(57)【要約】  ミクロモノスポラ・カルボナセア（Micromonospora carbonacea）の遺伝的改変によりエベルニノマイシンアナログを調製する方法が開示されている。これらの方法により調製されるエベルニノマイシンアナログ、およびこれらのアナログを使用して感染を処置する方法も開示される。
2018536426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エベルニノマイシン同属体を産生するための方法であって、発酵装置において、産生培地中でミクロモノスポラ・カルボナセア変種アウランティアカ（Micromonospora carbonacea var. aurantiaca）細菌を培養し、これにより発酵培養物を産生するステップ、前記発酵培養物から前記エベルニノマイシン同属体を含有する抽出物を得るステップ、ならびに前記発酵培養抽出物から前記エベルニノマイシン同属体を単離および精製するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記エベルニノマイシン同属体が、ロサラマイシンにコンジュゲートされているエベルニノマイシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エベルニノマイシン同属体を産生するための方法であって、発酵装置において、産生培地中でミクロモノスポラ・カルボナセア（Micromonospora carbonacea）細菌を培養し、これにより発酵培養物を産生するステップであって、前記細菌が、ｅｖｄ遺伝子クラスターの遺伝子における１つまたは複数の変異を含む、ステップ、前記発酵培養物から前記エベルニノマイシン同属体を含有する抽出物を得るステップ、ならびに前記発酵培養抽出物から前記エベルニノマイシン同属体を単離および精製するステップを含む、方法。
【請求項４】
前記細菌が改変または欠失されたＯ−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ−メチルトランスフェラーゼおよび／またはニトロソシンターゼ活性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、ｅｖｄＭ２、ｅｖｄＭ３、ｅｖｄＮ１およびｅｖｄＯ１からなる群から選択される遺伝子における１つまたは複数の変異を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、ミクロモノスポラ・カルボナセア変種アウランティアカ（Micromonospora carbonacea var. aurantiaca）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ミクロモノスポラ属（Micromonospora）を形質転換する方法であって、
ａ.膜の一方の側に、ドナー細菌およびレシピエントであるミクロモノスポラ（Micromonospora）細菌を含むコンジュゲート組成物を接触させるステップであって、前記膜が、前記ドナー細菌ではなくミクロモノスポラ（Micromonospora）菌糸体によって浸透されることが可能である、ステップ、
ｂ．前記膜を浸透するミクロモノスポラ（Micromonospora）のコロニーが成長するのに十分な時間および温度で前記組成物をインキュベートするステップ、ならびに
ｃ．前記膜およびドナー細菌を除去し、これにより、前記形質転換されたミクロモノスポラ属（Micromonospora）を残すステップ
を含む、方法。
【請求項８】
前記ドナー細菌が、大腸菌（E. coli）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記レシピエントであるミクロモノスポラ属（Micromonospora）が、Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｍ.カルボナセア（M. carbonacera）が、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacera var aurantiaca）である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜が、容器の底部を形成し、前記容器が前記コンジュゲート組成物を保持する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質転換されたミクロモノスポラ属（Micromonospora）が、ｅｖｄ遺伝子クラスターの遺伝子における１つまたは複数の変異を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記形質転換されたミクロモノスポラ属（Micromonospora）が、ｅｖｄＭ２、ｅｖｄＭ３、ｅｖｄＮ１およびｅｖｄＯ１からなる群から選択される遺伝子における１つまたは複数の変異を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
２％未満のラクトースおよび少なくとも２％のグルコースを含む培地中、８〜１２日間、２８〜３４℃で、ミクロモノスポラ属（Micromonospora）をインキュベートするステップを含む、ミクロモノスポラ属（Micromonospora）を培養する方法。
【請求項１５】
インキュベートするステップが、３０℃である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
インキュベートするステップが、１０日間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記培地が、３％以上のグルコースを含み、ラクトースを実質的に含まない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
以下の構造を有する化合物：
【化１】
2018536426.tif 000021
（式中、
Ｒ４〜Ｒ６はそれぞれ、個々に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル；またはオルセルリニルであり、
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、Ｈ、ＯＭｅ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドもしくはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、またはロサラマイシンに結合している１〜２０個の原子のリンカーであり、
Ｒ１２は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである）
または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１９】
以下の構造：
【化２】
2018536426.tif 000022
を有する、請求項１８に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２０】
以下の構造を有する化合物：
【化３】
2018536426.tif 000023
（式中、
Ｒ３およびＲ５はそれぞれ、個々に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル；またはオルセルリニルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ８は、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、Ｈ、ＯＭｅ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＮＯＨ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドもしくはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、またはロサラマイシンに結合している１〜２０個の原子のリンカーであり、
Ｒ１２は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである）
または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２１】
以下の構造：
【化４】
2018536426.tif 000024
を有する、請求項２０に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２２】
以下の構造を有する化合物：
【化５】
2018536426.tif 000025
（式中、
Ｒ３およびＲ５はそれぞれ、個々に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル；またはオルセルリニルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ８は、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、Ｈ、ＯＭｅ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＮＯＨ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドもしくはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、またはロサラマイシンに結合している１〜２０個の原子のリンカーであり、
Ｒ１２は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである）
または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２３】
以下の構造：
【化６】
2018536426.tif 000026
を有する、請求項２２に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２４】
以下の構造を有する化合物：
【化７】
2018536426.tif 000027
（式中、
Ｒ４〜Ｒ６はそれぞれ、個々に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル；またはオルセルリニルであり、
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、Ｈ、ＯＭｅ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドもしくはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、またはロサラマイシンに結合している１〜２０個の原子のリンカーであり、
Ｒ１２は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである）
または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２５】
以下の構造
【化８】
2018536426.tif 000028
を有する請求項２４に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２６】
以下の構造を有する化合物：
【化９】
2018536426.tif 000029
（式中、
Ｒ１、Ｒ３およびＲ５はそれぞれ、個々に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２は、ＨまたはＣｌであり、
Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル；またはオルセルリニルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ８は、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１２は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである）
または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２７】
以下の構造：
【化１０】
2018536426.tif 000030
を有する、請求項２６に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２８】
治療有効量の請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の化合物を、それを必要としている患者に投与するステップを含む、感染を処置する方法。
【請求項２９】
前記感染が、黄色ブドウ球菌（S. aureas）感染である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ｅｖｄ遺伝子クラスターの遺伝子における１つまたは複数の変異を含み、エベルニノマイシン同属体を発現する、単離されたミクロモノスポラ・カルボナセア（Micromonospora carbonacea）細菌。
【請求項３１】
改変または欠失されたＯ−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ−メチルトランスフェラーゼおよび／またはニトロソシンターゼ活性を有する、請求項３０に記載の細菌。
【請求項３２】
ｅｖｄＭ２、ｅｖｄＭ３、ｅｖｄＮ１およびｅｖｄＯ１からなる群から選択される遺伝子における１つまたは複数の変異を含む、請求項３０に記載の細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１５年１２月９日に出願の、米国仮特許出願第６２／２６５，１２６号明細書への優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
臨床現場において、薬物耐性細菌がますます流行しているために、新しい抗菌剤が必要となっている。米国疾病管理センタ−（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）による２０１３年度の報告書によれば、抗生物質耐性感染は、２，０４９，４４２例を超える疾病および２３，０００名の死亡をもたらした。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）は、単独で、毎年、約１００，０００例の感染およびほぼ死亡者の約半数の原因である。クリニックにおけるこのような危険な感染が猛威をふるっているので、新しい抗生物質の必要性が強く望まれている。試験済みおよび実際に存在する足場の改良は、新しい抗微生物剤を生成するための最も単純な方法であるが、新規な標的を用いる新しい足場が必要とされる。最新のクラスの抗生物質は、１９３０年代〜１９７０年代の抗生物質の研究の「黄金期」の間に発見された。しかし、１９７０年代初頭から１９９９年まで、新しいクラスの抗生物質は、１つしか上市されなかった。この状況は、２０００年以来、５つの新しいクラスの抗生物質が承認されたことにより、いくらか改善されたが、上記の統計は、現在、上市されているものとの交差耐性を示さないであろう、新規な作用機序を有する、新しいクラスの抗生物質が依然として強く望まれていることを示している。
【０００３】
オルトエステル連結によって定義される多糖類である、オルトソマイシンは、十分に調査されていないクラスの抗生物質である。エベルニノマイシンは、土壌細菌であるミクロモノスポラ・カルボナセア（Micromonospora carbonacea）によって産生され、かつＭＲＳＡおよびＶＲＥを含めた、様々なグラム陽性生物に対する活性を示す、幅広いスペクトルのオルトソマイシン抗生物質である。現在まで、１４種のエベルニノマイシンが報告されている。図１は、ミクロモノスポラ・カルボナセア（Micromonospora carbonacea）から単離されたエベルニノマイシンの種類を示している。エベルニノマイシンはすべて、Ａ環のニトロ糖のないＥｖｅｒ−２を除いて、ジクロロイソエバニニック酸を含有する、八糖類である。大多数のエベルニノマイシンはまた、糖鎖の反対側の端において、オルセリン酸も含有している。エベルニノマイシンは、３つの特異な酸化的特徴を有している。第１は、環Ｆに結合しているメチレンジオキシ架橋である。第２は、環Ｃと環Ｄとの間、および環Ｇと環Ｈとの間に位置している、同名の、オルトエステル連結である。最後は、（Ｌ）−エベルニトロース（環Ａ）は、エベルニノマイシンに特有のニトロ糖である。他の多糖類とは対照的に、エベルニノマイシンは、デオキシ糖をかなりの割合で含有している。環Ａ、Ｂ（Ｄ−オリボース）およびＣ（Ｄ−オリボース）、ならびにある場合、環Ｄ（Ｄ−エバロース）は、すべて、２，６−ジデオキシ糖である一方、環Ｅ（４−Ｏ−メチル−Ｄ−フコース）は、６−脱酸素化されている。環Ｆは２，６−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノースであり、環ＧはＬ−リキソースであり、環Ｈはオイレカネートである。
【０００４】
ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）Ｔｕ５７により産生されるアビラマイシンは、エベルニノマイシンに類似しているが、ニトロ糖のない七糖類である。少なくとも１６種のアビラマイシンが、これまでに特徴付けられている（図１）。アビラマイシンは、エベルニノマイシンと同じ七糖コアを有する。アビラマイシンはすべて、ジクロロイソエバニニック酸を含有するが、分子の右側（eastern side）にオルセリン酸がない。アビラマイシンの中での分化の主要点は、環Ｇおよび環Ｈの修飾である。エベルニノマイシンと同様に、アビラマイシンもやはり、メチレンジオキシ架橋、ならびに環Ｃと環Ｄおよび環Ｇと環Ｈとの間に位置している２つのオルトエステル連結を含有する。
【０００５】
エベルニノマイシンへの関心は、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（現在は、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ.）が抗微生物剤としてエベルニノマイシンＡ（ジラシン）を開発していた２０００年代初期においてピークを迎えた。エベルニノマイシンＡ（１）は、第ＩＩＩ相臨床試験に進んだ後、有効性と安全性の間のバランスに乏しいために中止された。しかし、このクラスのメンバーは、メチシリン耐性ブドウ球菌、グリコペプチド耐性腸球菌、バンコマイシン耐性腸球菌およびペニシリン耐性レンサ球菌などの臨床的に重要な株に対して強力な活性を有しているので、オルトソマイシンの検討は依然として関心が持たれており、感染性心内膜炎を処置するのに有効となり得る。
【０００６】
オルトソマイシンは、細菌の翻訳阻害剤として作用する。しかし、それらは、現在上市されている他の抗生物質とは異なる、大きなリボソームサブユニット上の部位を標的とする。エベルニノマイシンは、５０Ｓリボソームサブユニット上の特有の部位に結合することが示されており、ＩＦ２依存的様式で７０Ｓ開始複合体の形成を阻止し、これにより、細菌の翻訳を阻害する。具体的には、エベルニノマイシンは、リボソームタンパク質Ｌ１６、ならびにｒ２３Ｓ  ＲＮＡ螺旋８９および９１と相互作用するように思われる（図２）。エベルニノマイシンはまた、ＥＦ−４のＧＴＰアーゼ活性を阻害することにより、逆転座の強力な阻害剤でもある。
【発明の概要】
【０００７】
オルトソマイシンは、様々な薬物耐性グラム陽性細菌およびその新規な細菌標的に対するその活性により、臨床的に有用な薬物となり得る。自然界は、様々なエベルニノマイシンを既にもたらし、その構造−活性相関が理解し始められている。天然経路は基質に関してある程度の適応性および無差別性を含んでいるように思われるので、上記のことは、追い風となる。不運なことに、化学合成によるアナログの作製は、全合成が１３０を超える工程を必要とするので非実用的である。したがって、薬理学的および生物学的特性を有する、新しいエベルニノマイシン同属体を入手することが必要とされている。本明細書において開示されている方法および組成物は、これらの必要性および他の必要性に対処するものである。
【０００８】
本明細書において具現化され、幅広く記載されている、開示されている物質および方法の目的により、開示されている主題は、一態様では、化合物、組成物、ならびに化合物および組成物を作製して使用する方法に関する。特定の態様では、開示されている主題は、ミクロモノスポラ・カルボナセア（Micromonospora carbonacea）の遺伝的改変によりエベルニノマイシンアナログを調製する方法に関する。これらの方法により調製されるエベルニノマイシンアナログ、およびこれらのアナログを使用して感染を処置する方法も開示される。
【０００９】
さらなる利点は、後に続く記載中に一部説明されており、一部は、その記載から明白であるか、または以下に記載されている態様の実施により習得され得る。下記の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘されている要素および組合せにより実現されて達成される。上述の一般的な記載と以下の詳細説明のどちらも、例示でありかつ説明に過ぎないこと、および限定するものではないことを理解されたい。
【００１０】
本明細書の一部に組み込まれている、およびそれを構成する添付の図面が、下記のいくつかの態様を例示している。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】エベルニノマイシンおよびアビラマイシンの構造を含む図である。
【図２】オルトソマイシン抗生物質のリボソームの結合部位を示す図である。小さなリボソームサブユニット（ＰＤＢ  ２Ｊ００）は、暗灰色で示されており、大きなサブユニット（ＰＤＢ  ２Ｊ０１）は、明灰色で示されている。ＡおよびＰ部位は、サーモンピンク色で示されている。リボソームタンパク質Ｌ１６は、緑色（鎖Ｑ）で、螺旋８９（鎖Ａ、残基２４５４−２４９８）は青色で、および螺旋９１（鎖Ａ、残基２５２０−２５４５）はマゼンタ色で示されている。エベルニノマイシンおよびアビラマイシンと相互作用することが知られているアミノ酸残基およびヌクレオチドは、黄色で強調されている。
【図３】新しいエベルニノマイシンＥｖｅｒ−２およびＥｖｅｒ−Ｈ（１１）、Ｅｖｅｒ  Ｊ（１２）およびＥｖｅｒ−Ｋ（１３）の構造を含む図である。同様に、質量スペクトルのフラグメントパターンも示されている。破線は、フラグメント化実験の間の開裂位置を示している。
【図４】アビラマイシンＡおよびエベルニノマイシンＡの構造を示す図である。Ｓ．ビリジクロモゲネス（S. viridichromogenes）Ｔｕ５７に由来するＡｖｉ遺伝子クラスター、およびＭ．カルボナセア変種アフリカナ（M. carbonacea var africana）に由来するｅｖｅ遺伝子クラスター。遺伝子は、推定上の機能に従い、影が付けられている。
【図５】各培養条件により産生されたエベルニノマイシンＦの相対レベルが示されている、グラフである。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、各エベルニノマイシンアナログの最小阻害濃度が、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（S. aureus subsp. aureus ）Rosenbachに対して試験されたことを示すグラフである。図６Ａは、様々な濃度の黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（S. aureus subsp. aureus）Rosenbachに対するエベルニノマイシンＡの活性を示している。図６Ｂは、様々な濃度の黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（S. aureus subsp. aureus）Rosenbachに対する完全長エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートの活性を示している。図６Ｃは、様々な濃度の黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（S. aureus subsp. aureus）Rosenbachに対する短縮エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートの活性を示している。
【図７】図７Ａは、中央にコンジュゲート混合プレートを有する洗浄器／膜アセンブリの写真である。図７Ｂは、９日後に洗浄器／膜アセンブリを取り除き、アプラマイシン耐性接合完了体の純粋なコロニーが残っていることを示す写真である。
【図８】ｐＳＥＴ１５２およびｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥのマップを含む図である。ａａｃ（３）ＩＶは、アプラマイシン耐性マーカーである。ｈｙｇは、ハイグロマイシン耐性マーカーであるｈｐｈである。ｏｒｉＴは、移入起点である。ｉｎｔは、ファージφＣ３１インテグラーゼである。ａｔｔＰは、ファージφＣ３１結合部位である。ｅｒｍＥ＊は、複数のクローニング部位の上流で、直接、構成的に活性なプロモーターをコードする。
【図９】遺伝的相補性プラスミドである、ｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥのマップである。プラスミドマップは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓａｖｖｙ／において、Ｓａｖｖｙ（Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ＆Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｐ  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ（商標）２００１年、Ｍａｌａｙ  Ｋ  Ｂａｓｕ）を使用して生成した。Ｈｙｇは、ハイグロマイシン耐性マーカーｈｐｈである。ｏｒｉＴは、移入起点である。ｉｎｔは、ファージφＣ３１インテグラーゼである。ａｔｔＰは、ファージφＣ３１結合部位である。ｅｒｍＥ＊は、複数のクローニング部位の上流で、直接、構成的に活性なプロモーターである。
【図１０−１】図１０は、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）のｅｖｄ遺伝子クラスターに由来する、ＯＲＦの図示および推測される機能的割り当てを示す図である。
【図１０−２】上記と同じである。
【図１０−３】上記と同じである。
【図１１−１】図１１は、Ｍ．カルボナセア変種アフリカナ（M. carbonacea var africana）のｅｖｅ遺伝子クラスターに由来する、ＯＲＦの図示および推測される機能的割り当てを示す図である。
【図１１−２】上記と同じである。
【図１１−３】上記と同じである。
【図１２−１】図１２は、Ｓ．モバラエンシス（S.mobaraensis）のａｖａ遺伝子クラスターに由来する、ＯＲＦの図示および推測される機能的割り当てを示す図である。
【図１２−２】上記と同じである。
【図１２−３】上記と同じである。
【図１３】４種のクラスＩのオルトソマイシン遺伝子クラスターである、ｅｖｄ、ｅｖｅ、ａｖａおよびａｖｉに由来する、メチルトランスフェラーゼの系統発生解析の図である。
【図１４】２工程での標的遺伝子破壊に関するスキームを示す図である。
【図１５】単一交差対二重交差置換の図である。
【図１６】二重交差事象を確認する、標的置換変異体のサザンハイブリダイゼーションからの結果を示す図である。ブロットはすべて、予測されるシフトが実験により観察されたことを示しており、したがって、二重交差が確認される。パネルＡは、ΔｅｖｄＭ２：：ａａｃ（３）ＩＶのサザンブロット解析を示す。略図は、ｅｖｄＭ２とアプラマイシンカセットの置き換えで予測される相対シフトを図示している。パネルＢは、ΔｅｖｄＭ３：：ａａｃ（３）ＩＶのサザンブロット解析を示す。略図は、ｅｖｄＭ３とアプラマイシンカセットの置き換えで予測される相対シフトを図示している。パネルＣは、ΔｅｖｄＮ１：：ａａｃ（３）ＩＶのサザンブロット解析を示す。略図は、ｅｖｄＮ１をアプラマイシンカセットにより置き換えた相対シフトを図示している。ラダーは、ＤＩＧ標識されている、ＤＮＡ分子量マーカーＶＩＩ（製品番号１１６６９９４０９１０；Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。ＷＴは、野生型Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）である。ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶは制限である。
