(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の診断または予見に用いるラクトフェリンのタンパク質またはラクトフェリンをコードする核酸である。本発明は、被験者におけるＡＤの診断または予見方法であって、上記被験者の唾液または唾液試料中のラクトフェリン濃度を測定する工程と、上記ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも高いか低いかを判定する工程であって、上記ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも低い場合はＡＤまたはＡＤを予見する工程と、を含む方法である。他の態様は、被験者の唾液試料の中でのパーキンソン病（ＰＤ）の診断に用いる、ラクトフェリンのタンパク質、または、ラクトフェリンをコードする核酸である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の診断または予見に用いる、ラクトフェリンまたはラクトフェリンをコードする核酸分子。
【請求項２】
上記診断または予見は、粘膜組織および唾液から選択される被験者の生体試料の中にて行われる、請求項１に記載のアルツハイマー病の診断または予見に用いるラクトフェリン。
【請求項３】
被験者の唾液または唾液試料の中でのアルツハイマー病の診断または予見における、ラクトフェリンの使用。
【請求項４】
神経系疾患の表現形質転換を示す被験者におけるアルツハイマー病の診断方法であって、
上記被験者の唾液または唾液試料中のラクトフェリン濃度を測定する工程と、
上記ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも高いか低いかを判定する工程であって、上記ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも低い場合はアルツハイマー病であることを示す工程と、
を含む方法。
【請求項５】
神経系疾患の表現形質転換を示さない被験者におけるアルツハイマー病の予見方法であって、
上記被験者の唾液または唾液試料中のラクトフェリン濃度を測定する工程と、
上記ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも高いか低いかを判定する工程であって、上記ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも低い場合はアルツハイマー病を予見する工程と、
を含む方法。
【請求項６】
上記予見の期間は、上記被験者がアルツハイマー病の表現形質転換を示す前の９年までである、請求項５に記載の予見方法。
【請求項７】
上記期間は５年である、請求項６に記載の予見方法。
【請求項８】
上記被験者は哺乳類である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記哺乳類は人間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法を行うためのキットであって、
被験者の唾液または唾液試料中のラクトフェリンを定量化するための少なくとも１つの試薬であって、当該定量化された値と所定のカットオフ値とを比較することを可能にする試薬、を含むキット。
【請求項１１】
上記試薬は、ラクトフェリンに対して特異的な抗体である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
被験者の唾液または唾液試料中のラクトフェリンの定量化のための特定の医薬製剤を含む少なくとも１つの容器と、
上記医薬製剤の取扱説明書と、
上記ラクトフェリンの定量化の結果が、上記被験者におけるアルツハイマー病、または、上記被験者におけるアルツハイマー病を発症するリスク、を示す所定のカットオフ値よりも高いか低いかを判定するための指針と、を含むキット。
【請求項１３】
被験者のアルツハイマー病への進行を予測するシステムであって、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行うように構成されているデータ処理手段を備えている、システム：
（ｉ）唾液試料中のラクトフェリン濃度または当該ラクトフェリンをコードする核酸分子濃度を測定すること、
（ｉｉ）上記ラクトフェリン濃度が所定のカットオフ値よりも低いか否かを判定すること、および、
（ｉｉｉ）上記判定の結果を評価することによって、上記被験者におけるアルツハイマー病の機能転帰を予測すること。
【請求項１４】
被験者の唾液または唾液試料の中でのパーキンソン病の診断に用いる、ラクトフェリンまたはラクトフェリンをコードする核酸分子。
【請求項１５】
上記被験者は哺乳類である、請求項１４に記載のパーキンソン病の診断に用いるラクトフェリン。
【請求項１６】
上記哺乳類はヒトである、請求項１５に記載のパーキンソン病の診断に用いるラクトフェリン。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、医学、特にアルツハイマー病およびパーキンソン病の診断に用いられる。
【０００２】
〔背景技術〕
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症の症例のほとんどを占める。この疾病は、完全に発症するまでに数十年かかり、軽度認知障害（ＭＣＩ）として最初に症状が表れる他の変性認知症と、多くの前駆症状が共通する。ＡＤの初めの徴候は、誤って、加齢またはストレスのせいにされることが多い。
【０００３】
現在、ＡＤは、その人の病歴、親族の病歴、および行動観察に基づいて診断されている。詳しい神経心理検査によって、ある人がＡＤと診断されるための臨床的基準を満たす数年前から、軽度の認知的困難が明らかになる場合がある。また、記銘力、計画性、柔軟性、および抽象的思考といった実行機能におけるわずかな異常、または意味記憶障害が、徴候として現れる場合もある。記憶検査を含む知的機能の評価により、疾病の状態をさらに調べることができる。
【０００４】
診断プロセスを容易にするとともに統一することを可能にし得る診断基準を作成するために医師を訓練するすべての試みは、これらのパラメータに従っている。現在のところ、明確なＡＤ診断には、脳組織の顕微鏡検査を含む病理組織学的な確認が必要である。
【０００５】
