(57)【要約】  セルロースを効率的に生産する組成物は、ホヤ綱の被嚢類又は被嚢類セルロース合成酵素を発現する酵母に由来する細胞抽出物、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくとも１つの二価カチオン、セロビオース並びにＵＤＰ−グルコースを含む。この組成物は、６．６〜７．２の範囲のｐＨを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースを生産するための組成物であって、
ホヤ又はオタマボヤ綱の被嚢類に由来する細胞抽出物、
カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくとも１つの二価カチオン、
セロビオース並びに
ＵＤＰ−グルコース
を含む組成物であって、６．６〜７．２の範囲のｐＨを有する組成物。
【請求項２】
細胞抽出物が、Ciona intestinalisに由来する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
細胞抽出物が、Ciona intestinalisの尾芽期胚に由来する、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
セルロースを生産するための組成物であって、
セルロース産生に関与するタンパク質をコードする導入遺伝子を発現し得る形質転換酵母に由来するものであってもよい細胞抽出物、
カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくとも１つの二価カチオン、
セロビオース並びに
ＵＤＰ−グルコース
を含む組成物であって、６．６〜７．２の範囲のｐＨを有する組成物。
【請求項５】
細胞抽出物が、配列番号２のタンパク質を発現し得る形質転換酵母に由来するものであってもよい、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
二価カチオンの濃度が、２〜８mMの範囲である、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
組成物のｐＨが、ＭＯＰＳによって緩衝されている、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
組成物のｐＨが、６．８である、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
組成物が、安定化剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
被嚢類が、セルロース産生に関与するタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する、請求項１〜９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
セルロースを生産するための方法であって、
請求項１〜１０のいずれか一項記載の組成物を調製すること、
組成物をインキュベートすること、及び
組成物からセルロースを精製すること
を含む方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法によって調製されたセルロース。
【請求項１３】
下記ＩＲスペクトルを示すセルロース：
【化１】
2018517404.tif 000004
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースを生産するための組成物及び方法、具体的には、ホヤ綱の被嚢類又は被嚢類セルロース合成酵素を発現する酵母に由来する細胞抽出物を用いて、セルロースを生産するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
導入部
セルロースは、地球上で最も豊富に存在する材料の１つであり、最も一般的な有機高分子である。セルロースは、β（１−４）結合Ｄ−グルコースの直鎖からなる。セルロースは、その有用性に寄与する独自の結晶構造を有する。セルロースの結晶構造を操作することにより、セルロースに基づく多くの新しい生分解性材料を開発することができると期待されている。しかしながら、その結晶構造を備えたセルロースの人工合成は成功していない。植物及び細菌はセルロースを産生するが、カロース、即ち、β（１−３）結合Ｄ−グルコースを合成する酵素も有しており、セルロース及びカロースを合成する酵素が分離されると、結晶セルロースを生産するために分子機構を再構築することは不可能である。よって、効率的に、即ち、カロースを生産することなく、セルロースを生産するための新しい技術を開発する必要がある。
【０００３】
