(57)【要約】  培養乳製品中に存在するガス産生大腸菌群を計数する方法が提供される。本方法は、既定量の乳製品及び既定容量の希釈剤を含む混合物を形成することと、この混合物を薄膜培養デバイスに接種して、大腸菌群を増殖させるための栄養培地、有効濃度のラクトース、及び有効濃度のＭＯＰＳを含むヒドロゲルを形成することと、大腸菌群の増殖を促進する条件下で接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることと、接種済み培養デバイスに存在するガス産生コロニーを特定し計数することとを含み得る。
2018536437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養乳製品中に存在するガス産生大腸菌群を計数する方法であって、
既定量の前記乳製品及び既定容量の希釈剤を含む混合物を形成することと、
前記混合物を薄膜培養デバイスに接種して、大腸菌群を増殖させるための栄養培地、有効濃度のラクトース、及び有効濃度のＭＯＰＳを含むヒドロゲルを形成することと、
大腸菌群の増殖を促進する条件下で前記接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることと、
前記接種済み培養デバイスに存在するガス産生コロニーを特定し計数することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ヒドロゲル中のＭＯＰＳの前記有効濃度が１６ｍＭ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒドロゲル中のＭＯＰＳの前記有効濃度が４０ｍＭ以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記希釈剤が前記ＭＯＰＳを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記希釈剤中の前記ＭＯＰＳの濃度が２０ｍＭ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記希釈剤中の前記ＭＯＰＳの前記濃度が２５ｍＭ以上であり、かつ４５ｍＭ以下である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記混合物が５．０〜８．０のｐＨを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養乳製品が、ヨーグルト、サワークリーム、バターミルク、カード、レベン、カルピス、ケフィア、アイラン、カティーク、凝乳、及びカッテージチーズからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒドロゲル中のラクトースの前記有効濃度が０．５％（ｗ／ｖ）以上である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒドロゲル中のラクトースの前記有効濃度が１．２５％（ｗ／ｖ）以下である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ガス産生コロニーを計数することが、セラチア属のコロニーを計数することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記薄膜培養デバイスに接種した後に、前記ヒドロゲルが、大腸菌群の増殖を促進する栄養培地を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記薄膜培養デバイスに接種した後に、前記ヒドロゲルが、非大腸菌群の増殖を阻害する選択剤を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記薄膜培養デバイスに接種する前に、前記培養デバイスが前記選択剤を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択剤が前記薄膜培養デバイスにおいて実質的に水を含まない組成物として存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
大腸菌群の増殖を促進する条件下で前記接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることが、３５〜３７℃の範囲（両端の値を含む）の温度で前記薄膜培養デバイスをインキュベートすることを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記薄膜培養デバイスが、基材と、カバーシートと、前記基材と前記カバーシートとの間に配置された乾燥した再水和可能な冷水可溶性ゲル化剤とを備え、前記混合物を前記薄膜培養デバイスに接種して前記ヒドロゲルを形成することが、前記デバイスの前記カバーシート及び前記基材に接触する前記ヒドロゲルを形成することを含み、ガス産生コロニーを特定することが、前記ヒドロゲル中の前記コロニーに近接した空隙を観察することを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒドロゲル中の前記空隙を観察することが、空隙を貫通する直線に沿って少なくとも０．５ｍｍの寸法を有する空隙を観察することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記空隙が、前記ヒドロゲル中で視覚的に検出可能な細菌コロニーから１．５ｍｍ以下離れて配置されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ガス産生コロニーを計数することが、自動コロニー計数装置を使用して前記ガス産生コロニーを計数することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／２６３，９３２号の優先権を主張するものであり、この開示内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
大腸菌群は、代謝的に関連した微生物の多様な一群である。この群は、乳汁中に見られる二糖であるラクトースを発酵させて、二酸化炭素ガスを含む一群の代謝副産物にする能力があることによって定義される。したがって、試料中の大腸菌群を直接かつ正確に計数する能力は、細菌の単離されたコロニーによるガス産生を検出する能力に左右される。
【０００３】
薄膜培養デバイスは、好都合なことに、例えば、寒天培地を含有するペトリ皿を使用する従来の微生物計数技術の代わりに使用される。そのような薄膜培養デバイスのいくつかの例は、Ｈａｎｓｅｎらの米国特許第４，５６５，７８３号及びＭａｃｈらの同第５，３６４，７６６号に記載されており、これらの両特許は、参照によりその全体が本明細書に援用される。Ｈａｎｓｅｎらによって報告された典型的なデバイスでは、ゲル化剤及び微生物増殖栄養素を含有する冷水可溶性の乾燥粉末が、防水性の基材にコーティングされる。このコーティングされた基材に、指示染料及び粉末状ゲル化剤を含有するアクリレート接着剤で表面がコーティングされた透明なリードスルー（read-through）カバーシートが取り付けられる。
【０００４】
このデバイスを使用するときは、通常、コーティングされた基材に所定量の水性試料を接触させ、カバーシートを試料及び基材の上に置く。この水性試料が可溶性乾燥粉末を水和することで、可溶性乾燥粉末は、微生物の増殖を支えることのできるゲル化培地を形成する。増殖期間中、カバーシートに接着した指示薬の染料が生存可能な微生物の存在下で反応して、培養デバイスで増殖する細菌コロニーの可視化を可能にする検出可能な応答をもたらす。
【０００５】
