(57)【要約】  本発明は、細胞内のグルタチオンプールを増加させるためのスルホシステインおよびその誘導体の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のグルタチオンのレベルを増加させるための方法であって、前記細胞に細胞内グルタチオンレベルを増加させるのに有効な量のＳ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を添加することを含む前記方法。
【請求項２】
方法が、前記細胞を液体細胞培養培地中で培養すること、および培養過程の１以上の時点で細胞培養培地に培養中の細胞の細胞内グルタチオンレベルを増加させるのに有効な量のＳ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を添加することによって実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸ナトリウム塩を添加することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞培養培地が、６．８〜７．５のｐＨを有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｓ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩が、細胞培養におけるそれらの濃度が０．４〜５０ｍＭとなる量で添加されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、少なくとも１つ以上の糖成分、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１つ以上の塩、１つ以上の緩衝成分、１つ以上の補因子、ならびに１つ以上の核酸成分を含む細胞培養培地中で培養されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ａ）バイオリアクターを提供すること
ｂ）培養すべき細胞をＳ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を含む細胞培養培地と混合すること
ｃ）工程ｂ）の混合物をインキュベートすること
によって実施されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
−細胞および液体細胞培養培地をバイオリアクターに充填すること
−バイオリアクター内で細胞をインキュベートすること
−バイオリアクター内での細胞のインキュベーションの全時間にわたり連続的に、または前記インキュベーション時間内に１回または数回、バイオリアクターにフィード培地を添加すること
ここでフィード培地が、Ｓ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を含む、
によって実施されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
フィード培地が、１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度のＳ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グルタチオンのレベルが、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を添加しない細胞培養物と比較して、細胞培養時間の半分以上の間、２５％より高いことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
グルタチオンの細胞内の量を増加させるための、Ｓ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内のグルタチオンプールを増加させるためのスルホシステインおよびその誘導体の使用に関する。
【０００２】
アミノ酸Ｌ−グリシン、Ｌ−システイン、およびＬ−グルタミン酸（Ｌ−グルタマートとしても知られる）からなるトリペプチド分子であるグルタチオンは、哺乳動物の主要な細胞内抗酸化物質の１つである。グルタチオンは還元型（ＧＳＨ）および酸化型（ＧＳＳＧ）の状態で存在し、還元型（ＧＳＨ）が優勢である。ＧＳＳＧ対ＧＳＨ比の増加は、酸化的ストレスの指標とみなされている。
【０００３】
グルタチオンはほとんどの細胞で生産されるが、多くの疾患および他の病理は、細胞内グルタチオンのレベルの低下と関連する。グルタチオンは厳密に制御された細胞内成分であり、ガンマ−グルタミルシステインシンテターゼなる酵素による自身の合成のネガティブフィードバック阻害によってその生産が制限され、過剰量の可能性を大幅に最小限化している。グルタチオン合成の前駆体を用いたグルタチオンの増強は、グルタチオン欠乏症、高酸化ストレス、免疫欠損、および生体内の過負荷状態に対処するために開発された戦略であり、グルタチオンは問題の生体異物の解毒に関与する。
【０００４】
ヒトのグルタチオン欠乏状態は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、化学および感染性肝炎、筋萎縮性脳脊髄炎、慢性疲労症候群、前立腺および他のがん、白内障、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性閉塞性肺疾患、喘息、放射線中毒、栄養不足状態、困難な身体的ストレスおよび老化が含まれ、最適ではない免疫応答と関連しているが、これらに限定されない。多くの臨床病理は酸化的ストレスと関連しており、多くの医学文献で詳しく述べられている。
