(57)【要約】本発明は、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片、ならびにこれを含む医薬組成物および処置方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記エピトープが、表２に示された配列番号のうちの１つまたは複数を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記単離抗体またはその抗原結合性断片が、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、以下のβ−ｋｌｏｔｈｏのペプチド（配列番号２６２）：アミノ酸２４５〜２６６、２４６〜２６５、３４３〜３４９、３４４〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４９８、５０９〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６６９、６４６〜６７０、６９６〜７００、７７３〜８０４、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上を保護する、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
前記単離抗体または断片が、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させる、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定した場合に、１０ｐＭ以下のＫＤでヒトβ−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に結合する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記エピトープが、前記β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記エピトープが、前記β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に、５０ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体を活性化させる、単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
前記抗体または断片が、表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して、少なくとも９５％、９８％、または９９％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項９】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、表２に示される以下：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４１、１４２、１４３、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１９５、１９６、１９７、１９８、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、および２６１由来の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のペプチドを保護する、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
前記抗体または断片が、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、表２に示される以下：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４１、１４２、１４３、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１９５、１９６、１９７、１９８、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、および２６１由来の、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のペプチドを保護する、請求項９に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項１１】
前記抗体または断片が、表１の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３、ならびに／または表１の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項１２】
前記抗体または断片が、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（配列番号２６２）の残基７０１（Ｔｙｒ）または７０３（Ａｒｇ）に接触しない、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項１３】
前記抗体または断片が、配列番号２６３および２６８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４  ２４、４４、および６４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；５、２５、および４５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項１４】
前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、６９からなる群から選択されるＶＨ、またはその８０％もしくは９０％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択されるＶＬ、またはその８０％もしくは９０％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項１５】
前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、および２９からなる群から選択されるＶＨ、またはその９５％もしくは９７％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択されるＶＬ、またはその９５％もしくは９７％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項１６】
前記抗体または断片が、配列番号２６８の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項１７】
前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択される可変重鎖配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項１８】
前記抗体または断片が、配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項１９】
前記抗体または断片が、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択される可変重鎖と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される可変軽鎖配列とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項２０】
前記抗体または断片が、配列番号９の可変重鎖、および配列番号１９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片、配列番号２９の可変重鎖、および配列番号３９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片；配列番号４９の可変重鎖、および配列番号５９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片；ならびに配列番号６９の可変重鎖、および配列番号７９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項２１】
前記抗体または断片が、配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；５、２５、４５、および６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項２２】
前記抗体または断片が、配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；８、２８、４８、および６８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６、３６、５６、および７６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７、３７、５７、および７７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１８、３８、５８、および７８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項２３】
前記抗体または断片が、
（ｉ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号２３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号４３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号５５の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号６３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７５の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）配列番号４６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号５８の軽鎖ＣＤＲ３；または
（ｖｉｉｉ）配列番号６６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号７６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項２４】
単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体または断片が、請求項１２から２３のいずれか一項に記載の単離抗体または断片と同じエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２５】
単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体または断片が、β−ｋｌｏｔｈｏへの結合について、請求項１２から２３のいずれか一項に記載の単離抗体または断片と競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２６】
前記抗体または断片が、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、およびＮＯＶ００４からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項２７】
上記請求項の一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２８】
代謝障害を処置する方法であって、代謝障害に罹患している対象に、有効量の、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
前記対象が、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、ならびにメタボリックシンドロームのうちの１つまたは複数に罹患している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、肥満、糖尿病、および脂質異常症のうちの１つまたは複数に罹患している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
心血管障害を処置する方法であって、心血管障害に罹患している対象に、有効量の、前記請求項のいずれかに記載の抗体または断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３２】
前記対象が、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、および冠動脈性心疾患のうちの１つまたは複数に罹患している、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
医薬としての使用のための、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３４】
体重を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３５】
食欲または食物摂取を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３６】
対象における血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度または血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度を低減する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３７】
前記対象が、代謝障害に罹患している、請求項３４、３５、または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、ならびにメタボリックシンドロームのうちの１つまたは複数に罹患している、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記請求項のいずれかに記載の抗体のうちの１つまたは複数をコードする核酸。
【請求項４０】
表１に示される配列と、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む核酸。
【請求項４１】
表１に示される配列と、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む核酸。
【請求項４２】
請求項３９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４４】
代謝障害の処置における使用のための、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物。
【請求項４５】
β−ｋｌｏｔｈｏに結合する抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法であって、前記抗体またはその断片の発現に適する条件下で、宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる２０１５年８月３日に出願された米国仮出願第６２／２００，４４５号明細書の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１６年７月２８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「PAT056954_SL.txt」と名付けられ、１２４，４８７バイトのサイズである。
【０００３】
分野
本発明は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）模倣抗体に関する。また、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症（dyslipidemia）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常（glucose intolerance）、高血糖症、メタボリックシンドローム、ならびに他の代謝障害などのＦＧＦ２１関連障害を処置するための方法、ならびに重篤な罹病患者の死亡率および罹患率を低減するときの方法も開示される。
【背景技術】
【０００４】
背景
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーは、２２の、遺伝子的には顕著に異なるが、相同なリガンドを特徴とし、７つのサブファミリーへと群分けされる。公表された文献に従うと、ＦＧＦファミリーは、現在のところ、ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２３の、少なくとも２３のメンバーからなる（Reuss et al. (2003) Cell Tissue Res. 313:139-157）。
【０００５】
線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）は、マウス胚から単離され、ＦＧＦ１９およびＦＧＦ２３と近縁である。このＦＧＦサブファミリーは、古典的ＦＧＦでは一般的でない、多様な生理学的工程、すなわち、エネルギーホメオスタシスおよび胆汁酸ホメオスタシス、グルコース代謝および脂質代謝、ならびにリン酸ホメオスタシスのほか、ビタミンＤホメオスタシスも調節する。さらに、古典的ＦＧＦと異なり、このサブファミリーは、内分泌様にも作用する（Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8）。ＦＧＦ２１は、肝臓内で優先的に発現することが報告されており（Nishimura et al. (2000) Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206；国際特許公開第０１／３６６４０号パンフレット；および国際特許公開第０１／１８１７２号パンフレット）、虚血性血管疾患、創傷治癒、および肺細胞機能、気管支細胞機能、または肺胞細胞機能の喪失と関連する疾患、ならびに他の多数の障害のための処置として記載されている。
【０００６】
ＦＧＦ２１は、強力な代謝性調節因子として同定されている。ＦＧＦ２１の、食餌誘導性肥満または遺伝性肥満および糖尿病を伴う齧歯動物およびアカゲザルへの全身投与は、強力な血糖降下効果およびトリグリセリド低下効果を及ぼし、体重の低減をもたらす（Coskun, T, et al. (2008) Endocrinology 149:6018-6027; Kharitonenkov, A, et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635; Kharitonenkov, A, et al. (2007) Endocrinology 148:774-781; Xu, J, et al. (2009) Diabetes 58:250-259）。ＦＧＦ２１は、２８アミノ酸のリーダー配列を含有する、２０９アミノ酸のポリペプチドである。ヒトＦＧＦ２１は、マウスＦＧＦ２１に対する約７９％のアミノ酸同一性と、ラットＦＧＦ２１に対する約８０％のアミノ酸同一性とを有する。
【０００７】
哺乳動物では、ＦＧＦは、４つのＦＧＦ受容体のセットであるＦＧＦＲ１〜４を介して、それらの作用を媒介し、これにより、ＦＧＦＲ１〜４が多重スプライス変異体で発現する。各ＦＧＦ受容体は、リガンドが結合すると活性化し、ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）、ＲＡＦ１、ＡＫＴ１、およびＳＴＡＴを伴う、下流のシグナル伝達経路をもたらす、細胞内チロシンキナーゼドメインを含有する（Kharitonenkov, A. et al. (2008) BioDrugs 22:37-44）。いくつかの報告は、ＦＧＦＲ１〜３の、「ｃ」レポーターのスプライス変異体が、β−ｋｌｏｔｈｏに対する特異的なアフィニティーを呈示し、ＦＧＦ２１の内因性受容体として作用しうることを示唆した（Kurosu et al., 2007 J. Biol. Chem. 282:26687-26695); Ogawa et al., 2007 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7437; Kharitonenkov et al., 2008 J. Cell Physiol. 215, 1-7）。３Ｔ３−Ｌ１細胞内および白色脂肪組織内で、ＦＧＦＲ１は、圧倒的に最も豊富な受容体であり、したがって、この組織内の、ＦＧＦ２１の主要な機能的受容体は、β−ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体である可能性が最も高い。
【０００８】
ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ受容体、ならびにＦＲＳ２ａおよびＥＲＫを含む下流のシグナル伝達分子を活性化させるが、ＦＧＦＲとＦＧＦ２１との直接的相互作用は検出されていない。さらに、多様な非脂肪細胞は、複数のＦＧＦＲアイソフォームを発現させるが、ＦＧＦ２１に応答しない。これらのデータの全ては、共因子が、ＦＧＦＲを介するＦＧＦ２１シグナル伝達を媒介するはずであることを示唆する。研究は、肝臓内、脂肪細胞内、および膵臓内で、ＦＧＦ２１に対する細胞応答の決定基として高度に発現する、ベータ−ｋｌｏｔｈｏ（β−ｋｌｏｔｈｏ）を同定している（Kurosu, H. et al. (2007) J Biol Chem 282, 26687-95）。β−ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＧＦ２１に結合するが、ＦＧＦＲ単独は結合しない（Kharitonenkov, A. et al. (2008) J Cell Physiol 215, 1-7）。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、またはＦＧＦＲ３ｃと複合したβ−ｋｌｏｔｈｏには結合するが、ＦＧＦＲ４と複合したβ−ｋｌｏｔｈｏには結合しない（Owen et al., 2015 Trends in Endocrinology 26: 22-29）。同様の機構は、ＦＧＦ２３−ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ系においても同定されている（Urakawa, I. et al. (2006) Nature 444, 770-4）。
【０００９】
ＦＧＦ２１の生物学的活性は、マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞グルコース取込みアッセイにおいて、最初に同定された（Kharitonenkov, A. et al. (2005) J Clin Invest 115, 1627-35）。その後、ＦＧＦ２１は、インスリン非依存性のグルコース取込みおよびＧＬＵＴ１の発現を誘導することが示された。ＦＧＦ２１はまた、糖尿病齧歯動物モデルの範囲内で高血糖症を改善することも示されている。加えて、ＦＧＦ２１を過剰発現させるトランスジェニックマウスは、体重および体脂肪量の減少、ならびにインスリン感受性の増強を含む、食餌誘導性代謝異常に対して抵抗性であることも見出された（Badman, M.K. et al. (2007) Cell Metab 5, 426-37）。ＦＧＦ２１の、糖尿病性非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）への投与は、空腹時血漿グルコースレベル、空腹時血漿トリグリセリドレベル、空腹時血漿インスリンレベル、および空腹時血漿グルカゴンレベルの低下を引き起こし、ＨＤＬコレステロールのほぼ８０％の増大を含む、リポタンパク質プロファイルの著明な改善をもたらした（Kharitonenkov, A. et al. (2007) Endocrinology 148, 774-81）。重要なことに、このＮＨＰ研究中のいかなる時点においても、低血糖症は観察されなかった。他の研究では、ＦＧＦ２１が、空腹状態への適応を制御する一助となる、重要な内分泌ホルモンとして同定された。これは、これまで欠けていた要素であったＰＰＡＲαの下流を提供するものであり、これにより肝臓は、エネルギーホメオスタシスの生物学の調節において、体内の他の部分と情報をやり取りする。ＦＧＦ２１が、脂肪（脂肪分解）、肝臓（脂肪酸の酸化およびケトン生成）、および脳（麻痺）を調節するという観察の組合せによって、ＦＧＦ２１が空腹に対する応答の主要な内分泌調節因子であることが確立されている（Kharitonenkov, A. & Shanafelt, A.B. (2008) BioDrugs 22, 37-44）。
【００１０】
ＦＧＦ２１を、生物学的治療剤として直接使用することに関する問題は、その半減期が、非常に短いことである。マウスでは、ヒトＦＧＦ２１の半減期は、０．５〜１時間であり、カニクイザルでは、半減期は、２〜３時間である。さらに、野生型ＦＧＦ２１を、医薬製剤中または医薬調製物中で使用する場合、その安定性は、保存剤、例えば、ｍ−クレゾールにより有害な影響を受ける。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
要旨
本発明は、ＦＧＦ２１模倣抗体、すなわち、ベータ−ｋｌｏｔｈｏ（β−ｋｌｏｔｈｏ）に結合し、ヒト線維芽細胞増殖因子２１（以下、場合によって、「ＦＧＦ２１」と称する）受容体複合体と、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体依存性のシグナル伝達）とを活性化させるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、ならびにこれらを含む医薬組成物および処置方法に関する。
【００１２】
本発明の抗原結合性断片（ＦＧＦ２１模倣抗体、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の）は、ＦＧＦ２１様の活性および選択性を伴うが、治療的に所望の特徴、例えば、タンパク質の安定性、低免疫原性、作製の容易さ、および所望されるｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を付加した分子でありうる。
【００１３】
本発明のモノクローナルＦＧＦ２１模倣抗体、その抗原結合性断片、およびこれらを含む医薬組成物は、肥満、２型糖尿病、１型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、メタボリックシンドローム、高血圧症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈性心疾患、腎疾患、糖尿病性合併症、神経障害、胃不全麻痺、および他の代謝障害などのＦＧＦ２１関連障害を処置し、重篤な罹病患者の死亡率および罹患率を低減するのに有用である。
【００１４】
本明細書で記載される単離ＦＧＦ２１模倣抗体または抗原結合性断片は、β−ｋｌｏｔｈｏに、１００ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。例えば、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４５ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３５ｐＭ以下、２５ｐＭ以下、または１５ｐＭ以下のＫＤで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに、溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定した場合に１０ｐＭ以下のＫＤで結合することも可能であり、また、ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に５０ｎＭ以下のＥＣ５０で、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体も活性化させうる。
【００１５】
本発明は、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏに結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏに結合し、ＦＧＦ２１受容体複合体と、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体依存性のシグナル伝達）とを活性化させる、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。特定の態様では、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体、またはヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体を活性化させない。
【００１６】
本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏに結合し、結合について、表１に記載されている抗体とさらに競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はまた、表１に記載されている抗体と同じエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にもさらに関する。
【００１７】
本明細書で記載される抗体および／またはその抗原結合性断片の間の「競合」とは、いずれの抗体（またはその結合性断片）も、同じβ−ｋｌｏｔｈｏエピトープに結合する（例えば、競合的結合アッセイにより、当業者に周知の方法のうちのいずれかにより決定される通りに）ことを意味する。抗体またはその抗原結合性断片はまた、前記競合抗体またはその抗原結合性断片が、本発明の抗体または抗原結合性断片と同じβ−ｋｌｏｔｈｏエピトープまたは重複β−ｋｌｏｔｈｏエピトープに結合する場合にも、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ抗体または抗原結合性断片（例えば、ＮＯＶ００１またはＮＯＶ００２）と「競合する」。本明細書で使用される、競合抗体またはその抗原結合性断片はまた、（ｉ）本発明の抗体もしくは抗原結合性断片がその標的に結合することを立体的に遮断する（例えば、前記競合抗体が、近接する非重複β−ｋｌｏｔｈｏおよび／またはβ−ｋｌｏｔｈｏエピトープに結合し、本発明の抗体または抗原結合性断片がその標的に結合することを物理的に妨げる場合）；および／または（ｉｉ）異なる非重複β−ｋｌｏｔｈｏエピトープに結合し、発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ抗体または抗原結合性断片が、コンフォメーショナル変化の非存在下で生じる形では、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に結合できないように、前記タンパク質に対する前記コンフォメーショナル変化を誘導する、競合抗体またはその抗原結合性断片も含みうる。
【００１８】
本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片の結合アフィニティーは、溶解平衡滴定（ＳＥＴ）により決定することができる。当技術分野では、ＳＥＴ法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。代替的に、本明細書で記載される単離抗体または断片の結合アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより決定することもできる。当技術分野では、Ｂｉａｃｏｒｅ反応速度アッセイ法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。
【００１９】
単離ＦＧＦ２１模倣抗体またはその抗原結合性断片を使用して、ＦＧＦ２１受容体複合体の活性化を増大させ、これにより、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路の活性化を増大させることができる。
【００２０】
本明細書で記載される単離ＦＧＦ２１模倣抗体またはそれらの抗原結合性断片は、モノクローナル抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはｓｃＦｖ断片、および／またはＩｇＧアイソタイプでありうる。
【００２１】
本明細書で記載される単離ＦＧＦ２１模倣抗体またはそれらの抗原結合性断片はまた、アミノ酸が、ヒトＶＨ生殖細胞系列配列またはヒトＶＬ生殖細胞系列配列のそれぞれに由来する抗体フレームワークへと置換されたフレームワークも含みうる。
【００２２】
本発明の別の態様は、表１に記載されているＦａｂの完全重鎖および軽鎖配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＦａｂＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、ＮＯＶ００４の重鎖および軽鎖配列を有しうる。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、表１に記載されているＦａｂの重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＦａｂＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、ＮＯＶ００４の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有しうる。
【００２４】
本発明はまた、配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。別の態様では、このような単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む。
【００２５】
本発明はまた、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含み、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
【００２６】
本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、Ｋａｂａｔにより規定されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号３、４、および５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号１３、１４、および１５を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号２３、２４、および２５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号３３、３４、および３５を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号４３、４４、および４５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号５３、５４、および５５を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号６３、６４、および６５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号７３、７４、および７５を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
【００２７】
本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号６、７、および８を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号１６、１７、および１８を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号２６、２７、および２８を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号３６、３７、および３８を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号４６、４７、および４８を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号５６、５７、および５８を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号６６、６７、および６８を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号７６、７７、および７８を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
【００２８】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９、２９、４９および６９からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む。単離抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとは、組み合わさって、β−ｋｌｏｔｈｏに対する抗原結合性部位を形成する。特に、軽鎖可変ドメイン配列は、配列番号１９、３９、５９、および７９から選択することができ、この場合、前記単離抗体またはその抗原結合性断片は、ベータ−ｋｌｏｔｈｏに結合する。
【００２９】
本発明はまた、配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。単離抗体または抗原結合性断片は、重鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとは、組み合わさって、β−ｋｌｏｔｈｏに対する抗原結合性部位を形成する。
【００３０】
特に、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９および１９；２９および３９；４９および５９；または６９および７９、の配列をそれぞれ含む、重鎖および軽鎖可変ドメインを有しうる。
【００３１】
本発明はさらに、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインも含む。本発明のさらなる態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する。
【００３２】
本発明はまた、配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する。
【００３３】
本発明の別の態様では、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１、３１、５１、または７１の配列を含む重鎖を有しうる。単離抗体はまた、重鎖と組み合わさって、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに対する抗原結合性部位を形成しうる軽鎖も含みうる。特に、軽鎖は、配列番号２１、４１、６１、または８１を含む配列を有しうる。特に、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１および２１；３１および４１；５１および６１；または７１および８１、のそれぞれの配列を含む重鎖および軽鎖を有しうる。
【００３４】
本発明はなおさらに、配列番号９、２９、４９、または６９からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号２１、４１、６１、または８１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖も含む。
【００３５】
本発明はなおさらに、配列番号２１、４１、６１、または８１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する。
【００３６】
本発明はまた、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。本発明は同様に、薬学的に許容される担体と組み合わせた抗体組成物にも関する。具体的に、本発明はさらに、例えば、抗体であるＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、ＮＯＶ００４など、表１の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を含む。本発明はまた、表１の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちの２つ以上の組合せを含む医薬組成物にも関する。
【００３７】
本発明はまた、配列番号９、２９、４９、および６９から選択される配列を有する、可変重鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号１０、３０、５０、および７０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性の配列（sequence at least 90% sequence identity）を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号１０、３０、５０および７０である。
【００３８】
本発明はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８から選択される配列を有する可変軽鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号２０、４０、６０、および８０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性の配列を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号２０、４０、６０、および８０である。
【００３９】
本発明はまた、配列番号２０、４０、６０、および８０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸にも関する。
【００４０】
本発明はまた、本明細書で記載される核酸分子のうちの１つまたは複数を含むベクターにも関する。
【００４１】
本発明はまた、上記で記載した抗体の重鎖をコードする組換えＤＮＡ配列と、上記で記載した抗体の軽鎖をコードする第２の組換えＤＮＡ配列とを含む単離宿主細胞にも関し、この場合、前記ＤＮＡ配列は、プロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞内で発現することが可能である。抗体は、ヒトモノクローナル抗体でありうることが企図される。また、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物細胞であることも企図される。
【００４２】
本発明はまた、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）受容体を活性化させ、これにより、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体依存性のシグナル伝達）を活性化させることにも関し、この場合、方法は、細胞を、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む、有効量の組成物と接触させるステップを含む。
【００４３】
