(57)【要約】本発明は、タンパク質またはペプチドのＳＮ−３８抱合体、好ましくは、抗体または抗原結合抗体フラグメントの免疫抱合体を調製する改善された方法及び組成物に関する。より好ましくは、ＳＮ−３８は、ＣＬ２Ａリンカーの使用によって抗体または抗体フラグメントに結合され、抗体または抗体フラグメント１つあたり１〜１２個、より好ましくは６〜８個、代替的には１〜５個のＳＮ−３８部分が結合される。最も好ましくは、免疫抱合体は大規模バッチによって調製され、本明細書に開示されている反応スキームへの様々な修正によって、大規模での収率及び回収が最適化される。他の実施形態は、疾患治療の有効性を最大限にし、投与の副作用を最小限にする免疫抱合体の最適化投与量及び／または投与スケジュールに関する。【選択図】図１
2018520148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造の化合物ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を生成する方法であって、
【化１】
2018520148.tif 000019
下記に示されている反応スキームを実施することを含む、前記方法。
【化２】
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【請求項２】
１．１倍モル過剰量のフッ化テトラブチルアンモニウムを使用して、シリル保護基を除去すること及び中間体６を中間体７に変換することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
中間体６を含む有機抽出物に、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．３による３回の洗浄を実施することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
中間体７を含む有機抽出物に、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．３による２回の洗浄を実施することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
中間体７または中間体８を含む有機抽出物が水により洗浄されない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ジクロロメタン、酢酸エチル及びメタノールの混合物を用いたシリカゲルカラムからの段階溶出によって、中間体７を精製することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
中間体９がトリフェニルホスフィンに曝露されない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ａ）水中の硫酸銅及びアスコルビン酸ナトリウムと、
ｂ）ジクロロメタン中の中間体７、中間体８及び２，６−コリジンと
を含む二相混合物を形成することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記二相混合物を室温で一晩撹拌することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
中間体９をＥＤＴＡ洗浄及びクロマトグラフィーにより精製することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
中間体９からシリル基を除去してＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を形成する前に、中間体９を貯蔵のために固体に濃縮することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）固体中間体９の溶液を形成すること、ならびに（ｉｉ）溶液中の中間体９をジクロロ酢酸及びアニソールと反応させて、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を形成することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ｔ−ＢＭＥ）の滴加によって前記ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を沈殿させることを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＬ２Ａ−ＳＮ３８のマレイミド部分をタンパク質またはペプチドと反応させて、ＳＮ３８抱合タンパク質またはペプチドを作製することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記マレイミド部分がタンパク質またはペプチドの還元スルフヒドリルと反応する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質またはペプチドが、抗体または抗原結合抗体フラグメントであり、前記ＳＮ−３８抱合抗体または抗体フラグメントが免疫抱合体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫抱合体を接線流濾過（ＴＦＦ）により精製することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＴＦＦが、緩衝液の２５〜３０透析濾過体積を使用して５０，０００ダルトン分子量カットオフ膜により実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫抱合体をｐＨ６．０〜７．０のＧｏｏｄ生物学的緩衝液によって配合すること及び前記免疫抱合体を貯蔵のために凍結乾燥することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｇｏｏｄ生物学的緩衝液が、６〜７のｐＨ範囲、好ましくは６．５〜７のｐＨ範囲及び１０〜１００ｍＭ、好ましくは２５ｍＭの緩衝液濃度で、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記緩衝液が、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、二重特異性抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体及びＩｇＧ４の半分子からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体または抗体フラグメントが、ＣＬ２Ａ−ＳＮ３８の１と１２コピーの間に結合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体または抗体フラグメントが、ＣＬ２Ａ−ＳＮ３８の６と８コピーの間に結合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体または抗体フラグメントが、ＣＬ２Ａ−ＳＮ３８の１と５コピーの間に結合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、抗癌抗体、抗感染症抗体、または抗自己免疫性疾患抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、ＬＬ１（抗−ＣＤ７４）、ＬＬ２（抗−ＣＤ２２）、ＲＦＢ４（抗−ＣＤ２２）、ＲＳ７（抗−ＥＧＰ−１）、ＰＡＭ４（抗−ＭＵＣ５ＡＣ）、ＫＣ４（抗−ムチン）、Ａ１９（抗−ＣＤ１９）、Ａ２０（抗−ＣＤ２０）、ＭＮ−１４（抗−ＣＥＡＣＡＭ５）、ＭＮ−１５（抗−ＣＥＡＣＡＭ６）、ＭＮ−３（抗−ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｒ１（抗−ＩＧＦ−１Ｒ）、Ｍｕ−９（抗−ＣＳＡｐ）、Ｉｍｍｕ  ３１（抗−ＡＦＰ）、ＣＣ４９（抗−ＴＡＧ−７２）、Ｊ５９１（抗−ＰＳＭＡ）、ＨｕＪ５９１（抗−ＰＳＭＡ）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗−ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗−ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗−炭酸脱水酵素ＩＸ）及びｈＬ２４３（抗−ＨＬＡ−ＤＲ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体または抗体フラグメントが、炭酸脱水酵素ＩＸ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ  ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ−抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ及び癌遺伝子産物から選択される抗原に結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
疾患を治療する方法であって、
ａ）ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を請求項１に記載のとおりに生成することと、
ｂ）前記ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を抗体または抗原結合抗体フラグメントに抱合させて、免疫抱合体を作製することと、
ｃ）前記免疫抱合体を、疾患を有する対象に投与することと
を含む前記方法。
【請求項３１】
前記対象がヒト対象である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患が、癌、自己免疫性疾患、免疫系機能不全及び感染症からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患が癌であり、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ７４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＳＡｐ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＭＵＣ５ａｃ及びＡＦＰ（アルファ−フェトプロテイン）からなる群から選択される抗原に結合し、前記免疫抱合体が、３ｍｇ／ｋｇ〜１８ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記投与量が、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が、ｈＬＬ１（抗−ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗−ＣＤ２２）、ｈＲＦＢ４（抗−ＣＤ２２）、ｈＲＳ７（抗−ＴＲＯＰ−２）、ｈＰＡＭ４（抗−ＭＵＣ５ａｃ）、ｈＭＮ−３（抗−ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＭＮ−１４（抗−ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ−１５（抗−ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＡ１９（抗−ＣＤ１９）、ｈＡ２０（抗−ＣＤ２２）、ｈＭｕ−９（抗−ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗−ＨＬＡ−ＤＲ）及びｈＩＭＭＵ３１（抗−ＡＦＰ）からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が固形腫瘍であり、前記治療が、腫瘍サイズに少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％の低減をもたらす、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、結腸癌、胃癌、食道癌、甲状腺髄様癌、腎癌、乳癌、肺癌、膵癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、肝癌、皮膚癌、骨癌、脳癌、直腸癌及び黒色腫からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫が、低悪性度のＢ細胞リンパ腫、中悪性度のＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、毛様細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌が転移性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
サイズを低減すること、または転移性を排除することを更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌が他の療法に抵抗性があるが、前記免疫抱合体に応答する、請求項３２の記載の方法。
【請求項４２】
前記患者が、前記免疫抱合体による治療の前に、他の療法の少なくとも１つへの応答に失敗している、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
前記患者が、前記免疫抱合体による治療の前に、イリノテカンによる療法への応答に失敗している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌が固形腫瘍であり、前記治療が、腫瘍サイズに少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％の低減をもたらす、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫抱合体が、非抱合抗体、放射標識抗体、薬物抱合抗体、毒素抱合抗体、遺伝子療法、化学療法、治療用ペプチド、サイトカイン療法、オリゴヌクレオチド、局所放射線療法、外科手術及びＲＮＡ干渉療法からなる群から選択される１つ以上の治療様式と組み合わせて投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】
前記薬物、毒素、または化学療法剤が、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン（ａｐｌｉｄｉｎ）、アザリビン（ａｚａｒｉｂｉｎｅ）、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス（ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）、シクロホスファミド、クリゾチニブ、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ（ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ）、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フラボピリドール、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ホスタマチニブ（ｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂ）、ガネテスピブ（ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂ）、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レナリドミド（ｌｅｎｏｌｉｄａｍｉｄｅ）、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソ尿素、オラパリブ、プリカマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド及びＺＤ１８３９からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が癌のフロントライン（ｆｒｏｎｔ−ｌｉｎｅ）療法として実施される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年５月２３日出願の米国特許出願第１５／１６１，８０６号の一部継続であり、これは、２０１５年７月１日出願の米国特許出願第１４／７８９，３７５号（現在、発行済みの米国特許第９，３４５，４８９号）の分割であり、これは、２０１４年４月１７日出願の米国特許出願第１４／２５５，５０８号（現在、発行済みの米国特許第９，１０７，９６０号）の分割であり、これは、２０１３年７月２３日出願の米国特許出願第１３／９４８，７３２号（現在、発行済みの米国特許第９，０２８，８３３号）の一部継続であり、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０１２年１２月１３日出願の米国特許仮出願第６１／７３６，６８４号及び２０１３年１月７日出願の同第６１／７４９，５４８号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提供され、その全体が参照として本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１６年６月２７日に作成され、ＩＭＭ３４０ＷＯ１８＿ＳＬ．ｔｘｔと呼ばれ、６０，６３２バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、癌細胞、感染症生物、ならびに／または自己免疫性疾患に関連する細胞を標的にすることができ、その抱合体が、抗体部分及びカンプトテシンの薬物群から選択される薬物部分を含有する治療用免疫抱合体を生成する、改善された合成プロトコールに関する。抗体及び薬物部分は、治療有効性を増加する細胞内切断可能連結によって連結されている。最も好ましくは、カンプトテシンはＳＮ−３８であり、抗体部分と薬物部分を結合するリンカーはＣＬ２Ａであり、下記に記載されている。特定の実施形態において、免疫抱合体は、最適な有効性及び最小限の毒性を提供する特定の投与量および／または投与スケジュールで投与されうる。本明細書に開示されているヒト治療に使用されるＳＮ−３８抱合抗体の最適化された投与量及び投与スケジュールは、動物モデル研究から予測できなかった予想外の優れた有効性を示し、親化合物のイリノテカン（ＣＰＴ−１１）を含む標準的な抗癌療法に抵抗性のある癌に対する有効な治療を可能にする。本明細書に開示されている新規合成プロトコールは、副産物による汚染レベルを実質的に低下して、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体の合成効率の改善をもたらす。
【背景技術】
【０００４】
長年にわたり、毒性作用物質をヒトの癌に特異的に送達するためにモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を使用することは、特異的標的薬物療法の分野における科学者の目的であった。腫瘍関連ＭＡｂと適切な毒性作用物質との抱合体が開発されてきたが、癌療法において成功と失敗を繰り返し（ｍｉｘｅｄ  ｓｕｃｃｅｓｓ）、感染性及び自己免疫性疾患などの他の疾患に実質的に適用されていない。毒性作用物質は、最も一般的には化学療法薬であるが、粒子を放射する放射性核種、または細菌もしくは植物毒素も、とりわけ癌療法のためにＭＡｂと抱合されており（Ｓｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２００６  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；５６（４）：２２６−２４３）、最近では特定の感染性疾患の前臨床療法のために放射性免疫抱合体と抱合されている（Ｄａｄａｃｈｏｖａ  ａｎｄ  Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｑ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００６；５０（３）：１９３−２０４）。
【０００５】
ＭＡｂ−化学療法薬抱合体を使用する利点は、（ａ）化学療法薬それ自体が構造的に十分に確定されていること、（ｂ）化学療法薬が、多くの場合にＭＡｂ抗原結合領域から離れた特異的部位において、極めて十分に定義された抱合化学の使用によってＭＡｂタンパク質に連結していること、（ｃ）ＭＡｂ−化学療法薬抱合体が、ＭＡｂ及び細菌または植物毒素を伴う化学抱合体よりも高い再現性で作製される可能性があり、そのため商業的な開発が容易であり、規制認可を受けやすいこと、ならびに（ｄ）ＭＡｂ−化学療法薬抱合体が放射性核種ＭＡｂ抱合体よりも全身毒性の桁数が小さいことである。
【０００６】
タンパク質−薬物抱合体の初期の研究は、タンパク質−薬物抱合体が治療に有用であるために、薬物が標的細胞に内部移行すると、好ましくは最初の形態で放出されることを指摘した。Ｔｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６２６−６２９（１９８２））は、リソソームにより切断されて無傷の薬物を遊離する特定のペプチドリンカーを、薬物と抗体部分の間に使用する利点を示した。注目すべきことに、ヒドラゾンを含有するものなどの、弱酸切断可能リンカーを使用して調製されたＭＡｂ−化学療法薬抱合体は、腫瘍内のｐＨが多くの場合に正常な生理学的ｐＨよりも低いという観察に基づいて開発された（Ｗｉｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７０８，１４６号；Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２１２−２１５（１９９３））。最初に認可されたＭＡｂ−薬物抱合体であるゲムツズマブオゾガマイシンは、酸不安定ヒドラゾン結合を、抗ＣＤ３３抗体であるヒト化Ｐ６７．６と強力なカリチアマイシン誘導体との間に組み込んだ。Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９：３２４４−３２５４（２００１）；Ｈａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：４７−５８（２００２）。いくつかの場合において、ＭＡｂ−化学療法薬抱合体は、化学療法薬とＭＡｂとの間に還元的に不安定なヒンダードジスルフィド結合を用いることによって作製された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６））。
【０００７】
なお別の切断可能リンカーは、１〜４つのアミノ酸を含有するＴｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．のリソソーム不安定ペプチドスペーサーに類似した、Ｐｈｅ−ＬｙｓまたはＶａｌ−ＣｉｔなどのカテプシンＢ不安定ジペプチドスペーサーを伴い、薬物とジペプチドとの間に折り畳み可能スペーサーを追加的に組み込んでいる（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：８５５−８６９（２００２）；Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ６，２１４，３４５  Ｂ１；Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−７８４（２００３））。後者の手法は、カンプトテシンの免疫抱合体の調製にも利用された（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１２：２１７−２１９（２００２））。探究された別の切断可能部分は、抗体と化学療法薬との間のリンカーに組み込まれたエステル連結である。Ｇｉｌｌｉｍａｒｄ及びＳａｒａｇｏｖｉは、パクリタキセルのエステルが、抗ラットｐ７５  ＭＡｂ，ＭＣ１９２または抗ヒトＴｒｋＡ  ＭＡｂ，５Ｃ３と抱合すると、抱合体は標的特異的毒性を示すことが見出されたことを見出した。Ｇｉｌｌｉｍａｒｄ  ａｎｄ  Ｓａｒａｇｏｖｉ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：６９４−６９９（２００１）。
【０００８】
抗体−薬物抱合体の設計についての現在の概念は、細胞内でのみ切断される安定した結合を使用して抗体に結合した超毒薬（ｕｌｔｒａｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇ）の使用を強調する。この手法は、カリチアマイシン、モノメチルアウリスタチン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）−Ｅ（ＭＭＡＥ）及びマイタンシノイドなどの超毒薬の抱合体を設計するために使用されてきた。ＭＡｂへの非常に安定した結合は循環中の安定性をもたらすが、抱合体は、肝臓、脾臓及び腎臓においても処理され、それによって毒薬をこれらの臓器において放出し、疾患治療用途の治療範囲を潜在的に低減する。ホジキンリンパ腫のためにＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）及び難治性乳癌のためにＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（アド−トラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ））の近年の認可は希望が持てるが、非ホジキンリンパ腫におけるカリチアマイシン抱合体の投与可能最大投与量による治療有効性の欠如、その後の中断、ならびにＡＭＬのためのゲムツズマブオゾガマイシンの市場からの撤退は、ＡＤＣに超毒素（ｕｌｔｒａｔｏｘｉｃ）を使用することの限界を示している。
【０００９】
本発明の抱合体は、非抱合または「裸の（ｎａｋｅｄ）」抗体もしくは抗体フラグメントより大きな有効性を有するが、そのような非抱合抗体部分は、特定の状況下において使用されてきた。例えば癌において、裸の抗体は、リンパ腫（アレムツズマブ及びリツキシマブ）、結腸直腸及び他の癌（セツキシマブ及びベバシズマブ）、乳癌（トラスツズマブ）の治療において、ならびに多数の現在臨床開発中のもの（例えば、エプラツズマブ、ベルツズマブ、ミラツズマブ）において役割を果たしている。これらの症例の大部分において、臨床的使用は、これらの裸の、または非抱合抗体と、化学療法または放射線療法などの他の療法との組み合わせを伴っている。
【００１０】
ＳＮ−３８などの治療薬を抗体部分に結合するためのＣＬ２Ａリンカーの使用が、開示されている（例えば、米国特許第７，９９９，０８３号及び同第８，０８０，２５０号の実施例が、参照として本明細書に組み込まれる）。しかし、最大の有効性及び最小の毒性をもたらす最適化された投与スケジュールを含む、ＣＬ２Ａ及びＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体を調製及び使用するより効率的な方法、ならびにＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及び抗体−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体の効率的な大規模生成の必要性が、存在する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、カンプトテシン−抗体免疫抱合体を調製及び投与する改善された方法及び組成物を提供することによって、従来技術によって満たされていない必要性を解決する。好ましくは、カンプトテシンはＳＮ−３８である。開示されている方法及び組成物は、難治性である、または他の療法形態への応答が少ない様々な疾患及び状態の治療に使用され、選択的標的化に適した抗体または抗原結合抗体フラグメントが開発されうる、または利用可能である、もしくは既知である疾患を含むことができる。主題の免疫抱合体により治療されうる好ましい疾患または状態には、例えば、癌、自己免疫性疾患、免疫機能不全疾患、または感染性生物により引き起こされる疾患が含まれる。
【００１２】
本発明の様々な実施形態は、図１に例示されているように、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の生成のための新たな合成プロトコールに関する。予想外なことに、新規合成プロトコールは、副産物による汚染レベルの実質的な減少を伴って、改善された生成効率及び収率を示す。特定の実施形態において、新規合成プロトールには、本発明の実施に有利であることが見出された特定の中間体、前駆体、反応ステップ及び／または反応条件の使用が含まれうる。図１及び請求項１に示されているスキームは、合成プロトコールの特定の好ましい実施形態として開示されているが、当業者は、代替的なスキームを本発明の範囲内で利用できることを理解する。
【００１３】
予想外にも本発明の実施に有利であることが見出されている特定のステップまたは条件には、以下の１つ以上が含まれうる。（ｉ）シリル保護中間体６（図１）から脱シリル化中間体７（図１）への変換において、フッ化テトラブチルアンモニウムを、以前（例えば、米国特許第９，１０７，９６０号）に開示された１．４倍モル過剰の代わりに、１．１倍モル過剰を使用した。この試薬レベルは、脱シリル化に等しく効率的であり、同時に不純物プロファイルを低減し、それによって中間体７の純度を向上させ、改善された収率をもたらした。（ｉｉ）以前（米国特許第９，１０７，９６０号）に開示された、中間体６及び７（図１）の両方の調製における水性処理において、処理は、有機抽出物を、中間体６では０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．３により４回、中間体７では０．２５Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ６により４回洗浄すること、その後に、それぞれ水による洗浄を伴った。改善された方法において、緩衝液による洗浄を中間体６では３回、中間体７では２回に低減し、水による洗浄を両方から省いた。これらの修正は、水性有機エマルションの形成を顕著に低減し、有機抽出物からの生成物の回収を改善した。（ｉｉｉ）米国特許第９，１０７，９６０号に開示されている中間体７（図１）のクロマトグラフィー精製は、溶出にジクロロメタン−メタノール混合物の使用を伴った。改善された方法では、溶出に、様々なメタノール濃度を有するジクロロメタン−酢酸エチル−メタノール混合物、続いて様々な濃度のジクロロメタン−メタノール混合物の組み合わせを使用するように修正した。このことは、中間体のより良好で迅速な分離をもたらし、回収を改善した。これらの改善された手順を使用すると、中間体４から中間体７への３ステップ連続における全体的な収率は、これらの方法の変更を組み込むことによって２９〜４０％の範囲から６４％に改善された。
【００１４】
ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の合成プロトコールは、以下の改善の１つ以上を更に利用することができる。（ｉｖ）以前（米国特許第９，１０７，９６０号）に開示された合成プロトコールでは、中間体９（図１）を生成する中間体７及び８（図１）の銅（＋１）触媒反応は、臭化第一銅及びトリフェニルホスフィンの予め形成された錯体を、ジイソプロピルエチルアミンなどの第三級アミンを加えたジクロロメタン中において使用することによって実施した。後に、トリフェニルホスフィン単独の存在下では、中間体７の生成物の品質が経時的に劣化することが発見され、この試薬の有害な効果が示され、銅触媒反応が完了すると素早い除去を必要とした。このことは、精製された中間体９（図１）の収率を低減する潜在性を有する。下記の実施例に開示されているように、本プロトコールにおいて、反応は、水中の硫酸銅及びアスコルビン酸と、ジクロロメタン中の中間体７及び８、ならびに２，６−コリジンとを含有する二相混合物を使用することによって実施した。二相溶液を一晩、典型的には１８時間撹拌することによって、変換が完了し、粗生成物を、ＥＤＴＡ水溶液による簡単な洗浄によって、硫酸銅及びアスコルビン酸塩から分離した。この後に続くクロマトグラフィー精製によって、改善された生成物収率をもたらした。修正手順は、トリフェニルホスフィンの使用を回避している。（ｖ）溶液中の及び溶媒を用いないで単離された材料としての中間体９（図１）の安定性プロファイルは、生成物が固体生成物として−２０℃で４日間、またはジクロロメタン中の溶液として室温で１日貯蔵されたときに、＞９７％の純度を維持したことを示した。後者の場合では、室温での４日間の貯蔵は純度を８９．４％に低減し、一方、−２０℃で貯蔵した溶液は、僅か９２％の純度を示した。米国特許第９，１０７，９６０号において以前に開示されたように、クロマトグラフィー及びＥＤＴＡ洗浄の後に得た、ジクロロメタン中の材料を、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）及びアニソールにより媒介された脱保護反応にそのまま使用した。その状況下では、溶液形態の中間体９の貯蔵期間に応じて、最終材料（生成物１０、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）の品質が変わった。改善された方法では、精製した後の中間体９（図１）を固体に濃縮し、続いて最終ステップに使用した。この修正は、最終脱保護ステップの前に、中間体９の生成物の品質の変化についての不確実性を取り除いた。このステップにおける更なる変更は、反応後に、粗生成物の溶液を、激しく撹拌したｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ｔ−ＢＭＥ）に数時間かけて滴加することを伴い、このことによって、生成物を濾過可能な固体の形態で沈殿させることができた。反応混合物の添加が徐々にではなく、撹拌が激しくない場合では、生成物は固体ではなく油状物にになった。（ｖｉ）中間体１から中間体２（図１）への変換及び中間体２から中間体３（図１）への変換では、ＥＥＤＱが、アミドカップリング試薬として使用されている。しかし、これらの反応は、示されている特定の試薬に限定さない。当業者は、アミドカップリングが、Ｈａｎ  Ｓ−Ｙ  ａｎｄ  Ｋｉｍ  Ｙ−Ａ．Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４；６０：２４４７−２４６７に総説されているように、多数の異なる試薬によって達成されうることを認識する。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、カリチアマイシン、マイタンシノイド、またはＭＭＡＥのような超毒性化学療法剤のナノモル以下からピコモルの毒性と比較して、ナノモル毒性をインビトロにおいて有するＳＮ−３８などのカンプトテシンの抗体抱合体の治療的使用に関する。超毒素ではない薬物の使用は抗体−薬物リンカーの使用を可能にし、これは、遊離薬物の放出のために細胞内部移行を必要とせず、むしろ薬物のある程度の細胞外放出を可能にする。本明細書に記載されているＣＬ２Ａリンカーを用いると、抱合薬物の５０％が２４時間のうちに放出され、それによって、細胞外及び細胞内の両方に遊離することで薬物の生物学的利用能を増強する。加えて、相対的に非毒性である薬物の使用は、ＡＤＣの高い投与量の投与を可能にし、より良好な治療効果をもたらす。
【００１６】
主題の免疫抱合体に組み込まれた抗体は、様々なアイソタイプ、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のもの、より好ましくはヒトＩｇＧ１ヒンジ及び定常領域配列を含むものでありうる。抗体またはそのフラグメントは、キメラ、ヒト化、もしくは完全ヒト抗体、またはｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７：１５５４−１５５７）に記載されている半（ｈａｌｆ）ＩｇＧ４抗体などの、その抗原結合フラグメント、あるいは市販されている（例えば、ＡＢＬＹＮＸ（登録商標）、Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）でありうる。より好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、特定のアロタイプに属するヒト定常領域配列を含むように設計または選択されてもよく、このことによって、免疫抱合体がヒト対象に投与されると免疫原性の低減をもたらすこともある。投与に好ましいアロタイプには、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２、またはＧ１ｍ３，１，２などの非Ｇ１ｍ１アロタイプ（ｎＧ１ｍ１）が含まれる。より好ましくは、アロタイプは、ｎＧ１ｍ１、Ｇ１ｍ３、ｎＧ１ｍ１，２及びＫｍ３アロタイプからなる群から選択される。
【００１７】
使用される抗体は、当該技術に既知のあらゆる疾患関連抗原に結合することができる。例えば疾患状態が癌である場合、癌細胞によって発現された、そうでなければ関連づけられる多くの抗原が当該技術において知られており、炭酸脱水酵素ＩＸ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体特異的抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ  ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓癌ムチン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ−抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、癌遺伝子マーカー、ならびに癌遺伝子産物（例えば、Ｓｅｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６，１２：５０２３−３２、Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，１７８：１９７５−７９、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００５，５４：１８７−２０７を参照すること）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体は、ＡＦＰ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＡＦＰ、ＭＵＣ５ａｃ、ＣＤ７４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＨＬＡ−ＤＲに結合する。
【００１８】
利用することができる例示的な抗体には、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ、米国特許出願第１３／６８８，８１２号、１１／２９／１２出願）、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ５ａｃ、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗−ＣＤ２０、米国特許第７，１５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第５，７８９，５５４号）、ｈＲＦＢ４（抗ＣＤ２２、米国特許第９，１３９，６４９号）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ、米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第８，２８７，８６５号）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ−１、米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，５４１，４４０号）、Ａｂ１２４及びＡｂ１２５（抗ＣＸＣＲ４、米国特許第７，１３８，４９６号）が含まれるが、これらに限定されず、引用された特許または出願の実施例セクションは、それぞれ参照として本明細書に組み込まれる。より好ましくは、抗体は、ＩＭＭＵ−３１（抗ＡＦＰ）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＬ２４３もしくはＩＭＭＵ−１１４（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、またはｈＡ２０（抗ＣＤ２０）である。本明細書において使用されるとき、エプラツズマブ及びｈＬＬ２という用語は交換可能であり、ベルツズマブ及びｈＡ２０、ｈＬ２４３ｇ４Ｐ、ｈＬ２４３ガンマ４Ｐ及びＩＭＭＵ−１１４という用語も同様である。特定の好ましい実施形態において、免疫抱合体は、ＣＬ２Ａリンカーを伴う、ｈＭＮ−１４−ＳＮ−３８、ｈＭＮ−３−ＳＮ−３８、ｈＭＮ−１５−ＳＮ−３８、ｈＩＭＭＵ−３１−ＳＮ−３８、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８、ｈＲ１−ＳＮ−３８、ｈＡ２０−ＳＮ−３８、ｈＰＡＭ４−ＳＮ−３８、ｈＬ２４３−ＳＮ−３８、ｈＬＬ１−ＳＮ−３８、ｈＲＦＢ４−ＳＮ−３８、ｈＭｕ−９−ＳＮ−３８、またはｈＬＬ２−ＳＮ−３８抱合体でありうる。
【００１９】
使用される代替的抗体には、アブシキシマブ（抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）、ランブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）（抗ＣＡ−１２５）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＥｐＣＡＭ）、アトリズマブ（ａｔｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＬ−６受容体）、ベンラリズマブ（ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１２５）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ、米国特許出願第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として受託）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ、ＷＯ２００９／１３０５７５号）、トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０、Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｒｏｃｈｅ）、ムロモナブ−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、オマリズマブ（抗ＩｇＥ）；ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：８８１−８５）、ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ、Ｍ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）、セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、アダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの抗ＴＮＦ−α抗体；Ａｌｚ  ５０（Ｋｓｉｅｚａｋ−Ｒｅｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：７９４３−４７）、ガンテネルマブ、ソラネズマブ及びインフリキシマブなどのアルツハイマー病治療用抗体；５９Ｄ８、Ｔ２Ｇ１ｓ、ＭＨ１のような抗フィブリン抗体；ＭＯＲ０３０８７（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＡＧ）、ＭＯＲ２０２（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ３８（Ｇｅｎｍａｂ）またはダラツムマブ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）などの抗ＣＤ３８抗体；Ｐ４／Ｄ１０（米国特許第８，３３３，９７１号）、Ａｂ  ７５、Ａｂ  ７６、Ａｂ  ７７（Ｐａｕｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５８：１７８１−９０）などの抗ＨＩＶ抗体、ならびにＰｏｌｙｍｕｎ（Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）により記載及び販売され、全て参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８３１，０３４号、米国特許第５，９１１，９８９号、Ｖｃｅｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  ２００７；２１（１６）：２１６１−２１７及びＪｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３−９にも記載されている、抗ＨＩＶ抗体；ＣＲ６２６１（抗インフルエンザ）、エキスビビルマブ（ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）（抗Ｂ型肝炎）、フェルビズマブ（ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）（抗呼吸器多核体ウイルス）、フォラビルマブ（ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）（抗狂犬病ウイルス）、モタビズマブ（抗呼吸器多核体ウイルス）、パリビズマブ（抗呼吸器多核体ウイルス）、パノバクマブ（ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）（抗Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ラフィビルマブ（ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）（抗狂犬病ウイルス）、レガビルマブ（抗サイトメガロウイルス）、セビルマブ（ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）（抗サイトメガロウイルス）、チビルマブ（ｔｉｖｉｒｕｍａｂ）（抗Ｂ型肝炎）及びウルトキサズマブ（抗Ｅ．ｃｏｌｉ）などの病原体に対する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
好ましくは、抗体部分は少なくとも１個の薬物部分、より好ましくは１〜約５個の薬物部分、あるいは約７〜１２個の薬剤部分に連結する。様々な実施形態において、抗体部分は、４〜６個の薬物部分、６〜８個の薬物部分、または７〜８個の薬物部分に結合することができる。抗体１個あたりの薬物部分の数は、１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれ以上でありうる。
【００２１】
様々な実施形態は、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性及び慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、毛様細胞白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ腫及び白血病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、癌腫、黒色腫、肉腫、神経膠腫、骨及び皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない癌を治療するための本方法及び組成物の使用に関係しうる。癌腫には、口腔、食道、胃腸管、気道（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ）、肺、胃、結腸、乳房、卵巣、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頸部、膀胱、膵臓、骨、脳、結合組織、肝臓、胆嚢、膀胱、腎臓、皮膚、中枢神経系及び精巣の癌腫が含まれうる。
【００２２】
本免疫抱合体により治療できる可能性のある例示的な自己免疫性または免疫機能不全疾患には、急性免疫性血小板減少症、慢性免疫性血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、真性糖尿病（例えば、若年性糖尿病）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、線維性肺胞炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、臓器移植拒絶、セプシス、敗血症及び炎症が含まれる。
【００２３】
加えて、本方法及び組成物を使用して、感染症、例えば、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、真菌、ウイルス、寄生虫、または他の微生物病原体などの病原体による感染を伴う疾患を治療することができる。例には、ＡＩＤＳを引き起こすヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、結核のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ライム病スピロヘータ、ウエストナイルウイルス、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスＩ、単純ヘルペスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、サルウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ、Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ、Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ及びＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが含まれる。感染性生物に対する抗体（抗毒素及び抗ウイルス性抗体）、ならびに他の標的を網羅する総説は、Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；９３（１）：５−１５に含まれており、参照として本明細書に組み込まれる。
【００２４】
癌の治療に関与する特定の実施形態では、薬物抱合体を、外科手術、放射線療法、化学療法、裸抗体を用いる免疫療法、放射免疫療法、免疫調節物質、またはワクチンなどの別の治療様式と組み合わせて使用することができる。同様の併用療法を、自己免疫性疾患など抗体部分を受け入れやすい他の疾患の治療に使用することができる。例えば、カンプトテシン抱合体を、ＴＮＦ阻害剤、Ｂ細胞抗体、インターフェロン、インターロイキン、及び関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性硬化症、血管炎、またＩ型糖尿病（若年性糖尿病）などの自己免疫性疾患の治療に有効な他の作用物質と組み合わせることができる。これらの併用療法は、そのような組み合わせで与えられるそれぞれの治療薬の用量を下げることができ、したがって、特定の重篤な副作用を低減し、必要とされる治療過程を低減できる可能性がある。
【００２５】
感染症では、薬物免疫抱合体を、他の治療薬、免疫調節物質、裸ＭＡｂ、またはワクチン（例えば、肝炎、ＨＩＶもしくはパピローマウイルスに対するＭＡｂ、またはこれらのウイルスの免疫原に基づいたワクチン、またはＢ型肝炎におけるものなどのキナーゼ阻害剤）と組み合わせることができる。これら及び他のウイルス病原体に対する抗体及び抗原ベースワクチンは、当該技術において知られており、いくつかの場合では既に市販されている。抗炎症性モノクローナル抗体の開発は、参照として本明細書に組み込まれるＲｅｉｃｈｅｒｔ  ａｎｄ  Ｄｅｗｉｔｚ（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２００６；５：１９１−１９５）によって最近総説されており、これは、裸抗体療法が探究された優先度の高い病原体（ｐｒｉｏｒｉｔｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎ）についてまとめ、抗体が第ＩＩＩ相臨床試験にあるもの、または市販されているものは、臨床研究した２５個のうち２個の病原体のみ（呼吸器多核体ウイルス及びメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）であり、２０個が臨床研究中に中止されたという結果であった。併用療法については、感染性生物に対する治療のための放射免疫療法の使用が、例えば、米国特許第４，９２５，６４８号、同第５，３３２，５６７号、同第５，４３９，６６５号、同第５，６０１，８２５号、同第５，６０９，８４６号、同第５，６１２，０１６号、同第６，１２０，７６８号、同第６，３１９，５００号、同第６，４５８，９３３号、同第６，５４８，２７５号、ならびに米国特許出願公開第２００２０１３６６９０号及び同第２００３０１０３９８２号に開示されており、これらの実施例セクションが、それぞれ参照として本明細書に組み込まれる。
【００２６】
免疫抱合体の好ましい最適な投与には、好ましくは、毎週、毎週２回、隔週、または３週間毎に与えられる、３ｍｇ／ｋｇ〜１８ｍｇ／ｋｇの投与量が含まれうる。最適な投与スケジュールには、２週間連続の治療の後に１、２、３もしくは４週間の休止、または１週おきの治療及び休止、または１週間の治療の後に２、３もしくは４週間の休止、または３週間の治療の後に１、２、３もしくは４週間の休止、または４週間の治療の後に１、２、３もしくは４週間の休止、または５週間の治療の後に１、２、３、４もしくは５週間の休止、または２週間毎に１回、３週間毎に１回、もしくは１か月毎に１回の投与の治療サイクルが含まれうる。治療は、任意のサイクル数、好ましくは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６サイクルに延長することができる。使用される例示的な投与量には、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ及び２４ｍｇ／ｋｇが含まれうる。好ましい投与量は、４、６、８、９、１０、１２、１４、１６、または１８ｍｇ／ｋｇである。最も好ましい投与量は、８または１０ｍｇ／ｋｇである。当業者は、年齢、一般的な健康、特定の臓器機能、または体重などの様々な要因、また特定の臓器系（例えば、骨髄）への前の療法の効果が、免疫抱合体の最適な投与量の選択において考慮されうること、ならびに投与量及び／または投与頻度が治療過程において増加または減少されうることを認識する。投与量は、僅か４〜８用量の後に観察された腫瘍の縮小によって明らかなように、必要に応じて繰り返してもよい。本明細書に開示されている最適化された投与量及び投与スケジュールは、動物モデル研究では予測することができなかった予想外の優れた有効性及び低減された毒性を、ヒト対象において示している。驚くべきことに、優れた有効性は、ＳＮ−３８がインビボで誘導される親化合物のＣＰＴ−１１を含む１つ以上の標準的な抗癌療法に抵抗性があることが以前に見出された腫瘍において、治療を可能にする。
【００２７】
本組成物及び方法を用いた驚くべき結果は、反復注入であっても高用量の抗体−薬物抱合体の予想外に高い耐容性であり、比較的低い毒性度の悪心、嘔吐及び下痢、ならびに皮疹または管理可能な好中球減少症が観察されている。更に驚くべき結果は、ＳＮ−３８をアルブミン、ＰＥＧ、または他の担体と抱合させた他の生成物と異なり、抗体−薬物抱合体の蓄積が欠如していることである。蓄積の欠如は、反復または増量投与の後であっても、耐容性が改善され、重篤な毒性が欠如していることに関連している。これらの驚くべき結果は、投与量及び送達スケジュールの最適化を可能にし、予想外の高い有効性及び低い毒性を可能にする。本方法は、以前に耐性癌を有した個人において、腫瘍のサイズに（最長直径で測定して）１５％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上の縮小をもたらす。当業者は、腫瘍サイズが、全腫瘍体積、任意の寸法での最大腫瘍サイズ、またはいくつかの寸法によるサイズ測定の組み合わせなどの様々な異なる技術によって測定されうることを認識する。これは、コンピュータ断層撮影法、超音波検査法及び／または陽電子放射型断層撮影法などの標準的な放射線検査によるものであってもよい。サイズ測定の手段は、免疫抱合体治療により腫瘍サイズが減少し、好ましくは腫瘍の排除がもたらされる傾向を観察することに比べると、重要性は低い。
