【事件の表示】
　平成　７年特許願第５２４１９７号「等温鎖置換核酸増幅法」拒絶査定不服審判事件〔平成　７年　９月２１日国際公開、ＷＯ９５／２５１８０、平成　９年１０月２１日国内公表、特表平　９−５１０３５１〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯・本願発明　
　本願は、１９９５年３月１４日（パリ条約による優先権主張１９９４年３月１６日、米国）に国際出願されたものであって、その請求項１〜１７に係る発明は、平成１６年７月１３日付の手続補正書により補正された明細書および図面の記載からみて、その特許請求の範囲の請求項１〜１７に記載された事項により特定されるとおりのものと認められるところ、請求項１の記載は以下のとおりである（以下、これを本願発明という。）。　
「【請求項１】　非標的配列よりも優先的に特異的核酸標的配列を増幅する方法であって、下記ａおよびｂの工程　
　ａ．プライマー伸長条件下で、該標的配列を含む核酸鎖を含有する試料に下記のもの：　
　　ｉ．　５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼ；　
　　ｉｉ．　二種以上のヌクレオシド三リン酸；ならびに　
　　ｉｉｉ．　少なくとも２種類の異なる相補的プライマーおよび少なくとも２種類の異なるセンスプライマー　
を接触させ（該相補的プライマーはそれぞれ、該標的配列に対して３’の該核酸鎖上の核酸配列に相補的であるように設計されたヌクレオチド塩基配列を含み、該相補的プライマーのそれぞれのヌクレオチド塩基配列は該条件下で該核酸鎖上の核酸配列とハイブリダイゼーションしうるものであり、該センスプライマーはそれぞれ、該標的配列に対して５’の該核酸鎖上の核酸配列に対して類似となるように設計されたヌクレオチド塩基配列を含み、該それぞれのセンスプライマーの該ヌクレオチド塩基配列は、該条件下で該核酸鎖上の核酸配列に対して相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションしうるものであり、該プライマーは、該標的配列の増幅に必要な酵素のための反応部位を含むように修飾されたプライマーを包含するものではない）、ついで　
　ｂ．該標的配列を鎖置換により増幅すること（少なくとも４３℃の温度であって該核酸鎖またはその相補配列鎖といずれかの該プライマーを含むプライマー伸長生成物との間で形成される二本鎖が解離する温度よりも低い温度で該増幅工程が行われ、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター部位を含む相補プライマーまたはセンスプライマーの不存在下で該増幅工程が行われる）　
を含む方法であって、該増幅生成物に対して活性のある制限エンドヌクレアーゼが関与しない方法。」　
　
２．原審および当審が通知した拒絶理由　
（２−１）原審は、本願について、平成１０年９月１０日付で、以下の内容の拒絶理由を通知している。　
「１．この出願の請求項１〜２４に係る発明は、その出願前日本国内又は外国において頒布された下記の刊行物に記載された発明に基づいて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　記　 
刊行物：特表平５−２７６９４７号公報」　
　ここで、上記拒絶理由中、「特表平５−２７６９４７号公報」は、「特開平５−２７６９４７号公報」の誤記であることは明らかである。　
（２−２）当審は、また、平成１６年１月８日付で、以下の内容の拒絶理由を通知した。　
「１．この出願の請求項１〜１８に係る発明は、その出願前日本国内又は外国において頒布された下記の引用刊行物１および２に記載された発明に基づいて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。　
２．この出願は、特許請求の範囲の記載が特許法第３６条第４項及び第５項第２号に規定する要件を満たしていない。　 
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　記　 
刊行物１：国際公開９４／０３６３５号パンフレット（ＷＯ９４／０３６３５、１９９４年２月１７日国際公開）　 
刊行物２：特開平５−２７６９４７号公報」　
  
３．当審の判断　
　当審の上記拒絶理由に対し、審判請求人は上述のとおり本願明細書を補正した。　
　そこで、当該補正後の本願請求項１に係る発明（本願発明）について、原審ないし当審が通知した上記拒絶理由が解消しているかどうかを、以下検討する。　
（１）引用刊行物に記載された発明　
刊行物１：国際公開９４／０３６３５号パンフレット（ＷＯ９４／０３６３５、１９９４年２月１７日国際公開）
　「核酸の速やかな増幅と検出」という名称の発明についてのＰＣＴ国際出願の国際公開パンフレットであり、　
　特許請求の範囲の請求項１に、「試料中の二本の相補鎖からなる標的核酸配列を増幅する方法であって、以下の工程を含む方法。（ａ）三リン酸化ヌクレオシド、二つのオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対、および、核酸ポリメラーゼを当該試料に加え、（ｂ）当該標的核酸配列を変性して分離した一本鎖を形成させ、（ｃ）
反応温度を６８℃から８０℃の範囲に維持し、
当該伸長生成物が当該一本鎖から分離して当該プライマーの鋳型となり、
