(57)【要約】  本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎またはその合併症を含む、肝臓脂肪症の予防および／または治療に使用するための（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪肝の予防および／または治療のための医薬品として使用するための、（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
カリウム塩の形態での、請求項１に記載の（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノン。
【請求項３】
非アルコール性脂肪性肝炎を有する患者に使用するための、請求項１または２に記載の（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
肝線維症、肝硬変、肝不全または肝細胞癌を有する患者に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
脂肪肝の予防および／または治療のための医薬品として使用するための、有効成分としての（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩、特にそのカリウム塩の形態、と少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤とを含有する医薬組成物。
【請求項６】
非アルコール性脂肪性肝炎を有する患者に使用するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
２型糖尿病または脂質異常症の治療を受けている患者に使用するための、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎またはその合併症を含む脂肪肝（肝臓脂肪症）の予防および／または治療に使用するための、（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）  メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩に関する。
【０００２】
式：
【化１】
2018513175.tif 000002
によって表わされる（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル（ナフタレン−２−イル）メタノンおよびその薬学的に許容可能な塩、ならびに２型糖尿病、肥満、脂質異常症、動脈高血圧、アテローム性動脈硬化症および冠動脈イベント、脳卒中または下肢の動脈炎等のそれらに起因する臨床病理学、高血糖症、ブドウ糖不耐性、インシュリン耐性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、再狭窄、膵炎、網膜症、腎症、神経障害、特定のタイプの癌および緑内障のための両治癒的治療および予防的治療としてのそれらの使用は、特許出願ＷＯ  ２０１０／１００１３９に記載されている。
【０００３】
ウイルス性肝炎およびアルコール性肝疾患は世界的に深刻であるが、それらはすべての肝臓病の代表ではなく(do not represent)、最も重要なものさえ代表していない。過去二、三十年間にわたって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が今や西洋諸国において肝臓病の第一位の原因であることが徐々に明らかになってきた。
【０００４】
脂肪肝は肝細胞中の脂肪の蓄積に起因する。蓄積された脂肪の量が、体が処理することができる量を超過すると脂肪族化合物は緩やかに肝臓に蓄積する。脂肪が肝臓の少なくとも５％を占めると人は脂肪肝を有する。単純な脂肪肝は完全に良性の状態になり得、通常は肝損傷を引き起こさない。しかしながら、一度脂肪が蓄積されるだけで、肝臓は損傷を受けやすくなり、炎症および瘢痕を引き起こし得る。脂肪肝は、主として小児肥満症が驚くほど増加していることから、小児においてますます一般的になっている。
【０００５】
ＮＡＳＨは、非常にまん延している慢性肝炎であって、その脂肪症が肝細胞および小葉炎症（LaBrecque et al., World Gastroenterology Organisation Global Guidelines, J. Clin. Gastroenterol. 48, 467-473, 2014）および潜在的には線維症の組織学的病変に関連している。ＮＡＳＨは、しばしば心疾患およびとりわけ脳卒中の危険性の増加に関係している。  
【０００６】
