(57)【要約】  微粒子（例えばリポソーム）と血小板膜タンパク質を含み、損傷部位に移動することができる単球、または好中球、または他の循環血液細胞に結合している、プロテオリポソームなどのタンパク質微粒子を提供する。本明細書は、単球を介して治療剤を送達するためのプロテオリポソームの使用も提供する。【選択図】図1B
2018513170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子と1種類以上の血小板膜タンパク質を含み、損傷部位に移動することができる循環血液細胞に結合しているタンパク質微粒子。
【請求項２】
前記循環血液細胞が好中球または単球である、請求項1に記載のタンパク質微粒子。
【請求項３】
リポソームを含むプロテオリポソームである、請求項1または2に記載のタンパク質微粒子。
【請求項４】
治療剤を封入している、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子。
【請求項５】
リン脂質とコレステロールを含有するリポソームを含むプロテオリポソームである、請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子。
【請求項６】
前記1種類以上の血小板膜タンパク質が、血小板の膜から単離されたタンパク質混合物を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子。
【請求項７】
前記血小板が、活動していない血小板、または一部が活性化された血小板である、請求項6に記載のタンパク質微粒子。
【請求項８】
前記プロテオリポソームが、血小板膜の脂質成分を実質的に含まない、請求項1〜7のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子。
【請求項９】
内皮細胞に結合しない、請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子。
【請求項１０】
前記治療剤が心臓保護剤である、請求項4〜9のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子。
【請求項１１】
前記心臓保護剤が、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗線維形成剤、免疫調節剤、または血管新生促進剤のいずれかである、請求項10に記載のタンパク質微粒子。
【請求項１２】
被験者に治療剤を送達する方法であって、その治療剤を封入した請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子をその被験者に投与することを含む方法。
【請求項１３】
虚血性心疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、虚血性心疾患を治療するための治療剤を封入した請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１４】
前記被験者が、虚血性心疾患であること、または虚血性心疾患のリスクがあることが疑われるヒト患者である、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
治療剤を被験者に送達するための、請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子の使用。
【請求項１６】
虚血性心疾患の治療に使用するための薬剤を製造するための、請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子の使用。
【請求項１７】
治療剤を送達するためのキットであって、請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質微粒子と治療剤を含み、該治療剤が該タンパク質微粒子に封入されているキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年4月20日に出願された「血小板様タンパク質微粒子およびそれらを薬剤送達に用いる方法」という表題の米国仮特許出願第62/149,849号の出願日の利益を主張するものであり、その内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
がんや虚血性心疾患などの慢性疾患が多くの国における主な死因であり続けている。Bauer他、（2014年）、The Lancet第384巻：45〜52ページ。これらの疾患は多くの国の年間医療予算の大きな割合を占めているだけではく、病人を抱える家庭に財政的にも精神的にも莫大な負担を生じさせている。多くの慢性疾患に対する新しい治療法の開発と薬剤になる可能性のある新たな標的の同定に継続的な進歩が見られるとはいえ、可能性のあるこれらの治療法の治療への応用するのはまだ限定的である。多くの治療法が今日直面している重要な課題の1つは、標的特異性である。すなわち、いかにして治療作用を標的部位に限定するかが課題である。Raj他、（2014年）、Drug Delivery 第2014巻：1〜20ページ。
【０００３】
過去何十年以上にもわたり、虚血性心疾患（IHD）のための新たな薬剤標的の同定と開発に継続的な進歩が見られている。しかしIHDは多くの国で死の主要な原因であり続けている。Go他、（2014年）、Circulation第129巻：e28〜e292ページ。治療薬のほとんどは、その作用が標的部位に限定されない場合が多いことが知られている、Vander Heide他、（2013年）、Circulation Res第113巻：464〜477ページ。したがって、このような治療薬を治療対象部位にいかにしてうまく送達するかは、解決されないままに残されている大きな課題である。
【０００４】
IHDが進行する間に起こる重要なイベントの1つは、循環単球が梗塞領域にリクルートされることである。Liu他、（2011年）、Arterioscler Thromb Vasc Biol第31巻：834〜841ページ；Sarma他、（2002年）、Circulation第105巻：2166〜2171ページ；Furman他、（2001年）、J Am Coll Cardiol第38巻：1002〜1006ページ。これら循環単球は、内膜（endothelial lining）を横断するとマクロファージになり、その炎症活性を通じ、梗塞を起こした心臓により多くの損傷を引き起こす。これらマクロファージを標的とする治療薬が開発されているが、それら治療薬は、心臓の梗塞領域に存在するマクロファージに対してだけでなく、体内の別の場所のマクロファージにも作用することがわかっている。Ley他、（2011年）、Arterioscler Thromb Vasc Biol第31巻：1506〜1516ページ。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、リポソームと血小板膜タンパク質を含むプロテオリポソームの設計に基づいている。このようなプロテオリポソームは、単球などの循環血液細胞に結合できるが、内皮細胞には結合できない。そのためこれらプロテオリポソームを用いると、その中に封入された治療薬を、損傷部位（例えば心臓の梗塞領域）に移動することのできる単球に結合させて送達することができる。単球がマクロファージになると、プロテオリポソームはエンドサイトーシスを通じてそのマクロファージによって吸収され、そのことによって治療剤を、単球が集積する部位（例えば梗塞領域）に送達することができる。あるいは治療剤は、そのプロテオリポソームのエンドサイトーシスの前に、単球またはマクロファージが集積する疾患部位で放出させることができる。
【０００６】
したがって本開示により、プロテオリポソームなどのタンパク質微粒子として、微粒子（例えばリポソーム）と1種類以上の血小板膜タンパク質を含み、受動的または能動的に損傷部位に移動することができる単球、または好中球、または他の循環血液細胞に結合しているタンパク質微粒子が提供される。いくつかの実施態様では、このタンパク質微粒子は、心臓保護剤などの治療剤、例えば抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗線維形成剤、免疫調節剤、血管新生促進剤を封入している。いくつかの実施態様では、リポソームは、リン脂質とコレステロールを含んでいる。
【０００７】
本明細書に記載の任意のタンパク質微粒子（例えばプロテオリポソーム）において、1種類以上の血小板膜タンパク質は、血小板の膜から単離されたタンパク質混合物を含んでもよい。いくつかの実施態様では、血小板は、活動していない血小板、または一部が活性化された血小板である。本明細書では、一部が活性化された血小板は、早期活性化マーカー（例えばCD62P）を発現しているが、完全活性化マーカー（例えばCD40LやCD18）は発現していない血小板を意味する。
【０００８】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のタンパク質微粒子（例えばプロテオリポソーム）は、血小板膜の脂質成分を実質的に含んでいない。その代わりに、またはそれに加えて、本明細書に記載のどのタンパク質微粒子（例えばプロテオリポソーム）も内皮細胞に結合しない。
【０００９】
別の1つの側面では、本開示により、被験者に治療剤を送達する方法として、その治療剤を封入した本明細書に記載のいずれかのタンパク質微粒子（例えばいずれかのプロテオリポソーム）をその被験者に投与することを含む方法が提供される。
【００１０】
さらに別の1つの側面では、本開示により、虚血性心疾患を治療する方法として、それを必要とする被験者に、虚血性心疾患（IHD）を治療するための治療剤を封入した本明細書に記載のいずれかのタンパク質微粒子（例えばプロテオリポソーム）の有効量を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、抗IHD剤は抗炎症剤である。
【００１１】
本開示の範囲には、（a）抗IHD剤（例えば抗炎症剤）などの治療剤と医薬として許容可能な基剤を封入した本明細書に記載のいずれかのタンパク質微粒子（例えばプロテオリポソーム）を含み、治療剤を標的部位（例えば損傷部位）に送達するため、またはIHDを治療するために用いられる医薬組成物と（b）治療剤を標的部位に送達するための医薬、またはIHDの治療に使用するための医薬の製造における本明細書に記載のプロテオリポソームの使用も含まれる。
【００１２】
さらに、本開示により、薬剤送達用のキットとして、本明細書に記載のいずれかのタンパク質微粒子と、本明細書に記載の治療剤を含むキットが提供される。治療剤は、そのタンパク質微粒子に封入される。
【００１３】
本開示の1つ以上の実施態様の詳細は、以下の説明に記載されている。本開示の他の特徴または利点は、いくつかの実施態様に関する以下の図面と詳細な説明ならびに添付の請求項から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
図１図1A〜図1Gは、ヒトのPMPの精製とPLPの作製を示している。
【図１Ａ】図1Aは、PLPの作製を示す模式図であり、精製したヒト血小板膜タンパク質（PMP）を薄膜水和法によってDOPC系リポソームと共役させることを含んでいる。
【図１Ｂ】図1Bは、戦略の全体を示す模式図である。血小板が、心筋梗塞が進行する間にリクルートされた単球の表面に接着する（1参照）。したがって血小板-単球凝集体が滲出する（2参照）。そのため血小板様プロテオリポソーム（PLP）は、血小板と同様のやり方で単球と相互作用すると考えられる（3参照）。PLPは、内皮を横断すると、単球由来のマクロファージによってファゴサイトーシスを受けると考えられる（4参照）。
【図１Ｃ】図1Cは、PMPが、何回かの超遠心分離工程の後に単離された新鮮なヒト血小板から精製されることを示している。
【図１Ｄ】図1Dは、SDS-PAGEによって得た膜タンパク質の純度を示す写真である。黒い長方形は、最終的に精製された膜タンパク質溶液にはβ-アクチン（黒い長方形）が見られないことを示している。白い長方形は、最終膜タンパク質溶液から得られたタンパク質のバンドを示している。
【図１Ｅ】図1Eは、いくつかの血小板膜タンパク質が何であるかをウエスタンブロッティングによって明らかにした図である。
【図１Ｆ】図1Fは、（PMP共役体なしの）空リポソームとPLPのクライオEM画像を示す写真を含んでいる；スケール棒、100μm。
【図１Ｇ】図1Gは、ここに示されているさまざまなサンプルの中にGPIIbとCD42cが存在することを示す写真である。超遠心分離によって10 mg/mlのPLPを濃縮して1 mg/mlにし、PLPに共役させたPMPを、抗GPIIb抗体と抗CD42c抗体を用いてウエスタンブロッティングによって同定した。
【００１５】
図2A〜図2Bは、血小板様プロテオリポソームとさまざまなタイプの細胞の相互作用を示す写真である。
【図２Ａ】図2Aは、さまざまなタイプの細胞と相互作用する血小板様プロテオリポソームをリポソームと対比させた蛍光画像を示している。
【図２Ｂ】図2Bは、さまざまなタイプの細胞に結合した血小板様プロテオリポソームのフローサイトメトリー分析を示している。
【００１６】
図3A〜図3Eは、PLPの標的特異性を示している。
【図３Ａ】マウス内皮細胞（SVEC）、単球（RAW264.7）、マウス腹膜マクロファージ（MΦ）を、DiIで標識したリポソームまたはDiIで標識したPLPに37℃で4時間曝露した後、フローサイトメトリー分析を実施した（図3A）。
【図３Ｂ】PLPをMΦに曝露すると小胞（白い矢印）が形成された；スケール棒、2μm（図3B）。
【図３Ｃ】MΦの中にPLPが存在することは、TEMによっても見ることができた（白い矢印）；スケール棒、0.2μm（図3C）。
【図３Ｄ】DiIで標識したリポソームとこれら3種類の細胞の相互作用を蛍光イメージングによって可視化した；スケール棒、10μm。
【図３Ｅ】DiIで標識したPLPとこれら3種類の細胞の相互作用を蛍光イメージングによって可視化した；スケール棒、10μm。
【００１７】
図4A〜図4Dは、レーザーで損傷させたマウスの耳の皮膚におけるDiIで標識したPLPの局在状態を示す。マウスの耳に火傷による損傷を誘導した後、DiIで標識した5 mg/mlの空リポソームまたはPLP（白い矢印の先端）を静脈内に100μl注射した。血管はアイソレクチン抗体であらかじめ染色した。
【図４Ａ】多光子顕微鏡のレンズの焦点を損傷部位に合わせ、30分間にわたって空リポソームの滲出の経時画像を取得した。
【図４Ｂ】多光子顕微鏡のレンズの焦点を損傷部位に合わせ、30分間にわたってとPLPの滲出の経時画像を取得した。
【図４Ｃ】30分間撮影した後、損相部位周辺でランダムに選択した5箇所を、空リポソームで処理したマウスについて撮影した；スケール棒、50μm。
【図４Ｄ】30分間撮影した後、損相部位周辺でランダムに選択した5箇所を、PLPで処理したマウスについて撮影した；スケール棒、50μm。
【００１８】
図5A〜図5Fは、心筋I/R損傷のマウスモデルにおけるPLPの組織分布を示している。
【図５Ａ】10週齢のマウスを45分間虚血にし、その直後から24時間（図5A）または72時間（図5B）再灌流させた。リポソームまたはPLPを静脈内注射して4時間循環させた後、安楽死させた。回収した臓器に灌流を実施してからホモジェネートにした後、HPLC分析をした。n＝6、*、P＜0.05。**P＜0.01。を示している。
【図５Ｂ】10週齢のマウスを45分間虚血にし、その直後から24時間（図5A）または72時間（図5B）再灌流させた。リポソームまたはPLPを静脈内注射して4時間循環させた後、安楽死させた。回収した臓器に灌流を実施してからホモジェネートにした後、HPLC分析をした。n＝6、*、P＜0.05。**P＜0.01。を示している。
【図５Ｃ】図5Cは、I/Rで損傷した心臓におけるDiIで標識した空リポソームまたはPLPの局在状態を、凍結させて作製した切片サンプルで分析した結果を示している（核、青色；トロポニンI、緑色）。
【図５Ｄ】図5Dは、再灌流を24時間または72時間実施した時点で注入した空リポソームまたはPLPに4時間曝露した後のI/R損傷マウスから単離したCD11b+非筋細胞（図5E）とCD11b+ DiI+非筋細胞（図5F）に関するフローサイトメトリーと統計分析を示している。n＝5、***、P＜0.001。
【図５Ｅ】CD11b+非筋細胞の結果である。
【図５Ｆ】CD11b+ DiI+非筋細胞の結果である。
【００１９】
図6A〜図6Dは、心筋I/R損傷のマウスモデルにおけるPLP-CoPPの治療分析を示している。
【図６Ａ】図6Aは研究のプロトコルを示している。マウスを45分間虚血にし、再灌流を72時間実施した後、生理食塩水、CoPP（5 mg/kg）、リポ-CoPP（5 mg/kg）、PLP-CoPP（5 mg/kg）のいずれかを静脈内注射した。その後の注射は5日ごとに28日目まで行ない、その時点でマウスを安楽死させた。
