(57)【要約】  本発明は、特に、糖尿病、肥満、心血管疾患、脂肪肝疾患、及び／又はがんなどの障害の処置における使用のために脂質シャペロンａＰ２／ＦＡＢＰ４（「ａＰ２」と呼ぶ）を標的とする、改善された抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤、並びにその組成物の分野にある。一態様では、血清ａＰ２が標的化され、ａＰ２の生物活性が、低結合親和性ａＰ２モノクローナル抗体を使用して中和又はモジュレートされ、空腹時血糖値の低下、全身グルコース代謝の改善、全身インスリン感受性の増大、脂肪量の減少、肝臓脂肪変性の減少、心血管疾患の軽減及び／又は心血管疾患の発症リスクの低下を提供する、ａＰ２媒介性障害のための改善された処置が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列、又はＣＤＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列から独立に選択される１個、２個、又は３個の相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ）を含む軽鎖可変領域を含み、
ＣＤＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列が、配列番号７（ＣＤＲＬ１）又は配列番号５９７（ＣＤＲＬ１バリアント１）であり；
ＣＤＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列が、配列番号８（ＣＤＲＬ２）又は配列番号５９８（ＣＤＲＬ２バリアント１）であり；
ＣＤＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列が、配列番号９（ＣＤＲＬ３）、配列番号１０（ＣＤＲＬ３バリアント１）、配列番号１１（ＣＤＲＬ３バリアント２）、配列番号１２（ＣＤＲＬ３バリアント３）、又は配列番号１３（ＣＤＲＬ３バリアント４）から選択される、
ヒト化抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２】
ＣＤＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列、又はＣＤＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列から独立に選択される１個、２個、又は３個の相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ）を含む重鎖可変領域を含み、
ＣＤＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列が、配列番号１４（ＣＤＲＨ１）又は配列番号１５（ＣＤＲＨ１バリアント１）であり；
ＣＤＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列が、配列番号１６（ＣＤＲＨ２）、配列番号１７（ＣＤＲＨ２バリアント１）、又は配列番号１８（ＣＤＲＨ２バリアント２）であり；
ＣＤＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列が、配列番号１９（ＣＤＲＨ３）、配列番号２０（ＣＤＲＨ３バリアント１）、配列番号２１（ＣＤＲＨ３バリアント２）、又は配列番号６０２（ＣＤＲＨ３バリアント３）から選択される、
抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３】
１個、２個又は３個のＣＤＲ−Ｌが、ヒト免疫グロブリンフレームワークアミノ酸領域をさらに含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４】
１個、２個又は３個のＣＤＲ−Ｈが、ヒト免疫グロブリンフレームワークアミノ酸領域をさらに含む、請求項２に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項５】
抗体、又はその抗体剤が、約１０−７Ｍ以上のヒトａＰ２に対するＫＤを有する、請求項１、２、３又は４のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６】
軽鎖可変領域が、配列番号７（ＣＤＲＬ１）を含むＣＤＲ−Ｌ１領域を含む、請求項１、３又は５のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項７】
軽鎖可変領域が、配列番号５９７（ＣＤＲＬ１バリアント１）を含むＣＤＲ−Ｌ１領域を含む、請求項１、３又は５のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項８】
軽鎖可変領域が、配列番号８（ＣＤＲＬ２）を含むＣＤＲ−Ｌ２領域を含む、請求項１、３又は５のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項９】
軽鎖可変領域が、配列番号５９８（ＣＤＲＬ２バリアント１）を含むＣＤＲ−Ｌ２領域を含む、請求項１、３又は５のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１０】
軽鎖可変領域が、配列番号９（ＣＤＲＬ３）を含むＣＤＲ−Ｌ３領域を含む、請求項１、３又は５のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１１】
軽鎖可変領域が、配列番号１０（ＣＤＲＬ３バリアント１）を含むＣＤＲ−Ｌ３領域を含む、請求項１、３又は５のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１２】
軽鎖可変領域が、配列番号１１（ＣＤＲＬ３バリアント２）を含むＣＤＲ−Ｌ３領域を含む、請求項１、３又は５のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１３】
軽鎖可変領域が、配列番号１２（ＣＤＲＬ３バリアント３）を含むＣＤＲ−Ｌ３領域を含む、請求項１、３又は５のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４】
軽鎖可変領域が、配列番号１３（ＣＤＲＬ３バリアント４）を含むＣＤＲ−Ｌ３領域を含む、請求項１、３又は５のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１５】
軽鎖可変領域が、配列番号６０２（ＣＤＲＨ３バリアント３）を含むＣＤＲ−Ｌ３領域を含む、請求項１、３又は５のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１６】
配列番号８（ＣＤＲＬ２）を含むＣＤＲ−Ｌ２領域をさらに含む、請求項６又は７に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１７】
配列番号５９８（ＣＤＲＬ２バリアント１）を含むＣＤＲ−Ｌ２領域をさらに含む、請求項６又は７に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１８】
配列番号９（ＣＤＲＬ３）を含むＣＤＲ−Ｌ３領域をさらに含む、請求項６、７、１６、又は１７のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１９】
配列番号１０（ＣＤＲＬ３バリアント１）を含むＣＤＲ−Ｌ３領域をさらに含む、請求項６、７、１６、又は１７のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２０】
軽鎖可変領域が、配列番号１１（ＣＤＲＬ３バリアント２）を含むＣＤＲ−Ｌ３領域をさらに含む、請求項６、７、１６、又は１７のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２１】
軽鎖可変領域が、配列番号１２（ＣＤＲＬ３バリアント３）を含むＣＤＲ−Ｌ３領域をさらに含む、請求項６、７、１６、又は１７のいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２２】
ＣＤＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列、又はＣＤＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列から独立に選択される１個、２個、又は３個の相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ）を含む重鎖可変領域をさらに含み、
ＣＤＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列が、配列番号１４（ＣＤＲＨ１）、又は配列番号１５（ＣＤＲＨ１バリアント１）であり；
ＣＤＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列が、配列番号１６（ＣＤＲＨ２）、配列番号１７（ＣＤＲＨ２バリアント１）、又は配列番号１８（ＣＤＲＨ２バリアント２）であり；
ＣＤＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列が、配列番号１９（ＣＤＲＨ３）、配列番号２０（ＣＤＲＨ３バリアント１）、配列番号２１（ＣＤＲＨ３バリアント２）、又は配列番号６０２（ＣＤＲＨ３バリアント３）から選択される、
請求項１又は６から２１までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２３】
１個、２個、又は３個のＣＤＲＨが、ヒト免疫グロブリンフレームワークアミノ酸領域をさらに含む、請求項２２に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２４】
重鎖可変領域が、配列番号１４（ＣＤＲＨ１）を含むＣＤＲ−Ｈ１領域を含む、請求項２２又は２３に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２５】
重鎖可変領域が、配列番号１５（ＣＤＲＨ１バリアント１）を含むＣＤＲ−Ｈ１領域を含む、請求項２２又は２３に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２６】
重鎖可変領域が、配列番号１６（ＣＤＲＨ２）を含むＣＤＲ−Ｈ２領域を含む、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２７】
重鎖可変領域が、配列番号１７（ＣＤＲＨ２バリアント１）を含むＣＤＲ−Ｈ２領域を含む、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２８】
重鎖可変領域が、配列番号１８（ＣＤＲＨ２バリアント２）を含むＣＤＲ−Ｈ２領域を含む、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項２９】
重鎖可変領域が、配列番号１９（ＣＤＲＨ３）を含むＣＤＲ−Ｈ３領域を含む、請求項２２から２８までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３０】
重鎖可変領域が、配列番号２０（ＣＤＲＨ３バリアント１）を含むＣＤＲ−Ｈ３領域を含む、請求項２２から２８までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３１】
重鎖可変領域が、配列番号２１（ＣＤＲＨ３バリアント２）を含むＣＤＲ−Ｈ３領域を含む、請求項２２から２８までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３２】
重鎖可変領域が、配列番号６０２（ＣＤＲＨ３バリアント３）を含むＣＤＲ−Ｈ３領域を含む、請求項２２から２８までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３３】
抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤の結合親和性を増大又は減少させるために、ＣＤＲ領域又はフレームワーク領域中の１又は複数のアミノ酸が置換又は除去される、請求項１から３２までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３４】
軽鎖可変領域が、配列番号４４６（９０９ｇＬ１  ＶＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３５】
軽鎖可変領域が、配列番号４４７（９０９ｇＬ１  ＶＬ＋ＣＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３６】
軽鎖可変領域が、配列番号４４８（９０９ｇＬ１０  ＶＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３７】
軽鎖可変領域が、配列番号４４９（９０９ｇＬ１０  ＶＬ＋ＣＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３８】
軽鎖可変領域が、配列番号４５０（９０９ｇＬ５４  ＶＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項３９】
軽鎖可変領域が、配列番号４５１（９０９ｇＬ５４  ＶＬ＋ＣＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４０】
軽鎖可変領域が、配列番号４５２（９０９ｇＬ５５  ＶＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４１】
軽鎖可変領域が、配列番号４５３（９０９ｇＬ５５  ＶＬ＋ＣＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４２】
軽鎖可変領域が、配列番号４８７（９０９ｇＬ１３  ＶＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４３】
軽鎖可変領域が、配列番号４８８（９０９ｇＬ５０  ＶＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４４】
軽鎖可変領域が、配列番号４８９（９０９ｇＬ１３  ＶＬ＋ＣＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４５】
軽鎖可変領域が、配列番号４９０（９０９ｇＬ５０  ＶＬ＋ＣＬ領域）を含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４６】
軽鎖フレームワーク３領域中にアミノ酸置換Ｃ８８Ａをさらに含む、請求項３６から３９までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４７】
配列番号４４６（９０９ｇＬ１  ＶＬ領域）、配列番号４４８（９０９ｇＬ１０  ＶＬ領域）、配列番号４８７（９０９ｇＬ１３  ＶＬ領域）、配列番号４８８（９０９ｇＬ５０  ＶＬ領域）、配列番号４５０（９０９ｇＬ５４  ＶＬ領域）、又は配列番号４５２（９０９ｇＬ５５  ＶＬ領域）から選択される軽鎖可変領域と、配列番号４５５（９０９ｇＨ１  ＶＨ領域）、配列番号４５７（９０９ｇＨ１４  ＶＨ領域）、配列番号４５９（９０９ｇＨ１５  ＶＨ領域）、配列番号４６１（９０９ｇＨ６１  ＶＨ領域）、又は配列番号４６３（９０９ｇＨ６２  ＶＨ領域）から選択される重鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４８】
軽鎖可変領域が、軽鎖フレームワーク３領域中にアミノ酸置換Ｃ８８Ａをさらに含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項４９】
配列番号４４６（９０９ｇＬ１  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５５（９０９ｇＨ１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項５０】
配列番号４４８（９０９ｇＬ１０  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５９（９０９ｇＨ１５  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項５１】
配列番号４５０（９０９ｇＬ５４  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５９（９０９ｇＨ１５  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項５２】
ＩｇＡ重鎖定常領域をさらに含む、請求項１から５１まで、１２２から１２８まで、又は１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項５３】
ＩｇＤ重鎖定常領域をさらに含む、請求項１から５１まで、１２２から１２８まで、又は１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項５４】
ＩｇＥ重鎖定常領域をさらに含む、請求項１から５１まで、１２２から１２８まで、又は１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項５５】
ＩｇＧ重鎖定常領域をさらに含む、請求項１から５１まで、１２２から１２８まで、又は１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項５６】
ＩｇＭ重鎖定常領域をさらに含む、請求項１から５１まで、１２２から１２８まで、又は１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項５７】
Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、単一ドメイン軽鎖、単一ドメイン重鎖、ダイアボディ、二特異的抗体、トリアボディ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ、トリボディ、又は（Ｆａｂ−Ｆｖ）２−Ｆｃから選択される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２抗原結合剤。
【請求項５８】
配列番号１のａＰ２タンパク質（ヒトａＰ２タンパク質）の配列番号１のアミノ酸残基１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３８Ｋ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａ、又は配列番号１の１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３８Ｋ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａのいずれかの約４オングストローム以内のアミノ酸残基と接触する、抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項５９】
エピトープ結合領域が、３７Ａ又は５７Ｔから選択されるアミノ酸にさらに結合する、請求項５２に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６０】
約１０−７Ｍ以上の、ヒトａＰ２タンパク質に対するＫＤを有する、請求項５２又は５３に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６１】
エピトープ結合領域が軽鎖可変領域内に含まれる、請求項５２から５４までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６２】
配列番号４４５（ウサギＡｂ９０９  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域を含み、さらに任意選択で、配列番号４５４（ウサギＡｂ９０９  ＶＨ領域）の重鎖可変領域を含む、単離された抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６３】
アミノ酸残基１００Ｐｈｅ又は
ＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸残基２７Ｇｌｕ、２８Ａｓｐ、若しくは３０Ｓｅｒ；
及び
ＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸残基９２Ｔｙｒ、９３Ｇｌｙ、９４Ｔｈｒ、９５Ｔｙｒ、９６Ａｌａ
から選択される、相補性決定領域（ＣＤＲ）内に含まれるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む、抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６４】
アミノ酸残基１０４Ｌｅｕを含む重鎖可変領域をさらに含む、請求項６３に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６５】
約１０−７Ｍ以上の、ヒトａＰ２タンパク質に対するＫＤを有する、請求項６３又は６４に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６６】
デンプン、アルブミン、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択されるポリマーにコンジュゲートしている、請求項１から６５まで、１２２から１２８まで、又は１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６７】
ポリマーが、５〜５０ｋＤａの範囲の分子量を有するＰＥＧである、請求項６６に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６８】
抗体が完全長抗体である、請求項１から６５まで、１２２から１２８まで、又は１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項６９】
完全長抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ４Ｐからなる群から選択される、請求項６８に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項７０】
請求項１から６９まで、１２２から１２８まで、又は１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項７１】
配列番号４６５（ウサギＡｂ９０９  ＶＬ領域（配列番号４４５）ｃＤＮＡ）、配列番号４６６（ウサギＡｂ９０９  ＶＨ領域（配列番号４５４）ｃＤＮＡ）、配列番号４６７（９０９ｇＬ１  Ｖ領域（配列番号４４６）ｃＤＮＡ）、配列番号４６８（９０９ｇＬ１軽鎖（Ｖ＋定常）（配列番号４４７）ｃＤＮＡ）、配列番号４６９（９０９ｇＬ１０  Ｖ領域（配列番号４４８）ｃＤＮＡ）、配列番号４７０（９０９ｇＬ１０軽鎖（Ｖ＋定常）（配列番号４４９）ｃＤＮＡ）、配列番号４７１（９０９ｇＬ５４  Ｖ領域（配列番号４５０）ｃＤＮＡ）、配列番号４７２（９０９ｇＬ５４軽鎖（Ｖ＋定常）（配列番号４５１）ｃＤＮＡ）、配列番号４７３（９０９ｇＬ５５  Ｖ領域（配列番号４５２）ｃＤＮＡ）、配列番号４７４（９０９ｇＬ５５軽鎖（Ｖ＋定常）（配列番号４５３）ｃＤＮＡ）、配列番号４７５（９０９ｇＨ１  Ｖ領域（配列番号４５５）ｃＤＮＡ）、配列番号４７６（９０９ｇＨ１  ＩｇＧ４重鎖（Ｖ＋ヒトγ−４Ｐ定常）配列番号４５６）ｃＤＮＡ）、配列番号４７７（９０９ｇＨ１５  Ｖ領域（配列番号４５９）ｃＤＮＡ）、配列番号４７８（９０９ｇＨ１５  ＩｇＧ４重鎖（Ｖ＋ヒトガンマ−４Ｐ定常）（配列番号４６０）ｃＤＮＡ）、配列番号４８９（９０９ｇＬ１３  ＶＬ＋ＣＬ領域）、又は配列番号４９０（９０９ｇＬ５０  ＶＬ＋ＣＬ領域）から選択される１又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクター。
【請求項７２】
請求項７１に記載の１又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７３】
ヒトａＰ２に対する結合特異性を有する抗体又は抗原結合剤の生成のための方法であって、請求項７２に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体を単離するステップとを含む上記方法。
【請求項７４】
請求項１から６９までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体の１又は複数と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項７５】
障害を処置するのに有用な１又は複数のさらなる薬剤をさらに含む、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
療法における使用のための、請求項１から６９まで、１２２から１２８まで、若しくは１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物。
【請求項７７】
代謝障害、炎症障害、体重障害、心血管障害、又は新生物障害の処置における使用のための、請求項１から６９まで、１２２から１２８まで、若しくは１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物。
【請求項７８】
障害が糖尿病、肥満、脂質異常症、脂肪肝疾患、がん、アテローム性動脈硬化症、多嚢胞性卵巣症候群、又は閉経周辺期若しくは閉経後の心疾患である、請求項７７に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項７９】
請求項１から６９まで、１２２から１２８まで、若しくは１３２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主におけるａＰ２媒介性障害を防止する、又はその重症度を減弱させる方法。
【請求項８０】
障害がＩ型糖尿病である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
障害が肥満である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
障害が脂質異常症である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
障害が脂肪肝疾患である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
障害がアテローム性動脈硬化症である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
障害が多嚢胞性卵巣症候群である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８６】
障害ががんである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
障害が閉経周辺期又は閉経後関連心血管疾患である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８８】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主における総コレステロールレベルを低下させる方法。
【請求項８９】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主における高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質、超低密度リポタンパク質、及び／又はトリグリセリドレベルを低下させる方法。
【請求項９０】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主における空腹時血糖値を低下させる方法。
【請求項９１】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主における脂肪量レベルを低下させる方法。
【請求項９２】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主における肝臓グルコース産生を低下させる方法。
【請求項９３】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主における脂肪細胞脂肪分解を減少させる方法。
【請求項９４】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主における高インスリン血症を軽減する方法。
【請求項９５】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主における肝臓脂肪変性を減少させる方法。
【請求項９６】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主におけるグルコース代謝を増大させる方法。
【請求項９７】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主におけるインスリン感受性を増大させる方法。
【請求項９８】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主におけるインスリン発現を増加させる方法。
【請求項９９】
請求項１から６９まで、１００から１１１まで、１２２から１５２までのいずれか一項に記載の抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項７４若しくは７５に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、宿主における膵島β細胞死、機能障害、又は喪失を防止するための方法。
【請求項１００】
配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の１０Ｋ、３８Ｋ、１２Ｖ、１１Ｌ、１３０Ｅ、１３２Ａ、及び１３Ｓから選択される少なくとも１個の残基を含むエピトープに結合する、抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１０１】
配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の１０Ｋ、３８Ｋ、１２Ｖ、１１Ｌ、１３０Ｅ、１３２Ａ、１３Ｓ、５７Ｔ、及び３７Ａから選択される少なくとも３個の残基を含むエピトープに結合する、抗ａＰ２モノクローナル抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１０２】
エピトープが配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の１０Ｋを含む、請求項１００又は１０１に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０３】
エピトープが配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の３８Ｋを含む、請求項１００から１０２までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０４】
エピトープが配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の１２Ｖを含む、請求項１００から１０３までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０５】
エピトープが配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の１１Ｌを含む、請求項１００から１０４までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０６】
エピトープが配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の１３０Ｅを含む、請求項１００から１０５までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０７】
エピトープが配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の１３２Ａを含む、請求項１００から１０６までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０８】
エピトープが配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の１３Ｓを含む、請求項１００から１０７までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０９】
エピトープが配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の５７Ｔを含む、請求項１００から１０８までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１１０】
エピトープが配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）の３７Ａを含む、請求項１００から１０９までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１１１】
５００ｎＭ以上、５００ｎＭ〜１０μＭ、１〜７μＭ、又は２〜５μＭの、配列番号１に対する親和性（ＫＤ）を有する、請求項１００から１１０までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１１２】
代謝障害、炎症障害、体重障害、心血管障害、又は新生物障害の処置における使用のための、請求項１００から１１１までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１１３】
糖尿病、肥満、脂質異常症、脂肪肝疾患、がん、アテローム性動脈硬化症、多嚢胞性卵巣症候群、又は閉経周辺期若しくは閉経後関連心血管疾患の処置における使用のための、請求項１００から１１１までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１１４】
ヒト化抗体である、請求項１００から１１１までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１１５】
Ｆａｂ、改変型Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変型Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体又はｓｃＦｖである、請求項１００から１１１までのいずれか一項に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１１６】
配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）への結合について、請求項１から１１５までのいずれか一項に記載の抗体と競合する、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１１７】
代謝障害、炎症障害、体重障害、心血管障害、又は新生物障害の処置における使用のための、５００ｎＭ以上の、配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）に対する親和性（ＫＤ）を有する、抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１１８】
糖尿病、肥満、脂質異常症、脂肪肝疾患、がん、アテローム性動脈硬化症、又は多嚢胞性卵巣症候群の処置における使用のための、５００ｎＭ以上の、配列番号１（ヒトａＰ２タンパク質）に対する親和性（ＫＤ）を有する、抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１１９】
ＫＤが５００ｎＭ〜１０μＭである、請求項１１７又は１１８に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１２０】
ＫＤが１〜７μＭである、請求項１１７又は１１８に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１２１】
ＫＤが２〜５μＭである、請求項１１７又は１１８に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤。
【請求項１２２】
配列番号４５２（９０９ｇＬ５５  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５９（９０９ｇＨ１５  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１２３】
配列番号４８７（９０９ｇＬ１３  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５９（９０９ｇＨ１５  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１２４】
配列番号４８８（９０９ｇＬ５０  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５９（９０９ｇＨ１５  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１２５】
配列番号４４８（９０９ｇＬ１０  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５５（９０９ｇＨ１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１２６】
配列番号４５０（９０９ｇＬ５４  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５５（９０９ｇＨ１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１２７】
配列番号４８７（９０９ｇＬ１３  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５５（９０９ｇＨ１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１２８】
配列番号４８８（９０９ｇＬ５０  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５５（９０９ｇＨ１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１２９】
配列番号７〜２１から選択される少なくとも１又は複数のＣＤＲを含む抗Ａｐ２抗原結合剤であって、ＣＤＲが非Ｉｇフレームワークに移植されている、上記抗Ａｐ２抗原結合剤。
【請求項１３０】
非Ｉｇフレームワークがフィブロネクチンである、請求項１２９に記載の抗原結合剤。
【請求項１３１】
非Ｉｇフレームワークがロイシンジッパーである、請求項１２９に記載の抗原結合剤。
【請求項１３２】
配列番号４４６（９０９ｇＬ１  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５９（９０９ｇＨ１５  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１３３】
軽鎖可変領域が配列番号４４７（９０９ｇＬ１  ＶＬ＋ＣＬ領域）を含み、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤が配列番号４６０（９０９ｇＨ１５  ＩｇＧ４  ＶＨ＋ヒトγ−４Ｐ定常）をさらに含む、請求項１に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１３４】
配列番号４４６（９０９ｇＬ１  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５７（９０９ｇＨ１４  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１３５】
配列番号４４６（９０９ｇＬ１  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６１（９０９ｇＨ６１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１３６】
配列番号４４６（９０９ｇＬ１  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６３（９０９ｇＨ６２  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１３７】
配列番号４４８（９０９ｇＬ１０  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５７（９０９ｇＨ１４  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１３８】
配列番号４４８（９０９ｇＬ１０  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６１（９０９ｇＨ６１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１３９】
配列番号４４８（９０９ｇＬ１０  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６３（９０９ｇＨ６２  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４０】
配列番号４８７（９０９ｇＬ１３  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５７（９０９ｇＨ１４  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４１】
配列番号４８７（９０９ｇＬ１３  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６１（９０９ｇＨ６１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４２】
配列番号４８７（９０９ｇＬ１３  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６３（９０９ｇＨ６２  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４３】
配列番号４８８（９０９ｇＬ５０  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５７（９０９ｇＨ１４  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４４】
配列番号４８８（９０９ｇＬ５０  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６１（９０９ｇＨ６１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４５】
配列番号４８８（９０９ｇＬ５０  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６３（９０９ｇＨ６２  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４６】
配列番号４５０（９０９ｇＬ５４  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５７（９０９ｇＨ１４  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４７】
配列番号４５０（９０９ｇＬ５４  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６１（９０９ｇＨ６１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４８】
配列番号４５０（９０９ｇＬ５４  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６３（９０９ｇＨ６２  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１４９】
配列番号４５２（９０９ｇＬ５５  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５５（９０９ｇＨ１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１５０】
配列番号４５２（９０９ｇＬ５５  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４５７（９０９ｇＨ１４  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１５１】
配列番号４５２（９０９ｇＬ５５  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６１（９０９ｇＨ６１  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【請求項１５２】
配列番号４５２（９０９ｇＬ５５  ＶＬ領域）の軽鎖可変領域と、配列番号４６３（９０９ｇＨ６２  ＶＨ領域）の重鎖可変領域とを含む、請求項４７に記載の抗ａＰ２抗体、又は抗原結合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／１５５，２１７号、２０１５年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／２３２，１４８号、及び２０１５年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２６８，２５７号と関連し、その利益を主張する。これらの仮出願の全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、特に、糖尿病、肥満、心血管疾患、脂肪肝疾患、及び／又はがんなどの障害の処置における使用のために脂質シャペロンａＰ２／ＦＡＢＰ４（「ａＰ２」と呼ぶ）を標的とする、改善された抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤、並びにその組成物の分野にある。一態様では、血清ａＰ２が標的化され、ａＰ２の生物活性が、低結合親和性ａＰ２モノクローナル抗体を使用して中和又はモジュレートされ、空腹時血糖値の低下、全身グルコース代謝の改善、全身インスリン感受性の増大、脂肪量の減少、肝臓脂肪変性の減少、心血管疾患の軽減及び／又は心血管疾患の発症リスクの低下を提供する、ａＰ２媒介性障害のための改善された処置が開示される。
【０００３】
参照による組込み
２０１６年４月２５日に作成され、２５８ＫＢのサイズであるテキストファイル名「15020-001US1SequenceListing_ST25updated.txt」の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
ヒト脂肪細胞脂質結合タンパク質（ａＰ２）は、脂質の輸送及び貯蔵に関与する細胞内脂質結合タンパク質のファミリーに属する（Banzszak et al., (1994) Adv. Protein Chem. 45, 89-151）。ａＰ２タンパク質は、脂質分解及び脂質生成に関与し、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び代謝症候群などの脂質及びエネルギー代謝の疾患において示されている。ａＰ２は、代謝及び炎症応答系の統合においても示されている（Ozcan et al., (2006) Science 313(5790):1137-40；Makowski et al., (2005) J Biol Chem. 280(13):12888-95；及びErbay et al., (2009) Nat Med. 15(12):1383-91）。より最近では、ａＰ２は、ある特定の脂肪肉腫などのある特定の軟組織腫瘍において示差的に発現されることが示されている（Kashima et al., (2013) Virchows Arch. 462, 465-472）。
【０００５】
ａＰ２は、脂肪細胞中で高度に発現され、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ（ＰＰＡＲγ）アゴニスト、インスリン、及び脂肪酸により調節される（Hertzel et al., (2000) Trends Endocrinol. Metab. 11, 175-180；Hunt et al., (1986) PNAS USA 83, 3786-3790；Melki et al., (1993) J. Lipid Res. 34, 1527-1534；Distel et al., (1992) J. Biol. Chem. 267, 5937-5941）。ａＰ２欠損マウス（ａＰ２−／−）における研究は、遺伝的又は食餌誘導性肥満と関連するインスリン耐性の発生に対する保護並びにＣ１６：１ｎ７−パルミトレアートのレベルが増大した脂肪組織における脂質プロファイルの改善、肝臓脂肪変性の減少、並びに肝臓グルコース産生及び末梢グルコース処理の制御の改善を示す（Hotamisligil et al., (1996) Science 274, 1377-1379；Uysal et al., (2000) Endocrinol. 141, 3388-3396；Cao et al., (2008) Cell 134, 933-944）。
【０００６】
さらに、ａＰ２の遺伝的欠損又は薬学的遮断は、アポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ−／−）マウスモデルにおいて初期と進行性の両方のアテローム性動脈硬化病変を減少させる（Furuhashi et al., (2007) Nature, Jun 21;447(7147):959-65；Makowski et al., (2001) Nature Med. 7, 699-705；Layne et al., (2001) FASEB 15, 2733-2735；Boord et al., (2002) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vas. Bio. 22, 1686-1691）。さらに、ａＰ２欠損は、アポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ−／−）マウスにおいて初期及び進行性アテローム性動脈硬化症に対する顕著な保護をもたらす（Makowski et al., (2001) Nature Med. 7, 699-705；Fu et al., (2000) J. Lipid Res. 41, 2017-2023）。したがって、ａＰ２は、前臨床モデルにおける代謝疾患の発生の多くの態様において重要な役割を果たす。
【０００７】
過去２０年で、一般的なＦＡＢＰ及び特定のａＰ２の生物学的機能は、細胞内タンパク質としてのその作用に主に起因してきた。脂肪細胞中のａＰ２タンパク質の存在量は極端に高く、総細胞タンパク質の最大で数パーセントを占めるため（Cao et al., (2013) Cell Metab. 17(5):768-78）、伝統的な手法を用いたａＰ２の治療標的化は魅力的であり、前臨床モデルにおいて得られる有望な成功（Furuhashi et al., (2007) Nature 447, 959-965；Won et al., (2014) Nature Mat. 13, 1157-1164；Cai et al., (2013) Acta Pharm. Sinica 34, 1397-1402；Hoo et al., (2013) J. of Hepat. 58, 358-364）は、臨床解釈に向かってゆっくりと進行した。
【０００８】
細胞質中でのその存在に加えて、ａＰ２は非古典的な調節経路を介して脂肪組織から活発に分泌されることが最近示された（Cao et al., (2013) Cell Metab. 17(5), 768-778；Ertunc et al., (2015) J. Lipid Res. 56, 423-424）。分泌型のａＰ２は、新しいアディポカインとして作用し、空腹及び空腹関連シグナルに応答してマウスにおける肝臓グルコース産生及び全身グルコース恒常性を調節する。血清ａＰ２レベルは、肥満マウスにおいては有意に上昇し、循環ａＰ２の遮断は食餌誘導性肥満を有するマウスにおいてグルコース恒常性を改善する（Cao et al., (2013) Cell Metab. 17(5):768-78）。重要なことに、同じパターンは、分泌されるａＰ２レベルが肥満において増加し、複数の独立したヒト試験において代謝疾患及び心血管疾患と強く相関するヒト集団においても観察される（Xu et al., (2006) Clin. Chem. 53, 405-413；Yoo et al., (2011) J. Clin. Endocrin. & Metab. 96, E488-492；von Eynatten et al., (2012) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vas. Bio. 32, 2327-2335；Suh et al., (2014) Scandinavian J. Gastro. 49, 979-985；Furuhashi et al., (2011) PloS One 6, e27356；Ishimura et al., (2013) PloS One 8, e81318；Karakas et al., (2009) Metabolism: Clinical and Experimental 58, 1002-1007；Kaess et al., (2012) J. Endocrin. & Metab. 97, E1943-1947；Cabre et al., (2007) Atherosclerosis 195, e150-158）。最後に、ａＰ２発現の減少をもたらすハプロ不全対立遺伝子を担持するヒトは、糖尿病及び心血管疾患に対して保護される（Tuncman et al., (2006) PNAS USA 103, 6970-6975；Saksi et al., (2014) Circulation, Cardiovascular Genetics 7, 588-598）。
【０００９】
Ｃａｏらは、脂肪組織中のａＰ２タンパク質レベルにいかなる変化もなく生じる、肥満抗体で処置されたマウスにおける血漿ａＰ２レベルの低下を示すために、ウサギ抗マウスａＰ２ポリクローナル抗体を使用した（Cao et al., (2013) Cell Metab. 17(5): 768-778；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／１０２１７１）。肥満マウスにおける前記抗体の投与は、体重を変化させなかったが、免疫前ＩｇＧで処置された対照と比較して、処置の２週間以内に空腹時血糖値の有意な低下を引き起こした。グルコース負荷試験において、ａＰ２ポリクローナル抗体を受けているマウスは、対照動物と比較して、グルコース処理曲線の有意な改善を示した。
【００１０】
Ｍｉａｏらは、高脂肪食を受けている抗体処置されたマウスにおいて高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性炎症の改善を達成するための高親和性マウス抗ヒトａＰ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ  ２Ｅ４として同定された）の使用を報告した（Miao et al., (2015) Molecular and Cellular Endocrinology 403, 1-9）。しかしながら、高親和性ｍＡｂ  ２Ｅ４を用いた処置は、対照動物と比較して体重の劇的な増加をもたらし、処置の６週間後に基礎グルコースレベルの顕著な変化は観察されなかった。さらに、ｍＡｂ  ２Ｅ４処置は、ＨＦＤ誘導性インスリン耐性に影響することができなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、代謝障害の処置のための新規化合物、方法、及び組成物を同定することである。
【００１２】
特に、本発明の課題は、空腹時血糖値の低下、全身グルコース代謝の改善、グルコース耐性の改善、全身インスリン感受性の増大、脂肪量の減少、脂肪細胞脂肪分解の減少、肝臓グルコース産生の減少、高インスリン血症の軽減、及び／又は肝臓脂肪変性の減少のための新規化合物、方法、及び組成物を同定することである。
【００１３】
また、本発明の課題は、糖尿病、肥満、及び脂質異常症の処置のための新規化合物、方法、及び組成物を同定することである。
【００１４】
本発明のさらなる課題は、炎症誘導性障害、例えば、アテローム性動脈硬化症の処置のための新規化合物、方法、及び組成物を同定することである。
【００１５】
本発明の別の課題は、腫瘍、がん、又は他の新生物の処置のための新規化合物、方法、及び組成物を同定することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
ａＰ２媒介性障害の処置のための優れた、予想外の活性を有する抗ａＰ２モノクローナル抗体及び抗原結合剤が提供される。一実施形態では、可変領域を有する軽鎖又は軽鎖断片を含有し、前記可変領域が、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９から独立に選択される１個、２個、又は３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗ａＰ２モノクローナル抗体及び抗原結合剤が提供される。別の実施形態では、可変領域を有する軽鎖又は軽鎖断片を含み、前記可変領域が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号５９７、配列番号５９８、又は配列番号５９９から独立に選択される１個、２個、又は３個のＣＤＲを含む、抗ａＰ２モノクローナル抗体及び抗原結合剤が提供される。さらに別の実施形態では、可変領域を有する軽鎖又は軽鎖断片を含み、前記可変領域が、配列番号７、配列番号８及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号５９７、配列番号５９８、又は配列番号５９９から独立に選択される１個、２個、又は３個のＣＤＲを含む、抗ａＰ２モノクローナル抗体及び抗原結合剤が提供される。一実施形態では、可変領域を有する軽鎖又は軽鎖断片を含み、前記可変領域が、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号５９７、配列番号５９８、又は配列番号５９９から選択される少なくとも１個のＣＤＲを含む、抗ａＰ２モノクローナル抗体及び抗原結合剤が提供される。或いは、１又は複数の開示及び選択されたＣＤＲを、本明細書にさらに記載される、抗体又は抗原結合剤の特性に有害に影響しない、又はそれを改善する１又は複数のアミノ酸の置換によって変化させることができる。一実施形態では、選択されたＣＤＲ（単数又は複数）を、ヒト免疫グロブリンフレームワーク中に置く。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、さらに改変するか、又は変化させて、移植されたＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。
【００１７】
本明細書に開示される予想外の発見の１つは、記載される抗体及び抗原結合剤が、ａＰ２タンパク質に堅く結合しないということである。典型的には、Miao, et al.により報告されたように（背景技術を参照されたい）、堅い結合親和性（非常に低いＫＤ）を有する抗体及び抗原結合剤が求められる。約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する、より弱い結合親和性で、その分泌（非細胞質）状態のａＰ２タンパク質に結合する抗体又は抗原結合剤は、分泌されたａＰ２を中和し、ａＰ２媒介性障害に対する有意な阻害効果を引き起こす改善された能力を有することが発見された。ある特定の実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、約１０−４〜１０−６Ｍの、ヒトａＰ２に対するＫＤを有する。他の例では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、約５００ｎＭを超える、例えば、約５００ｎＭ〜約１０μＭの、ヒトａＰ２に対するＫＤを有する。別の実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、約１μＭ〜約７μＭ、又は２μＭ〜約５μＭの、ヒトａＰ２に対するＫＤを有する。代替的な実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、その天然の立体配座形態で、例えば、上記で特定された範囲の、マウスａＰ２に対する低い結合親和性を有する。
【００１８】
本発明者らはまた驚くべきことに、本明細書に記載の抗体で処置されたマウスが、対照処置動物において見られるものと同様の、又はそれよりわずかに低いレベルの総循環ａＰ２レベルを維持することを見出した。これらの知見は、Ｈ３を含む、より高い親和性の抗体について観察されるものとは対照的であり、この高親和性抗体によるマウスの処置は、総循環ａＰ２レベルの劇的な１０倍の増加をもたらす。高親和性抗体で処置されたマウスにおいて見られるａＰ２レベルの劇的な増加は、一般的には、高親和性ａＰ２抗体と複合体化した場合、短い半減期を有する、ａＰ２タンパク質の半減期の増大に起因するものであり得る。
【００１９】
それを必要とする宿主に投与される場合、これらの抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤は、分泌されるａＰ２の活性を中和し、より高い結合親和性を有する抗ａＰ２モノクローナル抗体と比較した場合、宿主における空腹時血糖値の低下、全身グルコース代謝の改善、全身インスリン感受性の増大、脂肪量の減少、肝臓脂肪変性の減少、血清脂質プロファイルの改善、及びアテローム生成プラーク形成の減少を提供する。したがって、本明細書に記載の抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤は、それを必要とする宿主、典型的には、ヒトに、有効量を投与することによって、限定されるものではないが、糖尿病（１型と２型の両方）、高血糖、肥満、脂肪肝疾患、脂質異常症、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＯＳ）、腫瘍又は新生物などの増殖性障害（限定されるものではないが、例えば、移行膀胱がん、卵巣がん、及び脂肪肉腫など）、アテローム性動脈硬化症、及び他の心血管障害などの代謝障害を処置するのに特に有用である。
【００２０】
いずれか１つの理論によって束縛されることを望むものではないが、様々な組織が循環ａＰ２レベルに寄与すると考えられる。例えば、脂肪組織は、循環ａＰ２のレベルに寄与すると考えられる。さらに、他の組織、例えば、マクロファージは、ａＰ２の循環レベルに寄与すると考えられる。一実施形態では、宿主は、ａＰ２媒介性障害を処置するために、本明細書に記載の抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤を投与される。一実施形態では、宿主は、障害が脂肪組織により寄与される循環ａＰ２によって媒介されるａＰ２媒介性障害を処置するために、本明細書に記載の抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤を投与される。一実施形態では、宿主は、障害がマクロファージにより寄与される循環ａＰ２によって媒介されるａＰ２媒介性障害を処置するために、本明細書に記載の抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤を投与される。
【００２１】
一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲ配列が、ヒト免疫グロブリンフレームワーク中に移植された、配列番号７〜１３又は配列番号５９７〜５９９から選択される少なくとも１個のＣＤＲ、及びＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ１バリアント２（配列番号６００）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＲＨ２バリアント３（配列番号６０１）、ＣＤＲＨ３（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、ＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）、又はＣＤＲＨ３バリアント３（配列番号６０２）から選択される少なくとも１個のＣＤＲを含む。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークをさらに改変するか、又は変化させて、移植されたＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗体結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１（配列番号４４６）、軽鎖配列９０９ｇＬ１  ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４４７）、軽鎖可変配列９０９ｇＬ１０（配列番号４４８）、軽鎖配列９０９ｇＬ１０  ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４４９）、軽鎖可変配列９０９ｇＬ１３（配列番号４８７）、軽鎖配列９０９ｇＬ１３  ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４８９）、軽鎖可変配列９０９ｇＬ５０（配列番号４８８）、軽鎖配列９０９ｇＬ５０  ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４９０）、軽鎖可変配列９０９ｇＬ５４（配列番号４５０）、軽鎖配列９０９ｇＬ５４  ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４５１）、軽鎖可変配列９０９ｇＬ５５（配列番号４５２）又は軽鎖配列９０９ｇＬ５５  ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４５３）を含む。
【００２３】
他の実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、９０９ｇＬ１（配列番号４４６）、９０９ｇＬ１０（配列番号４４８）、９０９ｇＬ１３（配列番号４８７）、９０９ｇＬ５０（配列番号４８８）、９０９ｇＬ５４（配列番号４５０）、又は９０９ｇＬ５５（配列番号４５２）から選択される軽鎖可変配列と、９０９ｇＨ１（配列番号４５５）、９０９ｇＨ１４（配列番号４５７）、９０９ｇＨ１５（配列番号４５９）、９０９ｇＨ６１（配列番号４６１）、及び９０９ｇＨ６２（配列番号４６３）から選択される重鎖可変配列とを含む。例えば、前記抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１（配列番号４４６）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１（配列番号４４５）とを含んでもよい。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１０（配列番号４４８）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１（配列番号４５５）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１０（配列番号４４８）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１５（配列番号４５９）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１（配列番号４４６）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１５（配列番号４５９）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１３（配列番号４８７）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１（配列番号４５５）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１３（配列番号４８７）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１５（配列番号４５９）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５０（配列番号４８８）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１（配列番号４５５）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５０（配列番号４８８）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１５（配列番号４５９）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５４（配列番号４５０）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１（配列番号４５５）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５４（配列番号４５０）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１５（配列番号４５９）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５５（配列番号４５２）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１（配列番号４５５）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５５（配列番号４５２）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１５（配列番号４５９）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１（配列番号４４６）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１４（配列番号４５７）とを含んでもよい。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１０（配列番号４４８）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１４（配列番号４５７）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１３（配列番号４８７）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１４（配列番号４５７）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５０（配列番号４８８）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１４（配列番号４５７）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５４（配列番号４５０）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１４（配列番号４５７）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５５（配列番号４５２）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ１４（配列番号４５７）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１（配列番号４４６）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６１（配列番号４６１）とを含んでもよい。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１０（配列番号４４８）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６１（配列番号４６１）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１３（配列番号４８７）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６１（配列番号４６１）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５０（配列番号４８８）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６１（配列番号４６１）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５４（配列番号４５０）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６１（配列番号４６１）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５５（配列番号４５２）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６１（配列番号４６１）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１（配列番号４４６）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６２（配列番号４６３）とを含んでもよい。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１０（配列番号４４８）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６２（配列番号４６３）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ１３（配列番号４８７）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６２（配列番号４６３）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５０（配列番号４８８）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６２（配列番号４６３）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５４（配列番号４５０）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６２（配列番号４６３）とを含む。一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、少なくとも軽鎖可変配列９０９ｇＬ５５（配列番号４５２）と、重鎖可変配列９０９ｇＨ６２（配列番号４６３）とを含む。抗ａＰ２モノクローナル抗体、及び関連する場合、本明細書に記載のＣＤＲを含有する可変軽鎖及び／又は可変重鎖配列を含有する本明細書に記載の抗原結合剤は、抗体分子の提唱された機能、特に、必要であり得るエフェクター機能を考慮して選択された定常領域ドメインをさらに含んでもよい。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭドメインであってもよい。特に、抗体分子が治療的使用を意図し、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、特に、例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプを使用することができる。或いは、抗体分子が治療目的を意図し、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常領域ドメインの配列バリアントを使用することもできることが理解される。例えば、Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108に記載されたように２４１位のセリンをプロリンに変化させたＩｇＧ４分子（ＩｇＧ４Ｐ）を使用することができ、本明細書で企図される。
