(57)【要約】  組成物は、Ｐｕｎｉｃａ抽出物と、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物とを含み、揮発性油構成成分の大部分は、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物から除去されている。生の／未加工の、及び加工した肉、魚、または家禽の肉が挙げられるがこれらに限定されない食品に本組成物を適用するための方法もまた提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｕｎｉｃａ抽出物と、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物と、を含む組成物であって、揮発性油構成成分の大部分は、前記Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物から除去されている、組成物。
【請求項２】
前記Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物は、カルノシン酸及びカルノソールならびにこれらの混合物から選択されるＬａｍｉａｃｅａｅフェノール系ジテルペンと、Ｐｕｎｉｃａ抽出物とを含み、Ｐｕｎｉｃａ抽出物対Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物の重量比は、０．６２５〜４８である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物は、ローズマリー抽出物、オレガノ抽出物、タイム抽出物、セージ抽出物、ミント抽出物、Ｓａｌｖｉａ抽出物、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ抽出物、Ｌｅｐｅｃｈｉｎｉａ抽出物、Ｏｒｅｇａｎｕｍ抽出物、Ｔｈｙｍｕｓ抽出物、Ｈｙｓｓｏｐｕｓ抽出物、及びこれらの混合物から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
アラビアガム、デキストロース、塩、脂肪酸のモノ及びジグリセリド、ＭＰＧ、ポリソルベート８０、デキストロース、植物油、グルコースシロップ、グリセリン、デカグリセロールモノオレエート、脂肪酸エステル、ベンジルアルコール、エチルアルコール、プロピレン、グリコール、ポリソルベート、ソルビタン、ソルビタントリオレエート、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ならびにこれらの組み合わせから選択される担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
マルトデキストリンが生じるデンプンとは異なる構造を有するマルトデキストリンの担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、乾燥粉末の形態である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
１つ以上の香味料と補助剤とをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、液体形態である、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
食品と、請求項１に記載の組成物と、を含む食品製品。
【請求項１０】
前記食品は、肉、家禽の肉、及び魚からなる群から選択される、請求項９に記載の食品製品。
【請求項１１】
前記肉、家禽の肉、及び魚は、生肉、家禽の生肉、及び生魚である、請求項１０に記載の食品製品。
【請求項１２】
前記Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物は、カルノシン酸、カルノソール、及びこれらの混合物から選択される１２ｐｐｍ以上のＬａｍｉａｃｅａｅフェノール系ジテルペンの量のＬａｍｉａｃｅａｅフェノール系ジテルペンと、５６ｐｐｍ以上のエラグ酸と、１９ｐｐｍ以上のＰｕｎｉｃａ抽出物からのプニカラギンと、を含む、請求項９に記載の食品製品。
【請求項１３】
１２〜１８８ｐｐｍのＬａｍｉａｃｅａｅフェノール系ジテルペンと、４〜２４ｐｐｍのエラグ酸と、１９〜１２０ｐｐｍのＰｕｎｉｃａ抽出物からのプニカラギンと、を含有する、請求項１２に記載の食品製品。
【請求項１４】
１２〜１８８ｐｐｍのＬａｍｉａｃｅａｅフェノール系ジテルペンと、４〜２４ｐｐｍのエラグ酸と、１９〜１２０ｐｐｍのＰｕｎｉｃａ抽出物からのプニカラギンと、を含有する、請求項９に記載の食品製品。
【請求項１５】
請求項９に記載の食品を含む包装食品製品であって、前記食品が２０％以上の酸素を含む雰囲気中で包装される、包装食品製品。
【請求項１６】
請求項９に記載の食品を含む包装食品製品であって、前記食品が雰囲気環境中で包装される、包装食品製品。
【請求項１７】
食品を加工するための方法であって、
Ｐｕｎｉｃａ抽出物とＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物とを含む組成物を食品に適用するか、またはそれ内に組み込むことを含み、前記揮発性油構成成分の大部分は、前記Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物から除去されている、方法。
【請求項１８】
２０％以上の酸素を含有する雰囲気中で、前記食品を包装することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記食品は、生肉、生魚、または家禽の生肉からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
食品に適用するか、またはそれ内に組み込むことは、乾燥粉末の形態の前記組成物を前記食品に適用することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
食品に適用するか、またはそれ内に組み込むことは、前記Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物及びＰｕｎｉｃａ抽出物の両方を含む単一の組成物を前記食品に適用するか、またはそれ内に組み込むことを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物は、カルノシン酸、カルノソール、及びこれらの混合物から選択されるＬａｍｉａｃｅａｅフェノール系ジテルペンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
Ｌａｍｉａｃｅａｅ化合物対Ｐｕｎｉｃａ抽出物の重量比は、０．６２５〜４８である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
カルノシン酸、カルノソール、及びＰｕｎｉｃａ抽出物を含有する、天然精油を本質的に含まないＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物と組み合わせて食品を含む食品製品であって、前記食品中に存在するＰｕｎｉｃａ抽出物対前記Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物の重量比は、約０．６２５〜約４８であり、Ｐｕｎｉｃａ抽出物のＰｕｎｉｃａエラグ酸は、４〜２４ｐｐｍの量で前記食品中に存在し、Ｐｕｎｉｃａプニカラギンは、１９〜１２０ｐｐｍの量で存在する、食品製品。
【請求項２５】
前記食品は、肉、家禽の肉、及び魚からなる群から選択される、請求項２４に記載の食品製品。
【請求項２６】
１２〜１８８ｐｐｍのＬａｍｉａｃｅａｅフェノール系ジテルペンと、４〜２４ｐｐｍのＰｕｎｉｃａ抽出物のエラグ酸と、１９〜１２０ｐｐｍのＰｕｎｉｃａ抽出物のプニカラギンと、を含有する、請求項２４に記載の食品製品。
【請求項２７】
前記Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物及びＰｕｎｉｃａ抽出物は、アラビアガム、デキストロース、塩、脂肪酸のモノ及びジグリセリド、ＭＰＧ、ポリソルベート８０、デキストロース、植物油、グルコースシロップ、グリセリン、デカグリセロールモノオレエート、脂肪酸エステル、ベンジルアルコール、エチルアルコール、プロピレン、グリコール、ポリソルベート、ソルビタン、ソルビタントリオレエート、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、デキストロース、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される担体をさらに含有する組成物の形態である、請求項２４に記載の食品製品。
【請求項２８】
前記組成物は、乾燥形態である、請求項２７に記載の食品製品。
【請求項２９】
前記組成物は、液体形態である、請求項２７に記載の食品製品。
【請求項３０】
食品製品を調製するための方法であって、
天然精油を本質的に含まず、カルノシン酸、カルノソール、及びＰｕｎｉｃａ抽出物を含む抗微生物剤である、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物の組み合わせを、食品に適用するか、またはそれ内に組み込むことを含み、前記食品中に存在するＰｕｎｉｃａ抽出物対前記Ｌａｍｉａｃｅａｅフェノール系ジテルペンの重量比は、約０．６２５〜４８であり、Ｐｕｎｉｃａ抽出物は、４〜２４ｐｐｍのＰｕｎｉｃａ抽出物のエラグ酸及び１９〜１２０ｐｐｍのＰｕｎｉｃａ抽出物のプニカラギンの量で前記食品中に存在する、方法。
【請求項３１】
前記食品は、肉、魚、または家禽の肉である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記肉、魚、または家禽の肉は、生肉、生魚、または家禽の生肉である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法は、色の持続期間を長持ちさせ、前記食品製品中の細菌増殖を阻害、減少、及び／または制限する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
阻害、減少、及び／または制限された前記細菌増殖は、ｌｉｓｔｅｒｉａである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｐｕｎｉｃａ抽出物は、プニカラギン及びエラグ酸からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
有効量のフェノール系ジテルペンならびに／またはプニカラギン及びエラグ酸を含む、抗微生物組成物。
【請求項３７】
有効量のフェノール系ジテルペンならびに／またはプニカラギン及びエラグ酸を含む、抗菌組成物。
【請求項３８】
前記組成物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓからなる群から選択される、グラム陽性菌に対して有効である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組成物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅからなる群から選択される、グラム陰性菌に対して有効である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
有効量のフェノール系ジテルペンならびにプニカラギン及びエラグ酸を含む、抗真菌／抗酵母組成物。
【請求項４１】
前記組成物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓからなる群から選択される、酵母に対して有効である、請求項４０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年２月６日出願の米国特許出願第１４／６１５，９６８号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、食品に対する色及び／または微生物安定性を長持ちさせるための組成物に関し、より具体的には、肉、魚、または家禽の肉（生／未加工及び加工）が挙げられるがこれらに限定されない食品に対する色及び／または微生物安定性を長持ちさせるための組成物に関する。食品の色及び／または微生物安定性を長持ちさせるのに有効であるこれらの組成物。
【背景技術】
【０００３】
食品の安全性及び食品腐敗の防止は、世界中で、特に食肉産業において、絶えず存在する問題である。食品の腐敗は、食品製造業者にとって重大な経済問題である。食品製造業者は、食べるのが安全である製品を届けることによって、一般の人々の健康及び安全を保護する必要がある。そのような食品は、冷蔵貯蔵または周囲温度貯蔵のいずれにおいても、保証された貯蔵寿命を有しなければならない。消費者は、高品質の良い味の食品を好む。これは、化学保存料、厳しい加熱方法、及び他の加工手段を用いて達成するのは困難である。食品の安全性及び保護は、より軽度の加工及び天然保存料の組み合わせたアプローチを使用して、複数の保存システムを用いて最良に達成される。食品媒介性微生物はまた、異なる保存手段を用いて保存された食品中で適応及び増殖する可能性が低下する。
【０００４】
食品保護及びＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどの食品腐敗生物の増殖に関する大きな懸念がある。この特定の種は、肉において最も問題のある腐敗微生物のうちの１つである。抗微生物剤に対する並外れた耐性などの異常な生理学的特徴は、それらが腐敗を引き起こす能力に大きく関与する。加えて、腐敗生物は時に、異なる保存料及び貯蔵条件に適応することができ、したがって、保存手段の組み合わせは、個々の手段よりも成功する可能性がある。
【０００５】
保証された貯蔵寿命を有する便利、天然、安全で健康な高品質の製品に対する一般の需要を満たすために、経済的、天然、かつ有効な保存システムを開発する必要性が高まっている。植物由来などの抗微生物材料が、この必要性を満たすのを補助するために食品中の保存料として使用され得る。そのような植物抽出物は、それらが天然であると見なされるため、望ましいと見なされる。さらに、規制の観点から、長期間の使用のため、植物抽出物は典型的に、ＧＲＡＳ（一般的に安全と認められた）状態を有する。また、より少量の抗微生物材料を利用して微生物保護を提供したいという要望が継続してある。したがって、新しい抗微生物材料または新しくより有効な抗微生物材料の組み合わせを提供する必要性がある。
【０００６】
それらの天然源にもかかわらず、植物由来の抗微生物製品は、可能な限り最低量で使用されることが望ましい。これは、費用の理由だけではなく、食料中の「添加剤」の量を最小限に抑えたいという消費者の要望を満たすためにも望ましい。さらに、多くの植物材料は、関連した味を有する。したがって、多くの要求水準の高い食品用途において、植物由来の保護剤の量の低減が有利である。
【０００７】
食肉製造業者は、彼らが効率的で、費用効率が高い、中央の加工センターから小売店に供給することを可能にする方法を求めている。腐敗（消費者の安全）に関する貯蔵寿命の増加は、肉がより長い流通経路を通って生産業者から小売業者、消費者へと進むため、これを可能にする必要がある。
【０００８】
色の貯蔵寿命は、消費者の承認に重要である。消費者は、明るい赤色のオキシミオグロビン色素の存在によって肉の新鮮さを判断する。生の肉におけるオキシミオグロビンは、それが安定した茶色の色素であるメトミオグロビンに変化するにつれて、貯蔵中経時的に減少する。オキシミオグロビン色素は、暗い貯蔵中、例えば、肉用冷凍庫内で薄くなるが、色素の消失は、小売店における点灯した冷蔵の陳列ケース内で最も顕著である。さらに、色素の損失は、主に本質的に見た目であり、それは、深刻な経済的影響をもたらす。最も新鮮に見えるカットを求めている消費者は、茶色のメトミオグロビンを少量でも含有する肉を購入することを避ける。
【０００９】
微生物腐敗と関連した貯蔵寿命は、深刻な問題である。微生物汚染された肉の販売からの食品媒介性疾患の発生と関連した潜在的な負債は、膨大である。食肉産業及び関連した小売店は、製造プロセス全体にわたって微生物汚染を防止することによって、消費者の安全を確実にするための方法を求めている。枝肉洗浄及び注意深く制御された低温加工などのプロセス改善が、現在、本産業において通常である。微生物腐敗と関連した貯蔵寿命を増加させるための一方法は、調整雰囲気包装（ＭＡＰ）を使用して、食品、例えば、肉を包装することである。
【００１０】
本産業において、より天然であると消費者によって認識される抗微生物方法及びプロセスの必要性がある。Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物とヘスペリジンとを含む組成物の抗微生物活性は、主な研究対象である。ほとんどの先行技術が、ハーブの抗微生物活性が揮発性精油構成成分中で中心となることを示す。
【００１１】
Ｐ．Ｍ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｓ．Ｎａｉｄｕ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｆｏｏｄ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａ．Ｓ．Ｎａｉｄｕ，ｅｄ．，２０００，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐａｇｅｓ  ２６５−２９４）は、スパイス、ハーブ、食用穀物、及び種子の精油由来の植物フェノール系化合物の抗微生物特性を再考察する。著者らは、スパイス及びハーブの抗微生物効果が、主に精油留分中のフェノール系化合物の存在によるものであり、かつ一部のモノテルペンも同様にある程度の活性を示すように思われることを教示する。カルバクロール、ｐ−シメン、及びチモールは、観察された活性の主要因である可能性が高いオレガノ、タイム、及びセイボリーの主要な揮発性構成成分として特定される。ローズマリーの活性抗微生物剤は、ボルネオール、樟脳、１，８−シネオール、アルファピネン、カンフェン、ベルベノン、及び酢酸ボルニルであることが示唆されている。セージの活性成分は、ツジョンであることが示唆されている。タイム油の精油の最小致死濃度は、培養物中で２２５〜９００ｐｐｍの範囲であることが示されている。食品中のこれらの精油の濃度は、深刻な香味の問題を引き起こす。培養実験が食品中の有効性に必要な濃度を過小評価するため、食品中の香味の問題は、培養の数が示唆するものよりも深刻である可能性が高い。この参考文献の別の部分において、精油の最小阻害濃度は、ローズマリーに関して１〜２％、タイムに関して０．１２〜２％、スペアミントに関して０．１２〜２％、セージに関して０．５〜２％、ペパーミントに関して０．５〜２％、及びオレガノに関して０．１２〜２％と記述されている。要約において、著者らは、ハーブ及びスパイス中の抗微生物化合物の濃度が、食品の感覚的性質に対する有害効果なしで有効に使用されるには、低すぎることを記述している。
【００１２】
Ｙ．Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，３８０，５０６号は、抗酸化及び抗微生物活性を有する保存料を生産するためのプロセスを教示する。そのプロセスは、ハーブスパイスの抽出物を極性及び非極性溶媒に分割することを伴う。分割された抽出物のうちの一部は、培養培地中のグラム陽性Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ微生物に対して抗微生物活性を示した。Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．によって試験された唯一の味の基準は、苦味であった。Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．は、精油の味認識に関しては何も語らなかった。Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．は、抽出物を脱臭せず、それは、抽出物が精油を含有し、肉の味に影響を及ぼしたことを意味する。味に対するこの影響は、Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．によって教示されたプロセスによって得られたローズマリー抽出物を使用することに対する阻害要因を教示する。
【００１３】