被嚢類は、カロースを産生することなく結晶セルロースを産生する唯一の既知の動物である（Nakashima, K. et al., Dev. Genes Evol., 214: 81-88 (2004), Nakashima, K. et al., Cell. Mol. Life Sci., 68: 1623-1631 (2011)）。本願発明者らは、ホヤ綱の被嚢類又は被嚢類セルロース合成酵素を発現する酵母に由来する細胞抽出物を用いて、セルロースを生産するための技術の開発に成功した。
【０００４】
［発明の要約］
本発明の１つの態様は、セルロースを生産するための組成物であって、ホヤ（Ascidian）又はオタマボヤ（Appendicularian）綱の被嚢類に由来する細胞抽出物、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくとも１つの二価カチオン、セロビオース並びにＵＤＰ−グルコースを含む組成物であって、６．６〜７．２の範囲のｐＨを有する組成物を提供する。
【０００５】
セルロースを生産するための組成物において、二価カチオンの濃度は、２〜８mMの範囲であってもよい。
【０００６】
セルロースを生産するための組成物において、細胞抽出物は、Ciona intestinalisに由来するものであってもよい。
【０００７】
セルロースを生産するための組成物において、細胞抽出物は、Ciona intestinalisの尾芽期胚に由来するものであってもよい。
【０００８】
セルロースを生産するための組成物において、組成物のｐＨは、ＭＯＰＳによって緩衝されてもよい。
【０００９】
セルロースを生産するための組成物において、組成物のｐＨは６．８であってもよい。
【００１０】
セルロースを生産するための組成物は、安定化剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤を更に含んでもよい。
【００１１】
セルロースを生産するための組成物において、被嚢類は、セルロース産生に関与するタンパク質をコードする導入遺伝子を発現してもよい。
【００１２】
セルロースを生産するための組成物において、ホヤ又はオタマボヤ綱の被嚢類に由来する細胞抽出物の代わりに、セルロース産生に関与するタンパク質をコードする導入遺伝子を発現し得る形質転換酵母に由来する細胞抽出物を用いることができる。
【００１３】
本発明の１つの態様は、セルロースを生産するための組成物であって、セルロース産生に関与するタンパク質をコードする導入遺伝子を発現し得る形質転換酵母に由来する細胞抽出物、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくとも１つの二価カチオン、セロビオース並びにＵＤＰ−グルコースを含む組成物であって、６．６〜７．２の範囲のｐＨを有する組成物を提供する。
【００１４】
セルロースを生産するための組成物において、細胞抽出物は、被嚢類のセルロース合成酵素をコードする導入遺伝子を発現し得る形質転換酵母に由来するものであってもよい。
【００１５】
セルロースを生産するための組成物において、細胞抽出物は、セルロース産生に関与するタンパク質を含有していてもよい形質転換酵母に由来するものであってもよい。
【００１６】
セルロースを生産するための組成物において、セルロース産生に関与するタンパク質は、セルロース産生に関与するタンパク質をコードする導入遺伝子に由来する組換えタンパク質であってもよい。
【００１７】
セルロースを生産するための組成物において、組換えタンパク質は、被嚢類のセルロース合成酵素であってもよい。
【００１８】
セルロースを生産するための組成物において、細胞抽出物は、配列番号２のタンパク質を発現し得る形質転換酵母に由来するものであってもよい。
【００１９】
本発明の別の態様は、セルロース産生に関与するタンパク質をコードする導入遺伝子を発現し得る形質転換酵母を提供する。
【００２０】
本発明の別の態様は、セルロース産生に関与するタンパク質をコードする導入遺伝子を提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、セルロースを生産するための方法を提供する。この方法は、セルロースを生産するための組成物を調製すること、組成物をインキュベートすること、及び組成物からセルロースを精製することを含む。
【００２２】
本発明の別の態様は、本出願のセルロースを生産するための方法により調製されるセルロースを提供する。
【００２３】
本発明の別の態様は、図２−Ａに示されるＩＲスペクトルを示すセルロースを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の方法によって合成された（図１−Ａ）か、又はCiona intestinalis組織から精製された（図１−Ｂ）セルロースのネガティブ染色されたＴＥＭ画像を示す。図１−Ａの挿入図は、直径１μmの標本の領域の電子回折パターンを示す。
【図２】図２は、本出願の方法によって調製されたセルロース（図２−Ａ）及びAvicel（図２−Ｂ）のＩＲスペクトルを示す。
【００２５】
[実施態様の説明]
