(57)【要約】  本発明は、−  プラスミノーゲンを含む血漿媒質中のプラスミノーゲンのプラスミンへの転換のための、プラスミノゲナーゼと呼ばれる、少なくとも１つの酵素、−  水溶液に不溶の固体担体であって、０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルター上で保持できるように適合した寸法を示す固体担体を含む酵素組成物であって、前記プラスミノゲナーゼが固体担体に結合しており、血漿媒質と接触してこの担体に結合したままであること、及び組成物が乾燥状態であることを特徴とする酵素組成物に関する。本発明はまた、かかる酵素組成物の調製方法、無菌かつ酵素組成物のない、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の調製のためのその使用、及び装置（２０）に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  プラスミノーゲンを含む血漿媒質中のプラスミノーゲンのプラスミンへの転換のための、プラスミノゲナーゼと呼ばれる、少なくとも１つの酵素と；
−  水溶液に不溶の固体担体であって、
０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルター上に保持できるように適合した寸法を示す固体担体と
を含む酵素組成物において、
前記プラスミノゲナーゼが固体担体と結合しており、血漿媒質と接触してこの担体に結合したままであり、組成物が乾燥状態であることを特徴とする酵素組成物。
【請求項２】
固体担体が分割された状態にあり、互いに直交する３方向に延びる３つの寸法を有する粒子から形成され、３つの寸法のうち少なくとも２つが０．２２μｍを超えることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
固体担体がポリメタクリルポリマーからなる群から選択される材料から形成されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１つのプラスミノゲナーゼが、酵素の分類のＥＣ  ３．４．２１のセリンエンドペプチダーゼであることを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１つのプラスミノゲナーゼが、少なくとも１つの共有結合によって固体担体に結合していることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
無菌であることを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
脱水した粉末の状態であることを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのプラスミノゲナーゼが、共有結合によって互いに直線状に結合した原子の主鎖を含む原子団によって固体担体に結合しており、主鎖が少なくとも４個に等しい原子数を有することを特徴とする、請求項１から７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
酵素組成物が接触している血漿媒質中に質量４００μｇ未満の遊離プラスミノゲナーゼを導入するように、各プラスミノゲナーゼが固体担体に結合しており、接触が下記の方法：
−  約３７℃の温度で、質量０．０１ｇから０．５ｇの脱水状態の酵素組成物を、体積０．５ｍＬから１．０ｍＬの血漿媒質と混合すること、次いで、
−  接触を５分よりも長い期間維持すること、次いで、
−  ０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルターで濾過することによって、酵素組成物と血漿媒質とを分離すること、及び、
−  血漿媒質中に放出されたプラスミノゲナーゼの質量を測定すること
によって行われることを特徴とする、請求項１から８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
接触している血漿媒質中のプラスミノーゲンの、プラスミノゲナーゼ活性と呼ばれる、プラスミンへの転換活性を、以下の条件：
−  約３７℃の温度で５分より長い期間、質量０．０１ｇから０．５ｇの脱水状態の酵素組成物を、体積０．５ｍＬから１．０ｍＬの血漿媒質と接触させること、及び、
−  酵素組成物とプラスミンの豊富な生体外血漿媒質とを濾過により分離した後に、パラニトロアニリン放出検査で測定された、１分当たり及びプラスミンの豊富な生体外血漿媒質１ミリリットル（ｍＬ）当たりの放出されたパラニトロアニリンが０．１μｍｏｌを超える、プラスミン活性と呼ばれる初期酵素活性を示す、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質を形成すること
において示し、
前記放出検査が、
○  ３７℃の温度に維持されるプラスミンの豊富な生体外血漿媒質中に、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中約１ｍＭ（すなわち１０−３ｍｏｌ／Ｌ）の初期濃度の下記の式（Ｉ）の発色性基質Ｓ−２２５１を混合すること、
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○  混合後、１分当たり及びプラスミンの豊富な生体外血漿媒質１ミリリットル（ｍＬ）当たりのパラニトロアニリン放出（パラニトロアニリンのμｍｏｌで）初期速度を算出すること
からなることを特徴とする、請求項１から９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１から１０の何れか一項に記載の酵素組成物の調製方法において、
−  プラスミノーゲンを含む血漿媒質中のプラスミノーゲンのプラスミンへの転換のための、プラスミノゲナーゼと呼ばれる、少なくとも１つの酵素を選択すること、
−  ○血漿媒質と接触したとき、安定した結合を各プラスミノゲナーゼと形成するように適合し、
○０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルター上に保持されるように適合した寸法を有する
水溶液に不溶な固体担体を選択すること、及び、
−  各プラスミノゲナーゼを固体担体に結合させるように、固体担体と各プラスミノゲナーゼを接触させること、及び、
−  酵素組成物を形成するように凍結乾燥工程を実施する、方法。
【請求項１２】
固体担体が、分割された状態で選択され、互いに直交する３方向に延びる３つの寸法を有する粒子から形成され、３つの寸法のうち少なくとも２つが０．２２μｍを超えることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの酵素組成物の滅菌工程を実施することを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
無菌かつ酵素組成物のない、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の調製のための、請求項１から１０の何れか一項に記載の酵素組成物の使用。
【請求項１５】
プラスミンの豊富な生体外血漿媒質１ｍＬ当たり２５μｇ未満の質量の遊離プラスミンを含む、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質を形成するように、３７℃で１５分間から６０分間の期間、一定量の酵素組成物を、一定量のプラスミノーゲンを含む血漿媒質と接触させ、それを維持することを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
一定量の請求項１から１０の何れか一項に記載の酵素組成物、及び０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルターを含む、無菌かつ酵素組成物のない、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の調製のための装置。
【請求項１７】
−  一定量の酵素組成物を含む容器（１）、
−  容器（１）に血漿媒質を導入する装置（３）、
−  酵素組成物の効果の下で容器（１）内に形成した血漿媒質を容器から採取する装置（１１）、
−  血漿媒質の濾過、及び酵素組成物のない無菌のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を構成する濾液の獲得を可能とするために配置された、採取装置（１１）及びフィルター
を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の装置（２０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体担体に固定化したプラスミノゲナーゼを含む酵素組成物、かかる酵素組成物の調製方法、プラスミンの豊富な自家生体外血漿媒質の調製のためのかかる酵素組成物の使用、及びかかる酵素組成物を含む装置に関する。
【０００２】
特に、本発明は、自家プラスミンで富化した自家組成物を必要とする患者における疾患の治療の一環として、例えば心血管疾患の一環、又は外科手術の一環、特に眼科の硝子体内手術のときに用いられるように適合された酵素組成物及びかかる酵素組成物を含む装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）など特定の眼科疾患の適応では、硝子体と網膜との間に生じる差異の接線方向の張力によってできた黄斑円孔が発生する。これらの疾患の治療には、これらの張力から網膜を解放しなければならない。公知の治療は主に、機械的に網膜と硝子体とを分離することを目的とする外科的な性質のものである。
【０００４】
