(57)【要約】  本発明は、癌の予防および治療、特に腫瘍発現抑制の分野に関している。 本発明はまた、この分野で使用するための化合物に関する。哺乳動物の脳における新規の腫瘍発現抑制（TMS）調節が認められた。本発明は、化合物、医薬製剤、特に癌の予防および治療、特に前記TMS調節に基づく腫瘍発現抑制のための医薬およびその方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式IIで示されるニューロン活性エンハンサー化合物またはその薬学的に許容される塩であり、
その化合物は、中枢神経系のカテコールアミン作動性ニューロンにおけるインパルス伝播を介したカテコールアミン神経伝達物質の遊離を増強するカテコールアミン作動性エンハンサー化合物であり、
その特異的エンハンサー用量において、癌またはその転移の予防または治療に使用するためのものであり、
【化１】
2018505852.tif 000010
式II中、
Qは、1または2個のヘテロ原子を有していてもよい置換または非置換の芳香族6員環基からなる基であり、
Qが置換されている場合、
その置換基は水素、ヒドロキシル、C 1-4アルキル、C 1-4アルコキシおよびハロゲンからなる群から選択され、好ましくは、Qは1または2個の置換基で置換されているか非置換であり、
R1はC 1-5アルキル、好ましくはメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はC 1-4アルキル、C 2-4アルケニルまたはC 2-4アルキニルであり; 
R3は水素、メチルまたはエチル
である。
【請求項２】
請求項１に記載のエンハンサー化合物であり、
その中でQが非置換の芳香族6員環基であり、好ましくはQがフェニル基であり、R1がメチル、エチルまたはプロピルであり、R2がC 2-3アルキル、C 2-3アルケニルまたはC 2-3アルキニルであり、好ましくはR2はエチニルであり、R3は水素またはメチルである。
【請求項３】
請求項１または２記載のエンハンサー化合物であり、
その中で化合物は一般式IVで示される化合物で示されるものであり、
【化２】
2018505852.tif 000011
式IV中、
Qはフェニルであり、
R1はメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はメチル、エチル、エチニルまたはプロピル、好ましくはエチルまたはエチニルであり; 
R3は水素、メチルまたはエチル
である。 
【請求項４】
請求項３に記載のエンハンサー化合物であり、
その中の一般式IVにおいて、
Qはフェニルであり、
R1はメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はエチルまたはエチニルであり; 
R3は水素またはメチルである。 
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のエンハンサー化合物であり、その化合物が、(R)-1-フェニル-N-プロピルペンタン-2-アミン（(-)-PPAP）である。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のエンハンサー化合物であり、その化合物が、(R)-N-メチル-N-(１-フェニルプロパン-2-イル）プロパ-2-イン-1-アミン（セレギリンまたは(-)-デプレニル）である。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その１日投与量が0.01mg/kg未満の特異的エンハンサー用量である。
【請求項８】
請求項７に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その１日投与量が0.005mg/kg未満の特異的エンハンサー用量である。
【請求項９】
請求項８に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その１日投与量が0.0025mg/kg未満の特異的エンハンサー用量である。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、それは脳におけるエンハンサー感受性ニューロンを刺激し、且つ特異的エンハンサー効果を有する量で、癌またはその転移の予防または抑制に使用するためである。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、癌が、悪性腫瘍または癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および胚細胞腫からなる群より選択される癌であり、好ましくは結合組織の癌腫または肉腫である。
【請求項１２】
請求項１１に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、悪性腫瘍が、粘液線維肉種、腺癌、結腸癌および肝転移からなる群から選択されるものである。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、被験体が温血動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトであり、好ましくは被験体が性的に成熟した被験体であり、好ましくは成人被験者である。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、被験体に長期間、好ましくは少なくとも1、2、3、5、6、8若しくは10ヶ月間、または少なくとも1、2、3、4、5若しくは6年間、被験体に投与される。
【請求項１５】
請求項１から14のいずれかに記載の使用のための化合物を活性化合物として含有する医薬であり、化合物が中枢神経系におけるインパルス伝播を介したカテコールアミンの遊離を増強する量で含有し、好ましくはその化合物の光学純度が80％以上である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予防および治療、特に腫瘍発現の抑制の分野に関する。本発明はまた、この分野で使用するための化合物に関する。本発明はまた、医薬製剤、特に癌の予防および治療、特に腫瘍発現の抑制に使用するための医薬およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍抑制のメカニズムは、今日集中的な研究の領域となっている。腫瘍抑制遺伝子、すなわち、癌への経路の第一歩から細胞を保護する抗癌遺伝子を利用するために懸命の努力がなされている。これらの遺伝子の喪失は、多くの種類のヒト癌細胞の形成のための癌原遺伝子または癌遺伝子の活性化よりも重要である（Weinberg，Robert A 2014）。様々な治療が試みられている。例えば、癌と戦う免疫系を刺激または助ける免疫療法は、1997年から視野に入っており、これは引き続き活発な研究領域となっている（Waldman TA 2003）。しかし、腫瘍発現の抑制を目的とした治療の結果は非常に不確実である。
【０００３】
特定の化合物が、MAO-B阻害と無関係とされる脳におけるカテコールアミン作動性またはセロトニン作動性活性を増強することは、長い間認識されている（KnollおよびMiklya、1994）。 
【０００４】
このエンハンサー調節には、有意に高い活性レベルで瞬時に働くことができる脳のエンハンサー感受性ニューロンの存在を必要とする。内因性エンハンサー物質であるフェニルエチルアミン（PEA）は、カテコールアミン、ドパミンおよびノルアドレナリン、ならびにセロトニンを含む、モノアミン作動性物質のインパルス伝播を介した遊離を増強することが見出されている[Knoll J（2001）CNS Drug Rev 7：317-345およびKnoll J（2003）Neurochem Res 28：1187-1209参照]。エンハンサー物質は、ニューロンの発火活性に応じて神経伝達物質の遊離を促進する特異的なエンハンサー感受性ニューロン上にそれら自身の受容体を有しているとされる。
【０００５】
エンハンサー調節はまた、私たちの生涯にわたる活動とバランスの重要な決定要因である、獲得的動因の発達において重要な役割を果たす。これらの皮質ニューロンのエンハンサー調節は、獲得的動因を明らかにし、我々の目標を達成するために必要とされる。エンハンサー調節は我々の学習能に影響し、感覚ニューロンによって知覚を調節する。これらの皮質および脳幹ニューロンの至適な活性は、それらの内因性エンハンサー物質がそれらの活性およびバランスを維持することに依存する。我々が老化するにつれて適切かつ活発なエンハンサー活性を有することは、長く、充実し、活発で健康的な寿命に不可欠である[Knoll J（2003）Neurochem Res 28：1187-1209を参照]。 
【０００６】
エンハンサー化合物は一種の「ニューロアンプライヤー(neuroampliers)」である。それらは、神経伝達物質遊離のパルスにおいてより大きな信号強度のために、細胞の連結領域のシナプスのギャップ結合における電子カップリングを増強する。この効果は、より強い信号発火のための信号対雑音比の増加に関連する。したがって、このメカニズムにより、モノアミン神経伝達物質の遊離は、それらの遊離を誘発する電気インパルスとより効率的にカップリングし、モノアミン作動性ニューロンの活性は増強され、即時および強力な活性を生じる。これらの知見は、黒質線条体経路および中脳辺縁−皮質回路が機能低下しているパーキンソン病およびアルツハイマー病における認知機能の増強または臨床的重要性のために、ならびにドパミンおよびノルアドレナリン双方のニューロンの活性低下に起因するうつ病の効果的な治療のために、非常に重要であるといわれてきた。 [EP1052259B1 corr. to WO 2000/026204、EP 0 957 080 B1 corr. to WO 1999/007667、Knoll J（2001）CNS Drug Rev 7：317-345、Miklya I（2011）In Tech Open Acces Publisher（www.intechopen.com）, pp.77-100] 。このカテコールアミン作動性およびセロトニン作動性神経系は、より高次脳の中心を活性に保ち、発育期以降の間の中脳のエンハンサー調節の継続的な低下は、年齢と何らかの形で関係している[Knoll J（1994）Pharmacol Toxicol 75：65-72]。 
【０００７】
潜在的にエンハンサー活性を有する多くの化合物が合成され、種々の神経系疾患の治療のために提案されている。
【０００８】
例えば、多くのエチルアミン誘導体が既に開示されている。特定の6-(2-アミノエチル)-ベンゾオキサゾリノン誘導体は、EP110,781において、抗不安薬および心不全治療薬として記載されている。さらに、アミノアルキルベンゾオキサジノン誘導体は、FR2,035,749において、中枢神経系の損傷に対する有用な治療法として記載されている。さらに、向精神性アルキルアミンは、JP06-99,420（公告公報）に医薬品としての使用が記載されている。典型的には、これらの化合物は、中枢神経系においてカテコールアミン遊離能を有するが、実際には、中枢刺激薬と同様に、過剰な量のカテコールアミンが副作用として神経毒性を生じることが容易に推察される。
【０００９】
この範囲において最も顕著な化合物の一つは、B型モノアミノオキシダーゼ（MAO）の選択的阻害薬として１番初めに導入された、(-)-デプレニル（セレギリン、エルデプリル、ユメックス、エムザム、ゼルパー）である。デプレニルは、パーキンソン病、アルツハイマー病、大うつ病を治療するために登録されており、アンチエイジング化合物として広く使用されている。本発明者らのグループは、MAO-B阻害効果のない低用量の(-)-デプレニルは、高度に特異的なカテコールアミン作動性活性エンハンサー物質として作用することを以前に実証した。これは、インパルス伝播による伝達物質の遊離を増強する。エンハンサー効果のために、生涯(-)-デプレニルで維持されたラットでは、その学習能力および性的活動が有意に長く保持され、プラセボ処置を施したラットよりもかなり長期間生存したことが（-）-デプレニルで実施された初期の長寿研究で示されている（Knoll and Miklya, 1995）。
【００１０】
加齢脳におけるMAO-B活性の進行性増加による、PEAの脳供給の加齢に関連した低下、および発育期以降の間のドパミン作動性ニューロン活性の平均以上の低下によるドパミンの脳配給の加齢に関連した低下は、加齢に伴う不可避な生化学的障害である。デプレニル（図1）が寿命を延ばすという以前の知見は、ラット、マウス、ハムスターおよびイヌにおいて確認された（表1）。
【００１１】
【表１】
2018505852.tif 000002