【００２８】
免疫抱合体は定期的なボーラス注入によって投与されうるが、代替的実施形態では、免疫抱合体を抗体−薬物抱合体の連続注入によって投与することができる。血液中の免疫抱合体のＣｍａｘを増加させ、ＰＫを延長させるため、連続注入は、例えば留置カテーテルによって投与することができる。そのような装置は当該技術において知られており、Ｈｉｃｋｍａｎ（登録商標）、Ｂｒｏｖｉａｃ（登録商標）、またはＰｏｒｔ−Ａ−Ｃａｔｈ（登録商標）カテーテルなどであり（例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔ  ３２：７４１−４８，２０１０を参照すること）、そのような既知の留置カテーテルのいずれかを使用することができる。様々な連続注入ポンプも当該技術において知られており、そのような既知の注入ポンプのいずれかを使用することができる。連続注入の投与量範囲は、１日あたり０．１〜２．０ｍｇ／ｋｇでありうる。より好ましくは、これらの免疫抱合体を、２〜５時間、より好ましくは２〜３時間の比較的短時間にわたって静脈内注入により投与することができる。
【００２９】
特定の好ましい実施形態において、免疫抱合体及び投与スケジュールは、標準的療法に抵抗性のある患者において有効でありうる。例えば、ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫抱合体を、ＳＮ−３８の親作用物質であるイリノテカンによる以前の療法に応答しなかった患者に投与することができる。驚くべきことに、イリノテカン抵抗性患者は、ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８に対して部分的な応答を示すことがある。免疫抱合体が腫瘍組織を特異的に標的にする能力は、治療剤の改善された標的化及び向上された送達によって、腫瘍の抵抗を克服することができる。異なるＳＮ−３８免疫抱合体の組み合わせ、または放射性核種、毒素もしくは他の薬物と抱合した抗体と組み合わされたＳＮ−３８抗体抱合体は、よりいっそう改善された有効性及び／または低減された毒性をもたらすことができる。特定の好ましい対象は、転移性結腸癌患者、三種陰性乳癌患者、ＨＥＲ＋、ＥＲ＋、プロゲステロン＋乳癌患者、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者、転移性膵癌患者、転移性腎細胞癌患者、転移性胃癌患者、転移性前立腺癌患者、または転移性小細胞肺癌患者でありうる。異なる実施形態において、療法は、フロントライン（ｆｒｏｎｔ−ｌｉｎｅ）、セカンドライン（ｓｅｃｏｎｄ−ｌｉｎｅ）、サードライン（ｔｈｉｒｄ−ｌｉｎｅ）、または他の患者の治療に適していることもある。
【００３０】
特定の実施形態は、ＣＬ２Ａ−ＳＮ３８抱合体及び抗体−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫抱合体を、改善された収率及び／または効率を伴って大規模で調製する改善された方法に関する。特に好ましい実施形態は、図１に示されている合成スキームによって説明されている。好ましくは、ＣＬ２Ａリンカーの末端にあるマレイミド基が、抗体部分、または他の標的化ペプチドもしくはタンパク質の還元システイン残基のスルフヒドリル側鎖と反応するが、ＣＬ２Ａ部分を抗体部分に結合する他の方法が知られており、使用することができる。更に好ましい実施形態において、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８部分から調製された免疫抱合体は、接線流濾過により精製され、それによって、煩わしいサイズ排除及び疎水性相互作用カラムのクロマトグラフィーを回避し、精製後に高いタンパク質回収を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の改善された大規模生成の新規スキームである。
【図２】ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体による、Ｃａｐａｎ  １ヒト膵癌を有する胸腺欠損ヌードマウスのインビボ治療である。
【図３】ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体による、ＢｘＰＣ３ヒト膵癌を有する胸腺欠損ヌードマウスのインビボ治療である。
【図４】ｈＭＮ−１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体による、ＬＳ１７４Ｔヒト結腸癌を有する胸腺欠損ヌードマウスのインビボ治療である。
【図５Ａ】ヒト非小細胞肺癌異種移植片を有するマウスにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療有効性である。Ｃａｌｕ−３腫瘍を有するマウス（Ｎ＝５〜７）に、ｈＲＳ７−−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を４日毎に合計で４回の注射（ｑ４ｄ×４）により注射した。全てのＡＤＣ及び対照を、示された量で投与した（１用量あたりのＳＮ−３８の量として表した。長い矢印＝抱合体の注射、短い矢印＝イリノテカンの注射）。
【図５Ｂ】ヒト結腸直腸癌異種移植片を有するマウスにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療有効性である。ＣＯＬＯ  ２０５腫瘍を有するマウス（Ｎ＝５）に、ＡＤＣを８回（ｑ４ｄ×８）またはイリノテカンのＭＴＤを２日毎に合計で５回の注射（ｑ２ｄ×５）により注射した。全てのＡＤＣ及び対照を、示された量で投与した（１用量あたりのＳＮ−３８の量として表した。長い矢印＝抱合体の注射、短い矢印＝イリノテカンの注射）。
【図５Ｃ】ヒト膵癌異種移植片を有するマウスにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療有効性である。Ｃａｐａｎ−１腫瘍を有するマウス（Ｎ＝１０）を、示された作用物質により毎週２回で４週間にわたって治療した。全てのＡＤＣ及び対照を、示された量で投与した（１用量あたりのＳＮ−３８の量として表した。長い矢印＝抱合体の注射、短い矢印＝イリノテカンの注射）。
【図５Ｄ】ヒト膵癌異種移植片を有するマウスにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療有効性である。ＢｘＰＣ−３腫瘍を有するマウス（Ｎ＝１０）を、示された作用物質により毎週２回で４週間にわたって治療した。全てのＡＤＣ及び対照を、示された量で投与した（１用量あたりのＳＮ−３８の量として表した。長い矢印＝抱合体の注射、短い矢印＝イリノテカンの注射）。
【図５Ｅ】ヒト肺扁平上皮癌異種移植片を有するマウスにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療有効性である。毎週２回で４週間にわたって与えられたＡＤＣに加えて、ＳＫ−ＭＥＳ−１腫瘍を有するマウス（Ｎ＝８）は、ＣＰＴ−１１のＭＴＤを受けた（ｑ２ｄ×５）。全てのＡＤＣ及び対照を、示された量で投与した（１用量あたりのＳＮ−３８の量として表した。長い矢印＝抱合体の注射、短い矢印＝イリノテカンの注射）。
【図６】皮下Ｒａｍｏｓモデルにおけるエプラツズマブ（Ｅｍａｂ）−ＳＮ−３８及びベルツズマブ（Ｖｍａｂ）−ＳＮ−３８抱合体の有効性の比較である。平均してほぼ０．３５ｃｍ３（０．２０〜０．５５ｃｍ３）の腫瘍を有するヌードマウス（１群あたりＮ＝１０）に、それぞれの抱合体の０．２５または０．５ｍｇを毎週２回で４週間にわたって投与した。
【図７】（７Ａ）皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍を有するヌードマウスにおける、無関係のラベツズマブ（Ｌｍａｂ）−ＳＮ−３８抱合体（破線）に対するＥｍａｂ抗−ＣＤ２２−ＳＮ−３８抱合体（実線）の特異性である。動物には、それぞれの抱合体を１用量あたり７５μｇ（平均体重の２２ｇに基づいて５４．５μｇ／ｋｇのＳＮ−３８）により毎週２回で４週間にわたって腹腔内から与えた。腫瘍の平均サイズが０．４ｃｍ３から出発した、無増悪期間（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）（ＴＴＰ）から３．０ｃｍ３までの生存期間である。Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８及びＬｍａｂ−ＳＮ−３８抱合体の生存期間中央値を比較したＰ値（示されている）が、それぞれのパネルにおいて示されている。（７Ｂ）皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍を有するヌードマウスにおける、無関係のラベツズマブ（Ｌｍａｂ）−ＳＮ−３８抱合体（破線）に対するＥｍａｂ抗−ＣＤ２２−ＳＮ−３８抱合体（実線）の特異性である。動物には、それぞれの抱合体を１用量あたり１２５μｇ（平均体重の２２ｇに基づいて９１μｇ／ｋｇのＳＮ−３８）により毎週２回で４週間にわたって腹腔内から与えた。腫瘍の平均サイズが０．４ｃｍ３から出発した、無増悪期間（ＴＴＰ）から３．０ｃｍ３までの生存期間である。Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８及びＬｍａｂ−ＳＮ−３８抱合体の生存期間中央値を比較したＰ値（示されている）が、それぞれのパネルにおいて示されている。（７Ｃ）皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍を有するヌードマウスにおける、無関係のラベツズマブ（Ｌｍａｂ）−ＳＮ−３８抱合体（破線）に対するＥｍａｂ抗−ＣＤ２２−ＳＮ−３８抱合体（実線）の特異性である。動物には、それぞれの抱合体を１用量あたり２５０μｇ（平均体重の２２ｇに基づいて１８２μｇ／ｋｇのＳＮ−３８）により毎週２回で４週間にわたって腹腔内から与えた。腫瘍の平均サイズが０．４ｃｍ３から出発した、無増悪期間（ＴＴＰ）から３．０ｃｍ３までの生存期間である。Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８及びＬｍａｂ−ＳＮ−３８抱合体の生存期間中央値を比較したＰ値（示されている）が、それぞれのパネルにおいて示されている。また生存曲線（灰色実線）は、イリノテカン（６．５μｇ／用量、２５０μｇ用量のＥｍａｂ−ＳＮ−３８抱合体とほぼ同じＳＮ−３８当量）の腹腔内注射を毎週与えた別の動物群を示す。
【図８】ＩＭＭＵ−１３０（ラベツズマブ−ＮＳ−３８）を投与する前の、患者の以前の治療歴である。以前の治療には、ステージＩＶ  ＣＲＣ結腸切除術／肝切除術（葉の一部）、肝転移の高周波アブレーション療法、肺転移の楔状切除術、ならびにイリノテカン／オキサリプラチン、Ｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘ、Ｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘ＋ベバシズマブ、ベバシズマブ＋５−ＦＵ／ロイコボリン、ＦｏｌＦｉｒｉ、Ｆｏｌｆｉｒｉ＋セツキシマブ、及びセツキシマブ単独による化学療法。患者は、１６ｍｇ／ｋｇの用量のＩＭＭＵ−１３２を緩徐ＩＶ注入により隔週に合計１７治療用量で受けた。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
以下の記載では多数の用語が使用されており、以下の定義は、本主題の理解を促進するために提供されている。本明細書において明確に定義されていない用語は、平易で通常の意味に従って使用される。
【００３３】
特定されない限り、ａまたはａｎは、「１つ以上」を意味する。
【００３４】
約という用語は、値のプラスまたはマイナス１０パーセント（１０％）を意味するために本明細書において使用される。例えば、「約１００」は、９０と１１０の間の任意の数を指す。
【００３５】
抗体は、本明細書において使用されるとき、完全長（すなわち、天然に生じる、もしくは正常な免疫グロブリン遺伝子フラグメント組み換えプロセスによって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントなどの免疫グロブリン分子の抗原結合部分を指す。抗体または抗体フラグメントを、本主題の範囲内で抱合させること、そうでなければ誘導体化させることができる。そのような抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（及びＩｇＧ４サブフォーム）、ならびにＩｇＡアイソタイプが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、単一ドメイン抗体（ＤＡＢまたはＶＨＨ）などの抗体の一部であり、上記に引用されたＩｇＧ４の半分子が含まれる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７（１４  Ｓｅｐｔ）：１５５４−１５５７）。単一ドメイン抗体の市販の形態は、ナノボディと呼ばれ（ＡＢＬＹＮＸ（登録商標）、Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、下記において更に詳細に考察される。構造にかかわりなく、使用される抗体フラグメントは、無傷の抗体により認識される同じ抗原に結合する。用語「抗体フラグメント」には、特定の抗原に結合して複合体を形成する、抗体と同様に作用する合成または遺伝子改変タンパク質も含まれる。例えば、抗体フラグメントには、重及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメントなど可変領域からなる単離フラグメント、軽及び重可変領域がペプチドリンカーにより結合している組み換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、ならびにＣＤＲなど超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。Ｆｖフラグメントは、異なる方法で構築されて多価及び／または多特異的結合形態を生じることができる。多価の場合では、特定のエピトープに対して１つを超える結合部位があり、一方、多特異的形態では、１つを超えるエピトープ（同じ抗原から、または１つの抗原及び異なる抗原から）が結合する。
【００３７】
裸抗体は、一般に治療剤に抱合しない抗体全体である。これは、抗体分子のＦｃ部分が、細胞溶解をもたらしうる機構を作用させる、補体結合及びＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）などのエフェクター機能または免疫学的機能を提供するからである。しかし、Ｆｃ部分に抗体の治療機能が必ずしも必要であることはなく、むしろアポトーシス、抗血管新生、抗転移活性、異型または同型接着の阻害などの抗接着活性、及びシグナル伝達経路の干渉などの他の機構が作用し、疾患の進行を妨げることができる。裸抗体には、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、ならびにこれらのフラグメントが含まれ、マウス抗体、ならびにキメラ、ヒト化、またはヒト抗体及びこれらのフラグメントなどの特定の組み換え抗体が含まれる。本明細書において使用されるとき、「裸」は、「非抱合」と同義語であり、治療剤と連結または抱合していないことを意味する。
【００３８】
キメラ抗体は、１つの種から誘導された抗体、好ましくは齧歯類抗体、より好ましくはマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、重及び軽抗体鎖の両方の可変ドメインを含有し、一方、抗体分子の定常ドメインがヒト抗体から誘導される、組み換えタンパク質である。獣医用途では、キメラ抗体の定常ドメインは、霊長類、ネコ、またはイヌなどの他の種から誘導されうる。
【００３９】
ヒト化抗体は、１つの種の抗体、例えばマウス抗体のＣＤＲがマウス抗体の重及び軽可変鎖からヒト重及び軽可変ドメイン（フレームワーク領域）に移行されている、組み換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体から誘導される。いくつかの場合において、ヒト化抗体のフレームワーク領域の特定の残基、特にＣＤＲ配列に接触または近接しているものは、修飾されていることがあり、例えば、元のマウス、齧歯類、類人猿、または他の抗体からの対応する残基に置き換えられていることがある。
【００４０】
ヒト抗体は、例えば、抗原投与に応答してヒト抗体を産生するように「改変された」遺伝子移入マウスから得られる。この技術では、ヒト重及び軽鎖座の要素が、内在性重鎖及び軽鎖座の標的化破損を含有する胚幹細胞系から誘導されたマウスの株に導入される。遺伝子導入マウスは、様々な抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、マウスを使用して、ハイブリドーマを分泌するヒト抗体を産生することができる。遺伝子導入マウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載されている。完全ヒト抗体は、遺伝子または染色体移入方法、またファージ提示技術によって構築することもでき、これらは全て当該技術において知られている。未免疫供与体の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体及びそのフラグメントをインビトロで産生することについては、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照すること。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子が、糸状バクテリオファージの主要な、または少数のコートタンパク質遺伝子にインフレームでクローンされ、ファージ粒子の表面に機能性抗体フラグメントとして提示される。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能特性に基づいた選択は、また、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。このように、ファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージ提示は様々なフォーマットで実施することができ、その総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照すること。ヒト抗体をインビトロ活性化Ｂ細胞によって生じることもできる。米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照すること。ぞれぞれの実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる。
【００４１】
感染症は、本明細書において使用されるとき、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、真菌、ウイルス、寄生虫、または他の微生物病原体などの病原体による感染を伴う疾患である。例には、ＡＩＤＳを引き起こすヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、結核のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ライム病スピロヘータ、ウエストナイルウイルス、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスＩ、単純ヘルペスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、サルウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ、Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ、Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ及びＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが含まれる。感染性生物に対する抗体（抗毒素及び抗ウイルス性抗体）、ならびに他の標的を網羅する総説は、Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；９３（１）：５−１５に含まれており、参照として本明細書に組み込まれる。
【００４２】
治療剤は、結合部分と、例えば抗体または抗体フラグメントと別々に、同時に、または順次に投与され、かつ疾患の治療に有用である分子または原子である。治療剤の例には、抗体、抗体フラグメント、抱合体、薬物、細胞傷害剤、アポトーシス促進剤（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、毒素、ヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ及びＲＮアーゼを含む）、ホルモン、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤もしくは感光染料、放射性同位体もしくは放射性核種、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ干渉、ペプチド、抗血管新生剤、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、プロドラッグ、酵素、結合タンパク質もしくはペプチド、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
免疫抱合体は、治療剤と抱合した抗体、抗体フラグメント、または他の抗体部分である。本明細書において使用されるとき、用語「抱合体」及び「免疫抱合体」は、交換可能に使用される。
【００４４】
本明細書において使用されるとき、抗体融合タンパク質という用語は、１つ以上の天然の抗体、単鎖抗体、または抗体フラグメントが、タンパク質またはペプチド、毒素、サイトカイン、ホルモンなどの別の部分と連結している、組み換え生成抗原結合分子である。特定の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、互いに融合した２つ以上の同じ、または異なる抗体、抗体フラグメント、または単鎖抗体を含むことができ、同じエピトープ、同じ抗原または異なる抗原の異なるエピトープに結合することができる。
【００４５】
免疫調節物質は、存在する場合、身体の免疫系を変更、抑制、または刺激する治療剤である。典型的には、使用される免疫調節物質は、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞などの免疫細胞を刺激して、免疫応答カスケードにおいて繁殖または活性化させる。しかし、いくつかの場合において、免疫調節物質は、自己免疫性疾患の治療処置では免疫細胞の繁殖または活性化を抑制することがある。本明細書に記載されている免疫調節物質の例は、サイトカインであり、これは特定の抗原と接触した１つの細胞個体群（例えば、抗原刺激Ｔリンパ球）により放出される、およそ５〜２０ｋＤａの小さな可溶性タンパク質であり、細胞の間の細胞間媒介物質として作用する。当業者は、サイトカインの例に、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びインターフェロンなどのいくつかの関連するシグナル伝達分子が含まれることを理解する。ケモカインは、サイトカインのサブセットである。特定のインターロイキン及びインターフェロンは、Ｔ細胞または他の免疫細胞の繁殖を刺激するサイトカインの例である。
【００４６】
ＣＰＴは、カンプトテシンの略語である。本出願において使用されるとき、ＣＰＴは、カンプトテシンそれ自体、またはカンプトテシンの類縁体もしくは誘導体を表す。カンプトテシン及び幾つかのその類縁体が、示された番号及び文字Ａ〜Ｅにより表示された環を伴って、下記のチャート１の式１に提示されている。
【化１】
2018520148.tif 000003
【００４７】
略語
ＤＣＡ−ジクロロ酢酸
Ｆｍｏｃ  −  フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド
ＥＥＤＱ  −  ２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン
ＭＣＣ−ｙｎｅ  −  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）−Ｎ−（２−プロピニル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド
ＭＭＴ  −  モノメトキシトリチル
ＰＡＢＯＨ  −  ｐ−アミノベンジルアルコール
ＰＥＧ  −  ポリエチレングリコール
ＴＢＡＦ  −  フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム
ＴＢＤＭＳ  −  ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
【００４８】
カンプトテシン抱合体
抗体または抗原結合抗体フラグメントに結合したカンプトテシン治療剤を含む免疫抱合体を調製する非限定的方法及び組成物が、下記に記載されている。好ましい実施形態において、薬物の溶解性は、確定されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分（すなわち、確定数のモノマー単位を含有するＰＥＧ）を薬物と抗体の間に配置することによって向上されており、確定されたＰＥＧは、好ましくは１〜３０個のモノマー単位、より好ましくは１〜１２個のモノマー単位、最も好ましくは８個のモノマー単位を含有する低分子量ＰＥＧである。
【００４９】
好ましくは、第１のリンカーは薬物の一方の末端に結合し、他方の末端をアセチレンまたはアジド基で終止させることができる。この第１のリンカーは、一方の末端にアジドまたはアセチレン基を有し、他方の末端にカルボン酸またはヒドロキシル基などの異なる反応性基を有する、確定されたＰＥＧ部分を含むことができる。前記の二官能性確定ＰＥＧ部分は、アミノアルコールのアミン基に結合していてもよく、後者のヒドロキシル基は、薬物のヒドロキシル基に炭酸塩の形態で結合していてもよい。あるいは、前記の確定された二官能性ＰＥＧの非アジド（または、アセチレン）部分は、Ｌ−アミノ酸またはポリペプチドのＮ末端に結合していてもよく、Ｃ末端にはアミノアルコールのアミノ基が結合していてもよく、後者のヒドロキシ基は、薬物のヒドロキシル基に、炭酸塩またはカルバミン酸塩の形態でそれぞれ結合していてもよい。
【００５０】
第２のリンカーは、抗体カップリング基と、第１のリンカーのアジド（または、アセチレン）基と相補性のある反応性基、すなわち、アセチレン（または、アジド）とを含み、薬物−（第１のリンカー）抱合体と、アセチレン−アジド付加環化反応を介して反応して、疾患標的化抗体への抱合に有用である最終二官能性薬物生成物をもたらすことができる。抗体カップリング基は、好ましくはチオールまたはチオール反応性基である。
【００５１】
ＳＮ−３８などのＣＰＴ類縁体を伴う薬物−リンカー前駆体の調製における、Ｃ−２０炭酸塩の存在下での１０−ヒドロキシル基の選択的再生方法が、下記に提供されている。ＳＮ−３８におけるフェノール性ヒドロキシルなどの薬物における反応性ヒドロキシル基の他の保護基、例えば、ｔ−ブチルジメチルシリルまたはｔ−ブチルジフェニルシリルを使用することもでき、これらを、誘導体化された薬物が抗体カップリング部分に連結される前に、フッ化テトラブチルアンモニウムにより脱保護することができる。ＣＰＴ類縁体の１０−ヒドロキシル基は、「ＢＯＣ」以外にエステルまたは炭酸塩として代替的に保護され、このようにして二官能性ＣＰＴは、この保護基を予め脱保護することなく、抗体に抱合される。保護基は、生体抱合体（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が投与された後、生理学的ｐＨ条件下で容易に脱保護されうる。
【００５２】
アセチレン−アジドカップリングでは、「クリックケミストリー（ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」と呼ばれ、アジド部分はＬ２にあり、アセチレン部分はＬ３にありうる。あるいは、Ｌ２はアセチレンを含有し、Ｌ３はアジドを含有しうる。「クリックケミストリー」は、アセチレン部分とアジド部分との銅（＋１）−触媒付加環化反応（Ｋｏｌｂ  ＨＣ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ  ＫＢ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２００３；８：１１２８−３７）を指すが、代替的な形態のクリックケミストリーが知られており、使用することができる。反応は、臭化第一銅及びトリフェニルホスフィンの混合物を使用して、ジクロロメタンなどの非極性有機溶媒における効率の高いカップリングを可能にすることができる。しかし、下記に開示されているように、トリホスフィンは特定の目的において不利であり、クリックカップリングステップを促進する代替的方法を利用することができる。クリックケミストリーの利点は、化学選択的であること及びチオール−マレイミド反応などの他の周知の抱合化学を補完することである。以下の考察では、抱合体が抗体または抗体フラグメントを含む場合、標的化ペプチドなどの他の種類の結合部分を代用することができる。
【００５３】
例示的な好ましい実施形態は、薬物誘導体と一般式２の抗体との抱合体を対象とする。
【化２】
2018520148.tif 000004
式中、ＭＡｂは、疾患標的化抗体であり、Ｌ２は、抗体カップリング部分及び１つ以上のアセチレン（または、アジド）基を含む架橋剤の構成成分であり、Ｌ１は、一方の末端にＬ２のアセチレン（または、アジド）部分と相補的なアジド（または、アセチレン）及び他方の末端にカルボン酸またはヒドロキシル基などの反応性基を有する確定されたＰＥＧを含み、ＡＡは、Ｌ−アミノ酸であり、ｍは、０、１、２、３、または４（好ましくは、１）の値の整数であり、Ａ’は、エタノールアミン、４−ヒドロキシベンジルアルコール、４−アミノベンジルアルコール、または置換もしくは非置換エチレンジアミンの群から選択される追加のスペーサーである。「ＡＡ」のＬアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから選択される。Ａ’基がヒドロキシルを含有する場合、薬物のヒドロキシル基またはアミノ基に炭酸塩またはカルバミン酸塩の形態でそれぞれ連結している。
【００５４】
式２の好ましい実施形態において、一般式２の「Ａ」はＡ−ＯＨであり、ここでＡ−ＯＨは、４−アミノベンジルアルコール、またはベンジル位置のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されている置換４−アミノベンジルアルコールなどの折り畳み可能部分であり、後者は、そのアミノ基を介して、Ｌ−アミノ酸に、または４つまでのＬ−アミノ酸部分を含むポリペプチドに結合しており、Ｎ末端は、抗体部分結合基の末端にある架橋剤に結合している。
【００５５】
好ましい実施形態の例が以下に提示されており、一般式（２）のＡ’のＡ−ＯＨ実施形態は、置換４−アミノベンジルアルコールから誘導され、「ＡＡ」は、単一のＬ−アミノ酸から構成され、一般式（２）ではｍ＝１であり、薬物はＳＮ−３８により例示されている。構造が下記に表されている（式３は、ＭＡｂ−ＣＬＸ−ＳＮ−３８と呼ばれる）。「ＡＡ」の単一アミノ酸は、次のＬ−アミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンのうちの任意の１つから選択される。４−アミノベンジルアルコール部分の置換基Ｒ（Ａ’のＡ−ＯＨ実施形態）は、水素、またはＣ１〜Ｃ１０アルキル基から選択されるアルキル基である。
【化３】
2018520148.tif 000005
【００５６】
式３のＭＡｂ−ＣＬＸ−ＳＮ−３８の実施形態であり、ここで、単一アミノ酸ＡＡはＬ−リシンであり、Ｒ＝Ｈであり、薬物はＳＮ−３８により例示されている（式４は、ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と呼ばれる）。
【化４】
2018520148.tif 000006
【００５７】
別の好ましい実施形態において、抱合体のＬ１構成成分は、１〜３０個の反復モノマー単位を有する確定されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを含有する。更に好ましい実施形態において、ＰＥＧは、１〜１２個（より好ましくは、８個）の反復モノマー単位を有する確定されたＰＥＧである。ＰＥＧの導入は、ヘテロ二官能化（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）ＰＥＧ誘導体の使用を伴うことがあり、これらは市販されている。ヘテロ二官能性ＰＥＧは、アジドまたはアセチレン基を含有することができる。「ＮＨＳ」がスクシンイミジルである、８個の反復モノマー単位を含有するヘテロ二官能性確定ＰＥＧの例が、下記に式５によって提示される。
【化５】
2018520148.tif 000007
【００５８】
好ましい実施形態では、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を生成する方法が図１に示されている。この実施形態では、免疫抱合体ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を作製するのに使用されるＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の調製に、特定の有意な工程変更が行われている。例えば、米国特許第７，９９９，０８３号に開示されている手順に対するこれらの変更は、当業者に明白ではなく、以下の変更を含む。
１）ヘキサンがＬｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（図１の中間体２）を沈殿させるために以前に使用されたが、ヘプタンを、安全な代替物としてヘキサンに取り替えた。除去されなかった残留ジエチルアミンをＮＭＲ分光法によってアッセイした。ジエチルアミンの存在が検出された場合、材料を更に精製してジエチルアミンを除去し、中間体２におけるジエチルアミンの存在により引き起こされる収率の低減を回避した。
２）ＳＮ−３８からの１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８（図１の中間体４）の調製において、反応における溶媒として以前使用されたジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に代え、それによって反応後の溶媒の除去を容易にした。ＤＭＦからＤＣＭへの切り替えは、規模拡大の容易さ、ならびにＤＭＦによる反応において時折観察された生成物収率のいくらかの低減のために実施した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドによるヒドロキシル基の保護は、溶媒としてＤＭＦを使用して慣用的に行ったが、他の溶媒も使用されている（Ｇｒｅｅｎｅ  ＴＷ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ  ＰＧＭ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ｐｐ  １２７−１３２）。ＳＮ−３８の文脈において、ＤＭＦの使用は、この材料がＤＣＭにおいて僅かに可溶性であるので好ましかった。ＤＣＭ媒体における生成物形成の高い収率は、予想外であり、予測することができなかった。
３）１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８から、図１におけるそのクロロギ酸エステル反応性中間体５への変換では、トリホスゲンを、１つのロットによってではなく少量ずつジクロロメタン溶液に加えた。このことは、収率を保ち、同時に大規模製造において潜在的に危険な反応温度の上昇を回避した。
４）最後から２番目の中間体のＭＣＣ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８（図１の中間体９）をもたらす、アジド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯ−ＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８（図１の中間体７）とＭＣＣ−ｙｎｅ（図１の中間体８）との付加環化反応では、反応混合物を最初にＥＤＴＡ抽出により処理して銅塩を除去した場合、生成物が不安定になり、収率の低減をもたらしたことが発見された。驚くべきことに、反応混合物のクロマトグラフィーが最初に実施され、続いてＥＤＴＡによる抽出を実施して、シリカゲルカラムによって完全に捕捉されなかった残留銅塩を除去した場合、生成物が安定したことも発見された。この工程変更も、不要な副産物の形成を回避することによって、収率に改善をもたらした。単に操作の順番を逆にすることによって、すなわち、最初にクロマトグラフィーを実施し、続いてＥＤＴＡによる抽出を実施することによって、精製する前の中間体９の安定性を改善することは、予想外であった。
５）上記の項目４の記載と同じ反応において、反応時間を１８〜２４時間の代わりに１４時間に低減すると、改善された収率を得た。
【００５９】
合成プロトコールにおける追加の改善が図１に組み込まれており、これらは優先権主張米国特許第９，１０７，９６０号に開示されていなかった。プロトコールにおけるこれらの変更は、当業者に明白ではなく、以下の変更を含む。
６）出発材料１から中間体２への２ステップ変換は、元々は第１のステップの中間体の単離を伴っていた。この工程は、出発材料１及び中間体２の間の中間体の単離がもはや必要でなくなるように短縮された。この２ステップ変換に対する更なる工程改善は、使用される揮発性のジエチルアミンの量の大きな低減を伴い、これは、安全性の改善であり、また、続く中間体２の単離の際にその除去を促進した。
７）スキームに示されていない、ＭＣＣ−ｙｎｅ（中間体８）の２ステップ調製は、元々は各ステップの後にクロマトグラフィー精製を伴ったが、両方のステップにおいて反応条件が変更され、中間体８及びその前駆体の両方の単離をクロマトグラフィーに頼ることなく、結晶化または沈殿によって行うことを可能にした。
８）出発材料３から中間体７への２ステップ変換は、元々は中間体６の単離を伴っていた。この工程は、中間体６の単離がもはや必要でなくなるように簡素化された。この２ステップ変換に対する更なる工程改善には、各ステップの後の分相数の減少（収率の増加、それに伴うエマルションの低減をもたらした）、ならびに脱保護に必要とされるＴＢＡＦの量の低減、それによってもたらされる純度プロファイルの改善が含まれた。中間体７の単離のためのクロマトグラフィー条件も改善されて、不純物の適切な分離及びカラムからの生成物の完全な回収を確実にした。
９）中間体７から中間体９への変換における元々の条件は、臭化銅（Ｉ）と共にトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）の使用を伴い、これらの条件は、中間体９のゆっくりとした分解の一因であるので、中間体９のはるかに良好な溶液安定性及び最終生成物ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のはるかに良好な全体的品質を提供する条件［硫酸銅（ＩＩ）、アスコルビン酸ナトリウム及び２，６−ルチジン］に代えた。
【００６０】
上記に記載された合成プロトコールにおける変更は、生成収率及び効率に大きな改善、ならびに最終生成物及び様々な中間ステップにおける汚染副産物の存在の減少をもたらした。汚染物質の減少は、更に、中間体合成反応において特定の精製ステップの簡素化または排除を可能にし、このことも収率及び効率を改善した。
【００６１】
ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８生成物が形成された後、腫瘍関連または他の疾患関連抗原に結合する抗体などの標的化分子に抱合させることができる。特定の実施形態において、二官能性薬物が、抗体結合基としてチオール反応性部分を含有する場合、標識される抗体のチオールは、チオール化試薬を使用することによって、還元システイン残基ではなく抗体のリシン基の側鎖に生じうる。ＭＡｂリシン基の修飾によりチオール基を抗体に導入する方法は、良く知られている（Ｗｏｎｇ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９１），ｐｐ  ２０−２２）。あるいは、還元剤のトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用する抗体の鎖間ジスルフィド結合の穏やかな還元は、抗体に７〜１０個のチオールを生じ、このことは、抗原結合領域から離れたＭＡｂの鎖間領域に複数の薬物部分を組み込む利点を有する。更に、ＴＣＥＰによって還元した後、還元された抗体を前精製する必要はなく、ジスルフィド還元抗体は、チオール反応性ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８にその場で抱合される。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、抗体とＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の抱合体は、数百グラムの抱合体を精製するため、２５〜３０透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）体積の抱合体配合緩衝液を使用して、５０，０００Ｄａ分子量カットオフ膜を用いる接線流濾過（ＴＦＦ）法により精製される。この方法は、高価で煩わしいサイズ排除及び疎水性クロマトグラフィーカラムクロによるマトグラフィー精製を用いる必要性を取り除く。
【００６３】
なお別の実施形態において、抱合体は、Ｇｏｏｄ生物学的緩衝液によってｐＨ６〜７．０で配合され、貯蔵用に凍結乾燥される。好ましくは、Ｇｏｏｄ緩衝液は、６〜７のｐＨ範囲、好ましくは６．５〜７のｐＨ範囲及び１０〜１００ｍＭ、好ましくは２５ｍＭの緩衝液濃度で、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）からなる群から選択される。最も好ましい配合緩衝液は、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５である。
【００６４】
更なる実施形態において、精製された抱合体は、トレハロース及びポリソルベート８０などの賦形剤と組み合わされ、凍結乾燥され、凍結乾燥物として−２０℃〜８℃の温度範囲で貯蔵される。
【００６５】
一般的な抗体技術
実質的にあらゆる標的抗原に対してモノクローナル抗体を調製する技術は、当該技術において良く知られている。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１，ｐａｇｅｓ  ２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）を参照すること。簡潔には、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射し、脾臓を取り出して、Ｂリンパ球を得て、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞に融合させて、ハイブリドーマを生成し、ハイブリドーマをクローン化し、抗原に対して抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対して抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することによって、得ることができる。ヒトの治療または診断に使用される抗体が望ましい場合、当業者は、対応するヒト抗原タンパク質またはペプチドが好ましくは抗体生成を誘導するために使用されることを理解する。
【００６６】
キメラまたはヒト化抗体の生成などの様々な技術は、抗体クローン化及び構築の手順を伴うことがある。目的の抗体の抗原結合ＶＫ（可変軽鎖）及びＶＨ（可変重鎖）配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ及びｃＤＮＡライブラリースクリーニングなどの様々な分子クローニング手順によって得ることができる。マウス抗体を発現する細胞からの抗体のＶ遺伝子を、ＰＣＲ増幅及び配列決定によってクローン化することができる。確実性を確認するため、クローンされたＶＬ及びＶＨ遺伝子を、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９））により記載されたように、キメラＡｂとして細胞培養物に発現させることができる。Ｖ遺伝子配列に基づいて、次にヒト化抗体を、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））により記載されたように設計及び構築することができる。
【００６７】
ｃＤＮＡは、マウス抗体を産生するあらゆる既知のハイブリドーマ系または形質移入細胞系から、一般的な分子クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ（１９８９））によって調製することができる。抗体のＶＫ配列は、プライマーＶＫ１ＢＡＣＫ及びＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：２８６（１９９３））に記載されている伸長プライマーセットを使用して増幅することができる。ＶＨ配列は、プライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））により記載されているマウスＩｇＧの定常領域にアニーリングするプライマーを使用して増幅することができる。ヒト化Ｖ遺伝子は、長オリゴヌクレオチドテンプレート合成とＰＣＲ増幅とを、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））に記載されているように組み合わせることによって構築することができる。
【００６８】
ＶＫのＰＣＲ産物を、ｐＢＲ３２７に基づいたステージングベクター（ｓｔａｇｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）などのステージングベクター、Ｉｇプロモーターを含有するＶＫｐＢＲ、シグナルペプチド配列及び好都合な制限部位にサブクローンすることができる。ＶＨのＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づいたＶＨｐＢＳなどの同様のステージングベクターにサブクローンすることができる。ＶＫ及びＶＨ配列をプロモーター及びシグナルペプチド配列と一緒に含有する発現カセットを、ＶＫｐＢＲ及びＶＨｐＢＳから切除し、ｐＫｈ及びｐＧ１ｇなどの適切な発現ベクターにそれぞれ連結することができる（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））。発現ベクターを、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体の産生をモニターするのに適した細胞及び上澄み液に同時形質移入することができる。あるいは、ＶＫ及びＶＨ発現カセットを切除し、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）により記載され、Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，８０：２６６０（１９９７））によっても示されているように、ｐｄＨＬ２などの単一発現ベクターにサブクローンすることができる。
【００６９】
代替的実施形態において、発現ベクターを、形質移入、無血清培地における増殖及び発現に前適応された宿主細胞に形質移入することができる。使用することができる例示的な細胞系には、Ｓｐ／ＥＥＥ、Ｓｐ／ＥＳＦ及びＳｐ／ＥＳＦ−Ｘ細胞系が含まれる。（例えば、米国特許第７，５３１，３２７号、同第７，５３７，９３０号及び同第７，６０８，４２５号を参照すること。それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。）これらの例示的な細胞系は、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞系に基づき、突然変異Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子が形質移入され、メトトレキセートに曝露されて、形質移入遺伝子配列が増幅され、タンパク質発現のために無血清細胞系に前適応されている。
【００７０】
キメラ及びヒト化抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えばマウス抗体の可変領域に置き換えられている、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む組み換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与されたとき、免疫原性の減少及び安定性の増加を示す。キメラ抗体を構築する方法は、当該技術において良く知られている（例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９）。
【００７１】
キメラモノクローナル抗体は、マウスＣＤＲをマウス免疫グロブリンの重及び軽可変鎖からヒト抗体の対応する可変ドメインに移行させることによってヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列に置き換えられる。ヒト化モノクローナルの安定性及び抗原特異性を保つため、１つ以上のヒトＦＲ残基がマウスの対応する残基に置き換えられていてもよい。ヒト化モノクローナル抗体を対象の治療処置に使用することができる。ヒト化モノクローナル抗体を産生する技術は、当該技術において良く知られている。（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７、Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９３，１５０：２８４４を参照すること。）
【００７２】
他の実施形態は、非ヒト霊長類抗体に関係しうる。ヒヒに治療上有用な抗体を生じる一般的な技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．のＷＯ９１／１１４６５号（１９９１年）及びＬｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０（１９９０）において見出すことができる。別の実施形態において、抗体はヒトモノクローナル抗体でありうる。そのような抗体は、下記に考察されているように、抗原投与に応答して特定のヒト抗体を産生するように改変された遺伝子導入マウスから得ることができる。
【００７３】
ヒト抗体
組み合わせ手法またはヒト免疫グロブリン座で形質転換された遺伝子導入マウスのいずれかを使用して完全ヒト抗体を産生する方法は、当該技術において知られている。（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８、Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６、Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４−５０を参照すること。それぞれ参照として本明細書に組み込まれる。）そのような完全ヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体より更に少ない副作用を示すこと及び本質的に内在性ヒト抗体としてインビボで機能することが予測される。特定の実施形態では、本方法及び手順をそのような技術により産生されるヒト抗体に利用することができる。
【００７４】
１つの代替案では、ファージ提示技術を使用して、ヒト抗体を生じることができる。（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０。参照として本明細書に組み込まれる。）ヒト抗体は、正常なヒトまたは癌などの特定の疾患状態を示すヒトから生じることができる（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。罹患した個人からヒト抗体を構築する利点は、循環抗体レパートリーが抗体を疾患関連抗原に向けるように偏向しうることである。
【００７５】
この方法論の１つの非限定例では、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）が、骨肉腫患者からヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージ提示ライブラリーを構築した。一般に、全ＲＮＡは循環血液中のリンパ球から得た（同書）。組み換えＦａｂを、μ、γ及びκ鎖抗体レパートリーからクローンし、ファージ提示ライブラリーに挿入した（同書）。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、重及び軽鎖免疫グロブリン配列に対して特定のプライマーを使用するＦａｂ  ｃＤＮＡライブラリーの作製に使用した。（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７。参照として本明細書に組み込まれる。）ライブラリーの構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．に従って実施した。（２０００，Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ｐｐ．９．１  ｔｏ  ９．２２。参照として本明細書に組み込まれる。）最終Ｆａｂフラグメントを制限エンドヌクレアーゼにより消費させ、バクテリオファージゲノムに挿入して、ファージ提示ライブラリーを作製した。そのようなライブラリーを標準的なファージ提示方法によって選別することができる。当業者は、この技術が単に例示的なものであること、ならびにファージ提示によりヒト抗体または抗体フラグメントを作製及び選別するあらゆる既知の方法が利用できることを認識する。
【００７６】
別の代替案において、ヒト抗体を産生するように遺伝子改変された遺伝子導入動物を使用して、上記に考察された標準的な免疫化プロトコールの使用により本質的にあらゆる免疫原標的に対して抗体を生じることができる。遺伝子導入マウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって記載されている。そのような系の非限定例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）からのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）である。（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３。参照として本明細書組み込まれる。）この動物及び類似の動物において、マウス抗体遺伝子は、不活性化されて機能性ヒト抗体遺伝子に置き換えられており、一方、残りのマウス免疫系は、元の状態のままである。
【００７７】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、大部分の可変領域配列をアクセサリー遺伝子及び制御配列と共に含むヒトＩｇＨ及びＩｇカッパ座の部分を含有する、生殖系列配置ＹＡＣ（酵母人工染色体）によって形質転換された。ヒト可変領域レパートリーを使用して、Ｂ細胞を産生する抗体を生じることができ、これを既知の技術により処理してハイブリドーマにすることができる。標的抗原の免疫化は正常な免疫応答によってヒト抗体を産生し、これを上記に考察された標準的技術によって採取及び／または産生することができる。そのような遺伝子導入マウスの様々な株が利用可能であり、それぞれ異なるクラスの抗体を産生することができる。遺伝子産生ヒト抗体は、治療可能性を有し、同時に正常なヒト抗体の薬物動態特性を保持することが示されている（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。当業者は、本組成物及び方法が特定の系の使用に限定されず、ヒト抗体を産生するように遺伝子改変された、あらゆる遺伝子導入マウスを利用できることを認識する。
