(57)【要約】不妊症の処置における使用のためのＦＳＨ、例えば組換えＦＳＨを含む調製物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
９から２４μｇの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む、不妊症の処置における使用のための組成物であって、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定された患者への投与のための組成物。
【請求項２】
連日投与のための、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定され、かつ血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌを有すると同定された患者への投与のための、請求項１または請求項２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定され、かつ血清ＡＭＨレベル０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌを有すると同定された患者への投与のための、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項５】
不妊症の処置が、患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定するステップ、およびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する（と同定された）患者にＦＳＨを投与するステップを含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項６】
不妊症の処置が、患者の血清ＡＭＨレベルを同定するステップ、および１５ｐｍｏｌ／Ｌ未満の血清ＡＭＨレベルを有する（と同定された）患者にＦＳＨを投与するステップを含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項７】
血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌを有し、かつＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者における不妊症の処置における使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む組成物であって、１日あたり９から２４μｇの用量または相当量の組換えＦＳＨが投与され、不妊症の処置が、患者の血清ＡＭＨレベルを同定するステップ、患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定するステップ、ならびに血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬかつＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅrを有する患者に組成物を投与するステップを含む、組成物。
【請求項８】
血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌを有し、かつＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／sｅrを有する患者における不妊症の処置のための、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
１２μｇ超から２４μｇのＦＳＨを含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
処置の１日目に開始し、６から１６日間継続するＦＳＨの投与のための、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
１２μｇ超から２４μｇの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む、不妊症の処置における使用のための組成物であって、処置前にＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定され、かつ処置前に血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌを有すると同定された患者への投与のための組成物。
【請求項１２】
１０から１２μｇの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む、不妊症の処置における使用のための組成物であって、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有すると（処置前に）同定された患者への投与のための組成物。
【請求項１３】
１０から１２μｇの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む、不妊症の処置における使用のための組成物であって、処置前にＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有すると同定され、かつ処置前に血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌを有すると同定された患者への投与のための組成物。
【請求項１４】
ＦＳＨが組換えＦＳＨである、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
ＦＳＨがα２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨである、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
組換えＦＳＨがα２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含み、全シアル酸付加の１から９９％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の９９％から１％がα２，３−シアル酸付加である、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
組換えＦＳＨがα２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含み、全シアル酸付加の１から５０％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の５０％から９９％がα２，３−シアル酸付加である、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
不妊症の処置が、
（ａ）患者の血清ＡＭＨレベルを同定するステップ；
（ｂ）患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定するステップ；ならびに
（ｃ）血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定された患者に１日あたり９から２４μｇの用量または相当量の組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を投与するステップ
を含む、不妊症の処置方法。
【請求項１９】
不妊症の処置が、
（ａ）患者の血清ＡＭＨレベルを同定するステップ；
（ｂ）患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定するステップ；ならびに
（ｃ）血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有すると同定された患者に１日あたり１０から１２μｇの用量または相当量の組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を投与するステップ
を含む、不妊症の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不妊症の処置のための組成物および医薬製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外受精（ＩＶＦ）などの生殖補助医療（ＡＲＴ）技術は周知である。これらのＡＲＴ技術は、一群の卵胞が完全成熟するように刺激される調節卵巣刺激法（ＣＯＳ）のステップを一般に必要とする。標準的ＣＯＳ治療計画は、卵胞発育を刺激する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）単独の、またはそれと黄体化ホルモン（ＬＨ）活性との組合せなどの、ゴナドトロピン〔gonadotrophin〕の投与を、通常は早発性ＬＨサージを予防するための刺激の前および／または刺激中でのＧｎＲＨアナログの投与と共に、含む。ＣＯＳのために一般に使用される医薬組成物は、組換え卵胞刺激ホルモン（ｒＦＳＨ）、尿由来ＦＳＨ、組換えＦＳＨ＋ＬＨ調製物、尿由来メノトロピン〔menotrophin〕［ヒト閉経期ゴナドトロピン（ｈＭＧ）］および高精製ヒト閉経期ゴナドトロピン（ＨＰ−ｈＭＧ）を含む。ＩＶＦは、重症の場合は生命を危うくする可能性がある、卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）の危険を伴う可能性がある。
【０００３】
上に示したとおり、標準的ＣＯＳプロトコールはＦＳＨの投与を一般に含む。ＦＳＨの用量は、年齢、ＦＳＨ刺激への以前の応答、ＦＳＨの基礎レベル、胞状卵胞数および近年では抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含む多数の因子に一般に依存する。臨床医は、所与の用量に応答した卵巣の複数の卵胞の発育を、循環中の１７−β−エストラジオールの上昇と共に、予期する。
【０００４】
所与の用量への応答（卵巣の複数の卵胞の発育、循環中の１７−β−エストラジオールの上昇）が適当である、または予期したとおりである場合、これは正常な卵巣予備能とも称される、正常な卵巣機能を示している。ＦＳＨ刺激に十分に応答しない患者は、わずかしか卵胞を産生せず、結果として刺激の際の彼女らの１７−β−エストラジオールレベルは、ゆっくり上昇し、比較的低いレベルに達する。これらの患者は「低応答者」と称され、卵巣予備能が減退していると言われる場合がある。年齢の上昇、骨盤癒着症、卵巣疾患および免疫学的因子を含むいくつかの因子が低応答に関与すると考えられている。
【０００５】
調節卵巣刺激法（ＣＯＳ）への女性の応答可能性を予測する能力は、個別化されたＣＯＳプロトコールの開発を可能にし得る。例えばこれは、刺激に過剰に応答すると予測される女性におけるＯＨＳＳの危険を低減でき、低応答者と分類された女性における妊娠結果を改善でき、および／またはＦＳＨの用量（および曝露）の低減をもたらし、それにより特定の患者における治療費を低減した（および治療の安全性を増大させた）。
【０００６】
抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の血清濃度は、いまや卵巣予備能の信頼できるマーカーとして確立されている。ＡＭＨのレベルの低下は、ＣＯＳの際のゴナドトロピンへの卵巣応答の低減と関連している。さらに、高レベルのＡＭＨは過剰卵巣応答の良好な予測因子であり、ＯＨＳＳの危険の指標である。
【０００７】
ＡＲＴを受けている３５歳未満の女性の予備研究では、ＣＯＮＳＯＲＴ投薬アルゴリズム（基礎ＦＳＨ、ＢＭＩ、年齢およびＡＦＣを組み込んでいる）が、ＯＨＳＳ発症の危険がある女性におけるＣＯＳのための、最適なＦＳＨ開始用量を予測するために使用された（Ｏｌｉｖｅｎｎｅｓ  ｅｔ．ａｌ．，２００９）。用量を個別化することは、適当な卵母細胞収量および良好な妊娠結果をもたらした。しかし、低用量群（７５ＩＵ  ＦＳＨ）では不適当な応答による中止が高率であり、患者の相当な割合においてＯＨＳＳが生じた。
【０００８】
上に示すとおり、標準的ＣＯＳプロトコールはＦＳＨの投与を含む場合がある。ＦＳＨは天然では脳下垂体前葉によって分泌され、卵胞発育および排卵を支持するように機能する。ＦＳＨは、他の糖タンパク質ホルモンＬＨおよびＣＧにも共通する９２アミノ酸アルファサブユニットと、ホルモンの生物学的特異性を付与するＦＳＨに固有の１１１アミノ酸ベータサブユニットとを含む（Ｐｉｅｒｃｅ  ａｎｄ  Ｐａｒｓｏｎｓ，１９８１）。各サブユニットは、複雑な炭水化物残基の付加によって翻訳後修飾される。両サブユニットは、Ｎ連結グリカン付着のための部位２個を有している、アルファサブユニットのアミノ酸５２および７８、ならびにベータサブユニットのアミノ酸残基７および２４である（Ｒａｔｈｎａｍ  ａｎｄ  Ｓａｘｅｎａ，１９７５，Ｓａｘｅｎａ  ａｎｄ  Ｒａｔｈｎａｍ，１９７６）。ＦＳＨはこのようにして、質量で約３０％までグリコシル化されている（Ｄｉａｓ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｒｏｅｙ．２００１．Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【０００９】
