(57)【要約】ビフィドバクテリウム・ロングムＡＨ１３６２（ＮＣＩＭＢ  ４１７１５）は、多糖類を産生し、エネルギー排出を増大させる。その株は、肥満および肥満関連メタボリックシンドロームの予防または処置において用いられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７１５の下で寄託されたビフィドバクテリウム・ロングムの株ＡＨ１３６２。
【請求項２】
生存可能細胞の形態の請求項１に記載の株。
【請求項３】
生存不能細胞の形態の請求項１に記載の株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の株を含む、配合物。
【請求項５】
プロバイオティクス材料をさらに含む、請求項４に記載の配合物。
【請求項６】
プレバイオティクス材料をさらに含む、請求項４または５に記載の配合物。
【請求項７】
摂取可能なキャリヤーをさらに含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項８】
摂取可能なキャリヤーが、薬学的に許容可能なキャリヤー、例えばカプセル、錠剤または粉末である、請求項７に記載の配合物。
【請求項９】
摂取可能なキャリヤーが、食品製品、例えば酸性乳、ヨーグルト、冷凍ヨーグルト、粉乳、乳濃縮物、チーズスプレッド、ドレッシングまたは飲料である、請求項７に記載の配合物。
【請求項１０】
タンパク質および／もしくはペプチド、特にグルタミン／グルタミン酸に富むタンパク質および／もしくはペプチド、脂質、炭水化物、ビタミン、鉱質ならびに／または微量元素をさらに含む、請求項４〜９のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１１】
前記株が、配合物のグラムあたり１０６ｃｆｕより多い量で存在する、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１２】
アジュバントをさらに含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１３】
細菌性構成要素をさらに含む、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１４】
薬物実体をさらに含む、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１５】
生物学的化合物をさらに含む、請求項４〜１４のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１６】
請求項１に記載の株または請求項４〜１５のいずれか１項に記載の配合物を含む、凍結乾燥された組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の株、請求項４〜１５のいずれか１項に記載の配合物、または請求項１６に記載の組成物を含む、食品。
【請求項１８】
請求項１に記載の株、請求項４〜１５のいずれか１項に記載の配合物、または請求項１６に記載の組成物を含む、医薬品。
【請求項１９】
請求項１に記載の株、請求項４〜１５のいずれか１項に記載の配合物、または請求項１６に記載の組成物を含む、カプセル。
【請求項２０】
胃腸管中での制御された放出に適合している、請求項１９に記載のカプセル。
【請求項２１】
肥満または肥満関連メタボリックシンドロームの予防または処置における使用のための、請求項１に記載の株、請求項４〜１５のいずれかに記載の配合物、または請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の予防または処置における使用のための、請求項１に記載の株、請求項４〜１５のいずれかに記載の配合物、または請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
肥満を予防または処置する必要がある対象にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７１５の下で寄託されたビフィドバクテリウム・ロングムの株ＡＨ１３６２を含む組成物を投与することを含む、肥満を予防または処置するための方法。
【請求項２４】
肥満関連メタボリックシンドロームを予防または処置する必要がある対象にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７１５の下で寄託されたビフィドバクテリウム・ロングムの株ＡＨ１３６２を含む組成物を投与することを含む、肥満関連メタボリックシンドロームを予防または処置するための方法。
【請求項２５】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を予防または処置する必要がある対象にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７１５の下で寄託されたビフィドバクテリウム・ロングムの株ＡＨ１３６２を含む組成物を投与することを含む、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を予防または処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）の株に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、２１世紀の最も深刻な公衆衛生の難題の１つである。世界的に、成人のおおよそ１３％が、肥満であり、さらに３９％が、太りすぎであると考えられている（ＷＨＯ、２０１５）。肥満は、エネルギーの摂取および消費の間の長期の不均衡の結果である多因子障害であり、遺伝的および環境的要因により影響を受ける。肥満は、インスリン抵抗性および慢性的な低度の炎症を特徴とする(Gregor and Hotamisligil, 2011, Kahn et al., 2006)。免疫系、代謝、および腸微生物叢の間の密接な相互作用が、肥満および代謝恒常性の制御において重要な役割を果たしている可能性がある。肥満は、慢性的代謝障害、例えば２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高血圧、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症および心血管疾患のクラスターを発現させ、悪化させるリスクを増大させ(Guh et al., 2009)、代謝的併存症の有病率は、ＢＭＩの増大と一致して増大している(Gupta et al., 2015)。肥満は、重篤であり生命を脅かす可能性のある疾患、例えばアレルギーおよび喘息、骨関節炎、胆嚢疾患および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（脂肪が肝臓中で蓄積する病気であり、肝臓の硬変の主因）を発現するリスクも増大させる。
【０００３】
ますます一般的になっている病気であるメタボリックシンドロームは、肥満、高脂血症（高トリグリセリド）、高血圧症（高血圧）およびグルコース不耐性（高血糖）および低ＨＤＬコレステロールの組み合わせを指す。これらの危険因子は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）および心血管疾患を発現する高いリスクのある対象の同定を助ける。
【０００４】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、非常に一般的な障害であり、アルコールをほとんどまたは全く飲まない人々の肝臓中に過剰な脂肪の蓄積が存在する状態の群を指す。
【０００５】
ＮＡＦＬＤのより重症の形態は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれる。ＮＡＳＨは、肝臓を腫脹させ、損傷状態にする。ＮＡＳＨは、太りすぎもしくは肥満である、または糖尿病、高コレステロールもしくは高トリグリセリドを有する人々において発現する傾向がある。
