(57)【要約】  本発明は、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１又は２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１又は２）、γ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１又は２）及びγ−アマニチン（４）の新規な誘導体、並びにこれらを合成する方法及び合成に用いられる新規な構築ブロックに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＣＨ3−ＣＨ（ＯＲ1）−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ（ＮＨＲ2）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ3（構造６）を有する化合物であって、式中のＲ1〜Ｒ3が保護基であり、Ｒ2が開裂する可能性のある条件下でＲ1及びＲ3は安定であり、Ｒ3が開裂する可能性のある条件下で、特にＲ1がアルカノイル、具体的にはアセチル又はＣＨ3ＣＯＣＨ2ＣＯ−であり、Ｒ2がＦｍｏｃであり、且つＲ3がベンジル又はｔ−ブチルである場合に、Ｒ1及びＲ2は安定である、化合物。
【請求項２】
構造６＊
【化１】
2018536666.tif 000045
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（ａ）構造５の化合物を、銅又はホウ素で、特に９−ボラビシクロ［３，３，１］ノナン（９−ＢＢＮ）で錯化する工程と；（ｂ）４−ヒドロキシ基を、化合物Ｒ1’−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ（式中、Ｘは脱離基であり、具体的には式中のＲ1’がアルキル、具体的にはＣ1-6アルキル、具体的にはメチルである）でアシル化する工程と；（ｃ）金属錯体を開裂する工程と；（ｄ）α−アミノ基を、Ｒ2基で、具体的にはＦｍｏｃ基で保護する工程と；（ｅ）カルボキシル基を、Ｒ3基で、具体的にはベンジル基又はｔ−ブチル基で保護する工程と；を含む、構造６（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＣＨ3−ＣＨ（ＯＲ1）−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ（ＮＨＲ2）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ3の化合物の合成方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の化合物と；アマトキシン又はその前駆体を合成するための少なくとも１つの追加的な試薬と；を含むキット。
【請求項５】
（ａ１）請求項１に記載の化合物から保護基Ｒ2を開裂させる工程と；（ａ２）工程（ａ１）に従って得られた遊離アミノ基を含む、６の脱保護変種を、ヒドロキシプロリンの活性化変種、その保護変種、又はそのシントン、あるいは特に、７、８及びＬから選択される構造の化合物に、共役させる工程と；を含む、アマトキシン又はその前駆体分子の合成方法
【化２】
2018536666.tif 000046
。
【請求項６】
γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１又は２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１又は２）、及びγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１又は２）である、化合物
【化３】
2018536666.tif 000047
【化４】
2018536666.tif 000048
【化５】
2018536666.tif 000049
。
【請求項７】
γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）、又はγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）と標的結合部分との複合体であって、前記複合体に任意で含まれるリンカー部分が、一方の側にて、前記γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）若しくはγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）中に存在する位置又は官能性基に連結され、且つもう一方の側にて、前記標的結合部分中に存在する位置又は官能性基に連結される、複合体。
【請求項８】
γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）、又はγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）と;結合部分と;の複合体であって、前記結合部分が、一方の側にて、前記γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）若しくはγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１又ｌは２）中に存在する位置又は官能性基に連結され、且つ前記複合体が、標的結合部分中に存在する位置又は官能性基に直接的に若しくは間接的に連結しうる位置又は官能性基を更に含む、複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１又は２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１又は２）、γ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１又は２）及びγ−アマニチン（４）の新規な誘導体、並びにこれらを合成する方法及び合成に用いられる新規な構築ブロックに関する。
【化１】
2018536666.tif 000003
【化２】
2018536666.tif 000004
【化３】
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【化４】
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【背景技術】
【０００２】
アマトキシンは、タマゴテングダケ（Amanita phalloides）マッシュルーム（図１を参照）に見出される８種のアミノ酸から構成される環状ペプチドである。アマトキシンは、哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それにより、更には影響の及んだ細胞に対しても転写及びタンパク質生合成を特異的に阻害する。細胞において転写が阻害されると、成長及び増殖が止む。アマニチンとＲＮＡ−ポリメラーゼＩＩとの複合体（complex）は、共有結合されていないが、極めて解離しづらい（ＫD＝３ｎＭ）。この酵素からアマニチンが解離するプロセスは極めて低速であるので、影響を受けた細胞が回復する見込みは殆どゼロである。転写の阻害があまりにも長時間にわたると、細胞はプログラムされた細胞死（アポトーシス）を経ることになる。
【０００３】
腫瘍治療用の細胞毒性部分としてのアマトキシンの用途は、１９８１年に、Ｔｒｐのインドール環に付着したリンカーを用い（図１：アミノ酸４を参照）、ジアゾ化により（Davis & Preston, Science 213 (1981) 1385-1388）、抗Ｔｈｙ１．２抗体をα−アマニチンに共役させることによって、既に探究されてきた。Davis & Prestonによって、７’位が付着部位として同定されただけでなく、７’位における置換によって細胞毒性活性を維持する誘導体が生ずることも十分に実証された（Morris & Venton, Int. Peptide Protein Res. 21 (1983) 419-430）。
【０００４】
特許出願（欧州特許出願公開第１，８５９，８１１（Ａ１）号明細書（２００７年１１月２８日発行）には、β−アマニチンのアマトキシンアミノ酸１のγＣ原子を、アルブミンに、又はモノクローナル抗体ＨＥＡ１２５、ＯＫＴ３、又はＰＡ−１に直接的に（すなわち、リンカー構造を介さずに）共役する複合体が記載された。そのうえ、これらの複合体（conjugate）が乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）、及びＴリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の増殖に及ぼす阻害効果も明らかにされた。リンカーの用途（例えば、アミド部分、エステル部分、エーテル部分、チオエーテル部分、ジスルフィド部分、尿素部分、チオ尿素部分、炭化水素部分などのような要素を含むリンカー）が提示されている。ただし、そのような構築体は実際に示されておらず、更なる詳細（例えば、アマトキシン上の付着部位）については述べられていない。
【０００５】
特許出願（国際公開第２０１０／１１５６２９号及び国際公開第２０１０／１１５６３０号）は、両方とも２０１０年１０月１４日に公開されたものであり、例えば抗ＥｐＣＡＭ抗体（ヒト化抗体ｈｕＨＥＡ１２５等）のような抗体が、（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ原子を介して（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’Ｃ原子を介して、又は（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ原子を介して、各事例において直接的にあるいは抗体とアマトキシンとの間のリンカーを介して、アマトキシンに共役される複合体について記載している。提示されているリンカーは、アミド部分、エステル部分、エーテル部分、チオエーテル部分、ジスルフィド部分、尿素部分、チオ尿素部分、炭化水素部分などのような要素を含む。そのうえ、これらの複合体が、乳癌細胞（細胞系統ＭＣＦ−７）、膵癌（細胞系統Ｃａｐａｎ−１）、大腸癌（細胞系統Ｃｏｌｏ２０５）、及び胆管癌（細胞系統ＯＺ）の増殖に及ぼす阻害効果が、明らかにされた。
【０００６】
アマトキシンは、採取されたタマゴテングダケ（Amanita phalloides）マッシュルーム子実体から、又は純粋な培養物から単離可能である（Zhang P, Chen Z, Hu J, Wei B, Zhang Z、及びHu W, Production and characterization of Amanitin toxins from a pure culture of Amanita exitialis, FEMS Microbiol Lett. 2005 Nov 15;252(2):223-8.Epub 2005 Sep 15）。しかしながら、得ることの可能なアマトキシンの量はかなり少量（天然子実体由来の乾燥物約０．３〜３ｍｇ／ｇの範囲、純粋な培養物由来の乾燥物の約１０％）であり、天然起源のアマトキシンの変種を更に改質するための柔軟性は、限定されている（［０００３］〜［０００５］に記載されている参考文献、及びその段落に引用されている参考文献を参照のこと）。
【０００７】
代わりに、担子菌を用いた発酵によって、アマトキシンを得ることもできる（Muraoka S,及びShinozawa T., Effective production of amanitins by two-step cultivation of the basidiomycete, Galerina fasciculata GF-060, J Biosci Bioeng. 2000;89(1):73-6; the reported yield was about 5 mg/l culture) or A. fissa (Guo XW, Wang GL, and Gong JH, Culture conditions and analysis of amanitins on Amanita spissa, Wei Sheng Wu Xue Bao. 2006 Jun;46(3):373-8; the reported yield was about 30μg/l culture）。繰り返しになるが、天然起源のアマトキシンは収量が低く、アマトキシン変種を更に改質するための柔軟性も限定されている。
【０００８】
最後に、アマトキシンは、部分的又は完全な合成によって調整されてきた（例えば、Zanotti G, Mohringer C, and Wieland T., Synthesis of analogues of amaninamide, an amatoxin from the white Amanita virosa mushroom, Int J Pept Protein Res. 1987 Oct;30(4):450-9; Zanotti G, Wieland T, Benedetti E, Di Blasio B, Pavone V, and Pedone C., Structure-toxicity relationships in the amatoxin series.Synthesis of S-deoxy[gamma(R)-hydroxy-Ile3]-amaninamide, its crystal and molecular structure and inhibitory efficiency, Int J Pept Protein Res. 1989 Sep;34(3):222-8; Zanotti G, Petersen G, and Wieland T., Structure-toxicity relationships in the amatoxin series.Structural variations of side chain 3 and inhibition of RNA polymerase II, Int J Pept Protein Res. 1992 Dec;40(6):551-8; Zhao et al., Synthesis of a Cytotoxic Amanitin for Biorthogonal Conjugation, ChemBioChem 16 (2015) 1420 - 1425）。
【０００９】
注目すべきことに、Zanotti et al., 1989（loc. cit.）には、生物学的に不活性なＳ−デオキソ−γ（Ｒ）−ヒドロキシ−イソロイシン−アマニンアミドの合成に関してレポートされている。しかしながら、活性エナンチオマーの合成に成功していないことは明らかである。
【００１０】
しかも、Zhao et al.（loc. cit）は、４（Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン由来のγ−アマニンアミド誘導体の合成に関してもレポートしている。しかしながら、著者らが突き止めたように、結果として得られるγ−アマニンアミド誘導体の毒性は無視できる程度であり、このことは、そのようなγ−アマニンアミド系構造の更なる開発に対する阻害要因（taught away）となる。
【００１１】
アマトキシンへの完全な合成経路を使用することによって、治療用途に必要とされるより多量のアマトキシン供給の選択肢を得ることができ、構築ブロックとして適切な出発材料を使用して種々の新規なα−又はβ−アマトキシン変種を構築することが可能となる。しかしながら、不可欠なビルディングブロック、γ，δ−ジヒドロキシイソロイシン、又はそれらのためのシントンが、純粋なジアステレオマーとして利用できなかったのが実情であることから、過去に模索された手法は制限されていた。国際公開第２０１４／００９０２５号には、γ，δ−ジヒドロキシイソロイシン用の新規なシントンが記載され、このシントンがアマトキシン合成に有用であることが述べられているが、にもかかわらず、そのような手法はコストが高くつくばかりでなく多大な労力も要する。
【００１２】
ゆえに、費用効果に優れ且つ堅牢なアマトキシン合成方法に対する絶大なニーズが、依然として存在していた。特に、α−及びβ−アマニチンを主成分とするアマトキシン複合体に取って代わる代替物に対する需要が熾烈化しているが、今までのところ、完璧な合成手段は全く同定されていない。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、入手の容易な（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−Ｌ−４−ヒドロキシイソロイシン（５）
