(57)【要約】  本発明は、主に、（ｉ）それぞれ波数および吸光度値を有する１つ以上のスペクトル成分を有する、血液を代表するサンプル赤外線スペクトルを生成するステップと；（ｉｉ）それぞれ波数および吸光度値の１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するスペクトルモデルの参照データベースを提供するステップであって、データベーススペクトル成分は病原体を同定するステップと；（ｉｉｉ）１つ以上データベーススペクトル成分が１つ以上のサンプルスペクトル成分に対応するどうか決定するステップと；（ｉｖ）同定した対応するデータベース成分のリストを作成するステップと、を含む血液中の病原体を検出する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプル中の病原体を検出する方法であって、
（ｉ）それぞれ波数および吸光度値を有する１つ以上のスペクトル成分を有する、血液サンプルを代表するサンプル赤外線スペクトルを生成するステップと、
（ｉｉ）それぞれ波数および吸光度値の１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するスペクトルモデルの参照データベースを提供するステップであって、前記データベーススペクトル成分は病原体を同定するステップと、
（ｉｉｉ）前記参照データベースが、１つ以上のサンプルスペクトル成分に対応する１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するかどうか決定するステップと、
（ｉｖ）同定した対応するデータベース成分のリストを作成するステップと、
を含むことを特徴とする血液サンプル中の病原体を検出する方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｉ）が、ステップ（ｉｉｉ）を行う１つ以上スペクトルの窓を選択するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉｖ）まとめられた個別のスペクトルモデルのそれぞれにおいてサンプル成分の数を決定し、前記まとめられたスペクトルモデルを順位付けするステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｉｖ）まとめられた個別のスペクトルモデルのそれぞれにおいてサンプル成分の数を決定し、所定の分類基準に基づいて前記まとめられたスペクトルモデルを分類するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記病原体が血液媒介ウイルス性疾病を含む群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記病原体が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、アレナウイルス科のウイルス（ラッサ熱、フニンおよびマチュポを含む）、ブニヤウイルス科のウイルス（クリミア・コンゴ出血熱、リフトバレー熱、ハンタン出血熱を含む）、フィロウイルス科のウイルス（エボラおよびマールブルグ）、フラビウイルス科のウイルス（黄熱、デング、オムスク出血熱、キャサヌール森林病、ウエストナイルウイルス）、アルファウイルス科（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスまたはベクター、バベシア・ディバージェンス（Ｂａｂｅｓｉａ  Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ビゲミナ（Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ）、バベシア・エクイ（Ｂ．ｅｑｕｉ）、バベシア・ミクロフティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｆｔｉ）、バベシア・ダンカニ（Ｂ．ｄｕｎｃａｎｉ）、リーシュマニア  トキソプラズマ原虫（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、プラスモディウム・オバール・クルチシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｃｕｒｔｉｓｉ）、プラスモディウム・オバール・ワリケリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｗａｌｌｉｋｅｒｉ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、ブルセイトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）およびクルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）を含む群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記データベーススペクトル成分が、肝炎Ａ、肝炎Ｂ、肝炎Ｃ、肝炎Ｄ、肝炎Ｅ、肝炎Ｇまたはこれらの組み合わせから選択される特定の肝炎ウイルスを同定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記血液サンプルを代表する前記赤外線スペクトルが血液サンプルの厚層から生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血液サンプルを代表する前記赤外線スペクトルが血液の単一液滴から生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記血液サンプルを代表する前記赤外線スペクトルが、容量５〜５０μｌ、より好ましくは５〜２５μｌの血液の単一液滴から作成されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血液サンプル中のマラリアを検出する方法であって、
（ｉ）それぞれ波数および吸光度値を有する１つ以上のスペクトル成分を有する、血液サンプルを代表するサンプル赤外線スペクトルを生成するステップと、
（ｉｉ）それぞれ波数および吸光度値の１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するスペクトルモデルの参照データベースを提供するステップであって、前記データベーススペクトル成分がマラリアを同定するステップと、
（ｉｉｉ）参照データベースが、１つ以上のサンプルスペクトル成分に対応する１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するどうか決定するステップと、
（ｉｖ）同定した対応するデータベース成分のリストを作成するステップと、
を含む血液サンプル中のマラリアを検出する方法。
【請求項１２】
前記血液サンプルを代表する前記赤外線スペクトルが血液サンプルの厚層から生成されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記血液サンプルを代表する前記赤外線スペクトルが血液の単一液滴から生成されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記血液サンプルを代表する前記赤外線スペクトルが容量５〜５０μｌ、より好ましくは５〜２５μｌの血液の単一液滴から作成されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記データベーススペクトル成分が、マラリアの特定の段階を同定することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記データベーススペクトル成分が１つ以上のプラスモディウム種を同定することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記データベーススペクトル成分が、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、プラスモディウム・オバール・クルチシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｃｕｒｔｉｓｉ）、プラスモディウム・オバール・ワリケリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｗａｌｌｉｋｅｒｉ）、四日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫またはこれらの組み合わせを含む群から選択される１つ以上のプラスモディウム種を同定する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
血液サンプル中の病原体を検出する方法を実行するアプリケーションを一過性でない形態で保存するためのコンピュータが読み込み可能な記憶媒体であって、前記血液サンプル中の病原体を検出する方法は、
（ｉ）血液サンプルを代表するＩＲスペクトルを記録するステップと、
（ｉｉ）前記スペクトルをスペクトルモデルの参照データベースと比較して、血液サンプルの波数および吸光度の１つ以上のスペクトル成分を同定するステップであって、前記スペクトル成分は病原体を同定するステップと、
（ｉｉｉ）データベースの個別のスペクトルモデルに対応する同定されたサンプル成分のリストを作成するステップと、を含み、
ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）が自動化されていることを特徴とするコンピュータが読み込み可能な記憶媒体。
【請求項１９】
ＩＲスペクトルの捕捉のための分光計とコンピュータとを含む、血液サンプル中の病原体を検出するシステムであって、
（ｉ）前記分光計は前記血液サンプルを代表するＩＲスペクトルを生成し、
（ｉｉ）前記コンピュータは、前記スペクトルをスペクトルモデルの参照データベースに適用して、前記血液サンプルの波数および吸光度の１つ以上のスペクトル成分を同定し、前記スペクトル成分は病原体を同定し、
（ｉｉｉ）前記コンピュータは、前記参照データベースの個別のスペクトルモデルに対応する同定されたサンプル成分のリストを作成することを特徴とする血液サンプル中の病原体を検出するシステム。
【請求項２０】
血液サンプル中の病原体の検出を可能にするように構成されたアプリケーションであって、
（ｉ）それぞれ波数および吸光度値を有する１つ以上のスペクトル成分を有する、血液サンプルを代表するサンプル赤外線スペクトルを生成するステップと、
（ｉｉ）それぞれ波数および吸光度値の１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するスペクトルモデルの参照データベースを提供するステップであって、前記データベーススペクトル成分は病原体を同定するステップと、
（ｉｉｉ）前記参照データベースが、１つ以上のサンプルスペクトル成分に対応する１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するどうか決定するステップと、
（ｉｖ）同定した対応するデータベース成分のリストを作成するステップと、
を含む方法を可能にするように構成された所定の指示セットを含むアプリケーション。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾病、特に血液媒介病原体の検出の分野に関する。特に好ましい実施形態では本発明は、血液中の感染症の検出および定量化に関する。
【０００２】
１つの形態では、本発明は、血液媒介病原体の検出、同定および定量化のために減衰全反射赤外（ＡＴＲ−ＩＲ）分光法を使用する方法に関する。
【０００３】
別の形態では、本発明は、ＡＴＲ−ＩＲによって血液から得られたデータの多変量分析の方法に関する。
【０００４】
１つの特定の態様では、本発明は、血液媒介感染症の診断のための使用に適している。
【０００５】
１つの特定の態様では本発明は、血液サンプルからのマラリア、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）、または肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）の感染の診断のための使用に適している。
【０００６】
以下、簡便のため、本発明をマラリアとの関連で説明するが、本発明は、その使用のみに限定されるものではなく、幅広い範囲の他の血液媒介感染因子に使用できることを理解すべきである。
【背景技術】
【０００７】
本明細書での文書、デバイス、行為または知識のいかなる議論も、本発明の内容を説明するために含まれることが理解される。さらに、本明細書全体を通じての議論は、発明者の理解および／または発明者による特定の関連した技術分野の課題の特定により生じるものである。また、本明細書での文書、デバイス、行為または知識などのもののいかなる議論も発明者の知識および経験の観点から、本発明の内容を説明するために含まれ、それ故に、そのような議論のいずれも、本開示および特許請求の範囲の優先日または該優先日前の、先行技術のベースまたはオーストラリアもしくは他の場所での関連した技術分野での技術常識の一部をいずれの事項が形成すると認めるものではない。
【０００８】
減衰全反射赤外（ＡＴＲ−ＩＲ）分光法