ＡＤの現状の定義または診断は、臨床的である。臨床診断には、ほとんどの場合、生物学的マーカーがない。家族性のＡＤにおける単一遺伝子性のケースのみ、遺伝子マーカーが存在し、ＡＤにおける当該単一遺伝子性の症例は、当該疾病の全症例のうち２％未満である。ＡｐｏＥ４対立遺伝子がアルツハイマー型認知症に対するリスクを増大させるとともに発症年齢に影響を及ぼす危険因子であるというＫａｎｅによる発見は、臨床的に重要であるというよりも科学的に重要であって、診断における力は、ほとんどない（Kane RA, Kane RL. "Effect of genetic testing for risk of Alzheimer's disease". N. Engl. J. Med. 2009, 361(3), 298-299）。
【０００６】
ＡＤに対する最も強力なバイオマーカーの候補として、磁気共鳴映像法または陽電子放出断層撮影における脳イメージング研究、および、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のβアミロイドおよびタウ等のタンパク質が挙げられる。ＡＤ研究においては、徴候が始まる前に病状を診断することに重きが置かれてきた。ＡＤの早期発見を可能にするために、多数のバイオマーカーおよび生化学的検査が用いられ、開発されてきた。
【０００７】
タンパク質ベースの検査を使用した場合の重大な欠点として、高コスト、侵襲的な処置の必要性、および、結果の判定に起因する問題が挙げられ、これらの欠点により、タンパク質ベースの検査を広範で使用することができない。例えば、皮質アミロイド負荷および脳内の容積変化の神経画像検査、ならびに、ＣＳＦ中のタンパク質濃度の評価は、普及していない診断手段である。
【０００８】
また、オートリソソームのタンパク質の血中濃度により、診断される１年から１０年前の対照群と疾病群とを識別することが可能である（Goetzl et al., "Altered lysosomal proteins in neural-derived plasma exosomes in preclinical Alzheimer's disease", Neurology 2015, Jul 7;85(1):40-7）。最近の別の研究では、一部の前述のプラズマバイオマーカーが症候前認知症期から認知症への移行を予測することができることが実証されている（Hye et al., "Plasma proteins predict conversion to dementia from prodromal disease". Alzheimer´s & Dementia 2014, 10, 799-807）。しかしながら、これらの研究はすべて、タンパク質、脂質、または別の代謝物を含む、バイオマーカーセットまたはバイオマーカーパネルに注目している。一般的に、バイオマーカーは、βアミロイドおよびタウに由来する分子からなる。これらの潜在的バイオマーカーは、既に発症している疾病の指標にはなるが、実際の早期発見または予見の実現性をなくしてしまう。その意味では、本発明は、ＡＤの前認知症期での診断が必要であるという科学的な認識によく一致している。
【０００９】
近年発表されているいくつかの論文では、認知症の初期症状の出現前に発見可能な分子レベルの変化または生化学的変化（リン脂質の血漿中濃度の低下等）について説明されている（Mapstone et al, "Plasma phospholipids identify antecedent memory impairment in older adults". Nat. Med. 2014, 20 (4) 415-420）。この研究において、２〜３年の期間内に、末梢血から採取した１０種類の脂質のパネルを用いて、ＭＣＩまたはＡＤを予測することができた。この時間的な制限が重要である。
【００１０】
厳格な臨床的基準、神経画像検査、および主にＣＳＦにおける生物学データに基づくＡＤ前認知症の診断を確立するためのＤｕｂｏｉｓによる近年の試みは、予防維持または予防的治療に達するように、バイオマーカーを診断プロセスに統合するためのより明確な臨床表現型を探すことに着目している（Dubois et al. "Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease" Lancet Neurol. 2014 Jun;13(6):614-29）。しかしながら、ＣＳＦまたは構造的および機能的磁気共鳴映像法における判定レベルを含む現在のバイオマーカーは、侵襲的である、多大な時間を必要とする、または高価であるため、満足できるものではない。
【００１１】
米国特許出願公開公報第２０１４／０６０２０４６号は、タウタンパク質に由来するペプチドに対する特異抗体の投与を含む、ＡＤの治療について説明している。当該文献は、疾病の遅い進行、および、無症候性の被験者による予防、について言及している。予防的投与は、１０才以上のすべての集団に推奨されている。上述のように、検出対象となるタウ異性体は、一旦疾病が発症すると体内で生成される可能性が非常に高く、予見をすることができない。
【００１２】
米国特許出願公開公報第２０１１／０２３６９１７号は、被験者の血清試料中の４７種類のバイオマーカータンパク質のパネルの検出を含む、被験者におけるＡＤの診断方法について説明している。当該パネルのマーカーのうち、トランスフェリンＩおよびＩＩが開示されている。これらの教示の第１の欠点は、血清試料が必要であり、その採取には専門医が必要であるということである。その上、その他のマーカーのうち、より正確な情報を提供するタンパク質については特に示唆されていない。この文献の教示からは、被験者におけるＡＤの診断に関連するタンパク質の探求が示唆されていることが当業者にはわからないであろう。実際、ＡＤの予測または早期発見を可能にする理想的なただ１つのバイオマーカーは、まだ特定されていない。
【００１３】
