(57)【要約】  ヒト免疫グロブリン及びラクダ科免疫グロブリンから誘導される抗体ベースの結合剤、並びに該結合剤を分泌するように操作された酵母菌株、並びに該操作された酵母菌株を使用するクロストリジウム・ディフィシル感染症の治療方法及び予防方法が記載される。これらの結合剤は、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ及び／又はトキシンＢを認識して、特異的に結合し、幾つかの場合にはトキシン中和活性を示す。該結合剤には、ラクダ科ＶＨＨペプチド単量体、連結されたＶＨＨペプチド単量体の群、抗体のＦｃドメインに結合された複数のＶＨＨペプチド単量体、及びＩｇＧ抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体が含まれる。【選択図】図２０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
四重特異性の四量体型結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株であって、前記結合剤は、連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体、及び第四のＶＨＨペプチド単量体を含み、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体は、独立して、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対して結合特異性を有する、操作された酵母菌株。
【請求項２】
前記第一のＶＨＨペプチド単量体、前記第二のＶＨＨペプチド単量体、前記第三のＶＨＨペプチド単量体、及び前記第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１に記載の操作された酵母菌株。
【請求項３】
前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１に記載の操作された酵母菌株。
【請求項４】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１に記載の操作された酵母菌株。
【請求項５】
前記結合剤はＡＢＡＢであり、ここで前記第一の単量体及び前記第三の単量体は、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記第一の単量体及び前記第三の単量体は、それぞれＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３（配列番号７）及びＡＡ６（配列番号５）であり、かつ前記第二の単量体及び前記第四の単量体は、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記第二の単量体及び前記第四の単量体は、それぞれＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）及びＥ３（配列番号３）である、請求項１に記載の操作された酵母菌株。
【請求項６】
前記ＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持するか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持するか、又はその両方を維持する、請求項５に記載の操作された酵母菌株。
【請求項７】
前記ＡＢＡＢ結合剤は、ＡＴ分泌シグナル（ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡ（配列番号９９））及びＩＶＳ分泌シグナル（ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ（配列番号１０３））から選択されるＮ末端分泌シグナルを更に含む、請求項５に記載の操作された酵母菌株。
【請求項８】
前記ＡＢＡＢ結合剤は、酵母内のプラスミドから発現され、ここで該ＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持するか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持するか、又はその両方を維持する、請求項５に記載の操作された酵母菌株。
【請求項９】
前記プラスミドは、ｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ−ｃＭｙｃ（配列番号８８）である、請求項８に記載の操作された酵母菌株。
【請求項１０】
前記ＡＢＡＢ結合剤のコーディング配列は、酵母の染色体中に組み込まれており、ここで該ＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持するか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持するか、又はその両方を維持する、請求項５に記載の操作された酵母菌株。
【請求項１１】
前記サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の操作された酵母菌株。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作された酵母菌株の製造方法であって、（ａ）サッカロマイセス属酵母菌株を、前記結合剤をコードする発現ベクターで形質転換させることと、（ｂ）（ａ）の酵母を該結合剤の産生についてスクリーニングすることとを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の操作された酵母菌株の製造方法であって、（ａ）前記結合剤をコードするポリヌクレオチド配列を、サッカロマイセス属酵母菌株のゲノム中に染色体組込みすることと、（ｂ）（ａ）の酵母を該結合剤の産生についてスクリーニングすることとを含む、方法。
【請求項１５】
前記操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記スクリーニングは、イムノアッセイを使用して実施される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターは、プラスミドｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ−ｃＭｙｃ（配列番号８８）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
染色体組込みは、
（ａ）前記ＡＢＡＢ結合剤をコードするポリヌクレオチド配列を、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６Ｔ８３Ｎ−タグなし（配列番号９０）から、（ｉ）選択された酵母染色体組込み部位に相同な核酸配列、並びに（ｉｉ）該プラスミドのＡＢＡＢ結合剤をコードする配列の５’領域及び３’領域に相同な核酸配列を含むプライマーを使用して増幅させて、組込みカセットを作製することと、
（ｂ）酵母を（ａ）で作製された組込みカセットと一緒にｐＣＲＩ−Ｓｂ−δ１（配列番号９１）又はｐＣＲＩ−Ｓｂ−δ２（配列番号９２）で形質転換させることで、相応の酵母染色体のδ部位内で、二本鎖切断の部位中への組込みカセットの自発的組込みを促進する条件下で二本鎖切断を誘導することと、
（ｃ）（ｂ）の形質転換された酵母を、ＡＢＡＢ結合剤の産生についてスクリーニングすることと、
により行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記スクリーニングは、イムノアッセイを使用して実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
被験体におけるＣ．ディフィシルによって誘発された疾患症状を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１種以上の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
Ｃ．ディフィシルに感染した被験体におけるＣ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを中和する方法であって、治療的有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１種以上の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
被験体におけるＣ．ディフィシル感染症を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１種以上の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体における正常な腸機能を維持する方法であって、治療的有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１種以上の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２４】
前記操作された酵母菌株は、該操作された酵母菌株と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤で存在する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記中和は、部分的又は完全な中和である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
治療的有効量の抗生物質を被験体に投与することを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療的有効量の操作された酵母菌株は、被験体の体重１ｋｇ当たり１０μｇから１００ｍｇの間の該操作された酵母菌株である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記操作された酵母菌株は、被験体へと経口で、鼻内で、又は直腸内で投与される、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
Ｃ．ディフィシルにより誘発された疾患症状は、下痢である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つのＶＨＨペプチド単量体を含むＶＨＨペプチド結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株であって、各々のＶＨＨペプチド単量体は、独立して、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）の固有のエピトープに対して結合特異性を有する、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項３２】
前記ＶＨＨペプチド結合剤は、２つの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む、請求項３１に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項３３】
前記ＶＨＨペプチド結合剤は、３つの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む、請求項３１に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項３４】
前記ＶＨＨペプチド結合剤は、４つの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む、請求項３１に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項３５】
前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項３４に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項３６】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）、又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体からなる群から選択され、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持するか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持するか、又はその両方を維持する、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項３７】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、リンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）から独立して選択されるリンカーを使用して連結される、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項３８】
前記配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項３７に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項３９】
前記サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項４０】
被験体におけるＣ．ディフィシルによって誘発された疾患症状を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の１種以上の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４１】
Ｃ．ディフィシルに感染した被験体におけるＣ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを中和する方法であって、治療的有効量の請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の１種以上の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４２】
被験体におけるＣ．ディフィシル感染症を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の１種以上の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４３】
Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体における正常な腸機能を維持する方法であって、治療的有効量の請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の１種以上の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
前記操作された酵母菌株は、該操作された酵母菌株と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤で存在する、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記中和は、部分的又は完全な中和である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
治療的有効量の抗生物質を被験体に投与することを更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記治療的有効量の操作された酵母菌株は、被験体の体重１ｋｇ当たり１０μｇから１００ｍｇの間の該操作された酵母菌株である、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記操作された酵母菌株は、被験体へと経口で、鼻内で、又は直腸内で投与される、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
Ｃ．ディフィシルにより誘発された疾患症状は、下痢である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）若しくはトキシンＢ（ＴｃｄＢ）の固有のエピトープ、又は両方に対する結合特異性を有する治療タンパク質を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項５２】
前記サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである、請求項５１に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項５３】
前記治療タンパク質は、抗体である、請求項５１又は５２に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項５４】
前記サッカロマイセス属酵母菌株は、（ａ）サッカロマイセス属酵母菌株を、前記治療タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換させること、及び（ｂ）（ａ）の酵母を該治療タンパク質の産生についてスクリーニングすることによって操作されている、請求項５１又は５２に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項５５】
前記サッカロマイセス属酵母菌株は、（ａ）前記治療タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、該サッカロマイセス属酵母菌株のゲノム中に染色体組込みすること、及び（ｂ）（ａ）の酵母を該治療タンパク質の産生についてスクリーニングすることによって操作されている、請求項５１又は５２に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項５６】
前記スクリーニングは、イムノアッセイを使用して実施される、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
被験体におけるＣ．ディフィシルによって誘発された疾患症状を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の請求項５１に記載の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５８】
Ｃ．ディフィシルに感染した被験体におけるＣ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを中和する方法であって、治療的有効量の請求項５１に記載の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５９】
被験体におけるＣ．ディフィシル感染症を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の請求項５１に記載の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項６０】
Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体における正常な腸機能を維持する方法であって、治療的有効量の請求項５１に記載の操作された酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項６１】
前記操作された酵母菌株は、該操作された酵母菌株と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤で存在する、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記中和は、部分的又は完全な中和である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
治療的有効量の抗生物質を被験体に投与することを更に含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記治療的有効量の操作された酵母菌株は、被験体の体重１ｋｇ当たり１０μｇから１００ｍｇの間の該操作された酵母菌株である、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記操作された酵母菌株は、被験体へと経口で、鼻内で、又は直腸内で投与される、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
Ｃ．ディフィシルにより誘発された疾患症状は、下痢である、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＤＫ０８４５０９及びＡＩ１０９７７６による政府の支援を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明における一定の権利を有し得る。
【０００２】
［配列表］
電子形式（ＡＳＣＩＩテキストファイル）の配列表は、本出願と同時に提出され、引用することにより本明細書の一部をなす。ＡＳＣＩＩテキストファイルのファイル名は、「２０１６＿１３４３Ａ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、そのファイルは、２０１６年１０月１３日に作成されたものであり、ファイルサイズは４０７ＫＢである。
【背景技術】
【０００３】
細菌のクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）は、院内抗生物質関連下痢症の最も一般的な原因であるだけでなく、偽膜性腸炎の病原体である［１］。アメリカ合衆国では、年間５０００００件を超えるＣ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＩ）が発生していると見積もられており、その年間死亡率は、菌株に依存して約３％〜１７％の範囲である。強毒性で抗生物質耐性の菌株の出現により、ＣＤＩ患者における死亡発生率は、急速に高まっている［２］。
【０００４】
ＣＤＩは、主に２種類のＣ．ディフィシルのエキソトキシンＴｃｄＡ及びＴｃｄＢによって引き起こされる（したがって、ＴｃｄＡ陰性ＴｃｄＢ陰性菌株は、非病原性である）［２１、２２］。これらの２種類のトキシンは、構造的に類似していて、宿主細胞に類似の作用機序を示す。それらのトキシンは両方とも宿主のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼを標的とし、それらの不活性化に続いて細胞骨格崩壊をもたらす。ＣＤＩの発病における２種類のトキシンの相対的な役割はよく理解されていないが、どちらのトキシンも個別に動物においてＣＤＩを引き起こし得ることは明らかである［２２、２３］。
【０００５】
ＣＤＩ患者の治療のための選択肢は限られており、再発率は高い（患者の２０％〜３５％）。抗生物質を使用するＣＤＩのための最近の標準的な処置は、マイクロフローラの破壊を引き起こし、３５％に迫る再燃率をもたらす［３、１３］。その他の介入（例えば、プロバイオティクス、トキシン吸収性ポリマー及びトキソイドワクチン）が試みられたが、予防戦略も治療戦略も、この感染症の発生率及び重症度の増加に追いついていない。再発患者におけるＣＤＩの更なる症状の発現（episodes：エピソード）のリスクは、５０％を上回ることがあり［１４］、それらの患者の一部は、何度も再発を繰り返すこととなる。再発性ＣＤＩは、同じ菌株又は新たに定着する菌株によって引き起こされることがある［１５〜１８］。
【０００６】
より新しい免疫ベースの療法は、臨床試験にて或る程度効果があることが裏付けられており、それには、重症ＣＤＩに対する免疫グロブリン静注（ＩＶＩＧ）［４〜８］及び再発性ＣＤＩに対するヒトモノクローナル抗体が含まれる［９］。スペクトルが狭い大環状抗生物質であるフィダキソマイシンは、ＣＤＩに対する経口バンコマイシンと類似した効果を示したが、再燃率の低下についてはかなり良くなっている［１０］。糞便移植は、難治性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩに対して有効であるが、標準化することが困難であるとともに、危険を伴うものである［１１、１２］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＣＤＩは、治療することが困難な苛立たしい状態であり、何ヶ月にもわたって、それどころか何年にもわたって患者を冒すため、甚大な罹患率及び死亡率が引き起こされることがある［１９］。したがって、ＣＤＩの新たな治療並びにＣＤＩを発症するリスクのある被験体における原発性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩの両方を予防する手段が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、Ｃ．ディフィシルの病原性因子であるＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに選択的に結合する抗体ベースの融合タンパク質型の結合剤、並びにこれらのＣ．ディフィシルのトキシンへの結合剤を発現及び分泌するように遺伝子操作された共生酵母のサッカロマイセス属菌株が提供される。上記酵母及び結合剤の両方とも、被験体における原発性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩの治療及び予防において有用性を示す。宿主腸内に上記結合剤を分泌するサッカロマイセス属菌を経口投与することで、進行中のＣＤＩを緩和することができ、再発を抑えることができる。
【０００９】
したがって、本発明は、幾つかある重要な特徴の中でも特に、Ｃ．ディフィシルのトキシンへの結合剤、該結合剤を産生するように操作されたサッカロマイセス属菌株（限定されるものではないが、サッカロマイセス・ボウラルディ（Saccharomyces boulardii）を含む）、操作された酵母菌株の作製方法、並びに上記結合剤及び操作された酵母菌株を使用する原発性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩの治療方法及び予防方法に関する。
【００１０】
結合剤
本発明の結合剤には、単純なＶＨＨペプチド単量体及び連結されたＶＨＨペプチド単量体の群（２つ、３つ、４つ又はそれより多くの単量体を含む）、並びに抗体のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体を含むより複雑な結合剤、並びに部分ＩｇＧ抗体又は完全ＩｇＧ抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体が含まれる。
【００１１】
第一の実施の形態においては、本発明は、２つ、３つ、４つ又はそれより多くの単量体を含む、ＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤及び連結されたＶＨＨペプチド単量体の群を含む結合剤であって、該単量体の各々がＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに、好ましくは特異的に結合する、結合剤に関する。このように、本発明は、少なくとも１つのＶＨＨペプチド単量体を含むＶＨＨペプチド結合剤であって、各々のＶＨＨペプチド単量体が、Ｃ．ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対して結合特異性を有する、結合剤を包含する。或る特定の態様において、これらの結合剤は、２つ、３つ、４つ又はそれより多くの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む。ＶＨＨペプチド単量体には、限定されるものではないが、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。
【００１２】
２つ以上の単量体が連結されているこの実施の形態の態様においては、それらの単量体は、一般的に１０個から２０個の間のアミノ酸を含むフレキシブルなペプチドリンカーによって連結され得る。適切なリンカーには、限定されるものではないが、リンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）が含まれる。
【００１３】
この実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに特異的に結合する。この実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ中和活性及び／又はＴｃｄＢ中和活性を示す。
【００１４】
この実施の形態の具体的な態様においては、結合剤は、連結された４つのＶＨＨペプチド単量体を含み、該単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ該単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。ＴｃｄＡのエピトープは、同一又は異なってもよい。ＴｃｄＢのエピトープは、同一又は異なってもよい。
