(57)【要約】  本発明は、ヒトカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）および／またはヒトカドヘリン５（ＣＤＨ５）および／またはヒトカドヘリン６（ＣＤＨ６）および／またはヒトカドヘリン２０（ＣＤＨ２０）に特異的に結合する薬剤に関する。本発明は、治療におけるこれらの薬剤の使用、被験体における癌の診断および／または予後診断および／または層別化のための方法、および前記薬剤を含む医薬組成物にも関する。本発明は、癌マーカーおよび転移のマーカーにも関する。
2018513141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピトープに特異的に結合する薬剤であって、前記エピトーブが、ヒトカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン５（ＣＤＨ５）の残基２３６〜２３８または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン６（ＣＤＨ６）の残基８３〜８５を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン２０（ＣＤＨ２０）の残基８９〜９１を含むエピトープであり、前記薬剤が、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディおよびアンチカリンからなる群から選択される免疫グロブリン薬剤または非免疫グロブリン薬剤である、薬剤。
【請求項２】
前記エピトープが、配列番号１で示される配列（ＶＳＬＲＧＤＴＲＧ）を含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記免疫グロブリン薬剤が、抗体であるか、または前記抗体の抗原結合フラグメントである、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記抗体結合フラグメントが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’からなる群から選択される、請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
前記抗体または前記抗原結合フラグメントが、重鎖の中に、
−配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］および配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］、または前記ＣＤＲの機能的に等価な改変体、
または
−配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］および配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］、または前記ＣＤＲの機能的に等価な改変体を含む、請求項３または４のいずれかに記載の薬剤。
【請求項６】
前記抗体または前記抗原結合フラグメントが、
−重鎖の中に、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２および配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖の中に、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、または前記ＣＤＲの機能的に等価な改変体を含むか、または
−重鎖の中に、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］および配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］を含み、軽鎖の中に、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、または前記ＣＤＲの機能的に等価な改変体を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
前記抗体が、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６で寄託されたリファレンスＰＡ３８３−２５．４．１を含むハイブリドーマ細胞株によって作られる、請求項３または４のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
前記抗体または前記抗原結合フラグメントがヒト化されてなる、請求項３〜７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項９】
前記抗体または抗原結合フラグメントが、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）またはラクダ抗体である、請求項３または４のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１０】
抗体構築物であって、請求項３〜８のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメントを含み、この抗体構築物は、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ、（ｓｃＦｖ）２およびダイアボディからなる群から選択される、抗体構築物。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜９のいずれかに記載の薬剤または請求項１０に記載の抗体構築物をコードする核酸、および
（ｂ）（ａ）に定義される核酸の相補的核酸からなる群から選択される、核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む発現カセット。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸または請求項１２に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１１に記載の核酸、または請求項１２に記載の発現カセット、または請求項１３に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１５】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６で寄託されたリファレンスＰＡ３８３−２５．４．１を含むハイブリドーマ細胞株。
【請求項１６】
ＬＲＧＤＴ（配列番号１４）、ＬＲＧＤＳ（配列番号１５）、ＬＲＧＤＹ（配列番号１６）、ＤＲＧＤＧ（配列番号１７）または前記配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するこれらの改変体からなる群から選択される配列ＲＧＤを含むペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドが、直鎖ペプチド、環状ペプチドまたは分岐ペプチドから選択される、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
医薬として使用するための、
−請求項１〜９のいずれかに記載の薬剤、または
−請求項１０に記載の抗体構築物、または
−請求項１６または１７のいずれかに記載のペプチド、または
−配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または
−配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または
−配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）。
【請求項１９】
癌の治療に使用するための、
−請求項１〜９のいずれかに記載の薬剤、または
−請求項１０に記載の抗体構築物、または
−請求項１６または１７のいずれかに記載のペプチド、または
−配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または
−配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または
−配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）。
【請求項２０】
被験体における癌を診断し、および／または予後診断し、および／または層別化するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）請求項１〜９のいずれかに記載の薬剤または請求項１０に記載の抗体構築物と、前記被験体からの生体サンプルとを接触させることと；
（ｉｉ）前記サンプルに結合していない前記薬剤または抗体構築物を分離することと；
（ｉｉｉ）前記生体サンプル中、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルを検出し、および／または定量化することと；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で検出された、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルと、リファレンス値のレベルとを比較することと；
（ｖ）得られた結果と、前記癌の存在および／または臨床転帰および／またはステージとを関連づけることとを含む、方法。
【請求項２１】
前記癌が、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌である、請求項１９に記載の使用するための薬剤、または抗体構築物、またはペプチド、またはポリペプチド、または請求項２０に記載の診断および／または予後診断および／または層別化のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２２】
前記ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌が、メラノーマ、乳癌、または消化器癌である、使用するための薬剤、または抗体構築物、またはペプチド、またはポリペプチド、または請求項２１に記載の診断および／または予後診断および／または層別化のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２３】
前記消化器癌が、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌および食道癌腫からなる群から選択される、使用するための薬剤、または抗体構築物、またはペプチド、またはポリペプチド、または請求項２２に記載の診断および／または予後診断および／または層別化のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２４】
前記癌が転移性である、請求項１９または２１〜２３のいずれかに記載の使用するための薬剤、または抗体構築物、またはペプチド、またはポリペプチド、または請求項２０〜２３のいずれかに記載の診断および／または予後診断および／または層別化のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２５】
治療有効量の
−請求項１〜９のいずれかに記載の薬剤、または
−請求項１０に記載の抗体構築物、または
−請求項１６または１７のいずれかに記載のペプチド、または
−配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または
−配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または
−配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）を、医薬的に許容され得る補形薬または担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項２６】
ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌のマーカーとしての、ヒトカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の残基６０３〜６０５を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン５（ＣＤＨ５）の残基２３６〜２３８または残基２９９〜３０１を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン６（ＣＤＨ６）の残基８３〜８５を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン２０（ＣＤＨ２０）の残基８９〜９１を含むエピトープの使用。
【請求項２７】
ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌の転移のマーカーとしての、ヒトカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の残基６０３〜６０５を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン５（ＣＤＨ５）の残基２３６〜２３８または残基２９９〜３０１を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン６（ＣＤＨ６）の残基８３〜８５を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン２０（ＣＤＨ２０）の残基８９〜９１を含むエピトープの使用。
【請求項２８】
前記ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌が、メラノーマ、乳癌、または消化器癌である、請求項２６および２７のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
前記消化器癌が、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌および食道癌腫からなる群から選択される、請求項２８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療の分野に関する。特に、本発明は、ヒトカドヘリン−１７、ヒトカドヘリン−５、ヒトカドヘリン−６および／またはヒトカドヘリン−２０に特異的に結合する薬剤、および当該薬剤についての方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）は、肝臓−腸カドヘリン（ＬＩ−カドヘリン）としても知られており、非古典的な７Ｄ−ドメインカドヘリンである。その配列は、７個の細胞外ドメインと、非常に短い細胞質内ドメインとによって形成されている。ＣＤＨ１７は、胎児の肝臓および胃腸管に存在し、胚形成中に発現亢進を示す。その遺伝子は、成人の健康な肝臓および消化管では抑制される。しかし、ＣＤＨ１７は、胃癌、食道癌腫、膵臓癌および肝臓癌腫中で再び発現する。原発性の結腸癌腫瘍、低分化型腫瘍およびリンパ節において、ＣＤＨ１７は、低レベルに発現する。
【０００３】
大腸癌患者からの腫瘍サンプルのうち、９０％より多いサンプルが、カドヘリン−１７（ＣＤＨ１７）の発現を示す。ＣＤＨ１７の発現が高いことと、肝転移および患者の生存率が悪いこととに顕著な関連がある。ＣＤＨ１７の発現は、転移がある患者では増加しており、予後診断が悪いことと相関があり、このことは、ＣＤＨ１７の発現と、転移末期中の最終的な肝臓コロニー化との関係を示唆している。
【０００４】
ＣＤＨ１７の発現は、高転移性のＫＭ１２ＳＭ結腸癌細胞中で増加する。これらの細胞における細胞膜タンパク質の網羅的なプロテオーム解析から、α２、α６、αｖ、β１およびβ４の５種類のインテグリンサブユニットのみが検出された。上皮結腸癌細胞において、数種類のβ６インテグリン構築物を除き、他のインテグリンの発現は記述されていない。ＣＤＨ１７は、大腸癌細胞中で、タンパク質の中でも特にα２β１インテグリンおよびα６β４インテグリンを含む大きなタンパク質複合体の一部であった。α６β４インテグリンは、この複合体中に存在するが、α２β１との相互作用のみがインテグリンシグナル伝達経路の引き金となり、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、Ｒａｓ、ＥＲＫ１／２およびサイクリンＤ１の活性化を引き起こし、細胞の接着および増殖を増大させた。α２インテグリンが、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）のＩＶ型コラーゲン依存性活性化に介在し、選択的な肝転移に介在することが記載されている。
【０００５】
Ｌｉｎら（２０１４、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ８５２９６）は、ＣＤＨ１７のノックダウンが、細胞の増殖、遊走、接着およびコロニー形成を阻害し、ＡＧＳヒトＧＣ細胞における細胞周期停止およびアポトーシスも誘発することを記載した。これらの結果は、ＣＤＨ１７がＧＣにおける細胞増殖のためのＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の活性化を制御する能力を示しており、ＣＤＨ１７が将来の研究のための魅力的な治療標的として役立つ可能性を示唆している。
【０００６】
Ｗａｎｇら（２０１４、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ７２３８６）は、ＨＣＣにおいてＣＤＨ１７抗原を標的とするモノクローナル抗体（Ｌｉｃ５）の潜在的な治療可能性について調べた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、Ｌｉｃ５が、用量に依存する様式でＣＤＨ１７発現を顕著に減少させ、β−カテニンシグナル伝達を抑制し、ＨＣＣ細胞においてアポトーシスにかかわる酵素であるカスパーゼ−８およびカスパーゼ−９の開裂を誘発し得ることを示した。皮下ＨＣＣ異種移植モデルにおける動物の治療は、Ｌｉｃ５抗体のみを用いて、または従来の化学療法による治療計画と組み合わせて、顕著な腫瘍成長阻害を同様に示した。
【０００７】
ＣＤＨ１７を発現する腫瘍を標的とする数少ない治療はあるものの、ＣＤＨ１７を発現する細胞を伴う癌の診断、予後診断および／または治療に適したＣＤＨ１７を特異的に認識する薬剤を提供することが当該技術分野において依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、ヒト７Ｄ−カドヘリン（ＣＤＨ１７）が、インテグリン結合の新しいリガンドとして作用する能力を有するＲＧＤ部位を含むことを発見した。この結論は、以下の観察から得られた。（ｉ）ＣＤＨ１７とα２β１インテグリンの相互作用が、ＲＧＤ結合部位の存在を必要としたこと（実施例２）、（ｉｉ）このＲＧＤモチーフが、結腸癌細胞中のα２β１インテグリンに特異的に結合する能力は、ｓｉＲＮＡ実験を含むさまざまな結合アッセイおよび細胞接着アッセイによって裏付けられたこと（実施例３）、（ｉｉｉ）ＣＤＨ１７−ＲＧＤエクトドメインは、結腸癌細胞と結合し、外部から加えたときにβ１インテグリンを活性化することができたこと（実施例３）、（ｉｖ）ｉｎ  ｖｉｖｏ接種の後、変異ＣＤＨ１７  ＲＡＤを発現する腫瘍細胞は、腫瘍の成長と肝臓コロニー化の大幅な遅れを示したこと（実施例６）。まとめると、ＲＧＤは、結腸癌の転移性細胞においてインテグリンの活性化を制御するスイッチとして働く。さらに、本発明者らは、ＣＤＨ１７のＲＧＤモチーフに特異的に結合する一連の薬剤と、α２β１インテグリンとの相互作用という点でＣＤＨ１７と競争するペプチドを作製した。本発明者らは、他のカドヘリン、例えば、ＣＤＨ５およびＣＤＨ６の中にもＲＧＤモチーフが存在することも観察し、この観察結果に基づき、本発明者らは、これらのカドヘリン中のＲＧＤモチーフに特異的に結合する薬剤についても作製した。
【０００９】
したがって、ある態様において、本発明は、薬剤であって、ヒトカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン５（ＣＤＨ５）の残基２３６〜２３８または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン６（ＣＤＨ６）の残基８３〜８５を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン２０（ＣＤＨ２０）の残基８９〜９１を含むエピトープに特異的に結合し、前記薬剤が、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディおよびアンチカリンからなる群から選択される免疫グロブリン薬剤または非免疫グロブリン薬剤である、薬剤に関する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、抗体構築物であって、本発明の抗原結合フラグメントを含み、この抗体構築物は、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ、（ｓｃＦｖ）２およびダイアボディからなる群から選択される、抗体構築物に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、
（ａ）本発明の薬剤または本発明の抗体構築物をコードする核酸、および
（ｂ）（ａ）に定義される核酸の相補的核酸からなる群から選択される核酸に関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸を含む発現カセットに関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸または発現カセットを含むベクターに関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸、または本発明の発現カセット、または本発明のベクターを含む細胞に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６で寄託されたリファレンスＰＡ３８３−２５．４．１を含むハイブリドーマ細胞株に関する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、ＬＲＧＤＴ（配列番号１４）、ＬＲＧＤＳ（配列番号１５）、ＬＲＧＤＹ（配列番号１６）、ＤＲＧＤＧ（配列番号１７）または前記配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するこれらの改変体からなる群から選択される配列ＲＧＤを含むペプチドに関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための、本発明の薬剤、または本発明の抗体構築物、または本発明のペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）に関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、癌の治療に使用するための、本発明の薬剤、または本発明の抗体構築物、または本発明のペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）に関する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、被験体における癌を診断し、および／または予後診断し、および／または層別化するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）本発明の薬剤または抗体構築物と、前記被験体からの生体サンプルとを接触させることと；
（ｉｉ）前記サンプルに結合していない前記薬剤または抗体構築物を分離することと；
（ｉｉｉ）前記生体サンプル中、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルを検出し、および／または定量化することと；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で検出された、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルと、リファレンス値のレベルとを比較することと；
（ｖ）得られた結果と、前記癌の存在および／または臨床転帰および／またはステージとを関連づけることとを含む、方法に関する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、治療有効量の本発明の薬剤、または本発明の抗体構築物、または本発明のペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）を、医薬的に許容され得る補形薬または担体と共に含む、医薬組成物に関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌のマーカーとしての、ヒトカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の残基６０３〜６０５を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン５（ＣＤＨ５）の残基２３６〜２３８または残基２９９〜３０１を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン６（ＣＤＨ６）の残基８３〜８５を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン２０（ＣＤＨ２０）の残基８９〜９１を含むエピトープの使用に関する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌の転移のマーカーとしての、ヒトカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の残基６０３〜６０５を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン５（ＣＤＨ５）の残基２３６〜２３８または残基２９９〜３０１を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン６（ＣＤＨ６）の残基８３〜８５を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン２０（ＣＤＨ２０）の残基８９〜９１を含むエピトープの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】カドヘリンタンパク質ファミリーの配列分析から、数種類のカドヘリンの中のＲＧＤモチーフが判明している。（Ａ）ＲＧＤモチーフ（右）と、このモチーフのフランキング配列（左）を含む５種類のカドヘリンの構造。（Ｂ）ウェスタンブロット（ＣＤＨ５、ＣＤＨ１６）またはＰＣＲ増幅アッセイ（ＣＤＨ６、ＣＤＨ２０）によって、ＫＭ１２ＳＭ細胞およびＲＫＯ細胞においてＣＤＨ１６、ＣＤＨ６、ＣＤＨ２０は検出されず、ＣＤＨ５はわずかに検出された。ポジティブコントロールとして、本発明者らは、乳癌（ＭＣＦ７）、淡明細胞型腎細胞癌（７８６−Ｏ）、ＳＫ−ＭＥＬ−１０３およびＡ３７５メラノーマの細胞株を使用した。