【００７８】
抗体フラグメントの産生
抗体フラグメントは、例えば、従来の方法による抗体全体のペプシンまたはパパイン消費によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素切断によって、Ｆ（ａｂ’）２と示される５Ｓフラグメントをもたらすように産生されうる。このフラグメントを、チオール還元剤及び任意選択でスルフヒドリル基の遮断剤の使用により更に切断して、ジスルフィド連結の切断をもたらし、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを産生することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断は、２つの一価Ｆａｂフラグメン及び１つのＦｃフラグメントを産生する。抗体フラグメントを産生する例示的な方法は、米国特許第４，０３６，９４５号、米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，８９：２３０、Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｐａｇｅ  ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９１，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）に開示されている。
【００７９】
一価軽重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントの更なる切断、または他の酵素、キメラもしくは遺伝子技術などの他の抗体切断方法を、無傷の抗体により認識される抗原にフラグメントが結合する限り使用することもできる。例えば、Ｆｖフラグメントは、ＶＨ鎖とＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２６５９に記載されているように、非共有的でありうる。あるいは、可変領域を分子間ジスルフィド結合により連結する、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質で架橋することができる。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照すること。
【００８０】
好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーにより結合しているＶＨ及びＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列により結合しているＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって、調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、発現ベクターは続いてＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に導入される。組み換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。ｓｃＦｖを産生する方法は、当該技術において良く知られている。Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１及びＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照すること。
【００８１】
別の形態の抗体フラグメントは、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）であり、時々、単鎖抗体と呼ばれる。単一ドメイン抗体を産生する技術は、当該技術において良く知られている（例えば、Ｃｏｓｓｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００７，５１：２５３−５９、Ｓｈｕｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ０６，４３：１９１２−１９、Ｔａｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：２４７７４−７８０を参照すること）。他の種類の抗体フラグメントは、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６、Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，ｐａｇｅｓ  １６６−１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ  １３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照すること。
【００８２】
抗体の変異
特定の実施形態では、抗体のＦｃ部分などの抗体の配列を変異させて、血清半減期などの抱合体の生理学的特性を最適化することができる。タンパク質においてアミノ酸配列を置換する方法は、当該技術において広く知られており、例えば、部位指定突然変異誘発などである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，１９８９）。好ましい実施形態において、変異は、Ｆｃ配列における１つ以上のグリコシル化部位の付加または除去を伴いうる。（例えば、米国特許第６，２５４，８６８号。その実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。）他の好ましい実施形態では、Ｆｃ配列において特定のアミノ酸置換を行うことができる。（例えば、Ｈｏｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４１：３５５−６２、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：３４６−５６、Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：１７５９−６９、米国特許第７，２１７，７９７号。それぞれ参照として本明細書に組み込まれる。）
【００８３】
抗体アロタイプ
治療抗体の免疫原性は、注入反応の危険性の増大及び治療反応の継続期間の減少に関連する（Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：６０２−０８）。治療抗体が宿主に免疫応答を誘発する程度は、部分的には抗体のアロタイプによって決定されうる（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３−２１）。抗体アロタイプは、抗体の定常領域配列の特定の位置におけるアミノ酸配列変異に関係する。重鎖γ型定常領域を含有するＩｇＧ抗体のアロタイプは、Ｇｍアロタイプと名付けられている（１９７６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７：１０５６−５９）。
【００８４】
一般的なＩｇＧ１ヒト抗体では、最も多く見られるアロタイプはＧ１ｍ１である（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３−２１）。しかし、Ｇ１ｍ３アロタイプも、白色人種において頻繁に発生している（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｇ１ｍ１抗体は、Ｇ１ｍ３患者などの非Ｇ１ｍ１（ｎＧ１ｍ１）受容者に投与されたとき、免疫応答を誘発する傾向があるアロタイプ配列を含有することが報告されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。非Ｇ１ｍ１アロタイプ抗体は、Ｇ１ｍ１患者に投与されたとき、同じ免疫原性はない（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００８５】
ヒトＧ１ｍ１アロタイプは、重鎖ＩｇＧ１のＣＨ３配列において、アミノ酸のアスパラギン酸をＫａｂａｔ位置３５６及びロイシンをＫａｂａｔ位置３５８に含む。ｎＧ１ｍ１アロタイプは、アミノ酸のグルタミン酸をＫａｂａｔ位置３５６及びメチオニンをＫａｂａｔ位置３５８に含む。Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１のアロタイプは、両方とも、グルタミン酸残基をＫａｂａｔ位置３５７に含み、これらのアロタイプは、時々、ＤＥＬアロタイプ及びＥＥＭアロタイプと呼ばれる。Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１アロタイプ抗体の重鎖定常領域配列の非限定例が、例示的な抗体のリツキシマブ（配列番号８５）及びベルツズマブ（配列番号８６）について下記に示されている。
リツキシマブ重鎖可変領域配列（配列番号８５）
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ベルツズマブ重鎖可変領域（配列番号８６）
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００８６】
Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９，ｍＡｂｓ  １：１−７）は、ＩｇＧアロタイプの配列変異の特徴及びこれらの免疫原性に対する効果を総説した。彼らは、Ｇ１ｍ３アロタイプが、Ｇ１ｍ１７アロタイプにおけるＫａｂａｔ  ２１４のリシン残基と比較して、Ｋａｂａｔ位置２１４のアルギニン残基によって特徴決定されることを報告した。ｎＧ１ｍ１，２アロタイプは、Ｋａｂａｔ位置３５６のグルタミン酸、Ｋａｂａｔ位置３５８のメチオニン及びＫａｂａｔ位置４３１のアラニンによって特徴決定された。Ｇ１ｍ１，２アロタイプは、Ｋａｂａｔ位置３５６のアスパラギン酸、Ｋａｂａｔ位置３５８のロイシン及びＫａｂａｔ位置４３１のグリシンによって特徴決定された。重鎖定常領域配列変異体に加えて、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）は、Ｋｍ１アロタイプがＫａｂａｔ位置１５３のバリン及びＫａｂａｔ位置１９１のロイシンにより特徴決定され、Ｋｍ１，２アロタイプがＫａｂａｔ位置１５３のアラニン及びＫａｂａｔ位置１９１のロイシンにより特徴決定され、Ｋｍ３アロタイプがＫａｂａｔ１５３のアラニン及びＫａｂａｔ位置１９１のバリンにより特徴決定される、カッパ軽鎖定常領域におけるアロタイプ変異体を報告した。
【００８７】
治療抗体に関して、ベルツズマブ及びリツキシマブは、それぞれ、多種多様な血液学的悪性病変及び／または自己免疫性疾患の治療に使用される、ＣＤ２０に対するヒト化及びキメラＩｇＧ１抗体である。表１はリツキシマブとベルツズマブのアロタイプ配列を比較している。表１に示されているように、リツキシマブ（Ｇ１ｍ１７，１）はＤＥＬアロタイプＩｇＧ１であり、ベルツズマブのアルギニンと比べて、リツキシマブのリシンのＫａｂａｔ位置２１４（重鎖ＣＨ１）に追加の配列変異を有する。ベルツズマブは、リツキシマブより対象において免疫原性が少ないことが報告されており（例えば、Ｍｏｒｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：３３４６−５３、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１３：１０６２−７０、Ｒｏｂａｋ  ＆  Ｒｏｂａｋ，２０１１，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５：１３−２５を参照すること）、ヒト化抗体とキメラ抗体の差の原因となる効果である。しかし、ＥＥＭ及びＤＥＬアロタイプにおけるアロタイプの差が、ベルツズマブの免疫原性の低下の理由である可能性もある。
【表１】
2018520148.tif 000008
【００８８】
ｎＧ１ｍ１遺伝子型の個人において治療抗体の免疫原性を低減するため、Ｋａｂａｔ２１４のアルギニンによって特徴決定されるＧ１ｍ３アロタイプ、ならびにＫａｂａｔ位置３５６のグルタミン酸、Ｋａｂａｔ位置３５８のメチオニン及びＫａｂａｔ位置４３１のアラニンによって特徴決定されるｎＧ１ｍ１，２ヌルアロタイプに対応する抗体のアロタイプを選択することが望ましい。驚くべきことに、Ｇ１ｍ３抗体の長期間にわたる反復皮下投与は、有意な免疫応答をもたらさなかったことが見出された。代替的実施形態において、Ｇ１ｍ３アロタイプに共通するヒトＩｇＧ４重鎖は、Ｋａｂａｔ２１４にアルギニン、Ｋａｂａｔ３５６にグルタミン酸、Ｋａｂａｔ３５９にメチオニン及びＫａｂａｔ４３１にアラニンを有する。免疫原性がこれらの位置の残基に少なくとも部分的に関係すると思われるので、治療抗体にヒトＩｇＧ４重鎖定常領域配列を使用することも、好ましい実施形態である。Ｇ１ｍ３  ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体の組み合わせを、治療的投与に使用することもできる。
【００８９】
既知の抗体
様々な実施形態において、本方法及び組成物は、当該技術に既知の様々な抗体のいずれかを利用することができる。使用される抗体は、多数の既知の供給会社から購入することができる。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。腫瘍関連抗原が含まれるが、これに限定されない様々な疾患標的に対する多数の抗体が、ＡＴＣＣに寄託されている、ならびに／または公表された可変領域配列を有し、本方法及び組成物による使用に利用可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号、同第７，２８２，５６７号、同第７，１５１，１６４号、同第７，０７４，４０３号、同第７，０６０，８０２号、同第７，０５６，５０９号、同第７，０４９，０６０号、同第７，０４５，１３２号、同第７，０４１，８０３号、同第７，０４１，８０２号、同第７，０４１，２９３号、同第７，０３８，０１８号、同第７，０３７，４９８号、同第７，０１２，１３３号、同第７，００１，５９８号、同第６，９９８，４６８号、同第６，９９４，９７６号、同第６，９９４，８５２号、同第６，９８９，２４１号、同第６，９７４，８６３号、同第６，９６５，０１８号、同第６，９６４，８５４号、同第６，９６２，９８１号、同第６，９６２，８１３号、同第６，９５６，１０７号、同第６，９５１，９２４号、同第６，９４９，２４４号、同第６，９４６，１２９号、同第６，９４３，０２０号、同第６，９３９，５４７号、同第６，９２１，６４５号、同第６，９２１，６４５号、同第６，９２１，５３３号、同第６，９１９，４３３号、同第６，９１９，０７８号、同第６，９１６，４７５号、同第６，９０５，６８１号、同第６，８９９，８７９号、同第６，８９３，６２５号、同第６，８８７，４６８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，８８４，５９４号、同第６，８８１，４０５号、同第６，８７８，８１２号、同第６，８７５，５８０号、同第６，８７２，５６８号、同第６，８６７，００６号、同第６，８６４，０６２号、同第６，８６１，５１１号、同第６，８６１，２２７号、同第６，８６１，２２６号、同第６，８３８，２８２号、同第６，８３５，５４９号、同第６，８３５，３７０号、同第６，８２４，７８０号、同第６，８２４，７７８号、同第６，８１２，２０６号、同第６，７９３，９２４号、同第６，７８３，７５８号、同第６，７７０，４５０号、同第６，７６７，７１１号、同第６，７６４，６８８号、同第６，７６４，６８１号、同第６，７６４，６７９号、同第６，７４３，８９８号、同第６，７３３，９８１号、同第６，７３０，３０７号、同第６，７２０，１５５号、同第６，７１６，９６６号、同第６，７０９，６５３号、同第６，６９３，１７６号、同第６，６９２，９０８号、同第６，６８９，６０７号、同第６，６８９，３６２号、同第６，６８９，３５５号、同第６，６８２，７３７号、同第６，６８２，７３６号、同第６，６８２，７３４号、同第６，６７３，３４４号、同第６，６５３，１０４号、同第６，６５２，８５２号、同第６，６３５，４８２号、同第６，６３０，１４４号、同第６，６１０，８３３号、同第６，６１０，２９４号、同第６，６０５，４４１号、同第６，６０５，２７９号、同第６，５９６，８５２号、同第６，５９２，８６８号、同第６，５７６，７４５号、同第６，５７２，８５６号、同第６，５６６，０７６号、同第６，５６２，６１８号、同第６，５４５，１３０号、同第６，５４４，７４９号、同第６，５３４，０５８号、同第６，５２８，６２５号、同第６，５２８，２６９号、同第６，５２１，２２７号、同第６，５１８，４０４号、同第６，５１１，６６５号、同第６，４９１，９１５号、同第６，４８８，９３０号、同第６，４８２，５９８号、同第６，４８２，４０８号、同第６，４７９，２４７号、同第６，４６８，５３１号、同第６，４６８，５２９号、同第６，４６５，１７３号、同第６，４６１，８２３号、同第６，４５８，３５６号、同第６，４５５，０４４号、同第６，４５５，０４０号、同第６，４５１，３１０号、同第６，４４４，２０６号、同第６，４４１，１４３号、同第６，４３２，４０４号、同第６，４３２，４０２号、同第６，４１９，９２８号、同第６，４１３，７２６号、同第６，４０６，６９４号、同第６，４０３，７７０号、同第６，４０３，０９１号、同第６，３９５，２７６号、同第６，３９５，２７４号、同第６，３８７，３５０号、同第６，３８３，７５９号、同第６，３８３，４８４号、同第６，３７６，６５４号、同第６，３７２，２１５号、同第６，３５９，１２６号、同第６，３５５，４８１号、同第６，３５５，４４４号、同第６，３５５，２４５号、同第６，３５５，２４４号、同第６，３４６，２４６号、同第６，３４４，１９８号、同第６，３４０，５７１号、同第６，３４０，４５９号、同第６，３３１，１７５号、同第６，３０６，３９３号、同第６，２５４，８６８号、同第６，１８７，２８７号、同第６，１８３，７４４号、同第６，１２９，９１４号、同第６，１２０，７６７号、同第６，０９６，２８９号、同第６，０７７，４９９号、同第５，９２２，３０２号、同第５，８７４，５４０号、同第５，８１４，４４０号、同第５，７９８，２２９号、同第５，７８９，５５４号、同第５，７７６，４５６号、同第５，７３６，１１９号、同第５，７１６，５９５号、同第５，６７７，１３６号、同第５，５８７，４５９号、同第５，４４３，９５３号、同第５，５２５，３３８号を参照すること。それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。これらは、単に例示的なものであり、多種多様な他の抗体及びそれらのハイブリドーマが当該技術において知られている。当業者は、ほとんどの抗体関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマが、目的の選択された疾患関連標的に対する抗体についてＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ及び／またはＵＳＰＴＯデータベースを簡単に検索することによって得られることを認識する。クローン抗体の抗原結合ドメインを、当該技術に周知の標準的な技術の使用によって増幅する、切除する、発現ベクターに連結する、適応宿主細胞に形質移入する及びタンパク質産生に使用することができる。（例えば、米国特許第７，５３１，３２７号、同第７，５３７，９３０号、同第７，６０８，４２５号及び同第７，７８５，８８０号を参照すること。それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。）
【００９０】
本方法及び組成物の範囲内で使用されうる特定の抗体には、ＬＬ１（抗−ＣＤ７４）、ＬＬ２またはＲＦＢ４（抗−ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗−ＣＤ２０）、リツキシマブ（抗−ＣＤ２０）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗−ＣＤ２０）、ランブロリズマブ（抗−ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗−ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗−ＣＴＬＡ−４）、ＲＳ７（抗−上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１、ＴＲＯＰ−２としても知られている））、ＰＡＭ４またはＫＣ４（両方とも抗−ムチン）、ＭＮ−１４（抗−癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅまたはＣＥＡＣＡＭ５としても知られている）、ＭＮ−１５またはＭＮ−３（抗−ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗−結腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ  ３１（抗−アルファ−フェトプロテイン）、Ｒ１（抗−ＩＧＦ−１Ｒ）、Ａ１９（抗−ＣＤ１９）、ＩＭＭＵ−Ｈ２Ｂ（抗−Ｈ２Ｂ）、ＩＭＭＵ−Ｈ３（抗−Ｈ３）、ＩＭＭＵ−Ｈ４（抗−Ｈ４）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１またはＨｕＪ５９１（抗−ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗−ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗−ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ  ＭＡｂ）、Ｌ２４３（抗−ＨＬＡ−ＤＲ）、アレムツズマブ（抗−ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗−ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗−ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗−ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗−ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗−ＥＧＦＲ）、トシツモマブ（抗−ＣＤ２０）、ＰＡＭ４（別名クリバツズマブ（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、抗−ムチン）及びトラスツズマブ（抗−ＥｒｂＢ２）が含まれるが、これらに限定されない。そのような抗体は当該技術において知られている。（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号、同第５，８７４，５４０号、同第６，１０７，０９０号、同第６，１８３，７４４号、同第６，３０６，３９３号、同第６，６５３，１０４号、同第６，７３０．３００号、同第６，８９９，８６４号、同第６，９２６，８９３号、同第６，９６２，７０２号、同第７，０７４，４０３号、同第７，２３０，０８４号、同第７，２３８，７８５号、同第７，２３８，７８６号、同第７，２５６，００４号、同第７，２８２，５６７号、同第７，３００，６５５号、同第７，３１２，３１８号、同第７，５８５，４９１号、同第７，６１２，１８０号、同第７，６４２，２３９号及び米国特許出願公開第２００５０２７１６７１号、同第２００６０１９３８６５号、同第２００６０２１０４７５号、同第２００７００８７００１号、米国特許出願第１４／１８０，６４６号。それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。）使用される特定の既知の抗体には、ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，１５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ−３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第５，７８９，５５４号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７２号）、ｈＬ２４３（米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７��，９２４号）、ｈＭＮ−１５（米国特許第８，２８７，８６５号）、ｈＲ１（米国特許出願第１３／６８８，８１２号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（米国特許第７，５４１，４４０号）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（米国特許出願第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣにＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託）、ならびにＤ２／Ｂ（ＷＯ第２００９／１３０５７５号）が含まれ、引用された特許または出願の内容は、それぞれ、図面及び実施例セクションに関して参照として本明細書に組み込まれる。
【００９１】
記載されている抱合体を使用して標的化されうる他の有用な抗原には、炭酸脱水酵素ＩＸ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体特異的抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ  ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ４抗原、膵臓癌ムチン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ−抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、癌遺伝子マーカー、ならびに癌遺伝子産物（例えば、Ｓｅｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６，１２：５０２３−３２、Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，１７８：１９７５−７９、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００５，５４：１８７−２０７を参照すること）が含まれる。
【００９２】
フローサイトメトリーによって示され、薬剤抱合免疫療法に適した抗体を選択するように誘導されうる、造血悪性細胞に対する適切な抗原標的の包括的な分析（クラスター命名（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）またはＣＤ）は、Ｃｒａｉｇ  ａｎｄ  Ｆｏｏｎ，Ｂｌｏｏｄ、２００８年１月１５日オンライン公開、ＤＯＬ  １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００７−１１−１２０５３５である。
【００９３】
ＣＤ６６抗原は、類似した構造を有する５つの異なる糖タンパク質のＣＤ６６ａ〜ｅからなり、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーメンバーのＢＣＧ、ＣＧＭ６、ＮＣＡ、ＣＧＭ１及びＣＥＡによりそれぞれコードされている。これらのＣＤ６６抗原（例えば、ＣＥＡＣＡＭ６）は、主に顆粒球、消化管の正常な上皮細胞及び様々な組織の腫瘍細胞において発現する。また、ＮＹ−ＥＳＯ−１などの精巣癌抗原（Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；１２０（１１）：２４１１−７）、ならびに骨髄性白血病における（Ｋｏｚｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２００５；１６３（１）：６２−７）、同様にＢ細胞疾患におけるＣＤ７９ａ、及び非ホジキンリンパ腫のＣＤ７９ｂ（Ｐｏｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１０（２）：６１６−６２３）が癌に適した標的として含まれる。多数の前述の抗原が、米国特許仮出願第６０／４２６，３７９号、表題「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、２００２年１１月１５日出願に開示されている。より治療抵抗性のある悪性前駆細胞個体群の原因であるとされる癌幹細胞（Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００７；９９：１４３５−４０）は、前立腺癌（Ｍａｉｔｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐｏｓ．Ｐｒｏｃ．２００６；５：１５５−７９）、非小細胞肺癌（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００７；１２２（３）：３８５−９１）及び神経膠芽腫（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（９）：４０１０−５）におけるＣＤ１３３、ならびに結腸直腸癌（Ｄａｌｅｒｂａ  ｅｒ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（２４）１０１５８−６３）、膵癌（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（３）：１０３０−７）及び頭頸部扁平上皮癌（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（３）９７３−８）におけるＣＤ４４など、特定の種類の癌において標的にされうる抗原を有する。乳癌療法に有用な別の標的は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００３；３７５：５１−９）に記載されているＬＩＶ−１抗原である。
【００９４】
多発性骨髄腫の治療では、適切な標的化抗体が、例えば、ＣＤ３８及びＣＤ１３８（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００６；１２（１１−１２）：３４５−３４６、Ｔａｓｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４（１２）：３６８８−９６）、ＣＤ７４（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、同上）、ＣＳ１（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２（４）：１３２９−３７）、ならびにＣＤ４０（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（１３）：５８９８−５９０６）に対して記載されている。
【００９５】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、自然及び適応免疫、ならびにアポトーシスの重要な制御因子である。ＣＤ７４はＭＩＦの内在性受容体であることが報告されている（Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７−７６）。ＭＩＦ媒介細胞内経路に対する拮抗的抗ＣＤ７４抗体の治療効果を、膀胱、前立腺、乳房、肺、結腸及び慢性リンパ性白血病の癌（例えば、Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：３４、Ｓｈａｃｈａｒ  ＆  Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６−５４）、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスなどの自己免疫性疾患（Ｍｏｒａｎｄ  ＆  Ｌｅｅｃｈ，２００５，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １０：１２−２２、Ｓｈａｃｈａｒ  ＆  Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６−５４）、腎同種移植片拒絶などの腎臓疾患（Ｌａｎ，２００８，Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０９：ｅ７９−８３）、ならびに多数の炎症性疾患（Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  ｅｐｕｂ  Ｍａｒｃｈ  ２２，２００９、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ  １０：３３）などの広範囲の疾患状態の治療に使用することができる。ミラツズマブ（ｈＬＬ１）は、ＭＩＦ媒介疾患の処置に治療的に使用される例示的な抗ＣＤ７４抗体である。
【００９６】
抗ＴＮＦ−α抗体は、当該技術において知られており、自己免疫性疾患、免疫機能不全（例えば、移植片対宿主病、臓器移植拒絶）、または糖尿病などの免疫疾患の治療に使用することができる。ＴＮＦ−αに対する既知の抗体には、ヒト抗体ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：８８１−８５）、マウス抗体ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ及びＭ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ  ＰＡ）、セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ならびにアダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）が含まれる。これら及び他の多くの既知の抗ＴＮＦ−α抗体を本方法及び組成物に使用することができる。免疫調節異常または自己免疫性疾患の治療に使用される他の抗体には、ベルツズマブ、エプラツズマブ、ミラツズマブ、またはｈＬ２４３などの抗Ｂ細胞抗体；トシリズマブ（抗−ＩＬ−６受容体）；バシリキシマブ（抗−ＣＤ２５）；ダクリズマブ（抗−ＣＤ２５）；エファリズマブ（抗−ＣＤ１１ａ）；ムロモナブ−ＣＤ３（抗−ＣＤ３受容体）；抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）；ナタリズマブ（抗−α４インテグリン）及びオマリズマブ（抗−ＩｇＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
チェックポイント阻害剤抗体が、主に癌治療に使用されている。免疫チェックポイントは、免疫系応答の自己寛容を維持し、免疫系応答の程度を調節して、末梢組織の損傷を最小限にすることに関与している免疫系の阻害経路を指す。しかし、腫瘍細胞も、免疫系チェックポイントを活性化して、腫瘍組織に対する免疫応答の有効性を減少させることができる。細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られている）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＣＤ２７９としても知られている）及びプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤＬ−１、ＣＤ２７４としても知られている）に対する例示的なチェックポイント阻害剤抗体を、１つ以上の他の作用物質と組み合わせて使用して、疾患細胞、組織、または病原体に対する免疫応答の有効性を向上させることができる。例示的な抗ＰＤ１抗体には、ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ＡＭＰ−２２４（ＭＥＲＣＫ）及びピディリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥＴＥＣＨ  ＬＴＤ．）が含まれる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１−１４）及びＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）によって市販されている。例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、ＭＤＸ−１１０５（ＭＥＤＡＲＥＸ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）及びＢＭＳ−９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）が含まれる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、また、例えばＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（ＭＩＨ１）によって市販されている。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体には、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレメリムマブ（ＰＦＩＺＥＲ）が含まれる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３４０９０）、ＳＩＮＯ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＣ．（１１１５９−Ｈ０３Ｈ、１１１５９−Ｈ０８Ｈ）及びＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＰＩＥＲＣＥ（ＰＡ５−２９５７２、ＰＡ５−２３９６７、ＰＡ５−２６４６５、ＭＡ１−１２２０５、ＭＡ１−３５９１４）によって市販されている。イピリムマブは、最近、転移性黒色腫の治療用にＦＤＡ認可を受けた（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １１：８９）。
【００９８】
別の好ましい実施形態では、急速に内部移行し、次に再発現され、処理され、細胞表面に提示されて、細胞による循環抱合体の連続取り込み及び付着成長（ａｃｃｒｅｔｉｏｎ）を可能にする抗体が、使用される。最も好ましい抗体／抗原対の例は、抗ＣＤ７４  ＭＡｂ（不変鎖、クラスＩＩ特異的シャペロン、Ｉｉ）のＬＬ１である。（例えば、米国特許第６，６５３，１０４号、同第７，３１２，３１８号を参照すること。それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。）ＣＤ７４抗原は、Ｂ細胞リンパ腫（多発性骨髄腫を含む）及び白血病、特定のＴ細胞リンパ腫、黒色腫、結腸、肺及び腎臓の癌、神経膠芽腫、ならびに特定の他の癌において高度に発現される（Ｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９８：２９６−３０２（１９９９））。癌におけるＣＤ７４抗体の使用についての総括は、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｓｅｐ  １５；１３（１８  Ｐｔ  ２）：５５５６ｓ−５５６３ｓに含まれ、参照として本明細書に組み込まれる。
【００９９】
抗ＣＤ７４抗体により好ましく治療される疾患には、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、黒色腫、肺、腎臓、結腸の癌、多形神経膠芽腫、組織球腫、骨髄性白血病及び多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されない。標的細胞の表面におけるＣＤ７４抗原の短時間の連続発現、続く抗原の内部移行及び抗原の再発現は、標的化ＬＬ１抗体が、担持する任意の化学療法部分と共に内部移行することを可能にする。このことは、高い治療的濃度のＬＬ１−化学療法薬抱合体が、そのような細胞の内部に蓄積することを可能にする。内部移行したＬＬ１−化学療法薬抱合体は、リソソーム及びエンドソームにより循環され、化学療法部分が標的細胞内に活性形態で放出される。
【０１００】
別の好ましい実施形態では、病原体に対する抗体が知られているので、治療抱合体を病原体に対して使用することができる。例えば、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫の感染を含み、例えば細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、真菌及びウイルスなどの病原体により引き起こされる感染性病変により産生された、または感染性病変と関連するマーカーに特異的に結合する抗体及び抗体フラグメント、ならびにそのような微生物に関連する抗原及び産物が、とりわけ、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第３，９２７，１９３号、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，３３１，６４７号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４６８，４５７号、同第４，４４４，７４４号、同第４，８１８，７０９号及び同第４，６２４，８４６号（それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる）、ならびに上記に引用されたＲｅｉｃｈｅｒｔ  ａｎｄ  Ｄｅｗｉｔｚに開示されている。感染性生物に対する抗体（抗毒素及び抗ウイルス性抗体）、ならびに他の標的を網羅する総説は、Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；９３（１）：５−１５に含まれており、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
好ましい実施形態において、病原体は、ＨＩＶウイルス、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ライム病スピロヘータ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスＩ、単純ヘルペスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、サルウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ、Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ、Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ及びＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群から選択され、これらは米国特許第６，４４０，４１６号に開示されており、この実施例セクションが参照として本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
より好ましい実施形態では、抗ｇｐ１２０及び他のそのような抗ＨＩＶ抗体を含む本発明の薬物抱合体をＡＩＤＳ患者のＨＩＶの治療薬として使用することができ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する抗体の薬物抱合体は、薬物耐性結核における治療薬として適している。抗ｇｐ１２０  ＭＡｂ（抗ＨＩＶ  ＭＡｂ）とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素などの毒素との融合タンパク質が、抗ウイルス特性について検査されている（Ｖａｎ  Ｏｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，５：７５−９１，１９９８）。ＡＩＤＳ患者においてＨＩＶ感染を治療する試みは、恐らく不十分な有効性または許容されない宿主毒素に起因して失敗した。本発明のＣＰＴ薬物抱合体は、有利なことに、そのようなタンパク質毒素の毒性副作用を欠いており、したがって、有利なことにＡＩＤＳ患者のＨＩＶ感染の治療に使用される。これらの薬物抱合体を単独で与えることができる、またはそのような患者に単独で与えられたときに有効である他の抗生物質もしくは治療剤と組み合わせて与えることができる。候補の抗ＨＩＶ抗体には、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＡＩＤＳ．２００６  Ｏｃｔ  ３；２０（１５）：１９１１−５）に記載されているＰ４／１０抗エンベロープ抗体、ならびにＰｏｌｙｍｕｎ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）により記載及び販売され、全て参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８３１，０３４号、米国特許第５，９１１，９８９号、Ｖｃｅｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  ２００７；２１（１６）：２１６１−２１７０及びＪｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３−９においても記載されている抗ＨＩＶ抗体が含まれる。ＨＩＶに対する好ましい標的化作用物質は、抵抗性を克服するため、これらの抗体の様々な組み合わせである。
【０１０３】
自己免疫性疾患または免疫系機能不全（例えば、移植片対宿主病、臓器移植拒絶）の治療に使用される抗体は、当該技術において知られており、開示されている方法及び組成物を使用してＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８に抱合されうる。自己免疫性／免疫機能不全疾患の治療に使用される抗体は、ＢＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−６、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５５、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロン、ＩＬ−６及びＨＬＡ−ＤＲが含まれるが、これらに限定されない例示的な抗原に結合することができる。上記に考察されたこれら及び他の標的抗原に結合する抗体を、自己免疫性または免疫機能不全疾患の治療に使用することができる。免疫抱合体により治療することができる自己免疫性疾患には、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維性肺胞炎が含まれうる。
【０１０４】
疾患関連抗原に対する上記に考察された抗体及び他の既知の抗体を、本方法及び組成物の実施にＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫抱合体として使用することができる。
【０１０５】
二重特異性及び多特異性抗体
二重特異性抗体は、多数の生物医学的用途に有用である。例えば、腫瘍細胞表面抗原及びＴ細胞表面受容体への結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞による特定の腫瘍細胞の溶解を誘導することができる。神経膠腫及びＴ細胞のＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体は、ヒト患者における脳腫瘍の治療に成功裏に使用されている（Ｎｉｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９０；３５５：３６８−３７１）。特定の実施形態において、本明細書に開示されている治療剤抱合のための技術及び組成物は、抗体部分として二重特異性または多特異性抗体を使用することができる。
【０１０６】
二重特異性または多特異性抗体を産生する多数の方法が知られており、例えば、米国特許第７，４０５，３２０号に開示されており、その実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。二重特異性抗体は、それぞれ異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体を産生する２つの異なるハイブリドーマの融合を伴う、クアドローマ法によって産生されうる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３；３０５：５３７−５４０）。
【０１０７】
二重特異性抗体を産生する別の方法は、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して、２つの異なるモノクローナル抗体を化学的に繋ぎ止めるている（Ｓｔａｅｒｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８５；３１４：６２８−６３１、Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８５；３１６：３５４−３５６）。二重特異性抗体は、２つの親モノクローナル抗体をそれぞれ対応する半分子に低減し、次に混合し、再酸化させて、ハイブリッド構造を得ることによっても産生することができる（Ｓｔａｅｒｚ  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８６；８３：１４５３−１４５７）。別の代替案は、適切なリンカーを使用して２または３つの別々に精製されたＦａｂ’フラグメントを化学的に架橋することを伴う。（例えば、ヨーロッパ特許出願第０４５３０８２号を参照すること。）
【０１０８】
他の方法には、特有の選択可能マーカーを、レトロウイルス誘導シャトルベクターを介して対応する親ハイブリドーマに遺伝子移入すること（ＤｅＭｏｎｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９０，８７：２９４１−２９４５）、またはハイブリドーマ細胞系を、異なる抗体の重及び軽鎖遺伝子を含有する発現プラスミドに形質移入することによって、ハイブリッドハイブリドーマの生成効率を改善することが含まれる。
【０１０９】
同族ＶＨ及びＶＬドメインを、適切な組成及び長さ（通常、１２個を超えるアミノ酸残基からなる）ペプチドリンカーで結合して、結合活性を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。ｓｃＦｖの製造方法は、米国特許第４，９４６，７７８号及び米国特許第５，１３２，４０５号に開示されており、それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。ペプチドリンカーの長さを１２個未満の残基に低減することは、同じ鎖にあるＶＨ及びＶＬドメインの対合を防止し、ＶＨ及びＶＬドメインと、他の鎖の相補的ドメインとの対合を強制して、機能性多量体の形成をもたらす。３〜１２個のアミノ酸残基のリンカーで結合しているＶＨ及びＶＬドメインのポリペプチド鎖は、主に二量体（二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）と呼ばれる）を形成する。０〜２個のアミノ酸残基のリンカーによって、三量体（三特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）と呼ばれる）及び四量体（四特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）と呼ばれる）が優先されるが、オリゴマー化の正確なパターンは、リンカーの長さに加えて、組成とＶドメインの配向（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）によって決まると思われる。
【０１１０】
これらの多特異性または二重特異性抗体を産生する技術は、低い収率、精製の必要性、低い安定性、または労働集約的技術として様々な難点を示している。最近では、「ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）」（ＤＮＬ（商標））として知られている二重特異性構築物を使用して、実質的にあらゆる所望の抗体、抗体フラグメント及び他のエフェクター分子の組み合わせを産生している。（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号、同第７，５２１，０５６号、同第７，５３４，８６６号、同第７，５２７，７８７号及び米国特許出願第１１／９２５，４０８号を参照すること。それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。）この技術は、アンカリングドメイン（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）（ＡＤ）と呼ばれる相補的タンパク質結合ドメイン、ならびに二量体化及びドッキングドメイン（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）（ＤＤＤ）を利用し、これらは互いに結合して、二量体、三量体、四量体、五量体及び六量体にわたる複合体構造の組立を可能にする。これらは、広範囲の精製を必要とすることなく、高い収率で安定した複合体を形成する。この技術は、単一特異性、二重特異性、または多特異性抗体の組立を可能にする。二重特異性または多特異性抗体を作製する当該技術に既知の技術のいずれかを、本請求の方法の実施に利用することができる。
【０１１１】
癌療法に好ましいような使用の組み合わせには、ＣＤ２０＋ＣＤ２２抗体、ＣＤ７４＋ＣＤ２０抗体、ＣＤ７４＋ＣＤ２２抗体、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）＋ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ）抗体、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）＋ＣＥＡＣＡＭ５抗体、ＥＧＰ−１（例えば、ＲＳ−７）＋ＩＬＧＦ抗体、ＣＥＡＣＡＭ５＋ＥＧＦＲ抗体が含まれる。そのような抗体を組み合わせて使用する必要があるばかりでなく、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど様々な形態の融合タンパク質として組み合わせることもでき、米国特許第６，０８３，４７７号、同第  ６，１８３，７４４号及び同第６，９６２，７０２号、ならびに米国特許出願公開第２００３０１２４０５８号、同第２００３０２１９４３３号、同第２００４０００１８２５号、同第２００４０２０２６６６号、同第２００４０２１９１５６号、同第２００４０２１９２０３号、同第２００４０２３５０６５号、同第２００５０００２９４５号、同第２００５００１４２０７号、同第２００５００２５７０９号、同第２００５００７９１８４号、同第２００５０１６９９２６号、同第２００５０１７５５８２号、同第２００５０２４９７３８号、同第２００６００１４２４５号及び同第２００６００３４７５９号に開示されており、それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
事前標的化（Ｐｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）
二重特異性抗体または多特異性抗体を、事前標的化技術に利用することもできる。事前標的化は、骨髄などの正常組織への望ましくない毒性に起因する直接標的化抗体の遅い血中クリアランスを解決するために元々開発された、多段階処理である。事前標的化では、放射性核種または他の治療剤が、数分以内に血中から排除される小型送達分子（標的化可能構築物（ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ））に結合される。事前標的化二重特異性抗体または多特異性抗体は、標的化可能構築物と標的抗原への結合部位を有し、最初に投与され、遊離抗体は循環から排除されることが可能であり、次に標的化可能構築物が投与される。