適宜、図面を参照して、本開示の様々な実施態様を詳細に説明する。様々な実施態様への言及は、本開示の範囲を限定するものではなく、それは添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。更には、本明細書に記載された例は、限定することを意図するものではなく、特許請求される発明の多くの可能な実施態様のうちの幾つかを単に述べるものである。
【００２６】
本出願の至るところで、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物は、本出願が関連する最新技術をより完全に説明するために、その全体が引用例として本出願に取り込まれる。開示される引用例はまた、引用例に依存する文章で論じられている、これらに含まれる材料について、個別にかつ具体的に引用例として本明細書に取り込まれる。
【００２７】
特に断りない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される、特定の物理的性質に関する成分の重量パーセント、寸法、及び値を表すものなどの全ての数は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものと理解されるべきである。本明細書及び特許請求の範囲で使用される特定の数値は、本発明の追加の実施態様を形成することも理解されるべきである。実施例に開示されている数値の正確さを確保するために努力が払われている。しかしながら、測定された数値はいずれも、それぞれの測定手法に見られる標準偏差から生じる若干の誤差を本質的に含む可能性がある。
【００２８】
本明細書に使用されるとき、不定冠詞の「a」又は「an」は、「少なくとも１つ」を意味し、明示的にこれと反対の指示がない限り、「１つだけ」に限定されるべきではない。よって、例えば、「二価カチオン（a divalent cation）」への言及は、文脈上他に明白に示されない限り、１つ、２つ又はそれ以上の二価カチオンを有する実施態様を含む。
【００２９】
本明細書に使用されるとき、「セルロースを生産する」という用語は、非晶質であっても、又はセルロースＩ（又はその結晶相、三斜晶系Ｉα及び単斜晶系Ｉβ同質異形）、セルロースII、セルロースIII及びセルロースIVの少なくとも１つの結晶構造を形成してもよい、β（１−４）結合Ｄ−グルコースの直鎖の生産を意味する（Nishiyama, Y., J. Wood Sci., 55: 241-249 (2009), Moon, R. J. et al., Chem. Soc. Rev., 40: 3941-3994 (2011)）。
【００３０】
「細胞抽出物」という用語は、細胞の細胞膜及び核膜を破壊することによって調製されるホモジネート、又はホモジネートの可溶性成分から、限定されるものではないが、超遠心分離などの手順で分離されたミクロソーム画分を意味する。本発明の細胞抽出物は、本明細書中に開示されるように調製され得る。しかし、例えば、パール細胞破砕器の代わりにフレンチプレスという、代替手段を採用することができる。細胞抽出物の調製中に、限定されるものではないが、０．５〜１０mM ＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡ、又は１〜１０％ グリセロールなどの安定化剤を、セルロースを合成する活性を有するホモジネート又はミクロソーム画分を含む溶液に補足することができる。細胞抽出物の調製及びセルロースを生産するための反応の間に、１〜１０％ グリセロールのような安定化剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤（限定されるものではないが、ＰＭＳＦ、ロイペプチン及びＮ−α−ｐ−トシル−Ｌ−Ｌｙｓクロロメチルケトンなど）を、細胞抽出物及び／又は反応混合物に補足することができる。細胞抽出物の調製及びセルロースを生産するための反応の間に、限定されるものではないが、Brij（商標）35、52、58、93、C10、O20及びS100、並びにTriton（商標）X-100などの穏やかな洗浄剤を補足することができる。また、細胞抽出物の調製及びセルロースを生産するための反応の間に、水溶液は、限定されるものではないが、Tris、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳなどの緩衝剤、そして特にＭＯＰＳによって、ｐＨ６．６〜７．２の範囲に、特に６．８に緩衝される。特に明記しない限り、本発明に使用するための水溶液は、当業者に公知の純水又は超純水に基づく。
【００３１】
