(57)【要約】  本発明は、細胞老化および皮膚加齢徴候の出現を低減または遅延させるための、生理学的に許容される溶媒中の０．１から１μＭの間の、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２を有する合成ペプチドまたはその塩を活性剤として含む組成物の美容的使用に関する。  本発明は、少なくとも２日の期間にわたる１日あたり少なくとも１回の組成物の局所適用のステップを含む、これらの新規な使用に関連した美容的処置方法にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の菲薄化、たるみ、水分の減少、皮膚弛緩、深いしわおよび細かい線、締まりおよび張りの損失、皮膚の色素性異常を除く皮膚萎縮から選択される細胞老化および皮膚加齢徴候の出現を、低減または遅延させるための、生理学的に許容される溶媒中の０．１から１μＭの間の、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）を有する合成ペプチドまたはその塩を活性剤として含む組成物であって、少なくとも２日の期間、１日あたり少なくとも１回、局所的に適用される組成物の美容的使用。
【請求項２】
前記組成物が、０．５から１μＭの間の前記合成ペプチドを含む、請求項１に記載の美容的使用。
【請求項３】
前記組成物が、１μＭ未満の前記合成ペプチドを含む、請求項１に記載の美容的使用。
【請求項４】
適用が、１日あたり２回行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載の美容的使用。
【請求項５】
適用が、少なくとも６週間にわたって行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載の美容的使用。
【請求項６】
適用が、少なくとも３カ月間にわたって行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載の美容的使用。
【請求項７】
前記合成ペプチドが、プロリダーゼの活性およびコラーゲンの合成を増加させる、請求項１から６のいずれか１項に記載の美容的使用。
【請求項８】
前記皮膚加齢の徴候が、しわである、請求項１から７のいずれか１項に記載の美容的使用。
【請求項９】
前記組成物が、ペプチド、ビタミンＣおよびその誘導体、Ｂ群からのビタミン、ＤＨＥＡ、植物ステロール、サリチル酸およびその誘導体、レチノイド、フラボノイド、アミノ糖、アゾール、金属塩、植物由来のペプチド抽出物、またはポリマーから選択される、本発明に記載の活性剤の作用を強化するための他の少なくとも１種の活性剤をさらに含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の美容的使用。
【請求項１０】
生理学的に許容される溶媒中の０．１から１μＭの間の、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）を有する合成ペプチドを活性剤として含む組成物の、少なくとも２日の期間にわたる１日あたり少なくとも１回の局所適用を含む、細胞老化の出現および皮膚加齢の徴候を低減または遅延させるための美容的処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品および経皮医薬活性剤の分野ならびにそれに関連した美容的処置方法に関する。
【０００２】
本発明は、細胞老化の出現を低減または遅延させるための、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２を有する合成ペプチドを含む組成物の新規な美容的使用に関する。
【０００３】
本発明は、皮膚加齢の徴候の出現、より詳細にはしわの出現を低減または遅延させるための前記ペプチドを含む組成物の新規な美容的使用にも関する。
【０００４】
本発明は、少なくとも２日の期間に１日あたり少なくとも１回の組成物の局所適用のステップを含む、これらの新規な使用に関連した美容的処置方法にも関する。
【背景技術】
【０００５】
皮膚は、いくつかの層（真皮、真皮表皮接合部、表皮）からなる被覆器官である。真皮は、皮膚のための支持組織であり、水、エラスチン線維およびコラーゲン線維からなる。後者は、皮膚線維のうちの約７０％であり、線維芽細胞によって合成される。
【０００６】
コラーゲンの合成、分解およびその再利用は、皮膚の細胞外マトリックスにおけるその発現レベルの維持に必須のステップである。これらのステップのすべて、特に、再利用は、高度に調節される。この後者のステップは、細胞質の酵素であるプロリダーゼによって行われる。プロリダーゼは、Ｃ末端部位にプロリンまたはヒドロキシプロリンを含みかつ主にコラーゲン由来であるイミドジペプチドおよびトリペプチドを分解する酵素である（Ｓｕｒａｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（２００８）３５：７３１−７３８）。したがって、プロリダーゼの作用により、プロリンおよびヒドロキシプロリンの細胞内の貯蔵所は、新しいコラーゲンの合成を可能にするために補充される。実際に、コラーゲンは、２３％のプロリンおよびヒドロキシプロリンからなるタンパク質であり、基礎となる要素、すなわち、プロリンおよびヒドロキシプロリンの入手のしやすさは、コラーゲンの新合成に不可欠である（Ｂａｒｂｕｌ  Ａ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３８：２０２１Ｓ−２０２４Ｓ，２００８）。コラーゲンを合成するために使用されるプロリンの９０％は、プロリダーゼの作用から生じる（Ｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３０（８）１３９５−１３９９（２００７））。
【０００７】
他のすべての器官と同じように、皮膚は、複雑な加齢の生理的過程を受ける。内因性の加齢または経時的な加齢は、遺伝的にプログラムされた老化、および内因性の要因による生化学的変化の結果である。皮膚において、それは、真皮および表皮の萎縮、乾燥、皮膚の弾力および締まりにおける低下、ならびに細かい線およびしわの出現をもたらす、細胞および細胞外マトリックスの再生における減速を特徴とする。一方、外因性の加齢は、環境上の攻撃、例えば、公害、日光（ＵＶ線）、疾患、生活習慣などが原因である。これは、これらの攻撃に慢性的に曝露される領域で内因性の加齢に追加され、これは、光老化として知られている。
【０００８】
したがって、２０歳から８０歳の間に、線維芽細胞の数は、半減することになる。さらに、線維芽細胞が加齢するときに、コラーゲン合成のレベルならびにプロリダーゼの活性が低下し、老化におけるこの酵素の関連、および線維芽細胞の老化を防止するための分子標的を見つける利点を実証する（Ｐａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｋａｉ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４−６，ｐｐ．２０７−２１３，１９９６）。
