(57)【要約】  本開示は、鞘翅目害虫における標的コードおよび転写非コード配列のＲＮＡ干渉媒介阻害による鞘翅目害虫の防除のための核酸分子およびその使用の方法に関する。本開示はまた、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子を発現するトランスジェニック植物を作製する方法ならびにそれにより得られる植物細胞および植物に関する。
2018500020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む単離核酸であって、前記ポリヌクレオチドが異種プロモーターに作動可能に連結する、単離核酸。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３、配列番号４６および配列番号６７からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
【請求項４】
前記生物がＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコント；Ｄ．バルベリ（D. barberi）スミスおよびローレンス；Ｄ．ｕ．ホワルディ（D. u. howardi）；Ｄ．ｖ．ゼアエ（D. v. zeae）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマー；およびＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイムからなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドから転写されるリボ核酸（ＲＮＡ）分子。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現から産生される二本鎖リボ核酸分子。
【請求項７】
ポリヌクレオチド配列を鞘翅目害虫と接触させることが、前記ポリヌクレオチドと特異的に相補的な内因性ヌクレオチド配列の発現を阻害する、請求項６に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項８】
リボヌクレオチド分子を鞘翅目害虫と接触させることが、前記害虫を殺すまたはその成長、生殖および／もしくは摂食を阻害する、請求項７に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項９】
第１、第２および第３のＲＮＡセグメントを含み、
前記第１のＲＮＡセグメントが前記ポリヌクレオチドを含み、
前記第３のＲＮＡセグメントが、第２のポリヌクレオチド配列により前記第１のＲＮＡセグメントに連結されており、
前記第１および前記第３のＲＮＡセグメントがリボ核酸に転写されたときにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成するように、前記第３のＲＮＡセグメントが実質的に前記第１のＲＮＡセグメントの逆相補体である、請求項６に記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項１０】
長さが約１５〜約３０ヌクレオチドの二本鎖リボ核酸分子および一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項５に記載のＲＮＡ。
【請求項１１】
異種プロモーターが、植物細胞中で機能的である、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項１３】
原核細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
真核細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】
植物細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドで形質転換された植物。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の植物の種子。
【請求項１８】
検出可能な量の前記ポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の植物から生産される商品生産物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが前記植物において二本鎖リボ核酸分子として発現する、請求項１６に記載の植物。
【請求項２０】
ゼア・マイス（Zea mays）細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２１】
ゼア・マイス（Zea mays）である、請求項１６に記載の植物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが前記植物においてリボ核酸分子として発現し、鞘翅目害虫が前記植物の一部を摂取したとき、前記リボ核酸分子が、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドと特異的に相補的である内因性ポリヌクレオチドの発現を阻害する、請求項１６に記載の植物。
【請求項２３】
内因性害虫遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの追加のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記さらなるポリヌクレオチドが親ＲＮＡｉ表現型をもたらすｉＲＮＡ分子をコードする、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記さらなるポリヌクレオチドがｂｒａｈｍａまたはｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡ分子をコードする、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記さらなるポリヌクレオチドがｉＲＮＡ分子（致死性ＲＮＡｉ）と接触する鞘翅目害虫の成長および／または発育の減少ならびに／あるいは死亡をもたらすｉＲＮＡ分子をコードする、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記追加のポリヌクレオチド（複数可）がそれぞれ植物細胞中で機能し得る異種プロモーターに作動可能に連結した、請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
【請求項２８】
鞘翅目害虫集団を防除する方法であって、鞘翅目害虫内部の生物学的機能を阻害するように前記鞘翅目害虫との接触により機能するリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む作用物質を用意することを含み、ＲＮＡが配列番号７０〜配列番号７３のいずれか；配列番号７０〜配列番号７３のいずれかの相補体；配列番号７０〜配列番号７３のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７０〜配列番号７３のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、配列番号３および配列番号６７のいずれかの転写物；配列番号１、配列番号３および配列番号６７のいずれかの転写物の相補体；配列番号１、配列番号３および配列番号６７のいずれかの転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；ならびに配列番号１、配列番号３および配列番号６７のいずれかの転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能である、方法。
【請求項２９】
前記作用物質が二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
鞘翅目害虫集団を防除する方法であって、
鞘翅目害虫内部の生物学的機能を阻害するように前記鞘翅目害虫との接触により機能するリボ核酸（ＲＮＡ）分子を鞘翅目害虫に導入することを含み、ＲＮＡが
配列番号７０〜配列番号７３のいずれか、
配列番号７０〜配列番号７３のいずれかの相補体、
配列番号７０〜配列番号７３のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、
配列番号７０〜配列番号７３のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体、
配列番号１、配列番号３および配列番号６７のいずれかの転写物、
配列番号１、配列番号３および配列番号６７のいずれかの転写物の相補体、
配列番号１、配列番号３および配列番号６７のいずれかの転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、ならびに
配列番号１、配列番号３および配列番号６７のいずれかの転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能であり、それによりＲＮＡｉ表現型を有する鞘翅目害虫を発生させることを含む、方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡが雄鞘翅目害虫に導入される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡが雌鞘翅目害虫に導入され、方法が、前記ｐＲＮＡｉ表現型を有する前記雌鞘翅目害虫を前記害虫集団中に放つことをさらに含み、前記ｐＲＮＡｉ表現型を有する前記雌鞘翅目害虫と前記集団の雄害虫との交配が、前記集団の他の雌害虫と雄害虫との交配よりも少ない生存能力のある子孫をもたらす、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
鞘翅目害虫集団を防除する方法であって、
鞘翅目害虫内部の生物学的機能を阻害するように前記鞘翅目害虫との接触により機能する第１および第２のポリヌクレオチド配列を含む作用物質を用意することを含み、前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号７０の約１９個〜約３０個の連続したヌクレオチドとの約９０％〜約１００％配列同一性を示す領域を含み、前記第１のポリヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする、方法。
【請求項３４】
リボ核酸分子が二本鎖リボ核酸分子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記鞘翅目害虫集団が、形質転換植物細胞を欠いている同じ宿主植物種の宿主植物に外寄生する同じ害虫種の集団と比較して減少する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
鞘翅目害虫集団を防除する方法であって、
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換植物細胞を鞘翅目害虫の宿主植物に加えることを含み、前記ポリヌクレオチドが、発現して、鞘翅目害虫内部の標的配列の発現を阻害するように前記集団に属する前記鞘翅目害虫との接触により機能し、前記ポリヌクレオチドを含まない同じ宿主植物種の植物における同じ害虫種の生殖と比べて、前記鞘翅目害虫または害虫集団の生殖の低減をもたらすリボ核酸分子を生成する、方法。
【請求項３７】
前記リボ核酸分子が二本鎖リボ核酸分子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記鞘翅目害虫集団が、前記形質転換植物細胞を欠いている同じ種の宿主植物に外寄生する鞘翅目害虫集団と比較して減少する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
植物における鞘翅目害虫の外寄生を防除する方法であって、
配列番号７０〜配列番号７３；
配列番号７０〜配列番号７３のいずれかの相補体；
配列番号７０〜配列番号７３のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；
配列番号７０〜配列番号７３のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；
配列番号１、配列番号３、および配列番号６７の転写物；
配列番号１、配列番号３、および配列番号６７のいずれかの転写物の相補体；
配列番号１、配列番号３、および配列番号６７のいずれかの転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；ならびに
配列番号１、配列番号３、および配列番号６７のいずれかの転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体
からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能であるリボ核酸（ＲＮＡ）を鞘翅目害虫の食餌に加えることを含む、方法。
【請求項４０】
前記食餌が前記ポリヌクレオチドを発現するように形質転換された植物細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記特異的にハイブリダイズ可能なＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ分子に含まれる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
コーン作物の収量を向上する方法であって、
請求項１に記載の核酸をコーン植物に導入して、トランスジェニックコーン植物を産生することと、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を可能にするために前記コーン植物を栽培することとを含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、鞘翅目害虫生殖または成長および鞘翅目害虫感染に起因する収量の損失を阻害する、方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、前記コーン植物の一部と接触した鞘翅目害虫における少なくとも第１の標的遺伝子を抑制するＲＮＡ分子を生成する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
トランスジェニック植物細胞を産生する方法であって、
請求項１に記載の核酸を含むベクターで植物細胞を形質転換することと、
複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で前記形質転換植物細胞を培養することと、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドをそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされるリボ核酸（ＲＮＡ）分子の発現について前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
前記ＲＮＡを発現する植物細胞を選択することと
を含む、方法。
【請求項４５】
前記ＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
トランスジェニック植物に鞘翅目害虫に対する保護をもたらす方法であって、
請求項４４に記載の方法により生成するトランスジェニック植物細胞を用意することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生することとを含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされる前記リボ核酸分子の発現が、形質転換植物に接触する鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節するのに十分である、方法。
【請求項４７】
トランスジェニック植物細胞を産生する方法であって、
鞘翅目害虫から植物を保護する手段を含むベクターで植物細胞を形質転換することと、
複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で前記形質転換植物細胞を培養することと、
鞘翅目害虫から植物を保護する手段をそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、
鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害するための手段の発現について前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段を発現する植物細胞を選択することと
を含む、方法。
【請求項４８】
鞘翅目害虫保護トランスジェニック植物を産生する方法であって、
請求項４７に記載の方法により産生された前記トランスジェニック植物細胞を用意することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることとを含み、鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する前記手段の発現が、形質転換植物に接触する鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節するのに十分である、方法。
【請求項４９】
バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項５０】
Ｂ．ツリンギエンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドがＣｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１ＡおよびＣｙｔ２Ｃを含む群から選択される、請求項４９に記載の核酸。
【請求項５１】
バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項５２】
Ｂ．ツリンギエンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドがＣｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１ＡおよびＣｙｔ２Ｃを含む群から選択される、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の植物。
【請求項５４】
Ｂ．ツリンギエンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドがＣｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１ＡおよびＣｙｔ２Ｃを含む群から選択される、請求項５３に記載の植物。
【請求項５５】
前記形質転換植物細胞がバチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５６】
Ｂ．ツリンギエンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドがＣｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１ＡおよびＣｙｔ２Ｃを含む群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、「鞘翅目害虫を防除するためのｈｙｎｃｈｂａｃｋ遺伝子の親ＲＮＡｉ抑制」について２０１４年１２月１６日に出願した米国仮特許出願番号第６２／０９２，７７２号、および「半翅目害虫を防除するためのｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子の親ＲＮＡｉ抑制」について２０１５年６月２日に出願した米国仮特許出願番号第６２／１７０，０７９号の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般的に、鞘翅目害虫により引き起こされる植物被害の遺伝子防除に関する。特定の実施形態において、本開示は、植物保護効果を得るための鞘翅目害虫の細胞における標的コードおよび非コードポリヌクレオチドの同定ならびに標的コードおよび非コードポリヌクレオチドの発現を転写後に抑制または阻害するための組換えＤＮＡ技術の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ウェスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント（LeConte）は、北アメリカにおける最も破壊的なトウモロコシ根切り虫の種の１つであり、米国中西部のコーン栽培地域において特に問題となっている。ノーザンコーンルートワーム（ＮＣＲ）、ジアブロティカ・バルベリ（Diabrotica barberi）スミスおよびローレンス（Smith and Lawrence）は、ＷＣＲと同じ範囲の多くにおいてともに生息する密接に関連する種である。アメリカにおける重要な害虫であるジアブロティカ属（Diabrotica）種の次のいくつかの他の関連亜種：メキシカンコーンルートワーム（ＭＣＲ）、Ｄ．ヴィルギフェラ・ゼアエ（D. virgifera zeae）クリサンおよびスミス（Krysan and Smith）；サザンコーンルートワーム（ＳＣＲ）、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディ（D. undecimpunctata howardi）バーバー（Barbar）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ウンデシムプンクタータ・テネラ（D. undecimpunctata tenella）；Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマー；ならびにＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイム（Mannerheim）が存在する。米国農務省は、トウモロコシ根切り虫が８億ドルの収量低下および２億ドルの処理費用を含む１０億ドルの収入減をもたらしていると推定している。
【０００４】
ＷＣＲおよびＮＣＲの両方は、夏に卵として土壌中に産み付けられる。該昆虫は、冬期に卵期に留まる。卵は、楕円形で、白く、長さが０．１ミリメートル未満である。幼虫は、５月後期または６月後期に孵化し、卵孵化の正確な時期は、温度差および場所により年ごとに異なる。新たに孵化した幼虫は、長さが３．１８ミリメートル未満の白色の虫である。孵化した時点に、幼虫は、コーンの根を常食とし始める。トウモロコシ根切り虫は、３つの幼虫齢を経る。数週間の摂食の後、幼虫は、脱皮して蛹期に入る。それらは、土壌中で蛹化し、その後、７月および８月に成虫として土壌から出てくる。根切り虫の成虫は、長さが約６．３５ミリメートルである。
【０００５】
トウモロコシ根切り虫の幼虫は、コーンおよび他のいくつかの草種を食して発育を完了する。スズメノテッポウを食して生育した幼虫は、後に出現し、コーンを食して生育した幼虫と比べて成虫として小さい頭蓋サイズを有する。Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-634。ＷＣＲ成虫は、コーンのひげ、花粉および露出した穂先の穀粒を常食とする。成虫は、得られるようになるとき、好ましいひげおよび花粉に速やかに移る。ＮＣＲ成虫もコーン植物体の生殖組織を常食とする。ＷＣＲ雌、一般的に１回交配する。Branson et al. (1977) Ann. Entom. Soc. America 70(4):506-8。
【０００６】
コーンにおける根切り虫被害の大部分は、幼虫による摂食によって引き起こされる。新たに孵化した根切り虫は、最初に微細なコーン根毛を常食とし、根端に潜り込む。幼虫がさらに成長すると、一次根を常食とし、それに潜り込む。トウモロコシ根切り虫が多数である場合、幼虫による摂食により、コーンの茎の基部に至るまでの根の切り取りがしばしばもたらされる。重度の根の傷害は、水および栄養素を植物体に輸送する根の能力を妨げ、植物体の成長を低下させ、穀物の生産の減少をもたらし、それにより、全収率をしばしば大幅に減少させる。重度の根の傷害は、収穫をより困難にし、収量をさらに減少させる、コーン植物体の倒伏もしばしばもたらす。さらに、成虫によるコーンの生殖組織の常食により、穂先のひげの切り取りがもたらされ得る。この「ひげのクリッピング」が花粉飛散時に十分に高度である場合、授粉が妨げられる可能性がある。
【０００７】
トウモロコシ根切り虫の防除は、輪作、化学殺虫剤、生物農薬（例えば、胞子形成グラム陽性細菌、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis））、Ｂｔ毒素を発現するトランスジェニック植物、またはそれらの組合せにより試みることができる。輪作は、農地の使用に制限を設けるという不利な状況に見舞われる。さらに、一部の根切り虫の種の産卵は、コーン以外の作物畑で起こり、あるいは長期の休眠期は、複数年にわたる卵の孵化をもたらし、それにより、コーンおよび他の作物を用いて実施される輪作の有効性が減ずることがあり得る。
【０００８】
化学殺虫剤は、トウモロコシ根切り虫の防除を達成するための戦略に最も高度に依拠する。化学殺虫剤の使用は、不完全なトウモロコシ根切り虫防除戦略であるが、化学殺虫剤の費用が殺虫剤の使用にもかかわらず起こり得る根切り虫被害からの収量低下の費用に加えられる場合にトウモロコシ根切り虫により毎年米国で１０億ドル以上が失われ得る。幼虫の高個体数、多雨および殺虫剤（複数可）の不適切な散布はすべて、不十分なトウモロコシ根切り虫防除をもたらし得る。さらに、殺虫剤の連用は、非標的種に対するそれらの毒性による重大な環境への懸念を生じさせるだけでなく、殺虫剤抵抗性の根切り虫の系統を選び出すこととなり得る。
【０００９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子のすべて、またはその十分なサイズの任意の一部に対して特異的である干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）分子（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子）がそれによりコードされるｍＲＮＡの分解をもたらす、内因性細胞経路を利用する方法である。近年、ＲＮＡｉは、多くの種および実験系、例えば、エレガンス線虫、植物、昆虫胚および組織培養中細胞における遺伝子「ノックダウン」を実施するために用いられている。例えば、Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47参照。
【００１０】
ＲＮＡｉは、ＤＩＣＥＲタンパク質複合体を含む内因性経路を経るｍＲＮＡの分解を伴う。ＤＩＣＥＲは、長いｄｓＲＮＡ分子を低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる、約２０ヌクレオチドの短い断片に切断する。ｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の２つの一本鎖ＲＮＡに巻き戻される。パッセンジャー鎖は、分解され、ガイド鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子は、ハイブリダイズされたパッセンジャーおよびガイド鎖を連結するポリヌクレオチド「ループ」を含む前駆体分子から切断された構造的に非常に類似した分子であり、同様にＲＩＳＣに組み込まれ得る。転写後遺伝子サイレンシングは、ガイド鎖が相補的ｍＲＮＡ分子に特異的に結合し、ＲＩＳＣ複合体の触媒成分である、アルゴノートによる切断を誘導するときに起こる。この過程は、植物、線虫および一部の昆虫などの一部の真核生物においてｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの濃度が最初は限定されたものであるにもかかわらず生物体全体にわたり全身的に広がることが公知である。
【００１１】
ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡに相補的な転写物のみが切断され、分解され、したがって、ｍＲＮＡ発現のノックダウンは、配列特異的である。植物では、ＤＩＣＥＲ遺伝子のいくつかの官能基が存在する。ＲＮＡｉの遺伝子サイレンシング効果は何日間も持続し、実験条件下では、９０％以上の標的転写物の存在量の減少と、対応するタンパク質のレベルの結果としての低下につながり得る。昆虫では、少なくとも２種のＤＩＣＥＲ遺伝子が存在し、ＤＩＣＥＲ１は、アルゴノート１によるｍｉＲＮＡ誘導分解を促進する。Lee et al. (2004) Cell 117(1):69-81。ＤＩＣＥＲ２は、アルゴノート２によるｓｉＲＮＡ誘導分解を促進する。
【００１２】
米国特許第７，６１２，１９４号明細書ならびに米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書、第２０１０／０１９２２６５号明細書および第２０１１／０１５４５４５号明細書は、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコントの蛹から単離された９１１２発現配列タグ（ＥＳＴ）配列のライブラリーを開示している。米国特許第７，６１２，１９４号明細書および米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書において植物細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現のためにそこに開示されたＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）液胞型プロトンＨ＋−ＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）のいくつかの特定の部分配列の１つと相補的である核酸分子をプロモーターに作動可能に連結することが示唆されている。米国特許出願公開第２０１０／０１９２２６５号明細書は、植物細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現のために未知および非開示機能のＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）遺伝子の特定の部分配列（部分配列は、エレガンス線虫（C. elegans）におけるＣ５６Ｃ１０．３遺伝子産物と５８％同一であると述べられている）と相補的である核酸分子にプロモーターを作動可能に連結することを示唆している。米国特許出願公開第２０１１／０１５４５４５号明細書は、植物細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現のためにＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）コートマーベータサブユニット遺伝子の２つの特定の部分配列と相補的である核酸分子にプロモーターを作動可能に連結することを示唆している。さらに、米国特許第７，９４３，８１９号明細書は、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコントの幼虫、蛹および切開中腸から単離された９０６の発現配列タグ（ＥＳＴ）のライブラリーを開示し、植物細胞における二本鎖ＲＮＡの発現のためにＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）負荷（charged）多胞体タンパク質４ｂ遺伝子の特定の部分配列と相補的である核酸分子にプロモーターを作動可能に連結することを示唆している。
【００１３】
Ｖ−ＡＴＰアーゼのいくつかの特定の部分配列および未知の機能の遺伝子の特定の部分配列以外には、ＲＮＡ干渉のためにそれらに示されている９千を超える配列のいずれかの特定の配列を使用するさらなる示唆は、米国特許第７，６１２，１９４号明細書ならびに米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書、第２０１０／０１９２２６５号明細書および第２０１１／０１５４５４５号明細書に示されていない。さらに、米国特許第７，６１２，１９４号明細書ならびに米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書、第２０１０／０１９２２６５号明細書および第２０１１／０１５４５４５号明細書のいずれも、示された９千を超える配列のどのその他のものがｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合に、トウモロコシ根切り虫の種において致死性、または別の面では有用でさえあるかについての指針を記載していない。米国特許第７，９４３，８１９号明細書は、負荷多胞体タンパク質４ｂ遺伝子の特定の部分配列以外には、ＲＮＡ干渉のためにそれに示されている９千を超える配列のいずれかの特定の配列を使用する示唆を記載していない。さらに、米国特許第７，９４３，８１９号明細書は、示された９千を超える配列のどのその他のものがｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合に、トウモロコシ根切り虫の種において致死性、または別の面では有用でさえあるかについての指針を記載していない。米国特許出願公開第２０１３／０４０１７３号明細書およびＰＣＴ出願公開国際公開第２０１３／１６９９２３号パンフレットは、トウモロコシにおけるＲＮＡ干渉のためのジアブロティカ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera）Ｓｎｆ７遺伝子由来の配列の使用を記載している。（Bolognesi et al. (2012) PLos ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534にも開示されている。）
【００１４】
トウモロコシ根切り虫ＤＮＡと相補的な配列（前述のような）の圧倒的大多数は、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合にトウモロコシ根切り虫の種からの植物保護効果をもたらさない。例えば、Baum et al.(2007), Natute Biotechnology 25:1322-1326は、ＲＮＡｉによりいくつかのＷＣＲ遺伝子標的を阻害する効果を記載している。これらの著者らは、彼らが試験した２６標的遺伝子のうちの８標的遺伝子が５２０ｎｇ／ｃｍ２を超える非常に高いｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）濃度で実験的に有意な鞘翅目害虫の死亡率をもたらすことができなかったことを報告した。
【００１５】
米国特許第７，６１２，１９４号明細書および米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書の著者らは、ウェスタンコーンルートワームを標的とするコーン植物におけるｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡｉの最初の報告を行った。Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6.これらの著者らは、トランスジェニックＲＮＡｉトウモロコシを開発するための可能な標的遺伝子をスクリーニングする高処理式ｉｎ  ｖｉｖｏ食餌ＲＮＡｉシステムを記載している。２９０の標的の最初の遺伝子プールのうち、１４のみが幼虫防除能を示した。最も有効な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のうちの１つは、液胞ＡＴＰアーゼサブユニットＡ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）をコードする遺伝子を標的とし、対応する内因性ｍＲＮＡの速やかな抑制をもたらし、低濃度のｄｓＲＮＡによる特異的ＲＮＡｉ反応を誘発した。このように、これらの著者らは、可能な害虫管理ツールとしてのｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡｉの可能性を最初に記録し、さらに候補遺伝子の比較的に小さい組からでさえも有効な標的を先験的に正確に特定することができないことを同時に示した。
【００１６】
昆虫防除のためのＲＮＡｉの他の可能な適用は、親ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）を含む。エレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）について最初に記載された、ｐＲＮＡｉは、体腔内へのｄｓＲＮＡの注射（または摂取によるｄｓＲＮＡの適用）により同定され、子孫胚における遺伝子の不活性化をもたらした。Fire et al. (1998), supra；Timmons and Fire (1998) Nature 395(6705):854。同様な過程は、モデル鞘翅目であるコクヌストモドキ（Tribolium castaneum）について記載され、胚発育中の分割を制御する３つの固有の遺伝子に対応するｄｓＲＮＡを注射した雌蛹が子孫胚における接合体遺伝子のノックダウンをもたらした。Bucher et al. (2002) Curr. Biol. 12(3):R85-6。この試験における子孫幼虫のほぼすべてが注射の１週間後に遺伝子特異的表現型を示した。機能ゲノミクス研究のためのｄｓＲＮＡの注射は、様々な昆虫において成功したが、ＲＮＡｉが害虫管理ツールとして有効であるためには、ｄｓＲＮＡへの経口曝露による腸環境からのｄｓＲＮＡの取込みおよびその後の必須遺伝子の下方制御が必要である。Auer and Frederick (2009) Trends Biotechnol. 27(11):644-51。
【００１７】
親ＲＮＡｉは、トビムシ（Orchesella cincta）（Konopova and Akam (2014) Evodevo 5(1):2）；トビイロウンカ（Nilaparvata lugens）;カブラハバチ（Athalia rosae）（Yoshiyama et al. (2013) J. Insect Physiol. 59(4):400-7）；チャバネゴキブリ（Blattella germanica）（Piulachs et al. (2010) Insect Biochem. Mol. Biol. 40:468-75）；およびエンドウヒゲナガアブラムシ（Acyrthosiphon pisum）（Mao et al. (2013) Arch Insect Biochem Physiol 84(4):209-21）を含む、多くの昆虫種における胚遺伝子の機能を記述するために用いられた。これらのすべての例におけるｐＲＮＡｉ反応は、親雌の血体腔内へのｄｓＲＮＡの注射により達成された。
【発明の概要】
【００１８】
開示
本明細書に開示するのは、核酸分子（例えば、標的遺伝子、ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）、ならびに例えば、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコント（ウェスタンコーンルートワーム、「ＷＣＲ」）；Ｄ．バルベリ（D. barberi）スミスおよびローレンス（ノーザンコーンルートワーム、「ＮＣＲ」）；Ｄ．ｕ．ホワルディ（D. u. howardi）バーバー（サザンコーンルートワーム、「ＳＣＲ」）；Ｄ．ｖ．ゼアエ（D. v. zeae）クリサンおよびスミス（メキシカンコーンルートワーム、「ＭＣＲ」）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマーおよびＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイムを含む、鞘翅目害虫の防除のためのそれらの使用の方法である。特定の例において、鞘翅目害虫において１つまたは複数の天然核酸の少なくとも一部に相同的であり得る例示的な核酸分子が開示される。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫は、害虫の次世代を生む現存世代の能力を低下させることによって防除される。ある特定の例において、鞘翅目害虫への核酸分子の送達は、害虫に有意な死亡率をもたらさないが、それから生み出される生存能力のある子孫の数を減少させる。
【００１９】
これらおよびさらなる例において、天然核酸分子は、標的遺伝子であり得、その産物は、例えばかつ制限なく、代謝過程に関与し、生殖過程に関与し、および／または胚の発育および／または幼虫の発育に関与し得る。いくつかの例において、それと相同のポリヌクレオチドを含む核酸分子による標的遺伝子の発現の転写後抑制は、鞘翅目害虫の生存率、成長および／または生殖の低下をもたらし得る。特定の例において、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子を転写後サイレンシングの標的遺伝子として選択する。特定の例において、転写後抑制に有用な標的遺伝子は、本明細書でジアブロティカ属（Diabrotica）ｈｕｎｃｈｂａｃｋ（配列番号１）と呼ぶ新規遺伝子である。したがって、配列番号１；配列番号１の相補体；および／または上述（例えば、配列番号３および配列番号６７）のいずれかの断片のポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を本明細書で開示する。
【００２０】
標的遺伝子産物（例えば、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子の産物）内のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子も開示する。例えば、核酸分子は、配列番号２（ジアブロティカ属（Diabrotica）ＨＵＮＣＨＢＡＣＫ）および／またはジアブロティカ属（Diabrotica）ｈｕｎｃｈｂａｃｋの産物内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。標的遺伝子産物内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの逆相補体であるポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに開示する。
【００２１】
さらに、鞘翅目害虫標的遺伝子、例えば、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子のすべてまたは一部と相補的であるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子の産生に用いることができるｃＤＮＡポリヌクレオチドを開示する。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡは、植物または細菌等の遺伝子操作生物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで産生され得る。特定の例において、ジアブロティカ属（Diabrotica）ｈｕｎｃｈｂａｃｋ（配列番号１）から転写されたｍＲＮＡのすべてまたは一部と相補的であるｉＲＮＡ分子を生成するのに用いることができるｃＤＮＡ分子を開示する。
【００２２】
鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段および鞘翅目害虫から植物を保護する手段をさらに開示する。鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段は、配列番号７０、配列番号７１、および配列番号７２からなる群から選択されるポリヌクレオチドならびにその相補体からなる一本または二本鎖ＲＮＡ分子である。鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段の機能的等価体は、配列番号１を含むＷＣＲ遺伝子から転写されたｍＲＮＡのすべてまたは一部と実質的に相同である一本もしくは二本鎖ＲＮＡ分子を含む。鞘翅目害虫から植物を保護する手段は、プロモーターに作動可能に連結した鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子であり、該ＤＮＡ分子は、コーン植物のゲノムに組み込まれることができる。
【００２３】
害虫内部の生物学的機能を阻害するように害虫により取り込まれるときに機能するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を鞘翅目害虫に与えることを含む、鞘翅目害虫の集団を防除する方法を開示する。ここで、ｉＲＮＡ分子は、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号３；配列番号３の相補体；配列番号６７；配列番号６７の相補体；配列番号１、配列番号３、および／または配列番号６７のすべてまたは一部を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１、配列番号３、および／または配列番号６７のすべてまたは一部を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの相補体；配列番号１、配列番号３、および／または配列番号６７のすべてまたは一部を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コードポリヌクレオチド；ならびに配列番号１、配列番号３、および／または配列番号６７のすべてまたは一部を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コードポリヌクレオチドの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドのすべてまたは一部（例えば、その少なくとも１５個の連続したヌクレオチド）を含む。
【００２４】
特定の例において、害虫内部の生物学的機能を阻害するように害虫により取り込まれるときに機能するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）分子を鞘翅目害虫に与えることを含む、鞘翅目害虫の集団を防除する方法が開示される。ここで、ｉＲＮＡ分子は、配列番号７０のすべてまたは一部；配列番号７０のすべてまたは一部の相補体；配列番号７１；配列番号７１の相補体；配列番号７３；および配列番号７３の相補体；配列番号１、配列番号３、および／または配列番号６７のいずれかのすべてまたは一部を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コードポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；ならびに配列番号１、配列番号３、および／または配列番号６７のすべてまたは一部を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コードポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む。
【００２５】
また、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｈｐＲＮＡを、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを発現する食餌ベースのアッセイまたは複数の遺伝子組換え植物細胞における鞘翅目害虫に与えることができる方法も本明細書で開示する。これらおよびさらなる例において、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡは、鞘翅目害虫により摂取させることができる。続いて、本発明のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡの摂取は、害虫におけるＲＮＡｉをもたらし得る。これがひいては代謝過程、生殖過程および／または幼虫の発育に必須の遺伝子のサイレンシングをもたらし得る。したがって、鞘翅目害虫の親防除に有用な例示的ポリヌクレオチド（複数可）を含む核酸分子を鞘翅目害虫に与える、方法を開示する。特定の例において、本発明の核酸分子の使用により防除される鞘翅目害虫は、ＷＣＲ、ＮＣＲ、またはＳＣＲであり得る。いくつかの例において、鞘翅目害虫への核酸分子の送達は、害虫に有意な死亡率をもたらさないが、それから生み出される生存能力のある子孫の数を減少させる。いくつかの例において、鞘翅目害虫への核酸分子の送達は、害虫に有意な死亡率をもたらし、それから生み出される生存能力のある子孫の数も減少させる。
【００２６】
前述および他の特徴は、添付図面に準拠して進められる、いくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】単一対のプライマーを含む単一の転写鋳型から（図１Ａ）および２つの転写鋳型から（図１Ｂ）ｄｓＲＮＡを生成するために用いた戦略の描写を含む図である。
【図２】キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）、およびジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ＨＵＮＣＨＢＡＣＫタンパク質配列のドメイン機構の描写を含む図である。キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）、コクヌストモドキ（T. castaneum）、およびＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ＨＵＮＣＨＢＡＣＫタンパク質は、ＳＭＡＲＴデータベースを用いてアノテートされた６つのＣ２Ｈ２型ジンクフィンガーを含有する。
【図３】ＷＣＲ卵産生および生存に対する特定のｄｓＲＮＡの効果を示すデータの概要を含む図である。成体ＷＣＲ雌１匹当たりの産卵した卵の数（図３Ａ）、および孵化した卵の百分率（図３Ｂ）が描写される。データは、平均値＋／−ＳＥＭである。同じ英字を有するバーは、有意に異ならない（Ｐ＞０．０５、Ｎ＝６）。
【図４−１】異なる実験条件下での胚の発育を検討するために切断したＷＣＲ卵の代表的な写真を含む図である。ＧＦＰ  ｄｓＲＮＡ（図４Ａ）で処理した雌により産卵された卵は、正常な発育を示している。ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡ（図４Ａ〜図４Ｂ）で処理した雌により産卵された卵は、不完全な胚の発育および奇形幼虫を示す。
【図４−２】異なる実験条件下での胚の発育を検討するために切断したＷＣＲ卵の代表的な写真を含む図である。ＧＦＰ  ｄｓＲＮＡ（図４Ａ）で処理した雌により産卵された卵は、正常な発育を示している。ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡ（図４Ａ〜図４Ｂ）で処理した雌により産卵された卵は、不完全な胚の発育および奇形幼虫を示す。
【図５−１】ＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露したＷＣＲ雌から採取した卵におけるｈｕｎｃｈｂａｃｋの相対的な発現を示すデータの要約を含む図である（図５Ａ）。また、ＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露した成体雌における（図５Ｂ）、ＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露した幼虫における（図５Ｃ）、ならびにＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露した成体雄における（図５Ｄ）ｈｕｎｃｈｂａｎｃｋの相対的な発現も示す。同じ英字が続くバーは、有意に異なっていない（Ｐ＞０．０５、Ｎ＝  １０個の卵または幼虫の３回の生物学的複製／２回の技術的複製を用いた複製／試料）。
【図５−２】ＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露したＷＣＲ雌から採取した卵におけるｈｕｎｃｈｂａｃｋの相対的な発現を示すデータの要約を含む図である（図５Ａ）。また、ＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露した成体雌における（図５Ｂ）、ＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露した幼虫における（図５Ｃ）、ならびにＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露した成体雄における（図５Ｄ）ｈｕｎｃｈｂａｎｃｋの相対的な発現も示す。同じ英字が続くバーは、有意に異なっていない（Ｐ＞０．０５、Ｎ＝  １０個の卵または幼虫の３回の生物学的複製／２回の技術的複製を用いた複製／試料）。
【図５−３】ＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露したＷＣＲ雌から採取した卵におけるｈｕｎｃｈｂａｃｋの相対的な発現を示すデータの要約を含む図である（図５Ａ）。また、ＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露した成体雌における（図５Ｂ）、ＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露した幼虫における（図５Ｃ）、ならびにＧＦＰおよび水対照と比較した、処理人工食餌中のｄｓＲＮＡに曝露した成体雄における（図５Ｄ）ｈｕｎｃｈｂａｎｃｋの相対的な発現も示す。同じ英字が続くバーは、有意に異なっていない（Ｐ＞０．０５、Ｎ＝  １０個の卵または幼虫の３回の生物学的複製／２回の技術的複製を用いた複製／試料）。
【図６】非リフュージ植物が、殺虫タンパク質および親活性ｉＲＮＡを発現する場合の殺虫タンパク質（Ｒ）およびＲＮＡｉ（Ｙ）に対して抵抗性の対立遺伝子頻度の増加の割合に対する「リフュージパッチ」（すなわち、トランスジェニック作物において殺虫性ｉＲＮＡまたは組換えタンパク質を発現しなかった）から出現した雌ＷＣＲ成体におけるｐＲＮＡｉ効果の相対的な規模の効果を示すモデリングデータの要約を含む図である。
【図７】非リフュージ植物が、殺虫タンパク質ならびに幼虫活性および親活性ｉＲＮＡ分子の両方を発現する場合の殺虫タンパク質（Ｒ）およびＲＮＡｉ（Ｙ）に対して抵抗性の対立遺伝子頻度の増加の割合に対する「リフュージパッチ」（すなわち、コーンルートワーム幼虫活性干渉ｄｓＲＮＡをトランスジェニック作物におけるコーンルートワーム活性殺虫タンパク質と共に含む植物のトランスジェニック作物において殺虫性ｉＲＮＡまたは組換えタンパク質を発現しなかった）から出現した雌ＷＣＲ成体におけるｐＲＮＡｉ効果の相対的な規模の効果を示すモデリングデータの要約を含む図である。
【図８】図８Ａは、交配前に６回の、交配直後に６回のおよび交配の６日後に６回の０．６７μｇ／μｌのｈｕｎｃｈｂａｃｋまたはＧＦＰへの曝露の後の雌１匹当たりの回収された卵の数を示すデータの要約を示すグラフであり、図８Ｂは、交配前に６回の、交配直後に６回のおよび交配の６日後に６回の０．６７μｇ／μｌのｈｕｎｃｈｂａｃｋまたはＧＦＰへの曝露の後の孵化した全幼虫の百分率の結果を示すグラフである。比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定により実施し、＊は、ｐ＜０．１での有意性を示し、＊＊は、ｐ＜０．０５での有意性を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１での有意性を示す。
【図９】交配前に６回の、交配直後に６回のおよび交配の６日後に６回の０．６７μｇ／μｌのｈｕｎｃｈｂａｃｋまたはＧＦＰへの曝露の後に測定した相対的ｈｕｎｃｈｂａｃｋ発現を示すデータの要約を示すグラフである。比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定により実施し、＊＊は、ｐ＜０．０５での有意性を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１での有意性を示す。
【図１０−１】Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）におけるｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡを用いたｐＲＮＡｉ応答に対する曝露効果の持続期間の図である。雌は、ｄｓＲＮＡで処理した食餌を与え、Ｔは、雌がｄｓＲＮＡ（０．６７μｇ／ｌ）を受けた回数を示し、食餌は、一日おきに１２日間供給した。図１０Ａ．産卵：ｄｓＲＮＡを与えた雌から採取した卵、最後の給餌曝露後に採取した卵。図１０Ｂ．孵化の百分率：図１０Ａから産卵された数に基づく卵の孵化。図１０Ｃ．曝露の持続期間での相対的なｈｕｎｃｈｂａｃｋ転写物発現。比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定により実施し、＊＊は、ｐ＜０．０５での有意性を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１での有意性を示す。
【図１０−２】Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）におけるｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡを用いたｐＲＮＡｉ応答に対する曝露効果の持続期間の図である。雌は、ｄｓＲＮＡで処理した食餌を与え、Ｔは、雌がｄｓＲＮＡ（０．６７μｇ／ｌ）を受けた回数を示し、食餌は、一日おきに１２日間供給した。図１０Ａ．産卵：ｄｓＲＮＡを与えた雌から採取した卵、最後の給餌曝露後に採取した卵。図１０Ｂ．孵化の百分率：図１０Ａから産卵された数に基づく卵の孵化。図１０Ｃ．曝露の持続期間での相対的なｈｕｎｃｈｂａｃｋ転写物発現。比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定により実施し、＊＊は、ｐ＜０．０５での有意性を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１での有意性を示す。
【図１１】濃度応答に関するＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）雌における相対的なｈｕｎｃｈｂａｃｋ転写物を示す図である。比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定により実施し、＊＊は、ｐ＜０．０５での有意性を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１での有意性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
配列一覧表
添付の配列一覧表に特定した核酸配列を３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に規定の通りにヌクレオチド塩基の標準的文字略記を用いて示す。列挙した核酸およびアミノ酸配列は、記述されたように配列したヌクレオチドおよびアミノ酸モノマーを有する分子（すなわち、それぞれポリヌクレオチドおよびポリペプチド）を定義する。列挙した核酸およびアミノ酸配列は、記述されたように配列したヌクレオチドおよびアミノ酸モノマーを含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドの属もそれぞれ定義する。遺伝コードの重複性を考慮すると、コード配列を含むヌクレオチド配列も、参照配列からなるポリヌクレオチドと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの属を記述することが理解される。アミノ酸配列は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドＯＲＦの属を記述することがさらに理解される。
【００２９】
各核酸配列の１つの鎖のみを示すが、相補鎖は、表示鎖の記載により含められるものと理解される。一次核酸配列の相補体および逆相補体は、一次配列によって必然的に開示されるので、核酸配列の相補的配列および逆相補的配列は、他の状態であることが明確に述べられていない限り（または配列が出現する文脈から他の状態であることが明らかでない限り）、該核酸配列の任意の参照により含められる。さらに、ＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列は、それが転写されたＤＮＡの配列によって決定される（チミン（Ｔ）に対するウラシル（Ｕ）核酸塩基の置換を別にすれば）ことは、当技術分野で理解されているので、ＲＮＡ配列は、それをコードするＤＮＡ配列への参照により含められる。添付の配列一覧表において、
配列番号１は、例示的なジアブロティカ属（Diabrotica）ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ＤＮＡを含むコンティグを示す：
【００３０】
【化１】
2018500020.tif 000003
【００３１】
配列番号２は、例示的なジアブロティカ属（Diabrotica）ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ＤＮＡによりコードされるジアブロティカ属（Diabrotica）ＨＵＮＣＨＢＡＣＫポリペプチドのアミノ酸配列を示す：
【００３２】
【化２】
2018500020.tif 000004
【００３３】
配列番号３は、ｄｓＲＮＡの産生に関していくつかの例において用いられる、本明細書でいくつかの箇所においてｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１と呼ぶ、例示的なジアブロティカ属（Diabrotica）ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ＤＮＡを示す：
【００３４】
【化３】
2018500020.tif 000005
【００３５】
配列番号４は、Ｔ７ファージプロモーターのヌクレオチド配列を示す。
【００３６】
配列番号５〜配列番号８は、ジアブロティカ属（Diabrotica）ｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子またはＧＦＰ遺伝子の遺伝子領域を増幅するために用いたプライマー（すべてのプライマーに関してＴ７プロモーターＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧを含む）を示す。
【００３７】
配列番号９は、ＧＦＰ遺伝子を示す。
【００３８】
配列番号１０は、例示的なＹＦＰ遺伝子を示す。
【００３９】
配列番号１１は、Ａｎｎｅｘｉｎ領域１のＤＮＡ配列を示す。
【００４０】
配列番号１２は、Ａｎｎｅｘｉｎ領域２のＤＮＡ配列を示す。
【００４１】
配列番号１３は、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ２領域１のＤＮＡ配列を示す。
【００４２】
配列番号１４は、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ２領域２のＤＮＡ配列を示す。
【００４３】
配列番号１５は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域１のＤＮＡ配列を示す。
【００４４】
配列番号１６は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域２のＤＮＡ配列を示す。
【００４５】
配列番号１７〜配列番号４４は、ｄｓＲＮＡ合成のためにＡｎｎｅｘｉｎ、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ２、ｍｔＲＰ−Ｌ４、およびＹＦＰの遺伝子領域を増幅するために用いたプライマーを示す。
【００４６】
配列番号４５は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む例示的なＤＮＡを示す。
【００４７】
配列番号４６は、ジアブロティカ属（Diabrotica）ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｖ１ヘアピン形成ＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡを示し、以下のセンスポリヌクレオチド、イントロンを含むループポリヌクレオチド（下線付き）、およびアンチセンスポリヌクレオチド（太字フォント）を含む：
【００４８】
【化４】
2018500020.tif 000006
【００４９】
配列番号４７は、Ｔ２０ＶＮプライマーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【００５０】
配列番号４８〜配列番号５２は、ｄｓＲＮＡ転写物発現解析に用いたプライマーおよびプローブを示す。
【００５１】
配列番号５３は、バイナリーベクター主鎖検出のために用いたＳｐｅｃＲコード領域の一部のヌクレオチド配列を示す。
【００５２】
配列番号５４は、ゲノムコピー数解析に用いたＡＡＤ１コード領域のヌクレオチド配列を示す。
【００５３】
配列番号５５〜配列番号６６は、遺伝子コピー数の決定およびバイナリーベクター主鎖検出のために用いたＤＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【００５４】
配列番号６７は、ｄｓＲＮＡの産生に関していくつかの例において用いた例示的なジアブロティカ属（Diabrotica）ｈｕｎｃｈｂａｃｋ（ｖ１）ＤＮＡを示す：
【００５５】
【化５】
2018500020.tif 000007
【００５６】
配列番号６８および配列番号６９は、ｄｓＲＮＡの産生に関していくつかの例において用いたｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｖ１配列のＰＣＲ増幅に用いたプライマーを示す。
【００５７】
配列番号７０〜配列番号７３は、例示的なｈｕｎｃｈｂａｃｋポリヌクレオチドおよびその断片を含む核酸から転写された例示的なＲＮＡを示す。
【００５８】
発明を実施するための態様（複数可）
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
本発明者らは、ｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニック植物に対する最も可能性が高い標的害虫種の１つであるウェスタンコーンルートワームを用いて、害虫管理のためのツールとしてのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を開発した。これまでのところ、ルートワーム幼虫におけるＲＮＡｉの標的として提案されたほとんどの遺伝子は、それらの目的を実際に達成しておらず、特定されてた有用な標的は、幼虫段階における致死性をもたらすものを含む。本明細書では、本発明者らは、例えば、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡを成体雌に与えることによりｉＲＮＡ分子を送達した場合に、胚の発育を妨げることが示されている、ウェスタンコーンルートワームにおけるｈｕｎｃｈｂａｃｋ（ｈｂ）のＲＮＡｉ媒介ノックダウンについて述べる。ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡへの成体雌昆虫の曝露は、経口投与されるときに成体の長寿に影響を及ぼさなかった。しかし、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡに曝露した雌から採取した卵の孵化は、ほぼ完全になかった。本明細書の実施形態では、成体昆虫への給餌によりｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡを送達する能力は、昆虫害虫（例えば、鞘翅目）の管理に非常に有用であるｐＲＮＡｉ効果をもたらすものである。さらに、幼体および成体ルートワームの両方における複数の標的配列に作用を及ぼす可能性は、ＲＮＡｉ技術を含む害虫管理への持続可能なアプローチを開発する機会を増大させ得るものである。
【００５９】
本明細書で開示するのは、鞘翅目害虫の外寄生の遺伝的防除のための方法および組成物である。鞘翅目害虫集団のＲＮＡｉ媒介防除のための標的遺伝子として用いる鞘翅目害虫の生活環に必須の１つまたは複数の遺伝子（複数可）（例えば、正常な生殖能力ならびに／あるいは胚および／または幼虫の発育に必須の遺伝子（複数可））を特定する方法も提供する。ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡプラスミドベクターは、成長、生存、発育および／または生殖に必須の１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）を抑制するように設計することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子を形成することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫における標的遺伝子のコードまたは非コード配列と相補的である核酸分子による標的遺伝子の発現の転写後抑制または阻害の方法を提供する。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫は、標的遺伝子のコードまたは非コード配列と相補的である核酸分子のすべてまたは一部から転写される１つまたは複数のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子を摂取し、それにより植物保護効果をもたらし得る。
【００６０】
いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫の少なくとも部分的な防除を達成するために標的遺伝子（複数可）のコードおよび／または非コード配列と相補的であるｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを用いる、標的遺伝子産物の発現の配列特異的阻害を含む。例えば、配列番号１およびそれらの断片に示す、ポリヌクレオチドを含む一組の単離および精製核酸分子を開示する。いくつかの実施形態では、安定化ｄｓＲＮＡ分子は、標的遺伝子の転写後サイレンシングまたは阻害のために、これらのポリヌクレオチド、その断片、またはこれらのポリヌクレオチドの１つを含む遺伝子から発現させることができる。特定の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号１、配列番号３、および配列番号６７のいずれかのすべてまたは一部を含む。
【００６１】
他の実施形態は、少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子（複数可）をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡをそのゲノムに有する組換え宿主細胞（例えば、植物細胞）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子（複数可）は、害虫または害虫の子孫における標的遺伝子の発現を転写後に検出されなくするまたは阻害するために鞘翅目害虫により摂取されたときに生成され得る。組換えＤＮＡは、例えば、配列番号１、配列番号３、および配列番号６７のいずれか；配列番号１、配列番号３、および配列番号６７のいずれかの断片；ならびに配列番号１、配列番号３、および配列番号６７のうちの１つを含む遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチド、および／またはその相補体を含み得る
【００６２】
いくつかの実施形態は、配列番号７０のすべてまたは一部を含む少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子（複数可）をコードする組換えＤＮＡ（例えば、配列番号７０〜配列番号７３からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド）を、そのゲノムに有する組換え宿主細胞を含む。鞘翅目害虫により摂取される場合、ｉＲＮＡ分子（複数可）は、害虫または害虫の子孫における標的ｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子（例えば、配列番号１、配列番号３、および配列番号６７からなる群から選択されるポリヌクレオチドのすべてまたは一部を含むＤＮＡ）の発現を停止または阻害し得、それにより、害虫の生殖、ならびに／または害虫の子孫における成長、発育、および／もしくは摂食の停止をもたらし得る。
【００６３】
他の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができる少なくとも１つのＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡをそのゲノムに有する組換え宿主細胞は、形質転換植物細胞であり得る。いくつかの実施形態は、そのような形質転換植物細胞を含むトランスジェニック植物を含む。そのようなトランスジェニック植物に加えて、トランスジェニック植物世代の子孫植物、トランスジェニック種子およびトランスジェニック植物産物をすべて提供し、それらのそれぞれが組換えＤＮＡ（複数可）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子は、トランスジェニック植物細胞において発現させることができる。したがって、これらおよび他の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、トランスジェニック植物細胞から単離することができる。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、コーン（ゼア・マイス（Zea mays））、ダイズ（グリシン・マクス（Glycine max））、綿およびイネ科（Poaceae）の植物からなる群から選択される植物である。
【００６４】
いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を含む。これらおよび他の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子を提供することができる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結することができ、転写終結配列にも作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、鞘翅目害虫細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法は、（ａ）ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより植物細胞に形質転換を起こさせることと、（ｂ）複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で形質転換植物細胞を培養することと、（ｃ）ベクターをそのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、（ｄ）選択された形質転換植物細胞がベクターのポリヌクレオチドによりコードされたｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子を含むことを判定することとを含み得る。植物は、そのゲノムに組み込まれたベクターを有し、ベクターのポリヌクレオチドによりコードされたｄｓＲＮＡ分子を含む植物細胞から再生させることができる。
【００６５】
そのゲノムに組み込まれたｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのポリヌクレオチドによりコードされたｄｓＲＮＡ分子を含むトランスジェニック植物も開示する。特定の実施形態では、植物におけるｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子の発現は、害虫の生殖が抑制されるように、形質転換植物もしくは植物細胞と接触する（例えば、形質転換植物、植物の一部（例えば、根）もしくは植物細胞を常食とすることにより）鞘翅目害虫の細胞中または形質転換植物もしくは植物細胞と接触する（例えば、親からの伝達により）鞘翅目害虫の子孫の細胞中の標的遺伝子の発現を調節するのに十分である。本明細書で開示するトランスジェニック植物は、鞘翅目害虫の外寄生に対する耐性および／またはそれらからの保護を示し得る。個々のトランスジェニック植物は、ＷＣＲ；ＮＣＲ；ＳＣＲ；ＭＣＲ；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマー；およびＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイムからなる群から選択される１つまたは複数の鞘翅目害虫（複数可）からの保護および／または保護の向上を示し得る。
【００６６】
鞘翅目害虫へのｉＲＮＡ分子等の防除剤の送達の方法を本明細書にさらに開示する。そのような防除剤は、宿主において摂食する、成長する、または別の方法で被害を引き起こす鞘翅目害虫集団の能力の低下を直接的または間接的にもたらし得る。いくつかの実施形態では、害虫またはその子孫における少なくとも１つの標的遺伝子を抑制し、それにより、親ＲＮＡｉをもたらし、害虫宿主における植物被害を低減または撲滅するための鞘翅目害虫への安定化ｄｓＲＮＡ分子の送達を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現を阻害する方法は、害虫における生殖、ならびに／または害虫の子孫における成長、発育、および／または摂食の停止をもたらし得る。いくつかの実施形態では、上記方法は、ｉＲＮＡ分子に接触する害虫（複数可）において直接死亡をもたらすことなく、外寄生における続く害虫世代の大きさを著しく低減し得る。いくつかの実施形態では、該方法は、ｉＲＮＡ分子に接触する害虫（複数可）の死亡を直接的にもたらさずに、外寄生に際しての害虫の次世代の構成数を著しく減少させ得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の外寄生の排除または低減を達成するために植物、動物および／または植物もしくは動物の環境に用いるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子を含む組成物（例えば、局所組成物）を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含む原核生物、例えば形質転換細菌細胞を含む組成物を提供する。特定の例において、そのような形質転換細菌細胞は、従来の農薬製剤として利用することができる。特定の実施形態では、組成物は、鞘翅目害虫に食させる栄養組成物または供給源または食物源であり得る。いくつかの実施形態は、害虫が利用できる栄養組成物または食物源を作ることを含む。ｉＲＮＡ分子を含む組成物の摂取は、鞘翅目害虫の１つまたは複数の細胞による該分子の取込みをもたらし得、これがひいては害虫またはその子孫の細胞（複数可）における少なくとも１つの標的遺伝子の発現の阻害をもたらし得る。鞘翅目害虫の外寄生による植物または植物細胞の摂取または被害は、害虫の宿主にｉＲＮＡ分子を含む１つまたは複数の組成物を供給することにより、害虫が存在する宿主組織または環境中またはその上において制限または排除することができる。
【００６８】
本明細書で開示する組成物および方法は、鞘翅目害虫による被害を防除するための他の方法および組成物と組み合わせて一緒に用いることができる。例えば、鞘翅目害虫から植物を保護するための本明細書で述べたｉＲＮＡ分子は、鞘翅目害虫に対して有効な１つまたは複数の化学物質、鞘翅目害虫に対して有効なバイオ農薬、輪作、ＲＮＡｉ媒介性の方法およびＲＮＡｉ組成物の特徴と異なる特徴を示す遺伝子組換え技術（例えば、鞘翅目害虫に有害である植物におけるタンパク質（例えば、Ｂｔ毒素）の組換え産生）、ならびに／または非親ｉＲＮＡ分子（例えば、ｉＲＮＡ分子を摂取する鞘翅目害虫における成長、発育、および／または摂食の停止をもたらす致死性ｉＲＮＡ分子）の組換え発現のさらなる使用を含む方法に用いることができる。
【００６９】
ＩＩ．略語
ｄｓＲＮＡ  二本鎖リボ核酸
ＧＩ        成長阻害
ＧＦＰ  緑色蛍光タンパク質
ＮＣＢＩ    米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）
ｇＤＮＡ  ゲノムデオキシリボ核酸
ｉＲＮＡ    阻害リボ核酸
ＯＲＦ      オープンリーディングフレーム
ＲＮＡｉ    リボ核酸干渉
ｍｉＲＮＡ  マイクロリボ核酸
ｓｉＲＮＡ  低分子阻害リボ核酸
ｈｐＲＮＡ  ヘアピンリボ核酸
ｓｈＲＮＡ  短ヘアピン型リボ核酸
ｐＲＮＡｉ  親ＲＮＡ干渉
ＵＴＲ      非翻訳領域
ＷＣＲ      ウェスタンコーンルートワーム（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）
ＮＣＲ      ノーザンコーンルートワーム（ジアブロティカ・バルベリ（Diabrotica barberi）スミスおよびローレンス）
ＭＣＲ      メキシカンコーンルートワーム（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Diabrotica virgifera zeae）クリサンおよびスミス）
ＰＣＲ      ポリメラーゼ連鎖反応
ｑＰＣＲ      定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＩＳＣ    ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体
ＲＨ  相対湿度
ＳＣＲ      サザンコーンルートワーム（ジアブロティカ・ウンデシムプンクタータ・ホワルディ（Diabrotica undecimpunctata howardi）バーバー）
ＳＥＭ        平均値の標準誤差
ｓｎＲＮＡ  核内低分子リボ核酸
ＹＥＰ        黄色蛍光タンパク質
【００７０】
ＩＩＩ．用語
続く説明および表において、多くの用語が用いられている。そのような用語に与えるべき範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確で、一貫した理解を可能にするために、以下の定義を記載する。
【００７１】
鞘翅目害虫：  本明細書で用いているように、「鞘翅目害虫」という用語は、コーンおよび他のイネ科植物を含む、農作物および農産物を常食とする、ジアブロティカ属（Diabrotica）の害虫を含む、鞘翅目（Coleoptera）の昆虫を意味する。特定の例において、鞘翅目害虫は、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコント（ＷＣＲ）；Ｄ．バルベリ（D. barberi）スミスおよびローレンス（ＮＣＲ）；Ｄ．ｕ．ホワルディ（D. u. howardi）（ＳＣＲ）；Ｄ．ｖ．ゼアエ（D. v. zeae）（ＭＣＲ）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D.u. tenella）；Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマー；ならびにＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイムを含むリストから選択される。
【００７２】
（生物との）接触：  本明細書で用いているように、核酸分子に関する、生物（例えば、鞘翅目害虫）「との接触」または「による取込み」という用語は、生物体内への核酸分子のインターナリゼーション、例えば、かつ制限なく、生物による分子の摂取（摂食による）；生物を核酸分子を含む組成物と接触させること；核酸分子を含む溶液による生物を漬けることを含む。
【００７３】
コンティグ：  本明細書で用いているように、「コンティグ」という用語は、単一遺伝源に由来する一組の重複ＤＮＡセグメントから再構築されているＤＮＡ配列を意味する。
【００７４】
コーン植物体：  本明細書で用いているように、「コーン植物体」という用語は、ゼア・マイス種（Zae mays）（トウモロコシ）の植物を意味する。「コーン植物」および「トウモロコシ」という用語は、本明細書で同義で用いる。
【００７５】
発現：  本明細書で用いているように、コードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子または導入遺伝子）の「発現」は、しばしばタンパク質の合成を含む、核酸転写単位のコード化情報（例えば、ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡ）が細胞の作動、非作動または構造部分に変換されるプロセスを意味する。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加または減少させる作用因子への細胞、組織または生物体の曝露による影響を受け得る。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡを経てタンパク質までの経路のどこかで調節することもできる。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡ等の中間分子の分解に作用するコントロールにより、またはそれらが行われた後に特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、画分化、もしくは分解により、またはそれらの組合せにより起こる。遺伝子発現は、制限なく、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕもしくはｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む、当技術分野で公知のいずれかの方法によりＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。
【００７６】
遺伝物質：  本明細書で用いているように、「遺伝物質」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の、すべての遺伝子および核酸分子を含む。
【００７７】
