(57)【要約】本発明は、ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン主構造を有する新規な種類のＰＰＡＲγ調節剤に関する。このＰＰＡＲγ調節剤は、細胞におけるＰＰＡＲγの発現および核転座を高めることができる。本発明はさらに、医薬として許容される細胞透過性薬剤送達系に封入されている本発明のＰＰＡＲγ調節剤を含む医薬組成物であって、それによりそれが細胞に直接送達可能である医薬組成物に関するものである。従って本発明は、処置を必要とする対象者に対して、治療上有効量の本発明のＰＰＡＲγ調節剤または本発明の医薬組成物を投与することを含む、ＰＰＡＲγ関連の障害もしくは疾患の予防もしくは治療方法を提供する。【選択図】  図４ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＰＡＲγ関連の障害もしくは疾患の予防もしくは治療方法であって、処置を必要とする対象者に対して、治療上有効量の下記式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2018505186.tif 000010
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは独立に、複素環およびジ（ヒドロキシアルキル）アミノからなる群から選択される。］または該化合物の医薬として許容される塩を投与することを含む方法。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ３が複素環であり、Ｒ２およびＲ４がジ（ヒドロキシアルキル）アミノである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複素環がピペリジルである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ジ（ヒドロキシアルキル）アミノがＮ，Ｎ−ジ（ヒドロキシエチル）アミノである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物がジピリダモールである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が細胞透過性薬剤送達系に封入されている請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞透過性薬剤送達系が、ニオソーム、ポリマーソーム、ナノ粒子、リポソーム、ナノ懸濁粒子、固体脂質ナノ粒子、磁性ナノ担体、ミセル、高分子複合体または粒子状薬剤担体である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞透過性薬剤送達系がリポソームである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リポソームが約１００から３００ｎｍの範囲の直径を有する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象者がヒトまたは非ヒト哺乳動物である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ヒト哺乳動物がネコまたはイヌである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＰＡＲγ関連の障害もしくは疾患が、インスリン耐性、耐糖能異常、ＩＩ型糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、血管心臓障害、アテローム性動脈硬化、異脂肪血症、肥満および症候群Ｘ、心血管疾患、炎症および神経疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、脊髄損傷、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患、眼疾患、ウィルス感染、多嚢胞卵巣、炎症性腸疾患、喘息、骨の疾患、加齢および長寿、薬物代謝、創傷治癒、座瘡、ミトコンドリア機能障害疾患、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、腎疾患、肝臓疾患、肺疾患、心血管疾患、膵臓疾患、下部尿路機能不全、勃起不全、髄膜炎、心腎臓症候群、自己免疫障害および全身性炎症応答症候群（敗血症）からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
薬剤および細胞膜受容体相互作用によって生じる血管拡張の副作用を低減するためのＰＰＡＲγ関連疾患の予防もしくは治療方法であって、処置を必要とする対象者に対して、細胞透過性薬剤送達系に基づいて、治療上有効量の請求項１で定義の式（Ｉ）の化合物または該化合物の医薬として許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１４】
Ｒ１およびＲ３が複素環であり、Ｒ２およびＲ４がジ（ヒドロキシアルキル）アミノである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複素環がピペリジルである請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ジ（ヒドロキシアルキル）アミノがＮ，Ｎ−ジ（ヒドロキシエチル）アミノである請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物がジピリダモールである請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞透過性薬剤送達系が、ニオソーム、ポリマーソーム、ナノ粒子、リポソーム、ナノ懸濁粒子、固体脂質ナノ粒子、磁性ナノ担体、ミセル、細胞透過性ペプチド、ＲＧＤペプチド、生分解性ナノ粒子、ウィルスベクター、高分子複合体または粒子状薬剤担体である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞透過性薬剤送達系がリポソームである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リポソームが約１００から３００ｎｍの範囲の直径を有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リポソームが正電荷を有するか中性電荷を有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記用量が０．４から１６０ｍｇ／ｋｇの範囲である請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象者がヒトまたは非ヒト哺乳動物である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記非ヒト哺乳動物がネコまたはイヌである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＰＡＲγ関連の障害もしくは疾患がインスリン耐性、耐糖能異常、ＩＩ型糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、血管心臓障害、アテローム性動脈硬化、異脂肪血症、肥満および症候群Ｘ、心血管疾患、炎症および神経疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、脊髄損傷、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患、眼疾患、ウィルス感染、多嚢胞卵巣、炎症性腸疾患、喘息、骨の疾患、加齢および長寿、薬物代謝、創傷治癒、座瘡、ミトコンドリア機能障害疾患、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、腎疾患、肝臓疾患、肺疾患、心血管疾患、膵臓疾患、下部尿路機能不全、勃起不全、髄膜炎、心腎臓症候群、自己免疫障害および全身性炎症応答症候群（敗血症）からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰＡＲγの発現および核転座を促進する方法および関連する治療的使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
核受容体ファミリーの中で、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ類）は、過去１０年間注目を集めてきた。ＰＰＡＲ類は、それのリガンドによって活性化される核転写因子であり、代謝症候群における非常に重要な制御因子として作用する（Guan, Y. J. Am. Soc. Nephrol, 2004, 15, 2801-2815）。従って、ＰＰＡＲ類は、インスリン耐性、耐糖能異常、ＩＩ型糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、血管心臓障害、アテローム性動脈硬化などの疾患の発生、進行および制御において重要な役割を果たす。
【０００３】
ＰＰＡＲ類は、三つのサブタイプ：ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＰＰＡＲγに分類され、それらは遺伝子の特異的ＤＮＡ配列への結合によって、その遺伝子の発現を制御する（Berger, J. et al., The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274 (10), 6718-6725）。ＰＰＡＲαは主として、肝臓、心臓、腸管、腎臓およびマクロファージで発現され、活性化された後は、脂肪酸の代謝を高め、マクロファージにおける炎症応答を軽減し、低密度リポタンパク質コレステロールを低下させることができ；ＰＰＡＲγは、脂肪細胞、胎盤腫および他の組織で発現され、活性化された後は、血糖値を下げてインスリン感受性を高めるだけでなく、脂質代謝、サイトカイン拮抗、抗炎症、免疫調節、血圧調節などにおいて重要な役割も果たし得る（Kasuga, J. et al., Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 5177-5190;US8822519B2）。
【０００４】
