Ｔｓｃｈｏｐｐ  Ｊ．Ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃａｓｐａｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏＩＬ−ｂｅｔａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １０：４１７−４２６，２００２．
４８．Ｍａｔｓｕｓａｋａ  Ｔ，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ，Ｎｉｓｈｉｏ  Ｙ，Ｍｕｋａｉｄｏ  Ｎ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  Ｋ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ  Ｓ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ＮＦ−ＩＬ６  ａｎｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８．ＰＮＡＳ  ９０：１０１９３−１０１９７，１９９９．
４９．ＭｃＧｅａｃｈｙ  ＭＪ  ａｎｄ  Ｃｕａ  ＤＪ．Ｔｈ１７  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ  Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｎｄｉｎｇ  Ｒｏａｄ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８：４４５−４５３，２００８．
５０．ＭｃＧｕｉｒｋ  Ｐ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｓ  ＫＨＧ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｖｏｋｅ  ａ  ｓｈｉｆｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：４５０−４５５，２００２．
５１．ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ＳＬ．ＭｃＢｉｎｄａｌｌ−ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｎａｍｅ  ｆｏｒ  ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ？  Ｃｅｌｌ  １０７：２５９−２６１，２００１．
５２．Ｍｅｎｅｇｈｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｂｏａｍ  ＣＭ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７：５３０−５３８，２００７．
５３．Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，Ｐｅｔｅｒ，Ｉａｃｏｍｉｎｉ，Ｊｏｈｎ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒａｎｄａｌｌ  Ｓ．，Ｈｅｒｒｕｐ，Ｋａｒｌ，Ｔｏｎｅｇａｗａ，Ｓｕｓｕｍｕ，ａｎｄ  Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｅ．ＲＡＧ−１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｈａｖｅ  ｎｏ  ｍａｔｕｒｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  ６８，８６９−７７．１９９２．
５４．Ｍｏｏｒｅ  ＢＢ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｂｏａｍ  ＣＭ．Ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９４：Ｌ１５２−Ｌ１６０，２００８．
５５．Ｍｕｌｌｅｎ  ＡＣ，Ｈｉｇｈ  ＦＡ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ＡＳ，Ｌｅｅ  ＨＷ，Ｖｉｌｌａｒｉｎｏ  ＡＶ，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ  ＤＭ，Ｋｕｎｇ  ＡＬ，Ｃｅｒｅｂ  Ｎ，Ｙａｏ  ＴＰ，Ｙａｎｇ  ＳＹ  ａｎｄ  Ｒｅｉｎｅｒ  ＳＬ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔ−ｂｅｔ  ｉｎ  Ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＴＨ１  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｅｆｏｒｅ  ＩＬ−１２−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１９０７−１９１０，２００１．
５６．Ｍｕｒｒａｙ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ  ＴＡ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：７２３−７３７，２０１１．
５７．Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｔ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｓ，Ｓａｓａｇａｗａ  Ｔ，Ｓａｓａｋｉ  Ｋ，Ｎａｒｕｔｏ  Ｍ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ  Ｓ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−２３５  ｂｙ  ａ  ｒａｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＮＦ−ＩＬ６．Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ  ９０：２２０７−２２１１，１９９３．
５８．Ｎｇｕｙｅｎ  ＴＬ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＲＳＫ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ８：７１０−７１６，２００８．