阻害：  本明細書で用いているように、「阻害」という用語は、コードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）に対する効果を記述するために用いる場合、コードポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡおよび／またはコードポリヌクレオチドのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質産物の細胞レベルの測定可能な低下を意味する。いくつかの例において、コードポリヌクレオチドの発現は、発現がほぼ無くなるように阻害することができる。「特異的阻害」は、特異的阻害が達成される細胞中の他のコードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）の発現に後に影響を及ぼすことのない標的コードポリヌクレオチドの阻害を意味する。
【００７８】
単離された：  「単離（された）」生物学的構成成分（核酸またはタンパク質等）は、構成成分の化学的または機能的変化がもたらされるのと同時に、構成成分が天然に存在する生物体の細胞中の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離された、とは別に産生された、またはから精製された（例えば、核酸は、核酸を染色体における残りのＤＮＡに連結している化学結合を切断することによって染色体から単離することができる）。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準精製方法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。該用語は、宿主細胞中で組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドも含む。
【００７９】
核酸分子：  本明細書で用いているように、「核酸分子」という用語は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方を含み得る、ヌクレオチドの重合体、ならびに合成体および上記のものの混合重合体を意味し得る。ヌクレオチドまたは核酸塩基は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、いずれかの型のヌクレオチドの修飾体を意味し得る。「核酸分子」は、本明細書で用いているように、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義語である。核酸分子は、特に示さない限り、通常、長さが少なくとも１０塩基である。慣例により、核酸分子のヌクレオチド配列は、分子の５’末端から３’末端の方向に読み取られる。核酸分子の「相補体」は、核酸分子の核酸塩基と塩基対（すなわち、Ａ−Ｔ／ＵおよびＧ−Ｃ）を形成し得る核酸塩基を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００８０】
いくつかの実施形態は、ｍＲＮＡ分子の相補体であるＲＮＡ分子に転写される鋳型ＤＮＡを含む核酸を含む。これらの実施形態では、ｍＲＮＡ分子に転写される核酸の相補体は、ＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを５’→３’方向に転写する）がｍＲＮＡ分子とハイブリダイズし得る相補体からの核酸を転写するように、５’→３’の配向で存在する。別途明確に述べない限り、または文脈から他の状態であることが明白でない限り、「相補体」という用語は、したがって、５’から３’まで、参照核酸の核酸塩基と塩基対を形成し得る核酸塩基を有するポリヌクレオチドを意味する。同様に、明示的に別の定めをした場合を除いて（または文脈から他の状態であることが明らかである場合を除いて）、核酸の「逆相補体」は、逆の配向の相補体を意味する。前述のことを以下の実例で示す。
ＡＴＧＡＴＧＡＴＧ  ポリヌクレオチド
ＴＡＣＴＡＣＴＡＣ  ポリヌクレオチドの「相補体」
ＣＡＴＣＡＴＣＡＴ  ポリヌクレオチドの「逆相補体」
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態は、ヘアピンＲＮＡ形成ＲＮＡｉ分子を含み得る。これらのＲＮＡｉ分子では、一本鎖ＲＮＡ分子が相補的および逆相補的ポリヌクレオチドを含む領域にわたって「折り重なり」、それ自体とハイブリダイズし得るように、ＲＮＡ干渉により標的とされる核酸の相補体および逆相補体の両方を同じ分子に見いだすことができる。
【００８２】
「核酸分子」は、すべてのポリヌクレオチド、例えば、一本および二本鎖型のＤＮＡ；一本鎖型のＲＮＡ；ならびに二本鎖型のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、個々の一本鎖としての、または二重らせんにおける核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の両方を意味する。「リボ核酸」（ＲＮＡ）という用語は、ｉＲＮＡ（阻害ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｈｐＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ、対応するアシル化アミノ鎖を負荷されているか、または負荷されていないかを問わず）およびｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を含む。「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）という用語は、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。「ポリヌクレオチド」および「核酸」、ならびにその「断片」という用語は、例えば、ｇＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、オペロン、およびペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするまたはコードするように適合させることができる工学的に操作したより小さいポリヌクレオチドを含む用語と当業者により理解される。
【００８３】
オリゴヌクレオチド：  オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、より長い核酸セグメントの切断により、または個々のヌクレオチド前駆体を重合させることにより、形成させることができる。自動合成器により、長さが数百塩基までのオリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは、相補的核酸に結合し得るので、それらは、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして用いることができる。ＤＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、ＤＮＡの増幅のための技術である、ＰＣＲに用いることができる。ＰＣＲにおいて、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長させ、相補鎖を複製することを可能にする、「プライマー」と一般的に呼ばれる。
【００８４】
核酸分子は、天然および／または非天然ヌクレオチド結合により結合した天然および修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。核酸分子は、当業者により容易に理解されるように、化学的もしくは生化学的に修飾することができ、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。そのような修飾は、例えば、標識、メチル化、類似体による１つまたは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合：例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等；荷電結合：例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等；ペンダント部分：例えば、ペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソレラン等；キレート剤；アルキル化剤；修飾結合：例えば、アルファアノマー核酸等）を含む。「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖、部分二重らせん、三重らせん、ヘアピン、環状およびパドロック型立体配座を含む、任意の位相幾何学的立体配座も含む。
【００８５】
ＤＮＡに関して本明細書で用いているように、「コードポリヌクレオチド」、「構造ポリヌクレオチド」または「構造核酸分子」という用語は、適切な調節エレメントの制御下におかれた場合、転写およびｍＲＮＡにより、ポリペプチドに最終的に翻訳されるポリヌクレオチドを意味する。ＲＮＡに関しては、「コードポリヌクレオチド」という用語は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるポリヌクレオチドを意味する。コードポリヌクレオチドの境界は、５’末端における翻訳開始コドンおよび３’末端における翻訳停止コドンにより決定される。コードポリヌクレオチドは、ｇＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ＥＳＴ；および組換えポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【００８６】
本明細書で用いているように、「転写非コードポリヌクレオチド」は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されない５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよびイントロンセグメント等のｍＲＮＡ分子のセグメントを意味する。さらに、「転写非コードポリヌクレオチド」は、細胞中で機能するＲＮＡ、例えば、構造ＲＮＡ（例えば、５Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、および２８Ｓ  ＲＮＡなどにより例示されるリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ））；転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）；ならびにＵ４、Ｕ５、Ｕ６など等のｓｎＲＮＡに転写される核酸を意味する。転写非コードポリヌクレオチドは、例えばおよび制限なく、小ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）も含み、この用語は、小ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）；小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）；マイクロＲＮＡ；小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）；および長鎖非コードＲＮＡを記述するためにしばしば用いられる。さらに、「転写非コードポリヌクレオチド」は、核酸における遺伝子内「リンカー」として天然に存在し得、またＲＮＡ分子に転写されるポリヌクレオチドを意味する。
【００８７】
致死性ＲＮＡ干渉：本明細書で用いているように、「致死性ＲＮＡ干渉」という用語は、例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡが送達される対象の死または生存能力の低下をもたらすＲＮＡ干渉を意味する。
【００８８】
親ＲＮＡ干渉：本明細書で用いているように、「親ＲＮＡ干渉」（ｐＲＮＡｉ）という用語は、例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡが送達される対象（例えば、鞘翅目害虫）の子孫に観察可能なＲＮＡ干渉表現型を意味する。いくつかの実施形態では、ｐＲＮＡｉは、鞘翅目害虫へのｄｓＲＮＡの送達を含み、それによって害虫が生存能力のある子孫を産む能力をより低くされる。ｐＲＮＡｉを開始する核酸は、核酸が送達される集団における死亡の発生率を増加させ得るまたは増加させ得ない。ある特定の例において、ｐＲＮＡｉを開始する核酸は、核酸が送達される集団における死亡の発生率を増加させない。例えば、鞘翅目害虫の集団にｐＲＮＡｉを開始する１つまたは複数の核酸を与えることができ、この場合、害虫は、生存し、交配するが、核酸（複数可）を与えられていない同じ種の害虫により産生される卵よりも生存能力のある子孫を孵化する能力が低い卵を産生する。ｐＲＮＡｉの１つの機序において、雌に送達された親ＲＮＡｉは、雌の子孫胚における接合体遺伝子発現をノックダウンすることができる。Bucher et al. (2002) Curr. Biol. 12(3):R85-6。
【００８９】
ゲノム：  本明細書で用いているように、「ゲノム」という用語は、細胞の核内に見いだされる染色体ＤＮＡを意味し、細胞の細胞分画物内に見いだされるオルガネラＤＮＡも意味する。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子が植物細胞のゲノムに組み込まれるように、ＤＮＡ分子を植物細胞に導入することができる。これらおよびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は、植物細胞の核ＤＮＡに組み込むか、または植物細胞の葉緑体もしくはミトコンドリアのＤＮＡに組み込むことができる。「ゲノム」という用語は、細菌に適用するとき、細菌細胞内の染色体およびプラスミドの両方を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子が細菌のゲノムに組み込まれるように、ＤＮＡ分子を細菌に導入することができる。これらおよびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は、染色体に組み込むか、または安定プラスミドとしてもしくはそれに位置することができる。
【００９０】
配列同一性：  「配列同一性」または「同一性」という用語は、本明細書で用いているように、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関連して、既定の比較ウインドウにわたり最大の一致が得られるようにアラインメントさせた場合に同じである２つの分子の配列における残基を意味する。
【００９１】
本明細書で用いているように、「配列同一性の百分率」という用語は、分子の２つの最適にアライメントされた配列（例えば、核酸配列またはポリペプチド配列）を比較ウインドウにわたり比較することにより決定される値を意味し、比較ウインドウにおける配列の一部は、２つの配列の最適のアライメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を測定して、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって計算する。参照配列と比較してすべての位置で同一である配列は、参照配列と１００％同一であると言われ、またその逆も同じである。
【００９２】
比較のために配列をアライメントする方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列のアラインメントの方法および相同性の計算の詳細な考察は、例えばAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10において見いだすことができる。
【００９３】
米国国立生物技術情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990)）が、いくつかの配列解析プログラムに関連して使用するために、米国国立生物技術情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの情報源およびインターネット上で利用できる。このプログラムを用いて配列同一性をどのようにして決定するかの説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」セクションのもとにインターネット上で入手できる。核酸配列の比較のために、デフォルトパラメーターに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いてＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ  ２配列」関数（function）を用いることができる。参照ポリヌクレオチドの配列とのはるかにより大きい配列類似性を有する核酸は、この方法により評価する場合、同一性の百分率の増加を示す。
【００９４】
特異的にハイブリダイズ可能な／特異的に相補的な：  本明細書で用いているように、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」という用語は、安定かつ特異的な結合が核酸分子と標的核酸分子との間で起こるように十分な程度の相補性を示す用語である。２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションは、２つの核酸分子の核酸塩基間の逆平行アライメントの形成を伴う。２つの分子は、そのとき逆鎖上の対応する塩基との水素結合を形成して、それが十分に安定である場合、当技術分野で周知の方法を用いて検出できる二重らせん分子を形成することができる。ポリヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるにはその標的核酸と１００％相補的である必要はない。しかし、ハイブリダイゼーションが特異的であるために存在しなければならない相補性の量は、用いるハイブリダイゼーション条件の関数である。
【００９５】
特定の厳密度をもたらすハイブリダイゼーション条件は、最適なハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸の組成および長さによって異なる。一般的に、洗浄時間も厳密性に影響を及ぼすが、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（とりわけＮａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）は、ハイブリダイゼーションの厳密性を決定づける。特定の厳密度を達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapter 9 and 11およびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に述べられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示および指針は、例えば、Tijssen, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993;およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見いだすことができる。
【００９６】
本明細書で用いているように、「厳密条件」は、ハイブリダイゼーション分子の配列の間に２０％未満のミスマッチおよび標的核酸分子内に相同ポリヌクレオチドが存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を含む。「厳密条件」は、厳密性のさらなる特定のレベルを含む。したがって、本明細書で用いているように、「中厳密性」条件は、２０％を超える配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高厳密性」の条件は、１０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件であり、「超高厳密性」の条件は、５％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。
【００９７】
以下は、代表的で、非限定的なハイブリダイゼーション条件である。
高厳密条件（少なくとも９０％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドを検出する）：  ５ｘ  ＳＳＣ緩衝液中での６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温でそれぞれ１５分間２回洗浄する；および０．５ｘ  ＳＳＣ緩衝液で６５℃でそれぞれ２０分間２回洗浄する。
中厳密条件（少なくとも８０％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドを検出する）：  ５ｘ〜６ｘＳＳＣ緩衝液中での６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温でそれぞれ５〜２０分間２回洗浄する；および１ｘ  ＳＳＣ緩衝液で５５〜７０℃でそれぞれ３０分間２回洗浄する。
非厳密対照条件（少なくとも５０％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする）：  ６ｘ  ＳＳＣ緩衝液中での室温〜５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２ｘ〜３ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温〜５５℃でそれぞれ２０〜３０分間少なくとも２回洗浄する。
【００９８】
本明細書で用いているように、核酸に関する「実質的に相同」または「実質的相同性」という用語は、参照核酸と厳密条件下でハイブリダイズする連続した核酸塩基を有すポリヌクレオチドを意味する。例えば、配列番号１、３、４６および６７のいずれかの参照核酸と実質的に相同である核酸は、配列番号１、３、４６および６７のいずれかの参照核酸と厳密条件（例えば、上に示した中厳密条件）のもとでハイブリダイズする核酸である。実質的に相同であるポリヌクレオチドは、少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。例えば、実質的に相同であるポリヌクレオチドは、７９％、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％および約１００％等の、約８０％〜１００％の配列同一性を有し得る。実質的相同性の特性は、特異的ハイブリダイゼーションに密接に関連している。例えば、特異的結合が望まれる条件下、例えば、厳密ハイブリダイゼーション条件下で非標的ポリヌクレオチドに対する核酸の特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在する場合に、核酸分子は、特異的にハイブリダイズする。
【００９９】
本明細書で用いているように、「オルソログ」という用語は、共通の祖先の核酸から発生し、２つ以上の種において共通の機能を保持し得る２つ以上の種における遺伝子を意味する。
【０１００】
本明細書で用いているように、５’→３’方向に読み取られたポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが３’→５’方向に読み取られた場合の他のポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチドと相補的である場合、２つの核酸分子は、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの逆相補体と配列同一性を示す。これらの用語および記述は、当技術分野で十分に定義されており、当業者に容易に理解される。
【０１０１】
作動可能に連結した：第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドと機能的関係にある場合、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結している。組換えよって産生させる場合、作動可能に連結したポリヌクレオチドは、一般的に連続しており、２つのコード領域を連結するために必要な場合、同じ読取枠に（例えば、翻訳段階で融合されるＯＲＦで）ある。しかし、核酸は、作動可能に連結されるのに連続している必要はない。
【０１０２】
「作動可能に連結した」という用語は、調節遺伝エレメントおよびコードポリヌクレオチドに関連して用いる場合、調節エレメントが連結されたコードポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節エレメント」または「制御エレメント」は、転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コードポリヌクレオチドの翻訳に影響を及ぼすポリヌクレオチドを意味する。調節エレメントは、プロモーター；翻訳リーダー；イントロン；エンハンサー；ステム−ループ構造；レプレッサー結合ポリヌクレオチド；終結配列を有するポリヌクレオチド；ポリアデニル化認識配列を有するポリヌクレオチド等を含み得る。特定の調節エレメントは、それと作動可能に連結したコードポリヌクレオチドの上流および／または下流に位置し得る。また、コードポリヌクレオチドと作動可能に連結した特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連相補鎖上に位置し得る。
【０１０３】
プロモーター：  本明細書で用いているように、「プロモーター」という用語は、転写の開始の上流にあり、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与し得るＤＮＡの領域を意味する。プロモーターは、細胞中の発現のためにコードポリヌクレオチドに作動可能に連結することができる、あるいはプロモーターは、細胞中の発現のためにコードポリヌクレオチドに作動可能に連結することができるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結することができる。「植物プロモーター」は、植物細胞中の転写を開始することができるプロモーターであり得る。発育制御下のプロモーターの例としては、葉、根、種子、繊維、木質導管、仮導管または厚膜組織等の特定の組織における転写を優先的に開始するプロモーター等がある。そのようなプロモーターは、「組織優先的」と呼ばれる。特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型特異的」プロモーターは、１つまたは複数の器官における特定の細胞型、例えば、根または葉における維管束細胞における発現を主として推進する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあり得るプロモーターであり得る。誘導性プロモーターにより転写を開始させ得る環境条件の例としては、嫌気性条件および光の存在等がある。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的および誘導性プロモーターは、「非構成性」プロモーターのクラスを構成する。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境条件下またはほとんどの組織もしくは細胞型で活性であり得るプロモーターである。
【０１０４】
任意の誘導性プロモーターを本発明のいくつかの実施形態で用いることができる。Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366を参照のこと。誘導性プロモーターにより、転写の速度は、誘導剤に応答して増大する。例示的な誘導性プロモーターは、銅に応答するＡＣＥＩシステムに由来するプロモーター；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシに由来するＩｎ２遺伝子；Ｔｎ１０のＴｅｔレプレッサー；およびその転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導され得る（Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421）、ステロイドホルモン遺伝子に由来する誘導性プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
例示的な構成性プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター等の、植物ウイルスに由来するプロモーター；イネアクチン遺伝子に由来するプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；およびＡＬＳプロモーター、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５‘側のＸｂａｌ／ＮｃｏＩ断片（または前記Ｘｂａｌ／ＮｃｏＩ断片と類似のポリヌクレオチド）（国際ＰＣＴ公開国際公開第９６／３０５３０号パンフレット）を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
さらに、あらゆる組織特異的または組織優先的プロモーターは、本発明のいくつかの実施形態で用いることができる。組織特異的プロモーターに作動可能に連結したコードポリヌクレオチドを含む核酸分子を用いて形質転換した植物は、特定の組織において、もっぱら、または優先的にコードポリヌクレオチドの産物を産生し得る。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターは、インゲンマメ属に由来するもの等の、種子優先的プロモーター；キャブまたはルビスコに由来するもの等の葉特異的および光誘導性プロモーター；ＬＡＴ５２に由来するもの等の葯特異的プロモーター；Ｚｍ１３に由来するもの等の花粉特異的プロモーター；およびａｐｇに由来するもの等の小胞子優先的プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
ダイズ植物：  本明細書で用いているように、「ダイズ植物」という用語は、グリシン属種（Glycine species）（例えば、Ｇ．マクス（G. max））の植物を意味する。
【０１０８】
形質転換：  本明細書で用いているように、「形質転換」または「形質導入」という用語は、細胞への１つまたは複数の核酸分子（複数可）の移入を意味する。核酸分子の細胞ゲノムへの取込みにより、またはエピソーム複製により、核酸分子が細胞により安定に複製されるようになる場合、細胞は、細胞に形質導入された核酸分子によって「形質転換」される。本明細書で用いているように、「形質転換」という用語は、核酸分子をそのような細胞に導入することができるすべての技術を含む。例は、ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3）；リポフェクション（Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）；マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）；直接ＤＮＡ取込み；および微粒子銃（Klein et al. (1987) Nature 327:70）を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
導入遺伝子：  外因性核酸。いくつかの例において、導入遺伝子は、鞘翅目害虫に見いだされる核酸分子と相補的であるポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡの１つまたは両方の鎖（複数可）をコードするＤＮＡであり得る。さらなる例において、導入遺伝子は、アンチセンスポリヌクレオチドであり得、アンチセンスポリヌクレオチドの発現は、標的核酸の発現を阻害し、それにより、親ＲＮＡｉ表現型をもたらす。なおもさらなる例において、導入遺伝子は、遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子、産業的または薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業的形質をコードする遺伝子）であり得る。これらおよび他の例において、導入遺伝子は、導入遺伝子のコードポリヌクレオチド（例えば、プロモーター）と作動可能に連結した調節エレメントを含み得る。
【０１１０】
ベクター：  例えば、形質転換細胞を生産するために細胞に導入する核酸分子。ベクターは、複製起点等の、宿主細胞中で複製することを可能にする遺伝エレメントを含み得る。ベクターの例は、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、または外因性ＤＮＡを細胞内に運ぶウイルスを含むが、これらに限定されない。ベクターは、アンチセンス分子、ならびに／または選択可能マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝エレメントを生産するものを含む、１つまたは複数の遺伝子も含み得る。ベクターは、細胞を形質導入、形質転換または感染させ、それにより、ベクターによりコードされる核酸分子および／またはタンパク質を細胞に発現させる。ベクターは、細胞への核酸分子の侵入を達成することを促進する物質を場合によって含む（例えば、リポソーム、タンパク質コーティング等）。
【０１１１】
収量：  同時に同じ条件下で成長する同じ成長場所における基準品種の収量と比べて約１００％またはそれ以上の安定化収量。特定の実施形態では、「収量向上」または「収量の向上」は、栽培品種が、同時に同じ条件下で成長する当作物に害であり、本明細書における組成物および方法により標的にされる、著しい密度の鞘翅目害虫を含む同じ成長場所における基準品種の収量と比べて１０５％またはそれ以上の安定化収量を有することを意味する。
【０１１２】
特に示さないまたは黙示しない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、本明細書で用いているように、「少なくとも１つ」を意味する。
【０１１３】
特に説明しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、例えば、Lewin’s Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびMeyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見いだすことができる。特に示さない限り、すべての百分率は、重量によるものであり、すべての溶媒の混合割合は、容積によるものである。すべての温度は、摂氏温度である。
【０１１４】
ＩＶ．鞘翅目害虫ポリヌクレオチドを含む核酸分子
Ａ．概要
本明細書で述べるのは、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子である。述べる核酸分子は、標的ポリヌクレオチド（例えば、天然遺伝子および非コードポリヌクレオチド）、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｈｐＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む。例えば、鞘翅目害虫における１つまたは複数の天然核酸のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であり得るｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子をいくつかの実施形態で述べる。これらおよびさらなる実施形態では、天然核酸（複数可）は、１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）であり得、その産物は、例えばかつ制限なしに、生殖過程に関与または幼虫の発育に関与し得る。本明細書で述べる核酸分子は、核酸分子が特異的に相補的である少なくとも１つの天然核酸（複数可）を含む細胞に導入される（例えば、親からの伝達により）場合、細胞中でＲＮＡｉを開始し、その後、天然核酸（複数可）の発現を低減または排除し得る。いくつかの例において、それに特異的に相補的な核酸分子による標的遺伝子の発現の低減または排除は、鞘翅目害虫における生殖、ならびに／あるいは害虫の子孫における成長、発育および／または摂食の低減または停止をもたらし得る。これらの方法は、例えば、ｉＲＮＡ分子に接触する害虫（複数可）の死亡を直接的にもたらさずに、外寄生に際しての害虫の次世代の構成数を著しく減少させ得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ｈｕｎｃｈｂａｃｋポリヌクレオチドを含む、鞘翅目害虫における少なくとも１つの標的遺伝子を選択することができる。特定の例において、鞘翅目害虫における標的遺伝子が選択され、標的遺伝子は、配列番号１、配列番号３および配列番号６７のうちから選択されるポリヌクレオチドを含む。
【０１１６】
ウェスタンコーンルートワームｈｕｎｃｈｂａｃｋは、１９５５ｂｐおよび５７３個のアミノ酸（ＨＵＮＣＨＢＡＣＫタンパク質）の配列を表す。この配列内で、６つのＣ２Ｈ２型ジンクフィンガードメインが、ジンクフィンガー転写因子としてのその役割に配慮して２２６〜２４８、２５５〜２７７、２８３〜３０５、３１１〜３３５、５２０〜５４２、および５４８〜５７２位で予測された。例えば、Tautz et al. (1987) Nature 327:383-9を参照のこと。ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムを用いてＮＣＢＩデータベースで検索した場合、最も類似した配列は、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）由来であり、それは、ほんの５３パーセントの配列同一性を示した。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ｈｕｎｃｈｂａｃｋポリヌクレオチドのタンパク質産物のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一（例えば、少なくとも８４％、８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％または１００％同一）である連続したアミノ酸配列を含むポリペプチドにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで逆翻訳することができるポリヌクレオチドを含む核酸分子であり得る。標的遺伝子は、例えば、害虫からの保護効果を植物にもたらすための、その転写後阻害が生存能力のある子孫を産む害虫の能力に対する有害な影響を有する、鞘翅目害虫における核酸であり得る。特定の例において、標的遺伝子は、配列番号２のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ翻訳産物であるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、約１００％同一または１００％同一である連続したアミノ酸配列を含むポリペプチドにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで逆翻訳することができるポリヌクレオチドを含む核酸分子である。
【０１１８】
いくつかの実施形態で提供するのは、その発現が、鞘翅目害虫におけるコードポリヌクレオチドによりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部と特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子をもたらす、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、発現ＲＮＡ分子の鞘翅目害虫による摂取の後、害虫の細胞中または害虫の子孫の細胞中のコードポリヌクレオチドの下方制御を得ることができる。特定の実施形態では、鞘翅目害虫の細胞中のコードポリヌクレオチドの下方制御は、害虫における生殖および／または増殖、ならびに／あるいは害虫の子孫における成長、発育および／または摂食の低減または停止をもたらし得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、標的鞘翅目害虫遺伝子の５’ＵＴＲ；３’ＵＴＲ；スプライスリーダー；イントロン；アウトロン（例えば、トランススプライシングでその後修飾される５’ＵＴＲ  ＲＮＡ）；ドナトロン（トランススプライシングのためのドナー配列を提供するのに必要な非コードＲＮＡ）等の転写非コードＲＮＡおよび他の非コード転写ＲＮＡを含む。そのようなポリヌクレオチドは、モノシストロン性およびポリシストロン性遺伝子の両方に由来し得る。
【０１２０】
したがって、いくつかの実施形態に関連して鞘翅目害虫における標的配列のすべてまたは一部に対して特異的に相補的である少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）についても本明細書で述べる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、複数の標的核酸、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の標的核酸のすべてまたは一部と相補的であるポリヌクレオチド（複数可）を含み得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、植物または細菌等の遺伝子組換え生物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで産生され得る。鞘翅目害虫における標的核酸のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であるｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子および／またはｈｐＲＮＡ分子の産生に用いることができるｃＤＮＡも開示する。特定の宿主標的の安定な形質転換を達成するのに用いる組換えＤＮＡ構築物をさらに述べる。形質転換宿主標的は、組換えＤＮＡ構築物から有効レベルのｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子を発現し得る。したがって、植物細胞中で機能し得る異種プロモーターに作動可能に連結した、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクターについても述べるものであり、該ポリヌクレオチド（複数可）の発現により、鞘翅目害虫における標的核酸のすべてまたは一部に特異的に相補的である連続した核酸塩基の連なりを含むＲＮＡ分子が結果として生じる。
【０１２１】
