(57)【要約】  １つの態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を有する対象又はそのリスクがある対象を治療する方法は、概して、該対象に、移植片対宿主病の少なくとも１つの症状又は臨床徴候を適切な対照対象より軽減するのに有効な複数の骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を投与することを含む。別の態様では、対象における腫瘍を治療する方法は、概して、該対象に、抗腫瘍剤を投与すること、及び、該対象に、インフラマソーム誘発物質を、ＭＤＳＣの活性化を増加させてＭＤＳＣのサプレッサー機能を下げるのに充分に有効な量で共投与することを含む。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を有する対象又はそのリスクがある対象を治療する方法であって、
前記対象に、移植片対宿主病の少なくとも１つの症状又は臨床徴候を適切な対照対象より軽減するのに有効な複数の骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を投与すること
を含む方法。
【請求項２】
前記複数のＭＤＳＣを投与することは、以前に投与されたＭＤＳＣがインフラマソーム活性化を起こす際に、ＭＤＳＣを複数回で連続投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１回のＭＤＳＣの投与は、前回のＭＤＳＣの投与の少なくとも３日後に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも３回のＭＤＳＣの投与を含む、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のＭＤＳＣの少なくとも一部は、インフラマソーム活性化に対する抵抗性を前記ＭＤＳＣにもたらす遺伝子改変を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子改変はアポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）の欠損を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インフラマソームを阻害する薬剤を、前記ＭＤＳＣがインフラマソーム活性化を起こす程度を減少させるのに有効な量で、前記対象に投与することをさらに含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧｖＨＤは急性移植片対宿主病を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象における腫瘍を治療する方法であって、
対象に抗腫瘍剤を投与すること；及び
該対象に、インフラマソーム誘発物質を、ＭＤＳＣのインフラマソーム活性化を増加させて前記ＭＤＳＣのサプレッサー機能を下げるのに充分に有効な量で共投与すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年８月６日に出願された米国仮特許出願第６２／２０１９９０号に基づく優先権を主張し、該仮出願の開示は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
政府資金提供
本発明は、国立衛生研究所から受けたＲ０１  ＨＬ５６０６７、ＡＩ  ３４４９５、ＨＬ１１８１８７９、Ｒ０１  ＣＡ１５６３３０、及びＵ１９−ＡＩ０６７７９８のもと政府の支援によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、１つの態様において、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を有する対象又はそのリスクがある対象を治療する方法を記載する。概してその方法は、対象に、移植片対宿主病の少なくとも１つの症状又は臨床徴候を、適切な対照対象より軽減するのに有効な複数の骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を投与することを含む。
【０００４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、以前に投与されたＭＤＳＣがインフラマソーム活性化を起こす際に、ＭＤＳＣを複数回で連続投与することを含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、複数のＭＤＳＣの少なくとも一部は、インフラマソーム活性化に対する抵抗性をＭＤＳＣにもたらす遺伝子改変を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象に、インフラマソーム活性化を阻害する薬剤を共投与することを含む。
【０００７】
別の態様においては、本開示は、対象の腫瘍を治療する方法を記載する。概して本発明の方法は、対象に抗腫瘍剤を投与すること、及び、該対象に、インフラマソーム誘発物質を、ＭＤＳＣのインフラマソーム活性化を増加させて前記ＭＤＳＣのサプレッサー機能を下げるのに充分に有効な量で共投与することを含む。
【０００８】
上記の本発明の概要は、本発明の各開示実施形態又はすべての実施を記載することを意図しない。以下に続く記載は説明に役立つ実施形態をより具体的に例示する。本出願の全体を通していくつかの箇所で、指針が例のリストを通して提供され、それらの例はさまざまな組み合わせで用いることができる。各例において、詳述されたリストは代表的なグループとしてのみ用いられて、独占的なリストとして見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】骨髄由来ＭＤＳＣ−ＩＬ１３はＧｖＨＤ生存を高めるが、抑制は生体内で５日後に損なわれる。（Ａ）致死的に照射したＢＡＬＢ／ｃレシピエントに、図示されているように、１×１０7個のＣ５７Ｂｌ／６骨髄（ＢＭのみ）又は骨髄と２×１０6個のＣＤ２５除去Ｔ細胞（ＧｖＨＤ）又は骨髄と、Ｔ細胞、６×１０6個のＭＤＳＣ−ＩＬ１３（ＧｖＨＤ＋ＭＤＳＣ−ＩＬ１３））を与えた。カプランマイヤー生存曲線は、４回のプールし、独立した実験（ｎ＝４０頭の動物／群）を表わす。ＧｖＨＤ対ＧｖＨＤ＋ＭＤＳＣ（ｐ＜０．０００１）。（Ｂ〜Ｃ）コンジェニック（ＣＤ４５．２+）ＭＤＳＣ−ＩＬ１３の表面発現は、骨髄のみ（ＧｖＨＤ無）又は骨髄プラスＴ細胞（ＧｖＨＤ）を受けた照射動物への移植の５日後に脾臓から回収した。データは、図示されるすべての標識についてｐ＜０．００１である１群当たり３連を表わす。（Ｄ）ＣＦＳＥ希釈で表わされる応答しているＴ細胞増殖を示す代表的なヒストグラム。移植の５日後にプールした脾臓の精製ＭＤＳＣ−ＩＬ１３は５×１０5個／ｍＬで、同数のＣＦＳＥで標識したレスポンダーＴ細胞、０．２５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３ε  ｍＡｂ、及び２．５×１０5個／ｍｌ、照射Ｔ細胞除去脾細胞とともに、特別に調合された１５０μＭ  Ｌ−アルギニン  ＲＰＭＩ培地中に播種した。陰影のついたヒストグラムは非刺激対照の増殖を示す。データは、１群当たり３つの試料及び合計３回の独立した実験を代表する。（Ｅ）生存率及び回収し、ＣＤ１１ｂ+ＣＤ４５．２+をゲートした総細胞数を示す回収ＭＤＳＣの要約データ。データは、１群当たり３つの試料を表し、３回の独立した実験を代表する。（Ｆ）上記のように移植するか、又は図示されるように０日目、３日目、及び６日目にＭＤＳＣ−ＩＬ１３の３回連続注入を施された致死的に照射したＢａｌｂ／ｃレシピエント。ＭＤＳＣを受けたマウスはすべて、ＧｖＨＤに対して生存の増加を示した、ｐ＜０．００１。ＭＤＳＣ対ＭＤＳＣ、０日目、３日目、及び６日目、ｐ＜０．０００１。生存曲線は、２回の独立した実験の１群当たり２０匹の動物を表し、０日目、７日目、及び１４日目に複数回の注入を施行したさらなる実験を代表する。
【図２】回収したＭＤＳＣにおいて明らかなインフラマソーム活性。（Ａ）回収された野生型又はＡＳＣ-／-ＭＤＳＣ−ＩＬ１３の細胞溶解物のウェスタンブロットは、カスパーゼ−１の活性ｐ１０形及びβ−アクチンを精査した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、ゲルイメージをグレイスケールにし、真っすぐに整え（straighten）、切り取って、サイズに従って目的のレーンを強調した。（Ｂ）β−アクチンに相対的なカスパーゼ−１ｐ１０ブロット定量、ＧｖＨＤ対他のすべての群、ｐ＜０．０５。定量化は、スキャンしたブロットでＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）のデンシトメトリー分析によって行った。（Ｃ）５日目後に回収したＭＤＳＣ−ＩＬ１３の上清のＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡを完全ＲＰＭＩ培地中に播種した。ＧｖＨＤ対他のすべての群、ｐ＜０．０５。点線はＥＬＩＳＡ検出の限界を示す。すべてのデータは２回の独立した実験を代表する。