閉経後のヒト尿から精製されたＦＳＨは何年もの間、自然生殖で排卵を促進するためおよび生殖補助技術のための卵母細胞を提供するための両方で、不妊症処置において使用されている。フォリトロピンアルファ（ＧＯＮＡＬ−Ｆ、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ／ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）およびフォリトロピンベータ（ＰＵＲＥＧＯＮ／ＦＯＬＬＩＳＴＩＭ、ＭＳＤ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）などの、卵巣刺激のための現在承認されている組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）製品は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株由来である。現在、ヒト細胞株由来のｒＦＳＨ産生物は商業的に入手できない。
【００１０】
ＦＳＨ調製物には、存在する種々のアイソフォームの量の差異に関連する相当な不均一性が伴う。個々のＦＳＨアイソフォームは、同一のアミノ酸配列を示すが、翻訳後修飾された程度が異なっている；具体的なアイソフォームは炭水化物分枝構造の不均一性およびシアル酸（末端糖）取り込みの量の差異によって特徴付けられ、その両方が特定のアイソフォーム生理活性に影響を与えると考えられている。
【００１１】
天然ＦＳＨのグリコシル化は非常に複雑である。天然由来下垂体ＦＳＨにおけるグリカンは、モノ、バイ、トリおよびテトラアンテナグリカンの組合せを含む場合がある、さまざまな構造を含有する場合がある（Ｐｉｅｒｃｅ  ａｎｄ  Ｐａｒｓｏｎｓ，１９８１．Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，１９８８）。グリカンはさらなる修飾を有する場合がある：コアフコシル化、二分グルコサミン、アセチルラクトサミンでの鎖伸長、部分的または完全なシアル酸付加、α２，３およびα２，６連結でのシアル酸付加およびガラクトースの硫酸化ガラクトサミン置換である（Ｄａｌｐａｔｈａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。さらに、個々のグリコシル化部位でグリカン構造の分布間に差異がある。個体の血清由来および閉経後の女性の尿由来のＦＳＨにおいて同等なレベルのグリカン複雑性が見出されている（Ｗｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００１２】
組換えＦＳＨ産生物のグリコシル化は、宿主細胞株に存在するグリコシル転移酵素の範囲を反映する。商業的に入手可能なｒＦＳＨ産生物は、操作されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）由来である。ＣＨＯ細胞由来ｒＦＳＨにおけるグリカン修飾の範囲は、天然産生物において見出されるものよりも限定されている。ＣＨＯ細胞由来ｒＦＳＨにおいて見出されるグリカン不均一性の低減の例は、二分グルコサミンの欠失ならびにコアフコシル化およびアセチルラクトサミン伸長の含有量の低減を含む（Ｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。加えて、ＣＨＯ細胞は、α２，３連結を使用してのみシアル酸を付加できる（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）；ＣＨＯ細胞由来ｒＦＳＨはα２，３−連結シアル酸だけを含み、α２，６−連結シアル酸を含まない。
【００１３】
したがってＣＨＯ細胞由来ＦＳＨは、α２，３およびα２，６−連結シアル酸の混合物のグリカンを含有し前者が優位である天然産生ＦＳＨ（例えばヒト下垂体／血清／尿中ＦＳＨ）とは異なる。したがってＣＨＯ系を使用して発現された組換えタンパク質は、それらの末端シアル酸連結の種類において、その天然カウンターパートとは異なる。これは、炭水化物部分が分子の薬理学的特質に寄与する場合があることから、薬学的使用のための生物製剤の産生において考慮すべき重要な事項である。
【００１４】
本出願者らは、ＷＯ２００９／１２７８２６Ａとして公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００９７８号の対象であるヒト由来組換えＦＳＨを開発した。α２，３およびα２，６−連結シアル酸の両方の混合物を含む組換えＦＳＨは、ｒＦＳＨおよびα２，３シアル酸転移酵素の両方を発現するようにヒト細胞株を操作することによって作られた。発現産生物は、非常に酸性であり、α２，３−およびα２，６−連結シアル酸の両方の混合物を有し、後者は内在性シアル酸転移酵素活性によってもたらされている。シアル酸連結、α２，３−またはα２，６−の種類が、ＦＳＨの生物学的クリアランスに劇的な影響を有する場合があることが見出された。α２，３およびα２，６−連結シアル酸の両方の混合物を含む組換えＦＳＨは、従来のＣＨＯ細胞において発現されたｒＦＳＨを超える２つの利点を有する。第１に、２種のシアル酸転移酵素の活性の組合せによって物質はさらに高度にシアル酸付加されており、第２に、物質は天然ＦＳＨにさらに密接に類似している。これは、α２，３−連結シアル酸だけを産生している（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、およびシアル酸含有量が減少している（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）ＣＨＯ細胞由来組換え産生物と比較してさらに生物学的に好適であると考えられる。
【発明の概要】
【００１５】
近年、卵胞刺激ホルモン受容体またはＦＳＨ受容体（ＦＳＨＲ）が卵巣予備能の減退に関連するまたは関与する場合があることが示唆されている。ＦＳＨ受容体は、ＦＳＨと相互作用する膜貫通受容体である。ＦＳＨ受容体は、アデニル酸シクラーゼに連結されたＧ−タンパク質共役７回膜貫通受容体であり、大きなＮ末端リガンド結合ドメインならびに推定リン酸化部位としてのセリンおよびスレオニン残基に富むＣ末端細胞質側末端を有する。その活性化はＦＳＨのホルモン機能のために必要である。ＦＳＨ受容体中の変異が卵巣予備能の減退を導くかもしれないと仮定されている。変異だけでなく、ＦＳＨ受容体バリアント（ＦＳＨ受容体多型）が見出されている。そのような多型の２種は、ＦＳＨ受容体のエクソン１０中の３０７位（Ａｌａ／Ｔｈｒ）および６８０位（Ａｓｎ／Ｓｅｒ）に位置している（図４）。これらは、３０７位におけるＡｌａまたはＴｈｒのバリアント、および６８０位におけるＡｓｎまたはＳｅｒのバリアントである。これらの多型は、６８０位に関する３種の異なるＦＳＨ受容体遺伝子型：Ａｓｎ／Ａｓｎ、Ａｓｎ／ＳｅｒおよびＳｅｒ／Ｓｅｒをもたらす［Ｓｉｍｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｖｏｌ８４，Ｎｏ．２，７５１〜７５５（１９９９）、Ｆａｌｃｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ２００５：８４：８０６〜８１１（２００５）およびＬｏｕｔｒａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４，（Ａｐｒｉｌ  ２００６）を参照されたい］。
【００１６】
本出願者らは、低ＡＭＨ［ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ、一般に低応答と関連付けられる］を有する、またＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定された患者は、低ＡＭＨおよびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有する患者と比較して、ＦＳＨ処置の継続期間が長いことを見出した。低ＡＭＨ［ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ、（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ、例えば５．０ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）］を有するだけでなく、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者への開始ＦＳＨ用量の増加は、したがって長期間のＦＳＨ処置を回避するための代替手段となり得る。これは特定のＡＭＨレベルを有するだけでなく、ＦＳＨＲに特定の多型を有すると同定された、特定の患者におけるＦＳＨの用量の調整を可能にする。
【００１７】
低ＡＭＨ［ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ、例えば５．０ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）］を有するだけでなく、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者へのＦＳＨのさらに高い開始用量の投与は、それが成功（妊娠および／または出生に関する）のさらに高い可能性および成功のさらに良好な予測を提供できることから有利である。患者が理想的な処置ウインドウ内で生じる適当な応答（予期された卵巣の複数の卵胞の発育、循環中の１７−β−エストラジオールの上昇）を有する場合、さらに成功が期待できる。応答がこの処置ウインドウの中央内にある、すなわちウインドウ内で早すぎも遅すぎもしない場合、成功はさらに増強される。低ＡＭＨおよびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者における処置期間の低減（用量を１２μｇを超えて増加させることによる）は、成功の見込みの増強を伴って、応答を処置ウインドウの中央に移動できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐＦＳＨアルファ／ベータ発現ベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図２】α２，３−シアル酸転移酵素（ＳＴ３ＧＡＬ４）発現ベクターを示す図である。
【図３】α２，６−シアル酸転移酵素（ＳＴ６ＧＡＬ１）発現ベクターを示す図である。
【図４】エクソン１０のアミノ酸３０７および６８０位ならびにプロモーター中の２９位での多型の位置を示すＦＳＨ受容体の模式図である。
【図５】実施例８の研究においてＦＳＨで処置した患者２２２名についてのＦＳＨ受容体遺伝子でのＳＮＰハプロタイプの分布を示す図である。
【図６】完全分析セットについて、６８０位に関する３種の異なるＦＳＨ受容体遺伝子型：Ａｓｎ／Ａｓｎ、Ａｓｎ／ＳｅｒおよびＳｅｒ／Ｓｅｒのそれぞれにおいて、ＡＭＨ＜１５ｐｍｏｌ／Ｌを有する患者／対象の、ゴナドトロピン（ＦＳＨ）処置の観察された継続期間（日）ならびに送達された合計ゴナドトロピン（ＦＳＨ）用量（μｇ）を示す結果の表である。
【図７】完全分析セットについて、６８０位に関する３種の異なるＦＳＨ受容体遺伝子型：Ａｓｎ／Ａｓｎ、Ａｓｎ／ＳｅｒおよびＳｅｒ／Ｓｅｒのそれぞれにおいて、ＡＭＨ＜１５ｐｍｏｌ／Ｌを有する患者／対象に送達されたゴナドトロピン（ＦＳＨ）処置の予測された継続期間（日）を、用量について調整して示す結果の表である。
【符号の説明】
【００１９】
図１、２および３：ｐＦＳＨアルファ／ベータ、ｐＳＴ３およびｐＳＴ６発現ベクターのプラスミドマップ。ＣＭＶ＝サイトメガロウイルスプロモーター、ＢＧＨｐ（Ａ）＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ｆｌ  ｏｒｉ＝ｆｌ複製開始点、ＳＶ４０＝シミアンウイルス４０プロモーター、Ｎｅｏ＝ネオマイシン耐性マーカー、Ｈｙｇ＝ハイグロマイシン耐性マーカー、ＳＶ４０  ｐ（Ａ）＝シミアンウイルス４０ポリアデニル化配列、ＦＳＨ  Ａ＝卵胞刺激ホルモンアルファポリペプチド、ＦＳＨ  Ｂ＝卵胞刺激ホルモンベータポリペプチド、ＳＴ３ＧＡＬ４＝α２，３−シアル酸転移酵素、ＳＴ６ＧＡＬ１＝α２，６−シアル酸転移酵素、ＣｏｌＥ１＝ＣｏｌＥ１複製開始点、Ａｍｐ＝アンピリシン耐性マーカー。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明による第一の態様では、９から２４μｇの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む、不妊症の処置における使用のための組成物（例えば医薬組成物）であって、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると（処置前に）同定された（例えば、として選択された）患者への（例えば連日の）投与のための、組成物が提供される。組成物は、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると（処置前に）同定され（例えば、として選択され）、かつ血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有すると（処置前に）同定された（例えば、として選択された）患者への（例えば連日の）投与のためのものであってよい。組成物は、９から２４μｇのＦＳＨ、例えば１０から１８μｇのＦＳＨ、例えば１２から１６μｇのＦＳＨ、例えば１２から１５μｇのＦＳＨを含んでよい。組成物は、１２μｇ超のＦＳＨ、例えば１２．３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１２．３３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１２．６７から２４μｇのＦＳＨ、例えば１３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１３から１６μｇのＦＳＨ、例えば１３から１５μｇのＦＳＨを含んでよい。
【００２１】