【０００５】
さらに、グルタチオン系の欠損は、有意な細胞老化および最終的には細胞疾病をもたらすことが一般的に認識されている。細胞性グルタチオンの濃度は、抗酸化機能に重要な影響を及ぼす。栄養素の制限、運動および酸化的ストレスは、細胞のグルタチオン濃度に重大な影響を及ぼす。
【０００６】
グルタチオンは、ＡＴＰ、マグネシウムならびに３つのアミノ酸であるグリシン、グルタミン酸およびシステインを利用する一連の生化学的反応で合成される。一般に、γ−グルタミルシステインの合成速度はグルタチオンの合成速度を決定し、システインのスルフヒドリル基はグルタチオンにその生物学的効力を提供する。したがって、システインの利用可能性はグルタチオンおよびその抗酸化機能の利用可能性にとって不可欠である。
【０００７】
グルタチオンの利用可能性は、治療用途および美容用途に関連するだけでなく、細胞培養用途にも関連し得る。培養細胞における総ＧＳＨプールの増加は、細胞内コンパートメントにおける酸化反応性の低下をもたらし、したがって、培養期間の延長およびしばしば力価の上昇につながる。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、細胞のＧＳＨ含有量を増加させる方法を見出すことであった。主に治療領域におけるこのためのいくつかのアプローチは、当該技術分野で知られている。
ＵＳ２０１４／０１００２８３は、ＧＳＨ誘導体Ｓ−アセチル−グルタチオンの使用を開示する。
ＵＳ２０１１／００７７３０３は、グリシンおよびＮ−アセチル−システインを提供することを開示している。
ＵＳ２０１３／０３３８１６５は、特定のシステイン／システインプロドラッグまたはＮ−アセチル−システインプロドラッグの使用を示唆している。
【０００９】
細胞培養用途では、グルタチオン前駆体は、特定のトランスポーターシステムが必要であるため、しばしば細胞によって取り込まれないので、かかるアプローチは、実行可能性が限られている。細胞培養のためには、より効果的かつ普遍的なアプローチが有益であろう。
【００１０】
Ｓ−スルホシステインおよびその塩は、哺乳動物細胞のＧＳＨ含有量を増加させることが見出されている。さらに、細胞にシステインまたはＳ−スルホシステインのいずれかの同等量が提供される場合、Ｓ−スルホシステインを受容した細胞は、システインを需要した細胞と比較してより高いＧＳＨ量を示すことが見出された。
【００１１】
したがって、本発明は、細胞内グルタチオンレベルを増加させるのに有効な量のＳ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を前記細胞に添加することを含む、細胞内グルタチオンレベルを増加させる方法に関する。
【００１２】
好ましい態様において、該方法は、細胞を液体細胞培養培地中で培養すること、および培養過程の１以上の時点で細胞培養培地に培養中の細胞の細胞内グルタチオンレベルを増加させるのに有効な量のＳ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を添加することによって実施される。
【００１３】
好ましい態様において、（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸ナトリウム塩が添加される。
別の好ましい態様において、細胞培養培地は、６．８〜７．５のｐＨを有する。
別の好ましい態様において、Ｓ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩は、細胞培養液中の濃度が０．４〜５０ｍＭになるような量で添加される。
【００１４】
ある態様において、細胞は、少なくとも１つ以上の糖成分、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１つ以上の塩、１つ以上の緩衝成分、１つ以上の緩衝成分、１つ以上の補因子、ならびに１つ以上の核酸成分を含む細胞培養培地中で培養される。
【００１５】
ある態様において、本発明の方法は、
ａ）バイオリアクターを提供すること
ｂ）培養すべき細胞をＳ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を含む細胞培養培地で混合すること
ｃ）工程ｂ）の混合物をインキュベートすること
によって実施される。
【００１６】
別の好ましい態様において、本発明の方法は、
−細胞および液体細胞培養培地をバイオリアクターに充填すること
−バイオリアクター内で細胞をインキュベートすること
−バイオリアクター内での細胞のインキュベーションの全時間にわたり連続的に、または前記インキュベーション時間内に１回または数回、バイオリアクターにフィード培地を添加すること、
ここでフィード培地が、Ｓ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を含む、によって実施される。
【００１７】
好ましくは、フィード培地は１〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度のＳ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を含む。
本発明はさらに、グルタチオンの細胞内の量を増加させるためのＳ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、システインまたはＳ−スルホシステインのいずれかを用いたバイオリアクターフェドバッチ実験で培養されたＣＨＯ細胞で達成されたＩｇＧ濃度の比較を示す。さらなる詳細は、例で見出すことができる。