【化５】
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が、直交的保護戦略（orthogonal protection strategy）によって保護可能であり、且つγ−ヒドロキシイソロイシンをアミノ酸３として有するアマトキシンの合成に利用可能であるという予期しない所見に基礎を置くものである。
【００１４】
ゆえに、一態様において本発明は、構造（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＣＨ3−ＣＨ（ＯＲ1）−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ（ＮＨＲ2）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ3（構造６）を有する（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−Ｌ−４−ヒドロキシイソロイシン（構造５）の誘導体であって、式中、Ｒ2が開裂する可能性のある条件下でＲ1及びＲ3は安定であり；Ｒ3が開裂する可能性のある条件下で、特にＲ1がアルカノイル、具体的にはアセチル又はＣＨ3ＣＯＣＨ2ＣＯ−であり、Ｒ2がＦｍｏｃであり、且つＲ3がベンジル又はｔ−ブチルである場合に、Ｒ1及びＲ2が安定である、化合物に関する。
【００１５】
第２の態様において本発明は、（ａ）構造５の化合物を、銅又はホウ素で、特に、９−ボラビシクロ［３，３，１］ノナン（９−ＢＢＮ）で錯化する工程と；（ｂ）４−ヒドロキシ基を化合物Ｒ1’−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ（式中、Ｘは脱離基であり、具体的にはＲ1’はアルキル、具体的にはＣ1-6アルキルであり、具体的にはメチルである）でアシル化する工程と；（ｃ）金属錯体を開裂する工程と；（ｄ）α−アミノ基をＲ2基で、具体的にはＦｍｏｃ基で保護する工程と；（ｅ）カルボキシル基をＲ3基で、具体的にはベンジル基又はｔ−ブチル基で保護する工程と；を含む、構造６（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＣＨ3−ＣＨ（ＯＲ1）−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ（ＮＨＲ2）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ3の化合物の合成方法に関する。
スキーム１（６＊：構造６  Ｒ1＝Ｍｅ；Ｒ2＝Ｆｍｏｃ；Ｒ3＝ベンジル）：
【化６】
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【００１６】
第３の態様において本発明は、構造６の化合物と；アマトキシン又はその前駆体を合成するための少なくとも１つの追加的な試薬と；を含む、キットに関する。
【００１７】
第４の態様において本発明は、（ａ１）保護基Ｒ2を、構造６の化合物（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＣＨ3−ＣＨ（ＯＲ1）−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ（ＮＨＲ2）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ3から開裂させる工程と；（ａ２）工程（ａ１）に従って得られた遊離アミノ基を含む６の脱保護変種を、ヒドロキシプロリンの活性化変種、その保護変種、又はそのシントン、あるいは具体的には７、８及びＬから選択される構造の化合物に、共役させる工程と；を含む、アマトキシン又はその前駆体分子の合成方法に関する。
【化７】
2018536666.tif 000009
【００１８】
第５の態様において、本発明は、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１又は２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１又は２）、及びγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１又は２）に関する。
【化８】
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【００１９】
第６の態様において本発明は、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）、又はγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）と標的結合部分との複合体であって、特に、前記標的結合部分が、少なくとも機能性の抗原結合ドメインを含む抗体又は抗体断片であり、前記複合体に任意で含まれるリンカー部分が、一方の側にて、前記γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）若しくはγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）中に存在する位置又は官能性基に連結され、且つもう一方の側にて、前記標的結合部分中に存在する位置又は官能性基に連結される、複合体に関する。
【００２０】
第７の態様において本発明は、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）、又はγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）と；一方の側にて、前記γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）若しくはγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）中に存在する位置又は官能性基に連結され、且つ、標的結合部分中に存在する位置又は官能性基に直接的に若しくは間接的に連結しうる位置又は官能性基を更に含み、特に、前記標的結合部分は、少なくとも機能性の抗原結合ドメインを含む抗体又は抗体断片である、結合部分と；の複合体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】様々なアマトキシンの構造式を示す図である。アマトキシンを形成する８種のアミノ酸を表す標準のナンバリングは、ボールド体表記の番号（１〜８）で指定されている。同様に、アミノ酸１、３及び４における原子の標準的呼称は（ギリシャ文字α〜γ、ギリシャ文字α〜δ、及び番号１’〜７’でそれぞれ）表記してある。
【００２２】
【図２】化合物１の合成スキーム（工程（ａ）〜（ｇ））を示す図である。
【００２３】
【図３】■：γ−アマニンアミド（１）（ＥＣ５０：９．７  １０-7Ｍ）；▲：γ−アマニチン（４）（ＥＣ５０：２．７  １０-7Ｍ）で処理されたＳＫＯＶ３細胞の生存可能性を示す図である。
【００２４】
【図４】化合物ＨＤＰ３０．１４８５のＮＭＲスペクトルを示す。（ａ）1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）；（ｂ）13Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書中に記載されている特定の方法論、実験計画書、及び試薬は、修正を施される可能性があるので、本発明はこれらだけに限定されない。この点を理解したうえで、本発明の詳細な説明を読み進めるべきである。また、当然のことながら、本明細書中に用いられている技術用語は、特定の実施形態について説明することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される。別途規定されていない限り、本明細書中に用いられている全ての技術用語及び科学用語は、当業者に遍く理解されているのと同じ意味を有する。
【００２６】
本明細書中に用いられている用語は、"A multilingual glossary of biotechnological  terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds.(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerlandに記載されているように定義されていることが好ましい。
【００２７】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」、並びに「含む（comprises）」及び「含んでなる（comprising）」のような変形態様は、記載されている整数、組成物若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を含むことを含意する一方、何らかの追加的な整数、組成物若しくは工程、又は整数、組成物若しくは工程の群は、任意で、存在する可能性もあり、追加的な整数、組成物若しくは工程、又は整数、組成物若しくは工程の群が全く存在しない実施形態を含むことを含意するものとして理解される。そのような後者の実施形態において「を含む（comprising）」という用語は、「からなる（consisting of）」と意味的に同様な範囲に含まれる。
【００２８】
本明細書の本文全体を通して、幾つかの文献が引用されている。本明細書中に引用されている文献の各々（全ての特許、特許出願、科学刊行誌、製造業者の仕様書、指示書、GenBank受託番号配列サブミッションなどを含む）は、前出かそれとも後出かを問わず、それぞれの特許法の下で可能な範囲内で、その全体が本明細書に参照により援用されている。本明細書中の如何なる文献も、先行発明による当該開示以前に発生した発明には権利のないことを認めるものとして解釈すべきではない。
【００２９】
以下、本発明について更に記載する。本発明の様々な態様については、以下の節に、より詳細に定義する。そのように定義された各態様は、他の意味に解すべきことが明示されていない限り、任意の他の態様（１つ又は複数）と組み合わせて用いることができる。特に、好ましい又は有利であるとして示唆される任意の特徴は、好ましい又は有利であるとして示唆される任意の他の特徴（１つ又は複数）と併用して差し支えない。
【００３０】
本発明は、容易に入手可能な（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−Ｌ−４−ヒドロキシイソロイシン（５）
【化９】
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が、直交的保護戦略（orthogonal protection strategy）によって保護可能であり、γ−ヒドロキシイソロイシンをアミノ酸３として有するアマトキシンの合成に有用であるという意外な見解を論拠としている。
【００３１】
α−アマニチンのアミノ酸３は、自然において本質的にα−及びβ−アマニチンにおいてのみ見出されるγ，δ−ジヒドロキシイソロイシン（ＣＡＳ  ５５３９９−９４−５）である。適切なエナンチオマー形態のγ，δ−ジヒドロキシイソロイシンの合成は複雑でしかもコストが高くつく。
【００３２】
対照的に、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−Ｌ−４−ヒドロキシイソロイシン（ＣＡＳ  ５５３９９−９３−４；構造５）は、フェヌグリーク（Trigonella foenum−graecum）中に大量に（乾燥種子中に０．６％）見出されるものであり、年間数百トン単位で商業的に生産されており、結果として、化合物５は市販品が出回っている。
【００３３】
ゆえに、一態様において本発明は、Ｒ2が開裂する可能性のある条件下でＲ1及びＲ3は安定であり；Ｒ3が開裂する可能性のある条件下で、特にＲ1がアルカノイル、具体的にはアセチル又はＣＨ3ＣＯＣＨ2ＣＯ−であり、Ｒ2がＦｍｏｃであり、且つＲ3がベンジル又はｔ−ブチルである場合にＲ1及びＲ2が安定である、構造（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＣＨ3−ＣＨ（ＯＲ1）−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ（ＮＨＲ2）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ3（構造６）を有する（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−Ｌ−４−ヒドロキシイソロイシン（構造５）誘導体に関する。
【００３４】
本明細書において、本化合物の「化学誘導体」（略語：「誘導体」）とは、本化合物に類似してはいるが、本化合物中に存在しない少なくとも１つの化学基を含有し、且つ／あるいは本化合物中に存在する少なくとも１つの化学基が欠失している、化学構造を有する種を指す。当該誘導体の比較対象となる化合物は、「親」化合物として知られている。「誘導体」は、１つ以上の化学反応工程において、親化合物から生成可能なのが一般的である。
【００３５】
今までのところ、化合物５をアマトキシンの合成に利用することに未だ成功していない。なぜなら、化合物５は容易にラクトン型（構造９）を生成して反応しなくなるからである。
【化１０】
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【００３６】
特定の実施形態において、Ｒ2は、塩基で（特に、第二級又は第三級アミンで）処理すると開裂する可能性があり、前記条件下でＲ1及びＲ3は安定である。
【００３７】
そのような特定の実施形態において、Ｒ2は、Ｆｍｏｃ基である。そのような特定の実施形態において、Ｒ2を選択的に開裂させるための条件は、以下から選択される。
−  ２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（１：４）を３〜５分間；
−  １〜５％ＤＢＵ／ＤＭＦ；
−  ２０％ピペリジン及び１〜５％ＤＢＵを、ＤＭＦ中に溶かした溶液；
−  モルホリン／ＤＭＦ（１：１）；
−  ４５°Ｃのピペリジン／ＤＭＦ（１：４）；
−  ０．１Ｍ  ＨＯＢｔを、ピペリジン／ＤＭＦ（１：４）中に溶かした溶液；
−  Ｂｕ4Ｎ+Ｆ-をＤＭＦ中に溶かした溶液、及び他のテトラアルキルアンモニウムフルオライド；並びに
−  ２％ＨＯＢｔ、２％ヘキサメチレンイミン、２５％Ｎ−メチルピロリジンをＤＭＳＯ／ＮＭＰ（１：１）中に溶かした溶液。
【００３８】
特定の実施形態では、水素添加によってＲ3が開裂する可能性があり、且つ前記条件下でＲ1及びＲ2は安定である。
【００３９】
そのような特定の実施形態において、Ｒ3はベンジル基である。そのような特定の実施形態において、Ｒ3を選択的に開裂させるための条件は、通常の圧力下、室温にてＰｄ／Ｃ（１０％）で４時間水素添加することである。
【００４０】
特定の実施形態において、Ｒ3は緩酸処理で開裂する可能性があり、前記条件下でＲ1及びＲ2は安定である。
【００４１】
そのような特定の実施形態において、Ｒ3は、ｔ−ブチル基である。そのような特定の実施形態において、Ｒ3を選択的に開裂させるための条件は、ＨＣｌの酢酸溶液中での処理、又はトリフルオロ酢酸での処理から選択される。
【００４２】
本発明の文脈において、別の保護基Ｒyが９０％を上回って具体的には９５％を上回って開裂する条件下で、前記基Ｒxの１０％未満、具体的には５％未満が同時的に開裂したときに、基Ｒxは安定である。
【００４３】
第２の態様において本発明は、（ａ）構造５の化合物を、銅又はホウ素で、特に、９−ボラビシクロ［３，３，１］ノナン（９−ＢＢＮ）で錯化する工程と；（ｂ）４−ヒドロキシ基を化合物Ｒ1’−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ（式中、Ｘは脱離基であり、具体的にはＲ1’はアルキル、具体的にはＣ1-6アルキルであり、具体的にはメチルである）でアシル化する工程と；（ｃ）金属錯体を開裂する工程と；（ｄ）α−アミノ基をＲ2基で、具体的にはＦｍｏｃ基で保護する工程と；（ｅ）カルボキシル基をＲ3基で、具体的にはベンジル基又はｔ−ブチル基で保護する工程と；を含む、構造６（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＣＨ3−ＣＨ（ＯＲ1）−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ（ＮＨＲ2）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ3の化合物の合成方法に関する。特定の実施形態において、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、及び−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒから選択される。