【００１５】
この実施の形態の具体的な態様においては、結合剤は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体（sequence variant：配列多様体）であって、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、若しくはトキシン中和活性を維持しているか、若しくはその両方を維持している、配列変異体を含む。幾つかの場合に、配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している。
【００１６】
第二の実施の形態においては、本発明は、ＩｇＧ抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤であって、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに結合する、結合剤に関する。これらのＩｇＧベースの結合剤においては、ＩｇＧ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域が、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体によって置き換えられている。
【００１７】
この実施の形態の或る特定の態様においては、これらの結合剤は、ＩｇＧの軽鎖及び重鎖のアミノ末端に可変領域の代わりに結合された２つ、３つ、４つ又はそれより多くの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む。ＶＨＨペプチド単量体には、限定されるものではないが、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。
【００１８】
２つ以上の単量体が連結されているこの実施の形態の態様においては、それらの単量体は、一般的に１０個から２０個の間のアミノ酸を含むフレキシブルなペプチドリンカーによって連結され得る。適切なリンカーには、限定されるものではないが、リンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）が含まれる。
【００１９】
第一の下位実施の形態においては、本発明は、ＩｇＧ抗体と、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体と、２組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、上記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、該抗体の各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体が、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ１組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤に関する。この結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「四重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、８つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ、同じ第二の単量体を２つ、同じ第三の単量体を２つ及び同じ第四の単量体を２つ）を有するため、「八量体型」と呼ばれる。
【００２０】
この下位実施の形態においては、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
【００２１】
この下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【００２２】
この下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【００２３】
この下位実施の形態の特定の態様において、結合剤の軽（κ）鎖は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６／Ｅ３κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ結合剤の重鎖は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３／５Ｄ重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含む。この結合剤が、ＩｇＧベースの結合剤である場合には、示されたアミノ酸配列を有する２つの重鎖ポリペプチド及び２つの軽鎖ポリペプチドが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が提供されることは、当業者に明らかであろう。配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。
【００２４】
第二の下位実施の形態においては、本発明は、ＩｇＧ抗体と、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む二重特異性又は四重特異性の四量体型結合剤であって、上記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、該抗体の第一のアームにつき、第一のＶＨＨペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第二のＶＨＨペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、該抗体の第二のアームにつき、第三のＶＨＨペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第四のＶＨＨペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体は、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤に関する。結合剤が「四重特異性」である場合に、該結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識し、「二重特異性」の場合には、該結合剤は、２種の異なるトキシンのエピトープを認識する。結合剤は、それらが４つのＶＨＨペプチド単量体を有する場合には「四量体型」である（二重特異性の場合に、第一の単量体及び第三の単量体は同じ配列を有し、同じエピトープに結合し、かつ第二の単量体及び第四の単量体は同じ配列を有し、同じエピトープに結合する；四重特異性の場合に、各々の単量体は異なる配列を有し、異なるエピトープに結合する）。
【００２５】
結合剤が二重特異性である場合、第一の単量体及び第二の単量体は、異なるエピトープに対する結合特異性を有し、第一の単量体及び第三の単量体は、同一のアミノ酸配列を有し、かつ第二の単量体及び第四の単量体は、同一のアミノ酸配列を有する。ＶＨＨペプチド単量体のうち１つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有することができ、かつＶＨＨペプチド単量体のうち１つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有することができる。
【００２６】
結合剤が四重特異性である場合、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、異なるエピトープに対する結合特異性を有する。ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有することができ、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有することができる。
【００２７】
この下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有する。
【００２８】
この下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【００２９】
この下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【００３０】
この下位実施の形態の特定の態様において、結合剤の軽（κ）鎖は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ結合剤の重鎖は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含む。この結合剤が、ＩｇＧベースの結合剤である場合には、示されたアミノ酸配列を有する２つの重鎖ポリペプチド及び２つの軽鎖ポリペプチドが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が提供されることは、当業者に明らかであろう。配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。
【００３１】
この下位実施の形態の別の特定の態様において、結合剤の軽（κ）鎖は、配列番号４２に示されるアミノ酸配列（Ｅ３κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ結合剤の重鎖は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列（５Ｄ重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含む。この結合剤が、ＩｇＧベースの結合剤である場合には、示されたアミノ酸配列を有する２つの重鎖ポリペプチド及び２つの軽鎖ポリペプチドが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が提供されることは、当業者に明らかであろう。配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。
【００３２】
この実施の形態及び下位実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに特異的に結合する。この実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ中和活性及び／又はＴｃｄＢ中和活性を示す。
【００３３】
第三の実施の形態においては、本発明は、抗体のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤であって、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに結合する、結合剤に関する。これらのＦｃドメインベースの結合剤においては、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体が、抗体重鎖のＦｃドメインの各アームのヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域に結合されている。したがって、ペプチド単量体は、抗体のＦａｂ領域と置き換えられている。
【００３４】
この実施の形態の或る特定の態様においては、これらの結合剤は、Ｆｃドメインのアームのアミノ末端に結合された２つ、３つ、４つ又はそれより多くの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む。ＶＨＨペプチド単量体には、限定されるものではないが、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。
【００３５】
２つ以上の単量体が連結されているこの実施の形態の態様においては、それらの単量体は、一般的に１０個から２０個の間のアミノ酸を含むフレキシブルなペプチドリンカーによって連結され得る。適切なリンカーには、限定されるものではないが、リンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）が含まれる。
【００３６】
第一の下位実施の形態においては、本発明は、抗体のＦｃドメインと、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、上記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームはアミノ末端を有しており、該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該アームのアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤に関する。この結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「四重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、８つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ、同じ第二の単量体を２つ、同じ第三の単量体を２つ及び同じ第四の単量体を２つ）を有するため、「八量体型」と呼ばれる。
【００３７】
この下位実施の形態の或る特定の態様において、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
【００３８】
この下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【００３９】
この下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【００４０】
この下位実施の形態の特定の態様において、結合剤は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列（ＡＢＡＢ−Ｆｃ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。この結合剤が、Ｆｃドメインベースの結合剤である場合に、示されたアミノ酸配列を有する２つの同一のポリペプチドが、該結合剤のアームとして機能すること、及び該アームが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が得られることは、当業者には明らかであろう。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。
【００４１】
第二の下位実施の形態においては、本発明は、抗体のＦｃドメインと、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体とを含む二重特異性の四量体型結合剤であって、上記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームはアミノ末端を有しており、該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、該アームのアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤に関する。この結合剤は、２種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「二重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、４つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ及び同じ第二の単量体を２つ）を有するため、「四量体型」と呼ばれる。
【００４２】
この下位実施の形態の或る特定の態様において、第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、同じ又は異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
【００４３】
この下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【００４４】
この下位実施の形態の特定の態様において、結合剤は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３／５Ｄ−Ｆｃ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。この結合剤が、Ｆｃドメインベースの結合剤である場合に、示されたアミノ酸配列を有する２つの同一のポリペプチドが、該結合剤のアームとして機能すること、及び該アームが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が得られることは、当業者には明らかであろう。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。
【００４５】
この下位実施の形態の別の特定の態様において、結合剤は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６／Ｅ３−Ｆｃ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。この結合剤が、Ｆｃドメインベースの結合剤である場合に、示されたアミノ酸配列を有する２つの同一のポリペプチドが、該結合剤のアームとして機能すること、及び該アームが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が得られることは、当業者には明らかであろう。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。
【００４６】
この実施の形態及び下位実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに特異的に結合する。この実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ中和活性及び／又はＴｃｄＢ中和活性を示す。
【００４７】
本発明には、本明細書で定義される様々な実施の形態及び態様において規定される各々の結合剤のヒト化された変異体が含まれる。同様に、本発明には、本明細書で定義される様々な実施の形態及び態様において規定される各々の結合剤のエピトープ結合断片が含まれる。
【００４８】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、及び宿主細胞
本発明には、本明細書で定義される様々な実施の形態及び態様において規定される各々の結合剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド並びにそれらの相補鎖が含まれる。また本発明には、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例えば、細菌及び酵母のもの）及び該発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、細菌、酵母、哺乳動物、昆虫のもの）も含まれる。さらに、本発明には、本明細書で定義される結合剤を製造する方法であって、宿主細胞を、発現ベクターによってコードされる結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法が含まれる。
【００４９】
操作されたＳ．ボウラルディ菌株
第四の実施形態においては、本発明は、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生するように操作されたサッカロマイセス属酵母菌株、例えばＳ．セレビシエ及びＳ．ボウラルディに関する。好ましい態様においては、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、上記結合剤を分泌する。
【００５０】
サッカロマイセス属酵母菌株のその個性は、本発明の１種以上の結合剤を産生し、好ましくは分泌するように操作され得ることにのみ限定される。本発明の好ましい態様においては、１種以上の結合剤を産生するように操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。このように、本発明は、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生する操作されたＳ．セレビシエ菌株、及び本明細書で定義される１種以上の結合剤を分泌する操作されたＳ．セレビシエ菌株を含む。また、本発明は、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生する操作されたＳ．ボウラルディ菌株、及び本明細書で定義される１種以上の結合剤を分泌する操作されたＳ．ボウラルディ菌株を含む。
【００５１】
この実施の形態の一例においては、本発明は、ＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤、又は２つ、３つ、４つ若しくはそれより多くの単量体を含む連結されたＶＨＨペプチド単量体の群を含む結合剤であって、該単量体の各々がＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに、好ましくは特異的に結合する結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株に関する。このように、本発明は、少なくとも１つのＶＨＨペプチド単量体を含むＶＨＨペプチド結合剤であって、各々のＶＨＨペプチド単量体が、Ｃ．ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対して結合特異性を有する結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を包含する。或る特定の態様において、これらの結合剤は、２つ、３つ、４つ又はそれより多くの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む。ＶＨＨペプチド単量体には、限定されるものではないが、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。
【００５２】
この実施の形態のもう一つの例においては、本発明は、本明細書で定義される、ＩｇＧ抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体を含む、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに結合する結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株に関する。これらのＩｇＧベースの結合剤においては、ＩｇＧ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域が、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体によって置き換えられている。
【００５３】
この実施の形態の更なる例においては、本発明は、本明細書で定義される、抗体Ｆｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体を含む、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに結合する結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株に関する。これらのＦｃドメインベースの結合剤においては、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体が、抗体重鎖のＦｃドメインの各アームのヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域に結合されている。したがって、ペプチド単量体は、抗体のＦａｂ領域と置き換えられている。
【００５４】
この実施の形態の更に別の例においては、本発明は、四重特異性の四量体型結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株であって、上記結合剤は、連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体、及び第四のＶＨＨペプチド単量体を含み、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体は、独立して、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対して結合特異性を有する、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株に関する。或る特定の態様において、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体、及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【００５５】
この実施の形態の好ましい例においては、本発明は、上記結合剤はＡＢＡＢであり、ここで第一の単量体及び第三の単量体は、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ第一の単量体及び第三の単量体は、それぞれＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３（配列番号７）及びＡＡ６（配列番号５）であり、かつ第二の単量体及び第四の単量体は、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ第二の単量体及び第四の単量体は、それぞれＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）及びＥ３（配列番号３）である、操作された酵母菌株に関する。或る特定の態様において、ＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。或る特定の態様において、ＡＢＡＢ結合剤は、ＡＴ分泌シグナル（ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡ（配列番号９９））及びＩＶＳ分泌シグナル（ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ（配列番号１０３））から選択されるＮ末端分泌シグナルを更に含む。
【００５６】
或る特定の態様において、ＡＢＡＢ結合剤は、酵母内のプラスミドから発現され、ここで該ＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。プラスミドは、限定されるものではないが、ｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ−ｃＭｙｃ（配列番号８８）であってもよい。
【００５７】
或る特定の態様において、ＡＢＡＢ結合剤のコーディング配列は、酵母菌株の染色体中に組み込まれており、ここで該ＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。
【００５８】
この実施の形態の態様は、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）若しくはトキシンＢ（ＴｃｄＢ）の固有のエピトープ、又は両方に対する結合特異性を有する治療タンパク質を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を含む。好ましくは、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。治療タンパク質は、被験体における医学的状態の改善若しくは治癒をもたらすことができるか、又は被験体において医学的状態が発生することを防止若しくは抑制することができるあらゆるタンパク質である。適切な治療タンパク質には、限定されるものではないが、（ａ）欠陥又は異常のあるタンパク質に置き換わるタンパク質、（ｂ）既存の経路を増加させるタンパク質、（ｃ）新規の機能又は活性を提供するタンパク質、（ｄ）分子又は生物と干渉するタンパク質、及び（ｅ）放射線核種、細胞傷害性薬物又はエフェクタータンパク質等のその他の化合物又はタンパク質を送達するタンパク質が含まれる。また治療タンパク質には、抗体及び抗体ベース薬物、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固薬、血液因子、骨形成タンパク質、操作された足場タンパク質、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、並びに血栓溶解薬も含まれる。さらに治療タンパク質は、二重特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び多重特異性融合タンパク質、小分子薬物と結合されたモノクローナル抗体、並びに最適化された薬物動態を有するタンパク質が含まれる。