【図１Ｂ】図１Ａ参照。
【図２Ａ−Ｃ】細胞の接着および増殖の増加には、ＣＤＨ１７ＲＧＤの存在が必要である。（Ａ、Ｂ）ＲＫＯ細胞およびＫＭ１２ＳＭ細胞を、ＣＤＨ１７−野生型（ＣＤＨ１７  ｗｔ）、変異形態（ＣＤＨ１７  ＲＡＤ）または空のベクター（Ｍｏｃｋ）をコードするベクターでトランスフェクトした。トランスフェクタントをウェスタンブロット（Ａ）またはフローサイトメトリー（Ｂ）によって分析し、全溶解液および細胞膜におけるＣＤＨ１７の発現をそれぞれ評価した。（Ｃ）ＲＫＯトランスフェクタントに細胞凝集アッセイを行った。凝集物を形成する細胞の代表的な写真および定量化が示される。
【図２Ｄ−Ｇ】（Ｄ）コラーゲンＩＶ型またはＭａｔｒｉｇｅｌ上で、トランスフェクタントに細胞接着アッセイを行った。ＣＤＨ１７野生型の過剰発現によって接着が顕著に向上したか、または内因性ＣＤＨ１７のサイレンシングによって減少した。（＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。（Ｅ）ＫＭ１２ＳＭトランスフェクタントに、Ｍａｔｒｉｇｅｌに対する細胞接着アッセイを行った。細胞接着は、示されているタンパク質のサイレンシングによって顕著に阻害された。＊＊＊ｐ＜０．００１。）（Ｆ）ＲＫＯおよびＫＭ１２ＳＭを、示されたインテグリンサブユニットのためにｓｉＲＮＡを用いて、またはコントロールｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクタントを溶解させ、抽出物をイムノブロット法によって分析し、発現における干渉を評価した。抗−ＲｈｏＧＤＩをローディングコントロールとして使用した。（Ｇ）トランスフェクタントを０．５％血清中で４８時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイを行った。細胞増殖は、ＣＤＨ１７  ｗｔの過剰発現によって顕著に増加した（＊＊、ｐ＜０．０１）。
【図３Ａ−Ｃ】ＣＤＨ１７ＲＧＤモチーフは、α２β１インテグリンのリガンドである。（Ａ）固定されたＣＤＨ１７  ＤＯＭ６  ｗｔに対するα２β１インテグリンの結合。ＫＭ１２ＳＭ細胞を溶解させ、アガロースに結合させたＣＤＨ１７  ＤＯＭ６  ｗｔの１ｍＬカラムにロードした。広範囲にわたって洗浄した後、カラムをＲＧＤＳペプチドを用いて溶出させた。フラクション（１ｍＬ）を析出させ、抗−α２および抗−β１のインテグリン抗体を用いたウェスタンブロットを行った。ＲＧＤＳの溶出は、フラクション番号７で始まった。（Ｂ）ＣＤＨ１７  ｗｔ、ＣＤＨ１７  ＲＡＤまたは空のベクター（Ｍｏｃｋ）をコードするベクターでトランスフェクトしたＲＫＯ細胞を溶解させ、抗−α２インテグリンまたは抗−ＣＤＨ１７抗体を用いて免疫沈降を行い、示される抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。（Ｃ）ＲＫＯ細胞およびＫＭ１２ＳＭ細胞におけるαｖインテグリンの発現をウェスタンブロット（左）および抗−αｖインテグリン、抗−ＣＤＨ１７またはコントロール抗体を用いた免疫沈降アッセイによって検出し、このインテグリンサブユニットとＣＤＨ１７との関係がないことを示している（右）。
【図３Ｄ−Ｅ】（Ｄ）クマシンブルーで染色したポリアクリルアミドゲルは、精製されたエクトドメインの発現（Ｅｃｄ、左）、または野生型（ｗｔ）またはＲＧＤモチーフを欠いた変異（ＲＡＤ）のＣＤＨ１７の精製されたドメイン６の発現（ＤＯＭ６、右）を示している。（Ｅ）ＣＤＨ１７エクトドメインをリガンドとして用いた可溶性結合アッセイ。フローサイトメトリーは、野生型エクトドメインと共にインキュベートした後、このタンパク質フラグメントが細胞表面に結合することを示した。平均蛍光強度は、それぞれのパネルで示される。
【図３Ｆ】（Ｆ）示されるインテグリンサブユニットのために抑制された細胞における、ＣＤＨ１７エクトドメインをリガンドとして使用する可溶性結合アッセイ。平均蛍光強度は、ＣＤＨ１７  Ｅｃｔ  ｗｔおよびＲＡＤの両方について示される。
【図４ＡＢ】ＣＤＨ１７のＲＧＤモチーフは、細胞接着に介在することができる。（Ａ）ＲＫＯ細胞およびＫＭ１２ＳＭ細胞に、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２存在下、異なる濃度のＣＤＨ１７−ＤＯＭ６  ｗｔまたはＣＤＨ１７−ＤＯＭ６  ＲＡＤでコーティングされたプレート中で細胞接着アッセイを行った。コーティングされていないプレートと比較して、ＣＤＨ１７−ＤＯＭ６  ｗｔでコーティングされたプレートまたはＣＤＨ１７−ＤＯＭ６−ＲＡＤでコーティングされたプレートにおいて、接着は顕著に増えた（＊＊、ｐ＜０．０１）。（Ｂ）ＲＧＤＳ、ＲＡＤＳペプチドｓまたは抗−β１インテグリンブロッキング抗体存在下、ＣＤＨ１７  ＤＯＭ６  ｗｔに対する細胞接着アッセイを行った。接着は、ペプチドまたは抗体の添加によって、有意に阻害された（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図４Ｃ】（Ｃ）示されるインテグリンサブユニットについて抑制された細胞を用いる、ＣＤＨ１７  ＤＯＭ６  ｗｔに対する細胞接着アッセイ。示されるインテグリンサブユニットの抑制によって、接着が有意に阻害された（＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図５ＡＢ】ＲＧＤは、β１インテグリン活性化およびマトリゲルへの細胞接着を高める。（Ａ）ＣＤＨ１７  ｗｔまたはＲＡＤをコードするベクターを用いて、または空のベクター（ｍｏｃｋ）を用いて、ＲＫＯ細胞およびＫＭ１２ＳＭ細胞をトランスフェクトし、高アフィニティ構造でβ１インテグリンを認識するＨＵＴＳ２１抗体を用いて、またはコントロール抗体を用いて、フローサイトメトリーアッセイを行った。それぞれのパネルの中に、平均蛍光強度が示される。（Ｂ）ＲＫＯ細胞およびＫＭ１２ＳＭ細胞をＣＤＨ１７のＤＯＭ６（２μｇ／ｍＬ）またはＥｃｄ（１０μｇ／ｍＬ）（ｗｔまたはＲＡＤ）または培地に４５分間さらし、Ａと同様に、ＨＵＴＳ２１抗体またはコントロール抗体を用いてフローサイトメトリーアッセイを行った。
【図５ＣＤ】（Ｃ）ＲＫＯ細胞およびＫＭ１２ＳＭ細胞を、配列にＲＧＤモチーフと、ＣＤＨ５、ＣＤＨ１６およびＣＤＨ１７に属するフランキングアミノ酸を含む９アミノ酸ペプチド（０．５μｇ／ｍＬ）に４５分間さらし、Ａと同様にフローサイトメトリーアッセイを行った。（Ｄ）ＣＤＨ１７  ＤＯＭ６またはＥｃｄ（ｗｔまたはＲＡＤ）を用いたインキュベートの後、細胞を集め、マトリゲルに対する細胞接着アッセイを行った。ＣＤＨ１７  ＤＯＭ６  ｗｔまたはＥｃｄ  ＲＡＤと共にインキュベートすることによって、接着は有意に高まった（＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図６】ＲＧＤモチーフは、腫瘍の成長と転移性の播種にとって重要である。（Ａ）ＣＤＨ１７  ｗｔ、ＣＤＨ１７  ＲＡＤまたは空のベクター（Ｍｏｃｋ）をコードするベクターを用いてトランスフェクトしたＲＫＯ細胞およびＫＭ１２ＳＭ細胞を用い、Ｓｗｉｓｓヌードマウスに脾臓内接種した。ヒトＧＡＰＤＨは、接種から２４時間後に肝臓から単離されたＲＮＡから増幅されたＲＴ−ＰＣＲであった。マウスβ−アクチンの増幅をコントロールとして使用した。（Ｂ）同じトランスフェクタントを皮下接種した。（上側）１０日後に成長した腫瘍の代表的な写真。（下側）１０日後の腫瘍の重さは、ＣＤＨ１７  ｗｔを発現する細胞において、有意に増加した（＊、ｐ＜０．０５）。
【図７Ａ−Ｃ】ＣＤＨ１７発現は、膵臓癌細胞において、細胞の接着と増殖を促進する。（Ａ）ヒト膵臓癌サンプル（ｎ＝４８）におけるＣＤＨ１７発現の免疫組織染色分析。強い染色、中程度の染色または陰性の染色の代表的な画像を示しており、それぞれの分類における割合を示している。（Ｂ）ＢｘＰｃ３、Ｃａｐａｎ−１およびＰＡＮＣ−１を、ＣＤＨ１７  ｗｔ、ＣＤＨ１７  ＲＡＤまたは空のベクター（Ｍｏｃｋ）をコードするベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクタントを溶解させ、抽出物にウェスタンブロット分析を行い、ＣＤＨ１７の過剰発現を確認した。（Ｃ）トランスフェクタントに、マトリゲルに対する細胞接着アッセイを行った。ＣＤＨ１７  ｗｔの過剰発現によって、接着が有意に高まった（＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図７Ｄ】（Ｄ）トランスフェクタントを、０．５％血清中、２４時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイを行った。ＣＤＨ１７  ｗｔの過剰発現によって、細胞の増殖が有意に高まった（＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。コントロールとして、細胞のフラクションに時間点０でＭＴＴアッセイを行った。
【図８ＡＢ】ＣＤＨ１７とα２β１インテグリンの相互作用のための提案されたモデル。（Ａ、Ｂ）連続した細胞のＣＤＨ１７（Ａ）または可溶性ＣＤＨ１７エクトドメイン（Ｂ）は、ＩＶ型コラーゲンに対するα２β１インテグリンの結合を調整することができる。（Ｃ）ＫＭ１２ＳＭからの２４時間馴化した培地を集め、濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解像し、トリプシンを用いて「ゲル中で」消化した。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計を用いてマススペクトルを獲得し、ＭＡＳＣＯＴサーチエンジンを用い、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに対してファイルをサーチした。ＣＤＨ１７に対するペプチドは、ＣＤＨ１７の配列で赤色にされている（右）。全ての検出されたペプチドは、ＣＤＨ１７のエクトドメイン（ドメイン１〜７）に属する（左）。エクトドメインの３２％は、プロテオーム解析によって検出された。
【図８Ｃ】図８ＡＢ参照。
【図９】β１インテグリン活性化を阻害する能力について、異なる抗体を試験する。異なる抗体（ＣＤＨ１７のドメイン６に対する市販の抗体、ＣＤＨ１７  ＲＧＤペプチドに対するモノクローナル抗体からの上清およびＲＧＤペプチドに対する血清）による、ＣＤＨ１７  ＲＧＤペプチドによって誘発されるβ１インテグリン活性化の阻害をＲＫＯ細胞で試験した。
【図１０】細胞増殖を停止させる能力について、図１０と同じ抗体を試験した。異なる抗体（ＣＤＨ１７のドメイン６に対する市販の抗体、ＣＤＨ１７のドメイン６に対するモノクローナル抗体からの上清およびＲＧＤペプチドに対する血清）による細胞成長の阻害をＫＭ１２ＳＭ細胞で試験した。
【図１１】ＲＫＯ細胞中、ＣＤＨ１７  ＲＧＤペプチドによって誘発されるβ１インテグリン活性化における阻害能力について、異なるハイブリドーマクローン抗ＲＧＤペプチドの初期の試験。
【図１２】ＲＫＯ細胞中、ＣＤＨ１７  ＲＧＤペプチドによって誘発されるβ１インテグリン活性化における阻害能力について、異なるハイブリドーマクローン抗ＲＧＤペプチドの第２の試験。
【図１３】β１インテグリン活性化に対する精製されたモノクローナル抗体の最後の試験。Ｍａｂ  ２５．４．１は、β１インテグリンの活性化を完全に阻害する（１００％）能力を示し、次いで、６．６．１（９０％）、１２．４．１（７０％）および６．５．２（＜６０％）であった。
【図１４】細胞接着に対する精製されたモノクローナル抗体の最後の試験。ｍＡｂを用いて得られる結果は、β１インテグリンの活性化に対し、同じ順番に従うが、逆であった。Ｍａｂ  ２５．４．１は、細胞接着に対する大きな阻害を引き起こし、次いで、他の３種類のｍＡｂは同じ順序であった。
【図１５】細胞増殖に対する精製されたモノクローナル抗体の最後の試験。Ｍａｂ  １２．４．１は、細胞増殖の低下において最も効果的であり、次いで、６．５．２、２５．４．１および６．６．１であった。
【図１６】カドヘリンＲＧＤモチーフ（ＣＤＨ１６由来のものを除く）は、β１−インテグリンの活性化を促進した。
【図１７】ＣＤＨ１７のＲＧＤモチーフに対するモノクローナル抗体は、ＣＤＨ５のＲＧＤペプチドによって、また、もっと短いＣＤＨ１７のＲＧＤペプチドによって誘発されるβ１−インテグリンの活性化を阻害した。
【図１８】メラノーマおよび乳癌の細胞株におけるＣＤＨ５の発現。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本明細書で使用される場合、「薬剤」または「結合薬剤」との用語は、区別せずに使用され、その同系の標的に特異的に結合する能力を有する分子を指し、他の分子への結合をほとんど示さないか、または全く示さない。一般的に、ある薬剤がその同系の標的に対する高いアフィニティを有し、他の分子には低いアフィニティを有すると考えられる。本発明との関連において、薬剤は、免疫グロブリン薬剤または非免疫グロブリン薬剤であってもよい。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン薬剤」との用語は、免疫グロブリンのドメインまたはフォールドに基づく構造を有するポリペプチド結合薬剤を指す。免疫グロブリンのドメインまたはフォールドを有するタンパク質には、免疫系の細胞表面抗原受容体、補助受容体および共刺激分子、リンパ球に対する抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、特定のサイトカイン受容体および細胞内筋タンパク質が含まれる。特に、本発明は、抗体または前記抗体の抗原結合フラグメントから選択される免疫グロブリン薬剤に関する。
【００２６】
「抗体」との用語は、本明細書で使用される場合、「抗原」と呼ばれる特定のタンパク質への特異的な結合活性を示す糖タンパク質を指す。「抗体」との用語は、全モノクローナル抗体または全ポリクローナル抗体、またはこれらのフラグメントを含み、ヒト抗体、抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト由来の抗体、例えば、マウス抗体、ラクダ抗体および免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）を含む。「モノクローナル抗体」は、１個の部位または抗原「決定基」に指向する特異性の高い均一な抗体の集合である。「ポリクローナル抗体」は、異なる抗原決定基に指向する不均一な抗体の集合を含む。抗体は、任意のアイソタイプであってもよい。アイソタイプの選択は、典型的には、ＡＤＣＣ誘発のような望ましいエフェクター機能によって導かれるだろう。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。
【００２７】
ある抗体の基本的な構造単位は、テトラマーを含むことがよく知られている。それぞれのテトラマーは、２つの同一なポリペプチド鎖の対で構成されており、それぞれが軽鎖（２５ＫＤａ）および重鎖（５０〜７５ＫＤａ）で構成されている。それぞれの鎖のアミノ酸末端領域は、約１００〜１１０、またはもっと多くのアミノ酸を含む可変領域を含み、この領域は、抗原認識に関与する。それぞれの鎖のカルボキシ末端領域は、エフェクター機能に介在する定常領域を含む。軽鎖および重鎖のそれぞれの対の可変領域は、抗体の結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗体は、２つの結合部位を有する。軽鎖は、κまたはλに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δおよびεに分類され、これらは、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥと規定する。
【００２８】
軽鎖および重鎖のそれぞれの対の可変領域は、抗体の結合部位を形成する。これらの可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３個の高頻度可変性の領域に接続するフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存された領域によって構築される同じ一般的な構造によって特徴付けられる。「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、そのタンパク質が抗原の形状と相補的な形状をした抗体内の領域を指す。したがって、ＣＤＲは、特定の抗原に対するそのタンパク質のアフィニティ（大雑把にいうと、結合強度）および特異性を決定付ける。それぞれの対の２つの鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列しており、特定のエピトープに結合する機能を獲得している。その結果、重鎖および軽鎖は両方とも、３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３によって特徴付けられる。
【００２９】
「ヒト化抗体」とは、親抗体の抗原結合特性を保持しているが、ヒトにおける免疫原性がほとんどない非ヒト抗体（典型的には、マウス抗体）から誘導される抗体を意味する。非ヒト抗体は、（ａ）ヒト定常領域に非ヒト可変領域全体を接合し、キメラ抗体を作製する；（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持しつつ、または保持せずに、ヒトのフレームワーク領域および定常領域に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを接合する；（ｃ）非ヒト可変領域全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様の部位を「クローキング」することを含む、種々の方法によって得られてもよい。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において記載されてきている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と呼ばれることが多く、典型的には、「インポート」可変領域から取られる。抗原に対する高いアフィニティと他の望ましい生体特性を保持しつつ、抗体がヒト化されていることがさらに重要である。この目的を達成するために、親配列の分析工程と、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた種々の概念的なヒト化産物によって、ヒト化抗体が調製される。ヒトによく似た抗体を製造するためのこの手法のさらなるアプローチは、いわゆる霊長類化抗体、すなわち、サル（または他の霊長類）抗体、特に、カニクイザル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含むように操作され、ヒト定常領域の配列、好ましくは、ヒト免疫グロブリンガンマ１またはガンマ４の定常領域（またはＰＥ改変体）を含む組換え抗体を調製することである。
【００３０】
「ヒト抗体」とは、既知のいずれかの標準的な方法によって作られるヒトの軽鎖および重鎖と定常領域を全体的に含む抗体を意味する。
【００３１】
「マウス抗体」とは、既知のいずれかの標準的な方法によって作られるマウスの軽鎖および重鎖と定常領域を全体的に含む抗体を意味する。
【００３２】
「ハイブリドーマ」との用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体を産生するＢ細胞と、組織培養物中で成長する能力と、抗体鎖の合成がないことについて選択される骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞とを融合することによって形成されるハイブリッド細胞株を指す。ハイブリドーマによって作られる抗体は、通常、単一の特異性を有するため、モノクローナル抗体である（ポリクローナル抗体とは対照的）。
【００３３】
「抗体フラグメント」との用語は、本明細書で使用される場合、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’フラグメントといった抗体のフラグメントを指す。抗体フラグメント製造のために種々の技術が開発されてきた。従来から、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解を介して誘導されていたが、さらに近年、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞によって直接的に製造することができる。抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一な抗原結合フラグメントが生成し、それぞれが単一の抗原−結合部位と、残りの「Ｆｃ」フラグメントを有し、この名前は、容易に結晶化する能力を反映したものである。ペプシン処理によって、２つの抗原−結合部位を有し、依然として抗原に架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、密な非共有会合における１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域のダイマーからなる。この構造において、それぞれの可変領域の３個の高頻度可変性領域が相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面の抗原結合部位を規定する。まとめると、６個のＣＤＲが、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、１個の可変領域（つまり、ある抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識し、結合する能力を有するが、結合部位全体よりもアフィニティが低い。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常領域および重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加という点で、Ｆａｂフラグメントとは異なる。
【００３４】
「抗体構築物」という用語は、本明細書で使用される場合、典型的には遺伝子操作技術によって作られる抗体結合領域に基づく構築物を指す。抗体構築物の例としては、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ、（ｓｃＦｖ）２およびダイアボディが挙げられる。これらの抗体構築物および他の抗体構築物は、Ｃｕｅｓｔａら、２０１０（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：３５５−６２）にまとめられており、これは参照することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００３５】
「重鎖抗体」との用語は、本明細書で使用される場合、２個の重鎖のみからなり、抗体中に通常みられる２個の軽鎖がない抗体を指す。重鎖抗体の例としては、軟骨魚類（例えばサメ）の免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ラクダ（例えば、ヒトコブラクダ、キャメル、ラマおよびアルパカ）で発現するラクダ抗体が挙げられる。ＩｇＮＡＲは、鎖あたり、通常の３個ではなく、５個の定常領域（ＣＨ）を有し、通常とは異なる位置にいくつかのジスルフィド結合を有し、ＣＤＲ３が、他の抗体において軽鎖に結合する部位を覆う長く延びたループを形成している。ラクダ抗体の重鎖は、これらの定常領域の１つ（ＣＨ１）を欠いており、可変領域（ＶＨ）に改変を受けており、この両方の構造要素は、軽鎖の結合に必須である。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「非免疫グロブリン薬剤」との用語は、異なる分子の性質、トポロジーまたは足場に基づく、免疫グロブリン以外の結合薬剤を指す。足場との用語は、通常は、特定の標的に結合するために、タンパク質改変体に異なる機能を与える改変されたアミノ酸または配列の挿入を有し得るタンパク質の骨格を記載することを意味している。このような非免疫グロブリン薬剤の例は、当該技術分野においてよく知られており、限定されないが、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディおよびアンチカリンが挙げられる。ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アンチカリンおよび他のタンパク質の足場は、Ｂｉｎｚら、２００５（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１２５７−６８）にまとめられており、参照することにより本明細書の開示の一部とされる。「ペプチドアプタマー」との用語は、タンパク質の足場に両端で接続し、特異的な標的分子に結合する短い可変ペプチド領域を指す。可変ループの長さは、典型的には、１０〜２０アミノ酸で構成され、足場は、良好な溶解度とコンパクトさといった特性を有する任意のタンパク質であってもよい。現在、細菌のタンパク質であるチオレドキシン−Ａは、最も使用されている足場タンパク質であり、この可変ループは、還元活性部位の中に挿入され、野生型タンパク質ではＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓループ（配列番号３０）であり、２つのＣｙｓ側鎖は、ジスルフィド架橋を形成することができる。「核酸アプタマー」または「ＤＮＡアプタマー」との用語は、本明細書で使用される場合、特定の分子標的に結合するための何回も繰り返される選択によって操作されたＤＮＡの短い鎖を指す。