【００２４】
一実施形態では、抗ａＰ２抗体は、軽鎖可変配列ウサギＡｂ９０９ＶＬ領域（配列番号４４５）を含み、さらに任意選択で、重鎖可変配列ウサギＡｂ９０９ＶＨ領域（配列番号４５４）を含む。
【００２５】
一実施形態では、肥満マウスにおいて空腹時血糖値を低下させる、全身グルコース代謝を改善する、全身インスリン感受性を増加させる、並びに脂肪量及び肝臓脂肪変性を減少させる、低結合親和性モノクローナル抗ａＰ２抗体ＣＡ３３、ウサギ９０９ＶＨ（配列番号４５４）及び９０９ＶＬ（配列番号４４５）を含むウサギ−マウスハイブリッド抗ａＰ２モノクローナル抗体が記載されている。
【００２６】
ＣＡ３３は、類似する親和性で、脂質に結合したａＰ２と脂質を含まないａＰ２との両方に結合することがわかっている（それぞれ、図２Ｈ及び２Ｉを参照されたい）。これらのデータは、ＣＡ３３の効能が、特定の脂質を担持するアポａＰ２分子のみ又はａＰ２分子のみへのその結合によっては媒介されないことを示唆する。また、ＣＡ３３エピトープは、ヒンジ領域（Ｅ１５、Ｎ１６、及びＦ１７を含有する）と重複せず、ＣＡ３３結合がａＰ２の疎水性ポケットへのリガンドの接近を変化させるとは考えられないこともわかっている。事実、中性のｐＨで、ａＰ２へのパラナリン酸（ｐａｒａｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ）の結合は、ＣＡ３３の存在又は非存在下で類似しており、ａＰ２への抗体結合が全体の脂質結合を遮断しないという結論を支持している（図２Ｇを参照されたい）。
【００２７】
さらに、外因性ａＰ２処置は、肝細胞中でフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦｏｘＯ１）及び転写コリプレッサーＣ末端結合タンパク質２（ＣｔＢＰ２）から構成される新規転写ホロ複合体の解離をもたらし、グルコース新生遺伝子の発現をもたらすことが発見された。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２相互作用は、痩せマウスの肝臓中で容易に検出されるが、循環ａＰ２のレベルが顕著に増加する設定である肥満の文脈では顕著に減少する。組換えａＰ２の投与はＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２相互作用を減少させるが、この相互作用はａＰ２遺伝子欠損及び抗体媒介性中和の設定では増加することが本明細書で示される。肥満マウスの肝臓中でのＣｔＢＰ２過剰発現は、グルコース新生及び脂肪生成遺伝子発現の抑制により耐糖能異常並びに肝臓脂肪変性を劇的に改善することが本明細書でさらに示された。本発明の一実施形態では、抗ａＰ２抗体を、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２経路の誤調節と関連する、ヒトを含む宿主における障害の処置のために投与する。一実施形態では、血清ａＰ２を標的化し、１又は複数のＦｏｘＯ１調節性又はＣｔＢＰ２調節性遺伝子の発現レベルが低下する、本明細書に記載の低結合親和性ａＰ２モノクローナル抗体を使用して、ａＰ２の生物活性を中和又はモジュレートする、ＦｏｘＯ１媒介性障害又はＣｔＢＰ２媒介性障害のための改善された処置が開示される。一実施形態では、宿主に、本明細書に記載の低結合親和性ａＰ２モノクローナル抗体を投与するステップを含む、ＦｏｘＯ１及び／又はＣｔＢＰ２調節性遺伝子の発現をモジュレートする方法が本明細書で提供される。Jack et al. "C-terminal binding protein: A metabolic sensor implicated in regulating adipogenesis." Int J Biochem Cell Biol. 2011 May; 43(5):693-6；Vernochet C, et al. "C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists." Mol Cell Biol. 2009 Sep;29(17):4714-28；Kajimura, S. et al. "Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex." Genes Dev. 2008 May 15;22 (10):1397-409を参照されたい。
【００２８】
抗原結合剤は、所望の結果をもたらす任意の形態にあってもよい。非限定例として、結合剤の形態は、一本鎖断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、単一ドメイン軽鎖、単一ドメイン重鎖、２つ以上の断片間に天然又は非天然の連結部分を含む合成抗原結合剤（例えば、２つ以上の本明細書に記載の軽鎖ＣＤＲを連結する化合物又は１若しくは複数のアミノ酸置換を有するそのバリアント）、標的化送達のためにコンジュゲートされた抗原結合剤、並びにそのような抗体から得られる、又は誘導される任意のペプチドを含んでもよい。
【００２９】
一態様では、本発明は、例えば、表１２に提供されるような、本明細書に記載の抗体又は断片をコードする、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドを提供する。また、前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供される。
【００３０】
具体的には、本発明は、例えば、限定されるものではないが、代謝、心血管、炎症、肝臓又は新生物障害又は症状などの、ａＰ２媒介性障害の重症度の減弱化をもたらす、宿主の体液、例えば、血液又は血清中の、分泌されるａＰ２（すなわち、細胞外ａＰ２）の活性を低下させることができる、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２抗体、又はその薬学的に許容される組成物を投与するステップを含む。
【００３１】
本発明の一態様では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、３〜４オングストローム以内の接触点のユニークなパターンでヒトａＰ２タンパク質（配列番号１）に結合する。
【００３２】
一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、アミノ酸配列：
【数１】
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を有するヒトａＰ２、又はその天然のバリアントに結合する。代替的な実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、配列番号１と比較して１又は複数個（例えば、１、２、３又は４個）のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を有するアミノ酸配列を有するヒトａＰ２タンパク質に結合する。
【００３３】
一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、上記の配列番号１で下線を付けたアミノ酸配列から選択されるエピトープに結合する。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、上記の配列番号１で太字の１又は複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個のアミノ酸と直接相互作用する。一例では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、配列番号１のアミノ酸９〜１７、アミノ酸２０〜２８、又はアミノ酸１１８〜１３２のうちの少なくとも１個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上を含むヒトａＰ２タンパク質のエピトープに結合し、任意選択で、少なくとも約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。
【００３４】
別の例では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又はその抗原結合剤は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、１３２Ａ（上記の配列番号１中で太字）から選択される１若しくは複数個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９個以上のアミノ酸残基、又は１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、及び１３２Ａのいずれかの約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒトａＰ２のエピトープに結合し、任意選択で、約１０−７Ｍ以上の、分泌されるａＰ２に対するＫＤを有する。
【００３５】
一実施形態では、抗体の軽鎖は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａから選択される１若しくは複数個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９個以上のアミノ酸残基、又はその約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒトａＰ２のエピトープに結合する。一実施形態では、抗体の軽鎖は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａから選択される１若しくは複数個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９個以上のアミノ酸残基、又はその約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒトａＰ２のエピトープに結合し、少なくとも約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。
【００３６】
一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、軽鎖ＣＤＲを介してのみ、又は主に介して、ａＰ２に結合する。代替的な実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、重鎖ＣＤＲがａＰ２に結合するよりも高い親和性でａＰ２に結合する軽鎖ＣＤＲを有する。一例として、抗体又は抗原結合剤は、ａＰ２に特異的に結合し、ＦＡＢＰ４／Ｍａｌ１に特異的に結合しない。
【００３７】
開示される抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤を製造する方法、並びに抗体又は断片を、ＰＥＧなどのポリマーにコンジュゲートさせる方法が本明細書に提供される。
【００３８】
本開示はまた、薬学的に許容される担体と共に、有効量の抗ａＰ２抗体及び／又は抗原結合剤の１つを含む医薬組成物も含む。抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を、静脈内、全身、局所的経皮、舌下、頬、経口、大動脈内、局所、鼻内、眼内、又は吸入などの任意の所望の経路によって宿主に投与することができる。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を、制御放出送達によって宿主に投与する。
【００３９】
分泌されるａＰ２の生物活性の低下又は減弱化をもたらす、有効量のヒト化抗体、例えば、本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を投与するステップを含む、ヒトなどの宿主におけるａＰ２媒介性障害を防止する、又はその重症度を減弱させる方法が提供される。それを必要とする宿主に有効量を投与することによる、記載される抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤の使用の非限定例は、
（ｉ）総コレステロールの低下；
（ｉｉ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、及び／若しくはトリグリセリドの低下；
（ｉｉｉ）空腹時血糖値の低下；
（ｉｖ）脂肪量レベルの低下；
（ｖ）肝臓グルコース産生の減少；
（ｖｉ）脂肪細胞脂肪分解の減少；
（ｖｉｉ）高インスリン血症の軽減；
（ｖｉｉｉ）肝臓脂肪変性の減少；
（ｉｘ）グルコース代謝の改善；
（ｘ）インスリン感受性の増大；並びに／又は
（ｘｉ）膵島β細胞死(islet β-cell death)、機能障害、若しくは喪失を防ぐこと
のうちの１つ又は組合せを含む。
【００４０】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システムを使用した生体分子相互作用分析によって決定したヒト及びマウスａＰ２に対する抗ａＰ２モノクローナル抗体（ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３及びＨ３）の結合親和性（ＫＤ（Ｍ））を列挙している表の図である。
【図１Ｂ】ビヒクル又は抗ａＰ２抗体を用いて肥満マウス（高脂肪食（ＨＦＤ）を与えた）を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ研究設計及び抗体レジメンを記載している概略図である。マウス（２１週齢）に、抗体投与前の１５週間、ＨＦＤを与えた（各群についてｎ＝１０）。抗ａＰ２抗体を、３３ｍｇ／ｋｇの濃度にて１週間に２回、皮下注射によって投与した。
【図１Ｃ】ビヒクル又は抗ａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３又はＨ３を用いて処置したマウスにおける０週（白抜きの棒）又は４週（黒抜きの棒）での血漿インスリンレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｄ】ビヒクル又は抗ａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３又はＨ３を用いて処置した高脂肪食（ＨＦＤ）の肥満マウスにおける０週（白抜きの棒）又は４週（黒抜きの棒）での血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。日中の食餌離脱の６時間後に血糖値を測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図１Ｅ】ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）の間の血糖値（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。ビヒクル（ダイヤモンド）又は抗ａＰ２モノクローナル抗体（グルコース１ｋｇ当たり０．７５ｇ）（ＣＡ３３；四角）（ＣＡ１５；三角）を用いたＨＦＤの肥満マウスにおける２週間の処置の後に試験を実施した。＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｆ】インスリン負荷試験（ＩＴＴ）の間のインスリンレベル（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。ビヒクル（ダイヤモンド）又は抗ａＰ２モノクローナル抗体（インスリン１ｋｇ当たり０．７５ＩＵ）（ＣＡ３３；四角）（ＣＡ１５；三角）を用いたＨＦＤの肥満マウスの３週間の処置後にこの試験を実施した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１Ｇ】ビヒクル又は抗ａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３又はＨ３を用いて処置したマウスにおける０週（白抜きの棒）又は４週（黒抜きの棒）での体重（ｇ）を示す棒グラフの図である。給餌状態において体重を測定した。＊ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】関連タンパク質ＦＡＢＰ３（灰色の棒）及びＦＡＢＰ５／Ｍａｌ１（薄灰色の棒）と比較したａＰ２（黒色の棒）に対する抗ａＰ２抗体ＣＡ３３及びＨ３についてオクテット分析（ｏｃｔｅｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって決定したシグナル相互作用（ｎｍ）の棒グラフの図である。
【図２Ｂ】ビヒクル、ＣＡ３３又はＨ３を用いて３週間処置したＨＦＤ給餌マウスにおけるＥＬＩＳＡによって決定した血漿ａＰ２レベル（ｎｇ／ｍｌ）の棒グラフの図である（ｎ＝１０のマウス／群）。実験を開始する前にマウスに１２週間ＨＦＤを与えていた。各群（ビヒクル、ＣＡ３３又はＨ３）からの３匹のマウス由来の血清中のａＰ２を検出するためのウェスタンブロットを差込み図において示す。＊＊ｐ＜０．０１。
【図２Ｃ】Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって決定したＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５及びＣＡ２３に対するＨ３の抗体交差遮断（ｃｒｏｓｓｂｌｏｃｋｉｎｇ）の表の図である。＋＋＝完全な遮断；＋＝部分的遮断；−＝交差遮断なし。
【図２Ｄ】水素重水素交換質量分析（ＨＤＸ）によって識別した、ＣＡ３３及びＨ３との相互作用に関連するａＰ２残基のエピトープ配列を示す図である。相互作用する残基には下線を引いている。
【図２Ｅ】ａＰ２と共結晶化した（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ）ＣＡ３３のＦａｂ及びａＰ２と共結晶化したＨ３のＦａｂの重ね合わせた画像の図である。
【図２Ｆ】ａＰ２上のＣＡ３３エピトープの高解像度マッピングである。両方の分子における相互作用残基を示す図である。水素結合は破線として示す。ａＰ２におけるＫ１０の側鎖はＹ９２のフェニル側鎖と疎水性相互作用を生じる。
【図２Ｇ】ＩｇＧ対照抗体（丸）又はＣＡ３３抗体（四角）の存在下でのａＰ２に対するパリナリン酸（ｐａｒａｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ）結合（相対蛍光）対ｐＨを示す線グラフの図である。
【図２Ｈ】増加させている濃度の脂質負荷ａＰ２との反応におけるａＰ２に対するＣＡ３３結合（共鳴単位）対時間（秒）を示すグラフの図である。
【図２Ｉ】増加させている濃度の脱脂質化（ｄｅ−ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）ａＰ２との反応におけるａＰ２に対するＣＡ３３結合（共鳴単位）対時間（秒）を示すグラフの図である。
【図３Ａ】３週間のＣＡ３３抗体又はビヒクル処置の前（白抜きの棒）及び後（黒抜きの棒）のＨＦＤ誘発性肥満ａＰ２−／−マウスにおける空腹時血糖（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。
【図３Ｂ】３週間のＣＡ３３抗体又はビヒクル処置の前（白抜きの棒）及び後（黒抜きの棒）のＨＦＤ誘発性肥満ａＰ２−／−マウスにおける体重（ｇ）を示す棒グラフの図である。
【図３Ｃ】ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）の間のＨＦＤ誘発性肥満ａＰ２−／−マウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。ａＰ２−／−マウスにおいて２週間のビヒクル（三角）又はＣＡ３３抗体処置（四角）後に試験を実施した。
【図３Ｄ】３週間のＣＡ３３抗体又はビヒクル処置の前（白抜きの棒）及び後（黒抜きの棒）のｏｂ／ｏｂマウスにおける体重（ｇ）を示す棒グラフの図である（ｎ＝１０のマウス／群）。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３Ｅ】３週間のＣＡ３３抗体又はビヒクル処置の前（白抜きの棒）及び後（黒抜きの棒）のｏｂ／ｏｂマウスにおける空腹時血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である（ｎ＝１０のマウス／群）。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３Ｆ】３週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３抗体処置（黒抜きの棒）後のｏｂ／ｏｂマウスにおける血漿インスリンレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３Ｇ】ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）の間のｏｂ／ｏｂマウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。ａＰ２−／−マウスにおいて２週間のビヒクル（三角）又はＣＡ３３抗体処置（四角）後に試験を実施した。＊ｐ＜０．０５。
【図４Ａ】ビヒクル又はＣＡ３３を用いた５週間の処置後のＨＦＤ誘発性肥満マウス由来のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した肝臓の代表的な画像の図である。スケールバーは５０μｍである。
【図４Ｂ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３抗体（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける肝臓トリグリセリド（ＴＧ）含有量（組織１ｇ当たりのｍｇ）の棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｃ】５週間のビヒクル（黒色の棒）又はＣＡ３３処置（灰色の棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウス由来の肝臓試料中の脂質合成遺伝子ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（Ｓｃｄ１）、脂肪酸合成酵素（Ｆａｓｎ）及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ１）のｍＲＮＡ発現を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図４Ｄ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）のレベル（ｍｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図４Ｅ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿グリセロールのレベル（ｍｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｆ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿総コレステロールのレベル（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｇ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿トリグリセリドのレベル（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。
【図４Ｈ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿ＦＡＢＰ３又はＦＡＢＰ５（Ｍａｌ１）のレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。
【図４Ｉ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿グルカゴンのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。
【図４Ｊ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿アディポネクチンのレベル（μｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。
【図５Ａ】５週間のビヒクル又はＣＡ３３処置後の二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）によって決定した体脂肪質量（ｇ）（白抜きの棒）及び除脂肪質量（ｇ）（灰色の棒）の棒グラフの図である（ｎ＝１０／群）。＊ｐ＜０．０５。
【図５Ｂ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後の肥満マウスの肝臓重量（ｇ）及び体重％を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図５Ｃ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後の明所又は暗所におけるマウスについての身体活動（活動単位−ＡＵ）を示す棒グラフの図である。
【図５Ｄ】ＨＦＤでのビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３で５週間処置したマウス（黒抜きの棒）後の肥満マウスにおける総食物摂取（ｇ）を示す棒グラフの図である（ｎ＝８／群）。
【図５Ｅ】ビヒクル（白抜きの棒）と比較して、ＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて８週間処置したマウスにおける明期及び暗期の間の体積によるＶＯ２濃度を示す棒グラフの図である。
【図５Ｆ】ビヒクル（白抜きの棒）と比較して、ＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて８週間処置したマウスにおける明期及び暗期の間の算出した呼吸商（ＲＥＲ）を示す棒グラフの図である。
【図５Ｇ】ビヒクル（白抜きの棒）と比較して、ＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて８週間処置したマウスにおける褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量を示す棒グラフの図である。
【図５Ｈ】ビヒクル（白抜きの棒）と比較して、ＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた８週間の処置後のマウスにおけるＢＡＴの代表的なＨ＆Ｅ染色した切片を示す画像の図である。
【図５Ｉ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３で５週間処置したマウス（黒抜きの棒）後の肥満マウスにおける性腺周囲（ｐｅｒｉｇｏｎａｄａｌ）白色脂肪組織（ＰＧＷＡＴ）の重量を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図５Ｊ】ビヒクル（左の画像）又はＣＡ３３（右の画像）を用いた５週間の処置後のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した精巣上体脂肪組織の代表的な画像の図である。スケールバーは２００μｍである。
【図５Ｋ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３で処置したマウス（黒抜きの棒）後のＦＡＣＳによって決定した脂肪組織におけるＦ４／８０＋Ｍａｃ細胞（％）を示す棒グラフの図である。
【図５Ｌ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３で処置したマウス（黒抜きの棒）後のＦＡＣＳ分析によって決定した脂肪組織におけるＣＤ１１ｂ＋細胞（％）を示す棒グラフの図である。
【図５Ｍ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３で処置したマウス（黒抜きの棒）後の性腺周囲白色脂肪組織（ＰＧ−ＷＡＴ）におけるＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、Ｆ４／８０又はＣＤ６８についてのｍＲＮＡレベル（ｍＲＮＡ／Ｔｂｐ）を示す棒グラフの図である。
【図５Ｎ】ビヒクル又はＣＡ３３を用いて３週間処置したマウスにおける脂肪組織ａＰ２／ＦＡＢＰ４タンパク質レベルを示すウェスタンブロットの図である。ａＰ２−／−、ｍａｌ１−／−及びａＰ２／ｍａｌ１−／−動物由来の脂肪組織試料をタンパク質対照として含んだ。β−チューブリンを負荷対照として示す。
【図５Ｏ】ビヒクル又はＣＡ３３を用いて３週間処置したマウスにおける脂肪組織Ｍａｌ１／ＦＡＢＰ５タンパク質レベルを示すウェスタンブロットの図である。ａＰ２−／−、ｍａｌ１−／−及びａＰ２／ｍａｌ１−／−動物由来の脂肪組織試料をタンパク質対照として含んだ。β−チューブリンを負荷対照として示す。
【図５Ｐ】ビヒクル又はＣＡ３３を用いて３週間処置したマウスにおけるａＰ２又はｍａｌ１のいずれかについての相対タンパク質レベルの棒グラフの図である。図５Ｐに示した結果は図５Ｎ及び５Ｏに示したウェスタンブロットを定量化している。
【図６Ａ】糖新生遺伝子ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（Ｐｃｋ１）及びグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）のｍＲＮＡ発現を示す棒グラフの図である。肝臓試料を、ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて４週間処置した肥満マウスから日中の食餌離脱の６時間後に採取した（各群についてｎ＝１０）。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｂ】肝臓試料中のＰｃｋ１の酵素活性（ｎＭ／分／ｇ）を示す棒グラフの図である。肝臓試料を、ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて４週間処置した肥満マウスから日中の食餌離脱の６時間後に採取した（各群についてｎ＝１０）。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｃ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて４週間処置したマウスについての肝臓ミクロソーム画分中のグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）の酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を示す棒グラフの図である（各群についてｎ＝１０）。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｄ】高インスリン血症−正常血糖クランプの間の血糖（ｍｇ／ｄｌ）対時間を示す線グラフの図である。クランプ研究は、ビヒクル（ダイヤモンド）又はＣＡ３３（四角）を用いた５週間の処置後、高脂肪食（ＨＦＤ）での肥満マウスにおいて実施した（各群についてｎ＝７）。
【図６Ｅ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置の後の高脂肪食（ＨＦＤ）での肥満マウスにおけるグルコール注入率（ＧＩＲ）（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｆ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置後の高脂肪食（ＨＦＤ）での肥満マウスにおけるクランプ肝臓グルコース産生（ｃ−ＨＧＰ）（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｇ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置後の高脂肪食（ＨＦＤ）での肥満マウスにおける全身グルコース消失率（ＲＤ）（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｈ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置後のＨＦＤでの肥満マウスにおける下腿三頭筋におけるグルコース取込み（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｉ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置後の高脂肪食（ＨＦＤ）での肥満マウスにおける全身解糖を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図７Ａ】ビヒクル対照に対する高親和性抗体（ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３及びＨ３）を使用した２週間の選択的抗体処置後のブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）におけるグルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。
【図７Ｂ】ビヒクル対照に対する高親和性抗体（ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３及びＨ３）を使用した３週間の選択的抗体処置後のインスリン耐性試験（ＩＴＴ）におけるグルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。
【図８Ａ】ＨＦＤ−マウスの高インスリン血症−正常血糖クランプの間のビヒクル対照（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）で処置したマウスにおける基礎肝臓グルコース産生（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。
【図８Ｂ】ＨＦＤ−マウスの高インスリン血症−正常血糖クランプの間のＣＡ３３マウス（黒抜きの棒）又はビヒクル対照マウス（白抜きの棒）における血清インスリンレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図８Ｃ】ＨＦＤ−マウスの高インスリン血症−正常血糖クランプの間のビヒクル対照（白抜きの棒）又はＣＡ３３で処置した（黒抜きの棒）マウスの性腺白色脂肪組織（ＧＷＡＴ）におけるグルコース取込み（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。
【図９】１型糖尿病についてのＮＯＤマウスモデルにおける糖尿病発生率（％）対時間（処置の週）を示す線グラフの図である。ＮＯＤマウスはビヒクル（ダイヤモンド）又はａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３（四角）を用いて処置した。
【図１０Ａ】１型糖尿病についてのＮＯＤマウスモデルにおける死亡率（％）対時間（処置の週）を示す線グラフの図である。ＮＯＤマウスはビヒクル（ダイヤモンド）又はａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３（四角）を用いて処置した。
【図１０Ｂ】６時間の絶食後、ＰＢＳで処置した又はａＰ２抗体で処置したＮＯＤマウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示す棒グラフの図である。
【図１０Ｃ】６時間の絶食後、ＰＢＳで処置した又はａＰ２抗体で処置したＮＯＤマウスにおけるインスリンレベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す線グラフの図である。
【図１１Ａ】ＮＯＤ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスをブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）に供した線グラフの図である。
【図１１Ｂ】ＮＯＤ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスをインスリン耐性試験（ＩＴＴ）に供した線グラフの図である。
【図１２Ａ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後のＮＯＳ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウス島からのインスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフの図である。
【図１２Ｂ】４週齢のＮＯＤ  ａＰ２＋／＋（左の棒）及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウス（右の棒）の単離した島からの総インスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）含有量を示す棒グラフを示す図である。
【図１２Ｃ】７週齢のＮＯＤ  ａＰ２＋／＋（左の棒）及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウス（右の棒）の単離した島からの総インスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）含有量を示す棒グラフを示す図である。
【図１３】膵臓切開後のＮＯＤ  ａＰ２＋／＋マウスと比較したＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおいて見える島の数を示す図である。
【図１４Ａ】ＮＯＤ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおける染色したベータ細胞を示す図である。
【図１４Ｂ】ＮＯＤ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおける染色したベータ細胞を後に定量化した棒グラフを示す図である。
【図１５Ａ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後、ラットインスリノーマベータ細胞系（ＩＮＳ１）からのグルコース刺激性インスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフを示す図である。
【図１５Ｂ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後、ａＰ２欠損ｃ５７ｂ／６マウス（マウス島）からのグルコース刺激性インスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフを示す図である。
【図１５Ｃ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後、ヒト島からのグルコースで刺激したインスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフを示す図である。
【図１５Ｄ】１０μｇ／ｍｌのａＰ２を用いた２０分の処置後、ａＰ２がマウス島内に取り込まれることを示す図である（ｎ＝５）。
【図１５Ｅ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後、ＩＮＳ１ベータ細胞からの「絶食」状態下で２４時間のａＰ２処置後のインスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフの図である。
【図１５Ｆ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後、ａＰ２−／−マウスから単離した初代島からの「絶食」状態下で２４時間のａＰ２処置後のインスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフの図である。
【図１６】マウス（ラットインスリンプロモーター−リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス−糖タンパク質、又はＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰ、マウス）における１型糖尿病の誘発性モデルの略図である。マウスにＬＣＭＶを注射し、これにより、β−細胞の破壊及び糖尿病の発症を導く。
【図１７】ａＰ２−／−（Ｃ群）及び３３ｍｇ／ｋｇのＣＡ３３（Ｂ群）又はＰＢＳ対照（Ａ群）のいずれかを週に２回注射し、通常の食餌を与えたａＰ２−正常マウスの群の１型糖尿病誘発性マウスモデル（ＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウス）におけるａＰ２−抗体投与スケジュールを示す概略図である。
【図１８】ａＰ２−／−（三角）及び３３ｍｇ／ｋｇのＣＡ３３（四角）又は対照（ＰＢＳ）（丸）のいずれかを週に２回注射し、通常の食餌を与えたａＰ２−正常マウスの群の１型糖尿病誘発性マウスモデル（ＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウス）における６時間の空腹時血糖測定（ｍｇ／ｄｌ）対時間（日数）を示す線グラフに図である。ＣＡ３３で処置した及びａＰ２欠損動物は、ビヒクルで処置した動物と比較して、ＬＣＭＶ投与後、有意に低い空腹時血糖を有した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図１９】ａＰ２−／−（三角）及び３３ｍｇ／ｋｇのＣＡ３３（四角）又は対照（ＰＢＳ）（丸）のいずれかを週に２回注射し、高脂肪食を与えたａＰ２−正常マウスの群の１型糖尿病誘発性マウスモデル（ＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウス）における１型糖尿病の発生率を示す棒グラフの図である。糖尿病は２５０ｍｇ／ｄｌより高い６時間空腹時血糖測定として定義した。ＣＡ３３処置は、ａＰ２遺伝的欠損動物において観測されたものと同様であるＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰモデルにおける１型糖尿病の発症に対する防御を与えた。
【図２０Ａ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウスにおける島浸潤（％；非膵島炎（白抜きの棒）；膵島周囲炎（格子柄の棒）；軽度膵島炎（灰色の棒）；重度膵島炎（黒色の棒））を示す棒グラフの図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。膵島炎スコア付けはＨ＆Ｅ染色した膵臓切片で実施した。各々の島は、「非膵島炎」、「膵島周囲炎」、「軽度膵島炎」又は「重度膵島炎」のいずれかとしてスコア付けした。棒グラフは、分析した各々の動物における各々の島の種類の百分率を表す。
【図２０Ｂ】ほとんど又は全くない膵島炎を示す島の代表的な写真の図である。
【図２０Ｃ】重度膵島炎を示す島の代表的な写真の図である。
【図２０Ｄ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウスにおける軽度膵島炎（％）を有する島を示す棒グラフの図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図２０Ｅ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウスにおける重度膵島炎（％）を有する島を示す棒グラフの図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図２１Ａ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウスにおけるＡＴＦ６（左の列）又はＸＢＰ１（右の列）について染色した島の一連の代表的な画像の図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。
【図２１Ｂ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウス由来の膵臓試料中のＡＴＦ６レベル（相対蛍光強度、ＲＦＩ）を示す棒グラフの図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図２１Ｃ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウス由来の膵臓試料中のｓＸＢＰ１レベル（相対蛍光強度、ＲＦＩ）を示す棒グラフの図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図２２Ａ】示した時点（週）におけるＡｐｏＥノックアウトマウス（アテローム性動脈硬化症マウスモデル）の平均体重に基づいて３３ｍｇ／ｋｇの投薬量を達成するための抗体用量（μｇ）及び注射体積（μｌ）の算定を提供している表の図である。
【図２２Ｂ】ＰＢＳ（丸）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（三角）を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるアテローム性動脈硬化症病変領域（％）を示すグラフの図である。屠殺したＡｐｏＥノックアウトマウス由来の大動脈を、近位大動脈から腸骨分岐点まで切断し、大動脈を正面調製物（ｅｎ  ｆａｃｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）においてピンで固定した。正面をピンで固定した大動脈をＳｕｄａｎ  ＩＶで染色した。病変領域の定量化を、ＮＩＨにおいて開発されたＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して達成した。ピンで固定した大動脈の外側周囲を、白色バックグラウンドとして大動脈の全領域を画定するためにソフトウェアにおいて定義した。次いでＳｕｄａｎ  ＩＶで赤色に染色した病変の領域のパーセントを測定し、ソフトウェアによって算出した。＊ｐ＜０．０５。
【図２２Ｃ】ウェスタンダイエット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｄｉｅｔ）を与え、ビヒクルを用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウス由来の正面をピンで留めた大動脈の代表的な画像の図である。
【図２２Ｄ】ウェスタンダイエットを与え、ＣＡ３３（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウス由来の正面をピンで留めた大動脈の代表的な画像の図である。
【図２２Ｅ】ウェスタンダイエットを与え、ＣＡ１５（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウス由来の正面をピンで留めた大動脈の代表的な画像の図である。
【図２２Ｆ】ＰＢＳ（丸）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（三角）を用いて１２週間処置したマウスにおけるＡｐｏＥノックアウトマウスの平均体重（ｇ）対年齢（週齢）を示す線グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。
【図２２Ｇ】ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスの脂肪組織におけるａＰ２タンパク質発現を示す図である。
【図２２Ｈ】１２週のウェスタンダイエットの後のＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスにおけるａＰ２のレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。
【図２２Ｉ】１２週のウェスタンダイエットの後のＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスにおけるトリグリセリドのレベル（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。
【図２２Ｊ】１２週のウェスタンダイエットの後のＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスにおけるコレステロールのレベル（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。
【図２２Ｋ】ＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症病変領域を示す棒グラフの図である。
【図２２Ｌ】１２週間ウェスタンダイエットを与えたＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウス由来の正面をピンで留めた大動脈の代表的な画像の図である。
【図２３Ａ】ＰＢＳ（黒色の棒）、ＣＡ３３（薄灰色の棒）又はＣＡ１５（灰色の棒）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスの平均体重（ｇ）を示す棒グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。ＣＡ３３で処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスより統計的に有意に低い平均体重を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図２３Ｂ】ＰＢＳ（黒色の棒）、ＣＡ３３（薄灰色の棒）又はＣＡ１５（灰色の棒）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスの肝臓重量（ｇ）を示す棒グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。ＣＡ３３で処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスより統計的に有意に低い肝臓重量を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図２３Ｃ】ＰＢＳ（黒色の棒）、ＣＡ３３（薄灰色の棒）又はＣＡ１５（灰色の棒）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスの体重−肝臓重量（ｇ）を示す棒グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。ＣＡ３３で処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスより低い平均体重−肝臓重量を示す。
【図２３Ｄ】ＰＢＳ（黒色の棒）、ＣＡ３３（薄灰色の棒）又はＣＡ１５（灰色の棒）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスの平均体重、除脂肪質量又は脂肪質量（ｇ）を示す棒グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置し、体重、除脂肪質量及び脂肪質量を二重Ｘ線吸収（ＤＥＸＡ）分光法によって測定した。
【図２４Ａ】ＰＢＳ（黒色の棒）、ＣＡ３３（薄灰色の棒）又はＣＡ１５（灰色の棒）を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるブドウ糖負荷試験前の空腹時基礎グルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）の棒グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。ＣＡ３３で処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスより統計的に有意に低い空腹時血糖を有する。＊ｐ＜０．０５。
【図２４Ｂ】ＰＢＳ（三角）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（丸）を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるブドウ糖負荷試験の間のグルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）の線グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。ブドウ糖負荷試験は、一晩（１６時間）の絶食後、意識のあるマウスへの経口グルコース投与（１．０ｇ／ｋｇ）によって実施した。
【図２５Ａ】ＰＢＳ（三角）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（丸）を用いて６週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるリポタンパク質画分（総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）又は高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ））中のコレステロール（ｍｇ／ｄｌ）の棒グラフの図である。リポタンパク質の粒径分布は、血漿のプールした試料を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって決定した。＊ｐ＜０．０５。
【図２５Ｂ】ＰＢＳ（三角）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（丸）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるリポタンパク質画分（総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）又は高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ））中のコレステロール（ｍｇ／ｄｌ）の棒グラフの図である。リポタンパク質の粒径分布は、血漿のプールした試料を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって決定した。＊ｐ＜０．０５。
【図２６Ａ】ＰＢＳ（三角）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（丸）を用いて６週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるリポタンパク質画分（総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）又は高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ））中のトリグリセリド（ｍｇ／ｄｌ）の棒グラフの図である。リポタンパク質の粒径分布は、血漿のプールした試料を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって決定した。＊ｐ＜０．０５。
【図２６Ｂ】ＰＢＳ（三角）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（丸）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるリポタンパク質画分（総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）又は高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ））中のトリグリセリド（ｍｇ／ｄｌ）の棒グラフの図である。リポタンパク質の粒径分布は、血漿のプールした試料を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって決定した。＊ｐ＜０．０５。
【図２７】抗ヒトａＰ２ヒト化カッパ軽鎖可変領域抗体断片を提供した図であり、９０９配列はウサギ可変軽鎖配列であり、９０９ｇＬ１、ｇＬ１０、ｇＬ１３、ｇＬ５０、ｇＬ５４及びｇＬ５５配列は、アクセプターフレームワークとしてＩＧＫＶ１−１７ヒト生殖細胞系列を使用した９０９可変軽鎖のヒト化移植である。ＣＤＲは太字／下線で示され、一方、適用可能なドナー残基は太字／イタリックで示され、強調されている：２Ｖ、３Ｖ、６３Ｋ及び７０Ｄ。システイン残基を除去するためのＣＤＲＬ３における突然変異は太字／下線で示され、強調されている：９０Ａ。
【図２８】抗ヒトａＰ２ヒト化重鎖可変領域抗体断片を提供した図であり、９０９配列はウサギ可変重鎖配列であり、９０９ｇＨ１、ｇＨ１４、ｇＨ１５、ｇＨ６１及びｇＨ６２配列は、アクセプターフレームワークとしてＩＧＨＶ４−４ヒト生殖細胞系列を使用した９０９可変重鎖のヒト化移植である。ＣＤＲは太字／下線で示される。ベータシート鎖ＤとＥとの間のループにおけるフレームワーク３内の２つの残基ギャップはｇＨ１において強調されている：７５及び７６。適用可能なドナー残基は太字／イタリックで示され、強調されている：２３Ｔ、６７Ｆ、７１Ｋ、７２Ａ、７３Ｓ、７４Ｔ、７７Ｔ、７８Ｖ、７９Ｄ、８９Ｔ及び９１Ｆ。システイン残基を除去するためのＣＤＲＨ２における突然変異は太字／下線で示され、強調されている：５９Ｓ。潜在的なアスパルタート異性化部位を除去するためのＣＤＲＨ３における突然変異は太字／下線で示され、強調されている：９８Ｅ。Ｎ末端グルタミン残基はグルタミン酸と置き換えられ、太字で示され、強調されている：１Ｅ。
【図２９】ａＰ２とネズミ由来の抗ａＰ２抗体との間の重要な接触点を表す図である。図に示されるように、重及び軽鎖のＣＤＲ領域を有する特定のアミノ酸残基の置換の結果、親抗体Ｈ３と比較して、変化した抗体の親和性の減少が生じた。
【図３０Ａ】親抗体Ｈ３と比較して、ネズミ由来の抗ａＰ２抗体における結合親和性の低下を誘導するためのアミノ酸置換を提供した図であり、ｇ１＝野生型親Ｈ３である。結合親和性（μＭ）をＣＡ３３及び２つの低下した親和性のＨ３様抗体について示す。
【図３０Ｂ】親抗体Ｈ３と比較して、ネズミ由来抗ａＰ２抗体における結合親和性の低下を誘導するためのアミノ酸置換を詳述している重鎖のタンパク質配列を提供した図であり、ｇ１＝野生型親Ｈ３である。ＣＤＲは下線が引かれ、アミノ酸置換は太字で示されている。
【図３０Ｃ】親抗体Ｈ３と比較して、ネズミ由来の抗ａＰ２抗体における結合親和性の低下を誘導するためのアミノ酸置換を詳述している軽鎖のタンパク質配列を提供した図であり、ｇ１＝野生型親Ｈ３である。ＣＤＲは下線が引かれ、アミノ酸置換は太字で示されている。
【図３１】結合親和性を低下させるように突然変異されているネズミ由来の抗ａＰ２抗体についてヒト及びマウスａＰ２に対する親和性データを示す表の図である。結合親和性（ＫＤ）を、各抗体（ＡＰＰ５１６８／ＰＢ１１７２及びＡＰＰ５１６９／ＰＢ１１７１）について２つのクローンで示し、平均結合親和性（ＫＤ）を示す（μＭ）。
【図３２】ａＰ２が、ＦｏｘＯ１依存的に糖新生遺伝子発現を調節することを示す図である。初代肝細胞を、３時間（図３２Ａ、図３２Ｂ、図３２Ｃ、図３２Ｄ及び図３２Ｅ）又は６時間（図３２Ｆ）、２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）の存在下又は非存在下で５０μｇのａＰ２と共に又はそれを有さずにインキュベートした。図３２Ａと図３２Ｂは肝細胞における糖新生遺伝子発現（それぞれＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１）に対するａＰ２の効果に対するホルスコリン刺激の影響及びこのプロセスにおけるａＰ２脂質結合の役割を示す図である（ｎ＝４）。ｍｕｔ：脂質結合突然変異体、ｄｅｌｉｐ：脱脂質化ａＰ２、ＷＴ：脂質負荷ａＰ２。図３２Ｃは、ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンによる転写因子のスクリーニング並びにホルスコリン及びａＰ２刺激性Ｇ６ｐｃ発現に対する効果を示す（ｎ＝４）。図３２Ｄは、ａＰ２媒介性Ｇ６ｐｃ発現に対するアデノウイルス媒介性ＦｏｘＯ１ノックダウンの効果を示す（ｎ＝４）。図３２Ｅは、ＦｏｘＯ１についてタンパク質レベルにおけるノックダウン効率を示す。図３２Ｆは、初代肝細胞におけるＦＨＲＥルシフェラーゼ活性のａＰ２刺激の効果を示す（ｎ＝６）。図３２Ｇは、アデノウイルス媒介性ＦｏｘＯ１ノックダウン及びａＰ２刺激後の肝細胞からのグルコース産生を示す図である（ｎ＝５）。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊、＊＊及びＮＳはそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及び有意差なしを示す。
【図３３】ａＰ２が糖新生遺伝子発現を調節するために脂肪酸代謝を変化させることを示す図である。図３３Ａ及び図３３Ｂは、ビヒクル又は５０μＭのエトモキシルと３０分間プレインキュベートし、２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）の存在下又は非存在下で３時間、５０μｇ／ｍｌのａｐ２で刺激した初代肝細胞からのＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１発現についてそれぞれ一覧にした結果を示す（ｎ＝４）。図３３Ｃと図３３Ｄは、酸素消費速度（ＯＣＲ、図３３Ｃ、ｎ＝６）又は脂肪酸取込み（図３３Ｄ、ｎ＝５）を測定するために示した時間について、初代肝細胞を、５０μｇ／ｍｌのａＰ２で２時間刺激し、１５０μＭのパルミタート（図３３Ｃ）又は１５０μＭのオレアート（図３３Ｄ）で刺激したときに得られた結果を示す。図３３Ｅ及び図３３Ｆは、初代肝細胞を５０μｇ／ｍｌのａＰ２で２時間刺激し、細胞を、２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）／１００μＭのパルミタートの存在下又は非存在下で３時間、５０μｇ／ｍｌのａｐ２でさらに刺激したときにＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１についてそれぞれ得られたｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝４）。図３３Ｇ及び図３３Ｈは、初代肝細胞を、５μＭのトリアクシンＣと３０分間プレインキュベートし、同じ濃度のトリアクシンＣを用いて又は用いずに図３３Ｄのようにさらに処理したときにＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１についてそれぞれ得られたｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝４）。図３３Ｉは、初代肝細胞をビヒクル又はａＰ２のいずれかを用いて処置した後の初代肝細胞における核脂肪アシル−ＣｏＡ（ｐｍｏｌ／１０６細胞）のレベルを示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊、＊＊及びＮＳはそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及び有意差なしを示す。
【図３４】ａＰ２によって調節された新規ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２転写複合体の存在を実証する図である。初代肝細胞を、２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）の存在下又は非存在下で３時間（図３４Ａ及びＢ）又は９０分（図３４Ｈ、Ｋ、Ｍ及びＮ）、５０μｇ／ｍｌのａＰ２（図３４Ａ、Ｂ、Ｈ、Ｌ、Ｍ及びＮ）で刺激した。図３４Ａと図３４Ｂは、Ｇ６ｐｃ及びＰｃｋ１それぞれのａＰ２誘発性発現に対するアデノウイルス媒介性ＣｔＢＰ１及びＣｔＢＰ２ノックダウンの効果を示す（ｎ＝４）。図３４Ｃは、長方形によって示されるヒト及びマウスＦｏｘＯ配列におけるＰｘＤＬＳ様モチーフを示す。図３４Ｄ及び図３４Ｅは、ＣｔＢＰ又はＦｏｘＯ１の相互免疫共沈降によって示される初代肝細胞における内因性ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ複合体を示す。図３４Ｆは及び図３４Ｇは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体におけるＰｘＤＬモチーフの重要な役割を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＣｔＢＰ２発現プラスミドと共に対照プラスミド、ＦＬＡＧ野生型ＦｏｘＯ１又は突然変異ＦＬＡＧ−ＦｏｘＯ１（Ｍｕｔ：ＰＳＤＬ＞ＰＳＡＳ、Δｐｓｄｌ：ＰｘＤＬモチーフ欠失）のいずれかをトランスフェクトした。複合体はＦＬＡＧアガロースビーズで免疫沈降させた。図３４Ｈは、ａＰ２処置による天然ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の解離を示す。内因性ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体を初代肝細胞から免疫沈降させた。図３４Ｉ及び図３４Ｊは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の栄養素感知能力を示す。ＨＥＫ２９３細胞にＦＬＡＧ野生型ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ２をトランスフェクトした。増加させている濃度のオレオイル−ＣｏＡ（０、５０、１５０、５００μＭ）（図３４Ｉ）又はＮＡＤＨ（０、１０、３０、１００μＭ）（図３４Ｊ）を細胞溶解物に加え、ＦＬＡＧアガロースビーズで免疫沈降させた。図３４Ｋは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体に対する細胞質酸化還元状態の効果を示す。ＨＥＫ２９３細胞にＦＬＡＧ野生型ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ２をトランスフェクトし、異なる割合のラクタート及びピルバートと１時間インキュベートした。図３４Ｌは、ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ２の核／細胞質内局在に対するホルスコリン及びａＰ２処置の効果を示す。ＮＥ：核抽出物。図３４Ｍ及び図３４ＮはＧ６ｐｃプロモーターにおけるＦｏｘＯ１又はＣｔＢＰ２のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析（ｎ＝４）をそれぞれ示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図３５】ＣｔＢＰ２による糖新生遺伝子発現の微調整された調節を示す図である。初代肝細胞を、ＣｔＢＰ２のノックダウン（図３５Ａ、Ｂ）又は過剰発現（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）後、ビヒクル又は２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）で３時間（Ａ、Ｄ及びＥ）又は６時間（Ｂ、Ｆ）刺激した。図３５Ａは、Ｇ６ｐｃ発現に対するＣｔＢＰ２及び／又はＦｏｘＯ１ノックダウンの効果を示す（ｎ＝５）。より明らかにｆｓｋの非存在下でのデータを示すためにｙ軸スケールを差込み図において拡大している。図３５Ｂは、ＣｔＢＰ２ノックダウン後のＦＨＲＥルシフェラーゼ活性を示す（ｎ＝８）。図３５Ｃは、初代肝細胞におけるＧＵＳ及びＣｔＢＰ２過剰発現を示す。図３５Ｄ及び図３５Ｅは、ＣｔＢＰ２過剰発現による糖新生遺伝子発現の調節を示す（ｎ＝４）。図３５Ｆは、ＣｔＢＰ２過剰発現後のＦＨＲＥルシフェラーゼ活性を示す（ｎ＝８）。図３５Ｇは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体に対するインスリン及びｃＡＭＰシグナリングの急性活性化の効果を示す。ＦＬＡＧ−ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ２をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ビヒクル、１００ｎＭのインスリン（ｉｎｓ）又は５０μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）のいずれかで３０分間刺激した。
【図３６】ｉｎ  ｖｉｖｏでの内因性ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の調節を示す図である。図３６Ａ、図３６Ｃ、図３６Ｅ、図３６Ｇ及び図３６Ｊ：以下のマウスの群からの肝臓ホモジネートを免疫共沈降に供して、内因性ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体をアッセイした。全てのマウスを４〜６時間の絶食後に屠殺した。図３６Ａ及び図３６Ｂ：遺伝的肥満ｏｂ／ｏｂマウス及びそれらの対照痩せマウスである。図３６Ｃ及び図３６Ｄ：食餌誘発性肥満マウス（１６週間高脂肪食（ＨＦＤ））及びそれらの対照痩せマウス（通常の食餌（ＮＣ））である。図３６Ｅ及び図３６Ｆ：１６週間の通常の食餌（ＮＣ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）でのａＰ２ノックアウト（ＫＯ）又はそれらの対照野生型（ＷＴ）マウスである。図３６Ｇ及び図３６Ｈ：モノクローナルａＰ２抗体（ＣＡ３３）又はビヒクルを用いて処置した食餌誘発性肥満マウス（ＨＦＤ）、並びに対照痩せマウス（ＮＣ）である。図３６Ｉ、図３６Ｊ、図３６Ｋ、図３６Ｌ及び図３６Ｍ：組換えａＰ２を野生型痩せマウスに５日間投与した。血清ａＰ２レベルを分析した（ｎ＝４）。血清ａＰ２レベル（図３６Ｉ）及びＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体（図３６Ｊ及び図３６Ｋ）、及び肝臓における遺伝子発現（図３６Ｌ及び図３６Ｍ）を分析した（ｎ＝４）。図３６Ｎは、形質導入の５日後の野生型痩せマウスの肝臓におけるＣｔＢＰ２のアデノウイルス媒介性ノックダウンからの結果を示す（ｎ＝６）。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図３７】肝臓におけるＣｔＢＰ２機能獲得は耐糖能を改善し、肥満マウスにおける脂肪症を寛解する図である。ＣｔＢＰ２は、アデノウイルス形質導入によって食餌誘発性肥満マウス（１４週間の食餌）の肝臓内で過剰発現した。ＨＦＤ：高脂肪食、ＮＣ：通常の食餌。図３７Ａ及び図３７Ｂは一晩絶食後の体重の測定を一覧にする（ｎ＝４〜５）。図３７Ｃ、図３７Ｄ及び図３７Ｑ：ＡｄＧＵＳ又はＡｄＣｔＢＰ２を形質導入した食餌誘発性肥満マウスを、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ、図３７Ｃ）、インスリン負荷試験（ＩＴＴ、図３７Ｄ）及びピルバート負荷試験（ＰＴＴ、図３７Ｑ）に供した（ｎ＝１０〜１２）。図３７Ｅ、図３７Ｆ及び図３７Ｇ：Ｇ６ｐｃ、Ｐｃｋ１、又はＡｌｂ  ｍＲＮＡについての肝臓におけるそれぞれの遺伝子発現である（ｎ＝４〜５）。図３７Ｈは、肝臓におけるＣｔＢＰ２機能獲得は耐糖能を改善し、肥満マウスにおける脂肪症を寛解する図である。図３７Ｉは、一覧にした肝臓トリグリセリド含有量を示す（ｎ＝１０）。図３７Ｊは一覧にした血清ＡＬＴレベルを示す（ｎ＝１０）。図３７Ｋ、図３７Ｌ、図３７Ｍ、図３７Ｎ及び図３７Ｏは、肝臓におけるＭｌｘｉｐｌ／Ｓｒｅｂｆ１ｃ（図３７Ｋ及び３７Ｌ）及び脂質合成遺伝子（図３７Ｍ、図３７Ｎ及び図３７Ｏ）発現を示す（ｎ＝１０）。マウスは一晩の絶食後に屠殺した。図３７Ｐは、潜在的な調節機構を示す概略図である。ＡＣＳＬ；アシル−ＣｏＡ合成酵素。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊、＊＊及びＮＳはそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及び有意差なしを示す。
【図３８】ｃＡＭＰ刺激が、ａＰ２誘発性糖新生遺伝子発現を増幅させる図である。図３８Ａと図３８Ｂは、初代肝細胞を、２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）の非存在下又は存在下で３時間、５０μｇ／ｍｌのａＰ２を用いて又は用いずに刺激したときからのＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１  ｍＲＮＡレベルをそれぞれ示す（ｎ＝４）。ｙ軸のスケールはｆｓｋの非存在下でのデータをより明確に示すために差込み図において拡大している。図３８Ｃ及び図３８Ｄにおいて、初代肝細胞を、ＰＫＡ阻害剤（Ｈ８９、２０μＭ）を用いて又は用いずに図３８Ａと同様に処置した（ｎ＝４）；Ｇ６ｐｃ  ｍＲＮＡ及びＰｃｋ１  ｍＲＮＡレベルを測定し、一覧にした。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊＊はスチューデントのｔ検定によって決定したｐ＜０．０１を示す。