【００４４】
第３の態様において本発明は、構造６の化合物と；アマトキシン又はその前駆体を合成するための少なくとも１つの追加的な試薬と；を含む、キットに関する。
スキーム１（６＊：構造４  Ｒ1＝Ｍｅ；Ｒ2＝Ｆｍｏｃ；Ｒ3＝ベンジル）：
【化１１】
2018536666.tif 000013
【００４５】
本発明の文脈において、「アマトキシン」という用語は、テングタケ（Amanita）属から単離された８アミノ酸から構成される全ての環状ペプチド（Wieland, T.及びFaulstich H.（Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 5 (1978) 185−260）に記載されているもの）を含み、更にはそれらの全ての化学誘導体；更には、それらの全ての半合成類似体；更にはそれらの全ての合成類似体（環状８アミノ酸である天然化合物のマスター構造に従って構築ブロックから構築されたもの）；更には、ヒドロキシル化アミノ酸の代わりに非ヒドロキシル化アミノ酸を含有する全ての合成又は半合成類似体；更には、チオエーテルスルホキシド部分が、スルフィド、スルホン、又はイオウ以外の原子（例えば、アマニチンの炭素類似体（carbaanalogue）中の炭素原子）で置換され、各事例において、任意のそのような誘導体又は類似体は、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼIIの阻害によって機能的に活性になる、全ての合成又は半合成類似体を含む。
【００４６】
アマトキシンは、機能的には、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチド又はデシペプチドとして定義される。アマトキシンは、上記に定義されているようなリンカー分子又は標的結合部分と反応しうる官能性基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基又はチオール捕捉基）を含むものが好ましい。図１に示すα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、アマヌリン酸、γ−アマニン、及びγ−アマニンアミドのほか、塩類、化学誘導体、半合成類似体、並びにこれらの合成類似体は、本発明の複合体に特に好適なアマトキシンである。γ−アマニン、γ−アマニンアミド、γ−アマニチン、及びε−アマニチン、特にγ−アマニン及びγ−アマニンアミドは、本発明に用いるのに特に好ましいアマトキシンである。
【００４７】
本発明の文脈において「アマトキシン又はその前駆体を合成するための追加的な試薬」という用語には、特に、（ｉ）アマトキシンの８アミノ酸主鎖構造を形成する残りの７つのアミノ酸、例えば、固体支持体に共役されたアミノ酸のうちのいずれか１つに対応する適切に保護され且つ／あるいは活性化アミノ酸系化合物；（ｉｉ）アマトキシンの８アミノ酸主鎖構造の部分に対応する適切に保護され且つ／あるいは活性化された予備形成済ジペプチド又はポリペプチド構築ブロック、例えば、固体支持体に共役されたそのような構築ブロック；並びに、（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）による試薬、又は化合物６と（ｉ）若しくは（ｉｉ）による試薬のうちのいずれかとを反応させて得られた生成物を活性化、脱保護、共役、合成、且つ／あるいは改質するのに必要な補助試薬；から選択される任意の試薬が包含される。
【００４８】
特定の実施形態において、前記少なくとも１つの追加的な試薬は、下掲のものから選択される。
（ｉ）樹脂、特に、メリフィールド樹脂；リンクアミド樹脂；及びＴＨＰ−樹脂からなる群から選択される樹脂；
（ｉｉ）保護ヒドロキシプロリン、特にフルオレニルメチルオキシカルボニル−（Ｆｍｏｃ−）−保護Ｏ−アリルヒドロキシプロリン（ＦｍｏｃＨｙｐＯＡｌｌ）；
（ｉｉｉ）保護アスパラギン、特にＦｍｏｃ−保護Ｎ−トリチルアスパラギン（Ｆｍｏｃ（Ｎ−Ｔｒｉ）ＡｓｎＯＨ）；
（ｉｖ）保護Ｃｙｓ−Ｔｒｐジペプチド、特に−ＳＨ及び−ＯＨ保護基（ＦｍｏｃＣｙｓ（Ｓ−２−（（ｏ−ＮＯ2Ｐｈ）ＳＯ2Ｔｒｐ−Ｏ−Ａｌｌｙｌ））］ＯＨ）を用いたＦｍｏｃ−保護Ｃｙｓ−Ｔｒｐジペプチド；
（ｖ）保護グリシン、特にＦｍｏｃ−保護グリシン（ＦｍｏｃＧｌｙ）；
（ｖｉ）保護イソロイシン、特にＦｍｏｃ−保護イソロイシン（ＦｍｏｃＩｌｅ）；
（ｖｉｉ）ペプチド共役試薬、特に、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）；ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）；及びｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）からなる群から選択されるペプチド共役試薬；並びに
（ｖｉｉｉ）第三級アミン、特にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤｉＰＥＡ）で処理した。
【００４９】
第４の態様において本発明は、（ａ１）構造６の化合物から保護基Ｒ2を開裂させる工程と；（ａ２）工程（ａ１）に従って得られた遊離アミノ基を含む６の脱保護変種を、ヒドロキシプロリンの活性化変種、その保護変種、又はそのシントン、あるいは特に７、８及びＬ（式中、Ｌは、ヒドロキシプロリン予備充填樹脂（例えばテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）樹脂）から選択される構造の化合物に、共役させる工程と；を含む、アマトキシン又はその前駆体分子の合成方法に関する。
【化１２】
2018536666.tif 000014
【００５０】
本発明の文脈において、「シントン」という用語は、化学反応の際に関心対象となる特定の化合物の合成等価物であるか、又はその合成等価物として使用できる化合物を指す。この定義には、前記化学反応に用いられる条件下では不安定であるか若しくは反応性である関心対象の化合物で、前記化学反応後に開裂可能な適切な保護基を介して保護あるいは遮蔽される部分を有する化合物が、包含される。
【００５１】
本発明の当該の態様に係る特定の実施形態において、本方法は、図２に示す工程（ｂ）〜（ｇ）のうちの１つ以上を更に含む。
【００５２】
特定の実施形態において、残りのアミノ酸は、Ｎ−末端合成戦略を介して共役される。
【００５３】
特定の実施形態において本方法は、固相を主成分とする合成であり、追加的に、以下の工程を含む。
（ｂ）反復ＦｍｏｃＮ−脱保護と；（ａ）化合物６を樹脂Ｌと反応させる工程で得られたＧを、Ｆｍｏｃ−（Ｎ−Ｔｒｉ）Ａｓｎ−ＯＨ；ＦｍｏｃＣｙｓ（Ｓ−２−（（ｏ−ＮＯ2Ｐｈ）ＳＯ2Ｔｒｐ−Ｏ−Ａｌｌｙｌ））］ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨと共役する工程によって、化合物Ｈを生ずる。
【化１３】
2018536666.tif 000015
（ｃ）ＨのＯ−アリル−及びＮ−Ｆｍｏｃ脱保護、続いて、環化によって、化合物Ｉが生ずる（Ｂ環閉鎖）：
【化１４】
2018536666.tif 000016
（ｄ）化合物Ｉが、２−ニトロアリールスルホンアミドＮで脱保護され、且つ樹脂から分離されて、化合物Ｊが生ずる。
【化１５】
2018536666.tif 000017
（ｅ）Ｊの溶液相環化によって、γ−アマニンアミド誘導体Ｋが生ずる。
【化１６】
2018536666.tif 000018
【００５４】
更に別の態様において本発明は、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）、及びγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）、又はその誘導体、又はその前駆体分子を溶液の形で合成する方法に関する。
【００５５】
特定の実施形態においてｘは、１及び２から選択され、特に１である。
【００５６】
或る実施形態において、そのような方法は追加的に、以下の工程のうちの１つ以上を含む。
（ｂ）Ｍ（工程（a）において化合物６と化合物７又は化合物８とを反応させて得られたもの）を、Ｆｍｏｃ−（Ｎ−Ｔｒｉ）Ａｓｎ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−（Ｓ−Ｔｒｉ）Ｃｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＮ−Ｂｏｃ−ＨＰＩＯＨ1［1 Zanotti, Giancarlo; Birr Christian; Wieland Theodor; International Journal of Peptide & Protein Research 18 (1981) 162-8]と反復ＦｍｏｃＮ−脱保護、共役して、化合物Ｎを生ずる。
【化１７】
2018536666.tif 000019
（ｃ）Ｎ−及びＳ−トリチル、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル及びＮ−tｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護基の酸性脱保護、並びにSavige−Fontana反応によるインサイチュ環閉鎖（Savige & Fontana, Int J Pept Protein Res. 15 (1980) 102-12）によって化合物Ｊを得た。
【００５７】
第５の態様において本発明は、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１又は２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１又は２）、及びγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１又は２）に関する。
【化１８】
2018536666.tif 000020
【００５８】
特定の実施形態においてｘは、１及び２から選択され、特に１である。
【００５９】
特定の実施形態において、化合物１、２又は３の純度は９０％超、特に９５％超である。
【００６０】
本発明の文脈において「純度」という用語は、存在する化合物１、２又は３の総量を指す。純度９０％超とは、例えば、９０％を上回る（すなわち９００μｇ超）化合物１が存在するとした場合に、この化合物１を組成物１ｍｇ中に含むことを意味する。残りの部分（すなわち、不純物には未反応出発物質、並びに他の反応物、溶媒、開裂生成物及び／又は副産物が含まれる場合がある。
【００６１】
特定の実施形態において、化合物１、２又は３（純度９０％超）から選択される化合物を含む組成物は、１００ｍｇ超の化合物１、２又は３をそれぞれ含む。ゆえに、痕跡量の化合物１、２又は３は論証可能的に、例えば、マッシュルーム抽出物由来の、天然起源のアマトキシンの錯体混合物中に存在する場合もあれば、あるいは、例えば副産物のような合成の錯体混合物中に存在する場合もあり、明示的に除外される。
【００６２】
第６の態様において本発明は、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）、又はγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）と；標的結合部分と；の複合体であって、特に、前記標的結合部分が、抗体又はその抗原結合断片であり、前記複合体が、リンカー部分を任意に含み、前記γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）若しくはγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）中に存在する位置又は官能性基に連結され、且つもう一方の側にて、前記標的結合部分中に存在する位置又は官能性基に連結される、複合体に関する。
【００６３】
特定の実施形態においてｘは、１及び２から選択され、特に１である。
【００６４】
本明細書において「標的結合部分」という用語は、標的分子又は標的エピトープに対し特異的に結合しうる、任意の分子又は分子の一部分を指す。本出願の文脈において、好ましい標的結合部分は、（ｉ）抗体又はその抗原結合断片；（ｉｉ）抗体様タンパク質；及び（ｉｉｉ）核酸アプタマーである。本発明に用いられる好適な「標的結合部分」は典型的に、分子量が４０ ０００Ｄａ（４０ｋＤａ）であるか、又はそれを上回る。
【００６５】
本明細書において、第１の化合物（例えば、抗体）が、第２の化合物（例えば、標的タンパク質等の抗原）「と特異的に結合する」と見なされるのは、前記第２の化合物に対する第１の化合物の解離定数ＫDが、１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、好ましくは３０μＭ以下、好ましくは２０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下、より好ましくは９００ｎＭ以下、より好ましくは８００ｎＭ以下、より好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは６００ｎＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは４００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２００ｎＭ以下、更になお好ましくは１００ｎＭ以下、更になお好ましくは９０ｎＭ以下、更になお好ましくは８０ｎＭ以下、更になお好ましくは７０ｎＭ以下、更になお好ましくは６０ｎＭ以下、更になお好ましくは５０ｎＭ以下、更になお好ましくは４０ｎＭ以下、更になお好ましくは３０ｎＭ以下、更になお好ましくは２０ｎＭ以下、更になお好ましくは１０ｎＭ以下の場合である。
【００６６】
本用途の文脈において、「標的分子」及び「標的エピトープ」という用語は、それぞれ、各々が標的結合部分を介して特異的に結合される抗原及び抗原のエピトープを指す。標的分子は、腫瘍関連抗原であって、特に、非腫瘍細胞の表面と比べて高濃度且つ／あるいは多様な立体配置にある、１種以上の腫瘍細胞の表面上に存在する、抗原又はエピトープであることが好ましい。前記抗原又はエピトープは、１種以上の腫瘍細胞の表面上に存在するが、非腫瘍細胞の表面上には存在しないことが好ましい。特定の実施形態において、標的結合部分は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ又は上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープに特異的に結合する。他の実施形態において、前記抗原又はエピトープは、自己免疫疾患に関与する細胞上で優先的に発現する。そのような特定の実施形態において、標的結合部分は、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）のエピトープに特異的に結合する。
【００６７】