【図２】図２は、システインまたはＳ−スルホシステインのいずれかを用いたバイオリアクターフェドバッチ実験で培養されたＣＨＯ細胞の細胞内反応種の比較を示す。さらなる詳細は、例で見出すことができる。
【図３】図３は、システインまたはＳ−スルホシステインのいずれかを用いたバイオリアクターフェドバッチ実験で培養されたＣＨＯ細胞のグルタチオンレベルの比較を示す。さらなる詳細は、例で見出すことができる。
【００１９】
（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸とも呼ばれるＳ−スルホシステインは、例えば、硫酸およびシステインの縮合によって得られる。適切な塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩またはそれらの混合物である。ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
【００２０】
Ｓ−スルホシステインおよびその塩はまた、以下の式ＩおよびＩＩによって示し得る：
【化１】
2018520692.tif 000002
ここで、Ｒは
【化２】
2018520692.tif 000003
であり、ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、好ましくはＨ、Ｎａ、Ｋである。プロパン酸という用語はまた、プロピオン酸という用語の代わりに使用することもできる。
【００２１】
（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニル−プロパン酸、Ｓ−スルホ−システインまたはシステイン−Ｓ−スルファートとも呼ばれる２−アミノ−３−スルホスルファニル−プロピオン酸およびその塩の合成は、例えばI.H.Segel and M.J.Johnson, Analytical Biochemistry 5 (1963), 330-337 and J.S. Church, D.J. Evans, Spectrochimica Acta Part A 69 (2008) 256-262に開示されている。ナトリウム塩はさらに、Bachem, Switzerlandから市販されている。
【００２２】
細胞培養培地は、細胞のin vitro増殖を維持および／または支持する成分の任意の混合物である。それは、天然培地または化学的に規定された培地であってもよい。細胞培養培地は、細胞のin vitro増殖を維持および／または支持するのに必要なすべての成分、またはさらなる成分が別々に添加されるようにいくつかの成分のみを含むことができる。細胞培養培地の例は、細胞のin vitro増殖を維持および／または支持するために必要なすべての成分を含む完全培地ならびに培地補充物またはフィードである。基本培地とも呼ばれる完全培地は、典型的には６．８〜７．８のｐＨを有する。フィード培地は、好ましくは８．５未満のｐＨを有する。
【００２３】
典型的には、本発明による細胞培養培地は、バイオリアクターにおける細胞の増殖を維持および／または支持するために、ならびに前記細胞のＩｇＧ生産を支持するために使用される。
いくつかの細胞培養培地は、滅菌水性液体として提供される。液体細胞培養培地の欠点は、貯蔵寿命が短縮され、輸送および貯蔵が困難であることである。結果として、多くの細胞培養培地は、現在、微粉砕された乾燥粉末混合物として提供されている。それらは、水および／または水溶液中に溶解する目的で製造され、溶解状態で設計され、前記細胞からのバイオ医薬品の増殖および／または生産のための実質的な栄養素を細胞に供給するための他の添加物をしばしば含む。
【００２４】
大部分のバイオ医薬品生産プラットフォームは、フェドバッチ細胞培養プロトコールに基づいている。その目的は、典型的に、増加する市場の需要に応じかつ製造コストを低減するために、高力価の細胞培養プロセスを開発することである。高性能な組換え細胞系の使用に加えて、細胞培養培地およびプロセスパラメータの改善は、最大の生産能力を実現するために必要とされる。
【００２５】
フェドバッチプロセスでは、基本培地が初期増殖および生産を支持し、フィード培地が栄養素の枯渇を防ぎ、生産段階を維持する。培地は、異なる生産段階の間に異なる代謝要求に対応するように選択される。供給戦略および制御パラメータを含むプロセスパラメータ設定は、細胞増殖およびタンパク質生産に適した化学的および物理的環境を規定する。
【００２６】
フィードまたはフィード培地は、細胞培養において最初の増殖および生産を支持する基本培地ではなく、栄養素の枯渇を防止するために後の段階で添加され、生産段階を維持する培地である細胞培養培地である。フィード培地は、基本培養培地と比較してより高い濃度のいくつかの成分を有し得る。例えば、アミノ酸または炭水化物を含む栄養素などのいくつかの成分は、基本培地中の約５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１２×、１４×、１６×、２０×、３０×、５０×、１００×、２００×、４００×、６００×、８００×の濃度で、または約１０００×の濃度でさえフィード培地中に存在してよい。
【００２７】