　発明の詳細な説明に、「この発明の各プライマーは二つの要求に適合するように選ばれる。第一に、それらは、文献で推奨される温度よりも高い温度で結合することができるように、標的配列の一本鎖に強く結合しなければならない。第二に、
ポリメラーゼの存在下、ヌクレオシドから合成されるプライマーの伸長生成物は、開始時に選択され、自発的に一本鎖の形により分離し易そうな一連の生成物の中で最も不安定なものであり、かくして、それは自ら適切なプライマーの標的配列となる。
プライマー伸長生成物は、これと反対に、二本鎖が自発的に分離する確率ができるだけ高いように、できる限り不安定であるべきである。
　
刊行物２（原審の拒絶理由における刊行物と同じ）：特開平５−２７６９４７号公報
　「核酸標的物の生成法」という名称の発明についての特許出願公開公報であり、　
（ｉ）特許請求の範囲に、　
「【請求項１】　（ａ）一つのプライマーを核酸配列にハイブリダイズさせ、　
（ｂ）（ａ）の核酸配列にもう一つのプライマーを（ａ）のプライマーより５’側に位置するようにハイブリダイズさせ、そして　
（ｃ）両方のプライマーから重合を開始させることにより（ａ）のプライマーを上記核酸から置換する工程からなる、核酸配列の生成法。　
【請求項２】　（ａ）および（ｂ）のそれぞれにおいて２つのプライマーを使用することにより、上記核酸配列の４つの二本鎖コピーを生成する、請求項１記載の方法。」　
と記載されており、　
（ｉｉ）発明の詳細な説明に、　
（１）本発明の核酸標的物の生成法について、　
「【００１８】【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）一つのプライマーを核酸配列にハイブリダイズさせ、（ｂ）（ａ）の上記プライマーの５’に位置する（ａ）の上記核酸配列にプライマーをハイブリダイズさせ、そして（ｃ）両方のプライマーから合成することにより（ａ）の上記プライマーを上記核酸から置換する工程からなる、核酸生成法に関する。」、　
「【００１９】本発明は、次に増幅およびクローニングを行うために５’末端および３’末端が規定された標的核酸配列を生成する方法に関する。」、　
「【００２２】次の置換型増幅法（ＳＤＡ）が強化されるのは、各起源の標的鎖から多数の修飾されたニッキング部位が生じるからである。…本発明の標的物生成法は合計６つの修飾されたニッキング部位を有する４つの二本鎖断片を生じる（図１を参照せよ）。」　
と記載され、　
（２）当該標的物生成法の具体的な手順について、　
「【００２８】その後のＳＤＡのための本発明による標的物生成法を始めるために、過剰量の４つのプライマーの存在下で増幅すべき核酸（例えば標的物）を熱変成する（図１）。２つのプライマー（Ｓ1およびＳ2）は典型的なＳＤＡプライマーであり、それらの３’末端に標的物結合領域、および標的物の相補配列の５’に位置するニッキング酵素認識配列を有する。２つのＳＤＡプライマー（Ｓ1およびＳ2）は指数的増幅に必要であり、ＳＤＡプライマー（Ｓ1またはＳ2）のいずれか一方のみは一次的増幅に必要である。他の２つのプライマー（Ｂ1およびＢ2）は単に標的物への結合領域からなる。（Ｂ1またはＢ2のいずれか一方のみの上流のプライマーは絶対に必要である。）Ｓ1およびＳ2は増幅される配列の周辺の位置において標的物の二本の鎖の別々の鎖に結合する。Ｂ1およびＢ2はそれぞれＳ1およびＳ2の上流に結合する。ｅｘｏ-クレノーは３つのデオキシヌクレオシド３リン酸および１つの標識デオキシヌクレオシド３リン酸を使用して、４つ全部のプライマーから同時に伸長合成する。Ｓ1およびＳ2からの伸長合成により２つの産物、Ｓ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔが形成される。Ｂ1およびＢ2の伸長合成により標的鋳型からＳ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔが置換される。置換された一本鎖のＳ1−ｅｘｔはＳ2およびＢ2の標的となる。同様に、置換されたＳ2−ｅｘｔはＳ1およびＢ1の標的となる。４つすべてのプライマーは鋳型Ｓ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔの上で伸長合成される。伸長合成と置換の工程を一緒に行うことにより、修飾されたニッキング酵素の認識部位を各末端に有する２つの二本鎖断片と、修飾されたニッキング酵素の認識部位を一方の末端のみに有する、より長い２つの二本鎖断片とが生じる。工程を追ってこの方法を記載してきたが、この方法は実際は同時に起こる。今や、増幅法は、以下に記載されそして引用により本明細書の一部をなす米国特許第０７／６４８，２５７号にも記載されている鎖置換型増幅法（ＳＤＡ）により、実施できる。」　
と、記載され、　
（３）当該標的物についてＳＤＡを行う手順について、　
「【００３３】図１の略図による標的物の生成によれば、
ＨｉｎｃＩＩを増幅のためのニッキング酵素として使用する
ＨｉｎｃＩＩは一方の鎖がホスホロチオエート化されている（ｈｅｍｉｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）認識部位にニックを入れ、そしてｅｘｏ-クレノーは反対側のＳＤＡプライマーの標的となる下流の鎖を置換しながらニックの３’末端から伸長合成する