【図６Ｂ】その後、マウスの心臓組織を切断してマッソンの3色染色法で染色した（図6B）。NT；処理せず、CoPP；単独のCoPP、リポ-CoPP；リポソームに封入したCoPP、PLP＋CoPP； PLPに封入したCoPP。スケール棒、切片全体の画像では1 mm、高倍率画像では100μm。
【図６Ｃ】図6Cは、各処理群（n＝4）における心臓の梗塞領域の統計分析を示している。*、P＜0.05；n.s、有意でない。
【図６Ｄ】図6Dは、I/Rで損傷した心臓において、再灌流を72時間実施した時点でさまざまな治療剤を静脈内注射した後に検出されたHO-1遺伝子と炎症促進遺伝子の発現を示している。
【００２０】
図7A〜図7Dは、PLP-CoPP処理後のMI損傷のマウスモデルの心臓機能の心エコー評価と血液化学分析を示している。
【図７Ａ】図7Aは処理プロトコルを示している。LAD動脈を恒久的に結紮してマウスを72時間放置した後、生理食塩水、リポのみ、PLPのみ、CoPP（5 mg/kg）、リポ-CoPP（5 mg/kg）、PLP-CoPP（5 mg/kg）のいずれかを約100μl静脈内注射した。その後は処理を5日ごとに28日目まで行ない、その時点でマウスの心臓機能を心エコー検査によって評価した（n＝8）
【図７Ｂ】LVEF、左心室駆出率；FS、短縮率；LVEDV、左心室拡張終期体積；LVESV、左心室収縮終期体積；IVSd、拡張期における心室間隔膜厚、IVSs、収縮期における心室間隔膜厚。
【図７Ｃ】マウスの血液を分析し、肝臓機能（図7C）、腎臓機能（図7D）、心臓機能（図7E）を評価するためのバイオマーカーを探した：AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ；TBIL、全ビリルビン；BUN、血液尿素窒素；CRE、クレアチニン；CKMB、クレアチンキナーゼMB。*、P＜0.05、***、P＜0.001。
【図７Ｄ】マウスの血液を分析し、肝臓機能（図7C）、腎臓機能（図7D）、心臓機能（図7E）を評価するためのバイオマーカーを探した：AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ；TBIL、全ビリルビン；BUN、血液尿素窒素；CRE、クレアチニン；CKMB、クレアチンキナーゼMB。*、P＜0.05、***、P＜0.001。
【００２１】
【図８】図8は、PLPが、血小板と循環単球の相互作用を生体模倣することを通じてCoPPの標的特異性を増大させることを示している。循環単球にPLPが結合することで、心臓保護薬（例えばCoPP）を送達するための代替経路が、EPR効果とは独立なやり方で提供される。リクルートされた循環単球が損傷した組織領域に浸潤すると、係留されたPLPが単球由来のマクロファージによってファゴサイトーシスを受ける。ファゴサイトーシスのとき、封入されたCoPPが細胞質ゾルに放出されてHO-1の発現が誘導される。すると炎症促進サイトカインの発現が下方調節される。さらに、PLPは、他の臓器に対するCoPPの有害な効果を最少にしただけでなく、送達用ビヒクルは、CoPPが常在性心臓マクロファージと接触する機会を最少にする可能性が大きい。
【００２２】
【図９】図9は、レーザー誘導損傷領域で注射の30分後に検出されたDiI+信号の統計的分析を示している。マウスの耳のレーザー誘導損傷領域で検出されるDiIで標識した空リポソームまたはPLPの全蛍光信号を測定し、統計的に分析した（n＝3）。***、P＜0.001。
【００２３】
図10A〜図10Cは、CoPPで誘導したHO-1発現のインビトロ分析を示している。
【図１０Ａ】図10Aは、CoPPとHO-1とビリルビンの間の関係を示す模式図である。細胞をリポソームまたはPLPに37℃で4時間曝露した。過剰分をすべてPBSで洗い流した。
【図１０Ｂ】次に細胞を37℃のインキュベータに一晩戻した後、ウエスタンブロッティングを実施した（図10B）。
【図１０Ｃ】図10Cは、触媒用のヘムをビリルビンに入れたとき、処理したすべてのサンプルで誘導されたHO-1の比活性を示している（n＝6）。NT；処理せず、CoPP；単独のCoPP、リポ＋CoPP；リポソームに封入したCoPP、PLP＋CoPP；PLPに封入したCoPP。*、P＜0.05、***、P＜0.001。
【００２４】
【図１１】図11は、切片にした心臓組織のヘマトキシリンとエオシンによる染色を示している。I/R損傷のマウスモデルの心臓における梗塞領域（n＝4）をヘマトキシリン／エオシン（H&E）によって評価した。スケール棒、切片全体の画像では1 mm、高倍率画像では100μm。マウスを45分間虚血にし、再灌流を72時間実施した後、生理食塩水、CoPP（5 mg/kg）、リポ-CoPP（5 mg/kg）、PLP-CoPP（5 mg/kg）のいずれかを静脈内注射した。その後の注射は5日ごとに28日目まで行ない、その時点でマウスを安楽死させた。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
疾患部位へのマクロファージのリクルートが、急性または慢性の疾患を持つ患者でファゴサイトーシスが起こっている間に発生する重要なイベントである。Pawelec他、Current opinion in immunology、2014年；第29巻：23〜28ページ。これらマクロファージは最初は血管の中に単球として出現する。Gordon他、Nature Reviews Immunology、2005年；第5巻：953〜964ページ。循環単球はその後、疾患部位に最も近い血管へと移動し、次いで内膜を通って侵入することによりその疾患部位に到達する。これは、滲出として知られるプロセスである。Hume、Current opinion in immunology、2006年；第18巻：49〜53ページ。
【００２６】
本開示により、単球に結合することができるため、診断剤や治療剤などの薬剤をその単球の移動を通じて望む部位（例えば疾患が起こっている部位）に送達するのに役立つ、プロテオリポソームなどの血小板様タンパク質微粒子（PLP）が提供される。タンパク質微粒子は、1種類以上のタンパク質を含む微粒子（例えばナノ粒子）であり、そのタンパク質は微粒子の表面に提示されることが好ましい。本明細書に記載のPLPは、精製した血小板膜タンパク質を表面に有するリポソーム系送達系である。このようなPLPは有利な薬剤送達用ビヒクルとして機能することができるため、循環血液細胞（例えば単球）を「シャトル」として用いてPLPに封入した治療剤を興味の対象である標的部位（例えば心臓の梗塞部位）に到達させることが可能である。PLPを運ぶ循環単球は、内膜を横断すると活性化されてマクロファージを形成すると考えられる。その後、その自己活性化したマクロファージにより、表面に結合したPLPのファゴサイトーシスが起こるため、封入されている薬剤（例えば抗炎症剤）がマクロファージの中に放出されるか、マクロファージの中で機能し、そのことによって治療効果が生じると考えられる。いくつかの場合には、薬剤は、マクロファージの遺伝子発現プロファイルを変える機能を発揮することができる。つまり、マクロファージがPLPを取り込むことで、サイトカイン／ケモカインの外分泌の低下および／または好ましい因子の分泌の増加につながり、組織修復／再生が促進される。
【００２７】
理論に囚われないとすると、本明細書に記載のPLPは、以下の利点を与えることができる。第1に、治療剤を興味の対象である標的部位（例えば心臓の心筋梗塞の領域）に送達して標的とする疾患（例えばIHD）を治療するための新たなアプローチを提供する。第2に、いくつかの好ましい実施態様では、本明細書に記載のPLPは、活動していない血小板、または一部が（弱く）活性化された血小板からの膜タンパク質だけを含んでいる。そのようなPLPは内皮細胞に結合しないため、望ましくない血栓形成を引き起こすことがないと考えられる。
【００２８】
血小板様タンパク質微粒子
本明細書に記載のタンパク質微粒子として、1種類以上の血小板膜タンパク質を含む任意の微粒子が可能であり、その血小板膜タンパク質は、その微粒子の表面に提示することができる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のタンパク質微粒子は血小板様プロテオリポソーム（PLP）である。PLPとは、リポソームの膜の中に通常は人工的手段で挿入された1種類以上の血小板膜タンパク質を有するリポソーム様ビヒクルを意味する。PLPは、中に1種類以上の血小板膜タンパク質が挿入されたリポソームを含むことができる。血小板膜タンパク質の少なくとも一部をPLPの表面に露出させ、そのタンパク質が結合パートナー（例えば単球などの循環血液細胞の表面上の受容体）と相互作用できるようにすることができる。いくつかの実施態様では、リポソームの中にある脂質と血小板膜タンパク質の比は、1,000,000：1〜30：1（w/w）の範囲である。いくつかの例では、この比は、1,000：1、30：1〜50：1（w/w）であり、例えば30：1〜40：1、または40：1〜50：1である。
【００２９】
本明細書に記載のPLPは、損傷部位に移動可能な単球および／または好中球および／または他の循環血液細胞に結合することができる。いくつかの実施態様では、PLPは、内皮細胞などの細胞よりも単球のほうに特異的に結合する。単球などの標的細胞に「特異的に結合する」PLPは、本分野でよく理解されている用語であり、そのような特異的な結合を明らかにする方法も本分野でよく知られている。PLPが単球などの標的細胞に対して「特異的な結合」活性を示すと言えるのは、標的細胞に対して別の標的細胞（例えば内皮細胞）に対するよりも頻繁に、および／またはより迅速に、および／またはより長時間、および／またはより大きな親和性で反応または会合する場合である。PLPが単球に「特異的に結合する」のは、内皮細胞などの他のタイプの細胞に結合するよりも大きな親和性で、および／またはより大きなアビディティで、および／またはより容易に、および／またはより長時間にわたって結合する場合である。この定義を読むと、例えば第1の標的細胞に特異的に結合するPLPは、第2の標的細胞に特異的に、または選択的に結合する可能性、または結合しない可能性があることも理解される。そのため「特異的な結合」または「選択的な結合」は、必ずしも排他的な結合である必要はない（が、排他的結合を含むことも可能である）。一般に、結合とは、選択的な結合を意味するが、必ずしもそうである必要はない。いくつかの特別な例では、本明細書に記述したPLPは内皮細胞に結合しないため、血栓形成を引き起こすことがない。すなわちPLPは、内皮細胞に結合しないか実質的に低レベルでしか結合しないため、その結合は、存在するにしても、有意な血栓形成（例えば、定型的な医学アッセイによって明らかにすることのできる臨床的に意味のある血栓形成）を誘起するには不十分である。
【００３０】
いくつかの実施態様では、本明細書に記述したPLPには血小板膜（全体またはその一部）の脂質成分が実質的にない。「実質的にない」とは、PLPが、最少量を超える量の血小板膜、例えば約10％未満、または約5％未満、または約2.5％未満を超える量の血小板膜を含んでいないことを意味する。いくつかの例では、PLPは血小板膜の脂質成分をまったく含んでいない（すなわち血小板膜の脂質成分がない）。
【００３１】
（i）リポソームと他の微粒子
本明細書で用いる「リポソーム」という用語は、内部水性空間を取り囲む外側脂質層膜（例えば、単膜リポソームとして知られる単一脂質二重層、または多重膜リポソームとして知られる多重脂質二重層）を含む組成物を意味する。例えばCullis他、Biochim. Biophys Acta、第559巻：399〜420ページ（1987年）を参照のこと。単膜リポソームは、一般に直径が約20〜約400ナノメートル（nm）、または約50〜約300 nm、または約300〜約400 nm、または約100〜約200 nmの範囲である。多重膜リポソームは、通常は直径が約1〜約10マイクロメートルの範囲であり、2〜数百の間の任意の数の同軸になった脂質二重層を水相の層と交互に含むことができる。
【００３２】
脂質二重層のそれぞれは、逆方向を向いた両親媒性脂質分子を含有する2つの単層を含むことができる。両親媒性脂質は、典型的には、1つ以上の非極性（疎水性）アシル鎖またはアルキル鎖に共有結合した極性（親水性）基を頭部に含んでいる。疎水性アシル鎖とそれを取り囲む水性媒体の間のエネルギー的に不利な接触によって両親媒性脂質分子の配列が誘導されて、頭部の極性基が二重層の表面を向き、アシル鎖は二重層の内側を向くことで、アシル鎖が水性環境と接触することをうまく阻止する。
【００３３】
1種類以上の天然および／または合成の脂質化合物を、本明細書に記載のリポソームの調製に使用できる。リポソームは、負に帯電した脂質、または正に帯電した脂質、またはこれらの組み合わせを含むことができる。負に帯電した適切な脂質の非限定的な例に含まれるのは、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、これらの不飽和ジアシル、混合されたアシル鎖対応物、カルジオリピンである。正に帯電した脂質の非限定的な例に含まれるのは、N,N'-ジメチル-N,N'-ジオクトアシル臭化アンモニウム（DDAB）、N,N'-ジメチル-N,N'-ジオクトアシル塩化アンモニウム（DDAC）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム（DOTMA）、3.β.-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル)コレステロール（DC-コール）、1,2-ジオレオイルオキシ-3-[トリメチルアンモニオ]-プロパン（DOTAP）、1,2-ジオクタデシルオキシ-3-[トリメチルアンモニオ]-プロパン（DSTAP）、1,2-ジオレオイルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチル塩化アンモニウム（DORI）や、例えばMartin他、Current Pharmaceutical Design 2005年、第11巻、375〜394ページに記載されているカチオン性脂質である。
【００３４】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のリポソームは、1種類以上のリン脂質を用いて調製することができるが、場合によっては、疎水性部分と親水性部分の両方を持っていて、分子の形とサイズが似た1種類以上の追加の分子（例えばコレステロール）も用いられる。本明細書に記載のリポソームの調製に用いられる適切なリン脂質の非限定的な例に含まれるのは、ホスファチジルコリン（レシチン）、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピップ、ホスファチジル酸、セレブロシド、ジセチルリン酸塩、ホスファチジルコリン、ジパルミトイル-ホスファチジルグリセロールが含まれる。追加の非リン含有脂質の非限定的な例には、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル-アミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、コハク酸ジアシルグリセロールなどである。
【００３５】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のリポソームの主要な脂質成分としてホスファチジルコリンが可能である。ホスファチジルコリンは、鎖の長さがさまざまで飽和の程度もさまざまな多彩なアシル鎖基を持つことができる。いくつかの例では、ホスファチジルコリンは、炭素鎖の長さが例えばC14〜C22の飽和脂肪酸を含んでいる。飽和した長鎖ホスファチジルコリンは、生体内で不飽和のものよりも浸透にくく、より安定である。一不飽和または二不飽和の脂肪酸を有するホスファチジルコリンや、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の混合物も使用できる。
【００３６】
本明細書に記載のどのリポソームも、ステロール、好ましくはコレステロールを、約0.1〜1.0の範囲のモル比（コレステロール：リン脂質）でさらに含むことができる。いくつかの例では、リポソームは、ジステアロイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジミリストイルホスファチジルコリン／コレステロール、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）／コレステロール、卵スフィンゴミエリン／コレステロールの組み合わせを含むことができる。
【００３７】