細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。一実施形態では、細胞は、脂肪細胞であることが企図される。他の実施形態では、細胞は、肝細胞、膵細胞、内皮細胞、筋肉、または腎細胞のうちの１つまたは複数でありうる。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
【００４４】
本発明はまた、対象におけるＦＧＦ２１関連障害を処置、改善、または防止する方法であって、対象に、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む、方法にも関する。一態様では、ＦＧＦ２１関連障害は、肥満である。一態様では、ＦＧＦ２１関連障害は、２型糖尿病である。対象は、ヒトであることが企図される。
【００４５】
前出の単離抗体またはその抗原結合性断片のうちのいずれも、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片でありうる。
【００４６】
本開示の非限定的な実施形態を、以下の態様において記載する：
１．β−ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン内のエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
２．β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、エピトープが、表２に示された配列番号のうちの１つまたは複数を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
３．β−ｋｌｏｔｈｏに結合する単離ＦＧＦ２１模倣抗体またはその抗原結合性断片であって、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させる、抗体または断片。
４．溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定した場合に、１０ｐＭ以下のＫＤでヒトβ−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
５．β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記エピトープが、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
６．β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記エピトープが、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
７．ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に、５０ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体を活性化させる、単離抗体またはその抗原結合性断片。
８．表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して、少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、態様１の単離抗体または抗原結合性断片。
９．表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して、少なくとも９８％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、態様１の単離抗体または抗原結合性断片。
１０．表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して、少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、態様１の単離抗体または抗原結合性断片。
１１．表１の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３、ならびに／または表１の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む、前記態様のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１２．表１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、変異体（variant）が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちの１つにおいて、少なくとも１〜４カ所のアミノ酸変化を有する、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１３．配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１４．配列番号９、２９、４９、６９からなる群から選択されるＶＨ、またはその９０％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択されるＶＬ、またはその９０％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１５．配列番号９、２９、４９、および２９からなる群から選択されるＶＨ、またはその９５％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択されるＶＬ、またはその９５％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１６．配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択されるＶＨ、またはその９７％の同一性を有するアミノ酸配列と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択されるＶＬ、またはその９７％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１７．配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択される可変重鎖配列を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１８．配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
１９．配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択される可変重鎖と；配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択される可変軽鎖配列とを含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２０．配列番号９の可変重鎖、および配列番号１９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片、配列番号２９の可変重鎖、および配列番号３９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片；配列番号４９の可変重鎖、および配列番号５９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片；ならびに配列番号６９の可変重鎖、および配列番号７９の可変軽鎖配列を含む抗体または断片からなる群から選択される、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２１．配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；５、２５、４５、および６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２２．配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２；８、２８、４８、および６８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６、３６、５６、および７６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７、３７、５７、および７７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１８、３８、５８、および７８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２３．配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２４．配列番号２３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２５．配列番号４３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号５５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２６．配列番号６３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６５の重鎖ＣＤＲ３；配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２７．配列番号６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２８．配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
２９．配列番号４６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号４８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号５８の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
３０．配列番号６６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号６７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号６８の重鎖ＣＤＲ３；配列番号７６の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７７の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７８の軽鎖ＣＤＲ３を含む、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
３１．態様１２〜３０のうちのいずれかによる単離抗体または断片と同じエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
３２．β−ｋｌｏｔｈｏへの結合について、態様１２〜３０のうちのいずれかによる単離抗体または断片と競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
３３．ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、およびＮＯＶ００４からなる群から選択される、態様１〜７のうちのいずれかの単離抗体または抗原結合性断片。
３４．上記態様のうちの１つの抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
３５．代謝障害を処置する方法であって、代謝障害に罹患している対象に、有効量の、態様１〜３０のうちのいずれかによる抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
３６．対象が、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、ならびにメタボリックシンドロームのうちの１つまたは複数に罹患している、態様３５の方法。
３７．対象が、肥満、糖尿病、および脂質異常症のうちの１つまたは複数に罹患している、態様３５の方法。
３８．心血管障害を処置する方法であって、心血管障害に罹患している対象に、有効量の、前記態様のうちのいずれかによる抗体または断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
３９．対象が、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、および冠動脈性心疾患のうちの１つまたは複数に罹患している、態様３８の方法。
４０．医薬（medicament）としての使用のための、態様１〜３０のうちのいずれかによる抗体またはその抗原結合性断片。
４１．前記態様のうちのいずれかによる抗体のうちの１つまたは複数をコードする核酸。
４２．表１に示される配列と、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む核酸。
４３．表１に示される配列と、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む核酸。
４４．態様４１による核酸を含むベクター。
４５．態様４４のベクターを含む宿主細胞。
４６．代謝障害の処置における使用のための、態様１〜３０のうちのいずれかによる抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物。
【００４７】
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００４８】
本明細書で使用される「ＦＧＦ２１」という用語は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバーを指す。ＦＧＦ２１のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０６１９８６．１）を、配列番号１として示し、その対応するポリヌクレオチド配列を、配列番号２（ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＭ＿０１９１１３．２）として示す。
【００４９】
本明細書で使用される「ＦＧＦ２１受容体」という用語は、ＦＧＦ２１の受容体（Kharitonenkov,A, et al. (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7; Kurosu,H, et al. (2007) JBC 282:26687-26695; Ogawa, Y, et al. (2007) PNAS 104:7432-7437）を指す。
【００５０】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ヒトにおいて発現する自然発生のポリペプチドを指す。本開示の目的では、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、２０９アミノ酸残基からなり、配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされたあらゆる全長ＦＧＦ２１ポリペプチド、例えば配列番号１；１８１アミノ酸残基からなり、全長ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端における２８アミノ酸残基（すなわちシグナルペプチドを構成する）が除去された、上記ポリペプチドのあらゆる成熟形態、およびそれらの変異体を指すように、互換的に使用することができる。
【００５１】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」）またはそれらの単鎖体を意味する。全抗体は、ジスルフィド結合により相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよび各ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
【００５２】
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性部分」または「抗原結合性断片」という用語は、所与の抗原（例えば、β−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する能力を保持する、インタクトな抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、インタクトな抗体の断片により果たされうる。抗体の抗原結合性部分または抗原結合性断片という用語内に包含される結合性断片の例は、Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００５３】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬドメインおよびＶＨドメインは、個別の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、この場合、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい）を形成する。このような単鎖抗体は、抗体の１つまたは複数の抗原結合性部分または抗原結合性断片を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形で有用性についてスクリーニングされる。
【００５４】
抗原結合性断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参照されたい）へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合性部分は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチド（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）に基づく足場へとグラフトすることができる。
【００５５】
抗原結合性断片は、相補的な軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合性領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み込むことができる（Zapata et al.(1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062；および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【００５６】
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が大きいほど、アフィニティーは強くなる。抗体またはその抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片）について本明細書で使用される「高アフィニティー」という用語は一般に、ＫＤが１０−９Ｍ以下の抗体または抗原結合性断片を指す。
【００５７】
「アミノ酸」という用語は、自然発生のアミノ酸および合成アミノ酸のほか、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。自然発生のアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンでもある。アミノ酸類似体とは、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したアルファ炭素を有する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
【００５８】
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、１つの抗原決定基だけと反応する個別の抗原結合部位の能力を指す。
【００５９】
抗体（例えば、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体）に「特異的に（または選択的に）結合する」という語句は、タンパク質および他の生体物質の異質な集団内のコグネイト抗原（例えば、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏまたはカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）の存在を決定する結合反応を指す。本明細書では、「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句が、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
【００６０】
「ＦＧＦ２１に媒介される」という用語または類似の用語は、本発明のＦＧＦ２１受容体および／または抗体が、β−ｋｌｏｔｈｏに結合すると、細胞応答およびＦＧＦ２１シグナル伝達経路を媒介し、これにより、以下：血漿トリグリセリド、血漿インスリン、血漿グルコース、食物摂取、および体重のうちの１つまたは複数の低減を含むがこれらに限定されない、様々な生理学的効果を誘発するという事実を指す。
【００６１】
本明細書で使用される「ＦＧＦ２１関連障害」、「ＦＧＦ２１関連状態」、「ＦＧＦ２１と関連する疾患もしくは状態」、または類似の用語は、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路の活性化（例えば、ＦＧＦ２１受容体シグナル伝達の活性化による）による防止、診断、および／または処置が求められる、任意の数の状態または疾患を指す。これらは、ＦＧＦ２１シグナル伝達の異常（例えば、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達および／またはＦＧＦ２１受容体によるシグナル伝達の活性化の異常）を特徴とする、状態、疾患、または障害を含みうる。これらの状態は、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、メタボリックシンドローム、急性心筋梗塞、高血圧症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈性心疾患、腎疾患、糖尿病性合併症、神経障害、胃不全麻痺、インスリン受容体内の重度の不活化突然変異と関連する障害、ならびに他の代謝障害（other metabolic disorders, and in reducing the mortality and morbidity of critically ill patients）などの、代謝障害、内分泌障害、および心血管障害を含むがこれらに限定されない。
【００６２】
「２型糖尿病」とは、インスリンが利用できるもかかわらず、過剰なグルコース産生を特徴とする状態であり、グルコースクリアランスが不十分な結果として、循環グルコースレベルが、過剰に高く保たれる。
【００６３】
「１型糖尿病」とは、インスリンの完全な欠如により引き起こされる、高血中グルコースレベルを特徴とする状態である。これは、体内の免疫系が、膵臓内のインスリン産生ベータ細胞を攻撃し、それらを破壊する場合に生じる。このため、膵臓は、インスリンをほとんど産生しないか、または全く産生しない。
【００６４】
「膵炎」とは、膵臓の炎症である。
【００６５】
「脂質異常症」とは、リポタンパク質の過剰産生または欠損を含む、リポタンパク質代謝の障害である。脂質異常症は、血中の総コレステロール濃度、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール濃度、およびトリグリセリド濃度の上昇、ならびに高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度の低下により顕在化しうる。
【００６６】
「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」とは、アルコール消費量と関連せず、肝細胞の脂肪の変化を特徴とし、小葉内の炎症および線維症を伴う肝疾患である。
【００６７】
「耐糖能異常」または耐糖能障害（ＩＧＴ）とは、心血管病態の危険性の増大と関連する、前糖尿病性の血糖異常状態である。前糖尿病性状態は、対象が、グルコースを、細胞へと効率的に送り込み、効率的な燃料供給源として活用することを妨げ、血中グルコースレベルの上昇と、ある程度のインスリン抵抗性とをもたらす。
【００６８】
「高血糖症」とは、血中の糖（グルコース）の過剰として定義される。
【００６９】
低血糖とも呼ばれる「低血糖症」は、血中グルコースレベルが、身体活動に十分なエネルギーを供給するには余りに低く降下する場合に生じる。
【００７０】
「高インスリン血症」とは、血中インスリンレベルが、正常レベルより高いこととして定義される。
【００７１】
「インスリン抵抗性」とは、正常量のインスリンにより、正常未満の生物学的応答がもたらされる状態として定義される。
【００７２】
ヒト対象に関する「肥満」とは、所与の集団の理想体重を、２０パーセントを超えて上回る体重として定義することができる（R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p. 904-916）。また「肥満」とは、３０以上の体格指数（ＢＭＩ；人のメートル単位の身長の２乗で除したキログラム単位の体重（ｋｇ／ｍ２）として定義される）として定義することもできる。
【００７３】
「メタボリックシンドローム」とは、以下の徴候：腹部脂肪（大半の男性において、腰回りが４０インチ以上である）；高血糖（空腹時において、１デシリットル当たり少なくとも１１０ミリグラム（ｍｇ／ｄｌ）；高トリグリセリド（血流中に少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ；低ＨＤＬ（４０ｍｇ／ｄｌ未満）；および１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧のうちの少なくとも３つによるクラスターとして定義することができる。
【００７４】
「高血圧症」または高血圧とは、全身動脈血圧の、心血管損傷または他の有害な帰結を誘導する可能性が高いレベルへの、一過性または持続性の上昇である。高血圧症は、任意に、１４０ｍｍＨｇを上回る収縮期血圧または９０ｍｍＨｇを上回る拡張期血圧として定義されている。
【００７５】
「心血管疾患」とは、心臓または血管と関連する疾患である。
【００７６】
「末梢動脈疾患」は、血液を、頭部、臓器、および四肢へと運ぶ動脈内に、プラークが蓄積する場合に生じる。経時的に、プラークは、動脈を硬化させ、狭窄させる場合があり、これにより、酸素に富む血液の、臓器、および体内の他の部分への流動が制限される。
【００７７】
「アテローム性動脈硬化」とは、大型および中型の動脈の内膜内の、不規則に分布した脂質沈着を特徴とする血管疾患であって、動脈内腔の狭窄を引き起こし、最終的に、線維症および石灰化へと進行する。病変は通例、限局性であり、緩徐かつ間欠的に進行する。血流の制限は、大半の臨床症状の原因となり、臨床症状は、病変の分布および重症度と共に変化する。
【００７８】
「脳卒中」とは、２４時間を超えて続く、大脳循環の機能障害と関連する、任意の急性臨床事象である。脳卒中は、不可逆性の脳損傷を伴い、症状の種類および重症度は、その循環が損なわれた脳組織の位置および広がりに依存する。
【００７９】
うっ血性心不全とも呼ばれる「心不全」とは、心臓が、体内の残りの部分へと、十分な血液を、もはや駆出できない状態である。
【００８０】
冠動脈疾患とも呼ばれる「冠動脈性心疾患」とは、血液および酸素を心臓へと供給する小血管の狭窄である。
【００８１】
「腎疾患」または腎症とは、腎臓の任意の疾患である。糖尿病性腎症は、１型糖尿病者または２型糖尿病者における罹患率および死亡率の主要な原因である。
【００８２】
「糖尿病性合併症」とは、高血中グルコースレベルにより引き起こされる問題であって、腎臓、神経（神経障害）、脚部（脚部潰瘍および循環の低下）、および眼（例えば、網膜症）など、他の身体機能に関する。糖尿病はまた、心疾患および骨関節障害に対する危険性も増大させる。糖尿病の、他の長期にわたる合併症は、皮膚問題、消化器問題、性機能不全、ならびに歯および歯茎に関する問題を含む。
【００８３】
「神経障害」とは、脳神経または末梢神経系もしくは自律神経系に関与する任意の疾患である。
【００８４】
「胃不全麻痺」とは、胃の蠕動の減退であり、結果として排便の遅延を引き起こす。
【００８５】
本発明により包含される、重篤な罹病患者は一般に、不安定な代謝亢進状態を経る。この不安定な代謝性状態は、一部の栄養物の相対的欠損をもたらしうる、基質代謝の変化に起因する。一般に、脂肪および筋肉の両方について、酸化の増大が見られる。
【００８６】
さらに、重篤な罹病患者は、全身性炎症性応答症候群または呼吸困難を経る患者であることが好ましい。罹患率の低減は、重篤な罹病患者が、さらなる疾病、状態、もしくは症状を発症する可能性を低減すること、またはさらなる疾病、状態、もしくは症状の重症度を低減することを意味する。例えば、罹患率を低減することは、菌血症もしくは敗血症、または多臓器不全と関連する合併症の発生率の減少に対応しうる。
【００８７】
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一なアミノ酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンであるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを改変せずに、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと改変することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸内の各コドン（通常メチオニンだけのコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンだけのコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一な分子をもたらしうることを認識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が含意されている。
【００８８】
ポリペプチド配列では、「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失、または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換表が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下の８つの群：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えば、Creighton, Proteins(1984)を参照されたい）。いくつかの実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしないアミノ酸修飾を指すのに使用する。
【００８９】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的な結合が可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通例、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からなり、通例、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有する。コンフォメーショナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープとは、前者への結合は、変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
【００９０】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョンに由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異により導入された突然変異）を含みうる。
【００９１】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を提示し、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞へと融合させた、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、非ヒトトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより作製される。
【００９２】
「ヒト化」抗体とは、ヒトにおいての免疫原性は小さいが、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分を、それらのヒト対応物（すなわち、定常領域、ならびに可変領域のフレームワーク部分）で置きかえることにより達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984；Morrison and Oi、Adv. Immunol., 44:65-92, 1988；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988；Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991；およびPadlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994を参照されたい。ヒト操作技術の他の例は、米国特許第５，７６６，８８６号明細書において開示されているＸｏｍａ技術を含むがこれらに限定されない。
【００９３】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手作業のアライメントおよび目視により測定される比較域または指定領域にわたり、最大の対応性について比較され、配列決定された場合の、２つの配列の、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じであれば（すなわち、指定される領域にわたる、または、指定されない場合は、配列全体にわたる、６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有すれば）、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、１００〜５００、または１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、または２００アミノ酸以上）の長さの領域にわたり存在する。
【００９４】
配列比較では、１つの配列が、それに照らして被験配列を比較する基準配列として働くことが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準配列をコンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもでき、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づき、被験配列について、基準配列と比べた配列同一性パーセントを計算する。
【００９５】
本明細書で使用される「比較域」は、２つの配列を最適に配列決定した後で、配列を、同じ数の連続的な位置による基準配列と比較しうる、２０〜６００、通例約５０〜約２００、より通例では、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数のうちのいずれか１つによるセグメントに対する言及を含む。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cによる局所相同性アルゴリズムにより行うこともでき、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970による相同性アライメントアルゴリズムにより行うこともでき、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988による類似性検索法（search for similarity method）により行うこともでき、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により行うこともでき、手作業のアライメントおよび目視（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.（Ringbou ed., 2003）を参照されたい）により行うこともできる。
【００９６】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990において記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Ｗを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを伴う。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（Altschul et al.,前出）と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメントスコアが増大しうる限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向にも拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最大値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積のために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合；または配列のいずれかの末端に達した場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムでは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。
【００９７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性についての統計学的解析（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照されたい）も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチングが偶然に生じる確率の指標をもたらす最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸を基準核酸に照らして比較したときの最小合計確率が約０．２未満であり、より好ましくは、約０．０１未満であり、最も好ましくは、約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似すると考えられる。
【００９８】
２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、E. Meyers and W. Miller（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネット上のgcg.comで入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、Needleman and Wunsch（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
【００９９】
上記で言及した配列同一性百分率以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけによって異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、２つの分子またはそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅しうることである。
【０１００】
「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する単離抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する単離抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞内物質および／または化学物質を実質的に含まない場合もある。
【０１０１】
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりもたらされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）を指す。アイソタイプはまた、これらのクラスのうちの１つの修飾バージョンも含み、その修飾は、Ｆｃ機能を改変する、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強または低減するように施されている。
【０１０２】
本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語が、特定の抗体−抗原間相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対し、本明細書で使用される「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離速度を指すことを意図する。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用して表面プラズモン共鳴を測定するか、または溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により溶液中のアフィニティーを測定するステップを含む。
【０１０３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成による抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
【０１０４】
本明細書では、「核酸」という用語が、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態または二本鎖形態におけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは修飾連結を含有する核酸であって、合成の核酸、自然発生の核酸、および非自然発生の核酸であり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと同様の形で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例は、限定なしに述べると、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【０１０５】
別段に指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も暗示的に包含するほか、明示的に指し示される配列も包含する。とりわけ、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことにより達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
【０１０６】
「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係を指す。「作動可能に連結された」という用語は、転写調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系内のコード配列の転写を刺激またはモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に隣接する必要も、近接して配置される必要もない。