「被嚢類」という用語は、本明細書に使用されるとき、その天然のゲノム中にセルロース合成酵素をコードする遺伝子を有する任意の被嚢類の種の動物、特にホヤ（Ascidian）又はオタマボヤ（Appendicularian）綱の種：限定されるものではないが、Ciona intestinalis、Ciona savignyi、及びCiona属の他の種；Molgula tectiformis、及びMolgula属の他の種；Halocynthia roretzi及びHalocynthia属の他の種のようなホヤ；並びに限定されるものではないが、Oikopleura dioica、Oikopleura longicauda、及びOikopleura属の他の種のようなオタマボヤ、特にCiona intestinalis及びOikopleura dioicaのような遺伝子研究のための実験室で使用される動物のことをいう。
【００３２】
上記の特定の種は、Ciona intestinalisのCiCesAタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：NP_001041448.1、本出願に添付された配列表の配列番号１に指定される）に対して６５％以上のアミノ酸配列同一性を持つ１つ又は２つのセルロース合成酵素タンパク質を有することが知られているため、本発明のセルロースを生産するための組成物及び方法は、上記のホヤ及びオタマボヤ綱の被嚢類のいずれかに由来する細胞抽出物を取り扱う。Nakashima, K.ら（2004）によると、セルロース合成酵素CiCesAは、表皮細胞で発現される。Nakamura, M.J.ら（Dev. Biol. 372: 274 - 284 (2012)）によると、Ciona intestinalisの尾芽期胚では表皮細胞が全細胞の約半分を構成するため、尾芽期胚は、本発明の組成物及び方法に利用される細胞抽出物を調製するための良好な生物学的材料になり得る。しかし、本発明の組成物及び方法は、任意の段階の全胚から、又はホヤ若しくはオタマボヤ起源の任意の特定の表皮細胞から調製された抽出物を取り扱うこともあろう。
【００３３】
上記の特定の種は、Oikopleura dioicaのOd-CesA1タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：[AB543594]、本出願に添付された配列表の配列番号２に指定される）に対して６５％以上のアミノ酸配列同一性を持つ１つ又は２つのセルロース合成酵素タンパク質を有することが知られている。
【００３４】
「セルロース産生に関与するタンパク質をコードする導入遺伝子」という用語は、限定されるものではないが、タンパク質を永続的又は一時的に発現させるための、被嚢類の生殖細胞系若しくは体細胞への、又は酵母へのＤＮＡのマイクロインジェクション法のような遺伝子導入技術によって、外来遺伝子を被嚢類又は酵母で発現させるように設計された外来遺伝子又は遺伝子構築物を意味する。外来遺伝子は、同じ種に由来するか、若しくは異なる被嚢類の種のような異なる種に由来するタンパク質、又は植物若しくは細菌界に由来するタンパク質をコードしてもよい。
【００３５】
レシピエント被嚢類は、セルロース産生に関与する全てのタンパク質を発現する野生型であっても、あるいはSasakura, Y.ら（Proc. Natl. Acad. Sci., 42: 15134 - 15139 (2005)）によって報告されたように、トランスポゾン介在性の挿入突然変異及びオリゴヌクレオチド誘発によるタンパク質発現阻害のような、誘発突然変異のために、セルロースを全く産生しないか、又は野生型動物と比較して実質的に減少した量のセルロースを産生する被嚢類であってもよい。
【００３６】
酵母は、特に限定されないが、子嚢菌門（Ascomycetous）の酵母に属していれば、宿主として用いられる。中でも、好ましくはこれらはサッカロミセス科（Saccharomycetaceae）に属し、より好ましくはサッカロミセス属（Saccharomyces）に属する。
【００３７】
「発現ベクター」という用語は、プラスミドベクターを意味するか、又はこれは人工染色体であってよい。発現ベクターは、「セルロース産生に関与するタンパク質をコードする導入遺伝子」を含む。酵母が宿主として使用される場合、プラスミドの形態が好ましい。
【００３８】
「形質転換酵母」という用語は、宿主となる酵母にポリヌクレオチド又は発現ベクターを導入することにより調製することができる。 「導入する」には、ポリヌクレオチド又は発現ベクターの導入だけでなく、宿主細胞に導入される遺伝子発現も含まれる。形質転換法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。形質転換法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気穿孔法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、トランスフェクション法及びマイクロインジェクション法が含まれる。形質転換酵母は、酵母選択マーカーの使用のような従来の方法によって選択することができる。
【００３９】