【０１１３】
事前標的化方法は、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，８６３，７１３号、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６，１９８８、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４，１９８７、Ｏｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８，１９８８、Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１，１９８８、Ｓｉｎｉｔｓｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６，１９８９、Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１，１９９０、Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８：１６７，１９９１、Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５９６０，１９９１、Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１，１９９１、米国特許第５，２５６，３９５号、Ｓｔｉｃｋｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０，１９９１、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３１１９，１９９１、米国特許第６，０７７，４９９号、同第７，０１１，８１２号、同第７，３００，６４４号、同第７，０７４，４０５号、同第６，９６２，７０２号、同第７，３８７，７７２号、同第７，０５２，８７２号、同第７，１３８，１０３号、同第６，０９０，３８１号、同第６，４７２，５１１号、同第６，９６２，７０２号及び同第６，９６２，７０２号に記載されており、それぞれ参照として本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
対象において疾患または障害を治療または診断する事前標的化方法は、（１）二重特異性抗体または抗体フラグメントを対象に投与すること、（２）任意選択で排除組成物（ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を対象に投与して、組成物により抗体を循環から排除させること、（３）ＳＮ−３８などの１つ以上のキレート剤、または化学的に結合した治療もしくは診断剤を含有する標的化可能構築物を、対象に投与することによって、提供されうる。
【０１１５】
標的化可能構築物
特定の実施形態において、事前標的化に使用される１つ以上の治療または診断剤により標識された標的化可能構築物ペプチドは、標的化可能構築物ペプチドへの１つ以上の結合部位及び疾患または状態に関連する標的抗原への１つ以上の結合部位を有する二重特異性抗体に結合するように選択されうる。二重特異性抗体を、抗体が最初に対象に投与される事前標的化技術に使用することができる。二重特異性抗体が標的抗原に結合し、非結合抗体が循環から排除されるために、十分な時間が許容されうる。次に標識ペプチドなどの標的化可能構築物を対象に投与し、二重特異性抗体に結合させ、疾患細胞または組織を局在化させることができる。
【０１１６】
そのような標的化可能構築物は多様な構造である可能性があり、標的化可能構築物に高い親和性で結合する抗体またはフラグメントの利用可能性のみならず、事前標的化方法及び二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）または多特異性抗体の範囲内で使用されたときの急速なインビボクリアランスによっても選択されうる。疎水性作用物質は、強力な免疫応答を誘発するために最良のものであり、一方、親水性作用物質は、急速なインビボクリアランスのために好ましい。したがって、疎水性と親水性の特徴の均衡が確立される。これは、親水性キレート剤を使用して、多くの有機部分の固有の疎水性を相殺することによって部分的に達成されうる。また、逆の溶液特性を有する標的化可能構築物のサブユニット、例えばペプチドを選択してもよく、これは、いくつかが疎水性であり、いくつかが親水性であるアミノ酸を含有する。
【０１１７】
僅か２個のアミノ酸残基、好ましくは２〜１０個の残基を有するペプチドを、使用することができ、キレート剤などの他の部分に結合させることもできる。リンカーは、好ましくは５０，０００ダルトン未満、有利には約２０，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、または５，０００ダルトン未満の分子量を有する低分子量抱合体であるべきである。とりわけ、標的化可能構築物ペプチドは、例えば二重特異性抗体への結合のために、４個以上の残基及び１つ以上のハプテンを有する。例示的なハプテンには、Ｉｎ−ＤＴＰＡ（インジウム−ジエチレントリアミン五酢酸）またはＨＳＧ（ヒスタミンスクシニルグリシン）が含まれうる。標的化可能構築物は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸）、ＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（［２−（４，７−ビスカルボキシメチル［１，４，７］トリアザシクロノナン−１−イル−エチル］−２−カルボニルメチル−アミノ］酢酸）、または他の既知のキレート部分などの１つ以上のキレート部分を含むこともできる。キレート部分を、例えば、治療用及び／または診断用の放射性核種、常磁性イオン、または造影剤への結合に使用することができる。
【０１１８】
標的化可能構築物は、非天然アミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸を主鎖構造に含んで、ペプチドのインビボにおける安定性を増加させることもできる。代替的実施形態では、非天然アミノ酸またはペプチドから構築されるものなどの他の主鎖構造を使用することができる。
【０１１９】
標的化可能構築物として使用されるペプチドは、固相支持体、ならびに反復的直交脱保護及びカップリング（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）の標準的技術を使用して、自動ペプチド合成機により都合良く合成される。後にキレート部分または他の作用物質の抱合に使用されるペプチド中の遊離アミノ基は、Ｂｏｃ基などの標準的保護基により有利に遮断され、一方、Ｎ末端残基をアセチル化して、血清安定性を増加させることができる。そのような保護基は、当業者に良く知られている。Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９９（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照すること。ペプチドが二重特異性抗体系の範囲内で後に使用されるために調製される場合、これらは有利には樹脂から切断され、対応するＣ末端アミドを生じて、インビボにおけるカルボキシペプチダーゼ活性を阻害する。
【０１２０】
二重特異性抗体による事前標的化が使用される場合、抗体は、標的組織により産生された、または、標的組織に関連する抗原への第１の結合部位及び標的化可能構築物のハプテンへの第２の結合部位を含有する。例示的なハプテンには、ＨＳＧ及びＩｎ−ＤＴＰＡが含まれるが、これらに限定されない。ＨＳＧハプテンに対して生じた抗体は、知られており（例えば、６７９抗体）、適切な二重特異性抗体に容易に組み込むことができる。（例えば、米国特許第６，９６２，７０２号、同第７，１３８，１０３号及び同第７，３００，６４４号を参照すること。対応する実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。）しかし、他のハプテン及びそれらに結合する抗体が当該技術において知られており、使用することができ、例えば、Ｉｎ−ＤＴＰＡ及び７３４抗体などである。（例えば、米国特許第７，５３４，４３１号。その実施例は、参照として本明細書に組み込まれる。）
【０１２１】
ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））
好ましい実施形態では、二価または多価抗体がＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体として形成される。（例えば、米国特許第７，５２１，０５６号、同第７，５２７，７８７号、同第７，５３４，８６６号、同第７，５５０，１４３号及び同第７，６６６，４００号を参照すること。それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。）一般に、様々なＡＫＡＰタンパク質のいずれかから誘導された、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の制御（Ｒ）サブユニットの二量体化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列と、アンカードメイン（ＡＤ）配列との間に生じる特異的高親和性結合相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４、Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＤＤＤ及びＡＤペプチドは、任意のタンパク質、ペプチドまたは他の分子に結合することができる。ＤＤＤ配列は自発的に二量体化して、ＡＤ配列と結合するので、この技術はＤＤＤまたはＡＤ配列に結合しうる任意の選択された分子間での複合体の形成を可能にする。
【０１２２】
標準的なＤＮＬ（商標）複合体は、１つのＡＤ連結分子に結合した２つのＤＤＤ連結分子を有する二量体を含むが、複合体構造の変動は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体及び他の多量体の形成を可能にする。いくつかの実施形態において、ＤＮＬ（商標）複合体は、同じ抗原決定基または２つ以上の異なる抗原に結合する、２つ以上の抗体、抗体フラグメント、または融合タンパク質を含むことができる。ＤＮＬ（商標）複合体は、タンパク質、ペプチド、免疫調節物質、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、結合タンパク質、ペプチドリガンド、担体タンパク質、毒素、オンコナーゼ（ｏｎｃｏｎａｓｅ）などのリボヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡなどの阻害性オリゴヌクレオチド、抗原または異種抗原、ＰＥＧなどのポリマー、酵素、治療剤、ホルモン、細胞傷害剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、または任意の他の分子もしくは凝集体などの、１つ以上の他のエフェクターを含むこともできる。
【０１２３】
Ｒサブユニットへの二次メッセンジャーｃＡＭＰの結合により誘発される最も研究されたシグナル伝達経路の一つにおいて中心的な役割を果たすＰＫＡが、最初に１９６８年にウサギ骨格筋から単離された（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性形態で保持されている２つの触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムには、２種類のＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）が見出され、それぞれα及びβアイソームを有する（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。したがって、ＰＫＡ制御サブユニットの４つのアイソフォームは、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα及びＲＩＩβである。Ｒサブユニットは、安定した二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは、ＲＩＩαの最初の４４個のアミノ末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。下記に考察されるように、他の制御サブユニットのアミノ酸配列の類似した部分が、二量体化及びドッキングに関与しており、それぞれ制御サブユニットのＮ末端の近くに位置している。ＲサブユニットへのｃＡＭＰの結合は、広範囲のセリン／トレオニンキナーゼ活性のために活性触媒サブユニットの放出をもたらし、これらはＡＫＡＰとのドッキングを介したＰＫＡの区画化によって選択された基質に向けられている（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５；２１５６１）。
【０１２４】
微小管結合タンパク質２である最初のＡＫＡＰが１９８４年に特徴決定されてから（Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）、形質膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア及び小胞体を含む様々な細胞内部位に局在化された５０を超えるＡＫＡＰが、酵母からヒトにわたる種において多様な構造を有して確認されている（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡにおけるＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８個の残基の両親媒性ヘリックスである（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個別のＡＫＡＰにおいて全く異なっており、ＲＩＩ二量体への報告されている結合親和性は、２〜９０ｎＭの範囲である（Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットのみに結合する。ヒトＲＩＩαでは、ＡＤは、２３個のアミノ末端残基により形成された疎水性表面に結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）。したがって、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメイン及びＡＫＡＰ結合ドメインは、両方とも同じＮ末端４４アミノ酸配列内に位置しており（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２、Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１；２０：１６５１）、これは本明細書においてＤＤＤと呼ばれる。
【０１２５】
本発明者たちは、ヒトＰＫＡ制御サブユニットのＤＤＤ及びＡＫＡＰのＡＤをリンカーモジュールの優れた対として利用して、本明細書以降にＡ及びＢと呼ばれる任意の２つの実体をドッキングし、非共有結合複合体にして、それを、ＤＤＤ及びＡＤの両方の戦略的な位置にシステイン残基を導入することによってＤＮＬ（商標）複合体に更にロックして、ジスルフィド結合の形成を促進するプラットフォーム技術を開発した。この手法の一般的な方法論は、以下のとおりである。実体Ａは、ＤＤＤ配列をＡの前駆体に連結し、本明細書以降にａと呼ばれる第１構成成分をもたらすことによって構築される。ＤＤＤ配列は、二量体の自発的形成を実施するので、Ａはａ２から構成される。実体Ｂは、ＡＤ配列をＢの前駆体に連結し、本明細書以降にｂと呼ばれる第２構成成分をもたらすことによって構築される。ａ２に含まれるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含まれるＡＤ配列に結合するドッキング部位を作り出し、ａ２とｂの容易な会合を促進して、ａ２ｂから構成される二成分三量体複合体を形成する。この結合事象は、後に続くジスルフィド架橋を介して２つの実体を共有結合的に固定する反応によって不可逆的になり、これは、初期結合相互作用が、ＤＤＤとＡＤの両方に配置された反応性チオール基を近接させて（Ｃｈｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）部位特異的に連結させるはずなので、有効な局所濃度の原則に基づいて非常に効率的に発生する。リンカー、アダプターモジュール及び前駆体の様々な組み合わせを使用して、異なる化学量論の多種多様なＤＮＬ（商用）構築物を産生及び使用することができる（例えば、米国特許第  ７，５５０，１４３号、同第７，５２１，０５６号、同第７，５３４，８６６号、同第７，５２７，７８７号及び同第７，６６６，４００号を参照すること）。
【０１２６】
２つの前駆体の官能基から離れてＤＤＤ及びＡＤを結合することによって、そのような部位特異的連結も、２つの前駆体の最初の活性を保つことが予測される。この手法は、本質的にモジュール式であり、潜在的に、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント及び他のエフェクター部分を含む広範囲の物質を、広範囲の活性に、部位特異的及び共有結合的に連結することに適用できる。下記の実施例に記載されている、ＡＤ及びＤＤＤ抱合エフェクターを構築する融合タンパク質の方法を利用して、実質的にあらゆるタンパク質またはペプチドをＤＮＬ（商標）構築物に組み込むことができる。しかし、この技術は限定的ではなく、他の抱合方法を利用してもよい。
【０１２７】
目的の融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を産生する核酸合成、ハイブリッド形成及び／または増幅を含む様々な方法が、融合タンパク質の作製のために知られている。そのような二本鎖核酸を、標準的な分子生物学技術によって、融合タンパク質を産生するために発現ベクターに挿入することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，１９８９を参照すること）。そのような好ましい実施形態において、ＡＤ及び／またはＤＤＤ部分を、エフェクタータンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合させることができる。しかし、当業者は、エフェクター部分へのＡＤまたはＤＤＤ部分の結合部位が、エフェクター部分の化学的性質及び生理学的活性に関与するエフェクター部分の一部（複数可）に応じて変わりうることを認識する。様々なエフェクター部分の部位特異的結合は、二価架橋試薬及び／または他の化学抱合技術の使用など、当該技術に既知の方法を使用して実施することができる。
【０１２８】
ＡＤ及びＤＤＤ部分の構造機能相関
異なる種類のＤＮＬ（商標）構築物では、異なるＡＤまたはＤＤＤ配列を利用することができる。例示的なＤＤＤ及びＡＤ配列が下記に提示されている。
ＤＤＤ１
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１）
ＤＤＤ２
CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号２）
ＡＤ１
QIEYLAKQIVDNAIQQA（配列番号３）
ＡＤ２
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC（配列番号４）
【０１２９】
当業者は、ＤＤＤ１及びＤＤＤ２がプロテインキナーゼＡのヒトＲＩＩαアイソフォームのＤＤＤ配列に基づいていることを認識する。しかし、代替的実施形態において、ＤＤＤ及びＡＤ部分は、プロテインキナーゼＡのヒトＲＩα形態のＤＤＤ配列及び対応するＡＫＡＰ配列に基づいていてもよく、下記にＤＤＤ３、ＤＤＤ３Ｃ及びＡＤ３によって例示されている。
ＤＤＤ３
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK（配列番号５）
ＤＤＤ３Ｃ
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK（配列番号６）
ＡＤ３
CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC（配列番号７）
【０１３０】
他の代替的実施形態において、ＡＤ及び／またはＤＤＤ部分の他の配列変異体をＤＮＬ（商標）複合体の構築に利用することができる。例えば、ヒトＰＫＡのＤＤＤ配列には４つの変異体しか存在せず、ＰＫＡのＲＩα、ＲＩＩα、ＲＩβ及びＲＩＩβのＤＤＤ部分に対応する。ＲＩＩαのＤＤＤ配列は、上記に開示されたＤＤＤ１及びＤＤＤ２に基づいている。４つのヒトＰＫＡのＤＤＤ配列が下記に示されている。ＤＤＤ配列は、ＲＩＩαの１〜４４残基、ＲＩＩβの１〜４４残基、ＲＩαの１２〜６１残基及びＲＩβの１３〜６６残基を表す。（ＤＤＤ１の配列は、ヒトＰＫＡ  ＲＩＩαのＤＤＤ部分から僅かに修飾されていることに留意すること。）
ＰＫＡ  ＲＩα
SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK（配列番号８）
ＰＫＡ  ＲＩβ
SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA（配列番号９）
ＰＫＡ  ＲＩＩα
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ（配列番号１０）
ＰＫＡ  ＲＩＩβ
SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER（配列番号１１）
【０１３１】
ＡＤ及びＤＤＤドメインの構造機能相関は、調査対象になっている。（例えば、Ｂｕｒｎｓ−Ｈａｍｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：２９８２−９２、Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２−３８、Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５−５０、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７−３０６、Ｓｔｏｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３−９９、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３−９５、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７−４０８を参照すること。それぞれの全ての内容は、参照として本明細書に組み込まれる。）
【０１３２】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７−４０８）は、ＡＤ−ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造を検査し、ヒトＤＤＤ配列が、下記の配列番号１において下線が引かれているように、二量体形成またはＡＫＡＰ結合のいずれかにとって重要である多数の保存アミノ酸残基を含有したと結論づけた。（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６の図１を参照すること。これは参照として本明細書に組み込まれる。）当業者は、ＤＤＤ配列の配列変異体を設計するとき、望ましくは、下線を引いた残基のいずれも変えることを避け、その一方、保存的アミノ酸置換を、二量体化及びＡＫＡＰ結合にとってあまり重要ではない残基に行ってもよいことを認識する。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１）
【０１３３】
下記により詳細に考察されるように、保存的アミノ酸置換は、２０個の一般的なＬ−アミノ酸のそれぞれにおいて特徴決定されている。したがって、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ（２００６）及び保存的アミノ酸置換のデータに基づいて、配列番号１に基づいた可能な代替的ＤＤＤ配列が、表２に示されている。表２を考案するにあたり、高度に保存的なアミノ酸置換のみが考慮された。例えば、帯電残基は同じ電荷の残基によってのみ置換され、小さい側鎖の残基は類似したサイズの残基によって置換され、ヒドロキシル側鎖は他のヒドロキシルによってのみ置換された、等々。アミノ酸二次構造のプロリンによる独自の効果のため、他の残基はプロリンによって置換されなかった。限定された数のそのような可能な代替的ＤＤＤ部分配列が、下記の配列番号１２から配列番号３１において示されている。当業者は、ＤＤＤ部分に属する範囲内の多数の代替種を、標準的な技術により、例えば、市販のペプチド合成機または周知の部位指定突然変異誘発技術を使用して構築できることを認識する。ＡＤ部分結合に対するアミノ酸置換の効果は、標準的な結合アッセイにより、例えば、Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５−５０）に開示されているようにして、容易に決定することもできる。
【表２】
2018520148.tif 000009
THIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１２）
SKIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１３）
SRIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１４）
SHINIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１５）
SHIQIPPALTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１６）
SHIQIPPGLSELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１７）
SHIQIPPGLTDLLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１８）
SHIQIPPGLTELLNGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１９）
SHIQIPPGLTELLQAYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号２０）
SHIQIPPGLTELLQGYSVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号２１）
SHIQIPPGLTELLQGYTVDVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号２２）
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLKQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号２３）
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRNQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号２４）
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQNPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号２５）
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPELVEFAVEYFTRLREARA（配列番号２６）
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVDFAVEYFTRLREARA（配列番号２７）
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFLVEYFTRLREARA（配列番号２８）
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFIVEYFTRLREARA（配列番号２９）
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFVVEYFTRLREARA（配列番号３０）
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVDYFTRLREARA（配列番号３１）
【０１３４】
Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５−５０）は、様々なＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列の生物情報学的分析を実施して、ＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれるＲＩＩ選択的ＡＤ配列（配列番号３）を設計して、ＤＤＤへの結合定数は０．４ｎＭであった。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合のペプチド拮抗薬として設計された。その置換がＤＤＤへの結合を減少させる傾向があったＡＫＡＰ−ＩＳ配列の残基には、下記の配列番号３において下線が引かれている。当業者は、ＡＤ配列の配列変異体を設計するとき、望ましくは、下線を引いた残基のいずれも変えることを避け、その一方、保存的アミノ酸置換を、ＤＤＤ結合にとってあまり重要ではない残基に行ってもよいことを認識する。表３は、上記の表２においてＤＤＤ１（配列番号１）について示されているものに類似した、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列（ＡＤ１、配列番号３）における可能な保存的アミノ酸置換を示す。
【０１３５】
限定された数のそのような可能な代替的ＡＤ部分の配列が、下記の配列番号３２から配列番号４９において示されている。ここでも、可能なＡＤ部分の配列に属する範囲内の極めて多数の種を、Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）にデータに基づいて当業者によって作製、試験及び使用することができる。Ａｌｔｏ（２００３）の図２は、実際の結合実験に基づいて、ＤＤＤ部分への結合活性を保持しながら実施することができる、更に多くの数の可能なアミノ酸置換を示していることが留意される。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
QIEYLAKQIVDNAIQQA（配列番号３）
【表３】
2018520148.tif 000010
NIEYLAKQIVDNAIQQA（配列番号３２）
QLEYLAKQIVDNAIQQA（配列番号３３）
QVEYLAKQIVDNAIQQA（配列番号３４）
QIDYLAKQIVDNAIQQA（配列番号３５）
QIEFLAKQIVDNAIQQA（配列番号３６）
QIETLAKQIVDNAIQQA（配列番号３７）
QIESLAKQIVDNAIQQA（配列番号３８）
QIEYIAKQIVDNAIQQA（配列番号３９）
QIEYVAKQIVDNAIQQA（配列番号４０）
QIEYLARQIVDNAIQQA（配列番号４１）
QIEYLAKNIVDNAIQQA（配列番号４２）
QIEYLAKQIVENAIQQA（配列番号４３）
QIEYLAKQIVDQAIQQA（配列番号４４）
QIEYLAKQIVDNAINQA（配列番号４５）
QIEYLAKQIVDNAIQNA（配列番号４６）
QIEYLAKQIVDNAIQQL（配列番号４７）
QIEYLAKQIVDNAIQQI（配列番号４８）
QIEYLAKQIVDNAIQQV（配列番号４９）
【０１３６】
Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３−９５）は、結晶学及びペプチドスクリーニングを利用して、ＲＩアイソフォームと比較して、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに５桁の大きさの高い選択性を示すＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号５０）を開発した。下線が引かれた残基は、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に対するアミノ酸置換の位置を示し、このことはＲＩＩαのＤＤＤ部分への結合を増加する。この配列において、Ｎ末端Ｑ残基は残基番号４と番号付けされており、Ｃ末端Ａ残基は残基番号２０である。置換を行うことによってＲＩＩαへの親和性に影響を与える可能性がある残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９及び２０であった（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。特定の代替的実施形態では、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列をＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ部分の配列で置換して、ＤＮＬ（商標）構築物を調製できることが考慮される。ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ配列で置換されうる他の代替的配列が、配列番号５１〜５３によって示されている。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に関連する置換には、下線が引かれている。配列番号４に示されているＡＤ２配列のように、ＡＤ部分は、追加的なＮ末端残基のシステイン及びグリシン、ならびにＣ末端残基のグリシン及びシステインを含むこともできると予測される。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ
QIEYVAKQIVDYAIHQA（配列番号５０）
代替的ＡＫＡＰ配列
QIEYKAKQIVDHAIHQA（配列番号５１）
QIEYHAKQIVDHAIHQA（配列番号５２）
QIEYVAKQIVDHAIHQA（配列番号５３）
【０１３７】
Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．の図２は、下記に示されている様々なＡＫＡＰタンパク質の追加的なＤＤＤ結合配列を開示した。
ＲＩＩ特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰ−ＫＬ
PLEYQAGLLVQNAIQQAI（配列番号５４）
ＡＫＡＰ７９
LLIETASSLVKNAIQLSI（配列番号５５）
ＡＫＡＰ−Ｌｂｃ
LIEEAASRIVDAVIEQVK（配列番号５６）
ＲＩ特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰｃｅ
ALYQFADRFSELVISEAL（配列番号５７）
ＲＩＡＤ
LEQVANQLADQIIKEAT（配列癌号５８）
ＰＶ３８
FEELAWKIAKMIWSDVF（配列番号５９）
二重特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰ７
ELVRLSKRLVENAVLKAV（配列番号６０）
ＭＡＰ２Ｄ
TAEEVSARIVQVVTAEAV（配列番号６１）
ＤＡＫＡＰ１
QIKQAAFQLISQVILEAT（配列番号６２）
ＤＡＫＡＰ２
LAWKIAKMIVSDVMQQ（配列番号６３）
【０１３８】
Ｓｔｏｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３−９９）は、配列番号６４〜６６により示されている、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合に対するペプチド競合者も開発した。ペプチド拮抗薬は、Ｈｔ３１（配列番号６４）、ＲＩＡＤ（配列番号６５）及びＰＶ−３８（配列番号６６）と命名された。Ｈｔ−３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに大きな親和性を示し、一方、ＲＩＡＤ及びＰＶ−３８は、ＲＩへの高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY（配列番号６４）
ＲＩＡＤ
LEQYANQLADQIIKEATE（配列番号６５）
ＰＶ−３８
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC（配列番号６６）
【０１３９】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７−３０６）は、ＰＫＡのＲＩＩ形態のＤＤＤに対して０．４ｎＭの低さの結合定数を有する、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合に対する更に他のペプチド競合者を開発した。様々なＡＫＡＰ拮抗的ペプチドの配列がＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の表１に提示されており、下記の表４に再現されている。ＡＫＡＰＩＳは、合成ＲＩＩサブユニット結合ペプチドを表す。他のペプチドは、全て、示されているＡＫＡＰのＲＩＩ結合ドメインから誘導されている。
【表４】
2018520148.tif 000011
【０１４０】
異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメインのうち高度に保存された残基は、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号３）を参照しながら下線を引くことによって示されている。残基は、Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）により観察されたものと同じであるが、Ｃ末端アラニン残基が付加されている。（Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）の図４を参照すること。これは参照として本明細書に組み込まれる。）ＲＩＩのＤＤＤ配列に特に高い親和性を有するペプチド拮抗薬の配列は、ＡＫＡＰ−ＩＳ、ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ、ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐ及びＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐの配列であった。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
QIEYLAKQIVDNAIQQA（配列番号３）
【０１４１】
Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２−３８）は、ヒト及び非ヒトタンパク質からの異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列の間の配列相同性の程度を検査し、異なるＤＤＤ部分において最も高度に保存されたと思われるＤＤＤ配列における残基を確認した。これらは、配列番号１のヒトＰＫＡ  ＲＩＩαのＤＤＤ配列を参照しながら下線を引くことによって下記に示されている。特に保存された残基は、更に斜体によって示されている。Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）により示唆された残基と重複するが、同一ではない残基が、ＡＫＡＰタンパク質への結合にとって重要である。当業者は、ＤＤＤの配列変異体を設計するとき、最も保存された残基（斜体）の変更を避けることが最も好ましく、保存された残基（下線）の変更を避けることも好ましく、一方、保存的アミノ酸置換を、下線の引かれていなく、斜体にもなっていない残基では考慮してもよいことを認識する。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA（配列番号１）
【０１４２】
Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）のデータに基づいて、ＤＤＤ１（配列番号１）の配列の保存的アミノ酸置換の修正セットが、表５に示されている。当業者は、上記の表１及び表２に開示されている代替的ＤＤＤアミノ酸配列を容易に導き出すことができる。
【表５】
2018520148.tif 000012
【０１４３】
当業者は、ＤＤＤまたはＡＤアミノ酸配列におけるこれら及び他のアミノ酸置換を、この分野における標準的な技術及び単に日常的な実験の使用によって、ＡＤまたはＤＤＤ部分に属する範囲内の代替的な種の産生に利用できることを認識する。
【０１４４】
代替的なＤＮＬ（商標）構造
特定の代替的実施形態において、ＤＮＬ（商標）構築物は、代替的に構築された抗体または抗体フラグメントを使用して形成することができ、ここでＡＤ部分は、重鎖のＦｃのＣ末端ではなく、カッパ軽鎖（Ｃｋ）のＣ末端に結合していてもよい。代替的に形成されたＤＮＬ（商標）構築物は、２０１２年６月１日出願の米国特許仮出願第６１／６５４，３１０号、２０１２年６月２０日出願の同第６１／６６２，０８６号、２０１２年７月１９日出願の同第６１／６７３，５５３号及び２０１２年８月１３日出願の同第６１／６８２，５３１号に開示されており、それぞれの全ての内容は、参照として本明細書に組み込まれる。軽鎖抱合型ＤＮＬ（商標）構築物は、インビトロにおいて向上されたＦｃエフェクター機能活性、ならびにインビボにおいて改善された薬物動態、安定性及び抗リンパ腫活性を示す（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２４：６３−７１）。
【０１４５】
Ｃｋ抱合型ＤＮＬ（商標）構築物は、米国特許仮出願第６１／６５４，３１０号、同第６１／６６２，０８６号、同第６１／６７３，５５３号及び同第６１／６８２，５３１号に開示されているように調製することができる。簡潔には、Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧを組み換え工学により生じ、ＡＤ２ペプチドをカッパ軽鎖のＣ末端に融合させた。ＣＫの天然のＣ末端がシステイン残基であり、ＣＨ１へのジスルフィド架橋を形成するので、１６アミノ酸残基の「ヒンジ」リンカーを使用して、Ｃｋ−ＶＨ１ジスルフィド架橋からＡＤ２を離した。Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベルツズマブ及びＣｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブの哺乳類発現ベクターを、ｐｄＨＬ２ベクターの使用により構築し、これは、以前は相同性ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールの発現に使用されていた。ＶＫ／ＣＫイントロンの範囲内のＢａｍ  ＨＩ制御部位からＣｋイントロンのＸｈｏ  Ｉ制御部位３’にわたってｐｄＨＬ２ベクター配列を含む２２０８−ｂｐヌクレオチド配列は、ＣＫのコード配列の３’末端のインフレームに、ヒンジリンカーのコード配列（ＥＦＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ、配列番号１６２）及びＡＤ２を挿入することによって合成した。この合成配列を、Ｂａｍ  ＨＩ及びＸｈｏ  Ｉ制御部位を介してベルツズマ及びエプラツズマブのＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターに挿入した。ＳｐＥＳＦＸ−１０による産生クローン（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｅ）の生成を、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールについて記載されたように実施した。Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベルツズマブ及びＣｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブを、バッチローラーボトル培養物（ｂａｔｃｈ  ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）において安定して形質移入された産生クローンによって産生し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、上澄み液から一段階で精製した。
【０１４６】
２２−（２０）−（２０）について以前に記載されたものと同じＤＮＬ（商標）方法に従って（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１３：６１６１−７１）、Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブをＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ベルツズマブに抱合させ、ベルツズマブからＦａｂに基づいたモジュールを誘導して、ｂｓＨｅｘＡｂ  ２２＊−（２０）−（２０）を生じ、ここで、２２＊は、エプラツズマブのＣｋ−ＡＤ２モジュールを示し、各（２０）は、ベルツズマブＦａｂの安定した二量体を表す。２２＊−（２０）−（２０）の特性を、類似した組成及び分子サイズを有するが、異なる構造を有する、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブを含む相同性Ｆｃ−ｂｓＨｅｘＡｂである２２−（２０）−（２０）と比較した。
【０１４７】
２０−２ｂについて以前に記載されたものと同じＤＮＬ（商標）方法に従って（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１４：３８６４−７１）、Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベルツズマブを、Ｃ末端にＤＤＤ２ペプチドが融合されているＩＦＮα２ｂのモジュールであるＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２に抱合させて、２０＊−２ｂを生じ、これは二量体ＩＦＮα２ｂが各軽鎖に融合しているベルツズマブを含む。２０＊−２ｂの特性を、相同性Ｆｃ−ＩｇＧ−ＩＦＮαである２０−２ｂと比較した。
【０１４８】
ｂｓＨｅｘＡｂｓ及びＩｇＧ−ＩＦＮαを、それぞれ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーによってＤＮＬ（商標）反応混合物から単離した。２つのＣｋ誘導プロトタイプ、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２）及び４つベルツズマブ（抗ＣＤ２０）Ｆａｂを含む抗ＣＤ２２／ＣＤ２０二重特異性六価抗体、ならびにベルツズマブ及び４つのインターフェロンα２ｂ分子を含むＣＤ２０標的化免疫サイトカインは、Ｆｃ誘導型の対応物と比較して、向上したＦＣエフェクター機能をインビトロで示し、また、改善された薬物動態、安定性及び抗リンパ腫活性をインビボで示した。
【０１４９】
アミノ酸置換
代替的実施形態において、開示されている方法及び組成物は、１個以上の置換アミノ酸残基を有するタンパク質またはペプチドの産生及び使用を伴っていることがある。例えば、ＤＮＬ（商標）構築物の作製に使用されるＤＤＤ及び／またはＡＤ配列を、上記に考察されたように修飾することができる。
【０１５０】
当業者は、一般に、アミノ酸置換が典型的には１つのアミノ酸を比較的類似した特性の別のアミノ酸に置き換えること（すなわち、保存的アミノ酸置換）を伴うことを認識する。様々なアミノ酸の特性、ならびにタンパク質構造及び機能に対するアミノ酸置換の効果は、当該技術において広範囲にわたる研究対象及び知識になっている。
【０１５１】
例えば、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮されうる（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性は、もたらされるタンパク質の二次構造に寄与し、次いでタンパク質と他の分子との相互作用を確定する。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が指定されており（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）、これらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。保存的置換を作製するとき、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の使用が好ましく、±１以内がより好ましく、±０．５以内が更により好ましい。
【０１５２】
アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性を考慮に入れることもできる（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。親水性値がアミノ酸残基に指定されており、アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０）、グルタミン酸（＋３．０）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）である。アミノ酸を、類似した疎水性がある他のもので置き換えることが好ましい。
【０１５３】
他の考慮には、アミノ酸側鎖のサイズが挙げられる。例えば、グリシンまたはセリンなどの小型側鎖を有するアミノ酸を、嵩高側鎖を有するアミノ酸、例えば、トリプトファンまたはチロシンに置き換えることは、一般に好ましくない。タンパク質二次構造に対する様々なアミノ酸残基の効果も考慮される。実証的な研究によって、タンパク質ドメインがアルファヘリカル、ベータシート、または逆向きターンの二次構造をとる傾向に対する異なるアミノ酸残基の効果が決定されており、当該技術において知られている（例えば、Ｃｈｏｕ  ＆  Ｆａｓｍａｎ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−２４５、１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４を参照すること）。
【０１５４】
そのような考慮及び広範囲の実証的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の表が構築され、当該技術において知られている。例えば、アルギニン及びリシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、セリン及びトレオニン、グルタミン及びアスパラギン、ならびにバリン、ロイシン及びイソロイシンである。あるいは、Ａｌａ（Ａ）ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａである。
【０１５５】
アミノ酸置換について他の考慮には、残基がタンパク質の内部に位置しているか、または溶媒に曝露されているかが挙げられる。内部残基では、保存的置換には、Ａｓｐ及びＡｓｎ、Ｓｅｒ及びＴｈｒ、Ｓｅｒ及びＡｌａ、Ｔｈｒ及びＡｌａ、Ａｌａ及びＧｌｙ、Ｉｌｅ及びＶａｌ、Ｖａｌ及びＬｅｕ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ、Ｌｅｕ及びＭｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｙｒ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが含まれる。（例えば、ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕのウエブサイトＰＲＯＷＬを参照すること）。溶媒に曝露される残基では、保存的置換には、Ａｓｐ及びＡｓｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａ、Ｇｌｙ及びＡｓｎ、Ａｌａ及びＰｒｏ、Ａｌａ及びＧｌｙ、Ａｌａ及びＳｅｒ、Ａｌａ及びＬｙｓ、Ｓｅｒ及びＴｈｒ、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｖａｌ及びＬｅｕ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ、Ｉｌｅ及びＶａｌ、Ｐｈｅ及びＴｙｒが含まれる（同上）。ＰＡＭ２５０スコア付けマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、Ｌｅｖｉｎマトリックス及びＲｉｓｌｅｒマトリックスなど、様々なマトリックスが構築されて、アミノ酸置換の選択を助けている（同上）。
【０１５６】
アミノ酸置換を決定するとき、陽荷電残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）及び陰荷電残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間のイオン性結合（塩架橋）または近くのシステイン残基の間のジスルフィド結合など、分子間または分子内結合の存在を考慮することもできる。
【０１５７】
コードされたタンパク質配列において任意のアミノ酸を他の任意のアミノ酸に置換する方法は、良く知られており、当業者にとっては日常的な実験、例えば、部位指定突然変異誘発による、またはアミン酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、組み立てて、発現ベクター構築物にスプライシングすることによるものである。
【０１５８】
ファージ提示
本組成物及び／または方法の特定の実施形態は、結合ペプチド及び／または様々な標的分子、細胞もしくは組織のペプチド模倣体に関係しうる。結合ペプチドは、ファージ提示技術が含まれるが、これに限定されない、当該技術に既知の任意の方法によって確認することができる。ペプチドの多様な個体群を産生するためのファージ提示の様々な方法及び技術が、当該技術において良く知られている。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，６２２，６９９号及び同第６，０６８，８２９号は、ファージライブラリーの調製方法を開示する。ファージ提示技術は、小さなペプチドが表面に発現されうるようにバクテリオファージを遺伝子操作することを伴う（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１：２２８−２５７）。ペプチドに加えて、単鎖抗体などの大きなタンパク質ドメインも、ファージ粒子の表面に提示されうる（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７−３８０）。
【０１５９】
所定の臓器、組織、細胞型、または標的分子に対して選択的な標的化アミノ酸配列を、パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）により単離することができる（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４−３６６、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．４３：１５９−１６２）。簡潔には、推定標的化ペプチドを含むファージライブラリーを、無傷の生物体に、または単離された臓器、組織、細胞型、もしくは標的分子に投与し、結合したファージを含む試料を収集する。標的に結合するファージを標的臓器、組織、細胞型、または標的分子から溶出し、次に宿主細菌において増殖させることによって増幅することができる。
【０１６０】