哺乳動物細胞培養培地は、哺乳動物細胞のin vitro増殖を維持および／または支持する成分の混合物である。哺乳動物細胞の例は、ヒトまたは動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＩＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＡＫ−１細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｌ５．１細胞、ハイブリドーマ細胞またはヒト細胞である。
【００２８】
化学的に規定された細胞培養培地は、化学的に規定されていない物質を含まない細胞培養培地である。これは、培地中で使用される全ての化学物質の化学組成が既知であること意味する。化学的に規定された培地は、酵母、動物または植物の組織を含まない。それらは、フィーダー細胞、血清、抽出物もしくは消化物または化学的に明確に規定されていないタンパク質を培地に提供し得る他の成分を含まない。化学的に規定されていないか、または明確に規定されていない化学成分は、その化学組成および構造が知られていない化学成分であり、様々な組成で存在するか、またはアルブミンまたはカゼインのようなタンパク質の化学組成および構造の評価に匹敵する莫大な実験努力でのみ規定され得る。
【００２９】
粉末細胞培養培地または乾燥粉末培地は、典型的には粉砕プロセスまたは凍結乾燥プロセスから生じる細胞培養培地である。つまり、粉末化された細胞培養培地は、液体培地ではなく粒状の微粒子培地である。用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と互換的に使用してよい。しかしながら、本明細書で使用される「乾燥粉末」は、単に、粒状化された材料の大まかな外観を指し、特に指示がない限り、材料が複合化または凝集化した溶媒を完全に含まないことを意味するものではない。粉末化された細胞培養培地はまた、粒状化された細胞培養培地であってもよく、例えばローラー圧縮によって粒状化される。
【００３０】
粉末細胞培養培地は、好ましくは、全ての成分を混合し、それらを粉砕することによって製造される。成分の混合は、粉砕によって乾燥粉末細胞培養培地を製造する当業者に公知である。好ましくは、混合物の全ての部分がほぼ同じ組成を有するように、全ての成分を完全に混合する。組成物の均一性が高いほど、均質な細胞増殖に関して得られる培地の品質が良好である。
【００３１】
微粉砕は、粉状の細胞培養培地を製造するのに適した任意のタイプのミルで行うことができる。典型的な例は、ボールミル、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルである。ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルが好ましく、ピンミルが非常に好ましい。
当業者は、このようなミルを動かす方法を知っている。
【００３２】
粉砕された粉末培地の使用のために、溶媒、好ましくは水（最も好ましくは蒸留および/または脱イオン水または精製水または注射用水）または水性緩衝液を培地に添加し、培地が溶媒に完全に溶解するまで成分を混合する。
溶媒はまた生理食塩水、適切なｐＨ範囲（典型的にはｐＨ１．０〜ｐＨ１０．０の範囲）を提供する可溶性の酸または塩基イオン、安定剤、界面活性剤、保存剤およびアルコールまたは他の極性有機溶媒を含んでよい。
【００３３】
細胞培養培地と溶媒との混合物に、ｐＨの調整のための緩衝物質、ウシ胎児血清、糖等のような物質をさらに添加することもまた可能である。次いで、得られた液体細胞培養培地を、増殖または維持される細胞と接触させる。
【００３４】
本発明の方法で治療される細胞は、正常細胞、不死化細胞、罹患細胞、形質転換細胞、変異細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞であってもよく、または形質転換された細胞系であるか、または天然源から確立される。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞、より好ましくはＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＥＫまたはＣＨＯ細胞であり、最も好ましくはＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−（ＤＧ４４およびＤｕｘｂ１１）、ＣＨＯ−ＭおよびＣＨＯＫ１細胞である。
【００３５】
細胞培養培地、特に完全培地は、典型的には、少なくとも１つ以上の糖成分、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１つ以上の塩、１つ以上の緩衝成分、１つ以上の補因子、ならびに１つ以上の核酸成分を含む。
【００３６】
培地は、ピルビン酸ナトリウム、インスリン、植物性タンパク質、脂肪酸および／または脂肪酸誘導体および／またはプルロニック酸および／または化学的に調製された非イオン性界面活性剤のような表面活性成分も含み得る。好適な非イオン性界面活性剤の一例は、ポロキサマーとも呼ばれる第一級ヒドロキシル基で終結する二官能性ブロックコポリマー界面活性剤であり、例えばBASF, Germanyから商標名pluronic（登録商標）で入手可能である。
【００３７】
糖成分は、グルコース、ガラクトース、リボースもしくはフルクトース（単糖類の例）またはスクロース、ラクトースもしくはマルトース（二糖類の例）のようなすべての単糖類または二糖類である。
本発明によるアミノ酸の例はチロシン、タンパク質原性アミノ酸、特に必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリン、ならびにＤ−アミノ酸のような非タンパク原性アミノ酸である。