「【００３４】図１から図２への移行は図１の最後の二本鎖断片を詳細に説明することにより、より明らかになるであろう。ＨｉｎｃＩＩが、Ｓ1プライマー配列を含む断片の左末端の、一方の鎖がホスホロチオエート化されている部位にニックを入れるならば、ｅｘｏ-クレノーはニック部位から複製を開始し、そして５’末端に5’ＧＡＣを有する下流の鎖および３’末端のプライマーＳ2の完全な相補配列を置換する。Ｓ2はこの置換された鎖に結合し、そしてｅｘｏ-クレノーは「ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰおよびｄＡＴＰ（αＳ）を使用した重合」による標識工程の産物として図２の右側に示される二本鎖断片を形成するＳ2を伸長合成する。同様の反応が、図１の下部に示された完全なセットの断片を用いて起こる。」　
と、記載されている。
（４）また、当該標的物生成法のその他の利用法について、　
「【００３０】標的物の生成のためのこの方法は、他の増幅法、例えばポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ）…、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）…、ライゲーション増幅反応（ＬＡＲ）…、リガーゼに基づく増幅システム（ＬＡＳ）…、およびＱ．Ｂ．レプリカーゼ…、および３ＳＲ…を用いて行うことができる。」、　
「【００３１】本発明の標的物生成法をＳＤＡ以外の増幅法と共に用いるならば、いくつかの修飾がなされうる。
引き続く増幅をポリメラーゼチェインリアクション法により行うのであれば、プライマーはどのような認識配列も含む必要はない。
増幅をＱベータレプリカーゼにより行うのであれば、認識配列は、
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含むべきである
３ＳＲを使用してＤＮＡを増幅するのであれば、プライマーＳ1および／またはＳ2は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター部位を含むはずである。
「【００４３】明らかに、
ＳＤＡを増幅法として用いず、そして例えばＰＣＲ法を使用するのであれば、修飾されたヌクレオチドを使用する必要はなく、またニッキング酵素は必要ない。
と、当該標的物生成法をＳＤＡ以外の増幅法と共に用いることができること、Ｑベータレプリカーゼや３ＳＲによる増幅法を用いる場合は、プライマーにＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含むべきこと、そして、ＰＣＲ法により増幅する場合には、修飾されたヌクレオチドを用いる必要はなく、ニッキング酵素も必要ないことが記載されており、　
　また、
「【００３２】さらに、この方法は、図１の工程を本質的に何度も繰り返すことにより行うことができる。通常二本鎖断片を変成するために加熱が適用される。このような方法は、ニッキング酵素の必要性を排除し、そして修飾されたヌクレオシドの必要性を排除する。即ち、この方法は本質的に増幅法となる。」　
と、他の増幅法と共に用いることなく、標的物生成法を繰り返すことによっても増幅できること、そして、標的物生成法の工程自体においては、修飾されたヌクレオチドを用いる必要はなく、ニッキング酵素も必要ないことが記載されている。　
（５）標的物生成に用いるプライマーの種数について、　
「【００３５】この方法において使用される
第一のプライマー（例えば、図１のＳ1およびＳ2を参照せよ）は
望むなら好きなだけのプライマーを使用することができる（より多くのプライマーを使用すればより多くの増幅可能な標的物が生成される）。
「【００３７】…
外側プライマー（若しくは「第二の」プライマー）は
望むならば好きなだけの数を使用できる
使用されるプライマーが多ければ、
標的断片の数が増える。
と、各プライマーの種数を増やすことにより、標的物の生成数を増やすことができることが記載されている。　
（６）そして、標的物生成法に用いるポリメラーゼについては、　
「【００４６】…ＳＤＡおよび
標的物生成法のための、この方法に有用なポリメラーゼは、
下流の重合鎖の置換もすべきであり、そして重要なことはあらゆる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているべきである。
ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損クレノー断片およびＢｓｔポリメラーゼ由来の同様の断片（バイオラッド社、リッチモンド、ＣＡ）が有用である。
と、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼを用いるべきことが記載され、　
（７）ポリメラーゼにより核酸重合および鎖置換反応を行う温度については、　
「【００４７】この方法のさらなる特徴は、合成において温度を上下する必要がないことである。多くの増幅法は、温度を上下することにより合成鎖から標的物を解離する必要がある。
この方法においては、変成後に単一の温度を使用することができる。
約３７℃から約４２℃が好ましい温度であることが分かった。酵素および核酸の変成が避けられる。
と、好ましくは約３７℃から約４２℃の、一定の温度で行うことが記載されている。　