【００５９】
操作されたＳ．ボウラルディ菌株の作製方法
また本発明は、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生するように操作されたサッカロマイセス属酵母菌株の作製方法に関する。
【００６０】
したがって、本発明は、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生するように操作されたサッカロマイセス属酵母菌株の製造方法であって、（ａ）サッカロマイセス属酵母菌株を、該結合剤をコードする発現ベクターで形質転換させることと、（ｂ）（ａ）の酵母を該結合剤の産生についてスクリーニングすることとを含む、製造方法を包含する。或る特定の態様において、発現ベクターは、プラスミドｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ−ｃＭｙｃ（配列番号８８）である。
【００６１】
したがって、本発明は、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生するように操作されたサッカロマイセス属酵母菌株の製造方法であって、（ａ）サッカロマイセス属酵母菌株のゲノムに、該結合剤をコードするポリヌクレオチド配列を染色体組込みすることと、（ｂ）（ａ）の酵母を該結合剤の産生についてスクリーニングすることとを含む、製造方法を包含する。或る特定の態様において、染色体組込みは、
（ａ）ＡＢＡＢ結合剤をコードするポリヌクレオチド配列を、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６Ｔ８３Ｎ−タグなし（配列番号９０）から、（ｉ）選択された酵母染色体組込み部位に相同な核酸配列、並びに（ｉｉ）該プラスミドのＡＢＡＢ結合剤をコードする配列の５’領域及び３’領域に相同な核酸配列を含むプライマーを使用して増幅させて、組込みカセットを作製することと、
（ｂ）酵母を（ａ）で作製された組込みカセットと一緒にｐＣＲＩ−Ｓｂ−δ１（配列番号９１）又はｐＣＲＩ−Ｓｂ−δ２（配列番号９２）で形質転換させることで、相応の酵母染色体のδ部位内で、二本鎖切断の部位中への組込みカセットの自発的組込みを促進する条件下で二本鎖切断を誘導することと、
（ｃ）（ｂ）の形質転換された酵母を、ＡＢＡＢ結合剤の産生についてスクリーニングすることと、
により行われる。
【００６２】
これらの方法の或る特定の態様においては、上記結合剤を産生するように操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、酵母のｕｒａ３欠損菌株等のサッカロマイセス属酵母の栄養素要求性菌株である。酵母のｕｒａ３欠損菌株は、ｕｒａ３選択に際して利用することができる。
【００６３】
これらの方法の或る特定の態様においては、上記結合剤を産生するように操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。
【００６４】
これらの方法の或る特定の態様においては、スクリーニングは、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイを使用して実施される。
【００６５】
医薬製剤
本発明には、本明細書で定義される１種以上の結合剤と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤が含まれる。また本発明には、本明細書で定義される１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤が含まれる。或る特定の態様において、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。
【００６６】
治療方法及び予防方法
第六の実施の形態においては、本発明は、被験体におけるＣ．ディフィシルによって誘発された疾患症状を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の本明細書で定義される１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法に関する。好ましい態様において、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。
【００６７】
本実施の形態の或る特定の態様において、Ｃ．ディフィシルにより誘発された疾患症状は、下痢である。
【００６８】
第七の実施の形態においては、本発明は、Ｃ．ディフィシルによって感染された被験体におけるＣ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを中和する方法であって、治療的有効量の本明細書で定義される１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む、方法に関する。好ましい態様において、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。
【００６９】
第八の実施の形態においては、本発明は、被験体におけるＣ．ディフィシル感染症を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の本明細書で定義される１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法に関する。好ましい態様において、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。第八の実施の形態の或る特定の態様においては、該方法は、治療的有効量の抗生物質を被験体に投与することを更に含む。
【００７０】
第九の実施の形態においては、本発明は、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体において正常な腸機能を維持する方法であって、治療的有効量の本明細書で定義される１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法に関する。好ましい態様においては、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。第九の実施の形態の或る特定の態様においては、該方法は、治療的有効量の抗生物質を被験体に投与することを更に含む。
【００７１】
これらの方法の或る特定の態様においては、結合剤は、該結合剤と医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤において存在する。
【００７２】
これらの方法の或る特定の態様においては、治療的有効量の結合剤は、被験体の体重１ｋｇ当たり１０μｇから１００ｍｇの間の結合剤である。
【００７３】
これらの方法の或る特定の態様においては、結合剤は、被験体へと経口で、非経口で、又は直腸内で投与される。
【００７４】
これらの方法の或る特定の態様においては、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、該操作された菌株と医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤で存在する。好ましい態様において、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。
【００７５】
これらの方法の或る特定の態様においては、治療的有効量の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、被験体の体重１ｋｇ当たり１０μｇから１００ｍｇの間の操作された菌株である。好ましい態様において、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。
【００７６】
これらの方法の或る特定の態様においては、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、被験体へと経口で、鼻内で、又は直腸内で投与される。好ましい態様において、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。
【００７７】
上記は、以下の本発明の詳細な説明をよりよく理解することができるように本発明の特徴及び技術的な利点を幅広く概説した。本発明の追加の特徴及び利点が本明細書に記載され、本発明の特許請求の範囲の主題をなす。本明細書に開示される任意の概念及び具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を実施するため他の構造を修飾又は設計するための基礎として容易に利用可能であることが当業者に理解される。また、かかる等価な構築物は、添付の特許請求の範囲に述べられる本発明の趣旨及び範囲から逸脱しないことが当業者によって明確に理解されなければならない。本発明の構成及び操作方法の両方について、本発明の特性と考えられる新規な特徴は、更なる目的及び利点と共に、添付の図面と組み合せて考慮される場合に以下の記載からより良く理解されるであろう。しかしながら、あらゆる記載、図面、実施例等が解説及び説明の目的に対してのみ提供され、本発明の範囲を定義することは何ら意図されないことが明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の結合剤の作製戦略の図である。
【図２】Ｃ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの、各トキシンのグルコシルトランスフェラーゼドメイン（ＧＴ）、システインプロテアーゼドメイン（ＣＰＤ）、移行ドメイン（ＴＤ）及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を示す図である。異なるトキシンドメインを認識してそれらに結合するＶＨＨが示されている。下線を引いたＶＨＨは、トキシン中和活性を有するものである。
【図３】単量体又は二量体のＶＨＨは強力な中和活性を有する。ＶＨＨはＴｃｄＡ（図３のＡ）又はＴｃｄＢ（図３のＢ）によって誘発される細胞円形化をｎＭ濃度で阻止する。（図３のＣ）ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢに対する２つのヘテロ二量体の図である。Ｎ末端にあるＨｉｓ（６）タグが精製を容易にし、フレキシブルなスペーサー（ＦＳ）が、２つのＶＨＨを隔てている。（図３のＤ）二量体５Ｄ／Ｅ３は、２種のＶＨＨの単純な混合物に対してその中和活性を少なくとも１０倍高める。ヘテロ二量体は、ＴｃｄＢ（図３のＥ）又はＴｃｄＡ（図３のＦ）による致死的な腹腔内負荷からマウスを十分に防御した。
【図４】ＡＢＡＢの図である。Ｈｉｓ−タグ及びＥ−タグは、それぞれ精製及び検出のためのエピトープタグである。ＦＳ：フレキシブルなリンカー；ＡＢＰ：アルブミン結合ペプチド。
【図５Ａ】ＡＢＡＢは、Ｃ．ディフィシルの胞子の負荷からマウスを防御するにあたって非常に強力であることを示す図である。
【図５Ｂ】ＡＢＡＢは、トキシンの負荷からマウスを防御するにあたって非常に強力であることを示す図である。ＭＫ  ＨｕＭａｂｓ：臨床試験中のMerck社の抗ＴｃｄＡヒトモノクローナル抗体（アクトクスマブ）及び抗ＴｃｄＢヒトモノクローナル抗体（ベズロトクスマブ）の混合物。
【図６】両方のトキシンに対する抗トキシン血清は、マウスをＣＤＩから防御することを示す図である。マウスに、Ｃ．ディフィシルの胞子（ＵＫ１菌株、１０６胞子／マウス）の接種前に４時間にわたって、ＴｃｄＡに対するアルパカ抗血清（「Ａｎｔｉ−Ａ」）５０μｌ、ＴｃｄＢに対するアルパカ抗血清（「Ａｎｔｉ−Ｂ」）５０μｌ、ＴｃｄＡ＋ＴｃｄＢに対するアルパカ抗血清（「Ａｎｔｉ−Ａ＋Ａｎｔｉ−Ｂ」）５０μｌ、又は免疫前血清（presera）若しくはＰＢＳ（「ＣＴＲ」）１００μｌを腹腔内注射した。マウス生存率（図６のＡ；Ａｎｔｉ−Ａ＋Ａｎｔｉ−Ｂ対ＰＢＳ、ｐ＝０．００６）及び体重減少率（図６のＢ）が図説されている（＊、Ａｎｔｉ−Ａ＋Ａｎｔｉ−Ｂと対照との間でｐ＜０．０５）。
【図７】ＡＢＡＢ及びＡＢＡＢ−ＩｇＧ分子の図である。
【図８Ａ】個々のＶＨＨのそれぞれのトキシンへの結合と比較した、ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＴｃｄＡへの結合のＥＬＩＳＡ分析を示す図である。
【図８Ｂ】個々のＶＨＨのそれぞれのトキシンへの結合と比較した、ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＴｃｄＢへの結合のＥＬＩＳＡ分析を示す図である。
【図９Ａ】四重特異性の抗体ＩｇＧ−ＡＢＡＢのＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方への同時結合のサンドウィッチＥＬＩＳＡ分析を示す図である。図９Ａは、ＴｃｄＡ（ＴｘＡ）に引き続き、ＴｃｄＢ（ＴｘＢ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加された連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧを示している。
【図９Ｂ】四重特異性の抗体ＩｇＧ−ＡＢＡＢのＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方への同時結合のサンドウィッチＥＬＩＳＡ分析を示す図である。図９Ｂは、ＴｃｄＢ（ＴｘＢ）に引き続き、ＴｃｄＡ（ＴｘＡ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加された連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧを示している。
【図１０Ａ】ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＴｃｄＡに対する中和活性を示す図である。
【図１０Ｂ】ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＴｃｄＢに対する中和活性を示す図である。
【図１１】Merck社のＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに対する抗体（アクトクスマブ及びベズロトクスマブ）と比較した、マウスにおけるＣ．ディフィシル感染症に対するＡＢＡＢ−ＩｇＧのｉｎ  ｖｉｖｏ中和活性を示すグラフである。
【図１２】予防的ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＣ．ディフィシル感染症に対する効果の研究の設計を示す図である。
【図１３】二重特異性のサンドウィッチ型ＥＬＩＳＡを示す図である。（図１３のＡ）ＥＬＩＳＡにおけるトキシン及び抗体の配置図。（図１３のＢ）様々なＴｃｄＡ濃度のＯ．Ｄ．示度；１２５ｎｇ／ｍｌのＴｃｄＡを、後続のＥＬＩＳＡのために選択した。
【図１４】Ｓｃ−ＡＢＡＢによって分泌されたＡＢＡＢの活性を示す図である。（図１４のＡ）Ｓ．セレビシエ培養上清中に分泌されたＡＢＡＢの中和効果。Ｓｃ：Ｓ．セレビシエ（ＢＹ４７４１）、Ｓｃ−ＡＢＡＢ：Ｓ．セレビシエ（ＢＹ４７４１）−ｐＤ１２１４−ＦＡＫＳ−ＡＢＡＢ、ｒ−ＡＢＡＢ：組換えＡＢＡＢ。Ｓｃ−ＡＢＡＢの上清中のＡＢＡＢは、細胞を中毒から完全に保護することが可能である。（図１４のＢ）個々のＳｃ−ＡＢＡＢクローンからの上清のＥＬＩＳＡのＯ．Ｄ．示度。
【図１５】様々な分泌シグナルでのＡＢＡＢ分泌レベルを示す図である。（図１５のＡ）Ｓ．セレビシエにおけるＥＬＩＳＡによって測定された、Ｏ．Ｄ．６００に対する細胞密度に対して正規化されたＡＢＡＢ分泌。統計学的有意性は、クルスカル−ウォリスの検定に引き続き、ダンの多重比較検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１）。（図１５のＢ）Ｓ．ボウラルディにおけるＥＬＩＳＡによって測定された、Ｏ．Ｄ．６００に対する細胞密度に対して正規化されたＡＢＡＢ分泌。統計学的有意性は、マン・ホイットニーの検定によって決定した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図１６】Ｓ．ボウラルディにおける相同組換えによる、染色体にコードされる遺伝子のねらいを定めた欠失の図である。
【図１７】ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディＵＲＡ３Δ／Δを示す図である。（図１７のＡ）バンコマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＹＰＤ中とそれを含有しないＹＰＤ中とでの増殖比較。（図１７のＢ）ＥＬＩＳＡによって測定される２時間インキュベートした後のＳ．ボウラルディ培養上清中のＡＢＡＢ安定性。（図１７のＣ）ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディＵＲＡ３Δ／Δの培養上清からのＡＢＡＢの中和活性。（図１７のＤ）ウェスタンブロットによるＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディＵＲＡ３Δ／Δ培養上清中でのＡＢＡＢ検出。濃縮：ＡＢＡＢは、Ｃ末端にｃ−Ｍｙｃタグを有し、α−ｃ−Ｍｙｃタグ抗体を使用して更に濃縮された。
【図１８】マウスでのＣＤＩ予防におけるＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディの保護を示す図である。（図１８のＡ）生存率、（図１８のＢ）体重減少、（図１８のＣ）下痢事象、感染の過程の全体を記録して表した。＊両側かつ９５％信頼区間でのフィッシャーの正確確率検定によって決定された有意性；ｐ値は、図１８のＡの場合に０．０１０８であり、図１８のＢ及び図１８のＣに関しては、通例の二元配置のＡＮＯＶＡ（繰り返しの措置なし）に引き続き、ダネットの多重比較検定を使用した（＊Ｐ≦０．０５）。「Ｓｂ：ＥＰ」は、空のプラスミドを有するＳ．ボウラルディであり、「Ｓｂ：ＡＢＡＢ」は、ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディである。
【図１９】ＣＤＩマウスの治療におけるＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディの保護を示す図である。（図１９のＡ）生存率、（図１９のＢ）体重減少、（図１９のＣ）下痢事象、感染の過程の全体を記録して表した。＊両側かつ９５％信頼区間でのフィッシャーの正確確率検定によって決定された有意性；ｐ値は、図１９のＡの場合に０．０２５６であり、図１９のＢ及び図１９のＣに関しては、通例の二元配置のＡＮＯＶＡ（繰り返しの措置なし）に引き続き、ダネットの多重比較検定を使用した（図１９のＢ及び図１９のＣの場合に＊Ｐ≦０．０５  ＊＊Ｐ≦０．０１  ＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。「Ｓｂ：ＥＰ」は、空のプラスミドを有するＳ．ボウラルディであり、「Ｓｂ：ＡＢＡＢ」は、ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディである。
【図２０】ＣＤＩ再発マウスにおけるＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディの保護を示す図である。（図２０のＡ）生存率、（図２０のＢ）体重減少、（図２０のＣ）下痢事象、感染の過程の全体を記録して表した。＊両側かつ９５％信頼区間でのフィッシャーの正確確率検定によって決定された有意性；ｐ値は、図２０のＡの場合に０．０１７であり、図２０のＢ及び図２０のＣに関しては、通例の二元配置のＡＮＯＶＡ（繰り返しの措置なし）に引き続き、ダネットの多重比較検定を使用した（図２０のＢ及び図２０のＣの場合に＊Ｐ≦０．０５  ＊＊＊Ｐ≦０．００１  ＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。「Ｓｂ：ＥＰ」は、空のプラスミドを有するＳ．ボウラルディであり、「Ｓｂ：ＡＢＡＢ」は、ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディである。
【図２１】ＣＲＩＳＰＲを使用するδ部位を標的とする染色体組込みの図である。Ｔｙ１−Ｈ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１８７０６）を、ＭＹＡ７９６のドラフトゲノムに対してブラストするために使用することで、δ部位配列を得た。収集された配列を使用して、共通のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位及びプロトスペーサーを特定した。２つのＰＡＭ部位配列は、多重部位に関する最高のカバレッジ、並びにＡＢＡＢ発現カセットの簡単な組込みのためのプロトスペーサー及びＰＡＭ部位の上流及び下流に位置する共通の相同配列に基づいて選択された。ＰＡＭ部位「Ｉ」は、配列番号９３に示され、ＰＡＭ部位「ＩＩ」は、配列番号９４に示されている。ＰＣＲによってＡＢＡＢ発現カセットを作製するためにプライマーで使用される相同組換え配列に下線が引かれている。
【図２２】ＣＲＩＳＰＲベースのδ部位を標的とする染色体組込みを使用するＳ．ボウラルディのＡＢＡＢ分泌を示す図である。（図２２のＡ）ＥＬＩＳＡによって測定されたＡＢＡＢ分泌。ＩＴＧ：ＡＢＡＢ組込みカセット。低：ＣＲＩＳＰＲプラスミド対ＩＴＧの比率が２、高：ＣＲＩＳＰＲプラスミド対ＩＴＧの比率が０．２５。（図２２のＢ）ＡＢＡＢ分泌量の比較。Ｍ−／−Ｃｉｒ０：ｐＫＣ、Ｍ−／−Ｃｉｒ＋：ＡＢＡＢ、Ｍ−／−Ｃｉｒ０：ＡＢＡＢは、プラスミドベースである。ＣｈＩｎｓ：従来の相同組換えによるＡＢＡＢカセットの単独部位を標的とする染色体組込み。ＣＲＩＳＰＲ１〜２：部位ＩでのＡＢＡＢカセットの組込み。ＣＲＩＳＰＲ３〜４：部位ＩＩでのＡＢＡＢカセットの組込み。
【図２３】ＣＤＩマウスの治療におけるＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディの保護を示す図である。（図２３のＡ）生存率、（図２３のＢ）体重減少、（図２３のＣ）下痢事象、感染の過程の全体を記録して表した。＊両側かつ９５％信頼区間でのフィッシャーの正確確率検定によって決定された有意性；ｐ値は、図２３のＡの場合に０．０３２５であり、図２３のＢ及び図２３のＣに関しては、通例の二元配置のＡＮＯＶＡ（繰り返しの措置なし）に引き続き、ダネットの多重比較検定を使用した（図２３のＢ及び図２３のＣの場合に＊Ｐ≦０．０５  ＊＊Ｐ≦０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
Ｉ．定義
特に指定のない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は例えば、Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford University Press刊行, 2000(ISBN019879276X)、Kendrew et al.（編）；The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Publishers刊行, 1994(ISBN0632021829)、及びRobert A. Meyers（編）, Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, Wiley, John & Sons, Inc.刊行, 1995(ISBN0471186341)、並びに他の同様の技術的参照文献に見ることができる。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」は１つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」という単語は、「を含む（comprising）」という単語とともに使用される場合に１つ又は２つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、「別の」は少なくとも２つ目又はそれ以上を意味する場合がある。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は複数のものを含み、複数形の用語は単数のものを含む。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、「約」は、明示されているか否かを問わず、例えば整数、分数及びパーセンテージを含む数値を指す。「約」という用語は一般に、当業者が列挙した値と同等である（例えば、同じ機能又は結果を有する）と考え得る数値の範囲（例えば、列挙した値の±５％〜１０％）を指す。場合によっては、「約」という用語は、最も近い有効数字まで四捨五入した数値を含み得る。
【００８２】
ＩＩ．本発明
Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＩ）は、主に、該細菌によって産生された２種の大きな外毒素、すなわちトキシンＡ（ＴｃｄＡ）及びトキシンＢ（ＴｃｄＢ）によって引き起こされる。これらのトキシンは、構造的に類似していて、宿主細胞に類似の作用機序を示す大型の単鎖タンパク質である（ＴｃｄＡは約３００ｋＤであり、ＴｃｄＢは約２７０ｋＤである）。両者のトキシンとも宿主のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼを標的とし、酵素不活性化に続いて、細胞骨格崩壊及びアポトーシスを起こす。腸上皮細胞において、ＴｃｄＡは、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼのグルコシル化を触媒し、細胞の完全な円形化のような形態変化を伴ってアクチン細胞骨格の再構築が起こり、そして腸管バリア機能が破壊される。それらのトキシンは、動物において個別にＣＤＩを引き起こすことができ、当該細菌のＴｃｄＡ−  ＴｃｄＢ−菌株は無毒性である。
【００８３】
数多くの独立した研究によって、それらのトキシンに対する中和抗体は、ＣＤＩに対する防御を与えることが裏付けられている［２４〜３３］。ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢは、Ｃ．ディフィシルにとっての必須の病原性因子であるため、両者のトキシンに対して産生された中和抗体は、動物モデルにおける毒素産生Ｃ．ディフィシル感染症を防ぐ［３０〜３３］。ヒトにおいては、抗トキシン抗体の高い血清濃度は、疾患の重症度の軽減及び再燃の発生率の低下と関連している［９、２５、２９］。
【００８４】
したがって、全身性投与及び経口投与された抗トキシン抗体について予防的根拠はある。しかしながら、単独のエピトープを標的とするモノクローナル抗体は、一般的に親和性が低く、そのような抗体の使用は、該トキシンのエピトープ内に突然変異（mutations：変異）を誘発し、更なる菌株を生成する危険性をはらんでいる。したがって、多数の主要な保存されたトキシンエピトープを標的とする中和性抗トキシンが強く望まれている。
【００８５】
本発明は、ＣＤＩ及びＣＤＩの症状の治療及び予防のための抗ＴｃｄＡ抗体及び抗ＴｃｄＢ抗体に関する既存の知識を基礎とするものである。本明細書においては、ヒト免疫グロブリン及びラクダ科免疫グロブリンから誘導される、任意に被験体において共生酵母のサッカロマイセス属菌株によって発現される抗体ベースの融合タンパク質型の結合剤が提供される。これらの結合剤は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを認識して特異的に結合する。これらの結合剤の一部は、トキシン中和活性を示す。これらの酵母ベースの免疫療法薬は、原発性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩ並びに原発性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩの症状を治療又は予防するために使用することができる。好ましい態様においては、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。
【００８６】
以下で詳細に論じられるように、ラクダ科動物（ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、野生種フタコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、及びグアナコ）は、軽鎖を欠いた、つまりは重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）［３４］である、通常のＩｇＧ［３５］によって達成されるのと同等の結合特性を有する機能的な免疫グロブリンのクラスを産生する。ＶＨＨと呼ばれるＨＣＡｂのＶＨドメインは、通常のヒトＶＨドメインと類似しているが、固有の配列及び構造的特徴を有している［３６］。このドメインをコードするＤＮＡは、簡単にクローニングすることができ、そして微生物中で発現させることで、元となるＨＣＡｂの抗原結合特性を維持した可溶性タンパク質単量体を得ることができる。これらのＶＨＨペプチド単量体型の結合剤は、小さく（約１５ｋＤａ）、製造しやすく、かつ一般的に従来の抗体フラグメントと比べてより安定である［３７〜３９］。ＶＨＨは、それらがプロテアーゼに対して比較的耐性があり、かつ更に操作することでそのような特性を増強することができるため、腸疾患の治療のために調査されている［４０］。該結合剤は、ヒト抗体、例えばＩｇＧ及びヒト抗体のフラグメント、例えばＦｃドメインを用いて融合タンパク質として製造することもできる。