【図３】ＭＤＳＣにおけるインビトロインフラマソーム誘導はサプレッサー機能の消失につながる。新規培養野生型及びＡＳＣ-／-ＭＤＳＣ−ＩＬ１３のインフラマソーム誘導は、０．２μｇ／ｍｌ  ＬＰＳを３時間加え、続いて２ｍＭ  ＡＴＰの添加又は０．８μｇ／ｍｌ  ポリ（ｄＴ）トランスフェクションすることによって行った。（Ａ）培養上清はさらに１時間後に集めて、ＥＬＩＳＡでＩＬ−１β産生についてアッセイした。データは３回の独立した実験を代表する。（Ｂ）インフラマソーム誘導ＭＤＳＣ−ＩＬ１３を充分に洗って、１：１の比でＣＦＳＥ抑制アッセイに播種した。データは、ゲートしたＣＦＳＥを標識したＣＤ８+レスポンダーＴ細胞、２回の独立した実験のｎ＝６試料／群を代表する。ＮＬＲＰ３はＬＰＳ＋ＡＴＰ処理を示し、ＡＩＭ２はＬＰＳ＋ポリ（ｄＴ）処理を示し、灰色ヒストグラムはＭＤＳＣ無増殖対照を表わす。図１０に示されるゲートしたＣＤ４+レスポンダーＴ細胞。（Ｃ）インフラマソーム誘発ＭＤＳＣ−ＩＬ１３を用い、上記のように処理されたＣ５７Ｂｌ／６→ＢＡＬＢ／ｃ  ＧｖＨＤモデルのカプランマイヤー生存曲線。ＭＤＳＣ対ＭＤＳＣ無  ｐ＜０．０００１、ＭＤＳＣ対ＭＤＳＣ  ＡＩＭ２  ｐ＜０．０００１、ＭＤＳＣ対ＭＤＳＣ  ＮＬＲＰ３  ｐ＝０．００２９。データは、１群当たり２回の独立した実験から合わせたｎ＝１８の動物を表わす。（Ｄ）野生型又は図示されるＡＳＣ-／-マウスから生成したＭＤＳＣ−ＩＬ１３を用いたＧｖＨＤのカプランマイヤー生存曲線。データは、３回の独立した実験の１群当たりｎ＝３０動物を表わす。ＭＤＳＣ対ＭＤＳＣ無  ｐ＝０．０３９９、ＭＤＳＣ対ＡＳＣ-／-ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０００６。（Ｅ）ヒストグラムは、移植後５日目から回収された野生型又はＡＳＣ-／-ＭＤＳＣ−ＩＬ１３に対して１：１の比で播種し、３日目に採取した場合に、ＣＦＳＥで標識した応答Ｔ細胞の分裂％割合を表わす。いずれの単独群と、ＧｖＨＤマウスから回収した野生型ＭＤＳＣ−ＩＬ１３と比較しても、有意なｐ値（＜０．０５）は見られなかった。
【図４】Ａｒｇ１発現の消失と関連したＭＤＳＣにおけるインフラマソーム誘導。ＭＤＳＣ−ＩＬ１３を、示されるようにＮＬＲＰ３インフラマソーム又はＡＩＭ２インフラマソームに向けて誘導し、充分に洗って、完全培地で一晩再培養した。（Ａ）総細胞数について正規化した、野生型又は（Ｂ）ＡＳＣ-／-ＭＤＳＣの細胞結合Ａｒｇ１の酵素活性。データは２回の独立した実験からプールする。ＹＦＰ−Ａｒｇ１トランスジェニックマウスから生成された後、インフラマソームのインビトロ誘導及び完全培地での再播種が続いたＭＤＳＣ。（Ｃ）代表的なヒストグラムとして示された、さらに２日培養した後のＣＤ１１ｂでゲートしたＭＤＳＣに関するＹＦＰ蛍光（陰影のついたヒストグラムは非刺激ＹＡＲＧ骨髄を表わす）及び（Ｄ）％ＹＦＰ+要約データ。（Ｅ）骨髄のみ（ＧｖＨＤ無）又は骨髄と全Ｔ細胞（ＧｖＨＤ）を動物に移植して５日目から回収したＭＤＳＣ−ＩＬ１３に関するＹＦＰ検出。ＹＡＲＧ骨髄（ＹＦＰ−Ａｒｇ１骨髄）はベースラインＹＦＰ蛍光を示す。（Ｆ）バルクＭＤＳＣ−ＩＬ１３又はソートした顆粒球Ｌｙ６Ｇ＋Ｃ＋（Ｌｙ６Ｇ＋）及び単球Ｌｙ６Ｃ＋サブセットに関するＮＬＲＰ３（ＡＴＰ＋ＬＰＳ）インフラマソーム活性化の前後のＩＬ−１β産生。（Ｇ）１：１の比で、ＭＤＳＣ−ＩＬ１３のソートした顆粒球（Ｌｙ６Ｇ＋）サブセット又は単球（Ｌｙ６Ｃ＋）の存在下における抗ＣＤ３ε主導ＣＤ８＋Ｂ６Ｔ細胞応答のＣＦＳＥ増殖。（Ｈ）バルクＭＤＳＣ−ＩＬ１３及びソートした顆粒球（Ｌｙ６Ｇ＋）サブセット又は単球（Ｌｙ６Ｃ＋）サブセットに関する細胞結合アルギナーゼ生物活性。破線はＡｒｇ１欠損脾細胞のバックグラウンド活性を示す。ＭＤＳＣサブセットに関するデータは、３回の独立した実験を代表する。
【図５】ヒトＭＤＳＣにおけるインフラマソーム誘導は、その抑制機能を妨げる。ヒトＭＤＳＣをドナーＰＢＭＣから生成した。（Ａ）採取前に０．２のμｇ／ｍｌ  ＬＰＳで３時間処理し、続いて２ｍＭ  ＡＴＰで１時間前処理したＭＤＳＣの上清のＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡ。データはｎ＝２の実験を代表する。（Ｂ）実線によって示される非血縁ドナーからの培養ヒトＭＤＳＣの存在下においてＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、カリフォルニア州）で標識したレスポンダーＰＢＭＣの代表的なヒストグラム。点線はＭＤＳＣ無の増殖対象を示し、灰色ヒストグラムはＰＢＭＣ単独（ＣＤ３ε無又はＭＤＳＣ無）を示す。Ｎｏ  Ｓｔｉｍは、抗ＣＤ３εなしでのＭＤＳＣに対するアロ応答を表わす。Ｓｔｉｍは、Ｔ細胞活性化のＭＤＳＣ抑制を示すための、抗ＣＤ３εマイクロビーズ（２：１）とＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の添加を示す。Ｓｔｉｍ＋Ｉｎｆｌ．Ｔｘ´ｄは、ＭＤＳＣを抗ＣＤ３εマイクロビーズとＩＬ−２とともに播種する前にインフラマソーム活性化のために処理したことを示す。（Ｃ）集積されたデータは、応答しているＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞の分裂％割合を示す。データは、３名の非血縁ＰＢＭＣドナーの応答を表わし、２回の独立した実験を代表する。
【図６】回収ＭＤＳＣ−ＩＬ１３の拡張表現型。コンジェニック（ＣＤ４５．２＋）ＭＤＳＣ−ＩＬ１３の表面発現は、骨髄のみ（ＧｖＨＤ無）又は骨髄とＴ細胞（ＧｖＨＤ）を受けた照射動物への移植の５日後に脾臓から回復した。データは、図示されるすべての標識についてｐ＝ｎｓ（＞０．０５）をもつ、１群当たり３連を表わす。データは２回の独立した実験を代表する。
【図７】ＣＤ４５．２＋ＭＤＳＣ−ＩＬ１３回復。（Ａ）濃縮の前後のプールされた脾細胞のＣＤ４５．２+頻度を示す代表的なフロープロット。下のグラフは、上のグラフに示される細胞（ＣＤ４５．２＋  ＣＤ４５．１−ｖｅ）細胞をゲートしたものを表わす。（Ｂ）ＧｖＨＤ無群及びＧｖＨＤ群のＭＤＳＣ−ＩＬ１３（ＣＤ４５．２＋）の濃縮効率。データは、３回の独立した実験を代表する。１群当たりｎ＝３。
【図８】高投与量ＭＤＳＣ−ＩＬ１３。ＧｖＨＤのモデルにおけるＭＤＳＣ−ＩＬ１３の０日目投与量の増加の効果を示すカプランマイヤー生存グラフ。２倍と３倍ＭＤＳＣ治療群を区別するために、すでに図１Ｆに示したデータが点線及び少し小さいシンボルによって示されている。データは、２倍及び３倍投与量に関する１群当たりｎ＝１０の２回の独立した実験の組み合わせを表わす。ＭＤＳＣを受けたマウスはすべて、ＧｖＨＤに対する生存の増加を示した。ｐ＜０．００１。ＭＤＳＣ−ＩＬ１３の１倍、２倍、又は３倍の０日目投与量は、互いに著しく異ならない。
【図９】ＭＤＳＣ−ＩＬ１３  ０日目注入表現型。注入前の採取日（＋４日間培養）における野生型Ｂ６（陰影）及びＡＳＣ  ｋｏ（太字）ＭＤＳＣ−ＩＬ１３に関する図示されたマーカーの表面発現。データは少なくとも３回の独立した実験を代表する。
【図１０】ＡＳＣ依存性インフラマソームは、ＣＤ４レスポンダーＴ細胞に対する抑制の消失を誘導した。図３Ｂにあるように、野生型（ｗｔ）又はＡＳＣ  ｋｏ  ＭＤＳＣ−ＩＬ１３を図示されるように処理し、充分に洗った後に、１：１の比でＣＦＳＥ  Ｔ細胞増殖アッセイに適用した。２回の独立した実験から、ゲートしたＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞の代表的なプロットが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、１つの態様において、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制するための骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の使用を改善する方法を記載する。概してその方法は、ＭＤＳＣの使用と、生体内ＭＤＳＣインフラマソーム活性化を制限する少なくとも１つの方法とを組み合わせることを伴う。
【００１１】
骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、進行中の炎症性反応の阻害に関わる自然に発生する免疫調節集団である。骨髄由来のＭＤＳＣが生体内で生成されると、致死性の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の急性モデルの生存率を高め得る。しかし、ドナーのＭＤＳＣを注入してもＧｖＨＤ致死率を部分的に軽減するにとどまる。ＭＤＳＣによる治療の治療上有益な可能性、そして最終的には、生存率を改善するために、本開示は、急性ＧｖＨＤ（ａＧｖＨＤ）における移植後のＭＤＳＣの最終的な効果についての研究を記載する。同種異系間ドナーからの造血移植において致死的に照射されたレシピエントに移植されるＭＤＳＣは、ａＧｖＨＤによる非常に強い炎症性の環境に曝露され、ＭＤＳＣの抑制能を直接的に弱らせしまう可能性がある。ＧｖＨＤ炎症状態の下で、ＭＤＳＣは抑制機能、ひいてはＭＤＳＣのＧｖＨＤによる致死を阻害するする能力を失ってしまいかねない。培養マウス由来ＭＤＳＣ及び培養ヒト由来ＭＤＳＣは、インフラマソーム活性化メディエーターに短時間インビトロで曝露しただけでも、抑制能を損なう可能性がある。インフラマソームの役割と整合して、インフラマソーム複合体を組み立てるアダプターＡＳＣ（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｐｅｃｋ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ＣＡＲＤ）を欠損するドナーＭＤＳＣは、野生型ドナーＭＤＳＣに対してＧｖＨＤ発症マウスの生存を改善した。これらのデータは、ＧｖＨＤ及び他の全身性炎症状態を阻害する治療的な方法としてＭＤＳＣを使用することは、生体内ＭＤＳＣインフラマソーム活性化を制限する方法と組み合わせるとより効果的であり、これによりＭＤＳＣに抑制能を維持する力を与えることができることを示唆する。
