(57)【要約】  フローサイトメトリデータの入力を受信し、且つデータを異なる部分母集団に自動的に分類してデータ内のパターンを認識するために、そのそれぞれがサポートベクターマシンを利用する分析要素の階層構造を使用してデータを分析するための自動化された方法及びシステムが提供されている。パターンは、患者用の診断予測を生成するために、又は複数の対象から収集された試料内のパターンを識別するために使用されてもよい。【選択図】図５
2018505392.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリデータの分析及び分類の方法において、前記フローサイトメトリデータは、前記データを記述する複数の特徴を含み、前記方法は、
細胞の母集団のフローサイトメトリイベントを含む入力データセットを、プロセッサ及びストレージ装置を含むコンピュータシステム内にダウンロードするステップ
を含み、前記プロセッサは、少なくとも１つのサポートベクターマシンを実行するようにプログラムされており、且つ
分析要素の階層構造を定義するステップであって、それぞれの分析要素は、異なるゲーティング定義に対応しており、それぞれの分析要素は、パラメータの組合せに関する既定の基準に従って細胞の部分母集団を分類するためにゲーティングアルゴリズムを適用し、前記分類は、分布カーネルを有するサポートベクターマシンを使用して実行される、ステップと、
フローサイトメトリデータ分類の識別情報を伴って表示装置において出力表示を生成するステップと
を実行することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、細胞の部分母集団を選択し、且つ前記部分母集団を更に分類するために異なるゲーティングアルゴリズムを適用する異なる分析要素を使用して、前記選択された細胞の部分母集団を分析するステップを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記分布カーネルは、以下の形態：
2018505392.tif 000015
を有するバタチャリアアフィニティを含み、ここで、ｐ及びｑは、入力データ点であり、Ｍは、正規分布の平均値であり、且つΣは、共分散行列であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記階層構造は、複数のブランチを有するツリーを含み、且つそれぞれのブランチによって生成された結果を診断分類に組み合わせる結論分析ステップを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記診断分類は、疾病の存在又は不存在の何れかを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記異なるゲーティング定義は、試料管ＩＤ、デブリ対非デブリ、顆粒球、単球、リンパ球、陰性マーカー強度、及び減少したマーカー強度からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、出力表示を生成するステップは、ユーザーによる視覚的検出を促進するために異常結果を強調表示するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
フローサイトメトリデータを自動的に分析する方法において、
複数の細胞を含む試料の側方散乱及び前方散乱イベントを検出するステップと、
２又は３次元において前記側方散乱及び前方散乱イベントの複数のプロットを生成するステップであって、前記複数のプロットは、フローサイトメトリデータを含む、ステップと、
分析要素の階層構造を使用して前記複数のプロットを処理するステップであって、それぞれの分析要素は、異なるゲーティング定義に対応しており、それぞれの分析要素は、パラメータの組合せに関する既定の基準に従って細胞の部分母集団を分類するためにゲーティングアルゴリズムを適用し、前記分類は、分布カーネルを使用して実行される、ステップと、
１つ又は複数のフローサイトメトリデータ分類の識別情報を伴って表示装置において出力を生成するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、細胞の部分母集団を選択し、且つ前記部分母集団を更に分類するために異なるゲーティングアルゴリズムを適用する異なる分析要素を使用して、前記選択された細胞の部分母集団を分析するステップを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法において、前記分布カーネルは、以下の形態：
2018505392.tif 000016
を有するバタチャリアアフィニティを含み、ここで、ｐ及びｑは、入力データ点であり、Ｍは、正規分布の平均値であり、且つΣは、共分散行列であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法において、前記階層構造は、複数のブランチを有するツリーを含み、且つそれぞれのブランチによって生成された結果を診断分類に組み合わせる結論分析ステップを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記診断分類は、疾病の存在又は不存在の何れかを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法において、前記異なるゲーティング定義は、試料管ＩＤ、デブリ対非デブリ、顆粒球、単球、リンパ球、陰性マーカー強度、及び減少したマーカー強度からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法において、出力表示を生成するステップは、ユーザーによる視覚的検出を促進するために異常結果を強調表示するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
フローサイトメトリデータの自動化された分析のためのシステムにおいて、
メモリであって、細胞を含む複数の試料に対して実行された複数の分析検査を含むフローサイトメトリデータをその内部に保存しているメモリと通信するコンピュータプロセッサであって、前記フローサイトメトリデータは、側方散乱及び前方散乱イベントを含む、コンピュータプロセッサと、
非一時的コンピュータ可読媒体内において実施されたコンピュータプログラムプロダクトと
を含み、前記コンピュータプログラムプロダクトは、前記コンピュータプロセッサに、
前記フローサイトメトリデータを受信することと、
２又は３次元において前記側方散乱及び前方散乱イベントの複数のプロットを生成することと、
分析要素の階層構造を使用して前記複数のプロットを処理することであって、それぞれの分析要素は、異なるゲーティング定義に対応しており、それぞれの分析要素は、パラメータの組合せに関する既定の基準に従って前記試料内の細胞の部分母集団を分類するためにゲーティングアルゴリズムを適用し、前記分類は、分布カーネルを使用して実行される、処理することと、
前記細胞の１つ又は複数のフローサイトメトリデータ分類の識別情報を伴って表示装置において出力を生成することと
を行わせるための命令を含むことを特徴とするシステム。
【請求項１６】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記コンピュータプログラムプロダクトは、前記コンピュータプロセッサに、細胞の部分母集団を選択し、且つ前記部分母集団を更に分類するために異なるゲーティングアルゴリズムを適用する異なる分析要素を使用して、前記選択された細胞の部分母集団を分析することを行わせるための命令を更に含むことを特徴とするシステム。
【請求項１７】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記分布カーネルは、以下の形態：
2018505392.tif 000017
を有するバタチャリアアフィニティを含み、ここで、ｐ及びｑは、入力データ点であり、Ｍは、正規分布の平均値であり、且つΣは、共分散行列であることを特徴とするシステム。
【請求項１８】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記階層構造は、複数のブランチを有するツリーを含み、且つそれぞれのブランチによって生成された結果を診断分類に組み合わせる結論分析ステップを更に含むことを特徴とするシステム。
【請求項１９】
請求項１８に記載のシステムにおいて、前記診断分類は、疾病の存在又は不存在の何れかを含むことを特徴とするシステム。
【請求項２０】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記異なるゲーティング定義は、試料管ＩＤ、デブリ対非デブリ、顆粒球、単球、リンパ球、陰性マーカー強度、及び減少したマーカー強度からなる群から選択されることを特徴とするシステム。
【請求項２１】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記メモリは、フローサイトメトリ装置と関連付けられており、且つ前記フローサイトメトリデータは、個々の対象に固有であることを特徴とするシステム。
【請求項２２】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記メモリは、複数の対象から収集された試料から生成された累積されたフローサイトメトリデータを保存するように構成されたデータベースを含むことを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年１２月１０日付けで出願された米国仮特許出願第６２／０９０，３１６号明細書の非仮特許出願である、２０１５年１２月１０日付けで出願された米国特許出願第１４／９６５，６４０号明細書の優先権の利益を主張するものであり、この特許文献は、参照によりそのすべてが本明細書に包含される。また、本出願は、米国特許第８，６２８，８１０号明細書の主題にも関し、この特許文献の開示内容は、参照によりそのすべてが本明細書に包含される。