【００８７】
本発明は、ＣＤＩの治療及び予防で使用することができる結合剤の製造においてＨＣＡｂの有利な特徴を利用している。本明細書で開示されるように、ＶＨＨペプチド単量体は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢのエピトープの認識及び結合についてスクリーニングされた。エピトープへの結合を示すとともにトキシン中和活性を有するこれらの単量体を連結させることで、本発明の結合剤を製造した。結合剤には、単純なＶＨＨペプチド単量体及び連結されたＶＨＨペプチド単量体の群（２つ、３つ、４つ又はそれより多くの単量体を含む）、並びに抗体のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体を含むより複雑な結合剤、並びにＩｇＧ抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体が含まれる（図１を参照）。
【００８８】
さらに、サッカロマイセス・ボウラルディは、ＦＤＡによって一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）生物であり、腸の健康促進及び下痢症状による胃腸病の回復に使用するために処方箋なしで一般に入手可能である。この酵母菌株は、ＣＤＩを含む腸疾患に対する安全性及び効力の両方について、多施設無作為化二重盲検プラセボ対照臨床試験において研究されている［４２〜４６］。Ｓ．ボウラルディによる処置は、ＣＤＩの再発を有意に減少させ［４４〜４６］、それらの再発患者は糞便中に、再発しない患者よりも有意に少ないＳ．ボウラルディを有していた［４３］。Ｃ．ディフィシルのトキシンに誘発される炎症に対する保護をもたらすＳ．ボウラルディの免疫調節効果は、記載されている［４７〜４９］。さらに、Ｓ．ボウラルディは、正常な微生物叢の維持を助けることができ［５０］、最近の臨床試験（ＮＣＴ０１４７３３６８）により、Ｓ．ボウラルディの処置が、抗生物質に誘発されるマイクロバイオームの変化を幾らか防ぐことができ、並行して抗生物質関連の下痢を減らすことができることが判明した。
【００８９】
Ｓ．ボウラルディに遺伝的に関連しているＳ．セレビシエ（一般的に「醸造酵母」としても知られる）を使用することで、高収率でＶＨＨを発現することに成功している［５１］。Ｓ．ボウラルディは、Ｓ．セレビシエとは生理学的に異なるが、ゲノム解析により、両者のゲノムはヌクレオチドレベルでは非常に類似していることが分かった［５２、５３］。したがって、Ｓ．セレビシエで使用するために以前に開発された分子遺伝学的ツールは、目下、Ｓ．ボウラルディで使用されており［５４〜５６］、そのため、この共生菌は、ＣＤＩに対する治療剤として操作するための一つの候補となる。
【００９０】
Ｓ．ボウラルディが経口治療剤として使用するのに理想的なものとなる幾つかの追加の代謝的特性が存在する。Ｓ．セレビシエとは異なり、Ｓ．ボウラルディは３７℃でよく育ち、酸性的環境条件により耐性であり［５７］、そのため、経口投与後にヒトの腸管中でより良く生存し、存続することに対して特に高い適性を有する。さらに、サッカロマイセス属菌による実験的口腔内定着マウスモデルは十分に特徴付けられており［５８］、このモデルを使用することで、Ｓ．ボウラルディにより口腔内処置された従来のマウスにおけるサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella Typhimurium）［５８、５９］及びサルモネラ・エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）［６０］等の腸内病原菌による口腔内負荷に対する保護だけでなく、予め処置されたノトバイオート動物におけるＣＤＩ負荷に対する保護も報告されている［５８、６１］。Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方を中和することが可能なＶＨＨ結合剤を分泌するように遺伝子操作された共生Ｓ．ボウラルディは、この共生菌が進行中のＣＤＩ及び再発性ＣＤＩの両方を中断させる治療能力を大きく改善することができるかもしれない。
【００９１】
Ｓ．ボウラルディの例外的な特性を考慮して、本明細書で定義される結合剤を発現するＳ．ボウラルディ菌株を作製し、試験した。実施例に記載されるように、これらの酵母ベースの免疫療法薬は、原発性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩ並びに原発性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩの症状を治療又は予防するために使用することができる。
【００９２】
ＶＨＨ単量体及びＶＨＨヘテロ二量体
国際公開第１６／１２７１０４号にて当初報告されたように、本発明者らは、Ｃ．ディフィシルの両方のトキシンの特異的ドメインに対するＶＨＨ単量体をスクリーニングするための効果的なプラットフォームを確立した。免疫原性の高い非毒性のホロトキシンを免疫化のために使用し、かつ生体活性のキメラ型トキシン（通常のドメイン機能を有する）をスクリーニングのために使用することで、ＶＨＨ単量体の、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢの異なるドメインへの結合のパネルを作製した。これらのＶＨＨ単量体の多くが強力な中和活性を有しており、それらのＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの特異的ドメインへの結合を確認した（図２）。
【００９３】
ＶＨＨ単量体の幾つかは、高度に保存されたＴｃｄＡ／ＴｃｄＢエピトープに結合する。例えば、Ｅ３  ＶＨＨ単量体は、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ結合部位に結合し、グリコシル化を阻止し、ＡＨ３  ＶＨＨ単量体は、該トキシンのＧＴドメインに結合し、７Ｆ  ＶＨＨ単量体は、システインプロテアーゼ開裂部位に結合し、そしてＧＴドメインの開裂及び放出を阻止する。幾つかのＶＨＨ単量体は強力なトキシン中和活性を有しており、トキシンの細胞毒性活性をｎＭ濃度で阻止することが可能である（図２で下線を引いた単量体、図３のＡ及びＢも参照）。表１は、これらのＶＨＨペプチド単量体の一部の野生型及びコドン最適化された形式の両方についての配列表中のアミノ酸配列及び核酸配列を表している。最適化された形式及び最適化されていない形式の両方とも本発明の様々な結合剤の製造において使用することができるが、哺乳動物細胞での発現のためにはコドン最適化された形式が好ましい。
【００９４】
本発明には、表１に引用された各々のＶＨＨペプチド単量体、並びにペプチド配列全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型ペプチドのトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持しているそれらの配列変異体が含まれる。また本発明には、表１の各々のＶＨＨペプチド単量体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの配列変異体、並びにそれらの相補鎖も含まれる。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
ペプチド単量体の結合活性を高めるために、２つのＶＨＨペプチド単量体が連結されたＶＨＨペプチドのホモ二量体型及びヘテロ二量体型の結合剤を作製した（図３のＣ）。ホモ二量体型の結合剤は、２種の異なるトキシンにある同一のエピトープに結合する２つの同一の単量体を含む。ヘテロ二量体型の結合剤は、同じトキシンの２種の異なるエピトープ又は２種の異なるトキシンにある異なるエピトープに結合する２つの異なる単量体を含む。ＶＨＨヘテロ二量体は、ヘテロ二量体を含む個別のＶＨＨペプチド単量体の等モルの混合物と比較して、本質的に増強された中和活性を有することが分かった（図３のＤ）。確かにヘテロ二量体５Ｄ／Ｅ３及びＡＨ３／ＡＡ６は、致死的な全身性のＴｃｄＢ負荷又はＴｃｄＡ負荷からそれぞれマウスを十分に防御することが見出されたが、５ＤとＥ３とを混合したもの、又は単独のＡＡ６は、部分的にのみ防御性であるに過ぎなかった（図３のＥ及びＦ）。
【００９７】
ホモ二量体及びヘテロ二量体におけるＶＨＨ単量体は、１０個から２０個の間のアミノ酸の短いフレキシブルなリンカーを使用して連結される。適切なリンカーには、表２で規定されたリンカーが含まれる。また表２には、コドン最適化された形式の３種のリンカーも含まれる。最適化された形式及び最適化されていない形式の両方とも本発明の様々な結合剤の製造において使用することができるが、哺乳動物細胞における発現のためにはコドン最適化された形式が好ましい。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
当業者によれば、上記ペプチドの特性から逸脱することなく、フレキシブルなリンカーの配列に小さな変更を加えることができることは理解されよう。したがって、ペプチド配列の全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ基礎を成すリンカーの特性を維持しているフレキシブルなリンカーの配列変異体を使用することができる。
【０１００】
本発明には、先に定義されたフレキシブルなリンカーによって連結された、表１に列挙された単量体のいずれかの対を含むＶＨＨペプチドホモ二量体型の結合剤が含まれる。また本発明には、先に定義されたフレキシブルなリンカーによって連結された、表１に列挙された単量体の２つの任意の組み合わせを含むＶＨＨペプチドヘテロ二量体型の結合剤も含まれる。ヘテロ二量体の例は、表３に規定される。
【０１０１】
【表３】
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【０１０２】
また本発明には、タンパク質配列の全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持しているＶＨＨペプチドホモ二量体及びヘテロ二量体の配列変異体も含まれる。さらに、本発明には、各々のＶＨＨペプチドホモ二量体、ヘテロ二量体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの配列変異体、並びにそれらの相補鎖が含まれる。
【０１０３】
また本発明には、３つの単量体が、先の表２で定義されたフレキシブルなリンカーを使用して連結された、ＶＨＨペプチドホモ三量体型及びヘテロ三量体型の結合剤も含まれる。同じ単量体を３つ含む三量体、同じ単量体を２つ及び別の単量体を１つ含む三量体、並びに異なる単量体を３つ含む三量体を含む表１の単量体の任意の組み合わせを使用することができる。タンパク質配列の全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持しているＶＨＨペプチドホモ三量体及びヘテロ三量体の配列変異体が本発明に含まれる。さらに、本発明には、各々のＶＨＨペプチドホモ三量体、ヘテロ三量体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの配列変異体、並びにそれらの相補鎖が含まれる。
【０１０４】
ＡＢＡＢ
ペプチド単量体及びヘテロ二量体の成功によって、本発明者らは、４つの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤の開発が可能となった。このことは、調査の目標であった。それというのも、過去の研究では、殆どの病原性Ｃ．ディフィシル菌株に対する十分な防御をもたらすためにはＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方を同時に中和することができることが必要であると考えられるため、それが可能な単独の抗体がＣＤＩの治療及び予防において最も有効な結合剤であることを示しているからである。各々のトキシンにある２種のエピトープを認識し結合する四重特異性の結合剤を作製することによって、該タンパク質の結合活性及び中和活性を強化することができる。したがって、４ドメイン型（四重特異性）ＶＨＨ結合剤が作製された。
【０１０５】
四重特異性の四量体型結合剤は、表１の単量体のいずれかの組み合わせから製造することができ、ここで該単量体は、表２のフレキシブルなリンカーを使用して連結される。これらの結合剤は、同じ単量体を４つ有する結合剤から、同じ単量体を３つ有する結合剤まで、同じ単量体を２つ有する結合剤まで、４つの固有の単量体を有する結合剤までの範囲及びその範囲内の別形を含む。タンパク質配列の全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持している該四量体の配列変異体が本発明に含まれる。さらに、本発明には、各々の四量体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの配列変異体、並びにそれらの相補鎖が含まれる。
【０１０６】
ＡＢＢＡは、４つの連結されたＶＨＨ単量体、つまりＡＨ３−Ｅ３−Ｅ３−ＡＡ６を含む本発明の特定の結合剤である。このように、ＡＢＢＡは、２つの同じ単量体（Ｅ３）と、２つの追加の異なる単量体（ＡＨ３及びＡＡ６）とを有する（表１を参照）。
【０１０７】
ＡＢＡＢは、４つの連結されたＶＨＨ単量体を含み、その各々がＴｃｄＡ又はＴｃｄＢの異なるエピトープに対して結合特異性を有する、本発明の別の特定の結合剤である。したがって、ＡＢＡＢは、４つの異なる中和性ＶＨＨ単量体からなり、２つがＴｃｄＡに対するものであり、かつ２つがＴｃｄＢに対するものである、四重特異性の四量体型結合剤である。この構造的特徴は、ＡＢＡＢが、各々のトキシンにある２種の異なる中和エピトープに同時に結合することを可能にする。以下に記載されるように、ＡＢＡＢの親和性／結合力及び中和活性は、ＣＤＩの治療のために現在臨床試験中のヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭａｂ）と比べて３−ｌｏｇ超も高い。
【０１０８】
ＡＢＡＢ結合剤は、ＶＨＨ単量体のＡＨ３、５Ｄ、ＡＡ６及びＥ３（表１）をフレキシブルなリンカー（表２）を用いて連結させることによって製造した。この結合剤は、保存された重複していないエピトープを標的とし、優れたトキシン中和活性を有する。ＡＢＡＢ（図４）の設計において、ＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３及びＡＡ６を、それらの間に５Ｄを配置することによって隔てた。それというのも、ＡＨ３及びＡＡ６は、互いに空間的に距離が置かれたＧＴ及びＴＤにそれぞれ結合するからである（図２）。この設計により、ＡＨ３及びＡＡ６は、ＴｃｄＡに同時に結合することが可能となった。
【０１０９】
ＡＢＡＢを含む完全なアミノ酸配列は、配列番号１９に規定され、そのタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２０に規定されている。したがって、本発明には、配列番号１９に規定されるＡＢＡＢ結合剤、並びにタンパク質配列の全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持している該ＡＢＡＢ結合剤の配列変異体が含まれる。配列変異体はヒト化され、及び／又はアミノ酸が、酵母による産生及び分泌に最適化されている変異体を含む。
【０１１０】
さらに、本発明には、ＡＢＡＢ結合剤をコードするポリヌクレオチド配列（例えば配列番号２０）及びそれらの配列変異体、並びにそれらの相補鎖が含まれる。
【０１１１】
本発明により包含されるＡＢＡＢ結合剤の修飾物には、（ｉ）精製を補助するためのタンパク質のアミノ末端でのＨｉｓ（６）タグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号６６）、（ｉｉ）検出を補助するためのタンパク質のカルボキシ末端でのＥタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ；配列番号６７）、（ｉｉｉ）ＶＨＨ単量体が２時間〜３時間の半減期を有し、ＡＢＰの封入が血清半減期を１０時間へと増大させ得るので、該タンパク質の血清半減期を増大させるための構築物のカルボキシル末端でのアルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）（ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＤ；配列番号２１）（図４を参照）、並びにタンパク質のカルボキシ末端でのＤ７タグ（ＳＳＡＰＴＫＡＫＲＲＶＶＱＲＥＫＴ；配列番号１１２）の１つ以上を有する結合剤が含まれる。本発明は、ＡＢＡＢ結合剤がこれらのタグ及びペプチドの１つ、２つ、３つ、又は４つを有するものを含む。Ｈｉｓタグ及びＤ７タグを含む修飾されたＡＢＡＢ結合剤の一例は、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列を含む（コーディング配列は、配列番号１１４に示されている）。
【０１１２】
酵母菌株がＡＢＡＢを産生するように操作される場合に、そのタンパク質は、該タンパク質のアミノ末端に分泌シグナルを含むように修飾されてもよい。分泌シグナルは、限定されるものではないが、表４に示される配列のうちの１つであってもよい。
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
アミノ末端分泌シグナルを含む修飾されたＡＢＡＢ結合剤の例には、ＡＴ−ＡＢＡＢ及びＩＶＳ−ＡＢＡＢが含まれる。
【０１１５】
酵母又は細菌中のプラスミドから発現される修飾されたＡＢＡＢ結合剤の一例は、配列番号１０７に示されるＡＢＡＢ結合剤を含み、それは、配列番号１０８に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１６】
染色体組込み後に酵母中で発現される修飾されたＡＢＡＢ結合剤の一例は、配列番号１０９に示されるＡＢＡＢ結合剤を含み、それは、配列番号１１０に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１７】
本発明の結合剤は各々、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに特異的に結合する。本発明の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ中和活性及び／又はＴｃｄＢ中和活性を示す。
【０１１８】
明快にするために、本明細書で使用される場合に「一重特異性」、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」等は、特定の結合剤が１種、２種、３種、４種等といった異なるエピトープにそれぞれ結合することを意味すると述べることができる。本明細書で使用される場合に、「単量体型」、「二量体型」、「三量体型」、「四量体型」等は、特定の結合剤が、１つ、２つ、３つ、４つ等の、それぞれのエピトープに結合する別々のＶＨＨペプチド単量体を有することを意味する。したがって、一重特異性の二量体型結合剤は、同じエピトープに結合する２つのＶＨＨペプチド単量体（例えばホモ二量体）を表し、二重特異性の二量体型結合剤は、２種の異なるエピトープに結合する２つのＶＨＨペプチド単量体（例えばヘテロ二量体）を有することとなる。四重特異性の八量体型結合剤は、４種の異なるエピトープを認識する８つのＶＨＨペプチド単量体を有する。
【０１１９】
ＶＨＨ−Ｆｃ
キメラＦｃ融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質の半減期を高める能力を有することがよく知られている。この戦略は、幾つかのＦＤＡ認可薬剤、例えばエタネルセプトで利用されている。原理証明研究は、単鎖抗体が、正しく集合し、かつヒトコブラクダＶＨＨ及びヒトＩｇＧのＦｃドメインをコードするｍｉｎｉ−Ｉｇ構築物を有するトランスジェニックマウスのＢ細胞によって発現されることを示している。またキメラ抗ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＶＨＨであるＥＧ２−Ｆｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏで優れた腫瘍集積を示し、膠芽細胞腫のターゲティングを改善し得る薬物動態特性を有する。
【０１２０】
本発明には、抗体のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体（ＶＨＨ−Ｆｃ）を含む結合剤であって、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに結合する、結合剤が含まれる。これらのＦｃドメインベースの結合剤においては、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体が、抗体重鎖のＦｃドメインのヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域に結合されている。したがって、ペプチド単量体は、該抗体のＦａｂ領域と置き換えられている。
【０１２１】
ＶＨＨペプチド単量体は、先の表１に規定されたいずれかの単量体であってもよく、該単量体には、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。２つ以上の単量体が連結されている場合には、それらの単量体は、一般的に１０個から２０個の間のアミノ酸を含むフレキシブルなペプチドリンカーによって連結され得る。適切なリンカーには、表２に規定されるリンカー、例えばリンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）が含まれる。
【０１２２】
ＶＨＨ−Ｆｃが一般的に、産生後に細胞内で自己集合する２つの同一鎖から構成される場合には、本発明には、２種の異なるＦｃ鎖を含むＶＨＨ−Ｆｃ結合剤も含まれる。そのような状況において、１種以上のＶＨＨ単量体の配列だけが、２つのＦｃ鎖の間で異なっていてもよく、又はＦｃ鎖自体が、異なる配列であってもよく、又は１種以上のＶＨＨ単量体及びＦｃ鎖の両方が、異なる配列であってもよい。
【０１２３】
ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤の１つの型は、抗体のＦｃドメインと、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む八量体型結合剤であって、ＶＨＨペプチド単量体が、ＴｃｄＡ又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有し、上記第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、共に連結され、かつ両方の抗体のＦｃドメインのアミノ末端に結合され、かつ上記抗体のＦｃドメインが、抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む、結合剤である。この結合剤は、４つのＶＨＨペプチド単量体を有することから、該結合剤は、一重特異性（単量体の全てが同じエピトープに結合する場合）、二重特異性（単量体が２種の異なるエピトープに結合する場合）、三重特異性（単量体が３種の異なるエピトープに結合する場合）又は四重特異性（単量体が４種の異なるエピトープに結合する場合）であってもよい。
【０１２４】
四重特異性のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤の具体的な一例は、ＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤、つまりは抗体のＦｃドメインと、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、上記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームはアミノ末端を有しており、該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該アームのアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤である（図１を参照）。この結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「四重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、８つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ、同じ第二の単量体を２つ、同じ第三の単量体を２つ及び同じ第四の単量体を２つ）を有するため、「八量体型」と呼ばれる。ＡＢＡＢ−Ｆｃは、特異的な結合活性及び中和活性を示すことが判明した。
【０１２５】
ＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３／５Ｄ／ＡＡ６／Ｅ３（示される順序で連結される）をコードする発現ベクターを作製することによって製造した。それらのＶＨＨペプチド単量体は、表２のフレキシブルなリンカーによって隔てられている。それぞれの鎖をコードする核酸配列は、配列番号２３に規定されている。それぞれの鎖のアミノ酸配列は、配列番号２２に規定されている。発現後の対となる鎖の自己集合にあたり、四重特異性の八量体型結合剤が得られた。本発明には、配列番号２２のＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤、上記で定義されたＡＢＡＢ結合剤の修飾物並びにタンパク質配列の全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持している配列変異体が含まれる。さらに、本発明には、これらの配列変異体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの相補鎖が含まれる。
【０１２６】
一重特異性のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤（ＡＨ３−Ｆｃ、５Ｄ−Ｆｃ、Ｅ３−Ｆｃ、ＡＡ６−Ｆｃ）及び二重特異性のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤（例えば、ＡＨ３／５Ｄ−Ｆｃ及びＡＡ６／Ｅ３−Ｆｃ）も、このＦｃ融合系を使用して作られた。一重特異性の結合剤に関しては、単独のＶＨＨペプチド単量体を、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合させた。発現及び集合において、対となる鎖から、一重特異性の二量体型結合剤（それらの鎖が同一である場合）又は二重特異性の二量体型結合剤（それらの鎖が異なる場合）が得られた。二重特異性の結合剤に関しては、２つの連結されたＶＨＨペプチド単量体（ＶＨＨホモ二量体又はヘテロ二量体）を、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合させた。発現及び集合において、対となる鎖から二重特異性の四量体型結合剤（それらの鎖が同一である場合）又は四重特異性の四量体型結合剤（それらの鎖が異なる場合）が得られた。表５は、これらの幾つかの結合剤についての配列を規定している。
【０１２７】
【表５】
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【０１２８】
１つの単量体との具体的な対合には、５Ｄ−Ｆｃ＋５Ｄ−Ｆｃ；Ｅ３−Ｆｃ＋Ｅ３−Ｆｃ；ＡＡ６−Ｆｃ＋ＡＡ６−Ｆｃ；ＡＨ３−Ｆｃ＋ＡＨ３−Ｆｃ；５Ｄ−Ｆｃ＋Ｅ３−Ｆｃ；５Ｄ−Ｆｃ＋ＡＡ６−Ｆｃ；５Ｄ−Ｆｃ＋ＡＨ３−Ｆｃ；Ｅ３−Ｆｃ＋ＡＡ６−Ｆｃ；Ｅ３−Ｆｃ＋ＡＨ３−Ｆｃ；及びＡＡ６−Ｆｃ＋ＡＨ３−Ｆｃが含まれる。２つの単量体との具体的な対合には、ＡＨ３−５Ｄ−Ｆｃ＋ＡＨ３−５Ｄ−Ｆｃ；ＡＡ６−Ｅ３−Ｆｃ＋ＡＡ６−Ｅ３−Ｆｃ；及びＡＨ３−５Ｄ−Ｆｃ＋ＡＡ６−Ｅ３−Ｆｃが含まれる。
【０１２９】
抗体のＦｃドメインと、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体とを含む二重特異性の四量体型ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤であって、上記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームはアミノ末端を有しており、該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、該アームのアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤が製造された。この結合剤は、２種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「二重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、４つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ及び同じ第二の単量体を２つ）を有するため、「四量体型」と呼ばれる。第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、同じエピトープ又は異なるエピトープに対する結合特異性を有していてもよい。ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有していてもよい。