いくつかの研究では、脳の炎症と口腔衛生との間に相関関係がある可能性が示されている。近年、ヒト唾液を診断用の生体液として提案する、唾液プロテオミクスに関する発表の数が著しく増加している。唾液には、低侵襲性、最小費用、ならびに、採取および処理の容易性、という観点から、多くの利点がある。ヒト唾液中にタンパク質Ａおよびタウが存在することが説明されており、ＡＤに対する潜在的バイオマーカーとしてのタンパク質Ａおよびタウの有用性が示唆されている（Shi et al., "Salivary tau species are potential biomarkers of Alzheimer's disease". J Alzheimer's Dis. 2011;27(2):299-305）。唾液試料中の他のタンパク質について説明されており、ＡＤの炎症反応および発症に関係するタンパク質が挙げられている（Ciregia et al., "A multidisciplinary approach to study a couple of monozygotic twins discordant for the chronic fatigue syndrome: a focus on potential salivary biomarkers." J Transl Med. 2013 Oct 2;11:243）。
【００１４】
この観点において、ＷＯ２０１３／１５３４６１Ａ２は、唾液に存在する一連の分子の中から２つのバイオマーカーが選択された後のＡＤの診断について説明している。また、言及したタンパク質は、既に発症した疾病をより示すものであるため、得られた結果を疾病の予見に用いることはできない。
【００１５】
ラクトフェリンは、トランスフェリンファミリーである鉄結合糖タンパク質であり、炎症性疾患の診断に広く用いられている。その分子は、炎症性サイトカインの生成を抑制するとともに、酸化的ストレスを調節する。ラクトフェリンは、パーキンソン病（ＰＤ）を含む別の神経変性疾患における酸化的損傷からの脳組織の保護にも関連する。また、ラクトフェリンは、ＡＤにおける神経細胞死に伴う主な組織病理学的特徴である、タウタンパク質の神経原線維濃縮体およびアミロイドベータ（Ａβ）老人斑の中で検出される（Wang et al., "Deposition of lactoferrin in fibrillar-type senile plaques in the brains of transgenic mouse models of Alzheimer's disease". Neurosci Lett 2010; 481: 164-7）。当該タンパク質は、感染／炎症部位において外分泌腺および好中球によって合成される、人間の分泌物の１つの成分である。唾液タンパク質の中で、当該タンパク質は、自然免疫の最も重要な因子であって、唾液中の細菌損傷に対する重要な防御因子に相当する。
【００１６】
Ｗｅｌｌｉｎｇは、血液脳関門（ＢＢＢ）に浸透可能ないくつかの抗菌ペプチド（ＡＭＰｓ）を開示している（Welling m. et al. "Potential role of antimicrobial peptides in the early onset of Alzheimer's disease", Alzheimer & Dementia, 11, p.51-57, 2015）。当該文献は、患者に投与されたときにＢＢＢを通過するラクトフェリンの能力、または、感染過程において上方制御されるラクトフェリンの能力、について強調している。さらに、当該文献は、生体内における脳の感染症の検出においてＡＭＰｓの考え得る使用を提案している。しかしながら、感染過程におけるＡＭＰｓの上方制御への着目と、ＡＤの診断における効果的な使用との間に成り立つ関係については、推論的である。
【００１７】
しかしながら、米国特許出願公開公報第２００３／００９６７３６号には、ラクトフェリンが、神経変性疾患を含む様々な疾患（特にＡＤ）の治療に役立つことが教示されている。他の神経変性疾患（特にＡＤ）の診断または予測において使用されている分子に関しては、関係性もなければ、暗示もない。
【００１８】
当該従来技術には、ＡＤの診断および／または予見に用いられるラクトフェリンは開示されていない。
【００１９】
ＷＯ２００９０７４３３１Ａ３は、本発明に最も近い従来技術であると考えられる。この文献の目的は、被験者の生体試料中の様々な遺伝子のタンパク質産物の検出を含む、ＡＤの早期診断方法を説明することにある。ＩＧＦ−１ＲまたはＨＩＳＴＩＨ３Ｅのようなその他の遺伝子の産物と同様に、トランスフェリン（ＴＦ）遺伝子の産物も、これらのバイオマーカーに含まれる。提案されている遺伝子間には、生物学的根拠に従った関係性はなく、当該遺伝子のすべてが、当該方法において用いられる類似した予測値を示す。特に、ラクトフェリンがそうでないのと同様に、他のいずれかで用いられることを推奨されるＴＦ‐遺伝子産物はない。その結果、遺伝子産物に関する適用範囲は、実現不可能なものであるとともに、疾病の診断のための検査を行うために当業者に過度の仕事量をもたらす。生体試料には唾液が含まれることが明記されているのにもかかわらず、実施例は、血液試料において行われている。当該文献は、すでに疾病を患っている患者においてその疾病を検出可能であるだけで、予見および考えられる予防処置を設けていないという、当該技術の診断法の主要な問題を認めている。しかしながら、著者の期待をよそに、その問題は未だ解決されていないと言わざるを得ない。検査した患者集団において、検査した遺伝子ＨＩＳＴ３Ｈ３ＥおよびＣＮＲ２は、実際に、疾病の存在を示すことが可能であるが、予見に対しては決して有用ではない。さらに、ＨＩＳＴ３Ｈ３ＥおよびＣＮＲ２のいずれの遺伝子も、ラクトフェリンには関係しない。
【００２０】
当該技術における課題が、アルツハイマー病の診断または予見のためのただ１つのバイオマーカーの発見であることが、さらに明確に示されている。本発明が提案する解決策は、被験者のラクトフェリン濃度を検出する方法である。
【００２１】
ＰＤに対しては、患者の脳内のラクトフェリンのニューロンの上方制御が、従来技術において周知である（Faucheux, B.A., et al. "Expression of lactoferrin receptors is increased in the mesencephalon of patients with Parkinson disease." Proc Natl Acad Sci USA 92, 9603-9607, 1995; Leveugle, B., et al. "Cellular distribution of the iron-binding protein lactotransferrin in the mesencephalon of Parkinson's disease cases". Acta Neuropathol 91, 566-5726, 1996)。しかしながら、発明者の知る限りでは、当該従来技術は、唾液中のタンパク質の制御について、教示も示唆もない。あらかじめ、各生体液の中の代謝産物の存在に関する直接的な関連がない。
