(57)【要約】  本発明は、概して、インフルエンザウイルスによる感染症にかかりやすい個体の予防処置のために、抗Ｍ１ポリペプチド抗体の生成のためのワクチンおよび／または抗原として利用することができるＭ１ポリペプチドを対象とする。本発明の抗Ｍ１ポリペプチド抗体は、インフルエンザウイルスに感染した個体の治療に有用であるか、またはインフルエンザウイルスによる感染症にかかりやすい個体の予防処置に、もしくは有効な抗体応答を生成することができない免疫抑制された個体に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜８０のうちの１つを含むＭ１ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号２〜５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９〜５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９〜７１、７３、および７５のうちの１つを含む、請求項１に記載のＭ１ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号２〜５のうちの１つを含む、請求項１に記載のＭ１ポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号３を含む、請求項１に記載のＭ１ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１〜８０のうちの１つに対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、Ｍ１ポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号２〜５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９〜５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９〜７１、７３、および７５のうちの１つに対して、７０％で配列同一性を有する、請求項５に記載のＭ１ポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜８０のうちの１つに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項６に記載のＭ１ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜８０のうちの１つに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６に記載のＭ１ポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜８０のうちの１つに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６に記載のＭ１ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１〜８０からなる群から選択されるポリペプチドをコード化する核酸、または配列番号１〜８０のうちの１つをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸を含むポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、配列番号２〜５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９〜５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９〜７１、７３、および７５からなる群から選択されるか、または配列番号２〜５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９〜５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９〜７１、７３、および７５のうちの１つをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記核酸が、配列番号２〜５からなる群から選択されるポリペプチドをコード化するか、または配列番号２〜５のうちの１つをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記核酸が、配列番号３からのポリペプチドをコード化するか、または配列番号３をコード化する前記核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドを含むインフルエンザワクチンであって、前記ポリペプチドが、請求項６に記載のＭ１ポリペプチドを含む、インフルエンザワクチン。
【請求項１６】
ポリペプチドを含むインフルエンザワクチンであって、前記ポリペプチドが、請求項１４に記載のＭ１ポリペプチドを含む、インフルエンザワクチン。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、担体に複合化されている、請求項２に記載のＭ１ポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、担体に複合化されている、請求項６に記載のＭ１ポリペプチド。
【請求項１９】
動物においてＭ１Ａ型インフルエンザウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１７に記載のＭ１ポリペプチドを含むワクチン製剤の有効量を前記動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２０】
動物においてＭ１Ａ型インフルエンザウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１８に記載のＭ１ポリペプチドを含むワクチン製剤の有効量を前記動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２１】
インフルエンザウイルス感染症に対して動物にワクチン接種を施す方法であって、請求項１７に記載のワクチンの有効量を前記動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２２】
インフルエンザウイルス感染症に対して動物にワクチン接種を施す方法であって、請求項１８に記載のワクチンの有効量を前記動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
動物の治療方法であって、抗体を動物に投与するステップを含み、前記抗体が、請求項６に記載のＭ１ポリペプチドに特異的に結合する、方法。
【請求項２４】
動物の治療方法であって、抗体を動物に投与するステップを含み、前記抗体が、請求項１４に記載のＭ１ポリペプチドに特異的に結合する、方法。
【請求項２５】
前記抗体が、複数のインフルエンザＡ型株において見出されるＭ１タンパク質に結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が、複数のインフルエンザＡ型株において見出されるＭ１タンパク質に結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ヒトが、インフルエンザウイルスに感染している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
ヒトが、インフルエンザウイルスに感染している、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍ１ポリペプチド、Ｍ１ポリペプチドを含有するワクチン、Ｍ１ポリペプチドに結合する抗体、および抗体を用いるインフルエンザ療法に関する。本発明の抗体およびポリペプチドは、診断でも使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、呼吸性飛沫感染様式を通して感染拡大する、インフルエンザウイルスによって引き起こされる急性の伝染性呼吸器疾患である。合併症のないインフルエンザは、通常、１週間以内に解消する全身および呼吸器症状の突発を特徴とする。ある特定の人では、インフルエンザは、既存の医学的状態を悪化させ、生命を脅かす合併症につながる可能性がある。インフルエンザウイルスは、ヒト、イヌ、鳥類、コウモリ、および家畜に感染する世界中に最も遍在するウイルスのうちの１つである。インフルエンザは、高齢者および乳幼児に重大な影響を及ぼす。インフルエンザは、経済的負担、罹患、および死亡をもたらし、これらは重大なことである。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属する、分節型ゲノムを有するエンベロープのあるネガティブセンスＲＮＡウイルスである。これらは、そのコアタンパク質に基づいて３つの違った型：Ａ、Ｂ、およびＣに分類される（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｘ  Ｎ  Ｊ，Ｆｕｋｕｄａ  Ｋ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．１９９８：１２：２７−３８）。インフルエンザＡウイルスは哺乳動物および鳥類の範囲にわたって感染することができ、一方Ｂ型（ヒトおよびアザラシ類の宿主範囲）およびＣ型は、本質的にヒトに限定されている。インフルエンザＡおよびＢウイルスは、Ａ型が最も病原性が強い状態で、ヒトの疾患の主な原因である。インフルエンザＡおよびＢウイルスの主な抗原決定基は、２つの表面糖タンパク質：ノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）であり、これら両方共に、人間の免疫応答を引き起こすことができる。ＨＡは、受容体結合および膜融合に関与している。ＮＡは、感染細胞からの子孫ウイルスの解裂を容易にし、ウイルスの凝集を防止し、かつ粘膜気道上皮を通しての移動を補助する。
【０００４】
インフルエンザウイルスの３つの型（Ａ、Ｂ、およびＣ型）が現在知られており、Ａ型ウイルスは、動物およびヒトの病態の原因となるが、一方Ｂ型およびＣ型ウイルスは、本質的にヒトにとって病原性である。Ａ型ウイルスは、ウイルスエンベロープの主要な糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原構造に従ってサブタイプに細分される。ＨＡの１８個のサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１８）およびＮＡの９個のサブタイプ（Ｎ１〜Ｎ１１）が際立っている。したがって、Ａ型ウイルスのサブタイプは、ウイルスエンベロープ中に存在するＨＡサブタイプおよびＮＡサブタイプによって定義される。野鳥およびコウモリは、全てのインフルエンザＡサブタイプの保有宿主を構成する。インフルエンザウイルスＡ型のある特定のサブタイプは、飼い鳥（Ｈ５Ｎ１およびＨ９Ｎ２を含む様々なサブタイプ）、ウマ（主としてＨ３Ｎ８）、ブタ（主として、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＨ１Ｎ２）ならびにヒト（主として、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）にも風土性感染または流行性（毎年の流行）感染する。イヌ、ネコ、および他の野生種も、時には、ある特定のサブタイプ（イヌではＨ３Ｎ８およびＨ５Ｎ１、ネコではＨ５Ｎ１）に感染することがある。
【０００５】
パンデミック間期（ｉｎｔｅｒｐａｎｄｅｍｉｃ）インフルエンザワクチンは、受精鶏卵中で増殖されたウイルスから調製されており、不活性化、または弱毒化生ワクチンのいずれかである。不活性化インフルエンザワクチンは、抗原性調製物の３つの可能な形態：不活性化全ウイルス、脂質エンベロープを可溶化するために精製されたウイルス粒子が洗剤または他の試薬で破壊されているサブ−ビリオン（いわゆる「スプリット」ワクチン）または精製ＨＡおよびＮＡ（サブユニットワクチン）から構成される。これらの不活性化ワクチンは、現在、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、または鼻孔内（ｉ．ｎ．）で供与される。世界保健機構（ＷＨＯ）の推奨によれば、季節性インフルエンザワクチンは、通常、ヒトの間で流行を繰り返している株からの４５μｇのＨＡ抗原を含有する（一元放射免疫拡散法（ＳＲＤ）により測定、（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ：ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５（１９７７）２３７−２４７；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９（１９８１）３１７−３３０）、これらの両方は、その全体が参照により組み込まれる）。これらは、一般に、２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ株（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ）に由来する抗原を含有する。大部分の場合の標準的な０．５ｍｌの注射可能な用量は、各株からの（少なくとも）１５μｇのヘマグルチニン抗原成分を含有する。ワクチン接種は、毎年のインフルエンザ流行の制御において重要な役割を果たす。さらに、世界的流行の際には、抗ウイルス薬は、要求をカバーするのに十分または効果的でない場合があり、インフルエンザのリスクに曝されている個体数は、パンデミック間期よりも多いであろう。大量に製造し、効率的に配布し、かつ投与することが可能である、長期にわたって広範囲に防御するワクチンの開発が本発明の目的である。
【０００６】
インフルエンザウイルスは、米国では、毎年数百万人に感染し、２００，０００人を超える入院、および２０，０００人を超える人の死亡につながっている。加えて、致命的なインフルエンザ株は時折発生し（例えば、１９１８年のスペイン風邪）、治療の有効な手段なほとんどない。季節性インフルエンザワクチンは、原因株が、ワクチン処方の時期から変化しない限り、いくらかの防御を提供する。ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの表面発現ウイルスタンパク質における高変異性は、毎年の再処方を要求する。集団は、有効な防御のための毎年の再免疫付与を受けねばならない。この必要性は、製造コストが高く、有用性がワクチンの各ウイルス成分の力価に依存することを意味している。
【０００７】
鶏卵によるよりはむしろ抗原製造の組換え細胞培養法が、今では使用されており、最近になって、２種のワクチン製品が、ＦＤＡにより承認されている。フルセルバックス（Ｆｌｕｃｅｌｖａｘ）は、哺乳動物細胞培養物から作製された組換えウイルス調製物（３種の不活性化ウイルス）である。フルブロック（Ｆｌｕｂｌｏｃ）（登録商標）は、昆虫細胞培養物によって作製された組換えＨＡワクチン（３種の異なるＨＡタンパク質）である。これらの製品は、ワクチン供給の問題を解決しようとしているが、ＨＡ系ワクチンに関連する抗原連続変異（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔ）の問題には対処していない。
【０００８】
本発明の目的は、翌年に効力を維持するであろう新しいインフルエンザワクチンを提供することによって、毎年のインフルエンザワクチン開発のための必要性およびコストを克服することである。本発明の目的はまた、新しいインフルエンザ株に対して防御を提供するであろうインフルエンザワクチンを提供することである。本発明のさらなる目的は、既にインフルエンザに感染した個体を治療するための、または個体の予防処置のためのインフルエンザ療法を提供することである。
【０００９】
本発明の目的はまた、Ｍ１ポリペプチドに結合する抗体もしくは抗体断片を含む組成物を用いて、感染患者におけるインフルエンザ感染症の重症度を低減すること、および／またはインフルエンザに感染した患者の流感症状の持続時間を短縮することである。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、インフルエンザのＭ１タンパク質の一部に相応するポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、Ｍ１タンパク質のＣ末端領域からのＭ１配列を含む。これらのポリペプチドはまた、インフルエンザウイルスの表面上に露出しているＭ１タンパク質の配列を含む。これらの表面露出ポリペプチド配列の少なくとも一部は、中和抗体と相互作用することができ、および／または免疫細胞と相互作用することができる。一実施形態では、インフルエンザウイルス上で表面露出されているＭ１ポリペプチド配列のＣ末端部分は、免疫防御のための標的である。一実施形態では、本ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質のＣ末端部分のアミノ酸残基２１５〜２５２の範囲内にある。一実施形態では、本ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質のアミノ酸残基２１５〜２４１の範囲内にある。別の実施形態では、Ｍ１ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質のアミノ酸残基２２０〜２３８の範囲内にある。一実施形態では、Ｍ１ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質の残基２２０〜２４２、２２０〜２５２、２２３〜２４２、または２２３〜２５２の範囲に及ぶ。一実施形態では、Ｍ１ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質の残基２１５〜２５２の範囲で認められるＭ１ポリペプチドの７〜３７個の連続したアミノ酸を含む。一実施形態では、Ｍ１ポリペプチドは、少なくとも１５〜５０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、Ｍ１ポリペプチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および／または５０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、上記Ｍ１ポリペプチドのいずれかと７０％、８０％、９０％、９５％、および９９％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。
【００１１】
一実施形態では、Ｍ１ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質の残基１３１〜２５２の範囲で認められるＭ１ポリペプチドの７〜１２０個の連続したアミノ酸を含む。一実施形態では、Ｍ１ポリペプチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、および／または１２２個のアミノ酸を含む。一実施形態では、Ｍ１ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質の残基１３１〜２５２の範囲で認められるＭ１ポリペプチドの７〜１２２個のアミノ酸を含む。この実施形態では、ポリペプチド中のアミノ酸の全てが、Ｍ１タンパク質の残基１３１〜２５２のＭ１ポリペプチド範囲内で連続している必要はない。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、１３１〜２５２からの残基の範囲でのＭ１ポリペプチドのいずれかと７０％、８０％、９０％、９５％、および９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、上記のＭ１ポリペプチドをコード化する核酸に関する。一実施形態では、本発明の核酸は、本発明のＭ１ポリペプチドのうちの１つをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸を含む。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、上記Ｍ１ポリペプチドをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコード化されたポリペプチドを含む。一実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１〜７のうちの１つのポリペプチドをコード化するか、または配列番号１〜７のうちの１つをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸である。一実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１〜７のうちの１つと７０％、８０％、９０％、９５％、および９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコード化する。一実施形態では、本発明の核酸は、配列番号８〜８０のうちの１つのポリペプチドをコード化するか、または配列番号８〜８０のうちの１つをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸である。一実施形態では、本発明の核酸は、配列番号８〜８０のうちの１つと７０％、８０％、９０％、９５％、および９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコード化する。
【００１３】
一実施形態では、Ｍ１ポリペプチドは、インフルエンザにかかりやすい生物体において防御的／治療的免疫応答を生じさせるために使用される。一実施形態では、この生物体は、ヒト、イヌ、または商業的に価値のある家畜である。一実施形態では、この生物体はヒトである。一実施形態では、Ｍ１ポリペプチド組成物は、該Ｍ１ポリペプチドに対する、体液性免疫応答、ＣＤ４  Ｔ細胞免疫応答などのＴ細胞免疫応答、およびＢ細胞記憶応答のうちの少なくとも１つを誘導することができる。
【００１４】
本発明はまた、本発明のＭ１ポリペプチドに特異的な抗体に関する。一実施形態では、坑Ｍ１ポリペプチド抗体は、インフルエンザウイルスに感染しているか、または感染している可能性がある生物体におけるインフルエンザの治療および／または予防のために使用される。一実施形態では、この生物体は、ヒト、イヌ、または商業的に価値のある家畜である。一実施形態では、この生物体はヒトである。一実施形態では、坑Ｍ１ポリペプチド抗体または抗体（複数）による生物体の治療は、インフルエンザの症状の重症度を低減および／またはインフルエンザの症状の期間を短縮させる。
【００１５】
一実施形態では、坑Ｍ１ポリペプチド抗体は、インフルエンザによる感染症を予防するために、または将来のインフルエンザによる感染症を改善するために、生物体の治療で使用される。一実施形態では、この生物体は、ヒト、イヌ、または商業的に価値のある家畜である。一実施形態では、この生物体はヒトである。一実施形態では、抗Ｍ１ポリペプチド抗体は、生物体において受動免疫を生成するために予防的に使用される。一実施形態では、抗Ｍ１抗体は、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９、もしくは２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９のエピトープに結合する抗体であるか、または、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９、もしくは２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９のエピトープに結合する抗体のヒューマニア化（ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ）、ヒト化、キメラ化、ないしは別の方法で遺伝子組み換えされた変異体である。
【００１６】