【０００６】
数多くの臨床および実験データが、増大した内臓脂肪組織からの遊離脂肪酸の増大した流動がインスリン抵抗性と関係するＮＡＦＬＤをもたらし得ることを示している。従って、肥満、インスリン抵抗性および脂質異常症を有する人は、ＮＡＦＬＤを発現する最大のリスクがある。
【０００７】
無菌マウスは、それらの従来法で育てられた対応するマウスよりも痩せていることが分かったという観察(Backhed et al., 2004)のため、腸微生物叢の肥満の発現への寄与が、ますます研究されている(Backhed et al., 2007, Cani et al., 2008b, Ridaura et al., 2013, Vrieze et al., 2012)。腸微生物叢の肥満への寄与は、多因子性であり、増進されたエネルギーの取り入れおよび脂肪貯蔵(Turnbaugh et al., 2006)、変化した代謝経路(Kotzampassi et al., 2014, Turnbaugh et al., 2009)ならびに慢性低度炎症をもたらす細菌移行(Cani et al., 2007, Cani et al., 2008a)のような問題を含む。従って、腸微生物叢のプロバイオティクスによる操作は、肥満を改善し、代謝的健康を向上させるのを助けるための可能性のある療法的手段である。ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株は、プロバイオティクスとして一般的に用いられており、株特異的様式でインビボにおいて健康に有益な作用を支持するという多数の証拠を有する(Aronsson et al., 2010, Lee et al., 2006, Naito et al., 2011)。
【０００８】
これらの株の作用機序は、十分に特性付けられていない。興味深い分子の一群は、細菌性菌体外多糖類（ＥＰＳ）である。ＥＰＳは、糖残基で構成され、細菌により周辺環境中に分泌される高分子量ポリマーである。菌体外多糖類（ＥＰＳ）産生細菌は、免疫調節作用を有することが示されている(Fanning et al., 2012, Hidalgo-Cantabrana et al., 2014, Vinderola et al., 2006, Volman et al., 2008, Jones et al., 2014)。多くの乳酸菌（ＬＡＢ）が、ＥＰＳを合成する能力を有する。しかし、ＥＰＳは、不均質な分子であり、組成、電荷および分子構造が異なり、それは、株特異的な生理活性が観察されることを説明し得る(Adams et al., 2008, Bland et al., 2004, Hidalgo-Cantabrana et al., 2012, Kankainen et al., 2009)。
【０００９】
肥満および代謝障害と関係する慢性低度炎症(Gregor and Hotamisligil, 2011)は、肥満の発現に有利に影響を及ぼすためのプロバイオティクスの投与による操作に関して標的とされ得る１つの危険因子である。我々は、以前に、別の乳酸菌であるＢ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＮＣＩＭＢ  ４１００３が、抗炎症作用を有することを示している。この細菌は、実質的なＥＰＳ外被を有する。そのＥＰＳ物質も、国際公開第２０１００５５４９９Ａ号において記載されているように、抗炎症作用を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１００５５４９９Ａ号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ＷＨＯ、２０１５
【非特許文献２】Gregor and Hotamisligil, 2011
【非特許文献３】Kahn et al., 2006
【非特許文献４】Guh et al., 2009
【非特許文献５】Gupta et al., 2015
【非特許文献６】Backhed et al., 2004
【非特許文献７】Backhed et al., 2007
【非特許文献８】Cani et al., 2008b
【非特許文献９】Ridaura et al., 2013
【非特許文献１０】Vrieze et al., 2012
【非特許文献１１】Turnbaugh et al., 2006
【非特許文献１２】Kotzampassi et al., 2014
【非特許文献１３】Turnbaugh et al., 2009
【非特許文献１４】Cani et al., 2007
【非特許文献１５】Cani et al., 2008a
【非特許文献１６】Aronsson et al., 2010
【非特許文献１７】Lee et al., 2006
【非特許文献１８】Naito et al., 2011
【非特許文献１９】Fanning et al., 2012
【非特許文献２０】Hidalgo-Cantabrana et al., 2014
【非特許文献２１】Vinderola et al., 2006
【非特許文献２２】Volman et al., 2008
【非特許文献２３】Jones et al., 2014
【非特許文献２４】Adams et al., 2008
【非特許文献２５】Bland et al., 2004
【非特許文献２６】Hidalgo-Cantabrana et al., 2012
【非特許文献２７】Kankainen et al., 2009
【非特許文献２８】Gregor and Hotamisligil, 2011
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、寄託された株ＮＣＩＭＢ  ４１７１５を提供する。ビフィドバクテリウム・ロングムの株ＡＨ１３６２は、ＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７１５の下で寄託された。
【００１３】
一側面によれば、本発明は、有効量のその株を含む、肥満および肥満と関連するメタボリックシンドロームの予防または処置における使用のための組成物を提供する。その株は、多糖類を産生し、エネルギー排出を増大させる。その株は、プラセボを与えられた健康な成人のボランティアからの便試料から分離された。
【００１４】
本発明の分離株は、対象における体脂肪の蓄積を低減するために用いられることができる。その株は、体重増加を妨げる、または体重を低減するために用いられることができる。その株は、過剰な体脂肪の蓄積の結果もたらされる病気の処置、予防、または緩和のために用いられることができる。
【００１５】
本発明は、肥満を予防または処置するための方法であって、ＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７１５の下で寄託された株を含む組成物を肥満を予防または処置する必要がある対象に投与することを含む方法も提供する。
【００１６】
本発明は、さらに、肥満と関連するメタボリックシンドロームを予防または処置するための方法であって、ＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７１５の下で寄託された株を含む組成物を肥満と関連するメタボリックシンドロームを予防または処置する必要がある対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を予防または処置するための方法であって、ＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７１５の下で寄託されたビフィドバクテリウム・ロングムの株ＡＨ１３６２を含む組成物を非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を予防または処置する必要がある対象に投与することを含む方法も提供する。