５９．Ｏｌｓｏｎ  ＡＬ，Ｓｗｉｇｒｉｓ  ＪＪ，Ｌｅｚｏｔｔｅ  ＤＣ，Ｎｏｒｒｉｓ  ＪＭ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＧ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ  ＫＫ．Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  １９９２  ｔｏ  ２００３．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７６：２７７−２８４，２００７．
６０．Ｏｒｅｎｓ  ＪＢ，Ｅｓｔｅｎｎｅ  Ｍ，Ａｒｃａｓｏｙ  Ｓ，Ｃｏｎｔｅ  ＪＶ，Ｃｏｒｒｉｓ  Ｐ，Ｅｇａｎ  ＪＪ，Ｅｇａｎ  Ｔ，Ｋｅｓｈａｖｊｅｅ  Ｓ，Ｋｎｏｏｐ  Ｃ，Ｋｏｔｌｏｆｆ  Ｒ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＦＪ，Ｎａｔｈａｎ  Ｓ，Ｐａｌｍｅｒ  Ｓ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ａ，Ｓｉｎｇｅｒ  Ｌ，Ｓｎｅｌｌ  Ｇ，Ｓｔｕｄｅｒ  Ｓ，Ｖａｃｈｉａｒｙ  ＪＬ，Ｇｉａｎｖｉｌｌｅ  ＡＲ．Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２５：７４５−７５５，２００６．
６１．Ｐａｌｏｍｂｅｌｌａ  ＶＪ，Ｒａｎｄｏ  ＯＪ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＡＬ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．Ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮＦ−ｋＢ１  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋＢ．Ｃｅｌｌ  ７８：７７３−７８５，１９９４．
６２．Ｐａｎｔｅｌｉｄｉｓ  Ｐ，Ｆａｎｎｉｎｇ  ＧＣ，Ｗｅｌｌｓ  ＡＵ，Ｗｅｌｓｈ  ＫＩ  ａｎｄ  ｄｕ  Ｂｏｉｓ  ＲＭ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ，ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ａｌｐｈａ，ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅ  ｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６３：１４３２−１４３６，２００１．
６３．Ｐａｒｄｏ  Ａ，Ｇｉｂｓｏｎ  Ｋ，Ｃｉｓｎｅｒｏｓ  Ｊ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ＴＪ，Ｙａｎｇ  Ｙ，Ｂｅｃｅｒｒｉｌ  Ｃ，Ｙｏｕｓｅｍ  Ｓ，Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｉ，Ｒｕｉｚ  Ｖ，Ｓｅｌｍａｎ  Ｍｓ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ  Ｎ．Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ．ＰｌｏＳ  Ｍｅｄ  ２：ｅ２５１，２００５．
６４．Ｐｅｄｒｏｚａ  Ｍ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＤＪ，Ｋａｒｍｏｕｔｙ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  Ｈ，Ｃｏｏｔｅ  Ｊ，Ｓｈａｗ  Ｓ，Ｃｏｒｒｉｇａｎ  Ｒ，Ｍｏｌｉｎａ  ＪＧ，Ａｌｃｏｒｎ  ＪＬ，Ｇａｌａｓ  Ｄ，Ｇｅｌｉｎａｓ  Ｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ＭＲ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｄｅｎｉｓｏｎｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２２６６７，２０１１．
６５．Ｐｈｉｌｌｉｐｐｓ  ＲＪ，Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＭＪ，Ｈｏｎｇ  Ｋ，Ｌｕｔｚ  ＭＡ，Ｍｕｒｒａｙ  ＬＡ，Ｘｕｅ  ＹＹ，Ｂｅｌｐｅｒｉｏ  ＪＡ，Ｋｅａｎｅ  ＭＰ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｅｔｅｒ  ＲＭ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ  ｔｒａｆｆｉｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＣＸＣＬ  １２  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１４：４３８−４４６，２００４．
６６．Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ  Ｂ，Ｔａｎｇ  Ｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙ  Ｓ．Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ＴＨ２  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１：６４７−６５５，２０１０．
６７．Ｒａｇｈｕ  Ｇ，Ｗｅｙｃｋｅｒ  Ｄ，Ｅｄｅｌｓｂｅｒｇ  Ｊ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＷＺ  ａｎｄ  Ｏｓｔｅｒ  Ｇ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７４：８１０−８１６，２００６．
６８．Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙ  Ｓ，Ｄｏｎｏｈｕｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｂｕｃｋ  Ｍ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｊｕｎ−Ｄ  ａｎｄ  ｍｙｏｇｅｎｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｃｈｅｘｉａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２９７：ｅ３９２−４０１，２００９．
