(57)【要約】  乳房切除術及び／又は乳房逆手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測する方法であって、被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することと、少なくとも１つの遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出すこととを含み、少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、及びＭＭＰ１５からなる群から選択され、導き出されたスコアが被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、方法。【選択図】図６
2018515124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測する方法であって、
ｉ．  前記被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することと、
ｉｉ．  前記少なくとも１つの遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出すことと、
を含み、前記少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出された前記スコアが前記被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出す工程を、予測分類モデルを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予測分類モデルが少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
導き出された前記スコアが第１の所定参照未満である場合に、前記被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の低リスク群に分類する工程を含む、先の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
導き出された前記スコアが前記第１の所定参照以上である場合に、前記被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の高リスク群に分類する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
導き出された前記スコアが第２の所定参照未満である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの低リスク群に分類する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
導き出された前記スコアが第３の所定参照以上である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの高リスク群に分類する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
導き出された前記スコアが前記第２の所定参照（両端値を含む）と前記第３の所定参照との間である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの中等度リスク群に分類する工程を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムが、
ｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは１８である）、
ｉｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋２×Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋２×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に、遺伝子を単変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、遺伝子を多変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を２ポイントとしてカウントし、総スコアは２１である）、
ｉｉｉ．  スコア＝３×ＴＲＰＶ６＋５×ＤＤＸ３９＋１８×ＢＵＢ１Ｂ＋４×ＣＣＲ１＋４×ＳＴＩＬ＋７×ＢＬＭ＋７×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＭＩ１＋９×ＴＰＸ２＋８×ＰＴＩ１＋３×ＴＣＦ３＋７×ＣＣＮＢ１＋２×ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋６×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋２×ＯＢＳＬ１＋６×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を単変量分析によって検査し、各遺伝子のスコアをその重み付けに従ってリスケーリングし、総スコアは１０２である）、
ｉｖ．  スコア＝２×ＴＲＰＶ６＋２×ＤＤＸ３９＋２×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋２×ＢＬＭ＋５×Ｃ１６ＯＲＦ７＋３×ＰＩＭ１＋３×ＴＰＸ２＋５×ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋３×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜５のスコアに対してリスケーリングし、該オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは４０である）、及び、
ｖ．  スコア＝４×ＴＲＰＶ６＋３×ＤＤＸ３９＋８×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋３×ＢＬＭ＋１１×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＩＭ１＋ＴＰＸ２＋２×ＰＴＩ１＋２×ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜１１のスコアに対してリスケーリングし、オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは５６である）、
からなる群から選択される、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定する工程が、該少なくとも１つの遺伝子と少なくとも１つの遺伝子プローブとをハイブリダイズさせることと、該少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することとを含む、先の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの遺伝子プローブがＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの遺伝子プローブをマイクロアレイチップ上に固定する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子発現レベルの測定をマイクロアレイ又は定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）によって行う、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の所定参照が３１というスコアである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の所定参照が２１というスコアである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３の所定参照が４４というスコアである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体が以下の条件：０個のリンパ節、１個〜３個の陽性リンパ節及び４個以上の陽性リンパ節の１つを有する、先の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
乳房切除術及び／又は乳房逆手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのキットであって、
ｉ．  前記被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子に特異的に結合し、該少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを定量化することが可能な少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいてスコアを導き出すための少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルと、
を含み、前記少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出された前記スコアが、前記被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、キット。
【請求項１９】
導き出された前記スコアが第１の所定参照未満である場合に、前記被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の低リスク群に分類する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
導き出された前記スコアが前記第１の所定参照以上である場合に、前記被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の高リスク群に分類する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
導き出された前記スコアが第２の所定参照未満である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの低リスク群に分類する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
導き出された前記スコアが第３の所定参照以上である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの高リスク群に分類する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
導き出された前記スコアが前記第２の所定参照（両端値を含む）と前記第３の所定参照との間である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの中等度リスク群に分類する、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムが、
ｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは１８である）、
ｉｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋２×Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋２×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に、遺伝子を単変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、遺伝子を多変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を２ポイントとしてカウントし、総スコアは２１である）、
ｉｉｉ．  スコア＝３×ＴＲＰＶ６＋５×ＤＤＸ３９＋１８×ＢＵＢ１Ｂ＋４×ＣＣＲ１＋４×ＳＴＩＬ＋７×ＢＬＭ＋７×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＭＩ１＋９×ＴＰＸ２＋８×ＰＴＩ１＋３×ＴＣＦ３＋７×ＣＣＮＢ１＋２×ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋６×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋２×ＯＢＳＬ１＋６×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を単変量分析によって検査し、各遺伝子のスコアをその重み付けに従ってリスケーリングし、総スコアは１０２である）、
ｉｖ．  スコア＝２×ＴＲＰＶ６＋２×ＤＤＸ３９＋２×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋２×ＢＬＭ＋５×Ｃ１６ＯＲＦ７＋３×ＰＩＭ１＋３×ＴＰＸ２＋５×ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋３×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜５のスコアに対してリスケーリングし、該オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは４０である）、及び、
ｖ．  スコア＝４×ＴＲＰＶ６＋３×ＤＤＸ３９＋８×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋３×ＢＬＭ＋１１×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＩＭ１＋ＴＰＸ２＋２×ＰＴＩ１＋２×ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜１１のスコアに対してリスケーリングし、該オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは５６である）、
からなる群から選択される、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記第１の所定参照が３１というスコアである、請求項１９又は２０に記載のキット。
【請求項２６】
前記第２の所定参照が２１というスコアである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
前記第３の所定参照が４４というスコアである、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項２８】
前記被験体が以下の条件：０個のリンパ節、１個〜３個の陽性リンパ節及び４個以上の陽性リンパ節の１つを有する、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのマイクロアレイであって、ＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するための少なくとも１つの遺伝子プローブを含む、マイクロアレイ。
【請求項３０】
予測されたＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の前記被験体の補助治療のタイプを予測又は決定するために使用する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１８〜２８のいずれか一項に記載のキット、又は請求項２９に記載のマイクロアレイ。
【請求項３１】
乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測する方法であって、
ｉ．  前記被験体から単離されたサンプル中の複数の遺伝子の発現レベルを測定することと、
ｉｉ．  前記複数の遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出すことと、
を含み、前記複数の遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出された前記スコアが前記被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、方法。
【請求項３２】
乳房切除術及び／又は乳房逆手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのキットであって、
ｉ．  前記被験体から単離されたサンプル中の複数の遺伝子に特異的に結合し、該複数の遺伝子の発現レベルを定量化することが可能な少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  前記複数の遺伝子の発現レベルに基づいてスコアを導き出すための少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルと、
を含み、前記複数の遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出された前記スコアが、前記被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、遺伝子発現プロファイル及び乳癌におけるその使用、特に、限定されるものではないが、乳房切除術及び／又は乳房温存手術（ＢＣＳ）後の乳癌を有する被験体における遺伝子発現プロファイルに基づいて局所的及び／又は領域性（局所領域）再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移リスクを予測する方法に関する。特に、限定されるものではないが、本発明は、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体において乳癌と関連する少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定し、局所領域再発及び／又は遠隔転移リスクを予測する所定のモデルに基づいてスコアを導き出すことに関する方法を提供し、これにより乳房切除術及び／又は乳房温存手術後に必要とされる治療タイプの決定が容易となる。
【背景技術】
【０００２】
以下の本発明の背景技術の論考は、本発明の理解を容易にすることを意図したものである。しかしながら、該論考はいかなる法域においても、言及される事柄のいずれかが本願の優先日に公表されている、既知である又は共通の一般知識の一部であると承認又は認可するものではないことを理解されたい。
【０００３】
乳癌の局所領域再発（ＬＲＲ）リスクを算出し、放射線療法が必要とされるかを決定する従来の方法は、局所領域再発と密接に関連することが見出された臨床リスク因子、例えば腫瘍サイズ、腋窩リンパ節の関与（腋窩ＬＮ）、エストロゲン受容体状態（ＥＲ状態）、診断時の年齢、リンパ管浸潤（ＬＶ浸潤）等に基づく（１-２）。幾つかの研究により局所領域再発と関連する個々の遺伝子が存在することが報告されているが、局所領域再発を予測することができる信頼性の高い生物学的マーカーはこれまでに存在していない（３-４）。
【０００４】
臨床業務では、乳癌の局所領域再発を低減する戦略は術後放射線療法を行うことであり、遠隔転移を減少させる戦略は全身補助化学療法及び／又はホルモン療法を行うことである。概して、４個以上の腋窩ＬＮの関与を有する患者には乳房切除術後放射線療法（ＰＭＲＴ）を行うべきであることが認められている（５）。
【０００５】
１個〜３個の陽性リンパ節を有する患者については、全米総合癌センターネットワーク（National Comprehensive Cancer Network）（ＮＣＣＮ）ガイドラインは、かかる患者におけるＰＭＲＴの利益が証明された３回の大規模無作為化対照試験の結果に基づいて、カウンセリング臨床医がＰＭＲＴを行うことを「強く検討する」よう推奨している（６-８）。しかしながら、リンパ節陰性患者の１０年局所領域再発率が５％未満であり、１個〜３個の陽性リンパ節を有する患者では約２０％、４個以上の陽性リンパ節を有する患者では約３２％であるとも報告されている（９）。したがって、臨床パラメーターに基づくと、乳房切除術後に局所領域再発が生じない可能性があり、ＰＭＲＴを必要としない約７０％〜８０％のリンパ節陽性患者が存在する一方で、高リスクの患者はＰＭＲＴから利益を得る可能性がある。
【０００６】
腫瘍生物学を評価するのに有望なツールとしてのゲノム分析における近年の進展により、１個〜３個の陽性リンパ節を有する乳癌患者のより個別的な予後判定をもたらす、リスク層別化を改善する新たな可能性が開かれる（１０）。例えば、Cheng, S.H., et al.は、教師なしクラスタリング及びベイズ系統樹モデルを用いて種々の遺伝子セットを開発しようと試みている。さらに、Ｎ０及びＮ１患者を局所領域再発の高リスク群及び低リスク群へと分類し、それらの潜在的３年局所領域再発率を算出するために遺伝子セットが使用されている（１１）。
【０００７】
一方、Solin, L.J., et al.は、広範囲局所切除後の非浸潤性癌である非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）の患者について局所領域再発を予測することが可能な１２遺伝子発現アッセイを報告している（１２）。
【０００８】