【００１８】
その株は、生存可能細胞の形態であることができる。その株は、生存不能細胞の形態であることができる。プロバイオティクス細菌の一般的な使用は、生存可能細胞の形態である。しかし、使用は、生存不能細胞、例えば殺菌された培養物、生存可能および生存不能培養物の混合物、またはプロバイオティクス細菌により発現された有益な因子を含有する組成物まで拡張されることもできる。これは、熱で殺菌された微生物または変更されたｐＨへの曝露もしくは圧力もしくはガンマ線照射を受けることにより殺菌された微生物を含むことができるであろう。生存不能細胞を用いると、製品の調製は、より簡単であり、細胞は、医薬中に容易に組み込まれることができ、貯蔵の要求は、生存可能細胞よりもはるかに限定されない。ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）ＹＩＴ  ９０１８は、米国特許第４３４７２４０号において記載されているように、熱殺菌された細胞の、腫瘍成長の処置および／または予防のための方法としての有効な使用の例を与える。
【００１９】
本発明は、本明細書で記載される株を含む配合物も提供する。配合物は、さらにプロバイオティクス材料を含むことができる。配合物は、さらにプレバイオティクス（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）材料を含むことができる。配合物は、さらにキャリヤーを含むことができる。キャリヤーは、摂取可能なキャリヤーであることができ、それは、薬学的に許容可能なキャリヤー、例えばカプセル、錠剤または粉末であることができる。摂取可能なキャリヤーは、食品製品、例えば酸性乳、ヨーグルト、冷凍ヨーグルト、粉乳、乳濃縮物、チーズスプレッド、ドレッシングまたは飲料であることができる。一部の例は、発酵食品製品、例えば発酵乳製品を含む。配合物は、さらにタンパク質および／もしくはペプチド、特にグルタミン／グルタミン酸に富むタンパク質および／もしくはペプチド、脂質、炭水化物、ビタミン、鉱質ならびに／または微量元素を含むことができる。ビフィドバクテリウム属の株は、配合物のグラムあたり１０６ｃｆｕより多い量で存在することができる。配合物は、さらに補助剤を含むことができる。配合物は、さらに細菌性構成要素を含むことができる。配合物は、さらに薬物実体を含むことができる。配合物は、さらに生物学的化合物を含むことができる。全ての場合において、配合物は、本明細書で記載される株を含み、キャリヤーまたは他の薬剤を含むことができる。その様なキャリヤーまたは他の薬剤は、ある場合において、天然に存在しない。配合物は、ある場合において、免疫処置およびワクチン接種プロトコルのために用いられることができる。
【００２０】
本発明は、本発明の株または本発明の配合物を含む凍結乾燥された組成物も提供する。
本発明は、食品における使用のための本明細書で記載される株または配合物も提供する。
【００２１】
本発明は、医薬品としての使用のための本明細書で記載される株または配合物も提供する。
本発明は、肥満および関連する疾病の予防および／または処置における使用のための本明細書で記載される株または配合物も提供する。
【００２２】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の予防および／または処置における使用のための本明細書で記載される株または配合物も提供する。
本明細書で記載される株は、ＩＬ−１０のレベルを修正するための生物療法剤（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）のパネルの調製において用いられることができる。
【００２３】
本発明は、肥満関連炎症の予防および／または処置における使用のための本明細書で記載される株または配合物も提供する。
本発明は、肥満関連代謝失調症の予防および／または処置における使用のための本明細書で記載される株または配合物も提供する。
【００２４】
本発明の特定の株は、動物（ヒトを含む）に、従来の製剤、例えばカプセル、マイクロカプセル、錠剤、顆粒、粉末、トローチ、丸剤、坐剤、懸濁液およびシロップにおいて経口摂取可能な形態で投与されることができることは、理解されるであろう。適切な配合物は、一般的に用いられている方法により、従来の有機性および無機性添加剤を用いて調製されることができる。医薬組成物中の有効成分の量は、所望の療法的作用を及ぼすであろうレベルにおけることができる。
【００２５】
配合物は、細菌性構成要素、薬物実体または生物学的化合物も含むことができる。
加えて、本発明の株を含むワクチンは、あらゆる適切な既知の方法を用いて調製されることができ、薬学的に許容可能なキャリヤーまたはアジュバントを含むことができる。
【００２６】
本発明は、本発明の株に由来するがなお寄託された株の活性を有する変異体およびバリアントも含む。その変異体およびバリアントは、その遺伝的および／または表現型的特性が親株と比較して変化している株を含む。天然存在バリアントは、選択的に分離された標的とされる特性の自然発生的変化を含む。親株の特性の意図的な変化は、従来の（インビトロ）遺伝子操作技術、例えば遺伝子破壊、接合伝達等により成し遂げられる。遺伝子改変は、外来性および／または内因性ＤＮＡ配列の株のゲノム中への、例えばプラスミドＤＮＡまたはバクテリオファージを含むベクターによる細菌株のゲノム中への挿入による導入を含む。
【００２７】
天然変異または誘導された変異は、少なくとも１塩基の変化、例えば欠失、挿入、転換または結果としてＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列の変化をもたらし得る他のＤＮＡ改変を含む。
【００２８】
変異体、バリアントおよび遺伝子改変された変異体という用語は、天然において全ての微生物に関して一致している速度でゲノム中に蓄積する遺伝子変化、ならびに／またはゲノムの意図的な（インビトロ）操作により達成されたのではないが環境圧、例えば抗生物質に曝露された際に細菌の生存を支持するような選択的利点を提供するバリアントおよび／もしくは変異体の自然選択を通して達成された自然発生的変異および／もしくは遺伝子の獲得および／もしくは遺伝子の喪失により起こる遺伝子変化を経ている株も含む。変異体は、生物の生化学的機能性を根本的には変化させないがその生成物がその生物の同定または選択のために用いられることができる（例えば抗生物質耐性）特定の遺伝子のゲノム中への意図的な（インビトロ）挿入により作り出されることができる。
【００２９】
当業者は、変異体またはバリアント株は親株とのＤＮＡ配列相同性分析により同定されることができることを理解しているであろう。実証可能な表現型の差異または測定可能な機能的差異を伴わずに親株との近い配列の同一性を有する株は、変異体またはバリアント株であると考えられる。親ＤＮＡ配列との９９．５％以上の配列同一性（相同性）を有する株は、変異体またはバリアントであると考えられることができる。配列相同性は、http://www.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/において公的に利用可能なオンライン相同性アルゴリズムである“ＢＬＡＳＴ”プログラムを用いて決定されることができる。
【００３０】
親株の変異体は、親株の１６ｓ〜２３ｓ遺伝子間スペーサーポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５．５％の配列相同性を有する派生株も含む。これらの変異体は、さらに細菌ゲノム中の他のＤＮＡ配列中にＤＮＡ変異を含むことができる。
【００３１】
本発明は、添付の図面に関連して、例としてのみ与えられているその一部の態様の以下の記載から、より明確に理解されると考えられ、ここで：