（ｉｉｉ）図１、図２が添付され、【図面の簡単な説明】には、これらについて　
「【図１】　図１は、鎖置換型増幅法のための標的物生成法の略図である。この図は、起源の標的配列を、図２に表されている「定常状態」増幅法に移行させる最初の工程を表す。標的ＤＮＡ試料を熱変成させる。過剰に存在する４つのプライマー（Ｂ1，Ｂ2，Ｓ1およびＳ2）は、増幅される配列の外側の位置で標的鎖に結合する。プライマーＳ1およびＳ2はそれらの５’末端にＨｉｎｃＩＩ認識配列を有する。ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰおよびｄＡＴＰ（αＳ）を使用して、ｅｘｏ-クレノーにより４つのプライマーから同時に伸長合成する。Ｂ1からの伸長合成によりプライマーＳ1からの伸長合成産物（Ｓ1−ｅｘｔ）が置換される。同様に、Ｂ2からの伸長合成によりＳ2伸長合成産物Ｓ2−ｅｘｔが置換される。Ｂ2およびＳ2は置換されたＳ1−ｅｘｔに結合する。Ｂ1およびＳ2は置換されたＳ2−ｅｘｔに結合する。鋳型Ｓ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔ上の伸長合成および増幅により、各末端の一方の鎖がホスホロチオエート化されているＨｉｎｃＩＩ部位を有する２つの断片、および一方の末端のみで一方の鎖がホスホロチオエート化されているＨｉｎｃＩＩ部位を有する２つのより長い断片が生成される。ＨｉｎｃＩＩのニッキングおよびｅｘｏ-クレノーによる伸長合成／増幅反応は、これら４つの断片から開始し、図２に表されている「定常状態」の連続反応にすぐにたどり着く。センスＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは細線と太線により区別される。ＨｉｎｃＩＩ認識配列は線上の伸び上がった部分により表される。」、　
「【図２】　図２は、鎖置換型増幅（ＳＤＡ）反応の「定常状態」の連続である。以下の反応工程は増幅の間連続的に繰り返される。過剰に存在するのは２つのＳＤＡプライマー（Ｓ1およびＳ2）である。Ｓ1の３’末端が標的（Ｔ1）となる置換鎖の３’末端に結合して５’が飛び出た二本鎖を形成する。同様に、Ｓ2は置換鎖Ｔ2に結合する。Ｓ1およびＳ2の５’の飛び出しは制限酵素ＨｉｎｃＩＩの認識配列（５’ＧＴＴＧＡＣ３’）を含む。ｅｘｏ-クレノーはｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰおよびｄＡＴＰ（αＳ）を使用して該二本鎖の３’末端から伸長合成し、Ｓ1Ｔ1およびＳ2Ｔ2上に一方の鎖がホスホロチオエート化された認識部位を生成する。ＨｉｎｃＩＩは一方の鎖がホスホロチオエート化された認識部位の保護されていないプライマー鎖にニックを入れ、修飾されている相補鎖を完全なまま残す。ｅｘｏ-クレノーはＳ1Ｔ1上のニックにおいて３’末端から伸長合成し、Ｔ2と機能的に均等な下流の鎖を置換する。同様に、Ｓ2Ｔ2上のニックにおける伸長合成により、Ｔ1と機能的に均等な下流の鎖が置換される。ニッキングおよび重合／置換工程はＳ1Ｔ1およびＳ2Ｔ2上で連続的に繰り返されるが、それはニックにおける伸長合成により、ニックを入れることが可能なＨｉｎｃＩＩ認識部位を生じるからである。標的の増幅は指数的であるが、それは標的Ｓ1となるＳ2Ｔ2から鎖が置換されると同時に標的Ｓ2となるＳ1Ｔ1から鎖が置換されるからである。センスＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは細線と太線により区別される。ＨｉｎｃＩＩ認識配列の一部５’ＧＡＣおよびその相補配列５’ＧＴＣは、それぞれ置換鎖の５’末端および３’末端に存在し、小さな箱型で表される。」　
と記載されている。　
（刊行物１、２の上記摘記箇所中の下線は、当審によるものである。）　
　
（２）本願発明と引用刊行物に記載された発明との対比・判断　
（２−１）本願発明　
　本願発明は、上述のとおり、　
「【請求項１】　非標的配列よりも優先的に特異的核酸標的配列を増幅する方法であって、下記ａおよびｂの工程　
　ａ．プライマー伸長条件下で、該標的配列を含む核酸鎖を含有する試料に下記のもの：　
　　ｉ．　５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼ；　
　　ｉｉ．　二種以上のヌクレオシド三リン酸；ならびに　
　　ｉｉｉ．　少なくとも２種類の異なる相補的プライマーおよび少なくとも２種類の異なるセンスプライマー　
を接触させ（該相補的プライマーはそれぞれ、該標的配列に対して３’の該核酸鎖上の核酸配列に相補的であるように設計されたヌクレオチド塩基配列を含み、該相補的プライマーのそれぞれのヌクレオチド塩基配列は該条件下で該核酸鎖上の核酸配列とハイブリダイゼーションしうるものであり、該センスプライマーはそれぞれ、該標的配列に対して５’の該核酸鎖上の核酸配列に対して類似となるように設計されたヌクレオチド塩基配列を含み、該それぞれのセンスプライマーの該ヌクレオチド塩基配列は、該条件下で該核酸鎖上の核酸配列に対して相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションしうるものであり、該プライマーは、該標的配列の増幅に必要な酵素のための反応部位を含むように修飾されたプライマーを包含するものではない）、ついで　