６９．Ｒｏｓａｔｉ  Ｍ，Ｖａｌｅｎｔｉｎ  Ａ，Ｐａｔｅｎａｕｄｅ  ＤＪ  ａｎｄ  Ｐａｖｌａｋｉｓ  ＧＮ．ＣＣＡＴ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅｔａ（Ｃ／ＥＢＰ  ｂｅｔａ）  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＣＣＲ５  ｐｒｏｍｏｔｏｒ：ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｃ／ＥＢＰ  ｂｅｔａ  ａｎｄ  ＣＣＲ５  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：１６５４−１６６２，２００１．
７０．Ｒｕｄｄｙ  ＭＪ，Ｗｏｎｇ  ＧＣ，Ｌｉｕ  ＸＫ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｈ，Ｋａｓａｙａｍａ  Ｓ，Ｋｉｒｋｗｏｏｄ  ＫＬ  ａｎｄ  Ｇａｆｆｅｎ  ＳＬ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−ｉｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７９：２５５９−２５６７，２００４．
７１．Ｒｕｆｆｅｌｌ  Ｄ，Ｍｏｕｒｋｉｏｔｉ  Ｆ，Ｇａｍｂａｒｄｅｌｌａ  Ａ，Ｋｉｒｓｔｅｔｔｅｒ．Ｐ，Ｌｏｐｅｚ  ＲＧ，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  Ｎ  ａｎｄ  Ｎｅｒｌｏｖ  Ｃ．Ａ  ＣＲＥＢ−Ｃ／ＥＢＰｂｅｔａ  ｃａｓｃａｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｍ２  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｒｅｐａｉｒ．ＰＮＡＳ  １０６：１７４７５−１７４８０，２００９．
７２．Ｓａｔｏ  ＡＫ，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ  Ｍ，Ｋｅｎｔ  ＲＢ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ  ＣＲ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：６３８−６４２，２００６．
７３．Ｓｃｈｒｅｃｋ  Ｒ，Ｒｉｅｂｅｒ  Ｐ  ａｎｄ  Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｓ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｗｉｄｅｌｙ  ｕｓｅｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＦ−ｋＢ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１．ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：２２４７−２２５８，１９９１．
７４．Ｓｃｈｒｉｅｒ  ＤＪ，Ｐｈａｎ  ＳＨ  ａｎｄ  ＭｃＧａｒｒｙ  ＢＭ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｄｅ（ｎｕ／ｎｕ）  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｖ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １２７：６１４−６１７，１９８３．
７５．Ｓｃｈｗａｂｅ  ＲＦ  ａｎｄ  Ｓａｋｕｒａｉ  Ｈ．ＩＫＫ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ  ｐ６５  ａｔ  Ｓ４６８  ｉｎ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ２．ＦＡＳＥＢ  Ｊ１９：１７５８−１７６０，２００５．
７６．Ｓｃｒｅｐａｎｔｉ  Ｉ，Ｍｕｓｉａｎｉ  Ｐ，Ｂｅｌｌａｖｉａ  Ｄ，Ｃａｐｐｅｌｌｅｔｔｉ  Ｍ，Ａｉｅｌｌｏ  ＦＢ，Ｍａｒｏｄｅｒ  Ｍ，Ｆｒａｔｉ  Ｌ，Ｍｏｄｅｓｔｉ  Ａ，Ｇｕｌｉｎｏ  Ａ  ａｎｄ  Ｐｏｌｉ  Ｖ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＬ−６  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ  Ｃａｓｔｌｅｍａｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｃ／ＥＢＰ［３−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８４：１５６１−１５６６，１９９６．
７７．Ｓｅｌｍａｎ  Ｍ，Ｋｉｎｇ  ＴＥ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｏ  Ａ．Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ  ａｂｏｕｔ  ｉｔｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １３４：１３６−１５１，２００１．
７８．Ｓｈｅｎ  Ｆ，Ｌｉ  Ｎ，Ｇａｄｅ  Ｐ，Ｋａｌｖａｋｏｌａｎｕ  ＤＶ，Ｗｅｉｂｌｅｙ  Ｔ，Ｄｏｂｌｅ  Ｂ，Ｗｏｏｄｇｅｔｔ  ＪＲ，Ｗｏｏｄ  ＴＤ  ａｎｄ  Ｇａｆｆｅｎ  ＳＬ．ＩＬ−１７  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｃ／ＥＢＰｂｅｔａ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ２  ｄｏｍａｉｎ．Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ２：ｒａ８，２００９．
７９．Ｓｍｉｔｈ  ＪＡ，Ｐｏｔｅｅｔ−Ｓｍｉｔｈ  Ｃ，Ｘｕ  Ｙ，Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＴＭ，Ｈｅｃｈｔ  ＳＭ  ａｎｄ  Ｌａｎｎｉｇａｎ  ＤＡ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐ９０  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ（ＲＳＫ）  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＲＳＫ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：１０２７−１０３４，２００５．