Ｄ．Ｎｉｎｋｏｖ（ＷＯ  ０１／１５６８０）は、医薬組成物が、Ｌａｍｉａｃｅａｅ科の植物由来の精油の抽出物を有機酸と組み合わせることによって調製され得ることを教示する。Ｎｉｎｋｏｖは、医薬組成物の抗微生物活性が、植物由来の油抽出物中のイソプロピルｏ−クレゾールなどの有機フェノールの存在によるものであることを教示する。
【００１４】
Ｋ．Ｓｈｅｔｔｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｇ．Ｌａｂｂｅ，（Ａｓｉａ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．（１９９８），７（３／４），ｐａｇｅｓ  ２７０−２７６は、Ｌａｍｉａｃａｅ植物をクローン化して、強化されたレベルのカルバクロール及びチモールなどの精油構成成分を生産するための研究を記載する。これらの精油構成成分は、いくつかの抗微生物特性を有するが、それらの商業用途は、これらの揮発性化合物によって食品に付与された強力な香味によって阻止される。
【００１５】
Ｊ．Ｃａｍｐｏ，Ｍ．Ａｍｉｏｔ  ａｎｄ  Ｃ．Ｎｇｕｙｅｎ−ｔｈｅ（２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ６３，ｐａｇｅｓ  １３５９−１３６８）は、ローズマリー抽出物が培養研究において抗微生物特性を有することを教示する。最小阻害濃度は、試験されている細菌の種によって異なったが、０．０６〜１％の範囲であった。これらの研究者らは、ローズマリー抽出物が、グラム陽性生物に対して、低脂肪及び低タンパク質含量を有する食品中で効果を発揮し得ることを示唆する。この参考文献において、実際に食品系は研究されなかった。この参考文献は、具体的にＬｉｓｔｅｒｉａを研究しなかった。
【００１６】
１９９９年１０月に出版されたＥ．Ｄｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ，Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｌｅａｎ  Ｃｏｌｏｒ  ａｎｄ  Ｒｅｔａｉｌ  Ｃａｓｅ−Ｌｉｆｅ  ｏｆ  Ｇｒｏｕｎｄ  Ｂｅｅｆ  Ｐａｔｔｉｅｓ”は、非ＭＡＰ牛挽肉の色の寿命に対する、他の天然抗酸化剤及びビタミンＥ食事補充と組み合わせたローズマリー抽出物の効果を記載する。この参考文献は、肉の微生物貯蔵寿命を延ばす方法を教示していない。著者らは、ローズマリーを含有する天然抗酸化剤を用いた肉における赤色保存が、統計的に対照と異なることができなかったため、ローズマリーを使用することによる肉の赤色改善を実証できなかった。対照の赤色は、商業的に望ましい期間内に変化した。この参考文献からのローズマリーを用いた肉における消失と同じ程度の、対照における赤色の消失は、肉の赤色を保存することが可能な安定剤としてローズマリー抽出物を使用することに対する阻害要因を教示する。
【００１７】
Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ，ｃｏｌｏｒ  ｃｈａｎｇｅ，ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｏｋｅｄ  ｂｅｅｆ”，Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２４，Ｉｓｓｕｅ  １，（２００７）：７−１４は、そのフェノール系ジテルペン中の含量は既知ではないローズマリー抽出物またはローズマリーオレオレジンが、抗リステリア効果を有することを示す。この参考文献において、ブドウ種子抽出物及びマツ樹皮抽出物は、ローズマリーよりも大きい抗リステリア効果を有し、それは、肉における主な抗リステリア天然生成物としてローズマリー抽出物を使用することに対する阻害要因を教示する。さらに、Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７は、肉へのローズマリー抽出物の添加が、赤色をそれほど消失していない対照と比較して、または肉の赤色の保存を有意に改善したブドウ抽出物と比較して、肉の赤色を有意に劣化させたことを示している。したがって、Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７は、肉の赤色を保存することが可能な安定剤としてローズマリー抽出物を使用しないものを教示する。
【００１８】
米国特許出願公開第２００４／１３１７０９号の研究は、揮発性油構成成分の大部分が除去されているＨｅｒｂａｌｏｘ（登録商標）Ｓｅａｓｏｎｉｎｇというローズマリー抽出物単独が、あったとしてもごくわずかな抗微生物効果を示すことを示す。この参考文献は、グラム陽性、より正確には肉の抗リステリア貯蔵寿命を延ばす方法を教示していない。
【００１９】
加えて、先行技術分野において報告された柑橘類からの植物由来抗微生物剤は、フラボノイドではなく酸である。例えば、柑橘類由来の化合物に関する先行特許は、本質的に酸を対象とする。ＫＲ２００４／０００１４４１は、細菌増殖の抑制剤としてのオレンジジュースを記載する。しかしながら、ＫＲ２００４／０００１４４１で報告されたジュースの約５０分の１未満のみが、肉を酸っぱいと認識することなく肉において使用され得る。肉が、クエン酸が豊富な溶液の最大７．２％のみを吸収するため、肉に吸収されたヘスペリジンの最終レベルは、０．４８％＊１／５０＊７．２％＝約０．０００７％未満に対応する。この参考文献は、ヘスペリジンが肉において抗リステリア効果を有し得たかどうかを教示していない。
【００２０】
Ｌｏｒｅｎｔｅ，Ｊｏｓe  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｓｐａｎｉｓｈ  ｌｅｍｏｎ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ（Ｌ．）Ｂｕｒｍ．）ｊｕｉｃｅｓ．”Ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６２（２０１４）：１８６−１９１は、柑橘類のジュースが５２．４ｇ／Ｌの滴定酸度を有し、クエン酸が主な構成成分であることを開示する。Ｌｏｒｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）によると、そのようなジュースにおいて、滴定酸度と比較したヘスペリジンレベルは、２桁超低く（２５７〜４８４．８ｍｇ／Ｌ）、それは、０．２６〜０．４８％のヘスペリジン（ｗ／ｖ）に対応する。そのような酸性組成物を肉に添加することは、すでに低レベルの肉の味に影響を及ぼす。
【００２１】
Ａｋｔａs，Ｎｅｓｉｍｉ，及びＭuｋｅｒｒｅｍ  Ｋａｙａ．“Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｒｉｎａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｗｅａｋ  ｏｒｇａｎｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｓａｌｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｅｅｆ．”Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１３．２（２００１）：８８−９４は、１％弱酸（クエン酸を含む）からの溶液を肉に添加することが、肉に酸味を与えることを示す。また、彼らは、１：１ｗ／ｖ（肉／マリネード）の割合でマリネされたとき、肉が、クエン酸を含有するマリネード中でのマリネ後に最大７．２％重量が増加することを示す。
【００２２】
ＷＯ２０１２／１１２３３７において、微生物の性質に関して、微生物が細菌であるかどうか、それらがグラム陽性菌であるかどうか、またはそれらがＬｉｓｔｅｒｉａであるかどうかを報告することなく、ヘスペリジンを含むフラボノイドが、ある程度活性な抗微生物活性を提供し得ることが報告されている。ＷＯ２０１２／１１２３３７は、活性な抗微生物化合物が酸であることを教示する。
【００２３】
Ｍｏｕｌｅｈｉ，Ｉｋｒａｍ，ｅｔ  ａｌ．“Ｖａｒｉｅｔｙ  ａｎｄ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｎｄａｒｉｎ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｂｌａｎｃｏ）  ａｎｄ  ｂｉｔｔｅｒ  ｏｒａｎｇｅ（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ  Ｌ．）ｓｅｅｄｓｅｘｔｒａｃｔｓ．”Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｒｏｐｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ３９（２０１２）：７４−８０は、柑橘種子抽出物が、１．３１〜２．５２ｍｇの当量のカテキン類／ｇ  ＤＷの総フラボノイドを含有することを報告している。ヘスペリジンが柑橘種子抽出物の総フラボノイドの＜１６％を表す場合、これは、ヘスペリジンがＤＷ柑橘種子抽出物中に約０．０３２％存在することを意味する。
【００２４】
Ｍａｎｄａｌａｒｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．“Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｅｒｇａｍｏｔ（Ｃｉｔｒｉｓ  ｂｅｒｇａｍｉａ  Ｒｉｓｓｏ）ｐｅｅｌ，ａ  ｂｙｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０３．６（２００７）：２０５６−２０６４は、インビトロで、フラボノイドが豊富な柑橘系抽出物がグラム陰性菌の増殖のみを阻害し、グラム陽性菌の増殖に影響を及ぼさず、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖に影響を及ぼさないことを開示する。Ｍａｎｄａｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、純粋な形態のネオヘスペリジンが、インビトロでのリステリア増殖に影響を及ぼさないことを示す。
【００２５】
Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．“Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｅｅｆ  ｍｅａｔｂａｌｌｓ．”Ｍｅａｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ６９．３（２００５）：３７１−３８０は、フラボノイド（主にヘスペリジンである）を含有する柑橘類抽出物が補充された肉が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖に影響を及ぼさないことを示す。例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、そのような抽出物が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対してではなく、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａを含む他の細菌の菌株に対して抗微生物効果を及ぼすことを示す。
【００２６】
Ｍａｎｄａｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．及びＦｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．の教示は、抗リステリア化合物としてヘスペリジンを使用することに対する阻害要因を教示し、肉におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して柑橘類抽出物からのフラボノイドのうちのいずれかまたは組み合わせを使用することを明らかな状態にしていない。例えば、Ｍａｎｄａｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、抗リステリア化合物としてヘスペリジンを使用することに対する阻害要因を教示し、精製されたフラボノイドが抗リステリア効果を有し得たことを明らかな状態にしていない。
【００２７】
エラグ酸が豊富なＰｕｎｉｃａ抽出物は、生のＭＡＰ肉に抗微生物効果を有しない。例えば、Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈａｙｅｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｔｅｐａｎｙａｎ，Ｖ．，Ａｌｌｅｎ，Ｐ．，Ｏ’Ｇｒａｄｙ，Ｍ．Ｎ．，＆Ｋｅｒｒｙ，Ｊ．ｐ．２０１０）．“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｕｔｅｉｎ，ｓｅｓａｍｏｌ，ｅｌｌａｇｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｏｌｉｖｅ  ｌｅａｆ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｈｅｌｆ−ｌｉｆｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｃｋａｇｅｄ  ｒａｗ  ｍｉｎｃｅｄ  ｂｅｅｆ  ｐａｔｔｉｅｓ”，Ｍｅａｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ，８４（４），６１３−６２０．）（以下、「Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ」）は、エラグ酸（Ｐｕｎｉｃａ抽出物からの活性化合物のうちの１つ）が、冷蔵された、かつ３００ｐｐｍで適用されたときの生のＭＡＰ牛肉に対して、抗微生物効果を有しないことを教示する。Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．は、エラグ酸が、冷蔵された、かつ３００ｐｐｍまたは６００ｐｐｍで適用されたときの生のＭＡＰ牛肉の赤色の保存を改善しなかったことを教示する。Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．は、抗微生物効果のために、３００ｐｐｍよりも低い濃度のエラグ酸を使用することに対する阻害要因を教示する。Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．は、肉の赤色を改善するためにエラグ酸を使用することに対する阻害要因を教示する。
【００２８】
味に影響を及ぼすことなく生肉の貯蔵寿命を増進する一般的な問題は依然として、商業的に望ましい貯蔵期間全体にわたる、腐敗生物及び病原体の増殖の防止ならびに肉の赤色の保存にある。
【発明の概要】
【００２９】
本発明に従った一態様によると、組成物は、フェノール系ジテルペンを含むＬａｍｉａｃｅａｅ（ローズマリー）抽出物（抽出物は天然精油を本質的に含まない）と、Ｐｕｎｉｃａ抽出物とを含む。１つの有利な組成物において、Ｐｕｎｉｃａ抽出物は、プニカラギン及びエラグ酸からなる群から選択される。有利に、ヘスペリジン抽出物は、純粋なヘスペリジンであり、すなわち、少なくとも８０％の濃度を有する。
【００３０】
本方法及び組成物の他の態様は、肉、家禽の肉、及び魚（生／未加工及び加工）が挙げられるがこれらに限定されない食品と使用するためのものであり、本開示の組成物の構成成分、包装食品製品、及び食品を包装する方法を含む。
【００３１】
本発明は、その一形態において、Ｐｕｎｉｃａ抽出物とＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物とを含む組成物に関し、揮発性構成成分の大部分は、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物から除去されている。
【００３２】
本発明は、その別の形態において、Ｐｕｎｉｃａ抽出物とＬａｍｉａｃｅａ抽出物とを含み、揮発性油構成成分の大部分がＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物から除去されている組成物を含有する、未加工／生の肉、家禽の肉、及び魚、ならびに加工された肉、家禽の肉、及び魚が挙げられるがこれらに限定されない食品に関する。
【００３３】
本発明は、その別の形態において、食品を包装することを含む、食品を加工するための方法に関する。本方法は、Ｐｕｎｉｃａ抽出物とＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物とを含み、揮発性油構成成分の大部分がＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物から除去されている組成物を、未加工／生の肉、家禽の肉、及び魚、ならびに加工された肉、家禽の肉、及び魚が挙げられるがこれらに限定されない食品に適用するか、またはそれ内に組み込むことを含む。任意に、本方法は、２０％以上の酸素を含有する雰囲気中で食品を包装することをさらに含むことができる。代替のさらなる実施形態では、酸素の量は、７０％ほどの酸素であってもよい。さらなる代替の実施形態では、包装食品製品は、標準的な雰囲気環境中で包装された未加工／生の肉、家禽の肉、及び魚、ならびに加工された肉、家禽の肉、及び魚が挙げられるがこれらに限定されない、食品を含む。
【００３４】
本発明は、その別の形態において、食品を包装するための方法に関する。本方法は、Ｐｕｎｉｃａ抽出物とＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物とを含み、揮発性油構成成分の大部分がＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物から除去されている組成物を、肉、魚、または家禽の肉（生／未加工及び加工）が挙げられるがこれらに限定されない、食品に適用するか、またはそれ内に組み込むことを含み、食品は、２０％以上の酸素を含む環境中で包装される。
【００３５】
本発明は、その別の形態において、有効量のフェノール系ジテルペン及び／またはヘスペリジンを含む抗微生物組成物に関する。１つの有利な形態において、抗微生物組成物は有効である。
【００３６】
本発明は、そのさらに別の形態において、有効量のフェノール系ジテルペンならびに／またはプニカラギン及びエラグ酸を含む抗菌組成物に関する。１つの有利なさらなる形態において、抗微生物組成物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓを含むグラム陽性菌に対して有効である。代替のさらなる形態において、組成物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍ、またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅを含むグラム陰性菌に対して有効である。
【００３７】
本発明は、その別の形態において、有効量のフェノール系ジテルペンならびに／またはプニカラギン及びエラグ酸を含む、抗真菌／抗酵母組成物に関する。１つのさらなる形態において、組成物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ．を含む酵母に対して有効である。
【００３８】
一形態において、本発明は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を阻害するために、ローズマリー抽出物と組み合わせて肉に添加され得る、Ｐｕｎｉｃａ抽出物の存在を対象とする。
【００３９】
本発明に従ったローズマリー抽出物は、肉の香味に影響を及ぼすことなく、肉の赤色の保存を改善し、微生物貯蔵寿命を延ばす。実際の肉系での本発明者らの研究は、揮発性精油構成成分の大部分が除去されており、肉の味に影響を及ぼさない抽出物である、脱臭化ローズマリー抽出物を使用する。ヘスペリジンまたはＰｕｎｉｃａ抽出物と組み合わされたとき、予想外に、食品の味に対していかなる影響もなく、相乗的な抗リステリア効果及び相乗的な色保存効果が観察される。
【００４０】