特許文献１は、乳癌患者の遺伝子発現マーカーを用いた評価方法を開示している。該方法では遺伝子配列を配列番号１６２の前駆体として使用し、乳癌患者が遠隔再発のリスクなしに長時間生存することができるかを評価又は予測するために、乳癌患者におけるＣＤ６８のＲＮＡ翻訳レベルと乳癌サンプル中のＣＤ６８のＲＮＡ翻訳レベルとの定量的比較を行う。この評価方法ではＣＤ６８ゲノム予後キットが使用され、患者の生存率を評価するために患者における遺伝子の統計データが参照される。しかしながら、使用される遺伝子はあまりに多様であり、得られる統計値が１．０１を超えることから、パラメーターも多様である。
【０００９】
特許文献２は、補助化学療法により患者に介入し、治療するかを評価するための多重遺伝子の使用を開示している。開示の評価方法では１４遺伝子セットが使用され、これは医療関係者が乳癌患者に更なる補助化学療法が必要であるかを決定する、又は乳癌患者に遠隔転移のリスクがあるかを評価する助けとなる。しかしながら、該方法は乳癌を有する閉経後女性からなる特定の患者群のみを標的とするものである。
【００１０】
局所領域再発及び／又は遠隔転移のリスクがある乳房切除術及び／又は乳房逆手術後の個体の同定は、かかるリスクの正確な予測が補助治療の決定に直接影響を与えることから極めて重要である。リスク層別化の改善により、個体におけるより正確なリスクの予測が可能となり、これはＰＭＲＴ、領域リンパ節照射（ＲＮＩ）、化学療法及びホルモン療法等の補助療法を回避することができる再発及び／又は遠隔転移のリスクが低い個体を同定することによって過度の治療又は過剰治療を低減又は防止する助けとなる。
【００１１】
早期乳癌の過剰治療を防止し、個別治療を調整するには、癌が無痛性又は侵襲性であるかを決定するために分子診断を利用することが鍵となる（１３、１４）。上記で論考される乳癌患者の局所領域再発又は遠隔転移の可能性を予測するための或る特定の遺伝子パネルが存在するが、これらは特定の患者群及び特定のタイプの乳癌に限られる。種々のサブタイプ、病期又は治療法にわたる、乳癌患者における局所領域再発及び／又は遠隔転移の可能性の評価はこれまで利用可能でない。さらに、現在のゲノムパネルによる非ルミナール乳癌のリスク層別化はこれまで限られている（１５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第８７４１６０５号
【特許文献２】国際公開第２０１４／０８５６５３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、上述の不利点の少なくとも一部を克服する、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌患者において局所領域再発及び／又は遠隔転移のリスクを予測する方法が必要とされる
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本書全体を通して、反対の指示がない限り、「含む（comprising）」、「からなる（consisting of）」等の用語は包括的でない、又は言い換えると、「含むが、これらに限定されない（including, but not limited to）」を意味すると解釈されるものとする。
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測する方法であって、
ｉ．  被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することと、
ｉｉ．  少なくとも１つの遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出すことと、
を含み、少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出されたスコアが被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、方法が提供される。
【００１６】
好ましくは、少なくとも１つの遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出す工程を、予測分類モデルを用いて行う。
【００１７】
好ましくは、予測分類モデルが少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む。
【００１８】
好ましくは、上記方法は、導き出されたスコアが第１の所定参照未満である場合に、被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の低リスク群に分類する工程を含む。
【００１９】
好ましくは、上記方法は、導き出されたスコアが第１の所定参照以上である場合に、被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の高リスク群に分類する工程を含む。
【００２０】
好ましくは、上記方法は、導き出されたスコアが第２の所定参照未満である場合に、被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの低リスク群に分類する工程を含む。
【００２１】
好ましくは、上記方法は、導き出されたスコアが第３の所定参照以上である場合に、被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの高リスク群に分類する工程を含む。
【００２２】
好ましくは、上記方法は、導き出されたスコアが第２の所定参照（両端値を含む）と第３の所定参照との間である場合に、被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの中等度リスク群に分類する工程を含む。
【００２３】
好ましくは、少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムが、
ｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは１８である）、
ｉｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋２×Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋２×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に、遺伝子を単変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、遺伝子を多変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を２ポイントとしてカウントし、総スコアは２１である）、
ｉｉｉ．  スコア＝３×ＴＲＰＶ６＋５×ＤＤＸ３９＋１８×ＢＵＢ１Ｂ＋４×ＣＣＲ１＋４×ＳＴＩＬ＋７×ＢＬＭ＋７×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＭＩ１＋９×ＴＰＸ２＋８×ＰＴＩ１＋３×ＴＣＦ３＋７×ＣＣＮＢ１＋２×ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋６×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋２×ＯＢＳＬ１＋６×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を単変量分析によって検査し、各遺伝子のスコアをその重み付けに従ってリスケーリングし、総スコアは１０２である）、
ｉｖ．  スコア＝２×ＴＲＰＶ６＋２×ＤＤＸ３９＋２×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋２×ＢＬＭ＋５×Ｃ１６ＯＲＦ７＋３×ＰＩＭ１＋３×ＴＰＸ２＋５×ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋３×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜５のスコアに対してリスケーリングし、該オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは４０である）、及び、
ｖ．  スコア＝４×ＴＲＰＶ６＋３×ＤＤＸ３９＋８×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋３×ＢＬＭ＋１１×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＩＭ１＋ＴＰＸ２＋２×ＰＴＩ１＋２×ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜１１のスコアに対してリスケーリングし、オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは５６である）、
からなる群から選択される。
【００２４】
好ましくは、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定する工程が、該少なくとも１つの遺伝子と少なくとも１つの遺伝子プローブとをハイブリダイズさせることと、該少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することとを含む。
【００２５】
好ましくは、少なくとも１つの遺伝子プローブがＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む。
【００２６】
好ましくは、少なくとも１つの遺伝子プローブをマイクロアレイチップ上に固定する。
【００２７】
好ましくは、遺伝子発現レベルの測定をマイクロアレイ又は定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）によって行う。
【００２８】
好ましくは、第１の所定参照が３１というスコアである。
【００２９】
好ましくは、第２の所定参照が２１というスコアである。
【００３０】
好ましくは、第３の所定参照が４４というスコアである。
【００３１】
好ましくは、被験体が以下の条件：０個のリンパ節、１個〜３個の陽性リンパ節及び４個以上の陽性リンパ節の１つを有する。
【００３２】
本発明の第２の態様によれば、乳房切除術及び／又は乳房逆手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのキットであって、
ｉ．  被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子に特異的に結合し、該少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを定量化することが可能な少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいてスコアを導き出すための少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルと、
を含み、少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出されたスコアが、被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、キットが提供される。
【００３３】
好ましくは、導き出されたスコアが第１の所定参照未満である場合に、被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の低リスク群に分類する。
【００３４】
好ましくは、導き出されたスコアが第１の所定参照以上である場合に、被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の高リスク群に分類する。
【００３５】
好ましくは、導き出されたスコアが第２の所定参照未満である場合に、被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの低リスク群に分類する。
【００３６】
好ましくは、導き出されたスコアが第３の所定参照以上である場合に、被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの高リスク群に分類する。
【００３７】
好ましくは、導き出されたスコアが第２の所定参照（両端値を含む）と第３の所定参照との間である場合に、被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの中等度リスク群に分類する。
【００３８】
好ましくは、少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムが、
ｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは１８である）、
ｉｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋２×Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋２×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に、遺伝子を単変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、遺伝子を多変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を２ポイントとしてカウントし、総スコアは２１である）、
ｉｉｉ．  スコア＝３×ＴＲＰＶ６＋５×ＤＤＸ３９＋１８×ＢＵＢ１Ｂ＋４×ＣＣＲ１＋４×ＳＴＩＬ＋７×ＢＬＭ＋７×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＭＩ１＋９×ＴＰＸ２＋８×ＰＴＩ１＋３×ＴＣＦ３＋７×ＣＣＮＢ１＋２×ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋６×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋２×ＯＢＳＬ１＋６×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を単変量分析によって検査し、各遺伝子のスコアをその重み付けに従ってリスケーリングし、総スコアは１０２である）、
ｉｖ．  スコア＝２×ＴＲＰＶ６＋２×ＤＤＸ３９＋２×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋２×ＢＬＭ＋５×Ｃ１６ＯＲＦ７＋３×ＰＩＭ１＋３×ＴＰＸ２＋５×ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋３×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜５のスコアに対してリスケーリングし、該オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは４０である）、及び、
ｖ．  スコア＝４×ＴＲＰＶ６＋３×ＤＤＸ３９＋８×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋３×ＢＬＭ＋１１×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＩＭ１＋ＴＰＸ２＋２×ＰＴＩ１＋２×ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜１１のスコアに対してリスケーリングし、該オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは５６である）、
からなる群から選択される。
【００３９】
好ましくは、第１の所定参照が３１というスコアである。
【００４０】
好ましくは、第２の所定参照が２１というスコアである。
【００４１】
好ましくは、第３の所定参照が４４というスコアである。
【００４２】
好ましくは、被験体が以下の条件：０個のリンパ節、１個〜３個の陽性リンパ節及び４個以上の陽性リンパ節の１つを有する。
【００４３】
本発明の第３の態様によれば、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのマイクロアレイであって、ＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するための少なくとも１つの遺伝子プローブを含む、マイクロアレイが提供される。
【００４４】
好ましくは、本発明の第１の態様に従って予測されたＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の被験体の補助治療のタイプを予測又は決定するために使用する。
【００４５】
好ましくは、本発明の第２の態様に従って予測されたＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の被験体の補助治療のタイプを予測又は決定するために使用する。
【００４６】
好ましくは、本発明の第３の態様に従って予測されたＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の被験体の補助治療のタイプを予測又は決定するために使用する。
【００４７】
本発明の第４の態様によれば、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測する方法であって、
ｉ．  被験体から単離されたサンプル中の複数の遺伝子の発現レベルを測定することと、
ｉｉ．  複数の遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出すことと、
を含み、複数の遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出されたスコアが被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、方法が提供される。
【００４８】
本発明の第５の態様によれば、乳房切除術及び／又は乳房逆手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのキットであって、
ｉ．  被験体から単離されたサンプル中の複数の遺伝子に特異的に結合し、該複数の遺伝子の発現レベルを定量化することが可能な少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  複数の遺伝子の発現レベルに基づいてスコアを導き出すための少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルと、
を含み、複数の遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出されたスコアが、被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、キットが提供される。
【００４９】
本発明の他の態様は、以下を含む。
【００５０】
本発明の別の態様は、乳房切除術及び／又はＢＣＳ後の乳癌患者のＬＲＲリスク及び放射線療法に対する応答をＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１及びＭＭＰ１５からなる遺伝子セットの発現レベルを検出することによって予測する方法に関する。該方法は、（Ａ）乳房切除術及び／又はＢＣＳ後の患者の検体から遺伝子（ｍＲＮＡ）を抽出することと、（Ｂ）抽出遺伝子と遺伝子プローブ中の遺伝子とをハイブリダイズさせることと、（Ｃ）遺伝子の各遺伝子プローブがＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１及びＭＭＰ１５からなる群から選択されることと、（Ｄ）検体から抽出された遺伝子の発現レベルを測定することと、（Ｅ）乳癌のＬＲＲ率を、１８遺伝子分類子（予測分類モデル）及び比例ハザードの分析アルゴリズムを用いて評価することとを含む。
【００５１】
幾つかの実施の形態では、本発明の方法は、腫瘍組織サンプルを乳房切除術又はＢＣＳ後の患者から得ることと、サンプルから全ＲＮＡを抽出することと、全ＲＮＡをＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１及びＭＭＰ１５からなる遺伝子セットである遺伝子マイクロアレイと接触させることと、遺伝子セット中の遺伝子の１つ又は全ての発現レベルを測定することと、１８遺伝子スコアを用いてハザード比を算出することとを含む。幾つかの実施の形態では、１８遺伝子分類子により適用されるアルゴリズム方程式のスコアが３１以上である場合、患者を乳癌のＬＲＲの高リスク群に分類する。スコアが３１未満である場合、患者を乳癌のＬＲＲの低リスク群に分類する。
【００５２】
本発明は、乳房切除術後の乳癌患者のＬＲＲリスク及び放射線療法に対する応答を評価する予測又は推定方法であって、（Ａ）乳房切除術及び／又はＢＣＳ後の患者の検体から遺伝子（ｍＲＮＡ）を抽出することと、（Ｂ）抽出遺伝子と遺伝子プローブ中の遺伝子とをハイブリダイズさせることと、（Ｃ）遺伝子の各遺伝子プローブがＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１及びＭＭＰ１５からなる群から選択されることと、（Ｄ）検体から抽出された遺伝子の発現レベルを測定することと、（Ｅ）乳癌のＬＲＲ率を、１８遺伝子分類子及び比例ハザードの分析アルゴリズムを用いて評価することとを含む、方法を更に提供する。該方法は、患者が乳癌のＬＲＲの高リスク群に分類される場合に、放射線療法により患者に介入し、治療することで乳癌のＬＲＲが防止されるかの評価を促すことを更に含む。