ガス産生細菌（例えばＣＯ２産生大腸菌群）の検出については、Ｈａｎｓｅｎらのデバイスの構成は、有利なことに、基材とカバーシートとの間のゲル化培地中のガス産生コロニーの近くに生体起源ガスを閉じ込める。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は一般に、大腸菌群に属する微生物の培養及び計数の方法に関する。加えて、本開示は、試料中の微生物を計数するためのデバイスに関する。特に、本開示は、薄膜培養デバイスにおいてガス産生大腸菌群を検出及び計数する改善された方法に関する。
【０００７】
本開示は、培養乳製品中に存在するガス産生大腸菌群を計数する方法を提供する。本方法は、既定量の乳製品及び既定容量の希釈剤を含む混合物を形成することと、この混合物を薄膜培養デバイスに接種して、大腸菌群を増殖させるための栄養培地、有効濃度のラクトース、及び有効濃度のＭＯＰＳを含むヒドロゲルを形成することと、大腸菌群の増殖を促進する条件下で接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることと、接種済み培養デバイスに存在するガス産生コロニーを特定し計数することとを含み得る。
【０００８】
本方法のいずれかの実施形態では、希釈剤は、ＭＯＰＳを含み得る。いずれかの実施形態では、希釈剤中のＭＯＰＳの濃度は、２０ｍＭ以上かつ５０ｍＭ以下であり得る。
【０００９】
「好ましい」及び「好ましくは」という語は、ある特定の状況下である特定の利益をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は他の状況において他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、他の実施形態を本発明の範囲から排除することを意図するものでもない。
【００１０】
本明細書において使用される場合、「１つの（a）」、「１つの（an）」、「その（the）」、「少なくとも１つの（at least one）」、及び「１つ以上（one or more）」は、互換的に使用される。したがって、例えば、「１つの（a）」微生物を検出する方法は、その方法が「１つ以上の（one or more）」微生物を検出し得ることを意味するものと解釈することができる。
【００１１】
「及び／又は」という用語は、列記される要素のうちの１つ若しくは全て、又は列記される要素のうちの任意の２つ以上の組合せを意味する。
【００１２】
また、本明細書において、端点による数値範囲の記載は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００１３】
「薄膜培養デバイス」とは、本明細書で使用される場合、シート状のカバーシートに取り付けられたシート状の基材を備える培養デバイスを指し、この基材及びカバーシートはそれぞれ、内向き主表面及び外向き主表面を有する。基材及び／又はカバーシートの内向き主表面には、冷水可溶性ゲル化剤を含む実質的に水を含まないコーティングが接着している。任意に、基材及び／又はカバーシートの内向き主表面には、栄養培地を含む実質的に水を含まないコーティングが接着している。任意に、栄養培地及び／又はゲル化剤は、基材及び／又はカバーシート上にコーティングされた接着剤層に接着していてもよい。任意に、本薄膜培養デバイスは、基材又はカバーシートの内向き表面に接着した、薄い穴の空いたスペーサを更に備えていてもよい。薄膜培養デバイスの非限定的な例は、米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、同第５，１３７，８１２号、及び同第５，２３２，８３８号に開示されており、これらの特許は全て、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００１４】
「乳製品」とは、本明細書で使用される場合、乳汁を含有する製品及び／又は乳汁由来の製品を指す。「培養乳製品」とは、本明細書で使用される場合、例えばラクトバチルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、又はロイコノストック（Leuconostoc）属に属する細菌等の乳酸菌で発酵されている酪農食品を指す。培養乳製品としては、培養バターミルク、サワークリーム、チーズ、カッテージチーズ、ヨーグルト、及びアシドフィルスミルクが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
「ＭＯＰＳ緩衝液」、「ＭＯＰＳ希釈剤」、「ＭＯＰＳを含む希釈剤」、及び「ＭＯＰＳを含む水溶液」とは、本明細書で使用される場合、（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）を含む組成物を指す。特定のｐＨに調整されているとき、「ＭＯＰＳ緩衝液」、「ＭＯＰＳ希釈剤」、又は「ＭＯＰＳを含む水溶液」は、ＭＯＰＳの共役塩基を更に含む。
【００１６】
「大腸菌群」とは、本明細書で使用される場合、食品、水、及び飲料の衛生的品質を示すのに使用される大腸菌の細菌群に属する微生物を指す。この群に分類される細菌は、ラクトースを発酵させて酸及びガス生成物にするそれらの能力によって定義される。大腸菌群の非限定的な例としては、シトロバクター（Citrobacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、ハフニア（Hafnia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、及びエシェリキア（Escherichia）属に分類される種が挙げられる。
【００１７】
本発明の特徴及び利点は、発明を実施するための形態、及び添付の特許請求の範囲を考慮することで理解される。本発明のこれら並びに他の特徴及び利点は、本発明の様々な例証となる実施形態との関連で後述され得る。
【００１８】
上記本発明の概要は、開示される本発明の各実施形態又は全ての実現形態を記載することを意図するものではない。続く図面及び発明を実施するための形態は、例証となる実施形態をより具体的に例示するものである。他の特徴、目的、及び利点は、発明を実施するための形態及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本開示による培養乳製品中に存在するガス産生大腸菌群を計数する方法の一実施形態を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示のいずれかの実施形態を詳細に説明する前に、本発明はその適用において、以下の説明に記載されているか又は以下の図面に例証されている構成の詳細及び構成要素の配置に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実践又は実行することができる。また、本明細書において使用される表現及び用語は説明を目的とするものであり、限定とみなされるべきではないことも理解されたい。本明細書における「含む（including）」、「備える（comprising）」、又は「有する（having）」、及びそれらのバリエーションの使用は、その前に列記された項目及びそれらの均等物、並びに追加的な項目を包含することを意味する。別途特定又は限定されない限り、「接続される（connected）」及び「連結される（coupled）」という用語、並びにそれらのバリエーションは、広い意味で使用されるものであり、直接的及び間接的な接続及び連結の両方を包含する。更に、「接続される」及び「連結される」は、物理的又は機械的な接続又は連結に制限されない。本開示の範囲を逸脱することなく他の実施形態を利用することができ、構造上又は論理上の変更を加えることもできることを理解されたい。更に、「前」、「後」、「上」、「下」等の用語は、各要素の互いに対する関係を説明するためにのみ使用されるものであり、装置の特定の向きを示すこと、装置の必要若しくは必須な向きを指示若しくは示唆すること、又は本明細書に記載される発明が使用時にどのように使用、装着、表示、若しくは配置されるかを指定することを目的とするものでは決してない。