【０００９】
研究により、コラーゲンの合成を増加させ、かつ、皮膚の加齢を防止する能力のある活性剤を同定することが可能となった。しかし、細胞内でコラーゲンの合成を効果的に標的とし、かつ、細胞老化を遅延させる能力のある新規な化合物を同定することが必要になってきた。
【００１０】
「ヘキサペプチド−２」という国際命名法ＩＮＣＩ名を有する、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２を有する合成ペプチドは、そのホワイトニング、コンシーリング、および皮膚ブライトニング活性ですでに知られている（Ｓａｗｙｅｒ  ＴＫ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｐｈａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ．１９８９  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；２（１）：１４０−６）。
【００１１】
しかし、皮膚の加齢に対するその効果については記載されていない。一方、特許出願ＥＰ２６６６７８０は、１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの濃度で、ヘキサペプチド−２が、インビトロで培養された線維芽細胞によるコラーゲンの分泌に対する効果を有さないのに対して、ビオチン基で化学的に置換された同じペプチドは、同じ濃度でコラーゲンの分泌を増加させることを開示している。
【００１２】
それにもかかわらず、ビオチン化されたヘキサペプチド−２は、プロリダーゼの活性化およびコラーゲンの発現に対するいかなる効果も有していない。
【００１３】
対照的に、発明者らは、研究中に、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２を有する合成ペプチドが、より低濃度で、０．１μＭから１μＭの範囲で使用されるときに、
−  プロリダーゼの発現および活性を上昇させる、
−  Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの発現を上昇させる、
−  老化させた線維芽細胞においてコラーゲンＩの発現を上昇させる、
−  線維芽細胞において老化マーカーの発現を低下または遅延させる、
−  しわの出現を低減させる
ことを示している。
【００１４】
これらは、したがって、このペプチドが、細胞老化の出現および皮膚加齢の徴候の出現、ならびに、より詳細には、しわの出現を低減または遅延させることを目的とした美容的使用に好適であることを実証している。
【００１５】
本明細書中で、Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２の配列を有する合成ペプチドは、「合成ペプチド」または「本発明によるペプチド」または「ヘキサペプチド−２」と無差別に呼ばれることになる。
【発明の概要】
【００１６】
したがって、本発明の主な目的は、細胞老化および皮膚加齢徴候の出現を低減または遅延させるための、生理学的に許容される溶媒中にて０．１から１μＭの間の、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）を有する合成ペプチドまたはその塩を活性剤として含む組成物の美容的使用であり、組成物は、少なくとも２日の期間、１日あたり少なくとも１回、局所的に適用される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「皮膚」という用語は、皮膚、粘膜および毛髪および爪を構成している被覆組織の集合体を意味する。
【００１８】
「細胞老化の出現を低減または遅延させる」という表現は、本発明によるペプチドが、ヒト線維芽細胞において、ＦＯＸＯ３ａ遺伝子の消失によって誘導された老化、もしくは多数回の培養継代によって誘導された複製的老化について、老化マーカーの発現を低下させるか、または実際にこれらの現象の出現を遅延させることを意味する。
【００１９】
「生理学的に許容される」という用語は、毒性、不耐性、不安定性、アレルギー反応および他の二次的な影響のリスクを冒すことなく、皮膚またはヒトの毛髪および爪との接触に好適である媒体または溶媒を意味する。
【００２０】
本発明による希釈ペプチドは、次いで、滅菌濾過によって滅菌される。
【００２１】
「皮膚加齢の徴候」という用語は、加齢斑もしくはほくろ型の皮膚の色素性異常または肌の色における他のあらゆる異常を除く、加齢を原因とする皮膚および毛髪および爪の外部的所見に対するあらゆる変容、例えば、皮膚の菲薄化、たるみ、水分の減少、皮膚弛緩、深いしわおよび細かい線、締まりおよび張りの損失、皮膚萎縮または他のあらゆる皮膚の内部的分解などを意味する。
【００２２】
好ましくは、「皮膚加齢の徴候を低減させる」という表現は、本発明によるペプチドが、しわの数、合計表面積、合計長さおよび合計深さを減少させることを意味する。
【００２３】
有利には、本発明による組成物は、局所適用に好適な形態である。
【００２４】
「局所適用」という用語は、本発明によるペプチドを含む組成物が、皮膚または粘膜の表面上に適用または塗布されることを意味する。
【００２５】
有利には、本発明によるペプチドを活性剤として含む組成物は、１日あたり少なくとも１回の頻度で局所的に適用されることになる。
【００２６】
別の実施形態では、組成物は、１日あたり２回の頻度で適用されることになる。
【００２７】
有利には、本発明によるペプチドを活性剤として含む組成物は、少なくとも２日の期間、局所的に適用されることになる。
【００２８】
別の実施形態では、組成物は、少なくとも６週の期間、適用されることになる。
【００２９】
別の実施形態では、組成物は、少なくとも３カ月の期間、適用されることになる。
【００３０】
本発明によるペプチドは、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２を有する合成ヘキサペプチドである。好ましくは、ペプチドは、トリフルオロ酢酸塩の形態である。
【００３１】
本発明によるペプチドは、１または複数の生理学的に許容される溶媒、例えば、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化されたジグリコール、環状ポリオールまたはこれらの溶媒の任意の混合物などの中に溶解されるので有利である。
【００３２】
有利には、本発明によるペプチドは、水溶液の形態である。
【００３３】
この希釈ステップ後、本発明によるペプチドは、リポソームなどの美容用ベクターもしくは化粧品の分野において使用される他の任意のマイクロカプセルの中にカプセル封入もしくは包含されてもよく、または粉末化された有機ポリマー、無機支持材、例えばタルクおよびベントナイトなどの上に吸着されてもよく、より一般的には、任意の生理学的に許容されるベクター中に溶解もしくはその上に固定されてもよい。
【００３４】