ＮＡＳＨの病因論は多元的である。それは、末梢および肝性インシュリン耐性、脂肪酸代謝障害、酸化ストレスおよび細胞線維性増殖に結びつく、様々な生理病理学の機序を含んでいる（Cusi, Gastroenterol. 142, 711-725, 2012）。しかしながら、現在のところ、肝生検によって診断されたＮＡＳＨは必ずしも糖尿病または脂質異常症に関係しているとは限らない。この病理学が複雑で多様的なことは、現在のところ確立され認識された治療的処置がなく、臨床試験が進行していることおよびメカニズムのアプローチが多様であることを説明している。しかしながら、酸化防止および抗炎症性の特性を有する胆汁酸誘導体での治療を想定することもできる（Coskun et al., Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 27, 142-149, 2015）。
【０００７】
グルココルチコイド（ヒト中のコルチゾール）は、エネルギー代謝の調整に優勢な役割を果たす遍在のホルモンである。それらは糖新生を促進し、インシュリン分泌および末梢グルコース再取込みを阻害する。１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１１β−ＨＳＤ）は、コルチゾンおよびコルチゾールの相互転換を確保することによって、肝臓、脂肪組織、腎臓および脳等の特定の標的組織中のグルココルチコイドレベルを調整する（Chapman et al., Physiol. Rev. 93, 1139-1206, 2013; Morgan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 111, E2482-E2491, 2014; Gathercole et al., Endocrine Rev. 34, 525-555, 2013）。脂肪組織中における、コルチゾールの局所的な増加は脂肪分解をより悪化させることにつながり得、その結果、血液中の遊離脂肪酸の上昇および肝臓中の脂質の門脈流入の増加がさらに起こる。この「脂肪毒性」と呼ばれる機序は脂肪肝、ＮＡＳＨを起こし得るデノボ脂質生成の刺激および糖新生を引き起こす（Ahmed et al., PLOS ONE 7, e29531, 2012）。この「末梢脂肪組織−肝臓」相互作用を越えて、１型１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを介した肝臓内コルチゾールの再生は、糖新生を引き起こし、かつ末梢インスリン耐性をも強める場合がある。ごく最近、マウスの１型１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性の低減が、脂質ホメオスタシスおよび肝臓生理病理学の重要な役割を果たす、循環する肝臓内の胆汁酸（Penno et al., Mol. Metab. 3, 554-546, 2014）の増加を引き起こすことが示された（Porez et al., J. Lipid Res. 53, 1723-1737, 2012）。
【０００８】
体重超過であるが糖尿病ではない対象に対して、脂肪肝疾患について、１型１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害の有意性が臨床的に研究された（Stefan et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2, 406-416, 2014）。その研究において、末梢インスリン感受性の改善は報告されず、この１型１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害物質が、別の作用の機序によって作用することが示唆された。しかしながら、他の化合物とではインスリン感受性が増加したことが明白に示され（Rosenstock et al., Diabetes Care 33, 1516-1522, 2010）、このことは同一薬効区分内の活性プロファイルの主な差異を強調したため、化合物ごとの組織分布を予測することが不可能となった。
【０００９】
したがって、すべての代謝的に活性な標的組織、とりわけ脂肪分解を介した肝臓とのその相互作用による末梢脂肪組織における１型１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害の重要性は、肝性脂肪毒性を低減しかつＮＡＳＨおよび関連の病理学を治療するための阻害的分子を達成するための重要な要素であると思われる。      
【００１０】
本発明者らは、予期せずに（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩、特にカリウム塩が、脂肪肝、とりわけＮＡＳＨまたはその合併症、を治療するために使用することができると見出した。
【００１１】
本発明において、用語「薬学的に許容可能な」とは、分子的実体(molecular entities)および組成物のうち、ヒトに投与された際に、副作用またはアレルギー作用あるいは他の望ましくない反応を生成しない分子的実体および組成物を指す。本明細書において使用する、用語「薬学的に許容可能な賦形剤」には、保存料、フィラー、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、抗菌剤または抗真菌剤あるいは腸および消化管の吸収および再吸収を確かに遅延させるための薬品等の任意の希釈剤、アジュバントまたは賦形剤が含まれる。これら媒体またはビヒクルの使用は当業者において周知である。