【００５３】
本発明は、１８個の遺伝子からなる遺伝子チップを提供する。１８個の遺伝子のうち４個（ＲＣＨＹ１、ＰＴＩ１、ＥＮＳＡ及びＴＲＰＶ６）のいずれかの遺伝子発現レベルが増大する場合、ＬＲＲリスクは低減する。１８個の遺伝子のうち他の１４個（ＢＬＭ、ＴＣＦ３、ＰＩＭ１、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＳＴＩＬ、ＴＰＸ２、ＣＣＮＢ１、ＭＭＰ１５、ＣＣＲ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、Ｃ１６ＯＲＦ７及びＤＴＸ２）のいずれかの遺伝子発現レベルが増大する場合、ＬＲＲリスクは増大する。
【００５４】
本発明の別の目的は患者を分類することであり、分類子により適用されるアルゴリズム方程式のスコアが３１以上である場合に、患者を乳癌のＬＲＲの高リスク群に分類し、スコアが３１未満である場合に、患者を乳癌のＬＲＲの低リスク群に分類する。
【００５５】
本発明の別の目的は患者を分類することであり、分類子により適用されるアルゴリズム方程式のスコアが３１以上である場合に、患者を乳癌のＬＲＲ及び遠隔転移の高リスク群に分類する。
【００５６】
本発明の更なる目的は、患者が乳癌のＬＲＲの高リスク群に分類される場合に、放射線療法により患者に介入し、治療することで乳癌のＬＲＲが防止されるかの評価を促すことである。
【００５７】
本発明の更なる目的は、マイクロアレイチップ上に固定される遺伝子プローブを提供することである。
【００５８】
本発明の評価方法における遺伝子発現レベルの測定は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はいわゆる（called）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定することを含む。
【００５９】
本発明の評価方法では、遺伝子発現レベルを１８遺伝子分類子及び比例ハザードの分析アルゴリズムを用いて分析し、乳癌のＬＲＲ率を評価する。ここで、比例ハザードの分析アルゴリズムは分析のアルゴリズムを含む。
【００６０】
本発明は、ＬＲＲ率を評価する方法及び読み取り機器を用いる、乳癌のＬＲＲ率を評価するための医療機器に関する。
【００６１】
本発明は、乳癌のＬＲＲ率を評価するための遺伝子プローブセットであって、（Ａ）ＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１及びＭＭＰ１５からなる群から選択される任意の遺伝子と、（Ｂ）遺伝子と乳癌患者から抽出された遺伝子とをハイブリダイズさせて、遺伝子の発現レベルを測定することとを含む、遺伝子プローブセットを更に提供する。乳癌患者の遺伝子を、１８遺伝子分類子及び比例ハザードの分析アルゴリズムを用いて分析し、乳癌のＬＲＲ率を評価する。
【００６２】
本発明は、乳癌のＬＲＲ率を評価するための上述の遺伝子プローブセットを用いて、乳癌患者のＬＲＲリスク及び放射線療法に対する応答を予測する方法も提供する。
【００６３】
本発明は、上述の遺伝子プローブセットを用いて乳癌のＬＲＲ率を評価する評価方法であって、１８遺伝子分類子により適用されるアルゴリズム方程式のスコアが３１以上である場合に、患者を乳癌のＬＲＲの高リスク群に分類することで、正確な評価メッセージを関係者に提供し、医療費、国民健康保険料支払い又は保険資金の負担及び無駄を低減する、評価方法を更に提供する。
【００６４】
本発明は、上述の遺伝子プローブセットを用い、１８遺伝子分類子により適用されるアルゴリズム方程式を用いて乳癌のＬＲＲ率を評価し、乳癌患者の器官又はリンパ組織遠隔転移のリスクを正確に予測する評価方法を更に提供する。
【００６５】
サンプル検体は乳癌腫瘍、好ましくは原発性乳癌腫瘍組織から得られる腫瘍組織であるのが好ましい。組織を当該技術分野で既知の従来の方法において分析する。
【００６６】
本発明の別の態様は、患者組織（例えば乳房腫瘍、他の乳房組織、ＬＮ腫瘍及び／又は組織、並びに血液）における遺伝子セットの発現レベルを決定し、患者組織と乳癌のＬＲＲ率との相関を調整することにより、乳房切除術後の乳癌患者のＬＲＲリスクを評定することである。乳癌のＬＲＲ率と高度に相関する遺伝子セットにはＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１及びＭＭＰ１５が含まれることが見出される。
【００６７】
遺伝子発現レベルは、当該技術分野で既知の任意の方法（例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はいわゆる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））、又は遺伝子発現に関する定量的情報を与えることができる今後考案される定量的方法において決定することができる。
【００６８】
幾つかの実施の形態では、遺伝子発現プロファイルはタンパク質、ポリペプチド又は核酸分子（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ）等の遺伝子発現産物によって定量的に決定される。核酸は核酸により直接、又は規則的遺伝子配列によって定量化することができる。付加的に、遺伝子セグメント又は多型遺伝子セグメントを定量化することもできる。
【００６９】
本発明の好ましい実施の形態では、定量化は乳癌患者の検体又はサンプル中の遺伝子発現レベルを測定することによって達成され、当該技術分野で既知の従来の方法において行うことができる。別の実施の形態では、検体サンプル中のｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの程度は、特定の好適な核酸を有する遺伝子セットマイクロアレイ上に固定される遺伝子プローブにより測定される。上述のマイクロアレイも本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチドマイクロアレイを作製する一方法は、国際公開第９５／１１９９５号に記載されている。当該技術分野で既知の他の従来の方法を用いることもできる。
【００７０】
遺伝子発現プロファイルは、任意の簡便な方法を用いて検体の初期核酸サンプルから生成することができる。すなわち、遺伝子発現プロファイルは任意の従来の方法、例えば当該技術分野で既に適用されている差次的遺伝子発現の分析方法を用いて得ることができる。代表的な簡便な遺伝子発現プロファイルは、マイクロアレイを用いて生成される。本発明の評価方法では、ＢＣＳ後の患者から得られる乳癌のＬＲＲ率と関連する遺伝子、すなわちＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１及びＭＭＰ１５からなる遺伝子セットを含む遺伝子を評価するために遺伝子マイクロアレイを用いる。初期調製検体の標的核酸は、配列のシグナル発生システムによって標識される。検体サンプルの標的核酸の調製後に、標的核酸のサンプルを遺伝子アレイとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズした標識核酸の複合体は、プローブのアレイ表面上の遺伝子と相補的な遺伝子配列を有する。ハイブリダイズした複合体を定性的又は定量的に検出する。
【００７１】
遺伝子発現レベルは、装置によって数値的に評定又は測定される。数値は装置により得られる生値であり、必要に応じて数値をリスケーリング、フィルタリング及び／又は正規化する。データは、例えば遺伝子チップ（gene chip）（商標）、プローブアレイ又はマイクロアレイ（Affymetrix, Inc.に対して付与された米国特許第５，６３１，７３４号、同第５，８７４，２１９号、同第５，８６１，２４２号、同第５，８５８，６５９号、同第５，８５６，１７４号、同第５，８４３，６５５号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８３４，７５８号、同第５，７７０，７２２号、同第５，７７０，４５６号、同第５，７３３，７２９号及び同第５，５５６，７５２号；全て、全体がそれらの技術を引用することにより本明細書の一部をなす）から得られる。ゲノム発現レベルは、ソフトウェア（例えば、AffymetrixのＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）ソフトウェア）で算出される。検体から得られる核酸（例えばｍＲＮＡ）を、特定のマイクロアレイ（一般にＤＮＡチップ又はバイオチップとしても知られる）のプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。
【００７２】
幾つかの実施の形態では、プローブキットはマイクロアレイ上に固定される。マイクロアレイはＵ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０アレイであるのが好ましい。
【００７３】
検体から得られる生遺伝子発現レベルデータを更にアッセイし、比例ハザードモデルを用いて１８遺伝子スコアを算出する。本発明の実施の形態では、１８遺伝子スコアは、以下の方程式によるアルゴリズムを用いて算出する：スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは１８である）。
【００７４】
別の実施の形態では、１８遺伝子スコアは、以下の方程式によるアルゴリズムを用いて算出する：スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋２×Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋２×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に、遺伝子を単変量分析により検証するのであれば、各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、遺伝子を多変量分析により検証するのであれば、各遺伝子を２ポイントとしてカウントし、総スコアは２１である）。
【００７５】
別の実施の形態では、１８遺伝子スコアは、単変量コックス回帰モデルにおいて以下の方程式によるアルゴリズムを用いて算出する：スコア＝３×ＴＲＰＶ６＋５×ＤＤＸ３９＋１８×ＢＵＢ１Ｂ＋４×ＣＣＲ１＋４×ＳＴＩＬ＋７×ＢＬＭ＋７×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＭＩ１＋９×ＴＰＸ２＋８×ＰＴＩ１＋３×ＴＣＦ３＋７×ＣＣＮＢ１＋２×ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋６×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋２×ＯＢＳＬ１＋６×ＭＭＰ１５（ここで、各遺伝子のスコアをその重み付けに従ってリスケーリングし、総スコアは１０２である）。
【００７６】
別の実施の形態では、１８遺伝子スコアは、多変量コックス回帰モデルにおいて以下の方程式によるアルゴリズムを用いて算出する：スコア＝２×ＴＲＰＶ６＋２×ＤＤＸ３９＋２×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋２×ＢＬＭ＋５×Ｃ１６ＯＲＦ７＋３×ＰＩＭ１＋３×ＴＰＸ２＋５×ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋３×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、各遺伝子のスコアを１〜５のスコアに対するオッズ比に従ってリスケーリングし、オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは４０である）。
【００７７】
別の実施の形態では、１８遺伝子スコアは、多変量コックス回帰モデルにおいて以下の方程式によるアルゴリズムを用いて算出する：スコア＝４×ＴＲＰＶ６＋３×ＤＤＸ３９＋８×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋３×ＢＬＭ＋１１×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＩＭ１＋ＴＰＸ２＋２×ＰＴＩ１＋２×ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、各遺伝子のスコアを１〜１１のスコアに対するオッズ比に従ってリスケーリングし、オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは５６である）。
【００７８】
別の態様では、本発明は、乳房切除術後の患者について乳癌のＬＲＲ率を評価するためのマイクロアレイであって、遺伝子セットがＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１及びＭＭＰ１５を含む、マイクロアレイを提供する。
【００７９】
更なる態様では、本発明は、乳房切除術及び／又はＢＣＳ後の患者について乳癌のＬＲＲ率を評価するためのマイクロアレイであって、遺伝子セットがＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１及びＭＭＰ１５を含む、マイクロアレイを提供する。
【００８０】
また別の態様では、本発明は上述の評価方法に使用される遺伝子セットを提供する。幾つかの実施の形態では、遺伝子セットは乳房切除術又はＢＣＳ後の乳癌患者から得られる検体の遺伝子発現を検出するための試薬を含み、試薬は検出される以下の特定の遺伝子からなる遺伝子セットの任意の１つ以上の遺伝子を有する：ＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１及びＭＭＰ１５。
【００８１】
本発明の他の態様及び利点は、本発明の様々な実施形態の以下の説明的な図面を参照して行われる次の記載の検討により当業者に明らかとなる。
【００８２】
ここで、単に説明的な例として添付の図面を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】乳癌のＬＲＲ率及び遠隔転移のリスクを評価するための本発明の実施形態による評価方法のフローチャートを示す図である。
【図１Ｂ】１８遺伝子スコアが３１未満及び３１以上の患者の５年ＬＲＲ制御可能性を示す図である。
【図２】本発明の実施形態による分類子モデルのＲＯＣ曲線を示す図である。
【図３】ＢＣＳ後の患者（９４％が補助放射線療法を受けた）の５年ＬＲＲ制御可能性を示す図である。
【図４】患者選択及び外部検証のフローを示す図である。
【図５】１８遺伝子分類子による低、中等度及び高リスク患者の無遠隔転移可能性（ＤＭＦＰ）を示す図である。（Ａ）全患者（Ｎ＝８１８）、（Ｂ）Ｉ期（Ｎ＝２１８）、（Ｃ）ＩＩ期（Ｎ＝４１１）、（Ｄ）ＩＩＩ期（Ｎ＝１８４）、（Ｅ）サブグループ分析、（Ｆ）乳癌サブタイプ（ＬＡ：ルミナールＡ様；ＬＢ：ルミナールＢ様；ＬＨ：ルミナールＨＥＲ２；ＴＮＢＣ；トリプルネガティブ乳癌）による低（２１未満のスコア）、中等度（２１〜４３のスコア）及び高リスク（４４以上のスコア）患者の比率。
【図６】（Ａ）遠隔再発、（Ｂ）死亡率、（Ｃ）局所的／領域性再発、及び（Ｄ）任意の再発の予測における各サブグループ、１８遺伝子スコア（連続変数として）のハザード比フォレストプロットを示す図である。
【図７】（Ａ）ＰＭＲＴを受けないＮ０-Ｎ１患者（ｎ＝１１４）におけるＬＲＲの５年累積発生率を示す図である。推定ＬＲＲ率は、３１のスコアを有する患者では５．３％である。（Ｂ）最良のカットオフは３１のスコアであり、ＰＭＲＴによりＬＲＲは１４．９％から１．６％まで（ｐ＝０．０９９）、任意の再発は３４．７％から８．４％まで低下する（ｐ＝０．０１５）。
【図８】１８個の遺伝子の教師なしクラスター分析及び１８遺伝子スコアによる１３５人の患者における教師ありクラスタリングにより、再発を有する患者及び有しない患者において異なる遺伝子発現プロファイルが明らかとなったことを示す図である。ヒートマップの下部に示されるように、局所領域再発（ＬＲＲ）を有する患者は青色であり、ＬＲＲ及び遠隔転移の両方を有する患者は紫色であり、遠隔転移患者は赤色であり、無疾患患者は黄色である。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本発明の他の特徴及び利点を、以下の実施形態において更に説明及び記載する。本明細書に記載の実施形態は本発明を限定するのではなく、単に本発明を説明するものである。
【００８５】
他に規定のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。さらに、他に規定のない限り、単数形の用語は複数のものを含むものとし、複数形の用語は単数のものを含むものとする。概して、本明細書に記載の分子生物学、タンパク質、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド化学、及びハイブリダイゼーション技術に関連して使用される名称は、当該技術分野で既知であり、一般に使用されているものである。本発明は本明細書に記載の特定の検出方法、検出試薬及び検出装置に限定されず、これらの検出方法及び試薬を適度に改良又は変更し、同じ結果及び目的を達成することができる。本明細書で適用される科学用語は、本発明の範囲又は分野の限定ではなく、具体的な説明のために使用される。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、単数形の用語は複数のものを含むものとし、複数形の用語は単数のものを含むものとする。
【００８６】
本開示に従って利用される場合、以下の用語は他に指定のない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。「及び／又は」という用語は本明細書で使用される場合、他の特徴又は構成要素の有無に関わらず２つの指定の特徴又は構成要素の各々の具体的な開示とみなされる。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、その各々が本明細書で個別に記載されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示とみなされる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「浸潤性乳癌」という用語は、小葉の膜又は管の外側から乳房組織へと広がった癌を指す。癌は続いて腋窩のリンパ節（ＬＮ）又はそれを越えて広がる可能性がある。乳癌細胞が身体の他の部分に見られる場合、癌は「転移性乳癌」と呼ばれる。
【００８８】
本明細書で使用される「局所領域再発」又は「ＬＲＲ」という用語は、乳癌と関連する場合、乳房切除術及び／又はＢＣＳによる治療後の乳房、胸壁、腋窩、鎖骨下、鎖骨上又は胸骨傍リンパ節（ＬＮ）領域中の領域を含む局所的及び／又は領域性の乳房の領域における疾患の再発を指す。
【００８９】
本明細書で使用される「遠隔転移」という用語は、乳房切除術及び／又はＢＣＳ後に元の（原発性）腫瘍から１つ以上の身体の他の部分、器官又は遠隔リンパ節（上記の段落に記載の「ＬＲＲ」という用語に包含されないリンパ節）へと広がった乳癌を指す。
【００９０】
「多変量統計」という用語は、２つ以上の結果変数の同時観察及び分析を包含する統計の形態を指す。多変量統計の使用は「多変量分析」と呼ばれる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「比例ハザードモデル」という用語は、生存データが共変量及びリスク因子を更に含む場合に、これらを使用して生存時間に対するこれらの共変量の影響を推定し、特定の期間内の生存可能性を予測することができる統計の生存モデルを指す。コックス比例ハザードモデルは、Sir. David Coxによって１９７２年に提案され、生存分析に最も一般的に使用される回帰分析モデルである。この方法は、コックスモデル又は比例ハザードモデルと呼ばれることが多い。
【００９２】
本明細書で使用される場合、核酸の「ハイブリダイゼーション」という用語は、ＲＮＡ及びＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド等の核酸の２つの相補鎖を接合するプロセスを指す。幾つかの実施形態では、核酸分子及びそれらの対応する遺伝子のセンス鎖を同時若しくは順番に検証し、又は核酸分子がそれらの対応するセンス鎖に相補的である。通例、核酸分子はセンス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、それらの対応の程度を表す。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「マイクロアレイ」という用語は、固体表面に密集及び付着させた微細なＤＮＡスポットの集合を指す。各ＤＮＡスポットは、プローブとして知られるピコモル量の特定のＤＮＡ配列を含有する。これらは、検体（標的と呼ばれる）サンプル中のｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡとも呼ばれる）と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする遺伝子の短い部分又はＤＮＡ単位であり得る。
【００９４】