【００１２】
離乳から性成熟までに増進したエンハンサー調節がカテコールアミン作動性ニューロンおよびセロトニン作動性ニューロンにおいて作用することが示されている。このメカニズムは発達期における継続を終結させ、青年期から成人期への移行の基礎を構成する（Knollら、2000）。 
【００１３】
エンハンサー感受性カテコールアミン作動性ニューロンおよびエンハンサー感受性セロトニン作動性ニューロンは、低「経済的」レベルで離乳期以前では機能し、離乳後に劇的に増強される。緊張した興奮は、離乳から性成熟までの発達段階では変化がない。性ホルモン（エストロン、テストステロン）は、増強しているカテコールアミン作動性およびセロトニン作動性活性を、離乳前の「経済」レベルに戻し、発達段階を終わらせる。この変化はまた、「自然死」までのエンハンサー調節（老化）のゆっくりとした連続的な減衰の始まりでもある。性成熟が完了した直後から安全かつ効率的な予防的薬理学的介入が行われるだけで、脳の老化が著しく遅くなることは明らかである。それらが特異的にエンハンサー効果を発揮する極端に低い用量範囲において、エンハンサー物質は、より低い機能のエンハンサー感受性ニューロンを選択的により良好なものに変換する。
【００１４】
振り返ってみると、1994年に出版された第2長寿研究の成果が、このメカニズムの最初の否定できない証拠であった。強壮で長生きである28週齢のWistar-Logan系雄性ラット1600匹での長寿試験において、94匹の性的能力の低いラット（LP）と99匹の性的能力の高いラット（HP）を選択し、生理食塩水およびデプレニルで生涯処置した。生理食塩水処置したLPラット（n=44）は134.58±2.29週間生存し、HPラットは151.24±1.36週間（P<0.001）生存した。 デプレニル処置LPラット（n=49）は、生理食塩水処置したLPラットよりも有意に長く生存し、生理食塩水処置HPラットと同じくらい長く生存した。デプレニル処置はまた、先天的なHPラット（n=50）をより優れた能力のラットに変換した。それらは185.30±1.96週間生存していた。50匹のラットのうち17匹は、我々の研究で使用した何百匹もの未処置または生理食塩水処置ラットについて長い観察期間中に観察された最大寿命より長生きであった。
【００１５】
エンハンサー効果は、二峰性、2つのベル型の濃度−効果曲線を有し、良好な性能のためにはエンハンサー物質の有効濃度範囲の一つが必要である。
【００１６】
より低い曲線が特異的なエンハンサー効果に関連する一方で、より高い濃度の曲線は非特異的効果に関連する。
【００１７】
(R)-1-(ベンゾフラン-2-イル)-2-プロピルアミノペンタン（略して(-)-BPAPまたはBPAP）は、差し当たり、最も強力で選択的な化合物として知られているが、エンハンサー物質としては後に開発されたものである。
【００１８】
BPAPの開発は、フェムト/ピコモル濃度でさえ、その特異的エンハンサー活性を発揮する（Knollら、1999）。
【００１９】
デプレニルおよびBPAPを用いた実験的および臨床的研究は、発達期以後の間の合成エンハンサー物質を予防的に投与することが、行動の老化に関連する衰えを著しく遅らせ、寿命を延ばすことを明らかにした。
【００２０】
ヒトにおいて、デプレニルの性成熟からの維持は、今日、この目的に到達する有望な機会を与えられた唯一の利用可能な治療であり、パーキンソン病およびアルツハイマー病のような加齢関連した神経変性疾患の発症を予防または遅延させる機会を与える。
【００２１】
モノアミン作動性ニューロンの活性増強効果、特にカテコールアミン作動性ニューロンのカテコールアミン作動性エンハンサー（CAE）効果にはかなりの注意が払われており、それは膜電位依存性エキソサイトーシスの増幅によるカテコールアミン遊離促進作用であり、貯蔵部位からのカテコールアミン置換による上記の遊離作用とは異なる（Life Sci., 58, 945-952(1996)、WO1999/007667およびWO2000/026204）。CAE効果によるカテコールアミン遊離を増強する化合物は、向精神薬、抗うつ薬、パーキンソン病および/またはアルツハイマー病の治療用組成物に有用であることが見出された（WO1999/007667、EP957080としても公開）。WO2000026204には、光学分割によってWO1999007667の有機アミン化合物からのそれぞれの光学異性体が記載されている。これらの光学活性異性体は、特にパーキンソン病および/またはアルツハイマー病を治療するための同じ群の疾患の薬理学的スクリーニングによって有用な治療法であることが判明した。
【００２２】
デプレニルは優先的にCAE物質であり、セロトニン作動性ニューロンの非常に弱いエンハンサーである。Kitani Kら（Kitani Kら、1998）は、動物モデルに基づいて、デプレニルが動物において抗酸化効果を示し、それにより動物における腫瘍発現を予防し得ることを提案した。しかしながら、著者らは、特異的なカテコールアミン作動性エンハンサー効果に起因する低用量の腫瘍発現抑制効果については何も言及していない。
ThyagaRajan、S.ら（ThyagaRajan、S.ら、1998）は、MAO-B阻害薬としてデプレニルが、0.25mg/kg体重以上の用量で、視床下部内側基底部（MBH）の隆起脳下垂体系ドパミン作動性（TIDA）ニューロンに対する神経保護効果を発揮することによって乳腺腫瘍の発現を抑制することを見出した一方で、特異的なエンハンサー効果を発揮するはるかに低い用量、例えば、0.01mg/kg体重よりも低用量で腫瘍抑制効果が可能であることを認識していない。
本発明者らの知る限りでは、カテコールアミン作動性神経系が、腫瘍発現に作用する脳内のメカニズムに関連しているということは、当該技術分野では一度も示唆されてはいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
安全な化合物の長期および低用量投与による腫瘍の発現抑制を提供する必要性が、当該技術分野において依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
特異的なCAE効果を有するニューロン活性エンハンサー化合物が腫瘍発現の抑制効果も有することは、本発明者らによって予想外に発見された。そこで、本発明者らは、本発明を完成させるために鋭意努力した。
【発明の簡単な説明】
【００２５】
本発明は、化合物またはその薬学的に許容される塩に関するものであり、該化合物は、中枢神経系のモノアミン作動性ニューロンにおけるインパルス伝播を介したモノアミン神経伝達物質の遊離を増強するモノアミン作動性活性エンハンサー化合物であるニューロン活性エンハンサー化合物であり、
該化合物の癌またはその転移を予防または治療するために使用するものであり、
好ましくは、該化合物は特異的エンハンサー用量で投与される、または投与のためのものである。
好ましくは、モノアミン作動性活性エンハンサー化合物の効果、すなわちモノアミン作動性ニューロンにおけるインパルス伝播を介したモノアミン神経伝達物質の遊離の増強が、以下の方法によって直接的または間接的に測定可能または検出可能である：
-カテコールアミンの測定、前記エンハンサー化合物の存在下で単離されたラット脳幹からの電気刺激により遊離された[3H] -ノルエピネフリン、[3H] -ドパミンの量の測定;
-条件回避反射（CAR）分析解析、合成カテコールアミン作動性活性エンハンサー（CAE）物質の投与により拮抗しうるが、B型MAOの選択的阻害またはカテコールアミン若しくはセロトニンの再取り込みの阻害はそれぞれ無効である、テトラベナジン処置によって学習欠損を来したマウスを用いて行うもの;そして 
-非常に広い用量範囲での候補エンハンサー化合物の投与。二峰性、ベル型の濃度効果曲線はエンハンサー効果に特徴的である（少なくともMAO阻害より低い範囲）；低用量範囲は「特異的エンハンサー効果」を示し、高用量範囲は、「非特異的エンハンサー効果」を示す（Knoll J 2012）。
【００２６】
特に、本発明は、一般式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩であって、
該化合物が、中枢神経系のモノアミン作動性ニューロンにおけるインパルス伝播を介したモノアミン神経伝達物質の遊離を増強するモノアミン作動性活性エンハンサー化合物であり、
癌またはその転移の予防または治療に使用するためのものである。
【化１】
2018505852.tif 000003
一般式Ｉにおいて、
Qは、非局在性のπ電子系を有する1つの6員環若しくは複素環を含んでなる置換若しくは非置換の6〜10員環または複素環式基であり、
Qが置換されている場合、該置換基は、水素、ヒドロキシル、C 1-4アルキル、C 1-4アルコキシおよびハロゲンからなる基から選択され、
Qが、1つの複素環を含み、該複素環は好ましくは多くても1-3の、好ましくは1-2のヘテロ原子を含み、  
該ヘテロ原子は、好ましくは、O、NおよびSから選択され、 
Xはメチレン、すなわち>CH2、またはエチレン、すなわち>CH-CH2、>NH、>NCH3または-O-、 
R1は、水素、C 1-6アルキル、C 2-4アルケニル、C 2-4アルキニルまたはC 2-4アルキルカルボニルであり、
R2は水素、C 1-4アルキル、C 2-4アルケニル、C 2-4アルキニル、C 2-4アルキルカルボニル、C 6-10アリールまたはC 7-11アリールアルキルであり; 
R3は、水素、メチルまたはエチルであり、
R1、R2およびR3のいずれか一つが、水素と異なる場合、互いに独立して、非置換または置換のいずれかであり、置換されている場合、該置換基は、好ましくは、水素、ヒドロキシル、C 1-4アルキル、C 1-4アルコキシおよびハロゲンからなる基から選ばれるが、置換基がC 1-4アルキルまたはC 1-4アルコキシである場合、その置換基は短く、すなわち置換されているR1、R2またはR3より少ない炭素原子を有していることを条件とする。
好ましくは、Qは1個または2個の置換基で置換されているか、非置換である。
好ましくは、R1、R2およびR3のいずれかは、1つ若しくは2つの置換基で置換されているか、または非置換である。
好ましくは、Qは、非局在性π電子系を有するC6環式または複素環式基である。
非局在性π電子系は、環全体に及ばなくてもよい。好ましくは、π電子系は芳香族であり、したがって好ましくはQは芳香族基である。 
【００２７】
一般式Iの化合物は、前記キラルティ中心または立体中心においてSまたはR立体配置の化合物であり、好ましくは、Cahn-Ingold-PrelogによるR立体配置化合物であり、この化合物は式Ｉで示される。
【化２】
2018505852.tif 000004
式中、Q、X、R1、R2およびR3は、上記または本明細書で定義したとおりである。
【００２８】
該化合物は、特異的なエンハンサー用量において癌またはその転移の予防または治療に使用するためのものである。
式Ｉの化合物の好ましい実施形態は、Xがメチレン基、すなわちCH2である。 
さらに好ましい実施形態では、Xはメチレン基、すなわちCH2であり、化合物はR配置化合物であり、化合物は一般式IIで示される。
【化３】
2018505852.tif 000005
モノアミン作動性活性エンハンサー化合物は、カテコールアミン作動性活性エンハンサー（CAE）物質であり、モノアミン作動性ニューロンは、カテコールアミン作動性ニューロンである。好ましくは、該化合物は、特異的エンハンサー用量で投与される。
【００２９】
さらに好ましい態様においては、本発明は、一般式IIのモノアミン作動性活性エンハンサー化合物またはその薬学的に許容される塩を癌またはその転移の予防または抑制に用いることに関するものであり、
その式IIにおいて、 
Qは、置換または非置換の不飽和、好ましくは芳香族の6員環基であり、1または2個のヘテロ原子を有していてもよく、
Qが置換されている場合、
該置換基は、水素、ヒドロキシル、C 1-4アルキル、C 1-4アルコキシおよびハロゲンからなる基から選択され、好ましくは、Qは1または2個の置換基で置換されているか、非置換であり、
R1はC 1-5アルキルであり、好ましくはメチルまたはエチルまたはプロピルであり; 
R2は、C 1-4アルキル、C 2-4アルケニルまたはC 2-4アルキンであり; 好ましくはC 2-3アルケニルまたはC 2-3アルキンである;
R3は、水素、メチルまたはエチルである。
好ましい実施形態では、Qは非置換芳香族6員環である。
【００３０】
あるいは、本発明は、一般式IIのモノアミン作動性活性エンハンサー化合物またはその薬学的に許容される塩を、癌またはその転移の予防または抑制に使用することに関するものであり、