【００２１】
大腸菌群は、食品及び飲料（例えば、乳汁及び水を含む）の衛生的品質を示すのに使用される。大腸菌群は水中、植物、及び土壌の環境に見出され得るが、その存在は、温血動物による糞便汚染の指標であり得る。大腸菌群は一般的に、３５〜３７℃でインキュベートしたときに酸及びガスの産生を伴うラクトースを発酵させるその能力により、食品又は水の試料中で検出される。大腸菌群には、例えば、シトロバクター、エンテロバクター、ハフニア、クレブシエラ、セラチア、及びエシェリキアをはじめとする多様な属の種が含まれる。
【００２２】
大腸菌群を計数する方法は公知である。大腸菌群を計数する例示的な方法は、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Ｐ．Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；２００２；「Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｏｌｉｆｏｒｍ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」；Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４；これは参照によりその全体が本明細書に援用される）に見出すことができる。この方法は、寒天培地上又はＰＥＴＲＩＦＩＬＭという乾燥した再水和可能な培養デバイス中で試験試料を培養する直接計数法を含む。この方法は、ブロス培地中で試験試料を培養することにより得られる最確数（ＭＰＮ）推定値を更に含む。いくつかの規制機関は、大腸菌群の同一性を確認するためにラクトースからのガス産生の検出を必要とする。
【００２３】
薄膜培養デバイスにおいて大腸菌群を培養するために使用される少なくとも１つの選択的栄養培地（例えば、バイオレットレッド胆汁ラクトース培地（ＶＲＢＬ））では、ある特定の大腸菌群（例えばセラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens））によるラクトースの発酵からのガスの産生が、培養乳製品を含有する試料中で実質的に低減し得ることが現在では公知である。本発明の方法は、薄膜培養デバイスにおける培養乳製品の阻害作用を排除するために特定の緩衝液の使用に依拠し、それにより、培養乳製品が試料中に存在する場合であっても大腸菌群の正確な計数が可能になる。
【００２４】
本開示は、薄膜培養デバイスを使用して培養乳製品中に存在する大腸菌群のコロニー形成単位を計数する改善された方法を提供する。本方法は、ＣＯ２ガスの産生が結果として生じるラクトースの発酵を促進するためのＭＯＰＳ緩衝液の使用を含む。驚くべきことに、ＭＯＰＳ緩衝液では、同様の強度及びｐＨの他の緩衝液よりも、培養乳製品試料中のある特定の大腸菌群によるガス産生が改善する。
【００２５】
図１は、薄膜培養デバイスにおいて培養乳製品中に存在する大腸菌群のコロニー形成単位を計数する改善された方法の一実施形態のブロック図を示す。方法１００は、培養乳製品及び希釈剤を含む混合物を形成する工程１０を含む。いずれかの実施形態では、既定量の乳製品を既定容量の希釈剤と混合することで、混合物が形成され得る。したがって、培養乳製品を希釈剤に希釈し、希釈係数を記録し、これを使用して、元の培養乳製品１グラム又は１ｍＬ当たりの大腸菌群（存在する場合）の数を計算することができる。
【００２６】
いずれかの実施形態では、混合物中の培養乳製品の希釈係数は、例えば約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：１０、約１：１００、約１：１０００、約１：１００００、又は約１：１０００００であり得る。
【００２７】
培養乳製品は、多様な培養乳製品のうちの任意のものであってよい。本方法を使用して試験することのできる培養乳製品の非限定的な例としては、ヨーグルト、チーズ、サワークリーム、バターミルク、カード、レベン、カルピス、ケフィア、アイラン、カティーク、凝乳、及びカッテージチーズが挙げられる。
【００２８】
食品及び飲料試料を懸濁及び／又は希釈するために使用される希釈剤は当該技術分野において公知であり、例えば、蒸留水、緩衝液、食塩溶液、栄養培地、及びそれらの混合物が挙げられる。本開示による好ましい希釈剤は、（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）（以下「ＭＯＰＳ」）を含む緩衝水溶液である。ＭＯＰＳは、遊離酸形態及び／又は遊離酸形態のＭＯＰＳの塩（例えばナトリウム塩）として希釈剤中に存在してもよい。本開示による好ましい希釈剤は、薄膜培養デバイスにおいて増殖する大腸菌群のコロニーによるガスを発生させるラクトース発酵を促進するのに有効な濃度のＭＯＰＳを含む水性緩衝液である。いずれかの実施形態では、希釈剤は、２０ｍＭ以上のＭＯＰＳを含み得る。いずれかの実施形態では、希釈剤は、５０ｍＭ以下のＭＯＰＳを含み得る。いずれかの実施形態では、希釈剤は、約２０〜５０ｍＭ（両端の値を含む）のＭＯＰＳを含み得る。本開示によるＭＯＰＳを含む水性緩衝液は、例えば、大腸菌群の増殖を促進するための栄養素、及び／又は非大腸菌群の増殖を阻害するための選択剤等の他の成分を任意に含んでもよいことが企図される。
【００２９】
いずれかの実施形態では、ＭＯＰＳを含む希釈剤は、培養乳製品と混合される前に所定のｐＨを有し得る。希釈剤中のＭＯＰＳの濃度及び希釈剤のｐＨの両方が混合物のｐＨに影響する。いずれかの実施形態では、所定のｐＨは、５超とすることができる。いずれかの実施形態では、所定のｐＨは、８未満とすることができる。いずれかの実施形態では、所定のｐＨは、５超とすることができる。いずれかの実施形態では、所定のｐＨは、５．５以上かつ７．５以下とすることができる。いずれかの実施形態では、所定のｐＨは、およそ７．０とすることができる。
【００３０】
希釈剤が培養乳製品と混合されるため、混合物中のＭＯＰＳの濃度は、希釈剤中のＭＯＰＳの濃度よりも低くてよい。例えば、２０ｍＭのＭＯＰＳを含む希釈剤を培養乳製品と混合して、培養乳製品が１：５に希釈されている混合物を生成するとき、混合物中のＭＯＰＳの濃度は約１６ｍＭである。したがって、５０ｍＭのＭＯＰＳを含む希釈剤を培養乳製品と混合して、乳製品が１：５に希釈されている混合物を生成するとき、混合物中のＭＯＰＳの濃度は約４０ｍＭである。
【００３１】
いずれかの実施形態では、混合物は容器（例えば、希釈ボトル、ホモジナイザーバッグ）内で形成されてもよい。いずれかの実施形態では、微生物が正確に計数され得るように、希釈剤、試料、そして存在する場合はあらゆる微生物をより一様に分布させるために、（例えば、当該技術分野で公知の混合装置を使用して）混合物を均質化してもよい。
【００３２】
いずれかの実施形態では、混合物を形成することは、既定範囲内のｐＨを有する混合物を形成することを含み得る。例えば、いずれかの実施形態では、既定範囲内のｐＨを有する混合物を形成することは、５超のｐＨを有する混合物を形成することを含み得る。いずれかの実施形態では、既定範囲内のｐＨを有する混合物を形成することは、８未満のｐＨを有する混合物を形成することを含み得る。いずれかの実施形態では、５．５〜７．５のｐＨを有する混合物を形成することである。
【００３３】