【００１２】
治療的使用のための本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩には、有機または無機の塩基から形成されたもの等の、本発明の化合物の通常の非毒性の塩が含まれる。例示目的で、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化カルシウム等の無機塩基に由来する塩およびリジンまたはアルギニン等の有機塩基に由来する塩を言及してもよい。
【００１３】
これら塩は、従来の化学的手法に従い、酸部分および対応する塩基を含有する本発明の化合物から合成してもよい。
【００１４】
（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノン（化合物１）に存在している水酸基のプロトンは、十分に酸性であるため当業者に公知の技術によって塩化可能である。よって、例示目的で３−（２−ナフトイル）−２−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−４−オレート１，１−ジオキシドカリウムは、エタノールとジクロロメタンの５０：５０混合物中で化合物１を溶解して、次いで１Ｍ水酸化カリウム水溶液の当量を添加した後に得てもよい。本発明は、より詳しくはこの特定のカリウム塩に関する。第二の例は、３−（２−ナフトイル）−２−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−４−オレート１，１−ジオキシドナトリウムであって、それは、水酸化カリウム水溶液を水酸化ナトリウム水溶液に置き替えることによって上記のように得られる。
【００１５】
本発明の化合物の治療的使用のための許容可能な溶媒には、本発明の化合物を調製する最後の工程の間に溶剤の存在により形成されたもの等の従来の溶媒が含まれる。例示目的で、溶媒には、水またはエタノールの存在に起因する溶媒を言及してもよい。
【００１６】
本発明によれば、ＮＡＳＨの潜在的な合併症は肝線維症、肝硬変、肝不全および肝細胞癌である。
【００１７】
肝線維症は、肝実質中の細胞外マトリックス成分の異常な高蓄積を特徴とする慢性肝炎の共通の結果である。その進行は肝硬変に結びつくかもしれない。
【００１８】
肝硬変は、慢性的なアルコール消費、肝臓中の脂肪蓄積および自己免疫疾患等の様々な原因に起因し得る。それは、線維症および肝臓の正常構造から構造的に異常な結節への変質の形態学的基準によって定義される。これら異常には肝機能の失調が伴う。
【００１９】
劇症肝炎と呼ばれることもある肝不全は、重篤で急性な肝細胞機能の低下である。最初の影響は、多臓器出血の危険性につながる凝血という大きな障害である。その予後は非常に厳しいものである。
【００２０】
肝細胞癌は原発性肝癌である。それは、通常肝硬変に生じる。肝細胞癌（肝硬変、ＮＡＳＨ）の危険因子を有する患者に対しては、現在、より初期の段階で疾患を検出するために、生物学的および形態学的なパラメーターのモニタリングを増やすことを採用している。
【００２１】
（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンは、１型１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの阻害物質である。
【００２２】
本発明は、脂肪肝の予防および／または治療における医薬品としての、（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩の使用に関する。
【００２３】
また本発明は、例えば、肝線維症、肝硬変、肝不全または肝細胞癌等の非アルコール性脂肪性肝炎またはその合併症の予防および／または治療における医薬品としての、（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩の使用に関する。
【００２４】
（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩の使用は、脂肪肝または脂肪性肝炎の予防および／または治療、アルコール離脱後遺症における医薬品としても好適であることに留意することが重要である。
【００２５】
本発明は、さらに、とりわけ、非アルコール性脂肪性肝炎または例えば、肝線維症、肝硬変、肝不全または肝細胞癌等のその合併症を有する患者における、脂肪肝の予防および／または治療における医薬品として使用するための、有効成分として（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩および少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物に関する。