【０００２】
本発明は、サポートベクターマシンを使用する、分布データ、特にフローサイトメトリデータの自動化された分析のための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
フローサイトメトリは、流動する液体ストリーム中において懸濁した微小な粒子の特性の計測である。レーザー光の合焦ビームがそれぞれの運動する粒子を照明し、且つ光がすべての方向に散乱する。交差点の前方に又はレーザービームに直交するように配置された検出器が、散乱した光のパルスを受け取ることによりって信号を生成し、これらの信号は、解釈のためにコンピュータアナライザに入力される。検出された前方散乱光の合計量は、粒子サイズ及び屈折率に依存して、レーザーによって観察される粒子の断面積と密接に相関している一方、側部散乱光の量は、形状又は粒度を通知することができる。
【０００４】
フローサイトメトリの最も広範に使用されている用途の１つが、医療診断用の細胞分析の用途であり、この場合、対象の粒子は、生理食塩水含有溶液中において懸濁した細胞である。フローサイトメトリ技法は、大量の細胞データを収集するための高スループットシステムを提供する。フローサイトメトリは、骨髄、末梢血、及び組織を含む様々なタイプの試料から、ＭＭ、ＣＬＬ、ＬＧＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＭＤＳ、ＣＭＭＬ、リンパ腫、ＭＢＬなどの異常を検出する際に有効なツールである。また、対象の細胞マーカーを蛍光色素によってラベル付与しうる場合、表面分子又は細胞内成分などの細胞の更なる特性を正確に定量化することが可能であり、例えば、特定の表面又は細胞内受容体に付着するように、抗体−蛍光色素結合が使用されてもよい。表面マーカーに照らした蛍光によってラベル付与されたモノクローナル抗体を使用する、成長の異なるステージにおける細胞の特徴判定による免疫表現型検査は、フローサイトメトリの最も一般的な用途の１つである。特定の構造（例えば、ＤＮＡやミトコンドリア）に結合する、又は局所的な化学的特性（例えば、Ｃａ＋＋濃度やｐＨなど）に対する感度を有する、その他の色素が開発されている。
【０００５】
フローサイトメトリは、医療診断で広く使用されているが、これは、水又はその他の液体分析などの非医療用途でも有用である。例えば、バクテリア又はその他の生物の存在又はタイプを識別するために海水が分析されてもよく、微生物について試験するためにミルクを分析することも可能であり、且つ粒子状汚染物質又は添加物について燃料が試験されてもよい。
【０００６】
使用されるレーザービームは、選択された１つ又は複数の蛍光色素を励起するための適切な色を有する。放出される蛍光の量は、対象である細胞マーカーの発現と相関しうる。それぞれのフローサイトメータは、通常、その構成に応じて、同時に多くの異なる蛍光色素を検出することができる。いくつかの装置では、異なる波長で放出される複数のレーザーを使用することにより、複数の蛍光色素が同時に分析されてもよい。例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から入手可能なＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメトリシステムは、４色動作のために構成されたマルチカラーフローサイトメータである。それぞれの細胞からの蛍光放出は、一連の光電増倍管によって収集され、及び後続の電気的イベントが収集され、且つコンピュータ上で分析され、コンピュータは、フローサイトメトリ規格（ＦＣＳ）データファイルにおいて、蛍光強度値をそれぞれの信号に対して割り当てる。データの分析は、データをフィルタリング又は「ゲーティング（ｇａｔｅ）」すると共に、更なる分析又はソーティングのためにイベントの部分母集団のサブセットを定義するために使用される超空間内で多角形領域の交差又は結合を識別するステップを伴っている。
【０００７】
国際解析細胞学会（ＩＳＡＣ）は、ＦＣＭデータの共通表現用のＦＣＳデータファイル規格を採択している。この規格は、シトメータに通された試料からの計測値を記録するために主要な分析装置のすべてによってサポートされており、この結果、研究者及び臨床医は、大きいデータ互換性の問題に直面することなく、いくつかの市販の装置及びソフトウェアの中から選択することができる。但し、この規格は、演算後処理及びデータ分析用のプロトコルを記述するには至っていない。
【０００８】
フローサイトメトリ分析の際に存在している大量のデータに起因して、しばしば、手動プロセスを通じてデータを十分に利用することが困難である。また、データの大きい次元により、従来の統計方法並びに人工ニューラルネットワークなどの学習技法を使用することが実現不能である。サポートベクターマシンは、高次元データを処理する能力を有するカーネルに基づいた機械学習技法である。これは、適切に設計されたカーネルによってフローデータを処理する際に有効なツールとなる可能性がある。
【０００９】
単一のケースのフローデータは、通常、複数の管から構成されている。それぞれの管は、複数回の分析検査の同時計測値を収容しうる。すべての分析検査が計測された際には、それぞれの実行により、通常、１０４個超のイベントが収集され、この結果、分析のために１０６個のレベルの計測値が生成されうる。
【００１０】
フローデータの分析における従来の方式は、通常、細胞の特定のグループを分離するためのデータに対する「ゲーティング」法と、一度に２つのパラメータを伴うデータの２Ｄプロットの大規模な集合体の手動検査とを伴っている。診断に有用であるフローサイトメトリデータの特徴は、通常、高次元空間内における属性データの分布において提示される。この結果、人間の読取者が、重畳した高次元パターンをデータ内で知覚することは困難である。
【００１１】
フローサイトメトリなどの最近の技術的な進歩により、膨大な量のデータが多くの異なる形態で生成されている。この情報爆発によってコンピュータ及び情報科学者に対して提示されている最大の課題の１つが、大量のデータを処理すると共に有意な情報を抽出する有効な方法の開発である。従来の統計方法は、低次元データでは有効であるが、高複雑性及び高次元によってしばしば特徴付けられる「新しいデータ」の処理では不十分であることが証明されている。具体的には、いわゆる「次元の呪い」が従来の統計ツールに対する深刻な制限である。機械学習は、これらの制限を克服するためのデータ処理及び分析における将来有望な新しいパラダイムを代表している。これは、システムを自動的に「学習」するための「データ駆動型」の方式を使用しており、これは、分類又は将来データに関する予測を実施するために使用することができる。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、機械学習の分野を革新すると共に、多数の困難なデータ分析の問題に対する真に有効な解決策を提供する最新の機械学習技術である。
【００１２】
ＳＶＭは、データ表現の柔軟性、演算効率、及びモデル容量に関する正規化を実現するために、高次元内積空間（しばしば、無限−次元ヒルベルト空間）内における最適な超平面の概念と入力空間上で定義されたカーネル機能とを組み合わせている。ＳＶＭは、分類（パターン認識）及び回帰（予測）問題の両方を解決するために使用することができる。通常のＳＶＭパターン認識環境は、以下のように付与される。
【００１３】
付与されたトレーニングデータの組は、以下のとおりである。
ｘｉ，ｙｉ      ｉ＝１，２，．．．，ｍ
【００１４】
ＳＶＭトレーニングは、最適な超平面を見出す問題として、以下のように定式化することができる。
2018505392.tif 000003
【００１５】
ラグランジュ乗数を使用することにより、これは、以下のような双対問題に変換される。
2018505392.tif 000004
【００１６】
二次プログラミング問題を解くことにより、本発明者らは、以下のようにＳＶＭ解を得る。
2018505392.tif 000005
【００１７】
フローサイトメトリデータの複雑性に起因して、必要な特徴を明示的に抽出すること、又は細胞遺伝学的結果を予測することになるパターンを定義することは困難である。ＳＶＭに基づいたシステムは、クラシファイアを構築するために必要とされるのが例間における類似性尺度のみであるという独特の利点を提供している。
【発明の概要】
【００１８】
本発明によれば、高度な機械学習技術及びその他の数学的アルゴリズムを使用することにより、分析プロセスの面倒なステップのほとんどを自動化するために、コンピュータ支援型フローサイトメトリデータ分析システムが提供されている。カスタム分布カーネルを有するサポートベクターマシン（ＳＶＭ）が、異常なフロー分布を検出するために使用されている。ガウス混合モデル（ＧＭＭ）が自動的クラスタリング及びゲーティングに対して適用されている。自動的なゲート認識のために特別なグラフアルゴリズムが開発されている。
【００１９】
このシステムは、ゲーティングの定義及び調節、２Ｄプロット、及び統計テーブルなどの従来の特徴を保持している。但し、このシステムは、すべての分析ステップで自動化を提供している。更には、ＳＶＭ方法は、従来の方式における２Ｄ又は３Ｄ制限をはるかに超えた分析を円滑に実行する。