【０１３０】
二重特異性の四量体型ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤の具体的な一例は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３／５Ｄ−Ｆｃ）を含む。また本発明には、少なくとも９５％の配列同一性を有し、トキシン中和活性を維持しているその配列変異体も含まれる。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。
【０１３１】
二重特異性の四量体型ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤の具体的な一例は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６／Ｅ３−Ｆｃ）を含む。また本発明には、少なくとも９５％の配列同一性を有し、トキシン中和活性を維持しているその配列変異体も含まれる。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。
【０１３２】
ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤は、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに特異的に結合する。本発明の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ中和活性及び／又はＴｃｄＢ中和活性を示す。
【０１３３】
ＶＨＨ−ＩｇＧ
また本発明には、Ｆｃドメインのみではなく抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤が含まれる。ＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤は、抗体の可変領域を欠いたＩｇＧ抗体の軽（κ又はλ）鎖及び重鎖に結合された１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体を含む。したがって、ペプチド単量体は、該抗体の可変領域と置き換えられている。
【０１３４】
ＶＨＨペプチド単量体は、先の表１に規定されたいずれかの単量体であってもよく、該単量体には、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。２つ以上の単量体が連結されている場合には、それらの単量体は、一般的に１０個から２０個の間のアミノ酸を含むフレキシブルなペプチドリンカーによって連結され得る。適切なリンカーには、表２に規定されるリンカー、例えばリンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）が含まれる。
【０１３５】
ＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤には、ＩｇＧ抗体と、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む八量体型結合剤であって、ＶＨＨペプチド単量体が、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有し、上記第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、共に連結され、かつ上記抗体の、抗体可変領域を欠いた両方の軽鎖のアミノ末端に結合され、かつ上記第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、共に結合され、かつ上記抗体の、抗体可変領域を欠いた両方の重鎖のアミノ末端に結合されている、結合剤が含まれる。この結合剤は、４つのＶＨＨペプチド単量体を有することから、該結合剤は、一重特異性（単量体の全てが同じエピトープに結合する場合）、二重特異性（単量体が２種の異なるエピトープに結合する場合）、三重特異性（単量体が３種の異なるエピトープに結合する場合）又は四重特異性（単量体が４種の異なるエピトープに結合する場合）であってもよい。
【０１３６】
四重特異性のＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤の具体的な一例は、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ結合剤、つまりはＩｇＧ抗体と、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体と、２組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、上記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、該抗体の各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体が、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ１組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤である（図１を参照）。この結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「四重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、８つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ、同じ第二の単量体を２つ、同じ第三の単量体を２つ及び同じ第四の単量体を２つ）を有するため、「八量体型」と呼ばれる。或る特定の態様において、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有することができる。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有することができ、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有することができる。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【０１３７】
四重特異性の八量体型ＡＢＡＢ−ＩｇＧ結合剤の具体的な一例は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する軽（κ）鎖（ＡＡ６／Ｅ３κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体、及び配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖（ＡＨ３／５Ｄ重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含む。この態様においては、該配列変異体は、トキシン中和活性を維持している。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。この結合剤は、第一の発現ベクターが、可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体重鎖に結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３／５Ｄ（示される順序で連結される）をコードし、第二の発現ベクターが、可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体の軽（κ）鎖に結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＡ６／Ｅ３（示される順序で連結される）をコードする２つの別個の発現ベクターを作製することによって製造された。ＡＡ６／Ｅ３−ＩｇＧ１軽（κ）鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４７に規定されている。ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ１重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４５に規定されている。本発明には、タンパク質配列の全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持しているＡＢＡＢ−ＩｇＧの配列変異体が含まれる。さらに、本発明には、これらの配列変異体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの相補鎖が含まれる。
【０１３８】
二重特異性又は四重特異性の四量体型ＩｇＧ結合剤は、本発明に含まれる。そのような結合剤は、ＩｇＧ抗体と、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含み、上記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、該抗体の第一のアームにつき、第一のＶＨＨペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第二のＶＨＨペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、該抗体の第二のアームにつき、第三のＶＨＨペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第四のＶＨＨペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体は、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。結合剤が「四重特異性」である場合に、該結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識し、「二重特異性」の場合には、該結合剤は、２種の異なるトキシンのエピトープを認識する。結合剤は、それらが４つのＶＨＨペプチド単量体を有する場合には「四量体型」である（二重特異性の場合に、第一の単量体及び第二の単量体は同じ配列を有し、同じエピトープに結合し、かつ第三の単量体及び第四の単量体は同じ配列を有し、同じエピトープに結合する；四重特異性の場合に、各々の単量体は異なる配列を有し、異なるエピトープに結合する）。
【０１３９】
結合剤が二重特異性である場合に、第一の単量体及び第三の単量体は、異なるエピトープに対する結合特異性を有し、第一の単量体及び第二の単量体は、同一のアミノ酸配列を有し、かつ第三の単量体及び第四の単量体は、同一のアミノ酸配列を有する。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち１つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつＶＨＨペプチド単量体のうち１つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【０１４０】
結合剤が四重特異性である場合に、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、異なるエピトープに対する結合特異性を有する。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【０１４１】
或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有する。他の態様において、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【０１４２】
或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【０１４３】
二重特異性の四量体型ＩｇＧ結合剤の具体的な一例は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有する軽（κ）鎖（ＡＡ６κ）及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖（ＡＨ３重鎖）を含む。また本発明には、少なくとも９５％の配列同一性を有し、トキシン中和活性を維持しているその配列変異体も含まれる。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。
【０１４４】
二重特異性の四量体型ＩｇＧ結合剤のもう一つの具体的な例は、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する軽（κ）鎖（Ｅ３κ）及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖（５Ｄ重鎖）を含む。また本発明には、少なくとも９５％の配列同一性を有し、トキシン中和活性を維持しているその配列変異体も含まれる。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置していてもよい。
【０１４５】
表６は、二重特異性及び四重特異性のＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤を作製するために使用される配列を規定している。その他の適切な対合には、（ｉ）５Ｄ−ＩｇＧ１−重鎖＋ＡＡ６−軽（κ又はλ）鎖、及び（ｉｉ）ＡＨ３−ＩｇＧ１−重鎖＋Ｅ３−軽（κ又はλ）鎖が含まれる。
【０１４６】
【表６】
2018536396.tif 000008
【０１４７】
しかしながら、本発明には、ＡＨ３、５Ｄ、ＡＡ６及びＥ３のいずれかに結合されたＩｇＧ１重鎖、並びにＡＨ３、５Ｄ、ＡＡ６及びＥ３のいずれかに結合されたＩｇＧ１軽（κ又はλ）鎖が含まれる。さらに、重鎖及び軽（κ又はλ）鎖の全ての可能な組み合わせが、本明細書に包含される。
【０１４８】
ヒト化された結合剤
ＶＨＨペプチド単量体は、それらの小さいサイズ及びそれらの骨格のファミリーＩＩＩのヒトＶＨ骨格との高度の同一性のため、ヒトに投与される場合に低い免疫原性しか示さないことが期待される。小さい一価ＶＨＨ単量体の全身性適用は、あってもごく僅かな中和性の抗体応答しか誘発しないと思われるが、タンパク質の免疫原性は、一般的にサイズ及び複雑さに伴って増大する。ＶＨＨ単量体の繰り返しの及び／又は長期にわたるｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のための２つの大きな障壁は、それらの短いと考えられる半減期及び潜在的な免疫原性である。価数及び血中半減期を高めるために、ＶＨＨ単量体は、本明細書で論じられるようにヒトＩｇＧ及びＦｃドメインと融合させることができる。考えられる免疫原性に対処するために、ＶＨＨ単量体は、その発現レベル、親和性、可溶性及び安定性を損なうことなく、必要に応じてヒト化することができる。これらの戦略は、ループドナーＶＨＨの抗原特異性及び親和性を維持しながら、ヒト化されたＶＨＨ単量体（ｈＶＨＨ単量体）の良好な発現、安定性及び可溶性をもたらすはずである。
【０１４９】
１つ以上のヒトＶＨ遺伝子との最高の同一性を確保し、最高の結合／中和活性を有するｈＶＨＨ単量体を選択し、その後に、該単量体は、ＶＨＨ多量体（例えば、ＡＢＡＢ）、ＶＨＨ−Ｆｃ及びＶＨＨ−ＩｇＧ構築物へと変換され、こうして完全ヒト化された結合剤、例えば完全ヒト化されたＡＢＡＢ、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ結合剤及びＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤が作製される。これらのヒト化された結合剤のタンパク質配列は、抗体のその標的抗原への結合能を担うＣＤＲセグメントの幾つかが非ヒト起源であるにもかかわらず、ヒト抗体変異体の配列と本質的に同一であり得る。したがって、この戦略は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの潜在的な免疫原性の可能性を低下させることで、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの安全性及び半減期を高める。
【０１５０】
したがって、本発明の結合剤は、本明細書で定義されたそれぞれの結合剤の、ｈＶＨＨペプチド単量体を含むヒト化された形式を包含する。
【０１５１】
エピトープ結合断片
本発明の結合剤には、本明細書で定義されるＶＨＨ−Ｆｃ結合剤及びＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤のそれぞれのエピトープ結合断片が含まれる。ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤及びＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤は、可変領域がＶＨＨ単量体によって置き換えられたヒトＩｇＧ抗体と構造の点で同等であることから、ヒト抗体フラグメントに関する用語は、そのような結合剤についても該当し得る。該フラグメントには、限定されるものではないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、及びＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、並びに二重特異性抗体及び三重特異性抗体が含まれる。
【０１５２】
本発明のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤及びＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤には、完全にヒト型の結合剤、ヒト化された結合剤、及びキメラ型結合剤が含まれる。結合剤は、モノクローナル型又はポリクローナル型であってもよい。さらに、結合剤は、組換え型の結合剤であってもよい。
【０１５３】
結合剤は、任意の種の動物において、けれども好ましくは哺乳動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ又はネコにおいて産生させることができる。例えば結合剤は、ヒト型若しくはヒト化されたものであってもよく、又はヒトへの投与に適したあらゆる結合剤調製物であってもよい。
【０１５４】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞及び作製方法
本発明には、本明細書で規定される各々の結合剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド及びそれらの相補鎖が含まれる。
【０１５５】
また本発明には、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び該発現ベクターを含む宿主細胞も含まれる。適切な発現ベクターには、例えばｐｃＤＮＡ３．１及びｐＳｅｃ−Ｈｉｓ、並びに酵母細胞を本発明の結合剤の産生体及び分泌体へと形質転換するのに使用されるプラスミドが含まれる。適切な宿主細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３細胞）、酵母細胞、及び昆虫細胞が含まれる。
【０１５６】
さらに、本発明には、本明細書で定義される結合剤を製造する方法であって、宿主細胞を、発現ベクターによってコードされる結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法が含まれる。
【０１５７】
操作された酵母菌株
本発明の結合剤の各々は、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株によって産生されてもよい。したがって、本発明はまた、本明細書で定義される結合剤（限定されるものではないが、ＶＨＨ単量体型の結合剤（表１を参照）、ＶＨＨホモ二量体型の結合剤、ＶＨＨヘテロ二量体型の結合剤（表３を参照）、ＡＢＡＢ結合剤、ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤（表５を参照）、ＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤（表６を参照）、及びそれらのエピトープ結合フラグメントを含む）のうちの１種以上を産生するように操作されたサッカロマイセス属酵母菌株、例えばＳ．セレビシエ及びＳ．ボウラルディに関する。好ましい態様においては、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、結合剤を分泌する。
【０１５８】
サッカロマイセス属酵母菌株のその個性は、本発明の１種以上の結合剤を産生し、好ましくは分泌するように操作され得ることにのみ限定される。本発明の好ましい態様においては、１種以上の結合剤を産生するように操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。このように、本発明は、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生する操作されたＳ．セレビシエ菌株、並びに本明細書で定義される１種以上の結合剤を分泌する操作されたＳ．セレビシエ菌株を含む。また、本発明は、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生する操作されたＳ．ボウラルディ菌株、並びに本明細書で定義される１種以上の結合剤を分泌する操作されたＳ．ボウラルディ菌株を含む。適切な酵母菌株には、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロマイセス・パラドクサス（Saccharomyces paradoxus）、及びサッカロマイセス・ウニスポラス（Saccharomyces unisporus）も含まれる。
【０１５９】
Ｓ．ボウラルディは、ＦＤＡ指定の一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）生物であり、腸の健康促進及び下痢症状による胃腸病の回復に使用するために処方箋なしで一般に入手可能である。この酵母種は、ＣＤＩを含む腸疾患に対する安全性及び効力の両方について、多施設無作為化二重盲検プラセボ対照臨床試験において研究されている［４２〜４６］。適切なＳ．ボウラルディ菌株は、Ｓ．ボウラルディ菌株ＭＹＡ７９６（ＡＣＴＴ、バージニア州、マナサス）である。
【０１６０】
本発明の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株の具体例は、ＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤、又は２つ、３つ、４つ若しくはそれより多くの単量体を含む連結されたＶＨＨペプチド単量体の群を含む結合剤であって、該単量体の各々がＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに、好ましくは特異的に結合する結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株である。このように、本発明は、少なくとも１つのＶＨＨペプチド単量体を含むＶＨＨペプチド結合剤であって、各々のＶＨＨペプチド単量体が、Ｃ．ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対して結合特異性を有する結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を包含する。或る特定の態様において、これらの結合剤は、２つ、３つ、４つ又はそれより多くの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む。ＶＨＨペプチド単量体には、限定されるものではないが、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。
【０１６１】
本発明の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株の別の具体例は、本明細書で定義される、ＩｇＧ抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体を含む、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに結合する結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株である。これらのＩｇＧベースの結合剤においては、ＩｇＧ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域が、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体によって置き換えられている。
【０１６２】
本発明の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株の更なる具体例は、本明細書で定義される、抗体Ｆｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体を含む、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに結合する結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株である。これらのＦｃドメインベースの結合剤においては、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体が、抗体重鎖のＦｃドメインの各アームのヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域に結合されている。したがって、ペプチド単量体は、抗体のＦａｂ領域と置き換えられている。
【０１６３】
本発明の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株の追加の具体例は、四重特異性の四量体型結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株であって、上記結合剤は、連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体、及び第四のＶＨＨペプチド単量体を含み、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体は、独立して、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対して結合特異性を有する、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株である。或る特定の態様において、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体、及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。適切なＶＨＨペプチド単量体には、ＡＨ３単量体（配列番号７）、ＡＡ６単量体（配列番号５）、５Ｄ単量体（配列番号１）、及びＥ３単量体（配列番号３）が含まれる。その他の単量体は、限定されるものではないが、表１に示される単量体を含む。
【０１６４】
好ましい例においては、本発明は、上記結合剤はＡＢＡＢであり、ここで第一の単量体及び第三の単量体は、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ第一の単量体及び第三の単量体は、それぞれＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３（配列番号７）及びＡＡ６（配列番号５）であり、かつ第二の単量体及び第四の単量体は、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ第二の単量体及び第四の単量体は、それぞれＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）及びＥ３（配列番号３）である、操作された酵母菌株に関する。
【０１６５】
ＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含んでよく、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。