【図３９】糖新生遺伝子のａＰ２媒介性上方制御に関与している転写因子（単数又は複数）のスクリーニングを示す図である。図３９Ａ、図３９Ｂ及び図３９Ｃは、図３２Ｃに示した実験に対応するｍＲＮＡレベルにおけるノックダウン効率を示す（ｎ＝４）。図３９Ｄ、図３９Ｅ、図３９Ｆ及び図３９Ｇは、糖新生遺伝子のａＰ２依存性上方制御に関与している転写因子（単数又は複数）のスクリーニングを示す。初代肝細胞を、Ｈｉｆ１ａ、Ｐｐａｒｇｃ１ａ又はＳｔａｔ３のノックダウン後、図３２Ａと同様に処置した（ｎ＝４）。図３９Ｈは、図３２のようにＦｏｘｏ１発現レベルを示す（ｎ＝４）。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図４０】ａＰ２によるＣｔＢＰ２依存性転写活性化の図である。図４０Ａ、図４０Ｂ、図４０Ｃ及び図４０Ｄは、図３４に対応するｍＲＮＡ及びタンパク質レベルにおけるノックダウン効率を示す（ｎ＝４）。図４０Ｅ、図４０Ｆ及び図４０Ｇは、ＨＮＦ４αのアデノウイルス媒介性ノックダウン後の初代肝細胞における糖新生遺伝子発現を示す（ｎ＝４）。Ｇ６ｐｃ及びＰｃｋ１についての遺伝子発現プロファイルを図４０Ｅ及び図４０Ｆにそれぞれ示し、そしてタンパク質レベルにおけるノックダウン効率を図４０Ｇに示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図４１】ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ複合体の特徴付けの図である。図４１Ａ及び図４１Ｂは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ１相互作用についての突然変異誘発研究の結果を示す。ＣｔＢＰ１発現プラスミドと共に野生型ＦＬＡＧ  ＦｏｘＯ１（ＷＴ）又は突然変異ＦｏｘＯ１（Ｍｕｔ：ＰＳＤＬ＞ＰＳＡＳ、Δｐｓｄｌ：ＰｘＤＬモチーフ欠失）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を溶解し、免疫共沈降に供した。図４１Ｃは、ホルスコリン（ｆｓｋ、２μＭ）の存在下又は非存在下で５０μｇ／ｍｌのａＰ２と初代肝細胞を２時間インキュベートすると、天然ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体が免疫沈降した結果を示す。図４１Ｄは、細胞のラクタート／ピルバート比を示す。初代肝細胞は図３３Ｅのように処置した。図４１Ｅは図３４Ｌに対応する免疫細胞化学を示す。図４１ＦはＦｏｘＯ１のリン酸化及びアセチル化のレベルを示す。初代肝細胞はホルスコリン（ｆｓｋ、２μＭ）及び／又は５０μｇ／ｍｌのａＰ２を用いて３０分間処置した。
【図４２】特定の遺伝子の発現に対するＣｔＢＰ２過剰発現の効果を示す図である。初代肝細胞を図３５Ｄのように処理し、遺伝子発現プロファイルを分析した。
【図４３】組換えａＰ２のｉｎ  ｖｉｖｏ投与の結果を示す図である。組換えａＰ２を野生型痩せマウスに５日間投与した（ｎ＝４）。図４３Ａ、図４３Ｂ、図４３Ｃ、図４４Ｄ、及び図４４Ｅは、ａＰ２の腹腔内注射の前（０日）及び後（５日）の体重、血清インスリンレベル、グルカゴン、グリセロール及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）についての結果をそれぞれ示す。図４３Ｆ及び図４３Ｇは、組換えａＰ２を用いて処置した野生型又は肝臓特異的ＦｏｘＯ１  ＫＯマウスにおけるＰｃｋ１及びＦｏｘｏ１についてのｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝７〜８）。データは平均±ＳＥＭとして表す。ＮＳはスチューデントのｔ検定によって決定した有意差なしを示す。
【図４４】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣｔＢＰ２過剰発現の図である。図４４Ａは、肝臓におけるＧＵＳ及びＣｔＢＰ２の過剰発現のタンパク質レベルを示す。図４４Ｂは、ＩＴＴ研究（図３７Ｄ、ｎ＝１０〜１２）においてベースラインに正規化していない血糖値を示す。図４４Ｃは、ＧＵＳ又はＣｔＢＰ２を過剰発現した肝臓における血清インスリンレベルを示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図４５】肝臓脂肪症の発症におけるＣｔＢＰ２の関与の図である。図４５Ａ、図４５Ｂ、図４５Ｃ、図４５Ｄ、図４５Ｅ及び図４５Ｆは、野生型初代肝細胞（図４５Ａ、図４５Ｂ、図４５Ｃ、図４５Ｄ、ｎ＝４）又はＦｏｘＯ１ノックアウト肝細胞（図４５Ｅ及び図４５Ｆ、ｎ＝５）における脂質合成遺伝子発現に対するＣｔＢＰ２過剰発現の効果を示す。図４５Ｇ、図４５Ｈ、図４５Ｉ及び図４５Ｊは野生型痩せマウスにおけるＡｄ／ｓｈＣｔＢＰ２形質導入の１４日後に分析した肝臓試料からの結果を示す。図４５Ｇは代表的なヘマトキシリン及びエオシン染色した肝臓切片を示す。図４５Ｈは、肝臓トリグリセリド含有量を示す（ｎ＝６）。図４５Ｉ及び図４５Ｊは、肝臓ステアロイル（Ｓｔｅａｒｙｏｌ）−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（Ｓｃｄ１）及び脂肪酸合成酵素（Ｆａｓｎ）発現をそれぞれ示す（ｎ＝６）。マウスを一晩の絶食後に屠殺した。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図４６】組換えａＰ２の付加がＦＯＸＯ１転座及び活性を活性化することを示す図である。図４６Ａは１０μｇ／ｍｌのａＰ２を用いて２０分間処置したマウス及びヒト島におけるＦＯＸＯ１の核転座を示す（Ｎ＝３のマウス島、Ｎ＝１のヒト島）。図４６Ｂは１０μｇ／ｍｌのａＰ２を用いて２４時間処置したＩＮＳ１細胞におけるＦＯＸＯ１標的遺伝子の遺伝子発現の変化を示す（Ｎ＝４／群）。図４６Ｃは１０μｇ／ｍｌのａＰ２処置の２４時間後の増加したＶＥＧＦＡタンパク質を示すＦＯＸＯ１標的遺伝子発現における変化の検証を示す（Ｎ＝３／群）。
【図４７】オボアルブミン又はビヒクルのいずれかを用いて処置した野生型及びａＰ２ノックアウトマウスにおけるメタコリンチャレンジ試験の間の気道抵抗（ｃｍＨ２Ｏ．ｓ／ｍｌ）対メタコリン（ｍｇ／ｍｌ）の線グラフの図である。
【００４２】
図１〜８は以下の実施例１においてさらに説明している。
図９〜１６は以下の実施例２においてさらに説明している。
図２２〜２６は以下の実施例３においてさらに説明している。
図２７〜２８は以下の実施例４においてさらに説明している。
図２９〜３１は以下の実施例５においてさらに説明している。
図３２〜４６は以下の実施例６においてさらに説明している。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
ａＰ２媒介性障害の処置のための優れた、予想外の活性を有する、抗ａＰ２モノクローナル抗体及び抗原結合剤が提供される。例えば、可変領域を有する軽鎖又は軽鎖断片を含み、前記可変領域が、配列番号７、配列番号８及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３から独立に選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む、抗ａＰ２モノクローナル抗体及び抗原結合剤が提供される。或いは、１又は複数の開示及び選択されたＣＤＲを、本明細書にさらに記載されるように、抗体又は抗原結合剤の特性に有害に影響しない、又はそれを改善する１又は複数のアミノ酸の置換によって変化させることができる。一実施形態では、選択されるＣＤＲ（単数又は複数）は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク中に置かれる。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークをさらに改変又は変化させて、移植されたＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。
【００４４】
本明細書に開示される予想外の発見の１つは、記載される抗体及び抗原結合剤が、ａＰ２タンパク質に堅く結合しないということである。典型的には、Miao, et al.（背景技術を参照されたい）により報告されたように、堅い結合親和性（非常に低いＫＤ）を有する抗体及び他の抗原結合剤が求められる。
【００４５】
したがって、別の実施形態では、約１０−７Ｍ以上のＫＤの、より弱い結合親和性で、その分泌（非細胞質）状態のａＰ２タンパク質に結合する抗体又は抗原結合剤は、それを必要とする宿主に有効量で提供された場合、分泌されるａＰ２を中和し、ａＰ２媒介性障害に対する有意な阻害効果を引き起こす改善された能力を有することが発見された。さらに、低親和性結合抗ａＰ２抗体の使用が、高親和性抗ａＰ２抗体の使用に関して見られる望ましくない効果、例えば、体重増加及びａＰ２血清レベルの増加を軽減することが発見された。
【００４６】
本発明の抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤は、或いは、抗体又は抗原結合剤と、ａＰ２タンパク質のエピトープ（単数又は複数）との接触点によって記載することができる。ａＰ２は、アミノ酸がフォールディングされたタンパク質中の近い位置にあるが、タンパク質がアンフォールディングされているか、又は伸長している場合には近くない、非連続的エピトープを有することが知られている（ＷＯ２０１０／１０２１７１を参照されたい）。かくして、一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又はその抗原結合剤は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、１３２Ａ（上記の配列番号１中で太字）から選択される１若しくは複数個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９個以上のアミノ酸残基、又は１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、及び１３２Ａのいずれかの約３若しくは４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒトａＰ２のエピトープに結合し、任意選択で、約１０−７Ｍ以上の、分泌されるａＰ２に対するＫＤを有する。特定の実施形態では、抗体は、３又は４オングストローム範囲内でこれらのアミノ酸のそれぞれとの接触を有する。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合剤は、少なくとも６、７、又は８個の列挙されたアミノ酸残基との、３又は４オングストローム範囲の接触を有する。
【００４７】
一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を介してのみ、又は主に介して、ａＰ２に結合する。代替的な実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、重鎖ＣＤＲがａＰ２に結合するよりも高い親和性で、ａＰ２に結合する軽鎖ＣＤＲを有する。一例として、抗体又は抗原結合剤は、ａＰ２に特異的に結合し、ＦＡＢＰ５／Ｍａｌ１に特異的に結合しない。
【００４８】
それを必要とする宿主に投与される場合、これらの抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤は、より高い結合親和性を有する抗ａＰ２モノクローナル抗体と比較した場合、宿主におけるａＰ２の活性を中和し、空腹時血糖値の低下、全身グルコース代謝の改善、全身インスリン感受性の増大、脂肪量、肝臓脂肪変性の減少、血清脂質プロファイルの改善、及び／又はアテローム生成プラーク形成の減少を提供する。したがって、本明細書に記載の抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤は、有効量を、それを必要とする宿主、典型的には、ヒトに投与することにより、限定されるものではないが、糖尿病（１型と２型の両方）、高血糖、肥満、脂肪肝疾患、脂質異常症、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＯＳ）、腫瘍又は新生物などの増殖性障害（例えば、移行膀胱がん、卵巣がん及び脂肪肉腫など）、アテローム性動脈硬化症及び他の心血管障害などの代謝障害を処置するのに特に有用である。
【００４９】
かくして、本発明は、少なくとも以下のものを提供する：
（ａ）本明細書に記載のモノクローナル抗ａＰ２抗体若しくは抗原性結合剤、又はその記載されたバリアント若しくはコンジュゲート；
（ｂ）本明細書に記載のヒト化モノクローナル抗ａＰ２抗体若しくは抗原性結合剤、又はその記載されたバリアント若しくはコンジュゲート；
（ｃ）抗体又は抗体コンジュゲートが、
ｉ．配列番号７〜１３に記載の１若しくは複数のＣＤＲ又は配列番号７〜１３に記載のＣＤＲ領域の結合特性に有害に影響しないアミノ酸置換を有するそのバリアントの構造的含有；
ｉｉ．１０−７Ｍ以上の、ヒトａＰ２に対するＫＤ結合親和性；及び／又は
ｉｉｉ．本明細書にさらに特定されるように、３又は４オングストローム以内のヒト又はマウスａＰ２タンパク質との接触点
のうちの少なくとも１つを特徴とする、本明細書に記載のモノクローナル抗ａＰ２抗体若しくは抗原性結合剤、又はその記載されたバリアント若しくはコンジュゲート；
（ｄ）ａＰ２媒介性障害を有する宿主、特に、ヒトを処置するのに使用するための、本明細書に記載のモノクローナル抗ａＰ２抗体若しくは抗原性結合剤、又はその記載されたバリアント若しくはコンジュゲート；
（ｅ）ａＰ２媒介性障害を有する宿主、特に、ヒトを処置するための、本明細書に記載のモノクローナル抗ａＰ２抗体若しくは抗原性結合剤、又はその記載されたバリアント若しくはコンジュゲートの使用；
（ｆ）ａＰ２媒介性障害を有する宿主、特に、ヒトを処置するための薬剤の製造における、本明細書に記載のモノクローナル抗ａＰ２抗体若しくは抗原性結合剤、又はその記載されたバリアント若しくはコンジュゲートの使用；
（ｇ）本明細書に記載のモノクローナル抗ａＰ２抗体若しくは抗原性結合剤、又はその記載されたバリアント若しくはコンジュゲートが製造において使用されることを特徴とする、ａＰ２媒介性障害の処置における治療的使用を意図される薬剤を製造するための方法；
（ｈ）有効量の本明細書に記載のモノクローナル抗ａＰ２抗体若しくは抗原性結合剤、又はその記載されたバリアント若しくはコンジュゲートを含む医薬組成物。
【００５０】
一般的定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似する、又は同等である方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御するものとする。さらに、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００５１】
別途文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本出願では、「又は」の使用は、別途記述しない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。また、「要素」又は「成分」などの用語は、別途具体的に記述しない限り、１つの単位を含む要素と成分の両方及び１を超えるサブ単位を含む要素及び成分を包含する。
【００５２】
一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法、及びそれらの技術は、当業界で周知であり、一般的に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、一般的には、当業界で周知の、また、別途指摘しない限り、本明細書を通して引用及び考察される様々な一般的な、及びより具体的な参考文献に記載された、従来の方法に従って実施される。酵素反応及び精製技術を、当業界で一般的に達成される、又は本明細書に記載されるように、製造業者の明細書に従って実施することができる。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、並びに医学、及び製薬化学と関連して使用される命名法、並びにその実験手順及び技術は、当業界で周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、及び送達、並びに患者の処置のために、標準的な技術が使用される。
【００５３】
本発明をより容易に理解することができるように、選択された用語を以下に定義する。
【００５４】
本明細書で使用される用語「宿主」とは、典型的には、ヒト対象を指し、特に、ヒト又はヒト化フレームワークがアクセプター構造として使用される。別の宿主を処置する場合、当業者であれば、拒絶を回避するため、又はより適合性にするために、抗体又は抗原結合剤をその宿主に合わせる必要があることを理解できる。本発明においてＣＤＲを使用し、ある範囲の宿主のための望ましい送達及び機能のために適切なフレームワーク又はペプチド配列中にそれらを操作する方法は公知である。他の宿主は、他の哺乳動物又は脊椎動物種を含んでもよい。したがって、用語「宿主」は、或いは、必要に応じて、抗体又は抗原結合剤が、宿主との適合性のために好適に設計された、マウス、サル、イヌ、ブタ、ウサギ、家畜化されたブタ科動物（ブタ及びイノシシ）、反芻動物、ウマ、家禽、ネコ科動物、ネズミ科動物、ウシ科動物、イヌ科動物などの動物を指してもよい。
【００５５】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。用語「ペプチド」及び「タンパク質」は、ポリペプチドの用語と互換的に使用され、アミノ酸のポリマー鎖を指してもよい。用語「ポリペプチド」は、天然又は人工のタンパク質、タンパク質断片、及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、モノマー又はポリマーであってもよい。
【００５６】
本明細書で使用される用語「回収すること」とは、例えば、当業界で周知のタンパク質精製技術を使用する単離によって、ポリペプチドなどの化学種を、天然に結合する成分を実質的に含まないようにするプロセスを指す。
【００５７】
本明細書で使用される用語「ヒトａＰ２タンパク質」又は「ヒトＦＡＢＰ４／ａＰ２タンパク質」とは、Baxa, C. A., Sha, R. S., Buelt, M. K., Smith, A. J., Matarese, V., Chinander, L. L., Boundy, K. L., Bernlohr, A. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry 28: 8683-8690, 1989により記載された、配列番号１によりコードされるタンパク質、及びその天然のバリアントを指す。
【００５８】
本明細書で使用される用語「マウスａＰ２タンパク質」又は「マウスＦＡＢ４Ｐ／ａＰ２タンパク質」とは、配列番号２によりコードされるタンパク質、及びその天然のバリアントを指す。マウスタンパク質は、番号Ｐ０４１１７の下でＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに登録されている。
【００５９】
抗体、タンパク質、又はペプチドと、第２の化学種との相互作用を参照して本明細書で使用される用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」とは、その相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、以下に定義される「抗原決定基」又は「エピトープ」）の存在に依存すること、例えば、抗体が、タンパク質全体よりもむしろ、特定のタンパク質構造を認識し、これに結合することを意味する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」と抗体とを含有する反応における、エピトープＡ（又は遊離した、未標識のＡ）を含有する分子の存在は、抗体に結合した標識されたＡの量を減少させる。
【００６０】
本明細書で使用される用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）を含む任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、又はａＰ２に特異的に結合させるＩｇ分子のエピトープ結合特性の少なくともいくつかの部分を保持する、その任意の機能的断片、突然変異体、バリアント、若しくは誘導体を広く指す。そのような突然変異体、バリアント、又は誘導抗体形式は、当業界で公知であり、以下に記載される。その非限定的実施形態は、以下に考察される。抗体は、それがある分子と特異的に反応し、それによって、該分子を抗体に結合させることができる場合、その分子に「結合することができる」と言われる。
【００６１】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、異なる抗体の混合物を含有する「ポリクローナル」抗体調製物とは対照的に、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を有する抗体分子、又はＩｇ分子の少なくとも軽鎖エピトープ結合特性を保持するその任意の機能的断片、突然変異体、バリアント、若しくは誘導体の調製物を指すことが意図される。モノクローナル抗体を、ファージ、細菌、酵母又はリボソームディスプレイのようないくつかの公知の技術、並びにハイブリドーマ由来抗体（例えば、標準的なKohler及びMilsteinのハイブリドーマ法（(1975) Nature 256:495-497）などの、ハイブリドーマ技術により調製されるハイブリドーマにより分泌される抗体）により例示される古典的方法により作製することができる。
【００６２】
完全長抗体においては、それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと省略される）と、重鎖定常領域（ＣＨ）とを含む。重鎖定常領域は、４つのドメイン−ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３（重鎖γ、α及びδ）、又はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４（重鎖μ及びε）のいずれかを含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと省略される）と、軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域にさらに細分することができる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲとを含む。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであってもよい。
【００６３】
本明細書で使用される用語「抗原結合剤」又は「抗原性結合剤」とは、抗原（例えば、ａＰ２）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１若しくは複数の断片若しくは部分、又は抗原に対する所望の結合能力を保持する抗体断片の合成改変を指す。抗体の抗原結合機能を、完全長抗体の断片若しくはある特定の部分、又はその改変によって実施させることができることが示されている。実施形態は、２つ以上の異なる抗原又は抗原のいくつかのエピトープ若しくは非連続的エピトープ領域に特異的に結合することができる、二特異的、二重特異的及び多特異的形式を含む。抗原結合剤の非限定例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）単一の可変ドメインを含む、ｄＡｂ断片（参照により本明細書に組み込まれる、Ward et al., (1989) Nature 341:544-546、Winter et al.,ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）性格が免疫グロブリンであるもの、例えば、ダイアボディ、スカブ、二特異的、トリアボディ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ、トリボディ、（Ｆａｂ−Ｆｖ）２−Ｆｃなどの抗体断片の融合物、並びに（ｖｉｉｉ）フィブロネクチン又はロイシンジッパーなどの非免疫グロブリンフレームワーク上に移植されたＣＤＲ又は抗体ループなどの抗体部分（本明細書に組み込まれる、Binz et al. (2005) Nat. Biotech. 23:1257-1268を参照されたい）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え又は他の方法を使用して、それらを、ＶＬ及びＶＨ領域が対形成して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；及びHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）にすることができる合成又は天然のリンカーにより、それらを連結することができる。そのような一本鎖抗体もまた、抗原結合剤の用語に包含されることが意図される。ダイアボディなどの、他の形態の一本鎖抗体も包含される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用することによって、そのドメインに別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作出する、二価の二特異的抗体である（例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照されたい）。そのような抗体結合部分は、当業界で公知である（Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)）。
【００６４】
本明細書で使用される用語「抗体構築物」とは、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインに連結された本発明の１又は複数の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合により連結された２つ以上のアミノ酸残基を含み、１又は複数の抗原結合部分を連結するために使用される。そのようなリンカーポリペプチドは、当業界で周知である（例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照されたい）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖又は軽鎖定常ドメイン、例えば、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ定常ドメインを指す。重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、当業界で公知である。Ｉｇ重鎖γ１定常領域及びＩｇ軽鎖λ及びκ鎖の非限定例は、それぞれ、表８及び表６に提供される。
【００６５】
さらに、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体部分と、１又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有的又は非共有的会合により形成される、より大きい免疫接着分子の一部であってもよい。そのような免疫接着分子の例としては、テトラマーｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101）及び二価及びビオチン化されたｓｃＦｖ分子を作製するためのマーカーペプチドであるシステイン残基とＣ末端ポリヒスチジンタグとの使用（Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058）が挙げられる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分を、それぞれ、全抗体の、パパイン又はペプシン消化などの従来の技術を使用して、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を、本明細書に記載の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して取得することができる。
【００６６】
本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ａＰ２に特異的に結合する単離された抗体は、ａＰ２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、例えば、ヒトａＰ２に特異的に結合する単離された抗体は、他の種に由来するａＰ２分子などの他の抗原に対する交差反応性を有する。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００６７】
用語「ＣＤＲ移植抗体」とは、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬの１又は複数のＣＤＲ領域の配列が、１又は複数のヒトＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）がマウスＣＤＲ配列と置き換えられたヒト重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体などの別の種のＣＤＲ配列と置き換えられる抗体を指す。
【００６８】
用語「Ｋａｂａｔ番号付け」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔラベリング」は、本明細書では互換的に使用される。当業界で認識されるこれらの用語は、抗体、又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基より可変性である（すなわち、超可変性である）アミノ酸残基を番号付けるシステムを指す（Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391及びKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。重鎖可変領域については、超可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによるアミノ酸位置３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）の範囲である。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)）によれば、ＣＤＲ−Ｈ１と同等のループは、残基２６から残基３２まで伸長する。かくして、別途指摘しない限り、本明細書で用いられる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムと、Ｃｈｏｔｈｉａの位相ループ定義との組合せにより記載されるように、残基２６〜３５を指すことが意図される。軽鎖可変領域については、超可変領域は、ＣＤＲＬ１についてはアミノ酸２４位〜３４位、ＣＤＲＬ２についてはアミノ酸５０位〜５６位、及びＣＤＲＬ３についてはアミノ酸８９位〜９７位の範囲である。
【００６９】
本明細書で使用される用語「アクセプター」及び「アクセプター抗体」とは、１又は複数のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供する、又はコードする抗体又は核酸配列を指す。一部の実施形態では、用語「アクセプター」とは、定常領域（単数又は複数）を提供する、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。さらに別の実施形態では、用語「アクセプター」とは、１又は複数のフレームワーク領域及び定常領域（単数又は複数）を提供する、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。特定の実施形態では、用語「アクセプター」とは、１又は複数のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％を提供する、又はコードするヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。この実施形態によれば、アクセプターは、ヒト抗体の１又は複数の特定の位置に存在しない少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、又は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有してもよい。アクセプターフレームワーク領域及び／又はアクセプター定常領域を、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当業界で周知の抗体、開発中の抗体、又は市販の抗体）から誘導するか、又は取得することができる。
【００７０】
本明細書で使用される用語「ＣＤＲ」とは、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域中には３個のＣＤＲが存在し、重鎖ＣＤＲについてはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と命名され、軽鎖ＣＤＲについてはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と命名されている。本明細書で使用される用語「ＣＤＲセット」とは、抗原に結合することができる単一の可変領域中に存在する３個のＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なって定義されている。Ｋａｂａｔにより記載されたシステム（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)）は、抗体の任意の可変領域に適用可能な一義的な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３個のＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲを、ＫａｂａｔのＣＤＲと呼ぶことができる。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者ら（Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)及びChothia et al., Nature 342:877-883 (1989)）は、ＫａｂａｔのＣＤＲ内のある特定のサブ部分が、アミノ酸配列レベルで大きな多様性を有するにも拘わらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンフォメーションを採用することを見出した。これらのサブ部分は、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と命名され、ここで、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖及び重鎖領域を命名する。これらの領域を、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲと呼ぶことができ、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔのＣＤＲと重複する他の境界定義ＣＤＲは、Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995))及びMacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996))によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記のシステムの１つに厳密に従わなくてもよいが、それにも拘わらず、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複するが、それらを、特定の残基又は残基群又はさらにはＣＤＲ全体が、抗原結合に有意に影響しないという予測又は実験的知見を考慮して短縮又は延長することができる。本明細書で使用される方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されたＣＤＲを用いてもよいが、好ましい実施形態は、Ｋａｂａｔ若しくはＣｈｏｔｈｉａ、又はその混合により定義されたＣＤＲを使用する。
【００７１】
本明細書で使用される用語「標準」残基とは、Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987)；Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992)、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）により定義された特定の標準ＣＤＲ構造を定義するＣＤＲ又はフレームワーク中の残基を指す。Chothia et al.によれば、多くの抗体のＣＤＲの重要部分は、アミノ酸配列レベルでの大きな多様性にも拘わらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンフォメーションを有する。それぞれの標準構造は主として、ループを形成するアミノ酸残基の連続的断片のためのペプチド骨格ねじれ角のセットを特定する。
【００７２】
本明細書で使用される用語「ドナー」及び「ドナー抗体」とは、１又は複数のＣＤＲを提供する抗体を指す。好ましい実施形態では、ドナー抗体は、フレームワーク領域が取得又は誘導される抗体とは異なる種に由来する抗体である。ヒト化抗体の文脈では、用語「ドナー抗体」は、１又は複数のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を指す。
【００７３】
本明細書で使用される用語「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」とは、可変領域からＣＤＲを引いた残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は異なるシステムによって決定することができるため、フレームワーク配列の意味は、対応して異なる解釈を受ける。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２及びＬ３並びに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）はまた、軽鎖及び重鎖上のフレームワーク領域を、それぞれの鎖上の４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割し、ここで、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に位置し、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４と特定しない場合、他のものによって言われるフレームワーク領域は、単一の天然免疫グロブリン鎖の可変領域内のＦＲの組合せを表す。本明細書で使用される、ＦＲは４つのサブ領域の１つを表し、ＦＲはフレームワーク領域を構成する４つのサブ領域のうちの２つ以上を表す。
【００７４】
ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、当業界で公知である。本発明の一実施形態では、ヒト軽鎖及び重鎖アクセプター配列は、表４、表５及び表７に記載される配列から選択される。ヒトフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４の異なる組合せが、前記表に記載される。
【００７５】
本明細書で使用される用語「生殖系列抗体遺伝子」又は「遺伝子断片」とは、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝子再配列及び突然変異をもたらす成熟プロセスを受けていない非リンパ系細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を指す。例えば、Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002)；Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)を参照されたい。本発明の様々な実施形態により提供される利点の１つは、生殖系列抗体遺伝子が、成熟抗体遺伝子よりも、種における個体に特徴的な必須アミノ酸配列構造を保存する可能性が高く、したがって、その種において治療的に使用した場合、外来起源に由来するものと認識される可能性が低いという認識を利用する。
【００７６】
本明細書で使用される用語「重要」残基とは、抗体、特に、ヒト化抗体の結合特異性及び／又は親和性に対してより多くの影響を有する可変領域内のある特定の残基を指す。重要残基としては、限定されるものではないが、以下の１又は複数：ＣＤＲに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位（Ｎ−又はＯ−グリコシル化部位のいずれかであってよい）、稀な残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、標準残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との接触残基、バーニアゾーン内の残基、及び可変重鎖ＣＤＲ１のＣｈｏｔｈｉａの定義と、第１の重鎖フレームワークのＫａｂａｔの定義との間で重複する領域中の残基が挙げられる。
【００７７】
用語「ヒト化抗体」は一般に、非ヒト種（例えば、ウサギ、マウスなど）に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒトのように」なるように、すなわち、ヒト生殖系列可変配列とより類似するように変化した抗体を指す。１つの型のヒト化抗体は、ヒトＣＤＲ配列を非ヒトＶＨ及びＶＬ配列中に導入して、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置き換えた、ＣＤＲ移植抗体である。別の型のヒト化抗体は、少なくとも１つの非ヒトＣＤＲをヒトフレームワーク中に挿入した、ＣＤＲ移植抗体である。典型的には、後者が本発明の焦点である。
【００７８】
特に、本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体又はそのバリアント、誘導体、類似体若しくは断片である。ＣＤＲの文脈において本明細書で使用される用語「実質的に」とは、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。一実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト抗体ＣＤＲと比較して、１又は複数（例えば、１、２、３又は４）個のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を有するＣＤＲ領域を有する。さらに、非ヒトＣＤＲを、公知の技術を使用して、より「ヒトのように」するか、又はヒトの身体と適合するように操作することができる。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のものと一致し、フレームワーク領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）ｃ、Ｆｖ）の実質的に全部を含む。好ましくは、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖並びに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３、又はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４を含んでもよい。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含有する。
【００７９】
ヒト化抗体を、ＩｇＹ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン、並びに限定されるものではないが、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、１より多いクラス又はアイソタイプに由来する配列を含んでもよく、特定の定常ドメインを、当業界で周知の技術を使用して所望のエフェクター機能を最適化するように選択することができる。
【００８０】
ヒト化抗体のフレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列と正確に一致する必要はなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークを、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失によって突然変異誘発させて、その部位でのＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれかと正確に一致しないようにすることができる。しかしながら、好ましい実施形態では、そのような突然変異は、広範囲に及ばないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、９８％又は９９％が、親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものと一致する。一実施形態では、１又は複数（例えば、１、２、３又は４）個のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失が、親ＦＲ及びＣＤＲ配列と比較してヒト化抗体中に存在してもよい。本明細書で使用される用語「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。本明細書で使用される用語「コンセンサス免疫グロブリン配列」とは、関連する免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も頻繁に存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)を参照されたい）。免疫グロブリンのファミリーにおいては、コンセンサス配列中のそれぞれの位置は、そのファミリーにおけるその位置に最も頻繁に存在するアミノ酸によって占有される。２個のアミノ酸が等しく頻繁に存在する場合、いずれかがコンセンサス配列中に含まれ得る。
【００８１】
本明細書で使用される「バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）」ゾーンとは、Foote and Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499、参照により本明細書に組み込まれる）により記載された、ＣＤＲ構造を調整し、抗原への適合を微調整することができるフレームワーク残基のサブセットを指す。バーニアゾーン残基は、ＣＤＲの下に層を形成し、ＣＤＲの構造及び抗体の親和性に対して影響し得る。
【００８２】
本明細書で使用される用語「中和」とは、本明細書に記載の抗体がａＰ２タンパク質に特異的に結合する場合の、ａＰ２タンパク質、例えば、分泌されるａＰ２タンパク質の生物活性の中和を指す。中和は、異なる様式の前記抗体のａＰ２への結合の結果であってもよい。好ましくは、中和抗体は、ａＰ２への結合がａＰ２の生物活性の中和をもたらす抗体である。好ましくは、中和抗体タンパク質は、ａＰ２に結合し、ａＰ２の生物活性を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、８０％、８５％以上低下させる。中和抗体によるａＰ２の生物活性の中和を、本明細書に記載のａＰ２生物活性の１又は複数の指標を測定することによって評価することができる。
【００８３】
本明細書で使用される「中和モノクローナル抗体」は、ａＰ２への結合時に、部分的又は完全に、ａＰ２の生物活性を阻害するか、又は低下させることができる、抗体分子の調製物を指すことが意図される。
【００８４】
本明細書で使用される用語「減弱」、「減弱させる」などは、血清ａＰ２レベルの上昇によって引き起こされる症状又は状態の重症度の低下又は軽減を指す。
【００８５】
用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、ある特定の実施形態では、特異的三次元構造特性及び／又は特異的電荷特性を有してもよい。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。ある特定の実施形態では、抗体は、それがタンパク質及び／又は大分子の複合混合物中のその標的抗原を選択的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００８６】
本明細書で使用される用語「Ｋｏｎ」は、当業界で公知のように、抗体／抗原複合体を形成する、抗体の抗原に対する結合に関する結合速度定数を指すことが意図される。
【００８７】
本明細書で使用される用語「Ｋｏｆｆ」は、当業界で公知のように、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する解離速度定数を指すことが意図される。
【００８８】
本明細書で使用される用語「Ｋｄ」は、当業界で公知のように、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すことが意図される。
【００８９】
免疫学的結合相互作用の強度又は親和性を、相互作用の解離定数（Ｋｄ）を単位として表すことができ、ここで、ｋｄが小さいほど、親和性が大きいか、又は高いことを表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性を、当業界で周知の方法を使用して定量することができる。１つのそのような方法は、抗原−結合部位／抗原複合体の形成及び解離の速度を測定することを含み、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び速度に両方向に同等に影響する幾何学的パラメータに依存する。かくして、「結合速度定数（「Ｋｏｎ」）」及び「解離速度定数（「Ｋｏｆｆ」）」を、濃度並びに結合及び解離の実際の速度の算出によって決定することができる（Nature 361:186-87 (1993)）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性と関連しない全てのパラメータの解除を可能にし、解離定数Ｋｄと等しい。Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473。
【００９０】
本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、抗体結合反応の固有の結合強度を決定する、抗体と抗原との結合（結合及び解離）の速度の尺度である親和性（又は親和定数）を指すことが意図される。
【００９１】
用語「抗体コンジュゲート」とは、治療剤又は細胞傷害剤などの第２の化学部分に化学的に連結された、抗体又は抗体断片又はその結合部分などの結合タンパク質を指す。本明細書では、用語「剤」は、化合物、化合物の混合物、生物学的大分子、又は生物学的材料から作製された抽出物を指すために使用される。
【００９２】
本明細書で使用される用語「結晶」及び「結晶化された」とは、結晶の形態で存在する、抗体、又はその抗原結合部分を指す。結晶は、不定形の固体状態又は液体結晶状態などの他の形態とは異なる、固体状態の物質の一形態である。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）、又は分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な、反復的三次元配置から構成される。これらの三次元配置は、当該分野でよく理解される特定の数的関係に従って配置される。結晶中で反復される基本単位、又は構成要素は、非対称単位と呼ばれる。所与の、明確に定義された結晶学的対称性に一致する配置中での非対称単位の反復は、結晶の「単位格子」を提供する。全ての三次元における規則的並進による単位格子の反復は、結晶を提供する。Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, N.Y., (1999)を参照されたい。
【００９３】
本明細書で言及される用語「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれかの２つ以上のヌクレオチドのポリマー形態、又はいずれかの型のヌクレオチドの改変形態を意味する。この用語は、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡを含むが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【００９４】
本明細書で使用される用語「単離されたポリヌクレオチド」とは、その起源のため、「単離されたポリヌクレオチド」が、「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出される；それが天然では連結されないポリヌクレオチドに作動可能に連結される；又はより大きい配列の一部として天然に存在しないポリヌクレオチドの全部又は一部と結合しない、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源、又はそのいくつかの組合せの）を意味する。
【００９５】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。１つの型のベクターは、追加のＤＮＡ断片をライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の型のベクターは、追加のＤＮＡ断片をウイルスゲノム中にライゲートすることができる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込み、それによって、宿主ゲノムと共に複製させることができる。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に、「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドは最も一般的に使用される形態のベクターであるため、本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」を互換的に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【００９６】
用語「作動可能に連結された」とは、記載される成分が、それらがその意図される様式で機能するのを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方法でライゲートされる。「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続的である発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスに、又は少し離れて作用する発現制御配列との両方を含む。本明細書で使用される用語「発現制御配列」とは、それらがライゲートされるコード配列の発現及びプロセッシングを行うのに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；並びに必要に応じて、タンパク質分泌を増強する配列を含む。そのような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる；原核生物においては、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含む；真核生物においては、一般に、そのような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現及びプロセッシングのために必須である成分を含むことが意図され、また、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を含んでもよい。
【００９７】
本明細書で定義される「形質転換」とは、外来ＤＮＡが宿主細胞に進入する任意のプロセスを指す。形質転換は、当業界で周知の様々な方法を使用して天然又は人工条件下で行ってもよい。形質転換は、外来核酸配列の、原核又は真核宿主細胞中への挿入のための任意の公知の方法に依拠してもよい。この方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、限定されるものではないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、及び粒子ボンバードメントを含んでもよい。そのような「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが自己複製するプラスミドとして、又は宿主染色体の一部として複製することができる安定に形質転換された細胞を含む。それらはまた、限られた時間にわたって挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを一過的に発現する細胞を含んでもよい。
【００９８】
本明細書で使用される用語「組換え宿主細胞」（又は単に、「宿主細胞」）は、外来ＤＮＡが導入された細胞を指すことが意図される。そのような用語は特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されることが理解されるべきである。ある特定の改変は突然変異又は環境的影響に起因してその後の世代に存在し得るため、そのような子孫は、事実、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲に依然として含まれる。好ましくは、宿主細胞は、任意の生物界から選択される原核及び真核細胞を含む。好ましい真核細胞としては、原生生物、真菌、植物及び動物細胞が挙げられる。最も好ましくは、宿主細胞は、限定されるものではないが、原核細胞系である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；哺乳動物細胞系ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ；昆虫細胞系Ｓｆ９；並びに真菌細胞であるサッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む。
【００９９】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のための標準的な技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術を、製造業者の明細書に従って、又は当業界で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載のように実施することができる。一般的には、前記技術及び手順を、当業界で周知の従来の方法に従って、並びに本明細書を通して引用及び考察される様々な一般的な、及びより具体的な参考文献に記載されたように実施することができる。例えば、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照されたい。
【０１００】
本明細書で使用される用語「有効量」とは、障害又は１若しくは複数のその症状の重症度及び／若しくは持続期間を軽減する、若しくは改善する、障害の進行を防止する、障害の寛解を引き起こす、障害と関連する１若しくは複数の症状の再発、発症、開始若しくは進行を防止する、障害を検出する、又は別の療法（例えば、予防剤若しくは治療剤）の予防効果若しくは治療効果（単数若しくは複数）を増強若しくは改善するのに十分である療法の量を指す。
【０１０１】
ａＰ２タンパク質
脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）は、脂質結合タンパク質（ＬＢＰ）のスーパーファミリーのメンバーである。現在まで、９種の異なるＦＡＢＰが同定されており、それぞれ、相対的組織濃縮を示す：Ｌ（肝臓）、Ｉ（腸）、Ｈ（筋肉及び心臓）、Ａ（脂肪細胞）、Ｅ（表皮）、Ｉｌ（回腸）、Ｂ（脳）、Ｍ（ミエリン）及びＴ（精巣）。全てのＦＡＢＰファミリーメンバーの主な役割は、脂肪酸取込み及び細胞内輸送の調節である。全てのＦＡＢＰの構造は類似しており、これらのタンパク質を特徴付ける塩基性モチーフは、β−バレルであり、単一のリガンド（例えば、脂肪酸、コレステロール、又はレチノイド）はその内部が水で満たされた空洞中に結合する。
【０１０２】
脂肪細胞の脂肪酸結合タンパク質ａＰ２は、全身グルコース及び脂質代謝を調節し、糖尿病及びアテローム性動脈硬化症などの多くの免疫代謝疾患の病理に関与している。ａＰ２は古典的には細胞質タンパク質であると考えられてきたが、肝臓グルコース新生を促進することにより、高血糖に寄与する活性アディポカインであることがわかった。血清ａＰ２レベルは、マウス及びヒト肥満において顕著に上昇することがわかった。
【０１０３】
ヒトａＰ２タンパク質は、表１のアミノ酸配列（配列番号１）を含む１３２アミノ酸からなる１４．７ｋＤａの細胞内及び細胞外（分泌型）脂質結合タンパク質である。ヒトａＰ２のｃＤＮＡ配列は、Baxa, C. A., Sha, R. S., Buelt, M. K., Smith, A. J., Matarese, V., Chinander, L. L., Boundy, K. L., Bernlohr, A. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry 28: 8683-8690, 1989に以前に記載されており、配列番号５に提供される。ヒトタンパク質は、番号Ｐ１５０９０の下でＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに登録されている。
【０１０４】
マウスａＰ２タンパク質配列は、表１の配列番号２のアミノ酸配列を含む。マウスａＰ２のｃＤＮＡ配列は、配列番号６に提供される。マウスタンパク質は、番号Ｐ０４１１７の下でＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに登録されている。
【０１０５】
ヒトとマウスのａＰ２タンパク質は両方とも、少なくとも２つの主要な保存ドメイン：１１アミノ酸の核局在化シグナル（ａａ２２〜３２：ｋｅｖｇｖｇｆａｔｒｋ（配列番号３））；及び３アミノ酸の脂肪酸結合領域（ａａ１２７〜１２９：ｒｖｙ（配列番号４））を含む。
【表１】
2018515082.tif 000003
【０１０６】
ａＰ２結合エピトープ
本発明の一態様では、ａＰ２分子内の特定の同定されたアミノ酸でヒトａＰ２又はマウスａＰ２に特異的に結合するが、その天然の立体配座形態でフォールディングされるか、又はその天然の結合パートナーと複合体化される、ヒト化モノクローナル抗体を含む抗ａＰ２モノクローナル抗体分子、及び抗原結合剤が提供される。
【０１０７】
一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、アミノ酸配列：
【数２】
2018515082.tif 000004
を有するヒトａＰ２、又はその天然のバリアントに結合する。
【０１０８】
代替的な実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するヒトａＰ２に結合する。一実施形態では、抗体は、１０−７Ｍ以上の、ａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、抗体は、上記の配列番号１で下線付きのアミノ酸配列から選択されるエピトープに結合し、約１０−７Ｍ以上の、ａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、抗体は、配列番号１と比較して１又は複数（例えば、１、２、３又は４）個のアミノ酸置換、付加、又は欠失を有するエピトープに結合する。
【０１０９】
Ｘ線結晶解析により決定されるａＰ２結合エピトープ
一実施形態では、抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤は、３又は４オングストローム距離以内で上記の配列番号１中で太字の１又は複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個のアミノ酸と直接相互作用する。別の実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、３又は４オングストローム距離以内で上記の配列番号１中で太字の全部で９個のアミノ酸と接触する。
【０１１０】
一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、及び１３２Ａから選択される少なくとも１若しくは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９個のアミノ酸残基（上記の配列番号１中の太字）、又は１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、及び１３２Ａのいずれかの約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒト及び／又はマウスａＰ２の非連続エピトープに結合する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、及び１３２Ａから選択される少なくとも１若しくは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９個のアミノ酸残基（上記の配列番号１中の太字）、又は１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、及び１３２Ａのいずれかの約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒトａＰ２のエピトープに結合し、１０−７Ｍ以上の、ａＰ２に対するＫＤを有する。
【０１１１】
代替的な実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３８Ｋ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａから選択される少なくとも１若しくは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、若しくは７個のアミノ酸残基（上記の配列番号１中の太字）、又は１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３８Ｋ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａのいずれかの約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒト及び／又はマウスａＰ２のエピトープに結合する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３８Ｋ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａから選択される少なくとも１若しくは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、若しくは７個のアミノ酸残基（上記の配列番号１中の太字）、又は１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３８Ｋ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａのいずれかの約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒトａＰ２のエピトープに結合し、１０−７Ｍ以上の、ａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、抗体は、３７Ａ及び／又は５７Ｔにさらに結合する。
【０１１２】
一実施形態では、抗体の軽鎖は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａから選択される少なくとも１若しくは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９個のアミノ酸残基、又はその約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒトａＰ２のエピトープに結合し、少なくとも約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。一実施形態では、抗体の軽鎖は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａから選択される少なくとも１若しくは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、若しくは７個のアミノ酸残基、又はその約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒトａＰ２のエピトープに結合し、少なくとも約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。
【０１１３】
一実施形態では、抗体の軽鎖は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３７Ａ、３８Ｋ、５７Ｔ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａから選択される少なくとも１若しくは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９個のアミノ酸残基、又はその約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒトａＰ２のエピトープに結合し、抗体の重鎖は、１０Ｋ及び１３２Ａの少なくとも１個、又はその約４オングストローム以内にあるアミノ酸を含むヒトａＰ２のエピトープに結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。
【０１１４】
一実施形態では、抗体の軽鎖は、１０Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１３Ｓ、３８Ｋ、１３０Ｅ、若しくは１３２Ａから選択される少なくとも１若しくは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、若しくは７個のアミノ酸残基、又はその約４オングストローム以内にあるアミノ酸残基を含むヒトａＰ２のエピトープに結合し、抗体の重鎖は、１０Ｋ及び１３２Ａの少なくとも１個、又はその約４オングストローム以内にあるアミノ酸を含むヒトａＰ２のエピトープに結合し、少なくとも約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。
【０１１５】
一実施形態では、抗体は、少なくとも１０Ｋにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも３８Ｋにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１２Ｖにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１１Ｌにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１３０Ｅにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１３２Ａにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１３Ｓにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１１Ｌ及び１２Ｖにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１３０Ｅ及び１３２Ａにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、上記の特定のアミノ酸においてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合し、約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。
【０１１６】
一実施形態では、抗体は、少なくとも１０Ｋ及び３８Ｋにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１０Ｋ、３８Ｋ及び１２Ｖにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１０Ｋ、３８Ｋ、１２Ｖ及び１１Ｌにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１０Ｋ、３８Ｋ、１２Ｖ、１１Ｌ、及び５７Ｔにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１０Ｋ、３８Ｋ、１２Ｖ、１１Ｌ、５７Ｔ、及び３７Ａにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１０Ｋ、３８Ｋ、１２Ｖ、１１Ｌ、５７Ｔ、３７Ａ、及び１３０Ｅにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１０Ｋ、３８Ｋ、１２Ｖ、１１Ｌ、５７Ｔ、３７Ａ、１３０Ｅ、及び１３２Ａにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。一実施形態では、抗体は、少なくとも１０Ｋ、３８Ｋ、１２Ｖ、１１Ｌ、５７Ｔ、３７Ａ、１３０Ｅ、１３２Ａ、及び１３Ｓにおいてその天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合する。
【０１１７】
また、本発明により提供される抗体により結合されるヒトａＰ２の特定の領域又はエピトープ、特に、軽鎖可変配列９０９ｇＬ１（配列番号４４６）、９０９ｇＬ１０（配列番号４４８）、９０９ｇＬ１３（配列番号４８７）、９０９ｇＬ５０（配列番号４８８）、９０９ｇＬ５４（配列番号４５０）、若しくは９０９ｇＬ５５（配列番号４５２）、及び／又は重鎖可変配列９０９ｇＨ１（配列番号４５５）、９０９ｇＨ１４（配列番号４５７）、９０９ｇＨ１５（配列番号４５９）、９０９ｇＨ６１（配列番号４６１）、若しくは９０９ｇＨ６２（配列番号４６３）を含む抗体により結合されるエピトープも、本明細書で提供される。
【０１１８】
本明細書で提供されるヒトａＰ２タンパク質のこの特定の領域又はエピトープを、本発明により提供される抗体のいずれか１つと共に、当業界で公知の任意の好適なエピトープマッピング法により同定することができる。そのような方法の例は、抗体により認識されるエピトープの配列を含有する抗体に特異的に結合することができる最も小さい断片を用いて、本発明の抗体への結合についてａＰ２に由来する変化する長さのペプチドをスクリーニングすることを含む。ａＰ２ペプチドを、合成的に、又はａＰ２タンパク質のタンパク質分解的消化によって生成することができる。抗体に結合するペプチドを、例えば、質量分析によって同定することができる。別の例では、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶解析を使用して、本発明の抗体により結合されるエピトープを同定することができる。ａＰ２の構造及びａＰ２タンパク質とその天然の結合パートナー、例えば、中鎖及び長鎖脂肪酸との特異的相互作用を決定するための結晶化及びＸ線結晶解析技術は、Marr et al., Expression, purification, crystallization and structure of human adipocyte lipid-binding protein (aP2), Acta Cryst. (2006), F62, 1058-1060に記載されている。一度同定されたら、本発明の抗体に結合するエピトープ断片を、必要に応じて、同じエピトープに結合するさらなる抗体を得るための免疫原として使用することができる。
【０１１９】
一例では、抗体分子のエピトープは、ａＰ２タンパク質（配列番号１）を使用するＸ線結晶解析によって決定される。
【０１２０】
一実施形態では、本発明の抗体は、表２で定義されるアミノ酸接触点においてその天然のコンフォメーションのマウス又はヒトａＰ２タンパク質と相互作用する表２で定義されるＣＤＲドメイン内の少なくとも１又は複数の特定のアミノ酸を含む。