好ましくは脳におけるエンハンサー感受性ニューロンを刺激し、そこに特異的なエンハンサー効果を発揮させる量において使用することに関するものであり、
式IIにおいて、 
Qは置換または非置換のフェニル基であり、前記フェニルが置換されている場合、
該置換基は、水素、ヒドロキシル、C 1-4アルキル、C 1-4アルコキシおよびハロゲンからなる基から選択され、好ましくは、前記非置換のフェニルであり、
R1はC 1-5アルキルであり、好ましくはメチルまたはエチルまたはプロピルであり; 
R2はC 1-4アルキル、C 2-4アルケニルまたはC 2-4アルキニル; 好ましくはC 2-3アルケニルまたはC 2-3アルキニル; 
R3は水素、メチルまたはエチル、好ましくは水素またはメチルである。 
【００３１】
あるいは、本発明は、一般式IIのモノアミン作動性活性エンハンサー化合物またはその薬学的に許容される塩の、
癌またはその転移の予防または抑制に使用することに関するものであり、
式IIにおいて、 
Qは置換または非置換のフェニル基であり、前記フェニルが置換されている場合、前記置換基は水素、ヒドロキシル、C 1-4アルキル、C 1-4アルコキシおよびハロゲンからなる基から選択され、好ましくは前記フェニルは1若しくは2個の置換基で置換されているか、非置換であり、
R1はメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はC 2-4アルケニル、C 2-4アルキニルまたはC 2-4アルキルカルボニルであり; 
R3は、水素、メチルまたはエチルである。 
その薬学的に許容される塩は、酸付加塩であってもよい。
【００３２】
一実施形態では、6員環はQ中に1または2個のヘテロ原子を含み、好ましくはQ中の1または2個のヘテロ原子はOおよびNから選択される。 
好ましくは、本発明による使用のための化合物において、R2は、C 2-3アルケニルおよびC  2-3アルキニルから選択される。
好ましくは、Qはフェニル基である。
好ましくは、Qはフェニル基であり、R1はメチルおよびエチルから選択され、R2はC 2-3アルケニルおよびC 2-3アルキンから選択される。
好ましい実施形態では、Qはフェニルであり、
R1はメチル、エチル、プロピルまたはブチル、好ましくはメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はC 1-4アルキル、C 2-4アルケニルまたはC 2-4アルキニル; 
R3は、水素、メチルまたはエチルである。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明の化合物は、一般式IVで示され、 
【化４】
2018505852.tif 000006
一般式IV中、 
R1、R2およびR3は、Qが、1若しくは2個のヘテロ原子を有していても有さなくてもよい、置換または非置換の不飽和、好ましくは芳香族の6員環である実施形態、またはその好ましい実施形態として定義した通りである。
好ましい実施形態では、Qはフェニルであり、 
R1はエチルまたはプロピルであり; 
R2はメチル、エチルまたはプロピル、好ましくはエチルであり; 
R3は水素、メチルまたはエチル、好ましくは水素またはメチル、より好ましくは水素である。
【００３４】
非常に好ましい実施形態において、モノアミン作動性活性エンハンサー化合物は、（R）-1-フェニル-N-プロピルペンタン-2-アミン[( -)-PPAP]である。
【００３５】
好ましい実施形態では、Qはフェニルである。 
【００３６】
R1はメチルまたはエチルであり、R2はC 2-3アルケニル、C 2-3アルキンである。好ましくは、R3は、水素、メチルまたはエチルである。
好ましい実施形態において、R2はエチニルである。
【００３７】
非常に好ましい実施形態において、モノアミン作動性活性エンハンサー化合物は、（R）-N-メチル-N-（1-フェニルプロパン-2-イル）プロパ-2-イン-1-アミン（セレギリンすなわち、( -) -デプレニル）である。
【００３８】
好ましくは、化合物は、エンハンサー感受性ニューロンを刺激する量で、すなわち、脳または中枢神経系においてカテコールアミン遊離を増強する量で使用される。
【００３９】
好ましくは、化合物は、脳または中枢神経系におけるカテコールアミン遊離を増強する量で使用される。
【００４０】
好ましくは、前記化合物は、一日量として0.01mg/kg体重未満、好ましくは0.005、0.0025mg/kg体重未満で投与される。好ましくは、化合物は1日量として0.0025mg/kg体重未満で投与される。好ましくは、これは「特異的なエンハンサー用量」である。
【００４１】
癌またはその転移を予防または治療することは、好ましくは、その発現を抑制することを伴う；この場合、それは前記癌または転移の発現を抑制するものと理解される。
【００４２】
一実施形態では、癌は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および胚細胞腫からなる群から選択される悪性腫瘍または新生物である。
【００４３】
好ましい実施形態において、悪性腫瘍は、癌腫または肉腫、好ましくは結合組織の癌腫または肉腫である。
【００４４】
非常に好ましい実施形態では、悪性腫瘍は、粘液線維肉腫、腺癌、結腸癌および肝転移からなる群から選択される。
一実施形態では、被験体は恒温動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトである。
好ましくは、化合物は、特異的なエンハンサー効果が発揮される低用量で投与される。
【００４５】
好ましくは、化合物は、他の効果はないが、そのエンハンサー効果が知られているまたは証明できるまたは効果（特異的なエンハンサー効果）が発揮される低用量で投与される。
【００４６】
好ましくは、前記化合物は、長期間、好ましくは少なくとも1、2、3、5、6、8若しくは10ヶ月間、若しくは少なくとも1、2、3、4、5若しくは6年間にわたって被験体に投与されるか、または被験体の予想寿命の1％、2％若しくは好ましくは5％より長期間投与される。
【００４７】
好ましくは、被験体は成人であり、投与の期間は1年、2年または好ましくは5年以上である。 
【００４８】
好ましい実施形態では、被験体は性的に成熟した被験体、好ましくは成人被験者である。
【００４９】
好ましい実施形態では、被験体は癌、例えば悪性腫瘍または新生物の発現が認められないことである。好ましくは、化合物は、癌またはその転移の防止または予防のために使用される。
【００５０】
本発明はまた、中枢神経系におけるカテコールアミン遊離を増強する量において、活性化合物として本発明に従って使用する化合物を含む医薬組成物または医薬に関するものである。
【００５１】
好ましくは、この医薬は本発明の使用のための化合物を含み、その化合物は、上記またはここにまたは以下に活性化合物として述べるように、光学純度が70％以上、好ましくは80％または90％または95％または97％または98％または99％以上のものである。
【００５２】
本発明はまた、癌またはその転移を予防若しくは治療する方法、または前記被験体における癌若しくは転移の発現を抑制して被検体を治療するための方法であって、上記または本明細書で定義した化合物を治療量で該被検体に投与することを含む方法に関するものである。
定義
【００５３】
本発明の「医薬組成物」は、本明細書で定義される癌の治療に適した少なくとも1つの生物学的に活性な物質を含む組成物である。医薬組成物はまた、例えば、併用療法において有用なさらなる生物学的に活性な物質、例えば、細胞傷害剤であり得る化学療法化合物を含み得る。さらに、組成物は、化学療法に伴う悪心および嘔吐の発現を予防または軽減するための補助化合物を含んでいてもよい。補助剤は当該分野で周知である。さらに、組成物は、免疫療法剤を含んでもよい。
【００５４】
「医薬」は、例えば恒温動物または哺乳類といった動物またはヒトにおける有効性が証拠によって支持されている医薬組成物であり、好ましくは、国若しくは地方若しくは地域社会の健康承認または健康機関に登録されているものである。
【００５５】
化合物の「治療量」は、本明細書に開示されるような癌の症状、特に癌またはその転移を、治療、防除、寛解、予防または改善するのに有効な化合物の量を指す。好ましくは、本発明の化合物の治療量は、他の治療効果、例えばMAO阻害、例えばMAO-B阻害を発揮する量よりも低く、好ましくは有意に低いものである。
【００５６】
「癌」は、本明細書において、被験体の癌細胞が悪性の無秩序または制御不能の増殖を特徴とする被験者の状態として理解される。増殖は、通常、癌という用語に含まれる「新生物」または「腫瘍」と呼ばれる細胞の瘤または塊を形成させる。
【００５７】
癌は、本明細書において、それが被験体の状態を進行的に悪化させる傾向がある場合、すなわち被験体に有害な作用を及ぼし、彼/彼女/被検体に死をもたらすことになるならば、「悪性腫瘍」とみなされる。
【００５８】
一実施形態では、細胞の瘤または塊（例えば、新生物または腫瘍）が最初は悪性ではなく、すなわち「良性」として発現または診断されても、それが（i）悪性になるリスクを有する場合、または（ii）後で悪性になる場合は、癌は悪性であるとみなされる。
【００５９】
癌の「発現」は、本明細書において、検出可能若しくは測定可能な徴候または癌が存在することの徴候すなわち特異的な証拠の出現として理解され、好ましくは、少なくともこれらのうち一つの徴候が存在するときに、癌が発現したと理解される。癌の「発現」は定量的に特徴付けることができ、またはそれによって発現のレベルが評価される。
【００６０】
癌の発現の「抑制」は、治療（若しくは治療的介入）若しくは処置の結果として、癌の発現が見られなかったか若しくは稀、すなわちより小さな確率でしか起こらないこと、または防止若しくは低減されていることをいい; または発現のレベルが、適切な対照または対照処置と比較して低くなっている場合をいう。対照は、治療若しくは処置が適用されていないか、またはプラセボを投与、例えば同じ被験体または対照被験体または被験体の対照群への投与として設定または処置することができる。即ち対照は、比較として値しうるものである。
【００６１】
「転移」は、癌細胞が原発巣からリンパ系または血流を介して身体の他の部分に広がるプロセスであり、一箇所または複数箇所への転移が生じる。
【００６２】
「動物」は、脊椎動物、好ましくは恒温動物、好ましくは哺乳動物を指す。広い意味においての動物の用語は、好ましくはヒトを含む哺乳動物である。必要に応じて、狭い意味での動物という用語は、ヒトを含まない。該動物は魚類、爬虫類、両生類、鳥類または哺乳類から選択することができる。好ましくは、動物は哺乳動物である。
【００６３】
「被験体」は、本明細書においては、本発明の製剤または組成物により、予防的処置を含む処置の対象となる動物またはヒトをいう。好ましくは、被験体は恒温動物であり、哺乳動物またはヒトである。好ましくは、被検体は患者である。
【００６４】
「患者」は、医療診断、観察または処置を受けている対象である。好ましくは、患者が癌を有する対象である。好ましくは、処置は、予防または治療をいう。
【００６５】
「エンハンサー化合物」は、ニューロン活性エンハンサー化合物（好ましくは、モノアミン作動性活性エンハンサー化合物であり、特により好ましくは、「カテコールアミン作動性エンハンサー化合物」であるCAE化合物、または「セロトニン作動性エンハンサー化合物」であるSAE化合物）であり、少なくともエンハンサー感受性ニューロン群、好ましくは、それぞれのモノアミン作動性神経伝達物質を遊離するニューロン（好ましくはカテコールアミン作動性およびセロトニン作動性ニューロン）を、用量依存的に賦活することが可能であり、モノアミンオキシダーゼ-A（MAO-A）を阻害せず、好ましくは、MAO-Bを阻害しない。
特に、該化合物が中枢神経系におけるモノアミン作動性ニューロンにおけるインパルス伝播を介したモノアミン神経伝達物質の遊離を増強する範囲を用量範囲と定義できる。好ましくはモノアミン作動性神経伝達物質、好ましくはカテコールアミンまたはセロトニンに対するエンハンサー効果により、膜電位依存性エキソサイトーシスの増幅を介して遊離が起こる。
好ましくは、エンハンサー化合物は、エンハンサー感受性ニューロンの興奮性を増大させる。
【００６６】
好ましくは、エンハンサー化合物は、脳または中枢神経系においてカテコールアミンの遊離を増強する（CAE化合物）。 
【００６７】
このカテコールアミン作動性エンハンサー効果（CAE効果）は、とりわけ以下の方法により、測定可能または検出可能である。
【００６８】
-単離された哺乳動物の脳、好ましくは脳幹、好ましくはラット脳幹から電気刺激により遊離された [3H] - ノルエピネフリン、[3H] -ドパミンの量を測定することにより；