組成物（例えば医薬組成物）は、上に、本明細書におよび特許請求の範囲に定義のヒト由来ｒＦＳＨの量の日用量または相当する日用量を含んでよい。組成物（例えば医薬組成物）は、処置の１日目に開始し、６から１６日間、例えば７から１６日間、例えば８から１６日間、例えば８から１３日間継続する、ＦＳＨの（連日）投与のためのものであってよい。不妊症の処置は、患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定する（例えば決定する、例えば測定する）ステップ、およびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する（と同定された）患者に用量を投与するステップを含んでよい。不妊症の処置は、患者の血清ＡＭＨレベルを同定する（例えば決定する、例えば測定する）ステップおよび、１５ｐｍｏｌ／Ｌ未満の血清ＡＭＨレベル（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有する（と同定された）患者に用量を投与するステップを含んでよい。
【００２２】
ＦＳＨは組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、全シアル酸付加の１から９９％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の９９％から１％がα２，３−シアル酸付加である、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、全シアル酸付加の１から５０％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の５０％から９９％がα２，３−シアル酸付加である、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、全シアル酸付加の５から４０％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の６０％から９５％がα２，３−シアル酸付加である、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。好ましくは、ＦＳＨはヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。
【００２３】
本発明によるさらなる態様では、血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有し、かつＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者における不妊症の処置における使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む組成物（例えば医薬組成物）であって、１日あたり９から２４μｇの用量または相当量の組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）が投与され、不妊症の処置が、患者の血清ＡＭＨレベルを同定する（例えば決定する）ステップ、患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定するステップ、ならびに血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）およびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する（と同定された）患者に組成物を投与するステップを含む、組成物が提供される。組成物は、９から２４μｇのＦＳＨ、例えば１０から１８μｇのＦＳＨ、例えば１２から１６μｇのＦＳＨ、例えば１２から１５μｇのＦＳＨを含んでよい。組成物は、１２μｇ超のＦＳＨ、例えば１２．３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１２．３３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１２．６７から２４μｇのＦＳＨ、例えば１３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１３から１６μｇのＦＳＨ、例えば１３から１５μｇのＦＳＨを含んでよい。
【００２４】
組成物（例えば医薬組成物）は、血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有し、かつＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者における不妊症の処置における使用のためのものであってよい［不妊症の処置は、患者の血清ＡＭＨレベルを同定する（例えば決定する）ステップ、患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定するステップ、および血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）およびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する（と同定された）患者に用量を投与するステップを含む］。
【００２５】
ＦＳＨは組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、全シアル酸付加の１から９９％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の９９％から１％がα２，３−シアル酸付加である、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、全シアル酸付加の１から５０％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の５０％から９９％がα２，３−シアル酸付加である、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、全シアル酸付加の５から４０％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の６０％から９５％がα２，３−シアル酸付加である、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。好ましくは、ＦＳＨはヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。
【００２６】
用量は、ＯＨＳＳの危険を最少化する一方で効果的な応答をもたらす。
【００２７】
上の用量は、患者の（対象の）初回刺激プロトコールでの不妊症の処置のためのものであってよい。さらなる刺激周期のために、用量が初回周期での実際の卵巣の応答に応じて調整され得ることは理解される。
【００２８】
ｒＦＳＨは、単一のアイソフォームとしてまたはアイソフォームの混合物として存在してよい。
【００２９】
本出願者らは、組換えＦＳＨの特定の用量が、患者の特定のＡＭＨレベルおよびＦＳＨＲ単一ヌクレオチド多型に基づいて、患者を処置するために使用され、それにより刺激への適当な応答の見込みを増加させ（例えば応答可能性が低い患者において）、および／またはＯＨＳＳもしくは他の副作用の危険を減少させる、「個別化」ＣＯＳプロトコールを発明した。
【００３０】
ＡＭＨの血清レベルは、当技術分野において周知の任意の方法によって決定（例えば測定）され得る。一例として、血清ＡＭＨレベルは、ＡＭＨ  Ｇｅｎ−ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｔｅｘａｓ）を使用して測定される。このアッセイは、１．１ｐｍｏｌ／Ｌを定量の最少限度として、０．５７ｐｍｏｌ／Ｌより高いＡＭＨ濃度を検出できる。他のアッセイも使用され得る。本明細書において、血清ＡＭＨ値は一般にｐｍｏｌ／Ｌの単位で記されている。これは、変換式１ｎｇ／ｍｌ  ＡＭＨ＝７．１ｐｍｏｌ／Ｌ  ＡＭＨを使用して、ｎｇ／ｍＬに変換され得る。
【００３１】
したがって組成物は、Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎ−ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙを使用して測定したときの血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）、または異なる方法によって測定される同等なＡＭＨレベルを有すると同定された（例えば、として選択された）患者への（例えば連日の）投与のためのものであってよい。
【００３２】
本明細書において用語「患者」および「対象」は、互換的に用いられる。
【００３３】
組成物（例えば医薬組成物）は好ましくは、上に、本明細書におよび特許請求の範囲に定義のヒト由来ｒＦＳＨの量の日用量または相当する日用量を含む。（日）用量は初回量であってよい（すなわちそれは処置の際に低減、増加または維持されてよい）。
【００３４】
ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定された患者は、当技術分野において周知の手段によって、例えば当技術分野において周知の方法によるゲノムＤＮＡの抽出に続く、ＦＳＨ受容体の６８０位での対立遺伝子バリアントの同定によって同定され得る［例えば、Ｇｒｏｍｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１，８３〜９７（２０００），Ｓｉｍｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｖｏｌ  ８４，Ｎｏ．２，７５１〜７５５（１９９９），Ｆａｌｃｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ２００５：８４：８０６〜８１１（２００５）およびその参考文献に記載の、血液からのゲノムＤＮＡの抽出のためのキットおよび続くＤＮＡ配列決定の手段による、またはＤＮＡ抽出に続く、１本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰに続くゲル電気泳動など）、もしくはＬｏｕｔｒａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４，Ａｐｒｉｌ  ２００６に記載されているようなＰＣＲおよびＲＦＬＰ法による］。それにより組成物は、ゲノムＤＮＡの抽出（例えば血液から）と、Ｌｏｕｔｒａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４，Ａｐｒｉｌ  ２００６に記載されているような、それに続くＰＣＲおよびＲＦＬＰ法または同等の方法による分析とによって測定したときに、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定された（例えば、として選択された）患者への（例えば連日の）投与のためのものであってよい。
【００３５】
組成物（例えば医薬組成物）は、処置の１日目に開始し、６から１６日間、例えば７から１６日間、例えば８から１６日間、例えば８から１３日間継続するＦＳＨの（連日）投与のためのものであってよい。組成物（例えば医薬組成物）は、ＧｎＲＨアゴニスト（例えばＳｙｎａｒｅｌ、Ｌｕｐｒｏｎ、Ｄｅｃａｐｅｐｔｙｌ）の投与から（例えば投与の開始から、例えば連日投与の開始から）１２から１６日後、例えば１３から１５日後、例えば１４日後の投与のためのものであってよい。組成物（例えば医薬組成物）は、ＧｎＲＨアゴニストを伴う投与のためのものであってよい。組成物（例えば医薬組成物）は、ＧｎＲＨアンタゴニスト（例えばｇａｎｉｒｅｌｉｘ、ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）の投与の前の投与、例えばＧｎＲＨアンタゴニストの投与の５または６日前の投与のためのものであってよい。組成物（例えば医薬組成物）は、ＧｎＲＨアンタゴニストを伴う投与のためのものであってよい。組成物（例えば医薬組成物）は、処置の６日目から（例えば連日）投与されるＧｎＲＨアンタゴニスト（例えばｇａｎｉｒｅｌｉｘ、ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）を伴う投与のためのものであってよい。好ましくは組成物（例えば医薬組成物）は、最終的な卵胞成熟を誘発するためのｈＣＧの高用量（排卵性）（例えば４，０００から１１，０００ＩＵのｈＣＧ、例えば５，０００ＩＵのｈＣＧ、１０，０００ＩＵのｈＣＧなど、または１５０から３５０マイクログラムの組換えｈＣＧ、例えば２５０マイクログラムの組換えｈＣＧ）の投与の前の投与のためのものである。
【００３６】
組成物が連日より多い（または少ない）頻度での投薬のためのものであってよいことは理解され、その場合、妥当な用量は本明細書に明記する（日）用量に相当する。
【００３７】
本明細書における用語「不妊症の処置」は、調節卵巣刺激法（ＣＯＳ）、または調節卵巣刺激法（ＣＯＳ）のステップもしくは段階を含む方法による不妊症の処置、例えば子宮腔内人工授精（ＩＵＩ）、体外受精（ＩＶＦ）、または細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）を含む。用語「不妊症の処置」は、排卵誘発（ＯＩ）によるまたは排卵誘発（ＯＩ）のステップもしくは段階を含む方法による不妊症の処置を含む。用語「不妊症の処置」は、子宮内膜症、例えばステージＩもしくはステージＩＩ子宮内膜症を有する対象、および／または無排卵性不妊症、例えばＷＨＯ  ＩＩ型無排卵不妊症を有する対象、および／または男性不妊症を有するパートナーを有する対象における不妊症の処置を含めて、卵管性または原因不明不妊症を有する対象における不妊症の処置を含む。組成物は、子宮内膜症を有する対象、例えば子宮内膜症の種々のステージについてＴｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＡＳＲＭ）分類系によって定義された（ステージＩＶは最も重度、ステージＩは最も軽度）ステージＩもしくはステージＩＩ子宮内膜症を有する対象における不妊症の処置（および／または調節卵巣刺激のため）（における使用）のためのものであり得る［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ：１９９６．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９９７；６７，８１７  ８２１］。