特定の実施形態では、ファージをパニング実施の間に宿主細菌において繁殖させることができる。ファージによって溶解されるのではなく、細菌は、特定の挿入物を提示するファージの複数のコピーを分泌することができる。望ましい場合、増幅されたファージを標的臓器、組織、細胞型、または標的分子に再び曝露させ、追加のパニングを実施するために収集することができる。複数のパニングの実施は、選択的または特異的な結合剤の個体群が得られるまで実施することができる。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージゲノム中の標的化ペプチド挿入物に対応するＤＮＡの配列決定によって決定することができる。次に、確認された標的化ペプチドを標準的なタンパク質化学技術により合成ペプチドとして産生することができる（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、減算プロトコール（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を使用して、バックグラウンドファージ結合を更に低減させることができる。減算の目的は、目的の標的以外の標的に結合するファージをライブラリーから取り除くことである。代替的実施形態では、ファージライブラリーを対照細胞、組織、または臓器によって予備選別することができる。例えば、腫瘍結合ペプチドを、対照の正常細胞系によってライブラリーを予備選別した後に確認することができる。減算した後、ライブラリーを目的の分子、細胞、組織、または臓器によって選別することができる。減算プロトコールの他の方法が知られており、本方法の実施に使用することができ、例えば、米国特許第５，８４０，８４１号、同第５，７０５，６１０号、同第５，６７０，３１２号及び同第５，４９２，８０７号に開示されている。
【０１６２】
ナノボディ
ナノボディは、約１２〜１５ｋＤａのサイズ（約１１０個のアミノ酸の長さ）の単一ドメイン抗体である。ナノボディは、完全なサイズの抗体のように標的抗原に選択的に結合し、抗原に対して類似した親和性を有することができる。しかし、サイズがかなり小さいので、固形腫瘍の中により良好に貫入することができる。小さいサイズは、ナノボディの安定性にも寄与しており、完全なサイズの抗体より極限ｐＨ及び温度に対して抵抗性がある（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔ  １４３１：３７−４６）。単一ドメイン抗体は、元々、ラクダ科（ラクダ、アルパカ、ラマ）が軽鎖のない完全機能抗体を有するという発見の後に開発された（例えば、Ｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７：１３−２２）。重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。抗体と同様に、ナノボディを多価及び／または二重特異性構築物として開発及び使用することができる。癌、炎症、感染性疾患、アルツハイマー病、急性冠動脈症候群及び他の障害における潜在的な臨床用途を伴って（例えば、Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８：６００−８、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２０１３，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８２：７７５−９７、Ｉｂａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０３：１０６３−７２）、ＩＬ−６Ｒ、ｖＷＦ、ＴＮＦ、ＲＳＶ、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ−１７Ａ  ＆  Ｆ及びＩｇＥなどの多様な標的抗原に対して標的化されているナノボディのヒト化形態が商業的に開発されている（例えば、ＡＢＬＹＮＸ（登録商標）、Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。
【０１６３】
ナノボディの血清半減期は完全なサイズの抗体より短く、排出は主に腎臓経路による。Ｆｃ領域を欠いているので、これらは補体依存性細胞傷害を示さない。
【０１６４】
ナノボディは、標的抗原によるラクダ、ラマ、アルパカ、またはサメの免疫化、続くｍＲＮＡの単離、ライブラリーへのクローニング及び抗原結合についてのスクリーニングによって産生することができる。ナノボディ配列を標準的な技術によってヒト化することができる（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：  ３２３、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５、Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４）。ヒト化は、ラクダ科とヒトのＦＲ配列に高い相同性があるので、比較的直接的なものである。
【０１６５】
様々な実施形態において、主題のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、細胞、組織、臓器、または病原体への抱合薬物の標的化送達のために、ナノボディを含むことができる。使用されるナノボディは、例えば、米国特許第７，８０７，１６２号、同第７，９３９，２７７号、同第８，１８８，２２３号、同第８，２１７，１４０号、同第８，３７２，３９８号、同第８，５５７，９６５号、同第８，６２３，３６１号及び同第８，６２９，２４４号に開示されており、それぞれの実施例は、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
抱合プロトコール
好ましい抱合プロトコールは、中性または酸性ｐＨにおいて容易である、チオール−マレイミド、チオール−ビニルスルホン、チオール−ブロモアセトアミド、またはチオール−ヨードアセトアミド反応に基づいている。このことは、例えば活性エステルを使用するときに必要となる高いｐＨ条件が、抱合に必要とされることを防ぐ。例示的な抱合プロトコールの更なる詳細は、下記の実施例セクションに記載されている。
【０１６７】
治療処置
別の態様において、本発明は、対象を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載されている治療用抱合体を対象に投与することを含む方法に関する。例えば、ｈＬＬ２  ＭＡｂ（エプラツズマブ、米国特許第６，１８３，７４４号を参照すること）などの抗ＣＤ２２抗体を、別のＣＤ２２エピトープ（ｈＲＦＢ４）に対して、または抗体を、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０、もしくはＨＬＡ−ＤＲなどの他のＢ細胞抗原に対して使用する、明細書に記載されている治療用抱合体により治療されうる疾患には、Ｂ細胞悪性病変（例えば、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞白血病）が含まれるが、これらに限定されない。他の疾患には、内皮誘導性消化器系上皮の腺癌、乳癌及び非小細胞肺癌などの癌、ならびに他の癌腫、肉腫、膠細胞腫瘍、骨髄性白血病などが含まれるが、これらに限定されない。特に、悪性固形腫瘍または造血系新生物、例えば、胃腸、胃、結腸、食道、肝臓、肺、乳房、膵臓、肝臓、前立腺、卵巣、精巣、脳、骨、もしくはリンパ性の腫瘍、肉腫、または黒色腫によって産生される、または関連づけられる抗原、例えば癌胎児性抗原に対する抗体が、有利に使用される。そのような治療薬を、疾患の状態及び抱合体の耐容性に応じて１回、または反復して与えることができ、任意選択で、外科手術、外部放射線、放射免疫療法、免疫療法、化学療法、アンチセンスセンス療法、ＲＮＡ干渉療法、遺伝子療法などの他の治療様式と組み合わせて使用することもできる。それぞれの組み合わせは、腫瘍の種類、病期、患者の状態及び前の療法、ならびに担当医師により考慮される他の要因に適応される。
【０１６８】
本明細書において使用されるとき、用語「対象」は、ヒトを含む哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない任意の動物（すなわち、脊椎動物及び無脊椎動物）を指す。この用語は、特定の年齢または性別に限定されないことが意図される。したがって、成人及び新生児の対象、ならびに胎児が、男性または女性にかかわらず、この用語に包含される。本明細書に提示される用量は、ヒト用であるが、体重または平方メートルのサイズに応じて、他の哺乳動物や小児のサイズにも適合させることができる。
【０１６９】
好ましい実施形態では、ｈＲＳ７  ＭＡｂなどの抗ＥＧＰ−１（抗−ＴＲＯＰ−２）抗体を含む治療用抱合体を使用して、食道、膵臓、肺、胃、結腸及び直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、腎臓及び前立腺の癌腫などの癌腫を治療することができ、米国特許第７，２３８，７８５号、同第７，５１７，９６４号及び同第８，０８４，５８３号に開示されており、それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。ｈＲＳ７抗体は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列のＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号９０）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号９１）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号９２）、ならびに重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号９３）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号９４）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号９５）を含むヒト化抗体である。
【０１７０】
別の好ましい実施形態では、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体（例えば、ｈＭＮ−１４、ラベツズマブ）及び／または抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体（例えば、ｈＭＮ−３もしくはｈＭＮ−１５）を含む治療用抱合体を使用して、ＣＥＡＣＡＭ５及び／またはＣＥＡＣＡＭ６を発現する様々な癌のいずれかを治療することができ、米国特許第７，５４１，４４０号、同第７，９５１，３６９号、同第５，８７４，５４０号、同第６，６７６，９２４号及び同第８，２６７，８６５号に開示されており、それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＣＥＡＣＡＭ６、またはこの２つの組み合わせを使用して治療することができる固形腫瘍には、乳房、肺、膵臓、食道、髄様甲状腺、卵巣、結腸、直腸、膀胱、口及び胃の癌が含まれるが、これらに限定されない。胃腸、呼吸器、泌尿生殖器及び乳房の癌を含む大部分の癌腫は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現し、本免疫抱合体により治療することができる。ｈＭＮ−１４抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＧＴＳＶＡ、配列番号９６）、ＣＤＲ２（ＷＴＳＴＲＨＴ、配列番号９７）及びＣＤＲ３（ＱＱＹＳＬＹＲＳ、配列番号９８）、ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＴＹＷＭＳ、配列番号９９）、ＣＤＲ２（ＥＩＨＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ、配列番号１００）及びＣＤＲ３（ＬＹＦＧＦＰＷＦＡＹ、配列番号１０１）を含むヒト化抗体である。
【０１７１】
ｈＭＮ−３抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、配列番号１０２）、ＣＤＲ２（ＫＶＳＮＲＦＳ、配列番号１０３）及びＣＤＲ３（ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ、配列番号１０４）、ならびに重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１０５）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号１０６）及びＣＤＲ３（ＫＧＷＭＤＦＮＳＳＬＤＹ、配列番号１０７）を含むヒト化抗体である。
【０１７２】
ｈＭＮ−１５抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列のＳＡＳＳＲＶＳＹＩＨ（配列番号１０８）、ＧＴＳＴＬＡＳ（配列番号１０９）及びＱＱＷＳＹＮＰＰＴ（配列番号１１０）、ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列のＤＹＹＭＳ（配列番号１１１）、ＦＩＡＮＫＡＮＧＨＴＴＤＹＳＰＳＶＫＧ（配列番号１１２）及びＤＭＧＩＲＷＮＦＤＶ（配列番号１１３）を含むヒト化抗体である。
【０１７３】
別の好ましい実施形態では、抗ＣＤ７４抗体（例えば、それぞれの実施例セクションが参照として本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，４０３号、同第７，３１２，３１８号、同第７，７７２，３７３号、同第７，９１９，０８７号及び同第７，９３１，９０３号に開示されているｈＬＬ１、ミラツズマブ）を含む治療用抱合体を使用して、腎臓、肺、腸、胃、乳房、前立腺、または卵巣の癌が含まれるが、これらに限定されないＣＤ７４を発現する様々な癌、ならびに多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫及びホジキンリンパ腫などのいくつかの血液癌のいずれかを治療することができる。ｈＬＬ１抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ、配列番号１１４）、ＣＤＲ２（ＴＶＳＮＲＦＳ、配列番号１１５）及びＣＤＲ３（ＳＱＳＳＨＶＰＰＴ、配列番号１１６）、ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＮＹＧＶＮ、配列番号１１７）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ、配列番号１１８）及びＣＤＲ３（ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ、配列番号１１９）を含むヒト化抗体である。
【０１７４】
別の好ましい実施形態では、抗ＣＤ２２抗体（例えば、それぞれの実施例セクションが参照として本明細書に組み込まれる米国特許第５，７８９，５５４号、同第６，１８３，７４４号、同第６，１８７，２８７号、同第６，３０６，３９３号、同第７，０７４，４０３号及び同第７，６４１，９０１号に開示されているｈＬＬ２、エプラツズマブ、またはキメラもしくはヒト化ＲＦＢ４抗体）を含む治療用抱合体を使用して、低悪性度のＢ細胞リンパ腫、中悪性度のＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、またはびまん性Ｂ細胞リンパ腫が含まれるが、これらに限定されない、ＣＤ２２を発現する様々な癌のいずれかを治療することができる。抗ＣＤ２２抱合体は、急性免疫性血小板減少症、慢性免疫性血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、真性糖尿病（例えば、若年性糖尿病）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、線維性肺胞炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、臓器移植拒絶、セプシス、敗血症及び炎症などの自己免疫性疾患の治療にも使用される。ｈＬＬ２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＡＮＨＫＹＬＡ、配列番号１２０）、ＣＤＲ２（ＷＡＳＴＲＥＳ、配列番号１２１）及びＣＤＲ３（ＨＱＹＬＳＳＷＴＦ、配列番号１２２）、ならびに重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＹＷＬＨ、配列番号１２３）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＲＮＤＹＴＥＹＮＱＮＦＫＤ、配列番号１２４）及びＣＤＲ３（ＲＤＩＴＴＦＹ、配列番号１２５）を含むヒト化抗体である。
【０１７５】
好ましい実施形態では、ｈＭｕ−９  ＭＡｂなどの抗ＣＳＡｐ抗体を含む治療用抱合体を使用して、結腸直腸、ならびに膵臓及び卵巣の癌を治療することができ、米国特許第  ６，９６２，７０２号、同第７，３８７，７７２号、同第７，４１４，１２１号、同第７，５５３，９５３号、同第７，６４１，８９１号及び同第７，６７０，８０４号に開示されており、それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。ｈＭｕ−９抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、配列番号１２６）、ＣＤＲ２（ＫＶＳＮＲＦＳ、配列番号１２７）及びＣＤＲ３（ＦＱＧＳＲＶＰＹＴ、配列番号１２８）、ならびに重鎖可変ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＥＹＶＩＴ、配列番号１２９）、ＣＤＲ２（ＥＩＹＰＧＳＧＳＴＳＹＮＥＫＦＫ、配列番号１３０）及びＣＤＲ３（ＥＤＬ、配列番号１３１）を含むヒト化抗体である。
【０１７６】
ｈＰＡＭ４  ＭＡｂを含む治療用抱合体を使用して、膵癌または他の固形腫瘍を治療することができ、米国特許第７，２３８，７８６号及び同第７，２８２，５６７号に開示されており、それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。ｈＰＡＭ４抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹ、配列番号１３２）、ＣＤＲ２（ＳＴＳＮＬＡＳ、配列番号１３３）及びＣＤＲ３（ＨＱＷＮＲＹＰＹＴ、配列番号１３４）、ならびに重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＹＶＬＨ、配列番号１３５）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号１３６）及びＣＤＲ３（ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹ、配列番号１３７）を含むヒト化抗体である。
【０１７７】
別の好ましい実施形態では、ＩＭＭＵ３１などの抗ＡＦＰ  ＭＡｂを含む治療用抱合体を使用し、ヒト化、キメラ及びヒト抗体の形態を用いて、肝細胞癌、胚細胞腫瘍及び他のＡＦＰ産生腫瘍を治療することができ、米国特許第７，３００，６５５号に開示されており、この実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。ＩＭＭＵ３１抗体は、重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＹＶＩＨＫＳＳＱＳＶＬＹＳＡＮＨＫＹＬＡ、配列番号１３８）、ＣＤＲ２（ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号１３９）及びＣＤＲ３（ＳＧＧＧＤＰＦＡＹ、配列番号１４０）、ならびに軽鎖のＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧ、配列番号１４１）、ＣＤＲ２（ＹＴＳＡＬＬＰ、配列番号１４２）及びＣＤＲ３（ＬＱＹＤＤＬＷＴ、配列番号１４３）を含むヒト化抗体である。
【０１７８】
別の好ましい実施形態では、ｈＬ２４３などの抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＭＡｂを含む治療用抱合体を使用して、リンパ腫、白血病、皮膚、食道、胃、結腸、直腸、膵臓、肺、乳房、卵巣、膀胱、子宮内膜、子宮頸部、精巣、腎臓、肝臓の癌、黒色腫、またはＨＬＡ−ＤＲを産生する他の腫瘍を治療することができ、米国特許第７，６１２，１８０号に開示されており、その実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。ｈＬ２４３抗体は、重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１４４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＲＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号１４５）及びＣＤＲ３（ＤＩＴＡＶＶＰＴＧＦＤＹ、配列番号１４６）、ならびに軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ、配列番号１４７）、ＣＤＲ２（ＡＡＳＮＬＡＤ、配列番号１４８）及びＣＤＲ３（ＱＨＦＷＴＴＰＷＡ、配列番号１４９）を含むヒト化抗体である。
【０１７９】
別の好ましい実施形態では、ベルツズマブ（ｈＡ２０）、１Ｆ５、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、またはリツキシマブなどの抗ＣＤ２０  ＭＡｂを含む治療用抱合体を使用して、リンパ腫、白血病、免疫性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、エヴァンス症候群、関節炎、動脈炎、尋常性天疱瘡、移植腎拒絶、移植心拒絶、関節リウマチ、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、Ｉ型真性糖尿病、ＧＶＨＤ、多発性硬化症、または多発性骨髄腫を治療することができ、米国特許第７，４３５，８０３号または同第８，２８７，８６４号に開示されており、それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。ｈＡ２０（ベルツズマブ）抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲＬ１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ、配列番号１５０）、ＣＤＲＬ２（ＡＴＳＮＬＡＳ、配列番号１５１）及びＣＤＲＬ３（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ、配列番号１５２）、ならびに重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲＨ１（ＳＹＮＭＨ、配列番号１５３）、ＣＤＲＨ２（ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ、配列番号１５４）及びＣＤＲＨ３（ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ、配列番号１５５）を含むヒト化抗体である。
【０１８０】
別の好ましい実施形態では、ｈＡ１９などの抗ＣＤ１９  ＭＡｂを含む治療用抱合体を使用して、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、または急性リンパ芽球性白血病などのＢ細胞関連リンパ腫及び白血病を治療することができる。治療することができる他の疾患には、急性または慢性免疫性血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬及び線維性肺胞炎などの自己免疫性疾患が含まれ、米国特許第７，１０９，３０４号、同第７，４６２，３５２号、同第７，９０２，３３８号、同第８，１４７，８３１号及び同第８，３３７，８４０号に開示されており、それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。ｈＡ１９抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１  ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号１５６）、ＣＤＲ２  ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号１５７）及びＣＤＲ３  ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号１５８）、ならびに重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１  ＳＹＷＭＮ（配列番号１５９）、ＣＤＲ２  ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号１６０）及びＣＤＲ３  ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号１６１）を含むヒト化抗体である。
【０１８１】
抗テネイシン抗体を含む治療用抱合体を使用して、造血系及び固形腫瘍を治療することができ、テネイシンに対する抗体を含む抱合体を使用して、固形腫瘍、好ましくは神経膠芽腫のような脳癌を治療することができる。
【０１８２】
好ましくは、ヒトの疾患の治療に使用される抗体は、ヒトまたはヒト化（ＣＤＲグラフト化）型の抗体であるが、マウス及びキメラ型の抗体を使用することもできる。送達作用物質として同じ種のＩｇＧ分子が、免疫応答を最小限するために最も好ましい。このことは、反復治療を考慮するときに特に重要である。ヒトでは、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体が、患者に抗ＩｇＧ免疫応答を生じる可能性が少ない。ｈＬＬ１及びｈＬＬ２などの抗体は、標的細胞の内部移行抗原に結合した後、急速に内部移行し、このことは、担持されている化学療法薬も細胞の中に急速に内部移行されることを意味する。しかし、内部移行の速度がゆっくりとした抗体を使用して、選択的療法を実施することもできる。
【０１８３】
病原体に対する抗体が知られているので、治療用抱合体を病原体に対して使用することができる。例えば、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫の感染を含み、例えば細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、真菌及びウイルスなどの病原体により引き起こされる感染性病変によって産生された、または関連付けられたマーカーに特異的に結合する抗体及び抗体フラグメント、ならびにそのような微生物に関連する抗原及び産物が、とりわけ、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第３，９２７，１９３号、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，３３１，６４７号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４６８，４５７号、同第４，４４４，７４４号、同第４，８１８，７０９号及び同第４，６２４，８４６号（それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる）、ならびに上記に引用されたＲｅｉｃｈｅｒｔ  ａｎｄ  Ｄｅｗｉｔｚに開示されている。好ましい実施形態において、病原体は、ＨＩＶウイルス、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ライム病スピロヘータ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスＩ、単純ヘルペスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、サルウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉ���  ｐａｒｖａ、Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ、Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ、Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ及びＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群から選択され、米国特許第６，４４０，４１６号に開示されており、この実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
抗ｇｐ１２０及び他のそのような抗ＨＩＶ抗体を含む本発明の薬物抱合体をＡＩＤＳ患者のＨＩＶの治療薬として使用することができ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する抗体の薬物抱合体は、薬物耐性結核における治療薬として適している。抗ｇｐ１２０  ＭＡｂ（抗ＨＩＶ  ＭＡｂ）とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素などの毒素との融合タンパク質が、抗ウイルス特性について検査されている（Ｖａｎ  Ｏｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，５：７５−９１，１９９８）。ＡＩＤＳ患者においてＨＩＶ感染を治療する試みは、恐らく不十分な有効性または許容されない宿主毒素に起因して失敗した。本発明の薬物抱合体は、有利なことに、そのようなタンパク質毒素の毒性副作用を欠いており、したがって、有利なことにＡＩＤＳ患者のＨＩＶ感染の治療に使用される。これらの薬物抱合体を単独で与えることができる、またはそのような患者に単独で与えられたときに有効である他の抗生物質もしくは治療剤と組み合わせて与えることができる。候補の抗ＨＩＶ抗体には、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＡＩＤＳ．２００６  Ｏｃｔ  ３；２０（１５）：１９１１−５）に記載されているＰ４／Ｄ１０抗エンベロープ抗体、ならびにＰｏｌｙｍｕｎ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）により記載及び販売され、全て参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８３１，０３４号、米国特許第５，９１１，９８９号、Ｖｃｅｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  ２００７；２１（１６）：２１６１−２１７０及びＪｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３−９においても記載されている抗ＨＩＶ抗体が含まれる。ＨＩＶに対する好ましい標的化作用物質は、抵抗性を克服するため、これらの抗体の様々な組み合わせである。
【０１８５】
細胞及び病原体へのより有効な組み込みは、多価で多特異性の、または多価で単一特異性の抗体の使用によって達成することができる。そのような二価及び二重特異性抗体の例は、米国特許第７，３８７，７７２号、同第７，３００，６５５号、同第７，２３８，７８５号及び同第７，２８２，５６７号において見出され、それぞれの実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。これらの多価または多特異性抗体は、複数の抗原標的を発現する、更には同じ抗原標的の複数のエピトープを発現するが、細胞または病原体の単一抗原標的の不十分な発現または利用可能性のため、多くの場合に免疫療法において抗体の標的化及び十分な結合を回避している癌及び感染性生物（病原体）の標的化にとって、特に好ましい。複数の抗原またはエピトープを標的化することによって、前記抗体は標的に対して高い結合及び滞留時間を示し、したがって、本発明において標的化される薬物による高い飽和をもたらす。
【０１８６】
治療用抱合体を使用して、自己免疫性疾患または免疫系機能不全（例えば、移植片対宿主病、臓器移植拒絶）を治療することもできる。自己免疫性／免疫機能不全疾患の治療に使用される抗体は、ＢＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−６、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＦＭＣ−７、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ及びＭＩＦが含まれるが、これらに限定されない例示的な抗原に結合することができる。上記に考察されたこれら及び他の標的抗原に結合する抗体を、自己免疫性または免疫機能不全疾患の治療に使用することができる。免疫抱合体により治療することができる自己免疫性疾患には、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維性肺胞炎が含まれうる。
【０１８７】
当業者は、抗体または抗体フラグメントに抱合されたカンプトテシンを含む主題の免疫抱合体を単独で、または二次抗体、二次抗体フラグメント、二次免疫抱合体、放射性核種、毒素、薬物、化学療法剤、放射線療法、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節物質、酵素、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡなどの１つ以上の他の治療剤と組み合わせて使用できることを認識する。そのような追加の治療剤を、主題の抗体−薬物免疫抱合体と別個に、組み合わせて、または結合させて投与することができる。
【０１８８】
特定の実施形態において、本発明のカンプトテシン抱合体と組み合わせて使用される治療剤は、１つ以上の同位体を含むことができる。罹患組織の治療に有用な放射性同位体には、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２２７Ｔｈ及び２１１Ｐｂが含まれるが、これらに限定されない。治療用放射性核種は、好ましくは２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは、オージェエミッタでは６０〜２００ｋｅＶ、ベータエミッタでは１００〜２，５００ｋｅＶ及びアルファエミッタでは４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有する。有用なベータ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。オージェ放出粒子をもたらして実質的に崩壊する放射性核種も、好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ及びＩｒ−１９２である。有用なベータ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。アルファ放出粒子を発生して実質的に崩壊する放射性核種も、好ましい。そのような放射性核種には、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｔｈ−２２７及びＦｍ−２５５が含まれるが、これらに限定されない。有用なアルファ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。使用される可能性のある追加的な放射性核種には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂなどが含まれる。
【０１８９】
放射性核種及び他の金属を、例えば、抗体または抱合体に結合させたキレート基を使用して送達することができる。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ及びＴＥＴＡなどの大環状キレートは、様々な金属及び放射性金属と共に、最も好ましくはガリウム、イットリウム及び銅のそれぞれの放射性核種と共に使用される。そのような金属キレート錯体は、環のサイズを目的の金属に合わせることによって、非常に安定させることができる。２２３Ｒａの錯化用の大環状ポリエーテルなどの他の環型キレートを使用することができる。
【０１９０】
本明細書に記載されているカンプトテシン抱合体と組み合わせて使用される治療剤には、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗物質、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害剤、抗有糸分裂薬、抗血管新生剤及びアポトーシス促進剤、特に、ドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、他のカンプトテシン、及びこれらと別のもの、ならび他の部類の抗癌剤などの化学療法剤も含まれる。他の癌化学療法薬には、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類縁体、ピリミジン類縁体、プリン類縁体、白金配位錯体、ホルモンなどが含まれる。適切な化学療法剤は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）及びＧＯＯＤＭＡＮ  ＡＮＤ  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）、ならびにこれらの出版物の改訂版に記載されている。実験薬などの他の適切な化学療法剤は、当業者に知られている。
【０１９１】
使用される例示的な薬物には、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン（ａｐｌｉｄｉｎ）、アザリビン（ａｚａｒｉｂｉｎｅ）、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス（ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ（ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ）、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、ホスタマチニブ（ｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂ）、ガネテスピブ（ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂ）、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソ尿素、オラパリブ、プリカマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド及びＺＤ１８３９が含まれるが、これらに限定されない。このような作用物質は、本明細書に記載されている抱合体の一部でありうる、または代替的に、記載されている抱合体との組み合わせにより、抱合体の前、抱合体と同時、もしくは抱合体の後に投与されうる。あるいは、当該技術に既知の１つ以上の治療用裸抗体を、記載されている抱合体と組み合わせて使用することができる。例示的な治療用裸抗体は、上記に記載されている。
【０１９２】
カンプトテシン抱合体と一緒に使用することができる治療剤は、標的部分に抱合させた毒素を含むこともできる。これに関連して使用することができる毒素には、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素が含まれる。（例えば、Ｐａｓｔａｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８６），４７：６４１及びＳｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２００６  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；５６（４）：２２６−４３を参照すること。）本明細書における使用に適する追加の毒素は当業者に知られており、米国特許第６，０７７，４９９号に開示されている。
【０１９３】
治療剤のなお別の部類には、１つ以上の免疫調節物質が含まれうる。使用される免疫調節物質は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン及びこれらの組み合わせから選択されうる。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロン−α、−β、−γ、または−λなどのインターフェロン及び「Ｓ１因子」と呼ばれるものなどの幹細胞増殖因子が特に有用である。サイトカインのうち、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び黄体化ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞増殖因子；プロスタグランジン；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、−γ及び−λなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５などのインターロイキン；ＬＩＦ；ｋｉｔ−リガンドまたはＦＬＴ−３；アンジオスタチン；トロンボスポンジン；エンドスタチン；腫瘍壊死因子；ならびにリンホトキシン（ＬＴ）が含まれる。本明細書において使用されるとき、サイトカインという用語には、天然源からのタンパク質、または組み換え細胞培養物からのタンパク質及び未変性配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【０１９４】
使用されるケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−アルファ、ＭＩＰ１−ベータ及びＩＰ−１０が含まれる。
【０１９５】
配合及び投与
抱合体の適切な投与経路には、経口、非経口、直腸内、経粘膜、腸内投与、髄内、くも膜下腔内、脳室内に直接、静脈内、または腹腔内注射が限定されることなく含まれる。好ましい投与経路は、非経口である。あるいは、化合物を全身的ではなく、例えば、固形腫瘍に化合物を直接注射することによって、局所的に投与することができる。
【０１９６】
免疫抱合体を既知の方法によって配合して、薬学的に有用な組成物を調製することができ、免疫抱合体は、薬学的に適切な賦形剤によって混合物と組み合わされる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に適切な賦形剤の一例である。他の適切な賦形剤は、当業者に良く知られている。例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、ならびにこれらの改訂版を参照すること。
【０１９７】
好ましい実施形態において、免疫抱合体は、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）及びピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）［Ｐｉｐｅｓ］からなる群から選択される緩衝液を使用する、Ｇｏｏｄ生物学的緩衝液（ｐＨ６〜７）によって配合される。より好ましい緩衝液は、ＭＥＳまたはＭＯＰＳであり、好ましくは２０〜１００ｍＭの範囲、より好ましくは約２５ｍＭｎの濃度である。２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５が最も好ましい。配合は、更に、賦形剤として２５ｍＭのトレハロース及び０．０１％ｖ／ｖのポリソルベート８０を含むことができ、賦形剤の添加の結果、最終緩衝液濃度は２２．２５ｍＭに修正されうる。好ましい貯蔵方法は、抱合体の凍結乾燥配合であり、−２０℃〜２℃の温度範囲で貯蔵され、最も好ましくは２℃〜８℃で貯蔵される。
【０１９８】
免疫抱合体を、例えば、ボーラス注射、緩徐注入、または連続注入を介する静脈内投与のために、配合することができる。好ましくは、本発明の抗体は、約４時間未満の時間にわたって、より好ましくは約３時間未満の時間にわたって注入される。例えば、最初の２５〜５０ｍｇを３０分以内、好ましくは１５分以内でも注入することができ、残りを次の２〜３時間にわたって注入することができる。注射用製剤は、単位剤形により、例えば、防腐剤を加えたアンプル剤または多用量容器により提示されうる。組成物は、懸濁剤、液剤、または油状もしくは水性ビヒクル中の乳剤などの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤及び／または分散剤などの配合剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、使用する前に適切なビヒクルにより、例えば発熱物質無含有滅菌水により構成される粉末形態でありうる。
【０１９９】
追加的な薬学的方法を用いて、治療用抱合体の作用持続時間を制御することができる。制御放出調合剤は、免疫抱合体と複合体を形成する、または免疫抱合体を吸着するポリマーの使用によって調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーは、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックス、ならびにステアリン酸二量体及びセバシン酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスを含む。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６（１９９２）。そのようなマトリックスからの免疫抱合体の放出速度は、免疫抱合体の分子量、マトリックス内の免疫抱合体の量及び分散粒子のサイズによって左右される。Ｓａｌｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（上記）。他の固体剤形は、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、ならびにこれらの改訂版に記載されている。
【０２００】
一般に、ヒトに投与される免疫抱合体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医療状態及び以前の病歴などの要因に応じて変わる。単回静脈内注入として約１ｍｇ／ｋｇ〜２４ｍｇ／ｋｇの範囲の免疫抱合体の投与量を、受容者に提供することが望ましい場合もあるが、より少ない、または多い投与量を状況によって投与することもできる。例えば、７０ｋｇの患者への１〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量は、７０〜１，４００ｍｇであり、１．７ｍの患者では４１〜８２４ｍｇ／ｍ２である。投与量は、必要に応じて、例えば、１週間に１回を４〜１０週間にわたって、１週間に１回を８週間にわたって、または１週間に１回を４週間にわたって繰り返すことができる。維持療法として必要に応じて、隔週で数か月間、または毎月もしくは３か月毎で数か月間など少ない頻度で与えることもできる。好ましい投与量には、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ及び２４ｍｇ／ｋｇが含まれうるが、これらに限定されない。１〜２４ｍｇ／ｋｇの範囲における任意の量を使用することができる。投与量は、好ましくは、複数回で１週間に１回または２回投与することができる。４週間、より好ましくは８週間、より好ましくは１６週間、またはより長期間の最小投与量スケジュールを使用することができる。投与スケジュールは、（ｉ）毎週、（ｉｉ）隔週、（ｉｉｉ）１週間の治療の後に２、３、または４週間の休止、（ｉｖ）２週間の治療の後に１、２、３、または４週間の休止、（ｖ）３週間の治療の後に１、２、３、４、または５週間の休止、（ｖｉ）４週間の治療の後に１、２、３、４、または５週間の休止、（ｖｉｉ）５週間の治療の後に１、２、３、４、または５週間の休止及び（ｖｉｉｉ）毎月からなる群から選択されることサイクルによる１週間に１回または２回の投与を含むことができる。サイクルは、４、６、８、１０、１２、１６、もしくは２０回、またはそれ以上の回数で繰り返すことができる。
【０２０１】
あるいは、免疫抱合体は、２または３週間毎に１投与量を投与することができ、合計で少なくとも３投与量を繰り返すことができる。または、１週間あたり２回を４〜６週間にわたって投与することができる。投与量が、およそ２００〜３００ｍｇ／ｍ２（１．７ｍの患者として１投与量あたり３４０ｍｇ、または７０ｋｇの患者として４．９ｍｇ／ｋｇ）に下がる場合、毎週１回または２回を４〜１０週間にわたって投与することができる。あるいは、投与量スケジュールを減少させてもよく、すなわち、２〜３か月あたり２または３週間毎であってもよい。しかし、１２ｍｇ／ｋｇを毎週１回または２〜３週間毎に１回などの更に高い用量を緩徐静注により、反復投与サイクルで投与することができる。投与スケジュールを、任意選択で、他の間隔で繰り返すことができ、投与量を、用量及びスケジュールを適切に調整しながら、様々な非経口経路によって与えることができる。
【０２０２】
好ましい実施形態において、免疫抱合体は癌の治療に使用される。癌の例には、癌腫、リンパ腫、神経膠芽腫、黒色腫、肉腫及び白血病、骨髄腫、またはリンパ性悪性病変が含まれるが、これらに限定されない。そのような癌のより詳細な例は上記に示されており、扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜癌、胃腸癌を含む腸または胃の癌、膵癌、多形神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、肝細胞癌、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、分化型甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌、また、頭頸部癌が含まれる。用語「癌」には、原発性悪性細胞または腫瘍（例えば、最初の悪性病変または腫瘍の部位以外の対象の身体部位に遊走していない細胞のもの）及び二次性悪性細胞または腫瘍（例えば、最初の腫瘍部位と異なる二次部位に悪性細胞または腫瘍細胞が遊走する転移から生じるもの）が含まれる。
【０２０３】
癌または悪性病変の他の例には、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性病変、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂及び尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部及び視覚路神経膠腫（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｇｌｉｏｍａ）、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽細胞腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｐｉｎｅａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  Ｔｕｍｏｒ）、小児原発性肝癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視覚路及び視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌性膵島細胞腫（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ）、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、毛様細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼球内黒色腫、島細胞腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝癌、肺癌、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、転移性原発不明扁平上皮頸部癌、転移性原発性扁平上皮頸部癌、転移性扁平上皮頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄球性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、原発不明転移性扁平上皮頸部癌、中咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、パラプロテイン血症、真性赤血球増加症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮頸部癌、胃癌（Ｓｔｏｍａｃｈ  Ｃａｎｃｅｒ）、テント上原始神経外胚葉��及び松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌、移行性腎盂及び尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路及び視床下部神経膠腫（Ｖｉｓｕａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  Ｇｌｉｏｍａ）、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに上記に列挙された臓器系に位置する新生物以外の他の任意の過剰繁殖性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０４】
本明細書において記載及び主張されている方法及び組成物を使用して、悪性または前悪性状態を治療すること及び上記に記載された障害が含まれるが、これらに限定されない新生物または悪性状態への進行を予防することができる。そのような使用は、特に、過形成、変質形成、またはとりわけ異形成からなる非新生物細胞増殖が生じている新生物または癌への進行が前もって知られている、または疑われる状態を示す（このような異常増速状態についての総説は、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ，Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８−７９（１９７６）を参照すること）。
【０２０５】