国際公開第２０１０／１２５１４８号、患者の血漿に異種ウロキナーゼを添加して得られた無菌組成物を患者の硝子体に投与する牽引性網膜剥離（英語では「ｔｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ」）の治療が知られている。この無菌組成物は、異種ウロキナーゼを含み、患者において免疫及び炎症反応の問題が生じうる。
【０００５】
また、プラスミンの触媒ドメインから形成した組み換えタンパク質を含む注射用組成物、及び生体外のヒトの目又は生体内のネコの目の硝子体−網膜の境界にかかる注射用組成物を注射することの効果（Gondorfer等, (2004), Investigative Ophtalmology & Visual Science, 45; 2, 641-647. Posterior Vitreous Detachment Induced by Microplasmin）が知られている。
【０００６】
しかし、かかる組み換えタンパク質は、その製造が複雑である。かかる注射用組成物における異種組み換えタンパク質の存在は、この注射用組成物を受けた患者に免疫反応の問題をもたらす。さらに、この注射用組成物のコストは高く、その結果、免疫反応リスクも最小限になるような、組み換えプラスミン使用の代替解決法が研究されている。
【０００７】
日本特許第２００７／０６８４９７号の、あらかじめ血漿から抽出したプラスミノーゲンをプラスミンに転換する方法が知られている。日本特許第２００７／０６８４９７号は、血漿中で直接、血漿のプラスミノーゲンをプラスミンに転換し、プラスミンを富化した自家血漿を調製することを可能とする方法は教示していない。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明は、これらの問題の全体を解決することを目的とする。
【０００９】
とりわけ、本発明は、酵素組成物の効果の下で、血漿媒質中のプラスミノーゲンをプラスミンに生体外で転換することを可能とする、酵素組成物、かかる酵素組成物の調製方法及び使用、及びかかる酵素組成物を含む装置を提案することを目的とする。本発明は、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質であって、患者の組織（一又は複数）に接触するときの前記プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の接触、特に注射による接触のときに、異種酵素を含まない又は最小限かつとりわけ免疫反応を起こすには不十分な遊離異種酵素の残量のみを有するプラスミンの豊富な血漿媒質の調製を可能とする。
【００１０】
本発明は、血漿媒質中のプラスミノーゲンのプラスミンへの、迅速な、特に３７℃で１５分間から６０分間の期間での転換を可能とするように適合した、酵素組成物、かかる酵素組成物の調製方法及び使用、及びかかる酵素組成物を含む装置を提案することを目的とする。
【００１１】
このためには、本発明は、
−  プラスミノーゲンを含む血漿媒質中のプラスミノーゲンのプラスミンへの転換のための、プラスミノゲナーゼと呼ばれる、少なくとも１つの酵素と；
−  水溶液に不溶の固体担体であって、
０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルター上に保持できるように適合した寸法を示す固体担体と
を含む酵素組成物において、前記プラスミノゲナーゼが固体担体と結合しており、血漿媒質と接触してこの担体に結合したままであり、組成物が乾燥状態であることを特徴とする酵素組成物に関する。
【００１２】
本明細書において、以下の用語を採用する。
−表現「血漿媒質」とは、血液細胞（赤血球、白血球、血小板）と、生存血液細胞を含まない血漿媒質との分離を可能とするように適合した条件において、生存血液細胞を含まず、凝固していない液状の血液、特にヒト血液の分別処理から直接もたらされたあらゆる液体媒質を示す。かかる分離は、例えばマイクロ流体の方法における遠心分離又は三細胞分離によって実施でき、
−表現「生体外血漿媒質」とは、ヒト又は動物の体から抽出したあらゆる血漿媒質を示し、
−用語「プラスミノゲナーゼ」とは、プラスミノーゲンのペプチド結合の切断によるプラスミノーゲンのプラスミンへの転換活性を示すあらゆる酵素を示し、
−表現「安定した結合」とは、所定の条件において、酵素組成物を約３７℃の温度で血漿媒質に浸漬させることによって接触させたとき、原子団間、特に固体担体と少なくとも１つのプラスミノゲナーゼとの間の結合を確実にするすべての力を示し、
−表現「ほぼ」とは、通常、値などの構造的特徴、又は機能的特徴が、物理的な意味がない急な不連続性を示すように捉えられるのではなく、考慮される技術的状況において、この構造又はこの機能だけでなく、同等の性質、もしくは同等の程度の効果を発生させるこの構造又はこの機能の若干の変化もカバーすることを示す。
【００１３】
本発明は、分割された状態の固体担体に固定化された少なくとも１つのプラスミノゲナーゼを含む酵素組成物であって、前記酵素組成物が、
−血漿媒質と接触させることが可能であり、
−血漿媒質と接触しているプラスミノゲナーゼの作用下で、血漿媒質中のプラスミノーゲンの少なくとも一部のプラスミンへの転換を可能とし、
−０．２２μｍ以下の分離閾値を有するメンブレン又はフィルター上で濾過することによって、プラスミンを富化した血漿媒質から分離できる
ように適合した組成物に関する。
【００１４】
プラスミノゲナーゼ、固体担体、及びプラスミノゲナーゼと固体担体との間に形成された結合は、酵素組成物が血漿媒質と接触したとき、プラスミノゲナーゼが固体担体と結合したままであるように選択される。
【００１５】
本発明による酵素組成物は乾燥状態である。表現「乾燥状態」とは、とりわけ本発明による酵素組成物が、酵素組成物の接触している血漿媒質のイオン組成及び／又はイオン濃度を変化しうるいかなる液体、特にいかなる水性液体ももたらさないということを示す。したがって、酵素組成物は、接触させられる血漿媒質の浸透圧特性を大して変化させない。酵素組成物は、血漿媒質への１回のみの添加では、添加された血漿媒質に存在するプラスミノーゲンの濃度を変化させることもない。
【００１６】
本発明による酵素組成物は、酵素組成物と接触させた血漿媒質中に遊離状態のプラスミノゲナーゼを放出しない、又は酵素組成物と接触させた血漿媒質中に遊離状態のプラスミノゲナーゼを少量しか放出しない。したがって、本発明による酵素組成物は、ある患者から採取した血液から形成された血漿媒質から、ほぼ異種プラスミノゲナーゼを含まないプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を調製する方法において用いることができる。かかるプラスミンが豊富であり、ほぼ異種プラスミノゲナーゼを含まない自家生体外血漿媒質は、この同じ患者に用いることを目的とする。
【００１７】
発明者は、プラスミノゲナーゼ活性を保存しながら、少なくとも１つのプラスミノゲナーゼを、水溶液に不溶の分割された状態の固体担体に固定化することが可能であることに気づいた。かかる酵素組成物は、一方では血漿媒質中のプラスミノーゲンをプラスミンに効率よく転換し、他方では酵素組成物と、このプラスミンの豊富な生体外血漿媒質において不都合で無視できないプラスミノゲナーゼの放出を制限し、特に完全に回避して、血漿媒質と酵素組成物との接触によって得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の分離を容易にすることを可能とする。したがって、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質には、ほぼ外因性及び異種のプラスミノゲナーゼを含まない。
【００１８】
本発明によれば、有利には、固体担体は、分割された状態であり、互いに直交する３方向に延びる３つの寸法を有する粒子から形成され、３つの寸法のうち少なくとも２つが０．２２μｍを超える。
【００１９】
本発明によれば、有利には、各粒径は０．２２μｍを超える。
【００２０】
本発明によれば、有利には、分割された状態の固体担体の少なくとも２つの粒径は１μｍから５００μｍであり、特に１０μｍから５００μｍであり、好ましくは１００μｍから５００μｍである。本発明によれば、有利には、分割された状態の固体担体の各粒径は１μｍから５００μｍであり、特に１０μｍから５００μｍであり、好ましくは１００μｍから５００μｍである。有利には、分割された状態の固体担体の粒径は、酵素組成物が滅菌フィルター、すなわち０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルターで保持されるように選択される。
【００２１】
本発明によれば、有利には、固体担体は、多孔質材料からなる。本発明によれば、有利には、多孔質材料は、平均孔径５ｎｍから５０ｎｍであり、好ましくは１０ｎｍから２０ｎｍである細孔を示す。有利には、多孔質材料は硬い材料からなる群から選択される。本発明によれば、有利には、固体担体は、高い比表面積の材料からなる群から選択された材料からなる。
【００２２】
本発明の特殊な変形態様によれば、有利には、酵素組成物の固体担体は、日本特許第２００７／０６８４９７号で挙げられた固体担体を除く固体担体である。本発明による酵素組成物の固体担体は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ／ＢＢ−ＣＮＢｒ担体、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ／ＮＨＳ担体、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ−ＥＣＨ担体、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ  １０担体、Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ担体、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ−ｅｐｏｘｙ担体、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  ＥＡＨ担体、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ−ｔｈｉｏｐｒｏｐｙｌ担体、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ｔｈｉｏｌ担体、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ−Ｈｚ担体、ＴＮＢ−ｔｈｉｏｌ担体、及びｐ−クロロメルクリ安香酸塩担体を除く固体担体である。