「セルロース産生に関与するタンパク質」という用語は、セルロース産生に関与する、被嚢類、植物又は細菌由来の任意のタンパク質であって、セルロース合成酵素、並びに天然セルロースの結晶相の少なくとも１つ：三斜晶Ｉα及び単斜晶Ｉβの同質異形を持つセルロースを産生する分子機構に関与するタンパク質などのタンパク質を意味する。
【００４０】
被嚢類セルロースの化学的精製は、当業者に公知の任意の実験プロトコール、例えば、Nakashima, K.ら（Marine Genomics, 1: 9-14. (2008)）により行うことができる。即ち、被嚢全体を被嚢類標本から取り出すことができる。試料は、高ｐＨで、例えば水酸化カリウムにより処理することができる。酸で中和した後、低ｐＨに緩衝されたＮａＣｌＯ２などの化学物質で、試料を漂白することができる。試料が白色になるまで、これらの工程を繰り返すことができる。蒸留水で洗浄後、試料を酢酸／硝酸水溶液（Updegraff, Anal. Biochem. 32: 420-424 (1969)）で処理し、蒸留水で洗浄して、凍結乾燥することにより、化学的に精製されたセルロースが生成する。全胚（受精後１２時間（hours post fertilization）（hpf））又は幼生（１８hpf）の標本も同様に処理することができる。
【００４１】
１４Ｃ標識セルロースの定量又はその放射活性の測定は、当業者に公知の任意の実験プロトコール、例えば、Lai-Kee-Him, J.ら（J. Biol. Chem., 277: 36931 - 36939. (2002)）により行うことができる。即ち、１４Ｃ標識ＵＤＰ−グルコースを基質として用いてインビトロで合成されたセルロースは、ガラス繊維フィルターでの濾過により回収することができる。ガラス繊維フィルターを洗浄し、乾燥させることができる。放射活性は、シンチレーションカウンターを用いて、液体シンチレーション混合物中で測定することができる。
【００４２】
本発明により合成されたセルロース又は被嚢類組織から精製されたセルロースなどのセルロース標本のＴＥＭ及び電子回折分析は、当業者に公知の任意の実験プロトコール、例えば、Lai-Kee-Him, J.ら（2002）により行うことができる。即ち、電子顕微鏡を用いてＴＥＭ観察を達成できる。標本は酢酸ウラニルでネガティブ染色されるか、又は染色されていないと認められるかのいずれかである。低線量の電子回折パターンは、直径１μmの選択された円形領域を用いて、染色されていない標本上で液体窒素温度で記録することができる。パターンは金の標準で較正することができる。クエンチ凍結装置を用いて低温ＴＥＭ標本を調製することができる。インビトロ合成の前後に、界面活性剤抽出物数滴を、グリッドによって支持されたレース状炭素膜上に付着させることができる。余分な液体を濾紙で吸い取った後直ちに、液体窒素で冷却した液体エタン中にグリッドを入れることができる。余分なエタンは濾紙で吸い取り、グリッドをクリオホルダーに載せて顕微鏡に移し、１〜３μmのアンダーフォーカスを用いて×１１，５００のような高倍率で観察することができる。
【００４３】
本発明によって合成されたセルロースのＸ線回折法による解析は、当業者に公知の任意の実験プロトコール、例えば、Nakashima, K.ら（2008）により行うことができる。即ち、セルロースを手で押して平らにすることができる。Ｘ線回折法は、Ｃｕ−Ｋα線（λ＝０．１５４１８nm）を有するＸ線回折計で実行することができる。光学スリット系を使用することができる。走査は、当業者に公知の散乱角、走査ステップ、及び走査速度で実行することができる。ピークの分離はソフトウェアで実行することができる。回折角は、フッ化ナトリウムのような標準化合物で較正することができる。結晶の同質異形を識別するためのＺ値は、Wada, M.ら（J. Wood Sci. 47: 124-128 (2001)）によるｄ−格子面間隔から計算することができる。配向のパラメーター、Ｒ２及びＲ３は、Koyama, M.ら（Cellulose 4: 147-160 (1997)）によるピークの積分強度から計算することができる。
【００４４】
減衰全反射ＦＴＩＲは、ＦＴＩＲシステムで実行することができる。セルロースはダイヤモンド反射体に押し付けられ、そして干渉図は反射モードで収集され、合算されて信号対雑音比を改善することができる。
【００４５】