「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーションがミスマッチ配列を有する核酸間で生じ得る範囲を指す。高ストリンジェンシー条件では分子間の完全な相補性が必要とされ、低ストリンジェンシー条件では、幾つかのミスマッチ塩基が存在する場合のハイブリダイゼーションが可能である。通例、高ストリンジェンシー条件は、ＮａＣｌ濃度を低下させるか、又は関与する分子の溶融温度（Ｔｍ）近くまで温度を上昇させることによって達成される。高ストリンジェンシー条件の例は、５０℃以上（例えば５５℃）及び０．１  ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションである。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「複数の遺伝子」という用語は、２つ以上の遺伝子を指す。
【００９６】
本明細書で使用される場合、略語「ＤＭＦＰ」は遠隔転移が存在しない可能性を指す。ここでの遠隔転移は、再発浸潤性乳癌が確認された又は臨床的に診断された生検として規定される。
【００９７】
本明細書で使用される場合、略語「ＨＥＲ２」はヒト上皮成長因子受容体２型を指す。
【００９８】
本明細書で使用される場合、略語「ＬＲＣＰ」は、ＬＲＲが存在しない可能性である局所的／領域性制御可能性を指す。
【００９９】
本明細書で使用される場合、略語「ＬＶＩ」はリンパ管浸潤を指す。
【０１００】
本明細書で使用される場合、略語「ＯＳ」は、乳癌、非乳癌又は未知の原因による死亡を含む任意の原因による死亡である全生存を指す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、略語「ＰＭＲＴ」は乳房切除術後放射線療法を指す。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、略語「ＲＦＰ」は無再燃可能性を指す。ここでの再燃は任意のＬＲＲ及び／又は遠隔転移と規定される。
【０１０３】
核酸又はそのフラグメントは、他の核酸（又はその相補鎖）と最適にアラインメント（適切なヌクレオチド挿入又は欠失を含む）し、少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、通常は少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％〜９８％のヌクレオチド塩基のヌクレオチド配列同一性が見られる場合、別の核酸と「実質的に相同」（「又は実質的に同様」）である。
【０１０４】
代替的には、核酸又はそのフラグメントを別の核酸（又はその相補鎖）、その鎖又は相補体と選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせた場合に、実質的相同性（又は同一性）が存在する。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性が全くない場合よりも実質的に選択的なハイブリダイゼーションが生じる場合に存在する。通例、選択的なハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％及び最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性が見られる場合に生じる。相同性比較の長さは記載のように、より長いストレッチであってもよく、或る特定の実施形態では多くの場合、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、通例は少なくとも約２８ヌクレオチド、より通例には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチド以上のストレッチにわたるものである。
【０１０５】
このため、本発明のポリヌクレオチドは、リスト１又は本明細書の配列表に示す配列に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するのが好ましい。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性が見られる。ヌクレオチド相同性の比較は、ポリペプチドについて下記に記載されるように行うことができる。好ましい配列比較プログラムは、下記のＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔ  ｆｉｔプログラムである。デフォルトスコアリングマトリックスは、各々の同一ヌクレオチドについて１０、各々のミスマッチについて−９のマッチ値を有する。各ヌクレオチドについてのデフォルトギャップ作成ペナルティは−５０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは−３である。
【０１０６】
本発明において、ホモログ又は相同配列は、少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、５００又は１０００ヌクレオチドにわたって配列表又は下記リスト１に記載のヌクレオチド配列とアミノ酸レベルで少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％又は９８％同一であるヌクレオチド配列を含むものとみなされる。特に、相同性は通例、非必須隣接配列ではなく、タンパク質の機能に必須であることが知られる連続アミノ酸配列をコードする配列のこれらの領域に関して考察するものとする。本発明の好ましいポリペプチドは、配列に記載のヌクレオチド配列の１つ以上に対して５０％、６０％又は７０％を超える相同性、より好ましくは８０％、９０％、９５％又は９７％を超える相同性を有する連続配列を含む。好ましいポリヌクレオチドは代替的又は付加的に、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列表又は下記リスト１に記載の配列に対して８０％、９０％、９５％又は９７％を超える相同性を有する連続配列を含み得る。
【０１０７】
他の好ましいポリヌクレオチドは、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする記載の配列に対して４０％、５０％、６０％又は７０％を超える相同性、より好ましくは８０％、９０％、９５％又は９７％を超える相同性を有する連続配列を含む。
【０１０８】
ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長又は２００ヌクレオチド長である。
【０１０９】
概して、ポリヌクレオチドの長さが短いほど、選択的ハイブリダイゼーションを得るのに必要とされる相同性は大きくなる。その結果として、本発明のポリヌクレオチドが約３０未満のヌクレオチドからなる場合、同一性％が本明細書の配列表又は下記リスト１に記載のヌクレオチド配列と比較して７５％を超える、好ましくは９０％又は９５％を超えるのが好ましい。逆に、本発明のポリヌクレオチドが、例えば５０又は１００を超えるヌクレオチドからなる場合、本明細書の配列表又は下記リスト１に記載の配列と比較した同一性％はより低い、例えば５０％超、好ましくは６０％又は７５％超であり得る。
【０１１０】
本発明の「ポリヌクレオチド」組成物はＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態及び混合ポリマー、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含み、当業者により容易に理解されるように化学的若しくは生化学的に修飾されていても、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有していてもよい。かかる修飾としては、例えば標識、メチル化、１つ以上の自然発生ヌクレオチドの類似体による置換、非荷電結合（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、荷電結合（例えばホスホロチオネート、ホスホロジチオエート等）等のヌクレオチド間修飾、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（例えば、αアノマー核酸等）が挙げられる。ポリヌクレオチドが水素結合及び他の化学的相互作用によって指定配列に結合する能力を模倣する合成分子も含まれる。かかる分子は当該技術分野で既知であり、例えば、分子の骨格中でペプチド結合をリン酸塩結合の代わりとしたものが挙げられる。
【０１１１】
「ポリペプチド」という用語はアミノ酸のポリマー及びその同等物を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。このため、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等を指す又は除外するものではない。例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、天然のアミノ酸等を含む）を含有するポリペプチド、自然発生及び非自然発生の両方の、置換結合及び当該技術分野で既知の他の修飾を有するポリペプチドが定義に含まれる。
【０１１２】
本発明において、相同配列は、少なくとも２０、５０、１００、２００、３００又は４００アミノ酸にわたって対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列表又は下記リスト１に記載の配列とアミノ酸レベルで少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むものとみなされる。特に、相同性は通例、非必須隣接配列ではなく、タンパク質の機能に必須であることが知られる配列のこれらの領域に関して考察するものとする。本発明の好ましいポリペプチドは、対応するアミノ酸の１つ以上に対して５０％、６０％又は７０％を超える相同性、より好ましくは８０％又は９０％を超える相同性を有する連続配列を含む。
【０１１３】
他の好ましいポリペプチドは、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列表又は下記リスト１に記載の配列の４０％、５０％、６０％又は７０％を超える相同性を有する連続配列を含む。相同性を類似性（すなわち、同様の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考察することもできるが、本発明においては、配列同一性に関して相同性を表現するのが好ましい。「実質的相同性」又は「実質的同一性」という用語は、ポリペプチドに言及する場合、問題のポリペプチド又はタンパク質が、自然発生タンパク質全体又はその一部と少なくとも約７０％の同一性、通常は少なくとも約８０％の同一性、好ましくは少なくとも約９０％又は９５％の同一性を示すことを示す。
【０１１４】
相同性の比較は目測により、又はより通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムにより、２つ以上の配列間の相同性％を算出することができる。
【０１１５】
相同性パーセント（％）は連続配列にわたって算出することができ、すなわち１つの配列を他の配列とアラインメントし、１つの配列中の各アミノ酸を、他の配列中の対応するアミノ酸と一度に１つの残基で直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通例、かかるギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数（例えば、５０未満の連続アミノ酸）でのみ行われる。
【０１１６】
これは非常に単純かつ一貫した方法であるが、例えば、そうでなければ同一の配列対において、１つの挿入又は欠失のためにその後のアミノ酸残基がアラインメントから排除されることにより、グローバルアラインメントを行う場合に相同性％の大きな低減が生じる可能性があることは考慮に入れていない。その結果として、殆どの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度に損なうことなく考え得る挿入及び欠失を考慮に入れた最適アラインメントをもたらすように設計されている。これは配列アラインメントにおいて「ギャップ」を挿入し、局所的相同性を最大限にしようとすることによって達成される。
【０１１７】
しかしながら、これらのより複雑な方法では、同じ数の同一アミノ酸について、可能な限り少ないギャップを有する（２つの比較配列間のより高い関連性を反映する）配列アラインメントが、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、アラインメントにおいて生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在について比較的高いコストを課し、ギャップ中の後続の各残基により小さなペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が通例使用されている。これは最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは当然ながら、より少ないギャップを有する最適化アラインメントをもたらす。殆どのアラインメントプログラムではギャップペナルティの変更が可能である。しかしながら、かかる配列比較ソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用するのが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔ  ｆｉｔパッケージ（下記を参照されたい）を使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティはギャップについて−１２、各伸長について−４である。
【０１１８】
したがって、最大相同性％の算出では、初めにギャップペナルティを考慮した最適アラインメントの生成が必要である。かかるアラインメント行うのに好適なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔ  ｆｉｔパッケージ（ウィスコンシン大学、米国；Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al., 1999（前掲誌） - Chapter 18を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡはどちらも、オフライン及びオンライン検索に利用可能である（Ausubel et al., 1999（前掲誌）, pages 7-58 to 7-60を参照されたい）。しかしながら、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用するのが好ましい。
【０１１９】
最終相同性％を同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセス自体は通例、全か無かの一対比較に基づくものではない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいて各々の一対比較にスコアを割り当てるスケーリング類似性スコアマトリックスが概して使用される。一般に使用される、かかるマトリックスの例は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは概して、公開デフォルト値又は供給される場合にカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。ＧＣＧパッケージについては公開デフォルト値、又は他のソフトウェアの場合はＢＬＯＳＵＭ６２等のデフォルトマトリックスを使用するのが好ましい。
【０１２０】
ソフトウェアにより最適アラインメントを生成した後、相同性％、好ましくは配列同一性％を算出することが可能である。ソフトウェアは通例、配列比較の一環としてこれを行い、数値結果を生成する。
【０１２１】
ポリペプチドの「フラグメント」、「一部」又は「セグメント」は、少なくとも約５個〜７個の連続アミノ酸、多くの場合、少なくとも約７個〜９個の連続アミノ酸、通例少なくとも約９個〜１３個の連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０個〜３０個以上の連続アミノ酸のアミノ酸残基のストレッチである。
【０１２２】
本発明の好ましいポリペプチドは、配列表又は下記リスト１に記載の配列と実質的に同様の機能を有する。本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列表又は下記リスト１に記載の配列と実質的に同様の機能を有するポリペプチドをコードする。「実質的に同様の機能」とは、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列表又は下記リスト１に記載の配列の核酸又はポリペプチドのホモログ、変異体、誘導体又はフラグメントの機能を指す。
【０１２３】
核酸ハイブリダイゼーションは、当業者により容易に理解されるように、塩基組成、相補鎖の長さ、及びハイブリダイズ核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度、温度又は有機溶媒等の条件によって影響を受ける。ストリンジェントな温度条件は概して、３０℃を超える、通例３７℃を超える、好ましくは４５℃を超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は通常、１０００ｍＭ未満、通例５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満である。しかしながら、パラメーターの組合せが任意の単一パラメーターの測定よりもはるかに重要である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、６５℃及び０．１倍ＳＳＣ（１倍ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））である。
【０１２４】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例又は実施形態において説明及び記載される。本明細書に記載の実施例又は実施形態は単に本発明の説明的な例であり、本発明を何ら限定するものではない。
【０１２５】
図１Ａに、乳癌の局所領域再発（ＬＲＲ）率及び遠隔転移のリスクを評価する本発明の実施形態による評価方法のフローチャートを説明する。
【０１２６】
本発明の実施形態によると、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測する方法であって、被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することと、少なくとも１つの遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出すこととを含み、少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、導き出されたスコアが被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、方法が記載される。
【０１２７】
上述の１８個の遺伝子の群から選択される少なくとも１つの遺伝子は、（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、若しくはそのフラグメント、ホモログ、変異体若しくは誘導体、（ｂ）対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする（ａ）の配列のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は（ｃ）（ａ）、（ｂ）の配列若しくはその相補体のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【０１２８】
少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルを用い、少なくとも１つの遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出す工程を行う。
【０１２９】
導き出されたスコアが第１の所定参照未満である場合、被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の低リスク群に分類する。導き出されたスコアが第１の所定参照以上である場合、被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の高リスク群に分類する。
【０１３０】
導き出されたスコアが第２の所定参照未満である場合、被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの低リスク群に分類する。導き出されたスコアが第３の所定参照以上である場合、被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの高リスク群に分類する。導き出されたスコアが第２の所定参照（両端値を含む）と第３の所定参照との間である場合、被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの中等度リスク群に分類する。
【０１３１】
第１の所定参照が３１というスコアであり、第２の所定参照が２１というスコアであり、第３の所定参照が４４というスコアであるのが好ましい。