本発明によって使用されうる組成物は、任意の適切な様式を使用して、特に、経口的または局所的に（外部的に）、適用されてもよく、かつ組成物の製剤は、当業者によって適合されることになる。
【００３５】
好ましくは、本発明による組成物は、局所適用に好適な形態である。したがって、これらの組成物は、生理学的に許容される溶媒、すなわち、適用中のいかなる不快のリスクもなく、かつすべての化粧品形態を包含する、皮膚ならびに毛髪および爪と適合する溶媒を含んでいなければならない。
【００３６】
これらの組成物は、特に、水溶液、含水アルコール溶液もしくは油溶液、水中油型、油中水型もしくは複数のエマルション、水性もしくは無水のゲル、またはコロイドの形態であってもよい。これらの組成物は、皮膚、粘膜、唇ならびに／または毛髪および爪への適用に好適である、クリーム、懸濁液、または粉末の形態であってもよい。これらの組成物は、多かれ少なかれ流動性であってよく、クリーム、ローション、ミルク、セラム、ポマード、クリーム、ペーストまたはフォームの外観を有していてもよい。これらは、スティックなどの、固体の形態であってもよく、またはエアロゾルの形態で皮膚に適用されてもよい。これらは、ケア製品および／または皮膚を化粧するための製品として使用されてもよい。
【００３７】
さらに、これらの組成物のすべては、日常的使用において適用の分野に想定される任意の添加物ならびにこれらの製剤に必要なアジュバント、例えば、共溶媒（エタノール、グリセロール、ベンジルアルコール、モイスチャライザーなど）、増粘剤、賦形剤、乳化剤、抗酸化剤、着色剤、遮光剤、色素、増量剤、保存剤、芳香剤、吸香剤、精油、微量元素、必須脂肪酸、界面活性剤、フィルム形成ポリマー、化学物質もしくは無機質のフィルター、モイスチャライザーまたは温泉水などを含む。挙げられうる例は、天然ポリマー型の水溶性ポリマー、例えば、多糖類、もしくはポリペプチド、メチルセルロースもしくはヒドロキシプロピルセルロース型のセルロース誘導体、または合成ポリマー、ポロキサマー、カルボマー、シロキサン、ＰＶＡもしくはＰＶＰ、および特にＡｓｈｌａｎｄ社によって販売されるポリマーなどである。
【００３８】
それぞれの場合において、当業者は、アジュバントならびにそれらの割合が、本発明の組成物に望ましい有利な特性に対して有害作用を有さないような様式で選択されることを確実にするために注意するであろう。これらのアジュバントは、例えば、組成物の総重量の０．０１％から２０％の濃度で存在していてもよい。本発明による組成物がエマルションであるときには、脂肪相は、組成物総重量について重量で５％から８０％、好ましくは、重量で５％から５０％であってもよい。組成物中に使用される乳化剤および共乳化剤は、考察中の分野において一般的に使用されるものから選択されることになる。一例として、それらは、組成物総重量について重量によって０．３％から３０％の割合で使用されてもよい。
【００３９】
明らかに、活性剤として使用される本発明によるペプチドは、単独で、または他の活性剤と共に使用されてもよい。
【００４０】
有利には、本発明による使用のための組成物は、皮膚加齢の徴候の予防および改善の分野において、本発明による活性剤の作用を強化することを目的とする少なくとも１種の他の活性剤、または、考察中の組成物の特性の範囲を増大させるための別の活性剤も含む。
【００４１】
非限定的な様式で挙げられうるのは、再生剤、アンチエイジング剤、抗しわ剤、無痛化剤、ラジカル捕捉剤、抗糖化剤、モイスチャライザー、抗菌剤、抗真菌剤、角質溶解剤、筋弛緩剤、剥離剤、安定剤、皮膚の巨大分子の合成もしくはエネルギー代謝もしくは微小循環もしくは爪増殖もしくは毛髪増殖の刺激剤、表皮の分化もしくは色素沈着の変調剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、または遮光剤もしくはフィルターのクラスの成分である。
【００４２】
より特定の実施形態では、本発明による組成物は、本発明によるペプチドに加えて、
−  チトクロームｃを活性化する少なくとも１種の化合物、および／または
−  少なくとも１種の加湿化合物、例えば、アクアポリンを活性化する化合物など、および／または
−  サーチュインを活性化する少なくとも１種の化合物、および／または
−  細胞の接着性を増大させる少なくとも１種の化合物、および／または
−  マトリックスタンパク質、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカンなどの産生を増大させる少なくとも１種の化合物、および／または
−  プロテアソーム活性を変調させる少なくとも１種の化合物、および／または
−  概日リズムを変調させる少なくとも１種の化合物、および／または
−  ＨＳＰタンパク質を変調させる少なくとも１種の化合物、および／または
−  細胞のエネルギーを増大させる少なくとも１種の化合物、および／または
−  皮膚の色素沈着を変調させる少なくとも１種の化合物、および／または
−  補酵素Ｑ１０を活性化する少なくとも１種の化合物、および／または
−  障壁機能を向上させる少なくとも１種の化合物、例えば、トランスグルタミナーゼもしくはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を活性化する化合物など、および／または
−  ミトコンドリアを保護する少なくとも１種の化合物
を含むことになる。
【００４３】
上記の前記化合物は、天然由来、例えば、植物ペプチドモイスチャライザーなどであってもよく、または、合成由来、例えば、ペプチドなどであってもよい。
【００４４】
これらの機能とは独立して、組成物中で本発明による活性剤と一緒にされる他の活性剤は、きわめて多様な化学構造を有しうる。列挙されうる非限定的な例は、ペプチド、ビタミンＣおよびその誘導体、Ｂ群からのビタミン、ＤＨＥＡ（ジヒドロエピアンドロステロン）、植物ステロール、サリチル酸およびその誘導体、レチノイド、フラボノイド、アミノ糖、アゾール、金属塩、植物由来のペプチド誘導体であるか、またはポリマーである。
【００４５】
有利には、本発明によるペプチドは、組成物中に０．１から１μＭの範囲内の濃度で、好ましくは、０．５から１μＭの範囲内の濃度で、さらにより好ましくは、厳密に１μＭ未満の濃度で存在する。
【００４６】
いかなる科学的理論にも拘束されることを望むものではないが、この範囲の濃度は、プロリダーゼの活性およびコラーゲンの合成における最適化された増大として定義される、望ましい分子的効果を得るための活性剤として本発明によるペプチドに必要な量である。
【００４７】
有利には、この範囲の濃度は、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの合成における最大の増加を得るために使用されうる。
【００４８】
本発明は、生理学的に好適な溶媒中の０．１から１μＭの間の、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２を有する合成ペプチドを活性剤として含む組成物の、少なくとも２日間に、１日あたり少なくとも１回の局所適用を含む、細胞老化および皮膚加齢徴候の出現を低減または遅延させるための美容的処置方法にも関する。