【００１２】
例えば、同種異系間造血細胞移植（ａＨＣＴ）は、白血病及びリンパ腫を含むさまざまな血液疾患の潜在的な根治療法である。移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の罹病及び死亡のリスクは、依然として、例えば、悪性及び非悪性リンパ球造血系障害を含む多くの病気に対して同種異系間移植が普及する妨げとなっている。ａＨＣＴの術後補助アジュバント療法としての標的細胞免疫療法は、標的を絞って、内部的に自己調節することによって前処置レジメンと関連する副作用を減らすと同時に、ＧｖＨＤをコントロールすることができる。骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、抑制能もつ骨髄系細胞として広義に定義され、腫瘍、外傷、及び感染などの病的状態と一致し現れる。骨髄（ＢＭ）からのデノボＭＤＳＣ産生は、炎症及び増殖因子放出（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ）に応答して起こる。
【００１３】
ＭＤＳＣは、局所アミノ酸枯渇、一酸化窒素、プロスタグランジンＥ２、抗炎症性サイトカイン、活性酸素種含む固有の機構及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の促進を介して全身性免疫病変を抑制することができる。インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）とインキュベーションしたＭＤＳＣの骨髄由来培養物は、Ｌ−アルギニンのアルギナーゼ１依存枯渇を介してａＧｖＨＤを抑制し、そして次にアロジェニックなＴ細胞応答を阻害する。
【００１４】
急性ＧｖＨＤ（ａＧＶＨＤ）は３つのフェーズ：移植前処置、ドナーＴ細胞プライミング、及びエフェクターフェーズ組織アポトーシスを有すると特徴付けされることが多い。移植前処置及びアロ特異的なドナーＴ細胞の高い頻度の急速プライミングは強度の全身性炎症につながる。ａＧｖＨＤは、レシピエントを攻撃する能力をもつドナーＴ細胞を増殖させるので、致死性を阻害する有効な方法は、炎症が高まり、アロ反応性Ｔ細胞が臓器傷害の一因となって、炎症反応を増幅する移植後早期にＴ細胞応答を弱めることを伴う。よって、ドナーＭＤＳＣが有効な治療を提供するために、これらの細胞は、アロ反応性Ｔ細胞プライミングと増殖を妨げるのに充分に長い期間実行可能な状態で残存し、機能しなければならない。
【００１５】
インフラマソームは、自然免疫感知経路の下流構成要素として作用する多分子複合体である。インフラマソーム活性化と関連する因子としては、例えば、死細胞及び死につつある細胞からの細菌産物及びｄａｎｇｅｒ関連分子（ＤＡＭＰ）の消化管関連の漏出が挙げられる。インフラマソーム活性化が起こるためには、開始シグナルが収束し、アダプタータンパク質ＡＳＣ（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｐｅｃｋ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ＣＡＲＤ）によって媒介されるプロカスパーゼ−１自己触媒開裂、並びに究極的には活性ＩＬ−１β又はＩＬ−１８の開裂及び搬出に至る必要がある。異なるインフラマソームに関与する分子は、活性化シグナルの源及びＡＳＣと融合する上流の分子によって異なる。例えば、ＡＩＭ２様受容体（ＡＬＲ）ファミリーインフラマソームは、細胞質ｄｓＤＮＡをＡＩＭ２（ａｂｓｅｎｔ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｍａ  ２）に結合することによって開始でき、その一方で、ＮＬＲＰ３（ＮＯＤ様受容体ファミリー、ｐｙｒｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３）インフラマソームは、微生物及びホストｄａｎｇｅｒシグナルによって活性化され、細胞外ＡＴＰ含量が変化する。
【００１６】
本開示は、移植後にＭＤＳＣを早期に単回注入しても、致死ＧｖＨＤのマウスモデルのＧｖＨＤを一時的に抑制をするものの、排除には至らないことを示す。データにより、ＧｖＨＤの炎症はＭＤＳＣをインフラマソームを活性化状態にさせ、ＧｖＨＤマウスにおけるＭＤＳＣ抑制機能に逆効果であることが確認された。しかし、ドナーＭＤＳＣを遺伝的に改変してインフラマソーム活性化を無効にすると、ＧｖＨＤ生存率を対照ＭＤＳＣ療法と比べて上昇させることができる。さらに、ヒトＭＤＳＣでも同じ経路が活性化される。あわせて考えると、この新たな情報はＭＤＳＣ治療用途を改善することができる。
【００１７】
ＧｖＨＤ状況下でＭＤＳＣはＣＤ１１ｃ+活性化表現型へ急速に分化する
ＭＤＳＣは、サイトカイン増殖因子ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦとともに４日間培養した新鮮な骨髄（ＢＭ）のから生成した。採取の２４時間前にＩＬ−４又はＩＬ−１３を用いて培養ＭＤＳＣを活性化することは、アルギナーゼ−１の発現を刺激し、インビトロ及びＧｖＨＤの状況においてＴ細胞の機能的な抑制を促進する。ＭＤＳＣ−ＩＬ１３がマウスａＧｖＨＤモデルの生存を延ばすのに有効なことを示すために、致死照射ＢＡＬＢ／ｃレシピエントは、０日目のＭＤＳＣ−ＩＬ１３細胞療法の存在又は非存在下において、ＣＤ２５除去Ｔ細胞と同種異系Ｃ５７Ｂｌ／６骨髄を与えてａＧｖＨＤを誘発した。Ｔ細胞はａＧｖＨＤを誘発し、結果として２４．５日の平均生存期間となった。しかし、ＭＤＳＣ−ＩＬ１３治療を受けた動物は生存が４７．５日まで延びた（図１Ａ）。臨床結果の向上にもかかわらず、治療を受けた大多数の動物は１００日目でまでにＧｖＨＤによって誘発された死のため死亡し、症状は軽減又は遅延されたが、取り除かれなかったことを示唆した。ａＧｖＨＤと関連した状態がどのようにＭＤＳＣ機能を直接変えうるかについて調べるために、骨髄又は骨髄とＴ細胞（ＧｖＨＤ状態）をコンジェニックＣＤ４５．２+ＭＤＳＣ−ＩＬ１３とともに  ＣＤ４５．１+動物に与え、次いで移植後５日目に犠牲にして回収したＭＤＳＣの表現型及び機能を調べた。
【００１８】
表現型的に、前処理と骨髄のみを受けた移植動物から回収されたＭＤＳＣは、未成熟ＣＤ１１ｃlo、ＭＨＣＩＩlo、Ｆ４／８０int発現（図１Ｂ及び図１Ｃ）を維持した。しかし、ａＧｖＨＤ状態（ＣＤ８+ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ２５）を経た動物へ移植されたＭＤＳＣ−ＩＬ１３は、活性化骨髄細胞の顕著な特徴であるＣＤ１１ｃ及びＭＨＣクラスＩＩを上方制御した。Ｆ４／８０発現も増加し、アロ反応性Ｔ細胞によって助長された進行炎症性環境に応答して活性化及び分化が急速に起こったことを示唆した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。共刺激及び活性化の他のマーカーは不変のままであった（図６）。回収されたＭＤＳＣの機能状態を測定するために、生体外で単離されたＭＤＳＣを抗ＣＤ３εｍＡｂで活性化し、ＣＦＳＥで標識したＴ細胞とともに共培養した。骨髄のみ移植した５日目の動物のＭＤＳＣ−ＩＬ１３は抑制性が高かった（図１Ｄ、ＧｖＨＤ無）。対照的に、ＧｖＨＤ動物から回収されたＭＤＳＣ−ＩＬ１３の存在下におけるＴ細胞応答は、ＭＤＳＣ対照群と比べて、全体の増殖のわずかな減少のみを示し（図１Ｄ）、ＧｖＨＤレシピエントのＭＤＳＣのサプレッサー細胞機能の消失を示した。
【００１９】
生体内でのＭＤＳＣによる抑制の消失についての１つの説明は、抑制細胞の生存が損なわれたことでありうる。ＭＤＳＣ生存は、外因性カスパーゼ−８及び内因性ミトコンドリア細胞死経路の連続的な抑制によって維持される。これらの経路のどちらかを操作することは、ＭＤＳＣ生存の急速な低下及び抑制の同時減少を引き起こすことがありうる。移植後のレシピエント脾臓の移植細胞の数及び生存率を調べた。５日目に総ＣＤ４５．２+ＣＤ１１ｂ+細胞の数又は生存率を見ると、骨髄単独とＧｖＨＤ状態との間に有意差は見られなかった（図１Ｅ）。これらのデータは、ＭＤＳＣ−ＩＬ１３が移植後の限られた期間にａＧｖＨＤを減らし、続いてＭＤＳＣ−ＩＬ１３がＧｖＨＤ状態の下でサプレッサー機能を失い、結果として治療効果を持続できなくなることを示唆する。
【００２０】
複数回のＭＤＳＣ−ＩＬ１３注入は、ＧｖＨＤ長期生存率を向上する
ＧｖＨＤ誘導の間にＭＤＳＣ−ＩＬ１３のＴ細胞に対する比を、３：１から移植時における６：１（２倍）又は９：１（３倍）に上げることは、全生存を有意に増加させなかった（図８）。対照的に、新しく培養したＭＤＳＣ−ＩＬ１３の反復投与は、ａＧｖＨＤの間、Ｔ細胞プライミングの移植周術期に、抑制環境を促進及び／又は維持した。培養ＭＤＳＣ−ＩＬ１３の３回の注入は移植後０日目、３日目、及び６日目に施され、合計で９：１の総ＭＤＳＣ−Ｔ細胞比になった。単回の０日目ＭＤＳＣ−ＩＬ１３注入が施された場合の＜１０％の長期生存者に対して、複数回のＭＤＳＣ−ＩＬ１３注入は長期の生存者のコホート（５０％）を助長ｓｈた（図１Ｆ）。新しく培養したＭＤＳＣ−ＩＬ１３の反復注入が生存率を上げるという観察結果は、ＧｖＨＤの誘導の間に見られる非常に強い炎症性環境はＭＤＳＣ持続性又は生存性に影響を及ぼさないが、その代わりに、ホスト環境を変え、結果として移植ＭＤＳＣ−ＩＬ１３は時間とともに抑制性が事実上弱くなるという仮説を支持する。
【００２１】
ＩＬ−１β生産、インフラマソーム活性化への関連転換