本方法及び組成物は、いかなる食品製品または飲料の食品製造業者にも、費用効率が高く、費用効果が高い、中央の加工センターからの製品を小売店に供給するための方法を提供することができる。本方法及び組成物は、生肉、生魚、及び家禽の生肉の貯蔵寿命を延ばすことができ、７０％以上の酸素及び３０％以上のＣＯ２を含有する雰囲気中で、延びた微生物及び色の貯蔵寿命を有する生肉、生魚、及び家禽の生肉を提供することができる。抽出物の組み合わせを使用する本開示に従った方法は、香味への悪影響なしで、肉の色の保存を改善し、生肉、生魚、及び家禽の生肉におけるリステリア増殖を遮断し、かつより低いがより有効な抑制濃度の植物抽出物の使用を可能にするために使用され得る。
【００４１】
本方法は特に、調整雰囲気包装（ＭＡＰ）肉との使用に適している。ＭＡＰ肉は、製品上の雰囲気を維持するガス不透過性材料中に包装される。酸素及び二酸化炭素の混合物は、多くの場合、ＭＡＰ肉で使用される。これらのガスの混合物は、本方法と非常に良好に協働する。
【００４２】
本方法及び組成物とは際立って対照的に、先行技術は、ヘスペリジンを含有する柑橘類抽出物が、インビトロまたは肉においてリステリア増殖に影響を及ぼさないことを教示する。ヘスペリチンまたはネオヘスペリジンなどの純粋なフラボノイドは、インビトロまたは肉においてリステリア増殖に何の影響も及ぼさない。Ｍａｎｄａｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、インビトロで、フラボノイドが豊富な柑橘系抽出物がグラム陰性菌の増殖のみを阻害し、グラム陽性菌の増殖に影響を及ぼさず、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖に影響を及ぼさないことを開示する。Ｍａｎｄａｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、純粋な形態のネオヘスペリジンが、インビトロでのリステリア増殖に影響を及ぼさないことを示す。
【００４３】
Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、フラボノイド（主にヘスペリジンである）を含有する柑橘類抽出物が補充された肉が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖に影響を及ぼさないことを示す。Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、そのような抽出物が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対してではなく、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａを含む他の細菌の菌株に対して抗微生物効果を及ぼすことを示す。
【００４４】
Ｍａｎｄａｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．及びＦｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．の教示は、抗リステリア化合物としてのヘスペリジンに対する阻害要因を教示し、肉におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して柑橘類抽出物からのフラボノイドのうちのいずれかまたは組み合わせを使用することを明らかな状態にしていない。さらに、Ｍａｎｄａｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．の教示は、抗リステリア化合物としてのヘスペリジンに対する阻害要因を教示し、精製されたフラボノイドが抗リステリア効果を有し得たことを明らかな状態にしていない。
【００４５】
本開示は、ヘスペリジンが少なくとも８０％、最大９９％、好ましくは９５％濃縮されたときに、それが肉におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を阻害することを示す。先行技術は、ヘスペリジンが肉におけるリステリア増殖に影響を及ぼさないことを教示するか、または少なくとも示唆する。本発明者らは、驚くべきことに、ヘスペリジンが肉（例えば、ミンチ肉）において使用されて、その微生物、色、及び味の貯蔵寿命を延ばすことができることを発見した。ヘスペリジンが単独で使用される場合、ヘスペリジンは、十分な抗リステリア効果を確実にするために、より高い濃度で使用される必要がある。驚くべきことに、かつ予想外に、ヘスペリジンへのフェノール系ジテルペンを含む植物抽出物の添加は、抗リステリア効果を相乗的に改善し、より低用量の各抽出物の使用を可能にする。
【００４６】
また、驚くべきことに、ヘスペリジン及びＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物は、相乗的にＭＡＰ牛挽肉の色を保存することがわかっている。低温条件で６日間貯蔵された牛挽肉の試料において、ローズマリー抽出物を加えたヘスペリジンは、ヘスペリジンまたはローズマリー単独の色保存の相加効果を超える。
【００４７】
先行技術は、ヘスペリジ含有抽出物が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ生物に対して阻害効果を有しないという記述でいっぱいである。驚くべきことに、本発明者らは、高酸素濃度の存在下でのヘスペリジンが、グラム陽性生物であるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを阻害するという証拠を発見した。ヘスペリジン及び高酸素雰囲気の組み合わせは、牛挽肉における主要な腐敗生物として単離されたグラム陽性生物であるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを阻害する。さらに驚くべきことに、ローズマリー及びヘスペリジンの組み合わせは、高酸素雰囲気下で、グラム陽性生物であるこれらのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの相乗的な阻害を示す。
【００４８】
フェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物及びヘスペリジンの組み合わせは、相乗的に、酸素の存在下で生肉、生魚、及び家禽の生肉の色を保存する。
【００４９】
ある特定の濃度でのヘスペリジン単独は、生の赤肉の色の寿命を保持せず、許容できない感覚刺激特性をもたらす。ローズマリー抽出物及びヘスペリジンの組み合わせは、冷蔵条件で牛挽肉の色の寿命を延ばすように相乗的に作用する。その組み合わせは、それがヘスペリジン単独及びローズマリー単独の相加作用を超えるため、相加的なだけではなく相乗的でもある。
【００５０】
ヘスペリジンへのフェノール系ジテルペンを含むＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物の添加は、生肉、生魚、及び家禽の生肉において色を保存し、微生物の増殖を阻害するのに有効である、香味が許容できる組成物をもたらす。
【００５１】
本開示によると、ヘスペリジン単独は、肉を含む食品におけるリステリア増殖を抑制する。さらに、本開示によると、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物、好ましくはローズマリー抽出物、及びヘスペリジンの組み合わせは、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物またはヘスペリジンのいずれか単独よりも、グラム陽性、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌増殖を抑制するのに有効である。
【００５２】
酸素の存在下でのフェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物及びヘスペリジンの組み合わせは、商業的に所望の貯蔵期間後に、パッケージ内の牛挽肉の香味に影響を及ぼさない。フェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物もしくはヘスペリジン単独も、酸素単独も、またはこれらの要因単独のうちの２つの組み合わせのいずれも、香味に影響を及ぼすことなく、商業的に所望の貯蔵期間の終わりに、それらの３つの組み合わせと同じくらい良好に色を保存しない。
【００５３】
驚くべきことに、ヘスペリジンへのフェノール系ジテルペンを含む植物抽出物の添加は、抗リステリア効果を相乗的に改善し、より低用量の各抽出物の使用を可能にする。
【００５４】
また、驚くべきことに、ヘスペリジン及びＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物は、相乗的にＭＡＰ牛挽肉の色を保存することがわかっている。低温条件で５日間貯蔵された牛挽肉の試料において、ローズマリー抽出物を加えたヘスペリジンは、ヘスペリジンまたはローズマリー単独の色保存の相加効果を超える。
【００５５】
本発明者らは、驚くべきことに、プニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物がミンチ肉で使用されて、その微生物、色、及び味貯蔵寿命を延ばすことができることを発見した。プニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物が単独で使用されるとき（すなわち、ローズマリー抽出物なしで）、十分な抗リステリア効果を確実にするために、より高い濃度のＰｕｎｉｃａ抽出物が必要とされる。驚くべきことに、ローズマリー抽出物または他のＬａｍｉａｃｅａｅの抽出物の添加は、抗リステリア効果を相乗的に改善し、より少量のＰｕｎｉｃａ抽出物（例えば、プニカラギン及びエラグ酸抽出物）の使用を可能にする。
【００５６】
また、驚くべきことに、プニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物ならびにＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物は、相乗的に、ＭＡＰ牛挽肉の色を保存することがわかっている。低温条件で５日間貯蔵された牛挽肉の試料において、ローズマリー抽出物を加えた、プニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物は、Ｐｕｎｉｃａまたはローズマリー単独の色保存の相加効果を超える。この相乗効果は、各抽出物の異なる濃度において観察された。
【００５７】
驚くべきことに、本発明者らは、高酸素濃度の存在下でのプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物が、グラム陽性生物であるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを阻害するという証拠を発見した。プニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物及び高酸素雰囲気の組み合わせは、牛挽肉における主要な腐敗生物として単離されたグラム陽性生物であるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを阻害する。さらに驚くべきことに、ローズマリーならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせは、高酸素雰囲気下で、グラム陽性生物であるこれらのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの相乗的な阻害を示す。
【００５８】
フェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物、ならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせは、相乗的に、酸素の存在下で生肉、生魚、及び家禽の生肉の色の貯蔵寿命を延ばす。ローズマリー抽出物または他の有効なＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物、ならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物、ならびに酸素の存在の組み合わせは、本発明にとって重要である。
【００５９】
ある特定の濃度でのプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物単独は、生の赤肉の色の寿命を短縮し、許容できない感覚刺激特性をもたらす。ローズマリー抽出物ならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせは、冷蔵条件で牛挽肉の色の寿命を延ばすように相乗的に作用する。その組み合わせは、それがプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物単独及びローズマリー単独の相加作用を超えるため、相加的なだけではなく相乗的でもある。
【００６０】
プニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物への、フェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物の添加は、生肉、生魚、及び家禽の生肉において色を保存し、微生物の増殖を阻害するのに有効である、香味が許容できる組成物をもたらす。
【００６１】
Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物、好ましくはローズマリー抽出物、ならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせは、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物またはプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物のいずれか単独よりも、グラム陽性、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌増殖を抑制するのに有効である。
【００６２】
酸素の存在下でのフェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物ならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせは、商業的に所望の貯蔵期間後に、パッケージ内の牛挽肉の香味に影響を及ぼさない。フェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物もしくはプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物単独も、酸素単独も、またはこれらの要因単独のうちの２つの組み合わせのいずれも、香味に影響を及ぼすことなく、貯蔵期間の少なくとも最大６日目に、それらの組み合わせと同じくらい良好かつ相乗的に色を保存しない。
【００６３】
驚くべきことに、ローズマリー抽出物または他のＬａｍｉａｃｅａｅの抽出物の添加は、抗リステリア効果を相乗的に改善し、より低用量の各抽出物の使用を可能にする。
【００６４】
また、驚くべきことに、プニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物ならびにＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物は、相乗的に、ＭＡＰ牛挽肉の色を保存することがわかっている。低温条件で５日間貯蔵された牛挽肉の試料において、ローズマリー抽出物を加えた、プニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物は、ヘスペリジンまたはローズマリー単独の色保存の相加効果を超える。
【００６５】
驚くべきことに、本発明者らは、高酸素濃度の存在下でのプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物が、グラム陽性生物であるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを阻害するという証拠を発見した。プニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物及び高酸素雰囲気の組み合わせは、牛挽肉における主要な腐敗生物として単離されたグラム陽性生物であるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを阻害する。さらに驚くべきことに、ローズマリーならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせは、高酸素雰囲気下で、グラム陽性生物であるこれらのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの相乗的な阻害を示す。
【００６６】
フェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物、ならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせは、相乗的に、酸素の存在下で生肉、生魚、及び家禽の生肉の色の貯蔵寿命を延ばす。したがって、ローズマリー抽出物または他の有効なＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物、ならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出出物、ならびに酸素の存在の組み合わせは、本開示の本方法及び組成物のうちのいくつかにとって有利である。
【００６７】
ある特定の濃度でのプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物単独は、生の赤肉の色の寿命を短縮し、許容できない感覚刺激特性をもたらす。ローズマリー抽出物ならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせは、冷蔵条件で牛挽肉の色の寿命を延ばすように相乗的に作用する。その組み合わせは、それがプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物単独及びローズマリー単独の相加作用を超えるため、相加的なだけではなく相乗的でもある。
【００６８】
プニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物への、フェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物の添加は、生肉、生魚、及び家禽の生肉において色を保存し、微生物の増殖を阻害するのに有効である、香味が許容できる組成物をもたらす。
【００６９】
Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物、好ましくはローズマリー抽出物、ならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせは、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物またはプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物のいずれか単独よりも、グラム陽性、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌増殖を抑制するのに相乗的に有効である。フェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物もしくはプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物単独も、酸素単独も、またはこれらの要因単独のうちの２つの組み合わせのいずれも、香味に影響を及ぼすことなく、商業的に所望の貯蔵期間内に、それらの３つの組み合わせと同じくらい良好に、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して肉を保存しない。
【００７０】
酸素の存在下でのフェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物ならびにプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせは、商業的に所望の貯蔵期間後に、パッケージ内の牛挽肉の香味に影響を及ぼさない。フェノール系ジテルペンを含有するＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物もしくはプニカラギン及びエラグ酸を含有するＰｕｎｉｃａ抽出物単独も、酸素単独も、またはこれらの要因単独のうちの２つの組み合わせのいずれも、香味に影響を及ぼすことなく、５日間の冷蔵期間後に、それらの３つの組み合わせと同じくらい良好に色を保存しない。