【図１７】オルトソマイシン関連オキシゲナーゼの系統発生解析を示す図である。解析は、方法の項目に記載されている通り、ＭＥＧＡ５を使用して行った。クラスＩのオルトソマイシン関連オキシゲナーゼは、３つの個別のグループを形成し、各グループは、各経路から１種のオキシゲナーゼを含有する。クラスＩＩに関連するオキシゲナーゼであるＨｙｇＸは、他のオキシゲナーゼとクラスター形成をしなかった。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃは、二重交差事象を確認する、標的欠失変異体のサザンハイブリダイゼーションからの結果を示す図である。図１８Ａは、ΔｅｖｄＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶのサザンブロット解析である。略図は、ｅｖｄＯ１とアプラマイシンカセットの置き換えで予測される相対シフトを図示している。ブロットは、予測されるシフトが実験により観察されたことを示しており、したがって、二重交差が確認される。図１８Ｂは、ΔｅｖｄＭＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶのサザンブロット解析である。略図は、ｅｖｄＭＯ１とアプラマイシンカセットの置き換えで予測される相対シフトを図示している。ブロットは、予測されるシフトが実験により観察されたことを示しており、したがって、二重交差が確認される。図１８Ｃは、ΔｅｖｄＯ２：：ａａｃ（３）ＩＶのサザンブロット解析である。略図は、ｅｖｄＯ２をアプラマイシンカセットにより置き換えた相対シフトを図示している。ブロットは予測されるシフトを有しておらず、遺伝子置換が成功しなかったことを示す。ラダーは、ＤＩＧ標識されている、ＤＮＡ分子量マーカーＶＩＩ（製品番号１１６６９９４０９１０；Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。ＷＴは、野生型Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）である。ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩは、ゲノムＤＮＡを予測されるサイズのフラグメントに開裂させるために使用される、制限エンドヌクレアーゼである。ブロットは、予測されるシフトが実験により観察されたことを示しており、したがって、二重交差が確認される。
【図１９−１】図１９は、短縮エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲート（８）のＮＭＲデータを示す図である。
【図１９−２】上記と同じである。
【図２０−１】図２０は、エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲート（９）のＮＭＲデータを示す図である。
【図２０−２】上記と同じである。
【図２０−３】上記と同じである。
【図２１−１】図２１は、エベルニノマイシンＨ（１１）のＮＭＲデータを示す図である。
【図２１−２】上記と同じである。
【図２１−３】上記と同じである。
【図２２−１】図２２Ａ〜２２Ｃは、野生型Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var. aurantiaca）、およびｅｖｄＭ５（ΔｅｖｄＭ５：：ａａｃ（３）ＩＶ）の遺伝子置換体のＬＣ／ＭＳクロマトグラムを示す図である。図２２Ａは、エベルニノマイシンＤ〜Ｇおよび新規な代謝産物について、ネガティブモードでの合計したイオン強度を示すクロマトグラムである。
【図２２−２】図２２Ｂは、ΔｅｖｄＭ５：：ａａｃ（３）ＩＶ代謝産物の構造を示す。図２２Ｃは、デス−メチルＥｖｅｒ  Ｆに関する、フラグメントパターンを示す。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｂは、野生型Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var. aurantiaca）、およびｅｖｄＤ２（ΔｅｖｄＤ２：：ａａｃ（３）ＩＶ）の遺伝子置換体のＬＣ／ＭＳクロマトグラムを示す図である。図２３Ａは、エベルニノマイシンＤ〜Ｇおよび新規な代謝産物について、ネガティブモードでの合計したイオン強度を示すクロマトグラムである。図２３Ｂは、ΔｅｖｄＤ２：：ａａｃ（３）ＩＶ代謝産物の構造を示す。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｂは、野生型Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var. aurantiaca）、ならびにｅｖｄＤ１（ΔｅｖｄＤ１：：ａａｃ（３）ＩＶ）およびｅｖｄＤ３（ΔｅｖｄＤ３：：ａａｃ（３）ＩＶ）の遺伝子置換体のＬＣ／ＭＳクロマトグラムを示す図である。図２４Ａは、エベルニノマイシンＤ〜Ｇおよび新規な代謝産物について、ネガティブモードでの合計したイオン強度を示すクロマトグラムである。図２４Ｂは、エベルニノマイシンＱに関するフラグメントパターンを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に記載されている物質、化合物、組成物および方法は、その中に含まれる、開示されている主題、図および実施例の特定の態様の以下の詳細説明を参照することにより、一層、容易に理解することができる。
【００１３】
本物質、化合物、組成物および方法を開示して記載する前に、下記の態様は、特定の合成方法および特定の試薬に限定されず、したがって、当然ながら、様々となり得ることを理解すべきである。本明細書において使用されている用語は、特定の態様を記載する目的に過ぎず、限定を意図するものではないこともやはり理解されたい。
【００１４】
同様に、本明細書を通じて、様々な刊行物が参照される。開示されている主題に関係する現状技術を一層完全に記載するため、これらの刊行物の全体の開示が、参照により本明細書に組み込まれている。開示されている参照文献はまた、該参照文献が依存する文章において議論されている、本明細書中に含まれている資料に関して、本明細書において参照により個々におよび具体的に組み込まれている。
【００１５】
一般的な定義
本明細書において、および後続する特許請求の範囲において、以下の意味を有するものと定義されることになる、いくつかの用語が参照される。
【００１６】
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、語「含む（comprise）」、ならびに「含まれている（comprising）」および「含む（comprises）」などのこの語の他の形態は、以下に限定されないが、例えば、他の添加物、構成成分、整数または工程を含むことを意味し、これらを除外することを意図するものではない。
【００１７】
本明細書および添付されている特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「ある組成物（a composition）」と言う場合、２つ以上のこのような組成物の混合物を含み、「ある抗生物質（an antibiotic）」と言う場合、２種以上のこのような抗生物質の混合物を含み、「本化合物（the compound）」と言う場合、２つ以上のこのような化合物の混合物を含むなどである。
【００１８】
「任意選択的に」または「場合により」は、後に記載されている事象または状況が、発生することができること、または発生することはできないこと、ならびにこの記載は、該事象または状況が発生する場合、およびそれらが発生しない場合を含むことを意味する。
【００１９】
本開示の幅広い範囲を説明する数値範囲およびパラメータが概数である場合に関わらず、具体例中に説明されている数値は、できる限り正確に報告されている。しかし、いかなる数値も、個々の試験測定において見られる標準偏差に必然的に起因するある種の誤差を、本質的に含んでいる。さらに、様々な範囲の数値範囲が本明細書において説明されている場合、列挙されている値を含めた、これらの値の任意の組合せが使用され得ることが企図されている。さらに、範囲は、本明細書では、「約」１つの具体的な値から、および／または「約」別の具体的な値までとして表現することができる。このような範囲を表現する場合、別の態様には、１つの具体的な値から、および／または他の具体的な値までが含まれる。同様に、前に置かれる「約」を使用することにより、値を概数として表す場合、この具体的な値が別の態様を形成すると理解されよう。各範囲の端点は、他の端点と関連して、および他の端点と独立しての両方で、重要であることがさらに理解されよう。特に明記されていない限り、用語「約」は、用語「約」によって修飾される具体的な値の５％以内（例えば、２％または１％以内）であることを意味する。
【００２０】
「軽減する（reduce）」、または「軽減すること（reducing）」もしくは「軽減（reduction）」などのこの語の他の形態は、事象または特徴（例えば、細菌成長または感染）が少なくなることを意味する。これは、ある標準値または予想値に通常、関連する、言い換えると、関連性があるが、必ずしも、標準値または相対値が参照される必要がないことが理解される。例えば、「細菌成長を低下させる」とは、標準または対照と比べて、細菌の量が低下したことを意味する。
【００２１】
「予防する（prevent）」、または「予防すること（preventing）」もしくは「予防（prevention）」などのこの語の他の形態は、特定の事象または特徴を停止させること、特定の事象もしくは特徴の発症または進行を安定化あるいは遅延させること、あるいは特定の事象または特徴が起こる機会を最小化させることを意味する。予防は、通常、例えば、低減するよりも絶対的であるので、対照との比較を必要としない。本明細書で使用する場合、何らかが低減され得るが、予防され得ない、しかし低減される何らかは、やはり予防され得る。同様に、何らかが予防され得るが、低減され得ない、しかし予防される何らかは、やはり低減され得る。特に具体的に示されていない限り、低減または予防が使用される場合、他の語の使用もやはり明確に開示されていることが理解される。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「処置」とは、有益な、または所望の臨床的結果を得ることを指す。有益なまたは所望の臨床的結果は、以下に限定されないが、１つまたは複数の症状（細菌成長または感染など）の緩和、感染の程度の低下、感染状態の安定化（すなわち、悪化しない）、感染の拡大の予防または遅延、感染の発生もしくは再発の予防または遅延、および感染の進行の遅延または減速のうちのいずれか１つまたは複数を含む。
【００２３】
用語「患者」は、好ましくは、抗生物質による処置、または任意の目的のための処置を必要としているヒト、より好ましくは、細菌感染を処置するためのこのような処置を必要としているヒトを指す。しかし、用語「患者」は、とりわけ、抗生物質による処置を必要としている、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよび非ヒト霊長類などの、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物も指すことができる。他の例では、用語「患者」は、家禽を指すこともできる。
【００２４】
本明細書の全体にわたり、識別語である「第１の」および「第２の」は、開示されている主題の様々な構成成分および工程の区別を補助するために、単に使用されているに過ぎないことが理解される。識別用語「第１の」および「第２の」は、これらの用語によって修飾されている構成成分または工程に対して、任意の特定の順序、量、優先度または重要度を暗示することを意図するものではない。
【００２５】
化学定義
本明細書で使用する場合、用語「組成物」は、指定量で指定成分を含む生成物、および指定量の指定成分の組合せから直接的にまたは間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図されている。
【００２６】
組成物中の特定の要素または構成成分の重量部に対する、本明細書における言及および最終的な特許請求の範囲は、重量部が表現されている組成物または物品における、要素または構成成分と他の任意の要素または構成成分との間の重量関係を表している。したがって、構成成分Ｘを２重量部、および構成成分Ｙを５重量部含有する混合物中では、ＸおよびＹは、２：５の重量比で存在し、追加の構成成分が該混合物中に含まれているかどうかに関わらず、このような比で存在している。
【００２７】
構成成分の重量％（ｗｔ.％）は、特に具体的に反対の記載がない限り、構成成分が含まれている製剤または組成物の総重量に基づいている。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「置換されている」は、有機化合物の許容可能な置換基をすべて含むことが企図されている。幅広い態様では、許容可能な置換基は、有機化合物の、非環式および環式、分岐状および非分岐状、炭素環式および複素環式、ならびに芳香族および非芳香族の置換基を含む。例示的な置換基には、例えば、以下に記載されているものが含まれる。許容可能な置換基は、適切な有機化合物にとって、１つまたは複数とすることができ、同一または異なることができる。本開示の目的として、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基、および／またはヘテロ原子の原子価を満足する、本明細書に記載されている有機化合物の任意の許容可能な置換基を有することができる。本開示は、有機化合物の許容可能な置換基によって、限定されることを決して意図するものではない。同様に、用語「置換」または「により置換されている」は、このような置換が、置換されている原子および置換基の許容される原子価に従うこと、およびこの置換が、安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離などによって変換を自発的に受けない化合物となるという暗黙の前提を含む。
【００２９】
用語「脂肪族」は、本明細書で使用する場合、非芳香族炭化水素基を指し、分岐および非分岐の、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を含む。
【００３０】
用語「アルキル」は、本明細書で使用する場合、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどの１〜２４個の炭素原子からなる、分岐または非分岐の飽和炭化水素基である。アルキル基はまた、置換または無置換とすることもできる。アルキル基は、以下に限定されないが、本明細書に記載されている、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールを含む、１つまたは複数の基により置換され得る。
【００３１】
記号Ａｎは、本明細書では、以下の定義における単なる一般的な置換基として使用されている。
【００３２】
用語「アルコキシ」は、本明細書で使用する場合、単一の末端エーテル連結を介して結合しているアルキル基である。すなわち「アルコキシ」基は、−ＯＡ１として定義することができ、Ａ１は上で定義されているアルキルである。
【００３３】
用語「アルケニル」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する、構造式を有する２〜２４個の炭素原子からなる炭化水素基である。（Ａ１Ａ２）Ｃ＝Ｃ（Ａ３Ａ４）などの非対称構造は、Ｅ異性体とＺ異性体の両方を含むことが意図されている。これは、本明細書における構造式で推定することができ、この場合、非対称アルケンが存在するか、または結合記号Ｃ＝Ｃによって明確に示され得る。アルケニル基は、以下に限定されないが、本明細書に記載されている、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールを含む、１つまたは複数の基により置換され得る。
【００３４】
用語「アルキニル」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する、構造式を有する２〜２４個の炭素原子からなる炭化水素基である。アルキニル基は、以下に限定されないが、本明細書に記載されている、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールを含む、１つまたは複数の基により置換され得る。
【００３５】
用語「アリール」は、本明細書で使用する場合、以下に限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼンなどを含む、炭素をベースとする任意の芳香族基を含む基である。用語「ヘテロアリール」は、芳香族基の環内に組み込まれている少なくとも１個のヘテロ原子を有する、芳香族基を含有する基として定義される。ヘテロ原子の例には、以下に限定されないが、窒素、酸素、硫黄およびリンが含まれる。用語「アリール」に含まれている、用語「非ヘテロアリール」は、ヘテロ原子を含有していない芳香族基を含有している基を定義する。アリールおよびヘテロアリール基は、置換され得るか、または置換され得ない。アリール基およびヘテロアリール基は、以下に限定されないが、本明細書に記載されている、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールを含む、１つまたは複数の基により置換され得る。用語「ビアリール」は、アリール基の特定のタイプであり、アリールの定義に含まれる。ビアリールは、ナフタレンにあるような、縮合環構造を介して一緒に結合しているか、またはビフェニルにあるような、１つもしくは複数の炭素−炭素結合を介して結合している、２つのアリール基を指す。
【００３６】
用語「シクロアルキル」は、本明細書で使用する場合、少なくとも３個の炭素原子からなる非芳香族の炭素をベースとする環である。シクロアルキル基の例には、以下に限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれる。用語「ヘテロシクロアルキル」は、上で定義されているシクロアルキル基であって、この場合、環の炭素原子の少なくとも１個が、以下に限定されないが、窒素、酸素、硫黄またはリンなどのヘテロ原子により置換されている、シクロアルキル基である。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、置換され得るか、または置換され得ない。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、以下に限定されないが、本明細書に記載されている、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールを含む、１つまたは複数の基により置換され得る。
【００３７】
用語「シクロアルケニル」は、本明細書で使用する場合、少なくとも３個の炭素原子からなり、少なくとも１つの二重結合、すなわちＣ＝Ｃを含有する、非芳香族の炭素をベースとする環である。シクロアルケニル基の例には、以下に限定されないが、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルなどが含まれる。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上で定義されているシクロアルケニル基のタイプであって、環の炭素原子の少なくとも１個が、以下に限定されないが、窒素、酸素、硫黄またはリンなどのヘテロ原子により置換されている、シクロアルキル基のタイプである。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、置換され得るか、または置換され得ない。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、以下に限定されないが、本明細書に記載されている、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールを含む、１つまたは複数の基により置換され得る。
【００３８】
用語「環式基」が、本明細書において使用され、アリール基、非アリール基（すなわち、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニル基）のどちらか一方、またはそれらの両方を指す。環式基は、置換され得るか、または置換され得ない、１つまたは複数の環系を有する。環式基は、１つもしくは複数のアリール基、１つもしくは複数の非アリール基、または１つもしくは複数のアリール基、および１つもしくは複数の非アリール基を含有することができる。
【００３９】
用語「アルデヒド」は、本明細書で使用する場合、式−Ｃ（Ｏ）Ｈにより表される。本明細書全体にわたり、「Ｃ（Ｏ）」は、Ｃ＝Ｏに関する略記法である。
【００４０】
用語「アミン」または「アミノ」は、本明細書で使用する場合、式ＮＡ１Ａ２Ａ３によって表され、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、独立して、上記の、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基とすることができる。
【００４１】
用語「カルボン酸」は、本明細書で使用する場合、式−Ｃ（Ｏ）ＯＨにより表される。「カルボキシレート」は、本明細書で使用する場合、式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−により表される。
【００４２】
用語「エステル」は、本明細書で使用する場合、式−ＯＣ（Ｏ）Ａ１または−Ｃ（Ｏ）ＯＡ１によって表され、Ａ１は、上記の、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基とすることができる。
【００４３】
用語「エーテル」は、本明細書で使用する場合、式Ａ１ＯＡ２によって表され、Ａ１およびＡ２は、独立して、上記の、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基とすることができる。
【００４４】
用語「ケトン」は、本明細書で使用する場合、式Ａ１Ｃ（Ｏ）Ａ２によって表され、Ａ１およびＡ２は、独立して、上記の、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基とすることができる。
【００４５】
用語「ハライド」は、本明細書で使用する場合、ハロゲン、すなわちフッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。
【００４６】
用語「ヒドロキシル」は、本明細書で使用する場合、式−ＯＨにより表される。
【００４７】
用語「ニトロ」は、本明細書で使用する場合、式−ＮＯ２により表される。
【００４８】
用語「シアノ」は、本明細書で使用する場合、式−ＣＮにより表される。
【００４９】
用語「アジド」は、本明細書で使用する場合、式−Ｎ３により表される。
【００５０】
用語「スルホニル」は、本明細書では、式−Ｓ（Ｏ）２Ａ１によって表されるスルホ−オキソ基を指すために使用され、Ａ１は、上記の、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基とすることができる。
【００５１】
用語「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」は、本明細書で使用する場合、式−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２により表される。
【００５２】
用語「チオール」は、本明細書で使用する場合、式−ＳＨにより表される。
【００５３】
本明細書において提供されている化合物は、キラル中心を含有することがあることを理解すべきである。このようなキラル中心は、（Ｒ−）または（Ｓ−）立体配置のどちらか一方とすることができる。本明細書において提供されている化合物は、鏡像異性体として純粋であるか、またはジアステレオマーもしくは鏡像異性体混合物のどちらかであってもよい。本明細書において提供されている化合物のキラル中心は、インビボでエピメリ化を受けることがあることを理解すべきである。したがって、当業者は、インビボでエピメリ化を受ける化合物の場合、その（Ｒ−）体の化合物の投与は、その（Ｓ−）体の化合物の投与と等価であることを認識している。
【００５４】
本明細書で使用する場合、実質的に純粋とは、当業者によって、純度または十分純粋であることを評価するために使用される、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析法（ＭＳ）、ガス−クロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、ならびに類似法などの分析の標準法により決定すると、容易に検出可能な不純物を含んでいないように見えるほど十分に均質であり、こうして、さらなる精製により、該物質の酵素活性および生物活性などの物理的および化学的特性が検出可能なほどに改変されないことを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための化合物の精製に関する従来的方法と現代的方法のどちらも、当業者に公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であってもよい。
【００５５】
特に反対の記載がない限り、くさびまたは破線としてではなく、実線としてだけで示されている化学結合を有する式は、可能な異性体のそれぞれ、例えば、各鏡像異性体、ジアステレオマーおよびメソ化合物、ならびにラセミ混合物またはスケールミック（scalemic）混合物などの異性体混合物を企図している。
【００５６】
「薬学的に許容される」構成成分は、過度の有害な副作用（毒性、刺激およびアレルギー反応など）なしに、ヒトおよび／または動物に使用するのに好適であり、妥当な利益／リスク比に見合うものである。
【００５７】
「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、かつ所望の薬理学的特性を有する塩を指す。そのような塩には、化合物中に存在している酸性プロトンが、無機塩基または有機塩基と反応することが可能な場合に形成され得るものが含まれる。好適な無機塩には、アルカリ金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアルミニウムと形成されるものが含まれる。好適な有機塩には、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基と形成されるものが含まれる。このような塩はまた、無機酸（例えば、塩酸および臭化水素酸）および有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびにメタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸などのアルカンスルホン酸およびアレーンスルホン酸）と形成される酸付加塩を含む。２つの酸性基が存在する場合、薬学的に許容される塩は、一酸一塩または二塩とすることができる。同様に、３つ以上の酸性基が存在する場合、このような基の一部またはすべてが、塩に変換され得る。
【００５８】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、一般に、安全な非毒性で望ましい、医薬組成物を調製するのに、従来的に有用な賦形剤を指し、獣医学的使用およびヒト医薬使用に許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合、気体とすることができる。
【００５９】
「薬学的に許容される担体」は、患者に開示化合物を送達するための、溶媒、懸濁化剤またはビヒクルなどの担体である。担体は、液体または固体とすることができ、投与の計画された方法を念頭において選択される。リポソームも医薬担体である。本明細書で使用する場合、「担体」は、溶媒、分散用媒体、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝化剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどのいずれかおよびすべてを含む。医薬活性物質のこのような媒体および作用剤の使用は、当分野において周知である。任意の従来の媒体または作用剤が活性成分と適合しない限りを除き、治療用組成物におけるその使用が企図されている。
【００６０】
用語「治療有効量」は、本明細書で使用する場合、研究者、獣医、医療医師または他の臨床家によって求められる、組織、系、動物またはヒトにおける、生物学的または医療的応答を誘発する、活性化合物または医薬剤の量を意味する。感染に関すると、有効量は、細菌細胞が縮小するのを引き起こす、および／もしくは細胞の成長速度を低下させる（細菌成長を抑制することなど）、または他の望ましくない細胞増殖を予防するもしくは遅延させるのに十分な量を含む。一部の実施形態では、有効量は、発症を遅延させるのに十分な量である。一部の実施形態では、有効量は、発症および／もしくは再発を予防する、または遅延させるのに十分な量である。有効量は、単回または多回用量で投与することができる。感染の場合、薬物または組成物の有効量は、以下とすることができる：（ｉ）細菌細胞数を低下させること；（ｉｉ）細菌細胞の末梢器官への浸潤を、ある程度、阻止する、抑制する、減速させる、および好ましくは停止させること；（ｉｉｉ）細菌成長を阻害すること；（ｉｖ）感染の発症および／もしくは再発を予防または遅延させること；および／または（ｖ）感染に関連する症状の１つまたは複数をある程度、緩和すること。
【００６１】
哺乳動物対象を処置するための、本明細書に記載されている化合物または組成物の有効量は、約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、とりわけ約１０〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日など、１日あたり、対象の体重１ｋｇあたり約０．１〜約１０００ｍｇ／ｋｇを含むことができる。用量は、一過的または継続的とすることができる。開示組成物の投与量の幅広い範囲が、安全であり有効であると考えられる。
【００６２】
生物学的定義
イタリック体の使用は核酸分子（例えば、ｅｎｒＪ  ｃＤＮＡ、遺伝子など）を示す。通常の文字は、ポリペプチドまたはタンパク質を示す。
【００６３】
ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異型」は、所与のコドン位における１つまたは複数のヌクレオチドの変化により、その位置においてコードされるアミノ酸に変化がないものである。
【００６４】
「機能保存的変異型」は、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、以下に限定されないが、あるアミノ酸が類似の特性（例えば、極性、水素結合の可能性、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸と置換されていることを含めた、ポリペプチドの全体の立体構造および機能を改変することなく、交換されているものである。同様の特性を有するアミノ酸は、当分野において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリシンは、親水性の塩基性アミノ酸であり、相互交換可能である。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンと置き換えることができる。このような交換は、見かけの分子量、またはタンパク質もしくはポリペプチドの等電点に対してほとんどまたはまったく影響を及ぼさないことが予測される。保存されているとして示されているもの以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素に相違点があることがあり、したがって、類似した機能（unction）の任意の２つのタンパク質の間のタンパク質またはアミノ酸の配列類似性率は様々となることがあり、例えば、クラスター法によるなどの、整列スキームにより決定すると、７０％〜９９％とすることができ、この場合、類似性は、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存的変異型」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定すると、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有している、ポリペプチドまたは酵素であって、それらと比較される天然もしくは親のタンパク質または酵素と同一もしくは実質的に類似した特性または機能を有する、ポリペプチドまたは酵素を含む。
【００６５】
用語「変異体」および「変異」は、遺伝物質、例えばＤＮＡ、または任意の過程、機構、またはこうした変化の結果の検出可能な任意の変化を意味する。これには、遺伝子変異が含まれ、この場合、遺伝子の構造（例えば、ＤＮＡ配列）の改変、任意の変異過程から発生する任意の遺伝子またはＤＮＡ、および修飾された遺伝子またはＤＮＡ配列によって発現された任意の発現産物（例えばタンパク質または酵素）が含まれる。用語「変異型」はまた、修飾または改変された遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞など、すなわち変異体の任意の種類を示すために使用することもできる。
【００６６】
本明細書で使用する場合、そのすべての文法形態および綴りの変化形における用語「相同性の」とは、スーパーファミリーに由来するタンパク質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）および異なる種（例えば、ミオシン軽鎖など）に由来する相同性タンパク質を含めた、「共通の進化起源」を有するタンパク質間の関係を指す（Reeck et al., Cell 50:667, 1987）。このようなタンパク質（および、そのコードした遺伝子）は、類似率、または保存位置における特定残基またはモチーフの存在に関するかどうかという、その配列類似性によって反映される配列相同性を有している。
【００６７】
したがって、そのすべての文法形態における、用語「配列類似性」とは、共通の進化起源（Ｒｅｅｃｋら、上記を参照されたい）を共有することができる、または共有し得ない、核酸間もしくはタンパク質のアミノ酸配列間の同一性または相当物の程度を指す。しかし、一般的な使用、および本明細書では、用語「相同性の」とは、「高度に」などの副詞により修飾されている場合、配列類似性を指すことができ、共通の進化起源に関することがあり、または関しないことがある。
【００６８】
具体的な実施形態では、本明細書において開示されているアルゴリズムの１つにより決定すると、コードされたポリペプチドが、全アミノ酸配列にわたり、高度に保存されているドメイン中、またはアレルに対して、少なくとも３５〜４０％、好ましくは少なくとも約６０％、および最も好ましくは少なくとも約９０または９５％の類似性である場合、２つのＤＮＡ配列は、「実質的に相同性」または「実質的に類似」である。配列比較アルゴリズムには、下記のアルゴリズムにより提供されるデフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、ＢＬＡＳＴ  Ｘ）、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージ向けのプログラムマニュアル、バージョン７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ.）パイルアッププログラムなどが含まれる。そのような配列の一例は、本発明の特定のエベルニノマイシン生合成遺伝子のアレルまたは種変異型である。実質的に相同性である配列は、配列データバンクにおいて、または例えば、その特定のシステムに関して定義されている厳密な条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において、入手可能な標準ソフトウェアを使用する配列を比較することにより特定することができる。
【００６９】
ＤＮＡの「増幅」は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ配列の混合物内の特定のＤＮＡ配列の濃度を増加させるための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を意味する。ＰＣＲの記載に関しては、Saiki et an, Science, 239:487, 1988を参照されたい。
【００７０】
「核酸分子」とは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）；またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）；または、ホスホロチオエートおよびチオエステルなどの、一本鎖形態または二本鎖螺旋のどちらか一方の、任意のそのホスホエステルアナログ；または、アミノ酸主鎖に塩基をコンジュゲートすることにより形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）；または修飾されている塩基、例えば、チオウラシル、チオ−グアニンおよびフルオロ−ウラシルを含有する核酸のリン酸エステルポリマー形態を指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡ螺旋が可能である。用語核酸分子、および特に、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、該分子の一次および二次構造のみを指し、それらを任意の特定の三次形態に限定するものではない。したがって、この用語は、とりわけ、線状（例えば、制限断片）または環状ＤＮＡ分子、プラスミドおよび染色体中で見いだされる、二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際には、配列は、ＤＮＡの転写されていない鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同性の配列を有する鎖）に沿って、５’から３’の方向に、配列だけが示されている通常の習慣に従って、本明細書に記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００７１】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）であり、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ヌクレオチド配列は、通常、タンパク質および酵素を作製するための細胞機構によって使用される情報を含めた、遺伝子情報を保有している。これらの用語は、二本鎖または一本鎖のゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成によるおよび遺伝的に操作されたポリヌクレオチド、ならびにセンスポリヌクレオチドとアンチセンスポリヌクレオチドの両方を含む（しかし、本明細書では、センス鎖（stand）しか表されない）。これは、一本鎖および二本鎖分子、すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体を含む。
【００７２】
ポリヌクレオチドは、本明細書では、天然の調節（発現調節）配列によって挟まれていてもよく、またはプロモーター、内部リボソーム開始部位（ＩＲＥＳ）およびその他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、反応要素、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’−非コード領域などを含めた、異種配列と結合していてもよい。核酸はまた、当分野において公知の多数の手段によって修飾されていてもよい。さらに、ポリヌクレオチドはまた、本明細書において、直接または間接的に、検出可能なシグナルをもたらすことができるラベルにより修飾されている、オリゴヌクレオチドとすることもできる。例示的なラベルには、放射性同位体、蛍光性分子、ビオチンなどが含まれる。
【００７３】
「コード配列」、またはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質もしくは酵素などの発現産物を「コードする」配列は、発現された場合に、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生をもたらす最小のヌクレオチド配列である。すなわち、ヌクレオチド配列は、そのようなポリペプチド、タンパク質または酵素に対するアミノ酸配列をコードする。タンパク質のコード配列は、開始コドン（通常、ＡＴＧであるが、本明細書に示されている通り、代替的な開始コドンを使用することができる）および停止コドンを含むことができる。
【００７４】
「構造遺伝子」とも呼ばれる、用語「遺伝子」は、１種または複数のタンパク質もしくは酵素のすべてまたは一部を含む、アミノ酸の特定配列をコードする、ＤＮＡ配列を意味し、例えば、遺伝子が発現される条件を決定付けるプロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含んでもよい。遺伝子の転写領域は、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’−ＵＴＲ、ならびにコード配列を含めた、非翻訳領域を含むことができる。
【００７５】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的として、プロモーター配列は、転写開始部位によって、その３’末端に境界が定められ、上流（５’方向）に延び、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でマップすることによって、都合よく定義される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされる。
【００７６】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写する場合に、細胞中の転写および翻訳調節配列の「調節下にある」、または「機能的に（または、動作的に）連結」しており、次に、ｍＲＮＡは、トランスＲＮＡスプライシングを受け（ｍＲＮＡが、イントロンを含む場合）、このコード配列によってコードされたタンパク質に翻訳される。
【００７７】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子またはＤＮＡ配列における情報の顕在化を可能にするか、または顕在化を誘発させること、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生することを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞において、または細胞によって発現されて、ｍＲＮＡまたはタンパク質などの「発現産物」を形成する。この発現産物そのもの、例えば産生するｍＲＮＡまたはタンパク質もやはり、細胞によって「発現された」と言うことができる。発現産物は、細胞内、細胞外または分泌されたものとして特徴付けることができる。用語「細胞内」は、細胞内部に存在するものを意味する。用語「細胞外」は、細胞外部に存在するものを意味する。細胞上または細胞内のどこかから、細胞の外側に有意な測定量で現れる場合、物質は細胞によって「分泌されている」。
【００７８】
用語「トランスフェクション」は、宿主細胞への異種核酸の導入を意味する。用語「形質転換」は、宿主細胞への異種遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入を意味し、その結果、この宿主細胞は、導入された遺伝子または配列を発現して所望の産物を産生する。導入された遺伝子または配列はまた、「クローニングされた」、または「異種の」遺伝子もしくは配列と呼ぶこともでき、開始、停止、プロモーター、シグナル、分泌、または細胞の遺伝子機構により使用される他の配列などの、調節または制御配列を含むことができる。遺伝子または配列は、非機能性配列、または未知の機能を有する配列を含むことができる。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容して発現した宿主細胞は、「形質転換された」ことになり、「形質転換体」または「クローン」となる。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属または種の細胞、あるいは異なる属または種の細胞を含めた、任意の起源に由来することができる。
【００７９】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、その結果、宿主を形質転換し、その導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することを可能とするビヒクルを意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスなどを含む。それらは、以下により詳細に議論されている。
【００８０】
ベクターは、通常、異種ＤＮＡが挿入される、伝播作用物質であるＤＮＡを含む。ＤＮＡの１つのセグメントをＤＮＡの別のセグメントに挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定部位（ヌクレオチドの特異的群）において、ＤＮＡを開裂する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を含む。「カセット」とは、ＤＮＡコード配列、または定義した制限部位において、ベクターに挿入され得る発現産物をコードするＤＮＡのセグメントを指す。カセット制限部位は、適切なリーディングフレーム内にカセットの挿入を確実にするよう設計される。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位に挿入されて、次に、ベクターによって、伝播性ベクターであるＤＮＡと共に宿主細胞内に運搬される。発現ベクターなどの挿入されたＤＮＡまたは付与されたＤＮＡのセグメントまたは配列はまた、「ＤＮＡ構築物」と呼ぶこともできる。一般的なタイプのベクターは、一般に、追加の（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる、通常、細菌起源の二本鎖ＤＮＡの自蔵分子（self-contained molecule）であるプラスミドであって、かつ適切な宿主細胞に容易に導入することができる上記のプラスミドである。プラスミドベクターは、多くの場合、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含み、かつ外来ＤＮＡの挿入に好適な１つまたは複数の制限部位を有する。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を、開始する、調節する、またはそうでない場合、媒介するまたは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同一遺伝子に由来してもよく、または異なる遺伝子に由来してもよく、同一または異なる生物に由来してもよい。プラスミドおよび真菌ベクターを含めた大多数のベクターは、様々な真核生物宿主および原核生物宿主において、複製および／または発現に関して記載されている。非限定例には、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ｐＲＳＥＴまたはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）またはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）、および本明細書において開示されているかもしくは引用されているか、または当業者に公知の方法を使用する多数の適切な宿主細胞が含まれる。組換えクローニングベクターは、多くの場合、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製システム、宿主における選択、例えば抗生物質耐性のための１つまたは複数のマーカー、および１つまたは複数の発現カセットを含む。
【００８１】
用語「宿主細胞」は、その細胞によって物質が産生されるよう、例えば、細胞によって、遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、タンパク質、または酵素が発現されるよう、何らかの方法で、選択される、修飾される、形質転換される、成長される、または使用されるもしくは操作される、任意の生物の任意の細胞を意味する。宿主細胞は、後に記載されている通り、スクリーニングまたは他のアッセイのために、さらに使用することができる。好ましい態様では、本発明の宿主細胞は、好ましくはストレプトマイセス属（Streptomyces）（例えば、Ziermann and Betlach, BioTechniques, 1999, 26:106に記載されている宿主細胞）、または代替として、ミクロモノスポラ（Micromonospera）である放線菌である。追加例には、以下に限定されないが、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）（ＡＴＣＣ２５４８６）、Ｓ．アンチビオチクス（S. antibioticus）（ＤＳＭ４０８６８）、Ｓ．ビキニエンシス（S. bikiniensis）（ＡＴＣＣ１１０６２）、Ｓ．パルブルス（S. parvulus）（ＡＴＣＣ１２４３４）、Ｓ．グラウエスセンス（S. glauescens）（ＥＴＨ２２７９４）、Ｓ．アクツオスス（S. actuosus）（ＡＴＣＣ２５４２１）、Ｓ．コエリコロル（S. coelicolor）（Ａ３（２））、Ｓ．アンボファシエンス（S. ambofaciens）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．グリセオフスクス（S. griseofuscus）、Ｓ．リモスス（S. limosus）など（Smokvina et al., Proceedings, 1:403-407も参照されたい）の株が含まれる。
【００８２】
用語「発現システム」は、例えば、ベクターによって搬送され、宿主細胞に導入される、外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現するための、好適な条件下における、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現システムは、大腸菌（E.coli）宿主細胞およびプラスミドベクターを含むが、アクチノマイセス属（actinomycte）宿主細胞発現システムが、エベルニノマイシンおよび関連産物の生合成にとって好ましい。
【００８３】
用語「異種の」とは、天然ではない要素の組合せを指す。例えば、異種ＤＮＡとは、細胞中、または細胞中の染色体部位中に、天然に位置しない、ＤＮＡを指す。異種遺伝子は、調節制御配列が、コード配列に関連して天然で見いだされない、遺伝子である。本発明の文脈では、ＥＶ生合成酵素遺伝子は、クローニングまたは発現のために挿入されるベクターＤＮＡと異種であり、ＥＶ生合成酵素遺伝子は、発現されるこのようなベクターを含有する宿主細胞、例えばＫ５６２細胞と異種である。
【００８４】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子にアニールすることができる場合、別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「厳密性」を決定する。相同性核酸に関する予備スクリーニングの場合、５５℃のＴｍ（溶融温度）に相当する低い厳密性のハイブリダイゼーション条件、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％のミルクおよびホルムアミドなし；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを使用することができる。中程度の厳密性のハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、４０％ホルムアミド（５×または６×ＳＣＣを含む）に対応する。高い厳密性のハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。ＳＣＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が、相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションの厳密性に応じて、塩基間のミスマッチが起こり得る。核酸をハイブリダイズするための適切な厳密性は、当分野において周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きければ大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッド体に対するＴｍの値は大きくなる。核酸のハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッド体の場合、Ｔｍを算出するための式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置が一層重要になり、オリゴヌクレオチドの長さにより、その特異性が決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、１１．７−１１．８を参照されたい）。ハイブリダイズ可能な核酸の場合の最小の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチドであり、より好ましくはその長さは少なくとも約２０個のヌクレオチドである。
【００８５】
具体的な実施形態では、用語「標準ハイブリダイゼーション条件」とは、５５℃のＴｍを指し、上記の条件を利用する。好ましい実施形態では、Ｔｍは６０℃である。より好ましい実施形態では、Ｔｍは、６５℃である。具体的な実施形態では、「高度な厳密性」とは、０．２×ＳＳＣ中、６８℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中、４２℃、またはこれらの２種の条件のどちらか一方の下で観察されるものと等価なハイブリダイゼーションレベルをもたらす条件下での、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を指す。
【００８６】
本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、一般に、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、およびより好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド、好ましくは１００個以下のヌクレオチドからなる核酸であって、対象とする、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは他の核酸をコードする、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子へのハイブリダイズ可能な、上記の核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、またはビオチンなどの標識が共有結合によりコンジュゲートされたヌクレオチドにより標識され得る。一実施形態では、標識されたオリゴヌクレオチドは、プローブとして使用されて、核酸の存在を検出することができる。別の実施形態では、ＥＶ生合成酵素の完全長またはフラグメントのどちらか一方をクローニングするためか、またはＥＶ生合成酵素をコードする核酸の存在を検出するために、オリゴヌクレオチド（その１つまたは両方が、標識されていてもよい）をＰＣＲプライマーとして使用することができる。さらなる実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＥＶ生合成酵素ＤＮＡ分子と三重螺旋を形成することができる。一般に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、核酸合成器で、合成により調製される。したがって、チオエステル結合などの非天然ホスホエステルアナログの結合を有するオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【００８７】
これより、開示物質、化合物、組成物、物品および方法の具体的な態様について詳細に述べ、それらの例が、添付の実施例および図で例示される。
【００８８】
化合物
現在まで、４種のエベルニノマイシン同属体、Ｅｖｅｒ  Ｄ〜Ｇである２〜５が、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）から報告され、これらはすべて、Ａ環上の窒素の酸化状態が様々である。ある種の例では、エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲート８および９が、本明細書において開示されている。ロサラマイシン（７）は、Ｍ.カルボナセア（M.carbonacea）によってやはり産生される、グリコシル化マクロラクトンである。
【００８９】
【化１】
2018536426.tif 000003
【００９０】
エベルニノマイシンＦ（４）のヒドロキシルアミノ官能基は、ロサラマイシンのアルデヒド部分と反応し、ニトロン連結を生成／２つの天然産物を連結するニトロンを創製する。完全長エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲート９は、分解した糖複合体８への無傷前駆体である。ニトロンを形成するための化学の先例は、十分に確立されており、本明細書におけるデータは、通常の培養条件に曝露されると、９は８に分解することを示している。この構造は、ニトロンにおいてシス形状とトランス形状のどちらか一方、またはそれらの両方を有するものとして示されており、したがって、シス、トランスおよびそれらの混合物が本明細書において企図されている。興味深いことに、ニトロン形成によるロサラマイシンによるエベルニノマイシンの捕捉は、新しいエベルニノマイシンの質量スペクトルによる同定の一助となるイオン化が増加する。自然界は、構造と活性との間の関係の検討を開始するための天然のエベルニノマイシン同属体をもたらしたが、さらなる検討のための、非天然アナログを作製する必要が依然として存在する。新しいアナログの化学合成が実用的でないので、本明細書では、新しいアナログは、エベルニノマイシン遺伝子クラスターの修飾によって調製する。
【００９１】
ある種の例では、以下の構造を有する化合物：
【００９２】
【化２】
2018536426.tif 000004
（式中、
Ｒ４〜Ｒ６はそれぞれ、個々に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル；またはオルセルリニルであり、
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、Ｈ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＮＯＨ、ＯＭｅ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドもしくはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、またはロサラマイシンに結合している１〜２０個の原子のリンカーであり、
Ｒ１２は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである）
または薬学的に許容されるその塩が開示される。
【００９３】