【００３８】
組成物は、初期卵胞相において１から１６ＩＵ／Ｌ、例えば１から１２ＩＵ／Ｌの正常血清ＦＳＨレベルを有する対象における不妊症の処置（および／または調節卵巣刺激）（における使用）のためのものであってよい。
【００３９】
組成物は、年齢１８から４２歳、例えば２５から３７歳として同定された対象における不妊症の処置（および／または調節卵巣刺激）（における使用）のためのものであってよい。産生物は、ＢＭＩ＞１５からＢＭＩ＜３８ｋｇ／ｍ２を有すると同定された対象、例えばＢＭＩ＞１８かつＢＭＩ＜２５ｋｇ／ｍ２を有すると同定された対象、例えばＢＭＩ＞２０かつＢＭＩ＜２５ｋｇ／ｍ２を有する対象における不妊症の処置（および／または調節卵巣刺激）（における使用）のためのものであってよい。
【００４０】
ｒＦＳＨは［シアル酸のモルのタンパク質のモルに対する比を単位として表した］６ｍｏｌ／ｍｏｌ以上、例えば６ｍｏｌ／ｍｏｌから１５ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば８ｍｏｌ／ｍｏｌから１４ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば９ｍｏｌ／ｍｏｌから１４ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば１０ｍｏｌ／ｍｏｌから１４ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば１１ｍｏｌ／ｍｏｌから１４ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば１２ｍｏｌ／ｍｏｌから１４ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば１２ｍｏｌ／ｍｏｌから１３ｍｏｌ／ｍｏｌの間のシアル酸含有量を有してよい。ｒＦＳＨは、ヒト細胞株において産生または発現され得る。
【００４１】
本発明による使用のためのＦＳＨ（ｒＦＳＨ）は、全シアル酸付加の１％から９９％がα２，３−シアル酸付加であってよい。ｒＦＳＨは、全シアル酸付加の１０％以上がα２，３−シアル酸付加であってよい。例えば全シアル酸付加の２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％以上がα２，３−シアル酸付加であってよい。ｒＦＳＨは、全シアル酸付加の５０から９５％、例えば全シアル酸付加の５０から７０％、例えば全シアル酸付加の６０から６９％、例えば６３から６７％、例えば全シアル酸付加のおよそ６５％の量でα２，３−シアル酸付加を好ましくは含んでよい。本発明による使用のためのＦＳＨ（ｒＦＳＨ）は、全シアル酸付加の１％から９９％がα２，６−シアル酸付加であってよい。本発明のｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、全シアル酸付加の５％以上、例えば５％から９９％、例えば５％から５０％がα２，６−シアル酸付加であってよい。ｒＦＳＨは、全シアル酸付加の５０％以下がα２，６−シアル酸付加であってよい。ｒＦＳＨは、全シアル酸付加の５から５０％、例えば全シアル酸付加の１０から５０％、例えば３１から３８％、例えば全シアル酸付加のおよそ３５％の量でα２，６−シアル酸付加を好ましくは含んでよい。シアル酸付加によって、ＦＳＨ炭水化物構造に存在するシアル酸残基の量が意味される。α２，３−シアル酸付加は、２，３位でのシアル酸付加（当技術分野において周知のとおり）および２，６位でのα２，６シアル酸付加（同様に当技術分野において周知のとおり）が意味される。したがって「全シアル酸付加の…％がα２，３シアル酸付加であってよい」は、ＦＳＨ中に存在するシアル酸残基の総数における２，３位でシアル酸付加の％を指す。用語「全シアル酸付加の…％がα２，６−シアル酸付加である」は、ＦＳＨ中に存在するシアル酸残基の総数における２，６位でシアル酸付加の％を指す。
【００４２】
ｒＦＳＨは、質量で（タンパク質に加えて炭水化物の質量ではなくタンパク質の質量に基づいて）６％以上（例えば６％から１５％の間、例えば７％から１３％の間、例えば８％から１２％の間、例えば１１％から１５％の間、例えば１２％から１４％の間）のシアル酸含有量（ＦＳＨ分子あたりのシアル酸付加の量）を有してよい。
【００４３】
ｒＦＳＨは、ヒト細胞株、例えばＰｅｒ．Ｃ６細胞株、ＨＴ１０８０細胞株などにおいて産生または発現されてよい。これは、シアル酸付加を維持するための、例えば細胞増殖培地の、操作および管理が公知のプロセスよりもあまり重要でない場合があることから、産生方法を簡便化（およびさらに効率的に）できる。方法は、公知のｒＦＳＨ産生物の産生と比較して塩基性ｒＦＳＨがあまり産生されず、酸性ｒＦＳＨが多く産生され、塩基性ＦＳＨの分離／除去が問題になりにくいことから、さらに効率的になり得る。ｒＦＳＨは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）由来細胞株または改変ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株において産生および発現されてよい。ヒト細胞株（例えばＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株、ＨＴ１０８０細胞株など）において産生または発現されるｒＦＳＨは、［細胞株の］内在性シアル酸転移酵素活性によって提供されるいくらかのα２，６−連結シアル酸（α２，６シアル酸付加）を含み、内在性シアル酸転移酵素活性によって提供されるいくらかのα２，３−連結シアル酸（α２，３シアル酸付加）を含む。細胞株は、α２，３−シアル酸転移酵素を使用して改変されてよい。細胞は、α２，６−シアル酸転移酵素を使用して改変されてよい。代替的にまたは追加的に、ｒＦＳＨは、［細胞株の］内在性シアル酸転移酵素活性によって提供されるα２，６−連結シアル酸（α２，６シアル酸付加）を含んでよい。本明細書において用語「ヒト由来組換えＦＳＨ」は、ヒト細胞株において産生または発現される組換えＦＳＨ（例えばヒト細胞株を操作することによって作られた組換えＦＳＨ）を意味する。
【００４４】
ｒＦＳＨは、α２，３−および／またはα２，６−シアル酸転移酵素を使用して産生され得る。一例では、ｒＦＳＨはα２，３−シアル酸転移酵素を使用して産生される。ｒＦＳＨは、内在性シアル酸転移酵素活性によってもたらされたα２，６−連結シアル酸（α２，６シアル酸付加）を含んでよい。
【００４５】
組成物は、医薬組成物であってよい。医薬組成物は、不妊症の処置のためのものである。不妊症の処置は、生殖補助技術（ＡＲＴ）、排卵誘発または子宮腔内受精（ＩＵＩ）を含んでよい。医薬組成物は、例えば公知のＦＳＨ調製物が使用される場合、医学的適用で使用されてよい。
【００４６】
産生物または組成物は、任意の経路の薬物投与、例えば経口、直腸内、非経口、経皮（例えばパッチ技術）、静脈内、筋肉内、皮下、胸骨内〔intrasusternal〕、膣内、腹腔内、局所（散剤、軟膏もしくは滴下剤）またはバッカルもしくは鼻内噴霧のための周知の組成物に製剤化されてよい。典型的な組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７５）の１４０５から１４１２頁および１４６１〜８７頁ならびにｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＸＩＶ  ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９７５）に記載されているような、水溶液、塩および保存剤を含む無毒性賦形剤、緩衝剤などの薬学的に許容される担体を含む。
【００４７】
好適な水性および非水性医薬用担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびその好適な混合物、植物油（オリーブ油など）およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。本発明の組成物は、これだけに限らないが、保存剤、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤および分散剤などの添加物も含有することができる。抗菌剤および抗真菌剤は、微生物の増殖を防ぐために含めることができ、例えば、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含む。保存剤が含まれる場合、ベンジルアルコール、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールは好ましい、しかし保存剤は決してこれらの例に限定されない。さらに、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが望ましい場合がある。産生物または組成物は、Ｎａ＋もしくはＫ＋塩からなる群から選択される薬学的に許容されるアルカリ金属カチオンまたはこれらの組合せを含む塩をさらに含む場合がある。好ましくは塩は、Ｎａ＋塩、例えばＮａＣｌまたはＮａ２ＳＯ４である。
【００４８】
好ましくは産生物または組成物は、組換えＦＳＨならびにポリソルベート２０、Ｌ−メチオニン、フェノール、硫酸二ナトリウムおよびリン酸ナトリウム緩衝剤の１つまたは複数を含む。
【００４９】
一部の場合、持続性作用をもたらすことは、皮下または筋肉内注射からＦＳＨ（および存在する場合は他の活性成分）の吸収を遅らせるために望ましい。これは、水溶性が乏しい結晶またはアモルファス物質の液体懸濁物の使用によって達成することができる。次いでＦＳＨの吸収速度は溶解の速度に依存し、今度は結晶サイズおよび結晶形態に依存させることができる。代替的に、非経口投与されたＦＳＨ組合せ形態の吸収の遅延は、ＦＳＨ組合せを油ビヒクル中に溶解するまたは懸濁することによって達成される。注射可能なデポー形態は、ポリ乳酸ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中にＦＳＨ（および存在する場合は他の活性成分）のマイクロカプセル化マトリクスを形成することによって作製することができる。ＦＳＨのポリマーに対する比および用いられる具体的なポリマーの性質に応じて、ＦＳＨの放出速度は調節することができる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリビニルピロリドン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）などを含む。注射可能なデポー製剤は、身体組織に適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中にＦＳＨを捕捉することによっても調製される。
【００５０】
注射可能な製剤は、例えば細菌保持フィルターを通す濾過によって、または滅菌水もしくは他の滅菌注射可能な媒体に使用直前に溶解もしくは分散することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。注射可能製剤は、任意の好適な容器内、例えばバイアル、プレフィルドシリンジ、注射カートリッジなどで供給することができる。
【００５１】
産生物または組成物は、単回使用のためまたは複数回使用（複数用量）のために製剤化されてよい。産生物または組成物が複数回使用のために製剤化される場合、保存剤が含まれることが好ましい。保存剤が含まれる場合、ベンジルアルコール、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールは好ましいが、保存剤はこれらの例に決して限定されない。単回使用または複数回使用に製剤化された産生物または組成物は、Ｎａ＋もしくはＫ＋塩からなる群から選択される薬学的に許容されるアルカリ金属カチオンまたはこれらの組合せを含む塩をさらに含んでよい。好ましくは塩はＮａ＋塩、例えばＮａＣｌまたはＮａ２ＳＯ４である。
【００５２】
産生物または組成物は、バイアル、プレフィルドカートリッジ（例えば単回投与用もしくは複数回使用のため）または例えば複数用量の投与のための「ペン」などの注射デバイスなどの容器に含めてもよい。
【００５３】