【００７１】
肉、魚、または家禽の肉に対して、添加剤の数を妥当な範囲内で保持するために、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を阻害する特性を提供する植物性抽出物を使用することが有利であり、より具体的には、肉の味に影響を及ぼすことなく、相乗的な抗リステリア効果を提供し、肉の赤色を保存する、植物性抽出物を組み合わせることが有利である。有利に、それらの個々の寄与の合計よりも優れた組み合わされた抽出物の、本開示に従った異なる植物性抽出物の製剤は、相乗的に、肉の味に影響を及ぼすことなく、全体的な抗リステリア活性を高め、肉の赤色を保存する働きをする。
【００７２】
本開示に従った方法及び組成物は、上記で紹介され、以下でより詳細に考察されるように、相乗効果を示す。本開示に従った方法及び組成物の相乗効果とは対照的に、２つの化合物が、作用機構にかかわらず同じ明らかな反応を引き起こし、かつ組み合わされた効果がそれらの個々の効果の代数和であるとき、その化合物は、総和を示すと言われることに留意されたい（Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。しかしながら、相乗作用において、２つの化合物の結合は、それらの個々の効果の代数和よりも大きい。
【００７３】
Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）における教示は、化合物の組み合わせの生物学的効果を評価するために使用されている。図１に示される（「先行技術」として認識され、Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｔｕｌａｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから引用された）、上部グラフの化合物の組み合わせ効果は、同様の機構を有する２つの化合物が一緒に与えられたとき、それらが典型的に相加効果をもたらすことを示す。これはまた、総和と称される。しかしながら、２つの化合物の効果がそれらの個々の効果の合計を超える場合、これは、相乗作用と称される予想外の効果である。
【００７４】
類推によって、図１の下部グラフに示されるような半用量に関する相乗的応答は、化合物Ａ及びＢの用量の半分の組み合わせがＡまたはＢ単独よりも大きい応答をもたらす場合に生じる。
【００７５】
肉などの食品マトリクスのための抗微生物製剤の当業者は、肉における抗微生物相乗作用が予測可能ではないことを認識している。３つの天然植物性抽出物間の異なる組み合わせに関して１つの相乗作用も開示され得なかった。Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｊ．，Ｂａｒｒｙ−Ｒｙａｎ，Ｃ．，＆Ｂｏｕｒｋｅ，Ｐ．（２００８）．“Ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｆｏｏｄ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２４（１），９１−９７）。組み合わせの相乗効果は、合成抽出物と天然抽出物との間の組み合わせに関してほとんど開示されていない（例えば、ＷＯ２０１３／１６９２３１）を参照されたい）。
【００７６】
本開示に従ったいくつかの組成物及び方法の１つの利点は、脱臭によって揮発性化合物を除去するプロセスによって達成される。脱臭プロセスは、ボルネオール、樟脳、１，８−シネオール、アルファピネン、カンフェン、ベルベノン、及び酢酸ボルニルを含む揮発性化合物を除去する。
【００７７】
本開示の本方法、システム、及び組成物に従った追加の利点は、ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物とのヘスペリジンまたはＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせによって達成される。さらに、米国特許第４，３８０，５０６号に記載されるプロセスとは異なり、本開示に従った方法は、分割プロセスを必要とせず、本方法は、追加の加工経費の使用を回避する。
【００７８】
本方法及びシステムの一態様に従った追加の利点は、揮発性化合物の濃度を低レベルまで低減して、肉などの組成物が適用される食品製品の味に影響を及ぼさず、それにより肉の味に影響を及ぼさない組成物である。
【００７９】
本発明のいくつかの態様の１つのさらなる利点は、（Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌによってすでに報告されているよりも）最大で６０超低い濃度のエラグ酸を有し、ローズマリー抽出物と組み合わされたときに抗リステリア効果をもたらす、Ｐｕｎｉｃａ抽出物の存在である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】出典“Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ”，（Ｔｕｌａｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）であり、上部分は、「Ｓｕｍｍａｔｉｏｎ：Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｅｑｕａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｆｆｅｃｔｓ  Ａｒｅ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  Ｗｈｅｎ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ”であり、下部分は、“Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｌｆ  ｔｈｅ  Ｄｏｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ａ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｂ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ａ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｇｒｅａｔｅｒ  Ｔｈａｎ  Ａ  ｏｒ  Ｂ  Ａｌｏｎｅ”である。
【図２】本発明に従った、肉におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ増殖を示すグラフである。
【図３】本発明に従った、ヘスペリジン及びローズマリー抽出物の組み合わせの抗リステリア相乗効果を示すグラフである。
【図４】本発明に従った、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ増殖を阻害及び低減する、ローズマリー抽出物及びヘスペリジンの異なる組み合わせの抗微生物表面応答を示すグラフである。
【図５】本発明に従ったローズマリー抽出物及びヘスペリジンの組み合わせに関する、本発明に従った肉の赤色値を示す棒グラフである。
【図６】本発明に従ったローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の様々な組み合わせに関する、本発明に従った肉の赤色値を示す棒グラフである。
【図７】ミンチ牛肉における、植物抽出物によるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ増殖の阻害を示すチャートである。
【図８】９日目の８℃でのミンチ牛肉における、植物抽出物によるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ増殖の阻害を示すグラフである。
【図９】は、６日目の８℃でのミンチ牛肉における、植物抽出物によるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ増殖の阻害を示すチャートである。
【図１０】本発明に従った、９日目の８℃でのミンチ牛肉における、植物抽出物によるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ増殖の阻害を示すチャートである。
【図１１】本発明に従った、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ増殖を阻害及び低減する、ローズマリー抽出物及びＰｕｎｉｃａ抽出物の異なる組み合わせの抗微生物表面応答を示すグラフである。
【図１２】家禽肉のソーセージにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを示すグラフである。
【図１３】本発明に従った、Ｒ／Ｐの抽出物組み合わせによる、家禽肉のソーセージにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ増殖の阻害を示すグラフである。
【図１４】Ｒ／Ｈの抽出物組み合わせによる、家禽肉のソーセージにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ増殖の阻害を示すグラフである。
【図１５】ポークソーセージにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを示すグラフである（対照）。
【図１６】Ｒ／Ｐの抽出物組み合わせによる、ポークソーセージにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ増殖の阻害を示すグラフである。
【図１７】Ｒ／Ｈの抽出物組み合わせによる、ポークソーセージにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ増殖の阻害を示すグラフである。
【図１８】スモークサーモンにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を示すグラフである（対照）。
【図１９】増殖の３０日目のスモークサーモンにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの阻害を示すグラフである。
【図２０】増殖の３０日目のスモークサーモンにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの阻害を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
本開示に従った組成物は、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物とヘスペリジンとを含み、味に影響を及ぼすことなく、生肉、生魚、及び家禽の生肉の貯蔵寿命を延ばすために組成物を使用するための方法を含む。
【００８２】
本発明は、別の形態において、Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物とＰｕｎｉｃａ抽出物とを含む組成物、ならびに味に影響を及ぼすことなく、生肉、生魚、及び家禽の生肉の貯蔵寿命を延ばすためにこれらの組成物を使用するための方法を含む。
【００８３】
本方法及び組成物は、単独で、またはヘスペリジンと、もしくはエラグ酸及びプニカラギンが豊富なＰｕｎｉｃａ抽出物と組み合わせて、フェノール系ジテルペンが豊富なローズマリー抽出物が、商業的に有意な期間にわたって肉の赤色を保存するという発見に基づく。本発明者らは、柑橘果皮から抽出され、次いで精製された、フラボノイドである純粋なヘスペリジンで肉を加工することが、肉におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を防止することを発見した。ヘスペリジンと、もしくはエラグ酸及びプニカラギンを含むＰｕｎｉｃａ抽出物と組み合わせた、フェノール系ジテルペンを含むＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物は、肉の味に影響を及ぼすことなく、商業的に所望の期間にわたって微生物の増殖を抑制するための、かつ肉の赤色を保存するための新規の解決法を相乗的に提供した。本発明の組成物は、グラム陽性微生物の増殖を阻害することがわかっている。本発明の組成物は、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖を阻害することがわかっている。本発明の組成物は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を阻害することがわかっている。
【００８４】
肉の味に影響を及ぼすことなく、肉におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ増殖を相乗的に防止するために使用されてきたであろう、かつ肉の色の保存を相乗的に改善する、フェノール系ジテルペン、カルノシン酸及びカルノソール、ならびにヘスペリジンで標準化された植物抽出物、またはフェノール系ジテルペン、カルノシン酸及びカルノソールで標準化された植物抽出物、ならびにエラグ酸及びプニカラギンで標準化された植物抽出物を含む組み合わせは、先行技術から検索され得なかった。
【００８５】
ヘスペリジンとの、またはプニカラギン及びエラグ酸を含むＰｕｎｉｃａ抽出物との、ローズマリーまたはフェノール系ジテルペンを含む他のＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物の組み合わせの抗微生物使用に関して、先行技術のうちのどれも、本方法及び組成物を予測することも、あるいは明らかな状態にすることもしていない。先行技術は、ハーブ製油の使用、またはクエン酸などの有機酸の使用に焦点を合わせている。本開示で使用されるローズマリー抽出物は、それらを、天然精油を本質的に含まず、フェノール系ジテルペンが豊富なものにする様式で加工される。先行技術は、フェノール系ジテルペンが豊富なＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物、ならびにプニカラギン及びエラグ酸が豊富なＰｕｎｉｃａ抽出物の相乗的な組み合わせを予測することも、あるいは明らかな状態にすることもしていない。
【００８６】
先行技術は、フェノール系ジテルペンが豊富なＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物及びヘスペリジンの相乗的な組み合わせを予測することも、あるいは明らかな状態にすることもしていない。先行技術は、グラム陽性生物、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対する、プニカラギン及びエラグ酸を含むＰｕｎｉｃａ抽出物との、またはヘスペリジンとの、フェノール系ジテルペンを含むＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物の組み合わせの驚くほど有益な抗微生物効果を予測することも、あるいは明らかな状態にすることもしていない。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ．先行技術は、プニカラギン及びエラグ酸を含むＰｕｎｉｃａ抽出物との、またはヘスペリジンとの、フェノール系ジテルペンを含むＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物の組み合わせの驚くほど有益な色保存効果を予測することも、あるいは明らかな状態にすることもしていない。
【００８７】
先行技術は、プニカラギン及びエラグ酸を含むＰｕｎｉｃａ抽出物との、またはヘスペリジンとの、フェノール系ジテルペンを含むＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物の組み合わせの食品の味に対する影響がないことを予測することも、あるいは明らかな状態にすることもしていない。
【００８８】
ナリンギン、イソクラメチン（ｉｓｏｃｕｒａｍｅｔｉｎ）、ネオヘスペリジン、ヘスペリジン、ポンシリン、ネビレチン（ｎｅｂｉｌｅｔｉｎ）、及びタンゲレチンが挙げられるがこれらに限定されない、同じ効果を有する他のフラボノイド。
【００８９】
定義
以下は、本開示全体を通じて使用される定義のリストである。
【００９０】
「有効量」とは、当業者が日常の実験を通じて容易に決定することが可能であることに従って、特定の効果を達成するために必要な量である。例えば、本開示に関して、生肉、生魚、及び家禽の生肉に適用されて、生肉、生魚、及び家禽の生肉の赤色の寿命を延ばすための、Ｐｕｎｉｃａ抽出物とＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物とを含む有効量の組成物は、Ｐｕｎｉｃａ及びＬａｍｉａｃｅａｅ抽出物の濃度、生肉、生魚、及び家禽の生肉の体積及び／または表面積、ならびに生肉、生魚、及び家禽の生肉の雰囲気環境条件が挙げられるがこれらに限定されない、既知のパラメータに基づき、赤色の寿命を提供するために決定される量である。同様に、他の食品の寿命を延ばすためのローズマリー／Ｐｕｎｉｃａの有効量は、同様の方法で決定される。
【００９１】
「食品」及び「食品製品」は、ヒトまたは動物が食べる製品を意味する。食品または食品製品としては、生肉、生魚、及び家禽の生肉、ならびに加工肉、加工魚、及び加工家禽肉が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９２】
「生肉、生魚、及び家禽の生肉」は、肉、魚、及び家禽、枝肉全体、そのカット部分、ならびにその挽いた部分を意味する。生肉、生魚、及び家禽の生肉としては、未加工の肉、魚、及び家禽の肉、ならびに肉、魚、または家禽の肉に組み込まれるポリリン酸塩、塩、水、香味、ブロス、添加タンパク質、糖、デンプンなどの添加剤を含む肉、魚、または家禽の肉の両方が挙げられる。これらの成分を含有し得る生肉、魚、または家禽の肉を、保存加工された肉、魚、家禽の肉と区別することが重要であり、保存加工された肉、魚、家禽の肉は、同じ成分を含有し得るが、以下：エリソルベート、エリソルビン酸、アスコルベート、アスコルビン酸、亜硝酸塩、硝酸塩、または培養物のうちの１つ以上も含有する。生肉、生魚、及び家禽の生肉は、保存加工された肉、魚、または家禽の肉とは区別され、かつそれらとは対照的で、かつそれらを含まないものとする。
【００９３】
「ヘスペリジン」とは、天然または合成から抽出された化合物を意味する。
【００９４】
「Ｌａｍｉａｃｅａｅ抽出物」とは、Ｌａｍｉａｃｅａｅ科、好ましくはローズマリー、セージ、オレガノ、タイム、ミント、及び以下の属：Ｓａｌｖｉａ、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ、Ｌｅｐｅｃｈｉｎｉａ、Ｏｒｅｇａｎｕｍ、Ｔｈｙｍｕｓ、Ｈｙｓｓｏｐｕｓ、及びこれらの混合物の植物由来の抽出物を意味する。最も好ましいのは、ローズマリーである。
【００９５】
「肉、魚、及び家禽の肉」は、ａ）加工された肉、魚、及び家禽の肉、ならびにｂ）未加工の肉、魚、及び家禽の肉の両方を意味する。
【００９６】
「フェノール系ジテルペン」とは、カルノシン酸、カルノソール、カルノシン酸メチル、及び他のフェノール系ジテルペン誘導体（ロスマノール、イソロスマノール、１１，１２−ジ−Ｏ−メチルイソロスマノール、１２−Ｏ−メチルカルノシン酸、ロスマノール−９−エチルエーテル、シルシマリチン（ｃｉｒｃｉｍａｒｉｔｉｎ）、カルノシン酸のメチル化、一酸化生成物、ゲンクワニン、エピロスマノール、イピイソロスマノール、カルノシン酸誘導体、エピロスマノールエチルエーテル、クリプトタンシノン）、ならびにこれらの混合物を意味する。
【００９７】
「加工された食料」ならびに「加工された肉、魚、及び家禽の肉」などの「加工された」とは、切断面が、製品がもはや生肉、魚、または家禽の肉の特徴を有しないことを示すような、肉、魚、もしくは家禽の肉などの食品の加工、またはそのような加工された製品のさらなる加工によって生じる製品である。加工は、加熱、燻煙、保存加工、熟成、乾燥、マリネ、抽出、押出、またはそれらのプロセスの組み合わせが挙げられる、初期の製品を実質的に変化させるいかなる行為も意味する。プロセスは、非加熱処理及び加熱処理プロセスを含む。