【０１６６】
ＡＢＡＢ結合剤は、表４に示される分泌シグナルから選択されるＮ末端分泌シグナルを含んでいてもよい。好ましい態様においては、Ｎ末端分泌シグナルは、ＡＴ分泌シグナル（ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡ（配列番号９９））又はＩＶＳ分泌シグナル（ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ（配列番号１０３））である。
【０１６７】
ＡＢＡＢ結合剤は、酵母内のプラスミドから発現されていてもよい。そのプラスミドは、限定されるものではないが、ｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ−ｃＭｙｃ（配列番号８８）であってもよい。プラスミドによりコードされるＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含んでよく、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。
【０１６８】
ＡＢＡＢ結合剤は、酵母の染色体中に組み込まれたコーディング配列から発現していてもよい。酵母染色体中に組み込まれたコーディング配列から発現されるＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含んでよく、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。
【０１６９】
また本発明は、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）若しくはトキシンＢ（ＴｃｄＢ）の固有のエピトープ、又は両方に対する結合特異性を有する治療タンパク質を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株に関する。好ましくは、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。治療タンパク質は、被験体における医学的状態の改善若しくは治癒をもたらすことができるか、又は被験体において医学的状態が発生することを防止若しくは抑制することができるあらゆるタンパク質である。適切な治療タンパク質には、限定されるものではないが、（ａ）欠陥又は異常のあるタンパク質に置き換わるタンパク質、（ｂ）既存の経路を増加させるタンパク質、（ｃ）新規の機能又は活性を提供するタンパク質、（ｄ）分子又は生物と干渉するタンパク質、及び（ｅ）放射線核種、細胞傷害性薬物又はエフェクタータンパク質等のその他の化合物又はタンパク質を送達するタンパク質が含まれる。また治療タンパク質には、抗体及び抗体ベース薬物、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固薬、血液因子、骨形成タンパク質、操作された足場タンパク質、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、並びに血栓溶解薬も含まれる。さらに治療タンパク質は、二重特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び多重特異性融合タンパク質、小分子薬物と結合されたモノクローナル抗体、並びに最適化された薬物動態を有するタンパク質が含まれる。
【０１７０】
操作された酵母菌株の作製方法
また本発明は、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生するようにサッカロマイセス属酵母菌株を操作する方法に関する。操作された酵母菌株を作製するために使用される手段は、特に限定されるものではなく、酵母を操作して同種タンパク質及び異種タンパク質を産生するために利用可能な当業者に知られている十分に確立されている数多くの技術が存在する。これらの方法の或る特定の態様においては、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディは、結合剤を産生するように操作されている。
【０１７１】
一例として、サッカロマイセス属酵母は、（ａ）サッカロマイセス属酵母菌株を、該結合剤をコードする発現ベクターで形質転換させること、及び（ｂ）得られた酵母を該結合剤の産生についてスクリーニングすることにより、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生するように操作することができる。或る特定の態様において、発現ベクターは、プラスミドｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ−ｃＭｙｃ（配列番号８８）である。このプラスミドは、特定のＡＢＡＢ結合剤をコードするが、この結合剤のためのコーディング領域は、本明細書で定義される結合剤のどのコーディング領域によって置き換えられていてもよい。
【０１７２】
更なる例として、サッカロマイセス属酵母は、（ａ）結合剤をコードするポリヌクレオチド配列を、サッカロマイセス属酵母菌株のゲノム中に染色体組込みすること、及び（ｂ）（ａ）の酵母を該結合剤の産生についてスクリーニングすることにより、本明細書で定義される１種以上の結合剤を産生するように操作することができる。或る特定の態様においては、染色体組込みは、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して行われる［８５〜８８］。一例としては、そのような方法は、（ａ）ＡＢＡＢ結合剤をコードするポリヌクレオチド配列を、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６Ｔ８３Ｎ−タグなし（配列番号９０）から、（ｉ）選択された酵母染色体組込み部位に相同な核酸配列、並びに（ｉｉ）該プラスミドのＡＢＡＢ結合剤をコードする配列の５’領域及び３’領域に相同な核酸配列を含むプライマーを使用して増幅させて、組込みカセットを作製する工程と、（ｂ）酵母を（ａ）で作製された組込みカセットと一緒にｐＣＲＩ−Ｓｂ−δ１（配列番号９１）又はｐＣＲＩ−Ｓｂ−δ２（配列番号９２）で形質転換させることで、相応の酵母染色体のδ部位内で、二本鎖切断の部位中への組込みカセットの自発的組込みを促進する条件下で二本鎖切断を誘導する工程と、（ｃ）（ｂ）の形質転換された酵母を、ＡＢＡＢ結合剤の産生についてスクリーニングする工程とを含んでよい。
【０１７３】
プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６Ｔ８３Ｎ−タグなしは、特定のＡＢＡＢ結合剤をコードするが、この結合剤のためのコーディング領域は、本明細書で定義される結合剤のどのコーディング領域によって置き換えられていてもよい。
【０１７４】
結合剤の産生について酵母をスクリーニングするために使用される適切な手段は、当業者には容易に理解されるものであり、それには、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット等のイムノアッセイが含まれる。
【０１７５】
治療及び予防の方法
本発明の結合剤及び操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、被験体におけるＣ．ディフィシルによって誘発される疾患症状を治療又は予防する方法において使用することができる。これらの方法は、一般的に、治療的有効量の本明細書で定義される１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む。この実施形態の或る特定の態様において、Ｃ．ディフィシルにより誘発された疾患症状は、下痢である。
【０１７６】
また本発明の結合剤及び操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、Ｃ．ディフィシルにより感染された被験体においてＣ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを中和するにあたり使用することもできる。これらの方法は、一般的に、治療的有効量の本明細書で定義される１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む。
【０１７７】
さらに、本発明の結合剤及び操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、被験体におけるＣ．ディフィシル感染症を治療する方法において使用することができる。これらの方法は、一般的に、治療的有効量の本明細書で定義される１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む。これらの同じ方法は、本明細書で定義されるように、ＣＤＩの治療のために使用することができる。
【０１７８】
本発明の結合剤及び操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体において正常な腸機能を維持する方法において使用することもできる。これらの方法は、一般的に、治療的有効量の本明細書で定義される１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む。
【０１７９】
また結合剤及び操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、即時的なＣＤＩの脅威を予防するための免疫予防において使用することもできる。さらに、受動免疫予防は、即時的及び長期的なＣＤＩの脅威の両方を予防するために使用することができる。それぞれのアプローチは、それ自体に特定の利点を伴い、特定の高リスク集団を対象とするために適している。これらの方法は、一般的に、治療的有効量の本明細書で定義される１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を、Ｃ．ディフィシル感染症を発症するリスクがある被験体に投与することを含む。
【０１８０】
本発明の方法の好ましい態様において、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。
【０１８１】
本発明の各々の方法は、１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を、該結合剤及び／又は操作されたサッカロマイセス属酵母菌株と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む１種以上の医薬製剤において投与することを含み得る。好ましい態様において、サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである。
【０１８２】
本明細書で使用される場合に、用語「治療する」、「治療している」、及び「治療」は、それらの通常かつ慣例的な意味を有し、その用語には、被験体におけるＣ．ディフィシル感染症若しくはＣ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＩ）の阻止、回復若しくはそれらの症状の重症度及び／又は頻度の低下、及び／又はＣ．ディフィシルに感染した被験体におけるＣ．ディフィシルのＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢの生物学的活性の部分的若しくは完全な阻害及び／又はその免疫学的クリアランスの増進、及び／又は被験体におけるＣ．ディフィシル細胞の成長、分裂、伝播若しくは増殖、若しくはＣ．ディフィシル感染の１つ以上が含まれる。治療とは、本発明の方法を実施していない被験体に対する約１％〜約１００％の阻止、回復、低下又は阻害を意味する。好ましくは、その阻止、回復、低下又は阻害は、本発明の方法を実施していない被験体に対して約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は１％である。
【０１８３】
本明細書で使用される場合に、用語「予防する」、「予防している」、及び「予防」は、それらの通常かつ慣例的な意味を有し、その用語には、被験体におけるＣ．ディフィシルのコロニー形成、発生若しくは進展の停止、防止、回避、軽減若しくは阻止、及び／又はＣ．ディフィシルに感染した被験体におけるＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢの生物学的活性及び／又は毒性効果の部分的若しくは完全な阻害、及び／又は被験体における細菌細胞の成長、分裂、伝播若しくは増殖、若しくは細菌感染の停止、防止、回避、軽減若しくは阻止の１つ以上が含まれる。予防は、予防処置がされていない被験体に対して、少なくとも約９５％だけ停止することを意味する。好ましくは、その停止は、約１００％、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％又は約９５％である。予防の成果は、日数単位（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日）、週単位（例えば、１週間、２週間、３週間又は４週間）、又は月単位（例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上）の期間にわたって継続し得る。
【０１８４】
本明細書で規定される治療及び予防の方法は、治療的有効量の抗生物質を被験体に投与することによっても補うことができる。好ましくは、抗生物質は、Ｃ．ディフィシルに対する抗菌活性を有することとなる。
【０１８５】
医薬製剤
結合剤及び操作されたサッカロマイセス属酵母菌株が被験体に直接的に投与され得る場合には、本発明の方法は、好ましくは１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤を投与することを基礎とする。したがって、本発明には、本明細書で定義される１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤が含まれる。
【０１８６】
医薬品に許容可能な担体及び希釈剤は、一般的に知られており、投与される具体的な結合剤又は操作されたサッカロマイセス属酵母菌株及び投与方法に応じて様々であってもよい。一般的に使用される担体及び希釈剤の例には、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせ、安定化剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び保存剤、等張剤、増量剤並びに滑沢剤が含まれる。結合剤及び／又は操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を含む製剤は、一般的に、任意の非ヒト成分、例えば動物血清（例えばウシ血清アルブミン）の不存在下に調製及び培養されることとなる。
【０１８７】
１種以上の結合剤及び／又は１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を含む医薬製剤は、被験体へと当業者に既知の方法及び技術を使用して投与することができる。ＣＤＩ疾患の特徴により、該製剤は、治療剤の注腸的送達、すなわち結合剤の下部ＧＩ管、例えば大腸又は結腸に対する狙いを定めた送達を使用する治療及び予防のためにより適したものになり得る。その他の送達方法には、限定されるものではないが、経口投与、鼻内投与、経肛門投与、静脈内注射又はエアロゾル投与が含まれる。他の方法には、限定されるものではないが、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、髄液包内（髄液領域）、頭蓋内、髄腔内及びくも膜下（髄液）が含まれる。
【０１８８】
投与の手段に応じて、投与量は、一度に全て、例えばカプセル剤若しくは液剤の経口用製剤で投与されてもよく、又はゆっくりと時間をかけて、例えば筋内若しくは静脈内投与で投与されてもよい。
【０１８９】
被験体に投与される単独の又は医薬製剤中の結合剤の量は、感染症の治療又は予防のために有効な量である。したがって、治療的有効量は、本発明の方法が実施される場合に被験体に投与される。一般的に、被験体の体重１ｋｇ当たりに約１μｇから約１０００ｍｇの間の結合剤が投与される。また適切な範囲には、約５０μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの間が含まれ、かつ約１０μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの間も含まれる。しかしながら、被験体に投与される結合剤の量は、場所、起源、感染症の程度及び重症度、治療されるべき被験体の年齢及び状態、投与手段等に依存して広い範囲の間で変動することとなる。医師は、最終的に使用すべき適切な投与量を決定するであろう。
【０１９０】
被験体に投与される単独の又は医薬製剤中の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株の量は、感染症の治療又は予防のために有効な量である。したがって、治療的有効量は、本発明の方法が実施される場合に被験体に投与される。一般的に、被験体の体重１ｋｇ当たりに約１μｇから約１０００ｍｇの間の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株が投与される。また適切な範囲には、約５０μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの間が含まれ、かつ約１０μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの間も含まれる。しかしながら、被験体に投与される操作されたサッカロマイセス属酵母菌株の量は、場所、起源、感染症の程度及び重症度、治療されるべき被験体の年齢及び状態、投与手段等に依存して広い範囲の間で変動することとなる。医師は、最終的に使用すべき適切な投与量を決定するであろう。
【０１９１】
結合剤、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株、並びに結合剤及び／又は操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を含む医薬製剤の投与頻度は、細菌感染の位置、治療又は予防されるべき感染症の詳細、及び投与方法を含む要因に応じて変動することとなる。それぞれの製剤は、独立して、１日４回、３回、２回若しくは１回、１日置きに、２日置きに、３日置きに、４日置きに、５日置きに、１週間に１回、７日置きに、８日置きに、９日置きに、隔週で、毎月、そして隔月で投与してもよい。
【０１９２】
治療又は予防の期間は、治療される感染の位置及び重症度又は感染症に罹る相対リスクを基礎とすることとなり、所属医師によって最良の決定がなされることとなる。しかしながら、治療の継続は、何日間、何週間、又は何ヶ月にもわたり継続するように検討される。
【０１９３】
本発明のそれぞれの実施形態及び態様においては、被験体は、ヒト、非ヒトの霊長類、トリ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、伴侶動物、例えばイヌ、ネコ若しくは齧歯類又は他の哺乳動物である。本発明の方法が適用され得る被験体には、Ｃ．ディフィシル感染症により罹りやすくなる潜在的な疾患又は状態を伴う被験体が含まれる。
【０１９４】
本発明は、１種以上の結合剤、１種以上の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株、又は結合剤及び／又は操作されたサッカロマイセス属酵母菌株を含む１種以上の医薬製剤を充填した１つ以上の容器を含むキットも提供する。キットは使用説明書も含み得る。医薬品又はバイオ製品の製造、使用又は販売を規制する行政機関によって指定される形式の、機関によるヒト投与のための製造、使用又は販売の認可を反映する通知もキットに更に付属し得る。
【実施例】
【０１９５】
ＩＩＩ．実施例
ＶＨＨ単量体型及びヘテロ二量体型結合剤
単独のドメイン（単量体型）の、トキシンＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの特異的ドメインに対する一重特異性のＶＨＨペプチド単量体をスクリーニングするための効果的なプラットフォームを確立した。免疫原性の高い非毒性のホロトキシンを免疫化のために使用し、かつ生体活性のキメラ型トキシン（通常のドメイン機能を有する）をスクリーニングのために使用することで、ＶＨＨ単量体の、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢの種々のドメインへの結合のパネルを作製した。これらのＶＨＨ単量体の多くが強力な中和活性を有し、それらの特異的ドメインへの結合を確認した（図２）。その非毒性のホロトキシンは、従来に記載される通り［３３］、それらの酵素的グルコシルトランスフェラーゼドメインに点突然変異を有する。生体活性のキメラ型トキシンを、また従来に記載される通り［３３］、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの間で機能的ドメインを交換することによって作製した。
【０１９６】
ＶＨＨ単量体の幾つかは、高度に保存されたＴｃｄＡ／ＴｃｄＢエピトープに結合する。例えば、ＶＨＨ  Ｅ３単量体は、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ結合部位に結合し、グリコシル化を阻止し、ＶＨＨ  ＡＨ３単量体は、該トキシンのＧＴドメインに結合し、ＶＨＨ  ７Ｆ単量体は、システインプロテアーゼ開裂部位に結合し、そしてＧＴドメインの開裂及び放出を阻止する。幾つかのＶＨＨ単量体は強力な中和活性を有しており、トキシンの細胞毒性活性をｎＭ濃度で阻止することが可能である（表１；図３のＡ及び図３のＢを参照）。
【０１９７】
結合活性を高めるために、２つのドメイン（二量体型）の二重特異性のＶＨＨヘテロ二量体を作製（表３；図３のＣ）することで、単独のタンパク質が、トキシンの２種の異なるエピトープを標的とすることが可能となった。これらの二重特異性のＶＨＨヘテロ二量体は、同じ２つのＶＨＨ単量体の等モルの混合物と比較して、本質的に増強された中和活性を有していた（図３のＤ）。ヘテロ二量体５Ｄ／Ｅ３及びＡＨ３／ＡＡ６は、致死的な全身性のＴｃｄＢ負荷又はＴｃｄＡ負荷からそれぞれマウスを十分に防御することが見出されたが、５ＤとＥ３とを混合したもの、又はＡＡ６単独は、部分的にのみ防御性であるに過ぎない（図３のＥ及びＦ）。
【０１９８】
四価の三重特異性ＶＨＨ結合剤（ＡＢＡ）は、保存された重複していないエピトープを標的とする最高の中和活性を有するＶＨＨを遺伝子融合させることによって生成された（ＡＨ３／Ｅ３／Ｅ３／ＡＡ６）［４１］。この合理的に設計されたトキシンへの結合剤は、個別の単量体と比べて本質的に高まっている結合親和性及び中和活性、並びに劇症性ＣＤＩに対する強力な治療効力を達成した。ＡＢＡは、１１種の異なるＴｃｄＡ陽性ＴｃｄＢ陽性のＣ．ディフィシルの臨床分離菌からのトキシンを広範に中和することが可能であるが、２種類のＴｃｄＡ陰性ＴｃｄＢ陽性の菌株に由来するＴｃｄＢは中和することができなかった。ＡＢＡのアミノ酸配列は、配列番号１１１に示されている。
【０１９９】
ヘテロ二量体を含むＶＨＨ単量体は、配列番号９〜配列番号１３（表２）から選択されるフレキシブルなリンカーを使用して連結させた。
【０２００】
ＡＢＡＢ結合剤
４つのドメイン（四量体型）の四重特異性ＶＨＨ結合剤を、ＶＨＨ単量体のＡＨ３、５Ｄ、Ｅ３及びＡＡ６を連結させることによって、つまりＡＢＢＡ（ＡＨ３／５Ｄ／Ｅ３／ＡＡ６）及びＡＢＡＢ（ＡＨ３／５Ｄ／ＡＡ６／Ｅ３）を作製した。これらの四重特異性の四量体型結合剤は、保存された重複していないエピトープを標的とし、優れたトキシン中和活性を有する。ＡＢＡＢ（図４）の設計において、ＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３及びＡＡ６を、それらの間に５Ｄ単量体を配置することによって隔てられた。それというのも、ＡＨ３及びＡＡ６は、それぞれ互いに空間的に距離が置かれたＧＴ及びＴＤに結合するからである（図２）。この設計により、ＡＨ３及びＡＡ６は、ＴｃｄＡに同時に結合することが可能となった。
【０２０１】
ＡＢＡＢ結合剤の構築において、フレキシブルなリンカーを、ＶＨＨ単量体の間に配置した（図４を参照）。ＡＢＡＢをコードする完全な核酸配列は、配列番号２０に規定され、そのタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１９に規定されている。
【０２０２】
或る特定の別形においては、Ｈｉｓ（６）−タグを、該タンパク質のアミノ末端に精製の補助のために設け、Ｅ−タグを、該タンパク質のカルボキシ末端に検出の補助のために設け、及び／又はアルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ、ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＤ；配列番号２１）は、該タンパク質の血清中半減期を高めるために該構築物のカルボキシル末端に配置した（図４を参照）。
【０２０３】
ＡＢＡＢは、個々の単量体及びＡＢＡに比べて本質的に高められた結合親和性（表７）及び中和活性（表８）を示すことが分かった。表８において、ベロ細胞を、連続希釈されたＡＡ６、ＡＨ３、ＡＢＡＢ又はMerck社の抗ＴｃｄＡ  ＨｕＭａｂ［９］の存在下で５ｎｇ／ｍｌのＴｃｄＡに曝した。ＴｃｄＡに誘発される細胞円形化から細胞を防御する抗体の最低用量を示す。
【０２０４】
【表７】
2018536396.tif 000009
【０２０５】
【表８】
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【０２０６】
ＡＢＡＢは、競合ＥＬＩＳＡにおいて全ての４つの個々のＶＨＨペプチド単量体と競合し、そしてサンドウィッチＥＬＩＳＡによって測定した場合にＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方に同時に結合し得ることも分かった。さらに、ＡＢＡＢは反応性が広範であり、最近の流行性菌株の殆どを代表する１３種の異なるＣ．ディフィシル菌株由来のトキシンを中和することができる（表９）。
【０２０７】
【表９】
2018536396.tif 000011
【０２０８】
ＡＢＡＢは、両方のトキシンへの結合及びそれらの中和に高い効力を示すことから、劇症性ＣＤＩの治療におけるその効力を評価した。Ｃ．ディフィシル胞子の負荷１日後に、たった４０μｇ／ｋｇのＡＢＡＢによる単回注射だけで、マウスにおける劇症性ＣＤＩが一転した。ＡＢＡＢ処置されたマウスは死ななかったが、コントロールマウスの５０％は、感染３日後に瀕死の状態となった（図５Ａ）。ＡＢＡＢは、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢでの全身性負荷後の死亡の予防においてMerck社のＨｕＭａｂｓと比べて４−ｌｏｇも強力である（図５Ｂ）［９］。このように、ＡＢＡＢは、Ｃ．ディフィシルのトキシン及び胞子の負荷に対して並外れたｉｎ  ｖｉｖｏ効力を有する。
【０２０９】
動物及びヒトの研究によって、受動投与された抗トキシン抗体がＣＤＩに対する防御をもたらすことが裏付けられた。初期の研究でも、抗トキシン多価血清が、マウスを原発性ＣＤＩ（図６のＡ及び図６のＢ）及び再発性／再燃性ＣＤＩから防御することが示された。これらの知見及び図５Ａ及び図５Ｂからの結果は、仮説を支持しており、ＣＤＩの予防のための非経口ＡＢＡＢ免疫化戦略の開発のための根拠を与えた。ＡＢＡＢを全身性送達のために最適化するという目標を達成するために、図１に図説されるキメラ型及びヒト化されたＡＢＡＢを、すなわちＶＨＨ−Ｆｃ結合剤及びＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤並びにヒト化されたタンパク質ｈＶＨＨ−Ｆｃ及びｈＶＨＨ−ＩｇＧを作製し、その後に、有力なタンパク質を、動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ中和活性及び防御について評価した。追加の結合剤の製造及び試験に関する詳細は、以下の段落に規定されている。
【０２１０】
ＡＢＡＢ−Ｆｃ
ＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３／５Ｄ／ＡＡ６／Ｅ３（示される順序で連結される）をコードする発現ベクターを作製することによって製造した。ＶＨＨペプチド単量体は、表２のフレキシブルなリンカーによって隔てられた。該タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２３に規定されている。ＡＢＡＢ−Ｆｃは、安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞系統の培養上清からプロテインＡビーズを使用して、ジスルフィド結合形成及び二価の分子産生を可能にする条件下で発現及び精製した。発現レベルは、培養上清１Ｌ当たりに約２０ｍｇであった。ＡＢＡＢ−Ｆｃは、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方との結合及び中和において十分に機能的である（データは示していない）。ＡＢＡＢ−Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号２２に規定されている。