【００２０】
本発明のシステムは、自動的なゲート予測、それぞれのプロット（それぞれのマーカー）ごとの正常対異常の自動的な判定、概要テーブルに基づいた異常結果の自動的な判定、異常の組合せ（概要テーブル、個々のプロット、及びゲート分布）に基づいた疾病タイプの自動的な判定を含む自動化されたフローサイトメトリデータ分析を提供している。システムは、正常対異常の指定をトレーニング及びカスタマイズする能力をユーザーに対して提供している。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリ分析システムは、視覚的に独特の特徴を有するラベル付与されたプロット及び値を表示することにより、異常から正常を弁別するための手段を提供しており、これは、システムユーザーのために異常な結果に明瞭にフラグ付与するために、例えば、赤色などの規定された色を使用することにより、強調表示することにより、太字化することにより、下線を付与することにより、又は任意のその他の視覚的に検出可能なインジケータにより実現することができる。フラグが付与された結果は、病理学者、医師、又はその他の医療要員による評価のために、関連した患者記録内に記録されることになる。
【００２１】
本発明のシステムは、病理学者によるフローデータの分析における精度及び効率の大幅な改善を支援することになる。また、これは、フローサイトメトリにおける新しいパターンの発見における強力なツールも提供することになる。
【００２２】
従来の市販のフローサイトメトリセットアップによって生成されたフローサイトメトリデータを分析するために、その例が、例えば米国特許第６，７６０，７１５号明細書、同第７，１１７，１８８号明細書、及び同第６，９９６，５４９号明細書に概略的に開示されているサポートベクターマシンが使用されており、これらの特許文献は、参照により本明細書に包含される。フローサイトメトリ計測を実施するための例示的なシステムについては、米国特許第５，８７２，６２７号明細書及び同第４，２８４，４１２号明細書に記述されており、これらの特許文献は、参照により本明細書に包含される。本明細書に記述されている特定の例では、データは、特に、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）などの血液状態を検出するための医療診断用途に関係している。フローサイトメトリによる免疫表現型検査は、形態と細胞遺伝学との組合せが診断に不十分であった場合にも、造血細胞内における定量的且つ定性的な異常を検出する正確且つ高感度な方法であることが証明されている。本明細書で開示されている自動化されたフローサイトメトリデータ分析システムは、フローサイトメトリ計測で生成される膨大な量のデータを自動的に分析する能力を提供し、これにより、フローサイトメトリの方法の精度、反復可能性、及び多様性を改善している。このような能力は、フローサイトメトリの診断的価値を改善するのみならず、現時点における制限された方式をはるかに超えるデータマイニング及びパターン認識のために、多数の対象からの大量のフローサイトメトリデータの収集及び分析を可能にすることにより、この方法の研究用途を拡張することになる。
【００２３】
本発明の一態様では、フローサイトメトリデータの分析及び分類の方法であって、フローサイトメトリデータは、データを記述する複数の特徴を含む、方法は、細胞の母集団のフローサイトメトリイベントを含む入力データセットを、プロセッサ及びストレージ装置を含むコンピュータシステムにダウンロードするステップを含み、プロセッサは、少なくとも１つのサポートベクターマシンを実行するようにプログラムされており、且つ分析要素の階層構造を定義するステップであって、それぞれの分析要素は、異なるゲーティング定義に対応しており、それぞれの分析要素は、パラメータの組合せに関する既定の基準に従って細胞の部分母集団を分類するためにゲーティングアルゴリズムを適用し、分類は、分布カーネルを有するサポートベクターマシンを使用して実行される、ステップと、フローサイトメトリデータ分類の識別情報を伴って表示装置において出力表示を生成するステップとを実行する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の部分母集団を選択し、且つ部分母集団を更に分類するために異なるゲーティングアルゴリズムを適用する異なる分析要素を使用して、選択された細胞の部分母集団を分析するステップを更に含む。好適な一実施形態では、分布カーネルは、以下の形態：
2018505392.tif 000006
を有するバタチャリアアフィニティを有しており、ここで、ｐ及びｑは、入力データ点であり、Ｍは、正規分布の平均値であり、且つΣは、共分散行列である。階層構造は、複数のブランチを有するツリーであってもよく、且つそれぞれのブランチによって生成された結果を診断分類に組み合わせる結論分析ステップを更に含む。診断分類は、疾病の存在又は非存在の何れかを含んでいてもよい。異なるゲーティング定義は、試料管ＩＤ、デブリ対非デブリ、顆粒球、単球、リンパ球、陰性マーカー強度、及び減少したマーカー強度からなる群から選択されてもよい。
【００２４】
本発明の別の態様では、フローサイトメトリデータを自動的に分析する方法は、試料の側方散乱及び前方散乱イベントを検出するステップと、２又は３次元において側方散乱及び前方散乱イベントの複数のプロットを生成するステップであって、複数のプロットは、フローサイトメトリデータを含む、ステップと、分析要素の階層構造を使用して複数のプロットを処理するステップであって、それぞれの分析要素は、異なるゲーティング定義に対応しており、それぞれの分析要素は、パラメータの組合せに関する既定の基準に従って細胞の部分母集団を分類するためにゲーティングアルゴリズムを適用し、分類は、分布カーネルを使用して実行される、ステップと、１つ又は複数のフローサイトメトリデータ分類の識別情報を伴って表示装置において出力を生成するステップとを含む。方法は、細胞の部分母集団を選択し、且つ部分母集団を更に分類するために異なるゲーティングアルゴリズムを適用する異なる分析要素を使用して、選択されたセルの部分母集団を分析するステップを更に含んでいてもよい。好適な一実施形態では、分布カーネルは、以下の形態：
2018505392.tif 000007
を有するバタチャリアアフィニティであり、ここで、ｐ及びｑは、入力データ点であり、Ｍは、正規分布の平均値であり、且つΣは、共分散行列である。階層構造は、複数のブランチを有するツリーであってもよく、且つそれぞれのブランチによって生成された結果を診断分類に組み合わせる結論分析ステップを更に含んでいてもよい。診断分類は、疾病の存在又は非存在の何れかを含んでいてもよい。異なるゲーティング定義は、試料管ＩＤ、デブリ対非デブリ、顆粒球、単球、リンパ球、陰性マーカー強度、及び減少したマーカー強度からなる群から選択される。
【００２５】
本発明の更に別の態様では、フローサイトメトリデータの自動化された分析のためのシステムは、メモリであって、細胞を含む複数の試料に対して実行された複数の分析検査を含むフローサイトメトリデータをその内部に保存しているモメリと通信するコンピュータプロセッサであって、フローサイトメトリデータは、側方散乱及び前方散乱イベントを含む、コンピュータプロセッサと、非一時的コンピュータ可読媒体内において実施されたコンピュータプログラムプロダクトとを含み、コンピュータプログラムプロダクトは、コンピュータプロセッサに、フローサイトメトリデータを受信することと、２又は３次元において側方散乱及び前方散乱イベントの複数のプロットを生成することと、分析要素の階層構造を使用して複数のプロットを処理することであって、それぞれの分析要素は、異なるゲーティング定義に対応しており、それぞれの分析要素は、パラメータの組合せに関する既定の基準に従って試料内の細胞の部分母集団を分類するためにゲーティングアルゴリズムを適用し、分類は、分布カーネルを使用して実行される、処理することと、細胞の１つ又は複数のフローサイトメトリデータ分類の識別情報を伴って表示装置において出力を生成することとを行わせるための命令を含む。コンピュータプログラムプロダクトは、コンピュータプロセッサに、細胞の部分母集団を選択し、且つ部分母集団を更に分類するために異なるゲーティングアルゴリズムを適用する異なる分析要素を使用して、選択された細胞の部分母集団を分析することを行わせるための命令を更に含んでいてもよい。好適な一実施形態では、分布カーネルは、以下の形態：
2018505392.tif 000008
を有するバタチャリアアフィニティを含み、ここで、ｐ及びｑは、入力データ点であり、Ｍは、正規分布の平均値であり、且つΣは、共分散行列である。階層構造は、複数のブランチを有するツリーであってもよく、且つシステムは、それぞれのブランチによって生成された結果を診断分類に組み合わせる結論分析ステップを更に含む。いくつかの実施形態では、診断分類は、疾病の存在又は非存在の何れかを含む。異なるゲーティング定義は、試料管ＩＤ、デブリ対非デブリ、顆粒球、単球、リンパ球、陰性マーカー強度、及び減少したマーカー強度からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、メモリは、フローサイトメトリ装置と関連付けられており、且つ個々の対象に固有である一方、その他の実施形態では、メモリは、複数の対象から収集された試料から生成された累積されたフローサイトメトリデータを保存するように構成されたデータベースであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明によるフローサイトメトリデータの自動化された収集及び分析用のシステムの概略図である。