分光法は、電磁放射線と物質との相互作用を調べることによって、物質の化学組成を発見することをテーマにしている科学の分科である。赤外（ＩＲ）分光法は、主として、２００〜４０００ｃｍ−１の波数のエネルギーである電磁スペクトルの赤外区域における波長を有する分子の振動によるエネルギーの吸収に関する。ラマン分光法は、典型的には２０〜４０００ｃｍ−１の波数シフトを有する分子の振動に依存する波長シフトを与える単色光の非弾性の散乱に関する。
【０００９】
ほとんどすべての生物学的分子の構造は、電磁スペクトルのＩＲ区域でのエネルギーを吸収する部分を含む。したがって、臨床サンプルのＩＲスペクトルは、その主要な生物学的成分を代表し、本質的に「代謝的なフィンガープリント」の範疇に入り得る。
【００１０】
ＡＴＲは、ＩＲと共に使用できるサンプリング技術である。ＡＴＲ分光法は、潜在的に携バンドできるという利点をもたらし、安価であり、それ故に、生物学的細胞および組織の分析における非常に強力なツールになっている。また、ＡＴＲは、さらに調製することなく固体または液体状態でサンプルを直接試験することを可能にし、透過ＩＲと比較して、サンプルへの通路長さがより短く、水溶液などの高度吸収媒体におけるＩＲ信号の強い減衰を避ける。
【００１１】
使用時には、サンプルを、サンプルより屈折率が高い結晶の表面と接触させる。ＩＲ光のビームを、サンプルと接触した内部の表面に少なくとも１回反射するようにＡＴＲ結晶に通過させる。この反射は、サンプルに及ぶエバネッセント波を形成する。サンプルへの浸透深さは、ＡＴＲ結晶およびプローブされる媒体での光の波長、入射角および屈折率に依存する。反射の数は変動し得る。その後、ビームを、それが結晶に存在するときに検出器によって回収する。
【００１２】
ウイルス性肝炎
ウイルス性肝炎は、６つの無関係の肝臓指向性のウイルスであるＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスおよびＧ型肝炎ウイルスの１つ以上によって引き起こされる。肝炎により、毎年世界中で何百万人が死亡している。診断は、患者の症状、身体検査および病歴を血液試験、肝臓生検および画像化と共に評価することによって行われる。多くの場合、肝炎を患う患者は、症状に気付かず、日常の血液試験の間に疾病に気付くようになるのみである。
【００１３】
しかし、いくつかの肝臓疾病がウイルス性肝炎と類似のサイン、症状または肝臓関数試験の異常を示す。したがって、肝臓のこれらの種々の疾病を迅速かつ安価に区別することができる新しい診断法が求められている。好ましくは、新しい診断法は、種々の肝炎ウイルスを区別することができる。
【００１４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ＨＩＶは、免疫システムの進行性の破壊を含む後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすレンチウイルスである。多くの患者が、ＨＩＶに感染していることに気付かず、幅広い、日常の試験は、感染リスクが高い集団セクターの間でも通常行われていない。
【００１５】
ＨＩＶの試験は、最初は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を二重で行って抗体陽性患者を検出することで行われる。その後、確認試験をより特異的な試験（例えばウェスタンブロットまたは免疫蛍光アッセイ）によって行う。ウェスタンブロットを単独で使用する場合、第２の検体が１ヶ月より後に通常回収され、再試験される。ＰＣＲ試験などの核酸試験も実施でき、診断の助けとなり得る。
【００１６】
これらの確立した試験様式は非常に正確であるが、時間、作業および費用の観点で負担となっている。したがって、ＨＩＶ感染を迅速かつ安価に検出する新しい診断法が依然として求められている。
【００１７】
マラリア
マラリアは、５つのプラスモディウム属の寄生性原虫、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、プラスモディウム・オバール・クルチシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｃｕｒｔｉｓｉ）、プラスモディウム・オバール・ワリケリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｗａｌｌｉｋｅｒｉ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）によって引き起こされる蚊媒介性疾病である。毎年最大１２０万人の死亡者数があり、正確かつ早期の診断に続いて感染の即時の処理が、死亡率を低減させ、抗マラリア薬の使いすぎを防ぐのに必須である。
【００１８】
その一生の間において、マラリア寄生虫は、生殖のおよび無性の生殖経路を含むいくつかの発生段階を超える。マラリアを診断する新しい技術は、費用効果が高く、高感度であり、マラリア寄生虫の循環段階が末梢血循環に存在する段階のみであることから、マラリア寄生虫の循環段階、すなわちリングおよび生殖母細胞形態を検出することができなければならない。
【００１９】
至適に、患者におけるマラリアの診断に続いて、適切な抗マラリア薬治療を直ちに開始しなければならない。治療は、３つの主要な因子によって誘導されるべきである：
・感染プラスモディウム種の同一性；
・患者の臨床状態；および
・感染が獲得された地理的領域および抗マラリア薬の以前の使用によって決定される感染寄生虫の薬剤感受性。
【００２０】
治療のための感染プラスモディウム種の決定は、３つの大きな理由により重要である。最初に、熱帯熱マラリア原虫および二日熱マラリア原虫の感染は、迅速に進行性の深刻な病気または死亡を引き起こし得る一方で、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、または四日熱マラリア原虫などの他の種は深刻な症状を引き起こす可能性が低い。第２に、三日熱マラリア原虫および卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）の感染は、肝臓において休眠中のままにし、再発性感染を引き起こし得るヒプノゾイト形態に対する処理も必要とする。最後に、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫の種は、異なる地理的領域にて異なる薬剤耐性パターンを有する。熱帯熱マラリア原虫および二日熱マラリア原虫感染にとっては、適切な治療の緊急開始が特に重要である。
【００２１】
Ｈｚおよび特定の脂質の分子署名に基づいて寄生虫ライフサイクルの赤血球内の段階を区別するために、主成分分析（ＰＣＡ）と組み合わせたシンクロトロン・フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）の可能性を調べる努力もなされている（Ｗｅｂｓｔｅｒら，Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｒａｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  Ｌｉｆｅｃｙｃｌｅ  Ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｌａｒｉａ  Ｐａｒａｓｉｔｅ  を用いて  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  ＦＴ−ＩＲ  Ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ａｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００９，  ８１．２５１６−２５２４）。Ｗｅｂｓｔｅｒらは、寄生虫が、その早期環状期から栄養細胞へ、最後にシゾント段階へ成熟する際に、特定の脂質バンドの吸光度およびシフトが増加することを見出した。
【００２２】
この研究は、ＦＴＩＲ分光法をマラリアの診断ツールとして使用する可能性を実証したが、明らかにシンクロトロンに基づいた方法は、分野の使用または日常の実験での使用に適していない。
【００２３】
ＦＴＩＲ分光学的診断は、スペクトルの精密な取得、スペクトルの前処理およびＡｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ分析（Ｌａｓｃｈら，Ｊ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒ．２０，２０９−２２０（２００６））または教師なし階層クラスター（無監督階層的クラスター）分析（Ｂａｍｂｅｒｙら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１７５８，９００−９０７（２００６）；Ｗｏｏｄら，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．９３，５９−６８（２００４））などの計量化学のツールに依存している。
【００２４】
臨床診断のツールとしてのＦＴＩＲの進展を妨げている調製法および散乱アーティファクトによって引き起こされるスペクトルの散乱を含む多くの要因によって生じた生物学的サンプル間の莫大なスペクトルの変動がある。さらに、いくつかの生物学的部分は、ランベルト・ベールの法則に従わない赤外線モル吸光係数特性を有する。
【００２５】
ＦＴＩＲ分光学的方法も、癌性および前癌性細胞および組織の検出に使用されている（Ｗｈｅｌａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ６，Ｎｏ．１０，７７５−７８４（２０１３）／ＤＯＩ  １０．１００２／ｊｂｉｏ．２０１２００１１２）。非ランベルト・ベール赤外線吸収挙動を克服するために、単純な統計的モデルが、細胞中のＤＮＡの濃度を予測するために開発された。しかしながら、この研究では、該研究から開発された単純モデルが、生物学的化合物の複雑な細胞または複雑な混合物に適切なものではないことが認められている。
【００２６】
別の研究（Ｓｉｔｏｌｅら，ＯＭＩＣＳ  Ａ  Ｊ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌ．１８（８）５１３−５２３（２０１４））では、血清の中間ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光学的プロファイリングがＨＩＶ／ＡＩＤＳ診断として探索されている。システムが診断に有望であることを示す一方で、人為的違いに基づくモデリングのために使用したデータで問題が生じることが明らかである。特に、結合した水での差異と、スペクトル上のＡＴＲ補正の欠如により生じるアーティファクトのために、負荷プロットにて分離が見られる。
【００２７】
したがって、診断としてのＦＴＩＲのより幅広い使用を可能にする新しい方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００２８】
本発明の目的は、血液媒介病原体を検出し、同定し、定量化するのに適した方法を提供することにある。
【００２９】
本発明の目的は、血液媒介感染症を検出し、定量化するための分野での使用および実験用途に適した方法を提供することにある。
【００３０】
本発明の目的は、全血、または血漿、または血液細胞、または乾燥した全血のサンプル中の血液媒介病原体を検出し、定量化するのに適した方法を提供することにある。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、関連した技術分野と関係する少なくとも１つの不利益を軽減することにある。
【００３２】
本明細書に記載した実施形態の目的は、関連した技術分野システムの上記の顕著な欠点の少なくとも１つを克服するか、または軽減することであり、あるいは関連した技術分野システムの有用な代替手段を少なくとも提供することである。
【００３３】
本明細書に記載する実施形態の第１の態様では、血液サンプル中の病原体を検出する方法が提供され、該方法は、
（ｉ）それぞれ波数および吸光度値を有する１つ以上のスペクトル成分を有する、血液サンプルを代表する赤外線サンプルスペクトルを生成するステップと、
（ｉｉ）それぞれ波数および吸光度値の１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するスペクトルモデルの参照データベースを提供するステップであって、前記データベーススペクトル成分は病原体を同定するステップと、
（ｉｉｉ）参照データベースが、１つ以上のサンプルスペクトル成分に対応する１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するどうか決定するステップと、
（ｉｖ）同定した対応するデータベース成分のリストを作成するステップと、を含む。
【００３４】
好ましくは、方法のステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉｉｉ）を行う１つ以上スペクトルの窓を選択するステップをさらに含む。
【００３５】
典型的には、ＩＲスペクトルは、患者の血液サンプルと接触したＡＴＲ基材を介してエバネッセントＩＲビームを送達することによって作成される。これは、ＡＴＲ上にまたは厚層塗抹標本からガラスまたはプラスチックスライドなどのスライド上にサンプルを置き、乾燥させることによって得ることができる。他の方法として、ＩＲスペクトルは、ガラス上の薄層血液塗抹標本の焦点面アレイ、すなわち、焦点面分光学的イメージングを用いて作成される。
【００３６】