異形成は、しばしば癌の前兆であり、主に上皮に見出される。これは、個別細胞の均一性及び細胞の構造配置の喪失を伴っている、非新生物細胞増殖の最も無秩序な形態である。異形成は、慢性的な刺激または炎症が存在する場合に特徴的に生じる。治療することができる異形成障害には、無汗性外胚葉異形成、前後異形成（ａｎｔｅｒｏｆａｃｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、窒息性胸郭異形成、心房指形成異常（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋骨異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成（ｃｒａｎｉｏｄｉａｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、頭蓋手根足根骨異形成（ｃｒａｎｉｏｃａｒｐｏｔａｒｓａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、頭蓋骨幹端異形成（ｃｒａｎｉｏｍｅｔａｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳−眼異形成、半肢骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ  ｈｅｍｉｍｅｌｉａ）、多発性骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）、点状骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ  ｐｕｎｃｔａｔａ）、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成（ｆａｃｉｏｄｉｇｉｔｏｇｅｎｉｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、家族性線維性上顎異形成（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｏｆ  ｊａｗｓ）、家族性白色襞性異形成（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｗｈｉｔｅ  ｆｏｌｄｅｄ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、線維筋性異形成、線維性骨異形成、開花性骨異形成（ｆｌｏｒｉｄ  ｏｓｓｅｏｕｓ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、遺伝性腎−網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少性外胚葉異形成（ｈｙｐｏｈｉｄｒｏｔｉｃ  ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、リンパ性減少性胸腺異形成（ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉｃ  ｔｈｙｍｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、乳腺異形成、下顎顔面異形成（ｍａｎｄｉｂｕｌｏｆａｃｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、骨幹端異形成（ｍｅｔａｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、Ｍｏｎｄｉｎｉ異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼耳脊椎異形成（ｏｃｕｌｏａｕｒｉｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼歯指異形成、眼脊椎異形成（ｏｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、歯牙異形成（ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質異形成（ｐｅｒｉａｐｉｃａｌ  ｃｅｍｅｎｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成（ｐｓｅｕｄｏａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成（ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）及び心室橈骨異形成（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｒａｄｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０６】
治療することができる追加の前新生物障害には、良性の繁殖異常（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大化、腸ポリープまたは腺腫、及び食道異形成）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎（ｓｏｌａｒ  ｃｈｅｉｌｉｔｉｓ）及び日光角化症が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０７】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、癌、特に上記に列挙された癌の増殖、進行及び／または転移の阻害に使用される。
【０２０８】
追加的な過剰繁殖性疾患、障害及び／または状態には、白血病（急性白血病、例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病［骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病性のものが含まれる］を含む）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄性［顆粒球性］白血病及び慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病などの悪性病変及び関連障害、ならびに線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫（ｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫などの肉腫及び癌腫が含まれるが、これらに限定されない固形腫瘍の進行及び／または転移が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０９】
免疫抱合体により治療することができる自己免疫性疾患には、急性及び慢性免疫性血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維性肺胞炎が含まれうる。
【０２１０】
キット
様々な実施形態は、患者の罹患組織を治療するのに適した構成成分を含有するキットに関連しうる。例示的なキットは、本明細書に記載されている少なくとも１つの抱合抗体または他の標的化部分を含むことができる。投与用の構成成分を含有する組成物が、経口送達などの消化管を介した送達用に配合されていない場合、他の経路を介してキットの構成成分を送達することができる装置を、含めることができる。非経口送達などの用途のための装置の１つの種類は、組成物を対象の身体に注射するのに使用されるシリンジである。吸入装置を使用することもできる。
【０２１１】
キットの構成成分を一緒に、または２つ以上の容器に別々に包装することができる。いくつかの実施形態において、容器は、再構成に適した組成物の滅菌凍結乾燥配合物を含有するバイアルでありうる。キットは、他の試薬の再構成及び／または希釈に適した１つ以上の緩衝液を含むこともできる。使用することができる他の容器には、パウチ、トレイ、ボックス、チューブなどが含まれるが、これらに限定されない。キットの構成成分を容器内に滅菌的に包装し、維持することができる。含めることができる別の構成成分は、キットの使用者への使用説明書である。
【実施例】
【０２１２】
本発明の様々な実施形態が、本発明の範囲を制限することなく、以下の実施例によって説明されている。
概要
下記に使用されている略語は以下である。ＤＣＣ  ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＮＨＳ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＤＭＡＰ  ４−ジメチルアミノピリジン、ＥＥＤＱ  ２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン、ＭＭＴ  モノメトキシトリチル、ＰＡＢＯＨ  ｐ−アミノベンジルアルコール、ＰＥＧ  ポリエチレングリコール、ＳＭＣＣ  スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ＴＢＡＦ  フッ化テトラブチルアンモニウム、ＴＢＤＭＳ  ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド。
【０２１３】
以下の実施例のヒドロキシ化合物のクロロギ酸エステルは、参照として組み込まれるＭｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．５１：６９１６−６９２６，２００８）に記載されている手順に従って、トリホスゲン及びＤＭＡＰを使用して調製した。抽出処理とは、クロロホルム、ジクロロメタン、または酢酸エチルによる抽出、ならびに飽和重炭酸塩、水及び飽和塩化ナトリウムによる任意の洗浄を指す。フラッシュクロマトグラフィーは、特に記述のない限り、２３０〜４００メッシュのシリカゲル及び１５％ｖ／ｖメタノール−ジクロロメタンまで使用するメタノール−ジクロロメタン勾配を使用して実施した。逆相ＨＰＬＣは、プレカラムフィルターを取り付けた７．８×３００ｍｍのＣ１８  ＨＰＬＣカラムを使用し、１分あたり３ｍＬの流速により１０分間かけて溶媒Ａ１００％から溶媒Ｂ１００％への溶媒勾配を使用し、１分あたり４．５ｍＬの流速により５もしくは１０分間にわたって溶媒Ｂ１００％を維持する方法Ａによって、またはプレカラムフィルターを取り付けた４．６×３０ｍｍのＸｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８、２．５μｍカラムを使用し、１分あたり１．５ｍＬの流速により４分間かけて溶媒Ａ１００％から溶媒Ｂ１００％の溶媒勾配を使用し、１分あたり２ｍＬの流速により１分間にわたって溶媒Ｂ１００％を維持する方法Ｂによって実施した。溶媒Ａは、０．３％酢酸アンモニウム水溶液、ｐＨ４．４６であり、一方、溶媒Ｂは、９：１のアセトニトリル−酢酸アンモニウム水溶液（０．３％）、ｐＨ４．４６であった。ＨＰＬＣは、３６０ｎｍ及び２５４ｎｍに設定した二重直列式吸光度検出器によってモニターした。
【０２１４】
実施例１：ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の調製
ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の合成についての好ましい反応スキームを図１に示す。米国特許第９，１０７，９６０号に記載された以前の方法の合成プロトコールが、図１に示されている改善されたプロトコールの基礎であった。米国特許第９，１０７，９６０号に開示された基質、中間体及び反応が、本実施例において考察されている。図１に組み込まれた米国特許第９，１０７，９６０号のプロトコールに対する更なる改善が、以下の実施例に記載されている。
【０２１５】
Ｏ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−［（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ］ヘプタエチレングリコール（中間体３）の調製：５００ｍＬの一つ口フラスコに、市販のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ））−ＯＨ（１６ｇ）、ｐ−アミノベンジルアルコール（３．２６ｇ）及びＥＥＤＱ（６．５２ｇ）を加え、続いて無水ジクロロメタン（８０ｍＬ）を加えた。一晩撹拌した後、ジエチルアミン（２５ｍＬ）を加え、更に６時間後、反応混合物を約５０ｍＬの体積に濃縮した。これをヘプタンで希釈し、溶液をまた５０ｍＬに濃縮した。ヘプタンによる２回の追加投入（それぞれ５０ｍＬ）は、底部にガム状材料を含有する二相混合物をもたらした。ガム状材料をジクロロメタン（２４ｍＬ）に取り、撹拌し、ヘプタン（８０ｍＬ）をゆっくりと添加して処理した。１時間撹拌した後、スラリーを濾過して、１３．０２ｇ（収率９９．６％）のＬｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（中間体２、図１）を得た。材料を、残留ジエチルアミンの存在が見出される場合、任意選択でクロマトグラフィーにより更に精製した。Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（１１．５１ｇ）を、無水ジクロロメタン（９０ｍＬ）中のＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）ヘプタエチレングリコール（ＰＥＧ−Ｎ３、１２．１０７ｇ）の溶液と混合した。この撹拌溶液に、ＥＥＤＱ（５．５４ｇ）を加えた。約１８時間後、反応混合物を濃縮し、酢酸エチル−メタノール勾配溶出を使用するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、純粋な表記生成物（中間体３、図１）を得た。
【０２１６】
ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８（中間体４）の調製：調製を修正して、ジメチルホルムアミドの代わりに、溶媒として、処理を容易にすることができるジクロロメタンを使用した。無水ジクロロメタン（１６０ｍＬ）中のジイソプロピルアミン（３６．６ｇ）の溶液を、ＳＮ−３８（３３ｇ）に加えた。懸濁液を氷／水浴で冷却し、撹拌した。この撹拌懸濁液に、ジクロロメタン（１２５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（３１．７２ｇ）の溶液を加えた。冷却浴を取り外し、反応混合物を４時間撹拌した。明澄な反応混合物を３８０ｍＬの、１０％塩化ナトリウム溶液中０．２Ｍ  ＨＣｌ及び３００ｍＬの１０％塩化ナトリウム溶液で洗浄した。乾燥し、溶媒を除去した後、生成物が酢酸エチル−ヘプタンに沈殿して、３８．７５ｇ（収率９１％）のＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８を得た。
【０２１７】
１０−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８−２０−Ｏ−クロロホルメート（反応性中間体５）の生成及びＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−［（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８］ヘプタエチレングリコール（中間体７）の調製：必要量のトリホスゲンの多量添加による大きな発熱を避けるため、改善された方法は、無水ジクロロメタン（４ｍＬ）中のトリホスゲン（０．２４ｇ）の溶液を、ジクロロメタン（１７ｍＬ）中の０．９４ｇのＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８及びＤＭＡＰ（０．７６ｇ）の撹拌混合物に３０分間かけて添加することを発明した。これは、無水メタノールで停止させた反応混合物の停止アリコートのＨＰＬＣ分析によって決定すると、反応中間体（図１の５）への９８．５％の変換をもたらした。このようにして、最初に未反応ＳＮ−３８と形成されたクロロギ酸エステルを停止させたことにより、二量体材料の形成の形跡のない、必要とされる生成物の完全な形成を確実にした。多量添加は、５．８℃〜１７．６℃の大きな発熱をもたらしたが、ゆっくりとした添加は、内部温度を、反応の質を損なうことなく、全体を通して＜１０℃に維持した。同じ手法を、２５０ｍＬの無水ジクロロメタン中の１１．２５ｇ（２２．２ｍｍｏｌ）のＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８を使用し、上記の小規模反応についての記載に見合った他の試薬を使用して、繰り返した。１５分後、ジクロロメタン（１２５ｍＬ）中の２５．０１ｇのＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−［（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ］ヘプタエチレングリコール（中間体３、図１）の溶液を８分間かけて加えた。７５分後、反応混合物を５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．３、水及びブラインで連続して洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次に生成物の溶液を、テトラヒドロフラン中の１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウム（３１ｍＬ）、無水ジクロロメタン（３４ｍＬ）及び酢酸（３ｍＬ）の混合物で撹拌した。２時間後、反応混合物を０．２５Ｍのクエン酸緩衝液、ｐＨ６、水及びブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。メタノール−塩化メチレン混合物により勾配溶出するシリカゲルクロマトグラフィーは、１７．３ｇ（収率５２％）の表記生成物（中間体７）をもたらした。
【０２１８】
ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の調製：無水ジクロロメタン（１３０ｍＬ）中のＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−［（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８］ヘプタエチレングリコール（中間体７、１０．２ｇ）を、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−Ｎ−（２−プロピニル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド（中間体８［「ＭＣＣ−ｙｎｅ」］、３．７８ｇ）と混合した。これに、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（０．３８ｇ）、臭化第一銅（０．２４ｇ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．２５ｍＬ）の混合物を加えた。反応混合物を周囲室温で１４時間撹拌した。材料を濃縮し、クロマトグラフィーにより精製し、純粋な生成物をＥＤＴＡ、水及びブラインで洗浄した。生成物のＯ−｛２−［（１，２，３−トリアゾリル）−４−［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミドメチル］］エチル｝−Ｏ’−［（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８］ヘプタエチレングリコール（中間体９）を１０．８ｇ（収率８９％）の量で得て、これは以前に得た６７％の最大収率よりも良好であった。この修正手順は、反応時間の低減（１８〜４１時間に対して１４時間）のために収率を改善し、また、クロマトグラフィーを最初に実施し、後にＥＤＴＡによる抽出を実施することによって、中間体９が以前に遭遇した安定性の問題を回避した。ジクロロメタン中の生成物溶液を、アニソール（２．８ｇ）と混合し、＜５℃に冷却し、ジクロロ酢酸（５．８ｇ）と２時間反応させた。最終生成物のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに合計収率（２ステップ）の８１％で沈殿した。
【０２１９】
実施例２．ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の改善された合成プロトコール
上記の実施例１に開示された合成プロトコールはＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の大規模調製に適しているが、米国特許第９，１０７，９６０号の出願日には知られてなく、予測できなかった更なる改善が、本明細書において開示されている。
【０２２０】
本明細書に開示されているＣＬ２Ａリンカーは、確定数のＰＥＧモノマーを含有するＰＥＧ部分を含む。図１に示されているように、好ましい実施形態において、リンカーに使用されるＰＥＧモノマーの数は８個である。しかし、本発明の範囲内の代替的実施形態は、１〜３０個、より好ましくは１〜１２個、より好ましくは６〜１０個、より好ましくは８個のＰＥＧモノマー数を利用することができる。
【０２２１】
方法の改善の実施には３つの主な段階があり、（ａ）中間体６から中間体７への変換、（ｂ）中間体８から中間体９への変換及び（ｃ）中間体９から中間体１０への変換である。
【０２２２】
中間体７の調製における収率の改善
シリル保護中間体６から脱シリル化中間体７への変換において、使用されたフッ化テトラブチルアンモニウムを以前の方法の１．４倍モル過剰量から本プロトコールの１．１倍モル過剰量に変更した。この試薬レベルは等しく効率的であり、また、不純物プロファイルを低減し、それによって中間体７の純度プロファイルを向上させ、改善された収率をもたらした。
【０２２３】
中間体６及び７の両方の調製における水性処理は、以下のように低減された。以前の方法において、処理は、有機抽出物を、中間体６では０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．３により４回、中間体７では０．２５Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ６により４回洗浄すること、その後に、それぞれ水による洗浄を伴った。改善されたプロトコールでは、緩衝液による洗浄を中間体６及び７ではそれぞれ３回及び２回に低減し、水による洗浄を両方から省いた。これらの修正は、エマルションの形成を顕著に低減し、有機抽出物からの生成物の回収を改善した。
【０２２４】
中間体７のクロマトグラフィー精製は、以前は溶出にジクロロメタン−メタノール混合物の使用を伴った。図１の改善されたプロトコールでは、溶出を、様々なメタノール濃度を有するジクロロメタン−酢酸エチル−メタノール混合物、続いて様々な濃度のジクロロメタン−メタノール混合物の組み合わせに修正した。このことは、中間体のより良好で迅速な分離をもたらし、回収を改善した。使用される溶媒の比率は、下記の実施例４により詳細に考察される。
【０２２５】
中間体４から中間体７への３ステップ連続における全体的な収率は、これらの方法の変更を組み込むことによって２９〜４０％の範囲から６４％に改善された。
【０２２６】
中間体９の調製における方法の堅牢性の改善
以前に開示された合成プロトコール（複数可）では、中間体９を生成する中間体７及び８の銅（＋１）触媒反応は、臭化第一銅及びトリフェニルホスフィンの新たに形成された錯体を、ジイソプロピルエチルアミンなどの第三級アミンを加えたジクロロメタン中において使用することによって実施した。この手順は良好に機能し、精製した後に中間体９を５０〜６０％の収率で生成した。しかし、錯体における臭化第一銅及びトリフェニルホスフィンの比率は、注意深く制御される必要があった。トリフェニルホスフィン単独の存在下では、中間体９の生成物の品質が経時的に劣化することが示され、この試薬の有害な効果が示され、銅触媒反応が完了すると、この試薬の素早い除去を必要とした。このことは特定の制限をもたらし、精製中間体９の収率を、特に大規模調製において下げる可能性がある。
【０２２７】
本明細書に開示されている修正手順において、反応は、水中の硫酸銅及びアスコルビン酸と、ジクロロメタン中の中間体７及び８、ならびに２，６−コリジンとを含有する二相混合物を使用することによって実施した。二相溶液を一晩、典型的には１８時間撹拌することによって、変換が完了し、粗生成物を、ＥＤＴＡ水溶液による簡単な洗浄及びクロマトグラフィーによる精製によって、硫酸銅及びアスコルビン酸塩から分離した。生成物の収率は、触媒として臭化第一銅／トリフェニルホスフィンを用いたものに類似していたが、改善されたプロトコールは、トリフェニルホスフィンの使用及び中間体の安定性に対する作用の可能性を回避している。
【０２２８】
最終生成物１０（ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）の調製方法の改善
溶液中の及び溶媒を用いないで単離された材料としての中間体９の安定性プロファイルは、生成物が固体生成物として−２０℃で４日間、またはジクロロメタン中の溶液として室温で１日貯蔵されたときに、＞９７％の純度を維持したことを示した。後者の場合では、室温での４日間の貯蔵は純度を８９．４％に低減し、一方、−２０℃で貯蔵した溶液は、僅か９２％の純度を示した。以前に開示されたプロトコールでは、クロマトグラフィー及びＥＤＴＡ洗浄の後に得た、ジクロロメタン中の材料を、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）及びアニソールにより媒介された脱保護反応にそのまま使用した。その状況下では、溶液形態の中間体９の貯蔵期間に応じて、最終材料（ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）の品質が変わる。改善されたプロトコールでは、精製した後の中間体９を固体に濃縮し、続いて最終脱保護ステップに使用した。この修正は、最終脱保護ステップの前に、中間体９の生成物の品質の変化についての不確実性を取り除いた。
【０２２９】
粗生成物の溶液の添加に関する別の改善は、反応後に、粗生成物の溶液を、激しく撹拌したｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ｔ−ＢＭＥ）に数時間かけて滴加することを伴い、このことによって、生成物を濾過可能な固体の形態で沈殿させることができた。反応混合物の添加が徐々にではなく、撹拌が激しくない場合では、生成物は固体として沈殿する代わりに油状物になった。
【０２３０】
他の変更を、図１の合成プロトコールの様々なステップに組み込むことができる。例えば、中間体１から中間体２への変換及び中間体２から中間体３への変換において、ＥＥＤＱが、アミドカップリング試薬として示されている。しかし、当業者は、アミドカップリングは、Ｈａｎ  Ｓ−Ｙ  ａｎｄ  Ｋｉｍ  Ｙ−Ａ．Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４；６０：２４４７−２４６７及びＶａｌｌｅｕｒ  Ｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｍ．Ａｍｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  ｍｙｔｈ  ｏｆ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ  ２００９；３８：６０６−６３１に総括されているように、多数の代替的試薬を使用して達成できることを認識している。非限定例において、有用なアミドカップリング試薬は（１）１−ヒドロキシ−１  Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）から選択される添加剤と共に使用されるジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミド試薬、（２）ウロニウム塩Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）及びＯ−ベンゾトリアゾール−１−イルｌ）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、（３）Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）及びＮ−イソブトキシカルボニル−２−イソブトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＩＩＤＱ）、ならびに（４）イソブチルクロロホルメートから選択されうる。
【０２３１】
実施例３．中間体６から中間体７への脱シリル化におけるフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）の１．４当量の使用に対する１．１当量の使用
１４ｍＬのＤＣＭに溶解した粗中間体６（１３．７８ｇ、０．８７３ｍｍｏｌ）を冷却し、酢酸（０．１２６ｇ）を含有する１Ｍのフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）の１．４当量で処理し、反応混合物を≦２０℃で維持した。１時間後、反応混合物を０．２５Ｍのクエン酸緩衝液、ｐＨ６（３×１０ｍＬ）、水及び５％塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ＨＰＬＣは、粗生成物が８５．５％の純度であることを示し、不純物は以下のように４つのピーク位置を示した。１．０％（０．７９の相対保持時間またはＲＲＴ）、２．４％（０．８６４のＲＲＴ）、１．５％（０．９４のＲＲＴ）及び３．７％（１．１６２のＲＲＴ）。同じ反応を、１．１当量の１Ｍ  ＴＢＡＦを使用して実施した場合、生成物のＨＰＬＣ純度は、８８．２％と僅かに改善したが、不純物は有意に低下した。０．３％（０．７９のＲＲＴ）、０．７％（０．８６４のＲＲＴ）、０．８％（０．９４のＲＲＴ）及び２．４％（１．１６２のＲＲＴ）。これらの不純物プロファイルの改善は、続くクロマトグラフィー分離を簡素化した。
【０２３２】
実施例４．中間体７のクロマトグラフィーにおける二成分溶媒系の使用に対する三成分溶媒系体の使用
１７．２ｇの粗中間体７の溶液を、１５％ジクロロメタン（ＤＣＭ）／酢酸エチルである移動相Ａ（ＭＰＡ）に充填されたシリカゲルカラムに適用した。溶出は、０〜５％メタノール−ＭＰＡを使用する段階勾配、続く２：１混合物の５％メタノール−ＭＰＡ及び５％メタノール−ＤＣＭ、１：２混合物の５％メタノール／ＭＰＡ及び５％メタノール−ＤＣＭ、最後に５％メタノール／ＤＣＭによって実施した。収集された７つの画分は、＞９３％の生成物純度を示し、以前に開示された二成分クロマトグラフィー溶出系の４４．７％の収率に対して、６９．６％の生成物収率をもたらした。後者の系では、１７．２ｇの粗中間体７の溶液を、修正手順の同じ条件下でシリカゲルカラムに適用したが、０〜５％メタノール−ＤＣＭ混合物を使用する段階勾配により溶出した。純度＞９３％の生成物が、わずか２つの画分において得られ、４４．７％の収率をもたらした。続く実験では、ＭＰＡを３０％ＤＣＭ／酢酸エチルから作製し、次に溶出用に様々な濃度のエタノール濃度と混合した。
【０２３３】
実施例５．中間体４から中間体７への３ステップ変換における収率の改善ステップ
１３３ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）中の８．８６８ｇ（１７．５ｍｍｏｌ）のＴＢＤＭＳ−ＳＮ−３８（中間体３）及び４−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ］ピリジン（ＤＭＡＰ，７．０６ｇ、３．３当量）の溶液を、窒素下で撹拌し、２．６℃の内部温度に冷却した。この溶液に、６分間かけて、４４ｍＬのＤＣＭ中のトリホスゲン（２．４ｇ、８．０８８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を１５℃の内部温度に２０分間かけて温め、１５〜１６℃で１０分間保持した。反応混合物を６．４℃の内部温度に冷却し、続いて９７．５ｍＬの無水ＤＣＭ中の中間体３（１８．０３ｍｍｏｌ、１．０３当量）の溶液を、内部温度を≦１５℃に維持しながら加えた。反応混合物を３．５時間撹拌し、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３緩衝液（３×９７．５ｇ）及び１０％塩化ナトリウム（９７．５ｇ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。
【０２３４】
濾過した溶液を≦１５℃の内部温度に冷却し、酢酸（２．５２ｇ、４２．０ｍｍｏｌ、２．４当量）を含有する、２７ｍＬのＤＣＭ中の１Ｍ  ＴＢＡＦ（１９．３ｍＬ、１９．３ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液で処理した。混合物を１０〜１６℃で４５分間撹拌し、次に２×３００ｇの、４００ｇの０．２５Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６及び２００ｇの１０％塩化ナトリウムの混合物で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥溶液を約５０ｍＬに濃縮し３０％ＤＣＭ／酢酸エチル（ＭＰＡ）を充填した４００ｇのシリカゲルカラムに適用した。溶出は、増加濃度のメタノール（ＭＰＡ中１〜５％メタノール）を含有する段階勾配、続く２：１ＭＰＡ／ＤＣＭ中の５％メタノール、１：２  ＭＰＡ／ＤＣＭ中５％メタノール及び５％メタノール／ＤＣＭによる溶出によって実施した。純度≧９４％の最高純度の画分を合わせ、約５０ｍＬに濃縮し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、２×８０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１：１、１６０ｍＬ）を投入して、最終体積の３５〜５０ｍＬにして、１６０ｍＬのヘプタンで希釈した。沈殿した固体生成物を濾過し、真空下、４０℃で乾燥した。収量は１７．２１ｇ（３．２ｗｔ％の残留ヘプタンを調整した後、６４．３％）であった。生成物である中間体７のＨＰＬＣ純度は、９５％であった。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、構造を確認した。単離収率の６４．３％は、以前に開示されたプロトコールによって得られた２９〜４０％より高かった。
【０２３５】
実施例６．トリフェニルホスフィンの存在下での中間体９の安定性
中間体９の純粋で組み合わせたクロマトグラフィー画分を、０ｍｏｌ％（対照）、１０ｍｏｌ％及び２０ｍｏｌ％のトリフェニルホスフィンの存在について、室温で９６時間にわたって評価した。下記の表６は、生成物の品質がトリフェニルホスフィンの存在下で劣化したことを示す。
【表６】
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【０２３６】
実施例７．中間体９の調製における改善
琥珀色ボトルに、中間体７（ｎ＝８、２３２ｇ、１５７ｍｍｏｌ、１当量）及び塩化メチレン（２．１ｋｇ）を投入して、溶液を形成した。この溶液を、オーバーヘッド撹拌機、温度プローブ及び窒素ブランケットを備えた１２Ｌの丸底フラスコに移した。丸底フラスコに、中間体８（７７ｇ、２８０ｍｍｏｌ、１．８当量）、塩化メチレン（１．２ｋｇ）、１Ｍ硫酸銅（ＩＩ）溶液（３２ｇ）、１Ｍ（＋）−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム溶液（９３ｇ）及び２，６−ルチジン（２０ｇ）を投入した。得られた溶液を一晩撹拌した。１８．５時間後、反応混合物を１．５Ｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液、ｐＨ５．５で６回洗浄した。有機層を０．７Ｌに濃縮し、１１”幅カラムに充填された６ｋｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。溶出は、０〜８％のメタノール−塩化メチレン混合物を用いて、５．８、１４．５、１４．５、２３．２、２３．２、２３．２、２３．２及び４６．４リットルの体積で連続段階勾配によって実施した。純粋画分を合わせ、溶媒を蒸発させた。回収：１４５ｇ（収率５２．６％、ＨＰＬＣ純度９６．５％）
【０２３７】
実施例８．中間体９の安定性プロファイル
中間体９は、硫酸銅／アスコルビン酸ナトリウム水溶液及び中間体７と８のＤＣＭ溶液の二相混合物を使用して調製した。生成物の単離によって、６０〜６５％の収率で純粋な中間体９を得た。無溶媒生成物（固体生成物）及びクロマトグラフィーの合わせた純粋画分（溶液形態）の両方を、安静性分析にかけた。表７は、ＨＰＬＣ分析による安定性データを提示する。このデータから、中間体９がＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８へ脱保護される前に、固体形体により低温度貯蔵されることが最適であると決定された。
【表７】
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【０２３８】
実施例９．ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（最終生成物１０）の調製
中間体９（１４５ｇ）を塩化メチレン（１．７ｋｇ）に溶解し、この溶液を、オーバーヘッド撹拌機、温度プローブ及び窒素ブランケットを備えた５Ｌの丸底フラスコに移した。この溶液に、アニソール（３９ｇ、３５９ｍｍｏｌ、４．３５当量）を加え、溶液を４℃に冷却した。ジクロロ酢酸（１０７ｇ、８３１ｍｍｏｌ、１０．０８当量）を、温度を≦４℃に維持しながら２０分間かけて加えた添加した後、温度を１５℃に増加し、反応混合物を４時間撹拌した。この反応混合物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ｔ−ＢＭＥ、３．８ｋｇ）に加え、オーバーヘッド撹拌機、添加漏斗及び窒素入口を取り付けた２２Ｌの丸底フラスコに、激しく撹拌しながら、１．５時間かけて入れた。得られたスラリーを室温で１２時間撹拌した。固体を沈殿させ、上澄みを廃棄した。固体を４％塩化メチレン／ｔ−ＢＭＥですすぎ、ｔ−ＢＭＥでスラリー化し、濾過した。収集した固体を真空下、≦４０℃で乾燥して、１２４．３ｇの表記化合物を黄色の固体（収率９３．６％）として得た。
【０２３９】
実施例１０．抗体へのＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の抱合
抗ＣＥＡＣＡＭ５ヒト化ＭＡｂのｈＭＮ−１４、抗ＣＤ２２ヒト化ＭＡｂのｈＬＬ２、抗ＣＤ２０ヒト化ＭＡｂのｈＡ２０、抗ＥＧＦ−１ヒト化ＭＡｂのｈＲＳ７及び抗ムチンヒト化ＭＡｂのｈＰＡＭＡ４を、これらの研究に使用した。それぞれの抗体を、７〜７．４の範囲のｐＨでリン酸緩衝液中のトリス（２−カルボキシエチル）リン酸（ＴＣＥＰ）により穏やかに還元し、ｐＨを６．５に調整し、共溶媒として５〜１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを使用し、周囲温度で２０分間インキュベートすることによって、約１０倍モル過剰量のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と反応させた。あらゆる過剰量のチオールを、抗体に対して１０倍モル過剰量の水性溶液として使用したＮ−エチルマレイミドでキャップした。
【０２４０】
抱合体を、２０〜３０透析濾過体積の最終配合緩衝液、２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５を使用して、接線流濾過（ＴＦＦ）により精製した。この方法は、煩わしいサイズ排除及び疎水性カラムの連続精製を回避し、それによって数百グラムの抱合体が容易に精製されることを可能にした。生成物を、３６６ｎｍでの吸光度及び標準値との相関によって、ＳＮ−３８についてアッセイした。タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度から差し引いて、この波長でのＳＮ−３８吸光度のスピルオーバーを補正した。これから、ＳＮ−３８／ＭＡｂ置換比（ＤＡＲ）を決定した。精製抱合体をガラスバイアルに凍結乾燥配合物として貯蔵し、真空下で蓋をして、−２０℃の冷凍庫に貯蔵した。これらの抱合物のうちのいくつかから得られた、典型的には５〜７の範囲であったＤＡＲが、表８に示されている。
【表８】
2018520148.tif 000015
【０２４１】
実施例１１．ヒト膵癌または結腸癌の前臨床モデルにおけるインビボ治療有効性
ヒト膵臓または結腸腫瘍異種移植片を皮下に有する免疫力低下胸腺欠損雌ヌードマウスを、特異的ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体もしくは対照抱合体のいずれかによって治療した、または未治療のままにした。特異的抱合体の治療有効性を観察した。図２は、Ｃａｐａｎ１膵臓腫瘍モデルを示し、ｈＲＳ７（抗−ＥＧＰ−１）、ｈＰＡＭ４（抗−ムチン）及びｈＭＮ−１４（抗−ＣＥＡＣＡＭ５）抗体の特異的ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、対照のｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体（抗−ＣＤ２０）及び未治療対照より良好な有効性を示した。ヒト膵癌のＢＸＰＣ３モデルと同様に、特異的ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、対照治療より良好な治療有効性を示した（図３）。同様に、ヒト結腸癌の侵襲性ＬＳ１７４Ｔモデルでは、特異的ｈＭＮ−１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８による治療は、非治療よりも有効であった（図４）。
【０２４２】
実施例１２．多様な上皮癌の有効な治療のためのヒト化抗ＴＲＯＰ−２ＩｇＧ−ＳＮ−３８抱合体
この研究の目的は、いくつかのヒト固形腫瘍型に対するＳＮ−３８−抗ＴＲＯＰ−２抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）の有効性を評価すること、ならびにマウス及びサルにおける耐容性を評価することであり、後者では、ヒトに類似したｈＲＳ７への組織交差反応性について評価した。２つのＳＮ−３８誘導体のＣＬ２−ＳＮ−３８（米国特許出願第７，５９１，９９４号を参照すること）及びＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を、抗ＴＲＯＰ−２ヒト化抗体のｈＲＳ７に抱合した。免疫抱合体を、安定性、結合及び細胞傷害性についてインビトロで特徴決定した。有効性を、ＴＲＯＰ−２抗原を発現した５つの異なるヒト固形腫瘍異種移植片モデルにいおて試験した。傷害性を、マウス及びカニクイザルにおいて評価した。
【０２４３】
２つのＳＮ−３８誘導体のｈＲＳ７抱合体は、薬物置換（約６）、細胞結合（Ｋｄ約１．２ｎｍｏｌ／Ｌ）、細胞傷害性（ＩＣ５０約２．２ｎｍｏｌ／Ｌ）及びインビトロ血清安定性（ｔ／１／２約２０時間）が同等であった。ＡＤＣへの細胞の曝露は、ＰＡＲＰ切断をもたらすシグナル伝達経路を示したが、ｐ５３およびｐ２１上方制御における遊離ＳＮ−３８の差が注目された。非標的化対照ＡＤＣと比較したとき、有意な抗腫瘍効果が、Ｃａｌｕ−３（Ｐ≦０．０５）、Ｃａｐａｎ−１（Ｐ＜０．０１８）、ＢｘＰＣ−３（Ｐ＜０．００５）及びＣＯＬＯ  ２０５（Ｐ＜０．０３３）の腫瘍を有するマウスにおける非毒性用量のｈＲＳ７−ＳＮ−３８によって、生じた。マウスは、短時間のＡＬＴ及びＡＳＴ肝臓酵素レベルの上昇のみを伴って、２×１２ｍｇ／ｋｇ（ＳＮ−３８当量）の用量に耐容した。２×０．９６ｍｇ／ｋｇを注入したカニクイザルは、血球数の一過性の減少のみを示したが、重要なことに、この値は正常範囲を下回らなかった。
【０２４４】
本発明者たちは、抗ＴＲＯＰ−２  ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣが、一連のヒト固形腫瘍型に対して有意で特異的な抗腫瘍効果をもたらしたと結論付けている。組織ＴＲＯＰ−２発現がヒトに類似しているサルにおいて、良好に耐容された。（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９。）
【０２４５】
腫瘍を有する患者におけるイリノテカンによる治療の成功は、主に活性ＳＮ−３８代謝産物へのＣＰＴ−１１プロドラッグの低い変換率に起因して、限定的であった。他の者は、この変換の必要性を迂回するため及びＳＮ−３８を腫瘍に受動的に送達するための手段として、非標的化形態のＳＮ−３８を検査した。本発明者たちは、ＳＮ−３８をヒト化抗ＴＲＯＰ−２抗体のｈＲＳ７に共有結合的に抱合させた。この抗体−薬物抱合体は、非小細胞肺癌、膵癌、結腸直腸癌及び肺扁平上皮癌を含む一連の皮下ヒト癌異種移植変モデルにおいて、全て非毒性用量（例えば、≦３．２ｍｇ／ｋｇ累積ＳＮ−３８等価用量）によって特異的抗腫瘍効果を有する。
【０２４６】
ＴＲＯＰ−２は、多くの上皮癌のみならず、いくつかの正常な組織にも広く発現しており、したがってカニクイザルにおける用量増加研究を実施して、この抱合体の臨床安全性を評価した。サルは、僅かな可逆的細胞傷害性のみを伴って、２４ｍｇのＳＮ−３８当量／ｋｇに耐容した。腫瘍標的化及び安全性プロファイルを考慮すると、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、イリノテカンに応答性のある固形腫瘍の管理に改善をもたらすことができる。
【０２４７】
ヒト栄養芽層細胞表面抗原（ＴＲＯＰ−２）は、ＧＡ７３３−１（胃抗原７３３−１）、ＥＧＰ−１（上皮糖タンパク質−１）及びＴＡＣＳＴＤ２（腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー）としても知られており、様々なヒト癌腫に発現し、より侵襲性の疾患に関連するので、いくつかにおいて予後的有意性を有する（例えば、Ａｌｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １１：５３９−４５、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８−４６、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．８：９８−１０２を参照すること）。マウスＴＲＯＰ−２が形質移入されたマウス膵癌細胞系におけるＴＲＯＰ−２の機能的役割の研究は、低血清条件での繁殖、遊走及びインビトロにおける足場非依存性増殖の増加、ならびにインビボにおけるＫｉ−６７発現の形跡を伴った増殖率の向上及び転移する高い可能性を明らかにした（Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＭｏｌＣａｎｃｅｒ  ９：２５３）。
【０２４８】
多くの上皮癌におけるＴＲＯＰ−２抗原の分布は、これを魅力的な治療標的にする。Ｓｔｅｉｎ及び同僚たち（１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８−４６）は、多数の固形腫瘍に存在するＥＧＰ−１に結合する抗体を特徴決定し、ＲＳ７−３Ｇ１１（ＲＳ７）と命名したが、抗原も、通常は低い強度または限定された領域でいくつかの正常組織において発現した。標的化及び治療有効性が、放射標識ＲＳ７を使用して多数のヒト腫瘍異種移植片において考証されたが（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５８５７ｓ−６３ｓ、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  ８０：２６３６−４１、Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ８４：１７３−８２）、この内部移行抗体は、非抱合系体では治療活性を示さなかった（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５８５７ｓ−６３ｓ）。しかし、インビトロでは、ＴＲＯＰ−２陽性癌に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示した。
【０２４９】
本発明者たちは、ＳＮ−３８のいくつかの誘導体に結合させた抗ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＤ６６ｅ）ＩｇＧ、イリノテカンの活性構成成分であるトポイソメラーゼーＩ阻害剤、またはＣＰＴ−１１を使用する、抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）の調製を報告した（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６、Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１）。誘導体は、インビトロ血清安定性にばらつきがあり、インビボ研究は、一方が、ある程度安定性を有する他方の連結よりも、ヒト結腸及び膵癌異種移植片の増殖を予防または阻止することに有効であることを見出した。
【０２５０】
重要なことに、これらの効果は、非毒性用量で生じることであり、初期の試験は、用量制限毒性を決定することができなかった（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１）。これらの結果は有望であるばかりでなく、驚くべきことでもあり、それは、ＣＥＡＣＡＭ５抗体が、ＡＤＣの成功にとって重要であると考えられた特性である内部移行をしないからである。本発明者たちは、抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＳＮ−３８抱合体の治療活性が、抗体局在化後の、腫瘍内におけるＳＮ−３８の緩徐放出に関係しうると推測した。イリノテカンは、細胞が増殖周期のＳ期に曝露される場合に最適に機能するので、持続放出が応答を改善すると予測される。事実、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはミセルなどの、非標的化血漿増量剤に結合したＳＮ−３８は、イリノテカンまたはＳＮ−３８単独より改善された有効性を示し（例えば、Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８−５６）、この機構に追加的な支持をもたらした。
【０２５１】
ＲＳ７抗体の上皮癌との広範囲な反応性及びその内部移行能力を考慮すると、本発明者たちは、ＲＳ７−ＳＮ−３８抱合体が薬物の持続性放出のみならず、直接的な細胞内送達によっても有益でありうると仮定した。したがって、本発明者たちは、ヒト化型のマウスＲＳ７抗体（ｈＲＳ７）を使用してＳＮ−３８抱合体を調製し、有効性を試験した。ＳＮ−３８誘導体に修飾を行い（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１）、インビボ安定性またはインビボ有効性を変更することなく、抱合体の質を改善した。この新たな誘導体（ＣＬ２Ａと呼ばれる）は、現在、抗体に結合するＳＮ−３８に好ましい作用物質である。ここで、本発明者たちは、ヌードマウスに移植されたいくつかの上皮癌細胞系におけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８抱合体の非毒性投与量での有効性を示し、他の研究は、有意に高い用量が耐容されうることを明らかにしている。更に重要なことに、ヒトに類似した組織にＴＲＯＰ−２を発現するサルにおける毒性研究は、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、マウスにおける治療有効用量よりかなり高い量を耐容し、抱合体が広範囲の上皮癌を有する患者の治療に有望な作用物質である証拠を提供している。
【０２５２】
材料及び方法
細胞系、抗体及び化学療法薬。この研究に使用された全てのヒト癌細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。これらには、Ｃａｌｕ−３（非小細胞肺癌）、ＳＫ−ＭＥＳ−１（肺扁平上皮癌）、ＣＯＬＯ  ２０５（結腸腺癌）、Ｃａｐａｎ−１及びＢｘＰＣ−３（膵臓腺癌）、ならびにＰＣ−３（前立腺腺癌）が含まれる。ヒト化ＲＳ７  ＩｇＧ及び対照ヒト化抗ＣＤ２０（ｈＡ２０  ＩｇＧ、ベルツズマブ）及び抗ＣＤ２２（ｈＬＬ２  ＩｇＧ、エプラツズマブ）抗体は、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．において調製した。イリノテカン（２０ｍｇ／ｍＬ）は、Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．から得た。
【０２５３】
ＳＮ−３８免疫抱合体及びインビトロ態様。ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の合成は、以前に記載されている。（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６。また米国特許第７，５９１，９９４号を参照すること。）ｈＲＳ７  ＩｇＧへの抱合及び血清安定性は、記載されたように実施した（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６、Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１）。ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（Ｍ．Ｗ．１４８０）及びそのｈＲＳ７抱合体の調製、安定性、結合及び細胞傷害性研究を、以前に記載されたように実施した（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６）。細胞溶解産物を調製し、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ、ｐ５３及びＰＡＲＰ（ポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ）による免疫ブロットを実施した。
【０２５４】
インビボ治療研究。全ての研究動物において、ＳＮ−３８免疫抱合体及びイリノテカンの用量は、ＳＮ−３８当量として示される。平均ＳＮ−３８／ＩｇＧ置換比の６に基づいて、２０ｇのマウスへの用量５００μｇのＡＤＣ（２５ｍｇ／ｋｇ）は、０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８を含有する。イリノテカン用量も同様にＳＮ−３８当量として示される（すなわち、４０ｍｇのイリノテカン／ｋｇは、２４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８と同等である）。４〜８週齢のＮＣｒ雌胸腺欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス及び１０週齢のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ．から購入した。耐容性研究を、ＳＮＢＬ  ＵＳＡ，Ｌｔｄ．からのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、２．５〜４ｋｇの雄及び雌）において実施した。動物には、異なるヒト癌細胞系を皮下移植した。腫瘍体積（ＴＶ）は、カリパスを使用して２つの寸法で測定し、体積を、Ｌ×ｗ２／２と定義し、ここで、Ｌは腫瘍の最長寸法であり、ｗは最短である。腫瘍は、療法が開始されたとき、０．１０〜０．４７ｃｍ３のサイズの範囲であった。それぞれの実験における治療レジメン、投与量及び動物の数は、「結果」に記載されている。凍結乾燥ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及び対照ＡＤＣを再構成し、必要に応じて滅菌食塩水で希釈した。全ての試薬は、静脈内投与されたイリノテカンを除いて腹腔内投与（０．１ｍＬ）した。投与レジメンは、本発明者たちの事前の調査によって影響を受け、ＡＤＣは、様々な長さの期間にわたって４日毎、または毎週２回で与えられた（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６、Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１）。この投与頻度は、抱合体のインビトロ血清半減期についての考慮を反映し、ＡＤＣへのより連続的な曝露を可能にした。
【０２５５】
統計。増殖曲線は、初期ＴＶの変化率として経時的に決定した。腫瘍増殖の統計分析は、曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいた。個別の腫瘍増殖のプロファイルは、線形曲線モデル形成によって得た。ｆ検定を用いて、増殖曲線の統計分析の前に群間の等分散性を決定した。片側ｔ検定を使用した食塩水対照を除き、両側ｔ検定を使用して、様々な治療群と対照の統計有意性を評価した（有意性Ｐ≦０．０５）。ＡＵＣの統計比較は、群内の最初の動物を進行のために安楽死させる時点まで実施した。
【０２５６】