【００４９】
本発明およびその結果としてもたらされる利点は、以下の通りである添付の図面を参照して、以下の非限定的な実施形態からより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】異なる年齢のドナーからのヒト線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現の試験を示す図である。
【図２】ｓｉＲＮＡ−ＦＯＸＯ３ａでのトランスフェクションによって老化させたヒト線維芽細胞におけるコラーゲンＩの発現に対するヘキサペプチド−２の効果の評価を示す図である。
【図３】複製的老化によって老化させたヒト線維芽細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの活性に対するヘキサペプチド−２（長期処理）の効果の評価を示す図である。
【図４】ヘキサペプチド−２の存在下（短期処理）での、複製的老化によって老化したヒト線維芽細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの活性に対するヘキサペプチド−２の効果の評価を示す図である。
【図５】複製的老化によって老化させたヒト線維芽細胞におけるプロリダーゼの活性に対するヘキサペプチド−２（長期処理）の効果の評価を示す図である。
【図６】複製的老化によって老化させたヒト線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現に対するヘキサペプチド−２（長期処理）の効果の評価を示す図である。
【図７】臨床試験によって評価される、しわの合計表面積に対する１％ヘキサペプチド−２の効果を示す図である。
【実施例】
【００５１】
本明細書および実施例において、他に明記されていない限り、所定の範囲が与えられる場合、それは前記範囲の上限および下限を含むことが理解されるものとする。
【００５２】
［実施例１：ヘキサペプチド−２の存在下での、ヒト線維芽細胞におけるプロリダーゼの発現の試験］
この試験の目的は、ヒト線維芽細胞においてプロリダーゼの発現に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。
【００５３】
プロトコール：培地中に希釈後０．５および１μＭの最終濃度のヘキサペプチド−２で培養ヒト線維芽細胞を２４時間処理した（１日あたり２回の適用）。次いで、細胞を洗浄し、冷却したメタノールで４℃で４分間固定した。プロリダーゼに特異的なマウスモノクローナル抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、参照番号ＬＳ−Ｃ１１５６４４）、次いで、蛍光色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号Ａ２１２０２）を結合させた抗マウス二次抗体の存在下で細胞をインキュベートした。次いで、細胞を落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡）下で調査した。得られた写真から蛍光の定量を行った。
【００５４】
結果：表１に示している顕微鏡観察により、ヘキサペプチド−２で処理した細胞において（ステューデントｔ検定を使用して）有意により強い細胞質蛍光が示された。
【表１】
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【００５５】
結論：ヘキサペプチド−２は、ヒト線維芽細胞においてプロリダーゼの発現を刺激する。
【００５６】
［実施例２：ヘキサペプチド−２の存在下での、ヒト線維芽細胞におけるプロリダーゼの活性の試験］
この試験の目的は、ヒト線維芽細胞においてプロリダーゼの活性に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。
【００５７】
プロトコール：培地中に希釈後０．５および１μＭの濃度のヘキサペプチド−２で培養ヒト線維芽細胞を２４時間処理した（１日あたり２回の適用）。同時に、線維芽細胞を、プロリダーゼの活性化因子および阻害剤であるレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｒ２６２５）およびＣｐｚ−Ｐｒｏ（Ｂａｃｈｅｍ、参照番号４００１３４３）で処理した。次に、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液を用いて、細胞を皿から分離した。細胞ペレットを回収し、２ｍＭのＭｎＣｌ２を含む溶液でプロリダーゼを３７℃で２時間活性化した後に、プロリダーゼ基質である４７ｍＭのグリシン−プロリン（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｇ３００２）を３７℃で１時間添加した。次に、各試料中に含まれるプロリンの量を、Ｃｈｉｎａｒｄの試薬を使用して５１５ｎｍの波長で決定した。同時に、較正曲線を確立するために、プロリン濃度範囲を作製した。各試料中のタンパク質の数に対するプロリンの比の記録を可能にする、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、参照番号２３２２５）を使用してタンパク質の量を決定した。
【００５８】
結果：ヘキサペプチド−２での処理は、（ステューデントｔ検定を使用して）プロリダーゼの活性の有意な上昇を可能にした。これらの結果を以下の表２に示している。
【表２】
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【００５９】
結論：ヘキサペプチド−２は、ヒト線維芽細胞においてプロリダーゼの活性を刺激する。
【００６０】
［実施例３：ヘキサペプチド−２の存在下での、ヒト線維芽細胞における細胞内コラーゲンＩの発現の試験］
この試験の目的は、フローサイトメトリーにより、ヒト線維芽細胞における細胞内コラーゲンＩの発現に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。
【００６１】
プロトコール：培地中に希釈後０．５および１μＭの濃度のヘキサペプチド−２で培養ヒト線維芽細胞を４８時間処理した（１日あたり２回の適用）。同時に、線維芽細胞を、コラーゲンＩの活性化因子であるＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、参照番号２４０Ｂ）で処理した。線維芽細胞をトリプシン処理し、細胞ペレットを回収した。次いで、冷却したメタノールで細胞を４℃で１５分間固定した。蛍光色素を結合させた、コラーゲンＩに特異的なマウスモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照：抗コラーゲンＩ型、クローン：５Ｄ８−Ｇ９）を用いて免疫標識を行った。次に、それぞれの細胞における蛍光の量を決定するために、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ）によって１００００個の細胞を解析した。
【００６２】