ホストＮＬＲＰ３インフラマソーム活性は、マウスモデルにおいてＧｖＨＤを悪化させる可能性がある。そのうえ、ＧｖＨＤ患者は、インフラマソーム関連血清カスパーゼ−１及びＩＬ−１βのレベルの増加を呈する可能性がある。くわえて、ＭＤＳＣは、ある特定の化学療法剤に曝露された場合に、ＩＬ−１βを直ちに産生し、結果として抗がん反応の変化をもたらす。ＧｖＨＤ状態の５日後に回収されたＭＤＳＣ−ＩＬ１３からの細胞溶解物は、カスパーゼ−１（インフラマソーム活性の上流メディエーター）の切断されたｐ１０形態のついて綿密に調べた。ウェスタンブロット解析は、骨髄単独移植対照レシピエントから回収されたＭＤＳＣ−ＩＬ１３と比べて、ＧｖＨＤ状態から回収されたＭＤＳＣ−ＩＬ１３のカスパーゼ−１ｐ１０の量の増加を示した（図２Ａ及び図２Ｂ）。インフラマソーム活性化へのＭＤＳＣ転換のさらなる証拠は、回収されたＭＤＳＣ−ＩＬ１３を一晩培養するために完全培地に入れたときに見出された。上澄みの分析はＧｖＨＤ状態のＩＬ−１βの増加を示した（図２Ｃ）。これらのデータは、ａＧｖＨＤ状態に関連するＭＤＳＣ−ＩＬ１３とインフラマソーム活性との間の相関を確認する。
【００２２】
ＩＬ−１βのＭＤＳＣ−ＩＬ１３インビトロ誘導はＡＳＣを必要とする
ＩＬ−１βは、Ｔエフェクター機能のＴｒｅｇ媒介抑制及び促進を直接妨げることができる。さらにインフラマソーム活性化及びＩＬ−１β産生のための役割を調べるために、培養ＭＤＳＣ−ＩＬ１３におけるインビトロインフラマソーム誘導を精査した。ＮＬＲＰ３及びＡＩＭ２は、さまざまなシグナルがインフラマソームカスケードを増強できるインフラマソームの２つの主要なファミリーを表わす。アダプタータンパク質ＡＳＣは、インフラマソームの完全な活性化のために必要な共通成分でありうる。それらがインフラマソーム活性のために誘導されることができるか否かをテストするために、野生型及びＡＳＣ-／-（Ｐｙｃａｒｄ-／-）骨髄を用いてＭＤＳＣ−ＩＬ１３を生成した。移植時に、ＡＳＣ-／-ＭＤＳＣ−ＩＬ１３は、野生型ＭＤＳＣ−ＩＬ１３と同様の表面表現型を有した（図９）。ＮＬＲＰ３インフラマソームは、ＭＤＳＣ−ＩＬ１３をＬＰＳとともに３時間インキュベーションし、続いてＡＴＰとインキュベーションすることによって試験を行ない、その一方で、ＡＩＭ２インフラマソームは、ＬＰＳを使用した後、ポリ（ｄＴ）トランスフェクションをすることによって使用された。二次的刺激後わずか１時間で、ＩＬ−１βが野生型ＭＤＳＣ−ＩＬ１３の培養上清に検出された（図３Ａ）。しかし、ＡＳＣ-／-ＭＤＳＣ−ＩＬ１３は検出可能なＩＬ−１βを産生せず、ＭＤＳＣ−ＩＬ１３はその環境の変化にすばやく応答してＡＳＣ依存的に炎症誘発性メディエーターＩＬ−１βを産生するということが確認された。そのうえ、ＭＤＳＣ−ＩＬ１３のインフラマソーム誘導はその抑制能を変えることができる。ちょうど４時間でインフラマソームを誘導する同一手順に続いて、ＭＤＳＣ−ＩＬ１３を充分に洗い、抗ＣＤ３ε刺激に対するＴ細胞増殖のインビトロ抑制アッセイに播種した。インビトロインフラマソーム誘導は、応答しているＣＤ８+（図３Ｂ）及びＣＤ４+（図１０）Ｔ細胞を機能的に抑制するＭＤＳＣ−ＩＬ１３の能力を減らす。さらに、この効果もＡＳＣに依存し、インフラマソーム活性化は、例えば、生存性及び／又は他の成熟因子を低下よりむしろ、抑制機能の消失と関連しているという仮説を支持した。
【００２３】
インフラマソーム誘導は、ＧｖＨＤのＭＤＳＣ−ＩＬ１３の有効性を減らす
インビトロ培養ＭＤＳＣ−ＩＬ１３を、ＮＬＲＰ３インフラマソーム又はＡＩＭ２インフラマソームの活性化のために上記の通り処理し、続いて充分に洗った後にａＧｖＨＤモデルに移植した。インビトロ抑制について見られたように、ＭＤＳＣ−ＩＬ１３のインフラマソーム活性化は、ＧｖＨＤ生存を著しく増加させた対照ＭＤＳＣ−ＩＬ１３療法に対してＧｖＨＤ生存効果を減少させた（ｐ＜０．０００１、図３Ｃ）。
【００２４】
治療的移植の後の成熟した、インフラマソーム活性化状態へのＭＤＳＣ−ＩＬ１３転換がａＧｖＨＤの状況に関与するので、遺伝的にインフラマソーム活性化ができないＭＤＳＣ−ＩＬ１３を使用することは、より良好に機能を維持し、さらにＧｖＨＤ生存を高めうる。実際、ＡＳＣ-／-ＭＤＳＣ−ＩＬ１３のレシピエントは野生型ＭＤＳＣ−ＩＬ１３と比べて生存がさらに改善し（ｐ＝０．０００６）、それらはともにＭＤＳＣ無群と比べて有意に良好だった（図３Ｄ）。さらに、移植の５日後のＧｖＨＤ動物から回収したＡＳＣ-／-ＭＤＳＣ−ＩＬ１３は、野生型ＭＤＳＣ−ＩＬ１３に対して、Ｔ細胞抑制能を増加させた（図３Ｅ）。これらの結果はともに、ＧｖＨＤ状況の下でＭＤＳＣ−ＩＬ１３生来のインフラマソーム活性化をＭＤＳＣ細胞療法の限定する役割を果たすとして直接的に関係づける。
【００２５】
ＧｖＨＤのＭＤＳＣ−ＩＬ１３媒介抑制の機序は、Ｔ細胞応答を直接弱め、ＧｖＨＤ生存を促進するアルギナーゼ−１（ａｒｇ１）活性である。ａｒｇ１活性がインフラマソーム誘導と一致して減少したか否かを決定するために、インフラマソーム誘導の後のＭＤＳＣ−ＩＬ１３のａｒｇ１酵素の生物活性を測定した。ＮＬＲＰ３インフラマソーム又はＡＩＭ２インフラマソームが誘導されたとき、ｍＲＮＡ（図示せず）又は生物酵素活性で測定されるａｒｇ１活性の著しい低下が見られた（図４Ａ及び図４Ｂ）。傾向はあったものの、同様の低下はＡＳＣ-／-ＭＤＳＣでははっきりと表れず、経路が直接つながっていない可能性があることを示唆した。ａｒｇ１活性をさらに調べるために、ＹＦＰ−Ａｒｇ１トランスジェニック動物（ａｒｇ１発現が黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）に結び付いているＹＡＲＧ）が用いられて、発現の関連消失について短時間でアッセイできるようになる。ＩＬ−１３はＹＦＰ蛍光を直ちに上方制御し、その一方で、ＩＦＮγ（ｉＮＯＳを発現するＭＤＳＣを誘導する）はＹＦＰ蛍光を増加させなかった（図４Ｃ及び図４Ｄ）。上記のように、ＮＬＲＰ３経路又はＡＩＭ２経路を介するインフラマソーム誘導はＹＦＰ蛍光の同時の消失を結果としてもたらし、ａｒｇ１発現がインフラマソームを誘導する状況に関連して止められたことを示した。そして、ＹＡＲＧトランスジェニック動物から生成されたＭＤＳＣ−ＩＬ１３は、移植モデルに適用され、ＧｖＨＤ状態に骨髄のみ又は骨髄と全Ｔ細胞を与えた。骨髄の動物から５日後に回収されたＭＤＳＣのＹＦＰ蛍光は、培養直後の発現と比べて減少したが、それでもまだバックグラウンドを超えて容易に検出された（図４Ｅ）。しかし、ＧｖＨＤ動物から回収されたＭＤＳＣ−ＩＬ１３では、ＹＦＰはもはや検出可能できず、非刺激骨髄で見られるバックグラウンドレベルに減少した。これらの結果は、ＧｖＨＤの間のａｒｇ１発現の消失とインフラマソーム活性との関連をさらに支持する。
【００２６】
ＭＤＳＣは、マウスの系において顆粒球（Ｌｙ６Ｇ+）及び単球（Ｌｙ６Ｃ+Ｇ-）とされる２つの主要サブセットを含み、不均質であると定義されることが多い。各サブセットがインフラマソーム活性化に対する同類の能力を有するか否か及び抑制能がどのように差次的に影響を受けうるかを決定するために各々を評価した。培養骨髄からのＭＤＳＣ−ＩＬ１３は、＞９０％がＬｙ６Ｃ＋（図９）であり、Ｌｙ６Ｇ発現に基づいてソートした。ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化条件は、Ｌｙ６Ｃ+Ｇ-単球サブセット及びＬｙ６Ｇ+顆粒球のサブセットの両方で同等レベルのＩＬ１β産生を導く（図４Ｆ）。しかし、インフラマソーム活性化から独立したインビトロ抑制アッセイに適用すると、抑制能は実質的にその全体がＬｙ６Ｃ+Ｇ-サブセット内に含まれていた（図４Ｇ）。さらに、ａｒｇ１生物活性は単球のサブセットと関連していた（図４Ｈ）。まとめると、これらのデータは、ＧｖＨＤマウスのサプレッサー機能の消失がインフラマソーム活性と関連し、Ｌｙ６Ｇ+へのシフト又はＩＬ１β産生能の違いに起因するものではないことを示す。よって、ＧｖＨＤ無群に対してＧｖＨＤの比較的高い頻度のＬｙ６Ｃ+Ｇ-サブセットは、生体内での抑制能の消失を説明しない。
【００２７】
ヒト培養ＭＤＳＣはそのインフラマソームが活性化されたときに機能を失う
ＭＤＳＣは、以前に記載されたようにヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から生成した（Lechner et al., 2010, J Immunol 185(4):2273-2284）。これらのＭＤＳＣを用いて、ヒトＭＤＳＣが、マウスＭＤＳＣで見いだされたように、インフラマソームによって活性化される機能消失しやすい同様の傾向がありうるか否かを調べた。ヒトＰＢＭＣは骨髄マーカーＣＤ３３に対して濃縮され、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−６とともに７日間培養した。これらの条件下では、ヒトＭＤＳＣは、非血縁ＰＢＭＣレスポンダーの抗ＣＤ３εｍＡｂによって進められる増殖を抑制した。ヒトＭＤＳＣは、ＬＰＳを加え、続いてＡＴＰを加えてＮＬＲＰ３インフラマソームを会合することによってインフラマソーム活性化条件に応答できることが確認された。ＬＰＳ及びＡＴＰはともに、ＩＬ−１βのＭＤＳＣによる産生を進めるのに必要である（図４Ａ）。次に、インフラマソーム活性化ＭＤＳＣは、抗ＣＤ３εｍＡｂ主導ＰＢＭＣ増殖アッセイに加えられた。マウスの系のように、インフラマソーム活性化構成成分（Ｓｔｉｍ＋Ｉｎｆｌ．Ｔｘ’ｄ）に曝露されたＭＤＳＣはＩＬ−１β産生に付随して抑制を失った。
【００２８】