【００３７】
「核酸」との用語は、本明細書で使用される場合、ホスホジエステル結合によって接続するヌクレオチドと呼ばれるモノマーの繰り返しによって形成されるポリマーを指す。この用語は、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含む。
【００３８】
「直鎖ペプチド」との用語は、本明細書で使用される場合、３〜２０個のアミノ酸を含み、アミノ末端およびカルボキシル末端の遊離末端を有し、直鎖のペプチドを指す。
【００３９】
「環状ペプチド」との用語は、本明細書で使用される場合、３〜２０個のアミノ酸を含み、ペプチドの骨格または側鎖のいずれかで環化によって拘束されるペプチドを指す。
【００４０】
「分岐ペプチド」との用語は、本明細書で使用される場合、３〜２０個のアミノ酸を含み、少なくともイソペプチド結合を含むペプチドを指す。「イソペプチド結合」は、ペプチドの主鎖には存在しないアミド結合であり、これにより、さらなる「分岐した」ペプチド鎖を形成する。
【００４１】
２つ以上のＣＤＲ配列、ペプチドまたはポリペプチドという観点で「同一で」または「同一性パーセント」との用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せず、最大一致性（ｍａｘｉｍｕｍ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）のために比較し、アラインメントさせた（必要な場合にはギャップを導入する）とき、同じであるか、または特定の割合で同じアミノ酸残基を含む２つ以上の配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアまたはアルゴリズムを用いて、または視覚観察によって測定することができる。種々のアルゴリズムおよびソフトウェアは、当該技術分野において知られており、これを使用し、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを得ることができる。このような配列アラインメントアルゴリズムの非限定的な一例は、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれたアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２）。特定の実施形態において、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用してもよい。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は、さらなる公的に利用可能なソフトウェアプログラムであり、これを使用し、配列をアラインメントすることができる。特定の実施形態において、２個のヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアのＧＡＰプログラムを用いて決定される（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよびギャップ重み付け４０、５０、６０、７０、または９０、長さ重み付け１、２、３、４、５、または６を用いる）。特定の代替的な実施形態において、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用し、２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定することができる（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、ギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、または４と、長さ重み付け１、２、３、４、５を用いる）。または、特定の実施形態において、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムを用いて決定される（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７（１９８９））。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を用い、ＰＡＭ１２０と、残基表、ギャップ長さのペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いて決定することができる。特定のアラインメントソフトウェアによる最大アラインメントに適したパラメーターは、当業者が決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメーターが使用される。特定の実施形態において、第２のアミノ酸配列に対する第１のアミノ酸配列の同一性パーセント「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として算出され、ここで、Ｙは、第１の配列および第２の配列のアラインメントで同一マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり（視覚観察または特定の配列アラインメントプログラムによってアラ��ンメントされる）、Ｚは、第２の配列中の残基の合計数である。第２の配列が第１の配列より長い場合、同一性パーセントは、前記第１の配列と第２の配列のオーバーラップ領域でのみ決定されてもよい。この場合には、上と同じ式を使用してもよいが、Ｚ値として、第１の配列と第２の配列がオーバーラップする領域の長さを使用し、前記領域は、第１の配列の長さと実質的に同じ長さを有する。
【００４２】
非限定的な例として、任意の特定のポリヌクレオチドが、リファレンス配列に対し、特定の配列同一性パーセントを有する（例えば、少なくとも７０％同一である、少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、ある実施形態において、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）かどうかは、特定の実施形態において、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１１）を用いて決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２  ４８９（１９８１）の局所的なホモロジーアルゴリズムを使用し、２つの配列間のホモロジーが最良のセグメントを発見する。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用い、特定の配列が、例えば、本発明のリファレンス配列に対して９５％同一であるかどうかを決定するとき、パラメーターは、同一性パーセントが、リファレンスアミノ酸配列の全長にわたって計算され、リファレンス配列の中の合計アミノ酸数の５％までのホモロジーにおけるギャップが許容されるように設定される。
【００４３】
ある実施形態において、本発明の２つのＣＤＲ配列、ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に同一であり、これは、配列比較アルゴリズムを用いて、または視覚観察によって測定した場合、最大一致性のために比較し、アラインメントしたとき、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、ある実施形態において、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸残基同一性を有することを意味する。同一性は、長さまたはその間の積算値が少なくとも約３、約４、約５、約１０、約２０、約４０〜６０残基である配列のある領域にわたって存在してもよく、６０〜８０残基、例えば、少なくとも約９０〜１００残基より長い領域にわたっていてもよく、ある実施形態において、配列は、比較される配列の全長にわたって実質的に同一である。
【００４４】
「エピトープ」という用語は、抗原決定基としても知られ、免疫系によって、具体的には、抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞によって認識される抗原の一部を指すが、本発明との関連において、この概念は、非免疫グロブリン結合薬剤による認識にも拡張される。例えば、エピトープは、抗体に結合する抗原の特異的な部分である。
【００４５】
「カドヘリン１７」または「ＣＤＨ−１７」または「ＣＤＨ１７」という用語は、本明細書で使用される場合、７個のカドヘリンドメインおよび膜貫通領域を含む細胞外領域からなるが、胃腸管および膵管には存在する保存された細胞質内ドメインを欠くタンパク質を指す。これは、腸管ペプチドに関連するトランスポーターＨＰＴ−１、肝臓−腸カドヘリンおよびＬＩ−カドヘリンとしても知られている。ヒトＣＤＨ−１７は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ１２８６４（バージョン１３１、２０１５年３月１１日）に示されている。
【００４６】
「カドヘリン５」または「ＣＤＨ−５」または「ＣＤＨ５」という用語は、本明細書で使用される場合、５個の細胞外カドヘリンの繰り返し、膜貫通領域、細胞間の接続部の役割を果たす高度に保存された細胞質尾部で構成されるカルシウム依存性細胞−細胞接着糖タンパク質を指す。これは２型カドヘリン、血管内皮カドヘリン、ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ１４４としても知られる。ヒトＣＤＨ−５は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ３３１５１（バージョン１３８、２０１５年３月１１日）に示されている。
【００４７】
「カドヘリン６」または「ＣＤＨ−６」または「ＣＤＨ６」という用語は、本明細書で使用される場合、５個の細胞外カドヘリンの繰り返し、膜貫通領域、高度に保存された細胞質尾部で構成されるカルシウム依存性細胞−細胞接着糖タンパク質を指す。これは、腎臓カドヘリンまたはＫ−カドヘリンとしても知られている。ヒトＣＤＨ−６は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ５５２８５（バージョン１３３、２０１５年３月１１日）に示されている。
【００４８】
「カドヘリン２０」または「ＣＤＨ−２０」または「ＣＤＨ２０」という用語は、本明細書で使用される場合、５個の細胞外カドヘリンの繰り返し、膜貫通領域、細胞質尾部で構成され、従来のカドヘリンに特異的なＨＡＶ細胞接着認識配列を欠くカルシウム依存性細胞−細胞接着糖タンパク質を指す。ヒトＣＤＨ−２０は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ９ＨＢＴ６（バージョン１３３、２０１５年３月１１日）に示されている。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌」という用語は、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が直接的または間接的に関与する癌を指す。これらの種類の細胞の関与は、癌の原因であるか、または原因ではないＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０とは独立している。例えば、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０は、通常またはリファレンスの生理学的条件またはリファレンス値に対し、改変された様式、位置または分布で、または改変された量で（例えば高い値で）発現されてもよい。このように、「ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌」との用語は、「ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞を伴う癌」または「ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が直接的または間接的に必要とする癌」または同様のものと実質的に同等である。ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌の例としては、限定されないが、メラノーマ、乳癌、および消化器癌、例えば、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌および食道癌腫が挙げられる。
【００５０】
癌が進行するにつれて、癌は転移する場合がある。「転移」または「転移性の疾患」との用語は、本明細書で使用される場合、ある臓器または部分から、別の直接接続していない臓器または部分への癌または疾患の広がりを指す。腫瘍細胞が転移すると、新しい腫瘍は、続発性または転移性の腫瘍と呼ばれ、その細胞は、原発性腫瘍の細胞と同様である。
【００５１】
「マーカー」または「腫瘍マーカー」または「癌マーカー」との用語は、本明細書で使用される場合、生体液、例えば、血液または尿、または体組織、例えば、腫瘍組織中に見出され、癌の中で増加し得るバイオマーカーを指す。
【００５２】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」との用語は、区別せずに使用することができ、疾患または障害の１つ以上の症状を予防するか、治癒するか、遅らせるか、重篤度を下げるか、または軽減するための試み、または疾患または障害を回復するか、またはこのような治療をしない場合に予想される期間を超えて患者の生存期間を延ばすための臨床的な介入を指す。
【００５３】
「サンプル」または「生体サンプル」との用語は、被験体から単離される生体材料を指すことを意図している。生体サンプルは、望ましいバイオマーカーを検出するのに適した任意の生体材料を含有していてもよく、被験体の細胞および／または非細胞材料を含んでいてもよい。サンプルは、任意の適切な組織または生体液、例えば、腫瘍組織、血液、唾液、血漿、血清、尿、髄液（ＣＳＦ）、糞便、頬または頬−咽頭の拭き取り液、手術標本および生検から得られる標本から単離することができる。
【００５４】
「被験体」との用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物に分類される全ての動物を指し、限定されないが、家畜および農場動物、霊長類およびヒト（例えばヒト）、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類が挙げられる。好ましくは、被験体は、任意の年齢または種族の男性または女性のヒトである。
【００５５】
「決定する」との用語は、本明細書で使用される場合、被験体における癌の診断、予後診断または層別化に有用であり得る任意のパラメーターの決定に関する。当業者によって理解されるように、パラメーターの決定は、１００％正しいことが好ましいが、診断または評価される被験体の１００％にとって正しい必要はない。しかし、この用語は、被験体の統計的に有意な割合を、所与のパラメーターが存在していると特定することができる必要がある。
【００５６】
被験体が統計的に有意であるかどうかは、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定などの種々のよく知られている統計的な評価ツールを用い、当業者によってさらなる面倒がない状態で決定することができる。詳細は、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３の中に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０５、０．０１、０．００５であるか、またはさらに小さい。
【００５７】
１．結合薬剤
第１の態様において、本発明は、ヒトカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の残基６０３〜６０５を含むエピトープに特異的に結合する薬剤（本明細書で以下「本発明の第１の結合薬剤」と称する）に関し、前記薬剤は、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディおよびアンチカリンからなる群から選択される免疫グロブリン薬剤または非免疫グロブリン薬剤である。
【００５８】
特定の実施形態において、上述の薬剤が結合するエピトープは、配列番号１４で示される配列（ＬＲＧＤＴ）を含むか、この配列からなる。この配列は、ヒトＣＤＨ１７の残基６０２〜６０６に対応する。上述の薬剤が結合するエピトープは、配列番号１４で示される配列（ＬＲＧＤＴ）のＮ末端に、またはＣ末端に、またはＮ末端とＣ末端の両方に、ＣＤＨ１７の対応するアミノ酸配列のうち、少なくとも１個の残基、または少なくとも２個の残基、または少なくとも３個の残基、または少なくとも４個の残基、または少なくとも５個の残基、または少なくとも６個の残基、または少なくとも７個の残基、または少なくとも８個の残基、または少なくとも９個の残基、または少なくとも１０個の残基、またはもっと多い残基を含んでいてもよいことが理解されるだろう。好ましい実施形態において、上述の薬剤が結合するエピトープは、配列番号１で示される配列（ＶＳＬＲＧＤＴＲＧ）を含むか、この配列からなる。
【００５９】
第２の態様において、本発明は、ヒトカドヘリン５（ＣＤＨ５）の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープに特異的に結合する薬剤（本明細書で以下「本発明の第２の結合薬剤」と称する）に関し、前記薬剤は、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディおよびアンチカリンからなる群から選択される免疫グロブリン薬剤または非免疫グロブリン薬剤である。
【００６０】
本発明は、ヒトＣＤＨ−５の残基２３６〜２３８を含むエピトープのみに特異的に結合するか、またはヒトＣＤＨ−５の残基２９９〜３０１のみに特異的に結合するか、または同時である必要はないが両方のエピトープに特異的に結合する、本発明の第２の結合薬剤にかかる薬剤を想定する。
【００６１】
第３の態様において、本発明は、ヒトカドヘリン６（ＣＤＨ６）の残基８３〜８５を含むエピトープに特異的に結合する薬剤（本明細書で以下「本発明の第３の結合薬剤」と称する）に関し、前記薬剤は、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディおよびアンチカリンからなる群から選択される免疫グロブリン薬剤または非免疫グロブリン薬剤である。
【００６２】
第４の態様において、本発明は、ヒトカドヘリン２０（ＣＤＨ２０）の残基８９〜９１を含むエピトープに特異的に結合する薬剤（本明細書で以下「本発明の第４の結合薬剤」と称する）に関し、前記薬剤は、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディおよびアンチカリンからなる群から選択される免疫グロブリン薬剤または非免疫グロブリン薬剤である。
【００６３】
本発明は、ヒトＣＤＨ１７の残基６０３〜６０５を含むエピトープ、ヒトＣＤＨ５の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープに特異的に結合することができる、本発明の第１または第２の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定する。ヒトＣＤＨ１７の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ６の残基８３〜８５を含むエピトープに特異的に結合することができる本発明の第１または第３の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定される。ヒトＣＤＨ１７の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ２０の残基８９〜９１を含むエピトープに特異的に結合することができる本発明の第１または第４の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定される。ヒトＣＤＨ５の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ６の残基８３〜８５を含むエピトープに特異的に結合することができる本発明の第２または第３の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定される。ヒトＣＤＨ５の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ２０の残基８９〜９１を含むエピトープに特異的に結合することができる本発明の第２または第４の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定される。ヒトＣＤＨ６の残基８３〜８５を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ２０の残基８９〜９１を含むエピトープに特異的に結合することができる本発明の第３または第４の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定される。
【００６４】
ヒトＣＤＨ１７の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ５の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ６の残基８３〜８５を含むエピトープに特異的に結合することができる本発明の第１、第２および第３の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定される。ヒトＣＤＨ１７の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ５の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ２０の残基８９〜９１を含むエピトープに特異的に結合することができる本発明の第１、第２および第４の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定される。ヒトＣＤＨ１７の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ６の残基８３〜８５を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ２０の残基８９〜９１を含むエピトープに特異的に結合することができる本発明の第１、第３および第４の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定される。ヒトＣＤＨ５の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ６の残基８３〜８５を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ２０の残基８９〜９１を含むエピトープに特異的に結合することができる本発明の第２、第３および第４の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定される。
【００６５】
ヒトＣＤＨ１７の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ５の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ６の残基８３〜８５を含むエピトープおよびヒトＣＤＨ２０の残基８９〜９１を含むエピトープに特異的に結合することができる本発明の第１、第２、第３および第４の結合薬剤にかかる結合薬剤も想定される。
【００６６】
本発明の第１、第２、第３および第４の結合薬剤は、同時に認識する全てのエピトープに結合する必要はないことも理解されるだろう。
【００６７】
本発明の第１、第２、第３または第４の結合薬剤の別の特定の実施形態において、前記薬剤は、抗体および前記抗体の抗原結合フラグメントから選択される免疫グロブリン薬剤である。好ましい実施形態において、前記抗体結合フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’からなる群から選択される。
【００６８】
本発明の第１、第２、第３または第４の結合薬剤の別の特定の実施形態において、前記抗体または前記抗原結合フラグメントは、重鎖の中に、
−配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］、および配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］、または前記ＣＤＲの機能的に等価な改変体、
または
−配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］、または前記ＣＤＲの機能的に等価な改変体
を含むか、またはこれらからなる。
【００６９】
好ましい実施形態において、前記抗体または前記抗原結合フラグメントは、
−重鎖の中に、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２および配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むか、これらからなり、軽鎖の中に、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、または前記ＣＤＲの機能的に等価な改変体を含むか、これらからなり、または
−重鎖の中に、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］および配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］を含むか、これらからなり、軽鎖の中に、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、または前記ＣＤＲの機能的に等価な改変体を含むか、これらからなる。
【００７０】
これら２セットのＣＤＲは、実施例１０で配列決定された抗体に属することも当業者ならすぐに明らかであり、これも本発明の一部である。
【００７１】
