(57)【要約】本開示は、免疫チェックポイントPD-1およびLAG-3の両方に特異的であることで、耐久性のある抗腫瘍応答または抗感染応答を生じさせるのに役立ちうる、融合ポリペプチドを提供する。そのような融合ポリペプチドは、多くの薬学的応用において、例えばさまざまな腫瘍などのヒト疾患を処置もしくは予防するための抗がん剤および/もしくは免疫調節物質として、または抗感染剤として使用することができる。本開示は、本明細書に記載する融合ポリペプチドの作製方法、ならびにそのような融合ポリペプチドを含む組成物にも関する。さらに本開示は、そのような融合ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにそのような融合ポリペプチドおよび核酸分子を作製するための方法に関する。加えて、本願は、そのような融合ポリペプチドの、およびそのような融合ポリペプチドのうちの1つまたは複数を含む組成物の、治療的および/または診断的使用を開示する。2018526989.tif 000046
2018526989.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つのサブユニットを任意の順序で含み、第1のサブユニットはPD-1に特異的であり、第2のサブユニットはLAG-3に特異的である、PD-1およびLAG-3の両方に結合する能力を有する融合ポリペプチド。
【請求項２】
第1のサブユニットが、PD-1に対する結合特異性を有する完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合性ドメインを含み、第2のサブユニットが、LAG-3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
最大でも約1nMのEC50値でPD-1に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
最大でも約0.3nMのEC50値でPD-1に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記融合ポリペプチドに含まれるPD-1に特異的な抗体のEC50値と少なくとも同程度か、それより優れたEC50値でPD-1に結合することができる、請求項2記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記融合ポリペプチドに含まれるPD-1に特異的な抗体のEC50値より低いEC50でPD-1に結合することができる、請求項2記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
最大でも約2nMのEC50値でLAG-3に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
最大でも約1nMのEC50値でLAG-3に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドに含まれるLAG-3に特異的なリポカリンムテインのEC50値と同等か、それより低いEC50値でLAG-3に結合することができる、請求項2記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
PD-1およびLAG-3に同時に結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
最大でも約10nMのEC50値でPD-1およびLAG-3に同時に結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
最大でも約0.6nMのEC50値でPD-1およびLAG-3に同時に結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
EC50値が、本質的に実施例2、3または5に記載されるように酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって決定される、請求項1〜12のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIIへのLAG-3の結合を競合的に阻害する、請求項1〜13のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIIへのLAG-3の結合を競合的に阻害する融合ポリペプチドの能力が、本質的に実施例6に記載されるように蛍光活性化細胞選別（FACS）によって分析される、請求項14記載のリポカリンムテイン。
【請求項１６】
T細胞応答を共刺激する能力を有する、請求項1〜15のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
T細胞応答を共刺激する能力が、本質的に実施例7または8に記載される機能的T細胞活性化アッセイにおいて測定される、請求項16記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
T細胞の刺激の存在下でIL-2および/またはIFN-γの産生を誘導することができる、請求項1〜17のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
IL-2および/またはIFN-γの産生を誘導する能力が、本質的に実施例7または8に記載されるように機能的T細胞活性化または殺滅アッセイにおいて測定される、請求項18記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
第2のサブユニットが、ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の配列位置14、25〜34、36、48、52〜53、55〜58、60〜61、66、79、85〜86、101、104〜106、108、110〜112、114、121、140、および153に1つまたは複数の変異アミノ酸残基を含むLAG-3特異的リポカリンムテインである、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
第2のサブユニットが、ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）と比較して、以下のアミノ酸残基突然変異
2018526989.tif 000041
のうちの少なくとも1つを含むLAG-3特異的リポカリンムテインである、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
第2のサブユニットが、ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）と比較して、以下のアミノ酸残基突然変異の組
2018526989.tif 000042
2018526989.tif 000043
のうちの1つを含むLAG-3特異的リポカリンムテインである、請求項1〜21のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
LAG-3特異的リポカリンムテインが、SEQ ID NO:13〜28からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、該フラグメントまたは変異体は、請求項20〜22のいずれか一項に定義したアミノ酸残基を含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
LAG-3特異的リポカリンムテインが、SEQ ID NO:13〜28からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項1〜22のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
1つのサブユニットが、本質的に図1に記載されるようにリンカーを介して別のサブユニットに連結されている、請求項1〜24のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
ペプチド結合が、構造化されていない（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）3リンカー（SEQ ID NO:2）である、請求項25記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
第1のサブユニットがモノクローナル抗体である、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
モノクローナル抗体の重鎖の可変領域が、SEQ ID NO:59〜84、112〜117からなる群より選択され、モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域が、SEQ ID NO:85〜111、118〜123からなる群より選択される、請求項27記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
モノクローナル抗体の重鎖の可変領域が、SEQ ID NO:59〜84、112〜117からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有し、モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域が、SEQ ID NO:85〜111、118〜123からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項27記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
モノクローナル抗体が以下のCDR配列
2018526989.tif 000044
2018526989.tif 000045
を有する、請求項27記載の融合ポリペプチド。
【請求項３１】
モノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、PDR001、MEDI0680、ピディリズマブ、ENUM-388D4、およびENUM-244C8からなる群より選択される、請求項27記載の融合ポリペプチド。
【請求項３２】
モノクローナル抗体がIgG4バックボーンを有する、請求項27記載の融合ポリペプチド。
【請求項３３】
IgG4バックボーンが、S228P、N297A、F234AおよびL235Aからなる群より選択される突然変異のうちのいずれか1つを有する、請求項32記載の融合ポリペプチド。
【請求項３４】
モノクローナル抗体がIgG1バックボーンを有する、請求項27記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
IgG1バックボーンが、N297A、L234AおよびL235Aからなる群より選択される突然変異のうちのいずれか1つを有する、請求項34記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
SEQ ID NO:4および5に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:4および9に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:4および6に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:4および10に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:3および7に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:3および8に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:3および11に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:3および12に示すアミノ酸を含む、請求項1〜35のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項３７】
請求項1〜37のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項３８】
前記核酸分子の発現を可能にする制御配列に機能的に連結されている、請求項37記載の核酸分子。
【請求項３９】
ベクター中またはファージミドベクター中に含まれている、請求項37または38記載の核酸分子。
【請求項４０】
請求項37〜39のいずれか一項記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項４１】
請求項1〜36のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを生産する方法であって、ムテインをコードする核酸から出発して遺伝子工学的方法を使って融合ポリペプチドが生産される、方法。
【請求項４２】
前記融合ポリペプチドが、細菌または真核宿主生物中で生産され、この宿主生物またはその培養物から単離される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
免疫チェックポイントPD-1およびLAG-3を同時に阻害するための、請求項1〜36のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
【請求項４４】
抗腫瘍リンパ球細胞活性を増加させるための、請求項1〜36のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
【請求項４５】
免疫チェックポイントPD-1およびLAG-3を同時に阻害する方法であって、請求項1〜36のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
【請求項４６】
抗腫瘍リンパ球細胞活性を増加させる方法であって、請求項1〜36のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
【請求項４７】
対象における主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIIへのヒトLAG-3の結合を妨害する方法であって、請求項1〜36のいずれか一項記載の1つまたは複数の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
I. 背景
リンパ球活性化遺伝子-3、すなわちLAG-3（分化抗原群（cluster of differentiation）223、すなわちCD223としても公知である）は免疫グロブリンスーパーファミリーの膜タンパク質である。LAG-3は構造的にも遺伝子的にも分化抗原群4（CD4）と関連しており、それをコードする遺伝子は12番染色体の短腕の遠位部、CD4遺伝子の近くにあることから、LAG-3遺伝子は遺伝子重複によって進化した可能性が示唆される（Triebel et al., J Exp Med, 1990）。LAG-3は休止末梢血リンパ球上には発現しないが、活性化T細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞上に発現し（Triebel et al., J Exp Med, 1990）、活性化B細胞上（Kisielow et al., Eur J Immunol, 2005）および形質細胞様樹状細胞上（Workman et al., J Immunol, 2009）にも発現すると報告されている。
【０００２】
CD4と同様に、LAG-3も主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII分子に結合するが、CD4と比べて、その親和性は2倍高く、結合部位も異なる（Huard et al., Proc Natl Acad Sci, 1997）。LAG-3による樹状細胞上のMHCクラスIIエンゲージメントは、樹状細胞のサイトカインプロファイルおよびケモカインプロファイルの変化につながる（Buisson and Triebel, Vaccine, 2003）。さらに、LAG-3は、樹状細胞によるインターロイキン12（IL-12）およびTNF-α（tissue necrosis factor alpha）の産生、ならびに同種異系T細胞による増殖およびインターフェロンガンマ（IFN-γ）応答を刺激する樹状細胞の能力の増加によって証明されるとおり、樹状細胞の成熟を引き起こすことが報告されている（Andreae et al., J Immunol, 2002）。LAG-3シグナリングおよびMHCクラスIIクロスリンキングは、ヒト分化抗原群4陽性（CD4＋）T細胞および分化抗原群8陽性（CD8＋）T細胞の一次活性化における初期事象を阻害すると報告されている（Macon-Lemaitre and Triebel, Immunology, 2005）。LAG-3はT細胞の細胞増殖、活性化およびホメオスタシスを負に制御する。
【０００３】
細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）およびプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）と同様に、LAG-3は阻害性免疫受容体である。T細胞応答の負の制御物質としてのLAG-3の大きな役割は、特にPD-1との関連において、ノックアウトマウスと標的特異的抗体の両方に基づく研究で、あざやかに証明されている（Woo et al., Cancer Res, 2012）。その研究では、二重抗LAG-3/抗PD-1抗体処置により、単一抗体処置にはほとんど抵抗性であった定着腫瘍を持つマウスの大半が治癒した。さらに、LAG-3/PD-1二重ノックアウトマウスは、複数の移植可能な腫瘍からの生残およびそれらのクリアランスに、著しい増加を示した。阻害性免疫チェックポイントとしての、PD-1とLAG-3との強力な協同的役割については、二重ノックアウトマウスが致死的な自己炎症を著しく起こしやすいという事実により、さらなる実験的裏づけが得られた。
【０００４】
プログラム細胞死タンパク質1、すなわちPD-1（分化抗原群279またはCD279としても公知である）は、分化抗原群28（CD28）遺伝子ファミリーのメンバーであり、活性化されたT細胞、B細胞および骨髄系列細胞上に発現する（Sharpe et al., Nat Immunol, 2007, Greenwald et al., Annu Rev Immunol, 2005）。PD-1は、プログラム細胞死1リガンド1（PD-L1）およびプログラム細胞死1リガンド2（PD-L2）の2種類のリガンドと相互作用する。これらのリガンドとPD-1との相互作用は、過度に活性なT細胞を局所的に制限することによる免疫系のダウンレギュレーションに重要な役割を果たし、それが結果として自己免疫を予防し、正常組織における感染中または炎症中の末梢性寛容を維持する。
【０００５】
PD-1はT細胞活性化を負に調節し、T細胞活性化に対するPD-1の阻害機能は、その細胞質ドメインの免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ITIM）に関連づけられる（Greenwald et al., Annu Rev Immunol, 2005、Parry et al., Mol Cell Biol, 2005）。PD-1のこの阻害機能の破壊は自己免疫につながりうる。一方、PD-1による持続的な負のシグナルは、慢性ウイルス感染および腫瘍免疫回避などといった多くの病的状況におけるT細胞機能障害に関係づけられている。
【０００６】
多くのがんでは、宿主抗腫瘍免疫に関連して、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）がPD-1を発現する（Galon et al., Science, 2006）。TILがPD-1阻害制御を受け、抗腫瘍免疫がPD-1/PD-L1シグナリングによって調節されることは、複数系統の証拠が示している。第一に、PD-L1の発現は多くのヒト腫瘍株およびマウス腫瘍株において確認され、その発現はIFN-γによりインビトロでさらにアップレギュレートされうる（Dong et al., Nat Med, 2002）。第二に、腫瘍細胞によるPD-L1の発現は、インビトロで、抗腫瘍T細胞による溶解に対するそれらの耐性と直接関連づけられている（Dong et al., Nat Med, 2002、Blank et al., Cancer Res, 2004）。第三に、PD-1ノックアウトマウスは腫瘍チャレンジに対して耐性であり（Iwai et al., Int Immunol, 2005）、PD-1ノックアウトマウスからのT細胞は、腫瘍保持マウスに養子移入した場合に、腫瘍拒絶に著しく有効である（Blank et al., Cancer Res, 2004）。第四に、モノクローナル抗体によってPD-1阻害シグナルを遮断することは、マウスにおいて宿主抗腫瘍免疫を増強することができる（Iwai et al., Int Immunol, 2005、Hirano et al., Cancer Res, 2005）。第五に、腫瘍における高度のPD-L1発現（免疫組織化学的染色によって検出）は、多くのヒトがんタイプで、予後不良と関連する（Hamanishi et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2007）。