【００２６】
本発明による組成物は、２型糖尿病および／または脂質異常症に有効な成分等の１種以上の他の有効成分と共に製剤化および／または投与されてもよい。
【００２７】
好ましい様式で、発明による組成物は、ビグナイド等のインシュリン耐性医薬品、例えばメトホルミン、低血糖スルファミド、グリニド、ＧＬＰ−１アナログ、グリプチンまたはアルファ−グルコシダーゼ阻害物質等のインシュリン分泌薬と組み合わせて製剤化および／または投与してもよい。
【００２８】
別の好ましい様式で、本発明による組成物は、スタチンまたはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害物質、エゼチミブ等の腸コレステロール吸収の阻害物質、フィブラート、イオン交換樹脂またはニコチン酸と組み合わせて製剤化および／または投与してもよい。
【００２９】
特に好ましい様式で、本発明による組成物は、例えば、アリロクマブまたはエボロクマブ等のＰＣＳＫ９に対するモノクローナル抗体と組み合わせて製剤化および/または投与してもよい。
【００３０】
本発明による医薬組成物は、ヒトへの投与のために製剤化してもよい。本発明による組成物は、経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、直腸または鼻腔内で投与してもよい。この場合、有効成分は従来の医薬担体と混合して、単一単位投薬形態でヒトに投与してもよい。好適な単一単位投薬形態には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤および経口溶液または懸濁液等の経口投薬形態；舌下および口腔投薬形態；皮下または経皮、局所、筋肉内、静脈内、鼻腔内、眼内投薬形態；または直腸投薬形態が含まれる。
【００３１】
錠剤状の固形組成物が調製された場合、主要な有効成分は、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、アラビアゴム、シリカ等の医薬ビヒクルと混合する。錠剤はスクロースまたは他の好適な材料でコーティングするか、またはそれらが延長したかまたは遅延した活性を有するように、また継続的に所定量の有効成分を放出するように処理してもよい。
【００３２】
カプセル剤は、有効成分を少なくとも1つの製剤賦形剤と混合し、かつ得られた混合物を軟カプセル剤または硬カプセル剤へ注ぎ入れることにより得てもよい。
【００３３】
シロップまたはエリキシル中の製剤は、甘味料、防腐剤、同様に香料および好適な着色料と一緒に有効成分を含有していてもよい。
【００３４】
水分散性な散剤または顆粒剤は、分散剤または湿潤剤、あるいは懸濁剤、同じように風味中和剤または甘味料と一緒に有効成分を含有していてもよい。
【００３５】
直腸内投与には、例えば、ココアバターまたはポリエチレングリコールなどの直腸温で溶解する結合剤と一緒に調製される坐剤が使用される。
【００３６】
非経口（静脈内、筋肉内、皮内、皮下）、鼻腔内または眼内の投与には、薬理学的に相溶性な分散剤および／または湿潤剤を含有する水性懸濁液、等張食塩水または無菌注射剤溶液が使用される。
【００３７】
また、有効成分は、場合により１つ以上の追加の担体と共にマイクロカプセルとして製剤化してもよい。
【００３８】
有利的には、本発明による医薬組成物は経口投与を意図している。
【００３９】
本発明の組成物中の（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノンまたはその薬学的に許容可能な塩の投薬量は、投与方法に特有の組成物に対する所望の治療反応を得るのに有効な物質量を有するために調節してもよい。本発明の化合物の有効量は、例えば、選択された投与経路；治療する個体の体重、年齢、性別および感受性；および病理学の性質等の多くのパラメーターによって変動する。従って、最適な投薬レジメンは、関連すると見なされたパラメーターの関数として当業者によって決定されるべきである。有効用量は、大規模な分量で異なるかもしれないが、１日量は、平均で体重７０ｋｇの成人に対して、１回以上の投与で、２４時間ごとに１ｍｇ〜２０００ｍｇの間、好ましくは５０〜１０００ｍｇの間であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【実施例】
【００４１】
本発明を、以下の例によってその範囲を制限することなく説明する。
【００４２】
実施例１：ヒト１型１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１１β−ＨＳＤ  １）の阻害；培養における原発性ヒト分化型脂肪細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
ヒト１１β−ＨＳＤ  １酵素の阻害を培養（ZenBio）中の原発性ヒト脂肪細胞で評価した。