再び図１を参照すると、方法１００は、混合物（すなわち、培養乳製品及び希釈剤を含むもの）を薄膜培養デバイスに接種して、大腸菌群を増殖させるための栄養培地、有効濃度のラクトース、及び有効濃度のＭＯＰＳを含むヒドロゲルを形成する工程２０を更に含む。いずれかの実施形態では、接種済み薄膜培養デバイスを形成することは、既定容量の混合物を薄膜培養デバイス内に置くことを最低でも含む。接種前の薄膜培養デバイスは、大腸菌群を増殖させるための栄養培地及び／又はラクトースを含んでいてもよい。接種前の薄膜培養デバイスが栄養培地及び／又はラクトースを含まない場合、それらは混合物中で（例えば希釈剤の成分として）提供されてもよいし、又は薄膜培養デバイス内に（例えばピペットによって）置かれ、デバイス内で混合物と混合されてもよい。
【００３４】
例えば、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（商標）大腸菌（E. coli）／大腸菌群数測定用プレート（品番６４０４、ミネソタ州セントポールの３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（商標）大腸菌群数測定用プレート（品番６４１０、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）、及びＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（商標）高感度大腸菌群数測定用プレート（品番６４０５、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）の商品名で販売されている薄膜培養デバイスはいずれも、本開示の方法における使用に好適である。前述の薄膜培養デバイスはいずれも、ラクトース、大腸菌群を増殖させるための栄養培地、及び非大腸菌群の増殖を阻害する選択剤（胆汁塩）を含む。接種前には、ラクトース、栄養培地の成分、及び選択剤は全て、実質的に水を含まない。既定容量の水性試料で再水和すると（例えば、培養乳製品及び希釈剤を含む混合物を薄膜培養デバイスに接種すると）、接種済みデバイスにおいてヒドロゲルが形成される。このヒドロゲルは、本開示の方法による有効濃度のラクトース及び有効濃度のＭＯＰＳを含む。
【００３５】
薄膜培養デバイスの作製は、例えば、米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、同第５，１３７，８１２号、及び同第５，２３２，８３８号に記載されている。参照により全体が本明細書に援用される国際公開第ＷＯ  ２０１２／１６１９９２（Ａ１）号に記載されているように、有効量のＭＯＰＳ又はその塩を接種前のかかる薄膜培養デバイスに組み込んでもよい。さもなければ、本明細書の実施例に記載されるように、培養乳製品と混合した希釈剤にＭＯＰＳを供給してもよい。
【００３６】
薄膜培養デバイスは、基材（例えば、自己支持型基材）と、カバーシート（例えば、デバイスの内部を観察することができるカバーシート）と、基材とカバーシートとの間に（例えばコーティングにおいて）配置された乾燥した再水和可能な冷水可溶性ゲル化剤（例えば、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、又はそれらの混合物）とを備え得る。任意に、接種前の薄膜培養デバイスは、基材とカバーシートとの間に（例えばコーティングにおいて）配置された栄養素、選択剤、及び／又は指示試薬を更に含んでいてもよい。
【００３７】
いずれかの実施形態では、接種済み薄膜培養デバイスを形成することは、培養乳製品及び希釈剤を含む混合物を薄膜培養デバイスの基材とカバーシートとの間に（例えばピペットによって）置くことを含む。上述のように、ＭＯＰＳ緩衝液は、薄膜培養デバイスの成分として供給してもよいし、又は本明細書に記載の方法１００の工程１０において混合物を形成するために使用される希釈剤の成分として供給してもよい。あるいは、ＭＯＰＳ（例えば水溶液中での）を混合物とは別々に薄膜培養デバイス内に（例えばピペットによって）置き、その後、混合物と混合してから、接種済み薄膜培養デバイスを閉じてもよいことが企図される。
【００３８】
更に、接種済み薄膜培養デバイスを形成することが、大腸菌群の増殖を促進するための栄養素及び／又は非大腸菌群の増殖を阻害するための選択剤を薄膜培養デバイス内に（例えばピペットによって）置くことを更に含み得ることが企図される。栄養素及び／又は選択剤は、１つ以上の溶液中に存在してもよく、この溶液は、薄膜培養デバイス内に置かれた後でデバイスが閉じられる前に混合物と混合されてもよい。
【００３９】
大腸菌群を含み得る水性培地（例えば、希釈剤及び培養乳製品の混合物）の接種後、薄膜培養デバイスの冷水可溶性ゲル化剤が培地に接触し、ヒドロゲルを形成する。ヒドロゲルは一定量の大腸菌群を有し、この大腸菌群は、混合物中に存在する場合、ヒドロゲル中で繁殖してコロニーを形成し、ヒドロゲル中のラクトースを発酵させ、それによって酸及びガス生成物を産生する。このガスは、ヒドロゲル中で各ガス産生コロニーに近接して捕捉され、ヒドロゲル中でガスを産生したコロニーに近接した観察可能なガス気泡を形成する。栄養素及び／又は選択剤は、接種前の薄膜培養デバイスに存在するか、又は接種中に薄膜培養デバイス内に置かれるかにかかわらず、ヒドロゲル中に拡散して、大腸菌群の増殖を培養乳製品中に存在し得る他の微生物（例えば乳酸菌）と比べて向上させる栄養培地を形成する。
【００４０】
薄膜培養デバイスの接種後にヒドロゲルが形成される場合、ヒドロゲルは、カバーシートと基材との間に挟まれる。
【００４１】
本方法のいずれかの実施形態では、混合物を薄膜培養デバイスに接種してヒドロゲルを形成することは、有効濃度のＭＯＰＳを有するヒドロゲルを形成することを含む。いずれかの実施形態では、ヒドロゲル中のＭＯＰＳの有効濃度は、１６ｍＭ以上とすることができる。いずれかの実施形態では、ヒドロゲル中のＭＯＰＳの有効濃度は、４０ｍＭ以下とすることができる。いずれかの実施形態では、ヒドロゲル中のＭＯＰＳの有効濃度は、１６〜４０ｍＭ（両端の値を含む）とすることができる。
【００４２】
混合物を薄膜培養デバイスに接種してヒドロゲルを形成することは、有効濃度のラクトースを有するヒドロゲルを形成することを含む。ラクトースの有効濃度は、薄膜培養デバイスにおいて増殖する大腸菌群のラクトース発酵コロニー形成単位に観察可能なガス気泡を形成するのに十分なものである。いずれかの実施形態では、ヒドロゲル中のラクトースの有効濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）以上とすることができる。いずれかの実施形態では、ヒドロゲル中のラクトースの有効濃度は、１．２５％（ｗ／ｖ）以下とすることができる。いずれかの実施形態では、ヒドロゲル中のラクトースの有効濃度は、０．５％〜１．２５％（ｗ／ｖ）以下（両端の値を含む）とすることができる。
【００４３】
再び図１を参照すると、混合物を薄膜培養デバイスに接種した後、方法１００は、大腸菌群の増殖を促進する条件下で接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートする工程３０を更に含む。当業者であれば、大腸菌群の増殖を促進する条件下で接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることが、周囲温度よりも高い温度で接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることを含み得ることを理解するであろう。好ましくは、接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることは、３０℃以上かつ４４℃以下の温度で培養デバイスをインキュベートすることを含む。いずれかの実施形態では、接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることは、３５〜３７℃の範囲（両端の値を含む）の温度で培養デバイスをインキュベートすることを含む。