発展途上国世界での多くの研究所が、日常の顕微鏡検査でスライド上の厚層血液塗抹標本を現在使用している。したがって、現在の実験の方法論を変えることなくスライド上の厚層を分析するのに本発明の方法が使用できるのは特に好都合である。さらに、本発明の方法は、保存された厚層血液サンプル中の病原体を検出するのに使用できる。
【００３７】
また、本発明は、一滴５０μｌ未満、より好ましくは５〜２５μｌなどの最小容量の血液を使用する選択肢を好都合に提供する。多くの感染症診断法は、はるかに大きい容量の血液を必要とする。
【００３８】
１つの特定の態様では、本発明は、血液サンプルからのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、あるいはウイルス性出血性ウイルスを含めた他の血液媒介ウイルス性疾病の診断への使用に適している。ウイルス性出血性ウイルスとしては、アレナウイルス科（ラッサ熱、フニンおよびマチュポ）、ブニヤウイルス科（クリミア・コンゴ出血熱、リフトバレー熱、ハンタン出血熱）、フィロウイルス科（エボラおよびマールブルグ）およびフラビウイルス科（黄熱、デング、オムスク出血熱、キャサヌール森林病、ウエストナイルウイルス）を含むいくつかのウイルス性ファミリーのウイルス、節足動物またはアルファウイルス科（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）のものなどのベクターによって運ばれるウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ヒトの他の血液媒介感染症は、マラリア（マラリアおよび種々の種の様々な相の間の区別を含む）、アフリカトリパノソーマ症、バベシア症、シャーガス病、リーシュマニア症、およびトキソプラズマ症を含む寄生虫によって運ばれ得る。寄生虫の血液媒介病原体としては、バベシア・ディバージェンス（Ｂａｂｅｓｉａ  Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ビゲミナ（Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ）、バベシア・エクイ（Ｂ．ｅｑｕｉ）、バベシア・ミクロフティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｆｔｉ）、バベシア・ダンカニ（Ｂ．ｄｕｎｃａｎｉ）、リーシュマニア  トキソプラズマ原虫（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、プラスモディウム・オバール・クルチシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｃｕｒｔｉｓｉ）、プラスモディウム・オバール・ワリケリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｗａｌｌｉｋｅｒｉ）、四日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、ブルセイトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）およびクルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）が挙げられる。
【００３９】
血液サンプル
患者の血液サンプルは、全血、血漿、血液細胞、乾燥した全血またはこれらの組み合わせなどのいずれの都合のよい形態であってもよい。好ましくは、血液サンプルは全血であり、単純な指刺しによって回収でき、ＩＲ分光計、またはガラスまたはプラスチックスライド上に直接送られる。
【００４０】
しかし、全血が特定の疾病の診断に常に最適であるとは限らない。使用される形態は、全血を処理するための装置の便宜および利用能を含む幅広い範囲の因子に依存する。特に、特定の疾病に関するＩＲスペクトルの変動が、疾病に関係または関連しない他の因子に起因し得ることを留意すべきである。それらの因子は、所定の吸光度またはパターンを隠し得、データベース中のスペクトルモデルに対応するサンプル成分のリストを作成するのを困難にする。
【００４１】
したがって、単純な全血前処理ステップを実施して、水（「乾燥した」サンプル）、細胞（血清サンプル）、タンパク質および極性化合物（有機抽出サンプル）などの相関していない成分を除くか、白血球または脂質などの所定の化合物を単離する必要があり得る。前処理ステップを実施することで、そうでなければ全血サンプルの直接測定によって検出不可能な疾病の診断が可能となり得る。
【００４２】
好ましくは、血液サンプルは「湿潤」、すなわち液体形態であり、乾燥していない。１つの形態では、「湿潤した」血液サンプルは、水などの天然に存在する溶媒や、メタノールなどを意図的に添加した溶媒を含有し得る。
【００４３】
湿潤したサンプルは、例えば、患者からの指刺しによって回収された全血を含む。当分野では、全血サンプルは、溶解し得、溶媒、通常は水を添加し得る。代替として、全血を分画して血漿を単離し得る。典型的には、分画は、適した機器が当分野でのものよりもむしろ容易に利用可能である研究室で行われる。例えば、全血サンプルはクロロホルムなどの溶媒で抽出して、分析のために脂質二重層を抽出し得る。
【００４４】
湿潤したサンプルよりは好ましいものではない代替物として、患者の血液サンプルは「乾燥した」ものであってもよく、すなわち、天然に存在するかまたは添加した溶媒を空気中、または加熱ランプの下で、または別の乾燥プロセスによって追い出してもよい。
【００４５】
病原体を同定するスペクトル成分
感染因子などの血液中に存在する病原体は、エネルギーを吸収して中間ＩＲ範囲内の信号を生じる生物学的部分を含む。エネルギーは、血液中に存在するウイルスなどの病原体によって直接吸収され得る。代替としてエネルギーは、病原体の存在を示す他の生物学的存在によって吸収され得る。一部の病原体によって引き起こされた代謝的な変化は、グルコースまたは尿素などのものの血中濃度の上昇をもたらし得、したがって間接的に病原体の存在を示す。
【００４６】
例えば、病原体がマラリアである場合、血液サンプルは、マラリア寄生虫の生殖サイクルの間に生じた感染因子と関連したすべての分子成分および化学成分であるマラリアの分子の表現型と関連したＩＲ吸収バンド域を示す。他の間接吸収が、宿主細胞およびその感染病原体に対する応答を改変することを含む患者の代謝的な状態を改変する病原体により発生し得る。重要なのは、本発明が、５種のプラスモディウム属の寄生性原虫を区別することが潜在的に可能であることである。例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫および四日熱マラリア原虫を用いる試験で、これらの３つの種の間のスペクトルの違いを検出でき、本発明の方法が、それらを区別することができることが確認されている。
【００４７】
ウイルスおよび／または感染因子は、それぞれ独特の特性を有し、例えばＨＩＶでは、これらの粒子は、ヌクレオカプシドタンパク質、後期アセンブリタンパク質（ｌａｔｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、および逆転写酵素およびインテグラーゼなどのウイルス粒子の発達に必須の酵素に堅く結合した１本鎖ＲＮＡを含有する。血液細胞内の細胞の成分に感染することが可能な、感染因子に独特の細胞内での複製形態もある。例えば、ＨＩＶは、ヘルパーＴ細胞（具体的にはＣＤ４＋Ｔ細胞）、マクロファージ、および樹状細胞などのヒト免疫系における生活細胞に感染する。
【００４８】
それ自体、感染病原体ごとの分子の表現型に対応するＩＲ吸収バンドを検出する可能性があり、ウイルスの複製中間体、「遊離」ウイルス粒子および感染した細胞の変化も含む。他の血液媒介感染因子は、全血内で活発に複製紙得ないが、ウイルス粒子または他のウイルス性成分は、血液中に見出し得、例えばＢ型肝炎ウイルスでは３つの形態が見出されている。最も豊富なのは、ＨＢｓＡｇを含有する、直径１７〜２５ｎｍの小さい球状の非伝染性粒子である。１０１３粒子／ｍｌ以上の濃度が一部の血清にて検出されている。長さは様々であるが、小さい粒子のものに匹敵する直径であるチューブ状のフィラメント状の形態も観察されている。また、それらは、ＨＢｓＡｇポリペプチドを含有する。第３の形態学的形態は４２ｎｍのＢ型肝炎ウイルス粒子である。
【００４９】
下表（表１）および図３は、生物学的化合物の典型的なＩＲバンドおよびそれらのそれぞれのアサインメントを示す。血液中の感染症の存在は、それらのバンドを通じてＩＲスペクトルに直接または間接的に関連し得る。
【表１】
2018500539.tif 000002
【００５０】
例えば、図１９は、対照スペクトルの減算後の、ＨＩＶの高いウイルス負荷を有する全血サンプルのＩＲスペクトルを示す。その後、違いが大きくなり、スペクトルは、以下のように分けることができる：
（Ａ）約１０１０〜１０５０ｃｍ−１および約１１４０〜１１９０ｃｍ−１の吸収バンドがウイルスの場合に増大する。それらは、ＲＮＡおよびＤＮＡに割り当てられることから、ウイルスそれ自体に潜在的に起因する（直接的な関係）。
（Ｂ）約１３８０〜１４１０ｃｍ−１の吸収バンドも、ウイルスの場合に増大する。それらの起源を確立するのは困難であるが、典型的な核の吸収バンドではなく、ウイルスの他の代謝産物に対する影響によるものである（間接関係）。
（Ｃ）約１０６０〜１１５０ｃｍ−１、約１１９５〜１３４０ｃｍ−１および約１４１０〜１６９０ｃｍ−１の領域の吸収バンドは、多くの場合、異なるサンプルごとに異なるパターンを示す。したがって、それらはウイルスの存在に結びつかない。それらは、疾病状態と関連していない他の生物学的因子と関連し得る。
【００５１】
したがって、ＨＩＶは、バンド（Ａ）および（Ｂ）に従い同定することができる。しかしながら、血液サンプル中の多数の天然の多様性を考慮すると、疾病と関連していない（Ｃ）のスペクトルの特徴が、より優位に立ち得る。したがって、検出のために単一の波数に依存する場合、十分な感度および特異性を得るのが困難であり得、機械学習アルゴリズムを用いてスペクトルのパターンを探すことが好ましい。
【００５２】
スペクトルモデル
上述したパターンは、分類関数（すなわちｆ＝ｇ（ｘ）の可能なｇ（ｘ））によって行われることが予想される演算の範囲の観点から表されるモデルを通じて典型的には見出される。アルゴリズムは、ｇ（ｘ）を確立するために（通常反復して）使用される数学的手順である。本発明では、モデルは、血液サンプルのスペクトル（Ｘ）と血液サンプル（Ｙ）の一部の属性、すなわち、病原体を同定するスペクトル成分との間の数学的関係を確立するアルゴリズム（Ｙ疾病の存在＝ｆ（Ｘスペクトル）からなる。
【００５３】
図２０は、どのように、疾病があるスペクトルおよび疾病がないスペクトルをアルゴリズムに入力して、クラス（疾病の存在について陽性、陰性または未知）ごとのスペクトルの特徴的なスペクトル成分を学び、「較正行列」を形成するかを示すフローチャートである。これから、新しい血液サンプルについてスペクトル（吸光度値のベクトル）に適用でき、スペクトルを陽性、陰性または未知と分類できるか決定する値を生成する数学操作のセットが提供される。
【００５４】
モデルは、１つの特定の病原体（例えばＨＩＶおよびＢ型肝炎ウイルスのための別個のモデル）または病原体の組み合わせに特異的であってもよい。組み合わせのモデルは、高い頻度で一緒に同定される２つ以上の病原体（例えばＨＩＶ＋Ｂ型肝炎ウイルス）に特に有用である。
【００５５】
分類のためのアルゴリズム
本発明での使用に適したアルゴリズムとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
−  線形モデリング（ＬＤＡ、ＰＬＳＤＡ、ＳＩＭＣＡ）；
−  神経ネットワーク分析（ＮＮＡ）；
−  ランダムフォレスト（ＲＦ）；
−  サポートベクターマシン（ＳＶＭ）。
【００５６】
典型的には、データセットごとのすべてのアルゴリズムの性能は、独立して調べられる。最良のモデリングシステムの選択は、通常、得られた予測結果に基づく。凝集モデルも使用できる（すなわち、サンプルごとに、それぞれのモデリングシステムがクラスに票を与え、最終の予測がｉそれらの票のモードを計算することによって得られる）。
【００５７】
特定の病原体の診断のために確立された「最も良いモデル」がないことに注目すべきである。病原体に固有の異なる因子、サンプルの数およびそれらサンプルの多様性に依存して、一部のアルゴリズムは、他のものよりも多い分類性能を示す。したがって、アプリケーションごとに、異なるモデリングの可能性の事前の深い調査を実施すべきである。至適には、モデリングに含まれるすべての変数を確立すべきである。
【００５８】
モデル性能を改善するために、スペクトルのいくつかの前処理を実施して、モデリングのためにそれらを調製し得る。
【００５９】
後述するように、波数のセットの選択が、より良好な分類性能を可能にし得る。
【００６０】
有用なモデルを作成するのに最適化し得る他の変数としては、ＲＦにおけるツリーの数およびＰＬＳＤＡにおける潜在的変数が挙げられる。
【００６１】
本明細書に記載する実施形態の第２の態様では、血液サンプル中の病原体を検出するためのスペクトルのモデルの参照データベースにおける使用のためのスペクトルモデルを作成する方法が提供され、該方法は：
（ｉ）病原体を保有する血液サンプルおよび病原体がない血液サンプルを代表する較正赤外線スペクトルを集めるステップであって、該較正スペクトルが１つ以上のスペクトル成分を有し、それぞれの成分が波数および吸光度値を有する、ステップと；
（ｉｉ）前記血液サンプルのスペクトル（Ｘ）と病原体を同定する血液サンプル（Ｙ）のスペクトル成分との間の関係を確立するアルゴリズムＹ疾病の存在＝ｆ（Ｘスペクトル）を作成するステップと、を含む。