結果：フローサイトメトリーによる解析後、ヘキサペプチド−２で処理した細胞においてより強い細胞質蛍光が検出された。これらの結果を以下の表３に示している。
【表３】
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【００６３】
結論：ヘキサペプチド−２は、ヒト線維芽細胞においてコラーゲンＩの発現を刺激する。
【００６４】
［実施例４：エクスビボ培養におけるヘキサペプチド−２の存在下での、ヒト皮膚におけるコラーゲンＩおよびＩＩＩの発現の試験］
この試験の目的は、エクスビボでのヒト皮膚におけるコラーゲンＩおよびＩＩＩの発現に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。
【００６５】
プロトコール：ヒト皮膚の試料を空気／液体境界面で培養した。ヘキサペプチド−２を、培地中に希釈後０．５および１μＭの濃度で、１日あたり２回の適用で、試料に局所的に適用し、次いで、試料を３７℃で４８時間インキュベートした。
【００６６】
次いで、これらの皮膚試料をホルムアルデヒドで固定し、次いで、パラフィン中に包埋した。次いで、４μｍの切片を作製した。
【００６７】
マイクロ波インキュベーション、次いで、トリプシンでの処理による特異的部位のデマスキング後に、次いで、コラーゲンＩおよびＩＩＩのラベリングを行った。コラーゲンＩに特異的なウサギポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、参照番号６００−４０１−１０３−０．５）、コラーゲンＩＩＩに特異的なウサギポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、参照番号６００−４０１−１０５−０．５）、次いで、蛍光色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号Ａ２１２０６）を結合させた抗ウサギ二次抗体を用いて免疫標識を行った。次いで、細胞を落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡）下で調査した。得られた写真から蛍光の定量を行った。
【００６８】
結果：顕微鏡的観察により、ヘキサペプチド−２で処理した生検の真皮において有意により強い蛍光が示された。これらの結果を以下の表４に示している。
【表４】
2018513148.tif 000006
【００６９】
結論：ヘキサペプチド−２は、エクスビボでヒト皮膚においてコラーゲンＩおよびＩＩＩの発現を刺激する。
【００７０】
［実施例５：異なる年齢のドナー由来のヒト線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現の試験］
この試験の目的は、ｑＰＣＲにより、異なる年齢のドナーからのヒト線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。ｍｉＲＮＡは、その標的を阻害することによって標的の転写後調節における基本的な役割を果たしている。ｍｉＲＮＡ−２９ａの発現が老化と共に上昇することは文献において実証されている（Ｍａｎｃｉｎｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ｍｉＲａｎｄａなどのデータベースを使用することにより、ｍｉＲＮＡ−２９ａの標的は、コラーゲンＩおよびプロリダーゼであると同定された。
【００７１】
プロトコール：３３、４５および６６歳の３名のドナーからのヒト線維芽細胞を、培地中に０．５および１μＭの濃度のヘキサペプチド−２で一晩処理した（１回の適用）。
【００７２】
ｍｉＲＮＡを抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ、参照番号ＡＭ１５６１）を用いて抽出し、次いで、特定のキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、参照番号４３７４９６６）で逆転写を行った。ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐに特異的なＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、参照番号００２１１２）および対照の内因性物質として使用されるＲＮＵ４４に特異的なＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、参照番号００１０９４）を使用して、サーモサイクラー内でリアルタイムＰＣＲを行った。比較Ｃｔ法により、ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現の相対定量を行った。
【００７３】
結果：３つの年齢を比較して、ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現は、老化と共に有意に（３３歳から４５歳の間で）＋３２％および（４５歳から６６歳の間で）＋４８％上昇する（ステューデントｔ検定）。３３、４５および６６歳のそれぞれの年齢において、ヘキサペプチド−２で処理した細胞は、（ステューデントｔ検定を使用して）ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現においてそれぞれ−１３％、−１４％および−２７％の有意な低下を示した。これらの結果を図１に示している。
【００７４】
結論：ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現は、細胞をヘキサペプチド−２で処理したときに低下し、これは、標的、例えば、コラーゲンおよびプロリダーゼなどに対するｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現の負の影響が制限されうることを意味する。
【００７５】
［実施例６：ヘキサペプチド−２の存在下での、ｓｉＲＮＡ−ＦＯＸＯ３ａでのトランスフェクションによって老化させたヒト線維芽細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの活性の試験］
この試験の目的は、ヒト老化線維芽細胞に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。ＦＯＸＯ３ａに対する干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＦＯＸＯ３ａ遺伝子を阻害することによって老化を誘導した。ＦＯＸＯ３ａは、細胞寿命に関与するフォークヘッド型転写因子である。ＦＯＸＯ３ａの発現を阻害することにより、細胞は、老化細胞に特徴的であるβ−ガラクトシダーゼを過剰発現する。
【００７６】
プロトコール：培養ヒト線維芽細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号５６５３１）によるトランスフェクションの技術を使用して、２５ｎＭの最終濃度のＦＯＸＯ３ａ特異的ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号ＨＳＳ１７７１７６）で処理し、または処理せず、かつ、培地中に１μＭの最終濃度のヘキサペプチド−２で４８時間処理（１日あたり２回の適用）または処理しなかった。