当業者は、本発明の第１、第２および第３の結合薬剤にかかる抗体または抗体フラグメントのＣＤＲのアミノ酸配列が、ポリペプチドの一次配列が改変されているとしても、抗体が、ヒトＣＤＨ１７の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよび／またはヒトＣＤＨ５の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよび／またはヒトＣＤＨ６の残基８３〜８５を含むエピトープおよび／またはヒトＣＤＨ２０の残基８９〜９１を含むエピトープに結合する能力を維持しているように１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよいことを理解するだろう。前記置換は、保存的置換であってもよく、保存的置換とは、一般的に、あるアミノ酸が、同様の特性を有する別のアミノ酸と置換されていることを示す。例えば、グルタミン酸（負に帯電したアミノ酸）をアスパラギン酸で置換することは、保存的アミノ酸置換であろう。
【００７２】
本発明は、配列番号２〜１３で示されるＣＤＲの配列の機能的に等価な改変体も想定し、この改変体は、本発明の範囲内に入る。本明細書で使用されるように、「ＣＤＲ配列の機能的に等価な改変体」との用語は、実質的に同様の配列同一性を有し、本明細書に記載されるような抗体または抗体フラグメントの一部である場合、同系の抗原に結合する能力を実質的に維持している、特定のＣＤＲ配列の配列改変体を指す。例えば、ＣＤＲ配列の機能的に等価な改変体は、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む前記配列のポリペプチド配列誘導体であってもよい。
【００７３】
本発明のＣＤＲ配列の機能的に等価な改変体は、配列番号２〜１３のいずれかで示される対応するアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ＣＤＲ配列の機能的に等価な改変体が、配列番号２〜１３のいずれかで示される対応するアミノ酸配列のＮ末端に、またはＣ末端に、またはＮ末端とＣ末端の両方に、少なくとも１個のアミノ酸、または少なくとも２個のアミノ酸、または少なくとも３個のアミノ酸、または少なくとも４個のアミノ酸、または少なくとも５個のアミノ酸、または少なくとも６個のアミノ酸、または少なくとも７個のアミノ酸、または少なくとも８個のアミノ酸、または少なくとも９個のアミノ酸、または少なくとも１０個のアミノ酸、またはもっと多いアミノ酸からなる付加を含むことも想定される。同様に、改変体が、配列番号２〜１３のいずれかで示される対応するアミノ酸配列のＮ末端に、またはＣ末端に、またはＮ末端とＣ末端の両方に、少なくとも１個のアミノ酸、または少なくとも２個のアミノ酸、または少なくとも３個のアミノ酸、または少なくとも４個のアミノ酸、または少なくとも５個のアミノ酸、または少なくとも６個のアミノ酸、または少なくとも７個のアミノ酸、または少なくとも８個のアミノ酸、または少なくとも９個のアミノ酸、または少なくとも１０個のアミノ酸、またはもっと多いアミノ酸からなる欠失を含むことも想定される。
【００７４】
本発明のＣＤＲ配列の機能的に等価な改変体は、好ましくは、本発明の１つのような抗体または抗体フラグメントの一部である場合、配列番号２〜１３のいずれかで示される対応するアミノ酸配列がその同系の抗原に結合する能力を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、またはもっと多く維持している。その同系の抗原に結合する能力は、その同系の抗原に対する抗体または抗体フラグメントのアフィニティ、アビディティー、特異性および／または選択性の値として決定されてもよい。
【００７５】
本発明の結合薬剤、特に、本明細書に記載される抗体または抗体フラグメントが、ヒトＣＤＨ１７の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよび／またはヒトＣＤＨ５の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよび／またはヒトＣＤＨ６の残基８３〜８５を含むエピトープに結合する能力は、当該技術分野においてよく知られる多くのアッセイによって決定することができる。好ましくは、結合薬剤の結合能力は、免疫沈降によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴によって、または免疫蛍光技術、例えば、免疫組織染色（ＩＨＣ）、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって決定される。ヒトＣＤＨ１７の残基６０３〜６０５を含むエピトープおよび／またはヒトＣＤＨ５の残基２３６〜２３８および／または残基２９９〜３０１を含むエピトープおよび／またはヒトＣＤＨ６の残基８３〜８５を含むエピトープおよび／またはヒトＣＤＨ２０の残基８９〜９１を含むエピトープに対する本発明の結合薬剤のアフィニティは、少なくとも１０−６Ｍ、少なくとも１０−７Ｍ、少なくとも１０−８Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１、少なくとも１０−１２Ｍ、またはもっと大きい。
【００７６】
本発明の第１、第２、第３または第４の結合薬剤の別の特定の実施形態において、前記薬剤は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）ＧｍｂＨに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６で寄託されたリファレンスＰＡ３８３−２５．４．１を含むハイブリドーマ細胞株によって作られる抗体、またはその抗原結合フラグメントである。
【００７７】
好ましい実施形態において、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）ＧｍｂＨに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６で寄託されたリファレンスＰＡ３８３−２５．４．１を含むハイブリドーマ細胞株によって作られる抗体の抗原結合フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’からなる群から選択される。
【００７８】
本発明の第１、第２、第３または第４の結合薬剤の別の特定の実施形態において、前記抗体または前記抗原結合フラグメントは、ヒト化されている。
【００７９】
本発明の第１、第２、第３または第４の結合薬剤の別の特定の実施形態において、前記抗体または前記抗原結合フラグメントは、ヒトである。
【００８０】
本発明の第１、第２、第３または第４の結合薬剤の別の特定の実施形態において、前記抗体または前記抗原結合フラグメントは、マウスである。
【００８１】
本発明の第１、第２、第３または第４の結合薬剤の別の特定の実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）である。
【００８２】
本発明の第１、第２、第３または第４の結合薬剤の別の特定の実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、ラクダ抗体である。
【００８３】
本発明の第１、第２、第３または第４の結合薬剤の別の実施形態において、薬剤は、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディおよびアンチカリンからなる群から選択される非免疫グロブリン薬剤である。
【００８４】
好ましい実施形態において、非免疫グロブリン薬剤は、ペプチドアプタマーである。別の好ましい実施形態において、非免疫グロブリン薬剤は、核酸アプタマーである。別の好ましい実施形態において、非免疫グロブリン薬剤は、ＤＡＲＰｉｎである。別の好ましい実施形態において、非免疫グロブリン薬剤は、アフィボディである。別の好ましい実施形態において、非免疫グロブリン薬剤は、アンチカリンである。
【００８５】
本明細書に記載する抗原結合フラグメントは、改変されたアビディティーおよび／または機能を有する構築物を得るために、遺伝子操作によって改変されていてもよいことは、当業者にはすぐに明らかであろう。抗体構築物を得るために、当該技術分野には、例えば、Ｃｕｅｓｔａら（上に引用）に強調されているような多くの手法が存在する。
【００８６】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明の第１、第２、第３または第４の結合薬剤と関連して記載される抗体フラグメントにかかる抗原結合フラグメントを含む抗体構築物（本明細書で以下、本発明の抗体構築物）に関し、この抗体構築物は、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ、（ｓｃＦｖ）２およびダイアボディからなる群から選択される。
【００８７】
特定の実施形態において、抗体構築物は、ｓｃＦｖである。別の特定の実施形態において、抗体構築物は、ｓｃＦｖ−Ｆｃである。別の特定の実施形態において、抗体構築物は、ミニボディである。別の特定の実施形態において、抗体構築物は、（ｓｃＦｖ）２である。別の特定の実施形態において、抗体構築物は、ダイアボディである。
【００８８】
別の特定の実施形態において、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ、（ｓｃＦｖ）２およびダイアボディからなる群から選択される抗体構築物は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）ＧｍｂＨに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６で寄託されたリファレンスＰＡ３８３−２５．４．１を含むハイブリドーマ細胞株によって作られる抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【００８９】
ＣＤＲまたは他の結合部位以外の位置での本明細書に記載する結合薬剤および抗体構築物のアミノ酸配列の改変も想定される。例えば、結合薬剤の結合アフィニティおよび／または他の生物学的特性を高めることも望ましいだろう。結合薬剤のアミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチドの変更を、核酸をコードする抗体に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような改変としては、例えば、結合薬剤のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が挙げられる。最終的な結合薬剤が望ましい特徴を有している限り、欠失、挿入および／または置換の任意の組み合わせがなされる。アミノ酸の変更も、タンパク質の翻訳後の過程を変える（例えば、グリコシル化部位の数または位置を変える）場合がある。アミノ酸配列の挿入としては、１００以上の残基を含むポリペプチドに対する、１個残基長からさまざまな範囲の長さのアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、１個または複数個のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端への挿入の例としては、Ｎ末端のメチオニル残基を含むペプチド、または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体ポリペプチド鎖が挙げられる。分子の他の挿入改変体としては、酵素のＮ末端またはＣ末端への融合、または血清の半減期を延ばすポリペプチドが挙げられる。
【００９０】
抗体である結合薬剤の特定の実施形態において、抗体の別の種類のアミノ酸改変体は、その元々のグリコシル化パターンを変更する。変更するとは、分子内にみられる１個以上の炭水化物部分が欠失していること、および／または分子内に存在しない１個以上のグリコシル化部位が付加されていることを意味する。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の接続を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素による接続のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらいずれかのトリペプチド配列が存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作られる。Ｏ結合したグリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンに対する単糖類または単糖誘導体Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのいずれかの接続を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンが使用されてもよい。抗体に対するグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうち１つ以上を含むようにアミノ酸配列を変更することによって簡便に達成される（Ｎ結合したグリコシル化部位の場合）。変更は、元々の抗体の配列に１個以上のセリン残基またはトレオニン残基を付加または置換することによってなされてもよい（Ｏ結合したグリコシル化部位の場合）。抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は、当該技術分野において知られている種々の方法によって調製される。これらの方法としては、限定されないが、天然源からの単離（天然に発生するアミノ酸配列改変体の場合）またはオリゴヌクレオチドが介在する（または部位指向型の）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、初期に調製された改変体または改変されていない態様の抗体のおよびカセット突然変異誘発による調製が挙げられる。
【００９１】
また、エフェクター機能を高めるために、例えば、抗体のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを高めるように、本明細書に記載する抗体を改変することが望ましい場合がある。このことは、抗体のＦｃ領域において１個以上のアミノ酸置換を導入することによって達成されてもよい。糖タンパク質（例えば、抗体）のアミノ酸骨格に付加されるグリコシル基は、いくつかの単糖類または単糖誘導体によって形成され、異なる哺乳動物または組織に由来する細胞で作られる同じ抗体の中で異なっていてもよい組成物を生じる。これに加え、異なる組成のグリコシル基が、抗体の抗原依存性細胞が介在する細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）に介在する効能に影響を与える可能性が示されている。したがって、異なる供給源に由来する抗体のグリコシル化パターンを学ぶことによって、これらの特性を高めることができる。
【００９２】
本明細書に記載する抗体に適した他の改変としては、Ｆｃ領域内のシステイン残基の導入が挙げられ、これによって、この領域内での鎖間ジスルフィド結合の形成が可能になり、インターナリゼーション能力が高まり、および／または補体依存細胞死および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が増加する。
【００９３】
結合薬剤の血清半減期を延ばすために、サルベージ受容体結合エピトープを薬剤に組み込んでもよい。本明細書で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」との用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指し、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏでの血清半減期を延ばす役割を担う。
【００９４】
別の態様において、本発明は、
（ａ）本発明の第１、第２および第３の結合薬剤にかかる薬剤、または本発明の抗体構築物をコードする核酸、および
（ｂ）（ａ）に定義される核酸の相補的核酸からなる群から選択される、核酸（本明細書で以下、「本発明の核酸」）に関する。
【００９５】
本発明の前記核酸は、本発明の結合薬剤または抗体構築物をコードするヌクレオチド配列の発現に操作可能に連結する制御配列を含んでいてもよく、これによって遺伝子構築物（本明細書で以下、「本発明の遺伝子構築物」）を形成する。本明細書で使用される場合、「操作可能に連結する」は、本発明の核酸配列によってコードされる結合薬剤または抗体構築物が、発現制御または制御配列の制御下、正しいリーディングフレームで発現することを意味する。したがって、別の態様において、本発明は、発現制御配列に操作可能に連結する本発明の遺伝子構築物を含む発現カセット（本明細書で以下、「本発明の発現カセット」）を提供する。本発明の遺伝子構築物は、従来技術で広く知られている技術の使用によって得ることができる。
【００９６】
制御配列は、転写と、適切な場合、前記抗体の翻訳を制御し、調整する配列であり、プロモーター配列、転写制御因子をコードする配列、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）および／または転写停止配列を含む。本発明の発現カセットは、さらに、エンハンサーを含んでいてもよく、エンハンサーは、プロモーター配列に隣接していてもよく、またはプロモーター配列から離れていてもよく、プロモーター配列からの転写を増大させる。特定の実施形態において、前記発現制御配列は、原核細胞および有機体（例えば細菌など）で機能性である。一方、別の特定の実施形態において、前記発現制御配列は、真核細胞および有機体（例えば、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物の細胞など）で機能性である。
【００９７】
この方法論において、任意の入手可能なプロモーターを使用してもよい。本発明の好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物に使用されるプロモーターは、トランスフェクトされる特定の細胞集合内で活性である。本発明の発現カセット中に存在し得る偏在するプロモーターの代表的で非限定的な例としては、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈＣＭＶ）、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ１−αプロモーターおよびユビキチンプロモーターＣが挙げられる。細胞特異的なプロモーターおよび／または組織（例えば、アルブミン）特異的なプロモーターの代表的で非限定的な例としては、肝臓、リンパに特異的なプロモーターなどが挙げられる。
【００９８】
有利には、本発明の発現カセットは、さらに、前記発現カセットを用い、形質転換された宿主細胞を選択することができるマーカーまたはモチーフまたは表現型をコードする遺伝子を含む。本発明の発現カセット中に存在し得る前記マーカーの代表的な例としては、抗生物質耐性遺伝子、毒性化合物に耐性がある遺伝子が挙げられ、一般的に、遺伝子的に形質転換された細胞を選択することができる全てのものが挙げられる。
【００９９】
本発明の遺伝子構築物または本発明の発現カセットは、適切なベクターに挿入されてもよい。したがって、別の態様において、本発明は、本発明の前記遺伝子構築物または前記発現カセットを含むベクター、例えば、発現ベクター（本明細書で以下、「本発明のベクター」）に関する。ベクターの選択は、これが後で導入される宿主細胞に依存する。一例として、前記核酸配列が挿入されるベクターは、宿主細胞に導入されるときに、前記細胞のゲノムに合体するか、または合体しないプラスミドまたはベクターであってもよい。ベクターを得ることは、当業者が知っている従来の方法によって行うことができる。特定の実施形態において、前記組換えベクターは、動物細胞をトランスフェクトするのに有用なベクターである。
【０１００】
前記ベクターを使用し、前記ベクターによる形質転換、トランスフェクトまたは感染を受けやすい細胞を形質転換し、トランスフェクトし、感染させることができる。このような細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。したがって、別の態様において、本発明は、本発明の核酸または発現カセットまたはベクターを含む細胞（本明細書で以下、「本発明の細胞」）に関する。本発明の細胞を得るために、細胞は、本発明のベクターを用いて形質転換され、トランスフェクトされ、または感染する必要があるだろう。したがって、前記形質転換された細胞、トランスフェクトされた細胞または感染した細胞は、本発明の核酸、本発明の遺伝子構築物または本発明の発現カセットまたはベクターを含む。
【０１０１】
形質転換された細胞、トランスフェクトされた細胞または感染した細胞は、当業者が知っている従来の方法によって得られてもよい。本発明を行うのに適した細胞としては、限定されないが、哺乳動物、植物、昆虫、真菌および細菌の細胞が挙げられる。細菌の細胞としては、限定されないが、グラム陽性菌由来の細胞、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ族の種、グラム陰性菌由来の細胞、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ族の細胞が挙げられる。真菌細胞としては、好ましくは、酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａが挙げられる。昆虫細胞としては、限定されないが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞およびＳｆ９細胞が挙げられる。植物細胞としては、特に、栽培植物、例えば、穀類、薬草、観賞植物または球根の細胞が挙げられる。本発明に適した哺乳動物の細胞としては、上皮細胞株、骨肉腫細胞株、神経芽腫細胞株、上皮癌腫、グリア細胞、肝細胞株、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＴＥＲＡ−２ヒトＥＣＣ細胞ｓ、ｍＥＳＣ系のＤ３細胞、ヒト胚幹細胞、例えば、ＨＳ２９３、ｈＭＳＣおよびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＲＥＨおよびＭＣＦ−７細胞が挙げられる。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）ＧｍｂＨに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６で寄託されたリファレンスＰＡ３８３−２５．４．１を含むハイブリドーマ細胞株（本明細書で以下、「本発明のハイブリドーマ細胞株」）に関する。
【０１０３】
別の態様において、本発明は、本発明の結合薬剤を製造することが可能な条件下で本発明の細胞またはハイブリドーマ細胞株を成長させることを含む、本発明の前記抗体を製造するための方法に関する。前記細胞の培養を最適化するための条件は、使用される細胞に依存するだろう。所望な場合、本発明の抗体を製造するための方法は、さらに、前記結合薬剤の単離および精製を含む。
【０１０４】
２．ペプチド
別の態様において、本発明は、ＬＲＧＤＴ（配列番号１４）、ＬＲＧＤＳ（配列番号１５）、ＬＲＧＤＹ（配列番号１６）、ＤＲＧＤＧ（配列番号１７）または前記配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するこれらの改変体からなる群から選択される配列ＲＧＤを含むペプチド（本明細書で以下、「本発明のペプチド」）に関する。
【０１０５】
当業者は、配列番号１４に示される配列が、ヒトＣＤＨ１７の残基６０２〜６０６に対応し、配列番号１５に示される配列が、ヒトＣＤＨ５の残基２３５〜２３９に対応し、配列番号１６に示される配列が、ヒトＣＤＨ５の残基２９８〜３０２に対応し、配列番号１７に示される配列が、ヒトＣＤＨ６の残基８２〜８６と、ヒトＣＤＨ２０の残基８８〜９２に対応することをすぐに理解するだろう。
【０１０６】
本発明は、前記配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列番号１４〜１７に示される配列を含むペプチドの改変体も想定する。したがって、本発明のペプチドの改変体は、配列番号１４〜１７のいずれかに示される対応するアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有するペプチドを含む。
【０１０７】
前記配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列番号１４〜１７に示されるペプチドの改変体が、配列番号１４〜１７のいずれかで示されるアミノ酸配列のＮ末端に、またはＣ末端に、またはＮ末端とＣ末端の両方に配置されるＣＤＨ１７、ＣＤＨ５またはＣＤＨ６の対応する配列からの少なくとも１個のアミノ酸、または少なくとも２個のアミノ酸、または少なくとも３個のアミノ酸、または少なくとも４個のアミノ酸、または少なくとも５個のアミノ酸、または少なくとも６個のアミノ酸、または少なくとも７個のアミノ酸、または少なくとも８個のアミノ酸、または少なくとも９個のアミノ酸、または少なくとも１０個のアミノ酸、またはもっと多いアミノ酸からなる付加を含むことも想定される。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ＳＬＲＧＤＴＲ（配列番号３２）、ＧＬＲＧＤＳＧ（配列番号３３）、ＩＬＲＧＤＹＱ（配列番号３４）、ＱＤＲＧＤＧＳ（配列番号３５）およびＭＤＲＧＤＧＳ（配列番号３６）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、ＶＳＬＲＧＤＴＲＧ（配列番号１）、ＱＧＬＲＧＤＳＧＴ（配列番号３７）、ＳＩＬＲＧＤＹＱＤ（配列番号１９）、ＤＱＤＲＧＤＧＳＬ（配列番号３８）およびＤＭＤＲＧＤＧＳＩ（配列番号３９）からなる群から選択される。
【０１０９】
特定の実施形態において、前記ペプチドは、直鎖ペプチドである。別の特定の実施形態において、前記ペプチドは、環状ペプチドである。別の特定の実施形態において、前記ペプチドは、分岐ペプチドである。
【０１１０】
３．治療への使用