【０１０７】
本明細書で使用される「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列を、産生細胞または産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア（Pichia）属細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように改変していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ酸配列を、完全に、または可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しかし、本明細書ではまた、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されていると称する。
【０１０８】
本明細書では、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語が、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほか、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生のアミノ酸ポリマーにも適用される。別段に指し示されない限りにおいて、特定のポリペプチド配列はまた、保存的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。
【０１０９】
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列（human immunoglobulin gene, sequences）の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他の任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体など、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される、全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある種の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、これらに関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で天然には存在しない可能性がある配列である。
【０１１０】
「組換え宿主細胞」（または、簡単に、「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけを指すことを意図するものではなく、このような細胞の子孫細胞も指すことを意図するものであることを理解されたい。後続する世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一ではない可能性もあるが、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【０１１１】
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、非ヒト霊長動物（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物）を含む。特記される場合を除き、本明細書では、「患者」または「対象」という用語が互換的に使用される。本明細書で使用される「カニクイザル（cyno）」または「カニクイザル（cynomolgus）」という用語は、カニクイザル（cynomolgus monkey）（カニクイザル（Macaca fascicularis））を指す。
【０１１２】
一実施形態では、本明細書で使用される、任意の疾患または障害（例えば、ＦＧＦ２１関連障害）「〜を処置すること」またはこれらの「処置」という用語は、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状のうちの少なくとも１つの発症を緩徐化するか、停止させるか、または軽減すること）を指す。別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、患者により識別可能でない可能性があるパラメータを含む少なくとも１つの物理的パラメータを緩和または改善することを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害を、物理的にモジュレートする（例えば、識別可能な症状の安定化）か、生理学的にモジュレートする（例えば、物理的パラメータの安定化）か、または物理的かつ生理学的にモジュレートすることを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害の発生または発症または進行を防止するかまたは遅延させることを指す。
【０１１３】
例えばＦＧＦ２１関連障害を含む、本明細書で記載される適応に関する場合の「防止」とは、例えば、前記悪化の危険性がある患者における、下記で記載される、ＦＧＦ２１関連疾患パラメータの悪化を防止または緩徐化する任意の作用を意味する。
【０１１４】
「ベクター」という用語は、それが連結された別のポリヌクレオチドを輸送することが可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターのうちの１つの種類は、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶまたはＡＡＶ２）などのウイルスベクターである。ある種のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）は、それらが導入された宿主細胞における自己複製が可能である。他のベクター（例えば、非哺乳動物のエピソームベクター）は、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、ある種のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と称する。
【０１１５】
一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等な機能をもたらすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターの他の形態も含むことを意図する。
【０１１６】
本明細書で使用される「ＦＧＦ２１活性のモジュレーション」とは、例えば、薬剤の、ＦＧＦ２１ポリヌクレオチドまたはＦＧＦ２１ポリペプチドとの相互作用の結果でありうるＦＧＦ２１活性の増大または減少、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路の活性化および／またはＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体依存性のシグナル伝達）の活性化などを指す。例えば、生物学的活性のモジュレーションとは、生物学的活性の増大または減少を指す。ＦＧＦ２１活性は、限定なしに述べると、対象における、血中グルコースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、もしくは血中コレステロールレベルをアッセイすること；ベータ−ｋｌｏｔｈｏおよび／もしくはＦＧＦ受容体（例えば、ＦＧＦＲ−１ｃ）のポリペプチドレベルを評価すること；またはＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体依存性のシグナル伝達）の活性化を評価することを含む手段により評価することができる。
【０１１７】
ＦＧＦ２１活性の比較はまた、例えば、ＦＧＦ２１の下流のバイオマーカーのレベルを測定し、ＦＧＦ２１シグナル伝達の増大を測定することによっても達成することができる。活性はまた、細胞内のシグナル伝達；キナーゼ活性；脂肪細胞へのグルコースの取込み；血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、もしくは血中コレステロールレベルの変動；肝臓脂質レベルもしくは肝臓トリグリセリドレベルの変化；ＦＧＦ２１および／もしくはベータ−ｋｌｏｔｈｏと、ＦＧＦ２１受容体との相互作用；またはＦＧＦ２１受容体のリン酸化を測定することによっても評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１受容体のリン酸化は、チロシンのリン酸化でありうる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１活性のモジュレーションは、ＦＧＦ２１と関連する表現型のモジュレーションを引き起こしうる。
【０１１８】
本明細書で使用される「ＦＧＦ２１の下流のバイオマーカー」は、遺伝子もしくは遺伝子産物、または遺伝子もしくは遺伝子産物についての測定可能な指標である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１の下流のマーカーである遺伝子または活性は、発現レベルまたは血管組織内のレベルの改変を呈示する。いくつかの実施形態では、下流のマーカーの活性は、ＦＧＦ２１モジュレーターの存在下で改変される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１を、本発明のＦＧＦ２１モジュレーターで撹乱すると、下流のマーカーは、発現レベルの改変を呈示する。ＦＧＦ２１の下流のマーカーは、限定せずに述べると、グルコースまたは２−デオキシ−グルコースの取込み、ｐＥＲＫレベル、および他のリン酸化タンパク質レベルもしくはアセチル化タンパク質レベル、またはＮＡＤレベルを含む。
【０１１９】
本明細書で使用される「〜を上方調節する」という用語は、増大、活性化もしくは活性の刺激、または量を指す。例えば、本発明の文脈では、ＦＧＦ２１モジュレーターは、ベータ−ｋｌｏｔｈｏおよび／またはＦＧＦ２１受容体の活性を増大させうる。一実施形態では、ＦＧＦＲ−１ｃは、ＦＧＦ２１モジュレーターに応答して上方調節されうる。上方調節とはまた、例えば、血中グルコースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、もしくは血中コレステロールレベルを低下させるか；肝臓脂質レベルもしくはトリグリセリドレベルを低減するか；体重を低減するか；耐糖能、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性を改善するか；またはＦＧＦ２１受容体のリン酸化を引き起こすか；またはＦＧＦ２１の下流のマーカーを増大させる能力など、ＦＧＦ２１と関連する活性も指す場合がある。ＦＧＦ２１受容体は、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ−１ｃでありうる。上方調節は、対照と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％でありうる。
【０１２０】
本明細書で使用される「モジュレーター」という用語は、１型もしくは２型糖尿病、または肥満などの代謝性状態など、ＦＧＦ２１関連障害と関連する、１つまたは複数の生理学的事象または生化学的事象をモジュレートする組成物を指す。前記事象は、血中グルコースレベル、血中インスリンレベル、血中トリグリセリドレベル、または血中コレステロールレベルを低下させ；肝臓脂質レベルまたはトリグリセリドレベルを低減し；体重を低減し；および耐糖能、エネルギー消費、またはインスリン感受性を改善する能力を含むがこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１−１】ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに対するＦＧＦ２１模倣抗体である、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、およびＮＯＶ００４についての溶液平衡滴定結合アッセイ。
【図１−２】ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに対するＦＧＦ２１模倣抗体である、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、およびＮＯＶ００４についての溶液平衡滴定結合アッセイ。
【図２−１】ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４による、Ａ）ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ２９３細胞、およびＢ）カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化。
【図２−２】ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４による、Ａ）ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ２９３細胞、およびＢ）カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化。
【図３−１】Ａ）ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ２９３細胞、Ｂ）ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ２９３細胞、およびＣ）ヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化についてのＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４のプロファイリング。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏまたはＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。ＦＧＦ１９は、ＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。
【図３−２】Ａ）ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ２９３細胞、Ｂ）ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ２９３細胞、およびＣ）ヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化についてのＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４のプロファイリング。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏまたはＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。ＦＧＦ１９は、ＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。
【図３−３】Ａ）ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ２９３細胞、Ｂ）ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ２９３細胞、およびＣ）ヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化についてのＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４のプロファイリング。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏまたはＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。ＦＧＦ１９は、ＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏの活性化についての陽性対照として使用した。
【図４】α−ｋｌｏｔｈｏ、Ｅｇｒ１ルシフェラーゼ、およびウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用する、ＦＧＦ２３活性についてのＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４のプロファイリングを示す図である。ＦＧＦ２３は、陽性対照として使用した。
【図５】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞による２−ＤＯＧの取込みを使用する、マウスとの交差反応性についてのＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４のプロファイリングを示す図である。ＦＧＦ２１は、陽性対照として使用した。
【図６】ラットにおけるＩＶ注射に続く、ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４の濃度−時間プロファイルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
詳細な説明
本発明は部分的に、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合し、ＦＧＦ受容体、例えば、ＦＧＦＲ１ｃの活性化と、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体依存性のシグナル伝達）の活性化とをもたらす抗体分子の発見に基づく。本発明は、完全ＩｇＧフォーマット抗体、ならびにＦａｂ断片など、その抗原結合性断片の両方（例えば、抗体である、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、およびＮＯＶ００４）に関する。
【０１２３】
したがって、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体（例えば、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）、医薬組成物、作製法、ならびにこのような抗体および組成物の使用法を提供する。
【０１２４】
ＦＧＦ２１タンパク質
本開示は、本明細書で定義される、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１受容体に媒介されるシグナル伝達）を誘導しうるＦＧＦ２１模倣ｍＡｂ（すなわち、ベータ−ｋｌｏｔｈｏ（β−ｋｌｏｔｈｏ）に結合するモノクローナル抗体）を提供する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦＧＦ２１の成熟形態は、分子の活性形態である。ＦＧＦ２１野生型配列は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１を有し、これは、例えば、Ｃｈｉｒｏｎ社に帰せられる、米国特許第６，７１６，６２６号明細書など、交付された特許において見出すことができる（配列番号１）。
【０１２５】
【化１】
2018526988.tif 000002
【０１２６】
全長ＦＧＦ２１ポリペプチド（ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＭ＿０１９１１３．２）をコードする、対応するｍＲＮＡ配列を、下記（配列番号２）に示す。
【０１２７】
【化２】
2018526988.tif 000003
【０１２８】
成熟ＦＧＦ２１配列は、リーダー配列を欠き、また、アミノ末端（リーダー配列を伴うかまたはを伴わない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング、小型のポリペプチドの、大型の前駆体からの切断、Ｎ結合型グリコシル化および／またはＯ結合型グリコシル化、ならびに当業者により理解される、他の翻訳後修飾など、ポリペプチドの他の修飾も含みうる。成熟ＦＧＦ２１配列の代表的な例は、以下の配列（全長ＦＧＦ２１タンパク質配列（ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１）のアミノ酸位置２９〜２０９を表す、配列番号８３）を有する。
【０１２９】
【化３】
2018526988.tif 000004
【０１３０】
成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド（配列番号８３）をコードする、対応するｃＤＮＡ配列を、下記（配列番号８４）に示す。
【０１３１】
【化４】
2018526988.tif 000005
【０１３２】
ＦＧＦ２１模倣抗体および抗原結合性断片
本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、実施例で記載される通りに単離された、ヒトモノクローナル抗体およびＦａｂを含むがこれらに限定されない。
【０１３３】
β−ｋｌｏｔｈｏの野生型配列は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿７８３８６４．１を有し、Xu, et al. (2007) J Biol Chem. 282(40):29069-72およびLin, et al. (2007) J Biol Chem. 282(37):27277-84などの文献において見出すことができる。ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏをコードする全長ｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１７５７３７）を有する。タンパク質配列は、以下（配列番号２６２）の通りである。
【０１３４】
【化５】
2018526988.tif 000006
【０１３５】
本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体であって、配列番号９、２９、４９、または６９のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＨ  ＣＤＲを含む（または、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
【０１３６】
本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特異的に結合する抗体であって、配列番号１９、３９、５９、または７９のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体であって、以下の表２に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含む（または、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
【０１３７】
本発明の他の抗体は、突然変異させているが、なお、ＣＤＲ領域内で、表１に記載されている配列内で描示されるＣＤＲ領域と、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、または９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明の他の抗体は、ＣＤＲ領域内で、表１に記載されている配列内で描示されるＣＤＲ領域と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させた、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
本発明はまた、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現について最適化することができる（例えば、表１は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖に最適化された核酸配列を示す）。
【０１３９】
【表１】
2018526988.tif 000007
2018526988.tif 000008
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【０１４０】
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させているが、表１に記載されている配列と、なお少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５パーセントの同一性を有する抗体を含む。いくつかの実施形態は、可変領域内で、実質的に同じ抗原結合活性を保持しながら、表１に記載されている配列において描示されている可変領域と比較した場合、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させている、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させているが、表１に記載されている配列となお少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５パーセントの同一性を有する抗体を含む。いくつかの実施形態は、可変領域内で、実質的に同じ抗原結合活性を保持しながら、表１に記載されている配列内で描示された可変領域と比較した場合に、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させている、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
【０１４２】
これらの抗体の各々は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合しうるので、ＶＨ配列、ＶＬ配列、全長軽鎖配列、および全長重鎖配列（アミノ酸配列と、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と）を「混合し、マッチさせて」、本発明の他のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を創出することができる。このような「混合し、マッチさせた」β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例節で記載される他のアッセイ）を使用して調べることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列を、構造的に類似する全長重鎖配列で置きかえるものとする。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列を、構造的に類似する全長軽鎖配列で置きかえるものとする。
【０１４３】
したがって、一態様では、本発明は、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１９、３９、５９、および７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供し、この場合、抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏ（例えば、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
【０１４４】
より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号９および１９；２９および３９；４９および５９；または６９および７９、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
【０１４５】
別の態様では、本発明は、（ｉ）哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号９、２９、４９、または６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長重鎖、ならびに哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号２１、４１、６１、または８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離抗体、または（ｉｉ）その抗原結合性部分を含む機能的タンパク質を提供する。より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号９および１９；２９および３９；４９および５９；または６９および７９、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
【０１４６】
本明細書で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および抗原結合アフィニティーを付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲがあり、各軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲがある。
【０１４７】
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け（Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)；Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)）（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）により記載されているスキームを含む、周知の多数のスキームのうちのいずれかを使用して、たやすく決定することができる。例えば、古典的なフォーマットでは、Ｋａｂａｔによれば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内のＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Ｃｈｏｔｈｉａによれば、ＶＨ内のＣＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、ＶＬ内のアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨ内のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬ内のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴによれば、ＶＨ内のＣＤＲアミノ酸残基は、約２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５１〜５７（ＨＣＤＲ２）、および９３〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、ＶＬ内のＣＤＲアミノ酸残基は、約２７〜３２（ＣＤＲ１）、５０〜５２（ＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＣＤＲ３）と番号付けされている（「Ｋａｂａｔ」による番号付け）。ＩＭＧＴによれば、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムである、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ  Ａｌｉｇｎを使用して決定することができる。
【０１４８】
例えば、Ｋａｂａｔによれば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内の抗体であるＮＯＶ００１のＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９９〜１０８（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３９（ＬＣＤＲ１）、５５〜６１（ＬＣＤＲ２）、および９４〜１０２（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Ｃｈｏｔｈｉａによれば、ＶＨ内のＣＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５７（ＨＣＤＲ２）、および９９〜１０８（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、ＶＬ内のアミノ酸残基は、２６〜３９（ＬＣＤＲ１）、５５〜５７（ＬＣＤＲ２）、および９６〜１０１（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨ内のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９９〜１０８（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬ内のアミノ酸残基２４〜３９（ＬＣＤＲ１）、５５〜６１（ＬＣＤＲ２）、および９４〜１０２（ＬＣＤＲ３）とからなる。
【０１４９】
別の態様では、本発明は、表１に記載されている重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはこれらの組合せを含むβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を提供する。抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号３、２３、４３、および６３に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４、２４、４４、および６４に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号５、２５、４５、および６５に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１３、３３、５３、および７３に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１４、３４、５４、および７４に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１５、３５、５５、および７５に示されている。これらのＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して表される。
【０１５０】
代替的に、Ｃｈｏｔｈｉａシステム（Al-Lazikani et al.,（1997）, JMB 273 927-948）を使用して規定される通り、抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６、２６、４６、および６６に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７、２７、４７、および６７に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８、２８、４８、および６８に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１６、３６、５６、および７６に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１７、３７、５７、および７７に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１８、３８、５８、および７８に示されている。
【０１５１】
代替的に、組合せシステムを使用して規定される、抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号２６３および２６８に示す。抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号４、２４、４４、および６４に示す。抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号５、２５、および４５に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号１３、３３、５３、および７３に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号１４、３４、５４、および７４に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号１５、３５、５５、および７５に示す。
【０１５２】
代替的に、ＩＭＧＴシステムを使用して規定される、抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号２６４および２６９に示す。抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号２６５および２７０に示す。抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号２６６および２７１に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号２６７および２７２に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号１７、２７３、および５７に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号１５、３５、５５、および７５に示す。
【０１５３】
これらの抗体の各々は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合することが可能であり、抗原結合特異性は主に、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域によりもたらされることを踏まえれば、各抗体は、本発明の他のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性分子を創出するのに、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含有することが好ましいが、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、およびＶＨ  ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、およびＶＬ  ＣＤＲ３配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合し、マッチさせることができる）。このような「混合し、マッチさせた」β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイおよび実施例で記載される結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）結合アッセイ）を使用して調べることができる。ＶＨ  ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。当業者には、新規のＶＨ配列およびＶＬ配列を、１つまたは複数のＶＨ  ＣＤＲ領域配列および／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体のための、本明細書で示されるＣＤＲ配列に由来する、構造的に類似する配列で置換することにより創出しうることがたやすく明らかであろう。前出に加えて、一実施形態では、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片は、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３、またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むことが可能であり、この場合、断片は、β−ｋｌｏｔｈｏに、単一の可変ドメインとして結合する。
【０１５４】
本発明のある種の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、表１に記載されているＦａｂの重鎖および軽鎖配列を有しうる。より具体的には、抗体またはその抗原結合性断片は、ＦａｂＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、ＮＯＶ００４の重鎖および軽鎖配列を有しうる。
【０１５５】
本発明のある種の実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、例えば、表１に示される、ＦａｂであるＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、またはＮＯＶ００４の、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにＦａｂであるＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、またはＮＯＶ００４の、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【０１５６】
本発明の他の実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。本発明のさらに他の実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。本発明のさらに他の実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの組合せにより規定され、表１に記載された、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。本発明のさらに他の実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、ＩＭＧＴにより規定され、表１に記載された、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。