-条件回避反射（CAR）解析により、例えば、テトラベナジン処置により学習障害を呈するネズミを用いて行いて、合成CAE物質またはA型MAO阻害薬の投与により拮抗できるが、B型MAOの選択的阻害またはカテコールアミン若しくはセロトニンの再取込み阻害は、それぞれ無効である；そして
-極めて広い用量範囲における、候補カテコールアミン作動性エンハンサー化合物の投与により、その中で、二峰性、ベル型の濃度効果曲線は、エンハンサー効果に特徴的であり；より低用量範囲では「特異的エンハンサー効果」を示し、一方、高用量範囲では、「非特異的エンハンサー効果」（両方の範囲または少なくとも典型的MAO阻害用量より低い範囲である）を示す。
【００６９】
エンハンサー効果の評価や検出においては、一つ以上の上記の方法および任意選択的に一つ以上のさらなる方法を用いることができる。
【００７０】
用語「含んでなる（comprise(s)）」または「含んでなる（comprising）」または「含む（including）」は、本明細書では、非網羅的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、列挙された特徴、方法段階または構成要素に加えて、更に別の特徴、方法段階または構成要素の付加、包含を許容するものである。
【００７１】
表現「実質的にからなる（consisting essentially of）」または「実質的に含んでなる（comprising substantially）」は、リストに、例えば請求項に、列記された必須の特徴または方法段階または構成要素からなると理解されるべきであり、一方で使用、方法、組成物、または他の主題の本質的な特徴に実質的に影響を与えない他の特徴または方法段階または構成要素を付加的に含有し得る。
「含んでなる（comprise(s)）」または「含んでなる（comprising）」または「含む（including）」は、本明細書では（本明細書に限ってのことであるが）、もし必要ならば、新規事項の追加をすることなく、「実質的にからなる（consisting essentially of）」または「実質的に含んでなる（comprising substantially）」と置き換えることができると理解されるべきである。
【００７２】
「含んでなる（comprise(s)）」または「含んでなる（comprising）」または「含む（including）」もまた、もし必要ならば、「からなる（consisting of）」に限定することができると理解されるべきである。
「1個以上」は、1個または1個以上を意味し、好ましくは1個、2個若しくは3個、または1個若しくは2個を意味する。 
「低級」アルキル、アルコキシ等は、好ましくは、C 1-6、C 1-4、C 1-3若しくはC 1-2、のアルキルまたはアルコキシ等を意味する。
【００７３】
本明細書で使用する場合、用語「アルキル」は、単独でまたは組み合わせて、好ましくは、1〜6個、好ましくは1〜4個、または1〜3個の炭素原子または1〜2個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖炭化水素基（すなわち、「C 1-6 」「C 1-4 」または「C 1-3 」または「C 1-2」のアルキル基）、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチルおよびt-ブチルなどを意味する。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「アルコキシ」は、アルキル基は前述の通りであり、アルキル-O-基を意味する。適切なアルコキシ基の非限定的な例としては、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシおよびn-ブトキシ、好ましくはメトキシが挙げられる。親部分への結合は、エーテル酸素を介しておこなわれる。
本明細書で使用される、用語「アリール」は、一環式または二環式芳香環、任意選択的に複素環を意味し、例えば、
-フェニル、ピリジニル、ピラニル、ジアジニル、オキサジニルまたはジオキシニル、
-ナフチル、好ましくは1-ナフチルまたは2-ナフチル、 
-インドリル、好ましくは1-インドール-2-イルまたは1-インドール-イル、 
-ベンゾジアゾリル、特に1,3-ベンゾジアゾリル、好ましくは1,3-ベンゾジアゾール-2-イル、 
-ベンゾフラニル、特に1-ベンゾフラニル、好ましくは1-ベンゾフラン-2-イルまたは1-ベンゾフラン-3-イル;または 
-ベンゾジオキソリル、特に1,3-ベンゾジオキソリル、好ましくは1,3-ベンゾジオキソール-2-イルである。
【００７５】
本明細書で使用される「複素環」化合物または基または環の構造は、炭素原子以外に、その環のメンバーとして少なくとも一の非炭素元素の原子を有する環状化合物である。好ましくは、その複素環式化合物の環は5-6員環である。
【００７６】
本明細書で使用される「アルケニル」は、単独でまたは組み合わせて、少なくとも一の炭素-炭素二重結合を含む直鎖または分枝鎖不飽和炭化水素基を意味し、該炭化水素基は、好ましくは2-6個、好ましくは2-4個、または2個の炭素原子（すなわち、「C 2-6」「C 2-4」または「C 2 -3」または「C 2-2」のアルキル基）を含有する。
【００７７】
本明細書中で使用される「アルキニル」は、単独でまたは組み合わせて、少なくとも一の炭素-炭素三重結合を含む直鎖または分岐鎖の不飽和炭化水素基を意味し、該炭化水素基は、好ましくは2-6個、好ましくは2-4個、または2-3個または2個の炭素原子（すなわち、「C2-6」、「C 2-4」または「C 2-3」または「C 2-2」のアルキル基）を含有する。
【００７８】
本明細書で使用される「アルキルカルボニル」は、アルキルと、炭素原子が酸素原子に二重結合しているカルボニル基を含むアルキル-CO-基を意味し、アルキル基は前述のとおりである。親部分への結合は、カルボニル基の炭素原子、エーテル酸素を介している。
【００７９】
本明細書で使用される“アリールアルキル”は、上述したように、さらに1個以上、好ましくは、1-3個または1-2個の置換基で置換されていてもよいアルキル基を介して親分子に結合しているアリールアルキル基を指す。
【００８０】
「飽和」基、環または化合物中においては、炭素原子の鎖が単結合のみによって互いに連結されているものである。「不飽和」基、環または化合物は、それぞれ、アルケンまたはアルキンまたはアリールで見られるように、炭素-炭素二重結合または三重結合または非局在性の、例えば、芳香族のようなπ電子系を含有しているものである。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「縮合環」は、その環がもう一つの基と縮合して二環式基を形成しているものを意味し、その環の2つのメンバー原子間の単結合は、その2つの環で共通、すなわち2つの環に共有されている。
【００８２】
「アルキル置換基」は、それによって置換されている例えばQ、R1、R2またはR3といった基、部分より、大きくない、好ましくはより小さい、すなわち、より短い好ましくはより少ない鎖原子、好ましくは炭素原子で構成されている。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】セレギリン/(-)-デプレニルの化学構造；系統的（IUPAC）名：(R)-N-メチル-N-(1 -フェニルプロパン-2-イル)プロパ-2-イン-1-アミン。
【図２】(-)-PPAP((-)-1-フェニル-2-プロピルアミノペンタンの化学構造、系統的（IUPAC）名：(R)-1-フェニル- N-プロピルペンタン-2-アミン。
【００８４】
【図３】シャトルボックスにおける長寿研究のための(-)-デプレニルの至適用量の選択。測定：(S)生理食塩水処置（対照）ラットの条件回避反応(CARs)を固定する能力; (T1)トレーニング1時間前の1mg/kgのテトラベナジンを皮下投与したラットの学習能力の阻害；[Tl+(-)-デプレニル]テトラベナジンの阻害効果を用量依存的に拮抗する(-)-デプレニルの能力。群間の行動の有意性は、多因子分散分析（ANOVA）によって評価した。*P<0.05; **P<0.01、***P<0.001
【００８５】
【図４】シャトルボックスにおける長寿研究のための(-)-BPAPの至適用量の選択。測定：（S）生理食塩水処置（対照）ラットの条件回避反応（CARs）を固定する能力; (T1)トレーニング1時間前の1mg/kgのテトラベナジンを皮下投与したラットの学習能力の阻害；[Tl+ (-)-BPAP]テトラベナジンの阻害効果を用量依存的に拮抗する(-)-BPAPの能力。群間の行動の有意性は、多因子分散分析（ANOVA）によって評価した。*P<0.01; **P<0.001
【００８６】
【図５】0.1mg/kg(-)-デプレニル慢性処置の生存に対する影響（N=40）
【図６】0.001mg/kg(-)-デプレニル慢性処置の生存に対する影響（N=40）
【図７】0.05mg/kg(-)-BPAP慢性処置の生存に対する影響（N=40）
【図８】0.0001mg/kg (-)-BPAP慢性処置の生存に対する影響（N=40）
【図９】0.1mg/kg(-)-デプレニル慢性処置による腫瘍発現抑制効果（N=40）
【図１０】0.001mg/kg(-)-デプレニルの慢性処置による腫瘍発現抑制効果（N=40）
【図１１】0.05mg/kg(-)-BPAP慢性処置による腫瘍発現抑制効果（N=40）
【図１２】0.0001mg/kg(-)-BPAP慢性処置による腫瘍発現抑制効果（N=40）
【図１３】(-)-デプレニルおよび(-)-BPAPをそれぞれ慢性処置させたラットの腫瘍発現から死亡までの時間
【図１４】エンハンサー物質である(-)-デプレニルおよび(-)-BPAPを1.5年間投与したFVB/N系マウスにおける肺癌発現の抑制効果
【発明の詳細な説明】
【００８７】
エンハンサー物質がエンハンサー感受性ニューロンの興奮性を増加させることを実証することは容易である。我々が、例えば3分間の回収期間中に単離したラット脳幹から電気的刺激により遊離した[3H]-ノルエピネフリン、[3H]-ドパミンまたは[3H]-セロトニン量を測定した時、また、特異的なエンハンサー効果を発揮するデプレニルやBPAPの至適濃度の存在下、測定を繰り返した時、標識された伝達物質の遊離量が優位に高い。これは、エンハンサー感受性ニューロン群が、全体として、合成エンハンサー物質の存在下で高い活性レベルで直ちに働くことを示している。単回ウォッシュアウト後、ニューロンは再びそれらの正常な活性レベルですぐに働く。ニューロンは、「悉無律」の様式で刺激に反応するので、ニューロン群（最も興奮性のもの）の一部のみが電気刺激に反応することは明らかである。エンハンサー物質は、ニューロンの興奮性を増幅させるので、そのエンハンサー物質の存在下、ニューロン群のより高い割合が興奮し、電気的刺激により遊離された標識伝達物質の量が有意に増加する（Knoll, 2005,3.1.3レビュー参照）。
【００８８】
脳幹におけるノルアドレナリン作動性、ドパミン作動性およびセロトニン作動性ニューロンによって表わされる、生命に重要な中枢神経系制御のエンハンサー感受性の実証；デプレニルがPEA-由来合成CAE物質であるという発見と同様に；それぞれの「特異的」と「非特異的」エンハンサー効果を発揮するデプレニルの低用量を用いて、我々の最初の長寿研究を開始した。
【００８９】
我々は以前に、ラット脳におけるカテコールアミン作動系およびセロトニン作動系におけるエンハンサー調節が離乳から性成熟まで有意に高い活性レベルで機能し続けること（KnollおよびMiklya、1995）、およびラットの性ホルモンは、離乳後に特徴的に脳におけるカテコールアミン作動性/セロトニン作動性トーンの有意な増強を終了させることを実証したので、2010年5月に性成熟した2ヶ月齢のWistar系雄性ラット（チャールズ・リバー）における長寿研究を開始した。そしてこの研究が、これまで未知のエンハンサー感受性腫瘍発現抑制（TMS）の調節が、哺乳動物の脳内で動作していることを明らかにした。この知見は、本特許明細書の主題の基礎を形成している。
【００９０】