このように、アロ反応性Ｔ細胞は臨床ＧｖＨＤの罹患及び死亡に対する寄与因子であり、制御性細胞療法の使用はそれらを制御する実行可能な戦略であることができる。ＭＤＳＣは比較的短い時間で正常骨髄から生成することができ、ＧｖＨＤ、自己免疫、及び同種異系移植片拒絶反応を効果的に抑制することができる。本開示は、サイトカインＩＬ−１３によって活性化されたＭＤＳＣがａｒｇ１を産生し、すると今度はＭＤＳＣがＧｖＨＤを抑制できるようにすることを報告する。しかし、ＭＨＣが完全にミスマッチであるストリンジェントなＧｖＨＤモデルでは、ＭＤＳＣ治療は、生存の延長を促進するが、結局のところ大多数の動物を致死ＧｖＨＤから保護できない。さらに、本開示は、養子移植ＭＤＳＣ生来のインフラマソーム活性化が生体内でその有効性を制限することを示す。培養ＭＤＳＣは、ＡＳＣ依存的に速やかに応答して相当量のＩＬ−１βを産生でき、インビトロで抑制の関連消失をもたらす結果となる。さらに、生体内移植の直後に、ａＧｖＨＤという状況の中でＭＤＳＣは成熟ＣＤ１１ｃ+表現型に転換し、インビトロ抑制能の消失を示す。ＧｖＨＤ無状態下の対照と違って、これらのＭＤＳＣは一晩培養したときにインフラマソーム活性化の指標であるカスパーゼ−１ｐ１０の量が増加し、ＩＬ−１βを分泌する。
【００２９】
対照的に、インフラマソーム活性化がＡＳＣ-／-ＭＤＳＣ−ＩＬ１３を用いて遺伝的に不可能な場合には、ＧｖＨＤ生存は野生型ＭＤＳＣ−ＩＬ１３移植レシピエントに比べて改善され、回収されたＡＳＣ-／-ＭＤＳＣ−ＩＬ１３はより良好な細胞外抑制能を維持する。インフラマソーム活性化／転換に対するＭＤＳＣ感受性を変えるさらなる方法は、ＡＳＣ又は他のインフラマソーム関連遺伝子（例えば、ＮＬＲＰ３、ＡＩＭ２、カスパーゼ−１）の遺伝子ノックダウンを含むことができる。遺伝子ノックダウンは、例えば、ｓｈ／ｓｉＲＮＡ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬＥＮ、及び／又はＣＲＩＳＰＥＲ技術、及び／又は部位特異的変異導入を用いて得ることができる。
【００３０】
骨髄細胞は、炎症誘発性方向及び抗炎症性方向の両方において免疫応答を開始して形成することに関与し、優れた可塑性を示す。この適応性は、正常骨髄からインビトロで抑制性が高い細胞を迅速に生成することができるが、ａＧｖＨＤなどの重症の炎症性環境への移植に際して見られる有効性が一過性になってしまうという点で良し悪しがありうる。ＭＤＳＣは実際には不均質であると特徴付けられ、表現型マーカーは疾患モデル間又は種間で必ずしも置き換えられないが、インフラマソーム活性化経路は非常によく保存されているようである。本開示において報告されているデータにおいて、マウス骨髄又はヒトＰＢＭＣから生成されたＭＤＳＣはインフラマソームを容易に活性化し、サプレッサー機能の消失に相関するＩＬ−１β産生を結果としてもたらす。ａＧｖＨＤ患者はカスパーゼ−１の切断及びＩＬ−１βの増加を示すことができ、ＧｖＨＤがインフラマソーム活性化に関連しているという結論をさらに支持する。ＭＤＳＣは定着腫瘍とほぼどこでも関連し、免疫治療介入を活発に乱す可能性がある。ＭＤＳＣの腫瘍誘発インフラマソーム活性化とＧｖＨＤ誘発インフラマソーム活性化と違いの１つは、腫瘍関連ＭＤＳＣ発症は、ＧｖＨＤの非常に強い全身性炎症反応とは対照的に、慢性局所炎症の状況において起こることである。
【００３１】
ＧＶＨＤによって活性化されるＭＤＳＣはＩＬ−１βを分泌するので、そのようなＭＤＳＣがＧＶＨＤ致死性プロセスに寄与した可能性がある。ＩＬ−１βは、それを産生する細胞、周囲の微環境の状態、及び時間的発現に依存する多面発現効果を有するが、一般的には、炎症誘発性且つ場合によっては対抗制御的であることが理解される。＋５日目のＧｖＨＤ移植レシピエントから回収されたＭＤＳＣ−ＩＬ１３細胞をインビトロ抑制アッセイに用いたとき、増殖しているＴ細胞は細胞分裂が少なかったものの、増殖しているＴ細胞の割合は、ＭＤＳＣが無い対照と異ならず、若干の抑制能が残っていたことを示唆した。これらのデータは、ＧＶＨＤによって活性化されたＭＤＳＣ−ＩＬ１３はＧＶＨＤ致死性を直接推し進めなかったことを示唆し、ＭＤＳＣ−ＩＬ１３で治療したレシピエントの生存曲線が２〜３週間遅れてＭＤＳＣ無対照の生存曲線に一致するという結果と整合性がある。養子移植の間にＭＤＳＣ−ＩＬ１３によって付与される生存効果を促進するアルギナーゼ−１発現は、インフラマソームで活性化されたＭＤＳＣにおいて阻害され、ドナーＭＤＳＣによる抑制の消失の原因である可能性があった。
【００３２】
インフラマソームメディエーターのＮＬＲファミリー、例えばＮＬＲＰ３などは、ＡＴＰ及び関連ｄａｎｇｅｒシグナルがともに前処理後に見られるのでＧｖＨＤ状態下でインフラマソーム転換を促進する候補であり、ＧｖＨＤを増強するのに関与しうる。ＧｖＨＤという状況の中でＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化は、放射線療法及び化学療法誘導プロトコールに対して示され、組織の損傷及びｄａｎｇｅｒ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出をもたらした。また、養子移植されたＭＤＳＣもインフラマソーム誘導に影響されやすい可能性があり、同じメディエーターが生体内活性化に寄与しうる。ＮＬＲＰ３インフラマソームを選択的に標的とする試薬は、ホストのインフラマソームを活性化し、注入されたドナーＭＤＳＣを阻害する２つの目的を促進しうる。例えば、小分子阻害剤であるＭＣＣ９５０と、代謝ストレスの下で作られるケトンであるβ−ヒドロキシ酪酸塩（ＢＨＢ））は、ＮＬＰＲ３活性化とＮＬＲＰ３媒介疾患の抑制に対する特異性を示した。あるいは、ｄｓＤＮＡなどのウィルス及び細菌産物も、ＧｖＨＤとインフラマソームのＡＩＭ２様受容体ファミリー双方の強力な推進因子でありうる。ＧｖＨＤ発症がホストＭｙＤ８８／ＴＲＩＦ経路活性に依存しない一方で、放射線及びＧｖＨＤによって誘発された損傷からの死細胞／死につつある細胞によるｄｓＤＮＡの放出は、いくつかの条件の下で致死性を増幅しうる。
【００３３】
総合的に考えると、本開示において報告されるデータは、ＭＤＳＣがインフラマソーム活性化を起こす程度がＧｖＨＤの炎症環境により阻害される度合い軽減することによってドナーＭＤＳＣの治療可能性が増加できることを示す。特に、遺伝子改変（例えば、遺伝子発現ノックダウン、ｓｈ／ｓｉＲＮＡ／メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＲＩＳＰＥＲ）を介して、又は、薬理学的な抑制（ＭＣＣ９５０／ＢＨＢ）を介してインフラマソーム活性化を阻害する治療的なＭＤＳＣ細胞療法の前処置はＭＤＳＣ機能を本質的に持する方法である。さらに、インフラマソーム形成若しくは機能を調節できる薬品及び薬剤又は（移植前、移植中、及び／若しくは移植後に）患者のインフラマソーム活性化を導く患者の誘発因子を調節する薬剤を送達するための薬理学的治療又は生体内ＭＤＳＣ特異的ターゲティングも、ＧｖＨＤの重症度の増加に関連することが示されているホスト由来インフラマソーム活性を防ぐという付加的な効果を伴って、ＭＤＳＣ細胞療法のインフラマソーム転換を減らすことができる。
【００３４】
逆に、一般に腫瘍増殖と関連して慢性的に炎症を起こしている状況において、デノボのＭＤＳＣ生成とインフラマソーム活性は互いに関連しあう場合が多い。このようなＭＤＳＣを抑制すると、化学療法、放射線療法、手術、並びに／又は薬、抗体／タンパク質、ワクチン、及び／若しくは細胞療法を用いる免疫療法の有効性を減少又は消滅させうる。ＭＤＳＣ機能が急性ＧｖＨＤによるインフラマソーム活性により直接的に損なわれることを示す本明細書が提示する発見は、炎症の程度がＭＤＳＣの機能的な支持に影響することを実証する。よって、上述の療法などの腫瘍の消失を目的とする抗腫瘍剤は、腫瘍関連ＭＤＳＣを除去／機能不全にする目的で局所又は全身のインフラマソーム活性化を強化することによってさらに促進することができる。
【００３５】
最先端の分野では、慢性的なインフラマソーム活性化がＭＤＳＣサプレッサー機能を増加させるであろうと当初提案されていた。しかし、ＧｖＨＤにおける我々の発見は、高レベルのインフラマソーム活性化はＭＤＳＣサプレッサー能力を逆にすることを示す。よって、腫瘍においてＭＤＳＣ抑制を逆にする新規の方法は、例えば、尿酸、ＡＴＰ、Ｔｏｌｌ様受容体を刺激する物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はインフラマソーム機能を上方制御できる他の薬剤などの誘発物質を提供することなどの方法を用いて腫瘍内でＭＤＳＣを活性化することを伴いうる。
【００３６】
よって、１つの態様では、本開示は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を有する対象又はそのリスクがある対象を治療する方法を記載する。概して、その方法は、対象に、移植片対宿主病の少なくとも１つの症状又は臨床徴候を適切な対照対象より軽減するのに有効な複数のＭＤＳＣを投与することを含む。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語又はその変形は、ＧｖＨＤに関連する症状又は臨床徴候を、何れかの程度で、減少させる、進行を制限するか、軽減するか、又は自然治癒させることを指す。「治療（treatment）」は、治療的（therapeutic）でもよく、予防的でもよい。「治療的」及びその変形は、それについて、ＧｖＨＤに関連する１つ以上の既存の症状又は臨床徴候を軽減する治療を指す。「予防的」及びその変形は、ＧｖＨＤの症状又は臨床徴候の発症及び／又は出現を、何れかの程度で制限する治療を指す。一般には、「治療的な」治療はＧｖＨＤが対象に現れた後に開始され、一方で「予防的」治療はＧｖＨＤが対象に現れる前に開始される。本明細書で使用される場合、「症状」はＧｖＨＤのいずれの主観的な証拠（subjective evidence）を指し、一方で「徴候」又は「臨床徴候」は患者以外の者によって見出されることができるＧｖＨＤに関する客観的な身体所見を指す。