本発明者らは、実施例１〜６に示されるように、ＣＤＨ１７中に存在するＲＧＤモチーフが、インテグリン活性化と腫瘍成長を誘発することを示した。これらの結果を、β１インテグリンの活性化を阻害する能力を有するＣＤＨ１７のＲＧＤモチーフに特異的に結合する抗体作製のためのベイトとして使用した（実施例８および１０）。したがって、これらの抗体は、腫瘍の成長および転移を減らすことによって、ＣＤＨ１７を発現する癌において潜在的な治療効果を有する（実施例６）。
【０１１１】
他のカドヘリン（例えば、ＣＤＨ５およびＣＤＨ６）中に存在する他のＲＧＤモチーフも存在するため、この観察結果から、実施例１１に示されるように、これらのカドヘリンを推定することもできる。
【０１１２】
したがって、このモチーフは、これらのカドヘリンを発現する腫瘍の播種を避けることを標的とすることができる。
【０１１３】
したがって、別の態様において、本発明は、医薬として使用（本明細書で以下、「本発明の第１の医学的な使用」）するための、
−本発明の薬剤、または
−本発明の抗体構築物、または
−本発明のペプチド、または
−配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または
−配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または
−配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）
に関する。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、癌の治療に使用（本明細書で以下、「本発明の第２の医学的な使用」）するための、
−本発明の薬剤、または
−本発明の抗体構築物、または
−本発明のペプチド、または
−配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または
−配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または
−配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）
に関する。
【０１１５】
この態様は、癌の治療のための医薬の製造において、本発明の薬剤、または本発明の抗体構築物、または本発明のペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）の使用として、再構築されてもよい。または、この態様は、本発明の薬剤、または本発明の抗体構築物、または本発明のペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において癌を治療するための方法として再構築されてもよい。
【０１１６】
「薬剤」、「抗体構築物」および「ペプチド」との薬剤は、従前より詳細に記述されており、これらの定義および特定の実施形態および好ましい実施形態は、参照することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１１７】
本発明の第１および第２の医学的な使用の特定の実施形態において、配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）は、ＣＤＨ１７のドメイン６である。別の特定の実施形態において、配列番号１５の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）は、ＣＨＤ５のドメイン２を含むか、またはこれからなるポリペプチドである。別の特定の実施形態において、配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）は、ＣＨＤ５のドメイン３を含むか、またはこれからなるポリペプチドである。別の特定の実施形態において、配列番号１５の配列および配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）は、ＣＨＤ５のドメイン２および３を含むか、またはこれらからなるポリペプチドである。別の特定の実施形態において、配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ６ではない）は、ＣＤＨ６のドメイン１を含むか、またはこれからなるポリペプチドである。別の特定の実施形態において、配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ２０ではない）は、ＣＤＨ２０のメイン１を含むか、またはこれからなるポリペプチドである。
【０１１８】
本発明の第２の医学的な使用の特定の実施形態において、癌は、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌である。
【０１１９】
好ましい実施形態において、前記ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌は、メラノーマ、乳癌および消化器癌から選択される。さらに好ましい実施形態において、前記消化器癌は、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌および食道癌腫からなる群から選択される。
【０１２０】
さらに好ましい実施形態において、前記消化器癌は結腸癌である。さらに好ましい実施形態において、前記消化器癌は膵臓癌である。さらに好ましい実施形態において、前記消化器癌は肝臓癌である。さらに好ましい実施形態において、前記消化器癌は胃癌である。さらに好ましい実施形態において、前記消化器癌は、食道癌である。
【０１２１】
別の好ましい実施形態において、前記ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌は、転移性でである。
【０１２２】
当業者なら理解するだろうが、これらの治療用途は、治療有効量の本発明の抗体構築物、またはペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）の投与を含むだろう。
【０１２３】
「治療有効量」との用語は、本明細書で使用される場合、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する疾患または状態の１つ以上の症状の適切な予防、治癒、遅延、重篤度の低下、または軽減を達成するのに必要な、本発明の薬剤、抗体構築物、またはペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）の量を指す。当業者は、過度な実験を行うことなく、当該技術分野においてよく知られている従来の技術（例えば、実施例６に使用されるもの）を用いることによって、これらの分子の治療有効量を決定することができるだろう。
【０１２４】
理論によって束縛されることを望まないが、本発明の薬剤、抗体構築物、またはペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）が、ＲＧＤモチーフに直接的に結合することによって、またはα２β１インテグリンと可溶性リガンドの結合部位を飽和させることによってＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０の中に存在するＲＧＤモチーフとα２β１インテグリンとの相互作用を防ぐことによって、その治療活性に介在すると考えられる。これに加えて、これらの化合物の治療効果に他の機構が関与している場合があり、これは、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの活性化を含んでいてもよい、化合物の特定の性質に依存するだろう。
【０１２５】
４．方法
４．１．診断の方法
別の態様において、本発明は、被験体における癌を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法（本明細書で以下、「本発明の癌の診断方法」）であって、
（ｉ）本発明の薬剤または抗体構築物と、前記被験体からの生体サンプルとを接触させることと；
（ｉｉ）前記サンプルに結合していない前記薬剤または抗体構築物を分離することと；
（ｉｉｉ）前記生体サンプル中、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルを検出し、および／または定量化することと；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で検出された、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物の存在および／または量と、リファレンス値の存在および／または量とを比較することと；
（ｖ）得られた結果と、前記癌の存在とを関連づけることとを含む、方法に関する。
【０１２６】
「薬剤」、「抗体構築物」および「癌」との用語は、従前より詳細に記述されており、これらの定義および特定の実施形態および好ましい実施形態は、参照することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１２７】
診断することは、本明細書で使用される場合、被験体においてあり得る疾患を決定および／または特定しようとする方法（すなわち、診断手順）と、この方法によって達する意見（すなわち、診断意見）の両方を指す。このように、治療についての医学的決断を行うことができるように、個々の状態を別個の明確なカテゴリーに分類しようとする企てと考えることもできる。当業者によって理解されるように、癌の診断は、１００％正しいことが好ましいが、診断または評価される被験体の１００％にとって正しい必要はない。しかし、この用語は、被験体の統計的に有意な割合を、肝臓癌を患っていると特定することができる必要がある。被験体が統計的に有意であるかどうかは、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定などの種々のよく知られた統計的な評価ツールを用い、当業者によってさらなる面倒がない状態で決定することができる。詳細は、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３の中に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０５、０．０１、０．００５であるか、またはさらに小さい。
【０１２８】
第１の工程において、本発明の診断方法は、本発明の薬剤または抗体構築物と、前記被験体からの生体サンプルとを接触させることを含む。
【０１２９】
特定の実施形態において、生体サンプルは、腫瘍サンプルまたは腫瘍細胞を含有するサンプルである。好ましい実施形態において、前記腫瘍サンプルまたは腫瘍細胞を含有するサンプルは、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を含有する。
【０１３０】
本発明の薬剤または抗体構築物は、適切なバッファー中、サンプル中に存在し得るＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０分子に薬剤または抗体構築物を結合させるようにサンプルに適用される。本発明の薬剤または抗体構築物の結合を可能にするのに適したバッファーの非限定的な例としては、ＰＢＳ、ＴＢＳ、リン酸バッファーおよびクエン酸バッファーが挙げられる。サンプル中に存在するＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０分子を検出するのに必要な本発明の薬剤または抗体構築物の量は、サンプルの大きさと、サンプル中に存在するＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０の量に依存し、当該技術分野において一般的な最適化手順によって簡単に決定することができる。示すように、薬剤または抗体構築物の濃度は、少なくとも１ｆＭ、少なくとも１０ｆＭ、少なくとも１００ｆＭ、少なくとも１ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１００μＭ、またはもっと高い。好ましくは、薬剤または抗体構築物の濃度は、１００ｆＭ〜１μＭ、さらに好ましくは、１ｐＭ〜１００ｎＭ、最も好ましくは、１００ｐＭ〜１ｎＭである。
【０１３１】
薬剤または抗体構築物を、適切な温度で、サンプル中に存在し得るＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０分子に薬剤または抗体構築物を結合させるのに十分な時間、サンプルと共にインキュベートする。この温度は、好ましくは、２０℃〜３７℃である。例えば、薬剤または抗体構築物は、サンプルと共に、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも１２０分間、またはもっと長くインキュベートされる。
【０１３２】
本発明の薬剤または抗体構築物が、サンプル中に存在し得るＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０分子に結合したら、第２の工程において、本発明の診断方法は、前記サンプルに結合していない前記薬剤または抗体構築物を分離することを含む。この工程は、この目的に適した任意の方法によって行われてもよい。例えば、適切なバッファーを用いた連続的な洗浄をサンプルに対して行ってもよい。
【０１３３】
第３の工程において、本発明の診断方法は、前記生体サンプル中のＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルを検出および／または定量化することを含む。本発明の薬剤または抗体構築物はそれ自体が検出可能な分子ではないため、検出工程は、薬剤または抗体構築物に特異的に結合する第２の検出可能な分子による、間接的な検出工程である。ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した薬剤または抗体構築物の検出は、実質的には、本発明の薬剤または抗体構築物に対し、高いアフィニティで結合することが知られている任意の抗体または試薬を用いて行うことができる。しかし、薬剤または抗体構築物に対する特定の抗体、例えば、ポリクローナルの血清、ハイブリドーマの上清、またはモノクローナル抗体およびそのフラグメントを使用することが好ましい。本発明の薬剤または抗体構築物に特異的な抗体または試薬は、検出可能な試薬を用いて適切に標識される。「検出可能な試薬」との用語は、直接的または間接的に検出される能力を有する試薬を指す。本発明に適した検出可能な試薬の例としては、限定されないが、放射性核種、フルオロフォアおよび蛍光性または生物発光性のタンパク質および酵素が挙げられ、これらは当該技術分野においてよく知られている。この試薬は、当業者なら知っている、試薬の種類とサンプルの種類に適した装置を用い、例えば、蛍光定量法または比色定量法によって検出されてもよい。
【０１３４】
特定の実施形態において、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０の検出および／または定量化は、イムノアッセイを用いることによって行われる。好ましい実施形態において、イムノアッセイは、化学発光酵素イムノアッセイであり、さらに好ましくは、固相化学発光酵素イムノアッセイである。適切なイムノアッセイとしては、限定されないが、ウェスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光酵素イムノアッセイおよび免疫多重アッセイが挙げられる。
【０１３５】
第３の工程の結果として、サンプル中に存在するＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した薬剤または抗体構築物のレベルの値が得られる。
【０１３６】
第４の工程において、本発明の診断方法は、工程（ｉｉｉ）で検出されたＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した薬剤または抗体構築物のレベルと、リファレンス値のレベルとを比較することを含む。
【０１３７】
「リファレンス値」との用語は、被験体から集めたサンプルから得られた値またはデータを評価するためのリファレンスとして使用される所定の基準を指す。リファレンス値またはリファレンスレベルは、絶対値、相対値、上限または下限を有する値、ある範囲の値、算術平均値、メジアン値、平均値、または特定のコントロールまたはベースライン値と比較した値であってもよい。本発明の癌の診断方法のリファレンス値は、１人以上の健康な被験体または前記癌に罹患していない被験体から得られたサンプル中に存在するＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した薬剤または抗体構築物のレベルの値から得ることができる。
【０１３８】
本発明との関連において、サンプル中のＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した薬剤または抗体構築物のレベルがリファレンス値より大きいとき、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルは、「大きい」と考えられる。ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルは、リファレンス値よりも少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはもっと大きいとき、リファレンス値より大きいと考えられる。
【０１３９】
同様に、サンプル中のＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した薬剤または抗体構築物のレベルがリファレンス値より少ないとき、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルは、「小さい」と考えられる。ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルは、リファレンス値よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはもっと小さいとき、リファレンス値より小さいと考えられる。
【０１４０】
最後の工程において、本発明の診断方法は、得られた結果と、前記癌の存在とを関連づけることを含む。
【０１４１】
特定の実施形態において、リファレンス値と比較したときに、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した薬剤または抗体構築物のレベルが高いことは、前記癌の存在および／または前記癌の転移の指標である。
【０１４２】
別の特定の実施形態において、生体サンプルは、血液、血清または血漿サンプルである。
【０１４３】
４．２．予後診断の方法
別の態様において、本発明は、被験体における癌を予後診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法（本明細書で以下、「本発明の癌の予後診断方法」）であって、
（ｉ）本発明の薬剤または抗体構築物と、前記被験体からの生体サンプルとを接触させることと；
（ｉｉ）前記サンプルに結合していない前記薬剤または抗体構築物を分離することと；
（ｉｉｉ）前記生体サンプル中、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルを検出し、および／または定量化することと；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で検出された、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物の存在および／または量と、リファレンス値の存在および／または量とを比較することと；
（ｖ）得られた結果と、前記癌の臨床転帰とを関連づけることとを含む、方法に関する。
【０１４４】
「薬剤」、「抗体構築物」および「癌」との用語は、すでに従前より詳細に記述されており、これらの定義および特定の実施形態および好ましい実施形態は、参照することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１４５】
この態様は、本発明の診断方法の工程（ｉ）〜（ｖ）を実行するため、その定義および特定の実施形態は、本発明の癌の予後診断方法に等しく適用する。
【０１４６】
「予後診断する」との用語は、本明細書で使用される場合、癌患者が良い臨床転帰または悪い臨床転帰のどちらかの特定の臨床転帰を有する可能性を決定することを指す。本発明において、「臨床転帰」は、予測される疾患の経過であると理解される。被験体の疾患がどのように進行するか、回復、障害または死亡する可能性があるかどうかについての医師の予測を示す。本発明の予後診断方法は、特定の患者に最も適した治療様式を選択することによって治療を決定するために、臨床的に使用することができる。当業者によって理解されるだろうが、癌の予後診断は、１００％正しいことが好ましいが、診断または評価される被験体の１００％にとって正しい必要はない。しかし、この用語は、被験体の統計的に有意な割合を、肝臓癌を患っていると特定することができる必要がある。被験体が統計的に有意であるかどうかは、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定などの種々のよく知られた統計的な評価ツールを用い、当業者によってさらなる面倒がない状態で決定することができる。詳細は、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３の中に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０５、０．０１、０．００５であるか、またはさらに小さい。
【０１４７】
「リファレンス値」との用語は、被験体から集めたサンプルから得られた値またはデータを評価するためのリファレンスとして使用される所定の基準を指す。リファレンス値またはリファレンスレベルは、絶対値、相対値、上限または下限を有する値、ある範囲の値、算術平均値、メジアン値、平均値、または特定のコントロールまたはベースライン値と比較した値であってもよい。本発明の癌の予後診断方法のリファレンス値は、良い臨床転帰または悪い臨床転帰を有すると分類された前記癌を患う被験体から得られたサンプルまたはサンプルプールの中に存在するＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した薬剤または抗体構築物のレベルの値から得ることができる。
【０１４８】
４．３．層別化の方法
別の態様において、本発明は、被験体における癌を層別化するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法（本明細書で以下、「本発明の癌の層別化方法」）であって、
（ｉ）本発明の薬剤または抗体構築物と、前記被験体からの生体サンプルとを接触させることと；
（ｉｉ）前記サンプルに結合していない前記薬剤または抗体構築物を分離することと；
（ｉｉｉ）前記生体サンプル中、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物のレベルを検出し、および／または定量化することと；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で検出された、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した前記薬剤または抗体構築物の存在および／または量と、リファレンス値の存在および／または量とを比較することと；
（ｖ）得られた結果と、前記癌のステージとを関連づけることとを含む、方法に関する。
【０１４９】
「薬剤」、「抗体構築物」および「癌」との用語は、すでに従前より詳細に記述されており、これらの定義および特定の実施形態および好ましい実施形態は、参照することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１５０】
この態様は、本発明の診断方法の工程（ｉ）〜（ｖ）を実行するため、その定義および特性は、本発明の癌の層別化方法に等しく適用する。
【０１５１】
「層別化する」との用語は、本明細書で使用される場合、癌が広がることによって進行する程度を決定することを指す。癌は、Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｔａｇｅ  Ｇｒｏｕｐｉｎｇに従って、以下のステージに分類されるだろう。
−ステージ０：本来の場所にとどまっている癌腫
−ステージＩ：癌が体内の一箇所に局在化している。
−ステージＩＩ：癌が局所的に進行している。
−ステージＩＩＩ：これも、癌が局所的に進行している。癌をステージＩＩとするか、ステージＩＩＩとするかは、特定の癌の種類によって変わるだろう。
−ステージＩＶ：癌は多くが転移しているか、または他の臓器または体内全体に広がっている。
【０１５２】
当業者に理解されるように、癌の予後診断は、１００％正しいことが好ましいが、診断または評価される被験体の１００％にとって正しい必要はない。しかし、この用語は、被験体の統計的に有意な割合を、肝臓癌を患っていると特定することができる必要がある。被験体が統計的に有意であるかどうかは、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定などの種々のよく知られた統計的な評価ツールを用い、当業者によってさらなる面倒がない状態で決定することができる。詳細は、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３の中に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０５、０．０１、０．００５であるか、またはさらに小さい。
【０１５３】
「リファレンス値」との用語は、被験体から集めたサンプルから得られた値またはデータを評価するためのリファレンスとして使用される所定の基準を指す。リファレンス値またはリファレンスレベルは、絶対値、相対値、上限または下限を有する値、ある範囲の値、算術平均値、メジアン値、平均値、または特定のコントロールまたはベースライン値と比較した値であってもよい。本発明の癌の層別化方法のリファレンス値は、ステージ０、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶと分類された前記癌を患う被験体から得られたサンプルまたはサンプルプール中に存在するＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０に結合した薬剤または抗体構築物のレベルの値から得ることができる。当業者は、異なるステージに対応する異なるリファレンス値を使用してもよいことを理解するだろう。