【０１３２】
本発明の別の実施形態によると、乳房切除術及び／又は乳房逆手術後の乳癌を有する被験体におけるＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのキットであって、被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子に特異的に結合し、該少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを定量化することが可能な少なくとも１つの試薬と、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいてスコアを導き出すための少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルとを含み、少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、導き出されたスコアが被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、キットが記載される。
【０１３３】
上述の１８個の遺伝子の群から選択される少なくとも１つの遺伝子は、（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、若しくはそのフラグメント、ホモログ、変異体若しくは誘導体、（ｂ）対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする（ａ）の配列のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は（ｃ）（ａ）、（ｂ）の配列若しくはその相補体のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【０１３４】
本発明の別の実施形態によると、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体におけるＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのマイクロアレイであって、ＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体の発現レベルを測定するための少なくとも１つの遺伝子プローブを含む、マイクロアレイが記載される。
【０１３５】
上述の１８個の遺伝子の群から選択される少なくとも１つの遺伝子は、（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、若しくはそのフラグメント、ホモログ、変異体若しくは誘導体、（ｂ）対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする（ａ）の配列のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は（ｃ）（ａ）、（ｂ）の配列若しくはその相補体のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【０１３６】
驚くべきことに、また有利には、上記の様々な実施形態で言及される任意の数の本発明の１８個の遺伝子を、任意の組合せで乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体におけるＬＲＲ及び／又は遠隔転移又は可能性を予測するために使用することができる。
【０１３７】
さらに、有利には、予測されたＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を用いて、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の被験体について補助治療のタイプを予測又は決定することができる。
【実施例】
【０１３８】
実施例１
乳房切除術又は乳房逆手術後の局所領域再発率と関連する遺伝子発現プロファイルを検証するＤＮＡマイクロアレイ分析
浸潤性乳癌を有する患者は、乳癌の新たな分類を開発する腫瘍遺伝子の医学研究において最終候補に残ったものとした。２００５年〜２０１２年に乳房切除術又は乳房温存手術（ＢＣＳ）を受けた、ＤＮＡ（又は遺伝子）マイクロアレイに利用可能な組織検体を有する合計２１７人の浸潤性乳癌を有する患者を本研究に選択した。２１７人の患者のうち、１３０人の患者が乳房切除術を受け、８７人の患者がＢＣＳを受けていた。２１７人の患者全てが、原発性腫瘍組織にＤＮＡ（又は遺伝子）マイクロアレイの研究を行うことを同意した。研究に適格な患者は、最低２年間の追跡調査中に乳房切除術後放射線療法（ＰＭＲＴ）を受けないものとする（ｎ＝１３０）。乳房温存手術（ＢＣＳ）を受けた患者（ｎ＝８７）は、局所領域再発（ＬＲＲ）率の予測における遺伝子発現プロファイリングのパフォーマンスを検査するために別個に分析した。
【０１３９】
本研究の乳房切除術又はＢＣＳ後の患者の臨床的特徴を下記表１に示す。臨床的特徴に基づくと、患者の大部分がＴ２期又はそれ以上にあり（５６％、７３／１３０）、９３％（１２１／１３０）がＮ０及びＮ１疾患を有していた。いずれの患者も乳房切除術又はＢＣＳ後に放射線療法を受けなかった。
【０１４０】
【表１】
2018515124.tif 000003
【０１４１】
２１７人の患者の各々の凍結組織サンプルは、治療（乳房切除術又はＢＣＳ）前に患者から採取した原発性腫瘍の外科検体から得た。全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Invitrogen，Carlsbad，CA）により腫瘍組織から抽出し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen，Valencia，CA）により精製し、Agilentの２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより定性的に評定した。ハイブリダイゼーション標的をAffymetrixのプロトコルに従って全ＲＮＡから調製し、Ｕ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０アレイにハイブリダイズさせた。
【０１４２】
１８個の遺伝子が、コックス比例ハザードモデルの単変量分析後の１３０人の乳房切除術患者におけるＬＲＲ率と顕著に関連することが見出された。これら１８個の遺伝子の機能は発癌プロセス、増殖、浸潤、炎症、細胞間相互作用、アポトーシス及び代謝に関与する遺伝子と関連する。最も顕著にＬＲＲ率と関連するこれらの遺伝子のうち、ＢＬＭ、ＴＣＦ３、ＰＩＭ１、ＲＣＨＹ１及びＰＴＩ１が発癌プロセスに関与し、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＳＴＩＬ、ＴＰＸ２及びＣＣＮＢ１が増殖に関与し、ＭＭＰ１５が浸潤と関連し、ＣＣＲ１及びＮＦＡＴＣ２１Ｐが炎症に関与し、ＴＲＰＶ６及びＤＴＸ２が細胞死と関連し、ＥＮＳＡが代謝と相関する（下記表２を参照されたい）。２２プローブセットの１８個の遺伝子を列挙した表３も参照されたい。
【０１４３】
【表２】
2018515124.tif 000004
【０１４４】
【表３】
2018515124.tif 000005
【０１４５】
実施例２
統計分析により検証したＬＲＲ率の遺伝子発現プロファイル
本発明の新たなプラットホームの３４個の遺伝子を８４遺伝子プローブセットに割り当てたが、未知の機能を有する４個の遺伝子を同定することができなかった。単変量分析後に、残りの３０個のうち１８個の遺伝子により、乳房切除術患者をＬＲＲ率に基づいて低リスク及び高リスク群に分類することが可能であることが見出された。多変量分析後に、患者を低リスク群及び高リスク群に分類することができる。１８個の遺伝子を使用して、ＢＣＳ患者を低リスク群及び高リスク群に分類した。１８遺伝子スコアが３１以上の患者を高リスクと規定し、スコアが３１未満の患者を低リスクと規定した。
【０１４６】
１８個の遺伝子（１８遺伝子パネル又は分類子）に基づくスコアリングアルゴリズム
表４に、比例ハザードモデルを用いた１８個の遺伝子の各々に基づいてスコアを導き出す又は算出する単変量分析及び多変量分析を示す。ハザード比が１未満である場合、多変量分析では１としてカウントする。
【０１４７】
【表４】
2018515124.tif 000006
【０１４８】
以下は、１８遺伝子パネルに基づく４つの例示的なスコアリングアルゴリズムである。
【０１４９】
アルゴリズム１：各遺伝子に１ポイント、合計１８個の遺伝子が存在する。総スコア＝１８。
スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５
【０１５０】
【表５】
2018515124.tif 000007
【０１５１】
アルゴリズム２：ハザード比が１未満である場合に、遺伝子を単変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、遺伝子を多変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を２ポイントとしてカウントし、総スコアは２１である。
スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋２×Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋２×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５
【０１５２】
【表６】
2018515124.tif 000008
【０１５３】
アルゴリズム３：１８遺伝子スコアを、単変量分析の単変量オッズ比に基づいて算出する。各遺伝子のスコアをその重み付けに従ってリスケーリングし、総スコアは１０２である。
スコア＝３×ＴＲＰＶ６＋５×ＤＤＸ３９＋１８×ＢＵＢ１Ｂ＋４×ＣＣＲ１＋４×ＳＴＩＬ＋７×ＢＬＭ＋７×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＩＭ１＋９×ＴＰＸ２＋８×ＰＴＩ１＋３×ＴＣＦ３＋７×ＣＣＮＢ１＋２×ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋６×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋２×ＯＢＳＬ１＋６×ＭＭＰ１５
【０１５４】
【表７】
2018515124.tif 000009
【０１５５】
アルゴリズム４：１８遺伝子スコアを、多変量分析のオッズ比に基づいて算出する。各遺伝子のスコアを１〜５のスコアに対するオッズ比に従ってリスケーリングし、オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは４０である。
スコア＝２×ＴＲＰＶ６＋２×ＤＤＸ３９＋２×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋２×ＢＬＭ＋５×Ｃ１６ＯＲＦ７＋３×ＰＩＭ１＋３×ＴＰＸ２＋５×ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋３×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５
【０１５６】
【表８】
2018515124.tif 000010
【０１５７】
結果
臨床決定は哲学的により保守的であることを意図し、患者を過剰治療する傾向にある。これに基づいて、最適カットオフ値（又は所定参照）を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線でスコア３１とした。これらの予測の全体的な精度は８７％であり、推定感度は９１％、特異度は８７％であった。１８遺伝子スコアが３１以上及び３１未満である患者における５年局所領域制御可能性は、それぞれ５０％及び１００％であった（ｐ＜０．０００１）（図１Ｂを参照されたい）。
【０１５８】
リンパ節（ＬＮ）状態は全体的診断の重要な因子である。ＬＮ状態は原発性腫瘍が「遠隔転移」として知られる形で広がっているかを決定するために使用することができる。ＬＮ状態は算出による評価に使用することもでき、その後の治療にとっての参照をもたらし得る。
【０１５９】
ＬＮ状態によると、１８遺伝子スコアがそれぞれ３１以上及び３１未満のＮ０及びＮ１患者では、５年ＬＲ制御可能性は統計的に異なっていた（５０％対１００％、ｐ＜０．０００１）。Ｎ２患者の数は結論を導き出すには少な過ぎたが、１８遺伝子パネルの予測力はＮ０-Ｎ１患者と同様であった。１８遺伝子分類子（又は予測分類モデル）により高リスクとして規定された患者は、ＬＮ転移の有無に関わらず非常に低い５年無転移生存及び全生存率を有していた。更なる詳細及びデータは上記表４に提示している。
【０１６０】
【表９】
2018515124.tif 000011
【０１６１】
表５に示されるように、１８遺伝子パネルに基づくプロファイリングは、主にＮ０及びＮ１乳房切除術患者に対するものである。本研究では、Ｎ０患者のＬＲＲ率は約５％であり、本遺伝子分類子（１８遺伝子パネル）により、９％のＮ０患者が高リスクであり、その５０％が癌再燃を有し得ることが確認された。対照的に、Ｎ１患者のＬＲＲ率は約２０％であり、本遺伝子分類子（１８遺伝子パネル）により、３８％のＮ１患者が高リスクであり、その５０％が癌再燃を有し得ることが確認される。Ｎ２患者については、本サンプルの数は何らかの結論を導き出すには少な過ぎるが、予測精度は同様であった。５５％のＮ２患者が高リスクに分類される。
【０１６２】
乳房切除術患者及びＢＣＳ患者の両方における１８遺伝子分類子のパフォーマンスの一貫性は非常に良好である。これにより、乳癌患者にＬＲＲのリスクがあるかを１８遺伝子分類子により予測することができることが強く示唆される。
【０１６３】
実施例３
乳房切除術患者のコックス比例ハザードモデル
現行の臨床業務に基づくと、Ｎ１乳癌患者が補助放射線療法を必要とするかを評価するために用いられる方法では、そのおよそ８０％が補助放射線療法に割り当てられる。しかしながら、放射線療法はこれらの患者のＬＲＲ率を低下させ、再燃に起因する二次遠隔転移を予防し、全生存率を改善する。
【０１６４】
コックス比例ハザードモデルは、生存率及び関連変数を説明するために広く使用されている。続いて、研究により（１８遺伝子パネル）分類子がＬＲＲ率制御と関連する独立した予後因子であるかを検査した。従来の比例ハザード分析により、ＬＲＲと関連するＬＮ転移の程度及びＥＲ状態を含む、比例ハザード分析及び定量的評価と関連する臨床パラメーターが確立されている。臨床パラメーター及び分類子の分類システムを用いて、１３０人の患者（乳房切除術を受けた）から得られる検体の比例ハザードを完全に分析した。
【０１６５】
これらの従来の臨床的変数と（１８遺伝子パネル）分類子との組合せが、ＬＲＲ率を予測する有意な独立因子であり得ることが確認された。（１８遺伝子パネル）分類子及び比例ハザード分析の使用により、患者の１８遺伝子スコアが３１以上である場合に（表６を参照されたい）、ＬＲＲ率のハザード比が６７．８（９５％信頼区間、８．３〜５５２．５）であることが示された。本研究では、Ｎ０及びＮ１患者を、新規の遺伝子発現プロファイル及び評価モデルを用いてより均一なサブグループへと分類することができることも確認された。
【０１６６】
【表１０】
2018515124.tif 000012
【０１６７】
実施例４
ＢＣＳ患者に対する（１８遺伝子パネル）分類子を用いたＬＲＲ率の評価
８７人のＢＣＳ患者を、マイクロアレイ情報を用いて分析した。これらの患者の９４％（８２／８７）が術後放射線療法を受けていた（表１を参照されたい）。これらの患者の臨床的特徴は、補助化学療法を受けたＴ１乳房切除術患者とは僅かに異なっていた。
【０１６８】
単変量及び多変量分析から、（１８遺伝子パネル）分類子により、術後補助化学療法を受けたＢＣＳ患者が高ＬＲＲリスクであるかを検証し得ることが確認された。（１８遺伝子パネル）分類子により、補助化学療法を受けていない患者に対する予後リスク評定のパフォーマンスが改善された。多変量分析から、３１以上の１８遺伝子スコア及び顕著なＬＶ浸潤がＬＲＲ率の独立リスク因子であることが示された。補助化学療法を受けていないＢＣＳ患者は４０％のＬＲＲリスク率を有し、（１８遺伝子パネル）分類子により低リスク群にあると検証された患者のＬＲＲ率は僅か３％であった（表７及び図３を参照されたい）。（１８遺伝子パネル）分類子により低リスク群にあると検証された場合、補助化学療法を受けていない患者はＬＲＲを有しない可能性がある。
【０１６９】
【表１１】
2018515124.tif 000013
【０１７０】
結論として、本発明に使用される（１８遺伝子パネル）分類子により、ＬＲＲのリスクが高い乳房切除術患者及びＢＣＳ患者について検証することができる。本発明では、（１８遺伝子パネル）分類子により、高リスクの乳房切除術患者及びＢＣＳ患者が放射線療法の介入を必要とするかを検証することができる。
【０１７１】
実施例５
異なるサブタイプ、病期又は治療法での遠隔転移の可能性の予測
材料及び方法
原発性腫瘍組織にわたるマイクロアレイベースの遺伝子発現プロファイルにより一次手術を受けた、手術可能な乳癌を有する合計８１８人の乳癌患者を研究に選択した。患者は、Koo Foundation Sun Yat-Sen Cancer Centerにおいて２００５年〜２０１２年に一次手術を受けた臨床病期Ｉ〜ＩＩＩの乳癌患者であった。患者選択のフローを図４に示す。研究に適格な患者は以下の組み入れ基準を満たすものとする：（１）乳癌の浸潤性癌を有する女性であること、（２）治療前に臨床病期Ｉ〜ＩＩＩであること、（３）非定型乳房切除術又は乳房全切除術及びセンチネルリンパ節生検による治療を受けていること、（４）新鮮凍結組織が利用可能であること、並びに（５）インフォームドコンセントに署名していること。
【０１７２】
AffymetrixのＵ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０アレイを用いたマイクロアレイ研究
合計８１８個の凍結組織サンプルが、２００５年〜２０１４年に任意の全身治療前に患者から採取した原発性腫瘍の外科検体に由来するものであった。ハイブリダイゼーション標的を全ＲＮＡから調製し、Affymetrixのプロトコルに従ってＵ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０アレイにハイブリダイズさせた。
【０１７３】
１８個の遺伝子及びスコアリングアルゴリズム
１８遺伝子パネル又は分類子は遺伝子ＢＬＭ、ＴＣＦ３、ＰＩＭ１、ＲＣＨＹ１、ＰＴＩ１、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＳＴＩＬ、ＴＰＸ２、ＣＣＮＢ１、ＭＭＰ１５、ＣＣＲ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＴＲＰＶ６、ＯＢＳＬ１、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＤＴＸ２（Ｎｏｔｃｈ）及びＥＮＳＡを含む。１８遺伝子スコアを、多変量分析のオッズ比に基づいて算出する。各遺伝子のスコアを１〜１１のスコアに対するオッズ比に従ってリスケーリングし、オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは５６である。
【０１７４】
スコアリングアルゴリズムは以下の通りである：１８遺伝子スコア＝４×ＴＲＰＶ６＋３×ＤＤＸ３９＋８×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋３×ＢＬＭ＋１１×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＩＭ１＋ＴＰＸ２＋２×ＰＴＩ１＋２×ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５；総スコア＝５６。
【０１７５】
１８遺伝子スコアが２１未満の患者を低遠隔転移リスクと規定し、２１〜４３のスコアを中等度遠隔転移リスク、４４以上のスコアを高遠隔転移リスクと規定する。
【０１７６】
統計的方法
コックス比例ハザード回帰モデルを用いて、以下のリスク因子の予後的意義を評定した：診断時の年齢、原発性腫瘍サイズ、罹患した腋窩リンパ節の数、組織学的悪性度、核異型度、リンパ管浸潤、ＥＲ／ＰＲ状態、ＨＥＲ２過剰発現及び１８遺伝子スコア。局所領域制御の期間は、治療初日から胸壁若しくは領域リンパ節再発又は最後の追跡調査の日までとして算出した。局所的／領域性制御可能性（ＬＲＣＰ）をカプランマイヤー法に従って算出した。ログランク検定を用いて、患者サブセット間のＬＲＣＰ、無再燃可能性（ＲＦＰ）、無遠隔転移可能性（ＤＭＦＰ）及び全生存の差異の統計的有意性を評定した。
【０１７７】
結果
患者
８１８人の全ての患者の基本特徴は、下記表８に見ることができる。転移を有しない患者の追跡調査間隔中央値は５６．４であった（０〜１５９．４）。転移を有する患者（生存患者のみ）の追跡調査間隔は６１．４（１８．０〜１６８．２）ヶ月であった。最も多い年齢は４０歳〜６０歳であった。原発性腫瘍は、通常は２ｃｍよりも大きかった（ｎ＝４８４、５９．２％）。Ｎ０疾患が最も多く（ｎ＝３９２、４７．９％）、その後にＮ１疾患（ｎ＝２４８、３０．３％）が続いた。殆どの患者がＥＲ又はＰＲ陽性（ｎ＝５３７、６５．６％）かつＨＥＲ２陰性（ｎ＝５１２、６２．６％）であった。顕著なリンパ管浸潤（ＬＶＩ）が２４．３％の患者（ｎ＝１９９）に見られた。腫瘍グレードＩＩＩ（ｎ＝４６１、５６．４％）が最も多く、その後にグレードＩＩ（ｎ＝２６７、３２．６％）が続いた。