プロトコル：
前脂肪細胞を解凍し、その生存率を確認する。その後、前脂肪細胞を、ZenBioによって提供された特定の前脂肪細胞培地（ＰＭ−１）中の９６ウェルマイクロプレート中に置いた。プレートを５％のＣＯ２で３７℃にてインキュベートした。細胞が密集してから１日以上後に、ＰＭ−１を、同様にZenBioによって提供された、イソブチルメチルキサンチン、インシュリン、デキサメサゾンおよびＰＰＡＲアゴニストを含有する特異的な分化培地（ＤＭ）と置き換えた。細胞は最低７日後に脂肪細胞に分化するだろう。次に、成熟した脂肪細胞を脂肪細胞維持培地（ＡＭ）中で４〜６日間維持した。その後、デキストランでコーティングされた木炭で処理した血清の存在下で、細胞を４８時間ステロイドが不足した状態に置き、コルチゾンでのパルス前に３７℃で１時間、試験する阻害物質またはそれらの担体（０．１％ＤＭＳＯ）で前処理した。トリチウム化したコルチゾンを４時間添加し、最終濃度２０ｎＭに到達させた。コルチゾール濃度を、ＳＰＡ技術を用いて、細胞上澄みから定量化した。ＥＣ５０値を、SigmaPlot v.11ソフトウェア、４つのパラメーター・ロジスティック方程式で得た。報告された値は、３つの異なるドナーに対して実施された３つの異なる実験からもたらされたものである。
【００４３】
試験阻害物質：
化合物１Ｋ：化合物１のカリウム塩、３−（２−ナフトイル）−２−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−４−オレート１，１−ジオキシドカリウム；
化合物２：３’−（４−ヒドロキシ−２−メチル-１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン-３-カルボニル）−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボニトリル
【００４４】
【表１】
2018513175.tif 000003
化合物１Ｋおよび２は、培養中の原発性ヒト脂肪細胞中の１型１１β−ＨＳＤの強力な阻害物質である。
【００４５】
実施例２：様々な１型１１β−ＨＳＤ阻害物質をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスへ単独経口投与した後の血漿生物活性の評価（バイオアベイラビリティ／能力（puissance）／効能）
プロトコル：
４〜６週齢の絶食させていないＣ５７ＢＬ／６Ｎ株雄マウスを評価した。試験する化合物またはビヒクル（１０ｍｌ／ｋｇで水中０．５％のメチルセルロース）を経口投与した。治療１回あたりマウスｎ＝３個体。
【００４６】
血液サンプルを、投与から１時間および４時間後に回収した。試験管を遠心分離して血漿を得て、生物分析まで７０℃で凍結した。血漿生物活性（最終容量２％）を、検出システム（ＳＰＡ技術）として１型１１β−ＨＳＤの阻害を用いて、試験した各用量での各化合物に対して分析した。各用量に対しての阻害を百分率で計算した（対担体で治療したマウス）。
【００４７】
試験化合物：
化合物１：（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−イル）（ナフタレン−２−イル）メタノン；
化合物１Ｋ：化合物１のカリウム塩、３−（２−ナフトイル）−２−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−４−オレート  １，１−ジオキシドカリウム
化合物２：特許ＷＯ２０１０／１００１３９に記載の３’−（４−ヒドロキシ−２−メチル−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−３−カルボニル）−［１、１’−ビフェニル］−４−カルボニトリル；
化合物２Ｋ：化合物２のカリウム塩、３−（４’−シアノビフェニル−４−カルボニル）−２−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−４−オレート  １，１−ジオキシドカリウム；
化合物３：特許出願ＵＳ２００５／００７０７２０に記載された、標準化合物、（３−（１−アダマンチル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］アゼピン。
【００４８】
【表２】
2018513175.tif 000004
【００４９】
化合物２の活性プロファイルは化合物１より本質的に高い。化合物１および２の塩化はこのモデルにおける活性の点からは反対の効果である。
【００５０】
【表３】
2018513175.tif 000005
【００５１】
化合物１は、治療したマウスの血漿に検出され、０．６３ｍｇ／ｋｇで１型１１β−ＨＳＤを阻害する。化合物１Ｋで処理した動物からの血漿試料のＬＣ／ＭＳ分析から、親分子の、化合物１に見出されたレベルより遥かに高い血漿レベルが示された。
【００５２】