例えば、開示物は、以下の構造を有する化合物：
【００９４】
【化３】
2018536426.tif 000005
または薬学的に許容されるその塩である。
【００９５】
同様に、以下の構造を有する化合物：
【００９６】
【化４】
2018536426.tif 000006
（式中、
Ｒ３およびＲ５はそれぞれ、個々に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル；またはオルセルリニルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ８は、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、Ｈ、ＯＭｅ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＮＯＨ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドもしくはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、またはロサラマイシンに結合している１〜２０個の原子のリンカーであり、
Ｒ１２は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである）
または薬学的に許容されるその塩が開示される。
【００９７】
例えば、以下の構造を有する化合物：
【００９８】
【化５】
2018536426.tif 000007
または薬学的に許容されるその塩が開示される。
【００９９】
同様に、以下の構造を有する化合物：
【０１００】
【化６】
2018536426.tif 000008
（式中、
Ｒ３およびＲ５はそれぞれ、個々に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル；またはオルセルリニルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ８は、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、Ｈ、ＯＭｅ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＮＯＨ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドもしくはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、またはロサラマイシンに結合している１〜２０個の原子のリンカーであり、
Ｒ１２は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである）
または薬学的に許容されるその塩が開示される。
【０１０１】
具体例は、以下の構造：
【０１０２】
【化７】
2018536426.tif 000009
およびその薬学的な塩を含む。
【０１０３】
同様に、以下の構造を有する化合物：
【０１０４】
【化８】
2018536426.tif 000010
（式中、
Ｒ４〜Ｒ６はそれぞれ、個々に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル；またはオルセルリニルであり、
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、Ｈ、ＯＭｅ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドもしくはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、またはロサラマイシンに結合している１〜２０個の原子のリンカーであり、
Ｒ１２は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである）
または薬学的に許容されるその塩が開示される。
【０１０５】
これらの化合物の具体例は、以下である：
【０１０６】
【化９】
2018536426.tif 000011
【０１０７】
同様に、以下の構造を有する化合物：
【０１０８】
【化１０】
2018536426.tif 000012
（式中、
Ｒ１、Ｒ３およびＲ５はそれぞれ、個々に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２は、ＨまたはＣｌであり、
Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル；またはオルセルリニルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ８は、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１２は、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、アジド、カルボン酸、シアノ、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールにより場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルである）
または薬学的に許容されるその塩が開示される。
【０１０９】
例えば、以下の構造を有する化合物：
【０１１０】
【化１１】
2018536426.tif 000013
または薬学的に許容されるその塩が開示される。同様に、シスニトロンおよびトランスニトロン構造が個々に開示されている。
【０１１１】
開示化合物の具体例では、Ｒ１は、ＯＣＨ３である。他の例では、Ｒ１は、Ｃｌである。開示化合物の他の具体例では、Ｒ２は、Ｃｌである。さらなる例では、Ｒ３は、Ｈ、ＣＨ３またはＣｌである。さらに他の例では、Ｒ４は、ＮＯ２、ＮＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３である。他の例では、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨまたはＯＣＨ３である。他の例では、Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３またはＯＣＨ３である。さらなる例では、Ｒ７は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣ２Ｈ９またはケトンである。他の例では、Ｒ８は、ＨまたはＣＯＣＨ３である。
【０１１２】
作製方法
オルトソマイシンの化学合成は複雑であり、１００を超える工程を必要とする。したがって、アナログの化学合成への代替が、本明細書において開示されており、これにより、エベルニノマイシンの産生を担う生合成経路が変わる。この経路において、酵素を除外する、加えるまたは修飾することにより、新しいアナログが創製される。ここでは、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）からのエベルニノマイシンの生合成経路における、各酵素の機能を推定するために、翻訳された配列類似性を使用した。さらに、２種の追加のオルトソマイシン遺伝子クラスターであるｅｖｅおよびａｖａに注釈を付けて、オルトソマイシン生合成の一層完全な写真を提示した。Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）におけるエベルニノマイシン経路に由来する３種の遺伝子の標的遺伝子置換により、この遺伝子クラスターの最初の機能評価が実現し、５種の新しいエベルニノマイシン同属体が蓄積した。遺伝子クラスターの変異性および非天然基質に対する生合成酵素の耐容性に関する情報を提示することにより、ここで示されている研究は、生合成経路の操作により、改善された効力および薬理学的特性のエベルニノマイシンアナログを構築するための方法を提供する。
【０１１３】
ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）Ｔｕ５７に由来するアビラマイシンＡの生合成遺伝子クラスターは、１９９７年に最初に報告された。２つの遺伝子の不活性化により、アビラマイシン生合成において、このクラスターの役割が確認された。この大きなクラスターは、４種のグリコシルトランスフェラーゼ、２２種の糖合成およびテーラーリング遺伝子（tailoring gene）、オルセリン酸生合成のための２種の遺伝子、１種のハロゲナーゼ、３種のオキシゲナーゼ、調節および輸送に関与する５種の遺伝子、およびアビラマイシン耐性を担う２種の遺伝子を含むように思われる（図４）。
【０１１４】
アビラマイシンクラスターに由来する４種の遺伝子が、ジクロロイソエバニニック酸生合成に関与している。ＡｖｉＭは、オルセリン酸合成を担う一方、ＡｖｉＮは、スターターユニットを制御することができる。ａｖｉＧ４の不活性化により、ジクロロイソエバニニック酸からメチル基が喪失し、ａｖｉＧ４は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼとして確認された。さらに、ハロゲナーゼａｖｉＨの不活性化は、環Ａの２個の塩素原子のないアビラマイシンアナログをもたらした。
【０１１５】
残りの３種のＯ−メチルトランスフェラーゼの正確な機能は、遺伝子不活性化によって決定した。ＡｖｉＧ２は、環ＦのＣ６酸素をメチル化し、ＡｖｉＧ５は、環ＥのＯ−メチル化を担い、ＡｖｉＧ６は、環ＦのＣ２ヒドロキシルをメチル化する（スキーム１、Ｂ）。Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄおよび共同研究者は、これらのメチルトランスフェラーゼの二重変異体と三重変異体の組合せ物を生成し、ガビバマイシンと名付けた一連のアビラマイシンアナログを生成した。推定上のＣ−メチルトランスフェラーゼＡｖｉＧ１をコードする遺伝子の破壊により、アビラマイシンの産生が停止した。しかし、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Saccharopolyspora erythraea）におけるエリトロマイシン経路に由来するａｖｉＧ１によるＣ−メチルトランスフェラーゼｅｒｙＢＩＩＩの変異体の相補により、エリトロマイシンの産生が回復した。この実験により、環Ｄの合成に関与している可能性が高いＣ−メチルトランスフェラーゼとして、ＡｖｉＧ１の役割が確認された。
【０１１６】
【化１２】
2018536426.tif 000014
【０１１７】
スキーム１では、列Ａは、環ＧであるＬ−リキソースの形成に関する提唱されるスキームである。ＡｖｉＥ２は、ＵＤＰ−Ｄ−グルクロン酸のＵＤＰ−Ｄ−キシロースへの脱カルボキシル化を触媒することを示す。列Ｂは、６−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコースからの２，６−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノースの形成のスキームである。ＡｖｉＸ１２は、特有のラジカルエピメリ化を触媒する。列Ｃは、Ｌ−エピ−バンコサミンからＬ−エベルニトロースが形成されることを示すスキームである。ＯＲＦ３６は、アミノからニトロソ酸化状態への窒素酸化を触媒する。それは、ニトロ形態に至るニトロソ同属体の自発的な酸化である可能性が高い。
【０１１８】
ＡｖｉＥ２のインビトロでの特徴付けにより、ＵＤＰ−Ｄ−グルクロン酸デカルボキシラーゼが、ＵＤＰ−Ｄ−グルクロン酸のＵＤＰ−Ｄ−キシロースへの転換に関与することが明らかになった。この結果は、ペントースであるＬ−リキソースが、ＵＤＰ−Ｄ−グルコースに元々由来していることを示している。Ｄ−キシロースのＬ−リキソースへの変換に、２つの追加的なエピメリ化工程が必要である（スキーム１、Ａ）。本発明者らは、ａｖｉＱ１、ａｖｉＱ２またはａｖｉＱ３が、これらのエピメリ化に必要な化学物をコードすることができると仮定している。これは、二次代謝に関与するＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼの最初の記載である。
【０１１９】
ａｖｉＸ１２を不活性化すると、Ｃ２において異なる立体化学を所有するＤ−マンノース（環Ｆ）よりもむしろＤ−グルコースを含有するアビラマイシンアナログが形成された。さらに、Ｃ２ヒドロキシルはメチル化されず、このことは、エピメリ化はこの位置のメチル化を進行させることを示唆している。上記の通り、Ｃ２におけるヒドロキシルのエピメリ化により、抗生物質の活性は完全に喪失する。したがって、ＡｖｉＸ１２は、活性アビラマイシンの形成に必要である。しかし、このエピメリ化は、非活性化炭素で起こるので、注目に値するものである（スキーム１、Ｂ）。その［Ｆｅ−Ｓ］クラスターの特徴付けに際して、ＡｖｉＸ１２は、ラジカルＡｄｏＭｅｔファミリーのメンバーであることが決定され、ＡｖｉＸ１２は、糖のエピメリ化に関与するラジカルＡｄｏＭｅｔファミリーの最初に報告されたメンバーであるように思われる。
【０１２０】
遺伝子の不活性化実験により、ＡｖｉＯ２およびＡｖｉＢ１は、オイレカネート生合成に関与することが示唆される。ａｖｉＯ２およびａｖｉＢ１が喪失すると、環ＨのＣ４位のアセチル残基が喪失されると提唱されているアビラマイシン誘導体になった。ＡｖｉＢ１およびＡｖｉＢ２は、ピルベートのアセチルカルバニオンへの変換を触媒する不完全なピルベートデカルボキシラーゼ複合体の一部であると仮説が立てられており、このアセチルカルバニオンは、続いて、ＡｖｉＯ２の作用により糖鎖に結合する。
【０１２１】
しかし、ＡｖｉＯ１、ＡｖｉＯ２およびＡｖｉＯ３は、オルトエステルおよびメチレンジオキシ架橋形成に関与するオキシダーゼであることが以前に提唱されている。アビラマイシン遺伝子クラスターのそれらの元々の分析により、これらの３種の遺伝子は、デオキシ糖の生合成に関与している可能性が低い、非ヘム鉄である、α−ケトグルタレート依存性オキシダーゼと相同性を有していることが分かった。ａｖｉＯ１およびａｖｉＯ３の不活性化により産生は停止したが、上記の通り、ａｖｉＯ２の不活性化により、推定上の脱アセチル化アビラマイシンアナログがもたらされた。これらの結果は、Ｍ．カルボナセア変種アフリカナ（M. carbonacea var africana）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ１９５９２９）（図４）およびＭ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ５７４２００−２）に由来するエベルニノマイシン遺伝子クラスターを精査するという観点から、興味深いものである。エベルニノマイシンは、アセチル基よりもオイレカネートに結合したオルセリン酸を含有しているが、その遺伝子クラスターは、依然として、ａｖｉＯ２に近いホモログを含有している。翻訳された配列類似性に基づいて、遺伝子に関する推定上の機能が提唱された（図４を参照されたい）。さらに、すべて既知のクラスＩのオルトソマイシン遺伝子クラスターは、ａｖｉクラスターに由来する３種のものに顕著な相同性を有する３種のオキシダーゼを含有している。クラスＩＩのオルトソマイシンであるハイグロマイシンＢ遺伝子クラスターはまた、推定上の非ヘム鉄である、α−ケトグルタレート依存性オキシダーゼＨｙｇＸも含有する。この証拠に基づくと、α−ケトグルタレート依存性オキシダーゼのファミリーは、オルトエステルおよびメチレンジオキシ架橋形成を担うと考えられる。
【０１２２】
ａｖｉＧＴ４の遺伝子を不活性化すると、末端のオイレカネート部分のないアビラマイシン誘導体になった。興味深いことに、オイレカネートは、すべてのオルトソマイシン中のオルトエステル連結を介して糖鎖に結合している。この連結の欠如は、ＡｖｉＧＴ４単独でオルトエステル形成を担うか、またはより高い可能性として、グリコシル化がオルトエステル形成より先に起こるかのどちらかであることを示唆している。
【０１２３】
Ｍ．カルボナセア変種アフリカナ（M. carbonacea var africana）ＡＴＣＣ３９１４９に由来するエベルニノマイシン遺伝子クラスターが、２００１年に報告された。ｅｖｅｒＪ、ｅｖｅｒＦおよびｅｖｅｒＷの挿入不活性化により、エベルニノマイシン産生が停止し、エベルニノマイシン生合成におけるこの遺伝子クラスターの役割が確認された。エベルニノマイシン遺伝子クラスターの生合成検討はほとんど報告されていないが、Ｍ．カルボナセア変種アフリカナ（M. carbonacea var africana）に由来するニトロソシンターゼＯＲＦ３６は、十分に特徴付けられている。減算解析が同時に行われた、２種のエベルニノマイシン遺伝子クラスターおよび２種のアビラマイシン遺伝子クラスターの解析により、Ｌ−エベルニトロース形成に関与する遺伝子のカセットが特定された（図４、遺伝子Ｎ１−Ｍ７）。特に興味深いのは、アミノ糖Ｌ−ＴＤＰ−エピ−バンコサミンをニトロソ形態に酸化することが示されている、フラビン依存性モノオキシゲナーゼＯＲＦ３６（Ｎ１）である（スキーム１、Ｃ）。遮光条件下での発酵でもニトロソ化合物が蓄積され、ニトロへの完全酸化が、酵素により触媒され得ないことを示している。ＯＲＦ３６の触媒的能力を試験するために、５種の酵素のインビトロ経路を構築した。ＯＲＦ３６は、ＴＤＰ−Ｌ−エピ−バンコサミンの祖先をヒドロキシルアミンの酸化状態に変換することができた。１８Ｏ２標識実験により、分子状酸素は、ヒドロキシルアミンおよびニトロソ産物に取り込まれることが明らかになった。さらに、ＯＲＦ３６のＸ線結晶構造が解明され、四量体酵素は、クラスＤのフラビン含有モノオキシゲナーゼの折りたたみと類似した折りたたみを有することが明らかになった。この構造により、その無秩序さを説明することができる、普通ではない開放活性部位があることも明らかになった。推定上のホスファターゼであるａｖｉＰの不活性化は、アビラマイシン産生に影響は及ぼさなかった。しかし、ａｖｉＤ、ａｖｉＯ１、ａｖｉＯ３、ａｖｉＥ２、ａｖｉＧ１、ｅｖｅｒＪ、ｅｖｅｒＦおよびｅｖｅｒＷの不活性化により、オルトソマイシン産生が停止された。
【０１２４】
各クラスターは、すべての糖残基に対して提唱されている前駆体である、ｄＴＤＰ−グルコースの形成を担う、推定上のグルコース−１−ホスフェートチミジルトランスフェラーゼ（ＥｖｄＳ４、ＥｖｅＳ１およびＡｖａＳ２）を含有する。ｄＴＤＰ−グルコースの形成後、オルトソマイシンのデオキシ糖およびジデオキシ糖を産生するために様々な酵素が必要である。エベルニノマイシンクラスターの各々では、２種の推定上の４，６−デヒドラターゼ（ＥｖｄＳ５、Ｅｖｄ１０、ＥｖｅＳ２およびＥｖｅＳ６）および１種の２，３−デヒドラターゼ（ＥｖｄＳ９およびＥｖｅＳ７）が存在する。アビラマイシンクラスターでは、３種の推定上の４，６−デヒドラターゼ（ＡｖａＳ３、ＡｖａＳ５およびＡｖａＳ８）および１種の２，３−デヒドラターゼ（ＡｖａＳ９）が存在する。ａｖａ経路におけるこれらのデヒドラターゼは、ａｖｉクラスターに提唱されているデヒドラターゼの数およびタイプに相当する。エベルニノマイシンクラスターはそれぞれ、５種の推定上のエピメラーゼ（ＥｖｄＳ２、ＥｖｄＳ３、ＥｖｄＳ６、ＥｖｄＳ１１、ＥｖｄＳ１３、ＥｖｅＳ３、ＥｖｅＳ５、ＥｖｅＳ１０、ＥｖｅＳ１１およびＥｖｅＳ１３）を含有している。ａｖａクラスターは、エベルニトロースの形成に必要なエピメラーゼがないので、４種の推定上のエピメラーゼ（ＡｖａＳ１、ＡｖａＳ４、ＡｖａＳ６およびＡｖａＳ７）しか含有していない。アビラマイシン経路におけるＡｖｉＸ１２への相同性に基づくと、ＥｖｄＳ２（７１％同一性）、ＥｖｅＳ５（７９％同一性）およびＡｖａＳ６（９６％同一性）の機能は、エピメラーゼとして割り当てられ、このエピメラーゼは、環ＦのＣ−２位で作用する。さらに、エベルニノマイシンクラスターの各々では、推定上のケトレダクターゼ（ｅｖｄＳ１、ｅｖｄＳ７、ｅｖｄＳ８、ｅｖｄＳ１４、ｅｖｅＳ４、ｅｖｅＳ８、ｅｖｅＳ９およびｅｖｅＳ１４）をコードする、４種の遺伝子が存在する。しかし、ａｖａクラスター（ａｖａＳ１０およびａｖａＳ１１）では、推定上のケトレダクターゼをコードする２種の遺伝子しか見いだされなかった。このことは、４種のケトレダクターゼをコードすると推定されているａｖｉクラスターとは対照的である。エベルニノマイシンおよびアビラマイシンに存在している多数のデオキシ糖のために、各酵素に関する正確な機能を提唱するのは困難である。
【０１２５】
ジクロロイソエバニニック酸部分の形成には、ポリケチドシンターゼ、アシルトランスフェラーゼ、ハロゲナーゼおよびＯ−メチルトランスフェラーゼが必要である。翻訳された配列類似性に基づくと、ｅｖｄＤ３、ｅｖｅＤ１およびａｖａＤ２は、ポリケチドトランスフェラーゼをコードする。ＥｖｄＤ１、ＥｖｅＤ２およびＡｖａＤ１は、推定上のアシルトランスフェラーゼである。留意すべきことに、ｅｖｅ、ａｖａおよびａｖｉ遺伝子クラスターおいて、アシルトランスフェラーゼは、ポリケチドシンターゼの直前にある一方、ｅｖｄ遺伝子クラスターでは、それらは１６種の遺伝子により分離されている。ＥｖｄＤ２、ＥｖｅＤ３およびＡｖａＤ３は、イソエベルニン酸（isoeverninic acid）を塩素化することが知られている、ＡｖｉＨと相同性（それぞれ、７８、７２および９２％の同一性）を有する推定上のハロゲナーゼである。最後に、ｅｖｄＭ５、ｅｖｅＭ８およびａｖａＭ６は、推定上の芳香族性Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードする。これらの遺伝子は、ジクロロイソエバニニック酸のオルト位をメチル化することが知られている、ａｖｉＧ４（それぞれ、６０、６１および８７％の同一性）と高い相同性を有している。
【０１２６】
他の糖残基とは異なり、エベルニトロース形成を担う遺伝子は、エベルニノマイシン遺伝子クラスターの端部において一緒にクラスターを形成している。留意すべきことに、エベルニトロースを含まない、アビラマイシン産生の経路では、これらの遺伝子のホモログは見いだされていない。以前の研究では、ＥｖｅＮ１（ＯＲＦ３６としても知られている）は、アミンのニトロソへの酸化を担っている。したがって、ｅｖｄクラスターｅｖｄＮ１中のホモログはまた、ニトロソシンターゼであると提唱されている。ＥｖｄＭ８およびｅｖｅＭ６は、Ｃ−３−メチルトランスフェラーゼ（どちらも、ｋｉｊＤ１と７１％の同一性を有する）をコードするように思われる。ルブラジリン経路からのＯ−メチルトランスフェラーゼへの配列類似性に基づくと、ＲｕｂＮ７、ＥｖｄＭ９（６１％同一性）およびｅｖｅＭ７（６１％同一性）は、エベルニトロースのＣ−３−ＯＨのメチル化を担うＯ−メチルトランスフェラーゼをコードする。エベルニトロース生合成に関与していると提唱されている他の酵素には、３−アミノトランスフェラーゼ（ＥｖｄＳ１２およびＥｖｅＳ１２）、３，５−エピメラーゼ（ＥｖｄＳ１３およびＥｖｅ  Ｓ１３）および４−ケトレダクターゼ（ＥｖｄＳ１４およびＥｖｅＳ１４）が含まれる。
【０１２７】
興味深いことに、各クラスター中のグリコシルトランスフェラーゼの数は、グリコシド連結の数に直接、相当しない。エベルニノマイシンおよびアビラマイシンはそれぞれ、グリコシルトランスフェラーゼの数より２個多いグリコシド連結を含有している。エベルニノマイシン経路のそれぞれにおいて、５種の推定上のグリコシルトランスフェラーゼ（ＥｖｄＧＴ１、ＥｖｄＧＴ２、ＥｖｄＧＴ３、ＥｖｄＧＴ４、ＥｖｄＧＴ５、ＥｖｅＧＴ１、ＥｖｅＧＴ２、ＥｖｅＧＴ３、ＥｖｅＧＴ４およびＥｖｅＧＴ５）が特定された。ａｖｉクラスターにおいて提唱されている４種のグリコシルトランスフェラーゼに対応する、ａｖａクラスター（ＡｖａＧＴ１、ＡｖａＧＴ２、ＡｖａＧＴ３およびＡｖａＧＴ４）における４種の推定上のグリコシルトランスフェラーゼが存在した。ＡｖｉＧＴ４への相同性に基づくと、アビラマイシン経路から特徴付けられるグリコシルトランスフェラーゼＥｖｄＧＴ１、ＥｖｅＧＴ３およびＡｖａＧＴ４は、環Ｈのグリコシド結合を担っている。グリコシルトランスフェラーゼの数が、糖の連結数と直接的に関連していないという事実は、一部のグリコシルトランスフェラーゼは繰り返し作用していること、または別のタイプの酵素が、グリコシド連結とオルトエステル連結の形成の両方を担っていることを示唆している。オキシゲナーゼの保存されたファミリーが、各経路（ＥｖｄＯ１、ＥｖｄＯ２、ＥｖｄＭＯ１、ＥｖｅＯ１、ＥｖｅＯ２、ＥｖｅＯ３、ＡｖａＯ１、ＡｖａＯ２およびＡｖａＯ３）において特定されている。オルトソマイシンのオルトエステル連結およびメチレンジオキシ架橋の形成におけるその役割は、本明細書において議論されている。
【０１２８】
テーラーリングに関与する遺伝子
オルトソマイシンは、大多数のテーラーリング酵素を必要とする、高度に修飾されているオリゴ糖である。ｅｖｄクラスターは、８種のＯ−メチルトランスフェラーゼ（ｅｖｄＭ１、ｅｖｄＭ２、ｅｖｄＭ４、ｅｖｄＭ５、ｅｖｄＭ６、ｅｖｄＭ７、ｅｖｄＭ９およびｅｖｄＭＯ１）および２種のＣ−メチルトランスフェラーゼ（ｅｖｄＭ３およびｅｖｄＭ８）をコードすると推定されている。留意すべきことに、ｅｖｄＭＯ１は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼおよびオキシゲナーゼの融合物のように思われる。ｅｖｅクラスターは、６種のＯ−メチルトランスフェラーゼ（ｅｖｅＭ１、ｅｖｅＭ２、ｅｖｅＭ３、ｅｖｅＭ４、ｅｖｅＭ７およびｅｖｅＭ８）および２種のＣ−メチルトランスフェラーゼ（ｅｖｅＭ５およびｅｖｅＭ６）をコードすると推定されている。完全に修飾されたエベルニノマイシンの産生には、９回のメチル化事象が必要である。ｅｖｄクラスターは、代替的なエベルニノマイシンアナログを担うことができる、さらに１種のメチルトランスフェラーゼを含有する。留意すべきことに、ｅｖｄクラスターおよびｅｖｅクラスターは、異なるエベルニノマイシンアナログを産生することが示され、これにより、各クラスター中で見いだされたメチルトランスフェラーゼの数の変動が説明される。ａｖａクラスターは、５種のＯ−メチルトランスフェラーゼ（ａｖａＭ２、ａｖａＭ３、ａｖａＭ４、ａｖａＭ５およびａｖａＭ６）および１種のＣ−メチルトランスフェラーゼ（ａｖａＭ１）をコードすると推定されている。これは、ａｖｉ遺伝子クラスターにおいて予測されるメチルトランスフェラーゼの数およびタイプに相当する。アビラマイシン遺伝子クラスターはそれぞれ、アビラマイシンＡの形成のために必要なメチル化事象の数よりも、１種余分のメチルトランスフェラーゼを含有しているように思われる。
【０１２９】
４種のクラスＩのオルトソマイシン遺伝子クラスターｅｖｄ、ｅｖｅ、ａｖａおよびａｖｉに由来するメチルトランスフェラーゼの系統発生解析に基づくと、ａｖｉクラスターの検討から推定し、メチルトランスフェラーゼの７種のクラスの機能を推定的に割り当てた（図１３）。単純にするため、この項目は、ｅｖｄクラスターに由来するメチルトランスフェラーゼの推定上の機能に着目する。ＥｖｄＭ３は、Ｄ環のＣ−３のメチル化を担う、Ｃ−メチルトランスフェラーゼをコードする、アビラマイシン経路に由来する、ａｖｉＧ１（４５％同一性）と相同性がある。既に議論した通り、ｅｖｄＭ５はａｖｉＧ４と相同性があり、ジクロロイソエバニニック酸のヒドロキシルをメチル化することが提唱されている。ＥｖｄＭ６は、Ｆ環のＣ−６ヒドロキシルをメチル化することが示されている、ａｖｉＧ２と相同性（５７％同一性）がある。ＥｖｄＭ７は、Ｆ環のＣ−２ヒドロキシルをメチル化することが示されている、ＡｖｉＧ６と６６％の配列同一性を共有している。本明細書において議論されている通り、ｅｖｄＭ８およびｅｖｄＭ９は、エベルニトロースのメチル化を担っている。最後に、ｅｖｄＭＯ１は、ａｖｉＧ５との相同性を有するＣ末端Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードし、その産物は、アビラマイシンのＥ環のＣ−４ヒドロキシルをメチル化することが示されている。
【０１３０】
調節および耐性に関与する遺伝子。
耐性遺伝子は、細菌の二次代謝産物のために、生合成遺伝子と一般にクラスターを形成する。実際に、オルトソマイシン経路では、耐性に関与しているように思われるいくつかの遺伝子が存在している。ｅｖｄ経路では、ｅｖｄＸ１、ｅｖｄＸ２およびｅｖｄＸ２は、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼをコードするように思われる。ｅｖｅ経路では、ｅｖｄＸ１およびｅｖｅＸ２は、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼをコードするように思われる。ａｖａ経路では、ａｖａＸ１およびａｖａＸ２は、それぞれ、ａｖｉＲｂおよびａｖｉＲａとの相同性を有する。ＡｖｉＲａおよびＡｖｉＲｂは、２３Ｓ  ｒＲＮＡをメチル化すること、およびアビラマイシンに耐性をもたらすことが示されている。さらに、ａｖａ経路は、２種の推定上のＡＢＣトランスポーターである、ＡＶＡＸ３およびＡｖａＸ４をコードする。
【０１３１】
ｅｖｄクラスターは、３種の調節因子、ＥｖｄＲ１、ＥｖｄＲ２およびＥｖｄＲ３をコードすると推定される。興味深いことに、ｅｖｅクラスターは、１種の調節因子ＥｖｅＲ１しかコードしないように思われる。ａｖａクラスターは、アビラマイシン経路における、ＡｖｉＣ１およびＡｖｉＣ２と相同性を有する、２種の調節因子である、ＡｖａＲ１およびＡｖａＲ２をコードすると推定される。ＡｖｉＣ１およびＡｖｉＣ２は、Ｓ．ビリドクロモゲネス（S. viridochromogenes）Ｔｕ５７中のアビラマイシン経路の転写活性化因子であることが示されている。
【０１３２】
遺伝子置換変異体の構築