　ｂ．該標的配列を鎖置換により増幅すること（少なくとも４３℃の温度であって該核酸鎖またはその相補配列鎖といずれかの該プライマーを含むプライマー伸長生成物との間で形成される二本鎖が解離する温度よりも低い温度で該増幅工程が行われ、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター部位を含む相補プライマーまたはセンスプライマーの不存在下で該増幅工程が行われる）　
を含む方法であって、該増幅生成物に対して活性のある制限エンドヌクレアーゼが関与しない方法。」というものである。　
（２−２）引用刊行物に記載された発明との対比　
　これに対して、原審が平成１０年９月１０付けで通知した拒絶理由で引用した刊行物（当審拒絶理由の刊行物２と同じ、以下、刊行物２という。）には、上述のとおり、「（ａ）一つのプライマーを核酸配列にハイブリダイズさせ、（ｂ）（ａ）の核酸配列にもう一つのプライマーを（ａ）のプライマーより５’側に位置するようにハイブリダイズさせ、そして（ｃ）両方のプライマーから重合を開始させることにより（ａ）のプライマーを上記核酸から置換する工程からなる、核酸配列の生成法。」（請求項１）が記載され、当該方法により生成した核酸配列を鎖置換型増幅法（ＳＤＡ）によりさらに増幅する手法について、標的物である核酸配列の生成と当該核酸配列のＳＤＡの２つの段階に分けて説明されている（前者について【００２８】及び図１、後者について【００３３】、【００３４】及び図２）。　
　そのうち、標的物の生成について、【００２８】には、上述のとおり、「その後のＳＤＡのための本発明による標的物生成法を始めるために、過剰量の４つのプライマーの存在下で増幅すべき核酸（例えば標的物）を熱変成する（図１）。２つのプライマー（Ｓ1およびＳ2）は典型的なＳＤＡプライマーであり、それらの３’末端に標的物結合領域、および標的物の相補配列の５’に位置するニッキング酵素認識配列を有する。…他の２つのプライマー（Ｂ1およびＢ2）は単に標的物への結合領域からなる。…Ｓ1およびＳ2は増幅される配列の周辺の位置において標的物の二本の鎖の別々の鎖に結合する。Ｂ1およびＢ2はそれぞれＳ1およびＳ2の上流に結合する。ｅｘｏ-クレノーは３つのデオキシヌクレオシド３リン酸および１つの標識デオキシヌクレオシド３リン酸を使用して、４つ全部のプライマーから同時に伸長合成する。Ｓ1およびＳ2からの伸長合成により２つの産物、Ｓ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔが形成される。Ｂ1およびＢ2の伸長合成により標的鋳型からＳ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔが置換される。置換された一本鎖のＳ1−ｅｘｔはＳ2およびＢ2の標的となる。同様に、置換されたＳ2−ｅｘｔはＳ1およびＢ1の標的となる。４つすべてのプライマーは鋳型Ｓ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔの上で伸長合成される。伸長合成と置換の工程を一緒に行うことにより、修飾されたニッキング酵素の認識部位を各末端に有する２つの二本鎖断片と、修飾されたニッキング酵素の認識部位を一方の末端のみに有する、より長い２つの二本鎖断片とが生じる。…」と記載され、これを図示した図１には、標的物である二本鎖核酸配列を変成して得られるそれぞれの一本鎖（Ｔ１，Ｔ２）にそれぞれ２つの異なる位置にハイブリダイズするプライマー（Ｓ１，Ｂ１およびＳ２，Ｂ２）が結合し、当該２つのプライマーがｅｘｏ−クレノーによりそれぞれ伸長合成されることにより、外側のプライマー（Ｂ１，Ｂ２）の伸長物により当該一本鎖上の内側のプライマー（Ｓ１，Ｓ２）の伸長物が置換され、これにより一本鎖となった内側のプライマー伸長物のそれぞれに対し他の一本鎖にハイブリダイズする２つのプライマーが結合し、ｅｘｏ−クレノーによりそれぞれ伸長合成され、当該プライマーのうちの外側のプライマーの伸長物により内側のプライマーの伸長物が置換されることにより、当該内側のプライマーの伸長物が一本鎖となり新たなプライマー伸長の鋳型となることにより、変成前１つであった二本鎖が６つの二本鎖（Ｔ１上でＢ１が、また、Ｔ２上でＢ２が伸長して生成した２つの二本鎖、Ｓ１−ｅｘｔ上でＢ２が、また、Ｓ２−ｅｘｔ上でＢ１が伸長して生成した２つの二本鎖、および、Ｓ１−ｅｘｔ上でＳ２が、また、Ｓ２−ｅｘｔ上でＳ１が伸長して生成した２つの一本鎖上で、Ｓ１またはＳ２が伸長して生成した２つの二本鎖）に増加することが示されており、これは、とりもなおさず、当該標的物生成工程において、二本鎖標的物が、当初の６倍と程度は小さいものの、増幅されることを示すものであるといえる。　