３種類のアイソフォームγ１、γ２およびγ３を含むＰＰＡＲγは、選択的スプライシングを介して同じ遺伝子から転写され、異なる組織特異性を示す。ＰＰＡＲγ１およびγ３は長さが同じである。しかしながら、γ２は、さらなる２８アミノ酸のＮ末端領域を含む。全てのＰＰＡＲγアイソフォームが、抗糖尿病薬チアゾリジンジオン類（ＴＺＤ類）によって活性化され得る。ＴＺＤ類は、核におけるＰＰＡＲγ類を標的とすることで作用することから、主として脂肪組織でインスリン耐性を改善し、主たる作用ではないが、ＰＰＡＲγの発現が相対的に低い肝臓および骨格筋で作用する。ＰＰＡＲγが脂肪組織における遺伝子の発現を調節するものと考えられることから、ＰＰＡＲγは、脂肪細胞分化において必須である。リガンド誘発活性化により、脂質代謝、脂質取り込みおよびインスリン作用が促進され、脂肪分解および遊離脂肪酸（ＦＦＡ）放出が弱まる。従って、循環ＦＦＡ類が減少し、脂肪組織における脂質レベルが上昇する。ＰＰＡＲγ作動薬により、肝臓および筋肉から脂質を再分配することで高度ＦＦＡ誘発インスリン耐性に応答する高血糖を改善することが提案されている。内臓脂肪組織から皮下脂肪に出される脂肪酸により、肝臓におけるグルコース産生の低下およびグルコース恒常性の改善が生じる。ＰＰＡＲγリガンドは、インスリン作用に影響する腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、レジスチン、レプチン、アジポネクチンなどの脂肪組織でのアディポカイン合成の調節にも関与する。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびレジスチンは、インスリン耐性を生じさせると考えられるが、レプチンおよびアジポネクチンは、インスリン感受性を高める可能性がある。さらに、ＰＰＡＲγは、発現、従ってインスリンシグナル伝達が阻害される肥満およびインスリン耐性齧歯類の脂肪組織におけるマクロファージの炎症性サイトカイン類、例えばＴＮＦ−α、およびケモカイン類の蓄積を低下させる。従って、ＰＰＡＲγ作動薬は、抗炎症に寄与する。結果的に、ＰＰＡＲγ活性化によって、肝臓および骨格筋におけるインスリン感受性向上、および高血糖軽減に至ると考えられる（Peng, Yi-Hui, Structure based drug design of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) agonists, Doctoral Dissertation, National Tsing Hua University, 2010）。
【０００５】
多くの疾患が、ＰＰＡＲγの調節に関連する。ＰＰＡＲγ作動薬が、インスリン耐性を特徴とする糖尿病および他の疾患の治療で用いられてきた。しかしながら、糖尿病に加えて、研究者らは、ＰＰＡＲγが複数の調節機序に関与し、アテローム性動脈硬化、異脂肪血症、肥満および症候群Ｘ、心血管疾患、炎症および神経疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、虚血性脳卒中、脊髄損傷、乾癬性関節炎、および慢性閉塞性肺疾患などの各種疾患の治療の標的となり得ることを認めている。ＰＰＡＲγはまた、眼疾患、ウィルス感染、腎疾患、多嚢胞卵巣、炎症性腸疾患、喘息、骨の疾患、加齢および長寿、薬物代謝、創傷治癒、座瘡、およびミトコンドリア機能障害疾患に関連することも報告されている（Kumar A, Hasamnis A. A clinical update on peroxisome proliferator-activated receptors. Syst Rev Pharm 2010; 1:175-81）。
【０００６】
ＰＰＡＲ類が炎症調節効果を有することが報告されている。特に、それは、組織損傷後の炎症応答を調節することができる。卒中に関する研究によれば、虚血／再潅流（Ｉ／Ｒ）傷害は、臓器移植、コンパートメント症候群、心筋梗塞、卒中、および出血性、外傷性もしくは敗血症性ショックなどの広範囲の疾患(状態)における、重大な臨床的意味を有する困難な病態生理学的状態を代表するものである。組織虚血とそれに続く再潅流とが、初期の段階で対処されなければ、罹患臓器における不可逆的組織損傷を伴う細胞壊死を生じる、炎症事象の全カスケードを誘発することが明らかになっている。近年の研究努力により、ＰＰＡＲ類がこの炎症応答の主要な調節因子を代表するものであることを示す証拠が増えてきており、ＰＰＡＲ活性化が炎症を制限し、虚血／再潅流傷害に対して複数の有用な効果を発揮することが明らかになるものと考えられる。結果的に、ＰＰＡＲ類を標的とする薬物が、Ｉ／Ｒ治療用の治療薬となる可能性が示唆されている（Neher MD, Weckbach S, Huber-Lang MS, Stahel PF. New insights into the role of peroxisome proliferator-activated receptors in regulating the inflammatory response after tissue injury. PPAR Res. 2012; 2012:728461）。
【０００７】
外傷性中枢神経系（ＣＮＳ）傷害における役割と同様に、ＰＰＡＲ組織発現とＩ／Ｒ傷害の間の強い関係を示すことができる。腎臓Ｉ／Ｒにおいて、ＰＰＡＲγ発現が腎臓の内皮細胞、間質細胞および集合管で大きく増加し、再潅流から１．５から５時間後にピークとなる。同様のＰＰＡＲγ上昇が、ラットでの局所的脳虚血後の皮質梗塞周囲領域で検出されている。興味深いことに、Ｌｅｅら（C. H. Lee, O. K. Park, K. Y. Yoo et al., "The role of peroxisome proliferator-activated receptor γ, and effects of its agonist, rosiglitazone, on transient cerebral ischemic damage, " Journal of the Neurological Sciences, vol. 300, no. 1-2, pp. 120-129, 2011）が最近、一過性脳虚血のモデルにおいて、海馬でのＰＰＡＲγ免疫反応性が小グリア細胞と共存しており、それが虚血脳での高機能状態の小グリア細胞を示すことを見出した。
【０００８】
近年、各種臓器でのＩ／Ｒ障害の動物試験により、虚血および再潅流後の組織傷害および臓器機能不全の軽減または予防におけるＰＰＡＲ類の非常に重要な役割が明らかになっている。結果的に、非常に多様な天然および合成ＰＰＡＲ作動薬が実験的Ｉ／Ｒモデルで試験されて、Ｉ／Ｒ傷害の転帰を大きく改善することが明らかになっている。ＰＰＡＲリガンドによる組織保護の機序は、これらの作動薬がＩＲ誘発炎症カスケードの変数パラメータと相互作用し、傷害進行に至る途中で複数の標的を阻害し得ることから多因子性であると考えられてきた。提案された作用機序には、（ｉ）内皮細胞上のＩＣＡＭ−１およびｐ−セレクチンのような接着分子の発現低下、（ｉｉ）浮腫形成抑制を伴う血管透過性低下、（ｉｉｉ）サイトカイン類およびケモカイン類のような前炎症性メディエータの放出阻害、（ｉｖ）好中球のような炎症細胞の活性化低下、（ｖ）反応性酸素種の形成減少、（ｖｉ）細胞のアポトーシスおよび壊死の抑制、および（ｖｉｉ）血小板凝集および血栓形成の阻害などがある。ＣＮＳ傷害と同様に、これらの抗炎症効果の大半が、転写因子（主としてＮＦ−κＢ）のＰＰＡＲ誘発抑制およびその後の炎症性遺伝子転写の阻害によって開始される。Ｉ／Ｒでの炎症応答に対するＰＰＡＲ活性化の上記の一般的効果に加えて、各種臓器系でのＰＰＡＲ作動薬の多くの組織特異的影響について報告されている。
【０００９】
腎臓虚血は、後の低酸素組織の再潅流がさらなる傷害を引き起こし得ることで複雑化する急性腎不全の主要な原因である。３種類全てのＰＰＡＲアイソフォームであるＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ、およびＰＰＡＲγに対する作動薬は、腎臓の虚血および再潅流を受けたマウスにおいて組織損傷を大幅に低減する。この腎保護は、腎皮質および腎髄質壊死の低下、腎臓損傷の組織学的徴候の軽減、および最後に血清クレアチニンおよび尿素窒素レベル低下を伴う腎機能の強力な上昇に反映されるこれらの有益な特性の基礎となる機序は、腎臓組織でのＰＰＡＲ類による脂肪酸β−酸化酵素の誘発からなるものであることができ、近位尿細管でＰＰＡＲαを発現するトランスジェニックマウスは、脂肪酸酸化を増加させ、Ｉ／Ｒ誘発腎不全から保護されることが明らかになっている。
【００１０】
肺のＩ／Ｒ傷害は現在でも肺移植後の患者の２０％で生じ、なおも移植後の最初の１ヶ月中の主要な死因である（R. C. King, O. A. R. Binns, F. Rodriguez et al., "Reperfusion injury significantly impacts clinical outcome after pulmonary transplantation, " Annals of Thoracic Surgery, vol. 69, no. 6, pp. 1681-1685, 2000）。虚血前の合成ＰＰＡＲγリガンドであるピオグリタゾンまたは天然ＰＰＡＲγ作動薬１５−デオキシ−Δ１２、１４−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）投与が、ラットでの肺Ｉ／Ｒ傷害を弱める可能性があると考えられる。オカダらによる最近の研究（M. Okada, S. F. Yan, and D. J. Pinsky, "Peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) activation suppresses ischemic induction of Egr-1 and its inflammatory gene targets, " FASEB Journal, vol. 16, no. 14, pp. 1861-1868, 2002）により、ＰＰＡＲγ活性化が虚血血管における炎症応答で非常に重要な役割を有する亜鉛フィンガー転写因子初期成長応答遺伝子−１（Ｅｇｒ−１）の活性化を抑制することが示された。従って、ＰＰＡＲγ活性化の結果として、インターロイキン−１βなどのＥｇｒ−１標的遺伝子の誘発が防止され、ＩＲ関連白血球停滞が減り、全体的生存率が改善される。
【００１１】
腸および胃Ｉ／Ｒ傷害は、腹部大動脈瘤、急性腸間膜虚血、小腸移植またはショックから生じる重体な臨床状態（疾患）である。腸Ｉ／Ｒの齧歯類モデルにおいて、ＰＰＡＲ作動薬の３種類全てのアイソタイプが、Ｉ／Ｒ誘発死亡率低下に関連する強い抗炎症、抗酸化および抗アポトーシス効果を示した。同様に、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンが、胃Ｉ／Ｒラットでの胃粘膜の糜爛および損傷を抑制した。さらに、腸Ｉ／Ｒ後の初期経腸栄養法の有益な効果は、ＰＰＡＲ誘発に関連するものであると考えられる。栄養成分グルタミンが、ＰＰＡＲγの活性化によって腸保護を行うことが報告されている。
【００１２】
虚血性脳血管疾患は、第３位の死因であり、神経機能障害および能力障害の主たる原因の一つである。各種研究から、ＰＰＡＲ作動薬が局所的および広範囲の両方の虚血を予防または重度低下させ得ることが示唆されている。ヒトにおいて、冠動脈性心疾患およびＨＤＬおよびＬＤＬコレステロール値低下のある男性をフィブレートおよびＰＰＡＲα作動薬ゲムフィブロジルで治療した場合に、卒中発生率が低下した。齧歯類の一過性虚血性脳傷害でのＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ、およびＰＰＡＲγリガンド投与により、神経損傷が大幅に低減され、梗塞容量が減り、脳血流が増え、神経転帰パラメータが改善された。この神経保護は、虚血前に予防的に、脳梗塞時に、または虚血後２時間の効力の時間ウィンドウで直後に動物を処置した場合に認められた。一過性虚血とは対照的に、血流を永久的に妨げて、その後の再潅流を行わなかった場合は、ＰＰＡＲγ活性化による梗塞容量の低減は起こらなかった。これらの知見は、ＰＰＡＲγの神経保護的役割が、再潅流時に生じる事象に特異的なものであることを示す証拠を裏付けるものである。
【００１３】
全体として、各種研究により、ＰＰＡＲ類に対するリガンドが、Ｉ／Ｒ誘発炎症カスケードの複数の標的を妨げることにより、多様な臓器でのＩ／Ｒ傷害の大幅な軽減を引き起こすことを示す証拠が得られている。
【００１４】