産生物または組成物は、ＦＳＨ（任意選択でｈＣＧ、ＬＨ、ＬＨ活性などと共に）を含む製剤（例えば注射可能な製剤）であってよい。存在する場合ＬＨ活性は、ＬＨまたはヒト絨毛性ゴナドトロピン、ｈＣＧから生じてよい。１つより多い活性成分（すなわちＦＳＨおよび例えばｈＣＧまたはＬＨ）がある場合、これらは、別々または一緒での投与のために好適なものとなり得る。別々に投与される場合、投与は逐次的にすることができる。産生物は、任意の好適なパッケージで供給することができる。例えば産生物は、ＦＳＨもしくはｈＣＧまたはＦＳＨおよびｈＣＧの両方の１つの組合せ（または組合せ）を含有する多数の容器（例えばプレフィルドシリンジまたはバイアル）を含むことができる。ｈＣＧは、組換えｈＣＧまたは尿由来ｈＣＧであってよい。産生物がＦＳＨ、例えば組換えＦＳＨを含有する多数の容器（例えばプレフィルドシリンジまたはバイアル）を含む場合、各容器は同じ量のＦＳＨを含んでよい。１つまたは複数の容器は異なる量のＦＳＨを含んでよい。シリンジまたはバイアルは、ブリスターパッケージまたは滅菌性を維持するための他の手段にパッケージされてよい。任意の産生物は、ＦＳＨ（および例えば存在する場合はｈＣＧ）製剤を使用するための説明書を任意選択で含むことができる。医薬組成物の種々の構成成分のｐＨおよび正確な濃度は、本分野の日常的習慣により調整される。ＧＯＯＤＭＡＮ  ａｎｄ  ＧＩＬＭＡＮ’ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＥＳ、７ｔｈ  ｅｄを参照されたい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は非経口投与のための組成物として供給される。非経口製剤の調製のための一般的方法は当技術分野において公知であり、上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ；ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹの７８０〜８２０頁に記載されている。非経口組成物は、液体製剤でまたは投与の直前に滅菌注射可能媒体と混合される固体として供給することができる。特に好ましい実施形態では、非経口組成物は投与の簡便性および投薬の均一性のために単位投与形態で供給される。
【００５４】
本発明によるさらなる態様では、不妊症［例えば血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）およびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者における不妊症］の処置方法であって、
（ａ）患者の血清ＡＭＨレベルを同定する（例えば決定する）こと、
（ｂ）患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定すること、ならびに（ｃ）血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）およびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する（と同定された）患者に１日あたり９から２４μｇの用量または相当量の組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を投与することを含む、不妊症の処置方法が提供される。組成物は、９から２４μｇのＦＳＨ、例えば１０から１８μｇのＦＳＨ、例えば１２から１６μｇのＦＳＨ、例えば１２から１５μｇのＦＳＨを含んでよい。組成物は、１２μｇ超のＦＳＨ、例えば１２．３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１２．３３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１２．６７から２４μｇのＦＳＨ、例えば１３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１３から１６μｇのＦＳＨ、例えば１３から１５μｇのＦＳＨを含んでよい。
【００５５】
ＦＳＨの投与は、処置の１日目に開始され、６から１６日間、例えば７から１６日間、例えば８から１６日間、例えば８から１３日間継続してよい。
【００５６】
ＦＳＨは組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、全シアル酸付加の１から９９％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の９９％から１％がα２，３−シアル酸付加である、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、全シアル酸付加の１から５０％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の５０％から９９％がα２，３−シアル酸付加である、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。ＦＳＨは、全シアル酸付加の５から４０％がα２，６−シアル酸付加であり、全シアル酸付加の６０％から９５％がα２，３−シアル酸付加である、α２，３−およびα２，６−シアル酸付加を含む組換えＦＳＨであってよい。好ましくは、ＦＳＨはヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。
【００５７】
投与は好ましくは、上におよび特許請求の範囲に定義のＦＳＨの量の日用量または相当する日用量を含む。（日）用量は初回量であってよい（すなわちそれは処置の際に低減、増加または維持されてよい）。
【００５８】
方法は、患者の（対象の）初回刺激プロトコールにおける不妊症の処置方法であってよい。さらなる刺激周期のために、用量が初回周期での実際の卵巣の応答に応じて調整され得ることは理解される。
【００５９】
本発明によるさらなる態様では、９から２４μｇの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む、不妊症の処置のための医薬品の製造における使用のためのＦＳＨを含む組成物（例えば医薬組成物）が提供され、医薬品は（処置前に）ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定された（例えば、として選択された）患者への（例えば連日の）投与のためのものである。医薬品は、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定され（例えば、として選択され）、かつ（処置前に）血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ））を有すると同定された（例えば、として選択された）患者への（例えば連日の）投与のためのものであってよい。組成物は、９から２４μｇのＦＳＨ、例えば１０から１８μｇのＦＳＨ、例えば１２から１６μｇのＦＳＨ、例えば１２から１５μｇのＦＳＨを含んでよい。組成物は、１２μｇ超のＦＳＨ、例えば１２．３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１２．３３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１２．６７から２４μｇのＦＳＨ、例えば１３から２４μｇのＦＳＨ、例えば１３から１６μｇのＦＳＨ、例えば１３から１５μｇのＦＳＨを含んでよい。
【００６０】
本出願者らは、低ＡＭＨ［ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）、一般に低応答と関連付けられる］を有する、またＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有すると同定された患者へのＦＳＨの投与が卵胞発育に関して良好な応答をもたらすことも見出した。これは、低ＡＭＨおよびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者の処置と比較して、ＦＳＨの投薬量の低減および／または処置期間の低減を伴って達成される。これは、特定のＡＭＨレベル、またＦＳＨＲにこれらの特定の多型を有すると同定された、特定の患者においてＦＳＨの用量を調整できるようにする。下に記載のとおり、ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＡｓｎ／Ａｓｎを有する患者への刺激の予測継続期間は、ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者について必要な刺激継続期間より１．５日間短い（図７を参照されたい）。したがって、処置前にＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＡｓｎ／Ａｓｎの両方（またはＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒの両方）を有すると同定された患者への用量を調整することは、薬剤費の観点では大幅な節約、およびこれらの患者において必要とされるよりも高い合計用量のＦＳＨの投与による潜在的副作用の危険の低減を可能にし得る。
【００６１】
本発明によるさらなる態様では、１０から１２μｇの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む不妊症の処置における使用のための組成物（例えば医薬組成物）であって、（処置前に）ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有すると同定された（として選択された）患者への（例えば連日の）投与のための組成物が提供される。組成物は、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有すると同定され（例えば、として選択され）、かつ（処置前に）血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有すると同定された（例えば、として選択された）患者への（例えば連日の）投与のためのものであってよい。組成物は、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／Ａｓｎを有すると同定され（例えば、として選択され）、かつ（処置前に）血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有すると同定された（例えば、として選択された）、患者への投与のためのものであってよい。組成物は、１０から１２μｇ未満のＦＳＨ、例えば１０から１１．９μｇのＦＳＨ、例えば１１から１１．９μｇのＦＳＨ、例えば１１．３３または１１．６７μｇのＦＳＨを含んでよい。
【００６２】
組成物（例えば医薬組成物）は、上に、本明細書におよび特許請求の範囲に定義のヒト由来ｒＦＳＨの量の日用量または相当する日用量を含んでよい。組成物（例えば医薬組成物）は、処置の１日目に開始し、６から１６日間、例えば７から１６日間、例えば８から１６日間、例えば８から１３日間継続する、ＦＳＨの（連日）投与のためのものであってよい。
【００６３】
不妊症の処置は、患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定する（例えば決定する、例えば測定する）ステップ、およびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有する（と同定された）患者に用量を投与するステップを含んでよい。不妊症の処置は、患者の血清ＡＭＨレベルを同定する（例えば決定する、例えば測定する）ステップ、および１５ｐｍｏｌ／Ｌ未満の血清ＡＭＨレベル（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有する（と同定された）患者に用量を投与するステップを含んでよい。
【００６４】
本発明によるさらなる態様では、血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有し、かつＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有する患者における不妊症の処置における使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む組成物（例えば医薬組成物）であって、１日あたり１０から１２μｇの用量または相当量の組換えＦＳＨが投与され、不妊症の処置が、患者の血清ＡＭＨレベルを同定する（例えば決定する）ステップ、患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定するステップ、ならびに血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）およびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有する（と同定された）患者に組成物を投与するステップを含む、組成物が提供される。組成物は、１０から１２μｇ未満のＦＳＨ、例えば１０から１１．９μｇのＦＳＨ、例えば１１から１１．９μｇのＦＳＨ、例えば１１．３３または１１．６７μｇのＦＳＨを含んでよい。
【００６５】
組成物（例えば医薬組成物）は、血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有し、かつびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／Ａｓｎを有する患者における不妊症の処置における使用のためのものであってよい［不妊症の処置は、患者の血清ＡＭＨレベルを同定する（例えば決定する）ステップ、患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定するステップ、ならびに血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）およびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／Ａｓｎを有する（と同定された）患者に用量を投与するステップを含む］。
【００６６】