　ここで、図１の標的物生成は、「その後のＳＤＡのため」行われるものであるため、「修飾されたニッキング酵素の認識部位を末端に有する二本鎖断片」を生成させる必要があり、そのために、内側の２つのプライマーＳ１およびＳ２として「標的物の相補配列の５’に位置するニッキング酵素認識配列を有する」ものを用い、ｅｘｏ−クレノーによるプライマーの伸長合成は「３つのデオキシヌクレオシド３リン酸および１つの標識デオキシヌクレオシド３リン酸を使用」して行われているが、刊行物２には、上述のとおり、当該標的物生成法をＳＤＡ以外の増幅法と共に用いることができること、そして、Ｑベータレプリカーゼや３ＳＲによる増幅法を用いる場合は、プライマーにＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含むべきこと、また、ＰＣＲ法により増幅する場合には、修飾されたヌクレオチドを用いる必要はなく、ニッキング酵素も必要ないことが記載されており（【００３０】、【００３１】及び【００４３】）、また、他の増幅法と共に用いることなく、加熱による二本鎖の変成工程から始まる標的物生成法を繰り返すことによっても標的物を増幅できること、そして、標的物生成法の工程自体においては、修飾されたヌクレオチドを用いる必要はなく、ニッキング酵素も必要ないことが記載されている（【００３２】）。　
　そうすると、刊行物２には、図１の手順において、ニッキング酵素の認識配列やＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターなどの「標的配列の増幅に必要な酵素のための反応部位」を含むように修飾されていないプライマーを用い、「増幅生成物に対して活性のある制限エンドヌクレアーゼが関与」することなく標的物核酸の生成を行うことにより、標的物核酸を当初の６倍に増幅することが記載され、また、そのように増幅した標的物核酸を更にＰＣＲ法により、あるいは当該標的物核酸の生成工程を繰り返すことにより、増幅することが記載されているといえる。すなわち、刊行物２には、図１の手順で標的物を生成する方法であって、「該プライマーは、該標的配列の増幅に必要な酵素のための反応部位を含むように修飾されたプライマーを包含するものではなく」、「ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター部位を含む相補プライマーまたはセンスプライマーの不存在下で該増幅工程が行われ」、かつ、「該増幅生成物に対して活性のある制限エンドヌクレアーゼが関与しない」方法が記載されているといえる。　
　そして、図１の方法でプライマー伸長に用いられている核酸ポリメラーゼであるｅｘｏ−クレノーは、刊行物２の【００４６】に「…標的物生成法のための、この方法に有用なポリメラーゼは、…あらゆる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているべきである。…例えば…ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損クレノー断片…が有用である。…」と記載されているとおり、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼであると認められ、また、図１において、標的物である二本鎖核酸配列のうち、プライマーＳ１乃至Ｂ１と反対方向のプライマーＳ２乃至Ｂ２との間の特定の配列を増幅したことは、「特異的核酸標的配列」を「非標的配列よりも優先的に増幅」したことに他ならない。更に、刊行物２には、プライマーの種数を増やすことにより、標的物の生成数を増やすことができることも記載されている（【００３５】、【００３７】）。　
　そこで、本願発明と刊行物２に記載された上記発明を対比すると、　
　両者は、「非標的配列よりも優先的に特異的核酸標的配列を増幅する方法であって、下記ａおよびｂの工程　
　ａ．プライマー伸長条件下で、該標的配列を含む核酸鎖を含有する試料に下記のもの：　
　　ｉ．　５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼ；　
　　ｉｉ．　二種以上のヌクレオシド三リン酸；ならびに　
　　ｉｉｉ．　少なくとも２種類の異なる相補的プライマーおよび少なくとも２種類の異なるセンスプライマー　
を接触させ（該相補的プライマーはそれぞれ、該標的配列に対して３’の該核酸鎖上の核酸配列に相補的であるように設計されたヌクレオチド塩基配列を含み、該相補的プライマーのそれぞれのヌクレオチド塩基配列は該条件下で該核酸鎖上の核酸配列とハイブリダイゼーションしうるものであり、該センスプライマーはそれぞれ、該標的配列に対して５’の該核酸鎖上の核酸配列に対して類似となるように設計されたヌクレオチド塩基配列を含み、該それぞれのセンスプライマーの該ヌクレオチド塩基配列は、該条件下で該核酸鎖上の核酸配列に対して相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションしうるものであり、該プライマーは、該標的配列の増幅に必要な酵素のための反応部位を含むように修飾されたプライマーを包含するものではない）、ついで　
　ｂ．該標的配列を鎖置換により増幅すること（ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター部位を含む相補プライマーまたはセンスプライマーの不存在下で該増幅工程が行われる）　
を含む方法であって、該増幅生成物に対して活性のある制限エンドヌクレアーゼが関与しない方法。」である点で一致するが、　
　前者が「少なくとも４３℃の温度であって該核酸鎖またはその相補配列鎖といずれかの該プライマーを含むプライマー伸長生成物との間で形成される二本鎖が解離する温度よりも低い温度で該増幅工程が行われる」のに対し、後者では「この方法においては、変成後に単一の温度を使用することができる。…約３７℃から約４２℃が好ましい温度であることが分かった。酵素および核酸の変成が避けられる。」（刊行物２、【００４７】参照）と、増幅工程の好適な温度が約３７℃から約４２℃であるとされている点で、両発明は相違する。　