ＰＰＡＲγ系ＰＰＡＲ作動薬は、抗炎症、抗酸化および抗ＭＭＰ類の特定を有し、細胞に対する保護を提供することができる。従って、急性虚血性疾患に加えて、そのようなＰＰＡＲγ作動薬は、急性肺傷害、急性腎臓傷害、急性肝臓傷害、急性心筋炎、急性心筋梗塞、急性胃腸障害および急性腹膜炎などの急性臓器傷害の治療に特に好適である。さらに、複数臓器傷害を治療する能力があることから、ＰＰＡＲγ作動薬は、臨床的に複数の臓器傷害を引き起こす敗血症および心腎臓症候群などの疾患を治療することができる。それらの製剤および担体を変えることで薬剤の半減期を延長し、放出特性を制御することで、ＰＰＡＲγ作動薬を、慢性炎症疾患の治療で用いることができる。
【００１５】
臨床的に利用可能なＰＰＡＲγ作動薬には、血糖を低下させる薬剤、例えばＴＺＤ類および血中脂質を低下させる薬剤、例えばスタチン類などがある。
【００１６】
ＴＺＤ類は、効果的な経口血糖降下薬である（図１参照）。薬理作用は、ＰＰＡＲγの活性化であることが立証されている。しかしながら、ＴＺＤ類は多くの副作用を有する。例えば、トログリタゾンは肝炎を引き起こし、２０００年以降販売停止となっており；ピオグリタゾンが膀胱癌のリスクを高める可能性があることを示す報告が複数あることから、フランスおよびドイツではその薬剤の使用は停止されており；心血管疾患のリスクが高くなるために、２０１０年以降、英国および欧州連合でのロシグリタゾンの使用が停止されている。
【００１７】
現在実験中のＰＰＡＲγ作動薬には、ネトグリタゾンおよびリボグリタゾンなどがある。早期に開発されたがまだ承認されていない薬剤にはシグリタゾンなどがある。これらの薬剤はなお、チアゾリジンジオンの主化学骨格を有していることから、肝臓炎症、膀胱癌および心血管疾患のリスクを高める可能性がある。
【００１８】
スタチン類は、血中脂質レベルを低下させる医薬である（図２参照）。スタチン類の薬理作用は、主としてＨＭＧ−ＣｏＡの阻害である。スタチン類は、標的酵素基質ＨＭＧ−ＣｏＡの主骨格に基づく化学的に修飾された構造を特徴とする。スタチン類には、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、アトルバスタチンおよびピタバスタチンなどがある。スタチン類がＰＰＡＲを活性化し得ることが報告されている。
【００１９】
他のＰＰＡＲ二重（αおよびγ）作動性薬剤には、テサグリタザル、ラガグリタザル、ナベグリタザルおよびムラグリタザルなどがある（図３参照）。それらは、ＩＩ型糖尿病および異脂肪血症の治療に用いられる。しかしながら、米国ＦＤＡによって確認されたこれら薬剤についての毒性の懸念がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】US8822519B2
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Guan, Y. J. Am. Soc. Nephrol, 2004, 15, 2801-2815
【非特許文献２】Berger, J. et al., The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274 (10), 6718-6725
【非特許文献３】Kasuga, J. et al., Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 5177-5190
【非特許文献４】Peng, Yi-Hui, Structure based drug design of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) agonists, Doctoral Dissertation, National Tsing Hua University, 2010
【非特許文献５】Kumar A, Hasamnis A. A clinical update on peroxisome proliferator-activated receptors. Syst Rev Pharm 2010; 1:175-81
【非特許文献６】Neher MD, Weckbach S, Huber-Lang MS, Stahel PF. New insights into the role of peroxisome proliferator-activated receptors in regulating the inflammatory response after tissue injury. PPAR Res. 2012; 2012:728461
【非特許文献７】C. H. Lee, O. K. Park, K. Y. Yoo et al., "The role of peroxisome proliferator-activated receptor γ, and effects of its agonist, rosiglitazone, on transient cerebral ischemic damage, " Journal of the Neurological Sciences, vol. 300, no. 1-2, pp. 120-129, 2011
【非特許文献８】R. C. King, O. A. R. Binns, F. Rodriguez et al., "Reperfusion injury significantly impacts clinical outcome after pulmonary transplantation, " Annals of Thoracic Surgery, vol. 69, no. 6, pp. 1681-1685, 2000
【非特許文献９】M. Okada, S. F. Yan, and D. J. Pinsky, "Peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) activation suppresses ischemic induction of Egr-1 and its inflammatory gene targets, " FASEB Journal, vol. 16, no. 14, pp. 1861-1868, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
以上の点を考慮して、ＰＰＡＲの活性または発現を調節する現在利用可能な薬剤は、主として、チアゾリジンジオン主骨格を有するもの、またはＨＭＧ−ＣｏＡ類縁体である。臨床的に安全かつ有功なＰＰＡＲγ作動薬の選択は限られている。現在利用可能なＰＰＡＲγ作動薬はなおも、副作用のリスクの可能性がある。ＰＰＡＲγ関連の障害または疾患の治療で用いることができる新規なＰＰＡＲγ調節剤（モジュレーター）を提供することが必要とされている。
【００２３】
ＵＳ３０３１４５０には、下記式を有する置換されたピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン化合物が開示されている。
【００２４】
【化１】
2018505186.tif 000003
式中、置換基Ｒ１からＲ４のうちの２個、３個または４個全てが、アミノ、低級アルキルアミノ、ジアルキルアミノ（そのアルキル部分は、１から１２個の炭素原子を有する。）、モノ−（ヒドロキシ−低級アルキル）アミノ、ジ−（ヒドロキシ−低級アルキル）−アミノ、（ヒドロキシ−低級アルキル）−アルキルアミノ（そのアルキル部分は、１から１２個の炭素原子を有する。）、（低級アルコキシ−低級アルキル）−アミノ、低級アルケニル−アミノ、シクロヘキシル−アミノ、ハロフェニル−アミノ、ニトロフェニル−アミノ、（低級アルコキシ−フェニル）アミノ、［（ジ−低級アルキル−アミノ）−フェニル］−アミノ、ベンジルアミノ、セミカルバジジル、ヒドラジニル、グアニジル、エチレンイミノ、ピペリジル、低級アルキル−ピペリジル、低級アルコキシ−ピペリジル、ヒドロキシ−ピペリジル、ピロリジル、低級アルキル−ピロリジル、低級アルコキシ−ピロリジル、ヒドロキシ−ピロリジル、モルホリル、低級アルキル−モルホリル、低級アルコキシ−モルホリル、ヒドロキシ−モルホリル、テトラヒドロピリジル、低級アルキル−テトラヒドロピリジル、低級アルコキシ−テトラヒドロピリジル、ヒドロキシテトラヒドロピリジル、ヘキサメチレンイミノ、低級アルキル−ヘキサメチレンイミノ、低級アルコキシ−ヘキサメチレンイミノ、ヒドロキシ−ヘキサメチレンイミノ、テトラヒドロキノリル、低級アルキル−テトラヒドロキノリル、低級アルコキシ−テトラヒドロキノリル、ヒドロキシ−テトラヒドロキノリル、ピペラジル、低級アルキルピペラジル、低級アルコキシ−ピペラジル、ヒドロキシ−ピペラジルおよびＮ′−低級アルキルピペラジルからなる群から選択される塩基性部分であり、残りの置換基Ｒ１からＲ４は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、メルカプト、低級アルキル、フェニル、低級アルコキシ、ジ−低級−アルキル−アミノ−低級アルコキシおよび低級アルキル−チオ、フェニル−チオ、ベンジル−チオ、低級アルコキシ−低級アルコキシ、それらの無毒性アルカリ金属塩およびそれらの無毒性酸付加塩からなる群から選択される。これらの化合物の中で、ジピリダモール（dipuridamole）が特に興味深いものである。
【００２５】
ジピリダモールは、下記構造式（Ｉ）を有する置換されたピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン化合物である。
【００２６】
【化２】
2018505186.tif 000004
【００２７】
ジピリダモールがホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）およびアデノシンの取り込みを阻害し得ることが知られている。しかしながら、動物試験により、高用量が治療的に許容されないことがわかる。これまでの研究により、高用量ジピリダモールが腎臓組織におけるアデノシンの蓄積、そして結果的に、特にネコおよびイヌなどの小型哺乳動物での血管収縮および腎血流低下という副作用の増加を引き起こすことが見出された（Arend LJ, Thompson CI, and Spielman WS. Dipyridamole decreases glomerular filtration in the sodium-depleted dog. Evidence for mediation by intrarenal adenosine. Circ Res 56: 242-251, 1985; Thompson CI, Sparks HV, and Spielman WS. Renal handling and production of plasma and urinary adenosine. Am J Physiol Renal Fluid Electrolyte Physiol 248: F545-F551, 1985; Arend LJ, Bakris GL, Burnett JC Jr Megerian C, and Spielman WS. Role for intrarenal adenosine in the renal hemodynamic response to contrast media. J Lab Clin Med 110: 406-411, 1987; Katholi RE, Taylor GJ, McCann WP, Woods WT Jr, Womack KA, McCoy CD, Katholi CR, Moses HW, Mishkel GJ, and Lucore CL. Nephrotoxicity from contrast media: attenuation with theophylline. Radiology 195: 17-22, 1995)。さらに、Linら(Lin JJ, Churchill PC, and Bidani AK. The effe