【図２】図２は、ＭＤＳ用のフローサイトメトリ分析における対象である母集団の分布の例示的な対数−対数表示である。
【図３】図３は、本発明によるデータ分析方法のフローチャートである。
【図４】図４は、本発明の一実施形態による分析のための例示的な階層構造の概略図である。
【図５】図５は、本発明のシステムの一実装形態による図４のツリーのそれぞれのノードの構造のブロック図である。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、本発明のシステムによって生成された分析結果の例である。
【図７】図７は、本発明の一実施形態による分析ツリーの例示的なブランチのフロー図である。
【図８】図８Ａ−８Ｅは、図７のブランチの例示的な分析シーケンスのサンプルスクリーンショットである。
【図９】図９は、フローサイトメトリ分析システムの一実施形態による生成された３次元プロットのサンプルスクリーンショットである。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態による分析結果のサンプルスクリーンショットである。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｆは、６つの異なる分析のうちの１つについて生成されたサンプルプロットであり、図１１Ａ−１１Ｃ及び１１Ｆは正常結果を表しており、図１１Ｄ−１１Ｅは異常結果を通知するために強調表示されている。
【図１２】図１２は、異なる部分母集団における計測及び算出された値を列挙したサンプルスプレッドシートである。
【図１３】図１３は、部分母集団のパラメータと、対応するフローサイトメトリデータとを示す。
【図１４】図１４は、別の部分母集団のパラメータと、対応するフローサイトメトリデータとを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明によれば、フローサイトメトリデータの分析のための方法及びシステムが提供される。具体的には、本発明の方法は、分布特性に関するデータの分析で使用されるカーネルの生成を含む。フローサイトメトリの用途における入力データｐは、空間内における多数の点の集合体である。例えば、画像は、２次元空間内における点の組として見なすことができる。適切な正規化後、ｐは、確率分布として見なされてもよい。分布の傾向をキャプチャするために、このような２つの入力データｐ及びｑについてカーネルを定義するには、分布内の個々の点のみではなく、２つの分布全体間の類似性を計測するｐ及びｑに関する関数を定義しなければならない。
【００２８】
このような「分布カーネル」を構築するための１つの方法は、２つの分布間の距離関数（発散）を使用するというものである。ρ（ｐ，ｑ）が距離関数である場合、以下の式がカーネルである。
ｋ（ｐ，ｑ）＝ｅ−ρ（ｐ，ｑ）      （１）
【００２９】
２つの確率分布間の差を計測する多数の距離関数が存在している。カルバック−ライブラー発散、バタチャリアアフィニティ、ジェフリーの発散、マハラノビス距離、コルモゴロフ変分距離、及び予想条件付きエントロピーは、何れもこのような距離の例である。距離関数が付与されたら、カーネルを上述の式に基づいて構築することができる。
【００３０】
例えば、特別なカスタムカーネルをバタチャリアアフィニティに基づいて構築することができる。平均Ｍ及び共分散行列Σを有する正規分布の場合、バタチャリアアフィニティは、以下の形態を有する。
2018505392.tif 000009
【００３１】
この距離関数から、上述の式を使用して新しいカーネルが以下のように定義される。
2018505392.tif 000010
【００３２】
この分布カーネルは、線形複雑性により演算効率が優れており、且つ大量の入力データを処理することができる。通常の密度推定法は、演算複雑性Ｏ（ｎ２）を有しており、これは、いくつかの用途では過大である場合がありうる。本発明の分布カーネルは、クラシファイア及びその他の予測システムを生成するために、ＳＶＭ又はその他の機械学習システムにおいて直接的に適用することができる。分布カーネルは、ＳＶＭ及びその他のカーネルマシンで頻繁に使用されている標準的なカーネルとの比較において、いくつかの独特の利点を提供する。これらは、大きいデータコンポーネントの全体的な分布間における類似性をキャプチャしており、これは、いくつかの用途では極めて重要でありうる。
【００３３】
図３は、フローサイトメトリデータの分析に使用される例示的なプロセスフローを提供している。当業者には容易に明らかとなるように、フローサイトメトリデータは、分布データの一例として提供されており、且つ後述する技法を使用することにより、その他のタイプの分布データが処理及び分類されてもよい。
【００３４】
フローサイトメータ１０６によって生成された未加工データは、コンピュータ処理システムに入力されており（ステップ３０２）、コンピュータ処理システムは、少なくとも、１つ又は複数のサポートベクターマシンを実行するようにプログラムされたメモリ及びプロセッサを含む。通常のパーソナルコンピュータ（ＰＣ）又はＡＰＰＬＥ（登録商標）のＭＡＣ（登録商標）タイプのプロセッサは、このような処理に適している。入力データセットは、サポートベクターマシンをトレーニングする際に使用されるもの、及びトレーニングの有効性を試験する際に使用されるものという２つの部分に分割されてもよい。ステップ３０４では、プロセッサ内で１つ又は複数の特徴選択プログラムを実行することにより、特徴選択アルゴリズムがトレーニングデータセットに対して実行されている。ステップ３０６では、バタチャリアアフィニティに基づいたカーネルなどの分布カーネルを有するサポートベクターマシンを使用することにより、低減された特徴の組を有するトレーニングデータセットが処理されている。ステップ３０８では、独立した試験データセット内において、ステップ３０４で選択された特徴に対応するデータを抽出し、且つトレーニングされた分布カーネルを有するＳＶＭを使用して試験データを処理することにより、トレーニングステップの有効性が評価されている。試験の結果が最適未満の結果を通知している場合、ＳＶＭは、最適解が実現される時点まで再トレーニング及び再試験されることになる。トレーニングが満足できると判定された場合、ステップ３１０では、患者の試料について取得されたフローサイトメトリ計測値に対応するライブデータがプロセッサに入力される。ステップ３１２では、トレーニング及び試験された分布カーネルを有するＳＶＭを通じて、ステップ３０４で選択された特徴が患者データから選択されると共に処理されており、結果は、正常又は異常としての患者の試料の分類である。ステップ３１４では、結果を要約したレポートが生成されており、このレポートは、コンピュータモニタ１２２上に表示されてもよく、印刷されたレポート１２４上に表示されてもよく、且つ／又は電子メール若しくはその他のネットワークファイル転送システムを介して研究所又は臨床研究室、病院、若しくは医師のオフィスに送信されてもよい。また、データグループ分けの１及び２次元表現を有するヒストグラムが表示及び／又は印刷されてもよい。また、結果は、未加工データ、ヒストグラム、及びその他の患者データと共に、コンピュータメモリ又は患者データベース内に保存されることになる。
【００３５】
自動化された分析システムにおける改善された信頼性を提供するために、任意選択の更なる診断手順がフローサイトメトリメータ及び結果と組み合わせられてもよい。Ｚｈａｎｇらの米国特許第７，３８３，２３７号明細書に開示されているものに類似した方式を使用することにより、フローサイトメトリ試験の結果がその他のタイプの試験と組み合わせられてもよく、この特許文献は、参照により本明細書に包含される。図３は、欠失、転座、反転、及びその他の異常を識別するために、染色体分析又は蛍光原位置交雑（ＦＩＳＨ）などの従来の手順で生成された染色体の画像から対象の特徴を抽出することにより、ＳＶＭを使用した細胞遺伝学的データのコンピュータ支援型の画像分析を実行するための任意選択のフロー経路を示している。ステップ３２０では、トレーニング画像データがコンピュータプロセッサに入力されており、このプロセッサでは、このデータは、対象の特徴を識別及び抽出するために事前処理される。一般に、トレーニング画像データは、対象の特徴を識別するために事前処理され（ステップ３２２）、次いで画像処理ＳＶＭをトレーニングするために使用される。次いで、試験画像データは、最適解が実現されたことを検証するために使用される（ステップ３２４）。最適解が実現されていない場合、ステップ３２４が反復されることになり、且つＳＶＭは再トレーニング及び再試験されることになる。最適解が実現されている場合、ライブ患者画像データは、事前処理（ステップ３２８）及び分類（ステップ３３０）のために入力されることになる（ステップ３２６）。
【００３６】
米国特許第７，３８３，２３７号明細書に記述されているように、好適な方式では、画像内の対象のそれぞれの特徴は別個に事前処理され（ステップ３２２）、且つその特徴について最適化されたＳＶＭによって処理されている。対象のすべての特徴の分析の結果は、全体画像を分類した出力を生成するために、第２レベル画像処理ＳＶＭで組み合わせられる。トレーニングされた１つ又は複数のＳＶＭは、事前処理済みの画像試験データを使用して試験される（ステップ３２４）。解が最適である場合、ライブ患者（フローサイトメトリ分析が実行されている同一の患者）データに対応した画像がプロセッサに入力される（ステップ３２６）。患者画像データは、対象の特徴を識別するために事前処理され（ステップ３２８）、且つ対象のそれぞれの特徴が、特定の特徴について最適化されたトレーニングされた第１レベルＳＶＭにより処理される。対象の特徴の分析の合成された結果が組み合わせられ、且つ全体画像を分類した出力を生成するために、トレーニング済みの第２レベル画像処理ＳＶＭに入力される（ステップ３３０）。