【００４４】
いずれかの実施形態では、大腸菌群の増殖を促進する条件下で接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることは、大腸菌群の観察可能なコロニーを形成させるのに十分な期間にわたって培養デバイスをインキュベートすることを含む。観察可能なコロニーを形成させるための期間は、約４時間〜約４８時間（両端の値を含む）、好ましくは約１６〜約２６時間（両端の値を含む）、より好ましくは約１８〜約２４時間であり得る。本開示による薄膜培養デバイスは、指示試薬（例えば、トリフェニルテトラゾリウムクロリド等のレドックス染料、例えば５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等の発色性酵素基材）、又は蛍光発生酵素基材（例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含んでいてもよく、これは、大腸菌群と反応して、コロニーの観察を容易にする、有色かつ／又は蛍光性の生成物を形成する。通常、薄膜培養デバイスにおいて増殖する大腸菌群のコロニーによって産生された観察可能なガス気泡の蓄積は、インキュベーションの１６〜１８時間以内に起こる。ガス気泡のサイズは、１８時間より長いインキュベーション期間中にある程度まで継続して増加し得る。
【００４５】
大腸菌群の増殖を促進する条件下で一定期間にわたって接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートした後、方法１００は、接種済み培養デバイスに存在するガス産生コロニーを特定し計数する工程４０を更に含む。
【００４６】
接種済み培養デバイスに存在するコロニーを特定することは、薄膜培養デバイスにおいて形成されたヒドロゲルを細菌コロニーの指標に関して観察することを含み得る。薄膜培養デバイスにおけるコロニーは、例えば、上述のようにコロニー内の細菌と指示試薬との反応に関連したヒドロゲルの色の変化によって特定することができる。
【００４７】
接種済み培養デバイスに存在するガス産生コロニーを特定することは、薄膜培養デバイスの基材とカバーシートとの間に挟まれたヒドロゲルの一部分を生体起源ガス気泡が動かしたことによって生じたヒドロゲル中の空隙を観察することを含み得る。生体起源ガス気泡は、通常、それを産生するコロニーに近接して存在する。空隙は、ヒドロゲル中の実質的に無色で高度に光透過性の領域として観察され得る。薄膜培養デバイスにおける生体起源ガス気泡の観察は、例えば、参照により全体が本明細書に援用される国際公開第ＷＯ  ２０１４／０９９６４４号（Ａ１）に記載されている。
【００４８】
ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群数測定用プレートの使用のために製造元から提供されているＴｈｅ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅは、薄膜培養デバイスに観察されるガス気泡が特定のコロニーに関連しているかどうかの判定に関する指針を提供する。部分的には、この指針は、微生物コロニーへのガス気泡への近接性に関する。一般に、特定の微生物コロニーに接触しているガス気泡は、そのコロニーに関連した（すなわち、そのコロニーによって産生された）ものとみなされる。加えて、約３コロニー径に等しい距離内に位置しているガス気泡は、そのコロニーに関連した（すなわち、そのコロニーによって産生された）ものとみなされる。したがって、０．５ｍｍの直径を有するコロニーは、コロニーから最大約１．５ｍｍ離れた位置にあるガス気泡を産生し得る。いずれかの近接した微生物コロニーに対するガス気泡（例えば、ヒドロゲル中の空隙として観察されるもの）の位置は、そのコロニーを形成する微生物によってガス気泡が産生されたかどうかを判定するために使用される。
【００４９】
ヒドロゲル中の空隙を観察することは、最小寸法を有する空隙を観察することを含み得る。いずれかの実施形態では、ヒドロゲル中の空隙を観察することは、空隙を貫通する直線に沿って少なくとも０．５ｍｍの寸法を有する空隙を観察することを含む。いずれかの実施形態では、ヒドロゲル中の空隙を観察することは、空隙を貫通する直線に沿って少なくとも１．０ｍｍの寸法を有する空隙を観察することを含む。いずれかの実施形態では、ヒドロゲル中の空隙を観察することは、空隙を貫通する直線に沿って最大３ｍｍの寸法を有する空隙を観察することを含む。
【００５０】
いずれかの実施形態では、接種済み培養デバイスに存在するガス産生コロニーを特定し計数することは、培養乳製品中に存在する大腸菌群コロニー形成単位に関連した大腸菌群のコロニーを特定し計数することを含み得る。したがって、本開示の方法で使用される薄膜培養デバイスにおけるガス産生コロニーの存在は、培養乳製品中の大腸菌群の存在を示し得る。
【００５１】
本開示による方法のいずれかの実施形態では、ガス産生コロニーを計数することは、ガス産生コロニーを手作業で計数することを含む。本明細書で使用される場合、ガス産生コロニーを手作業で計数することには、薄膜培養デバイスの照明及び／又は拡大を行うデバイス（例えば、Ｑｕｅｂｅｃ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いてコロニーを計数することが含まれる。あるいは、本開示の方法のいずれかの実施形態では、ガス産生コロニーを計数することは、例えば、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ミネソタ州セントポール）から入手可能なＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートリーダー等の自動コロニー計数装置を使用してガス産生コロニーを計数することを含む。
【００５２】
本開示による方法は、大腸菌群のある特定の種を検出するために使用することができ、ここで、薄膜培養デバイスにおけるガス最終生成物（例えばＣＯ２）へのラクトース発酵は、培養デバイスに接種するために使用される試料中の培養乳製品の存在によって抑制される。そのような大腸菌群の非限定的な例としては、セラチア・リクファシエンス（Serratia liquefaciens）種のメンバーが挙げられる。ラクトース発酵からのガス産生が培養乳製品によって抑制され得る他の大腸菌群としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）種（別称、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans））のメンバーが挙げられる。
【００５３】
上述され、図に示された実施形態は、単に例として提示されるものであり、本開示の概念及び原理における限定を意図するものではない。このように、本開示の趣旨及び範囲を逸脱することなく、要素並びにそれらの構成及び配置における様々な変更が可能であることは、当業者であれば理解するであろう。
【００５４】
本明細書において引用された参考文献及び公開文献は全て、参照によりその全体が本開示に明示的に援用される。
【００５５】
以下の実施形態は、本開示の例証を意図するものであり、限定するものではない。
【００５６】
例示的な実施形態
実施形態Ａは、培養乳製品中に存在するガス産生大腸菌群を計数する方法であって、
既定量の乳製品及び既定容量の希釈剤を含む混合物を形成することと、
この混合物を薄膜培養デバイスに接種して、大腸菌群を増殖させるための栄養培地、有効濃度のラクトース、及び有効濃度のＭＯＰＳを含むヒドロゲルを形成することと、
大腸菌群の増殖を促進する条件下で接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることと、