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ＥＰＳのふわふわした（ｆｌｕｆｆｙ）ペレットの高さにより測定された、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の株のかさ高さを示す。
【図２】図２は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３のヘキサデカンへの％接着の棒グラフである。
【図３】図３は、ＥＰＳ陽性Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３および低ＥＰＳ産生ラクトバシラス株による４８時間の刺激後のＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイにおけるＩＬ−１０誘導のグラフである。ＥＰＳ低ラクトバシラス株と比較して、ＥＰＳ陽性Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３による刺激の後に、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の増進された誘導が存在する；
【図４】図４は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３および低ＥＰＳ産生ラクトバシラス株による４８時間の刺激後のＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイにおけるＴＮＦ−α誘導のグラフである。ＥＰＳ低ラクトバシラス株と比較してＥＰＳ陽性Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３による刺激の後に、炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αの低下した誘導が存在する；
【図５】図５は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５による４８時間の刺激後のＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイにおけるＩＬ−１０誘導のグラフである。両方の株は、用量反応性の様式で、類似したレベルの抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を誘導する；
【図６】図６は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５による４８時間の刺激後のＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイにおけるＴＮＦ−α誘導のグラフである。Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３と比較して、類似したレベルのＴＮＦ−αを誘導する；
【図７】図７は、高脂肪食（ＨＦＤ）対照群と比較した場合に、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５が１６周目までに体脂肪量増加の有意な低減を示した一方でＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３は有意な作用を有しなかったことを示している；
【図８】図８は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の脂肪パッドの重量への作用を図説している。Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５は、脂肪パッドの重量（皮下脂肪および副睾丸脂肪）における有意な低減を有していた一方で、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３は、有意な作用を有していなかった；
【図９】図９は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の肝臓総コレステロールおよびトリグリセリド類への作用を図説している。Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５は、ＤＩＯマウスにおいて肝臓総コレステロールおよびトリグリセリド類を低減したが、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３は、低減しなかった；
【図１０】図１０は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の血漿総コレステロールへの作用を図説している；
【図１１】図１１は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の血漿ＬＤＬ−コレステロールへの作用を図説している；
【図１２】図１２は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の血漿ＶＬＤＬ−コレステロールへの作用を図説している；
【図１３】図１３は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）血中グルコースへの作用を図説している；
【図１４】図１４は、ＤＩＯマウスモデルにおける高脂肪食（ＨＦＤ）対照群と比較したＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の投与後のマウスあたりの累積飼料摂取量を示す；そして
【図１５】図１５は、ＤＩＯマウスモデルにおける高脂肪食（ＨＦＤ）対照群と比較したＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の投与後の％累積エネルギー排出の概算を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
ビフィドバクテリウム・ロングムＡＨ１３６２の寄託は、ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア社（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）（ＮＣＩＭＢ）、ファーガソンビル、クレイブストーンエステート、バックスバーン、アバディーン、ＡＢ２１  ９ＹＡ、スコットランド、英国において２０１０年５月６日に行われ、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７１５を与えられた。
【００３４】
本明細書は、比較としてナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア社（ＮＣＩＭＢ）、ファーガソンビル、クレイブストーンエステート、バックスバーン、アバディーン、ＡＢ２１  ９ＹＡ、スコットランド、英国において１９９９年１月１３日に受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１００３の下で寄託されたビフィドバクテリウム・ロングム３５６２４株にも言及する。
【実施例】
【００３５】
以下の例は、さらに本発明の範囲内の態様を記載および実証する。実施例は、説明のためにのみ与えられており、本発明の精神および範囲から逸脱することなくその多くの変更が可能であるため、本発明の限定として解釈されるべきではない。
【００３６】
我々は、新規のＥＰＳ産生ビフィドバクテリウム株（Ｂ．ロングムＡＨ１３６２）は、肥満および関連する代謝障害と関係するマーカーを減弱することを見出している。Ｂ．ロングムＡＨ１３６２の投与は、腸微生物叢の変化、減少した脂肪貯蔵ならびに減少した肝臓トリグリセリドおよび肝臓総コレステロールレベルならびに増大した脂肪排出と関係していた。驚くべきことに、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の投与は、同じ作用を有していなかった。