本明細書において、「抗体又はその抗原結合断片」という用語は、免疫グロブリン分子（すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子）の免疫グロブリン分子及び免疫学的に活性な部分を指す。ゆえに、「これらの抗原結合断片」という用語は、少なくとも機能性の抗原結合ドメインを含む抗体断片を指す。加えて、この抗体断片に含まれる免疫グロブリン様タンパク質は、例えば、標的タンパク質であるＨｅｒ−２／ｎｅｕ又はＥｐＣＡＭ等の標的分子に特異的に結合するための、ファージディスプレイ等の技術を介して選択される。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、又はサブクラスでありうる。本発明に用いるための好適な「抗体及びこれらの抗原結合断片」としては、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異性、ヘテロ複合体、多特異性、ヒト、ヒト化（とりわけ、ＣＤＲ移植）、脱免疫化、又はキメラ抗体、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、断片（Ｆａｂ発現ライブラリによって生成されたもの）、二重特異性抗体（ダイアボディ）、又は四重特異性抗体（テトラボディ）（Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (1993) 6444-8）、ナノボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、並びに上記のうちのいずれかのエピトープ−結合断片が挙げられる。
【００６８】
一部の実施形態において、抗原結合断片は、本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、並びにＶＬ又はＶＨドメインのいずれかを含む断片が挙げられる。一本鎖抗体を備える抗原結合抗体断片は、可変ドメインを単独で含む場合もあれば、あるいはこの可変ドメインと、ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの全体又は一部との組み合わせを含む場合もある。同様に、可変ドメインとヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとを任意に組み合わせてなる抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。
【００６９】
本発明において有用な抗体は、任意の動物起源（例えば、鳥類及び哺乳動物由来）のものでありうる。抗体は、ヒト、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモット若しくはウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌ由来であることが好ましい。抗体は、ヒト又はマウス由来であるものが、特に好ましい。本明細書において「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が包含されるだけでなく、ヒト免疫グロブリンライブラリ又は１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子導入（transgenic）動物で、且つ例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ＆ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓによる米国特許出願第５，９３９，５９８号明細書に記載されているような内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体も、包含される。
【００７０】
「抗体様タンパク質」という用語は、例えば、ループの突然変異誘発によって、標的分子に対し特異的に結合するようにエンジニアリングされているタンパク質を指す。そのような抗体様タンパク質は、両端にてタンパク質足場に付着した少なくとも１つの可変ペプチドループを含むのがごく一般的である。この二重構造的制約によって、抗体様タンパク質の結合親和性が、抗体の結合親和性と同等のレベルにまで大きく増大する。可変ペプチドループの長さは、典型的に、１０〜２０アミノ酸からなる。足場タンパク質は、溶解特性の良好な任意のタンパク質でありうる。足場タンパク質は、小型の球状タンパク質であることが好ましい。抗体様タンパク質類には、アフィボディ、アンチカリン、及び設計アンキリン反復タンパク質が包含されるが、これらに限定されるものではない（総説については、Binz et al., Nat Biotechnol. 2005, 1257-68を参照のこと）。抗体様タンパク質は、大型の変異体ライブラリから誘導される場合があり、例えば、大きなファージディスプレイライブラリからパンされ、通常の抗体と同様に単離可能である。また、球状タンパク質中の表面露出残基のコンビナトリアル突然変異誘発によって、抗体様結合タンパク質を得ることも可能である。
【００７１】
「核酸アプタマー」という用語は、核酸分子が、インビトロ選択又はＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）の反復実行によって標的分子に結合するようにエンジニアリングされていることを指す（総説については、Brody及びGold, J Biotechnol. 74 (2000) 5-13を参照のこと）。核酸アプタマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子でありうる。アプタマーは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’−フッ素置換ピリミジンなどの修飾を含む場合がある。
【００７２】
本発明の文脈において「リンカー」は、リンカーの一端に付着している２つの成分のそれぞれに連結している構造を指す。リンカーを結合基とした事例では、アマトキシンが抗体に直接結合すると、アマトキシンがＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用する能力が低下する可能性がある。特定の実施形態において、リンカーは、２つの成分間の距離を増加させ、これらの成分間（例えば、この事例では、抗体とアマトキシンとの間）の立体障害を緩和する。特定の実施形態において、リンカーは、その主鎖中に１〜３０個の原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の原子）からなる連続鎖を有する。すなわち、リンカーの長さは、アマトキシン部分と抗体との間の原子又は結合の個数で測定される最も短い連結として定義され、リンカー主鎖の一方の側がアマトキシンと反応し、且つ他方の側が反応に利用可能であるかあるいは抗体と反応したものとされる。本発明の文脈において、リンカーは、Ｃ1-20アルキレン基、Ｃ1-20ヘテロアルキレン基、Ｃ2-20アルケニレン基、Ｃ2-20ヘテロアルケニレン基、Ｃ2-20アルキニレン基、Ｃ2-20ヘテロアルキニレン基、シクロアルキレン基、ヘテロシクロアルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、アラアルキレン基、又はヘテロアラルキレン基が、任意で置換されることが好ましい。リンカーは、１つ以上の構造要素（例えば、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分及びこれらに類するものを含む場合がある。リンカーはまた、これらの構造要素のうちの２つ以上の組み合わせを含む場合がある。これらの構造要素のそれぞれは、リンカー内に１回を上回って、例えば、２回、３回、４回、５回又は６回存在する場合がある。一部の実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を含む場合がある。単一の工程、又は後続の２つ以上の工程のいずれかにおいて、アマトキシン及び抗体にリンカーを付着させるべきことが理解される。その目的を達成するため、リンカーは、近位端及び遠位端にて、結合対象となる成分のうちの１つに存在する基に対し共有結合を形成しうる基で、好ましくは、アマトキシン又は標的結合ペプチド上で活性化された基；あるいは（ｉｉ）活性化されるかあるいは活性化可能であって、アマトキシン上の基と共有結合を形成する基；の２通りの群を有することが好ましい。したがって、そのような共役反応、例えば、エステル結合、エーテル結合、ウレタン結合、ペプチド結合などの結果として、リンカーの近位端及び遠位端に化学基が位置することが好ましい。
【００７３】
特定の実施形態において、リンカーＬは独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１〜２０個の原子（具体的には２〜１８個の原子、より具体的には５〜１６個の原子、更により具体的には６〜１５個の原子）の直鎖である。特定の実施形態において、直鎖中の原子の少なくとも６０％は、Ｃ原子である。特定の実施形態において、直鎖中の原子は、単結合で結合されている。
【００７４】
特定の実施形態において、リンカーＬは、アルキレン基、ヘテロアルキレン基、アルケニレン基、ヘテロアルケニレン基、アルキニレン基、ヘテロアルキニレン基、シクロアルキレン基、ヘテロシクロアルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、アラアルキレン基、又はヘテロアラルキレン基であり、これらの基は、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含み、前記リンカーは任意で置換される。
【００７５】
「アルキレン」という用語は、炭素原子１〜１０個を有する基を含む、炭素原子１〜２０個を有する二価の直鎖飽和炭化水素基を指す。或る実施形態において、アルキレン基は、低級アルキレン基でありうる。「低級アルキレン」という用語は、炭素原子１〜６個を有し、或る実施形態において炭素原子１〜５個又は１〜４個を有するアルキレン基を指す。アルキレン基の例としては、限定されないが、メチレン（−ＣＨ2−）、エチレン（−ＣＨ2−ＣＨ2−）、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、及びｎ−ヘキシレンが挙げられる。
【００７６】
「アルケニレン」という用語は、炭素原子２〜２０個を有する二価の直鎖基で、炭素−炭素結合のうちの少なくとも１つが二重結合であり、他の結合が単結合又は更に二重結合でありうるものを指す。本明細書において「アルキニレン」という用語は、炭素−炭素結合のうちの少なくとも１つは三重結合であり、一方、その他の結合は、単結合、二重結合、又は更には、三重結合でありうる、２〜２０個の炭素原子を有する基を指す。アルケニレン基の例としては、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、１−プロペニレン、２−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、３−ブテニレンなどが挙げられる。アルキニレン基の例としては、エチニレン、１−プロピニレン、２−プロピニレンなどが挙げられる。
【００７７】
本明細書において「シクロアルキレン」は、任意の安定な単環系若しくは多環系の一部である二価環において、そのような環が３〜１２個の炭素原子を有するがヘテロ原子を全く有さず、且つそのような環が完全飽和である二価環を指すことを意図したものであり、「シクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環系若しくは多環系の一部である二価環において、そのような環が３〜１２個の炭素原子を有するがヘテロ原子を全く有さず、且つそのような環（ただし、任意のアリーレン環を除く）が少なくとも部分不飽和である二価環を指すことを意図したものである。シクロアルキレンの例としては、限定されないが、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、及びシクロヘプチレンが挙げられる。シクロアルケニレンの例としては、限定されないが、シクロペンテニレン及びシクロヘキセニレンが挙げられる。
【００７８】
本明細書において「ヘテロシクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環系又は多環系の一部である二価環において；そのような環が３〜約１２個の原子を有し；そのような環が炭素原子と、少なくとも１つのヘテロ原子（特に、少なくとも１つのヘテロ原子が独立にＮ、Ｏ及びＳからなる群から選択されるもの）と、からなり；ヘテロシクロアルキレンが、そのような完全飽和である環を指し；且つヘテロシクロアルケニレンが、少なくとも部分不飽和である環（ただし、任意のアリーレン又はヘテロアリーレン環を除く）を指す、二価環を指すことを意図した用語である。
【００７９】
「アリーレン」という用語は、任意の安定な単環系若しくは多環系の一部である二価の環又は環系において、そのような環又は環系が３〜２０個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を全く有さず、且つ環又は環系が「４ｎ＋２」π電子則により定義される芳香部分（フェニレンを含む）からなる、二価の環若しくは環系を意味することを意図した用語である。
【００８０】
本明細書において「ヘテロアリーレン」という用語は、任意の安定な単環系若しくは多環系の一部である二価の環又は環系において、そのような環又は環系が３〜２０個の原子を有し、環又は環系が「４ｎ＋２」π電子則により定義される芳香部分からなり、炭素原子、並びに１つ以上の窒素、イオウ及び／又は酸素ヘテロ原子を含有する、二価の環又は環系を意味することを意図した用語である。
【００８１】
本発明の文脈において、「置換（substituted）」という用語は、リンカーの骨格内に存在する１つ以上の水素が、指示された基から選択された基で置換され、ただし、指示された原子の通常の原子価、又は置換される基の適切な原子価を超過しないこと、並びに、その置換によって、安定な化合物を生ずることを示すことを意図した用語である。「任意で置換される」という用語は、リンカーが、本明細書中に定義されているように、本明細書中に定義されている１つ以上の置換基で置換されていないかそれとも置換されているかのいずれかであることを意味するように意図した用語である。置換基は、ケト（又はオキソ（すなわち、＝Ｏ）基、チオ又はイミノ基又はこれらに類するものである場合、リンカー骨格原子上の２つの水素が置換される。例示的な置換基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、（チオ）エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、（チオ）アミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、ハロアルキル、例えば、パーフルオロアルキル（トリフルオロメチル等）、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ（任意で、例えば、アルキル、アリール、又はヘテロアリールによる一置換若しくは二置換）、イミノ、カルボキサミド、カルバモイル（任意で、例えば、アルキル、アリール、又はヘテロアリールによる一置換若しくは二置換）、アミディーノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、（チオ）ウレイド、（アリールチオ）ウレイド、アルキル（チオ）ウレイド、シクロアルキル（チオ）ウレイド、アリールオキシ、アラルコキシ、又は−Ｏ（ＣＨ2）n−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＨ、−（ＣＨ2）nＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）nＲ、−（ＣＨ2）nＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、又は−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）2Ｒ（式中、ｎは、１−４であり、Ｒは独立に水素、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−シクロアルキル、−シクロアルケニル、−（Ｃ結合ヘテロシクロアルキル）、−（Ｃ結合ヘテロシクロアルケニル）、−アリール、及び−ヘテロアリールから選択され、複数の置換度が許容される）が挙げられる。当業者には理解されるように、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルなどのような置換基、又は−ＯＨ、−ＮＨＲなどのような官能性基はそれ自体、適宜に置換可能である。同様に、置換部分がそれ自体、適宜に置換可能であることも、当業者に理解されるであろう。
【００８２】
特定の実施形態において、リンカーＬは、以下の部分：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）のうちの１つから選択される部分を含む。