【００７７】
細胞をすすぎ、固定バッファー（０．２％グルタルアルデヒド、２％ホルムアルデヒド）中で固定した。次いで、細胞を、４０ｍＭのクエン酸／リン酸塩（ｐＨ６）、５ｍＭのＫ３ＦｅＣＮ６、５ｍＭのＫ４ＦｅＣＮ６、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＭｇＣｌ２中に１ｍｇ／ｍＬのＸ−Ｇａｌの溶液と共に、ＣＯ２なしで３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、白色光下で顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡）を用いて細胞を調査した。
【００７８】
結果：特異的なβ−ガラクトシダーゼ活性を有する老化細胞を青く染色した。ＦＯＸＯ３ａ特異的ｓｉＲＮＡで処理した細胞は、老化と関連付けされているβ−ガラクトシダーゼの増加を示し、結果として、青色に染色された細胞の数における増加をもたらした。ＦＯＸＯ３ａ特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしてヘキサペプチド−２で処理した細胞は、老化と関連付けされているβ−ガラクトシダーゼの活性の可視的な低下を示し、結果として、青色に染色された細胞の数における減少をもたらした（結果は示していない）。
【００７９】
結論：ヘキサペプチド−２での処理により、未処理のトランスフェクト細胞よりも老化のレベルが低い細胞を観察することができた。
【００８０】
［実施例７：ヘキサペプチド−２の存在下での、ｓｉＲＮＡ−ＦＯＸＯ３ａのトランスフェクションによって老化させたヒト線維芽細胞におけるコラーゲンＩの発現の試験］
この試験の目的は、ｓｉＲＮＡ−ＦＯＸＯ３ａのトランスフェクションによるヒト老化線維芽細胞におけるコラーゲンＩの発現に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。
【００８１】
プロトコール：培養ヒト線維芽細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号５６５３１）によるトランスフェクションの技術を使用して、２５ｎＭの最終濃度のＦＯＸＯ３ａ特異的ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号ＨＳＳ１７７１７６）で処理し、または処理せず、培地中に０．５または１μＭの濃度のヘキサペプチド−２で４８時間処理（１日あたり２回の適用）または処理しなかった。
【００８２】
線維芽細胞をトリプシン処理し、細胞ペレットを回収した。次いで、冷却したメタノールにより、細胞を４℃で１５分間固定した。免疫標識を、蛍光色素を結合させた、コラーゲンＩに特異的なマウスモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照  抗コラーゲンＩ型、クローン：５Ｄ８−Ｇ９）を用いて行った。次に、それぞれの細胞における蛍光のレベルを決定するために、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ）を使用して１００００個の細胞を解析した。
【００８３】
結果：ｓｉＲＮＡ−ＦＯＸＯ３ａでのトランスフェクションによる老化の誘導後、これらの細胞においてコラーゲンＩの発現における低下が観察された。老化させてヘキサペプチド−２で処理した細胞は、それ自体でコラーゲンＩの発現におけるより少ない低下を示した。これらの結果を図２に示している。
【００８４】
結論：ヘキサペプチド−２での処理は、コラーゲンＩの発現における低下などの老化の影響を限定させるために使用することができる。
【００８５】
［実施例８：ヘキサペプチド−２の存在下（長期処理）での、複製的老化によって老化させたヒト線維芽細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの活性の試験］
この試験の目的は、ヒト老化線維芽細胞に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。４８時間で老化を誘導できる、ｓｉＲＮＡ−ＦＯＸＯ３ａのトランスフェクションによって得られる老化モデルとは対照的に、複製的老化は、約３カ月を必要とする長いプロセスである。線維芽細胞を、それらを分離させ、かつ結果としてそれらを老化させるために、トリプシン処理によって定期的に継代培養した。
【００８６】
プロトコール：ヒト線維芽細胞を、特定の培地中で培養して、培養下で（２７回を超える継代の間）維持し、培地中に１μＭの濃度のヘキサペプチド−２を毎日適用（すなわち、１週間あたり５回の適用）処理し、または処理しなかった。それぞれの継代において細胞の一部を凍結させた。次に、鍵となる継代である４、１２、１６、２０、２４および２７代目を選択した。凍結後、β−ガラクトシダーゼの活性をアッセイすることにより、１μＭのヘキサペプチド−２で処理し、または処理しなかった線維芽細胞の老化の表現型を評価した。
【００８７】
この目的のために、細胞をすすぎ、固定バッファー（０．２％グルタルアルデヒド、２％ホルムアルデヒド）中で固定した。次いで、細胞を、４０ｍＭのクエン酸／リン酸塩（ｐＨ６）、５ｍＭのＫ３ＦｅＣＮ６、５ｍＭのＫ４ＦｅＣＮ６、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＭｇＣｌ２中に１ｍｇ／ｍＬのＸ−Ｇａｌの溶液と共に、ＣＯ２なしで３７℃で２４時間、インキュベートした。次いで、白色光下で顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡）を用いて細胞を調査した。
【００８８】
結果：細胞継代の過程の中で、β−ガラクトシダーゼの活性は上昇し、各回の継代と共に老化のレベルが上昇したことが示唆された。これらの細胞を１μＭのヘキサペプチド−２で処理したときには、本発明者らは、（ステューデントｔ検定を使用して）未処理の細胞と比較したβ−ガラクトシダーゼの活性における−２２％の一般的な有意な低下を観察した。これらの結果を図３に示している。
【００８９】
結論：約３カ月の長期処理後に、本発明者らは、ヘキサペプチド−２で処理した細胞における老化の程度が、未処理の細胞におけるよりも低かったことを観察した。したがって、ヘキサペプチド−２での処理により、細胞の加齢を減速させることができた。
【００９０】
［実施例９：ヘキサペプチド−２の存在下（短期処理）での、複製的老化によるヒト老化線維芽細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の試験］
この試験の目的は、複製的老化によるヒト老化線維芽細胞に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。
【００９１】