本長寿研究は、これまで未知であったエンハンサー感受性腫瘍抑制機構（TSM）が、Wistar系ラットの脳内で機能していることを明らかにした。寿命の最初の1年が終了するあたりで、高い割合で、筋肉を含む皮下組織に浸潤して急速に増殖する粘液線維肉腫を発現し始めることが我々のWistar系ラットの亜系統に特徴である。我々は雄性ラットで長寿研究に取り組み、50％の動物が寿命の間に腫瘍を発現することを観察した。我々は、エンハンサー物質 [（-）-デプレニル（0.1mg/kg）または(-)-BPAP（0.05または0.0001mg/kg）]を用いて、2ヶ月齢の終わりから週3回処置したラットにおいて、粘液線維肉腫の発現が有意に減少したことを経験した。40匹の生理食塩水処置（対照）ラットの群において、最初の動物が11ヶ月齢で腫瘍を発現し、その群の20匹のラットが30ヶ月齢の終わりに腫瘍を発現した。これとは対照的に、0.0001mg/kgの(-)-BPAPで処置した40匹のラットの群においては、腫瘍を発現した最初のラットは20ヶ月齢であり、この群のラットが30ヶ月齢を終えるとき、わずか8匹のみが粘液線維肉腫を発現していた（P<0.001）。0.05mg/kgの(-)-BPAPで処置した40匹の雄性ラットの群では、腫瘍を発現した最初のラットは13ヶ月齢であり、この群のラットが30ヶ月齢を終えるとき、わずか7匹のみが、腫瘍を発現していた（P<0. 001）。0.1mg/kgのデプレニルで処置した40匹の雄性ラットの群において、腫瘍を発現した最初のラットは16ヶ月齢であり、この群のラットが30ヶ月齢を終えるとき、11匹のラットのみが腫瘍を発現していた（P<0.01）。したがって、0.0001mg/kgの(-)-BPAPでさえ、0.1mg/kgの(-)-デプレニルより腫瘍発現を抑制する効力が強かった。
【００９１】
(-)-デプレニルおよび(-)-BPAPの公知のエンハンサー効果と同じく、TMS効果もまた中枢性の効果である。
【００９２】
TMS調節は、腫瘍細胞における直接の細胞傷害作用とは無関係であるため、我々は、2種類のヒト培養髄芽腫細胞株におけるBPAPおよびデプレニルの効果を試験した：線維形成性小脳髄芽腫由来のDaoy HTB-186細胞株（Jacobsenら、1985）および二倍体DNA量を持つ後頭蓋窩髄芽腫由来のUW-228-2細胞株（Kelesら、1985）を用いて試験した。これは、(-)-デプレニルおよび(-)-BPAPの両方が、培養中のヒト髄芽腫細胞の増殖を阻害せず、上記の結論と一致している。
【００９３】
Wistar系ラットは、筋肉を含む皮下組織に浸潤し急速に増殖する粘液線維肉腫を発現する感受性を持って生まれる。彼らはまた、腫瘍の発現に対する先天的な防御機構を持って生まれる。
【００９４】
デプレニルおよびBPAPはTMSニューロンをより高い活性レベルに保つので、結果的に粘液線維肉腫の発現に影響を及ぼす。
【００９５】
デプレニルは、カテコールアミン作動性ニューロンのPEA由来の合成エンハンサーである；しかしデプレニルは、セロトニン作動性ニューロンにほとんど不活性である。
【００９６】
模範的な実験ツールとして特異的なエンハンサー物質であるデプレニルを使用して、我々は全く予想外にラット脳におけるエンハンサー感受性TMS調節の活動性を発見した。
【００９７】
予想されたように、エンハンサー感受性調節やこれらの調節に関連する内因性エンハンサー物質の多くの側面はなお不明である。エンハンサーの研究は明らかにそのパイオニア段階にある。
【００９８】
BPAPが、別の種におけるin vivoでの腫瘍増殖および転移を阻害するかどうかを更に研究するために、肺癌形成についてFVB/N系マウスを用いた試験がなされた（Taketo M. 1991）（実施例3を参照）。 
【００９９】
以下にTMS脳調節の性質、エンハンサー物質の作用機序、および腫瘍研究に別の経路を提供する機会：予防についてさらに議論する。
【０１００】
エンハンサー感受性ノルアドレナリン作動性、ドパミン作動性、およびセロトニン作動性神経系におけるデプレニルおよびBPAPのエンハンサー効果、継続的に加齢に伴う活性低下、および図9-12に示すエンハンサー物質の効果に関する経験を照らし合わせると、これまでに知られていないエンハンサー感受性ニューロン群がラット脳に存在し、それらは個体が罹患しそうな腫瘍を抑制する生理的機能であると、我々は学説に拘束されることなく、合理的に結論づけることができる。これは、哺乳類の脳における高度に効果的なTMS機構の存在の最初の例である。
【０１０１】
先行技術の結果から、老化に起因して、エンハンサー感受性ニューロンはその神経系に関連する病的状態の徴候をもたらす決定的な閾値に達することになる。例えば、エンハンサー感受性ドパミン作動性ニューロンの場合、加齢に伴う神経系の減衰により、線条体におけるドパミン含量が、パーキンソン病（PD）の症状が現れ、病気として診断されるときには、危険なレベル（正常値の30％）に達していることを、我々は正確に知っている。
【０１０２】
いかなるタイプのパフォーマンスを研究するために使用される方法および種にかかわらず、観察者は個々のパフォーマンスの大きな差異に遭遇することは一般的な経験である。どんな機能を測定しても、哺乳類の全ての群において、より低いパフォーマンスおよびより高いパフォーマンスをする個体を見つけるであろう。エンハンサー感受性調節において、我々は長寿の研究で、デプレニルの投与により、パフォーマンスのより低い個体をより良いパフォーマンスをする個体に変えることを実証した。（Knoll,1988；Knoll, Dallo, Yen, 1989; Knoll, Yen, Miklya, 1994）。
【０１０３】
このすべてがエンハンサー感受性TMSメカニズムの真実である。至適用量でのエンハンサー物質の予防的投与はTMSシステムをより高い活性レベルに保つので、最初の腫瘍の発現は後方にずれて起こることとなり、TMSシステムの活性低下が決定的な閾値を超える前に、つまり抑制されていない腫瘍細胞の増殖が始まる前に、より高い割合のラットが寿命を閉じる。例えば、この実験では、生理食塩水処置群のラット（N=40）の最後の動物が32ヶ月で死亡した。その群の半分（20匹のラット）が腫瘍を発現することなく死亡した。TMS機能に関して、これらのラットは高機能の個体であったと言うことができる。他の半分のラット（20匹のラット）は、死ぬ前に腫瘍を発現した。したがって、これらのラットにおいて、TMSニューロンにおけるエンハンサー調節の加齢に関連した低下は、決定的な閾値を超え、我々は粘液線維肉腫の発現を観察した。例えば0.05mg/kgのBPAPの生涯投与でTMSニューロンをより高い活性レベルに保つと、TMSニューロンのエンハンサー調節の老化に関連する減衰が遅延し、7匹のラットのみが粘液線維肉腫を発現した（図11参照）。 
【０１０４】
エンハンサー物質は、従来知られていなかったエンハンサー感受性TMS機構が脳内で働いていることを明らかにしている。合成エンハンサー物質の予防的投与の助けにより、その個体がその系統が罹患しやすい腫瘍の発現を回避する機会を有意に増加させる。生理食塩水またはエンハンサー処置ラットで生じた粘液線維肉腫の顕微鏡検査および組織学には差異がない。さらに、図13は、生理食塩水、デプレニルまたはBPAPで慢性処置したラットにおいて、腫瘍発現から死亡までの時間に有意差がないことを示している。
【０１０５】
表2は、加齢に関連した体重変化に関して、生理食塩水処置-またはエンハンサー処置ラットの間に有意差がないことを示している。
【０１０６】
【表２】
2018505852.tif 000007
【０１０７】
エンハンサー物質は、脳内のエンハンサー感受性ニューロンに非常に特異的な至適濃度で作用するので、2種のヒト髄芽細胞腫細胞株に対してBPAPおよびデプレニルが無効であったことは、粘液線維肉腫の発現に感受性のある我々のラットの系統において、これまで未知のエンハンサー感受性調節が作用して腫瘍の発現を抑制しているという我々の結論を強く支持する。
【０１０８】
エンハンサー調節の老化に関連した低下のために、腫瘍を発現するラットの数は、時間が経過するにつれて連続的に増加している。適切な用量のエンハンサー物質の維持は、エンハンサー感受性ニューロンをより高い活性レベルに保ち、腫瘍を発現させたラットの数を、有意に少なくする。
【０１０９】
本発明のエンハンサー化合物の調製は、例えば以下の特許および特許出願：WO1999007667A1、WO1988002254（A1）に記載されている。 
【０１１０】
好ましくは、鏡像異性的に純粋な化合物が使用される。
【０１１１】
本発明のエンハンサー化合物の製剤化は、一般に、当業者の技術の範囲内である。通常、セレギリンのようなMAO阻害薬に関連する豊富なガイダンスは、用量が有意に低く、製剤をこの低用量に適合させるべきであることを除いて、従うことができる。
デプレニル（セレギリン）の製剤バリエーションは、例えば当該分野で周知である[例えばClarke A et al. J Neural Transm. 2003年11月; 110（11）：1257-71。セレギリンの新しい低用量製剤：臨床的有効性、患者の好みおよびMAO-B阻害選択性; Fowler、Joanna S.、初回通過代謝を回避する、選択的MAO-B阻害薬セレギリン製剤が、ヒト脳においてMAO-Aも阻害するという証拠；Neuropsychophamacologyのオンライン出版物、2014年10月29日; doi：10.1038 / npp.2014.214]。
【０１１２】
一般に、低用量、口腔剤および速い分散および遅延性製剤は当該技術分野において周知であり、本明細書では患者の要求に従って適用することができる。
【０１１３】
特に低用量医薬の調製については、豊富な教示が以下の刊行物に見られる：[Ahmed H, Shah N.（2000）低用量医薬品の製剤化 - 理論と実践。 Am. Pharm. Rev.3（3）：9-14; Jack Zheng（2009）低用量経口製剤の製剤化と分析開発。John Wiley & Sons] 
【０１１４】
本発明は、本明細書中の実施例によってさらに説明される。これらの実施例は例示的かつ実例的な性質を有し、本発明の説明は本明細書で提供される全教示を含むことに留意すべきである。
【実施例】
【０１１５】
実施例1  (-)-デプレニルおよび対照化合物(-)-BPAPを用いたラットモデルにおける長寿試験
材料および方法 
材料 
(-)1-(ベンゾフラン-2-イル）-2-プロピル-アミノペンタンHCl [(-)-BPAP] 藤本製薬株式会社、大阪、日本; (-)-デプレニル（セレギリン）、サノフィ-キノイン、ブダペスト、ハンガリー; テトラベナジン HCl（ハンガリー、ブダペストの技術科学大学、有機化学講座のC. Szantay教授によって合成）。
【０１１６】
動物
ゼンメルワイス大学の飼育コロニーから提供された体重250〜350gのWistar系雄性ラット（チャールズ・リバー）で実験を行った。動物を12時間の明暗サイクルおよび温度（22±2℃）および相対湿度（55±5％）に制御された条件下で維持した。室温および相対湿度を毎日確認した。ラットを標準実験室用飼料および水道水で自由摂餌および飲水で飼育した。すべての操作は、実験的および他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約に準拠している。この研究は、ブダペストのゼンメルワイス大学の動物倫理委員会によって承認された（承認番号：1810/003/2004）。
【０１１７】
シャトルボックス実験による長寿研究のためのデプレニルおよびBPAPの適切なCAE用量の選択 
シャトルボックスの改変版では、双方向条件回避反射（CAR）の獲得を5日間連続して解析した。ラットを、中央に小さなゲートを有する仕切りによって2つの部分に分割されたボックスに入れ、動物を条件刺激（CS、光刺激）の影響下で仕切りを横切るように訓練した。5秒以内に反応しなかった場合、無条件刺激（US）であるフットショック（1mA）が与えられた。ラットがUSに5秒以内に応答しなかった場合、それは逃避失敗（EF）として分類された。1回の試行は、10秒の試行間隔と20秒のCSから構成された。CSの最後の5秒はUSの5秒をオーバーラップさせた。各学習セッションでは、CAR、EF、および信号間反応（IR）の数が自動的に計数され、多元配置分散分析ANOVAによって評価された。
【０１１８】
テトラベナジン処理（1mg/kg皮下）は、脳幹のカテコールアミン作動性ニューロンの神経終末の貯蔵部位からノルエピネフリンおよびドパミンの少なくとも90％を枯渇させる。カテコールアミン作動性脳エンジンの機能低下のために、皮質ニューロンの活性化は、CARの獲得に必要なレベルより低いままである。テトラベナジン処置によって引き起こされる学習障害は、合成CAE物質またはA型MAO阻害薬の投与によって拮抗され得るが、B型MAOの選択的阻害またはカテコールアミンおよび/またはセロトニンの再取込みの阻害は無効である（Knollら、1992）。 
【０１１９】
エンハンサー物質は、特有の用量依存性をもってエンハンサー効果を発揮する：二峰性、ベル型の濃度効果曲線は、エンハンサー効果に特徴的である。BPAPは、フェムト/ピコモル濃度範囲（「特異的エンハンサー効果」）および1000万倍高い濃度範囲（「非特異的エンハンサー効果」）におけるノルアドレナリン作動性ニューロンの活性を増強した。デプレニルは、BPAPよりも強力ではないCAE物質であるが、その他の点では、BPAPと同じ特徴を有し、特異的かつ非特異的なエンハンサー効果を発揮する（Knollら、1999、Knoll、Miklya、Knoll B、2002）。 