特定の例において、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、ｈｕｎｃｈｂａｃｋポリヌクレオチドを含むジアブロティカ属（Diabrotica）から単離された天然核酸のすべてもしくは一部（例えば、配列番号１、配列番号３および配列番号６７のいずれか）；発現したとき、ｈｕｎｃｈｂａｃｋによりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてもしくは一部と特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子をもたらすＤＮＡ；ｈｕｎｃｈｂａｃｋによりコードされるＲＮＡ分子のすべてまたは一部と特異的に相補的である少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）；ｈｕｎｃｈｂａｃｋによりコードされるＲＮＡ分子のすべてもしくは一部と特異的に相補的であるｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子および／またはｈｐＲＮＡ分子の産生に用いることができるｃＤＮＡ；ならびに形質転換宿主標的が１つまたは複数の前述の核酸分子を含む、特定の宿主標的の安定な形質転換を達成するのに用いる組換えＤＮＡ構築物を含み得る。
【０１２２】
Ｂ．核酸分子
本発明は、とりわけ、鞘翅目害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子；ならびに鞘翅目害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子発現を阻害するために細胞もしくは微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができるＤＮＡ分子を提供する。
【０１２３】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１９個の連続したヌクレオチド）の断片（例えば、配列番号３および配列番号６７）；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上）のポリヌクレオチド（複数可）を含む単離核酸分子を提供する。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドの鞘翅目害虫との接触またはそれによる取込みは、害虫の成長、発育、生殖および／または摂食を阻害する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号７０；配列番号７０の相補体；配列番号７１；配列番号７１の相補体；配列番号７２；配列番号７２の相補体；配列番号７３；配列番号７３の相補体；配列番号７０、配列番号７１および配列番号７３のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７０、配列番号７１および配列番号７３のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含む遺伝子からジアブロティカ属（Diabrotica）生物において転写された天然ポリリボヌクレオチド；配列番号１を含む遺伝子からジアブロティカ属（Diabrotica）生物において転写された天然ポリリボヌクレオチドの相補体；配列番号１を含む遺伝子からジアブロティカ属（Diabrotica）生物において転写された天然ポリリボヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１を含む遺伝子からジアブロティカ属（Diabrotica）生物において転写された天然ポリリボヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上）のポリヌクレオチド（複数可）を含み得る。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドの鞘翅目害虫との接触またはそれによる取込みは、害虫の成長、発育、生殖および／または摂食を阻害する。
【０１２５】
他の実施形態では、本発明の核酸分子は、鞘翅目害虫の細胞、組織または器官における標的遺伝子発現を阻害するように細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができる少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のＤＮＡ（複数可）を含み得る。そのようなＤＮＡ（複数可）は、ｄｓＲＮＡ分子（複数可）を形成することができるコード化ＲＮＡの転写を開始または増大させるようにＤＮＡ分子を含む細胞中で機能するプロモーターに作動可能に連結させることができる。一実施形態では、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のＤＮＡ（複数可）は、配列番号１のポリヌクレオチドに由来し得る。配列番号１の誘導体は、配列番号１の断片を含む。いくつかの実施形態では、そのような断片は、例えば、配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドまたはその相補体を含む。したがって、そのような断片は、例えば、配列番号１の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０．２００個もしくはそれ以上の連続したヌクレオチドまたはその相補体を含み得る。いくつかの例において、そのような断片は、例えば、配列番号１の少なくとも１９個の連続したヌクレオチド（例えば、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の連続したヌクレオチド）、またはその相補体を含み得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫の細胞、組織または器官における標的遺伝子の発現を阻害するために部分的または完全に安定化されたｄｓＲＮＡ分子を鞘翅目害虫に導入することを含む。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）として発現させ、鞘翅目害虫により取り込ませた場合、配列番号１、３および６７ならびにその相補体のいずれかの１つまたは複数の断片を含むポリヌクレオチドは、死、発育停止、成長阻害、性比の変化、一腹子数の減少、鞘翅目害虫による感染の停止および／または摂食の停止の１つまたは複数をもたらし得る。特定の例において、配列番号１、配列番号３および配列番号６７、ならびにその相補体のいずれかの１つまたは複数の断片を含むポリヌクレオチド（例えば、約１５個〜約３００個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）は、害虫の次世代を産む害虫の現存世代の能力の低下をもたらす。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本発明により提供されるｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４６および／または配列番号６７を含む標的遺伝子からの転写物に相補的なポリヌクレオチド、ならびに／あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号４６および／または配列番号６７の断片に相補的なポリヌクレオチドを含み、鞘翅目害虫におけるその標的遺伝子の阻害は、害虫もしくは害虫の子孫の成長、発育、または他の生物学的機能に必須であるポリペプチドもしくはポリヌクレオチド作用物質の減少または除去をもたらす。選択されるポリヌクレオチドは、配列番号１、３、４６および／または６７、配列番号１、３、４６および／または６７の連続した断片、あるいは前述のもののいずれかの相補体と約８０％〜約１００％の配列同一性を示し得る。例えば、選択されるポリヌクレオチドは、配列番号１、３、４６および／または６７、配列番号１、３、４６および／または６７の連続した断片、あるいは前述のもののいずれかの相補体と７９％、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、または約１００％の配列同一性を示し得る。
【０１２８】
他の実施形態では、標的遺伝子発現を阻害するように細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができるＤＮＡ分子は、１つまたは複数の標的鞘翅目害虫種に見いだされる天然ポリヌクレオチドのすべてまたは一部に特異的に相補的である単一ポリヌクレオチドを含み得る。あるいは該ＤＮＡ分子は、複数のそのような特異的に相補的ポリヌクレオチドからキメラとして構築することができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、「リンカー」により分離された第１および第２のポリヌクレオチドを含み得る。リンカーは、これが望ましい場合、第１および第２のポリヌクレオチドの間の二次構造の形成を促進するヌクレオチドの任意の配列を含む領域であり得る。一実施形態では、リンカーは、ｍＲＮＡのセンスまたはアンチセンスコードポリヌクレオチドの一部である。リンカーは、代わりになるべきものとして、核酸分子と共有結合することができるヌクレオチドまたはそのホモログの任意の組合せを含み得る。いくつかの例において、リンカーは、イントロン（例えば、ＳＴ−ＬＳＩイントロンなど）を含み得る。
【０１３０】
例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、異なるＲＮＡ分子のそれぞれが第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、第１および第２のポリヌクレオチドが互いに相補的である、１つまたは複数の異なるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含み得る。第１および第２のポリヌクレオチド配列は、リンカー配列によりＲＮＡ分子内でつなぐことができる。リンカーは、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドの一部を構成し得る。第１および第２のポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子の発現は、第１および第２のポリヌクレオチドの特異的分子内塩基対合による、本発明のｄｓＲＮＡ分子の形成につながり得る。第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドは、鞘翅目害虫の生得のポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または転写非コードポリヌクレオチド）、その誘導体、またはそれと相補的なポリヌクレオチドと実質的に同一であり得る。
【０１３１】
ｄｓＲＮＡ核酸分子は、重合リボヌクレオチドの二本鎖を含み、リン酸−糖主鎖またはヌクレオシドの修飾を含み得る。ＲＮＡ構造の修飾は、特異的阻害を可能にするように調整することができる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を生成することができるように、ｄｓＲＮＡ分子をユビキタス酵素法により修飾することができる。この酵素法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、真核生物におけるＤＩＣＥＲ等のＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ酵素を利用し得る。Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-8;およびHamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2を参照のこと。ＤＩＣＥＲまたは機能的に同等のＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素は、より大きいｄｓＲＮＡ鎖および／またはｈｐＲＮＡ分子を、それぞれが長さが約１９〜２５ヌクレオチドである、より小さいオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）に切断する。これらの酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、２〜３ヌクレオチドの３’突出ならびに５’リン酸および３’ヒドロキシル末端を有する。ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素から生成されたｓｉＲＮＡ分子は、細胞中の一本鎖ＲＮＡに巻き戻され、分離される。ｓｉＲＮＡ分子は、次に標的遺伝子から転写されたＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、両ＲＮＡ分子は、その後、固有の細胞ＲＮＡ分解メカニズムにより分解される。このプロセスは、標的生物における標的遺伝子によりコードされるＲＮＡの効果的な分解または除去をもたらし得る。その結果は、標的遺伝子の転写後サイレンシングである。いくつかの実施形態では、異種核酸分子から内因性ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、鞘翅目害虫における標的遺伝子の下方制御を効果的に媒介し得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、分子間ハイブリダイゼーションによりｉｎ  ｖｉｖｏでｄｓＲＮＡ分子を形成することができる一本鎖ＲＮＡ分子に転写され得る少なくとも１種の非天然ポリヌクレオチドを含み得る。そのようなｄｓＲＮＡは、一般的に自己集合性であり、標的遺伝子の転写後阻害を達成するために鞘翅目害虫の栄養源に供給することができる。これらおよびさらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、それぞれが鞘翅目害虫における異なる標的遺伝子と特異的に相補的である、２種の非天然ポリヌクレオチドを含み得る。そのような核酸分子をｄｓＲＮＡ分子として、鞘翅目害虫に供給する場合、ｄｓＲＮＡ分子は、害虫における少なくとも２種の異なる標的遺伝子の発現を阻害する。
【０１３３】
Ｃ．核酸分子を得ること
鞘翅目害虫における様々なポリヌクレオチドは、ｉＲＮＡおよびｉＲＮＡをコードするＤＮＡ分子等の、本発明の核酸分子の設計のための標的として用いることができる。しかし、天然ポリヌクレオチドの選択は、簡単なプロセスではない。鞘翅目害虫における少数の天然ポリヌクレオチドのみが有効な標的となる。例えば、本発明の核酸分子により特定の天然ポリヌクレオチドを効果的に下方制御することができるかどうか、あるいは特定の天然ポリヌクレオチドの下方制御が鞘翅目害虫の成長、生存能力、増殖および／または生殖に対する有害作用を有するかどうかは、確実に予測することはできない。それらから単離されたＥＳＴ等の、天然鞘翅目害虫ポリヌクレオチドの圧倒的大多数（例えば、米国特許第７，６１２，１９４号明細書に示されている鞘翅目害虫ポリヌクレオチド）は、害虫の成長、生存能力、増殖および／または生殖に対する有害効果を有さない。鞘翅目害虫に対する有害作用を有し得る天然ポリヌクレオチドのどれを、宿主植物におけるそのような天然ポリヌクレオチドに対して相補的な核酸分子を発現させ、宿主植物に害をもたらすことなく、摂食により害虫に有害効果をもたらすための組換え技術に用いることができるかも予測できない。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子（例えば、鞘翅目害虫の宿主植物に供給するｄｓＲＮＡ分子）は、代謝または異化生化学的経路、細胞分裂、生殖、エネルギー代謝、胚の発育、幼虫の発育、転写調節などに関与するポリペプチド等の、鞘翅目害虫の生殖および／または発育に必須のタンパク質またはタンパク質の一部をコードするｃＤＮＡを標的とするように選択される。本明細書で述べるように、その少なくとも１つのセグメントが標的有害生物の細胞中で産生されるＲＮＡの少なくとも実質的に同じセグメントと特異的に相補的である、１つまたは複数のｄｓＲＮＡを含む標的生物による組成物の摂取は、交配する、産卵する、もしくは生存能力のある子孫を産むことの不全またはその能力の低下をもたらし得る。鞘翅目害虫に由来する、ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、害虫による外寄生に抵抗性の植物細胞を構築するために用いることができる。鞘翅目害虫の宿主植物（例えば、Ｚ．マイス（Z. mays））は、例えば、本明細書に提供する鞘翅目害虫に由来する１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むように形質転換を起こさせることができる。宿主に形質転換を起こさせたポリヌクレオチドは、形質転換宿主内の細胞または生体液中でｄｓＲＮＡ配列を形成する１つまたは複数のＲＮＡをコードし、ひいては害虫がトランスジェニック植物との栄養関係を結ぶ場合／時にｄｓＲＮＡを利用できるようにし得る。これは、害虫の細胞中の１つまたは複数の遺伝子の発現の抑制、ならびに最終的に生殖および／または発育の阻害をもたらし得る。
【０１３５】
代替的な実施形態では、鞘翅目害虫の成長、発育および生殖に本質的に関与する遺伝子を標的とする。本発明に用いる他の標的遺伝子は、例えば、鞘翅目害虫の生存能力、運動、移動、成長、発育、感染性および餌場の確定に重要な役割を果たすものを含み得る。したがって、標的遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子または転写因子であり得る。さらに、本発明に用いる天然鞘翅目害虫ポリヌクレオチドは、その機能が当業者に公知であり、そのポリヌクレオチドが標的鞘翅目害虫のゲノムにおける標的遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能である、植物、ウイルス、細菌または昆虫遺伝子のホモログ（例えば、オルソログ）から得ることもできる。ハイブリダイゼーションにより既知のヌクレオチド配列を有する遺伝子のホモログを同定する方法は、当業者に公知である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を生成するためのポリヌクレオチドを含む核酸分子を得る方法を提供する。１つのそのような実施形態は、（ａ）鞘翅目害虫におけるｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制時に１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）をそれらの発現、機能および表現型について解析するステップと、（ｂ）ｄｓＲＮＡ媒介抑制解析で生殖または発育表現型の変化（例えば、低下）を示す標的鞘翅目害虫のポリヌクレオチドまたはそのホモログのすべてもしくは一部を含むプローブによりｃＤＮＡまたはｇＤＮＡライブラリーを探査するステップと、（ｃ）プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定するステップと、（ｄ）ステップ（ｂ）で同定されたＤＮＡクローンを単離するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）で単離されたクローンを含むｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片の配列を決定するステップであって、配列決定された核酸分子がＲＮＡまたはそのホモログのすべてもしくは実質的な部分を含んでいるステップと、（ｆ）遺伝子、またはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのすべてもしくは実質的な部分を化学的に合成するステップとを含む。
【０１３７】
さらなる実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子の実質的な部分を生成するためのポリヌクレオチドを含む核酸断片を得る方法は、（ａ）標的鞘翅目害虫の天然ポリヌクレオチドの一部と特異的に相補的である第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを合成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローニングベクターに存在するｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ挿入断片を増幅するステップとを含み、増幅核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ分子の実質的な部分を含む。
【０１３８】
本発明の核酸は、多くのアプローチにより単離し、増幅し、または生成することができる。例えば、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子は、ｇＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリー、またはその一部から得られた標的ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または標的転写非コードポリヌクレオチド）のＰＣＲ増幅により得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、標的生物から抽出することができ、核酸ライブラリーは、当業者に公知の方法を用いてそれから作製することができる。標的生物から得られたｇＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、標的遺伝子のＰＣＲ増幅および配列決定に用いることができる。確認済みのＰＣＲ産物は、最小プロモーターによりセンスおよびアンチセンスＲＮＡを生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型として用いることができる。あるいは、核酸分子は、ホスホルアミダイト化学等の標準的な化学を用いる自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）モデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置）の使用を含む、多くの技術（例えば、Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214;およびAgrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423）のいずれかにより合成することができる。例えば、Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311；米国特許第４，９８０，４６０号明細書、第４，７２５，６７７号明細書、第４，４１５，７３２号明細書、第４，４５８，０６６号明細書および第４，９７３，６７９号明細書を参照のこと。ホスホロチオエート、ホスホルアミデート等の非天然主鎖基をもたらす代替の化学も用いることができる。
【０１３９】
本発明のＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子は、手動または自動化反応により当業者により化学的もしくは酵素的に、あるいはＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む細胞中でｉｎ  ｖｉｖｏで生成することができる。ＲＮＡは、部分または完全有機合成によっても生成することができ、任意の修飾リボヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素または有機合成により導入することができる。ＲＮＡ分子は、細胞ＲＮＡポリメラーゼまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）により合成することができる。ポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な発現構築物は、当技術分野で公知である。例えば、国際ＰＣＴ公開国際公開第０９７／３２０１６号パンフレットならびに米国特許第５，５９３，８７４号明細書、第５，６９８，４２５号明細書、第５，７１２，１３５号明細書、第５，７８９，２１４号明細書および第５，８０４，６９３号明細書を参照のこと。化学的にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素合成により合成されるＲＮＡ分子は、細胞に導入する前に精製することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィーまたはそれらの組合せにより混合物から精製することができる。あるいは、化学的にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素合成により合成されるＲＮＡ分子は、例えば、試料の処理による損失を避けるために、精製せずにまたは最小限の精製で用いることができる。ＲＮＡ分子は、保存のために乾燥するか、または水溶液に溶解することができる。溶液は、ｄｓＲＮＡ分子の二重らせん鎖のアニーリングおよび／または安定化を促進するための緩衝剤または塩を含んでいてもよい。
【０１４０】
実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、単一自己相補的ＲＮＡ鎖により、または２つの相補的ＲＮＡ鎖から形成させることができる。ｄｓＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏで１つまたは２つのＲＮＡ鎖の転写を媒介し得る。あるいはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を媒介するのにクローン化ＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。鞘翅目害虫における標的遺伝子の転写後阻害は、宿主の器官、組織もしくは細胞型における特異的転写（例えば、組織特異的プロモーターを用いることによる）；宿主における環境条件の刺激（例えば、感染、ストレス、温度および／または化学誘導物質に応答性である誘導性プロモーターを用いることによる）；および／または宿主の発育段階もしくは年齢における工学的転写（例えば、発育段階特異的プロモーターを用いることによる）により宿主標的化することができる。ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ鎖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで転写されるかどうかを問わず、ポリアデニル化され得るか、またはされ得ず、細胞の翻訳装置によりポリペプチドに翻訳されることができ得るか、またはでき得ない。
【０１４１】
Ｄ．組換えベクターおよび宿主細胞形質転換
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞または植物細胞）への導入のためのＤＮＡ分子であって、ＲＮＡへの発現ならびに鞘翅目害虫による摂取により、害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子の抑制を達成するポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子も提供する。したがって、いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫における標的遺伝子発現を阻害するための植物細胞中でｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子として発現することができるポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供する。発現を開始または増大させるために、そのような組換え核酸分子は、１つまたは複数の調節エレメントを含んでいてもよく、調節エレメントは、ｉＲＮＡとして発現することができるポリヌクレオチドに作動可能に連結することができる。植物において遺伝子抑制分子を発現させる方法は、公知であり、本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いることができる。例えば、国際ＰＣＴ公開国際公開第０６／０７３７２７号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号明細書を参照のこと。
【０１４２】
特定の実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み得る。そのような組換えＤＮＡ分子は、摂取により鞘翅目害虫細胞における内因性標的遺伝子（複数可）の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードし得る。多くの実施形態では、転写ＲＮＡは、安定化構造で、例えば、ヘアピンならびにステムおよびループ構造として提供することができるｄｓＲＮＡ分子を形成し得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子の１本の鎖は、配列番号１、配列番号３、配列番号４６および配列番号６７；配列番号１、配列番号３、配列番号４６および／または配列番号６７の相補体；配列番号１、配列番号３、配列番号４６および／または配列番号６７の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１、配列番号３、配列番号４６および／または配列番号６７の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、配列番号３、および／または配列番号６７を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１、配列番号３、および／または配列番号６７を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの相補体；配列番号１、配列番号３、および／または配列番号６７を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；ならびに配列番号１、配列番号３、および／または配列番号６７を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドによりコードされるＲＮＡと実質的に相同であるポリヌクレオチドからの転写により形成され得る。
【０１４４】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子は、少なくとも１つのプロモーターに対して、１つのポリヌクレオチドがセンス配向をなし、他のポリヌクレオチドがアンチセンス配向をなすように、少なくとも２つのポリヌクレオチドが配列し、センスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドが、例えば、約５から約１０００ヌクレオチドのリンカーにより連結またはつながれている、コード領域を含み得る。リンカーは、センスおよびアンチセンスポリヌクレオチド間のループを形成する可能性がある。センスポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドは、標的遺伝子（例えば、配列番号１を含むｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子）またはその断片によりコードされるＲＮＡと実質的に相同であり得る。しかし、いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、リンカーなしにｄｓＲＮＡ分子を形成し得る、ＲＮＡをコードし得る。複数の実施形態では、センスコードポリヌクレオチドおよびアンチセンスコードポリヌクレオチドは、異なる長さであり得る。
【０１４５】
鞘翅目害虫に対する有害効果または鞘翅目害虫に対する植物保護効果を有すると同定されたポリヌクレオチドは、本発明の組換え核酸分子における適切な発現カセットの創製により発現ｄｓＲＮＡ分子に容易に取り込むことができる。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、標的遺伝子ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１およびその断片を含むｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子）によりコードされるＲＮＡに対応する第１のセグメントを選択し、このポリヌクレオチドを第１のセグメントに相同または相補的でない第２のセグメントリンカー領域に連結し、これを、少なくとも一部が第１のセグメントと実質的に相補的である第３のセグメントに連結することにより、ステムおよびループ構造を有するヘアピンとして発現させることができる。そのような構築物は、第１のセグメントと第３のセグメントとの分子内塩基対合によりステムおよびループ構造を形成し、ループ構造が生じ、第２のセグメントを含む。例えば、米国特許出願公開第２００２／００４８８１４号明細書および第２００３／００１８９９３号明細書ならびに国際ＰＣＴ公開国際公開第９４／０１５５０号パンフレットおよび国際公開第９８／０５７７０号パンフレットを参照のこと。ｄｓＲＮＡ分子は、例えば、ステム−ループ構造（例えば、ヘアピン）等の二本鎖構造の形態で生成することができ、それにより、天然鞘翅目害虫ポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡの生成は、ｓｉＲＮＡの生成の増大をもたらす、またはｄｓＲＮＡヘアピンプロモーターの転写遺伝子サイレンシングを防ぐためにメチル化を低下させる、例えば、追加の植物発現性カセット上の標的遺伝子の断片の共発現により増大する。
【０１４６】
本発明の実施形態は、１つまたは複数のｉＲＮＡ分子の発現の鞘翅目害虫保護レベルを達成するための植物への本発明の組換え核酸分子の導入（すなわち、形質転換）を含む。組換えＤＮＡ分子は、例えば、線状または閉環プラスミド等のベクターであり得る。ベクターシステムは、単一ベクターもしくはプラスミド、または宿主のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む２つ以上のベクターもしくはプラスミドであり得る。さらに、ベクターは、発現ベクターであり得る。本発明の核酸は、例えば、連結コードポリヌクレオチドまたは他のＤＮＡエレメントの発現を駆動するために１つまたは複数の宿主において機能する適切なプロモーターの制御下でベクターに適切に挿入することができる。多くのベクターがこの目的のために利用でき、適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズおよびベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に主として依存する。各ベクターは、その機能（例えば、ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する個々の宿主細胞に依存する様々な構成成分を含む。
【０１４７】
トランスジェニック植物に鞘翅目害虫からの保護を与えるために、例えば、組換えＤＮＡを組換え植物の組織または液内でｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ分子）に転写させることができる。ｉＲＮＡ分子は、宿主植物種に被害をもたらし得る鞘翅目害虫内部の対応する転写ポリヌクレオチドと実質的に相同であり、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み得る。鞘翅目害虫は、例えば、ｉＲＮＡ分子を含むトランスジェニック宿主植物の細胞または液を摂取することにより、トランスジェニック宿主植物の細胞中で転写されるｉＲＮＡ分子と接触し得る。したがって、標的遺伝子の発現は、トランスジェニック宿主植物に外寄生する鞘翅目害虫体内のｉＲＮＡ分子により抑制される。いくつかの実施形態では、標的鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現の抑制により、植物が害虫による攻撃に抵抗することがもたらされ得る。
【０１４８】
本発明の組換え核酸分子により形質転換された植物細胞との栄養関係にある鞘翅目害虫へのｉＲＮＡ分子の送達を可能にするために、植物細胞中のｉＲＮＡ分子の発現（すなわち、転写）が必要である。したがって、組換え核酸分子は、核酸分子を増幅させる細菌細胞および核酸分子を発現させる植物細胞等の、宿主細胞中で機能する異種プロモーター配列等の１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結した本発明のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１４９】
本発明の核酸分子に用いるのに適するプロモーター配列は、すべてが当技術分野で周知である、誘導性、ウイルス、合成または構成性であるものを含む。そのようなプロモーターを記載している非限定的な例としては、米国特許第６，４３７，２１７号明細書（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；第５，６４１，８７６号明細書（イネアクチンプロモーター）；第６，４２６，４４６号明細書（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；第６，４２９，３６２号明細書（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；第６，２３２，５２６号明細書（トウモロコシＡ３プロモーター）；第６，１７７，６１１号明細書（構成性トウモロコシプロモーター）；第５，３２２，９３８号明細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６号明細書（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）；第６，４３３，２５２号明細書（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；第６，４２９，３５７号明細書（イネアクチン２プロモーターおよびイネアクチン２イントロン）；第６，２９４，７１４号明細書（光誘導性プロモーター）；第６，１４０，０７８号明細書（塩誘導性プロモーター）；第６，２５２，１３８号明細書（病原体誘導性プロモーター）；第６，１７５，０６０号明細書（リン欠乏誘導性プロモーター）；第６，３８８，１７０号明細書（二方向プロモーター）；第６，６３５，８０６号明細書（ガンマコイキシンプロモーター）；ならびに米国特許出願公開第２００９／７５７，０８９号明細書（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）等がある。追加のプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9）およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導プラスミド上で運ばれる）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター等のカリモウイルスプロモーター（Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24）；ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-2）；ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8）；スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8）；Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83）；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号明細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６号明細書）；ＦＭＶ  ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号明細書および第５，３７８，６１９号明細書）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号明細書）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号明細書）；およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受託番号Ｖ０００８７；Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7）等がある。
【０１５０】
特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、根特異的プロモーター等の組織特異的プロモーターを含む。根特異的プロモーターは、作動可能に連結したコードポリヌクレオチドの発現を根組織においてもっぱらまたは優先的に駆動する。根特異的プロモーターの例は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，１１０，７３２号明細書、第５，４５９，２５２号明細書および第５，８３７，８４８号明細書ならびにOpperman et al. (1994) Science 263:221-3；およびHirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18を参照のこと。いくつかの実施形態では、本発明による鞘翅目害虫の防除のためのポリヌクレオチドまたは断片は、該ポリヌクレオチドまたは断片に対して反対の転写方向に配向した２つの根特異的プロモーター間でクローニングされ得る。そして、それらは、トランスジェニック植物細胞中で作動可能であり、その中で発現して、上述のように、その後にｄｓＲＮＡ分子を形成し得るトランスジェニック植物細胞中のＲＮＡ分子を生成する。植物組織において発現したｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子発現の抑制が達成されるように鞘翅目害虫により摂取せることができる。
【０１５１】
対象の核酸分子に任意選択的に作動可能に連結することができるさらなる調節エレメントとしては、プロモーターエレメントとコードポリヌクレオチドとの間に位置する翻訳リーダーエレメントとして機能する５’ＵＴＲ等がある。翻訳リーダーエレメントは、完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在し、それは、一次転写物のプロセシングおよび／またはＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例としては、トウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）、植物ウイルス外被タンパク質、植物ルビスコリーダーおよびその他等がある。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照のこと。５’ＵＴＲの非限定的な例としては、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号明細書）；ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）；ＡｔＡｎｔｌ；ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7）；およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受託番号Ｖ０００８７；およびBevan et al. (1983) Nature 304:184-7）等がある。