【００２３】
本発明によれば、有利には、固体担体、特に分割された状態の固体担体は、ポリグルコシドポリマー及びポリメタクリルポリマーからなる群から選択された材料からなる。
【００２４】
発明の他の特殊な変形態様によれば、有利には、固体担体は、担体ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ及びＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）からなる群から選択される。有利には、分割された状態の固体担体は平均径１００μｍから３００μｍの球状の粒子からなる。
【００２５】
本発明によれば、有利には、固体担体、特に分割された状態の固体担体は、ポリメタクリルポリマーからなる群から選択された材料からなる。本発明によれば、有利には、固体担体は、特にポリメタクリルコポリマー、例えばポリメタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ）／ジメタクリル酸エチレン（ＥＤＭＡ）コポリマーからなる群から選択された材料からなる。
【００２６】
本発明によれば、有利には、少なくとも１つのプラスミノゲナーゼ、特に各プラスミノゲナーゼ−は、酵素の分類のＥＣ  ３．４．２１のセリンエンドペプチダーゼ、特に抗血栓活性のあるエンドペプチダーゼ−である。
【００２７】
本発明によれば、有利には、少なくとも１つのプラスミノゲナーゼ、特に各プラスミノゲナーゼは、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ナットウキナーゼ、及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）からなる群から選択される。本発明によれば、有利には、少なくとも１つのプラスミノゲナーゼは、ウロキナーゼＵ０６３３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）である。本発明によれば、有利には、酵素組成物は単一のプラスミノゲナーゼを含む。変形態様として、酵素組成物は複数の異なる混合状態のプラスミノゲナーゼを含みうる。
【００２８】
本発明によれば、有利には、少なくとも１つのプラスミノゲナーゼは、共有結合、イオン結合、配位共有結合（又は配位結合）、及びファンデルワース型の親水性相互作用からなる群から選択される、少なくとも１つの安定した結合によって固体担体に結合している。
【００２９】
本発明によれば、有利には、少なくとも１つの安定した結合は、濃度０．５ＭのＮａＣｌ水溶液との接触に持ちこたえられるように選択される。
【００３０】
本発明によれば、有利には、少なくとも１つのプラスミノゲナーゼ、特に各プラスミノゲナーゼは、少なくとも１つの共有結合によって固体担体に結合している。とりわけ、少なくとも１つのかかる共有結合は、前記プラスミノゲナーゼの遊離アミノ基と固体担体のエポキシ基との化学反応によって形成される。
【００３１】
本発明の代替実施態様によれば、有利には、酵素組成物は単一のプラスミノゲナーゼ、又は複数のプラスミノゲナーゼの混合物を含む。
【００３２】
本発明によれば、有利には、酵素組成物は、本発明による酵素組成物と血漿媒質との接触によって、ほぼ非発熱性のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を形成するように適合している。本発明による酵素組成物は、異種化合物、特に異種プラスミノゲナーゼを、特に約３７℃の温度での酵素組成物と血漿媒質との接触によって得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質中に放出しないように適合されており、前記異種化合物は、一定量のこのプラスミンの豊富な生体外血漿媒質で治療を行う患者において免疫反応を誘起しうる。
【００３３】
血漿媒質と本発明による酵素組成物との接触によって得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の発熱性／非発熱性は、プラスミンの豊富な自家生体外血漿媒質の注射を受けたウサギの体温を測定することによって分析する。注射後にウサギの体温が上昇しないことは、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の非発熱性を示す。
【００３４】
本発明によれば、有利には、酵素組成物にはあらゆる微生物、とりわけあらゆる病原微生物を含まない。本発明によれば、有利には、酵素組成物は無菌である。
【００３５】
酵素組成物は乾燥状態である。酵素組成物は、血漿媒質と、特に水又は水溶液（注射剤又は生理食塩水など）を添加せずに直接接触させ、血漿媒質中のプラスミノーゲンの少なくとも一部からのプラスミンへの転換を、血漿媒質との接触させた前記プラスミノゲナーゼの作用下で可能にするように適合した乾燥粉末の形態でありうる。
【００３６】
酵素組成物は乾燥かつ脱水した状態である。したがって、乾燥かつ脱水した状態で保存しうる。酵素組成物は、血漿媒質と、特に水又は水溶液（注射剤又は生理食塩水など）添加せずに直接接触させ、血漿媒質中のプラスミノーゲンの少なくとも一部からのプラスミンへの転換を、血漿媒質との接触させた前記プラスミノゲナーゼの作用下で可能にするように適合している。
【００３７】
本発明によれば、有利には、酵素組成物は脱水した粉末の状態である。
【００３８】
本発明によれば、有利には、各プラスミノゲナーゼは、酵素組成物が接触している血漿媒質中に質量４００μｇ未満の遊離プラスミノゲナーゼを導入するように固体担体に結合しており、接触は下記の方法：
−  約３７℃の温度で、質量０．０１ｇから０．５ｇ、特に約０．１ｇの脱水状態の酵素組成物を、体積０．５ｍＬから１．０ｍＬ、特に約０．７ｍＬの血漿媒質と混合すること、次いで、
−  接触を、５分よりも長く、特に５分から６０分の間維持すること、次いで、
−  ０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルターで濾過することによって酵素組成物と血漿媒質とを分離すること、及び、
−  血漿媒質中に放出されたプラスミノゲナーゼの質量を測定すること
によって行われる。
【００３９】
本発明によれば、有利には、酵素組成物が接触する血漿媒質中の遊離プラスミノゲナーゼの質量は、２００μｇ未満、特に１００μｇ未満、好ましくは５０μｇ未満である。本発明によれば、有利には、酵素組成物が接触する血漿媒質中の遊離プラスミノゲナーゼの質量は、４０μｇ未満、特に３０μｇ未満、とりわけ２５μｇ未満、好ましくは２０μｇ未満、より好ましくは１０μｇ未満である。
【００４０】
本発明によれば、有利には、酵素組成物が接触する血漿媒質中の遊離プラスミノゲナーゼの質量は、２０μｇ未満、特に１５．０μｇ未満、とりわけ８．０μｇ未満、好ましくは３．０μｇ未満、より好ましくは１．５μｇ未満である。
【００４１】
本発明によれば、有利には、酵素組成物接触する血漿媒質中の遊離プラスミノゲナーゼの質量は、１０μｇ未満、特に８．０μｇ未満、とりわけ６．０μｇ未満、好ましくは５．０μｇ未満、より好ましくは２μｇ未満である。本発明によれば、有利には、酵素組成物が接触する血漿媒質中の遊離プラスミノゲナーゼの質量は０．５μｇ未満である。
【００４２】
遊離プラスミノゲナーゼの定量は、あらゆる適合した方法、例えばプラスミノゲナーゼに特異な一次抗体及び定量化可能な二次抗体を用い、血漿媒質中の既知の量のプラスミノゲナーゼを含む溶液からの校正曲線を実施する「ＥＬＩＳＡ」タイプの免疫酵素定量によって行う。
【００４３】
また、酵素組成物の濾過による除去後に得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性の時間的変化を分析する間接的な方法によって、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中に放出されたプラスミノゲナーゼの活性を検出することも可能である。プラスミノーゲン濃度の限定されない条件において、プラスミン活性の顕著な上昇がプラスミンの豊富な生体外血漿媒質中に遊離プラスミノゲナーゼがあることを示しうるのに対し、プラスミン活性のほとんど安定した状態は、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中に遊離プラスミンが存在しないことを示す。
【００４４】
本発明による酵素組成物は、免疫原性の低いプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の形成を可能にする。
【００４５】
本発明によれば、有利には、少なくとも１つのプラスミノゲナーゼ、特に各プラスミノゲナーゼ−は、共有結合によって互いに直線状に結合した原子の主鎖（すなわち原子数が最も多い鎖）を含む原子団によって固体担体に結合しており、主鎖は少なくとも４個に等しく、特に１０から１５原子の原子数を有する。
【００４６】
本発明によれば、有利には、酵素組成物は、接触している血漿媒質中のプラスミノーゲンの、プラスミノゲナーゼ活性と呼ばれる、プラスミンへの転換の活性を、以下の条件：
−  約３７℃の温度で、５分より長い期間、特に５分から６０分間、質量０．０１ｇから０．５ｇ、特に約０．１ｇの脱水状態の前記酵素組成物を、体積０．５ｍＬから１．０ｍＬ、特に約０．７ｍＬの血漿媒質と接触させること、及び、