【００３７】
ステップ３３０の結果は、患者データベース内の患者のファイル内における保存のために伝達することが可能であり（ステップ３１６）、且つ／又はステップ３１２からのフローサイトメトリデータ結果との組合せにおける分析のために第２レベルＳＶＭに入力されることになる。この第２レベルＳＶＭは、ステップ３０８、３２４、及び３４０間の点線によって示されているように、トレーニング及び試験データを使用して既にトレーニング及び試験済みの状態となる。ステップ３４２における組み合わせられた分析のために、ステップ３１６及びステップ３３０の結果は、トレーニング済みの第２レベルＳＶＭによる処理のために組み合わせられる。この組み合わせられた処理の結果は、一般に、例えば、正常又は異常、罹患又は非罹患などの２値出力となる。組み合わせられた結果は、ステップ３１４における表示のために出力されてもよく、且つ／又は保存のためにメモリ又は患者データベースに入力されてもよい（ステップ３１６）。専門家分析や患者履歴などのその他のタイプのデータ及び分析を内蔵するために、更なる任意選択の２次フロー経路が提供されてもよく、これらの２次フロー経路は、スクリーニング、監視、及び／又は治療のために使用されうる最終診断又は予後診断スコア又はその他の出力を生成するために組み合わせられてもよい。
【実施例】
【００３８】
実施例１：骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の検出
本研究の目的は、細胞遺伝学における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に関係した染色体異常とフローサイトメトリデータ内のパターンとの間の潜在的な関係の調査である。この免疫表現型検査の分析は、フローサイトメトリの最も一般的な用途の１つであり、且つ試料収集及び準備のプロトコルについては当業者に周知である。図１に示されているシーケンスに従って、フローサイトメータシステム１０６のフローセルに懸濁液を導入するように適合されたいくつかの管１０４又はその他の容器内で細胞懸濁液を生成するために、ＭＤＳを有すると疑われている患者からの骨髄吸引物１０２が生理食塩水又はナトリウムヘパリン溶液中において収集されている。異なる蛍光色素と結合されたモノクローナル抗体を収容する試薬が管に導入されており、それぞれの管は、抗体の異なる組合せを受け取っており、それぞれの異なる組合せは、いくつかの可能な蛍光色素のうちの１つと結合されている。フローサイトメータは、多数の製造者から市販されており、これにはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）又はＯｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）のＣｙｔｏｒｏｎ／Ａｂｓｏｌｕｔｅ（商標）が含まれる。この例の場合、４色計測のためにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）システムが使用された。当業者には明らかとなるように、このようなシステムは、図が概略的なものとなり、その結果、フローサイトメータのアナライザフィールド内において、試料の存在のみが通知されるようにカルーセル内に充填された複数の試料の自動化された処理を提供している。フローサイトメータシステム１０６内の前方散乱検出器１０８及び側方散乱検出器１１０は、細胞が分析ストリームを通じて導かれるのに伴って、検出されたイベントに対応する電気信号を生成する。側方散乱検出器１１０の間に含まれている蛍光検出器は、様々な蛍光マーカーと結合された抗体によって通知される抗原の発現によって生成される蛍光信号の振幅を計測する。様々な検出器のそれぞれによって計測されたパルスの高さ（振幅）に基づいて数値が生成される。結果的に得られる信号は、コンピュータワークステーション１２０内のプロセッサに入力され、且つグラフィカル表示モニタ１２２上における表示のために、検出されたイベントに対応したヒストグラム（シングル又はデュアルパラメータ）を生成するために使用される。標準試料との比較に基づいた正常又は異常による入力データの分類を伴う本発明によるこのデータの分析は、モニタ１２２上に印刷又は表示されうるレポート１２４を結果的にもたらす。また、未加工のデータ、ヒストグラム、及びレポートは、コンピュータワークステーション１２０内の内部メモリ及び別個のメモリ装置の何れか又は両方内に保存されることになり、これには、患者のその他の記録との関連付けのために、医療研究室又はその他の医療施設内のデータウェアハウスの一部分を構成しうるデータベースサーバー１３０が含まれていてもよい。
【００３９】
例示的なプロセスシーケンスでは、入力データセットは、フローサイトメトリ及び細胞遺伝学データの両方を有する７７個のケース（患者）を含んでいる。すべての患者はＭＤＳを有する疑いがある。７７個のケースのうち、３７は、数又は構造の変化についての染色体全体の顕微鏡検査を伴う細胞遺伝学的試験によって通知された染色体異常を有していた。残りの４０は、細胞遺伝学下では陰性であることが見出されている。
【００４０】
懸濁液中における吸引された骨髄試料は、それぞれの患者ごとに１３個の管にわたって分割された。標準的な４色免疫蛍光プロトコルでは、その１つがブランクである７つの異なる分析検査を実行するために、前方光散乱（ＦＳＣ）及び直角光散乱（ＳＳＣ）が４色抗体組合せと共に収集された。それぞれのケースは、通常、分析検査のすべてが計測される２０，０００〜５０，０００個のイベントを有していた。それぞれのケースごとの結果的に得られたフローサイトメトリデータセットは、約１０６個の計測値を有していた。図２は、マーキングされた様々な細胞母集団を有する側方散乱対ＣＤ４５発現を示す例示的なヒストグラムを示している。
【００４１】
１３個の管のそれぞれごとにＦＳＣ及びＳＳＣが計測され、これにより、図２の左下に示されている細胞デブリを排除するためのゲーティングが許容された。これに加えて、それぞれの管ごとに、蛍光マーカーとの抗原特異度の異なる組合せが使用された。以下の表１は、ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ＰｅｒＣＰ（ペリジニン−クロロフィル）、及びＡＰＣ（アロフィコシアニン）というマーカーとのモノクローナル抗体の異なる組合せを列挙している。識別された蛍光マーカーと結合されたモノクローナル抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、Ｃａｌｔａｇ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を含むいくつかの異なる供給源から市販されている。リンパ球のゲーティングの検証のために、成熟リンパ球の計数のために使用されるＣＤ４５抗体が、それぞれの組合せにおいて含まれている。
2018505392.tif 000011
【００４２】
ＳＶＭのトレーニング及びトレーニングの評価の両方のためのデータを提供するために、７７個のケースのデータ全体がトレーニングセットと、独立した試験セットとに分割された。ＳＶＭをトレーニングするために、４０個のケース（細胞遺伝学的試験によって判定された２０個の陽性及び２０個の陰性）が使用された。残りの３７個のケース（１７個の陽性及び２０個の陰性）は、独立した試験セットを形成するために使用された。
【００４３】
２つの確率分布間の差を計測するために、バタチャリアアフィニティに基づいた上述のカスタムカーネルがフローサイトメトリデータの分析のために使用された。
【００４４】
クラシファイア内におけるすべての分析検査からのデータを包含すれば、最適な性能を有するシステムを生成することにならない。従って、トレーニングセットに基づいて、分析検査に関する特徴の選択が実施される。特徴選択ステップでは２つの性能尺度が適用された。第１の特徴選択方法である、ＳＶＭの一個抜き（ＬＯＯ）エラーレートは、初期データセットについてＳＶＭをトレーニングするステップと、その後の、ＬＯＯエラーが減少するように、勾配ステップを実行することによってスケーリングパラメータを更新するステップとを伴っている。これらのステップは、ＬＯＯエラーの最小値に到達する時点まで反復される。停止基準を適用することができる。第２の特徴選択方法は、カーネルアライメントであった。このような技法については、Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉの米国特許第７，２９９，２１３号明細書に記述されており、この特許文献の内容は、参照により本明細書に包含される。カーネルアライメントは、トレーニングデータのみを使用しており、且つカーネルマシンのトレーニングが実行される前に実行することができる。
【００４５】
特徴選択プロセスにおいて、多数の特徴がデータの正確な分類に寄与することにならないと判定された。表２には、特徴選択手順の結果が付与されている。
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【００４６】
表２のエントリにおける「１」の値は、特定の分析検査（管／分析検査の組合せ）が選択されることを意味し、「０」は、その分析検査が選択されなかったことを意味している。この結果、データを分類するために検討を要するそれぞれのケースからの特徴の数が、オリジナルの９１から２６に低減された。次いで、分布カーネルを有するＳＶＭをトレーニングするために、低減された数の分析検査からのデータが使用された。