【００３８】
チロシンは、Ｌ−またはＤ−チロシン、好ましくはＬ−チロシンを意味する。システインは、Ｌ−またはＤ−システイン、好ましくはＬ−システインを意味する。
ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、様々なレチノイド、および４つのカロチノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）、およびビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆物質もまた含まれる。
【００３９】
塩の例は、重炭酸塩、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン酸、カリウムおよびナトリウムなどの無機イオン、またはＣｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、ＶおよびＺｎなどの希少金属を含む。例は、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、一塩基性リン酸ナトリウム無水物（ＮａＨ２ＰＯ４）、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、二塩基性リン酸ナトリウム無水物（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物である。
【００４０】
緩衝液の例は、ＣＯ２／ＨＣＯ３（炭酸塩）、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳおよびＴＲＩＳである。
補因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、フラビンモノヌクレオチドおよび誘導体、グルタチオン、ヘムヌクレオチドリン酸および誘導体である。
【００４１】
本発明による核酸成分は、シトシン、グアニン、アデニン、チミンまたはウラシルのような核酸塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシンおよびチミジンのようなヌクレオシド、ならびにアデノシン一リン酸またはアデノシン二リン酸またはアデノシン三リン酸のようなヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
フィード培地は、完全培地と比較して異なる組成を有してよい。それらは、典型的には、アミノ酸、微量元素およびビタミンを含む。それらはまた、糖成分を含んでもよいが、製造上の理由から、糖成分が別個のフィードに添加されることがある。
【００４３】
適切なフィード培地は、例えば、以下の化合物の1つ以上を含むことができる：
Ｌ−アスパラギン一水和物
Ｌ−イソロイシン
Ｌ−フェニルアラニン
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物
Ｌ−ロイシン
Ｌ−スレオニン
Ｌ−リジン一塩酸塩
Ｌ−プロリン
Ｌ−セリン
Ｌ−アルギニン一塩酸塩
Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物
Ｌ−メチオニン
Ｌ−バリン
Ｌ−アスパラギン酸一ナトリウム一水和物
Ｌ−トリプトファン
塩化コリン
ミオ−イノシトール
ニコチンアミド
パントテン酸カルシウム
ピリドキシン塩酸塩
塩化スズ塩酸塩
微細化ビタミンＢ１２（シアノコッバラミン）
ビオチン
葉酸
リボフラビン
無水硫酸マグネシウム
硫酸銅（ＩＩ）六水和物
硫酸亜鉛七水和物
１，４−ジアミノブタン二塩酸塩
ヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物
硫化カドミウム水和物
塩化マンガン（ＩＩ）四水和物
塩化ニッケル（ＩＩ）六水和物
ケイ酸ナトリウム
メタバナジン酸ナトリウム
塩化第二スズ（ＩＩ）
亜セレン酸ナトリウム（約４５％ＳＥ）
リン酸二水素ナトリウム一水和物
硝酸アンモニア（ＩＩＩ）塩（約１８％ＦＥ）
【００４４】
本発明の要点は、細胞中の総グルタチオンプールを増加させることである。Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を添加することによって細胞内のグルタチオンの量を増加させることにより、以下の肯定的な効果の１つ以上が典型的に達成されることが見出されている：
−より長い培養時間
−より高い力価（生産されたＩｇＧの濃度）
−より高い比生産性
−より低い細胞内酸化電位
高い力価、高い生産性、およびより長い培養時間もすべて細胞培養効率を増加させるので、これらの効果は細胞培養に非常に有益である。
【００４５】
本発明によるＳ−スルホシステインおよび／またはその塩で処理される細胞は、典型的には、バイオ医薬品の生産目的のためにバイオリアクターで培養される細胞である。適切な細胞培養プロセスの例は、フェドバッチプロセスまたは灌流細胞培養プロセスである。
Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、細胞培養の任意の段階で細胞に添加することができる。