（２−３）相違点についての判断　
　そこで、上記相違点につき検討すると、刊行物２には、上述のとおり、【００４７】に、鎖置換反応温度について、約３７〜約４２℃が好適であるとの記載はあるものの、刊行物２と同種の鎖置換反応について記載した特開平５−１９２１９５号公報の実施例１（【００４８】〜【００５１】）には、鎖置換反応を４５℃で行ったことが記載されており(【００４９】参照)、このことからみても、刊行物２の上記記載は単に鎖置換反応の好適な温度が約３７〜約４２℃であることを述べたに過ぎないものであり、これ以外の温度、例えばこの温度域を僅か１℃超えたにすぎない４３℃程度の温度では鎖置換反応が起こらないことを述べたものとはいえない。　
　そうすると、反応温度が４２℃を僅かに超えた程度の態様や４５℃程度の態様については、本願発明は刊行物２に記載された発明と区別することができないし、それ以上の温度の場合についても、そのような温度を採用することにより、刊行物２に記載された発明に比して格別の効果が得られたのでなければ、当業者が適宜になし得る程度のこととせざるを得ない。　
　これに関し、請求人は、当審の第１回目の審尋に対し提出した平成１４年２月１５日付の回答書において、本願明細書の実施例１の増幅は指数関数的なものであり、刊行物２の標的物生成工程における二本鎖の増加とは程度が異なるものである旨主張し、本願発明は、刊行物２に記載された単なる鎖置換反応だけでは説明できない格別の効果を奏する旨主張する。　
　しかしながら、当該実施例１は相補的プライマー７種、センスプライマー６種を用いて行ったものであり、それにより１０００倍程度の増幅度が得られたものであるが、鎖置換反応による増幅度は、使用する相補的プライマー、センスプライマーの種数が増加するほど増大することは明らかであり、それぞれ２種の場合は６であった増幅度が、それぞれ７種及び６種用いた場合に１０００倍程度となることは、計算上十分に見込まれることであるから、当該実施例１の効果は、１本鎖の鋳型に複数のハイブリダイズする部位の異なるプライマーがそれぞれ結合、伸長し、逐次鎖置換反応が起こることのみでも説明できないとはいえない。　
　そこで、この点を明確にするために、当審は、平成１５年４月１１日付の審尋で、上述の点を指摘するとともに、より少ないプライマー種、例えば相補的プライマー、センスプライマー各１種でも一定温度で増幅できることを示す等、本願発明において鎖置換反応だけでは説明できない増幅度が得られることを端的に示すことを求めた。　
　これに対し、請求人は、平成１５年１０月１５日付の回答書において、自らの実験結果等を示すことなく、本願出願後の別人の特許出願公報（米国特許第６０３３８８１号明細書、ＰＣＴ／ＡＴ９６／００１０６（国際公開パンフレットとして１９９８年４月６日に公開）に対応するもの）を参考資料２として提出し、相補的プライマー、センスプライマー各１種でも一定温度で増幅できることが裏付けられている旨主張している。　
　しかしながら、当該資料の増幅反応は、当審の拒絶理由で引用した刊行物１で上述のとおり「核酸鎖とプライマー伸長生成物との間で形成される二本鎖が自発的に一本鎖に解離する温度」とされている６８℃以上の温度で行うものであり、本願発明に規定される「少なくとも４３℃の温度であって該核酸鎖またはその相補配列鎖といずれかの該プライマーを含むプライマー伸長生成物との間で形成される二本鎖が解離する温度よりも低い温度」という範囲内の一定温度で、鎖置換によらない増幅が行えることを裏付けるものとはいえない。　
　当審は、平成１７年９月２７日付で請求人にＦＡＸにより審尋書を発し、この点を指摘して意見を求めた。　
　これに対し、請求人は、平成１７年１０月１７日付のＦＡＸによる回答書において、参考資料２に「このような等温の工程において、増幅は進行し、一方、核酸あるいは核酸フラグメントは二重鎖、すなわち、相補的な塩基ペアー間の水素結合が保持されたままであり、増幅されるべき核酸はほとんど無傷のままである。換言すると、このことは、増幅の期間中相補的な核酸あるいは核酸フラグメントは、それぞれ、二重鎖として存在することを意味する。」（第６欄２３〜２９行）という記載があることをもって、参考資料２の増幅は「核酸鎖またはその相補配列鎖といずれかの該プライマーを含むプライマー伸長生成物との間で形成される二本鎖が解離する温度よりも低い温度」で行われたものである旨主張する。しかしながら、参考資料２の実施例は、いずれも６８℃〜８４℃という、本願優先日前に頒布された刊行物１によれば「核酸鎖とプライマー伸長生成物との間で形成される二本鎖が自発的に一本鎖に解離する温度」とされている６８℃〜８０℃の温度域あるいはそれ以上の温度域で増幅を行っており、参考資料２の上記記載のみをもって、参考資料２の増幅が「核酸鎖またはその相補配列鎖といずれかの該プライマーを含むプライマー伸長生成物との間で形成される二本鎖が解離する温度よりも低い温度」で行われたとは直ちにはいえない。また、仮に、参考資料２の増幅が「核酸鎖またはその相補配列鎖といずれかの該プライマーを含むプライマー伸長生成物との間で形成される二本鎖が解離する温度よりも低い温度」で行われたのだとしても、そのことが、参考資料２の実施例の温度域よりもずっと低い４３℃程度の温度でも参考資料２と同様の増幅度が得られることを裏付けることにはならない。　