一実施形態では、抗Ｍ１ポリペプチド抗体は、生物体において１〜４週間またはそれより長い半減期を有する。一実施形態では、抗Ｍ１ポリペプチド抗体は、生物体において２週間の半減期を有する。一実施形態では、生物体において抗Ｍ１ポリペプチド抗体から生じた受動免疫は、少なくとも２〜３半減期の間続く。一実施形態では、生物体において抗Ｍ１ポリペプチド抗体から生じた受動免疫は、少なくとも１〜７週間、または２、３、４、５もしくは６ヶ月間続く。
【００１７】
一実施形態では、抗Ｍ１ポリペプチド抗体は、４〜１２週間の半減期を有するように遺伝子操作される。一実施形態では、抗Ｍ１ポリペプチド抗体は、キメラ化、ヒト化、もしくはヒューマニア化（登録商標）抗体、またはヒト抗体である。一実施形態では、抗Ｍ１ポリペプチド抗体は、生物体において半減期を延長させる分子と複合化されている。一実施形態では、抗Ｍ１ポリペプチド抗体は、抗体の半減期を延長させるために、ポリエチレングリコールまたは別の好適なポリマーもしくは分子と複合化されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、モノクローナル抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９によるインフルエンザウイルス株ＰＲ／８のプラーク阻害アッセイを示す。
【図２】図２は、モノクローナル抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９による追加のインフルエンザウイルス株のプラーク阻害アッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、例として例示されており、限定するものではない。
定義
【００２０】
本明細書で使用される場合、「抗体」とは、結合タンパク質として機能的に定義され、かつ免疫グロブリンコーディング遺伝子のフレームワーク領域に由来すると認識されるアミノ酸配列を含むものとして構造的に定義されたタンパク質を指す。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコード化される１つ以上のポリペプチドからなり得る。認識された免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類されている。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類されており、これらは、今度は、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ画定する。
【００２１】
典型的なγ免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成されており、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識を担当する約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を画定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれ指す。
【００２２】
抗体は、完全な免疫グロブリンとして、または多くの十分に特性化された断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド結合下で抗体を消化して、それ自体が本来、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１−ヒンジに結合した軽鎖である、Ｆａｂ’の二量体のＦ（ａｂ）’２を生成する。Ｆ（ａｂ）’２は、適度な条件下で還元され、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を破断し、これによって、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は、ヒンジ領域の一部を有する本質的にＦａｂである（他の抗体断片の詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい）。様々な抗体断片は、完全な抗体の消化の点から定義されるが、当業者であれば、断片が化学的に、または組換えＤＮＡ法を利用することによるいずれかで新規合成され得ることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用される場合、抗体という用語は、全抗体の修飾によって生成されるか、または組換えＤＮＡ方法論を使用して合成されるかのいずれかの抗体断片も含む。好ましい抗体は、可変重鎖領域および可変軽鎖領域が一緒に結合されて（直接的に、またはペプチドリンカーを通して）連続したポリペプチドを形成している単鎖Ｆｖ抗体（ｓＦＶまたはｓｃＦｖ）などの単鎖抗体（１本鎖ポリペプチドとして存在する抗体）を含むＶＨ−ＶＬ二量体を含む。単鎖Ｆｖ抗体は、直接結合されているか、またはペプチドコード化リンカーによって結合されているかのいずれかのＶＨをコード化するおよびＶＬをコード化する配列を含む核酸から発現され得る共有結合されたＶＨ−ＶＬヘテロ二量体である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３，１９８８）。ＶＨおよびＶＬは、１本鎖ポリペプチドとして互いに連結されているが、ＶＨおよびＶＬドメインは非共有的に会合している。あるいは、抗体は別の断片とすることができる。他の断片もまた、組換え技術を用いて生成され得る。例えば、Ｆａｂ分子は、鎖（重鎖または軽鎖）のうちの１つがｇ３キャプシドタンパク質に融合されて、相補鎖が細胞膜周辺に可溶性分子として搬出される場合に、ファージ上で発現され得る。この２つの鎖は、同一の、または異なるレプリコン上でコード化されることができ、各Ｆａｂ分子中の２つの抗体鎖は、翻訳後に会合し、二量体は、ｇ３ｐの鎖のうちの１つへの連結を介してファージ粒子内に組み込まれる（例えば、その全体が参照により本明細に組み込まれる、米国特許第５，７３３，７４３号を参照されたい）。抗体Ｖ領域からの自然には凝集しているが、化学的に分離されている軽鎖および重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造と実質的に同様な三次元構造に折り畳める分子に変換するｓｃＦｖ抗体および多くの他の構造は、当業者には既知である（例えば、それらの全てが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９５６，７７８号を参照されたい）。特に好ましい抗体には、ファージ上で発現されるか、または鎖が可溶性タンパク質、例えばｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２として分泌される、ベクターを用いて組換え技術によって生成された全てのものが含まれる。抗体はまた、ダイアボディまたはミニボディを含むことができる。
【００２３】
本発明の抗体はまた、ラクダ類からの抗体などの重鎖二量体も含む。ラクダ類における重鎖二量体ＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖との疎水性相互作用を行う必要がないために、ラクダ類では、通常は軽鎖と接触する重鎖内の領域が、親水性アミノ酸残基に変更されている。重鎖二量体ＩｇＧのＶＨドメインは、ＶＨＨドメインと呼ばれる。
【００２４】
ラクダ類では、抗体レパートリーの多様性は、ＶＨまたはＶＨＨ領域内の相補的決定領域（ＣＤＲ）１、２、および３によって決定される。ラクダのＶＨＨ領域内のＣＤＲ３は、平均して１６個のアミノ酸のその比較的長い長さによって特徴付けられる（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（９）：１１２９）。これは、多くの他の種の抗体のＣＤＲ３領域とは対照的である。例えば、マウスのＶＨのＣＤＲ３は、平均で９個のアミノ酸を有する。
【００２５】
ラクダ類の可変領域のインビボ多様性を維持しているラクダ類由来の抗体可変領域のライブラリーは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００５年２月１７日に公開された、米国特許出願公開第ＵＳ２００５００３７４２１号で開示された方法によって作製され得る。
【００２６】
抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、抗体の作用の重要な機構である。ＡＤＣＣは、いくつかの方法によって増強させることができ、その多くは、改善されたＦｃ受容体結合を有する最終産物抗体を伴う。抗体Ｆｃ領域中のアミノ酸置換は、ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対するＦｃ結合親和性を増加させて（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００９，ｖｏｌ．３，ｐｐ．７−１６）ＡＤＣＣ活性を改善することが示されている。ＡＤＣＣを改善するための別の方法は、抗体グリコシル化の糖組成を変更することである。これは、フコース残基を欠如する抗体、すなわち、「アフコシル化」または「脱フコキシル化」抗体を作製することによって行われる。１つの方法は、フコースが抗体に付加され得ないように、抗体のグリコシル化部位を変更／修飾することを伴う（特許第６１９４５５１号（２００１年２月２７日））。別の方法は、例えば、酵素的分解、または任意の他の手段によるフコースの除去によって、抗体上に前から存在するフコースを除去することである。別の方法は、例えば、フコシルトランスフェラーゼ活性の抑制または欠失によって、フコースが抗体に転移または付加され得ないための宿主発現系の遺伝子操作を伴う（米国特許出願公開第２００７０１３４７５９号（２００７年６月１４日）および同第２００８０１６６７５６号（２００８年７月１０日）、これらの両方共に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、適切な条件下で、特異的な免疫応答を誘導することができ、また特異的抗体もしくは特異的に感作されたＴリンパ球、またはその両方などによるその応答の生成物と反応することができる物質を指す。抗原は、毒素および異種タンパク質などの可溶性物質、または細菌および組織細胞などの微粒子状物質であってもよいが、抗原決定基（エピトープ）として既知のタンパク質または多糖類分子の一部のみが、抗体またはリンパ球上の特異的受容体と結合する。より広義には、「抗原」という用語は、その物質が免疫原性であろうとなかろうと、抗体が結合するか、または抗体が求められる任意の物質を指すように使用されてもよい。このような抗原の場合には、抗体は、いかなる免疫応答にも無関係に、遺伝子組換え法によって同定され得る。
【００２８】
本明細書で使用される場合、抗体の「結合特性」という用語は、抗体が結合する抗原の同一性、好ましくは抗原が結合するエピトープの同一性を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「キメラポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチドが、野生型である領域と変異されている領域とを含むことを意味する。またこれは、ポリペプチドが、１つのポリヌクレオチドからの野生型領域と、別の関連するポリヌクレオチドからの野生型領域とを含むことを意味し得る。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「相補的決定領域」または「ＣＤＲ」は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによって例示された当該技術分野で認識された用語を指す。ＣＤＲは、一般に、超可変領域または超可変ループとしても知られている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７；Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）（１９８７）；およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、ＣＤＲに隣接するＶドメインの領域を指す。ＣＤＲおよびフレームワーク領域の位置は、様々な当該技術分野において周知の定義、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｃｈｏｔｈｉａ，ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）、およびＡｂＭを用いて決定することができる（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，８７７−８８３；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７９９−８１７；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １９９７，２７３（４）を参照されたい）。抗原結合部位の定義も下記に記載されている：Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＭＧＴ，ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，２１９−２２１（２０００）；およびＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ＩＭＧＴ，ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｊａｎ  １；２９（１）：２０７−９（２００１）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２（５），７３２−７４５（１９９６）；およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９２６８−９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０３，１２１−１５３，（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，１，１２６，（１９９２）；およびＲｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎ  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１−１７２  １９９６、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「有効量」は、特定の生物学的結果を得るために有効な、本明細書に記載される化合物、製剤、材料、または組成物の量を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、特異的なＢ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原もしくはハプテン状の部位を指す。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定基部位」と互換的に使用される。エピトープは、抗体の可変領域結合ポケットと相互作用する結合相互作用を形成することができる抗原または他の巨大分子の一部を含む。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ハプテン」という用語は、タンパク質などのより大きな担体と連結すると、生物体における免疫応答、例えば、それに特異的に結合する（遊離状態または結合状態のいずれかで）抗体の生成などを引き出すことができる小分子である。「ハプテン」は、予備形成された抗体に結合することができるが、それ独自で抗体生成を刺激することに失敗し得る。本発明との関係においては、「ハプテン」という用語は、自然発生または非自然発生のいずれかの修飾アミノ酸を含む。したがって、例えば、「ハプテン」という用語は、ホスホチロシン、ホスホスレオニン、ホスホセリン、または硫酸化チロシン（スルホチロシン）、硫酸化セリン（スルホセリン）、もしくは硫酸化スレオニン（スルホスレオニン）などの硫酸化残基などの自然発生の修飾アミノ酸を含み、またｐ−ニトロ−フェニルアラニンなどの非自然発生修飾アミノ酸も含む。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、ポリヌクレオチドの一部に関して使用されるとき、核酸が、本来は互いに同じ関係では通常見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、核酸は、通常、遺伝子組み換えにより生成された、新たな機能的核酸を作製するために配置された、例えば無関係な遺伝子からの２つ以上の配列を有する。同様に、「異種」ポリペプチドまたはタンパク質は、本来は互いに同じ関係では認められない２つ以上のサブ配列を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明のベクターがその中に導入、発現および／または増殖され得る原核細胞または真核細胞を指す。微生物宿主細胞は、細菌、酵母、微細な真菌および真菌ならびに変形菌類のライフサイクルにおける微視的段階を含む原核細胞または真核細胞の微生物の細胞である。典型的な原核細胞宿主細胞には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の様々な株が含まれる。典型的な真核細胞宿主細胞は、酵母もしくは糸状菌、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞、ネズミＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞、ヒト胎児由来腎臓１９３細胞、もしくは齧歯類骨髄腫またはハイブリドーマ細胞などの哺乳動物細胞である。
【００３６】
本明細書で使用される場合、組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」という用語は、関心の組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体媒介免疫応答の宿主における発現である。通常、「免疫学的応答」には、以下の作用：関心対象の組成物またはワクチン中に含まれる抗原もしくは抗原（複数）に特異的に向けられる、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の生成のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主は、新しい感染症に対する耐性が増強されるようになり、および／または疾患の臨床的重症度が低減されるように、治療的または防護的免疫学的応答のいずれかを表示するであろう。このような防護は、感染宿主によって通常表示される症状の低減もしくは欠如、完全ホストにおけるより迅速な回復時間および／または低下したウイルス力価のいずれかによって実証されるであろう。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、核酸もしくはポリペプチドの天然源に存在している他の核酸もしくはポリペプチドから分離されているのみならず、ポリペプチドからも分離されている核酸もしくはポリペプチドを指し、好ましくは、（どちらかといえば）溶媒、緩衝液、イオン、またはその溶液中に通常存在する他の構成成分のみの存在下において見出される核酸もしくはポリペプチドを指す。「単離された」および「精製された」という用語は、それらの天然源において存在する核酸もしくはポリペプチドを包含しない。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「哺乳動物」という用語は、その全てが体毛を有し、かつ子供に授乳する温血脊椎動物を指す。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「多価」という用語は、ワクチンが、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのインフルエンザ分離株からのＭ１ポリペプチドを含有すること、またはワクチンが、１つのインフルエンザ分離株からのＭ１ポリペプチドと、Ｍ１ポリペプチド分離株とは異なる別のインフルエンザ分離株からの抗原性調製物とを含有することを意味する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「自然発生」という用語は、構成要素が遺伝子組み換え手段によって改変されていない単一遺伝子によって、および生物体内に、例えばナイーブな細胞または抗原に曝された細胞から作成された抗体ライブラリー中に前から存在する単一遺伝子によってコード化されていることを意味する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「配列同一性の百分率」および「百分率相同性」は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの間の比較を指すために、本明細書で互換的に使用されており、２つの最適に整列された配列を比較ウインドウにわたって比較することによって判定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列と比べると付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この百分率は、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列において発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、この一致した位置の数を、比較のウインドウ内の位置の総数で割って、その結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率を得ることによって算出され得る。あるいは、この百分率は、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列において発生するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基が、ギャップと整列される位置の数を決定して一致した位置の数を得て、この一致した位置の数を、比較のウインドウ内の位置の総数で割って、その結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率を得ることによって算出され得る。当業者であれば、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを理解するであろう。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１のローカル相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性アライメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似性サーチ方法によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって；または目視検査によって（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）行うことができる。配列同一性％および配列類似性％を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２，１９７７に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトを通して公開されている。ヌクレオチド配列についてのＢＬＡＳＴは、デフォルトパラメータ、例えば、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いるＢＬＡＳＴＮプログラムを使用���ることができる。アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴは、デフォルトパラメータ、例えば、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）を用いるＢＬＡＳＴＰプログラム、およびスコア行列を用いるＢＬＯＳＵＭ６２使用することができる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５，１９８９を参照）。配列アライメントおよび配列同一性％の例示の決定もまた、提供されたデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用することができる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「ポリペプチド断片」という用語は、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書で互換的に使用される。ポリマーは直鎖または分岐鎖とすることができ、これは、修飾アミノ酸またはアミノ酸アナログを含んでもよく、またこれは、アミノ酸以外の化学部分によって分断されてもよい。この用語はまた、自然に、または介入によって、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識もしくは生理成分との複合化などの任意の他の操作もしくは改変によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、示された核酸もしくはポリペプチドが、他の生体高分子、例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質などの実質的不在下で存在することを意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、これが、存在する示された生体高分子の少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９．８重量％を構成するように精製される（しかしながら、水、緩衝液、および他の小分子、特に、１０００ダルトン未満の分子量を有する分子は存在することができる）。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「組換え核酸」は、自然界で通常見られない形態の核酸を指す。すなわち、組換え核酸は、自然界では核酸に隣接しないヌクレオチド配列によって隣接されているか、自然界では通常見られない配列を有する。組換え核酸は、元をたどれば、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によってインビトロで形成され得るか、あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応などの技術を用いて形成され得る。組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物体内に再導入されると、これは、非組み換え的に、すなわち、インビトロでの操作よりはむしろインビボでの宿主細胞の細胞機構を使用して複製するであろうが、組換えにより一旦生成されたこのような核酸は、その後非組み換え的に複製されるとはいえ、本発明の目的のために組換えとなおみなされる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「組換えポリペプチド」という用語は、組換え核酸から発現されたポリペプチド、またはインビトロで化学的に合成されたポリペプチドを指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「組換え変異体」という用語は、ＤＮＡ組換え技術を用いて作成された、アミノ酸挿入、欠失、および置換によって、自然発生ポリペプチドとは異なっている任意のポリペプチドを指す。どのアミノ酸残基が、酵素活性または結合活性などの関心対象の活性を無効にすることなく置き換えられ、付加され、または欠失され得るかを決定する際の指針は、特定のポリペプチドの配列を、相同のペプチドのものと比較し、高相同性の領域において行われるアミノ酸配列の変化の数を最小限に抑えることによって認められることができる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「レパートリー」または「ライブラリー」という用語は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＬＣ、ＶＨ、またはＶＬなどの抗体もしくは抗体断片、または可変領域のサブ断片、例えば、天然のアンサンブルから得られる交換カセットをコード化する遺伝子のライブラリーを指すか、または例えばヒトドナーにおいて存在しており、主として末梢血ならびに脾臓の細胞から得られた抗体遺伝子の「レパートリー」を指す。いくつかの実施形態では、ヒトドナーは、「非免疫性」であり、すなわち、感染症の症状を呈していない。本発明では、ライブラリーまたはレパートリーは、多くの場合、Ｖ領域の所与の部分の交換カセットであるメンバーを含む。用語Ｆｄは、Ｆａｂ断片中に含まれる重鎖の一部を意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、４２℃の温度において５×ＳＳＣにて５０％のホルムアミド中でハイブリダイズすることと、フィルターを６０℃で０．２×ＳＳＣ中で洗浄することを指す（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムである）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はまた、洗浄のために低イオン強度および高温を用いること、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；ホルムアミドなどの変性剤を用いるハイブリダイゼーション、例えば、４２℃で、５０体積％のホルムアミドと０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルプロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウム緩衝液、および７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム；または４２℃で、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストラン、それと共に０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃にて、および５０％ホルムアミド中で５５℃での洗浄、その後の５５℃でのＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシーな洗浄も包含する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「実質的同一性」は、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の同一性、および８９〜９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列を指す。実質的同一性はまた、少なくとも２０個の残基位置の比較ウインドウまたは少なくとも３０〜５０個の残基のウインドウにわたって基準配列と比べての少なくとも９９％の配列同一性も包含し、配列同一性の百分率は、基準配列を、比較のウインドウにわたって欠失または付加もしくは置換を含む配列と比較することによって算出される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態では、「実質的同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列が、標準パラメータ、すなわち、デフォルトパラメータを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなど最適に整列されるとき、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性またはそれ以上（例えば、９９％の配列同一性）を共有することを意味する。
【００５０】
好ましくは、アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似した構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えた結果、すなわち、保存的アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行われてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれ、負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「合成抗体ライブラリー」という用語は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ＬＣ、ＶＨ、またはＶＬなどの１つ以上の抗体もしくは抗体断片、または可変領域のサブ断片、例えば、その中で相補的決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ以上が、例えば、オリゴヌクレオチド指定突然変異によって部分的または完全に改変されている交換カセットをコード化する遺伝子のライブラリーを指す。「ランダム化」は、ＣＤＲをコード化する配列の一部または全てが、全ての２０個のアミノ酸またはこれらのアミノ酸のいくつかのサブセットをランダムにコード化する配列によって置き換えられていることを意味する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、実験技術を通して行われるアミノ酸もしくはヌクレオチドの挿入、欠失、および置換によって、自然発生ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドとは異なっている任意のポリペプチドを指す。
【００５３】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、前後関係から明らかでない限り、複数の指示対象を含める。同様に、「または」という語は、文脈上明らかに別途記載のない限り、「および」を含むよう意図する。抗原などの物質の濃度またはレベルに関して与えられた数量的限界は、近似値であるように意図する。したがって、濃度が少なくとも（例えば）２００μｇであると指示される場合、この濃度は、少なくとも近似的に「約」または「約」２００μｇであると理解されることを意図する。
Ｍ１ポリペプチド
【００５４】
本発明は、ヒト個体または集団におけるインフルエンザウイルスに対して免疫応答、特に一次免疫応答を誘導する方法に関し、該方法は、本発明のＭ１ポリペプチドまたはその抗原性調製物を含むＭ１ポリペプチド組成物の投与を含む。実施形態では、免疫応答は、未経験な免疫機能が低下した、または以前に感染したヒト個体または集団において得られる。
【００５５】
Ｍ−タンパク質、または基質タンパク質のＭ１は、インフルエンザウイルスの主要な構造成分である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｍ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐＨ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｏｍａｉｎ，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（５）：ｅ３７７８６．：ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３７７８６、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｍ遺伝子は、２つのタンパク質、Ｍ１およびＭ２をコード化する。Ｍ１タンパク質は、より臨床的に関連するインフルエンザサブタイプである、インフルエンザウイルスの全てのＡ型サブタイプにわたって高度に保存されている。Ｍ１タンパク質のＣ末端部分は、ウイルス上で細胞外に露出されており、その高い配列保存性を考慮すると、ユニバーサルサブユニットワクチン免疫原の優れた標的を意味している。
【００５６】
一実施形態では、標的Ｍ１ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質のＣ末端におけるアミノ酸残基、具体的にはＭ１タンパク質の２１５〜２５２、または２１５〜２４０、または２２０〜２３８、または２２０〜２４２、または２２０〜２５２、または２２３〜２４２、または２２３〜２５２にわたる。一実施形態では、Ｍ１ポリペプチドは、ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱ（配列番号１）、ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫ（配列番号２）、ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ（配列番号３）、ＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫ（配列番号４）、ＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ（配列番号５）、ＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ（配列番号６）、もしくは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、および／または３８個のアミノ酸の、この配列からの連続したアミノ酸からなるポリペプチド、またはＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ（配列番号７）、もしくは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、および／または１２２個のアミノ酸の、この配列からのアミノ酸からなるポリペプチドである。この実施形態では、ポリペプチド中のアミノ酸の全てが、Ｍ１タンパク質の残基１３１〜２５２のＭ１ポリペプチド範囲内で連続している必要はない。
【００５７】
一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、例えば、Ａ／バンコク／１６３／２０００（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号８）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＳＡＦＧＬＩＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＫＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡ  ＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号９）；Ａ／ＰＲ／８／３４（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号１０）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶ  ＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号１１）；Ａ／ＡＡ／ヒューストン／１９４５（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号１２）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲ  ＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号１３）；Ａ／ベルリン／６／２００６（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＫＮＤＬＬＤＮＬＱ）（配列番号１４）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＳＡＦＧＬＩＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＫＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲ  ＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＮＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＫＮＤＬＬＤＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号１５）；Ａ／ブランデンブルグ／１／２００６（ＧＴＨＰＮＳＳＴＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号１６）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＳＡＦＧＬＩＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱ  ＨＫＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＮＳＳＴＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号１７）；Ａ／ブレビグ・ミッション／１／１９１８（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＩＥＮＬＱ）（配列番号１８）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＴＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＩＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号１９）；Ａ／チリ／８８８５／２００１（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号２０）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＳＡＦＧＬＩＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＫＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＮＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号２１）；Ａ／ダナン／ＤＮ３１１／２００８（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号２２）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥ��ＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＡＴＴＮＰＬＩＫＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫ  ＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＩＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＤＬＬＥＮＬＱＸＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号２３）；Ａ／ＦＬＷ／１９５１（ＧＴＲＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号２４）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＲＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ（配列番号２５）；Ａ／ＦＷ／１／１９５０（ＧＴＨＰＲＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号２６）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＲＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号２７）；Ａ／フィジー／１５８９９／８３（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＦＥＮＬＱ）（配列番号２８）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＳＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＫＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＦＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号２９）；  Ａ／フォートマンモス／１−ＭＡ／１９４７（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＮＬＬＥＮＬＱ）（配列番号３０）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＡＴＥＶＡＦＧＬＩＣＡＴＣＥＱＩＡＤＡＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳ  ＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＮＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号３１）；Ａ／ハノイ／ＴＸ２３３／２００８（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＫＳＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号３２）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＳＡＦＧＬＩＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＫＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡ  ＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＫＳＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号３３）；Ａ／アイオワ／ＣＥＩＤ２３／２００５（ＧＴＨＰＮＳＳＴＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号３４）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＴＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶ  ＩＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＳＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＴＩＧＴＨＰＮＳＳＴＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号３５）；Ａ／マレーシア／３５１６４／２００６（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＫＫＤＬＬＤＮＬＱ）（配列番号３６）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＳＡＦＧＬＩＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＫＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲ  ＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＫＫＤＬＬＤＮＬＱＡＹＱＫＲＭ��ＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号３７）；Ａ／マナグア／４０８６．