【０１５４】
５．医薬組成物
別の態様において、本発明は、治療有効量の
−本発明の薬剤、または
−本発明の抗体構築物、または
−本発明のペプチド、または
−配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または
−配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または
−配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）を、医薬的に許容され得る補形薬または担体と共に含む、医薬組成物（本明細書で以下、「本発明の医薬組成物」）に関する。
【０１５５】
配列番号１４〜１７の配列（但し、前記ポリペプチドは、それぞれ、ヒトＣＤＨ１７、ヒトＣＤＨ５、ヒトＣＤＨ６、ヒトＣＤＨ２０ではない）を含む「薬剤」、「抗体構築物」、「ペプチド」および「ポリペプチド」との用語は、すでに従前より詳細に記述されており、これらの定義および特定の実施形態および好ましい実施形態は、参照することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１５６】
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、被験体への投与のために、治療有効量の本発明の薬剤、抗体構築物、またはペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、または配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）を、医薬的に許容され得る補形薬、担体、アジュバント、または賦形剤と共に含む。ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌をもつ被験体に投与して、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞を殺すか、またはアポトーシスを誘発するために、前記医薬組成物を使用してもよい。
【０１５７】
「治療有効量」との用語は、本発明の医学的な使用およびその定義という観点で詳細に記述されており、特定の実施形態は、参照することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１５８】
「医薬的に許容され得る担体」との用語は、本明細書で使用される場合、医薬投与に適合する任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性薬剤および吸収遅延薬剤などを含むことを意図している。医薬的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野においてよく知られている。従来の媒体または薬剤が上述の活性化合物と不適合である場合を除き、それらの組成物への使用が想定される。許容され得る担体、補形薬、または安定化剤は、使用される投薬量および濃度では受容者にとって非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸のバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩を生成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１５９】
本発明の薬剤、抗体構築物、またはペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）は、同じ製剤内に存在してもよく、または異なる製剤で投与されてもよい。投与は、同時であってもよく、または連続していてもよく、いずれかの順序で効果的であってもよい。
【０１６０】
ある実施形態において、本発明の薬剤、抗体構築物、またはペプチド、または配列番号１４の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ１７ではない）、配列番号１５の配列および／または配列番号１６の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドはヒトＣＤＨ５ではない）、または配列番号１７の配列を含むポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤＨ６でもなく、ヒトＣＤＨ２０でもない）は、前記化合物が体内からすみやかに排泄されてしまわないように保護する担体、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系を含む放出制御型製剤と共に調製される。生分解可能で生体適合性のポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用してもよい。このような製剤を調製するための方法は、当業者には明らかであろう。これらは、当業者によく知られた方法に従って調製することができる。
【０１６１】
別の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物の投与経路は、腫瘍内または非経口である。
【０１６２】
「非経口」との用語は、本明細書で使用される場合、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣への投与を含む。静脈内形態の非経口投与が、一般的に好ましい。これに加え、本発明の医薬組成物は、例えば、投薬量を減らしつつのパルス注入によって適切に投与される場合がある。好ましくは、投薬は、投与が一時的であるか継続的であるかに部分的に依存して、注射によって与えられ、最も好ましくは、静脈注射または皮下注射によって与えられる。
【０１６３】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、非経口投与に合うように作られていてもよく、例えば、適切な単位投薬形態の滅菌溶液、懸濁物または凍結乾燥した製品であってもよい。注射可能な使用に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌の注射可能な溶液または分散物をその場で調製するための分散物および滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために、適切な担体としては、生理食塩水、静菌性水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、容易に注射可能な状態で存在する程度まで流体であるべきである。製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなどの医薬的に許容され得るポリオール、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であってもよい。例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径を管理することによって、界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用からの保護は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌剤および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合に、等張性薬剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールおよび塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましいだろう。注射可能な組成物の長時間にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチンを組成物に含むことによってもたらされるだろう。上述の製剤は、スペインおよび米国の薬局方、および同様の参考文書に記載され、または引用されるような標準的な方法によって調製されるだろう。
【０１６４】
滅菌の注射可能な溶液は、上に列挙した成分のいずれかまたは組み合わせと共に、必要な量の活性化合物（例えば、薬剤、抗体構築物、ペプチドまたはポリペプチド）を適切な溶媒に組み込み、必要な場合にはその後に濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散物は、活性化合物を、上に列挙した成分から、基本的な分散媒体と必要な他の成分を含む滅菌賦形剤に組み込むことによって調製される。滅菌の注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、あらかじめ滅菌濾過した溶液から、活性成分と、さらなる望ましい成分とを含む粉末が得られる。
【０１６５】
簡単な投与、均一な投与のために、単位投薬形態で医薬組成物を配合することが特に有利である。本明細書で使用される単位投薬形態は、治療される被験体のための単回投薬に適した物理的に別個の単位を指す。それぞれの単位は、必要な医薬担体と組み合わせて、望ましい治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物（例えば、薬剤、抗体構築物、ペプチドまたはポリペプチド）を含有する。本発明の単位投薬形態の仕様は、活性化合物に固有の特徴および達成される特定の治療効果、個々の治療のためにこのような活性化合物を混合する当該技術分野に固有の限定によって、また直接的にこれに依存して示される。
【０１６６】
一般的に、本発明の抗体の有効な投与量は、選択する化合物の相対的な効能、治療される障害の重篤度、罹患者の体重に依存するだろう。しかし、活性化合物は、典型的には、１日に１回以上、例えば、１日に１回、２回、３回または４回、０．００１〜１，０００ｍｇ／体重ｋｇ／日、好ましくは、約０．０１〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ／日、最も好ましくは、約０．０５〜１０ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲の典型的な１日の投薬量で投与されるだろう。
【０１６７】
医薬組成物は、投与のための指示と共に、容器、袋、ディスペンサーの中に入っていてもよい。
【０１６８】
６．使用
本発明の別の態様は、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌のマーカーとしての、ヒトカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の残基６０３〜６０５を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン５（ＣＤＨ５）の残基２３６〜２３８または残基２９９〜３０１を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン６（ＣＤＨ６）の残基８３〜８５を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン２０（ＣＤＨ２０）の残基８９〜９１を含むエピトープの使用に関する。
【０１６９】
特定の実施形態において、前記ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌は、メラノーマ、乳癌、または消化器癌である。
【０１７０】
好ましい実施形態において、前記消化器癌は、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌および食道癌腫からなる群から選択される。
【０１７１】
本発明の別の態様は、ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌の転移性のマーカーとしての、ヒトカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の残基６０３〜６０５を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン５（ＣＤＨ５）の残基２３６〜２３８または残基２９９〜３０１を含むエピトープ、および／またはヒトカドヘリン６（ＣＤＨ６）の残基８３〜８５を含むエピトープおよび／またはヒトカドヘリン２０（ＣＤＨ２０）の残基８９〜９１を含むエピトープの使用に関する。
【０１７２】
特定の実施形態において、前記ＣＤＨ１７および／またはＣＤＨ５および／またはＣＤＨ６および／またはＣＤＨ２０を発現する細胞が関与する癌は、メラノーマ、乳癌、または消化器癌である。
【０１７３】
好ましい実施形態において、前記消化器癌は、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌および食道癌腫からなる群から選択される。
【０１７４】
本発明の種々の実施形態を以下の実施例によって説明し、これらの実施例は、説明のために選ばれたものであり、本明細書に記載する本発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【０１７５】
材料および方法
細胞株、抗体およびペプチド
ＫＭ１２ＳＭヒト結腸癌細胞は、Ｄｒ  Ｆｉｄｌｅｒ’ｓ  ｌａｂ（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、米国）から直接購入した。ＲＫＯヒト結腸癌細胞および膵臓癌細胞株であるＢｘＰｃ３、Ｃａｐａｎ−１およびＰＡＮＣ１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。７８６−Ｏ淡明細胞型腎細胞癌腫細胞株は、Ｍ．Ｊ．Ｃａｌｚａｄａ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｐｒｉｎｃｅｓａ、マドリッド、スペイン）のご厚意により提供された。本発明者らは、コントロールとして、ＭＣＦ７乳癌腫細胞株、ＳＫ−ＭＥＬ−１０３およびＡ３７５メラノーマ細胞株も使用した。全ての細胞株は、購入してから６ヶ月以内に使用し、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と抗生物質を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、５％  ＣＯ２の加湿雰囲気内、３７℃で培養された。
【０１７６】
抗−ＣＤＨ６、抗−ＣＤＨ５、抗−ＦＡＫ、抗−ＲｈｏＧＤＩ、抗−α２、β１、α６、β４およびαｖインテグリンといった抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗−ｐＦＡＫ、ＥＲＫ１／２、ｐＥＲＫ１／２およびブロッキング抗−β１インテグリン（Ｌｉａ  １／２．１）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから得た。高アフィニティ構造に特異的な抗−β１インテグリン（ＨＵＴＳ−２１）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。抗−ＣＤＨ１７抗体（Ｈ−１６７およびＣ−１７）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ＬＩ−カドヘリン（Ｈ−１６７）は、ヒト由来のＬＩ−カドヘリンのＣ末端にマッピングするアミノ酸６６６〜８３２に対するウサギポリクローナル抗体である。ＬＩ−カドヘリン（Ｃ−１７）は、ヒト由来のＬＩ−カドヘリンのＣ末端でのペプチドマッピングに対する、アフィニティ精製されたヤギポリクローナル抗体である。抗ＣＤＨ１７（番号１４１７１３）は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから得られ、このタンパク質の完全な細胞外ドメインを用いて免疫付与した後に得られた。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の抗ＣＤＨ１７ドメイン６は、以下に記載するように得られた。合成ペプチドＲＧＤＳは、Ｓｉｇｍａから購入した。ＲＡＤＳ（配列番号１８）、ＳＩＬＲＧＤＹＱＤ（ＣＤＨ５）（配列番号１９）、ＲＡＩＲＲＧＤＴＥＧ（ＣＤＨ１６）（配列番号２０）およびＶＳＬＲＧＤＴＲＧ（ＣＤＨ１７）（配列番号１）といったペプチドは、Ｆｏｃｕｓ  ＸＣ装置（ＡＡＰＰｔｅｃ）を用いた固相化学を用いて合成された。
【０１７７】
ＣＤＨ７（ｗｔおよび変異型）の組換えドメイン６は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ内で産生され、標準的な手順に従って精製された。
【０１７８】
（ＣＤＨ１７のクローニングおよび突然変異誘発、タンパク質精製およびトランスフェクション）
ヒト大腸癌細胞株Ｃａｃｏ２由来のＣＤＨ１７  ｍＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって逆転写され、ｃＤＮＡは、プライマー：５’−ＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＡＧＴＧ−３’（配列番号２１）および５’−ＣＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＧＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号２２）を用いるＲＴ−ＰＣＲによって増幅された。
【０１７９】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含むＡＧ−３’。ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩを用いて消化し、ｐｃＤＮＡ３．１内にクローン作製した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、プライマー：５’−ＧＧＡＣＡＴＡＡＧＣＴＡＴＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧ−３’（配列番号２３）および５’−ＣＣＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＴＧＴＣＣ−３’（配列番号２４）を用いて、モチーフ６０３−ＲＧＤ−６０５をＲＡＤに変えるＣＤＨ１７の突然変異誘発を行った。ＤＮＡシークエンシングによって変異の存在を確認した。ＪｅｔＰｒｉｍｅ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用い、ｐｃＤＮＡ３．１中、ＣＤＨ１７野生型（ｗｔ）またはＣＤＨ１７  ＲＡＤを用いて細胞を一過的にトランスフェクトした。４８時間後に、トランスフェクタントのフラクションを溶解させ、ウェスタンブロットによって分析し、ＣＤＨ１７の発現を評価した。コントロールｓｉＲＮＡおよびＣＤＨ１７に対するｓｉＲＮＡ（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１６６３５４）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【０１８０】
標準的な手順に従って、昆虫細胞中、バキュロウイルス系を用いてＣＤＨ１７の組換えエクトドメイン（ｗｔおよびＲＡＤ変異型）を発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ中で組換えドメイン６（ｗｔおよび変異型）を産生し、標準的な手順に従って精製した。
【０１８１】
逆転写−ＰＣＲ
ＣＤＨ６およびＣＤＨ２０の増幅のために、Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ）中、細胞を溶解させた。ＲＮＡを抽出し、ＭｏＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて逆転写した。プライマー５’−ＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＣＡＧＧＡＡＡＣ−３’（配列番号２５）および５’−ＴＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＴＧ−３’（配列番号２６）を用い、ＰＣＲによってＣＤＨ６の増幅を行った。ＣＤＨ２０のために、プライマーは、５’−ＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＡ−３’（配列番号２７）および５’−ＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＧ−３’（配列番号２８）であった。ＰＣＲプロフィールは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で４５秒を３３サイクルであった。
【０１８２】
細胞接着および可溶性結合アッセイ
細胞接着のために、９６ウェルプレートを、コーティングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．８）中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（４μＬ／ｍＬ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＩＶ型コラーゲン（５μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２０時間コーティングし、接着培地（血清を含まないＤＭＥＭ中、０．４％  ＢＳＡ）と共に２時間インキュベートし、非特異的な結合をブロックした。血清を用いずに５時間かけて細胞を飢餓状態にして、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、ＰＢＳ中の２ｍＭ  ＥＤＴＡで切り離し、血清を含まないＤＭＥＭに再懸濁させ、１００μＬ中７×１０４個の細胞をプレートに３個１組で加え、次いで、２５分間インキュベートした。ＤＭＥＭで３回洗浄することによって、接着していない細胞を除去した。結合した細胞を、蛍光分析機（ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙ）を用いて定量化した。
【０１８３】
可溶性結合アッセイのために細胞を切り離し、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋を含まないＨＢＳＳ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ＣＤＨ１７エクトドメイン（１０μｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４０分間インキュベートし、洗浄し、抗−ＣＤＨ１７抗体と共に４℃でインキュベートし、再び洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤＨ１７のドメイン６（２〜１０μｇ／ｍＬ）に対する細胞接着のために、９６ウェルマイクロタイタープレート中、接着アッセイを上述のように、但し、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含有する培地中で行い、マルチチャンネルピペットを用いて細胞を優しく洗浄した。ブロッキングアッセイのために、接着の前に細胞を抗−β１インテグリン（５μｇ／ｍＬ）と共に１０分間あらかじめインキュベートしておいた。
【０１８４】
α２β１インテグリンのためのアフィニティクロマトグラフィー
１ｍｇの精製されたＣＤＨ１７のドメイン６  ｗｔをＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ  １ｍＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続した。ＫＭ１２ＳＭ細胞抽出物（２０ｍｇ）をこのカラムにロードし、１０分間インキュベートし、ＡＫＴＡシステムを用いて流速０．４ｍＬ／分で、１０ｍＬの溶解バッファーで洗浄した。１．５ｍＭ  ＲＧＤＳペプチド（配列番号２９）５ｍＬを用いて溶出を行った。
【０１８５】
細胞分離
タンパク質Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングされた磁気ビーズを、１０μｇの抗−α２インテグリンと共に４℃で１時間インキュベートした。α２インテグリンについてノックダウンされた４×１０５個のＲＫＯ細胞またはノックダウンされていないこの細胞を、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡに再懸濁させ、上述のコーティングされたビーズと共に４℃で４０分間インキュベートした。細胞を磁気によって分離し、それぞれの集合に、抗−α２インテグリン抗体を用いたウェスタンブロット分析を行い、単離効率を評価した。
【０１８６】
フローサイトメトリー
ＰＢＳ中の２ｍＭ  ＥＤＴＡで細胞を切り離し、一次抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８で標識された二次抗体（抗−マウスＩｇＧまたは抗−ウサギＩｇＧ、Ｄａｋｏ）と共にインキュベートした。Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ細胞蛍光測定機で蛍光を測定した。指定した抗体の平均蛍光強度をそれぞれのパネルの中に示している。リファレンスとして、無関係のコントロール抗体（抗−カドヘリン−１１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、０．３の平均蛍光強度を与えた。
【０１８７】
２．５×１０５個のＫＭ１２ＳＭ細胞を含有する容積５０Ｌを、それぞれのハイブリドーマクローンの希釈していない上清５０μＬと混合し、ＲＴで３０分間インキュベートした。インキュベート後、２００μＬのＰＢＳ−３％ＦＢＳで細胞を２回洗浄し、遠心分離処理し（４℃、１０００×ｇで１０分間）、暗状態、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１／２０００希釈物５０μＬ存在下、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析までは暗状態に維持した。非特異的な結合をモニタリングするために内部コントロールが含まれていたが、ここで、正常なＢＡＬＢ／ｃマウス血清（１：１００）と共に細胞をインキュベートし、上と同じ二次試薬および手順を用いて分析した。