【００４７】
次いで、選択された分析検査を使用することにより、トレーニング済みのＳＶＭが、３７個の独立したケースについて試験される。２値分類試験の性能の従来の統計的尺度を使用することにより、０のカットオフにおける結果が要約された。感度又は再現率は、細胞遺伝学的試験によって判定された陽性の合計数に対する正しく分類された陽性の割合の尺度を提供している。特異度は、正しく識別された陰性の割合を計測している。試験データの分析の結果は、以下のとおりである。
感度：１５／１７＝８８％      特異度：１９／２０＝９５％
【００４８】
この手順は、３／３７＝８％という全体エラーレートを生成している。二項分布における推定標準偏差σ＝０．０４４９を使用することにより、試験は、エラーレートが１５％未満になるという９５％の信頼性レベルを生成した。
【００４９】
図４は、根付きツリー４００によって表された本発明のシステムの階層構造を示している。ツリーのそれぞれのノード４１０は、特定のゲーティングされたフローデータに属する様々なタスクを実行する基本分析要素を表している。所与のノードで実行される分析に応じて、複数のブランチがノードから外に成長してもよい。図示の例では、初期ノード４１０は、３つのブランチ４０２、４０４、４０６に分割されている。ツリー内のノードの数及びブランチの数は、分析対象のパラメータに応じて変化することになる。例えば、ブランチ４０２内では、第２ノードは、ブランチ４０２ａ及び４０２ｂに分割されるという結果をもたらしている。ブランチ４０４は、その第２ノードで３つのブランチ４０４ａ、４０４ｂ、及び４０４ｃに分割され、次いで、ブランチ４０４ｂは、第３ノードでブランチ４０４ｂａ及び４０４ｂｂに分割されている。ツリー構造は、階層構造ゲーティングを反映している。それぞれのノードにおける入力データは、その親ノードからのゲーティングの結果である。
【００５０】
図５は、図４に示されているツリー内のそれぞれのノード４１０の構造を示している。それぞれのノードは、ゲーティング定義５０２と、ゲーティングされたデータセット５０４と、データのグラフィカルプロット５０６と、ＳＶＭ構成５０８と、トレーニングされたＳＶＭデータセット５１０とを含む。
【００５１】
実施例２：標準白血病／リンパ腫パネルのサンプル結果
図６Ａ及び図６Ｂには、本発明のシステムによって生成された例示的な結果が示されている。分析ソフトウェアは、標準的なＦＣＳフォーマットでデータファイルを読み取る機能を含んでいる。また、分析ソフトウェアは、様々なフォーマットで結果をエクスポートすることもできる。図６Ａは、十分な分解能を提供するために、複数のページにわたって分割されている。それぞれのケースにおいて、図の第１ページは、スクリーンショットの左パネル５２０に対応し、第２ページは、中央パネル５２２であり、且つ第３ページは、右パネル５２４である。左パネル５２０は、ゲーティングされたデータに対応するファイルを表示している。図示のように、第１ゲーティングパラメータ５２６は、試料管番号（管１、管２、．．．、管ｘ）である。例えば、このゲーティング動作は、図４の第１ノード４１０に対応することになるであろう。次のゲーティング５２８（サブゲーティング）は、非デブリ及び非デブリ＋デブリであり、これは、例えば、ブランチ４０２ａ内の第２ノードとなるであろう。次いで、非デブリは、単核細胞及びリンパ球により、更にサブゲーティングされている。以前の例に従って、このゲーティング５３０及び分析は、ブランチ４０２ａ内の第３ノードで実行されることになるであろう。
【００５２】
図６Ａの中央パネル５２２は、パラメータによって判定された異なる部分母集団によってマーキングされたフローサイトメトリデータを表示している。このケースでは、マーカーは、ＳＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ（側方散乱強度、線形）によって検出されるＣＤ４５  ＫＯである。図６Ａの右パネル５２４は、ゲーティング及びＳＶＭ分析で使用される様々なパラメータを列挙した表を提供している。図示のように、パラメータＳＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ及びＣＤ４５  ＫＯは、「ｉｎ  ＳＶＭ」という見出しの下においてチェックされており、これにより、ＳＶＭ分析が、上述の式（３）における分布カーネル内のｐ及びｑのデータを提供するこれらのパラメータに基づいて実行されたことを通知している。
【００５３】
図６Ｂのスクリーンショットの底部は、図示の試験用のスクリーニングパネル内において可能なマーカー（抗体）の例示的なリストを提供している。ここで、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ１１７、ＨＬＡ−ＤＲ、ｋａｐｐａ、及びｌａｍｂｄａという２４個のマーカーが示されており、これは、標準的な白血病／リンパ腫パネルを表しており、このパネルは、白血病及びリンパ腫の診断を支援するために、且つ治療後のフォローアップのために有用である。マーカーのすべてがこのスクリーンショット内に表されうるわけではないが、図６Ｂは、ＣＤ４５  ＫＯ対ＳＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ（左上象限）とＳＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ対ＦＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ（右上象限）との２つの２Ｄフローサイトメトリプロットを含む分析の結果のサンプルスクリーンショットを示している。これに加えて、当業者には容易に明らかとなるように、適切なマーカーの選択は、既知の又は存在すると疑われている異常に依存することになる。例えば、拡張された白血病／リンパ腫パネルは、標準的なパネル用の列挙されたマーカーに、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、及びＦＭＣ−７を追加してもよい。予後診断及び治療監視のために、相対的に小さい選択されたマーカーのパネルが使用されてもよい。使用されるマーカーとは無関係に、大量のデータから関連する部分母集団の情報を抽出するために、同一の基本手順が踏襲されることになる。
【００５４】
ソフトウェアシステムの一部分は、ゲーティング構造の設計、ＳＶＭの構成及びトレーニング、及び既定値の設定を円滑に実行している。ゲーティングは、観察対象のパラメータに関する特定の基準に基づいて細胞の部分母集団を選択する任意のプロセスとして定義される。ゲーティングは、データの複雑性を低減すると共に分析をデータの特定の部分母集団に合焦するための有効な技法である。但し、分析のすべての側面に対処するために、通常、多数のゲートが存在することになり、且つゲーティング構造自体が複雑化する場合もある。
【００５５】
このシステムの階層構造は、非常に一般的なタイプのゲーティングの柔軟且つ便利な定義を円滑に実行する。
【００５６】
それぞれのノードにおいて、ステップ５０２では、任意の２つのパラメータの選択に基づいて２Ｄゲーティングが定義されている。２Ｄプロット５０６は、ゲーティングを定義するための基礎である。
【００５７】
ノードにおけるゲーティグされたデータ５０４は、現時点のノードに先行する一連のノードにおけるゲーティングのチェーンの累積結果である。それぞれのノードは、パラメータの任意の組合せを有する２Ｄゲーティングを定義していることから、階層方式は、実質的に任意のゲーティング構成の定義を許容している。
【００５８】
例えば、ＦＳ（前方散乱）及びＳＳ（側方散乱）に関するゲーティングにより、デブリをフィルタリングによって除去することができる。非デブリについては、ＣＤ４５−Ｄｉｍ（減少したマーカー）、単球、ＣＤ４５−陰性（陰性マーカー）、顆粒球、及びリンパ球という５つの部分母集団を分離するために、ＦＳ及びＣＤ４５マーカーに関する別のゲーティングを定義することできる。新しいノードを供給するために単核細胞を更にゲーティングすることができる。
【００５９】
図７は、図４に示されているものなどのツリー４００の１つのブランチ内の可能なゲーティングシーケンスを示すフロー図を提供している。図示のブランチは、３つのノードを含み、これらのノードのそれぞれは、イベントデータを選択された母集団に分離するために、ＳＶＭ処理ステップを含む図５に示されたノード４１０の構造を有する。例えば、ステップ６５０では、側方散乱（ＳＳ）及び前方散乱（ＦＳ）イベントが検出され、次いで、ステップ６５２では、プロットされることにより、データ分布を有する２Ｄ画像が生成されている。ステップ６５４では、ノード＃１は、ＳＳ／ＦＳデータのプロットを使用することにより、デブリから非デブリを分離するためにゲーティング動作を実行している。図８Ａには、この分離が示されており、この場合、スクリーンショットの中央パネル内のプロットは、非デブリとデブリとの間のラインを示している。ステップ６５６では、非デブリが選択されており、次いで分析は、ＣＤ４５及びＳＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮについて評価された非デブリデータを含むプロットに向けられる。このプロットは、図８Ｂの中央パネルに示されている。ステップ６５８では、ノード＃２は、非デブリデータを顆粒球、単球、リンパ球、ＣＤ４５−Ｄｉｍ、及びＣＤ４５−Ｎｅｇという５つの母集団グループに分離している。図８Ｃの中央パネル内のプロットは、ＣＤ４５  ＫＯマーカーのＳＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮデータをプロットすることによって識別されたグループ分けを示している（図８Ｃの右パネル内の「ｉｎ  ＳＶＭ」の下におけるチェックされたパラメータである「ＳＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ」及び「ＣＤ４５  ＫＯ」に留意されたい）。次のステップ６６０では、顆粒球データが排除されており、且つＣＤ３及びＣＤ５細胞表面レセプタを分離するために、図８Ｄの中央パネル内にプロットされている残りの単核細胞データがノード＃３でゲーティングされている（ステップ６６２）。図８Ｅには、結果的に得られたプロットが提供されており、これは、Ｘ及びＹ上の％陽性、Ｘ及びＹ上の％陰性、％二重陽性、及び％二重陰性に基づいて象限にサブゲーティングされたフローサイトメトリデータを示している。このブレークダウンは、分布カーネルを使用したプロット内のデータのＳＶＭ分析により生成される。図８Ｅの右パネルの上部部分は、分布分析用の数値を提供している。