開示された方法では、エベルニノマイシンはＭ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）から産生される。産生パラメータの変更は、産生レベルの劇的な増加をもたらし、新しいエベルニノマイシン同属体の同定が可能になり、そのそれぞれの、ニトロ糖のＮ−酸化状態は様々である。さらに、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する効力を保持している、普通ではないエベルニノマイシン-ロサラマイシンコンジュゲートが同定された。エベルニノマイシンの生合成を研究するため、Ｍ．カルボナセア（M. carbonacea）の遺伝子操作法およびエベルニノマイシンアナログの容易な分析法を開発した。
【０１３３】
ＢｉｅｒｍａｎおよびＭａｚｏｄｉｅｒによって開発されたストレプトマイセス属（Streptomyces）の古典的なコンジュゲート法は、Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）の形質転換体を産生せず、したがって、新しい方法を開発して本明細書において開示した。放線菌へのＤＮＡの接合移入に関すると、大腸菌（Escherichia coli）は、ドナー細菌として一般に使用される。多数の放線菌がメチル制限的であるので、ＤＮＡは、移入前に、非メチル化株である、大腸菌（E. coli）１２５６７により継代した。次に、ｏｒｉＴを含有するベクターを、非伝播性プラスミドｐＵＺ８００２を含有する大腸菌（E. coli）１２５６７によって、Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）に動かすことができる。大腸菌（E. coli）１２５６７／ｐＵＺ８００２をドナー株として使用したが、温度、選択様式、およびレシピエントであるＭ.カルボナセア（M. carbonacea）株の調製を含めた、Ｂｉｅｒｍａｎのプロトコルの他のパラメータを修正した。さらに、遺伝子置換体の遺伝的相補に利用可能な好適なベクターがないため、新しいベクターシステムを設計して、Ｍ．カルボナセア（M. carbonacea）の成功を収めた変換に実施した。
【０１３４】
さらに、Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）の遺伝子操作に対する修正済みプロトコルを使用して、形質転換物を産生した。レシピエント細菌の調製への修飾、接合完了体単離の方法、およびインキュベート温度は、一層高いコンジュゲート効率をもたらした。膜−洗浄器アセンブリの開発は、今や、接合完了体の迅速な単離を可能にする。以前は、低濃度のナリジクス酸を使用して、ドナー大腸菌（E. coli）の成長を妨げた。これらの条件を使用するコロニーの単離は、長くかかり、純粋なＭ．カルボナセア（M. carbonacea）コロニーを得るために、多数の工程を必要とし、大腸菌（E. coli）は、多くの場合、よりゆっくりとした成長をするＭ．カルボナセア（M. carbonacea）コロニーより速い。膜は、より大きな大腸菌（E. coli）が膜の上部に捕捉される間に、Ｍ．カルボナセア（M. carbonacea）の菌糸体が寒天の下まで浸透することを可能にする。適切なインキュベート時間後に膜を除去すると、大腸菌（E. coli）とさらに分離する必要のない、コロニーが現れる。洗浄器−膜アセンブリは、単離手順をかなり簡単にし、純粋な接合完了体を取得する時間を低減する。
【０１３５】
具体例では、エベルニノマイシン同属体を産生するための方法であって、発酵装置において、産生培地中でミクロモノスポラ・カルボナセア変種アウランティアカ（Micromonospora carbonacea var. aurantiaca）細菌を培養し、これにより発酵培養物を産生するステップ、該発酵培養物からエベルニノマイシン同属体を含有する抽出物を得るステップ、ならびに該発酵培養抽出物からエベルニノマイシン同属体を単離および精製するステップを含む、方法が、本明細書において開示されている。これらの方法を使用して、本明細書において開示されている化合物８および９などの、ロサラマイシンにコンジュゲートされているエベルニノマイシンを含む、エベルニノマイシン同属体（conger）を産生することができる。
【０１３６】
具体例では、エベルニノマイシン同属体を産生するための方法であって、発酵装置において、産生培地中でミクロモノスポラ・カルボナセア（Micromonospora carbonacea）細菌を培養し、これにより発酵培養物を産生するステップであって、該細菌が改変または欠失されたＯ−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ−メチルトランスフェラーゼおよび／またはニトロソシンターゼ活性を有する、ステップ、該発酵培養物からエベルニノマイシン同属体を含有する抽出物を得るステップ、ならびに該発酵培養抽出物からエベルニノマイシン同属体を単離および精製するステップを含む、方法が、本明細書において開示されている。ある種の例では、細菌は、ｅｖｄ遺伝子クラスターの遺伝子における１つまたは複数の変異を含むことができる。他の例では、細菌は、ｅｖｄＭ２、ｅｖｄＭ３、ｅｖｄＮ１およびｅｖｄＯ１からなる群から選択される遺伝子における１つまたは複数の変異を含むことができる。さらに他の例では、細菌は、ミクロモノスポラ・カルボナセア変種アウランティアカ（Micromonospora carbonacea var. aurantiaca）を含むことができる。
【０１３７】
同様に、ミクロモノスポラ属（Micromonospora）を形質転換する方法であって、膜の一方の側に、ドナー細菌およびレシピエントであるミクロモノスポラ属（Micromonospora）の細菌を含むコンジュゲート組成物を接触させるステップであって、この膜が、ドナー細菌ではなくミクロモノスポラ属（Micromonospora）の菌糸体によって浸透されることが可能である、ステップ、該膜を浸透するミクロモノスポラ属（Micromonospora）のコロニーが成長するのに十分な時間および温度で組成物をインキュベートするステップ、ならびに膜およびドナー細菌を除去し、これにより、形質転換されたミクロモノスポラ属（Micromonospora）を残すステップを含む、方法が開示される。ある種の例では、ドナー細菌は、大腸菌（E. coli）である。他の例では、レシピエントであるミクロモノスポラ属（Micromonospora）は、Ｍ．カルボナセア（M. carbonacea）である。さらに他の例では、Ｍ．カルボナセア（M. carbonacera）は、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacera var aurantiaca）である。さらなる例では、膜は、容器の底部を形成し、この容器は、コンジュゲート組成物を保持する。ある種の例では、形質転換されたミクロモノスポラ属（Micromonospora）は、ｅｖｄ遺伝子クラスターの遺伝子における１つまたは複数の変異を含むことができる。ある種の例では、形質転換されたミクロモノスポラ属（Micromonospora）は、ｅｖｄＭ２、ｅｖｄＭ３、ｅｖｄＮ１およびｅｖｄＯ１からなる群から選択される遺伝子における１つまたは複数の変異を含むことができる。
【０１３８】
さらに、２％未満のラクトースおよび少なくとも２％のグルコースを含む培地中、８〜１２日間、２８〜３４℃で、ミクロモノスポラ属（Micromonospora）をインキュベートするステップを含む、ミクロモノスポラ属（Micromonospora）を培養する方法が開示されている。例えば、インキュベートするステップは、３０℃とすることができる。他の例では、インキュベートするステップは、１０日間とすることができる。ある種の例では、培地は、３％以上のグルコースを含むことができ、ラクトースを実質的に含み得ない。
【０１３９】
ｅｖｄクラスターは、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）において、遺伝子置換を構築することにより、エベルニノマイシンの生合成を担うことを、初めて実験により確認した。ｅｖｄＮ１、ｅｖｄＭ３およびｅｖｄＭ２の標的遺伝子置換は、２工程のＰＣＲ標的戦略を使用して行った（図１４）。まず、λ−Ｒｅｄ組換えを使用して、大腸菌（E. coli）中のコスミド上で、遺伝子置換体を調製した。標的遺伝子の両側に存在する領域と相同性を有する３９個の塩基対伸張を用いて、アプラマイシン耐性および移入起点をコードするカセットを設計した。λ−Ｒｅｄ組換えシステム（ガンマ、ベータおよびエキソ）の３種の遺伝子を誘発させると、ＰＣＲにより産生した線状カセットと大腸菌（E. coli）における対象とする遺伝子を含有するコスミドとの間の相同性組変え体が刺激されて、所望の遺伝子置換体が産生した。遺伝子置換体は、カセットおよびシークエンシングのＰＣＲ増幅によって確認した。
【０１４０】
次に、放線菌のメチル化感度により、コンジュゲートする間に、コスミドの伝播を担うプラスミドｐＵＺ８００２を含有する大腸菌（E. coli）の非メチル化株である、ＥＴ１２５６７に、電気穿孔法によってコスミドを形質転換した。次いで、所望の遺伝子置換体を有するコスミドを内包するドナー大腸菌（E. coli）株とコンジュゲートすることにより、脱メチル化コスミドをＭ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）に形質転換した。本明細書において議論されている通り、接合完了体を単離するための新しい方法を開発した。この方法は、ドナー大腸菌（E. coli）が下に捕捉されたまま、Ｍ．カルボナセア（M.carbonacea）の菌糸体が浸透する０．４μｍの膜を使用した。
【０１４１】
コスミドをＭ.カルボナセア（M. carbonacea）に形質転換する際に、二重交差変異体を産生するために、相同組換えを２回行わなければならない（図１５）。第１の組換え事象は一重交差をもたらし、ここで、コスミド全体が遺伝子クラスターに取り込まれる。遺伝子クラスター中のこのような多量のＤＮＡの挿入により、遺伝子クラスター全体の極性作用および破壊がもたらされ得る。したがって、第２回目の組換えにより生じる二重交差が望ましいものであった。二重交差変異体を選択するため、アプラマイシン耐性かつカナマイシン感受性の接合完了体をさらなる解析のために選択した。次に、二重交差を確認するため、アプラマイシンおよびカナマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ増幅により、これらの変異株を解析した。この確認方法を使用すると、ｅｖｄＮ１、ｅｖｄＭ１およびｅｖｄＭ２は、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）において首尾よく破壊されたように思われた。しかし、ＰＣＲは、交差したゲノム位置を確認することはできないので、サザンブロット解析を使用して、置換変異体を確認した（図１６）。推定上の各遺伝子置換体の上流に、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）プローブを設計した。野生型Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）および各変異株に由来するゲノムＤＮＡを単離し、適切なエンドヌクレアーゼにより消化させて、予測可能なサイズのフラグメントを得た。野生型Ｍ．カルボナセア（M. carbonacea）および各変異株に対する、プローブ標識フラグメントの特異的シフトについてブロットを解析した。予測可能なバンドシフトが観察されたので、ｅｖｄＮ１、ｅｖｄＭ３およびｅｖｄＭ２の遺伝子置換が確認された（図１６）。
【０１４２】
エベルニノマイシン産生に及ぼす３種の遺伝子置換体の影響を評価するため、変異株の粗製抽出物のタンデム型液体クロマトグラフィー質量スペクトル（ＬＣ／ＭＳ）分析を使用した。ＬＣ／ＭＳデータの分析により、３種の遺伝子置換株のすべてにおいて、エベルニノマイシンＤ〜Ｇの産生が停止したことが明らかになった。これらの結果により、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）において、エベルニノマイシン遺伝子クラスターが初めて実験により確認された。
【０１４３】
エベルニノマイシン生合成におけるｅｖｄＮ１の役割
Ｍ．カルボナセア変種アフリカナ（M. carbonacea var africana）のエベルニノマイシン遺伝子クラスターのニトロソシンターゼであるＯＲＦ３６は、既にインビトロで特徴付けられた。生化学的特徴付けにより、ＯＲＦ３６は、エベルニノマイシンＥのアミノ糖を二重酸化して、対応するエベルニノマイシンＧのニトロソ糖にする触媒となることが明らかになった。インビボでのニトロソシンターゼを特徴付けるために、ｅｖｄＮ１をアプラマイシンカセットで置き換えて、ΔｅｖｄＮ１：：ａａｃ（３）ＩＶを産生した。この変異体の抽出物の分析により、完全長エベルニノマイシンＤ〜Ｇ（１〜４）の産生は失われるが、ニトロ糖のないエベルニノマイシン−２（５）は蓄積することが明らかになった。留意すべきことに、エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲート（６および７）は、ヒドロキシルアミノ官能基が失われているため、もはや形成されなかった。Ｅｖｅｒ−２の構造は、質量スペクトルのフラグメント化によって確認した（図３）。遺伝的相補により、野生型エベルニノマイシンの産生が回復することはなく、置換は正確であったが、極性作用により、下流遺伝子の活性喪失が引き起こされたことを示した。エベルニノマイシン遺伝子クラスターの試験により、オペロンの開始時に、ｅｖｄＮ１を有する１つのオペロンに、ニトロ糖クラスターを生合成する遺伝子があることが明らかになった。ニトロソシンターゼの遺伝子置換に由来する極性作用のために、ニトロ糖オペロン、したがってＡ環の完全な機能喪失が観察された。
【０１４４】
エベルニノマイシン生合成におけるｅｖｄＭ３の役割
以前に明記されている通り、ｅｖｄＭ３は、Ｓ．ビリドクロモゲネス（S.viridochromogenes）Ｔｕ５７における、アビラマイシン経路に由来するＡｖｉＧ１と相同性を有する、Ｃ−３メチルトランスフェラーゼをコードすることが提唱された。以前のＡｖｉＧ１を用いるインビトロ研究により、ＥｒｙＢＩＩＩの活性を相補することができるＣ−メチルトランスフェラーゼこそ、エリトロマイシン経路における、Ｌ−ミカローゼ生合成に関与するＣ−３−メチルトランスフェラーゼであることが示された。Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄのグループは、ＡｖｉＧ１が、アビラマイシン産生体である、Ｓ．ビリドクロモゲネス（S.viridochromogenes）において欠失している場合、すべてのアビラマイシンの産生が停止することを報告した。１５しかし、ｅｖｄＭ３がＭ.カルボナセア（M. carbonacea）で不活性化されていると、エベルニノマイシンＨ、ＪおよびＫと呼ぶ３種の新しい代謝産物が蓄積した（図３）。
【０１４５】
エベルニノマイシンＨは、この変異株中の主要な代謝産物であり、その構造はＮＭＲにより決定されて、質量スペクトルのフラグメント化によって確認された。少量の代謝産物であるＥｖｅｒ  ＪおよびＥｖｅｒ  Ｋの構造決定は、高分解能質量スペクトルのフラグメント化を使用して行った（図３）。これらの代謝産物はいずれも、Ｄ環のＣ−３メチルおよびＧ環のＣ−２上のＯ−メチルがなかった。さらに、Ｄ環のＣ−２位にヒドロキシルが付与された。この位置におけるヒドロキシルは、他のエベルニノマイシンでは特定されていたが、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）により産生された以前のエベルニノマイシンでは特定されていなかった。ｅｖｄＭ３の下流には、Ｏ−メチルトランスフェラーゼへの相同性を有するｅｖｄＭ４が存在している。ｅｖｄＭ３の遺伝子置換に起因する極性作用により、ｅｖｄＭ４の機能喪失が引き起こされ、ひいては、Ｇ環上のＯ−メチルが喪失した可能性が高い。興味深いことに、Ｅｖｅｒ  Ｋは、エベルニノマイシンにおいて、以前に観察されなかった、Ｆ環上にメチルを得た。
【０１４６】
ｅｖｄＭ３による遺伝的相補により、メチル基の付加に対応する質量を有する、Ｅｖｅｒ  Ｌ（１０）と名付けられた代謝産物が産生した。不運なことに、Ｅｖｅｒ  Ｌの産生レベルが低いために、正確な構造帰属はできなかった。しかし、この代謝産物は、Ｃ−メチルトランスフェラーゼｅｖｄＭ３との相補後にしか出現しなかったので、相補により、Ｄ環のＣ−メチルが回復した可能性が高い。これらの結果は、Ｃ−３メチルトランスフェラーゼとしてのｅｖｄＭ３の予測された機能、および極性作用がｅｖｄＭ３の遺伝的相補により回復されないｅｖｄＭ４の機能喪失を引き起こしたことと一致する。
【０１４７】
興味深いことに、エベルニノマイシンＨは、１６μｇ／ｍＬのＭＩＣで、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（S. aureus subsp.aureus）Ｒｏｓｅｎｂａｃｈに対する活性を維持した。エベルニノマイシンＨは、エベルニノマイシンＡ（Ｚｉｒａｃｉｎ（商標）、ＭＩＣ＝１μｇ／ｍＬ）ほど強力ではないが、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に対して依然として中程度の活性があり、エベルニノマイシンの構造−活性関係に関する重要な情報を提供することができる。
【０１４８】
エベルニノマイシン生合成におけるｅｖｄＭ２の役割
翻訳された配列類似性に基づくと、ｅｖｄＭ２は、糖Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードする。この推定上のメチルトランスフェラーゼの機能を決定するため、遺伝子置換体ΔｅｖｄＭ２：：ａａｃ（３）ＩＶを構築した。変異体の抽出物の分析に際して、デスメチルアナログを同定しなかった。しかし、短縮エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲート（６）が検出された。不運なことに、ｅｖｄＭ２との遺伝的相補性は、いかなる追加的な代謝産物の産生も回復しなかった。ＥｖｄＭ２に関する正確な機能は不確かであるが、ここで示された配列類似性および遺伝子置換データにより、ＥｖｄＭ２は、分子の右側上にＯ−メチル、可能性としてメチレンジオキシ架橋のメチレンを導入することが示される。
【０１４９】
エベルニノマイシン遺伝子クラスターの変異性
ｅｖｄＮ１、ｅｖｄＭ３およびｅｖｄＭ２の標的遺伝子置換により、エベルニノマイシンＤ〜Ｇは、これらの変異体により産生されなかったので、エベルニノマイシン生合成におけるｅｖｄ遺伝子クラスターの役割が確認された。さらに、５種の新しいエベルニノマイシンアナログを産生し、エベルニノマイシンのＤ環のＣ−３位のメチル化を担うＣ３−メチルトランスフェラーゼとしてのｅｖｄＭ３の役割を帰属した。留意すべきことに、極性作用は、下流の遺伝子にかなり影響を及ぼし、予測しない代謝産物の蓄積をもたらした。
【０１５０】
遺伝子置換変異体の分析により、オペロンにおける第１の遺伝子がカセットで置き換えられると、破壊的な極性作用により、オペロン全体の機能喪失が引き起こされることが明らかになった。ΔｅｖｄＮ１：：ａａｃ（３）ＩＶの場合、ニトロソシンターゼをコードするｅｖｄＮ１の置換により、エベルニトロースが完全に喪失された。様々なＮ−酸化状態のエベルニノマイシンが、野生型株によって産生されるという事実によって証拠付けられるように、グリコシル化に糖の完全酸化を必要としない。したがって、ニトロソシンターゼの置換により、アミノ糖が産生するはずである。しかし、ｅｖｄＮ１は、エベルニトロース形成に必要な酵素をコードするオペロンにおける、最初の遺伝子に存在しているので、遺伝子置換に起因する極性作用によって、多数の下流遺伝子が破壊されて、エベルニトロースの産生が停止された可能性が高い。
【０１５１】
さらに、ΔｅｖｄＭ２：：ａａｃ（３）ＩＶ変異体の分析により、分子の右側部分全体が失われることが明らかになった。ｅｖｄＭ２は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードすることが提唱され、ｅｖｄＭ２の喪失は、デスメチル化合物をもたらすことが予測されるので、この結果は興味深い。しかし、ｅｖｄＭ２はまた、２種のさらなるメチルトランスフェラーゼである、グリコシルトランスフェラーゼおよび機能が未知の遺伝子をコードする、オペロンにおける最初の遺伝子でもある。ｅｖｄＭ２をカセットで置換すると、下流遺伝子の機能喪失がもたらされる極性作用を引き起こし、エベルニノマイシンの産生が変わる。
【０１５２】
ｅｖｄＭ３の置換により、３つの新しい代謝産物である、エベルニノマイシンＨ、ＪおよびＫが産生した。留意すべきことに、これらの代謝産物はすべて、Ｄ環のＣ−３メチルを欠失しており、このことは、ＥｖｄＭ３の提唱されている機能と一致する。しかし、Ｄ環のＣ−２のヒドロキシル化およびＧ環のＣ−２からのＯ−メチルの喪失などの、さらなる修飾が観察された。興味深いことに、Ｆ環のＣ−３ヒドロキシルがメチル化され、これは、エベルニノマイシンにおいて、以前には決して観察されなかった。ｅｖｄＭ３のゲノム周辺の調査により、これらの予測せぬ変化の１つに、ある考察がもたらされた。ｅｖｄＭ３は、オペロンにおける最初の遺伝子ではないので、その置換は、ｅｖｄＭ２またはｅｖｄＮ１の置換がもたらしたような、オペロンの完全喪失をもたらさなかった。しかし、ｅｖｄＭ３の直後の下流は、別のメチルトランスフェラーゼであるｅｖｄＭ４である。ＥｖｄＭ４は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼであると提唱されているが、アビラマイシン経路における遺伝子への相同性は有していない。新しい代謝産物は、Ｇ環上にＯ−メチルがなく、かつこの同じ位置は、アビラマイシンでは異なる修飾を有しているので、極性作用はｅｖｄＭ４の機能喪失をもたらすこと、およびＥｖｄＭ４はＧ環のＣ−２ヒドロキシルのメチル化を担っている可能性が高い。
【０１５３】
遺伝子置換変異体によって産生された代謝産物は、非天然基質に対する、エベルニノマイシンの生合成の酵素の耐性に関する有用な情報をもたらした。最も興味深いことに、Ｄ環のＣ−３におけるメチル基が喪失したにも関わらず、Ｃ環とＤ環との間に、オルトエステル連結が依然として形成された。この結果は、修飾部位における直接的なメチル基の喪失は、その酵素能力に影響を及ぼさないので、オルトエステルシンターゼは、その基質に対する大きな変化に耐性があり得るという証拠である。さらに、Ｇ環のＯ−メチルの喪失、Ｆ環上のＯ−メチルの付加、およびエベルニトロースの喪失などの、構造に対する他の変化も、グリコシルトランスフェラーゼによって十分に耐容され、構造としての他の生合成機構が依然として十分に組み立てられて、作り上げられた。
【０１５４】
構造の分析はまた、オルトソマイシン生合成の時機に関する情報も提供することができる。具体的には、Ｅｖｅｒ−２は、エベルニトロースしか欠いていない、十分に精巧に産生された六糖類であるので、このニトロ糖は、オリゴ糖鎖に結合する最後の糖残基でなければならない。さらに、環Ｆと環Ｇとの間の１，１連結が最初に組み立てられて、その後の糖残基の付加のための適切なグリコシル受容体をもたらさなければならない。次に、Ｆ環およびＧ環のカップリング後、エベルニトロースの付加により終えるこの二方向性グリコシル受容体から鎖が組み立てられる。
【０１５５】
オルトソマイシンクラスターに由来するオキシゲナーゼの役割
翻訳された配列類似性を使用して、５種のオルトソマイシン遺伝子クラスターの中で、非ヘム鉄であるα−ケトグルタレート依存性オキシゲナーゼをコードすると推定される、５種のオルトソマイシン遺伝子クラスターから、１３種のオープンリーディングフレームを特定した。推定上のオキシゲナーゼの数は、どれだけの予期される酸化的環化が、各オルトソマイシンにおいて、オルトエステル連結およびメチレンジオキシ架橋形成に必要であるかということと直接、相関している。エベルニノマイシンおよびアビラマイシン遺伝子クラスターはそれぞれ、各分子中に見いだされる、２つのオルトエステル連結およびメチレンジオキシ架橋に相当する、これらのオキシゲナーゼのうちの３種を含有している。反対に、１つのオルトエステル連結だけを含有しているハイグロマイシンＢに関する生合成クラスターでは、これらの推定上のオキシゲナーゼは１つしか見いだされなかった。さらに、これらは、このような酸化に対する十分な触媒的能力を有するように思われる、各遺伝子クラスター内の唯一の酵素である。
【０１５６】
１３種のオルトソマイシン関連オキシゲナーゼの系統発生解析は、フィタノイル−ＣｏＡ  ２−ヒドロキシラーゼ（ＰｈｙＨ）サブファミリーに最も関連性が近い、非ヘム鉄であるα−ケトグルタレート依存性オキシゲナーゼの異なるサブファミリーを形成している（図１７）。ＰｈｙＨサブファミリーは、ハロゲン化、二酸素化およびヒドロキシル化を含めた、様々な酵素能力を有する酵素をコードする。オルトソマイシン関連オキシゲナーゼサブファミリーは、さらに部分群に分けることができる。３つの部分群は、アビラマイシンおよびエベルニノマイシン遺伝子クラスターの各々に由来する、１種のオキシゲナーゼを含有する。第４の部分群は、ハイグロマイシン遺伝子クラスターに由来する、ＨｙｇＸしか含有していない。異なる部分群の酵素間の配列同一性は、２２〜４３％であり、これは、関連する機構と一致するが、基質は異なる。同じ部分群に属する酵素は、６５〜９３％という、はるかに高い配列同一性を有する。この高い配列同一性により、部分群内のオキシゲナーゼは、密接に関連している基質に対して同じ反応を触媒することが示唆される。配列同一性は、表３中に見いだすことができる。
【０１５７】
【表１】
2018536426.tif 000015
【０１５８】
エベルニノマイシン生合成に対するオキシゲナーゼの要件
オルトソマイシン生合成における、推定上のオキシゲナーゼの役割を決定するため、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）において、エベルニノマイシン経路からｅｖｄＯ１、ｅｖｄＯ２およびｅｖｄＭＯ１の遺伝子置換体を作製した。ｅｖｄＯ１、ｅｖｄＯ２およびｅｖＭＯ１の標的遺伝子置換は、本明細書に記載されている、２工程のＰＣＲ標的戦略を使用して行った。二重交差変異体を選択するため、アプラマイシン耐性およびカナマイシン感受性の接合完了体をさらなる解析に選択した。次に、二重交差を確認するため、アプラマイシンおよびカナマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ増幅により、これらの変異株を解析した。この確認方法を使用すると、ｅｖｄＯ１、ｅｖｄＯ２およびｅｖｄＭＯ１は、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）において首尾よく、破壊されたように思われた。
【０１５９】
しかし、ＰＣＲは、交差位置を確認することはできないので、サザンブロット解析を使用して、置換変異体を確認した（図１８）。推定上の遺伝子置換体のそれぞれの上流に、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）プローブを設計した。野生型および各変異株に由来するゲノムＤＮＡを単離し、適切なエンドヌクレアーゼにより消化させて、予測可能なサイズのフラグメントを得た。野生型Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）および各変異株のプローブ標識フラグメントの特異的シフトについてブロットを解析した。予測可能なバンドシフトが観察されたので、ｅｖｄＯ１およびｅｖｄＭＯ１の遺伝子置換が確認された。しかし、ＰＣＲ解析は、ｅｖｄＯ２が、首尾よく置き換えられたことを示唆したが、サザンブロット解析により、予測されたバンドシフトが観察されなかったので、ｅｖｄＯ２の置換は、実際には不首尾に終わったことが明らかになった。アプラマイシンカセットは、ゲノムの異なる領域に統合された可能性が高い。ｅｖｄＯ２置換を生じさせるさらなる努力は成功しなかった。この結果は、ＰＣＲだけではなく、サザンブロット解析によっても、各変異株を徹底的に解析することの重要性を強調するものである。
【０１６０】
エベルニノマイシン産生に及ぼすオキシゲナーゼ遺伝子置換体の影響を評価するため、変異株の粗製抽出物のタンデム型液体クロマトグラフィー質量スペクトル（ＬＣ／ＭＳ）を使用した。ＬＣ／ＭＳデータの分析により、ｅｖｄＯ１とｅｖｄＭＯ１の遺伝子置換株のどちらにおいても、エベルニノマイシンＤ〜Ｇの産生が停止したことが明らかになった（図４）。ｅｖｄＯ２変異株のサザンブロット解析と一致して、エベルニノマイシン産生は、これらの変異体のいずれにも影響を受けなかった。これらの結果は、ｅｖｄＯ１およびｅｖｄＭＯ１は、エベルニノマイシン生合成に実際に関与していること、およびＭ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）における、エベルニノマイシン遺伝子クラスターの最初の確認を成すものであることを確証したものである。
【０１６１】
ΔｅｖｄＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶおよびΔｅｖｄＭＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶ株の遺伝的相補性