【０１７８】
乳癌サブタイプ（図６を参照されたい）との関連では、３２．５％（ｎ＝２６６）の患者がルミナールＡサブタイプ、１２．６％（ｎ＝１０３）がルミナールＢサブタイプ、２０．５％（ｎ＝１６８）がＨＥＲ２−ルミナールサブタイプ、１６．９％（ｎ＝１３８）がＨＥＲ−２サブタイプ、１７．５％（ｎ＝１４３）がトリプルネガティブサブタイプであった。
【０１７９】
補助化学療法を８７．７％（ｎ＝７１７）、補助ホルモン療法を６２．１％（ｎ＝５０８）、アジュバント放射線療法を６９．１％（ｎ＝５６５）の患者に行った。
【０１８０】
下記表１に示されるように、遠隔転移と顕著に関連するリスク因子は、より高い腫瘍病期、より進行した結節期、両方のホルモン受容体への陰性及び顕著なＬＶＩを含む。
【０１８１】
１８遺伝子分類子
１８遺伝子スコアリングアルゴリズムによると、２１．９％（ｎ＝１７９）の患者が低リスク（２１未満のスコア）、５７．５％（ｎ＝４７０）が中等度リスク（２１〜４３のスコア）、２０．７％（ｎ＝１６９）の患者が高リスク（４４以上のスコア）に分類された。低、中等度及び高リスク群における遠隔転移率は、それぞれ２．２％、１４．３％及び３２％であった（ｐ＜０．０００１、表１を参照されたい）。
【０１８２】
コックス比例ハザード回帰モデルによる遠隔転移と関連する因子の単変量及び多変量分析は、下記表９に見ることができる。
【０１８３】
コックス比例ハザード回帰モデルによる遠隔転移の単変量分析から、１８遺伝子スコアが２１以上の患者のハザード比が８．９（３．３〜２４．２）であることが明らかとなった（表９）。多変量分析では、ハザード比は５．７（２．０〜１５．９）であった。遠隔転移と独立して関連する他のリスク因子には、Ｔ期（Ｔ３対Ｔ１、ＨＲ  ３．８、９５％ＣＩ  １．８〜８．１）及びＮ期（Ｎ３対Ｎ０、ＨＲ  ５．９、９５％ＣＩ  ３．３〜１０．７）が含まれていた。いずれの補助治療（ホルモン療法、放射線療法及び化学療法）も、それぞれホルモン療法については２．３（１．１、４．９）、化学療法については２．１（１．１、３．９）、放射線療法については１．８（１．１、３．０）のハザード比で遠隔転移のリスクを増大しなかった（表９）。
【０１８４】
異なる病期、サブタイプ及びサブグループにおける１８遺伝子分類子のパフォーマンス
図５Ａから低、中等度及び高リスク群の５年ＤＭＦＰ率がそれぞれ９６．６％、８５．０％及び５９．６％であることが示される。１８遺伝子分類子により分析したＩ期、ＩＩ期及びＩＩＩ期の低リスク群のパーセンテージは、それぞれ３６．２％（７９／２１８）、１９．９％（８２／４１１）及び９．７％（１８／１８４）であった（図５）。スコアが２１未満の患者（低リスク群）では、Ｉ期、ＩＩ期及びＩＩＩ期の５年ＤＭＦＰ率は１００％、９４．５％及び９０．９％であった。高リスク群（４４以上のスコア）では、対応する５年ＤＭＦＰ率は、それぞれ７９．３％、６８．０％及び４０．６％であった。
【０１８５】
図５ＥからルミナールＡ様、ルミナールＢ様、ルミナールＨＥＲ２、ＨＥＲ２及びトリプルネガティブサブタイプにおける低リスク患者の割合がそれぞれ４３．２％（１１５／２６６）、８．７％（９／１０３）、１５．５％（２６／１６８）、９．４％（１３／１３８）及び１１．２％（１６／１４３）であることが示される。図５Ｅに示されるように、ルミナールＡ様、ルミナールＢ様、ルミナールＨＲ２、ＨＥＲ２及びトリプルネガティブサブタイプにおける低リスク群の５年ＤＭＦＰ率は９７．５％、１００％、９０％、９２．３％及び１００％であった。対応する５年ＲＦＰ率はそれぞれ９８．８％、１００％、１００％、１００％及び９０％であった。高リスク群では、対応する５年ＤＭＦＰ率は５４．５％、５４．２％、６８．１％、４７．９％及び６９．２％であった。ルミナール様サブタイプの平均１８遺伝子スコアは、ＨＥＲ２サブタイプ（３５．６）及びトリプルネガティブサブタイプ（３６．７）よりも低かった（２６．８）。
【０１８６】
１８遺伝子スコアを連続変数として用いて、図７で１８遺伝子分類子が遠隔再発、ＬＲＲ、任意の再発及び全生存と関連する独立予後因子であることを実証する。この観察結果は、様々な年齢層（４０歳未満、４０歳〜６０歳及び６０歳超）、病期（Ｔ３及びＴ４を除く）、サブタイプ（ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２状態）及び治療法（化学療法、放射線療法及びホルモン療法）の全体にわたる。ハザード比はおよそ１．０６〜１．１４である。再発リスクはスコア増加によって１．０６〜１．１４増大する。
【０１８７】
本発明の別の実施形態では、ＬＲＲの再発及び／又は遠隔転移を有する患者及び有しない患者における遺伝子発現プロファイルを表す方法は、デンドログラムの形態である（図８を参照されたい）。１８個の遺伝子の教師なしクラスター分析及び１８遺伝子スコアによる１３５人の患者における教師ありクラスタリングから、再発を有する患者及び有しない患者における明らかな遺伝子発現プロファイルが明らかとなった。図８のヒートマップの下部に示されるように、局所領域再発（ＬＲＲ）を有する患者は青色であり、ＬＲＲ及び遠隔転移の両方を有する患者は紫色であり、遠隔転移患者は赤色であり、無疾患患者は黄色である。
【０１８８】
論考
１８遺伝子分類子は癌サブタイプ、病期、手術のタイプ又は補助治療に関わらず遠隔転移を予測することが可能な多機能遺伝子パネルである。低、中等度及び高リスク群における５年ＤＭＦＰ率は、それぞれ９６．６％、８５％及び５９．６％であった。他の臨床的及び病理的変数により調整すると、１８遺伝子分類子はハザード比が５．７（９５％ＣＩ、２．０〜１５．９）の遠隔転移の独立予後因子である（表９）。フォレストプロットにより、１８遺伝子分類子が種々のサブグループにおけるＬＲＲ、遠隔転移、任意の再燃及び死亡率と有意に関連することが確認された（図５Ａ〜図５Ｄ）。１８遺伝子スコアを連続変数として用いることで、スコア増加による遠隔転移のハザード比は１．０８（９５％ＣＩ、１．０６〜１．１）、ＬＲＲのハザード比は１．０９（１．０６〜１．１３）、任意の再発のハザード比は１．０８（１．０６〜１．０９）、死亡率のハザード比は１．０９（１．０６〜１．１３）であった。１８遺伝子分類子は同時に、遠隔転移及びＬＲＲの両方の予後バイオマーカーとなる力を有する。
【０１８９】
８１８人の患者の研究群を、台湾の乳癌患者の約１０分の１を治療している独立癌センターにおいて無作為に選択された乳癌集団である８１５５人の患者の初期群から選択した（１６、１７）。乳癌の特定のサブタイプ及び病期に焦点を合わせている他の多重遺伝子パネル試験とは異なり、本研究では、１８遺伝子分類子が同様に乳癌を有する一般集団における遠隔転移の良好又は不良な予後値を有する普遍的多重遺伝子パネルであるとしている。
【０１９０】
本研究群における遠隔転移率は、死亡又は再発する患者が初めに研究に参加していることから初期群よりも高い（図４）。しかしながら、このコホートの結果は、１）より高いＴ及びＮ期により遠隔転移の可能性が増大し、２）補助治療により遠隔転移の可能性が減少し、３）トリプルネガティブサブタイプがルミナール様乳癌よりも侵襲性であり、１８遺伝子スコア及び再発率はより高いという共通認識に適合する。
【０１９１】
１８遺伝子分類子により、５年遠隔転移率が４％未満の２２％の低リスク乳癌患者の全体を明らかにすることが可能である。１８遺伝子分類子には３つの独自の特徴がある。第一に、１８遺伝子分類子は乳癌を有する多数の一般集団を検証する初めてのアジア人ベースのゲノムパネルである。第二に、１８遺伝子分類子は非ルミナール乳癌における再燃リスクを層別化すると考えられる。第三に、１８遺伝子分類子は同時にＬＲＲ及び遠隔転移の可能性の両方を予測することができる。
【０１９２】
過去１５年間に、早期乳癌が種々の分子サブタイプ及び予後を有する不均一疾患であるという共通認識が得られている（１３、１８、１９）。背景技術の項で論考したように、幾つかの早期乳癌の多重遺伝子パネルがこれまでに開発されている（１５）。その後の多重遺伝子パネル（Ｐｒｏｓｉｇｎａ、ＥｎｄｏＰｒｅｄｉｃｔ、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｄｅｘ）は、以前のもの（ＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ、ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｇｒａｄｅ  Ｉｎｄｅｘ）よりも後期遠隔転移の予測に良好であると言われている（２０、２１）。これらは主にルミナール様（ＥＲ陽性／ＨＥＲ２陰性）及びリンパ節陰性乳癌に焦点を合わせており、サブセットの低リスク群における化学療法を除外する可能性をもたらす。
【０１９３】
しかしながら、非ルミナール乳癌患者における再燃リスクを層別化する可能性は、依然として既存のパネルに基づく未解決の課題である。例えば、７０遺伝子及び７６遺伝子パネルの予後リスクの識別はＥＲ陽性患者では良好であるが、ＥＲ陰性患者では５％未満しか低リスク群に分類されない（１３、１４）。２１遺伝子パネルによるＨＥＲ−２サブタイプの比較的高い（５０％超）偽陰性率も注目されている（２２）。これは、第１世代ゲノムパネルがＥＲ陽性疾患の予後を決定するために増殖関連遺伝子の定量化に大きくリレーすることに起因し得る（２３）。結果として、これらの研究では多重遺伝子パネルの臨床的有効性は他の乳癌サブタイプに限定される。幾つかの研究から、免疫応答及び間質浸潤と関連する遺伝子発現プロファイルがＥＲ陰性及び高増殖性ＥＲ陽性乳癌の予後値を有することが示されている（２４-２７）。しかしながら、第２世代ゲノムパネルにより低リスク群として分類される患者の５年再燃率は依然として２０％に達する。
【０１９４】
１８遺伝子分類子の１８個の遺伝子は増殖、発癌プロセス、浸潤、炎症、細胞間相互作用、アポトーシス及び代謝と関連する。本研究では、１８遺伝子分類子により１２．７％のＨＥＲ２（＋）及び１１．２％のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）患者が、５年遠隔転移率がそれぞれ８％及び０％の低リスク群として同定された。この驚くべき結果により、非ルミナール乳癌の再燃リスクを層別化する可能性がもたらされる。そうであれば、この疾患サブセットにおける化学療法の適用量を低減する又は抑えることが可能となり得る。他のよく知られた情報では、１８遺伝子分類子の高リスク群において５年ＤＭＦＰが治療に関わらず僅か４０％〜６０％であり、ドースデンス化学療法又は新規の臨床試験をこれらの患者において考察することができるとされている。
【０１９５】
さらに、乳癌の人種的相違は別の問題である（２８）。アジア人女性は、地域によっては非ヒスパニック系コーカサス人及びアフリカ系アメリカ人よりも良好な生存率を有するため、欧米ゲノムパネルによるアジア人集団のリスクの過剰評価につながる可能性がある（２９）。
【０１９６】
本１８遺伝子分類子は、ドースデンス化学療法及び高線量の放射線療法から利益を得る可能性がある高リスク患者群を同定することも可能である。低リスク群の５年遠隔転移率は僅か２．２％（４／１７９）である。以前の研究によると、補助化学療法は再発リスクを３０％〜５０％低減し得る。最大のオッズ、例えば５０％が考慮されると仮定すると、化学療法を行わない場合の低リスク群における初期遠隔転移率はおよそ４．４％であり得る。３％未満増大させると、低リスク群における化学療法の毒性作用を受ける他の９５％の患者が残る。
【０１９７】
まとめると、１８遺伝子分類子はＬＲＲ及び遠隔転移を同時に予測することが可能な普遍的パネルである。
【０１９８】
【表１２】
2018515124.tif 000014
【０１９９】
【表１３】
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【０２００】
リスト１：１８遺伝子分類子の１８個の遺伝子の各々の遺伝子コード配列
１．  ＴＲＰＶ６：一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー６（ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４２７４．３（配列番号１）
２．  ＤＤＸ３９：ＤＥＡＤボックスヘリカーゼ３９Ａ（ホモ・サピエンス（ヒト））（配列番号２）
３．  ＢＵＢ１Ｂ：ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／トレオニンキナーゼＢ（ホモ・サピエンス（ヒト））（配列番号３）
４．  ＣＣＲ１：Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１２９５．２（配列番号４）
５．  ＳＴＩＬ：ＳＣＬ／ＴＡＬ１遮断遺伝子座（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００３０３５．２（配列番号５）
６．  ＢＬＭ：ブルーム症候群ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００００５７．３（配列番号６）
７．  Ｃ１６ＯＲＦ７（前称）：ＶＰＳ９ドメイン含有１（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００４９１３．２（配列番号７）
８．  ＴＰＸ２：ＴＰＸ２、微小管核形成因子（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１２１１２．４（配列番号８）
９．  ＰＴＩ１（ＥＥＦ１Ａ１としても知られる）：真核生物翻訳伸長因子１α１（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１４０２．５（配列番号９）
１０．  ＴＣＦ３：転写因子３（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００３２００．３（配列番号１０）
１１．  ＣＣＮＢ１：サイクリンＢ１（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０３１９６６．３（配列番号１１）
１２．  ＤＴＸ２：ｄｅｌｔｅｘ  ２、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２０８９２．２（配列番号１２）
１３．  ＰＩＭ１：Ｐｉｍ−１プロトオンコジーン、セリン／トレオニンキナーゼ（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００２６４８．３（配列番号１３）
１４．  ＥＮＳＡ：エンドスルフィンα（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿２０７０４２．１（配列番号１４）
１５．  ＲＣＨＹ１：リングフィンガー及びＣＨＹジンクフィンガードメイン含有１（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１５４３６．３（配列番号１５）
１６．  ＮＦＡＴＣ２ＩＰ：活性化Ｔ細胞２相互作用タンパク質の核因子（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０３２８１５．３（配列番号１６）
１７．  ＯＢＳＬ１：オブスキュリン様１（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１５３１１．２（配列番号１７）
１８．  ＭＭＰ１５：マトリックスメタロペプチダーゼ１５（ホモ・サピエンス（ヒト））ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００２４２８．３（配列番号１８）
【０２０１】
本発明の利益
ＰＭＲＴを患者に１日１回、週５回行う。治療過程を完了するのに通常は４週間〜６週間かかる。かかる治療は患者のみならず、その家族及び社会に対しても大きな負担をもたらし、これには毎日の治療のための通院、欠勤、従業員の休暇による人員の再配置、追加の財務費用等が含まれる。本発明の予後試験及びキットは、補助治療の決定に影響を与える、より高い精度及び正確さの予測をもたらし、ＰＭＲＴ、化学療法及びホルモン療法等の補助療法を回避することができる再発及び／又は遠隔転移のリスクが低い個体を同定することによって過度の治療又は過剰治療を低減又は防止することができる。過度の治療又は過剰治療の低減又は防止により、過度の治療又は過剰治療と関連する不必要な副作用が有利に低減又は防止される。その結果として、関連した患者、その家族及び社会に対する負担を軽減することができる。
【０２０２】
本発明において使用される（１８遺伝子パネル）分類子は、図２に示す３４遺伝子セット予測モデルと共通の幾つかの基本概念を有するが、本発明は正確に予測及び検証することができる精度、感度及び特異度の高い評価キットを提供する。臨床的には、（１８遺伝子パネル）分類子は患者の潜在的ＬＲＲリスクを予測するための評価に効果的な補助ツールをもたらす。
【０２０３】
さらに、１８遺伝子分類子は乳癌患者における遠隔転移の可能性を予測することも可能である。スコアリングアルゴリズムに基づいて、１８遺伝子スコアが２１未満の患者を低遠隔転移リスク、スコアが２１〜４３の患者を中等度遠隔転移リスク、スコアが４４以上の患者を高遠隔転移リスクとして規定した。有利には、主要転帰は５年無遠隔転移可能性（ＤＭＦＰ）である。
【０２０４】
５６．７（０〜１６８．２）ヶ月の追跡調査間隔中央値では、低リスク（ｎ＝１７９／８１８、２１．９％）、中等度リスク（ｎ＝４７０／８１８、５７．５％）及び高リスク（ｎ＝１６９／８１８、２０．７％）として分類された患者の５年ＤＭＦＰ率は、それぞれ９６．６％、８５％及び５９．６％であった。Ｉ期（ｎ＝７９／２１８、３６．２％）の低リスク群の５年ＤＭＦＰ率は１００％、ＩＩ期（ｎ＝８２／４１１、１９．９％）の５年ＤＭＦＰ率は９４．５％、ＩＩＩ期（ｎ＝１８／１８４、９．７％）の５年ＤＭＦＰ率は９０．９％であった。多変量分析から、１８遺伝子分類子が年齢、癌サブタイプ、腫瘍グレード、リンパ節状態又は補助治療に関わらず遠隔転移に影響を及ぼす独立予後因子であり、２１以上のスコアで調整されたハザード比（ＨＲ）が５．７（９５％ＣＩ、２．０〜１５．９；ｐ＝０．０００９）であることが明らかとなった。
【０２０５】
通例、任意の種類のリスク予測について、かかる予測が概して５％リスク（又は９５％の信頼度）に基づいて行われることが本産業において認められている。本発明では、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体におけるＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を予測する場合、提案されるＬＲＲ及び遠隔転移のリスク層別化のカットオフ値は５％リスク（又は９５％の信頼度）に基づくものである。しかしながら、より保守的な又はあまり保守的でないことが好ましい又は望ましい場合に、カットオフ値はそれに応じて変化し得ることを理解されたい。
【０２０６】
例えば、上記の実施形態の１つ以上において、スコアリングアルゴリズムに基づいて被験体がＬＲＲの低リスク又は高リスク群に該当するかを分類するための最適カットオフ値はスコア３１であった。この場合、３１未満のスコアは低ＬＲＲリスクと規定され、３１以上のスコアは高ＬＲＲリスクと規定される。
【０２０７】
別の例では、上記の実施形態の１つ以上において、スコアリングアルゴリズムに基づくと、スコアが２１未満の被験体は低遠隔転移リスクと規定され、スコアが２１〜４３の被験体は中等度遠隔転移リスク、スコアが４４以上の被験体は高遠隔転移リスクと規定される。
【０２０８】
上述の参照スコア３１（又は第１の所定参照）を、被験体が遠隔転移の低リスク又は高リスク群に該当するかを分類するために使用することもできる。しかしながら、かかるスコアを遠隔転移のリスク分類に使用する場合、全体的な精度及び感度及び特異度が影響を受ける可能性がある（すなわち増大又は減少する）。
【０２０９】
同様に、上述の２１未満のスコア（又は第２の所定参照）、２１〜４３及び４４以上のスコア（又は第３の所定参照）を被験体がＬＲＲの低リスク、中等度リスク又は高リスク群に該当するかを分類するために使用することもできる。しかしながら、かかるスコアをＬＲＲのリスク分類に使用する場合、全体的な精度及び感度及び特異度が影響を受ける可能性がある（すなわち増大又は減少する）。
【０２１０】
まとめると、ＬＲＲ及び遠隔転移のリスク分類に好ましい又は最適なスコアを記載しているが、好ましい又は所望の保守性又はリスク選好の程度に応じて最適参照スコアを変更することが可能である。
【０２１１】
有利には、１８遺伝子分類子は、乳癌患者におけるＬＲＲ及び／又は遠隔転移のリスクを予測又は推定するための乳癌の普遍的予後バイオマーカーである。
【０２１２】
現行の医療行為は静的平均（static average）によって治療を行うものである。実際に利益をもたらす治療もあるが、もたらさない治療もある。これは医療資金の大きな無駄を引き起こす。対照的に、本発明は、精密かつ効果的な評価方法、システム及びキットを有利に提供し、これにより医療及び保険資金の精密かつ効果的な使用が容易になる。
【０２１３】
他の実施形態