【０１８８】
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）細胞分析機（ＢＤ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。データの獲得、保存および分析のためにＣｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウェアパッケージを使用した。サンプルあたり少なくとも１０，０００の事象を獲得し、その特定の前方（ＦＳＣ）および側方（ＳＳＣ）光散乱特性に基づいて細胞を同定した。それぞれのアッセイから得た標識された細胞の相対的な蛍光強度（ＦＬ−１）を、１つのヒストグラムチャートを用い、陽性蛍光細胞の割合として決定した。非特異的な結合境界値として、内部コントロールのヒストグラム分布にマーカーを設定した。
【０１８９】
細胞凝集アッセイ
ＰＢＳ中の２ｍＭ  ＥＤＴＡで１０５個の細胞を切り離し、１００μＬのＤＭＥＭに再懸濁させ、３０ｒｐｍで一定に振とうしつつ、３７℃で３０分間かけて凝集させた。５箇所の異なる領域において、顕微鏡で全細胞および凝集物を生成する細胞を計測した。
【０１９０】
増殖アッセイ
ＫＭ１２ＳＭ細胞またはＲＫＯ細胞を９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルで接種し、０．５％血清を含むＤＭＥＭ中、３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、その後、Ｔｈｙｚｏｌｙｌ  Ｂｌｕｅ  Ｔｒｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）（０．６ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に１時間インキュベートした。５６０ｎｍでの吸光度と、時間点０に集めたコントロール細胞との比較によって細胞増殖を決定した。
【０１９１】
ウェスタンブロットおよび免疫沈降
４時間かけて細胞を飢餓状態にし、ＣＤＨ１７のドメイン６でコーティングされたプレートに４５分間かけて結合させた。次いで、細胞を切り離し、洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中、１％  Ｉｇｅｐａｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌで溶解させた。タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離し、ニトロセルロース膜に移し、次いで、一次抗体（１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、その後、ＨＲＰ−抗−マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＨＲＰ−抗−ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかと共にインキュベートした。反応性タンパク質を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて視覚化した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてデンシトメトリー分析を行った。免疫沈降のために、細胞を溶解させ、５００μｇの細胞溶解物を、示される抗体（５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。免疫複合体は、５０μｌのタンパク質Ｇ−セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって捕捉された。洗浄後、サンプルをローディングバッファーに再懸濁させ、５分間沸騰させ、遠心分離処理し、その後、ウェスタンブロット分析のために１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。
【０１９２】
免疫組織染色
Ｆｕｎｄａｃｉｏｎ  Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｄｉａｚ（マドリッド、スペイン）において、膵臓癌について２００３年から２０１３年の間に診断し、治療した全４８人の患者を、この試験のために使用した。全ての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得て、必要な場合、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｆｕｎｄａｃｉｏｎ  Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｄｉａｚ（マドリッド）のＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認を受けた。既に記載したようにサンプルを固定し、染色した。
【０１９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
Ｓｗｉｓｓヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを行った。Ｃｏｎｓｅｊｏ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎｅｓ  Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｓ（ＣＳＩＣ、マドリッド、スペイン）のＥｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、マウスを用いた実験研究に使用するプロトコルを承認した。肝臓集積アッセイを既に記載したように行った。簡単に言うと、ＣＤＨ１７  ｗｔ、ＲＡＤまたは空のベクター（ｍｏｃｋ）をコードするベクターでトランスフェクトされた１０６個のＫＭ１２ＳＭ細胞またはＲＫＯ細胞をマウス（ｎ＝３）に脾臓内接種し、２４時間後に安楽死させた。ＴＲＩｚｏｌを用いてマウスの肝臓からＲＮＡを単離し、逆転写した。ｃＤＮＡに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いた３０サイクルのＰＣＲを行い、ハウスキーピング遺伝子であるヒトＧＡＰＤＨを増幅させた。ローディングコントロールとして、マウスβ−アクチンの増幅を行った。異種移植のために、ヌードマウス（ｎ＝３）において、０．１％グルコースを含むＰＢＳ中、５×１０６個のＫＭ１２ＳＭ細胞またはＲＫＯ細胞の皮下注射によって腫瘍を誘発させた。１０日後、マウスを安楽死させ、腫瘍を切開し、重さを測った。
【０１９４】
統計学的分析
ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較試験によってデータを分析した。両方の分析において、有意性の許容され得る最小レベルはｐ＜０．０５であった。
【０１９５】
マウスモノクローナル抗体の免疫付与および調製
４匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＣＤＨ１７抗原として、ＯＶＡと接合したペプチドＣＤＨ１７（ＶＳＬＲＧＤＴＲＧ）（配列番号１）を用い、腹腔内（ｉｐ）で３回免疫付与した。第１に、ペプチド−ＯＶＡ  ５０μｇを完全フロイントアジュバントに乳化させ、次いで、ペプチド−ＯＶＡ  ２５μｇを含む２回の注射を不完全フロイントアジュバントに乳化させた。それぞれの免疫付与の間の期間は、１５日間であった。３回目の免疫付与の後に、マウスにおいて、間接的なＥＬＩＳＡ抗体タイター抗−ペプチドによって決定するための出血を５日間行った。本発明者らは、活性化アッセイのβ−１インテグリンにおいて免疫付与されたマウス由来のＣＩＢポリクローナル血清の評価も、このインテグリンの高アフィニティ形態を認識する抗体を用いて行い、フローサイトメーターで測定した（以下を参照）。
【０１９６】
１回目の出血から１０日後、動物（３番）を脾臓細胞のドナーとして選択し、この動物は、２５μｇのペプチド−ＯＶＡの注射を受けた（ｉｐ）。３日後、脾臓を取り出し、さらなるアッセイのポジティブコントロールとして、血清から血液サンプルを採取した。マウス骨髄腫ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４の細胞株を融合のために選択した。ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって記載される手順に従って融合工程を行い、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ４０００）を融合薬剤として使用した。骨髄腫／脾臓細胞の比率は１を使用した。融合後、完全選択的ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）中、９６ウェルプレートに細胞を２×１０５細胞／ウェルの密度で接種した。融合してから５日後または６日後から開始し、潜在的な抗−ペプチド抗体ＣＤＨ１７を分泌するハイブリドーマのクローンを観察することができた。産生するクローンの選択は、以下に従って行った。
・Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現したＣＤＨ１７タンパク質に対する間接的なＥＬＩＳＡ
・ＢＳＡに接続したペプチドＶＳＬＲＧＤＴＲＧ（配列番号１）に対する間接的なＥＬＩＳＡ
・ＫＭ１２ＳＭ細胞に対する直接的なフローサイトメトリー
・阻害アッセイにおけるフローサイトメトリー
【０１９７】
ＢＳＡに接続したＣＤＨ１７  ＲＧＤペプチドに対する間接的なＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、炭酸バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．６）中、ＢＳＡに接続したＣＤＨ１７ＲＧＤペプチド（ＶＳＬＲＧＤＴＲＧ）（配列番号１）の５０μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬ溶液を加え、４℃で終夜インキュベートすることによってコーティングした。コーティングされたプレートを、洗浄バッファー（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ  １５０μＬを各ウェルに加え、非特異的な結合を減らした。このプレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、それぞれのクローンの希釈していない上清５０μＬを、コーティングされたウェルに加えた。このプレートを３７℃で２時間インキュベートし、洗浄バッファーで３回洗浄した。次いで、それぞれのウェルに、ＨＲＰに接合したヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１／２０００希釈物５０μＬを加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄バッファーで５回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。５０μＬ／ウェルのＨ２ＳＯ４（２Ｎ）を加えることによって、１０分後に色の発色を止めた。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０１９８】
β１インテグリンの高アフィニティ構造状態の決定
ＰＢＳ中の２ｍｍのＥＤＴＡを用いてＲＫＯ細胞を切り離し、ＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭに再懸濁させ、免疫血清またはコントロール血清（１：５０に希釈した）存在下、カドヘリン５由来のＲＧＤモチーフとフランキング配列（ドメイン２のＲＧＤモチーフの場合、配列番号３７（ＣＤＨ５Ａ）、ドメイン３のＲＧＤモチーフの場合、配列番号１９（ＣＤＨ５Ｂ））、カドヘリン６（配列番号３８）、カドヘリン１７（ＶＳＬＲＧＤＴＲＧ）（配列番号１）およびカドヘリン２０（配列番号３９）、カドヘリン１６（配列番号３１、ＲＡＩＲＧＤＴＥＧ）を含む９−アミノ酸ペプチドと共に３７℃で２５分間インキュベートした。インキュベート後、高アフィニティ構造の抗体（Ｈｕｔｓ２１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＡｌｅｘａ  ４８８に接続した抗−マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ）において、抗体−β１インテグリンを用い、細胞にフローサイトメトリーアッセイを行った。Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ細胞蛍光測定法で蛍光を分析した。指定した抗体の平均蛍光強度をそれぞれのパネルの中に示している。リファレンスとして、無関係のコントロール抗体は、０．３の平均蛍光強度を与えた。
【０１９９】
または、ＲＫＯ細胞を４時間かけて飢餓状態にして、ＰＢＳ中のＥＤＴＡ  ２ｍＭを用いて切り離し、１μｇ／ｍＬの以下のペプチドを含む、血清を含まないＤＭＥＭ中でインキュベートした。ＲＧＤモチーフと、カドヘリン１７（配列番号１）に対応するフランキング配列と、カドヘリン５中に存在する２つのモチーフ（ドメイン２のＲＧＤモチーフの場合、配列番号３７（ＣＤＨ５Ａ）、ドメイン３のＲＧＤモチーフの場合、配列番号１９（ＣＤＨ５Ｂ））を含む９ａａ  ペプチド、それぞれＣＤＨ１７、ＳＬＲＧＤＴＲ（配列番号３２）およびＬＲＧＤＴ（配列番号１４）の配列に対応するＲＧＤモチーフのそれぞれの側にそれぞれ２ａａまたは１ａａを含む７ａａおよび５ａａのペプチド。同時に、示される抗−ＣＤＨ１７  ＲＧＤモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）に対し、細胞をインキュベートした。４０分後、細胞を洗浄し、高アフィニティ構造でβ１−インテグリンに結合するＨＵＴＳ２１抗体を用いるフローサイトメトリーアッセイを行った。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）血球計算器（ＢＤ）でデータを集め、９ａａのＣＤＨ１７  ＲＧＤペプチド（配列番号１）によって誘発されるβ１−インテグリン活性化の％として表した。
【０２００】
ハイブリドーマ由来の抗体可変領域のクローニング
クローンＰＡ３８３−１２．４．１、ＰＡ３８３−２５．４．１（Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）ＧｍｂＨに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６で寄託されたリファレンスＰＡ３８３−２５．４．１を含むハイブリドーマ細胞株）、ＰＡ３８３−６．６．１およびＰＡ３８３−６．５．２由来の抗−カドヘリン１７のＲＧＤ−ドメインハイブリドーマ細胞を、Ｌ−グルタミンおよび炭酸水素ナトリウム（Ｒ０８８３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含み、１０％胎児ウシ血清（Ｆ７５２４、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（Ｐ４４５８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中、５％  ＣＯ２中、３７℃で単層として成長させた。ｍＲＮＡ抽出のためにハイブリドーマ細胞を集め、Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ（ＩＳＯＱ５、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）のためのＩｓｏＱｕｉｃｋ（商標）Ｋｉｔを用い、上清からそれぞれの分泌したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のアイソタイプを決定した。
【０２０１】
ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（１５５９６−０２６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびクロロホルム（１．０２４４５．１０００、Ｍｅｒｃｋ）を用い、３×１０７細胞からそれぞれのハイブリドーマの全ＲＮＡを抽出し、その後、遠心分離処理によって水相を分離した。次いで、７０％エタノール（１．００９８３．１０００、Ｍｅｒｃｋ）を用いた沈殿によってｍＲＮＡを単離し、製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（７４１０４、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。精製されたｍＲＮＡの濃度および純度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ  ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて評価され、妥当な２６０／２８０および２６０／２３０の比率を示している。それぞれのハイブリドーマからの精製されたｍＲＮＡの一体性は、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた分析によって確認された。
【０２０２】
それぞれのハイブリドーマから得られた約５μｇのｍＲＮＡを、１μｌ  オリゴ（ｄＴ）２０プライマー（１８４１８−０２０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１μｌ  ｄＮＴＰ（Ｒ０１９２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が入ったＰＣＲ管に加え、超純水を加え、中間の反応容積１３μｌに達する。６５℃、５分間の変性の後、4μｌの５×第１の鎖バッファー、１μｌ  ０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μｌ  ＲＮａｓｅＯＵＴ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ阻害剤（１０７７７−０１９、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１μｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（１８０８０−０９３、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、逆転写のためにそれぞれの管に加え、２０μｌの最終的な反応容積に達し、その後、２５℃で５分間、５０℃で６０分、７０℃で１５分を１サイクル行った。最後に、１μｌのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｈ（１８０２１−０１４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をこの管に加え、反応物を３７℃で２０分間インキュベートした。１μｌのそれぞれの反応物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０２０３】
いくつかの市販のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＶＨおよびＶＬの増幅のために首尾良く使用された。ハイブリドーマからのＶＬの増幅のために、アイソタイプに従って、λプライマーまたはκプライマーのいずれかを選択した（Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１：３５−５５）。ＶＬの増幅のために１μｌのｃＤＮＡ反応物、０．８μｌのＶＬ＿Ｂａｃｋおよび０．８μｌのＶＬ＿Ｆｏｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘｅｓを含むか、またはＶＨの増幅のために０．８μｌのＶＨ＿Ｂａｃｋおよび０．８μｌのＶＨ＿Ｆｏｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘｅｓ、２μｌのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、０．５μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、４μｌのベタインおよび製造業者によって供給された２μｌの反応バッファー１０×を含む２０μｌの容積でＰＣＲ反応を行った。
【０２０４】
９４℃で３分間の変性の後、０．１５μｌのＫＯＤ（２．５単位／μｌ）ＤＮＡポリメラーゼ（７１０８５−３、Ｎｏｖａｇｅｎ）を加え、その後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分を３２サイクル、７２℃で７分を１サイクル行った。１μｌのそれぞれのＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）ＧｍｂＨに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６で寄託されたハイブリドーマＰＡ３８３−２５．４．１からのＶＨおよびＶＬの増幅は可能ではなかった。
【０２０５】
ＶＬおよびＶＨの全長ＰＣＲ産物は、製造業者の指示に従って、ＧｅｎｅＪＥＴ（商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｋ０６９１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と組み合わせて、分取アガロースゲル電気泳動によって精製された。
【０２０６】
ゲルによって精製されたＶＬフラグメントおよびＶＨフラグメントを、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（Ａ１３８０、Ｐｒｏｍｅｇａ）で、製造業者の指示に従って、別個にクローン作製し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ａ１３８０、Ｐｒｏｍｅｇａ）の中で形質転換した。ＰＣＲ反応によってコロニー分析を行った。
【０２０７】
アンピシリン（Ａ９５１８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むルリアブロス培地（１５５１、Ｐｒｏｎａｄｉｓａ）中、ＰＣＲ陽性コロニーを培養し、成長させ、その後、ＧｅｎｅＪＥＴ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｋ０５０３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、製造業者の指示に従って、プラスミドＤＮＡ抽出を行った。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  ＤｙｅＴＭ  ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒシステムおよびＡＢＩ  ３７３０マルチキャピラリーＤＮＡ分析機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、シークエンシングによって核酸配列を決定した。Ｇｅｏｓｐｉｚａ’ｓ  ＦｉｎｃｈＴＶソフトウェアを使用し、ＷｉｎｄｏｗｓでＤＮＡ配列を観察し、分析した。
【０２０８】
メラノーマ細胞株および乳癌細胞株におけるＣＤＨ５の発現
乳癌（ＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）またはメラノーマ（ＭｅＷｏ、Ｍｅｌ５７、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＳＫ−ＭＥＬ−１０３、ＳＫ−ＭＥＬ−１４７、Ａ３７３、ＢＬＭ）、および不死化したメラニン細胞（Ｍｅｌ  ＳＴＶ）由来の示されるヒト細胞株を溶解させ、５０μｇの抽出物をＰＡＧＥ−ＳＤＳによって解像し、抗−ＣＤＨ５抗体を用いるウェスタンブロットを行った。同じブロットを再びプローブで処理し、抗−αチューブリン抗体と共にインキュベートし、タンパク質の合計量を評価した。
【０２０９】
実施例１：ヒトＣＤＨ１７配列は、ＲＧＤモチーフを含む
３１種のヒトカドヘリン遺伝子の配列を見直した後、ＲＧＤモチーフは、ＣＤＨ１７およびＣＤＨ１６の細胞外ドメインの中に見出された。ＲＧＤモチーフを含む他のカドヘリンは、ＶＥ−カドヘリン（ＣＤＨ５）、胎児腎臓Ｋ−カドヘリン（ＣＤＨ６）およびＣＤＨ２０であった。これらは全てＩＩ型の典型的なカドヘリンに分類される。ＲＧＤモチーフは、ＣＤＨ１７のドメイン６およびＣＤＨ１６のドメイン５に存在した（図１Ａ）。オルソロガスなＣＤＨ１７の分析は、ＣＤＨ１７中のＲＧＤモチーフが、ある種の哺乳動物に排他的に存在することを示した（データは示さず）。例えば、マウスＣＤＨ１７は、ＲＧＤモチーフを含んでいない。ＲＧＤのフランキング配列（図１Ａ）は、フィブロネクチンのようなインテグリンリガンドのための他の報告されているコンセンサス配列とは異なっている。本発明者らの結腸癌細胞におけるさらなるカドヘリンを捨てるために、本発明者らは、ウェスタンブロットまたはＰＣＲのいずれかによって、他のＲＧＤカドヘリンの発現を試験した。ＲＫＯ細胞およびＫＭ１２ＳＭ細胞は、ＣＤＨ６、ＣＤＨ１６またはＣＤＨ２０を発現しなかった。ＣＤＨ５は、ＫＭ１２ＳＭ細胞でわずかに検出されたが、ＲＫＯ細胞では検出されなかった（図１Ｂ）。乳癌、腎臓癌およびメラノーマの癌細胞をポジティブコントロールとして使用した。
【０２１０】
ＣＤＨ１７の構造は知られていないが、ＲＧＤモチーフは、２つの異なるバイオインフォマティクス手法を用い、露出していると予測される。Ｊｐｒｅｄ  ３（Ｃｏｌｅら、２００８、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６：Ｗ１９７−２０１）によれば、ＣＤＨ１７のドメイン６は、ＣＤＨ１のドメイン２の既知の構造と最も有意にマッチした。両ドメインのアラインメントは、ＲＧＤモチーフが、ＣＤＨ１の露出したＷＲＤ残基（３７２〜３７４）とマッチすることを示した。したがって、ＮｅｔＳｕｒｆＰソフトウェア（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２００９、ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：５１）は、タンパク質残基の表面からの近づきやすさを計算し、ＣＤＨ１７の中のＲＧＤモチーフの露出を予測した。これらの予測は、タンパク質−タンパク質相互作用のためのＲＧＤモチーフの近づきやすさを示唆している。