極性作用が、遺伝子置換において、エベルニノマイシン産生に影響を及ぼすかどうかを判定するため、ΔｅｖｄＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶおよびΔｅｖｄＭＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶを遺伝的に相補し、株：ΔｅｖｄＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶ＿ＧＣおよびΔｅｖｄＭＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶ＿ＧＣを産生した。ΔｅｖｄＭＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶ＿ＧＣの場合、エベルニノマイシン産生は、遺伝的相補によって回復されなかった。この結果は、極性作用が、遺伝子クラスターにおいて他の重要な遺伝子の破壊を引き起こして、産生が停止されたことと一致した。しかし、ΔｅｖｄＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶ＿ＧＣの場合、遺伝的相補は、エベルニノマイシンＤ〜Ｇの産生を回復しなかった一方、興味深いことに、短縮エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートの産生は観察された。このコンジュゲートは、一層大きな代謝産物の分解生成物であるが、環ＣのＣ−１位は、オルトエステル連結の酸化状態と一致している。このコンジュゲートが、ΔｅｖｄＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶでは観察されなかったことを考慮すると、このデータは、ｅｖｄＯ１がＣ環とＤ環との間のオルトエステル連結の形成を担っていることをかなり示唆している。
【０１６２】
オルトソマイシン関連オキシゲナーゼの構造的特徴付け
オルトソマイシン生合成における、これらのオキシゲナーゼの役割をさらに理解するために、系統発生的部分群（ＡｖｉＯ１、ＥｖｄＯ１、ＥｖｄＯ２およびＨｙｇＸ）のそれぞれに由来する代表的なオキシゲナーゼの結晶構造を決定した。各酵素は、逆平行のβ−鎖を含有するβ−シート間のメタロ中心を収容する活性部位を有する、二本鎖β−螺旋モチーフを採った。折りたたみは、これらの酵素間では保存されたが、オリゴマー化状態は、ＡｖｉＯ１およびＥｖｄＯ２はモノマーとして、ＥｖｄＯ１は二量体として、ＨｙｇＸは四量体としてというように、様々であった。本発明者らの配列解析と一致して、構造的類似性探索により、オルトソマイシン関連オキシゲナーゼは、非ヘム鉄であるα−ケトグルタレート依存性オキシゲナーゼのＰｈｙＨサブファミリーに関連していることが明らかになった。
【０１６３】
以前の研究により、非ヘム鉄である、α−ケトグルタレート依存性オキシゲナーゼの二本鎖β−螺旋のβ鎖間へのループ挿入により、基質特異性が制御されることが示唆された。実際に、本明細書において特徴付けたオキシゲナーゼはすべて、ループ挿入を含有し、大きな結合溝を形成する。留意すべきことに、ループ挿入はすべて、適応性の測定基準として一般に解釈される、高い結晶温度因子を有する。この適応性は、基質の結合時に、立体構造を変化させる、基質結合ループを示唆するものである。この提唱と一致して、４種のプロモーターのループの比較により、α−ケトグルタレートのＨｙｇＸへの結合時に、これらのループはほぼ２０Å移動して活性部位の閉鎖を促進することが示された。
【０１６４】
非ヘム鉄である、α−ケトグルタレート依存性オキシゲナーゼの大部分において、活性部位における鉄の配位は、２個のヒスチジンおよび１個の酸性残基を含んで、フェイシャルトライアッド（facial triad）として知られている、保存されたＨ−Ｘ−Ｄ／Ｅ…Ｈモチーフを形成する。ここに記載されている結晶構造は、活性部位にＦｅ２＋よりもむしろ、触媒的に不活性なＮｉ２＋を含有しているが、Ｎｉ２＋は、オルトソマイシン関連オキシゲナーゼにおいてＦｅ２＋配位の典型的な八面体配位形状を保持したことが確認された。ＡｖｉＯ１、ＥｖｄＯ１およびＥｖｄＯ２は、正準なフェイシャルトライアッドを保持している一方、ＨｙｇＸは、様々なものを含有し、この場合、酸性残基は、グリシンおよびグルタミン酸が位置している４つの残基により置換された後に、端部のヒスチジンが金属配位圏を完全に埋めて、新規なＨ−Ｘ−Ｇ…Ｅ−Ｘ３−Ｈモチーフを形成する。予測される通り、オキシゲナーゼとα−ケトグルタレートまたはスクシネートとの共構造により、α−ケトグルタレートは、酸性リガンドに対してトランスに２ーケト基を有する金属に直接、結合していることが明らかになった。
【０１６５】
不運なことに、オルトソマイシン関連オキシゲナーゼの基質は未知であり、考えられる基質ライブラリーの合成は現実的ではない。しかし、酵素は、その産物に対してアフィニティーを有するので、ＨｙｇＸへのハイグロマイシンＢの結合を、トリプトファン蛍光消失（Ｋｄ＝３．４±０．５μＭ）を使用して測定した。この低いマイクロモル濃度のアフィニティーは、酵素とその産物との間に観察されるアフィニティーと一致し、ＨｙｇＸは、ハイグロマイシンＢ生合成における最後の工程を触媒することを示唆している。ＨｙｇＸとα−ケトグルタレートおよびハイグロマイシンＢとの共構造は１．６Åの解像度であることが決定された。ハイグロマイシンＢに関する明白な電子密度は、金属中心に接近しているオルトエステルの架橋酸素の１つを示した。この結合は、１０の直接的および５の水媒介性相互作用によって安定化された位置に非常に特異的であった。ハイグロマイシンＢは、アノマー炭素の酸素化に十分近い、金属から５．２Åにあるデストミン酸のアノマー炭素の方を向いていた。興味深いことに、ＨｙｇＸ−ハイグロマイシンＢの共構造とＥｖｄＯ１、ＥｖｄＯ２およびＡｖｉＯ１構造との構造的比較により、ハイグロマイシンＢのリガンド形状は、ＨｙｇＸが正準なフェイシャルトライアッドを保持している場合、立体的な衝突をもたらすことが示される。ＥｖｄＯ１、ＥｖｄＯ２およびＡｖｉＯ１は、ＨｙｇＸと同じ化学反応を触媒する可能性が高いので、フェイシャルトライアッドは、基質収容のために修飾されている可能性が最も高い。ＨｙｇＸは、アノマー炭素を酸素化する化学的な産生指向でハイグロマイシンＢに結合することができたという事実は、酵素のこのファミリーは、オルトソマイシンのオルトエステル連結を形成するということを強力に示唆している。
【０１６６】
使用方法
本明細書において開示されている化合物（compund）は、感染の処置または細菌の成長阻害に使用することができる。ある種の例では、患者に、治療（thereapeutically）有効量の本明細書において開示されている化合物のいずれかを投与するステップを含む、患者における感染を処置する方法が開示されている。処置することができる感染の具体例には、以下に限定されないが、ハンセン菌、マイコバクテリア、ナイセリア属（Neisseria）、結核細菌、放線菌、コリネバクテリア、リステリア、クロストリジウム菌、桿菌、腸球菌、ボルテデレン（Bortedellen）、シュードモナス菌、ヘリコバクター菌、ヘモフィルス菌、ビブリオ菌、赤痢菌、エルシニア菌およびサルモネラ菌が含まれる。
【０１６７】
例には、以下の疾患が含まれる：結核；肺炎；腸チフス；パラチフス；梅毒、胃炎；胃腸炎；ルール（Ruhr）；悪疫；腸炎；腸外感染、大腸菌（E. coli）による腹膜炎および盲腸炎、ならびにＥＨＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＴＥＣおよびＥＩＥＣによる腸感染；コレラ、ジオネラ症、百日咳、ブルセラ症、ライム病、レプトスピラ症、発疹チフス、トラコーマ、淋病、髄膜炎、敗血症、ハンセン病など。
【０１６８】
開示された方法のさらなる対象は、本明細書において開示されている化合物をヒトまたは動物に投与することによって、ヒトまたは動物において、特に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を含む感染症の処置である。
【０１６９】
他の例では、患者に、治療有効量の本明細書において開示されている修飾生物のいずれかを投与するステップを含む、患者における感染を処置する方法が本明細書において開示されている。これらの生物は、そのままで、または凍結乾燥形態で、または懸濁液で投与することができる。生物は、プロバイオテックスとして作用することができ、他のプロバイオティクスおよび／または栄養補給剤と一緒に投与することができる。
【０１７０】
これらの開示方法では、感染を有するヒトを処置することができるが、家畜（ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、家禽、およびコンパニオン動物（イヌ、ネコ、ウサギなど）も処置することができる。本組成物または生物は、単独で、または他の治療剤もしくは栄養補給剤と組み合わせて投与することができ、例えば、本組成物は食料と一緒にすることができる。
【０１７１】
投与
開示化合物は、個別または組合せ医薬製剤で、逐次または同時のどちらか一方で投与することができる。１つまたは複数の開示化合物が、第２の治療剤と組み合わせて使用される場合、各化合物の用量は、該化合物が単独で使用される場合と同じとすることができ、または異なることもできる。適切な用量は、当業者により容易に認識されるであろう。
【０１７２】
本発明の化合物を参照する、用語「投与」およびその変化形（例えば、化合物を「投与すること（administering）」）は、本化合物または本化合物のプロドラッグを、処置を必要としている動物の系に導入することを意味する。本発明の化合物またはそのプロドラッグが、１つまたは複数の他の活性剤（例えば、細胞毒性剤など）と組み合わせて供給される場合、「投与」およびその変化形は、化合物またはそのプロドラッグ、および他の薬剤の同時および逐次導入を含むことがそれぞれ理解される。
【０１７３】
開示化合物、およびそれを含有する組成物のインビボでの施用は、当業者に現在または今後、公知となる、任意の好適な方法および技法により行うことができる。例えば、開示化合物は、生理学的または薬学的に許容される形態で製剤化されて、例えば、経口、経鼻、直腸、局所および非経口投与経路を含めた、当分野において公知の任意の好適な経路によって投与され得る。本明細書で使用する場合、用語の非経口には、注射によるなどの、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、腹腔内および胸骨内投与が含まれる。開示化合物または組成物の投与は、単回投与、または当業者により容易に決定することができる連続的もしくは個別の時間間隔とすることができる。
【０１７４】
本明細書において開示されている化合物、およびそれを含む組成物はまた、リポソーム技術、遅延放出カプセル、埋込式ポンプおよび生体分解性容器を利用して投与することもできる。これらの送達方法は、有利なことに、長期間にわたる一定投与量を供給することができる。本化合物はまた、その塩誘導体形態または結晶形態で投与することもできる
【０１７５】
本明細書において開示されている化合物は、薬学的に許容される組成物を調製するための公知の方法によって製剤化することができる。製剤は、当業者に周知かつ容易に利用可能な、いくつかの情報源に詳細に記載されている。例えば、E.W. MartinによるRemington’s Pharmaceutical Science（1995）は、開示方法に関連して使用することができる製剤を記載している。一般に、本明細書において開示されている化合物は、化合物の有効な投与を容易にするため、有効量の化合物を好適な担体と組み合わせるよう、製剤化することができる。使用される組成物はまた、様々な形態とすることもできる。これらには、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液剤または懸濁液剤、坐剤、注射剤および注入可能な溶液剤、ならびにスプレー剤などの、固体、半固体および液状剤形が含まれる。好ましい形態は、所期の投与形式および治療用途に依存する。本組成物はまた、当業者に公知の、従来的な薬学的に許容される担体および希釈剤を好ましくは含む。化合物と一緒に使用するための担体または希釈剤の例は、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、アルミナ、デンプン、生理食塩水、ならびに等価な担体および希釈剤を含む。所望の治療的処置のためのこのような投与量を投与するためには、本明細書において開示されている組成物は、１つまたは複数の対象とする化合物を全量で、担体または希釈剤を含む全組成物の重量に対して、約０．１重量％〜９９重量％、とりわけ１〜１５重量％の間で有利に含むことができる。
【０１７６】
投与に好適な製剤は、例えば、抗酸化剤、緩衝化剤、静菌剤、および製剤を所期のレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有することができる水性滅菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含むことができる、水性および非水性滅菌懸濁液剤を含む。製剤は、単位用量または多回用量の容器、例えば、密封したアンプルおよびバイアルで提供されることができ、使用前に、滅菌液体担体、例えば注射用水の状態にすることしか必要としない、冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で保管することができる。即時使用可能な注射溶液剤および懸濁液剤は、滅菌散剤、顆粒剤、錠剤などから調製することができる。特に、上記の成分に加えて、本明細書において開示されている組成物は、問題の製剤のタイプを考慮して、当分野において従来的な他の作用剤を含むことができることを理解すべきである。
【０１７７】
本明細書において開示されている化合物、およびそれを含む組成物は、細胞に直接接触させることにより、または担体手段によるかのどちらか一方で、細胞に送達することができる。細胞に化合物および組成物を送達するための担体手段は、当分野において公知であり、例えば、リポソーム部分に該組成物をカプセル封入することを含む。本明細書において開示されている化合物および組成物を細胞に送達するための別の手段は、標的細胞に送達するよう標的化されている、タンパク質または核酸に化合物を結合させることを含む。米国特許第６，９６０，６４８号明細書および米国特許出願公開第２００３００３２５９４号明細書および同第２００２０１２０１００号明細書は、別の組成物と結合させて、組成物が生物膜を通過して転座することを可能にするアミノ酸配列を開示している。米国特許出願公開第２００２００３５２４３号明細書はまた、細胞内送達するための、生物学的部分を輸送して細胞膜を通過させるための組成物を記載している。化合物はまた、ポリマーに取り込まれることができ、ポリマーの例は、頭蓋内腫瘍向けのポリ（Ｄ−Ｌラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマー；２０：８０のモル比（ＧＬＩＡＤＥＬ中で使用する場合）のポリ［ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン：セバシン酸］；コンドロイチン；キチン；およびキトサンを含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、所望の治療的処置のためのこのような投与量を投与するためには、本明細書において開示されている医薬組成物は、１つまたは複数の化合物を全量で、担体または希釈剤を含む全組成物の重量に対して、約０．１重量％〜４５重量％、とりわけ１〜１５重量％の間で含むことができる。例示として、投与される活性成分の投与量レベルは、以下とすることができる：動物の（体）重量の、静脈内では、０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内では、０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ；皮下では、０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ；筋肉内では、０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ；経口では、０．０１〜約２００ｍｇ／ｋｇ、および好ましくは約１〜１００ｍｇ／ｋｇ；鼻内点滴では、０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ；およびエアゾールでは、０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ。
【実施例】
【０１７９】
開示されている主題による方法、組成物および結果を例示するために、以下の実施例が以下に説明されている。これらの実施例は、本明細書に開示されている主題のすべての態様を含むことが意図されているわけではなく、むしろ、代表的な方法、組成物および結果を例示することが意図されている。これらの実施例は、当業者に明白な、本発明の等価物および変形を除外することを意図するものではない。
【０１８０】
数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実なものにする努力がなされているが、ある程度の誤差および偏差が、考慮されるべきである。特に示さない限り、部は重量部であり、温度は℃であるか、または周囲温度であり、圧力は大気圧またはその近辺である。記載の方法から得られる生成物純度および収率を最適化するために使用することができる反応条件、例えば、構成成分の濃度、温度、圧力、ならびに他の反応の範囲および条件の変形ならびに組合せが多数存在する。合理的かつ型通りの実験しか、このような方法条件を最適化するために必要としないであろう。
【０１８１】
大腸菌（E. coli）株は、ＬＢブロス中で成長させた。Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）ＮＲＲＬ２９９７および置換変異体は、ＴＳＢ（トリプトンソイブロス）寒天上およびＴＳＢ液体中で成長させた。属間コンジュゲートは、固形ＡＳ１培地（０．１％酵母抽出物、０．５％可溶性デンプン、０．０２％Ｌ−アラニン、０．０２％Ｌ−アルギニン、０．０５％Ｌ−アスパラギン、０．２５％ＮａＣｌ、１％Ｎａ２ＳＯ４、２％アガロース、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補給）上で行った。アプラマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、ナリジクス酸（２５μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）は、以下に記載される選択に必要な場合に使用した。
【０１８２】
Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）に由来するエベルニノマイシンの産生
種培養物は、５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中で、１００ｍＬの２９９７発芽培地（０．３％牛肉エキス、０．５％トリプトース、０．１％デキストロース、２．４％可溶性デンプン、０．５％酵母抽出物および０．１％炭酸カルシウム）に、振とうしながら、ＴＳＢ寒天からの菌糸体のループを３０℃で５日間、接種することにより産生した。エベルニノマイシン産生に関すると、２Ｌのバッフル付けフェルンバッハフラスコ中で、種培養物２５ｍＬを５００ｍＬの産生培地（０．５％酵母抽出物、０．１％コーンスティープソリッド、０．１％炭酸カルシウム、３％グルコース）に加え、３０℃で１０日間、振とうしながら成長させた。Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０樹脂（１００ｍＬ、メタノールにより既に予め平衡にし、水により洗浄）を発酵培養物に加え、振とうしながら６０分間、インキュベートした。合わせた樹脂および菌糸体を３０００ｘｇで遠心分離することにより採集して、２５０ｍＬメタノールおよび２５０ｍＬアセトンにより続けて抽出し、回転蒸発により蒸発乾固した。得られた粗製抽出物を、３００ｍＬの溶媒グレードのメタノールに再懸濁し、吸引ろ過によりシリカゲルを含むフリット付けガラス漏斗（９×２ｃｍ）でろ過し、濃縮乾固した。抽出物をＨＰＬＣグレードのメタノール中、２００ｍｇ／ｍＬの最終濃度で再懸濁した後、ＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１８３】
エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートの単離
粗製抽出物用の分離の最初の寸法は、メタノール中、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０カラムを使用する、サイズ排除クロマトグラフィーとした。フラクションは、ＬＣ／ＭＳによって分析し、エベルニノマイシンを含有しているフラクションを一緒にして、直線グラジエントを使用するＲＰ−ＨＰＬＣで分離した。移動相は、（Ａ）９９％水／１％アセトニトリル（１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む）、ｐＨ＝８および（Ｂ）５％水／９５％アセトニトリル（１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む）、ｐＨ＝８とした。
【０１８４】
エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートの分解
精製した、完全長エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲート（９）（９０％水／１０％ＤＭＳＯ中の０．２ｍｇ／ｍＬ濃度）を振とうしながら、３０℃で、４８時間、インキュベートした。一定分量を設計した時間点で採取し、ＬＣ／ＭＳ分析に供した。
【０１８５】
エベルニノマイシンの質量スペクトル分析
抽出物は、ＨＥＳＩエレクトロスプレーイオン化源を装備したＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍａｘトリプルステージ四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、ネガティブイオンモードとポジティブイオンモードの両方で分析した。Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＬＣ  Ｐｕｍｐ  Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、Ａｃｃｕｃｏｒｅ  Ｃ１８カラム（粒子サイズ：２．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）またはＬｕｎａ  Ｃ１８（２）カラム（粒子サイズ：５μｍ、２５０×４．６ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に２０μｌを注入して分離した。移動相は、（Ａ）９５％水／５％アセトニトリル（１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む）および（Ｂ）５％水／９５％アセトニトリル（１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む）とした。Ａｃｃｕｃｏｒｅ  Ｃ１８カラムの場合のグラジエント条件は、０〜１分、１００％Ａ；１〜２０分、１００％Ｂまで直線グラジエント；２０〜２６分、１００％Ｂ；２６〜７分、１００％Ａまで直線グラジエント；２７〜３０分、１００％Ａとした。Ｌｕｎａ  Ｃ１８カラムの場合のグラジエント条件は、０〜１分、１００％Ａ；１〜３０分、１００％Ｂまで直線グラジエント；３０〜４５分、１００％Ｂ；４５〜４７分、１００％Ａまで直線グラジエント；４７〜５０分、１００％Ａとした。流速は、１ｍＬ／分で維持し、１５μＬをＡｃｃｅｌａ  ＰＤＡ検出器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に送液し、５μＬを質量スペクトル分析に供した。それぞれ、１０ｐｓｉおよび５４ｐｓｉに設定した補助ガスおよびシースガスの両方に窒素を使用した。ポジティブイオンモードにおける分析の場合：キャピラリー温度２７５℃；スプレー電圧４．５ｋＶ；キャピラリーオフセット３５Ｖ；チューブレンズ電圧１３３Ｖ；スキマーオフセット５Ｖ。ネガティブイオンモードにおける分析の場合：キャピラリー温度２７５℃；スプレー電圧３．０ｋＶ；キャピラリーオフセット−３５Ｖ；チューブレンズ電圧−１３２Ｖ；スキマーオフセット５Ｖ。フラグメント化検討の場合、衝突エネルギー、または２０、３０、３５もしくは４０Ｖを使用し、３５Ｖの衝突エネルギーが最良の結果をもたらした。
【０１８６】
黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（S. aureus subsp. aureus）Ｒｏｓｅｎｂａｃｈに対する生物活性試験
精製されたエベルニノマイシンおよびコンジュゲートの抗菌活性は、試験生物として、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（Staphyloccocus aureus subsp. aureus）Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ（ＡＴＣＣ６５３８Ｐ）を使用する、ＮＣＣＬＳガイドラインに従い、ブロス微量希釈アッセイによって決定した。
【０１８７】
膜を使用しないＭ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）コンジュゲート
Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）は、ＴＳＢ寒天（Ｏｘｏｉｄ（商標）トリプトンソイブロス、２％アガロース）上、３０℃で７日間、成長させた。コンジュゲート受容体菌糸体は、５０ｍＬのファルコン管中のＴＳＢ培地１０ｍＬに、菌糸体のループを接種して、３０℃で５日間、振とうしながらインキュベートすることにより調製した。次に、培養物を３０００ｘｇで１０分間、遠心分離し、ペレットを新しいＴＳＢ２ｍＬ中に再懸濁した。１５０μＬの一定分量を、滅菌した１．５ｍＬのエッペンドルフ管に移送し、滅菌したプラスチック製細胞ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。アプラマイシンおよびカナマイシンを含有する５０ｍＬのファルコン管中で、一晩で新しく調製したＬＢ培養物１％を１０ｍＬのＬＢ培地に接種することにより、遺伝子置換体を含有しているドナー大腸菌（E. coli）ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２細胞を調製し、振とうしながら、３７℃で、ＯＤ６００が０．４になるまで成長させた。培養物を３０００ｘｇで１０分間、遠心分離し、ペレットを新しい１０ｍＬのＬＢで３回、洗浄した。最後の洗浄後、ペレットを１５０μＬのＬＢ中に再懸濁した。ドナー大腸菌（E. coli）５０μＬをレシピエントのＭ.カルボナセア（M. carbonacea）１５０μＬに加えた。細菌混合物は、ＡＳ１寒天（０．１％酵母抽出物、０．５％可溶性デンプン、０．０２％Ｌ−アラニン、０．０２％Ｌ−アルギニン、０．０５％Ｌ−アスパラギン、０．２５％ＮａＣｌ、１％Ｎａ２ＳＯ４、２％アガロース、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補給）上でプレート培養した。次に、このプレートを完全に乾燥するまで、３７℃で１〜２時間、インキュベートした。３０℃で１６〜２０時間のインキュベート後、アプラマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびナリジクス酸（１２．５μｇ／ｍＬ）を上記のプレートに広げた。次に、このプレートをコロニーが明確に目視可能になるまで、さらに３０℃でさらに６〜９日間、インキュベートした。次に、滅菌したピペットの先端を使用して、コンジュゲートコロニーをアプラマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびナリジクス酸（１２．５μｇ／ｍＬ）を含有する新しいＴＳＢプレート上に採取した。純粋なＭ．カルボナセア（M. carbonacea）コロニーが単離されるまで、この過程を繰り返した。
【０１８８】
膜を使用するＭ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）コンジュゲート
ドナーおよびレシピエント培養物は、上記の通り調製した。プレート培養前に、滅菌した０．４μｍ膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、製品番号ＨＴＴＰ０４７００）を、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）７３２多目的シーラント（１００％ケイ素ゴム）を使用して、滅菌プラスチック製洗浄器に付着させた。乾燥後、膜−洗浄器装置をそれぞれ、ＡＳ１寒天プレート上に配置した。次に、細菌の混合物を膜上部でプレート培養した。各プレートを完全に乾燥するまで、３７℃で１〜２時間、インキュベートした。３０℃で１６時間のインキュベートした後、アプラマイシン耐性接合完了体を選択するために、洗浄器の上部の細菌混合物にアプラマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を加えた。３０℃で７〜９日間のインキュベートした後、膜を取り除き、アプラマイシンを含有するＴＳＢプレート上に、純粋なコロニーの筋を付けた。
【０１８９】
エベルニノマイシン産生パラメータの改善