−  酵素組成物とプラスミンの豊富な生体外血漿媒質とを濾過により分離した後に、パラニトロアニリン放出検査で測定された、１分当たり及びプラスミンの豊富な生体外血漿媒質１ミリリットル（ｍＬ）当たりの放出されたパラニトロアニリンが０．１μｍｏｌを超える、特に０．１から０．３μｍｏｌ、好ましくは約０．２μｍｏｌである、プラスミン活性と呼ばれる初期酵素活性を示す、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質を形成すること
において示し、
前記放出検査が、
○  ３７℃の温度に維持されたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質中で、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中約１ｍＭ（すなわち１０−３ｍｏｌ／Ｌ）の初期濃度の下記の式（Ｉ）の発色性基質Ｓ−２２５１を混合すること、
2018515131.tif 000003
○  混合後、１分当たり、及びプラスミンの豊富な生体外血漿媒質１ミリリットル（ｍＬ）当たりのパラニトロアニリン放出（パラニトロアニリンのμｍｏｌで）初期速度を算定することからなる。
【００４７】
３７℃で５分間から６０分間の期間、血漿媒質中のプラスミノーゲンのプラスミンへの転換、及びプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の形成を可能とするように適合した条件下のプラスミノーゲンを含む、一定量の血漿媒質と接触させている一定量の酵素組成物を配置する間接的な方法によって、血漿媒質と本発明による酵素組成物との接触から得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性を測定する。
【００４８】
次いで、酵素組成物と、血漿媒質中のプラスミノーゲンのプラスミンへの転換によって形成されたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質との、特に滅菌濾過による分離の工程を実施する。有利には、この滅菌濾過工程は、０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルターで１つのみの濾過工程で実施できる。しかし、この滅菌濾過工程は、いくつかの工程で実施可能であり、酵素組成物と、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質との分離の１回目の濾過であって、滅菌ではない１回目の濾過と、次いで酵素組成物のないプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の２回目の濾過とを含み、前記２回目の濾過は０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルターでの滅菌濾過である。
【００４９】
プラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性を決定する。実際には、分光光度測定槽内に、３７℃で、一定体積のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質と、同体積のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の作用下でパラニトロアニリンを放出しうる色原性基質水溶液、例えば、濃度約２ｍＭの発色性基質として（測定媒質中のＳ−２２５１濃度が約１ｍＭになるように）、下記の式（ＩＶ）のＳ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ・２ＨＣｌ，Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｌｅ  Ｐｒｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｇｅｒｖａｉｓ，ＦＲＡＮＣＥ）との混合によって、プラスミンの活性の測定媒質を調製する。
2018515131.tif 000004
混合物から、３７℃で５分間維持された測定媒質の４０５ｎｍでの吸光度（光学密度、ＯＤ４０５ｎｍ）の変化を測定する。４０５ｎｍでの吸光度の時間的変化曲線からの傾き、すなわちΔａｂｓ／ｍｉｎで表される反応の初期速度Ｖｉを算定する。プラスミン活性（プラスミンの豊富な生体外血漿媒質のＵ／ｍＬで表される）は、以下の式（ＩＩＩ）によって求められ、
2018515131.tif 000005
式中、
−  ＶｉはΔａｂｓ／ｍｉｎで表される反応の初期速度、
−  Ｖｍは測定媒質の総体積（ｍＬ）、
−  εは４０５ｎｍでのパラニトロアニリンの分子吸光係数（Ｍ−１．ｃｍ−１）、
−  Ｌは分光光度測定槽の光路長（ｃｍ）、及び、
−  Ｖｐは分光光度測定槽内に導入されたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の体積（ｍＬ）
である。
【００５０】
場合によっては、コントロールとして、上記手順において、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質を、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の由来となった同体積の血漿媒質に替えて、プラスミンを富化していない血漿媒質のプラスミン基礎活性を測定する。プラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性値から、このようにして算出されたプラスミン基礎活性値を差し引く。
【００５１】
本発明はまた、本発明による酵素組成物の調製方法に及ぶ。
【００５２】
本発明はまた、本発明による酵素組成物の調製方法に関し、その方法において、
−  プラスミノーゲンを含む血漿媒質中のプラスミノーゲンのプラスミンへの転換のための、プラスミノゲナーゼと呼ばれる、少なくとも１つの酵素を選択する、
−  ○血漿媒質と接触したとき、安定した結合を各プラスミノゲナーゼと形成するように適合した、及び、
○０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルター上に保持されるように適合した寸法を有する、
水溶液に不要な固体担体を選択する、及び、
−  各プラスミノゲナーゼを固体担体に結合させるように、固体担体と各プラスミノゲナーゼを接触させる、及び、
−  酵素組成物を形成するように凍結乾燥工程を実施する。
【００５３】
本発明によれば、有利には、溶液状態の各プラスミノゲナーゼを固体担体に接触させることだけによって、各プラスミノゲナーゼを固体担体に固定化する。このために、固体担体を各プラスミノゲナーゼの溶液、特に水溶液に浸漬し、固体担体と各プラスミノゲナーゼとの間の結合が可能となるために十分な期間、撹拌下で維持する。次いで、酵素組成物を脱水した状態で形成し、プラスミノゲナーゼ（一又は複数）の活性を保存するように凍結乾燥工程を実施する。
【００５４】
本発明によれば、有利には、酵素組成物を形成するように適合した条件、特に温度条件を選択する。
【００５５】
本発明によれば、有利には、酵素の分類のＥＣ  ３．４．２１のセリンエンドペプチダーゼ、特に抗血栓活性のエンドペプチダーゼ−からなる群から少なくとも１つのプラスミノゲナーゼ、特に各プラスミノゲナーゼを選択する。
【００５６】
本発明の第１の実施態様によれば、有利には、固体担体が分割された状態で選択され、互いに直交する３方向に延びる３つの寸法を有する粒子から形成され、３つの寸法のうち少なくとも２つが０．２２μｍを超える。本発明によれば、有利には、各粒径は０．２２μｍを超える。
【００５７】
本発明によれば、有利には、ほぼ球形であり、粒径が０．２２μｍを超える粒子を示す分割された状態の固体担体の群から固体担体を選択する。したがって、かかる固体担体は、最大透過粒径０．２２μｍを示す濾過装置で保持されうる。
【００５８】
本発明によれば、有利には、分割された状態の固体担体の３つの粒径のうち少なくとも２つは１μｍから５００μｍ、特に１０μｍから５００μｍ、好ましくは１００μｍから５００μｍである。本発明によれば、有利には分割された状態の固体担体の各粒径は、１μｍから５００μｍ、特に１０μｍから５００μｍ、好ましくは１００μｍから５００μｍである。
【００５９】
本発明によれば、有利には、約０．２２μｍの分離閾値を示す濾過による分離装置、例えばポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）又はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）製のフィルターを含む濾過による分離装置によって保持しうる分割された状態の固体担体を選択する。
【００６０】
本発明によれば、有利には、分割された状態の固体担体は、少なくとも１つのプラスミノゲナーゼと少なくとも１つの安定した結合、特に少なくとも１つの共有結合を形成するのに適した、少なくとも１つの表面リガンドを含む物質からなる。有利には、表面リガンドは、共有結合によって互いに直線状に結合した原子の主鎖（すなわち原子数が最も多い鎖）を含み、主鎖が少なくとも４個に等しい、特に１０個から１５個の原子の原子数を示す原子団からなる。
【００６１】
本発明によれば、有利には、少なくとも１つの表面リガンドは、エポキシ基を含む。本発明によれば、有利には、少なくとも１つの表面リガンドは、固体担体に結合した以下の式（ＩＩＩ）のアミノエポキシド基である。
2018515131.tif 000006
【００６２】
本発明によれば、有利には、固体担体、特に分割された状態の固体担体の物質は、官能基化ポリグリコシド及び官能基化メタクリル酸塩ポリマーからなる群から選択される。本発明によれば、有利には、分割された状態の固体担体は、１つのエポキシ基によって表面付近を官能基化されたポリグリコシド及び少なくとも１つのエポキシ基によって表面付近を官能基化されたメタクリル酸塩ポリマーからなる群から選択される。