本明細書中に使用されるとき、「配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する」という句は、本発明のプライマーが、特定の配列識別子に関連する特定のポリペプチド配列に対して、６５％以上、例えば、６５、７０、７５、８０、８５，９０、９５、９７、９９％以上、又は１００％の配列同一性を有することを意味する。配列同一性は、以下に記載されるように比較すべき２つの配列を整列させ、整列した部分における同一のアミノ酸残基の数を求め、その数を本発明の（照会された）配列中のアミノ酸残基の総数で割り、その結果に１００を掛けることにより決定される。複数ポリペプチド配列を整列させることができ、特定領域内の同一残基の割合は、公的に利用可能なコンピュータアルゴリズムを用いて別のポリペプチドに対して決定することができる。ポリヌクレオチド配列を整列させ、その類似性を同定するための２つの例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＰ及びＦＡＳＴＡアルゴリズムである。コンピュータアルゴリズムＢＬＡＳＴＰ及びＦＡＳＴＡは、米国のＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）などのインターネット上で入手可能である。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用は、Altschulらの刊行物（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されている。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用は、PearsonとLipman（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448, 1988）及びPearson（Methods in Enzymol. 183: 63-98, 1990）に記載されている。
【実施例１】
【００４６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって更に説明される。
【００４７】
被嚢類胚の収集
Ciona intestinalisの成体を解剖して、卵子及び精管からの精子を得た。人工授精後、人工海水で被嚢類胚を洗浄することにより、２細胞期で余剰精子を除去し、１８℃の人工海水中でインキュベートした。胚は、尾芽後期に遠沈により収集した。
【００４８】
被嚢類セルロースの化学精製
被嚢全体をCiona intestinalisの成体標本から外科的に取り出した。試料を６０℃で一晩乾燥させる前後に秤量し、次いで５％（w/v）水酸化カリウムで３７℃で一晩処理した。室温で６時間１％（v/v）酢酸で中和した後、試料を８０℃で２時間、５０mM 酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ４．９に緩衝した０．３５％ ＮａＣｌＯ２で漂白した。試料が白色になるまでこれらの工程を繰り返した。蒸留水で３回洗浄した後、試料を７３％（v/v）酢酸／９％（v/v）硝酸水溶液で９５℃で３０分間処理し（Updegraff, 1969）、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥することにより、化学的に精製されたセルロースが生成する。全胚（受精後１２時間（hpf））又は幼生（１８hpf）の標本を同様の方法で、それぞれ１、１０及び１００個体の群にして処理した。
【００４９】
被嚢類細胞抽出物の調製
収集した胚を洗浄緩衝液Ｉ（１００mM ＭＯＰＳ（ｐｈ７．０）、２mM ＥＤＴＡ及び２mM ＥＧＴＡ）で２回洗浄した。胚は、パール細胞破砕器での２回の均質化に付した。ホモジネートの上清は、遠心分離（５，０００×ｇ、１０分間、４℃）と、これに続くミラクロスフィルター（Millipore、Millipore、Merck Ltd.）での超遠心チューブへの濾過によって分離した。超遠心分離（１００，０００×ｇ、６０分間、４℃）後、ペレットを集め、洗浄緩衝液II（１００mM ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、２mM ＥＤＴＡ、２mM ＥＧＴＡ及び１０％（w/v）グリセロール）１mLに懸濁した。被嚢類胚抽出物のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce、Life Technologies Corporation）により測定した。被嚢類胚抽出物を洗浄緩衝液IIで６〜８mg/mLに希釈して、その後の反応に使用した。
【００５０】
反応混合物の調製
基質緩衝液（以下を参照のこと）５００マイクロリットルを、最初に２０mM ＵＤＰ−グルコース（放射性標識実験のために１４Ｃ標識ＵＤＰ−グルコースを含むことができる）５０マイクロリットルと、次に純水 ２００マイクロリットルと、そして最後に上記の被嚢類細胞抽出物 ２５０マイクロリットルと順次混合することにより、セルロース合成のための反応混合物を調製した。セルロース合成のために、反応混合物を室温で２４時間インキュベートした。
【００５１】
反応条件の最適化（１）：ｐＨ
６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、及び７．６に調整されたＭＯＰＳのｐＨで、洗浄緩衝液II及びｐＨを最適化するための基質緩衝液（５０mM ＭＯＰＳ、４０mM セロビオース、４mM ＣａＣｌ２及び４mM ＭｇＣｌ２）を調製した。
【００５２】