【０１５７】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１５８】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号２５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号３３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号３５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１５９】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号４３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号４５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号５３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号５５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６０】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号６３鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号６５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号７３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号７５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６１】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号８の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１８の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６２】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号３６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号３８の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６３】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号４６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４７の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号４８の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号５６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６４】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号６６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６７の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号６８の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号７６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号７８の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６５】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２６３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６６】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２６８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号２５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号３３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号３５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６７】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２６３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号４５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号５３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号５５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６８】
別の具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２６８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６４の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号２５の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号７３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７４の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号７５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６９】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２６４の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２６５の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号２６６の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２６７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１７０】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２６９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２７０の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号２７１の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２７２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２７３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号３５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１７１】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２６４の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２６５の重鎖可変領域のＣＤＲ２；配列番号２６６の重鎖可変領域のＣＤＲ３；配列番号２６７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号５７の軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および配列番号５５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１７２】
具体的な実施形態では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２６９の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２７０の重鎖可変領域のＣＤＲ２；配列番号２７１の重鎖可変領域のＣＤＲ３；配列番号２７２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２７３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および配列番号７５の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１７３】
ある種の実施形態では、本発明は、表１に記載されている、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片を含む。好ましい実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏに結合し、ＦＧＦ２１受容体複合体を活性化させる抗体または抗原結合性断片は、ＦａｂであるＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、ＮＯＶ００４である。
【０１７４】
本明細書で使用されるヒト抗体は、抗体の可変領域または全長鎖を、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得る場合、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるか、またはこれ「に由来する」重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは全長軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを、対象の抗原で免疫化すること、または対象の抗原を伴うファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるか、またはこれ「に由来する」ヒト抗体は、それ自体、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列と最も近縁である（すなわち、同一性％が最も大きい）ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより同定することができる。
【０１７５】
特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるか、またはこれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生の体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較したアミノ酸の差違を含有しうる。しかし、ＶＨフレームワーク領域内またはＶＬフレームワーク領域内で、選択されるヒト抗体は、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であり、ヒト抗体を、他の種の生殖細胞系列の免疫グロブリンのアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較した場合に、ヒトとして同定するアミノ酸残基を含有することが典型的である。ある種の場合に、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％、なおまたは少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一でありうる。
【０１７６】
組換えヒト抗体は、ＶＨフレームワーク領域内またはＶＬフレームワーク領域内の、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、１０アミノ酸以下の差違を提示することが典型的である。ある種の場合に、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、５アミノ酸以下、なおまたは４、３、２、もしくは１アミノ酸以下の差違を提示しうる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子の例は、下記で記載される生殖細胞系列の可変ドメイン断片のほか、ＤＰ４７およびＤＰＫ９を含むがこれらに限定されない。
【０１７７】
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載されている配列と相同なアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供するが、抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）に結合し、表１に記載されている抗体の所望の機能的特性を保持する。
【０１７８】
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体またはその機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号９、２９、４９、または６９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番号１９、３９、５９、または７９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含み；抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏ（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する。本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号３、４、５、１３、１４、および１５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号６、７、８、１６、１７、および１８をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、組合せにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６３、４、５、１３、１４、および１５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、ＩＭＧＴにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６４、２６５、２６６、２６７、１７、および１５をさらに含む。
【０１７９】
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体またはその機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏ（例えば、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する。本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号３、４、５、１３、１４、および１５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号６、７、８、１６、１７、および１８をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、組合せにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６３、４、５、１３、１４、および１５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、ＩＭＧＴにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６４、２６５、２６６、２６７、１７、および１５をさらに含む。
【０１８０】
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体またはその機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏ（例えば、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する。本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２３、２４、２５、３３、３４、および３５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６、２７、２８、３６、３７、および３８をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、組合せにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６８、２４、２５、３３、３４、および３５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、ＩＭＧＴにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、および３５をさらに含む。
【０１８１】
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体またはその機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏ（例えば、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する。本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号４３、４４、４５、５３、５４、および５５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号４６、４７、４８、５６、５７、および５８をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、組合せにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６３,４４、４５、５３、５４、および５５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、ＩＭＧＴにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６４、２６５、２６６、２６７、５７、および５５をさらに含む。
【０１８２】
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体またはその機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号６９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；抗体は、β−ｋｌｏｔｈｏ（例えば、ヒトおよびカニクイザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する。本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号６３、６４、６５、７３、７４、および７５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号６６、６７、６８、７６、７７、および７８をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、組合せにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６８、６４、２５、７３、７４、および７５をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、ＩＭＧＴにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、および７５をさらに含む。
【０１８３】
他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４、または５カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除き同一でありうる。表１に記載されている抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号１０、３０、５０、または７０、および配列番号２０、４０、６０、または８０、のそれぞれをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
【０１８４】
他の実施形態では、全長重鎖アミノ酸配列および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、表１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。配列番号９、２９、４９、または６９のうちのいずれかの全長重鎖、および配列番号１９、３９、５９、または７９、のうちのいずれかの全長軽鎖と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。配列番号１１、３１、５１、または７１のうちのいずれかの全長重鎖、および配列番号２１、４１、６１、または８１のうちのいずれかの全長軽鎖と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
【０１８５】
他の実施形態では、全長重鎖ヌクレオチド配列および／または全長軽鎖ヌクレオチド配列は、表１に示される配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
【０１８６】
他の実施形態では、重鎖可変領域のヌクレオチド配列および／または軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、表１に示される配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲは、表１に示される配列と、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
【０１８８】
本明細書で使用される、２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する配列により共有される、同一な位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【０１８９】
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに照らして検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさらに使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10によるＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。
【０１９０】
保存的修飾を伴う抗体
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、この場合、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。
【０１９１】
したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなる単離抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号３、２３、４３、および６３、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号４、２４、４４、および６４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号５、２５、４５、および６５、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号１３、３３、５３、および７３、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号１４、３４、５４、および７４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号１５、３５、５５、および７５、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０１９２】
したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなる、単離抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号２６３および２６８、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４、２４、４４、および６４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５、２５、および４５、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１３、３３、５３、および７３、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１４、３４、５４、および７４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１５、３５、５５、および７５、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０１９３】
他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現について最適化されており、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖からなる、哺乳動物細胞における発現について最適化された単離抗体であって、全長重鎖が、配列番号１１、３１、５１、または７１、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、全長軽鎖が、配列番号２１、４１、６１、または８１、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、β−ｋｌｏｔｈｏ（例えば、ヒト、およびカニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏ）に特異的に結合する抗体を提供する。
【０１９４】
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に記載されているβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体（例えば、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、またはＮＯＶ００４）と同じエピトープに結合する抗体を提供する。特定の態様では、このような抗体および抗原結合性断片は、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能である。したがって、β−ｋｌｏｔｈｏ結合アッセイ（実施例で記載されるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合アッセイなど）において、本発明の他の抗体と競合する（例えば、本発明の他の抗体の結合を、統計学的に有意な形で競合的に阻害する）それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定することができる。本発明の抗体の、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力により、被験抗体が、その抗体と、β−ｋｌｏｔｈｏへの結合について競合することが可能であり、このような抗体は、非限定的な理論によれば、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは関連の（例えば、構造的に類似するか、または空間的に近接した）エピトープに結合しうることが裏付けられる。ある種の実施形態では、本発明の抗体と同じβ−ｋｌｏｔｈｏ上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。本明細書で使用される通り、等モル濃度の競合抗体の存在下で、競合抗体が、本発明の抗体または抗原結合性断片のβ−ｋｌｏｔｈｏとの結合を、５０％を超えて（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）阻害するとき、抗体は、結合について「競合する」。ある種の実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏ上の、本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。このようなヒト化モノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。
【０１９５】
特定の態様では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体であるＮＯＶ００１と同じエピトープに結合する抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体であるＮＯＶ００２と同じエピトープに結合する抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体であるＮＯＶ００３と同じエピトープに結合する抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体であるＮＯＶ００４と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
【０１９６】
特定の態様では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
【０１９７】
特定の態様では、本発明は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
【０１９８】
特定の態様では、本発明は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
【０１９９】
特定の態様では、本発明は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
【０２００】
具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、エピトープは、表２に示された配列番号のうちの１つまたは複数を含む。特定の態様では、このような抗体および抗原結合性断片は、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能である。
【０２０１】
特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む。特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基５３６〜５５０のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む。特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基８３４〜８５７のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む。特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基９５９〜９８６のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０２０２】
特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの１つまたは複数のアミノ酸を含む。具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの２つ以上のアミノ酸を含む。具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの３つ以上のアミノ酸を含む。具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のアミノ酸を含む。
【０２０３】
特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む。特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６９６〜７００のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む。特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む。
【０２０４】
特定の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、またはそれ以上を含む。ある種の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの２つ以上のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む。具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの３つ以上のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む。具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏの３つ以上のエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、前記エピトープは、β−ｋｌｏｔｈｏ配列（配列番号２６２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、および６４６〜６８９のアミノ酸を含む。
【０２０５】
具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏのエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を提示し、この場合、エピトープは、表２に示された配列番号のうちの１つまたは複数を含み、前記単離抗体および抗原結合性断片は、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能であり、例えば、表２に示される通り、−０．５〜−２．１の範囲の、重水素取込みの変化により特徴付けられる通り、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により、β−ｋｌｏｔｈｏの１つまたは複数のペプチドを保護することが可能である。
【０２０６】
特定の態様では、本明細書では、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、以下のβ−ｋｌｏｔｈｏペプチド（配列番号２６２）：アミノ酸２４５〜２６６、２４６〜２６５、３４３〜３４９、３４４〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４９８、５０９〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６６９、６４６〜６７０、６９６〜７００、７７３〜８０４、８３４〜８５７、および９５９〜９８６のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上を保護する、単離抗体またはその抗原結合性断片が提示される。
【０２０７】
具体的な態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させる、単離抗体またはその抗原結合性断片であって、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、表２に示される以下：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４１、１４２、１４３、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１９５、１９６、１９７、１９８、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、および２６１由来の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のペプチドを保護する、単離抗体またはその抗原結合性断片が提示される。
【０２０８】
ある種の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させる、単離抗体またはその抗原結合性断片であって、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、表２に示される以下：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１４１、１４２、１４３、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１９５、１９６、１９７、１９８、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、および２６１由来の、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のペプチドを保護する、単離抗体またはその抗原結合性断片が提示される。
【０２０９】
ある種の態様では、本明細書では、β−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させる、単離抗体またはその抗原結合性断片であって、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（配列番号２６２）の残基７０１（Ｔｙｒ）または７０３（Ａｒｇ）に接触しない、単離抗体またはその抗原結合性断片が提示される。
【０２１０】
操作抗体および修飾抗体
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１つまたは複数を有する抗体を使用して、本発明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内、および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することにより操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる。
【０２１１】
実施しうる可変領域操作のうちの１つの種類は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間の多様性が、ＣＤＲの外部の配列より大きい。ＣＤＲ配列は、大半の抗体−抗原間相互作用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグラフトされた特異的自然発生抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327；Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525；Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029-10033；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【０２１２】
したがって、本発明の別の実施形態は、表１に示されるＨＣＤＲ１配列から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；表１に示されるＨＣＤＲ２配列から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；表１に示されるＨＣＤＲ３配列から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と；表１に示されるＬＣＤＲ１配列から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；表１に示されるＬＣＤＲ２配列から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および表１に示されるＬＣＤＲ３配列から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域とを含む、単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体のＶＨ  ＣＤＲ配列およびＶＬ  ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体に由来する、異なるフレームワーク配列を含有しうる。
【０２１３】
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列のそれぞれを含む重鎖可変領域と、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列のそれぞれを有する軽鎖可変領域とを含む単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体のＶＨ  ＣＤＲ配列およびＶＬ  ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。
【０２１４】
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公表されたＤＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、ヒト生殖細胞系列の配列データベースである「ＶＢａｓｅ」（インターネットのmrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能である）のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kabat, E. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson, I. M. et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798；およびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836においても見出すことができる。
【０２１５】
本発明の抗体における使用のためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレームワーク配列である。ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、およびＶＨ  ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、およびＶＬ  ＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域へとグラフトすることもでき、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して、１つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領域へとグラフトすることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。本明細書で記載される抗体および抗原結合性断片をその上に構築する足場として活用されうるフレームワークは、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３、Ｖｋ１、Ｖｌ２、およびＶｋ２を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、さらなるフレームワークが知られており、例えば、インターネットのvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1上のｖＢａｓｅデータベースにおいて見出すことができる。
【０２１６】
したがって、本発明の実施形態は、配列番号９、２９、４９、または６９からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号１９、３９、５９、または７９からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をさらに含む、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片に関する。
【０２１７】