【０１５２】
対象の核酸分子に任意選択的に作動可能に連結することができる追加の調節エレメントとしては、３’非翻訳配列、３’転写終結領域またはポリアデニル化領域等もある。これらは、ポリヌクレオチドの下流に位置する遺伝エレメントであり、ポリアデニル化シグナル、および／または転写またはｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことができる他の調節シグナルをもたらすポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物においてｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすように機能する。ポリアデニル化エレメントは、様々な植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し得る。３’転写終結領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ３’領域（ｎｏｓ３’；Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）である。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80に示されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ｐｓ．ＲＢｃＳ２−Ｅ９；Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受託番号Ｅ０１３１２）からのもの等がある。
【０１５３】
いくつかの実施形態は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドに作動可能に連結した上述の調節配列の少なくとも１つを含む単離かつ精製ＤＮＡ分子を含む植物形質転換ベクターを含み得る。発現した場合、該１つまたは複数のポリヌクレオチドは、鞘翅目害虫における天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部と特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のＲＮＡ分子（複数可）を生じさせる。したがって、該ポリヌクレオチド（複数可）は、標的鞘翅目害虫ＲＮＡ転写物内に存在するポリヌクレオチドのすべてまたは一部をコードするセグメントを含み得、標的害虫転写物のすべてまたは一部の逆向き反復配列を含み得る。植物形質転換ベクターは、複数の標的ポリヌクレオチドに特異的に相補的なポリヌクレオチドを含み、それにより、標的鞘翅目害虫の１つまたは複数の集団または種の細胞中の２つ以上の遺伝子の発現を阻害するための複数のｄｓＲＮＡの生成を可能にし得る。異なる遺伝子に存在するポリヌクレオチドに特異的に相補的なポリヌクレオチドのセグメントは、トランスジェニック植物における発現のための単一複合核酸分子中に組み合わせることができる。そのようなセグメントは、連続していても、またはリンカーにより分離されていてもよい。
【０１５４】
他の実施形態では、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド（複数可）を既に含む本発明のプラスミドは、同じプラスミドにおける追加のポリヌクレオチド（複数可）の逐次的挿入により修飾することができ、追加のポリヌクレオチド（複数可）は、最初の少なくとも１つのポリヌクレオチド（複数可）と同じ調節エレメントに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、複数の標的遺伝子の阻害のために設計することができる。いくつかの実施形態では、阻害される複数の遺伝子は、同じ鞘翅目害虫種から得ることができ、これにより、核酸分子の有効性が増大し得る。他の実施形態では、遺伝子は、異なる害虫（例えば、鞘翅目害虫）から得ることができ、これにより、作用物質（複数可）が有効である害虫の範囲が拡大し得る。複数の遺伝子を抑制または発現と抑制の組合せの標的とする場合、ポリシストロン性ＤＮＡエレメントを作製することができる。
【０１５５】
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、植物細胞等の形質転換細胞に選択可能な表現型を付与する選択可能マーカーを含み得る。選択可能マーカーは、本発明の組換え核酸分子を含む植物または植物細胞を選択するためにも用いることができる。マーカーは、殺生物剤抵抗性、抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン、ジェネチシン（Ｇ４１８）、ブレオマイシン、ハイグロマイシン等）または除草剤耐性（例えば、グリホセート等）をコードし得る。選択可能マーカーの例は、カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８等を用いて選択することができるｎｅｏ遺伝子；ビアラホス抵抗性をコードするｂａｒ遺伝子；グリホセート耐性をコードする突然変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を付与する突然変異アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子：およびメトトレキセート抵抗性ＤＨＦＲ遺伝子であり得るが、これらに限定されない。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリン等に対する抵抗性を付与する複数の選択可能マーカーが利用できる。そのような選択可能マーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号明細書、第５，６３３，４３５号明細書、第５，７８０，７０８号明細書および第６，１１８，０４７号明細書に示されている。
【０１５６】
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、スクリーニング可能マーカーも含み得る。スクリーニング可能マーカーは、発現をモニターするために用いることができる。例示的なスクリーニング可能マーカーとしては、様々な色原性基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードするＲ遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al. (1988) “Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.” In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp.263-82）；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41）；様々な色原性基質が公知である酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、色原性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow et al. (1986) Science 234:856-9）；色原性カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55）；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2）；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化し、これが次にメラニンに縮合することを可能にする酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14）；およびα−ガラクトシダーゼ等がある。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、上述の組換え核酸分子は、トランスジェニック植物の創製ならびに鞘翅目害虫に対する感受性の低下を示すトランスジェニック植物を調製するための植物における異種核酸の発現の方法に用いることができる。植物形質転換ベクターは、例えば、ｉＲＮＡ分子をコードする核酸分子を植物形質転換ベクターに挿入し、これらを植物に導入することによって調製することができる。
【０１５８】
宿主細胞の形質転換の適切な方法としては、例えば、プロトプラストの形質転換による（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号明細書参照）、乾燥／抑制媒介ＤＮＡ取込みによる（例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8参照）、エレクトロポレーションによる（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号明細書参照）、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌による（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号明細書および第５，４６４，７６５号明細書参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換による（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号明細書、第５，５９１，６１６号明細書、第５，６９３，５１２号明細書、第５，８２４，８７７号明細書、第５，９８１，８４０号明細書および第６，３８４，３０１号明細書参照）およびＤＮＡコーティング粒子の促進による（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号明細書、第５，５５０，３１８号明細書、第５，５３８，８８０号明細書、第６，１６０，２０８号明細書、第６，３９９，８６１号明細書および第６，４０３，８６５号明細書参照）等の、ＤＮＡを細胞に導入することができる方法等がある。コーンを形質転換するのにとりわけ有用な技術は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号明細書および第５，５９１，６１６号明細書ならびに国際ＰＣＴ公開国際公開第９５／０６７２２号パンフレットに記載されている。これらのような技術の適用により、事実上あらゆる種の細胞を安定に形質転換させることができる。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込む。多細胞種の場合、トランスジェニック細胞をトランスジェニック生物に再生することができる。これらの技術のいずれも、例えば、トランスジェニック植物のゲノムに１つまたは複数のｉＲＮＡ分子をコードする１つまたは複数の核酸を含むトランスジェニック植物を産生するのに用いることができる。
【０１５９】
発現ベクターを植物に導入するために最も広く用いられている方法は、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）の天然の形質転換システムに基づいている。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞に遺伝的に形質転換を起こさせる植物病原性土壌細菌である。それぞれＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、植物の遺伝的形質転換に関与する遺伝子を運ぶ。Ｔｉ（腫瘍誘導）プラスミドは、形質転換植物に転移する、Ｔ−ＤＮＡとして公知である大きいセグメントを含む。Ｔｉプラスミドの他のセグメントである、Ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ転移に関与する。Ｔ−ＤＮＡ領域は、末端反復配列に隣接する。修飾バイナリーベクターにおいて、腫瘍誘導遺伝子が欠失しており、Ｖｉｒ領域の機能は、Ｔ−ＤＮＡ境界エレメントが隣接する外来ＤＮＡを導入するために用いられる。Ｔ領域は、トランスジェニック細胞および植物の効率的な回収のための選択可能マーカー、ならびに核酸をコードするｄｓＲＮＡ等の導入のためのポリヌクレオチドを挿入するための多重クローニング部位も含み得る。
【０１６０】
したがって、いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号明細書、第４，６９３，９７７号明細書、第４，８８６，９３７号明細書および第５，５０１，９６７号明細書ならびに欧州特許第０１２２７９１号明細書参照）またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＲｉプラスミドに由来する。追加の植物形質転換ベクターとしては、例えば、および制限なく、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7；Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42により；および欧州特許第０１２０５１６号明細書に記載されているもの、ならびに前述のもののいずれかに由来するもの等がある。天然で植物と相互作用するシノリゾビウム属（Sinorhizobium）、リゾビウム属（Rhizobium）およびメソリゾビウム属（Mesorhizobium）等の他の細菌を、多くの多様な植物への遺伝子導入を媒介するように修飾することができる。これらの植物関連共生細菌は、非病害性Ｔｉプラスミドおよび適切なバイナリーベクターの両方の獲得により遺伝子導入に適格にすることができる。
【０１６１】
外因性ＤＮＡをエント細胞に供給した後、形質転換細胞は、一般的にさらなる培養および植物再生のために同定される。形質転換細胞を同定する能力を改善するために、前述の選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を形質転換体を生成するために用いる形質転換ベクターとともに用いることを望むことができる。選択可能マーカーを用いる場合、細胞を選択剤または複数の選択剤に曝露することにより、形質転換細胞は、形質転換された可能性のある細胞集団内で同定される。スクリーニング可能マーカーを用いる場合、所望のマーカー遺伝子形質について細胞をスクリーニングすることができる。
【０１６２】
選択剤への曝露で生残している細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性と評価された細胞は、植物の再生を補助する培地中で培養することができる。いくつかの実施形態では、任意の適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）は、成長調節剤等のさらなる物質を含めることにより改良することができる。植物再生努力を開始するのに十分な組織が利用できるまで、または手作業による選択を反復した後、組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）、組織を成長調節剤を含む基礎培地上に維持し、その後、芽条形成を促す培地に移す。十分な芽条形成が起こるまで、培養物を定期的に移す。芽条が形成されたならば、それらを根形成を促す培地に移す。十分な根が形成されたならば、さらなる成長および成熟のために植物を土壌に移すことができる。
【０１６３】
再生植物における対象の核酸分子（例えば、鞘翅目害虫における標的遺伝子発現を抑制する１つまたは複数のｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ）の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイとしては、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲならびに核酸配列決定等の分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロット）によるまたは酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出等の生化学的アッセイ；葉部または根部アッセイ等の植物部位アッセイ；ならびに全再生植物の表現型の解析等がある。
【０１６４】
組込みイベントは、例えば、例えば対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅により解析することができる。ＰＣＲ遺伝子型決定は、ゲノムに組み込まれた対象の核酸分子を含むと予測された単離宿主植物カルス組織から得られたｇＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と、それに続くＰＣＲ増幅産物の標準クローニングおよび配列解析を含むが、これらに限定されないと理解される。ＰＣＲ遺伝子型決定の方法は、十分に記載され（例えば、Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53）、任意の植物種（例えば、Ｚ．マイス（Z. mays））または細胞培養物を含む組織型に由来するｇＤＮＡに適用することができる。
【０１６５】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）依存性形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、一般的に１つの染色体に挿入された単一組換えＤＮＡを含む。該単一組換えＤＮＡのポリヌクレオチドは、「トランスジェニックイベント」または「組込みイベント」と呼ばれる。そのようなトランスジェニック植物は、挿入外来ポリヌクレオチドに対して異型接合である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子に対して同型接合であるトランスジェニック植物は、単一外来遺伝子を含む独立分離トランスジェニック植物をそれ自体、例えば、Ｔ０植物と性的に交配（自殖）して、Ｔ１種子を産生することにより得ることができる。産生されたＴ１種子の４分の１は、導入遺伝子に対して同型接合となる。Ｔ１種子を発芽させることにより、一般的に異型接合体と同型接合体との区別を可能にするＳＮＰアッセイまたは熱増幅アッセイ（すなわち、接合性アッセイ）を用いて異型接合性について試験することができる植物が得られる。
【０１６６】
特定の実施形態では、鞘翅目害虫保護効果を有する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０種またはそれ以上の異なるｉＲＮＡ分子が植物細胞中で産生される。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、異なる形質転換イベントで導入された複数の核酸から、または単一形質転換イベントで導入された単一核酸から発現させることができる。いくつかの実施形態では、複数のｉＲＮＡ分子が単一プロモーターの制御下で発現する。他の実施形態では、複数のｉＲＮＡ分子が複数のプロモーターの制御下で発現する。鞘翅目害虫の同じ種の異なる集団、あるいは鞘翅目害虫の異なる種の両方において、１つもしくは複数の鞘翅目害虫内部の異なる遺伝子座（例えば、配列番号１、３および６７で定義される遺伝子座）に対してそれぞれ相同である複数のポリヌクレオチドを含む単一ｉＲＮＡ分子を発現させることができる。
【０１６７】
組換え核酸分子による植物の直接形質転換に加えて、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第１の植物をそのようなイベントを欠いている第２の植物と交配することにより、トランスジェニック植物を作製することができる。例えば、ｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を形質転換に適用できる第１の植物系統に導入して、トランスジェニック植物を産生することができ、そのトランスジェニック植物を第２の植物系統と交配して、ｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを第２の植物系統に移入することができる。
【０１６８】
本発明はまた、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む商品生産物を含む。特定の実施形態は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組換え植物または種子から生産された商品生産物を含む。本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む商品生産物は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、植物の粗びき粉、油、粉砕もしくは全粒または種子、あるいは組換え植物または種子の粗びき粉、油、または粉砕もしくは全粒を含む食品生産物を含むと思われるが、これらに限定されないものとする。ここで企図した１つまたは複数の一次産品または商品生産物中の本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドの検出は、一次産品または商品生産物が、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制法を用いて害虫を防除する目的のために本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現するように設計されたトランスジェニック植物から生産されるという事実上の証拠である。
【０１６９】
いくつかの態様では、形質転換植物細胞から得られたトランスジェニック植物により生産された種子および商品生産物が含まれ、種子または商品生産物は、検出可能な量の本発明の核酸を含む。いくつかの実施形態では、そのような商品生産物は、例えば、トランスジェニック植物を得て、それらから食品または飼料を調製することによって生産することができる。本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む商品生産物としては、例えば、および制限なく、本発明の１つまたは複数の核酸を含む、植物の粗びき粉、油、粉砕もしくは全粒または種子、ならびに組換え植物または種子の粗びき粉、油、または粉砕もしくは全粒を含むあらゆる食品等がある。１つまたは複数の一次産品または商品生産物中の本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドの検出は、一次産品または商品生産物が、鞘翅目害虫を防除する目的のために本発明の１つまたは複数のｉＲＮＡ分子を発現するように設計されたトランスジェニック植物から生産されるという事実上の証拠である。
【０１７０】
他の実施形態では、本発明の核酸分子を含むトランスジェニック植物または種子は、制限なく、以下を含む、そのゲノムに少なくとも１つの他のトランスジェニックイベントも含み得る：配列番号１、配列番号３、および配列番号６７により定義されるもの以外の鞘翅目害虫における遺伝子座を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；鞘翅目害虫以外の生物（例えば、植物寄生線虫）における遺伝子を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；殺虫タンパク質（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホセートに対する耐性を与える遺伝子）；ならびに収量の増加、脂肪酸代謝の変化または細胞質雄性不稔性の回復等のトランスジェニック植物における望ましい表現型に寄与する遺伝子。特定の実施形態では、植物病害および昆虫被害の防除の増大のための所望の形質を達成するために本発明のｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを植物における他の昆虫防除および病害抵抗性形質と組み合わせることができる。異なる作用機序を用いる昆虫防除形質を組み合わせることは、単一の防除形質を有する植物と比べて優れた耐久性を有する保護トランスジェニック植物をもたらし得る。その理由は、例えば、形質（複数可）に対する抵抗性が圃場で起こる可能性が低いためである。
【０１７１】
Ｖ．鞘翅目害虫における標的遺伝子の抑制
Ａ．概要
本発明のいくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な少なくとも１つの核酸分子を鞘翅目害虫に与えることができ、核酸分子は、害虫におけるＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングをもたらす。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）を鞘翅目害虫に与えることができる。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、核酸分子を害虫と接触させることによって害虫に与えることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、害虫の給餌基体、例えば、栄養組成物に加えることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、害虫により摂取される核酸分子を含む植物物質の摂取により与えることができる。特定の実施形態では、核酸分子は、植物物質に導入された組換え核酸の発現により、例えば、組換え核酸を含むベクターによる植物細胞の形質転換および形質転換植物細胞からの植物物質または全植物の再生により、植物物質中に存在する。
【０１７２】
Ｂ．ＲＮＡｉ媒介遺伝子抑制
特定の複数の実施形態では、本発明は、例えば、標的ポリヌクレオチドと特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの鎖を含むｉＲＮＡ分子を設計することにより、鞘翅目（例えば、ＷＣＲもしくはＮＣＲ）害虫のトランスクリプトームにおける必須天然ポリヌクレオチド（例えば、必須遺伝子）を標的とするように設計することができるｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）を提供する。そのように設計されたｉＲＮＡ分子の配列は、標的ポリヌクレオチドと同一であり得るか、あるいはｉＲＮＡ分子とその標的ポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを妨げないミスマッチを取り込み得る。
【０１７３】
本発明のｉＲＮＡ分子を鞘翅目害虫における遺伝子抑制の方法に用い、それにより、植物（例えば、ｉＲＮＡ分子を含む保護形質転換植物）おける害虫によってもたらされる被害のレベルまたは発生率を低下させることができる。本明細書で用いているように、「遺伝子抑制」という用語は、発現の転写後抑制および転写抑制を含む遺伝子またはコードポリヌクレオチドからのタンパク質発現の低下を含む、ｍＲＮＡへの遺伝子転写およびｍＲＮＡのその後の翻訳の結果として産生されるタンパク質のレベルを低下させる周知の方法のいずれかを意味する。転写後抑制は、抑制の標的とする遺伝子から転写されたｍＲＮＡのすべてまたは一部と抑制のために用いる対応するｉＲＮＡ分子との間の特異的相同性によって媒介される。さらに、転写後抑制は、リポソームによる結合のために細胞中で利用できるｍＲＮＡの量の実質的かつ測定可能な低下を意味する。
【０１７４】
ｉＲＮＡ分子がｄｓＲＮＡ分子である特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、酵素であるＤＩＣＥＲによって短いｓｉＲＮＡ分子（長さが約２０ヌクレオチド）に切断され得る。ｄｓＲＮＡ分子に対するＤＩＣＥＲ活性により生じた二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、２つの一本鎖ｓｉＲＮＡ、すなわち「パッセンジャー鎖」と「ガイド鎖」に分離され得る。パッセンジャー鎖は、分解することができ、ガイド鎖は、ＲＩＳＣに取り込むことができる。転写後抑制は、ガイド鎖とｍＲＮＡ分子の特異的に相補的なポリヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションおよびその後のアルゴノート（ＲＩＳＣ複合体の触媒構成成分）酵素による切断によって起こる。
【０１７５】
いくつかの本発明の実施形態では、あらゆる形態のｉＲＮＡ分子を用いることができる。当業者は、ｄｓＲＮＡ分子が、調製中および細胞にｉＲＮＡ分子を供給するステップ中に一般的に一本鎖ＲＮＡ分子よりも安定であり、細胞中でも一般的により安定であることを理解するであろう。したがって、例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子は、いくつかの実施形態では同等に有効であり得るが、ｄｓＲＮＡ分子をその安定性のため選択することができる。
【０１７６】
特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させて、鞘翅目害虫のゲノム内のポリヌクレオチドによりコードされる核酸分子と実質的に相同であるｉＲＮＡ分子を生成することができる、ポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｉＲＮＡ分子は、ステム−ループ構造を含む安定化ｄｓＲＮＡ分子であり得る。鞘翅目害虫がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｉＲＮＡ分子と接触した後、害虫における標的遺伝子（例えば、必須遺伝子）の転写後阻害が起こり得る。
【０１７７】
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１９個の連続したヌクレオチド）を含む核酸分子からのｉＲＮＡの発現を鞘翅目害虫における標的遺伝子の転写後抑制の方法に用い、ポリヌクレオチドは、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号３；配列番号３の相補体；配列番号６７；配列番号６７の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号３の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号３の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号６７の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号６７の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの相補体；配列番号３を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチド；配列番号３を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの相補体；配列番号６７を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチド；配列番号６７を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号３を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号３を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号６７を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号６７を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される。特定の実施形態では、前述のもののいずれかと少なくとも約８０％同一（例えば、７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％および１００％）である核酸分子の発現を用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫の少なくとも１つの細胞中に存在するＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。
【０１７８】
ＲＮＡｉ転写後抑制システムが、遺伝子突然変異、系統多型または進化的分岐のため予想され得る標的遺伝子における配列変動に耐えることができることは、本明細書におけるいくつかの実施形態の重要な特徴である。導入される核酸分子が標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズされる限り、導入される核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと絶対的に相同である必要はあり得ない。さらに、導入される核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡに対して、全長である必要はあり得ない。
【０１７９】
本発明のｉＲＮＡ技術を用いる標的遺伝子の阻害は、配列特異的である。すなわち、ｉＲＮＡ分子（複数可）と実質的に相同のポリヌクレオチドは、遺伝的阻害の標的となる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を阻害のために用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、標的ポリヌクレオチドと比べて１つまたは複数の挿入、欠失および／または点突然変異を有するポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を用いることができる。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子と標的遺伝子の一部は、例えば、少なくとも約８０％以上、少なくとも約８１％以上、少なくとも約８２％以上、少なくとも約８３％以上、少なくとも約８４％以上、少なくとも約８５％以上、少なくとも約８６％以上、少なくとも約８７％以上、少なくとも約８８％以上、少なくとも約８９％以上、少なくとも約９０％以上、少なくとも約９１％以上、少なくとも約９２％以上、少なくとも約９３％以上、少なくとも約９４％以上、少なくとも約９５％以上、少なくとも約９６％以上、少なくとも約９７％以上、少なくとも約９８％以上、少なくとも約９９％以上、少なくとも約１００％以上、および１００％の配列同一性を共有し得る。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の二重らせん領域は、標的遺伝子転写物の一部と特異的にハイブリダイズ可能であり得る。特異的にハイブリダイズ可能な分子において、より大きい相同性を示す全長に満たないポリヌクレオチドは、より長く、より低い相同性のポリヌクレオチドを補う。標的遺伝子転写物の一部と同一であるｄｓＲＮＡ分子の二重らせん領域のポリヌクレオチドの長さは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００または少なくとも約１０００塩基であり得る。いくつかの実施形態では、２０〜１００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチドを用いることができ、例えば、１００〜２００または３００〜５００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを用いることができる。特定の実施形態では、約２００〜３００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチドを用いることができる。特定の実施形態では、標的遺伝子のサイズによって、約５００〜１０００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチドを用いることができる。
【０１８０】
特定の実施形態では、鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現は、著しい抑制が起こるように、害虫の細胞内で少なくとも１０％、少なくとも３３％、少なくとも５０％、または少なくとも８０％抑制され得る。著しい抑制は、検出可能な表現型をもたらす閾値を超える抑制（例えば、生殖、摂食、発育の停止等）、あるいはＲＮＡの検出可能な減少および／または標的遺伝子に対応する遺伝子産物が抑制されることを意味する。本発明の特定の実施形態では、抑制は、害虫の実質的にすべての細胞で起こるが、他の実施形態では、抑制は、標的遺伝子を発現する細胞のサブセットでのみ起こる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、転写抑制は、「プロモータートランス抑制」と呼ばれることを達成するように、プロモーターＤＮＡまたはその相補体との実質的な配列同一性を示すｄｓＲＮＡ分子の細胞中の存在によって媒介される。遺伝子抑制は、例えば、ｄｓＲＮＡ分子を含む植物物質を摂取またはそれと接触することにより、そのようなｄｓＲＮＡ分子を摂取またはそれと接触し得る鞘翅目害虫における標的遺伝子に対して有効であり得る。プロモータートランス抑制に用いるｄｓＲＮＡ分子は、鞘翅目害虫の細胞中の１つまたは複数の相同または相補的ポリヌクレオチドの発現を阻害または抑制するように特別に設計することができる。植物細胞における遺伝子発現を調節するためのアンチセンスまたはセンス配向ＲＮＡによる転写後遺伝子抑制は、米国特許第５，１０７，０６５号明細書、第５，７５９，８２９号明細書、第５，２８３，１８４号明細書および第５，２３１，０２０号明細書に開示されている。
【０１８２】
Ｃ．鞘翅目害虫に与えるｉＲＮＡ分子の発現
鞘翅目害虫におけるＲＮＡｉ媒介遺伝子抑制のためのｉＲＮＡ分子の発現は、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ方式のいずれか１つにより行うことができる。ｉＲＮＡ分子は、次に、例えば、ｉＲＮＡ分子を鞘翅目害虫と接触させることにより、または害虫にｉＲＮＡ分子を摂取もしくは別の方法でインターナリゼーションさせることにより、害虫に与えることができる。本発明のいくつかの実施形態は、鞘翅目害虫の形質転換宿主植物、形質転換植物細胞ならびに形質転換植物の子孫を含む。形質転換植物細胞および形質転換植物は、害虫保護効果をもたらすために、例えば、異種プロモーターの制御下で１つまたは複数のｉＲＮＡ分子を発現するように工学的に操作することができる。したがって、形質転換植物および植物細胞が摂食時に鞘翅目害虫により消費される場合、害虫は、トランスジェニック植物または細胞において発現したｉＲＮＡ分子を摂取し得る。本発明のポリヌクレオチドは、様々な原核および真核微生物宿主に導入して、ｉＲＮＡ分子を生成することもできる。「微生物」という用語は、細菌および菌類等の原核および真核種を含む。
【０１８３】
遺伝子発現の調節は、そのような発現の部分的または完全な抑制を含み得る。他の実施形態では、鞘翅目害虫における遺伝子発現の抑制の方法は、その少なくとも１つのセグメントが鞘翅目害虫の細胞内のｍＲＮＡ配列と相補的である、本明細書で述べたポリヌクレオチドの転写後に形成された遺伝子抑制量の少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子を害虫の宿主の組織に供給することを含む。本発明による鞘翅目害虫により摂取されるｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子等のその改変型を含む、ｄｓＲＮＡ分子は、例えば、配列番号１、配列番号３および配列番号６７からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％同一であり得る。したがって、それらに導入された場合、鞘翅目害虫における内因性コードポリヌクレオチドまたは標的コードポリヌクレオチドの発現を抑制または阻害する、本発明のｄｓＲＮＡ分子を得るための非天然ポリヌクレオチドおよび組換えＤＮＡ構築物を含むが、これらに限定されない単離され、実質的に精製された核酸分子を提供する。
【０１８４】
特定の実施形態は、鞘翅目害虫植物における１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）の転写後阻害ならびに植物害虫の集団の防除のためのｉＲＮＡ分子の送達のための送達システムを提供する。いくつかの実施形態では、送達システムは、宿主細胞中で転写されたＲＮＡ分子を含む宿主トランスジェニック植物細胞または宿主細胞の内容物の摂取を含む。これらおよびさらなる実施形態では、本発明の安定化ｄｓＲＮＡ分子を供給する（providing）組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物を創製する。特定のｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物は、組換えＤＮＡ技術（当技術分野で周知である基本技術）を用いて、本発明のｉＲＮＡ分子（例えば、安定化ｄｓＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベーターを構築し、植物細胞または植物を形質転換し、転写ｉＲＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物を生成することにより、産生することができる。
【０１８５】
トランスジェニック植物に鞘翅目害虫からの保護を与えるために、例えば、組換えＤＮＡ分子をｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子またはｈｐＲＮＡ分子等のｉＲＮＡ分子に転写することができる。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子は、組換え植物の組織または液内でｄｓＲＮＡ分子を形成し得る。そのようなｄｓＲＮＡ分子は、宿主植物に外寄生し得る種類の鞘翅目害虫体内のＤＮＡから転写される対応するポリヌクレオチドと同一であるポリヌクレオチドから一部構成され得る。鞘翅目害虫体内の標的遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡ分子により抑制され、鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現の抑制は、トランスジェニック植物が害虫への抵抗をもたらす。ｄｓＲＮＡ分子の調節作用は、例えば、ハウスキーピング遺伝子；転写因子；脱皮関連遺伝子；ならびに細胞代謝または正常成長および発育に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子を含む、細胞分裂、染色体リモデリングおよび細胞代謝または細胞形質転換に関与する内因性遺伝子を含む、害虫において発現する様々な遺伝子に適用できることが示された。
【０１８６】
導入遺伝子からのｉｎ  ｖｉｖｏでの、または発現構築物からの転写のために、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーおよびポリアデニル化シグナル）をいくつかの実施形態で用いて、ＲＮＡ鎖（または（複数の）鎖）を転写することができる。したがって、いくつかの実施形態では、上述のように、ｉＲＮＡ分子を生成するのに用いるポリヌクレオチドは、植物宿主細胞中の機能し得る１つまたは複数のプロモーターエレメントに作動可能に連結することができる。プロモーターは、通常、宿主ゲノムに常在する内因性プロモーターであり得る。本発明のポリヌクレオチドは、作動可能に連結したプロモーターエレメントの制御下で、その転写および／または得られる転写物の安定性に有利に作用するさらなるエレメントにより両側に隣接され得る。そのようなエレメントは、作動可能に連結したプロモーターの上流、発現構築物の３’末端の下流に位置し、プロモーターの上流と発現構築物の３’末端の下流の両方に存在し得る。