【００６２】
モデルの作成：
適したモデルの作成に典型的に使用されるステップは、以下のものを含み、図２３に示されている：
【００６３】
サンプルセットの入手：
血液サンプルとそれらの参照データ（すなわち、それらが所与の病原体に対して陽性または陰性）のセットが集められる。血液サンプルのＩＲスペクトルが記録され、行列Ｘ（ｎ＝サンプルｘの数、ｖ＝波数の数）および参照データＹ（ｎｘ１）のベクトルを作成するのに使用される。血液サンプルは、３つの異なるサブセット：較正、検証および試験セットに分類される。
【００６４】
スペクトルの前処理：
変動の無関係な外因を除去し、所定のバンドと関連したスペクトルの違いを増大させることを目的として、モデリングの前に、上述したスペクトル上で数学操作を行い得る。これらの数学操作としては、例えば：
−  ベースラインシフトおよび通路の長さの変化の補正、
−  実験の手順（大気寄与、散乱またはＡＴＲ補正）に関連したスペクトルのアーティファクトの補正、および
−  導関数または平均のセンタリングの使用による、スペクトルの間の、特にバンドの最大の位置でのバンドの違いの増大。
【００６５】
変数選択手順：
スペクトルの無情報部分は、分類の精度を改善するために除去し得る。特に、特定の疾病に関連する限られた数の波数（選択されたスペクトルの窓）を使用することが好ましい。例えば、一部の病原体では、スペクトルの有益な部分は、３１００〜２７００ｃｍ−１での脂質を特徴付けるＣ−Ｈ（伸縮）であり得る。タンパク質、核酸および炭水化物については、スペクトルの有益な部分は、１８００〜９００ｃｍ−１であり得る。アミド１、２または３の伸縮モードを示す部分でのスペクトルの有益な窓は、１８００〜１２００ｃｍ−１にある可能性がより高い。
【００６６】
連続してまたは同時に、複数のスペクトルの窓を使用し、それらを処理することが可能である。
【００６７】
２つ以上の選択されたスペクトルの窓を使用することで、典型的には、モデルを使用して得られた結果の精度が改善される。例えば、図２４〜２７は、マラリア陽性サンプル、および対照サンプルを用いて、１つのスペクトルの窓（図２４および２５）および２つのスペクトルの窓（図２６および２７）を使用して、赤血球のサンプル（メタノールで固定）で実施した（後述するように）ＰＬＳ−ＤＡを示す。
【００６８】
具体的には、図２４および２５は、マラリアと関連した脂質に対応するスペクトルの窓の使用に関し、コンフュージョンテーブル（Ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ  Ｔａｂｌｅ）（ＣＶ）（表２）に対応する：
【表２】
2018500539.tif 000003
【００６９】
図２６および２７は、マラリアについてのＣ−ＯおよびＰ−Ｏ領域に対応するスペクトルの窓に加えて、マラリアと関連した脂質に対応するスペクトルの窓の使用に関し、コンフュージョンテーブル（Ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ  Ｔａｂｌｅ）（ＣＶ）（表３）に対応する：
【表３】
2018500539.tif 000004
【００７０】
明らかに、１つの窓を使用すると、いくつかの偽陽性およびいくつかの偽陰性が生じたが、モデルの性能は、２つのスペクトルの窓を使用すると改善する。
【００７１】
モデリング：
上述した前処理および変数選択ステップの後に、較正データのみモデルの構築に採用する。アルゴリズムが適用され、関数ｙ＝ｆselected(x)が確立される。また、このプロセスは、モデルの一部の内部のパラメータを設定するのにも役立ち得る。
【００７２】
パラメータの最適化：
このステップでは、関数が、サンプルの検証セットのスペクトルに適用される。関数によって戻されたＹvalが、参照データの１つと比較され、その結果いずれの分類エラーも同定する。この点で、対応する関連したエラーによって、パラメータ（前処理、変数選択、モデルのタイプ、アルゴリズム、および他の変数）を変更することができ、新しいｆ（ｘ）を得ることができる。アプリケーションの要件を満たす分類性能を有する関数（および関連したパラメータ）の１つがｙ＝ｆselected(x)で選択できる。したがって、検証セットは、トレーニングセットを用いて作成した、モデリングに含まれるすべてのパラメータを調整するのにのみ使用される。
【００７３】
プロセスを繰り返してもよいが、パラメータの選択は、種々の他のアプローチ、または下記のものを含むアプローチの組み合わせによっても実施できることが当業者であれば容易に理解できる：
−  分析の問題の性質の知識の使用；例えば、モデルが線形出ない場合、ＰＬＳＤＡを使用しないか、またはＣＯ２領域を分類に使用しない、および
−  繰り返し手順の使用（例えば変数選択における遺伝的アルゴリズム）。
【００７４】
最適化：
最適化ステップは、例えば変数のすべての可能値を用いて分類エラーを計算することと、ＰＬＳＤＡにおける潜在的変数を選択することを含む。また、この手順は、サンプルの数が限られ、検証セットが利用可能でない場合、トレーニングセットのＣＶを用いても実施できる。
【００７５】
試験モデル：
その後、モデリングステップにおいて選択された関数の実際の分類能力を、サンプルの独立した試験を用いて評価する（すなわち、試験サンプルのＸ試験スペクトルを関数における入力として導入し、出力Ｙ試験を参照データＹ試験と比較する）。エラー値は、分類の予想されたエラーである。想定できる場合、モデルは、未知の疾病状態の新しい患者の血液サンプルにて使用される準備ができている。
【００７６】
新しいサンプルの診断：
適切なｙ＝ｆselected(x)が既知のエラー制限によって確立されると、患者からの新しいサンプルのスペクトルに適用でき、応答（陽性および陰性）を決定することができる。
【００７７】
使用した方法が、進行中の精度を確実にするためにモニタリングも必要とすることが容易に理解される。これは、モデルの将来の変化を予測できる対照サンプルを用いて実施できる。
【００７８】
図２１は、モデル生成の好ましい実施形態、および未知の疾病状態を有する血液サンプルへの適用を示す。モデルは、線形であっても、非線形であってもよい。しかし、この好ましい実施形態では、線形モデルが、部分最小二乗アルゴリズム（ＰＬＳ  ＤＡ）によって、判別分析に基づいて作成されて、各波数（ｉ）の質量のベクトル、「回帰ベクトル」が提供される：
【数１】
2018500539.tif 000005
【００７９】
先に説明したように、特定の疾病に関連する限られた数の波数（選択されたバンド域幅）を使用することが好ましい。所定の領域の直接の選択から遺伝的アルゴリズムなどの複雑な反復性の選択まで、それらの波数を選択する様々な方法がある。
【００８０】
スペクトルを吸光度値のベクトルとみなす：
【数２】
2018500539.tif 000006
【００８１】
最終結果は、回帰ベクトルＷ（ｉ）に各吸光度Ｘ（ｉ）でのスペクトルの吸光度値を掛けることによって計算される：
【数３】
2018500539.tif 000007
【００８２】
＋１に近いＹ値は、１つのクラス（例えば病原体に対して陽性）に割り当てられ、０に近いＹ値は、他のクラス（例えば病原体に対して陰性）に割り当てられる。１つのクラスまたは他のクラスへのアサインメントに関するカットオフ値が任意であり、最適化できるか、または変化できる変数の１つであることが理解される。これは、偽陰性より偽陽性がより多いことが好ましい場合に適切である可能性がある。
【００８３】
したがって、本発明の方法は、疾病に対し陽性である血液サンプル、疾病に対し陰性である血液サンプル、または未知の疾病状態の血液サンプルを割り当てるか、または目印をつけるさらなるステップを含み得る。したがってさらなるステップは、
（ｉｖ）まとめられた個別のスペクトルモデルのそれぞれにおいてサンプル成分の数を決定し、該まとめられたスペクトルモデルを順位付けすることを含み得る。
【００８４】
代替として、さらなるステップは、
（ｉｖ）まとめられた個別のスペクトルモデルのそれぞれにおいてサンプル成分の数を決定し、所定の分類基準に基づいて前記まとめられたスペクトルモデルを分類することを含み得る。
【００８５】
図２２は、モデルを作成して、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨｅｐＢ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨｅｐＣ）を含む肝炎ウイルス（Ｈｅｐ）に対して陽性または陰性としてサンプルを分類する本発明の方法を表すフローチャートを含む。本発明に従うモデルは、特定の肝炎ウイルス（肝炎Ａ、肝炎Ｂ、肝炎Ｃ、肝炎Ｄ、肝炎Ｅ、肝炎Ｇ）または肝炎ウイルスの組み合わせを同定するのに使用できる。
【００８６】
具体的には、図２２は、ＨｅｐＢを負荷した１０個の血液サンプル（血清サンプル）、ＨｅｐＣを負荷した１０個の血清サンプルおよびＨＩＶを負荷した１１個の血清サンプルを用いる較正を反映する。前処理ステップは、第１の導関数および平均のセンタリングの計算を含む。変数選択ステップは、適切なフィンガープリント領域（９００〜１７５０ｃｍ−１）を選択することからなる。
【００８７】
その後、ＰＬＳモデルはＮＩＮＰＡＬＳアルゴリズムと組み合わせられ、回帰ベクトルの質量を得るためにＰＬＳに統合アルゴリズムが使用される。使用される別のパラメータは、ＬＶ（４）Ｙ＝ｆselected(x)：回帰ベクトルの数である。
【００８８】
サンプルの限られたセット（利用可能な検証セットよりもむしろ）を交差検証と共に用いて検証ステップが実施される。図２２に示すように、２つのサンプル（サンプル番号２２および３３）がモデルを試験するのに使用される（ＮＢ：これは例示のために過ぎない。典型的にははるかに多くのサンプルがモデルを試験するのに使用される）。モデルが１００％のサンプルを分類するのに適していると、患者からの未知の血液サンプルの状態を分類するのに使用される準備ができている。
【００８９】
図２０は、第１のステップにおいて、作成した較正スペクトルをどのように病原体を負荷または病原体がないことが既知の血液サンプルを用いて集めるかを示す。スペクトルのモデルの参照データベースは、回帰ベクトルによって定められる。新しい血液サンプル（未知の病原体の存在）を代表するＩＲスペクトルが作成され、前記スペクトルをスペクトルのモデルの参照データベースに適用して、血液サンプルの波数および吸光度の１つ以上のスペクトル成分を同定する。スペクトル成分は、この場合、肝炎ウイルス（ＨＢＶまたはＨＣＶ）またはＨＩＶのいずれかと病原体を同定する。サンプル成分のリストが、データベースのそれぞれのスペクトルのモデルに対応して特定される。最後に、新しい血液サンプルは、肝炎ウイルス（ＨＢＶもしくはＨＣＶ）またはＨＩＶについて陽性または陰性と分類される。
【００９０】
システムおよびデバイス
スペクトルのモデルの生成、特定の病原体に対して陽性または陰性であることが既知である既知の血液サンプルからの較正スペクトルの調製は、研究室で実施できる。これらが生成されると、アルゴリズムおよびモデル関数をソフトウェア・アプリケーション（ａｐｐ）に組み込むことができ、無線で使用者に送ることができる。
【００９１】
したがって別の実施形態では、本発明は、血液サンプル中の病原体を検出する方法を実行するアプリケーションを一過性でない形態で保存するコンピュータが読み込み可能な記憶媒体を提供し、該方法は、
（ｉ）血液サンプルを代表するＩＲスペクトルを記録するステップと；
（ｉｉ）該スペクトルをスペクトルモデルの参照データベースと比較して、血液サンプルの波数および吸光度の１つ以上のスペクトル成分を同定するステップであって、スペクトル成分は病原体を同定するステップと；
（ｉｉｉ）データベースの個別のスペクトルモデルに対応する同定されたサンプル成分のリストを作成するステップと、を含み、
ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）が自動化されている。
【００９２】
コンピュータが読み込み可能な記憶媒体に保存されたアプリケーションに加えて、クラウドまたは他のコンピュータ関係の等価物に保存され得ることは当業者に明らかである。血液サンプル中の病原体の検出を可能にするように構成されたアプリケーションが提供され、前記アプリケーションは、
（ｉ）それぞれ波数および吸光度値を有する１つ以上のスペクトル成分を有する、血液サンプルを代表するサンプル赤外線スペクトルを生成するステップと、
（ｉｉ）それぞれ波数および吸光度値の１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するスペクトルモデルの参照データベースを提供するステップであって、前記データベーススペクトル成分は病原体を同定するステップと、
（ｉｉｉ）参照データベースが、１つ以上のサンプルスペクトル成分に対応する１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するどうか決定するステップと、
（ｉｖ）同定した対応するデータベース成分のリストを作成するステップと、
を含む方法を可能にするように構成された所定の指示セットを含む。
【００９３】
したがって、本発明の方法を操作するためには、患者の血液サンプルのＩＲスペクトルを生成する手段（標準ＦＴ−ＩＲ分光計およびダイヤモンド結晶ＡＴＲアクセサリーなど）と、診断を導き出すモデル関数を有することを必要とするのみである。これは、本発明の方法が、遠隔地でさえも、現場使用に適した相対的に小さいサイズに適合できることを意味する。