したがって、本発明の実施形態は、配列番号９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号１９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【０２１８】
特定の態様では、本発明の実施形態は、配列番号２９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号３９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【０２１９】
特定の態様では、本発明の実施形態は、配列番号４９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号５９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【０２２０】
特定の態様では、本発明の実施形態は、配列番号６９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号７９のアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【０２２１】
可変領域修飾の別の種類は、「アフィニティー成熟」として公知の、ＶＨ  ＣＤＲ１領域内、ＶＨ  ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＨ  ＣＤＲ３領域内、ならびに／またはＶＬ  ＣＤＲ１領域内、ＶＬ  ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＬ  ＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、アフィニティー）を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され、実施例でも提示される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保存的修飾（上記で論じた）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、ＣＤＲ領域内の、典型的には１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基も改変する。
【０２２２】
ある種のアミノ酸配列モチーフは、グリコシル化（すなわち、ＮｘＳ／Ｔ［配列中、ｘは、任意だがＰではない］）、遊離システインの酸化、脱アミノ化（例えば、ＮＧ）または異性体化（例えば、ＤＧ）などの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を経ることが公知である。ＣＤＲ領域内に存在する場合、これらのモチーフは、産物の均質性を増大させるために、部位特異的突然変異誘発により除去することが理想的である。
【０２２３】
当技術分野では、アフィニティー成熟の工程について十分に記載されている。多くのディスプレイ系の中で、ファージディスプレイ（Smith GP (1985) Science 228:1315-1317）および酵母など、真核細胞上のディスプレイ（Boder ET and Wittrup KD (1997) Nature Biotechnology 15: 553-557）は、抗体−抗原間相互作用について選択するのに、最も一般的に適用される系であると考えられる。これらのディスプレイ系の利点は、広範にわたる抗原に適し、選択厳密性を容易に調整しうることである。ファージディスプレイでは、ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片を提示することができ、酵母ディスプレイでは、これらに加えて、全長ＩｇＧを提示することができる。これらの一般的に適用される方法は、多様性が１×１０７を超える、大規模なライブラリーからの、所望の抗体変異体の選択を可能とする。多様性が小規模な、例えば、１×１０３であるライブラリーは、マイクロ発現およびＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができる。
【０２２４】
非標的化抗体変異体ライブラリーまたはランダム抗体変異体ライブラリーは、例えば、エラープローンＰＣＲ（Cadwell RC and Joyce GF (1994) Mutagenic PCR. PCR Methods Appl. 3: S136-S140）により作り出すことができ、非常に簡便であるが、場合によって限定的である手法をもたらす。別の戦略は、抗体候補物質のＣＤＲ指向性多様化である。１つまたは複数のＣＤＲ内の１つまたは複数の位置は、例えば、縮重オリゴ（Thompson J et al. (1996) J.Mol.Biol. 256: 77-88）、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）（Kayushin AL et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 3748-3755）、または当技術分野で公知の、他の任意の手法を使用して、特異的に標的とすることができる。
【０２２５】
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号３、２３、４３、および６３を有する群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３、２３、４３、および６３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１領域（a VH CDR1 region consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 3, 23, 43, and 63 or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions, or additions as compared to SEQ ID NOs: 3, 23, 43, and 63）；配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号４、２４、４４、および６４と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２領域；配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号５、２５、４５、および６５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３領域；配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１３、３３、５３、および７３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１領域；配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１４、３４、５４、および７４と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２領域；ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１５、３５、５５、および７５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域からなる、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
【０２２６】
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号６、２６、４６、および６６を有する群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６、２６、４６、および６６と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１領域（a VH CDR1 region consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 6, 26, 46, and 66 or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions, or additions as compared to SEQ ID NOs: 6, 26, 46, and 66）；配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７、２７、４７、および６７と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２領域；配列番号８、２８、４８、および６８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号８、２８、４８、および６８と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１３、３３、５３、および７３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１領域；配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１４、３４、５４、および７４と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２領域；ならびに配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１５、３５、５５、および７５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域からなる、単離β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
【０２２７】
抗原結合性ドメインの、代替的なフレームワークまたは足場へのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、β−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する少なくとも１つの結合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワークまたは足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリンまたはそれらの断片の５つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
【０２２８】
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトしうる非免疫グロブリン足場を使用して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出すことに関する。それらが、標的のβ−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；およびＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、低分子モジュラー免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むがこれらに限定されない。
【０２２９】
フィブロネクチン足場は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンの第１０モジュール（１０  Ｆｎ３ドメイン））に基づく。ＩＩＩ型フィブロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する（ＣＤＲと類似する）、２つのベータシートの間に分配された、７つまたは８つのベータ鎖を有する。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも３つのこのようなループがあり、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号明細書を参照されたい）。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマＩｇＧ内の抗原認識単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるループのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらのフィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置きかえうる、足場として使用することができる。
【０２３０】
アンキリン技術は、アンキリンに由来するリピートモジュールを伴うタンパク質を、異なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。アンキリンリピートモジュールとは、２つのアンチパラレルのα−ヘリックスおよびβ−ターンからなる、３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することにより大部分が最適化される。
【０２３１】
アビマーは、ＬＲＰ−１など、天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超えるタンパク質が、構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の（２つ〜１０の）異なる「Ａドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうるアビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書；同第２００５００５３９７３号明細書；同第２００５００４８５１２号明細書；および同第２００６０００８８４４号明細書において記載されている方法を使用して創出することができる。
【０２３２】
アフィニティーリガンドであるアフィボディとは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク質である。プロテインＡとは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの１３が、多数のリガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている５８アミノ酸からなる（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書を参照されたい）。アフィボディ分子は、抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量が６ｋＤａである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体の結合部位と同様である。
【０２３３】
アンチカリンとは、Ｐｉｅｒｉｓ  ＰｒｏｔｅｏＬａｂ  ＡＧ社により開発された生成物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカリンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、１６０〜１８０アミノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する４つのループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性部位を独自の工程で再形成することができる。４つのループのセットを突然変異誘発することによりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの１つのタンパク質である、オオモンシロチョウ（Pieris Brassicae）のビリン結合性タンパク質（ＢＢＰ）が使用されている。アンチカリンについて記載する特許出願の１つの例は、ＰＣＴ国際公開第１９９９１６８７３号パンフレットにある。
【０２３４】
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのためにデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから非常に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対するいかなる構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリン足場が援用されており、それらのうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型で、高度な熱安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに由来するタンパク質の例は、国際公開第２００１０４１４４号パンフレットにおいて記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、国際公開第２００４１０６３６８号パンフレットにおいて記載されている。
【０２３５】
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの環状ペプチド様分子（分子量：１〜２ｋＤａ）である。
【０２３６】
本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラ抗体またはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体は、ヒト対象へと投与された場合の抗原性がさらに低減されている。
【０２３７】
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vicugna））などの新世界メンバーを含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（dromedary）（フタコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Calelus dromaderius））ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺乳動物に由来するある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する抗体の場合の、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、典型的な４つの鎖の四次構造とは構造的に異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公表された国際公開第９４／０４６７８号パンフレット）を参照されたい。
【０２３８】
ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラクダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に取得された米国特許第５，７５９，８０８号明細書を参照されたい。また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279:1256-1261；Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424:783-788；Pleschberger, M. et al., 2003 Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int J Cancer 89:456-62；およびLauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17:3512-3520も参照されたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト由来の他の抗体と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似する配列を得るように、組換えにより改変することができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。したがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を、さらに低減することができる。
【０２３９】
ラクダ科動物ナノボディの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１０分の１で、タンパク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの１つの帰結は、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において用いられうることである。
【０２４０】
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なｐＨおよびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボディを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へとたやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうることである。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。２００４年８月１９日に公表された米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照されたい。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大きな治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞内で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現させ、機能的である。
【０２４１】
したがって、本発明の特色は、β−ｋｌｏｔｈｏに対して高いアフィニティーを有するラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書のある種の実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において産生される、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、β−ｋｌｏｔｈｏまたはそのペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代替的に、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわち、例えば、本明細書の実施例において記載されている、標的としてのβ−ｋｌｏｔｈｏを伴うパニング手順を使用する、適切に突然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を提示するファージライブラリーからの選択によっても作製される。操作されたナノボディはさらに、遺伝子操作により、レシピエント対象における半減期が、４５分間〜２週間となるようにカスタマイズすることもできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディを、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４において記載されている通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列へとグラフトすることにより得る。
【０２４２】
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはその断片を含む二特異性分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域は、少なくとも２つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）へと連結することもできる。本発明の抗体は実際、３つ以上の異なる結合性部位および／または標的分子に結合する多特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の２つ以上の機能的分子へと連結することもでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」という用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、本発明の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合性模倣体など、１つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結する（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形で）ことができる。
【０２４３】
したがって、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープと異なる、β−ｋｌｏｔｈｏの別のエピトープである。
【０２４４】
加えて、二特異性分子が多特異性である本発明では、分子は、第１の標的エピトープおよび第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性もさらに含みうる。
【０２４５】
一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号明細書において記載されている、Ｆｖもしくは単鎖構築物など、その任意の最小断片でありうる。
【０２４６】
ダイアボディとは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖上で発現させた、二価の二特異性分子である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対合し、これにより、２つの抗原結合性部位を創出する（例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123を参照されたい）。ダイアボディは、ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ構造（ＶＨ−ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ構造（ＶＬ−ＶＨ立体配置）を伴う２つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることにより作製することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させることができる。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を、約１５アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45（3〜4）:128〜30；Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2（1）:21-36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌内の可溶性で活性の単量体形態で発現させることができる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45（34）:128-30；Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2（1）:21-36；Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3（2）:83-105；Ridgway et al.,1996 Protein Eng., 9（7）:617-21を参照されたい）。ダイアボディをＦｃへと融合させて、「ジダイアボディ」を作り出すことができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279（4）:2856-65を参照されたい）。
【０２４７】
本発明の二特異性分子内で援用しうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
【０２４８】
二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特異性をコンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の各結合特異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋剤を、共有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法は、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78、118-132；Brennan et al., 1985 Science 229:81-83；およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139:2367-2375において記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
【０２４９】
結合特異性が、抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
【０２５０】
代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内で発現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書において記載されている。
【０２５１】
それらの特異的な標的に対する二特異性分子の結合は、例えば、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害アッセイ）、またはウェスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試薬（例えば、抗体）を援用することにより、特に対象となるタンパク質−抗体間複合体の存在が検出される。
【０２５２】
別の態様では、本発明は、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する、本発明の抗体の少なくとも２つの同一であるかまたは異なる抗原結合性部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合性部分は、タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、併せて連結することができる。代替的に、二特異性分子のための連結法も記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体の定常領域に結合する抗体、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域と本発明の抗体の抗体の架橋によって得ることができる。
【０２５３】
三量体化ドメインについては、例えば、Ｂｏｒｅａｎによる特許である欧州特許第１０１２２８０号明細書において記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７において記載されている。
【０２５４】
半減期を延長した抗体
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した、ベータ−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。
【０２５５】
多くの因子が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。例えば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）による分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和およびマクロファージおよび樹状細胞による取込み）。様々な戦略を使用して、本発明の抗体の半減期を延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性リガンド、および炭水化物シールドとの化学的連結により、アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺伝子融合により、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディ、およびアンチカリンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリングする（遺伝子的または化学的に）ことにより、ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合性タンパク質、およびＦｃとの遺伝子融合により、またはナノ担体、徐放製剤、もしくは医療デバイスへの組込みにより、本発明の抗体の半減期を延長することができる。
【０２５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のＰＥＧなど、不活性のポリマー分子を、ＰＥＧの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へと付着することができる。抗体をＰＥＧ化するには、抗体またはその断片を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが典型的である。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコールもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。ある種の実施形態では、ＰＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、使用されるであろう。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により緊密にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認することができる。反応しなかったＰＥＧは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載されるイムノアッセイにより、結合活性ならびにｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性について調べることができる。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化する方法が知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照されたい。
【０２５７】
他の改変されたＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直交性直接操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering）（ＲｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ）を含む。この技術は、３０を超える新たなアミノ酸の、大腸菌（E. coli）細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを可能とする。ｔＲＮＡは、非天然アミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置へと組み込み、アンバーを終始コドンから化学的に特定されたアミノ酸の組込みシグナルを伝達するコドンへと転換する。
【０２５８】
組換えＰＥＧ化技術（ｒＰＥＧ）はまた、血清半減期の延長にも使用することができる。この技術は、３００〜６００アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のＰＥＧ化とは対照的に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
【０２５９】
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術である。ＰＳＡとは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系により認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。ＰＳＡは、数百万年にわたり、それらの壁をＰＳＡでコーティングするように進化したある種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易に作製することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内ではＰＳＡと化学的に同一であるので、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
【０２６０】
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーであり、体内の酵素により代謝されうる。ＨＥＳ溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増大させることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを改変することにより、広範にわたるＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。
【０２６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体はまた、１つまたは複数のアミノ酸修飾（すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合性断片（好ましくはＦｃドメイン断片またはヒンジＦｃドメイン断片）へと導入しても作り出すことができる。例えば、国際公開第９８／２３２８９号パンフレット、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット；および米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照されたい。
【０２６２】
さらに、抗体または抗体断片を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン；ＨＳＡ）へとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法が周知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号パンフレット、同第９３／１５２００号パンフレット、および同第０１／７７１３７号パンフレット；ならびに欧州特許第４１３，６２２号明細書を参照されたい。加えて、上記で記載した二特異性抗体の文脈では、抗体の特異性は、抗体の１つの結合性ドメインが、ＦＧＦ２１に結合するのに対し、抗体の第２の結合性ドメインは、血清アルブミン、好ましくは、ＨＳＡに結合するようにデザインすることもできる。
【０２６３】
半減期を延長するための戦略は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期の延長が所望される、ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質においてとりわけ有用である。
【０２６４】
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと（またはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドへと）、組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）、β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特異的に結合する抗体またはそれらの断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ  ＣＤＲ）と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術分野では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合またはコンジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、および同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書および同第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレットおよび同第９１／０６５７０号パンフレット；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539；Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい。
【０２６５】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて、「ＤＮＡシャフリング」と称する）の技法を介して作り出すことができる。ＤＮＡシャフリングを援用して、本発明の抗体またはそれらの断片の活性を改変する（例えば、アフィニティーが大きく、解離速度が小さい抗体またはそれらの断片）ことができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書；Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16（2）:76-82；Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；ならびにLorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24（2）:308-313（これらの特許および刊行物の各々は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体もしくはそれらの断片、またはコードされる抗体もしくはそれらの断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることにより改変することができる。β−ｋｌｏｔｈｏタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、区間、一部、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
【０２６６】
さらに、抗体またはそれらの断片は、精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列へと融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それらのうちの多くが市販されている中でとりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）において提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチド（配列番号２７４）である。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824において記載されている通り、例えば、ヘキサヒスチジン（配列番号２７４）は、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）に対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、および「フラッグ」タグを含むがこれらに限定されない。