【０００７】
したがって、T細胞、NK細胞、B細胞、および形質細胞様樹状細胞などのLAG-3＋リンパ球の応答を調節することができ、同時にそのようなリンパ球からPD-1阻害制御を取り除くことができる新しい化合物が必要とされている。そのような組み合わせは、がん、臓器移植拒絶の処置もしくは予防、または自己免疫疾患もしくは自己炎症性疾患の処置において、重要な用途を有しうる。これに関連して、本開示は、LAG-3およびPD-1の両方に結合し、それによって免疫応答を調節する、一群の新規タンパク質を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
II. 定義
以下の一覧では、本明細書の全体を通して使用される用語、語句、および略号を定義する。本明細書に列挙して定義する用語はいずれも、すべての文法形式を包含するものとする。
【０００９】
本明細書において使用される場合、別段の指定がある場合を除き、「LAG-3」はヒトLAG-3（huLAG-3）を意味し、ヒトLAG-3の変異体（variant）、アイソフォームおよび種ホモログを包含する。LAG-3は、「リンパ球活性化遺伝子3」、「分化抗原群223」または「CD223」としても公知であり、これらは相互可換的に使用される。ヒトLAG-3は、UniProt P18627（2009年7月7日付けバージョン5）によって規定される完全長タンパク質、そのフラグメント、またはその変異体を意味する。ヒトLAG-3はLAG3遺伝子によってコードされる。
【００１０】
本明細書において使用される場合、別段の指定がある場合を除き、「PD-1」は、ヒトPD-1（huPD-1）を意味し、ヒトPD-1の変異体、アイソフォームおよび種ホモログを包含する。PD-1は、「プログラム細胞死タンパク質1」、「分化抗原群279」または「CD279」としても公知であり、これらは相互可換的に使用される。ヒトPD-1は、UniProt Q15116によって規定される完全長タンパク質、そのフラグメント、またはその変異体を意味する。ヒトPD-1はPDCD1遺伝子によってコードされる。
【００１１】
本明細書において、「検出可能な親和性」とは、通常はKdまたはEC50を尺度として、最大でも約10-5Mまたはそれ以下の親和性定数で、選択された標的に結合する能力を意味する（低いKd値またはEC50値ほど、高い結合活性を表す）。ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）などの一般的方法では測定することができない、より低い親和性は、あまり重要ではない。
【００１２】
本明細書において、1つまたは複数の選択された標的（本件の場合はLAG-3および/またはPD-1）に対する本開示のタンパク質（例えばリポカリンムテインもしくは抗体）またはその融合ポリペプチドの「結合親和性」は、当業者に公知の数多くの方法によって測定することができる（そして、それによりムテイン-リガンド複合体のKd値が決定される）。そのような方法には、蛍光滴定、競合ELISA、等温滴定熱量測定（ITC）などの熱量測定法、および表面プラズモン共鳴（SPR）などがあるが、それらに限定されるわけではない。そのような方法は当技術分野において確立されており、その例を以下にも詳述する。
【００１３】
また、それぞれの結合物質とそのリガンドとの間の複合体形成は、それぞれの結合パートナーの濃度、競合物質の存在、使用する緩衝系のpHおよびイオン強度、ならびに解離定数Kdの決定に使用される実験方法（例えば蛍光滴定、競合ELISAまたは表面プラズモン共鳴であるが、これらはほんのいくつかの例にすぎない）、さらには実験データの評価に使用される数学的アルゴリズムなどといった、多種多様な因子の影響を受けることにも注意されたい。
【００１４】
それゆえに、所与のリガンドに対する特定のリポカリンムテインの親和性を決定するために使用される方法および実験装置に依存して、Kd値（それぞれの結合物質とその標的/リガンドとの間に形成される複合体の解離定数）が一定の実験範囲内で変動しうることは、当業者にとっては明らかである。これは、例えばそのKd値が表面プラズモン共鳴（SPR）で決定されたか、競合ELISAで決定されたか、直接ELISAで決定されたか、または別の方法で決定されたかなどに依存して、計測されるKd値にはわずかな偏差、または許容誤差範囲が存在しうることを意味する。
【００１５】
本明細書にいう「ムテイン」、「変異（mutated）」実体（entity）（タンパク質であるか核酸であるかを問わない）、または「突然変異体（mutant）」とは、天然（野生型）の核酸またはタンパク質「リファレンス」スキャフォールドと比較した、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または挿入を指す。この用語は、本明細書に記載するムテインおよび変異体のフラグメントも包含する。本開示のリポカリンムテイン、そのフラグメントまたは変異体は、好ましくは、本明細書に記載するようにLAG-3に結合する機能を有する。
【００１６】
本開示のムテインに関連して本明細書において使用する用語「フラグメント」は、N末および/またはC末が短縮された、すなわち少なくとも1つのN末および/またはC末アミノ酸を欠く、完全長成熟ヒト涙液リポカリン（hTlcまたはhTLPC）から誘導されるタンパク質またはペプチドに関する。そのようなフラグメントは、N末および/またはC末アミノ酸のうちの最大2個、最大3個、最大4個、最大5個、最大10個、最大15個、最大20個、最大25個、または最大30個（これらの間の数字をすべて含む）を欠きうる。具体例として、そのようなフラグメントは、4個のN末アミノ酸および2個のC末アミノ酸を欠きうる。フラグメントは、好ましくは、完全長涙液リポカリン（ムテイン）の機能的フラグメントであると理解され、これは、そのフラグメントが、好ましくは、そのフラグメントの元となった完全長涙液リポカリン（ムテイン）の結合ポケットを含むことを意味する。具体例として、そのような機能的フラグメントは、ネイティブ成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列の少なくともアミノ酸7〜153を含みうる。そのようなフラグメントは、成熟リポカリンの一次配列のうちの少なくとも10個またはそれ以上、例えば20個もしくは30個またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができ、通常は、成熟リポカリンのイムノアッセイで検出可能である。一般に、本開示のリポカリンムテインの、または本開示による組み合わせの、または本明細書に記載する融合タンパク質の、対応タンパク質リガンドであるLAG-3に関連して本明細書において使用する用語「フラグメント」は、N末および/またはC末が短縮されたタンパク質またはペプチドリガンドであって、本開示のムテインによって認識されかつ/または結合されるという完全長リガンドの能力を保っているものに関する。
【００１７】
本明細書において使用する用語「突然変異誘発」は、成熟リポカリンの所与の配列位置に本来存在するアミノ酸を、それぞれの天然ポリペプチド配列中のその特定位置には存在しない少なくとも1つのアミノ酸で置換することができるように、実験条件が選ばれることを意味する。「突然変異誘発」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入による配列セグメントの長さの（付加的）修飾も包含する。したがって、例えば、選ばれた配列位置にある1つのアミノ酸が、一続きになった3つのランダム突然変異で置き換えられて、野生型タンパク質のそれぞれのセグメントの長さと比較して2つのアミノ酸残基が挿入されたことになるのは、本開示の範囲内である。そのような挿入または欠失は、本開示において突然変異誘発の対象となりうるペプチドセグメントのいずれにおいても、互いに独立して導入されうる。本開示の例示的一態様では、数個の突然変異の挿入が、選ばれたリポカリンスキャフォールドのループAB中に導入されうる（国際特許出願公開第WO 2005/019256号参照。この特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００１８】
「ランダム突然変異誘発」という用語は、前もって決定された単一アミノ酸（突然変異）が一定の配列位置に存在するのではなくて、突然変異誘発中に所定の配列位置に少なくとも2種類のアミノ酸が一定の確率で組み込まれうることを意味する。
【００１９】
「同一性」とは、配列間の類似性または関係性を測る配列の一特性である。本開示において使用する「配列同一性」または「同一性」という用語は、本開示のポリペプチドの配列を問題の配列と（相同）アラインメントした後の、それら2つの配列のうちの長い方の残基数を基準とした、ペアごとの同一残基のパーセンテージを意味する。配列同一性は、同一アミノ酸残基の数を残基の総数で割り、その結果に100を掛けることによって測られる。
【００２０】
「相同性」という用語は、本明細書では、その通常の意味で使用され、本開示のポリペプチド（例えば本開示の任意のリポカリンムテイン）の直鎖アミノ酸配列において等価な位置にある同一アミノ酸ならびに保存的置換とみなされるアミノ酸（例えばアスパラギン酸残基によるグルタミン酸残基の交換）を包含する。
【００２１】
配列相同性または配列同一性のパーセンテージは、ここでは、例えばプログラムBLASTP、バージョンblastp 2.2.5（2002年11月16日; Altschul, et al., Nucl. Acids Res. 1997参照）を使って決定することができる。この態様において、相同性のパーセンテージは、プロペプチド配列を含む全ポリペプチド配列のアラインメントに基づき（行列: BLOSUM 62;ギャップコスト: 11.1;カットオフ値は10-3に設定）、好ましくは野生型タンパク質スキャフォールドを、ペアワイズ比較におけるリファレンスとして使用する。これは、アラインメントのためにプログラムが選択したアミノ酸の総数で割った、BLASTPプログラム出力に結果として示される「ポジティブ（positive）」（相同アミノ酸）の数のパーセンテージとして計算される。
【００２２】
具体的には、リポカリン（ムテイン）のアミノ酸配列のアミノ酸残基が、野生型リポカリンのアミノ酸中の一定の位置に対応するアミノ酸残基と異なるかどうかを決定するために、当業者は、例えば手作業によるアラインメント、またはBLAST2.0（Basic Local Alignment Search Toolの略）もしくはClustalWなどのコンピュータプログラム、または配列アラインメントを作成するのに適した他の任意の適切なプログラムを使ったアラインメントなど、当技術分野において周知の手段および方法を使用することができる。したがって、リポカリンの野生型配列が「対象配列」または「リファレンス配列」となることができるのに対して、本明細書に記載する野生型リポカリンとは異なるリポカリンのアミノ酸配列は「クエリー配列」となる。「野生型配列」、「リファレンス配列」および「対象配列」という用語は、本明細書では相互可換的に使用される。好ましいリポカリンの野生型配列は、SEQ ID NO:1に示すhTlcの配列である。
【００２３】
「ギャップ」とは、アミノ酸の付加または欠失の結果であるアラインメント中の空白をいう。したがって、厳密に同じ配列である2つのコピーは100％の同一性を有するが、それほど高度には保存されず欠失、付加、または置き換えを有する配列は、それより程度の低い配列同一性を有しうる。標準的なパラメータを使って配列同一性を決定するために、例えばBLAST（Altschul, et al., Nucleic Acids Res., 1997）、BLAST2（Altschul, et al., J. Mol. Biol., 1990）、およびSmith-Waterman（Smith and Waterman, J Mol Biol, 1981）など、いくつかのコンピュータプログラムが利用可能であることを、当業者は認識するであろう。
【００２４】
本開示において使用する用語「変異体」は、置換、欠失、挿入または化学修飾などによるアミノ酸配列の修飾を含む、タンパク質またはペプチドの誘導体に関する。そのような修飾は、いくつかの態様では、タンパク質またはペプチドの機能性を低減しない。そのような変異体には、1つまたは複数のアミノ酸が各々のD-立体異性体で置き換えられているか、20種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸、例えばオルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ノルバリンなどで置き換えられている、タンパク質が包含される。しかし、そのような置換は保存的であってもよく、すなわちアミノ酸残基は、化学的に類似するアミノ酸残基で置き換えられる。保存的置換の例は、以下のグループのメンバー間での置き換えである:1）アラニン、セリン、およびスレオニン; 2）アスパラギン酸およびグルタミン酸; 3）アスパラギンおよびグルタミン; 4）アルギニンおよびリジン; 5）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン;ならびに6）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。本開示のリポカリンムテインの、または本開示による組み合わせの、および/もしくは融合タンパク質の、対応タンパク質標的であるLAG-3および/またはPD-1に関連して本明細書において使用する用語「変異体」は、野生型LAG-3またはPD-1タンパク質、例えば本明細書に記載するとおりSwissProt/UniProtに登録されたLAG-3またはPD-1リファレンスタンパク質それぞれと比較して、1つまたは複数の、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80個またはそれ以上の、アミノ酸の置換、欠失および/または挿入を有する、LAG-3および/もしくはPD-1またはそのフラグメントそれぞれに関する。LAG-3またはPD-1変異体はそれぞれ、好ましくは、野生型ヒトLAG-3またはPD-1、例えば本明細書に記載するとおりSwissProt/UniProtに登録されたLAG-3またはPD-1リファレンスタンパク質に対して、少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％または95％のアミノ酸同一性を有する。
【００２５】
「ネイティブ配列」のリポカリンとは、自然から得られる対応ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するリポカリンを意味する。したがってネイティブ配列リポカリンは、任意の生物からの、特に哺乳動物からの、それぞれの天然リポカリンのアミノ酸配列を有することができる。そのようなネイティブ配列ポリペプチドは、自然から単離するか、組換え手段または合成手段によって生産することができる。「ネイティブ配列」ポリペプチドという用語は、リポカリンの天然切断型または天然分泌型、リポカリンの天然変異体型、例えば選択的スプライス型または天然対立遺伝子変異体を、特に包含する。ポリペプチド「変異体」とは、ネイティブ配列ポリペプチドに対して少なくとも約50％、60％、70％、80％または少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有する、生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、ポリペプチドのN末またはC末において1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されまたは欠失しているポリペプチドが含まれる。一般に変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドに対して、少なくとも約70％の、例えば少なくとも約80％、例えば少なくとも約85％の、アミノ酸配列同一性、例えば少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有する。具体例として、本開示のhTlcムテインでは、タンパク質の生物学的機能に影響を及ぼすことなく、N末の最初の4アミノ酸残基（His-His-Leu-Leu）およびC末の最後の2アミノ酸残基（Ser-Asp）を欠失させることができる。例えばSEQ ID NO:13〜28。
【００２６】
本開示において使用する場合、「位置」という用語は、本明細書に示すアミノ酸配列内でのアミノ酸の位置、または本明細書に示す核酸配列内でのヌクレオチドの位置を意味する。1つまたは複数のリポカリンムテインのアミノ酸配列位置との関連で本明細書において使用される「対応する」または「対応」という用語を理解するために、対応位置は、先行するヌクレオチド/アミノ酸の数だけでは決定されない。したがって、本開示によれば、置換されうる所与のアミノ酸の位置は、（突然変異体または野生型）リポカリン中の他のどこかにあるアミノ酸の欠失または付加ゆえに、変動しうる。同様に、本開示によれば、置換されうる所与のヌクレオチドの位置も、ムテインまたは野生型リポカリン5'-非翻訳領域（UTR）、例えばプロモーターおよび/または他の任意の制御配列もしくは制御遺伝子（エクソンおよびイントロンを含む）中の他のどこかにある欠失または追加ヌクレオチドゆえに、変動しうる。
【００２７】
このように、本開示による「対応位置」に関して、ヌクレオチド/アミノ酸の位置は、類似の隣接ヌクレオチド/アミノ酸とは、表示される数字の点で異なりうるが、交換、欠失または付加されうる該隣接ヌクレオチド/アミノ酸も、当該1つまたは複数の「対応位置」によって含まれると理解されることが好ましい。
【００２８】
加えて、本開示によるリファレンス配列に基づくリポカリンムテイン中の対応位置については、リポカリン間の高度に保存された全体的フォールディングパターンに照らして当業者には理解されるとおり、ヌクレオチド/アミノ酸の位置は、たとえそれらが表示される数字の点で異なっていたとしても、（突然変異体または野生型）リポカリン中の他のどこかにある位置と、構造的に対応すると理解されることが好ましい。
【００２９】
「アルブミン」という用語は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンまたはラット血清アルブミンなど、すべての哺乳動物アルブミンを包含する。
【００３０】
非天然標的に関して本明細書において使用する用語「有機分子」または「小有機分子」は、少なくとも2つの炭素原子を含むが、回転可能な炭素結合の数は好ましくは7または12を越えず、100〜2000ダルトン、好ましくは100〜1000ダルトンの範囲の分子量を有し、1つまたは2つの金属原子を含んでもよい有機分子を表す。
【００３１】
本明細書において使用する「検出する」、「検出」、「検出可能な」または「検出すること」という単語は、定量的レベルおよび定性的レベルの両方で、ならびにそれらの組み合わせで、理解される。したがってこれは、関心対象の分子の定量的、半定量的および定性的測定を包含する。
【００３２】
「対象」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。「哺乳動物」という用語は、本明細書では、哺乳動物に分類される任意の動物を指すために使用され、ヒト、家畜および農用動物、ならびに動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、ブタ、サル、例えばカニクイザルなどを含むが、ここでは具体例をいくつか挙げただけで、これらに限定されるわけではない。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。
【００３３】
「有効量」とは、有益な結果または所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は1回または複数回の投与で投与することができる。
【００３４】
「試料」は、任意の対象から採取された生物学的試料と定義される。生物学的試料には、血液、血清、尿、糞便、精液、または組織が包含されるが、それらに限定されるわけではない。
【００３５】
本明細書において開示する融合ポリペプチドの「サブユニット」は、ポリペプチドの一続きのアミノ酸であって、該ポリペプチドのユニークな機能単位を規定するもの、例えば標的に対する結合モチーフを与えるものとして定義される。
【００３６】
本明細書にいう「融合ポリペプチド」は、2つ以上のサブユニットを含み、それらサブユニットのうちの少なくとも1つはLAG-3に結合し、もう1つのサブユニットはPD-1に結合する。これらのサブユニットは、融合ポリペプチド内で、共有結合によって連結されていてもよく、非共有結合によって連結されていてもよい。好ましくは、融合ポリペプチドは、2つ以上のサブユニット間の翻訳融合物である。翻訳融合物は、あるサブユニットのコード配列をもう1つのサブユニットのコード配列と読み枠を合わせて遺伝子操作することによって作製しうる。両サブユニットの間には、リンカーをコードするヌクレオチド配列を介在させることができる。ただし、本開示の融合ポリペプチドのサブユニットは、化学リンカー（chemical linker）によって連結することもできる。
【００３７】