実施例３：様々な１型１１β−ＨＳＤ阻害化合物をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスへ単一経口投与した後の白色脂肪組織の生物活性の評価（分布／能力（puissance）／効能）
プロトコル
投与から４時間後に、マウスを安楽死させ、鼠蹊の白色脂肪組織を取り、生物分析の日まで−７０℃で凍結させた。白色脂肪組織を液体窒素中で均質化し、次に、アセトニトリル（４ｍｌのアセトニトリルおよび２００ｍｇの鼠蹊の白色脂肪組織に対して１ｍｌの蒸留水）で処理し、可溶物質を抽出した。アセトニトリル画分を回収し、次に乾燥させ、残留物を、白色脂肪組織３００ｍｇに対してＤＭＳＯ１ｍｌに溶解させた。鼠蹊の白色脂肪組織（ウェル１個当たり組織１５０μｇの当量、１％ＤＭＳＯ）の生物活性を、ヒト１型１１β−ＨＳＤの阻害を検出システム（ＳＰＡ技術）として用いて、試験した化合物それぞれおよび用量それぞれについて分析した。
試験化合物：実施例２と同一。
【００５３】
【表４】
2018513175.tif 000006
【００５４】
実施例２のように、化合物２は化合物１より本質的に活発であり、塩化は反対の効果を生む。
【００５５】
実施例４：化合物１、１Ｋおよび２Ｋをカニクイザルへ単一投与した後のプレドニゾンからプレドニゾロンへの転化の阻害（能力（puissance）／効能）
プロトコル
使用したプロトコルは、Bhatらによって記載されている（J. Pharmacol. Exp. Ther. 324, 299-305, 2008）。１１β−ＨＳＤ酵素が、げっ歯動物とヒトとでは比較的著しい種特異性を示すため、霊長目の動物を種として選択した。
【００５６】
簡潔には、研究は一晩絶食させた実験未使用の雄カニクイザルの成体で行なった。１型１１β−ＨＳＤ阻害物質またはそのビヒクル（水に０．５％のメチルセルロース）を、鼻腔挿管によって投与した。２時間後に、プレドニゾン（１０ｍｇ／ｋｇ）の曝露を経口投与で行い、血液試料を２４時間規則的に採取した。これら試料を遠心分離し血漿を得て、すぐに―７０℃で生物分析まで凍結させた。プレドニゾン、プレドニゾロンおよび１型１１β−ＨＳＤ阻害物質の血漿レベルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法によって測定した。
【００５７】
研究は１０週間にわたって行なわれた。時間および曲線下面積の関数としての血漿中濃度のプロファイルは、台形法を用いてすべてのパラメーターに対して計算する。
【００５８】
３つの研究が行なわれた：
−研究１
化合物１の効果を３つの用量で評価する：１．２５、５および２０ｍｇ／ｋｇ。
化合物１を介した１型１１β−ＨＳＤの阻害は、プレドニゾンのプレドニゾロンへの転化の減少を特徴とし、この特定時間内の優勢な肝性インパクトを示す。３０分〜４時間の間で計算された曲線下面積の血漿プレドニゾロン／プレドニゾン比は、効能評価への重要なパラメーターである。この第一の研究において、化合物１は、５ｍｇ／ｋｇで１型１１β−ＨＳＤの用量依存阻害を示し、その阻害は２０ｍｇ／ｋｇで３４％に達する。サルで行なわれたこの研究の個体間の変動性を考慮すれば、化合物１を２０ｍｇ／ｋｇで治療した動物の８０％は、プレドニゾロン／プレドニゾン比の阻害４６％で、薬理学的治療に順調に応答した。同様に、動物の６０％は、５ｍｇ／ｋｇの用量の化合物１に順調に応答し、その阻害は２８％に達した。マウスでの結果によって示されるように化合物１が非常によい分布を有すると思われる脂肪組織に対する効果は、実験の特定の時間枠により、このモデルでは取り扱われなかったことが強調されるべきである。この研究の間、化合物１について特別の臨床的または挙動的な兆候は報告されなかった。
【００５９】
−研究２
化合物１Ｋの効果を３つの用量で評価する：２０、４０および８０ｍｇ／ｋｇ。プロトコルは、血液試料をサル１個体あたり７個ではなく５個採取した以外は、上述のものに比較的類似している。化合物１Ｋも１０週間にわたって評価した。
【００６０】
プレドニゾンのプレドニゾロンへの転化は、１型１１β−ＨＳＤの活性に依存する。化合物１Ｋは、３０分〜４時間の間で計算された曲線下面積の血漿プレドニゾロン／プレドニゾン比の「最大の」阻害（少なくとも８０％）を引き起こし、この結果は、１つのグループ当たり５個体の動物で、すべての試験した用量について得られた（図１Ａ）。薬学的応答は個体間で少し変動した。図１は、３０分〜４時間の間の曲線下面積で計算されたプレドニゾロン／プレドニゾン比（パネルＡ）および実験期間６時間の血漿曝露（パネルＢ）に対する化合物１Ｋの効果を表わした図である。
【００６１】
２０ｍｇ／ｋｇの同一用量において、カリウム塩（１Ｋ）および非塩化形態（化合物１）は、このバイオマーカーをそれぞれ８１％および３４％阻害した。薬理活性のこの大きな差異は、化合物１Ｋをほぼ８倍に増加させる血漿曝露と恐らく関係がある。このプロトコルでは、主として肝１型１１β−ＨＳＤの活性を評価することが可能となる。最高用量４０および８０ｍｇ／ｋｇでは、化合物１Ｋの血漿曝露がさらに増加し（図１Ｂ）、プレドニゾンのプレドニゾロンへの転化はそれぞれ７９％および８９％と著しく阻害される。この研究の間、化合物１Ｋについて８０ｍｇ／ｋｇでさえも特別の臨床的または挙動的な兆候は報告されなかった。