本発明の態様によるキットは抗体、アプタマー、増幅系、検出試薬（色原体、フルオロフォア等）、希釈緩衝液、洗浄溶液、対比染色剤又はそれらの任意の組合せを含有し得る。キットの構成要素は、手作業での又は部分的若しくは完全に自動化された上述の方法の実施のためにパッケージ化することができる。キットに関わる他の実施形態では、本発明は本発明の組成物と、任意にそれらの使用の説明書とを含むキットを企図する。かかるキットは、例えば患者集団の層別化、診断、予後判定、治療処置決定のガイド及び他の用途を含む様々な用途を有し得る。
【０２１４】
本明細書又は引用することにより本明細書の一部をなす任意の文献中で言及される任意の製品の任意の製造業者の取扱説明書、明細書、製品仕様書及び製品シートは、引用することにより本明細書の一部をなすものとし、本発明の実施に際して用いることができる。
【０２１５】
本明細書に開示される特徴は全て、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示される各々の特徴は同じ、同等の又は同様の目的を果たす代替的な特徴に置き換えることができる。このため、明示的に別段の定めをした場合を除き、開示される各々の特徴は一般的な一連の同等又は同様の特徴の一例にすぎない。
【０２１６】
上述の記載を鑑みて、上記の実施形態は本発明の実例としてのみ提示されており、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確認することができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な用法及び条件に適合させるために本発明の様々な変更及び修正を行うことができることを理解されたい。このため、他の実施形態も特許請求の範囲に含まれる。
【０２１７】
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【図１Ａ】
2018515124.tif 000016
【図１Ｂ】
2018515124.tif 000017
【図２】
2018515124.tif 000018
【図３】
2018515124.tif 000019
【図４】
2018515124.tif 000020
【図５Ａ−５Ｄ】
2018515124.tif 000021
【図５Ｅ】
2018515124.tif 000022
【図５Ｆ】
2018515124.tif 000023
【図６Ａ】
2018515124.tif 000024
【図６Ｂ】
2018515124.tif 000025
【図６Ｃ】
2018515124.tif 000026
【図６Ｄ】
2018515124.tif 000027
【図７Ａ】
2018515124.tif 000028
【図７Ｂ】
2018515124.tif 000029
【図８】
2018515124.tif 000030
【配列表】
2018515124000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月22日(2018.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測する、下記の方法であって、
ｉ．  前記被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、及び
ｉｉ．  前記少なくとも１つの遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出すこと、
を含む方法であって、
前記少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出された前記スコアが前記被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出す工程を、予測分類モデルを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予測分類モデルが少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
導き出された前記スコアが第１の所定参照未満である場合に、前記被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の低リスク群に分類する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
導き出された前記スコアが前記第１の所定参照以上である場合に、前記被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の高リスク群に分類する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
導き出された前記スコアが第２の所定参照未満である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの低リスク群に分類する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
導き出された前記スコアが第３の所定参照以上である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの高リスク群に分類する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
導き出された前記スコアが前記第２の所定参照（両端値を含む）と前記第３の所定参照との間である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの中等度リスク群に分類する工程を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムが、
ｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは１８である）、
ｉｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋２×Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋２×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に、遺伝子を単変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、遺伝子を多変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を２ポイントとしてカウントし、総スコアは２１である）、
ｉｉｉ．  スコア＝３×ＴＲＰＶ６＋５×ＤＤＸ３９＋１８×ＢＵＢ１Ｂ＋４×ＣＣＲ１＋４×ＳＴＩＬ＋７×ＢＬＭ＋７×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＭＩ１＋９×ＴＰＸ２＋８×ＰＴＩ１＋３×ＴＣＦ３＋７×ＣＣＮＢ１＋２×ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋６×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋２×ＯＢＳＬ１＋６×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を単変量分析によって検査し、各遺伝子のスコアをその重み付けに従ってリスケーリングし、総スコアは１０２である）、
ｉｖ．  スコア＝２×ＴＲＰＶ６＋２×ＤＤＸ３９＋２×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋２×ＢＬＭ＋５×Ｃ１６ＯＲＦ７＋３×ＰＩＭ１＋３×ＴＰＸ２＋５×ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋３×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜５のスコアに対してリスケーリングし、該オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは４０である）、及び、
ｖ．  スコア＝４×ＴＲＰＶ６＋３×ＤＤＸ３９＋８×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋３×ＢＬＭ＋１１×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＩＭ１＋ＴＰＸ２＋２×ＰＴＩ１＋２×ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜１１のスコアに対してリスケーリングし、オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは５６である）、
からなる群から選択される、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定する工程が、該少なくとも１つの遺伝子と少なくとも１つの遺伝子プローブとをハイブリダイズさせることと、該少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することとを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの遺伝子プローブがＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの遺伝子プローブをマイクロアレイチップ上に固定する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子発現レベルの測定をマイクロアレイ又は定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）によって行う、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の所定参照が３１というスコアである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の所定参照が２１というスコアである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３の所定参照が４４というスコアである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体が以下の条件：０個の陽性リンパ節、１個〜３個の陽性リンパ節及び４個以上の陽性リンパ節の１つを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのキットであって、
ｉ．  前記被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子に特異的に結合し、該少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを定量化することが可能な少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいてスコアを導き出すための少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルと、
を含み、前記少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出された前記スコアが、前記被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、キット。
【請求項１９】
導き出された前記スコアが第１の所定参照未満である場合に、前記被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の低リスク群に分類する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
導き出された前記スコアが前記第１の所定参照以上である場合に、前記被験体をＬＲＲ及び／又は遠隔転移の高リスク群に分類する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
導き出された前記スコアが第２の所定参照未満である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの低リスク群に分類する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
導き出された前記スコアが第３の所定参照以上である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの高リスク群に分類する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
導き出された前記スコアが前記第２の所定参照（両端値を含む）と前記第３の所定参照との間である場合に、前記被験体を遠隔転移及び／又はＬＲＲの中等度リスク群に分類する、請求項２１又は２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムが、
ｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは１８である）、
ｉｉ．  スコア＝ＴＲＰＶ６＋ＤＤＸ３９＋ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋ＢＬＭ＋２×Ｃ１６ＯＲＦ７＋ＴＰＸ２＋ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋ＰＩＭ１＋ＥＮＳＡ＋ＲＣＨＹ１＋２×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、ハザード比が１未満である場合に、遺伝子を単変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、遺伝子を多変量分析により検査するのであれば、各遺伝子を２ポイントとしてカウントし、総スコアは２１である）、
ｉｉｉ．  スコア＝３×ＴＲＰＶ６＋５×ＤＤＸ３９＋１８×ＢＵＢ１Ｂ＋４×ＣＣＲ１＋４×ＳＴＩＬ＋７×ＢＬＭ＋７×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＭＩ１＋９×ＴＰＸ２＋８×ＰＴＩ１＋３×ＴＣＦ３＋７×ＣＣＮＢ１＋２×ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋６×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋２×ＯＢＳＬ１＋６×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を単変量分析によって検査し、各遺伝子のスコアをその重み付けに従ってリスケーリングし、総スコアは１０２である）、
ｉｖ．  スコア＝２×ＴＲＰＶ６＋２×ＤＤＸ３９＋２×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋２×ＢＬＭ＋５×Ｃ１６ＯＲＦ７＋３×ＰＩＭ１＋３×ＴＰＸ２＋５×ＰＴＩ１＋ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋３×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜５のスコアに対してリスケーリングし、該オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは４０である）、及び、
ｖ．  スコア＝４×ＴＲＰＶ６＋３×ＤＤＸ３９＋８×ＢＵＢ１Ｂ＋ＣＣＲ１＋ＳＴＩＬ＋３×ＢＬＭ＋１１×Ｃ１６ＯＲＦ７＋４×ＰＩＭ１＋ＴＰＸ２＋２×ＰＴＩ１＋２×ＴＣＦ３＋ＣＣＮＢ１＋ＤＴＸ２＋２×ＥＮＳＡ＋５×ＲＣＨＹ１＋４×ＮＦＡＴＣ２ＩＰ＋ＯＢＳＬ１＋２×ＭＭＰ１５（ここで、遺伝子を多変量分析によって検査し、各遺伝子のオッズ比を１〜１１のスコアに対してリスケーリングし、該オッズ比が１未満である場合に各遺伝子を１ポイントとしてカウントし、総スコアは５６である）、
からなる群から選択される、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記第１の所定参照が３１というスコアである、請求項１９又は２０に記載のキット。
【請求項２６】
前記第２の所定参照が２１というスコアである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
前記第３の所定参照が４４というスコアである、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項２８】
前記被験体が以下の条件：０個の陽性リンパ節、１個〜３個の陽性リンパ節及び４個以上の陽性リンパ節の１つを有する、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのマイクロアレイであって、ＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するための少なくとも１つの遺伝子プローブを含む、マイクロアレイ。
【請求項３０】
予測されたＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の前記被験体の補助治療のタイプを予測又は決定するために使用する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１８〜２８のいずれか一項に記載のキット、又は請求項２９に記載のマイクロアレイ。
【請求項３１】
乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測する、下記の工程、
ｉ．  前記被験体から単離されたサンプル中の複数の遺伝子の発現レベルを測定すること、及び
ｉｉ．  前記複数の遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出すこと、
を含む方法であって、
前記複数の遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出された前記スコアが前記被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、方法。
【請求項３２】
乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのキットであって、
ｉ．  前記被験体から単離されたサンプル中の複数の遺伝子に特異的に結合し、該複数の遺伝子の発現レベルを定量化することが可能な少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  前記複数の遺伝子の発現レベルに基づいてスコアを導き出すための少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルと、
を含み、前記複数の遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出された前記スコアが、前記被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
乳癌の局所領域再発（ＬＲＲ）リスクを算出し、放射線療法が必要とされるかを決定する従来の方法は、局所領域再発と密接に関連することが見出された臨床リスク因子、例えば腫瘍サイズ、腋窩リンパ節の関与（腋窩ＬＮ）、エストロゲン受容体状態（ＥＲ状態）、診断時の年齢、リンパ管浸潤（ＬＶ浸潤）等に基づく（１及び２）。幾つかの研究により局所領域再発と関連する個々の遺伝子が存在することが報告されているが、局所領域再発を予測することができる信頼性の高い生物学的マーカーはこれまでに存在していない（３及び４）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
局所領域再発及び／又は遠隔転移のリスクがある乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の個体の同定は、かかるリスクの正確な予測が補助治療の決定に直接影響を与えることから極めて重要である。リスク層別化の改善により、個体におけるより正確なリスクの予測が可能となり、これはＰＭＲＴ、領域リンパ節照射（ＲＮＩ）、化学療法及びホルモン療法等の補助療法を回避することができる再発及び／又は遠隔転移のリスクが低い個体を同定することによって過度の治療又は過剰治療を低減又は防止する助けとなる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
早期乳癌の過剰治療を防止し、個別治療を調整するには、癌が無痛性又は侵襲性であるかを決定するために分子診断を利用することが鍵となる（１３及び１４）。上記で論考される乳癌患者の局所領域再発又は遠隔転移の可能性を予測するための或る特定の遺伝子パネルが存在するが、これらは特定の患者群及び特定のタイプの乳癌に限られる。種々のサブタイプ、病期又は治療法にわたる、乳癌患者における局所領域再発及び／又は遠隔転移の可能性の評価はこれまで利用可能でない。さらに、現在のゲノムパネルによる非ルミナール乳癌のリスク層別化はこれまで限られている（１５）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測する、下記の工程、
ｉ．  被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、及び
ｉｉ．  少なくとも１つの遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出すこと、
を含む方法であって、