本開示の融合ポリペプチドに含まれうる「リンカー」は、本明細書に記載する融合ポリペプチドの2つ以上のサブユニットを連結する。連結は共有結合または非共有結合による連結であることができる。好ましい共有結合による連結は、アミノ酸間のペプチド結合など、ペプチド結合によるものである。したがって好ましい一態様において、該リンカーは、1つまたは複数のアミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上のアミノ酸を含む。好ましいリンカーは本明細書に記載する。他の好ましいリンカーは化学リンカーである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
III. 図面の説明
【図１ａ】図1は、PD-1およびLAG-3標的に対して二重特異性であるか、LAG-3に対して単一特異性である、本願に記載する代表的融合ポリペプチドの設計の概略を示す図である。図1a〜eの代表的二重特異性融合ポリペプチドは、PD-1に特異的な抗体（例えばSEQ ID NO:3および4の抗体）と、LAG-3に特異的な1つまたは複数のリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテイン）とに基づいて作製された。図に記載するPD-1特異的抗体の重鎖または軽鎖のどちらか一方のC末またはN末のどちらか一方にリポカリンムテインを遺伝子融合することで、SEQ ID NO:5および4、SEQ ID NO:9および4の融合ポリペプチドとした。図1a〜eは、PD-1に特異的な別の抗体（例えばSEQ ID NO:47および48の抗体）と、LAG-3に特異的な1つまたは複数のリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテイン）とを使って作製することができる、さらなる代表的融合ポリペプチドも示している。図1に示すように、PD-1特異的抗体の重鎖または軽鎖のどちらか一方のC末またはN末のどちらか一方にリポカリンムテインを遺伝子融合することで、SEQ ID NO:51および48、SEQ ID NO:55および48の融合ポリペプチドを得た。
【図１ｂ】図に記載するPD-1特異的抗体の重鎖または軽鎖のどちらか一方のC末またはN末のどちらか一方にリポカリンムテインを遺伝子融合することで、SEQ ID NO:6および4、SEQ ID NO:10および4の融合ポリペプチドとした。図に示すPD-1特異的抗体の重鎖または軽鎖のどちらか一方のC末またはN末のどちらか一方にリポカリンムテインを遺伝子融合することで、SEQ ID NO:52および48、SEQ ID NO:56および48の融合ポリペプチドを得た。
【図１ｃ】図に記載するPD-1特異的抗体の重鎖または軽鎖のどちらか一方のC末またはN末のどちらか一方にリポカリンムテインを遺伝子融合することで、SEQ ID NO:3および7、SEQ ID NO:3および11の融合ポリペプチドとした。図に示すPD-1特異的抗体の重鎖または軽鎖のどちらか一方のC末またはN末のどちらか一方にリポカリンムテインを遺伝子融合することで、SEQ ID NO:47および53、SEQ ID NO:47および57の融合ポリペプチドを得た。
【図１ｄ】図に記載するPD-1特異的抗体の重鎖または軽鎖のどちらか一方のC末またはN末のどちらか一方にリポカリンムテインを遺伝子融合することで、SEQ ID NO:3および8、SEQ ID NO:3および12の融合ポリペプチドとした。図に示すPD-1特異的抗体の重鎖または軽鎖のどちらか一方のC末またはN末のどちらか一方にリポカリンムテインを遺伝子融合することで、SEQ ID NO:47および54、SEQ ID NO:47および58の融合ポリペプチドを得た。
【図１ｅ】SEQ ID NO:3のFc部分のC末にSEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテインを遺伝子融合して、それぞれSEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42とすることによって、LAG-3単一特異性融合ポリペプチドを作製した。
【図１ｆ】図1f〜iはさらに、PD-1に特異的な抗体（例えばSEQ ID NO:3および4の抗体またはSEQ ID NO:47および48の抗体）と、LAG-3に特異的な1つまたは複数のリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテイン）とに基づいて作製された、さらなる融合ポリペプチドの設計と、そのようなポリペプチドの対応する配列を示している。
【図１ｇ】図1f〜iはさらに、PD-1に特異的な抗体（例えばSEQ ID NO:3および4の抗体またはSEQ ID NO:47および48の抗体）と、LAG-3に特異的な1つまたは複数のリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテイン）とに基づいて作製された、さらなる融合ポリペプチドの設計と、そのようなポリペプチドの対応する配列を示している。
【図１ｈ】図1f〜iはさらに、PD-1に特異的な抗体（例えばSEQ ID NO:3および4の抗体またはSEQ ID NO:47および48の抗体）と、LAG-3に特異的な1つまたは複数のリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテイン）とに基づいて作製された、さらなる融合ポリペプチドの設計と、そのようなポリペプチドの対応する配列を示している。
【図１ｉ】図1f〜iはさらに、PD-1に特異的な抗体（例えばSEQ ID NO:3および4の抗体またはSEQ ID NO:47および48の抗体）と、LAG-3に特異的な1つまたは複数のリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテイン）とに基づいて作製された、さらなる融合ポリペプチドの設計と、そのようなポリペプチドの対応する配列を示している。
【図２】PD-1に対する、代表的融合ポリペプチド、ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）、ならびに陰性対照リポカリンムテイン（SEQ ID NO:43）の結合を決定した、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）の結果を示す図である。組換えヒトPD-1-His（C末ポリヒスチジンタグを持つPD-1）をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験作用物質（融合ポリペプチド、ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）、ならびに陰性対照リポカリンムテイン（SEQ ID NO:43））を、最高濃度250nMから始まる1:3希釈系列で力価測定した。結合した研究対象の試料は、実施例2に記載するように、抗ヒトIgG Fc抗体によって検出した。データは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし傾きを1に固定した1:1結合モデルでフィットさせた。図2AはSEQ ID NO:17のリポカリンムテインを持つ融合ポリペプチドに関する結果を示し、図2BはSEQ ID NO:27のリポカリンムテインを持つ融合ポリペプチドに関する結果を示している。結果として得られたEC50値を表2に掲載する。
【図３Ａ】図3は、LAG-3に対する、代表的融合ポリペプチド、ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）、ならびにLAG-3結合性リポカリンムテイン（SEQ ID NO:17および27）、ならびにLAG-3に結合しない陰性対照リポカリンムテイン（SEQ ID NO:43）の結合を決定した、ELISA実験の結果を示す図である。ヒトLAG-3-His（C末ポリヒスチジンタグを持つLAG-3）をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験作用物質を最高濃度250nMから出発して力価測定した。結合した研究対象の作用物質は、実施例3に記載するように、抗Tlc抗体または抗ヒトIgG-Fc抗体によって検出した。データは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし傾きを1に固定した1:1結合モデルでフィットさせた。図3Aは、抗Tlc抗体で検出された、SEQ ID NO:17のリポカリンムテインを持つ融合ポリペプチドに関する結果を示す。結果として得られたEC50値を表3に掲載する。
【図３Ｂ】抗Tlc抗体で検出された、SEQ ID NO:27のリポカリンムテインを持つ融合ポリペプチドに関する結果を示す。結果として得られたEC50値を表3に掲載する。
【図３Ｃ】抗ヒトIgG-Fc抗体で検出された、SEQ ID NO:17のリポカリンムテインを持つ融合ポリペプチドに関する結果を示す。結果として得られたEC50値を表3に掲載する。
【図３Ｄ】抗ヒトIgG-Fc抗体で検出された、SEQ ID NO:27のリポカリンムテインを持つ融合ポリペプチドに関する結果を示す。結果として得られたEC50値を表3に掲載する。
【図４Ａ】実施例4に記載するように哺乳動物細胞上に発現させたヒトPD-1に対する融合ポリペプチドの特異的結合を評価するために実行した蛍光活性化細胞選別（FACS）研究の結果を示す図である。hIgG4（Sigma）とSEQ ID NO:43とを組み合わせた陰性対照は、結合を示さなかった。蛍光強度の幾何平均を最大平均に対して正規化し、1:1結合モデルでフィットさせた。結果として得られたEC50値を表4に掲載する。
【図４Ｂ】実施例4に記載するように哺乳動物細胞上に発現させたヒトPD-1に対する融合ポリペプチドの特異的結合を評価するために実行した蛍光活性化細胞選別（FACS）研究の結果を示す図である。hIgG4（Sigma）とSEQ ID NO:43とを組み合わせた陰性対照は、結合を示さなかった。蛍光強度の幾何平均を最大平均に対して正規化し、1:1結合モデルでフィットさせた。結果として得られたEC50値を表4に掲載する。
【図４Ｃ】実施例4に記載するように哺乳動物細胞上に発現させたヒトLAG-3に対する融合ポリペプチドの特異的結合を評価するために実行した蛍光活性化細胞選別（FACS）研究の結果を示す図である。hIgG4（Sigma）とSEQ ID NO:43とを組み合わせた陰性対照は、結合を示さなかった。蛍光強度の幾何平均を最大平均に対して正規化し、1:1結合モデルでフィットさせた。結果として得られたEC50値を表4に掲載する。
【図４Ｄ】実施例4に記載するように哺乳動物細胞上に発現させたヒトLAG-3に対する融合ポリペプチドの特異的結合を評価するために実行した蛍光活性化細胞選別（FACS）研究の結果を示す図である。hIgG4（Sigma）とSEQ ID NO:43とを組み合わせた陰性対照は、結合を示さなかった。蛍光強度の幾何平均を最大平均に対して正規化し、1:1結合モデルでフィットさせた。結果として得られたEC50値を表4に掲載する。
【図５】PD-1およびLAG-3の両標的に同時に結合する代表的融合ポリペプチドの能力を決定したELISA実験の結果を表す図である。組換えPD-1-Hisをマイクロタイタープレートにコーティングし、次に250nMの最高濃度から出発する融合タンパク質の力価測定を行った。次に、定濃度のビオチン化ヒトLAG-3-Fcを加え、それを実施例5に記載するようにエクストラビジン（extravidin）によって検出した。図5Aは、SEQ ID NO:17のリポカリンムテインを持つ融合ポリペプチドならびにPD-1に対するSEQ ID NO:3および4のベンチマーク抗体に関する結果を示し、図5Bは、SEQ ID NO:27のリポカリンムテインを持つ融合ポリペプチドならびにPD-1に対するSEQ ID NO:3および4のベンチマーク抗体に関する結果を示す。
【図６】実施例6に記載するように行った競合FACS研究において示された、融合ポリペプチドがLAG-3への結合に関して主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII分子（LAG-3の天然リガンド）と競合することを示す図である。定濃度のヒトLAG-3-Fc融合物（ヒトIgG1 Fcフラグメントに融合されたヒトLAG-3細胞外ドメイン）と、融合ポリペプチドまたは対照の希釈系列とを、MHCクラスII陽性ヒト細胞株A375と共にインキュベートした。細胞に結合したhuLAG-3-Fcを、蛍光標識抗IgG Fc抗体を使って検出した。LAG-3およびPD-1二重特異性抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドまたはLAG-3単一特異性Fc-リポカリンムテイン融合ポリペプチドによる、MHCクラスII分子へのhuLAG-3-Fc結合の用量依存的阻害が観察された。
【図７】T細胞活性化を誘導するSEQ ID NO:5および4の融合ポリペプチドの能力を調べた代表的実験の結果を示す図である。ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）ならびにベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）とFc-リポカリンムテイン融合ポリペプチド（SEQ ID NO:41）とのカクテルも試験した。この実験では、ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）刺激ヒト末梢血単核球（PBMC）を、融合ポリペプチドまたは対照と共に、2つの異なる濃度でインキュベートした。T細胞活性化を反映する、分泌されたインターロイキン2（IL-2）のレベルを、実施例7に記載するように、電気化学ルミネセンスに基づくアッセイにより、T細胞活性化に関する読み出し情報として決定した。
【図８】T細胞活性化を誘導するSEQ ID NO:5および4の融合ポリペプチドの能力を調べた代表的実験の結果を示す図である。ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）ならびにベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）とFc-リポカリンムテイン融合ポリペプチド（SEQ ID NO:41）とのカクテルも試験した。この実験では、黒色腫A375細胞をコーティングし、一晩接着させた。翌日、フィトヘマグルチニン（PHA）で前処理した精製T細胞を、さまざまな濃度の二重特異性融合ポリペプチドおよび対照の存在下、コーティングした細胞上でインキュベートした。T細胞活性化を反映する上清インターフェロンガンマ（IFN-γ）のレベルを、実施例8に記載するように、電気化学ルミネセンスに基づくアッセイによって決定した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
IV. 開示の詳細な説明
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、次に挙げる少なくとも2つのサブユニットを、任意の順序で含有する:（1）PD-1に特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合性ドメインを含む、第1のサブユニット、および（2）LAG-3に特異的なリポカリンムテインを含む、第2のサブユニット。
【００４０】
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは第3のサブユニットも含有しうる。例えば、ポリペプチドは、LAG-3に特異的な第3のサブユニットを含有しうる。いくつかの態様において、第3のサブユニットは、LAG-3に特異的なリポカリンムテインを含む。例えば2つのリポカリンムテインを、免疫グロブリンサブユニットに、1つは免疫グロブリンのC末に、そして1つは免疫グロブリンのN末に、融合することができる。いくつかの態様において、リポカリンムテインは、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖に融合することができる。
【００４１】
いくつかの態様では、本質的に図1に記載するように、1つのサブユニットを別のサブユニットに連結することができる。例えば1つのリポカリンムテインを、免疫グロブリン重鎖ドメイン（VH）のC末、VHのN末、免疫グロブリン軽鎖（VL）のC末、および/またはVLのN末に、ペプチド結合を介して連結することができる（図1）。いくつかの特定態様において、リポカリンムテインサブユニットは、そのN末および/またはそのC末で、免疫グロブリンサブユニットに融合することができる。例えばリポカリンムテインを、免疫グロブリンの重鎖定常領域（CH）のC末または軽鎖定常領域（CL）のC末に、ペプチド結合を介して連結しうる。いくつかのさらなる態様において、ペプチド結合はリンカー、好ましくは構造化されていない（G4S）3リンカー、例えばSEQ ID NO:19に示すものでありうる。リンカーは、1〜50個のアミノ酸、例えば1、2、3、4、5、10、11、12、13、14、15、16、17 18、19、20、25、30、35、40、45または50個のアミノ酸を有しうる。
【００４２】
これに関連して、1つのサブユニットを、そのN末および/またはそのC末において、別のサブユニットに融合しうる。例えば、1つのサブユニットが完全長免疫グロブリンを含む場合は、別のサブユニットを、その第2のサブユニットのN末と該免疫グロブリンの重鎖定常領域（CH）のC末との間のペプチド結合を介して連結しうる。いくつかのさらなる態様では、第3のサブユニットを、第3の結合ドメインのN末と該免疫グロブリンの軽鎖定常領域（CL）のC末との間のペプチド結合を介して連結しうる。いくつかのさらなる態様において、ペプチド結合はリンカー、好ましくは構造化されていない（G4S）3リンカー、例えばSEQ ID NO:2に示すものでありうる。
【００４３】
本開示の融合ポリペプチドであって、そのサブユニットの1つが完全長免疫グロブリンを含み、該ポリペプチドがPD-1およびLAG-3に同時に会合（engage）する融合ポリペプチドに関するいくつかの態様において、Fc受容体陽性細胞に対する完全長免疫グロブリンのFc領域のFc機能は、同時に保存されていてもよい。
【００４４】
本開示の融合ポリペプチドであって、そのサブユニットの1つが完全長免疫グロブリンを含み、該ポリペプチドがPD-1およびLAG-3に同時に会合する融合ポリペプチドに関する他のいくつかの態様において、Fc受容体陽性細胞に対する完全長免疫グロブリンのFc領域のFc機能は、タンパク質工学によって低減または完全に抑制されていてもよい。これは、例えばIgG1バックボーンからIgG4へと転換することによって達成されうる。IgG4は、IgG1と比べて低減したFc-ガンマ受容体相互作用を示すことが公知である。Fc-ガンマ受容体への残存する結合をさらに低減するために、F234AおよびL235Aなどの変異を、IgG4バックボーン中に導入してもよい。加えて、IgG4半抗体の交換を最小限に抑えるために、S228P変異をIgG4バックボーン中に導入してもよい。いくつかのさらなる態様では、天然のグリコシル化モチーフを除去するために、さらにN297A変異が融合ポリペプチドの免疫グロブリン重鎖に存在してもよい。
【００４５】
いくつかの態様では、PD-1およびLAG-3への同時結合の結果として、本開示の融合ポリペプチドは、耐久性のある抗腫瘍応答または抗感染応答を呈しうる。
【００４６】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる免疫グロブリンのFc部分は、体内での融合ポリペプチドの安定性および残留性にとって極めて重要な、融合ポリペプチドの血清中レベルの維持に貢献しうる。例えば、Fc部分が内皮細胞上および食細胞上のFc受容体に結合すると、融合ポリペプチドは細胞内に移行して、血流へと再循環されることで、体内でのその半減期を向上させうる。
【００４７】
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、例えば融合ポリペプチドを本質的に実施例2に記載するようにELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）アッセイにおいて測定した場合に、最大でも約10nM、またはそれ未満、例えば約5nM、約1nM、もしくは約0.5nM、またはそれ未満のEC50値で、PD-1に結合することが可能でありうる。
【００４８】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、当該融合ポリペプチドに含まれるPD-1に特異的な免疫グロブリン、例えばSEQ ID NO:3および4によって与えられる重鎖および軽鎖を有する抗体と、本融合ポリペプチドとを、本質的に実施例2に記載するようにELISAにおいてアッセイした場合に、該免疫グロブリンのEC50値と同等のEC50値で、PD-1に結合することができうる。
【００４９】
別の一局面において、本融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドを本質的に実施例3に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、最大でも約10nM、またはそれ未満、例えば約5nM、約1nMもしくは約0.5nM、またはそれ未満のEC50値で、LAG-3に結合することができうる。