反応条件の最適化（２）：二価カチオン濃度
５０mM ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、４０mM セロビオース、及び２、４又は８mMのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２及び／又はＭｎＣｌ２の組合せを用いて、二価カチオン濃度を最適化するための基質緩衝液を調製した。
【００５３】
反応生成物の精製
反応終了後、反応混合物を遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、２０℃）することにより上清を除去して、合成されたセルロースを含む沈殿物を２％ ＳＤＳ １．５mLと混合し、１００℃で１時間インキュベートした。ＳＤＳ混合物を遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、２０℃）することにより上清を除去して、沈殿物を２％ ＮａＯＨ １．５mLと混合し、１００℃で７５分間インキュベートした。ＮａＯＨ混合物を遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、２０℃）することにより上清を除去した。チューブを数回反転させて沈殿物を純水 １．５mLと混合した。上清を除去するための遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、２０℃）と、合成されたセルロースを含む沈殿物と新鮮な純水との混合とを含む、合成されたセルロースを水で洗浄する工程を更に５回繰り返した。水洗工程を繰り返した後、合成されたセルロースを後述の分析に付した。
【００５４】
１４Ｃ標識セルロースの定量
１４Ｃ標識ＵＤＰ−グルコースを含む反応混合物で合成されたセルロースを、ガラス繊維フィルターでの濾過によって回収した。ガラス繊維フィルターを洗浄し、乾燥させた。シンチレーションカウンターを用いて液体シンチレーション混合物中で放射活性を測定した。
【００５５】
ＴＥＭ及び電子回折分析
ＴＥＭ観察及び電子回折分析は、イメージング用の電子顕微鏡及び電子回折のための２００kVを用いて達成することができる。本発明により合成されたか、又はCiona intestinalis組織から精製されたセルロースのようなセルロース標本は、酢酸ウラニルでネガティブ染色されたか、又は染色されていないと認められたかのいずれかである。低線量の電子回折パターンを、直径１μmの選択された円形領域を用いて、染色されていない標本上で液体窒素温度で記録した。
【００５６】
フーリエ変換赤外分光分析
減衰全反射ＦＴＩＲは、Spectrum One ＦＴＩＲシステム（Perkin Elmer）で実行された。本発明により合成されたか、又はCiona intestinalis組織から精製されたセルロースを、フォースゲージ ５０でダイヤモンド反射体に押し付け、干渉図（４０００〜４００cm−１）を２cm−１の分解能で反射モードで収集して、合算することにより信号対雑音比を改善した。
【００５７】
結果
以下の表１は、反応混合物のｐＨを最適化するための実験の結果を要約する。
【００５８】
【表１】
2018517404.tif 000002
【００５９】
表１は、示されたｐＨで合成されたセルロースに組み込まれた放射活性の測定値と、各ｐＨにおける測定値を最高放射活性のｐＨであるｐＨ６．８の測定値で除して得られる百分率値とを示す。表１は、ｐＨ６．６からｐＨ７．２の範囲にわたって高い合成活性が観測され、ｐＨ６．８で最高合成活性が観測されたことを示す。
【００６０】
以下の表２は、反応混合物の二価カチオン濃度を最適化するための実験の結果を示す。
【００６１】
【表２】
2018517404.tif 000003
【００６２】
表２は、各二価カチオン濃度で合成されたセルロースに組み込まれた放射活性の測定値と、各濃度の測定値を最高放射活性の濃度である４mM Ｃａ２＋、４mM Ｍｇ２＋及び０mM Ｍｎ２＋の測定値で除して得られる百分率値とを示す。表２は、Ｃａ２＋又はＭｇ２＋のいずれかが２〜８mMの条件で高い合成活性が観測され、４mM Ｃａ２＋、４mM Ｍｇ２＋及び０mM Ｍｎ２＋の濃度で最高合成活性が観測されたことを示す。Ｍｎ２＋は、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋の非存在下でのセルロース合成を促進した。Ｍｎ２＋の効果は２mMでは顕著であるが、４mM以上の濃度ではあまり目立たない。Ｍｎ２＋は、Ｃａ２＋及び／又はＭｇ２＋の存在下でのセルロース合成に対して阻害効果を有する。
【００６３】
これらの結果から、Ciona intestinalis胚から抽出した無細胞系におけるセルロース合成の好ましい条件は、ｐＨ６．８、Ｍｎ２＋を含まない４mM Ｃａ２＋及び４mM Ｍｇ２＋であると結論される。
【００６４】