【００２２】
ＰＤに関する課題は、疾病の診断用のただ１つのバイオマーカーを発見することである。本発明によって提案される解決法は、唾液中のラクトフェリン濃度を検出する方法である。
【００２３】
〔本発明の説明〕
本発明は、ＡＤの診断または予見に用いる、ラクトフェリンまたはラクトフェリンをコードする核酸分子である。好ましい態様において、上記診断または予見は、粘膜組織（好ましくは口腔粘膜組織）、および、唾液から選択される被験者の生体試料の中にて行われる。また、本発明は、被験者の唾液または唾液試料の中でのＡＤの診断または予見における、ラクトフェリンの使用である。
【００２４】
本発明の範囲において、「診断」という用語は、状態がＡＤであってもいずれかの段階のＭＣＩの初発症状であっても、患者において測定され得る疾病の進行度を含む。
【００２５】
発明の範囲において、「予見」という用語は、健常者における症状への表現形質転換（phenoconversion）がまだ検出できない段階での、ＡＤの予測と理解される。
【００２６】
タンパク質のカットオフ値は、診断トレーニング試験にて特定されたラクトフェリンタンパク質に由来した。ＭＣＩ／ＡＤへの表現形質転換の予測値は、７．４３μｇ／ｍｌ未満であった。これは、ＭＣＩまたはＡＤとの診断を受けたすべての被験者は、７．４３μｇ／ｍｌよりも低い唾液ラクトフェリン値を示し、すべての健常者は、７．４３μｇ／ｍｌよりも高い唾液ラクトフェリン値を示したことを意味する。
【００２７】
これに基づいて、本発明の他の態様は、被験者におけるアルツハイマー病の診断方法であって、当該被験者の唾液または唾液試料中のラクトフェリン濃度を測定する工程と、上記ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも高いか低いかを判定する工程であって、上記ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも低い場合はＡＤであることを示す工程と、を含む方法ある。ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも低く、被験者が神経系疾患の表現形質転換を示す場合、当該方法は、ＡＤであることを示す。
【００２８】
本発明のさらに他の好ましい態様は、被験者におけるＡＤの予見方法であって、当該被験者の唾液または唾液試料中のラクトフェリン濃度を測定する工程と、上記ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも高いか低いかを判定する工程であって、上記ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも低い場合はＡＤを予見する工程と、を含む方法である。ラクトフェリン濃度が７．４３μｇ／ｍｌよりも低く、被験者が神経系疾患の表現形質転換を示さない場合、当該方法は、ＡＤの予見を示す。
【００２９】
本出願は、年齢を適合させた対照と比較して、ＭＣＩ患者およびＡＤ患者のヒト唾液中のラクトフェリン濃度がより低いことを示し、このタンパク質がＡＤの初期段階に関与し得ることを示唆している。唾液中にて減少したラクトフェリン濃度が測定されることは、ＡＤ病理に特異的であると考えられる。
【００３０】
本発明の範囲において、唾液中のラクトフェリンの存在の確認には、当該確認がｅｘ−ｖｉｖｏで行われるか、ｉｎ−ｖｉｖｏで行われるかに関係なく、被験者の健康に対して著しく高いリスクを含み得る侵襲的または外科的な工程は含まれない。
【００３１】
本出願は、唾液中のラクトフェリン濃度によって、５年以内にＭＣＩまたはＡＤのどちらかに進行すると考えられる認知健常者と、将来、認知機能が正常のままであると考えられる認知健常者と、を明確に区別することができることを示す。我々の知る限り、これは、５年の期間内における表現形質転換を１００％の精度にて予測することができる、初めてのただ１つのバイオマーカーである。本発明は、さらに、９年の期間内に、健康状態からＭＣＩおよび／またはＡＤへ表現形質転換することを予測することができる。
【００３２】
唾液中のラクトフェリン濃度と、唾液試料採取時の年齢との組み合わせを用いるロジスティック回帰分析により、被験者を、若年者または高齢者群のどちらかに（図５Ａ）、かつ、高齢者群内においてはＭＣＩ／ＡＤへの表現形質転換者と非表現形質転換者とに（図５Ｂ）、正確に分類した。
【００３３】
唾液中のラクトフェリン濃度の減少と表現形質転換の発生との間の相関関係を用いて、直線回帰分析を行うことによって、表現形質転換期を決定した。低い方のラクトフェリン濃度は、このモデルにおける増加したＡＤの表現形質転換リスクに関係があった（図６）。唾液中のラクトフェリン濃度は、表現形質転換の発現時期の変化に関連することがわかった。
【００３４】
この点で、回帰分析によって方程式が作成された。
ｙ＝０．６２８９ｘ＋１．６９５４
当該方程式は、唾液中のラクトフェリン濃度と発症までの年数との関係を表す。この方程式において、「ｙ」は唾液中のラクトフェリン濃度であり、「ｘ」は表現形質転換の年数である。唾液中のラクトフェリン濃度がカットオフ値（例えば７．４３μｇ／ｍｌ）よりも低い被験者の仮想症例に対してこの方程式を当てはめると、結果としてもたらされる期間は、９年以上のＭＣＩ／ＡＤへの表現形質転換期間である。
【００３５】
このため、他の好ましい態様において、当該予見の期間は、上記被験者がＡＤの表現形質転換を示す前の９年までであり、より好ましくは８年、７年、６年、または５年までである。
【００３６】
本発明の他の好ましい態様において、上記被験者は哺乳類であり、より好ましくは人間である。
【００３７】
唾液中のように、涙および口腔粘膜のペレットから得られた同様の結果は、末梢の非侵襲的生体試料のラクトフェリン濃度がＡＤに対する診断ツールとして用いられてもよいことを示す。唾液中のラクトフェリンは、脳病理学的変化および／または臨床的変化が検出される前であっても、最初の防御ラインに相当することが可能であり、かつ、ＭＣＩの被験者におけるラクトフェリンの減少は、初期ＡＤのバイオマーカーとみなすことができる。
【００３８】
実際、唾液中のラクトフェリン濃度の同様の減少は、２つの群（年齢および性別において対である、健常対照群およびＡＤ群）を用いた予備実験から得られた口腔粘膜中でも検出できた。ラクトフェリン濃度は、健常対照群では１０．７８±１．９μｇ／ｍｌであったのに対して、ＡＤ患者では４．３５±０．８８μｇ／ｍｌと著しく減少していた。データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表している。