【００５０】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、当該融合ポリペプチドに含まれるLAG-3に特異的なリポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテインと、本ポリペプチドとを、本質的に実施例3に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、該リポカリンムテインのEC50値と少なくとも同程度か、それより優れたEC50値で、LAG-3に結合することができる。
【００５１】
いくつかの態様において、PD-1にもLAG-3にも特異的な本開示の融合ポリペプチドは、例えば該融合ポリペプチドを本質的に実施例5に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、PD-1およびLAG-3に同時に結合する能力を有しうる。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、例えば本質的に実施例5に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、最大でも約100nMのEC50値で、PD-1およびLAG-3に同時に結合する能力を有しうる。
【００５２】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、MHCクラスIIに対する、例えば抗原提示細胞（APC）または腫瘍細胞上に発現したMHCクラスIIに対する、LAG-3の結合を阻害する能力を有する。阻害作用様式は、例えば、本質的に実施例6に記載するように、FACS分析によって決定することができる。
【００５３】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例7および8に記載するように、機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞活性化を反映するIL-2および/またはIFN-γの産生を誘導することができ、コーティング濃度が高いとIL-2および/またはIFN-γ誘導も強くなる傾向さえ示しうる。
【００５４】
A. 融合ポリペプチドに含まれる例示的免疫グロブリン
いくつかの態様では、融合ポリペプチドに関して、第1の結合ドメインは、PD-1に特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合性ドメインを含む。免疫グロブリンは、例えばIgG1、IgG2またはIgG4でありうる。さらなる態様において、免疫グロブリンはPD-1に対するモノクローナル抗体である。
【００５５】
本開示のPD-1結合性抗体の具体例は、いずれも当技術分野において公知である抗体ニボルマブ（Opdivoが販売しており、ONO-4538、BMS-936558、またはMDX1106としても公知である）、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブまたはMK03475とも呼ばれる、商品名Keytruda）、PDR001、MEDI0680（旧名AMP-514）、ピディリズマブ（CT-011）、ENUM-388D4、またはENUM-244C8のVH領域およびVL領域を含むPD-1結合性抗体と同じエピトープを交差ブロックし、またはそれら同じエピトープに結合する、抗原結合性領域を含みうる。別の一特定態様において、本開示のPD-1結合性抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、PDR001、MEDI0680、ピディリズマブ、ENUM-388D4、およびENUM-244C8からなる群より選択される抗体の抗原結合性領域、例えば3つの重鎖相補性決定領域（CDR）（HCDR1、HCDR2およびHCDR3）ならびに3つの軽鎖CDR（LCDR1、LCDR2およびLCDR3）のうちのいずれか1つを含みうる。
【００５６】
いくつかの態様において、PD-1に結合する抗体またはその抗原結合性ドメインは、SEQ ID NO:124〜154からなる群より選択される配列のうちのいずれか1つを交差ブロックまたは結合する、抗原結合性領域を有する。
【００５７】
いくつかの態様において、PD-1に結合する抗体は、SEQ ID NO:3および4のベンチマーク抗体またはSEQ ID NO:47および48のベンチマーク抗体の配列を有するであろう。
【００５８】
いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインは、SEQ ID NO:59〜84からなる群より選択される重鎖可変領域（HCVR）、およびSEQ ID NO:85〜111からなる群より選択される軽鎖可変領域（LCVR）を有するであろう。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインは、SEQ ID NO:112〜117からなる群より選択される重鎖可変領域（HCVR）およびSEQ ID NO:118〜123からなる群より選択される軽鎖可変領域（LCVR）を有するであろう。
【００５９】
いくつかの態様において、PD-1抗体または抗原結合性ドメインは、SEQ ID NO:59〜84、112〜117のうちのいずれか1つであるHCVRを含む重鎖、およびSEQ ID NO:85〜111、118〜123のいずれか1つであるLCVRを含む軽鎖を有するであろう。
【００６０】
いくつかの態様において、PD-1抗体の重鎖および軽鎖ペアは、それぞれHCVRおよびLCVRを、以下のとおりに含む:SEQ ID NO:112および118; SEQ ID NO:112および119; SEQ ID NO:112および120; SEQ ID NO:112および121; SEQ ID NO:112および122; SEQ ID NO:112および123; SEQ ID NO:113および118; SEQ ID NO:113および119; SEQ ID NO:113および120; SEQ ID NO:113および121; SEQ ID NO:113および122; SEQ ID NO:113および123; SEQ ID NO:114および118; SEQ ID NO:114および119; SEQ ID NO:114および120; SEQ ID NO:114および121:SEQ ID NO:114および122; SEQ ID NO:114および123; SEQ ID NO:115および118; SEQ ID NO:115および119; SEQ ID NO:115および120; SEQ ID NO:115および121; SEQ ID NO:115および122; SEQ ID NO:115および123; SEQ ID NO:116および118; SEQ ID NO:116および119; SEQ ID NO:116および120; SEQ ID NO:116および121; SEQ ID NO:116および122; SEQ ID NO:116および123; SEQ ID NO:117および118; SEQ ID NO:117および119; SEQ ID NO:117および120; SEQ ID NO:117および121; SEQ ID NO:117および122;ならびにSEQ ID NO:117および123。
【００６１】
いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインは、SEQ ID NO:59〜84からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％の配列同一性を持つ重鎖可変領域（HCVR）、およびSEQ ID NO:85〜111からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％の配列同一性を持つ軽鎖可変領域（LCVR）を有するであろう。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインは、SEQ ID NO:112〜117からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％の配列同一性を持つ重鎖可変領域（HCVR）、およびSEQ ID NO:118〜123からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％の配列同一性を持つ軽鎖可変領域（LCVR）を有するであろう。
【００６２】
いくつかのさらなる好ましい態様において、PD-1に特異的に結合する本開示の抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、PDR001、MEDI0680、ピディリズマブ、ENUM-388D4、もしくはENUM-244C8、またはその抗原結合性ドメインである。
【００６３】
以下の特許出願を含むさまざまな特許出願が、抗PD-1抗体、その生産、および/またはそのような抗PD-1抗体を使って免疫応答を強化する方法を開示している:米国特許出願公開番号US2003/0039653、US2004/0213795、US2006/0110383、US2007/0065427、US2007/0122378、US2009/0217401、US2011/0008369、およびUS2015/0203579、ならびにPCT国際出願公開番号WO2003/099196、WO2006/121168、WO2007/005874、WO2008/156712、WO2009114335、WO2010/027423、WO2011/110604、WO2012/145493、WO2013/014668、WO2014/194302、WO2015/035606、およびWO2016/106159。これらの出願のそれぞれの開示は、参照によりその全体が、本明細書に組み入れられる。
【００６４】
本開示のPD-1結合性抗体は、上述の出願において開示された抗PD-1抗体のいずれか一つでありうる。
【００６５】
本開示のPD-1結合性抗体は、上述の出願において開示された抗PD-1抗体のいずれか一つのVH領域およびVL領域を含むPD-1結合性抗体と同じエピトープを交差ブロックし、または同じエピトープに結合する抗原結合性領域を含みうる。別の一特定態様において、PD-1結合性抗体は、上述の出願に開示されている抗PD-1抗体のいずれか1つの抗原結合性領域、例えば3つの重鎖相補性決定領域（CDR）（HCDR1、HCDR2およびHCDR3）ならびに3つの軽鎖CDR（LCDR1、LCDR2およびLCDR3）のうちのいずれか1つを含みうる。
【００６６】
いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの重鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000003
。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの重鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000004
。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの重鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000005
。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの重鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000006
。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの重鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000007
。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの重鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000008
。
【００６７】
いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの軽鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000009
。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの軽鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000010
。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの軽鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000011
。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの軽鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000012
。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの軽鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000013
。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインの軽鎖可変領域は、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう:
2018526989.tif 000014
。
【００６８】
いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインは、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう重鎖可変領域:
2018526989.tif 000015
と、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう軽鎖可変領域:
2018526989.tif 000016
とを含む。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインは、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう重鎖可変領域:
2018526989.tif 000017
と、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう軽鎖可変領域:
2018526989.tif 000018
とを含む。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインは、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう重鎖可変領域:
2018526989.tif 000019
と、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう軽鎖可変領域:
2018526989.tif 000020
とを含む。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインは、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう重鎖可変領域:
2018526989.tif 000021
と、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう軽鎖可変領域:
2018526989.tif 000022
とを含む。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインは、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう重鎖可変領域:
2018526989.tif 000023
と、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう軽鎖可変領域:
2018526989.tif 000024
とを含む。いくつかの態様において、PD-1抗体またはその抗原結合性ドメインは、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう重鎖可変領域:
2018526989.tif 000025
と、以下の配列を有する3つの相補性決定領域（CDR）を有するであろう軽鎖可変領域:
2018526989.tif 000026
とを含む。
【００６９】
別段の表示がある場合を除き、本明細書において開示するCDR配列はいずれも、Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136（1999）に記載されているように、IMGT法に従って定義される。CDR1は位置27〜38からなり、CDR2は位置56〜65からなり、生殖細胞系V遺伝子の場合、CDR3は位置105〜116からなり、再配列されたV-J遺伝子またはV-D-J遺伝子の場合、CDR3は位置105〜117（J-PHEまたはJ-TRP118の前の位置）からなって、13アミノ酸未満の再配列CDR3-IMGTの場合はループの最上部にギャップを、また13アミノ酸超の再配列CDR3-IMGTについては追加位置112.1、111.1、112.2、111.2などを伴う。このパラグラフに記載する位置は、Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136（1999）に記載のIMGTナンバリングに従う。
【００７０】
他のいくつかの態様において、本開示のPD-1結合性抗体に関して、エフェクター機能が無効化された抗体は、KabatのEUインデックスによるナンバリング（Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000）で、F234およびL235に突然変異を有するか、位置D265およびP329に突然変異を有することが好ましい。
【００７１】
本開示の融合ポリペプチドに含まれるPD-1に特異的に結合する抗体は、本発明の二重特異性結合分子のインビボ半減期を延ばすことを可能にするFc部分を含みうる。そのようなFc部分は、好ましくはヒト由来であり、より好ましくはIgG1抗体またはIgG4抗体のヒトFc部分であり、さらに好ましくはエフェクター機能が活性化または無効化されている工学的に操作されたIgG1またはIgG4のヒトFc部分であって、ここではエフェクター機能を無効化することの方がエフェクター機能を活性化することより好ましい。最も好ましくは、そのようなFc部分は、KabatのEUインデックス（Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000）によるナンバリングで位置234および/または235における突然変異によってエフェクター機能を無効化するように操作されている。いくつかの態様では、エフェクター機能を無効化するために、抗PD-1抗体の位置F234およびL235に突然変異を導入しうる。別の態様では、エフェクター機能を無効化するために、抗PD-1抗体の位置D265およびP329に突然変異を導入しうる。これら突然変異候補セットのどちらについても、ナンバリングはKabatのEUインデックス（Shields et al., J Biol Chem, 2001）による。
【００７２】
抗体およびそのフラグメントを生産するためのさまざまな技法が当技術分野では周知であり、それらは例えばAltshuler et al.（Biochemistry（Mosc）, 2010）に記載されている。したがってポリクローナル抗体は、添加剤およびアジュバントと混合された抗原による免疫化後に、動物の血液から得ることができ、モノクローナル抗体は連続継代性細胞株培養物によって産生される抗体を与える任意の技法によって生産することができる。そのような技法の例は、例えばHarlow and Lane（1999）,（1988）に記載されており、Koehler and Milstein, 1975によって最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法（例えばLi et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2006、Kozbor and Roder, Immunol Today, 1983参照）、およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBV-ハイブリドーマ技法（Cole et al., Cancer Res, 1984）などがある。さらにまた、組換え抗体はモノクローナル抗体から得ることも、ファージ、リボソーム、mRNA、または細胞ディスプレイなどのさまざまなディスプレイ方法を使って新規に調製することもできる。組換え（ヒト化）抗体またはそのフラグメントの発現に適した系は、例えば細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞株またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物などから選択することができる（例えば米国特許第6,080,560号; Holliger and Hudson, Nat Biotechnol, 2005参照）。さらに、単鎖抗体の生産に関して記載された技法（特に米国特許第4,946,778号参照）を、本発明の標的に特異的な単鎖抗体を生産するために適合させることができる。ファージ抗体の効率を増加させるために、BIAcoreシステムにおいて利用されている表面プラズモン共鳴を使用することができる。