必要なときには、本明細書に記載のリポソームをポリマー層で被覆して生体内における安定性を大きくすることができる（例えば立体的に安定化されたリポソーム）。適切なポリマーの非限定的な例にはポリ(エチレングリコール)が含まれる。ポリ(エチレングリコール)は、親水性表面層を形成することで、リポソームの循環半減期を改善し、治療標的に到達するリポソームの量を増やすことができる。例えばWorking他、J Pharmacol Exp Ther、第289巻：1128〜1133ページ（1999年）；Gabizon他、J Controlled Release 第53巻：275〜279ページ（1998年）；AdlakhaHutcheon他、Nat Biotechnol第17巻：775-779ページ（1999年）；Koning他、Biochim Biophys Acta第1420巻：153〜167ページ（1999年）を参照のこと。本明細書に記載のリポソームの作製に役立つPEG-脂質の非限定的な例に含まれるのは、1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-350]（mPEG 350 PE）；1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-550]（mPEG 550 PE）；1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-750]（mPEG 750 PE）；1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-1000]（mPEG 1000 PE）；1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]（mPEG 2000 PE）；1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-3000]（mPEG 3000 PE）；1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000]（mPEG 5000 PE）；N-Acyl-スフィンゴシン-1-[スクシニル(メトキシ ポリエチレングリコール) 750]（mPEG 750セラミド）；N-アシル-スフィンゴシン-1-[スクシニル(メトキシポリエチレングリコール)-2000]（mPEG 2000 セラミド）；N-アシル-スフィンゴシン-1-[スクシニル(メトキシ ポリエチレングリコール)-5000]（mPEG 5000セラミド）である。
【００３８】
本明細書に記載のリポソームに調製には多彩な方法を利用することができる。そのような方法は、本分野で公知であるか、本明細書に開示されており、例えばLichtenbergとBarenholzがMethods of Biochemical Analysis、第33巻、337〜462ページ（1988年）に記載している方法がある。Szoka他、Ann. Rev. Biophys. Bioen. 第9巻：467ページ（1980年）；アメリカ合衆国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号；『Liposomes』、Marc J. Ostro編、Marcel Dekker社、ニューヨーク、1983年、第1章；Hope他、Chem. Phys. Lip. 第40巻：89ページ（1986年）も参照のこと。なおそれぞれの文献の関係する開示内容は、参照により本明細書に組み込まれている。小さな単膜リポソーム（SUV、サイズが100 nm未満）は、以前に報告されている（Tsengta、1999年）ように、薄膜水和法と反復押出法という標準的な方法を組み合わせて調製することができる。
【００３９】
リポソームを望むサイズにするには従来の技術を利用することができる。例えばアメリカ合衆国特許第4,737,323号とHope他、Biochim. Biophys. Acta、第812巻：55〜65ページ（1985年）を参照のこと。なおそれぞれの文献の関係する開示内容は、参照により本明細書に組み込まれている。リポソーム懸濁液を浴またはプローブで超音波処理するとサイズが徐々に小さくなり、サイズが約50 nm未満の小さな単膜リポソームが生じる。ホモジェネート作製または微小流体化は、剪断エネルギーを利用して大きなリポソームをより小さなリポソームにするための別の方法である。典型的なホモジェネート作製法では、選択されたサイズ（典型的には約100〜500 nm）のリポソームが観察されるまで、多重膜リポソームが何度も標準的なエマルジョンホモジェナイザーを通過する。どちらの方法でも、粒子のサイズ分布は、従来のレーザー-ビーム粒子サイズ識別によってモニターすることができる。
【００４０】
小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通過させてリポソームを押し出すというのが、リポソームのサイズを小さくして比較的よく揃ったサイズ分布にするのに非常に効果的な方法である。典型的には、望むリポソームのサイズ分布になるまで、懸濁液が何度も膜を通過する。孔のより小さな膜を通過させてリポソームを押し出すことで、徐々に小さなサイズのリポソームを実現することができる。
【００４１】
本明細書に記載のどのリポソームも、従来法を利用して分析することで、その物理的および／または化学的な特徴を明らかにすることができる。例えばリン酸塩アッセイを利用してリポソームの濃度を求めることができる。1つのリン酸塩アッセイは、モリブデン酸塩とマラカイトグリーン染料の間の相互作用に基づいている。主な原理は、無機リン酸塩がモリブデン酸塩と反応して無色の還元されていないリンモリブデン酸塩複合体を形成し、それを酸性条件下で還元したときに青色の複合体に変換されることに関係している。リンモリブデン酸塩は、マラカイトグリーンとの複合体になっているときよりも20倍または30倍多く発色する。最終生成物である還元された緑色の可溶性複合体は、620 nmでの吸光度によって測定される。それが、溶液中に無機リン酸塩が存在することの直接的な指標である。
【００４２】
別の実施態様では、本明細書に記載の薬剤送達用粒子として、1種類以上のポリマーまたはコポリマーでできたナノ粒子が可能である。例えばナノ粒子としてポリ(乳酸-コ-グリコール酸)（PLAG）ナノ粒子が可能である。これは定型的な技術で調製することができる。
【００４３】
（ii）血小板-膜タンパク質
本明細書に記載のプロテオリポソーム（PLP）などのタンパク質微粒子は、1種類以上の血小板膜タンパク質を含み、その血小板膜タンパク質はPLPの表面に提示されることが好ましい。いくつかの実施態様では、その1種類以上の血小板膜タンパク質は、活動していない血小板および／または一部が活性化された血小板の表面にだけ存在し、活性化された血小板の表面には存在しない。血小板膜タンパク質は、p-セレクチン（CD62p）、CD40L、CD18、またはこれらの組み合わせを含むことができる。あるいは血小板膜タンパク質は、CD40L、またはCD18、またはその両方を実質的に含んでいない（例えばCD40Lを含まない、またはCD18を含まない、またはその両方を含まない）。いくつかの実施態様では、血小板膜タンパク質は、GPIIb、および／またはCD42c、および／または下記の表2に掲載した1種類以上のタンパク質、例えば循環血液細胞（例えば単球）との相互作用に関与するタンパク質を含むことができる。いくつかの例では、本明細書に記載のPLPは、活動していない血小板および／または一部が活性化された血小板から従来の技術（例えば下記の実施例に記載した方法）によって単離した膜タンパク質の混合物を含んでいる。
【００４４】
本明細書に記載のPLPの調製に用いる血小板膜タンパク質は、従来法または本明細書に記載の方法で調製することができる。例えばタンパク質のそれぞれを従来の組み換え技術で調製した後、本明細書に記載の任意のリポソームに組み込んでPLPを形成することができる。あるいは血小板膜タンパク質は、定型的な技術に従って血小板から（例えば活動していない血小板または一部が活性化された血小板から）精製することができる。タンパク質混合物は適切なリポソームに組み込むことができる。あるいはタンパク質混合物をさらに精製して望む膜タンパク質を（例えばクロマトグラフィによって）豊富にし、その豊富にされたタンパク質をPLPの調製に用いることができる。
【００４５】
一例では、血小板膜タンパク質は、活動していない血小板または弱く（一部が）活性化された血小板から単離される。活動していない血小板または弱く活性化された血小板から単離された膜タンパク質を用いて調製されたPLPは、内皮細胞に結合しないという利点を有するため、血栓形成が回避される。
【００４６】
本分野で知られている任意の方法により、1種類以上の血小板膜タンパク質を本明細書に記載のリポソームに組み込んでプロテオリポソームを形成することができる。例えばアメリカ合衆国特許出願公開第2005/0123594号を参照のこと。なおその関連する開示内容は、所定の目的で参照により本明細書に組み込まれている。一例では、本明細書に記載のリポソームを調製するための成分（例えば脂質）を含む脂質溶液を、プロテオリポソームの形成が可能な条件下で適切な洗浄剤の存在下にて血小板膜タンパク質と混合することができる。脂質とタンパク質の比は、30：1〜50：1（例えば30：1）の範囲が可能である。洗浄剤と遊離タンパク質は、適切な温度（例えば4℃）で適切な緩衝液（例えばPBS）に対して徹底的に透析することによって除去できる。必要な場合には、BioBead処理（SM-2；Bio-Rad社）を繰り返すことで残った洗浄剤を除去することができる。
【００４７】
（iii）治療剤
本明細書に記載のどのタンパク質微粒子も、治療剤、例えば心臓保護剤（例えば抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗線維形成剤、免疫調節剤、血管新生促進剤）を封入することができる。
【００４８】
抗炎症剤は、炎症を抑制することのできる化合物である。非限定的な例に含まれるのは、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）であるアスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンである。他の例に含まれるのは、アルクロフェナク、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、アルゲストンアセトニド、αアミラーゼ、アムシナファル、アムシナフィド、アムフェナクナトリウム、塩酸アミプリロース、アナキンラ、アニロラク、アニトラザフェン、アパゾン、バルサラジド二ナトリウム、ベンダザク、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロメライン、ブロペラモール、ブデソニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリプロフェン、プロピオン酸クロベタゾール、ブチル酸クロベタゾン、クロピラク、プロピオン酸クロチカゾン、酢酸コルメタゾン、コルトドキソン、デカノン酸塩、デフラザコート、デラテストリル、デポ-テストステロン、デゾニド、デゾキシメタゾン、ジプロピオン酸デキサメタゾン、ジクロフェナクナトリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジ酢酸ジフロラゾン、ジフルミドンナトリウム、ジフルニザール、ジフルプレドナート、ジフタロン、ジメチルススホキシド、ドロシノニド、エンドリゾン、エンリボマブ、エノリカムナトリウム、エピリゾール、エトドラク、エトフェナメート、フェルビナク、フェナモール、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンドサール、フェンピパロン、フェンチアザク、フラザロン、フルアザコート、フルフェナム酸、フルミゾール、酢酸フルニソリド、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルオコルチンブチル、酢酸フルオロメトロン、フルクアゾン、フルビプロフェン、フルレトフェン、プロピオン酸フルチカゾン、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタゾール、酢酸ハロプレドン、イブフェナク、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノール、イロニダップ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、酢酸イソフルプレドン、イソキセパック、イソキシカム、ケトプロフェン、塩酸ロフェミゾール、ロモキシカム、エタボン酸ロテプレドノール、メクロフェナム酸ナトリウム、メクロフェナム酸、メクロリゾンジブチラート、メフェナム酸、メサラミン、メセクラゾン、メステロロン、メタンドロステノロン、メテノロン、酢酸メテノロン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、モルニフルマート、ナブメトン、ナンドロロン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサンドロラン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、オキシメトロン、塩酸パラニリン、ポリ硫酸ペントサンナトリウム、グリセリン酸フェンブタゾンナトリウム、ピルフェニドン、ピロキシカム、桂皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピプロフェン、プレドナザート（prednazate）、プロフェロン、プロドル酸、プロクアゾン、プロキサゾール、クエン酸プロキサゾール、リメキソロン、ロマザリト、サルコレックス、サルナセジン、サルサレート、塩化サングイナリウム、セクラゾン、セルメタシン、スタノゾロール、スドキシカム、スリンダク、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルマート、タロサラート、テブフェロン、テニダップ、テニダップナトリウム、テノキシカム、テシカム、テシミド、テストステロン、テストステロンブレンド、テトリダミン、チオピナク、ピバル酸チクソコルトール、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロニド、トリフルミダート、ジドメタシン、ゾメピラクナトリウムである。
【００４９】
抗アポトーシス剤または心臓保護剤は、アポトーシスを抑制することのできるタンパク質、核酸、小分子化合物である。例には、IGF、PDGF、ニューレグリン、アンギオポエチンが含まれる。
【００５０】
本明細書で用いる血管新生促進剤は、新たな血管の発達を促進する機能を有する化合物（例えばタンパク質、核酸、小分子化合物）を意味する。本明細書に記載の血管新生促進剤として、増殖因子、または内皮細胞の増殖または移動を刺激することによって血管新生を誘導または促進するサイトカイン（例えば血管内皮増殖因子（VEGF））が可能である。あるいは血管新生促進剤として、線維芽細胞増殖因子（FGF）ファミリーのメンバー、例えばFGF-1（酸性）、FGF-2（塩基性）、FGF-4、FGF-5が可能である。例には、トラフェルミン、GENERX（登録商標）、アデノウイルス遺伝子療法のベクターをコードしているFGF-4が含まれる。追加の血管新生促進剤には、アンギオポエチン-1が含まれる。本開示で用いる血管新生促進剤の非限定的な具体例には、VEGF、FGF、アンギオポエチン、PDGFが含まれる。
【００５１】
抗線維形成剤は、線維形成（その中には、典型的にはコラーゲンからなる線維性結合組織の異常な形成が含まれる）に対する抑制活性を有する化合物（例えばタンパク質、核酸、小分子化合物）を意味する。本明細書に記載の抗線維形成剤は、例えば身体の損傷領域においてコラーゲンの形成を減らしたり、コラーゲンの代謝または除去を促進したりといったさまざまな作用機構を持つことができる。線維性組織の存在を減らす活性を有するそのような化合物はすべて、そのような薬剤のそれぞれが作用する具体的な機構に関係なく、本明細書に含まれる。例にはニンテダニブとピルフェニドンが含まれる。
【００５２】
免疫調節剤は、望ましくない免疫応答を阻止または改善することのできるタンパク質、核酸、小分子化合物である。例には、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、アプレミラスト、ステロイドが含まれる。
【００５３】
本明細書に記載のどの治療剤も、従来法または本明細書に記載の方法により、やはり本明細書に記載の適切なプロテオリポソームに組み込むことができる。いくつかの実施態様では、プロテオリポソームへの装填は、例えばMaurer他、Expert Opinion in Biological Therapy 第1巻、923〜947ページ；NBoman他、Cancer Res. 第54巻、2830〜2833ページ；Waterhouse他、Methods Enzymol. 第391巻（2005年）40〜57ページ（なおこれらの内容は、想定する目的で参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているように、そのプロテオリポソームの膜（プロテオリポソームの内側は酸性である）を横断するpH勾配を実現し、そのプロテオリポソームを、その中に封入される治療剤とともにインキュベートすることによって実現できる。いくつかの例では、pH勾配として硫酸アンモニウム勾配が可能である。それに関する全体的なことは、Haran他、Biochim. Biophys. Acta第1115巻（1993年）201〜215ページとアメリカ合衆国特許第5,316,771号に記載されている。なおこれらの内容は、想定する目的で参照により本明細書に組み込まれている。治療剤がプロテオリポソームに装填されると、その組成物を直接用いること、またはその組成物をさらに処理して装填されなかったあらゆる薬剤を除去することができる。