【０１８７】
実施形態では、標的遺伝子（例えば、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子）の抑制は、親ＲＮＡｉ表現型；ｉＲＮＡ分子と接触した対象（例えば、鞘翅目害虫）の子孫に観測可能である表現型をもたらす。いくつかの実施形態では、ｐＲＮＡｉ表現型は、害虫が生存能力のある子孫を産む能力がより低くなっていることを含む。ｐＲＮＡｉの特定の例において、ｐＲＮＡｉを開始する核酸は、核酸が送達される集団における（例えば、幼虫を含む全集団の成体集団における）死亡の発生率を増加させない。ｐＲＮＡｉの他の例において、ｐＲＮＡｉを開始する核酸は、核酸が送達される集団における死亡の発生率も増加させる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の集団をｉＲＮＡ分子と接触させ、それにより、ｐＲＮＡｉをもたらし、害虫は、生存し、交配するが、核酸（複数可）が与えられていない同じ種の害虫により産生される卵よりも生存能力のある子孫を孵化する能力が低い卵を産生する。いくつかの例において、そのような害虫は、卵を産卵しないか、またはｉＲＮＡ分子と接触していない同じ種の害虫において観察可能なものより少数の卵を産生する。いくつかの例において、そのような害虫により産卵された卵は、孵化しないか、またはｉＲＮＡ分子と接触していない同じ種の害虫において観察可能なものより著しく低い率で孵化する。いくつかの例において、そのような害虫により産卵された卵から孵化する幼虫は、生存能力がないか、またはｉＲＮＡ分子と接触していない同じ種の害虫において観察可能なものより生存能力が低い。
【０１８９】
昆虫による摂食からの保護をもたらす物質を産生するトランスジェニック作物は、昆虫保護物質（複数可）の利益の持続性を低減させる標的害虫集団による適応に脆弱である。伝統的には、トランスジェニック作物に対する害虫の適応の遅延は、（１）「リフュージ」（殺虫物質を含まず、したがって、殺虫物質（複数可）に感受性である昆虫の生存を可能にする作物）の植付け、および／または（２）１つの作用機序に抵抗性である個体が第２の作用機序により殺滅されるように、標的害虫に対する複数の作用機序を有する殺虫物質を組み合わせることによって達成される。
【０１９０】
いくつかの例において、ｉＲＮＡ分子（例えば、宿主植物における導入遺伝子から発現する）は、昆虫抵抗性管理遺伝子ピラミッドにおけるバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質技術および／または致死性ＲＮＡｉ技術と組み合わせて、これらの防除技術のいずれかに対して抵抗性の昆虫集団の発生を軽減するための新たな作用機序を提示している。
【０１９１】
親ＲＮＡｉは、いくつかの実施形態では、致死性ＲＮＡｉにより得られる防除と異なる種類の害虫防除をもたらす可能性があり、これを致死性ＲＮＡｉと組み合わせて相乗的な害虫防除をもたらすことができる。したがって、特定の実施形態では、鞘翅目植物害虫における１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）の転写後阻害のためのｉＲＮＡ分子は、他のｉＲＮＡ分子と組み合わせて冗長ＲＮＡｉターゲティングおよび相乗的ＲＮＡｉ効果を提供することができる。
【０１９２】
卵の死亡または卵生存能力の喪失をもたらす親ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）は、昆虫保護のためのＲＮＡｉおよび他の機序を使用するトランスジェニック作物にさらなる耐久性の利益をもたらす可能性を有する。ｐＲＮＡｉは、曝露昆虫が子孫を産むことと、したがって、殺虫物質（複数可）に対する抵抗性をもたらす、それらが保有する任意の対立遺伝子を次世代に伝えることとを妨げる。ｐＲＮＡｉは、同じ害虫集団からの保護をもたらす１つまたは複数のさらなる殺虫物質と組み合わせる場合に昆虫保護トランスジェニック作物の耐久性を延長させるのにとりわけ有用である。そのようなさらなる殺虫物質は、いくつかの実施形態では、例えば、ｄｓＲＮＡ；幼虫活性ｄｓＲＮＡ；殺虫タンパク質（バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）または他の生物に由来するもの等）；および他の殺虫物質を含み得る。この利益は、殺虫物質に対して抵抗性である昆虫が、リフュージ作物におけるよりもトランスジェニック作物において集団のより高い割合として発生するために生ずる。次世代に伝えられる抵抗性対立遺伝子と感受性対立遺伝子との比が、ｐＲＮＡｉの非存在下よりもｐＲＮＡｉの存在下で低い場合、抵抗性の発生は遅延する。
【０１９３】
例えば、ｐＲＮＡｉは、ｉＲＮＡ分子を発現する植物に被害を与えている第一害虫世代における個体の数を減少させない可能性がある。しかし、そのような害虫が次世代まで外寄生を持続する能力は、低下する可能性がある。逆に、致死性ＲＮＡｉは、植物に既に外寄生している害虫を死滅させる可能性がある。ｐＲＮＡｉを致死性ＲＮＡｉと組み合わせる場合、親ｉＲＮＡ分子と接触する害虫は、ｉＲＮＡと接触しなかった系外の害虫と交配する可能性があるが、そのような交配の子孫は、生存不能または生存能力がより低く、したがって、植物に外寄生することが不可能である可能性がある。同時に、致死性ｉＲＮＡ分子と接触する害虫は、直接的に影響を受ける可能性がある。これらの２つの効果の組合せは相乗的であり得る。すなわち、組み合わせたｐＲＮＡｉおよび致死性ＲＮＡｉ効果は、ｐＲＮＡｉおよび致死性ＲＮＡｉの単独での効果の和より大きい可能性がある。ｐＲＮＡｉは、例えば、致死性および親ｉＲＮＡ分子の両方を発現する植物を用意することにより；致死性ｉＲＮＡ分子を発現する第１の植物および親ｉＲＮＡ分子を発現する第２の植物を同じ場所に配置することにより；ならびに／あるいは雌および／または雄害虫をｐＲＮＡｉ分子と接触させ、その後、それらが植物害虫と非生産的に交配することができるように、接触害虫を植物環境中に放つことにより、ｐＲＮＡｉを致死性ＲＮＡｉと組み合わせることができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態は、植物を常食とする鞘翅目害虫により引き起こされる宿主植物（例えば、コーン植物）に対する被害を低減する方法であって、本発明の少なくとも１つの核酸分子を発現する形質転換植物細胞を宿主植物に供給することを含み、核酸分子（複数可）は、害虫（複数可）により取り込まれることにより機能して、害虫（複数可）内部の標的ポリヌクレオチドの発現を阻害し、その発現の抑制が、例えば、害虫（複数可）の死亡および／または成長の低減に加えて、生殖の低減をもたらし、それにより、害虫により引き起こされる宿主植物に対する被害を低減する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、ｄｓＲＮＡ分子を含む。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれが鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な１つのポリヌクレオチドからなる。
【０１９５】
他の実施形態では、コーン作物の収量を増加させる方法であって、本発明の少なくとも１つの核酸分子をコーン植物に導入することと、および核酸を含むｉＲＮＡ分子の発現を可能にするためにコーン植物を培養することとを含み、核酸を含むｉＲＮＡ分子の発現が、鞘翅目害虫の被害ならびに／あるいは成長を抑制し、それにより、鞘翅目害虫の外寄生による収量低下を低減または解消する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれ鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子（複数可）は、鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる１つのポリヌクレオチドからなる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、植物作物の収量を増加させる方法であって、本発明の少なくとも１つの核酸分子を雌鞘翅目害虫に導入する（例えば、注入により、摂取により、噴霧することにより、およびＤＮＡからの発現により）ことと、雌害虫を作物中に放つこととを含み、雌害虫を含む交配対が生存能力のある子孫を産むことが不可能または産む能力がより低くなり、それにより、鞘翅目害虫の外寄生による収量低下を低減または解消する、方法を提供する。特定の実施形態では、そのような方法は、害虫の次世代の防除をもたらす。同様の実施形態では、方法は、本発明の核酸分子を雄鞘翅目害虫に導入することと、雄害虫を作物中に放つこととを含む（例えば、ｐＲＮＡｉ雄害虫は、未処理対照より少ない精子を生成する）。例えば、ＷＣＲ雌が一般的に１回のみ交配することを考慮すると、これらのｐＲＮＡｉ雌および／または雄は、交配をめぐり天然ＷＣＲ昆虫を圧倒するための競合に用いることができる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｉＲＮＡ分子を生成するように発現するＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれが鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能である複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能である１つのポリヌクレオチドからなる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、本発明の少なくとも１つのｉＲＮＡ分子をコードする、ポリヌクレオチドがプロモーターおよび転写終結エレメントに作動可能に連結されている、ポリヌクレオチドを含むベクターにより植物細胞を形質転換することと、複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で形質転換植物細胞を培養することと、ポリヌクレオチドをそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされるｉＲＮＡ分子の発現について形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、ｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック植物細胞を選択することと、鞘翅目害虫に選択されたトランスジェニック植物細胞を食餌として与えることとを含む、方法を提供する。植物も、組み込まれた核酸分子によりコードされるｉＲＮＡ分子を発現する形質転換植物細胞から再生させることができる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれ鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子（複数可）は、鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる１つのポリヌクレオチドからなる。
【０１９８】
本発明のｉＲＮＡ分子は、植物細胞のゲノムに取り込まれた、または植え付けの前の種子に適用されるコーティングもしくは種子処理に取り込まれるような組換え遺伝子からの発現の産物として、植物種（例えば、コーン）の種子に取り込むことができる。組換え遺伝子を含む植物細胞は、トランスジェニックイベントであると考えられる。本発明の実施形態に鞘翅目害虫へのｉＲＮＡ分子の送達のための送達システムも含まれる。例えば、本発明のｉＲＮＡ分子は、害虫（複数可）の細胞に直接導入することができる。導入の方法は、鞘翅目害虫の食餌中へのｉＲＮＡの直接混入（例えば、害虫の宿主の植物組織と混合することによる）、ならびに本発明のｉＲＮＡ分子を含む組成物の宿主植物組織への散布を含み得る。例えば、ｉＲＮＡ分子は、植物表面上に噴霧することができる。あるいは、ｉＲＮＡ分子は、微生物により発現させることができ、微生物は、植物表面上に塗布することができ、または注入等の物理的手段により根もしくは幹に導入することができる。上で述べたように、トランスジェニック植物は、植物に外寄生することが公知の鞘翅目害虫を殺すのに十分な量で少なくとも１つのｉＲＮＡ分子を発現するように工学的に操作することもできる。化学または酵素合成により生成したｉＲＮＡ分子は、一般的農業慣行と調和した方法で製剤化することもでき、鞘翅目害虫による植物被害を防除するためのスプレー式製品として用いることができる。製剤は、効果的な葉の被覆に必要な適切なアジュバント（例えば、展着剤および湿潤剤）、ならびにＵＶ損傷からｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）を保護するためのＵＶ保護剤を含み得る。そのような添加物は、生物殺虫剤産業で一般的に用いられており、当業者に周知である。そのような施用は、鞘翅目害虫からの植物の保護を向上させるために他のスプレー式殺虫剤施用（生物学的に基づくまたは別の方法）と組み合わせることができる。
【０１９９】
本明細書で引用した刊行物、特許および特許出願を含む、すべての参考文献は、本開示の明示的詳細と不一致でない程度まで、参照によって本明細書に組み込まれ、したがって、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個別かつ具体的に示され、本明細書にその全体が記載されていたかのようなことと同じ程度に組み込まれる。本明細書で述べた参考文献は、本出願の出願日の前のそれらの開示についてのみ記載する。本明細書における何物も、発明者らが先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことの容認と解釈すべきでない。
【０２００】
以下の実施例は、特定の個別の特徴および／または態様を例示するために示す。これらの実施例は、述べる特定の特徴または態様に本開示を限定するものと解釈すべきではない。
［実施例］
【実施例１】
【０２０１】
材料および方法
試料の調製およびジアブロティカ属（Diabrotica）幼虫給餌アッセイのためのバイオアッセイ
多数のｄｓＲＮＡ分子（ｈｕｎｃｈｂａｃｋに相当するものを含む）を、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉキット（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）またはＨｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを用いて合成および精製した。精製ｄｓＲＮＡ分子は、ＴＥ緩衝液に入れて用意し、すべてのバイオアッセイは、ＷＣＲの死および成長阻害についてのバックグラウンド基準としての役割を果たした、この緩衝液からなる対照処理を含んでいた。バイオアッセイ緩衝液中のｄｓＲＮＡ分子の濃度は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて測定した。
【０２０２】
人工昆虫飼料を給餌した新生幼虫を用いて実施したバイオアッセイにおける昆虫活性について試料を試験した。ＷＣＲ卵は、ＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ，ＩＮＣ．（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から入手した。
【０２０３】
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された（Ｃ−Ｄ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）１２８ウエルプラスチックトレーで実施した。各ウエルは、鞘翅目昆虫の成長用に設計された約１．０ｍＬの飼料を含んでいた。ｄｓＲＮＡ試料の６０μＬアリコートを各ウエルの１．５ｃｍ２の飼料の表面上にピペットにより送達した（４０μＬ／ｃｍ２）。ｄｓＲＮＡ試料の濃度は、ウエルにおける表面積の１平方センチメートル当たりのｄｓＲＮＡの量（ｎｇ／ｃｍ２）として計算した。処理トレーは、飼料表面上の液体が蒸発するかまたは飼料中に吸収されるまで、フュームフード内に保持した。
【０２０４】
羽化の数時間以内に、個々の幼虫を湿らせたラクダ毛ブラシで捕捉し、処理飼料上にのせた（１ウエル当たり１または２匹の幼虫）。次いで、１２８ウエルプラスチックトレーの外寄生ウエルを透明プラスチックの粘着性シートで密封し、ガス交換を可能にするために通気孔をつけた。バイオアッセイトレーを制御された環境条件下（２８℃、相対湿度約４０％、１６：８（明／暗））で９日間保持し、その後、各試料に曝露した昆虫の総数、死亡昆虫の数および生存昆虫の体重を記録した。死亡百分率、平均生体重および成長抑制を各処置について計算した。成長阻害は、平均生体重の減少と定義した。成長阻害（ＧＩ）は、以下のように計算した。
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
ここで、ＴＷＩＴは、処理における生存昆虫の総体重であり、ＴＮＩＴは、処理における昆虫の総数であり、ＴＷＩＢＣは、バックグラウンド基準（緩衝液対照）における生存昆虫の総体重であり、ＴＮＩＢＣは、バックグラウンド基準（緩衝液対照）における昆虫の総数である。
【０２０５】
ＧＩ５０は、ＧＩ値が５０％である食餌中の試料の濃度と判断される。ＬＣ５０（５０％致死濃度）は、試験昆虫の５０％が刹滅される食餌中の試料の濃度として記録する。統計解析は、ＪＭＰ（商標）ソフトウェア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて行った。
【実施例２】
【０２０６】
ジアブロティカ属（Diabrotica）由来の候補標的遺伝子の同定
ＲＮＡｉトランスジェニック植物昆虫保護技術による防除のための候補標的遺伝子配列を得るためのプールトランスクリプトーム解析のためにＷＣＲ（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）の発育の複数の段階を選択した。
【０２０７】
一適例において、以下のフェノール／ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）に基づく方法（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＥＮＴＥＲ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用いて、全ＲＮＡを約０．９ｇｍの全初齢ＷＣＲ幼虫（孵化後４〜５日；１６℃に保持）から単離し、精製した。
【０２０８】
幼虫を、均一な懸濁液が得られるまで、１０ｍＬのＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）を含む１５ｍＬホモジナイザーで室温でホモジナイズした。室温での５分のインキュベーションの後に、ホモジネートを１．５ｍＬ小遠心管に分配し（１本の管につき１ｍＬ）、２００μＬのクロロホルムを加え、混合物を１５秒間激しく振とうした。抽出物を室温で１０分間静置した後、４℃で１２０００ｘｇで遠心分離することにより相を分離した。上相（約０．６ｍＬを構成する）を他の滅菌済み１．５ｍＬ管に注意深く移し、等容積の室温のイソプロパノールを加えた。室温で５〜１０分間インキュベートした後、混合物を１２０００ｘｇ（４℃または２５℃）で８分間遠心分離した。
【０２０９】
上清を注意深く除去し、捨て、毎回の洗浄後に７５００ｘｇ（４℃または２５℃）で５分間の遠心分離により回収して、ＲＮＡペレットを７５％エタノールを用いてボルテックスすることにより２回洗浄した。エタノールを注意深く除去し、ペレットを３〜５分間風乾し、次いで、ヌクレアーゼ不含有滅菌水に溶解した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度（Ａ）を測定することにより決定した。約０．９ｇｍの幼虫からの一般的な抽出により、１．９のＡ２６０／Ａ２８０比を有する１ｍｇを超える全ＲＮＡが得られた。そのように抽出されたＲＮＡは、さらなる処理まで−８０℃で保存した。
【０２１０】
ＲＮＡの質は、アリコートを１％アガロースゲルに通すことにより判断した。アガロースゲル溶液は、高圧滅菌済み容器中でＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水で希釈した高圧滅菌済み１０Ｘ  ＴＡＥ緩衝液（トリス・酢酸・ＥＤＴＡ；１ｘ濃度は０．０４Ｍトリス・酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）、ｐＨ８．０）を用いて調製した。１ｘ  ＴＡＥをランニング緩衝液として用いた。使用前に、電気泳動槽およびウエル形成コームをＲＮＡｓｅ  ＡＷＡＹ（商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＩＮＣ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で清浄にした。２μＬのＲＮＡ試料を８μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）および１０μＬのＲＮＡ試料緩衝液（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標）カタログ番号７０６０６；ＥＭＤ４  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）と混合した。試料を７０℃で３分間加熱し、室温に冷却し、１ウエル当たり５μＬ（１μＬ〜２μＬのＲＮＡを含む）をロードした。分子の大きさの比較のために市販のＲＮＡ分子量マーカーを同時に別個のウエルで実験にかけた。ゲルは、６０ボルトで２時間実験にかけた。
【０２１１】
標準化ｃＤＮＡライブラリーは、商業サービス提供会社（ＥＵＲＯＦＩＮＳ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によってランダムプライミングを用いて幼虫の全ＲＮＡから作製された。標準化幼虫ｃＤＮＡライブラリーは、ＥＵＲＯＦＩＮＳ  ＭＷＧ  ＯｐｅｒｏｎにおいてＧＳ  ＦＬＸ  ４５４  Ｔｉｔａｎｉｕｍ（商標）シリーズ化学により１／２プレートスケールで配列決定がなされ、これにより、３４８ｂｐの平均リード長を有する６００，０００を超えるリードが得られた。３５０，０００リードが５０，０００を超えるコンティグにアセンブルされた。非アセンブルリードおよびコンティグの両方が公開プログラムであるＦＯＲＭＡＴＤＢ（ＮＣＢＩから入手できる）を用いてＢＬＡＳＴａｂｌｅデータベースに変換された。
【０２１２】
他のＷＣＲ発育段階で集められた物質から全ＲＮＡおよび標準化ｃＤＮＡライブラリーが同様に作製された。様々な発育段階を代表するｃＤＮＡライブラリーメンバーを合わせることによって標的遺伝子スクリーニング用のプールされたトランスクリプトームライブラリーが構築された。
【０２１３】
ショウジョウバエ属（Drosophila）およびコクヌストモドキ（Tribolium）等の他の昆虫における特定の遺伝子の致死性ＲＮＡｉ効果に関する情報を用いてＲＮＡｉターゲティングのための候補遺伝子を選択した。例えば、初期胚発生中の前後極性の確立に必要な転写因子であるギャップ遺伝子ｈｕｎｃｈｂａｃｋは、ショウジョウバエ属（Drosophila）およびコクヌストモドキ（Tribolium）におけるｈｕｎｃｈｂａｃｋ機能の全体的な保存に基づいて選択した（Brizuela et al. (1994) Genetics 137(3):803-13、Schroder (2003) Nature 422(6932):621-5、Marques-Souza et al. (2008) Development 135(5):881-8）。
【０２１４】
候補タンパク質コード配列を用いたＴＢＬＡＳＴＮ検索を非アセンブルジアブロティカ属（Diabrotica）配列リードまたはアセンブルコンティグを含むＢＬＡＳＴａｂｌｅデータベースに対して行った。ＢＬＡＳＴＸを用いてジアブロティカ属（Diabrotica）配列への有意なヒット（コンティグ相同性についてはｅ−２０より良好、非アセンブル配列リード相同性についてはｅ−１０より良好と定義）がＮＣＢＩ非冗長データベースに対して確認された。このＢＬＡＳＴＸ検索の結果から、ＴＢＬＡＳＴＮ検索で同定されたジアブロティカ属（Diabrotica）ホモログ候補遺伝子配列が、実際にジアブロティカ属（Diabrotica）遺伝子を含んでいたこと、または非ジアブロティカ属（Diabrotica）候補遺伝子配列とのジアブロティカ属（Diabrotica）配列で得られるベストフィットであったことが確認された。ほとんどの場合に、タンパク質をコードすると注釈をつけられたコクヌストモドキ（Tribolium）候補遺伝子は、ジアブロティカ属（Diabrotica）トランスクリプトーム配列における配列または複数の配列との明確な配列相同性を示した。少数の場合に、ジアブロティカ属（Diabrotica）コンティグの一部または非ジアブロティカ属（Diabrotica）候補遺伝子との相同性により選択された非アセンブル配列が重複していたこと、およびコンティグのアセンブリがこれらの重複に加わらなかったことが明らかであった。これらの場合、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ｖ４．９（ＧＥＮＥ  ＣＯＤＥＳ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、配列をより長いコンティグにアセンブルした。
【０２１５】
Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）のさらなるトランスクリプトームの配列決定が以前に記載された。Eyun et al. (2014) PLoS One 9(4):e94052。別の例示では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）ペアードエンドならびに４５４チタン配列決定法を用いて、卵（フィルタリング後に１５，１６２，０１７Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）ペアードエンドリード）、新生幼虫（neonates）（フィルタリング後に７２１，６９７，２８８Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）ペアードエンドリード）および第三齢幼虫の中腸（両方についてフィルタリング後に４４，８５２，４８８Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）ペアードエンドリードおよび４１５，７４２Ｒｏｃｈｅ  ４５４リード）から調製したｃＤＮＡから合計約７００ギガ塩基が配列決定された。新規トランスクリプトームアセンブリーは、３つの試料のそれぞれならびにプールされたデータセットについてＴｒｉｎｉｔｙ（Grabherr et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29(7):644-52）を用いて実施した。プールアセンブリーは、９１４ｂｐの平均長を有する１６３，８７１コンティグをもたらした。ショウジョウバエ属（Drosophila）またはコクヌストモドキ（Tribolium）由来のＨＵＮＣＨＢＡＣＫのアミノ酸配列をクエリー配列として用いて、１０−５のカットオフＥ値を用いてｔＢＬＡＳＴＮでルートワームトランスクリプトームおよびゲノムデータベース（未公表）を検索した。推定されたアミノ酸配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸ（商標）を用いてアライメントし、ＧｅｎｅＤｏｃ（商標）ソフトウェアを用いて編集した。
【０２１６】
部分配列である配列番号３および配列番号６７を有する転写物配列番号１を含む、鞘翅目害虫の死またはＷＣＲにおける成長、発育もしくは生殖の阻害をもたらし得る候補標的遺伝子が同定された。これらの配列は、ＨＵＮＣＨＢＡＣＫタンパク質またはその部分領域をコードし、それらは、ギャップ遺伝子としても定義されるＣ２Ｈ２型ジンク−フィンガータンパク質ファミリー転写因子に相当し、その遺伝子損失は、体制においてギャップを生じる。ＷＣＲ  ｈｕｎｃｈｂａｃｋ配列内で、６つのＣ２Ｈ２型ジンクフィンガードメインが、ＳＭＡＲＴデータベース（ワールドワイブウェブ上でＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎにて利用可能）を用いて、ジンクフィンガー転写因子としてのその役割に配慮して、５７３アミノ酸タンパク質の２２６〜２４８、２５５〜２７７、２８３〜３０５、３１１〜３３５、５２０〜５４２、および５４８〜５７２位で予測された（図２）。
【０２１７】
配列番号１のポリヌクレオチドは、新規である。該配列は、公開データベースに収載されておらず、国際公開第２０１１／０２５８６０号パンフレット、米国特許出願公開第２００７０１２４８３６号明細書、米国特許出願公開第２００９０３０６１８９号明細書、米国特許出願公開第２００７００５０８６０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１９２２６５号明細書、または米国特許第７，６１２，１９４号明細書に開示されていない。ＧＥＮＢＡＮＫにおける検索により見出された有意な相同ヌクレオチド配列は存在しなかった。ジアブロティカ属（Diabrotica）ＨＵＮＣＨＢＡＣＫアミノ酸配列（配列番号２）の最も近いホモログは、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００１０３８０９３．１を有するコクヌストモドキ（Tribolium castaneum）タンパク質である（６６％類似；相同性領域にわたり５３％同一）。
【０２１８】
ジアブロティカ属（Diabrotica）候補ｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子の配列の全長または部分クローンを用いて、ｄｓＲＮＡの合成のためのＰＣＲアンプリコンを得た。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）（配列番号１０；Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21:841-850）のコード領域を含むＤＮＡクローンからのｄｓＲＮＡも増幅した。
【実施例３】
【０２１９】
ジアブロティカ属（Diabrotica）由来の標的遺伝子の増幅
各標的遺伝子のコード領域の一部をＰＣＲにより増幅するためにプライマーを設計した。表１を参照のこと。適切な場合、Ｔ７ファージプロモーター配列（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号４））を増幅センスまたはアンチセンス鎖の５’末端に取り込んだ。表１を参照のこと。全ＲＮＡをＷＣＲから抽出し、第一鎖ｃＤＮＡを、天然標的遺伝子配列のすべてまたは一部を増幅するために配置された対向プライマーを用いたＰＣＲ反応用の鋳型として用いた。
【０２２０】
【表１】
2018500020.tif 000008
【実施例４】
【０２２１】
ＲＮＡｉ構築物
ＰＣＲによる鋳型の調製およびｄｓＲＮＡ合成。
ｈｕｃｎｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡの生成のための特定の鋳型を得るために用いた戦略を図１Ａおよび図１Ｂに示す。ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１またはｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｖ１  ｄｓＲＮＡ合成に用いることを目的とした鋳型ＤＮＡは、それぞれプライマー対１およびプライマー対２（表１）ならびに全ＲＮＡから作製した（ＰＣＲ鋳型としての）第一鎖ｃＤＮＡを用いたＰＣＲにより作製した。選択されたｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１およびｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｖ１標的遺伝子領域について、２つの別個のＰＣＲ増幅を実施した（図１）。第１のＰＣＲ増幅で、増幅センス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が導入された。第２の反応で、アンチセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が取り込まれた。標的遺伝子の各領域の２つのＰＣＲ増幅断片をほぼ等量で混合し、混合物をｄｓＲＮＡの生成のための転写鋳型として用いた。図１。特定のプライマーにより増幅されたｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１  ｄｓＲＮＡ鋳型の配列は、配列番号３として開示する。特定のプライマーにより増幅されたｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｖ１  ｄｓＲＮＡ鋳型の配列は、配列番号６７として開示する。
【０２２２】
ＹＦＰ陰性対照を得るために、単一ＰＣＲ増幅を実施した（図１Ｂ）。ＰＣＲ増幅により、増幅センスおよびアンチセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が導入された。次いで、標的遺伝子の各領域の２つのＰＣＲ増幅断片をほぼ等量で混合し、混合物をｄｓＲＮＡの生成のための転写鋳型として用いた（図１Ｂ）。陰性対照ＹＦＰコード領域（配列番号１０）のｄｓＲＮＡは、プライマー対３（表１）および鋳型としてのＹＦＰコード領域のＤＮＡクローンを用いて生成した。ＧＦＰ陰性対照は、プライマー対４（表１）を用いてｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅した。ｈｕｎｃｈｂａｃｋおよびＧＦＰを含む増幅されたＰＣＲ産物を、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ高収率転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いたｄｓＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成のための鋳型として用いた。合成されたｄｓＲＮＡは、製造業者の使用説明書により本質的に指示された通りにＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）またはＡＭＢＩＯＮ（登録商標）ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉキットを用いて精製した。ｄｓＲＮＡ調製物をＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）または同等の手段を用いて定量し、ゲル電気泳動により分析して、純度を決定した。
【実施例５】
【０２２３】
ジアブロティカ属（Diabrotica）幼虫における候補標的遺伝子のスクリーニング
反復バイオアッセイにより、食餌ベースのアッセイにおいてＷＣＲに投与した場合に、実施例２で同定されたｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１標的遺伝子配列から得られた合成ｄｓＲＮＡ調製物の摂取が、ウェスタンコーンルートワーム幼虫の死亡および成長阻害をもたらしたことが示された（表２）。
【０２２４】
【表２】
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【０２２５】
ＲＮＡｉ媒介昆虫防除のためにジアブロティカ属（Diabrotica）種の特定の遺伝子を活用することができることが以前に示唆された。９０６種の配列を開示した、米国特許出願公開第２００７／０１２４８３６号明細書、および９，１１２種の配列を開示した、米国特許第７，６１４，９２４号明細書を参照のこと。しかし、ＲＮＡｉ媒介昆虫防除に有用性を有することが示唆された多くの遺伝子がジアブロティカ属（Diabrotica）を防除するには有効でないことが確認された。ＲＮＡｉ媒介昆虫防除に有用性を有することが示唆された他の遺伝子と比較して、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１がジアブロティカ属（Diabrotica）の驚くべきかつ予期しない防除をもたらしたことも確認された。
【０２２６】
例えば、Ａｎｎｅｘｉｎ、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ２およびｍｔＲＰ−Ｌ４は、それぞれ米国特許第７，６１４，９２４号明細書でＲＮＡｉ媒介昆虫防除に有効であることが示唆された。配列番号１１は、Ａｎｎｅｘｉｎ領域１のＤＮＡ配列であり、配列番号１２は、Ａｎｎｅｘｉｎ領域２のＤＮＡ配列である。配列番号１３は、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ２領域１のＤＮＡ配列であり、配列番号１４は、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ２領域２のＤＮＡ配列である。配列番号１５は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域１のＤＮＡ配列であり、配列番号１６は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域２のＤＮＡ配列である。
【０２２７】
上述の配列のそれぞれを用いて、実施例４の二重プライマー対法（図１）によりｄｓＲＮＡを生成し、ｄｓＲＮＡを上述の食餌ベースのバイオアッセイ法によりそれぞれ試験した。ＹＦＰ配列（配列番号１０）も陰性対照としてのｄｓＲＮＡを生成するために用いた。表３にＡｎｎｅｘｉｎ、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ２、ｍｔＲＰ−Ｌ４、およびＹＦＰ  ｄｓＲＮＡ分子を生成するために用いたプライマーの配列を示す。表４にこれらのｄｓＲＮＡ分子への９日間の曝露後のＷＣＲ幼虫の飼料ベースのバイオアッセイの結果を示す。反復したバイオアッセイで、これらのｄｓＲＮＡの摂取がＴＥ緩衝液、ＹＦＰ  ｄｓＲＮＡまたは水の対照試料について認められたものを上回るウェスタンコーンルートワーム幼虫の死亡または成長阻害をもたらさなかったことが示された。
【０２２８】
【表３−１】
2018500020.tif 000010
【０２２９】
【表３−２】
2018500020.tif 000011
【０２３０】
【表４】
2018500020.tif 000012
【実施例６】
【０２３１】
ジアブロティカ属（Diabrotica）成体摂食アッセイのための試料の調製およびバイオアッセイ
妊娠成体雌にｈｕｎｃｈｂａｃｋ標的遺伝子配列のセグメントに対応するｄｓＲＮＡを与えることによってウェスタンコーンルートワームにおける親ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を行った。成体ルートワーム（羽化後＜４８時間）は、ＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ，Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から得た。成体は、すべてのバイオアッセイのために２３±１℃、＞７５％の相対湿度および８時間：１６時間の明：暗期間で飼育した。昆虫飼育食餌は、Branson and Jackson (1988), J. Kansas Entomol. Soc. 61:353-55）から適合させた。再蒸留水を２．９％寒天および５．６ｍＬのグリセロールと共に含む溶液に乾燥成分を加えた（４８ｇｍ／１００ｍＬ）。さらに微生物の増殖を抑えるために食餌１００ｍＬ当たり４７％プロピオン酸および６％リン酸溶液を含む０．５ｍＬの混合物を加えた。寒天を沸騰水に溶解し、乾燥成分、グリセロールおよびプロピオン酸／リン酸溶液を加え、十分に混合し、約２ｍｍの深さまで注いだ。固化した食餌プラグ（直径約４ｍｍ、高さ２ｍｍ；２５．１２ｍｍ３）をＮｏ．１コルクボーラーを用いて食餌から切り出した。６匹の成体雄および雌（２４〜４８時間齢）を未処理人工食餌を与えて飼育し、通気式蓋を備えた１６ウェルトレー（５．１ｃｍ長×３．８ｃｍ幅×２．９ｃｍ高）中で４日間交配させた。
【０２３２】
５日目に、雄を容器から除去し、雌に３μＬ  ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１（配列番号３）遺伝子特異的ｄｓＲＮＡ（２μｇ／食餌プラグ；約７９．６ｎｇ／ｍｍ３）で処理した人工食餌表面プラグを給餌した。対照処理は、同じ濃度のＧＦＰ  ｄｓＲＮＡ（配列番号９）または同じ容積の水で処理した食餌に曝露した妊娠雌からなっていた。ＧＦＰ  ｄｓＲＮＡは、それらの５’末端にＴ７プロモーター配列を有する対向プライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて上述のように生成した。ｄｓＲＮＡで処理した新たな人工食餌を実験を通して１日おきに与えた。１１日目に、雌を、６０メッシュふるいによりふるい分けした、高圧滅菌済みシルト質粘土ローム土壌を含む産卵ケージ（７．５ｃｍ×５．５ｃｍ×５．５ｃｍ）（ＳｈｏｗＭａｎ  ｂｏｘ，Ａｌｔｈｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｉｌｔｏｎ、ＣＴ）に移した（Jackson (1986) Rearing and handling of Diabrotica virgifera and Diabrotica undecimpunctata howardi.  Pages 25 to 47 in J. L. Krysan and T.A. Miller, eds. Methods for the study of pest Diabrotica. Springer-Verlag, New York）。雌に４日間産卵させ、卵を産卵ボックス内の土壌中で２７℃で１０日間インキュベートし、次いで、６０メッシュふるいを通して産卵土壌を洗浄することにより土壌から除去した。真菌の増殖を防ぐために卵をホルムアルデヒド（５ｍＬ再蒸留水中５００μＬホルムアルデヒド）およびカルバミン酸メチル−（ブチルカルバモイル）−２−ベンズイミダゾール（５０ｍＬ再蒸留水中０．０２５ｇ）の溶液で処理した。産卵ボックスから除去した雌および各処理について卵の副試料を、後の定量的ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析（実施例７参照）のために液体窒素で急速冷凍した。ディッシュをＤｉｎｏ−Ｌｉｔｅ  Ｐｒｏデジタル顕微鏡（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）により写真撮影し、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアの細胞計数機能を用いてすべての卵を数えた（Schneider et al. (2012) Nat. Methods 9:671-5）。採取した卵をペトリ皿内の湿潤濾紙上に２８℃で保持し、１５日間モニターして、卵生存能力を判定した。それぞれ３〜６匹の雌を含む、６回の反復を別の日に行った。各処理について孵化した幼虫の数を更なる孵化が認められなくなるまで毎日記録した。