図１は、合成セルロース（図１−Ａ）又はCiona intestinalis組織から精製されたセルロース（図１−Ｂ）のネガティブ染色ＴＥＭ画像を示す。図１−Ａの挿入図は、直径１μmの合成されたセルロースの領域の電子回折パターンを示す。格子面（１１０）、（０２０）及び（２２０）のｄ−格子面間隔値は、それぞれ０．４４８nm（ｎ＝１１）、０．４０８nm（ｎ＝１１）及び０．２２２nm（ｎ＝３）であった。これらの結果は、上記例で合成されたセルロースが、セルロースII構造（逆平行鎖）であり、天然セルロースの構造であるセルロースＩ（全て平行鎖）ではないことを示唆した。
【実施例２】
【００６５】
１．発現ベクターの構築
Oikopleura dioicaに由来するセルロース合成酵素であるOd-CesA1の完全長コード領域（本出願に添付された配列表の配列番号２）を、プライマー対のOdF及びOdRを用いてｃＤＮＡ鋳型からＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。増幅された断片を、In-Fusionクローニングを用いて分泌発現のための完全長のα因子を置換することにより、pGAPZα発現ベクター（Life Technologies）中にクローン化した。得られたプラスミドをOd1pGZと命名した。
【００６６】
２．酵母Pichia pastorisを宿主として用いる組換えタンパク質の発現
Od1pGZを、AvrII制限酵素で処理して、酵母Pichia pastorisを酢酸リチウム法で形質転換するために使用した。形質転換されたPichia pastorisを、Zeocin（１００μg/ml）を含むＹＰＤ培地（１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、２％ グルコース）５mL中で３０℃、２００rpmで２４時間培養（前培養）し、次にこれをＹＰＤ培地 ３００mL中に接種して、３０℃、２００rpmで２４時間培養（本培養）した。
【００６７】
３．組換えタンパク質を用いるセルロースの試験管合成
酵母細胞を遠心分離（４℃、１，０００×ｇ、３分間）により回収し、細胞破壊用培地（５０mM リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５％ グリセロール、１mM ＥＤＴＡ）に懸濁し、次いでこれらをLV1 Microfluidizer（Microfluidics）を使用して３０，０００psiで３回の処理に付すことにより破壊した。ホモジネートを遠心分離（４℃、１，０００×ｇ、３分間）して、回収した上清を超遠心分離（４℃、１００，０００×ｇ、６０分間）することにより、沈降ペレットとしてミクロソーム画分を得た。ミクロソーム画分を溶液（７５mM ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、２．５％ グリセロール、２０mM セロビオース、１mM ＵＤＰ−グルコース、８mM ＭｇＣｌ２、０．５mM ＥＤＴＡ、０．５mM ＥＧＴＡ）に懸濁し、２４℃で１２時間反応させた。
【００６８】
４．合成生成物の回収及び分析
ＳＤＳを反応混合物に最終濃度２％となるように加え、５０℃で２４時間脱脂に付した。反応混合物を遠心分離（２８℃、２０，０００×ｇ、２０分間）に付して、不溶性画分を沈殿物として回収した。沈殿物をプロテアーゼ処理（プロテイナーゼＫ（２０μg/ 1mL リン酸緩衝生理食塩水中での濃度）、１％ ＳＤＳ、５０℃、４８時間）に付し、次に再び遠心分離することにより沈殿物を回収した（２８℃、１６，０００×ｇ、２０分間）。沈殿物をアルカリ処理（２％ 水酸化カリウム、２４℃、２４時間）に付し、続いて遠心分離することにより沈殿物を回収した（３０℃、１６，０００×ｇ、２０分間）。得られた沈殿物を酢酸（７２％）と硝酸（１２％）の混合溶液に懸濁して、１００℃で３０分間処理した後、等量の水で希釈して、次に遠心分離（１５℃、１６，０００×ｇ、２０分間）することにより沈殿物を回収した。回収した沈殿物を水で数回洗浄して、次に水に懸濁することにより合成生成物を得た。
【００６９】
５．合成セルロースの分析データ
合成生成物（５μg）をフッ化バリウム窓板に塗布し、乾燥後、Spotlight 200（PerkinElmer）を用いてマイクロＦＴ−ＩＲ分光法に付した。図２は、合成生成物及びセルロース試料（測定面積：１００μm×１００μm）について得られたスペクトルを示す。
【００７０】
本発明の範囲及び本質を逸することなく、本発明に対して様々な変形及び改変を行うことができることは、当業者には明らかであろう。よって、本発明は、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内に入るならば、本発明の変形及び変化を包含することが意図される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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