【００７３】
B. 融合ポリペプチドに含まれる例示的LAG-3特異的リポカリンムテイン
本明細書にいう「リポカリン」は、複数（好ましくは4つ）のループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している複数（好ましくは8つ）のβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有する、重量が約18〜20kDaの単量体型タンパク質と定義される。サイズ、形状、および化学的特徴が異なる標的を収容する能力をそれぞれが有するリポカリンファミリーメンバー間に、さまざまな異なる結合様式を生じさせるのは、他の点では剛直なリポカリンスキャフォールドにおけるループの多様性である（例えばSkerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996に概説されている）。事実、リポカリンタンパク質ファミリーは、広範なリガンドに結合するように自然に進化しており、それらが共有する全体的配列保存のレベルは異常に低い（多くの場合、配列同一性は20％未満である）にもかかわらず、高度に保存された全体的フォールディングパターンを保っている。さまざまなリポカリンにおける位置間の対応は当業者には周知である（例えば米国特許第7,250,297号を参照されたい）。
【００７４】
上記のとおり、リポカリンは、その超二次構造、すなわち4つのループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している8つのβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域によって規定されるポリペプチドである。本開示は、本明細書において具体的に開示するリポカリンムテインに限定されない。この点に関して、本開示は、4つのループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している8つのβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有するリポカリンムテインであって、前記4つのループのうちの少なくとも3つのそれぞれの少なくとも1つのアミノ酸がリファレンス配列と比べて変異しており、LAG-3に検出可能な親和性で結合するのに有効であるリポカリンムテインに関する。
【００７５】
一特定態様において、本明細書に開示するリポカリンムテインは、リポカリン-1、ヒト涙液プレアルブミンまたはフォン・エブネル腺タンパク質とも呼ばれるヒト涙液リポカリン（hTlcまたはTLPC）のムテインである。本明細書において使用する用語「ヒト涙液リポカリン」または「hTlc」または「リポカリン-1」は、SwissProt/UniProtデータバンクアクセッション番号P31025（アイソフォーム1）の成熟ヒト涙液リポカリンを指す。SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P31025に示されるアミノ酸配列は、好ましい「リファレンス配列」として使用することができ、より好ましくは、SEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列がここで「リファレンス配列」として使用される。
【００７６】
いくつかの態様において、LAG-3に検出可能な親和性で結合するリポカリンムテインは、リファレンス配列のネイティブシステイン残基の、別のアミノ酸、例えばセリン残基による、アミノ酸置換を、少なくとも1つは含みうる。他のいくつかの態様において、LAG-3に検出可能な親和性で結合するリポカリンムテインは、野生型リポカリンの1つまたは複数のアミノ酸を置換する1つまたは複数の非ネイティブシステイン残基を含みうる。さらなる一特定態様において、本開示によるリポカリンムテインは、システイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を少なくとも2つは含み、それによって1つまたは複数のシステイン架橋を形成している。いくつかの態様において、該システイン架橋は少なくとも2つのループ領域を接続しうる。これらの領域の定義は、本明細書では、Flower (Biochem J, 1996), (Biochim Biophys Acta, 2000)およびBreustedt et al. (J Biol Chem, 2005)に従って使用される。関連態様において、本開示は、LAG-3に結合することによってLAG-3の下流シグナリング経路を活性化する能力を有する1つまたは複数のリポカリンムテインを教示する。
【００７７】
LAG-3に向けられた、またはLAG-3に特異的な、本開示のタンパク質は、明確なタンパク質スキャフォールド、好ましくはリポカリンスキャフォールドに基づく多くの特異的結合タンパク質ムテインを包含する。交換され、欠失し、または挿入されるヌクレオチドまたはアミノ酸のそれぞれの数は、好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個またはそれ以上、例えば25、30、35、40、45または50個であり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11個は好ましく、9、10または11個はさらに好ましい。ただし、本開示のタンパク質ムテインは、依然として、LAG-3に結合する能力を有することが好ましい。
【００７８】
一局面において、本開示は、LAG-3に少なくとも検出可能な親和性で結合するさまざまなリポカリンムテインを包含する。この意味で、LAG-3は、リファレンス野生型リポカリンの非天然リガンドであるとみなすことができ、ここで「非天然リガンド」とは、生理的条件下で野生型リポカリンに結合しない化合物を指す。野生型リポカリンを一定の配列位置における1つまたは複数の突然変異で工学的に操作することにより、本開示は、非天然リガンドであるLAG-3に対する高い親和性および高い特異性が可能であることを示す。いくつかの態様では、野生型リポカリン上の一定の配列位置をコードする1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12個またはさらにそれ以上のヌクレオチドトリプレットにおいて、ヌクレオチドトリプレットの部分集合でこれらの位置における置換を行うことによって、ランダム突然変異誘発を実行しうる。
【００７９】
さらに、本開示のリポカリンムテインは、リファレンスリポカリンの直鎖ポリペプチド配列の一定の配列位置に対応する配列位置のうちの任意の1つまたは複数に、例えば少なくとも任意の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個に、変異アミノ酸残基を有しうる。
【００８０】
本開示のリポカリンムテインは、変異アミノ酸配列位置以外では、「親」タンパク質スキャフォールド（リポカリンスキャフォールドなど）の野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、本開示によるリポカリンムテインは、1つまたは複数の配列位置に1つまたは複数のアミノ酸突然変異も、そのような突然変異が当該ムテインの結合活性およびフォールディングを、少なくとも本質的には、阻止することも、妨害することもないのであれば、保持しうる。そのような突然変異は、確立された標準的方法（Sambrook and Russell, 2001, Molecular cloning: a laboratory manual）を使って、DNAレベルで非常に容易に実現することができる。アミノ酸配列改変の具体例は、挿入または欠失およびアミノ酸置換である。そのような置換は保存的でありうる。すなわち、アミノ酸残基は、特性が、とりわけ極性およびサイズに関して、化学的に類似しているアミノ酸残基で置き換えられる。保存的置換の例は、以下のグループのメンバー間での置き換えである:1）アラニン、セリン、およびスレオニン; 2）アスパラギン酸およびグルタミン酸; 3）アスパラギンおよびグルタミン; 4）アルギニンおよびリジン; 5）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン;ならびに6）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。他方、アミノ酸配列中に非保存的改変を導入することも可能である。加えて、単一のアミノ酸残基を置き換える代わりに、リファレンスリポカリン、好ましくはhTlcの一次構造のうちの1つまたは複数の連続アミノ酸を挿入または欠失させることも、それらの欠失または挿入が安定なフォールディングされた機能的なムテインをもたらす限りにおいて、可能である。そのようなムテインでは、例えば、ポリペプチドのN末またはC末において、1つまたは複数のアミノ酸残基を付加し、または欠失させる（例えばN末およびC末が切断されたTlcムテイン）。一般にそのようなムテインは、hTlc（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列に対して、およそ少なくとも70％、例えば少なくとも約80％、例えば少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有しうる。一具体例として、本開示は、成熟ヒト涙液リポカリンの配列のN末の最初の4アミノ酸残基（His-His-Leu-Leu;位置1〜4）および/または成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列のC末の最後の2アミノ酸残基（Ser-Asp;位置157〜158）を欠失させた、上に定義したTlcムテイン（SEQ ID NO:13〜28）も包含する。
【００８１】
本明細書において開示するリポカリンムテインのアミノ酸配列は、他のリポカリンとの配列同一性と比較した場合に、リファレンスリポカリン、好ましくはhTlcに対して高い配列同一性を有する。この一般的状況において、本開示のリポカリンムテインのアミノ酸配列は、リファレンスリポカリンのアミノ酸配列に、少なくとも実質的に類似している。ただし、ギャップ（以下に定義する）が、アミノ酸の付加または欠失の結果としてアラインメント中に存在する可能性はある。リファレンスリポカリンの配列に実質的に類似する本開示のリポカリンムテインのそれぞれの配列は、いくつかの態様では、リファレンスリポカリンの配列に対して、少なくとも70％の同一性または配列相同性、少なくとも75％の同一性または配列相同性、少なくとも80％の同一性または配列相同性、少なくとも82％の同一性または配列相同性、少なくとも85％の同一性または配列相同性、少なくとも87％の同一性または配列相同性、または少なくとも90％の同一性もしくは配列相同性、例えば少なくとも95％の同一性または配列相同性を有する。ただし、改変された位置または配列は保たれており、1つまたは複数のギャップが可能である。
【００８２】
本明細書において、本開示のリポカリンムテインは、それが、ある標的（例えばLAG-3）と1つまたは複数のリファレンス標的とを区別することができるのであれば、当該標的に「特異的に結合」する。結合特異性は絶対的特性ではなく相対的特性だからである。「特異的結合」は、例えばウェスタンブロット、ELISA試験、FACS、RIA（radioimmunoassay）試験、ECL（electrochemiluminescence）試験、IRMA（immunoradiometric assay）、IHC（ImmunoHistoChemistry）およびペプチドスキャンに従って決定することができる。
【００８３】
一局面において、本開示はLAG-3結合性hTlcムテインを提供する。
【００８４】
これに関連して、本開示は、Kdを尺度として約300nM以下、さらには約100nM以下の親和性で、LAG-3に結合する能力を有する、1つまたは複数のhTlcムテインを提供する。
【００８５】
いくつかの態様において、そのようなhTlcムテインは、hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置14、25〜34、36、48、52〜53、55〜58、60〜61、66、79、85〜86、101、104〜106、108、110〜112、114、121、140および153に対応する1つまたは複数の位置に変異アミノ酸残基を含む。
【００８６】
いくつかの特定態様において、そのようなhTlcムテインは、hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置26〜34、55〜58、60〜61、65、104〜106および108に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含有しうる。
【００８７】
さらなる特定態様において、そのようなhTlcムテインは、hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置101、111、114および153に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基をさらに含みうる。
【００８８】
他の特定態様において、本hTlcムテインは、hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置14、25〜34、36、48、52〜53、55〜58、60〜61、66、79、85〜86、101、104〜106、108、110〜112、114、121、140および153に対応する1つまたは複数の位置に変異アミノ酸残基を含むことができる。
【００８９】
いくつかのさらなる態様において、本hTlcムテインは、hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の配列位置14、25〜34、36、48、52〜53、55〜58、60〜61、66、79、85〜86、101、104〜106、108、110〜112、114、121、140および153に対応する1つまたは複数の配列位置に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26個、さらにはそれ以上の変異アミノ酸残基を含むことができ、該ポリペプチドはLAG-3、特にヒトLAG-3に結合する。
【００９０】
いくつかのさらなる態様において、本開示は、hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）との比較において、配列位置14、25〜34、36、48、52〜53、55〜58、60〜61、66、79、85〜86、101、104〜106、108、110〜112、114、121、140、および153に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個、さらにはそれ以上の変異アミノ酸残基を含むhTlcムテインであり、かつLAG-3、特にヒトLAG-3に結合する、ポリペプチドに関する。
【００９１】
いくつかの態様において、本開示によるリポカリンムテインは、ネイティブシステイン残基の、例えばセリン残基によるアミノ酸置換を、少なくとも1つ含みうる。いくつかの態様において、本開示によるhTlcムテインは、位置61および/または153にあるネイティブシステイン残基の、セリン残基などの別のアミノ酸によるアミノ酸置換を含む。これとの関連において、システイン残基61および153によって形成される野生型涙液リポカリンの構造ジスルフィド結合（Breustedt, et al., J Biol Chem, 2005参照）の（それぞれのナイーブ核酸ライブラリーのレベルでの）除去が、安定にフォールディングされるだけでなく、所与の非天然リガンドに高い親和性で結合することもできる涙液リポカリンムテインを与えうることがわかっていることに注意されたい。いくつかの特定態様において、本開示によるTlcムテインは、アミノ酸置換Cys61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、ProもしくはTrp、および/またはCys153、Lys、Arg、Thrを含む。そのような置換は、Cys61とCys153とを連結する天然ジスルフィド架橋の形成を防止するのに有用であり、よってムテインの取り扱いを容易にすることが判明している。ただし、LAG-3に結合し、かつCys61とCys153との間に形成されたジスルフィド架橋を有するhTlcも、本発明の一部である。
【００９２】
いくつかの態様では、構造ジスルフィド結合の排除により、本開示のムテインへの非天然人工ジスルフィド結合の（自発的）生成または計画的導入が可能になり、それによってムテインの安定性が増加するという、さらなる利点が得られうる。例えば、いくつかの態様では、位置61、101および153にあるシステインコドンのうちの2つまたは3つすべてが、別のアミノ酸のコドンで置き換えられる。さらに、いくつかの態様において、本開示によるhTlcムテインは、位置101にあるネイティブシステイン残基の、セリン残基またはヒスチジン残基によるアミノ酸置換を含む。
【００９３】
いくつかの態様において、本開示によるムテインは、hTlcのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）に関して、位置28または105における、システイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を含む。
【００９４】
さらに、いくつかの態様において、本開示によるムテインは、hTlcのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）に関して、位置111にあるネイティブアルギニン残基の、プロリン残基によるアミノ酸置換を含む。さらに、いくつかの態様において、本開示によるムテインは、hTlcのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）に関して、位置114にあるネイティブリジン残基の、トリプトファン残基またはグルタミン酸によるアミノ酸置換を含む。
【００９５】
いくつかの態様において、本開示によるLAG-3結合性Tlcムテインは、hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置14、25〜34、36、48、52〜53、55〜58、60〜61、66、79、85〜86、101、104〜106、108、110〜112、114、121、140、および153に対応する1つまたは複数の位置に、以下の変異アミノ酸残基のうちの1つまたは複数を含む:Ser 14→Pro; Asp 25→Ser; Arg 26→Ser、Phe、Gly、Ala、AspまたはGlu; Glu 27→Asp、ValまたはThr; Phe 28→CysまたはAsp; Pro 29→Phe、LeuまたはTrp; Glu 30→Trp、AsnまたはTyr; Met 31→Ile, Val、Asp、LeuまたはTyr; Asn 32→Asp、Glu、Tyr、Trp、Val、ThrまたはMet; Leu 33→Asp、GluまたはPro; Glu 34→Val、TrpまたはHis; Val 36→Ala; Asn 48→Asp; Lys 52→Glu、Ser、ArgまたはAsn; Val 53→Ala; Met 55→AlaまたはVal; Leu 56→Asp、GlnまたはAsn; Ile 57→Leu; Ser 58→Phe、TrpまたはAsp; Arg 60→PheまたはGlu; Cys 61→Trp、Pro、LeuまたはTrp; Ala 66→Asn; Ala 79→Glu; Val 85→Ala; Ala 86→Asp; Cys 101→SerまたはPhe; Glu 104→Tyr; Leu 105→CysまたはGly; His 106→Ala、Glu、Thr、Tyr、GlnまたはVal; Lys 108→Tyr、Phe、ThrまたはTrp; Val 110→GlyまたはAla; Arg 111→Pro; Gly 112→MetまたはThr; Lys 114→TrpまたはAla; Lys 121→Thr; Ser 140→GlyおよびCys 153→Ser。いくつかの態様において、本開示によるhTlcムテインは、hTlc（SEQ ID NO:1）のこれらの配列位置における変異アミノ酸残基を、2個以上、例えば3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個、さらにはそれ以上、例えば13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25もしくは26個、またはすべて含む。
【００９６】
いくつかのさらなる態様において、LAG-3結合性hTlcムテインは、hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）との比較において、以下のアミノ酸置換の組
2018526989.tif 000027
2018526989.tif 000028
2018526989.tif 000029