【００３９】
本発明において用いられるモデルは、ＭＣＩ／ＡＤ対健常対照の分類に対して、疾病群（ＭＣＩ／ＡＤ）と、信頼区間（ＣＩ）（１−１）９５％である１のＡＵＣを有する健常対照群と、を分類する（図４Ｂ）。しかしながら、これらのデータは、血液試料またはＣＳＦのいずれにおいても再現され得ない。
【００４０】
これらの結果に基づき、任意のトランスフェリンファミリーである鉄結合糖タンパク質が、ＡＤの潜在的マーカーであるとみなされる。
【００４１】
他の好ましい態様は、本発明の方法を行うためのキットであって、被験者の唾液または唾液試料中のラクトフェリンを定量化するための少なくとも１つの試薬であって、当該定量化された値と所定のカットオフ値（好ましくは７．４３μｇ／ｍｌ）とを比較することを可能にする試薬、を含むキットである。より好ましい態様において、当該試薬は、ラクトフェリンに対して特異的な抗体である。
【００４２】
本発明の範囲において、ラクトフェリンに対して特異的な抗体とは、ラクトフェリンを特異的に認識することができる抗体を意図している。
【００４３】
さらに他の好ましい態様は、被験者の唾液または唾液試料中のラクトフェリンの定量化のための特定の医薬製剤を含む少なくとも１つの容器と、当該医薬製剤の取扱説明書と、上記ラクトフェリンの定量化の結果が、上記被験者におけるＡＤまたはＡＤを発症するリスク、を示す所定のカットオフ値（好ましくは７．４３μｇ／ｍｌ）よりも高いか低いかを判定するための指針（dispositive）と、を含むキットである。
【００４４】
本発明は、生体試料が得られるセンター(centres)よりも、他のセンターにおいて多数の患者の診断または予見を管理する可能性を提示する。その意味では、本発明のさらなる態様は、被験者のＡＤへの進行を予測するシステムであって、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行うように構成されているデータ処理手段を備えている、システムである：（ｉ）唾液試料中のラクトフェリン濃度または当該ラクトフェリンをコードする核酸分子濃度を測定すること、（ｉｉ）上記ラクトフェリン濃度が所定のカットオフ値（好ましくは７．４３μｇ／ｍｌ）よりも低いか否かを判定すること、および、（ｉｉｉ）上記判定の結果を評価することによって、上記被験者におけるＡＤの機能転帰（functional outcome）を予測すること。
【００４５】
これに対して、パーキンソン病（ＰＤ）患者の唾液中のラクトフェリン濃度は、健常対照群にて観察されるラクトフェリン濃度に対して、有意に高いことを示した（図２Ｂ）。ＰＤ群と健常対照群との一対比較は、１２．６１±３．３１μｇ／ｍｌ（ＰＤにおいて）、対、１０．７８±１．０μｇ／ｍｌ（健常対照群において）という、重要な変化を示した。データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。これらの知見は、前述のように、ＰＤ患者におけるラクトフェリンのニューロンにおける発現増加に一致している。
【００４６】
また、ラクトフェリンの基準は、ＰＤ患者にも対応していることが分かった。実際、本発明の他の態様は、被験者の唾液または唾液試料の中でのパーキンソン病の診断に用いる、ラクトフェリンまたはラクトフェリンをコードする核酸分子に言及する。好ましい態様において、当該被験者は哺乳類であり、より好ましくはヒトである。
【００４７】
〔図面の簡単な説明〕
図１Ａは、すべての試料に存在する、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにて分離した後の７５ｋＤａのラクトフェリンのバンドを示す。ＭＣＩ、ＡＤ、および健常対照群に由来するヒト唾液中のラクトフェリンの識別。唾液プールに相当するクマシーブルー染色したＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル。レーン１：対照群、レーン２：ＭＣＩ群、レーン３および４：ＡＤ群。略７５ｋＤａに相当するバンドを矢印で示す。
【００４８】
図２Ａは、ヒトＥＬＩＳＡキットによって測定された唾液中のラクトフェリン濃度は、対照群と比較して、ＭＣＩおよびＡＤ患者において減少したことを示す。
【００４９】
図２Ｂは、ヒトＥＬＩＳＡキットによって測定された唾液中のラクトフェリン濃度は、健常対照群と比較して、ＰＤにおいて増加したことを示す。
【００５０】
図３Ａは、ＭＣＩおよびＡＤ群における、唾液中のラクトフェリン濃度と、認知低下との相関関係を示す。この関係は、主に、疾病の段階とラクトフェリン濃度との有意な負の関連性によって築かれた（Ｒ＝−０．７４、ｐ＜０．００１）。
【００５１】
図３Ｂは、ＭＣＩおよびＡＤ患者に利用可能な認知力の基準（Ｒ＝０．７３、ｐ＜０．００１）である、唾液中のラクトフェリン濃度とＭＭＳＥスコアとの相関関係を示す。
【００５２】
図３Ｃは、健常対照群およびＭＣＩ／ＡＤ群に由来する唾液中のラクトフェリン濃度の検査から得られたＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣプロットは、感度（有病正診率）に対する１−特異度（無病誤診率）を示す。ＲＯＣ曲線下面積ＡＵＣ＝１（９５％  ＣＩ  １‐１）。
【００５３】
図４Ａは、健常対照群および変換者群の唾液中のラクトフェリン濃度の検査に対して得られた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。ＲＯＣプロットは、感度（または有病正診率）に対する１‐特異度（または偽陽性率）を示す。このバイナリ分類子システム（ＲＯＣ曲線）は、曲線下のロバスト面積ＡＵＣ＝０．９８４（９５％  ＣＩ  ０．９３２−１）をもたらした。ＡＵＣは、０．９３から１の９５％の信頼区間（ＣＩ）にて、パラメータが２つの診断群をうまく区別できるか否かの基準である。
【００５４】
図４Ｂは、唾液中のラクトフェリン濃度によって予測された、ａＭＣＩまたはＡＤのいずれかへの変換を示す。当該グラフは、最小Ｃｏｘ比例ハザードモデルに基づいた、異常に減少した（陽性）、または、通常／高い（陰性）ラクトフェリン濃度に依存した、ａＭＣＩまたはＡＤのいずれかへの表現形質転換の平均期間を示す。点線は陰性である。実線は陽性である。
【００５５】