【０１２０】
図3は、このin vivo試験においても、二峰性、ベル型の用量効果関係がDのエンハンサー効果を特徴付けることを示している。我々は、長寿試験のために、2つの用量のデプレニル、0.001mg/kgおよび0.1mg/kgを選択した。0.001mg/kgを、特異的エンハンサー効果を発揮する至適用量として選択した。非特異的エンハンサー効果を有する用量に関して、B型MAOが適切なモノアミンを十分に酸化することを可能にするので、有効性の低い0.1mg/kg用量を寿命試験のために選択した。この図はまた、MAO-Aの阻害による非常に高用量のデプレニル（5-10mg/kg）が、テトラベナジン誘発学習障害を拮抗するのに有効であることを示している。
【０１２１】
図4は、シャトルボックスにおけるBPAPの用量関連効果を示す。長寿試験のために、我々は特異的（0.0001mg/kg）および非特異的（0.05mg/kg）エンハンサー効果を誘発する至適用量を選択した。BPAPは2 mg/kg以上の用量でMAO-Aの活性を阻害するので（Knollら、1999）、極めて高い用量範囲（2〜10mg/kg）でテトラベナジン誘発性学習障害に拮抗する。
【０１２２】
0.0001mg/kgBPAPがシャトルボックスでのテトラベナジン誘発学習障害に拮抗するという事実（図4）は、エンハンサー物質がカテコールアミン作動性の脳エンジンを活発にさせるユニークなメカニズムの主要なin vivoの証拠であることは明らかである。至適な低用量のPEAおよびデプレニル、ならびにトリプタミンおよびBPAPでは、エンハンサー感受性ニューロンの興奮性の増加が見られたため、我々は、脳内のカテコールアミン作動性およびセロトニン作動性ニューロンにおけるインパルス伝播を介した伝達物質の遊離の増強を測定した。低用量では、デプレニルは選択的CAE物質である。優位なセロトニン作動性活性エンハンサー物質であるBPAPは、Dよりもはるかに強力なエンハンサーを示すCAE物質でもある。
【０１２３】
長寿研究 
長寿研究は、ゼンメルワイス大学の飼育コロニーから提供された200匹の雄性ラットで実施された。ラットは2010年2月の終わりに生まれた。2ヶ月の馴化期間の後、ラットを無作為に5つの群に分けた。長寿試験は2010年5月初旬に開始した。動物は自然死するまで観察された。この研究のデータは、生理食塩水処置群の最後の動物が2012年10月31日に死亡したため、2012年10月31日までに観察された変化を表す。後で示すように、エンハンサー処置群の数匹のラットは、2012年11月1日時点でまだ生存していた。
【０１２４】
長寿試験の間、5匹のラットが、上部がステンレススチールのポリカーボネートケージ（高さ：18cm；幅：42cm；長さ：44cm）で飼育された。ケージの床敷きは週3回（月曜日、水曜日、金曜日）に新しいものと取り換えた。体重は毎月1回測定した。処置は2ヶ月齢の終わりに始めた。生理食塩水、(-)-デプレニルおよび(-)-BPAPをそれぞれ週3回（月曜日、水曜日、金曜日）皮下注射した。長寿試験に供した5匹のラットの処置を表３に示す。
【０１２５】
群と個体の混合を避けるために、生理食塩水処置したラットを1から40の青色で標識した； D処理したラットは1から80（1-40：0.1mg/kgで処置したラットおよび41-80：0.001mg/kgで処置したラット）に緑色で標識した。B処理したラットは、1〜80（1-40：0.05mg/kgで処置したラットおよび41-80：0.0001mg/kgで処置したラット）に黒色で標識した。
【０１２６】
【表３】
2018505852.tif 000008
【０１２７】
腫瘍の観察 
我々は、皮下腫瘍の出現を注意深く観察し、腫瘍の発達を死亡まで追跡した。組織学的解析は、例として各群の数匹のラットについて死後に行った。
【０１２８】
ラットに発生した皮下腫瘍を2つの最大直径で測定した。動物を屠殺後、腫瘍を摘出し、写真を撮った。組織を室温で24時間、10％中性ホルマリン（PBS、pH7.0）中で摘出直後に固定し、脱水し、パラフィンに包埋した。3-4マイクロメーター厚の切片を切り出し、常法としてヘマトキシリンおよびエオシン（HE）によって染色した。
【０１２９】
腫瘍は灰白色、軟性であった。時折、様々な程度の出血性および壊死性領域が検出された。組織学的には、腫瘍細胞は円形または楕円形の核および好酸球性の細胞質を有する丸くまたは細長い形状であった。時には有糸分裂像が見られた。細胞は、コラーゲン線維の領域を含む淡い部分的に好酸性、部分的に好塩基性の疎性マトリックス中に取り囲まれていた。腫瘍は皮下組織および横紋筋に浸潤していた。
【０１３０】
腫瘍の起源を証明するために、ホルマリン固定パラフィン包埋切片で免疫組織化学的反応を行った。脱パラフィンおよび再水和の後、スライドを抗ビメンチン抗体（Dako, Glostrup, Denmark, 1：1200希釈）、平滑筋抗体（SMA, Dako, 1：400希釈）、デスミン（Dako, 1：300希釈）、Ki67（Dako, 1：100希釈）でインキュベーションした。反応は、Ventana Benchmarck XT自動化免疫組織化学染色システム（Ventana Medical System Inc., Tuscon, AZ, USA）でHRP マルチマーベースのビオチンフリー検出法を用いて行った。試薬および二次抗体は、Ventana（iView DAB Detection Kit, Ventana）から得た。 
【０１３１】
免疫組織化学は、SMAおよびデスミンの反応は陰性で、ビメンチンで強く染色される間葉由来腫瘍細胞であることを証明した。Ki67は腫瘍細胞の5％で陽性であり、腫瘍細胞の増殖を示した。
最終的な組織学的診断は、皮下組織における粘液線維肉腫であった。
【０１３２】
長寿研究の成果 
デプレニルおよびBPAPが「特異的」および「非特異的」エンハンサー効果を発揮する低用量での延命効果
薬物のCAE効果の発見前に行ったデプレニルの2つの長寿研究では、脳のMAO-B活性を完全に阻害する0.25mg/kg用量のデプレニルを使用した。この研究では、シャトルボックス実験で発揮された化合物が「非特異的」および「特異的」エンハンサー効果を示す（図3参照）デプレニルのピーク用量を使用した。
【０１３３】
生理食塩水処置群の最初の動物は、9ヶ月齢で死亡し、最後の動物は、32ヶ月齢で死亡した。 
【０１３４】
図5は、0.1mg/kgのデプレニルで処置したラットの群において、最初の動物は11ヶ月齢に死亡し、2匹のラットが、32ヶ月齢の終わりまで生存していた（P>0.05）。図6は、0.001mg/kgデプレニルで処置したラットの群において、最初の動物が13ヶ月齢で死亡し、どのラットも32ヶ月齢の終わりには生存していなかった（P>0.05）ことを示す。
【０１３５】
図5および6によれば、デプレニルはラットの寿命を有意に延長しなかったが、この方向への変化は明らかである。しかし、B処理したラットは、生理食塩水で処置したラットよりも有意に長く生存していた。
【０１３６】
図7は、0.05mg/kgのBPAPで処置したラットの群では、その最初の動物が14ヶ月齢で死亡し、5匹のラットが32ヶ月齢の終わりまで生存していたことを示す（*P<0.05）。図8は、0.0001mg/kgBPAPで処置したラットの群において、最初の動物が16ヶ月齢で死亡し、1匹のラットは32ヶ月齢の終わりまで生存していた（*P<0.05）。
【０１３７】
デプレニルおよびBPAPの腫瘍発現抑制（TMS）効果 
我々の長寿研究の過程で、我々はラットの脳内で以前は知られていなかったユニークなエンハンサー感受性TMS機構が作動していることを発見した。
【０１３８】
Wistar系ラット（チャールズ・リバー）の本来の特性として、生後1年の終わり頃に、筋肉を含む皮下組織に浸潤し急速に増殖する粘液線維肉腫が出現し始め、時間の経過とともに腫瘍を発現したラットの数が増加し、最終的には、集団の約半分が粘液線維肉腫で死亡する。
【０１３９】
実施中の長寿試験では、生理食塩水処置群のラットで、腫瘍を発現した最初の動物は、11ヶ月齢で、その群の20匹のラットは、27ヶ月齢の終わりまでに腫瘍を発現した。この群の最後の2匹の動物は、32ヶ月齢で死亡した。 
【０１４０】
0.1mg/kgのデプレニルで処置したラット群では、最初の動物が16ヶ月齢で腫瘍を発現し、その群の11匹のラットが32ヶ月齢の終わりまでに腫瘍を発現した。最後の動物は32ヶ月齢で腫瘍を発現した。この群の2匹のラットはまだ生存している。図9は、0.1mg/kgのデプレニルを投与したラットの処置が粘液線維肉腫の発現を有意に抑制したことを示す（P<0.01）。
【０１４１】
デプレニル0.001mg/kgで処置したラット群では、12ヶ月齢で最初の動物が腫瘍を発現し、その群の15匹のラットが32ヶ月齢の終わりに腫瘍を発現した。最後の動物は29ヶ月齢で腫瘍を発現した。この群の最後の動物は、32ヶ月齢で死亡した。図10は、0.001mg/kgのデプレニルのTMS効果は有意ではなかったが、その傾向は否定できないことを示している。
【０１４２】
0.05mg/kgのBPAPで処置したラット群では、13ヶ月齢で最初の動物が腫瘍を発現し、その群の7匹のラットは32ヶ月齢の終わりに腫瘍を発現した。最後の動物は29ヶ月齢で腫瘍を発現した。この群の5匹のラットはまだ生存している。図11は、0.05mg/kgのBPAPで処置したラットでは粘液線維肉腫の発現を有意に抑制したことを示す（P<0.001）。
【０１４３】
0.0001mg/kgのBPAPで処置したラット群では、25ヶ月齢で最初の動物が腫瘍を発現し、その群の8匹のラットが32ヶ月齢の終わりに腫瘍を発現した。最後の動物は31ヶ月齢で腫瘍発現した。この群の1匹のラットはまだ生存している。図12は、0.0001mg/kgのBPAPで処置したラットでは粘液線維肉腫の発現を有意に抑制したことを示す（P<0.001）。
【０１４４】
腫瘍の説明
肉眼的観察
ラットの皮下の局所において、結節が出現した。粘液線維肉腫の典型的な皮下局在を説明している。
腫瘍は限局性であったが、検出可能な被膜は見られなかった。写真は、特徴的な構造を持たない灰白色の腫瘍の切断面を示している。時折、小さな出血領域と黄色の同質性の壊死領域が見られることがある。
【０１４５】
組織学 
ヘマトキシリン-エオシン（HE）染色切片では、腫瘍細胞は、多数の小血管を有する、疎性の淡い好酸性マトリックスに局在していた。腫瘍細胞は、中央性または偏心性に局在した丸みを帯びた核および淡い好酸球性の細胞質を有する細長いまたは星状の形態を有していた。時折有糸分裂像が検出された。PAS反応では、マトリックスは淡陽性反応を示し、腫瘍細胞は主に陰性であった。写真は、皮下腫瘍の典型的な組織学を示している。
【０１４６】
免疫組織化学 
免疫組織化学反応により、腫瘍細胞はビメンチンに対して強く陽性に染色された。SMA（平滑筋抗原）の抗体は血管のみを染色し、腫瘍細胞は陰性であった。抗デスミン抗体は、筋肉構成成分のみと反応し、陰性染色された腫瘍細胞が浸潤していた。
【０１４７】
H-カルデスモン反応は陰性であった。
このデータは、我々の研究で使用されたWistar系ラットでは、急速に増殖する皮下粘液線維肉腫の発現を示す割合が、時間につれて連続的に増加するという実験的証拠を提供し、この腫瘍の発現はこの系統の本来の特性であることを明らかにしているようである。
【０１４８】
実施例2  ヒト培養髄芽腫細胞株に関する実験 
細胞株 
ヒト髄芽腫細胞株、DaoyはATCCCから購入し、UW-228はSilber教授（University of Washington, Seattle, WA, USA）の好意により提供されたものである。 
【０１４９】
維持
DaoyおよびUW-228-2細胞株は、50ml FCS（Gibco）、40mgゲンタマイシン（Sandoz）、5ml ピルビン酸ナトリウム（S8636, Sigma, St Louis, USA ） 、
5ml 非必須アミノ酸溶液（M7145, Sigma, St Louis, USA）10ml L-グルタミン（Sigma, St Louis, USA）を含有した500mlのイーグル最小必須培地、α改変型（M8042, Sigma, St Louis, USA）で、37℃、で5％CO 2中で維持された。
【０１５０】
増殖アッセイ 