【００８３】
本発明の特定の実施形態において、リンカーＬは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラアルキレン及びヘテロアラルキレン基のリストから選択される幾つかのｍ基を含み、各基は、任意で、独立に置換可能であり、リンカーは独立に、以下の部分：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）（式中、ｍ＝ｎ＋１である）のうちの１つから選択される幾つかのｎ部分を更に含む。特定の実施形態では、ｍ＝２且つｎ＝１であるか、あるいはｍ＝３且つｎ＝２である。特定の実施形態において、リンカーは２若しくは３個の非置換アルキレン基を含み、且つ１若しくは２個のジスルフィド基、エーテル基、チオエーテル基、アミン基、エステル基、カルボキサミド基、非置換アルキレン基を結合するウレタン部分又は尿素部分をそれぞれ含む。
【００８４】
特定の実施形態において、直鎖中のＣ原子は独立に、任意で置換されるメチレン基（−ＣＨ2−）の一部分である。そのような特定の実施形態において、任意選択の置換基は独立に、ハロゲン及びＣ1-6アルキル、具体的にはメチルから選択される。
【００８５】
特定の実施形態において、リンカーＬは安定なリンカーである。
【００８６】
本発明の文脈において、「安定なリンカー」という用語は、（ｉ）酵素の存在下、且つ（ｉｉ）細胞内還元環境にて、安定なリンカーを指す。
【００８７】
特定の実施形態において、安定なリンカーは、（ｉ）酵素−開裂可能な下部構造、及び／又は（ｉｉ）ジスルフィド基を含まない。そのような特定の実施形態において、リンカーの長さは、最高１２原子、具体的には２〜１０原子、より具体的には４〜９原子、最も具体的には６〜８原子である。
【００８８】
他の特定の実施形態において、リンカーは、開裂性リンカーである。
【００８９】
本発明の文脈において、「開裂性リンカー」という用語は、（ｉ）酵素により開裂可能なリンカー、又は（ｉｉ）還元性リンカーを指す。
【００９０】
本発明の文脈において、「還元性リンカー」という用語は、細胞内還元環境内で開裂可能なリンカー、特に、ジスルフィド基を含有するリンカーであって、結果として、細胞内還元環境による内在化後に、標的化抗体に複合された毒素カーゴを細胞内放出するリンカーを指す（Shen et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 10905-10908を参照のこと）。特定の実施形態において、還元性リンカーは部分を含む。
【化１９】
2018536666.tif 000021
式中のＲ１〜Ｒ４は独立に、Ｈ及びメチルから選択される。
【００９１】
他の特定の実施形態において、リンカーは、開裂性リンカー、特に（ｉ）酵素を介して開裂可能なリンカー、又は（ｉｉ）還元性リンカー、特に、ジスルフィド基を含むリンカーである。そのような特定の実施形態において、そのような開裂性リンカーの長さは、最高２０原子、具体的には６〜１８、より具体的には８〜１６、最も具体的には１０〜１５原子でありうる。
【００９２】
特定の実施形態において、開裂性リンカーは、構造Ｌ1−Ｌ＊−Ｌ2を含む。
【化２０】
2018536666.tif 000022
式中、Ｌ1は、Ｌ＊をアマトキシンに連結するリンカーの一部であり、特に、Ｌ1は、−ＮＨ−基又は−Ｏ−基、具体的には−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−基、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｏ−基又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基を介してＬ＊に連結されていて、且つ式中のＬ2は、Ｌ＊を標的結合部分に連結するリンカーの一部分であり、特に、式中のＬ1は、−（ＣＨ2）m部分（ｍは１〜８、特に１〜５から選択される整数）を介して、−（ＣＨ2  ＣＨ2Ｏ）n部分（ｎは１〜３、特に１〜２から選択される整数）を介して、Ｌ＊に連結されている。
【００９３】
他の特定の実施形態において、Ｌ＊は、以下の構造を有する。
【化２１】
2018536666.tif 000023
【００９４】
特定の実施形態において、前記リンカーは、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）、又はγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）内に存在し、このリンカーは、一方の側にて、以下から選択される位置に連結されている。
（ｉ）化合物１の事例では、アマトキシンアミノ酸１のγＣ原子（アミド結合）におけるアミド基の窒素原子；
（ｉｉ）化合物２の事例では、アマトキシンアミノ酸１のγＣ原子（エステル結合）における酸基の酸素原子；
（ｉｉｉ）化合物３の事例では、アマトキシンアミノ酸１のγＣ原子におけるヒドロキサム酸基の酸素原子；
（ｉｖ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ原子におけるヒドロキシ基の酸素原子、特に、エステル結合、エーテル結合又はウレタン結合を介して；あるいは
（ｖ）アマトキシンアミノ酸４の６’Ｃ原子；並びに
（ｖｉ）アミノ酸４の窒素環。
【００９５】
特定の実施形態において、前記リンカーは、他の側に存在し、且つ尿素部分（…−リンカー−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分）を介して、標的結合部分に連結されている。そのような特定の実施形態において、尿素部分は、標的結合部分（例えば、リジン側鎖のアミノ基）内に元々存在する第一級アミンを、カルバミン酸誘導体…−リンカー−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｚ（式中、Ｚは、第一級アミンで置換可能な脱離基）と反応させることによって生ずる。
【００９６】
他の特定の実施形態において、前記リンカーは、他の側に存在し、且つチオエーテル部分（…−リンカー−Ｓ−標的結合部分）を介して、標的結合部分に連結されている。そのような特定の実施形態において、チオエーテル部分は、標的結合部分（例えば、システイン側鎖のチオール基）内に元々存在するチオール基を、チオール反応性基と反応させることによって生ずる。
【００９７】
本発明の文脈において、「チオール反応性基」という用語は、具体的にはｐＨ値が６．０〜８．０の範囲にあり、より具体的にはｐＨ値が６．５〜７．５の範囲にある、抗体の遊離システインのチオール基と選択的に反応する基を指す。特に、「選択的に」という用語は、チオール反応性基を含む分子と、少なくとも１つの遊離システイン残基を含む抗体と、の共役反応の１０％未満（具体的には５％未満、より具体的には２％未満）が、抗体の非システイン残基（例えば、リジン残基）との共役反応であることを意味する。
【００９８】
特定の実施形態において、チオール基をチオール反応性基に共役して得られる部分は、チオール置換アセタミド；チオール置換スクシンイミド；チオール置換スクシンアミド酸；チオール置換ヘテロアリール、具体的にはチオール置換ベンゾチアゾル、チオール置換フェニルテトラゾール及びチオール置換フェニルオキサジアゾル；並びにジスルフィドから選択され、１つのイオウ原子が抗体のシステイン残基から誘導される。特定の実施形態において、チオール基をチオール反応性基に共役して得られる部分は、チオール置換スクシンイミドである。
【００９９】
第７の態様において本発明は、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）、又はγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）と；一方の側にて、前記γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１若しくは２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１若しくは２）若しくはγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１若しくは２）中に存在する位置又は官能性基に連結され、且つ、標的結合部分中に存在する位置又は官能性基に直接的に若しくは間接的に連結しうる位置又は官能性基を更に含み、特に、前記標的結合部分は、少なくとも機能性の抗原結合ドメインを含む抗体又は抗体断片である、結合部分と；の複合体に関する。
【０１００】
特定の実施形態においてｘは、１及び２から選択され、特に１である。
【０１０１】
特定の実施形態において、前記位置又は官能性基は、標的結合部分中に存在する位置又は官能性基に直接的に若しくは間接的に連結しうるものであり、カルバミン酸誘導体−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｚ（式中、Ｚは、標的結合部分の求核基で置換可能な、特に、標的結合部分の第一級アミンで置換可能な、脱離基）である。
【０１０２】
特定の実施形態において、一方の側にて、リンカーに連結され、且つ標的結合部分中に存在する位置又は官能性基に直接的に若しくは間接的に連結しうる前記位置又は官能性基は、チオール反応性基である。特定の実施形態において、チオール反応性基は、ヨードアセタミド、マレイミド、マレイミド（３位に脱離基を有するもの）；特に、−Ｂｒ、及び置換チオール（例えば、米国特許出願第９，２９５，７２９号明細書を参照）から選択される脱離基；４位に脱離基を有する１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、特に、−Ｂｒ、及び置換チオール（例えば、米国特許出願第９，２９５，７２９号明細書を参照）から選択される脱離基、メチルスルホニルベンゾチアゾル、メチルスルホニルフェニルテトラゾール、メチルスルホニルフェニルオキサジアゾルから選択される（Toda et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 52 (2013) 12592-6を参照）、及び５−ニトロ−ピリジン−２−イル−ジスルフィド（…−Ｌ−Ｓ−Ｓ−（５−ニトロ−ピリジン−２−イルを参照のこと）。
【０１０３】
特定の実施形態において、一方の側にてリンカーに連結され、標的結合部分中に存在する位置又は官能性基に直接的に若しくは間接的に連結しうる前記位置又は官能性基は、１つの標的結合部分又は２つの標的結合部分内に存在する２つのチオール基と反応しうる部分である。特定の実施形態において、チオール反応性基は、３位及び４位に、特に３，４−ジブロモマレイミド、３，４−ビス（アリールチオ）−マレイミド、特に３，４−ジフェニルチオ−マレイミド、及び３，４−ビス（ヘテロアリールチオ）−マレイミド、特に３，４−ビス（２−ピリジニル−スルファニル）−マレイミドから選択される２つの脱離基を有する、マレイミドである。他の特定の実施形態において、チオール反応性基は、４位及び５位に、特に、４，５−ブロモ−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、４，５−ビス（アリールチオ）−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、特に４，５−ジフェニルチオ−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、及び４，５−ビス（ヘテロアリールチオ）−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、特に４，５−ビス（２−ピリジニル−スルファニル）−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオンから選択される、２つの脱離基を有する１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオンである。
【０１０４】
特定の実施形態において、標的結合部分中に存在する位置又は官能性基に直接的に若しくは間接的に連結しうる位置又は官能性基は、エチル基でないか、あるいは、より一般的には、アルキニル基でないか、あるいは１，３−双極環状付加における１,３双極子と反応しうる基でない（Click Chemistry）。
【０１０５】
別の態様において本発明は、特に、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１又は２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１又は２）、及びγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１又は２）から選択される、本発明のアマトキシンに関し、あるいは薬品として使用するための、アマトキシンと標的結合部分とからなる本発明の複合体に関する。
【０１０６】
別の態様において本発明は、特に、γ−アマニンアミド（１；ｘ＝０、１又は２）、γ−アマニンアミド酸（２；ｘ＝０、１又は２）、及びγ−アマニナミドヒドロキサム酸（３；ｘ＝０、１又は２）から選択される、本発明のアマトキシンに関し、あるいは、特に、患者における癌の治療に用いるための、アマトキシンと標的結合部分とからなる本発明の複合体であって、癌が、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、複合体に関する。
【０１０７】
本明細において、疾患若しくは障害に関して「を治療する（treat）」、「を治療すること（treating）」又は「治療（treatment）」と言う場合、（ａ）障害の重篤度を軽減すること；（ｂ）治療中の障害に特徴的な症状の進展を予防又は制限すること；（ｃ）治療中の障害に特徴的な症状の悪化を阻害すること；（ｄ）以前に障害を有した患者において障害の再発を予防又は制限すること；及び（ｅ）以前にその障害に対し徴候を示した患者において症状の再発を予防又は制限すること；のうちの１つ以上を達成することを意味する。
【０１０８】
本明細書において、治療は、本発明による複合体又は医薬組成物を患者に投与することを含む場合があり、本治療において「投与すること（administering）」には、インビボでの投与のほか、組織に対する直接的なエクスビボでの（例えば、静脈移植片）投与が包含される。
【０１０９】
特定の実施形態では、治療有効量の本発明の複合体が用いられる。
【０１１０】
「治療有効量」は、意図された目的を達成するうえで充分な治療剤の量である。所与の治療剤の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療剤を投与される動物のサイズ及び種、並びに投与の目的等の要因も応じて変わってくる。個々の各症例における有効量は、当該技術分野において確立された方法に従って、当業者によって経験的に特定される。
【０１１１】
別の態様において本発明は、本発明によるアマトキシン、又は本発明のアマトキシン複合体を含み、標的結合部分、並びに１つ以上の医薬的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤；及び／若しくは防腐剤を更に含む、医薬組成物に関する。
【０１１２】
「医薬的に許容される（Pharmaceutically acceptable）」は、連邦又は州政府の規制機関によって承認されたこと、あるいは、動物において、より具体的にはヒトにおいて用いられる米国薬局方（U.S. Pharmacopeia）又は他の一般的に承認された薬局方にリストされていることを意味する。
【０１１３】
特定の実施形態において、医薬組成物は、全身投与薬の形態で用いられる。これには、とりわけ注射剤及び注入剤を含む非経口剤が包含される。注射剤は、アンプルの形態として、又はいわゆる注射剤（例えば使用準備済（ready-to-use）シリンジ若しくは単回使用シリンジ）として調合され、それ以外では、多回回収用のパンクチャラブルフラスコで調合される。注射剤の投与は、皮下（ｓ．ｃ．）、筋内（ｉ．ｍ．）、静脈の（ｉ．ｖ．）、又は皮内（ｉ．ｃ．）適用の形態とすることができる。特に、結晶、溶液、ナノ粒子又はコロイド分散系（ヒドロゾル等）の懸濁液として、それぞれ適切な注射製剤を生成可能である。
【０１１４】