図４Ｃは、ラクトフェリン発現値、および、発症または表現形質転換の年数を用いた、ロジスティック回帰分析を示す。回帰分析によって作成された方程式は、ｙ＝０．６２８９ｘ＋１．６９５４であった。
【００５６】
図５Ａは、若年者の健康な群と高齢者の健康な群との両方に分類するための正確な基準としての、唾液ラクトフェリン値および年齢を用いる回帰分析を示す。丸印は認知症でない若年者を示し、四角印は認知症でない高齢者を示す。
【００５７】
図５Ｂは、高齢者の群（非表現形質転換者）と、ＭＣＩおよびＡＤへの表現形質転換者との両方に分類するための正確な基準としての、唾液ラクトフェリン発現値および年齢を用いた回帰分析を示す。丸印は表現形質転換者を示し、四角印は認知症でない高齢者を示す。
【００５８】
〔実施例〕
以下の実施例は、例証的ではあるが非限定的に本発明を示すことを目的として提供される。
【００５９】
〔実施例１．唾液試料の採取〕
ドセ・デ・オクツーブレ大学病院（Hospital Universitario 12 de Octubre）（スペイン、マドリッド）において、２７４人の参加者を神経内科に登録して、ＡＤ診断トレーニング試験を実施した。被験者の認知状態によって、年齢を適合させた４つの群の被験者を、ａＭＣＩ、ＡＤ、パーキンソン病（ＰＤ）、および、認知健常対照群（表１）として定義した。米国国立神経疾患脳卒中研究所（National Institute on Neurological Disorders and Stroke）およびアルツハイマー病および関連疾患協会（Alzheimer's Disease and Related Disorders Association（NINDS-ADRDA））の指針（McKhann et al., "The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease". Alzheimer's Dement. 2011; 7: 263-9）に従って、ＡＤ患者を診断した。ＰＤの可能性例の基準（Gelb et al., "Diagnostic criteria for Parkinson disease". Arch Neurol. 1999 Jan;56(1):33-9）に基づいて、ＰＤ患者を診断した。また、認知症のための基準（Pedersen, "Mild cognitive impairment as a diagnostic entity". J Intern Med 2004; 256: 183-94）を満たさなかった認知障害のある患者を、ＭＣＩ患者群として追加で定義した。疾病重症度を、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）のスコアを用いて判定した。ヘルシンキ宣言（Declaration of Helsinki）に従って、被験者の同意を得た。また、被験者の承認は、ドセ・デ・オクツーブレ病院の研究倫理委員会から得た。Ｂｅｒｍｅｊｏ−Ｐａｒｅｊａによって既に説明されているように（Bermejo-Pareja et al., "Saliva levels of Abeta1-42 as potential biomarker of Alzheimer's disease: a pilot study". BMC Neurol 2010; 10: 108）、非刺激唾液を、２％アジ化ナトリウム溶液にて予めコーティングされた滅菌プラスチック容器に収集した。収集した試料を、即座に氷の上に置き、６００×ｇの低回転にて１０分間、４℃でプレクリアした。等分した０．５ｍｌの試料を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて処理した後、−８０℃にて保管した。製造者の指示に従って、ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード）を用いて、タンパク質評価を分析した。
【００６０】
表１．第１訓練研究からの被験者の人口統計的および臨床的特性
【００６１】
【表１】
2018536410.tif 000003
【００６２】
Ｍ＝男性、Ｆ＝女性、ａＭＣＩ＝健忘性軽度認知障害、ＡＤ＝アルツハイマー病、ＰＤ＝パーキンソン病、ＭＭＳＥ＝ミニメンタルステート検査スコア、ＮＡ＝該当なし、ｎｓ＝非有意。データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表している。**Ｐ＜０．０１、対、対健常対照群、***Ｐ＜０．００１、対、健常対照群。
【００６３】
〔実施例２．唾液試料におけるラクトフェリンの測定〕
唾液中における、配列番号１に示すヒトラクトフェリンの発現量を、ＭＣＩドナーおよび対照被験者と比較しながら、ＡＤ患者から収集した試料を用いて検出した。各群（ＭＣＩ、ＡＤ、および認知症でない高齢の対照）の４人の男性被験者から収集した唾液試料を、等量を混合させてプールした。５０μｇのプールを、それぞれＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルにローディングした。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにて分離した後、７５ｋＤａのバンドが、すべての試料において検出された。当該バンドは、質量分析（３１％の補填範囲）によって確認済みのラクトフェリンの分子量に適合した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア(ＧＥヘルスケア社)を用いてタンパク質の発現における違いを評価した。加えられた等量のタンパク質に関するバンドの強度解析によって、健常対照群と比較して、ＭＣＩ（１４％）およびＡＤ（５１％および５８％）のラクトフェリン濃度が低いことが示された（図１Ａ）。ヒト唾液中のラクトフェリンの存在を実証するために、トリプシンおよびエンドペプチダーゼＡｓｐ‐Ｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてゲルを消化した後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計４８００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、マサチューセッツ州フレーミングハム）、および、４０００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、タンパク質を確認した。アミノ酸の補填範囲は、ラクトフェリンの３１％であった。