少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出されたスコアが被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、方法が提供される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
好ましくは、被験体が以下の条件：０個の陽性リンパ節、１個〜３個の陽性リンパ節及び４個以上の陽性リンパ節の１つを有する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明の第２の態様によれば、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのキットであって、
ｉ．  被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子に特異的に結合し、該少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを定量化することが可能な少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいてスコアを導き出すための少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルと、
を含み、少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出されたスコアが、被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、キットが提供される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
好ましくは、被験体が以下の条件：０個の陽性リンパ節、１個〜３個の陽性リンパ節及び４個以上の陽性リンパ節の１つを有する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明の第４の態様によれば、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測する下記の工程、
ｉ．  被験体から単離されたサンプル中の複数の遺伝子の発現レベルを測定すること、及び
ｉｉ．  複数の遺伝子の測定発現レベルに基づいてスコアを導き出すこと、
を含む方法であって、
複数の遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出されたスコアが被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる方法が提供される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本発明の第５の態様によれば、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体における局所領域再発（ＬＲＲ）及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのキットであって、
ｉ．  被験体から単離されたサンプル中の複数の遺伝子に特異的に結合し、該複数の遺伝子の発現レベルを定量化することが可能な少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  複数の遺伝子の発現レベルに基づいてスコアを導き出すための少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルと、
を含み、複数の遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、
導き出されたスコアが、被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、キットが提供される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
【図１Ａ】乳癌のＬＲＲ率及び遠隔転移のリスクを評価するための本発明の実施形態による評価方法のフローチャートを示す図である。
【図１Ｂ】１８遺伝子スコアが３１未満及び３１以上の患者の５年ＬＲＲ制御可能性を示す図である。
【図２】本発明の実施形態による分類子モデルのＲＯＣ曲線を示す図である。
【図３】ＢＣＳ後の患者（９４％が補助放射線療法を受けた）の５年ＬＲＲ制御可能性を示す図である。
【図４】患者選択及び外部検証のフローを示す図である。
【図５】１８遺伝子分類子による低、中等度及び高リスク患者の無遠隔転移可能性（ＤＭＦＰ）を示す図である：（Ａ）全患者（Ｎ＝８１８）、（Ｂ）Ｉ期（Ｎ＝２１８）、（Ｃ）ＩＩ期（Ｎ＝４１１）、（Ｄ）ＩＩＩ期（Ｎ＝１８４）、（Ｅ）サブグループ分析、（Ｆ）乳癌サブタイプ（ＬＡ：ルミナールＡ様；ＬＢ：ルミナールＢ様；ＬＨ：ルミナールＨＥＲ２；ＴＮＢＣ；トリプルネガティブ乳癌）による低（２１未満のスコア）、中等度（２１〜４３のスコア）及び高リスク（４４以上のスコア）患者の比率。
【図６】（Ａ）遠隔再発、（Ｂ）死亡率、（Ｃ）局所的／領域性再発、及び（Ｄ）任意の再発の予測における各サブグループ、１８遺伝子スコア（連続変数として）のハザード比フォレストプロットを示す図である。
【図７】（Ａ）ＰＭＲＴを受けないＮ０及びＮ１患者（ｎ＝１１４）におけるＬＲＲの５年累積発生率を示す図である。推定ＬＲＲ率は、３１のスコアを有する患者では５．３％である。（Ｂ）最良のカットオフは３１のスコアであり、ＰＭＲＴによりＬＲＲは１４．９％から１．６％まで（ｐ＝０．０９９）、任意の再発は３４．７％から８．４％まで低下する（ｐ＝０．０１５）。
【図８】１８個の遺伝子の教師なしクラスター分析及び１８遺伝子スコアによる１３５人の患者における教師ありクラスタリングにより、再発を有する患者及び有しない患者において異なる遺伝子発現プロファイルが明らかとなったことを示す図である。ヒートマップの下部に示されるように、局所領域再発（ＬＲＲ）を有する患者は青色であり、ＬＲＲ及び遠隔転移の両方を有する患者は紫色であり、遠隔転移患者は赤色であり、無疾患患者は黄色である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
他の好ましいポリペプチドは、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列表又は下記リスト１に記載の配列に対して４０％、５０％、６０％又は７０％を超える相同性を有する連続配列を含む。相同性を類似性（すなわち、同様の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考察することもできるが、本発明においては、配列同一性に関して相同性を表現するのが好ましい。「実質的相同性」又は「実質的同一性」という用語は、ポリペプチドに言及する場合、問題のポリペプチド又はタンパク質が、自然発生タンパク質全体又はその一部と少なくとも約７０％の同一性、通常は少なくとも約８０％の同一性、好ましくは少なくとも約９０％又は９５％の同一性を示すことを示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
本発明の別の実施形態によると、乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体におけるＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を予測するためのキットであって、被験体から単離されたサンプル中の少なくとも１つの遺伝子に特異的に結合し、該少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを定量化することが可能な少なくとも１つの試薬と、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいてスコアを導き出すための少なくとも１つのスコアリングアルゴリズムを含む予測分類モデルとを含み、少なくとも１つの遺伝子がＴＲＰＶ６、ＤＤＸ３９、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＲ１、ＳＴＩＬ、ＢＬＭ、Ｃ１６ＯＲＦ７、ＴＰＸ２、ＰＴＩ１、ＴＣＦ３、ＣＣＮＢ１、ＤＴＸ２、ＰＩＭ１、ＥＮＳＡ、ＲＣＨＹ１、ＮＦＡＴＣ２ＩＰ、ＯＢＳＬ１、ＭＭＰ１５、及びそのフラグメント、ホモログ、変異体又は誘導体からなる群から選択され、導き出されたスコアが被験体におけるＬＲＲの可能性及び／又は遠隔転移の可能性の指標となる、キットが記載される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
驚くべきことに、また有利には、上記の様々な実施形態で言及される任意の数の本発明の１８個の遺伝子を、任意の組合せで乳房切除術及び／又は乳房温存手術後の乳癌を有する被験体におけるＬＲＲ及び／又は遠隔転移の可能性を予測するために使用することができる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
実施例１
乳房切除術又は乳房温存手術後の局所領域再発率と関連する遺伝子発現プロファイルを検証するＤＮＡマイクロアレイ分析
浸潤性乳癌を有する患者は、乳癌の新たな分類を開発する腫瘍遺伝子の医学研究において最終候補に残ったものとした。２００５年〜２０１２年に乳房切除術又は乳房温存手術（ＢＣＳ）を受けた、ＤＮＡ（又は遺伝子）マイクロアレイに利用可能な組織検体を有する合計２１７人の浸潤性乳癌を有する患者を本研究に選択した。２１７人の患者のうち、１３０人の患者が乳房切除術を受け、８７人の患者がＢＣＳを受けていた。２１７人の患者全てが、原発性腫瘍組織にＤＮＡ（又は遺伝子）マイクロアレイの研究を行うことを同意した。研究に適格な患者は、最低２年間の追跡調査中に乳房切除術後放射線療法（ＰＭＲＴ）を受けないものとする（ｎ＝１３０）。乳房温存手術（ＢＣＳ）を受けた患者（ｎ＝８７）は、局所領域再発（ＬＲＲ）率の予測における遺伝子発現プロファイリングのパフォーマンスを検査するために別個に分析した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
【表５】
2018515124.tif 000031
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
【表７】
2018515124.tif 000032
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
【表８】
2018515124.tif 000033
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
ＬＮ状態によると、１８遺伝子スコアがそれぞれ３１以上及び３１未満のＮ０及びＮ１患者では、５年ＬＲ制御可能性は統計的に異なっていた（５０％対１００％、ｐ＜０．０００１）。Ｎ２患者の数は結論を導き出すには少な過ぎたが、１８遺伝子パネルの予測力はＮ０及びＮ１患者と同様であった。１８遺伝子分類子（又は予測分類モデル）により高リスクとして規定された患者は、ＬＮ転移の有無に関わらず非常に低い５年無転移生存及び全生存率を有していた。更なる詳細及びデータは上記表４〜８に提示している。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
表９に示されるように、１８遺伝子パネルに基づくプロファイリングは、主にＮ０及びＮ１乳房切除術患者に対するものである。本研究では、Ｎ０患者のＬＲＲ率は約５％であり、本遺伝子分類子（１８遺伝子パネル）により、９％のＮ０患者が高リスクであり、その５０％が癌再燃を有し得ることが確認された。対照的に、Ｎ１患者のＬＲＲ率は約２０％であり、本遺伝子分類子（１８遺伝子パネル）により、３８％のＮ１患者が高リスクであり、その５０％が癌再燃を有し得ることが確認される。Ｎ２患者については、本サンプルの数は何らかの結論を導き出すには少な過ぎるが、予測精度は同様であった。５５％のＮ２患者が高リスクに分類される。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
これらの従来の臨床的変数と（１８遺伝子パネル）分類子との組合せが、ＬＲＲ率を予測する有意な独立因子であり得ることが確認された。（１８遺伝子パネル）分類子及び比例ハザード分析の使用により、患者の１８遺伝子スコアが３１以上である場合に（表１０を参照されたい）、ＬＲＲ率のハザード比が６７．８（９５％信頼区間、８．３〜５５２．５）であることが示された。本研究では、Ｎ０及びＮ１患者を、新規の遺伝子発現プロファイル及び評価モデルを用いてより均一なサブグループへと分類することができることも確認された。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
単変量及び多変量分析から、（１８遺伝子パネル）分類子により、術後補助化学療法を受けたＢＣＳ患者が高ＬＲＲリスクであるかを検証し得ることが確認された。（１８遺伝子パネル）分類子により、補助化学療法を受けていない患者に対する予後リスク評定のパフォーマンスが改善された。多変量分析から、３１以上の１８遺伝子スコア及び顕著なＬＶ浸潤がＬＲＲ率の独立リスク因子であることが示された。補助化学療法を受けていないＢＣＳ患者は４０％のＬＲＲリスク率を有し、（１８遺伝子パネル）分類子により低リスク群にあると検証された患者のＬＲＲ率は僅か３％であった（表１１及び図３を参照されたい）。（１８遺伝子パネル）分類子により低リスク群にあると検証された場合、補助化学療法を受けていない患者はＬＲＲを有しない可能性がある。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
結果
患者
８１８人の全ての患者の基本特徴は、下記表１２に見ることができる。転移を有しない患者の追跡調査間隔中央値は５６．４であった（０〜１５９．４）。転移を有する患者（生存患者のみ）の追跡調査間隔は６１．４（１８．０〜１６８．２）ヶ月であった。最も多い年齢は４０歳〜６０歳であった。原発性腫瘍は、通常は２ｃｍよりも大きかった（ｎ＝４８４、５９．２％）。Ｎ０疾患が最も多く（ｎ＝３９２、４７．９％）、その後にＮ１疾患（ｎ＝２４８、３０．３％）が続いた。殆どの患者がＥＲ又はＰＲ陽性（ｎ＝５３７、６５．６％）かつＨＥＲ２陰性（ｎ＝５１２、６２．６％）であった。顕著なリンパ管浸潤（ＬＶＩ）が２４．３％の患者（ｎ＝１９９）に見られた。腫瘍グレードＩＩＩ（ｎ＝４６１、５６．４％）が最も多く、その後にグレードＩＩ（ｎ＝２６７、３２．６％）が続いた。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
下記表１２に示されるように、遠隔転移と顕著に関連するリスク因子は、より高い腫瘍病期、より進行した結節期、両方のホルモン受容体への陰性及び顕著なＬＶＩを含む。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
１８遺伝子分類子
１８遺伝子スコアリングアルゴリズムによると、２１．９％（ｎ＝１７９）の患者が低リスク（２１未満のスコア）、５７．５％（ｎ＝４７０）が中等度リスク（２１〜４３のスコア）、２０．７％（ｎ＝１６９）の患者が高リスク（４４以上のスコア）に分類された。低、中等度及び高リスク群における遠隔転移率は、それぞれ２．２％、１４．３％及び３２％であった（ｐ＜０．０００１、表１２を参照されたい）。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８２】
コックス比例ハザード回帰モデルによる遠隔転移と関連する因子の単変量及び多変量分析は、下記表１３に見ることができる。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
コックス比例ハザード回帰モデルによる遠隔転移の単変量分析から、１８遺伝子スコアが２１以上の患者のハザード比が８．９（３．３〜２４．２）であることが明らかとなった（表１３）。多変量分析では、ハザード比は５．７（２．０〜１５．９）であった。遠隔転移と独立して関連する他のリスク因子には、Ｔ期（Ｔ３対Ｔ１、ＨＲ  ３．８、９５％ＣＩ  １．８〜８．１）及びＮ期（Ｎ３対Ｎ０、ＨＲ  ５．９、９５％ＣＩ  ３．３〜１０．７）が含まれていた。いずれの補助治療（ホルモン療法、放射線療法及び化学療法）も、それぞれホルモン療法については２．３（１．１、４．９）、化学療法については２．１（１．１、３．９）、放射線療法については１．８（１．１、３．０）のハザード比で遠隔転移のリスクを増大しなかった（表１３）。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
本発明の別の実施形態では、ＬＲＲの再発及び／又は遠隔転移を有する患者及び有しない患者における遺伝子発現プロファイルを表す方法は、デンドログラムの形態である（図１２を参照されたい）。１８個の遺伝子の教師なしクラスター分析及び１８遺伝子スコアによる１３５人の患者における教師ありクラスタリングから、再発を有する患者及び有しない患者における明らかな遺伝子発現プロファイルが明らかとなった。図１２のヒートマップの下部に示されるように、局所領域再発（ＬＲＲ）を有する患者は青色であり、ＬＲＲ及び遠隔転移の両方を有する患者は紫色であり、遠隔転移患者は赤色であり、無疾患患者は黄色である。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
論考
１８遺伝子分類子は癌サブタイプ、病期、手術のタイプ又は補助治療に関わらず遠隔転移を予測することが可能な多機能遺伝子パネルである。低、中等度及び高リスク群における５年ＤＭＦＰ率は、それぞれ９６．６％、８５％及び５９．６％であった。他の臨床的及び病理的変数により調整すると、１８遺伝子分類子はハザード比が５．７（９５％ＣＩ、２．０〜１５．９）の遠隔転移の独立予後因子である（表１３）。フォレストプロットにより、１８遺伝子分類子が種々のサブグループにおけるＬＲＲ、遠隔転移、任意の再燃及び死亡率と有意に関連することが確認された（図５Ａ〜図５Ｄ）。１８遺伝子スコアを連続変数として用いることで、スコア増加による遠隔転移のハザード比は１．０８（９５％ＣＩ、１．０６〜１．１）、ＬＲＲのハザード比は１．０９（１．０６〜１．１３）、任意の再発のハザード比は１．０８（１．０６〜１．０９）、死亡率のハザード比は１．０９（１．０６〜１．１３）であった。１８遺伝子分類子は同時に、遠隔転移及びＬＲＲの両方の予後バイオマーカーとなる力を有する。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
８１８人の患者の研究群を、台湾の乳癌患者の約１０分の１を治療している独立癌センターにおいて無作為に選択された乳癌集団である８１５５人の患者の初期群から選択した（１６及び１７）。乳癌の特定のサブタイプ及び病期に焦点を合わせている他の多重遺伝子パネル試験とは異なり、本研究では、１８遺伝子分類子が同様に乳癌を有する一般集団における遠隔転移の良好又は不良な予後値を有する普遍的多重遺伝子パネルであるとしている。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
過去１５年間に、早期乳癌が種々の分子サブタイプ及び予後を有する不均一疾患であるという共通認識が得られている（１３、１８及び１９）。背景技術の項で論考したように、幾つかの早期乳癌の多重遺伝子パネルがこれまでに開発されている（１５）。その後の多重遺伝子パネル（Ｐｒｏｓｉｇｎａ、ＥｎｄｏＰｒｅｄｉｃｔ、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｄｅｘ）は、以前のもの（ＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ、ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｇｒａｄｅ  Ｉｎｄｅｘ）よりも後期遠隔転移の予測に良好であると言われている（２０及び２１）。これらは主にルミナール様（ＥＲ陽性／ＨＥＲ２陰性）及びリンパ節陰性乳癌に焦点を合わせており、サブセットの低リスク群における化学療法を除外する可能性をもたらす。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
しかしながら、非ルミナール乳癌患者における再燃リスクを層別化する可能性は、依然として既存のパネルに基づく未解決の課題である。例えば、７０遺伝子及び７６遺伝子パネルの予後リスクの識別はＥＲ陽性患者では良好であるが、ＥＲ陰性患者では５％未満しか低リスク群に分類されない（１３及び１４）。２１遺伝子パネルによるＨＥＲ−２サブタイプの比較的高い（５０％超）偽陰性率も注目されている（２２）。これは、第１世代ゲノムパネルがＥＲ陽性疾患の予後を決定するために増殖関連遺伝子の定量化に大きく依存することに起因し得る（２３）。結果として、これらの研究では多重遺伝子パネルの臨床的有効性は他の乳癌サブタイプに限定される。幾つかの研究から、免疫応答及び間質浸潤と関連する遺伝子発現プロファイルがＥＲ陰性及び高増殖性ＥＲ陽性乳癌の予後値を有することが示されている（２４〜２７）。しかしながら、第２世代ゲノムパネルにより低リスク群として分類される患者の５年再燃率は依然として２０％に達する。
【国際調査報告】
2018515124.tif 000034
2018515124.tif 000035
2018515124.tif 000036
2018515124.tif 000037
2018515124.tif 000038