ct of dipyridamole on the initiation phase of postischemic acute renal failure in rats. Can J Physiol Pharmacol 65: 1491-1495, 1987）は、ジピリダモールの投与が、虚血後急性腎不全を患うマウスの状態を増悪させることを開示している。従って、ジピリダモールは小型哺乳動物での使用には適さないと考えられる。ジピリダモールの静注によって核医学での心拍動記録で使用される血管拡張を誘発することが、短期間中に多量のジピリダモールを投与することが低血圧を引き起こす例として役立つ。従って、臨床処置でのジピリダモールの治療用量を減らす方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
発明の概要
本発明において、ある種の置換されたピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン化合物、例えばジピリダモールがＰＰＡＲγの発現および核転座を促進する能力を有することが認められている。従って、本発明は、ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン主構造を有する新規な種類のＰＰＡＲγ調節剤（モジュレーター）、ならびにそのようなＰＰＡＲγ調節剤を用いてＰＰＡＲγ関連の障害もしくは疾患、例えばインスリン耐性、耐糖能異常、ＩＩ型糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、血管心臓障害、アテローム性動脈硬化、異脂肪血症、肥満および症候群Ｘ、心血管疾患、炎症および神経疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、虚血性脳卒中、脊髄損傷、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患、眼疾患、ウィルス感染、多嚢胞卵巣、炎症性腸疾患、喘息、骨の疾患、加齢および長寿、薬物代謝、創傷治癒、座瘡、ミトコンドリア機能障害疾患、虚血性脳卒中、腎疾患、肝臓疾患、肺疾患、心血管疾患、自己免疫障害、および全身性炎症応答症候群（敗血症）を予防または治療する方法を提供する。本発明はまた、ＰＰＡＲγの発現および核転座を増加させる方法に関するものでもある。
【００２９】
１実施形態において、本発明は、ＰＰＡＲγ関連の障害もしくは疾患の予防もしくは治療方法であって、処置を必要とする対象者（被験者）に対して、治療上有効量のＰＰＡＲγ調節剤、好ましくは下記式Ｉの化合物：
【００３０】
【化３】
2018505186.tif 000005
【００３１】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは独立に、複素環およびジ（ヒドロキシアルキル）アミノからなる群から選択される。］またはそれの医薬として許容される塩（製薬上許容される塩）を投与することを含む方法に関するものである。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、ＰＰＡＲγ関連疾患の予防もしくは治療方法であって、処置を必要とする対象者に対して、医薬として許容される細胞透過性薬剤送達系にに封入された治療上有効量の式Ｉの化合物またはそれの医薬として許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００３３】
本発明はさらに、ＰＰＡＲγ関連の障害もしくは疾患を予防もしくは治療するための医薬の製造における式Ｉの化合物またはそれの医薬として許容される塩の使用に関するものである。好ましい実施形態において、その医薬は、医薬として許容される細胞透過性薬剤送達系に封入された式Ｉの化合物もしくはそれの医薬として許容される塩を含む。
【００３４】
本発明はさらに、医薬として許容される細胞透過性薬剤送達系に封入された治療上有効量の式Ｉの化合物もしくはそれの医薬として許容される塩を含む、ＰＰＡＲγ関連疾患の予防もしくは治療のための医薬組成物に関するものである。好ましい実施形態において、当該化合物はジピリダモールであり、細胞透過性薬剤送達系はリポソームである。
【００３５】
以下のセクションで、本発明について詳細に説明する。本発明の他の特徴、目的および利点は、その詳細な説明および本発明の特許請求の範囲で容易に知ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）薬剤の化学構造を示す図である。
【図２】スタチン薬剤の化学構造を示す図である。
【図３】ＰＰＡＲ二重作動薬（αおよびγ）薬剤の化学構造を示す図である。
【図４ａ】遊離型で送達される場合のジピリダモールの作用を示す図式である。
【図４ｂ】細胞透過性薬剤送達系で送達される場合のジピリダモールの作用を示す図式である。
【図５】リポソームの直径のデータを示す図である。
【図６】処置後のＬＰＳ誘発敗血症マウスの生存率を示す図である。
【図７ａ】ジピリダモール（遊離型）およびジピリダモールリポソームで処理したＨＥＫ２９３細胞でのＰＰＡＲγの発現を示す図である。
【図７ｂ】ジピリダモール（遊離型）およびジピリダモールリポソームで処理したＨＥＫ２９３細胞でのＰＰＡＲγの発現を示す図である。
【図８】ジピリダモール（遊離型）およびジピリダモールリポソームで処理したＨＥＫ２９３細胞の生存度を示す図である。
【図９】処理後の肝臓マーカー（ＡＳＴ、ＡＬＴ）および腎臓マーカー（ＢＵＮ、クレアチニン）を示す図である。
【図１０】処理後の肝臓組織のＨＥ染色を示す図である。
【図１１】処理後の肺組織のＨＥ染色を示す図である。
【図１２ａ】処理後の腎臓での、ＰＰＡＲγ発現のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図１２ｂ】処理後の肝臓での、ＰＰＡＲγ発現のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図１３ａ】ジピリダモールおよびジピリダモールリポソームの血圧に対する効果を示す図である。
【図１３ｂ】ジピリダモールおよびジピリダモールリポソームの血圧に対する効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本明細書において別段の断りがない限り、本発明との関連で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって共通に理解される意味を有するものである。それらの用語の意味および範囲は明瞭であるべきであるが、潜在的に曖昧性がある場合には、本明細書で提供される定義が、辞書的定義や外部的定義に優先する。
【００３８】
本開示に従って使用される場合、別段の断りがない限り、次の用語は、下記の意味を有するものと理解されるものである。
【００３９】
本明細書で使用される「ＰＰＡＲγ調節剤」という用語は、ＰＰＡＲγの発現または核転座を調節することができる薬剤を指す。
【００４０】
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、１から６個の炭素原子、特には１から４個の炭素基を有する飽和直鎖もしくは分岐炭化水素基を指し、例えばメチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピル、１−エチル−２−メチルプロピルである。Ｃ１−Ｃ４−アルキルは、例えばメチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピルまたは１，１−ジメチルエチルを意味する。
【００４１】
本明細書で使用される「複素環」という用語は、５から８個の環員を有する単環式基であって、各場合で、これらの環員のうちの１、２、３もしくは４個が互いに独立に酸素、窒素および硫黄からなる群から選択されるヘテロ原子であるものを指す。
【００４２】
本明細書で使用される「予防する」または「予防」という用語は、感受性の対象者の症状発症を遅延させること、または疾患発生を低減させることを指す。
【００４３】
本明細書で使用される「治療する」または「治療」という用語は、感受性の対象者の症状を軽減および／または改善すること、またはある種の致死的障害もしくは疾患の対象者の生存率を高めることを指す。
【００４４】
本明細書で使用される「ＰＰＡＲγ関連の障害もしくは疾患(状態)」という用語は、ＰＰＡＲγの調節が有用である障害または疾患を指す。例えば、そのような障害または疾患には、インスリン耐性、耐糖能異常、ＩＩ型糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、血管心臓障害、アテローム性動脈硬化、異脂肪血症、肥満および症候群Ｘ、心血管疾患、炎症および神経疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、虚血性脳卒中、脊髄損傷、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患、眼疾患、ウィルス感染、多嚢胞卵巣、炎症性腸疾患、喘息、骨の疾患、加齢および長寿、薬物代謝、創傷治癒、座瘡、ミトコンドリア機能障害疾患、虚血性脳卒中、腎疾患、肝臓疾患、肺疾患、心血管疾患、自己免疫障害、全身性炎症応答症候群（敗血症）などがある。
【００４５】
本明細書で使用される「対象者」という用語は、動物、特には哺乳動物を指す。一つの好ましい実施形態において、「対象者」という用語は、ヒトを指す。別の好ましい実施形態において、「対象者」という用語は、ネコおよびイヌなどのコンパニオン・アニマルを指す。
【００４６】
本明細書で使用される「治療上有効量」という用語は、単独で、または治療効力を示すＰＰＡＲγ関連の障害もしくは疾患の治療のための他の治療／医薬と組み合わせて使用される有効成分の量を指す。
【００４７】
「担体」、「医薬として許容される担体」、「細胞透過性薬剤送達系」または「医薬として許容される細胞透過性薬剤送達系」という用語は、医薬有効成分を封入することができる粒子を指す。本発明に好適な細胞透過性薬剤送達系の例には、ニオソーム、ポリマーソーム、ナノ粒子、リポソーム、ナノ懸濁粒子、固体脂質ナノ粒子、磁性ナノ担体、ミセル、高分子複合体、粒子状薬剤担体などがある。
【００４８】
文脈によって他の形で必要とされない限り、単数の用語は複数のものを含むものであり、複数の用語は単数のものを含むものである。
【００４９】
本発明者らは驚くべきことに、ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン構造を有する化合物が、ＰＰＡＲγの発現および核転座を高め得ることから、新規な種類のＰＰＡＲγ調節剤として働き得ることを見出した。好ましい実施形態において、そのピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン化合物はジピリダモールである。
【００５０】
従って本発明は、ＰＰＡＲγ関連の障害もしくは疾患の予防もしくは治療方法であって、処置を必要とする対象者に対して、治療上有効量の下記式（Ｉ）の化合物：
【００５１】
【化４】
2018505186.tif 000006