【００５４】
pH式装填技術は、一般に、リポソーム内pHが低いpH勾配の発生と、その後の治療剤の装填という2つの工程を含んでいる。膜貫通プロトン勾配は、多彩な方法で発生させることができる。例えばプロテオリポソームを低pH緩衝液（例えばpH 4のクエン酸塩緩衝液）の中で調製した後、外部緩衝溶液をpH 7.5の緩衝液と交換することができる（例えばMadden他、Chem. Phys. Lipids、第53巻：37〜46ページ（1990年））。あるいはイオノフォアをカチオン勾配（大きな内部カチオン濃度）とともに用いることができる（例えばFenske他、Biochim Biophy. Acta、第1414巻：188〜204ページ（1998年））。イオノフォア（例えばニゲリシンやA23187）は、1価または2価のカチオンの外向きの運動をそれぞれプロトンの内向きの運動とカップルさせることで、プロテオリポソームの内部を酸性化する。さらに、プロテオリポソームは、高濃度の弱塩基（例えば硫酸アンモニウム）の存在下で調製することができる（Haran他、Biochim. Biophys. Acta、第1115巻：201〜215ページ（1993年））。外部アンモニウム塩溶液を除去すると、同じ原理に従ってpH勾配が発生する。これも、その後の薬剤装填プロセスにとって重要である。
【００５５】
治療剤の能動的な装填には、pH勾配に加えて金属イオン勾配も用いることができる。例えばCheung他、Biochim Biophys Acta、第1414巻：205〜216ページ（1998年）を参照のこと。中性の形態になった弱塩基性の治療剤は膜を横断して浸透し、薬剤-金属イオン複合体を形成することでリポソーム内の水中に保持される。
【００５６】
治療剤が水溶性の弱塩基性の薬剤である場合、水溶液に溶かし（例えば300 mMのスクロース、または適切なpHの等張緩衝溶液）、プロテオリポソーム懸濁液と組み合わせた後、適切な温度でインキュベートすることができる。薬剤溶液は、薬剤の溶解度を大きくするため、水と混和する少量の有機溶媒（例えば10％未満のエタノール）を含むことができる。インキュベーションの温度と時間は、脂質の組成と薬剤の性質に依存する。典型的には、コレステロールと長鎖飽和脂肪酸からなるリポソーム（例えばDSPC／コレステロール）は、短鎖の飽和脂質から形成されたリポソーム（例えばDMPC／コレステロール）または不飽和な脂質よりも浸透しにくく、迅速かつ効率的な装填を実現するにはより高い温度を必要とする。例えばDSPC／コレステロールリポソームは、典型的には、60℃以上の温度を必要とする。装填は、典型的には5〜15分後に完了するが、2時間かかる可能性もある。
【００５７】
治療剤が親油性である場合、リポソームの二層の2つの単層の間にその治療剤が分布できる条件下で脂質と混合してプロテオリポソームを作製することができる。その後、本明細書に記載の方法を利用し、膜貫通pHまたは他のイオン勾配に応答して、外側の単層内の治療剤を（LNの二層の内側の単層を向いた）リポソームの内側に装填することができる。
【００５８】
プロテオリポソームへの化合物の間接的装填では、Ceh他、Biochim Biophys Acta、1995年11月1日；第1239巻(2)：145〜156ページに記載されている膜貫通勾配の形成を利用する。この方法は、プロテオリポソームに装填される治療剤とボロン酸化合物を、懸濁したプロテオリポソームとともにインキュベートすることを含み、そのことにより、プロテオリポソームの中に治療剤を蓄積することが実現される（Ceh他、1995年と、アメリカ合衆国特許第6,051,251号）。
【００５９】
医薬組成物とその利用
本開示により、本明細書に記載の1種類以上の治療剤を封入することのできる本明細書に記載のプロテオリポソームなどの任意のタンパク質微粒子と、医薬として許容可能な基剤または賦形剤を含む医薬組成物も提供される。この医薬組成物に含まれる基剤は、その組成物の活性成分と適合するという意味で「許容可能」でなければならず、しかもその活性成分を安定化し、治療する被験者にとって有害でないことが好ましい。
【００６０】
本明細書に開示した組成物にとって適切な基剤または賦形剤として、個人の身体がプロテオリポソームを吸収すること、および／またはそのプロテオリポソームが単球に結合することを容易にする能力、および／または単球から発達したマクロファージによるそのプロテオリポソームのエンドサイトーシスを促進する能力を増大させる物質が可能である。適切な基剤および／または賦形剤には、便利で正確な用量を可能にするため本明細書に記載の改変プロテオリポソームを用いた体積の大きな製剤を作るのに使用できるあらゆる物質も含まれる。それに加え、基剤および／または賦形剤は、本明細書に記載のプロテオリポソームを製造プロセスで取り扱いやすくするために使用することができる。投与経路と薬物療法の形態に応じ、さまざまな基剤および／または賦形剤を使用することができる。賦形剤の非限定的な例に含まれるのは、抗接着剤、結合剤、コーティング崩壊剤、充填剤、香料（例えば甘味料）、着色剤、流動促進剤、潤滑剤、保存剤、吸収剤である。本明細書に記載の基剤および／または賦形剤は、ビヒクルおよび／または希釈剤も含むことができる。ここに「ビヒクル」は、通常は溶媒または担体として作用するさまざまな媒体のうちの任意のものを意味し、「希釈剤」は、組成物の活性成分を希釈するために提供される希釈用物質を意味する。適切な希釈剤には、医薬調製物の粘度を低下させることのできるあらゆる物質が含まれる。
【００６１】
基剤および／または賦形剤のタイプと量は、選択した医薬の形態に応じて選択される。適切な医薬の形態は、溶液、輸液、懸濁液などの液体系；コロイド、ゲル、ペースト、クリームなどの半固体系；粉末、顆粒、錠剤、カプセル、ペレット、マイクロ顆粒、ミニ錠剤、マイクロカプセル、マイクロペレット、座薬などの固体系などである。上記の系のそれぞれは、本分野で周知の技術を用い、通常放出、遅延放出、加速放出に適したように製剤化することができる。
【００６２】
本明細書に記載のプロテオリポソームを含む医薬組成物は、標準的な技術のほか、本明細書に記載の技術に従って調製することができる。いくつかの例では、医薬組成物は、非経口投与用に製剤化される。非経口投与には、小管内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与が含まれる。いくつかの例では、医薬組成物は、ボーラス注射または輸液によって静脈内に投与される。本発明で用いるのに適した製剤は、『Remington's Pharmaceutical Sciences』、Mack Publishing Company、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、第17版（1985年）に見いだすことができる。
【００６３】
いくつかの例では、医薬組成物は注射用（例えば静脈内輸液用）に製剤化される。注射可能な減菌組成物（例えば注射可能な水性または油性の減菌懸濁液）は、適切な分散剤または湿潤剤（Tween 80など）または懸濁剤を用いて本分野で知られている技術に従って製剤化することができる。注射可能な減菌調製物として、非毒性で非経口投与可能な希釈液または溶媒の中の注射可能な減菌溶液または減菌懸濁液、例えば1,3-ブタンジオールの中の溶液も可能である。使用できる許容可能なビヒクルと溶媒には、マンニトール、水、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。それに加え、減菌不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として一般に用いられている（例えば合成されたモノグリセリドまたはジグリセリド）。脂肪酸（オレイン酸とそのグリセリド誘導体）は、医薬として許容可能な天然の油（例えばオリーブ油やひまし油）の特にポリオキシエチル化されたものと同様、注射可能な調製物において有用である。これらの油溶液または油懸濁液は、長鎖アルコール系の希釈剤または分散剤や、カルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤も含むことができる。一般に用いられている他の界面活性剤（例えばTweenやSpan）や、医薬の製造に一般に用いられている他の同様の乳化剤、生物学的利用能増強剤が、医薬の製造に一般に用いられる。
【００６４】
循環単球を担体として使用することで、任意の医薬組成物を用いて治療剤を望む標的部位に送達することができる。その実践には、治療剤（例えば抗炎症剤）を封入した本明細書に記載の任意のプロテオリポソームを含む有効量の医薬組成物を、治療を必要とする被験者（例えばヒト被験者）に、適切な経路（例えば本明細書に記載の経路）で投与することができる。プロテオリポソームは、単球への結合活性を通じて被験者の循環単球と会合し、単球が集積する部位（例えば炎症が起こっている部位）に送達されると考えられる。単球は内皮細胞層を横断するとマクロファージへと分化し、そのマクロファージが、会合したプロテオリポソームをエンドサイトーシスにより吸収し、そのことによって捕獲されている治療剤が放出されてその治療効果を及ぼす。
【００６５】
本明細書で用いる「有効量」は、単独で、または1種類以上の他の活性剤と組み合わせて被験者に治療効果をもたらすのに必要な各活性剤の量を意味する。有効量は、当業者には知られているように、投与経路、使用する賦形剤、同時に使用する他の活性剤に応じて変化する。
【００６６】
そのような量は、もちろん、治療する個々の病気、病気の重篤度、個々の患者のパラメータ（年齢、身体の状態、身長、性別、体重が含まれる）、治療期間、同時に実施している治療（もしあるなら）の性質、具体的な投与経路や、健康管理者の知識と経験の範囲にある同様の因子に依存する。これらの因子は当業者には周知であり、定型的な実験の範囲で取り扱うことができる。個々の成分またはその組み合わせの最大用量、すなわち医学的に安全であると判断される最大安全用量を用いることが一般に好ましい。しかし当業者には、医学的な理由、または心理的な理由、または実質的にあらゆる他の理由で、患者がより少ない用量または許容量にこだわる可能性があることが理解されよう。
【００６７】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗炎症剤を含む医薬組成物は、虚血性心疾患（IHD）の治療用である。本明細書では、「治療する」という用語は、1種類以上の活性剤を含む組成物を、アレルギー疾患、またはアレルギー疾患の症状、またはアレルギー疾患の傾向がある被験者に、その疾患、またはその疾患の症状、またはその疾患の傾向を治癒させる、または癒す、または緩和する、または軽減する、または変化させる、または治療する、または改善させる、または向上させる、または変えることを目的として適用または投与することを意味する。
【００６８】
プロテオリポソームは、IHDであること、またはIHDのリスクがあることが疑われる被験者（例えばヒトIHD患者）に投与されると、単球に付着して心臓の梗塞領域に送達され、その標的部位で望む治療効果を及ぼすことができる。IHDは、アテローム性動脈硬化が原因で心臓への血液の供給が低下することを特徴とする疾患である。IHDに付随する症状の非限定的な例には、胸の痛みまたは不快感が含まれる。
【００６９】
キット
本開示により、治療剤を標的部位に送達するのに用いるキット、または抗IHD剤（例えば抗炎症剤）を心臓の梗塞領域に送達することによってIHDを治療するのに用いるキットも提供される。このようなキットは、本明細書に記載の任意の医薬組成物を収容した1つ以上の容器を含むことができる。その医薬組成物には、タンパク質微粒子（例えば、治療剤を封入したプロテオリポソームやナノ粒子など）と、医薬として許容可能な基剤が含まれている。
【００７０】
いくつかの実施態様では、キットは、本明細書に記載の任意の方法に従って使用するための指示を含むことができる。含まれている指示は、封入されている治療剤を送達することを目的とした医薬組成物の投与、または本明細書に記載の任意の方法に従ってIHDを治療することを目的とした医薬組成物の投与に関する記述を含むことができる。キットはさらに、ある個人がIHDであるかどうか、またはある個人にIHDの疑いがあるかどうか、またはある個人にIHDのリスクがあるかどうかを明らかにすることに基づいてその個人に適した治療を選択することに関する記述を含むことができる。治療剤を封入したプロテオリポソームを含む本明細書に記載の医薬組成物の使用に関する指示は、一般に、目的とする治療のための投与量、投与計画、投与経路に関する情報を含んでいる。容器として、単位用量、バルクパッケージ（例えば多数回用量パッケージ）、サブユニット用量にすることが可能である。本発明のキットに添付される指示は、典型的には、ラベルまたはパッケージ挿入物（例えばキットに含まれている紙）に記載されている指示だが、機械が読むことのできる指示（例えば磁気ディスクまたは光学的記憶ディスクに記録されている指示）も許容できる。
【００７１】
ラベルまたはパッケージ挿入物は、その組成物を用いて治療剤を標的部位に送達すること、またはその組成物を用いてIHDを治療することを示している。指示は、本明細書に記載の任意の方法を実施するために提供することができる。
【００７２】
本明細書に記載のキットは適切に包装される。適切な包装の非限定的な例には、バイアル、瓶、ジャー、可撓性パッケージング（例えば密封されたマイラーまたはプラスチックの袋）などが含まれる。特殊な装置（例えば吸入器）、鼻腔投与装置（例えば噴霧器）、輸液装置（例えばミニポンプ）と組み合わせて用いるパッケージも考えられる。キットは、減菌アクセスポートを備えることができる（例えば容器として、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針で穴を開けることのできるストッパ付きのバイアルが可能である）。容器も、減菌アクセスポートを備えることができる（例えば容器として、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針で穴を開けることのできるストッパ付きのバイアルが可能である）。
【００７３】
本明細書に記載のキットは、場合によっては、追加の成分（例えば緩衝液）と解釈情報を提供することができる。通常は、キットは、容器と、その容器の表面のラベル、またはその容器に添付されるパッケージ挿入物を含んでいる。いくつかの実施態様では、本開示により、上に説明したキットの内容を含む製品が提供される。
【００７４】
一般的な技術
本発明を実施するには、特に断わらない限り、本分野の技能に含まれる分子生物学（組み換え技術が含まれる）、微生物学、細胞生物学、生化学、免疫学の一般的な技術を利用することになる。そのような技術は文献に十分に説明されている。文献としては、例えば『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』、第2版（Sambrook他、1989年）Cold Spring Harbor Press；『Oligonucleotide Synthesis』（M. J. Gait編、1984年）；『Methods in Molecular Biology』、Humana Press；『Cell Biology: A Laboratory Notebook』（J. E. Cellis編、1998年）Academic Press；『Animal Cell Culture』（R. I. Freshney編、1987年）；『Introduction to Cell and Tissue Culture』（J. P. Mather とP. E. Roberts、1998年）Plenum Press；『Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures』（A. Doyle、J. B. Griffiths、D. G. Newell編、1993年〜1998年）J. Wiley and Sons；『Methods in Enzymology』（Academic Press）；『Handbook of Experimental Immunology』（D. M. WeirとC. C. Blackwell編）；『Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells』（J. M. MillerとM. P. Calos編、1987年）；『Current Protocols in Molecular Biology』（F. M. Ausubel他編、1987年）；『PCR: The Polymerase Chain Reaction』（Mullis他編、1994年）；『Current Protocols in Immunology』（J. E. Coligan他編、1991年）；『Short Protocols in Molecular Biology』（Wiley and Sons、1999年）；『Immunobiology』（C. A. JanewayとP. Travers、1997年）；『Antibodies』（P. Finch、1997年）；『Antibodies: a practical approach』（D. Catty編、IRL Press、1988年〜1989年）；『Monoclonal antibodies: a practical approach』（P. ShepherdとC. Dean編、Oxford University Press、2000年）；『Using antibodies: a laboratory manual』（E. HarlowとD. Lane（Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999年）；『The Antibodies』（M. ZanettiとJ. D. Capra編、Harwood Academic Publishers、1995年）がある。