【００９４】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、ＩＲスペクトルの捕捉のための分光計とコンピュータとを含む血液サンプル中の病原体を検出するシステムを提供し、,
（ｉ）分光計は血液サンプルを代表するＩＲスペクトルを生成し,
（ｉｉ）コンピュータは該スペクトルをスペクトルモデルの参照データベースに適用して、血液サンプルの波数および吸光度の１つ以上のスペクトル成分を同定し、スペクトル成分は病原体を同定し、
（ｉｉｉ）コンピュータは、データベースの個別のスペクトルモデルに対応する同定されたサンプル成分のリストを作成する。
【００９５】
他の態様および好ましい形態が明細書に開示されるか、かつ／または添付の特許請求の範囲に記載され、本発明の説明の一部をなす。本質的に、本発明の実施形態は、血液サンプルのＩＲスペクトル内の吸光度のパターンが、機械学習アルゴリズムなどを用いて再検討でき、疾病状態の存在または非存在を同定するのに使用できるという認識に由来する。
【００９６】
本発明によってもたらされる利点として下記のものが挙げられる。
・迅速な治療を促進する感染の迅速な検出；
・生体内に存在する感染因子の迅速な同定；
・直接的で、低コストの診断方法；
・既存の機器を使用できる方法；
・厚層スライドサンプルの使用などの既存の血液サンプル採取技術と共に使用可能；
・ＨＩＶ、肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、またはアレナウイルス科（ラッサ熱、フニンおよびマチュポ）、ブニヤウイルス科（クリミア・コンゴ出血熱、リフトバレー熱、ハンタン出血熱）、フィロウイルス科（エボラおよびマールブルグ）およびフラビウイルス科（黄熱、デング、オムスク出血熱、キャサヌール森林病、ウエストナイルウイルス）を含めたいくつかのウイルスファミリーのウイルスを含むがこれらに限定されないウイルス性出血性ウイルス、アルファウイルス科（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）のものなどの節足動物またはベクターによって運ばれるウイルスを含む他の血液媒介ウイルス性疾病を含む広範囲の病原体の検出に使用できる。寄生虫の血液媒介病原体は、バベシア・ディバージェンス（Ｂａｂｅｓｉａ  Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ビゲミナ（Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ）、バベシア・エクイ（Ｂ．ｅｑｕｉ）、バベシア・ミクロフティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｆｔｉ）、バベシア・ダンカニ（Ｂ．ｄｕｎｃａｎｉ）、リーシュマニア・トキソプラズマ原虫（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、プラスモディウム・オバール・クルチシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｃｕｒｔｉｓｉ）、プラスモディウム・オバール・ワリケリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｗａｌｌｉｋｅｒｉ）、四日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、ブルセイトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）およびクルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）を含む；
・血液サンプル中に存在する類似のまたは密接に関連した病原体を区別することができる；
・最小容量（液滴）の血液を利用できる。
【００９７】
本発明の実施形態の適用性のさらなる範囲が、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、本開示の精神および範囲内での様々な変形および改変はこの詳細な説明から当業者に明らかであることから、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のみのために記載されていることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
本願の好ましいおよび他の実施形態のさらなる開示、目的、利点および態様は、添付の図面と併せて以下の実施形態の説明を参照することで、当業者であればよく理解でき、これらは例示を目的とするものであって、本開示を何ら制限するものではない。
【００９９】
図面を以下に説明する：
【図１】サンプルの異なるセット；全血（１）、溶解した全血（３）、血漿（５）、ＲＢＣ（７）、メタノール中のＲＢＣ（９）、および凝固血液のスラリー（１１）から得られたスペクトルを示す図である。
【図２】ＲＢＣの有機抽出物（２０）、全血（２１）および血漿（２２）血液脂質抽出物のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを示す図である。
【図３】生物学的化合物と関連した典型的なＩＲバンド、および化合物中の種々の部分−νＣＨ３、νＣＨ２、νＣＨ、（２３）；νＣＯ（２４）；ν（Ｐ−Ｏ）、ν（Ｃ＝Ｏ）（２５）；δＣＨ２およびδＣＨ３（２６）；アミノ酸（２７）およびアミドＩ、アミドＩＩおよびアミドＩＩＩ（２８）へのそれらのアサインメントを示す図である；
【図４】Ｂ型肝炎ウイルス（３０）、Ｃ型肝炎ウイルス（３１）およびＨＩＶ（３２）の異なる負荷を有する血清のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを示す図である。図４ａは、３０００〜１０００ｃｍ−１のフルスペクトルを示す。図４ｂ１７５０〜９００ｃｍ−１の領域の拡張を示す。図４ｃは、核酸と関連した１２５０〜９５０ｃｍ−１の領域のさらなる拡張を示す。目視検査は、９７０および１１６０ｃｍ−１辺りのＨＩＶに感染したサンプルのスペクトルにおけるいくつかのバンドを示す。それらのバンド（黒矢印）は、肝炎に感染した患者から得られたスペクトルでは見られず、ＲＮＡおよびＤＮＡの存在に関連し得る。
【図５】対照サンプル（３５）、およびＨＩＶ（３６）およびＣ型肝炎ウイルス（３７）の異なる負荷を有するサンプルを含む全血のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを示す図である。図５ａは、３０００〜１０００ｃｍ−１のフルスペクトルを示す。図５ｂは、１７５０〜９００ｃｍ−１の領域の拡張を示す。図５ｃは、核酸と関連する１２５０〜９５０ｃｍ−１の領域のさらなる拡張を示す。この場合、１１４０および１１１０ｃｍ−１辺りで観察されたＨＩＶのスペクトルのバンドは、さらに自明である。
【図６】対照サンプル（４０）、全血（４１）および血清（４２）を含むＨＩＶ負荷を有するサンプルのＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを示す図である。図６ａは、３０００〜１０００ｃｍ−１のフルスペクトルを示す、図６ｂは、１７５０〜９００ｃｍ−１の領域の拡張を示す。図６ｃは、核酸と関連する１２５０〜９５０ｃｍ−１の領域のさらなる拡張を示す。また、核に具体的に割り当てられたバンドが示され、強いＷＢの場合にはるかに強い。ＩＴは、ＷＢ中のリンパ球の存在によって生じ得る。実験下において、それらのバンドは、対照において見出されていない。
【図７】対照、およびＢ型肝炎ウイルスを負荷した血清サンプルのＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを示す図である。図７ａは、３０００〜１０００ｃｍ−１のフルスペクトルを示す。図７ｂは、１７５０〜９００ｃｍ−１の領域の拡張を示す。図７ｃは、核酸と関連する１２５０〜９５０ｃｍ−１の領域のさらなる拡張を示す。肉眼では、対照（４５）とＢ型肝炎ウイルスの病理学的サンプル（４６）とのスペクトルの違いを見出すことができない。
【図８】対照、Ｃ型肝炎ウイルスを負荷した全血および血清サンプルのＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを示す図である。図８ａは、３０００〜１０００ｃｍ−１のフルスペクトルを示す。図８ｂは、１７５０〜９００ｃｍ−１の領域の拡張を示す。図８ｃは、核酸と関連する１２５０〜９５０ｃｍ−１の領域のさらなる拡張を示す。また、肉眼では、対照（５０）と、全血（５１）および血清（５２）中の肝炎Ｃの病理学的サンプルとのスペクトルの違いを見出すことができない。
【図９】図９ａ、９ｂおよび９ｃは、対照（白菱形）に対するＷＢ中のＨＩＶ（白四角）、ＷＢ中Ｃ型肝炎ウイルスの（黒三角）、血清中のＢ型肝炎ウイルス（黒下三角）、血清中のＣ型肝炎ウイルス（＊）および血清中のＨＩＶ（白丸）のサンプル／スコアを示す多変量分析の結果を図示するプロットである。多変量分析は、違いを明確にするか、または隠れパターンを見つけるのに使用される。選択された方法は、分散の方向に配向された新しい座標でサンプルを提示する教師なし方法（すなわち、クラスを考慮せず、スペクトルを使用するのみである）である主成分分析（ＰＣＡ）である。データの全部にわたって実施したＰＣＡのスコアでは、２つの第１のスコア空間が血清（５６）と全血（５７）との区別、特に、ＨＩＶ（５８）と肝炎（６０）ウイルスサンプルとの区別を示す。
【図１０】肝炎Ｂ（白菱形）、肝炎Ｃ（白四角）およびＨＩＶ（黒三角）についての２つの異なる形式（図１０ａおよび図１０ｂ）での血清スペクトルの多変量分析を示す図である。血清データの場合では、ＨＩＶ−ＨＩＶおよび肝炎が、ＰＣ１（６２）対ＰＣ２空間（６３）で明らかに区別される。
【図１１】２つの異なる形式（図１１ａおよび図１１ｂ）での血清スペクトル（肝炎のみ）の多変量分析を示す図である。スペクトルの目視検査では違いが明らかでないが、スコアプロット上で肝炎Ｂ（白菱形）と肝炎Ｃ（白四角）とを比較すると、病気ごとに異なるクラスターがある。
【図１２】血清スペクトル（肝炎Ｂのみ）（白菱形）の多変量分析を示す図である。標識は、ウイルス負荷のログを示す。負荷が最も高いサンプルは、その他のものと明らかに区別される。
【図１３】２つの異なる形式（図１３ａおよび図１３ｂ）での全血スペクトルの多変量分析を示す図である。全血の場合、スコアＰＣ２（７０）およびＰＣ３（７１）は、ＨＩＶ（白四角）と、肝炎Ｃ（黒三角）と、対照（白菱形）とを明らかに区別する。
【図１４】乾燥したＷＢサンプルを用いる、感染したＷＢ（７３、７４）および対照（７５）からのスペクトルの比較を可能にするＡＴＲ−ＦＴＩＲプロットである。図１４ａは、３０００〜１０００ｃｍ−１のフルスペクトルを示す。図１４ｂは、１７５０〜９００ｃｍ−１の領域の拡張を示す。図１４ｃは核酸と関連する１２５０〜９５０ｃｍ−１の領域のさらなる拡張を示す。
【図１５】湿潤した溶解血液サンプルを用いる、感染したＷＢ（７７）および対照（７８）からのスペクトルの比較を可能にするＡＴＲ−ＦＴＩＲプロットである。図１５ａは、３０００〜１０００ｃｍ−１のフルスペクトルを示す。図１５ｂは、１７５０〜９００ｃｍ−１の領域の拡張を示す。
【図１６】感染したＷＢ（８０）および対照（８１）を用いる、乾燥した溶解血液サンプルからのスペクトルの比較を可能にするＡＴＲ−ＦＴＩＲプロットである。図１６ａは、３０００〜１０００ｃｍ−１のフルスペクトルを示す。図１６ｂは、１７５０〜９００ｃｍ−１の領域の拡張を示す。
【図１７】異なる負荷のマラリアを添加したＷＢのメタノール抽出物のＡＴＲ−ＦＴＩＲプロット（対照（９０）；０．００７７％（９１）；０．０３１％（９２）；０．２５％（９３）；０．４９％（９４）；１．９６％（９５））を含む図である。図１７は、１７００〜１７２８ｃｍ−１の領域の拡張を示す。添加レベルを反映して、カルボニルのバンドのシフトを明らかに見ることができる。
【図１８】ＷＢサンプル中の予測レベル対寄生虫の実際のレベルの部分最小二乗回帰プロットである。回帰分析によって、高い寄生虫負荷と低い寄生虫負荷との判別が可能になる。方法が線形であり、数桁をカバーすることに留意すべきである。並べ替え検定は、回帰が９５％信頼レベルで有意であることを示した。
【図１９】対照スペクトルの減算後のＨＩＶのウイルス負荷が高い全血サンプルのＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを示す図である。
【図２０】本発明の方法の一実施形態に従うステップを示すフローチャートである。
【図２１】好ましいデータ操作の指示を含む、図２０のより詳細なステップを示すフローチャートである。
【図２２】肝炎ウイルス（Ｈｅｐ）またはＨＩＶに対して陽性または陰性に血液サンプルを分類するモデルを作成するのに使用する場合の本発明の方法を示すフローチャートである。
【図２３】本発明に従って血液サンプルを分類するのに適したモードの作成について表すさらなるフローチャートである。
【図２４】破線でマークしたＤｉｓｃｒｉｍ  Ｙ  １による、メタノールで固定したマラリア感染ＲＢＣ血液サンプル（白四角）および対照（白菱形）サンプルについての線形指数に対して予測されたＹ  ＣＶのプロットである。
【図２５】３０００〜２８２０ｃｍ−１のスペクトルの窓についてのＩＲ吸収プロットである。
【図２６】メタノールで固定したマラリア感染ＲＢＣ血液サンプル（白四角）および対照（白菱形）サンプルについての線形指数に対して予測されたＹ  ＣＶのプロットである。