【表２−１】
2018515082.tif 000005
【表２−２】
2018515082.tif 000006
【表２−３】
2018515082.tif 000007
【０１２１】
本発明の抗ａＰ２モノクローナル抗体を、結合中にその天然のコンフォメーション形態のａＰ２タンパク質と接触するＣＤＲ内の特定のアミノ酸によってさらに定義することができる。一実施形態では、同定された特定の位置に以下のアミノ酸：ＣＤＲＬ１−２７Ｇｌｕ、２８Ａｓｐ、３０Ｓｅｒ；ＣＤＲＬ３−９２Ｔｙｒ、９３Ｇｌｙ、９４Ｔｈｒ、９５Ｔｙｒ、９６Ａｌａ；及び１００Ｐｈｅを含む軽鎖を含む精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、その天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合し、約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体はヒト化される。
【０１２２】
一実施形態では、同定された位置に以下のアミノ酸：ＣＤＲＬ１−２７Ｇｌｕ、２８Ａｓｐ、３０Ｓｅｒ；ＣＤＲＬ３−９２Ｔｙｒ、９３Ｇｌｙ、９４Ｔｈｒ、９５Ｔｙｒ、９６Ａｌａ；及び１００Ｐｈｅを含む軽鎖と、同定された位置に以下のアミノ酸：１０４Ｌｅｕを含む重鎖とを含む精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、その天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合し、約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体はヒト化される。
【０１２３】
一実施形態では、同定された位置に以下のアミノ酸：ＣＤＲＬ３−９１Ａｌａを含む軽鎖と、同定された位置に以下のアミノ酸：ＣＤＲＨ１−３３Ａｌａ；ＣＤＲＨ２−５２Ｓｅｒを含む重鎖とを含む精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体が提供される。一実施形態では、重鎖は、同定された位置に以下のアミノ酸：ＣＤＲＨ３−９８Ｐｈｅをさらに含む。一実施形態では、抗体は、その天然のコンフォメーションのヒトａＰ２タンパク質に結合し、約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体はヒト化される。
【０１２４】
一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、その軽鎖ＣＤＲを介してのみ、又は主にそれを介して、ａＰ２に結合する。代替的な実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、その重鎖ＣＤＲがａＰ２に結合するよりも高い親和性でａＰ２に結合する軽鎖ＣＤＲを有する。
【０１２５】
一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、その天然のコンフォメーション形態のヒトａＰ２に対する低い親和性を有することを特徴とする。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約１０−７Ｍ以上の、ヒトａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約１０−４〜１０−６Ｍの、ヒトａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約５００ｎＭを超える、ヒトａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約５００ｎＭ〜約１０μＭの、ヒトａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約１μＭ〜約７μＭの、ヒトａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約２μＭ〜約５μＭの、ヒトａＰ２に対するＫＤを有する。
【０１２６】
代替的な実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、その天然のコンフォメーション形態のマウスａＰ２に対する低い結合親和性を有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、１０−７Ｍ以上の、マウスａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約１０−４〜１０−６Ｍの、マウスａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約５００ｎＭを超える、マウスａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約５００ｎＭ〜約１０μＭの、マウスａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約１μＭ〜約７μＭの、マウスａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約２μＭ〜約５μＭの、マウスａＰ２に対するＫＤを有する。
【０１２７】
一実施形態では、抗体は、ａＰ２に特異的に結合し、ＦＡＢＰ５／Ｍａｌ１に特異的に結合しない。
【０１２８】
一実施形態では、少なくとも１０−７Ｍ未満の、ａＰ２に対するＫＤを有する抗ａＰ２抗体を同定すること、抗ａＰ２抗体のＣＤＲ領域又はＦＲ領域のいずれかにある少なくとも１個のアミノ酸を変化させることにより、ａＰ２に対する親和性を低下させ、前記変化が少なくとも約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する抗ａＰ２抗体をもたらす、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体、及びそれを作製する方法が提供される。一実施形態では、変化した抗体は、その天然のコンフォメーション形態のヒトａＰ２に結合することができる。代替的な実施形態では、変化した抗体は、その天然のコンフォメーション形態のマウスａＰ２に結合することができる。一実施形態では、１）ａＰ２タンパク質に対する少なくとも１０−７Ｍ未満の親和性を有するモノクローナル抗体を同定するステップ、２）その天然のコンフォメーション形態のａＰ２タンパク質と接触するＣＤＲ領域内のアミノ酸を同定するステップ、並びに３）１又は複数の接触アミノ酸を、アラニン、フェニルアラニン、及びセリンから選択されるアミノ酸と置換するステップを含み、前記置換が約１０−７Ｍ以上のＫＤまで抗体の親和性の低下をもたらす、１０−７Ｍ未満のＫＤを有する抗ａＰ２抗体に対する親和性を低下させる方法が提供される。一実施形態では、ＣＤＲＬ３中のシステイン残基が置換される。一実施形態では、システイン残基は、アラニン、グルタミン、及びヒスチジンから選択されるアミノ酸と置換される。
【０１２９】
水素−重水素交換により決定されるａＰ２結合エピトープ
本発明の一態様では、精製されたモノクローナル抗体は、配列番号１のアミノ酸９〜１７、アミノ酸２０〜２８、又はアミノ酸１１８〜１３２の、少なくとも１個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上を含む、水素−重水素交換（ＨＤＸ）により決定されるヒトａＰ２タンパク質のエピトープに結合する。一実施形態では、精製されたモノクローナル抗体は、配列番号１のアミノ酸９〜１７（ＷＫＬＶＳＳＥＮＦ）（配列番号２２）、アミノ酸２０〜２８（ＹＭＫＥＶＧＶＧＦ）（配列番号２３）、又はアミノ酸１１８〜１３２（ＣＶＭＫＧＶＴＳＴＲＶＹＥＲＡ）（配列番号２４）の、少なくとも１個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上を含む、ヒトａＰ２タンパク質のエピトープに結合し、少なくとも約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、ヒトａＰ２タンパク質がその天然のコンフォメーション形態にある場合、配列番号１のアミノ酸９〜１７、アミノ酸２０〜２８、又はアミノ酸１１８〜１３２の、少なくとも１個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の接触点の３〜４オングストローム以内にあるヒトａＰ２タンパク質のエピトープに結合する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、ヒトａＰ２タンパク質がその天然のコンフォメーション形態にある場合、配列番号１のアミノ酸９〜１７、アミノ酸２０〜２８、又はアミノ酸１１８〜１３２の、少なくとも１個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の接触点の３〜４オングストローム以内にあるヒトａＰ２タンパク質のエピトープに結合し、少なくとも約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。結合相互作用及び抗体−エピトープマップを決定するための水素−重水素交換（ＨＤＸ）は、例えば、Pandit et al. (2012) J. Mol. Recognit. Mar;25(3):114-24（参照により本明細書に組み込まれる）により記載されたように、当業界で周知である。
【０１３０】
抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤の構造
抗ａＰ２モノクローナル抗体及び抗原結合剤は、ａＰ２媒介性障害の処置のための優れた、予想外の活性を有することが発見された。一実施形態では、軽鎖又は可変領域を有する軽鎖断片を含有し、前記可変領域が配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から独立に選択される１、２又は３個のＣＤＲを含む、抗ａＰ２モノクローナル抗体及び断片が提供される。或いは、１又は複数の開示及び選択されたＣＤＲを、本明細書にさらに記載されるように、抗体又は抗原結合剤の特性に有害に影響しない、又はそれを改善する、１又は複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸）の置換によって変化させることができる。一実施形態では、選択されたＣＤＲ（単数又は複数）を、ヒト免疫グロブリンフレームワーク中に入れる。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークをさらに改変するか、又は変化させて、移植されたＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。
【０１３１】
したがって、別の実施形態では、約１０−７Ｍ以上のＫＤのより弱い結合親和性でその分泌（非細胞質）状態のａＰ２タンパク質に結合する抗体又は抗原結合剤は、それを必要とする宿主に有効量で提供した場合、分泌されるａＰ２を中和し、ａＰ２媒介性障害に対する有意な阻害効果を引き起こす改善された能力を有することが発見された。
【０１３２】
抗体分子中には、２つの重鎖と２つの軽鎖が存在する。それぞれの重鎖及びそれぞれの軽鎖は、そのＮ末端に可変ドメインを有する。それぞれの可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）と交互に４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。可変ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔら（上掲）によって考案されたシステム、又はＣＤＲ−Ｈ１については、上記のＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの組合せに従って従来通り番号付けられる。別途指摘しない限り、本明細書においては、この番号付けシステムが使用される。
【０１３３】
免疫グロブリン（Ｉｇ）は、Ｂ細胞の抗原認識分子である。Ｉｇ分子は、それぞれの重鎖が軽鎖に連結され、２個の重鎖が互いに連結されるように、ジスルフィド結合によって連結された、２個の同一の重鎖及びカッパ又はラムダのいずれかである２個の同一の軽鎖から作られる。カッパ及びラムダ軽鎖は、見かけ上、機能的な相違はない。Ｉｇカッパ及びラムダ軽鎖はそれぞれ、抗原結合部位を含有するＮ末端可変（Ｖ）領域と、シグナリング機能を提供するＣ領域遺伝子（ＩＧＫＣ又はＩＧＬＣ）によりコードされるＣ末端定常（Ｃ）領域とを有する。カッパ及びラムダ軽鎖Ｖ領域は、２つの型の遺伝子：Ｖ遺伝子及び連結（Ｊ）遺伝子によってコードされる。Ｖ領域を集合させるそれぞれの型のちょうど１つの遺伝子の無作為選択が、Ｉｇ分子間のＶ領域の大きな多様性を担う。ヒト第２染色体上のカッパ軽鎖遺伝子座は、約４０個の機能的Ｖ遺伝子を含有し、次いで、約５個の機能的Ｊ遺伝子を含有する。ヒト第２２染色体上のラムダ軽鎖遺伝子座は、約３０個の機能的Ｖ遺伝子を含有し、次いで、約４個の機能的Ｊ遺伝子を含有する。多型性のため、機能的Ｖ及びＪ遺伝子の数は、個体間で異なる。
【０１３４】
それぞれのＩｇ重鎖は、抗原結合部位を含有するＮ末端可変（Ｖ）領域と、エフェクター又はシグナリング機能を提供するＣ領域遺伝子によりコードされるＣ末端定常（Ｃ）領域とを有する。重鎖Ｖ領域は、３つの型の遺伝子：Ｖ遺伝子、連結（Ｊ）遺伝子、及び多様性（Ｄ）遺伝子によってコードされる。Ｖ領域を集合させるそれぞれの型のちょうど１つの遺伝子の無作為選択が、Ｉｇ分子間のＶ領域の大きな多様性を担う。ヒト第１４染色体上の重鎖遺伝子座は、約４０個の機能的Ｖ遺伝子を含有し、次いで、約２５個の機能的Ｄ遺伝子及び約６個の機能的Ｊ遺伝子を含有する。多型性のため、機能的Ｖ、Ｊ及びＤ遺伝子の数は、個体間で異なる。５つの型の哺乳動物免疫グロブリン重鎖：γ、δ、α、μ及びεが存在する。それらは免疫グロブリンのクラス：それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥを規定する。重鎖γ、α及びδは、３つの直列（互いに隣に一直線にある）の免疫グロブリンドメインから構成される定常領域を有するが、可撓性の追加のためにＣＨ１とＣＨ２領域の間にヒンジ領域も有する。重鎖μ及びεは、４つのドメインから構成される定常領域を有する。
【０１３５】
Ｋａｂａｔの残基指定は、アミノ酸残基の線状番号付けと常に直接一致するわけではない。実際の線状アミノ酸配列は、基本可変ドメイン構造のフレームワークにしても、又はＣＤＲにしても、構造成分の短縮、又はそれへの挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも少ない、又は追加のアミノ酸を含有してもよい。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けを、抗体の配列中の相同な残基と、「標準」Ｋａｂａｔ番号配列とのアラインメントにより、所与の抗体について決定することができる。
【０１３６】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けによる残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲＨ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）に位置する。しかしながら、Chothia (Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917)によれば、ＣＤＲ−Ｈ１と等価なループは、残基２６から残基３２まで伸長する。かくして、別途指摘しない限り、本明細書で用いられる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムと、Ｃｈｏｔｈｉａの位相ループ定義との組合せにより記載されたような、残基２６〜３５を指すことが意図される。
【０１３７】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けによる残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲＬ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲＬ３）に位置する。本開示における使用のための抗体を、当業界で公知の任意の好適な方法を使用して取得することができる。融合タンパク質を含むａＰ２タンパク質、又は該タンパク質を（組換え的若しくは天然に）発現する細胞を使用して、ａＰ２を特異的に認識する抗体を産生させることができる。使用されるａＰ２タンパク質は、完全な生物活性タンパク質又はその断片若しくは誘導体であってもよい。
【０１３８】
宿主を免疫するために使用するためのａＰ２タンパク質又はペプチドを、当業界で周知の方法によって、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から調製するか、又はそれらを天然の生物源から回収することができる。ａＰ２タンパク質は、一部の例では、例えば、親和性タグ若しくは同様のものに融合された、又はその天然の生物学的パートナーと複合体化した、融合タンパク質などのより大きいタンパク質の一部であってもよい。
【０１３９】
ａＰ２タンパク質に対して生成された抗体を、動物の免疫化が必要である場合、周知且つ日常的なプロトコールを使用して、前記タンパク質を動物、好ましくは、非ヒト動物に投与することによって取得することができる。例えば、Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタなどの多くの温血動物を免疫することができる。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが一般的には最も好適である。モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術（Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985）などの当業界で公知の任意の方法により調製することができる。
【０１４０】
また、本発明における使用のための抗体を、例えば、Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７により記載された方法により、特異的抗体の産生のために選択された単一のリンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによって、単一のリンパ球抗体方法を使用して生成することもできる。抗体のためのスクリーニングを、ヒトａＰ２への結合を測定するためのアッセイ及び／又はその天然の受容体へのａＰ２の結合を遮断する能力を測定するためのアッセイを使用して実施することができる。結合アッセイの例は、特に、プレート上に固定された、ヒトａＰ２とヒトＦｃとの融合タンパク質を使用し、融合タンパク質に結合した抗ａＰ２抗体を検出するために二次抗体を用いる、ＥＬＩＳＡである。好適な拮抗及び遮断アッセイの例は、本明細書の実施例に記載される。
【０１４１】
ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、非ヒト種（例えば、ウサギ又はマウス）に由来する１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを有する抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ＣＤＲ全体よりもむしろ、ＣＤＲの特異性決定残基を導入することが必要であるに過ぎないことが理解される（例えば、Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34を参照されたい）。ヒト化抗体は、任意選択で、ＣＤＲが誘導された非ヒト種に由来する１又は複数のフレームワーク残基をさらに含んでもよい。後者は、ドナー残基と呼ばれることが多い。本発明の抗体分子は、好適には、約１０−７Ｍ以上、特にマイクロモル濃度（μＭ）範囲の結合親和性を有する。親和性を、単離された天然若しくは組換えのａＰ２又は好適な融合タンパク質／ポリペプチドを使用して、本明細書の実施例に記載されるＢＩＡｃｏｒｅなどの当業界で公知の任意の好適な方法を使用して測定することができる。本明細書に記載の一実施形態では、本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体の結合親和性は、約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する抗体を含んでもよい。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約１０−４〜１０−６ＭのヒトａＰ２に対するＫＤを有する。一実施形態では、精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体は、約２〜約５μＭのヒトａＰ２に対するＫＤを有する。
【０１４２】
一例では、本発明の抗体は、ＦＡＢＰ５／Ｍａｌ１に結合しない。一例では、本発明の抗体は、その天然の非線状構造コンフォメーションのａＰ２に結合する。
【０１４３】
当業者であれば、本発明の抗体又は抗原結合剤の親和性、並びに結合剤（抗体など）が結合を阻害する程度を、従来の技術、例えば、Scatchard et al. (Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949))により記載されたものを使用して、又はＢＩＡｃｏｒｅなどのシステムを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。表面プラズモン共鳴については、標的分子を固相上に固定し、移動相中のリガンドに曝露し、フローセルに沿って泳動する。固定された標的へのリガンド結合が生じる場合、局所屈折率が変化し、ＳＰＲ角の変化をもたらし、これを、反射光の強度の変化を検出することによってリアルタイムでモニタリングすることができる。ＳＰＲシグナルの変化の速度を分析して、結合反応の結合段階と解離段階に関する見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比は、見かけの平衡定数（親和性）を与える（例えば、Wolff et al, Cancer Res. 53:2560-65 (1993)を参照されたい）。
【０１４４】
本発明では、試験抗体分子の親和性は、典型的には、以下のようにＳＰＲを使用して決定される。試験抗体分子を固相上に捕捉し、ヒトａＰ２を移動相中の捕捉抗体上で泳動し、ヒトａＰ２に対する試験抗体分子の親和性を決定する。試験抗体分子を、任意の適切な方法を使用して、例えば、抗Ｆｃ又は抗Ｆａｂ’特異的捕捉剤を使用して固相チップ表面上に捕捉することができる。一例では、親和性は、ｐＨ６で決定される。一例では、親和性は、ｐＨ７．４で決定される。
【０１４５】
本発明により提供される抗体の親和性を、当業界で公知の任意の好適な方法を使用して変化させることができることが理解される。したがって、本発明はまた、ａＰ２に対する親和性が改善された、本発明の抗体分子のバリアントにも関する。また、本明細書にさらに記載されるように、ＫＤを少なくとも約１０−７Ｍ以上に低下させるための高親和性抗ヒトａＰ２抗体の改変も企図される。そのようなバリアントを、ＣＤＲの突然変異（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌の突然変異株の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャッフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）及びセクシャルＰＣＲ（Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含むいくつかの親和性成熟プロトコールにより取得することができる。Vaughan et al. (supra)は、これらの親和性成熟の方法を考察している。
【０１４６】
ＣＤＲ領域
本発明の一態様では、抗体が少なくとも１つ、又は１つより多い表３に提供されるＣＤＲ領域を含むその天然のコンフォメーションのａＰ２タンパク質に結合する、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤が提供される。
【表３】
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【０１４７】
一態様では、可変ドメインが、ＣＤＲＬ１（ＱＡＳＥＤＩＳＲＹＬＶ）（配列番号７）、ＣＤＲＬ１バリアント１（ＳＶＳＳＳＩＳＳＳＮＬＨ）（配列番号５９７）、ＣＤＲＬ２（ＫＡＳＴＬＡＳ）（配列番号８）、ＣＤＲＬ２バリアント１（ＧＴＳＮＬＡＳ）（配列番号５９８）、ＣＤＲＬ３（ＱＣＴＹＧＴＹＡＧＳＦＦＹＳ）（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（ＱＡＴＹＧＴＹＡＧＳＦＦＹＳ）（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（ＱＱＴＹＧＴＹＡＧＳＦＦＹＳ）（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（ＱＨＴＹＧＴＹＡＧＳＦＦＹＳ）（配列番号１２）、ＣＤＲＬ３バリアント４（ＱＱＡＳＨＹＰＬＴ）（配列番号１３）、又はＣＤＲＬ３バリアント５（ＱＱＷＳＨＹＰＬＴ）（配列番号５９９）から独立に選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む、軽鎖を含む精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合断片が提供される。一実施形態では、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、及びＣＤＲＬ３（配列番号９）を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合剤が本明細書で提供される。一実施形態では、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、及びＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合剤が本明細書で提供される。一実施形態では、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、及びＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合剤が本明細書で提供される。一実施形態では、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、及びＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合剤が本明細書で提供される。
【０１４８】
一実施形態では、抗体が約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する、ＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合剤が本明細書で提供される。一実施形態では、ＣＤＲＬ１バリアント１（配列番号５９７）、ＣＤＲＬ２バリアント１（配列番号５９８）、及びＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合剤が本明細書で提供される。一実施形態では、ＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＨＲ１バリアント１（ＧＹＴＦＴＳＮＡＩＴ）（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２バリアント２（ＤＩＳＰＧＳＧＳＴＴＮＮＥＫＦＫＳ）（配列番号１８）、及び一実施形態では、ＣＤＲＨ３バリアント２（ＬＲＧＦＹＤＹＦＤＦ）（配列番号２１）を含む重鎖可変領域とを含む抗体又は抗原結合剤が本明細書で提供される。
【０１４９】
一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、ＣＤＲＬ３（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）、及びＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）から選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含み、約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。一実施形態では、上記で同定されたＣＤＲ配列を、ヒト免疫グロブリンフレームワーク中に移植する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、例えば、バーニアゾーン内でさらに改変又は変化させて、移植されたＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。
【０１５０】
一実施形態では、可変ドメインが、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、ＣＤＲＬ３（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）、又はＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％相同であるアミノ酸配列から独立に選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む、軽鎖を含む精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤が提供される。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。一実施形態では、上記で同定されたＣＤＲ配列を、ヒト免疫グロブリンフレームワーク中に移植する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、例えば、バーニアゾーン内でさらに改変又は変化させて、移植されたＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。一実施形態では、可変ドメインが、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、ＣＤＲＬ３（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）、又はＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）と比較して１又は複数（例えば、１、２、３又は４）個のアミノ酸置換、付加、又は欠失を有するアミノ酸配列から独立に選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む、軽鎖を含む精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤が提供される。
【０１５１】
一態様では、可変ドメインが、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、ＣＤＲＬ３（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）、又はＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）から選択される１、２、又は３個のＣＤＲ、及びＣＤＲＨ１（ＧＦＳＬＳＴＹＹＭＳ）（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ１バリアント２（ＧＹＴＦＴＳＮＷＩＴ）（配列番号６００）、ＣＤＲＨ２（ＩＩＹＰＳＧＳＴＹＣＡＳＷＡＫＧ）（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（ＩＩＹＰＳＧＳＴＹＳＡＳＷＡＫＧ）（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＲＨ２バリアント３（ＤＩＹＰＧＳＧＳＴＴＮＮＥＫＦＫＳ）（配列番号６０１）、ＣＤＨＲ３（ＰＤＮＤＧＴＳＧＹＬＳＧＦＧＬ）（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（ＰＤＮＥＧＴＳＧＹＬＳＧＦＧＬ）（配列番号２０）、ＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）、又はＣＤＲＨ３バリアント３（ＬＲＧＹＹＤＹＦＤＦＷ）（配列番号６０２）から選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む軽鎖を含む精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤が提供される。一実施形態では、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、及びＣＤＲＨ３バリアント３（配列番号６０２）を含む重鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合剤が本明細書で提供される。一実施形態では、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、及びＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）を含む重鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合剤が本明細書で提供される。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。一実施形態では、上記で同定されたＣＤＲ配列を、ヒト免疫グロブリンフレームワーク中に移植する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、例えば、バーニアゾーン内でさらに改変又は変化させて、移植されたＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。
【０１５２】
一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＨＲ３（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、又はＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）から選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含み、約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲ  ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、及びＣＤＨＲ３（配列番号１９）を含む。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲ  ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、及びＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）を含む。一実施形態では、抗体は、ＣＤＲ  ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）及びＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）を含む。一実施形態では、抗体は、ＣＤＲ  ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、及びＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、及びＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）を含む。一実施形態では、上記で同定されたＣＤＲ配列を、ヒト免疫グロブリンフレームワーク中に移植する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、例えば、バーニアゾーン内でさらに改変又は変化させて、移植されたＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＨＲ３（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、又はＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）と比較して、１又は複数（例えば、１、２、３又は４）個のアミノ酸置換、付加、又は欠失を有するアミノ酸配列から選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む。
【０１５３】
一実施形態では、可変ドメインが、ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＨＲ３（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、又はＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％相同であるアミノ酸配列から選択される１、２、又は３個のＣＤＲを含む、重鎖を含む精製された抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤が提供される。一実施形態では、抗体又は抗原結合剤は、約１０−７Ｍ以上のＫＤを有する。一実施形態では、上記で同定されたＣＤＲ配列を、ヒト免疫グロブリンフレームワーク中に移植する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンフレームワークを、例えば、バーニアゾーン内でさらに改変又は変化させて、移植されたＣＤＲ領域の結合親和性特異性を維持する。
【０１５４】
以下にさらに記載されるように、ＣＤＲを変化させるか、又は改変して、改善された結合親和性を提供し、異なる骨格中に移植された場合の結合親和性の喪失を最小化するか、又はＣＤＲとハイブリッドフレームワークとの望ましくない相互作用を減少させることができる。
【０１５５】
ヒト化抗体及び抗原結合剤
本発明の一態様では、ヒト化抗ａＰ２モノクローナル抗体及び抗原結合剤が本明細書で提供される。ヒト化抗体は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワーク中に移植されたドナー抗体（例えば、マウス又はウサギモノクローナル抗体などの非ヒト抗体）に由来する１又は複数のＣＤＲ（必要に応じて、１又は複数の改変されたＣＤＲを含む）を含有する抗体である。概説については、Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998を参照されたい。
【０１５６】
一実施形態では、導入されるＣＤＲ全体よりもむしろ、本明細書に上記されたＣＤＲのいずれか１つに由来する１又は複数の特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに導入する（例えば、Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34を参照されたい）。一実施形態では、１又は複数の本明細書に記載のＣＤＲに由来する特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに導入する。別の実施形態では、本明細書に記載のそれぞれのＣＤＲに由来する特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに導入する。
【０１５７】
ＣＤＲ又は特異性決定残基を移植する場合、マウス、ウサギ、霊長類及びヒトフレームワーク領域などの、ＣＤＲが誘導されるドナー抗体のクラス／型を考慮した任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用することができる。
【０１５８】
好適には、本発明によるヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域並びに本明細書に具体的に提供される１又は複数のＣＤＲを含む可変ドメインを有する。かくして、一実施形態では、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域と非ヒトドナーＣＤＲとを含む、ヒトａＰ２に結合するヒト化モノクローナル抗体が提供される。
【０１５９】
ＣＤＲ移植抗体の構築は、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲを、長いオリゴヌクレオチドを使用する部位特異的突然変異誘発によってヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域上に移植する方法を開示し、本明細書に組み込まれる欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２３９４００に一般的に記載されている。ＣＤＲは、抗体の抗原結合特異性を決定し、可変ドメインのフレームワーク領域上に担持された相対的に短いペプチド配列である。
【０１６０】
ＣＤＲ移植によるモノクローナル抗体のヒト化に関する最も早い研究は、ＮＰなどの合成抗原を認識するモノクローナル抗体に関して実行された。しかしながら、リゾチームを認識するマウスモノクローナル抗体及びヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットモノクローナル抗体をＣＤＲ移植によりヒト化した例は、それぞれ、Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988)及びRiechmann et al (Nature, 332, 323-324, 1988)により記載されている。抗体のヒト化は、マウス、ラット、ヤギ、又はウサギ抗体などの非ヒト抗体のＣＤＲを、「類似する」ヒトフレームワーク（アクセプター）上に移植すること、及びドナーモノクローナル抗体から手動で選択され、ヒトアクセプターフレームワーク中に組み込まれる最小数の重要フレームワーク残基（復帰突然変異）を選択して、元のＣＤＲコンフォメーションを維持することにより達成される。そのような方法は、当業界で公知であり、Jones et al., Nature 321:522 (1986)；Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)、Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)、Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992)；Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)、Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)；Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)；Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６、ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６、ＥＰ２３９４００、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，７２３，３２３号、第５，９７６，８６２号、第５，８２４，５１４号、第５，８１７，４８３号、第５，８１４，４７６号、第５，７６３，１９２号、第５，７２３，３２３号、第５，７６６，８８６号、第５，７１４，３５２号、第６，２０４，０２３号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，２２５，５３９号、第４，８１６，５６７号（本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。
【０１６１】
ヒト可変重鎖及び軽鎖生殖系列サブファミリー分類を、Ｋａｂａｔの生殖系列サブグループ指定から誘導することができる：特定のＶＨ配列についてはＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６若しくはＶＨ７並びにフレームワーク４に関する特定の可変重鎖連結基については、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、及びＪＨ６；フレームワーク１、２及び３に関する特定のＶＬカッパ配列についてはＶＫ１、ＶＫ２、ＶＫ３、ＶＫ４、ＶＫ５若しくはＶＫ６、並びにフレームワーク４に関する特定のカッパ連結基についてはＪＫ１、ＪＫ２、ＪＫ３、ＪＫ４、若しくはＪＫ５；又はフレームワーク１、２及び３に関する特定のＶＬラムダ配列についてはＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、若しくはＶＬ１０、並びにフレームワーク４に関する特定のラムダ連結基については、ＪＬ１、ＪＬ２、ＪＬ３、若しくはＪＬ７。
【０１６２】
一実施形態では、本明細書で企図される軽鎖の一般的なフレームワークは、ＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４及びＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４−ＣＬ、及びその変形から選択される構造を含み、ここで、ＣＤＲ領域は、配列番号７〜１３から選択される少なくとも１つの可変軽鎖ＣＤＲから選択され、フレームワーク領域は、例えば、表４（配列番号２５〜１４９）に提供される免疫グロブリンカッパ軽鎖可変フレームワーク領域、又は例えば、表５（配列番号１５０〜２４６）に提供される免疫グロブリンラムダ軽鎖可変フレームワーク領域のいずれかから選択され、免疫グロブリン軽鎖定常領域は、フレームワーク領域がカッパ軽鎖可変フレームワーク領域である場合はカッパ軽鎖定常領域（配列番号２４７）に由来するか、又はフレームワーク領域がラムダ軽鎖可変フレームワーク領域である場合はラムダ軽鎖定常領域（配列番号２４８）に由来する。
【０１６３】
一実施形態では、本明細書で企図される重鎖領域の一般的なフレームワークは、ＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４、ＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１、ＩｇＧ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ免疫グロブリンクラスについてはＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＤＨ２並びにＩｇＭ及びＩｇＥ免疫グロブリンクラスについてはＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１−ＣＨ２、ＩｇＧ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ免疫グロブリンクラスについてはＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ＩｇＭ及びＩｇＥ免疫グロブリンクラスについてはＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、並びにＩｇＭ及びＩｇＥ免疫グロブリンクラスについてはＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４、並びにその変形から選択される構造を含み、ここで、ＣＤＲ領域は、配列番号１４〜２１から選択される少なくとも１つの可変重鎖ＣＤＲから選択され、フレームワーク領域は、表７（配列番号２４９〜４０７）に記載の重鎖可変フレームワーク領域から選択され、重鎖定常領域は、例えば、表８（配列番号４０８〜４４３）に提供されるものから選択される。ＩｇＡ及びＩｇＭクラスは、それぞれ、ＩｇＭ又はＩｇＡの２つのモノマー単位を一緒に連結するように働く、表９に提供される連結ポリペプチド（配列番号４４４）をさらに含んでもよい。ＩｇＭの場合、Ｊ鎖連結ダイマーは、ＩｇＭペプタマーのための核形成単位であり、ＩｇＡの場合、それはより大きいポリマーを誘導する。
【０１６４】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提唱された機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特定の実施形態では、特に、抗体分子が治療的使用を意図され、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用することができる。或いは、抗体分子が治療目的を意図され、抗体エフェクター機能が必要でない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常領域ドメインの配列バリアントを使用することもできることが理解される。例えば、２４１位のセリンを、Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108に記載されたようにプロリンに変化させたＩｇＧ４分子を使用することができる。また、当業者であれば、抗体が様々な翻訳後改変を受けてもよいことを理解できる。これらの改変の型及び程度は、抗体を発現させるために使用される宿主細胞系並びに培養条件に依存することが多い。そのような改変は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化の変化を含んでもよい。よくある改変は、カルボキシペプチダーゼの作用に起因する、カルボキシ末端塩基性残基（リシン又はアルギニンなど）の喪失である（Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995に記載されている）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リシンは存在しなくてもよい。
【０１６５】
一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、ＣＤＲが、それぞれ、ヒト軽鎖又は重鎖可変フレームワーク中に移植された、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、ＣＤＲＬ３（配列番号９）若しくはＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）、及びＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ、並びに／又はＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＲＨ３（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、若しくはＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ、又はその組合せ若しくはバリアントを含む。
【０１６６】
一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、ヒトアクセプター軽鎖フレームワーク中に移植された、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、ＣＤＲＬ３（配列番号９）、ＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）、ＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）、及びＣＤＲＬ３バリアント４（配列番号１３）から選択される１、２、又は３つの軽鎖ＣＤＲ、又はその組合せ若しくはバリアントを含む。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、ヒトアクセプター軽鎖フレームワーク中に移植された、ＣＤＲＬ１（配列番号７）、ＣＤＲＬ２（配列番号８）、及びＣＤＲＬ３（配列番号９）若しくはＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０）若しくはＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１）若しくはＣＤＲＬ３バリアント３（配列番号１２）を含む可変軽鎖、又はその組合せ若しくはバリアントを含む。一実施形態では、ヒトアクセプター軽鎖フレームワークは、フレームワーク１、２、及び３についてはヒトＩＧＫＶ（ＶＬカッパ）遺伝子、並びにフレームワーク４についてはＩＧＫＪ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に由来する。一実施形態では、ヒトアクセプター軽鎖フレームワークは、フレームワーク１、２、及び３についてはヒトＩＧＬＶ（ＶＬラムダ）、並びにフレームワーク４についてはＩＧＬＪ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に由来する。ヒト軽鎖ＩＧＫＶ及びＩＧＫＪアクセプターフレームワーク領域の非限定例は、例えば、表４に提供され、ヒト軽鎖ＩＧＬＶ及びＩＧＬＪアクセプターフレームワーク領域の非限定例は、例えば、表５に提供される。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【０１６７】
本発明における使用のための免疫グロブリン定常軽鎖領域は、ＣＤＲが移植される可変軽鎖によって決定される。例えば、可変軽鎖ＦＲ領域が免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域に由来する場合、免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域（ＩＧＫＣ）に由来する定常軽鎖領域を使用して、軽鎖ＶＬ−ＣＬ鎖を産生することができる。本発明において使用することができるＩＧＫＣは、以下の表６中の配列番号２４７を含む。逆に、フレームワーク領域が免疫グロブリンラムダ軽鎖可変領域である場合、免疫グロブリンラムダ軽鎖定常領域（ＩＧＬＣ）を使用して、ラムダＶＬ−ＣＬ軽鎖を産生することができる。本発明において使用することができる免疫グロブリンラムダ軽鎖定常領域は、以下の表６の（配列番号２４８）、及びその対立遺伝子バリアントを含み、例えば、ＩＧＫＣバリアントについてはＯＭＩＭ登録番号１４７２００及びＩＧＬＣバリアントについては１４７２２０に同定されたように、当業界で一般に公知である。
【表６】
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【０１６８】
一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、ヒトアクセプター重鎖フレームワーク中に移植された、ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、ＣＤＲＨ３（配列番号１９）、ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、ＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ、又はその組合せ若しくはバリアントを有する。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、ヒトアクセプター重鎖フレームワーク中に移植された、ＣＤＲ  ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ２（配列番号１６）、ＣＤＲＨ３（配列番号１９）、又はそのバリアントを含む。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、ヒトアクセプター重鎖フレームワーク中に移植された、ＣＤＲ  ＣＤＲＨ１（配列番号１４）、ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７）、若しくはＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０）、又はそのバリアントを含む。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、ヒトアクセプター重鎖フレームワーク中に移植された、ＣＤＲ  ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）及びＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、又はそのバリアントを含む。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体は、ヒトアクセプター重鎖フレームワーク中に移植された、ＣＤＲ  ＣＤＲＨ１バリアント１（配列番号１５）、ＣＤＲＨ２バリアント２（配列番号１８）、若しくはＣＤＲＨ３バリアント２（配列番号２１）、又はそのバリアントを含む。一実施形態では、ヒトアクセプター重鎖フレームワークは、フレームワーク１、２、及び３についてはヒトＩＧＨＶ遺伝子、及びフレームワーク４についてはＩＧＨＪ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に由来する。ヒト重鎖ＩＧＨＶ及びＩＧＨＪアクセプターフレームワーク領域の非限定例は、例えば、表７に提供される。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【０１６９】
本発明における使用のための免疫グロブリン重鎖定常領域は、所望の免疫グロブリンクラスに関する決定因子である。全てのクラスの免疫グロブリン−ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥが本明細書で企図される。例えば、所望の免疫グロブリンがＩｇＧである場合、ＩｇＧ重鎖定常領域（ＩＧＧＨ）をコードするアミノ酸配列を使用することができる。本発明において使用することができる免疫グロブリン重鎖定常領域としては、以下の表８に提供されるＩＧＧＨ、ＩＧＤＨ、ＩＧＡＨ、ＩＧＭＨ、及びＩＧＥＨ（配列番号４０８〜４４３）のもの、並びに例えば、ＩＧＧＨ１バリアントについては、ＯＭＩＭ登録番号１４７１００、ＩＧＧＨ２バリアントについては１４７１１０、ＩＧＧＨ３バリアントについては１４７１２０、ＩＧＧＨ４バリアントについては１４７１３０、ＩＧＡＨ１バリアントについては１４６９００、ＩＧＡＨ２バリアントについては１４７０００、ＩＧＥＨバリアントについては１４７１８０、ＩＧＭＨバリアントについては１４７０２０、ＩＧＤＨバリアントについては１４７１７０（全て参照により本明細書に組み込まれる）として同定された、当業界で一般的に公知であるその対立遺伝子バリアントが挙げられる。ある特定の実施形態では、特定の免疫グロブリンクラスのヒンジ領域を、本明細書で企図される抗体の構築において使用することができる。一実施形態では、ヒンジ領域を、表８に記載の天然のヒンジ領域アミノ酸配列（配列番号４０９、４１３、４１７、４２５、４２９、４３３、及び４３７）、又はそのバリアントから誘導することができる。一実施形態では、ヒンジ領域を、合成的に生成することができる。一実施形態では、表９に記載の連結ポリペプチド、又はそのバリアントと複合体化することができる、免疫グロブリンクラスＩｇＡ及びＩｇＭの抗体も、本明細書でさらに企図される。
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表９】
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【０１７０】
ＣＤＲ及びヒトフレームワークの改変
Riechmann et al.,は、ＣＤＲのみの導入（Kabat (Kabat et al. (supra)及びWu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)により定義される）が、ＣＤＲ移植産物における満足のいく抗原結合活性を提供するには十分なものではないことを見出した。いくつかのフレームワーク残基がドナーフレームワーク領域のものと一致するように、それらを変化させる必要があることがわかった。どのフレームワーク残基を変化させる必要があるかを選択するための提唱された基準は、本明細書に組み込まれる国際特許出願ＷＯ９０／０７８６１に記載されている。
【０１７１】
ヒト可変ドメインフレームワーク中での非ヒトＣＤＲの置換は、ヒト可変ドメインフレームワークが、ＣＤＲが起源とする非ヒト可変フレームワークと同じか、又は類似するコンフォメーションを採用する場合、ＣＤＲの正確な空間的方向の保持をもたらす可能性が最も高い。これは、フレームワーク配列が、ＣＤＲが誘導された非ヒト可変フレームワークドメインと高い程度の配列同一性を示すヒト抗体からヒト可変ドメインを取得することによって達成される。上記のように、重鎖及び軽鎖可変フレームワーク領域を、同じか、又は異なるヒト抗体配列から誘導することができる。ヒト抗体配列は、天然のヒト抗体の配列であってもよいか、又はいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってもよい。Kettleborough et al, Protein Engineering 4:773 (1991)；Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993)及びCarter et al,ＷＯ９２／２２６５３を参照されたい。
【０１７２】
非ヒトドナー免疫グロブリン及び適切なヒトアクセプター免疫グロブリンの相補性決定領域を同定したら、次のステップは、もしあれば、これらの成分に由来する残基を置換して、得られるヒト化抗体の特性を最適化するべきかどうかを決定することである。一般に、非ヒト残基の導入は、抗体がヒトにおいてヒト抗ドナー抗体（ＨＡＤＡ）応答を惹起するリスクを増大させるため、ヒトアミノ酸残基の、非ヒトアミノ酸残基による置換を最小化するべきである。免疫応答を決定する当業界で認識された方法を実施して、特定の宿主において、又は臨床試験中にＨＡＤＡ応答をモニタリングすることができる。宿主に投与されるヒト化抗体に、前記療法の投与の開始時に、及びそれを通して、免疫原性評価を与えることができる。ＨＡＤＡ応答は、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）及び／又は固相ＥＬＩＳＡ分析などの、当業者には公知の方法を使用して、宿主に由来する血清試料中で、ヒト化治療試薬に対する抗体を検出することによって測定される。
【０１７３】
置換のためのアミノ酸残基の選択は、部分的には、コンピュータモデリングにより決定される。免疫グロブリン分子の三次元画像を作製するためのコンピュータハードウェア及びソフトウェアが、本明細書に記載される。一般的には、免疫グロブリン鎖又はそのドメインに関する分解された構造から出発して、分子モデルが作製される。モデル化される鎖を、分解された三次元構造の鎖又はドメインとのアミノ酸配列類似性について比較し、最も高い配列類似性を示す鎖又はドメインを、分子モデルの構築のための出発点として選択する。少なくとも５０％の配列同一性を有する鎖又はドメインを、モデリングのために選択し、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％以上の配列同一性を有するものを、モデリングのために選択する。分解された出発構造を改変して、モデル化される免疫グロブリン鎖又はドメイン中の実際のアミノ酸と、出発構造中のものとの差異を可能にする。次いで、改変された構造を、複合免疫グロブリンに集合させる。最後に、エネルギー最小化によって、また、全ての原子が互いに適切な距離にあり、結合の長さ及び角度が化学的に許容される限界内にあることを検証することにより、モデルを精緻化する。
【０１７４】
置換のためのアミノ酸残基の選択を、部分的には、特定の位置のアミノ酸の特徴の検査、又は特定のアミノ酸の置換若しくは突然変異誘発の効果の経験的観察によって決定することもできる。例えば、アミノ酸が、ドナー可変領域フレームワーク残基と、選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合、アミノ酸が、
（１）抗原に直接的に非共有結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）そうでなければＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、コンピュータモデリングにより決定された場合にＣＤＲ領域の約３〜６オングストローム以内にある）、又は
（４）ＶＬ−ＶＨ接触面に参加する、
ことが合理的に予想される場合、通常、ヒトフレームワークアミノ酸を、ドナー抗体に由来する等価なフレームワークアミノ酸で置換すべきである。
【０１７５】
「抗原に直接的に非共有結合する」残基としては、例えば、水素結合、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ力、疎水性相互作用などにより、確立された化学力に従って抗原上のアミノ酸と直接的に相互作用する高い確率を有するフレームワーク領域中の位置にあるアミノ酸が挙げられる。ＣＤＲ及びフレームワーク領域は、Kabat et al.又はChothia et al., supraによって定義された通りである。Kabat et al., supraによって定義されたフレームワーク残基が、Chothia et al., supraによって定義された構造ループ残基を構成する場合、ドナー抗体中に存在するアミノ酸を、ヒト化抗体中での置換のために選択することができる。「ＣＤＲ領域に隣接する」残基としては、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列中の１又は複数のＣＤＲに直接隣接する位置、例えば、Ｋａｂａｔにより定義されたＣＤＲ、又はＣｈｏｔｈｉａにより定義されたＣＤＲ（例えば、Chothia and Lesk 1MB 196:901 (1987)を参照されたい）に直接隣接する位置のアミノ酸残基が挙げられる。これらのアミノ酸は、特に、ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用する、アクセプターから選択される場合、ドナーＣＤＲを変形させ、親和性を低下させる可能性が高い。さらに、隣接するアミノ酸は、抗原と直接相互作用することができ（参照により本明細書に組み込まれるAmit et al, Science, 233:747 (1986)）、ドナーからのこれらのアミノ酸の選択は、元の抗体における親和性を提供する全ての抗原接触を保持するのが望ましい。
【０１７６】
「そうでなければＣＤＲ領域と相互作用する」残基としては、ＣＤＲ領域に影響するのに十分な空間的方向にあると二次構造分析によって決定されるものが挙げられる。一実施形態では、「そうでなければＣＤＲ領域と相互作用する」残基は、ドナー免疫グロブリンの三次元モデル（例えば、コンピュータにより生成されたモデル）を分析することにより同定される。典型的には、元のドナー抗体の三次元モデルは、ＣＤＲの外側のある特定のアミノ酸がＣＤＲに近く、水素結合、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ力、疎水性相互作用などによりＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用する高い確率を有することを示す。これらのアミノ酸位置で、アクセプター免疫グロブリンアミノ酸よりもむしろ、ドナー免疫グロブリンアミノ酸を選択することができる。この基準によるアミノ酸は、一般的には、ＣＤＲ中のいくつかの原子の約３オングストローム単位（Ａ）以内に側鎖原子を有し、上記に列挙されたものなどの、確立された化学力に従ってＣＤＲ原子と相互作用し得る原子を含有しなければならない。水素結合を形成し得る原子の場合、３Åはその核の間で測定されるが、結合を形成しない原子については、３ÅはそのＶａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ表面間で測定される。したがって、後者の場合、核は、相互作用することができると考えられる原子については、約６Å（３Å＋Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ半径の和）以内になければならない。多くの場合、核は、４又は５〜６Å間隔である。アミノ酸がＣＤＲと相互作用することができるかどうかを決定する際に、構造の観点から、重鎖ＣＤＲ２の最後の８アミノ酸はフレームワークの一部としてより多く振る舞うため、これらの８アミノ酸をＣＤＲの一部として考慮しないことが好ましい。
【０１７７】
ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用することができるアミノ酸を、さらに別の方法で同定することができる。それぞれのフレームワークアミノ酸の溶媒接近表面積を、２つの方法：（１）無傷抗体中、及び（２）そのＣＤＲが除去された抗体からなる仮説的分子中で算出する。約１０平方オングストローム以上のこれらの数の間の有意差は、溶媒へのフレームワークアミノ酸の接近が、ＣＤＲによって少なくとも部分的に遮断され、したがって、アミノ酸がＣＤＲとの接触を作っていることを示す。アミノ酸の溶媒接近表面積を、当業界で公知のアルゴリズム（例えば、Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983)及びLee and Richards, J. Mol. Biol. 55:379 (1971)（両方とも参照により本明細書に組み込まれる））を使用して、抗体の三次元モデルに基づいて算出することができる。また、フレームワークアミノ酸は、別のフレームワークアミノ酸のコンフォメーションに影響し、次いで、ＣＤＲと接触することにより、ＣＤＲと間接的に時々相互作用してもよい。
【０１７８】
フレームワーク中のいくつかの位置の特定のアミノ酸は、多くの抗体中のＣＤＲと相互作用することが知られている（Chothia and Lesk, supra、Chothia et al., supra及びTramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175 (1990)、全て参照により本明細書に組み込まれる）。注目すべきことに、軽鎖の２、４８、６５、及び７１位並びに重鎖の７１及び９４位のアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）は、多くの抗体中のＣＤＲと相互作用することができることが知られている。軽鎖中の３５位並びに重鎖中の９３及び１０３位のアミノ酸も、ＣＤＲと相互作用する可能性が高い。これらの番号付けられた位置の全てにおいては、ヒト化免疫グロブリン中にあるアクセプターアミノ酸よりもむしろ、ドナーアミノ酸の選択（それらが異なる場合）が好ましい。他方、軽鎖の最初の５アミノ酸などの、ＣＤＲ領域と相互作用することができるある特定の残基を、ヒト化免疫グロブリンにおける親和性を喪失することなく、アクセプター免疫グロブリンから選択することができることもある。
【０１７９】
一実施形態では、配列番号７〜１３から選択される少なくとも１個の軽鎖ＣＤＲ、配列番号１４〜２１から選択される少なくとも１個の重鎖ＣＤＲ、及び置換がドナー残基に由来する、ヒトアクセプターフレームワーク内の少なくとも１個の置換を含む、ａＰ２に対するヒト化抗体が提供される。
【０１８０】
一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの２３、６７、７１、７２、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８８、８９、９１、９３及び９４位のうちの１個にある残基（Ｋａｂａｔ番号付け）がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される。一実施形態では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの２３、６７、７１、７２、７３、７４、７７、７８、７９、８９、及び９１位のうちの１個にある残基（Ｋａｂａｔ番号付け）がドナー残基である。一実施形態では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの２３、６７、７１、７２、７３、７４、７７、７８、７９、８８、８９、９１、９３、及び９４位のうちの１個にある残基（Ｋａｂａｔ番号付け）がドナー残基であるが、任意選択で（任意の順列で）２３、６７、７１、７２、７３、７４、７７、７８、７９、８８、８９、９１、９３及び９４位の１又は複数の残基がヒトアクセプター配列を使用してもよい。例えば、配列番号４５５、４５７、４５９、４６１、及び４６３に与えられる配列を参照されたい。
【０１８１】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基１は、代替アミノ酸、例えば、グルタミン酸と置き換えられる。
【０１８２】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基２３は、代替アミノ酸、例えば、トレオニンと置き換えられる。
【０１８３】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖の残基２３は、アラニンである。
【０１８４】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基６７は、代替アミノ酸、例えば、フェニルアラニンと置き換えられる。
【０１８５】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基６７は、バリンである。
【０１８６】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７１は、代替アミノ酸、例えば、リシンと置き換えられる。
【０１８７】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７１は、バリンである。
【０１８８】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７２は、代替アミノ酸、例えば、アラニンと置き換えられる。
【０１８９】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７２は、アスパラギン酸である。
【０１９０】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７３は、代替アミノ酸、例えば、セリンと置き換えられる。
【０１９１】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７３は、リシンである。
【０１９２】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７４は、代替アミノ酸、例えば、トレオニンと置き換えられる。
【０１９３】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７４は、セリンである。