【００５２】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれは独立に、複素環およびジ（ヒドロキシアルキル）アミノからなる群から選択される。］またはそれの医薬として許容される塩を投与することを含む方法を提供する。
【００５３】
１実施形態において、Ｒ１およびＲ３は複素環、好ましくはピペリジルであり、Ｒ２およびＲ４はジ（ヒドロキシアルキル）アミノ、好ましくはＮ，Ｎ−ジ（ヒドロキシエチル）アミノである。
【００５４】
好ましい実施形態において、当該化合物はジピリダモールである。
【００５５】
別の実施形態において、当該化合物は、細胞透過性薬剤送達系、例えばニオソーム、ポリマーソーム、ナノ粒子、リポソーム、ナノ懸濁粒子、固体脂質ナノ粒子、磁性ナノ担体、ミセル、高分子複合体または粒子状薬剤担体に封入されている。
【００５６】
好ましい実施形態において、前記細胞透過性薬剤送達系はリポソームである。別の実施形態において、前記リポソームは、約１００から３００ｎｍ、好ましくは約１５０から２８０ｎｍ、より好ましくは約１８０から２７０ｎｍの範囲の直径を有する。
【００５７】
ジピリダモールを遊離型で投与する場合、それが細胞膜上の受容体に結合し、好ましくない副作用を引き起こすシグナル伝達経路を活性化することが、当業界では知られている。本発明者らは、ジピリダモールがＰＰＡＲγ発現および核転座を促進することから、下流シグナル伝達経路を活性化し得ることを見出した。ＰＰＡＲγシグナル伝達経路の活性化は、ＰＰＡＲγ失活に関連することが知られている多くの疾患の治療を促進することができる。
【００５８】
図４ａには、ジピリダモールを遊離型で投与する場合、それは主として細胞外で作用し、アデノシンの蓄積を促進し、それによって血行動態障害および血圧変化を生じることが示されている。図４ｂには、細胞内のジピリダモールがＰＰＡＲγシグナル伝達経路を活性化することができ、それがＬＰＳによって生じる腎臓損失を阻害することが可能であることが示されている。そのような場合、細胞外のジピリダモールの好ましくない作用を回避することができる。下記の実施例において、本発明は、ジピリダモールを細胞に直接送達することにより、細胞膜上の受容体への結合を回避して、酸化的ストレスおよびアデノシンの蓄積によって生じる血管収縮などの副作用を低減することが可能であることを示すものである。
【００５９】
ナノ粒子薬剤担体が細胞に進入する方途は、従来の薬剤のものと異なる。従来の薬剤が、拡散によって細胞に進入し、それは用量依存的である。すなわち、血中薬剤濃度が高いほど、細胞中の薬剤濃度は高くなり、薬剤は細胞質のみに進入することができる。ナノ粒子薬剤送達系は、エンドサイトーシスを介して細胞によって吸収され、細胞進入後にはリソソーム作用性である。注射後の初期段階で、ナノ粒子薬剤送達系の濃度は、時間依存的に高くなる。
【００６０】
エンドサイトーシスは、細胞外材料を細胞に取り込むプロセスである。このプロセスは、３種類、すなわち食作用、飲作用および受容体介在エンドサイトーシスに分類することができる。食作用は、特殊化した細胞でのみ起こる。これらの細胞は、細胞外材料による刺激があると増殖および凝集し、分解するために細胞中のリソソームにそれらを飲み込む。このプロセスは、免疫系のマクロファージおよび好中球で生じる。飲作用は、細胞膜の陥入によるポケット形成し、それを次に細胞内に摘み取って小胞を形成することで、細胞内に細胞外の液および分子を内在化する方法である。次に、その小胞がサイトゾル中に移動し、エンドソームおよびリソソームなどの他の小胞と融合する。
【００６１】
担体の構造に応じて、飲作用は、液相飲作用および吸着性飲作用という２種類に分類することができる。担体が細胞と相互作用する官能基を持たない場合、細胞は、液相飲作用によって薬剤担体を飲み込む。このプロセスは遅く、細胞膜周囲の担体濃度によって決まる。吸着性飲作用は、担体が疎水性基を有するか正電荷を有する場合に生じる。そのような担体は、細胞膜によって物理的に吸着され、細胞の飲み込み能力を高める。上記の２種類のエンドサイトーシスは非特異的プロセスであり、薬剤をそれらの標的に送達するのには適さない。ターゲティングは、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）を介してある種の癌細胞においてのみ達成することができる。
【００６２】
受容体介在エンドサイトーシスは、吸収される分子に特異的な受容体部位を有するタンパク質を含む細胞膜小胞の内向き出芽によって、細胞が分子を吸収する（エンドサイトーシス）プロセスである。薬剤担体が細胞上の受容体に結合した後に、内因性シグナルにより、細胞膜が被覆小窩の形成を開始する。被覆小窩の表面積は、細胞膜の１から２％に達する。被覆小窩は細胞膜から脱離し、細胞内に進入して、細胞に被覆小胞を形成し、次にエンドソームを形成して、跳躍運動で細胞内に移動する。エンドソームは、微小管および小胞を含む複雑な構造である。その小胞はゴルジと融合することができる。プロトンポンプのため（ＡＴＰａｓｅ）、エンドソームは通常は酸性となる。次に、エンドソームはリソソームと融合して、二次リソソームを形成する。
【００６３】
細胞膜は、ミトコンドリア、細胞質または核における標的部位への治療薬の効率的送達のために克服すべき障壁である。疎水性リン脂質は、治療薬の輸送を妨害する細胞膜の主要成分である。従って、各種送達系、例えばリポソーム、ナノ粒子およびウィルスベクターが、膜を通って小分子、ペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドを移動させるために開発されている。本明細書において、そのような薬剤送達方法は、細胞透過性薬剤送達系と称される。
【００６４】
多くの細胞透過性薬剤送達系（リポソーム、細胞透過性ペプチド、カチオン性ポリマー複合体およびポリマーナノ粒子）が、治療薬の細胞内送達のために研究されている。それらは、一連の膜障壁を横断して、細胞における薬剤作用部位に到達するように適応させる必要がある。このプロセス中、薬剤分子のかなりの部分が、各連続的障壁で失われる。これらの障壁には、エンドサイトーシスによる薬剤−担体の細胞会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）および内在化；薬剤もしくは薬剤−担体の細胞質への細胞内輸送および放出；薬剤もしくは薬剤−担体の核またはいずれか他の細胞オルガネラへの細胞質転座；および核／オルガネラ取り込みなどがある。細胞は、特異的機能を有するいくつかの細胞内オルガネラを含む。これらの特定のオルガネラへの治療薬の細胞内ターゲティングは、治療効力を大幅に高めるだけでなく、非特異的効果および従って毒性を低下させると予想される。従って、各種細胞透過性薬剤送達系を用いる治療薬の細胞内標的特異的送達を達成することに大いに関心が持たれている。
【００６５】
薬剤のエンドサイトーシスを促進する細胞透過性薬剤送達系には、ナノサイズポリマー担体およびリポソームなどがある。薬剤の特性および製造プロセスに応じて、ナノサイズ薬剤担体は、ナノ粒子、ナノリポソーム、ナノ懸濁粒子、固体脂質ナノ粒子、磁性ナノ担体などに分類することができる。
【００６６】
上記の細胞透過性薬剤送達系に加えて、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、生分解性ナノ粒子およびウィルスベクターを、薬剤の細胞への透過を促進するための送達系として用いることもできる。
【００６７】
ＲＧＤペプチドの細胞内在化には、主として細胞膜でのクラスリン、カベオラおよびマクロピノサイトーシス飲食作用経路が介在している。細胞膜でのエンドサイトーシス輸送の主要エフェクターの一つとして、クラスリン介在エンドサイトーシスが、リガンドの受容体依存性エンドサイトーシスを介した細胞への大型細胞外粒子の輸送に関与している。ペプチド内在化の別経路は、カベオラ介在エンドサイトーシスを介したものである。この経路による内在化は、細胞膜での脂質ラフトによって促進され；これらのラフトは、エンドソームを形成するカベオリン−１タンパク質を含み、それがその後に細胞全体に輸送される。対照的に、マクロピノサイトーシスには、小細胞外粒子の細胞への液相エンドサイトーシスが関与する。αＶβ３インテグリンがインテグリン代謝の調節の一環としてのクラスリン依存性およびカベオラ依存性の両方のエンドサイトーシス経路を介して内在化され得ることが示されている。従って、ＲＧＤペプチドは、細胞透過薬剤送達系には理想的である（Cam A, Sivaguru M, Gonzalez de Mejia E. Endocytic mechanism of internalization of dietary peptide lunasin into macrophages in inflammatory condition associated with cardiovascular disease. PLoS One. 2013 Sep 5;8(9):e72115）。
【００６８】
細胞膜が大型の親水性タンパク質、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの細胞内送達の主要な障壁を構成することから、細胞透過性ペプチド類（ＣＰＰ類）が、この障壁を克服すべく研究されてきた。これらのＣＰＰ類は、細胞膜を横断してタグ付けされた分子またはコロイド薬剤送達系を細胞質および核に輸送することができる。ＣＰＰ類の特徴は、一続きの９から１６のカチオン性アミノ酸残基の存在によるものであり；最も一般的に研究されているＣＰＰ類には、ＨＩＶ−１トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチド、ＨＳＶＶＰ−２２（単純ヘルペスウィルス１型転写因子）ペプチドおよびペネトラチンなどがある。これらのＣＰＰ類が細胞に進入する詳細な機序を決定するのに、いくつかの理論が提案されている。例えば、細胞膜を通るＴＡＴ透過が受容体およびトランスポーターから独立であることが明らかになっており、リン脂質二重層を不安定化することで逆ミセルを形成することによって細胞に進入することが示唆されている。ＴＡＴカップリングの主たる利点は、分子の効率的送達とともに、カップリングした分子の生理活性が防止され、輸送される分子の大きさも律速因子ではないことである。
【００６９】
ＴＡＴは、細胞内送達を促進するだけでなく、核送達も促進することが示唆されていることから、核酸送達について研究されてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合したＴＡＴペプチドは、オリゴヌクレオチドを核に送達することが明らかになっている。内在化した後、ＴＡＴペプチドは、ゴルジ体のマーカーであるＢＯＤＩＰＹ−セラミドとともにゴルジ体内部で共存することも認められている。従って、後期エンドソームへの進入なしでの早期エンドソームからゴルジ体への直接輸送がある可能性は大いにある。ペプチドが小胞体からのサイトゾルに進入する分泌経路が存在する可能性があると考えられる。遺伝子治療は、遺伝的障害、後天性障害および神経変性障害の治療において大きな可能性を示している。非ウィルス生遺伝子送達法の中で、リポソーム、カチオン性脂質−ＤＮＡ、ポリマー錯体などの各種の薬剤送達系およびポリマーについて現在検討されている。非ウィルス性遺伝子発現ベクターの細胞取り込みが比較的不十分であることを克服するため、ベクターへのＴＡＴペプチド結合について研究が行われている。
【００７０】