本発明によるさらなる態様では、不妊症［例えば、血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有し、かつＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有する患者における不妊症］の処置方法であって、（ａ）患者の血清ＡＭＨレベルを同定する（例えば決定する）こと、（ｂ）患者のＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントを同定すること、ならびに（ｃ）血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）およびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有する（と同定された）患者に１日あたり１０から１２μｇの用量または相当量の組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を投与するステップを含む、不妊症の処置方法が提供される。組成物は、１０から１２μｇ未満のＦＳＨ、例えば１０から１１．９μｇのＦＳＨ、例えば１１から１１．９μｇのＦＳＨ、例えば１１．３３または１１．６７μｇのＦＳＨを含んでよい。
【００６７】
ＦＳＨの投与は、処置の１日目に開始され、６から１３日間、例えば７から１３日間、例えば８から１３日間、例えば８から１１日間継続してよい。
【００６８】
本発明によるさらなる態様では、不妊症の処置のための医薬品の製造における使用のためのＦＳＨを含む組成物（例えば医薬組成物）であって、１０から１２μｇの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含み、医薬品が（処置前に）ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有すると同定された（として選択された）患者への（例えば連日の）投与のための組成物が提供される。医薬品は、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／ＡｓｎまたはバリアントＡｓｎ／Ｓｅｒを有すると同定され（例えば、として選択され）、かつ（処置前に）血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有すると同定された（例えば、として選択された）患者への（例えば連日の）投与のためのものであってよい。医薬品は、ＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＡｓｎ／Ａｓｎを有すると同定され（例えば、として選択され）、かつ（処置前に）血清ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）を有すると同定された（例えば、として選択された）患者への投与のためのものであってよい。組成物は、１０から１２μｇ未満のＦＳＨ、例えば１０から１１．９μｇのＦＳＨ、例えば１１から１１．９μｇのＦＳＨ、例えば１１．３３または１１．６７μｇのＦＳＨを含んでよい。
【００６９】
本発明のこれらの態様に関するＦＳＨ、患者の血清ＡＭＨレベルおよびＦＳＨ受容体の６８０位でのバリアントの同定などは、本明細書に列挙する本発明の他の態様についても同様であってよいことは理解される。
【００７０】
発明の詳細な記載
本発明は、添付の図を参照してここにより詳細に記載される。
【００７１】
配列選択
ヒトＦＳＨ
ＦＳＨアルファポリペプチドに対する遺伝子のコード領域は、Ｆｉｄｄｅｓ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ（１９８１）に従って使用された。配列はＡＨ００７３３８として預けられ、構築時にこのタンパク質配列の他のバリアントはなかった。配列は本明細書において配列番号１と称される。
【００７２】
ＦＳＨベータポリペプチドに対する遺伝子のコード領域は、Ｋｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）に従って使用された。配列はＮＭ＿０００５１０として預けられ、構築時にこのタンパク質配列の他のバリアントはなかった。配列は本明細書において配列番号２と称される。
【００７３】
シアル酸転移酵素
α２，３−シアル酸転移酵素  −  ベータガラクトシドアルファ−２，３−シアル酸転移酵素４（α２，３−シアル酸転移酵素、ＳＴ３ＧＡＬ４）に対する遺伝子のコード領域は、Ｋｉｔａｇａｗａ  ａｎｄ  Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４）に従って使用された。配列はＬ２３７６７として預けられ、本明細書において配列番号３と称される。
【００７４】
α２，６−シアル酸転移酵素  −  ベータガラクトサミドアルファ−２，６−シアル酸転移酵素１（α２，６−シアル酸転移酵素、ＳＴ６ＧＡＬ１）に対する遺伝子のコード領域は、Ｇｒｕｎｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）に従って使用された。配列はＮＭ＿００３０３２として預けられ、本明細書において配列番号４と称される。
【実施例】
【００７５】
［実施例１］ＦＳＨ発現ベクターの構築
ＦＳＨアルファポリペプチド（ＡＨ００７３３８、配列番号１）およびＦＳＨベータポリペプチド（ＮＭ＿００３０３２、配列番号２）のコード配列を、プライマーの組合せ、ＦＳＨａ−ｆｗおよびＦＳＨａ−ｒｅｖならびにＦＳＨｂ−ｆｗおよびＦＳＨｂ−ｒｅｃをそれぞれ使用して、ＰＣＲによって増幅した。
ＦＳＨａ−ｆｗ  ５’−ＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＣ−３’（配列番号９）
ＦＳＨａ−ｒｅｖ  ５’−ＧＧＡＴＧＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＧＡＴＴＴＧＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣ−３’（配列番号１０）
ＦＳＨｂ−ｆｗ  ５’−ＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＣＡＣＴＣＣＡＧＴＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１１）
ＦＳＨｂ−ｒｅｖ  ５’−ＣＣＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＧＧ−３’（配列番号１２）
【００７６】
得られた増幅ＦＳＨベータＤＮＡを制限酵素ＡｓｃＩおよびＨｐａＩで消化し、ネオマイシン選択マーカーを有するＣＭＶ駆動哺乳動物発現ベクター上のＡｓｃＩおよびＨｐａＩ部位に挿入した。同様にＦＳＨアルファＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化し、ＦＳＨベータポリペプチドＤＮＡを既に含む発現ベクター上のＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ部位に挿入した。
【００７７】
ベクターＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＨ５α株を形質転換するために使用した。コロニーを増幅のために取った。ＦＳＨアルファおよびベータの両方を含有するクターを含有するコロニーを配列決定のために選択し、全てが配列番号１および配列番号２による正しい配列を含有していた。プラスミドｐＦＳＨ  Ａ＋Ｂ＃１７をトランスフェクションのために選択した（図１）。
【００７８】
［実施例２］ＳＴ３発現ベクターの構築
ベータガラクトシドアルファ−２，３−シアル酸転移酵素４（ＳＴ３、Ｌ２３７６７、配列番号３）のコード配列を、プライマーの組合せ、２，３ＳＴｆｗおよび２，３ＳＴｒｅｖを使用してＰＣＲによって増幅した。
２，３ＳＴｆｗ  ５’−ＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣ−３’（配列番号１３）
２，３ＳＴｒｅｖ  ５’−ＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＣＧＴＧＡＧＧＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号１４）
【００７９】
得られた増幅ＳＴ３  ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ハイグロマイシン耐性マーカーを有するＣＭＶ駆動哺乳動物発現ベクター上のＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩ部位に挿入した。ベクターを既に記載のとおり増幅し、配列決定した。クローンｐＳＴ３＃１（図２）は、配列番号３による正しい配列を含有しており、トランスフェクションのために選択した。
【００８０】
［実施例３］ＳＴ６発現ベクターの構築
ベータガラクトサミドアルファ−２，６−シアル酸転移酵素１（ＳＴ６、ＮＭ＿００３０３２、配列番号４）のコード配列を、プライマーの組合せ、２，６ＳＴｆｗおよび２，６ＳＴｒｅｖを使用してＰＣＲによって増幅した。
２，６ＳＴｆｗ  ５’−ＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１５）
２，６ＳＴｒｅｖ  ５’−ＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＡＧＴＴＡＧＣＡＧＴＧＡＡＴＧＧＴＣＣＧＧ−３’（配列番号１６）
【００８１】
得られた増幅ＳＴ６  ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ハイグロマイシン耐性マーカーを有するＣＭＶ駆動哺乳動物発現ベクター上のＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩ部位に挿入した。ベクターを既に記載のとおり増幅し、配列決定した。クローンｐＳＴ６＃１１（図３）は、配列番号４による正しい配列を含有しており、トランスフェクションのために選択した。
【００８２】
［実施例４］ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞におけるｐＦＳＨ  α＋βの安定発現。クローンのトランスフェクション、単離およびスクリーニング
単一のプラスミドからＦＳＨの両ポリペプチド鎖を発現することによって、ＦＳＨを産生するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）クローンを生成した（実施例１を参照されたい）。
【００８３】
安定クローンを得るためのｐＦＳＨ  α＋β構築物を含むリポソームベーストランスフェクション剤。安定クローンを、１０％のＦＣＳを補充し、Ｇ４１８を含有するＶＰＲＯ中で選択した。トランスフェクション３週間後、Ｇ４１８耐性クローンが増殖した。クローンを単離のために選択した。単離したクローンを７０〜８０％コンフルエントまで選択培地で培養した。上清を、ＦＳＨタンパク質含有量についてＦＳＨ選択的ＥＬＩＳＡを使用して、およびクローン細胞株におけるＦＳＨ受容体での薬理学的活性についてｃＡＭＰ蓄積アッセイを使用して、アッセイした。機能性タンパク質を発現しているクローンを培養増殖のために２４ウエル、６ウエルおよびＴ８０フラスコに進めた。
【００８４】
７個のクローンからの物質の生産性および品質を決定するための研究を、十分な物質を生成するためにＴ８０フラスコ中で開始した。細胞を既に記載のとおり補充培地で７日間培養し、上清を回収した。生産性をＦＳＨ選択的ＥＬＩＳＡを使用して決定した。物質の等電点プロファイルを当技術分野において公知の方法による等電点電気泳動（ＩＥＦ）によって決定した。十分な生産性および品質を有するクローンをシアル酸転移酵素操作のために選択した。
【００８５】
［実施例５］シアル酸付加のレベルは、α２，３−シアル酸転移酵素を過剰発現している細胞において増加している。ＦＳＨ発現ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞におけるｐＳＴ３の安定発現、クローンのトランスフェクション、単離およびスクリーニング。
高度にシアル酸付加されたＦＳＨを産生するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）クローンを、ＦＳＨの両ポリペプチド鎖を既に発現している（実施例４由来）ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞中で、別のプラスミド（実施例２）からα２，３−シアル酸転移酵素を発現させることによって生成した。実施例４に記載のとおりＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞から産生されたクローンを、生産性、良好な増殖プロファイル、機能性タンパク質の産生およびいくつかのシアル酸付加を含む産生されたＦＳＨを含むそれらの特徴について選択した。安定クローンは実施例４に既に記載のとおり生成した。クローンを単離し、増殖させ、アッセイした。α２，３−シアル酸転移酵素クローンを無血清培地および懸濁条件に適合させた。
【００８６】
前述のとおり、クローンをＦＳＨ選択的ＥＬＩＳＡ、ＦＳＨ受容体細胞株における機能性応答、ＩＥＦ、代謝クリアランス速度およびＳｔｅｅｌｍａｎ  Ｐｏｈｌｅｙ分析を使用してアッセイした。結果を、商業的に入手できる組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ−ｆ、Ｓｅｒｏｎｏ）および親ＦＳＨ  ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株と比較した。大部分のクローンによって産生されたＦＳＨは、α２，３−シアル酸転移酵素を伴わずに発現されたＦＳＨと比較して、顕著に改善されたシアル酸付加（すなわち多数のシアル酸を有するＦＳＨアイソフォームが平均でより多い）を有する。結論としてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞におけるシアル酸転移酵素を伴うＦＳＨの発現は、ＦＳＨだけを発現している細胞と比較してＦＳＨのシアル酸付加のレベルが上昇していた。