【０２３３】
成体ＷＣＲ雌によるｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１  ｄｓＲＮＡ分子の摂取は、卵生存能力に対する驚くべき、劇的かつ再現性のある効果を有することが示された。ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡに曝露した交配雌は、未処理食餌またはＧＦＰ  ｄｓＲＮＡで処理した食餌に曝露した雌とほぼ等数の卵を産生した（図３Ａ；表５）。しかし、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡに曝露した成体雌から採取した卵は、生存能力がなかった（図３Ｂ；表５）。ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡに曝露した成体雌は、３％未満の卵の孵化を有した。
【０２３４】
図３Ａおよび図３Ｂは、ｄｓＲＮＡ処理が、卵産生および卵の生存に与える効果に関して表５のデータをグラフで概説する。
【０２３５】
【表５】
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【０２３６】
各処理について、非孵化卵を切断して、胚の発育を検査し、親ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）の表現型応答を推定した。ＧＦＰ  ｄｓＲＮＡで処理したＷＣＲ雌により産卵された卵は、正常な発育を示した（図４Ａ）。これと対照的に、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１  ｄｓＲＮＡを投与した雌により産卵された卵は、卵内で幾らか胚の発育を示したが、切断した場合、明らかに短く、多数の腹部および胸部セグメントを欠損しているようであったが、応答は、個々の幼虫間で可変的であった（図４Ｂ）。したがって、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡの摂取が、幼虫に対する致死性または成長阻害性効果を有することは、本発明の予期しない、驚くべき所見である。妊娠成体ＷＣＲ雌によるｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡの摂取が、成体雌自体に対する認識できる劇的な影響を有さないが、卵産生および卵生存能力に劇的に影響を及ぼすことは、さらに驚くべき、予期しないことである。
【０２３７】
前述の結果は、ウェスタンコーンルートワーム幼虫および成体におけるＲＮＡｉの全身性の性質、ならびに胚の発育に関連する遺伝子が、ｄｓＲＮＡに曝露した雌の卵においてノックダウンするという親効果を達成する可能性を明確に実証するものである。重要なことに、これは、ウェスタンコーンルートワームにおける摂取ｄｓＲＮＡに対するｐＲＮＡｉ応答の最初の報告である。全身性応答は、ｄｓＲＮＡの曝露および取込みが起こる消化管以外の組織におけるノックダウンの所見に基づいて示される。一般的に昆虫および具体的にはルートワームは、植物および線虫における全身性応答に関連付けられたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを欠いているため、本発明者らの結果は、ｄｓＲＮＡが腸組織により取り込まれ、他の組織（例えば、発育段階の卵巣小管）に転移し得ることを確認するものである。
【０２３８】
卵が孵化しないように胚の発育に関与する遺伝子の発現をノックダウンする能力は、ウェスタンコーンルートワームの防除を達成し、改善するまたとない機会を与えるものである。成体は地上生殖組織（絹糸および雄穂等）を容易に摂食するため、卵が孵化することを妨げることによって次世代における根の保護を達成するためにｄｓＲＮＡのトランスジェニック発現により成体ルートワームをｉＲＮＡ防除剤に曝露させることができる。コーン植物におけるｄｓＲＮＡのトランスジェニック発現による、または表面散布ｉＲＮＡとの接触によるｄｓＲＮＡの送達は、幼虫を直接的に標的とし、害虫管理戦略の全体的な耐久性を増強する他のトランスジェニックアプローチの重要なスタッキングパートナーとなるものである。
【実施例７】
【０２３９】
実時間ＰＣＲ解析
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて製造業者の推奨に従って成体雌、雄、処理した雌から孵化した幼虫および卵の全身から単離した。転写反応の開始の前に、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて全ＲＮＡをＤＮａｓｅで処理して、任意のｇＤＮＡを除去した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を用いて、実時間定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）用の鋳型としての第一鎖ｃＤＮＡを合成した。ＲＮＡを分光光度法により２６０ｎｍで定量し、アガロースゲル電気泳動により純度を評価した。ｑＰＣＲ解析に用いたプライマーは、Ｂｅａｃｏｎ  ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて設計した。プライマー対の効率は、５倍連続希釈（１：１／５：１／２５：１／１２５：１／６２５）を用いて３連で評価した。増幅効率は、本試験に用いたすべてのｑＰＣＲプライマー対について９６．１％より高かった。本試験に用いたすべてのプライマーの組合せは、ｃＤＮＡ鋳型の量とＰＣＲ産物の量との間の線形相関を示した。すべての相関係数は、０．９９より大きかった。７５００  Ｆａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＳＤＳ  ｖ２．０．６ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、勾配、相関係数および効率を決定した。それぞれ２つの技術的反復を含む、３つの生物学的反復をｑＰＣＲ解析に用いた。ｑＰＣＲは、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）および７５００  Ｆａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ実時間ＰＣＲ検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて実施した。ｑＰＣＲサイクリングパラメーターは、製造業者のプロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に記載されているように、それぞれ３秒間９５℃、３０秒間５８℃からなる４０サイクルを含んでいた。各ＰＣＲ反応の終了時に、融解曲線を作成して、単一ピークを確認し、プライマーダイマーおよび非特異的産物の形成の可能性を除外した。転写物の相対的定量化は、比較２−ΔΔＣＴ法を用いて計算し、β−アクチンに対して標準化した。
【０２４０】
図５（Ａ〜Ｄ）は、水対照と比較した、卵、成体雌、幼虫、および成体雄におけるｈｕｎｃｈｂａｃｋならびにＧＦＰの相対的な転写レベルを示す表６のデータをグラフで概説する。成体（雄および雌）および卵において転写レベルの驚くべき低減が見られる。処理した雌から孵化した幼虫において転写物の低減は見られない。
【０２４１】
【表６】
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【実施例８】
【０２４２】
植物形質転換ベクターの構築
ｈｕｎｃｈｂａｃｋ（配列番号１）、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１（配列番号３）および／またはｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｖ１（配列番号６７）のセグメントを含むｄｓＲＮＡヘアピン形成のための標的遺伝子構築物を含むエントリーベクターを、化学合成断片（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）および標準分子クローニング法の組合せを用いてアセンブルする。ＲＮＡ一次転写物による分子内ヘアピン形成は、互いに逆向きの標的遺伝子セグメントの２つのコピーを（単一転写単位内で）配列させることによって促進され、２つのセグメントは、リンカー配列（例えば、ＳＴ−ＬＳ１イントロン、配列番号４５；Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220:245-50）により分離されている。したがって、一次ｍＲＮＡ転写物は、リンカー配列により分離された、互いの大きな逆向き反復配列としての２つのｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子セグメント配列を含む。プロモーターのコピー（例えば、トウモロコシユビキチン１、米国特許第５，５１０，４７４号明細書；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓ；イネアクチン遺伝子由来のプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；ＡＬＳプロモーター；ファゼオリン遺伝子プロモーター；ｃａｂ；ｒｕｂｉｓｃｏ；ＬＡＴ５２；Ｚｍ１３；および／またはａｐｇ）を用いて、一次ｍＲＮＡヘアピン転写物の生成を駆動し、例えばかつ制限なく、トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子の３’非翻訳領域を含む断片（ＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ  ｖ２；米国特許第６，６９９，９８４号明細書）、ＡｔＵｂｉ１０、ＡｔＥｆ１またはＳｔＰｉｎＩＩを用いて、ヘアピンＲＮＡ発現遺伝子の転写を終結させる。
【０２４３】
エントリーベクターは、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ（配列番号１）、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１（配列番号３）およびｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｖ１（配列番号６７）のセグメントを含むｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｖ１ヘアピンＲＮＡ構築物（配列番号４６）を含む。
【０２４４】
上述のエントリーベクターは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介トウモロコシ胚形質転換用のｈｕｎｃｈｂａｃｋヘアピンＲＮＡ発現形質転換ベクターを生成するための一般的なバイナリーデスティネーションベクターとの標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応に用いる。
【０２４５】
ＹＦＰヘアピンｄｓＲＮＡを発現する遺伝子を含む、陰性対照バイナリーベクターは、一般的なバイナリーデスティネーションベクターおよびエントリーベクターを用いて標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応により構築する。エントリーベクターは、トウモロコシユビキチン１プロモーター（上記のような）の発現制御下のＹＦＰヘアピン配列およびトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子の３’非翻訳領域を含む断片（上記のような）を含む。
【０２４６】
バイナリーデスティネーションベクターは、植物作動可能プロモーター（例えば、サトウキビ桿菌状バドナウイルス（ＳｃＢＶ）プロモーター（Schenk et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30）またはＺｍＵｂｉｌ（米国特許第５，５１０，４７４号明細書））の調節下の除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；（ＡＡＤ−１  ｖ３、米国特許第７，８３８，７３３号明細書、およびWright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5））を含む。これらのプロモーターに由来する５’ＵＴＲおよびイントロンは、プロモーターセグメントの３’末端とＡＡＤ−１コード領域の開始コドンとの間に位置する。トウモロコシリパーゼ遺伝子に由来する３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ；米国特許第７，１７９，９０２号明細書）を含む断片を用いて、ＡＡＤ−１  ｍＲＮＡの転写を終結させる。
【０２４７】
ＹＦＰタンパク質を発現する遺伝子を含む、さらなる陰性対照バイナリーベクターを一般的なバイナリーデスティネーションベクターおよびエントリーベクターを用いて標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応により構築する。バイナリーデスティネーションベクターは、トウモロコシユビキチン１プロモーター（上記のような）の発現調節下の除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；ＡＡＤ−１  ｖ３）（上記のような）およびトウモロコシリパーゼ遺伝子に由来する３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ；上記のような）を含む断片を含む。エントリーベクターは、トウモロコシユビキチン１プロモーター（上記のような）の発現制御下のＹＦＰコード領域およびトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子に由来する３’非翻訳領域（上記のような）を含む断片を含む。
【０２４８】
配列番号４６は、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｖ１ヘアピン形成配列を示す。
【実施例９】
【０２４９】
殺虫ｄｓＲＮＡを含むトランスジェニックトウモロコシ組織
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換
植物ゲノムに安定に組み込まれたキメラ遺伝子の発現により１つまたは複数の殺虫ｄｓＲＮＡ分子（例えば、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ（配列番号１）、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｒｅｇ１（配列番号３）およびｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｖ１（配列番号６７）のセグメントを含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を産生するトランスジェニックトウモロコシ細胞、組織および植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換の後に生成する。スーパーバイナリーまたはバイナリー形質転換ベクターを用いるトウモロコシ形質転換法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３０４，６０４号明細書に記載されているように、当技術分野で公知である。形質転換組織は、ハロキシホップ含有培地上で成長するそれらの能力により選択し、適宜、ｄｓＲＮＡの産生についてスクリーニングする。そのような形質転換組織培養の一部は、実施例１で述べたように本質的に、バイオアッセイのために新生トウモロコシ根切り虫幼虫に与えることができる。
【０２５０】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始
上（実施例７）で述べたバイナリー形質転換ベクターｐＤＡＢ１０９８１９またはｐＤＡＢ１１４２４５を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）菌株ＤＡｔ１３１９２細胞（国際公開第２０１２／０１６２２２号パンフレット）のグリセロールストックを適切な抗生物質を含むＡＢ最少培地プレート（Watson, et al. (1975) J. Bacteriol. 123:255-264）に画線接種し、２０℃で３日間成長させる。次いで、培養物を同じ抗生物質を含むＹＥＰプレート（ｇｍ／Ｌ；酵母エキス、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５）に画線接種し、２０℃で１日間インキュベートする。
【０２５１】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養
実験当日に、接種培地およびアセトシリンゴンを含む保存溶液を実験における構築物の数に対して適切な容積で調製し、滅菌済みの使い捨て２５０ｍＬフラスコにピペットで移す。接種培地（Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341）は、２．２ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン（Frame et al. (2011)）；６８．４ｇｍ／Ｌスクロース；３６ｇｍ／Ｌグルコース；１１５ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；および１００ｍｇ／Ｌミオイノシトールを含む（ｐＨ５．４）。アセトシリンゴンを接種培地を含むフラスコに１００％ジメチルスルホキシド中１Ｍ保存溶液から２００μＭの最終濃度になるまで加え、溶液を十分に混合する。
【０２５２】
各構築物について、ＹＥＰプレートからのアグロバクテリウム（Agrobacterium）を満たした１または２接種ループを滅菌済みの使い捨て５０ｍＬ遠心管中の１５ｍＬの接種培地／アセトシリンゴン保存溶液に懸濁し、５５０ｎｍでの溶液の光学濃度（ＯＤ５５０）を測定する。次いで、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合物を用いて懸濁液を０．３〜０．４のＯＤ５５０に希釈する。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液の管を、室温で約７５ｒｐｍに設定したプラットフォーム振とう機上に水平にのせ、胚切開を実施しながら１〜４時間振とうする。
【０２５３】
穂の滅菌および胚の単離  トウモロコシ未熟胚を温室内で成長させたゼア・マイス（Zea mays）近交系Ｂ１０４の植物（Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406）から入手し、自家または近縁授粉して、穂を産生させる。穂は、授粉後約１０〜１２日目に収穫する。実験日に、脱殻した穂を層流フード内で市販の漂白剤（ＵＬＴＲＡ  ＣＬＯＲＯＸ（登録商標）殺菌漂白剤、６．１５％次亜塩素酸ナトリウム；２滴のＴＷＥＥＮ２０を含む）の２０％溶液中に浸漬し、２０〜３０分間振とうした後、滅菌脱イオン水で３回すすぐことによって表面滅菌する。未熟接合胚（１．８〜２．２ｍｍ長）を各穂から無菌的に切り離し、２００μＭアセトシリンゴンを含む液体接種培地中適切なアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の２．０ｍＬ懸濁液を含む小遠心管に無作為に分配し、２μＬの１０％ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤（ＥＶＯＮＩＫ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ；Ｅｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を加える。所与のセットの実験について、プールした穂由来の胚を各形質転換に使用する。
【０２５４】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養
単離後、胚をロッカープラットフォーム上に５分間置く。次いで、管の内容物を、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌスクロース；７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／Ｌジカンバ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸または３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；１００ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；ＤＭＳＯ中２００μＭアセトシリンゴン；および３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）を含むｐＨ５．８の共培養培地のプレート上に注ぐ。液体アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を滅菌済みの使い捨てホールピペットにより除去する。次いで、胚を、顕微鏡を活用して滅菌済み鉗子を用いて胚盤を上向きにして配向させる。プレートを閉じ、３Ｍ（商標）ＭＩＣＲＯＰＯＲＥ（商標）医療用テープで密封し、約６０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光合成有効放射（ＰＡＲ）の連続光を用いた２５℃のインキュベーターに入れる。
【０２５５】
カルスの選択およびトランスジェニックイベントの再生  共培養期間の後、胚を、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌスクロース；７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／Ｌジカンバ；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；１００ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；０．５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＲ；Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）；２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン；および２．３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）から構成されているｐＨ５．８の静止培地に移す。３６以下の胚を各プレートに除去する。プレートを透明プラスチックボックスに入れ、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で７〜１０日間インキュベートする。次いで、カルス化胚を、１００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．０３６２ｍｇ／Ｌ；ＡＡＤ−１遺伝子を含むカルスの選択用）を含む（上記）静止培地から構成されている、選択培地１上に移す（＜１８／プレート）。プレートを透明ボックスに戻し、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で７日間インキュベートする。次いで、カルス化胚を、５００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．１８１ｍｇ／Ｌ）を含む（上記）静止培地から構成されている、選択培地ＩＩ上に移す（＜１２／プレート）。プレートを透明ボックスに戻し、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で１４日間インキュベートする。この選択ステップは、トランスジェニックカルスがさらに増殖し、分化することを可能とする。
【０２５６】
増殖性の胚発生カルスを再生前培地に移す（＜９／プレート）。再生前培地は、ｐＨ５．８で４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；４５ｇｍ／Ｌスクロース；３５０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；５０ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物；１．０ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；０．２５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ；ＮａＯＨ中０．５ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸；エタノール中２．５ｍｇ／Ｌアブシジン酸；１ｍｇ／Ｌ  ６−ベンジルアミノプリン；２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン；２．５ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）；および０．１８１ｍｇ／Ｌ  Ｒ−ハロキシホップ酸を含む。プレートを透明ボックス中に保存し、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で７日間インキュベートする。次いで、再生カルスをＰＨＹＴＡＴＲＡＹＳ（商標）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）中の再生培地に移し（＜６／プレート）、１日当たり１６時間点灯／８時間消灯（約１６０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲで）で２８℃で１４日間または芽条および根が発生するまでインキュベートする。再生培地は、ｐＨ５．８で４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；６０ｇｍ／Ｌスクロース；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；１２５ｍｇ／Ｌカルベニシリン；３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＬＡＮ（商標）ゴム；および０．１８１ｍｇ／Ｌ  Ｒ−ハロキシホップ酸を含んでいる。次いで、一次根付きの小芽条を単離し、選択せずに伸長培地に移す。伸長培地は、ｐＨ５．８で４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌスクロース；および３．５ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＲＩＴＥ（商標）を含んでいる。
【０２５７】
ハロキシホップを含む培地上で成長するそれらの能力により選択した形質転換植物の芽条をＰＨＹＴＡＴＲＡＹＳ（商標）から成長培地（ＰＲＯＭＩＸ  ＢＸ；ＰＲＥＭＩＥＲ  ＴＥＣＨ  ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ）を満たした小ポットに移植し、カップまたはＨＵＭＩ−ＤＯＭＥＳ（ＡＲＣＯ  ＰＬＡＳＴＩＣＳ）で覆い、次いで、ＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）成長チャンバー（２７℃昼間／２４℃夜間、１６時間明期、５０〜７０％ＲＨ、２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲ）内で環境に順化させる。場合によっては、推定トランスジェニック小植物を、トウモロコシゲノムに組み込まれたＡＡＤ１除草剤耐性遺伝子を検出するように設計されたプライマーを用いた定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにより導入遺伝子相対コピー数について解析する。さらに、ＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイを用いて、推定形質転換体の発現ｄｓＲＮＡにおけるリンカー配列の存在を検出する。次いで、選択された形質転換小植物をさらなる成長および試験のために温室に移す。
【０２５８】
バイオアッセイおよび種子生産のための温室におけるＴ０植物の移動および樹立
植物がＶ３−Ｖ４段階に達した場合、それらをＩＥ  ＣＵＳＴＯＭ  ＢＬＥＮＤ（ＰＲＯＦＩＬＥ／ＭＥＴＲＯ  ＭＩＸ  １６０）土壌ミックスに移植し、温室内（光曝露の種類：光または同化；高照度限界：１２００ＰＡＲ；日照時間１６時間；２７℃昼間／２４℃夜間）で開花まで成長させる。
【０２５９】
昆虫バイオアッセイに用いるための植物を小ポットからＴＩＮＵＳ（商標）３５０−４  ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（登録商標）（ＳＰＥＮＣＥＲ−ＬＥＭＡＩＲＥ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ；Ａｃｈｅｓｏｎ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａ）に移植する（ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲ（登録商標）のイベントにつき１つの植物体）。植物は、ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（登録商標）に移植してから約４日後に、バイオアッセイに用いる。
【０２６０】
非トランスジェニックエリート近交系Ｂ１０４の植物または他の適切な花粉ドナーから採取した花粉をＴ０トランスジェニック植物のひげに授粉することにより、Ｔ１世代の植物を得る。可能な場合、逆交配も実施する。
【実施例１０】
【０２６１】
成体ジアブロティカ属（Diabrotica）植物摂食バイオアッセイ
親ＲＮＡｉ標的およびＧＦＰ対照のｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニックコーン茎葉（Ｖ３−４）を凍結乾燥し、乳鉢および乳棒を用いて微細粉末に粉砕し、人工食餌へ取り込む前に均一な粒径を達成するために６００μＭスクリーンに通してふるいにかける。該人工食餌は、水の量を２倍にすることを除いて親ＲＮＡｉ実験について以前に述べたのと同じ食餌である（２０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏ、０．４０ｇ寒天、６．０ｇ混合食餌、７００μＬグリセロール、２７．５μＬ防カビ剤）。固化の前に、凍結乾燥コーン葉組織を、４０ｍｇ／ｍｌ食餌の割合で食餌に混入し、十分に混合した。次いで、食餌をプラスチックペトリ皿の表面上に約４ｍｍの深さまで注ぎ、固化させる。食餌プラグを食餌から切り取り、親ＲＮＡｉ実験について以前に述べた同じ方法を用いてウェスタンコーンルートワーム成体を曝露するために用いる。
【０２６２】
植物が穂軸、雄穂および絹糸を発生するまでｐＲＮＡｉ  Ｔ０またはＴ１イベントを温室内で生育させた。合計２５匹の新たに発生したルートワーム成体を各植物に放ち、成体が逃げることを防ぐために植物全体を覆った。成体を放ってから２週間後に、雌成体を各植物から回収し、卵の収集のために実験室内に保持した。親ＲＮＡｉ標的および予想される表現型に応じて、雌１匹当たりの卵の数、卵孵化の百分率および幼虫死亡率等のパラメーターを記録し、対照植物と比較した。
【実施例１１】
【０２６３】
トランスジェニックトウモロコシのジアブロティカ属（Diabrotica）幼虫根摂食バイオアッセイ
昆虫バイオアッセイ
植物細胞中で生成する対象発明のｄｓＲＮＡの生物活性は、バイオアッセイ法によって示される。例えば、殺虫ｄｓＲＮＡを生成する植物に由来する様々な植物組織または組織片を制御された摂食環境における標的昆虫に与えることによって、有効性を示すことができる。あるいは、殺虫ｄｓＲＮＡを生成する植物に由来する様々な植物組織から抽出物を調製し、抽出された核酸を本明細書で前述したようにバイオアッセイのための人工飼料の上に分配して加える。そのような摂食アッセイの結果は、殺虫ｄｓＲＮＡを生成しない宿主植物の適切な対照組織を用いる同様に実施されたバイオアッセイと、または他の対照試料と比較する。
【０２６４】
トランスジェニックトウモロコシイベントを用いた昆虫バイオアッセイ
洗浄卵から孵化した２匹のウェスタンコーンルートワーム幼虫（１〜３日齢）を選択し、バイオアッセイトレーの各ウエルに入れる。次いで、ウエルを「ＰＵＬＬ  Ｎ’  ＰＥＥＬ」タブカバー（ＢＩＯ−ＣＶ−１６、ＢＩＯ−ＳＥＲＶ）で覆い、１８時間／６時間  明／暗サイクルとした２８℃インキュベーターに入れた。最初の外寄生の９日後に、各処理における昆虫の総数のうちの死亡昆虫の百分率と計算される、死亡率について幼虫を評価した。昆虫試料を−２０℃で２日間凍結し、次いで、各処理の昆虫の幼虫をプールし、体重を測定する。成長阻害の百分率は、２つの対照ウエル処理の平均体重の平均値によって割った実験処理の平均体重として計算する。データは、成長阻害百分率（陰性対照の）として表す。対照平均体重を超える平均体重は、ゼロに標準化する。
【０２６５】
温室内の昆虫バイオアッセイ
ウェスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）卵は、ＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から土壌入りで受領する。ＷＣＲ卵を２８℃で１０〜１１日間インキュベートする。土壌からの卵を洗浄し、０．１５％寒天溶液中に入れ、濃度を０．２５ｍＬアリコート当たり約７５〜１００個の卵に調整する。孵化速度をモニターするために卵懸濁液のアリコートを用いて孵化プレートをペトリ皿中にセットする。
【０２６６】
ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（登録商標）中で成育中のトウモロコシ植物体の周囲の土壌に１５０〜２００個のＷＣＲ卵を外寄生させる。昆虫に２週間摂食させ、その後、「根評点付け」を各植物に対して行う。Oleson et al.（2005） J. Econ. Entomol. 98:1-8に本質的に準拠して等級付けに節損傷評価基準（Node-Injury Scale）を用いる。このバイオアッセイに合格した植物を種子生産のために１８．９リットルのポットに移植する。移植した植物を殺虫剤で処理して、さらなる根切り虫被害および温室内の昆虫の放出を防止する。種子生産のために植物に人工授粉する。これらの植物により産生された種子は、Ｔ１および植物のその後の世代における評価のために残す。
【０２６７】
温室バイオアッセイに２種の陰性対照植物を含める。トランスジェニック陰性対照植物は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）またはＹＦＰヘアピンｄｓＲＮＡを産生するように設計された遺伝子を含むベクターによる形質転換により生成する（実施例４参照）。非形質転換陰性対照植物を、系統Ｂ１０４の種子から成長させる。２つの別個の日付でバイオアッセイを行い、陰性対照は、植物材料の各セットに含まれる。
【実施例１２】
【０２６８】
トランスジェニックトウモロコシ組織の分子解析
トウモロコシ組織の分子解析（例えば、ＲＮＡ  ｑＰＣＲ）は、根の食害を評価するのと同じ日に温室生育植物から採取された葉および根の試料について実施する。
【０２６９】
Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲのＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイの結果は、ヘアピン導入遺伝子の発現をバリデートするために用いる。（トウモロコシ組織には通常、内因性Ｐｅｒ５遺伝子の発現が存在するので、非形質転換トウモロコシ植物において低レベルのＰｅｒ５  ３’ＵＴＲの検出が予想される。）発現ＲＮＡにおける反復配列間の介在配列（ｄｓＲＮＡヘアピン分子の形成に不可欠である）のＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイの結果を用いて、ヘアピン転写物の存在をバリデートする。導入遺伝子ＲＮＡ発現レベルは、内因性トウモロコシ遺伝子のＲＮＡレベルを基準として測定する。
【０２７０】
ｇＤＮＡにおけるＡＡＤ１コード領域の一部を検出するためのＤＮＡ  ｑＰＣＲ解析を用いて、導入遺伝子挿入コピー数を推定する。これらの解析用の試料は、環境チャンバー内で生育した植物から採取した。結果は、単一コピー天然遺伝子の一部を検出するために設計されたアッセイのＤＮＡ  ｑＰＣＲ結果と比較し、単純イベント（導入遺伝子の１つまたは２つのコピーを有する）を温室内のさらなる試験に進める。
【０２７１】
さらに、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子（ＳｐｅｃＲ；Ｔ−ＤＮＡの外側のバイナリーベクタープラスミド上に含まれる）の一部を検出するため設計されたｑＰＣＲアッセイを用いて、トランスジェニック植物が外来組込みプラスミド主鎖配列を含むかどうかを判定する。
【０２７２】
ヘアピンＲＮＡ転写物発現レベル：Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲ  ｑＰＣＲ。カルス細胞イベントまたはトランスジェニック植物をＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ配列の実時間定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析して、ＴＩＰ４ｌ様タンパク質（すなわち、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＴ４Ｇ３４２７０のトウモロコシホモログ；７４％のトウモロコシ同一性のｔＢＬＡＳＴＸスコアを有する）をコードする、内部トウモロコシ遺伝子（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＢＴ０６９７３４）の転写物レベルと比較した、全長ヘアピン転写物の相対的な発現レベルを決定する。ＲＮＡＥＡＳＹ（商標）９６キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてＲＮＡを単離する。溶出後、全ＲＮＡをキットの提案プロトコールに従ってＤＮａｓｅＩ処理にかける。次いでＲＮＡをＮＡＮＯＤＲＯＰ  ８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で定量し、濃度を２５ｎｇ／μＬに対して標準化する。第一鎖ｃＤＮＡは、製造業者の推奨プロトコールに実質的に従って、５μＬの変性ＲＮＡを用いて１０μＬのＨＩＧＨ  ＣＡＰＡＣＩＴＹ  ｃＤＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＫＩＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて作製する。複合ランダムプライマーおよびオリゴｄＴの作業ストックを調製するために、ランダムプライマーストックミックスの１ｍＬ管への１０μＬの１００μＭ  Ｔ２０ＶＮオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ、ここで、Ｖは、Ａ、ＣまたはＧであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである；配列番号４７）の添加を含めるようにプロトコールをわずかに修正する。
【０２７３】
ｃＤＮＡ合成の後に、試料をヌクレアーゼ不含有水で１：３に希釈し、アッセイに供するまで、−２０℃で保存する。
【０２７４】
Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲおよびＴＩＰ４ｌ様転写物の別個の実時間ＰＣＲアッセイを１０μＬの反応容積でＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（商標）４８０（ＲＯＣＨＥ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で実施する。Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲアッセイについては、反応は、Ｐ５Ｕ７６Ｓ（Ｆ）（配列番号４８）およびＰ５Ｕ７６Ａ（Ｒ）（配列番号４９）プライマーならびにＲＯＣＨＥ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＲＯＢＥ（商標）（ＵＰＬ７６；カタログ番号４８８９９６０００１；ＦＡＭで標識する）を用いて行う。ＴＩＰ４ｌ様参照遺伝子アッセイについては、プライマーＴＩＰｍｘＦ（配列番号５０）およびＴＩＰｍｘＲ（配列番号５１）、ならびにＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）で標識したＨＸＴＩＰプローブ（配列番号５２）を用いる。
【０２７５】
すべてのアッセイは、無鋳型の陰性対照（ミックスのみ）を含む。標準曲線について、試料交差汚染について確認するために、ブランク（ソースウェル中水）もソースプレートに含める。プライマーおよびプローブ配列を表７に示す。様々な転写物の検出用の反応構成成分のレシピを表８に開示し、ＰＣＲ反応条件を表９に要約する。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセインアミダイト）蛍光部分を４６５ｎｍで励起し、蛍光を５１０ｎｍで測定し、ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）蛍光部分の対応する値は、５３３ｎｍおよび５８０ｎｍである。
【０２７６】
【表７】
2018500020.tif 000015
【０２７７】
【表８】
2018500020.tif 000016
【０２７８】
【表９】
2018500020.tif 000017
【０２７９】
データは、供給業者の推奨に従ってＣｑ値の計算のための二次微分最大値アルゴリズムを用いた相対的定量化によりＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（商標）ソフトウェアｖ１．５を用いて解析する。発現解析については、最適化ＰＣＲ反応について、産物がサイクルごとに倍加するという仮定のもとに２の基礎値が選択される、２つの標的間のＣｑ値の差の比較に依拠する、ΔΔＣｔ法（すなわち、２−（Ｃｑ  ＴＡＲＧＥＴ−Ｃｑ  ＲＥＦ））を用いて発現値を計算する。
【０２８０】
ヘアピン転写物のサイズおよび完全性：ノーザンブロットアッセイ。場合によっては、ｈｕｎｃｈｂａｃｋヘアピンｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニック植物におけるｈｕｎｃｈｂａｃｋヘアピンＲＮＡの分子サイズを測定するためのノーザンブロット（ＲＮＡブロット）解析を用いることにより、トランスジェニック植物のさらなる分子的特徴付けが得られる。