接種済み培養デバイスに存在するガス産生コロニーを特定し計数することと
を含む、方法である。
【００５７】
実施形態Ｂは、ヒドロゲル中のＭＯＰＳの有効濃度が１６ｍＭ以上である、実施形態Ａの方法である。
【００５８】
実施形態Ｃは、ヒドロゲル中のＭＯＰＳの有効濃度が４０ｍＭ以下である、実施形態Ｂの方法である。
【００５９】
実施形態Ｄは、希釈剤がＭＯＰＳを含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
【００６０】
実施形態Ｅは、希釈剤中のＭＯＰＳの濃度が２０ｍＭ以上である、実施形態Ｄの方法である。
【００６１】
実施形態Ｆは、希釈剤中のＭＯＰＳの濃度が５０ｍＭ以下である、実施形態Ｅの方法である。
【００６２】
実施形態Ｇは、希釈剤中のＭＯＰＳの濃度が２５ｍＭ以上であり、かつ４５ｍＭ以下である、実施形態Ｆの方法である。
【００６３】
実施形態Ｈは、混合物が５超のｐＨを有する、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
【００６４】
実施形態Ｉは、混合物が８未満のｐＨを有する、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
【００６５】
実施形態Ｊは、混合物が５．５以上かつ７．５以下のｐＨを有する、実施形態Ｉの方法である。
【００６６】
実施形態Ｋは、ヨーグルト、サワークリーム、バターミルク、カード、レベン、カルピス、ケフィア、アイラン、カティーク、凝乳、及びカッテージチーズからなる群から選択される培養乳製品である。
【００６７】
実施形態Ｌは、ヒドロゲル中のラクトースの有効濃度が０．５％（ｗ／ｖ）以上である、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
【００６８】
実施形態Ｍは、ヒドロゲル中のラクトースの有効濃度が１．２５％（ｗ／ｖ）以下である、実施形態Ｌの方法である。
【００６９】
実施形態Ｎは、ガス産生コロニーを計数することが、セラチア属のコロニーを計数することを含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法である。
【００７０】
実施形態Ｏは、薄膜培養デバイスに接種した後に、ヒドロゲルが、大腸菌群の増殖を促進する栄養培地を含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
【００７１】
実施形態Ｐは、薄膜培養デバイスに接種する前に、培養デバイスが、栄養培地の少なくとも１種の栄養素を含む、実施形態Ｏの方法である。
【００７２】
実施形態Ｑは、少なくとも１種の栄養素が薄膜培養デバイスにおいて実質的に水を含まない組成物として存在する、実施形態Ｐの方法である。
【００７３】
実施形態Ｒは、薄膜培養デバイスに接種した後に、ヒドロゲルが、非大腸菌群の増殖を阻害する選択剤を含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
【００７４】
実施形態Ｓは、薄膜培養デバイスに接種する前に、培養デバイスが選択剤を含む、実施形態Ｎの方法である。
【００７５】
実施形態Ｔは、薄膜培養デバイスに接種する前に、選択剤が薄膜培養デバイスにおいて実質的に水を含まない組成物として存在する、実施形態Ｓの方法である。
【００７６】
実施形態Ｕは、大腸菌群の増殖を促進する条件下で接種済み薄膜培養デバイスをインキュベートすることが、３５〜３７℃の範囲（両端の値を含む）の温度で薄膜培養デバイスをインキュベートすることを含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
【００７７】
実施形態Ｖは、薄膜培養デバイスが、基材と、カバーシートと、基材とカバーシートとの間に配置された乾燥した再水和可能な冷水可溶性ゲル化剤とを備え、混合物を薄膜培養デバイスに接種してヒドロゲルを形成することが、デバイスのカバーシート及び基材に接触するヒドロゲルを形成することを含み、ガス産生コロニーを特定することが、ヒドロゲル中のコロニーに近接した空隙を観察することを含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
【００７８】
実施形態Ｗは、ヒドロゲル中の空隙を観察することが、空隙を貫通する直線に沿って少なくとも０．５ｍｍの寸法を有する空隙を観察することを含む、実施形態Ｖの方法である。
【００７９】
実施形態Ｘは、空隙が、ヒドロゲル中で視覚的に検出可能な細菌コロニーから１．５ｍｍ以下離れて配置されている、実施形態Ｗの方法である。
【００８０】
実施形態Ｙは、ガス産生コロニーを計数することが、ガス産生コロニーを手作業で計数することを含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
【００８１】
実施形態Ｚは、ガス産生コロニーを計数することが、自動コロニー計数装置を使用してガス産生コロニーを計数することを含む、実施形態Ａ〜Ｙのいずれか１つの方法である。
【実施例】
【００８２】
参照例１〜９。Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤に希釈したセラチア・リクファシエンス添加培養乳製品の計数。
【００８３】
これらの実施例で使用した薄膜培養デバイス（ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（商標）高感度大腸菌群数測定用プレート）は、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手した。本明細書に記載される実験では、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナサス）から入手した大腸菌群（セラチア・リクファシエンス）（ＡＴＣＣ  ５１８１４）を使用した。Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤はＥｄｇｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（テネシー州メンフィス）から入手した。様々な培養乳製品（表１に示す）を小売元から入手した。
【００８４】
各乳製品１部を希釈剤（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤）４部と別々に混合した。したがって、培養乳製品の全希釈係数は１：５であった。セラチア・リクファシエンス(S.liquefaciens)の一晩培養物をＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤に希釈し、希釈した培養乳製品の各容器に小容量の希釈培養物を加えて、希釈乳製品及びおよそ５０コロニー形成単位（colony-forming unit、CFU）のセラチア・リクファシエンスを含有する混合物を得た。この混合物をホモジナイズして、混合物中の乳製品及び細菌をより一様に分散させた。ｐＨを測定するために、この混合物の一部分を取り出した。
【００８５】
製造元の指示に従い、各混合物１ｍＬを使用して別々のＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（商標）高感度大腸菌群数測定用プレートに接種した。接種後、３５℃でおよそ２４時間にわたってプレートをインキュベートした。インキュベーション後、製造元の指示に従い、プレート内のガス産生コロニーである大腸菌コロニーを手作業で特定し、各プレートで観察されたコロニーの数を記録した。
【００８６】