【０１９４】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７７は、代替アミノ酸、例えば、トレオニンと置き換えられる。
【０１９５】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７７は、グルタミンである。
【０１９６】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７８は、代替アミノ酸、例えば、バリンと置き換えられる。
【０１９７】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７８は、フェニルアラニンである。
【０１９８】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７９は、代替アミノ酸、例えば、アスパラギン酸と置き換えられる。
【０１９９】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基７９は、セリンである。
【０２００】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基８９は、代替アミノ酸、例えば、トレオニンと置き換えられる。
【０２０１】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基８９は、バリンである。
【０２０２】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基９１は、代替アミノ酸、例えば、フェニルアラニンと置き換えられる。
【０２０３】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、重鎖可変ドメインの残基９１は、チロシンである。
【０２０４】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１７、及び配列番号１９又は配列番号２０であり、残基２３はアラニンであり、残基６７はバリンであり、残基７１はバリンであり、残基７２はアスパラギン酸であり、残基７３はリシンであり、残基７４はセリンであり、残基７７はグルタミンであり、残基７８はフェニルアラニンであり、残基７９はセリンであり、残基８９はバリンであり、残基９１はチロシンである。
【０２０５】
したがって、一例では、少なくとも、軽鎖の可変ドメインの２、３、３６、３７、５８、６３、又は７０位のうちの１個の残基（Ｋａｂａｔ番号付け）がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される。一実施形態では、少なくとも、軽鎖の可変ドメインの２、３、６３、又は７０位のうちの１個の残基（Ｋａｂａｔ番号付け）がドナー残基である。例えば、配列番号４４６、４４８、４５０、及び４５２に与えられる配列を参照されたい。
【０２０６】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２であり、軽鎖可変ドメインの残基２は、代替アミノ酸、例えば、バリンと置き換えられる。
【０２０７】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２であり、軽鎖可変ドメインの残基２は、イソロイシンである。
【０２０８】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２であり、軽鎖可変ドメインの残基３は、代替アミノ酸、例えば、バリンと置き換えられる。
【０２０９】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２であり、軽鎖可変ドメインの残基３は、グルタミンである。
【０２１０】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２であり、軽鎖可変ドメインの残基６３は、代替アミノ酸、例えば、リシンと置き換えられる。
【０２１１】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２であり、軽鎖可変ドメインの残基６３は、セリンである。
【０２１２】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２であり、軽鎖可変ドメインの残基７０は、代替アミノ酸、例えば、アスパラギン酸と置き換えられる。
【０２１３】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２であり、軽鎖可変ドメインの残基７０は、グルタミン酸である。
【０２１４】
一実施形態では、ＣＤＲは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２であり、残基２はイソロイシンであり、残基３はグルタミンであり、残基６３はセリンであり、残基７０はグルタミン酸である。
【０２１５】
「ＶＬ−ＶＨ接触面に参加する」残基又は「パッキング残基」は、例えば、Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985)又はChothia et al, supraにより定義された、ＶＬとＶＨの間の接触面にある残基を含む。一般に、非通常パッキング残基を、それらがヒトフレームワーク中のものと異なる場合、ヒト化抗体中で保持するべきである。
【０２１６】
一般に、上記基準を満たす１又は複数のアミノ酸が置換される。いくつかの実施形態では、上記基準を満たす全部又は多くのアミノ酸が置換される。時には、特定のアミノ酸が上記基準を満たすかどうかに関するいくらかの曖昧さが存在し、そのうちの一方はその特定の置換を有し、他方は有さない、代替的なバリアント免疫グロブリンが産生される。そのように産生された代替的なバリアント免疫グロブリンを、所望の活性について本明細書に記載のアッセイのいずれかにおいて試験し、好ましい免疫グロブリンを選択することができる。
【０２１７】
通常、ヒト化抗体中のＣＤＲ領域は、ドナー抗体の対応するＣＤＲ領域と実質的に同一であり、より通常は、同一である。通常は望ましくないが、得られるヒト化免疫グロブリンの結合親和性に感知できるほどに影響することなく、ＣＤＲ残基の１又は複数の保存的アミノ酸置換を作製することができることもある。保存的置換又は類似置換により、例えば、イソロイシン又はバリンに置換されるロイシンなどの、組合せが意図される。互いに頻繁に置換することができる他のアミノ酸としては、限定されるものではないが、
フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が挙げられる。
【０２１８】
置換のためのさらなる候補は、その位置でのヒト免疫グロブリンにとって非通常であるか、又は「稀」であるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸を、ドナー抗体の等価な位置に由来する、又はより典型的なヒト免疫グロブリンの等価な位置に由来するアミノ酸で置換することができる。例えば、アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸がヒト免疫グロブリン配列中のその位置について稀であり、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がその位置にとって一般的である場合；又はアクセプター免疫グロブリン中のアミノ酸が、他のヒト配列と比較して、その位置について稀であり、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸も稀である場合、置換が望ましい。これらの基準は、ヒトフレームワーク中の非典型的なアミノ酸が抗体構造を破壊しないことを確保するのに役立つ。さらに、非通常のヒトアクセプターアミノ酸を、ヒト抗体にとって期せずして典型的であるドナー抗体に由来するアミノ酸で置き換えることにより、ヒト化抗体の免疫原性を低下させることができる。
【０２１９】
本明細書で使用される用語「稀な」とは、配列の代表的なサンプルにおいて約２０％未満であるが、通常は、約１０％未満でその位置に存在するアミノ酸を示し、本明細書で使用される用語「一般的な」とは、代表的なサンプルにおいて配列の約２５％より多くであるが、通常は約５０％より多く存在するアミノ酸を示す。例えば、全てのヒト軽鎖及び重鎖可変領域配列は、互いに特に相同であり、ある特定の重要な位置に同じアミノ酸を有する配列の「サブグループ」にそれぞれグループ化される（Kabat et al, supra）。ヒトアクセプター配列中のアミノ酸がヒト配列間で「稀」であるか、又は「一般的」であるかどうかを決定する場合、アクセプター配列と同じサブグループ中のヒト配列のみを考慮することが好ましいことが多い。
【０２２０】
置換のためのさらなる候補は、Chothia et al., supraにより提唱された代替的な定義の下でＣＤＲ領域の一部として同定されるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。置換のためのさらなる候補は、本明細書及び／又は本明細書に記載の接触定義に記載の配列番号７〜２１のＣＤＲの下でＣＤＲ領域の一部として同定されるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。
【０２２１】
置換のためのさらなる候補は、稀な、又は非通常のドナーフレームワーク残基に対応するアクセプターフレームワーク残基である。稀な、又は非通常のドナーフレームワーク残基は、その位置でドナー抗体にとって稀であるか、又は非通常である（本明細書に定義される）ものである。ドナー抗体について、Ｋａｂａｔに従ってサブグループを決定し、コンセンサスと異なる残基位置を同定することができる。これらのドナー特異的な差異は、活性を増強する、ドナー配列中の体細胞突然変異を指摘し得る。結合に影響すると予測される非通常残基は保持されるが、結合にとって重要ではないと予測される残基を置換することができる。
【０２２２】
置換のためのさらなる候補は、アクセプターフレームワーク領域中に存在する非生殖系列残基である。例えば、アクセプター抗体鎖（すなわち、ドナー抗体鎖との有意な配列同一性を有するヒト抗体鎖）を生殖系列抗体鎖と整列させる場合（同様に、ドナー鎖との有意な配列同一性を有する）、アクセプター鎖フレームワークと生殖系列鎖フレームワークとの間で一致しない残基を、生殖系列配列に由来する対応する残基で置換することができる。
【０２２３】
上記で考察された特定のアミノ酸置換以外に、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域は、それらが誘導されたヒト抗体のフレームワーク領域と、通常は実質的に同一であり、より通常は、同一である。勿論、フレームワーク領域中のアミノ酸の多くは、抗体の特異性又は親和性にはほとんど寄与しないか、又は直接寄与しない。かくして、フレームワーク残基の多くの個々の保存的置換を、得られるヒト化免疫グロブリンの特異性又は親和性を感知できるほど変化させることなく許容することができる。かくして、一実施形態では、ヒト化免疫グロブリンの可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列又はそのような配列のコンセンサスに対して少なくとも８５％の配列類似性又は同一性を有する。別の実施形態では、ヒト化免疫グロブリンの可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列又はそのような配列のコンセンサスに対して少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列類似性又は同一性を有する。しかしながら、一般的には、そのような置換は望ましくない。
【０２２４】
本明細書で使用される場合、同一性及び類似性の程度を、例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410；Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272、Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141；Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402；Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２２５】
参照により本明細書に組み込まれるVaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998)を含む、ＣＤＲ移植抗体を考察するいくつかの概説が刊行されている。
【０２２６】
本発明の抗ａＰ２抗体は、例えば、ＷＯ２００７／０２４７１５に開示された分子ＤＶＤ−Ｉｇ、又はＷＯ２０１１／０３０１０７に記載されたいわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃのように、さらなる結合ドメインをさらに含んでもよい。したがって、本明細書に用いられた抗体としては、二価、三価、又は四価完全長抗体が挙げられる。
【０２２７】
抗原結合剤
抗原結合剤としては、一本鎖抗体（すなわち、完全長重鎖及び軽鎖）；Ｆａｂ、改変型Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変型Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、例えば、ＷＯ２００１０９０１９０に記載された単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ−抗原結合剤（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136；Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217を参照されたい）が挙げられる。これらの抗体断片を作出及び製造するための方法は、当業界で周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181を参照されたい）。Ｆａｂ−Ｆｖ形式は、ＷＯ２００９／０４０５６２に初めて開示され、そのジスルフィド安定化型であるＦａｂ−ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０３５０１２に初めて開示された。本発明における使用のための他の抗体断片としては、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’断片が挙げられる。多価抗体は、多特異性、例えば、二特異性を含んでもよく、又は一特異的であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２５８３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。後者の１つのそのような例は、ＷＯ９２／２２５８３に記載されたＴｒｉ−Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。
【０２２８】
典型的なＦａｂ’分子は、重鎖が可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及び天然の、若しくは改変されたヒンジ領域を含み、軽鎖が可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む、重鎖と軽鎖の対を含む。
【０２２９】
一実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２を作出するための本開示によるＦａｂ’のダイマーが提供され、例えば、ダイマー化は、本明細書に記載の天然ヒンジ配列、又はその誘導体、又は合成ヒンジ配列を介するものであってもよい。
【０２３０】
抗体結合ドメインは、一般的には、３個は重鎖に由来し、３個は軽鎖に由来する６個のＣＤＲを含む。一実施形態では、ＣＤＲは、フレームワーク中にあり、一緒になって可変領域を形成する。かくして、一実施形態では、抗原結合剤は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含むａＰ２に特異的な結合ドメインを含む。
【０２３１】
ａＰ２に結合する抗体の能力を有意に変化させることなく、１又は複数（例えば、１、２、３又は４）個のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を、上記又は下記のように、本発明により提供されるＣＤＲ又は他の配列（例えば、可変ドメイン）に対して加えることができることが理解される。当業者であれば、任意のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失の効果を、例えば、本明細書、特に、実施例に記載の方法を使用することによって容易に試験することができる。
【０２３２】
一実施形態では、ａＰ２に対する結合親和性が、約１０−７Ｍ以上の親和性に保持され、増加するか、又は減少するように、本発明により提供される抗体又は断片中で用いられるＣＤＲ又はフレームワーク領域に対して、１又は複数（例えば、１、２、３又は４）個のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を加えることができる。一実施形態では、例えば、約１０−７Ｍ以上まで結合親和性を低下させるために、ＣＤＲ、フレームワーク領域、又はその両方に対して改変を加えた改変されたヒト化抗体が提供される。
【０２３３】
ウサギドナーＣＤＲ／ヒトアクセプターフレームワーク抗ａＰ２モノクローナル抗体
本発明の一態様では、抗ヒトａＰ２タンパク質モノクローナル抗体に由来するＣＤＲを、ヒト軽鎖及び重鎖フレームワーク領域中に移植した、抗ａＰ２ウサギＣＤＲ／マウスフレームワークハイブリッドドナーモノクローナル抗体に由来するヒト化抗ａＰ２モノクローナル抗体が提供される。
【０２３４】
一実施形態では、可変軽鎖Ａｂ９０９ＶＬ（配列番号４４５（以下の表１０及び図２７））は、ヒトフレームワーク中へのその後の移植に使用されるドナー軽鎖配列であり、任意選択で、その後のＣＤＲ及びフレームワーク改変を実施することができる。一実施形態では、配列番号４４５に提供される可変軽鎖に由来する配列番号７、８及び９中に提供されるＣＤＲを、ヒト免疫グロブリンのヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖可変ドメインＩＧＫＶＡ３０−ＪＫ４中に移植し、Ａ３０  ＦＲ１（配列番号４０）−ＣＤＲＬ１（配列番号７）−Ａ３０  ＦＲ２（配列番号４１）−ＣＤＲＬ２（配列番号８）−Ａ３０  ＦＲ３（配列番号４１）−ＣＤＲＬ３（配列番号９）−ＪＫ４（配列番号１４８）を含むヒト化軽鎖可変領域を得る。
【０２３５】
一実施形態では、配列番号４４５に提供される可変軽鎖に由来する配列番号７、８及び１０に提供されるＣＤＲを、ヒト免疫グロブリンのヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖可変ドメインＩＧＫＶＡ３０−ＪＫ４中に移植し、Ａ３０  ＦＲ１（配列番号４０）−ＣＤＲＬ１（配列番号７）−Ａ３０  ＦＲ２（配列番号４１）−ＣＤＲＬ２（配列番号８）−Ａ３０  ＦＲ３（配列番号４１）−ＣＤＲＬ３（配列番号１０）−ＪＫ４（配列番号１４８）を含むヒト化軽鎖可変領域を得て、Ａｂ９０９ｇＬ１３（配列番号４８７）を得る。
【０２３６】
一実施形態では、Ａｂ９０９ＶＬ（配列番号４４５）に由来する軽鎖可変領域ドナー残基２Ｖ、３Ｖ、６３Ｋ、及び７０Ｄを、ＩＧＫＶ３０−ＪＫ４アミノ酸２Ｉ、３Ｑ、６３Ｓ、７０Ｅに対するアミノ酸置換残基として使用し、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ１（配列番号４４６（以下の表１０及び図２７））を得る、ヒト化カッパ軽鎖可変領域９０９ｇＬ１（配列番号４４６（以下の表１０及び図２７））が提供される。
【０２３７】
一実施形態では、ヒト化カッパ軽鎖可変領域９０９ｇＬ１（配列番号４４６（以下の表１０及び図２７））がヒトカッパ軽鎖定常領域をさらに含む、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ１  ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４４７（以下の表１０））が提供される。
【０２３８】
一実施形態では、Ａｂ９０９ＶＬ（配列番号４４５）に由来する軽鎖可変領域ドナー残基２Ｖ、３Ｖ、６３Ｋ、及び７０Ｄを、ＩＧＫＶ３０−ＪＫ４アミノ酸２Ｉ、３Ｑ、６３Ｓ、７０Ｅに対するアミノ酸置換残基として使用し、ＣＤＲＬ３の２番目の位置のシステインからアラニンへの置換（ＣＤＲＬ３バリアント１（配列番号１０））を提供し、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ１０（配列番号４４８（以下の表１０及び図２７））を得る、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ１０（配列番号４４８（以下の表１０及び図２７））が提供される。或いは、ＦＲ３中にＣ８８Ａを含むさらなる置換を提供し、Ａｂ９０９ｇＬ５０（配列番号４８８）を得る。
【０２３９】
一実施形態では、ヒト化カッパ軽鎖可変領域９０９ｇＬ１０（配列番号４４８（以下の表１０及び図２７））が、ヒトカッパ軽鎖定常領域をさらに含む、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ１０  ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４４９（以下の表１０））が提供される。或いは、ＦＲ３中にＣ８８Ａを含むさらなる置換を提供し、Ａｂ９０９ｇＬ５０ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４９０）を得る。
【０２４０】
一実施形態では、Ａｂ９０９  ＶＬ（配列番号４４５）に由来する軽鎖可変領域ドナー残基２Ｖ、３Ｖ、６３Ｋ、及び７０Ｄを、ＩＧＫＶ３０−ＪＫ４アミノ酸２Ｉ、３Ｑ、６３Ｓ、７０Ｅに対するアミノ酸置換残基として使用し、ＣＤＲＬ３の２番目の位置のシステインからグルタミンへの置換（ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１１））を提供し、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ５４（配列番号４５０（以下の表１０））を得る、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ５４（配列番号４５０（以下の表１０）が提供される。
【０２４１】
一実施形態では、ヒト化カッパ軽鎖可変領域９０９ｇＬ５４（配列番号４５０（以下の表１０））がヒトカッパ軽鎖定常領域をさらに含む、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ５４  ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４５１（以下の表１０））が提供される。
【０２４２】
一実施形態では、Ａｂ９０９  ＶＬ（配列番号４４５）に由来する軽鎖可変領域ドナー残基２Ｖ、３Ｖ、６３Ｋ、及び７０Ｄを、ＩＧＫＶ３０−ＪＫ４アミノ酸２Ｉ、３Ｑ、６３Ｓ、７０Ｅのためのアミノ酸置換残基として使用し、ＣＤＲＬ３の２番目の位置のシステインからヒスチジンへの置換（ＣＤＲＬ３バリアント２（配列番号１２））を提供し、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ５５（配列番号４５２（以下の表１０））を得る、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ５５（配列番号４５２（以下の表１０）が提供される。
【０２４３】
一実施形態では、ヒト化カッパ軽鎖可変領域９０９ｇＬ５５（配列番号４５２（以下の表１０））がヒトカッパ軽鎖定常領域をさらに含む、ヒト化カッパ軽鎖９０９ｇＬ５５  ＶＬ＋ＣＬ（配列番号４５３（以下の表１０））が提供される。
【表１０−１】
2018515082.tif 000028
【表１０−２】
2018515082.tif 000029
【０２４４】
例えば、可変重鎖Ａｂ９０９  ＶＨ（配列番号４５４（以下の表１１及び図２８））は、ヒトフレームワーク中へのその後の移植のための使用されるドナー重鎖配列であり、任意選択で、その後のＣＤＲ及びフレームワーク改変を実施することができる。一実施形態では、配列番号４５４に提供される可変重鎖に由来する配列番号１４、１６、及び１９に提供される可変重鎖ＣＤＲを、ヒト免疫グロブリンのヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインＩＧＨＶ４−０４−ＪＨ４（配列番号４８１（図２８））中に移植し、４−０４ＦＲ１（配列番号３５７）−ＣＤＲＨ１（配列番号１４）−４−０４ＦＲ２（配列番号３５８）−ＣＤＲＨ２（配列番号１６）−４−０４ＦＲ３（配列番号３５９）−ＣＤＲＨ３（配列番号１９）−ＪＨ４（配列番号４０５）を含むヒト化重鎖可変領域を得る。
【０２４５】
一実施形態では、Ａｂ９０９ＶＨ（配列番号４５４）に由来する重鎖可変領域ドナー残基２３Ｔ、６７Ｆ、７１Ｋ、７２Ａ、７３Ｓ、７４Ｔ、７７Ｔ、７８Ｖ、７９Ｄ、８９Ｔ、９１Ｆを、ＩＧＨＶ４−０４−ＪＫ４アミノ酸２３Ａ、６７Ｖ、７１Ｖ、７２Ｄ、７３Ｋ、７４Ｓ、７７Ｑ、７８Ｆ、７９Ｓ、８９Ｖ、９１Ｙに対するアミノ酸置換残基として使用し、ＩＧＨＶ４−０４−ＪＫ４アミノ酸１Ｑを１Ｅに置換し、アミノ酸７５及び７６のベータシート鎖Ｄ及びＥ間のループ中のフレームワーク３中の２個のアミノ酸残基アミノ酸ギャップを維持し、ヒト化重鎖９０９ｇＨ１（配列番号４５５（以下の表１１及び図２８））を得る、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ１可変領域（配列番号４５５（以下の表１１及び図２８））が提供される。
【０２４６】
一実施形態では、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ１（配列番号４５５（以下の表１１及び図２８））が、ヒトＩｇＧ４Ｐ定常領域をさらに含む、ヒト化ＩｇＧ４重鎖９０９ｇＨ１  ＶＨ＋ＩｇＧ４Ｐ定常（配列番号４５６（以下の表１１））が提供される。本明細書で用いられるＩｇＧ４Ｐは、アミノ酸２４１がプロリンにより置き換えられ、例えば、２４１位のセリンが、Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108に記載のようにプロリンに変化した、野生型ＩｇＧ４アイソタイプの突然変異である。
【０２４７】
一実施形態では、Ａｂ９０９ＶＨ（配列番号４５４）に由来する重鎖可変領域ドナー残基６７Ｆ、７１Ｋ、７２Ａ、７３Ｓ、７４Ｔ、７７Ｔ、７８Ｖ、７９Ｄ、８９Ｔ、９１Ｆを、ＩＧＨＶ４−０４−ＪＫ４アミノ酸６７Ｖ、７１Ｖ、７２Ｄ、７３Ｋ、７４Ｓ、７７Ｑ、７８Ｆ、７９Ｓ、８９Ｖ、９１Ｙに対するアミノ酸置換残基として使用し、ＩＧＨＶ４−０４−ＪＫ４アミノ酸１Ｑを１Ｅに置換し、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ１４（配列番号４５７（以下の表１１及び図２８））を得る、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ１４可変領域（配列番号４５７（以下の表１１及び図２８））が提供される。
【０２４８】
一実施形態では、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ１４（配列番号４５７（以下の表１１及び図２８））が、ヒトＩｇＧ４Ｐ定常領域をさらに含む、ヒト化ＩｇＧ４重鎖９０９ｇＨ１４  ＶＨ＋ＩｇＧ４Ｐ定常（配列番号４５８（以下の表１１））が提供される。本明細書で用いられるＩｇＧ４Ｐは、アミノ酸２４１がプロリンにより置き換えられ、例えば、２４１位のセリンが、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０（１）、１０５〜１０８頁に記載のようにプロリンに変化した、野生型ＩｇＧ４アイソタイプの突然変異である。
【０２４９】
一実施形態では、ウサギＡｂ９０９ＶＨ（配列番号４５４）に由来する重鎖可変領域ドナー残基２３Ｔ、６７Ｆ、７１Ｋ、７２Ａ、７３Ｓ、７４Ｔ、７７Ｔ、７８Ｖ、７９Ｄ、８９Ｔ、９１Ｆを、ＩＧＨＶ４−０４−ＪＫ４アミノ酸２３Ａ、６７Ｖ、７１Ｖ、７２Ｄ、７３Ｋ、７４Ｓ、７７Ｑ、７８Ｆ、７９Ｓ、８９Ｖ、９１Ｙに対するアミノ酸置換残基として使用し、ＩＧＨＶ４−０４−ＪＫ４アミノ酸１Ｑを１Ｅに置換し、ＣＤＲＨ２の１０番目の位置のシステインからセリンへの置換（ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７））及びＣＤＲＨ３の４番目の位置のアスパラギン酸からグルタミン酸への置換（ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０））があり、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ１５ＶＨ領域（配列番号４５９（以下の表１１及び図２８））を得る、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ１５可変領域（配列番号４５９（以下の表１１及び図２８））が提供される。
【０２５０】
一実施形態では、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ１５  ＶＨ（配列番号４５９（以下の表１１及び図２８））が、ヒトＩｇＧ４Ｐ定常領域をさらに含む、ヒト化ＩｇＧ４重鎖９０９ｇＨ１５  ＶＨ＋ＩｇＧ４Ｐ定常（配列番号４６０（以下の表１１））が提供される。本明細書で用いられるＩｇＧ４Ｐは、アミノ酸２４１がプロリンにより置き換えられ、例えば、２４１位のセリンが、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０（１）、１０５〜１０８頁に記載のようにプロリンに変化した、野生型ＩｇＧ４アイソタイプの突然変異である。
【０２５１】
一実施形態では、ウサギＡｂ９０９ＶＨ（配列番号４５４）に由来する重鎖可変領域ドナー残基７１Ｋ、７３Ｓ、７８Ｖを、ＩＧＨＶ４−０４−ＪＫ４アミノ酸７１Ｖ、７３Ｋ、７８Ｆに対するアミノ酸置換残基として使用し、ＩＧＨＶ４−０４−ＪＫ４アミノ酸１Ｑを１Ｅに置換し、ヒト化重鎖９０９ｇＨ６１  ＶＨ領域（配列番号４６１（以下の表１１及び図２８））を得る、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ６１可変領域（配列番号４６１（以下の表１１及び図２８））が提供される。
【０２５２】
一実施形態では、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ６１  ＶＨ（配列番号４６１（以下の表１１及び図２８））が、ヒトＩｇＧ４Ｐ定常領域をさらに含む、ヒト化ＩｇＧ４重鎖９０９ｇＨ６１  ＶＨ＋ＩｇＧ４Ｐ定常（配列番号４６２（以下の表１１））が提供される。本明細書で用いられるＩｇＧ４Ｐは、アミノ酸２４１がプロリンにより置き換えられ、例えば、２４１位のセリンが、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０（１）、１０５〜１０８頁に記載のようにプロリンに変化した、野生型ＩｇＧ４アイソタイプの突然変異である。
【０２５３】
一実施形態では、ウサギＡｂ９０９ＶＨ（配列番号４５４）に由来する重鎖可変領域ドナー残基７１Ｋ、７３Ｓ、７８Ｖを、ＩＧＨＶ４−０４−ＪＫ４アミノ酸７１Ｖ、７３Ｋ、７８Ｆに対するアミノ酸置換残基として使用し、ＩＧＨＶ４−０４−ＪＫ４アミノ酸１Ｑを１Ｅに置換し、ＣＤＲＨ２の１０番目の位置のシステインからセリンへの置換（ＣＤＲＨ２バリアント１（配列番号１７））及びＣＤＲＨ３の４番目の位置のアスパラギン酸からグルタミン酸への置換（ＣＤＲＨ３バリアント１（配列番号２０））があり、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ６２ＶＨ領域（配列番号４６３（以下の表１１及び図２８））を得る、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ６２可変領域（配列番号４６３（以下の表１１及び図２８））が提供される。
【０２５４】
一実施形態では、ヒト化重鎖可変領域９０９ｇＨ６２  ＶＨ（配列番号４６３（以下の表１１及び図２８））が、ヒトＩｇＧ４Ｐ定常領域をさらに含む、ヒト化ＩｇＧ４重鎖９０９ｇＨ６２  ＶＨ＋ＩｇＧ４Ｐ定常（配列番号４６４（以下の表１１））が提供される。本明細書で用いられるＩｇＧ４Ｐは、アミノ酸２４１がプロリンにより置き換えられ、例えば、２４１位のセリンが、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０（１）、１０５〜１０８頁に記載のようにプロリンに変化した、野生型ＩｇＧ４アイソタイプの突然変異である。
【表１１−１】
2018515082.tif 000030
【表１１−２】
2018515082.tif 000031
【表１１−３】
2018515082.tif 000032
【０２５５】
一実施形態では、本開示は、本明細書に開示される配列と８０％類似する、又は同一である、例えば、関連する配列、例えば、可変ドメイン配列、ＣＤＲ配列又はＣＤＲを含まない可変ドメイン配列の一部又は全部にわたって、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似する、又は同一である抗体配列を提供する。一実施形態では、関連する配列は、配列番号４４６、４４７、４４８、４８７、４８８、４８９、４９０、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、又は４６４から選択される。一実施形態では、本開示は、配列番号４４６、４４７、４４８、４８７、４８８、４８９、４９０、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、又は４６４から選択される、関連する配列、例えば、可変ドメイン配列、ＣＤＲ配列又はＣＤＲを含まない可変ドメイン配列中に１又は複数（例えば、１、２、３又は４）個のアミノ酸置換、付加、又は欠失を有する抗体配列を提供する。
【０２５６】
一実施形態では、本発明は、軽鎖の可変ドメインが、配列番号４４６、４４８、４８７、４８８、４５０、又は４５２から選択される配列に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む、軽鎖を含むヒトａＰ２に結合する抗体分子を提供する。一実施形態では、本発明は、軽鎖の可変ドメインが、配列番号４４６、４４８、４８７、４８８、４５０、又は４５２と比較して、その配列中に１又は複数（例えば、１、２、３、又は４）個のアミノ酸置換、付加、又は欠失を有する配列を含む、軽鎖を含むヒトａＰ２に結合する抗体分子を提供する。
【０２５７】
一実施形態では、本発明は、抗体が、配列番号４５５、４５７、４５９、４６１又は４６３から選択される配列と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似するか、又は同一である重鎖可変ドメインを有する、ヒトａＰ２に結合する抗体分子を提供する。一実施形態では、本発明は、抗体が、配列番号４５５、４６７、４５９、４６１又は４６３と比較してその配列中に１又は複数（例えば、１、２、３又は４）個のアミノ酸置換、付加、又は欠失を有する重鎖可変ドメインを有する、ヒトａＰ２に結合する抗体分子を提供する。
【０２５８】
本発明のヒト化抗体の軽鎖のための好適なフレームワーク領域は、ＪＫ４（配列番号１４８）と共に、ヒト生殖系列サブグループＩｇＫＶ１−１７（Ａ３０）（配列番号４０〜４２）に由来する。したがって、一例では、軽鎖フレームワーク領域が、ＪＫ４（配列番号１４８）と共に、ヒトサブグループＩｇＫＶ１−１７（Ａ３０）（配列番号４０〜４２）に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号７に記載の配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号８に記載の配列及びＣＤＲＬ３については配列番号９、１０、１１又は１２から選択される配列を含むヒト化抗体が提供される。ＪＫ４配列は、以下の通りである：ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１４８）。一例では、抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号４４６、４４８、４８７、４８８、４５０、及び４５２から選択される配列を含む。
【０２５９】
本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域のための好適なフレームワーク領域は、ＪＨ４（配列番号４０５）と共に、ヒト生殖系列サブグループＩＧＨＶ４−０４（配列番号３５７、３５８、及び３５９）に由来する。したがって、一例では、重鎖フレームワーク領域がＪＨ４（配列番号４０５）と共にヒトサブグループＩＧＨＶ４−０４（配列番号３５７、３５８、及び３５９）に由来する、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１４に記載の配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号１６又は１７から選択される配列及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号１９又は２０から選択される配列を含むヒト化抗体が提供される。ＪＨ４配列は、以下の通りである：ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４０５）。
【０２６０】
一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４６、４４８、４８７、４８８、４５０、又は４５２から選択される軽鎖可変領域と、配列番号４５５、４５７、４５９、４６１、又は４６３から選択される重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４６に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５５に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４８に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５５に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４５０に記載の軽鎖可変領域と、４５５に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４５２に記載の軽鎖可変領域と、４５５に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４８７に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５５に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４８８に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５５に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４６に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５９に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４８に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５９に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４５０に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５９に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４５２に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５９に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４８７に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５９に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４８８に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５９に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４６に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５７に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４８に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５７に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４５０に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５７に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４５２に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５７に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４８７に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５７に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４８８に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４５７に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４６に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６１に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４８に記載の軽鎖可変領域と、４６１に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４５０に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６１に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４５２に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６１に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４８７に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６１に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４８８に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６１に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４６に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６３に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４４８に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６３に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４５０に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６３に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４５２に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６３に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４８７に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６３に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。一実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号４８８に記載の軽鎖可変領域と、配列番号４６３に記載の重鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。
【０２６１】
一実施形態では、本開示の抗体分子は、軽鎖については配列番号４４６、４４８、４８７、４８８、４５０、又は４５２及び重鎖については配列番号４５５、４５７、４５９、４６１、又は４６３に示される可変領域を含む完全長ＩｇＧ１抗体である。
【０２６２】
一実施形態では、本開示の抗体分子は、軽鎖については配列番号４４６、４４８、４８７、４８８、４５０、又は４５２及び重鎖については配列番号４５５、４５７、４５９、４６１、又は４６３に示される可変領域を含む完全長ＩｇＧ４Ｐ抗体である。
【０２６３】
一実施形態では、本開示の抗体分子は、軽鎖については配列番号４４６、４４８、４８７、４８８、４５０、又は４５２及び重鎖については配列番号４５５、４５７、４５９、４６１、又は４６３に示される可変領域を含む完全長ＩｇＧ４Ｐ抗体である。一実施形態では、抗体分子は、軽鎖については配列番号４４７、４４９、４８９、４９０、４５１、又は４５３から選択される配列及び重鎖については配列番号４５６、４５８、４６０、４６２、又は４６４から選択される配列を含む軽鎖を有する。一実施形態では、本開示による抗体は、例えば、ＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１００３５０１２、ＷＯ２０１１／０３０１０７、ＷＯ２０１１／０６１４９２及びＷＯ２０１１／０８６０９１（全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、免疫グロブリン部分、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片と、それに直接又は間接に連結された１又は２個の単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）とを含むａＰ２結合抗体融合タンパク質として提供される。
【０２６４】
一実施形態では、融合タンパク質は、任意選択で、ジスルフィド結合により連結された、例えば、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）対としての２ドメイン抗体を含む。
【０２６５】
本発明の抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｓｃＦＡｂ、ｄＦｖ、単一ドメイン軽鎖抗体、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどを含む。
【０２６６】
Ｆａｂは、ＩｇＧをプロテアーゼであるパパインで処理する（Ｈ鎖の２２４位のアミノ酸残基で切断する）ことにより得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合を介して一緒に結合した、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０２６７】
本発明のＦａｂを、ａＰ２と特異的に反応する本発明のヒトＣＤＲ移植抗体を、プロテアーゼであるパパインで処理することによって取得することができる。また、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、及び原核生物又は真核生物中に該ベクターを導入して、Ｆａｂを発現させることによって、Ｆａｂを産生させることもできる。
【０２６８】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをプロテアーゼであるペプシンで処理することによって得られる断片のうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合したＦａｂよりもわずかに長い、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０２６９】
ａＰ２と特異的に反応するヒトＣＤＲ移植抗体を、プロテアーゼであるペプシンで処理することによって、本発明のＦ（ａｂ’）２を取得することができる。また、以下に記載のＦａｂ’を、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して結合させることによって、Ｆ（ａｂ’）２を産生させることもできる。
【０２７０】
Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０２７１】
ａＰ２と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤であるジチオトレイトールで処理することによって、本発明のＦａｂ’を取得することができる。また、ａＰ２と特異的に反応する本発明のヒトＣＤＲ移植抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、及び原核生物又は真核生物中に該ベクターを導入して、Ｆａｂ’を発現させることによって、本発明のＦａｂ’を産生させることもできる。
【０２７２】
ｓｃＦｖは、１つのＶＨ鎖と１つのＶＬ鎖とが、１２個以上の残基の適切なペプチドリンカー（Ｐ）を使用して連結され、抗原結合活性を有する、ＶＨ−Ｐ−ＶＬ又はＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドである。
【０２７３】
本発明のａＰ２と特異的に反応するヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得すること、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、該ＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、次いで、該発現ベクターを、原核生物又は真核生物中に導入して、ｓｃＦｖを発現させることによって、本発明のｓｃＦｖを産生させることができる。
【０２７４】
ダイアボディは、同じか、又は異なる抗原結合特異性を有するｓｃＦｖがダイマーを形成し、同じ抗原に対する二価抗原結合活性又は異なる抗原に対する２つの特異的抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０２７５】
ａＰ２と特異的に反応する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得すること、３〜１０個の残基のポリペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、該ＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、次いで、該発現ベクターを、原核生物又は真核生物中に導入して、ダイアボディを発現させることによって、本発明のダイアボディ、例えば、ａＰ２と特異的に反応する二価ダイアボディを産生させることができる。
【０２７６】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬのそれぞれの１個のアミノ酸残基を、システイン残基間のジスルフィド結合を介してシステイン残基と置換したポリペプチドを結合させることによって得られる。システイン残基と置換されるアミノ酸残基を、Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994))により示された方法に従って、抗体の三次元構造評価に基づいて選択することができる。
【０２７７】
本発明のａＰ２と特異的に反応するヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得すること、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、該ＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、次いで、該発現ベクターを、原核生物又は真核生物中に導入して、ｄｓＦｖを発現させることによって、本発明のｄｓＦｖを産生させることができる。
【０２７８】
Ｈ鎖及びＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１つの領域を含有させることにより、ＣＤＲを含むペプチドを構成させる。複数のＣＤＲを直接的に、又は適切なペプチドリンカーを介して結合することができる。
【０２７９】
ａＰ２と特異的に反応するヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするｃＤＮＡを取得すること、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築すること、該ＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、次いで、該発現ベクターを、原核生物又は真核生物中に導入して、ペプチドを発現させることによって、本発明のＣＤＲを含むペプチドを産生させることができる。また、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメトキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって、ＣＤＲを含むペプチドを産生させることもできる。
【０２８０】
本発明の抗体は、放射性同位体、タンパク質、薬剤などを、本発明の抗体に化学的又は遺伝的にコンジュゲートさせた抗体誘導体を含む。
【０２８１】
放射性同位体、タンパク質又は薬剤を、ａＰ２と特異的に反応する抗体若しくは抗体断片のＨ鎖若しくはＬ鎖のＮ末端側又はＣ末端側に、抗体若しくは抗体断片の適切な置換基若しくは側鎖に、又は抗体若しくは抗体断片中の糖鎖に化学的にコンジュゲートさせることによって、本発明の抗体誘導体を産生させることができる（Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)）。
【０２８２】
また、ａＰ２と特異的に反応する本発明の抗体又は抗体断片をコードするＤＮＡを、結合させるタンパク質をコードする他のＤＮＡに連結すること、該ＤＮＡを発現ベクター中に挿入すること、及び該発現ベクターを宿主細胞中に導入することによって、それを遺伝的に産生させることもできる。
【０２８３】
放射性同位体は、１３１Ｉ、１２５Ｉなどを含み、それを、例えば、クロラミンＴ法によって抗体にコンジュゲートさせることができる。
【０２８４】
薬剤は、好ましくは、低分子量化合物である。例としては、アルキル化剤（例えば、窒素マスタード、シクロホスファミド）、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル、メトトレキサート）、抗生物質（例えば、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシン）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、ホルモン薬（例えば、タモキシフェン、デキサメタゾン）などの抗がん剤（Clinical Oncology, edited by Japanese Society of Clinical Oncology, published by Cancer and Chemotherapy (1996)）；ステロイド剤（例えば、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン）、非ステロイド薬（例えば、アスピリン、インドメタシン）、免疫調節剤（例えば、金チオリンゴ酸塩、ペニシラミン）、免疫抑制剤（例えば、シクロホスファミド、アザチオプリン）及び抗ヒスタミン剤（例えば、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマスチン）などの抗炎症剤（Inflammation and Anti-inflammatory Therapy, Ishiyaku Shuppan (1982)）が挙げられる。ダウノマイシンを抗体にコンジュゲートさせる方法としては、ダウノマイシンと、抗体のアミノ基とを、グルタルアルデヒドを介してコンジュゲートさせる方法、ダウノマイシンのアミノ基と、抗体のカルボキシル基とを、水溶性カルボジイミドを介してコンジュゲートさせる方法などが挙げられる。
【０２８５】
また、がん細胞を直接阻害するために、リシン、ジフテリア毒素などの毒素を使用することができる。例えば、抗体又は抗体断片をコードするｃＤＮＡを、タンパク質をコードする他のｃＤＮＡに連結すること、融合抗体をコードするＤＮＡを構築すること、該ＤＮＡを原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、次いで、それを、原核生物又は真核生物中に導入して、融合抗体を発現させることによって、タンパク質との融合抗体を産生させることができる。
【０２８６】
全体が参照により本明細書に組み込まれるBinz et al., (2005) Nat. Biotech. 23:1257-1268に記載された、フィブロネクチン又はロイシンジッパーなどの非Ｉｇフレームワーク上に移植された、結合剤、例えば、免疫グロブリン様断片と、ダイアボディ、ｓｃＡｂ、二特異的断片、トリアボディ、Ｆａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、トリボディ、（Ｆａｂ−Ｆｖ）２−Ｆｃ及びＣＤＲ又はＣＤＲを含む抗体ループなどの抗体断片又は部分などの薬剤との融合物を含む、抗体断片又は抗原結合剤が本明細書でさらに企図される。
【０２８７】
コンジュゲートされた抗ａＰ２モノクローナル抗体及び抗原結合剤
必要に応じて、本発明における使用のための抗体又は抗原結合剤を、１又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートさせることができる。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子又は本発明の抗体に結合させることができる単一の部分を形成するように連結された２つ以上のそのような分子を含んでもよいことが理解される。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが望ましい場合、抗体断片を直接的に、又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結する標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順によって、これを調製することができる。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、当業界で周知である（Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53；Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58及びDubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123を参照されたい）。特定の化学的手順としては、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３／０３１５８１に記載のものが挙げられる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、例えば、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載の組換えＤＮＡ手順を使用して、連結を達成することができる。
【０２８８】
本明細書で使用されるエフェクター分子という用語は、例えば、抗新生物剤、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、抗原結合剤、合成（ＰＥＧを含む）又は天然のポリマー、核酸及びその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に、放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子並びに蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法により検出することができる化合物などのリポーター基を含む。
【０２８９】
エフェクター分子の例は、細胞にとって有害である（例えば、殺傷する）任意の薬剤などの細胞毒素又は細胞傷害剤を含んでもよい。例としては、コンブレタスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステルリン、タキソール、サイトハラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにその類似体又は相同体が挙げられる。
【０２９０】
エフェクター分子としては、限定されるものではないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、並びに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も挙げられる。
【０２９１】
他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種；又は限定されるものではないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を含んでもよい。
【０２９２】
他のエフェクター分子としては、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。目的の酵素としては、限定されるものではないが、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられる。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、限定されるものではないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、若しくはジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子若しくは組織プラスミノゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤若しくは抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又は、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは他の増殖因子及び免疫グロブリンなどの生物学的応答改変剤が挙げられる。
【０２９３】
他のエフェクター分子は、例えば、診断において有用な検出可能物質を含んでもよい。検出可能物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、ポジトロン放出金属（ポジトロン放出断層撮影における使用のため）、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。一般的に、診断剤としての使用のための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが挙げられる；好適な蛍光材料としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられる；好適な発光材料としては、ルミノールが挙げられる；好適な生物発光材料としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；並びに好適な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが挙げられる。
【０２９４】
別の例では、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期を増加させる、及び／又は抗体の免疫原性を低下させる、及び／又は上皮バリアを横断する免疫系への抗体の送達を増強することができる。この型の好適なエフェクター分子の例としては、ＷＯ０５／１１７９８４に記載のものなどのポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物が挙げられる。
【０２９５】
一例では、ａＰ２又は抗ヒトａＰ２抗体とは無関係であるエフェクター分子により提供される半減期が有利である。
【０２９６】
エフェクター分子がポリマーである場合、それは一般に、合成又は天然のポリマー、例えば、置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー又は分枝状若しくは非分枝状多糖、例えば、ホモ−若しくはヘテロ−多糖であってもよい。
【０２９７】
上記の合成ポリマー上に存在してもよい特定の任意選択の置換基としては、１又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が挙げられる。
【０２９８】
合成ポリマーの特定例としては、置換されていてもよい直鎖又は分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が挙げられる。
【０２９９】
特定の天然ポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体が挙げられる。
【０３００】
一実施形態では、ポリマーは、ヒト血清アルブミン又はその断片などの、アルブミン又はその断片である。一実施形態では、ポリマーは、ＰＥＧ分子である。
【０３０１】
コンジュゲートに関して本明細書で使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択的反応基を含むことが意図される。反応基を、直接的に、又はリンカー断片を介して、ポリマーに連結することができる。そのような基の残基は、一部の例では、抗体断片とポリマーとの連結基として生成物の一部を形成することが理解される。
【０３０２】
天然又は合成ポリマーのサイズは、必要に応じて変化してもよいが、一般的には、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば、２００００〜４００００Ｄａなどの５０００〜４００００Ｄａの範囲の平均分子量にある。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図される使用、例えば、腫瘍などのある特定の組織に局在化する能力又は循環半減期の延長に基づいて選択してもよい（概説については、Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545を参照されたい）。かくして、例えば、生成物が、例えば、腫瘍の処置における使用のために、循環から離脱させ、組織に浸透させることを意図する場合、例えば、約５０００Ｄａの分子量を有する低分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が循環中に残存する適用については、例えば、２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する高分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。
【０３０３】
好適なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）、又は特に、約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有する、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体などのポリアルキレンポリマーが挙げられる。
【０３０４】
一例では、本発明における使用のための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合される。１つの特定の例では、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子を、抗体断片中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して結合することができる。そのようなアミノ酸は、抗体断片中に天然に存在するか、又は組換えＤＮＡ法を使用して断片中に操作してもよい（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号；米国特許第５，６６７，４２５号；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一例では、本発明の抗体分子は、改変がエフェクター分子の結合を可能にする１又は複数のアミノ酸の、その重鎖のＣ末端への付加である、改変型Ｆａｂ断片である。好適には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子を結合することができる１又は複数のシステイン残基を含有する改変型ヒンジ領域を形成する。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を結合することができる。
【０３０５】
好適には、ＰＥＧ分子を、抗体断片中に位置する少なくとも１個のシステイン残基のチオール基を介して共有的に連結する。改変された抗体断片に結合されるそれぞれのポリマー分子を、断片中に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有的に連結することができる。共有的連結は、一般に、ジスルフィド結合、又は特に、硫黄−炭素結合である。チオール基を結合点として使用する場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体を使用することができる。活性化されたポリマーを、上記のポリマー改変抗体断片の調製における出発材料として使用することができる。
【０３０６】
活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどのチオール反応基を含有する任意のポリマーであってもよい。そのような出発材料を商業的に（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡ）取得するか、又は従来の化学的手順を使用して商業的に入手可能な出発材料から調製することができる。特定のＰＥＧ分子としては、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）並びにＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が挙げられる。
【０３０７】
一実施形態では、抗体は、ＰＥＧ化された、すなわち、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７［"Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York、"Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC及び"Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York；Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545も参照されたい］に開示された方法に従って、それにＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を共有的に結合させた、改変型Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はｄｉＦａｂである。一例では、ＰＥＧは、ヒンジ領域中のシステインに結合される。一例では、ＰＥＧ改変Ｆａｂ断片は、改変されたヒンジ領域中の単一のチオール基に共有的に連結されたマレイミド基を有する。リシン残基を、マレイミド基に共有的に連結し、リシン残基上のそれぞれのアミン基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを結合させることができる。Ｆａｂ断片に結合されるＰＥＧの総分子量は、したがって、約４０，０００Ｄａであってもよい。
【０３０８】
特定のＰＥＧ分子は、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２０，０００）改変されたリシンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドを含む。
【０３０９】
ＰＥＧリンカーの代替的な供給源は、ＧＬ２−４００ＭＡ３（ここで、下記の構造式中のｍは５である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ここで、ｍは２である）を供給し、ｎが約４５０であるＮＯＦを含む：
【化１】
2018515082.tif 000033
すなわち、それぞれのＰＥＧは約２０，０００Ｄａである。
【０３１０】
かくして、一実施形態では、ＰＥＧは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ３として知られるＭｗ４０，０００の２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−｛［３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２アーム分枝状ＰＥＧ、−ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５−ＭＡＬである。
【０３１１】
以下の型：
【化２】
2018515082.tif 000034
のさらなる代替的なＰＥＧエフェクター分子が、Ｄｒ  Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ及びＪｅｎｋｅｍから入手可能である。
【０３１２】
一実施形態では、鎖中のアミノ酸２２９にある、又はほぼそこにあるシステインアミノ酸残基、例えば、重鎖のアミノ酸２２９（連続的番号付けによる）、例えば、配列番号４５６、４６０、４５８、４６２、又は４６４のアミノ酸２２９を介して結合された、ＰＥＧ化された（例えば、本明細書に記載のＰＥＧを用いて）抗体が提供される。
【０３１３】
一実施形態では、本開示は、１又は複数のＰＥＧポリマー、例えば、４０ｋＤａのポリマー又は複数のポリマーなどの１又は２のポリマーを含むＦａｂ’  ＰＥＧ分子を提供する。