８０．Ｓｏｌｔ  ＬＡ，Ｋｕｍａｒ  Ｎ，Ｎｕｈａｎｔ  Ｐ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｌａｕｅｒ  ＪＬ，Ｌｉｕ  Ｊ，Ｉｓｔｒａｔｅ  ＭＡ，Ｋａｍｅｎｅｃｋａ  ＴＭ，Ｒｏｕｓｈ  ＷＲ，Ｖｉｄｏｖｉｃ  Ｄ，Ｓｃｈｕｒｅｒ  ＳＣ，Ｘｕ  Ｊ，Ｗａｇｏｎｅｒ  Ｇ，Ｄｒｅｗ  ＰＤ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＰＲ  ａｎｄ  Ｂｕｒｒｉｓ  ＴＰ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＨ１７  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＲＯＲ  ｌｉｇａｎｄ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７２：４９１−４９４，２０１１．
８１．Ｓｐｉｅｒｉｎｇｓ  Ｄ，ＭｃＳｔａｙ  Ｇ，Ｓａｌｅｈ  Ｍ，Ｂｅｎｄｅｒ  Ｃ，Ｃｈｉｐｕｋ  Ｊ，Ｍａｕｒｅｒ  Ｕ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄ．Ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｄｅａｔｈ：ｔｈｅ（ｕｎｅｘｐｕｒｇａｔｅｄ）  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６６−６７，２００５．
８２．Ｓｔｅｉｎ  Ｂ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ  Ａ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｇｅｎｅ  ｉｎｖｏｌｖｅ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｃ／ＥＢＰ  ａｎｄ  ＮＦ−ｋＢ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３：７１９１−７１９８，１９９３．
８３．Ｓｔｅｉｎ  Ｂ，Ｃｏｇｓｗｅｌｌ  Ｐ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ  Ａ，Ｊｒ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＮＦ−ｋＢ  ａｎｄ  Ｃ／ＥＢＰ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ：Ｒｅｌ  ｄｏｍａｉｎ−ｂＺＩＰ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３：３９６４−３９７４，１９９３．
８４．Ｓｚａｂｏ  ＳＪ，Ｋｉｍ  ＳＴ，Ｃｏｓｔａ  ＧＬ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ｆａｔｈｍａｎ  ＣＧ  ａｎｄ  Ｇｌｉｍｃｈｅｒ  ＬＨ．Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ，Ｔ−ｂｅｔ，Ｄｉｒｅｃｔｓ  Ｔｈ１  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  １００：６５５−６６９，２０００．
８５．Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｆ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ，Ｓａｓａｋｉ  Ｓ，Ｉｓｈｉｉ  Ｎ，Ｋｌｉｎｍａｎ  ＤＭ  ａｎｄ  Ｉｓｈｉｉ  ＫＪ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＴＬＲ９  Ｇｅｎｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：２５５２−２５６１，２００４．
８６．Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ  Ｃ，Ｃａｅｌｌｅｓ  Ｃ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｅｒ  Ｐ，Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ，Ｋａｒｉｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＦ−ＩＬ６／ＬＡＰ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５４４−５４７，１９９３．
８７．Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ  Ｃ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｅｒ  Ｐ，Ｋａｒｉｎ  Ｍ，Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ  ａｎｄ  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ａｎｄ  Ｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＬＡＰ（ＮＦ−ＩＬ６）  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ＤＮＡ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９３：２５５４−２５６１，１９９４．
８８．Ｔｒｕｊｉｌｌｏ  Ｇ，Ｍｅｎｅｇｈｉｎ  Ａ，Ｆｌａｈｅｒｔｙ  ＫＲ，Ｓｈｏｌｌ  ＬＭ，Ｍｙｅｒｓ  ＪＬ，Ｋａｚｅｒｏｏｎｉ  ＥＡ，Ｇｒｏｓｓ  ＢＨ，Ｏａｋ  ＳＲ，Ｃｏｅｌｈｏ  ＡＬ，Ｅｖａｎｏｆｆ  Ｈ，Ｄａｙ  Ｅ，Ｔｏｅｗｓ  ＧＢ，Ｊｏｓｈｉ  ＡＤ，Ｓｃｈａｌｌｅｒ  ＭＡ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｂ，Ｊａｒａｉ  Ｇ，Ｗｅｓｔｗｉｃｋ  Ｊ，Ｋｕｎｋｅｌ  ＳＬ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＦＪ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｂｏａｍ  ＣＭ．ＴＬＲ９  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｓ  Ｒａｐｉｄｌｙ  ｆｒｏｍ  Ｓｌｏｗｌｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：５７ｒａ８２，２０１０．