薬物動態及び体内分布。１１１Ｉｎ放射標識したｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びｈＲＳ７  ＩｇＧを、皮下ＳＫ−ＭＥＳ−１腫瘍（約０．３ｃｍ３）を有するヌードマウスに注射した。１つの群に２０μＣｉ（２５０μｇのタンパク質）の１１１Ｉｎ−ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を静脈内注射し、別の群は、２０μＣｉ（２５０μｇのタンパク質）の１１１Ｉｎ−ｈＲＳ７  ＩｇＧを受けた。様々な時点でマウス（各時点で５匹）に麻酔をかけ、心臓内穿刺により出血させ、安楽死させた。腫瘍及び様々な組織を取り出し、計量し、γシンチレーションにより数えて、組織１グラムあたりの注射用量率（ＩＤ／ｇ％）を決定した。第３の群に２５０μｇの未標識ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を、１１１Ｉｎ−ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を投与する３日前に注射し、同様に死検した。両側ｔ検定を使用して、ｆ検定の使用により等分散性を決定した後、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びｈＲＳ７  ＩｇＧの取り込みを比較した。血中クリアランスの薬物動態分析をＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウエア（Ｐａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．）の使用により実施した。
【０２５７】
Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス及びカニクイザルにおける耐容性。簡潔には、マウスを４群に分け、それぞれ、酢酸ナトリウム緩衝液対照の２ｍＬの腹腔内注射、または３つの異なる用量のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（４、８、もしくは１２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８）を、「結果」に記載されている血液及び血清収集の０日目及び３日後に受けた。カニクイザル（雄３匹及び雌３匹、２．５〜４．０ｋｇ）に、２つの異なる用量のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を投与した。投与量、時間、ならびに可能性のある血液毒性及び血清化学の評価のために出血させたサルの数が、「結果」に記載されている。
【０２５８】
結果
ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の安定性及び効力。２つの異なる連結を使用して、ＳＮ−３８をｈＲＳ７  ＩｇＧに抱合させた。最初のものはＣＬ２−ＳＮ−３８と呼ばれ、以前に記載されている（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６、Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１）。フェニルアラニン部分を除去する点において、ＣＬ２リンカーの合成に変更を行った。この変更は、合成を簡素化したが、抱合の結果に影響を与えなかった（例えば、ＣＬ２−ＳＮ−３８及びＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、両方ともＩｇＧ分子１個あたり約６個のＳＮ−３８を組み込んだ）。対照比較は、血清安定性、抗原結合、またはインビトロ細胞毒性に有意な差のないことが見出した（示されず）。
【０２５９】
ＣＬ２からＣＬ２ＡへのＳＮ−３８リンカーの変更が、インビボ効力に影響を与えなかったことを確認するため、０．４ｍｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８をそれぞれ毎週２回×４週間使用し、ＣＯＬＯ  ２０５またはＣａｐａｎ−１腫瘍を有するマウスにおいて（示されず）、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ及びｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８を比較し、両方の研究において０．２５ｃｍ３のサイズの腫瘍から出発した。ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ及びＣＬ２−ＳＮ−３８の両方の抱合体は、未治療と比較して（ＣＯＬＯ  ２０５モデルでは食塩水に対してＡＵＣ１４日間Ｐ＜０．００２、Ｃａｐａｎ−１モデルでは食塩水に対してＡＵＣ２１日間Ｐ＜０．００１）、ならびに非標的化抗ＣＤ２０対照ＡＤＣのｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と比較して（ＣＯＬＯ  ２０５モデルではＡＵＣ１４日間Ｐ＜０．００３Ｃａｐａｎ−１モデルではＡＵＣ３５日間Ｐ＜０．００２）腫瘍増殖を有意に阻害した。研究の終了時（１４０日目）に、Ｃａｐａｎ−１モデルではｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８により治療されたマウスの５０％、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８で治療されたマウスの４０％が無腫瘍であり、一方、ｈＡ２０−ＡＤＣで治療された動物の僅か２０％に目に見える疾患の徴候がなかった。重要なことに、両方の腫瘍モデルにおいて２つの特異的抱合体の有効性に差はなかった。
【０２６０】
作用機序。インビトロ細胞傷害性研究は、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、いくつかの異なる固形腫瘍系に対してｎｍｏｌ／Ｌ範囲のＩＣ５０値を有したことを示した（表９）。遊離ＳＮ−３８のＩＣ５０は、全ての細胞系において抱合体より低かった。ＴＲＯＰ−２発現とｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８への感受性との間に相関関係はなかったが、遊離ＳＮ−３８に対するＡＤＣのＩＣ５０比は、ＴＲＯＰ−２の発現が高い細胞において低く、それは、より多くの抗原が存在するときの薬物の向上された内部移行能力を反転している可能性が最も高い。
【表９】
2018520148.tif 000016
【０２６１】
ＳＮ−３８は、細胞においていくつかのシグナル伝達経路を活性化することが知られており、アポトーシスをもたらす。本発明者たちの初期の研究は、初期シグナル伝達事象（ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１及びｐ５３）、ならびに１つの後のアポトーシス事象［ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断］に関与する２つのタンパク質の発現をインビトロで検査した（示されず）。ＢｘＰＣ−３では、ＳＮ−３８は、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現に２０倍の増加をもたらし、一方、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、僅か１０倍の増加をもたらし、この知見は、この細胞系における遊離ＳＮ−３８の高い活性と一致した（表９）。しかし、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現をＣａｌｕ−３において遊離ＳＮ−３８の２倍を超えて増加した（示されず）。
【０２６２】
ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８媒介及び遊離ＳＮ−３８媒介シグナル伝達事象におけるの大きな相違が、ｐ５３発現において観察された。ＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３の両方では、遊離ＳＮ−３８によるｐ５３の上方制御は、４８時間まで明白ではなく、一方、ｈＲＳ７−ＣＬ２１−ＳＮ−３８は、ｐ５３を２４時間以内に上方制御した（示されず）。加えて、ＡＤＣに曝露された細胞におけるｐ５３発現は、ＳＮ−３８と比較して両方の細胞系において高かった（示されず）。興味深いことに、ｈＲＳ７  ＩｇＧは、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現に明らかな効果を有さなかったが、ＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３の両方においてｐ５３の上方制御を誘導したが、４８時間の曝露の後であった。後のアポトーシス事象では、ＳＮ−３８または抱合体のいずれかとインキュベートしたとき、ＰＡＲＰの切断が両方の細胞系において明白であった。切断ＰＡＲｐの存在は、ＢｘＰＣ−３において２４時間で高くなり、ｐ２１の高い発現及び低いＩＣ５０と相関する。遊離ＳＮ−３８によるＡＤＣより高い程度の切断は、細胞傷害性の知見と一致した。
【０２６３】
ｈＲＳ７−ＳＮ−３８の有効性。ＴＲＯＰ−２がいくつかのヒト癌腫において広く発現しているので、研究をいくつかの異なる比と癌モデルにおいて実施し、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８連結の評価から開始したが、後に、ＣＬ２Ａ連結を有する抱合体を使用した。４日毎×４のｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８の０．０４ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇを与えたＣａｌｕ−３担持ヌードマウスは、等量のｈＬＬ２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を投与した動物と比較して有意に改善された応答を有した（それぞれ、ＴＶ＝０．１４±０．２２ｃｍ３対０．８０±０．９１ｃｍ３、ＡＵＣ４２日間Ｐ＜０．０２６、図５Ａ）。用量応答は、用量が０．４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８に増加したときに観察された。この高い用量レベルでは、ｈＲＳ７抱合体が与えられた全てのマウスが２８日以内に「治癒」し、１４７日目の研究の終了時まで無腫瘍の状態を維持したが、無関係のＡＤＣにより治療された動物では腫瘍は再増殖した（特異的対無関係ＡＵＣ９８日間、Ｐ＝０．０５）。ｈＲＳ７  ＩｇＧとＳＮ−３８の混合物を受けたマウスでは、腫瘍は、５６日目までに＞４．５倍に進行した（ＴＶ＝１．１０±０．８８ｃｍ３、ＡＵＣ５６日間Ｐ＜０．００６対ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８）。
【０２６４】
有効性も、ヒト結腸（ＣＯＬＯ  ２０５）及び膵臓（Ｃａｐａｎ−１）腫瘍異種移植片によって検査した。ＣＯＬＯ  ２０５腫瘍担持動物において（図５Ｂ）、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８（０．４ｍｇ／ｋｇ、ｑ４ｄ×８）は２８日間の治療期間にわたって腫瘍増殖を予防し、抗ＣＤ２０  ＡＤＣ（ｈＡ２０−ＣＬ２−ＳＮ−３８）またはｈＲＳ７  ＩｇＧと比較して有意に小さい腫瘍であった（ＴＶ＝０．１６±０．０９ｃｍ３、それぞれ１．１９±０．５９ｃｍ３及び１．７７±０．９３ｃｍ３、ＡＵＣ２８日間Ｐ＜０．０１６）。イリノテカンのＭＴＤ（２４ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇ、ｑ２ｄ×５）は、マウス血清がヒト血清より効率的にイリノテカンをＳＮ−３８に変換できるので、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８と同じく有効であったが、イリノテカンのＳＮ−３８用量（累積２，４００μｇ）は、抱合体（合計６４μｇ）より３７．５倍大きかった。
【０２６５】
Ｃａｐａｎ−１を有する動物は、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８抱合体のＳＮ−３８等価用量で与えられたとき、イリノテカン単独に有意な応答を示さなかった。（例えば、３５日目に、平均腫瘍サイズは、０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８が与えられたイリノテカン治療動物の１．７８±０．６２ｃｍ３に対して、０．４ｍｇのＳＮ−３８／ｋｇ  ｈＲＳ７−ＳＮ−３８が与えられた動物では０．０４±０．０５ｃｍ３であった。ＡＵＣ３５日目Ｐ＜０．００１、図５Ｃ。）イリノテカン用量が４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８に１０倍増加されると、応答は改善されたが、抱合体の０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８用量レベルと同じような有意性はなかった（ＴＶ＝０．１７±０．１８ｃｍ３対１．６９±０．４７ｃｍ３、ＡＵＣ４９日目Ｐ＜０．００１）。等用量の非標的化ｈＡ２０−ＣＬ２−ＳＮ−３８も、イリノテカン治療動物と比較して有意な抗腫瘍効果を有したが、特異的ｈＲＳ７抱合体は、無関係ＡＤＣより有意に良好であった（ＴＶ＝０．１７±０．１８ｃｍ３対０．８０±０．６８ｃｍ３、ＡＵＣ４９日目Ｐ＜０．０１８）。
【０２６６】
次にｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣによる研究をヒト上皮癌の他の２つのモデルに広げた。ＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腫瘍を有するマウスにおいて（図５Ｄ）、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、ここでも、食塩水もしくは等量の非標的化ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（それぞれＴＶ＝０．２４  ０．１１ｃｍ３対１．１７±０．４５ｃｍ３及び１．０５±０．７３ｃｍ３、ＡＵＣ２１日目Ｐ＜０．００１）、または１０倍高いＳＮ−３８等価用量で与えられたイリノテカン（それぞれＴＶ＝０．２７±０．１８ｃｍ３対０．９０±０．６２ｃｍ３、ＡＵＣ２５日目Ｐ  ＜０．００４）により治療された対照マウスと比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した。興味深いことに、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＤＣにより治療されたＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト肺扁平上皮癌担持マウスにおいて（図５Ｅ）、腫瘍増殖阻害は、食塩水または非抱合ｈＲＳ７  ＩｇＧよりも優れていたが（それぞれＴＶ＝０．３６±０．２５ｃｍ３対１．０２±０．７０ｃｍ３及び１．３０±１．０８ｃｍ３、ＡＵＣ２８日間、Ｐ＜０．０４３）、非標的化ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８またはイリノテカンのＭＴＤは、特異的ｈＲＳ７−ＳＮ−３８抱合体と同じ抗腫瘍効果を提供した。全てのマウス研究において、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣは、体重減に関して十分に耐容された（示されず）。
【０２６７】
ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の体内分布。ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８または非抱合ｈＲＳ７  ＩｇＧの体内分布を、対応する１１１Ｉｎ標識基質の使用によって、ＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト肺扁平上皮癌異種移植片（示されず）を有するマウスにおいて比較した。薬物動態分析を実施して、非抱合ｈＲＳ７に対するｈＲＳ７−ＣＬＡ２−ＳＮ−３８のクリアランスを決定した（示されず）。ＡＤＣは、等価量の非抱合ｈＲＳ７より迅速に排除され、ＡＤＣは約４０％短い半減期及び平均滞留時間を示した。いずれにしても、このことは腫瘍取り込みに対して最小限の影響を与えた（示されず）。２４時間と４８時間の時点において有意な差があったが、７２時間（ピーク取り込み）では、腫瘍中の両方の作用物質の量は類似していた。正常組織のうちで、肝臓及び脾臓の差が最も際立っていた（示されず）。注射の２４時間後、ｈＲＳ７  ＩｇＧより＞２倍多くのｈＲＳ７−ＣＬＡ２−ＳＮ−３８が肝臓に存在した。逆に、脾臓には、ピーク取り込み時（４８時間の時点）にｈＲＳ７−ＣＬＡ２−ＳＮ−３８より３倍多くの親ｈＲＳ７  ＩｇＧが存在した。残りの組織における取り込み及びクリアランスは、一般に、血中濃度の差が反映された。
【０２６８】
毎週２回の用量が療法において与えられたので、１１１Ｉｎ標識抗体の注射の３日前に前用量の０．２ｍｇ／ｋｇ（２５０μｇのタンパク質）のｈＲＳ７  ＡＤＣを最初に受けた動物の一群における腫瘍取り込みを、検査した。前投与マウスにおける１１１Ｉｎ−ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の腫瘍取り込みは、前用量を受けなかった動物と比較して、全ての時点で有意に低減された。（例えば、７２時間の時点では、前投与腫瘍取り込みは、前用量を与えられなかった動物の２５．４％±８．１％ＩＤ／ｇに対して１２．５％±３．８％ＩＤ／ｇであった。Ｐ＝０．０１２３。）前投与は、血中クリアランスまたは組織取り込みにたいして明らかな影響を与えなかった（示されず）。これらの研究は、いくつかの腫瘍モデルにおいて、特異的抗体の腫瘍付着成長が、先行用量（複数可）によって低減されうることを示唆しており、このことは、治療応答の特性がＡＤＣの増加用量によって減少うる理由及び更なる用量増大が指示されない理由を説明する可能性がある。
【０２６９】
Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス及びカニクイザルにおけるｈＲＳ７−ＣＬＡ２−ＳＮ−３８の耐容性。Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、それぞれ４、８及び１２ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇのｈＲＳ７−ＣＬＡ２−ＳＮ−３８の２用量に対して３日間にわたって耐容性があり、一過性の最小体重減があった（示されず）。造血毒性は発生せず、血清化学は、上昇したアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼのみを明らかにした（示されず）。治療の７日後、ＡＳＴは３つの治療群の全てにおいて正常レベルを上回って上昇し（＞２９８Ｕ／Ｌ）（示されず）、大多数のマウスは２×８ｍｇ／ｋｇの群のマウスであった。しかし、治療の１５日後、大部分のマウスは正常範囲内になった。ＡＬＴレベルも治療の７日以内に正常範囲を上回り（＞７７Ｕ／Ｌ）（示されず）、１５日目までには正常化した証拠があった。これら全てのマウスの肝臓は、組織損傷の組織学的証拠を示さなかった（示されず）。腎機能に関しては、グルコース及び塩化物レベルのみが治療群においてある程度上昇した。２×８ｍｇ／ｋｇでは、７匹のマウスのうち５匹が僅かに上昇したグルコールレベルを示し（２７３〜３２０ｍｇ／ｄＬの範囲、正常な２６３ｍｇ／ｄｌの上限）、注射の１５日後までに正常に戻った。同様に、塩化物レベルも、２つの最高投与量群において、１１６〜１２７ｍｍｏｌ／Ｌ（正常範囲の１１５ｍｍｏｌ／Ｌの上限）の範囲で僅かに上昇し（２×８ｍｇ／ｋｇ群では５７％、２×１２ｍｇ／ｋｇ群では１００％のマウス）、注射後１５日たっても上昇したままであった。このことは胃腸毒性を示す可能性もあり、それは大部分の塩化物が腸からの吸収によって得られるからであるが、終了時には、検査したあらゆる臓器系において組織損傷の組織学的証拠はなかった（示されず）。
【０２７０】
マウスは、ｈＲＳ７に結合されたＴＲＯＰ−２を発現しないので、より適切なモデルが、臨床用途のｈＲＳ７の可能性を決定するために必要であった。免疫組織学研究は、ヒト及びカニクイザルの両方における複数の組織において結合を明らかにした（乳房、目、胃腸管、肝臓、肺、卵巣、卵管、膵臓、副甲状腺、前立腺、唾液腺、皮膚、胸腺、甲状腺、扁桃腺、尿管、膀胱及び子宮、示されず）。この交差反応性の他に、耐容性研究をサルにおいて実施した。
【０２７１】
２×０．９６ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇのｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を受けた群は、注入の後及び研究の終了時まで有意な臨床事象を有さなかった。体重減は７．３％を超えず、１５日目までには順化体重に戻った。一過性の減少が、大部分の血球計数データ（示されず）において注目されたが、値は正常範囲を下回っていなかった。異常な値は、血清化学において見出されなかった。１１日目（最後の注射の８日後）に死検された動物の病理組織学は、造血臓器（胸腺、下顎及び腸間膜リンパ節、脾臓、及び骨髄）、消化器（胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸及び直腸）、女性生殖器（卵巣、子宮及び膣）、ならびに注射部位において微視的変化を示した。これらの変化は、最小から中程度の範囲であり、後の時点で完全な回復に向かった胸腺及び胃腸管を除いて、全ての組織が回復期間の終了時（３２日目）に完全に逆転した。
【０２７２】
２×１．９２ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇの用量レベルの抱合体では、胃腸合併症及び骨髄抑制による１匹の死亡があり、この群の他の動物は、２×０．９６ｍｇ／ｋｇ群に類似しているが、より重篤な事象を示した。これらのデータは、用量制限毒性がイリノテカンと同一である、すなわち腸及び血液学的であることを示している。したがって、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のＭＴＤは、２×０．９６及び１．９２ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇにあり、ヒトの等価用量の２×０．３〜０．６ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８を表している。
【０２７３】
考察
ＴＲＯＰ−２は、肺、乳房、結腸直腸、膵臓、前立腺及び卵巣の癌を含む多くの上皮腫瘍において発現するタンパク質であり、細胞傷害剤の送達にとって潜在的に重要な標的である。ＲＳ７抗体は、ＴＲＯＰ−２に結合すると内部移行し（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５８５７ｓ−６３ｓ）、細胞傷害約の直接的な細胞内送達を可能にする。
【０２７４】
化学療法薬を抗体に抱合させることは、３０年以上にわたって探究されてきた。ＡＤＣの相当な部分が腫瘍によって処理されず、正常な細胞にいおって処理されるので、これらの作用物質は、腫瘍において治療レベルに達する前に正常な臓器系に対して毒性になりすぎる危険性がある。任意の治療薬において、治療範囲は、ＡＤＣの可能性を決定する主な要因であり、したがって「超毒性」薬を検査するのではなく、本発明者たちは、ＳＮ−３８をＴＲＯＰ−２標的化ＡＤＣの薬物構成成分として選択した。
【０２７５】
ＳＮ−３８は、強力なトポイソメラーゼーＩ阻害剤であり、いくつかの細胞系においてナノモル範囲のＩＣ５０値を有する。直腸結腸癌の治療に使用され、肺、乳房及び脳の癌においても活性を有するものは、活性形態のプロドラッグ、イリノテカンである。本発明者たちは、ＡＤＣの形態で直接標的化されるＳＮ−３８が、活性ＳＮ−３８への低い及び患者毎にばらつきがあるＣＰＴ−１１の生物変換を克服することによって、ＣＰＴ−１１よりも治療的に有意に改善されると推論した。
【０２７６】
最初のＣＬ２誘導体に挿入されたＰｈｅ−Ｌｙｓペプチドは、カテプシンＢによる切断を可能にする。合成過程を簡素化する努力において、ＣＬ２Ａではフェニルアラニンが排除されており、したがってカテプシンＢ切断部位は除去されている。興味深いことに、生成物は、ＣＬ２により得られた広範囲なプロファイルより良好に確定されたクロマトグラフィープロファイルを有したが（示されず）、より重要なことに、この変化は、比較試験によると、抱合体の結合、安定性、または効力に対して影響を与えなかった。これらのデータは、ＣＬ２のＳＮ−３８は、カテプシンＢ切断部位ではなく、ＳＮ−３８のラクトン環へのｐＨ感受性炭酸ベンジル結合において主に切断されて抱合体から放出されたことを示唆している。
【０２７７】
一連の固形腫瘍細胞系に対する一貫したｈＲＳ７  ＡＤＣのインビトロ細胞傷害性は、ｎｍｏｌ／Ｌ範囲のＩＣ５０値を有した。しかし、遊離ＳＮ−３８に曝露された細胞は、ＡＤＣと比較して低いＩＣ５０値を示した。遊離及び抱合ＳＮ−３８の相違は、ＥＮＺ−２２０８（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１８８８−９６）及びＮＫ０１２（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８−５６）においても報告された。ＥＮＺ−２２０８は、分枝鎖ＰＥＧを利用して、ＰＥＧ１つあたり約３．５〜４分子のＳＮ−３８を連結し、一方、ＮＫ０１２は、２０重量％のＳＮ−３８を含有するミセルナノ粒子である。本発明者たちのＡＤＣによって、この相違（すなわち、抱合ＳＮ−３８に対する遊離ＳＮ−３８の効力の比）は、腫瘍細胞におけるＴＲＯＰ−２発現レベルが増加すると減少し、薬物の標的化送達に利益を示唆している。インビトロ血清安定性に関して、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８のＣＬ２−及びＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８形態は、両方とも、約２０時間のｔ／１／２を生じ、これはＥＮＺ−２２０８について報告された１２．３分間の短いｔ／１／２と対照的であるが（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １９：８４９−５９）、２４時間後の生理学的条件下では、ＮＫ０１２からのＳＮ−３８の５７％の放出に類似している（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８−５６）。
【０２７８】
ｈＲＳ７−ＳＮ−３８による（ＣＬ２−ＳＮ−３８またはＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のいずれかによる）腫瘍担持マウスの治療は、５つの異なる腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を有意に阻害した。これらのうちの４つでは、退縮が観察され、Ｃａｌｕ−３の場合では、最高用量のｈＲＳ７−ＳＮ−３を受けた全てのマウスは、研究の完了時には無腫瘍になった。ヒトと異なり、イリノテカンは、マウスにおいて血漿エステラーゼにより非常に効率的にＳＮ−３８に変換され、５０％を超えた変換率を有し、ヒトよりマウスにおいて高い有効性を生じた。イリノテカンが１０倍高い、または同等のＳＮ−３８レベルで投与される場合、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８は、腫瘍増殖の制御において有意に良好であった。イリノテカンが、そのＭＴＤの２４ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｄ×５（ＳＮ−３８の３７．５倍を超える）で投与されたときにのみ、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８の有効性と等しかった。患者において、イリノテカンの生物変換が顕著に低いので、本発明者たちは、この利益がｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８を更に優先させると予測する。
【０２７９】
本発明者たちは、ＳＫ−ＭＥＳ−１などのいくつかの抗原発現細胞系において、抗原結合ＡＤＣの使用が、無関係な非結合抱合体より良好な治療応答を補償するものではないことも示した。これは、異例または予想外の知見ではない。事実、前に記述された非結合ＳＮ−３８抱合体は、イリノテカンと比較して治療活性を向上させ、そのためイリノテカンＩｇＧ−ＳＮ−３８抱合体は、いくらかの活性を有すると予測される。このことは、腫瘍が巨大分子の通過を正常な組織より良好に可能にさせる未熟な漏出性の容器を有するという事実に関連する。本発明者たちの抱合体を用いると、ｐＨがリソソームレベルを模倣するベル（例えば、３７℃でｐＨ５．３、示されず）に低下すると、ＳＮ−３８の５０％が約１３時間で放出され、一方、血清の中性ｐＨでは、放出速度はほぼ２倍低減される。無関係の抱合体が酸性腫瘍微小環境に進入すると、いくつかのＳＮ−３８を局所的に放出すると予測される。腫瘍生理学及び薬物に対する固有の感受性などの他の要因も、この「ベースライン」活性の確定に役割を果たす。しかし、長い滞留時間を有する特的抱合体は、特定の抗体を捕捉するために十分な抗原が存在する限り、このベースライン応答より向上した効力を有するはずである。ＳＫ−ＭＥＳ−１モデルにおける体内分布研究は、腫瘍抗原が連続投与の結果として飽和になると、特異的抱合体の腫瘍取り込みが低減し、無関係の抱合体によって見出されるものと類似した治療結果を生じることも示した。
【０２８０】
本発明者たちのＡＤＣと他のＳＮ−３８送達作用物質の公表された報告とを直接比較することは困難なことであるが、いくつかの一般的な観察を行うことができる。本発明者たちの治療研究では、最高個体用量は、０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８である。Ｃａｌｕ−３モデルでは、僅か４回の注射が、２０ｇのマウスに総累積用量の１．６ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８または３２μｇのＳＮ−３８を与えた。ＥＮＺ−２２０８による複数の研究を、そのＭＴＤの１０ｍｇ／ｋｇ×５を使用して行い、ＮＫ０１２による前臨床研究は、そのＭＴＤの３０ｍｇ／ｋｇ×３を伴った。このようにして有意な抗腫瘍効果が、ＥＮＺ−２２０８及びＮＫ０１２それぞれの報告された用量より３０倍及び５５倍少ないＳＮ−３８当量のｈＲＳ７−ＳＮ−３８によって得た。１０倍少ないｈＲＳ７  ＡＤＣ（０．０４ｍｇ／ｋｇ）によっても、有意な抗腫瘍効果が観察され、一方、低用量のＥＮＺ−２２０８は存在せず、ＮＫ０１２用量が４倍下げられて７．５ｍｇ／ｋｇになったとき、有効性が失われた（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８−５６）。正常なマウスは、１週間にわたる累積用量の２４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８（１，５００ｍｇ／ｋｇの抱合体）によって急性毒性を示さず、ＭＴＤが高いことを示した。このように、腫瘍担持動物は、７．５〜１５倍低い量のＳＮ−３８当量で有効に治療された。
【０２８１】
トポイソメラーゼーＩ阻害剤として、ＳＮ−３８は、ｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の上方制御を伴って、細胞のＤＮＡに有意な損傷を誘導し、カスパーゼ活性及びＰＡＲＰの切断をもたらす。本発明者たちがＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３細胞を本発明のＡＤＣに曝露したとき、ｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１は、両方とも基礎レベルを超えて上方制御された。加えて、ＰＡＲＰ切断も両方の細胞系において明白であり、これらの細胞におけるアポトーシス事象が確認された。遊離ＳＮ−３８及び本発明のｈＲＳ７−ＳＮ−３８の両方によるＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３におけるｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の上方制御が、ｐ５３より高いことが興味深かった。このことは、これらの２つの細胞系におけるｐ５３の突然変異状態及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１媒介アポトーシスのｐ５３非依存的経路の使用を示している場合がある。
【０２８２】
興味深い観察は、遊離ＳＮ−３８に対して、ｈＲＳ７−ＡＤＣにより媒介された、ＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３の両方における２４時間でのｐ５３の早期上方制御であった。裸ｈＲＳ７  ＩｇＧはこれらの細胞系においてｐ５３を上方制御できるが、４８時間の曝露後であった。ＴＲＯＰ−２過剰発現及び抗体による架橋は、いくつかのＭＡＰＫ関連シグナル伝達事象、また細胞内カルシウム放出に関連している。ｈＲＳ７の結合は、ＰＡＲＰ切断の欠如によって明白なように、ＢｘＰＣ−３及びＣａｌｕ−３にアポトーシスを誘導するには不十分であるが、ＳＮ−３８抱合体をｈＲＳ７に含めることが腫瘍増殖阻害の大きな効果をもたすことができるように、細胞を刺激するには十分でありうる。研究は、どの経路がＳＮ−３８のｈＲＳ７送達に関与しているか、遊離ＳＮ−３８とどのように異なりうるか及びｐ５３の状態がこのシグナル伝達にどのような効果を果たしうるかを理解するため、現在進行中である。
【０２８３】
体内分布研究は、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８が親ｈＲＳ７  ＩｇＧと類似した腫瘍取り込みを有するが、２倍高い肝臓取り込みによって顕著に迅速に排除され、このことは、ＳＮ−３８の疎水性に起因しうる。ＡＤＣが肝臓から排除されたことによって、肝臓及び胃腸毒性は、用量制限的であることが予測された。マウスは増加した肝臓トランスアミナーゼの証拠を有したが、胃腸毒性は最大でも軽度なものであり、一過性の減量を有し、病理組織学的検査により注目される異常はなかった。興味深いことに、血液毒性は見られなかった。しかし、イリノテカンに予測される同一の毒性プロファイルを示し、胃腸及び血液毒性は用量制限的であった。
【０２８４】
ｈＲＳ７により認識されたＴＲＯＰ−２は、マウスにおいて発現されないので、ヒトに類似したＴＲＯＰ−２組織発現を有するサルにおいて、毒性研究を実施することが非常に重要であった。サルは、０．９６ｍｇ／ｋｇ／用量（約１２ｍｇ／ｍ２）を、軽度で可逆的な毒性を伴って耐容し、これから、ヒト用量の約０．３ｍｇ／ｋｇ／用量（約１１ｍｇ／ｍ２）が推定される。ＮＫ０１２の第Ｉ相臨床試験において、固形腫瘍を有する患者は、３週間毎の２８ｍｇ／ｍ２のＳＮ３８を耐容し、用量制限毒性としてグレード４の好中球減少症を伴った（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：５０５８−６６）。同様に、ＥＮＺ−２２０８の第Ｉ相臨床試験は、用量制限的発熱性好中球減少症を明らかにし、推奨は、１０ｍｇ／ｍ２を３週間毎または患者にＧ−ＣＳＦが投与された場合には１６ｍｇ／ｍ２を投与することであった。サルが累積ヒト等価用量の２２ｍｇ／２を耐容したので、ｈＲＳ７が多数の正常組織に結合するとしても、ｈＲＳ７  ＡＤＣの単回治療は、他の非標的化ＳＮ−３８作用物質と類似しうることが可能である。事実、抗ＴＲＯＰ−２抗体の特異性は、毒性プロファイルがイリノテカンと類似していたので、ＤＬＴを確定することに役割を果たすとは思われなかった。更に重要なことに、抗腫瘍活性がヒト等価用量の０．０３ｍｇのＳＮ−３８当量／ｋｇ／用量ちょうどに応答するマウスと同じようにヒトにおいても達成されうる場合、有意な抗腫瘍応答を臨床的に実現することができる。
【０２８５】
結論として、マウスにおけるインビボヒト癌異種移植片モデルと組み合わせた、サルの毒性研究は、このＡＤＣ標的化ＴＲＯＰ−２が、異なる上皮起源のいくつかの腫瘍に対して有効な治療薬であることを示した。
【０２８６】
実施例１３．血液系悪性病変に対する抗ＣＤ２２（エプラツズマブ）抱合ＳＮ−３８
本発明者たちは、およそ５０％のＩｇＧ結合ＳＮ−３８を血清中に２４時間毎に解離させるＣＬ２Ａリンカーにより調製したとき、ゆっくりと内部移行するＳＮ−３８抱合抗体を成功裏に使用できたことを、以前に見出した。この研究では、エプラツズマブ（急速に内部移行する）及びベルツズマブ（ゆっくりと内部移行する）、ヒト化抗ＣＤ２２、ならびに抗ＣＤ２０  ＩｇＧのそれぞれにより調製されたＳＮ−３８抱合体の有効性を、Ｂ細胞悪性病変の治療において検査した。両方の抗体−薬物抱合体は様々なヒトリンパ腫／白血病細胞系に対して類似したナノモル活性を有したが、ＳＮ−３８の緩徐放出は、無関係の抱合体であってもインビトロにおいて効力の識別を妨げた。ＳＮ−３８が抗ＣＤ２２抱合体に安定して連結されたとき、その効力は４０〜５５倍低減された。したがって、安定性の低い、ゆっくりと解離するＣＬ２Ａリンカーを有するものだけで、更なる研究を実施した。インビボにおいて、ＲａｍｏｓがＣＤ２２より１５倍多くＣＤ２０を発現しても、類似した抗腫瘍活性が、Ｒａｍｏｓ異種移植片を有するマウスにおいてＣＤ２２及びＣＤ２０抗体−薬物抱合体に見出され、エプラツズマブ−ＳＮ３８抱合体（Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８）の内部移行が、その活性を向上させたことを示唆している。Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８は、インビボにおいて無関係のＩｇＧ−ＳＮ−３８抱合体より有効性があり、大部分の十分に確立されたＲａｍｏｓ異種移植片を非毒性用量で排除した。インビトロ及びインビボ研究は、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を、より有効な治療のために非抱合ベルツズマブと組み合わせることができることを示した。このように、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８は、毒性レベルをはるかに下回る用量でリンパ腫及び白血病において活性であり、したがって、単独で、または抗ＣＤ２０抗体療法と組み合わせて治療可能性を有する新しい有望な作用物質を表す。（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４−３４。）
【０２８７】
序論
著しい努力が白血病及びリンパ腫の生物学的療法に集中しており、非抱合抗体（例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ）、放射性免疫抱合体（９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタン、１３１Ｉ−トシツモマブ）及び薬物抱合体（ゲムツズマブオゾガマイシン）が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可を受けた。別の抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）のブレンツキシマブベドチン（ＳＧＮ−３５、抗ＣＤ３０−アウリスタチンＥ）は、近年、ＦＤＡによりホジキンリンパ腫及び未分化大細胞リンパ腫において迅速認可を受けた。前臨床及び臨床開発において、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ７４およびＣＤ７９ｂを標的にする多数の他のＡＤＣも存在する。
【０２８８】
これらの標的の全てに対する抗体は、内部移行するので、薬物担体にすることは正しい選択である。ＣＤ２２の内部移行及び特異性が、ＣＤ２２を白血病及びリンパ腫の特に重要な標的にしており、少なくとも３つの異なる抗ＣＤ２２抱合体が臨床調査中であり、ＣＭＣ−５４４（酸不安定抱合カリチアマイシン）、抗ＣＤ２２マイタンシン抱合体（安定して連結されたＭＣＣ−ＤＭ１）及びＣＡＴ−３８８８（旧ＢＬ２２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素単鎖融合タンパク質）が含まれる。これらの抱合体全てにおける活性剤は、ナノモル以下の効力（すなわち、いわゆる超毒性）を有する。
【０２８９】
本発明者たちは、抗体を、プロドラッグのイリノテカンから誘導された低ナノモル効力を有するトポイソメラーゼーＩ阻害剤であるＳＮ−３８と抱合させる方法を開発した（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６２、Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６）。４つのＳＮ−３８連結化学を、緩徐内部移行抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体により調製した抱合体を最初に使用して検査した（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６２、Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６）。抱合体は、ＣＥＡＣＡＭ５結合を保持したが、ヒト血清におけるＳＮ−３８の解離速度が異なり、半減期は、およそ１０から６７時間までばらつきがあった（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６２）。最終的には、ＣＬ２と呼ばれ、中間的な安定性（２４〜３５時間で約５０％の解離）を有するリンカーが、更なる開発のために選択された。ＣＬ２は、近年修飾され、簡素化及び製造収率の改善のために、カテプシンＢ切断可能ジペプチドからフェニルアラニンが排除された。新たな誘導体はＣＬ２Ａと呼ばれ、ＳＮ３８へのｐＨ感受性炭酸塩連結を保持しているが、もはやカテプシンＢにより選択的に切断されない。いずれにしても、元のＣＬ２リンカーと類似した血清安定性及びインビボ活性を有する（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９）。毒性のない有意な有効性が緩徐内部移行抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＳＮ−３８によって見出されたので、本発明者たちは、その活性が、腫瘍に局在化された後のＳＮ−３８の緩徐放出によって助けられたと想定した。このように、この報告の主な目的は、ＣＬ２Ａリンカーと、Ｂ細胞癌に高度に特異的であるが、抗原発現及び内部移行特性が異なる２つの抗体とを使用して調製された抱合体の、治療展望を評価することであった。
【０２９０】
エプラツズマブ（Ｅｍａｂ）は、急速に内部移行する（例えば、１時間以内に≧５０％）ヒト化抗ＣＤ２２  ＩｇＧ１であり、非抱合及び抱合系体によりリンパ腫及び白血病において広範囲に評価されてきた。ベルツズマブ（Ｖｍａｂ）は、ヒト化抗ＣＤ２０抗体であり、これも臨床的に研究されてきたが、ゆっくりと内部移行する（例えば、１時間に約１０％）。ＣＤ２０は、通常、非ホジキンリンパ腫においてＣＤ２２よりもかなり高いレベルで発現し、一方、ＣＤ２２は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）に優先的に発現するが、多発性骨髄腫には発現しない。両方の抗体は、非抱合剤として患者において有効であるが、ベルツズマブのみがマウス異種移植片モデルにおいて活性である（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：２８６８−７６）。非抱合ベルツズマブと組み合わせた９０Ｙ−ＥｍａｂがＮＨＬモデルにおいて向上された有効性を有したことを示した以前の研究（Ｍａｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６１５４−６０）に基づいて、本発明者たちは、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８＋ベルツズマブ組み合わせが、同じ標的抗原を競合することなく、または追加的な毒性を有することなく、追加的な利益を提供できるかについても検査した。
【０２９１】
材料及び方法
細胞系。Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）及びＪｅＫｏ−１（マントル細胞リンパ腫）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。ＲＥＨ、ＲＳ４；１１、ＭＮ−６０及び６９７（ＡＬＬ）は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎから購入した。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ（濾胞性  ＮＨＬ）は、Ｄｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｒ．Ｓｍｉｔｈ（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から贈呈された。全ての細胞系は、１０〜２０％のウシ胎児血清を含有する推奨補充培地中において加湿ＣＯ２インキュベーター（５％）により３７℃で培養し、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａについて定期的に検査した。
【０２９２】
抗体及び抱合方法。エプラツズマブ及びベルツズマブは、それぞれ、ヒト化抗ＣＤ２２及び抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５  ＩｇＧ１であるラベツズマブ（Ｌｍａｂ）及びヒト化抗体抗ＴＲＯＰ−２抗体であるＲＳ７（両方とも、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．からのもの）を、非結合性の無関係対照として使用した。ここで、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８、Ｖｍａｂ−ＳＮ−３８及びＬｍａｂ−ＳＮ−３８は、上記に記載されたＣＬ２Ａリンカーを使用して調製された抱合体を指す。ヒト血清におけるインビトロ研究は、およそ５０％の活性ＳＮ−３８部分がＩｇＧから毎日放出されることを示した（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９）。ＣＬ２Ｅと呼ばれる別のリンカー（米国特許第７，９９９，０８３号及び同第８，０８０，２５０号を参照すること）は、ヒト血清において１４日間にわたって安定しているが、リソソームにより処理されるとＳＮ−３８の放出を促進する、カテプシンＢ切断部位を含有する。ＣＬ２Ｅを調製する方法、ならびにＣＬ２Ａ及びＣＬ２Ｅリンカーの構造は、米国特許第７，９９９，０８３号及び同第８，０８０，２５０号に提示されている。抱合体は、ＩｇＧ１つあたり６つのＳＮ−３８単位を含有した（例えば、１．０ｍｇのＩｇＧ−ＳＮ−３８抱合体は約１６μｇのＳＮ−３８を含有する）。
【０２９３】
インビトロ細胞結合及び細胞傷害性。フローサイトメトリーを、４℃で１時間インキュベートした非抱合特異的及び無関係抗体の使用によって実施し、結合を、これも４℃で１時間インキュベートしたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−Ｆｃγフラグメント特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の使用によって明らかにした。蛍光中央値は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアパッケージを使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって決定した。
【０２９４】
細胞傷害性は、ＭＴＳ色素還元アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。用量応答曲線［ヤギ抗ヒトＦｃγ  Ｆ（ａｂ’）２、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈを用いる／用いない］は、三回の測定の平均から生成し、ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア（ｖ５）を使用して計算し、統計比較は、データの最良適合曲線に対するＦ検定を使用した。有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。
【０２９５】
免疫ブロット法。試験作用物質への２４または４８時間の曝露の後、初期（ｐ２１発現）及び後期（ＰＡＲＰ切断）アポトーシスのマーカーをウエスタンブロット法により明らかにした。
【０２９６】
インビボ研究。皮下Ｒａｍｏｓモデルは、培養物（生存率＞９５％）から１×１０７個の細胞（０．２ｍＬ）を４〜６週齢雌ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に移植することによって開始した。移植から３週間に、０．４〜０．８ｃｍ３（カリパスにより測定、Ｌ×Ｗ×Ｄ）の範囲の腫瘍を有する動物を、それぞれ同じ範囲の腫瘍サイズを有する動物群に分けた。腫瘍サイズ及び体重を少なくとも毎週１回測定し、腫瘍が３．０ｃｍ３に増殖したとき、または２０％を超える体重減があったとき、動物を研究から除いた。静脈内ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ及び６９７モデルは、２．５×１０６個及び１×１０７個の細胞を、雌の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）にそれぞれ静脈内注射することによって開始した。治療は、ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞投与の５日後及び６９７接種の７日後から開始した。動物を、後肢麻痺または他の罹患徴候を代替生存エンドポイントとして使用して、毎日観察した。全ての治療は、≦０．２ｍＬを腹腔内に与えた。特定の投与量及び頻度が「結果」のセクションに提示されている。マウスがイリノテカンをＳＮ−３８に効率的に変換するので、イリノテカンの投与をＳＮ−３８当量に調整し、ＳＮ−３８当量は、ＡＤＣ質量の１．６及びイリノテカン質量の６０％に基づいている。
【０２９７】
有効性は、上記に示された代替生存エンドポイントとして無増悪期間（ＴＴＰ）を使用して、カプラン・マイヤー曲線によって表した。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアを使用してログランク検定（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）にょって実施した（有意性Ｐ＜０．０５）。
【０２９８】
結果
インビトロにおける抗原発現及び細胞傷害性。全ての細胞系がＳＮ−３８への高い感受性があり、ＥＣ５０値は、Ｄａｕｄｉの０．１３ｎｍｏｌ／ＬからＲＳ４；１１の２．２８ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲であった（表１０）。６９７及びＲＳ４；１１を除いて、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８抗ＣＤ２２抱合体は、ＳＮ−３８より２〜７倍少ない有効性があった。これは、本発明の標的化、または他の非標的化ＳＮ３８抱合体に共通した知見である。抗原発現における差にもかかわらず、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びＶｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、非結合Ｌｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体に類似した有効性を有し、このことは、４日間ＭＴＳアッセイの際のおよそ９０％のＳＮ−３８の解離に起因する可能性があった。短い曝露時間を使用した他のインビトロ手順も、抱合体の効力における差を識別するには有効ではなかった。例えば、１日曝露後のアネキシンＶ染色は、未処理及び処理細胞における差を見出すことに失敗した（示されず）。ｐ２１の上方制御及びＰＡＲＰ切断も、アポトーシスの初期及び後期マーカーとして、それぞれ検査した。Ｒａｍｏｓはｐ２１を発現しなかった。しかし、ＰＡＲＰ切断は検出されたが、４８時間の曝露の後であり、ＳＮ−３８治療細胞においてより強く発現した（示されず）。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞系はｐ２１を発現したが、ｐ２１の上方制御も、ＰＡＲＰ切断も、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８曝露の４８時間後まで明白ではなかった。しかし、両方とも、遊離ＳＮ−３８による２４時間曝露後に観察された（示されず）。遊離ＳＮ−３８による増強された強度及びアポトーシス事象の初期活性化は、ＩｇＧ抱合系体より低いＥＣ５０と一致しているが、結果は、少なくとも４８時間の曝露時間が必要であることを示しているが、この時点で、およそ７５％のＳＮ−３８が抱合体から放出される。
【表１０】
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【０２９９】
本発明者たちは、ＰＡＲＰ切断及びｐ２１発現を、ここでは、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８＋Ｖｍａｂで処理した細胞において検査した。Ｒａｍｏｓによる初期研究を確認すると、ＰＡＲＰ切断は、最初に、抱合体への４８時間曝露後に初めて生じ、発現は架橋抗体の存在下で変化しなかった（示されず）。４８時間を超えるベルツズマブへの曝露は、ＰＡＲＰ切断に対して効果はなかったが、切断は、架橋抗体が添加されると、２４時間以内に強力となった（示されず）。しかし、ベルツズマブ単独（架橋剤なし）がＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と組み合わされるとき、ＰＡＲＰ切断は、２４時間の曝露後に生じ（示されず）、ベルツズマブが、架橋剤の不在下であってもアポトーシスのより急速な開始を誘導できることを示した。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞系において唯一注目される差は、組み合わせがｐ２１の発現を４８時間で大きく増強させたことであり（示されず）、ここでも、ベルツズマブがＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体と組み合わされたときに、アポトーシス誘導が加速されたことを示唆した。Ｒａｍｏｓと比較してＷＳＵ−ＦＳＣＣＬにおけるアポトーシス誘導の遅延は、ＣＤ２２及びＣＤ２０の低い発現によって説明することができる。
【０３００】
超毒性作用物質は、多くの場合、これらの早期放出が毒性を増加するので、血清中において極めて安定しているリンカーを使用するが、これらの抱合体は、薬物が最適に送達されるために内部移行しなければならない。エプラツズマブは急速に内部移行するので、本発明者たちは、ＣＬ２Ａ連結Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８抱合体のインビトロ細胞傷害性を血清安定性ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８抱合体と比較して、より安定して連結されたＳＮ−３８が有益でありうるかを検査した。両方の抱合体は、類似した結合親和性を有したが（示されず）、より安定したＥｍａｂ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８は、３つの細胞系において、ＣＬ２Ａ抱合体よりおよそ４０〜５５倍効力が少なかった（示されず）。特異性がＣＬ２Ａ抱合体から欠如していたので、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８は、非結合Ｌｍａｂ抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８抱合体より、一貫して２倍多くの効力があった（示されず）。本発明者たちは、より安定して連結された抱合体が緩徐内部移行ベルツズマブ抱合体に適している可能性はないと結論づけ、したがって、調査をＣＬ２Ａ連結ＳＮ−３８抱合体のみについて続けた。
【０３０１】