【００３８】
また、「リスクがある」という用語は、明細書に記載のリスクを実際に有している対象又は有していない対象であってもよい。よって、例えば、ＧｖＨＤを発症する「リスクがある」対象は、対象がＧｖＨＤを罹患又は発症している症状又は臨床徴候の何れかを呈するか否かにかかわらず、ＧｖＨＤを罹患又は発症するリスクの増加を示す１又は複数の指標を欠く者に対し、当該１又は複数の指標を有する対象である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、前に投与されたＭＤＳＣがインフラマソーム活性化を起こしアロ反応性Ｔ細胞を抑制することができなくなるので、本発明の方法は、前の投与のＭＤＳＣを置き換えるためのＭＤＳＣの反復投与を含んでもよい。すなわち、連続的に再投与されるＭＤＳＣにより、炎症性環境においてサプレッション機能を失っているＭＤＳＣの集団を、インフラマソーム機能が活性化されていない新たなＭＤＳＣで補充することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、治療は、最低でも少なくとも２回のＭＤＳＣの投与、例えば、少なくとも３回の投与、少なくとも５回の投与、少なくとも１０回の投与、少なくとも１５回の投与、少なくとも２０回の投与、少なくとも２５回の投与、又は少なくとも５０回の投与を含んでもよい。いくつかの実施形態では、治療は、最高で５０回以下のＭＤＳＣの投与、例えば、４０回以下の投与、３０回以下の投与、２０回以下の投与、１０回以下の投与、又は５回以下の投与を含んでもよい。いくつかの実施形態では、治療は、上記何れかの最低投与回数と、その最低投与回数より上記何れかの最高投与回数によって規定される端点を有する投与の範囲を含んでもよい。よって、好ましい実施形態では、治療は３回から５回までのＭＤＳＣの投与を含んでもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣの連続投与は、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも３０日、又は少なくとも９０日の最小間隔で離間してもよい。いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣの連続投与は、１年以下、６ヵ月以下、９０日以下、６０日以下、３０日以下、又は１４日以下の最大間隔で離間してもよい。いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣの連続投与は、上記何れかの投与間最小間隔と、その投与間最小間隔より大きい上記何れかの投与間最大間隔によって規定される端点を有する範囲として特徴付けられる間隔で離間してもよい。よって、好ましい実施形態では、治療は最低で１日１回から１日おきに１回をもつ間隔で投与されるＭＤＳＣを含んでもよい。
【００４２】
場合によっては、ＭＤＳＣの少なくとも一部は、ＭＤＳＣにインフラマソーム活性化に対する抵抗性をもたらす遺伝子改変で処理される及び／又はそのような改変を含んでもよい。場合によっては、ＭＤＳＣは、例えば、ＭＤＳＣにインフラマソーム活性化に対する抵抗性をもたらす薬品、ｓｈ／ｓｉＲＮＡ、及び／又はＣＲＩＳＰＲを用いて前処理してもよい。ＭＤＳＣにインフラマソーム活性化に対する抵抗性をもたらす例示的な遺伝子改変としては、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｐｅｃｋ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ＣＡＲＤＡＳＣ）の欠損を挙げることができる。
【００４３】
いくつかの実施例では、同様の効果を、ＭＤＳＣ注入の間及び／又はＭＤＳＣ注入の後にインフラマソームを阻害する薬剤でさらに処理することによって達成してもよく、それによって注入したＭＤＳＣがインフラマソーム活性化を起こす程度を減らすことができる。インフラマソームを阻害するための例示的な方法は、インフラマソームを直接的に阻害する薬剤を含みうる。他の方法は、インフラマソーム誘発物質を標的とし、且つ／又は少なくとも部分的にインフラマソーム誘発物質を中和する薬剤を使用することを伴いうる。例示的なインフラマソーム誘発物質としては、例えば、尿酸、ＡＴＰ、Ｔｏｌｌ様受容体を刺激する物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はインフラマソーム機能を上方制御できる他の薬剤が挙げられる。
【００４４】
治療は、予防的であるにせよ治療的であるにせよ、少なくとも１週間、例えば、少なくとも２週間、少なくとも１か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、又は少なくとも１年間の最小期間施行することができる。治療は、２０年間以下、例えば、１０年間以下、５年間以下、２年間以下、１年間以下、９ヵ月間以下、６ヵ月間以下、３ヵ月間以下、２ヵ月間以下、１ヵ月間以下、又は２週間以下の最大期間施行することができる。治療は、上記何れかの最小期間と、その最小期間より長い上記何れかの最大期間によって規定される端点をもつ範囲として特徴付けられる期間施行することができる。よって、好ましい実施形態では、治療は１週間から２週間の期間であってもよい。
【００４５】
ＭＤＳＣは、薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物に製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「担体」は、いずれの溶媒、分散媒、媒体、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤及び／又は抗真菌薬、等張薬品、吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。医薬活性物質用のそのような媒体及び／又は薬剤の使用は当該技術分野において周知である。いずれの従来の媒体又は薬剤も活性成分と配合禁忌である場合以外は、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助活性成分も組成物に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「薬理学的に許容される」は、生物学的に又はその他の形で望ましくない材料ではない材料を指し、つまり、その材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに、又はそれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれとも有害に相互作用することなく、ＭＤＳＣとともに個人に投与することができるものである。
【００４６】
医薬組成物は、投与の好ましい経路に適合するさまざまな形態に製剤化してもよい。よって、組成物は、例えば、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹膜内など）経路を含む既知の経路を介して投与しうる。
【００４７】
よって、ＭＤＳＣは、限定されないが、溶液、懸濁液、エマルション、又はいずれの形態の混合物を含むいずれの適切な形態でも提供しうる。組成物は、いずれの薬理学的に許容される賦形剤、担体、又は媒体を含む製剤で送達しうる。
【００４８】
製剤は単位剤形で存在すると利便性が高いことがある。薬学の分野で周知の方法によって調製されうる。薬理学的に許容される担体を含む組成物を調製する方法は、ＭＤＳＣを１つ以上の副成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般には、製剤は、均一に且つ／又は密接に活性化合物を、液体担体、微粉固体担体、又は両方と結合させ、次いで必要ならば、生成物を所望の製剤に成形することによって調製されうる。
【００４９】
投与されるＭＤＳＣの量は、限定されないが、対象の体重、健康状態、及び／若しくは年齢、並びに／又は投与の経路を含むさまざまな因子に応じて変えることができる。よって、所与の単位剤形に含まれるＭＤＳＣの絶対量は大きく異なる可能性があり、対象の種、年齢、体重、及び健康状態、並びに／又は投与の方法などのさまざまな因子に依存する。したがって、すべての考えられる用途に有効なＭＤＳＣの量を構成する量をあまねく記載することは現実的ではない。しかし、当業者ならそのような因子を充分に考慮して適切な量を容易に決めることができる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣの単回投与は、最低でも少なくとも１０5個のＭＤＳＣ、例えば、少なくとも１０6個のＭＤＳＣ、少なくとも１０7個のＭＤＳＣ、少なくとも１０8個のＭＤＳＣ、少なくとも１０9個のＭＤＳＣ、少なくとも１０10のＭＤＳＣ、少なくとも１０11個のＭＤＳＣ、又は少なくとも１０12個のＭＤＳＣを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣの単回投与は、最高で１０13個以下のＭＤＳＣ、例えば、１０12個以下のＭＤＳＣ、１０11個以下のＭＤＳＣ、１０10個以下のＭＤＳＣ、１０9個以下のＭＤＳＣ、１０8個以下のＭＤＳＣ、１０7個以下のＭＤＳＣ、又は１０6個以下のＭＤＳＣを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣの単回投与は、上記何れかのＭＤＳＣの最小数と、そのＭＤＳＣの最小数より大きい、上記何れかのＭＤＳＣの最大数とによって規定される端点をもつ範囲として特徴付けられるＭＤＳＣの数を含むことができる。よって、１つの好ましい実施形態では、ＭＤＳＣの単回投与は、１０7個のＭＤＳＣ〜１０10個のＭＤＳＣの範囲を含むことができる。他の好ましい実施形態において、ＭＤＳＣの単回投与は、４×１０7個のＭＤＳＣ〜５×１０8個のＭＤＳＣの範囲を含むことができる。