96ウェルプレート（Sarstedt）の各ウェルに、3x103DaoyまたはUW-228-2細胞を播種し、100μlの10％FCS含有培地を加えた。播種24時間後、さらに100μlの培地に溶解した薬物によって、細胞を72時間処理した。最初に、両細胞株を単独の(-)-BPAPおよび(-)-デプレニルで処理し、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13および10-14Mの濃度で用量-効果曲線を評価した。併用試験では、10-3、3.3×10-4、1.1×10-5および3.7×10-5Mのテモゾロミド（Schering Plough, USA）、または、0.04、0.2、1、5μMのシスプラチン（Ebewe Pharma, Austria）、または0.04、0.2、1、5μMのエトポシド（Ebewe Pharma, Austria）または10-7、10-6、10-5および10-4μMの（UW228-2）、または0.001、0.005、0.025および0.125μM（Daoy）のビンクリスチン（Richter Gedeon, Hungary）は、単独または10-13若しくは10-8 Mの(-)-BPAP若しくは(-)-デプレニルとの併用で行われた。
【０１５１】
細胞増殖は、製造者のプロトコールに記載された方法に従い、72時間処理後に、MTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイ（M5655, Sigma）によって評価した。
【０１５２】
統計 
シャトルボックスにおける群間のパフォーマンスの有意性は、多因子分散分析（ANOVA）によって評価した。ラットにおける腫瘍発現から死亡までの期間およびエンハンサー物質で慢性処置されたラットの加齢に関連した体重変化に関する有意性は、一元配置ANOVAによって解析した。生存率および腫瘍発現の統計解析は、Kaplan-Meier法によって行った。
【０１５３】
ヒト培養髄芽腫細胞株での実験結果
我々は、2種のヒト培養髄芽腫細胞株、すなわち、線維形成性小脳髄芽細胞腫由来のDaoy HTB-186細胞株（Jacobsenら、1985）および二倍体DNA量を持つ後頭蓋窩髄芽腫由来のUW-228-2細胞株（Kelesら、1985）におけるエンハンサー物質の効果を試験し、10-14〜10-6Mの9濃度範囲でデプレニルおよびBPAPの効果を調べた。適用したいずれの濃度においてもデプレニルまたはBPAPは、培養された髄芽細胞腫細胞の増殖に影響を与えなかった。さらに、BPAPおよびデプレニルは、調べられた既知の腫瘍細胞増殖阻害薬の有効性を変化させなかった（方法においては調べられた組み合わせを参照）。
【０１５４】
培養腫瘍細胞の増殖に対するエンハンサー物質が無効であったことは、エンハンサー感受性TMS調節の生理学的機能と一致した。
【０１５５】
実施例３  FVB/N系マウスの長寿試験−肺癌の自然発生の抑制
【０１５６】
マウスの寿命における(-)-デプレニルおよび(-)-BPAPの効果を調べるために、無作為に選択したマウスに、「特異的」（低い、すなわち特異的エンハンサー用量）および「非特異的」（より高い、すなわち非特異的なエンハンサー用量）エンハンサー効果を発揮する投与量で処置されたマウスを無作為に選択し剖検した；6ヶ月、1年、1,5年および2年の時点で屠殺し、無作為に選択されたマウスにおける肺癌の発現を検出した。
【０１５７】
方法
5群の性成熟したマウスを、2つの異なる用量の(-)-デプレニルおよび(-)-BPAPでそれぞれ毎日処理した。
群1：対照：生理食塩水 
群2：BPAP低用量：0.0001mg/kg(-)-BPAP 
群3：BPAP高用量：0.05mg/kg(-)-BPAP 
群4：デプレニル低用量：0.001mg/kg(-)-デプレニル
群5：デプレニル高用量：0.1mg/kg(-)-デプレニル
合計172匹のマウスを実験に供した。体重は隔月に測定した。
モニタリングのために、我々は6ヶ月、1年、1.5年および2年の時点で各群のマウスを屠殺することを計画した；残りの動物は自発死まで飼育した。
【０１５８】
結果 
長寿研究はまだ実施中である；現時点（2015年11月）まで、6ヶ月、1年、1.5年間処置したマウスの剖検が行われた。6ヶ月または1年の生理食塩水処置マウスでは肺癌は検出されなかった。しかし、1.5年間の生理食塩水処置マウスの75％において、腫瘍が検出されなかったが、腫瘍出現は、1.5年齢のエンハンサー処置マウスでは有意に低かったかまたは全く存在しなかった。
結果を表4および図19および20に示す。有意水準は、両側カイ二乗検定で算出した。
【０１５９】
【表４】
2018505852.tif 000009
【０１６０】
表4は、特異的エンハンサー用量で処置した18ヶ月齢の解剖マウスがいずれも肺癌を発現しなかったことを示している。
図14は、表4に示すように、4匹の生理食塩水処置マウスと、18ヶ月間エンハンサー物質を毎日処置した14匹のマウスとの間の有意差の計算結果を示している。
図15は、特異的なエンハンサー効果を発揮する極めて低用量の(-)-BPAPが、FVB/N系マウスにおける肺癌の発現を完全に制御することを示している。
【０１６１】
実施例４  電気刺激によりラット脳幹から遊離されたモノアミン神経伝達物質の測定（参考例） 
この測定は、EP1052259B1（WO2000026204A1に対応）の実施例2に記載されている測定法に準じ、必要な変更を加えて行うことができる。この方法は、[Knoll J, Knoll B and Miklya I Life Sci, 58, 2101-2114（1996）]に記載されている。 
【０１６２】
要約すると、ラットから脳幹（平均重量約800mg）を単離し、酸素添加をしたクレブス溶液に浸す。次に、遊離を測定するために、標識された神経伝達物質の溶液を調製物に添加し、適切な環境下で取込ませる。必要な場合には、MAO活性を阻止する。 
【０１６３】
モノアミンの取込み後、脳幹を適切なオーガンバスに固定し、取り込みを促進し、モノアミンの代謝を阻害する適切な溶液で洗浄する。
【０１６４】
灌流液の分画は定期的に実施され、モノアミンが放射性標識されている場合、画分はシンチレーション液と混合される。
【０１６５】
本発明の化合物は、エンハンサー濃度で灌流液緩衝液に溶解される。（陰性）対照として、灌流液緩衝液または化合物を含まない適切な緩衝液を使用することができる。陽性対照として、既知のエンハンサー効果を有する化合物を使用することができる。
【０１６６】
エンハンサー効果の典型的な曲線（典型的には二峰性曲線）を取る場合、可能な濃度範囲にわたる異なる濃度の溶液を調製する。
【０１６７】
電気刺激の前に十分な時間、組織を本発明の化合物を含む緩衝液で灌流する。
【０１６８】
脳幹を、矩形パルス（例えば、3Hz、1ms、60V）で、例えば3分間刺激する。実験の初めに、最初の刺激の前に数回、例えば3回のわずかな静止期間が設けた。その後、いくつかの、例えば、7回のわずかな静止期間が刺激の間に割り当てられる。
【０１６９】
本発明の化合物は、電気刺激が神経細胞に与えられたとき、エキソサイトーシスの増加によってモノアミン神経伝達物質遊離を増強することが確認されている。
【０１７０】
結果 
電気刺激された脳（例えば、脳幹）からのモノアミン神経伝達物質の遊離を引き起こす、本発明の化合物の低用量または最低用量が規定される場合、エンハンサー化合物の最小用量は、MAO阻害薬の量より低く、特に0.04または0.02μg/ml未満、またはさらにより好ましくは0.015μgまたは0.01μg/mlより高くないかまたはより低い量とする。
【０１７１】
広範囲にわたる濃度系列が適用される場合、典型的には、本発明の化合物の濃度の機能として、遊離されたモノアミン量の二峰性曲線が得られる。しかしながら、エンハンサー効果に典型的な低濃度範囲において、少なくともベル形の曲線が得られる。典型的には、この曲線の中位は、0.04または0.02μg/ml未満、またはさらにより好ましくは、0.015μgまたは0.01μg/mlより高くないかまたは低い。
【０１７２】
実施例５  脳組織から遊離された生体アミンの測定
この測定は、EP1052259B1（WO2000026204A1に対応）の実施例4に記載されている測定法に準じ、これに必要な変更を加えて行うことができる。この方法は、[Knoll J, Knoll B and Miklya I Life Sci, 58, 2101-2114（1996）]に記載されている。 
【０１７３】
Wistar系ラットなどのラットから単離した脳組織（線条体、黒質、嗅結節、青斑核および縫線核など）を体温の酸素添加したクレブス溶液に浸す。調製物をオーガンバスに浸し、適切な時間インキュベートし、必要に応じて溶液を交換する。本発明の化合物を含有するクレブス溶液中で組織を適切な時間浸した後、この期間に遊離した生体アミンを定量する。本発明の化合物を、適切な場合には、既知のエンハンサー化合物であるポジティブコントロールを生理食塩水に溶解し、ネガティブコントロールとして生理食塩水を、脳サンプルの解剖の30分前に皮下投与する。
20分間遊離した適切なアミン量は、例えばクロマトグラフィーによって測定され、nmol/g組織として示される。平均値間の差異は、例えばスチューデントt検定を使用して検定される。有意水準は例えばP<0.05に設定する。
【０１７４】
エンハンサー化合物がモノアミン神経伝達物質遊離を増加させることが予想される。特に、純粋なエンハンサー化合物は、低濃度、例えばMAO阻害薬の有効濃度よりも低い濃度、特に一日当たり0.05mg/kg若しくは0.02mg/kg未満、またはさらに好ましくは一日当たり0.015mg/kg若しくは0.01mg/kgより高くないか若しくはより低い、または一日当たり0.005mg/kg若しくは0.002mg/kg未満、またはさらにより好ましくは一日当たり0.0015mg/kg若しくは0.001mg/kgより高くないか若しくはより低い濃度においてモノアミン神経伝達物質の遊離を増加させる。
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
エンハンサー物質の適切な低い特異的エンハンサー用量の作用の特異的メカニズムは、その独自の安全性の基礎を形成する。特異的なエンハンサー効果を発揮する極めて低い用量では、機能の低いエンハンサー感受性ニューロンをより優れたものに選択的に変換する。
【０１７６】
二峰性、ベル型の濃度効果曲線はエンハンサー効果に特徴的であるため、適切なパフォーマンスのためにはエンハンサー物質の特異的なエンハンサー効果に典型的な一定の濃度範囲が必要であり、それより低い濃度およびより高い濃度は、より効果が低い。
【０１７７】
生涯予防薬は独特の薬物安全性を必要とする。今日使用されているすべての薬物は、高機能の生物の生理学的環境を厳しく変化させるため、原則として生涯にわたる日常投与には不適当である。対照的に、本発明の合成エンハンサー物質、特にそれらが特異的なエンハンサー効果を発揮する低濃度において、より機能の低いエンハンサー感受性ニューロンを、より優れた機能に変え、ニューロンの生理学的環境を変えずに、生涯の予防薬に適している。
本発明のデプレニルまたはPPAPなどのエンハンサー物質は、それらの特異的なエンハンサー効果を非常に低い用量で発揮する。典型的には、デプレニルによって例示されるように、それらはより高用量で忍容性があり、これらの化合物の安全域は独特である。本発明者らによるこれまでに知られていない機構、即ち哺乳類の脳における腫瘍発現制御（TMS）の調節の発見は、これまで知られていなかったエンハンサー感受性脳制御の例である。
【０１７８】
本発明者らは、本明細書において、合成フェニルエチルアミン類縁化合物のカテコールアミン作動性特異的エンハンサー活性に基づく腫瘍抑制機構を初めて開示する。今回の結果は、本発明のエンハンサー物質が、今日この目的のために使用されるいずれの薬剤とも質的に異なってカテコールアミン作動性ニューロンの活性を増大させることを示している。
【０１７９】
本発明は、医薬製剤、特に癌の予防および治療、特に腫瘍発現の抑制に使用するための医薬ならびにその方法に関する。
【０１８０】
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【図１】
2018505852.tif 000012
【図２】
2018505852.tif 000013
【図３】
2018505852.tif 000014
【図４】
2018505852.tif 000015
【図５】
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【図６】
2018505852.tif 000017
【図７】
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【図８】
2018505852.tif 000019
【図９】
2018505852.tif 000020
【図１０】
2018505852.tif 000021