注射用製剤は更に、水性等張性希釈剤で溶解又は分散できる濃縮物として生成することも可能である。注入剤は、等張溶液、脂肪エマルジョン、リポソーム製剤及びマイクロエマルジョンの形態で調合することもできる。注射剤と同様、注入剤は、希釈用の濃縮物の形態で調合できる。また、注射用製剤は、入院治療及び通院治療の両方において、例えば、ミニポンプを介して永久注入剤の形態で適用することもできる。
【０１１５】
非経口薬物製剤（例えば、アルブミン、血漿、増量剤、界面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ影響物質、錯化物質、又は高分子物質）に加えることができる。特に、本発明の標的結合部分複合体の吸着に影響を及ぼす物質として、タンパク質又はポリマーに加えることもできるし、あるいは、本発明の標的結合部分トキシン複合体の吸着を低減させることを目的に、注射器具又は包装資材（例えば、プラスチック若しくはガラス）のような材料に加えることもできる。
【０１１６】
本発明のアマトキシンは、マイクロキャリアに対し、又は、例えばポリ（メタ）アクリレート、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸若しくはポリエーテルウレタン等を主成分とする微分散粒子に対し結合しうる、標的結合部分を含む。また、例えば、本発明の標的結合部分トキシン複合体を、微分散形態、分散形態及び懸濁形態でそれぞれ導入する場合、例えば「複数の単位原則」に基づいてデポー調整物として、非経口製剤を改質することもあれば、あるいは、本発明の標的結合部分トキシン複合体が製剤中に封入されている場合、例えば、引き続いてインプラントされる錠剤又はロッドの形で投与する際に、薬剤に結晶を溶かした懸濁液として、又は「単一の単位原則」に基づいて、非経口製剤を改質することもある。単一単位及び複数単位製剤中の、これらのインプラント又はデポー薬品は、多くの場合、いわゆる生分解性ポリマー（例えば、乳酸とグリコール酸とのポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレート又はポリサッカライド等）からなる。
【０１１７】
本発明の医薬組成物の製造時に添加される補助剤及び担体で、非経口剤として調合されるものとして好ましいのは、aqua sterilisata（滅菌水）、ｐＨ値影響物質（例えば有機酸若しくは無機酸又は塩基及びその塩、ｐＨ値調節用緩衝物質、等張化のための物質（例えば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース及びフルクトース等）；界面活性剤及び界面活性剤のそれぞれ、及び乳化剤（例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸の部分エステル等（例：Tween（登録商標））；あるいは例えば、ポリオキシエチレンの脂肪エステル（例：Cremophor（登録商標））、脂肪油（例えばピーナッツ油、大豆油又はヒマシ油等）；脂肪酸の合成エステル類（例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル並びに中性油等（例：Miglyol（登録商標））のほか、アジュバント重合体（例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドン等）；有機溶剤の溶解性を増大させる添加剤（例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、プロピレングリコール等）；あるいは錯体形成物質（例えばクエン酸塩及び尿素等）；防腐剤（例えば安息香酸ヒドロキシプロピルエステル及びメチルエステル等、ベンジルアルコール、酸化防止剤（例えば亜硫酸ナトリウム等）；並びに安定剤（例えばＥＤＴＡ等）である。
【０１１８】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物を懸濁液として調合する際、本発明の標的結合部分トキシン複合体、又は表面活性剤及び多電解質の固化防止用に増粘剤を加えることによって、沈渣及び／又は錯体形成剤（例えばＥＤＴＡ等）が確実に再懸濁されるようにする。また、活性成分と様々なポリマーとの複合体を得ることも可能であり、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Pluronics（登録商標）又はポリエチレングリコールソルビット脂肪酸エステルは、そのようなポリマーの例である。本発明の標的結合部分トキシン複合体はまた、例えばシクロデキストリンを含む包接化合物の形態で、液体製剤中に取り込むこともできる。特定の実施形態では、更に補助剤として分散剤を加える場合もある。マンネイトを製造する場合、デキストラン、サッカロースなどの凍結乾燥物の足場剤；ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ又は各種のゼラチンを使用できる。
【実施例】
【０１１９】
以下、本発明を非限定例を挙げることによって、より詳細に説明する。
１．ベンジル（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−アセトキシ−３−メチルペンタノエートＨＤＰ３０．１４８５の合成
【化２２】
2018536666.tif 000024
１．１  （２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アセトキシ−３−メチル−ペンタン酸錯体ＨＤＰ３０．１４０９の合成
【化２３】
2018536666.tif 000025
工程１．１．１：
【０１２０】
アルゴン下、４．４７ｇ（１８．３ｍｍｏｌ）の９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（９−ＢＢＮ）二量体を、１２０ｍｌの乾燥メタノールに加えた。この混合物を還流しながら３０分間加熱して、最終的に９−ＢＢＮを完全に溶解させた。透明の溶液を５０°Ｃまで冷却して、４．８６ｇ（３３．０ｍｍｏｌ）の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−２−アミノ−４−ヒドロキシ−３−メチル−ペンタン酸を加えた。結果として得られた懸濁液を更に３時間かけて加熱し、この間にガスの放出が止み、懸濁液が透明の均質な溶液になった。メタノール溶液を氷浴中で冷却し、結晶生成物を濾過で除去して、クロマトグラフ的に純粋な（シリカゲル；ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール（１０／１０／１）、ニンヒドリン）アミノ酸−ホウ素錯体５．６５ｇを得た。この濾過物を蒸発乾固させ、ｎ−ヘキサンからｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール（１０／１０／１）に勾配をかけて、シリカゲル上で残りの残渣を精製して、追加量のアミノ酸−ホウ素錯体１．７３ｇを得た。合計収量は、７．３８ｇ（８４％収率）であった。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：２６８．０９［ＭＨ］+；計算値：２６７．２０（Ｃ14Ｈ26ＢＮＯ3）
工程１．１．２：
【０１２１】
この錯体を、乾燥ＴＨＦ３６０ｍｌとピリジン（７．３８ｍｌ（９１．３ｍｍｏｌ）との混合物中に溶解した。１．８５ｍｌ（２５．９ｍｍｏｌ）の塩化アセチルを、室温で加えた。４時間撹拌した後に、ピリジン（７．３８ｍｌ（９１．３ｍｍｏｌ））及び塩化アセチル（１．８５ｍｌ（２５．９ｍｍｏｌ））を加えた。引き続き４時間かけて撹拌し、反応混合物を濾過で除去して、蒸発乾固させた。残渣をシリカゲル上に置き、ｎ−ヘキサンから酢酸エチルに勾配をかけて、フラッシュクロマトグラフィで精製して、Ｏ−アセチルホウ素錯体ＨＤＰ３０．１４０９の白色結晶塊４．３４ｇ（５９％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：３１０．０７［ＭＨ］+；計算値：３０９．２１（Ｃ16Ｈ28ＢＮＯ4）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：３３２．１３［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：３３２．２１（Ｃ16Ｈ28ＢＮＮａＯ4）
1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ  ５．０８（ｄｑ，Ｊ＝９．６，６．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．８５（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．３０（ｄｑｄ，Ｊ＝９．８，７．０，２．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．０２（ｓ，３Ｈ）、１．９５〜１．７０（ｍ，８Ｈ）、１．６５（ｄｔ，Ｊ＝１９．０，７．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．４９〜１．４０（ｍ，２Ｈ）、１．２７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）、１．０７（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）、０．５３（ｓ，２Ｈ）。
13Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ  １７５．８３，１７２．０２，７２．８８，５７．５５，４９．５１，４０．７９，３２．７６，３２．５５，３２．２５，３１．９３，２５．５２，２５．２２，２１．１５，１８．６１，１３．０２。
１．２  （２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−アセトキシ−３−メチルペンタノエートＨＤＰ３０．１４２７の合成
【化２４】
2018536666.tif 000026
【０１２２】
４．１４ｇ（１３．４ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１４０９を、３５ｍｌのメタノール中に懸濁させた。２１０ｍｌのクロロホルムを加え、透明の溶液を２３°Ｃで２４時間撹拌した。クロロホルム及びメタノールを、真空中で蒸発させ、残渣を、新たに調製されたメタノール／クロロホルム（３５ｍｌ／２１０ｍｌ）混合物中に再溶解した。溶液を５０°Ｃまで加熱し、６時間かけて蒸発乾固させた。残りの残渣を７００ｍｌのジエチルエーテルで処理し、６０分間撹拌した。結果として得られた懸濁液を濾過で除去し、白色固体を真空乾燥させた。この固体を、９０ｍｌの１,４−ジオキサン及び６５ｍｌのアセトン中に再懸濁させた。０．８Ｍ  ＮａＨＣＯ3水溶液６０ｍｌを加えた。２相混合物を、５．２４ｇ（１５．５ｍｍｏｌ）のＮ−（フルオレニル−９−メトキシカルボニルオキシ）−スクシンイミド（ＦｍｏｃＯＳｕ）で一度に処理した。
【０１２３】
この混合物をアルゴン下、室温で１７時間撹拌し、５％クエン酸で酸性化した。水相をジエチルエーテルで３回抽出した。結合エーテル相を水で３回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。１％酢酸含有のＣＨＣｌ3から１％酢酸含有のＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（４０／１）混合物の勾配で、粗酸をシリカゲルクロマトグラフィで精製した。生成物画分を蒸発させ、２．４８ｇ（４５％収率）のＨＤＰ３０．１４２７を白色の結晶塊として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：４１２,２３［ＭＨ］+；計算値：４１１．１７（Ｃ23Ｈ25Ｎ6）
1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ  ７．７７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．６１（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）、７．４４〜７．３７（ｍ，２Ｈ）、７．３２（ｔｄｄ，Ｊ＝７．５，２．８，１．２Ｈｚ，２Ｈ）、５．５４（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．９３〜４．８４（ｍ，１Ｈ）、４．５０（ｄｄ，Ｊ＝９．２，３．１Ｈｚ，１Ｈ）、４．４４〜４．３３（ｍ，２Ｈ）、４．２５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．５１〜２．４１（ｍ，１Ｈ）、２．０４（ｓ，３Ｈ）、１．２６（ｄ，Ｊ＝６．０，Ｈｚ  ３Ｈ）、１．０４（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
13Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  １７６．２６，１７１．２３，１５６．４８，１４３．７７，１４３．５９，１４１．２４，１２７．７０，１２７．０６，１２５．１２，７１．２２，６７．３６，５５．９３，４７．０４，４１．２１，２１．１１，１８．４３，１４．２７。
１．３  化合物６（ベンジル（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−イル）メトキシ）カルボニル）−アミノ）−４−アセトキシ−３−メチルペンタノエート（ＨＤＰ３０．１４８５）の合成
【化２５】
2018536666.tif 000027
【０１２４】
２．４７ｇ（６．００ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１４２７を、１２０ｍｌの乾燥メタノール中に溶かした溶液を、０．０３Ｍフェニルジアゾメタンのトルエン溶液２２５ｍｌで１時間にわたって処理した。フェニルジアゾメタン溶液を、Zhou et al., J. Am. Chem. Soc., 131 (2009) 11734-11743に従って調整した。Ｎ2の遊離が止んだ後、アルゴン下、反応混合物を更に１時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ2、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（１／１））でモニターし、完了後に、蒸発乾固させた。ｎ−ヘキサンから酢酸エチルに勾配をかけて、シリカゲルクロマトグラフィで残渣を精製した。純粋な画分を結合し、蒸発させて、ＨＤＰ３０．１４８５の白色固体を得た。
収量：２．４１ｇ（８０％）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：５２４．４３［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：５２４．２２（Ｃ30Ｈ31ＮａＮＯ6）
1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ  ７．７６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、７．６１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．４４〜７．２７（ｍ，９Ｈ）、５．５３（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．１８（ｓ，２Ｈ）、４．９２〜４．８２（ｍ，１Ｈ）、４．５０（ｄｄ，Ｊ＝９．３，３．４Ｈｚ，１Ｈ）、４．３７（ｑｄ，Ｊ＝１０．６，７．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．２４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．４４（ｄｄｔ，Ｊ＝１３．５，１０．０，５．０Ｈｚ，１Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、１．２３（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）、０．９９（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
13Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  １７１．５６，１７０．８４，１５６．４９，１４３．８８，１４３．６６，１４１．２２，１３５．１８，１２８．６４，１２８．２４，１２７．６５，１２７．０５，１２５．１６，１１９．９１，７６．７１，７０．９９，６７．３０，６７．１４，５６．１８，４７．０８，４１．１９，２１．０５，１８．２８，１４．２２。
２．ＨＤＰ３０．０２８７の合成
【化２６】
2018536666.tif 000028
２．１  ＨＤＰ３０．００８１（ＴｒＮＨ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−ＯＭｅ）の合成
【化２７】
2018536666.tif 000029
【０１２５】
１．５９ｇ（５．００ｍｍｏｌ）のＮ−トリチルグリシン及び０．９１ｇ（５．００ｍｍｏｌ）のＬ−イソロイシン−メチルエステル塩酸塩を、２５ｍｌの乾燥ジクロロメタン中に懸濁させ、０．８７ｍｌ（５．００ｍｍｏｌ）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）で処理した。０．７７ｇ（５．００ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔｘＨ2Ｏ）を透明の溶液に加えた。反応混合物を、アルゴンでフラッシュした。次いで、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をジクロロメタン中に溶かした１Ｍ溶液５．００ｍｌを、室温で加えた。２〜３分後に、透明の溶液が混濁した。反応混合物を、アルゴン下、室温で２０時間撹拌した。結晶質の不溶性ジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、ジクロロメタンで洗浄した。ロータリーエバポレータでジクロロメタン相を蒸発させると、２５ｍｌの酢酸エチル中に半固体残渣が沈殿した。不溶性追加的なジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、酢酸エチル溶液を蒸発させて、黄色の油を得た。これを、ＣＨＣｌ3からＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（４０／１）に勾配をかけて、シリカゲルカラム上で精製した。減圧下で画分を蒸発させて、２．０７ｇ（９３％）のＨＤＰ  ３０．００８１を白色の発泡体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：４４５．４３［ＭＨ］+；計算値：４４４．２４（Ｃ28Ｈ32Ｎ2Ｏ3）
２．２  ＨＤＰ３０．００８３（ＴｒＮＨ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−ＯＨ）の合成
【化２８】
2018536666.tif 000030
【０１２６】
５．４０ｇ（１２．１５ｍｍｏｌ）のＴｒＮＨ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−ＯＭｅを５０ｍｌのメタノール中に溶かした溶液を、２Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液２６ｍｌで処理した。結果として得られた懸濁液を、アルゴン下、周囲温度で２０時間撹拌した。最後に、透明の溶液を蒸発乾固させた。残りの残渣を、ＣＨＣｌ3１００ｍｌと５％クエン酸水溶液１００ｍｌとの混合物中に分散させた。ＣＨＣｌ3相を、水及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。溶媒が蒸発した後、純粋なＨＤＰ３０．００８３が無色の油として得られ、減圧下で白色の発泡体（３．５０ｇ、６７％）に固化した。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：４３１,４８［ＭＨ］+；計算値：４３０．２３（Ｃ27Ｈ30Ｎ2Ｏ3）
２．３  ＨＤＰ３０．００８４（ＴｒＮＨ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ）の合成
【化２９】
2018536666.tif 000031
【０１２７】
７．２０ｇ（１６．７０ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．００８３  ＴｒＮＨ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−ＯＨ及び２．１０ｇ（１６．７０ｍｍｏｌ）のグリシンメチルエステル塩酸塩を、１２５ｍｌの乾燥ジクロロメタン中に懸濁させた。２．８５ｍｌ（１６．７０ｍｍｏｌ）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加えた後、２．５７ｇ（１６．７０ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ×Ｈ2Ｏ）を加え、反応混合物を、アルゴンでフラッシュした。３．４６ｇ（１６．７０ｍｍｏｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を室温で加えて、アルゴン下、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。不溶性ジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、ジクロロメタンで洗浄した。ロータリーエバポレータでジクロロメタン相を蒸発させると、クロロホルム３０ｍｌ中に租残渣（１２．４３ｇ）が沈殿した。不溶性ジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、ＣＨＣｌ3からＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（４０／１）に勾配をかけて、シリカゲルカラム上でクロロホルム溶液を精製した。生成物画分を蒸発させ、減圧下、３．５５ｇ（４２％）の白色固体を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：５０１．２９［ＭＨ］+；計算値：５０１．２６（Ｃ30Ｈ35Ｎ3Ｏ4）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：５２４．３３［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：５２４．２６（Ｃ30Ｈ35Ｎ3ＮａＯ4）
２．４  ＨＤＰ３０．００８９（Ｈ2Ｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ）の合成
【化３０】
2018536666.tif 000032
【０１２８】
ＨＤＰ３０．００８４  ＴｒＮＨ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ２．０３ｇ（４．０５ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン１１０ｍｌ中に溶解した。トリフルオロ酢酸（１．５０ｍｌ）を加え、黄色の溶液をアルゴン下、室温で４時間撹拌した。ゲル化反応混合物を５０ｍｌのメタノールで処理し、更に１時間撹拌した。無色透明の溶液を蒸発乾固させ、残りの残渣を１００ｍｌのジエチルエーテルで一晩撹拌した。白色固体を濾過で除去し、真空乾燥させた。
Ｈ2Ｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ  ×  ＴＦＡの１．４０ｇ（７１％）白色固体
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：２６０．２３［ＭＨ］+；計算値：２５９．１５（Ｃ11Ｈ21Ｎ3Ｏ4）
２．５  ＨＤＰ３０．０２６３（ＢｏｃＨｐｉ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ）の合成
【化３１】
2018536666.tif 000033
【０１２９】
２．２７ｇ（５．３３ｍｍｏｌ）のＢｏｃＨｐｉ（１−Ｂｏｃ−Ｌ−３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］−インドール−２−カルボン酸（Droste, H., Wieland, T., Liebigs Annalen der Chemie 11 (1987) 901-10；及びSavige, W.E., Aust. J. Chem. 1975, 2275-2287）を５０ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド中に溶かした溶液に、周囲温度にて１．９６ｇ（５．２６ｍｍｏｌ）のＨ2Ｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ（ＨＤＰ３０．００８９）、１．８３ｍｌ（１０．４９ｍｍｏｌ）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）、及び２．７４ｇ（５．２７ｍｍｏｌ）のＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）を加えた。反応混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で１４時間撹拌し、１５０ｍｌのクロロホルムで希釈した。有機溶液を５％クエン酸（１×）、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（１×）及び水（３×）で抽出し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過で除去し、蒸発乾固させた。ＣＨＣｌ3からＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（１０／１）に勾配をかけて溶離させ、固体残渣をシリカゲルカラム上で精製した。ＨＤＰ３０．０２６３を白色固体として得た。収量：１．７９ｇ（６０％）。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：５６２．３４［ＭＨ］+；計算値：５６１．２８（Ｃ27Ｈ39Ｎ5Ｏ8）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：５８４．４１［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：５８４．２８（Ｃ27Ｈ39Ｎ5ＮａＯ8）
２．６  ＨＤＰ３０．０２８７（ＢｏｃＨｐｉ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＨ）の合成
【化３２】
2018536666.tif 000034
【０１３０】
２８０．５ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）のＢｏｃＨｐｉ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ（ＨＤＰ３０．０２６３）を７．５ｍｌの乾燥メタノール中に溶かした溶液を、２Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液５５０μｌで処理した。アルゴン下、反応混合物を周囲温度で３時間撹拌した。反応完了後、この反応物を、５００μｌの酢酸溶液（ＴＬＣ（ＳｉＯ2）：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／１％ＡｃＯＨ）で急冷し、蒸発乾固させた。１％ＡｃＯＨ含有のＣＨＣｌ3から１％ＡｃＯＨ含有のＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（９／１）に勾配をかけて、残渣をシリカゲル上で精製した。収量：２２５ｍｇ（８２％）。
Ｓ（ＥＳＩ+）実測値：５４８．１０［ＭＨ］+；計算値：５４７．２６（Ｃ26Ｈ37Ｎ5Ｏ6）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：５７０．３０［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：５７０．２６（Ｃ26Ｈ37Ｎ5ＮａＯ6）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）実測値：１０９５．１０［２Ｍ＋Ｈ］+
３．γ−アマニンアミドＨＤＰ３０．１７９０の合成
【化３３】
2018536666.tif 000035
３．１  ＨＤＰ３０．１７８８の合成
【化３４】
2018536666.tif 000036
【０１３１】
２０００ｍｇ（４．８８ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃＮ−Ｈｙｐ（ＯtＢｕ）ＯＨを３５ｍｌの乾燥酢酸エチル中に溶解し、９０４ｍｇ（４．９１ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールで処理し、５ｍｌの酢酸エチル中に溶解して、１１１２ｍｇ（５．３９ｍｍｏｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を５ｍｌの酢酸エチル中に溶解した。アルゴン下、室温で２０時間撹拌した後、尿素の沈澱物を濾過で除去し、酢酸エチルで洗浄した。有機溶剤を蒸発させ、残りの高粘度の無色油を高真空乾燥させた。収量：２．４５ｇ（８７％）。この十分高純度の生成物は、更に精製せずに、次の工程で用いた。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：５７６．２３［ＭＨ］+；計算値：５７５．１７（Ｃ30Ｈ26Ｆ5ＮＯ5）
３．２  ＨＤＰ３０．１５０２の合成
【化３５】
2018536666.tif 000037
経路Ａ：
【０１３２】
８１５．０ｍｇ（１．６３ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１４８５を、３５ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド中に溶解した。４７３μｌ（４．５５ｍｍｏｌ）のジエチルアミンを加えた後、アルゴン下、反応混合物を室温で２．５時間撹拌し、減圧下、３５°Ｃ、４０ｍｍ  Ｈｇにて、過剰なジエチルアミンをロータリーエバポレータで除去した（減圧下、１時間放置した）。次いで、ジメチルホルムアミド溶液を、１８７０．０ｍｇ（３．２５ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１７８８  ＦｍｏｃＮ−Ｐｒｏ（ＯｔＢｕ）−Ｏ５ＦＰｈ及び２８３．０μｌ（１．６３ｍｍｏｌ）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）で処理した。アルゴン下、反応混合物を撹拌した。１９時間後、溶液をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸（１×）及び水（３×）で洗浄した。この揮発性物質を、硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、蒸発させて、ｎ−ヘキサンから酢酸エチルに直線勾配をかけて、残渣をシリカゲル上で精製した。生成物画分を採取し、溶剤を蒸発させて、白色固体を得た。収量：８３．０ｍｇ（８％）。
経路Ｂ（Ueki et al., Chem. Lett. 1993, 721-724）：
【０１３３】