【図２７】３０００〜２８２０ｃｍ−１および１４００〜９００ｃｍ−１のスペクトルの窓についてのＩＲ吸収プロットである。
【図２８】対照（１００）、およびマラリア寄生虫血症を負荷した血液サンプル（リングおよび栄養細胞-ＲＰ（１０１）、ＲＮＰ（１０２）およびＴＰ（１０３））についての、４０００〜０ｃｍ−１のスペクトルの窓についてのＩＲ吸収プロットである。
【図２９】図２９（ａ）および２９（ｂ）は、３１１６．１９〜２７６８．７１および１８２８．４６〜８５２．９１ｃｍ−１の領域でのサンプルについての複数のＳＰＣファイルのサンプル／スコアを示す、図２８で表した結果の多変量分析の結果を表す２つの異なる形式のプロットである（対照（白菱形）、ＲＰ（白四角）、ＲＮＰ（黒三角）、ＴＰ（黒下三角））。楕円波線がｘ軸およびｙ軸にわたって９５％信頼レベルを示し、破線でもマークした。ＰＣ１（７０．１７％）（１１０）およびＰＣ２（１５．２０％）（１１１）が図２９ｂに含まれており、複数のＳＰＣファイルについての変数／負荷を表す。
【図３０】図４６で表したサンプル（対照（白菱形）、ＲＰ（白四角）、ＲＮＰ（黒三角）、ＴＰ（黒下三角））中の寄生虫血症の予測レベル対実際のレベルの部分最小二乗回帰プロットである。
【図３１】２５００〜４０００ｃｍ−１の領域での平均スペクトルに基づいた、染色した細胞の可視画像（図３１ａ）および非処理細胞のＩＲ画像（図３１ｂ）を示す図である。図３１ｃは、２つの細胞の視覚的な近接写真（ＡおよびＢでマークし、図３１ａ中、丸で囲んだ）である。図３１ｄは対応するＩＲ画像である。
【図３２】マラリア原虫に感染した領域（白菱形）、第１の非感染領域（黒三角）および第２の非感染領域（白四角）についての、図３１に対応するＰＣＡを示す図である。
【図３３】変数／負荷プロットである。
【図３４】ＬＶ１成分（切れ目のない線）およびＹ１のＲｅｇベクトル（破線）を示す、実施した、管理されたモデルＰＬＳＤＡ（導関数なし）を示す図である。
【図３５】異なるタイプの肝炎（肝炎Ｂ（１２０）；肝炎Ｃ（１２５））を有する血漿サンプルについてのＩＲスペクトルを示す図である。
【図３６】サンプル中の肝炎（肝炎Ｂ（白菱形）；肝炎Ｃ（白四角））の予測レベル対実際のレベルの部分最小二乗回帰プロットである。
【図３７】ある濃度の範囲のグルコースおよび尿素を負荷し、ガラス繊維上で乾燥した血液サンプル（１００ｍｇ／ｄｌ（１３０）；２９７ｍｇ／ｄｌ（１３２）；４９０ｍｇ／ｄｌ（１３４）；６７９ｍｇ／ｄｌ（１３６）；８６５ｍｇ／ｄｌ（１３８）；グルコースなし］（１４０））についてのＦＴＩＲスペクトルを示す図である。
【図３８】図３３で示した、グルコースについての結果の部分最小二乗プロットである。切れ目のない線は、最良適合を示し、破線は、予測された相関と添加された相関との１：１相関を示す。
【図３９】グルコースについての標準ＩＲスペクトルである。
【図４０】図３３で示した、尿素についての結果の部分最小二乗プロットである。切れ目のない線は、最良適合を示し、破線は、予測された相関と添加された相関との１：１相関を示す。
【図４１】波数に対する負荷値の標準ＩＲスペクトルを示す図である。
【図４２】使用者に示されるスペクトルの品質管理のための典型的なグラフィカル・ユーザー・インターフェースの例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本発明を、ＡＴＲ−ＩＲ分析に適したサンプルを得るのに適した下記のプロトコールの例を参照してさらに詳細に説明する。
【０１０１】
１．結晶洗浄の一般的な手順
概して、ＡＴＲ結晶は、下記ステップを用いて洗浄される：
ａ）湿らせたソフトセルロースを、サンプルを取り除くために使用する。
ｂ）ＡＴＲ結晶を、ソフトセルロースと、水および／または有機溶媒を用いて洗浄する。
ｃ）いずれのメモリ効果も破棄するために空の結晶のスペクトルを得る。
ｄ）タンパク質を除去するのが困難である場合、ＰＢＳ、界面活性剤またはミセルの水の使用が推奨される。
【０１０２】
２．サンプル調製のための一般的な手順
２．１  全血（ＷＢ）サンプリング方法
ＥＤＴＡチューブで、またはランセットで直接患者から全血を抽出する。
【０１０３】
２．１．１  湿潤ＷＢ
本発明の方法に従って、湿潤全血サンプルを典型的には処理して、下記ステップを用いて、図１に示すものと類似のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）空の清浄なＡＴＲ結晶を用いてバックグラウンドを得る。
ｂ）１０μｌの水のスペクトルを測定することによって水（Ｗ）のブランクを得る。
ｃ）１０μｌのＥＢをマイクロピペットで取り、ＡＴＲ結晶の表面上に置く。
ｄ）全血（ＲＷＢ）の生スペクトルを直ちに獲得する。
ｅ）ＲＷＢのｉの波数からＷのｉの波数の強度を引くことで、全血の最終のスペクトル（ＷＢｗ）を得る。
【数４】
2018500539.tif 000008
ｆ）一般的な手順に従って結晶を洗浄する。
【０１０４】
２．１．２  乾燥したＷＢ
本発明の方法に従って、乾燥した全血サンプルを典型的には処理して、下記ステップを用いて、図１に示すＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）空の清浄なＡＴＲ結晶を用いてバックグラウンドを得る。
ｂ）１〜５μｌ（量はアプリケーションに依存）をマイクロピペットで取り、ＡＴＲ結晶の表面上に置く。
ｃ）サンプルを、異なる方法（乾燥を可能にする／乾燥器または加熱ランプを用いる）で乾燥する
ｄ）乾燥後、全血のスペクトル（ＷＢｄ）を獲得する。
ｅ）上記の一般的な手順に従って結晶を洗浄する。
【０１０５】
２．２  溶解ＷＢサンプル方法
ＷＢサンプルを上記と同じ手順で得、全血と蒸留水とを比率１：１（ｖ／ｖ）で混合するか、または全血と７％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液とを比率８：１（ｖ／ｖ）で混合することによって溶解する。
【０１０６】
２．２．１  湿潤した溶解ＷＢ
湿潤した溶解全血サンプルを本発明の方法に従って典型的には処理して、下記ステップを用いて、図１に示すＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）空の清浄なＡＴＲ結晶を用いてバックグラウンドを得る。
ｂ）溶解に使用した方法次第で、１０μｌの蒸留水、または蒸留水と比率８：１（ｖ／ｖ）で混合した７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液のブランクのスペクトルを測定することによって、水のブランク（Ｗ）を得る。
ｃ）１０μｌの溶解したＷＢをマイクロピペットで取り、ＡＴＲ結晶の表面上に置く。血漿（ＲＬ）の生スペクトルを直ちに得る。
ｄ）溶解した全血の最終のスペクトル（Ｌｗ）を、ＲＬのｉの波数からＷのｉの波数の強度を引くことによって得る。
【数５】
2018500539.tif 000009
ｅ）上記の一般的な手順に従って結晶を洗浄する。
【０１０７】
２．２．２  乾燥した溶解ＷＢ
乾燥した溶解全血サンプルを、本発明の方法に従って典型的には処理して、下記ステップを用いて、図１に示すＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）空の清浄なＡＴＲ結晶を用いてバックグラウンドを得る。
ｂ）１〜５（アプリケーション次第）μｌの溶解したＷＢをマイクロピペットで取り、ＡＴＲ結晶の表面上に置く。
ｃ）サンプルを、異なる方法（乾燥を可能にする／乾燥器または加熱ランプを用いる）で乾燥する
ｄ）乾燥後、血漿のスペクトル（Ｌｄ）を獲得する。
ｅ）上記の一般的な手順に従って結晶を洗浄する。
【０１０８】
２．３  血漿（Ｐ）サンプル方法。
最初に、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）含有チューブ（血清が必要である場合には血清チューブ）で、またはランセットで直接、患者から全血を抽出することで、患者の血漿サンプルを典型的には調製する。ＷＢサンプルを、１６００ｇで１０分間遠心する。上相からパスツールピペットで血漿を得る。
【０１０９】
２．３．１  湿潤した血漿
湿潤した血漿サンプルを本発明の方法に従って典型的には処理して、下記ステップを用いて、図１に示すＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）空の清浄なＡＴＲ結晶からバックグラウンドを得る。
ｂ）１０μｌの水のスペクトルを測定することによって、水のブランク（Ｗ）を得る。
ｃ）１０μｌの血漿をマイクロピペットで取り、ＡＴＲ結晶の表面上に置く。血漿（ＲＰ）の生スペクトルを直ちに得る。
ｄ）ＲＰのｉの波数からＷのｉの波数の強度を引くことで血漿の最終のスペクトル（Ｐｗ）を得る。
【数６】
2018500539.tif 000010
ｅ）上記のステップに従って結晶を洗浄する。
【０１１０】
２．３．２  乾燥した血漿
乾燥した血漿サンプルを、本発明の方法に従って典型的には処理して、下記ステップを用いて、図１に示すＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）空の清浄なＡＴＲ結晶を用いてバックグラウンドを得る。
ｂ）１〜５μｌ（量はアプリケーションに依存）の血漿をマイクロピペットで取り、ＡＴＲ結晶の表面上に置く。
ｃ）サンプルを、異なる方法（乾燥を可能にする／乾燥器または加熱ランプを用いる）で乾燥する
ｄ）乾燥後、血漿のスペクトル（Ｐｄ）を獲得する。
ｅ）上記の一般的な手順に従って結晶を洗浄する。
【０１１１】
２．４  赤血球（ＲＢＣ）サンプル方法
患者のＲＢＣのサンプルを、ＥＤＴＡチューブ（血清が必要である場合、血清チューブ）またはランセットで直接、患者から全血を抽出することによって得る。ＷＢサンプルを１６００ｇで１０分間遠心する。下相からパスツールピペットでＲＢＣを得る。
【０１１２】
２．４．１  湿潤したＲＢＣ
本発明の方法に従って、湿潤したＲＢＣサンプルを典型的には処理して、下記ステップを用いて、図１に示すＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）空の清浄なＡＴＲ結晶を用いてバックグラウンドを得る。
ｂ）１０μｌの水のスペクトルを測定することによって、水のブランク（Ｗ）を得る。
ｃ）１０μｌのＲＢＣをマイクロピペットで取り、ＡＴＲ結晶の表面上に置く。ＲＢＣの生スペクトル（ＲＲＢＣｓ）を直ちに得る。
ｄ）ＲＰのｉの波数からＷのｉの波数の強度を引くことで、血漿の最終のスペクトル（ＲＢＣｓｗ）を得る。
【数７】
2018500539.tif 000011
ｅ）上記の一般的な手順に従って結晶を洗浄する。
【０１１３】
２．４．２  乾燥したＲＢＣ
本発明の方法に従って、乾燥したＲＢＣサンプルを典型的には処理して、下記ステップを用いて、図１に示すＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）空の清浄なＡＴＲ結晶を用いてバックグラウンドを得る。
ｂ）１〜５（アプリケーション次第）μｌのＲＢＣをマイクロピペットで取り、ＡＴＲ結晶の表面上に置く。
ｃ）サンプルを、異なる方法（乾燥を可能にする／乾燥器または加熱ランプを用いる）で乾燥する
ｄ）乾燥後、血漿のスペクトル（ＲＢＣｄ）を得る。
ｅ）上記の一般的な手順に従って結晶を洗浄する。
【０１１４】
２．５  溶媒に入れたＲＢＣ
本発明の方法に従って、メタノール（ＭｅＯＨ）などの溶媒中のＲＢＣサンプルを典型的には処理して、下記ステップを用いて、図１に示すＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）得られたＲＢＣをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄して、血漿／血清成分を除去し、その後、１ｍＬの冷メタノール０．４：１（ｖ／ｖ）と混合する。
ｂ）メタノールに入れたＲＢＣを１〜５（アプリケーション次第）μｌマイクロピペットで取り、ＡＴＲ結晶の表面上に置く。
ｃ）サンプルを、異なる方法（乾燥を可能にする／乾燥器または加熱ランプを用いる）で乾燥する
ｄ）乾燥後、メタノールに入れたＲＢＣのスペクトル（ＲＢＣｓｍ）を得る。
ｅ）上記の一般的な手順に従って結晶を洗浄する。
【０１１５】
２．５  溶媒中の凝固全血のスラリー
メタノール（ＭｅＯＨ）などの溶媒中の凝固全血のスラリーを、本発明の方法に従って典型的には処理して、下記ステップを用いて、図１に示すＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）セクション１．１のものと同じ手順でＷＢを抽出する。
ｂ）１〜５μｌのＷＢをＡＴＲ結晶上にマイクロピペットで置く。
ｃ）同じ量のメタノールをＷＢの先の滴の上に置き、凝固血液のスラリーを作製する。
ｄ）サンプルを、異なる方法（乾燥を可能にする／乾燥器または加熱ランプを用いる）で乾燥する
ｅ）乾燥後、乾燥スラリーのスペクトルを獲得する。
ｆ）上記の一般的な手順に従って結晶を洗浄する。
【０１１６】
２．６  血清／血漿／血液脂質抽出物
メタノール（ＭｅＯＨ）などの溶媒中の血清からの脂質抽出物、または血漿または血液またはそれらの組み合わせを、本発明の方法に従って典型的には処理して、下記ステップを用いて、図２に示すＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを生成する：