【００９８】
「Ｐｕｎｉｃａ抽出物」は、Ｐｕｎｉｃａ属、好ましくはＰｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ及びＰｕｎｉｃａ  ｐｒｏｔｏＰｕｎｉｃａ、ならびにこれらの混合物の植物由来の抽出物を意味する。最も好ましいのは、Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍである。
【００９９】
「未加工の」（肉、魚、及び家禽の肉など）は、食料（例えば、肉、魚、及び家禽の肉）の元の状態の実質的な変化をもたらすいかなる処理も受けていないことを意味する。しかしながら、食料は、例えば、分離されていても、分割されていても、切断されていても、骨抜きされていても、ミンチされていても、皮剥ぎされていても、そぎ落とされていても、ピーリングされていても、挽かれていても、カットされていても、洗浄されていても、切り取られていても、急速冷凍されていても、冷凍されていても、冷蔵されていても、粉砕もしくは外皮除去されていても、包装されていても、または包装されていなくてもよい。肉、魚、及び家禽の肉を含む未加工の食料としては、それに食料シーズニングもしくは添加剤が添加されているか、または肉、魚、もしくは家禽の肉の内部の筋肉繊維を改質し、したがって生肉、魚、または家禽の肉の特徴を排除するのに不十分な加工を受けている、未処理の生肉、生魚、及び家禽の生肉、ならびに粉砕またはミンチされている生肉、生魚、及び家禽の生肉が挙げられる。
【０１００】
本方法及び組成物の開発において、ヘスペリジンがある特定の濃度範囲内で調製されたときに、肉において抗リステリア効果を有することが発見された。
【０１０１】
本方法及び組成物の開発において、ヘスペリジンまたはＰｕｎｉｃａ抽出物と組み合わされた、フェノール系ジテルペンを含むローズマリー抽出物が、抽出物が単独で適用されるときよりも、肉におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を抑制することに対して優れた効果を有することが発見された。
【０１０２】
本方法及び組成物の開発において、ヘスペリジンと、またはプニカラギン及びエラグ酸を含むＰｕｎｉｃａ抽出物と組み合わされた、ローズマリーの抽出物のある特定の混合物が、ある特定の濃度比の範囲内で調製されたときに、相乗的な抗リステリア効果を提供することが発見された。
【０１０３】
本方法及び組成物の開発において、ヘスペリジンまたはＰｕｎｉｃａ抽出物と組み合わされた、フェノール系ジテルペンを含むローズマリー抽出物が、抽出物が単独で適用されるときよりも、肉における赤色を保存することに対して優れた効果を有することが発見された。
【０１０４】
本方法及び組成物の開発において、ヘスペリジンと、またはプニカラギン及びエラグ酸を含むＰｕｎｉｃａ抽出物と組み合わされた、ローズマリーの抽出物のある特定の混合物が、ある特定の濃度比の範囲内で調製されたときに、肉において相乗的な赤色保存効果を提供することが発見された。
【０１０５】
フェノール系ジテルペンが豊富な抽出物及びヘスペリジンまたはＰＵＮＩＣＡ抽出物の混合物
カルノシン酸またはカルノソールなどのフェノール系ジテルペンは、特にＬａｍｉａｃｅａｅ中で生じる。これまで、カルノシン酸は、Ｌａｍｉａｃｅａｅを除外して、数個の種のみで識別されている。本発明者らの知っている限りでは、Ｍｅｎｔｈｅａｅ連の７０個の属のうち７つのみがカルノシン酸を含有する：Ｓａｌｖｉａ（Ｂｒｉｅｓｋｏｒｎ  ａｎｄ  Ｄｕｍｌｉｎｇ，１９６９）、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ（Ｌｕｉｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，２００５）、Ｌｅｐｅｃｈｉｎｉａ（Ｂｒｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、Ｏｒｅｇａｎｕｍ（Ｈｏｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、及びＴｈｙｍｕｓ（Ａｃｈｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。それは、Ｈｙｓｓｏｐｕｓ中に存在し得、その考えられる誘導体のうちの１つ、ロスマノール−９−エチルエーテル（７）が特定された（Ｄｊａｒｍａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。カルノシン酸はまた、Ｏｃｉｍｅａｅ連の１つの属、Ｏｃｉｍｕｍ中に少量の化合物として生じる（Ｊａｙａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。Ｂｒｉｅｓｋｏｒｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｄｕｍｌｉｎｇ，Ｈ．Ｊ．，１９６９。Ｃａｒｎｏｓｏｌｓａｕｒｅ，ｄｅｒ  ｗｉｃｈｔｉｇｅ  ａｎｔｉｏｘｙｄａｔｉｖ  ｗｉｒｋｓａｍｅ  Ｉｎｈａｌｔｓｓｔｏｆｆ  ｄｅｓ  Ｒｏｓｍａｒｉｎ−ｕｎｄ  Ｓａｌｂｅｉｂｌａｔｔｅｓ．Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｒ  Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇ  ｕｎｄ  Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  １４１，１０−１６、Ｌｕｉｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，２００５、Ｂｒｕｎｏ，Ｍａｕｒｉｚｉｏ，ｅｔ  ａｌ．“Ａｂｉｅｔａｎｅ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｐｅｃｈｉｎｉａ  ｍｅｙｅｎｉ    ａｎｄ  Ｌｅｐｅｃｈｉｎｉａ  ｈａｓｔａｔａ．”Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０．７（１９９１）：２３３９−２３４３、Ｈｏｓｓａｉｎ，Ｍｏｈａｍｍａｄ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌａｍｉａｃｅａｅ  ｓｐｉｃｅｓ  ｂｙ  ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８．１９（２０１０）：１０５７６−１０５８１、Ａｃｈｏｕｒ，Ｓ．，Ｋｈｅｌｉｆｉ，Ｅ．，Ａｔｔｉａ，Ｙ．，Ｆｅｒｊａｎｉ，Ｅ．，Ｎｏｕｒｅｄｄｉｎｅ  Ｈｅｌｌａｈ  Ａ．，２０１２。Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｔｈｙｍｕｓ  ｃａｐｉｔａｔｕｓ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｂｙ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ７７，Ｃ７０３−Ｃ７０９、Ｄｊａｒｍａｔｉ，Ｚ．，Ｊａｎｋｏｖ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｃｈｗｉｒｔｌｉｃｈ，Ｅ．，Ｄｊｕｌｉｎａｃ，Ｂ．，Ｄｊｏｒｄｅｊｅｖｉｃ，Ａ．，１９９１。Ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓａｇｅ  ｂｙ  ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ＣＯ２  ｅｘｔｒａｃｔｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ６８，７３１−７３４、Ｊａｙａｓｉｎｇｈｅ，Ｃ．，Ｇｏｔｏｈ，Ｎ．，Ａｏｋｉ，Ｔ．，Ｗａｄａ，Ｓ．，２００３。Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｗｅｅｔ  ｂａｓｉｌ（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ  Ｌ．）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１，４４４２−４４４９。Ｓｅａｓｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｎｄ  ｃａｒｎｏｓｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｒｏｓｅｍａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔｓ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｒａｄｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３，１０６−１１２。
【０１０６】
ここで、本質的にフェノール系のジテルペンを抽出及び濃縮する目的で、これらのフェノール系ジテルペンをローズマリーから抽出した：４４〜８５％。次いで、このようにして得られた抽出物を脱臭して、食品の味に影響を及ぼす精油及び揮発性化合物を排除した。
【０１０７】
ローズマリー抽出物
ローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の葉は、様々な溶媒で抽出され得、異なる化合物が豊富である抽出物をもたらすことができる。例えば、水性抽出物がロスマリン酸にかなり富んでいる一方で、有機溶媒を使用した抽出はむしろ、カルノシン酸及びカルノソールなどのフェノール系ジテルペンが豊富な抽出物をもたらす。ローズマリー抽出物の組成物を調製するための詳細な手順は、米国特許第５，８５９，２９３号及びＷＯ９６／３４５３４に記載され、両方が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
ローズマリーの葉を室温でアセトンを用いて抽出した。抽出が完了した後、アセトン抽出物を濾過して、ローズマリーの葉から溶液を分離し、減圧下で濃縮して、濃縮天然抽出物を作製した。この時、濃縮抽出物は、軽度の加熱下で、真空中で直接乾燥させられ、約１５％〜３０％カルノシン酸及び１％〜３％カルノソールを含む組成物である粉末抽出物を作製することができる。あるいは、濃縮天然抽出物に炭酸ナトリウム水溶液（ＮａＨＣＯ３）を添加して、カルノシン酸及び他の有機酸を溶解した一方で、塩基不溶性物質を沈殿させた。
【０１０９】
その溶液を濾過して固体から分離し、濾液をさらに減圧下で濃縮した。いったん仕上げの濃縮が達成されると、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）を添加し、酸不溶性物質（カルノシン酸、カルノソール、及びカルノシン誘導体を含む）を濃縮溶液から沈殿させた。活性炭は、濾過前に溶液中のローズマリー抽出物を脱臭するためのプロセス中に使用される。濾過によって、沈殿固体を続いて液体から分離し、水で洗い流して不純物を除去した。
【０１１０】
最後に、固体を真空オーブン内で乾燥させ、次いで、粉末に粉砕して、約４０〜６５％カルノシン酸、２〜１０％カルノソール、及び２〜１０％  １２−Ｏ−メチルカルノシン酸を含有する組成物を作製した。ここで、使用した抽出物は、＞４８％のカルノシン酸＋カルノソールを含有した。ローズマリー抽出物を脱臭するために最後のステップを行った。それは、アセトン／ヘキサンの混合物を用いた以前の固体の後続の抽出に対応した。このステップの目的は、脂肪分子及び揮発性化合物の排除であった。濾液を減圧下で濃縮し、液体担体上で直接製剤化した。
【０１１１】
本明細書及び特許請求の範囲内で、フェノール系ジテルペン、カルノシン酸及びカルノソールで標準化されたこの抽出物は、ローズマリー、またはローズマリー抽出物、またはローズマリー（粉末）、またはローズマリー（液体）のいずれかと称される。
【０１１２】
ヘスペリジン抽出
【０１１３】
乾燥未熟果実（ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ  Ｌ．）を蒸気に曝露して、水での抽出前にペクチンを除去した。続いて、水酸化ナトリウム及び水酸化カルシウムを溶液に添加して、ｐＨ値を安定させた。濾過ステップに続いて、ＨＣｌを使用して濾液の酸性化を誘発した。このステップの後に、ヘスペリジンは沈殿し、溶液は除去され、沈殿物は乾燥させられる。最終生成物は、ＨＰＬＣで測定して、９０％〜９９％ヘスペリジン、好ましくは９５％を超えるヘスペリジンを含有する。
【０１１４】
得られた抽出物は、本質的にヘスペリジン（＞８０％）を含有し、純粋であると見なされる。本開示全体を通じて、＞９５％においてヘスペリジンで標準化されたこの抽出物は、ヘスペリジン、またはヘスペリジン（粉末）、またはヘスペリジン（液体）と称される。
【０１１５】
Ｐｕｎｉｃａ抽出
ザクロの皮の苦味（Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ  Ｌ．）をエタノール／水を用いて抽出した。抽出物を濾過し、次いで濃縮した。乾燥前に、抽出物を担体と、本実施例ではマルトデキストリンと混合した。異なる乾燥技術が適用され得る。この抽出物を、ＨＰＬＣによって決定される通り、以下のポリフェノール：プニカラギン（ＨＰＬＣによって＞７．５％）及びエラグ酸（１．５〜２．５％）で標準化した。
【０１１６】
本開示全体を通じて、プニカラギン（ＨＰＬＣによって＞７．５％）及びエラグ酸（１．５〜２．５％）で標準化されたこの抽出物は、Ｐｕｎｉｃａ、またはＰｕｎｉｃａ抽出物、またはＰｕｎｉｃａ（粉末）、またはＰｕｎｉｃａ（液体）のいずれかと称される。
【０１１７】
ローズマリー抽出物／ヘスペリジン及びローズマリー抽出物／Ｐｕｎｉｃａ抽出物の生成物及び混合物の調製
【０１１８】
植物抽出物及びそれらの組み合わせを乾燥させて粉末にした。抽出物の組み合わせの好適な乾燥プロセスを確実にするために、マルトデキストリンを使用した。マルトデキストリンは、乾燥プロセスのために一般的に使用される賦形剤または担体である。
【０１１９】
マルトデキストリンは、２０未満のデキストロース当量を有するデンプン加水分解生成物として定義される。デキストロース当量（ＤＥ値）は、加水分解物の乾燥物質上でのＤ−グルコースの割合として表現された、デンプン由来のオリゴ糖の還元力の基準であり、無水グルコース単位の平均重合度（ＤＰ）の逆値である。デンプン加水分解の生成物として、マルトデキストリンは、直鎖アミロース及び分岐鎖アミロペクチン分解産物を含有し、したがって、それらは、−（１，４）及び−（１，６）結合によって結合されたＤ−グルコースポリマーと見なされる。
【０１２０】
マルトデキストリンは天然化合物（デンプン）由来であるが、それらの構造は、それらが由来する天然分子（デンプン）の初期構造とは異なる。この差は、加水分解プロセスによって誘発される。したがって、マルトデキストリン構造は、自然に発生しない。
【０１２１】
他の考えられる賦形剤または担体としては、マルトデキストリン、アラビアガム、デキストロース、塩、脂肪酸のモノ及びジグリセリド、ＭＰＧ、ポリソルベート８０、植物油、脂肪酸のモノ及びジグリセリド、グルコースシロップ、グリセリン、水、及びアルコールが挙げられる。
【０１２２】
組成物を１５％脂肪で生のミンチ牛肉に添加した。
【０１２３】
本方法及び組成物につながる研究の過程で、多くの異なる濃度比のローズマリー抽出物及びヘスペリジンまたはＰｕｎｉｃａ抽出物の混合物を、伝統的な微生物学的方法を使用して、抗リステリア有効性に関して試験した。全てのここで研究された試料における細菌計数を、標準化法に従ってＡｌｏａ培地上で実施した（ＮＦ  ＥＮ  ＩＳＯ  １１−２９０）。いかなる抗リステリア剤も用いらず、かついかなる植物抽出物も用いらず、肉においてＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を評価した（対照）。対照肉におけるリステリア増殖のデータは、図２に表される。６日間の増殖後、Ｌｉｓｔｅｒｉａはわずかに、０．２９ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬだけ増殖した。９日間の増殖後、Ｌｉｓｔｅｒｉａは２．４２ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬ増殖した。肉に関する実験を、２０％超のＯ２、より正確には７０％のＯ２及び３０％のＣＯ２を含有した調整雰囲気包装（ＭＡＰ）中で実施した。
【０１２４】
肉製造に続いて、ミンチプロセスの直後に肉のバッチをサンプリングし、冷蔵条件下で研究所に輸送した。研究所において、肉を２ｋｇの試料にサンプリングし、実験の２４時間前に、−２０℃において真空下で調節され、２ｋｇの肉試料を２〜４℃で移し、中心部温度が−１℃に達するまで、２４時間±３時間、この温度で保持した。
【０１２５】
この段階で、バイオセーフティレベル３の研究所で、２ｋｇの肉試料にＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを接種して、他の微生物による汚染を回避するようにした。そのような研究所において、肉への任意のさらなる補充を実施した。４℃での接種材料の均質化に続いて、接種された２ｋｇの肉試料に植物抽出物を補充し、均質化した。植物抽出物は粉末形態であり、そのようなものとして肉に添加した。それらを乾燥粉末として保持するために、乾燥プロセス前に、植物抽出物にマルトデキストリンを補充した。
【０１２６】
植物抽出物は、親油性もしくは親水性液体、またはこれらの組み合わせとして肉に添加され得る。そうするために、植物親油性または親水性抽出物は、可溶化されるか、または液体である必要があり、乾燥していない抽出物は、乾燥ステップを受けることなく直接使用され得る。
【０１２７】
植物抽出物の補充及び均質化の直後、２片の１００ｇのそのように形成されたミンチ肉を一緒にトレイに配置した。抽出物処置のない対照肉片は、同じ手順を踏んだ。
【０１２８】
次いで、トレイを、４または８℃で、２０％以上の酸素、好ましくは７０％のＯ２及び３０％のＣＯ２の調整雰囲気下で調節した。包装された肉を規定の時間にわたって暗い場所で貯蔵した。
【０１２９】
ローズマリー及びヘスペリジン抽出物、ローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物、典型的な抗リステリア化合物（乳酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウム）、ならびに未処置の対照を伴う一連の実験を実施した。ローズマリー及びヘスペリジンの混合物または単独の抽出物を、１．１８％で肉に添加した。ローズマリー及びＰｕｎｉｃａの混合物または単独の抽出物を、０．４８％で肉に添加した。典型的な抗リステリア化合物、乳酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを、別々の実験において、それぞれ２５ｇ／ｋｇ及び３ｇ／ｋｇの伝統的な濃度で添加した。
【０１３０】
試験前に、以下の割合及び用量に従って、抽出物の組み合わせを調製し、肉に添加した。
【０１３１】
【表１】
2018505679.tif 000002
【０１３２】
【表２】
2018505679.tif 000003
【０１３３】
補充及び均質化の直後、ハンバーグの形状の２片の１００ｇのミンチ肉をトレイに配置した。次いで、トレイを、７０％のＯ２及び３０％のＣＯ２の調整雰囲気下で調節し、リステリア増殖及び赤色を含む感覚刺激特性の分析まで、８℃で貯蔵した。貯蔵の０日目、６日目、及び９日目に、そのような分析を実施した。
【０１３４】