Ｋｌｅｅｍａｎらは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを介してＴＡＴに共役的にカップリングしたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）による肺胞基底上皮細胞での遺伝子発現を示しており、それは非結合ＰＥＧ錯体と比べて気管内投与後のマウス肺でイン・ビボでの高いトランスフェクション効率を示した。Ｒｕｄｏｌｐｈらによる同様の研究で、二量体ＨＩＶ−１  ＴＡＴに結合した固体脂質粒子が、肺への遺伝子送達向上を示した。
【００７１】
ＣＰＰ類は代表的には、リジンもしくはアルギニンなどの高い相対的存在度の正電荷を有するアミノ酸を含むか、極性／荷電アミノ酸および非極性の疎水性アミノ酸の交互パターンを含む配列を有するアミノ酸組成を有する。これら２種類の構造は、それぞれ多カチオン性または両親媒性であると称される。第３の種類のＣＰＰ類は、細胞取り込みに必須である低正味荷電または疎水性のアミノ酸基を有する非極性残基のみを含む疎水性ペプチドを含む。細胞透過性ペプチドの中で、アルギニン豊富細胞透過性ペプチドが最も広く研究されてきた。例としては、ＨＩＶトランス活性化因子タンパク質ＴＡＴからのＴＡＴペプチド、ペネトラチン、ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質からの１６アミノ酸ドメイン、フロックハウスウィルス（ＦＨＶ）コートペプチド（配列３５から４９）、およびオリゴアルギニン類などがある。
【００７２】
生分解性ナノ粒子介在細胞内送達は、エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、および異なる細胞内区画への選別が関与する動的プロセスである。ＮＰ表面およびそれの細胞表面との相互作用が生分解性ナノ粒子の取り込みおよび細胞内輸送を制御し、従って封入された治療剤のそれを制御するように思われる。
【００７３】
ウィルスベクターは、遺伝物質を細胞に送達するために分子生物学者が一般に使用される手段である。このプロセスは、生体内で（イン・ビボ）または細胞培養液で（イン・ビトロ）行うことができる。従って、ウィルスベクターは、細胞透過性薬剤送達系での使用のための利用可能な選択肢である。
【００７４】
細胞透過性ペプチドおよび生分解性ナノ粒子は、薬剤を調整するだけでなく、キャリアに結合されることで膜透過効果を促進することができる。
【００７５】
ジピリダモールは、受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ＥＮＴ）阻害剤である。ヌクレオシド輸送体（ＮＴ類）は、細胞膜を横断するヌクレオシド類の輸送において必須の役割を果たす。ジピリダモールは、アデノシンの膜貫通拡散を促進する受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ＥＮＴ）を遮断する。ジピリダモールは、主として低酸素症または炎症時に生じるようなアデノシンの細胞外形成増加の状況で、細胞外内因性アデノシン濃度を高める。しかしながら、ジピリダモールによって誘発される細胞外内因性アデノシン濃縮は血管拡張を引き起こし、それは臓器潅流の代謝制御に寄与する。ジピリダモール負荷心筋イメージングは、冠動脈疾患を診断および評価するための良好な広く使用される技術である。ＩＶジピリダモールによる冠動脈拡張は、ＣＡＤ患者における冠盗血と一致する側副依存性心筋への血流における大幅な低下に関連する。さらに、腎臓、肺、膵臓、脳などの多くの臓器におけるジピリダモールの血管収縮剤効果および血管拡張剤効果を開発したさらなる研究があった。
【００７６】
ジピリダモールは、一部の臓器における血管収縮を引き起こすだけでなく、低血圧およびその後の眩暈などの副作用や心臓血管の拡張による動悸も生じ得る。血圧低下の効果により、ジピリダモールは、敗血症、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、急性肺傷害、急性肝臓損傷、心筋梗塞および心腎臓症候群（これらに限定されるものではない）を有する患者などの生理的に不安定な患者の治療に不適切となる。さらに、ジピリダモールの血流制限効果は、血管豊富な臓器が関与する疾患の治療でのそれの使用を制限するものである。
【００７７】
ジピリダモールの薬理作用は主として細胞膜上でのものであることから、細胞内シグナル伝達およびＰＰＡＲγ調節を促進しながら膜上の受動拡散型ヌクレオシド輸送体との結合を回避する膜透過用に設計された送達系は、心血管拡張増加および局所血流制限による組織血流低下の効果を防止することができる。従って、血圧低下による急性および重度の患者におけるジピリダモールの臨床的応用における制限を解消することができる。
【００７８】
ジピリダモールは、非選択的ホスホジエステラーゼ阻害薬でもある。細胞内薬剤送達の増加は、細胞内ＰＤＥに対するジピリダモールの阻害を促進する。ＰＤＥファミリーの構成員は、特有の細胞特異的および組織特異的分布を有する。ジピリダモールは、各種組織における細胞膜上または細胞質内のＰＤＥの分布プロファイルに応じてＰＤＥ調節に関連する疾患を治療するための抗炎症、抗酸化、抗線維症および平滑筋弛緩剤として用いることができる。
【００７９】
ＰＤＥ類の特有の細胞特異的および組織特異的分布を、下記の表に示してある（ＵＳ２０１２／００６５１６５参照）。
【００８０】
2018505186.tif 000007
【００８１】
ジピリダモールが膜を透過する能力が高くなることで、特定組織におけるＰＤＥ３、ＰＤＥ５およびＰＤＥ８の阻害を促進し、ＰＤＥ３、ＰＤＥ５およびＰＤＥ８関連の疾患におけるジピリダモール治療効力を与えることができる。そのような場合、ジピリダモールは、他のＰＤＥ５阻害薬のように下部尿路機能不全および勃起不全を治療するのに用いることができる。さらに、ジピリダモールは非選択的ＰＤＥ阻害薬であることから、それは、膜貫通薬剤送達系によって送達される時に、ＰＤＥ関連疾患の治療に用いることができる。
【００８２】
１実施形態において、本発明の式（Ｉ）の化合物は、細胞への送達のための細胞透過性薬剤送達系に封入されている。好ましい実施形態において、細胞透過性薬剤送達系は、ニオソーム、ポリマーソーム、ナノ粒子、リポソーム、ナノ懸濁粒子、固体脂質ナノ粒子、磁性ナノ担体、ミセル、高分子複合体または粒子状薬剤担体である。好ましくは、細胞透過性薬剤送達系はリポソームである。本発明に好適なリポソームは、約１００から３００ｎｍ、好ましくは約１５０から２８０ｎｍ、より好ましくは約１８０から２７０ｎｍの範囲の直径を有する。
【００８３】
本発明の別の実施形態において、細胞透過性薬剤送達系は、１μｍ未満の直径を有するニオソーム、ポリマーソーム、またはポリマーであることができる。表面電位、親水性／疎水性、大きさ、形態、形状および／または表面曲率に基づいて変更を行うことができる。
【００８４】
本発明のリポソーム製剤は、各種性質の小胞（例えば、単ラメラまたは多ラメラ）、組成、大きさおよび特性を含むことで、多様な組成、ｐＨおよび浸透力の水系媒体を包み込むことができる。好ましい実施形態において、リポソーム脂質層膜の主要構成成分は、下記に列記のものなどの天然もしくは合成リン脂質からなる群から選択される。   
−１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）
−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）
−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）
−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）
−１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）
−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエルハノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｌｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＭＰＥ）
−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエルハノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｌｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＰＰＥ）
−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエルハノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｌｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＳＰＥ）
−１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエルハノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｌｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ）
−１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）
−１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）
−１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）
−１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）
−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＭＰＧ）
−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）
−１，２−ジステアロイル−ｓ／ｉ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＳＰＧ）
−１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＯＰＧ）
−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）
−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＰＰＡ）
−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＰＰＳ）
−ホスファチジルセリン（ＰＳ）、および
−天然Ｌ−ａ−ホスファチジルコリン（鶏卵から、ＥＰＣ、または大豆から、ＳＰＣおよびＨＳＰＣ）。
【００８５】
好ましいリン脂質は長鎖飽和リン脂質であり、例えば１２より多い、好ましくは１４より多い、より好ましくは１６より多い、最も好ましくは１８より多い炭素原子のアルキル鎖を有するものである。
【００８６】
本発明による使用に好ましいリポソーム組成物は好ましくは、リポソームが単ラメラおよび／または多ラメラであり、下記のものを含むものである：