８９．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ＦＭ  ａｎｄ  Ｐａｓｕｔ  Ｇ．ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １０：１４５１−１４５８，２００５．
９０．Ｗｅｇｎｅｒ  Ｍ，Ｃａｏ  Ｚ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ＭＧ．Ｃａｌｃｉｕｍ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｏｆ  Ｃ／ＥＢＰ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：３７０−３７３，１９９２．
９１．Ｗｉｌｓｏｎ  ＭＳ，Ｅｌｎｅｋａｖｅ  Ｅ，Ｍｅｎｔｉｎｋ−Ｋａｎｅ  ＭＭ，Ｈｏｄｇｅｓ  ＭＧ，Ｐｅｓｃｅ  ＪＴ，Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ  ＴＲ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＲＷ，Ｋａｍａｎａｋａ  Ｍ，Ｆｌａｖｅｌｌ  ＲＡ，Ｋｅａｎｅ−Ｍｙｅｒｓ  Ａ，Ｃｈｅｅｖｅｒ  ＡＷ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ  ＴＡ．ＩＬ−１３Ｒａ２  ａｎｄ  ＩＬ−１０  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ａｉｒｗａｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｉｒｗａｙ−ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１７：２９４１−２９５１，２００７．
９２．Ｗｉｌｓｏｎ  ＭＳ，Ｍａｄａｌａ  ＳＫ，Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ  ＴＲ，Ｇｏｃｈｕｉｃｏ  ＢＲ，Ｒｏｓａｓ  ＩＯ，Ｃｈｅｅｖｅｒ  ＡＷ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ  ＴＡ．Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ａｎｄ  ＩＬ−１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｓ  ＩＬ−１７Ａ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０７：５３５−５５２，２０１０．
９３．Ｙａｎｇ  ＤＤ，Ｃｏｎｚｅ  Ｄ，Ｗｈｉｔｍａｒｓｈ  ＡＪ，Ｂａｒｒｅｔｔ  Ｔ，Ｄａｖｉｓ  ＲＪ，Ｒｉｎｃｔ｜ｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ  ＲＡ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｔｈ１  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  ＪＮＫ２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：５７５−５８５，１９９８．
９４．Ｚｈａｎｇ  Ｋ，Ｇｈａｒａｅｅ−Ｋｅｒｍａｎｉ  Ｍ，ＭｃＧａｒｒｙ  Ｂ，Ｒｅｍｉｃｋ  Ｄ  ａｎｄ  Ｐｈａｎ  ＳＨ．ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｕｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５８：９５４−９５９，１９９７．
９５．Ｚｈｅｎｇ  Ｗ−Ｐ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ  ＲＡ．Ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＧＡＴＡ−３  Ｉｓ  Ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ａｎｄ  Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＣＤ４  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ．
【０２１６】
マクロファージインフラマソーム活性化および肝損傷に関する参考文献
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２．Ｃｈｕｎｇ，Ｒ．＆  Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１７５４−１７６７（２００５）．
３．Ｃｈｏｊｋｉｅｒ，Ｍ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｌｉｅｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ．Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ：Ｌｏｎｄｏｎ，４３０−４５０（１９９８）．
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５．Ｄｕｆｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ，ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５，５６−６５（２００５）．
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７．Ｏｕｙａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ａ２Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＨＩＦ−ｌａ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．４，１−１８（２０１３）．