のうちの1つを含む。
【００９７】
残りの領域、すなわち配列位置14、25〜34、36、48、52〜53、55〜58、60〜61、66、79、85〜86、101、104〜106、108、110〜112、114、121、140および153とは異なる領域において、本開示のhTlcムテインは、変異アミノ酸配列位置外では、野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。
【００９８】
さらなる態様において、本開示によるhTlcムテインは、hTlcの配列（SEQ ID NO:1）に対して、少なくとも70％の配列同一性または少なくとも70％の配列相同性を有する。具体例としてSEQ ID NO:14のムテインは、hTlcのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）に対して、約86％のアミノ酸配列同一性または配列相同性を有する。
【００９９】
さらなる特定態様において、本開示のhTlcムテインは、SEQ ID NO:13〜28のいずれか1つに示すアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
【０１００】
さらなる特定態様において、本開示のhTlcムテインは、SEQ ID NO:13〜28からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１０１】
本開示は、SEQ ID NO:13〜28からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するhTlcムテインの構造ホモログであって、該hTlcムテインとの関係において約60％超、好ましくは65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、92％超、最も好ましくは95％超のアミノ酸配列相同性または配列同一性を有する構造ホモログも包含する。
【０１０２】
本開示によるhTlcムテインは、天然型のhTlc (SEQ ID NO: 1)の突然変異誘発を使って得ることができる。突然変異誘発のいくつかの態様において、置換（すなわち置き換え）は保存的置換である。しかしながら、リポカリンムテインがLAG-3に結合するその能力を保っており、かつ/または、それが、hTlcのアミノ酸配列（SEQ ID NO: 1）に対する少なくとも60％、例えば少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％またはそれ以上の配列同一性であるという点においてその時置換される配列に対して配列同一性を有する限り、非保存的置換、または下記の例示的置換からの1つまたは複数を含む、任意の置換が想定される。
【０１０３】
いくつかの特定態様において、本開示は、KDを尺度として約15nM以下の親和性でヒトLAG-3に結合するリポカリンムテインであって、SEQ ID NO:17および27のいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも90％またはそれ以上、例えば95％の配列同一性を有するリポカリンムテインを提供する。
【０１０４】
一態様において、本開示のリポカリンムテインは、そのN末および/またはそのC末において、当該ムテインの血清中半減期を延ばすタンパク質ドメインである融合パートナーに融合される。さらなる特定態様において、このタンパク質ドメインは、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質である。
【０１０５】
別の一態様において、本開示のリポカリンムテインは、ムテインの血清中半減期を延ばす化合物にコンジュゲートされる。より好ましくは、ムテインは、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルデンプン（hydroethylstarch）、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される化合物にコンジュゲートされる。
【０１０６】
さらなる別の一態様において、本開示は、本明細書において開示するリポカリンムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。本開示は該核酸分子を含有する宿主細胞を包含する。
【０１０７】
C. LAG-3およびPD-1に特異的な融合ポリペプチドの例示的な用途、応用および生産
LAG-3は、制御性T細胞（Treg）活性の促進、ならびにT細胞の活性化および増殖の負の制御に、重要な役割を果たすと報告されている（Workman and Vignali, J Immunol, 2005）。天然のTregおよび誘導されたTregはどちらも、それらの抑制機能が最大になるために必要なLAG-3の発現レベルが上昇している（Huang et al., Immunity, 2004、Camisaschi et al., J Immunol, 2010）。さらにまた、CD4＋エフェクターT細胞におけるLAG-3の異所性発現は、増殖能を低減し、それらに第三者（third party）T細胞に対する制御能を付与する（Huang et al., Immunity, 2004）。疲弊した（exhausted）リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）特異的CD8＋T細胞における高いLAG-3発現がそれらの無応答状態の一因となり、CD8＋T細胞の抗腫瘍応答を制限することも、最近の研究によって示されている（Grosso et al., J Clin Invest, 2007、Blackburn et al., Nat Immunol, 2009）。実際、LAG-3は、2つのマウスモデルにおいて、CD8＋T細胞への直接的効果により、自己抗原および腫瘍抗原に対する寛容を維持した（Grosso et al., J Clin Invest, 2007）。
【０１０８】
しかし、腫瘍発生および腫瘍再発という状況で観察される免疫寛容は、LAG-3だけでなくT細胞のさまざまな負の制御性受容体の共発現によって媒介されるようである。慢性ウイルス感染モデル（Grosso et al., J Clin Invest, 2007、Blackburn et al., Nat Immunol, 2009、Lyford-Pike et al., Cancer Res, 2013）、ノックアウトマウス（Woo et al., Cancer Res, 2012、Bettini et al., J Immunol, 2011、Okazaki et al., J Exp Med, 2011）、腫瘍再発モデル（Goding et al., J Immunol, 2013）、およびそれらほどではないものの、ヒトがん患者（Goding et al., J Immunol, 2013、Gandhi et al., Blood, 2006、Matsuzaki et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2010）からのデータは、抗原に曝露され続けたT細胞は、「疲弊（exhaustion）」と呼ばれるプロセスによって、次第に不活化された状態になるというモデルを裏付けている。疲弊したT細胞は、細胞の増殖能、サイトカイン産生能、および標的細胞殺滅能を制限し、Treg活性を増加させる作用を持つ、T細胞の負の制御性受容体、主としてPD-1およびLAG-3の発現を特徴とする。しかし、腫瘍の発生および再発においてこれらの分子が発現するタイミングおよび順序は、まだ完全には特徴づけられていない。
【０１０９】
PD-1は、T細胞の活性化および寛容の制御に極めて重要な役割を果たす細胞表面シグナリング受容体である（Keir et al., Annu Rev Immunol, 2008）。これはI型膜貫通タンパク質であり、BTLA、CTLA-4、ICOSおよびCD28と共に、T細胞共刺激受容体のCD28ファミリーを構成する。PD-1は、主として、活性化T細胞、B細胞、および骨髄性細胞上に発現する（Dong et al., Nat Med, 1999）。これはナチュラルキラー（NK）細胞上にも発現する（Terme et al., Cancer Res, 2011）。
【０１１０】
PD-1がそのリガンドPD-L1およびPD-L2に結合すると、近位細胞内免疫受容体チロシン阻害ドメイン中のチロシン残基のリン酸化が起こり、続いてホスファターゼSHP-2が動員され、最終的にT細胞活性化のダウンレギュレーションが起こる。PD-1の重要な役割の一つは、感染に対する炎症応答時に末梢組織におけるT細胞の活性を制限し、よって自己免疫の発生を制限することである（Pardoll, Nat Rev Cancer, 2012）。この負の制御的役割の証拠は、PD-1欠損マウスが心筋症と共に関節炎および腎炎を含むループス様自己免疫疾患を発症するという知見に由来する（Nishimura et al., Science, 2001、Nishimura et al., Immunity, 1999）。腫瘍の場合、その帰結は、腫瘍微小環境内での免疫耐性の発生である。PD-1は腫瘍浸潤性リンパ球上に高発現し、そのリガンドは多種多様な腫瘍の細胞表面上でアップレギュレートされる（Dong et al., Nat Med, 2002）。PD-1へのリガンドの結合が免疫回避をもたらすことは複数のマウスがんモデルが証明している。加えて、この相互作用の遮断は抗腫瘍活性をもたらす（Hamid et al., N Engl J Med, 2013、Topalian et al., N Engl J Med, 2012）。
【０１１１】
自己抗原に対する寛容および腫瘍抗原に対する寛容のどちらにおいても、PD-1阻害経路とLAG-3阻害経路との間には強い相乗作用があるので、これらの標的の二重遮断は、がんに対するコンビナトリアル戦略として有望である（Woo et al., Cancer Res, 2012）。
【０１１２】
本開示の融合ポリペプチドは、免疫チェックポイントPD-1およびLAG-3を同時に標的とすることにより、耐久性のある抗腫瘍および/または抗感染応答を生じ、抗腫瘍リンパ球細胞活性を増加させ、抗腫瘍免疫を強化することにより、相乗的抗腫瘍結果をもたらしうる。
【０１１３】
それゆえに、本開示の融合ポリペプチドには、医薬領域において数多くの応用が考えられる。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、PD-1およびLAG-3の二重ターゲティングによる相乗効果をもたらしうる。
【０１１４】
一局面において、本開示は、試料中のPD-1およびLAG-3を検出するための、本明細書に開示する融合ポリペプチドの使用、ならびにそれぞれの診断方法に関する。
【０１１５】
別の一局面において、本開示は、PD-1およびLAG-3の同時結合のための、本明細書に開示する1つもしくは複数の融合ポリペプチドの使用またはそのようなポリペプチドを含む1つもしくは複数の組成物の使用を特徴とする。
【０１１６】
本開示は、PD-1およびLAG-3との複合体形成について記述するように、1つまたは複数の融合ポリペプチドの使用にも関係する。
【０１１７】
それゆえに、本開示のさらなる一局面において、ここに開示する1つまたは複数の融合ポリペプチドは、PD-1およびLAG-3の検出に使用される。そのような使用は、1つまたは複数の該融合ポリペプチドを、PD-1およびLAG-3を含有すると疑われる試料と、適切な条件下で接触させ、それによって融合ポリペプチドとPD-1およびLAG-3との間の複合体の形成を可能にする工程、および適切なシグナルによって前記複合体を検出する工程を含みうる。検出可能なシグナルは、上に説明したような標識、または結合（すなわち複合体形成）そのものによる物理的性質の変化を原因としうる。一例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、結合パートナー（そのうちの一つが金箔などの表面に固定化されているもの）の結合時に変化する。
【０１１８】
本明細書に開示する融合ポリペプチドはPD-1およびLAG-3の分離にも使用しうる。そのような使用は、1つまたは複数の融合ポリペプチドを、PD-1およびLAG-3を含有すると思われる試料と、適切な条件下で接触させ、それによって融合ポリペプチドとPD-1およびLAG-3との間の複合体の形成を可能にする工程、およびこの複合体を試料から分離する工程を含みうる。
【０１１９】
さらなる別の一局面において、本開示は、本開示の融合ポリペプチドを含む診断キットまたは分析キットを特徴とする。
【０１２０】
さらなる別の一局面において、本開示では、診断薬におけるそれらの使用に加えて、本開示の融合ポリペプチドと薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学組成物も考えられる。
【０１２１】
さらにまた本開示は、抗感染剤および/または抗がん剤ならびに免疫調節物質として使用するための、PD-1およびLAG-3に同時に結合する融合ポリペプチドを提供する。本開示の融合ポリペプチドは、さまざまな腫瘍および自己炎症などといったヒト疾患を、その処置または予防を必要とする対象において、処置または予防する方法であって、治療有効量の1つまたは複数の本開示の融合ポリペプチドを該対象に投与する工程を含む方法において使用されることが想定される。
【０１２２】
本開示の融合ポリペプチドを使って処置しうるがんの例として、肝がん、骨がん、膵がん、皮膚がん、頭頸部がん、乳がん、肺がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、腎がん、子宮がん、卵巣がん、直腸結腸がん、大腸がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、精巣20がん、子宮がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、25小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌、中枢神経系（CNS）の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮細胞がん、アスベストが誘発するがんを含む環境誘発がん、血液悪性疾患30、例えば多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫/原発性縦隔B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、および前駆Tリンパ芽球性リンパ腫など、ならびにこれらのがんの任意の組み合わせが挙げられる。本発明は転移がんの処置にも応用可能である。
【０１２３】
一態様において、ヒト患者は、非小細胞肺がん（NSCLC）またはウイルス関連がん（例えばヒトパピローマウイルス（HPV）関連腫瘍）または胃腺癌を患っている。一特定態様において、HPV関連腫瘍はHPV＋頭頸部がん（HNC）である。別の一特定態様において、胃腺癌はエプスタイン・バー・ウイルス（EBV）感染に関連している。
【０１２４】
別の一態様において、本開示は、本明細書に開示する融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（DNAおよびRNA）にも関係する。さらに別の一態様において、本開示は該核酸分子を含有する宿主細胞を包含する。遺伝暗号の縮重は、一定のコドンを同じアミノ酸を指定する別のコドンで置換することを可能にするので、本開示は、本明細書に記載する融合ポリペプチドをコードする具体的核酸分子に限定されるのではなく、機能的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むすべての核酸分子を包含する。これに関連して、本開示は、本開示の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にも関係する。
【０１２５】
いくつかの態様において、本願に開示するリポカリンムテインをコードする核酸分子、例えばDNAは、本明細書に開示する融合ポリペプチドの発現が可能になるように、本開示の免疫グロブリンをコードするもう一つの核酸分子に「機能的に連結」される。これに関連して、機能的連結とは、ある核酸分子の配列エレメントともう一つの核酸分子の配列エレメントとが単一ポリペプチドとしての融合ポリペプチドの発現を可能にするような形でつながれる連結である。
【０１２６】
本開示は、本開示の融合ポリペプチドまたはその中の任意のサブユニットをコードする核酸から出発し、遺伝子工学の方法を使って、本開示の融合ポリペプチドを生産するための方法にも関係する。いくつかの態様において、本方法はインビボで実行することができ、その場合、融合ポリペプチドは、例えば細菌宿主生物または真核宿主生物中で生産した後、この宿主細胞またはその培養物から単離することができる。本開示の融合ポリペプチドをインビトロで、例えばインビトロ翻訳系を使うことによって生産することも可能である。
【０１２７】
融合ポリペプチドをインビボで生産する場合は、そのようなポリペプチドをコードする核酸を、（既に上に概説したように）組換えDNA技術を使って、適切な細菌宿主生物または真核宿主性物に導入する。この目的のために、宿主細胞をまず、確立された標準的方法を使って、本明細書に記載する融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含むクローニングベクターで形質転換する。次に宿主細胞を、異種DNAの発現を可能にし、よって対応するポリペプチドの合成を可能にする条件下で、培養する。次に、細胞または培養培地からポリペプチドを回収する。
【０１２８】
本開示の一態様において、本方法は、融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子を、融合ポリペプチドに含まれるhTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の配列位置14、25〜34、36、48、52〜53、55〜58、60〜61、66、79、85〜86、101、104〜106、108、110〜112、114、121、140および153に対応する配列位置のうちの少なくとも1つ、場合によってはそれ以上をコードするヌクレオチドトリプレットにおける突然変異導入に供する工程を含む。
【０１２９】
加えて、融合ポリペプチドに含まれる本開示のhTlcムテインに関して、Cys61とCys153との間の天然のジスルフィド結合は除去しうる。したがってそのようなムテインは、還元的レドックス環境を有する細胞コンパートメントにおいて、例えばグラム陰性菌の細胞質において、生産することができる。
【０１３０】
本開示は、表示した実験的突然変異誘発の配列位置以外に追加の突然変異を含む、本開示のリポカリンムテインをコードする核酸分子も包含する。そのような突然変異は許容されることが多く、例えばそれらがムテインのフォールディング効率、血清中安定性、熱安定性またはリガンド結合親和性の改善に寄与するのであれば、有利であると判明する場合さえある。
【０１３１】
本願において開示する核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にするための1つ（または複数の）制御配列に「機能的に連結され」うる。
【０１３２】
DNAなどの核酸分子は、それが、転写制御および/または翻訳制御に関する情報を含有する配列要素を含み、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結され」ているのであれば、「核酸分子を発現する能力を有する」または「ヌクレオチド配列の発現を可能にする」能力を有するという。機能的連結とは、制御配列要素と発現すべき配列とが遺伝子発現を可能にするような形で接続されている連結である。遺伝子発現に必要な制御領域の正確な性質は種間で変動しうるが、一般にこれらの領域はプロモーターを含み、原核生物の場合、それは、プロモーターそのもの、すなわち転写の開始を指示するDNA要素と、RNAに転写されたときに翻訳開始のシグナルを出すことになるDNA要素との両方を含有する。そのようなプロモーター領域は通常、転写および翻訳の開始に関与する5'非コード配列、例えば原核生物における-35/-10ボックスおよびシャイン・ダルガノ配列、または真核生物におけるTATAボックス、CAAT配列、および5'キャッピング要素を含む。これらの領域は、エンハンサー要素またはリプレッサー要素、ならびにネイティブポリペプチドを宿主細胞の特定コンパートメントに導くための、翻訳されるシグナル配列およびリーダー配列も含むことができる。
【０１３３】
加えて、3'非コード配列は、転写終結、ポリアデニル化などに関与する制御要素を含有しうる。ただし、これらの終結配列が特定の宿主細胞において十分に機能しない場合には、それらをその細胞において機能的なシグナルで置換しうる。
【０１３４】
それゆえに、本開示の核酸分子は、プロモーター配列などの制御配列を含むことができる。いくつかの態様において、本開示の核酸分子はプロモーター配列および転写終結配列を含む。適切な原核生物プロモーターには、例えばtetプロモーター、lacUV5プロモーターまたはT7プロモーターなどがある。真核細胞における発現に有用なプロモーターの例は、SV40プロモーターまたはCMVプロモーターである。
【０１３５】