参照対照(Reference Control)は、培養乳製品１部及びＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤４部を用いて細菌添加混合物を調製する代わりに、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤５部を用いて「混合物」を調製したことを除いては、参照例に記載したように調製した（すなわち、これらの試料中に培養乳製品は存在しなかった）。参照対照は、試料中の培養乳製品の存在が原因で生じ得るいかなる障害もない場合に、どれだけ多くの細菌が試料中で観察され得るかを示す。
【００８７】
表２は、各参照例のｐＨ、及び試験した各試料中で観察されたガス産生コロニーの数の一覧である。このデータは、試料のそれぞれに１ｍＬ当たり約３５ＣＦＵのセラチア・リクファシエンスを添加したことを示す（参照対照を参照されたい）。このデータは更に、各試料への培養乳製品の添加が、試料混合物のｐＨを約７．８から約４．０〜５．２に低下させたことを示す。加えて、このデータは、培養乳製品を含有する試料中で観察されたＣＦＵの平均数が、同じ希釈剤を有するが培養乳製品を有しない参照対照よりも約２５ＣＦＵ低かった（すなわち約７０％低かった）ことを示す。
【００８８】
【表１】
2018536437.tif 000003
【００８９】
表２．Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤に希釈した培養乳製品を含有する試料中のセラチア・リクファシエンスの計数。参照例１〜９におけるプレート毎のＣＦＵの平均数はおよそ１０であった。各参照例中の培養乳製品は表１に列記されている。ＣＦＵの報告値は、各条件につき２つの複製試料の平均を表す。
【表２】
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【００９０】
比較例１〜９。Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤に希釈したセラチア・リクファシエンス添加培養乳製品の計数。
【００９１】
これらの例で使用した薄膜培養デバイス、大腸菌群、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤、及び培養乳製品は、参照例１〜９で使用したものと同じであった。培養乳製品、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤、及び大腸菌群を含む混合物を参照例１〜９に記載したように調製したが、培養乳製品を希釈剤と混合した後に混合物のｐＨを約７．０に調整するために小容量（１ｍＬ以下）の０．１Ｎ  ＮａＯＨを混合物に加えたことを除く。
【００９２】
参照例１〜９に記載したように薄膜培養デバイスの接種及びインキュベーションを行った。インキュベーション期間後、参照例１〜９に記載のように、薄膜培養デバイスにおけるガス産生コロニーを特定し、計数した。
【００９３】
比較対照(Comparative Control)Ａは、培養乳製品１部及びＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤４部を用いて細菌添加混合物を調製する代わりに、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤５部を用いて「混合物」を調製したことを除いては、比較例１〜９に記載したように調製した（すなわち、これらの試料中に培養乳製品は存在しなかった）。比較対照Ａは、試料中の培養乳製品の存在が原因で生じ得るいかなる障害もない場合に、どれだけ多くの細菌が試料中で観察され得るかを示す。
【００９４】
表３は、各比較例のｐＨ、及び試験した各試料中で観察されたガス産生コロニーの数の一覧である。このデータは、試料のそれぞれに１ｍＬ当たり約３５ＣＦＵのセラチア・リクファシエンスを添加したことを示す（比較対照Ａを参照されたい）。このデータは、培養乳製品を含有する試料中で観察されたＣＦＵの平均数が、同じ希釈剤を有するが培養乳製品を有しない比較対照Ａよりも約１１ＣＦＵ低かった（すなわち約３５％低かった）ことを示す。
【００９５】
表３．Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤に希釈した後にｐＨ調整を行った培養乳製品を含有する試料中のセラチア・リクファシエンスの計数。比較例１〜９におけるプレート毎のＣＦＵの平均数はおよそ１９であった。比較例のそれぞれにおける培養乳製品は表１に列記されている。ＣＦＵの報告値は、各条件につき２つの複製試料の平均を表す。
【表３】
2018536437.tif 000005
【００９６】
比較例１０〜１８。２０ｍＭリン酸塩を含む希釈剤に希釈したセラチア・リクファシエンス添加培養乳製品の計数。
【００９７】
これらの例で使用した薄膜培養デバイス、大腸菌群、及び培養乳製品は、参照例１〜９で使用したものと同じであった。試薬グレードのリン酸水素二カリウムを使用して希釈剤（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０５）を調製した。培養乳製品、リン酸緩衝希釈液、及び大腸菌群を含む混合物を、参照例１〜９に記載したように調製した。
【００９８】
参照例１〜９に記載したように薄膜培養デバイスの接種及びインキュベーションを行った。インキュベーション期間後、参照例１〜９に記載のように、薄膜培養デバイスにおけるガス産生コロニーを特定し、計数した。
【００９９】
比較対照Ｂは、培養乳製品１部及び２０ｍＭリン酸緩衝希釈液４部を用いて細菌添加混合物を調製する代わりに、２０ｍＭリン酸緩衝希釈液５部を用いて「混合物」を調製したことを除いては、比較例１０〜１８に記載したように調製した（すなわち、これらの試料中に培養乳製品は存在しなかった）。比較対照Ｂは、試料中の培養乳製品の存在が原因で生じ得るいかなる障害もない場合に、どれだけ多くの細菌が試料中で観察され得るかを示す。
【０１００】
表４は、各比較例のｐＨ、及び試験した各試料中で観察されたガス産生コロニーの数の一覧である。このデータは、試料のそれぞれに１ｍＬ当たり約２９ＣＦＵのセラチア・リクファシエンスを添加したことを示す（比較対照Ｂを参照されたい）。このデータは、培養乳製品を含有する試料中で観察されたＣＦＵの平均数が、同じ希釈剤を有したが培養乳製品を有しなかった比較対照Ｂよりも約１５ＣＦＵ低かった（すなわち約５２％低かった）ことを示す。
【０１０１】
表４．２０ｍＭリン酸緩衝希釈液に希釈した培養乳製品を含有する試料中のセラチア・リクファシエンスの計数。比較例１０〜１８におけるプレート毎のＣＦＵの平均数はおよそ１４であった。比較例のそれぞれにおける培養乳製品は表１に列記されている。ＣＦＵの報告値は、各条件につき２つの複製試料の平均を表す。
【表４】
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【０１０２】
比較例１９〜２７。３５ｍＭリン酸塩を含む希釈剤に希釈したＳｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ添加培養乳製品の計数。
【０１０３】
これらの例で使用した薄膜培養デバイス、大腸菌群、及び培養乳製品は、参照例１〜９で使用したものと同じであった。試薬グレードのリン酸水素二カリウムを使用して希釈剤（３５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０１）を調製した。培養乳製品、リン酸緩衝希釈液、及び大腸菌群を含む混合物を、参照例１〜９に記載したように調製した。
【０１０４】
参照例１〜９に記載したように薄膜培養デバイスの接種及びインキュベーションを行った。インキュベーション期間後、参照例１〜９に記載のように、薄膜培養デバイスにおけるガス産生コロニーを特定し、計数した。