各抽出物及び化合物に関して、かつそれらの組み合わせに関して、冷蔵条件下での肉において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を評価した。実験の開始時に、商業的な貯蔵寿命の３分の２（６日間）において、かつ貯蔵寿命の商業的期間（９日間）に対応する時点で、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を測定した。リステリア増殖の対数値（ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬ）を各実験及び処置に対して計算した。植物抽出物で処置された肉と未処置の対照との間のリステリア増殖の対数値（ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬ）の差を計算して、最終結果を得た。より負の値が得られるほど、抽出物または抽出物の組み合わせの抗リステリア効果はより高くなった。肉の科学微生物学において、所与の時間にわたって、値は、０．５Ｌｏｇ１０  ＣＦＵ・ｇ−１の差が観察されたときに２つの列の間で有意であると見なされる（Ｃｈａｉｌｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、（Ｇｕｉｄｅ  ｐｏｕｒ  ｌａ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄｅ  ｍeｔｈｏｄｅｓ  ｄ’ｅｓｓａｉｓ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ  ｅｔ  ｌ’eｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｄｅ  ｌｅｕｒ  ｉｎｃｅｒｔｉｔｕｄｅ  ｄｅ  ｍｅｓｕｒｅ  ｄａｎｓ  ｌｅｓ  ｄｏｍａｉｎｅｓ  ｄｅ  ｌａ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ  ａｌｉｍｅｎｔａｉｒｅ  ｅｔ  ｄｅ  ｌ’ｅｎｖｉｒｏｎｎｅｍｅｎｔ），Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒｉｓｃｈｅ  Ｅｉｄｇｅｎｏｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ，Ｃｏｎｆeｄeｒａｔｉｏｎ  ｓｕｉｓｓｅ，Ｄeｐａｒｔｅｍｅｎｔ  ｆeｄeｒａｌ  ｄｅ  ｌ’eｃｏｎｏｍｉｅ，ｄｅ  ｌａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｅｔ  ｄｅ  ｌａ  ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  ＤＥＦＲ，Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｎｏ．３２８，Ａｐｒｉｌ  ２０１３，Ｒｅｖ．０３）。微生物学において、処置は、その効果が未処置の対照と比較して−０．５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬを超える場合、有意な抗菌効果を有することに留意されたい。
【０１３５】
リステリア増殖中、肉の色を監視し、抽出物の添加直後（０日目）及び増殖６日目に画像を撮影した。標準化された光曝露条件下で、かつ「ＰａｃｋＳｈｏｔ  Ｃｒｅａｔｏｒ」と呼ばれるシステムを使用して画像を撮影した。実際に、この専門的な装置は、単色光を拡散する４つの蛍光灯を含む最適化されたライトボックスからなり、最小限の反射で、同じ条件下で常に撮影される画像をもたらす。
【０１３６】
異なる時間スケールにおける「試料」を表す各写真を、オープンソース画像解析プログラムＩｍａｇｅＪに取り込んだ。そのソフトウェアは、色または密度などの異なる食品パラメータを測定するために、食品産業において一般的に使用される（Ｒｅｉｎｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒｓ  ｏｎ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｔａｒｃｈ  Ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｄｉａ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１，２０１１，２０４０−３０４６、Ｋｅｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ３Ｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｄｉａ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１，２０１１，４８３−４９１）。赤色の代表的な値を得るために、ＲＧＢモデルの３つの色度、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）及び青（Ｂ）のうちの色度赤（Ｒ）を使用し、を試料にわたって引いた線の各ピクセルの色を測定した。ビルトインＲＧＢプロファイルプロットプラグインを使用して、この線に沿った各ピクセルの異なる色の値、特に赤色の値を判定した。結果は、この線に沿ったピクセル数の関数としての異なる色の値の変化として表される。結果を、ｐ＜０．０５におけるＡＮＯＶＡ試験を使用して有意差に関して統計的に分析した。したがって、１つの試料当たり、１０００を超えるピクセルを分析した。
【０１３７】
肉の色に対する植物抽出物の効果を評価するために、処置された肉の赤色を未処置の対照と比較した。［抽出物を用いた肉における赤色］−［対照肉における赤色（抽出物なし）］によって、効果を計算した。負の効果とは、抽出物の添加が肉の赤色を保存しないことを意味する。正の効果とは、抽出物の添加が対照と比較して肉の赤色を改善することを意味する。
【０１３８】
ローズマリー及びヘスペリジンの混合物
生肉におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖
【０１３９】
６日目及び９日目のそのような試験の結果は、図７及び図８に示される。データは、２〜６回の反復の平均値である。データは、接種対照（未処置の肉）と比較した、処置された肉におけるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ増殖の対数差分を表す。データを、ＡＮＯＶＡを使用してｐ＜０．０５における有意性に関して統計的に分析した。異なる文字は、ｐ＜０．０５における有意差を示す。
【０１４０】
ローズマリー抽出物及び／またはヘスペリジンを使用した６日目のそのような試験の結果は、以下の表１に記載される。
【０１４１】
【表３】
2018505679.tif 000004
【０１４２】
そのような短い継続時間（低温条件で６日間の増殖）において、ｌｏｇで表現される、未処置の肉と比較した植物抽出物で処置された肉におけるリステリア増殖の差が、−０．５ｌｏｇに到達せず、それが、そのような短い増殖の時間において、抗リステリア効果が認識され得ないことを意味することに留意されたい。そのような短い継続時間（低温条件で６日間の増殖）において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが対照の肉において、０．２９ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬのみ増殖したことに留意されたい（図２）。
【０１４３】
組み合わされたとき、ローズマリー抽出物及びヘスペリジンの組み合わせの測定した効果が、組み合わせ効果が予想外に拮抗的であるため、６日間の増殖後に上記の濃度における相乗効果に対応しないことに留意されたい。
【０１４４】
濃度を半分にしたとき、上記の表から計算された以下の予測した効果及び測定した効果が得られ、表２に示した。
【０１４５】
【表４】
2018505679.tif 000005
【０１４６】
そのような短い継続時間（低温条件で６日間の増殖）において、ｌｏｇで表現される、未処置の肉と比較した植物抽出物で処置された肉におけるリステリア増殖の差が、−０．５ｌｏｇに到達せず、それが、そのような短い増殖の時間において、抗リステリア効果が認識され得ないことを意味することに留意されたい。そのような短い継続時間（低温条件で６日間の増殖）において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが対照の肉において、０．２９ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬのみ増殖したことに留意されたい（図２）。
【０１４７】
上記の表２において、半用量で単独で適用されたヘスペリジンが、驚くべきことに、最大用量におけるよりも大きい抗リステリア効果を有することに留意されたい。予想外の効果は、アスタリスクによって示される。一方で、半用量のローズマリーならびに半用量のローズマリー及び最大用量のヘスペリジンの組み合わせの効果は、予測されたものに拮抗した。最後に、半用量のローズマリー及び半用量のヘスペリジンの組み合わせならびに最大用量のローズマリー及び半用量のヘスペリジンの組み合わせの効果は、予測した通り追加の範囲内にとどまった。
【０１４８】
ローズマリー抽出物及び／またはヘスペリジンを使用した９日目のそのような試験の結果は、以下の表３に記載される。
【０１４９】
【表５】
2018505679.tif 000006
【０１５０】
低温条件で９日間の増殖後、ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬで表されたリステリア増殖の差が、−０．５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬを超え、それが、上記の表に示される全ての抽出物の抗リステリア効果ならびにそれらの濃度及び組み合わせが、商業的に所望の期間内に認識され得ることを意味することに留意されたい。
【０１５１】
【表６】
2018505679.tif 000007
【０１５２】
肉における９日間の増殖後、全ての試験された濃度における抽出物単独またはそれらの組み合わせは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を０．５ｌｏｇ超阻害し、それは、それらが肉において抗リステリア効果を有したことを意味する。
【０１５３】
予想外に、先行技術を考慮して、かつインビトロでのデータを考慮して、ヘスペリジンは、全ての試験された濃度において抗リステリア効果を有した。さらに、予想外に、ローズマリー抽出物またはヘスペリジン単独は、最大濃度と比較して半分の濃度で使用されたときに、より大きい抗リステリア効果を有した。さらに、予想外に、半分の濃度でヘスペリジンと組み合わされたローズマリー抽出物は、最大濃度における各抽出物単独よりも大きい抗リステリア効果を有した。これは相乗作用である（図３）。
【０１５４】
３つのレベルで設計した応答曲面法実験計画法を使用して、異なる濃度及びそれらの応答表面を分析した。これらの結果は、図４に示される。それらは、図５に提供されるように、［植物抽出物で処置された肉における（ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ））−（ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）対照の肉（処置なし））］＜０．５として決定される、肉において抗リステリア応答を提供する以下の濃度範囲を示す。
【０１５５】
【表７】
2018505679.tif 000008
【０１５６】
抗リステリア効果を確実にするために、上記の抽出物の濃度（表５）のいずれも、組み合わせてまたは単独で肉に添加され得ることに留意されたい。単独でまたは組み合わせて肉に添加された抽出物の全体の割合は、１．１８％を超えなかった。
【０１５７】
リステリア増殖中、肉の色を監視し、抽出物の添加直後（０日目）及び増殖６日目に画像を撮影した。
【０１５８】
異なる時間スケールにおける「試料」を表す各写真を、オープンソース画像解析プログラムＩｍａｇｅＪに取り込んだ。そのソフトウェアは、色または密度などの異なる食品パラメータを測定するために、食品産業において一般的に使用される（Ｒｅｉｎｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｋｅｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１。ＲＧＢモデルの３つの色度、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、及び青（Ｂ）の代表的な値を得るために、試料にわたって線を引いた。ビルトインＲＧＢプロファイルプロットプラグインを使用して、この線に沿った各ピクセルの異なる色の値を判定した。結果は、この線に沿ったピクセル数の関数としての異なる色の値の変化として表される。結果を、ｐ＜０．０５におけるＡＮＯＶＡ試験を使用して有意差に関して統計的に分析した。１つの試料当たり、１０００を超えるピクセルを分析した。
【０１５９】
生肉の赤色
【０１６０】
感覚分析のパネルによって、肉の色を認識した。このパネルは、明るい赤、赤、茶、及び緑の色相の間で肉の色を区別した。全ての肉の試料は、実験の０日目に明るい赤であった。
【０１６１】
６日目に、全体的なパネル認識は、以下の通り、異なる肉の処置に供された異なる肉の試料の色を記載する。
【０１６２】
【表８】
2018505679.tif 000009
【０１６３】
リステリア増殖中、植物抽出物が補充されたか、またはされていない肉の色を監視し、抽出物の添加直後（０日目）及び増殖６日目に画像を撮影した。
【０１６４】
単独でまたは組み合わせて、ローズマリー抽出物及びヘスペリジンを使用した６日目のそのような監視の結果は、以下の表６に記載される。
【０１６５】
【表９】
2018505679.tif 000010
【０１６６】
肉における６日間の増殖後の赤肉に対する最大濃度のローズマリー抽出物及びヘスペリジンの効果。効果を、［抽出物を用いた肉の赤色］−［対照肉の赤色（抽出物なし）］を使用して計算した。
【０１６７】
先行技術からの報告とは対照的に、予想外に、ローズマリー抽出物は、対照と比較して肉の赤色をより良好に保存した。ヘスペリジンはわずかに低かったが同様の効果を有した。
【０１６８】
組み合わせ効果は、追加の範囲内にとどまり、これらの濃度において相乗的であるとは認められなかった。
【０１６９】
対照と比較した抽出物の組み合わせは、各抽出物単独よりも赤色の保存を有意に改善する。
【０１７０】
【表１０】
2018505679.tif 000011
【０１７１】
図５は、肉に添加されたヘスペリジンの濃度が半分にされたとき、それが対照と比較して肉の赤色の保存を有意に減少させたことを示す。
【０１７２】
ローズマリーの添加は、未処置の対照の肉と比較して肉の色の保存を有意に改善した。予想外に、ローズマリーの濃度を半分にすることは、最大のローズマリー濃度よりも肉の赤色保存においてより大きい効果を引き起こした。加えて、予想外に、ヘスペリジンの濃度を半分にすることは、予測されたような赤色の保存効果をもたらさなかったが、この濃度で、ヘスペリジンは、対照と比較して赤色の保存を低下させた。さらに、予想外に、肉の赤色の保存に対する最大濃度のローズマリー及び半分の濃度のヘスペリジンの組み合わせの効果は、最大濃度のローズマリーまたは半分にした濃度のヘスペリジン単独の予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０１７３】
さらに、予想外に、肉の赤色の保存に対する半分の濃度のローズマリー及び半分の濃度のヘスペリジンの組み合わせの効果は、半分の濃度のローズマリーまたは半分の濃度にしたヘスペリジン単独の予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０１７４】
半分にした濃度のローズマリー抽出物及び最大濃度のヘスペリジンに関して、それらの組み合わせ効果は、追加の範囲内にとどまり、したがって、相乗的であるとは認められなかった。
【０１７５】
図５は、任意のここに示された濃度でのローズマリーとヘスペリジンとの間の全ての組み合わせが、対照と比較して、かつ酢酸ナトリウム及び乳酸ナトリウムなどの典型的な抗リステリア化合物と比較して、肉の赤色の保存を有意に改善したことを示す。
ローズマリー及びＰＵＮＩＣＡの混合物
【０１７６】
生肉におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖
【０１７７】
６日目及び９日目のそのような試験の結果は、図９及び図１０に示される。データは、２〜６回の反復の平均値である。データは、接種対照（未処置の肉）と比較した、処置された肉におけるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  増殖の対数差分を表す。データを、ＡＮＯＶＡを使用してｐ＜０．０５における有意性に関して統計的に分析した。異なる文字は、ｐ＜０．０５における有意差を示す。
【０１７８】
【表１１】
2018505679.tif 000012
【０１７９】
そのような短い継続時間（低温条件で６日間の増殖）において、ｌｏｇで表現される、未処置の肉と比較した植物抽出物で処置された肉におけるリステリア増殖の差が、−０．５ｌｏｇに到達せず、それが、そのような短い増殖の時間において、抗リステリア効果が認識され得ないことを意味することに留意されたい。
【０１８０】
組み合わされたとき、ローズマリー抽出物及びＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの測定した効果が相乗効果に対応しなかったことに留意されたい。
【０１８１】
濃度を半分にしたとき、上記の表から計算された以下の予測した効果及び測定した効果が得られた。
【０１８２】
【表１２】
2018505679.tif 000013
【０１８３】
そのような短い継続時間（低温条件で６日間の増殖）において、ｌｏｇで表現されるリステリア増殖における差が、−０．５ｌｏｇに到達せず、それが、そのような短い増殖の時間において、抗リステリア効果が認識され得ないことを意味することに留意されたい。
【０１８４】
予想外の効果は、アスタリスクによって示される
【０１８５】
予想外に、半分の濃度のローズマリー及び半分の濃度のＰｕｎｉｃａの組み合わせの抗リステリア効果は、半分にした濃度のローズマリーまたは半分にした濃度のＰｕｎｉｃａ単独の予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０１８６】
さらに、予想外に、最大濃度のローズマリー及び半分の濃度のＰｕｎｉｃａの組み合わせの抗リステリア効果は、最大濃度のローズマリーまたは半分にした濃度のＰｕｎｉｃａ単独の予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０１８７】
さらに、予想外に、半分の濃度のローズマリー及び最大濃度のＰｕｎｉｃａの組み合わせの抗リステリア効果は、半分にした濃度のローズマリーまたは最大濃度のＰｕｎｉｃａ単独の予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０１８８】
ローズマリー抽出物及び／またはＰｕｎｉｃａ抽出物を使用した９日目のそのような試験の結果は、表１０に記載される。
【０１８９】
【表１３】
2018505679.tif 000014
【０１９０】
上記の通り、微生物学において、処置は、その効果が未処置の対照と比較して−０．５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬを超える場合、抗菌効果を有することに留意されたい。低温条件で９日間の増殖後、対照と比較して、ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬで表されたリステリア増殖の差が、最大濃度のＰｕｎｉｃａまたは最大濃度のローズマリー及び最大濃度のＰｕｎｉｃａの組み合わせで、肉を処置したときに、−０．５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬを超えたことに留意されたい。最大濃度のローズマリー単独は、未処置の対照の肉と比較してリステリア増殖を有意に阻害しなかった。しかしながら、最大濃度のＰｕｎｉｃａと最大濃度のローズマリーを組み合わせることは、抽出物を単独で使用したときよりも大きい抗リステリア効果を有し、抗リステリア増殖における有意な効果のために必要とされる−０．５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬの閾値を超えることが可能であった。
【０１９１】
【表１４】
2018505679.tif 000015
【０１９２】