【００６４】
製造者の指示に従って、市販のヒトラクトフェリンＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ社）を用いてラクトフェリンの発現量を平均化することによって、これらの違いのさらなる立証を得た。ＡＮＯＶＡの後でテューキー・クレーマー検定（Ｔｕｃｋｅｙ‐Ｋｒａｍｅｒ  ｔｅｓｔ）を行うことによって３つの群を一対比較したところ、健常対照群と比較して、ＭＣＩ患者群およびＡＤ患者群のラクトフェリン濃度が有意に低いことが示された（Ｐ値＜０．０５、図２Ａ）。ＰＤの唾液中のラクトフェリン濃度は、健常対照群において観察されたラクトフェリン濃度に対して、有意に高かった（図２Ｂ）。
【００６５】
〔実施例３．診断ツールとしての唾液中のラクトフェリン含有量〕
唾液中のラクトフェリン濃度を、認知症の進行期間全体を通して測定した。ＭＣＩ群およびＡＤ群における唾液中のラクトフェリン濃度と、認知低下との相関関係は、明白であると思われる。この関係は、主に、疾病の段階と、ラクトフェリン濃度との有意な負の関連性によって築かれた（Ｒ＝−０．７４２；ｐ＜０．００１）（図３Ａ）。ＭＭＳＥスコアを用いて認知症の進行をフォローアップした。また、唾液中のラクトフェリン濃度には、健康な人の１５および１０μｇ／ｍｌに対して、ＭＣＩおよびＡＤを含む認知症の人の７．４３μｇ／ｍｌ未満という、非常に有意な相関関係（Ｒ＝０．７３１；ｐ＜０．００１）（図３Ｂ）があり、唾液中のラクトフェリン濃度を、ＭＣＩ患者およびＡＤ患者におけるＭＭＳＥスコアと関連付けることができた。Ｋｅｎｄａｌｌのタウ、および、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関関係を、それぞれ相関関係分析に用いた。
【００６６】
直線回帰分析を用いることにより、ＡＤおよびａＭＣＩを患っている患者の唾液中のラクトフェリンが、それぞれ、認知力が保たれている健康な参加者よりも少ない、６．４３２μｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：６．８５０〜６．０１４；ｐ＜０．００１）、および、５．３１０μｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：５．８１０〜４．８１０；ｐ＜０．００１）であることを発見した。ラクトフェリン分析にて得たこれらの結果を用いて、ａＭＣＩ／ＡＤ群を健常対照群と区別する個別の線形分類モデルを構築した。受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を行いて、群分類のための分類モデルの性能を評価した。唾液分析から発見されたラクトフェリン濃度を用いた分類モデルにより、ａＭＣＩ／ＡＤ群および健常対照群分類に対して感度１００％（９５％ＣＩ：９６．９０％〜１００％）および特異度１００％（９５％ＣＩ：９５．９５％〜１００％）である、１（９５％ＣＩ：１−１）の曲線下面積（ＡＵＣ）（図３Ｃ）がもたらされた。カットオフ値は、７．４３μｇ／ｍｌ（Ｙｏｕｄｅｎ指数:１）であった。
【００６７】
〔実施例４．診断ツールとしての唾液中のラクトフェリンの妥当性確認〕
次に、唾液のラクトフェリンのカットオフ値を、過去の研究で用いられた同一の標準臨床評価を有する９１人のさらなる参加者を登録した、無作為な独立した２つの新たな集団群にて検証した。Alzheimer Disease Research Unit、CIEN Foundation、Queen Sofia Foundation Alzheimer Center（マドリッド、スペイン）、および、Pablo de Olavide University（スペイン、セビリア）という２つの団体にて公募した参加者の統計学的特性を、表２に示す。
【００６８】
表２．妥当性を確認する研究の被験者の統計学的特性
【００６９】
【表２】
2018536410.tif 000004
【００７０】
Ｆ＝女性、Ｍ＝男性、ａＭＣＩ＝健忘性軽度認識障害、ＡＤ＝アルツハイマー病、ｎｓ＝非有意。データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。***Ｐ値＜０．００１、対、健常対照群。
【００７１】
唾液中のラクトフェリン（７．４３μｇ／ｍｌ）のカットオフ値は、すべての患者（ＭＣＩ／ＡＤ；ｎ＝５１）、および、すべての認知健常者（ｎ＝４０）を正確に分類したことが、結果として示された。
【００７２】
〔実施例５．予測ツールとしての唾液中のラクトフェリン含有量〕
唾液中のラクトフェリン濃度の指標としての可能性を詳しく調べるために、記憶障害のない認知健常対照群の参加者を、この群に統合した（表３）。
【００７３】
表３．被験者の統計学的特性
【００７４】
【表３】
2018536410.tif 000005
【００７５】
Ｍ＝男性、Ｆ＝女性。
【００７６】
非刺激性の全ての唾液を、滅菌プラスチック容器に収集した。また、ラクトフェリン濃度を、実施例１に記載したように決定した。８人の被験者は、健常対照群と比較して、唾液中のラクトフェリン濃度が有意に低かった（３．４７±０．４１μｇ／ｍｌ、対、１０．５４±１．５８μｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０５）。ＭＣＩまたはＡＤのいずれかへの表現形質転換にかかる平均期間は、３．２５年（１〜５年の範囲）であった。表４は、表現形質転換（発症）までの期間と年齢とに関連性（高齢の被験者は期間が短い）があることを示す。
【００７７】
表４．転換者の統計学的特性
【００７８】
【表４】
2018536410.tif 000006
【００７９】
Ｌｔ＝ラクトフェリン、ＡＤ＝アルツハイマー病、ＭＣＩ＝軽度認知障害、Ｍ＝男性、Ｆ＝女性、ＨＤ＝高血圧症、ＤＭ＝糖尿病、ＨＤ＝心臓病（Heard）、ＨＣ=高コレステロール。
【００８０】
〔実施例６．粘膜中のラクトフェリン含有量〕
Ａａｇａａｒｄにしたがって、口腔粘膜を滅菌プラスチック容器に収集した（Aagaard et al., "The Human Microbiome Project strategy for comprehensive sampling of the human microbiome and why it matters". FASEB J. 2013 Mar; 27(3):1012-22）。手短に言えば、表５に記載された参加者は、収集する唾液を口内で１分以上溜めておいた後、５０ｍｌの採集チューブに唾液を垂らした。当該唾液を６，０００×ｇにて１０分間、４℃にて遠心分離し、ペレットを−８０℃にて保管した。