最初に、エベルニノマイシンの産生量は非常に少なく、野生型エベルニノマイシンの分析を困難にし、および変異株からの代謝産物の分析（この場合、産生量は一層低かった）を不可能にした。エベルニノマイシンの力価を改善するため、培地構成成分、温度および時間を含めた産生パラメータを修正した。特許から抽出した元々の産生パラメータは、３％ラクトース、０．５％酵母抽出物、０．１％コーンスティープソリッドおよび０．１％炭酸カルシウムからなる培地構成成分であり、２６℃のインキュベート温度、および４日の産生時間であった。グルコースは、エベルニノマイシンのほとんどの糖への前駆体であるので、グルコースを追加して、産生レベルを向上させた。実際に、培地に２％のグルコースを追加すると、エベルニノマイシン産生がわずかに向上し、温度を３０℃に上げると、一層高いエベルニノマイシンレベル（それぞれ、３５％および１３３％の向上、図５）を生じた。しかし、温度を３７℃まで上げると、産生に負の影響を及ぼした。追加のグルコースを加え、培地から二糖類であるラクトースを除去すると、エベルニノマイシン産生が、さらにかなり（３８４％）改善した。修正した最後のパラメータは時間であった。産生期に費やした培養時間の長さは、エベルニノマイシンの産生レベルに直接リンクしており、１０日間の長さが、最高の力価のエベルニノマイシン、すなわち３，０００％を超える増加をもたらした。
【０１９０】
Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）により産生したエベルニノマイシンの同定
Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）によって産生されたエベルニノマイシンを特徴付けるため、質量スペクトルのフラグメント化を使用した。この方法を使用して、エベルニノマイシンＤ〜Ｇ（１〜４）と名付けた、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）によって産生した主要なエベルニノマイシンアナログを同定した（ネガティブモードでエベルニノマイシンのＬＣ／ＭＳ分析からの抽出したイオンクロマトグラム：ｅｖｅｒ  Ｄ、ｍ／ｚ＝１５３４．５［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ  Ｄ、ｍ／ｚ＝１５０４．５、［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ  Ｆ、ｍ／ｚ＝１５２２．５［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ  Ｇ、ｍ／ｚ＝１５２０．５［Ｍ−Ｈ］−）。これらの同属体の各々は、窒素の酸化状態が異なり、アミノからヒドロキシルアミノおよびニトロソ段階、これらから完全に酸化されたニトロまで動く、生合成中間体のラダーをもたらす。相対イオン強度のみに基づくと、ヒドロキシルアミノ酸化状態は、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）によって産生した主要なエベルニノマイシン同属体である（スキーム２、「Ｒ」は、窒素の酸化状態である）。
【０１９１】
【化１３】
2018536426.tif 000016
【０１９２】
グリコシド連結の不安定性を利用し、予測可能なフラグメントパターンを生成し、この場合、各遷移は、糖残基の喪失を表す。留意すべきことに、Ａ環が失われて、正に帯電したイオンを生成することを使用して、Ｎ酸化状態を判定する。最も豊富なエベルニノマイシンである、エベルニノマイシンＦ（３）のフラグメント化により、環Ｃと環Ｄのフラグメント間の非常に不安定なオルトエステル連結により、最初に、五糖のフラグメントが得られることを明らかにする。次に、糖残基E〜Hの逐次喪失が、予想可能なことに起こる。分子の左側に関して、Ａ１−（Ａ）−Ｂ−Ｃ−Ｄ環について、１つのユニットとして、Ａ１およびＢ残基の喪失、および他の残基の逐次喪失を伴うフラグメントが観測された。類似のフラグメントパターンが、エベルニノマイシンＥ（２）に関して観測されたが、産生レベルがより低いために、それほど多数のフラグメントは同定されなかった。この予測可能なフラグメントパターンは、野生型エベルニノマイシンの同定を容易にし、変異株によって産生した代謝産物の特徴付けに必須であった。
【０１９３】
【化１４】
2018536426.tif 000017
【０１９４】
二機能性抗生物質の同定
この変異型によって産生したエベルニノマイシンを評価している間の驚くべき発見は、エベルニノマイシンＦは、やはりＭ.カルボナセア（M. carbonacea）によって産生される、別の天然産物であるロサラマイシン（５）と反応するということである。具体的には、エベルニノマイシンＦのヒドロキシルアミノ官能基は、ロサラマイシンのアルデヒドと反応して、２種の代謝産物が一緒に繋がったニトロンを生成する。ロサラマイシン（ロサミシンとしても知られている）は、Ｍ．ロサリア（M.rosaria）から既に特徴付けられている１６員のマクロライド抗生物質であり、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）およびクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）を含めた、様々な生物に対して活性を有する。完全長エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲート（６）に加えて、短縮型も野生型Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）の粗製抽出物中に存在している。短縮型および完全長コンジュゲートの両方の構造が、ＮＭＲによって解明された（図１９および図２０）。完全長エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートは、通常の培養条件下で、エベルニノマイシン−三糖に分解し、これは、ニトロン連結によって依然としてロサラマイシン（７）に繋がっている。これらの２種のコンジュゲートを、ブロス微量希釈アッセイ中で、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（S. aureus subsp. aureus）Ｒｏｓｅｎｂａｃｈに対して試験し、両方のエベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートが、エベルニノマイシンＡのＭＩＣと等しいＭＩＣを有することが分かった（図６Ａ、１μｇ／ｍＬ）。このエベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートの予測しなかった発見は、２つの異なるクラスの分子のメンバーからなる、二機能性抗生物質の興味深い検討をもたらす。
【０１９５】
コンジュゲートによる、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）の形質転換
エベルニノマイシンの生合成を調査するため、および生合成機構の変更により新しいアナログを創製するため、Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）の遺伝子操作に対する確固たる手順を必要とした。Ｍ．カルボナセア（M. carbonacea）および他のミクロモノスポラ属種（Micromonospora species）の形質転換の以前の報告は、属間コンジュゲートに依存しているが、詳細はほとんど報告されていなかった。不運なことに、属間コンジュゲートのための古典的な方法は、効率的な形質転換結果を生じなかった。したがって、属間コンジュゲートによるＭ．カルボナセア（M. carbonacea）の形質転換のための代替法を開発した。通常、コンジュゲート混合物から大腸菌（E. coli）を除去するために、ナリジクス酸を使用する。しかし、大腸菌（E. coli）を効率的に死滅させる濃度では、Ｍ．カルボナセア（M. carbonacea）は生存できない。ナリジクス酸の異なる濃度を試験して、大腸菌（E. coli）の死滅とＭ．カルボナセア（M. carbonacea）の生存との間の最良のバランスを見いだした。５０μｇ／ｍＬでは、Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）は、生存可能ではなかった。２５μｇ／ｍＬの濃度のナリジクス酸は、大腸菌（E. coli）の成長を妨げたが、Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）の成長もやはり妨げた。ナリジクス酸の濃度を１２．５μｇ／ｍＬに低下させても、依然として、大腸菌（E. coli）成長を妨げたが、実質的に一層のＭ．カルボナセア（M. carbonacea）成長を可能にした。その後の形質転換は、１２．５μｇ／ｍＬのナリジクス酸で行った。
【０１９６】
コンジュゲート効率をさらに改善するため、抗生物質の適用直前に１６時間のインキュベート後に、過剰大腸菌（E. coli）をコンジュゲートプレート培養から優しく洗浄した。コンジュゲートは、ドナーとレシピエント生物との間の物理的な相互作用を必要とするので、Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）培養物を機械的にホモジナイズし、ドナー大腸菌（E. coli）とレシピエントであるＭ．カルボナセア（M. carbonacea）との間のコンジュゲートについて、より大きな表面積を作製した。さらに、細菌間のコンジュゲートは、液体中よりもむしろ固体表面上で最も効率よく起こるので、細菌の最初のプレート培養後に、３７℃でプレートを完全に乾燥すると、コンジュゲート効率は一層高くなった。最後に、コンジュゲート効率は３０℃と３７℃の両方で評価し、３０℃でのインキュベートが最大数のコロニーをもたらした。
【０１９７】
コンジュゲート手順への上記の修正により、十分なコンジュゲート効率がもたらされたが、大腸菌（E. coli）を除去するナリジクス酸不含法を開発して、純粋なＭ．カルボナセア（M. carbonacea）接合完了体のより容易かつ迅速な単離が可能になった。ドナーおよびレシピエント細菌のコンジュゲート混合物を、ＡＳ１寒天上の滅菌プラスチック製洗浄器により取り囲まれた０．４μｍの膜の上にプレート培養する（図７Ａ）。プレート培養の前に、膜をケイ素接着剤により洗浄器に付着させた。洗浄器は、細菌混合物を含有している一方、膜は、大腸菌（E. coli）は不可能であるが、Ｍ．カルボナセア（M. carbonacea）は下の寒天に選択的に浸透することが可能である。９日後、洗浄器／膜アセンブリを取り除くと、寒天上にアプラマイシン耐性接合完了体の純粋なコロニーが現れた（図７Ｂ）。
【０１９８】
遺伝的相補システムの開発
好適な遺伝的相補性プラスミドが、利用可能でなかったので、放線菌において使用するための、一般に使用されている組込みベクターであるｐＳＥＴ１５２を修飾することにより、新しいベクターであるｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥを創製した（図８）。修飾ベクターは、本発明者らの研究室で設計し、次に、Ｍｕｔａｇｅｎｅｘから注文した。遺伝的相補性プラスミドに対する要件には、適切な耐性マーカー、対象とする遺伝子の発現のための構成的に活性なプロモーター、放線菌へのコンジュゲートのための移入起点部位（ｏｒｉＴ）、および宿主染色体に安定的に取り込ませるためのインテグラーゼが含まれる。ｐＳＥＴ１５２は、インテグラーゼおよびｏｒｉＴを既に含有していたが、適切な耐性マーカーおよびプロモーターを欠いた。アプラマイシン耐性要素（ａａｃ（３）ＩＶ）をハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼであるｈｐｈに置き換えることにより、ｐＳＥＴ１５２をまず修飾し、ハイグロマイシンＢに耐性を付与した。さらに、構成的に活性なプロモーターをコードするｅｒｍＥ＊を、下流の複数のクローニング部位と組み合わせて、ｐＳＥＴ１５２のＸｂａＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。新しく生成したｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥは、コンジュゲートにより、野生型Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）に容易に形質転換された。形質転換の成功は、ハイグロマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ増幅によって確認した。ｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥは、Ｍ．カルボナセア（M. carbonacea）のみの使用に制限されない。ｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥは、無関係の土壌放線菌であるノカルジオプシス（Nocardiopsis）ＦＵ４０に首尾よく形質転換することができる。
【０１９９】
Ｅｖｄ、ＥｖｅおよびＡｖａ遺伝子クラスターの注解
５種のオルトソマイシン遺伝子クラスターは、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能である：ａｖａ（ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）に由来するアビラマイシン生合成）、ａｖｉ（Ｓ．ビリドクロモゲネス（S.viridochromogenes）Ｔｕ５７に由来するアビラマイシン生合成）、ｅｖｄ（ミクロモノスポラ・カルボナセア変種アウランティアカ（Micromonospora carbonacea var aurantiaca）に由来するエベルニノマイシン生合成）、ｅｖｅ（Ｍ．カルボナセア変種アフリカナ（M. carbonacea var africana）に由来するエベルニノマイシン生合成）およびｈｙｇ（Ｓ．ハイグロスコピクス（S. hygroscopicus）に由来するハイグロマイシンＢ生合成）。しかし、これらのクラスターのうちの２つだけ、すなわちａｖｉおよびｈｙｇは、機能注釈を含む。したがって、翻訳された配列類似性および比較ゲノム学を使用して、ａｖａ、ｅｖｄおよびｅｖｅ遺伝子クラスターに関する機能を提唱した。図１０、図１１および図１２は、それぞれ、ｅｖｄ、ｅｖｅおよびａｖａの遺伝子クラスターの配置および推定機能を図示している。
【０２００】
抗ＳＭＡＳＨを使用して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド配列から同定した。各ＯＲＦは、翻訳済みＢＬＡＳＴ（ＢｌａｓｔＸ）を使用して解析した。相同性タンパク質の機能に基づいて、遺伝子名を割り当て、機能を提唱した。
【０２０１】
大腸菌（E. coli）における遺伝子置換体の産生
ＰＣＲ標的遺伝子置換戦略を使用して、遺伝子ｅｖｄＭ２、ｅｖｄＭ３およびｅｖｄＮ１をコスミドＣＡまたはＣＧ上で個々に削除した。ラムダＲｅｄ形質転換受容性細胞は、コスミドＣＡまたはコスミドＣＧのどちらか一方を含有する、新しく一晩培養した１％の大腸菌（E. coli）ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０を、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０ｍＭ  Ｌ−アラビノースを含有する１０ｍＬ  ＬＢ培地に接種することにより調製した。培養物は、３０℃でＯＤ６００が０．６になるまで振とうしながら成長させた。細胞を４℃、３０００ｘｇで１０分間、遠心分離することによって回収した。ペレットを１０ｍＬの氷冷１０％グリセロールで３回、洗浄した。次に、このペレットを１００μＬの氷冷１０％グリセロール中で再懸濁し、形質転換するまで氷上で維持した。
【０２０２】
表１に一覧表示されているプライマーを使用して、アプラマイシン（apramcycin）耐性マーカー（ａａｃ（３）ＩＶ）、ｏｒｉＴおよびＦＲＴ領域を含有する遺伝子置換カセットをＰＣＲによって増幅した。次に、１．４ｋｂのＰＣＲ産物を電気穿孔法によって、コスミドを含有するアラビノース誘発株ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０に直接、形質転換し、ここで、ラムダＲｅｄ媒介性の相同組換えにより、対象とする遺伝子の置換が可能になった。形質転換された大腸菌（E. coli）は、アプラマイシンを含有するＬＢ寒天にプレート培養し、３７℃で一晩、インキュベートして、温度感受性プラスミドｐＩＪ７９０の喪失を促進させた。アプラマイシンを含有する液体ＬＢに、これらのプレートからのコロニーを接種し、３７℃で一晩、振とうしながら成長させた。遺伝子置換は、プライマーＤｅｌＵｐおよびＤｅｌＤｎ、ならびにシークエンシングを使用するＰＣＲによって確認した。得られたコスミドは、電気穿孔法により、コスミドの接合移入に必要な遺伝子を含有するプラスミドｐＵＺ８００２を含有する、メチル化されていない大腸菌（E. coli）株ＥＴ１２５６７に形質転換した。大腸菌（E. coli）における遺伝子置換は、カナマイシン、アプラマイシンおよびクロラムフェニコールを含有する、液体ＬＢ培地中、３７℃で維持した。
【０２０３】
ＰＣＲ標的ストレプトマイセス属（Streptomyces）遺伝子置換戦略の第２の工程は、エベルニノマイシン産生生物における、対象の遺伝子の置換であった。本明細書に記載されている方法を使用して、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）の形質転換を行った。インフレーム二重交差物を産生するため、相同組換えを２回、必要とした。３０℃で７〜９日間、インキュベートした後、アプラマイシンまたはカナマイシンのどちらか一方を含有する固形ＴＳＢ培地に接合完了体の筋を付けて、二重交差変異体を同定した。二重交差は、アプラマイシン耐性遺伝子を増幅する場合、プライマーＡｐｒＵｐおよびＡｐｒＤｎを使用し、カナマイシン耐性遺伝子を増幅する場合、ＮｅｏＵｐおよびＮｅｏＤｎを使用する、カナマイシンおよびアプラマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ増幅によって確認した（配列は、表１に見いだすことができる）。
【０２０４】
Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）における二重交差変異体は、サザンハイブリダイゼーションにより確認した。遺伝子特異的プローブは、対象とする遺伝子の上流で設計した（プライマー配列は、表１に見いだすことができる）。ｅｖｄＭ２プローブ（７８２ｂｐ）は、プライマーであるＥｖｄＭ２−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−ＦｏｒおよびＥｖｄＭ２−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｒｅｖを使用して増幅した。ｅｖｄＭ３プローブ（５７４ｂｐ）は、プライマーであるＥｖｄＭ３−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−ＦｏｒおよびＥｖｄＭ３−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｒｅｖを使用して増幅した。ｅｖｄＮ１プローブ（７００ｂｐ）は、プライマーであるＥｖｄＮ１−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−ＦｏｒおよびＥｖｄＮ１−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｒｅｖを使用して増幅した。アプラマイシン耐性遺伝子に特異的な８８４ｂｐプローブも設計し、プライマーであるＡｐｒ−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−ＦｏｒおよびＡｐｒ−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｒｅｖを使用して増幅した。プローブはすべて、ＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：１１５８５６１４９１０）を使用して、ジゴケシゲニンで標識した。ハイブリダイゼーションおよび検出は、上述のＤＩＧ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔを使用して実施した。
【０２０５】
【表２−１】
2018536426.tif 000018
【０２０６】
【表２−２】
2018536426.tif 000019
【０２０７】
遺伝子置換変異体の相補
Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）において使用するための好適な相補性プラスミドを産生するため、ｐＳＥＴ１５２誘導体を設計して、Ｍｕｔａｇｅｎｅｘから注文した。ｐＳＥＴ１５２から始めて、構成的プロモーターｅｒｍＥ＊を複数のクローニング部位の上流に挿入した。次に、新しい相補性プラスミドｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥを産生するため、アプラマイシン耐性遺伝子（ａａｃ（３）ＩＶ）をハイグロマイシンＢ耐性マーカーｈｙｇで置き換えた（図９のマップ）。ΔｅｖｄＭ２：：ａａｃ（３）ＩＶ、ΔｅｖｄＭ３：：ａａｃ（３）ＩＶおよびΔｅｖｄＮ１：：ａａｃ（３）ＩＶの相補に関しては、表１に一覧表示されているプライマーを使用するＰＣＲによって、ｅｖｄＭ２、ｅｖｄＭ３およびｅｖｄＮ１を増幅した。続いて、ＰＣＲ産物を、ｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥのＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、各変異株のための相補性プラスミドを産生した。
【０２０８】
上記の相補性プラスミドをそれぞれ、コンジュゲート体の大腸菌（E. coli）株ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に形質転換した。ドナー大腸菌（E. coli）とレシピエントのＭ．カルボナセア（M. carbonacea）との間のコンジュゲートは、遺伝子置換体および遺伝的相補性プラスミドを含有する変異体を選択するために、１６時間のインキュベート後にアプラマイシンおよびハイグロマイシンを添加したことを除いて、既に記載した方法と同じ方法で行った。相補された株の粗製抽出物を調製し、本明細書に記載されているＨＰＬＣ／ＭＳによって分析した。
【０２０９】
Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）変異体に由来する代謝産物の分析
種培養物は、５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中で、１００ｍＬの２９９７発芽培地（０．３％牛肉エキス、０．５％トリプトース、０．１％デキストロース、２．４％可溶性デンプン、０．５％酵母抽出物、０．１％炭酸カルシウム、５０μｇ／ｍｌアプラマイシン）に、振とうしながら、ＴＳＢ寒天からの菌糸体のループを３０℃で５日間、接種することにより産生した。産生に関すると、２Ｌのバッフル付けフェルンバッハフラスコ中で、種培養物２５ｍＬを５００ｍＬのアパラマイシン不含産生培地（０．５％酵母抽出物、０．１％コーンスティープソリッド、０．１％炭酸カルシウム、３％グルコース）に加え、３０℃で１０日間、振とうしながら成長させた。Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０樹脂（１００ｍＬ、メタノールにより既に予め平衡にし、水により洗浄）を発酵培養物に加え、振とうしながら６０分間、インキュベートした。合わせた樹脂および菌糸体を３０００ｘｇで遠心分離することにより採集して、２５０ｍＬメタノールおよび２５０ｍＬアセトンにより続けて抽出し、回転蒸発により蒸発乾固した。得られた粗製抽出物を、３００ｍＬの溶媒グレードのメタノールに再懸濁し、吸引ろ過によりシリカゲルを含むフリット付けガラス漏斗（９×２ｃｍ）でろ過し、濃縮乾固した。抽出物をＨＰＬＣグレードのメタノール中、２００ｍｇ／ｍＬの最終濃度で再懸濁した後、ＬＣ／ＭＳにより分析した。粗製抽出物の質量スペクトル分析は、本明細書に記載されている方法を使用して行った。
【０２１０】
エベルニノマイシンＨの単離
粗製抽出物用の分離の最初の寸法は、メタノール中、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０カラムを使用する、サイズ排除クロマトグラフィーとした。フラクションは、ＬＣ／ＭＳによって分析し、エベルニノマイシンＨを含有しているフラクションを一緒にして、直線グラジエントを使用する逆相ＨＰＬＣを使用して分離した。移動相は、（Ａ）９９％水／１％アセトニトリル（１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む）、ｐＨ＝８および（Ｂ）５％水／９５％アセトニトリル（１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む）、ｐＨ＝８とした。
【０２１１】
エベルニノマイシンアナログの構造分析
Ｅｖｅｒ−２の構造は、本明細書に記載されているＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍａｘトリプルステージ四重極質量分析計およびパラメータを使用して確認した。スキマーオフセット５Ｖで、２０Ｖ〜４０Ｖの衝突エネルギーをポジティブモードで使用し、Ｅｖｅｒ−２をフラグメント化した。エベルニノマイシンＨの構造は、ＮＭＲ分析によって決定した。エベルニノマイシンＨ、ＪおよびＫの構造は、１５Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＦＴＩＣＲを使用して決定した（図２１）。
【０２１２】
野生型Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）、ｅｖｄＮ１の遺伝子置換体（ΔｅｖｄＮ１：：ａａｃ（３）ＩＶ）、およびｅｖｄＮ１遺伝子置換体の遺伝的相補体（ΔｅｖｄＮ１：：ａａｃ（３）ＩＶ＿ＧＣ）のＬＣ／ＭＳ分析。エベルニノマイシンＤ〜Ｇおよび短縮エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートのクロマトグラムイオン強度：ネガティブモードｅｖｅｒ  Ｄ（１）、ｍ／ｚ＝１，５３４．５［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ  Ｅ（２）、ｍ／ｚ＝１，５０４．５［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ  Ｆ（３）、ｍ／ｚ＝１，５２０．５［Ｍ−Ｈ］−；およびｅｖｅｒ  Ｇ（４）、ｍ／ｚ＝１，５１８．５［Ｍ−Ｈ］−；コンジュゲート（６）１２６１．５［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ−２、ｍ／ｚ＝１３４７．５［Ｍ−Ｈ］−。ポジティブモード（実線）：ｅｖｅｒ  Ｄ、ｍ／ｚ＝１，５３６．５［Ｍ＋Ｈ］＋；ｅｖｅｒ  Ｅ、ｍ／ｚ＝１，５０６．５［Ｍ＋Ｈ］＋；ｅｖｅｒ  Ｆ、ｍ／ｚ＝１，５２２．５［Ｍ＋Ｈ］＋；およびｅｖｅｒ  Ｇ、ｍ／ｚ＝１，５２０．５［Ｍ＋Ｈ］＋；コンジュゲート１２６１．５［Ｍ＋Ｈ］＋；ｅｖｅｒ−２（５）、ｍ／ｚ＝１３４９．５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２１３】
野生型Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）、ｅｖｄＭ３の遺伝子置換体（ΔｅｖｄＭ３：：ａａｃ（３）ＩＶ）、およびｅｖｄＭ３遺伝子置換体の遺伝的相補体（Δｅｖｄ３：：ａａｃ（３）ＩＶ＿ＧＣ）のＬＣ／ＭＳ分析。エベルニノマイシンＤ〜Ｇおよび短縮エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートのクロマトグラムイオン強度：ネガティブモード（点線）：ｅｖｅｒ  Ｄ（１）、ｍ／ｚ＝１，５３４．５［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ  Ｅ（２）、ｍ／ｚ＝１，５０４．５［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ  Ｆ（３）、ｍ／ｚ＝１，５２０．５［Ｍ−Ｈ］−；およびｅｖｅｒ  Ｇ（４）、ｍ／ｚ＝１，５１８．５［Ｍ−Ｈ］−；コンジュゲート（６）１２６１．５［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ  Ｈ、ｍ／ｚ＝１５２１．５［Ｍ−Ｈ］−。ポジティブモード（実線）：ｅｖｅｒ  Ｄ、ｍ／ｚ＝１，５３６．５［Ｍ＋Ｈ］＋；ｅｖｅｒ  Ｅ、ｍ／ｚ＝１，５０６．５［Ｍ＋Ｈ］＋；ｅｖｅｒ  Ｆ、ｍ／ｚ＝１，５２２．５［Ｍ＋Ｈ］＋；およびｅｖｅｒ  Ｇ、ｍ／ｚ＝１，５２０．５［Ｍ＋Ｈ］＋；コンジュゲート１２６１．５［Ｍ＋Ｈ］＋；ｅｖｅｒ  Ｊ、ｍ／ｚ＝１４９４．５［Ｍ＋Ｈ］＋；ｅｖｅｒ  Ｋ、ｍ／ｚ＝１５０８．５［Ｍ＋Ｈ］＋；ｅｖｅｒ  Ｌ、ｍ／ｚ＝１５５５．５［Ｍ＋Ｈ２Ｏ］＋。
【０２１４】