【０２８１】
すべての材料および装置は、使用前にＲＮａｓｅＺＡＰ（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）で処理する。組織試料（１００ｍｇ〜５００ｍｇ）を２ｍＬのＳＡＦＥＬＯＣＫ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ管中に採取し、１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中３つのタングステンビーズを含むＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機（ＧＡＲＣＩＡ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）で５分間破壊し、次いで、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートする。任意選択で、試料を４℃で１１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を新たな２ｍＬのＳＡＦＥＬＯＣＫ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ管中に移す。２００μＬのクロロホルムをホモジネートに加えた後、管を反転により２〜５分間混合し、室温で１０分間インキュベートし、４℃で１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離する。上相を滅菌済み１．５ｍＬのＥＰＰＥＮＤＯＲＦ管中に移し、６００μＬの１００％イソプロパノールを加えた後、室温で１０分間から２時間インキュベートし、次いで４℃〜２５℃で１２，０００ｘｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、ＲＮＡペレットを１ｍＬの７０％エタノールで２回洗浄し、洗浄の間に４℃〜２５℃で７，５００ｘｇで１０分間遠心分離する。エタノールを捨て、ペレットを、５０μＬのヌクレアーゼ不含有水に再懸濁する前に３分間から５分間簡単に風乾する。
【０２８２】
全ＲＮＡをＮＡＮＯＤＲＯＰ８０００（登録商標）（ＴＨＥＲＭＯ−ＦＩＳＨＥＲ）を用いて定量し、試料を５μｇ／１０μＬに標準化する。次いで１０μＬのグリオキサール（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を各試料に加える。５〜１４ｎｇのＤＩＧ  ＲＮＡ標準マーカーミックス（ＲＯＣＨＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を分配し、等容積のグリオキサールに加える。試料およびマーカーＲＮＡを５０℃で４５分間変性し、ＮＯＲＴＨＥＲＮＭＡＸ  １０Ｘグリオキサールランニング緩衝液（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中１．２５％  ＳＥＡＫＥＭ  ＧＯＬＤアガロース（ＬＯＮＺＡ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）ゲル上に加えるまで、氷上で保存する。ＲＮＡを電気泳動により６５ボルト／３０ｍＡで２時間１５分間分離する。
【０２８３】
電気泳動の後、ゲルを２Ｘ  ＳＳＣで５分間すすぎ、ＧＥＬ  ＤＯＣステーション（ＢＩＯＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で撮像し、次いで、転移緩衝液（３Ｍ塩化ナトリウムおよび３００ｍＭクエン酸三ナトリウムからなる２０Ｘ  ＳＳＣ、ｐＨ７．０）としての１０Ｘ  ＳＳＣを用いて、ＲＮＡをナイロン膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に室温で一夜受動的に転移させる。転移後、膜を２Ｘ  ＳＳＣで５分間すすぎ、ＲＮＡを膜（ＡＧＩＬＥＮＴ／ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）にＵＶ架橋させ、膜を室温で最長２日間乾燥する。
【０２８４】
膜をＵＬＴＲＡＨＹＢ緩衝液（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中で１〜２時間プレハイブリダイズする。プローブは、ＲＯＣＨＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＤＩＧ手順によりジゴキシゲニンで標識した目的の配列（例えば、適宜、配列番号４６のアンチセンス配列部分）を含むＰＣＲ増幅産物からなっている。推奨緩衝液中のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション管中６０℃の温度で一夜行う。ハイブリダイゼーションの後、すべてをＤＩＧキットの供給業者により推奨された方法により、ブロットをＤＩＧ洗浄に供し、包み、フィルムに１〜３０分間曝露し、次いでフィルムを現像する。
【０２８５】
導入遺伝子コピー数の決定。２つの葉打抜き片にほぼ相当するトウモロコシ葉片を９６ウェル収集プレート（ＱＩＡＧＥＮ）に収集する。組織の破壊は、１つのステンレススチールビーズを含むＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６  ＡＰ１溶解緩衝液（ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６  ＰＬＡＮＴ  ＫＩＴにより供給；ＱＩＡＧＥＮ）中でＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機（ＧＡＲＣＩＡ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて行う。組織の温浸後、ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６  ＰＬＡＮＴ  ＫＩＴおよびＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６抽出ロボットを用いて高処理方式でｇＤＮＡを単離する。ｑＰＣＲ反応を開始する前にｇＤＮＡを２：３のＤＮＡ：水に希釈する。
【０２８６】
ｑＰＣＲ解析。加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子の検出は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システムを用いて実時間ＰＣＲにより実施する。リンカー配列（例えば、ＳＴ−ＬＳ１；配列番号４５）を検出するための、またはＳｐｅｃＲ遺伝子の一部（すなわち、バイナリーベクタープラスミド上に位置するスペクチオマイシン抵抗性遺伝子；配列番号５３；表１０におけるＳＰＣ１オリゴヌクレオチド）を検出するための加水分解プローブアッセイに用いるオリゴヌクレオチドは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＰＲＯＢＥ  ＤＥＳＩＧＮ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ２．０を用いて設計する。さらに、ＡＡＤ−１除草剤耐性遺伝子のセグメント（配列番号５４；表１０におけるＧＡＡＤ１オリゴヌクレオチド）を検出するための加水分解プローブアッセイに用いるオリゴヌクレオチドは、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェア（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて設計する。表１０にプライマーおよびプローブの配列を示す。アッセイは、ｇＤＮＡが各アッセイにおいて存在していたことを保証するための内部参照配列としての役割を果たす、内因性トウモロコシ染色体遺伝子用の試薬（インベルターゼ；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｕ１６１２３；本明細書でＩＶＲ１と呼ぶ）により多重化する。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０  ＰＲＯＢＥＳ  ＭＡＳＴＥＲミックス（ＲＯＣＨＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブ（表１１）を含む１０μＬ容積多重反応における１ｘ最終濃度で調製する。２段階増幅反応を表１２に概説するように実施する。ＦＡＭおよびＨＥＸ標識プローブの発蛍光団活性化および発光は、上述の通りであり、ＣＹ５コンジュゲートは、６５０ｎｍで最大限に励起され、６７０ｎｍで最大限に蛍光を発する。
【０２８７】
Ｃｐスコア（蛍光シグナルがバックグラウンド閾値に交わる点）は、フィットポイントアルゴリズム（ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＳＯＦＴＷＡＲＥリリース１．５）およびＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔモジュール（ΔΔＣｔ法に基づく）を用いて実時間ＰＣＲデータから決定する。データは、前述のように取り扱う（上記；ＲＮＡ  ｑＰＣＲ）。
【０２８８】
【表１０】
2018500020.tif 000018
【０２８９】
【表１１】
2018500020.tif 000019
【０２９０】
【表１２】
2018500020.tif 000020
【実施例１３】
【０２９１】
鞘翅目害虫配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
１０〜２０のトランスジェニックＴ０ゼア・マイス（Zea mays）植物を実施例８で述べたように生成する。ＲＮＡｉ構築物のヘアピンｄｓＲＮＡを発現するさらなる１０〜２０のＴ１ゼア・マイス（Zea mays）独立系をトウモロコシ根切り虫チャレンジのために得る。配列番号１、配列番号３および配列番号６７に示す配列から、ヘアピンｄｓＲＮＡが得られ得る。さらなるヘアピンｄｓＲＮＡは、例えば、Ｃａｆｌ−１８０（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５８号明細書）、ＶａｔｐａｓｅＣ（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５９号明細書）、Ｒｈｏ１（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２６０号明細書）、ＶａｔｐａｓｅＨ（米国特許出願公開第２０１２／０１９８５８６号明細書）、ＰＰＩ−８７Ｂ（米国特許出願公開第２０１３／００９１６００号明細書）、ＲＰＡ７０（米国特許出願公開第２０１３／００９１６０１号明細書）、ＲＰＳ６（米国特許出願公開第２０１３／００９７７３０号明細書）、Ｂｒａｈｍａ（ＵＳＳＮ）およびＫｒｕｐｐｅｌ（ＵＳＳＮ）等の鞘翅目害虫配列から得られ得る。これらは、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の分子解析法により確認される。選択される独立Ｔ１系からの全ＲＮＡ調製物は、任意選択的に、ＲＮＡｉ構築物のそれぞれにおけるヘアピン発現カセットのリンカーに結合するように設計されたプライマーを用いるｑＰＣＲに用いられる。さらに、ＲＮＡｉ構築物における各標的遺伝子に対する特異的プライマーは、任意選択的に、植物体におけるｓｉＲＮＡ生成に必要なプロセシング前（pre-processed）ｍＲＮＡを増幅し、その生成を確認するために用いられる。各標的遺伝子の所望のバンドの増幅により、各トランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物におけるヘアピンＲＮＡの発現が確認される。標的遺伝子のｄｓＲＮＡヘアピンのｓｉＲＮＡへのプロセシングは、任意選択的に、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを用いて独立トランスジェニック系においてその後確認される。
【０２９２】
さらに、標的遺伝子との８０％を超える配列同一性を有するミスマッチ配列を有するＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子との１００％の配列同一性を有するＲＮＡｉ分子について認められるものと同様の仕方でトウモロコシ根切り虫に作用する。同じＲＮＡｉ構築物におけるヘアピンｄｓＲＮＡを形成するミスマッチ配列と天然配列との対合により、摂食鞘翅目害虫の成長、発育、生殖および生存能力に影響を及ぼすことができる植物処理ｓｉＲＮＡがもたらされる。
【０２９３】
標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの植物体への送達および摂食による鞘翅目害虫によるその後の取込みにより、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによる鞘翅目害虫における標的遺伝子の下方制御がもたらされる。標的遺伝子の機能が発育の１つまたは複数の段階で重要である場合、鞘翅目害虫の成長、発育および生殖が影響を受け、ＷＣＲ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、ＭＣＲ、Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント、Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）、Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマーおよびＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイムの少なくとも１つの場合、外寄生し、摂食し、発育し、かつ／または生殖することの不成功につながるか、あるいは鞘翅目害虫の死につながる。次いで、鞘翅目害虫を防除するために、標的遺伝子の選択およびＲＮＡｉの成功裏での適用を用いる。
【０２９４】
トランスジェニックＲＮＡｉ系および非形質転換ゼア・マイス（Zea mays）の表現型比較  ヘアピンｄｓＲＮＡを創製するために選択した標的鞘翅目害虫遺伝子または配列は、あらゆる公知の植物遺伝子配列との類似性がない。したがって、これらの鞘翅目害虫遺伝子または配列を標的とする構築物による（全身性）ＲＮＡｉの生成または活性化は、トランスジェニック植物に対してあらゆる有害な影響を及ぼすことは、予想されない。しかし、トランスジェニック系の発育および形態特性を非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有さない「空」のベクターにより形質転換したトランスジェニック系の植物と比較する。植物の根、芽条、茎葉および生殖特性を比較する。トランスジェニック植物および非形質転換植物の根の長さおよび成長パターンに観察可能な差はない。高さ等の植物の芽条の特性、葉の数およびサイズ、開花時期、花のサイズおよび外観は、同様である。温室内でｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび土壌中で栽培した場合、一般的に、トランスジェニック系と標的ｉＲＮＡ分子の発現のないものとの間に観察可能な形態の差はない。
【実施例１４】
【０２９５】
鞘翅目害虫配列およびさらなるＲＮＡｉ構築物を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
鞘翅目害虫以外の生物を標的とするｉＲＮＡ分子に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）方法論（Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67参照）により１つまたは複数の殺虫性ｄｓＲＮＡ分子（例えば、配列番号１、配列番号３または配列番号６７を含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を産生するように二次的に形質転換される。実施例７に述べたように本質的に調製される植物形質転換プラスミドベクターを、鞘翅目害虫以外の生物を標的とするｉＲＮＡ分子に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックＨｉ  ＩＩまたはＢ１０４ゼア・マイス（Zea mays）植物から得られたトウモロコシ懸濁細胞または未熟トウモロコシ胚にアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換法により送達する。
【実施例１５】
【０２９６】
ＲＮＡｉ構築物およびさらなる鞘翅目害虫防除配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
鞘翅目害虫生物を標的とするｉＲＮＡ分子（例えば、配列番号１、配列番号３、または配列番号６７を含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）方法論（Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67参照）により１つまたは複数の殺虫タンパク質分子、例えば、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１Ａ、およびＣｙｔ２Ｃ殺虫タンパク質を産生するように二次的に形質転換される。実施例７に述べたように本質的に調製される植物形質転換プラスミドベクターを、鞘翅目害虫生物を標的とするｉＲＮＡ分子に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックＢ１０４ゼア・マイス（Zea mays）植物から得られたトウモロコシ懸濁細胞または未熟トウモロコシ胚にアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換法により送達する。鞘翅目害虫の防除のためのｉＲＮＡ分子および殺虫タンパク質を産生する二重形質転換植物が得られる。
【実施例１６】
【０２９７】
ｐＲＮＡｉ媒介昆虫保護
卵の死亡または卵生存能力の喪失をもたらす親ＲＮＡｉは、昆虫保護のためのＲＮＡｉおよび他の機序を使用するトランスジェニック作物にさらなる耐久性の利益をもたらす。この有用性を示すために基本的な２パッチモデルを用いた。
【０２９８】
１つのパッチは、殺虫成分を発現するトランスジェニック作物を含有し、第２のパッチは、殺虫成分を発現しないリフュージ作物を含有していた。卵は、２つのモデル化パッチにそれらの相対的割合に従って「産卵」させた。この例では、トランスジェニックパッチは、地表の９５％に相当し、リフュージパッチは、５％に相当していた。トランスジェニック作物は、コーンルートワーム幼虫に対して活性な殺虫タンパク質を発現した。
【０２９９】
殺虫タンパク質に対するコーンルートワーム抵抗性は、一方（Ｓ）が感受性を与え、他方（Ｒ）が抵抗性を与える、２つの可能な対立遺伝子を有する、一遺伝子性としてモデル化した。殺虫タンパク質は、それを常食とする同型接合性感受性（ＳＳ）コーンルートワーム幼虫の９７％死亡率をもたらすようにモデル化した。抵抗性対立遺伝子（ＲＲ）に同型接合性であるコーンルートワーム幼虫の死亡はないと仮定した。殺虫タンパク質に対する抵抗性は、不完全に劣性であると仮定し、それにより機能的優性度は０．３である（トランスジェニック作物を常食とする、タンパク質に対する抵抗性について異型接合性（ＲＳ）である幼虫の６７．９％の死亡率がある）。
【０３００】
トランスジェニック作物は、ＲＮＡ干渉（ｐＲＮＡｉ）によって、トランスジェニック作物に曝露される成体雌コーンルートワームの卵を生存不能にする、親活性ｄｓＲＮＡも発現した。ｐＲＮＡｉに対するコーンルートワーム抵抗性も、一方（Ｘ）がＲＮＡｉに対する成体雌の感受性を与え、他方（Ｙ）がＲＮＡｉに対する成体雌の抵抗性を与える、２つの可能な対立遺伝子を有する一遺伝子性とみなされた。ｄｓＲＮＡへの高レベルの曝露を仮定して、ｐＲＮＡｉは、同型接合性感受性（ＸＸ）雌により産生された卵の９９．９％が生存不能にするようにモデル化した。このモデルは、ｐＲＮＡｉが、同型接合性抵抗性（ＹＹ）雌により産生された卵生存能力に対して作用を及ぼさないと仮定した。ｄｓＲＮＡに対する抵抗性は、劣性であるものと仮定し、それにより機能的優性度は０．０１である（ｄｓＲＮＡに対する抵抗性について異型接合性（ＸＹ）である雌により産生された卵の９８．９％が生存不能である）。
【０３０１】
該モデルでは、生存成体間にランダムな交配およびそれらの相対的割合に応じた２つのパッチにわたるランダムな産卵が存在していた。生存能力のある子孫の遺伝子型頻度は、２遺伝子座遺伝系に関するメンデル遺伝学に従っていた。
【０３０２】
ｐＲＮＡｉの効果は、成体雌が親活性ｄｓＲＮＡを発現する植物組織を常食とすることを必要とするものであった。卵の発育の妨害は、トランスジェニック作物からよりもリフュージ作物から出現する成体雌について低い可能性があり、コーンルートワーム成体は、それらが幼虫の発育の後に出現したパッチにおいてより広範囲に摂食すると予測される。したがって、リフュージパッチから出現した雌コーンルートワーム成体に対するｐＲＮＡｉの効果の相対的な規模は、変化し、ｐＲＮＡｉ効果の割合は、０（リフュージパッチから出現した成体雌に対するｐＲＮＡｉの効果なし）から１（トランスジェニックパッチから出現した成体雌に対するものとリフュージパッチから出現した成体雌に対するｐＲＮＡｉの同じ効果）までの範囲であった。
【０３０３】
このモデルは、ｐＲＮＡｉの効果が、親活性ｄｓＲＮＡを発現する植物組織を成体雄が常食とすることによってもまたは別法として達成される状況を示すように容易に調節することができると思われる。
【０３０４】
２つの抵抗性対立遺伝子の頻度を世代にわたって計算した。抵抗性対立遺伝子の両方（ＲおよびＹ）の初期頻度は、０．００５と仮定した。結果は、抵抗性対立遺伝子のそれぞれの頻度が０．０５に達する昆虫世代の数として示した。ｐＲＮＡｉによってもたらされる抵抗性遅延を検討するために、ｐＲＮＡｉを含めたシミュレーションを、ｐＲＮＡｉを含まなかったが、他のすべての方法が同じであったシミュレーションと比較した（図６）。
【０３０５】
モデルは、トランスジェニック作物におけるコーンルートワーム活性殺虫タンパク質と組み合わせてコーンルートワーム幼虫活性干渉ｄｓＲＮＡを含むように修正することもできた。その場合、幼虫ＲＮＡｉは、同型接合性ＲＮＡｉ感受性コーンルートワーム幼虫（遺伝子型ＸＸ）の９７％幼虫死亡率の効果を帰せられ、同型接合性ＲＮＡｉ抵抗性（ＹＹ）であるコーンルートワーム幼虫に対しては効果を帰せられなかった。ＲＮＡｉ抵抗性（ＸＹ）について異型接合性であったコーンルートワーム幼虫の６７．９％の死亡率が存在した。抵抗性の同じ機序が、コーンルートワーム幼虫における幼虫活性ＲＮＡｉおよびｐＲＮＡの両方に適用されることが推定された。前述のように、トランスジェニックパッチから出現した成体雌における効果と比較したリフュージパッチから出現した成体雌におけるｐＲＮＡｉ効果は、０から１まで変化した。前述のように、ｐＲＮＡｉによってもたらされる抵抗性の遅延を検討するために、ｐＲＮＡｉを含めたシミュレーションを、ｐＲＮＡｉを含まなかったが、他のすべての方法（幼虫ＲＮＡｉを含む）が同じであったシミュレーションと比較した（図７）。
【０３０６】
リフュージパッチから出現した雌コーンルートワーム成体の卵生存能力に対するｐＲＮＡｉ効果の規模がトランスジェニックパッチから出現した成体についての効果の規模と比較して低かった場合、ｐＲＮＡｉの明らかな抵抗性管理の利益が認められた。殺虫タンパク質に加えて親活性ｄｓＲＮＡを産生したトランスジェニック植物は、殺虫タンパク質のみを産生したトランスジェニック植物と比較してはるかに耐久性が高かった。同様に、殺虫タンパク質および幼虫活性ｄｓＲＮＡの両方に加えて親活性ｄｓＲＮＡを産生したトランスジェニック植物は、殺虫タンパク質および幼虫活性ｄｓＲＮＡのみを産生したトランスジェニック植物と比較してはるかに耐久性が高かった。後者の場合、耐久性の利益は、殺虫タンパク質および殺虫性干渉ｄｓＲＮＡの両方に当てはまるものであった。
【実施例１７】
【０３０７】
ＷＣＲ雄に対する親ＲＮＡｉ効果
新たに発生した未交尾ＷＣＲ雄（ＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ；Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）をｐＲＮＡｉ用のｄｓＲＮＡ（ｈｕｎｃｈｂａｃｋ）で処理した人工食餌に、連続的ｄｓＲＮＡ給餌により７日間曝露した。次いで、生存雄を未交尾雌と対にし、４日間交配させた。雌を産卵チャンバー内に隔離し、未処理食餌を与えて飼育して、卵生存能力に基づいて、交配が成功であったかどうかを判定した。さらに、雌を解剖して、１０日間の産卵の後の精包の存在を検査した。ＧＦＰ  ｄｓＲＮＡおよび水の対照を含めた。
【０３０８】
反復１回当たり処理１回当たり１０匹の雄および１０匹の雌の３回反復を実施した。反復は、新たに出現した成体を用いて異なる３日に完了した。反復１回当たりの各処理は、反復１回当たり処理１回当たり１０匹の雄を含み、トレーの１つのウェルに入れた。各ウェルは、水またはｄｓＲＮＡ（ＧＦＰ（配列番号９）またはｈｕｎｃｈｂａｃｋ（配列番号３））で処理した１２個の食餌プラグを含んでいた。各食餌プラグは、３μＬの水中２μｇのｄｓＲＮＡで処理した。トレーを、２３±１℃の温度、相対湿度＞８０％およびＬ：Ｄ  １６：８を有する成長チャンバーに移した。雄を３日目、５日目、および７日目に、各ウェルに１２個の処理食餌プラグを含む新たなトレーに移した。７日目に、処理１回当たり反復１回当たり３匹の雄を、実施例７で述べたように、ｑＰＣＲ解析のために急速冷凍した。８日目に、１０匹の雌および１０匹の処理した雄を容器に一緒に入れて、交配させた。各容器には、２２個の未処理食餌プラグを含めた。昆虫を１０日目に２２個の未処理食餌プラグを含む新たなトレーに移した。雄を１２日目に除去し、蛍光染色技法を用いて精子生存能力を測定するために用いた。雌は、２２日目まで１日おきに１２個の未処理食餌プラグを含む新たなトレーに移した。１６日目に、雌を産卵のために高圧滅菌土壌を含有する卵ケージに移した。２２日目に、すべての雌を土壌ケージから除去し、凍結して、精包の存在について検査した。土壌ケージを２７±１℃の温度、相対湿度＞８０％および２４時間暗とした新たな成長チャンバーに移した。２８日目に、土壌を＃６０ふるいを用いて洗浄して、各ケージから卵を採取した。卵を、真菌汚染を防ぐためにホルムアルデヒド（５ｍＬ再蒸留水中５００μＬホルムアルデヒド）およびカルバミン酸メチル−（ブチルカルバモイル）−２−ベンズイミダゾール（５０ｍＬ再蒸留水中０．０２５ｇ）の溶液で処理し、濾紙を含む小ペトリ皿に入れた。ＩｍａｇｅＪソフトウェアの細胞カウンター機能（Schneider et al. (2012) Nat. Methods 9:671-5）を用いた卵の計数のために各ペトリ皿の写真を撮影した。卵を含むペトリ皿を２７±１℃の温度、相対湿度＞８０％および２４時間暗とした小成長チャンバーに移した。２９日目から４２日目まで幼虫孵化を毎日モニターした。
【０３０９】
精子の生存能力。未交尾のウェスタンコーンルートワーム雄を、親ＲＮＡｉ遺伝子ｈｕｎｃｈｂａｃｋを用いた、ｄｓＲＮＡにより処理した人工食餌に７日間曝露した。処理食餌を１日おきに与えた。反復１回当たり処理１回当たり４匹の雄を用いて、Collins and Donoghue (1999)により記載されたように生存精子と死滅精子とを識別するための蛍光技法を用いて精子の生存能力について試験した。Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ｓｐｅｒｍ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）は、膜浸透性核酸染色である、ＳＹＢＲ  １４、および死滅細胞を染色する、プロピジウムヨウ化物を含む。
【０３１０】
ＷＣＲ雄を氷上で麻酔し、精巣および精嚢を切り離し、１０μＬの緩衝液（ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＢＳＡ  １０％、ｐＨ７．４）に入れ、高圧滅菌ようじで破砕した。Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ｓｐｅｒｍ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（商標）を用いて、精子の生存能力を直ちに評価した。１μＬの容積のＳＹＢＲ  １４（ＤＭＳＯ中０．１ｍＭ）を加え、室温で１０分間インキュベートした後、１μＬのプロピジウムヨウ化物（２．４ｍＭ）を加え、再び室温で１０分間インキュベートした。１０μＬの容積の精子染色溶液をガラスマイクロスライドに移し、カバーガラスで覆った。試料は、Ｎｉｋｏｎ  Ａ１共焦点およびＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア付きのＮｉｋｏｎ（商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ  ９０ｉ顕微鏡を用いて評価した。４８８励起、生存精子のための５００〜５５０ｎｍバンドパス（ＳＹＢＲ  １４）および死滅精子のための６６３〜７３８ｎｍバンドパス（プロピジウムヨウ化物）で同時に、試料を１０倍で可視化した。デジタル画像は、試料１つ当たり５視野について記録した。生存（緑色）および死滅（赤色）精子の数は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアの細胞カウンター機能（Schneider et al. (2012) Nat. Methods 9:671-5）を用いて評価した。
【０３１１】
ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡを７日間摂取した雄は、ＧＦＰ  ｄｓＲＮＡまたは水単独を摂取した雄より少ない全精子および少ない死滅精子を産生した（表２０）。生存精子の平均数は、処理間で有意に異ならなかった。ｄｓＲＮＡ処理物を摂取した雄と交配した雌１匹当たりの卵の数または雌からの卵孵化の百分率の統計学的な差はなかった（表２１）。ｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡに４回曝露した雄に関する転写物発現において統計学的な差はなかった。
【０３１２】
【表１３】
2018500020.tif 000021
【０３１３】
【表１４】
2018500020.tif 000022
【０３１４】
未交尾雄は、ｄｓＲＮＡへの曝露が合計６回に増加したことを除いて、上述のように処理した。雄を３日目、５日目、７日目、９日目、および１１日目に１２個の処理食餌プラグを含む新たなトレーに移した。次いで、生存雄を未交尾雌と対にし、４日間交配させた。雌を産卵チャンバーに隔離し、未処理食餌で維持して、卵生存能力に基づいて、交配が成功したかどうかを判定した。
【０３１５】
【表１５】
2018500020.tif 000023
【０３１６】
雄における相対的な発現を、実施例７で述べたように決定した。
【０３１７】
【表１６】
2018500020.tif 000024
【実施例１８】
【０３１８】
有効濃度
交配雌を４つの曝露条件のｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡに曝露して、有効濃度を決定した。新たに出現した（＜４８時間）成体雄および雌をＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から入手した。処理は、食餌プラグ１個当たり２、０．２、０．０２および０．００２μｇのｈｕｎｃｈｂａｃｋ（配列番号３）ｄｓＲＮＡを含んでいた。２μｇのＧＦＰおよび水を対照とした。１０匹の雄および１０匹の雌を未処理人工食餌の２０個のペレットを含む１つのウェルに一緒に入れた。トレーを成長チャンバーに移し、２３±１℃の温度、相対湿度＞８０％および１６：８  Ｌ：Ｄ光周期に維持した。雄を５日目に実験から除外した。新たに処理した食餌を１３日目まで１日おきに与えた。１４日目に雌を高圧滅菌土壌を含む卵ケージに移し、新しい処理人工食餌を与えた（ケージ１つ当たり１１個のプラグ）。卵ケージを成長チャンバー内に戻した。
【０３１９】
１６日目に、新しい処理食餌を上述のように与えた。すべての雌を１８日目に土壌ケージから除去し、ｑＰＣＲのために急速冷凍した。土壌ケージを２７±１℃の温度、相対湿度＞８０％および２４時間暗とした新たな成長チャンバーに移した。２４日目に、土壌を＃６０ふるいを用いて洗浄して、各ケージから卵を採取した。卵を、真菌汚染を防ぐために、ホルムアルデヒド（５ｍＬ再蒸留水中５００μＬホルムアルデヒド）およびカルバミン酸メチル−（ブチルカルバモイル）−２−ベンズイミダゾール（５０ｍＬ再蒸留水中０．０２５ｇ）の溶液で処理し、濾紙を含む小ペトリ皿に入れた。ＩｍａｇｅＪソフトウェアの細胞カウンター機能（Schneider et al. (2012) Nat. Methods 9:671-5）を用いた卵の計数のために各ペトリ皿の写真を撮影した。卵を含むペトリ皿を２７±１℃の温度、相対湿度＞８０％および２４時間暗とした小成長チャンバーに移した。幼虫孵化を１５日間を通して毎日モニターした。各日に幼虫を計数し、ペトリ皿から除去した。
【０３２０】
２および０．２μｇ／食餌プラグ処理で有意に低い卵孵化が認められた（表２４）が、どの試験した用量と対照との間にも雌１匹当たりの産卵した卵の数の差はなかった。
【０３２１】
【表１７】
2018500020.tif 000025
【０３２２】
２、０．２および０．０２の濃度で処理したＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）雌からの相対的なｈｕｎｃｈｂａｃｋ発現は、対照（水およびＧＦＰ）よりも有意に低かった（図１１）。比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定により実施した。
【実施例１９】
【０３２３】
曝露のタイミング
親ＲＮＡｉ効果を発生させるのに必要な曝露のタイミングを決定するために、雌を３つの異なる時点に開始して２μｇのｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡに６回曝露した。雌を交配前に６回、交配直後に６回および交配の６日後にｄｓＲＮＡに曝露した。反復１回当たり１０匹の雌および１０匹の雄の３反復を各曝露時間について完了した。成体ＷＣＲをＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から受け取った。
【０３２４】
交配前のｄｓＲＮＡの摂取。１０匹の雌を、処理人工食餌の１１個のペレット（ペレット１個当たり２μｇ  ｄｓＲＮＡ）を含む１つのウェルに入れた。トレーを、２３±１℃の温度、相対湿度＞８０％および１６：８  Ｌ：Ｄ光周期を有する成長チャンバーに移した。雌を新しい処理食餌を含むトレーに１０日間にわたり１日おきに移した。１２日目に、雌を１０匹の雄と対にし、未処理食餌の２２個のプラグを与えた。雄は、４日後に除去した。新しい未処理食餌を８日間にわたり１日おきに与えた。２２日目に、雌を、高圧滅菌土壌を未処理人工食餌の１１個のプラグと共に含む卵ケージに移した。卵ケージを成長チャンバー内に戻し、２４日目に、食餌を交換した。２６日目に雌を土壌ケージから除去し、ｑＰＣＲのために急速冷凍した。
【０３２５】
土壌ケージを、２７±１℃の温度、相対湿度＞８０％および２４時間暗とした成長チャンバーに移した。４日後に土壌を＃６０ふるいを用いて洗浄して、各ケージから卵を採取した。卵を、真菌汚染を防ぐために、ホルムアルデヒド（５ｍＬ再蒸留水中５００μＬホルムアルデヒド）およびカルバミン酸メチル−（ブチルカルバモイル）−２−ベンズイミダゾール（５０ｍＬ再蒸留水中０．０２５ｇ）の溶液で処理し、濾紙を含む小ペトリ皿に入れた。ＩｍａｇｅＪソフトウェアの細胞カウンター機能を用いた卵の計数のために各ペトリ皿の写真を撮影した。卵を含むペトリ皿を、２７±１℃の温度、相対湿度＞８０％および２４時間暗とした小成長チャンバーに移した。幼虫孵化を１５日間毎日モニターした。各日に幼虫を計数し、ペトリ皿から除去した。図８Ａは、雌１匹当たりの回収された卵の数を示すデータの概要を示し、図８Ｂは、それぞれ、交配前に６回の、交配直後に６回の、および交配の６日後に６回の、０．６７μｇ／μｌのｈｕｎｃｈｂａｃｋまたはＧＦＰへの曝露後に孵化した全幼虫の百分率の結果を示す。比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定により実施し、＊は、ｐ＜０．１での有意性を示し、＊＊は、ｐ＜０．０５での有意性を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１での有意性を示す。図９は、交配前に６回の、交配直後に６回の、および交配の６日後に６回の、０．６７μｇ／μｌのｈｕｎｃｈｂａｃｋまたはＧＦＰへの曝露後に測定した相対的なｈｕｎｃｈｂａｃｋ発現を示すデータの概要を示す。比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定により実施し、＊＊は、ｐ＜０．０５での有意性を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１での有意性を示す。
【０３２６】
交配直後のｄｓＲＮＡの摂取。１０匹の雄および１０匹の雌を試験の開始時に未処理人工食餌の２２個のペレットを含む１つのウェルに一緒に入れたこと以外は上記の方法に類似した方法を用いた。上述のようにトレーを成長チャンバーに移した。新しい未処理食餌を３日目に与え、雄を５日目に除去した。次いで雌を処理人工食餌に移し、成長チャンバー内で維持した。新しい処理食餌を６日間にわたり１日おきに与えた。１２日目に雌を、高圧滅菌土壌を処理人工食餌の１１個のプラグ共に含む卵ケージに移した。卵ケージを成長チャンバー内に戻し、１４日目に新しい処理食餌を与えた。１６日目にすべての雌を土壌ケージから除去し、ｑＰＣＲのために急速冷凍した。土壌ケージおよび卵の洗浄を上述のように６日後に行った。卵の計数のために各ペトリ皿の写真を撮影した。幼虫孵化を１５日間毎日モニターした。雌１匹当たりの卵の結果を図８Ａに示し、孵化した全幼虫の百分率の結果を図８Ｂに示す。雌の相対的ｈｕｎｃｈｂａｃｋ発現は、６回のｄｓＲＮＡの投与を受けた後に測定し、図９に示す。
【０３２７】
交配後のｄｓＲＮＡの摂取。雌が処理食餌に移された１１日目まで１日おきに昆虫が未処理人工食餌の給餌を受けたことを除いて、方法は、交配直後のｄｓＲＮＡ摂取について上述したものと同様である。１２日目に雌を、高圧滅菌土壌を処理人工食餌の１１個のプラグと共に含む卵ケージに移した。卵ケージを成長チャンバー内に戻した。新しい処理食餌を１２〜２０日目に１日おきに与えた。２２日目に、すべての雌を土壌ケージから除去し、ｑＰＣＲのために急速冷凍した。土壌ケージおよび卵の洗浄を上述のように６日後に行った。卵の計数のために各ペトリ皿の写真を撮影した。幼虫孵化を１５日間毎日モニターした。各日に幼虫を計数し、ペトリ皿から除去した。雌１匹当たりの卵の結果を図８Ａに示し、孵化した全幼虫百分率の結果を図８Ｂに示す。相対的ｈｕｎｃｈｂａｃｋ発現を測定し、図９に示す。
【０３２８】
試験を通してすべての処理について雌の死亡数を１日おきに記録した。
【実施例２０】
【０３２９】
曝露の持続期間
未交尾雄および雌を未処理食餌を与えて４日の期間にわたり交配させ、その後、交配雌を２μｇのｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡに曝露した。曝露の持続期間の効果を評価するために、昆虫をｈｕｎｃｈｂａｃｋまたはＧＦＰ  ｄｓＲＮＡに、１、２、４または６回曝露した（図１０および図１０ＢにＴ１、Ｔ２、Ｔ４またはＴ６として示す）。処理１回当たり１０匹の雌および１０匹の雄の４回の反復を完了した。成体雄および雌をＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から受け取った。１０匹の雄および１０匹の雌を未処理人工食餌の２０個のペレットを含む１つのウェルに一緒に入れた。トレーを２３±１℃の温度、相対湿度＞８０％および１６：８  Ｌ：Ｄ光周期を有する成長チャンバー内に保持した。新しい未処理人工食餌を３日目に与えた。雄を５日目に除去し、雌を、それぞれの処理についてウェル１つ当たり１１個の食餌プラグを含む新しいトレーに移した。７日目に、雌を新しい処理人工食餌を含むトレーに移し、死亡数を記録した。１回（Ｔ１）の曝露処理の雌を未処理食餌に移した。１０日および１２日目に雌を新しい処理人工食餌を含むトレーに移し、死亡数を記録した。Ｔ１およびＴ２からの雌を、未処理食餌に移した。１４日目に雌を高圧滅菌土壌を含む卵ケージに移し、新しい処理人工食餌を与えた。Ｔ１、Ｔ２およびＴ４の雌に未処理食餌を与えた。１６日目に、古い食餌を除去し、新しい処理食餌を加えた。Ｔ１、Ｔ２およびＴ４の雌に未処理食餌を与えた。１８日後にすべての雌を土壌ケージから除去し、ｑＰＣＲのために急速冷凍した。土壌ケージを温度２７±１℃の温度、相対湿度＞８０％および２４時間暗とした成長チャンバーに移した。卵を洗浄し、曝露の時期を表示した各ペトリ皿の写真を撮影した。１５日間毎日、産卵した幼虫を計数し、ペトリ皿から除去した。雌１匹当たりの産卵した卵の百分率の結果を図１０Ａに示す。孵化した全幼虫百分率の結果を図１０Ｂに示す。雌の相対的ｈｕｎｃｈｂａｃｋ発現を測定して、図１０Ｃに示す。
【実施例２１】
【０３３０】
卵巣の発育
Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）の卵巣の発育を、曝露の時期について述べたように交配前および交配直後にｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡで処理した人工食餌に曝露した雌において評価した。雌を２μｇのｈｕｎｃｈｂａｃｋもしくはＧＦＰ  ｄｓＲＮＡ、または水に６回曝露した。処理１回当たり５匹の雌を最終ｄｓＲＮＡ曝露の１日後に採取し、後の卵巣切開のために７０％エタノールに保存した。すべての生存雌の卵巣切開は、立体顕微鏡下で実施した。画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＺＸ１６顕微鏡、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＤＦ  ＰＬＡＰＯ  ２Ｘ  ＰＦＣレンズおよびＯｌｙｍｐｕｓ  ＣｅｌｌＳｅｎｓ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓソフトウエア（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて取得した。
【０３３１】
Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）の切開により、水、ＧＦＰまたはｈｕｎｃｈｂａｃｋ  ｄｓＲＮＡにより処理した雌の間に卵巣の発育の明らかな差がないことが明らかになった。これは、未交配雌ならびに交配直後に切開した雌の両方に当てはまった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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