本開示の核酸分子は、ベクター、または他の任意の種類のクローニング媒体、例えばプラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、もしくは人工染色体の一部であることもできる。
【０１３６】
一態様では、核酸分子がファージミドに含まれる。ファージミドベクターとは、関心対象のcDNAに融合された、M13またはf1などの溶原性ファージの遺伝子間領域またはそれらの機能的部分をコードするベクターを表す。そのようなファージミドベクターと適当なヘルパーファージ（例えばM13K07、VCS-M13またはR408）とによる細菌宿主細胞の重感染後に、インタクトなファージ粒子が生産され、それによって、コードされている異種cDNAを、ファージ表面にディスプレイされたその対応ポリペプチドに物理的にカップリングすることが可能になる（Lowman, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1997, Rodi and Makowski, Curr Opin Biotechnol, 1999）。
【０１３７】
そのようなクローニング媒体は、上述の制御配列および本明細書に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸配列の他にも、発現に使用される宿主細胞に適合する種に由来する複製配列およびコントロール配列、ならびに形質転換細胞またはトランスフェクト細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含むことができる。当技術分野では数多くの適切なクローニングベクターが公知であり、市販されている。
【０１３８】
本明細書に記載する融合ポリペプチドをコードするDNA分子（例えば、SEQ ID NO:29〜36）、そして特に、そのようなポリペプチドのコード配列を含有するクローニングベクターは、当該遺伝子を発現させる能力を有する宿主細胞中に形質転換することができる。形質転換は標準的技法を使って行うことができる。したがって本開示は、本明細書に開示する核酸分子を含有する宿主細胞にも向けられる。
【０１３９】
形質転換細胞は、本開示の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養される。適切な宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）（E. coli）もしくは枯草菌（Bacillus subtilis）、または真核細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、SF9またはHigh5昆虫細胞、不死化哺乳動物細胞株（例えばHeLa細胞またはCHO細胞）または初代哺乳動物細胞であることができる。
【０１４０】
本明細書に開示する融合ポリペプチドに含まれるものを含む本開示のリポカリンムテインが分子内ジスルフィド結合を含む一部の態様において、適当なシグナル配列を使って、酸化性の酸化還元環境を有する細胞コンパートメントに新生ポリペプチドを向かわせることが好ましいであろう。そのような酸化性環境は、大腸菌などのグラム陰性菌のペリプラズムによって、またはグラム陽性菌の細胞外環境において、または真核細胞の小胞体の内腔において提供されうるものであり、通常は構造的ジスルフィド結合の形成に有利である。
【０１４１】
一部の態様において、宿主細胞の、好ましくは大腸菌の、サイトゾルにおいて本開示の融合ポリペプチドを生産することも可能である。その場合は、ポリペプチドを可溶性の折りたたまれた状態で直接的に得るか、封入体の形態で回収した後、インビトロで復元させることができる。さらなる選択肢は、酸化性の細胞内環境を有し、それゆえに、サイトゾルにおけるジスルフィド結合の形成を可能としうる、特別な宿主株の使用である（Venturi et al., J Mol Biol, 2002）。
【０１４２】
いくつかの態様において、本明細書に記載する本開示の融合ポリペプチドは、必ずしも遺伝子工学操作のみを使って作製または生産されなくてもよい。むしろ、メリフィールド固相ポリペプチド合成などの化学合成によって、またはインビトロ転写およびインビトロ翻訳によって、そのようなポリペプチドを得ることもできる。例えば、そのような融合ポリペプチドに含まれる有望な融合ポリペプチドおよび/またはリポカリンムテインを、分子モデリングを使って同定し、インビトロで合成し、関心対象の標的に対する結合活性について調べることが可能である。タンパク質の固相合成および/または液相合成のための方法は、当技術分野において周知である（例えばBruckdorfer et al., Curr Pharm Biotechnol, 2004参照）。
【０１４３】
別の一態様において、本開示の融合ポリペプチドは、当業者に公知の確立された方法を使用するインビトロ転写/翻訳によって生産されうる。
【０１４４】
本開示によって予期されるが本明細書に明示的には開示されていないタンパク質配列または核酸配列を持つ融合ポリペプチドを調製するのに有用な方法は、当業者には理解されるであろう。概略として、アミノ酸配列のそのような修飾には、一定の制限酵素のための切断部位を組み入れることによってポリペプチド遺伝子またはそのパーツのサブクローニングを簡単にするための、単一アミノ酸位置の指定突然変異導入が含まれる。加えて、融合ポリペプチドの標的（例えばPD-1およびLAG-3）に対する融合ポリペプチドの親和性をさらに改善するために、これらの突然変異を組み入れることもできる。さらにまた、必要であれば、フォールディング安定性、血清中安定性、タンパク質耐性または水溶性を改善するため、または凝集傾向を低減するためなど、ポリペプチドの一定の特徴を調節するために、突然変異を導入することができる。例えばジスルフィド架橋形成を防止するために天然のシステイン残基を他のアミノ酸に変異させることができる。
【０１４５】
本開示の融合ポリペプチドは、単純な有機合成戦略、固相支援合成技法などといった多くの従来型かつ周知の技法のいずれかによって、または市販の自動合成装置によって、調製しうる。その一方で、本開示の融合ポリペプチドは、従来の組換え技法だけによって、または従来の組換え技法を従来の合成技法と組み合わせることによって、調製することもできる。本開示による融合ポリペプチドは、本明細書の上記（A）章および（B）章において定義した化合物を組み合わせることによって得ることができる。
【０１４６】
この開示のさらなる目的、利点、および特徴は、限定を意図しない以下の実施例および添付するその図面を検討すれば、当業者には明白になるであろう。したがって、例示的態様および随意の特徴によって本開示を具体的に開示するが、当業者は、本明細書に開示する、そこに体現されている開示の変更態様および変形態様を採用することができ、そのような変更態様および変形態様はこの開示の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。
【実施例】
【０１４７】
V. 実施例
実施例1:代表的融合ポリペプチドの発現および分析
PD-1およびLAG-3に同時に会合するように、本発明者らは、SEQ ID NO:3および4によって与えられる重鎖および軽鎖を有するPD-1特異的抗体と、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:27のLAG-3特異的リポカリンムテインとを、構造化されていない（G4S）3リンカー（SEQ ID NO:2）を介して一つに融合することにより、いくつかの代表的抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドを作製した。作製されたさまざまなフォーマットを図1a〜eに示す。SEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテインのどちらか一方を、SEQ ID NO:3の重鎖およびSEQ ID NO:4の軽鎖で構成される抗体の4つの末部のうちのいずれか一つに融合することにより、上述の融合ポリペプチド（それぞれ、SEQ ID NO:5および4; SEQ ID NO:9および4、SEQ ID NO:6および4、SEQ ID NO:10および4; SEQ ID NO:3および7; SEQ ID NO:3および11、SEQ ID NO:3および8、ならびにSEQ ID NO:3および12）を作製した。抗体の重鎖または軽鎖のどちらか一方のN末にリポカリンムテインを融合した場合、リポカリンムテインはそのC末、リンカー配列（SEQ ID NO:2）の前に、2つの追加アミノ酸セリンおよびアスパラギン酸を含有した。SEQ ID NO:3の重鎖およびSEQ ID NO:4の軽鎖で構成されるPD-1特異的抗体は、インビトロおよびインビボでのIgG4半抗体交換を最小限に抑えるためにS228P突然変異を含有する操作されたIgG4バックボーンを有した（Silva et al., J Biol Chem, 2015）。加えて、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:27のLAG-3特異的リポカリンムテインを、構造化されていない（G4S）3リンカー（SEQ ID NO:2）を介して、SEQ ID NO:3のFc部分のC末に融合することによって、リポカリンムテインFc融合物も作製した。これら2つの異なるコンストラクトを図1に示す（SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42）。さらに図1f〜iは、PD-1に特異的な抗体（例えばSEQ ID NO:3および4の抗体またはSEQ ID NO:47および48の抗体）とLAG-3に特異的な1つまたは複数のリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテイン）とに基づいて作製された、さらなる融合ポリペプチドの設計と、そのようなポリペプチドの対応する配列を示している。
【０１４８】
融合ポリペプチドのコンストラクトを遺伝子合成によって作製し、哺乳類発現ベクター中にクローニングした。次にそれらを、Expi293F（商標）細胞（Life Technologies）中で一過性に発現させた。細胞培養培地中の融合ポリペプチドの濃度はForteBio Protein Aセンサー（Pall Corp.）で測定するか、またはPOROS（登録商標）プロテインAアフィニティーカラム（Applied Biosystems）を用いるHPLC（Agilent Technologies）によって測定した。
【０１４９】
同様に、PD-1およびLAG-3に同時に会合するように、それぞれSEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48によって与えられる重鎖および軽鎖を有するPD-1特異的抗体と、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:27のLAG-3特異的リポカリンムテインを、例えば構造化されていない（G4S）3リンカー（SEQ ID NO:2）を介して、一つに融合することができる。さまざまなフォーマットを作製することができる。必要な変更を加えて図1を参照されたい。そのようなさまざまなフォーマットは、SEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48のアミノ酸配列を重鎖および軽鎖として使用する点を除けば、それぞれSEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4によって与えられる重鎖および軽鎖を有するPD-1特異的抗体とSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:27のLAG-3特異的リポカリンムテインとを一つに融合する、PD-1-LAG-3抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドについて上述したとおり、同様に作製することができる。
【０１５０】
具体的に述べると、図1は、PD-1に特異的な別の抗体（例えばSEQ ID NO:47および48の抗体）とLAG-3に特異的な1つまたは複数のリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:17のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:27のリポカリンムテイン）とを使って、本明細書に記載の方法と同じ方法によって作製することができる、さらなる代表的融合ポリペプチドを示している。図1に示すPD-1特異的抗体の重鎖または軽鎖のどちらか一方のC末またはN末のどちらか一方にリポカリンムテインを遺伝子融合することで、SEQ ID NO:51および48、SEQ ID NO:55および48、SEQ ID NO:52および48、SEQ ID NO:56および48、SEQ ID NO:47および53、SEQ ID NO:47および57、SEQ ID NO:47および54、ならびにSEQ ID NO:47および58の融合ポリペプチドを得た。
【０１５１】
プロテインAクロマトグラフィーを使用し、続いてリン酸緩衝食塩水（PBS）中でサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を行うことにより、融合ポリペプチドを精製した。SEC精製後に、単量体型タンパク質を含有するフラクションをプールし、分析用SECを使って再び分析する。プロテインA精製後の1リットルに外挿したコンストラクトの力価は、下記の表1に記載するとおりである。融合ポリペプチドの発現は、抗体の場合と同じ範囲にある。
【０１５２】
（表１）Expi293F（商標）細胞における一過性発現に関する発現力価
1リットル発現スケールに外挿
2018526989.tif 000030
【０１５３】
実施例2:酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）におけるPD-1に対する融合ポリペプチドの結合
本発明者らは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）アッセイを使って、組換えヒトPD-1-His（C末ポリヒスチジンタグを持つPD-1、ACROBiosystems）に対する融合ポリペプチドの結合力価を決定した。PBS中、濃度1μg/mLのPD-1-Hisを、マイクロタイタープレート上に4℃で一晩コーティングした。PBS-0.05％T（0.05％（v/v）Tween 20を補足したPBS）で洗浄した後、プレートを、PBS-0.1％T（0.1％（v/v）Tween 20を補足したPBS）中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングした。100μLのPBS-0.05％Tで5回洗浄した後、ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）または融合ポリペプチドを様々な濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートしてから、もう1度洗浄工程を行った。PBS-0.1％T-2％BSA中で1:5000希釈抗ヒトIgG Fc-HRP（Jackson Laboratory）と共にインキュベートした後、結合した抗体/研究対象の融合ポリペプチドを検出した。さらなる洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
【０１５４】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィットから得られたフィット曲線（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）と共に、図2に示す。結果として得られたEC50値を表2に掲載する。観察されたEC50値は、試験したすべての分子で、よく似ており、融合ポリペプチドに含まれるPD-1特異的抗体（SEQ ID NO:3および4）と同等であった。融合ポリペプチドに含める場合、記載のPD-1特異的抗体は、抗体の4つの末部のいずれか一つにおいてリポカリンムテインと融合させることができ、それでもなおPD-1に結合することを、この実験は示している。
【０１５５】
（表２）PD-1結合に関するELISAデータ
2018526989.tif 000031
【０１５６】
実施例3:ELISAにおけるLAG-3に対する融合ポリペプチドの結合
本発明者らは、ELISAアッセイを使って、組換えLAG-3-His（ACROBiosystems）に対する抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチド、Fc-リポカリンムテイン融合ポリペプチド（SEQ ID NO:41およびSEQ ID NO:42）ならびにSEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:27の親リポカリンムテインの結合力価を決定した。融合ポリペプチド/リポカリンムテインをPBSに希釈し（1μg/mL）、マイクロタイタープレート上に4℃で一晩コーティングした。プレートは、各インキュベーション工程後に100μLのPBS-0.05％Tで5回、洗浄した。プレートを、PBS-0.1％T中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングしてから、洗浄した。単量体型のLAG-3特異的リポカリンムテイン（SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:27）、または抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチド、またはFc-リポカリンムテインポリペプチドをさまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、もう1度洗浄工程を行った。1時間のインキュベーション後に、PBS-0.1％T-2％BSA中の、HRPにコンジュゲートされたポリクローナル1:2000希釈抗Tlc抗体を、室温で1時間加えた。さらなる洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。また、別個の実験として、他の点では同一であるELISAアッセイにおいて、1:5000希釈抗ヒトIgG Fc-HRP（Jackson Laboratory）を加えた。
【０１５７】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィットから得られたフィット曲線（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）と共に、図3に示す。結果として得られたEC50値を表3に示す。試験した分子のEC50値はどちらの検出方法でも同等であった。同じリポカリンムテインをポリペプチド中に含めた場合、LAG-3に対する結合力価は、融合フォーマットが異なっても互いに同等であり、それぞれの親リポカリンムテインとも同等であった。SEQ ID NO:43を陰性対照としたが、これは、LAG-3への結合を示さなかった（データ省略）。リポカリンムテインは、上述の融合ポリペプチドに含める場合に、LAG-3に対する活性を失うことなく、抗体の4つの端部に融合させうることを、この実験は示している。
【０１５８】
（表３）LAG-3結合に関するELISAデータ
2018526989.tif 000032
【０１５９】
実施例4:PD-1およびLAG-3を発現する細胞に結合する融合ポリペプチドの蛍光活性化細胞選別（FACS）分析
本発明者らは、ヒトPD-1（CHO-huPD-1）またはヒトLAG-3（CHO-huLAG-3）がそれぞれ安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞への融合ポリペプチドの特異的結合を陰性対照と比較して評価するために、蛍光活性化細胞選別（FACS）研究を使用した。細胞株は、Flp-Inシステム（Invitrogen）を製造者の説明に従って使用することにより、作製した。モックトランスフェクトFlp-In CHO細胞を陰性対照とした。
【０１６０】
トランスフェクトCHO細胞は、10％ウシ胎仔血清（FCS、Biochrom）と500μg/mlハイグロマイシンB（Roth）とを補足したハムF12培地（Invitrogen）中で維持した。細胞は、製造者の説明に従い、標準条件下（37℃、5％CO2雰囲気）、細胞培養フラスコ中で培養した。継代培養またはFACS実験のために接着細胞を解離させるには、Accutase（PAA Laboratories）を製造者の説明に従って使用した。
【０１６１】
この実験を行うために、PD-1陽性および陰性対照Flp-In CHO細胞、ならびにLAG-3陽性および陰性対照Flp-In CHO細胞を、融合ポリペプチドと共にインキュベートし、結合した融合ポリペプチドを、以下に説明するとおりFACS分析において蛍光標識抗リポカリンムテイン抗体を使用することによって検出した。
【０１６２】
5％ウシ胎仔血清を含有する氷冷PBS（PBS-FCS）中で、1ウェルあたり2.5×104個の細胞を1時間プレインキュベートした。次に、典型的には250〜0.001nMの範囲にある融合ポリペプチド、リポカリンムテインおよび陰性対照の希釈系列を細胞に加え、氷上で1時間インキュベートした。細胞を300×gでの遠心分離を使って氷冷PBS中で2回洗浄し、次に蛍光色素Alexa488（Pieris）で標識されたウサギ抗Tlc抗体と共に氷上で30分インキュベートした。次に細胞を洗浄し、IQueフローサイトメーター（Intellicyte）を使って分析した。蛍光強度の幾何平均を最大平均に対して正規化し、GraphPadソフトウェアを使って、EC50値を自由パラメータとし傾きを1に固定した1:1結合モデルでフィットさせた。