８．Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ  Ｃａｓｐａｓｅ−１−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｆａｓ／Ｆａｓ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＩＬ−１８  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｃａｕｓｅｓ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，３５９−３６７（１９９９）．
９．Ｄｉｅｈｌ，Ａ．Ｍ．Ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗａｔｃｈ  ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８．，４９７−４９９（２０１２）．
１０．Ｍａｒｔｉｎｏｎ，Ｆ．，Ｂｕｒｎｓ，Ｋ．＆  Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃａｓｐａｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏＩＬ−ｂｅｔａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １０，４１７−４２６（２００２）．
１１．Ｆｒａｎｃｈｉ，Ｌ．，Ｅｉｇｅｎｂｒｏｄ，Ｔ．，Ｍｕｎｏｚ−Ｐｌａｎｉｌｌｏ，Ｒ．＆  Ｎｕｎｅｚ，Ｇ．Ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ：ａ  ｃａｓｐａｓｅ−１−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，２４１−２４７（２００９）．
１２．Ｄｅｓｃｏｍｂｅｓ，Ｐ．，Ｃｈｏｊｋｉｅｒ，Ｍ．，Ｌｉｃｈｔｓｔｅｉｎｅｒ，Ｓ．，Ｆａｌｖｅｙ，Ｅ．＆  Ｓｃｈｉｂｌｅｒ，Ｕ．ＬＡＰ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ／ＥＢＰ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ，ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｌｉｖｅｒ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ４，１５４１−１５５１（１９９０）．
１３．Ａｋｉｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ＩＬ−６  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＮＦ−ＩＬ６）  ｉｓ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  Ｃ／ＥＢＰ  ｆａｍｉｌｙ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ９，１８９７−１９０６（１９９０）．
１４．Ｐｏｌｉ，Ｖ．，Ｍａｎｃｉｎｉ，Ｆ．Ｐ．＆  Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．ＩＬ６−ＤＢＰ，ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｎｅｗ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｃ／ＥＢＰ．Ｃｅｌｌ  ６３，６４３−６５３（１９９０）．
１５．Ｉｗａｍａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）  ａｎｄ  ＰＵ．１  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５，５４７−５５８（２００２）．
１６．Ｓｅｂａｓｔｉａｎ，Ｔ．＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔｏｐ  ａｎｄ  ｇｏ：ａｎｔｉ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ／ＥＢＰｂ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ５，９５３−９５７（２００６）．
１７．Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａ．Ｄ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６，６８１６−６８２８（２００７）．
１８．Ｂｕｃｋ，Ｍ．，Ｐｏｌｉ，Ｖ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｅｒ，Ｐ．，Ｃｈｏｊｋｉｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｓｅｒｉｎｅ  １０５  ｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ２１７  ｉｎ  Ｃ／ＥＢＰ  ｂｅｔａ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＴＧＦ  ａｌｐｈａ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４，１０８７−１０９２（１９９９）．
１９．Ｂｕｃｋ  Ｍ，Ｃ．Ｍ．Ｃ／ＥＢＰβ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃａｓｐａｓｅ  ８  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｓｔｅｌｌａｔｅ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ４１，Ｓ２９５−Ｓ２９９（２００１）．
２０．Ｂｕｃｋ，Ｍ．＆  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ，Ｍ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ：Ｃ／ＥＢＰｂ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７，７３１−７３８（２００３）．
２１．Ｂｕｃｋ，Ｍ．＆  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ，Ｍ．Ａ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ−６  ｋｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  Ｃ／ＥＢＰ−ｂｅｔａ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２，ｅ１３７２（２００７）．