【００７５】
当業者は、上記の記述に基づけばさらに努力することなく本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって以下の具体的な実施態様は単なる例示であり、いかなる意味でも本開示のほかの部分を制限するものではないと解釈されるべきである。本明細書で引用したあらゆる刊行物は、本明細書で参照する目的または主題のため、引用によって組み込まれている。
【実施例】
【００７６】
実施例：急性心筋梗塞の標的療法の新戦略としての血小板-単球相互作用の生体模倣
有効な心臓保護治療戦略の開発は難しい状態が続いている。というのも、可能性のある多くの心臓保護薬が基礎医学での結果を臨床での結果に結びつけるのに失敗しているからである。鍵となる問題の1つは、梗塞を起こした心臓を標的とした薬剤送達の最適化である。封入された薬剤を梗塞領域へと能動的に送達するための薬剤送達系がいくつか報告されてきたが、そうした薬剤送達系の機能化された表面は、薬剤を標的部位により長く保持すること、または薬剤の循環半減期をより長くすることを可能にしているだけである。したがって、これら送達系のための薬剤送達の主要経路として、増大した透過性と保持（EPR）の効果が相変わらず必要とされている。
【００７７】
本研究により、EPR効果に頼ることなく心臓の梗塞領域に心臓保護薬を送達するための新規な薬剤送達系が提供される。この新規な薬剤送達系は、心筋梗塞（MI）後に血小板が循環単球と相互作用することを真似ている。例えば血小板様プロテオリポソーム（PLP）は、精製されたヒト血小板膜タンパク質と脂質（例えば1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）脂質）を用いて作製した。この戦略の概略を図1Bに示す。インビトロのデータから、PLPは単球とマクロファージに対して強い親和性を示すが、内皮細胞に対してはそうでないことがわかった。生体多光子イメージングから、PLPは、対照である空リポソームよりも組織損傷部位のほうを標的とすることが明らかになった。再灌流を72時間実施して単球のリクルートが最大レベルに達したときPLPを注入すると、心臓の梗塞部位には対照領域よりも有意に多いPLPが存在していた。さらに、PLPに封入されたコバルトプロトポルフィリン（CoPP）（PLP-CoPP）は、MIのマウスモデルにおいて、心臓機能を改善しつつ、封入されたその薬剤の有害な効果を減らすことがわかった。
【００７８】
本研究から得られた結果は、本明細書に記載のPLP系を用いて薬剤を望む部位（例えば心臓の梗塞部位）にうまく送達できることを示している。
【００７９】
材料と方法
動物実験
すべての研究で使用する8週齢のオスのBALB/cマウスは国研院動物中心（台湾国）から購入し、餌と水に自由にアクセスできるようにして12時間夜／昼のサイクルを維持した。
【００８０】
心筋虚血-再灌流（I/R）のための手術を、Ojhaら（（2008年）、Am J Physiol Heart Circ Physiol第294巻：H2435〜H2443ページ）に公開されているプロトコルに従って実施した。簡単に述べると、マウスに、部屋の空気-イソフランを適切な速度と一回換気量で呼吸させた。左胸腔切開により心臓にアクセスした。そのとき、左肺を引っ込めて心膜に入れるようにした。その後、左心房を持ち上げて左前下行冠動脈（LAD）を露出させ、テーパー針に取り付けた7-0絹縫合糸を用いて隔離された状態にした。縫合糸をポリエチレン-10チューブにきつく縛り、冠動脈の閉塞を通じた可逆的な虚血を提供した。閉塞後、虚血の状態を45分間継続させた。45分後、縫合糸を緩め、損傷した心筋の再灌流が可能になるようにした。翌日、マウスに心エコー検査を実施して外科手術の成功を調べた。同様に、心筋虚血（MI）のマウスモデルで左心耳から遠位2〜3 mmの位置でLADを恒久的に結紮するという外科手術を実施した。
【００８１】
心エコー検査
I/RとMI両方のマウスモデルにおける心臓機能を、Chenら（（2015年）、Stem Cells Trans Med 第4巻：269〜275ページ）に公開されている方法に従い、30-MHzプローブ（Vevo770；Visual Sonics社、トロント、オンタリオ州、カナダ国）を用いて評価した。マウスを最初に左側面位の状態にした。胸骨傍長軸画像をMモード画像と2次元心エコー画像の両方について取得した。乳頭筋挿入部位の位置で心室の長軸に垂直に左心室拡張終期直径（LVEDD）と左心室収縮終期直径（LVESD）を測定した。LVEVは、心エコーシステムが(LVEDV - LVESV)/LVEDV×100％によって自動的に計算した。この式でLVEDVは左心室拡張終期体積であり、7.0×LVEDD3/(2.4 + LVEDD)として計算され、LVESVは左心室収縮終期体積であり、7.0×LVESD3/(2.4 + LVESD)として計算される。
【００８２】
ヒト血小板の単離と血小板膜タンパク質の精製
不活性化された血小板または一部が活性化された血小板を、中央研究院の生物医学科学研究所からの倫理的承認を得た上で、ヒトドナーから回収した。血液を、酸性クエン酸デキストロース（ACD）で抗凝固処理した真空容器（BD Sciences社、カタログ番号366450）の中に回収した。血液を室温にて350×gで20分間遠心分離することにより、血小板が豊富になった血漿（PRP）を用意した。上層（PRP）を新しい試験管に移し、下層を廃棄した。次にPRPを室温にて1,200×gで遠心分離すると、血小板が少ない血漿を含む血小板ペレットが上清として得られた。この血小板ペレットをタイロードの緩衝液（1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2、2.7 mM KCl、136.9 mM NaCl、0.4 mM NaH2PO4、11.9 mM NaHCO3、5.6 mM D-グルコース、0.1U/mlアピラーゼ）に再懸濁させ、再び室温にて1,200×gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、血小板を1 mlのタイロードの緩衝液に再懸濁させた。
【００８３】
ヒト血小板膜タンパク質（PMP）を精製する方法は、Donovanら（（2013年）、Alzheimer’s Res Ther第5巻：32ページ）に公開されているプロトコルをいくらか改変したものに基づいていた。簡単に述べると、精製したヒト血小板ペレットをタイロード緩衝液に再懸濁させ、室温にて1,100×gで15分間遠心分離した後、ペレットを5 mlの血小板溶解緩衝液（10 mMトリスHCl、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl、0.5 mM PMSF、pH 8）に再懸濁させ、氷の上で30分間インキュベートした。その後、再懸濁させた血小板溶液を氷の上で6×15秒間超音波処理し、次いで室温にて1,500×gで10分間遠心分離した。そのとき、分離された血小板オルガネラを廃棄し、上清の中の血小板タンパク質成分の残りを保持した。4℃にて180,000×gで2時間遠心分離した後、ペレットを氷の上で100 mM Na2CO3、pH 11に15分間再懸濁させることで、残った脂質をタンパク質成分から除去した。次にこの溶液を4℃にて180,000×gで2時間遠心分離し、ペレットを殺菌水に再懸濁させた。図1Cは、全血小板ホモジェネートからPMPを精製する方法の一例を示している。
【００８４】
タンパク質の同定
精製したヒト血小板膜タンパク質溶液に含まれる膜タンパク質の同定は、IBMS 蛋白質体核心設施（中央研究院、台湾国）で実施した。
【００８５】
細胞
マウス内皮細胞SVEC（CRL-2181、ATCC）と単球RAW264.7細胞（TIB-71、ATCC）を、2 mMのグルタミンと10％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の中で培養した。Zhangら（（2008年）、Curr Protoc Immunol第14巻：14.1ページ）に従ってマウス腹腔マクロファージ（MΦ）を成体マウスから単離した。簡単に述べると、マウスを2 mlの3％チオグリコール酸塩に少なくとも3日間曝露した。冷たいPBS（10 ml）を用いて腹腔滲出細胞を回収した。その細胞を37℃で2時間放置して組織培養プレートに接着させた後、新鮮な培地（DMEM/F-12＋10％FBS）と交換した。
【００８６】
SDS-PAGEとウエスタンブロッティング
サンプルを4〜12％SDS-ポリアクリルアミドゲル（BioRad社、アメリカ合衆国）上で分離した。PVDF膜に移した後、一次抗体と二次抗体を適用し、信号をECL-プラス試薬で検出した。ヒトGPIIbに対する一次抗体（GTX113758）、ヒトCD42cに対する一次抗体（GTX113355）、β-アクチンに対する一次抗体（GTX109639）をGeneTex社（アメリカ合衆国）から購入した。抗ヒトCD62P（sc-19672）はSanta Cruz社（アメリカ合衆国）からのものであった。ウサギポリクローナル抗HO-1抗体は、Linら（（2013年）、Arterioscler Thromb Vasc Biol 第33巻：785〜794ページ）に従って自作した。
【００８７】
組織学的染色
サンプルをスクロース溶液（15％w/v）の中で6時間脱水し、次いで濃（30％w/v）スクロース溶液に一晩入れた後、-20℃で組織凍結媒体の中に埋め込み、低温で切片にした。厚さ5μmの各切片をスライドガラスの上に装着した後、マッソンの三色染色プロトコルに従ってヘマトキシリン-エオシンで染色した。染色した切片を、顕微鏡（Axiovert200M；Zeiss社、ドイツ国）に取り付けたディジタルカメラ（モデルD30、日立製作所、日本国）で撮影した。
【００８８】
免疫蛍光イメージング
空リポソームとPLPをDiIC18（Life Technologies社、アメリカ合衆国）で標識した。その後、DiIで標識した両方の材料とさまざまなタイプの細胞の相互作用を調べた。細胞を最初にスライドガラスの上に播種し、どちらかの材料に37℃で6時間曝露した。結合しなかったあらゆる材料を温かいPBSで洗い流した。その後、スライドガラスの上に播種した細胞をカバースリップで覆い、Zeiss社のAxioscope顕微鏡で画像を取得し、AxioVisionソフトウエアで処理した。凍結させた心臓切片に含まれるDiIで標識した空リポソームとPLPを免疫検出するため、マウス心筋細胞を染色するための抗マウストロポニンI（DSHB社、アメリカ合衆国）でその心臓切片を標識し、核をDAPI（0.1 mg/ml）で対比染色した。画像をやはりZeiss社のAxioscope顕微鏡で取得し、AxioVisionソフトウエアで処理した。
【００８９】
非筋細胞の単離
成体マウスから心臓を切除した後、その組織を冷たいハンクス平衡塩溶液（HBSS）＋1％FBSで3回洗浄した。心臓を灌流して過剰な血液を除去した後、200μlのディスパーゼII溶液（5 U/mlディスパーゼII、5 mM CaCl2、0.1 U/mlコラゲナーゼB）の中に入れた。次に、カミソリの刃で心臓を切断して細かいメッシュにした後、5 mlのディスパーゼII溶液の中で37℃にて30分間インキュベートした。その後、5 mlのDMEM＋10％FBSを溶液に添加し、氷の上で40μmのフィルタを用いて濾過した。濾液を保管し、4℃にて1,000 rpmで5分間遠心分離した。次に、ペレットでフローサイトメトリーを実施した。
【００９０】
フローサイトメトリー
細胞を、DiIで標識した空リポソームまたはDiIで標識したPLPに曝露した後、温かいPBSで洗浄した。室温にて1,000 rpmで5分間遠心分離することにより、結合しなかった空リポソームまたはPLPを除去した。その後、細胞ペレットを5％ヤギ血清の混合物とともに氷の上で30分間インキュベートした。サンプルを4℃にて1,000 rpmで5分間遠心分離した後、それぞれの一次抗体、すなわち抗マウスF4/80 APC（MCA497APC、AbDSerotec社、アメリカ合衆国）、または抗マウスCD11b（14-0112、eBioscience社、アメリカ合衆国）、または抗CD144（555289、BD Science社、アメリカ合衆国）とともに4℃にて暗所で1時間インキュベートした。過剰な一次抗体を4℃にて1,000 rpmで5分間遠心分離することによって除去した。その後、サンプルを蛍光標識したそれぞれの二次抗体とともに4℃にて暗所で1時間インキュベートした。過剰な二次抗体を遠心分離によって除去した後、サンプルに対してフローサイトメトリー分析（BD Science社、アメリカ合衆国）を実施した。
【００９１】
PCR分析
TRI試薬（1 ml/心臓全体）を用いて全RNAを心臓全体から単離した。その後、ランダムプライマーミキサー（ProtoScript M-MuLV First Strand cDNA合成キット、New England BioLabs社）を用いて1μgのRNAをcDNAに転写し、特異的プライマー（表1）を用いてPCRにより35サイクルかけて増幅した。反応物に対して95℃で1分間、58℃で1分間、72℃で1.5分間のサイクルを実施し、変性、アニーリング、伸長がそれぞれ可能になるようにした。次に、TBE緩衝液（80 mMトリス塩基、80 mMホウ酸、2 mM EDTA、pH 8）の中の1％（w/v）寒天ゲル上で60 Vにて1時間にわたってPCR産物を分離した。HealthView Nucleic Acid Stain（Genomics社、台北、台湾国）を用いてゲルを30分間染色した後、UV光のもとで可視化した。
【００９２】
【表１】
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【００９３】
血小板様プロテオリポソームの調製
血小板様プロテオリポソームの調製は、薄膜水和法に基づいていた。Jang他、（2012年）、PNAS第109巻：1679〜1684ページ。方法の一例を図1Aに示す。1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）の10 mg/ml貯蔵溶液と3.28 mgのコレステロール（Avanti Polar Lipids社）の10 mg/ml貯蔵溶液を1 mlのクロロホルムとメタノール（9：1 v/v）に溶かし、体積にて6：4のモル比で混合した。薄膜をロータリーエバポレータによって形成した。脂質にDiIC18（Life Technologies社、アメリカ合衆国）の標識があらかじめ付けられている場合、染料を原初の混合物に添加した後、薄膜形成工程（10 mgのDOPCにつき20μl）を実施した。次に、薄膜を1 mlのHEPES-PBS緩衝液に再懸濁させると、脂質の最終濃度は約10 mg/mlであった。凍結-解凍を何回か実施した後、脂質溶液を100 nmのポリカーボネート膜（Whatman社、アメリカ合衆国）を通過させて押し出した。
【００９４】
次に、形成された脂質溶液を、1％n-オクチル-β-D-グルコピラノシド（OG）の存在下で、精製したヒト血小板膜タンパク質と30：1の比で室温にて1時間混合した。SM-2-BioBeadsを製造者（BioRad社）のプロトコルに従って用いて洗浄剤を除去した。その後、4℃にて6,000×gで5分間遠心分離することによってPLPをビーズから分離した。洗浄剤なしのプロテオリポソームを含んでいた上清をPBSに対して透析し、結合しなかったヒトPMPをすべて除去した。PLPへのコバルトプロトポルフィリン（CoPP、Enzo社）の封入は、Hamoriら（（1993年）、Pediatr Res 第34巻：1〜5ページ）に従って実施した。封入する望みの量のCoPPを洗浄剤なしのPLP溶液と混合した後、液体窒素の中で凍結させた。その後、この混合物を一晩凍結乾燥させた。翌日、凍結乾燥した生成物をPBSで水和し、4℃にて80,000 rpmで2時間遠心分離した。ペレットを再懸濁させ、超遠心分離をさらに1時間繰り返して過剰なCoPPを洗い流した。最後にペレットを望む体積のPBSの中に再懸濁させた。