【００５１】
別の態様では、本開示は腫瘍を治療する方法を記載する。概してその方法は、ＭＤＳＣのインフラマソーム活性化を充分に増加させて腫瘍の近くでＭＤＳＣのサプレッサー機能を無効にすることを含む。場合によっては、インフラマソーム活性化を増加させることは、例えば、尿酸、ＡＴＰ、Ｔｏｌｌ様受容体を刺激する物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はインフラマソーム機能を上方制御できる他の薬剤などの少なくとも１つのインフラマソーム誘発物質を提供することを含みうる。
【００５２】
インフラマソーム誘発物質は、例えば、化学療法、放射線療法、手術、ならび／又は薬、抗体／タンパク質、ワクチン、及び／若しくは細胞療法を用いる免疫療法などの、腫瘍を消滅させるように設計された従来の抗がん剤とともに共投与することができる。本明細書中で使用される場合、「共投与された」とは、その組み合わせの治療効果又は予防効果が、単独で投与される何れかの成分の治療効果又は予防効果よりも大きくなるように投与される組み合わせの２つ以上の成分を指す。２つの成分は、同時に共投与されてもよく、又は連続的に共投与されてもよい。同時に共投与された成分は、１つ以上の医薬組成物中に提供されうる。２つ以上の成分の連続共投与は、各成分が同時に治療部位に存在できるように成分が投与される場合を含む。あるいは、２つの成分の連続共投与は、少なくとも１つの成分が治療部位から消え、１つ以上の追加成分が治療部位に与えられるまで、成分を投与する細胞効果（例えば、サイトカイン生産、ある特定の細胞集団の活性化など）の少なくとも１つは治療部位で持続する場合を含みうる。よって、共投与される組み合わせは、ある特定の状況では、決して化学混合物中に互いに存在しない成分を含みうる。
【００５３】
いくつかの場合では、抗腫瘍剤は、その療法が規制当局の承認を得ている同一投与量及び頻度で投与してもよい。他の場合では、抗腫瘍剤は、その療法が臨床研究又は臨床前研究において評価されている同一投与量及び頻度で投与してもよい。インフラマソーム誘発物質と共投与するときに所望のレベルの抗腫瘍効果を達成するように必要に応じて投与量及び／又は頻度を変えることができる。よって、標準的な／既知の投与レジメンを使用でき、且つ／又は必要に応じて投薬をカスタマイズすることができる。
【００５４】
同様に、インフラマソーム誘発物質はいずれの適切な形態にも製剤化されうる。そのうえ、例えば、インフラマソーム誘発物質は、それが規制当局の承認を得うる同一投与量及び頻度で投与されうる。他の場合には、インフラマソーム誘発物質は、それが臨床研究又は臨床前研究において評価されうる同一投与量及び頻度で投与されうる。インフラマソーム誘発物質は、所望のレベルのインフラマソーム誘発物質を達成するように必要に応じて投与量及び／又は頻度を変えることができる。よって、標準的な／既知の投与レジメンを使用でき、且つ／又は必要に応じて投薬をカスタマイズすることができる。
【００５５】
前述の明細書及び後述の請求項において、「及び／又は」という用語は、１つ若しくはすべての列挙された要素又は列挙された要素の何れか２つ以上の組み合せを意味する；用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、及びその変形は、非限定（open ended）と解釈されるべきであり、すなわち、さらなる要素又はステップが任意選択で存在しても在しなくてもよい；別段の指定がない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１」は、互換可能に使用され、１又は１を超えることを意味する；並びに、端点による数の範囲の記載は、その範囲内で包含されるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００５６】
前述の説明において、特定の実施形態が明確にするために分離して記載されている場合がある。ある特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と相いれないということが別段明確に示されない限り、ある特定の実施形態は、１つ以上の実施形態に関連して本明細書に記載の互換性をもつ特徴の組み合わせを含むことができる。
【００５７】
個別のステップを含む、本明細書において開示されているいずれの方法についても、それらのステップはいずれの実行可能な順序でも行ってもよい。そして、必要に応じて、２つ以上のステップのいずれの組み合わせも同時に実行してもよい。
【００５８】
本発明を以下の例によって説明する。特定の例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載の本発明の範囲及び趣旨に従って広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【実施例】
【００５９】
マウス
６〜８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２d）、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ（Ｈ２b）、及びＢ６−Ｌｙ５．２／Ｃｒ（Ｂ６−ＣＤ４５．１+、Ｈ２b）マウスは、米国国立がん研究所から購入した。ＡＳＣノックアウトマウス（Mariathasan et al., 2004. Nature 430(6996):213-218）及びＣ５７Ｂｌ／６遺伝的背景のＹＦＰ−Ａｒｇ１（ＹＡＲＧ）マウス（Reese et al., 2007. Nature 447(7140):92-96）は以前に報告されている。マウスはすべて、ミネソタ大学の研究機関内動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認されたプロトコールにある特定病原体除去施設内のマイクロアイソレーターケージで繁殖させ、飼育した。
【００６０】
ＭＤＳＣ生成
Ｃ５７Ｂｌ／６骨髄を１０％ウシ胎児血清、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、並びに補助アミノ酸（Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−アスパラギンの各々１．５ｍＭ）を加えたダルベッコ変法イーグル培地の１ｍＬ当たり３×１０5個の細胞で培養することによってマウスＭＤＳＣを生成した。１００ｎｇ／ｍＬ  顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ／ニューポジェン、アムジェン社、サウザンドオークス、カリフォルニア州）及び２．５ｎｇ／ｍＬ  マウス顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｒ＆Ｄシステム社、ミネアポリス、ミネソタ州）を加え、培養物を３７℃にて１０％ＣＯ2で４日間インキュベーションした。３日目に、アルギナーゼ−１誘導のために４０ｎｇ／ｍＬ  組換えマウスＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄシステム社、ミネアポリス、ミネソタ州）を加えた。代替的に、ＩＦＮγを同じ濃度で加えた。ＭＤＳＣを４日目に培養上清の７０％を静かに除去することによって集めた。次いで、残留培地及び緩く付着した細胞を集めた後、トリプシン／ＥＤＴＡを加えた。３７℃で１０分後、プレートを軽くこすり取って洗浄し、残りの細胞を集め、軽度に付着した細胞と合わせて、＞９２％のＣＤ１１ｂ+回収となった。インフラマソーム誘導のために、４日目にＬＰＳ（０．２μｇ／ｍｌ）を培養物に加えた。３時間後、ＮＬＲＰ３インフラマソームを刺激するために、２ｍＭ  ＡＴＰを１時間加えた。代替的に、ＡＩＭ２インフラマソームを活性化するために、ポリ（ｄＴ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬を製造業者の取扱説明書（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）に従って用いて１時間加えた後に洗浄し、上清又は養子移植を分析した。
【００６１】
ヒトＭＤＳＣをメモリアル血液センター（Memorial Blood Center）（ミネアポリス、ミネソタ州）より入手した成人血液から単離した正常ドナーＰＢＭＣから、ヒストパック勾配（シグマ‐アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）を用いて遠心分離することによって生成した。インビトロ生成は、事前にＣＤ３３+骨髄細胞濃縮をする改変をして、以前に報告（Lechner et al., 2010. J Immunol 185(4):2273-2284）の通りに実施し、その濃縮はミルテニーＭＡＣシステムを取扱説明書に従って使用して実施した。培養物を７日目にインフラマソーム誘導のために集めた後に洗浄し、以前に記載されている通りに（Hippen et al., 2008. Blood 112(7):2847-2857）抑制機能アッセイに播種した。ヒト血液バンク試料は、ミネソタ大学の研究におけるヒト対象の使用に関する委員会（Committee on the Use of Human Subjects in Research）によって承認されたガイドラインを介して入手した。