【０３１４】
本開示によるＦａｂ’−ＰＥＧ分子は、それらがＦｃ断片とは無関係の半減期を有する点で特に有利であり得る。一例では、本発明は、抗体又はその抗原結合剤がａＰ２へのＦｃ結合とは無関係である半減期を有する、治療有効量の抗ａＰ２抗体又はその抗原結合剤を投与するステップを含む、ヒトａＰ２生物活性をモジュレートすることによって改善される疾患を処置する方法を提供する。
【０３１５】
一実施形態では、ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子などのポリマーにコンジュゲートされたＦａｂ’が提供される。
【０３１６】
一実施形態では、ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子などのポリマーにコンジュゲートされたｓｃＦｖが提供される。
【０３１７】
一実施形態では、抗体又は断片は、例えば、半減期を増加させるために、デンプン分子にコンジュゲートされる。デンプンをタンパク質にコンジュゲートさせる方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０１７，７３９号に記載されている。
【０３１８】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。好適には、ＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードする。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、化学的プロセッシングにより生成された合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその任意の組合せを含んでもよい。
【０３１９】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を、当業者には周知の方法によって取得することができる。例えば、抗体重鎖及び軽鎖の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列を、必要に応じて、決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成することができる。
【０３２０】
アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者には広く入手可能であり、その既知のアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【０３２１】
分子生物学の標準的な技術を使用して、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全に、又は部分的に合成することができる。部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を、必要に応じて使用することができる。
【０３２２】
好適なｃＤＮＡ配列の例を、以下の表１２に提供する。
【０３２３】
ヒト化軽鎖可変領域をコードする好適なｃＤＮＡ配列の例を、配列番号４６７、４６９、４９１、４９３、４７１及び４７３に提供する。ヒト化重鎖可変領域をコードする好適なＤＮＡ配列の例を、配列番号４７５、５０７、４７７、５０９、及び５１１に提供する。
【０３２４】
軽鎖（可変及び定常）をコードする好適なｃＤＮＡ配列の例を、配列番号４６８、４７０、４９２、４９４、４７２、及び４７４に提供する。
【０３２５】
重鎖（可変及び定常）をコードする好適なｃＤＮＡ配列の例を、配列番号４７６、５０８、４７８、５１０、及び５１２に提供する。
【表１２−１】
2018515082.tif 000035
【表１２−２】
2018515082.tif 000036
【表１２−３】
2018515082.tif 000037
【表１２−４】
2018515082.tif 000038
【表１２−５】
2018515082.tif 000039
【表１２−６】
2018515082.tif 000040
【表１２−７】
2018515082.tif 000041
【表１２−８】
2018515082.tif 000042
【表１２−９】
2018515082.tif 000043
【０３２６】
本発明はまた、本発明の１又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターにも関する。したがって、本発明の抗体をコードする１又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターが提供される。好適には、クローニング又は発現ベクターは、それぞれ、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖と、好適なシグナル配列とをコードする、２つのＤＮＡ配列を含む。一例では、ベクターは、重鎖と軽鎖との間の遺伝子間配列を含む（ＷＯ０３／０４８２０８を参照されたい）。
【０３２７】
ベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者には周知である。これに関して、"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York及びCold Spring Harbour Publishingにより作製されたManiatis Manualが参照される。
【０３２８】
抗ａＰ２抗体又はその断片を発現する宿主細胞
また、本発明の抗体をコードする１又は複数のＤＮＡ配列を含む１又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。任意の好適な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用することができる。細菌、例えば、大腸菌、及び他の微生物系を使用するか、又は真核生物、例えば、哺乳動物の宿主細胞発現系を使用することもできる。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。
【０３２９】
本発明における使用のための好適な型のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）は、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞などの、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含み、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用することができる、ＣＨＯ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞、又はグルタミン合成酵素選択マーカーと共に使用することができるＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞を含んでもよい。抗体を発現させるのに有用な他の細胞型としては、リンパ球細胞系、例えば、ＮＳＯミエローマ細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞が挙げられる。他の好適な細胞は、ヒト胚性腎（ｈｅｋ）線維芽細胞、例えば、ｈｅｋ２９３Ｆ及びＥｘｐｉＨｅｋ細胞を含んでもよく、これらは当業界で公知である。
【０３３０】
一実施形態では、配列番号４６７、４６９、４９１、４９３、４７１、４７３、４７５、５０７、４７７、５０９、５１１、４６８、４７０、４９２、４９４、４７２、４７４、４７６、５０８、４７８、５１０、又は５１２から選択されるＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０３３１】
抗ａＰ２抗体又はその断片の産生
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現をもたらすのに好適な条件下で、本発明のベクターを含有する宿主細胞を培養すること、及び抗体分子を単離することを含む、本発明による抗体分子の産生のためのプロセスも提供する。
【０３３２】
抗体分子は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドコード配列のみが、宿主細胞をトランスフェクトするために使用する必要がある、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含んでもよい。重鎖と軽鎖の両方を含む生成物の産生のために、細胞系に、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターと、重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターとの２つのベクターをトランスフェクトすることができる。或いは、ベクターが軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む、単一のベクターを使用することができる。
【０３３３】
宿主細胞を培養する、及び抗体又はその断片を発現させる、後者を単離する、任意選択で、それを精製して、単離された抗体又は断片を提供するためのプロセスが提供される。一実施形態では、プロセスは、エフェクター分子を、単離された抗体又は断片にコンジュゲートさせるステップ、例えば、特に、本明細書に記載のＰＥＧポリマーにコンジュゲートさせるステップをさらに含む。
【０３３４】
一実施形態では、不純物がカラム上に保持され、抗体が溶出されるように、非結合様式で陰イオン交換クロマトグラフィーを実施するステップを含む、抗体（特に、本発明による抗体又は断片）を精製するためのプロセスが提供される。
【０３３５】
一実施形態では、精製は、プロテインＡカラム上での親和性捕捉、次いで、滴定を用いる。一実施形態では、精製は、プロテインＧカラム上での親和性捕捉、次いで、ＨＰＬＣ滴定を用いる。一実施形態では、精製は、ａＰ２カラム上での親和性捕捉、次いで、滴定を用いる。
【０３３６】
一実施形態では、精製は、アルブミン融合又はコンジュゲート分子の精製のためにシバクロンブルー又は同様のものを用いる。
【０３３７】
プロセスにおける使用のための好適なイオン交換樹脂としては、Ｑ．ＦＦ樹脂（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給）が挙げられる。ステップは、例えば、約８のｐＨで実施することができる。
【０３３８】
プロセスは、例えば、４．５などの、約４〜５のｐＨで実施される、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる初期捕捉ステップをさらに含んでもよい。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣａｐｔｏＳ樹脂又はＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給）などの樹脂を用いてもよい。次いで、抗体又は断片を、例えば、２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムなどのイオン性塩溶液を用いて樹脂から溶出させることができる。
【０３３９】
かくして、１又は複数のクロマトグラフィーステップは、必要に応じて、１又は複数の洗浄ステップを含んでもよい。
【０３４０】
精製プロセスはまた、透析濾過ステップ又はＨＰＬＣ濾過ステップなどの、１又は複数の濾過ステップを含んでもよい。
【０３４１】
かくして、一実施形態では、実質的に精製された形態、特に、内毒素及び／又は宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡを含まない、又は実質的に含まない、精製された抗ａＰ２抗体又は断片、例えば、ヒト化抗体又は断片、特に、本発明による抗体又は断片が提供される。
【０３４２】
上掲の通り使用される、から精製されたとは、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ以上純粋などの、少なくとも９０％の純度を指すことが意図される。
【０３４３】
内毒素を実質的に含まないとは、一般に、０．５又は０．１ＥＵ／ｍｇ生成物などの、１ＥＵ／ｍｇ抗体生成物以下の内毒素含量を指すことが意図される。
【０３４４】
宿主細胞タンパク質又はＤＮＡを実質的に含まないとは、一般に、１００μｇ／ｍｇ以下、特に、必要に応じて、２０μｇ／ｍｇなどの、４００μｇ／ｍｇ抗体生成物以下の宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含量を指すことが意図される。
【０３４５】
医薬組成物
本発明の抗体は病態の処置及び／又は予防において有用であるため、本発明は、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と共に、本発明の抗体又は抗原結合剤を含む医薬組成物又は診断組成物も提供する。したがって、薬剤の製造のための本発明の抗体又は抗原結合剤の使用が提供される。組成物は、通常、薬学的に許容される担体を通常含む滅菌された医薬組成物の一部として供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。
【０３４６】
本発明はまた、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と一緒に、本発明の抗体又は抗原結合剤を添加及び混合するステップを含む、医薬組成物又は診断組成物の調製のためのプロセスも提供する。
【０３４７】
抗体又は抗原結合剤は、医薬組成物若しくは診断組成物中の唯一の活性成分であってもよく、又は他の抗体成分若しくはステロイド若しくは他の薬物分子、特に、半減期がａＰ２結合とは無関係である薬物分子などの、非抗体成分を含む他の活性成分を伴ってもよい。
【０３４８】
医薬組成物は、好適には、治療有効量の本発明の抗体又は抗原結合剤を含む。本明細書で使用される用語「治療有効量」とは、標的とされた疾患若しくは状態を処置、改善、若しくは防止する、又は検出可能な治療若しくは防止効果を示すのに必要とされる治療剤の量を指す。任意の開示される抗体又は抗原結合剤について、治療有効量を、細胞培養アッセイ又は動物モデルにおいて、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類において最初に見積もることができる。また、動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定することができる。
【０３４９】
ヒト対象のための正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の一般的健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ（単数又は複数）、療法に対する反応感度及び許容性／応答に依存する。この量は、日常的な実験によって決定することができ、医師の判断のうちにある。一般的には、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００ｍｇ／ｋｇである。医薬組成物を、用量あたり所定量の本発明の活性剤を含有する単位剤形中に都合良く提供することができる。
【０３５０】
本開示による抗体又は抗原結合剤の治療用量は、ｉｎ  ｖｉｖｏで見かけの毒性効果を示さない。
【０３５１】
有利には、ｉｎ  ｖｉｖｏでのａＰ２活性のレベルを、本開示による抗体又は結合剤の連続用量の投与によって適切に低下したレベルに維持することができる。
【０３５２】
組成物を、患者に対して個別に投与するか、又は他の薬剤、薬物又はホルモンと共に（例えば、同時に、連続的に、又は別々に）投与してもよい。
【０３５３】
医薬組成物はまた、抗体又は抗原結合剤の投与のための薬学的に許容される担体を含有してもよい。担体は、それ自体、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導するべきではなく、毒性的であるべきではない。好適な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの大きな、ゆっくりと代謝される大分子であってもよい。
【０３５４】
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。
【０３５５】
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有してもよい。さらに、湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝化物質などの補助物質が、そのような組成物中に存在してもよい。そのような担体は、医薬組成物を、患者による摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁剤として製剤化することを可能にする。
【０３５６】
投与のための好ましい形態としては、例えば、注射又は輸注、例えば、ボーラス注射又は連続輸注による非経口投与にとって好適な形態が挙げられる。生成物が注射又は輸注のためのものである場合、それは油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液の形態を取ってもよく、それは懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調剤を含有してもよい。或いは、抗体分子は、適切な滅菌液体と共に使用前に再構成させるために、乾燥形態にあってもよい。
【０３５７】
一度製剤化されたら、本発明の組成物を、対象に直接投与することができる。処置される対象は動物であってもよい。しかしながら、組成物はヒト対象への投与のために適合化されるのが好ましい。
【０３５８】
本発明の医薬組成物を、限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経真皮、経皮（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸経路などの、任意数の経路によって投与することができる。皮下噴射器を使用して、本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療組成物を、液体溶液又は懸濁液として、注射として調製することができる。注射前に液体ビヒクル中の溶液、又は懸濁液にとって好適な固体形態を調製することもできる。組成物の直接送達は一般に、皮下、腹腔内、静脈内若しくは筋肉内注射によって達成されるか、又は組織の間質腔に送達される。また、組成物を病変に投与することもできる。用量処置は、単回用量スケジュール又は複数用量スケジュールであってもよい。
【０３５９】
組成物中の活性成分は抗体分子であることが理解される。そのままでは、それは胃腸管での分解を受けやすい。かくして、組成物を胃腸管を使用する経路によって投与しようとする場合、組成物は分解から抗体を保護するが、一度、胃腸管から吸収されたら、抗体を放出する薬剤を含有する必要がある。
【０３６０】
薬学的に許容される担体の完全な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)で利用可能である。
【０３６１】
一実施形態では、本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体は、埋込み体、経皮パッチ、及びマイクロカプセル送達系を含む制御放出製剤として投与される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法が、例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978によって記載されている。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。
【０３６２】
一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体を連続的に投与する、例えば、抗体を、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、又は第４，５９６，５５６号に開示されたデバイスなどの、無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な埋込み体及びモジュールの例としては、制御された速度で薬剤を分注するための埋込み可能なマイクロ輸注ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介して医薬品を投与するための治療用デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な輸注速度で薬剤を送達するための薬剤輸注ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続薬物送達のための可変流動性の埋込み可能な輸注装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバ区画を有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のそのような埋込み体、送達系、及びモジュールが公知である。
【０３６３】
治療適用
抗ヒトａＰ２ヒト化抗体化合物を含む、本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体化合物、並びに開示される抗原結合剤は、脂質シャペロンａＰ２／ＦＡＢＰ４タンパク質を標的化し、限定されるものではないが、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、肥満、及び脂肪肝疾患、脂肪肉腫、膀胱がん、及び卵巣がんを含むがん、並びに心血管障害などの、代謝障害を処置するのに有用である。驚くべきことに、本明細書に記載の抗ａＰ２抗体化合物が、それを必要とする宿主に投与した場合、ａＰ２の活性を中和し、より高い結合親和性を有する抗ａＰ２モノクローナル抗体と比較した場合、宿主における空腹時血糖値の低下、全身グルコース代謝の改善、全身インスリン感受性の増大、脂肪量の減少、肝臓脂肪変性の減少、血清脂質プロファイルの改善、及び／又はアテローム生成プラーク形成の減少を提供する、低い結合親和性で分泌されたａＰ２に結合することができることが発見された。
【０３６４】
本発明の一態様では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を投与することにより、宿主におけるａＰ２媒介性障害を処置するための方法が提供される。一実施形態では、障害は代謝障害である。一実施形態では、障害は糖尿病である。一実施形態では、障害はＩ型糖尿病である。一実施形態では、障害はＩＩ型糖尿病である。一実施形態では、障害は高血糖である。一実施形態では、障害は肥満である。一実施形態では、障害は脂質異常症である。一実施形態では、障害は脂肪肝疾患である。一実施形態では、障害は心血管障害である。一実施形態では、障害はアテローム性動脈硬化症である。一実施形態では、障害は炎症障害である。一実施形態では、障害は喘息である。一実施形態では、障害は増殖性障害、例えば、腫瘍又は新生物である。一実施形態では、腫瘍は、移行膀胱がん、卵巣がん、及び脂肪肉腫から選択される。一実施形態では、障害は多嚢胞性卵巣症候群（ＰＯＳ）である。
【０３６５】
代謝障害
本発明の一態様では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を投与することにより、宿主における代謝障害を処置するための方法が提供される。代謝障害は、対象における異常な代謝（すなわち、生命プロセス及び活動のためにエネルギーが提供される生細胞における化学的変化）により引き起こされるか、又はそれを特徴とする障害、疾患、又は状態を含む。代謝障害は、高血糖又は異常な脂肪細胞（例えば、褐色若しくは白色脂肪細胞）表現型若しくは機能と関連する疾患、障害、又は状態を含む。代謝障害は、細胞増殖、成長、分化、又は移動、細胞の恒常性の調節、細胞間又は細胞内コミュニケーションなどの細胞機能；肝機能、腎機能、又は脂肪細胞機能などの組織機能；ホルモン応答（例えば、インスリン応答）などの、生物における全身応答に有害に影響し得る。代謝障害の例としては、肥満、糖尿病、過食症、内分泌異常、トリグリセリド貯蔵疾患、Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｌ症候群、Ｌａｕｒｅｎｃｅ−Ｍｏｏｎ症候群、Ｐｒａｄｅｒ−Ｌａｂｈａｒｔ−Ｗｉｌｌｉ症候群、及び脂質代謝の障害が挙げられる。
【０３６６】
糖尿病
糖尿病は、世界で最も一般的な代謝疾患である。毎日、米国では１７００件の糖尿病の新規症例が診断され、糖尿病を有する１６００万人の米国人のうちの少なくとも３分の１がそれに気付いていない。糖尿病は、成人における失明、腎不全、及び下肢切断の主因であり、心血管疾患及び脳卒中の主要な危険因子である。
【０３６７】
本発明の一態様では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を宿主に投与することによって糖尿病を処置するための方法が提供される。一実施形態では、障害はＩ型糖尿病である。一実施形態では、障害はＩＩ型糖尿病である。
【０３６８】
Ｉ型糖尿病は、膵臓ベータ細胞の自己免疫的破壊の結果生じ、インスリン欠乏を引き起こす。ＩＩ型又は非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、９０％を超える症例を占め、末梢組織、特に、骨格筋及び脂肪細胞におけるグルコース取込みに対するインスリン作用に対する耐性、肝臓グルコース産生を阻害するインスリン作用の障害、及びインスリン分泌の誤調節を特徴とする。
【０３６９】
本発明の一実施形態では、インスリンと共に、又は交互に、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を宿主に投与することによって、宿主におけるＩ型糖尿病を処置する方法が本明細書で提供される。本発明の一実施形態では、合成インスリン類似体と共に、又は交互に、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を宿主に投与することによって、宿主におけるＩ型糖尿病を処置する方法が本明細書で提供される。
【０３７０】
ＩＩ型糖尿病を有する一部の人々は、食事及び運動のみでその目標血糖値を達成することができるが、多くは薬剤又はインスリン療法も必要とする。本発明の一実施形態では、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ、Ｇｌｕｍｅｔｚａ）；グリブリド（ＤｉａＢｅｔａ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）及びグリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）などのスルホニルウレア；メグリチニド、例えば、レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）及びナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）；チアゾリジンジオン、例えば、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）及びピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）；ＤＰＰ−４阻害剤、例えば、シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ）、サクサグリプチン（Ｏｎｇｌｙｚａ）及びリナグリプチン（Ｔｒａｄｊｅｎｔａ）；ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、例えば、エキセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）及びリラグルチド（Ｖｉｃｔｏｚａ）；ＳＧＬＴ２阻害剤、例えば、カナグリフロジン（Ｉｎｖｏｋａｎａ）及びダパグリフロジン（Ｆａｒｘｉｇａ）から選択される化合物；又はインスリン療法と共に、又は交互に、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を宿主に投与することによって、宿主におけるＩＩ型糖尿病を処置する方法が本明細書で提供される。インスリンの非限定例としては、インスリングルリシン（Ａｐｉｄｒａ）；インスリンリスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ）；インスリンアスパート（Ｎｏｖｏｌｏｇ）；インスリングラルギン（Ｌａｎｔｕｓ）；インスリンデテミル（Ｌｅｖｅｍｉｒ）；インスリンイソファン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｎ、Ｎｏｖｏｌｉｎ  Ｎ）が挙げられる。
【０３７１】
一実施形態では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を宿主に投与することによって糖尿病と関連する疾患又は状態を処置する方法が本明細書で提供される。糖尿病と関連する疾患及び状態としては、限定されるものではないが、高血糖、高インスリン血症、高脂血症、インスリン耐性、グルコース代謝障害、肥満、糖尿病性網膜症、黄斑変性、白内障、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、糖尿病性神経障害、勃起障害、月経前症候群、血管再狭窄及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。さらに、糖尿病と関連する疾患及び状態は、限定されるものではないが、肝動脈心疾患、高血圧、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、皮膚及び結合組織障害、足潰瘍、代謝性アシドーシス、関節炎、骨粗鬆症、特に、耐糖能障害の状態を含む。
【０３７２】
体重障害
本発明の一実施形態では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を投与することによって宿主における肥満を処置するための方法が提供される。肥満は、最も一般的な体重障害であり、西側世界では推定で３０〜５０％の中年集団が罹患している。
【０３７３】
本発明の一実施形態では、肥満を処置するための第２の治療剤と共に、又は交互に、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を投与することによって宿主における肥満を処置するための方法が提供される。肥満のための処置の例としては、限定されるものではないが、フェンテルミン、Ｂｅｌｖｉｑ（ロルカセリン）、ジエチルプロピオン、酒石酸フェンジメトラジン、Ｘｅｎｉｃａｌ（オルリスタット）、Ｃｏｎｔｒａｖｅ、オルリスタット、メタンフェタミン、Ｄｅｓｏｘｙｎ、Ｄｉｄｒｅｘ、Ｂｏｎｔｒｉｌ  ＰＤＭ、Ｓｕｐｒｅｎｚａ、ベンズフェタミン、Ｑｓｙｍｉａ（フェンテルミン−トピラマット）、Ｒｅｇｉｍｅｘ、ナルトレキソン−ブプロピオン、Ｅｖｅｋｅｏ、ロルカセリン、及び硫酸アンフェタミンが挙げられる。
【０３７４】
一実施形態では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を投与することによって宿主における体重増加を軽減するか、又は阻害するための方法が提供される。
【０３７５】
脂肪肝疾患
脂肪肝の発生並びに非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝臓炎症、肝硬変及び肝不全などの、脂肪肝から生じる状態の処置及び防止のための組成物及び方法が必要である。本発明の一実施形態では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を投与することによって宿主における脂肪肝疾患を処置するための方法が提供される。
【０３７６】
一実施形態では、本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、オメガ−３脂肪酸又はペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストと共に、又は交互に投与される。
【０３７７】
オメガ−３脂肪酸は、ＤＧＡＴを阻害することにより、並びにペルオキシソーム及びミトコンドリアベータ酸化を刺激することにより、血清トリグリセリドを減少させることが知られている。２つのオメガ−３脂肪酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が、ＰＰＡＲ−アルファとＰＰＡＲ−ガンマの両方に対して高い親和性を有することがわかった。海洋油、例えば、魚油は、脂質代謝を調節することがわかっているＥＰＡ及びＤＨＡの良好な供給源である。オメガ−３脂肪酸は、心血管疾患、特に、軽度の高血圧、高トリグリセリド血症の危険因子に対する、及び第ＶＩＩ凝固因子リン脂質複合体活性に対する有益な効果を有することがわかっている。オメガ−３脂肪酸は、血清トリグリセリドを低下させ、血清ＨＤＬ−コレステロールを増加させ、収縮期及び拡張期血圧及び脈拍数を低下させ、血中第ＶＩＩ凝固因子−リン脂質複合体の活性を低下させる。さらに、オメガ−３脂肪酸は、重篤な副作用を生じることなく、良好に許容されると考えられる。１つのそのような形態のオメガ−３脂肪酸は、ＤＨＡ及びＥＰＡを含有する魚油に由来する、オメガ−３、長鎖、ポリ不飽和脂肪酸の濃縮物であり、Ｏｍａｃｏｒ（登録商標）の商標の下で販売されている。そのような形態のオメガ−３脂肪酸は、例えば、米国特許第５，５０２，０７７号、第５，６５６，６６７号及び第５，６９８，５９４号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３７８】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、レチノイド、ステロイド及び甲状腺ホルモン受容体と関連する、核ホルモン受容体スーパーファミリーリガンド活性化転写因子のメンバーである。異なる遺伝子の産物であり、ＰＰＡＲ−アルファ、ＰＰＡＲ−ベータ／デルタ（又は単に、デルタ）及びＰＰＡＲ−ガンマと一般に指定される３つの異なるＰＰＡＲサブタイプが存在する。ペルオキシソーム活性を刺激する一般的なクラスの薬剤は、ＰＰＡＲアゴニスト、例えば、ＰＰＡＲ−アルファアゴニスト、ＰＰＡＲ−ガンマアゴニスト及びＰＰＡＲ−デルタアゴニストとして公知である。一部の薬剤は、アルファ／ガンマアゴニストなどの、ＰＰＡＲアゴニストの組合せであり、他の一部の薬剤は二重のアゴニスト／アンタゴニスト活性を有する。フェノフィブラート、ベザフィブラート、クロフィブラート及びゲンフィブロジルなどのフィブラートは、ＰＰＡＲ−アルファアゴニストであり、トリグリセリドに富むリポタンパク質を減少させる、ＨＤＬを増加させる、及びアテローム生成性高密度ＬＤＬを減少させるために患者において使用される。フィブラートは、典型的には、そのような患者に経口投与される。フェノフィブラート又は２−［４−（４−クロロベンゾイル）フェノキシ］−２−メチル−プロパン酸、１−メチルエチルエステルは、血中トリグリセリド及びコレステロールレベルを低下させるその効能のため、医学的有効成分として長年知られてきた。
【０３７９】
心血管疾患
本発明の一実施形態では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を投与することによって宿主における心血管疾患を処置するための方法が提供される。本発明の抗ａＰ２抗体は、心虚血及び／又は脳虚血、心筋梗塞、狭心症、末梢血管疾患及び脳卒中などの、アテローム性動脈硬化症の結果生じる心血管疾患及び脳血管疾患を防止する、阻害する、又はそのリスクを軽減するのに有用である。
【０３８０】
一実施形態では、抗アテローム性動脈硬化剤と共に、又は交互に、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を宿主に投与することによって、宿主におけるアテローム性動脈硬化症の結果生じる心血管疾患及び脳血管疾患を防止する、阻害する、又はそのリスクを軽減するための方法が提供される。
【０３８１】
抗アテローム性動脈硬化剤の例としては、限定されるものではないが、ＨＭＧ  ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、フィブリン酸誘導体、スクアレン合成酵素阻害剤及び他の公知のコレステロール低下剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、ＡＣＡＴ阻害剤、及び本明細書の以下に開示されるＰＰＡＲα／γ二重アゴニストが挙げられる。
【０３８２】
抗アテローム性動脈硬化剤は、ＨＭＧ  ＣｏＡリダクターゼ阻害剤であってもよく、限定されるものではないが、米国特許第３，９８３，１４０号に開示されたメバスタチン及び関連化合物、米国特許第４，２３１，９３８号に開示されたロバスタチン（メビノリン）及び関連化合物、米国特許第４，３４６，２２７号に開示されたようなプラバスタチン及び関連化合物、米国特許第４，４４８，７８４号及び第４，４５０，１７１号に開示されたシンバスタチン及び関連化合物が挙げられ、プラバスタチン、ロバスタチン又はシンバスタチンが好ましい。本明細書で用いることができる他のＨＭＧ  ＣｏＡリダクターゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、米国特許第５，３５４，７７２号に開示されたフルバスタチン、米国特許第５，００６，５３０号及び第５，１７７，０８０号に開示されたセリバスタチン、米国特許第４，６８１，８９３号、第５，２７３，９９５号、第５，３８５，９２９号及び第５，６８６，１０４号に開示されたアトルバスタチン、米国特許第４，６１３，６１０号に開示されたメバロノラクトン誘導体のピラゾール類似体、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０３４８８に開示されたメバロノラクトン誘導体のインデン類似体、米国特許第４，６４７，５７６号に開示された６−（２−（置換ピロール−１−イル）−アルキル）ピラン−２−オン及びその誘導体、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０７０５４に開示されたＳｅａｒｌｅのＳＣ−４５３５５（３置換ペンタンジオン酸誘導体）ジクロロアセタート、メバロノラクトンのイミダゾール類似体、仏国特許第２，５９６，３９３号に開示された３−カルボキシ−２−ヒドロキシ−プロパン−ホスホン酸誘導体、欧州特許出願第０２２１０２５号に開示された２，３−二置換ピロール、フラン及びチオフェン誘導体、米国特許第４，６８６，２３７号に開示されたメバロノラクトンのナフチル類似体、米国特許第４，４９９，２８９号に開示されたオクタヒドロナフタレン、欧州特許出願第０１４２１４６Ａ２号に開示されたメビノリン（ロバスタチン）のケト類似体、並びに他の公知のＨＭＧ  ＣｏＡリダクターゼ阻害剤が挙げられる。さらに、本明細書における使用にとって好適なＨＭＧ  ＣｏＡリダクターゼを阻害するのに有用なホスフィン酸化合物は、ＧＢ２２０５８３７に開示されている。
【０３８３】
本明細書における使用にとって好適なスクアレン合成酵素阻害剤としては、限定されるものではないが、米国特許第５，７１２，３９６号に開示されたα−ホスホノ−スルホナート、Biller et al, J. Med. Chem., 1988, Vol. 31, No. 10, pp 1869-1871により開示されたもの、例えば、イソプレノイド（ホスフィニルメチル）ホスホナート並びに米国特許第４，８７１，７２１号及び第４，９２４，０２４号に開示された他のスクアレン合成酵素阻害剤が挙げられる。さらに、本明細書における使用にとって好適な他のスクアレン合成酵素阻害剤としては、P. Ortiz de Montellano et al, J. Med. Chem., 1977, 20, 243-249により開示されたテルペノイドピロリン酸、Corey and Volante, J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 1291-1293により開示されたファルネシル二リン酸類似体Ａ及びプレスクアレンピロリン酸（ＰＳＱ−ＰＰ）類似体、McClard, R. W. et al, J.A.C.S., 1987, 109, 5544により報告されたホスフィニルホスホナート並びにCapson, T. L., PhD dissertation, June 1987, Dept. Med. Chem. U of Utah, abstract, Table of Contents, pp 16, 17, 40-43, 48-51, Summaryにより報告されたシクロプロパンが挙げられる。
【０３８４】
本明細書における使用にとって好適な他のコレステロール低下薬としては、限定されるものではないが、フェノフィブラート、ゲンフィブロジル、クロフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クリノフィブラートなどの、フィブリン酸誘導体、プロブコール、及び米国特許第３，６７４，８３６号に開示された関連化合物などの抗高リポタンパク質血症剤（プロブコール及びゲンフィブロジルが好ましい胆汁酸抑制剤、例えば、コレスチラミン、コレスチポール及びＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｃｈｏｌｅｘ（登録商標）、Ｐｏｌｉｄｅｘｉｄｅ（登録商標））である）、並びにクロフィブラート、リポスタビル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ）、Ｅｉｓａｌ  Ｅ−５０５０（Ｎ置換エタノールアミン誘導体、イマニキシ（ｉｍａｎｉｘｉｉ）（ＨＯＥ−４０２）、テトラヒドロリプスタチン（ＴＨＬ）、イスチグマスタニルホスホリルコリン（ＳＰＣ、Ｒｏｃｈｅ）、アミノシクロデキストリン（Ｔａｎａｂｅ  Ｓｅｉｙａｋｕ）、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ  ＡＪ−８１４（アズレン誘導体）、メリナミド（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ）、Ｓａｎｄｏｚ  ５８−０３５、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  ＣＬ−２７７，０８２及びＣＬ−２８３，５４６（二置換尿素誘導体）、ニコチン酸、アシピモックス、アシフラン、ネオマイシン、ｐ−アミノサリチル酸、アスピリン、米国特許第４，７５９，９２３号に開示されたものなどのポリ（ジアリルメチルアミン）誘導体、米国特許第４，０２７，００９号に開示されたものなどの第４級アミンポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）及びイオネン、及び他の公知の血清コレステロール低下剤が挙げられる。
【０３８５】
抗アテローム性動脈硬化剤はまた、Murakami et al, "A Novel Insulin Sensitizer Acts As a Coligand for Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha (PPAR alpha) and PPAR gamma. Effect on PPAR alpha Activation on Abnormal Lipid Metabolism in Liver of Zucker Fatty Rats", Diabetes 47, 1841-1847 (1998)により開示されたものなどのＰＰＡＲα／γ二重アゴニストであってもよい。
【０３８６】
抗アテローム性動脈硬化剤は、"The ACAT inhibitor, Cl-1011 is effective in the prevention and regression of aortic fatty streak area in hamsters", Nicolosi et al, Atherosclerosis (Shannon, Irel). (1998), 137(1), 77-85；"The pharmacological profile of FCE 27677: a novel ACAT inhibitor with potent hypolipidemic activity mediated by selective suppression of the hepatic secretion of ApoB100-containing lipoprotein", Ghiselli, Giancarlo, Cardiovasc. Drug Rev. (1998), 16(1), 16-30；"RP 73163: a bioavailable alkylsulfinyl-diphenylimidazole ACAT inhibitor", Smith, C., et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. (1996), 6(1), 47-50; "ACAT inhibitors: physiologic mechanisms for hypolipidemic and anti-atherosclerotic activities in experimental animals", Krause et al, Editor(s): Ruffolo, Robert R., Jr.; Hollinger, Mannfred A., Inflammation: Mediators Pathways (1995), 173-98, Publisher: CRC, Boca Raton, Fla.；"ACAT inhibitors: potential anti-atherosclerotic agents", Sliskovic et al, Curr. Med. Chem. (1994), 1(3), 204-25；"Inhibitors of acyl-CoA:cholesterol O-acyl transferase (ACAT) as hypocholesterolemic agents. 6. The first water-soluble ACAT inhibitor with lipid-regulating activity. Inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase (ACAT). 7. Development of a series of substituted N-phenyl-N′-[(1-phenylcyclopentyl)methyl]ureas with enhanced hypocholesterolemic activity", Stout et al, Chemtracts: Org. Chem. (1995), 8(6), 359-62に開示されたものなどのＡＣＡＴ阻害剤であってもよい。
【０３８７】
他の抗アテローム性動脈硬化剤はまた、ＷＯ９７／１２６１５に開示されたベンズイミダゾール誘導体などの１５−リポキシゲナーゼ（１５−ＬＯ）阻害剤、ＷＯ９７／１２６１３に開示された１５−ＬＯ阻害剤、ＷＯ９６／３８１４４に開示されたイソチアゾロン、及びSendobry et al "Attenuation of diet-induced atherosclerosis in rabbits with a highly selective 15-lipoxygenase inhibitor lacking significant antioxidant properties, Brit. J. Pharmacology (1997) 120, 1199-1206、及びCornicelli et al, "15-Lipoxygenase and its Inhibition: A Novel Therapeutic Target for Vascular Disease", Current Pharmaceutical Design, 1999, 5, 11-20により開示された１５−ＬＯ阻害剤などのリポキシゲナーゼ阻害剤であってもよい。
【０３８８】
一実施形態では、宿主が閉経周辺期又は閉経後である、宿主における心血管障害を防止する、減弱させる、又は処置する方法が本明細書で提供される。ａＰ２は、閉経前の女性よりも心血管疾患の発生率が高い閉経周辺期及び閉経後の女性において増加することが知られている。したがって、本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤の投与を使用して、循環ａＰ２レベルの上昇と関連する心血管疾患を減弱させる、防止する、又はそれを発症するリスクがある、若しくは発症した閉経周辺期及び閉経後の女性を処置することができる。
【０３８９】
炎症疾患
本明細書に記載の抗ａＰ２抗体及び抗原結合剤を、対象における炎症障害の処置のために投与することができる。炎症は、物理的、化学的、又は生物学的因子により引き起こされる傷害又は異常な刺激に対する応答として生じ得る。炎症反応は、局部反応及びその結果の形態学的変化、感染性生物などの有害材料の破壊又は除去、並びに修復及び治癒をもたらす応答を含んでもよい。障害を参照して使用される場合の用語「炎症性」とは、不適切である、又は正常な様式では解決しない炎症により引き起こされる、その結果生じる、又はそれをもたらす病理学的プロセスを指す。炎症性障害は、全身性であるか、又は特定の組織若しくは臓器に局在化されていてもよい。
【０３９０】
炎症は、限定されるものではないが、全身炎症応答（ＳＩＲＳ）；アルツハイマー病（及び慢性神経炎症、グリア活性化を含む関連する状態及び症状）；ミクログリアの増加；老人斑形成；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、関節炎（及び限定されるものではないが、急性関節炎症、抗原誘導性関節炎、慢性リンパ球性甲状腺炎と関連する関節炎、コラーゲン誘導性関節炎、若年性関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、予後及び連鎖球菌誘導性関節炎、脊椎関節症、及び痛風性関節炎などの関連する状態及び症状）、喘息（及び気管支喘息；慢性閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、若年性喘息及び職業性喘息などの関連する状態及び症状）；心血管疾患（及びアテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、慢性心低酸素症、鬱血性心不全、冠動脈疾患、心筋症並びに大動脈平滑筋細胞活性化、心臓細胞アポトーシス及び心臓細胞機能の免疫調節を含む心臓細胞機能障害などの関連する状態及び症状）；糖尿病（及び自己免疫性糖尿病、インスリン依存性（Ｉ型）糖尿病、糖尿病性歯周炎、糖尿病性網膜症、及び糖尿病性腎症などの関連する状態）；胃腸炎症（及びセリアック病、関連する骨減少症、慢性結腸炎、クローン病、炎症性腸疾患及び潰瘍性大腸炎などの関連状態及び症状）；胃潰瘍；ウイルス性及び他の型の肝炎、コレステロール胆石及び肝線維症などの肝臓炎症；ＨＩＶ感染（及び変性応答、神経変性応答、及びＨＩＶ関連ホジキン病などの関連する状態）；川崎症候群（及び皮膚粘膜リンパ節症候群、頸部リンパ節腫脹、冠動脈病変、浮腫、発熱、白血球増加、軽度の貧血、表皮剥脱、発疹、結膜発赤、血小板増加症などの関連する疾患及び状態）；腎症（及び糖尿病性腎症、末期腎不全、急性及び慢性糸球体腎炎、急性及び慢性間質性腎炎、ループス腎炎、グッドパスチャー症候群、血液透析生存及び腎虚血性再かん流傷害などの関連する疾患及び状態）；神経変性疾患又は神経病理学的状態（及び急性神経変性、加齢及び神経変性疾患におけるＩＬ−１の誘導、視床下部ニューロンのＩＬ−１誘導性可塑性及び慢性ストレス過敏症、ミエロパシーなどの関連する疾患及び状態）；眼病（及び糖尿病性網膜症、グレーブス眼病、角膜外傷又は角膜潰瘍を含む感染と関連する炎症、及びブドウ膜炎などの関連する疾患及び状態）、骨粗鬆症（及び歯槽骨、大腿骨、橈骨、椎骨又は手根骨の減少又は骨折の発生、閉経後骨量減少、骨折の発生又は骨量減少の速度などの関連する疾患及び状態）；中耳炎（成人又は小児）；膵炎又は膵臓細葉炎；歯周病（及び成人性、早発性及び糖尿病性などの関連する疾患及び状態）；慢性肺疾患、慢性副鼻腔炎、ヒアリン膜症、ＳＩＤＳにおける低酸素症及び肺疾患などの肺疾患；冠動脈又は他の血管移植片の再狭窄；関節リウマチ、リウマチ性アショフ体、リウマチ疾患及びリウマチ性心筋炎などのリウマチ；慢性リンパ球性甲状腺炎などの甲状腺炎；慢性前立腺炎、慢性骨盤痛症候群及び尿石症などの尿路感染；円形脱毛症、自己免疫性心筋炎、グレーブス病、グレーブス眼病、硬化性苔癬、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、全身硬化症、甲状腺疾患、例えば、甲状腺腫及びリンパ性甲状腺腫（橋本甲状腺炎、リンパ節様甲状腺腫）などの、自己免疫疾患を含む免疫障害；肺損傷（急性出血性肺損傷、グッドパスチャー症候群、急性虚血再かん流）、職業性及び環境性汚染物質（例えば、毒性油症候群珪肺に対する感受性）により引き起こされる心筋梗塞、放射線外傷、及び創傷治癒応答の効率（例えば、熱傷又は温度創傷、慢性創傷、外科的創傷及び脊髄損傷）、敗血症、急性期応答（例えば、発熱応答）、一般的炎症応答、急性呼吸窮迫症候群、急性全身炎症応答、創傷治癒、接着、免疫炎症応答、神経内分泌応答、発熱及び発熱耐性、急性期応答、ストレス応答、疾患感受性、反復運動ストレス、テニス肘、並びに疼痛管理及び応答を含む多くの障害において起こることが知られている。
【０３９１】
本発明の一実施形態では、抗炎症剤と共に、又は交互に、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を宿主に投与することによって宿主におけるＩ型糖尿病を処置する方法が本明細書で提供される。抗炎症剤は、ステロイド性抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤、又はその組合せであってもよい。一部の実施形態では、抗炎症薬としては、限定されるものではないが、アルクロフェナク、アルクロメタゾンプロピオン酸エステル、アルゲストンアセトニド、アルファアミラーゼ、アムシナファル、アムシナフィド、アムフェナクナトリウム、塩酸アミプリローズ、アナキンラ、アニロラック、アニトラザフェン、アパゾン、バルサラジドジナトリウム、ベンダザック、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロメライン、ブロペラモール、ブデゾニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリプロフェン、プロピオン酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾン、クロピラック、プロピオン酸クロチカゾン、酢酸コルメタゾン、コルトドキソン、デフラザコート、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾンプロピオン酸エステル、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジフロラゾン酢酸エステル、ジフルミドンナトリウム、ジフルニサル、ジフルプレドナート、ジフタロン、ジメチルスルホキシド、ドロシノニド、エンドリソン、エンリモマブ、エノリカムナトリウム、エピリゾール、エトドラック、エトフェナマート、フェルビナク、フェナモール、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロラック、フェンドザル、フェンピパロン、フェンチアザック、フラザロン、フルアザコート、フルフェナミン酸、フルミゾール、酢酸フルニゾリド、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルコルチンブチル、酢酸フルオロメトロン、フルクアゾン、フルルビプロフェン、フルレトフェン、プロピオン酸フルチカゾン、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタゾール、酢酸ハロプレドン、イブフェナク、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノール、イロニダップ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、酢酸イソフルプレドン、イソキセパック、イソキシカム、ケトプロフェン、塩酸ロフェミゾール、ロモキシカム、ロテプレドノールエタボナート、メクロフェナム酸ナトリウム、メクロフェナム酸、メクロリソンジブチラート、メフェナム酸、メサラミン、メセクラゾン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、モルニフルマート、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、塩酸パラニリン、ペントサン多硫酸ナトリウム、フェンブタゾンナトリウムグリセラート、ピルフェニドン、ピロキシカム、桂皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピルプロフェン、プレドナザート、プリフェロン、プリフェロン、プロドール酸、プロクアゾン、プロキサゾール、クエン酸プロキサゾール、リメキソロン、ロマザリット、サルコレックス、サルナセジン、サルサラート、塩化サングイナリウム、セクラゾン、セルメタシン、スドキシカム、スリンダック、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルマート、タロサラート、テブフェロン、テニダップ、テニダップナトリウム、テノキシカム、テシカム、テシミド、テトリダミン、チオピナック、チクソコルトールピバル酸エステル、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロニド、トリフルミダート、ジドメタシン、ゾメピラックナトリウム、アスピリン（アセチルサリチル酸）、サリチル酸、コルチコステロイド、糖質コルチコイド、タクロリムス、ピメコルリムス、そのプロドラッグ、そのコドラッグ、及びその組合せが挙げられる。
【０３９２】
がん
本発明は、本明細書に開示される抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤を投与して、がんを処置する方法をさらに提供する。一実施形態では、がんは、脂肪肉腫、腸間膜混合ミュラー腫瘍、脊髄神経鞘腫、胆嚢がん、前立腺がん、脳星状細胞腫、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、結腸がん、食道がん、閉経後乳がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、及び膵臓がんから選択される。
【０３９３】
本発明の一実施形態では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を投与することによって、宿主における増殖性障害、例えば、腫瘍又は新生物を処置するための方法が提供される。一実施形態では、腫瘍は、移行膀胱がん、卵巣がん、及び脂肪肉腫から選択される。
【０３９４】
一実施形態では、がんは膀胱がんである。一実施形態では、がんは膀胱の移行細胞癌である。本発明の一実施形態では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を宿主に投与することによって宿主における膀胱がんを処置する方法が本明細書で提供される。
【０３９５】
本発明の一実施形態では、さらなる化学療法剤と共に、又は交互に、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を投与することによって宿主における膀胱がんを処置する方法が提供される。膀胱がんの処置のためのさらなる化学療法剤としては、限定されるものではないが、メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シスプラチン、ゲンシタビン、カルボプラチン、パクリタキセル、及びエピルビシンが挙げられる。
【０３９６】
一実施形態では、がんは卵巣がんである。本発明の一実施形態では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を宿主に投与することによって宿主における卵巣がんを処置する方法が本明細書で提供される。
【０３９７】
本発明の一実施形態では、さらなる化学療法剤と共に、又は交互に、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を投与することによって宿主における卵巣がんを処置するための方法が提供される。卵巣がんの処置のためのさらなる化学療法剤としては、限定されるものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、アルブミン結合パクリタキセル、アルトレタミン、カペシタビン、シクロホスファミド、エトポシド、ゲンシタビン、イホスファミド、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、メルファラン、ペメトレキセド、トポテカン、及びビノレルビンが挙げられる。
【０３９８】
本発明の一実施形態では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を投与することによって宿主における脂肪肉腫を処置する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、脂肪肉腫は、高分化型脂肪肉腫、粘液性脂肪肉腫、多形型脂肪肉腫、又は脱分化型脂肪肉腫である。一実施形態では、肉腫、例えば、限定されるものではないが、線維性組織球腫、滑膜肉腫、又は平滑筋肉腫を処置する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤は、化学療法剤及び／又は放射性薬剤と共に投与される。
【０３９９】
一実施形態では、新生物は、良性脂肪腫、例えば、腺脂肪腫、血管脂肪平滑筋腫、血管脂肪腫、小脳橋角及び内耳道脂肪腫、軟骨脂肪腫、脳梁脂肪腫、冬眠腺腫、皮内紡錘細胞脂肪腫、神経性線維脂肪腫、多形型脂肪腫、紡錘細胞脂肪腫、及び表在性皮下脂肪腫である。
【０４００】
ａＰ２媒介性障害の重症度を減弱させる方法
治療有効量の本明細書に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合剤を宿主に投与することによって、宿主、典型的には、ヒトにおけるａＰ２の異常なレベルにより引き起こされる疾患又は障害を防止又は処置する方法が提供される。モノクローナル抗体又は断片は、ａＰ２の生物活性を部分的に、又は完全に阻害する、又は軽減するのに十分な用量で投与される。
【０４０１】
一態様では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を投与し、分泌されたａＰ２の生物活性の減少若しくは減弱化、並びに上昇したａＰ２血清レベルの関連する生理学的硬化の減少、例えば、総コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、及び／若しくはトリグリセリド、空腹時血糖値、脂肪量レベル、肝臓グルコース産生、脂肪細胞脂肪分解、高インスリン血症、及び／又は肝臓脂肪変性の軽減をもたらすことによって、宿主におけるａＰ２媒介性障害を防止する、又はその重症度を減弱させる方法が提供される。一実施形態では、分泌されたａＰ２の生物活性の減弱化は、インスリン感受性、グルコース代謝の増加、及び／又は膵島β細胞死、機能障害、若しくは喪失の防止をもたらす。
【０４０２】
本発明の一態様では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体又は抗原結合剤を投与することによって、宿主における総コレステロールを減少させる方法が提供される。一実施形態では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２モノクローナル抗体を投与することによって、宿主における総コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、及び／又はトリグリセリドを減少させる方法が本明細書で提供される。
【０４０３】
本発明の他の態様では、有効量の本明細書に記載の抗ａＰ２抗体又は抗原結合剤を、それを必要とする宿主、典型的には、ヒトに投与することを含む、
空腹時血糖値を低下させる方法；
脂肪量レベルを低下させる方法；
肝臓グルコース産生を減少させる方法；
脂肪細胞脂肪分解を減少させる方法；
高インスリン血症を軽減する方法；
肝臓脂肪変性を軽減する方法；
グルコース代謝を増加させる方法；
インスリン感受性を増大させる方法；
β細胞死、機能障害、若しくは喪失を防止する方法；及び／又は
宿主における循環分泌ａＰ２レベルを決定する方法
が提供される。
【実施例】
【０４０４】
脂質シャペロンａＰ２／ＦＡＢＰ４は糖尿病及びアテローム性動脈硬化症等の多くの免疫代謝疾患の病理に関係している。複数の系列の証拠もまた、ヒト疾患におけるその関与を支持しているが、治療応用のためにａＰ２をターゲティングすることはまだ達成されていない。最近の研究により、ａＰ２は単に細胞内タンパク質だけでなく、肝臓糖新生を促進し、末梢インスリン作用を妨げることによって高血糖の一因となる活性アディポカインであることもまた、示されている。血清ａＰ２レベルはマウス及びヒトの肥満において著しく上昇し、代謝合併症と強く相関する。例示的な実施形態として、ウサギ９０９ＶＨ（配列番号４５４）及び９０９ＶＬ（配列番号４４５）を含むウサギ−マウスハイブリッド抗ａＰ２モノクローナル抗体である、低い結合親和性モノクローナル抗ａＰ２抗体ＣＡ３３は、肥満マウスにおいて、空腹時血糖値を下げ、全身のグルコース代謝を改善し、全身のインスリン感受性を増加させ、脂肪質量及び肝臓脂肪症を低減させることが記載されている。ａＰ２−ＣＡ３３複合体の構造を調べ、標的エピトープを、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効性を欠いている別のモノクローナル抗体（抗ａＰ２モノクローナル抗体Ｈ３）と比較した結晶学的研究によって決定した。高インスリン血症−正常血糖クランプ研究において、ＣＡ３３の抗糖尿病効果は肝臓グルコース生産の調節及び末梢グルコース利用と主に関連していた。重要なことに、この抗体はａＰ２欠損マウスにおいて生物学的効果を示さず、その標的特異性を実証している。
【０４０５】
（実施例１）
分泌ａＰ２をターゲティングする例示的モノクローナル抗体の調製
動物
動物の世話及び実験手順は、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験委員会からの承認を得て実施した。オスのマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するレプチン欠損（ｏｂ／ｏｂ）及び食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウス）はＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、１２時間の明／暗周期で飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するＤＩＯマウスを、クランプ研究において、そのためにそれらのマウスを２０週間ＨＦＤで維持したことを除いて、処置を開始する前に高脂肪食（６０％ｋｃａｌの脂肪、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｄ１２４９２ｉ）で１２〜１５週間維持した。レプチン欠損（ｏｂ／ｏｂ）マウスを通常の食餌（ＲＤ、ＰｉｃｏＬａｂ  ５０５８  Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ）で維持した。使用した動物は、規定食モデルについて１８〜３１週齢及びｏｂ／ｏｂモデルについて９〜１２週齢であった。全ての実験において、本文書において他に述べられていない限り、各群において少なくとも７匹のマウスを使用した。マウスを、３〜５週にわたって、１週間に２回の皮下注射によって１５０μｌのＰＢＳ（ビヒクル）又は１５０μｌのＰＢＳ中の１匹のマウス当たり１．５ｍｇ（約３３ｍｇ／ｋｇ）の抗ａＰ２モノクローナル抗体で処置した（図１Ｂ）。日中の食餌離脱の６時間後、処置の前後に血液試料を尾から採取した。給餌状態において体重を毎週測定した。食餌離脱の６時間後又は一晩絶食の１６時間後に血糖値を毎週測定した。２週間の処置後、ブドウ糖負荷試験を腹腔内グルコース注射（ＤＩＯについて０．７５ｇ／ｋｇ、ｏｂ／ｏｂマウスについて０．５ｇ／ｋｇ）によって実施した。３週間の処置後、インスリン負荷試験を腹腔内インスリン注射（０．７５ＩＵ／ｋｇ）によってＤＩＯマウスにおいて実施した。５週間の処置後、高インスリン血症−正常血糖クランプ実験を以前に記載されているようにＤＩＯマウスにおいて実施した（Furuhashi et al., (2007) Nature 447, 959-965；Maeda et al., (2005) Cell metabolism 1, 107-119）。
【０４０６】
代謝ケージ（Ｏｘｙｍａｘ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及び二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ；ＰＩＸＩｍｕｓ）による総体脂肪質量測定を以前に記載されているように実施した（Furuhashi et al., (2007) Nature 447, 959-965）。
【０４０７】
抗ａＰ２抗体の産生及び投与
ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３及びＣＡ３３（ウサギＡｂ９０９）を産生し、ＵＣＢによって精製した。ニュージーランド白ウサギを、組換えヒト及びマウスａＰ２（社内において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で生成した：それぞれ受託番号ＣＡＧ３３１８４．１及びＣＡＪ１８５９７．１）を含有する混合物で免疫化した。脾細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び骨髄を免疫化したウサギから採取し、続いて−８０℃にて保存した。免疫化した動物由来のＢ細胞培養物を、Zubler et al., ("Mutant EL-4 thymoma cells polyclonally activate murine and human B cells via direct cell interaction", J Immunol 134, 3662-3668 (1985)によって記載されている方法と同様の方法を使用して調製した。７日のインキュベーション後、抗原特異的抗体含有ウェルを、Ｓｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に固定したビオチン化マウス又はヒトａＰ２を用いて同種蛍光結合免疫吸着法を使用して識別した。目的のウェルから抗原特異的Ｂ細胞を識別し、単離し、回収するために、本発明者らは蛍光焦点法を使用した（Clargo et al., (2014) mAbs 6, 143-159）。この方法は、陽性ウェルからＢ細胞を採取するステップと、ビオチン化マウス及びヒトａＰ２並びにヤギ抗ウサギＦｃ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でコートした常磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合するステップとを含んだ。３７℃にて１時間の静的インキュベーション後、そのＢ細胞周囲の蛍光ハロの存在に起因して抗原特異的Ｂ細胞を識別することができた。個々の抗原特異的抗体を分泌するＢ細胞を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０顕微鏡を使用して見て、エッペンドルフマイクロマニピュレーターを用いて採集し、ＰＣＲチューブ内に沈着させた。これらの単一Ｂ細胞由来の可変領域遺伝子を、重及び軽鎖可変領域に特異的であるプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって回収した。様々な発現ベクター内への可変領域；マウスγ１  ＩｇＧ、マウスＦａｂ、ウサギγ１  ＩｇＧ（ＶＨ）又はマウスカッパ及びウサギカッパ（ＶＬ）のクローニングを可能にする３’及び５’末端において制限部位を組み込んでいるネステッド２°ＰＣＲにより、２ラウンドのＰＣＲを実施した。重及び軽鎖構築物を、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＥＫ−２９３細胞内にトランスフェクトし、組換え抗体を６ウェルプレート内に発現させた。５日の発現後、上清を採取し、抗体を、ＢｉａＣｏｒｅシステムを使用した生体分子相互作用分析によってさらなるスクリーニングに供して、親和性及びエピトープビン（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎ）を決定した。
【０４０８】
マウス抗ａＰ２モノクローナル抗体Ｈ３は、Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって産生された。メスのＣ５７ＢＬ／６  ａＰ２−／−マウス、４〜６週齢を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中に懸濁し、等体積の完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で乳化した完全長ヒトａＰ２／ＦＡＢＰ４−Ｇｓｔ組換えタンパク質の注射によって免疫化した。脾臓を免疫化したマウスから採取し、細胞懸濁液を調製し、ＰＢＳで洗浄した。脾臓細胞をカウントし、２：１の脾臓：骨髄腫の比にて重又は軽鎖免疫グロブリンのいずれかを分泌できないＳＰ２／０骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ８−００６、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）と混合した（Kearney et al., (1979) Journal of Immunology 123, 1548-1550）。細胞を、標準的な手順（Kohler et al., (1975) Nature 256, 495-497）に従ってＨＡＴ選択培地入りの１２個の９６ウェル組織培養プレート中でポリエチレングリコール１４５０（ＡＴＣＣ）と融合した。融合後、１０から２１日の間、ハイブリドーマコロニーが可視化でき、培養上清を採取し、次いでｓｔｒｅｐ−Ｈｉｓ−ヒト−ａＰ２／ＦＡＢＰ４でのウェスタンブロットによってスクリーニングした。１７個の選択した陽性ウェルの二次スクリーニングを、５０μｌ／ウェルのｓｔｒｅｐ−Ｈｉｓ−ヒト−ａＰ２／ＦＡＢＰ４の２μｇ／ｍｌ溶液（０．１μｇ／ウェル）又は無関係のＧｓｔタンパク質でコートし、４℃にて一晩インキュベートした高タンパク質結合９６ウェルＥＩＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を使用して行った。陽性ハイブリドーマを限界希釈によってサブクローニングし、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。上清融合物を、Ｉｓｏｓｔｒｉｐキット（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてアイソタイプを判別した（ｉｓｏｔｙｐｅｄ）。