プロトコール：ヒト線維芽細胞を、特定の培地中で培養して、長期培養処理下で（２８回を超える継代の間、すなわち、約３カ月間）維持した。それぞれの継代において細胞の一部を凍結させた。次に、鍵となる継代である４、１２、１６、２０および２８代目を選択した。凍結後、線維芽細胞を培地中に１μＭのヘキサペプチド−２で４８時間処理した（１日あたり２回の適用）。β−ガラクトシダーゼの活性をアッセイすることにより、１μＭのヘキサペプチド−２で処理したまたは処理しなかった線維芽細胞の老化の表現型を評価した。
【００９２】
この目的のために、細胞をすすぎ、固定バッファー（０．２％グルタルアルデヒド、２％ホルムアルデヒド）中で固定した。次いで、細胞を、４０ｍＭのクエン酸／リン酸塩（ｐＨ６）、５ｍＭのＫ３ＦｅＣＮ６、５ｍＭのＫ４ＦｅＣＮ６、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＭｇＣｌ２中に１ｍｇ／ｍＬのＸ−Ｇａｌの溶液と共に、ＣＯ２なしで３７℃で２４時間、インキュベートした。次いで、白色光下で顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡）を用いて細胞を調査した。
【００９３】
結果：細胞継代の過程の中で、β−ガラクトシダーゼの活性は上昇し、各世代の老化のレベルが示唆された。老化された、これらの細胞を１μＭのヘキサペプチド−２で処理したときには、本発明者らは、（ステューデントｔ検定を使用して）未処理の細胞と比較したβ−ガラクトシダーゼの活性における−３１％の一般的な有意な低下を観察した。これらの結果を図４に示している。
【００９４】
結論：４８時間の短期処理後に、本発明者らは、ヘキサペプチド−２で処理した細胞が、未処理の細胞よりも低いレベルの老化を有していたことを観察した。したがって、ヘキサペプチド−２での処理を、細胞の加齢を減速させるために使用することができた。
【００９５】
［実施例１０：ヘキサペプチド−２の存在下（長期処理）での、複製的老化によって老化させたヒト線維芽細胞におけるプロリダーゼの活性の試験］
この試験の目的は、ヒト老化線維芽細胞におけるプロリダーゼの活性に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。プロリダーゼの活性が細胞の加齢と共に低下することは文献において示されており、これは、老化細胞において観察されるコラーゲンＩにおける低減と相関する（Ｐａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｋａｉ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １９９６）。
【００９６】
プロトコール：ヒト線維芽細胞を、特定の培地中で培養して、長期培養処理下で（２０回を超える継代の間、すなわち、約３カ月間）維持し、培地中に１μＭの濃度のヘキサペプチド−２の毎日の適用により処理し、または処理しなかった（１週間あたり５回の適用）。それぞれの継代について細胞の一部を凍結させた。次に、２つの継代、１２および２０代目を選択した。凍結後、これらの条件についてプロリダーゼの活性を観察した。
【００９７】
この目的のために、細胞を１５０ｍＭのＮａＣｌの溶液でそれらの支持材から分離した。細胞ペレットを回収し、２ｍＭのＭｎＣｌ２を含む溶液でプロリダーゼを３７℃にて２時間活性化した後に、プロリダーゼの基質である４７ｍＭのグリシン−プロリン（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｇ３００２）を、３７℃で１時間添加した。次に、各試料中に含まれるプロリン含有量を、Ｃｈｉｎａｒｄの試薬を使用して５１５ｎｍの波長で決定した。同時に、較正曲線を確立するために、プロリンの濃度範囲を作製した。プロリン含有量を各試料中のタンパク質の数と関連付けするために、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、参照番号２３２２５）を使用してタンパク質含有量を決定した。
【００９８】
結果：継代Ｐ１２（若いとみなされる細胞）およびＰ２０（老化しているとみなされる細胞）の比較により、プロリダーゼの活性は、複製的老化の間に３６％（ステューデントｔ検定を使用して有意な値）低下することが示される。興味深いことに、ヘキサペプチド−２は、若い細胞（Ｐ１２）に対する影響をほとんどまたは全く有さなかったのに対して、老化細胞（Ｐ２０）へのヘキサペプチド−２の適用により、同じ継代における未処理の対照細胞と比較したプロリダーゼの活性において２０％（ステューデントｔ検定を使用して有意な値）の回復が示された。
【００９９】
これらの結果を図５に示している。
【０１００】
結論：老化の間に、プロリダーゼの活性は、コラーゲンの発現と共に、低下する。ヘキサペプチド−２での処理は、プロリダーゼの活性の維持を可能にすることができ、それによってコラーゲン再利用が維持される結果となる。
【０１０１】
［実施例１１：ヘキサペプチド−２の存在下（長期処理）での、複製的老化によって老化させたヒト線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現の試験］
この試験の目的は、複製的老化による、ヒト老化線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現に対するヘキサペプチド−２の影響を決定することであった。ｍｉＲＮＡは、その標的を阻害することによって、標的の転写後調節における基本的な役割を果たしている。ｍｉＲＮＡ−２９ａの発現が老化と共に上昇することは文献において示されている（Ｍａｎｃｉｎｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ｍｉＲａｎｄａなどのデータベースにより、ｍｉＲＮＡ−２９ａの標的が同定され、コラーゲンＩおよびプロリダーゼが含まれていた。
【０１０２】
プロトコール：ヒト線維芽細胞を、特定の培地中で培養して、長期培養処理下で（２４回を超える継代の間、すなわち、約３カ月間）維持し、培地中に１μＭの濃度のヘキサペプチド−２の毎日の適用によって処理し、または処理しなかった（１週間あたり５回の適用）。それぞれの継代について、細胞の一部を凍結させた。次に、３つの継代、４、１２および２４代目を選択した。凍結後、定量ＰＣＲにより、これらの条件についてｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現を観察した。
【０１０３】
ｍｉＲＮＡを抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ、参照番号ＡＭ１５６１）の補助で抽出し、次いで、特定のキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、参照番号４３７４９６６）により逆転写を行った。ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐに特異的なＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、００２１１２）および内因性対照として使用されるＲＮＵ４４に特異的なＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、００１０９４）を用いて、サーモサイクラー内でリアルタイムＰＣＲを行った。比較Ｃｔ法を使用して、ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現の相対定量を行った。