野生型Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）、ｅｖｄＭ２の遺伝子置換体（ΔｅｖｄＭ２：：ａａｃ（３）ＩＶ）、およびｅｖｄＭ３遺伝子置換体の遺伝的相補体（ΔｅｖｄＭ２：：ａａｃ（３）ＩＶ＿ＧＣ）のＬＣ／ＭＳ分析、ならびに短縮エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートの構造。エベルニノマイシンＤ〜Ｇおよび短縮エベルニノマイシン−ロサラマイシンコンジュゲートのクロマトグラムイオン強度：ネガティブモード（点線）：ｅｖｅｒ  Ｄ（１）、ｍ／ｚ＝１，５３４．５［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ  Ｅ（２）、ｍ／ｚ＝１，５０４．５［Ｍ−Ｈ］−；ｅｖｅｒ  Ｆ（３）、ｍ／ｚ＝１，５２０．５［Ｍ−Ｈ］−；およびｅｖｅｒ  Ｇ（４）、ｍ／ｚ＝１，５１８．５［Ｍ−Ｈ］−；コンジュゲート（６）、ｍ／ｚ＝１２６１．５［Ｍ−Ｈ］−。ポジティブモード（実線）：ｅｖｅｒ  Ｄ、ｍ／ｚ＝１，５３６．５［Ｍ＋Ｈ］＋；ｅｖｅｒ  Ｅ、ｍ／ｚ＝１，５０６．５［Ｍ＋Ｈ］＋；ｅｖｅｒ  Ｆ、ｍ／ｚ＝１，５２２．５［Ｍ＋Ｈ］＋；およびｅｖｅｒ  Ｇ、ｍ／ｚ＝１，５２０．５［Ｍ＋Ｈ］＋；コンジュゲート１２６１．５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２１５】
系統発生解析
近隣結合統計学的方法を使用するＭＥＧＡ５により、公知のオルトソマイシン経路および関連オキシダーゼのそれぞれに由来するオキシゲナーゼの配列を解析した。系統学試験は、１０００回の反復による、ブートストラップ方法とした。
【０２１６】
遺伝子置換変異体の構築および解析
遺伝子ｅｖｄＯ１、ｅｖｄＯ２およびｅｖｄＭＯ１は、本明細書において詳細に記載されている、ＰＣＲ標的ストレプトマイセス属（Streptomyces）遺伝子置換戦略を修正したものを使用して、Ｍ．カルボナセア変種アウランティアカ（M. carbonacea var aurantiaca）において、個々に消去した。ａａｃ（３）ＩＶ耐性マーカー、ｏｒｉＴおよびフリッパーゼリコンビナーゼ標的（ＦＲＴ）領域を含有する遺伝子置換カセットは、ｅｖｄＯ１遺伝子置換の場合、プライマーＥｖｄＯ１−Ｒｅｄ−ＦおよびＥｖｄＯ１−Ｒｅｄ−Ｒを使用して、ｅｖｄＯ２遺伝子置換の場合、ＥｖｄＯ２−Ｒｅｄ−ＦおよびＥｖｄＯ２−Ｒｅｄ−Ｒを使用して、ｅｖｄＭＯ１遺伝子置換の場合、ＥｖｄＭＯ１−Ｒｅｄ−ＦおよびＥｖｄＭＯ１−Ｒｅｄ−Ｒを使用する、ＰＣＲにより増幅した（プライマー配列は、表２に見いだされる）。次に、ＰＣＲ産物を、電気穿孔法によって、コスミドＣＡを含有する、アラビノース誘発株大腸菌（E. coli）ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０に直接、形質転換し、ここで、λ  Ｒｅｄ媒介性の相同組換えにより、ｅｖｄＯ１、ｅｖｄＯ２またはｅｖｄＭＯ１の遺伝子置換が可能になった。得られたコスミドは、電気穿孔法により、コスミドの接合移入に必要な遺伝子を含有するプラスミドｐＵＺ８００２を含有する、メチル化されていない大腸菌（E. coli）株ＥＴ１２５６７に形質転換した。大腸菌（E. coli）における遺伝子置換は、カナマイシン、アプラマイシンおよびクロラムフェニコールを含有する、液体ＬＢ培地中、３７℃で維持した。
【０２１７】
【表３】
2018536426.tif 000020
【０２１８】
Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）における遺伝子置換体の構築は、上記の遺伝子操作法を使用して、本明細書に記載されている通り実施した。３０℃で７〜９日間のインキュベート後、膜を取り除き、アプラマイシンを含有するＴＳＢプレート上に、コロニーで筋を付けた。二重交差変異体は、アプラマイシン耐性遺伝子を増幅する場合、プライマーＡｐｒ−ＦｏｒおよびＡｐｒ−Ｒｅｖを使用し、カナマイシン耐性遺伝子を増幅する場合、Ｎｅｏ−ＦｏｒおよびＮｅｏ−Ｒｅｖを使用する、カナマイシンおよびアプラマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ増幅によって同定した（プライマーの配列は、表２に見いだされる）。Ｍ.カルボナセア（M. carbonacea）における二重交差変異体は、サザンハイブリダイゼーションにより確認した。遺伝子特異的プローブは、対象とする遺伝子の上流で設計した（プライマー配列は、表２に見いだすことができる）。ｅｖｄＯ１プローブ（７８５ｂｐ）は、プライマーであるＥｖｄＯ１−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−ＦｏｒおよびＥｖｄＯ１−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｒｅｖを使用して増幅した。ｅｖｄＯ２プローブ（７１９ｂｐ）は、プライマーであるＥｖｄＯ２−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−ＦｏｒおよびＥｖｄＯ２−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｒｅｖを使用して増幅した。ｅｖｄＭＯ１プローブ（７９８ｂｐ）は、プライマーであるＥｖｄＭＯ１−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−ＦｏｒおよびＥｖｄＭＯ１−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｒｅｖを使用して増幅した。アプラマイシン耐性遺伝子にハイブリダイズしたアプラマイシンカセットプローブを設計した。アプラマイシンプローブ（８８４ｂｐ）は、プライマーであるＡｐｒ−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−ＦｏｒおよびＡｐｒ−Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｒｅｖを使用して増幅した。プローブはすべて、ＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ  ＩＩ（カタログ番号：１１５８５６１４９１０、Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ジゴケシゲニン（ＤＩＧ）で標識した。ハイブリダイゼーションおよび検出は、上述のＤＩＧ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔを使用して実施した。変異株によって産生されたエベルニノマイシンを産生し、上記の通り、ＨＰＬＣ／ＭＳによって分析した。
【０２１９】
オキシゲナーゼ置換体の遺伝的相補
遺伝的相補は、上記の通り実施した。ΔｅｖｄＯ１：：ａａｃ（３）ＩＶの相補の場合、ｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥ＋ｅｖｄＯ１を産生するための、ｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥのＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングしたｅｖｄＯ１を含む追加のプラスミドを、Ｍｕｔａｇｅｎｅｘから注文した。ΔｅｖｄＯＭ１：：ａａｃ（３）ＩＶの相補の場合、ＥｖｄＭＯ１は、プライマーＥｖｄＭＯ１−ＧＣ−ＦｏｒおよびＥｖｄＭＯ１−ＧＣ−Ｒｅｖを使用するＰＣＲにより増幅した（配列は、表２に見いだすことができる）。続いて、ＰＣＲ産物を、ｐＳＥＴ１５２ｅｒｍＥのＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。
【０２２０】
タンパク質発現および精製
遺伝子はすべて、合成し（ＥｖｄＯ１およびＥｖｄＯ２の場合、Ｍｒ.Ｇｅｎｅ、ＡｖｉＯ１の場合、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＨｙｇＸの場合ＧｅｎｅＡｒｔ）、ｐＥＴ２８ａ（＋）（ＥｖｄＯ１、ＥｖｄＯ２、ＨｙｇＸ）またはｐＥＴ２３（ＡｖｉＯ１）のどちらか一方にサブクローニングした。得られたベクターは、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。温度が１８℃まで低下する時、ＯＤ６００が０．４になるまで、培養物をＬＢ（４０μｇ／ｍＬカナマイシン）中、３７℃で、振とうしながら成長させた。４５分後に、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することによって、ＯＤ６００が０．６〜０．９となり、タンパク質発現が誘発された。低温で、１６時間、培養物を継続して振とうし、次に、５，０００×ｇで１５分間、遠心分離することによって収穫し、−２０℃で保管した。細胞ペレットを解凍し、培養物１リットルあたり１５ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール；ｐＨ８．０）に再懸濁し、一錠の完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤混合物の錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を補給した。音波照射によって試料を溶解した。細胞の溶解後、精製工程のすべてを４℃で行った。粗製溶解物を４０，０００×ｇで１時間、遠心分離によって濁りをなくした。この上澄み液を溶解緩衝液で平衡にしたＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に通した。次に、このカラムを２０ｍＭイミダゾールを含有する溶解緩衝液で洗浄した。２５０ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液を使用してタンパク質を溶出し、溶解緩衝液で１：１に直ちに希釈した。この試料を透析して、保存用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）にした。Ｆｅ２＋を取り込ませるため、ＨｙｇＸを０．５ｍＭ  ＥＤＴＡと共にまず１時間、インキュベートして、いかなるＮｉ２＋も除去し、次に、ＰＢＳに対して広範囲に透析した。次に、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、この試料の緩衝液交換を行い、５０ｍＭ  Ｍｏｐｓ（ｐＨ７．０）とした。（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２を加えて１ｍＭの最終濃度にして、３０分間、インキュベートした。次に、この試料をＰＤ−１０カラムに通し、過剰の鉄を除去した。ＨｙｇＸ−Ｆｅを１２ｍｇ／ｍＬまで濃縮して、すばやく凍結し、−８０℃で保管した。ヒスチジンタグをＥｖｄＯ２およびＡｖｉＯ１から除去した後、結晶化させた。トロンビン（２０Ｕ）を加え、４℃で一晩、インキュベートし、Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグを除去した。開裂したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムに通し、未処理試料を分離して、フロースルーを採集した。保存用緩衝液で平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬカラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって、試料をさらに精製した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥを使用してフラクションを分析し、プールして、１８ｍｇ／ｍＬ（ＥｖｄＯ１）、６ｍｇ／ｍＬ（ＥｖｄＯ２）、１６ｍｇ／ｍＬ（ＡｖｉＯ１）または１６ｍｇ／ｍＬ（ＨｙｇＸ）まで濃縮した。タンパク質は、すばやく凍結させて、一定分量で−８０℃で保管した。
【０２２１】
トリプトファン蛍光消光アッセイ
ＨｙｇＸに結合するハイグロマイシンＢのＫｄは、ハイグロマイシンＢの結合時のＨｙｇＸの単一トリプトファン残基からの内部蛍光の消失をモニタリングすることにより決定した。Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｖａｒｉａｎ蛍光分光計を使用し、発光および励起スリットはどちらも、１０ｎｍに設定し、検出器の電圧は８００Ｖに設定して、試料蛍光を２０℃で測定した。発光波長は、２８０ｎｍに設定し、採集したスペクトルは、３００〜４００ｎｍであり、結合アフィニティーの算出には３５０ｎｍを使用した。各試料は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５ｍＭ  ＡＫＧおよび０．０５ｍＭ  ＮｉＣｌ２中の０．５μＭ  ＨｙｇＸを９９０μＬ含有し、これを次に、様々な濃度のハイグロマイシンＢ（上記の緩衝中で希釈）１０μＬと混合した。スペクトルは、三連で測定し、実験は３回、繰り返した。より濃度がより高いハイグロマイシンＢは、３００〜４００ｎｍの間のバックグラウンド蛍光を有するので、この実験は緩衝液だけを使用して繰り返し、ＨｙｇＸが存在する状態で採取した測定値から減算した。ハイグロマイシンＢ濃度を変えることに起因する蛍光変化をハイグロマイシンＢの濃度に対してプロットし、カレイダグラフバージョン４．０を使用する、単一結合部位モデルに当てはめた。
【０２２２】
結晶化
結晶は、等しい比のタンパク質とレザーバー溶液を含有する液滴３μＬ中、室温で、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して成長させた。ＥｖｄＯ１（保存用緩衝液および０．４ｍＭ  ＮｉＣｌ２中、１８ｍｇ／ｍＬ）の結晶は、１００ｍＭクエン酸三ナトリウム（ｐＨ５．１）および１３％（重量／重量）ＰＥＧ８０００のレザーバー溶液で３日後に現れた。ＥｖｄＯ２（保存用緩衝液中、６ｍｇ／ｍＬ）は、１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）、３８％（重量／重量）ＰＥＧ８０００および２５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で結晶化した。使用したＥｖｄＯ２−ＡＫＧの共結晶は、新しく調製した１００ｍＭイミダゾール中の２００ｍＭ  ＡＫＧ（ｐＨ８．０）で浸漬した、ＥｖｄＯ２結晶を完全に形成した。ＡｖｉＯ１（保存用緩衝液中、１６ｍｇ／ｍＬ）は、１００ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１０．５）、１．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．８Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４および２００ｍＭ  Ｌｉ２ＳＯ４中で結晶化した。ＨｙｇＸ（保存用緩衝液中、１６ｍｇ／ｍＬ）は、１００ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１２％（重量／重量）ＰＥＧ８０００から結晶化した。ＨｙｇＸ−ＡＫＧ結晶は、ＨｙｇＸ（保存用緩衝液中、１６ｍｇ／ｍＬ）を３ｍＭ  ＡＫＧと３０分間、インキュベートすることにより成長させた後、液滴を設定した。結晶化条件は、５０ｍＭ  ＣｓＣｌ、１００ｍＭ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．５）および３０％（重量／重量）Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  Ｍ−６００からなった。ＨｙｇＸ−ＡＫＧ−ハイグロマイシンＢ結晶は、１００ｍＭ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．３）および１８％（重量／重量）ＰＥＧ２００００を含有するレザーバーを使用して、ＨｙｇＸ（保存用緩衝液および１ｍＭ  ＮｉＣｌ２、３ｍＭ  ＡＫＧおよび５ｍＭハイグロマイシンＢ中、１６ｍｇ／ｍＬ）から成長させた。０．６Ｍコハク酸（ｐＨ約７）中でＨｙｇＸ−Ｆｅは結晶化した。Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  Ｍ−６００から成長したものを除くすべての結晶を、凍結防止剤を含有するレザーバー溶液の人工母液を作製して、結晶を１分間、浸漬した後、液体窒素に入れることにより凍結冷却することによって凍結保護した。ＥｖｄＯ１およびＡｖｉＯ１の場合、結晶化条件は、２０％の５０／５０（体積／体積）グリセロール／エチレングリコールミックスを補給した。ＥｖｄＯ２およびＨｙｇＸの場合、結晶化条件は、１７％（体積／体積）エチレングリコールを補給した。
【０２２３】
結晶データの収集、加工、構造決定および改良
回折データは、Ｍａｒ３００  ＣＣＤ検出器で、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ、ＩＬ）のＬＳ−ＣＡＴビームラインで採集した。データはすべて、プログラムのＨＫＬ２０００スイートを使用して加工し、スケール化した。ＥｖｄＯ１、ＡｖｉＯ１およびＨｙｇＸの構造は、１．４８４Åのウエッジで収集したデータを使用し、結合したニッケルイオンからの異常信号からの単波長異常分散法（ＳＡＤ）位相調整法により決定した。この波長は、ＸＦｌａｓｈ１００１ＳＤ検出器（Ｂｒｕｋｅｒ−ＡＸＳ）を使用する、ＦｅおよびＮｉ  Ｋ−エッジ周辺のＸ線蛍光スキャンを使用して実験により決定した。ＨｙｇＸ−Ｆｅ２＋データセットは、Ｘ線蛍光によりＦｅ２＋からの異常信号の最大化として特定した波長である、１．７３９Åで採集した。ニッケル−結合部位は、プログラムＨＫＬ２ＭＡＰおよびＳＨＥＬＸＣ／Ｄ／Ｅを使用して決定し、位相調整および密度修正するために、ＰＨＥＮＩＸのＡｕｔｏＳｏｌルーチンに入力した。ＥｖｄＯ２は、ＰＨＡＳＥＲによる分子置換を使用して決定した。ＥｖｄＯ２に対する探索モデルを開発するため、ヒトフィタノイル−ＣｏＡジオキシゲナーゼｐｈｙｈｄ１（ＰＤＢ  ＩＤコード３ＯＢＺ）を、１７  ２−ヒドロキシラーゼ（ＰＤＢ  ＩＤコード２Ａ１Ｘ）のヒトフィタノイル−ＣｏＡと構造的に一列にして、すべての非保存的二次構造、リガンドおよび水分子を除去した。ＥｖｄＯ２とＡＫＧおよびＨｙｇＸとハイグロマイシンＢの共構造は、リガンド未結合構造からの同形置換により決定した。構造はすべて、ＰＨＥＮＩＸのＡｕｔｏＢｕｉｌｄを使用して改善した。モデル構築は、ＣＮＳにおいて算出した、コンポジットオミットマップにより、ＣＯＯＴで行った。微調節は、ｐｈｅｎｉｘ.ｒｅｆｉｎｅを使用して行った。ＨｙｇＸ−ＡＫＧ−ハイグロマイシンＢの共構造は、４つのプロモーターのうちの２つにおいて、Ｎ末端に大きな障害を含む。厳密な拘束によるオミットマップおよびさらなる微調節を使用して、この構造の微調節の間にモデルの偏りを最小化した。重要なことに、１．６Åの解像構造に対して予測される質の明確な電子密度が、２つの鎖に対して観察され、これらは、コンピュータによるドッキングコントロールおよびすべての図に対して使用した鎖であった。
【０２２４】
ＤＣＥへの修飾に基づくアナログ
エベルニノマイシンの作用機序における、ジクロロイソエバニニック（ＤＣＥ）酸部分の重要性は、ウィルソンのグループからの研究により、最近、明確にされた（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 113:7527）。芳香族環Ａ１は、アルギニン残基とのスタッキングにより、リボソームタンパク質Ｌ１６と重要な相互作用を形成する。この位置におけるリボソームの変異により、完全なエベルニノマイシン耐性がもたらされる（Aarestrup, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000, 44:3425; Zarazaga, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2002, 46:3657; Adrian, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000, 44:732）。さらに、この位置で観察される変異は、エベルニノマイシン生合成遺伝子クラスターにおいて存在するｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼ（methyltranferase）によりコードされる耐性と関わりがない（Mosbacher, et al. J. Mol. Biol. 2003, 329:147; Weitnauer, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2001, 45:690）。したがって、ＤＣＥ環とＬ１６タンパク質との間の重要な相互作用は、耐性の出現を防止するために標的化するよう指向されたエベルニノマイシンを誘導化する機会をもたらすことができる。エベルニノマイシンアナログを合成により得るのが困難であるので、細菌機構を使用して、新規なエベルニノマイシン代謝産物を作製することができる。これは、第１に、ＤＣＥ部分の生合成の一層詳細な理解を必要とする。ＤＣＥ生合成に関連すると推定されている４種の遺伝子には、アシルトランスフェラーゼ（ｅｖｄＤ１）、繰り返し型のＩ型ポリケチドシンターゼ（ｅｖｄＤ３）、フラビン依存性ハロゲナーゼ（ｅｖｄＤ２）およびＯ−メチルトランスフェラーゼ（ｅｖｄＭ５）が含まれる。これらの４種のＤＣＥ遺伝子の機能的な解析は、多孔性バクテリアコンジュゲート法と組み合わせた、ラムダ−ＲＥＤ法を使用する標的遺伝子置換により行った。対象の遺伝子を、産生生物である、ミクロモノスポラ・カルボナセア変種アウランティアカ（Micromonaspora carbonacea var. aurantiaca）において、アプラマイシン耐性カセットに置き換えた。変異株抽出物の解析により、いくつかの新規なエベルニノマイシン代謝産物、およびエベルニノマイシン生合成の一層完全な理解が本発明者らにもたらされた。
【０２２５】
ｏ−メチルトランスフェラーゼ変異株ΔｅｖｄＭ５：：ａａｃ（３）ＩＶの抽出物は、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）により評価した。変異株は、野生型エベルニノマイシンＤ〜Ｇを産生しなかった。しかし、ΔｅｖｄＭ５：：ａａｃ（３）ＩＶ抽出物は、４種の新規なハロゲン化代謝産物を産生し、正確な質量は、１５２１．５、１４９１．５、１５０７．５および１５０５．５であった。これらの質量は、野生型エベルニノマイシンから正確に１４．０の違いがあり（Ｅｖｅｒ  Ｄ−１５３５．５；Ｅｖｅｒ  Ｅ−１５０５．５；Ｅｖｅｒ  Ｆ−１５２１．５；Ｅｖｅｒ  Ｇ−１５１９．５）、メチル基の喪失を示すものである（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。遺伝的欠失が、ＤＣＥ上のｏ−メチル基の喪失をもたらすことを確認するため、代謝産物をタンデム型ＬＣ／ＭＳによりさらに評価した。９つのフラグメント化（ＭＳ２）により、これらの新規な代謝産物の一層詳細な分析が可能となり、ＤＣＥ環からｏーメチル基が喪失していることを確認した（図２２Ｃ）。エベルニノマイシン構造の残りに変化はなかった。全体として、エベルニトロース糖のアミン基の酸化状態しか違いのない４種のデス−メチルエベルニノマイシン構造を同定した。ｏ−メチル基の喪失は、エベルニノマイシンの水溶解度を向上させることが予想され、これにより、そのインビボ薬物動態が改変することがある（Weitnauer, et al. Chem. Biol. 2004, 11:1403）。
【０２２６】
推定上のフラビン依存性ハロゲナーゼ（ｅｖｄＤ２）の、次の標的となる遺伝子欠失を解析した。ｏ−メチルトランスフェラーゼの欠失に起因する結果を考慮すると、ハロゲナーゼの欠失により、ＤＣＥ環から２個の塩素がない４種のエベルニノマイシン代謝産物が産生するが、そうでない場合、八糖類骨格を保持するという仮説を立てた。予想通り、ΔｅｖｄＤ２：：ａａｃ（３）ＩＶ抽出物のＬＣ／ＭＳ評価により、野生型エベルニノマイシンの産生が完全に失われることが示された。しかし、予想される代謝産物も存在しなかった。代わりに、正確な質量である１２５２．３および１２６６．３を有する、２つの明らかにハロゲン化されていない代謝産物が観察された（図２３Ａおよび２３Ｂ）。既に記載されているタンデム型ＬＣ／ＭＳによって、これらの代謝産物をさらに評価した。これにより、代謝産物は、ＤＣＥ部分上に２個の塩素およびメチル基のない、エベルニノマイシン関連分子であることが明らかになった。さらに、これらの代謝産物はまた、全部のエベルニトロース糖（環Ａ）を欠くように思われた。これらの代謝産物を、エベルニノマイシンＲ（質量１２５２．３）およびエベルニノマイシンＳ（質量１２６６．３）として表した。Ｅｖｅｒ  ＲとＥｖｅｒ  Ｓとの間の１４．０という質量差は、２種の代謝産物間でメチル基の差異があることを示した。フラグメント化データにより、さらなるメチル基が、２，６−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノース（環Ｆ）上に位置している可能性が最も高いことが示された。以前の機能解析および遺伝の相同性比較を本発明者らの実験室で行い、エベルニノマイシン生合成経路における、９種のメチルトランスフェラーゼのすべてが帰属可能になった。この研究の再調査により、環ＦのＣ−６ヒドロキシルにおいてメチル化を担う、ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ｅｖｄＭ７）をコードする遺伝子は、欠失したハロゲナーゼ遺伝子の直後の下流にあることが示されている。したがって、ハロゲナーゼが欠失すると、極性作用により、ｏ−メチルトランスフェラーゼｅｖｄＭ７の機能喪失をもたらす可能性が高い。
【０２２７】
推定上のアシルトランスフェラーゼ（ｅｖｄＤ１）およびその繰り返し型のＩ型ポリケチドシンターゼ（ｅｖｄＤ３）も欠失して、ＤＣＥの生合成におけるそれらの役割を確認した。これらの遺伝子のどちらか一方が欠失すると、ＤＣＥ環を完全に欠くエベルニノマイシンアナログをもたらすことが予測された。しかし、フラビン依存性ハロゲナーゼ（ｅｖｄＤ２）の欠失からの結果に基づくと、ＤＣＥ環の存在に明白な依存性があるので、いずれの新しい代謝産物も、エベルニトロース糖をやはり欠く可能性があるという仮説をやはり立てた。変異株ΔｅｖｄＤ１：：ａａｃ（３）ＩＶとΔｅｖｄＤ３：：ａａｃ（３）ＩＶのどちらからの抽出物も、野生型エベルニノマイシン産生の完全喪失を示した。正確な質量が１１１６．４を有する単一の新規な代謝産物が、両方の変異株の抽出物中、同じ溶出時間で観察された。タンデム型ＭＳからのフラグメントパターンにより、代謝産物は、ジクロロイソエバニニック酸（環Ａ１）およびエベルニトロース糖（環Ａ）のないエベルニノマイシン短絡産物（shunt product）であることが確認された。この代謝産物は、エベルニノマイシンＱと名付けた（図２４Ａおよび２４Ｂ）。エベルニトロースの喪失により、グリコシルトランスフェラーゼによるエベルニトロースのｄ−オリボース（環Ｂ）への結合は、十分に精巧に産生されたＤＣＥ構成成分の存在に依存することが示される。
【０２２８】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態により、範囲が限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な修正が、上述の説明および添付の図から、当業者には明らかになろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内に収まることが意図されている。
【図１】
2018536426.tif 000031
【図２】
2018536426.tif 000032
【図３】
2018536426.tif 000033
【図４】
2018536426.tif 000034
【図５】
2018536426.tif 000035
【図６】
2018536426.tif 000036
【図７】
2018536426.tif 000037
【図８】
2018536426.tif 000038
【図９】
2018536426.tif 000039
【図１０−１】
2018536426.tif 000040
【図１０−２】
2018536426.tif 000041
【図１０−３】
2018536426.tif 000042
【図１１−１】
2018536426.tif 000043
【図１１−２】
2018536426.tif 000044
【図１１−３】
2018536426.tif 000045
【図１２−１】
2018536426.tif 000046
【図１２−２】
2018536426.tif 000047
【図１２−３】
2018536426.tif 000048
【図１３】
2018536426.tif 000049
【図１４】
2018536426.tif 000050
【図１５】
2018536426.tif 000051
【図１６】
2018536426.tif 000052
【図１７】
2018536426.tif 000053
【図１８】
2018536426.tif 000054
【図１９−１】
2018536426.tif 000055
【図１９−２】
2018536426.tif 000056
【図２０−１】
2018536426.tif 000057
【図２０−２】
2018536426.tif 000058
【図２０−３】
2018536426.tif 000059
【図２１−１】
2018536426.tif 000060
【図２１−２】
2018536426.tif 000061
【図２１−３】
2018536426.tif 000062
【図２２−１】
2018536426.tif 000063
【図２２−２】
2018536426.tif 000064
【図２３】
2018536426.tif 000065
【図２４】
2018536426.tif 000066
【配列表】
2018536426000001.app
【国際調査報告】
2018536426.tif 000067
2018536426.tif 000068
2018536426.tif 000069