【００６２】
−研究３
霊長目の動物５個体に対して上記と類似の実験プロトコルを実施し、化合物２Ｋ（１．２５、５および２０ｍｇ／ｋｇ）および比較のために１用量の１Ｋ（５ｍｇ／ｋｇ）の用量−応答関係を試験した。プレドニゾンのプレドニゾロンへの１型１１β−ＨＳＤ活性依存的転化を評価した。化合物２Ｋは、用量２０ｍｇ／ｋｇでこの活性をおよそ５０％阻害する（図２Ａ）。図２は、試験した３つの用量での、３０分〜４時間の間の曲線下面積で計算された血漿プレドニゾロン／プレドニゾン比（パネルＡ）、および６時間実験期間中のプラズマ曝露  （パネルＢ）に対する化合物２Ｋの効果を表した図である。用量５ｍｇ／ｋｇの化合物１Ｋで得られた結果を、２つのパネルにおいて比較した。この研究から、用量２０ｍｇ／ｋｇ未満の化合物２Ｋは不活性であって、そのプラズマ曝露がより高いにもかかわらず、化合物１Ｋより驚くほど強力ではないことが示された（図２Ｂ）。しかしながら、全く反対に、化合物２Ｋの遥かに有益ではない活性プロファイルは、１型１１β−ＨＳＤを阻害するための固有能力が、化合物１Ｋに劣るためではない（実施例１参照）。
【００６３】
実施例５：化合物１Ｋをカニクイザルへ単一経口投与した後の肝１型１１β−ＨＳＤの阻害（ｅｘ  ｖｉｖｏ活性）
プロトコル
成体雄カニクイザル５個体（実施例４の研究１および２で使用した動物と同一）を実験前に夜断食させた。血液試料を、化合物１Ｋ投与直前（用量２０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝３）または賦形剤投与直前（水に０．５％のメチルセルロース、ｎ＝２）、次いで経口投与から４時間後に採取した。動物を安楽死させ、サルの検死を行い、血漿および標的組織の試料を採取し、次いで液体窒素中で凍結させ、ｅｘ  ｖｉｖｏ分析まで−７０℃で保管した。１型１１β−ＨＳＤのｅｘ  ｖｉｖｏ活性を試験するために、５〜１０ｍｇの肝臓試料を２つ、ＨＥＰＥＳ５０ｍＭ（ｐＨ７．４）、ＫＣｌ  １００ｍＭ、ＮａＣｌ  ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ中の［１，２−３Ｈ］コルチゾン  １７ｎＭで３７℃にて３０分間インキュベートした。血漿レベルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法で測定した。肝臓試料を超音波処理で均質化し、アセトニトリル（組織２００ｍｇに対して蒸留水１ｍｌ、アセトニトリル４ｍｌ）で抽出した。化合物の組織内濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法によって測定した。
【００６４】
結果
経口投与から４時間後に、化合物１Ｋの平均血漿レベルは１６９６７±３５７６ｎｇ／ｍｌ（ＳＥＭ）であった。これらのデータは、前の研究の結果と完全に調和していた。図３は、２０ｍｇ／ｋｇでの化合物１Ｋの投与による、カニクイザルの肝臓中での１型１１β−ＨＳＤのｅｘ  ｖｉｖｏ活性に対する効果を示した図である。
【００６５】
化合物の単一経口投与は、肝１型１１β−ＨＳＤのｅｘ  ｖｉｖｏ活性を６８％本質的に阻害する結果となり、化合物１Ｋを３×１０−６Ｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ添加することによってさらに阻害するかもしれない（図３）。化合物１Ｋの平均肝臓レベル（相対値で示すレベル）は、１３．６±３．７ｎｇ／ｍｇ組織である。
【００６６】
実施例６：化合物１Ｋをカニクイザルへ単一経口投与した後の脂肪組織（腸間膜および皮下）の１型１１β−ＨＳＤの阻害（ｅｘ  ｖｉｖｏ活性）
プロトコル
プロトコルは、組織試料が腸間膜、皮下および鼠蹊の脂肪組織からである以外は、実施例５に記載されたものと同一である。
【００６７】
結果
図４は、２０ｍｇ／ｋｇでの化合物１の投与による、カニクイザルの脂肪組織中の１型１１β−ＨＳＤのｅｘ  ｖｉｖｏ活性に対する影響をまとめた図である。化合物１Ｋの単一経口投与は、末梢および内臓の脂肪組織の１型１１β−ＨＳＤのｅｘ  ｖｉｖｏ活性の完全な阻害を引き起こす。鼠蹊の脂肪組織に関する結果は類似している（データは示さず）。腸間膜、皮下および鼠蹊の脂肪組織中の化合物１Ｋの組織内濃度（相対値）は、それぞれ６．６±０．４、１．３±０．１および６．１±１．５ｎｇ／ｍｇである。
【００６８】
これらの結果から、脂肪組織に浸透するための、化合物１Ｋの非常に強い向性が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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