【０４０９】
ラージスケール一過性トランスフェクションを、ＵＣＢが所有しているＣＨＯＳＸＥ細胞系及びエレクトロポレーション発現プラットフォームを使用して実施した。細胞を、３７℃にて８％ＣＯ２を補充したシェーカーインキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ  ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、スイス）において１４０ｒｐｍにて２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを補充したＣＤＣＨＯ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）中で対数増殖期に維持した。トランスフェクションの前に、細胞数及び生存率を、ＣＥＤＥＸ細胞計数器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  ＡＧ．Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、ドイツ）を使用して決定し、２×１０８細胞／ｍｌを１０分間１４００ｒｐｍにて遠心分離した。ペレット化した細胞を、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＭａｘＣｙｔｅ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で洗浄し、さらに１０分間再び回転させ、ペレットを新鮮な緩衝液中で２×１０８細胞／ｍｌにて再懸濁した。次いでＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｌｕｓ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（登録商標）を使用して精製したプラスミドＤＮＡを４００μｇ／ｍｌにて加えた。ＭＡｘｃｙｔｅ  ＳＴＸ（登録商標）フローエレクトロポレーション機器を使用したエレクトロポレーション後、細胞を、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ及び抗生物質である抗有糸分裂溶液を含有するＰｒｏＣＨＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中でトランスフェクトし、３７℃及び５％ＣＯ２にてＢｉｏｒｅａｃｔｏｒプラットフォームセットに置いた、２５ｒｐｍの振動によって波動が誘導されるウェーブバッグ（Ｃｅｌｌ  Ｂａｇ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で培養した。
【０４１０】
トランスフェクションの２４時間後、ボーラス供給物を加え、温度を３２℃に低下させ、培養の持続期間（１２〜１４日間）の間維持した。４日目に、３ｍＭの酪酸ナトリウム（ｎ−ＢＵＴＲＩＣ  ＡＣＩＤナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ  Ｂ−５８８７）を培養物に加えた。１４日目に、培養物を４０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、保持した上清を、０．２２μｍのＳＡＲＴＯ  ＢＲＡＮ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、続いて０．２２μｍのＧａｍｍａゴールドフィルターによって濾過した。マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現するＣＨＯＳＸＥ採取物をＮａＣｌ（４Ｍまで）の添加によって調整した。試料を、１５ｍｌ／分にて０．１Ｍのグリシン＋４ＭのＮａＣｌ  ｐＨ８．５で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ充填カラム（ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。試料を０．１Ｍのグリシン＋４ＭのＮａＣｌ  ｐＨ８．５で洗浄し、さらなる洗浄ステップを０．１５ＭのＮａ２ＨＰＯ４  ｐＨ９で実施した。Ａ２８０ｎｍにおけるＵ．Ｖ吸光度ピークを、０．１Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ３．４溶出緩衝液を使用したカラムからの溶出の間に収集し、次いで２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５の添加によってｐＨ７．４に中和した。次いでプロテインＡからのｍＡｂプールを、ミニセッテ（ｍｉｎｉｓｅｔｔｅ）タンジェンシャルフローフィルトレーションデバイスを使用して適切な体積に濃縮し、その後、ＨｉＬｏａｄ  ＸＫ  ５０／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００分取用グレードゲル濾過カラム（ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製した。次いで回収した画分をモノマーピークについて分析的ゲル濾過技術によって分析し、清浄なモノマー画分を最終産物としてプールした。次いで最終産物試料を、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びに最終的な純度の確認のために分析的ゲル濾過によって特徴付けた。試料をまた、試験し、エンドトキシン測定のためのＬＡＬアッセイ法を使用してエンドトキシンについて陰性であることを見出した。試験した全てのｍＡｂについての最終的な緩衝液はＰＢＳであった。ｉｎ  ｖｉｖｏ分析に関して、精製した抗体を生理食水中で１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、高脂肪食のｏｂ／ｏｂ及びＷＴマウス内に１匹のマウス当たり１．５ｍｇ（３３ｍｇ／ｋｇ）の用量で注射した。
【０４１１】
抗体親和性の測定
ａＰ２（以下に記載されているように大腸菌内で組換えにより生成した）に対する抗ａＰ２結合の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した生体分子相互作用分析によって決定した。１０ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ５緩衝液中のＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ，Ｉｎｃ．）を、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して４５００〜６０００の間の反応単位（ＲＵ）の捕捉レベルでアミンカップリング化学によってＣＭ５センサーチップに固定した。抗ａＰ２  ＩｇＧをランニング緩衝液中で１〜１０μｇ／ｍｌの間に希釈した。１０μｌ／分での抗ａＰ２  ＩｇＧの６０秒の注射を、固定した抗マウスＩｇＧ、Ｆｃによる捕捉のために使用し、次いでａＰ２を、３０μ／分にて１８０秒間、捕捉した抗ａＰ２に対して２５ｎＭから３．１３ｎＭまで滴定し、続いて３００秒解離した。表面を、１０μｌ／分にて、２×６０秒、４０ｍＭのＨＣｌ及び１×３０秒、５ｍＭのＮａＯＨによって再生した。局所的Ｒｍａｘで１：１の結合モデルを使用したＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン１．０）を使用してデータを分析した。ＣＡ３３に関して、１０μｌ／分における抗体の６０秒の注射を、固定化した抗マウスＩｇＧ、Ｆｃによる捕捉のために使用し、次いでａＰ２を、３０μｌ／分にて１８０秒間、捕捉した抗ａＰ２に対して４０μＭから０．６２５μＭまで滴定し、続いて３００秒解離した。表面を、１０μ／分にて、１×６０秒、４０ｍＭのＨＣｌ、１×３０秒、５ｍＭのＮａＯＨ及び１×６０秒、４０ｍＭのＨＣｌによって再生した。定常状態フィッティングを使用して親和性の値を決定した。
【０４１２】
抗体交差遮断
捕捉したウサギ抗ａＰ２  ＩｇＧに対するマウス抗ａＰ２  ＩｇＧの存在下又は非存在下でマウスａＰ２を注射することによってアッセイを実施した。生体分子相互作用分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）を使用して実施した。抗ａＰ２ウサギＩｇＧの一過性の上清を、１０μ／分の流速及び６０秒の注射を使用して固定した抗ウサギＦｃ表面（１つのフローセル当たり１つの上清）に捕捉して、２００ＲＵを超える反応レベルを得た。次いで１００ｎＭ、０ｎＭにてマウスａＰ２又は１００ｎＭにてマウスａＰ２と５００ｎＭにてマウス抗ａＰ２  ＩｇＧを１２０秒間通過させ、続いて１２０秒解離した。表面を、２×６０秒、４０ｍＭのＨＣｌ及び１×３０秒、５ｍＭのＮａＯＨで再生した。
【０４１３】
ＦＡＢＰ交差反応
組換えヒトタンパク質ａＰ２（大腸菌内でＵＣＢにおいて生成した（以下の方法を参照のこと））、ｈＦＡＢＰ３（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）及びｈＦＡＢＰ５／ｈＭａｌ１（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）を、５倍モル過剰のＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてビオチン化し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して未結合のビオチンから精製した。全ての結合研究は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ３８４システム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．）を使用して２５℃にて実施した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中での１２０秒のベースラインステップ後、Ｄｉｐ及びＲｅａｄＴＭストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．）に、６０ｎｍにて９０秒間、ビオチン化した組換えｈａＰ２、ｈＦＡＢＰ３又はｈＦＡＢＰ５／ｈＭａｌ１を負荷した。ＰＢＳ−Ｔ中での６０秒の安定化ステップ後、各々のＦＡＢＰを負荷したバイオセンサーを、８００ｎＭにてモノクローナル抗体の試料に移し、会合を５分間測定した。次いでバイオセンサーを５分間、ＰＢＳ−Ｔに戻して解離を測定した。抗体の非特異的結合を、負荷していないバイオセンサーチップを使用してモニターした。最大会合結合、すなわちシグナルが水平になると、バックグラウンド結合を差し引いて、各抗体／ＦＡＢＰの組合せについてプロットした。
【０４１４】
ａＰ２発現及び精製
大腸菌内での発現のために最適化したマウス（又はヒト）ａＰ２  ｃＤＮＡは、ＤＮＡ  ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）から購入し、インフレームＮ末端１０Ｈｉｓ−タグ、続いてタバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位を含有する修飾したｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に直接サブクローニングした。タンパク質を大腸菌株ＢＬ２１ＤＥ３内で発現させ、以下のように精製した。典型的に、細胞を、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠剤、ＥＤＴＡ−フリー（Ｒｏｃｈｅ、Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｈｉｌｌ）を補充した大腸菌培養物１リットル当たり５０ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４））中で、冷却した細胞破壊器（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．）を用いて溶解した。次いで溶解物を高速遠心分離（６００００ｇ、３０分、４℃）によって清浄化した。１００ｍｌの除去した溶解物当たり４ｍｌ／Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、４℃にて１時間回転させた。ビーズを、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合したＴｒｉ−Ｃｏｒｎカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填し、タンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液中で溶出した。４〜１２％のＢｉｓ／Ｔｒｉｓ  ＮｕＰａｇｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）ゲル電気泳動によって判断して目的のタンパク質を含有する画分を透析してイミダゾールを除去し、１００ｍｇのタンパク質当たり１ｍｇの割合にてＴＥＶプロテアーゼで処理した。４℃にて一晩のインキュベーション後、試料をＴｒｉ−Ｃｏｒｎカラム内のＮｉ／ＮＴＡビーズに再び通した。未標識の（すなわちＴＥＶ切断型）ａＰ２タンパク質はビーズと結合せず、カラムフロースルー中に回収された。タンパク質を濃縮し、ＰＢＳ、１ｍＭのＤＴＴ中で予め平衡化したＳ７５  ２６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。ピーク画分をプールし、５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次いでこのタンパク質の６ｍｌを抽出し、２：１の比にてアセトニトリルで沈殿させて全ての脂質を除去した。１６０００ｇにて１５分間の遠心分離後、アセトニトリル＋緩衝液を元の脂質含有量の分析のために除去した。次いで変性タンパク質のペレットを６ｍｌの６ＭのＧｕＨＣｌ  ＰＢＳ＋２μＭｏｌｅのパルミチン酸（５：１の比のパルミチン酸対ａＰ２）中に再懸濁し、次いでリフォールディングを可能にするために４℃にて２０時間、５ＬのＰＢＳに対して２回透析した。沈殿物を除去するための遠心分離後（１６０００ｇ、１５分）、ＰＢＳ中のＳ７５  ２６／２０カラムを使用してタンパク質をゲル濾過して凝集物を除去した。ピーク画分をプールし、１３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０４１５】
ａＰ２結晶学
精製したマウスａＰ２を、以下のようにＣＡ３３及びＨ３  Ｆａｂ（従来の方法によってＵＣＢにおいて生成した）と複合体化した。複合体は、１３ｍｇ／ｍｌにて０．５ｍｌのａＰ２を、２１．８ｍｇ／ｍｌにて０．８ｍｌのＣＡ３３  Ｆａｂ又は１３．６ｍｇ／ｍｌにて１．２６ｍｌのＨ３  Ｆａｂのいずれかと混合することによって作製した（１．２：１のａＰ２：Ｆａｂのモル比）。タンパク質を室温にて３０分間インキュベートし、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ＋５％のグリセロール中でＳ７５  １６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流した。ピーク画分をプールし、結晶学のために１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０４１６】
市販のスクリーニングキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してシッティングドロップ結晶化実験を設定した。結晶化条件を最適化することを必要とせずに一次結晶化スクリーニングにおいて直接、回折品質の結晶を得た。ａＰ２／ＣＡ３３複合体に関して、ウェル溶液は０．１ＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、０．２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１６％のＰＥＧ  ４Ｋ及び１０％のイソプロパノールを含有した。ａＰ２／Ｈ３複合体に関して、ウェル溶液は０．１ＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５、０．１５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び２４％のＰＥＧ  ４Ｋを含有した。ａＰ２／ＣＡ３３について２．９Åデータセット及びａＰ２／Ｈ３について２．３Åデータセットを与えるｉ０２（λ＝０．９７９４９）でＤｉａｍｏｎｄ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎにおいてデータを収集した。ＡＰ２及びＦａｂドメイン開始モデルと共にＰｈａｓｅｒ（４４）（ＣＣＰ４）を使用した分子置換によって構造を決定した。２つの複合体がａＰ２／ＣＡ３３について非対称ユニットであり、ａＰ２／Ｈ３について１つであることを見出した。全ての改良統計値が両方のモデルに対して収束するまで、ＣＮＳ（Brunger et al., (2007) Nature Protocols 2, 2728-2733）及びｃｏｏｔ（Emsley et al., (2004) Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 60, 2126-2132）（ＣＣＰ４）を使用して改良及びモデル構築のサイクルを実施した。上記のエピトープ情報はａＰ２／Ｆａｂ接触面において４Å距離内の原子を考慮することによって導き出された。データ収集及び改良統計値を以下に示す。丸括弧内の値は高解像度シェルを指す。
【表１３】
2018515082.tif 000044
【０４１７】
高インスリン血症−正常血糖クランプ研究及び肝臓生化学アッセイ
高インスリン血症−正常血糖クランプを、報告されている手順（Cao et al., (2013) Cell Metab. 17, 768-778）の改良によって実施した。具体的には、マウスを５時間の絶食後に固定し、５ｍＵ／ｋｇ／分のインスリンを注入した。血液試料を血漿グルコース濃度の中間測定のために１０分間隔で採取し、２５％のグルコースを可変の割合で注入して、基礎濃度において血漿グルコースを維持した。ベースラインの全身グルコース処理を［３−３Ｈ］−グルコース（０．０５μＣｉ／分）の持続注入により推定した。この後にインスリン刺激による全身グルコース処理を決定し、それにより［３−３Ｈ］−グルコースを０．１μＣｉ／分にて注入した。
【０４１８】
肝臓内の総脂質を、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒプロトコール（Bligh et al., (1959) Canadian J. Biochem. and Phys. 37, 911-917）に従って抽出し、比色法を、製造業者の使用説明書（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って市販のキットによるトリグリセリド含有量測定のために使用した。糖新生酵素Ｐｃｋ１活性を、報告されている方法（Petrescu et al., (1979) Analytical Biochem. 96, 279-281）の改良によって測定した。グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）活性をＳｉｇｍａプロトコール［ＥＣ  ３．１．３．９］の改良によって測定した。簡潔に述べると、肝臓を、２５０ｍＭのスクロース、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ及びＥＤＴＡを含有する溶解緩衝液中でホモジナイズした。溶解物を１５分間、最高速度で遠心分離し、上清（主に細胞質）を単離した。次いでミクロソーム画分を細胞質試料の超遠心分離によって単離した。ミクロソームタンパク質濃度を市販のＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。２００ｍＭのグルコース−６−リン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）をＢｉｓ−Ｔｒｉｓ中でプレインキュベートした。１５０μｇのミクロソームタンパク質又は組換えＧ６Ｐａｓｅの段階希釈を加え、３７℃にて２０分間、その溶液中でインキュベートした。次いで２０％のＴＣＡを加え、混合し、室温にて５分間インキュベートした。試料を４℃にて１０分間、最高速度で遠心分離し、上清を別のＵＶプレートに移した。発色試薬を加え、６６０ｎｍにて吸光度を測定し、組換えグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）酵素の段階希釈で調製した標準曲線に正規化した。
【０４１９】
血漿ａＰ２、ｍａｌ１、ＦＡＢＰ３、アディポネクチン、グルカゴン及びインスリンＥＬＩＳＡ
血液を、日中の食餌離脱の６時間後又は一晩の食餌離脱の１６時間後、尾部出血によってマウスから採取した。末梢血液試料を心穿刺によって採取したか、又は尾静脈から採取した。試料を４℃にて１５分間３，０００ｒｐｍにて微量遠心分離器において回転させた。血漿ａＰ２（Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ  Ｒ＆Ｄ）、ｍａｌ１（Ｃｉｒｃｕｌｅｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍａｌ１  ＥＬＩＳＡ、ＣｙｃＬｅｘ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、日本）、ＦＡＢＰ３（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）グルカゴン、アディポネクチン（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）及びインスリン（インスリン−マウス超高感度ＥＬＩＳＡ、Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）測定を製造業者の使用説明書に従って実施した。
【０４２０】
定量的リアルタイムＰＣＲ分析
組織を日中の食餌離脱の６時間後に採取し、即座に凍結させ、−８０℃にて保存した。ＲＮＡ単離を、製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して実施した。第１の鎖ｃＤＮＡ合成のために、０．５〜１ｎｇのＲＮＡ及び５×ｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用した（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｕｓ、ＣＡ）。定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）を使用して実施し、ＶｉｉＡ７  ＰＣＲ機械（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）を使用して試料を分析した。Ｑ−ＰＣＲのために使用したプライマーは以下の通りであった：
【表１４】
2018515082.tif 000045
【０４２１】
統計的分析
結果は平均±ＳＥＭとして示す。統計的有意性は反復測定ＡＮＯＶＡ又はスチューデントのｔ検定によって決定した。＊はｐ＜０．０５における有意性を示し、＊＊はＰ＜０．０１における有意性を示す。
【０４２２】
抗ａＰ２モノクローナル抗体開発及びスクリーニング
肥満は、肝臓グルコース産生の上昇並びに低減した末梢グルコース処理及びインスリン耐性、２型糖尿病の特徴の原因となる、循環ａＰ２の増加した値に関連している。したがって、血清ａＰ２を中和することは、糖尿病及び場合により他の代謝疾患を治療するための効果的な手法となる。
【０４２３】
ヒト及びマウスａＰ２ペプチドに対して惹起したマウス及びウサギ−マウスハイブリッドモノクローナル抗体を産生し、スクリーニングした。Ｂｉａｃｏｒｅシステムを使用した生体分子相互作用分析による結合親和性の評価により、マイクロモルから低ナノモルの範囲まで、これらの抗体に対する広範囲の親和性が実証された（図１Ａ）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの抗体の潜在的効果についての開始試験として、抗体を、高脂肪食（ＨＦＤ）誘発性肥満を有するマウスに４週間皮下投与した（図１Ｂ）。ＨＦＤ給餌の結果、実験の間に血清インスリンレベルの上昇、マウス抗体Ｈ３による処置によって鈍化し、ハイブリッド抗体ＣＡ３３によって反転したが、試験した他の３つのハイブリッド抗体によって元に戻る効果が生じた（図１Ｃ）。興味深いことに、ＣＡ３３はまた、空腹時血糖も有意に減少させたが（図１Ｄ）、試験した他の抗体は血糖を改善せず、ＣＡ３３が、ＨＦＤに関連したインスリン耐性を低減させ、グルコース代謝を改善したことを示した。グルコース代謝の全身改善を、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）を使用してさらに検証した。ＣＡ３３治療の結果、有意に改善された耐糖能が生じたが（図１）、他の抗体は、耐糖能を改善せず、グルコース処理曲線はビヒクルと比較して異ならなかった（図７Ａ）。さらに、ＣＡ３３処置のみが、インスリン負荷試験において実証されたようにインスリン感受性を著しく改善したが、試験した他の抗体はビヒクルと同様であった（図１Ｆ、図７Ｂ）。抗体で処置した群の１つ（ＣＡ１５）を除いて全てにおいて体重増加が中程度低下したが（図１Ｇ）、これはグルコース代謝の改善と相関しなかった。まとめると、これらの結果は、ＣＡ３３が抗糖尿病特性を独自に有することを実証した。
【０４２４】
ＣＡ３３はａＰ２を中和する低親和性抗体である
ＣＡ３３を、その特有の治療特性をより良く理解するためにさらに特徴付けた。オクテット結合（ｏｃｔｅｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ）アッセイにおいて、試験した抗体の全てはａＰ２との飽和結合を実証した。それらは測定可能であるが、関連タンパク質ＦＡＢＰ３と低い相互作用（約２．５％のａＰ２／ＦＡＢＰ４相互作用）であり、Ｍａｌ１／ＦＡＢＰ５とごくわずかな相互作用があり、これは対照ＩｇＧと同様であった（図２Ａ）。興味深いことに、本発明者らはまた、ＣＡ３３で処置したマウスにおけるグルコース恒常性の改善は、循環ａＰ２レベルに対するこの抗体の特有の効果と関連したことを見出した。４週の処置後、ＣＡ３３で処置したマウスは、対照で処置した動物において見られたものと同様又はそれよりわずかに低いレベルで循環ａＰ２レベルを維持したが、Ｈ３を含む全ての他の抗体は循環ａＰ２レベルの劇的な１０倍の増加を生じた（図２Ｂ）。実際に、循環ａＰ２は対照及びＣＡ−３３で処置したマウスの両方においてウェスタンブロットによって検出できなかったが、Ｈ３処置後、血清において確実に明らかであった（図２Ｂ、差込み図）。
【０４２５】
標的部位を特徴付けることを開始する交差遮断実験において、本発明者らは、ＣＡ３３がａＰ２に対して効果のないマウス抗体Ｈ３の結合を部分的に遮断したが、Ｈ３結合はハイブリッド抗体ＣＡ１３及びＣＡ１５によって完全に遮断されたことを見出した（図２Ｃ）。これらのデータは、ＣＡ３３のみによって認識されるエピトープが、Ｈ３によって認識されるエピトープと部分的に重複していることを示唆している。さらなる分析において、例えば、Pandit et al. (2012) J. Mol. Recognit. Mar;25(3):114-24（参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているように、水素重水素交換質量分析実験に基づいたエピトープ識別は、Ｈ３について識別したエピトープと部分的に重複している、残基９〜１７、２０〜２８及び１１８〜１３２上のａＰ２の第１のアルファヘリックス及び第１のベータシートとのＣＡ３３の相互作用を示した（図２Ｄ）。これらのエピトープを正確に理解するために、次いで本発明者らは、ａＰ２と共にＣＡ３３及びＨ３のＦａｂ断片を共結晶化した（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｉｚｅｄ）（図２Ｅ）。結晶の分析により、ＣＡ３３が、二次構造エレメントベータ１及びベータ１０並びにアルファ２とベータ２及びベータ３とベータ４を連結するランダムコイル領域にわたって広がっているエピトープと結合し、ａＰ２アミノ酸５７Ｔ、３８Ｋ、１１Ｌ、１２Ｖ、１０Ｋ及び１３０Ｅを含むことが示された（図２Ｆ）。ＣＡ３３によるＨ３の部分的遮断にも関わらず、本発明者らは、それらのエピトープの直接的な重複が実際にはないことを観測した。代わりに、ａＰ２  Ｐｈｅ５８周囲の領域の顕著な移動は、競合実験において他方の抗体によって一方の抗体の結合を部分的に遮断することができる。加えて、ＣＡ３３  Ｆａｂの低親和性は結晶構造によって説明することができる。稀に、ＣＡ３３の重鎖における１つのアミノ酸だけはａＰ２と接触し、多数の接点は軽鎖を通る（図２Ｅ、Ｆ）。対照的に、Ｈ３−ａＰ２接点は、両方のＦａｂ鎖がａＰ２と相互作用しており、より従来的である。この構造はまた、ＣＡ３３がβ−バレル（１４Ｓから３７Ａ）の「蓋」に結合しないことを示し、結合ポケット又はＥ１５、Ｎ１６及びＦ１７を含有する「ヒンジ」への脂質の接近を制御すると仮定されている。加えて、ａＰ２との脂質結合（パリナリン酸）はＣＡ３３の存在によって実質的に変化しなかったことが見出された（図２Ｇ）。Ｈ３は「蓋」と直接結合するが、限定された活性を有する。脂質結合ａＰ２又は脂質遊離ａＰ２とのＣＡ３３の結合もまた、生化学分析（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して試験した。図２Ｈ及び２Ｉに見られるように、ＣＡ３３は、以下の親和性で脂質結合ａＰ２及び脂質遊離ａＰ２の両方と結合する：
【表１５】
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累積的に、これらの結果は、ＣＡ３３活性がａＰ２脂質結合と無関係であり得ることを示唆している。
【０４２６】
ａＰ２に対するＣＡ３３の比較的低い親和性を考慮して、オフターゲット効果を試験した。ＨＦＤを給餌したａＰ２−／−マウスにおけるＣＡ３３処置の効果を試験した。これらの実験において、抗体治療はこのモデルにおいて体重又は空腹時血糖のいかなる変化も誘導することができなかった（図３Ａ、３Ｂ）。さらに、ＣＡ３３は肥満ａＰ２−／−マウスにおいて耐糖能に影響を与えず（図３Ｃ）、抗体の効果がａＰ２をターゲティングすることに起因することが明確に実証された。
【０４２７】
最後に、重度の遺伝的肥満の第２のモデルにおけるＣＡ３３の効果及びレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスを使用したインスリン耐性を試験した。３週の処置の過程にわたって、ＣＡ３３及びビヒクルで処置した群の両方は体重が増加したが、程度はＣＡ３３で処置した群において低かった（図３Ｄ）。ｏｂ／ｏｂマウスにおける高血糖が対照と比較してＣＡ３３で処置したマウスにおいて正常化したことが際立っている（図３Ｅ）。高インスリン血症の程度もまた、ＣＡ３３で処置した動物において部分的に低減した（図３Ｆ）。正常なグルコース及びより低いインスリンレベルにより、ａＰ２を中和すると、グルコース代謝が改善されることが示唆される。実際に、外因性グルコースの投与後、ＣＡ３３で処置したｏｂ／ｏｂマウスもまた、極めて重度の肥満の存在にも関わらず、ビヒクルで処置したマウスと比較して有意に改善した耐糖能を示した（図３Ｇ）。これらのデータは、独立した前臨床モデルにおける代謝疾患に対するａＰ２中和の広範囲の適用性を明確に示し、食餌性及び遺伝的肥満の関係において得られた結果と一致する。
【０４２８】
ＣＡ３３処置は脂質代謝を改善し、肥満マウスにおける肝臓脂肪症を阻害する
代謝利点を生じることができる候補モノクローナル抗体を識別し、物理的に特徴付けることにより、ＨＦＤモデルにおける詳細な機能的研究を実施した。ＣＡ３３処置の代謝効果をさらに調べるために、本発明者らは、ＨＦＤ誘発性肥満マウスをＣＡ３３又はビヒクルで５週間処置し、肝臓に対する効果を試験した。予想されたように、長期の高脂肪給餌はビヒクルで処置したマウスにおいて脂肪症及びトリグリセリド蓄積を誘発したが、これらの効果はＣＡ３３処置によって有意に改善した（図４Ａ、Ｂ）。加えて、肝臓脂質恒常性の改善が、デノボ脂質生成に関与する重要遺伝子の低減した肝臓発現に伴った（図４Ｃ）。遺伝的ａＰ２欠損と同様に、ＣＡ３３で処置したマウスは、中度に高い血漿遊離脂肪酸レベル（図４Ｄ）及びより低いグリセロールレベル（図４Ｅ）を有した。総コレステロールレベルもまた、ＣＡ３３で処置した群においてより低かったが（図４Ｆ）、血漿トリグリセリドにおいて有意差はなかった（図４Ｇ）。特に、完全な全身の遺伝的ａＰ２欠損は組織ｍａｌ１（ＦＡＢＰ５／Ｍａｌ１）発現の実質的な上方制御に関連するが、代償性変化の欠如を示すＣＡ３３処置時の循環ｍａｌ１レベルの有意な変化は検出されなかった（図４Ｈ）。加えて、ＣＡ３３処置はＦＡＢＰ３タンパク質の循環レベルを有意に変化させなかった（図４Ｈ）。また、ＣＡ３３で処置したマウスにおいてグルカゴン又はアディポネクチンの血清中レベルの変化もなかった（図４Ｉ〜Ｊ）。
【０４２９】
脂肪組織及び身体組成に対するＣＡ３３処置の効果
脂肪組織及び身体組成に対するＣＡ３３処置の影響もまた、試験した。二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）走査により、ＣＡ３３処置が脂肪質量を有意に低減させ（図５Ａ）、一方で、除脂肪質量もまた、わずかに低減したことが示され、このことは、固形臓器、特に肝臓における低減した脂質蓄積を反映している可能性がある（図４Ａ、Ｂ）。実際に、ＣＡ３３処置は肝臓重量を有意に減少させ、この低下は、体重の百分率として表したとき有意なままであった（図５Ｂ）。ＣＡ３３で処置した肥満マウスにおける体重の減少は、ＨＦＤでのａＰ２欠損及び混合型のａＰ２／ｍａｌ１欠損を有するマウスの表現型を想起させ、抗体治療が代謝パラメータを直接変化させるという可能性を高める。代謝ケージ分析において、身体的活動、食餌摂取及び熱産生はビヒクル及び抗体で処置したマウスにおいて同様であった（図５Ｃ、Ｄ）。
【０４３０】
ＣＡ３３は脂肪酸酸化を増加させることができる
さらなる代謝測定のために、ＨＦＤを与えた肥満マウスを、間接的な開回路熱量計（Ｏｘｙｍａｘ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に置いた。体積による酸素及び二酸化炭素濃度を、部分的に密閉したチャンバの入口及び出口部分においてモニターし、そのチャンバを通して周囲空気の既知の流れを強制的に排気した。部分の間で測定した濃度差を使用して、酸素消費（ＶＯ２）及び二酸化炭素産生（ＶＣＯ２）をコンピュータで計算し、呼吸交換率（ＶＣＯ２／ＶＯ２）を算出した。代謝ケージ分析において、ＨＦＤを与え、ＣＡ３３を用いて８週間処置した肥満マウスは、ビヒクルで処置したマウスと比較して増加したＶＯ２利用を示し（図５Ｅ）、０．７に近い呼吸商（ＲＥＲ）を生じ（図５Ｆ）、抗体が脂質利用を増加させたことを示唆している。
【０４３１】
組織学的分析により、予想されたように、長期のＨＦＤ給餌の結果、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）において豊富な脂質蓄積が生じたことが明らかになった。しかしながら、ＣＡ３３による処置の結果、ＢＡＴ組織重量の有意な減少が生じ、脂肪滴サイズを劇的に減少させた（図５Ｇ、５Ｈ）。
【０４３２】
一般に、脂肪組織蓄積は抗体で処置した群と対照群との間で同様であるように見えたが、性腺周囲脂肪体のサイズは有意に減少した（ＰＧＷＡＴ、図５Ｉ）。ＰＧＷＡＴのＨ＆Ｅ染色した切片の分析により、ＣＡ３３及びビヒクルで処置したマウスにおいて同程度の炎症細胞浸潤が明らかになった（図５Ｊ）。実際に、ＦＡＣＳ分析による脂肪組織調製物におけるＦ４／８０及びＣＤ１１ｂ陽性骨髄性細胞の浸潤は、群の間で同様の数のこれらの免疫細胞を示した（図５Ｋ、Ｌ）。加えて、ＣＡ３３で処置したマウスから単離した性腺周囲白色脂肪組織（ＰＧ−ＷＡＴ）における炎症マーカーＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、Ｆ４／８０又はＣＤ６８の発現において観測された変化はなく、ＩＬ−６  ｍＲＮＡレベルを穏やかに増加させただけであった（図５Ｍ）。脂肪組織ａＰ２タンパク質レベルは抗体処置時にわずかな増加を示し（図５Ｎ及び図５Ｐ）、本発明者らは、ｍａｌ１の代償性調節を観測せず（図５Ｏ及び図５Ｐ）、成体マウスにおける循環ａＰ２の中和は、他のＦＡＢＰアイソフォームによる分子補償を生じず、このように遺伝的欠損とは異なることを示唆している。
【０４３３】
ＣＡ３３は肝臓グルコース産生を減少させ、末梢インスリン感受性を増加させる
肝臓グルコース産生及び末梢グルコース利用の両方は、正常血糖の維持並びに給餌及び絶食反応に対する適応に重要である。最近の研究により、肝臓グルコース産生及び肝臓糖新生活性がａＰ２によって調節されることが実証され（Cao et al., (2013) Cell Metab. 17, 768-778）、この反応が、単独で又は末梢効果と組み合わせて、ａＰ２遮断の抗糖尿病効果を媒介する際に重要であり得ることが示唆された。これがＣＡ３３の治療特性の基礎となるかどうかを決定するために、５週間のＣＡ３３又はビヒクル処置後のＨＦＤを与えたマウス由来の肝臓を採取した。ＣＡ３３で処置した肥満マウス由来の試料中の糖新生遺伝子ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（Ｐｃｋ１）及びグルコース−６−リン酸（Ｇ６ｐｃ）の発現の顕著な低下を観測した（図６Ａ）。加えて、細胞質ＰＣＫ１の酵素活性及びミクロソームグルコース−６−リン酸は、ＣＡ３３で処置したマウス由来の試料中で有意に低減した（図６Ｂ、Ｃ）。これらの見解は肝臓におけるａＰ２機能の以前の研究と一致した（Cao et al., (2013) Cell Metab. 17, 768-778）。
【０４３４】
次に高インスリン血症−正常血糖クランプ研究によって全身グルコース流量を試験した（図６Ｄ）。これらの実験のために、マウスを抗体処置の前にＨＦＤで２０週間飼育し、５週間の抗体介入後にクランプ研究を実施した。クランプ研究の間、ＣＡ３３で処置した肥満マウスは正常血糖値を維持するために有意に高いグルコース注入率を必要とし（図６Ｅ）、減少したクランプ肝臓グルコース産生（図６Ｆ）、及び減少した基礎肝臓グルコース産生に対する有意でない傾向（図８Ａ、ｐ＝０．０７）を示した。ＣＡ３３処置はまた、全身クランプグルコース処理率（ＲＤ）を有意に増加させたが（図６Ｇ）、血漿インスリンレベルは等量のインスリン注入（５ｍＵ／ｋｇ／分）にも関わらず対照と比較して減少した（図８Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＣＡ３３がまた、全身体系のインスリン感受性を増加させ、インスリン刺激性グルコース利用を増加させることを示す。グルコース利用をさらに評価するために、本発明者らは、クランプ実験後に末梢組織を採取し、１４Ｃ  ２−デオキシグルコース取込みアッセイを実施した。インスリン刺激性グルコース取込みは、ＣＡ３３で処置した肥満マウスから単離した筋肉組織において有意により高く（図４Ｈ）、性腺周囲白色脂肪組織（ＰＧＷＡＴ）においてグルコース取込みを増加させる傾向があった（図８Ｃ、ｐ＝０．１）。さらに、解糖の副産物として血漿［３Ｈ２Ｏ］の増加の割合として測定した、全身解糖もまた、ＣＡ３３処置によって増加した（図６Ｉ）。これらのデータは、ＣＡ３３のグルコース低下効果が主に、肝臓内のグルコース産生を減少させ、筋肉等の末梢組織内のグルコース利用を増加させることによって発生するという結論を支持する。
【０４３５】
（例２）
１型糖尿病を処置するための抗ａＰ２モノクローナル抗体（ＣＡ３３）
ＣＡ３３処置は１型糖尿病のＮＯＤマウスモデルにおいて高血糖及び死亡を阻止する
糖尿病発症が自然発生する１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）のモデルである、ＮＯＤマウス（S. Makino, K. Kunimoto, Y. Murakoa, Y. Mizushima, K. Katagiri, Y. Tochino. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken-dobutsu, Experimental animals 29, 1-13 (1980)）を使用して、糖尿病発生及び死亡に対するＣＡ３３処置の効果を試験した。動物の世話及び実験手順は、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験委員会からの承認を得て実施した。８週齢のメスのＮＯＤマウスにビヒクル又はＣＡ３３のいずれかを皮下注射した。最初の６週の処置のために、ＣＡ３３で処置したマウスに、約４５ｍｇ／ｋｇ用量に対応する、１回の注射当たり１ｍｇを１週間に２回注射した。研究の７週目に開始して、ＣＡ３３で処置したマウスに、３０ｍｇ／ｋｇ用量のＣＡ３３を１週間に２回注射した。６時間の空腹時血糖を週に１回測定した。糖尿病の発生は、２週連続の６時間の空腹時血糖が２００ｍｇ／ｄＬ超と定義した。
【０４３６】
図９に見られるように、抗ａＰ２モノクローナル抗体（ＣＡ３３）によるＮＯＤマウスの処置は高血糖の発生を阻止した。結果として、ＣＡ３３による処置はまた、この実験においてＮＯＤマウスの死亡率を低下させた（図１０Ａ）。さらに、１０週齢からの２２週間（３２週齢まで）の抗ａＰ２抗体によるＮＯＤマウスの処置は、ビヒクルで処置したＮＯＤマウスと比較して、１１、１２及び１５週間の処置において空腹時血糖（６時間の絶食）を低下させ（図１０Ｂ）、１６週間の処置において空腹時インスリンレベル（６時間の絶食）を低下させた（図１０Ｃ）。
【０４３７】
ａＰ２欠損の結果、向上したインスリン分泌に起因してＮＯＤマウスにおいて改善された耐糖能及び増加したベータ細胞質量が生じる
遺伝子欠失、小分子阻害又は抗体媒介性中和を介してａＰ２機能を遮断することは、肥満誘発性耐糖能異常のマウスモデルにおいて保護的であることが以前に報告されている（Hotamisligil et al, 2006；Uysal et al., 1996；Furuhashi et al., 2007；Cao et al., 2013；Burak et al., 2015）。ａＰ２欠失が、痩せＮＯＤマウスにおいてグルコース恒常性の改善を同様に与えるかどうかを見るために調査した。実際に、ＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスは、離乳時期（データは示さず）及び７〜８週齢の両方においてａＰ２＋／＋対照と比較して有意に改善された耐糖能を示した（図１１Ａ）。特に、グルコース恒常性に対するこの効果は、マウスが１１週齢に達する時までに喪失し、このモデルにおける膵島炎の予測される発症と一致した。
【０４３８】
肥満の状況において、ａＰ２を遮断することは改善されたインスリン感受性と関連している。しかしながら、対照と比較して痩せＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおける変化したインスリン感受性は観測されなかった（図１１Ｂ）。このことは、ＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおける改善された耐糖能が、ａＰ２欠損のベータ細胞固有の効果と関連するという可能性を高めた。ベータ細胞機能に対するａＰ２遺伝子欠失の効果を評価するために、４、７及び１２週齢において島（膵島）をＮＯＤ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスから単離した。ベースラインにおいて、遺伝子型はインスリン分泌の差異と関連しなかった。しかしながら、高グルコースで刺激すると、ａＰ２−／−島はａＰ２＋／＋対照より１つの細胞当たり有意に多いインスリンを分泌した（図１２Ａ）。興味深いことに、この向上したインスリン分泌は年齢と共に下がり始め（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）、１９週齢のマウスから単離した島において有意なインスリン分泌の差異は観測されなかった（データは示さず）。このことは、若いＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおける耐糖能の一時的な改善の見解と一致し、膵島炎の発症前に、向上したベータ細胞反応性の少なくとも一部は、ＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおけるグルコース恒常性表現型の基礎となることを示唆している。
【０４３９】
ａＰ２欠損の状況において観測された改善されたグルコース調節もまた、ベータ細胞質量の変化と関連した。注目すべきことに、膵臓切開の間、ａＰ２＋／＋対照におけるよりもＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおいて多くの島を見ることができた（図１３）。この観測を、ＮＯＤ  ａＰ２−／−マウス及び対照においてベータ細胞質量を定量化することによってさらに検証した。７週齢の動物において、ａＰ２欠損はベータ細胞質量の有意（約３５％）な増加と関連した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。
【０４４０】
ホルモンａＰ２はグルコース刺激性インスリン分泌を増幅させる
ａＰ２が能動的に分泌されるホルモンであるという最近の発見及び抗体媒介性ａＰ２中和が１型糖尿病のモデルにおいて保護的であるという見解を考慮して、ａＰ２の循環型を、この分子がそれらの機能、生存又は増殖を調節するためにベータ細胞に対して直接作用するかどうかを試行し、理解するためにさらに調査した。初代島へのａＰ２の添加は管理されていて、栄養が豊富な条件はグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）に対して効果を有さなかったが（図１５Ａ、図１５Ｂ及び図１５Ｃ）、飢餓条件（すなわち、ＦＯＸＯ１が活性化される条件）下では、ａＰ２の添加はＧＳＩＳを増強するように作用する（図１５Ｅ及び図１５Ｆ）。１０μｇ／ｍｌのａＰ２による処置の２０分後、ａＰ２が実際にマウス島内に取込まれることを確認するためにウェスタンブロットを実施した（図１５Ｄ）。長期の飢餓後のグルコース反応性インスリン分泌のこの相乗作用は、栄養の枯渇に反応する増加したストレス抵抗性と関連し得る。このことは非常に有益であり得るが、ＦＯＸＯ１の慢性的活性化は、ベータ細胞機能に有害であり、インスリン発現の喪失、正常に機能しないＧＳＩＳ、ベータ細胞脱分化及びＰＤＸ１活性の喪失に起因するアポトーシスに対する増加した感受性を生じることが示されている。したがってＴ１Ｄの文脈において、ベータ細胞ＦＯＸＯ１の慢性的活性化は免疫破壊に対する感受性を増加させ、疾患発症を早める場合がある。
【０４４１】
ａＰ２をターゲティングするモノクローナル抗体（ＣＡ３３）は、１型糖尿病のＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウスモデルにおいて糖尿病の発生を低下させるのに効果的である
分泌されたａＰ２の中和は、若年性糖尿病とも称されている、１型糖尿病において有益な効果を与えた。ＣＡ３３によるａＰ２のモノクローナル抗体ターゲティングは、１型糖尿病の当該技術分野において認識されているラットインスリンプロモーター−リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス−糖タンパク質（ＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰ）モデルにおいて糖尿病の発生を低下させるのに効果的であった。
【０４４２】
１型糖尿病のＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウスモデルは、高い浸透率及びウイルス媒介性β細胞破壊に起因する糖尿病の急速な発症によって特徴付けられる（図１６）（Oldstone et al., (1991) Cell 65:319-331）。ＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウスは、シアトルのＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおけるＫ．Ｂｏｒｎｆｅｌｄｔの実験室から与えられた。全ての交雑したマウスモデルの遺伝的バックグラウンドを、ＡＢＩ  ３１３０分析器を用いてコンジェニック遺伝子型決定（Ｃ５７ＢＬ／６についての２８８遺伝子座）によって検証した。ＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰモデルにおいて、ＬＣＭＶ（２×１０３ＰＦＵ／ｍｌ）の投与により糖尿病を誘発した。動物の世話及び実験手順は、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験委員会からの承認を得て実施した。
【０４４３】
実験を３つの群のマウスで実施した（図１７）。Ａ群は、−１４日目に開始して週に２回、ビヒクル（ＰＢＳ）を腹腔内注射した８匹のＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＧＰ＋）マウスからなった。Ｂ群は、−１４日目に開始して週に２回、１回の注射当たり１．５ｍｇの用量でＣＡ３３を腹腔内注射した８匹のＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＧＰ＋）マウスからなった。Ｃ群は、−１４日目に開始して週に２回、ビヒクルを腹腔内注射した８匹のＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＧＰ＋）、ａＰ２−／−マウスからなった。０日目に、ＬＣＭＶ（２×１０３ＰＦＵ／ｍｌ）の投与により糖尿病を誘発した。ビヒクル又はＣＡ３３による処置はＬＣＭＶの投与後２週間継続した（図１７）。
【０４４４】
６時間の空腹時血糖値を定期的に測定し、糖尿病の発症を６時間の空腹時血糖が２５０ｍｇ／ｄＬ超と定義した。ＧＰ＋ビヒクルで処置した動物は、空腹時血糖値の有意な上昇（図１８）及びＬＣＭＶ処置から１４日以内に７５％より高い糖尿病の発生率（図１９）を示した。ＧＰ＋、ａＰ２−／−マウスは、ＬＣＭＶ処置後、ＧＰ＋ビヒクルで処置したマウスより全体で有意に低い血糖値を示した（図１８）。ＧＰ＋、ａＰ２−／−マウスはまた、ＧＰ＋ビヒクルで処置したマウスより非常に低い糖尿病の発生率、すなわち１５％対７５％の発生率を経験した（図１９）。モノクローナル抗体で処置したＧＰ＋マウスは、ビヒクルで処置した対照マウスより有意に低い血糖値を示し（図１８）、糖尿病表現型の発生はモノクローナル抗体で処置した群において観測されなかった（図１９）。
【０４４５】
これらの結果は、遺伝的欠損を介する又はモノクローナル抗体中和かのいずれかによるａＰ２レベルの低下が、１型糖尿病のこのウイルス誘発性モデルにおいて強力な抗糖尿病効果を有することを実証している。
【０４４６】
ａＰ２をターゲティングするモノクローナル抗体（ＣＡ３３）は１型糖尿病のＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウスモデルにおいて炎症を低下させるのに効果的である
１型糖尿病のＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウスモデルは上記に記載されている。３つの群のマウスにおいて膵島炎レベルを決定することによって炎症を試験した。Ａ群は、−１４日目に開始して週に２回、ビヒクル（ＰＢＳ）を腹腔内注射した８匹のＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＧＰ＋）マウスからなった。Ｂ群は、−１４日目に開始して週に２回、１回の注射当たり１．５ｍｇの用量でＣＡ３３を腹腔内注射した８匹のＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＧＰ＋）マウスからなった。Ｃ群は、−１４日目に開始して週に２回、ビヒクルを腹腔内注射した８匹のＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＧＰ＋）、ａＰ２−／−マウスからなった。０日目に、ＬＣＭＶ（２×１０３ＰＦＵ／ｍｌ）の投与により糖尿病を誘発した。ビヒクル又はＣＡ３３による処置はＬＣＭＶの投与後２週間継続した。
【０４４７】
膵島炎スコア付けを、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した脾臓切片で実施した。各島を、「非膵島炎」、「膵島周囲炎」、「軽度膵島炎」又は「重度膵島炎」のいずれかとしてスコア付けする。棒グラフは、分析した各動物における各島の種類の百分率を表す（図２０Ａ）。
【０４４８】
抗体染色のために、ＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウス由来の膵臓をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。次いで、膵臓の５μｍの連続切片を生成し、染色を、確立されたプロトコールに従って、インスリンに対する抗体（Ｌｉｎｃｏ）、ＡＴＦ６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ホスホ−ｅＩＦ２α（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）；ｓＸＢＰ１（社内）並びにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。
【０４４９】
染色後、画像解析を、ＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．）において開発されたカスタムソフトウェアを使用することによって実施した。簡潔に述べると、島領域を、多重画像にわたって最適化した閾値強度値における又はそれを超えるインスリン染色（緑色チャネル）の隣接領域（結合ピクセル）として識別した。インスリン（緑色チャネル）及びｓＸＢＰ１又はＡＴＦ６（赤色チャネル）のいずれかについての平均蛍光強度を、島内のピクセルの数で割った全てのピクセルについての強度の合計として算出した。
【０４５０】
図２０Ａに示すように、ＧＰ＋ビヒクルで処置した動物は高レベルの炎症を示し、ほとんどの島は軽度又は重度膵島炎のいずれかを示した。ＧＰ＋、ａＰ２−／−マウスは減少したレベルの炎症を示し、ほとんどの島は軽度膵島炎を示した（図２０Ａ及び２０Ｄ）。モノクローナル抗体（ＣＡ３３）で処置したＧＰ＋マウスもまた、減少したレベルの炎症を示し、減少した数の島が重度膵島炎を示した（図２０Ａ及び２０Ｅ）。
【０４５１】
図２１Ａにおける画像に示すように、島形態及び小胞体（ＥＲ）適応能力は、増加したレベルのＡＴＦ６及びｓＸＢＰ１染色によって示されるように、ａＰ２欠損及びＣＡ３３で処置したＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウスにおいて保存された。ＡＴＦ６レベルは、ＧＰ＋、ａＰ２−／−マウス及びモノクローナル抗体（ＣＡ３３）で処置したＧＰ＋マウスの両方において有意に増加した（図２１Ｂ）。加えて、ｓＸＢＰ１レベルもまた、ＧＰ＋、ａＰ２−／−マウス及びモノクローナル抗体（ＣＡ３３）で処置したＧＰ＋マウスの両方において有意に増加した（図２１Ｃ）。
【０４５２】
これらの結果は、遺伝的欠損を介する又はモノクローナル抗体中和によるａＰ２活性レベルの低下が、１型糖尿病のこのウイルス誘発性モデルにおいて炎症を低下させ、島形態を保存することを実証する。
【０４５３】
（例３）
アテローム性動脈硬化症の処置、低減又は予防のための抗ａＰ２モノクローナル抗体
動物
動物の世話及び実験手順は、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験委員会からの承認を得て実施した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドのオスのＡｐｏＥ−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を１２時間の明周期に飼育し、４〜５週齢で開始して、高コレステロールのアテローム形成性のウェスタンダイエット（Ｄ１２０７９Ｂ：２１％の脂肪、０．２１％のコレステロール；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）を自由に与えた。マウスを６週齢で開始して１２週間、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与により処置した。
【０４５４】
アテローム性動脈硬化症病変の評価
マウスを屠殺し、左心室を通る注入によって生理食塩水及び次いで１０％の中性緩衝ホルマリン溶液で洗い流した。大動脈を近位大動脈から腸骨分岐点まで切断し、大動脈を正面調製物においてピンで固定した。正面をピンで固定した大動脈をＳｕｄａｎ  ＩＶで染色した。
【０４５５】
病変領域の定量化を、ＮＩＨにおいて開発されたＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して達成した。ピンで固定した大動脈の外側周囲を、白色バックグラウンドとして大動脈の全領域を画定するためにソフトウェアにおいて定義した。次いでＳｕｄａｎ  ＩＶで赤色に染色した病変の領域のパーセントを測定し、ソフトウェアによって算出した。
【０４５６】
図２２Ｂに示されるように、ＣＡ３３を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスは減少したアテローム性動脈硬化症病変領域を有した。対照的に、ＣＡ１５を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスは、対照と比較してアテローム性動脈硬化症病変領域において有意な差異を示さなかった。ＡｐｏＥノックアウトマウス由来の正面をピンで留めた大動脈の代表的な画像を、図２２Ｃ（ビヒクルで処置したマウス）、図２２Ｄ（ＣＡ３３で処置したマウス）及び図２２Ｅ（ＣＡ１５で処置したマウス）に示す。
【０４５７】
ａＰ２が脂肪組織においてｌｏｘ−Ｐシステムで特異的にノックアウトされているマウス（ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウス）の欠失効率をウェスタンブロットによって分析した（図２２Ｇ）。ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスをＡｐｏＥ−／−マウスと交配してＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスを作製した。１２週間ウェスタンダイエットを与えたＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスを、血清ａＰ２、ＴＧ及びコレステロールレベルについて分析した（図２２Ｈ、図２２Ｉ及び図２２Ｊ）。図２２Ｉ及び図２２Ｊに示されるように、ＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスは、ＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋マウスと比較してより低いトリグリセリド及びコレステロールレベルを有した。これらのマウスを屠殺した後、アテローム性動脈硬化症病変領域を、これらのマウス由来の正面の大動脈のＳｕｄａｎ  ＩＶ染色によって分析した（図２２Ｋ及び図２２Ｌ）。図２２Ｋに示されるように、ＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスは、ＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋マウスと比較して減少したアテローム性動脈硬化症病変領域を有した。全体として、これらの結果は、脂肪組織由来のａＰ２がＡｐｏＥ−／−マウスにおいて脂質異常症及びアテローム性動脈硬化症の発症を調節することを示す。
【０４５８】
体重及び肝臓重量
ＡｐｏＥノックアウトマウスに、マウスが１８週齢になるまで、４〜５週齢で開始してウェスタンダイエットを与えた。マウスを、６週齢で開始して１２週間、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与によって処置した。体重、除脂肪質量及び脂肪質量を、二重Ｘ線吸収（ＤＸＡ）分光法によって測定した。
【０４５９】
図２３Ａに示されるように、ＣＡ３３抗体を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスは体重の有意な減少を示した。加えて、ＣＡ３３を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスもまた、肝臓重量の有意な減少を示した（図２３Ｂ）。対照的に、ＣＡ１５を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスは体重又は肝臓重量の有意な差異を全く示さなかった（図２３Ａ、２３Ｂ及び２３Ｃ）。
【０４６０】
図２３Ｄに示されるように、ＣＡ３３抗体を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスは除脂肪質量又は脂肪質量の有意な減少を全く明らかにしなかった。加えて、ＣＡ１５抗体を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスは除脂肪質量又は脂肪質量の有意な差異を全く示さなかった（図２３Ｄ）。
【０４６１】
ブドウ糖負荷試験
ブドウ糖負荷試験を、一晩（１６時間）絶食させた後の意識のあるマウスで経口グルコース投与（１．０ｇ／ｋｇ）によって実施した。リポタンパク質の粒径分布を、６週間又は１２週間のビヒクル又は抗体処置（３３ｍｇ／ｋｇ）の後、血漿のプールした試料を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって決定した。
【０４６２】
図２４Ａに示されるように、ＣＡ３３で処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスより統計的に有意に低い空腹時血糖を有した。しかしながら、ＣＡ３３で処置したマウスはブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）においてグルコースに対する反応の差異を全く示さなかった（図２４Ｂ）。
【０４６３】
リポタンパク質画分中のコレステロール及びトリグリセリドの測定
コレステロール及びトリグリセリドを、６週間又は１２週間、ＰＢＳ、ＣＡ３３（３３ｍｇ／ｋｇ）又はＣＡ１５（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおいてリポタンパク質画分（総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）又は高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ））中で測定した。リポタンパク質の粒径分布を、血漿のプールした試料を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって決定した。
【０４６４】
図２５Ａに示されるように、ＣＡ３３を用いて６週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスは、総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）及び高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ）においてコレステロールレベルの有意な減少を示した。加えて、ＣＡ３３を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスは、総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）及び高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ）においてコレステロールレベルの有意な減少を示した（図２５Ｂ）。６週間のＣＡ１５を用いたＡｐｏＥノックアウトマウスの処置はコレステロールレベルの有意な差異を全く生じなかったが（図２５Ａ）、１２週間のＣＡ１５を用いたＡｐｏＥノックアウトマウスの処置は、ＣＡ３３で処置した動物と比較して、総リポタンパク質、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）及び高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ）においてコレステロールのわずかな減少を引き起こした（図２５Ｂ）。
【０４６５】
図２６Ａに示されるように、ＣＡ３３を用いて６週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスは、総リポタンパク質及び非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）においてトリグリセリドレベルの有意な減少を示した。加えて、ＣＡ３３を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスは、総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）及び高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ）においてトリグリセリドレベルの有意な減少を示した（図２６Ｂ）。対照的に、６週間又は１２週間のＣＡ１５を用いたＡｐｏＥノックアウトマウスの処置は、ＰＢＳを用いて処置した対照動物と比較して、トリグリセリドレベルの有意な差異を全く生じなかった（図２６Ａ及び２６Ｂ）。
【０４６６】
（例４）
ＣＡ３３のヒト化
ウサギ抗体９０９（ＣＡ３３）を、ウサギＣＤＲ／マウスフレームワークハイブリッド抗体Ｖ領域ＣＤＲ由来のＣＤＲをヒト生殖細胞系列抗体Ｖ領域フレームワークに移植することによってヒト化した。抗体の活性を回復させるために、ウサギ／マウスハイブリッドＶ領域由来の複数のフレームワーク残基もまた、ヒト化配列において保持された。Adair et al. (1991) (Humanised antibodies. ＷＯ９１／０９９６７）によって概説されているプロトコールを使用してこれらの残基を選択した。ウサギ／マウスハイブリッド抗体（ドナー）Ｖ領域配列とヒト生殖細胞系列（アクセプター）Ｖ領域配列とのアラインメントを、設計されたヒト化配列と一緒に図２７（ＶＬ）及び図２８（ＶＨ）に示す。ドナーからアクセプター配列まで移植したＣＤＲは、組み合わせたＣｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義を使用したＣＤＲＨ１（Adair et al., 1991 Humanised antibodies. ＷＯ９１／０９９６７を参照のこと）を除いて、Ｋａｂａｔ（Kabat et al., 1987）によって定義されている通りである。
【０４６７】
複数のバリアント重及び軽鎖Ｖ領域配列をコードする遺伝子を設計し、ＤＮＡ  ２．０  Ｉｎｃによる自動化合成手法によって構築した。重及び軽鎖Ｖ領域の両方のさらなるバリアントを、場合によっては、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するためか、又は不対システイン残基を除去するためのＣＤＲ内の突然変異を含む、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発によってＶＨ及びＶＫ遺伝子を修飾することによって作製した。これらの遺伝子を、哺乳動物細胞中でヒト化９０９  ＩｇＧ４Ｐ（ヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐを含有するヒトＩｇＧ４、Angal et al., Mol Immunol. 1993, 30(1):105-8）抗体の発現を可能にするようにベクター内にクローニングした。バリアントヒト化抗体鎖及びその組合せを発現させ、親抗体に対するそれらの効力、それらの生物物理学的特性及び下流プロセシングについての適合性について評価し、図２４及び２５に示される重及び軽鎖移植の選択を導いた。
【０４６８】
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１−１７（Ａ３０）とＪＫ４  Ｊ領域を抗体９０９軽鎖ＣＤＲについてのアクセプターとして選択した。移植ｇＬ１（配列番号４４６）、ｇＬ１０（配列番号４４８）、ｇＬ５４（配列番号４５０）及びｇＬ５５（配列番号４５２）における軽鎖フレームワーク残基の全ては、残基２、３、６３及び７０（Ｋａｂａｔ番号付け）を除いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子由来であり、それぞれ、ドナー残基バリン（２Ｖ）、バリン（３Ｖ）、リシン（６３Ｋ）及びアスパラギン酸（７０Ｄ）を保持した。残基２、３、６３及び７０の保持はヒト化抗体の完全な有効性に不可欠であった。ｇＬ１０移植、ｇＬ５４移植及びｇＬ５５移植のＣＤＲＬ３における残基９０をそれぞれ、システイン（９０Ｃ）からセリン（９０Ｓ）、グルタミン（９０Ｑ）及びヒスチジン（Ｈ９０）残基へと突然変異させ、それによりｇＬ１０、ｇＬ５４及びｇＬ５５配列から不対システイン残基を除去した。
【０４６９】
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ４−４とＪＨ４  Ｊ領域を、抗体９０９の重鎖ＣＤＲについてのアクセプターとして選択した。多くのウサギ抗体と同様に、抗体９０９のＶＨ領域は選択されたヒトアクセプターより短い。ヒトアクセプター配列と整列させると、抗体９０９由来のＶＨ領域のフレームワーク１（配列番号４５４）は、ヒト化抗体に保持される、Ｎ末端残基を欠失している（図２８）。９０９ウサギＶＨ領域のフレームワーク３もまた、ベータシート鎖ＤとＥとの間のループにおいて２つの残基（７５及び７６）を欠失している：移植ｇＨ１（配列番号４５５）においてフレームワーク３におけるギャップが保存されるが、移植ｇＨ１４（配列番号４５７）、ｇＨ１５（配列番号４５９）、ｇＨ６１（配列番号４６１）及びｇＨ６２（配列番号４６３）においてギャップは、選択されたヒトアクセプター配列由来の対応する残基（リシン７５、７５Ｋ；アスパラギン７６、７６Ｎ）で満たされる（図２８）。移植ｇＨ１及びｇＨ１５における重鎖フレームワーク残基の全ては、残基２３、６７、７１、７２、７３、７４、７７、７８、７９、８９及び９１（Ｋａｂａｔ番号付け）を除いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子由来であり、それぞれ、ドナー残基トレオニン（２３Ｔ）、フェニルアラニン（６７Ｆ）、リシン（７１Ｋ）、アラニン（７２Ａ）、セリン（７３Ｓ）、トレオニン（７４Ｔ）、トレオニン（７７Ｔ）、バリン（７８Ｖ）、アスパラギン酸（７９Ｄ）、トレオニン（８９Ｔ）及びフェニルアラニン（９１Ｆ）を保持した。移植ｇＨ１４における重鎖フレームワーク残基は、残基６７、７１、７２、７３、７４、７７、７８、７９、８９及び９１（Ｋａｂａｔ番号付け）を除いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に由来し、それぞれ、ドナー残基トレオニン（２３Ｔ）、フェニルアラニン（６７Ｆ）、リシン（７１Ｋ）、アラニン（７２Ａ）、セリン（７３Ｓ）、トレオニン（７４Ｔ）、トレオニン（７７Ｔ）、バリン（７８Ｖ）、アスパラギン酸（７９Ｄ）、トレオニン（８９Ｔ）及びフェニルアラニン（９１Ｆ）を保持した。移植ｇＨ６１及びｇＨ６２における重鎖フレームワーク残基は、残基７１、７３及び７８（Ｋａｂａｔ番号付け）を除いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子由来であり、それぞれ、ドナー残基リシン（７１Ｋ）、セリン（７３Ｓ）及びバリン（７８Ｖ）を保持した。ヒトフレームワークの１位におけるグルタミン残基を、均質な生成物の発現及び精製を提供するためにグルタミン酸（１Ｅ）と置き換えた：抗体及び抗体断片のＮ末端におけるグルタミンのピログルタマートへの変換は広範に報告されている。ｇＨ１５移植及びｇＨ６２移植のＣＤＲＨ２（配列番号１９）における残基５９をシステイン（５９Ｃ）からセリン（５９Ｓ）残基へ突然変異させ、それによりｇＨ１５配列から不対システイン残基を除去した。移植ｇＨ１５及び移植ｇＨ６２のＣＤＲＨ３（配列番号２０）における残基９８をアスパラギン酸（９８Ｄ）からグルタミン酸（９８Ｅ）残基へ突然変異させ、それによりｇＨ１５配列から潜在的なアスパラギン酸異性化部位を除去した。
【０４７０】
哺乳動物細胞におけるヒト化Ａｂ９０９の発現のために、ヒト化軽鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトＣ−カッパ定常領域（Ｋ１ｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡ配列に結合して、隣接軽鎖遺伝子を作製した。ヒト化重鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐ（Angal et al., Mol Immunol. 1993, 30(1):105-8）を有するヒトガンマ−４重鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列に結合して、隣接重鎖遺伝子を作製した。重及び軽鎖遺伝子を、哺乳動物発現ベクター１２３５−ｐＧＬ３ａ（１）−ＳＲＨａ（３）−ＳＲＬａ（３）−ＤＨＦＲ（３）内にクローニングした（Ｃｅｌｌｃａ  ＧｍｂＨ）。
【０４７１】
（例５）
高親和性抗ａＰ２モノクローナル抗体の親和性を低下させる
低親和性抗ａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３の治療活性を考慮して、アミノ酸残基置換を、治療活性をモジュレートする潜在的なａＰ２を有する低親和性抗体を開発するために高親和性抗ａＰ２モノクローナルネズミ抗体（Ｈ３  ｇＬ１／ｇＨ１）において調査した。Ｈ３  ｇＬ１／ｇＨ１の元のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を、それらの突然変異配列と共に、以下の表１３に提供する。
【表１６−１】
2018515082.tif 000047
【表１６−２】
2018515082.tif 000048
【表１６−３】
2018515082.tif 000049
【０４７２】
Ｈ３（ｇＬ１／ｇＨ１）の親和性をＣＡ３３の親和性に低下させるために、Ｈ３残基は結晶構造（図２９）の目視検査によって識別され、アラニン、フェニルアラニン又はセリンに突然変異されたネズミａＰ２と重要な接点を形成する可能性がある。最初に、９つの位置にわたる１１の点突然変異のパネルを生成し、ＳＰＲ分析を使用してランク付けした。親和性の有意な低下を示した突然変異を組み合わせ、次いでＯｃｔｅｔを使用してランク付けした。ＣＡ３３の親和性がほぼ一致するまでさらなる組合せを生成した。
【０４７３】
軽鎖親ＣＤＲＬ３領域におけるアミノ酸残基Ｗ９１をＡｌａに、重鎖ＣＤＲＨ１領域におけるＷ３３をＡｌａに、及び重鎖ＣＤＲＨ２領域におけるＹ５２をＳｅｒ（Ｈ３  ｇＬ１１／ｇＨ１９）に置換することによって、親和性は＜０．０７μＭから低下した。重鎖ＣＤＲＨ１領域におけるアミノ酸残基Ｗ３３をＡｌａに、重鎖ＣＤＲＨ２領域におけるＹ５２をＳｅｒに、及び重鎖ＣＤＲＨ３領域におけるＹ９８をＰｈｅ（Ｈ３  ｇＬ１／ｇＨ２０）に置換することによって、親和性は＜０．０７μＭから低下した。結果として得られた抗体の完全な可変鎖及びそれらのアラインメントを図３０Ｂ及びＣに提供する。