【０１０５】
比較対照Ｃは、培養乳製品１部及び３５ｍＭリン酸緩衝希釈液４部を用いて細菌添加混合物を調製する代わりに、３５ｍＭリン酸緩衝希釈液５部を用いて「混合物」を調製したことを除いては、比較例１９〜２７に記載したように調製した（すなわち、これらの試料中に培養乳製品は存在しなかった）。比較対照Ｃは、試料中の培養乳製品の存在が原因で生じ得るいかなる障害もない場合に、どれだけ多くの細菌が試料中で観察され得るかを示す。
【０１０６】
表５は、各比較例のｐＨ、及び試験した各試料中で観察されたガス産生コロニーの数の一覧である。このデータは、試料のそれぞれに１ｍＬ当たり約３３ＣＦＵのセラチア・リクファシエンスを添加したことを示す（比較対照Ｃを参照されたい）。このデータは、培養乳製品を含有する試料中で観察されたＣＦＵの平均数が、同じ希釈剤を有するが培養乳製品を有しない比較対照Ｃよりも約２１ＣＦＵ低かった（すなわち約６４％低かった）ことを示す。
【０１０７】
表５．３５ｍＭリン酸緩衝希釈液に希釈した培養乳製品を含有する試料中のセラチア・リクファシエンスの計数。比較例１９〜２７におけるプレート毎のＣＦＵの平均数はおよそ１２であった。比較例のそれぞれにおける培養乳製品は表１に列記されている。ＣＦＵの報告値は、各条件につき２つの複製試料の平均を表す。
【表５】
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【０１０８】
実施例１〜９。２０ｍＭ  ＭＯＰＳを含む希釈剤に希釈したセラチア・リクファシエンス添加培養乳製品の計数。
【０１０９】
これらの例で使用した薄膜培養デバイス、大腸菌群、及び培養乳製品は、参照例１〜９で使用したものと同じであった。試薬グレードのＭＯＰＳ遊離酸及びＭＯＰＳナトリウム塩を使用して希釈剤（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０４）を調製した。培養乳製品、ＭＯＰＳを含む希釈剤、及び大腸菌群を含む混合物を、参照例１〜９に記載したように調製した。
【０１１０】
参照例１〜９に記載したように薄膜培養デバイスの接種及びインキュベーションを行った。インキュベーション期間後、参照例１〜９に記載のように、薄膜培養デバイスにおけるガス産生コロニーを特定し、計数した。
【０１１１】
実施例対照(Example Control)１は、培養乳製品１部及び２０ｍＭ  ＭＯＰＳ希釈剤４部を用いて細菌添加混合物を調製する代わりに、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ希釈剤５部を用いて「混合物」を調製したことを除いては、実施例１〜９に記載したように調製した（すなわち、これらの試料中に培養乳製品は存在しなかった）。実施例対照１は、試料中の培養乳製品の存在が原因で生じ得るいかなる障害もない場合に、どれだけ多くの細菌が試料中で観察され得るかを示す。
【０１１２】
表６は、各実施例のｐＨ、及び試験した各試料中で観察されたガス産生コロニーの数の一覧である。このデータは、試料のそれぞれに１ｍＬ当たり約２９ＣＦＵのセラチア・リクファシエンスを添加したことを示す（実施例対照１を参照されたい）。このデータは、培養乳製品を含有する試料中で観察されたＣＦＵの平均数が、同じ希釈剤を有するが培養乳製品を有しない実施例対照１よりも約７ＣＦＵのみ低かった（すなわち約２４％低かった）ことを示す。
【０１１３】
表６．２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝希釈剤に希釈した培養乳製品を含有する試料中のセラチア・リクファシエンスの計数。実施例１〜９におけるプレート毎のＣＦＵの平均数はおよそ２２であった。実施例のそれぞれにおける培養乳製品は表１に列記されている。ＣＦＵの報告値は、各条件につき２つの複製試料の平均を表す。
【表６】
2018536437.tif 000008
【０１１４】
実施例１０〜１８。３５ｍＭ  ＭＯＰＳを含む希釈剤に希釈したセラチア・リクファシエンス添加培養乳製品の計数。
【０１１５】
これらの例で使用した薄膜培養デバイス、大腸菌群、及び培養乳製品は、参照例１〜９で使用したものと同じであった。試薬グレードのＭＯＰＳ遊離酸及びＭＯＰＳナトリウム塩を使用して希釈剤（３５ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０３）を調製した。培養乳製品、ＭＯＰＳを含む希釈剤、及び大腸菌群を含む混合物を、参照例１〜９に記載したように調製した。
【０１１６】
参照例１〜９に記載したように薄膜培養デバイスの接種及びインキュベーションを行った。インキュベーション期間後、参照例１〜９に記載のように、薄膜培養デバイスにおけるガス産生コロニーを特定し、計数した。
【０１１７】
実施例対照２は、培養乳製品１部及び３５ｍＭ  ＭＯＰＳ希釈剤４部を用いて細菌添加混合物を調製する代わりに、３５ｍＭ  ＭＯＰＳ希釈剤５部を用いて「混合物」を調製したことを除いては、実施例１０〜１８に記載したように調製した（すなわち、これらの試料中に培養乳製品は存在しなかった）。実施例対照２は、試料中の培養乳製品の存在が原因で生じ得るいかなる障害もない場合に、どれだけ多くの細菌が試料中で観察され得るかを示す。
【０１１８】
表７は、各実施例のｐＨ、及び試験した各試料中で観察されたガス産生コロニーの数の一覧である。このデータは、試料のそれぞれに１ｍＬ当たり約４６ＣＦＵのセラチア・リクファシエンスを添加したことを示す（実施例対照２を参照されたい）。このデータは、培養乳製品を含有する試料中で観察されたＣＦＵの平均数が、同じ希釈剤を有するが培養乳製品を有しない実施例対照２よりも約４ＣＦＵのみ低かった（すなわち約９％低かった）ことを示す。
【０１１９】
表７．３５ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝希釈剤に希釈した培養乳製品を含有する試料中のセラチア・リクファシエンスの計数。実施例１０〜１８におけるプレート毎のＣＦＵの平均数はおよそ４２であった。実施例のそれぞれにおける培養乳製品は表１に列記されている。ＣＦＵの報告値は、各条件につき２つの複製試料の平均を表す。
【表７】
2018536437.tif 000009
【０１２０】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び公開文献、並びに電子的に入手可能な資料の全開示内容が、参照により援用される。本出願の開示内容と参照により本明細書に援用されたいずれかの文書の開示内容との間に何らかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示内容が優先するものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解しやすいように示したものにすぎない。これによって不必要な限定がなされるものではない。本発明は図示及び記載された細部そのものに限定されず、当業者に明白なバリエーションは、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれる。
【０１２１】
全ての見出しは読者の便宜のためのものであり、見出しに続く文言の意味を限定することが明記されていない限りそのように使用されるものではない。
【０１２２】
本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な修正を行うことができる。これらの実施形態及び他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【国際調査報告】
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