２２．Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＦ−ＩＬ６／ＬＡＰ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６４，５４４−５４７（１９９３）．
２３．Ｂｕｃｋ，Ｍ．＆  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ，Ｍ．Ｃ／ＥＢＰ（ｂｅｔａ）  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｄｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｈｒａｘ  ｌｅｔｈａｌ  ｔｏｘｉｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９３，Ｃ１７８８−Ｃ１７９６（２００７）．
２４．Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｓ．，Ｄｏｎｏｈｕｅ，Ｍ．＆  Ｂｕｃｋ，Ｍ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｊｕｎ−Ｄ  ａｎｄ  ｍｙｏｇｅｎｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｃｈｅｘｉａ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９７，Ｅ３９２−４０１（２００９）．
２５．Ｃｈｏｊｋｉｅｒ，Ｍ．Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ：ｉｎ  ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ａｎｓｗｅｒｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４１，２３７−２４６（２００５）．
２６．Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｔｈａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−Ｆａｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６４，８０６−８０９（１９９３）．
２７．Ｂｕｃｋ，Ｍ．，Ｐｏｌｉ，Ｖ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．＆  Ｃｈｏｊｋｉｅｒ，Ｍ．Ｃ／ＥＢＰｂｅｔａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＳＫ  ｃｒｅａｔｅｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＸＥＸＤ  ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｂｏｘ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ８，８０７−８１６（２００１）．
２８．Ｍａｌｈｉ，Ｈ．＆  Ｇｏｒｅｓ，Ｇ．Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３４，１６４１−１６５４（２００８）．
２９．Ｃｉｅｓｌｉｋ，Ｋ．，Ｚｈｕ，Ｙ．＆  Ｗｕ，Ｋ．Ｋ．Ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ−２  ａｎｄ  Ｃｙｃｌｏ−ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｅｔａ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｖｉａ  ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７，４９３０４−４９３１０（２００２）．
３０．Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｈａｎｇ，Ｓ．，Ｍｉｌｌａｒｄ，Ｍ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ−Ａｇｕｓ，Ｎ．＆  Ｄｅｐｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，１２５３−１２５８（２０００）．
３１．Ｊｕｌｉｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＢ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８，７４２−７５５（２００５）．
３２．Ｗａｌｓｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｍｕｒｕｖｅ，Ｄ．Ａ．＆  Ｐｏｗｅｒ，Ｃ．Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＮＳ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５，８４−９７（２０１４）．
３３．Ｍａｒｔｉｎｏｎ，Ｆ．，Ｍａｙｏｒ，Ａ．＆  Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｓ：Ｇｕａｒｄｉａｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｄｙ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７，２２９−２６５（２００９）．
３４．Ｔａｂｕｅｎｃａ，Ｊ．Ｍ．Ｔｏｘｉｃ−ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｐｅｓｅｅｄ  ｏｉｌ  ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｉｌｉｎｅ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３１８，５６７−５６８（１９８１）．
３５．Ｓｏｌｉｓ−Ｈｅｒｒｕｚｏ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ  ｃｏｏｋｉｎｇ  ｏｉｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４，１３１−１３９（１９８４）．
３６．Ｄａｄｌｅｙ−Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，８８−８９（２００６）．