【０２６７】
他の実施形態では、本発明の抗体またはそれらの断片を、診断剤または検出可能薬剤へとコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行、および／または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一部としてモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検出は、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどであるがこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネシウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放射性材料；ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリングすることにより達成することができる。
【０２６８】
本発明は、治療用部分へとコンジュゲートさせた抗体またはそれらの断片の使用もさらに包含する。抗体またはその断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。
【０２６９】
さらに、抗体またはその断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学的治療剤に限定されるとはみなされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤；または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパク質を含みうる。
【０２７０】
さらに、抗体は、２１３Ｂｉなどのアルファ放射体などの放射性金属イオン、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環状キレート化剤などの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。ある種の実施形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が参照によりそれらの全体において組み込まれる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4（10）:2483-90；Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10（4）:553-7；およびZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26（8）:943-50において記載されている。
【０２７１】
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.（eds.）, pp.243-56（Alan R. Liss, Inc. 1985）；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery（2nd Ed.）, Robinson et al.,（eds.）, pp.623-53（Marcel Dekker, Inc. 1987）；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.（eds.）, pp.475-506（1985）；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.（eds.）, pp.303-16（Academic Press 1985）；およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
【０２７２】
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと付着させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。
【０２７３】
本発明の抗体を作製する方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、配列番号１０、３０、５０、または７０に示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号２０、４０、６０、または８０に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、表１において同定される核酸分子である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表１において同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、または９９％）同一なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現させるとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、ＦＧＦ２１抗原結合能を呈示することが可能である。
【０２７４】
本発明ではまた、上記で示したβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の重鎖または軽鎖に由来する少なくとも１つのＣＤＲ領域、および、通例３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、上記で示したβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの縮重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードするであろう。
【０２７５】
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードしうる。本発明の核酸配列のうちのいくつかは、配列番号１１、３１、５１、または７１に示される重鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。他のいくつかの核酸配列は、配列番号２１、４１、６１、または８１に示される軽鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。
【０２７６】
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成、またはβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体またはその結合性断片をコードする既存の配列（例えば、下記の実施例で記載される配列）に対するＰＣＲによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化学合成は、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979によるホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981によるジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により達成することができる。ＰＣＲによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich（Ed.）, Freeman Press, NY, NY, 1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al.（Ed.）, Academic Press, San Diego, CA, 1990；Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991において記載されている通りに実施することができる。
【０２７７】
本発明ではまた、上記で記載したβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体鎖または結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺乳動物宿主細胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系は、プラスミド、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを伴うエピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内のＦＧＦ２１結合性ポリヌクレオチドおよびＦＧＦ２１結合性ポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ｂ、およびｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ｂ、およびｐＥＢＶＨｉｓ  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の他の多数のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brent et al.,前出；Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995；およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
【０２７８】
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存する。発現ベクターは、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有することが典型的である。いくつかの実施形態では、誘導条件下を除き、挿入された配列の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体鎖または断片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらのエレメントは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接のリボソーム結合性部位または他の配列を典型的に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れることにより増強することもできる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞内の発現を増大させることができる。
【０２７９】
発現ベクターはまた、挿入されたＦＧＦ２１結合性抗体配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしうる。挿入されたβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル配列へと連結することが多い。β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってまた、定常領域またはそれらの一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体またはそれらの断片の作製をもたらす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型的である。
【０２８０】
β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、およびサルモネラ（Salmonella）属種、セラチア（Serratia）属種、および多様なシュードモナス（Pseudomonas）属種など、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモーター系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選択で、オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開始して終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。本発明のＦＧＦ２１結合性ポリペプチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することができる。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
【０２８１】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性ポリペプチドを発現させ、作製するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現させるハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例で記載される、１Ｄ６．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞系（例えば、下記で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）の場合もある。それらは、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不死化動物細胞またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブリンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において一般に論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）、ならびにリボソーム結合性部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含みうる。これらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および／またはモジュレート可能プロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト即初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０２８２】
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用することができる（一般に、Sambrook et al.,前出を参照されたい）。他の方法は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロインジェクション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質であるＶＰ２２との融合体（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強型取込み、およびｅｘ  ｖｉｖｏにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる高収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体鎖または結合性断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で１〜２日間にわたり成長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導入された配列を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる。
【０２８３】
モノクローナル抗体の作出
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーションの技法を含む、様々な技法により作製することができる。モノクローナル抗体を作製するための多くの技法、例えば、Ｂリンパ球の、ウイルスによる形質転換または発がん性形質転換を援用することができる。
【０２８４】
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系、ラット系、およびウサギ系を含む。マウスにおけるハイブリドーマの作製は、十分に確立された手順である。当技術分野では、免疫化プロトコールと、融合のための、免疫化された脾臓細胞を単離するための技法とが公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた公知である。
【０２８５】
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、上記で記載した通りに調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づき、調製することができる。重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分子生物学の技法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）を使用して、マウス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワークへと挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５２２５５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらによる、米国特許第５５３０１０１号明細書；同第５５８５０８９号明細書；同第５６９３７６２号明細書；および同第６１８０３７０号明細書を参照されたい。
【０２８６】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。β−ｋｌｏｔｈｏを指向する、このようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の部分を保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソミックマウスを使用して作り出すことができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソミックマウスは、本明細書では、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称するマウスを含み、本明細書ではまとめて、「ヒトＩｇマウス」と称する。
【０２８７】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座であって、再配列されていないヒト重（μおよびγ）鎖免疫グロブリン配列およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン配列を、内因性μ鎖遺伝子座および内因性κ鎖遺伝子座を不活化させる標的突然変異と併せてコードする、ミニ遺伝子座（例えば、Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859を参照されたい）を含有する。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはマウスＩｇκの発現の低減を呈示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を経て、高アフィニティーのヒトＩｇＧκモノクローナルを産出する（Lonberg, N. et al., 1994 supra；Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546において総説されている）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノム修飾については、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込まれる、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656；Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724；Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123；Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591；およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851においてさらに記載されている。さらに、全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；および同第５，７７０，４２９号明細書；Ｓｕｒａｎｉらによる米国特許第５，５４５，８０７号明細書；全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、ＰＣＴ国際公開第９２１０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９７１１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、および国際公開第９９／４５９６２号パンフレット；ならびにＫｏｒｍａｎらによるＰＣＴ国際公開第０１／１４４２４号パンフレットも参照されたい。
【０２８８】
別の実施形態では、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスなど、導入遺伝子上および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用して、本発明のヒト抗体をもたらすことができる。本明細書では、このようなマウスを、「ＫＭマウス」と称するが、これについては、Ｉｓｈｉｄａらによる、ＰＣＴ国際公開第０２／４３４７８号パンフレットにおいて詳細に記載されている。
【０２８９】
ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる、当技術分野では、なおさらに代替的なトランスジェニック動物系が利用可能であり、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体をもたらすのに使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称する、代替的なトランスジェニック系も使用することができる。このようなマウスについては、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる、米国特許第５，９３９，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書；および同第６，１６２，９６３号明細書において記載されている。
【０２９０】
さらに、当技術分野では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる、代替的なトランスクロモソミック動物系が利用可能であり、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体をもたらすのに使用することができる。例えば、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保有するマウスであって、「ＴＣマウス」と称するマウスを使用しうるが、このようなマウスについては、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727において記載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を保有するウシについても記載されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明のＦＧＦ２１結合性抗体をもたらすのに使用することができる。
【０２９１】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当技術分野では、ヒト抗体を単離するための、このようなファージディスプレイ法が確立されているか、または下記の実施例において記載される。例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；および同第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらによる、米国特許第５，４２７，９０８号明細書；および同第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによる、米国特許第５，９６９，１０８号明細書；および同第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらによる、米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；および同第６，５９３，０８１号明細書を参照されたい。
【０２９２】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化したら、ヒト抗体応答を発生させうるように、ヒト免疫細胞を再構築した、ＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。このようなマウスについては、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらによる、米国特許第５，４７６，９９６号明細書；および同第５，６９８，７６７号明細書において記載されている。
【０２９３】
フレームワークまたはＦｃの操作
本発明の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基へと修飾を施した操作抗体を含む。このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、１つの手法は、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すには、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、本発明により包含されることを意図する。
【０２９４】
フレームワーク修飾の別の種類は、１つもしくは複数のフレームワーク領域内の残基、なおまたは、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法はまた、「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書においてさらに詳細に記載されている。
【０２９５】
フレームワーク内またはＣＤＲ領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、Ｆｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することもでき（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することができる）、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記でさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスである。
【０２９６】
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変する、例えば、増大または減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
【０２９７】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインのＳｐＡへの結合と比べて損なわれるように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間界面領域へと導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書においてさらに詳細に記載されている。
【０２９８】
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。多様な手法が可能である。例えば、以下の突然変異：Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７５号明細書において記載されている、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つまたは複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体を、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書；および同第６，１２１，０２２号明細書において記載されている、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取されたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、ＣＨ１領域内またはＣＬ領域内で改変することもできる。
【０２９９】
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能を改変する異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原結合能は保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。この手法は、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号明細書；および同第５，６４８，２６０号明細書においてさらに詳細に記載されている。
【０３００】
別の実施形態では、抗体が、Ｃ１ｑへの結合を改変し、かつ／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
【０３０１】
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を改変して、これにより、補体に結合する抗体の能力を改変する。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ国際公開第９４／２９３５１号パンフレットにおいてさらに記載されている。
【０３０２】
さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第００／４２０７２号パンフレットにおいてさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合性部位もマップされており、結合を改善させた変異体も記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604を参照されたい）。
【０３０３】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、脱グリコシル化抗体（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、１つまたは複数のアミノ酸置換を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる。このような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させることができる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書；および同第６，３５０，８６１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
【０３０４】
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製することもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増大させることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野では、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、このような細胞系内で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットは、フコースをＡｓｎ（２９７）連結された炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞内で発現させた抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、変異体のＣＨＯ細胞系である、Ｌｅｃｌ３細胞について記載している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ国際公開第９９／５４３４２号パンフレットは、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大を結果としてもたらす二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈示するように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作された細胞系について記載している（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照されたい）。
【０３０５】
改変抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または全長重鎖および全長軽鎖配列を有するβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体は、全長重鎖配列および／もしくは全長軽鎖配列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはこれらへと付着された定常領域を修飾することにより、新たなβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を創出するのに使用することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の構造特色を使用して、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに結合し、また、ＦＧＦ２１受容体複合体の１つまたは複数の機能的特性も活性化させること（例えば、ＦＧＦ２１受容体シグナル伝達を活性化させること）など、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する、構造的に関連するβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を創出する。
【０３０６】
例えば、本発明の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域またはそれらの突然変異は、組換えにより、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わせて、組換えにより操作された、上記で論じた、本発明の、さらなるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を創出することができる。他の種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のための出発材料は、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。操作抗体を創出するのに、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有される情報を、元の配列に由来する「第２世代の」配列を創出するための出発材料として使用し、次いで、「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
【０３０７】
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とからなるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を作製するステップと、重鎖可変領域の抗体配列および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出するステップと、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるステップとを含む方法を提供する。
【０３０８】
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号８、２８、４８、および６８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号１６、３６、５６、および７６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１７、３７、５７、および７７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号１８、３８、５８、および７８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とからなるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を調製し、重鎖可変領域の抗体配列および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供する。
【０３０９】
したがって、別の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞における発現について最適化されたβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体であって、配列番号１１、３１、５１、または７１の群から選択される配列を有する全長重鎖抗体配列と、配列番号２１、４１、６１、または８１の群から選択される配列を有する全長軽鎖抗体配列とからなるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を調製し、全長重鎖抗体配列および／または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供する。一実施形態では、重鎖または軽鎖の改変は、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域内である。
【０３１０】
改変抗体配列はまた、ＣＤＲ３配列、または米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号明細書において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列には多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など、抗体を、抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技術に従い実施することができる。
【０３１１】
標準的な分子生物学の技法を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができる。改変抗体配列によりコードされる抗体は、ヒト、カニクイザル、ラット、および／またはマウスのβ−ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合すること；ならびに抗体が、ＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ２９３  ｐＥＲＫ細胞アッセイにおいて、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達、例えば、ＦＧＦ２１受容体に依存するシグナル伝達を活性化させることを含むがこれらに限定されない、本明細書で記載されるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の機能的特性のうちの１つ、一部、または全部を保持する抗体である。
【０３１２】
本発明の抗体を操作する方法のある種の実施形態では、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体コード配列の全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に、突然変異を導入することができ、結果として得られる修飾β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体を、本明細書で記載される結合活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。当技術分野では、突然変異法が記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ国際公開第０２／０９２７８０号パンフレットは、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはこれらの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングするための方法について記載している。代替的に、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットは、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。本発明のある種の実施形態では、抗体は、脱アミド化部位を除去するように操作されている。脱アミド化は、ペプチド内またはタンパク質内の構造的変化および機能的変化を引き起こすことが公知である。脱アミドは、生物学的活性の低下のほか、タンパク質医薬品の薬物動態および抗原性の改変も結果としてもたらしうる（Anal Chem. 2005 March 1,;77（5）:1432-9）。
【０３１３】
本発明のある種の実施形態では、抗体は、ｐＩを増大させ、それらの薬物様特性を改善するように操作されている。タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理的特性の鍵となる決定因子である。ｐＩが小さな抗体は、可溶性が小さく、安定性が小さく、凝集しやすいことが公知である。さらに、ｐＩが小さな抗体の精製は、とりわけ、臨床における使用のためのスケールアップにおいて、困難であり、問題を生じる可能性がある。本発明の抗β−ｋｌｏｔｈｏ抗体またはＦａｂのｐＩを増大させることにより、それらの可溶性が改善され、抗体を高濃度（＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することが可能となった。抗体を高濃度（例えば、＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することにより、高用量の抗体を、患者の眼へと、硝子体内注射を介して投与することが可能な利点がもたらされ、これにより、心血管障害を含む慢性疾患を処置するための著明な利点である、投与頻度の低減を可能とすることができる。ｐＩの増大はまた、抗体のＩｇＧバージョンのＦｃＲｎを媒介するリサイクリングも増大させ、これにより、薬物が長時間にわたり体内にとどまり、要求される注射の回数を少なくすることも可能としうる。最後に、ｐＩの増大に起因して、抗体の全体的な安定性が著明に改善され、その結果として、保管寿命およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける生物学的活性の延長がもたらされる。ｐＩは、８．２以上であることが好ましい。