【００９５】
HPLCによる定量
その後のHPLC分析のため、Chenら（（2015年）、Nanoscale 第7巻：15863〜15872ページ）に従ってサンプルを調製した。DiIで標識した空リポソームまたはPLPを注射してから4時間後、すべてのマウスにPBSを灌流して血管内のDiIで標識したすべての材料を洗い流した。その後マウスを安楽死させ、主要な臓器（脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓）を手早く回収した。回収した組織を約100 mgのいくつかの断片に切断して計量した。IPA緩衝液（0.5 ml、0.075 M HCl と混合した10％イソプロパノール、9：1 v/v）を各サンプルに添加した後、ジルコニアビーズを備えるMagNALyser装置（Roche社、マンハイム、ドイツ国）を用いて完全なホモジェネートにした。次に、ホモジェネートになったサンプルを4℃にて3,000 rpmで20秒間遠心分離した後、0.5 mlのIPA緩衝液をさらに添加した。サンプルを4℃で一晩放置した後、4℃にて14,000 rpmで15分間遠心分離した。抽出された蛍光染料を含む上清を取り出して希釈し、HPLC分析を実施した。HPLCは、Waters社のe2695 Separation ModuleとWaters社の2475 FLR Detector（アメリカ合衆国）を用いて実施した。X-Bridge C18カラム（250×4.6 mm、5μm, Waters社、アメリカ合衆国）を40℃で使用し、蛍光検出器を励起波長505 nm、発光波長515 nmに設定した。移動相はメタノールと脱イオン水（77：23、v/v）からなり、流速は1 ml/分であった。DiIで標識した既知の濃度の空リポソームまたはPLPの段階希釈によってHPLC標準を測定した。
【００９６】
空リポソームまたはPLPへのCoPPの封入効率は、空リポソームに封入されたCoPP（リポ-CoPP）溶液とPLPに封入されたCoPP（PLP-CoPP）溶液の両方を溶解緩衝液（90％エタノール／10％1M HCl、v/v）で処理した後に空リポソームまたはPLPから放出されたCoPPの量を測定することによって求めた。これらの溶液に対してHPLC分析を実施した。X-Bridge C18カラム（250×4.6 mm、5μm、Waters社、アメリカ合衆国）を40℃で用い、UV検出器を励起波長404 nm、発光波長417 nmに設定した。Rossi他、（1986年）、Biomed Chrom第1巻：163〜168ページ。濃度が既知のCoPPの標準曲線を構成し、各サンプルの封入効率を求めた。
【００９７】
クライオEMとTEM
クライオEM画像を得るためのサンプル調製と撮影は、独立したスタッフが中央研究院（台湾国）の学術及儀器事務所の低温電顕核心実験室で実施した。簡単に述べると、Tecnai F20電子顕微鏡（FEI）を200 keVで用いて空リポソームまたはPLPの画像を取得した。各曝露に関する低用量条件は、約20e-/Å2であった。焦点を2〜3μm外して画像を取得し、4k×4k CCDカメラ（Gatan社、アメリカ合衆国）に記録した。
【００９８】
ファゴサイトーシスを受けたPLPを含むマクロファージのTEM画像は、中央研究院（台湾国）の生物医学科学研究所の穿透式電子顕微鏡核心実験室の独立したスタッフが撮影した。サンプルは、最初に細胞をACLARフィルム（EMS社、アメリカ合衆国）の上に37℃で一晩播種することによって調製した。その後、播種した細胞をPLPに37℃で6時間曝露し、過剰なPLPを温かいPBSで洗い流した。その後、サンプルのTEMイメージングを実施した。
【００９９】
生体多光子顕微鏡法
生体多光子イメージング実験のためのイメージング手続きは、以前にLeeら（（2012年）、Nat Commun 第3巻：1054ページ）が記載しているようにして実施した。実験の前に、耳を脱毛し、75％エタノールと水で拭った。多光子レーザービームを耳の真皮の限られた領域に約30秒間フォーカスさせることによってレーザー損傷を誘導した。すべてのマウスを2.5％イソフラン（Minrad社）で麻酔した後、実験中は1.5％イソフランの状態を維持した。FITC-デキストランを尾の静脈から静脈内注射してマウスの血管を標識し、マウスを空リポソーム処理群またはPLP処理群に分けた（n＝3）。4時間安定化させた後、FVMPE-RSマルチモード多光子走査顕微鏡（Olympus社）を用いて組織損傷領域を撮影した。その後、DiIで標識した5 mg/mlの空リポソームまたはPLPを尾の静脈から100μl静脈内注射し、その直後から30分後まで耳の組織損傷領域を観察した。その間、画像を5分ごとに撮影した。
【０１００】
HO-1活性アッセイ
CoPPに曝露した細胞内で誘導されたHO-1の比活性を求めるため、分析した細胞抽出物に含まれるビリルビンの量を測定した。Lam他、（2005年）、J Immunol第174巻：2297〜2304ページ。マグネシウムを補足したリン酸カリウム溶液（0.1M KPO4 と2 mM MgCl2；pH 7.4）に細胞ペレットを再懸濁し、凍結-解凍サイクルを3回実施し、超音波処理によって細胞質のHO-1タンパク質を放出させた。HO-1酵素アッセイでは、100 mM PBS、2 mM MgCl2、3 mgのラット肝臓サイトゾル、0.8 mM NADPH、2 mMグルコース-6-リン酸塩、0.2 Uグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、20μM酵素基質ヘミンを含む反応混合物と、1mgのサンプルを用いた。反応を各サンプルの最終体積が1 mlになるまで行なわせ、暗所で37℃にて1時間インキュベートした。クロロホルムを添加して反応を終了させ、ビリルビンを遠心分離によって抽出し、分光測光によって464 nmと530 nmでの吸光度の差として測定した（ビリルビンの消光係数は40 mM-1cm-1）。各サンプル中のタンパク質の濃度をBradfordタンパク質アッセイで求め、HO-1活性を、1時間にタンパク質1 mgにつき形成されたビリルビンのマイクロモル数として表わした。
【０１０１】
血液検査
血液検査はすべて、台湾小鼠診所で独立したスタッフが実施した。約56週齢のオスのBALB/cマウスをすべての分析で用いた（各群でn＝5）。
【０１０２】
統計分析
一元ANOVA（分散の分析）検定の後、チュキー事後検定を利用して試験条件下での処理の間の統計的有意性を比較した。p値が0.05未満を有意であると見なした。
【０１０３】
結果
ヒト血小板からの血小板膜タンパク質の精製
精製した血小板膜タンパク質溶液が細胞質タンパク質をまったく含んでいないことを確認するため、SDS-PAGE分析とウエスタンブロッティング分析を実施した（それぞれ図1Dと図1E）。SDS-PAGEにより、精製したPMPを装填したレーンで多数のバンドが明らかになった。これらのバンドは、さまざまなPMPを表わしている可能性が大きい（白い長方形、図1D）。約42 kDaの位置にある共通のバンドはβ-アクチンを表わしており（Moebius他、（2005年）、Mol Cell Proteomics 第4巻：1754〜1761ページ）、精製したヒトPMPを除く全サンプルで検出された（黒い長方形、図1D）。β-アクチンは血小板の中の主要な細胞質タンパク質である（Lewandrowski他、（2009年）、Blood第114巻：E10〜E19ページ）ため、その不在は、精製したPMP溶液が細胞質タンパク質によって実質的に汚染されていないことを示唆していた。次に、検出されたバンドのいくつかが何であるかをウエスタンブロッティングによって確認した。
【０１０４】
図1Eに示したように、PLPサンプルでは、CD62、GPIIb、CD42cといった血小板タンパク質が検出されたが、β-アクチンは検出されなかった。CD62D（P-セレクチン）は、単球表面のp-セレクチン糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）と相互作用することでよく知られる活性化された血小板受容体であるのに対し、フィブリノーゲンが、単球表面のGPIIb（インテグリンαIIb）とCD11b（インテグリンαM）の相互作用を媒介する。血小板CD42c（GPIb）は、単球表面のCD11bと直接相互作用することがわかっている。単球と相互作用する既知の他の血小板受容体とともに、精製したPMP溶液中の3種類の血小板受容体が何であるかも質量分析によって確認した（表2）。GPIIbとCD42cの両方とも血小板膜の表面で構成的に発現するのに対し、CD62Pは初期血小板活性化マーカーであり、針で破裂させることによって「弱く」誘導することができる。Murakami他、（1996年）、European J of Clin Invest第26巻：966〜1003ページ；Marquardt他、（2002年）、Stroke第33巻：2570〜2574ページ；Harmon他、（2011年）、Int Cellular Med Society 1〜11ページ。
【０１０５】
【表２】
2018513170.tif 000004
【０１０６】
上の表に掲載した1種類以上の血小板膜タンパク質を用いて本明細書に記載のPLPを作製することができる。いくつかの例では、血小板-単球相互作用に関与することが明らかにされている太字にした少なくとも1種類のタンパク質を用いて本明細書に記載のPLPが作製される。
【０１０７】
PLPは、DOPC系リポソームを用いたヒトPMPの再構成によって作製される
薄膜水和法（Jang他、（2012年）、PNAS 第109巻：1679〜1684ページ）によってPLPのバッチを調製した。このPLP は、DOPCとコレステロールの混合物（9：1、w/w）と、精製したヒトPMPを30：1の比にしたものからなる。クライオEM画像では、空リポソームは不規則な形と凝集を示した（図1F）。それに対してPLPでは一様な円形が見られた。しかしクライオEM画像から、PLPのサイズが揃っておらず、すべてのPLPが約100 nmのサイズになっているわけではないことがわかった。動的光散乱（DLS）測定から同様の結果が明らかになり、平均すると大半のPLPはサイズが100 nmに近い（PDI＝0.077）のに対し、空リポソームは平均サイズが約130 nmであった（PDI＝0.12、表3）。重要なことだが、PLPの全表面電荷は空リポソームと比べてより大きな負の値であることが示された。血小板膜タンパク質は負に帯電していることが知られているため、これは、DOPC系リポソームへのヒトPMPの共役が成功したことを示唆していた。Lewandrowski他、（2009年）、Blood 第214巻：E10〜E19ページ。さらに、PLPの表面にヒトPMPが存在することが、ウエスタンブロッティングによって確認された（図1G）。なぜなら抗ヒトGPIIb抗体と抗ヒトCD42c抗体の両方ともPLPに対してプラスの反応性を持っていたが、空リポソームに対してはプラスの反応性を持たなかったからである。
【０１０８】
【表３】
2018513170.tif 000005
【０１０９】
異なる3つのバッチのDOPC系リポソームとPLP（n＝3）のサイズ、表面電荷、多分散性指数（PDI）をMalvern Zetasizer Nano ZSによって測定した。PLPの水力直径とゼータ電位をリポソームと統計的に比較した。**、P＜0.01、***、P＜0.001。
【０１１０】
PLPは、単球に対して標的特異性を示すが、内皮細胞に対しては標的特異性を示さない
ヒトPMPが機能的役割を持つことを証明するため、DiIで標識した空リポソームとDiIで標識したPLPを、マウス内皮細胞（SVEC）、マウス単球（RAW264.7）、マウス腹腔マクロファージ（MΦ）とともに37℃で4時間インキュベートした。その後、DiIで標識した空リポソームまたはDiIで標識したPLPで過剰なもの、または結合しなかったものを除去し、次いでフローサイトメトリー分析を実施した（図3A）。空リポソームとは異なり、PLPはRAW264.7に対して強い結合親和性を示したが、SVECに対しては結合親和性を示さなかった。MΦのファゴサイトーシス活性が原因で、空リポソームとPLPの両方とも、MΦでは他の2つのタイプの細胞におけるよりもDiI信号が小さかった。それに加え、PLPをMΦに曝露すると多数の小胞が形成され（白い矢印、図3B）、いくつかの小胞の中にPLPを見ることができた（白い矢印、図3B）。
【０１１１】
同様の結果が蛍光画像でも見られた。これは、DiIで標識した空リポソームとPLPがこれら3つのタイプの細胞と相互作用することを示している。調べた全部で3つのタイプの細胞は、DiIで標識した空リポソームと確かに相互作用をした（図3D）。それに対してPLPはSVECとまったく相互作用しなかったが、RAW264.7とMΦではDiI信号が検出された（図3E）。RAW264.7細胞の中に凝集していることが見られた空リポソームとは異なり、PLPは、細胞ゾルの中よりもRAW264.7細胞の表面に断然局在していた。
【０１１２】
まとめると、これらの結果は、PLPの表面にヒトPMPが存在することで、プロテオリポソームは単球に結合できるが、内皮細胞には結合できないことを示していた。この性質は重要である。なぜならPLPは、静脈内注射する場合には内皮に沿って凝集する可能性が小さいことと、空リポソームよりも循環単球に接着する可能性が大きいことを示しているからである。その代わりに、またはそれに加えて、本明細書に記載のプロテオリポソームは、血小板および／または赤血球細胞に対する結合活性が低いため、血栓形成を誘導するリスクが減る可能性がある。さらに、曝露4時間後に大半のPLPは細胞ゾルの中よりもRAW264.7の表面に局在した。これは、PLPが循環単球によるファゴサイトーシスを受ける可能性がより小さく、したがって薬剤の放出が早すぎる可能性が最小になることを示唆している。
【０１１３】
蛍光イメージングの結果を図2Aに示す。DiIで標識したリポソームは、内皮細胞、単球、マクロファージに強く結合した。逆に、DiIで標識した血小板様プロテオリポソームは、単球とマクロファージでだけ正の信号を示しただけであった。さらに、血小板様プロテオリポソームの蛍光信号は、マクロファージの内側に局在していたが、単球とともにインキュベートしたときには膜表面に局在した。したがってデータは、血小板様プロテオリポソームは単球に対する標的特異性を持つが、内皮細胞に対しては持たないことを示唆していた。それに加え、血小板様プロテオリポソームは、単球の膜表面に局在していたが、マクロファージとともにインキュベートしたときには細胞内に局在した。同じ結果が、フローサイトメトリー分析でも見られた（図2B）。
【０１１４】
PLPは、空リポソームよりも組織損傷部位のほうを標的とする
傷の治癒における炎症反応はCHD患者で見られるのと同様であるため、レーザーで誘導したマウスの耳組織の傷をモデルとして、空リポソームとPLPの標的プロファイルを生体内で調べた。損傷を作り出した後、マウスを約48時間放置し、次いでDiIで標識した空リポソームまたはPLPをマウスの尾の静脈を通じて静脈内注射した。注射するとき、2光子顕微鏡のレンズの焦点を損傷領域に合わせ、2種類のリポソームの画像を30分後まで5分ごとに取得した。PLPを注射したマウス（図4B）と比較すると、注射した空リポソームのうちのごく少量（白い矢印の先頭、図4A）が損傷領域に見られた。30分後の時点で撮影した画像から3D回転画像を構成すると、DiIで標識したPLPは大量に組織損傷部位に浸潤した一方で、ごく少量の空リポソームしか損傷組織では見られないことがわかった。損傷領域に存在していなかった血管を30分後の時点で可視化すると、DiIで標識した空リポソームが大量に存在していることがわかった（図4C）。逆に、損傷部位の外側の領域ではDiIで標識したPLPがごく少量しか検出されなかった（図4D）。PLPを注射したマウスは、PBSまたは空リポソームで処理したマウスと比べて損傷部位で有意に大きいDiI信号を示した（図9）。結論として、生体多光子イメージングデータから、PLPは空リポソームよりも損傷部位のほうを標的とすることが証明された。これは、リクルートされた単球に背負われたことによる可能性が大きい。
【０１１５】
PLPは、虚血／再灌流（I/R）で損傷した心臓をより多く標的とした