【０２１１】
一重特異性のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤（ＡＨ３−Ｆｃ、５Ｄ−Ｆｃ、Ｅ３−Ｆｃ、ＡＡ６−Ｆｃ）及び二重特異性のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤（ＡＨ３／５Ｄ−Ｆｃ及びＡＡ６／Ｅ３−Ｆｃ）も、このＦｃ融合系を使用して作製した。上記表５は、これらの追加の結合剤についての配列を規定している。
【０２１２】
ＡＢＡＢ−ＩｇＧ
図１に図説されるように、二重特異性のＶＨＨ−ＩｇＧ（ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ及びＥ３／ＡＡ６−ＩｇＧ）は、単量体を、ヒトＩｇＧ重鎖及び軽（κ又はλ）鎖と個別に融合させることによって作製することができる。四重特異性のＶＨＨ−ＩｇＧ（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ）結合剤は、二量体を、ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖と個別に融合させることによって作製することができる。重鎖及び軽鎖の構築物を同時トランスフェクションすることで、ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ、Ｅ３／ＡＡ６−ＩｇＧ及びＡＢＡＢ−ＩｇＧのキメラタンパク質が生成する。２つのＶＨＨを重鎖及び軽鎖へと分けると、恐らく二重特異性及び四重特異性のＶＨＨキメラ型タンパク質の収率及び安定性が改善する。これによって、ＶＨＨ−ヒトＩｇＧキメラ型抗体がＡＢＡＢのｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性及び効力を補助するか否かを決定することができる。同様に、ＡＢＡＢ−ＩｇＧのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の更なる改善は、ＦｃＲｎ受容体に対する高められた結合親和性を有するＡＢＡＢ−ＩｇＧ変異体において試験することもできる。
【０２１３】
二重特異性（ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ１及びＥ３／ＡＡ６−ＩｇＧ１）並びに四重特異性（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１）のＩｇＧ１結合剤は、それぞれの結合剤の重鎖及び軽（κ）鎖をコードする発現ベクターを同時トランスフェクションすることによって製造した。それらのＶＨＨペプチド単量体を、表２のフレキシブルなリンカーによって隔てた。
【０２１４】
二重特異性の四量体型ＶＨＨ−ＩｇＧ１結合剤は、第一の発現ベクターが、重鎖可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体重鎖（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に結合されたＶＨＨペプチド単量体をコードし、第二の発現ベクターが、軽鎖可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体の軽（κ）鎖（ＣＫ）に結合されたＶＨＨペプチド単量体をコードする２つの別個の発現ベクターを作製することによって製造した。これらの結合剤は、得られた結合剤のそれぞれの軽鎖が第一のＶＨＨ単量体に連結され、かつ得られた結合剤のそれぞれの重鎖が第二のＶＨＨ単量体に連結されているため二重特異性で四量体型である。上記表６は、これらの追加の結合剤についての配列を規定している。適切な対合には、（ｉ）ＡＨ３−ＩｇＧ１−重鎖＋ＡＡ６−軽（κ又はλ）鎖、（ｉｉ）５Ｄ−ＩｇＧ１−重鎖＋Ｅ３−軽（κ又はλ）鎖、（ｉｉｉ）５Ｄ−ＩｇＧ１−重鎖＋ＡＡ６−軽（κ又はλ）鎖、及び（ｉｖ）ＡＨ３−ＩｇＧ１−重鎖＋Ｅ３−軽（κ又はλ）鎖が含まれる。
【０２１５】
四重特異性の八量体型ＡＢＡＢ−ＩｇＧ結合剤を製造した。これらの結合剤は、得られた結合剤のそれぞれの軽（κ又はλ）鎖が２つ（第一及び第二）の連結されたＶＨＨ単量体に結合され、かつ得られた結合剤のそれぞれの重鎖が２つ（第三及び第四）の連結されたＶＨＨ単量体に結合され、ここで第一の単量体、第二の単量体、第三の単量体及び第四の単量体は、異なるエピトープに結合するため、四重特異性で八量体型である。
【０２１６】
特定の四重特異性の八量体型ＡＢＡＢ−ＩｇＧ（図７）結合剤は、第一の発現ベクターが、重鎖可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体重鎖（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３／５Ｄ（示される順序で連結される）をコードし、第二の発現ベクターが、軽鎖可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体の軽（κ）鎖（ＣＫ）に結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＡ６／Ｅ３（示される順序で連結される）をコードする２つの別個の発現ベクターを作製することによって製造した。ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ１重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４５に規定されており、そのアミノ酸配列は、配列番号４４に規定されている。ＡＡ６／Ｅ３−ＩｇＧ１κ鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４７に規定されており、そのアミノ酸配列は、配列番号４６に規定されている。
【０２１７】
二重特異性（ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ１及びＥ３／ＡＡ６−ＩｇＧ１）及び四重特異性（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１）のＩｇＧ１結合剤は、安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞系統の培養上清からプロテインＡビーズを使用して、ジスルフィド結合形成及び二価の分子産生を可能にする条件下で発現及び精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、９０％超の純度の精製されたＡＢＡＢ−ＩｇＧ１が、非還元ゲルにおいて約２１８ＫＤａの合計分子量（軽鎖及び重鎖を一緒にした分子量）を有することが示される（データは示していない）。還元ゲルにおいて、重鎖の分子量は６８ＫＤａであることが示され、かつ軽鎖の分子量は４１ＫＤａであることが示される。
【０２１８】
ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１のＴｃｄＡ及びＴｃｄＢへの結合を確認した。図８Ａ及び図８Ｂは、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１の両方のトキシンへの結合と、個別の構成要素（ＡＨ３、ＡＡ６、Ｅ３及び５Ｄ）との比較を図説している。図８Ａは、プレートを１μｇ／ｍｌのＴｃｄＡ（ＴｘＡ）でコーティングした実験の結果を示している。連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧを、０ｎｇ／ｍｌ、０．６４ｎｇ／ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ及び２０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。それらのプレートを洗浄し、Merck社の抗体（抗ＴｃｄＡ）、Ｆｃ−ＡＢＢＡ（ＡＢＡＢ−Ｆｃ）、Ｈａｂａｂ（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ）並びにＶＨＨ抗ＴｃｄＢ単量体ＡＡ６及びＡＨ３を、示された量（ｎｇ／ｍｌ）で添加した。適切な標識された抗体を検出のために使用した。図８Ｂは、プレートを１μｇ／ｍｌのＴｃｄＢ（ＴｘＢ）でコーティングした実験の結果を示している。連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧを、０ｎｇ／ｍｌ、０．６４ｎｇ／ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ及び４００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。それらのプレートを洗浄し、Merck社の抗体（抗ＴｃｄＢ）、Ｆｃ−ＡＢＢＡ（ＡＢＡＢ−Ｆｃ）、Ｈａｂａｂ（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ）並びにＶＨＨ抗ＴｃｄＢ単量体Ｅ３及び５Ｄを、示された量（ｎｇ／ｍｌ）で添加した。適切な標識された抗体を検出のために使用した。
【０２１９】
予想されるように、四重特異性の抗体は、サンドウィッチＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに同時に結合することができる（図９Ａ及び図９Ｂ）。第一の実験構成においては、プレートを１μｇ／ｍｌのＴｃｄＡ（ＴｘＡ）でコーティングした。連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧ（Ｈａｂａｂ）を、０ｎｇ／ｍｌ、１．６ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。それらのプレートを洗浄し、以下の量：１．６ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌのＴｃｄＢを添加した。マウス抗ＴｘＢ抗体（５００×）及びヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（３０００×）抗体を検出のために使用した。図９Ａに与えられた結果は、ＴｘＢがＴｘＡのコーティングによって検出されることを示しており、それは、ＩｇＧ−ＡＢＡＢがＴｘＡ／Ｂに同時に結合することを示唆している。第二の実験構成においては、プレートを１μｇ／ｍｌのＴｃｄＢ（ＴｘＢ）でコーティングした。連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧ（Ｈａｂａｂ）を、０ｎｇ／ｍｌ、１．６ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。それらのプレートを洗浄し、以下の量：１．６ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌのＴｃｄＡを添加した。マウス抗ＴｘＡ抗体（５００×）及びヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（３０００×）抗体を検出のために使用した。図９Ｂに与えられた結果は、ＴｘＡがＴｘＢのコーティングによって検出されることを示しており、これもまたＩｇＧ−ＡＢＡＢがＴｘＡ／Ｂに同時に結合することを示唆している。
【０２２０】
培養細胞においてそれらのトキシンの細胞変性効果に対するＡＢＡＢ−ＩｇＧ１の中和活性も調べた。ＴｃｄＡ（１００ｎｇ／ｍｌ、図１０Ａ）を、連続希釈されたMerck社の抗ＴｃｄＡヒトモノクローナル抗体、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１（Ｈａｂａｂａ）及びＶＨＨ抗ＴｃｄＡ単量体ＡＡ６及びＡＨ３と混合してから、それを１００μｌの培養培地中のベロ細胞単層に添加し、３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。図１０Ａに与えられた結果は、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１が、ＴｃｄＡの中和においてMerck社の抗体よりも少なくとも１０００倍も強力であることを示している。同様の実験において、ＴｃｄＢ（１０ｐｇ／ｍｌ、図１０Ｂ）を、連続希釈されたMerck社の抗ＴｃｄＢヒトモノクローナル抗体、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１（Ｈａｂａｂａ）並びにＶＨＨ抗ＴｃｄＢ単量体Ｅ３及び５Ｄと混合してから、それを１００μｌの培養培地中のベロ細胞単層に添加し、３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。図１０Ｂに与えられた結果は、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１が、ＴｃｄＢの中和においてMerck社の抗体よりも少なくとも１０００倍も強力であることを示している。
【０２２１】
ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１のｉｎ  ｖｉｖｏ中和活性を、ＣＤＩのマウスモデルにおいて研究し、その結果を図１１に示す。マウスを、致死用量のＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの混合物（マウス１匹当たりに２５ｎｇの各々のトキシン）で負荷し、４時間後に、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ（１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇ）、Merck社の抗トキシンＡ抗体及び抗トキシンＢ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物又はＰＢＳを、そのマウスに投与した。それらの結果は、ＡＢＡＢ−ＩｇＧの中和活性が、より低い濃度でもMerck社の抗体よりも断然高いことを裏付けている。
【０２２２】
ＡＢＡＢ−ＩｇＧの動物試験
ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１結合剤を、予防処置アッセイ及び再負荷生存アッセイの両方で試験した。図１２は、両方の研究の実験デザインを示している。６週齢〜８週齢の雌のＣ５７マウスを使用し、含まれる条件は、ＰＢＳ：１０ｍｌ／ｋｇ、腹腔内、ｎ＝１４；ＡＢＡＢ−ＩｇＧ：２００μｇ／ｋｇ、腹腔内、ｎ＝１０；ＡＢＡＢ−ＩｇＧ：１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、ｎ＝１０；ＡＢＡＢ−ＩｇＧ：５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、ｎ＝１０であった。
【０２２３】
表１０は、マウスのＣ．ディフィシルの胞子（ＵＫ１、０２７／ＢＩ／ＮＡＰ１流行性菌株）に対する予防的処置で見られた結果の概要を示している。ＡＢＡＢ−ＩｇＧ又はＰＢＳを、Ｃ．ディフィシルの胞子の投与１日前に投与した。そこから明らかなように、ＡＢＡＢ−ＩｇＧは、ＣＤＩに対して用量に関連した予防的防御を示した。ここで、５ｍｇ／ｋｇでは、調べた全てのパラメータに対して完全な防御が示され、２００μｇ／ｋｇは、２００μｇ／ｋｇの二重特異性のＶＨＨ融合抗体ＡＢＡ［４１］よりも強力であることが判明した。
【０２２４】
【表１０】
2018536396.tif 000012
【０２２５】
表１１は、マウスのＣ．ディフィシルの胞子に対する再負荷で見られた結果の概要を示している。ＡＢＡＢ−ＩｇＧ又はＰＢＳを、Ｃ．ディフィシルの胞子の投与１５日前に投与した。そこから明らかなように、ＡＢＡＢ−ＩｇＧの１用量は、胞子の再負荷によって引き起こされたＣＤＩに対して或る程度の防御を示したが、その防御は、一次負荷の間の防御と比較して大幅に効果が低かった。これは、時間に伴う抗体レベルの降下と、一次負荷後のＰＢＳ群における抗体生成とによるものであると考えられる。
【０２２６】
【表１１】
2018536396.tif 000013
【０２２７】
ＩｇＧ−ＡＢＡＢの腸内送達を、マウスの劇症性ＣＤＩからの保護についても試験した。開腹術後にマウス盲腸中にＩｇＧ−ＡＢＡＢを単回注射すると、マウスは、死の転帰をとる劇症性ＣＤＩに対して完全に保護されたが、一方でコントロールマウスの５０％は、死んだ（データは示していない）。疾患の進行度及び重症度は、以前の文献［６２］から改変された臨床スコアリングシステムを用いて毎日評価した。上記臨床スコアリングシステムは、４つの基準（活動性レベル、姿勢、毛皮、及び下痢）を含み、それぞれ０から４までの評点で格付けされており、足し合わせることで最大１６の値で評点を付けた。正常なマウスは０の評点が付けられることとなり、死に至ったマウスには、１６の評点が付けられた。１１と等しいか又はそれより高い評点を有するマウスは、安楽死させるべきである。ＩｇＧ−ＡＢＡＢ処置群における１匹のマウスだけは一過性の下痢を発症したが、ＰＢＳを注射したマウスは、重症のＣＤＩ疾患症状を発症した（データは示していない）。このように、マウスの腸内に用手的に注射によって送達されたＩｇ−ＡＢＡＢは、強力な治療効果を示した。
【０２２８】
結合剤の発現、精製及び評価
様々な選択基準を用いて、本明細書のアプローチに記載される実験で作製された結合剤を選択する。第一に、本明細書に定義される構築物の各々は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる小規模組換えタンパク質の製造のための２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにおいて使用することができる。各々の構築物の産生収率は、定量的ＥＬＩＳＡによって測定することができる。第二に、組換えタンパク質の結合活性をＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してスクリーニングすることで、それらのトキシンに対する本来の結合活性を維持している構築物を選択することができる。第三に、それらのタンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて中和活性について評価する（図３）。
【０２２９】
観察結果を総合すると、組換え型結合剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの多重反応性及び／又は自己反応性が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安全性及び半減期に関する潜在的な問題であることが示唆される。原発急性ＣＤＩの予防のための全身性結合剤として選択されたＡＢＡＢ結合剤の適用には、キメラ型のヒト化されたＡＢＡＢタンパク質の多重反応性及び／又は自己反応性が制限されることが恐らく必要とされる。タンパク質プロテオミクスの進歩により、組換え型抗体の多重反応性及び自己反応性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングすることが可能となった。それは、代用となる治療用抗体のための優れたツールである。したがって、良好な収率、高い結合親和性及び強力な中和活性を有する選択されたヒト化された結合剤を、潜在的な多重反応性及び自己反応性について、自己抗原マイクロアレイ試験及びＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（Invitrogen）を用いて更に試験することができる。
【０２３０】
上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから、ＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤及びＡＢＡＢ−ＩｇＧ結合剤の候補を、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ毒性、血清中半減期及び免疫原性について評価することができる。
【０２３１】
ＡＢＡＢを分泌するＳ．セレビシエ（Ｓｃ−ＡＢＡＢ）の作製
ＣＤＩを伴う被験体又はＣＤＩ発症のリスクを伴う被験体の腸に結合剤をｉｎ  ｖｉｖｏで産生及び送達するための手段を開発した。Ｓ．セレビシエはＳ．ボウラルディと遺伝的に類似しており［５２、５３］、遺伝的ツールはＳ．セレビシエについては容易に入手可能であるので、Ｓ．セレビシエをまずは、ＡＢＡＢ分泌の検証のために使用した。
【０２３２】
新規の二重特異性サンドウィッチ型ＥＬＩＳＡ法を、まずはＡＢＡＢ分泌の評価のために開発した。その設定においては、ＡＢＡＢ二重特異性のための結合抗原として精製されたＴｃｄＡ及びＴｃｄＢが利用され、検出のためにα−ＴｃｄＡ抗体が利用された（図１３のＡ）。標準化のために、プレートをＴｃｄＢ（１μｇ／ｍｌ）でコートし、そのプレート中に連続希釈されたＡＢＢＡ（（ＡＨ３−Ｅ３−Ｅ３−ＡＡ６））標準を加えた。その後に、連続希釈されたｒＴｃｄＡ（１μｇ／ｍｌ〜７．８ｎｇ／ｍｌ）を加えた。次いで、ＴｃｄＡの捕捉を、ＴｃｄＡに対するモノクローナル抗体を加え、引き続きＨＲＰ結合二次抗体を加えることによって測定した。標準曲線に関する結果は、図１３のＢに示されている。これらの結果に基づいて、１２５ｎｇ／ｍｌのｒＴｃｄＡを使用して導き出された標準曲線を、酵母培養上清中のＡＢＡＢの分泌レベルを測定するために選択し、全ての後続のＥＬＩＳＡのために使用した。
【０２３３】
Ｅ．コリ（ｐＵＣ）及び酵母（２ミクロン環状物）の両方に由来する複製起点と、酵母栄養要求性選択マーカーＵＲＡ３（ウラシルの合成能を与える）とを含むシャトルプラスミド（ｐＤ１２１４−ＦＡＫＳ）を、DNA 2.0社（カリフォルニア州、ニューアーク）から入手した。ＡＢＡＢをコードする配列（配列番号２０）、並びにそれぞれＡＢＡＢのＮ末端及びＣ末端にあるＨｉｓタグをコードする配列（配列番号６６）及びＤ７タグをコードする配列（配列番号１１２）を、強力な構成的な酵母翻訳伸長因子プロモーター（ＰＴＥＦ）によって転写が制御され、かつα接合因子分泌シグナルリーダー配列（ＦＡＫＳ）への融合によって細胞外分泌が提供されるこのプラスミドの骨格に挿入した。得られたプラスミド（ｐＤ１２１４−ＦＡＫＳ−Ｈｉｓ−ｈＡＢＡＢ−Ｄ７）の配列は、配列番号６８に示される。
【０２３４】
プラスミドｐＤ１２１４−ＦＡＫＳ−Ｈｉｓ−ｈＡＢＡＢ−Ｄ７を、Ｓ．セレビシエ菌株ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  Ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０）、つまりＵＲＡ３ノックアウトされたＳ２８８Ｃ誘導体の実験室株中に形質転換させた。次いで酵母形質転換体を、ウラシルを含まないドロップアウトミックスを含有するＹＮＢ培地（１Ｌの滅菌ｄｄＨ２Ｏ中６．８ｇのＹＮＢ、２０ｇのグルコース、２ｇのドロップアウトミックス）中にて３０℃、２５０ｒｐｍでＯ．Ｄ．が１に達するまで振盪器中で一晩培養した。次いで細胞を遠心分離して底に集め、１×ＳＤＳローディングバッファー中で超音波処理により溶解させた。超音波処理後に、全細胞溶解物を、９８℃で５分間にわたり処理してから、ＳＤＳゲルにロードした。それぞれのウェルに同量の酵母コントロール細胞溶解物をロードしたが、ただし、コントロール細胞は、ウラシルを含まないＹＮＢ培地中では生存することができないため、ウラシルを補ったＹＮＢ中で培養した。
【０２３５】
２５種の酵母形質転換体及び３種の酵母コントロールコロニーからの培養上清を遠心分離することで細胞を遠沈して、次に細胞不含の上清を、０．０５％のｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中の２．５％ミルクで１：３の比率で希釈し、そして振盪器中で２５０ｒｐｍ及び３０℃で２４時間インキュベートした後に上記のＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。図１４のＢは、酵母コントロールコロニーからの培養上清に対して、全ての酵母形質転換体が、培養上清中にＡＢＡＢを分泌したことを示している。
【０２３６】
細胞ベースの中和アッセイを使用して、培養上清中に分泌されたＡＢＡＢの生物学的活性を評価した。このアッセイにおいて、４時間で１００％の細胞円形化を引き起こすために十分な量のトキシンＡ又はトキシンＢを、ＰＢＳ、ＢＹ４７４１コントロールコロニー由来の細胞不含の培養上清又はＢＹ４７４１−ＡＢＡＢコロニー由来の細胞不含の培養上清と一緒に加えた。組換えＡＢＡＢは、ポジティブコントロールとして使用した。培養上清中に分泌されたＡＢＡＢの生物学的活性を、細胞円形化を抑制する中和活性のレベルによって測定した。Ｓ．セレビシエから分泌された全長ＡＢＡＢは、精製された組換えＡＢＡＢと比較して、確かにその中和活性を維持している（図１４のＡ）。これらの結果を合わせると、Ｓ．ボウラルディによるＡＢＡＢ分泌の妥当性がほのめかされる。
【０２３７】
更なる実験において、Ｓｃ−ＡＢＡＢの１０１０ＣＦＵの用量でのマウスの強制経口投与は、マウスに悪影響を及ぼさず、マウスは生きたＳｃ−ＡＢＡＢを放出することが、サブローＣＡＦ寒天上に糞便をプレーティングすることにより測定することで（データは示していない）裏付けられた。マウスから回収された分離株は、上記アッセイを使用すると、その機能的ＡＢＡＢを産生する能力を維持していた。
【０２３８】
ＡＢＡＢ分泌最適化
ＡＢＡＢ分泌レベルとｉｎ  ｖｉｖｏ治療効力とは当然のように関連している。したがって、既存のＦＡＫＳ分泌シグナルを数多くの市販の分泌シグナルに置き換えることによりＡＢＡＢ分泌の更なる最適化の可能性を調べた。分泌配列は、細胞外輸送の前に、小胞体及びゴルジ体領域への外来タンパク質の翻訳時又は翻訳後移行を促す。α接合因子、つまりＳ．セレビシエにおいて分泌されるタンパク質の良好な収率を一般的にもたらす異種タンパク質分泌のためのシグナル配列が通常使用されるが［６９、７０］、研究によれば、イヌリナーゼ又はインベルターゼ等のその他のタンパク質からのその他の分泌配列が、或る特定の異種タンパク質を分泌するためにより適していることが実証されている［７１、７２］。
【０２３９】
１１種の異なる市販の分泌シグナル（表４、DNA 2.0社、カリフォルニア州、ニューアーク）を、個々に、同じｐＤ１２１４プラスミド骨格において、ＴＥＦプロモーターの制御下でＡＢＡＢと遺伝子融合させた。ＡＢＡＢと一緒に択一的な分泌シグナルをコードするプラスミドには、以下のプラスミドが含まれ、それらのプラスミドでは、ＦＡＫＳ分泌シグナルが、示される表４からの新しい分泌シグナルに置き換えられており、ｈｉｓタグ及びＤ７タグは両者とも取り除かれている：
プラスミドｐＤ１２１４−ＡＫＳ−ｈＡＢＡＢ（配列番号７０）
プラスミドｐＤ１２１４−ＡＫ−ｈＡＢＡＢ（配列番号７１）
プラスミドｐＤ１２１４−ＡＴ−ｈＡＢＡＢ（配列番号７２）
プラスミドｐＤ１２１４−ＡＡ−ｈＡＢＡＢ（配列番号７３）
プラスミドｐＤ１２１４−ＧＡ−ｈＡＢＡＢ（配列番号７４）
プラスミドｐＤ１２１４−ＩＮ−ｈＡＢＡＢ（配列番号７５）
プラスミドｐＤ１２１４−ＩＶＳ−ｈＡＢＡＢ（配列番号７６）
プラスミドｐＤ１２１４−ＫＰ−ｈＡＢＡＢ（配列番号７７）
プラスミドｐＤ１２１４−ＬＺ−ｈＡＢＡＢ（配列番号７８）
プラスミドｐＤ１２１４−ＳＡ−ｈＡＢＡＢ（配列番号７９）
【０２４０】
さらに、本来のＡＢＡＢ構築物（ｐＤ１２１４−ＦＡＫＳ−Ｈｉｓ−ｈＡＢＡＢ−Ｄ７）におけるｈｉｓタグ及びＤ７タグの両方を取り除いて、プラスミドｐＤ１２１４−ＦＡＫＳ−ｈＡＢＡＢ（配列番号６９）を作製し、培養のインキュベート温度は、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験及び臨床試験に関連する計画により良く適合させるために３７℃に高めた。次いで全ての１１種のプラスミドを、ＢＹ４７４１に形質転換させ、それぞれの選択用プレートから５種の独立したコロニーを選択して、培養上清を生成させた。分泌されたＡＢＡＢの量を、上記と同じＥＬＩＳＡによって測定した。さらに、全ての群にわたる公正な比較を提供するためにＥ／Ｏ値を使用した。Ｅ／Ｏ値は、ＥＬＩＳＡのＯ．Ｄ．値を培養Ｏ．Ｄ．値に対して標準化することによって定義される。ＡＢＡＢに関する最良の分泌シグナルのうちの２つは、ＡＴ及びＩＶＳであることが判明した（表４、図１５のＡ）。
【０２４１】