０４／２００８（ＧＴＨＰＳＳＳＮＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号３８）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＳＡＦＧＬＩＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱ  ＨＫＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＮＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号３９）；Ａ／テキサス／ＶＲ０６−０５０２／２００７（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＮＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号４０）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＳＡＦＧＬＩ  ＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＫＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号４１）；Ａ／ＷＳＮ／１９３３（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＳＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号４２）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶ  ＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＤＩＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＳＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号４３）；Ａ／コロラド／１８／２０１１（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＲＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号４４）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＴＶＴＴＥＡＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＡＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＮＱＴＲＱＭＶＨＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＲＤＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号４５）；Ａ／ケンタッキー／０４／２０１０（ＧＴＨＰＮＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号４６）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＴＶＴＴＥＡＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＡＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＮＱＴＲＱＭＶＨＡＭＲＴＶＧＴＨＰＮＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号４７）；Ａ／メリーランド／２８／２００９（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＧＮＬＱ）（配列番号４８）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＴＶＴＴＥＡＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＡＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫ  ＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＮＱＴＲＱＭＶＨＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＧＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ（配列番号４９）；Ａ／ニューメキシコ／０５／２０１２（ＧＴＨＰＳＳＳＳＧＬＲＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号５０）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＴＶＴＴＥＡＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＡＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶ  ＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＮＱＴＲＱＭＶＨＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＳＧＬＲＤＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号５１）；Ａ／フィリピン／ＴＭＣ１０−１３５／２０１０（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＲＤＤＬＬＤＮＬＱ）（配列番号５２）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＴＶＴＴＥＡＡＦ���ＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤ  ＳＱＨＲＳＨＲＱＭＡＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＮＱＴＲＱＭＶＨＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＲＤＤＬＬＤＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ（配列番号５３）；Ａ／シンガポール／ＧＰ４３０７／２０１０（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＤＮＬＱ）（配列番号５４）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＴＶＴＴＥＡＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＡＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＮＱＴＲＱＭＶＨＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＤＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号５５）；Ａ／シンガポール／ＧＰ４８９／２０１０（ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＡＬＬＥＮＬＱ）（配列番号５６）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＴＶＴＴＥＡＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＡＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴ  ＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＮＱＴＲＱＭＶＨＡＭＲＴＩＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＤＡＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号５７）；Ａ／ボストン／１４／２００７（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＤＬＬＥＫＬＱ）（配列番号５８）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＡＴＴＮＰＬＩＫＨＥＮＲＭＶＬＡＳ  ＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＩＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＤＬＬＥＫＬＱＴＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号５９）；Ａ／ブリスベン／０９／２００６（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＮＬＬＥＮＬＱ）（配列番号６０）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＡＴＴＮＰＬＩＫＨＥＮＲＭＶ  ＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＩＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＮＬＬＥＮＬＱＴＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号６１）；Ａ／ホンコン／ＣＵＨ３４１７５／２００２（ＧＴＨＰＳＳＳＮＧＬＲＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号６２）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳ  ＱＨＲＳＨＲＱＭＶＡＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＩＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＮＧＬＲＤＤＬＬＥＮＬＱＴＹＱ
ＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号６３）；Ａ／キルギスタン／ＷＲＡＩＲ１２５６Ｐ／２００８（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＤＬＬＧＮＬＱ）（配列番号６４）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＡＴＴＮＰＬＩＫＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＩＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＤＬＬＧＮＬＱＴＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号６５）；Ａ／マレーシア／１２５３０／１９９７（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＤＬＬＤＮＬＱ）（配列番号６６）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＡＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫ  ＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＩＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＶＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＤＬＬＤＮＬＱＴＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号６７）；Ａ／南京／１６６３／２０１０（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＧＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号６８）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＡＴＴＮＰＬＩＫＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡ  ＫＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＩＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＧＤＬＬＥＮＬＱＴＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＲ）（配列番号６９）；Ａ／ワイオミング／０８／２０１０（ＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＤＬＩＥＮＬＱ）（配列番号７０）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＳＴＴＮＰＬＩＫＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡ  ＲＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＩＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＨＰＳＳＳＴＧＬＲＤＤＬＩＥＮＬＱＴＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号７１）；Ａ／バークレー／１／１９６８（ＧＴＰＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号７２）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫ  ＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＴＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＰＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号７３）；Ａ／韓国／４２６／１９６８（ＧＴＰＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱ）（配列番号７４）もしくは（ＩＹＮＲＭＧＡＶＴＴＥＶＡＦＧＬＶＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶＴＴＴＮＰＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＡＳＴＴＡＫ  ＡＭＥＱＭＡＧＳＳＥＱＡＡＥＡＭＥＶＡＳＱＡＲＱＭＶＱＡＭＲＡＩＧＴＰＰＳＳＳＡＧＬＫＤＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ）（配列番号７５）などの自然発生株変異体を含む。
【００５８】
一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質の２２０〜２３８からの配列、ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱ（配列番号１）、または以下の置換のうちの１つ以上を有する変異体を含む：２２２位のＨのＲまたはＮへの変更、２２４位のＳのＲまたはＮへの変更、２２７位のＡのＴまたはＮへの変更、２３０位のＫのＲへの変更、２３１位のＮのＤ、Ｓ、またはＫへの変更、２３２位のＤのＮまたはＧへの変更、２３４位のＬのＦまたはＩへの変更、２３５位のＥのＤ、Ｈ、またはＫへの変更、２３６位のＮのＨまたはＫへの変更。
【化１】
2018535694.tif 000003
【００５９】
一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、以下の配列変異体を包含する：
【化２】
2018535694.tif 000004
式中、Ｘ＝任意のアミノ酸である。
【００６０】
一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質の１３１〜２５２からの配列、または以下の置換のうちの１つ以上を有する変異体を含む：１３７位のＡのＴへの変更、１３９位のＴのＡへの変更、１４２位のＶのＳまたはＡへの変更、１４７位のＶのＩへの変更、１６０位のＲのＫへの変更、１６６位のＶのＡへの変更、１６７位のＴのＡまたはＳへの変更、１７４位のＲのＫへの変更、１８０位のＬのＩへの変更、１８７位のＫのＲへの変更、２００位のＡのＳへの変更、２０５位のＶのＤまたはＩへの変更、２０６位のＡのＩへの変更、２０７位のＳのＮへの変更、２０９位のＡのＴへの変更、２１４位のＱのＨへの変更、２１８位のＴのＡへの変更、２２２位のＨのＲ、Ｐ、またはＮへの変更、２２４位のＳのＲまたはＮへの変更、２２７位のＡのＴ、Ｓ、またはＮへの変更、２３０位のＫのＲまたはＧへの変更、２３１位のＮのＤ、Ｓ、またはＫへの変更、２３２位のＤのＮ、Ａ、またはＧへの変更、２３４位のＬのＦまたはＩへの変更、２３５位のＥのＤ、Ｈ、Ｇ、Ｋへの変更、２３６位のＮのＨまたはＫへの変更、もしくは２３９位のＡのＴへの変更。これらの変更および基準配列を表１（配列番号７８）に示す。
【００６１】
一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、以下の配列変異体を包含する：
【化３】
2018535694.tif 000005
式中、Ｘ＝任意のアミノ酸である。
【００６２】
一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、配列番号１〜８０のポリペプチドのうちの１つをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコード化されたＭ１ポリペプチドを含む。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、配列番号１〜７のポリペプチドのうちの１つをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコード化されたＭ１ポリペプチドを含む。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、配列番号８〜７５のポリペプチドのうちの１つをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコード化されたＭ１ポリペプチドを含む。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、配列番号２〜５のポリペプチドのうちの１つをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコード化されたＭ１ポリペプチドを含む。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、配列番号３のポリペプチドをコード化する核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコード化されたＭ１ポリペプチドを含む。
【００６３】
一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、配列番号１〜８０のうちの１つに対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、配列番号１〜７のうちの１つに対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、配列番号８〜７５のうちの１つに対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、配列番号２〜５のうちの１つに対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、配列番号３に対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。
【００６４】
本発明のＭ１ポリペプチドは、インフルエンザに対して防護することができる。すなわち、これらは、動物において免疫応答を刺激することができる。抗原は、Ｍ１ポリペプチドを、単独で、または担体に複合化されて、もしくはスキャフォールド、免疫原性特性を有するインサートを含有する組換えベクター、エピトープ、ハプテン、またはこれらの任意の組み合わせで提示されて含んでもよい。
【００６５】
本発明のＭ１ポリペプチドは、Ｍ１ポリペプチドの免疫原性断片および変異体を包含する。したがって、「免疫原性または抗原性ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドが機能して、本明細書で定義される免疫原性応答を引き起こす限りにおいて、配列に対する欠失、付加および置換をさらに企図する。「保存的変異」という用語は、アミノ酸残基の別の生物学的に類似した残基による置き換え、またはコード化アミノ酸残基が変化しないか、または別の構造的に、化学的に、ないしは別の方法で機能的に類似した残基に変更されるような核酸配列中のヌクレオチドの置き換えを意味する。これに関して、特に好ましい置換は、一般には、本来は保存的であり、すなわち、これらの置換は、アミノ酸のファミリー内で起こる。例えば、アミノ酸は、概ね、４つのファミリーに分けられる。（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、およびチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されるときもある。保存的変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換、または１つの極性残基の別の極性残基への置換、例えば、アルギニンのリジンへの、グルタミン酸のアスパラギン酸への、またはグルタミンのアスパラギンへの置換など；または生物活性に大きな影響を有しないであろう構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の類似の保存的置き換えが挙げられる。基準分子と同じアミノ酸配列を実質的に有するが、このたんぱく質の免疫原性に実質的に影響しない微量のアミノ酸置換を有するタンパク質は、したがって、基準ポリペプチドの定義内にある。このような修飾によって生成されたポリペプチドの全ては、本明細に含まれる。「保存的変異」という用語は、置換ポリペプチドに対して生じた抗体がまた、非置換のポリペプチドと免疫反応するという条件で、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含む。