【００６０】
このプロセスは、患者の試料のそれぞれの管について反復されることになるであろう。異なるゲーティング定義を有する更なるブランチを並行して実行することが可能であり、例えば、ブランチは、異なる分離の組を実行するためにノード＃１から分岐することができるであろう。任意選択の最終ステップは、それぞれのブランチの末尾で実現された結果を考慮することにより、診断結論を生成するために、それぞれのツリーブランチの結果を組み合わせるというものとなるであろう。好適な実施形態では、この最終的な分析ステップは、サポートベクターマシンによって実行されることになり、これにより、診断スコア、例えば、陽性又は陰性などの２値の結果、確率、予後予測、又は患者の診断若しくは予後のその他の適切なインジケータが生成されることになるであろう。
【００６１】
以下は、本発明の一実施形態による自動的ゲート検出用の例示的なアルゴリズムである。
【００６２】
システムは、ユーザーによって規定された点及びラインからゲート定義を自動的に検出する。アルゴリズム用の疑似コードが以下に付与されている。
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【００６３】
いくつかの状況では、ゲーティングが、個々のケースごとにいくつかの調節を必要とする場合がある。分析に関与する多数のゲートに起因して、これは面倒なプロセスになりうる。
【００６４】
本発明のシステムは、クラスタリングに基づいた自動的ゲーティング調節機能を提供している。フローサイトメトリデータにおけるゲートは、通常、細胞のクラスタと関連付けられている。実際のデータの自動化されたクラスタリングは、既定のゲーティングテンプレートに対して適切な調節を実施するための自然な方法を提供している。
【００６５】
ガウス混合モデル（ＧＭＭ）は、ガウス分布の重み付けされた合計である確率分布である。
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【００６６】
ＧＭＭにおけるパラメータは、期待値−最大化（ＥＭ）アルゴリズムと呼称される学習アルゴリズムによって判定することができる。統計学では、期待値−最大化アルゴリズムは、統計モデルにおいてパラメータの最大尤度又は最大帰納的（ＭＡＰ）推定値を見出すための反復的な方法であり、この場合、モデルは、観察されていない潜在変数に依存している。
【００６７】
本システムは、ノードにおけるフローデータ内でクラスタを検出するためにＧＭＭに適用される。次いで、クラスタ情報は、ゲーティングテンプレートに対して調節を実施するために使用される。また、ユーザーは、ゲーティングを手動で調節するための選択肢も有する。
【００６８】
ゲーティング後、分析のためにそれぞれの部分母集団の特性（パラメータ）がキャプチャされる。ゲーティングツリー内のそれぞれのノードは、関連したＳＶＭを有しており、これは、ノードに存在しているゲーティングされたデータに基づいて定義されている。特定の部分母集団と関連したＳＶＭは、その部分母集団のデータにおける分布パターンを分析するように、且つ部分母集団内のデータの正常／異常の定量的な評価を提供するようにトレーニングされる。
【００６９】
ＳＶＭ入力は、２Ｄプロットに限定されるものではない。ＳＶＭ学習及び後続のＳＶＭ分類のために、パラメータとそれぞれのノードにおけるゲーティングされた母集団の任意の組合せを使用することができる。システムは、Ｃ−ＳＶＭ、ｎｕ−ＳＶＭ、及びシングル−クラス−ＳＶＭなどの異なるタイプのＳＶＭを使用してもよい。
【００７０】
ソフトウェアシステムの更なる特徴は、データをインポートし、ゲーティング調節を実施し、ＳＶＭ分析を実行し、且つ結果をグラフィカルに提示するための機能を含む。
【００７１】
ＳＶＭに基づいた分析ノードの分散システムは、ケース全体に関する異常の定量的通知を提供することになる。
【００７２】
ソフトウェアシステムの一実施形態では、データを表示する様々な視覚化方法が含まれていてもよい。従来の２Ｄプロットに加えて、図９に示されているように３Ｄプロットが利用可能であり、この場合、Ｘ軸は、ＣＤ４５  ＫＯであり（ＣＤ４５−クロームオレンジ色素）、Ｙ軸は、ＳＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ（側方散乱強度、線形）であり、且つＺ軸は、ＦＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ（前方散乱強度、線形）である。３Ｄプロットのために任意の３つのパラメータが選択されてもよい。ユーザーは、３Ｄプロットを対話方式によって運動させてもよく、回転させてもよく、且つスケーリングさせてもよい。３Ｄ機能は、フローデータの構造の大幅に改善された表現を提供する。
【００７３】
実施例３：異常結果の強調表示
自動化されたフローサイトメトリ分析システムの主な目的は、研究室の技術者が、病理学者の検討を必要としているケースを相対的に容易に識別できるようにするというものである。これは、部分的には、分析結果の表示内で特定の色のフォントを使用するか、又は赤色などで強調表示するなどにより、視覚的に弁別可能な特徴を使用して異常プロット及び値を表示することにより実現される。
【００７４】
図１０は、ユーザーワークステーションのモニタ上における画面表示６００の一例を提供している。この例では、患者の試料に対してフローサイトメトリ分析が適用された。分析の一部分において、ＣＤ４５陰性（０．９３％）、顆粒球（５０．５８％）、単球（３．７８％）、ＣＤ４５−Ｄｉｍ（２．００％）、及びリンパ球（４２．７０％）の部分母集団及び相対的な百分率を分離するために、ＳＳ及びＣＤ４５に関するゲーティングの際に識別された部分母集団を示すようにプロット６１０が生成され、これらがＣＤ４５  ＫＯ（ＣＤ４５−クロームオレンジ色素）のＸ軸及びＳＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮのＹ軸においてプロットされている。この例では、リンパ球のカウントが２０〜４０％の正常範囲を超過しており、その結果、異常値が計測されたとユーザーに通知するためにプロットが強調表示される。カラーディスプレイでは、プロットの上部バー６１２が赤色であってもよく、又はプロット全体が赤色によって縁取られてもよいであろう。例示を目的として、プロットの上部バー６１２は波状のラインによって強調表示されている。
【００７５】
プロット６１４は、ＦＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ及びＳＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮに関するゲーティングの結果を示している。このゲーティングの結果は異常結果を示さなかったことから、プロットは、プロットの透明な上部バー６１６によって示されているように、強調表示されてはいない。表示内の表６１８は、それぞれの部分母集団ごとの数値結果を提供している。この場合にも、リンパ球の異常値に起因して、表示された値は、異常値が計測されたとユーザーに通知するために強調表示される。カラーディスプレイ上では、数値「４２．７０」は、その他の値から弁別するために赤色又は何らかのその他の色で表示されてもよいであろう。例示を目的として、値は、下線が付与された状態で、太字で、及びイタリック体で示されている。プロット６１０に示されている部分母集団の分析は、その数値結果が表示の表６２０に表示されているリンパ球の更なるゲーティングを含んでいた。上述のように、それぞれのサブ部分母集団は、初期のゲーティング及び分析を実行したノードから分岐した別個のノードで分析される。この例では、リンパ球は、Ｔ−細胞（ＣＤ２、ＣＤ３）、Ｂ−細胞（ＣＤ１９、ＣＤ２０）、ＮＫ−細胞（ＣＤ１６、（ＣＤ３−ＣＤ５６））、及びｐｒｅ−Ｂ細胞（ＣＤ１０＋ＣＤ１９）という部分母集団にゲーティングされている。結果的に得られた数値結果が表６２０に入力されており、この場合、Ｂ−細胞に関係した異常結果が、表示において値６２２及び６２４を強調表示することにより示されている。表示の表６３０内では、ＣＤ４−ＣＤ８の別の異常値も強調表示されている。
【００７６】