PLPを臨床で冠動脈心疾患（CHD）患者に応用できることを証明するため、空リポソームとPLPの組織分布をI/R損傷のマウスモデルで調べた。マウスに外科的に誘導した虚血を45分間起こした後、再灌流させた。ヒトCHD患者では、梗塞を起こした心臓にリクルートされる単球の数が梗塞の72時間後にピークに達すること（van der Laan他、（2014年）、Eur Heart J 第35巻：376〜385ページ）が明らかにされているため、再灌流の24時間後または72時間後に、DiIで標識した5 mg/kgの空リポソームまたはPLPをマウスに100μl注射した。その後、空リポソームとPLPの両方を4時間循環させてからマウスを安楽死させ、臓器中のDiI信号のレベルをHPLC分析で調べた（図5Aと図5B）。
【０１１６】
再灌流を24時間実施した時点でマウスに空リポソームまたはPLPを投与したとき、脳はどちらの脂質材料に対してもプラスのDiI検出信号を示さなかった。最小レベルの信号が心臓、肺、腎臓で検出されたが、空リポソームとPLPの間で検出信号に有意差はなかった。肝臓と脾臓が、空リポソームとPLPの両方で最も大きなDiI信号を示した2つの主要な臓器であった。興味深いことに、脾臓では、PLPの検出が空リポソームよりも有意に少なかった。これは、PLP表面のヒトPMPが、脾臓にPLPが捕捉されるのを阻止する役割を果たしている可能性があることを示唆している。同様の分布プロファイルが、心臓を除き、再灌流を72時間実施した時点でDiIで標識した空リポソームまたはPLPを静脈内注射したときに見られた。注目すべきことに、有意差は脾臓で見られただけではない。なぜならPLPは、心臓で空リポソームより高い応答を示すことも見られたからである。これは、PLPの表面にPMPが存在していると、梗塞を起こした心臓をより多く標的とすることを示している。梗塞を起こした心臓にPLPが存在することは、再灌流を72時間実施した時点でPLPを投与した心臓組織切片でも検出できた（図5C）。シャム群とは異なり、DiIで標識した空リポソームで処理した群でも、DiIで標識したPLPで処理した群でも、まったく無傷のサルコメア構造をI/Rで損傷した心臓で見ることはできなかった。しかしPLPの蛍光信号が梗塞領域ではっきりと見られたのに対し、空リポソームで処理した心臓サンプルでは目に見える検出信号はなかった。
【０１１７】
損傷した心筋へのPLPの輸送が実際には単球を媒介とすることを証明するため、心臓全体に浸潤した単球の数をフローサイトメトリーによって求めた（図5D）。再灌流を24時間実施した後に安楽死させたマウスからの心臓は、空リポソームで処理した群とPLPで処理した群の両方で非常にわずかのCD11b+しか示さなかった。逆に、再灌流を72時間実施した後に安楽死させたマウスは、損傷した心臓でCD11b+細胞の有意な増加を示した（図5E）。さらに、心臓内のCD11b+ DiI+細胞の数は、再灌流を72時間実施した時点で投与したPLPで処理したマウスでは、再灌流を24時間実施した時点で投与したPLPで処理したマウスよりも有意に多かった（図5F）。再灌流を24時間または72時間実施した時点で空リポソームを投与したマウスでは同じ効果は見られなかった。したがってこのデータは、再灌流を72時間実施した時点で注射すると、有意な量のPLPが損傷した心筋に浸潤することと、その浸潤は単球を媒介とすることを示していた。
【０１１８】
PLPに封入したコバルトプロトポルフィリンIX（CoPP）を用いた処理により心臓の梗塞領域が小さくなった
コバルトプロトポルフィリンIX（CoPP）は、ヘムオキシゲナーゼ-1（HO-1）の発現を通じてマクロファージの炎症活性を抑えることが知られている小分子である（図10A）。HO-1は、ヘムが壊れてビリベルジンと一酸化炭素（CO）と鉄になる触媒として機能した。COおよびビリベルジンと、ヘム最終分解代謝産物であるビリルビンは、強い抗酸化活性と抗炎症活性を持つことが知られていて（Zao他、（2013年）、PLoS One第8巻：e75927ページ）、副生成物である鉄は、抗アポトーシス活性を持つフェリチンの合成に関与することが明らかにされている（Zao他、（2013年）、PLoS One第8巻：e75927ページ）。CoPPを用いた治療によって心臓の梗塞領域が有意に小さくなることが示されている。Sodhi他、（2015年）、J Cardiol Ther第2巻：291〜301ページ；Cao他、（2012年）、Front Physiol第3巻：160ページ；Chen他、（2013年）、Int J Mol Sci第14巻：2684〜2706ページ。そこで、I/R損傷のマウスモデルにおいてPLPに封入したCoPP（PLP-CoPP）を静脈内注射すると同様の治療効果が見られるかどうかを調べた。
【０１１９】
最初に、PLP-CoPPがHO-1の発現を誘導する能力をSVEC、RAW264.7細胞、MΦで調べた（図10B）。β-アクチンの発現と比較すると、空リポソームに封入したCoPP（リポ-CoPP）またはPLP-CoPPは、SVECでは有意なHO-1の発現にならなかったが、単独のCoPPを用いた処理は、いくらかの発現を誘導する結果になっているように見える。逆に、単独のCoPPまたはリポ-CoPPを用いた処理は、処理していない対照と比べてHO-1の強い発現を誘導した。PLP-CoPP で処理したRAW264.7細胞におけるHO-1の発現は、処理していない対照よりも強かったが、バンドは、単独のCoPPまたはリポ-CoPPを用いた処理と比べて強度が小さかった。したがってこのデータから、PLPの表面のヒトPMPは、リポ-CoPPとは異なり、封入されたCoPPが細胞によって容易に取り込まれるのを阻止していることが示唆される。SVECおよびRAW264.7細胞と比較すると、CoPPで処理したMΦのすべての形態でHO-1の強い発現が見られた。さらに、インビトロ活性アッセイでビリルビンのレベルを測定することにより、CoPPによって誘導されるHO-1の発現はすべて酵素活性であることが証明された（図10C）。それに加え、それぞれにおけるHO-1の酵素活性は、CoPPで処理した各サンプルにおける酵素の発現レベルに対応していた。
【０１２０】
PLP-CoPPがI/R損傷のマウスモデルにおいて心臓の梗塞領域を小さくする能力を調べる実験を行なう前に、空リポソームとPLPに封入されたCoPPの安定性を調べた（表5）。DLS測定から、PLP-CoPPの封入効率は、封入直後に測定した値と比べて3日後も違いがないが、リポ-CoPPではそうでないことがわかった。さらに、PLP-CoPPのサイズは、最初に封入してから3日後も違いがなかった。しかし7日目以降はCoPP封入効率の有意な低下がリポ-CoPPとPLP-CoPPの両方で見られた。したがってその後のすべての動物実験において、リポ-CoPPは生体内実験の1日前に調製したのに対し、PLP-CoPPは実験の3〜4日前に新たに調製した。
【０１２１】
【表４】
2018513170.tif 000006
リポソームまたはPLPに封入したコバルトプロトポルフィリンIX（CoPP）の3つのバッチ（n＝3）に対して動的レーザー散乱分析を実施し、封入後の粒子のサイズを求めた。異なるインキュベーション時間でのリポソームまたはPLPへのCoPPの封入効率はHPLCによって求めた。リポソームまたはPLPへのCoPPの封入効率を封入直後に測定した値との比較で、**、P＜0.01、***、P＜0.001。
【０１２２】
マウスにおけるCoPPの以前の薬物動態研究から、5 mg/kgのCoPPを5日ごとに用いると生体内でHO-1の強い発現を誘導するのに十分であることが示されている。Chen他、（2013年）、Int J Mol Sci第14巻：2684〜2706ページ。マウスを45分間虚血にし、再灌流を約72時間実施した後、5 mg/kgの単独のCoPP、リポ-CoPP、PLP-CoPPを尾の静脈を通じて100μl注射した（図6A）。次に、再灌流後21日目まで同じ用量を5日ごとに投与した後、マウスを安楽死させ、心臓を回収して組織学的分析を行なった（図6Bと図11）。I/R＋生理食塩水群と比較すると、リポ-CoPPで処理したマウスは梗塞領域を小さくすることに関してあまり改善を示さなかったが、単独のCoPPまたはPLP-CoPPで処理したマウスでは有意な縮小が見られた（図6C）。これらの結果から、PLPへのCoPPの封入はこの薬剤の治療効果を低下させないことが証明された。さらに、空リポソームに封入されたCoPPは梗塞を起こした心臓に治療効果を及ぼさなかったという事実は、共役したヒトPMPが封入された薬剤を梗塞を起こした心臓に送達する上で重要な役割を果たしていることを明らかに示している。
【０１２３】
CoPPまたはPLP-CoPPを用いた処理は、I/Rで損傷した心臓でいくつかの炎症促進遺伝子を下方調節することがわかった（図6D）。CoPPまたはPLP-CoPPを静脈内注射したマウスの心臓では、生理食塩水やリポ-CoPPで処理したマウスと比べ、HO-1遺伝子（HMXO1）の発現が上方調節された。比較すると、TNFα、MCP-1、IL6、IL1βといった炎症促進遺伝子が、CoPPやPLP-CoPPで処理した群において下方調節された。したがってこれらの結果は、CoPP またはPLP-CoPPがI/Rで損傷した心臓でHO-1の発現を誘導できることと、HO-1が抗炎症効果を及ぼし、その結果としていくつかの炎症促進サイトカインを下方調節することを示していた。
【０１２４】
PLPはCoPPの有害な効果を最少にする
MIの動物モデルにおけるCoPPの治療上の利点が文献によく記載されているが、その望まない標的外効果も報告されている。Schmidt、（2007年）、FASEB J 第21巻：2639ページ；Ryter他、（2006年）、Physiol Rev 第86巻：583〜650ページ。PLP-CoPPの全体的効果を評価するため、非再灌流MIのマウスモデルにおいてPLP-CoPP処理後の心臓機能を最初に調べた。虚血を外科手術によって誘導した後、マウスに5 mg/kgの単独のCoPP、リポ-CoPP、PLP-CoPPを梗塞の3日後に100μl静脈内注射した。その後、マウスに同じ用量を梗塞の28日後まで5日ごとに投与した（図7A）。MIの28日後に全処理群でマウスの心臓機能を心エコー検査によって評価した（図7B）。血液が心臓と1回接触するごとに心臓を離れる血液の量を測定する左心室駆出率（LVEF、％）は、MI＋PLP-CoPPの群において、MI＋生理食塩水の群、MI＋リポ-CoPPの群、2種類のビヒクルだけの群よりも有意に大きかった。MI＋CoPPの群とMI＋PLP-CoPPの群の間に有意差はなかった。同様の結果が、心筋の厚さの影響を受ける短縮率（FS％）の測定でも見られ、PLP-CoPPで処理した群は、MI＋CoPPの群を除く他の処理群と比べてFS％の有意な改善を示した。左心室拡張終期体積（LVEDV）と左心室収縮終期体積（LVESV）における血液の体積もすべての群で評価した。単独のCoPPまたはPLP-CoPPでの処理は、シャム群で見られたのと同じレベルまでLVEDVとLVESVを下げることはなかったが、それでも結果は、他の処理群と比べて有意に優れていた。同様に、拡張期における心室間隔膜厚（IVSd）または収縮期における心室間隔膜厚（IVSs）の測定値はさらに、PLP-CoPPが、単独のCoPPで処理した場合と同様にマウスの心臓機能全体を改善させることを示していた。
【０１２５】
次に、PLPが他の臓器に対するCoPPの標的外効果を最少にする能力を調べるため、全処理群の血液で28日間の処理の終了時に血清分析を実施した（図7C〜図7E）。血清中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）、アラニントランスアミナーゼ（ALT）、全ビリルビンのレベルをバイオマーカーとして用い、CoPPの肝臓毒性を評価した（図7C）。ASTとTBILの測定では処理群の間に有意差がなかった。しかしMI＋CoPPの群では、MI＋PLP-CoPPの群よりも有意に高いALTのレベルが検出された。さらに、MI＋リポ-CoPPの群とMI＋PLP-CoPPの群の両方が、シャム群と同様のALTレベルを示した。同様の結果が、腎臓毒性のバイオマーカーである血液尿素窒素（BUN）とクレアチニン（CRE）の血清レベルの測定値でも見られた（図7D）。リポ-CoPP処理もPLP-CoPP処理も、CoPP処理と同様、BUNまたはCREの血清レベルを上昇させなかったことが明らかであった。心臓毒性のバイオマーカーであるクレアチンキナーゼMB（CKMB）の血清レベルの測定値は、MI＋CoPPの群とMI＋PLP-CoPPの群の両方が他の処理群と比べて有意に低いCKMBレベルであることを示していた（図7E）。これは、CoPPそのものは追加の心臓毒性を誘導せず、CKMBのあらゆるレベル上昇は虚血による損傷の結果である可能性が大きいことを示していた。
【０１２６】
合わせて考えると、本研究の結果は、本明細書に記載のPLPが心臓の損傷領域にCoPPを有効に送達し、CoPPの標的外送達に伴う副作用を最少にすることを示していた。このプロセスを図8に示す。
【０１２７】
考察
潜在的な心臓保護薬の基礎医学における有望な結果を臨床に移すことは困難な仕事に留まっている。過去数十年にわたって投資が続けられているにもかからわず、有効な心臓保護薬は相変わらず市販されていない。Altamirano他、（2015年）、J Physiol 第593巻：3773〜3788ページ；Perricone他、（2014年）、Pharmacol Res 第89巻：36〜45ページ；Sluijter他、（2014年）、Pharmacol Ther 第144巻：60〜70ページ。臨床でうまくいっていないいくつかの結果は、不適切な動物モデルとヒト患者の個々のライフスタイルに帰されてきた。しかし全身に送達される薬剤の標的特異性を最大にすることもまだ実現されないままである。例えばアメリカ合衆国のFDAがII型糖尿病を治療するための抗糖尿病薬として認可したメトフォルミンは、いくつかの動物モデルで心臓保護効果を持つことが示されている。Whittington他、（2013年）、Cardiovasc Drug Ther 第27巻：5〜16ページ。しかし冠動脈バイパス手術の間にCHD患者をメトフォルミンであらかじめ治療した最近の臨床試験は、心筋の損傷を有意に減らすことに失敗した。El Messaoudi他、（2015年）、Lancet Diabetes Endocrinol 第3巻：615-623ページ。さらに、メトフォルミンで治療した群の患者は、プラセボ群と比べて下痢やそれ以外の胃腸の不快感の発生が有意に多かった。したがって臨床の結果は、メトフォルミンが、治療した患者の心臓保護機能を持たないだけでなく、不利な効果も誘導することを示していた。報告されているいくつかの薬剤送達系は、梗塞を起こした心臓に能動的に送達されると主張されているが、これら送達系の機能化された表面は、標的部位にそれをよりよく保持すること、および／またはその循環半減期を長くすることを可能にするだけである。Dvir他、（2011年）、Nano Lett 第11巻：4411〜4414ページ；Yan他、（2014年）、Biomaterials 第35巻：1063〜1073ページ；Chang他、（2013年）、J Control Release 第170巻：287〜294ページ；Nguyen他、（2015年）、Adv Mater 第27巻：5547〜5552ページ。これら送達系は、標的部位に到達する主要経路として相変わらずEPR効果に頼っている。いくつかの報告と臨床研究が、今や、EPR効果は、がんの治療を含め、もはや依存できる薬剤送達戦略ではないことを示している。Nichols他、（2014年）、J Control Release第190巻：451〜464ページ。したがって本明細書に開示した単球を媒介とする送達戦略は、薬剤送達の真に能動的な形態である。
【０１２８】
単球を媒介とする戦略は、がんの薬剤の送達に関して以前に報告されている。しかし報告されている送達系は、内皮によっても認識される機能化された表面を有する（Qin他、（2015年）、Nanomedicine第11巻：391〜400ページ）か、循環単球によるファゴサイトーシスをより容易にする機能化されていない表面を有する（Nagaoka他、（2015年）、PLoS One第10巻：e0132451ページ；Afergan他、（2008年）、J Control Release第132巻：84〜90ページ）か、送達用ビヒクルを全身に送達する前に単球の外部供給源とあらかじめ混合する必要があった（Anselmo他、（2015年）、J Control Release第199巻：29〜36ページ）。それに対して本明細書に記載のPLPは、梗塞後の血小板と循環単球の間の生理的相互作用を真似るように設計された。PLP上のPMPは、送達系が、梗塞を起こした心臓にリクルートされつつある循環単球にヒッチハイクすることを可能にする。それと同時にこのタンパク質は、内皮に対する物理的障害を提供して、望ましくない血栓形成を阻止する可能性が大きい。それに加え、PLPは、細胞によるファゴサイトーシスを受けるのではなく、曝露の4時間後に単球の表面に凝集することが明らかにされた。このような性質は極めて重要である。というのもファゴサイトーシスが早く起こると封入された薬剤の放出が早すぎて望まない効果が誘導される可能性があるからである。
【０１２９】