３７．Ｌａｍｋａｎｆｉ，Ｍ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１，２１３−２２０（２０１１）．
３８．Ｒｙｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｆａｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｆｕｌｍｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ９５，２０４７−２０５５（２０００）．
３９．Ｔａｉｅｂ，Ｊ．，Ｍａｔｈｕｒｉｎ，Ｐ．，Ｐｏｙｎａｒｄ，Ｔ．，Ｇｏｕｇｅｒｏｔ−Ｐｏｃｉｄａｌｏ，Ｍ．Ａ．＆  Ｃｈｏｌｌｅｔ−Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｒａｉｓｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｆａｓ  ａｎｄ  Ｆａｓ−ｌｉｇａｎｄ  ｉｎ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ  ３５１，１９３０−１９３１（１９９８）．
４０．Ｃｓｏｋａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ａ２Ａ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃ／ＥＢＰｂｅｔａ  ａｒｅ  ｃｒｕｃｉａｌｌｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ＩＬ−１０  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｂｌｏｏｄ  １１０，２６８５−２６９５（２００７）．
４１．Ｍｅｈａｌ，Ｗ．Ｚ．Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３２，５０７−５１５（２０１４）．
４２．Ｍｕｒｒａｙ，Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４１，１４−２０（２０１４）．
４３．Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＤＡ，Ａｌｃｏｒｎ  ＪＭ，Ｆｅｉｔｅｌｂｅｒｇ  ＳＰ，Ｌｅｆｆｅｒｔ  ＨＬ，Ｃｈｏｊｋｉｅｒ  Ｍ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．７，１０５−１５（１９９０）．
【０２１７】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によってその範囲を限定されるものではない。実際、当業者には上記の説明から、本明細書に記載されるものに加えて様々な修正形態が明らかになるであろう。このような修正形態は、添付の「特許請求の範囲」の範囲内に含まれるものとする。
【０２１８】
本明細書に引用される特許、特許出願、刊行物、試験方法、文献をはじめとする資料は、本明細書に物理的に記載されている場合と同様に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2018520999.tif 000013
【図２Ａ】
2018520999.tif 000014
【図２Ｂ】
2018520999.tif 000015
【図３】
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【図４】
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【図５】
2018520999.tif 000018
【図６】
2018520999.tif 000019
【図７Ａ】
2018520999.tif 000020
【図７Ｂ】
2018520999.tif 000021
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018520999.tif 000024
【図１１】
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【図１２】
2018520999.tif 000026
【図１３Ａ】
2018520999.tif 000027
【図１３Ｂ】
2018520999.tif 000028
【図１３Ｃ】
2018520999.tif 000029
【図１３Ｄ】
2018520999.tif 000030
【図１４Ａ】
2018520999.tif 000031
【図１４Ｂ】
2018520999.tif 000032
【図１５Ａ】
2018520999.tif 000033
【図１５Ｂ】
2018520999.tif 000034
【図１５Ｃ】
2018520999.tif 000035
【図１５Ｄ】
2018520999.tif 000036
【図１５Ｅ】
2018520999.tif 000037
【図１６Ａ−Ｃ】
2018520999.tif 000038
【図１６Ｄ−Ｆ】
2018520999.tif 000039
【図１７Ａ】
2018520999.tif 000040
【図１７Ｂ】
2018520999.tif 000041
【図１８Ａ】
2018520999.tif 000042
【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2018520999.tif 000045
【図１９Ｃ】
2018520999.tif 000046
【図２０Ａ−Ｃ】
2018520999.tif 000047
【図２０Ｄ−Ｆ】
2018520999.tif 000048
【図２０Ｇ−Ｊ】
2018520999.tif 000049
【図２１】
2018520999.tif 000050
【図２２】
2018520999.tif 000051
【図２３Ａ】
2018520999.tif 000052
【図２３Ｂ】
2018520999.tif 000053
【図２４】
2018520999.tif 000054
【図２５Ａ】
2018520999.tif 000055
【図２５Ｂ】
2018520999.tif 000056
【図２６】
2018520999.tif 000057
【図２７】
2018520999.tif 000058
【図２８】
2018520999.tif 000059
【配列表】
2018520999000001.app
【国際調査報告】
2018520999.tif 000060
2018520999.tif 000061
2018520999.tif 000062
2018520999.tif 000063