【０３１４】
改変抗体の機能的特性は、実施例において示されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）など、当技術分野において利用可能であり、かつ／または本明細書で記載される標準的なアッセイを使用して評価することができる。
【０３１５】
予防的使用および治療的使用
本明細書で記載される、β−ｋｌｏｔｈｏに結合する抗体は、それを必要とする対に、有効量の、本発明の抗体または抗原結合性断片を投与することにより、ＦＧＦ２１シグナル伝達の異常（例えば、ＦＧＦ２１に媒介されるシグナル伝達および／またはＦＧＦ２１受容体によるシグナル伝達の活性化の異常）と関連する疾患または障害を処置するのに治療的に有用な濃度で使用することができる。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、ＦＧＦ２１関連代謝障害を処置する方法を提供する。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、ＦＧＦ２１関連心血管障害を処置する方法を提供する。
【０３１６】
本発明の抗体を、とりわけ、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、メタボリックシンドローム、急性心筋梗塞、高血圧症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈性心疾患、腎疾患、糖尿病性合併症、神経障害、胃不全麻痺、インスリン受容体内の重度の不活化突然変異と関連する障害、ならびに他の代謝障害などの、代謝障害、内分泌障害、および心血管障害を含むがこれらに限定されない、ＦＧＦ２１に関連する状態または障害を処置、防止、および改善し（prevent treat, prevent, and improve）、重篤な罹病患者の死亡率および罹患率を低減するのに使用することができる。
【０３１７】
本発明の抗体はまた、ＦＧＦ２１関連障害を防止、処置、または改善するための他の薬剤と組み合わせて使用することもできる。例えば、スタチン療法を、心血管障害または代謝障害を伴う患者を処置するために、本発明のＦＧＦ２１模倣抗体および抗原結合性断片と組み合わせて使用することができる。
【０３１８】
特定の態様では、本明細書では、体重を低減する（例えば、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％）方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、β−ｋｌｏｔｈｏに結合しβ−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能な本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が提示される。
【０３１９】
特定の態様では、本明細書では、食欲または食物摂取を低減する（例えば、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％）方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、β−ｋｌｏｔｈｏに結合しβ−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能な本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が提示される。
【０３２０】
特定の態様では、本明細書では、対象における血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度または血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度を低減する（例えば、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％）方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、β−ｋｌｏｔｈｏに結合しβ−ｋｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの活性を増大させることが可能な本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が提示される。
【０３２１】
具体的な態様では、対象は、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖症、ならびにメタボリックシンドロームなどの代謝障害に罹患している。具体的な態様では、対象は、心血管障害に罹患している。
【０３２２】
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と併せて製剤化されたβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体（インタクトなまたは結合性断片）を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、例えば、心血管障害の処置または防止に適する１つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。薬学的に許容される担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物の調製を容易とするのに使用することもできる。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
【０３２３】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。投与経路および／または投与方式は、所望される結果に応じて変化する。投与は、硝子体内投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、もしくは皮下投与であるか、または標的部位に近接して投与することが好ましい。薬学的に許容される担体は、硝子体内投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適するものとする。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二特異性分子および多特異性分子である抗体は、化合物を、化合物を不活化しうる酸および他の天然の状態の作用から保護する材料でコーティングすることができる。
【０３２４】
組成物は、滅菌であり、かつ、流体であるものとする。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
【０３２５】
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知であり、日常的に実施されている方法に従い調製することができる。例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000；およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造することが好ましい。本発明の医薬組成物中では、β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の治療的に有効な用量または治療的に効果的な用量を援用することが典型的である。β−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容される剤形へと製剤化する。投与レジメンは、所望される最適応答（例えば、治療的応答）をもたらすように調整する。例えば、単一のボーラスを投与することもでき、複数に分割された用量をある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要件により指し示されるのに応じて、用量を比例的に低減するかまたは増大させることもできる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を、投与量単位形態で製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される投与量単位形態とは、処置される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位を指す。各単位は、要求される医薬担体との関連で、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性化合物を含有する。
【０３２６】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与方式に所望される治療的応答を達成するのに有効な量の有効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援用される本発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および医療既往歴などの因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
【０３２７】
医師または獣医師は、医薬組成物中で援用される本発明の抗体の投与を、所望の治療効果を達成するのに要求されるレベル未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、投与量を漸増させることができる。一般に、本明細書で記載される心血管障害を処置するのに有効な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるのか治療的であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するように滴定することが必要である。具体的な実施形態では、抗体の全身投与では、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇの範囲であり、あるいは、宿主の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１５ｍｇの範囲である。具体的な実施形態では、抗体の硝子体内投与では、投与量は、眼１つ当たり０．１ｍｇ〜眼１つ当たり５ｍｇの範囲でありうる。例えば０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．１ｍｇ／ｍｌ、２．２ｍｇ／ｍｌ、２．３ｍｇ／ｍｌ、２．４ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、２．６ｍｇ／ｍｌ、２．７ｍｇ／ｍｌ、２．８ｍｇ／ｍｌ、２．９ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．１ｍｇ／ｍｌ、３．２ｍｇ／ｍｌ、３．３ｍｇ／ｍｌ、３．４ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、３．６ｍｇ／ｍｌ、３．７ｍｇ／ｍｌ、３．８ｍｇ／ｍｌ、３．９ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．１ｍｇ／ｍｌ、４．２ｍｇ／ｍｌ、４．３ｍｇ／ｍｌ、４．４ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、４．６ｍｇ／ｍｌ、４．７ｍｇ／ｍｌ、４．８ｍｇ／ｍｌ、４．９ｍｇ／ｍｌ、または５．０ｍｇ／ｍｌ。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与を伴う。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与、または必要に応じた（ＰＲＮ）全身投与を伴う。
【０３２８】
抗体は通例、複数回投与する。単回の投与の間の間隔は、毎週、毎月、または毎年でありうる。間隔はまた、患者におけるβ−ｋｌｏｔｈｏ結合性抗体の血中レベルを測定することにより指し示される通り、不規則でもありうる。加えて、医師が代替的な投与間隔を決定する場合もあり、毎月または効果的であるのに必要な間隔で投与する。全身投与のいくつかの方法では、投与量は、抗体の血漿中濃度１〜１０００μｇ／ｍｌを達成するように調整し、いくつかの方法では、２５〜５００μｇ／ｍｌを達成するように調整する。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合は、低頻度の投与が要求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体の半減期より長い半減期を示す。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかに応じて変化しうる。予防的適用では、比較的低投与量を、比較的低頻度の間隔で、長期にわたり投与する。一部の患者には、彼らの余生にわたり処置を施し続ける。治療的適用では場合によって、比較的高投与量が、疾患の進行が軽減されるか終結するまで、比較的短い間隔で要求され、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求される。その後、患者には、予防的レジメを投与することができる。
【実施例】
【０３２９】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提示されるものであり、その範囲を限定するために提示されるものではない。当業者には、本発明の他の変形がたやすく明らかであろうし、添付の特許請求の範囲によっても包含される。
【０３３０】
実施例１：抗原としての使用のための、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿３００．１９細胞の調製
ヒトＦＧＦＲ１ｃ（アミノ酸１〜３８６）およびβ−ｋｌｏｔｈｏを安定的に発現させる３００．１９細胞を、全細胞抗原としての使用のために作り出した。ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１７５７３７）をコードする全長ｃＤＮＡを、ｐＥＦ１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番Ｖ９２１２０）のＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ部位へとクローニングした。ヒトＦＧＦＲ１ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０２３１０６）のアミノ酸１〜３８６をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番Ｖ９６２２０）のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位へとクローニングした。両方の構築物では、Ｋｏｚａｋ配列（ＣＡＣＣ）を、開始コドンの直前に入れ、終止コドンを、ベクター内のＭｙｃ−Ｈｉｓタグの前に加えた。Ａｍａｘａ  ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスおよびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ；型番ＶＣＡ−１００３）を使用する電気穿孔により、マウスｐｒｅ−Ｂ３００〜１９細胞に、β−ｋｌｏｔｈｏプラスミドおよびＦＧＦＲ１ｃプラスミドを共トランスフェクトした。１ｍｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番１０１３１）および８ｕｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番４６〜１１２０）を、３週間にわたり使用して、安定的なクローンを選択した。
【０３３１】
実施例２：細胞アッセイにおける使用のための、ＦＧＦＲ＿β−ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ２９３細胞の調製
β−ｋｌｏｔｈｏ抗体の結合特異性、機能的活性、またはオーソログの交差反応性について調べるため、標準的なＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクションおよび細胞クローン選択法を使用して、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ、またはカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏを安定的に発現させるＨＥＫ２９３細胞を作り出した。
【０３３２】
以下の、全長ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（ＮＭ＿１７５７３７）、ヒトＦＧＦＲ１ｃ（ＮＭ＿０２３１０６）、ヒトＦＧＦＲ２ｃ（ＮＰ＿００１１３８３８７）、ヒトＦＧＦＲ３ｃ（ＮＰ＿０００１３３）、またはヒトＦＧＦＲ４（ＮＰ＿９９８８１２）のｃＤＮＡをコードする、哺乳動物発現プラスミドを使用した：カニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏのためには、ヒトおよびアカゲザルのβ−ｋｌｏｔｈｏ配列に基づくプライマーにより、全長配列を、カニクイザル脂肪組織ｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ；型番Ｃ１５３４００３−Ｃｙ）からＰＣＲ増幅し、クローニングした。カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ  ｃＤＮＡは、ヒトＦＧＦＲ１ｃ配列（ＮＭ＿０２３１０６）に基づくプライマーを使用して、カニクイザル脂肪組織ｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ；型番Ｃ１５３４００３−Ｃｙ）からクローニングしたところ、ヒトＦＧＦＲ１ｃと、アミノ酸レベルで、１００％同一であることが示された。よって、ヒトＦＧＦＲ１ｃアミノ酸配列と、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃアミノ酸配列とは、同一であるので、上記で記載したヒトＦＧＦＲ１ｃ  ｃＤＮＡ構築物を使用して、カニクイザルβ−ｋｌｏｔｈｏおよびヒトＦＧＦＲ１ｃ（ＮＭ＿０２３１０６）を安定的に発現させるＨＥＫ２９３細胞を作製した。
【０３３３】
実施例３：ｐＥＲＫ細胞アッセイを使用する、ＦＧＦＲ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体の活性化の測定
細胞を培養し、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ  １／２（ｐＥＲＫ）レベルを測定するために、標準的な技法を使用した。略述すると、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ、またはカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏを安定的に発現させるＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；ＳＨ３００７１）、ブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１１１３９０２）、およびジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１０１３１０３５）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１９９５）中、５％ＣＯ２、３７℃で維持した。細胞を、ポリＤ−リシンでコーティングされた３８４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；３５４６６３）へと播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で、一晩にわたりインキュベートした後、血清飢餓させた。
【０３３４】
β−ｋｌｏｔｈｏ抗体のハイブリドーマ上清を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地で希釈し、多様な濃度の抗体を、プレートへと添加した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、次いで、溶解緩衝液で溶解させた。細胞溶解物を、３８４ウェルアッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；型番６００８２８０）へと移し、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＳｕｒｅＦｉｒｅ（商標）ｐＥＲＫ  １／２キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＴＧＲＥＳ１０Ｋ）を使用して、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ  １／２レベルを測定した。標準的なＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ環境を使用して、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１０４マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で、プレートを読み取った。式：Y＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０（Ｌｏｇ  ＩＣ５０−ｘ）×ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して、タンパク質濃度と対比させた、ｐＥＲＫ活性の、ベース活性に対する倍数として、用量応答データをグラフ化して、ＥＣ５０値を決定した。
【０３３５】
実施例４：モノクローナル抗体の調製
抗ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ抗体は、本質的に、Dreyer et al (2010) (Dreyer AM et.al. (2010) BMC Biotechnology 10:87)において記載されている通り、Ｂａｌｂ／ｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；株：ＢＡＬＢ／ｃＪ）マウス、またはＢｃｌ２  ２２  ｗｅｈｉ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；株：Ｃ．Ｃｇ−Ｔｇ（ＢＣＬ２）２２Ｗｅｈｉ／Ｊ）マウス内の全細胞免疫化により作り出した。
【０３３６】
略述すると、１×１０７個のヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿３００．１９細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスへと、１０〜３０日間隔で、６回にわたり注射した。初回の全細胞注射は、フロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆ５８８１）により行った。細胞およびアジュバントは、２つの、近接するが、顕著に異なる皮下部位に、混合せず、別個に注射した。これらの後、同じ細胞の腹腔内注射を、Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ６３２２）を伴うか、またはアジュバントを伴わずに行った。
【０３３７】
Ｂｃｌ２  ２２  ｗｅｈｉマウスを使用して、１×１０７個のヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿３００．１９細胞を、これらの動物へと、７日間隔で、４回にわたり注射した。初回の注射は、フロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆ５８８１）により行った。細胞およびアジュバントは、２つの、近接するが、顕著に異なる皮下部位の２つのセットに、別個に注射した。後続の細胞の注射は、アジュバントを伴わずに、皮下において行った。
【０３３８】
免疫化されたマウスにおける免疫応答は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイにより測定した。１，０００または１０，０００倍に希釈された免疫化されたマウスに由来する血清を使用して、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫおよびヒトＦＧＦＲ１ｃ＿  β−ｋｌｏｔｈｏ＿３００．１９細胞を染色した後、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）抗マウスＩｇＧ検出用二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；型番１１５−１３６−０７１）を施した。蛍光は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターまたはＦｏｒｅｓｓａフローサイトメーター上で読み取った。最高力価のマウス４匹を、エレクトロフュージョンのために選び出した。
【０３３９】
実施例５：ハイブリドーマのスクリーニング、サブクローニング、および選択
２×１０８個の脾臓細胞および５×１０７個の融合パートナーであるＦ０細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１６４６）を、Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＣＭ−Ｃ；Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で洗浄し、製造元の仕様に従い、ピークパルスを６００ボルトとしてＨｙｂｒｉｍｕｎｅ  Ｗａｖｅｆｏｒｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＣＥＥＦ−５０Ｂモデル）を使用して、融合させた。細胞を、３８４ウェルプレートへと、ウェル１つ当たりのＦ０細胞３，０００個の計算された密度で播種し、ＨＡＴ選択培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；型番Ｈ０２６２）中で培養した。
【０３４０】
一次スクリーニングは、ハイスループットのＦＡＣＳプラットフォーム（Anderson, Paul. Automated Hybridoma Screening, Expansion, Archiving and Antibody Purification. In: 3rd Annual 2014 SLAS Conference. Jan. 18-22, 2014, San Diego, CA）を使用して実施した。略述すると、ハイブリドーマ上清を、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏを安定的に発現させる細胞系および非発現細胞系と共にインキュベートし、抗体の結合を、抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ；型番１１５−１３６−０７１）により決定した。
【０３４１】
各ハイブリドーマ上清に由来する抗体を、４つのバーコード付き細胞系：３００．１９親細胞、ヒト＿ＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ＿３００．１９細胞、親ＨＥＫ  ２９３細胞、およびヒトＦＧＦＲ１ｃ−β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ  ２９３細胞に対する結合について、同時に調べ、一次スクリーニングにおいて、３４８のヒットを選び出した。一次ヒットを、９６ウェルプレート内で拡大し、結合を、ヒトＦＧＦＲ１ｃ−β−ｋｌｏｔｈｏ＿ＨＥＫ  ２９３細胞上で、ＦＡＣＳにより、再度確認し、１２２の確認されたヒットを得た。実施例２で記載したｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ  １／２アッセイを使用して、ＦＡＣＳにより結合を再確認した１１５のヒットのＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地含有上清を、細胞における、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体の活性化についてプロファイリングした。
【０３４２】
これらの上清中のｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ  １／２細胞の活性を最大とするハイブリドーマを拡大し、ＩｇＧを、それらの上清から精製した。実施例２で記載したｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ  １／２アッセイを使用して、７４のハイブリドーマから精製されたＩｇＧを、細胞における、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体の活性化についてプロファイリングした。実施例２で記載したｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ  １／２アッセイ を使用して、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体による、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ  １／２の活性化効力が最良であるハイブリドーマに由来するＩｇＧを、オーソログの、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体との交差反応性、ならびにヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏおよびヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体に対する選択性についてプロファイリングした。これらのプロファイリング結果に基づき、ハイブリドーマクローンである、９９Ｇ０９および１２７Ｆ１９を、さらなるプロファイリングのために選択した。
【０３４３】
９９Ｇ０９および１２７Ｆ１９による、α−ｋｌｏｔｈｏを発現させる細胞内のシグナル伝達について査定するため、ＨＥＫ２９３細胞に、α−ｋｌｏｔｈｏ、Ｅｇｒ１ルシフェラーゼ、およびウミシイタケ（Renilla）属ルシフェラーゼをトランスフェクトした。略述すると、ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中で培養し、ウェル１つ当たりの細胞３００００個で播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、Ｋｌｏｔｈｏ、Ｅｇｒ−１−ｌｕｃ、およびＴＫ−Ｒｅｎｎｉｌａをトランスフェクトした。翌日、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ２１、９９Ｇ０９、および１２７Ｆ１９を、０．１％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで、表示の濃度へと希釈し、トランスフェクトされた細胞へと、一晩にわたり添加した。ルシフェラーゼ活性は、製造元の指示書に従い、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｅ２９２０）により検出した。予測される通り、そのシグナル伝達のために、α−ｋｌｏｔｈｏの発現を要請するＦＧＦ２３は、強力なルシフェラーゼ発現を示した。しかし、ＦＧＦ２１も、９９Ｇ０９も、１２７Ｆ１９も、著明なルシフェラーゼ発現を示さなかったことから、α−ｋｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ２１またはこれらのＦＧＦ２１模倣抗体の共受容体として作用しないことが示唆される。
【０３４４】
実施例６：モノクローナル抗体のヒト化およびアフィニティー成熟
ヒト化
当技術分野では、ヒト化の工程について十分に記載されている（Jones PT et al. (1986) Nature 321: 522-525; Queen C et al. (1989) PNAS USA 86: 10029-10033; Riechmann L et al. (1988) Nature 33:323-327; Verhoeyen M et al. (1988) Science 239: 1534-1536）。ヒト化という用語は、非ヒト抗体、例えば、マウス由来抗体の抗原結合性部位の、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト生殖細胞系列配列への導入として説明される（Retter I et al. (2005). Nucleic Acids Res. 33: D671-D674）。
【０３４５】
抗体をヒト化する主要な根拠は、ヒトにおいて、抗体に対する免疫原性応答を発生させる危険性を最小化することに認められる（Rebello PR et al. (1999) Transplantation 68: 1417-1420）。抗原結合性部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（Chothia C and Lesk AM (1987) Journal of Molecular Biology 196: 901-917; Kabat E et al. (1991) Anon. 5th Edition ed; NIH Publication No. 91: 3242）と、ＣＤＲ外、すなわち、可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）のフレームワーク領域内の位置であって、結合に直接的または間接的に影響を及ぼす位置とを含む。結合に直接的に影響を及ぼしうるフレームワーク残基は、例えば、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する、いわゆる「アウター」ループ領域内に見出すことができる。結合に間接的に影響を及ぼす残基は、例えば、いわゆるバーニヤ帯域において見出される（Foote J, Winter G. (1992) Journal of Molecular Biology 224:4 87-499）。これらは、ＣＤＲのコンフォメーションを支持すると考えられる。ＣＤＲの外側のこれらの位置は、フレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列アクセプター配列に照らした、最終的なヒト化抗体の逸脱の数を最小化するのに適する、アクセプターフレームワークを選び出す場合に考慮される。
【０３４６】
配列の最適化、アフィニティー成熟
ある種のアミノ酸配列モチーフは、グリコシル化（すなわち、ＮｘＳ／Ｔ、ｘは、Ｐ以外の任意）、遊離システインの酸化、脱アミノ化（例えば、ＮＧ）または異性体化（例えば、ＤＧ）などの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を経ることが公知である。ＣＤＲ領域内に存在する場合、これらのモチーフは、産物の均質性を増大させるために、部位特異的突然変異誘発により除去することが理想的である。
【０３４７】
当技術分野では、アフィニティー成熟の工程について十分に記載されている。多くのディスプレイ系の中で、ファージディスプレイ（Smith GP, 1985, Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228:1315-1317）および酵母など、真核細胞上のディスプレイ（Boder ET and Wittrup KD, 1997, Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nature Biotechnology 15: 553-557）は、抗体−抗原間相互作用について選択するのに、最も一般的に適用される系であると考えられる。これらのディスプレイ系の利点は、広範にわたる抗原に適し、選択厳密性を容易に調整しうることである。ファージディスプレイでは、ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片を提示することができ、酵母ディスプレイでは、全長ＩｇＧが加わる。これらの一般的に適用される方法は、多様性が１×１０７を超える、大規模なライブラリーからの、所望の抗体変異体の選択を可能とする。多様性が小規模、例えば、１，０００、のライブラリーは、マイクロ発現およびＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができる。非標的化抗体変異体ライブラリーまたはランダム抗体変異体ライブラリーは、例えば、エラープローンＰＣＲ（Cadwell RC and Joyce GF, 1994, Mutagenic PCR. PCR Methods Appl. 3: S136-S140）により作り出すことができ、非常に簡便であるが、場合によって限定的である手法をもたらす。別の戦略は、抗体候補物質のＣＤＲ指向性多様化である。１つまたは複数のＣＤＲ内の１つまたは複数の位置は、例えば、縮重オリゴヌクレオチド（Thompson J et al., 1996, Affinity maturation of a high-affinity human monoclonal antibody against the third hypervariable loop of human immunodeficiency virus: use of phage display to improve affinity and broaden strain reactivity. J.Mol.Biol. 256: 77-88）、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）（Kayushin AL et al., 1996, A convenient approach to the synthesis of trinucleotide phosphoramidites--synthons for the generation of oligonucleotide/peptide libraries. Nucleic Acids Res. 24: 3748-3755）、または当技術分野で公知の、他の任意の手法を使用して、特異的に標的とすることができる。
【０３４８】
発現プラスミドの作出
ヒト（homosapiens）へのコドン最適化を含む、ヒト化ＶＬドメインおよびヒト化ＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に依頼した。ＶＬドメインおよびＶＨドメインをコードする配列は、ＧｅｎｅＡｒｔによるベクターからのカットアンドペーストにより、哺乳動物細胞内の分離に適する発現ベクターへとサブクローニングした。重鎖および軽鎖は、共トランスフェクションを可能とするように、個別の発現ベクターへとクローニングした。発現ベクターのエレメントは、プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を容易とするシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソームにおける複製および原核生物内の複製を可能とするエレメント（例えば、ＳＶ４０起点およびＣｏｌＥ１エレメントまたは当技術分野で公知の他のエレメント）、ならびに選択を可能とするエレメント（アンピシリン耐性遺伝子およびゼオシンマーカー）を含む。
【０３４９】
ヒト化抗体候補物質の発現および精製
ＳＶ４０ラージＴ抗原を構成的に発現させるヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３−Ｔ  ＡＴＣＣ１１２６８）は、ヒト化ＩｇＧタンパク質および／または最適化されたＩｇＧタンパク質の一過性発現に好ましい宿主細胞系のうちの１つである。トランスフェクションは、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ：２５，０００、直鎖状；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、型番２３９６６）を、トランスフェクション試薬として使用して実施する。ＰＥＩ原液は、９００ｍｌの細胞培養グレード水中に、１ｇのＰＥＩを、室温（ＲＴ）で、注意深く溶解することにより調製する。
【０３５０】
精製は、２つのステップで実施し、これにより、ヒト化し、アフィニティー成熟させたｍＡｂを、マウスハイブリドーマから作り出した。ＮＯＶ００１は、マウスハイブリドーマである９９Ｇ０９に由来する、ヒト化しアフィニティー成熟させたｍＡｂである。ＮＯＶ００２は、マウスハイブリドーマである１２７Ｆ１９に由来する、ヒト化しアフィニティー成熟させたｍＡｂである。アイソタイプである、ＩｇＧ１  Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）またはＩｇＧ１κ  Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ（ＤＡＰＡ）は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および相補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を促進する抗体の能力を低減する防止手段として選択した（Hezareh M et al. (2001) Journal of Virology 75: 12161-12168）。ＮＯＶ００１は、同じｍＡｂのＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）アイソタイプであり、ＮＯＶ００３は、同じｍＡｂのＩｇＧ１（ＤＡＰＡ）アイソタイプである。ＮＯＶ００２は、同じｍＡｂのＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）アイソタイプであり、ＮＯＶ００４は、同じｍＡｂのＩｇＧ１（ＤＡＰＡ）アイソタイプである。
【０３５１】
実施例７：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるモノクローナル抗体の特徴付け
実施例５で記載したＳＥＴアッセイを使用して、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏに対するｍＡｂのＫＤを推定した。ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、およびＮＯＶ００４は、それぞれ、約４２ｐＭ、８ｐＭ、および９ｐＭのＫＤを有する（図１）。実施例３で記載したｐＥＲＫアッセイを使用して、ｍＡｂを、ＦＧＦＲ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体の活性についてプロファイリングした。ＮＯＶ００２は、ヒトおよびカニクイザルのＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体を、それぞれ、約５ｎＭおよび３７ｎＭのＥＣ５０で活性化させた（図２）。ＮＯＶ００４は、ヒトおよびカニクイザルのＦＧＦＲ１ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体を、それぞれ、約６ｎＭおよび４０ｎＭのＥＣ５０で活性化させた（図２）。ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４は、ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体、またはヒトＦＧＦＲ４＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体を活性化させなかった（図３）。ｍＡｂを、実施例５で記載したＦＧＦ２３活性についてプロファイリングした。ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４は、ＦＧＦ２３活性を呈示しなかった（図４）。ｍＡｂを、実施例５で記載した、マウスＦＧＦＲ＿β−ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体に対する交差反応性についてプロファイリングした。ｍＡｂである、ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４は、マウス３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞によるグルコースの取込みをもたらさなかった（図５）。