【００８１】
表５．被験者の統計学的特性
【００８２】
【表５】
2018536410.tif 000007
【００８３】
Ｍ＝男性、Ｆ＝女性。
【００８４】
（ラクトフェリン濃度を、実施例１に記載したように測定した。６人の被験者では、健常対照群と比較して、ラクトフェリン濃度が有意に低かった（４．２８±０．５０μｇ／ｍｌ（ＡＤにおいて）、対、９．０５±１．４７μｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０５、表６）。ＭＣＩまたはＡＤのいずれかへの表現形質転換にかかる平均期間は、３．８３年（４〜３年の範囲）であった。記憶障害のない認知健常対照群の参加者を表５に示す群に統合した。
【００８５】
表６．転換者の統計学的特性
【００８６】
【表６】
2018536410.tif 000008
【００８７】
Ｌｔ＝ラクトフェリン、ＡＤ＝アルツハイマー病、ＭＣＩ＝軽度認識障害、Ｍ＝男性、Ｆ＝女性。
【００８８】
〔実施例７．ＭＣＩ／ＡＤへの表現形質転換の予測モデルの構築〕
ラクトフェリンのElisa分析の前述の例にて示したデータを用いて、ＡＤ病理状態か非病理状態かを識別できる分離線形分類モデル（separate linear classifier model）を構築した。受信者動作特性（ＲＯＣ）分析によって、群分類のための分類モデルの性能を評価する。唾液分析から見出されたラクトフェリン濃度を用いる分類モデルにより、９５％（０．９３−１）の信頼区間（ＣＩ、図４Ａ）を有する０．９８の曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて、転換者群と健常対照群とを効率的に分類した。このモデルは、転換者群と健常対照群とを分類するために、１００％の感度および９８．６％の特異度をもたらした（図４Ａ）。このＲＯＣ曲線は、診断検査評価のための基礎ツールであり、正常なケースと、病気のケースとを区別するための検査の精度を評価した。ＲＯＣは、真の陰性試料を不正確に分類する確率に対して、陽性試料を正確に分類する確率をプロットしたもの、と解釈することができる。したがって、ＲＯＣプロットのＡＵＣの測定は、予測精度の基準である。
【００８９】
ラクトフェリン濃度が異常に少ないか、あるいは正常または高いかによって決まる、ａＭＣＩまたはＡＤへの表現形質転換にかかる平均期間を見積もるための確率は、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて決定された（図４Ｂ）。唾液中のラクトフェリンは、ＡＤの発生可能性を予測する独立した予見因子であることが、結果として示された（ＨＲ：０．４２８（９５％ＣＩ：０．３２４〜０．５６７；ｐ＜０．０００１））。
【００９０】
本研究において、ＡＵＣ＝０．９８は、ロバストな識別能を示す（１が完全な識別を示す）。回帰分析により、唾液中のラクトフェリン濃度と表現形質転換（発症）の時間（年数）との関係を表すための方程式、ｙ＝０．６２８９ｘ＋１．６９５４（「ｙ」は唾液中のラクトフェリン濃度、「ｘ」は表現形質転換の年数）を生み出した（図４Ｃ）。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１Ａ】すべての試料に存在する、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにて分離した後の７５ｋＤａのラクトフェリンのバンドを示す。
【図２Ａ】ヒトＥＬＩＳＡキットによって測定された唾液中のラクトフェリン濃度は、対照群と比較して、ＭＣＩおよびＡＤ患者において減少したことを示す。
【図２Ｂ】ヒトＥＬＩＳＡキットによって測定された唾液中のラクトフェリン濃度は、健常対照群と比較して、ＰＤにおいて増加したことを示す。
【図３Ａ】ＭＣＩおよびＡＤ群における、唾液中のラクトフェリン濃度と、認知低下との相関関係を示す。
【図３Ｂ】ＭＣＩおよびＡＤ患者に利用可能な認知力の基準（Ｒ＝０．７３、ｐ＜０．００１）である、唾液中のラクトフェリン濃度とＭＭＳＥスコアとの相関関係を示す。
【図３Ｃ】健常対照群およびＭＣＩ／ＡＤ群に由来する唾液中のラクトフェリン濃度の検査から得られたＲＯＣ曲線を示す。
【図４Ａ】健常対照群および変換者群の唾液中のラクトフェリン濃度の検査に対して得られた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図４Ｂ】唾液中のラクトフェリン濃度によって予測された、ａＭＣＩまたはＡＤのいずれかへの変換を示す。
【図４Ｃ】ラクトフェリン発現値、および、発症または表現形質転換の年数を用いた、ロジスティック回帰分析を示す。
【図５Ａ】若年者の健康な群と高齢者の健康な群との両方に分類するための正確な基準としての、唾液ラクトフェリン値および年齢を用いる回帰分析を示す。
【図５Ｂ】高齢者の群（非表現形質転換者）と、ＭＣＩおよびＡＤへの表現形質転換者との両方に分類するための正確な基準としての、唾液ラクトフェリン発現値および年齢を用いた回帰分析を示す。
【図１Ａ】
2018536410.tif 000009
【図２Ａ】
2018536410.tif 000010
【図２Ｂ】
2018536410.tif 000011
【図３Ａ】
2018536410.tif 000012
【図３Ｂ】
2018536410.tif 000013
【図３Ｃ】
2018536410.tif 000014
【図４Ａ】
2018536410.tif 000015
【図４Ｂ】
2018536410.tif 000016
【図４Ｃ】
2018536410.tif 000017
【図５Ａ】
2018536410.tif 000018
【図５Ｂ】
2018536410.tif 000019
【配列表】
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【国際調査報告】
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2018536410.tif 000021
2018536410.tif 000022
2018536410.tif 000023
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