それは細胞培養を開始するときに添加することができる。この場合、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、好ましくは、細胞培養を開始するために使用される基本培地の他の成分と混合され、粉砕される。次いで、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むこの乾燥粉末混合物を、粉末が溶解するように粉末および溶媒を混合することによって適切な溶媒に溶解し、所望の均質な濃度の培地成分を含む液体細胞培養培地を生産する。
【００４６】
Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、細胞の培養中に１回または複数回添加することもできる。細胞培養は、典型的には１〜３週間行われる。この時間の間、フィード培地は連続的にまたは１回以上添加される。Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、他のフィード培地成分と一緒にフィード培地中に添加することができ、またはＳ−スルホシステインおよび／またはその塩のみを含む別個のフィード中に加えることができる。また、フィードは、典型的には液体であり、フィードの全ての成分が細胞培養物に添加される前に適切な溶媒に溶解される。
【００４７】
好ましい態様において、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩がフィードとして添加される。好ましくは、細胞培養中に少なくとも４回、好ましくは４〜６回添加される。一態様において、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、２日および４日おきに添加される。
Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むフィードのｐＨは、好ましくは６．８〜７．５、最も好ましくは６．８〜７．１である。
【００４８】
Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩が、０．４〜５０ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭの濃度で細胞培養物中に存在する場合、グルタチオンのレベルが最も効果的に増加し得ることが見出されている。典型的には、培養プロセス全体の間に細胞培養物に添加されるフィードの容量は、バイオリアクターに既に存在する細胞培養培地の容量の約３０％である。フィード中のＳ−スルホシステインおよび／またはその塩の濃度は、好ましくは１〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／ｌである。
【００４９】
典型的には、細胞培養は、
ａ）バイオリアクターを提供すること
ｂ）培養されるべき細胞を、バイオリアクター中の液体細胞培養培地と混合すること
ｃ）工程ｂ）の混合物をある時間インキュベートすること
によって実施される。
バイオリアクターは、細胞を培養することができる任意の容器、バッグ、ベッセルまたはタンクである。細胞培養を行うことは、当業者に公知である。これは、典型的には、ｐＨ、浸透圧、温度、撹拌、通気（酸素／ＣＯ２）などの適切な条件下でバイオリアクター中の細胞をインキュベートし、細胞培養中にフィード培地を１回または数回任意に添加することによって行われる。好ましくは、細胞培養はフェドバッチ細胞培養として実施される。
【００５０】
フェドバッチ培養は、細胞の培養中に1つ以上の栄養素（基質）がバイオリアクターに供給（補充）され、生成物（単数または複数）が実行の最後までバイオリアクターに残る細胞培養プロセスである。この方法の別の記載は、基本培地が最初の細胞培養を支持し、栄養素枯渇を防ぐためにフィード培地が添加されるというものである。フェドバッチ培養の利点は、培養液中の供給基質の濃度を任意に所望のレベルに制御できることである。
【００５１】
一般に、フェドバッチ培養は、栄養素（または栄養素）の濃度を制御する場合、所望の代謝産物（この場合、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩のような）の収率または生産性に影響を及ぼす場合、従来のバッチ培養より優れている。
その結果、本発明は好ましくは、
−細胞および液体細胞培養培地をバイオリアクターに充填すること
−バイオリアクター内で細胞をインキュベートすること
−バイオリアクター内での細胞のインキュベーションの全時間にわたり連続的に、または前記インキュベーション時間内に１回または数回、バイオリアクターにフィード培地を添加することによって実施され、
ここでフィード培地は、好ましくは６．８〜７．５のｐＨを有し、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含む。
【００５２】
別の態様において、細胞培養は灌流培養によって実施される。灌流培養は、細胞を、例えば濾過、カプセル化、マイクロキャリアへの固定などによって培養物中に保持する培養であり、培養培地はバイオリアクターから連続的または断続的に導入および除去される。この場合、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、好ましくは培養培地の一部として導入される。
【００５３】
灌流培養において、細胞培養の過程で、細胞（バイオマス）が細胞培養物（細胞懸濁物）から分離され、一方で使用済み培地がプロセスから回収され、他方で新しい栄養素は、新鮮な培地を介して細胞に利用可能となる。細胞がプロセス中に培養系に保持される場合、これは「灌流」と呼ばれる。プロセスの間に細胞が使用済み培地とともに系から除去される場合、これは「連続法」と呼ばれる。灌流プロセスでは、最大の細胞濃度を維持することができるように、細胞を一定の時間間隔で培養系から除去することもまたできる。