【０３５２】
実施例８：ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメインの、ＮＯＶ００１およびＮＯＶ００２との水素−重水素交換による、エピトープマッピング
質量分析（ＭＳ）と組み合わせた水素−重水素交換（ＨＤｘ）（Woods VL et al. (2001) High Resolution, High-Throughput Amide Deuterium Exchange-Mass Spectrometry (DXMS) Determination of Protein Binding Site Structure and Dynamics: Utility in Pharmaceutical Design. J. Cell. Biochem. Supp.; 84(37): 89-98）を使用して、ＮＯＶ００１およびＮＯＶ００２の、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）上の推定結合性部位（アミノ酸５２〜９９７）をマッピングした。ＨＤｘ骨格では、タンパク質のアミド水素を、重水素で置きかえる。この工程は、タンパク質の構造／動態および溶媒接触性に対して高感度であり、したがって、リガンド結合時に重水素取込みの減少を経る位置について報告することが可能である。これらの実験の目標は、ＮＯＶ００１またはＮＯＶ００２に結合するときの、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤの潜在的エピトープを同定し、その動態について理解することであった。重水素取込みの変化は、直接的結合およびアロステリック事象の両方に対して高感度である。
【０３５３】
ＨＤｘ／ＭＳ実験は、文献（Chalmers MJ et al. (2006) Probing protein ligand interactions by automated hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem.; 78(4): 1005-1014）に記載されている方法と同様の方法を使用して実施した。実験は、ＬＥＡＰ  ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ、およびＳｙｎａｐｔ  Ｇ２質量分析計を含む、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＤｘ−ＭＳプラットフォーム上で実施した。ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ（アミノ酸５２〜９９７）のタンパク質骨格を標識付けするのに使用される重水素緩衝液は、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）であり、溶液中の重水素の全百分率は、９５％であった。タンパク質であるヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（アミノ酸５２〜９９７）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍから注文した（５８８９−ＫＢ−０５０）。タンパク質は、ＨＤｘ−ＭＳ解析の前に、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２に対して、一晩にわたり透析した。抗体の非存在下における、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ（アミノ酸５２〜９９７）の、重水素による標識付け実験のために、冷却された試験管内で、１００μｌの重水素緩衝液（９５％の重水素）を使用して、容量を１３μｌとする、３００ピコモルのヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ（アミノ酸５２〜９９７）を希釈し、４℃のローテーター上で、１５分間にわたりインキュベートした。次いで、標識付け反応を、１００μｌの冷却クエンチ緩衝液により、２℃で５分間にわたりクエンチした後、自動式ペプシン消化およびペプチド解析のための、ＬＣ−ＭＳシステムへと注入した。
【０３５４】
ＮＯＶ００１またはＮＯＶ００２の存在下における、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ（アミノ酸５２〜９９７）重水素による標識付け実験のために、３５０ピコモルのＮＯＶ００１またはＮＯＶ００２を、まず、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｐｌｕｓビーズ上に固定化し、ＤＳＳ（スベリン酸ジスクシンイミジル）を使用して架橋した。標識付け実験を実施するために、３５０ピコモルの抗体を含有する抗体ビーズを、３００ピコモルのヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ（アミノ酸５２〜９９７）と共に、４℃で２０分間にわたりインキュベートした。２０分後、ビーズを、２００μｌのＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次いで、２００μｌの冷却された重水素緩衝液（８４．１％の重水素）を添加し、複合体を、４℃で１５分間にわたりインキュベートした。１５分後、重水素緩衝液をスピンアウトし、標識付け反応を、２００μｌの冷却されたクエンチ緩衝液により、氷上で４．５分間にわたりクエンチした。試料を、遠心分離機内で、３０秒間にわたりスピンした後、クエンチされた溶液を、自動式ペプシン消化およびペプチド解析のための、ＬＣ−ＭＳシステムへと注入した。
【０３５５】
全ての重水素交換実験は、０．５ＭのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）および３Ｍの尿素（ｐＨ＝２．６）を使用してクエンチした。クエンチの後、交換された抗原を、１２℃でＰｏｒｏｓｚｙｍｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｅｐｓｉｎカラム（２．１×３０ｍｍ）を使用するオンラインペプシン消化に続く、Ｗａｔｅｒｓ  Ｖａｎｇｕａｒｄ  ＨＳＳ  Ｔ３トラッピングカラム上のトラッピングにかけた。ペプチドを、トラッピングカラムから溶出させ、Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １×１００ｍｍカラム（１℃で維持される）上、４０μｌ／分の流量で、２〜３５％Ｂの二成分の８．４分の勾配（移動相Ａは、９９．９％の水および０．１％のギ酸であり；移動相Ｂは、９９．９％のアセトニトリルおよび０．１％のギ酸である）を使用して分離した。
【０３５６】
ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ（アミノ酸５２〜９９７）については、配列のうちの８２％を、本明細書で記載される重水素交換実験によりモニタリングした。ＮＯＶ００１またはＮＯＶ００２が結合したβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤと、ＮＯＶ００１またはＮＯＶ００２が結合しなかったβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤとの示差的実験のためには、２つの状態の間の重水素取込みの変化について検討することが有益である。表２では、負の値は、ＮＯＶ００１−β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ複合体またはＮＯＶ００２−β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ複合体が、β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ単独と比べて、小さな重水素取込みを経ることを指し示す。重水素取込みの減少は、抗体による、交換可能な重水素からの抗原の保護、または水素結合ネットワークの安定化に起因しうる。これに対し、正の値は、複合体が、β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ単独と比べて、大きな重水素取込みを経ることを指し示す。重水素取込みの増大は、水素結合ネットワークの不安定化（すなわち、タンパク質の局在的なアンフォールディング）に起因しうる。アポβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤおよびＮＯＶ００１−β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ複合体またはＮＯＶ００２−β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ複合体など、２つの異なる状態の間の、重水素交換の示差的変化を検討する場合、手法を使用して、変化が著明であるのかどうかを決定することが典型的である。差違が０．５Ｄａを超える限りにおいて、差違は著明であると考えることが典型的である（Houde D, et al. (2010) J. Pharma. Sci.; 100(6): 2071-2086）。
【０３５７】
表２は、ＮＯＶ００１−β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ複合体またはＮＯＶ００２−β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ複合体について、β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ単独と比べた重水素取込みの変化を列挙する。−０．５Ｄａを、著明なカットオフとして使用する（Houde D, et al. (2010) The Utility of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry in Biopharmaceutical Comparability Studies. J. Pharma. Sci.; 100(6): 2071-2086）。ＮＯＶ００１−β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ複合体では、以下のペプチド：アミノ酸２４５〜２６６、３４４〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４９８、５０９〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６７０、６９６〜７００、７７３〜８０４、８３４〜８５７、および９５９〜９８６が著明に保護される。ＮＯＶ００２−β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ複合体では、以下のペプチド：アミノ酸２４６〜２６５、３４３〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４９８、５０９〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６６９、７７３〜８０４、８３４〜８５７、および９５９〜９８６が著明に保護される。
【０３５８】
重複するペプチドの保護値を比較することにより、重水素交換データの分解能をさらに改善することができる。例えば、ＮＯＶ００１−β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ複合体内で、アミノ酸３２９〜３４２のペプチドは、−０．５１Ｄａで保護されるに過ぎないが、より大型である、アミノ酸３３０〜３４８のペプチドは、−１．４８Ｄａで保護される。よって、大型ペプチドの、著明に保護される領域は、アミノ酸３４３〜３４７の領域であるはずだと推定することができる。この解析を、データにわたり実施することにより、ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００１が、β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ（例えば、配列番号２６２内の前記領域）に結合したとき、アミノ酸２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、および９５９〜９８６の領域が、最も強く保護されることが明らかとなる。
【０３５９】
さらに、前出で言及した、最も強く保護される領域以外に、ＮＯＶ００１により保護される、全体的な多くの領域はまた、ＮＯＶ００２でも保護される。これらの保護領域は、直鎖状配列空間内の多くの領域にわたり広がるが、ＥＣＤのＣ末端側に向かって、保護領域は増大する。これに対し、２つの抗体を差別化する領域は少数である。ＮＯＶ００１では、２つの領域：アミノ酸６４６〜６７０およびアミノ酸６９７〜７００が固有に保護され、ＮＯＶ００２では、１つの領域である、アミノ酸６４６〜６８９が固有に保護される。総じて、β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤに対して、ＨＤｘ−ＭＳだけを使用して、ＮＯＶ００２のエピトープを、ＮＯＶ００１のエピトープから差別化することは、困難であった。ＨＤｘデータは、エピトープが酷似することを示唆する。
【０３６０】
表２は、ＮＯＶ００１およびＮＯＶ００２の結合の、ヒトβ−ｋｌｏｔｈｏ（アミノ酸５３〜９９７）による重水素取込み（deuterium incorporation human β-klotho (53-997aa)）に対する効果を示す。質量分析により検出される各ペプチドについて、β−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ単独と比べた、ＮＯＶ００１−β−ｋｌｏｔｈｏ複合体、およびβ−ｋｌｏｔｈｏ  ＥＣＤ単独と比べた、ＮＯＶ００２−β−ｋｌｏｔｈｏ複合体の、重水素取込みの変化（ドルトン単位）を示す。
【０３６１】
【表２】
2018526988.tif 000019
2018526988.tif 000020
2018526988.tif 000021
2018526988.tif 000022
2018526988.tif 000023
2018526988.tif 000024
【０３６２】
実施例９：ラットにおける、モノクローナル抗体の薬物動態プロファイル
動物および維持状態
動物のケアおよび管理は、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）に従い施した。全ての手順は、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓにより示されている基準により統括し、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコールＣＶ９０５４に従い実施した。雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（群１つ当たりのｎ＝３）は、底部の堅固なケージ内の、不断に自動給水するように装備されたラック上で飼育し、１２時間の明暗周期（午前６時〜午後６時）で維持し、標準的な齧歯動物用食餌（Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ；型番８６０４）を自由に得られるように施した。動物施設は、３０〜７０％の湿度を伴う、６８〜７６°Ｆの間で維持した。
【０３６３】
ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４の調製および投与
２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中の、ＮＯＶ００２（１２．００ｍｇ／ｍＬ）およびＮＯＶ００４（１６．０ｍｇ／ｍＬ）の原液は、凍結させて出荷され、−８０℃で保存され、使用前に、冷蔵下で融解させた。投与日の午前中に、両方の抗体を、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液で２ｍｇ／ｍＬまで希釈し、適切な容量を、投与用シリンジ（５ｍＬ／ｋｇ）へと吸引し、投与まで、室温で保った。動物を、試験管固定装置に置き、尾静脈への静脈内（ＩＶ）注射（１０ｍｇ／ｋｇ）を介して、ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４を投与した。
【０３６４】
血液試料の採取
血液試料は、−３日目（ベースライン）、投与後０日目（投与の１および６時間後）、ならびに１、２、４、７、１４、２１、および２８日目に採取した。全ての時点は、０日目に施された投与の終了を起点とした。各時点において、約０．２ｍＬ（２００μＬ）の血液を、ＥＤＴＡ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ；型番３６５９７３）を伴う、ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ／ｓｅｐａｒａｔｏｒ  ｔｕｂｅへと採取した。出血を止めるために、ゲージにより、圧力を加えた。試料を、２０，８１７×ｇで、１０分間にわたり遠心分離し、次いで、約１００μＬの血漿を、０．２ｍＬのＴｈｅｒｍｏ−ｓｔｒｉｐ  ｔｕｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ；型番ＡＢ−０４５１）へと移し、８０℃で凍結させた。各採取の後、ラットを、それらの飼育ケージに戻した。
【０３６５】
血漿総ＮＯＶ００２濃度または血漿総ＮＯＶ００４濃度の測定
捕捉抗体としてのマウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（Ｒ１０Ｚ８Ｅ９）、および検出抗体としての、ＨＲＰ標識を伴う、ヤギ抗ヒトＩｇＧによる、特注のサンドイッチイムノアッセイを使用して、ラット血漿中のヒトＩｇＧ（すなわち、ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４）を定量化した。３８４ウェルの白色マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ；Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ；型番７８１０７４）を、捕捉抗体（ウェル１つ当たり３０μＬのＰＢＳ中に２μｇ／ｍＬ）でコーティングした。プレートは、振とうせずに、室温（ＲＴ）で、一晩にわたりインキュベートした。コーティング溶液を、洗浄せずに、吸引した後で、１×Ｍｉｌｋ  Ｄｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（ＫＰＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ；型番５０−８２−０１）９０μＬを、各ウェルへと添加し、プレートを、室温で２時間にわたり、インキュベートした。インキュベーションの終了時に、溶液を吸引し、プレートを、乾燥剤と共に、フォイルパウチ内、−８０℃で保存した。
【０３６６】
アッセイの当日、０．１５〜６００ｎｇ／ｍＬの範囲の標準濃度の１６種のＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４を、陰性対照として緩衝液を含むカゼイン緩衝液での系列希釈により調製した。全ての研究試料を、手作業により、カゼイン緩衝液で１：５０に希釈し、次いで、Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ（Ｔｅｃａｎ；Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、合計５回の希釈で５倍に系列希釈した。プレートを、３００ｒｐｍで振とうしながら、室温で２時間にわたりインキュベートし、次いで、リン酸洗浄緩衝液（ウェル１つ当たり９０μＬ）で、３回にわたり洗浄した。ＨＲＰで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（ウェル１つ当たり３０μＬのカゼイン緩衝液中４００ｎｇ／ｍＬ）を、各プレートへと添加し、プレートを、３００ｒｐｍで振とうしながら、室温で１時間にわたりインキュベートした。プレートを、リン酸洗浄緩衝液（ウェル１つ当たり９０μＬ）で、３回にわたり洗浄し、次いで、ＫＰＬ  ＬｕｍｉＧＬＯ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加した（ウェル１つ当たり３０μＬ；型番５４−６１−００）。化学発光は、全ての波長において、５０ミリ秒間の積分時間で、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で、速やかに読み取った。血漿試料中のヒトＦｃ濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４についての検量線から内挿し、希釈係数を乗じ、ｎＭ濃度へと変換した。
【０３６７】
動物は、ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４のそれぞれのＩＶ投与の１時間後において、１２０７および１１１５ｎＭの平均Ｃｍａｘを呈示した。ＮＯＶ００２およびＮＯＶ００４は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、同等なＰＫプロファイルを呈示する（図６）。
【０３６８】
実施例１０：肥満カニクイザルにおける研究
肥満カニクイザルにおける、ＮＯＶ００２の、食物摂取量、体重、および血漿バイオマーカーに対する効果について研究した。
【０３６９】
プロトコール：
５匹の雄カニクイザルを、２回にわたり皮下（ｓ．ｃ．）処置し、用量を１ｍｇ／ｋｇとするＮＯＶ００２を、隔週（研究の０および７日目）投与し、食物摂取量、体重、および血漿バイオマーカーを、投与後１００日間を超える期間にわたり評価した。各投与のために、動物を、それらの飼育ケージ内で拘束し、血液試料を採取し、次いで、各動物に、１ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ００２の皮下投与を施した。食物摂取量の測定は、初回投与の１週間前に開始し、研究を通して継続した。研究用食餌は、給餌の前に秤量し、各日のための、２つの等量に分けた。翌朝、残った食餌を回収し、秤量した。受け皿に落ちたペレット（１ｇずつ）の数を数え、残った食物の重量に加えた。毎日の食物摂取量は、供給された食物の重量から、回収された食物の重量を差し引いた量として計算した。果物および野菜の摂取量は、測定しなかった。秤の動的特徴を使用して、空腹時体重を、毎週３回午前中に、二連で測定した（血液採取または投与の前に）。
【０３７０】
血漿ＮＯＶ００２濃度の測定
ＥＬＩＳＡベースのサンドイッチイムノアッセイを使用して、カニクイザル血漿中のヒトＦｃ  ＩｇＧを定量化した。ヒトＩｇＧに対するマウスモノクローナル抗体である、抗ヒトＩｇＧマウスＩｇＧ１を、捕捉抗体として使用した。Ｇｒｅｉｎｅｒの、白色３８４ウェルプレートを、２μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧマウスＩｇＧ１（ウェル１つ当たり３０μＬ）でコーティングし、室温（ＲＴ）で、一晩にわたりインキュベートした。コーティング抗体を吸引し、１×ミルクブロッカー（ＫＰＬ；５０−８２−０１）を、ウェル１つ当たり９０μＬで、室温で２時間にわたり添加した。ブロッキング溶液を吸引し、プレートを、プレートバッグ内、乾燥剤と共に、アッセイまで、−８０℃で保存した。アッセイの当日、プレートおよび試薬を、室温とした。基準物質は、精製されたＩｇＧを、緩衝液対照を含む、特注のカゼイン試料希釈液中、４０００〜１６ｐＭに希釈することにより作製した。試料を、基準物質と同じ希釈液中、１：５０、１：２５０、１：１２５０、および１：６２５０に、二連で希釈し、次いで、基準物質、希釈された試料、および対照を、プレートへと、室温で２時間にわたり添加した（全てのステップのための作業容量は、ウェル１つ当たり３０μＬとした）。次いで、プレートを、リン酸ベースの洗浄緩衝液で、３回にわたり洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された、抗ヒトＦｃ−ガンマ抗体を、プレートへと、室温で１時間にわたり添加し、次いで、プレートを、リン酸ベースの洗浄緩衝液で、３回にわたり洗浄した。化学発光基質を、プレートへと添加し、プレートを、発光プレートリーダー上で、速やかに読み取った。
【０３７１】
ＮＯＶ００２基準物質は、プレート１枚当たり三連でアッセイした。希釈された血漿試料は、二連でアッセイした。未知の試料は、ＩｇＧ検量線から内挿した。試料濃度の曲線への当てはめ、逆算、回収％、および内挿は、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．４．１を使用して実施した。ＩｇＧ基準物質により発生するシグナルは、４パラメータロジスティック曲線当てはめオプションを使用して、プロットし、当てはめた。血漿試料中のＦｃ濃度（ｐＭ）は、ＮＯＶ００２についての検量線から内挿し、希釈係数を乗じた。アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）は、３１．２５０ｐＭであり、定量上限（ＵＬＯＱ）は、４０００ｐＭであった。ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱは、１００回収％±２０％およびＣＶ＜２０％とするときの、標準濃度の上限および下限として規定し、次いで、希釈係数を乗じる。
【０３７２】
抗薬物抗体の検出
血漿試料を、ＬｏｗＣｒｏｓｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｏｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；型番１００  ５００）中で、１：５に希釈した。ＬｏｗＣｒｏｓｓ  Ｂｕｆｆｅｒ中に、０．６μｇ／ｍＬの、ビオチンで標識されたＮＯＶ００２と、０．６μｇ／ｍＬの、ジゴキシゲニンで標識されたＮＯＶ００２とを含有する反応混合物を調製した。希釈された血漿（８０μＬ）を、９６ウェルＵ字底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ；型番３５１１７７）内に１６０μＬの反応混合物と合わせた。プレートの縁をパラフィルムで密封し、プレートを、振とうプラットフォーム上、３７℃で２時間にわたりインキュベートした（光から保護して、１５０ｒｐｍで）。次いで、各混合物のアリコート（１００μＬ）を、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ；型番１１７３４７７６００１）の二連のウェルへと移し、これをまず、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０（ウェル１つ当たり３００μＬ）を含有する、１×ＰＢＳからなる洗浄緩衝液で、３回にわたり洗浄した。プレートを密封し、次いで、振とうプラットフォーム上、室温で１時間にわたりインキュベートした（光から保護して、３００ｒｐｍで）。プレートを、洗浄緩衝液（ウェル１つ当たり３００μＬ）で、３回にわたり洗浄し、次いで、ＬｏｗＣｒｏｓｓ  Ｂｕｆｆｅｒで１：２５００に希釈した、１００μＬの抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼ＿ＰＯＤ  Ｆａｂ断片（Ｒｏｃｈｅ；型番１１６３３７１６００１）を、各ウェルへと添加した。プレートを密封し、振とうプラットフォーム上、室温で４５分間にわたりインキュベートし（光から保護して、３００ｒｐｍで）、次いで、洗浄緩衝液（ウェル１つ当たり３００μＬ）で、３回にわたり洗浄した。ＴＭＢ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＴＸ；型番Ｅ１０２；ウェル１つ当たり１００μＬ）を、各ウェルへと添加し、光から保護して、青色を、９〜１０分間にわたり発色させた。０．１８ＮのＨ２ＳＯ４  １００μＬを、各ウェルへと添加することにより、発色反応を停止させ、プレートを短時間にわたり振とうし、黄色を、ＯＤ４５０で測定した。
【０３７３】
血漿グルコース濃度の測定
血漿グルコース濃度は、Ａｕｔｏｋｉｔ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｓｓａｙ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ；型番４３９−９０９０１）を使用して測定した。検量線は、較正剤を、５００、２００、１００、５０、２０、および０ｍｇ／ｄＬの基準物質へと希釈することにより作成した。アッセイ試薬（３００μＬ）を、３７℃まであらかじめ加熱し、透明平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番２６９６２０）中に２μＬの血漿、基準物質、および対照試料へと添加した。プレートを、プレートシェーカー上で３０秒間にわたり混合し、次いで、３７℃で５分間にわたりインキュベートした。２０秒間にわたる混合に続き、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳ  ３８４（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、５０５／６００ｎｍで、プレートを読み取った。試料中のグルコース濃度は、検量線と比較することにより計算した。
【０３７４】
血漿インスリン濃度の測定
血漿インスリン濃度は、製造元の指示書に従い、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＩＡ  Ｋｉｔ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ；型番ＨＩ−１４Ｋ）を使用して決定した。適切な量のアッセイ緩衝液、基準物質、または希釈血漿試料を、５ｍＬ、７５×１２ｍｍのＰＰ  ＳＡＲＳＴＥＤＴ試験管（型番５５．５２６）内の１２５Ｉ−インスリンおよび抗インスリン抗体と混合した。試験管をボルテックスし、覆いをし、室温で２０時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、４℃の沈殿試薬１ｍＬを添加し、試験管をボルテックスし、４℃で３０分間にわたりインキュベートした。全ての試験管を、３０分間にわたり（３０００ｒｐｍ  ４℃で）遠心分離し、上清をデカントし、ペレットを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＷＩＺＡＲＤ２  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（モデル番号２４７０；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上でカウントした。インスリン濃度は、既知量のインスリンを使用して作成した、検量線と比較することにより計算した。
【０３７５】
血漿トリグリセリド濃度の測定
血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度は、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＧＰＯ）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｅｔ（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｎｔｏｎ、ＭＩ、型番Ｔ７５３２−５００）を使用して測定した。あらかじめ加熱された、アッセイ試薬（３００μＬ、３７℃）を、透明平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ；型番２６９６２０）内の５μＬの血漿へと添加した。プレートを、プレートシェーカー上で３０秒間にわたり混合し、次いで、３７℃のインキュベーター内に、５分間にわたり静置した。２０秒間にわたる混合に続き、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳプレートリーダーを使用して、５００ｎｍにおける吸光度を測定した。ＴＧ濃度は、既知量のＴＧ基準物質（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番Ｔ７５３１−ＳＴＤ）を使用して作成した、検量線と比較することにより計算した。
【０３７６】
血漿コレステロール濃度の測定：
血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度は、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｌｉｑｕｉｄ）Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番Ｃ７５１０−５００）を使用して定量化した。あらかじめ加熱された、アッセイ試薬（２００μＬ、３７℃）を、透明平底９６ウェルアッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番２６９６２０）内の１０μＬの血漿へと添加した。プレートを、プレートシェーカー上で３０秒間にわたり混合し、次いで、３７℃で５分間にわたりインキュベートした。２０秒間にわたる混合に続き、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳプレートリーダーで、５００ｎｍにおける吸光度を測定した。コレステロール濃度は、既知量のコレステロール基準物質（Ｓｔａｎｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｏｅｒｎｅ、ＴＸ；型番１０１２−０３０）を使用して作成した、検量線と比較することにより計算した。
【０３７７】
血漿高密度リポタンパク質コレステロール濃度の測定
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度を決定するために、５０μＬの血漿試料を、０．５ｍＬのマイクロ遠心管内で、５０μＬのＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ；型番４３１〜５２５０１）と合わせ、短時間にわたりボルテックスした。遠心管を、室温で１０分間にわたり静置し、次いで、２０００×ｇ、４℃で、１０分間にわたり遠心分離した。遠心分離に続き、上清（元の血漿試料のうちのＨＤＬコレステロール部分を含有する）のうちの約半分を取り出し、１０μＬを、上記で記載したコレステロールアッセイのために使用した。
【０３７８】
血漿β−ヒドロキシ酪酸濃度の測定
血漿β−ヒドロキシ酪酸（β−ＨＢ）濃度は、β−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ＬｉｑｕｉＣｏｌｏｒ  Ｔｅｓｔキット（Ｓｔａｎｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；型番２４４０−０５８）を使用して測定した。アッセイ試薬Ｒ１（２１５μＬ、３７℃へとあらかじめ加熱した）を、透明平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番２６９６２０）内の２０μＬの品質管理試料または血漿試料へと添加した。プレートを、プレートシェーカー上で３０秒間にわたり混合し、次いで、３７℃のインキュベーター内に、５分間にわたり静置した。吸光度のプレリーディングは、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳプレートリーダー内、５０５ｎｍで測定した。アッセイ試薬Ｒ２（３５μＬ、３７℃へとあらかじめ加熱した）を、各ウェルへと添加し、プレートを、プレートシェーカー上で３０秒間にわたり再度混合し、３７℃で５分間にわたりインキュベートした。２０秒間にわたる混合に続き、最終的な吸光度を、５０５ｎｍで測定し、ここから、プレリーディングされた値を差し引いた。β−ＨＢ濃度は、既知量のβ−ＨＢ較正剤（Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ；型番４１２−７３７９１）を使用して作成した、較正曲線と比較することにより計算した。
【０３７９】
統計学的解析
統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０５；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して実施した。各動物についての食物摂取データは、ベースライン（−６〜０日目の平均として計算した）に対するパーセントとして標準化し、次いで、群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を計算し；ダンの多重比較事後検定を伴う、ノンパラメトリックのフリードマンの検定により、各日を、０日目と比較した。体重は、ベースライン（−７、−５、−３、および０日目の平均として計算した）に対するパーセントとして計算した、群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。生の体重データおよび血漿バイオマーカーデータもまた、ダンの多重比較事後検定を伴う、ノンパラメトリックのフリードマンの検定により解析した。Ｐ＜０．０５を、有意と考えた。
【０３８０】
結果
ＮＯＶ００２を投与する前に、動物を、既存の抗薬物抗体（ＡＤＡ）についてスクリーニングし、全てのサルは、ＡＤＡ陰性であることを見出した。ＮＯＶ００２が、肥満サルの食物摂取および体重（平均ベースライン体重＝１２．４±０．９ｋｇであり、これは、−６〜０日目の平均として計算した）を低減しうるのかどうかを決定するために、各動物に、研究の０および７日目において、隔週で、１ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ００２の皮下投与を、２回にわたり施した。ＮＯＶ００２は、食物摂取を、ベースラインと比較して有意に減少させ、ベースラインに照らした、約４４％への平均ピーク低減は、投与後３２日目に生じる。食物摂取は、投与後１８、２２、２４、２５、２６、２９、および３２日目において、ダンの事後検定を伴う、フリードマンの検定により、０日目と対比して、有意に低かった。５匹のサル全てが、食物摂取量の明確な減少を呈示したが、食物摂取の低減の大きさおよび持続時間は、群間で可変的であった。
【０３８１】
体重もまた、研究を通して測定し、投与後６７日目において、ピーク平均体重の−８．９％の変化を観察した。体重は、投与後３７〜７０日目において、ダンの事後検定を伴う、フリードマンの検定により、０日目と対比して、有意に低かった。食物摂取に対する効果と同様に、１ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ００２による処置後、体重変化の程度および持続期間のばらつきも観察されたが、これは、個々の動物の食物摂取応答と符合した：食物摂取の低減が最大であるサルは、研究期間中における体重の減少は最も大きかった。
【０３８２】
ＮＯＶ００２の、食物摂取および体重に対する効果の査定に加えて、脂質および炭水化物の代謝についての血漿バイオマーカーに対する効果についても調べた。ＮＯＶ００２は、投与後３２日目において、血漿ＴＧ濃度および血漿ＴＣ濃度の両方を、ベースライン（−７、-３、および０日目の平均；ダンの事後検定を伴う、フリードマンの検定）に対する有意差を伴って減少させた。表３は、３２日目におけるベースラインに対する全ての血漿バイオマーカー変化についてまとめる。ベースラインと比較して、ＮＯＶ００２は、研究期間中のいかなる時点においても、血漿高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度、血漿β−ヒドロキシ酪酸（β−ＨＢ）濃度、血漿グルコース濃度、または血漿インスリン濃度を有意に変化させなかったが、ＮＯＶ００２は、血漿アジポネクチンレベルを、投与後３５日目において、有意に上昇させた。
【０３８３】
【表３】
2018526988.tif 000025
【０３８４】
また、研究を通して、多様な時点（例えば、１、２、３、４、７日目（投与前および投与の６時間後）、１１〜８１日目における毎週２回、およびその後における毎週１回）において、ＡＤＡ形成についても調べた。スクリーニング前には、いずれのサルも、ＮＯＶ００２  ＡＤＡを提示しなかったが、３匹の動物は、研究期間中に、ＮＯＶ００２に対するＡＤＡを発症した。ＮＯＶ００２  ＰＫプロファイルは、ＡＤＡ陽性動物と、ＡＤＡ陰性動物との間で異ならないと考えられた。
【０３８５】
ＮＯＶ００２は、肥満カニクイザルにおける食物摂取および体重を、効果的に低下させた。２回にわたる１ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ００２の皮下投与により処置された動物では、投与後６７日目における、８．９％のピーク体重の低減が観察されたが、食物摂取および体重の低減は、個々の動物の間で変動した。体重の減少は、血漿ＴＧ濃度および血漿ＴＣ濃度の低減を伴ったことから、ＮＯＶ００２の、血漿脂質プロファイルに対する有益な効果が示される。これらのデータは、ＮＯＶ００２が、食物摂取、体重、ならびに血漿ＴＧ濃度および血漿ＴＣ濃度の低減に効果的であることを指し示すことから、ＮＯＶ００２のほか、ＮＯＶ００４など、その変異体、ＮＯＶ００２またはＮＯＶ００４のＣＤＲを含む他の抗β−ｋｌｏｔｈｏ抗体、およびＮＯＶ００２（例えば、表２に示される保護ペプチドのうちの１つまたは複数に結合する抗体）と同じエピトープに結合するか、またはＮＯＶ００２と競合する、他の抗β−ｋｌｏｔｈｏ抗体であれば、肥満などの代謝障害のための新たな治療に効果的であることを示唆する。
【０３８６】
参照による組込み
本明細書で引用される全ての参考文献であって、特許、特許出願、論文、教科書などを含む参考文献、およびそれらにおいて引用された参考文献は、それらについて既に言及した程度において（to the extent that they are not already）、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０３８７】
同等物
前出の明細書は、当業者が、本発明を実施することを可能とするのに十分であると考えられる。前出の記載および実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態について詳述し、本発明者らにより企図される最良の方式について記載する。しかし、前出の記載および実施例が、本文中でいかに詳述されているように見えるとしても、本発明は、多くの様式で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の同等物に従うとみなされるべきであることが察知されるであろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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