ａ）セクション１．１のものと同じ手順でＷＢ／血漿／血清を抽出する。
ｂ）ＷＢ／血漿／血清を有機溶媒と混合する。エマルジョンが形成した場合、サンプルを遠心すべきである。
ｃ）１〜５μｌの抽出相をマイクロピペットで取り、ＡＴＲ結晶上に置く。
ｄ）サンプルを、異なる方法（乾燥を可能にする／乾燥器または加熱ランプを用いる）で乾燥する
ｅ）乾燥後、乾燥したフィルムのスペクトルを獲得する。
ｆ）上記一般的な手順に従って結晶を洗浄する。
【０１１７】
病原体としてのマラリア
マラリアは、異なる種のプラスモディウム属によって引き起こされる。異なる種のマラリア原虫は、異なる分子の表現型および対応する赤外スペクトルを有する。異なる種のマラリア原因因子がマラリア参照データベースに含まれる。異なる種のマラリア原虫を特定するか、または同定するには、典型的には下記の方法を最初に使用して、ヒトが下記のようなマラリアを有することを同定する。
【０１１８】
したがって、本発明に従う血液サンプル中のマラリアを検出する方法のさらなる実施形態では、該方法は、下記のステップ：
（ｉ）それぞれ波数および吸光度値を有する１つ以上のスペクトル成分を有する、血液サンプルを代表するサンプル赤外線スペクトルを生成するステップと、
（ｉｉ）それぞれ波数および吸光度値の１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するスペクトルモデルの参照データベースを提供するステップであって、データベーススペクトル成分がマラリアを同定するステップと、
（ｉｉｉ）参照データベースが、１つ以上のサンプルスペクトル成分に対応する１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するかどうか決定するステップと、
（ｉｖ）同定した対応するデータベース成分のリストを作成するステップと、
を含む。
【０１１９】
本発明の方法のさらなる実施形態では、マラリアの原因因子を種々のプラスモディウム種へ特定し、決定するために、該方法は、
（ｉ）それぞれ波数および吸光度値を有する１つ以上のスペクトル成分を有する、血液サンプルを代表するサンプル赤外線スペクトルを生成するステップと、
（ｉｉ）それぞれ波数および吸光度値の１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するスペクトルモデルの参照データベースを提供するステップであって、データベーススペクトル成分が、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、プラスモディウム・オバール・クルチシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｃｕｒｔｉｓｉ）、プラスモディウム・オバール・ワリケリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｗａｌｌｉｋｅｒｉ）、四日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫またはこれらの組み合わせ（これらに限定されない）などの異なるプラスモディウム種を同定するステップと、
（ｉｉｉ）参照データベースが、１つ以上のサンプルスペクトル成分に対応する１つ以上のデータベーススペクトル成分を有するかどうか決定するステップと、
（ｉｖ）同定した対応するデータベース成分のリストを作成するステップと、
を含む。
【０１２０】
実験結果−マラリア
上記の方法を用いて実施した実験試験は、スペクトルと、血液中のマラリア寄生虫濃度との相関を示した。異なる濃度の寄生虫血症（リングおよび栄養細胞）を負荷した赤血球（ＲＢＣ）および全血漿サンプル（ＷＢ）をガラス繊維紙にて乾燥した。負荷の計画を表４に要約する。
【表４】
2018500539.tif 000012
2018500539.tif 000013
【０１２１】
図２８は、対照と、表４に記載したようにマラリアを負荷したＲＰ、ＲＮＰおよびＴＰサンプルのＩＲ吸収スペクトルである。肉眼では、対照と病理学的サンプルとのスペクトルの違いを容易に区別できない。
【０１２２】
図２９ａおよび２９ｂは、３１１６．１９〜２７６８．７１および１８２８．４６〜８５２．９１ｃｍ−１の領域での、サンプルについての複数のＳＰＣファイルのサンプル／スコアを示す多変量分析の結果を表す２つの異なる形式のプロットである。多変量分析は、違いを明確にするか、または隠れパターンを見つけるのに使用される。選択された方法は、分散の方向に配向された新しい座標でのサンプルを提示する教師なし方法（すなわち、クラスを考慮せず、スペクトルを使用するのみ）である主成分分析（ＰＣＡ）である。
【０１２３】
図３０は、サンプル中の寄生虫血症の予測レベル対実際のレベルの部分最小二乗回帰プロットである。回帰分析は、高い寄生虫負荷と低い寄生虫負荷との判別を可能にする。方法は線形であり、数桁をカバーすることに留意すべきである。
【０１２４】
紙で乾燥した場合にＲＢＣ上のマラリアの栄養細胞のＩＲ署名が維持されたかどうか見るために、さらなる実験試験を行った。１０個のＲＢＣサンプルに５％寄生虫血症（栄養細胞）を負荷し、通常の濾紙上で乾燥した。１２個の正常なＲＢＣサンプルも対照として作製した。
【０１２５】
また、本発明の方法は、顕微鏡検査およびＰＣＲによって、熱帯熱マラリア原虫および／または三日熱マラリア原虫を含有することが既知であるサンプルについての検出にも使用される。ＦＴＲを用いた結果は、方法がマラリア種と混合感染の両方による感染の検出に適していることを実証した。
【０１２６】
実験結果−ガラスでのＲＢＣの薄層塗抹標本から得られた画像を用いるマラリアの検出
５％マラリア栄養体に感染したＲＢＣと、非感染血液細胞との区別に関して本発明の方法の有効性を調べるために、実験調査を行った。
【０１２７】
この場合では、焦点面アレイ、すなわち、ガラス上での薄層血液塗抹標本のＦＰ分光学的イメージングを使用した。画像取得後、栄養体の視覚的検出のために、サンプルをギムザ染色で染色した。
【０１２８】
図３１は、染色した細胞の可視画像（図３１ａ）と、領域２５００〜４０００ｃｍ−１の平均スペクトルに基づく非処理細胞のＩＲ画像（図３１ｂ）を示す。図３１ｃは、２つの細胞の視覚的な近接写真（ＡおよびＢでマークされ、図３１ａでは丸で囲まれている）であり、図３１ｄは、対応するＩＲ画像である。これらの画像から、寄生虫が存在していない場合、スペクトルの密度がより大きいことが明らかである。ＰＣＡ分析は、３つの領域-非感染ＲＢＣ領域（１１２）、栄養体のマラリア原虫（１１３）および栄養体なしの感染したＲＢＣの一部の第２の非感染領域（１１４）を明らかに示す。
【０１２９】
対応するＰＣＡが、マラリア原虫に感染した領域（白菱形）、第１の非感染領域（黒三角）および第２の非感染領域（白四角）について、図３２にて記録されている。９５％信頼レベルが、−４および４にてマークされている。
【０１３０】
図３３は、変数／負荷プロットである。違いをより綿密に調査するために、管理されたモデルＰＬＳＤＡ（導関数なし）を実施し、図３４に示す。ＬＶ１成分（切れ目のない線）およびＹ１のＲｅｇベクトル（破線）が示されている。回帰ベクトルは非常にノイズが多いが、感染画素と非感染画素とを識別することができる３３００ｃｍ−１バンドのシフトがある。
【０１３１】
上述した結果に基づいて、ガラス上の非処理ＲＢＣ薄膜での寄生虫血症の同定のための以下の方法論が提案できる：
（ｉ）薄層塗抹標本を作製し,
（ｉｉ）顕微鏡の視覚的分析を実施し、視覚的画像を生成し,
（ｉｉｉ）ＦＴＩＲ画像を生成し,
（ｉｖ）（ａ）寄生虫またはＲＢＣと分類するために、画像の各画素をモデル化し,
（ｉｖ）（ｂ）各ＲＢＣの画素を平均化するＲＢＣ平均スペクトルを抽出し、各ＲＢＣが感染しているか、または感染していないかを調べる。
実験結果−肝炎
【０１３２】
上記の方法を用いて実施した実験試験は、異なるタイプの肝炎を有する血漿サンプルを区別することが可能であることを示す。
【０１３３】
サンプルごとに、肝炎Ｂ（ＨＢ）および肝炎Ｃ（ＨＣ）を有する約３μｌの血漿を事前にカットしたガラス繊維濾紙上に置き、２０分間空気乾燥した。その後、乾燥した血漿サンプルを有するガラス紙を、ダイヤモンドＡＴＲ−ＦＴＩＲ窓の結晶上に置き、スペクトルを８ｃｍ−１で、５０スキャンを共に追加して記録し、空気のバックグラウンドスペクトルに対する比率で表した。生じたスペクトルを図３５に示す。
【０１３４】
図３６は、サンプル中の肝炎の予測レベル対実際のレベルの部分最小二乗回帰プロットである。サンプルについて、データ分析を、１５８３．１８〜１４９２．１３ｃｍ−１および１３０４．４５〜１１２０．４９ｃｍ−１の領域で実施した。回帰分析によって、高い寄生虫負荷と低い寄生虫負荷との判別、およびＨＢ感染とＨＣ感染との判別が可能になる。
【０１３５】
実験結果−グルコースおよび尿素
以前の実験結果は、スペクトル効果が、血液中に存在する寄生虫血症の形態の病原体によって直接吸収されたＩＲエネルギーに関係することを示した。本発明の方法を用いて実施した実験試験も、病原体によって生じた他の生物学的存在によって吸収されたエネルギーによって、病原体を間接的に検出することができることを示している。例えば、病原体は、グルコース、尿素またはそれらの両方の増加を引き起こし得る。
【０１３６】
幅広い濃度範囲のグルコースおよび尿素を血液サンプルに負荷し、ガラス繊維上で乾燥した。図３７は、サンプルでのＦＴＩＲスペクトルを示し、グルコースの吸光度がサンプル中のグルコースの濃度に比例することを示す。
【０１３７】
図３８は、結果の部分最小二乗プロットである。続いて、図３９に示すように、回帰ベクトルは、グルコース標準スペクトルと相互に関連している。
【０１３８】
類似のアプローチを尿素で採用した。図４０は、結果の部分最小二乗プロットである。続いて、図４１に示すように、回帰ベクトルは、グルコース標準スペクトルと相互に関連している。
実験結果−品質管理
【０１３９】
上述したモデルの１つに含ませる前に、スペクトルの検証を実施できる。これは、獲得したスペクトルがモデルに含まれる特徴と類似の特徴を有することを確実にする。また、技術課題がモデルからの情報の抽出を妨げないであろうことも確実にする。例えば、以下の２つの品質管理の方法を開発した。
品質管理-モデル独立
【０１４０】
第１のものは、モデルから独立した、すなわち、データベースにのみ依存した品質管理に頼る。品質管理は、成分の違いの超過分（または欠点）およびサンプルに関する干渉をモニターするのを試みることに注目する。成分の相対濃度を、アルゴリズムを用いて計算し、この濃度を閾値の値と比較する。例えば、成分の相対濃度値の分布をデータベース上で作成できる。その後上端および下端で次第に減少する分布の一部を、閾値を定めるのに使用できる。成分の相対濃度が閾値外である場合、スペクトルは品質管理に合格しない。
【０１４１】
典型的には、この品質管理方法では、以下の３つの構成成分が順次考えられる。
（ｉ）大気干渉：バックグラウンドとサンプル測定との間のＩＲ活性大気蒸気の変動は、正および負の閾値を用いて検出される負および正のバンドを生じ得る；
（ｉｉ）溶媒：溶媒（水、ＭｅＯＨ）が適切に除去されていない；
（ｉｉｉ）サンプル：例えば接触不良により、結晶上に十分なサンプルがない。
品質管理-モデル依存
【０１４２】
第２の品質管理方法は、モデルと関連し、モデリングの観点から、サンプルと較正サンプルとの間の距離の測定に頼る。典型的な例は、ＰＬＳＤＡ上でのＴ２およびＳＱ残留と９５％信頼区間の使用である。
【０１４３】
例えば、記録されたスペクトルについての品質管理を、（ｉ）大気干渉（水）、（ｉｉ）溶媒（メタノール）、（ｉｉｉ）サンプル、および最後に（ｉｖ）モデルへの距離の順序で実施し得る。典型的には、これは、表５のものなどの結果と相関する：
【表５】
2018500539.tif 000014
【０１４４】
使用者に表示されるだろう典型的なグラフィカル・ユーザー・インターフェースの例を図４２に図示する。
【０１４５】
本発明を、その特定の実施形態に関連して説明したが、当然ながら、さらなる改変が可能である。本願は、概して本発明の本質に従い、本発明に関する技術分野内の既知または慣行に入り、前述した必須の特徴に適用され得る本開示からの発展を含む本発明のいずれのバリエーションの使用または適応もカバーするよう意図されている。
【０１４６】
本発明の必須の特徴の精神から逸脱することなく、いくつかの形態で本発明を具体化し得ることから、上記の実施形態が特段の定めがなければ、本発明を制限するものではなく、添付の特許請求の範囲で定められる本発明の精神および範囲内で広く解釈すべきであることを理解すべきである。説明した実施形態は、例示のみであり、制限するものではないと見なすべきである。
【０１４７】
種々の改変および等価な変性が、本発明および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれるよう意図されている。したがって、特定の実施形態は、本発明の本質を実行し得る多くの方法の例示であると理解すべきである。特許請求の範囲では、ミーンズ・プラス・ファンクションの節は、定められた機能を実施する構造と、構造上の等価物だけではなく、等価な構造もカバーするよう意図されている。
【０１４８】
「サーバー」、「安全なサーバー」または類似の用語が本明細書で使用されている場合、文脈上別の解釈が要求される場合を除いて、通信装置は、通信システムに使用し得るものと記載されており、本発明をいずれの特定の通信装置のタイプに制限すると解釈すべきではない。したがって、通信装置は、含み得る、保護されていても、保護されていなくてもよい、ブリッジ、ルーター、ブリッジルーター（ルーター）、スイッチ、ノード、または他の通信装置を含み得るが、これらに限定されない。