【００６２】
ＧｖＨＤ
７００ｃＧｙ全身照射法を用いてＢＡＬＢ／ｃレシピエントを致死的に照射した１日後、１×１０7個のＣ５７Ｂｌ／６ドナー骨髄、２×１０6個のリンパ節精製Ｃ５７Ｂｌ／６  ＣＤ２５除去Ｔ細胞、及び６×１０6個の培養Ｃ５７Ｂｌ／６  ＭＤＳＣ−ＩＬ１３を０日目又は示されるように注入した。Ｔ細胞濃縮を、ネガティブ細胞分離システム（EASYSEP、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー、カナダ）並びにＣＤ１９、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＮＫ１．１、γδＴＣＲ、及びＣＤ２５に対するビオチン化抗体を製造業者の取扱説明書に従って使用して実施した。生存しているかどうかマウスを毎日モニターした。
【００６３】
ＭＤＳＣ生体外回収
ＣＤ４５．２+（Ｂ６又はＡＳＣ  ｋｏ）コンジェニックドナーから生成したＭＤＳＣ−ＩＬ１３をＣＤ４５．１+レシピエントに記載されているように移植した。回収を増やし、機能アッセイを容易にするために、移植の５日後に３〜４頭のレシピエントの脾臓を試料ごとにプールした（１群あたりｎ＝３の試料）。ＲＡＰＩＤＳＰＨＥＲＥ  ＥＡＳＹＳＥＰ法（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー、カナダ）及び抗ＣＤ４５．１−ビオチン化抗体を製造業者の取扱説明書に従って使用してホスト及びドナーＴ細胞を除去することによってＣＤ４５．２+（ＭＤＳＣ−ＩＬ１３）脾細胞を単離し、＞８０％のＣＤ４５．２＋ＭＤＳＣ−ＩＬ１３回収をもたらした（図７）。
【００６４】
顆粒球性の（Ｌｙ６Ｇ＋）サブセット及び単球性の（Ｌｙ６Ｃ＋  Ｇ−ｖｅ）サブセットのＭＤＳＣ−ＩＬ１３ソーティング
Ｌｙ６Ｇ＋発現に基づいて分離するために、製造業者の取扱説明書に従って、ＭＤＳＣ−ＩＬ１３培養物をＡＰＣ結合抗Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８）抗体で一括標識した後、抗ＡＰＣマイクロビーズで標識し、ミルテニーＭＡＣ  ＬＳカラムに加えた。これは、さらなる分析のためにのちに使用する顆粒球性のサブセットと単球性のサブセットの効果的なソーティングをもたらした。
【００６５】
フローサイトメトリー及び抑制機能アッセイ
フローサイトメトリーデータの収集はＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで実施し、解析はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ社、アシュランド、オレゴン州）を用いて行った。マウス抑制機能アッセイに関して、応答しているＴ細胞を３．５μＭ  カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色し、０．２５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３εとともにインキュベーションした後、３日目に分析した。ヒトＭＤＳＣ抑制機能アッセイでは、レスポンダーＰＢＭＣをＣＥＬＬＴＲＡＣＥ  Ｖｉｏｌｅｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州）で標識し、抗ＣＤ３εｍＡｂでコーティングしたビーズ（ＤＹＮＡＬ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州；２：１の比）と１００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ−２で刺激した。試料は４日目に採取した。
【００６６】
ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、及びアルギナーゼアッセイ
培養上清中のマウスＩＬ−１β及びヒトＩＬ−１βを、それぞれのＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  ＥＬＩＳＡセットを製造業者の取扱説明書（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンノゼ、カリフォルニア州）に従って使用して評価した。ウェスタンブロッティングに関して、精製したＭＤＳＣを洗い、ＲＩＰＡ、プロテアーゼ（サンタクルーズバイオテクノロジー社、ダラス、テキサス州）阻害剤及びホスファターゼ（シグマ‐アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）阻害剤カクテルを含有する溶解バッファーに再懸濁した後、瞬間凍結させた。細胞溶解物の４μｇのタンパク質を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）で分け、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＧＥヘルスケア社、リトル・チャルフォント、英国）に転写し、抗切断型カスパーゼ‐１ｐ１０ウサギｍＡｂ（ｓｃ−５１４、サンタクルーズバイオテクノロジー社、ダラス、テキサス州；１：５００）を用いて切断型カスパーゼ‐１の検出のためにプローブを付けた。使用した二次抗体は、抗切断型カスパーゼ‐１抗体の検出のためにはＨＲＰ結合抗ウサギ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ダンバース、マサチューセッツ州）（１：１０，０００）及び抗β−アクチン抗体の検出のためにはＨＲＰ結合抗マウス抗体（１：２７５０）であった。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州）を使用してウェスタンブロットバンドの相対的定量を推定した。アルギナーゼ−１活性をＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍアルギナーゼアッセイキット（Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＬＣ社、ヘイワード、カリフォルニア州）を用いて決定した。１つの試料あたり４×１０5個の細胞に試料を正規化し、洗浄し、沈殿させ、１００μｌのプロテアーゼ阻害剤含有溶解バッファーに再懸濁した後、製造業者の取扱説明書に従ってアッセイをした。
【００６７】
統計解析
生存研究はカプランマイヤー生存曲線で表わし、統計比較はログランク統計を用いて決定した。スチューデントのｔ検定をインビトロ収集データの統計解析に用いた（プリズムソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、ラホヤ、カリフォルニア州）。ｐ＜０．０５を統計的に有意と定義した。
【００６８】
本明細書において引用されるすべての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に利用可能な資料（例えば、ジェンバンク及びＲｅｆＳｅｑの登録ヌクレオチド配列  並びに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢの登録アミノ酸配列、並びにジェンバンク及びＲｅｆＳｅｑの注釈付きコード領域の解釈を含む）の完全な開示は、参照によりその全体が援用される。本出願の開示と、参照により本願明細書に援用される何れかの文献の開示との間に不一致が存在する場合には、本出願の開示が優先されるものとする。上記の詳細な説明及び例は理解を深める目的で提供されたにすぎない。そこから不必要な限定がなされることはない。本発明は図示され、且つ記載されたまさにその詳細に限定されず、当業者に明らかな変形は、請求項によって定められる本発明の範囲内に含まれることになる。
【００６９】
別段の指示がない限り、本明細書及び請求項で使用される構成成分の量、分子量などを表現する数値はすべて、いずれの場合にも用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。従って、別段そうでない旨の指示がない限り、本明細書及び請求項に示される数値パラメーターは近似値であり、本発明により得ようとする所望の特性に応じて異なりうる。最低限でも、また均等論を請求項に限定しようとするものではないが、各数値パラメーターは、少なくとも、報告される有効桁の数を踏まえて、且つ通常の四捨五入丸技法を適用することにより解釈されなければならない。
【００７０】
本発明の広い範囲を示す数値的範囲及びパラメーターは近似値であるが、具体例に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかし、すべての数値は、それらの試験測定値各々に見られる標準偏差から必然的にもたらされる範囲を本来包含する。
【００７１】
見出しはすべて、読者の便宜のためであり、そのような指定がない限り、その見出しに続く本文が意味するところを限定するのに使用されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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