【００６３】
有利には、分割された状態の固体担体は、平均粒径が１００μｍから３００μｍである担体ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）  ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ及びＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）からなる群から選択される。
【００６４】
本発明による方法において、有利には、少なくとも１つの滅菌工程を実施する。プラスミノゲナーゼ活性の少なくとも一部を保存しうるようなあらゆる公知の滅菌方法による少なくとも１つの滅菌工程を実施する。本発明によれば、有利には、少なくとも１つの照射による滅菌工程を実施する。
【００６５】
本発明によれば、有利には、少なくとも１つの酵素組成物の滅菌工程を実施する。本発明によれば、有利には、少なくとも１つの照射による酵素組成物の滅菌工程を実施する。本発明によれば、有利には、少なくとも１つの所定の温度での照射による滅菌工程を実施する。かかる照射による滅菌工程は０℃未満の温度で実施しうる。本発明によれば、有利には、少なくとも１つの０℃を超える温度での照射による滅菌工程を実施する。
【００６６】
本発明による方法において、有利には、少なくとも１つの連続照射による滅菌工程を実施し、前記連続照射は少なくとも１つの冷却段階で中断される。
【００６７】
有利には、少なくとも１つの５．１０３Ｊ／ｋｇ（５ｋＧｙ）から５．１０４Ｊ／ｋｇ（５０ｋＧｙ）のエネルギー量を放出する照射による滅菌工程を実施する。有利には、ベータ線及びガンマ線からなる群から選択される放射線の照射による少なくとも１つの滅菌工程を実施する。
【００６８】
本発明によれば、有利には、酵素組成物の凍結乾燥工程を実施する。酵素組成物を脱水した粉末の形態に形成する。
【００６９】
本発明による方法において、有利には、凍結乾燥後、少なくとも１つの酵素組成物の照射による滅菌工程を実施する。本発明による方法によって、無菌酵素組成物を得ることが可能となる。
【００７０】
本発明による方法において、無菌かつ非発熱性の酵素組成物が得られる。
【００７１】
本発明はまた、本発明による方法によって得られうる酵素組成物に及ぶ。
【００７２】
本発明はまた、無菌かつ酵素組成物のないプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の調製のための、本発明による酵素組成物のあらゆる使用に及ぶ。
【００７３】
本発明はまた、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の調製、特にプラスミンの豊富な無菌生体外血漿媒質の調製のための、本発明による酵素組成物のあらゆる使用に及ぶ。
【００７４】
本発明によれば、有利には、血漿媒質中のプラスミノーゲンの少なくとも一部をプラスミノーゲンの活性形態であるプラスミンに転換し、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中に注目すべき遊離プラスミノゲナーゼの放出がなく、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質を投与された患者において免疫反応の誘起リスクを制限するようにプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を形成するために本発明による酵素組成物を用いる。このとき、プラスミノゲナーゼの自家プラスミンへの変換を要するあらゆる疾患の予防又は治療の一環として、例えば心血管疾患治療の一環として、又はとりわけ眼科での硝子体網膜障害の治療の硝子体内手術のとき、特に外科手術のときの外科手術の一環として、用いられうるプラスミンの豊富な生体外血漿媒質が得られる。かかるプラスミンの豊富な生体外血漿媒質は、滅菌フィルターによる分離／濾過によって、固体担体がなく、酵素がほぼない、無菌の形態で得られうる。
【００７５】
本発明によれば、有利には、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質１ｍＬ当たり２５μｇ未満の質量の遊離プラスミンを含む、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質を形成するように、１５分間から６０分間の期間、一定量の酵素組成物を、プラスミノーゲンを含む一定量の血漿媒質と接触させ、それを維持する。有利には、プラスミノゲナーゼに最適な温度に近い温度、特に約３７℃の温度で、酵素組成物と血漿媒質との接触を維持する。かかる方法は、プラスミノゲナーゼの効果の下でのプラスミノーゲンのプラスミンへの転換、次いでプラスミノゲナーゼの効果の下で形成されたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の採取を可能とするための、酵素組成物と一定量の血漿媒質との接触、及び所定の温度で、適合した期間、混合物の維持のみを要するという点で、実施が容易であり、前記採取は濾過、特に滅菌濾過を含む。プラスミンの豊富な生体外血漿媒質は、直接、例えば眼科での硝子体網膜障害の治療の硝子体内手術のとき、特に外科手術のとき、硝子体内注射で用いられるように適合している。有利には、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質は自家である。
【００７６】
本発明によれば、有利には、硝子体内（ＩＶＴ）注射の実施専用の室内で実施される方法において、有資格者、特に外科医、眼科医、准看護師が、
−患者の採血、次いで、
−血漿媒質の、特に遠心分離による調製、次いで、
−所定の期間及び約３７℃の温度での前記血漿媒質と本発明による酵素組成物との混合による接触、次いで、
−患者の体内にプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を注射するために、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質と酵素組成物との分離
を行う、本発明による酵素組成物を用いる。
【００７７】
本発明によれば、有利には、酵素組成物を保持するのに適したフィルターによる濾過によって、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質と酵素組成物との分離を実施する。
【００７８】
本発明によれば、有利には、約０．２２μｍの分離閾値を有するフィルターによる濾過によって、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質と酵素組成物との分離を実施する。有利には、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質と酵素組成物との分離は、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の滅菌分離である。
【００７９】
本発明による酵素組成物は、タンパク繊維の加水分解によって硝子体網膜牽引を解放する目的で、患者の硝子体内にプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を注射する治療のときに用いられる。
【００８０】
本発明による酵素組成物は、自家、すなわち患者の血液由来であり、この患者のみに注射するために調製された血漿媒質から得られた、異種タンパク質のない、すなわち患者において免疫反応を誘起しうるのに十分な量の異種タンパク質のない、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の調製のために用いられる。
【００８１】
本発明によれば、有利には、酵素組成物は、非発熱性であるプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の調製のために用いられる。ウサギの一定量の血漿媒質から得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を注射された、前記ウサギの体温の測定によって、非発熱性のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の獲得条件を有効とする。注射後にウサギの体温上昇がないことは、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の非発熱性を示し、その獲得条件を有効とする。
【００８２】
本発明によれば、有利には、酵素組成物は、無菌であるプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の調製のために用いられる。
【００８３】
本発明はまた、一定量の本発明による酵素組成物及び０．２２μｍ以下の分離閾値を有するフィルターを含む、無菌かつ酵素組成物のないプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の調製のための装置に及ぶ。
【００８４】
本発明はまた、
−  一定量の酵素組成物を含む容器、特に密閉容器、
−  容器に血漿媒質を導入する装置、
−  酵素組成物の効果の下で容器内に形成した血漿媒質を容器外に採取する装置、
−  血漿媒質の濾過、及び酵素組成物のない無菌のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を構成する濾液の獲得を可能とするために配置された、採取装置（１１）及びフィルター
を含む装置に及ぶ。
【００８５】
本発明による装置は、有利には、少なくとも、
−  本発明による一定量の無菌酵素組成物を含む容器であって、前記容器が密閉され、酵素組成物の無菌状態を保存するように適合した容器、