（ｉ）１から１００、好ましくは４０から７０ｍｏｌ％の好ましくはＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ、ＭＰＰＣ、ＰＭＰＣ、ＳＰＰＣ、ＰＳＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＳ、ＰＳ，ＥＰＣ、ＳＰＣおよびＨＳＰＣからなる群から選択される生理的に許容されるリン脂質；
（ｉｉ）１から１００、好ましくは４０から７０ｍｏｌ％のスフィンゴ脂質、好ましくはスフィンゴミエリン；
（ｉｉｉ）１から１００、好ましくは４０から７０ｍｏｌ％の界面活性剤、好ましくは疎水性アルキルエーテル（例えばＢｒｉｊ）、アルキルエステル、ポリソルベート、ソルビタンエステルおよび／またはアルキルアミドを特徴とするもの；
（ｉｖ）５から１００、好ましくは５０から１００ｍｏｌ％の両親媒性ポリマーおよび／またはコポリマー、好ましくは少なくとも１個の親水性ポリマーまたはコポリマー、例えばポリエチレングリコールのブロック、および少なくとも１個の疎水性ポリマーまたはコポリマー、例えばポリ（ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ブチレンオキサイド）、ポリ（スチレンオキサイド）、ポリ（スチレン）、ポリ（エチルエチレン）、またはポリジメチルシロキサンのブロックを含むブロックコポリマー；
（ｖ）０から６０ｍｏｌ％、好ましくは２０から５０ｍｏｌ％の毒素保持促進化合物、好ましくはステロール誘導体、好ましくはコレステロール；または
（ｖｉ）０から３０ｍｏｌ％、好ましくは１から５ｍｏｌ％の立体安定剤、好ましくはＰＥＧ化化合物、好ましくはＰＥＧ化脂質、より好ましくはＤＳＰＥ−ＰＥＧ。
【００８７】
好ましい実施形態では、リポソーム様小胞はポリマー製であり、脂質を含まないことから、それは形式的にはリポソームとは考えられないが、ポリマーソームと称される。しかしながら、本発明に関しては、ポリマーソームは、本発明および特許請求の範囲を定義するのに使用されるリポソームという用語によって包含されるものである。
【００８８】
同様に、合成界面活性剤製であり、脂質を含まないリポソーム様小胞はニオソームと称される。しかしながら、本発明に関して、ニオソームは、本発明および特許請求の範囲を定義するのに使用されるリポソームという用語によって包含されるものである。
【００８９】
本発明の１実施形態において、異なる高分子ポリマーの重合を用いることができ、それは、ＡＢＡおよびＢＡＢなどのトリブロックコポリマー型でのもの、およびＰＬＬＡ−ＰＥＧ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、ＰＬＡ−ＰＥＧ、ＰＬＬＡ−ｍＰＥＧ、ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧおよびＰＬＡ−ｍＰＥＧなどのブロックコポリマー型でのものを含む。星型およびＬ型などの各種形状を設計することができ、ＰＥＧ−（ＰＬＧＡ）８、ＰＥＧ−（ＰＬＬＡ）８およびＰＥＧ−（ＰＤＬＡ）８Ｓｔａｒのブロックコポリマーなどがある。ＰＥＧ化修飾を用いて、ポリマービヒクルおよびリポソームなどのビヒクルを修飾することで、血漿タンパク質の結合速度低下の効果を達成することができる（Park, J. et al., (2009) "PEGylated PLGA nanoparticles for the improved delivery of doxorubicin. Nanomedicine. " 5(4):410-418.; Luck, M. et al., (1998) "Plasma protein adsorption on biodegradable microspheres consisting of poly(D,L-lactide-co-glycolide), poly(L-lactide) or ABA triblock copolymers containing poly(oxyethylene). Influence of production method and polymer composition. " J. Control Release. 55(2-3):107-20.; and Sempf, K. et al, (2013) "Adsorption of plasma proteins on uncoated PLGA nanoparticles. " Eur. J. Pharm. Biopharm. 85(1):53-60を参照する。）。
【００９０】
動物用量は、体重に基づく単純変換によってヒト等価用量（ＨＥＤ）に外挿すべきではない。連邦食品医薬品局は、動物用量のヒト用量への外挿は、ｍｇ／ｍ２で表される場合が多いＢＳＡへの正規化によってのみ正確に行われると提案している。ヒト用量当量は、次の式：ＨＥＤ（ｍｇ／ｋｇ）＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×動物Ｋｍ／ヒトＫｍを用いてより適切に計算することができる。マウスで使用される用量をヒトについての表面積に基づく用量に変換するためには、２２．４ｍｇ／ｋｇ（バウアー（Ｂａｕｒ）のマウス用量）にマウスについてのＫｍ係数（３）を掛け、次にヒトについてのＫｍ係数（３７）で割る（下記の表を参照する。）。
ＦＤＡガイドライン案からのデータに基づく値
【００９１】
2018505186.tif 000008
【００９２】
ｍｇ／ｋｇ単位で表現される用量をｍｇ／ｍ２単位の用量に変換するためには、Ｋｍ値を掛ける。本発明によれば、マウスでのリポソーム−ジピリダモールの有効用量は１０ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇであり、ハムスターでは６から６０ｍｇ／ｋｇであり、ラットでは５から５０ｍｇ／ｋｇであり、モルモットでは３．７５から３７．５ｍｇ／ｋｇであり、ウサギでは２．５から２５ｍｇ／ｋｇであり、サルでは２．５から２５ｍｇ／ｋｇであり、イヌでは１．５から１５ｍｇ／ｋｇであり、ネコでは２．４から２４ｍｇ／ｋｇであり、ヒヒでは１．５から１５ｍｇ／ｋｇであり、小児では１．２から１２ｍｇ／ｋｇであり、成人では０．８１から８．１ｍｇ／ｋｇである。生物種間の薬剤感受性の差を考慮すると、生物種に限定しない最も広い用量範囲は０．４から１６０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．６から１２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．８ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇである。
【００９３】
以上、本発明について概説してきたが、下記の実施例を参照することで本発明についての理解をさらに深めることができ、それらの実施例は本発明の医薬組成物の製造のための例示的プロトコールならびに脳卒中の治療促進におけるそれの使用を提供するものである。当該実施例は例示目的でのみ提供されるものであり、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確製を確保すべく努力したが、当然のことながら、一部の実験誤差および逸脱は許容されるべきものである。
【００９４】
（実施例）
実施例１：ジピリダモールリポソームの製造
リン脂質に対して５ｍｏｌ％でＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを含むかそれを含まない、コレステロールのモルパーセントが５％から７５％である正電荷および中性電荷を含むリン脂質およびコレステロールを用いて、リポソームを製造した。小単ラメラ小胞を製造した。乾燥脂質フィルムを硫酸アンモニウムで水和させ、次に一連のポリカーボネート膜フィルターを通して押し出した。膜横断ｐＨ勾配または脱水−再水和を介してジピリダモールをリポソームに封入し、押し出されたリポソームの直径は１００から３５０ｎｍの範囲であった。リポソーム−ジピリダモールの直径は、図５に示したように約１６９から２７６ｎｍであった。
【００９５】
実施例２：ジピリダモールリポソームで処理したＨＥＫ２９３細胞
実施例２．１：ジピリダモールリポソームで処理した細胞におけるＰＰＡＲγの発現
アッセイで用いた細胞系は、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３であった。その細胞を、下記の表１に示した薬剤で処理した。
表１：実験計画
【００９６】
【表１】
2018505186.tif 000009
【００９７】
処理後０時間、３時間および１２時間で細胞を回収した。回収した細胞を緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ＝７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）１５０μＬで洗浄し、４℃にて３０００ｇで１０分間遠心した。サイトゾルタンパク質を含む上清を回収し、ペレットを緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ＝７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４２Ｍ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＤＴＴ、１．０Ｍ  ＰＭＳＦ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）５０μＬで再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートし、次に４℃にて１２０００ｇで１０分間遠心した。次に、核タンパク質を含む上清を回収し、ＰＰＡＲγの活性化の指標となるＰ６５タンパク質の発現をウェスタンブロッティングを用いて分析した。方法は次の通りである。
【００９８】
タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイを用いて測定した。６倍サンプル緩衝液（０．８ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％ＳＤＳ、６０％グリセリン、０．６Ｍ  β−メルカプトエタノール、０．０６％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）を核タンパク質５０μｇに加え、等容量の溶解緩衝液をサンプルに加えた。９５℃で１０分間加熱してタンパク質を変性させた後、サンプルを直ちに氷冷した。
【００９９】
次に、サンプルを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（１００Ｖ）によって分離し、湿式ブロッティングによってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、ＰＶＤＦ膜を室温で６０分間にわたり５％スキムミルクで処理して、非特異的結合をブロックした。その膜を、４℃で終夜にわたり一次抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。膜を、室温で６０分間にわたり二次抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、膜をＰＢＳでもう１回洗浄し、検出用の増強化学発光（ＥＣＬ）基質とともにインキュベートした。自動化学発光および蛍光撮像システム（ＵＶＰ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｕｍ）を用いて画像写真を撮った。対照群と比較した試験群でのＰＰＡＲγの発現発現を、図７ａ（１２時間）および図７ｂ（０および３時間）に示してある。