【０４７４】
結合親和性を低下させるために突然変異されている抗ａＰ２抗体（５２５１．ｍＩｇＧ１１６８（ＰＢ１１７２）及び５２５２．ｍＩｇＧ１．１６９（ＰＢ１１７１））の結合親和性を試験するさらなる実験を図３１に示す。ＰＢ１１７２はｇ１１軽鎖に含まれ、ｇ１９重鎖（図３０Ｂ及びＣを参照のこと）及びＰＢ１１７１はｇ１軽鎖及びｇ２０重鎖に含まれた（図３０Ｂ及びＣを参照のこと）。ヒトａＰ２に対する結合親和性は、ＰＢ１１７２及びＰＢ１１７１抗体のそれぞれについて６．０３μＭ及び５．８２μＭであった。マウスａＰ２に対する結合親和性は、ＰＢ１１７２及びＰＢ１１７１抗体のそれぞれについて４．５７μＭ及び５．１２μＭであった。
【０４７５】
（例６）
アディポカインａＰ２は、抑制性ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２転写複合体を破壊することによって肝臓グルコース産生を調節する
動物
レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウス（１０週齢）及び高脂肪食誘発性肥満マウス（高脂肪食で１２〜１６週）はＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。使用した全てのマウスはオスであり、１２時間の暗／明周期に維持した。動物に関与する全ての実験手順は、動物実験委員会、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈのガイドラインに従って行った。
【０４７６】
１）高脂肪食研究におけるａＰ２ノックアウトマウス。
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンドの野生型又はａＰ２欠損マウス［Hotamisligil, G.S., et al. Uncoupling of obesity from insulin resistance through a targeted mutation in aP2, the adipocyte fatty acid binding protein. Science 274, 1377-1379 (1996)を参照のこと］に、８週齢から１６週間、高脂肪食（６０ｋｃａｌ％、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．、ＮＪ、Ｄ１２４９２ｉ）又は通常の食餌（ＲＤ、ＰｉｃｏＬａｂ  ５０５８  Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ）のいずれかを与えた。
【０４７７】
２）ａＰ２抗体を用いた食餌誘発性肥満マウスの処置。
野生型マウスに高脂肪食を１２週間与えて食餌性肥満を誘発し、その後、同じ食餌で４週にわたって週に２回、ビヒクル又はモノクローナルａＰ２抗体（１匹のマウス当たり１．５ｍｇのＣＡ３３）のいずれかで処置した。
【０４７８】
３）組換えａＰ２タンパク質注射研究。
野生型マウス（１０〜１２週齢）に、５日にわたって１日に２回、ビヒクル又は組換えａＰ２タンパク質（１匹のマウス当たり１００μｇ）のいずれかの腹腔内注射を与えた。ＦｏｘＯ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスは、寛大にもＤｏｍｅｎｉｃｏ  Ａｃｃｉｌｉ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ）によって提供され、アルブミン−Ｃｒｅマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）と交配して肝臓特異的ＦｏｘＯ１ノックアウトマウスを作製した。野生型マウス又はＦｏｘＯ１肝臓特異的ノックアウトマウスのいずれかを同様に組換えａＰ２を用いて処置した。
【０４７９】
４）アデノウイルス形質導入研究。
β−グルクロニダーゼ（ＡｄＧＵＳ）、ＣｔＢＰ２（ＡｄＣｔＢＰ２）、ｓｈ−対照（Ａｄ／ｓｈ対照）、ｓｈ−ＦｏｘＯ１（Ａｄ／ｓｈＦｏｘＯ１）又はｓｈ−ＣｔＢＰ２（Ａｄ／ｓｈＣｔＢＰ２）のいずれかをコードする組換えアデノウイルスを、１匹のマウス当たり１．５×１０１１粒子の力価でマウスに送達した。ブドウ糖負荷試験を、一晩の絶食後、腹腔内グルコース注射（０．７５ｇ／ｋｇ）によって実施し、インスリン負荷試験を、６時間の絶食後、インスリンの腹腔内注射（０．５Ｕ／ｋｇ）によって実施した。以下の系を使用して血清パラメータを分析した：ａＰ２；マウスＦＡＢＰ４  ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ）、インスリン；Ｍｏｕｓｅ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ）、グルカゴン；Ｇｌｕｃａｇｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＦＡ；ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、グリセロール；Ｆｒｅｅ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）；ＡＬＴ活性アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）。肝臓トリグリセリドをクロロホルム−メタノール法によって抽出し、比色分析法（Ｓｉｇｍａ）によって決定した。
【０４８０】
組換えタンパク質産生及び精製
Ｎ末端ポリヒスチジンタグ、続いてＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するマウスａＰ２  ｃＤＮＡをｐＥＴ２８ベクター（ＥＭＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）内にクローニングし、プラスミドを大腸菌のＢＬ２１ＡＩ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。親和性精製及び広範なエンドトキシン除去の後、Ｎ末端ＨｉｓタグをＴＥＶプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ）による切断によって除去した。脂質結合突然変異体（Ｒ１２６Ｌ、Ｙ１２８Ｆ）を同じストラテジーに従って生成した［Erbay, E., et al. Reducing endoplasmic reticulum stress through a macrophage lipid chaperone alleviates atherosclerosis. Nature Medicine 15, 1383-1391 (2009)を参照のこと］。組換えタンパク質を脱脂質化するために、Ｌｉｐｉｄｅｘ１０００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５の１０％置換ヒドロキシアルコキシプロピル誘導体への疎水性リガンドの温度依存性結合を利用した。３７℃にて、Ｌｉｐｉｄｅｘ  １０００は水溶液から非タンパク質結合及びタンパク質会合脂質の両方を除去するが、０℃にてそれは非タンパク質結合脂質を除去するだけである［Glatz, J.F. & Veerkamp, J.H. Removal of fatty acids from serum albumin by Lipidex 1000 chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 8, 57-61 (1983)を参照のこと］。組換えａＰ２タンパク質を３７℃にて２回Ｌｉｐｉｄｅｘ１０００により脱脂質化した。その後、得られたタンパク質を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるゲル濾過によってさらに精製した。
【０４８１】
初代肝細胞単離、転写因子のスクリーニング、細胞下分画及びアデノウイルス形質導入
初代マウス肝細胞を以前に記載されているように単離した。Sekiya, M., et al. SREBP-1-independent regulation of lipogenic gene expression in adipocytes. Journal of Lipid Research 48, 1581-1591 (2007)を参照のこと。一晩の血清飢餓の後、他に示さない限り、細胞を、３時間、ホルスコリン（２μＭ、Ｓｉｇｍａ）の存在下又は非存在下で５０μｇ／ｍｌの組換えａＰ２を有するウィリアム培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で処理した。転写因子のスクリーニングのために、オンターゲットとｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎから購入し、ＲＮＡｉＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によって初代肝細胞内に一過性にトランスフェクトした。細胞下分画のために、細胞を９０分間上記に示したように処理し、ＮＥ−ＰＥＲ細胞分画システム（Ｐｉｅｒｃｅ）を利用して分画した。アデノウイルス形質導入のために、ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６ベクター内にクローニングし、続いてｐＡｄ／ＢＬＯＣＫ−ｉｔ−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で組換えを行った。ｓｈＲＮＡの標的化配列を以下のように設計した。対照；５’−ＧＴＣＴＣＣＡＣＧＣＧＣＡＧＴＡＣＡＴＴＴ−３’、配列番号５４１  Ｆｏｘｏ１；５’−ＧＣＡＴＧＴＴＴＡＴＴＧＡＧＣＧＣＴＴＧＧ−３’、配列番号５４２  ＣｔＢＰ１；５’−ＧＣＡＧＣＧＧＧＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＴＣＧ−３’、配列番号５４３  ＣｔＢＰ２；５’−ＧＧＧＡＡＧＡＣＴＡＧＧＡＣＧＴＧＡＴＴＡ−３’  配列番号５４４及び５’−ＧＣＣＡＣＡＴＴＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣ−３’、配列番号５４５  ＨＮＦ４ａ；５’−ＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡ−３’  配列番号５４６。フォークヘッド応答エレメント（ＦＨＲＥ）ルシフェラーゼ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）をｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。ウミシイタケルシフェラーゼをコードするアデノウイルスは、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）から購入した。アデノウイルスをＨＥＫ２９３Ａ細胞中で増幅させ、ＣｓＣｌ勾配遠心分離によって精製した。ＦｏｘＯ転写活性を測定するために、ＦＨＲＥルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼを発現するアデノウイルスを初代肝細胞に２４時間感染させた。その後、細胞を一晩血清飢餓にし、６時間、２μＭのホルスコリンの非存在下又は存在下で５０μｇ／ｍｌのａＰ２タンパク質とインキュベートした。細胞を受動的溶解緩衝液に溶解し、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼレポーターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して分析した。ホタルルシフェラーゼシグナルをウミシイタケルシフェラーゼに正規化した。
【０４８２】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて合成した。定量的リアルタイムＰＣＲ分析を、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）におけるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを使用して実施した。データを酸性リボソームリンタンパク質Ｐ０（Ｒｐｌｐ０、３６Ｂ４）発現に正規化した。Ｑ−ＰＣＲのために使用したプライマーは以下の通りであった：
【表１７−１】
2018515082.tif 000050
【表１７−２】
2018515082.tif 000051
【０４８３】
核脂肪アシル−ＣｏＡ含有量
初代肝細胞（１つの試料当たり６×１０６細胞）を５０μｇ／ｍｌのａＰ２で２時間刺激した。細胞をＰＢＳで洗浄し、以前にT. Nakamura et al., A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Rep 11, 295-307 (2015)に記載されているように、洗浄剤を用いずに核を単離した。単離した核における脂質を、酢酸で酸性化された水を使用して基本的にＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法によって抽出した。メタノール／水相内に分配した脂肪アシル−ＣｏＡを回収した。脂肪アシル−ＣｏＡを脂肪アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（Ｗａｋｏ、日本）によって酸化し、２，３−ｔｒａｎｓ−エノイル−ＣｏＡ及び過酸化水素を得た。過酸化水素を蛍光検出システム（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＹ）によって定量化した。
【０４８４】
グルコース産生アッセイ
初代肝細胞に、Ａｄ／ｓｈ対照又はＡｄ／ｓｈＦｏｘＯ１のいずれかを２４時間感染させ、さらに５％のＦＢＳを有する新鮮なウィリアムＥ培地中で１２時間インキュベートした。その後、細胞を一晩血清飢餓にし、ホルスコリン（２μＭ）の存在下又は非存在下で対照又は組換えａＰ２（５０μｇ／ｍｌ）のいずれかと５時間インキュベートした。細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したグルコースを有さないＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄し、同じ濃度のビヒクル、ａＰ２及び／又はホルスコリンの存在下で２０ｍＭのグリセロールを有し、グルコースを有さない同じＤＭＥＭと２時間インキュベートした。培地中のグルコース濃度を、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって決定した。
【０４８５】
ウェスタンブロット分析及び免疫共沈降実験
タンパク質を、完全プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を有する緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）を用いて細胞又は肝臓試料から抽出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。アセチル化したＦｏｘＯ１を検出するために、５μＭのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及び５ｍＭのニコチンアミドを緩衝液Ａに含めて、ＦｏｘＯ１タンパク質の脱アセチル化を遮断した。膜を、抗ＦｏｘＯ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃ２９Ｈ４）、抗ＣｔＢＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｅ−１２）、抗ＣｔＢＰ１（ＢＤ）、抗ＣｔＢＰ２（ＢＤ）、抗ＦＬＡＧ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、抗ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＦＬ−３３５）、抗ラミンＡ／Ｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４Ｃ１１）、抗ホスホＰＫＡ基質（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９６２１）、抗ＧＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ｐＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９２７１）、抗Ａｋｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｈ−１３６）、抗Ａｃ−ＦＫＨＲ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｄ−１９）、抗−ｐＦｏｘＯ１（Ｓｅｒ２５６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９４６１）及び抗−ＨＮＦ４ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃ−１９）とインキュベートした。膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とコンジュゲートした二次抗体とインキュベートし、増強化学発光システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して可視化した。ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰの内因性結合を検出するために、抗ＦｏｘＯ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃ−９）、抗ＣｔＢＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｅ−１２）、抗ＣｔＢＰ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｅ−１６）、対照マウスＩｇＧ（社内で生成した）又は対照ヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を、５０ｍＭのジメチルピメリミダート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてプロテインＧダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と架橋した。初代肝細胞又は肝臓試料を緩衝液Ａで溶解し、タンパク質複合体を、低濃度のＮＰ４０（０．５％）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）を有する緩衝液Ａ中で４℃にて４時間免疫沈降した。ビーズを、ＥＤＴＡを有さず、０．５％ＮＰ４０を有する緩衝液Ａで４回洗浄し、ＳＤＳローディング緩衝液で溶出し、ウェスタンブロット分析によって分析した。ＦＬＡＧタグ免疫共沈降研究を以下のように実施した。ＦＬＡＧ野生型ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ１をコードするプラスミドは、それぞれＤｏｍｅｎｉｃｏ  Ａｃｃｉｌｉ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ）及びＰｅｒｅ  Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、ＭＡ）からの寄贈品である。ＣｔＢＰ２  ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。ＦｏｘＯ１におけるＰＳＤＬモチーフを、ＰＳＡＳに突然変異させたか、又は遺伝子調整部位特異的突然変異誘発シス���ム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって欠失した。ＨＥＫ２９３細胞に、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣｔＢＰ１又はＣｔＢＰ２のいずれかと共に対照プラスミド、ＦＬＡＧ野生型ＦｏｘＯ１又は突然変異ＦＬＡＧ  ＦｏｘＯ１を、一過性にトランスフェクトした。細胞を、１％ＮＰ４０を有する緩衝液Ａで溶解し、０．５％ＮＰ４０を有する緩衝液Ａ中のＦＬＡＧ  Ｍ２磁気ビーズ（Ｓｉｇｍａ）を用いて４℃にて４時間免疫沈降した。ビーズを、０．５％ＮＰ４０を有する緩衝液Ａで４回洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌの３ｘ  ＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ）で溶出した。オレオイル−ＣｏＡ及びＮＡＤＨの効果を評価するために、細胞溶解物を、増加させた濃度のオレオイル−ＣｏＡ又はＮＡＤＨと共にＦＬＡＧ  Ｍ２磁気ビーズを用いて４℃にて４時間免疫沈降した。その後、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体を溶出し、同様に分析した。
【０４８６】
脂肪酸取込みアッセイ
［１−１４Ｃ］オレアート（５９．０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をＢＳＡ（脂肪酸を含まない、Ｓｉｇｍａ、ＢＳＡ：オレアート＝１：６）とコンジュゲートした。初代肝細胞を組換えａＰ２（５０μｇ／ｍｌ）と２時間インキュベートし、［１−１４Ｃ］オレアート−ＢＳＡ複合体を加えて１５０μＭの最終濃度を得た。示した期間の後、細胞を氷上に置き、冷ＰＢＳで５回洗浄し、０．１ＮのＮａＯＨで溶解して、放射活性及びタンパク質濃度を測定した。
【０４８７】
脂肪酸酸化
初代肝細胞を、Ｉ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）でコートしたＸＦ９６細胞培養マイクロプレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に７×１０３／ウェルの密度にて播種した。細胞を、血清を有さないウィリアムＥ培地中で組換えａＰ２（５０μｇ／ｍｌ）により２時間処理し、その後、培養培地を、同じ濃度のビヒクル又は組換えａＰ２を有するＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液（１１１ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭグルコース、０．５ｍＭカルニチン、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）に変えた。酸素（Ｏ２）消費速度（ＯＣＲ）を、ＢＳＡ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とコンジュゲートした１５０μＭのパルミタートへの曝露の前後に測定した。
【０４８８】
免疫細胞化学
初代肝細胞を上記のように９０分間インキュベートし、室温にて１０分間４％のパラホルムアルデヒド中で固定した。細胞を０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理し、１０％のロバ血清（Ｓｉｇｍａ）で１時間遮断した。ＣｔＢＰ２及びＦｏｘＯ１を検出するために利用した一次抗体はそれぞれ、ヤギポリクローナルＣｔＢＰ２抗体Ｅ−１６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：５０）並びにａｂ３９６７０（Ａｂｃａｍ（登録商標）、１：１００）、Ｃ２９Ｈ４（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１００）及びＨ−１２８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：１００）を含有するウサギポリクローナルＦｏｘＯ１抗体の混合物であった。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５６８とコンジュゲートしたロバ抗ヤギＩｇＧ及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７とコンジュゲートしたロバ抗ウサギＩｇＧを二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：２００）として適用した。
【０４８９】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
初代肝細胞を上記のように９０分間インキュベートし、室温にて１０分間１％のホルムアルデヒド中で固定した。架橋を、１２５ｍＭの最終濃度までグリシンを加えることによってクエンチした。その後、クロマチン剪断をＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によって達成したという若干の改良をしてＭａｇｎａ  ＣｈＩＰ  ＨｉＳｅｎｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＣｈＩＰアッセイを実施した。クロマチンを、対照ＩｇＧ、抗ＦｏｘＯ１（Ａｂｃａｍ（登録商標）、ａｂ３９６７０）又は抗ＣｔＢＰ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｅ−１６）のいずれかで免疫沈降した。免疫沈降したＤＮＡ及び入力ＤＮＡを、Ｇ６ｐｃ遺伝子プロモーターに特異的なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲによって定量化した。Hall, J.A., Tabata, M., Rodgers, J.T. & Puigserver, P. USP7 attenuates hepatic gluconeogenesis through modulation of FoxO1 gene promoter occupancy. Molecular endocrinology 28, 912-924 (2014)を参照のこと。
【０４９０】
細胞ラクタート／ピルバート測定
細胞質ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比を推定するために、細胞ラクタート及びピルバート含有量を、キット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて測定した。ピルバート／ＮＡＤＨとラクタート／ＮＡＤとの間の変換が平衡であるとき、細胞質ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比はラクタート／ピルバート比によって推定することができた。Williamson, D.H., Lund, P. & Krebs, H.A. The redox state of free nicotinamide-adenine dinucleotide in the cytoplasm and mitochondria of rat liver. The Biochemical Journal 103, 514-527 (1967)を参照のこと。
【０４９１】
ａＰ２はＦｏｘＯ１依存的に糖新生遺伝子発現を上方制御する
アディポカインとして作用すると、ａＰ２は、ｉｎ  ｖｉｖｏで肝臓及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで肝細胞の両方において糖新生遺伝子の発現を直接上方制御する。Cao, H., et al. Adipocyte lipid chaperone AP2 is a secreted adipokine regulating hepatic glucose production. Cell metabolism 17, 768-778 (2013)を参照のこと。
【０４９２】
上方制御の程度は細胞培養系において適度であるため、さらなる実験設定を、これらの遺伝子のより強固な上方制御を得るために試験した。絶食を模倣するシグナルの存在が遺伝子発現に対するａＰ２の効果を増加させることを発見した。例えば、ホルスコリン（アデニル酸シクラーゼの活性化因子）及びグルカゴン（データは示さず）は、初代肝細胞におけるＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１遺伝子発現を上方制御するａＰ２の能力を向上させた（図３８Ａ及び３８Ｂ）。反対に、Ｈ８９によるｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナリングを遮断することにより、ａＰ２の効果が無効になった（図３８Ｃ及び３８Ｄ）。
【０４９３】
さらに、この設定におけるａＰ２による糖新生遺伝子調節の分子基盤は本明細書に記載されているように識別されている。脱脂質化ａｐ２及び脂質結合能力を欠失しているａＰ２の突然変異型（Ｒ１２６Ｌ、Ｙ１２８Ｆ）（Erbay, E., et al. Reducing endoplasmic reticulum stress through a macrophage lipid chaperone alleviates atherosclerosis. Nature Medicine 15, 1383-1391 (2009)）の両方は、ホルスコリンの存在下で糖新生遺伝子発現を上方制御することができず（図３２Ａ及び３２Ｂ）、ａＰ２脂質カーゴがこの活性の重要なメディエーターであることを示している。
【０４９４】
遺伝子発現に対するａＰ２の効果を無効にするそれらの能力について、ＦｏｘＯ１、低酸素誘導因子１α（Ｈｉｆ１α）、シグナル伝達物質及び転写活性化因子３（Ｓｔａｔ３）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ共活性化因子１α（ＰＧＣ−１α、Ｐｐａｒｇｃ１ａ）、ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα、Ｃｅｂｐａ）及びグルココルチコイド受容体（ＧＲ、核受容体サブファミリー３グループＣメンバー１、Ｎｒ３ｃ１）等のいくつかの重要な肝臓転写因子及び補因子をスクリーニングするためにｓｉＲＮＡノックダウンを使用した。これらの中で、以前に糖新生遺伝子発現の転写調節において重要な役割を果たすことが示されているＦｏｘＯ１のノックダウン（Lin, H.V. & Accili, D. Hormonal regulation of hepatic glucose production in health and disease. Cell metabolism 14, 9-19 (2011)を参照のこと）が、Ｇ６ｐｃ発現に対するａＰ２の効果を最も著しく鈍化させた（図３２Ｃ、３９Ａ〜３９Ｈ）。
【０４９５】
この見解をアデノウイルス媒介性ｓｈＲＮＡ送達によってさらに検証した。再び、アデノウイルス媒介性ＦｏｘＯ１ノックダウンは、ａＰ２によって誘導されたＧ６ｐｃ遺伝子発現の上方制御を有意に減少させた（図３２Ｄ及び３２Ｅ）。この見解と一致して、ａＰ２は初代肝細胞におけるＦｏｘＯ応答性ルシフェラーゼレポーター（ＦＨＲＥ）の活性を増加させ、この効果はホルスコリンの存在下でより顕著であった（図３２Ｆ）。ａＰ２による処置はＦｏｘｏ１の発現レベルに影響を与えなかった（図３９Ｈ）。さらに、ａＰ２はＦｏｘＯ１依存的に肝細胞からのグルコース産生を増加させた（図３２Ｇ）。
【０４９６】
細胞外ａＰ２は肝細胞における脂肪酸代謝を変化させる
ａＰ２は脂肪酸結合タンパク質であり、ａＰ２の遺伝的欠損及び抗体媒介性中和は全身の脂肪酸代謝を変化させることが知られているので（Hotamisligil, G.S., et al. Uncoupling of obesity from insulin resistance through a targeted mutation in aP2, the adipocyte fatty acid binding protein. Science (New York, N.Y.) 274, 1377-1379 (1996)；Maeda, K., et al. Adipocyte/macrophage fatty acid binding proteins control integrated metabolic responses in obesity and diabetes. Cell metabolism 1, 107-119 (2005)；Cao, H., et al. Regulation of metabolic responses by adipocyte/macrophage Fatty Acid-binding proteins in leptin-deficient mice. Diabetes 55, 1915-1922 (2006)）、肝細胞における脂肪酸代謝に対する外因性ａＰ２処置の効果を評価した。ａＰ２の効果は、脂肪酸酸化阻害剤であるエトモキシルの存在下で有意に減少した（図３３Ａ及び３３Ｂ）。このデータは、ａＰ２が脂肪酸酸化を阻害することによって糖新生遺伝子発現を調節していることを示唆している。この見解と一致して、ａＰ２は、パルミタート注射後の酸素消費速度によって測定して、脂肪酸酸化のパルミタート刺激性の増加を減少させた（図３３Ｃ）。さらに、ａＰ２は肝細胞への脂肪酸取込みを確実に増加させたが（図３３Ｄ）、観察されたａＰ２による脂肪酸酸化の阻害の程度（図３３Ｃ）は過小評価であり得ることを示唆している。さらに、外因的に供給されたパルミタートは、ａＰ２によって誘導される糖新生遺伝子発現の程度を増加させた（図３３Ｅ及び３３Ｆ）。
【０４９７】
細胞内に取り込まれると、脂肪酸はＣｏＡでエステル化されて脂肪アシル−ＣｏＡチオエステルを形成し、それらが酸化及び脂質合成のために利用されるミトコンドリア及び小胞体等の細胞小器官に輸送される。Mashek, D.G. & Coleman, R.A. Cellular fatty acid uptake: the contribution of metabolism. Current opinion in lipidology 17, 274-278 (2006)及びAnderson, C.M. & Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular aspects of medicine 34, 516-528 (2013)を参照のこと。ａＰ２処置後、脂肪酸酸化の減少を伴う脂肪酸取込みの増加は、代謝疾患において調節的な役割を果たすことが示されている細胞質の脂肪アシル−ＣｏＡの蓄積をおそらく引き起こす。DeFronzo, R.A. Insulin resistance, lipotoxicity, type 2 diabetes and atherosclerosis: the missing links. The Claude Bernard Lecture 2009. Diabetologia 53, 1270-1287 (2010)を参照のこと。ａＰ２誘導性糖新生遺伝子発現に対するパルミタートの効果が細胞質アシル−ＣｏＡに関与するかどうかを試験するために、アシル−ＣｏＡ合成酵素阻害剤である、トリアクシンＣを使用した。Mashek, D.G. & Coleman, R.A. Cellular fatty acid uptake: the contribution of metabolism. Current opinion in lipidology 17, 274-278 (2006)を参照のこと。アシル−ＣｏＡ合成酵素の化学的阻害は、遺伝子発現に対するａＰ２の効果を増強する外因性パルミタートの能力を有意に減少させた（図３３Ｇ及び３３Ｈ）。さらに、ａＰ２で初代肝細胞を処置すると、核脂肪アシル−ＣｏＡの蓄積の有意な増加が誘発された（図３３Ｉ）。まとめると、これらのデータにより、肝細胞における脂質流量及び代謝回転の両方がａＰ２によってモジュレートされ、これが、糖新生遺伝子発現に対するａＰ２の効果の基礎となることが示される。
【０４９８】
新規の抑制的複合体である、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２はａＰ２によってモジュレートされる
ＦｏｘＯ１は、細胞内脂質環境によって調節されることは以前に示されていない。したがって、脂質シグナリングをＦｏｘＯ１活性化に関連付けることができるかもしれない分子を試験した。Ｃ末端結合タンパク質（ＣｔＢＰ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ）だけでなく、脂肪アシル−ＣｏＡにも結合することが示されている転写リプレッサーである。Nardini, M., et al. CtBP/BARS: a dual-function protein involved in transcription co-repression and Golgi membrane fission. The EMBO journal 22, 3122-3130 (2003)を参照のこと。重要なことに、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ結合は、ＣｔＢＰの立体構造変化を誘導し、活性リプレッサー形態のホモ二量体化及び形成を促進するが、アシル−ＣｏＡ結合は単量体の立体構造を誘導する。Nardini, M., et al. CtBP/BARS: a dual-function protein involved in transcription co-repression and Golgi membrane fission. The EMBO journal 22, 3122-3130 (2003)を参照のこと。本発明者らの実験系において、本発明者らは、ａＰ２媒介性遺伝子発現に対する２つのＣｔＢＰアイソフォームの各々の役割を試験した。ＣｔＢＰ１のノックダウンはａＰ２誘導性遺伝子発現に対して影響を及ぼさなかったが、ＣｔＢＰ２ノックダウンはａＰ２の効果を遮断した（図３４Ａ、３４Ｂ、４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ及び４０Ｄを参照のこと）。特に、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）は、長鎖脂肪アシル−ＣｏＡに対する結合親和性を有する周知の糖新生転写因子であるが（Hertz, R., Magenheim, J., Berman, I. & Bar-Tana, J. Fatty acyl-CoA thioesters are ligands of hepatic nuclear factor-4alpha. Nature 392, 512-516 (1998)）、ａＰ２媒介性遺伝子発現に対するＨＮＦ４αノックダウンの効果は観測されなかった（図４０Ｅ及び４０Ｆ）。
【０４９９】
ＣｔＢＰはＤＮＡ結合タンパク質におけるＰｘＤＬｘモチーフに結合する。Chinnadurai, G. Transcriptional regulation by C-terminal binding proteins. The international journal of biochemistry & cell biology 39, 1593-1607 (2007)及びTurner, J. & Crossley, M. The CtBP family: enigmatic and enzymatic transcriptional co-repressors. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology 23, 683-690 (2001)を参照のこと。配列分析により、複数のマウス及びヒトＦｏｘＯタンパク質におけるＰｘＤＬｘモチーフが明らかになり（図３４Ｃ）、ＦｏｘＯとＣｔＢＰとの間の直接的相互作用についての可能性が示唆される。免疫共沈降実験により、初代肝細胞における内因性ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ複合体が明らかになった（図３４Ｄ及び３４Ｅ）。ＦｏｘＯ１におけるＰＳＤＬモチーフの突然変異又は欠失は、ＦｏｘＯ１とＣｔＢＰ２との間の相互作用を特異的に低下させたが、ＦｏｘＯ１とＣｔＢＰ１又は別の結合パートナーである、β−カテニンとの相互作用を減少させず（図３４Ｆ、３４Ｇ、４１Ａ及び４１Ｂ）、ＣｔＢＰ２はそのＰｘＤＬｘモチーフを介してＦｏｘＯ１に直接結合するのに対して、ＣｔＢＰ１はＦｏｘＯ１に間接的に又は他の相互作用部位（単数又は複数）を介して結合できることが示される。注目すべきことに、初代肝細胞をａＰ２で刺激すると、ＦｏｘＯ１はＣｔＢＰ２から解離した（図３４Ｈ及び４１Ｃを参照のこと）。
【０５００】
ＣｔＢＰによる転写抑制に対するＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの効果は完全に調査されているが [Zhang, Q., Piston, D.W. & Goodman, R.H. Regulation of corepressor function by nuclear NADH. Science (New York, N.Y.) 295, 1895-1897 (2002)；Kumar, V., et al. Transcription corepressor CtBP is an NAD(+)-regulated dehydrogenase. Molecular cell 10, 857-869 (2002)；Fjeld, C.C., Birdsong, W.T. & Goodman, R.H. Differential binding of NAD+ and NADH allows the transcriptional corepressor carboxyl-terminal binding protein to serve as a metabolic sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 9202-9207 (2003)；及びThio, S.S., Bonventre, J.V. & Hsu, S.I. The CtBP2 co-repressor is regulated by NADH-dependent dimerization and possesses a novel N-terminal repression domain. Nucleic Acids Research 32, 1836-1847 (2004)]、ＣｔＢＰの転写リプレッサー活性に対する脂肪アシル−ＣｏＡの効果は研究されていない。Valente, C., Spano, S., Luini, A. & Corda, D. Purification and functional properties of the membrane fissioning protein CtBP3/BARS. Methods In Enzymology 404, 296-316 (2005)を参照のこと。これを解明するために、増加させた濃度のオレオイル−ＣｏＡを細胞溶解物に加え、この処理の結果、用量依存的にＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の解離が生じたことが見出された（図３４Ｉ）。対照的に、本発明者らはまた、外因性ＮＡＤＨの存在下でＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体形成の増加も観測した（図３４Ｊを参照のこと）。ＣｔＢＰは、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比を感知する酸化還元センサーであることが報告されており（Zhang, Q., Piston, D.W. & Goodman, R.H. Regulation of corepressor function by nuclear NADH. Science (New York, N.Y.) 295, 1895-1897 (2002)；Chinnadurai, G. Transcriptional regulation by C-terminal binding proteins. The International Journal Of Biochemistry & Cell Biology 39, 1593-1607 (2007)）、したがってＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体が、細胞質の酸化還元状態又はＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比に応答することができるかどうかを試験した。ＦＬＡＧ−ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ２をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を異なる比の細胞外ラクタート／ピルバートで処理して、細胞質の酸化還元状態を変化させた。ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の形成は、高い細胞外ラクタート／ピルバート比（低い細胞質のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比）を有する細胞において向上した（図３４Ｋを参照のこと）。これらのデータは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体が脂肪アシル−ＣｏＡだけでなく、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨによっても調節されることを示唆している。したがって、本発明者らは次に、ａＰ２処理が細胞質のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比を直接変化させるかどうかを求めた。細胞質のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比は、乳酸脱水素酵素の平衡を仮定すると、細胞のピルバート／ラクタート比に反映されるので、本発明者らは、図３３Ｅ及び３３Ｆと同じ実験設定において細胞のラクタート／ピルバート比を測定した。ラクタート／ピルバート比は、パルミタートの存在下又は非存在下でａＰ２によって増加する傾向があるが、その差は有意ではなかった（図４１Ｄを参照のこと）。脂肪酸酸化の阻害はラクタート産生を増加させることが報告されていた。Pike, L.S., Smift, A.L., Croteau, N.J., Ferrick, D.A. & Wu, M. Inhibition of fatty acid oxidation by etomoxir impairs NADPH production and increases reactive oxygen species resulting in ATP depletion and cell death in human glioblastoma cells. Biochimica Et Biophysica Acta 1807, 726-734 (2011)を参照のこと。したがって、ラクタ���ト／ピルバート比の増加に対するこの傾向は脂肪酸酸化の阻害に続発する可能性がある。ここで、本発明者らは、比較的急性の実験設定においてａＰ２の直接的な作用を調べた。したがって、ａＰ２は、長期プロセスにおいて二次的にＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比に影響を及ぼし得るが、ａＰ２は、主に細胞の脂肪アシル−ＣｏＡ含有量をモジュレートすることによって、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体形成を調節する。ＦｏｘＯ活性は、リン酸化及びアセチル化等の翻訳後修飾を介した核細胞質シャトルによって部分的に調節される。Eijkelenboom, A. & Burgering, B.M. FOXOs: signalling integrators for homeostasis maintenance. Nature Reviews. Molecular Cell Biology 14, 83-97 (2013)を参照のこと。細胞質含有量の変化はごくわずかであったが、ａＰ２処理は、肝細胞中のＦｏｘＯ１の核含有量を増加させる傾向があったことが見出された（図３４Ｌ及び４１Ｅを参照のこと）。加えて、これらの刺激によるＣｔＢＰ２の核細胞質シャトルは観測されなかった。興味深いことに、ａＰ２及びホルスコリン処理は、タンパク質の核−細胞質シャトルを調節することが知られている修飾である、ＦｏｘＯ１リン酸化及びアセチル化のレベルを明確に変化させなかった。（図４１Ｆを参照のこと）
【０５０１】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイによってＣｔＢＰ２及びＦｏｘＯ１のプロモーター占有率をさらに調べた。ａＰ２への曝露は、ホルスコリンの非存在下又は存在下でＧ６ｐｃプロモーターからのＣｔＢＰ２の解離を引き起こした（図３４Ｍ及び３４Ｎ）。その効果はわずかであったが、ＦｏｘＯ１はａＰ２処理によってＧ６ｐｃプロモーターに動員された（図３４Ｍ及び３４Ｎ）。
【０５０２】
ＣｔＢＰ２は糖新生遺伝子発現を厳密に調節する
この新たに識別された転写系の特徴をさらに調査した。ＣｔＢＰはリプレッサーであることが知られているが、場合によっては、活性化因子として機能する。Fang, M., et al. C-terminal-binding protein directly activates and represses Wnt transcriptional targets in Drosophila. The EMBO journal 25, 2735-2745 (2006)を参照のこと。したがって、ＦｏｘＯ１媒介性糖新生遺伝子発現に対するＣｔＢＰ２の効果を検証した。ＣｔＢＰ２ノックダウンは、初代肝細胞におけるＧ６ｐｃ（図３５Ａ）及びＰｃｋ１（データは示さず）の発現を上方制御し、この効果はホルスコリンの存在下で向上し、このことは、これらの遺伝子のａＰ２媒介性上方制御の場合も同様であった。さらに、ＣｔＢＰ２ノックダウンによるこれらの遺伝子の上方制御はＦｏｘＯ１の同時ノックダウンによって減少した（図３５Ａ）。ＣｔＢＰ２ノックダウンはまた、ＦｏｘＯ応答性ルシフェラーゼレポーターを活性化した（図３５Ｂ）。反対に、ＣｔＢＰ２過剰発現はベースラインにおいてＧ６ｐｃ発現を下方制御し、Ｇ６ｐｃ及びＰｃｋ１のホルスコリン誘発性上方制御はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）過剰発現と比較してＣｔＢＰ２過剰発現によって確実に抑制された（図３５Ｃ、３５Ｄ及び３５Ｅを参照のこと）。ＣｔＢＰ２の過剰発現の際に発生する一般的な転写抑制の可能性を除外するために、複数の肝細胞遺伝子の発現を評価した。細胞代謝を調節するいくつかの遺伝子は上方制御され（例えばＡｃａｄｍ）、他の遺伝子は変化せず（例えばＡｌｂ、Ｃｒｅｂ１）（図３６Ａ〜３６Ｎを参照のこと、データは示さず）、ＣｔＢＰ２の特異的効果を示唆している。ＣｔＢＰ２過剰発現後のＦｏｘＯ１標的遺伝子の下方制御もまた、ＦｏｘＯ応答性ルシフェラーゼレポーター活性によって検証した（図３５Ｆ）。
【０５０３】
それらの経路がＦｏｘＯ１転写活性を調節することが以前に知られているので、インスリン及びｃＡＭＰシグナリングがＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２転写複合体を調節するかどうか、もまた、調査した。Brunet, A., et al. Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor. Cell 96, 857-868 (1999)；Nakae, J., et al. Regulation of insulin action and pancreatic beta-cell function by mutated alleles of the gene encoding forkhead transcription factor Foxo1. Nature Genetics 32, 245-253 (2002)；及びMihaylova, M.M., et al. Class IIa histone deacetylases are hormone-activated regulators of FOXO and mammalian glucose homeostasis. Cell 145, 607-621 (2011)を参照のこと。本明細書に示されているように、向上した解糖流量を介して増加したＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比によって引き起こされ得る、インスリン処理によるＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の軽度の増加が観測されたが、これらの経路の急性活性化はＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の形成を確実に変化させなかった（図３５Ｇ）。
【０５０４】
循環ａＰ２活性はｉｎ  ｖｉｖｏでＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２ホロ複合体を解離する
ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体のａＰ２モジュレーションの関連性をさらに調査するために、転写複合体形成をｉｎ  ｖｉｖｏで分析した。肥満マウスの肝臓における減少したＮＡＤ＋及び増加した脂肪アシル−ＣｏＡの含有量は報告されているので（Samuel, V.T., et al. Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. The Journal of Biological Chemistry 279, 32345-32353 (2004)；Hammond, L.E., et al. Mitochondrial glycerol-3-phosphate acyltransferase-1 is essential in liver for the metabolism of excess acyl-CoAs. The Journal of Biological Chemistry 280, 25629-25636 (2005)；Cheng, Z., et al. Foxo1 integrates insulin signaling with mitochondrial function in the liver. Nature Medicine 15, 1307-1311 (2009)；及びEckel-Mahan, K.L., et al. Reprogramming of the circadian clock by nutritional challenge. Cell 155, 1464-1478 (2013)）、ＣｔＢＰの機能不全のコリプレッサー活性は、肥満における調節されていない肝臓糖新生の基礎となる可能性がある。上昇したレベルの循環ａＰ２を有する、遺伝的に誘発された及び食餌誘発性肥満マウスの両方の肝臓において（Cao, H., et al. Adipocyte lipid chaperone aP2 is a secreted adipokine regulating hepatic glucose production. Cell Metabolism 17, 768-778 (2013)）、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２会合は痩せ対照と比較して劇的に低下した（図３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃ及び３６Ｄを参照のこと）。加えて、ａＰ２の遺伝的欠損及びａＰ２の抗体媒介性中和（抗ａＰ２モノクローナルＣＡ３３を使用）の両方は、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の形成を確実に向上させ（図３６Ｅ、３６Ｆ、３６Ｇ及び３６Ｈ）、これらの動物における肝臓グルコース産生の低下と一致する。Maeda, K., et al. Adipocyte/macrophage fatty acid binding proteins control integrated metabolic responses in obesity and diabetes. Cell Metabolism 1, 107-119 (2005)；Cao, H., et al. Adipocyte lipid chaperone aP2 is a secreted adipokine regulating hepatic glucose production. Cell Metabolism 17, 768-778 (2013)を参照のこと。
【０５０５】
上昇した循環ａＰ２がＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体を破壊するのに十分であるかどうかを決定するために、野生型痩せマウスへの５日間のＩＰ注射によって組換えａＰ２を投与し、その結果、肥満マウスにおいて観測されたレベルと同様である、血清ａＰ２レベルの軽度の増加が生じた（図３６Ｉ）［Cao, H., et al. Adipocyte lipid chaperone aP2 is a secreted adipokine regulating hepatic glucose production. Cell Metabolism 17, 768-778 (2013)］。循環ａＰ２のこの短期の増加の結果、肝臓におけるＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２相互作用の有意な低下が生じ（図３６Ｊ及び３６Ｋ）、これにより、Ｇ６ｐｃ発現の選択的な増加がもたらされた（図３６Ｌ）。重要なことに、この急性処置は、インスリン、グルカゴン、遊離脂肪酸又はグリセロール等の体重又は血清代謝パラメータに影響を与えなかった（図４３Ａ、４３Ｂ、４３Ｃ、４３Ｄ、４３Ｅ、４３Ｆ及び４３Ｇ）。
【０５０６】
肝細胞におけるＣｔＢＰ２過剰発現が糖新生遺伝子発現を確実に下方制御したので（図３５Ｄ及び３５Ｅ）、このシグナリング経路の治療可能性を、アデノウイルス媒介性遺伝子送達によって食餌誘発性肥満マウスの肝臓においてＣｔＢＰ２を過剰発現することによってｉｎ  ｖｉｖｏで調査した。アデノウイルス形質導入の３日後、ＣｔＢＰ２過剰発現は体重減少を誘発せずに肥満マウスにおける空腹時血糖値を正常化した（図３７Ａ、３７Ｂ及び４５Ａ）。独立したコホートにおいて、肥満マウスにおける３日間のアデノウイルスＣｔＢＰ２の過剰発現の結果、耐糖能の著しい改善が生じた（図３７Ｃ）。この改善は、５日間のアデノウイルス形質導入後のインスリン耐性試験によって決定されるように、インスリン感受性の変化によるものではなかった（図３７Ｄ、４５Ｅ及び４５Ｆ）。このモデルにおける肝臓グルコース産生をより直接的に評価するために、ピルバート耐性試験を実施し、ＣｔＢＰ２過剰発現の結果、ピルバート注射後、著しく鈍化したグルコース変動が生じたことを観測した（図３７Ｑ）。この見解と一致して、肝臓におけるＧ６ｐｃ発現はＣｔＢＰ２過剰発現動物において確実に下方制御したが、Ａｌｂ遺伝子発現は影響を受けなかった（図３７Ｅ、３７Ｆ及び３７Ｇ）。
【０５０７】
さらに、７日間のＣｔＢＰ２過剰発現後、肥満マウスにおける肝臓脂質蓄積の低下を観測した（図３７Ｈ）。肝脂肪症の劇的な改善はａＰ２の遺伝子欠失及び抗体媒介性中和の別の特徴である。Maeda, K., et al. Adipocyte/macrophage fatty acid binding proteins control integrated metabolic responses in obesity and diabetes. Cell Metabolism 1, 107-119 (2005)；Cao, H., et al. Regulation of metabolic responses by adipocyte/macrophage Fatty Acid-binding proteins in leptin-deficient mice. Diabetes 55, 1915-1922 (2006)を参照のこと。ＣｔＢＰ２過剰発現による脂肪症の低減もまた、肝臓トリグリセリドの測定によって検証し（図３７Ｉ）、これは、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの低下を伴った（図３７Ｊ）。これらの見解と一致して、脂質合成遺伝子発現はＣｔＢＰ２過剰発現によって確実に下方制御した（図３７Ｋ、３７Ｌ、３７Ｍ、３７Ｎ及び３７Ｏ）。この発現プロファイルはまた、細胞自律的に初代肝細胞においても観測された（図４５Ａ、４５Ｂ、４５Ｃ及び４５Ｄ）。ＣｔＢＰ２過剰発現は、ＦｏｘＯ１ノックアウト肝細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルを減少させ（図４５Ｅ及び４５Ｆ）、このことは、ＣｔＢＰ２がＦｏｘＯ１非依存的に脂質合成遺伝子発現を調節することを示唆している。肝臓脂肪症を抑制する際のＣｔＢＰ２の役割もまた、ＣｔＢＰ２の機能喪失によって示された。Ａｄ／ｓｈＣｔＢＰ２の形質導入の１４日後、ＣｔＢＰ２ノックダウンの結果、通常の食餌の痩せマウスにおける肝臓中のトリグリセリドの蓄積が生じ（図４５Ｇ及び４５Ｈ）、これは脂質合成遺伝子の発現の増加を伴った（図４５Ｉ及び４５Ｊ）。
【０５０８】
まとめると、循環ａＰ２タンパク質の作用の基礎となる分子機構を調査し、脂肪アシル−ＣｏＡ及びＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ等の細胞栄養素を感知する、ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ２から構成される新規転写ホロ複合体を識別した。脂肪酸代謝をモジュレートすることによって、ａＰ２はＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の解離を媒介し、糖新生遺伝子発現を駆動するようにＦｏｘＯ１を遊離させる（図３７Ｐ）。
【０５０９】
さらに、アディポカインａＰ２は、それがＦＯＸＯ１活性のモジュレーションを介して肝臓グルコース産生を増加させるように作用する、絶食条件下で上昇する。膵臓ベータ細胞において、ＦＯＸＯ１は、ＰＤＸ１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス１）に対する逆調節転写因子として作用する、ベータ細胞機能の重要な調節因子である。長期の絶食等のストレス条件下で、ＦＯＸＯ１は核へ移行し、そこでＦＯＸＯ１はＰＤＸ１結合を置き換え、抗酸化物質及びアンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）タンパク質についてのものを含むストレス応答遺伝子の発現を活性化する。組換えａＰ２の初代マウス及びヒト島への添加は、ＦＯＸＯ１の転座を促進し（図４６Ａ）、ａＰ２がＦＯＸＯ１依存性経路を介してベータ細胞機能をモジュレートするように作用できることが示唆される。このさらなる証拠は、ＩＮＳ１細胞における２４時間の処置後のＦＯＸＯ１標的遺伝子及びその後のタンパク質の発現の増加と共に示される（図４６Ｂ及び図４６Ｃ）。
【０５１０】
ａＰ２の非存在下で、ＦＯＸＯ１転座は低下し、それによりＰＤＸ１の活性の増加が可能となる。向上したＰＤＸ１活性は、増加したインスリン発現、グルコース輸送体及びグルコキナーゼの上方制御に起因する向上したグルコース感知、並びにアポトーシスに対する低下した感受性に対応する。したがって、遺伝子欠失又は抗体処置によるａＰ２の枯渇は、ＦＯＸＯ１依存性機構を介してＴ１Ｄを阻止するように作用することができる。
【０５１１】
（例７）
ａＰ２欠損は、気管支収縮剤（メタコリン）の吸入時にａＰ２ノックアウトマウスにおいて改善された気道機能をもたらす
１１〜１３週齢までの通常の食餌で飼育された野生型及びａＰ２遺伝子欠損マウスを、実験の０日及び１４日に腹腔内（ＩＰ）注射したオボアルブミン（ＯＶＡ）１００マイクログラムで感作させた。次いで２８日、３０日、３２日及び３３日に、動物にＰＢＳ中の１％ＯＶＡを噴霧した。実験測定値を３４日に収集した。気道抵抗を、増加させた濃度にて、気管支収縮剤であるメタコリンを使用してチャレンジの間に測定した。マウスにメタコリンを２０分間噴霧し、ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ装置（Ｓｃｉｒｅｑ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、カナダ）を使用して反復測定を合計で１２回の連続測定で３分間行った。図４７に示した結果は、ａｐ２欠損マウスが、同じ条件下の野生型マウスと比較して、メタコリンチャレンジの間に改善された気道機能を有することを示している。
【０５１２】
本明細書は、本発明の実施形態を参照して記載されている。しかしながら、当業者は、様々な修飾及び変更が、以下の特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲から逸脱せずになされてもよいことを理解する。したがって、本明細書は、限定的な意味ではなく、例示的であるとみなされ、全てのこのような修飾は本発明の範囲内に含まれることを意図する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
2018515082.tif 000063
【図２Ｆ】
2018515082.tif 000064
【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図５Ｏ】
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【図５Ｐ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
2018515082.tif 000152
【図２２Ｊ】
2018515082.tif 000153
【図２２Ｋ】
2018515082.tif 000154
【図２２Ｌ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2018515082.tif 000168
【図３０Ａ】
2018515082.tif 000169
【図３０Ｂ】
2018515082.tif 000170
【図３０Ｃ】
2018515082.tif 000171
【図３１】
2018515082.tif 000172
【図３２Ａ】
2018515082.tif 000173
【図３２Ｂ】
2018515082.tif 000174
【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
2018515082.tif 000178
【図３２Ｇ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３３Ｇ】
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【図３３Ｈ】
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【図３３Ｉ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３４Ｇ】
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【図３４Ｈ】
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【図３４Ｉ】
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【図３４Ｊ】
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【図３４Ｋ】
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【図３４Ｌ】
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【図３４Ｍ】
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【図３４Ｎ】
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【図３５Ａ】
2018515082.tif 000203
【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３５Ｇ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３６Ｅ】
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【図３６Ｆ】
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【図３６Ｇ】
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【図３６Ｈ】
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【図３６Ｉ】
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【図３６Ｊ】
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【図３６Ｋ】
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【図３６Ｌ】
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【図３６Ｍ】
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【図３６Ｎ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３７Ｅ】
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【図３７Ｆ】
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【図３７Ｇ】
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【図３７Ｈ】
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【図３７Ｉ】
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【図３７Ｊ】
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【図３７Ｋ】
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【図３７Ｌ】
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【図３７Ｍ】
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【図３７Ｎ】
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【図３７Ｏ】
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【図３７Ｐ】
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【図３７Ｑ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
2018515082.tif 000244
【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
2018515082.tif 000248
【図３９Ｅ】
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【図３９Ｆ】
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【図３９Ｇ】
2018515082.tif 000251
【図３９Ｈ】
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【図４０Ａ】
2018515082.tif 000253
【図４０Ｂ】
2018515082.tif 000254
【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
2018515082.tif 000256
【図４０Ｅ】
2018515082.tif 000257
【図４０Ｆ】
2018515082.tif 000258
【図４０Ｇ】
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【図４１Ａ】
2018515082.tif 000260
【図４１Ｂ】
2018515082.tif 000261
【図４１Ｃ】
2018515082.tif 000262
【図４１Ｄ】
2018515082.tif 000263
【図４１Ｅ】
2018515082.tif 000264
【図４１Ｆ】
2018515082.tif 000265
【図４２】
2018515082.tif 000266
【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
2018515082.tif 000268
【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
2018515082.tif 000270
【図４３Ｅ】
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【図４３Ｆ】
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【図４３Ｇ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５Ａ】
2018515082.tif 000277
【図４５Ｂ】
2018515082.tif 000278
【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
2018515082.tif 000280
【図４５Ｅ】
2018515082.tif 000281
【図４５Ｆ】
2018515082.tif 000282
【図４５Ｇ】
2018515082.tif 000283
【図４５Ｈ】
2018515082.tif 000284
【図４５Ｉ】
2018515082.tif 000285
【図４５Ｊ】
2018515082.tif 000286
【図４６Ａ】
2018515082.tif 000287
【図４６Ｂ】
2018515082.tif 000288
【図４６Ｃ】
2018515082.tif 000289
【図４７】
2018515082.tif 000290
【配列表】
2018515082000001.app
【国際調査報告】
2018515082.tif 000291
2018515082.tif 000292
2018515082.tif 000293
2018515082.tif 000294
2018515082.tif 000295
2018515082.tif 000296