−  容器内に一定量の血漿媒質を導入する装置、
−  酵素組成物を含むプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を採取する装置、及び、
−  フィルター。有利には、フィルターはプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の滅菌、及び無菌かつ酵素組成物のないプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の形成のフィルターである、
キット、すなわち分離した状態のいくつかのパーツを含む箱の形態である。
【００８６】
本発明による装置の第１の実施態様において、キットの各構成パーツは、個包装に分けて無菌状態で梱包される。
【００８７】
本発明による装置の第２の実施態様において、キットのいくつかの構成パーツは、無菌状態で共通の包装に、まとめて無菌状態で梱包される。パーツは、組み立てられた状態、又は解体された状態、又は一部組み立てられた状態、及び無菌状態でありうる。
【００８８】
本発明による装置の第３の実施態様において、酵素組成物を含む容器を除くキットのいくつかの構成パーツは、無菌ではない状態で共通の包装に、まとめて、集まった状態、又は切り離された状態、又は一部集まった状態で梱包され、次いで公知の適合したあらゆる滅菌方法によって滅菌される。酵素組成物を含む容器は、固定化酵素の酵素活性を尊重するあらゆる滅菌方法によって滅菌しうる。
【００８９】
本発明によれば、有利には、容器内に一定量の血漿媒質を導入する装置は、
−  栓が取り外し可能な注入の先端を備えたシリンダー内をスライドするピストンを含むシリンジ、
−  シリンジの、栓が取り外し可能な先端と接続できるように適合した針
を含み、シリンジ及び針は、協力し、
○血漿媒質の調製チューブ内の一定量の血漿媒質を採取する、及び、
○容器に前記一定量の血漿媒質を導入する
ことを可能とするように適合している。
【００９０】
有利には、血漿媒質の調製チューブはまた、例えばＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）チューブの形態での採血チューブであって、前記採血を可能とし、場合によっては採取された前記血漿媒質の凝固を妨げるように適合したチューブである。
【００９１】
有利には、導入装置の針は、血漿媒質の採取及び調製チューブに血漿媒質の採取を可能とするように適合した長さを示す。
【００９２】
本発明によれば、有利には、採取装置は、
−  容器内の一定量のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の採取の無菌シリンジ、
−  酵素組成物を含むプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の容器内で無菌シリンジと採取針との間に挿入するように適合したフィルターであって、前記フィルターが、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質及び酵素組成物を受け取り、酵素組成物を保持し、プラスミンが豊富で、酵素組成物のない生体外血漿媒質のシリンジに引き渡すのに適したフィルター
を含む。
【００９３】
本発明の他の実施態様によれば、有利には、装置はまた、心血管疾患治療の一環として、又は外科手術、とりわけ眼科治療の硝子体内手術のとき、特に外科手術のときの一環として、患者の体内にプラスミンの豊富な血漿媒質を注入する追加の無菌の針を含みうる。
【００９４】
本発明によれば、有利には、容器は、針を貫通させ、容器に血漿媒質を導入し、容器からプラスミンの豊富な血漿媒質を採取することを可能とするように適合した、ポリマーからなる栓を備えた瓶である。
【００９５】
本発明によれば、有利には、フィルターは、分離閾値が０．２２μｍ、すなわち平均粒径が０．２２μｍを超える粒子、特に細菌、酵母、菌類をフィルターに保持するように適合した、滅菌フィルターである。
【００９６】
本発明によれば、有利には、装置は、無菌酵素組成物を含む少なくとも１つの無菌容器、少なくとも１つの無菌シリンジ、少なくとも１つの無菌針、及び無菌の濾過装置を含む無菌外部梱包カバーを含む。有利には、シリンジ、針、濾過装置、及び無菌外部梱包カバーからなるセットは、滅菌処理（照射、エチレンオキサイド、又はその他）によって滅菌し、次いで酵素組成物を含む無菌容器と併用しうる。
【００９７】
本発明はまた、以上又は以下に記載のすべて又は一部の特徴を組み合わせることを特徴とする、酵素組成物、かかる酵素組成物の調製方法、使用、及び血漿媒質の治療装置又はキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明の装置を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
本発明の他の目的、特徴、利点は、本発明による装置を表す唯一の図、及び参考として挙げられた、限定的ではない本発明を示した例を参照する以下の本明細書を読むことにより明らかになる。
【０１００】
プラスミノゲナーゼ（ウロキナーゼ）活性の決定
プラスミノゲナーゼを含む溶液の酵素活性（Ｕ／ｍＬ）は、溶液に導入された基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ・２ＨＣｌ，Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｗｅｒｆｅｎ  Ｆｒａｎｃｅ，Ｌｅ  Ｐｒｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｇｅｒｖａｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）の所定の温度での加水分解反応の初期速度の測定によって決定する。
【０１０１】
分光光度測定槽に、一定体積の生理食塩水に入れたプラスミノゲナーゼ溶液と、同体積の濃度約２ｍＭ（測定媒質中のＳ−２２５１濃度が約１ｍＭになるように）の、プラスミノゲナーゼ／ウロキナーゼの作用下でパラニトロアニリン（ε≒１０，０００Ｍ−１．ｃｍ−１）を放出しうるＳ−２２５１水溶液との混合によって、３７℃の測定媒質を形成する。混合物から、３７℃での測定媒質の４０５ｎｍでの吸光度（光学密度、ＯＤ４０５ｎｍ）の変化を、例えば連続的に測定する。４０５ｎｍでの吸光度の時間的変化曲線からの傾き、すなわちΔａｂｓ／ｍｉｎで表される反応の初期速度Ｖｉを算定する。酵素活性（測定媒質Ｕ／ｍＬで表される）は、以下の式（Ｉ）によって求められ、
2018515131.tif 000007
式中、
−  ＶｉはΔａｂｓ／ｍｉｎで表される反応の初期速度、
−  Ｖｍは測定媒質の体積（ｍＬ）、
−  εは４０５ｎｍでのパラニトロアニリンの分子吸光係数（Ｍ−１．ｃｍ−１）、
−  Ｌは分光光度測定槽の光路長（ｃｍ）、及び、
−  Ｖｓは分光光度測定槽内に導入されたプラスミノゲナーゼ溶液の体積（ｍＬ）
である。
【０１０２】
プラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性の決定
一定量の本発明による酵素組成物を、一定量のプラスミノーゲンを含む血漿媒質と、３７℃で５分間から６０分間の期間、接触させることによって得られた、酵素組成物を含まないプラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミンの酵素活性（プラスミン活性と呼ばれる）を、Ｓ−２２５１からのパラニトロアニリンの形成の分光光度測定によって決定する。
【０１０３】
分光光度測定槽に、一定体積のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質と、同体積の濃度約２ｍＭ（測定媒質中のＳ−２２５１濃度が約１ｍＭになるように）の、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中のプラスミンの作用下で、パラニトロアニリンを放出しうるＳ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ・２ＨＣｌ，Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｗｅｒｆｅｎ  Ｆｒａｎｃｅ，Ｌｅ  Ｐｒｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｇｅｒｖａｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）水溶液との３７℃での混合によって、測定媒質を調製する。混合物から、５分間、３７℃での測定媒質の４０５ｎｍでの吸光度（光学密度、ＯＤ４０５ｎｍ）の変化を測定する。４０５ｎｍでの吸光度の時間的変化曲線からの傾き、すなわちΔａｂｓ／ｍｉｎで表される反応の初期速度Ｖｉを算定する。プラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性（プラスミンの豊富な生体外血漿媒質Ｕ／ｍＬで表される）は、以下の式（ＩＩ）によって求められ、
2018515131.tif 000008
式中、
−  ＶｉはΔａｂｓ／ｍｉｎで表される反応の初期速度、
−  Ｖｍは測定媒質の体積（ｍＬ）、
−  εは４０５ｎｍでのパラニトロアニリンの分子吸光係数（Ｍ−１．ｃｍ−１）、
−  Ｌは分光光度測定槽の光路長（ｃｍ）、及び、
−  Ｖｐは分光光度測定槽内に導入されたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の体積（ｍＬ）
である。
【０１０４】
プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中のプラスミノゲナーゼ、特にウロキナーゼ−量の決定
プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中のプラスミノゲナーゼ量は、それ自体が公知のあらゆる蛍光測定によって、例えばプラスミノゲナーゼに特異な一次抗体（特にヒトウロキナーゼに向けられた抗体、例えばウサギ抗体ＡＢｃａｍ  ａｂ２４１２１）及びＡｍｐｌｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄの存在下で定量化しうる二次抗体（例えば、ウサギＩｇＧに向けられ、ＨＲＰ（「Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ」）標識されたヤギ抗体）を用いて、「ＥＬＩＳＡ」タイプの免疫酵素法による定量によって決定する。血漿媒質の既知のプラスミノゲナーゼ量を含む溶液から校正曲線を実施する。
【０１０５】
本発明による酵素組成物の調製
本発明による酵素組成物の製造方法において、親水性多孔質材料からなる担体の群、特に親水性多孔質材料からなり、エポキシド性質の表面グラフト基を示す担体の群から、分割された状態の固体担体を選択する。固体担体として、担体Ｅｐｏｘｙ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））を選択できる。また、固体担体として、担体ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＥＰ／Ｓ（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ，Ｂｉｎａｓｃａ，Ｉｔａｌｙ）を選択できる。
【０１０６】
平均粒径が１００μｍから３００μｍである、分割された状態の固体担体ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ，Ｂｉｎａｓｃａ，Ｉｔａｌｙ）を選択できる。材料ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓの粒子は、ポリメタクリル酸から形成され、乾燥状態の担体１グラム当たりアミノエポキシド基少なくとも７５μｍｏｌの割合で、以下の式（ＩＩＩ）のアミノエポキシド基によって表面が官能基化されている。
2018515131.tif 000009
担体の平均多孔度は１０ｎｍから２０ｎｍである。
【０１０７】
本発明による方法において、プラスミノゲナーゼ、例えばウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、又はナットウキナーゼ、又は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）の固定化を、分割された状態の固体材料で実施する。このために、水和水性組成物の中で、一定量の無水固体材料を水和する。水和水性組成物は、例えば等張水、「注射液調製用」水（ＰＰＩと呼ばれる）、又は無菌生理食塩水でありうる。例えば、０．２ｇの分割された状態の脱水した固体材料、例えば０．２ｇの乾燥状態のＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓを、１時間常温で４０ｍＬの注射用水に配置し、次いでｐＨ６．８の無菌生理食塩水０．７ｍＬで、水和した固体材料の洗浄を連続して３回実施する。
【０１０８】
次いで、洗浄した固体材料を、１ｍＬ当たり約２ユニット（２Ｕ／ｍＬ）のプラスミノゲナーゼ活性を含むヒトウロキナーゼ（Ｕ０６３３，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）の水溶液、特に非発熱性無菌生理食塩水、又は無菌眼内灌流液ＢＳＳ（Ｂｉｏａｑｕａ（登録商標）、「Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」）０．７ｍＬと接触させる。
【０１０９】
固体担体と酵素との接触を数時間維持する。反応液体上清を採取し、次いでこのようにして得られた酵素組成物を、注射用水、又は好ましくは無菌生理食塩水を用いた１Ｍ  ＮａＣｌ溶液０．７ｍＬで３回洗浄する。
【０１１０】
「ＧＭＰ」条件の酵素組成物
本発明の有利な実施態様によれば、酵素組成物の合成を、注射用組成物として許容可能な上限値未満、特に０．５エンドトキシンユニットＥＵ／ｍＬ未満の発熱性化合物量を示す酵素組成物を形成するように適合した条件において実施する。この実施態様によれば、分割された状態の固体担体は、適正製造規範（ＧＭＰ、又は英語で「Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ」）を遵守し、減少した発熱性エンドトキシン量を示す方法によって得られたＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ担体である。
【０１１１】
使用された消耗品、特に「ファルコン」チューブ、シリンジ、０．２２μｍフィルター、マイクロピペット用チップ、チューブは、無菌かつ非発熱性と認定された消耗品である。研究室のガラス容器及び器具（担体水和用の瓶、凍結乾燥瓶、栓、及びさじ）は、使用前に１６時間アルカリ性洗浄溶液（Ｅ−ｔｏｘａ  Ｃｌｅａｎ，１％）で処理し、水で洗浄し、滅菌する。すべての操作は層流フードの下で実施される。非発熱性である出発試料及び溶媒を選択し、無菌状態の最適な条件において、酵素組成物の調製工程を実施する。
【０１１２】
以下に記載の「ＧＭＰ」固定化条件における、分割された状態の固体担体ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＨＦＡ／ＳへのウロキナーゼＵ０６３３の固定化を実行する。ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ、ＧＭＰ条件において生産）４．４６ｇを、材料を水和するために撹拌下、常温で１時間、注射用水８９３ｍＬの中に配置する。次いで、固体担体は、生理食塩水１５．６ｍＬで３回洗浄し、次いで酵素組成物を形成するように、２Ｕ／ｍＬ濃度の無菌生理食塩水のウロキナーゼ（分離閾値０．２２μｍ以下のフィルターによる濾過によって滅菌した、無菌生理食塩水を用いたウロキナーゼ溶液Ｕ０６３３）１５．６ｍＬと数時間接触させる。次いで、生理食塩水１５．６ｍＬで酵素組成物を３回洗浄する。洗浄液は除去し、湿った酵素組成物０．２ｇのアリコート画分を無菌凍結乾燥瓶でサンプリングする。湿った樹脂のアリコート画分は凍結乾燥し、４℃で保存する。
【０１１３】
プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の調製
血漿媒質０．７ｍＬを、３７℃で５分間から６０分間の期間、上記で得られた酵素組成物のアリコート画分に接触させる。濾過によって、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質を酵素組成物から分離する。血漿媒質を３７℃の温度に配置して、基質Ｓ−２２５１の存在下でプラスミン活性（プラスミンの豊富な生体外血漿媒質のＵ／ｍＬ）を測定する。５分から６０分、特に約１５分である、血漿媒質と酵素組成物との接触時間について、約０．２±０．１Ｕ／ｍＬの酵素活性を観察する。
【実施例】
【０１１４】
実施例１−本発明による酵素組成物の調製
注射用水中で材料ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ「ＧＭＰ」０．２ｇを水和し、次いでｐＨ６．８の無菌生理食塩水０．７ｍＬで水和した材料の洗浄を連続して３回実施する。このようにして洗浄した材料を、２Ｕ／ｍＬの酵素活性を示す生理食塩水中で、プラスミノゲナーゼ（ウロキナーゼＵ０６３３）溶液０．７ｍＬと接触させる。担体と酵素との接触を数時間維持する。反応液体上清を除去し、次いで連続して３回の洗浄を実施する。
【０１１５】
免疫酵素法「ＥＬＩＳＡ」によって測定された、３７℃で６０分間の酵素組成物０．２ｇと血漿媒質０．７ｍＬとの接触によって得られた、生体外血漿媒質中に存在するウロキナーゼの質量は、２μｇから２０μｇである。
【０１１６】
実施例２−本発明による酵素組成物活性に対する凍結乾燥の影響
分割された状態の固体担体ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ「ＧＭＰ」にウロキナーゼを、実施例１に記載の方法によって固定化する。得られた酵素組成物の凍結乾燥工程を実施する、又はしない。１５分間又は６０分間の期間、血漿媒質０．７ｍＬに同量（０．２ｇ）の酵素組成物を配置し、凍結乾燥した又はしていない酵素組成物の能力を調査する。濾過によってプラスミンの豊富な生体外血漿媒質と酵素組成物とを分離する。３７℃のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質に、測定媒質において最終濃度１ｍＭのＳ−２２５１基質溶液を添加し、生体外血漿媒質のプラスミン活性を測定する。結果は下記の表１に示されている。
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【０１１７】
酵素組成物の凍結乾燥は、血漿媒質中のプラスミノーゲンのプラスミンへの転換活性に対して効果はない。
【０１１８】
照射による酵素組成物の滅菌
凍結乾燥後、酵素組成物の２５ｋＧｙでの照射工程を実施する。１５分間又は６０分間、前記滅菌した酵素組成物と血漿媒質との接触によって得られた、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性の測定によって、照射した酵素組成物の活性を間接的に分析する。濾過によって酵素組成物を除去し、Ｓ−２２５１の存在下で、このようにして得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性を測定する。１５分間の接触後に得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性は、０．１１６から０．１４８Ｕ／ｍＬであり、６０分間の接触後に得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性は、０．２００から０．２１８Ｕ／ｍＬである。酵素組成物の滅菌照射によって、０．１Ｕ／ｍＬを超える、１５分間の接触後に得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性、及び０．２Ｕ／ｍＬを超える、６０分間の接触後に得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質のプラスミン活性の保存が可能となる。