【００３７】
実施例１−Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５の同一性が、遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）領域のＢＬＡＳＴ分析により確証された。
方法
１６ｓ〜２３ｓ遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）の配列決定が、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５を同定するために実施された。簡潔には、総ＤＮＡが、１００μｌの抽出溶液および２５μｌの組織調製溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＸＮＡＴ２キット）を用いて株から分離された。試料は、室温で５分間インキュベートされた後、９５℃で２時間インキュベートされ、次いで１００μｌの中和溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＸＮＡＴ２キット）が添加された。ＤＮＡ溶液は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いて定量化され、４℃で貯蔵された。ＰＣＲが、ＩＧＳプライマーを用いて実施された。両方の株の同定のために用いられたプライマー対は、ＩＧＳ  Ｒ  ５’−ＣＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡ−３’およびＩＧＳ  Ｌ  ５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴ−３’であった。サイクル条件は、９４℃で４分間（１サイクル）、９４℃で４５秒間、５３℃で４５秒間、７２℃で４５秒間（２８サイクル）であった。ＰＣＲ反応は、２μｌ（１００ｎｇ）のＤＮＡ、ＰＣＲ混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｄ  Ｔａｑ）、０．０２５ｎＭ  ＩＧＳ  ＬおよびＲプライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を含有していた。ＰＣＲ反応は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆサーモサイクラー上で実施された。ＰＣＲ産物は、ＩＧＳプロフィールを決定するためにＴＡＥ中で２％アガロースＥｔＢｒ染色ゲル上で分子量マーカー（１００ｂｐラダー、Ｒｏｃｈｅ）と並べて泳動された。ビフィドバクテリウムのＰＣＲ産物（単一のバンド）が、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製された。ラクトバシラスのＰＣＲ産物は、３本のバンドをもたらした。おおよそ２８０ｂｐに存在するバンド（最も低いバンド）が、切り出され、ＧｅｎＥｌｕｔｅアガローススピンカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて精製され、上記のように再度配列決定され、ＰＣＲ産物が、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製された。精製されたＰＣＲ産物が、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（英国）において、遺伝子間スペーサー領域に関するプライマー配列（上記）を用いて配列決定された。次いで、配列データが、ヌクレオチド相同性により株の同一性を決定するために、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースに対して検索された。結果として得られたＤＮＡ配列データが、その配列に対する最も近いマッチを同定するためにＮＣＢＩ標準ヌクレオチド対ヌクレオチド相同性ＢＬＡＳＴ検索エンジン(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にかけられた。
【００３８】
結果
【００３９】
【表１】
2018536427.tif 000003
【００４０】
【表２】
2018536427.tif 000004
【００４１】
実施例２−ＥＰＳのふわふわしたペレットの試験（株のかさ高さ）
方法
それぞれの株が、ブロス中で発酵させられた。遠心分離後に収集された微粒子が、洗浄され、続いて凍結乾燥された。
【００４２】
総細胞数（２×１０Ｅ１０）に関して調節された凍結乾燥粉末が、１０ｍｌ  ＰＢＳ中で再懸濁され、４０００ｒｐｍ／１０分間／４℃で遠心分離された。
結果
図１：ＥＰＳのふわふわしたペレットの高さにより測定された、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の株のかさ高さ。
【００４３】
Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３は、０．９ｃｍのふわふわしたペレットを生成し、一方でＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５は、２．５ｃｍのふわふわしたペレットを生成した。
【００４４】
結論
Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３は、高ＥＰＳ産生菌であることが知られている。ＥＰＳのふわふわしたペレットの試験および結果として得られたペレットの高さは、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５がＥＰＳを産生し、そしてＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３よりも多くのＥＰＳを産生することを、確証している。
【００４５】
実施例３−ヘキサデカンに対する微生物接着（ＭＡＴＨ）アッセイ
疎水性は、分子の物理特性であり、それによりそれは水を反発する。疎水性材料は、水からの油の除去、石油流出の管理、および非極性物質を極性化合物から除去するための化学的分離プロセスのために用いられる。細菌細胞の疎水性は、存在するタンパク質、ペプチドおよび多糖類に関するその細胞表面の組成に依存する。腸粘膜に接着するプロバイオティクス株の能力は、細菌細胞が胃腸管通過の間に定着するのを助け、それに腸における競合的利点を提供する。株の疎水性は、接着能力に寄与する１つの因子である。腸上皮細胞に接着するその株の能力の指標としてのヘキサデカンに対する細菌接着の決定は、有効な定性的アプローチである(Kiely & Olson, 2000)。
【００４６】
方法
Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の、それらの疎水性の尺度としてのヘキサデカンに接着する能力を、ヘキサデカンに対する微生物接着（ＭＡＴＨ）試験を用いて決定した。ヘキサデカンに対する接着は、一部修正したRosenberg et al, 1980の方法に従って測定された(Crow and Gopal, 1995; Bellon-Fontaine et al, 1996)。細菌は、定常期において５０００ｇで１５分間の遠心分離により回収され、ＰＢＳで２回洗浄され、０．１ｍｏｌ／ｌ  ＫＮＯ３（ｐＨ６．２）中で０．８のＯＤ６００まで再懸濁された。細胞懸濁液の吸光度が、６００ｎｍ（Ａ０）において測定された。２ｍｌのヘキサデカン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が、２ｍｌの細胞懸濁液に添加された。室温で１０分間のプレインキュベーションの後、２相系は、２分間ボルテックスすることにより混合された。水相が、室温で２０分間のインキュベーションの後除去され、その６００ｎｍにおける吸光度（Ａ１）が、測定された。ヘキサデカンに対する細菌接着の％が、（１−Ａ１／Ａ０）×１００として計算され、ここで、Ａ０およびＡ１は、それぞれ溶媒による抽出の前および後の吸光度である。実験は、独立した培養物に由来する細胞を用いて３通りで行われた。