【０２１１】
実施例２：ＣＤＨ１７中のＲＧＤの変異は、大腸癌細胞の接着と増殖を低下させるが、凝集には影響を与えない
大腸癌細胞に対するＲＧＤモチーフの影響を調べるために、野生型ＣＤＨ１７（ＣＤＨ１７−ｗｔ）またはＲＡＤ変異体（ＣＤＨ１７−ＲＡＤ）をコードするベクターを使用し、ＫＭ１２ＳＭおよびＲＫＯのヒト大腸癌細胞をトランスフェクトした。低分化型ＲＫＯ細胞は、ＣＤＨ１７を発現しない非転移性の細胞であり、一方、ＫＭ１２ＳＭは、ＣＤＨ１７を発現する高頻度転移性の結腸癌細胞である。トランスフェクトの後、野生型およびＲＡＤ変異型のＣＤＨ１７は、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリーによって検出される場合、両細胞株において同レベルで過剰発現した（図２Ａ、Ｂ）。第１に、本発明者らは、ＣＤＨ１７を発現する細胞の凝集を調べた。ＲＫＯ  ＣＤＨ１７トランスフェクタントは、切り離し後に、ｍｏｃｋ細胞に対し、細胞凝集の顕著な増加を示した（図２Ｃ）。この増加は、ＣＤＨ１７  ＲＡＤトランスフェクタントが凝集において同じ増加を示したため、ＲＧＤとは独立していた。この結果は、他のカドヘリンについて記載されるように、ＣＤＨ１７の同型の凝集能力を示唆している。
【０２１２】
次いで、本発明者らは、マトリゲルまたはＩＶ型コラーゲンに対する細胞接着に対するトランスフェクタントの能力を評価した。両細胞株におけるＣＤＨ１７−ｗｔの過剰発現は、両方の種類の細胞外マトリックスに対する接着を高めた（図２Ｄ）。これとは対照的に、ＣＤＨ１７−ＲＡＤトランスフェクタントは、ｍｏｃｋトランスフェクタントと同様に基本的な接着を示し、このことは、細胞接着を高めるのにＲＧＤモチーフが必要であったことを示唆している。また、ＣＤＨ１７サイレンシングは、ＫＭ１２ＳＭ細胞の接着を顕著に下げた（図２Ｄ）。細胞接着は、ＫＭ１２ＳＭ細胞を用いた接着アッセイにおいて、それぞれのインテグリンサブユニットに対するｓｉＲＮＡを用いて示される場合、α２β１インテグリンを必要としたが、α６β４インテグリンは必要としなかった（図２Ｅ、Ｆ）。最後に、ＣＤＨ１７−ｗｔを発現する細胞は、増殖の顕著な増加を示し、一方、ＣＤＨ１７−ＲＡＤ変異体は、細胞増殖を増加させることができなかった（図２Ｇ）。まとめると、これらのデータは、ＲＧＤモチーフの存在が、結腸癌細胞において、α２β１インテグリンによって、細胞の接着と増殖を高めたが、同型の凝集には影響を与えないことを示す。
【０２１３】
実施例３：ＣＤＨ１７  ＲＧＤ結合モチーフは、α２β１インテグリンのためのリガンドである
以前、本発明者らは、ＣＤＨ１７およびα２β１インテグリンが一緒に免疫沈降することを示した。直接的な相互作用を明らかにするために、本発明者らは、セファロースに対するＣＤＨ１７のドメイン６  ｗｔの接続に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いてα２β１インテグリンを精製しようと決めた。ＫＭ１２ＳＭ溶解物をアフィニティカラムにロードし、十分に洗浄し、このカラムをＲＧＤＳペプチドで溶出させた。溶出したフラクションのウェスタンブロットによって、両方のα２β１インテグリンサブユニットを検出し、ＣＤＨ１７に対するインテグリンの結合およびこの結合におけるＲＧＤモチーフの役割を確認する（図３Ａ）。この会合がＲＧＤに依存することを確認するために、ＣＤＨ１７−ｗｔを用いてトランスフェクトした後、ＲＫＯ細胞においてＣＤＨ１７をα２β１インテグリンと一緒に免疫沈降させた。対照的に、ＲＫＯにおいて、トランスフェクトされたＣＤＨ１７−ＲＡＤは、α２インテグリンを用いた免疫沈降の後に検出されず、逆も真であった（図３Ｂ）。ＣＤＨ１７−ＲＧＤ  ｗｔが存在したとき、α２β１インテグリンは、ＦＡＫと会合したが、ＲＡＤ変異後には会合しなかった。したがって、シグナル伝達を開始するために、ＲＧＤモチーフの結合は、インテグリン−ＦＡＫの会合にとって重要であった。αｖインテグリンを捨てるために、本発明者らは、さらなる同時免疫沈降を行った。本発明者らは、ＣＤＨ１７−同時免疫沈降においてαｖインテグリンを検出せず、逆も真であった（図３Ｃ）。
【０２１４】
外因性ＣＤＨ１７が、使用するインテグリンのリガンドになり得るかどうかを評価するために、本発明者らは、（ｉ）バキュロウイルス中で発現する、精製された組換えＣＤＨ１７エクトドメイン、（ｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉで発現する組換えＣＤＨ１７のドメイン６（５７１〜６６５）を使用した。これに加え、本発明者らは、エクトドメインおよびドメイン６のＲＡＤ変異体を調製した（図３Ｄ）。インキュベートの後、ＣＤＨ１７エクトドメインは細胞表面に結合した（図３Ｅ）。しかし、ＣＤＨ１７エクトドメインのＲＡＤ変異体形態は、細胞に結合することはできなかった。この結合がα２β１インテグリンに特異的であったことを確認するために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡを用いてα２β１インテグリンおよびα６β４インテグリンの発現を抑制した（図２Ｄ）。ＲＫＯおよびＫＭ１２ＳＭの両方の種類の細胞において、α２β１インテグリンサブユニットのサイレンシングは、ＣＤＨ１７−ＲＧＤエクトドメインの結合を阻害した。しかし、α６β４インテグリンサブユニットのサイレンシングは、ＣＤＨ１７エクトドメインが細胞表面に結合する能力に影響を与えなかった（図３Ｆ）。
【０２１５】
次いで、本発明者らは、組換えドメイン６を細胞接着アッセイのリガンドとして試験した。本発明者らは、ドメイン６でコーティングされたプレートに対する細胞接着を促進するために、ＲＫＯおよびＫＭ１２ＳＭにおいて、２μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬが、それぞれ最適な投薬量であることを発見した（図４Ａ）。さらに、両細胞株において、ＣＤＨ１７のドメイン６  ｗｔに対する細胞接着を阻害するためのＲＧＤＳペプチドの明確な用量依存性の効果が存在した。この競争は、１μＭで開始し、ブロッキング抗体である抗−β１インテグリンを用いて得られる競争と同様であった（図４Ｂ）。対照的に、ＲＡＤＳペプチドは、細胞接着を阻害しなかった（図４Ｂ）。この結果は、ＣＤＨ１７のドメイン６が、ＲＧＤに依存する様式で細胞接着に介在することを示唆している。再び、この結合がインテグリン依存性であったことを確認するために、本発明者らは、上述の４種類のインテグリンサブユニットの発現を抑制した。α２β１インテグリンのサイレンシングのみが、ＣＤＨ１７のドメイン６に対する細胞接着を顕著に阻害した（図４Ｃ）。
【０２１６】
実施例４：β１インテグリン活性化におけるＲＧＤモチーフの役割
インテグリン活性化におけるＲＧＤモチーフの役割を評価するために、本発明者らは、ＣＤＨ１７  ｗｔおよびそのＲＡＤ変異体を含むベクターを用い、両細胞株をトランスフェクトした。α２β１インテグリンの発現は、大腸癌細胞においてＣＤＨ１７の発現レベルを変更することによって影響を受けなかった。しかし、ＣＤＨ１７−ｗｔは、β１インテグリンの高アフィニティ構造を特異的に認識するＨＵＴＳ２１抗体を用いることによって示されるように、ＲＫＯ細胞およびＫＭ１２ＳＭ細胞におけるβ１インテグリンの高アフィニティ構造を増加させた（図５Ａ）。対照的に、ＣＤＨ１７−ＲＡＤでトランスフェクトされた細胞は、ｍｏｃｋ細胞よりも、同様の量の高アフィニティ構造のβ１インテグリンを示した（図５Ａ）。したがって、ＣＤＨ１７中のＲＧＤモチーフは、β１インテグリン活性化に必要な高アフィニティ構造への変化をもたらした。同じ様式で、ＣＤＨ１７エクトドメインまたはドメイン６  ｗｔと共にあらかじめインキュベートすると、高アフィニティ構造におけるβ１インテグリンの量が増え、一方、ＲＡＤ変異体と共にインキュベートしても、影響はなかった（図５Ｂ）。これに加え、本発明者らは、インテグリン活性化に対するＲＧＤフランキング配列の効果を試験した。ＣＤＨ１７ペプチドを除き、本発明者らは、ＣＤＨ１６およびＣＤＨ５のＲＧＤフランキング配列を試験した。ＣＤＨ１７ペプチドの露出によって、両細胞株において高アフィニティ構造β１インテグリンが増えた（図５Ｃ）。細胞がＣＤＨ５ＲＧＤペプチドにさらされているとき、同様の効果が観察された（図５Ｃ）。対照的に、ＣＤＨ１６  ＲＧＤは、β１インテグリン活性化に影響はなかった（図５Ｃ）。これらの結果は、β１インテグリン活性化に対するＲＧＤフランキング配列の関連を確認するものである。
【０２１７】
最後に、本発明者らは、β１インテグリンの高アフィニティ構造への変化が細胞の接着能力を高めるかどうかを評価する。ＣＤＨ１７エクトドメインおよびドメイン６  ｗｔは、マトリゲルに対する細胞接着を顕著に高め、一方、ＲＡＤ変異体は、その基本レベルをほとんど高めなかった（図５Ｄ）。
【０２１８】
実施例５：ＣＤＨ１７  ＲＧＤモチーフは、腫瘍の成長および転移に重要である
本発明者らは、ＣＤＨ１７  ｗｔまたは変異ＲＡＤを含有するＲＫＯ細胞およびＫＭ１２細胞を用い、３個１組でＳｗｉｓｓヌードマウスの皮下接種および脾臓内接種を行った。細胞の脾臓注射から２４時間後にマウスを屠殺し、ＤＮＡ抽出およびＰＣＲ分析のために肝臓を集めた（図６Ａ）。ＣＤＨ１７−ＲＧＤ細胞を接種したマウス由来の肝臓ＤＮＡは、ヒトＧＡＰＤＨプライマーを用いるＰＣＲによって陽性であった。対照的に、ＣＤＨ１７−ＲＡＤ変異体細胞を接種したマウスは、肝臓で無視できないＤＮＡ増幅を示した。皮下接種の後、ＣＤＨ１７  ｗｔ細胞は、かなりの腫瘍を進行させた。対照的に、ＲＡＤ変異体を含む細胞は、コントロールｍｏｃｋと同様の非常に小さな腫瘍を示した（図６Ｂ）。腫瘍の重さは、ＣＤＨ１７−ＲＧＤとＲＡＤ細胞のこれらの差を裏付けた（図６Ｂ）。これらの結果は、結腸癌の腫瘍の成長および転移性の播種において、ＲＧＤモチーフのための重要な役割を裏付けている。
【０２１９】
実施例６：ＣＤＨ１７  ＲＧＤモチーフは、膵臓癌細胞に関係がある
いくつかの膵臓腫瘍において、ＣＤＨ１７の過剰発現が報告されている。ここで、４８人の膵臓癌患者のサンプルセットにおいて、本発明者らは、免疫組織染色によって、腫瘍の６０．４％においてＣＤＨ１７の発現を検出した。ＣＤＨ１７陽性腫瘍の中で、６２．１％が強い染色を示し、このことは、ＣＤＨ１７の過剰発現を示している（図７Ａ）。本発明者らの知見を膵臓癌に拡張することができるかどうかを学ぶために、本発明者らは、ＢｘＰＣ３、ＰＡＮＣ−１およびＣＡＰＡＮの膵臓癌細胞株を使用した。ＰＡＮＣ−１細胞およびＣＡＰＡＮ細胞は、ＣＤＨ１７の発現を示したが、ＢｘＰＣ３は示さなかった（図７Ｂ）。ＣＤＨ１７−ｗｔおよびＣＤＨ１７−ＲＡＤ変異体ベクターを用いたトランスフェクションの後、本発明者らは、接着能力に明らかな差があるのを観察した。ＣＤＨ１７−ｗｔが、上述の３種類の細胞株において明確な増加を引き起こす場合、ＲＡＤ変異体は、基礎レベルを超えて接着は増加しなかった（図７Ｃ）。さらに、細胞増殖は、ＣＤＨ１７−ＲＧＤトランスフェクタントで増加したが、ＣＤＨ１７−ＲＡＤを用いてトランスフェクトされた細胞では増加しなかった（図７Ｄ）。これらの結果は、本発明者らの知見を、膵臓癌のようなＣＤＨ１７を発現する他の癌へと拡張することを裏付けている。
【０２２０】
実施例１〜６の考察
本発明者らは、ヒト７Ｄ−カドヘリン（ＣＤＨ１７）が、インテグリン結合のための新規リガンドとして作用する能力を有するＲＧＤ部位を含むことを発見した。この結論は、以下の観察結果から得られた。（ｉ）ＣＤＨ１７とα２β１インテグリンの相互作用が、ＲＧＤ結合部位の存在を必要としたこと、（ｉｉ）このＲＧＤモチーフが、結腸癌細胞中のα２β１インテグリンに特異的に結合する能力は、ｓｉＲＮＡ実験を含むさまざまな結合アッセイおよび細胞接着アッセイによって裏付けられたこと、（ｉｉｉ）ＣＤＨ１７−ＲＧＤエクトドメインは、結腸癌細胞と結合し、外部から加えたときにβ１インテグリンを活性化することができたこと、（ｉｖ）ｉｎ  ｖｉｖｏ接種の後、変異ＣＤＨ１７  ＲＡＤを発現する腫瘍細胞は、腫瘍の成長と肝臓コロニー化の大幅な遅れを示したこと。まとめると、ＲＧＤは、結腸癌の転移性細胞においてインテグリンの活性化を制御するスイッチとして働く。
【０２２１】
別の関連する問題は、カドヘリン／インテグリン相互作用が「ｃｉｓ」で起こるか、または「ｔｒａｎｓ」で起こるかである。「ｔｒａｎｓ」モデルは、リガンド認識部位であるα２およびβ１サブユニットの界面での接触を容易にするため、連続した細胞表面にＣＤＨ１７が存在すること（図８Ａ）、またはＣＤＨ１７の可溶性エクトドメインの存在（図８Ｂ）を必要とするだろう。本発明者らのデータは、「ｔｒａｎｓ」での相互作用が、可能性が高いことを示唆している。可溶性の組換えエクトドメインを用いたインキュベート、次いで、インテグリン活性化が、細胞表面膜から分子を放出した後のＣＤＨ１７の可溶性形態との相互作用を模倣するためである。さらに、ＣＤＨ１７のみを発現する細胞と、α２インテグリンのみを発現する細胞の同時培養は、２つの細胞間の「ｔｒａｎｓ」相互作用を反映する。ここでもまだ、「ｃｉｓ」での相互作用は、完全に除外することはできない。
【０２２２】
ＣＤＨ５（２個のＲＧＤモチーフを含む）、ＣＤＨ６またはＣＤＨ２０のような他のカドヘリンも、ＲＧＤ結合部位を含み、これらのカドヘリンは、他の種類の癌における癌の転移に重要な役割を果たし、これらのカドヘリンが過剰発現する。ここで、本発明者らは、ＣＤＨ１６ではなく、ＣＤＨ５のＲＧＤもα２β１インテグリンを活性化するという証拠を提供する。そこで、カドヘリンＲＧＤモチーフのフランキング配列は、インテグリンの結合能力に大きな影響を与え、その相互作用に特異性を与える。この仮説と一致して、近年の研究は、癌および血管損傷におけるこれらのカドヘリンの役割を指摘している。ＣＤＨ５およびＣＤＨ６は、血小板凝集の誘発に起因して、それぞれ、癌の進行、血栓形成および血管損傷を促進するようである。いくつかの研究は、侵襲性のヒト乳癌および乳癌モデルにおけるＣＤＨ５の上方制御を報告し、ＣＤＨ５の誘発は、攻撃的なメラノーマにおける血管擬態の原因であった。血小板において、以前の研究から、αＩＩｂβ３インテグリンのための新規リガンドとしてのＣＤＨ６の役割が明らかになっており、この結合が、血小板凝集および血栓形成の原因となる。この相互作用は、転移段階で患者で起こる血栓症の徴候および腫瘍転移に対する血小板の寄与になんらかの役割を果たすだろう。転移の促進のためにＲＧＤを含有するカドヘリンの一般的な機構としてインテグリン結合能力を明確にするために、さらなる実験が必要である。
【０２２３】
ＣＤＨ１７は、他のカドヘリンと同様に、腫瘍の微細環境におけるプロテアーゼ活性の増加に起因して、エクトドメイン放出の標的である。以前の観察は、ＫＭ１２ＳＭ細胞の馴化培地におけるＣＤＨ１７の放出を確認した。ＣＤＨ１７の分泌した可溶性形態は、ＲＧＤドメインを含んでいた。転移性の細胞におけるこの「放出」によって、ＣＤＨ１７は、結腸癌患者の生物流体（血清または血漿）における検出のための候補バイオマーカーとなる。次いで、ＣＤＨ１７は、患者の層別化および標的化治療に有用であろう。
【０２２４】
実施例７：β１インテグリン活性化の阻害能力における、免疫付与のために使用されるＣＤＨ１７配列の効果
本発明者らは、β１インテグリン活性化を阻害する能力について、異なる抗体を試験した。ＣＤＨ１７の全細胞外ドメインまたはＣ−ペプチドドメインに対する市販の抗体（Ｈ１６７、Ｃ−１７または１４１７１３）は、β１インテグリン活性化の阻害を行うことができなかった（図９）。さらに、本発明者らが、ＣＤＨ１７のドメイン６に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを試験すると、これらの抗体は、非常に限定された程度までしかβ１インテグリン活性化を阻害することができなかった（＜５０％）。β１インテグリン活性化状態の増加によって、結腸癌細胞における細胞増殖の増加が引き起こされた（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅら、２０１４、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３３：１６５８−１６６９）。カドヘリン−１７  ＲＧＤモチーフに対して作られた抗体が細胞増殖を阻害することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、これらの抗体が存在する状態または存在しない状態で、結腸癌細胞に細胞増殖アッセイを行った。予想されるように、これらの抗体は、細胞増殖を阻害することができ、このことは、カドヘリン−１７におけるＲＧＤモチーフのブロッキングによって、細胞増殖が損なわれることを示している。これらの市販の抗体またはＣＤＨ１７のドメイン６に対する抗体は、細胞の増殖または接着に対し、有意な効果はなかった（図１０）。
【０２２５】
しかし、ペプチドＶＳＬＲＧＤＴＲＧ（配列番号１）を用いて免疫付与されたマウス由来のポリクローナル血清（１番、２番、３番）は、β１インテグリン活性化をほぼ１００％阻害した。マウス血清３番は、ペプチドによって誘発されるＣＤＨ１７の活性化を完全に阻害した。血清１番および２番も、ほぼ完全に阻害した（図９）。この阻害は、細胞増殖の停止を伴う。この観点で、これらのポリクローナル血清は、ＭＴＴアッセイにおいて１：５０希釈率で試験したとき、増殖を完全に阻害し、血清３番の場合には、１：２００の希釈率でほぼ完全に阻害した（図１０）。これらの結果は、ＣＤＨ１７  ＲＧＤモチーフを含有する精製されたペプチドに対する非常に集中した免疫応答のみが、ブロッキング免疫応答のための効果的な抗体を誘発することができることを伝えている。
【０２２６】
実施例８：β１インテグリン活性化の阻害能力を有するモノクローナル抗体の開発
３番のマウスをハイブリドーマ開発のために選択した。ＣＤＨ１７抗体を産生する細胞融合の後に得られたハイブリドーマ上清を用い、初期の試験を行った（図１１）。クローン６番は、β１インテグリン活性化をほぼ１００％阻害することができた。このクローンを、クローン１２、１９および２５と共に、モノクローナル抗体のさらなる選択および単離のために選択した。第１のクローニング工程の後に、これらのクローンを用い、第２の試験を行った（図１２）。クローン６．５、６．６、１２．４および２５．４を最後のクローニングのために選択した。
【０２２７】
限界希釈による第２のクローニング工程の後、クローン６．５．１、６．５．２、６．６．１、６．６．２、１２．４．１および２５．４．１を最後の特性決定のために選択した（表１）。標準的な手順に従って、Ｌ−グルタミンと炭酸水素ナトリウムを含み、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中、ハイブリドーマ細胞を成長させた。培養上清を集め、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をタンパク質Ｇによって精製し、さらなる使用のためにＰＢＳに対して透析した。β１インテグリン活性化、細胞増殖および細胞接着に対する効果について、ｍＡｂを試験した。ｍＡｂ  ２５．４．１は、β１インテグリンの活性化を完全に阻害する（１００％）能力を示し、次いで、６．６．１（９０％）、１２．４．１（７０％）および６．５．２（＜６０％）であった（図１３）。
【０２２８】
細胞接着を分析するとき、予想されるように、ｍＡｂを用いて得られる結果は、β１インテグリンの活性化に対し、同じ順番に従うが、逆であった。Ｍａｂ  ２５．４．１は、細胞接着に対する大きな阻害を引き起こし、次いで、他の３種類のｍＡｂは同じ順序であった。これらは、市販の抗−ＣＤＨ１７抗体およびコントロール抗体よりもかなり効果的っであった（図１４）。
【０２２９】
細胞増殖に関し、Ｍａｂ  １２．４．１は、細胞増殖の低下において最も効果的であり、次いで、６．５．２、２５．４．１および６．６．１であった（図１５）。
【０２３０】
まとめると、２５．４．１は、β１インテグリン活性化および細胞接着の阻害に特に有用であると思われる。対照的に、１２．４．１は、細胞増殖をブロックするのに特に有用なようである。
【表１】
2018513141.tif 000003
【０２３１】
実施例９：シークエンシングおよびＣＤＲの同定
ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのナンバリングスキームの一連の規則に従って、クローンＰＡ３８３−１２．４．１、ＰＡ３８３−６．６．１およびＰＡ３８３−６．５．２について、マウスから誘導されるハイブリドーマから得られ得る相補性（または特異性）を決定する領域（ＣＤＲ）を同定した。得られた配列は、以下の通りである。
【表２】
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【０２３２】
ハイブリドーマＰＡ３８３−２５．４．１由来のＶＨおよびＶＬの増幅が可能ではなかったため、この細胞培養は、微生物の寄託の国際承認に関するブタベスト条約に従う特許手続きのために、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６の下、リファレンスＰＡ３８３−２５．４．１と共に寄託された。
【０２３３】
実施例１０：カドヘリンＲＧＤモチーフ（ＣＤＨ１６由来のものを除く）は、β１−インテグリンの活性化を促進した
カドヘリン５のＲＧＤモチーフ（ドメイン２のＲＧＤモチーフの場合、配列番号３７（ＣＤＨ５Ａ）、ドメイン３のＲＧＤモチーフの場合、配列番号１９（ＣＤＨ５Ｂ）、カドヘリン６（配列番号３８）、カドヘリン１７（配列番号１）およびカドヘリン２０（配列番号３９）であるが、カドヘリン１６（配列番号３１、ＲＡＩＲＧＤＴＥＧ）ではない）とフランキング配列を含む９ａａペプチドを用いた治療は、β１−インテグリンから高アフィニティ構造への構造変化を誘発し、フローサイトメーターにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌細胞株）、ＢＬＭ（メラノーマ細胞株）およびＲＫＯ（結腸癌細胞株）細胞中、Ｈｕｔｓ２１  β１抗体によって検出された（図１６）。
【０２３４】
実施例１１：ＣＤＨ１７のＲＧＤモチーフに対するモノクローナル抗体は、ＣＤＨ５のＲＧＤペプチドによって、また、もっと短いＣＤＨ１７のＲＧＤペプチドによって誘発されるβ１−インテグリンの活性化を阻害した
ＣＤＨ１７（配列番号１）、ＣＤＨ５Ａ（配列番号３７）またはＣＤＨ５Ｂ（配列番号１９）の９ａａ  ＲＧＤペプチド、または７ａａまたは５ａａのみのＣＤＨ１７  ＲＧＤペプチドのもっと短い形態を用い、同時に、指定の抗体を用いてＲＫＯ結腸癌細胞を処理し、前述のようにフローサイトメトリーアッセイを行った。９ａａのＣＤＨ１７  ＲＧＤペプチド（配列番号１）（１００％とする）、７ａａのペプチド：ＳＬＲＧＤＴＲ（配列番号３２）、５ａａのペプチド：ＬＲＧＤＴ（配列番号１４）によって誘発されるインテグリン活性化に関し、データを示した（図１７）。これらのデータは、（ｉ）ＣＤＨ１７由来の７ａａおよび５ａａのペプチドが、インテグリン活性化を効果的に誘発することができ、（ｉｉ）１２．４．１ｍＡｂおよび２５．４．１ｍＡｂは、これらの短いペプチドをもっと効果的にブロックし、（ｉｉｉ）ＣＤＨ５由来の両ＲＧＤを含むペプチドは、β１インテグリンを活性化することができ、（ｉｖ）１２．４．１および２５．４．１は、領域Ｂ（ドメイン３）を用いると効果的であり、６．６．１は、領域Ａ（ドメイン２）を用いると効果的であることを示す。この結果は、他のカドヘリンに対する抗−ＣＤＨ１７  ｍＡｂの有用性を確認するものである。
【０２３５】
実施例１２：メラノーマ細胞株および乳癌細胞株におけるＣＤＨ５の発現
ＣＤＨ５の発現を決定するために、散発性で転移性または高頻度転移性であると分類されることが知られている種々のメラノーマ株および乳癌細胞株を分析した。図１８に示される結果は、試験した７種のメラノーマ細胞株のうち４種と全ての乳癌細胞株がＣＤＨ５発現について陽性であったことを反映している。
【０２３６】
ブタベスト条約に従う生体材料の寄託
ハイブリドーマＰＡ３８３−２５．４．１は、微生物の寄託の国際承認に関するブタベスト条約に従う特許手続きのために、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ、Ｄ−３７１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに２０１５年４月９日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６６で寄託された。
【図１Ａ】
2018513141.tif 000005
【図１Ｂ】
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【図２Ａ−Ｃ】
2018513141.tif 000007
【図２Ｄ−Ｇ】
2018513141.tif 000008
【図３Ａ−Ｃ】
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【図３Ｄ−Ｅ】
2018513141.tif 000010
【図３Ｆ】
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【図４ＡＢ】
2018513141.tif 000012
【図４Ｃ】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｃ】
2018513141.tif 000017
【図７Ｄ】
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【図８ＡＢ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
2018513141.tif 000022
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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