【００６６】
「変異体」Ｍ１ポリペプチドは、実質的に類似する配列を意味することを意図する。ポリヌクレオチドの場合には、変異体は、天然のポリヌクレオチド内の１つ以上の部位における１つ以上のヌクレオチドの欠失ならびに／もしくは付加、および／または天然のポリヌクレオチドの１つ以上の部位における１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で使用される場合、「天然の」ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、それぞれ、自然発生ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列を含む。本発明の特定のポリヌクレオチド（すなわち、基準ポリヌクレオチド）の変異体も、変異体ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドと、基準ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドとの間の配列同一性の％の比較によって評価され得る。「変異体」タンパク質は、天然のタンパク質の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失もしくは付加および／または天然のタンパク質の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換によって、天然のタンパク質から誘導されたタンパク質を意味することを意図する。本発明によって包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち、これらは免疫応答を引き起こす能力を有する。
【００６７】
他のインフルエンザ株およびサブタイプに由来するＭ１ポリペプチドの相同体は、本発明の範囲内にあると意図する。本明細書で使用される場合、「相同体」という用語は、アナログおよびパラログを含む。「アナログ」という用語は、同じまたは類似した機能を有するが、無関係の宿主生物体において別々に進化した２つのポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを指す。「パラログ」という用語は、ゲノム内の複製によって関連している２つのポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを指す。パラログは、通常、異なる機能を有するが、これらの機能は関連することができる。野生型インフルエンザポリペプチドのアナログおよびパラログは、翻訳後修飾によって、アミノ酸配列の差によって、またはこれら両方によって、野生型インフルエンザポリペプチドとは異なり得る。特に、本発明の相同体は、概ね、野生型インフルエンザポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、または９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を呈するであろうし、また類似した機能を呈するであろう。変異体は、対立遺伝子変異体を含む。「対立遺伝子変異体」という用語は、タンパク質のアミノ酸配列における変化をもたらし、かつ天然の集団（例えば、ウイルス種または品種）内に存在する多型性を含有するポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを指す。このような天然の対立遺伝子変異は、通常、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドにおける１〜５％の変動をもたらし得る。対立遺伝子変異体は、多くの異なる種における関心対象の核酸配列を配列決定することによって特定することができ、これは、ハイブリダイゼーションプローブを用いて、これらの種における同じ遺伝子座を特定することによって、容易に行うことができる。天然の対立遺伝子変異の結果であり、かつ関心対象の遺伝子の機能的活性を変更しない、ありとあらゆるこのような核酸変異および得られるアミノ酸多型性もしくは変異は、本発明の範囲内にあることを意図する。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「誘導体」または「変異体」という用語は、（１）対応するポリペプチドが、野生型ポリペプチドと比較されるとき、実質的に同等の機能を有するように、または（２）抗体が野生型ポリペプチドと免疫反応性であるポリペプチドに対して生じるように、１つ以上の保存的アミノ酸変異または他の微量の修飾を有する、Ｍ１ポリペプチド、またはＭ１ポリペプチドをコード化する核酸を指す。これらの変異体または誘導体は、非修飾の対応するポリペプチドと比べて実質的に同等の活性を有するペプチドをもたらし得る、インフルエンザポリペプチドの一次アミノ酸配列の微量の修飾を有するポリペプチドを含む。このような修飾は、部位特異的突然変異誘発によるなど、意図的であってもよく、または自発的であってもよい。「変異体」という用語は、ポリペプチドが機能して、本明細書で定義される免疫原性応答を引き起こす限りにおいて、配列に対する欠失、付加および置換をさらに企図する。「変異体」という用語はまた、ポリペプチドの宿主種からの発現または分泌を容易にするために、天然のシグナルペプチドが、異種シグナルペプチドで置き換えられているポリペプチドの修飾も含む。「変異体」という用語はまた、完全に異なるタンパク質配列であるが、類似した構造であり、交差反応免疫も誘発させる「ミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ）」を含んでもよい。
【００６９】
本発明のＭ１ポリペプチドはまた、Ｍ１ポリペプチドのグリコシル化部位または修飾もしくは誘導体化のための他の部位の導入のための、アミノ酸配列を含んでもよい。一実施形態では、上記の本発明のＭ１ポリペプチドは、グリコシル化部位として作用し得るアミノ酸配列Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔを含んでもよい。グリコシル化の間に、オリゴ糖鎖は、トリペプチド配列Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔで生じるアスパラギン（Ｎ）に連結され、式中、Ｘは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸とすることができる。この配列は、グリコシル化配列と呼ばれる。このグリコシル化部位は、Ｍ１ポリペプチドに使用されるＭ１配列のＮ末端に、Ｃ末端に、または内部配列内に定置されてもよい。
【００７０】
本発明のＭ１ポリペプチドのうちのいずれかはまた、ハプテン複合体で使用されてもよい。このような複合体は、Ｍ１ポリペプチドエピトープ（複数可）を生物体の免疫系に提示するために、好適な担体ポリペプチドおよび／またはスキャフォールドポリペプチドを用いてもよい。例えば、Ｍ１−ポリペプチドは、モノクローナル抗体のＣＤＲ３中に挿入されるか、またはＣＤＲ３に完全に取って代わってもよい。この場合、免疫付与のための対象からの異なる種のモノクローナル抗体スキャフォールドを用いることによって、最大のアジュバント効果が得られるであろう。これらのＭ１ポリペプチドハプテンは、Ｍ１ポリペプチドに対する免疫応答を増大または引き起こし得る。好適な担体分子は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＫＬＨ、オボアルブミン、ＢＳＡ、他の血清アルブミン、これら毒素、ジフテリア毒素、および破傷風毒素が挙げられる。
【００７１】
ＤＮＡ構築物を調製および精製するための分子生物学の標準的技術は、本発明のＭ１ポリペプチドとのハプテン複合体の調製を可能にする。これらの分子生物学の技術は、ハプテン複合体をコード化する遺伝子構築物を作製するために、また好適な宿主細胞中でのハプテンの製造のための発現構築物を作製するために、使用することができる。あるいは、本発明のハプテンは、本発明のＭ１ポリペプチドを担体またはスキャフォールドポリペプチドに複合化するための標準ポリペプチド技術を用いて作製されてもよい。したがって、分子生物学の標準技術は、本発明のハプテンの生成に十分であるが、開示された特定のハプテンは、新規の治療薬を提供する。
【００７２】
本発明の一態様では、Ｍ１ポリペプチド（複数可）を含む、一価または多価、例えば二価、三価、または四価の組成物が提供され、この組成物はまた、該一次免疫原性組成物中に存在する株の抗原性変異体であるインフルエンザ株によって引き起こされたインフルエンザ感染症の重症度の低下または予防で使用するための、不活性化もしくは弱毒化インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物を含んでもよい。本発明の一実施形態では、多価組成物の不活性化または弱毒化インフルエンザウイルスは、血清型Ｂインフルエンザのためのものである
免疫応答および有効性
【００７３】
一実施形態では、本発明のＭ１ポリペプチドは、中和抗体力価の幾何平均抗体力価（ＧＭＴ）および中和抗体応答についての血清変換率（ＳＣＲ）（０日目に検出可能な抗体を含まず、ワクチン接種後に１：２８の力価への増加または中和抗体力価における４倍またはそれ以上の増加を有するワクチンの百分率として定義される）によって測定される、インフルエンザに対する中和抗体に関する体液性応答を誘導することもできる。
【００７４】
別の特定の実施形態では、該ワクチン接種はさらに、またはそれに加えてインフルエンザに対するＣＤ４Ｔ細胞免疫応答および／またはＢ細胞記憶応答を生成する。特定の実施形態では、ヒト患者は、ワクチン株に対して血清陰性であるか、または免疫学的にナイーブである（すなわち、既存の免疫を有しない）。一実施形態では、該Ｍ１ポリペプチド組成物の投与は、代わりに、または追加的に、抗原遭遇時に、抗体分泌軽質細胞に分化することができる末梢血Ｂリンパ球の頻度によって測定される、Ｂ記憶細胞応答を誘導する。
【００７５】
本発明のインフルエンザ薬剤は、ワクチンについての特定の国際基準を適切に満たしている。標準はインフルエンザワクチンの効力を測定するために国際的に適用される。血清変数は、インフルエンザワクチンの毎年のライセンシング手順に関連する臨床試験（表１Ａ）のためのヒト用医薬品評価欧州委員会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ（ＣＨＭＰ／ＢＷＰ／２１４／９６、欧州医薬品委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ＣＰＭＰ）、Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９９７．ＣＨＭＰ／ＢＷＰ／２１４／９６  ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｎ°９６−０６６６：１−２２）の基準に従って評価する。この要件は、成人集団（１８〜６０歳）と高齢者集団（＞６０歳）について異なる（表１Ａ）。大流行間期のインフルエンザワクチンについては、少なくとも１個の評価（血清変換因子、血清変換率、血清防御率）は、ワクチン中に含まれる全てのインフルエンザ株について、欧州の要件を満たすべきである。１：４０以上の力価比率は、これらの力価が現在利用可能な最良の防御相関であると期待されるため、最も関連するとみなされる（Ｂｅｙｅｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｃｌｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｖｅｓｔ．；１５：１−１２）。
【００７６】
７０％の血清防御率は、欧州健康規制当局（ＣＨＭＰ−ヒト用医薬品欧州委員会）により定義されており、毎年の季節性インフルエンザワクチンについて満たすことを通常要求される３個の基準のうちの１個であり、ＣＨＭＰもパンデミック候補ワクチンが満たすことを期待している。
【００７７】
しかしながら、数学的モデリングは、集団レベルで、抗原ドリフトした１種以上の異種株に対して３０％しか有効でないワクチンも、パンデミックの規模を低下させるのを助けることにおいて有益であり、パンデミック株に対して３０％の効力を有する（プレパンデミック）ワクチン（３０％の交叉防御）を用いるパンデミックワクチン接種キャンペーンが、臨床的な攻撃速度を７５％効果的に低下させ、結果として、集団内の罹患率／死亡率を低下させることができることを示している。したがって、本発明の加速初回免疫付与は、インフルエンザパンデミックまたは起源で出現するインフルエンザ株の夾雑の早期の緩和を達成するための方法である。
【００７８】
ＦＤＡは、パンデミックインフルエンザワクチンのライセンス交付を支援するのに必要な臨床データに関するドラフトガイダンス（ＣＢＥＲドラフト基準）（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ  Ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ（ＨＦＭ−４０），１４０１  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｓｕｉｔｅ  ２００Ｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５２−１４４８から、もしくは１−８００−８３５−４７０９もしくは３０１−８２７−１８００への電話により、またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｂｅｒ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｈｔｍでインターネットから入手可能）を公開しており、提唱された基準はＣＨＭＰ基準にも基づいている。ＦＤＡはわずかに異なる年齢カットオフ点を用いている。好適な評価項目としては同様に、１）１：４０以上のＨＩ抗体力価を達成する被験者の割合（％）、および２）ワクチン接種後のＨＩ抗体力価の４倍上昇として定義される血清変換率が挙げられる。幾何学的平均力価（ＧＭＴ）を結果に含めるべきであるが、そのデータは推定値だけでなく、血清変換の発生率の９５％信頼区間の下限も含むべきであり、４２日目の１：４０以上のＨＩ力価の発生率は目標値を満たすか、またはこれを超えなければならない。したがって、これらのデータおよびこれらの評価の推定値の９５％信頼区間（ＣＩ）を提供すべきである。ＦＤＡドラフトガイダンスは、両方の目標を満たすことを要求している。
【００７９】
したがって、本発明の一態様では、Ｍ１ポリペプチド組成物の投与により誘導される該免疫応答または防御が、インフルエンザワクチン効力に関する３つ全部のＥＵ規制基準を満たす場合、本明細書で特許請求される組成物、方法または使用が提供される。好適には、少なくとも１つ、好適には２つ、または３つの以下の基準が、組成物のインフルエンザ株について満たされる：血清陰性集団中の＞３０％、＞４０％、＞５０％の血清変換率；血清陰性集団中の＞６０％、＞７０％、＞８０％の血清防御率；血清陰性集団中の＞２．０、＞２．５、＞３．０、＞４．０の血清変換係数。
インフルエンザウイルス
【００８０】
インフルエンザＡウイルスは、継続的に進化しており、結果として、抗原変異を受ける（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＮＰ，Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｊ．Ｕｐｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｃｏｕｎｔｓ：ｇｌｏｂａｌ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９１８−１９２０  “Ｓｐａｎｉｓｈ”  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｐａｎｄｅｍｉｃ．Ｂｕｌｌ．Ｈｉｓｔ．Ｍｅｄ．２００６；７６：１０５−１１５）。大流行間期には、循環するインフルエンザウイルスは、前回の流行に由来するものと関連する。ウイルスは人生初期の感染から免疫レベルを変化させながら人々の間で拡散する。そのような循環は、通常は２〜３年の期間にわたり、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる効率的な校正を欠き、表面糖タンパク質におけるアミノ酸置換をもたらし、一般的な集団間で再び流行を引き起こすのに十分に変化した新しい株の選択を促進する高率の転写エラーをもたらす；このプロセスを「抗原ドリフト」と呼ぶ。
【００８１】
断片化ウイルスゲノムは、第２の型の抗原性変異を可能にする。予測不可能な間隔で、２種以上のインフルエンザウイルスが宿主細胞に同時に感染する場合、遺伝子再集合は、新規インフルエンザウイルスをもたらすであろう。ここで、得られる抗原は、ヒトにおいて以前に循環していた株の対応するタンパク質から２０％〜５０％変化し得る。「抗原シフト」と呼ばれるこの現象は、「集団免疫」を回避し、パンデミックを確立する新規表面または内部タンパク質を有する新規ウイルスを生成し得る。
【００８２】
「ドリフト」および「シフト」の両方のこれらの抗原変化は予測不可能であり、それらが最終的には新しいインフルエンザ株の出現を誘導し、ウイルスが免疫系を回避することができ、周知の、ほとんど毎年の流行を引き起こすため、免疫学的観点からは劇的な影響を有し得る。
【００８３】
毎年の流行に加えて、効率的にヒトからヒトへ伝染することができる、新しく出現するインフルエンザウイルスは、過去にパンデミック、すなわち、より高い感染率および死亡率の、全年齢群における突然の、地球規模的な流行を引き起こしてきた。前世紀には３回のインフルエンザパンデミック、世界中で２０００〜５０００万人の死亡の原因となる１９１８〜１９１９年の「スペイン風邪」、１９５７年の「アジア風邪」および１９６８年の「香港風邪」が見られた。
【００８４】
パンデミックインフルエンザウイルス株の特徴は、以下の通りである：ノイラミニダーゼサブタイプの変化を伴って、または伴わなくともよい、現在循環している株におけるヘマグルチニンと比較して新しいヘマグルチニンを含むこと；ヒト集団において水平感染され得ること；およびヒトに対して病原性であること。新しいヘマグルチニンは、１９５７年に最後に循環したＨ２などの、長期間、おそらく、少なくとも１０年間、ヒト集団において明らかでなかったものであり得、またはそれは、例えば、通常は鳥に認められるＨ５、Ｈ９、Ｈ７もしくはＨ６などの、ヒト集団においては以前に循環していたことのないヘマグルチニンであり得る。これらの場合、大きい集団（例えば、Ｈ２の場合）または全集団（Ｈ５、Ｈ７、Ｈ６もしくはＨ９の場合）は、パンデミックインフルエンザウイルス株に対して免疫学的にナイーブである。現在、ヒトにおいてインフルエンザパンデミックを引き起こす可能性のあるものとＷＨＯにより同定されたインフルエンザＡウイルスは、高病原性Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスである。したがって、本発明にしたがって使用するためのパンデミックワクチンは、好適にはＨ５Ｎ１ウイルスを含むであろう。特許請求された組成物中への含有のための他の好適な株は、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、またはＨ２Ｎ２である。
【００８５】
本発明のＭ１ポリペプチドは、（１）本発明のＭ１ポリペプチドをコード化する選択された領域のインフルエンザゲノムもまた、Ｍ２タンパク質の一部をコード化し、および（２）インフルエンザのＭ１ならびにＭ２タンパク質が、大部分はウイルス粒子内に埋め込まれた構造タンパク質であるために、このような抗原性変異に左右されにくい。これら両方の理由のために、Ｍ１タンパク質は、インフルエンザ株の間の配列変動をほとんど有せず、ヘマグルチニンなどの表面露出抗原で認められる急速な抗原ドリフトを支援する能力をほとんど有しないであろう。
ＤＮＡおよびＲＮＡワクチン
【００８６】
本発明のＭ１ポリペプチドはまた、ＤＮＡもしくはＲＮＡワクチンとして生物体に導入されてもよい。本発明のＤＮＡもしくはＲＮＡワクチンは、本発明のＭ１ポリペプチドをコード化するであろう。これらのコード化Ｍ１ポリペプチドは、担体ポリペプチドと共にコード化融合タンパク質中に存在してもよく、またはスキャフォールドポリペプチド中に融合されてもよい。
【００８７】
ＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物を調製および精製するための分子生物学の標準技術は、本発明のＤＮＡもしくはＲＮＡ治療薬の調製を可能にする。分子生物学の標準技術は、本発明の産物の生成に十分であるが、開示された特定の構築物は、新規の治療薬を提供する。
【００８８】
ワクチンレシピエントに導入されるべき発現可能なＤＮＡもしくはＲＮＡの量は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物中で使用される転写および翻訳プロモータの強度に、また発現された遺伝子産物の免疫原性に依存するであろう。一般には、約１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇの免疫学的または予防的に有効な用量が、筋組織に直接投与される。皮下注射、皮内導入、皮膚を通しての圧入、および腹腔内、静脈内、または吸入送達などの他の投与のモードも企図される。ブースター免疫付与が提供されることも企図される。
【００８９】
ＤＮＡもしくはＲＮＡは裸であってもよく、すなわち、レシピエントの免疫系に影響を及ぼすいかなるタンパク質、アジュバントまたは他の作用剤とも会合されていない。この場合、ＤＮＡもしくはＲＮＡが滅菌生理食塩水または、滅菌緩衝生理食塩水などであるが、これらに限定されない生理学的に許容できる溶液中にあることが望ましい。あるいは、ＤＮＡもしくはＲＮＡは、レシチンリポソームまたは当該技術分野において既知の他のリポソームなどのリポソームと、ＤＮＡ−リポソーム混合物もしくはＲＮＡ−リポソーム混合物として会合されてもよく（例えば国際特許第ＷＯ９３／２４６４０号を参照）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡは、免疫応答を高めるために、タンパク質または他の担体などの当該技術分野において既知のアジュバントと会合されてもよい。カルシウムイオン、ウイルスタンパク質および他のトランスフェクション促進剤などであるが、これらに限定されない、ＤＮＡもしくはＲＮＡの細胞取込みにおいて補助する作用剤もまた、有利に使用されてもよい。これらの作用剤は、一般的に、トランスフェクション促進剤および薬学的に許容できる担体と称される。本明細書で使用される場合、遺伝子という用語は、別個のポリペプチドをコード化する核酸のセグメントを指す。製剤およびワクチンという用語は、免疫応答を誘導するのに有用な組成物を示すために互換的に用いられる。構築物、およびプラスミドという用語は、互換的に用いられる。ベクターという用語は、本発明の方法に従って使用するために、その中に遺伝子がクローンされ得るＤＮＡもしくはＲＮＡを示すために用いられる。
【００９０】
ＤＮＡワクチン製剤は、高度精製されたヌクレアーゼを含まないＤＮＡを光から保護し、かつ生理学的に許容できる緩衝液を含む滅菌ガラスバイアル中に、少なくとも約８．０を超え、少なくとも約９．５までのｐＨ範囲内の生理学的に許容できる緩衝液、最大約３００ｍＭの範囲の塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＬｉＣｌを含むがこれらに限定されない）、およびフリーラジカルスカベンジャーのエタノール（最大約３％の範囲）と組み合わせた金属イオンキレート剤ＥＤＴＡ（最大約５ｍＭの範囲）を含有する脱金属化溶液と、最高の適切なＤＮＡ濃度とを含む。本発明の特定の態様では、ＤＮＡワクチン製剤は、高度精製されたヌクレアーゼを含まないＤＮＡを光から保護し、かつ生理学的に許容できる緩衝液を含む滅菌ガラスバイアル中に、ＥＤＴＡおよびエタノールの組み合わせ、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、約１μＭ〜約１ｍＭの範囲のＥＤＴＡ、最大約２％で存在するエタノール、全体で最高の適切なＤＮＡ濃度を含む。