【００４７】
結果
図２：Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の、それらの疎水性の尺度としてのヘキサデカンへの％接着。
【００４８】
結論
Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５（５８．３％）は、ヘキサデカンに関するより高い親和性を示し、これは、それがＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３（２８．６％）と比較してより大きい疎水性を有していたことを示している。
【００４９】
実施例４−ＰＢＭＣ抗炎症プロフィール
Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３および低ＥＰＳ産生ラクトバシラス株の抗炎症プロフィールが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サイトカイン誘導アッセイにおいて抗炎症性サイトカインＩＬ−１０および炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αの誘導を評価することにより調べられた。
【００５０】
方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サイトカイン誘導アッセイ
血液が、３人の健康なボランティアから、コーク教育病院の臨床研究倫理委員会の承認の下で得られた。対象は、全てであり、供血前に１ヵ月以上の間、プロバイオティクス、抗生物質または抗炎症薬物療法の使用を控えていた。ＰＢＭＣが、血液の層を分離する親水性多糖類であるｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いる密度勾配分離により、全血から抽出され、‘淡黄色の被膜’が、ＰＢＭＣを含有する血漿の層の下に形成された。それぞれの株に関して、１００ｍｇの凍結乾燥粉末が、量り分けられ、無菌のＤｕｌｂｅｃｏｓ  ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で再懸濁された。細菌細胞は、遠心分離により２回洗浄され（４０００ｒｐｍ／１０分間／４℃／ブレーキ０）、無菌ＰＢＳ中で再懸濁された。直接顕微鏡計数が、実施され、細胞調製物は、１００：１、５０：１、２５：１の総細菌：ＰＢＭＣ細胞の比率を与えるように適切な濃度まで希釈された。技術的複製が、３通りで実施された。次いで、ＰＢＭＣは、２×１０５細胞／ｍｌの濃度で（ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で）、対照培地と共に、または増大する濃度の細菌株：１×１０６細胞/ｍｌ（２５：１  細菌：ＰＢＭＣ）、１×１０７細胞/ｍｌ（５０：１  細菌：ＰＢＭＣ）および２×１０７細胞/ｍｌ（１００：１  細菌：ＰＢＭＣ）と共に、３７℃において４８時間インキュベートされた。上清が、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０および炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αに関してアッセイされ、それは、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）多重プラットフォーム組織培養キット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国メリーランド州）を用いて測定された。以前に抗炎症活性を有することが示されているＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３(Groeger et al., 2013)が、アッセイの正確さを検証するための陽性対照として用いられた。
【００５１】
結果
図３：ＥＰＳ陽性Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３および低ＥＰＳ産生ラクトバシラス株による４８時間の刺激後のＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイにおけるＩＬ−１０誘導。ＥＰＳ低ラクトバシラス株と比較して、ＥＰＳ陽性Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３による刺激の後に、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の増進された誘導が存在する。
【００５２】
図４：Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３および低ＥＰＳ産生ラクトバシラス株による４８時間の刺激後のＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイにおけるＴＮＦ−α誘導。ＥＰＳ低ラクトバシラス株と比較して、ＥＰＳ陽性Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３による刺激の後に、炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αの低下した誘導が存在する。
【００５３】
図５：Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５による４８時間の刺激後のＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイにおけるＩＬ−１０誘導。両方の株は、用量反応性の様式で、類似したレベルの抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を誘導する。
【００５４】
図６：Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５による４８時間の刺激後のＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイにおけるＴＮＦ−α誘導。Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３と比較して、類似したレベルのＴＮＦ−αを誘導する。
【００５５】
結論
ＥＰＳに富むＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３は、ＰＢＭＣサイトカイン誘導アッセイにおいて類似した抗炎症免疫プロフィールを誘導する。低ＥＰＳ産生株は、非常に異なる免疫プロフィールをもたらす。
【００５６】
実施例５−Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３およびＥＰＳ低ラクトバシラス株の投与の、食事性肥満（ＤＩＯ）マウスモデルにおける代謝的結果に対する作用
方法
動物