【０１６３】
SEQ ID NO:5および4、SEQ ID NO:6および4、SEQ ID NO:3および7、ならびにSEQ ID NO:3および8に関する例示的データを図4および表4に示す。抗PD-1抗体重鎖のN末へのリポカリンムテインの融合（SEQ ID NO:6および4）は、PD-1に対する抗体の結合力価を低減するようであるが、他の融合部位は、細胞上に発現したヒトPD-1に対する結合を変化させない。LAG-3に対するSEQ ID NO:5および4のEC50が向上しているのは、アビディティ効果によるのかもしれない。予想どおり、陰性対照は、細胞上に発現したヒトPD-1にも細胞上に発現したヒトLAG-3にも結合しなかった（データ省略）。
【０１６４】
（表４）huPD-1およびhuLAG-3への結合に関するFACSデータ
2018526989.tif 000033
【０１６５】
実施例5:ELISAに基づく同時標的結合の証明
PD-1およびLAG-3への融合ポリペプチドの同時結合を証明するために、二重結合ELISAフォーマットを使用した。PBS中の組換えPD-1-His（ACROBiosystems）（1μg/mL）をマイクロタイタープレートに4℃で一晩コーティングした。プレートは、各インキュベーション工程後に100μLのPBS-0.05％Tで5回、洗浄した。プレートを、PBS-0.1％T中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングしてから、再び洗浄した。さまざまな濃度の融合ポリペプチドをウェルに加え、室温で1時間インキュベートしてから、洗浄工程を行った。次に、ビオチン化ヒトLAG-3-Fc（R&D Systems）をPBS-0.1％T-2％BSA中、2μg/mLの定濃度で、1時間加えた。洗浄後に、PBS-0.1％T-2％BSA中のExtravidin-HRP（Sigma-Aldrich）の1:5000希釈液をウェルに加え、1時間インキュベートした。さらなる洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
【０１６６】
融合ポリペプチドの二重結合データを、1:1結合シグモイドフィットから得られたフィット曲線（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）と共に、図5に示す。EC50値を表5に要約する。すべての融合ポリペプチドが明白な結合シグナルを示したことから、融合ポリペプチドはPD-1およびLAG-3に同時に会合できることが証明された。ただし、N末重鎖融合物（SEQ ID NO:6および4ならびにSEQ ID NO:10および4）は他のフォーマットと比較してEC50が2分の1であるから、抗体上のリポカリンムテインの付着位置は、この二重結合フォーマットにおけるEC50に影響する。
【０１６７】
（表５）PD-1とLAG-3の両方への同時標的結合に関するELISAデータ
2018526989.tif 000034
【０１６８】
実施例6:ヒトLAG-3に対する融合ポリペプチドと主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII発現細胞との競合的結合のFACS分析
所与の融合ポリペプチドが主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII陽性細胞上のMHCクラスIIへのLAG-3結合を妨害するかどうかを評価するために、競合FACS実験を利用した。この実験では、定濃度のヒトLAG-3-Fc融合物（huLAG-3-Fc、R&D system）と、融合ポリペプチドの希釈系列とを、MHCクラスII陽性ヒト細胞株A375と共にインキュベートし、蛍光標識抗IgG Fc抗体を使って、細胞に結合したhuLAG-3-Fcを検出した。このアッセイでは、huLAG-3とそのリガンドMHCクラスIIとの結合を妨害する競合的リポカリンムテインが、MHCクラスII陽性細胞株A375へのhuLAG-3-Fc結合の低減をもたらす。
【０１６９】
黒色腫細胞株A375は10％ウシ胎仔血清（FCS、Biochrom）を補足したDMEM培地（Invitrogen）に維持した。細胞は、製造者の説明に従い、標準条件下（37℃、5％CO2雰囲気）、細胞培養フラスコ中で培養した。継代培養またはFACS実験のために接着細胞を解離させるには、Accutase（PAA Laboratories）を製造者の説明に従って使用した。
【０１７０】
FACSアッセイのために、1ウェルあたり5×104個のA375細胞をPBS-FCS中で1時間インキュベートした後、3nM huLAG-3-Fcと、さまざまな濃度の融合ポリペプチドとを加えた。細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、PBS-FCSに再懸濁し、フィコエリトリン標識抗ヒトIgG Fc抗体（Jackson Immunologics）と共に氷上で30分インキュベートした。次に細胞を洗浄し、Intellicyt IQueフローサイトメーター（Intellicyt）を使って分析した。A375細胞へのhuLAG-3-Fc結合によって生じた蛍光データを、Forecytソフトウェアを使って分析し、その結果得られた幾何蛍光平均を、huLAG-3-Fc最大結合に対して正規化した。huLAG-3-Fc結合のパーセントはGraphpadソフトウェアを使ってプロットし、フィットさせた。選択された競合結合曲線を図6に掲載する。このデータは、試験した抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドおよびFc-リポカリンムテイン融合ポリペプチドが、huLAG-3の、ヒトMHCクラスII発現細胞上のそのリガンドMHCクラスIIへの結合と、競合することを示している。LAG-3/MHCクラスII分子結合に対する融合ポリペプチドの阻害効果は、リファレンスLAG-3モノクローナル抗体（SEQ ID NO:49および50）と同等な濃度で現れた。LAG-3に結合しなかった陰性対照hIgG4（Sigma）およびリポカリンムテイン（SEQ ID NO:43）は、競合を何も示さなかった。図6参照。
【０１７１】
実施例7:ヒト末梢血単核球（PBMC）を使ったT細胞活性化の評価
本発明者らは、LAG-3およびPD-1とそれぞれのリガンドとの間の相互作用を遮断することによって負のチェックポイント分子LAG-3およびPD-1の阻害シグナリングを打ち消す融合ポリペプチドの能力を評価するために、T細胞アッセイを使用した。この目的のために、融合ポリペプチドをブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）刺激ヒトヒト末梢血単核球（PBMC）にさまざまな濃度で加え、37℃で3日間インキュベートした。読み出し情報として、上清中の、分泌されたIL-2およびIFN-γのレベルを評価した。
【０１７２】
ポリスクロース密度勾配（Biocoll 1.077g/mL、Biochrom）による遠心分離をBiochromのプロトコールに従って行うことにより、健常ボランティアドナーのPBMCをバフィーコートから単離した。精製されたPBMCを90％FCSと10％DMSOとからなる緩衝液に再懸濁し、液体窒素を使って直ちに凍結し、さらなる使用時まで液体窒素中に貯蔵した。アッセイのために、PBMCを16時間融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中で培養した。
【０１７３】
以下の手順を実験条件ごとに三連で行った。
【０１７４】
平底組織培養プレートの各ウェルにおいて、SEBをさまざまな濃度で補足した培養培地またはSEBを補足していない培養培地中で、1×105個のPBMCをインキュベートした。次に、融合ポリペプチドを、2つの異なる濃度、すなわち150nMまたは2000nMでウェルに加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。読み出し情報として、上清中の、IL-2およびIFN-γのレベルを評価した。
【０１７５】
細胞培養上清中のヒトIL-2およびヒトIFN-γを、R&D SystemsのIL-2およびIFN-γ DuoSetキットを使って定量した。
【０１７６】
以下の手順はIL-2定量を説明している。IFN-γ定量にも、特異的IFN-γ抗体を用いて同じ手順を使用した。
【０１７７】
第1の工程では、PBS中の1μg/mL「ヒトIL-2 Capture Antibody」（R&D Systems）を使って、384ウェルプレートを室温で2時間、コーティングした。次に、80μLのPBS-0.05％Tでウェルを5回洗浄した。1％カゼイン（w/w）を追加したPBS-0.05％T中で1時間のブロッキングを行った後、プールした上清、および培養培地に希釈したIL-2標準の濃度系列を、384ウェルプレート中、4℃で一晩、インキュベートした。捕捉されたIL-2の検出および定量が可能になるように、0.5％カゼインを含有するPBS-T中の、100ng/mLヤギ抗hIL-2-Bio検出抗体（R&D Systems）と1μg/mL Sulfotag標識ストレプトアビジン（Mesoscale Discovery）との混合物を加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に、25μLの読み取り緩衝液を各ウェルに加え、Mesoscale Discoveryリーダーを使って、各ウェルの電気化学ルミネセンス（ECL）シグナルを読み取った。分析および定量はMesoscale Discoveryソフトウェアを使って行った。
【０１７８】
代表的実験の結果を図7に示す。これは、融合ポリペプチド（SEQ ID NO:5および4）によって誘導されるIL-2分泌レベルの増加を示している。融合ポリペプチドは、ベンチマーク抗体/リポカリン-Fcムテインカクテル（SEQ ID NO:3および4ならびにSEQ ID NO:41）、融合ポリペプチドに含まれるPD-1特異的ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）、またはリポカリン-Fcムテインよりも改善されたサイトカイン分泌を示す。hIgG4（Sigma）の陰性対照は、基礎活性と比べて、T細胞によるIL-2のさらなる産生を、ほとんど誘導しない。
【０１７９】
実施例8:LAG-3およびPD-1リガンドを発現するA375腫瘍細胞を用いた機能的T細胞活性化アッセイ
本発明者らは、LAG-3およびPD-1とそれぞれのリガンドとの間の相互作用を遮断することによって負のチェックポイント分子LAG-3およびPD-1の阻害シグナリングを打ち消す融合ポリペプチドの能力を評価するために、さらにもう一つのT細胞アッセイを使用した。本発明者らは、PHAで前もって刺激されたT細胞に、LAG-3のリガンドであるMHCIIとPD-1のリガンドであるPD-L1とを発現する黒色腫細胞株A375の存在下で、さまざまな濃度の融合ポリペプチドを適用し、次に37℃で3日間インキュベートした。読み出し情報として、本発明者らは、上清中の、分泌されたIL-2およびIFN-γのレベルを評価した。
【０１８０】
ポリスクロース密度勾配（Biocoll 1.077g/mL、Biochrom製）による遠心分離をBiochromのプロトコールに従って行うことにより、健常ボランティアドナーのヒト末梢血単核球（PBMC）をバフィーコートから単離した。結果として得られたPBMCから、Pan T細胞精製キット（Miltenyi Biotec GmbH）と製造者のプロトコールとを使って、Tリンパ球を単離した。精製されたT細胞を90％FCSと10％DMSOとからなる緩衝液に再懸濁し、液体窒素を使って直ちに凍結し、さらなる使用時まで液体窒素中に貯蔵した。
【０１８１】
アッセイのために、T細胞を16時間融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中で培養した。次に、T細胞を2×106細胞/mlの密度に設定し、培養培地中の5μg/ml PHA-P（Sigma Aldrich）で48時間刺激した。
【０１８２】
以下の手順を実験条件ごとに三連で行った。
【０１８３】
黒色腫細胞株A375を1ウェルあたり5×104細胞の密度でプレーティングし、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で一晩、接着させた。標的細胞は、前もって標準的条件下で成長させ、Accutase（PAA Laboratories）を使って剥離し、培養培地に再懸濁しておいた。
【０１８４】
次に、腫瘍細胞の増殖を阻止するために、腫瘍細胞を、濃度30μg/mlのマイトマイシンC（Sigma Aldrich）により、37℃で1時間処理した。プレートをPBSで2回洗浄し、各ウェルに、PHAで前もって刺激されたT細胞懸濁液100μL（5×104個のT細胞に相当）、選択された融合ポリペプチド（SEQ ID NO:5および4）、抗体/リポカリンムテインカクテル、PD-1特異的ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）、または陰性対照を、1nM〜100nMの範囲の濃度で加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。
【０１８５】
次に、上清中のIL-2およびIFN-γのレベルを、実施例7においてIFN-γ分泌について述べたように評価した（IL-2分泌に関するデータは示していない）。
【０１８６】
例示的データを図8に示す。これらのデータは、PD-1およびLAG-3二重特異性融合ポリペプチドで処理することによるIFN-γ分泌レベルの明らかな増加を示している。
【０１８７】
実施例9:融合ポリペプチドの安定性評価
総合的安定性の一般指標としての融解温度（Tm）を決定するために、PBS（Gibco）中でタンパク質濃度が1mg/mLの融合タンパク質を、キャピラリーnanoDSC計器（CSC6300、TA Instruments）を用い、1℃/分で走査（25〜100℃）した。Tmは、表示されたサーモグラムから、統合Nano Analyzeソフトウェアを使って算出した。
【０１８８】
結果として得られた融合ポリペプチドのTmおよび融解開始温度を下記表6に列挙する。融合ポリペプチドはいずれもリファレンス抗体（SEQ ID NO:3および4）と同じ範囲のTmおよび融解開始温度を有する。
【０１８９】
（表６）nanoDSCによって決定された融合ポリペプチドの融解温度（Tm）および融解開始温度
2018526989.tif 000035
【０１９０】
貯蔵安定性を評価するために、PBS中、1mg/mLの濃度で、融合ポリペプチドを37℃で1週間インキュベートした。活性な融合ポリペプチドを定量ELISA（qELISA）において測定した。単量体型タンパク質を分析用サイズ排除クロマトグラフィーで測定した。SEQ ID NO:5および4、SEQ ID NO:6および4、SEQ ID NO:3および7、ならびにSEQ ID NO:3および8に関する例示的データを表8に示す。
【０１９１】
タンパク質活性をアッセイするために、実施例5に記載の同時結合ELISAを適用した。
【０１９２】
標準タンパク質希釈液による検量線を調製した。各試料について、検量線の直線範囲内にある3つの異なる独立した希釈液を調製した。希釈液にはPBS-0.1％T-2％BSAを使用し、場合によってはこれに1％ヒト血漿を補足した。各試料について、同じマトリックス中、同じ濃度において、-20℃で貯蔵した非ストレス負荷試料を比較の基準にして、活性の回収百分率を検量線から算出した。
【０１９３】
分析用サイズ排除クロマトグラフィーは、Superdex 200, 3.2/300 Increaseカラム（GE Healthcare）を2本直列にしたAgilent HPLCシステムで行い、溶離液としてPBS（Gibco）を0.3mL/分の流速で使用した。単量体の回収百分率は、-20℃で凍結した非ストレス負荷リファレンス試料を比較の基準にして、各試料の単量体ピーク面積によって決定した。
【０１９４】
さらに血漿における貯蔵安定性を評価するために、濃度0.5mg/mLの融合ポリペプチドを、ヒト血漿中、37℃で1週間インキュベートした。活性な融合ポリペプチドを、記載のとおり、定量ELISAで測定した。
【０１９５】
（表８）qELISAにおける活性および分析用SECにおける単量体含量（PBS中で保存した試料のみ）の回収率によって評価した、PBS中またはヒト血漿（HPL）中、37℃で1週間の貯蔵後の安定性: qELISAにおいて安定＝100±15％; aSECにおいて安定＝100±5％;リファレンスを含むすべての試料で、少なくとも99面積パーセントの単量体含量が検出された
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【０１９６】
本明細書に例示的に記載した態様は、本明細書において具体的に開示しない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の限定が存在しなくても、適切に実施しうる。したがって例えば「含む（comprising）」、「包含する（including）」、「含有する（containing）」などの用語は、拡大的、非限定的に解釈されるべきである。加えて、本明細書において使用する用語および表現は、説明のために使用されているのであって、限定のために使用されているのではなく、そのような用語および表現の使用には、示され記載された特徴またはその部分のいずれの等価物も排除しようという意図はなく、さまざまな変更態様が本願発明の範囲内で可能であると認識される。したがって、本態様を好ましい態様および随意の特徴によって具体的に開示したが、当業者はその変更態様および変形態様を採ることができ、そのような変更態様および変形態様は本発明の範囲内にあるとみなされると理解すべきである。本明細書において記載した特許、特許出願、教科書および査読付き刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。さらにまた、参照により本明細書に組み入れられた参考文献における用語の定義または用法が、本明細書に掲載した当該用語の定義と一致しないか相反する場合は、本明細書に掲載した当該用語の定義が適用され、参考文献における当該用語の定義は適用されない。一般的開示に含まれる狭い種概念および下位類概念群のそれぞれも、本発明の一部を形成する。これには、削除された事項が本明細書に具体的に陳述されているかどうかに関わらず、類概念から任意の内容を除去するただし書きまたは消極的限定の付いた本発明の一般的記述が包含される。加えて、特徴がマーカッシュ群で記載される場合、それによって本開示がそのマーカッシュ群の任意の個々の要素または任意の要素の部分群についても記載されることは、当業者にはわかるであろう。さらなる態様は、以下の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０１９７】
等価物:当業者は、本明細書に記載した本発明の具体的態様に対する多くの等価物を認識し、または通常行われる程度の実験を用いて確かめることができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。この明細書において言及した刊行物、特許および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることを具体的かつ個別に示されたかのように、それと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９８】
非特許文献
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2018526989.tif 000038
2018526989.tif 000039
2018526989.tif 000040
【図１ａ】
2018526989.tif 000047
【図１ｂ】
2018526989.tif 000048
【図１ｃ】
2018526989.tif 000049
【図１ｄ】
2018526989.tif 000050
【図１ｅ】
2018526989.tif 000051
【図１ｆ】
2018526989.tif 000052
【図１ｇ】
2018526989.tif 000053
【図１ｈ】
2018526989.tif 000054
【図１ｉ】
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【図２】
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【図３Ａ】
2018526989.tif 000057
【図３Ｂ】
2018526989.tif 000058
【図３Ｃ】
2018526989.tif 000059
【図３Ｄ】
2018526989.tif 000060
【図４Ａ】
2018526989.tif 000061
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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