Ｓ．ボウラルディに関する栄養要求性突然変異菌株を入手することができなかったので、Ｇ４１８に対する耐性をコードするａｐｈＡ１遺伝子を有する別の２μｍベースのプラスミド（ｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ、配列番号８０、Lars Nielsen及びClaudia Vickersによる寄贈（Addgene社のプラスミド番号４６８１９））を、ｐＤ１２１４プラスミドの代わりに使用して、Ｓ．ボウラルディにおけるＡＢＡＢ分泌を確認した。Ｓ．セレビシエについての最良の２種の分泌シグナル（ＡＴ及びＩＶＳ）を、ＡＢＡＢと遺伝子融合させ、ｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍプラスミド骨格に挿入して、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｈＡＢＡＢ＊（配列番号８１）及びｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＩＶＳ−ｈＡＢＡＢ＊（配列番号８２）を作製した。両方のプラスミドを使用してＳ．ボウラルディ（菌株ＭＹＡ７９６）を形質転換し、Ｓ．ボウラルディにおけるＡＴ及びＩＶＳによるＡＢＡＢ分泌は、ＥＬＩＳＡによって測定されるようにＳ．セレビシエと同等であった（図１５のＢ）。ｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｈＡＢＡＢ（配列番号８３）という、ｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｈＡＢＡＢ＊とはＡＴ配列とｈＡＢＡＢ配列との間に分子クローニングサイト（molecular cloning site）を含む点で異なる更なる構築物を調製した。
【０２４２】
次いで、ＡＢＡＢ分泌を、ＡＴ分泌シグナルを有する構築物においてヌクレオチドレベルで酵母コドン最適化（ｙＡＢＡＢ）によって更に最適化することで、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ（配列番号８４）を作製した。ＰＴＥＦとＡＢＡＢコーディング配列との間に４０個のヌクレオチドを含む配列は、ＡＢＡＢ分泌のために必ずしも必要ではないことも判明し、それを取り除くことで、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−Ｘ４０−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ（配列番号８５）を得た。ＡＴ配列とＡＢＡＢ配列との間に２個の制限クローニングサイトを含む更なる配列は、ＡＢＡＢ分泌に悪影響を及ぼすことが分かったので、この配列も、後続の研究に関してＡＢＡＢ分泌を最大化するために省いた（プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ＲＳｙＡＢＡＢ、配列番号１１５）。
【０２４３】
次に、個々の単量体の分泌量を測定することで、ＡＡ６が最も少なく分泌されることが分かった。ＡＡ６の分泌を改善して、さらにＡＢＡＢ分泌を最適化するために、一群の主要アミノ酸残基を利用した。Ｔ８３Ｎ突然変異は、ＡＡ６分泌を改善することが分かった。さらに、ｈＡＡ６配列を有するＳ．ボウラルディは、酵母最適化されたｙＡＡ６配列を有するものよりも多くのＡＡ６を分泌することが分かった。したがって、ＡＡ６内にＴ８３Ｎ突然変異を有するＡＢＡＢ（ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  Ｔ８３Ｎ、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ＡＡ６Ｔ８３Ｎ、配列番号１１６）と、ｙＡＡ６配列がｈＡＡ６  Ｔ８３Ｎ配列と置き換わったＡＢＡＢ（ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６  Ｔ８３Ｎ、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６Ｔ８３Ｎ、そのプラスミドは、配列番号９０の配列を有するが、ｃ−Ｍｙｃをコードする配列を欠いている）との間で比較を行うことで、どの配列がより良好な分泌を示すかを判定した。これらの構築物の間に有意差は存在しないことが分かり、今後はＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６  Ｔ８３Ｎを最終配列として最終的に決定した。ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６  Ｔ８３Ｎをコードするヌクレオチド配列は、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６Ｔ８３Ｎ−タグなし（配列番号９０）中に備えられている。ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６  Ｔ８３Ｎのアミノ酸配列は、配列番号１１７に示される。
【０２４４】
栄養要求性Ｓ．ボウラルディ菌株の作製
ＡＢＡＢをコードする発現プラスミドを、Ｓ．ボウラルディ菌株中にクローニングすることができる。Ｓ．ボウラルディ菌株は、正常な体温を許容することができ、Ｓ．セレビシエよりも良好に酸性条件を許容することができ、それにより、新たな経口的な酵母ベースの治療戦略としての効力は改善され得る。野生型Ｓ．ボウラルディ菌株に対する２つの改変を行うことで、酵母ＵＲＡ３代謝選択マーカーによって与えられる発現プラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を保つことができる。１）ＵＲＡ３の両者の染色体アレルにおいて欠失を有する２倍体栄養要求性突然変異体を構築することができ、かつ２）内因性の２ミクロン環状物をＳ．ボウラルディからキュアリングして、意図しない組換えがＡＢＡＢ発現と干渉することを防ぐことができる。
【０２４５】
野生型サッカロマイセス属菌株において栄養要求性突然変異体を構築するための最も簡単かつ効率的な方法は、サッカロマイセス属菌において非常に高い頻度で生ずる相同組換えによる染色体にコードされた遺伝子のねらいを定めた欠失を含む。標的となる遺伝子の完全な欠失は、野生型に復帰し得る自発的突然変異の選択よりも好ましい。したがって、遺伝子欠失は、栄養不足の増殖培地を使用して、低温（３０℃）でインキュベートする芽胞形成による野生型２倍体から一般的に誘導されるＳ．セレビシエにおける半数体状態のために好ましい。しかしながら、Ｓ．ボウラルディは、胞子欠損性であり、かつ通常の芽胞形成条件下では半数体細胞の形成が困難である［６４、６５］。両方の染色体遺伝子アレル（例えば、ＵＲＡ３）の欠失のための２段階法が使用され、そこでは、各々の欠失段階が選択され得る。その方法は、図１６で図解されている。
【０２４６】
全ての染色体欠失は、線状ＤＮＡ欠失カセットの酢酸リチウムで促進される遺伝子形質転換［７３］によって実施した。酢酸リチウムベースの形質転換はＳ．セレビシエのプロトコルに由来するものであり、Ｓ．ボウラルディと互換性があることが判明したが、Ｓ．ボウラルディは、より一層形質転換しにくいことが分かった［５５、５６］。差は、約１００倍である。Ｓ．セレビシアにおける形質転換効率は、グルコース濃度及び熱ショック時間の調節によって改善することができる［７４］。したがって、Ｓ．ボウラルディ形質転換において最適化のために、様々なグルコース濃度及び熱ショック時間を取り入れた。Ｓ．ボウラルディのために試験した最良の条件は、前培養における２％グルコース及び４２℃での２０分の熱ショック時間であり、これらの条件は、全ての研究における全ての形質転換手順のために使用した。
【０２４７】
それぞれ酵母におけるＧ４１８及びフレオマイシンに対する耐性を与える遺伝子ａｐｈＡ１及びｂｌｅを含む２つの欠失カセットを、ＰＣＲによって、ｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ（配列番号８０）及びｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｐｈ（配列番号８６）（Lars Nielsen及びClaudia Vickersによる寄贈（Addgene社のプラスミド番号４６８２０））を鋳型として使用して作製した。両方の欠失カセットは、同じ方向で２つのＰ１の交叉遺伝子座（locus of X-over P1）（ｌｏｘＰ）に隣接しており、こうしてＣｒｅレコンビナーゼを使用して抗生物質耐性遺伝子を反転させることが可能となる。ＵＲＡ３プロモーター（ＰＵＲＡ３）の上流であり、かつＵＲＡ３の停止コドンの下流にある４０塩基対の相同配列を、ＰＣＲプライマー中に導入して、Ｓ．ボウラルディにおける部位特異的遺伝子欠失のための２種類の最終欠失カセットを作製した（図１６を参照）。Ｓ．ボウラルディの染色体ＶにおけるＵＲＡ３遺伝子の正確な配列及び位置を、サッカロマイセス属菌ゲノムデータベース（ＳＧＤ）からのオンラインで公表されている配列からＵＲＡ３遺伝子アノテーションを使用してマッピングした。第一のＵＲＡ３アレルとａｐｈＡ１欠失カセットとを置き換える１番目の交叉は、Ｇ４１８に対する耐性を使用するために選択され［６６］、第二のＵＲＡ３アレルとｂｌｅ欠失カセットとを置き換える２番目の交叉は、フレオマイシンに対する耐性を使用するために選択される［７５］（図１６）。両方のＵＲＡ３アレルとａｐｈＡ１欠失カセット及びｂｌｅ欠失カセットとの置換えは、両方の抗生物質に対する耐性によって明らかにされた（データは示していない）だけでなく、ウラシルを欠いた最小合成培地プレート上での増殖の欠如（データは示していない）によって明らかにされた。また酵母の表現型は、クロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）を含むサブロープレート上での増殖によって確認された（データは示していない）。さらに、ＵＲＡ３染色体領域におけるＵＲＡ３遺伝子、ａｐｈＡ１遺伝子又はｂｌｅ遺伝子を標的とする３つの固有のプライマーセットを設計し、鋳型として、野生型（ＷＴ）ゲノムＤＮＡ、ＵＲＡ３Δ：：ａｐｈＡ１／ＵＲＡ３（１番目の交叉）ゲノムＤＮＡ、及びＵＲＡ３Δ：：ａｐｈＡ１／Δ：：ｂｌｅ（２番目の交叉）ゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲを実施した。ＵＲＡ３染色体領域におけるＵＲＡ３遺伝子、ａｐｈＡ１遺伝子又はｂｌｅ遺伝子を標的とする予想されるＰＣＲ産物サイズは、それぞれ７６６ｂｐ、１１８３ｂｐ、及び６６２ｂｐである。これらの３つの固有のプライマーセットを使用したＷＴのクローン、１番目の交叉のクローン、及び２番目の交叉のクローンからのＰＣＲ産物のＤＮＡ電気泳動により、ＵＲＡ３アレルの不存在、並びに２番目の交叉の菌株のａｐｈＡ１欠失カセット及びｂｌｅ欠失カセットの組込みが確認された。
【０２４８】
２番目の交叉の菌株を、次いでｐＰＬ５０７１＿ＴＥＦ１−Ｃｒｅ＿ＵＲＡ３（ｐＰＬ５０７１、配列番号９５）［７６］で形質転換させることで、ａｐｈＡ１欠失カセット及びｂｌｅ欠失カセットを除去した。ｐＰＬ５０７１を有する菌株は、ＣｒｅレコンビナーゼをＰＴＥＦ下に構成的に発現する。Ｃｒｅレコンビナーゼは、その際、ａｐｈＡ１欠失カセット及びｂｌｅ欠失カセットに隣接するｌｏｘｐ配列を標的とし、これによりａｐｈＡ１欠失カセット及びｂｌｅ欠失カセットの切り出しが引き起こされ、ＵＲＡ３染色体領域においてｌｏｘｐ部位が１つだけ残される。ａｐｈＡ１欠失カセット及びｂｌｅ欠失カセットの切り出しに成功した菌株は、Ｇ４１８又はフレオマイシンいずれの存在下でも増殖することができず、両方のＵＲＡ３アレルの欠損がなおも維持されるので、最小合成培地プレートにおいてはウラシルの存在下でのみ増殖することができ、ウラシルが補われない最小合成培地プレートにおいては、増殖は示されなかった。
【０２４９】
ｐＰＬ５０７１の除去は、ＹＰＤにおいて増殖させ、後に増殖したコロニーについてウラシル及びピリミジン類似体の５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を含有する最小合成培地上で選択することによって達成される［７７］。ｐＰＬ５０７１を有する菌株は、ＵＲＡ３遺伝子を有し、その遺伝子は、チミジル酸シンテターゼの強力な阻害剤である毒性の中間体５−フルオロデオキシウリジンを合成することができ、それによりＤＮＡ合成が中断され、細胞死がもたらされ、ｐＰＬ５０７１を失った菌株の選択が可能となる。またｐＰＬ５０７１の不存在は、ｐＰＬ５０７１特異的プライマーによるＰＣＲと、ＰＣＲ産物のＤＮＡ電気泳動とによって確認された。
【０２５０】
２μｍプラスミドは、サッカロマイセス属菌株において汎在する非常に安定な６．１ｋｂのプラスミドである。このプラスミドは、酵母宿主生物に選択上の利益を与えず、効率的なＲＥＰ１−ＲＥＰ２−ＳＴＢプラスミド分配システムの存在により極めて安定である［６８］。使用されるＳ．ボウラルディ菌株も、ＰＣＲにより確認されるように、このプラスミドを含む。２μｍプラスミドを除去するために、ｐＢＩＳ−ＧＡＬｋＦＬＰ−ＵＲＡ３（配列番号８７）［６７］を使用して、２μｍプラスミドをキュアリングし、引き続きウラシル及び５−ＦＯＡにより除去した。２μｍプラスミドの消失は、ＰＣＲによって複製起点に特異的なプライマーを使用して確認された。
【０２５１】
これらの操作により得られるＳ．ボウラルディの栄養要求性菌株を、Ｓ．ボウラルディＵＲＡ３Δ／Δと呼称する。
【０２５２】
ＡＢＡＢのｉｎ  ｓｉｔｕ送達のための栄養要求性Ｓ．ボウラルディ菌株
ＡＢＡＢのｉｎ  ｓｉｔｕ送達のための栄養要求性Ｓ．ボウラルディ菌株を構築するために、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−Ｘ４０−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ（配列番号８５）のａｐｈＡ１カセットを、ｐＤプラスミドからのＵＲＡ３カセットによって置き換え、プラスミドｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ−ｃＭｙｃ（配列番号８８）を作製した。次いでこのプラスミドを使用することで、Ｓ．ボウラルディＵＲＡ３Δ／Δを形質転換させた。得られた菌株は、精製されたＡＢＡＢと比較した場合に細胞毒性アッセイにおいて完全に機能的なＡＢＡＢを分泌している（図１７のＣ）。ウェスタンブロッティングは、ＨＲＰと結合されたα−ラマ抗体を使用してＳ．ボウラルディ培養上清から相応のＡＢＡＢバンドを示した（図１７のＤ）。ＡＢＡＢのＣ末端は、ｃ−Ｍｙｃタグを含み、α−ｃ−Ｍｙｃ抗体によって更にプルダウンされ得る（図１７のＤ）。
【０２５３】
空のプラスミド（ＥＰ）コントロールのために、ＡＴ−ｙＡＢＡＢ配列を、後にｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ−ｃＭｙｃ（配列番号８８）から除去することで、ｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ｃＭｙｃ（配列番号８９）を作製した。このプラスミドで形質転換されたＳ．ボウラルディＵＲＡ３Δ／Δ菌株は、ＵＲＡ３が補われた菌株となるが、ＡＢＡＢは分泌しない。ＡＢＡＢを分泌するＳ．ボウラルディＵＲＡ３Δ／Δ菌株はまた、バンコマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＹＰＤ中で培養した場合に増殖阻害を示さなかった（図１７のＡ）。このことは、ＣＤＩ患者の治療に一般的に使用されるバンコマイシンと同時にＳ．ボウラルディを投与することができ、Ｓ．ボウラルディがＡＢＡＢを分泌することで進行中のＣＤＩが治療されることを示唆している。さらに、精製されたＡＢＡＢが、Ｏ．Ｄ．１０でＳ．ボウラルディから回収される培養上清中で２時間の期間にわたり安定であることは、分泌されたＡＢＡＢが、Ｓ．ボウラルディから分解されずに拡散される可能性があることを示唆している。
【０２５４】
抗生物質処置されたマウスに経口送達されるＳ．ボウラルディの安全性評価
ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディＵＲＡ３Δ／Δが、ＣＤＩモデル［２０、３３、６２、７８］においてマウスを保護し得るかどうかを評価する前に、安全性評価を実施することで、抗生物質処置されたマウスにおけるＳ．ボウラルディの安全用量を決定した。この安全性評価においては、マウスにまずは抗生物質カクテルをその毎日の飲用水中に３日間にわたり供給し、その後に通常の水に切り替えた。Ｓ．ボウラルディの経口送達１日前に、マウスにクリンダマイシンを腹腔内注射した。これによりマウスに対する抗生物質処置を終え、次いで安全性評価のためにＳ．ボウラルディをマウスに経口送達した。その安全性評価には、これらの抗生物質処置されたマウスの毎日の体重変化及びそれらの糞便試料中のＳ．ボウラルディの残存の監視が含まれる。マウスは、１０１０個の細胞のＳ．ボウラルディを経口送達した場合に、Ｓ．ボウラルディがＧＲＡＳ生物であるという考えと一致して６日間の監視の間に病気の徴候を示さず、かつ着実な体重増加を示した。しかしながら、引き続いてのＣＤＩマウス研究のためには、ペレットの再懸濁を容易にし、再懸濁時の高い粘度により生じ得るマウスへの投与量のばらつきを小さくするために、１０９個の細胞のＳ．ボウラルディだけを投与した。またＳ．ボウラルディは、これらの抗生物質処置されたマウスの胃腸管内に限られた定着しか示さず、最後の強制投与の３日後には、サブロープレートからは検出可能なＳ．ボウラルディは回収されなかった（データは示していない）。
【０２５５】
マウスにおける原発性ＣＤＩに対するＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディの保護
ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディの保護は、確立された原発性マウスＣＤＩモデルを使用して評価した。ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディは、マウスにおける原発性ＣＤＩに対する予防又は治療のいずれかとして送達された。簡潔には、原発性ＣＤＩは、マウスにおいて、抗生物質混合物をその飲料水中に３日間にわたり補給し、その後にＣ．ディフィシル胞子の負荷２４時間前にクリンダマイシンを腹腔内注射することによって確立された。１０５個のＣ．ディフィシル胞子（ＵＫ１、０２７／ＢＩ／ＮＡＰ１流行性菌株）をマウスに強制投与することで、ＣＤＩを誘発させた。予防的評価のために、通常の飲料水に切り替えた翌日に、マウスにＳ．ボウラルディの経口投与を開始し、それを７日間にわたり毎日続けた。治療的評価のために、胞子の負荷から６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に、マウスにＳ．ボウラルディを経口投与した。コントロールは、ＰＢＳ、及び空のプラスミドで形質転換されたＳ．ボウラルディを含んでいた。両者の方法において、ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディを投与したマウスは、ＣＤＩに誘発される死に対して有意に保護された（図１８のＡ及び図１９のＡ、ＰＢＳ：ネガティブコントロール、Ｓｂ：ＥＰ：空のプラスミドで形質転換されたＳ．ボウラルディ、Ｓｂ：ＢＡＢ：ＡＢＡＢを分泌するＳ．ボウラルディ）。ＣＤＩマウスは、一般的に約２日目から３日目に下痢による最も大きな体重低下を伴う体重減少を経て、徐々に回復した。ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディを投与したマウスの体重は、有意により早期に回復し（図１８のＢ及び図１９のＢ）、下痢事象の割合は、負荷から２日後に有意に低下した（図１８のＣ及び図１９のＣ）。
【０２５６】
マウスにおける再発性ＣＤＩに対するＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディの保護
ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディの保護を、マウスにおける再発性ＣＤＩに対して評価した。再発性ＣＤＩを誘発させるために、マウスに、抗生物質カクテルをその毎日の飲料水中に３日間与えた。抗生物質水から３日後に、マウスを次に通常の飲料水に戻し替えた。１０５個のＣ．ディフィシル胞子（ＵＫ１、０２７／ＢＩ／ＮＡＰ１流行性菌株）の経口送達１日前に、マウスにクリンダマイシンを腹腔内注射した。胞子の負荷から６時間後に、通常の水を、６日間にわたり０．５ｍｇ／ｍｌのバンコマイシンを含有する水に変えて、研究の残りの間に再び通常の水に戻し替えた。マウスは、一般的に、バンコマイシン中止の４日後に、更なるＣ．ディフィシル胞子の負荷なくしてＣＤＩの徴候を発現する。再発モデルの過程では、Ｓ．ボウラルディを、バンコマイシン水と一緒に１２日間にわたり毎日一回経口送達した。このモデルを使用して、マウスにおけるＣＤＩ再発を抑制することに対するＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディの保護効力を評価する。これらのマウスの生存率、体重減少、及び下痢事象を、毎日監視した。コントロールは、ＰＢＳ、及び空のプラスミドで形質転換されたＳ．ボウラルディを含んでいた。ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディを投与したマウスは、再発に誘発されるＣＤＩによる死に対して有意に保護された（図２０のＡ、ＰＢＳ：ネガティブコントロール、Ｓｂ：ＥＰ：空のプラスミドで形質転換されたＳ．ボウラルディ、Ｓｂ：ＢＡＢ：ＡＢＡＢを分泌するＳ．ボウラルディ）。原発性ＣＤＩマウスと同様に、再発性ＣＤＩマウスも、一般的にバンコマイシン水の中止から約４日から５日後に最も大きい体重低下を伴う体重減少を経た。ＡＢＡＢを発現するＳ．ボウラルディを投与したマウスは、体重減少から有意に保護され（図２０のＢ）、下痢再発事象の割合は、有意に低下した（図２０のＣ）。
【０２５７】
染色体組込みによるＡＢＡＢカセットの安定性の最適化
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベースのシステムを使用するゲノム編集は、近年Ｓ．セレビシエ及びＳ．ボウラルディの両方で実証された［７９〜８１］。さらに、大きな断片の欠失は、同時に２つのガイド配列を標的とすることによって達成することができる［８２］。外来遺伝子は、選択圧がない場合に、一般的に染色体中に組み込まれた場合の方が、プラスミドを介して導入された場合よりも安定的に保持される。しかしながら、染色体組込みは、しばしば高コピーを達成するために多くの回数の組込みを必要とする。最近の刊行物で報告されているプロトコルは、Ｓ．セレビシエゲノム中のδ部位等の多コピーの共通配列を標的とすることによりＣＲＩＳＰＲに誘導される二本鎖切断によってこの困難を乗り越えており、これらの部位に大きな断片の同時の組込みが達成された［８３］。ＤＮＡ二本鎖切断は、非相同的末端結合又は相同組換えのいずれかによって修復され得るが、内因性の相同配列が存在する場合に、宿主は、ＤＮＡ二本鎖切断を修復するために相同組換えにより相同配列を優先的に使用する［８３］。
【０２５８】
δ部位は、Ｔｙ因子Ｉ及びＩＩに属する長鎖末端反復（ＬＴＲ）であり、Ｓ．セレビシエにおいて最も豊富なＬＴＲである。Ｓ．セレビシエにおいてより一般的に見られるクラスＩＩトランスポゾン（レトロトランスポゾン）により代表される５つの種類のＴｙ因子（１〜５）が存在する。約５１個のレトロトランスポゾン（Ｔｙ１〜５）が存在し、２５１個のδ部位がＳ．セレビシエゲノム全体に存在すると見積もられている［８４］。そのようなδ部位は、Ｓ．ボウラルディ染色体へのＡＢＡＢ発現カセット組込みのための魅力的な標的配列である。しかしながら、Ｓ．ボウラルディのδ部位について知られていることははるかに少ない。したがって、Ｔｙ１−Ｈ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１８７０６）［８４］を、まずはＳ．ボウラルディ菌株ＭＹＡ７９６（ATCC、バージニア州、マナサス）（ドラフトゲノムはNCBIから入手した）中のＴｙ１〜２因子を調査するためにプローブとして使用し、Ｓ．ボウラルディゲノム中の可能なＴｙ１〜２因子及びそれらのδ部位を特定した。驚くべきことに、ＭＹＡ７９６には、完全なＴｙ１〜２因子は見られなかった。全体で５７個のδ部位が見出された。これには、全ての１６個の染色体にわたって特定されて、４４個の完全なδ部位及び１２個の部分的部位並びに１個の完全なδ部位を含む部分的Ｔｙ因子が含まれる（表１２）。
【０２５９】
【表１２】
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【０２６０】
Ｓ．ボウラルディの２倍体状態のため、Ｓ．ボウラルディゲノムにわたって約１１４個のδ部位が存在する。ＣＲＩＳＰＲにより簡単に多重δ部位を標的とし得るために、全ての５７個のδ部位の配列を、ＭＵＳＣＬＥを使用する多重配列アライメントのために収集し、５７個のδ配列の中でも多数に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を特定した。２つのＰＡＭ部位を、プロトスペーサー中に均一性を有する最多数のδ配列に基づいて、上流配列及び下流配列として選択した。これらのＰＡＭ部位の配列は、図２１に図示され、具体的な配列は以下の通りである：
ＰＡＭ部位Ｉ
ＴＧＴＴＧＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＣＴＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＡＴＡＣＧＧＴＧＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＡＴＡＧＴＣＡＴＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣ（配列番号９３）
ＰＡＭ部位ＩＩ
ＡＡＴＡＴＴＴＡＴＡＧＡＡＴＴＧＴＧＴＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＴＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＣＴＡＧＴＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＡＣＣＴＡＡＴＡＴＴＡＴＡＧＣＣＴＴＡＡＴＣ（配列番号９４）。
【０２６１】
Ｐａｍ部位Ｉ及びＰａｍ部位ＩＩの両方において、点線により下線が引かれた配列は、上流の相同配列に相当し、単線により下線が引かれた配列は、２０ｂｐのプロトスペーサーに相当し、二重線により下線が引かれた配列は、ＰＡＭ配列に相当し、波線により下線が引かれた配列は、下流の相同配列に相当する。
【０２６２】
δ部位内の共通の上流及び下流の相同配列を伴うこれらの２つのＰＡＭ部位は、Ｓ．ボウラルディゲノム中へのＡＢＡＢ発現カセットの簡単な染色体組込みを可能にする。相同組換え配列を含むＡＢＡＢ組込みカセットを、ＰＣＲによって、３’末端で最後の３個のヌクレオチドが除去された上流の相同配列及び５’末端で最初の２個のヌクレオチドが除去された下流の相同配列、並びにプラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６Ｔ８３Ｎ−タグなしを鋳型（配列番号９０）として使用するＰＣＲのために必要とされる相応のアニーリング配列を含むプライマーを使用して作製した。
【０２６３】
ＡＢＡＢ組込みカセットのＰＣＲ産物と、相応のガイド配列（ｐＣＲＩ−Ｓｂ−δ１（配列番号９１）及びｐＣＲＩ−Ｓｂ−δ２（配列番号９２））を含むＣＲＩＳＰＲプラスミドとを、ＰＡＭ部位Ｉ及びＰＡＭ部位ＩＩを標的にして独立的にかつ連続的に染色体中にＡＢＡＢを組み込むためにＳ．ボウラルディに同時形質転換した。ＰＣＲ産物のＣＲＩＳＰＲプラスミドに対する比率は、効果的な組込みクローンを作製するために重要であることが判明した（図２２のＡ、ＩＴＧ低対ＩＴＧ高）。さらに、ＩＴＧ高群からの最も高いＡＢＡＢ分泌クローンの、同じ組込みカセット及びＣＲＩＳＰＲプラスミドによる繰り返しの形質転換は、独立したクローンの全体のＡＢＡＢ分泌を更に改善しなかった（図２２のＡ、２回目のＩＴＧ高）。ＩＴＧ高群からの最も高いＡＢＡＢ分泌クローン（ＣＲＩＳＰＲ−２）のＡＢＡＢ分泌は、その際、相同組換え配列を含むＡＢＡＢ組込みカセット、及び部位ＩＩを標的とするＣＲＩＳＰＲプラスミド中のその相応のガイド配列の第二の組を同時形質転換することによって更に改善された（図２２のＡ）。２つの最も高いＡＢＡＢ分泌クローンであるＣＲＩＳＰ−３及びＣＲＩＳＰＲ−４を選択した。これらの４種の代表的なクローンのＡＢＡＢ分泌量及び経時的安定性は、図２２のＢに示される。予備的なマウスＣＤＩ研究を実施した。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ−４は、数多くのマウスＣＤＩモデルにおいて保護を示した以前のＭ−／−：ＡＢＡＢクローンよりも良くないことが判明した（図２３）。
【０２６４】
本発明はその或る特定の実施形態を参照して記載されているが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更を行い得ることを理解する。添付の特許請求の範囲は、記載される具体的な実施形態に限定されない。
【０２６５】
参考資料
本明細書で言及される全ての特許及び出版物は、本発明の属する技術分野の当業者の技術水準の指標である。各々の引用される特許及び出版物はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。以下の参考資料は、全て本出願で引用されている。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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