本研究で開示したPLPを媒介とする薬剤送達系の例は、血管損傷部位への血小板の凝集を促進する上で重要な役割を果たすことが知られている血小板膜リン脂質を含む血小板膜全体ではなく、純粋なPMP溶液を利用していた。Davi他、（2007年）、N Engl J Med 第357巻：2482〜2494ページ。目的は、単球の表面にPLPが付着する機会を最大にすることであるため、膜リン脂質が存在していると、望ましくない凝集が内皮の表面上とPLP相互間で促進される可能性が大きいと考えられる。さらに、ポリマーではなくリポソームがPLPのコアとして選択された。なぜならリポソームは多彩な薬剤を封入することができ、調節体により受け入れられやすいからである。Torchilin他、（2014年）、Nat Rev Drug Discov 第13巻：813〜827ページ。さらに、血小板膜全体が使用される場合、血小板膜リン脂質が存在していると、ヒトPMPとDOPC脂質の共役の成功が阻止される可能性が大きくなると考えられる。
【０１３０】
本明細書に記載のPLPは、作製するのに単一のタイプの組み換えタンパク質を使用したり、所定の組み換えタンパク質の混合物を使用したりしなくてもよく、その代わりに、精製したヒトPMPの混合物を全面的に含むことができる。そのようなPLPは単球と高いレベルの相互作用をし、そのことによって薬剤送達活性を高めた。
【０１３１】
本研究で証明されたのは、梗塞を起こした心臓で再灌流の72時間後にだけPLPを検出でき、24時間後には検出できなかったことである。この結果は予想外であった。というのも、単球と相互作用する血小板受容体のいくつかは、ヒト患者で梗塞を起こした心臓に梗塞後24時間以内にリクルートされる好中球とも相互作用することが知られているからである。Hausenloy他、（2015年）、N Engl J Med 第373巻：1073〜1075ページ。共役プロセスがヒトPMPにいくらか改変を誘導し、その結果として好中球に対する親和性が小さくなった可能性がある。しかし灌流を72時間実施した時点で静脈内注射すると、注射された全PLPの約5％が心臓の中に存在していたが、注射された全空リポソームのほうは約0.3％であった。さらに、PLPの数の増加は、梗塞を起こした心臓で72時間後の時点で検出される単球の数の増加と相関していた。これは、単球を媒介として標的に向かったことを示唆している。このようなデータは、リクルートされる単球の数が梗塞後72時間の時点でピークに達し、その大半は梗塞領域にあるというヒトの臨床データに対応している。van der Laan他、（2014年）、Eur Heart J 第35巻：376〜385ページ。
【０１３２】
最近の臨床研究に基づくと、再灌流相の間に起こる炎症応答が、虚血を生き延びる心筋細胞の生存に莫大な効果を及ぼすことが明らかである。Hausenloy他、（2015年）、N Engl J Med 第373巻：1073〜1075ページ；Altamirano他、（2015年）、J Physiol 第593巻：3773〜3788ページ。いくつかの抗炎症薬が開発されているが、どの薬剤も有効であることが証明されたことはこれまでにない。よく報告されているのは、リクルートされた単球が二相特性を持つことと、開発された多くの薬剤が目指す標的はMI相の間の炎症活性であることである。しかしこれら抗炎症薬のいくつかは常在性心臓マクロファージにも影響を与えることも指摘された。単球由来の浸潤するマクロファージとは異なり、常在性心臓マクロファージは主に胚性前駆体に由来し、ゴミを内部化し、アポトーシスする心筋細胞を飲み込むことをより効率的に行なう。Epelman他、（2014年）、Immunity第40巻：91〜104ページ。さまざまな研究から、これらの細胞は、止血において重要な役割を持つことが明らかになった。なぜなら、その炎症活性を抑制すると実際に炎症相全体が延長され、最終的に心臓機能が低下する結果になったからである。Wan他、（2013年）、Circ Res 第113巻：1004〜1012ページ。
【０１３３】
したがって本研究のPLPは、単球由来の新たにリクルートされたマクロファージだけを標的とする可能性が大きい。なぜなら対照である空リポソームは、再灌流を72時間実施した時点で注射したときには、梗塞を起こした心臓に蓄積しなかったからである。したがって再灌流を72時間実施した時点で注射されたPLP-CoPPは、常在性心臓マクロファージと自由に相互作用することができたというよりは、損傷した心筋に浸潤した直後に、単球からマクロファージになった担体によるファゴサイトーシスを受けた可能性が大きい。常在性心臓マクロファージに対するCoPPの効果に関する報告は存在していないが、本研究は、CoPPで処理したマウスとPLP-CoPPで処理したマウスの間で治療結果に有意差がないことを示した。常在性心臓マクロファージの数は、リクルートされた単球に由来するマクロファージよりも少ないことが知られている（Luo他、（2014年）、Stem Cells Transl Med第3巻：734〜744ページ）ため、CoPPとPLP-CoPPの間の有意差は、よりあとの時点でだけ見られる可能性が大きい。しかし本研究により、梗塞後72時間の時点でPLP-CoPPを静脈内注射することが、常在性心臓マクロファージを残しておきつつ、新たにリクルートされた単球に由来するマクロファージの炎症活性を低下させるための優れた戦略となる可能性のあることが明らかに証明された。
【０１３４】
CoPPは、転写因子FOXO1の発現を増大させ、HO-1のプロモータにFOXO1が結合しやすくすることが知られているため、HO-1の転写活性を増大させる。Liu他、（2013年）、PLoS One第8巻：e80521ページ。最近、CoPPであらかじめ処理すると、ヒト胚性幹細胞由来の心筋がI/R損傷から保護されることがインビトロモデルと生体内モデルの両方で証明された。Luo他、（2014年）、Stem Cells Transl Med第3巻：734〜744ページ。I/R損傷のマウスモデルの心臓を調べることで、生理食塩水またはリポ-CoPPで処理したマウスとは異なり、CoPPまたはPLP-CoPPの送達がHO-1の発現を誘導することがわかった。CoPPが誘導するHO-1の発現増大によっていくつかの炎症促進遺伝子の発現が下方調節された。別の研究者たちは、HO-1が、いくつかの炎症促進サイトカインの発現を直接的または間接的に下方調節する心臓保護酵素であることを示した。Sodhi他、（2015年）、J Cardiol Ther 第2巻：291〜301; Collino他、（2013年）、Dis Model Mech第6巻：1012〜1020ページ；Wang他、（2010年）、Circulation 第121巻：1912〜1925ページ。
【０１３５】
多くの研究によってさまざまな動物モデルでI/R損傷におけるCoPPの利点が証明されてきたが、この薬剤の効果に関するヒトの臨床データは入手できない。重要な懸念の1つは、CoPPのコバルト成分が重金属であることである。初期の研究により、長期にわたるCoPPの全身注射により肝臓毒性が生じる可能性のあることが示唆された。Schmidt、（2007年）、FASEB J第21巻：2639ページ。実際、CoPP処理後のMIのマウスモデルの心臓機能に関する生体内研究では、肝臓毒性の最も重要な標準バイオマーカーであるALTの血清レベルが有意に上昇することがわかった。ASTとTBILの両方についても肝臓毒性に関して臨床で試験されているところである。しかしALTとは異なり、ASTとTBILのアッセイは、これらバイオマーカーの間で相違が頻繁に見られることが原因で、ALT測定を支持する補足材料としか見なされていない。Ozer他、（2008年）、Toxicology第245巻：194〜205ページ。AST測定とTBIL測定でCoPP処理群の間に有意差が見られなかったとはいえ、単独のCoPPで処理した群でのALTレベルの上昇は、ALTが実際に肝臓毒性をいくらか誘導したことを示していた。より重要なのは、リポ-CoPPで処理した群もPLP-CoPPで処理した群も、28日後までの期間にALT血清レベルの有意な上昇を示さなかったことである。同様に、単独のCoPPは、腎臓毒性を誘導することが示された。なぜならBUNとCREの血清レベルが他の処理群よりも有意に高かったからである。まとめると、全身に送達された単独のCoPPは、MIのマウスモデルにおいて、心臓機能全体を改善するが追加の心臓毒性は誘導しないことが示されたが、肝臓毒性と腎臓毒性の兆候が観察された。逆に、PLP-CoPPは、心臓の改善レベルに関しては同様であったが、肝臓と腎臓に対する有害な効果は誘導しなかった。したがって送達されたCoPPの効果が大きく改善された。
【０１３６】
まとめると、本研究に記載したPLPは、ヒトPMPのタンパク質成分だけを利用し、膜リン脂質は利用しなかった。その帰結として、このPLPは、インビトロモデルと生体内モデルの両方で内皮に対して示す親和性が小さかったため、心筋梗塞後にリクルートされる循環単球に結合する機会が増大する。したがってこのPLPは、循環単球にヒッチハイクすることを通じ、梗塞を起こした心臓を標的とすることが空リポソームよりも多かった。こうすることで、心臓に到達する主経路としてのEPR効果に依存する必要性が最少になった。再灌流を72時間実施した時点でPLP-CoPPを投与することは、心臓の炎症を少なくするための優れた治療戦略である。なぜなら封入されたCoPPは、常在性心臓マクロファージを残しておきつつ、リクルートされた単球由来のマクロファージの炎症活性を下方調節する可能性が大きいからである（図8）。さらに、静脈内注射したPLP-CoPPは、この薬剤の有害な効果を減らしつつ、単独のCoPPと同レベルの心臓改善効果を示した。
【０１３７】
他の実施態様
本明細書に開示されているどの特徴も任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ目的、または等価な目的、または同様の目的で機能する代わりの特徴で置き換えることができる。したがって特に断わらない限り、開示されている各特徴は、一般的な一連の等価な特徴または同様の特徴の一例にすぎない。
【０１３８】
上記の記述から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明をさまざまな用途や条件に合わせるため、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、本発明をさまざまに変更したり改変したりすることができる。したがって他の実施態様も請求項に含まれる。
【０１３９】
均等物
本発明のいくつかの実施態様をここに記載し、図示してきたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実行するための多彩な他の手段および／または構造、および／または、本明細書に記載の結果および／または利点の1つ以上を得るための多彩な他の手段および／または構造を容易に想起するであろう。そうしたバリエーションおよび／または改変のそれぞれは、本明細書に記載の本発明の実施態様の範囲に含まれると見なされる。より一般に、本明細書に記載のあらゆるパラメータ、サイズ、材料、構成は例示を意味していること、そして実際のパラメータ、および／またはサイズ、および／または材料、および／または構成は、本発明の教示が利用される具体的な用途に依存することを当業者は容易に理解するであろう。当業者は、定型的な実験以上のものを利用することなく、本明細書に記載の本発明の具体的な実施態様と等価な多くのことを認識するか、確認することができるであろう。したがって、上記の実施態様は単なる例示であり、添付の請求項および均等の範囲内で、具体的に説明して請求項に記載したのとは異なる本発明の実施態様を実施することができると理解すべきである。本開示の本発明の実施態様は、本明細書に記載の個々の特徴、および／または系、および／または物品、および／または材料、および／またはキット、および／または方法を対象としている。それに加え、そのような特徴、および／または系、および／または物品、および／または材料、および／またはキット、および／または方法の2つ以上の任意の組み合わせは、本開示の本発明の範囲に含まれる。
【０１４０】
本明細書で規定して使用するあらゆる定義は、辞書の定義、および／または参照により組み込まれている文献における定義、および／または規定した用語の通常の意味に優先すると理解されるべきである。
【０１４１】
本明細書と請求項で用いる不定冠詞「1つの」は、特に断わらない限り、「少なくとも1つの」を意味すると理解されるべきである。
【０１４２】
本明細書と請求項で用いる「および／または」という句は、そのように組み合わされている要素、すなわちある場合には組み合わされて存在し、別の場合には分かれて存在する要素の「いずれか、または両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」とともに列挙されている多数の要素は、同様に解釈すべきである。すなわち、要素の「1つ以上」がそのように組み合わされていると解釈すべきである。「および／または」という句によって具体的に明示されている要素とは別の要素が場合によっては存在していてもよく、それら別の要素は、具体的に明示されている要素と関連していてもいなくてもよい。したがって非限定的な例として、「Aおよび／またはB」は、「含む」などの数の限定がない表記と組み合わせて使用するとき、1つの態様では、Aだけ（場合によってはB以外の要素も含む）を意味し、別の1つの態様では、Bだけ（場合によってはA以外の要素も含む）を意味し、さらに別の1つの態様では、AとBの両方（場合によっては他の要素も含む）意味することなどが可能である。
【０１４３】
本明細書と請求項で用いる「または」は、上に定義した「および／または」と同じ意味を持つと理解されるべきである。例えばあるリストの中の項目を分けるとき、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈される。すなわち、多数の要素またはリストにされた要素の少なくとも1つだけでなく、2つ以上と、場合によってはリストにない追加の項目も含むと解釈される。そうではないことが明確に指示されている句、例えば「…のうちの1つだけ」または「…のうちの正確に1つ」や、請求項で用いるときの「…からなる」は、多数の要素またはリストにされた要素の中の正確に1つの要素を含むことを意味する。一般に、本明細書で用いる「または」という単語は、排他性を示す「…のいずれか」、「…のうちの1つ」、「…のうちの1つだけ」、「…のうちの正確に1つ」といった句が前にあるときには、排他的な代替要素を指す（すなわち「一方または他方であって両方ではない」）とだけ解釈される。「主に…からなる」は、請求項で用いるときには、特許法の分野で用いられている通常の意味を持つ。
【０１４４】
本明細書と請求項で1つ以上の要素からなるリストに言及して用いられる「少なくとも1つの」という句は、その要素リストに含まれる任意の1つ以上の要素から選択した少なくとも1つの要素を意味するが、その要素リストに具体的に掲載されている少なくとも1つの単独の要素を含んでいる必要は必ずしもなく、その要素リストに含まれる要素の任意の組み合わせも除外されないと理解されるべきである。この定義により、「少なくとも1つの」が言及する要素リストの中に具体的に明示されている要素とは別の要素が場合によっては存在することが可能になり、それら別の要素は、具体的に明示されている要素と関連していてもいなくてもよい。したがって非限定的な例として、「AとBのうちの少なくとも1つ」（またはそれと同等な「AとBの少なくとも1つ」、またはそれと同等な「Aおよび／またはBの少なくとも1つ」）は、1つの態様では、少なくとも1つ（場合によっては2つ以上）のAを意味し、Bは存在せず（場合によってはB以外の要素を含む）を意味し、別の1つの態様では、少なくとも1つ（場合によっては2つ以上）のBを意味し、Aは存在せず（場合によってはA以外の要素を含む）、さらに別の1つの態様では、少なくとも1つ（場合によっては2つ以上）のAと少なくとも1つ（場合によっては2つ以上）のBを含むこと意味することなどが可能である。
【０１４５】
特に明確に断わらない限り、1つ以上の工程または操作を含む本明細書に記載のどの方法でも、その方法のそれら工程または操作の順番は、必ずしもその方法のそれら工程または操作が記載されている順番に限定されない。
【０１４６】
請求項では、明細書におけるのと同様、「含む」、「含有する」、「備える」、「有する」、「含んでいる」、「関係する」、「保持する」、「からなる」などのつなぎの句はすべて、終わりが決められていないこと、すなわち含まれる事項の数に制限がないことを意味すると理解されるべきである。「…からなる」と「主に…からなる」というつなぎの句だけは、アメリカ合衆国特許庁特許審査手続きマニュアルの2111.03項に記載されているように、それぞれ、数が制限されたつなぎの句、または数がある程度制限されたつなぎの句である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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