【００５４】
当業者には、この操作は「ブリーディング（bleeding）」として知られている。細胞分離は、間接的に細胞分離の促進を伴ういくつかの技術を含む様々な技術を用いて行われる。細胞分離のいくつかの可能な方法の例は、濾過、細胞カプセル化、マイクロキャリアへの細胞付着、細胞沈降または遠心分離である。
本発明の方法では、細胞内グルタチオンレベルを効果的に増加させることができることが見出されている。典型的には、そのレベルは細胞培養の少なくとも一部の時間の２倍超にすることができる。好ましくは、グルタチオンのレベルは、同等の条件下でＳ−スルホシステインおよび／またはその塩を添加しない細胞培養と比較して、細胞培養時間の半分超の間に少なくとも１０％、好ましくは２５％超増加することが好ましい。
【００５５】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに例示されるが、これらに限定されるものではない。
上記および下記に引用された全ての出願、特許および公報並びに２０１５年７月３０日に出願された対応するＥＰ１５１７９０６５．６号の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
例
以下の例は、本発明の実際的な用途を表す。
１．２ＬガラスバイオリアクターにおいてＣＨＯ懸濁細胞株を使用したCellvento（登録商標）ＣＨＯ  ２２０培地およびｆｅｅｄ２２０におけるバイオリアクターフェドバッチ実験
【００５７】
１５ｍＭのＳ−スルホ−Ｌ−システイン（ＳＳ）を中性ｐＨの主となるＦｅｅｄ−２２０（ｎ＝５）に組み込んだ。フィードを３日目に３％（ｖ／ｖ）および５、７、９および１４日目に６％（ｖ／ｖ）の比率で添加した。コントロールの条件において、ＳＳを含まないフィードを同じ比率で添加し、一方で１５０ｍＭのＬ−システインをアルカリ性のフィードに別々に添加し、３日目に０．３％（ｖ／ｖ）および５、７、９、１４日目に６％（ｖ／ｖ）添加した（ｎ＝２）。ｐＨを６．９５±０．１５に制御した。溶存酸素濃度は、オープンパイプスパージャーを介して純酸素および空気を散布することによって５０％空気飽和度に制御した。温度を３７℃に設定し、培養の５日目に３７℃から３３℃にシフトさせた。撹拌は１４０ｒｐｍで維持した。上清中のＩｇＧ濃度を、濁度測定法を用いるCedex BioHTを用いて測定した。結果を図１に示す。力価（ＩｇＧ濃度）は、標準と比較してＳＳで高いことがわかる。
【００５８】
コントロールプロセスに対するＳ−スルホシステインを用いたフェドバッチにおけるＣＨＯ細胞中の細胞内反応種
６−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート染色（Carboxy H2DCFDA、Life Technologies）を用いて、細胞内反応種を定量した。Perkin Elmer蛍光リーダーを用いて酸化反応による蛍光の増加を測定した。これらの実験のために、コントロール条件と１５ｍＭのＳＳＣ条件とを比較したフェドバッチ実験において測定を行った。サンプルを毎日採取し、直ちに分析した。簡単に説明すると、３×１０５細胞を遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）し、ＰＢＳ（陰性コントロール）に再懸濁するか、または５０μＭカルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを添加し、３７℃および１０００ｒｐｍで２０分間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁し、プレートリーダーを用いて分析した（両方の条件についてｎ＝３）。フィード中でＳ−スルホシステインを使用した場合の蛍光強度が低いことは、細胞における反応性が低く、したがって分子の抗酸化能を示す。結果を図２に示す。
【００５９】
コントロールプロセスに対するＳ−スルホシステインを用いたフェドバッチにおけるＣＨＯ細胞の細胞内総グルタチオン
細胞内総グルタチオンを定量するために、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、さらなる分析のために−２０℃で凍結した。潜在的なＣｙｓ変換酵素の活性を阻害するために１２×１０６個の細胞を、４つのホスファターゼ阻害剤：フッ化ナトリウム、バナジウム酸ナトリウム、β−グリセロリン酸およびピロリン酸ナトリウム含む１００μｌのphosphoSafe試薬（Merck Millipore）に溶解し、２０ｍＭのヨードアセトアミド（活性部位に１つのシステインを含むすべての酵素のアルキル化）を補充した。グルタチオン濃度（ＧＳＨおよびＧＳＳＧ）を、AccQ Tag Ultra（登録商標）試薬キットに基づくプレカラム誘導体化を使用してUPLCによって決定した。誘導体化、クロマトグラフィーおよびデータ分析は、供給業者の推奨（Waters, Milford, MA）にしたがって行った。総グルタチオンを、ＧＳＨおよびＧＳＳＧの添加によって得、ＦＢプロセスの各日のコントロール条件で得られた濃度で正規化した。結果を図３に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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