【０１４９】
本発明の種々の態様を示すためにフローチャートが使用される場合、本発明をいずれの特定の論理の流れまたは論理の実行に制限すると解釈すべきでないことも留意すべきである。説明した論理は、全体の結果を変化させることや、本発明の真の範囲を逸脱することなく、異なる論理ブロック（例えば、プログラム、モジュール、関数、またはサブルーチン）に分割し得る。多くの場合、論理要素を、全体の結果を変化させることや、本発明の真の範囲を逸脱することなく、追加するか、改変するか、除外するか、異なる順番で実施するか、または異なる論理構成物（例えば、論理ゲート、ルーピングプリミティブ、条件付き論理、および他の論理構成物）を用いて実行し得る。
【０１５０】
本発明の種々の実施形態は、プロセッサと共に使用するためのコンピュータプログラム論理（例えば、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、デジタル・シグナル・プロセッサ、または汎用コンピュータ、そのことについては、いずれの市販のプロセッサが、単一のプロセッサ、システムにおけるプロセッサの連続したまたは平行なセットのいずれかとして本発明の実施形態を実行するのに使用され得る。市販のプロセッサの例としては、Ｍｅｒｃｅｄ（商標）、Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）、Ｐｅｎｔｉｕｍ  ＩＩ（商標）、Ｘｅｏｎ（商標）、Ｃｅｌｅｒｏｎ（商標）、Ｐｅｎｔｉｕｍ  Ｐｒｏ（商標）、Ｅｆｆｉｃｅｏｎ（商標）、Ａｔｈｌｏｎ（商標）、ＡＭＤ（商標）などが挙げられるが、これらに限定されない）、プログラム可能論理回路と共に使用するためのプログラム可能論理（例えば、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（Ｆｉｅｌｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｇａｔｅ  Ａｒｒａｙ）（ＦＰＧＡ）または他のＰＬＤ）、個別成分、集積回路工学（例えば、特定用途向け集積回路（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ）（ＡＳＩＣ））、またはそれらのいずれの組み合わせも含むいずれの他の手段も含む、多くの異なる形態で具体化され得る。本発明の典型的な実施形態では、優位に、コンピュータ実行形式に変換され、それ自体コンピュータが読み込み可能な媒体に保存され、オペレーティングシステムの制御下でマイクロプロセッサによって実行される一連のコンピュータプログラムの指示として、使用者とサーバーとのすべての通信が実行される。
【０１５１】
本明細書に記載されている機能性のすべてまたは一部を実行するコンピュータプログラム論理は、ソースコード形態、コンピュータ実行形式、および様々な中間体形態（例えば、アセンブラ、コンパイラ、リンカー、またはロケーターによって生成した形態）を含む、様々な形態で具体化し得る。ソースコードは、様々なプログラミング言語（例えば、オブジェクトコード、アセンブリ言語、またはＦｏｒｔｒａｎ、Ｃ、Ｃ＋＋、ＪＡＶＡ（登録商標）、またはＨＴＭＬなどの高級言語。また、本発明の実施形態を実行するのに使用され得る何百もの利用可能なコンピュータ言語があり、その中でもより一般的なものはＡｄａ；Ａｌｇｏｌ；ＡＰＬ；ａｗｋ；Ｂａｓｉｃ；Ｃ；Ｃ＋＋；Ｃｏｎｏｌ；Ｄｅｌｐｈｉ；Ｅｉｆｆｅｌ；Ｅｕｐｈｏｒｉａ；第４の；Ｆｏｒｔｒａｎ；ＨＴＭＬ；Ｉｃｏｎ；Ｊａｖａ；Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ（登録商標）；Ｌｉｓｐ；Ｌｏｇｏ；Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ；ＭａｔＬａｂ；Ｍｉｒａｎｄａ；Ｍｏｄｕｌａ−２；Ｏｂｅｒｏｎ；Ｐａｓｃａｌ；Ｐｅｒｌ；ＰＬ／Ｉ；Ｐｒｏｌｏｇ；Ｐｙｔｈｏｎ；Ｒｅｘｘ；ＳＡＳ；Ｓｃｈｅｍｅ；ｓｅｄ；Ｓｉｍｕｌａ；Ｓｍａｌｌｔａｌｋ；Ｓｎｏｂｏｌ；ＳＱＬ；Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ；Ｖｉｓｕａｌ  Ｃ＋＋；Ｌｉｎｕｘ（登録商標）およびＸＭＬである）のいずれにおいても実行される一連のコンピュータプログラム指示を、様々なオペレーティングシステムまたは動作環境での使用のために含み得る。ソースコードは、種々のデータ構造および通信メッセージを定め得、使用し得る。ソースコードは、コンピュータ実行形式（例えばインタープリターを介して）であり得、またはソースコードは、コンピュータ実行形式に変換され得る（例えば、変換装置、アセンブラ、またはコンパイラを介して）。
【０１５２】
コンピュータプログラムは、いずれの形態でも（例えば、ソースコードの形態、コンピュータ実行形式、または中間体形態）、半導体メモリデバイス（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、またはフラッシュプログラム可能なＲＡＭ）、磁気メモリデバイス（例えば、ディスケットまたは固定ディスク）、光学メモリデバイス（例えば、ＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭ）、ＰＣカード（例えば、ＰＣＭＣＩＡカード）、または他のメモリデバイスなどの接触型記憶媒体にて、永久にまたは一時的に固定し得る。コンピュータプログラムは、様々な通信技術（アナログ技術、デジタル技術、光学技術、無線技術（例えばブルートゥース（登録商標））、ネットワーク形成技術、およびインターネットワーキング技術を含むが、これらに限定されない）のいずれかを用いてコンピュータに伝達できる信号でいずれの形態でも固定し得る。コンピュータプログラムは、コンピュータシステムで予めロードされるか（例えば、システムＲＯＭまたは固定したディスク上で）、または通信システム（例えば、インターネットまたはワールド・ワイド・ウェブ）を通して、サーバーまたは電子掲示板から配布される、印刷文書化または電子文書化（例えば、市販ソフトウェア）を伴う着脱式記憶媒体としてのいずれの形態でも配布され得る。
【０１５３】
本明細書に記載する機能性のすべてのまたは一部を実行するハードウェア論理（プログラム可能論理回路と共に使用するためのプログラム可能論理を含む）は、従来の手動の方法を用いて設計し得るか、あるいはコンピュータ支援設計（ＣＡＤ）、ハードウェア記述言語（例えば、ＶＨＤＬまたはＡＨＤＬ）、またはＰＬＤプログラミング言語（例えば、ＰＡＬＡＳＭ、ＡＢＥＬ、またはＣＵＰＬ）などの種々のツールを用いて、設計するか、捕捉するか、シミュレーションするか、または電子工学的に記述し得る。また、ハードウェア論理は、本発明の実施形態を実施するための表示画面に組み込まれ得、表示画面は、アナログ表示画面、デジタル表示画面、ＣＲＴ、ＬＥＤスクリーン、プラズマスクリーン、液晶ダイオードスクリーンなどに区分し得る。
【０１５４】
プログラム可能論理は、半導体メモリデバイス（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、またはフラッシュプログラム可能なＲＡＭ）、磁気メモリデバイス（例えば、ディスケットまたは固定ディスク）、光学メモリデバイス（例えば、ＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭ）、または他のメモリデバイスなどの接触型記憶媒体にて、永久にまたは一時的に固定し得る。プログラム可能論理は、様々な通信技術（アナログ技術、デジタル技術、光学技術、無線技術（例えばブルートゥース（登録商標））、ネットワーク形成技術、およびインターネットワーキング技術を含むが、これらに限定されない）のいずれかを用いてコンピュータに伝達できる信号でいずれの形態でも固定し得る。プログラム可能論理は、コンピュータシステムで予めロードされるか（例えば、システムＲＯＭまたは固定したディスク上で）、または通信システム（例えば、インターネットまたはワールド・ワイド・ウェブ）を通して、サーバーまたは電子掲示板から配布される、印刷文書化または電子文書化（例えば、市販ソフトウェア）を伴う着脱式記憶媒体としてのいずれの形態でも配布され得る。
【０１５５】
本明細書で使用される場合の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ／ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、述べられた特徴、整数、ステップまたは成分の存在を特定するとみなされ、を防止する１つ以上他の特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群の存在または追加を除外するものではない。したがって、文脈上明白に他の意味に解釈すべき場合を除いて、明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびそれと同種のものは、排他的もしくは徹底的な意味とは対照的に包含的な意味で、すなわち「含むが、限定されない」という意味で解釈すべきである。
【図１】
2018500539.tif 000015
【図２】
2018500539.tif 000016
【図３】
2018500539.tif 000017
【図４ａ】
2018500539.tif 000018
【図４ｂ】
2018500539.tif 000019
【図４ｃ】
2018500539.tif 000020
【図５ａ】
2018500539.tif 000021
【図５ｂ】
2018500539.tif 000022
【図５ｃ】
2018500539.tif 000023
【図６ａ】
2018500539.tif 000024
【図６ｂ】
2018500539.tif 000025
【図６ｃ】
2018500539.tif 000026
【図７ａ】
2018500539.tif 000027
【図７ｂ】
2018500539.tif 000028
【図７ｃ】
2018500539.tif 000029
【図８ａ】
2018500539.tif 000030
【図８ｂ】
2018500539.tif 000031
【図８ｃ】
2018500539.tif 000032
【図９ａ】
2018500539.tif 000033
【図９ｂ】
2018500539.tif 000034
【図９ｃ】
2018500539.tif 000035
【図１０ａ】
2018500539.tif 000036
【図１０ｂ】
2018500539.tif 000037
【図１１ａ】
2018500539.tif 000038
【図１１ｂ】
2018500539.tif 000039
【図１２】
2018500539.tif 000040
【図１３ａ】
2018500539.tif 000041
【図１３ｂ】
2018500539.tif 000042
【図１４ａ】
2018500539.tif 000043
【図１４ｂ】
2018500539.tif 000044
【図１４ｃ】
2018500539.tif 000045
【図１５ａ】
2018500539.tif 000046
【図１５ｂ】
2018500539.tif 000047
【図１６ａ】
2018500539.tif 000048
【図１６ｂ】
2018500539.tif 000049
【図１７】
2018500539.tif 000050
【図１８】
2018500539.tif 000051
【図１９】
2018500539.tif 000052
【図２０】
2018500539.tif 000053
【図２１】
2018500539.tif 000054
【図２２】
2018500539.tif 000055
【図２３】
2018500539.tif 000056
【図２４】
2018500539.tif 000057
【図２５】
2018500539.tif 000058
【図２６】
2018500539.tif 000059
【図２７】
2018500539.tif 000060
【図２８】
2018500539.tif 000061
【図２９ａ】
2018500539.tif 000062
【図２９ｂ】
2018500539.tif 000063
【図３０】
2018500539.tif 000064
【図３１ａ】
2018500539.tif 000065
【図３１ｂ】
2018500539.tif 000066
【図３１ｃ】
2018500539.tif 000067
【図３１ｄ】
2018500539.tif 000068
【図３２】
2018500539.tif 000069
【図３３】
2018500539.tif 000070
【図３４】
2018500539.tif 000071
【図３５】
2018500539.tif 000072
【図３６】
2018500539.tif 000073
【図３７】
2018500539.tif 000074
【図３８】
2018500539.tif 000075
【図３９】
2018500539.tif 000076
【図４０】
2018500539.tif 000077
【図４１】
2018500539.tif 000078
【図４２】
2018500539.tif 000079
【国際調査報告】
2018500539.tif 000080
2018500539.tif 000081
2018500539.tif 000082