【図１１】
2018505852.tif 000022
【図１２】
2018505852.tif 000023
【図１３】
2018505852.tif 000024
【図１４】
2018505852.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月5日(2016.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式IIで示されるニューロン活性エンハンサー化合物またはその薬学的に許容される塩であり、
その化合物は、中枢神経系のカテコールアミン作動性ニューロンにおけるインパルス伝播を介したカテコールアミン神経伝達物質の遊離を増強するカテコールアミン作動性エンハンサー化合物であり、
それを哺乳動物の脳内におけるエンハンサー感受性ニューロンを刺激してそこに特異的エンハンサー効果を奏させる特異的エンハンサー用量において、癌またはその転移の予防または治療に使用するためのものであり、
【化１】
2018505852.tif 000026
式II中、
Qは、1または2個のヘテロ原子を有していてもよい置換または非置換の芳香族6員環基からなる基であり、
Qが置換されている場合、
その置換基は水素、ヒドロキシル、C 1-4アルキル、C 1-4アルコキシおよびハロゲンからなる群から選択され、好ましくは、Qは1または2個の置換基で置換されているか非置換であり、
R1はC 1-5アルキル、好ましくはメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はC 1-4アルキル、C 2-4アルケニルまたはC 2-4アルキニルであり; 
R3は水素、メチルまたはエチル
である。
【請求項２】
請求項１に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、
その中でQが非置換の芳香族6員環基であり、好ましくはQがフェニル基であり、R1がメチル、エチルまたはプロピルであり、R2がC 2-3アルキル、C 2-3アルケニルまたはC 2-3アルキニルであり、好ましくはR2はエチニルであり、R3は水素またはメチルである。
【請求項３】
請求項１または２記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、
その中で化合物は一般式IVで示される化合物で示されるものであり、
【化２】
2018505852.tif 000027
式IV中、
Qはフェニルであり、
R1はメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はメチル、エチル、エチニルまたはプロピル、好ましくはエチルまたはエチニルであり; 
R3は水素、メチルまたはエチル
である。 
【請求項４】
請求項３に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、
その中の一般式IVにおいて、
Qはフェニルであり、
R1はメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はエチルまたはエチニルであり; 
R3は水素またはメチルである。 
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その化合物が、(R)-1-フェニル-N-プロピルペンタン-2-アミン（(-)-PPAP）である。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その化合物が、(R)-N-メチル-N-(１-フェニルプロパン-2-イル）プロパ-2-イン-1-アミン（セレギリンまたは(-)-デプレニル）である。 
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その１日投与量が0.01mg/kg未満の特異的エンハンサー用量である。
【請求項８】
請求項７に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その１日投与量が0.005mg/kg未満の特異的エンハンサー用量である。
【請求項９】
請求項８に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その１日投与量が0.0025mg/kg未満の特異的エンハンサー用量である。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、哺乳動物が性的に成熟したヒト、特に成人被験者である
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、癌が、悪性腫瘍または癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および胚細胞腫からなる群より選択される癌であり、好ましくは結合組織の癌腫または肉腫である。
【請求項１２】
請求項１１に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、悪性腫瘍が、粘液線維肉種、腺癌、結腸癌および肝転移からなる群から選択されるものである。
【請求項１３】
請求項１から１３のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、被験体に長期間、好ましくは少なくとも1、2、3、5、6、8若しくは10ヶ月間、または少なくとも1、2、3、4、5若しくは6年間、被験体に投与される。
【請求項１４】
請求項１から１４のいずれかに記載の使用のための化合物を活性化合物として含有する医薬であり、化合物が中枢神経系におけるインパルス伝播を介したカテコールアミンの遊離を増強する量で含有し、好ましくはその化合物の光学純度が80％以上である。
【請求項１５】
請求項１記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、
その化合物が、(R)-N-メチル-N-(1-フェニルプロパン-2-イル）プロパ-2-イン-1-アミン（セレギリンまたは(-)-デプレニル）であり、その１日投与量が0.01 mg/kg未満の特異的エンハンサー用量であり、その哺乳動物が性的に成熟したヒトであり、好ましくは成人被験者である。
【請求項１６】
請求項１５に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、化合物が被験体に少なくとも1、2、3、5、6、8若しくは10ヶ月間、または少なくとも1、2、3、4、5年若しくは6年間、投与される。

【手続補正書】
【提出日】平成29年1月18日(2017.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式IIで示されるニューロン活性エンハンサー化合物またはその薬学的に許容される塩であり、
その化合物は、中枢神経系のカテコールアミン作動性ニューロンにおけるインパルス伝播を介したカテコールアミン神経伝達物質の遊離を増強するカテコールアミン作動性エンハンサー化合物であり、
１日投与量が0.01mg/kgより少ない特異的エンハンサー投与量であり、
それを哺乳動物の脳内におけるエンハンサー感受性ニューロンを刺激してそこに特異的エンハンサー効果を奏させる特異的エンハンサー用量において、癌またはその転移の予防または治療に使用するためのものであり、
【化１】
2018505852.tif 000028
式II中、
Qは、1または2個のヘテロ原子を有していてもよい置換または非置換の芳香族6員環基からなる基であり、
Qが置換されている場合、
その置換基は水素、ヒドロキシル、C 1-4アルキル、C 1-4アルコキシおよびハロゲンからなる群から選択され、好ましくは、Qは1または2個の置換基で置換されているか非置換であり、
R1はC 1-5アルキル、好ましくはメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はC 1-4アルキル、C 2-4アルケニルまたはC 2-4アルキニルであり; 
R3は水素、メチルまたはエチル
である。
【請求項２】
請求項１に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、
その中でQが非置換の芳香族6員環基であり、好ましくはQがフェニル基であり、R1がメチル、エチルまたはプロピルであり、R2がC 2-3アルキル、C 2-3アルケニルまたはC 2-3アルキニルであり、好ましくはR2はエチニルであり、R3は水素またはメチルである。
【請求項３】
請求項１または２記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、
その中で化合物は一般式IVで示される化合物で示されるものであり、
【化２】
2018505852.tif 000029
式IV中、
Qはフェニルであり、
R1はメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はメチル、エチル、エチニルまたはプロピル、好ましくはエチルまたはエチニルであり; 
R3は水素、メチルまたはエチル
である。 
【請求項４】
請求項３に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、
その中の一般式IVにおいて、
Qはフェニルであり、
R1はメチル、エチルまたはプロピルであり; 
R2はエチルまたはエチニルであり; 
R3は水素またはメチルである。 
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その化合物が、(R)-1-フェニル-N-プロピルペンタン-2-アミン（(-)-PPAP）である。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その化合物が、(R)-N-メチル-N-(１-フェニルプロパン-2-イル）プロパ-2-イン-1-アミン（セレギリンまたは(-)-デプレニル）である。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その１日投与量が0.005mg/kg未満の特異的エンハンサー用量である。 
【請求項８】
請求項７に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、その１日投与量が0.0025mg/kg未満の特異的エンハンサー用量である。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、哺乳動物が性的に成熟したヒト、特に成人被験者である
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、癌が、悪性腫瘍または癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および胚細胞腫からなる群より選択される癌であり、好ましくは結合組織の癌腫または肉腫である。
【請求項１１】
請求項１０に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、悪性腫瘍が、粘液線維肉種、腺癌、結腸癌および肝転移からなる群から選択されるものである。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、被験体に長期間、好ましくは少なくとも1、2、3、5、6、8若しくは10ヶ月間、または少なくとも1、2、3、4、5若しくは6年間、被験体に投与される。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の使用のための化合物を活性化合物として含有する医薬であり、化合物が中枢神経系におけるインパルス伝播を介したカテコールアミンの遊離を増強する量で含有し、好ましくはその化合物の光学純度が80％以上である。
【請求項１４】
請求項１記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、
その化合物が、(R)-N-メチル-N-(1-フェニルプロパン-2-イル）プロパ-2-イン-1-アミン（セレギリンまたは(-)-デプレニル）であり、その哺乳動物が性的に成熟したヒトであり、好ましくは成人被験者である。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用のためのエンハンサー化合物であり、化合物が被験体に少なくとも1、2、3、5、6、8若しくは10ヶ月間、または少なくとも1、2、3、4、5年若しくは6年間、投与される。

【国際調査報告】
2018505852.tif 000030
2018505852.tif 000031