【００８７】
［実施例６］産生および精製概要
手順は、無血清培地中に懸濁で培養したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞においてＦＳＨを産生するために開発した。手順を下に記載し、いくつかのＦＳＨ産生ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株に適用した。
【００８８】
α２，３−クローン（実施例５）由来のＦＳＨをＬｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）によって記載の方法の変法を使用して調製した。
【００８９】
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＦＳＨの産生のために、細胞株を無血清培地、すなわち、Ｅｘｃｅｌｌ  ５２５（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適合させた。細胞をＴ８０培養フラスコ中で７０％〜９０％コンフルエント単層を形成するように最初に培養した。継代の際に、細胞を無血清培地、Ｅｘｃｅｌｌ  ５２５＋４ｍＭ  Ｌ−グルタミン中に、０．３×１０６個／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。細胞懸濁物２５ｍｌを２５０ｍｌ振盪フラスコに入れ、１００ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２で振盪した。１×１０６個／ｍｌ超の細胞密度に達した後、細胞を０．２または０．３×１０６個／ｍｌの細胞密度で継代培養し、さらに振盪フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２、１００ｒｐｍで培養した。
【００９０】
ＦＳＨの産生のために、細胞を無血清産生培地、すなわち、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の増殖を非常に高い細胞密度（バッチ培養で通常１０７個／ｍｌ超）に支持するＶＰＲＯ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。細胞を１×１０６個／ｍｌ超にＥｘｃｅｌｌ  ５２５中で最初に培養し、次いで５分間、１０００ｒｐｍで遠沈し、続いてＶＰＲＯ培地＋６ｍＭ  Ｌ−グルタミンに１×１０６個／ｍｌの密度で懸濁した。次いで細胞を振盪フラスコ中で７〜１０日間、３７℃、５％ＣＯ２、１００ｒｐｍで培養した。この期間で、細胞は１０７個／ｍｌ超の密度に増殖した。培養培地を細胞生存率が減少し始めた後に回収した。細胞を５分間、１０００ｒｐｍで遠沈し、上清をＦＳＨの定量および精製のために使用した。ＦＳＨの濃度をＥＬＩＳＡ（ＤＲＧ  ＥＩＡ  １２８８）を使用して決定した。
【００９１】
次いでＦＳＨの精製をＬｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）によって記載の方法の変法を使用して実行した。電荷選択的クロマトグラフィーを使用する精製を、当技術分野において周知の方法によって、高度にシアル酸付加された形態を富化するために実行した。
【００９２】
全てのクロマトグラフィー手順の際に、本明細書で特許請求されるＦＳＨのシアル酸付加形態の富化をＲＩＡ（ＤＲＧ  ＥＩＡ  １２８８）および／またはＩＥＦによって確認した。
【００９３】
［実施例７］α２，３およびα２，６シアル酸の相対量の定量
精製されたｒＦＳＨ（実施例６）上のα２，３およびα２，６シアル酸の相対百分率量を公知の技術を使用して測定した。
【００９４】
Ｎ−グリカンを変性条件下でＰＮＧａｓｅ  Ｆを使用して試料から放出させ、次いで２−アミノベンズアミドで標識した。次いで放出されたグリカン形態を、電荷分布の決定のために、Ｗｅａｋ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＷＡＸ）カラムによって分離および分析した。全シアル酸の決定のために２，３，６，８シアリダーゼで、および２，３シアル酸の決定のために２，３シアリダーゼで処置した標識グリカンを、ＷＡＸカラムによってさらに分析した。
【００９５】
電荷グリカンの相対百分率を未消化および消化グリカンプール中に存在する構造から算出し、図４に示す（試料８個について）。これらは、α２，３シアル酸付加について５０％〜９５％（例えば約８０％から９０％）およびα２，６シアル酸付加について５％から５０％、一般に約１０から２０％（または約３１％もしくは３５％）の範囲内に見出された。
【００９６】
［実施例８］ＧＯＮＡＬ−Ｆと比較してＦＥ９９９０４９を調査する複数用量研究
以下は、体外受精（ＩＶＦ）／細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のために調節卵巣刺激を受けている患者におけるＦＥ９９９０４９の用量応答関係を評価する、無作為化、対照、査定者盲検、並行群、多国籍、多施設試験を記載する。患者集団は、年齢１８から３７歳、ＢＭＩが１８．５から３２．０ｋｇ／ｍ２のＩＶＦ患者２６５名であった。
【００９７】
試験は、主要評価項目として採取された卵母細胞の数での用量応答試験として設計した。二次評価項目は、エンドクリンプロファイル、卵胞発育、卵母細胞受精、胚品質および処置効率（すなわち全ゴナドトロピン消費および刺激の継続期間）に関するさまざまな用量のＦＥ９９９０４９の定性的および定量的影響を調査する。試験は、ＩＶＦ／ＩＣＳＩ周期のための調節卵巣刺激において使用される場合の、妊娠を確立するためのＦＥ９９９０４９の有効性を評価するために設計されている。
【００９８】
対象を、卵巣応答に関連して治験集団の均一性を増加させ、試験で使用されるＦＥ９９９０４９用量およびＧＯＮＡＬ−Ｆ用量に対する潜在的応答不良者および過剰応答者の数を最少化するための、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）評価を含む、組み入れ基準および除外基準でのコンプライアンスについて無作為化する前の３カ月以内に評価した。ＡＭＨ評価は、ＡＭＨ  Ｇｅｎ−ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｔｅｘａｓ）を使用して測定した。このアッセイは、１．１ｐｍｏｌ／Ｌを定量の最少限度として、０．５７ｐｍｏｌ／Ｌより高いＡＭＨ濃度を検出できる。
【００９９】
彼女らの月経周期の２〜３日目に、対象を１：１：１：１：１：１様式で９０ＩＵ、１２０ＩＵ、１５０ＩＵ、１８０ＩＵもしくは２１０ＩＵ  ＦＥ９９９０４９または１５０ＩＵ  ＧＯＮＡＬ−Ｆのいずれかでの処置に無作為化し、卵巣刺激を開始した。無作為化は、スクリーニングでのＡＭＨレベルに応じて層別化した［５．０〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ（低ＡＭＨ）および１５．０から４４．９ｐｍｏｌ／Ｌ（高ＡＭＨ））。
【０１００】
ＦＤＡの要求でＧｏｎａｌ−Ｆは質量によって充填（ＦｂＭ）されており、したがってμｇ用量を参照することは好適である。Ｇｏｎａｌ−Ｆラベルは、６００ＩＵ／４４μｇを示しており、そのことは１５０ＩＵが１１μｇであることを示す。しかしいくらかの変動があり、この試験についてのバッチ証明書は１１．３μｇのＧｏｎａｌ−Ｆが１５０ＩＵに相当することを示した。ＦＥ９９９０４９用量は生物学的活性ではなくタンパク質含有量（μｇ）によって表されている。したがって、ＦＥ９９９０４９の用量は、５．２μｇ（９０ＩＵ）、６．９μｇ（１２０ＩＵ）、８．６μｇ（１５０ＩＵ）、１０．３μｇ（１８０ＩＵ）または１２．１μｇ（２１０ＩＵ）であった。
【０１０１】
対象および用量分布を次に記載する（データは対象数）。
【０１０２】
【表１】
2018513161.tif 000002
【０１０３】
ＦＥ９９９０４９またはＧＯＮＡＬ−Ｆの日用量レベルは、刺激期間全体を通じて固定する。刺激の際に、対象は刺激１、４および６日目ならびにその後少なくとも２日ごとにモニターする。１５ｍｍ以上の卵胞３個が観察される場合、来診は連日で実施する。対象は、ＦＥ９９９０４９またはＧＯＮＡＬ−Ｆで最長１６日間処置する。
【０１０４】
早発性ＬＨサージを予防するために、ＧｎＲＨアンタゴニスト（ガニレリクスアセテート、ＯＲＧＡＬＵＴＲＡＮ、ＭＳＤ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）を刺激６日目に０．２５ｍｇの日用量で開始し、刺激期間にわたって継続してもよい。最終卵胞成熟の誘発は、直径≧１７ｍｍを有する卵胞が３個以上観察される時に行う。直径≧１２ｍｍを有する卵胞が２５個未満の場合、組換えｈＣＧ（絨毛性ゴナドトロピンアルファ、ＯＶＩＴＲＥＬＬＥ、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ／ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）２５０μｇを投与する。直径≧１２ｍｍを有する卵胞が２５〜３５個ある場合、ＧｎＲＨアゴニスト（トリプトレリンアセテート、ＤＥＣＡＰＥＰＴＹＬ／ＧＯＮＡＰＥＰＴＹＬ、Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）０．２ｍｇを投与する。直径≧１２ｍｍを有する卵胞が３５個超として定義される過剰卵巣応答の場合、処置は中止する。刺激１０日目に直径≧１０ｍｍを有する卵胞が３個未満として定義される卵巣応答不良が観察される場合、周期は中止することができる。
【０１０５】
卵母細胞採取は、最終卵胞成熟化の誘発後３６時間（±２時間）で行い、卵母細胞をＩＶＦおよび／またはＩＣＳＩによって授精させた。受精および胚発育を卵母細胞採取から移植の日まで評価する。ｈＣＧでの最終卵胞成熟化の誘発を受けた対象について、利用可能な最良の質の胚盤胞１個を卵母細胞採取の５日後に移植し、残りの胚盤胞は凍結する。ＧｎＲＨアゴニストでの最終卵胞成熟化の誘発を受ける対象について、新鮮周期では胚移植は行わず、代わりに胚盤胞は５日目に凍結する。膣用プロゲステロン錠剤（ＬＵＴＩＮＵＳ、Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）１００ｍｇ、１日３回を黄体期支持のために卵母細胞採取翌日から臨床妊娠来診日まで提供する。βｈＣＧ検査を胚移植１３〜１５日後に実施し、臨床的妊娠を経膣超音波（ＴＶＵ）によって胚移植５〜６週間後に確認する。
【０１０６】
結果
採取された卵母細胞の数（主要評価項目）を次の表に示す。
【０１０７】
【表２】
2018513161.tif 000003
【０１０８】
主目的は満たされた：顕著な用量応答関係が採取された卵母細胞の数に関してＦＥ９９９０４９について確立された。この発見は、全体的な治験集団においてだけでなく、無作為化で使用された２つのＡＭＨ層それぞれについても観察された。
ＦＥ９９９０４９について顕著な用量応答を全ての重要な客観的薬力学的パラメーター、例えばエストラジオール、インヒビンＢおよびインヒビンＡについて実証した。同程度のマイクログラム用量レベルで、ＦＥ９９９０４９での薬力学的応答はＧＯＮＡＬ−Ｆでのものよりも大きかった（これらの結果は未記載）。
ＦＥ９９９０４９への曝露後の血清ＦＳＨ濃度は、ＧＯＮＡＬ−Ｆについてよりも顕著に高かった。結果は、ＦＥ９９９０４９のＰＫプロファイルがＧＯＮＡＬ−Ｆのものとは異なっていることを確認している。
ＦＥ９９９０４９で処置したＩＶＦ／ＩＣＳＩ患者における受精率、胚盤胞発育および妊娠率は、予測の範囲内であった。
ＦＥ９９９０４９の使用に安全性への懸念はなかった。良好な局所忍容性を記載した。
【０１０９】
さらなる分析
本出願者らは、採取される卵母細胞の数に関して次の基準を満たすＦＥ９９９０４９用量（複数可）を同定するためにデータをさらに分析した：
・  卵母細胞が８〜１４個の範囲で採取される
・  卵母細胞が８個未満である患者の割合の最少化
・  卵母細胞が４個未満または２０個以上である患者の割合の最少化
【０１１０】
低ＡＭＨ層
表２に見られるとおり、第１の判定基準（卵母細胞が８〜１４個の範囲で採取される）を満たすＦＥ９９９０４９の用量は、１２．１μｇであった（平均９．４個の卵母細胞を採取した）。卵母細胞の分布を下の表３に示す。
【０１１１】
【表３】
2018513161.tif 000004
【０１１２】
四角および矢印によって示すとおり、１２．１μｇのＦＥ９９９０４９の用量は、低ＡＭＨ群の対象の６０％において最も望ましい数の卵母細胞の採取を提供する。これは、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（対象の３３％だけが卵母細胞の最も望ましい数）についての顕著な改善である。中程度または重度の性質の初期ＯＨＳＳの徴候はなく、予防的処置が必要とされることはなかったので、低ＡＭＨを有する患者における１２．１μｇのＦＥ９９９０４９の用量に関連する懸念はない。
【０１１３】
したがって本出願者らは、６から２４μｇ、例えば９から１４μｇ、例えば１２μｇの用量または相当する用量のヒト由来組換えＦＳＨが、血清ＡＭＨ＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ、例えば０．０５〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ、例えば５．０〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌを有する患者における不妊症の処置における使用のために好適であることを見出した。この用量は、ＯＨＳＳの危険を最少化する一方で効果的な応答をもたらす。
【０１１４】
予備評価