【０１０４】
結果：Ｐ４、Ｐ１２およびＰ２０の３つの継代の比較後、本発明者らは、ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現が、老化と共に有意に（Ｐ４からＰ１２の間で）＋２５％および（Ｐ４からＰ２４の間で）＋５２％上昇したことを観察することができた（ステューデントｔ検定）。４代目では、ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現に対するヘキサペプチド−２の影響は観察されなかった。対照的に、１２および２４代目では、ヘキサペプチド−２で処理した細胞は、（ステューデントｔ検定を使用して）ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現においてそれぞれ−１６％および−７％の有意な低下を示した。これらの結果を図６に示している。
【０１０５】
結論：１μＭのヘキサペプチド−２で処理した細胞は、老化にかかわらず特定のレベルのｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現を維持するようであり、したがって、標的、例えば、コラーゲンおよびプロリダーゼなどに対する、ｍｉＲＮＡ−２９ａ−３ｐの発現の負の影響が制限されることを可能にする。
【０１０６】
［実施例１２：顔用のアンチエイジング美容用組成物の調製］
【表５】
2018513148.tif 000007
【０１０７】
この調合物の調製のための条件下において、１％のヘキサペプチド−２は、１μＭの濃度に相当する。
【０１０８】
「プラセボ」と呼ばれる顔用の美容用組成物は、ヘキサペプチド−２を精製水と置き換えたという例外付きで、厳密に同じ様式で作製した。
【０１０９】
［実施例１３  しわの出現に対する１％のヘキサペプチド−２の効果の試験（臨床試験）］
目的：プラセボに対して、１％のヘキサペプチド−２を含む美容用組成物による局所処置後のしわの出現についての臨床試験。
【０１１０】
プロトコール：
参加者の数：３５（３５〜６５歳）。
試験：プラセボに対する二重盲検試験。
試験した製品：ヘキサペプチド−２、実施例１２に記載のような美容用組成物対プラセボ組成物中に１％の製剤（すなわち、１μＭの最終濃度）。条件：
適用の回数：２ｍｇ／ｃｍ２の用量で、朝および晩、１日あたり２回の適用。
試験の期間：６週間。
コントロールを加える：０日目（Ｄ０）、および４２日目（Ｄ４２）。
測定：Ｖｉｓｉｏｌｉｎｅ（登録商標）ＶＬ６５０ソフトウェアを使用した、目尻のしわで製作したシリコンレプリカの解析
統計的解析：データの分布の正規性に依存して、「ｔ」ステューデント検定またはウィルコクソン検定のいずれかを使用した。
【０１１１】
結果：実施例１２による組成物中に１％の調合のヘキサペプチド−２の適用後、シリコンレプリカの解析により、プラセボと比較したＤ４２におけるしわの数、合計表面積、合計長さ、合計深さおよび最大深さにおける統計的に有意な減少が示された。これらの結果を図７、８および９ならびに以下の表５に示している。
【表６】
2018513148.tif 000008
【０１１２】
結論：４２日にわたる１％ヘキサペプチド−２の局所適用（すなわち、１μＭの濃度で）は、しわの出現において統計的に有意な低減を引き起こす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2018513148000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月6日(2017.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の菲薄化、たるみ、水分の減少、皮膚弛緩、深いしわおよび細かい線、締まりおよび張りの損失、皮膚の色素性異常を除く皮膚萎縮から選択される細胞老化および皮膚加齢徴候の出現を、低減または遅延させるための美容用組成物であって、生理学的に許容される溶媒中の０．１から１μＭの間の、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）を有する合成ペプチドまたはその塩を活性剤として含み、少なくとも２日間、１日あたり少なくとも１回、局所的に適用される美容用組成物。
【請求項２】
前記組成物が、０．５から１μＭの間の前記合成ペプチドを含む、請求項１に記載の美容用組成物。
【請求項３】
前記組成物が、１μＭ未満の前記合成ペプチドを含む、請求項１に記載の美容用組成物。
【請求項４】
１日あたり２回適用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の美容用組成物。
【請求項５】
少なくとも６週間にわたって適用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の美容用組成物。
【請求項６】
少なくとも３カ月間にわたって適用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の美容用組成物。
【請求項７】
前記合成ペプチドが、プロリダーゼの活性およびコラーゲンの合成を増加させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の美容用組成物。
【請求項８】
前記皮膚加齢の徴候が、しわである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の美容用組成物。
【請求項９】
前記組成物が、ペプチド、ビタミンＣおよびその誘導体、Ｂ群からのビタミン、ＤＨＥＡ、植物ステロール、サリチル酸およびその誘導体、レチノイド、フラボノイド、アミノ糖、アゾール、金属塩、植物由来のペプチド抽出物、またはポリマーから選択される、本発明に記載の活性剤の作用を強化するための他の少なくとも１種の活性剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の美容用組成物。
【請求項１０】
生理学的に許容される溶媒中の０．１から１μＭの間の、配列Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）を有する合成ペプチドを活性剤として含む組成物の、少なくとも２日の期間にわたる１日あたり少なくとも１回の局所適用を含む、細胞老化の出現および皮膚加齢の徴候を低減または遅延させるための美容的処置方法（ただし、人間を治療する方法を除く）。
【国際調査報告】
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