【００９１】
本開示のＤＮＡもしくはＲＮＡワクチンは、遺伝暗号の結果、例えば、特異的な宿主に対する最適化コドン使用として縮重されている配列を含む。本明細書で使用される場合、「最適化」は、所与の種におけるその発現を増加させるように遺伝子組み換えされているポリヌクレオチドを指す。インフルエンザポリペプチドをコードする最適化ポリヌクレオチドを提供するために、インフルエンザタンパク質遺伝子のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列は、１）特定の種において高度に発現される遺伝子によって好まれるコドンを含むように、２）該種において実質的に認められるヌクレオチド塩基組成中のＡ＋ＴまたはＧ＋Ｃ含量を含むように、３）該種の開始配列を形成するように、または４）不安定化、不適切なポリアデニル化、分解およびＲＮＡの停止を引き起こす配列、もしくは二次構造のヘアピンまたはＲＮＡスプライス部位を形成する配列を排除するように修飾され得る。該種におけるインフルエンザタンパク質の発現の増加は、真核細胞および原核細胞において、または特定の種においてコドン使用の頻度分布を利用することによって得ることができる。「好ましいコドン使用の頻度」という用語は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用において特異的な宿主細胞によって示される優先傾向を指す。２０種の天然アミノ酸があり、それらの大部分は、２つ以上のコドンによって特定される。したがって、全ての縮重ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列によってコード化されたインフルエンザポリヌクレオチドのアミノ酸配列が、機能的に変化していない限りにおいて、本開示に含まれる。
【００９２】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実施され得る。ハイブリダイゼーション反応ストリンジェンシーを増加させる条件は周知である。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）を参照されたい。
【００９３】
本発明のＤＮＡワクチンの作製および投与に関する追加の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９２７，８７０号で見ることができる。ＲＮＡワクチンの作製および使用に関する追加の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ”，２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０，４４１４−４４１８で見られる。
ワクチン調製物
【００９４】
Ｍ１ポリペプチドの調製法は、当該技術分野において周知である。Ｍ１ポリペプチドは、所望の純度で、かつ免疫応答を誘導するのに十分な濃度で、生理学的に許容できる担体と混合される。生理学的に許容できる担体は、ワクチンで使用されると投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。一般的には、ワクチンは、注射用に、通常、筋肉内または皮下注射ように処方される。注射用に好適な担体には、滅菌水が含まれるが、好ましくは、生理食塩水などの生理的塩溶液、またはリン酸緩衝生理食塩水もしくは乳酸リンゲルなどの緩衝塩溶液である。ワクチンは、一般的に、アジュバントを含有する。有用なアジュバントには、細胞傷害性Ｔ細胞を刺激するＱＳ２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．から市販されている、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ））、およびミョウバン（水酸化アルミニウムアジュバント）が挙げられる。細胞性免疫または局所免疫を向上させる種々のアジュバントを有する処方も使用することができる。特に、サイトカインなどの免疫増強物質が、ワクチンに含まれ得る。好適な免疫増強サイトカインの例には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）ならびにインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）などのインターロイキン、および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）が挙げられる。
【００９５】
ワクチン中に存在し得る追加の賦形剤には、低分子量ポリペプチド（約１０個未満の残基）、タンパク質、アミノ酸、グルコースまたはデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、およびタンパク質を安定化するか、または微生物の増殖を阻害する他の賦形剤が挙げられる。
【００９６】
本発明によるワクチンはまた、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するタンパク質を発現するように特別に設計された、１つ以上の遺伝子操作を受けたウイルスも含有することができる。好適な遺伝子操作を受けたウイルスは、例えば、カナリア痘ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、弱毒化ヒトヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルスなど）、および水痘帯状疱疹ウイルス由来のものである。例示の遺伝子操作を受けたウイルスは、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することができるＭ１ポリペプチドを発現するように改変されている。Ｍ１ポリペプチドワクチンによる免疫付与は、免疫応答を引き起こすための、Ｍ１ポリペプチド配列（複数可）の１つ以上の用量の投与を伴う。
【００９７】
一実施形態では、本発明に従って使用するための一次組成物はアジュバントである。特定の実施形態では、アジュバントは、水中油乳濁液系アジュバントまたはアジュバント系である。一実施形態では、水中油乳濁液は、代謝性油と、乳化剤と、任意にステロールおよび／またはアルファ−トコフェノールなどのトコールとを含む。別の特定の実施形態では、該水中油乳濁液アジュバントは、全量の０．５％〜２０％の量で、少なくとも７０％強が１μｍ未満の直径を有する油滴を有する、少なくとも１つの代謝性油を含む。
【００９８】
代謝性油という用語の意味は、当該技術分野において周知である。代謝性を、「代謝により変換され得ること」と定義することができる（Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７４））。油は、レシピエントに対して非毒性的であり、代謝により転換され得る任意の植物油、魚油、動物油または合成油であってよい。ナッツ、種子、および穀類は植物油の一般的な起源である。合成油も本発明の一部であり、ＮＥＯＢＥＥ（商標）などの市販の油が挙げられる。特に好適な代謝性油はスクアレンである。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメ肝油中に大量に認められ、オリーブ油、小麦胚種油、米ぬか油、および酵母中に少量認められる不飽和の油であり、本発明における使用にとって特に好適な油である。スクアレンは、コレステロールの生合成の間に酵素的に転換されるという事実のため、代謝性油である（Ｍｅｒｃｋ  ｉｎｄｅｘ，１０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｎｔｒｙ  ｎｏ．８６１９）。一実施形態では、代謝性油は、免疫原性組成物の全量の０．５％〜２０％（最終濃度）の量、好適には、全量の１．０％〜１０％の量、好適には、全量の２．０％〜６．０％の量で存在する。特定の実施形態においては、代謝性油は、免疫原性組成物の全量の約０．２５〜１．２５体積％の量で存在する。
【００９９】
好適には、本発明の水中油乳濁液系は、サブミクロン範囲の小さい油滴サイズを有する。好適には、液滴サイズは、直径１２０〜７５０ｎｍ、好適には、１２０〜６００ｎｍの範囲であろう。典型的には、水中油乳濁液は、少なくとも７０％強が直径５００ｎｍ未満であり、特に、少なくとも８０％強が直径３００ｎｍ未満であり、好適には、少なくとも９０％強が直径１２０〜２００ｎｍの範囲である油滴を含有する。
【０１００】
本発明による水中油乳濁液はまたステロールおよび／またはトコフェロール、特に、アルファトコフェロールなどのトコールを含む。ステロールは当該技術分野において周知であり、例えば、コレステロールはよく知られており、例えば、動物脂肪中に認められる天然ステロールとして、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１１ｔｈ  Ｅｄｎ．，３４１頁に開示されている。他の好適なステロールとしては、β−シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、およびエルゴカルシフェロールが挙げられる。該ステロールは、好適には、免疫原性組成物の全量の約０．０１重量／体積％〜約２０重量／体積％の量、好適には、約０．１重量／体積％〜約５重量／体積％の量で存在する。好適には、ステロールがコレステロールである場合、それは免疫原性組成物の全量の約０．０２重量／体積％〜約０．２重量／体積％の量で、典型的には、０．５ｍｌのワクチン用量中、約０．０２重量／体積％の量で存在する。
【０１０１】
トコール（例えば、ビタミンＥ）はまた、油乳濁液アジュバントにおいて使用されることも多い（欧州特許第０３８２２７１  Ｂ１号；米国特許第５，６６７，７８４号；国際特許第ＷＯ９５／１７２１０号）。本発明の油乳濁液（必要に応じて、水中油乳濁液）において用いられるトコールを、トコールが、必要に応じて直径１ミクロン未満の乳化剤を含むトコール液滴の分散物であってよい欧州特許第０３８２２７１  Ｂ１号に記載のように製剤化することができる。あるいは、トコールを、別の油と共に用いて、油乳濁液の油相を形成させることができる。上記の代謝性油などの、トコールと組み合わせて用いることができる油乳濁液の例は、本明細書に記載されている。
【０１０２】
水中油乳濁液は、乳化剤を含む。乳化剤は、免疫原性組成物の約０．０１〜約５．０重量％（ｗ／ｗ）の量で、好適には、約０．１〜約２．０重量％（ｗ／ｗ）の量で存在してもよい。好適な濃度は、全組成物の約０．５〜約１．５重量％（ｗ／ｗ）である。
【０１０３】
乳化剤は、好適にはポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸（ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０）であってよい。特定の実施形態においては、０．５ｍｌのワクチン用量は、１重量％のＴｗｅｅｎ８０を含み、０．７ｍｌのワクチン用量は約０．７重量％のＴｗｅｅｎ８０を含む。別の特定の実施形態においては、Ｔｗｅｅｎ８０の濃度は約０．１重量％または約０．２重量％である。一態様においては、ポリソルベート８０の量は、ワクチン用量あたり約４．９ｍｇ、好適には、ワクチン用量あたり約４．６〜約５．２ｍｇである。別の態様においては、ポリソルベート８０の量は、ワクチン用量あたり約２．４ｍｇ、好適には、ワクチン用量あたり約２．０〜約２．８ｍｇである。別の態様においては、ポリソルベート８０の量は、ワクチン用量あたり約１．２ｍｇ、好適には、ワクチン用量あたり約１．０〜約１．５ｍｇである。別の態様においては、ポリソルベート８０の量は、ワクチン用量あたり約０．６ｍｇ、好適には、ワクチン用量あたり約０．４〜０．８ｍｇである。
【０１０４】
水中油乳濁液アジュバントを他のアジュバントまたは免疫刺激剤と共に使用することができ、したがって、本発明の重要な実施形態は、スクアレンもしくは別の代謝性油、アルファトコフェロールなどのトコフェロール、およびｔｗｅｅｎ８０を含む水中油製剤である。水中油乳濁液はまた、Ｓｐａｎ８５（ポリオキシエチレントリオレイン酸ソルビタン）および／またはレシチンを含んでもよい。典型的には、水中油は、免疫原性組成物の全量の約２〜約１０％のスクアレン、２〜１０％のアルファトコフェロールおよび約０．３〜約３％のＴｗｅｅｎ８０を含み得、また国際特許第ＷＯ９５／１７２１０号に記載の手順に従って製造することができる。好適には、スクアレン：アルファトコフェロールの比率は１以下であるが、それはこれがより安定な乳濁液を提供するからである。Ｓｐａｎ８５はまた、例えば、約１％のレベルで存在してもよい。
【０１０５】
インフルエンザワクチン調製物を、チオマーサルなどの保存剤の存在下で調製することができる。好適には、保存剤、特に、チオマーサルは約１００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。あるいは、インフルエンザワクチン調製物を、２０μｇ／ｍｌを超えない濃度、または好適には５μｇ／ｍｌ未満の濃度などの低レベルの保存剤、特に、チオマーサルの存在下で調製する。別の好適な代替的な実施形態においては、インフルエンザワクチン調製物を、チオマーサルの非存在下で作製する。好適には、得られるインフルエンザワクチン調製物は、有機水銀保存剤の非存在下で安定であり、特に、この調製物は残留チオマーサルを含まない。特に、インフルエンザウイルス調製物は、チオマーサルの非存在下で、または低レベルのチオマーサル（一般的には、５μｇ／ｍｌ以下）の存在下で安定化されたＭ１ポリペプチド抗原を含む。具体的には、Ｂインフルエンザ株の安定化を、α−トコフェロールコハク酸（コハク酸ビタミンＥ、すなわち、ＶＥＳとしても知られる）などのアルファトコフェロールの誘導体により実施する。そのような調製物およびそれらを調製する方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許第ＷＯ０２／０９７０７２号に開示されている。
【０１０６】
アジュバント化Ｍ１ポリペプチドワクチンの１回用量の容量は、約０．２５〜１ｍｌであってよく、通常は成人用製剤については約０．５ｍｌに相当する。好適には、０．５ｍｌの成人用量は、約０．２５ｍｌのアジュバントと約０．２５ｍｌの抗原に相当する。各ワクチン用量は、約１５μｇのＭ１ポリペプチドを含んでもよい。代替的な実施形態においては、各ワクチン用量は、約１５μｇ未満、好適には、約１０μｇ未満の量などの、少量のＭ１ポリペプチドを含む。好適な量は、約２μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約７．５μｇ、もしくは約１０μｇのＭ１ポリペプチド、またはワクチン組成物が本明細書で定義される効力基準の少なくとも１つを満たすように、約１５μｇより低い任意の好適な量のＭ１ポリペプチドである。有利には、約１μｇのＭ１ポリペプチド用量、または上記で定義された規制基準を満たすことを可能にする約０．５μｇなどのさらに低いＭ１ポリペプチド用量である。約１ｍｌのワクチン用量（例えば、約０．５ｍｌのアジュバントと約０．５ｍｌの抗原調製物）も好適である。約０．２５ｍｌのワクチン用量（例えば、約０．１２５ｍｌのアジュバントと約０．１２５ｍｌの抗原調製物）も、特に幼児集団にとっては好適である。Ｍ１ポリペプチドワクチンの１回用量の容量は、約０．２５〜１ｍｌであってよく、通常は成人用製剤については約０．５ｍｌに相当する。好適には、０．５ｍｌの成人用量は、約０．２５ｍｌのアジュバントと約０．２５ｍｌの抗原に相当する。約１ｍｌのワクチン用量（例えば、約０．５ｍｌのアジュバントと約０．５ｍｌの抗原調製物）も好適である。約０．２５ｍｌのワクチン用量（例えば、約０．１２５ｍｌのアジュバントと約０．１２５ｍｌの抗原調製物）も、特に幼児集団にとっては好適である。
免疫刺激剤
【０１０７】
別の実施形態においては、本組成物は、さらなるアジュバント、特に、ＴＬＲ−４リガンドアジュバント、好適には、リピドＡの非毒性誘導体を含んでもよい。好適なＴＬＲ−４リガンドは、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。他の好適なＴＬＲ−４リガンドは、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）およびその誘導体、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）およびＲＳＶのＦタンパク質である。
【０１０８】
一実施形態においては、本組成物はさらに、リピドＡの非毒性誘導体、特に、モノホスホリルリピドＡまたはより具体的には、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドを含んでもよい。
【０１０９】
好ましくは３Ｄ−ＭＰＬである該リポポリサッカリドを、免疫原性組成物のヒト用量あたり、１〜５０μｇの量で用いることができる。有利には、３Ｄ−ＭＰＬを、約２５μｇ、例えば、２０〜３０μｇ、好適には、２１〜２９μｇまたは２２〜２８μｇまたは２３〜２７μｇまたは２４〜２７μｇ、または２５μｇのレベルで用いる。別の実施形態においては、免疫原性組成物のヒト用量は、約１０μｇ、例えば、５〜１５μｇ、好適には６〜１４μｇ、例えば、７〜１３μｇまたは８〜１２μｇまたは９〜１１μｇ、または１０μｇのレベルの３Ｄ−ＭＰＬを含む。さらなる実施形態においては、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇ、例えば、１〜９μｇ、または２〜８μｇまたは好適には３〜７μｇまたは４〜６μｇ、または５μｇのレベルの３Ｄ−ＭＰＬを含む。
【０１１０】
ＭＰＬの用量は、好適には、ヒトにおいて抗原に対する免疫応答を増強することができる。特に、好適なＭＰＬ量は、非アジュバント化組成物と比較して、または別のＭＰＬ量でアジュバント化された組成物と比較して、本組成物の免疫学的能力を改善するが、反応原性プロファイルから許容されるものである。
【０１１１】
リピドＡの合成誘導体は既知であり、いくつかはＴＬＲ−４アゴニストとして記載されており、限定されるものではないが、ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルリン酸二水素）（国際特許第ＷＯ９５／１４０２６号）、ＯＭ２９４ＤＰ（３Ｓ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１，１０−ビス（リン酸二水素）（国際特許第ＷＯ９９／６４３０１号および国際特許第ＷＯ００／０４６２号）、ＯＭ１９７ＭＰ−ＡｃＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１−リン酸二水素１０−（６−アミノヘキサン酸）（国際特許第ＷＯ０１／４６１２７号）が挙げられる。
【０１１２】
用いることができる他のＴＬＲ４リガンドは、国際特許第ＷＯ９８５０３９９号もしくは米国特許第６，３０３，３４７号に開示されたものなどのアルキルグルコサミニドリン酸（ＡＧＰ）（ＡＧＰの調製のためのプロセスも開示されている）、または米国特許第６，７６４，８４０号に開示されたＡＧＰの薬学的に許容できる塩であり、全ての３つの特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかのＡＧＰはＴＬＲ４アゴニストであり、いくつかはＴＬＲ４アンタゴニストである。両方ともアジュバントとして有用であると考えられる。
【０１１３】
ＴＬＲ−４を介してシグナリング応答を引き起こすことができる他の好適なＴＬＲ−４リガンド（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｂｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＩ  ２００３  ｐ１６３０−５）は、例えば、グラム陰性細菌に由来するリポポリサッカリドおよびその誘導体、またはその断片、特に、ＬＰＳの非毒性誘導体（３Ｄ−ＭＰＬ）など）である。他の好適なＴＬＲアゴニストは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５、または９０；界面活性剤プロテインＡ、ヒアルロナンオリゴサッカリド、硫酸ヘパラン断片、フィブロネクチン断片、フィブリノゲンペプチドおよびｂ−ディフェンシン−２、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）または呼吸器合胞体ウイルスのＦタンパク質である。いくつかの実施形態においては、ＴＬＲアゴニストはＨＳＰ  ６０、７０、または９０である。
【０１１４】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、昆虫とヒトの間で進化的に保存されたＩ型膜貫通受容体である。１０種のＴＬＲがこれまでのところ確立されている（ＴＬＲ１〜１０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｂｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＩ  ２００３  ｐ１６３０−５）。ＴＬＲファミリーのメンバーは、類似する細胞外および細胞内ドメインを有する；その細胞外ドメインはロイシンに富む反復配列を有し、その細胞内ドメインはインターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の細胞内領域と類似することが示された。ＴＬＲ細胞は免疫細胞および他の細胞（血管上皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞および腸上皮細胞など）の間で示差的に発現される。ＴＬＲの細胞内ドメインは、その細胞質領域中にＩＬ−１Ｒドメインを有する、アダプタータンパク質Ｍｙｄ８８と相互作用し、サイトカインのＮＦ−ＫＢ活性化を誘導することができる；このＭｙｄ８８経路は、サイトカイン放出がＴＬＲ活性化により行われる１つの方法である。ＴＬＲは、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージなど）などの細胞型において主に発現される。
【０１１５】
別の実施形態においては、本アジュバントおよび免疫原性組成物は、サポニンアジュバントをさらに含む。本発明における使用にとって特に好適なサポニンは、Ｑｕｉｌ  Ａおよびその誘導体である。Ｑｕｉｌ  Ａは、南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）から単離されたサポニン調製物であり、アジュバント活性を有すると１９７４年にＤａｌｓｇａａｒｄらにより初めて記載された（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、“Ｓａｐｏｎｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ａｒｃｈｉｖ．ｆｕｒ  ｄｉｅ  ｇｅｓａｍｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，Ｖｏｌ．４４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐ２４３−２５４）。Ｑｕｉｌ  Ａに関連する毒性を有せずにアジュバント活性を保持するＱｕｉｌ  Ａ（欧州特許第０３６２２７８号）の好ましい断片がＨＰＬＣにより単離されており、例えば、ＱＳ７およびＱＳ２１（ＱＡ７およびＱＡ２１としても知られる）が挙げられる。ＱＳ−２１は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮から誘導される天然サポニンであり、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｔｈ１細胞および主要なＩｇＧ２ａ抗体応答を誘導し、本発明の内容において好ましいサポニンである。本発明の好適な形態においては、免疫原性組成物内のサポニンアジュバントは、サポナリア・モリナのｑｕｉｌ  Ａの誘導体、好ましくは、Ｑｕｉｌ  Ａの免疫学的に活性な画分、例えば、ＱＳ−１７もしくはＱＳ−２１、好適には、ＱＳ−２１である。一実施形態においては、本発明の組成物は、実質的に純粋な形態の免疫学的に活性なサポニン画分を含む。好ましくは、本発明の組成物は、実質的に純粋な形態のＱＳ２１を含み、すなわち、ＱＳ２１は少なくとも９０％純粋であり、例えば、少なくとも９５％純粋、または少なくとも９８％純粋である。