肉における９日間の増殖後、ほとんど全ての試験された濃度における抽出物単独またはそれらの組み合わせの１つを除いた全てが、対照と比較してＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を０．５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬ超阻害し、それは、それらが肉において抗リステリア効果を有したことを意味する。半分の濃度で試験されたときのローズマリー抽出物単独のみが、対照と比較して−０．５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬの差に到達しなかった。
【０１９３】
予想外に、Ｐｕｎｉｃａ抽出物単独は、最大濃度と比較して半分の濃度で使用されたときに、より大きい抗リステリア効果を有した。さらに、予想外に、半分の濃度で使用されたときに、ローズマリー抽出物は、予測したよりも大きい抗リステリア効果を有した。さらに、予想外に、半分の濃度のローズマリー及び最大濃度のＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの抗リステリア効果は、半分にした濃度のローズマリーまたは半分にした濃度のＰｕｎｉｃａ抽出物単独のそれらの予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０１９４】
加えて、予想外に、最大濃度のローズマリー及び半分の濃度のＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの抗リステリア効果は、最大濃度のローズマリーまたは半分にした濃度のヘスペリジン単独の予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０１９５】
さらに、予想外に、半分の濃度でＰｕｎｉｃａ抽出物と組み合わされたローズマリー抽出物は、最大濃度における各抽出物単独よりも大きい抗リステリア効果を有した。これは相乗作用である（例えば、図１を参照されたい）。
【０１９６】
３つのレベルで設計した応答曲面法実験計画法を使用して、異なる濃度及びそれらの応答表面を分析した。これらの結果は、図１１に示される。それらは、表１２に示されるように、［植物抽出物で処置された肉における（ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ））−（ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）対照の肉（処置なし））］＜−１として決定される、肉において抗リステリア応答を提供する以下の濃度範囲を示す。
【０１９７】
【表１５】
2018505679.tif 000016
【０１９８】
抗リステリア効果を確実にするために、上記の抽出物の濃度（表１２）のいずれも、組み合わせてまたは単独で肉に添加され得ることに留意されたい。単独でまたは組み合わせて肉に添加された抽出物の全体の割合は、０．１８％を超えなかった。
【０１９９】
生肉の赤色
【０２００】
感覚分析のパネルによって、肉の色を認識した。このパネルは、明るい赤、赤、茶、及び緑の色相の間で肉の色を区別した。全ての肉の試料は、実験の０日目に明るい赤色であった。
【０２０１】
６日目に、全体的なパネル認識は、以下の通り、異なる肉の処置に供された異なる肉の試料の色を記載する。
【０２０２】
【表１６】
2018505679.tif 000017
【０２０３】
リステリア増殖中、植物抽出物が補充されたか、またはされていない肉の色を監視し、抽出物の添加直後（０日目）及び増殖６日目に画像を撮影した。赤色ピクセルを、上記の方法の節で説明されるように定量化した。
【０２０４】
単独でまたは組み合わせて、ローズマリー抽出物及びＰｕｎｉｃａ抽出物を使用した６日目のそのような監視の結果は、以下に記載される。
【０２０５】
【表１７】
2018505679.tif 000018
【０２０６】
上記の濃度において（表１３）、単独で添加されたとき、ローズマリーまたはＰｕｎｉｃａ抽出物は、対照と比較して肉の色の保存を低下させた。したがって、組み合わされたとき、これらの抽出物が肉の色の保存をさらに低下させ得ると予測された。予想外に、組み合わされたとき、ローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物は、対照と比較して肉の色の保存を改善した。
【０２０７】
予想外に、肉の赤色の保存に対する最大濃度のローズマリー及び最大濃度のＰｕｎｉｃａの組み合わせの効果は、最大濃度のローズマリーまたは最大濃度のＰｕｎｉｃａ単独の予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０２０８】
【表１８】
2018505679.tif 000019
【０２０９】
ローズマリー抽出物及びＰｕｎｉｃａ抽出物：肉における６日間のリステリア増殖後の肉の赤色の保存に対する、最大濃度及び半分の濃度ならびに半分の濃度及び最大濃度の組み合わせの効果各効果を、［抽出物を用いた肉の赤色］−［対照肉の赤色（抽出物なし）］によって計算した。
【０２１０】
最大濃度のローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物が肉の赤色の保存を低下させたため、半分にした濃度が肉の赤色の保存を同様に低下させた可能性があると予測された。予想外に、添加したローズマリー濃度を半分にすることは、未処置の対照と比較して肉の赤色の保存を有意に改善した。
【０２１１】
ローズマリーの添加は、未処置の対照の肉と比較して肉の色の保存を有意に改善した。予想外に、添加したＰｕｎｉｃａ抽出物の濃度を半分にすることは、予測したほど肉の赤色の保存を低下させなかった。
【０２１２】
さらに、予想外に、半分の濃度のローズマリー及び半分の濃度のＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの赤色の保存の改善は、半分にした濃度のローズマリーまたは半分にした濃度のＰｕｎｉｃａ抽出物単独のそれらの予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０２１３】
加えて、予想外に、最大濃度のローズマリー及び半分の濃度のＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの赤色の保存の改善は、最大濃度のローズマリーまたは半分にした濃度のヘスペリジン単独の予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０２１４】
さらに、予想外に、最大濃度Ｐｕｎｉｃａ抽出物及び半分の濃度のローズマリー抽出物の組み合わせの赤色の保存の改善は、最大濃度のＰｕｎｉｃａ抽出物または半分にした濃度のローズマリー抽出物単独の予測した追加の効果を超えた。これは相乗作用である。
【０２１５】
予想外に、最大濃度のＰｕｎｉｃａ抽出物及び半分の濃度のローズマリー抽出物の組み合わせは、色の保存がそのような組み合わせの適用後に低下すると予測されたが、肉の色の保存を改善した。
【０２１６】
図６は、任意のここに示された濃度でのローズマリーとＰｕｎｉｃａ抽出物との間の全ての組み合わせが、対照と比較して、かつ酢酸ナトリウム及び乳酸ナトリウムなどの典型的な抗リステリア剤と比較して、肉の赤色の保存を有意に改善したことを示す。
【０２１７】
当業者は、現在開示された主題の教示から逸脱することなく、追加の実施形態もまた可能であることを認識するであろう。この発明を実施するための形態、特に本明細書に開示される例示的な実施形態の具体的な詳細は、主に理解を明確にするために示され、修正が本開示を読んだ後に当業者に明らかとなり、かつ現在開示された主題の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得るため、いかなる不必要な制限もそれから理解されるものではない。
【０２１８】
当業者は、現在開示された主題の教示から逸脱することなく、追加の実施形態もまた可能であることを認識するであろう。この発明を実施するための形態、特に本明細書に開示される例示的な実施形態の具体的な詳細は、主に理解を明確にするために示され、修正が本開示を読んだ後に当業者に明らかとなり、かつ現在開示された主題の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得るため、いかなる不必要な制限もそれから理解されるものではない。
【０２１９】
インビトロ実験：
【０２２０】
単独の及び組み合わせたローズマリー、Ｐｕｎｉｃａ、及びヘスペリジン抽出物の抗微生物活性、ローズマリー、ヘスペリジン、Ｐｕｎｉｃａ、及びそれらの組み合わせの植物抽出物、ローズマリー／ヘスペリジン、ローズマリー／Ｐｕｎｉｃａを、以下のプロトコルに従ってＤＭＳＯ５０％最終で、１０％で調製し、そこで、抽出物の組み合わせを調製し、マルトデキストリンを用いて最大１００％に仕上げ、試験前に以下の割合及び用量に従って試験溶液に添加した。
【０２２１】
【表１９】
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【０２２２】
【表２０】
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【０２２３】
研究／試験溶液の調製
【０２２４】
２００ｍｇの抽出物（組み合わせ）を１ｍＬの１００％  ＤＭＳＯと混合し、ボルテックスし、１００％、４５ｋＨｚ、通常モードで１０分間超音波処理し、よくボルテックスし、再び超音波処理し、１００ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ５０％最終の最終濃度で、滅菌水中で１：２に希釈した。
【０２２５】
１００ｍｇ／ｍＬでのこれらの調製物を、滅菌した５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管内で調製した。最小殺菌濃度（ＭＢＣ）プレートを調製する前に試料を採取した。ＭＢＣ、最小殺真菌濃度（ＭＦＣ）、及び最小阻止濃度（ＭＩＣ）。
【０２２６】
原理
【０２２７】
最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、接種材料の少なくとも９９．９９％を死滅させるために必要とされる最低試料濃度である（−４ｌｏｇ１０）。最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、特定の細菌を死滅させるために必要とされる抗菌剤の最低濃度である。それは、試験薬剤を含有しない寒天平板に継代培養することによって、液体希釈最小阻止濃度（ＭＩＣ）試験から決定され得る。ＭＢＣは、初期の細菌接種材料の生存性を≧９９．９％低減する、抗菌剤の最低濃度を決定することによって特定される。ＭＢＣはＭＩＣに補完的であり、ＭＩＣ試験が増殖を阻害する抗微生物剤の最低レベルを示す一方で、ＭＢＣは、微生物の死滅をもたらす抗微生物剤の最低レベルを示す。これは、特定のＭＩＣが阻害を示す場合でさえ、抗微生物が死滅を引き起こさなかったため、細菌を寒天上で平板培養することがなお生物の増殖をもたらす可能性があることを意味する。抗菌剤は通常、ＭＢＣがＭＩＣの４倍未満である場合、殺菌性と見なされる。この試験は、視覚的に増殖をほとんどまたは全く示さないウェル内の微生物の総数に基づき、次いで平板培養した。１０％  ＤＭＳＯ５０％最終で調製した試料を、１つの当量のＤＭＳＯ対照（それぞれ１２．５、２．５、及び０．５％）に対して、２．５、０．５、及び０．１％の濃度で試験した。
【０２２８】
酵母の場合、殺真菌最小濃度（ＣＭＦ）をＷＣＤとして実施した。真菌であるＡ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ菌株の場合、単なる増殖の存在を殺真菌活性の非存在と解釈する。最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、適合されたインキュベーション期間の後、微生物の目に見える増殖を阻害する抗微生物の最低濃度である。最小阻止濃度は典型的に、植物抽出物またはそれらの組み合わせなどの新しい抗微生物剤の効力を決定するために使用される。最小阻止濃度またはＭＩＣは、ここで試験した抽出物によって微生物増殖を阻害するのに十分である最低濃度である。この試験は、試験した抽出物ありまたはなし（対照）で研究される微生物菌株を含有するウェルの視覚観察に基づく。微生物増殖の時間の長さ及び条件を、当業者に周知の伝統的な方法に従って実施した。
【０２２９】
試験を以下の細菌菌株、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｉｓ、ならびに２つの酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、ならびにかび、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓに対して実施した。細菌及び酵母に対して１０５−１０６ＣＦＵ／ｍＬ、及びＡ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓに対して１０５芽胞／ｍＬの調整された接種材料を用いて、栄養に富んだ培地内で内部手順に従って、殺菌及び殺真菌活性の評価を実施した。
【０２３０】
抽出物の抗微生物評価の前に、抽出物の無菌性を平板培養によって検証した。いかなる微生物増殖の非存在も必須であった。表１７に要約されるように、微生物培養を伝統的に実施した。
【０２３１】
【表２１】
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【０２３２】
結果
【０２３３】
【表２２】
2018505679.tif 000023
【０２３４】
【表２３】
2018505679.tif 000024
【０２３５】
予想外に、ローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの抗ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ効果は、抽出物が単独で適用されたときのそれらの予測した追加の効果を超えた。実際に、同じ抗ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ効果を達成し、微生物増殖を４ｌｏｇ減少させるために、抽出物が単独で適用されたときのＭＢＣと比較して、ＭＢＣが、抽出物が組み合わされたときに最善の状態で半分にされると予測された可能性がある。驚くべきことに、ここで、ＭＢＣは、２．５〜５倍減少した。これは相乗作用である。
【０２３６】
さらに予想外に、ローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの抗ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ効果は、抽出物が単独で適用されたときのそれらの予測した追加の効果を超えた。実際に、同じ抗ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ効果を達成し、微生物増殖を４ｌｏｇ減少させるために、抽出物が単独で適用されたときのＭＢＣと比較して、ＭＢＣが、抽出物が組み合わされたときに最善の状態で半分にされると予測された可能性がある。驚くべきことに、ここで、ＭＢＣは、２．５〜５倍減少した。これは相乗作用である。
【０２３７】
さらに予想外に、ローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの抗ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ効果は、抽出物が単独で適用されたときのそれらの予測した追加の効果を超えた。実際に、同じ抗ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ効果を達成し、微生物増殖を４ｌｏｇ減少させるために、抽出物が単独で適用されたときのＭＩＢと比較して、ＭＩＢが、抽出物が組み合わされたときに最善の状態で半分にされると予測された可能性がある。これは相乗作用である。Ｐｕｎｉｃａ抽出物が０．０１６％のＭＩＣ効果を有したことに留意されたい。これは、そのＭＢＣがＭＩＣよりも高くなければならないことを暗示し、０．０１６％よりも高いことを意味する。いずれにしても、ローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせのＭＢＣが、抽出物単独のＭＩＣよりも２倍超低いことは、さらに予想外である。
【０２３８】
【表２４】
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【０２３９】
予想外に、組み合わせて適用されたとき、細菌または酵母、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの微生物増殖を阻害するための組み合わせＲ／Ｐの最小濃度は、驚くほど低く、それは、予測よりも２〜４倍低かった。驚くべきことに、２つの抽出物が組み合わされたとき、それらの活性は、相乗的に予測よりも２．５〜５倍増加する。
【０２４０】
さらに予想外に、ローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの抗ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ効果は、抽出物が単独で適用されたときのそれらの予測した追加の効果を超えた。実際に、同じ抗ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ効果を達成し、微生物増殖を阻害するために、抽出物が単独で適用されたときのＭＩＣと比較して、ＭＩＣが最善の状態で最低のＭＩＣであると予測された可能性がある。驚くべきことに、ここで、ＭＩＣは、予測よりも４倍減少した。これは相乗作用である。
【０２４１】
さらに予想外に、ローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの抗ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ効果は、抽出物が単独で適用されたときのそれらの予測した追加の効果を超えた。実際に、同じ抗ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ効果を達成し、微生物増殖を阻害するために、抽出物が単独で適用されたときのＭＩＣと比較して、ＭＩＣが、抽出物が組み合わされたときに最善の状態で半分にされると予測された可能性がある。驚くべきことに、ここで、ＭＩＣは、予測よりも２〜４．５倍減少した。これは相乗作用である。
【０２４２】
さらに予想外に、ローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの抗ｃａｎｄｉｄａ効果は、抽出物が単独で適用されたときのそれらの予測した追加の効果を超えた。実際に、同じ抗ｃａｎｄｉｄａ効果を達成し、微生物増殖を阻害するために、抽出物が単独で適用されたときのＭＩＣと比較して、ＭＩＣが最善の状態で最低のＭＩＣであると予測された可能性がある。驚くべきことに、ここで、ＭＩＣは、予測よりも４倍減少した。これは相乗作用である。
【０２４３】
また、さらに予想外に、ローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の組み合わせの抗ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ効果は、抽出物が単独で適用されたときのそれらの予測した追加の効果を超えた。実際に、同じ抗ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ効果を達成し、微生物増殖を阻害するために、抽出物が単独で適用されたときのＭＩＣと比較して、ＭＩＣが最善の状態で最低のＭＩＣであると予測された可能性がある。驚くべきことに、ここで、ＭＩＣは、予測よりも４倍減少した。これは相乗作用である。
【０２４４】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＳ．ｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍがグラム陰性菌であることに留意されたい。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及びＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、グラム陽性菌である。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、酵母である。