　したがって、本願発明において、「少なくとも２種類の異なる相補的プライマーおよび少なくとも２種類の異なるセンスプライマー」を用いた場合に、鎖置換反応だけでは説明できない増幅度が得られることは示されておらず、本願発明により、引用例２に記載された発明に比して格別の効果が得られたものと認めることができない。　
　以上のとおりであるから、本願発明は、本願優先日前に頒布され、平成１０年９月１０日付で審査官が通知した拒絶理由で引用した刊行物（すなわち、当審が通知した拒絶理由で引用した刊行物２）に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものといわざるを得ない。　
　
４．請求人の提示する補正案について　
　審判請求人は、当審が平成１７年９月２７日付で発したＦＡＸによる審尋に対する平成１７年１０月１７日付のＦＡＸによる回答書において、新たな補正案を提示している。そのうちの主要なものは以下のとおりであり、この補正案の要点は、本願発明の方法がＤＭＳＯなどの鎖分離剤の存在下行われることを特定する点にある。　
「【請求項１】　非標的配列よりも優先的に特異的核酸標的配列を増幅する方法であって、下記ａおよびｂの工程　
　ａ．プライマー伸長条件下で、該標的配列を含む核酸鎖を含有する試料に下記のもの：　
　　ｉ．　５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼ；　
　　ｉｉ．
　
　　ｉｉｉ．　
鎖分離剤；ならびに
　　
ｉｖ．
を接触させ（該相補的プライマーはそれぞれ、該標的配列に対して３’の該核酸鎖上の核酸配列に相補的であるように設計されたヌクレオチド塩基配列を含み、該相補的プライマーのそれぞれのヌクレオチド塩基配列は該条件下で該核酸鎖上の核酸配列とハイブリダイゼーションしうるものであり、該センスプライマーはそれぞれ、該標的配列に対して５’の該核酸鎖上の核酸配列に対して類似となるように設計されたヌクレオチド塩基配列を含み、該それぞれのセンスプライマーの該ヌクレオチド塩基配列は、該条件下で該核酸鎖上の核酸配列に対して相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションしうるものであり、該プライマーは、該標的配列の増幅に必要な酵素のための反応部位を含むように修飾されたプライマーを包含するものではない）、ついで　
　ｂ．該標的配列を鎖置換により増幅することを含む方法であって、
４２℃ないし６０℃の範囲において該増幅工程が行われ、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター部位を含む相補プライマーまたはセンスプライマーの不存在下で該増幅工程が行われ、該増幅生成物に対して活性のある制限エンドヌクレアーゼを用いない
　…
【請求項１４】　
鎖分離剤がヘリカーゼ、ＲｅｃＡタンパク、または一本鎖核酸結合タンパクである請求項１ないし１３のいずれか１項の方法。
【請求項１５】　
鎖分離剤がＤＭＳＯである請求項１ないし１３のいずれか１項の方法。
　しかしながら、これらのうち、ＤＭＳＯについては、例えば、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．７（１９８９）ｐ．７６２−７６８に、「ＰＣＲ緩衝液　［１０×］ＰＣＲ緩衝液は、塩化カリウム５００ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（室温でｐＨ８．３）１００ｍＭ、塩化マグネシウム１５ｍＭ、及び０．１％ｗ／ｖのゼラチン（シグマ・カタログ・ナンバーＧ２５００）を含む。…ＤＭＳＯなどの他の成分が、ときに、ＰＣＲのために用いる緩衝液に含められた。…ＤＭＳＯは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼをやや阻害する一方、鋳型の二次構造を減少させるかもしれず、あるケースにおいて、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定にとって有用であった。」（７６３頁右欄の「ＰＣＲ緩衝液」の項）と記載されているとおり、ＰＣＲ法による核酸配列増幅において、標的配列が二次構造をとり、プライマーのハイブリダイズと伸長が適切に行われなくなるのを防ぐために用いられているものであり、ＰＣＲ法と同様にプライマーが適切に標的配列にハイブリダイズし、伸長することを必要とする刊行物２の標的物生成法においても同様の効果を期待してＤＭＳＯを用いることは、当業者が容易に想起し得ることであり、また、これにより予測しがたい格別の効果が得られたものとも認められない。　
　また、ヘリカーゼ、ＲｅｃＡタンパク、及び一本鎖核酸結合タンパクについては、本願明細書にこれらを用いた実施例が記載されておらず、これらを共存させることによりどのような効果があるのか不明であり、これにより格別の効果が得られるものとは認められない。　
　以上のとおりであるから、当該補正案によっても上記拒絶理由は解消しないので、当該補正案のとおり補正する機会を設ける必要を認めない。　
　
５．むすび　
　以上のとおりであるから、本願発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本特許出願は拒絶すべきものである。　
　よって、結論のとおり審決する。