【０１１６】
他の有用なサポニンは、植物アスクラス・ヒッポカスタナム（Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）またはギオフィラ・ストラチウム（ｇｙｏｐｈｉｌｌａ  ｓｔｒｕｔｈｉｕｍ）に由来する。文献に記載された他のサポニンとしては、トチノキの種子中に存在するサポニン、アスクラス・ヒッポカスタナム（Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）の混合物としてＭｅｒｃｋ  ｉｎｄｅｘ（第１２版、エントリー番号３７３７）に記載されたエスチンが挙げられる。その単離は、クロマトグラフィーおよび精製（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈ．４，２１３（１９５３））、ならびにイオン交換樹脂（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｒｂｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第３，２３８，２９０号）により記載されている。エスチンの画分は精製されており、生物学的に活性であることが示されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）１９９６  Ａｕｇｕｓｔ；４４（８）：１４５４−１４６４）。ジプソフィラ・ストラチウム（ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｓｔｒｕｔｈｉｕｍ．）に由来するサポニン（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒ．Ｖｏｃｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．，４２，２１３−２２６）も選択肢の一つである。
【０１１７】
３Ｄ−ＭＰＬおよび／またはＱＳ２１の用量は、好適には、ヒトにおいて抗原に対する免疫応答を増強することができる。特に、好適な３Ｄ−ＭＰＬおよび／またはＱＳ２１量は、非アジュバント化組成物と比較して、または別の３Ｄ−ＭＰＬまたはＱＳ２１量でアジュバント化された組成物と比較して、本組成物の免疫学的能力を改善するが、反応原性プロファイルから許容されるものである。典型的には、ヒトへの投与のために、サポニン（例えば、ＱＳ２１）および／またはＬＰＳ誘導体（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）は、用量あたり１０〜５０μｇ、または１μｇ〜２５μｇなどの１μｇ〜２００μｇの範囲で免疫原性組成物のヒト用量中に存在するであろう。
【０１１８】
追加の免疫刺激剤が含まれるアジュバントは、幼児用および／または高齢者用ワクチン製剤にとって特に好適である。
ワクチン接種
【０１１９】
本発明の組成物を、皮内、粘膜、例えば、鼻内、経口、筋肉内、皮下、硬膜内、静脈内、粘膜などの任意の好適な送達経路により投与することができる。他の送達経路は、当該技術分野において周知である。
【０１２０】
筋肉内送達経路は、本発明のＭ１ポリペプチド組成物にとって特に好適である。本発明による組成物を、特にパンデミックワクチンにとって好適な、単回投与容器、またはあるいは、複数回投与容器中で提供することができる。この例においては、チオマーサルなどの抗微生物保存剤は、典型的には、使用中の夾雑を防止するために存在する。チオマーサル濃度は、２５μｇ／０．５ｍｌ用量（すなわち、５０μｇ／ｍＬ）であってよい。好適には、５μｇ／０．５ｍｌ用量（すなわち、１０μｇ／ｍｌ）または１０μｇ／０．５ｍｌ用量（すなわち、２０μｇ／ｍｌ）のチオマーサル濃度が存在する。針を用いない液体ジェット注入装置、例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ  ２０００（Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）などの好適なＩＭ送達装置を用いることができる。あるいは、ペン−インジェクター装置を用いることができる。そのような送達装置の使用は、パンデミックの間に必要とされるものなどの大規模免疫付与キャンペーンに特に従順であってよい。
【０１２１】
皮内送達は、別の好適な経路である。任意の好適な装置、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許第ＷＯ９９／３４８５０号および欧州特許第１０９２４４４号に記載のもの、およびその機能的等価物などの、針を用いないか、または短い針の装置を、皮内送達に用いることができる。また、液体ジェットインジェクターまたは角質層を貫通し、真皮に到達するジェットを生成する針を介して、液体ワクチンを真皮に送達するジェット注入装置も好適である。また、皮膚の外側層から真皮に向かって粉末形態のワクチンを加速するために圧縮ガスを使用する弾道粉末／粒子送達装置も好適である。さらに、皮内投与の古典的なマントゥー法においては、従来のシリンジを用いることができる。
【０１２２】
別の好適な投与経路は、皮下経路である。皮下送達のためには、任意の好適な装置、例えば、古典的な針または針を用いないジェットインジェクターサービスを用いることができる。好適には、該装置に、液体ワクチン製剤を予め充填する。
【０１２３】
あるいは、本ワクチンを鼻内投与する。典型的には、本ワクチンを、好適には、肺に吸入させずに、鼻咽頭領域に局所投与する。ワクチン製剤を肺に進入させないか、または実質的に進入させずに、それを鼻咽頭領域に送達する鼻内送達装置を用いることが望ましい。本発明によるワクチンの鼻内投与のための好適な装置は、スプレー装置であり、それらは当該技術分野において周知である。
【０１２４】
あるいは、表皮または経皮ワクチン接種経路も本発明において企図される。
抗体
【０１２５】
本発明の抗体は、本発明のＭ１ポリペプチドのうちの１つ以上に対して結合特異性を有するであろう。本発明の抗体は、上述の全ての形態を包含する。一実施形態では、本抗体は、特定の生物体のために遺伝子操作を受けているであろう。生物体は、ヒト、イヌ、または、例えば、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリ、もしくは他の鳥類などの商業的に価値のある家畜とすることができる。抗体のこのような遺伝子操作には、例えば、ヒト化、ヒューマニア化、キメラ化、または当該技術分野において既知のレパートリー技術もしくはモノクローナル技術のいずれかを用いるヒト（もしくは他の生物体の）抗体の単離が挙げられる。
【０１２６】
抗原特異的ヒト抗体の単離のための確立された方法には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むようにトランスジェニックされたマウスからのハイブリドーマのスクリーニング（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊａｋｏｂａｖｉｔｓ，１９９８，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．３１：３３−４２）、および糸状バクテリオファージ上で発現され、かつコード化されたヒト抗体断片の組換えライブラリー（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４）、酵母細胞（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，１９９７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：５５３−５５７）、およびリボソーム（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９４：４９３７−４９４２）が固定化抗原に対してパンニングされるインビトロ法が挙げられる。これらの方法は、多くの有用なヒト抗体をもたらしている。
【０１２７】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウスは、一般的に、ヒトの多様性全ては発現しないが、これらのトランスジェニック動物において発現されるヒト抗体は、親和性成熟を受けることができる。所望のより高い親和性および特異性の抗体は、これらのトランスジェニックマウスから得ることができるが、これに対して、ディスプレイ技術から得たヒト抗体は、これらのディスプレイ抗体がディスプレイ系内で自然の親和性成熟を受けないために、使用される抗体レパートリーによって制限されるであろう。
【０１２８】
特異性および親和性を維持しながら、非ヒト抗体の免疫原性を最小限に抑えるために最も広く使用されている方法は、非ヒト抗体のＣＤＲを、通常、非ヒトフレームワークに対するそれらの構造的相同性のために選択されるヒトフレームワーク上にグラフト化させることを伴う（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５；米国特許第５，２２５，５３９号、これらの双方ともに、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。元々は、これらの方法は、親和性の大幅な損失をもたらした。しかしながら、その後、親和性のいくつかが、非ヒトＣＤＲ１および２の標準的な構造を維持するために必要とされるフレームワーク内の重要な位置において非ヒト残基を復元することによって回復され得ることが示された（Ｂａｊｏｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：２２０８１−４；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１−５３；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，１９９７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７３：９２７−４８、これらの全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＤＲ３の天然の立体配座を回復することは、それらの構造が非常に変化しやすいために、はるかに不確実な企てである。したがって、どの非ヒト残基が復元され、機能的ＣＤＲ３立体配座を回復させるかを決定することは、可能な試行錯誤を組み合わせてのモデリングの大きな問題である。ＣＤＲグラフティングによる抗体のヒト化のための例示の方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許６，１８０，３７０号に開示されている。
【０１２９】
従来のＣＤＲグラフティングアプローチに対する改良は、様々なハイブリッド選択アプローチを使用し、この中で、非ヒト抗体の一部が、抗原結合のための選択の連続的なラウンドにおいて、相補的ヒト抗体配列のライブラリーと組み合わされおり、その過程において、非ヒト配列の大部分が、ヒト配列で徐々に置き換えられる。例えば、鎖シャッフリング技術（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−８３）において、非ヒト鎖の親和性が、抗原上の同じエピトープに対するヒトパートナーの選択を制約するのに十分であろうという理論的根拠に基づいて、非ヒト抗体の１本の鎖は、他の鎖のナイーブなヒトレパートリーと組み合わされる。選択されたヒトパートナーは、次いで、残りの非ヒト鎖のためのヒト対応物の選択をガイドするために使用される。
【０１３０】
他の方法論には、鎖置換技術が含まれ、ここでは、非ヒトＣＤＲ３は保持されており、フレームワークとＣＤＲ１および２とを含むＶ領域の残部のみが、逐次的に実施される工程においてここに置き換えられる（例えば、米国特許出願第２００３０１６６８７１号；Ｒａｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：８９１０−１５，１９９８；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３６０７３−３６０７８，２０００；Ｒａｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１３６６８−１３６７６，２０００、これらの全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３１】
上記の方法論は、所望の宿主を適切な抗体配列のドナーとして用いることによって、抗Ｍ１ポリペプチド抗体の宿主範囲を変更するために、本発明の抗Ｍ１ポリペプチド抗体で使用することができる。
【０１３２】
一実施形態では、本発明の抗Ｍ１ポリペプチド抗体は、生物体の体内における抗体の半減期を向上させる分子で修飾されている。このような修飾には、例えば、ＰＥＧ化、またはデキストランなどの他の親水性ポリマー、または他のポリカーボハイドレート、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）などとの誘導体化が含まれる。このような誘導体化のためのかかるポリマーは、当該技術分野において周知である。
【０１３３】
一実施形態では、本発明の抗体は、アミノ酸２２０〜２３８位にわたるインフルエンザウイルス基質（Ｍ１）タンパク質のＣ末端領域に結合するモノクローナル抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９を含む。ハイブリドーマは、ＰＲ／８Ｍタンパク質に対して産生され、その結合は、配列ＧＨＴＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱにマッピングされている。一実施形態では、抗Ｍ１抗体は、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９であるか、または２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９のエピトープに結合する抗体であるか、または２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９のヒューマニア化、ヒト化、キメラ化、ないしは別の方法で遺伝子組み換えされた変異体である。
抗体による治療方法
【０１３４】
本発明は、抗Ｍ１ポリペプチド抗体の有効量を動物に投与することを含む治療方法を提供し、これにより、インフルエンザウイルスによるその後の感染症が重症度において低減され、および／または感染症が、インフルエンザ症状の持続時間において短縮される。一実施形態では、抗Ｍ１ポリペプチドの有効量は、動物がインフルエンザに感染した後に、動物に投与される。一実施形態では、抗Ｍ１ポリペプチドの有効量は、動物がインフルエンザに感染する前に、動物に投与される。一実施形態では、インフルエンザに感染した動物における抗Ｍ１ポリペプチド抗体の有効量の投与は、動物におけるインフルエンザ感染症の重症度を低減し、および／またはインフルエンザ症状の持続時間を短縮する。一実施形態では、抗Ｍ１ポリペプチド抗体療法で処置される動物は、ヒト患者である。
【０１３５】
一実施形態では、抗Ｍ１抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９は、５０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに静脈内投与され、次いでマウスは、株Ａ／ＰＲ／８／３４またはＡ／ＣＡ／０４／０９のインフルエンザウイルスを鼻腔内でチャレンジ感染させる。この抗体は、マウスＩｇＧ１アイソタイプである。マウスは、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９抗体から約５０％の防御を獲得した。抗Ｍ１抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９はまた、ＩｇＧ２ａなどのより活性なアイソタイプに遺伝子操作を受けて、チャレンジ感染実験を繰り返す。一実施形態では、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９に結合する抗Ｍ１抗体は、ヒトフレームワーク配列を有し、かつヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する。一実施形態では、抗Ｍ１抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプを有するヒト化またはヒューマニア化２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９である。これらの代替抗体は、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内もしくは鼻腔内投与によって、マウスまたはヒトに投与される。あるいは、これらの抗体は、鳥類、例えばニワトリに、家畜、例えば、ブタ、ウシ、ウマなどに、ペット、例えばイヌ、ネコなどに投与するために、遺伝子操作を受けてもよい。
【０１３６】
疾患の種類および重症度に応じて、抗Ｍ１ポリペプチド抗体の約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）が、例えば、１回以上の別個の投与による、または持続注入によるかのいずれかでの患者への投与のための初回投与量である。典型的な１日投与量は、患者の必要性に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であってもよい。特に望ましい投与量としては、例えば、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および１５ｍｇ／ｋｇが挙げられる。数日間にわたるまたはそれより長繰り返し投与の場合には、状態に応じて、当該技術分野において既知の方法によって測定される、インフルエンザ感染症が治療されるまで、治療は持続される。一実施形態では、他の投与レジメンが有用である場合もある。例えば、本発明の抗Ｍ１ポリペプチド抗体が、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、毎週、隔週、３週間毎、４週間毎に１回、または投与間のそれよりも長い期間で投与される場合、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇであるがこれらに限定されない用量が含まれる。本発明の療法の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易に監視される。
【０１３７】
本発明に従って使用される抗Ｍ１ポリペプチド抗体治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、任意の薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、一般的に凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、貯蔵用に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。抗体結晶も企図される（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００２／０１３６７１９号を参照されたい）。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１３８】
本明細書の製剤は、必要に応じて、治療のための２つ以上の活性化合物を含有してもよく、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものが望ましい。活性成分はまた例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルを、コロイド薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンで、例えばコアセルベーション法または界面重合により調製されるマイクロカプセルに捕捉することができる。このような技術は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１３９】
持続放出調製物を調製することができる。持続放出調製物の適切な例は、抗体を含む固形親水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメート共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ．ＲＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドとからなる注射可能なミクロスフィア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
ポリペプチドの製造
【０１４０】
本発明のＭ１ポリペプチドおよび／または抗体の製造のための組換え技術は、当該技術分野において周知である。本発明のＭ１ポリペプチドまたは抗体は、様々な宿主細胞型、例えば、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞などで製造することができる。酵母もしくは糸状菌、または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ネズミＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞、ヒト胎児由来腎臓１９３細胞、または齧歯類骨髄腫もしくはハイブリドーマ細胞など）、大腸菌、特定の昆虫細胞、および他の市販の宿主細胞系などのある特定の宿主細胞で使用するための組換え発現構築物またはベクターを作製するための技術は、当該技術分野において周知である。これらの宿主細胞中で組換えポリペプチドを発現すること、およびこれらの宿主細胞から組換えポリペプチドを得ることも、当該技術分野において周知である。一実施形態では、本発明の完全長抗体は、抗体をグリコシル化することができる宿主細胞系で作製されるであろう。一実施形態では、グリコシル化は、抗体で治療される標的生物体のグリコシル化であるだろう。一実施形態では、グリコシル化は、抗体で治療される標的生物体のグリコシル化に似ているであろう。代替実施形態では、グリコシル化は、グリコシル化がアジュバント効果を提供するが、抗体のエフェクター機能を実質的に損なわないように、治療される生物体のものとは異なるであろう。
【０１４１】
本発明のＭ１ポリペプチドはまた、ポリペプチド合成装置を用いる（例えば、試験管内で）化学合成によって作製することができる。
【０１４２】
本明細書で引用される全ての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許の各々が、その刊行物が引用しているものと関連付けて方法および／または材料を開示しかつ説明するために、本明細書に参照として組み込まれるように特異的かつ個別的に示されているのと同程度に、参照として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１４３】
実施例１．抗Ｍ１ポリペプチド抗体によるインフルエンザ感染症の阻害
モノクローナル抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９を、プラーク阻害アッセイにおいて、インフルエンザ株のパネルに対する結合について、および中和活性について検討した。モノクローナル抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９は、アミノ酸２２０〜２３６位にわたるインフルエンザウイルス基質（Ｍ１）タンパク質のＣ末端領域に結合する。２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９はまた、２２０〜２３７位、２２０〜２３８位、２２０〜２３９位、２２０〜２４０位、または２２０〜２４１位に和たるアミノ酸においてＭ１タンパク質に結合することができる。