図１１Ａ〜図１１Ｆは、患者からの第２試料の分析に基づいて異常結果の存在についてユーザーに対する通知を提供する表示特徴の更なる図を提供している。図１１Ａは、Ｋａｐｐａ  ＦＩＴＣをＦＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮに照らしてプロットしている。透明な上部バーは、正常結果を示している。同様に、図１１Ｂ（Ｌａｍｂｄａ  ＰＥ対ＦＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ）及び図１１Ｃ（ＣＤ２３  ＥＣＤ対ＦＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ）にプロットされている結果も正常である。但し、プロットの上部のバー内で強調表示することによって示されているように、図１１Ｄ（ＣＤ１９  ＰＣ５．５対ＦＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ）及び図１１Ｅ（ＣＤ１１ｃ  ＰＣ７対ＦＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ）は異常である）。図１１Ｅ（ＣＤ１０  ＡＰＣ対ＦＳ  ＩＮＴ  ＬＩＮ）は、このパラメータの正常結果を示している。
【００７７】
図１２は、それぞれの部分母集団の様々なパラメータをキャプチャ及び定量化するための例示的なスプレッドシート７００を示している。スプレッドシートのリストは、ノード番号（列Ｃ）、例えば、管番号や非デブリなどのゲーティングされたパラメータ（列Ｄ）、例えば、非デブリ、デブリ、ゲート１、ＣＤ４  ＡＰＣＡなどのサブゲート特性（列Ｅ）を含む。列Ｆは、Ｘ軸パラメータに対応しており、列Ｇは、Ｙ軸パラメータを提供している。列Ｈ〜Ｍは、重み、Ｘ−及びＹ−平均、並びにそれぞれの母集団の共分散を提供しており、これらは何れもＳＶＭ分析用の分布カーネルとの関連で使用される。
【００７８】
図１３は、本発明の一実施形態によるフローサイトメトリデータ分析に関与するプロセスの更なる詳細を提供している。プロット７１２は、それぞれＸ及びＹ−マーカー、ＣＤ２０  Ｖ４５０、及びＣＤ２３  ＥＣＤを使用することにより、単核細胞２についてゲーティングされたフローサイトメトリデータのプロットを示している。この分析を実行するために使用されたノード用のスプレッドシートデータ７１０（（図１２の列Ｃの）サンプルノード番号６５）が単核細胞２についてゲーティングされ、次いでＸ及びＹ上の％陽性、Ｘ及びＹ上の％陰性、％二重陽性、及び％二重陰性という４つの象限にサブゲーティングされている。これらの象限内へのサブゲーティングは、異なる象限に含まれている細胞のカウントに対応した重み（百分率）を提供している。それぞれのマーカーごとの算出された平均値は、それぞれの母集団ごとに、分布（共分散）と共にスプレッドシート内に提供されている。これらの結果は正常値の外であることから、異常結果が識別されたとユーザーに通知するために、プロット７１２の上部バンド７１４が強調表示されている。
【００７９】
図１４は、本発明の一実施形態によるフローサイトメトリデータ分析に関与するプロセスの別の例を提供している。プロット８１２は、Ｘ−マーカーＣＤ２０  Ｖ４５０及びＹ−マーカーＫａｐｐａ  ＦＩＴＣを使用することにより、リンパ球２についてゲーティングされたフローサイトメトリデータを示している。（図１２の列Ｃの）サンプルノード番号７７用のスプレッドシートデータ８１０がＸ及びＹ上の％陽性、Ｘ及びＹ上の％陰性、％二重陽性、及び％二重陰性という４つの象限内にゲーティング及びサブゲーティングされている。それぞれのマーカーごとの算出された平均値が、それぞれの母集団ごとに、分布（共分散）と共にスプレッドシート内に提供されている。これらの結果は正常値の外であることから、異常結果が識別されたとユーザーに通知するために、上部バンド８１４が強調表示されている。
【００８０】
以上の例及び添付図面から明らかとなるように、フローサイトメトリデータを自動的に分析するためにパラメータの任意の組合せが使用されてもよい。それぞれのパラメータは別個にである。
【００８１】
いくつかの実施形態では、システムは、分析されたケースからデータを収集するために、データベースを維持するように構成されている（例えば、図１のデータベース１３０を参照されたい）。すべての関連するデータ、報告された統計値、及びＳＶＭ評価用の特徴は、このデータベース内に保存されている。フローサイトメトリ専門家の間における一般的な意見の一致は、大量のフローサイトメトリデータ内には、現時点で知られているものよりも有用な情報が存在しているというものである。このデータベースは、フローデータにおける新しいパターン及び診断情報の発見についての将来の研究の促進を支援することになる。
【００８２】
ソフトウェアは、好ましくは、分析の終了時点でデータを保存するための注意喚起を伴うユーザー命令を含む。同一のケースの複数の分析の場合、古いデータを上書きするための、又はデータの両方のバージョンを保存するための選択肢が利用可能である。
【００８３】
ソフトウェアシステムの完全性及びセキュリティを保証するために、ソフトウェアシステムの好適な実施形態は、リアルタイム認証機能を含む。認証要求を処理するために認証サーバーが確立される。クライアントソフトウェアは、セキュアプロトコルを通じてインターネット上でサーバーと通信する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、分析は、フローサイトメトリ装置が存在している研究室から離れたクライアントマシン上で実行されてもよい。例えば、未加工データが、処理されてもよく、且つネットワークを介して１つ又は複数のリモート場所に送信されてもよい。クライアントマシン上で稼働しているフローサイトメトリ分析ソフトウェアは、正常動作の開始が許可される前に認証を完了させることが必要となる。
【００８５】
一実施形態では、クライアントは、以下のフィールドを含む暗号化されたメッセージをサーバーに送信することになる。
ノンス
タイムスタンプ
アカウント
使用法
ソフトウェアシグネチャ
ハードウェアシグネチャ
【００８６】
認証要求を受信した際、サーバーは、フィールドのそれぞれを検証することになる。認証に成功した場合、サーバーは、要求にマッチングした暗号化された認証メッセージをクライアントに返送することになる。このプロトコルは、「リプレイ攻撃」を防止するように設計されている。ノンス及びタイムスタンプの使用は、メッセージが同一のクライアントについても一意であることを保証することになる。
【００８７】
認証機能は、ソフトウェアが悪意をもって変更されておらず、ソフトウェアが適切にライセンスされており、システムが、準拠した環境において適切に構成されており、且つすべての分析されたケースがカバーされていることの保証の提供を支援することになる。
【００８８】
フローサイトメトリによる免疫表現型検査は、形態及び細胞遺伝学の組合せが診断に不十分であった場合にも、造血細胞内における定量的且つ定性的な異常の検出のための正確且つ高感度の方法である。本明細書で開示されている自動化されたフローサイトメトリデータ分析システムは、フローサイトメトリ計測で生成される膨大な量のデータを自動的に分析する能力を提供し、これにより、フローサイトメトリ方法の精度、反復可能性、及び多様性を改善している。本明細書において開示されている方法によって提供される能力は、フローサイトメトリの診断的価値を改善するのみならず、現時点の制限された方式をはるかに上回るデータマイニング及びパターン認識のために、多くの患者からの膨大な量のフローサイトメトリデータの収集及び分析を可能にすることにより、この技法の研究用途も拡張している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ａ−３】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ａ−３】
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【図８Ｂ−１】
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【図８Ｂ−２】
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【図８Ｂ−３】
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【図８Ｃ−１】
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【図８Ｃ−２】
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【図８Ｃ−３】
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【図８Ｄ−１】
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【図８Ｄ−２】
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【図８Ｄ−３】
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【図８Ｅ−１】
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【図８Ｅ−２】
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【図８Ｅ−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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