体重に基づいてランダム化された７週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６ＪＲｃｃＨｓｄマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オランダ）（７２匹のマウス、群あたりｎ＝１２）が、２２±３℃の温度、５０±２０％の湿度、それぞれ１２時間の明／暗サイクルおよび１時間あたり１５〜２０回の新鮮な空気との交換による制御された環境において維持された。マウスは、グループごとに（ｇｒｏｕｐ  ｗｉｓｅ）収容され（ケージあたり４匹のマウス）、オートクレーブされたトウモロコシの穂軸が、寝床を与える材料として用いられた。マウスは、５週齢で受け取られ、１週間隔離された後、試験の開始前に１週間の順化が行われた。０日目から、マウスは自由に餌を与えられ、それぞれのケージ中のマウスは、５０ｍｌの淡水の無菌飲料水（群１および２；表１）または凍結乾燥プロバイオティクス（１×１０９ｃｆｕ／用量／日）を含有する飲料水（群３、４、５および６；表１）を、ステンレス鋼のシッパーチューブを取り付けられたポリカーボネートボトルにより提供された。処置は、１６週間継続された。
【００５７】
実験設計
０日目以降、群１は、低脂肪飼料（ＬＦＤ）Ｄ１２４５０（１０％  ｋｃａｌ％脂肪、ガンマ線照射済み；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ、米国）を、他の５つの群（群２〜６）は、高脂肪飼料（ＨＦＤ）Ｄ１２４５１（４５％  ｋｃａｌ％脂肪、ガンマ線照射済み；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ）を１６週間の期間与えられた。ＨＦＤの摂食は、動物においてインスリン抵抗性および肥満を誘導し、それは、体重および空腹時血糖値における増大により特性付けられた。群１および２は、淡水の無菌飲料水を提供され、一方で群３、４、５および６は、１×１０９ｃｆｕ／用量／日の適切なプロバイオティクス（表１）を含有する飲料水を提供された。健康全般の観察が、毎日その日の同じ時間に実施された。これは、注意力、毛の質感、ケージでの活動ならびに鼻、目、口および耳からのあらゆる排出物の存在を含んでいた。マウスにより消費された飼料の量を評価するために、予め測定された飼料が、それぞれのケージにおいて維持され、食べ残しの試料は、３日ごとに測定および記録された。動物の水の消費は、最初の投与日から開始して毎日測定された。それぞれのケージ中のマウス（ｎ＝４）は、毎日５０ｍＬの水を提供された。それぞれのケージ中の残っている水が、２４時間ごとに測定された。
【００５８】
体重および組織試料採取
体重は、全ての動物に関して個々に、受け取った時点、ランダム化の日、処置前、そしてその後３日に１回記録された。体重におけるパーセント変化は、式（ＴＴ−ＴＣ）／ＴＣ＊１００に従って計算され、式中、ＴＴは、試験日処置済（ｔｅｓｔ  ｄａｙ  ｔｒｅａｔｅｄ）であり、ＴＣは、試験日対照である。マウスは、体脂肪量および除脂肪量の組成を評価するために、−１および２８、５６、８４および１１２日目にＥｃｈｏ  ＭＲＩ（ＥｃｈｏＭＲＩ−７００（商標））を用いるＥｃｈｏ磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を受けた。動物は、プラスチックホルダー中に鎮静も麻酔もなしで置かれた。体脂肪量（Ｆａｔ）は、体内の全ての脂肪分子の質量として測定された。除脂肪量（Ｌｅａｎ）は、水を含有する体の部分全部に相当する筋組織質量である。“遊離の水”への寄与は、大部分は膀胱に由来する。水の総量は、遊離の水および除脂肪量中に含有される水の両方を含み、それは、体の全含水量である。プラスチックホルダーは、相互汚染を避けるために、異なる群からの動物の間で消毒された。異なる群からの動物を扱う際は、無菌技法に従った。１６週目の終了時に、動物は、ＣＯ２窒息により屠殺された。肝臓、骨格筋、内臓脂肪（精巣上体、腎臓および腸間膜）、皮下脂肪、脾臓、盲腸、褐色脂肪、脳および腸が、採取され、重量を量られ、将来の生化学および遺伝子分析のために−８０℃で保管された。
【００５９】
代謝マーカー
血液試料が、ランダム血中グルコース測定のために、最初の投与日に開始し／その日を含め、０、３０、６０、９０および１１２日目に朝９時にテイルニッピング（ｔａｉｌ  ｎｉｐｐｉｎｇ）法により採取された（合計５回の試料採取が行われた）。血中グルコース分析が、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ血糖値測定器（Ｏｎｅ  ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ  ２）により行われた。異なる群からの動物を扱う際は、無菌技法に従った。１６週目の終了時に、マウスは、６時間絶食させられ、血液が、血中グルコースの概算のためにテイルニッピング法（非麻酔の採血方式）により採取された。血液は、軽いイソフルラン麻酔下で後眼窩穿刺法により採取され、血漿が分離され、それは、完全に自動化されたランダムアクセス臨床化学分析器（ＥＭ−３６０、Ｅｒｂａ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）により総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド類（ＴＧ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよび非エステル型脂肪酸（ＮＥＦＡ）を概算するために用いられた。血漿ＶＬＤＬレベルは、次の計算法により得られた：（ＶＬＤＬ＝トリグリセリド類（ｍｇ／ｄｌ）／５）。肝臓ＴＣおよびＴＧの概算のために、肝臓が、イソプロパノール中でホモジナイズされ（１ｍｌ／５０ｍｇ組織）、４℃で１時間インキュベートされた。試料は、４℃で２，５００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離された。上清中のコレステロールおよびトリグリセリド濃度が、完全に自動化されたランダムアクセス臨床化学分析器（ＥＭ−３６０、Ｅｒｂａ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により測定された。
【００６０】
エネルギー排出の概算
２個の糞のペレットが、それぞれのマウスから６、１０および１５週目に採取され、ボンベ熱量測定によりそれらの総発熱価に関して分析された。ボンベ熱量測定分析に関して、試料は、重量を測定され、６０℃で４８時間オーブン乾燥された。糞のエネルギー含量が、１１０９セミミクロボンベを用いるＰａｒｒ  ６１００熱量計（Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＆  Ｃｏ．、米国イリノイ州モリーン）を用いて評価された。熱量計のエネルギー等価係数は、安息香酸標準を用いて決定され、それぞれの試料（１００ｍｇ）は、３通りで分析された。試験の過程にわたるプロバイオティクスを与えられたマウスの累積エネルギー排出は、高脂肪飼料対照群からのマウスにより排出されたエネルギーと比較した百分率として概算された。
【００６１】
統計分析
統計分析が、２つの群の間の差異に関して独立ｔ検定を用いて実施された。２つより多くの群が評価される場合、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキーの多重比較検定が、用いられた。データは、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析された。結果は、ｐ＜０．０５である場合に統計的に有意であると考えられた。
【００６２】
【表３】
2018536427.tif 000005
【００６３】
結果
図７：高脂肪食（ＨＦＤ）対照群と比較した場合に、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５は、１６周目までに体脂肪量増加の有意な低減を示し、一方でＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３は、有意な作用を有しなかった。
【００６４】