【０１１９】
プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中の遊離ウロキナーゼの定量
３７℃で６０分間の血漿媒質と酵素組成物との接触によって得られた、プラスミンを富化した生体外血漿媒質中に存在するウロキナーゼ量の「ＥＬＩＳＡ」タイプの免疫酵素法による定量は、下記の表２に示されている。
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【０１２０】
照射による最終滅菌と併用した凍結乾燥によって、プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中に酵素組成物によって放出されたウロキナーゼ量の減少が可能となる。
【０１２１】
照射を供した、血漿媒質と酵素組成物（分割された状態の固体担体に固定化されたウロキナーゼを含む）との接触によって得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質中に存在する遊離ウロキナーゼ量は、照射を供していない、血漿媒質と酵素組成物との接触によって得られたプラスミンの豊富な生体外血漿媒質中に存在するウロキナーゼ量よりも少ない。酵素組成物の照射と凍結乾燥による処理の併用によって、約１０μｇ以下、とりわけ５μｇ未満のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質中のウロキナーゼ量の獲得が可能となる。
【０１２２】
本発明による酵素組成物は、血漿媒質を、高いプラスミン活性を示すプラスミンを富化した生体外血漿媒質に転換することを可能とする。本発明による酵素組成物は、多量の免疫原性プラスミノゲナーゼからなる生体外血漿媒質に導入せずに、血漿媒質中のプラスミノーゲンをプラスミンに転換することを可能とする。
【０１２３】
血漿媒質の調製及び活性化
無菌状態で、治療する患者の血液を一定量、ＥＤＴＡタイプの抗凝固薬又はクエン酸ナトリウムを含む採血チューブ（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標），ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）に採血する。血液細胞と血漿媒質との分離工程を、４０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によって実施する。無菌状態、３７℃で、プラスミノーゲンがプラスミンに転換できるために必要な、少なくとも１５分間の期間、血漿媒質を酵素組成物と接触させる。滅菌フィルター（分離閾値０．２２μｍ）、例えばフィルターＭｉｌｌｅｘ  ＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はフィルターＡｃｒｏｄｉｓｋ  Ｓｙｒｉｎｇｕｅ  Ｆｉｌｔｅｒ，ＰＮ４６０２（Ｐａｌｌ）による濾過によって、酵素組成物と、遊離ウロキナーゼのないプラスミンの豊富な生体外血漿媒質とを分離する。次いで、適合した体積の無菌のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の眼内注射を実行する。
【０１２４】
プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中の遊離ウロキナーゼの定量
プラスミンの豊富な生体外血漿媒質中に存在する遊離ウロキナーゼ量の免疫酵素法「ＥＬＩＳＡ」による定量によって、２０μｇ未満の平均遊離ウロキナーゼ量が示された。
【０１２５】
唯一の図に表された本発明の特殊な変形態様による装置２０は、
−  密閉し、一定量の本発明による無菌酵素組成物２を含む容器、例えばガラス製の容器１、
−  容器１に一定量の血漿媒質を無菌状態で導入し、前記血漿媒質を酵素組成物２と接触させ、
○採血、及び容器１から採取した前記一定量の血漿媒質を導入するチューブから、一定量の血漿媒質の無菌注入シリンジ４であって、前記無菌注入シリンジ４が、栓が取り外し可能でアクシャルな、注入先端８と呼ばれる先端を備えたシリンダー７内をスライドするピストン６を含むシリンジ４、
○無菌注入シリンジ４の先端８と接続できるように適合し、貫通可能な栓１０を通じて容器に導入できて、シリンダー７内をスライドするピストン６の平行移動の効果の下で血漿媒質を容器１に導入可能なように適合した注入針５。注入針５は、例えば好ましくは約２０ゲージ（壁厚０．１５２４ｍｍに対して外形０．９０８１ｍｍ）の針である、
を含む手段３、
−  酵素組成物２の効果の下で一定量のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を採取及び濾過し、
○容器１から一定量のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を調製する無菌シリンジ１２、
○プラスミンの豊富な生体外血漿媒質の入口１４、及び無菌調製シリンジ１２に接続し、無菌調製シリンジ１２に無菌かつプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を引き渡すことができるように適合しうる出口１５を備えた濾過装置１３であって、濾過装置１３が、無菌調製シリンジ１２の効果の下で入口１４と出口１５との間を流れるプラスミンの豊富な生体外血漿媒質から酵素組成物を保持するのに適したフィルター１６を含み、前記入口１４を組み立てて、容器１のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を採取する針１７に密閉状態で接続できるように適合した濾過装置１３、
○血漿媒質を濾過装置１３の入口１４に連結するように配置できるように適合し、容器１に導入できて、容器１からプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を採取できるように適合した尖った先端１８を示す、前記採取針１７。採取針１７は、例えば好ましくは約２０ゲージ（壁厚０．１５２４ｍｍに対して外径０．９０８１ｍｍ）の針である、
を含む手段１１
を含む。
【０１２６】
貫通可能な栓１０は、弾性ポリマー、例えばクロロブチルからなり、針５で貫通できて、容器１への血漿媒質の導入及び容器１からのプラスミンの豊富な生体外血漿媒質の採取が可能となるように適合している。
【０１２７】
濾過装置１３は、約０．２２μｍの分離閾値を有するフィルター１６、すなわち平均粒径が０．２２μｍを超える粒子を保持できるように適合したフィルターでの濾過による滅菌装置である。
【０１２８】
装置２０は、酵素組成物、容器１に無菌状態で一定量の血漿媒質を導入する手段３、及びプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を採取、及び濾過する手段１１を含む、容器１の無菌外部梱包カバー３０を含む。容器１に無菌状態で一定量の血漿媒質を導入する手段３（無菌注入シリンジ４、及び注入針５を含む）、及びプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を採取及び濾過する手段１１（無菌調製シリンジ１２，濾過装置１３、及び採取針１７を含む）を含む無菌外部梱包カバー３０は、梱包後、適合したあらゆる滅菌手段によって滅菌でき、密閉され、本発明による無菌酵素組成物２を含む容器１は、酵素組成物２の機能性を尊重する滅菌手段によって滅菌する。
【０１２９】
呈示されていない変形態様において、装置２０はまた、一定量のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を調製する無菌シリンジ１２に含まれる、適合した体積のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を患者の体内に注射する、追加の無菌の針を含みうる。かかる注射針は、２５から３０ゲージ（すなわち外径が０．３０ｍｍから０．５０ｍｍである）である針である。
【０１３０】
一定量のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を調製する無菌シリンジ１２は、「ルアーロック」タイプのアダプターからなる、栓が取り外し可能な先端を示し、注射針はシリンジ１２の「ルアーロック」アダプターの補助先端を示しうる。
【０１３１】
本発明の呈示されていない他の変形態様による装置は、
−  密閉され、一定量の本発明による無菌酵素組成物２を含む容器１、
−  容器１から一定量のプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を調製する無菌シリンジ１２であって、体積１００μＬから２５０μＬの、無菌かつ酵素組成物のないプラスミンの豊富な生体外血漿媒質を含み、引き渡しうるのに適した正確なシリンジである無菌シリンジ１２、及び、
−  濾過装置１３
を含みうる。
【０１３２】
本発明は保護範囲を出ない多くの変形態様を対象としうる。例えば、本発明による装置の構成パーツは、外部カバー３０内で、解体された状態、又は部分的に組み立てられた状態でありうる。
【図１】
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【国際調査報告】
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