【０１４４】
２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９を、ＭＤＣＫ細胞の部分的に感染した菌叢への寒天重層中に添加し、ＣＯ２と共に３７℃にて３日間インキュベートした（図１）。結果は、１５ｕｇの抗体が、プラーク形成を完全に阻害することを示した。２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９がウイルスまたは感染細胞上のＭタンパク質の露出部分にのみ到達したために、プラーク形成の防止は、ＰＲ／８からの基質タンパク質のＣ末端領域が表面到達可能であるべきことを示唆している。ＭＤＣＫ細胞の菌叢上のウイルスプラークの阻害を、２つの別個の方法によってさらに分析した。２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９抗体を含有する寒天重層の追加の前に、細胞をウイルスで感染させて、３０分間インキュベートした。あるいは、細胞を感染させる前に、ウイルスおよび抗体を混合して、３０分間インキュベートした。感染および更なる３０分間のインキュベーション後に、抗体を含まない寒天重層を添加した。結果は、阻害された総プラークにおいて、２つの実験の間の差異を示さなかった。これらの結果は、ウイルス感染の阻害が、感染細胞からのウイルス出芽の阻止によるものではなく、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９のウイルスへの結合に起因することを示唆している。追加試験は、プラークアッセイにおいて、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９がＡ／サウスダコタ（Ｈ１Ｎ１）のプラーク形成を阻害し、Ａ／ウルグアイ（Ｈ３Ｎ２）を部分的に阻害することを明らかにした（図２）。２３１位におけるアミノ酸変異は、抗体の効力の低下に起因し得る。しかしながら、部分的阻害であっても、Ｍタンパク質の伸張されたＣ末端（アミノ酸残基２１５〜２５２における）が表面露出されており、免疫付与のための実行可能な標的であることを示している。２３１位におけるアスパラギンまたはアスパラギン酸のいずれかを用いるさらなる試験を実施した。ＰＲ／８およびＡ／サウスダコタからのＭタンパク質は、２３１位にアスパラギンを含有し、一方Ａ／ウルグアイは、この位置にアスパラギン酸を含有する。加えて、ＰＲ／８およびサウスダコタは、Ｈ１Ｎ１表面糖タンパク質を有し、一方ウルグアイはＨ３Ｎ２表面糖タンパク質を有する。２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９が広範囲の中和活性を有するかどうかを決定するために、一連の中和実験を実施し、Ｈ１Ｎ１設定における２３１位の両アスパラギンおよびアスパラギン酸変異に対する有効性と、Ｈ３Ｎ２設定におけるアスパラギン酸設定に対する有効性を試験した。２３１位にアスパラギンを含有するＭタンパク質は、Ｈ３Ｎ２においては試験することができず、この変異が野生型ウイルスにおいては発生しないと考えられるためである。２種のウイルス、Ａ／ＷＳＮ／３３およびＡ／ポートチャーマーズ／１／７３を、プラーク阻害アッセイで試験した。Ａ／ＷＳＮ／３３は、Ｈ１Ｎ１ウイルスであるが、ＰＲ／８とは異なり、Ｍ１タンパク質の２３１位においてアスパラギン酸を含有する。Ａ／ポートチャーマーズ／１／７３は、２３１位にアスパラギン酸を含有する、Ｈ３Ｎ２ウイルスである。これと同時に、２種の対照ウイルス：Ａ／ＰＲ／８およびＡ／ＵＳＳＲ／９０／７７も試験を行った。ＰＲ／８およびＵＳＳＲ／９０は、ＡＡ２２０〜ＡＡ２３６に同じアミノ酸配列を有するが、異なるＨ１Ｎ１タンパク質を有する。結果は、全てのウイルスが、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９によって、用量依存的様式で阻害されることを示した（図３）。２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９によるプラーク形成の阻害は、２３１位でのアミノ酸変異によって影響されず、かつＨ３Ｎ２またはＨ１Ｎ１糖タンパク質のいずれによっても影響されなかった。上記データとＮＣＢＩデータベースに含まれる野生型Ｍタンパク質の配列解析とを組み合わせると、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９がＭ１の全ての既知の変異体に結合すると結論付けるのが妥当である。ワクチン設定におけるＣ末端ペプチド２１５〜２５２の提示は、積極的な抗体応答によって付与される十分に立証された効力を利用するポリクローナル抗体応答を生成し、これが、モノクローナル抗体とは対照的に、ワクチンによって付与される防護における非線形的な増加の結果につながるであろう。このポリクローナル抗体応答は、ワクチン接種された生物体の、Ａ型基質タンパク質を有するいかなるインフルエンザに対する例外なくあてはまる防御を提供するであろう。
実施例２．新しい抗Ｍ１ポリペプチド抗体
【０１４５】
Ａ／ＰＲ／８／３８インフルエンザウイルスからのＭ１タンパク質の２２０〜２３６のアミノ酸配列を含むＭ１ポリペプチドを、免疫原性担体タンパク質（ＫＬＨ、オボアルブミン、およびＢＳＡ）に複合化させて、１０〜１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。このＭ１ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＨＴＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮを有する。２回の連続する追加免疫を提供し、１つは、初回注射から１４日目に、もう１つは２８日目に行った。接種の直前および３回の注射のそれぞれから７日後に、血清血を採集した。採集した血清の分析は、２回目の追加免疫後に、Ｍ１ポリペプチドに対する、および全Ｍ１タンパク質それ自体に対する強い応答を示している。
【０１４６】
ペプチドＧＨＴＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮは、Ａ／ＰＲ／８基質タンパク質のアミノ酸配列２２０〜２３６を含む。このペプチドを、ＫＬＨ、オボアルブミン、およびＢＳＡに化学的に複合化した。
【０１４７】
１０〜１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、接種のための３つの群：Ａ群−対照（マウス７７〜８１）、Ｂ群−ペプチド複合体（マウス８２〜８６）、Ｃ群−ペプチドのみ（マウス８７〜９１）に無作為に割り付けた。全てのマウスに、１日目、１５日目、および２９日目に注射を施した。１日目の注射は、フロイント完全アジュバントを含み、その後の追加免疫は、フロイント不完全アジュバントを含有した。Ａ群のマウス（対照）には、５０ｕｇのＫＬＨを最初に注射し、５０ｕｇのオボアルブミンで２回追加免疫した（１５日目および２９日目）。Ｂ群のマウスには、５０ｕｇのＫＬＨ−ペプチド複合体を摂取し（１日目）、５０ｕｇのオボアルブミン−ペプチド複合体で２回追加免疫した（１５日目および２９日目）。Ｃ群のマウスには、Ｂ群に等しいモル濃度を表す量で、ペプチド（複合体なし）で注射および追加免疫した。
【０１４８】
マウスの３つの群を、ＢＳＡのみで（Ａ群、マウス７７〜８１）、Ｍ１ポリペプチド−ＢＳＡ複合体で（Ｂ群、マウス８２〜８６）、またはＭ１ポリペプチドのみで（Ｃ群、マウス８７〜９１）接種した。マウスを、ＢＳＡのみで（Ａ群）、Ｍ１ポリペプチド複合体で（Ｂ群）、またはＭ１ポリペプチドのみで（Ｃ群）のいずれかで２回追加免疫した。Ａ群（ＢＳＡのみ）から採取した血清は、ＢＳＡ、Ｍ１ポリペプチド複合体、およびＭ１タンパク質への結合を示さなかった（図１）。Ｂ群（Ｍ１ポリペプチド−ＢＳＡ複合体）から採取した血清は、Ｍ１ポリペプチド−ＢＳＡへの結合ならびにＭタンパク質への結合を示している。ＢＳＡへの結合は観察されず、このことは、Ｍ１ポリペプチドに対する結合が特異的であることを示している。Ｍ１ポリペプチドのみ（Ｃ群）から採取された血清は、ＢＳＡ、Ｍ１ポリペプチド−ＢＳＡ複合体、またはＭタンパク質への結合を表さなかった。
実施例３．グルコシル化を有するＭ１ポリペプチド
【０１４９】
免疫原性応答ならびに防御の比較を、Ｍ１ポリペプチドのグリコシル化形態および非グリコシル化形態を用いて、マウスモデルで評価した。２３１位における主な変異体は、この抗原部位への抗体の結合に影響を及ぼす可能性があり、２３１位で突然変異を有するＭ１ポリペプチドもまた試験される。
【０１５０】
精製した非グリコシル化Ｍ１ポリペプチドおよび変異体２３１  Ｍ１ポリペプチドを、等しい比率で合わせて、５０ｕｇをフロイントのアジュバントと共に、マウスの群（１０匹のマウス／群）に投与した。同時に、グリコシル化Ｍ１ポリペプチドを、フロイントのアジュバントと共に、マウスの追加の群に投与した。各群を、２週間後に、それらの対応のＭ１ポリペプチド１０ｕｇで追加免疫する。初回注射の１日前、追加免疫の１日前、および追加免疫の７日後に、およそ１００μｌの血液を各マウスから採取する。各マウスからの血清を、Ｍ１ポリペプチド（グリコシル化を有するか有しない）、Ｍ１タンパク質、および対照非特異的ペプチドに対する結合について分析する。２週間後に、１回のさらなる追加免疫を施し、追加免疫から７日後に血清を採集する。Ｍ１ポリペプチドの変異体に対する血清応答は、グリコシル化形態および非グリコシル化形態に対する応答の定量化を可能にし、またウイルスチャレンジ実験についての免疫付与スケジュールを決定する。
【０１５１】
マウスの６つの群（１０匹のマウス／群）を、Ｍ１ポリペプチドおよび変異体２３１  Ｍ１ポリペプチドで免疫付与および追加免疫する。３つの群は、組み合わされたグリコシル化Ｍ１ポリペプチドを受容するものであり（群１〜３）、３つの群は、アジュバントと共に非グリコシル化形態を受容するものである（群４〜６）。マウスを、最終追加免疫から３日後に、致死量のインフルエンザウイルスでチャレンジする。群は、Ｍタンパク質の３種の特定された変異体を再現するウイルスでチャレンジする：Ａ／ＰＲ／８（１群、４群）、Ａ／ＷＳＮもしくは等価物（２群、５群）、およびＡ／サウスダコタもしくは等価物（３群、６群）。３つの追加の群を、非免疫付与対照として、各ウイルスでチャレンジする。体温および生存を７日間にわたって測定する。
実施例４．抗Ｍ１ポリペプチド抗体によるインフルエンザウイルスの阻害
【０１５２】
インビトロでの抗体中和が、ウイルス感染のブロックにおいて有効であることが証明されたので、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９の生成物体内のウイルス感染をブロックする能力について試験した。生卵中のウイルス複製をブロックするための抗体の能力に基づいて、生全鶏卵を生動物の代用として使用した。伝統的には、インフルエンザウイルスの卵内感染が、（１）ワクチン製造のための種株としてのリアソータントウイルスを高収量で得る選択に、および（２）ワクチン製造のためのインフルエンザ株の製造に用いられている。インフルエンザウイルスの鶏卵ベースの製造は、インフルエンザウイルスの製造のための最も堅牢かつ最適な方法であると見なされている。したがって、この宿主におけるウイルス複製のブロックは、治療効力の強力な指標である。この実験では、ウイルスの卵内複製の阻止は、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９抗体の治療効力を決定するためのアッセイとして使用される。２００個の感染性ウイルス粒子（Ａ／ＰＲ／８／３４）を、７５０μｇ／ｍｌの２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９抗体中に混合した。Ａ／ＰＲ／８／３４は、その非常に高い量のウイルスを急速に複製する能力のために、リアソータント種ウイルスの製造に伝統的に使用されている。室温での３０分間のインキュベーションの後に、１００μｌの抗体ウイルスミックスを、１０日受精鶏卵中に注入した。抗体を含まないウイルスからなる対照もまた、１０日受精鶏卵中に注入した。卵をパラフィンで密封し、３５℃で４０時間インキュベートし、尿膜液を採取した。次いで、尿膜液を、標準赤血球凝集アッセイによって、ウイルスについて試験を行った。試料を、２倍まで段階希釈し、０．５％のニワトリ赤血球を添加した。室温で３０分間のインキュベーション後に、試料を赤血球凝集について採点した。２つの別個の同等な実験を実施した。
【表１】
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【０１５３】
対照１、２は、ＰＲ／８／３４のみ、ＰＲ／８＋Ａｂ１、２：ＰＲ／８＋７５０ｕｇ／ｍｌの２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９である。結果は、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９抗体の添加が、卵内のウイルス複製を完全にブロックすることを示した（表２）。１０日受精鶏卵における尿膜液の容量は１０ｍｌであり、したがって、卵内の抗体の最終濃度は７．５μｇ／ｍｌであった。
実施例５．マウスにおける抗Ｍ１抗体によるインフルエンザウイルスの阻害
【０１５４】
一実施形態では、抗Ｍ１抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９を、株Ａ／ＰＲ／８／３４またはＡ／ＣＡ／０４／０９の生インフルエンザウイルスと混合して、次いで、この混合物をマウスに鼻腔内投与した。５００μｇの抗Ｍ１抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９を、１×ＬＤ９０用量のインフルエンザウイルスと混合して、次いで、マウスに投与した。接種された全てのマウスは、抗Ｍ１抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９によってインフルエンザウイルス感染症から防御された。
【０１５５】
一実施形態では、抗Ｍ１抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９を、５０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに静脈内投与し、次いでマウスは、株Ａ／ＰＲ／８／３４またはＡ／ＣＡ／０４／０９のインフルエンザウイルスを鼻腔内でチャレンジ感染させた。この抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。マウスは、２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９抗体の前静脈内（ｐｒｅ−ｉ．ｖ．）注射による鼻腔内インフルエンザウイルスチャレンジから約１５％の防御を獲得した。
【０１５６】
抗Ｍ１抗体２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９はまた、ヒトＩｇＧ１アイソタイプへの遺伝子操作を受けて、チャレンジ感染実験を繰り返す。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９を、５０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに静脈内投与し（任意に、チャレンジの前に複数用量が投与される）、次いでマウスを、株Ａ／ＰＲ／８／３４、Ａ／ＣＡ／０４／０９、またはＡ／ビクトリア／３／７５のインフルエンザウイルスを鼻腔内でチャレンジ感染させる。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ２Ｂ−Ｂ１０−Ｇ９をまた、２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに鼻腔内投与し、次いでマウスを、株Ａ／ＰＲ／８／３４、Ａ／ＣＡ／０４／０９、またはＡ／ビクトリア／３／７５のインフルエンザウイルスを鼻腔内でチャレンジ感染させる。
実施例６．残基２２０〜２４２（配列番号２）、２２０〜２５２（配列番号３）、または２３３〜２５２（配列番号８０）を含むＭ１ポリペプチドによる免疫付与
【０１５７】
一実施形態では、３種の異なるＭ１ポリペプチドを、３種の異なる担体に複合化し、次いでウサギを免疫付与するために用いる。３種のＭ１ポリペプチドは、
ペプチド１（２２０〜２４２）ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫ（配列番号２）、
ペプチド２（２２０〜２５２）ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ  （配列番号３）、
ペプチド３（２３４〜２５２）ＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ（配列番号８０）である。
各ペプチドを、Ｎ末端における単一のシステイン残基で作製し、担体タンパク質へ複合化させた。これらのペプチド１〜３（それぞれ、配列番号２、３、および８０）のそれぞれを、日常的な方法を用いて、Ｎ末端システインを介して、担体タンパク質ＫＬＨ、オボアルブミン、およびＢＳＡに別個に複合化した。例えば、担体タンパク質は、製造元の指示に従って２−イミノチオランＨＣｌで処理し、活性化担体を、製造業者によって記載されたビス（マレイミド）ヘキサン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＢＭＨカタログ番号２２３３０）を用いてペプチドに複合化した。
【０１５８】
ウサギを、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｑｕｉｃｋ免疫刺激剤と組み合わされたフロイントの完全アジュバント中のＫＬＨ−ペプチド複合体２００μｇの皮内注射によって免疫付与した。７日後に、ウサギは、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｑｕｉｃｋ免疫刺激剤と組み合わされたフロイントの不完全アジュバント中のＫＬＨ−ペプチド複合体１００μｇの２回目の皮内注射を受けた。さらに７日後に（初回注射から１４日目）、ウサギは、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｑｕｉｃｋ免疫刺激剤と組み合わされたフロイントの不完全アジュバント中のＯＶＡ−ペプチド１または２複合体の１００μｇの２回目の皮内ブースター注射を受けた。初回注射の直前に各ウサギから血清を採集し、最終追加免疫から７日後（２１日目）、および最終ブースターから１４日後（２８日目）に、ウサギを全採血して、血清を採集した。
【０１５９】
ペプチド１および２の複合体を注射したウサギは、対応するペプチド１または２−ＢＳＡ複合体に対して強力な応答を示したが、一方、ペプチド３の複合体を注射したウサギは、ペプチド３−ＢＳＡ複合体と反応する抗体応答をほとんどまたは全く有しなかった。注射を施したウサギからの血清も、Ｍ１タンパク質に対して試験し、ペプチド１または２複合体を注射したウサギからの血清は、Ｍ１タンパク質に対する強力な抗体応答を提与したが、一方ペプチド３複合体を注射したウサギの血清は、Ｍ１タンパク質との反応をほとんどまたは全く供与しなかった。ペプチド１−複合体およびペプチド２−複合体を注射したウサギからの血清は、Ｍ１タンパク質に対して非常に強い応答を供与した。
【０１６０】
次いで、ウサギからの血清を、インフルエンザの異なる株によるプラーク形成の阻害について試験した。ＭＤＣＫ細胞をコンフルエンスまで増殖させて、インフルエンザウイルス（株Ａ／プエルトルコ／８（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／ビクトリア（Ｈ３Ｎ２））を５０のプラーク形成単位を、プレートに４５分間かけて添加し、４５分間のインキュベーション後に、ウイルスを含む緩衝液を除去し、細胞を洗浄した。ウサギ血清を異なる希釈率で含有する寒天重層を、ＭＤＣＫ細胞上に重ね合わせた。７２時間後に、寒天重層を除去し、細胞を固定化して、０．１％のクリスタルバイオレットで染色した。１：１００および１：２５０の免疫希釈で、ペプチド２複合体を注射したウサギからの血清は、免疫前にウサギ血清によって引き起こされるバックグラウンド阻害を上回る、Ａ／プエルトリコ／８（Ｈ１Ｎ１）からのプラーク形成の阻害を示した。ウイルスＡ／ビクトリア（Ｈ３Ｎ２）に対しては、ペプチド２−複合体を注射したウサギからの血清は、１：７５０および１：１０００の希釈で、免疫前血清を超える阻害を示した。また、ペプチド１−複合体からの血清は、１：４５の希釈で、Ａ／ビクトリア（Ｈ３Ｎ２）に対する免疫前血清を超えるプラーク形成の阻害を示した。
実施例７．残基２２３〜２４２（配列番号４）、２２３〜２５２（配列番号５）を含むＭ１ポリペプチドによる免疫付与
【０１６１】
一実施形態では、２種の異なるＭ１ポリペプチドを、３種の異なる担体に複合化し、次いでウサギを免疫付与するために用いる。２種のＭ１ポリペプチドは、
ペプチド４（２２３〜２４２）ＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫ（配列番号４）、
ペプチド５（２２３〜２５２）ＰＳＳＳＡＧＬＫＮＤＬＬＥＮＬＱＡＹＱＫＲＭＧＶＱＭＱＲＦＫ（配列番号５）である。
各ペプチドを、Ｎ末端における単一のシステイン残基で作製し、担体タンパク質へ複合化させる。これらのペプチ４または５（配列番号４または５）のそれぞれを、日常的な方法を用いて、Ｎ末端システインを介して、担体タンパク質ＫＬＨ、オボアルブミン、およびＢＳＡに別個に複合化した。
【０１６２】
ウサギを、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｑｕｉｃｋ免疫刺激剤と組み合わされたフロイントの完全アジュバント中のＫＬＨ−ペプチド複合体２００μｇの皮内注射によって免疫付与する。７日後に、ウサギは、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｑｕｉｃｋ免疫刺激剤と組み合わされたフロイントの完全アジュバント中のＫＬＨ−ペプチド複合体１００μｇの２回目の皮内注射を受ける。さらに７日後に（初回注射から１４日目）、ウサギは、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｑｕｉｃｋ免疫刺激剤と組み合わされたフロイントの完全アジュバント中のＯＶＡ−ペプチド複合体の１００μｇの２回目の皮内ブースター注射を受ける。各注射の直前に各ウサギから血清を採集し、最終追加免疫から７日後（２１日目）、および最終ブースターから１４日後（２８日目）に、ウサギを全採血して、血清を採集する。
【０１６３】
ウサギからの血清を、実施例６に記載したＢＳＡに複合化された抗ペプチド抗体についてのペプチド４および５に対して試験を行い、血清は、実施例６で記載されたプラーク阻害アッセイにおいて試験する。
【０１６４】
本明細書で引用される全ての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許の各々が、その刊行物が引用しているものと関連付けて方法および／または材料を開示しかつ説明するために、本明細書に参照として組み込まれるように特異的かつ個別的に示されているのと同程度に、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
当業者であれば、わずかな日常的な実験を用いるだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または確認することができるであろう。このような透過物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018535694.tif 000010
2018535694.tif 000011
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