予備評価として本発明者らは、ＦＥ９９９０４９での刺激後の卵巣応答および治療効率への、ＦＳＨ受容体多型の寄与を調査した。
【０１１５】
試験の全ての患者由来のゲノムＤＮＡをＦＳＨ−Ｒの２９、３０７および６８０位での一塩基多型（ＳＮＰ）について、モデナ・レッジョ・エミリア大学、イタリアで分析した。図４は、エクソン１０のアミノ酸３０７および６８０位ならびにプロモーター中の２９位での多型の位置を示すＦＳＨ受容体の模式図である。ＳＮＰ  ＦＳＨ−Ｒ組合せのこの分布は、次のとおり：２９位についてＡＡ  ７％、ＡＧ  ３５％およびＧＧ  ５８％；３０７位についてＴｈｒ／Ｔｈｒ  ２９％、Ａｌａ／Ｔｈｒ  ５４％およびＡｌａ／Ａｌａ  １７％；ならびに６８０位についてＡｓｎ／Ａｓｎ  ３０％、Ａｓｎ／Ｓｅｒ  ５３％およびＳｅｒ／Ｓｅｒ  １７％。図５は、実施例８の研究においてＦＳＨで処置した患者２２２名についてのＦＳＨ受容体遺伝子でのＳＮＰハプロタイプの分布を示す。各位置についての分布および全体の組合せは、低ＡＭＨと高ＡＭＨ層との間で顕著には異ならなかった。
【０１１６】
臨床試験の結果を、ＳＮＰが処置の継続期間および必要な合計用量に影響を有するかどうかを評価するためにさらに分析した。これは、低ＡＭＨ群および高ＡＭＨ群について行った。
【０１１７】
ＦＳＨＲ多型をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）およびＲＦＬＰ（制限断片長多型）によって当技術分野において公知の方法により調査した。女性をＡｓｎ／Ａｓｎ、Ａｓｎ／ＳｅｒおよびＳｅｒ／Ｓｅｒ遺伝子型に分類した。遺伝子解析は次のプロトコール概要に記載されており、患者は特別なインフォームドコンセントに署名した。試料は刺激１日目に他の血液試料の一部として取った。それらをモデナ・レッジョ・エミリア大学で測定した。
【０１１８】
ＦＳＨ受容体遺伝子でのＳＮＰ分析のために使用された手順概要
一般的手順：
１．ゲノムＤＮＡ抽出（Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥを使用して血液から）
２．ｎａｎｏｄｒｏｐを使用する操作手順
【０１１９】
ＨＲＭ手順：
高解像度融解分析（ＨＲＭ）法によるＳＮＰ遺伝子型判定（ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｃｏｄ  ｅｎｚｙｍｅ．１７２−５２０１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ；ＨＳＰ−９６  ｐｌａｔｅｓ、ｃａｔ．ＨＳＰ９６４５、Ｂｉｏ−Ｒａｄ；およびＣＦＸ９６  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  Ｂｉｏ−Ｒａｄを使用する）。
【０１２０】
配列決定手順：
ＨＲＭ結果に疑問がある場合（同じ試料での２回の独立したＨＲＭ後）、次の配列決定手順を利用する：
１．ＰＣＲ反応および増幅
２．ＰＣＲ産生物精製
３．精製されたＰＣＲの定量
４．配列反応プロトコール
５．配列産生物精製
６．ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０装置によって実行するキャピラリー電気泳動
７．ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００でのキャピラリー電気泳動配列決定によって得られた結果の評価および検証
【０１２１】
結果
図７は、完全分析セットについて、６８０位に関する３種の異なるＦＳＨ受容体遺伝子型：Ａｓｎ／Ａｓｎ、Ａｓｎ／ＳｅｒおよびＳｅｒ／Ｓｅｒのそれぞれにおいて、ＡＭＨ＜１５ｐｍｏｌ／Ｌを有する患者／対象に送達されたゴナドトロピン（ＦＳＨ）処置の予測された継続期間（日）を、用量について調整して示す結果の表である。
【０１２２】
図７は、ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者の刺激のために必要な処置の予測平均継続期間が９．５９日間であり、ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＡｓｎ／Ａｓｎ（８．１３日間）を有する患者の刺激のために必要なものより約１．５日間長く、ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＳｅｒ／Ａｓｎ（８．２６日間）を有する患者の刺激のために必要なものより約１．３日間長いことを示している。
【０１２３】
上に記載のとおり、成功（妊娠および／または出生に関して）は、患者が理想的な処置ウインドウ内で生じる適当な応答（予期された卵巣多卵胞発育、循環中の１７−β−エストラジオールの上昇）を有する場合に可能性が高い。成功は、応答がこの処置ウインドウの中央にある、すなわちウインドウ内で早すぎも遅すぎもしない場合にさらに増強される。低ＡＭＨおよびＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者における処置の継続期間の低減（用量を１２μｇを超えて増加させることによる）は、応答を処置ウインドウの中央内へと移動させ、成功の見込みを増強し得る。
【０１２４】
したがって、処置前にＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有すると同定された患者への用量を調整することは可能であり得る。処置前にＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者が同定されると、Ｓｅｒ／ＡｓｎおよびＡｓｎ／Ａｓｎを有する者と比較して、これらの患者において開始用量を増加できるようになり得る。
【０１２５】
上に記載のとおり、１２．１μｇのＦＥ９９９０４９の用量は、低ＡＭＨ群における対象の６０％において最も望ましい数の卵母細胞の採取を提供する（表３）。表３に示す低ＡＭＨ群は、バリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者も、Ｓｅｒ／ＡｓｎおよびＡｓｎ／Ａｓｎを有する者も含んでいた。低ＡＭＨ［ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ、（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ、例えば５．０ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）］を有し、またＦＳＨ受容体の６８０位にバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者への、ＦＳＨのより高い開始用量（例えば９から２４μｇ、例えば１２μｇ超から２４μｇ、例えば１２．３３μｇまたは１３μｇのヒト由来組換え体）の投与は、それが成功（妊娠および／または出生に関する）のさらに高い可能性および成功のさらに良好な予測を提供できることから、有利なものとなり得る。
【０１２６】
図７は、ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＡｓｎ／Ａｓｎを有する患者の刺激のために必要な処置の平均継続期間が８．１３日間であること、およびＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＳｅｒ／Ａｓｎを有する患者の刺激のために必要な期間が８．２６日間であって、ＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬおよびバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者の相当する処置のための継続期間（９．５９日間）よりも約１．５から１．３日間短いことを示している。それにより処置前でのＡＭＨレベル＜１５ｐｍｏｌ／ＬならびにバリアントＳｅｒ／ＡｓｎおよびＡｓｎ／Ａｓｎを有する患者が同定されると、これらの患者について卵胞発育に関して良好な応答を依然として提供しながら、開始用量を１２μｇ未満、例えば１０から１２μｇのＦＥ９９９０４９に低減、または処置の継続期間を低減できるようになり得る。これは、薬剤費の観点から、およびこれらの患者における効果のために必要であるよりも高い用量の投与に伴う危険の低減の観点からも薬剤費を提供できる。
【０１２７】
図６は、完全分析セットについて、６８０位に関する３種の異なるＦＳＨ受容体遺伝子型：Ａｓｎ／Ａｓｎ、Ａｓｎ／ＳｅｒおよびＳｅｒ／Ｓｅｒのそれぞれにおいて、ＡＭＨ＜１５ｐｍｏｌ／Ｌを有する患者／対象の、ゴナドトロピン（ＦＳＨ）処置の観察された継続期間（日）ならびに送達された合計ゴナドトロピン（ＦＳＨ）用量（μｇ）を示す結果の表である。これは、図７に示す効果を確認している。
【０１２８】
結果は、高ＡＭＨ集団ではＳＮＰに関連するこの効果を示さなかった。
【０１２９】
これは、特定のＡＭＨレベル、およびＦＳＨＲに特定の多型を有すると同定された特定の患者におけるＦＳＨの用量の調整を可能にする。
【０１３０】
［実施例９］個別化されたＣＯＳプロトコール（低ＡＭＨ）
選択された患者は、当技術分野において公知の方法による体外受精（ＩＶＦ）／細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のためにＣＯＳを受けようとしている。前処置プロトコールは、ＡＭＨ  Ｇｅｎ−ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｔｅｘａｓ）を使用する患者の血清ＡＭＨの評価／スクリーニングを含む。このアッセイは、１．１ｐｍｏｌ／Ｌを定量の最少限度として、０．５７ｐｍｏｌ／Ｌより高いＡＭＨ濃度を検出できる。ＡＭＨは、他のアッセイキット（例えばＲｏｃｈｅから入手可能）を使用して測定してもよい。前処置プロトコールは、当技術分野において周知の方法によるゲノムＤＮＡの抽出に続くＦＳＨ受容体の６８０位での対立遺伝子バリアントの同定を含む（例えば、Ｇｒｏｍｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１，８３〜９７（２０００）、Ｓｉｍｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｖｏｌ  ８４，Ｎｏ．２，７５１〜７５５（１９９９）、Ｆａｌｃｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ２００５：８４：８０６〜８１１（２００５）およびこれらの参考文献に記載のとおり、血液からのゲノムＤＮＡの抽出のためのキットおよび続くＤＮＡ配列決定の手段による、またはＬｏｕｔｒａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４，Ａｐｒｉｌ  ２００６に記載のものなどのＰＣＲおよびＲＦＬＰ法による）。
【０１３１】
ＣＯＳプロトコールは、通常の様式では、スクリーニングでのＡＭＨレベルによるＦＥ９９９０４９の初回量の投与とは別に開始する。１５ｐｍｏｌ／Ｌ未満のＡＭＨレベルおよびバリアントＳｅｒ／ＡｓｎまたはＡｓｎ／Ａｓｎを有する患者は、およそ１２μｇのＦＥ９９９０４９、実施例６の方法により製造されたヒト由来組換えＦＳＨ産生物、または１２μｇ未満のＦＥ９９９０４９、例えばヒト由来組換えＦＳＨの１０から１２μｇ、例えば１１．３３μｇもしくは１１．６７μｇの初回日用量を投与される。１５ｐｍｏｌ／Ｌ未満のＡＭＨレベルおよびバリアントＳｅｒ／Ｓｅｒを有する患者は、ヒト由来組換えＦＳＨの１２μｇより高い初回日用量（例えば１２．３３から２４μｇまたは１３〜２４μｇ）を受ける。
【０１３２】
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【０１３３】
配列番号１
卵胞刺激ホルモンアルファポリペプチド
受託番号ＡＨ００７３３８
ＦＳＨアルファのヌクレオチド配列
【化１】
2018513161.tif 000005
ＦＳＨアルファのタンパク質配列（配列番号５）
【化２】
2018513161.tif 000006
【０１３４】
配列番号２
卵胞刺激ホルモンベータポリペプチド
受託番号ＮＭ＿０００５１０
ＦＳＨベータのヌクレオチド配列
【化３】
2018513161.tif 000007
ＦＳＨベータのタンパク質配列（配列番号６）
【化４】
2018513161.tif 000008
【０１３５】
配列番号３
ベータガラクトシドアルファ−２，３−シアル酸転移酵素４
受託番号Ｌ２３７６７
ＳＴ３ＧＡＬ４のヌクレオチド配列
【化５】
2018513161.tif 000009
ＳＴ３ＧＡＬ４のタンパク質配列（配列番号７）
【化６】
2018513161.tif 000010
【０１３６】
配列番号４
ベータガラクトサミドアルファ−２，６−シアル酸転移酵素１
受託番号ＮＭ＿００３０３２
ＳＴ６ＧＡＬ１のヌクレオチド配列
【化７】
2018513161.tif 000011
０ｐ−
ＳＴ６ＧＡＬ１のタンパク質配列（配列番号８）
【化８】
2018513161.tif 000012
【図１】
2018513161.tif 000013
【図２】
2018513161.tif 000014
【図３】
2018513161.tif 000015
【図４】
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【図５】
2018513161.tif 000017
【図６】
2018513161.tif 000018
【図７】
2018513161.tif 000019
【配列表】
2018513161000001.app
【国際調査報告】
2018513161.tif 000020
2018513161.tif 000021
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