図８：Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の脂肪パッドの重量への作用。Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５は、脂肪パッドの重量（皮下脂肪および副睾丸脂肪）における有意な低減を有していた一方で、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３は、有意な作用を有していなかった；
図９：Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の肝臓総コレステロールおよびトリグリセリド類への作用。Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５は、ＤＩＯマウスにおいて肝臓総コレステロールおよびトリグリセリド類を低減したが、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３は、低減しなかった。
【００６５】
図１０：Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の血漿総コレステロールへの作用。
図１１：Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の血漿ＬＤＬ−コレステロールへの作用。
【００６６】
図１２：Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の血漿ＶＬＤＬ−コレステロールへの作用。
図１３：Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の末端血中グルコースへの作用。
【００６７】
図１４：ＤＩＯマウスモデルにおける高脂肪食（ＨＦＤ）対照群と比較したＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の投与後のマウスあたりの累積飼料摂取量。
【００６８】
図１５：ＤＩＯマウスモデルにおける高脂肪食（ＨＦＤ）対照群と比較したＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５およびＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１００３の投与後の％累積エネルギー排出の概算。
【００６９】
低ＥＰＳ産生ラクトバシラス株は、このモデルにおいて有意な作用を一切有していなかった。
結論
Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５の投与は、両方の株に関して１６週目までに体脂肪量における有意な低減をもたらした。これは、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５に関して皮下脂肪および副睾丸脂肪における統計的に有意な低減を伴っていた。Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５の投与は、ＨＦＤ対照群と比較した場合に肝臓総コレステロールおよびトリグリセリドレベルにおける有意な低減をもたらした。さらに、総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロールおよびＶＬＤＬ−コレステロールにおける有意な改善も、ＨＦＤ対照群と比較した場合にＢ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５の投与により観察された。試験の過程にわたって累積飼料摂取量における有意差はなかったにもかかわらず、我々は、Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５に関する％エネルギー排出における増大を観察し、これは、疎水性Ｂ．ロングムＮＣＩＭＢ  ４１７１５株の投与は摂取された食物から抽出されるエネルギーの量を低減することができ、それがこのＤＩＯマウスモデルにおいて観察された代謝的結果における向上の原因であり得ることを示唆している。
【００７０】
プレバイオティクス
プロバイオティクス生物の導入は、適切なキャリヤー中の微生物の摂取により成し遂げられる。大腸における株の増殖を促進するであろう媒体を提供することは、有利であろう。１種類以上のオリゴ糖類、多糖類、または他のプレバイオティクスの添加は、胃腸管中での乳酸菌の増殖を増進する。プレバイオティクスは、プラスの価値を有すると考えられる常在細菌、例えばビフィドバクテリウム属、ラクトバシラス属により結腸中で特異的に発酵させられるあらゆる生存不能な食物構成要素を指す。プレバイオティクスのタイプは、フルクトース、キシロース、大豆、ガラクトース、グルコースおよびマンノースを含有するプレバイオティクスを含み得る。プロバイオティクス株の１種類以上のプレバイオティクス化合物との組み合わせられた投与は、投与されたプロバイオティクスのインビボでの増殖を増進し、結果としてより明白な健康の利益をもたらすことができ、それはシンバイオティクスと呼ばれる。
【００７１】
他の有効成分
株は、予防的に、または処置の方法として、それ自体で、または他のプロバイオティクスおよび／もしくは上記のようなプレバイオティクス材料と共にのどちらで投与されることもできることは、理解されるであろう。加えて、株は、他の有効物質、例えば炎症または他の障害、特に免疫学的関与を有する障害を処置するために用いられる有効物質を用いる予防または処置計画の一部として用いられることができる。そのような組み合わせは、単一の配合物において、または同時もしくは異なる時点で投与され、同じもしくは異なる投与経路を用いる別々の配合物として投与されることができる。
【００７２】
配合物
本発明の株の１以上は、動物（ヒトを含む）に、従来の製剤、例えばカプセル、マイクロカプセル、錠剤、顆粒、粉末、トローチ、丸剤、坐剤、懸濁液およびシロップにおいて経口摂取可能な形態で投与されることができる。適切な配合物は、一般的に用いられている方法により、従来の有機性および無機性添加剤を用いて調製されることができる。医薬組成物中の有効成分の量は、所望の療法的作用を及ぼすであろうレベルにおけることができる。
【００７３】
配合物は、細菌性構成要素、薬物実体または生物学的化合物を含むこともできる。
加えて、本発明の株の１種類以上を含むワクチンが、あらゆる適切な既知の方法を用いて調製されることができ、薬学的に許容可能なキャリヤーまたはアジュバントを含むことができる。
【００７４】
本発明の株は、その株の制御された放出、例えば遅延放出を促進するように配合されることができる。例えば、配合物は、胃腸管中の特定の位置において、例えば小腸または結腸中でその株を放出するように適合していることができる。そのような制御された放出を達成するため、株は、その株を特定の位置で放出するように適合しているコーティングを有するカプセル中に配合されることができる。そのような制御された放出を促進するために、ある範囲のコーティングが、利用可能である。１つのそのようなコーティングのファミリーは、商標Ｅｕｄｒａｇｉｔの下で入手可能なコーティングである。
【００７５】
本明細書で引用された全ての文献は、関連する部分において、参照により本明細書に援用される。
本発明は、上記の態様に限定されず、それは、細部において変更されることができる。
【００７６】
参考文献
【００７７】
【化１】
2018536427.tif 000006
【００７８】
【化２】
2018536427.tif 000007
【００７９】
【化３】
2018536427.tif 000008
【００８０】
【化４】
2018536427.tif 000009
【図１】
2018536427.tif 000010
【図２】
2018536427.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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