【０１００】
この実験で使用した一次抗体は、ウサギ−ヒトＰＰＡＲγ抗体（１：１０００）（カタログ番号：０７−４６６）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ；およびウサギ抗ヒトＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃ（１：１０００）（カタログ番号：ＧＴＸ６２４５７）、ＧｅｎｅＴｅｘである。この実験で使用した二次抗体は、マウス抗ウサギＨＲＰ（１：３０００）（ａｂ６７２１）、ｓｉｇｍａである。
【０１０１】
実施例２．２：ジピリダモールリポソームで処理した細胞の生存度
製造者説明書に従ってＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、日本）を用い、最初の処置から２４時間後に、生存細胞の数を評価し、プレート読取装置Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を用い、各ウェルの上清について波長４５０ｎｍでの光吸収率を測定した。データを図８に示してある。
【０１０２】
実施例３：ＬＰＳ誘発敗血症マウスでの生存率分析
この試験では、８から１２週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを用いた。それら動物は、午前６時から午後１８時の明周期で空調された環境で飼育し、標準齧歯類飼料を自由に摂取させた。ＬＰＳ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１１１：Ｂ４）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，  Ｍｉｌｗａｕｋｅ，  Ｗ，  ＵＳＡ）を、各使用時に新鮮に、無菌パイロジェンフリー水に溶かした。最初に、マウスにＬＰＳ（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、次に７２時間にわたり生存率を観察した。ＬＰＳの用量は、注射された動物の半数で２４時間より長い生存を示す予備実験によって決定した。ＬＰＳ処理の１時間後に、ジピリダモールを投与した。
【０１０３】
実施例４：血漿におけるバイオマーカーの検出
４．１：肝臓マーカー（ＡＳＴ、ＡＬＴ）および腎臓マーカー（ＢＵＮ、クレアチニン）
生化学測定用の血液検体を、実験前および実験２４時間の時点で各動物について採取した。サンプルを遠心によって分離し、血清を分析まで−８０℃で保存した。血清総コレステロールを、Ｍｅｒｃｋアッセイキット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を用いて測定した。血清血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）も、ＳＰＯＴＣＨＥＭＴＭ自動ドライ化学システム（ＳＰ−４４１０；Ａｒｋｒａｙ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、日本）を用いて測定した。データを図９に示してある。
【０１０４】
図９で、ＬＰＳ処理によって肝臓および腎臓の損傷が誘発され、それによって血中アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、クレアチニン、およびＢＵＮレベルが大幅に上昇することが示されている。低用量のジピリダモールまたはリポソームジピリダモールによる処理により、血清中ＡＳＴ、ＡＬＴ、クレアチニンおよびＢＵＮレベルのＬＰＳ誘発上昇が弱まる。これは、ジピリダモールが急性または慢性の肝臓および腎臓炎症ならびに敗血症治療の治療効力を有することを示している。さらに、高用量のジピリダモールによって血圧が変化し、生理状態および生存率に影響があることから、リポソームジピリダモールの用量依存的効力は、より広い適用可能用量範囲を示唆し得るものである。
【０１０５】
実施例５：組織傷害の測定
５．１：ＩＨＣ
１０％ホスフェート緩衝ホルマリン中で固定した肝臓および肺から、パラフィン包埋切片（３μｍ）を得た。過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染色を、盲検化観察者による光学顕微鏡検査（Ｎｉｋｏｎ  Ｅ８００；Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いる形態分析に用いた。各マウスについて、少なくとも１０倍の高倍率視野を調べた。肝臓および肺組織のＨＥ染色を、それぞれ図１０および１１に示してある。
【０１０６】
蓄積されたマクロファージおよび好中球によって誘発される過剰な炎症および組織損傷が、ＬＰＳ処理７２時間後のＨＥ染色肝臓および肺切片で認められた。ジピリダモールまたはリポソームジピリダモールによる後処理によって、組織の損傷および炎症が減弱された。遊離型ジピリダモールと比較して、リポソームジピリダモールは、組織学においてより良好な治療効力を示す。
【０１０７】
５．２：腎臓および肝臓におけるＰＰＡＲγの活性化状態
マウス組織を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭショ糖、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｎａｃａｒａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，  Ｉｎｃ．）、プロテアーゼ阻害薬（ｃＯｍｐｌｅｔｅ，  Ｍｉｎｉ，  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびホスファターゼ阻害薬（ＰｈｏｓＳＴＯＰ，  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で均質化した。１０００ｒｐｍで運転するＢｒａｕｎ  Ｐｏｔｔｅｒ  Ｓホモジナイザーで６往復行程を用いた。ホモジネートを遠心し（８００ｇ）、ペレットを廃棄した。上清を１２０００ｇで１０分間再度遠心し、得られた上清を回収した。サンプルを回収した後、ブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を測定した。６倍サンプル緩衝液（０．８ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％ＳＤＳ、６０％グリセリン、０．６Ｍβ−メルカプトエタノール、０．０６％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）を、全細胞タンパク質５０μｇに加え、等容量の溶解緩衝液をサンプルに加えた。９５℃で１０分間加熱してタンパク質を変性させた後、サンプルを直ちに氷上で冷却した。
【０１０８】
次に、サンプルを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（１００Ｖ）によって分離し、湿式ブロッティングによってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、ＰＶＤＦ膜を室温で６０分間にわたり５％スキムミルクで処理して、非特異的結合をブロックした。その膜を、４℃で終夜にわたり一次抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。膜を、室温で６０分間にわたり二次抗体（抗ウサギＩｇＧ、ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、膜をＰＢＳでもう１回洗浄し、検出用の増強化学発光（ＥＣＬ）基質とともにインキュベートした。自動化学発光および蛍光撮像システム（ＵＶＰ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｕｍ）を用いて画像写真を撮った。
【０１０９】
使用した抗体：ｔ−ＰＰＡＲγ（１：１０００；ａｂｃａｍ  ａｂ１９１４０７）およびβ−アクチン（１：１０００；ＧｅｎｅＴｅｘ  ＧＴＸ１０９６３９）。腎臓および肝臓におけるｔ−ＰＰＡＲγ発現のデータを、それぞれ図１２ａおよび１２ｂに示してある。
【０１１０】
実験結果から、腎臓組織であるか肝臓組織であるかを問わず、ジピリダモールまたはリポソームジピリダモールは、用量依存的にＰＰＡＲγ発現を誘発する活性を有することが明らかにわかる。食作用および融合を介したリポソームによる細胞への薬剤浸透増強のために、ＰＰＡＲγの発現が大きく増加する。
【０１１１】
実施例６：血圧に対するジピリダモールリポソームの効果
ジピリダモールは、血圧降下効果を有する。各種の急性状態（疾患）および危険状態の治療において、血圧の低下が疾患の予後に影響し得る。従って、血圧に対する本発明のジピリダモールリポソームの効果を検出することで、臨床的使用に可能な最大用量の評価が可能となる。
【０１１２】
次の薬剤：（１）生理食塩水、（２）ＬＰＳ、（３）ＬＰＳと次にジピリダモール（遊離型）、１０ｍｇ／ｋｇ、（４）ＬＰＳと次にジピリダモール（遊離型）、１００ｍｇ／ｋｇ、（５）ＬＰＳと次にジピリダモールリポソーム、１０ｍｇ／ｋｇ、および（６）ＬＰＳと次にジピリダモールリポソーム、１００ｍｇ／ｋｇの静脈投与後に、非侵襲性血圧装置を用いて、マウスの血圧を測定した。結果を図１３ａに示してある。
【０１１３】
異なる用量（薬剤処理前のＬＰＳはない）での別の試験結果を図１３ｂに示してある。
【０１１４】
上記の実験データは、ジピリダモールが細胞に進入する能力を高めることにより、ジピリダモールの薬理機序が変化して、ＰＰＡＲγ発現に対するジピリダモールの活性上昇および細胞膜に対するジピリダモールの活性の低下が生じることで、血管に対する薬剤の刺激および結果的に生じる血流に対する重度の妨害が低減されることを示している。ＰＰＡＲγ発現に対するジピリダモールの活性を高めることにより、ジピリダモールは、複数の疾患の治療における可能性を示している。複数機序の作用により、ジピリダモールの抗炎症活性および抗アポトーシス活性が、ＰＰＡＲγ経路を介して高められる。ジピリダモールを用いて、血圧を障害することなく、急性および重度の疾患および小型哺乳動物を治療することができる。
【図１】
2018505186.tif 000011
【図２】
2018505186.tif 000012
【図３】
2018505186.tif 000013
【図４ａ】
2018505186.tif 000014
【図４ｂ】
2018505186.tif 000015
【図５】
2018505186.tif 000016
【図６】
2018505186.tif 000017
【図７ａ】
2018505186.tif 000018
【図７ｂ】
2018505186.tif 000019
【図８】
2018505186.tif 000020
【図９】
2018505186.tif 000021
【図１０】
2018505186.tif 000022
【図１１】
2018505186.tif 000023
【図１２ａ】
2018505186.tif 000024
【図１２ｂ】
2018505186.tif 000025
【図１３ａ】
2018505186.tif 000026
【図１３ｂ】
2018505186.tif 000027
【国際調査報告】
2018505186.tif 000028
2018505186.tif 000029
2018505186.tif 000030