２．４１ｇ（４．８０ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１４８５を２４ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド中に溶かした溶液に、８．３１ｍｌ（４７．８７ｍｍｏｌ、１０．０当量）１−オクタンチオール及び３．０３ｇ（１１．５９ｍｍｏｌ、２．４当量）フッ化テトラブチルアンモニウム水和物を加えた。１分間超音波処理した後、６．６ｇ（２８．８ｍｍｏｌ）のビス−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５イル）ジスルフィドを一度に加えた。黄色の溶液を３分間超音波処理し、３．０１ｍｌ（１７．２８ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）で処理し、３．２１ｇ（５．５９ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１７８８を２４ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド中に溶解した。この反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で３０分間撹拌した後、５％ＮａＨＣＯ3溶液５０ｍｌで希釈した。この混合物を酢酸エチルで抽出し、有機相を水で３回洗浄した。この有機溶剤を、硫酸ナトリウム上で乾燥させた後で蒸発させ、残りの黄色の油を高真空乾燥させた。収量：１２．１ｇ。ｎ−ヘキサンから酢酸エチルに直線勾配をかけて、粗物質をシリカゲル上で精製した。生成物画分を採取し、溶剤を蒸発させて、白色固体を得た。収量：１．５０ｇ（４９％）。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：６７１．３１［ＭＨ］+；計算値：６７０．３３（Ｃ39Ｈ46Ｎ2Ｏ8）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：６９３．５０［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：６９３．３３（Ｃ39Ｈ46Ｎ2ＮａＯ8）
３．３  ＨＤＰ３０．１１７０（ＦｍｏｃＮＨ−Ｃｙｓ（ＳＴｒ）−Ａｓｎ（ＮＨＴｒ）−ＯＨ）の合成
【化３６】
2018536666.tif 000038
【０１３４】
２０８５ｍｇ（５．５７ｍｍｏｌ）のＨ2Ｎ−Ａｓｎ（ＮＨＴｒ）ＯＨを７５ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、３７９８ｍｇ（５．５６ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃＮＨ−Ｃｙｓ（ＳＴｒ）ＯＮＨＳ、及び３０００μｌのＮ，Ｎ−エチル−ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加えた。アルゴン下、反応混合物を室温で撹拌した。２２時間後、混合物をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸水溶液（１×）及び水（３×）で抽出した。有機溶剤を、ＭｇＳＯ4上で乾燥させて蒸発させた。固体残渣をシリカゲル上に置き、１％ＡｃＯＨ含有のＣＨＣｌ3からＡｃＯＨ含有のＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（４０／１）に勾配をかけて溶離させ、カラムクロマトグラフィで精製した。精製物の純粋な画分を採取し、蒸発乾固させて、３０１０ｍｇ（５３％）の白色の結晶を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+）［Ｍ＋Ｎａ］+  実測値：９６４．２１；計算値：９６４．３４（Ｃ60Ｈ51Ｎ3ＮａＯ6Ｓ）
ＭＳ（ＥＳＩ+）［２Ｍ＋Ｈ］+  実測値：１８８２．４３；計算値：１８８３．７１（Ｃ120Ｈ103Ｎ6Ｏ12Ｓ2）
ＭＳ（ＥＳＩ+）［２Ｍ＋Ｎａ］+  実測値：１９０４．７９；計算値：１９０５．６９（Ｃ120Ｈ102Ｎ6ＮａＯ12Ｓ2）
３．４  ＨＤＰ３０．１６６８
【化３７】
2018536666.tif 000039
【０１３５】
２１３．０ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１５０２を、１１ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド中に溶解した。９３．０μｌ（０．８９ｍｍｏｌを加えた後、アルゴン下、反応混合物を５時間撹拌した。減圧下、３５°Ｃ、３５ｍｍ  Ｈｇにて、ロータリーエバポレータで、過剰なジエチルアミンを除去した（減圧下、１時間放置した）。ジメチルホルムアミド溶液を、２９９．１ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１１７０  ＦｍｏｃＮＨ−Ｃｙｓ（ＳＴｒ）−Ａｓｎ（ＮＨＴｒ）−ＯＨ、１６５．４（０．３２ｍｍｏｌ）のＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、及び５５．３μｌ（０．３２ｍｍｏｌ）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）で処理した。反応混合物を、アルゴン下、１７時間撹拌して、クロロホルムで希釈した。有機溶剤を、５％クエン酸（１×）及び水（３×）で洗浄した。この揮発性物質を、硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、蒸発させて、ｎ−ヘキサンから酢酸エチルに勾配をかけて、残渣をシリカゲルカラム上で精製した。生成物画分を採取し、蒸発させて、白色固体を得た。収量：２４９ｍｇ（５７％）のＨＤＰ３０．１６６８.
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：１３７２．１５［ＭＨ］+；計算値：１３７１．６０（Ｃ84Ｈ85Ｎ5Ｏ11Ｓ）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：１３９４．７３［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：１３９４．６０（Ｃ84Ｈ85Ｎ5ＮａＯ11Ｓ）
３．５  ＨＤＰ３０．１６０６の合成
【化３８】
2018536666.tif 000040
【０１３６】
２４８．０ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１６６８を、８ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド中に溶解させた。５２．６μｌ（０．５１ｍｍｏｌ）のジエチルアミンを加えた後、アルゴン下、反応混合物を室温で４．５時間を撹拌した。減圧下、ロータリーエバポレータで、３７°Ｃ、３７ｍｍ  Ｈｇにて過剰なジエチルアミンを除去した（１時間放置して真空排気した）。次いで、ジメチルホルムアミド溶液を、９８．９ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．０２８７  ＢｏｃＨｐｉ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＨ、９４．１（０．１８ｍｍｏｌ）のＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、及び３１．５μｌ（０．１８ｍｍｏｌ）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）で処理し、アルゴン下、１７時間撹拌した。ＤＭＦ溶液をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸（１×）及び水（３×）で洗浄した。この揮発性物質を、硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、蒸発させ、ＣＨＣｌ3からＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（１５／１）に直線勾配をかけて、残渣（３９８．０ｍｇ）をシリカゲルカラム上で精製した。生成物画分を採取し、溶剤を蒸発させて、白色固体（２２８．２ｍｇ（７５％））を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：１６７９．２８［ＭＨ］+；計算値：１６７８．７８（Ｃ95Ｈ110Ｎ10Ｏ16Ｓ）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：１７０１．６８［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：１７０１．７８（Ｃ95Ｈ110Ｎ10ＮａＯ16Ｓ）
３．６  ＨＤＰ３０．１６０７の合成
【化３９】
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【０１３７】
２２８．１ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１６０６を、１０ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶解した。アルゴン下、透明の溶液を５時間撹拌し、（３５°Ｃにてロータリーエバポレータで）蒸発乾固させた。残渣をメタノール（３×）で蒸発させ、痕跡量のトリフルオロ酢酸を除去した。残りの残渣（２５４．２ｍｇ）をＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Luna（商標）１０μ、２５０×２１ｍｍ、Phenomenex（登録商標）、２３０ｎｍ）で精製し、９５％Ｈ2Ｏ／５％ＭｅＯＨ／０．０５％ＴＦＡから９５％ＭｅＯＨ／５％Ｈ2Ｏ／０．０５％ＴＦＡに勾配をかけて、流速１５ｍｌ／分.純粋な画分を蒸発させて、水中で凍結乾燥し、６５．１ｍｇ（４７％）のＨＤＰ３０．１６０７を非晶質の固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：１０２１．５３［ＭＨ］+；計算値：１０２０．４４（Ｃ48Ｈ64Ｎ10Ｏ13Ｓ）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：１０４３．６３［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：１０４３．４４（Ｃ48Ｈ64Ｎ10ＮａＯ13Ｓ）
３．７  ＨＤＰ３０．１６７６の合成
【化４０】
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【０１３８】
１２．３ｍｇ（１２．０６μｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１６７６を、４ｍｌのエタノールと０．２ｍｌの酢酸との混合物中に溶解した。２５ｍｇのＰｄ／Ｃ（１０％）を加えた後、反応フラスコに水素を充填した。通常の圧力下、水素添加を室温で遂行した。４時間後、ＴＬＣ対照（ＳｉＯ2：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ（６５／２５／４）に、脱ベンジル化の完了を示す。触媒を濾過で除去し、反応混合物を蒸発乾固させた。粗生成物を、ＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Luna（商標）１０μ、２５０×２１ｍｍ、Phenomenex（登録商標）、２３０ｎｍ）を使用して、９５％Ｈ2Ｏ／５％ＭｅＯＨ／０．０５％ＴＦＡから９５％ＭｅＯＨ／５％Ｈ2Ｏ／０．０５％ＴＦＡに勾配をかけて、流速１５ｍｌ／分で精製した。純粋な画分を蒸発乾固させ、水中で凍結乾燥し、５．６４ｍｇ（５０％）のＨＤＰ３０．１６７６を非晶質の固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：９３１．４８［ＭＨ］+；計算値：９３０．３９（Ｃ41Ｈ58Ｎ10Ｏ13Ｓ）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：９５３．５９［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：９５３．３９（Ｃ41Ｈ58Ｎ10ＮａＯ13Ｓ）
３．８  ＨＤＰ３０．１６７９の合成
【化４１】
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【０１３９】
３２．６ｍｇ（３５．０μｍｏｌ）のセコペプチドＨＤＰ３０．１６７６を、３６ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、その後、アルゴン雰囲気下、室温にて５４．７ｍｇ（１０５．１μｍｏｌ）のＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、１６．０９ｍｇ（１０５．１μｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ×ＦＦＨ2Ｏ）、及び３６．６μｌ（２１０．０μｍｏｌ）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）で処理した。アルゴン下、反応混合物を周囲温度で２３時間撹拌した。揮発性物質を高真空下（０．２６ｍｍ  Ｈｇ、３９°Ｃ）で除去し、ＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Luna（商標）１０μ、２５０×２１ｍｍ、Phenomenex（登録商標）、２３０ｎｍ）を使用して、９５％Ｈ2Ｏ／５％ＭｅＯＨ／０．０５％ＴＦＡから９５％ＭｅＯＨ／５％Ｈ2Ｏ／０．０５％ＴＦＡに勾配をかけて、残渣を流速１５ｍｌ／分で精製した。純粋な画分を蒸発させ、水中での凍結乾燥により、１１．１ｍｇ（３５％）のＨＤＰ３０．１６７９を非晶質の固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：９１３．４４［ＭＨ］+；計算値：９１２．３８（Ｃ41Ｈ56Ｎ10Ｏ12Ｓ）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：９３５．５８［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：９３５．３８（Ｃ41Ｈ56Ｎ10ＮａＯ12Ｓ）
３．９  ＨＤＰ３０．１７９０の合成
【化４２】
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【０１４０】
１１．０ｍｇ（１２．１ｍｍｏｌ）のＨＤＰ３０．１６７９を、７モルのアンモニア／無水メタノール溶液１８００μｌ中に溶解した。反応フラスコを、アルゴンでフラッシュし、密閉して室温で４８時間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させてから、ＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Luna（商標）１０μ、２５０×２１ｍｍ、Phenomenex（登録商標）、２３０ｎｍ）で、９５％Ｈ2Ｏ／５％ＭｅＯＨ／０．０５％ＴＦＡから９５％ＭｅＯＨ／５％Ｈ2Ｏ／０．０５％ＴＦＡに勾配をかけて、残りの残渣（１３．９ｍｇ）を流速１５ｍｌ／分で精製した。生成物画分を蒸発させ、水中での凍結乾燥により、４．５６ｍｇ（４４％）のＨＤＰ３０．１７９０を非晶質の白色固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：８７１．５１［ＭＨ］+；計算値：８７０．３７（Ｃ39Ｈ54Ｎ10Ｏ11Ｓ）
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：８９３．６９［Ｍ＋Ｎａ］+；計算値：８９３．３７（Ｃ39Ｈ54Ｎ10ＮａＯ11Ｓ）
【図１】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図２（ｃ）】
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【図２（ｄ）】
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【図２（ｅ）】
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【図２（ｆ）】
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【図２（ｇ）】
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【図３】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【国際調査報告】
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