【０２４５】
Ｐｕｎｉｃａ抽出物と組み合わせたローズマリーは、グラム陽性（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（肉における）、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む）、グラム陰性（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含む）の細菌及び酵母（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む）の増殖に対する相乗的な抗微生物効果を明確に示す。
【０２４６】
【表２５】
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【０２４７】
ローズマリーと組み合わせたヘスペリジンが、ここで試験した最高濃度：２．５％でさえ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して、インビトロでの殺菌効果を有しなかったことに留意されたい。
【０２４８】
それにもかかわらず、驚くべきことに、そのような抽出物の組み合わせは、相乗的に、肉製品におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖を有意かつ効率的に阻害した。
【０２４９】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ増殖に対する先行技術で報告されたようなインビトロでの、及び肉（本研究）におけるヘスペリジン効果を比較すると、同様の観察結果が引き出され得る。実際に、インビトロでのヘスペリジンが抗リステリア効果を有しないが、それは、牛肉におけるリステリア増殖を阻害する。
【０２５０】
肉／家禽の肉／魚マトリクスにおけるローズマリー／ＰＵＮＩＣＡ及びローズマリー／ヘスペリジン抽出物の使用
【０２５１】
加工方法、抽出物組み込み、リステリア汚染、及び増殖阻害
産業によって使用される標準的なレシピに従って、生のポークソーセージ及び家禽の肉を生産した。スモークサーモンによってここで例示される魚及び海鮮物に関する限り、その加工もまた、その産業手順に従って行った。
【０２５２】
肉／家禽／魚のバッチ
【０２５３】
可能な場合はいつでも、各肉／分類に対してｐＨ及び内因性細菌叢（構成叢の速度及び性質）の観点から生の材料の変動性を克服するために、異なる肉／家禽の肉／魚の卸売業者／（サーモン）養殖場からの生の材料の３つのバッチに対して、加工を実施した。植物抽出物またはそれらの組み合わせを、基本的な配合成分と一緒に、各レシピの開始時に組み込んだ。植物抽出物またはそれらの組み合わせを、以下の表２３、２４、２６、２７、２９、及び３０で説明されるように、１〜３個の異なる濃度で食品マトリクスに組み込んだ。
【０２５４】
全ての製品分類に関する限り、対照、すなわち、植物抽出物を含まない製品を試験した。
【０２５５】
ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの菌株の性質及び起源／細菌調製条件
【０２５６】
混合物中のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの２つの菌株（５０／５０）を、標準操作手順ＮＦ  Ｖ０１−００９に従って、かつ任意の肉／家禽の肉／魚の製品に関して研究した。肉製品における試験に関する限り、参照菌株ＣＩＰ  ７８３８（血清型４ｂ）、及び生の豚肉において５０％超を占めるものである、いわゆる豚肉から単離した野外株（ＡＤＩＶコレクション）血清型１／２ａを使用した。
【０２５７】
家禽の肉に関する限り、参照菌株７８３８を家禽の枝肉から単離したＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの菌株に結合した（ＡＤＩＶコレクション、血清型１／２ｂ）。サーモンにおける試験に関する限り、参照菌株ＣＩＰ  ７８３８を、ＡＤＩＶがそのネットワークの提携企業によって提供されたサーモンから単離した菌株と混合した。ここで研究した食品マトリクスに関する限り、標準操作手順ＮＦ  Ｖ０１−００９（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２０１４）のガイドラインに従って、２つの菌株を調製及び接種した。
【０２５８】
ｃｒｙｏｂｉｌｌｅｓ（−８０℃）として保存された冷凍菌株を、個々に再生及び培養した。各菌株を、１０ｍＬのＢＨＩ培養培地内に０．１ｍＬ移植することによって再生した（３０℃で２４時間）。２回の連続する継代培養は、各菌株の前培養をもたらした。続いて、各菌株を再び３０℃で２４時間培養した。後者の培養物をマトリクス製品汚染で使用した（対数期の終わりまたは初期静止期に）。２回の連続する遠心分離の後、ペレットを１０ｍＬの緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）中に懸濁し、ＢＨＩ培地上で計算を実施し、細菌溶液を接種前に２４時間０℃で保持した。細菌増殖の読み取り後、次いで、２〜３ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｇで２つの菌株の混合物（５０／５０）を食品マトリクス製品に接種するために濃度を調節した。
【０２５９】
接種方法
【０２６０】
ＮＦ  Ｖ０１−００９において指定されるように、製品接種様式は、産業汚染の現実と合っているべきである。したがって、ソーセージ（豚肉または家禽の肉）を、肉の混合物の塊における接種によって感染させて、肉からの汚染をシミュレーションした。スモークサーモンの汚染が生の材料の取り扱い中に、またはスライス／包装時に生じるため、ここで、サーモンのスライスの表面の汚染を適用した。
【０２６１】
製品の表面上の接種方法は、ＡＤＩＶによって開発されており、製品の表面における所望の濃度を得るための方法で計算された、正確な重量の接種材料が提供された。接種方法とは関係なく（挽きまたは表面）、食品製品の十分な水分活性を維持するために、１／１００の重量／体積比を超えないように、食品マトリクスに添加される水性体積を計算した（ＮＦ  Ｖ０１−００９）。
【０２６２】
肉／家禽の肉／魚の製品の生産及び抽出物組み込み
【０２６３】
ポークソーセージ
【０２６４】
脂肪分が少ない豚肉（８６％）及び豚肉の脂肪分（１４％）から、実施規則に従って、従来のプロセスに従って、ポークソーセージを製造した。グリッド（６ｍｍグリッド）を通じて低温で、豚肉の脂肪分及び脂肪分が少ない部分を挽く／ミンチにすることによって、ソーセージ製造用の初期の肉の混合物を得た。次いで、表２４及び表２５に従って、適用可能な場合はいつでも、ここで試験した植物抽出物を添加した。均質化の後、次いで、混合物を天然ケーシングに詰めた（羊料理、直径２４／２６）。
【０２６５】
汚染／包装
【０２６６】
所与のバッチに対して、４２ｋｇの肉の混合物を調製し、次いで、試験シリーズの生産のためにそれぞれ５ｋｇの異なる組に分割した。５ｋｇの肉の混合物を、いかなる抗微生物剤も添加剤も含有しなかった、調製された混合物（２３ｇ／ｋｇのＭｉｘ  Ｆｒａｉｃｈｅ  ２３０  Ｓｏｕｔｈ）及び５０ｇの水／ｋｇに添加した。均質化の後、そのように得られた混合物をいくつかの部分に分割した。人工的なリステリア汚染がない部分を、ＭＡＰ条件下（７０％のＯ２／３０％のＣＯ２）で包装したトレイ内に配置し（１トレイ当たり６本のソーセージ）、保存時間の１／３は４℃であり、保存時間の２／３は８℃である保存時間計画を有した。他の部分を、上記の通り包装及び保存する前に、３ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｇの平均速度でＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって人工的に汚染した（挽肉の塊における接種）。植物抽出物を含まなかった汚染肉試料を対照と称した。
【０２６７】
保存中の分析的監視
【０２６８】
Ｄ０及びＪＤＬＣ（Ｄ１４）に対して微生物学的分析を実施し、それらは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、全中温酸化細菌叢（ＦＡＭ）、及び乳細菌叢の計数に関与した。分析の各時点で、単一の反復バッチをトレイの分析によって実施した（３つのバッチに対してｎ＝３）。
【０２６９】
家禽肉のソーセージの製造
【０２７０】
ポークソーセージに関する記載と同じ実験条件に従って、家禽肉のソーセージを生産した。唯一の差は、使用される生の材料の性質及び添加された可能性がある化合物の性質にとどまる。実際に、この場合、鶏モモ肉８５％の上部及び皮によって代表される脂肪分を使用して、脂肪分が少ない肉を作製した。
【０２７１】
挽肉の混合物は、いかなる典型的な抗微生物も含まなかったが、抗微生物または抗酸化活性を有するいかなる成分も除去された混合物を含有した（Ｍｉｘ  Ｃｈｉｐｏ  Ｆｌｉｇｈｔ  ３１０〜３１ｇ／ｋｇ）。そのように調製した混合物は、植物抽出物を含んだか、または含まなかったか（対照）のいずれかであり、豚肉に関する記載と同じ実験条件及びリステリア／細菌分析に従った。
【０２７２】
スモークサーモンの調製及び接種
【０２７３】
スモークサーモンの製造を、当業者に周知かつ利用可能な伝統的な手順に従って実施した。肉製品に関して、３つの異なる起源からの３つの異なるサーモンのバッチを同週中に作製した。製品を、リステリア／細菌分析の前に、産業用地において真空下でトレイ上にスライスして包装した（１トレイ当たり約２００ｇ）。
【０２７４】
試験した海鮮物、すなわち、スモークサーモンを、表２９及び３０に記載される割合及び濃度に従った、ローズマリー及びヘスペリジン抽出物ならびにローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の組み込んだ抽出物の組み合わせであった。サーモンを計量し、次いで、３±０．５ｌｏｇ／ｇの平均速度の２つの菌株の混合物（５０／５０）を用いた噴霧によって表面接種した。接種後、プレートを再び真空包装し、３０日間８℃で貯蔵庫に入れた。リステリア増殖を接種後（０日目）及び増殖の３０日目に監視した。接種されていない対照を、比較目的で、ここで試験した全ての肉／家禽の肉／魚マトリクスに対して、冷蔵で保持した。
【０２７５】
ｐＨ、全中温酸化細菌叢、乳細菌叢を、牛肉、豚肉、家禽の肉、または魚における全ての実験全体を通じて測定した。これらの食品マトリクスにおけるここで試験した植物性抽出物の存在は、ｐＨ、全中温酸化細菌叢、乳細菌叢に有意な影響を及ぼさなかった。
【０２７６】
実施例：家禽肉のソーセージにおけるＲ／Ｐ及びＲ／Ｈの抗微生物効果
【０２７７】
当業者に利用可能であり、ミンチ牛肉に関してかつ上記に記載されたプロトコルに基づいた伝統的な方法を、加工家禽肉のソーセージに適用した。
【０２７８】
上記の通り、簡潔に、異なる濃度でのＲ／Ｐ及びＲ／Ｈ抽出物の組み合わせを含む、ソーセージに加工した家禽の生肉の３つの異なるバッチに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを接種した。対照は、植物抽出物を含まなかった。家禽の生肉試料を低温条件で保持し、リステリア増殖を１４日目に測定した。
【０２７９】
【表２６】
2018505679.tif 000027
【０２８０】
抽出物を以下の通り調製した。上記の半量のＲ（０．５Ｒ）及び半量のＨ（０．５Ｈ）または半量のＰ（０．５Ｐ）抽出物を、表２１に従って一緒に混合し、混合物をマルトデキストリンによって最大１００％に仕上げた。これらの粉末状混合物を、表２３及び２４に記載される割合で、ソーセージへの加工時の家禽の生肉に添加した。表２３及び２４はまた、％及びｐｐｍでの抽出物及び抽出物化合物、抽出物、ならびに肉マトリクス中の最終含量を示す。
【０２８１】
０．５％の０．５Ｒ＋０．５Ｈが、ミンチ牛肉において試験した０．５Ｒ＋０．５Ｈと称される抽出物化合物における量に対応することに留意されたい。さらに、０．３％の０．５Ｒ＋０．５Ｐが、ミンチ牛肉において試験した０．５Ｒ＋０．５Ｐと称される抽出物化合物における量に対応することに留意されたい。全ての得られたデータを、ミンチ牛肉に関して伝えた説明に従って、分析及び表現した（すなわち、ｄｅｌｔａ  ｌｏｇなど）。
【０２８２】
【表２７】
2018505679.tif 000028
【０２８３】
【表２８】
2018505679.tif 000029
【０２８４】
結果：
【０２８５】
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、対照の肉において明確に増殖した（図１２）。抽出物の組み合わせを肉に添加したとき、それらは、リステリア増殖を効率的に阻害した（図１３及び図１４）。それらのデータは、ローズマリー及びヘスペリジンならびにローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の相乗的な抗リステリア効果を明確に実証した、ミンチ牛肉において見つけたデータを裏付ける。
【０２８６】
実施例：ポークソーセージにおけるＲ／Ｐ及びＲ／Ｈの抗微生物効果。
【０２８７】
当業者に利用可能であり、ミンチ牛肉に関してかつ上記に記載されたプロトコルに基づいた伝統的な方法を、加工ポークソーセージに適用した。
【０２８８】
簡潔に、異なる濃度でＲ／Ｐ及びＲ／Ｈ抽出物の組み合わせを含む、ソーセージに加工した生の豚肉の３つの異なるバッチに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを接種した。対照は、植物抽出物を含まなかった。生の豚肉試料を低温条件（８℃）で保持し、リステリア増殖を１４日目に測定した。
【０２８９】
【表２９】
2018505679.tif 000030
【０２９０】
抽出物を以下の通り調製した。上記の半量のＲ（０．５Ｒ）及び半量のＨ（０．５Ｈ）または半量のＰ（０．５Ｐ）抽出物を、表２４に従って一緒に混合し、混合物をマルトデキストリンによって最大１００％に仕上げた。これらの粉末状混合物を、表２６及び２７に記載される割合で、ソーセージへの加工時の生の豚肉に添加した。表２６及び２７はまた、％及びｐｐｍでの抽出物及び抽出物化合物、抽出物、ならびに肉マトリクス中の最終含量を示す。
【０２９１】
０．５％の０．５Ｒ＋０．５Ｈが、ミンチ牛肉において試験した０．５Ｒ＋０．５Ｈと称される抽出物化合物における量に対応することに留意されたい。また、０．３％の０．５Ｒ＋０．５Ｐが、ミンチ牛肉において試験した０．５Ｒ＋０．５Ｐと称される抽出物化合物における量に対応することに留意されたい。全ての得られたデータを、ミンチ牛肉に関して上記に示された説明に従って、分析及び表現した（すなわち、ｄｅｌｔａ  ｌｏｇなど）。
【０２９２】
【表３０】
2018505679.tif 000031
【０２９３】
【表３１】
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【０２９４】
【表３２】
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【０２９５】
結果：
【０２９６】
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、対照の肉において明確に増殖した（図１５）。抽出物の組み合わせを肉に添加したとき、それらは、全てのここで試験した濃度において、リステリア増殖を効率的に阻害した（図１６及び図１７）。それらのデータは、ローズマリー及びヘスペリジンならびにローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の相乗的な抗リステリア効果を明確に実証した、ミンチ牛肉において見つけたデータを裏付ける。
【０２９７】
当業者に利用可能であり、ミンチ牛肉に関してかつ上記に記載されたプロトコルに基づいた伝統的な方法を、スモークサーモンに適用した。
【０２９８】
上記の通り、簡潔に、異なる濃度でのＲ／Ｐ及びＲ／Ｈ抽出物の組み合わせを含む、スモークサーモンの３つの異なるバッチに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを接種した。対照は、植物抽出物を含まなかった。スモークサーモン試料を低温条件で保持し、リステリア増殖を１４日目に測定した。
【０２９９】
家禽肉のソーセージの１バッチ当たりの初期リステリア負荷は、表２８に示される通りであった。
【０３００】
【表３３】
2018505679.tif 000034
【０３０１】
【表３４】
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【０３０２】
【表３５】
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【０３０３】
０．３％の０．５Ｒ＋０．５Ｐが、ミンチ牛肉において添加され、かつ０．５Ｒ＋０．５Ｐと称される、抽出物の組み合わせの同じ割合及び投与量に対応することに留意されたい。
【０３０４】
結果：
【０３０５】
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、対照のスモークサーモンにおいて明確に増殖した（図１８）。抽出物の組み合わせを肉に添加したとき、それらは、リステリア増殖を効率的に阻害した（図１９及び図２０）。それらのデータは、ローズマリー及びヘスペリジンならびにローズマリー及びＰｕｎｉｃａ抽出物の相乗的な抗リステリア効果を明確に実証した、ミンチ牛肉において見つけたデータを裏付ける。
【０３０６】
参考文献
多くの参考文献が本開示全体を通じて列挙されてきた。以下に列挙される追加の参考文献を含む本開示に列挙される全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０７】
Ｋａｉ  Ｒｅｉｎｅｋｅ，Ｈｅｎｎｉｎｇ  Ｗｅｉｃｈ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｋｎｏｒｒ，“Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒｓ  ｏｎ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｔａｒｃｈ  Ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｃｅｄｉａ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，（２０１１），ｐａｇｅｓ  ２０４０−２０４６。
【０３０８】
Ｓｈｉｖａｎｇｉ  Ｋｅｌｋａｒ，Ｓｃｏｔｔ  Ｓｔｅｌｌａ，Ｃａｒｏｌ  Ｂｏｕｓｈｅｙ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｏｋｏｓ，“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ３Ｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｃｅｄｉａ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，（２０１１），ｐａｇｅｓ  ４８３−４９１。
【０３０９】
Ｓ．Ｃｈａｉｌｌｏｕ，Ｓ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅａｎｓ，Ｍ．Ｒｉｖｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．Ｌｕｃｑｕｉｎ，Ｍ．Ｃ．Ｃｈａｍｐｏｍｉｅｒ−Ｖｅｒｇeｓ，Ｍ．Ｚａｇｏｒｅｃ；“Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｔｒａｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｕｓｅｄ  ａｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｇｒｏｕｎｄ  ｂｅｅｆ”；Ｍｅａｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９７，（３）（２０１４），ｐａｇｅｓ  ３３２−３３８。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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