インビトロアッセイの制約のため、有効性を異種移植変モデルによって評価した。表１０に示されているように、全てのリンパ腫細胞系は、ＣＤ２２よりはるかに高いＣＤ２０の発現を有している。Ｄａｕｄｉは、ＣＤ２２及びＣＤ２０の最高の発現を有したが、非抱合ベルツズマブに対してインビボにおいて非常感受性があり、インビトロ試験は、ＳＮ−３８への最高の感受性を明らかにした（表１０）。これらの特性は、特に非抱合エプラツズマブが動物において有効な治療薬ではない場合、非抱合体と、ＳＮ−３８抱合体に起因した活性との差を評価することを困難にする可能性がある。Ｒａｍｏｓが、９０Ｙ−Ｅｍａｂをベルツズマブと組み合わせる利益を示すために以前に使用されていたので（Ｍａｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６１５４−６０）、本発明者たちは、Ｒａｍｏｓヒトバーキット細胞系におけるＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びＶｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体の比較から出発することを選択した。ＣＤ２２より１５倍高いＣＤ２０の発現を示すフローサイトメトリーにもかかわらず、Ｒａｍｏｓ異種移植片の免疫組織学は、豊富なＣＤ２２及びＣＤ２０を示し、ＣＤ２２は、ＣＤ２０より均一に発現したと思われる。
【０３０２】
未治療動物におけるＲａｍｏｓ異種移植片は急速に進行し、６日以内に出発サイズの０．４ｃｍ３から終止サイズの３．０ｃｍ３に達し（示されず）、以前に報告されたように、ベルツズマブも、エプラツズマブも、十分に確立されたＲａｍｏｓ異種移植片にはっきりとした影響を与えなかった（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５０：４４４−５３）。他のＳＮ−３８抱合体を使用する以前の知見と一致して、４週間にわたる毎週２回の０．５ｍｇ／用量レジメンにより治療された動物で、はっきりとした体重減を有したものはいなかった。両方の抱合体は、腫瘍増殖の制御に極めて有効であり、８０％を超える動物には、４週間治療の終了時までに腫瘍の形跡がなかった（図６）。０．２５ｍｇのＶｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８用量は、最初の４週間にわたって増殖の制御が良好であったが、０．５ｍｇでは、類似した初期増殖制御が両方の抱合体において観察された。このように、ＣＤ２２より１５倍高いＣＤ２０の発現にもかかわらず、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、Ｖｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と比べて勝るとも劣らなかった。したがって、残りの研究は、Ｅｍａｂ−ＳＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の単独または非抱合ベルツズマブとの組み合わせに集中した。
【０３０３】
Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８用量応答及び特異性。用量応答関係が特異的Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及び無関係Ｌｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体において見られたが、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、試験した３つのレベルのうち２において有意に良好な増殖制御を有し、中間用量で特異的抱合体を優先する強い傾向を有した（図７）。ここでも、０．２５ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、大部分の腫瘍を除去し、ここで１０匹のうち７匹の動物は、１２週間のモニター期間の終了時に無腫瘍であり、体重の変化はなかった。イリノテカン単独（６．５μｇ／用量、０．２５ｍｇの抱合体をほぼ同じＳＮ−３８当量）を与えた動物は、生存期間中央値の１．９週間を有し、研究の終了時には１１匹のうち３匹の動物が無腫瘍であり、これは、無関係のＬｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体の３．４５週間の生存期間中央値と有意に異ならなかった（Ｐ＝０．４５２、図７  ７Ｃ）。
【０３０４】
６９７播種性白血病モデルでは、食塩水治療動物の生存期間中央値は、腫瘍接種からちょうど１７日間であった。非抱合エプラツズマブ＋イリノテカン（０．５ｍｇの抱合体と同じモル当量のＳＮ−３８）を与えた動物は、同じ生存期間中央値を有し、一方、０．５ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、７日間の腫瘍接種から出発して毎週２回与えられた動物は、２４．５日間生存し、非治療動物（Ｐ＜０．０００１）より、またはイリノテカンと共に非抱合エプラツズマブが与えられた動物（Ｐ＝０．０１６）より有意に長かった。しかし、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、無関係の抱合体より有意に良好ではなく（生存期間中央値＝２２日間、Ｐ＝０．３０４）、この細胞系におけるＣＤ２２の低い発現を反映している可能性が最も高い。
【０３０５】
非抱合Ｖｍａｂ抗ＣＤ２０と組み合わせたＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８。本発明者たちは、以前に、９０ＹーＥｍａｂが皮下Ｒａｍｏｓモデルにおいて非抱合ベルツズマブと組み合わせたときに改善された応答を報告し（Ｍａｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６１５４−６０）、したがって、この可能性をＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８によって検査した。パイロット研究では、平均しておよそ０．３ｃｍ３の皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍を有する５匹の動物に、ベルツズマブ（０．１ｍｇ）、０．１ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８、またはＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８＋Ｖｍａｂを与えた（全ての作用物質は、毎週２回で４週間にわたって与えられた）。２．０ｃｍ３へのＴＴＰ中央値は、それぞれ２２日、１４日及び７７日超（ベルツズマブ対Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８単独、Ｐ＝０．５９、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８＋Ｖｍａｂ対Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８、Ｐ＝０．０１４５）であり、ベルツズマブとＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の組み合わせが全体的な治療応答を改善したという初期の指摘をもたらした。同様に毎週２回で４週間の治療レジメンを使用した追跡研究では、０．１ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８＋０．１ｍｇのベルツズマブを与えた１１匹のうち６匹の動物が、治療開始から１６週間にわたって腫瘍の形跡を有さず、一方、ベルツズマブ単独または０．１ｍｇの対照Ｌｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を受けた動物の生存期間中央値は、それぞれ１．９及び３．３週間であり、１１匹のうち３匹の動物が、それぞれの群において、１６週間にわたって無腫瘍であった（示されず）。長期間のＴＴＰ中央値及びより多くの生存者にもかかわらず、群の間に有意な差は見出されなかった。このように、豊富なＣＤ２０及び中程度のレベルのＣＤ２２を有するＲａｍｏｓモデルでは、非毒性用量レベルで与えられたＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、非抱合抗ＣＤ２０療法より有意に良好ではなかったが、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を非抱合抗ＣＤ２０療法に加えると、毒性を有することなく応答を改善すると思われた。ＳＮ−３８抱合体が最大耐容用量よりかなり少ないレベルで与えられおり、したがって、これらの結果は、非抱合抗ＣＤ２０療法がＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体と等しいと解釈されるべきではないことを強調することが重要である。
【０３０６】
２つの追加的な研究は、ＣＤ２０及びＣＤ２２の低い発現を有するＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ濾胞性ＮＨＬ細胞系を使用して、静脈内移植モデルにおいて実施した。食塩治療動物の生存期間中央値は、腫瘍移植〜４０〜４２日間であった。イリノテカン単独（示されず）は、０．３ｍｇのＡＤＣと同じＳＮ−３８当量を含有する用量が与えられ、生存期間中央値を増加したが（それぞれ、４９日対４０日、Ｐ＝０．０４２）、１５匹のうち１４匹の動物は、４９日目に疾患進行ために死亡し、食塩群における１５匹のうち最後の増加４匹の動物は、おなじ日に排除された（示されず）。相対的に低いＣＤ２０発現にもかかわらず、ベルツズマブ単独（３５μｇを毎週２回×４週間）は、このモデルにおいて有効であった。生存期間中央値は、第１の研究では９１日間に増加し、２匹が治癒し（１６１日目）、第２の研究では７７日間に増加したが、８９日後には生存者はなかった（ベルツズマブ単独対食塩水治療、両方の研究でＰ＜０．００１）。イリノテカン及びベルツズマブと組み合わせた非抱合エプラツズマブ（０．３ｍｇ／用量）は、ベルツズマブ単独と同じ生存期間中央値を有し、エプラツズマブも、イリノテカンも、正味の応答に寄与しないこが示唆された。
【０３０７】
ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬによる低いＣＤ２２の発現のために予測されたように、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８単独は、Ｒａｍｏｓの場合と同じように有効ではなかった。０．１５ｍｇの用量では、食塩群より有意な利益は見られなかったが、０．３ｍｇでは、生存期間中央値は、６３日間に増加し、食塩治療動物と比較して有意な改善をもたらした（Ｐ＝０．００６）。０．３ｍｇのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を使用する第２の研究は、食塩水群と比較して向上した生存期間を確認した（７５日間対４０日間、Ｐ＜０．０００１）。この応答の特異性は、第１の研究では明らかではなく、無関係Ｌｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体及びＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の生存期間中央値は、０．１５または０．３ｍｇ用量レベルでは異なっていなかった（２つの用量レベルでのＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体により、それぞれ４２日間対４９日間及び６３日間対６３日間）。しかし、第２の研究では、０．３ｍｇ用量のＥｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、無関係抱合体より生存期間の有意な改善をもたらした（７５日間対４９日間、Ｐ＜０．０００１）。ここでも、このモデルにおいて特異性を示すことの困難さは、低いＣＤ２２発現に関係する可能性が最も高い。
【０３０８】
特異的Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８をベルツズマブと組み合わせることは、生存期間を実質的に増加し、対照Ｌｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８より堅牢な応答を有する証拠がある。例えば、第１の研究では、ベルツズマブ＋０．１５または０．３ｍｇの対照抱合体で治療された動物は、それぞれ生存期間中央値の９８及び９１日間を有し、ベルツズマブ単独と類似していた（９１日間、示されず）。しかし、ベルツズマブ＋０．１５ｍｇの特異的Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、生存期間中央値を１４０日間に増加した。この改善はベルツズマブ単独より有意に高くないが（Ｐ＝０．２５７）、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８用量が、ベルツズマブにより０．３ｍｇに増加したとき、１０匹のうち６匹の動物は、研究の終了時に生存しており、対照抱合体＋ベルツズマブより有意な生存利益をもたらした（Ｐ＝０．０００２）。第２の研究では、ベルツズマブ単独の生存期間中央値は、第１よりも短く（９１日間に対して７７日間）、それでも、ベルツズマブとの対照抱合体の生存期間中央値は、ここでも９１日間であり、ベルツズマブ単独よりの有意な生存利益を生じた。特異的Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体をベルツズマブと組み合わせると、生存期間中央値を１２６日間に延長させ、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びベルツズマブの単独の、それぞれの生存期間中央値の７５日間及び７７日間より有意に長かった（それぞれＰ＜０．０００１）。しかし、この研究では、対照ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体との組み合わせに対する統計的改善の要件を、完全に満たすことはなかった（Ｐ＝０．０７８）。
【０３０９】
考察
過去１０年間にわたって、ＡＤＣは癌療法にいて相当な利益を得てきたが、いくつかの失敗もあった。研究者が単独で使用するには毒性が多すぎる作用物質を検査する場合には、大きな利益を生じたが、抗体と結合させると、いわゆる超毒性は、前臨床試験において実質的に改善された応答を生じた。ホジキンリンパ腫における、アウリスタチン抱合体であるブレンツキシマブベドチンの近年の認可及び非抱合トラスツズマブに抵抗性の乳癌における単一作用物質としてのトラスツズマブ−ＤＭ１抗ＨＥＲ２マイタンシン抱合体による臨床的成功は、これらの超毒性作用物質担持ＡＤＣが、許容された治療様式となりつつあることを示唆している。しかし、それ自体ピコモル範囲で強力な作用物質により調製された抱合体は、近年、抗ＣＤ３３カリチアマイシン抱合体であるゲムツズマブオゾガマイシンを市場から撤退させる決定が示唆しているように、毒性の危険性が増加する可能性がある（Ｒａｖａｎｄｉ，２０１１，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２９：３４９−５１）。このように、ＡＤＣの成功は、薬物と抗体を一緒に結合させるのに適切な化学を確認すること、ならびに細胞傷害剤の適切で選択的な送達を可能にするほど十分に発現された適切な標的を特定することによって、左右される。
【０３１０】
本発明者たちは、ＳＮ−３８をＩｇＧに結合させて、ＳＮ−３８が血清中に抱合体をゆっくりと放出されること（１日あたり約５０％）を可能にするＣＬ２Ａリンカーを開発した。このリンカーによって、ゆっくりと内部移行する抗体は、有効な治療薬になることができ、それは、おそらく、腫瘍に局在化した抱合体が、内部移行していなくても、十分な薬物を局所的に放出するからである。ＣＬ２Ａリンカーは、近年、急速に内部移行することが報告されたＴＲＯＰ−２への抗体にも使用された（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９）。このように、緩徐放出機構は、内部移行及び非内部移行抗体にとって有益であると思われる。
【０３１１】
この報告において、本発明者たちは、急速に内部移行する抗ＣＤ２２  ＩｇＧであるエプラツズマブ及びゆっくりと内部移行するの抗ＣＤ２０  ＩｇＧであるベルツズマブにょり調製されたＳＮ３８抱合体を、Ｂ細胞悪性病変の治療において比較することによって、ＣＬ２Ａリンカーの評価を広げた。マウス親エプラツズマブによる以前の研究は、大部分の抗体が１時間以内に内部移行し、５０％のＣＤ２２が５時間以内に細胞表面に再発現することを示した（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５６：５３８−４５）。この内部移行及び再発現過程は、ＣＤ２２の低い表面発現を補うことができる細胞内送達を可能にする。多くのＢ細胞悪性病変がＣＤ２２よりはるかに多くのＣＤ２０を発現するので、ＣＤ２０を標的にする抱合体は、腫瘍に局在化した後に毒性負荷量を放出することによって、薬物のより多くのモルを送達することができる。
【０３１２】
インビトロ細胞傷害性研究は、抱合体から培地へのＳＮ−３８の放出のため、特異的抱合体または無関係の抱合体であっても効力を識別することができなかった。事実、ＳＮ−３８単独は、抱合体よりいくらか強力であり、細胞に進入し、トポイソメラーゼーＩと会合する加速された能力を反映している場合がある。他の研究は、アポトーシスの初期徴候が見られるまで、抱合体が４８時間の曝露を必要とすることを明らかにしたので、本発明者たちは、インビトロ試験は、これら２つの抱合体の効力を識別できないと結論づけ、したがってインビボ研究を用いた。
【０３１３】
異種移植片モデルでは、両方の抱合体がＲａｍｏｓ腫瘍に対して類似した抗腫瘍活性を有し、フローサイトメトリーは、ＣＤ２２よりほぼ１５倍多くのＣＤ２０が発現されたことを示した。このことは、とりわけ、いずれかの作用物質が他の作用物質の結合に干渉するかという懸念を有することなく、非抱合Ｖｍａｂ抗ＣＤ２０療法と組み合わせることができるので、Ｅｍａｂ抗ＣＤ２２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抗体を選択することに支持を与えた。事実、抗ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体が使用される場合、総ＩｇＧタンパク質用量は、容量制限毒性がＳＮ−３８含有量によって誘導されるので、有効な非抱合抗ＣＤ２０抗体治療にとって典型的に必要とされるレベルを下回る可能性がある。より多くの非標識抗ＣＤ２０を抗ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体に付加することは、抱合体の取り込みを低減する及びその有効性を潜在的に減少する危険性がある。しかし、本発明者たちが放射標識エプラツズマブと非抱合ベルツズマブとの組み合わせにおいて以前に示したように、利益は、両方の作用物質が最大有効及び安全投与量で与えられたときに誘導することができる。インビトロ研究は、ベルツズマブが、シグナル伝達の向上に使用される架橋剤の不在下であっても、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８によって開始されたアポトーシス事象を加速させたことを示した。このように、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体がＣＤ２０抱合体と同じ様に有効である限り、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体を選択することは、一方または両方の抗原の発現が低い腫瘍においても、より有効な併用療法を可能にするので当然の選択である。
【０３１４】
超毒性薬物を使用する大部分のＡＤＣが安定して連結されるので、本発明者たちは、血清安定性であるが、細胞内切断可能な抗ＣＤ２２−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８抱合体も試験したが、ＣＬ２Ａリンカーより４０〜５５倍低い効力があることが分かった。他の人たちは、抗ＣＤ２０または抗ＣＤ２２抗体に抱合させた様々な超毒性薬物を検査し、内部移行する抱合体は、一般により活性であることを見出したが、ゆっくりと内部移行する抗体であっても、放出された薬物が細胞膜を貫通する場合には有効でありうることも観察した。ＣＬ２Ａ型リンカーはＳＮ−３８にとって適切でありうるが、血清中への少量の持続的放出であっても、毒性を増加し、治療範囲を損なう毒性の大きい作用物質には、最適ではない場合がある。
【０３１５】
Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、Ｒａｍｏｓを有するマウスにおいて０．６ｍｇの累積用量で活性であり（７５μｇを毎週２回で４週間）、これは、ちょうど２．５ｍｇ／ｋｇのヒト用量と推定される。このように、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は患者において十分な治療範囲を有するはずである。更に、抗ＴＲＯＰ−２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体の有効及び安全用量を、９０Ｙ標識抗体の最大耐容用量と比較すると、毒性の明らかな増加はなく、有効性が改善された（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １０：１０７２−８１）。このように、これらのＳＮ−３８抗体抱合体の安全性及び有効性プロフィールは、他の併用療法にとって非常に好ましいものである。
【０３１６】
イリノテカンは造血器癌の治療に日常的に使用されていないとしても、ＳＮ−３８は、リンパ腫及び白血病細胞系において、固形腫瘍と同じ様に効力があった（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９）。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞系において、特異的及び無関係ＩｇＧ抱合体は、イリノテカンより有意に良好であり、一方、Ｒａｍｏｓでは、無関係抱合体のＴＴＰ中央値は長かったが、イリノテカンより有意に良好であった。これらの結果は、非特異的ＩｇＧが薬物の優れた担体であること及び遊離薬物より、またはアルブミンもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−Ｆｃで調製された抱合体よりインビボで効力があることを示した他の研究と一致していた。ＰＥＧ−ＳＮ−３８抱合体は有意な抗腫瘍効果を有したが、１０〜３０ｍｇ／ｋｇＳＮ−３８当量の範囲の最大耐容量で与えられていた（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９４：１４５６−９）。対照的に、Ｒａｍｏｓを有する動物に４週間にわたって与えられたＳＮ−３８の最大累積用量は、僅か１．６ｍｇ／ｋｇであり（すなわち、毎週２回で４週間にわたって与えられたＥｍａｂ−ＳＮ−３８の０．２５ｍｇの投与）、これは非毒性であった。
【０３１７】
Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の特異的治療活性は、高いＣＤ２２発現を有する細胞系において改善されたと思われた。例えば、Ｒａｍｏｓでは、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８単独の特異的治療活性が、検査された３つの異なる用量レベルのうち２つにおいて記録され、相当数の腫瘍が完全に除去された。対照的に、約２．５倍低いＣＤ２２の発現を有したＷＳＵ−ＦＳＣＣＬでは、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、２つの研究のうちの１つにおいて無関係ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体と比較して生存期間を有意に改善した。しかし、非抱合抗ＣＤ２０療法と組み合わせて使用されるとき、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は治療応答を増幅させることを強調することが重要である。このように、これらの２つの治療の組み合わせは、ＣＤ２２が高く発現していない状況においても、応答を増強することができる。
【０３１８】
結論として、安定性の低いＣＬ２Ａ−ＳＮ−２８リンカーを使用して、Ｅｍａｂ抗ＣＤ２２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、ＣＤ２０発現がＣＤ２２よりｌｏｇ倍高いという事実にもかかわらず、類似した抗ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体とインビボにおいて非毒性用量で等しく活性であった。治療応答は、ＣＤ２２発現が低い場合であっても、Ｅｍａｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と非抱合Ｖｍａｂ抗ＣＤ２０療法との組み合わせによって利益を得ており、併用療法は、両方の抗原が存在するとき、多数のＢ細胞悪性病変において応答を改善できることを示唆している。現在の研究は、この組み合わせが、多様なリンパ腫及び白血病前臨床モデルにおいて極めて効力があり、それでもなお宿主毒性が低いと思われることを示唆している。
【０３１９】
実施例１４．ＣＤ７４＋ヒト癌の治療のための抗ＣＤ７４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体
ＣＤ７４は、内部移行し、かつ抗体結合後に再循環されるので、抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）にとって魅力的な標的である。ＣＤ７４は、大部分が血液癌に関連するが、固形癌においても発現する。したがって、ＣＤ７４発現固形腫瘍の治療のためにヒト化抗ＣＤ７４抗体であるミラツズマブにより調製されたＡＤＣの有用性を、検査した。ミラツズマブ−ドキソルビシン及び２つのミラツズマブ−ＳＮ−３８抱合体は、切断可能リンカー（ＣＬ２Ａ及びＣＬ２Ｅ）によって調製され、血清中の安定性及びリソソームによるＳＮ−３８の放出方法が異なっていた。ＣＤ７４発現は、フローサイトメトリー及び免疫組織学によって決定した。インビトロ細胞傷害性及びインビボ治療研究を、ヒト癌細胞系Ａ−３７５（黒色腫）、ＨｕＨ−７及びＨｅｐ−Ｇ２（肝細胞腫）、Ｃａｐａｎ−１（膵臓）、ＮＣＩ−Ｎ８７（胃）、ならびのＲａｊｉバーキットリンパ腫において実施した。ミラツズマブ−ＳＮ−３８  ＡＤＣを、抗ＴＲＯＰ−２及び抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体により調製したＳＮ−３８  ＡＤＣと、これらの標的抗原を発現する異種移植片において比較した。
【０３２０】
ミラツズマブ−ドキソルビシンは、リンパ腫モデルにおいて最も有効であり、一方、Ａ−３７５及びＣａｐａｎ−１では、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のみが治療利益を示した。ＴＲＯＰ−２またはＣＥＡＣＡＭ６よりもかなり低いＣＤ７４の表面発現にもかかわらず、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、ＴＲＯＰ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と類似した有効性をＣａｐａｎ−１に対して有したが、ＮＣＩ−Ｎ８７では、抗ＣＥＡＣＡＭ６及び抗ＴＲＯＰ−２抱合体のほうが優れていた。単一用量レベルでの２つの肝細胞腫細胞系による研究は、食塩治療動物より有意な利益を示したが、無関係ＩｇＧ抱合体に対しては示さなかった。ＣＤ７４は、いくつかの固形腫瘍異種移植片におけるＡＤＣの適切な標的であり、その有効性は、主にＣＤ７４発現の均一性によって影響を受け、ＣＬ２Ａ連結ＳＮ−３８抱合体が、最良の治療応答をもたらした。
【０３２１】
序論
ＣＤ７４は、不変鎖またはＩｉと呼ばれ、ＨＬＡ−ＤＲと会合し、かつクラスＩＩ抗原の提示構造への抗原ペプチドの結合を阻害する、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。これは、不変鎖複合体をエンドソーム及びリソソームに向けるシャペロン分子として機能し、ＮＦ−ｋＢにより媒介される経路を使用するＢ細胞の成熟における及びＣＤ４４との相互作用を介したＴ細胞応答におけるアクセサリー分子として機能し（Ｎａｕｊｏｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７４：２５７−６８）、マクロファージ遊走阻止因子であり炎症促進性サイトカインの受容体であり（Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７−７６）、細胞繁殖及び生存経路の活性化に関与している。
【０３２２】
正常なヒト組織では、ＣＤ７４は、主に、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス島、活性化Ｔ細胞のサブセット及び胸腺上皮に発現し（示されず）、Ｂ細胞腫瘍の９０％超に発現する（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：６６０６−１１、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ  １０４：３７０５−１１）。初期の研究は、ＣＤ７４が膜に存在するかについて矛盾するデータを有し、それは、部分的には不変鎖に対する抗体は分子の細胞質部分に対して特異的であるからであるが、表面には比較的少数のコピーが存在し、細胞表面の半減期が非常に短いからでもある。細胞表面のおよそ８０％のＣＤ７４が、ＭＨＣ  ＩＩ抗原ＨＬＡ−ＤＲに会合する（Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：８５８１−８５）。マウス抗ＣＤ７４抗体のＬＬ１を使用して、Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞系が４．８×１０４コピー／細胞を有すると推定したが、急速な細胞内移行のため、１日あたり約８×１０６抗体分子が内部移行し、異化された（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２０：２９３−３００）。このように、ＣＤ７４内部移行は、極めて動的であり、抗体が表面から素早く移動して、細胞内において負荷軽減し、続いて表面にＣＤ７４を再発現させる。Ｆａｂ’内部移行は、ＩｇＧ結合と同じ速さで生じ、二価結合を必要としないことを示している。ＣＤＲグラフト型のマウスＬＬ１であるミラツズマブ（ｈＬＬ１）による後期の研究は、抗体がＢ細胞繁殖、遊走及び付着分子発現を変更しうることを見出したが（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ  １０４：３７０５−１１、Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４３：２５５、Ｆｒｏｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １４：Ｒ５４）、抗ＣＤ７４抗体の例外的な内部移行特性は、抗ＣＤ７４抗体を、癌治療薬の細胞内送達のための効率的な担体にした。（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７−７１）。前臨床有効性及び毒性の結果に基づいて、多発性骨髄腫（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，１１２：３６９７）、ならびに非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ性白血病にミラツズマブ−ドキソルビシンを用いる第Ｉ相臨床試験を、開始した。
【０３２３】
興味深いことに、ＣＤ７４は、胃、腎臓、膀胱、非小細胞肺癌、特定の肉腫及び神経膠芽腫などの非造血器癌においても発現し（例えば、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ４：１−１２）、したがって、この抗原を発現する固形腫瘍の治療標的となりうる。ミラツズマブ−ドキソルビシン抱合体は、血液癌のモデルにおいて極めて活性であったので、この評価は当然のことである。しかし本発明者たちは、近年、極めて強力なトポイソメラーゼーＩ阻害剤であるＳＮ−３８を抗体に結合させる手順を開発した。ＳＮ−３８は、イリノテカンの活性形態であり、その薬理学及び代謝が良く知られている。これらの抱合体は、固形細胞系に対してナノモル効力を有し、能動的に内部移行しなかった抗体によって活性になることが見出された。以前の研究は、血清中においてある程度安定している他のリンカーより、ＳＮ−３８を半減期が約１日の抱合体から血清中に解離させるリンカー（ＣＬ２Ａ）が優先されることを示した。しかしミラツズマブの例外的な内部移行能力を考慮すると、血清中では極めて安定しているが、リソソームにより取り込まれるとＳＮ−３８を放出することができる新たなリンカー（ＣＬ２Ｅ）を開発した。
【０３２４】
現在の調査は、主に固形腫瘍に対する有効な療法のため、１つはドキソルビシンを伴い、２つはＳＮ−３８抱合体である、これら３つのミラツズマブ抗ＣＤ７４抱合体を使用する展望を検査した。
【０３２５】
材料及び方法
ヒト腫瘍細胞系。Ｒａｊｉバーキットリンパ腫の、Ａ３７５（黒色腫）、Ｃａｐａｎ−１（膵臓腺癌）、ＮＣＩ−Ｎ８７（胃癌）、Ｈｅｐ−Ｇ２肝細胞腫及びＭＣ／ＣＡＲ骨髄腫細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。ＨｕＨ−７肝細胞腫細胞系は、Ｊａｐａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）から購入した。全ての細胞系は、１０％〜２０％のウシ胎児血清及び補充剤を含有する推奨培地中において加湿ＣＯ２インキュベーター（５％）により３７℃で培養した。細胞を＜５０回継代し、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａについて定期的に検査した。
【０３２６】
抗体及び抱合方法。ミラツズマブ（抗−ＣＤ７４  ＭＡｂ）、エプラツズマブ（抗−ＣＤ２２）、ベルツズマブ（抗−ＣＤ２０）、ラベツズマブ（抗−ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ１５（抗−ＣＥＡＣＡＭ６）及びｈＲＳ７（抗−ＴＲＯＰ−２）は、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＣＬ２Ａ及びＣＬ２Ｅリンカー、ならびにこれらのＳＮ−３８誘導体は、上記の実施例に記載されたように調製され、抗体に抱合された。ミラツズマブ−ドキソルビシン抱合体は、以前に記載されたように調製した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７−７１）。全ての抱合体は、ＩｇＧのジスルフィド還元、続いてこれらのリンカーに対応するマレイミド誘導体との反応によって調製した。分光光度分析は、薬物：ＩｇＧのモル置換比を５〜７と推定した（１．０ｍｇのタンパク質が、約１６μｇのＳＮ−３８または２５μｇのドキソルビシン当量を含有する）。
【０３２７】
インビトロ細胞結合及び細胞傷害性。抗原陽性細胞への非抱合及び抱合ミラツズマブの細胞結合を比較したアッセイ、ならびに細胞傷害性試験は、ＭＴＳ色素還元法（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用した。
【０３２８】
フローサイトメトリー及び免疫組織学。フローサイトメトリーは、膜結合抗原または膜及び細胞質抗原のみの評価を提供することによって実施した。免疫組織学は、抗原回復法を用いることなく、抗ヒトＩｇＧ抱合体によって明らかとなった抗体を１０μｇ／ｍＬで使用して染色した、皮下腫瘍異種移植片のホルマリン固定パラフィン包埋切片において実施した。
【０３２９】
インビボ研究。雌ヌードマウス（４〜８週齢）または雌ＳＣＩＤマウス（７週齢）は、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入し、１週間隔離した後に使用した。食塩対照を含む全ての作用物質を、毎週２回で４週間にわたって腹腔内投与した。特定の用量は「結果」に提示されている。毒性は、毎週の体重測定によって評価した。Ｒａｊｉバーキットリンパ腫モデルでは、ＳＣＩＤマウスに、０．１ｍＬ培地中の２．５×１０６Ｒａｊｉ細胞を静脈内注射した。５日後、動物は、抱合体または食塩水の単回静脈内注射（０．１ｍＬ）を受けた（Ｎ＝１０／群）。マウスを、困難及び麻痺の徴候について毎日観察し、後肢麻痺、初期体重の＞１５％減、または他の瀕死状態（代替生存エンドポイント）のいずれかが発生したときに安楽死させた。
【０３３０】
皮下腫瘍をカリパスによって２つの寸法で測定し、腫瘍体積（ＴＶ）をＬ×ｗ２／２と計算し、ここでＬは最長直径であり、ｗは最短である。測定は、少なくとも毎週１回行い、腫瘍が１．０ｃｍ３に増殖したとき（すなわち、代替生存エンドポイント）に、動物を殺処分した。Ａ−３７５黒色腫細胞系（０．２ｍＬ中６×１０６細胞）を、ヌードマウスに移植し、腫瘍が平均して０．２３±０．０６ｃｍ３になったときに（Ｎ＝８／群）、治療を開始した。連続継代腫瘍の懸濁液（１５％ｗ／ｖの腫瘍懸濁液の０．３ｍＬ）を組織培養物の８×１０６細胞と組み合わせて使用して、Ｃａｐａｎ−１をヌードマウスに皮下移植した。ＴＶが平均して０．２７±０．０５ｃｍ３になったときに（Ｎ＝１０／群）、治療を開始した。ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌異種移植片は、マトリゲルと末期培養物からの１×１０７細胞との１：１（ｖ／ｖ）混合物の０．２ｍＬを皮下に注射することによって開始した。ＴＶが平均して０．２４９±０．０４５ｃｍ３になったときに（Ｎ＝７／群）、治療を開始した。同じ手順に従って、ヌードマウスにＨｅｐ−Ｇ２及びＨｕＨ−７肝細胞腫異種移植片を発生させた。Ｈｅｐ−Ｇ２が平均して０．３６４±０．０６２ｃｍ３（Ｎ＝５／群）になったとき及びＨＵＨ−７が平均して０．２９８±０．０５５ｃｍ３（Ｎ＝５／群）になったとき、治療を開始した。
【０３３１】
有効性は、生存期間中央値の決定のために上記に記述された代替生存エンドポイントを使用して、カプラン・マイヤー生存曲線によって表した。分析は、有意性をＰ＜０．０５に定め、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によって実施した。
【０３３２】
結果
ヒト腫瘍細胞系及び異種移植片におけるＣＤ７４発現。固形腫瘍細胞系における膜のみのＣＤ７４のＭＦＩが、多くの場合にバックグラウンドＭＦＩより＜２倍高いので（Ａ−３７５黒色腫細胞系を除く）、４つの異なる固形細胞型から誘導された６つの細胞系を、主に透過細胞の分析に基づいてＣＤ７４陽性として確認した（表１１）。Ｒａｊｉにおける表面ＣＤ７４発現は、固形腫瘍細胞系より＞５倍高かったが、透過Ｒａｊｉ細胞における全てのＣＤ７４は、大部分の固形細胞系と類似していた。
【０３３３】
【表１１】
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【０３３４】
免疫組織学は、Ｒａｊｉ皮下異種移植片がほぼ均一であること及び突起細胞表面標識によって強力に染色されたこと（示されず）を示した。Ｈｅｐ−Ｇ２肝細胞腫細胞系は、固形腫瘍のうちで最も均一な取り込みを有し、主に細胞質であるが、中程度に強い染色を有し（示されず）、次にＡ−３７５黒色腫細胞系が続き、より強力で、いくらか均一性の少ない染色を有し、大部分が細胞質であるが、より強力な発現を有した（示されず）。Ｃａｐａｎ−１膵臓細胞系（示されず）及びＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞系（示されず）は、中程度（Ｃａｐａｎ−１）から強度（ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌異種）のＣＤ７４染色を有したが、均一な分布ではなかった。ＨＵＨ−７肝細胞腫細胞系（示されず）は、最も均一性が少なく、染色が最も弱かった。
【０３３５】
抱合体の免疫反応性。非抱合ミラツズマブ、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びミラツズマブ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８抱合体のＫｄ値は、有意に異なっておらず、平均してそれぞれ０．７７ｎＭ、０．５９ｎＭ及び０．８０ｎＭであった。ＭＣ／ＣＡＲ多発性骨髄腫細胞系において測定された非抱合及びドキソルビシン抱合ミラツズマブのＫｄ値は、それぞれ０．５±０．０２ｎＭ及び０．８±０．２ｎＭであった（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１８８８−９６）。
【０３３６】
抱合体のインビトロ薬物放出及び血清安定性。メルカプトエタノールキャップＣＬ２Ａ及びＣＬ２ＥリンカーからのＳＮ−３８の放出機構は、リソソーム条件を部分的模擬した環境下、すなわち、低ｐＨ（ｐＨ５．０）下及びカテプシンＢの存在または不在下で決定した。ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８基質は、酵素（示されず）の不在下、ｐＨ５で不活性であったが、カテプシンＢの存在下では、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ部位での切断は素早く進行し、半減期は３４分間であった（示されず）。活性ＳＮ−３８の形成は、ＳＮ−３８の１０位のカルバメート結合の分子内環化を必要とし、ゆっくりと生じ、半減期は１０．７時間である（示されず）。
【０３３７】
予測されたように、カテプシンＢは、ＣＬ２Ａリンカーにおいて活性ＳＮ−３８の放出に対して効果がなかった。しかし、ＣＬ２Ａは、切断可能カルボン酸ベンジル結合を有し、ＳＮ−３８をｐＨ５．０でＣＬ２Ｅリンカーと類似した速度で放出し、半減期は約１０．２時間である（示されず）。ｐＨ感受性アシルシドラゾンを有するミラツズマブ−ドキソルビシン抱合体は、ｐＨ５．０で半減期の７〜８時間を有した（示されず）。
【０３３８】
これら全てのリンカーがリソソーム関連条件下において類似した速度で薬物を放出するが、血清中の安定性は非常に異なる。ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、遊離ＳＮ−３８の５０％を２１．５５±０．１７時間で放出し（示されず）、他のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体と一致していた。しかしＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８抱合体は、極めて不活性であり、半減期は約２１００時間と推定される。ミラツズマブ−ドキソルビシン抱合体は、ドキソルビシンの５０％を９８時間で放出し、このことは、他の２つの抗体−ドキソルビシン抱合体と類似していた（示されず）。
【０３３９】
細胞傷害性。これらの抱合体の評価に関連する重大な問題は、造血器及び固形腫瘍細胞系における遊離ドキソルビシン及びＳＮ−３８の相対的効力であった。本発明者たちは、以前、ＳＮ−３８がいくつかのＢ細胞リンパ腫及び急性白血病細胞系において活性であり、効力が０．１３〜２．２８ｎＭの範囲であったことを報告した（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４−３４）。後にインビボ治療研究に使用した４つの固形腫瘍細胞系におけるＳＮ−３８効力は、２．０〜６ｎＭの範囲であった（示されず）。ドキソルビシンは、さまざまな応答を有し、Ｒａｊｉリンパ腫及びＡ−３７５黒色腫細胞系では３〜４ｎＭの効力であったが、Ｃａｐａｎ−１、ＮＣＩ−Ｎ８７及びＨｅｐ−Ｇ２細胞系では、ほぼ１０倍効力が低かった。ＳＮ−３８とドキソルビシンの効力を比較した他の研究は、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌では、１８対１８（それぞれ、ＳＮ−３８対ドキソルビシンのｎＭ効力）であること、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌では、２対２ｎＭであること、ＳＫ−ＯＶ−４卵巣癌では、１８対９０ｎＭであること、Ｃａｌｕ−３肺腺癌では３２対５８２ｎＭであること、Ｃａｐａｎ−２膵癌では、３７対２２１ｎＭであること、ＮＣＩ−Ｈ４６６小細胞肺癌では、０．１対２ｎＭであることを見出した。このように、ＳＮ−３８は、これら６つの細胞系のうち４つについてドキソルビシンの５〜２０倍高い効力があり、ＬＳ１７４Ｔ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１では効力が類似していた。まとめると、これらのデータは、固形腫瘍に対してドキソルビシンがＳＮ−３８より有効性が少なく、一方、ＳＮ−３８は、固形及び造血器腫瘍において等しく有効であると思われることを示した。
【０３４０】
予測されたように、３つの抱合体形態は、多くの場合、インビトロにおいて遊離薬物より数桁小さい有効性があり、それは、両方の薬物が細胞内に容易に輸送されると予測されるが、薬物抱合体は薬物を細胞内に輸送するため抗体結合を必要とするからである。４日間アッセイを通して、９０％を超えるＳＮ−３８が抱合体から培地に放出されるので（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９、Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４−３４）、ＣＬ２Ａ連結ＳＮ−３８抱合体は例外である。このように、抱合体が急速に内部移行した場合であっても、遊離薬物とＣＬ２Ａ連結薬物の差を識別することが困難である。
【０３４１】
安定してＣＬ２Ｅ連結されているＳＮ−３８は、遊離ＳＮ−３８と比較すると、Ｒａｊｉ細胞系において比較的良好に機能したが、４つの固形腫瘍細胞系において相当（７〜１６倍）低い効力を有し、ＣＤ７４の比較的低い表面発現がこれらの固形腫瘍への薬物輸送を最小限にすることに役割を果たしうることを示唆している。ミラツズマブ−ドキソルビシン抱合体は、全ての細胞系において遊離ドキソルビシンと比較したとき、有意に異なる有効性を有し、これは、固形腫瘍細胞系における遊離ＳＮ−３８に対するＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８に類似した大きさであった。
【０３４２】
上記に記述された６つの追加的な細胞系において、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、ミラツズマブ−ドキソルビシンより９〜６０倍大きい効力であり（示されず）、ここでもこの結果は、主に、ＣＬ２Ａ連結抱合体が、大部分のＳＮ３８を４日間のインキュベーション期間にわたって培地に放出し、一方、ドキソルビシン抱合体が、最大で５０％の薬物を同じ期間にわたって放出するという事実によって影響を受けた。ＣＬ２Ｅ連結ミラツズマブは、これらの他の細胞系において検査しなかった。
【０３４３】
ヒト腫瘍異種移植片のインビボ療法。様々な抗体により調製したミラツズマブ−ドキソルビシンまたはＳＮ−３８抱合体を用いた以前のインビボ研究は、これらの最大耐容用量よりはるかに低い用量で有効であったこと（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７−７１、Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：５２５７−６４、Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１、Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９、Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２２４−３４）を示し、したがってインビボ試験は、十分に耐容されたレベルでそれぞれの抱合体に類似しているが固定量を比較することに集中した。
【０３４４】
初期研究は、最初に、ドキソルビシン及びＳＮ−３８抱合体と２つのＳＮ−３８抱合体（示されず）とを比較する方法を決めるため、リンパ腫の播種Ｒａｊｉモデルにおいてドキソルビシン及びＳＮ−３８抱合体を検査した。全ての特異的抱合体は、生存期間中央値が、僅か２０日間であった非標的化ラベツズマブ−ＳＮ−３８抱合体または食塩水治療動物より有意に良好であった（Ｐ＜０．０００１）。ＲａｊｉにおいてＳＮ−３８抱合体より８倍の利益を示すインビトロ研究にもかかわらず、最高の生存期間は、ミラツズマブ−ドキソルビシン抱合体によって見られ、全ての動物には単回１７．５ｍｇ／ｋｇ（３５０μｇ）用量が与えられ、２．０ｍｇ／ｋｇ（４０μｇ）が与えられた１０匹の動物のうち７匹が、研究の完了時（１１２日目）に生存していた（例えば、１７．５ｍｇ／ｋｇ用量のミラツズマブ−ドキソルビシン対ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８、Ｐ＝０．００１２）。インビトロ研究が、両方の抱合体が内部移行したときに活性ＳＮ−３８を類似した速度で放出すると示唆していても、生存率は、より安定したＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８抱合体で有意に低かった（Ｐ＜０．０００１及びＰ＝０．０１９７、ＣＬ２Ａ対ＣＬ２Ｅでは、それぞれ１７．５及び２．０ｍｇ／ｋｇ用量）。
【０３４５】
ドキソルビシン及びＳＮ−３８の両方に最適のインビトロ応答を有したので、Ａ−３７５黒色腫細胞から開始して、５つの固形腫瘍細胞系を検査した。Ａ−３７５異種移植片は急速に増殖し、食塩水治療動物は、僅か１０．５日間の生存期間中央値を有した（示されず）。１２．５ｍｇ／ｋｇ（動物１匹あたり０．２５ｍｇ）の毎週２回の用量のミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、生存期間を２８日間に延ばし（Ｐ＝０．０００６）、これは、生存期間中央値の１７．５日間を有する対照エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体より有意に良好であり、（Ｐ＝０．００８９）、後者は、食塩治療動物と有意に異なっていなかった（Ｐ＝０．１９６７）。ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ抱合体は、ミラツズマブ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８抱合体より有意に長い生存期間を提供し（Ｐ＝０．００１４）、対照エプラツズマブ−ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８抱合体と同じ１４日間の生存期間中央値を有した。ＳＮ−３８抱合体より２倍高い用量のミラツズマブ−ドキソルビシンを与えたにもかかわらず、生存期間中央値は、食塩水治療動物より良好ではなかった（１０．５日間）。
【０３４６】
Ａ−３７５黒色腫モデルを用いると、Ｃａｐａｎ−１では、ＣＬ２Ａ連結ＳＮ３８抱合体のみが有効であり、生存期間中央値は３５日間であり、低用量（５ｍｇ／ｋｇ、動物１匹あたり１００μｇ）（Ｐ＜０．０２）であっても、未治療動物と有意に異なっていた（Ｐ＜０．０３６）（示されず）。ミラツズマブ−ＣＬ２Ｅも、非標的化エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体も、または２倍高い用量のミラツズマブ−ドキソルビシン抱合体も、生存利益をもたらさなかった（食塩水に対してｐ＝０．４４）。内部移行抗ＴＲＯＰ−２  ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抗体（ｈＲＳ７−ＳＮ−３８、ＩＭＭＵ−１３２）の同じ用量を与えた動物を用いた同じ研究において、生存期間中央値は、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と等しかったことが注目に値する（示されず）。ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、様々な固形腫瘍を治療するための、目的のＡＤＣとして以前に確認されている（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９）。Ｃａｐａｎ−１への表面結合ｈＲＳ７のＭＦＩは、ミラツズマブの２２と比較して（表１１を参照すること）、２３７であった（示されず）。このように、著しく低い表面抗原発現を有しているにもかかわらず、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８および抱合体は、このモデルにおいてｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体と同様に機能した。
【０３４７】
固形腫瘍異種移植片のうちの２つにおいて劣った治療結果を有するミラツズマブ−ドキソルビシン抱合体によって、ミラツズマブ−ＳＮ−３８抱合体を、多くの固形腫瘍の表面により高く発現しているＴＲＯＰ−２（ｈＲＳ７）またはＣＥＡＣＡＭ６（ｈＭＮ−１５）に対する他のヒト化抗体により調製されたＳＮ−３８抱合体と比較することに焦点を移した（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：２、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８−４６）。３つの追加的な異種移植片モデルを検査した。
【０３４８】
胃腫瘍モデル、ＮＣＩ−Ｎ８７において、１７．５ｍｇ／ｋｇ／用量（３５０μｇ）のミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、生存期間にいくらかの改善をもたらしたが、食塩水治療動物（３１日間対１４日間、Ｐ＝０．０７６０）または非結合ベルツズマブ抗−ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体（２１日間、Ｐ＝０．３１２８）（示されず）と比較して統計的有意性を満たすことができなかった。しかし、ｈＲＳ７−及びｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ抱合体は、生存期間中央値を、それぞれ６６日間及び６３日間に有意に改善した（Ｐ＝０．０００１）。表面発現ＴＲＯＰ−２及びＣＥＡＣＡＭ６のＭＦＩは、それぞれ７９５及び１１２３であり、ちょうど５であるＣＤ７４よりはるかに高かった（表１１を参照すること）。免疫組織学は、この細胞系の異種移植片におけるＣＤ７４の比較的強い細胞質発現を示したが、重要なことは、これが散乱していることであり、腫瘍内の画定されたポケットにおいてのみ現れている（示されず）。ＣＥＡＣＡＭ６及びＴＲＯＰ−２は、ＣＤ７４より均一に発現しており（示されず）、ＣＥＡＣＡＭ６は、細胞質及び膜の両方により多く存在し、ＴＲＯＰ−２は主に膜において見出された。このように、抗ＣＥＡＣＡＭ６及び抗ＴＲＯＰ−２抱合体により改善された生存期間は、ＮＣＩ−Ｎ８７における高い抗原密度及びより均一な発現の両方が反映されている可能性が最も高い。
【０３４９】
Ｈｅｐ−Ｇ２肝細胞腫細胞系において（示されず）、免疫組織学は、ＣＤ７４の中程度の細胞質染色を有する非常に均一な発現を示し、フローサイトメトリーは、比較的低い表面初面（ＭＦＩ＝９）を示した。ｈＭＮ−１５によるＭＦＩは、１７５であり、免疫組織学は、ＣＥＡＣＡＭ６のかなり均一な膜及び細胞質発現を示し、非常に強力な膜染色の単離ポケットを有した（示されず）。Ｈｅｐ−Ｇ２異種移植片を有する動物による研究は、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、生存期間を食塩水治療群の２１日間と比較して４５日間に延ばし（Ｐ＝０．００４８）、一方、ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、生存期間を３５日間に改善した。ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８よりミラツズマブを好む傾向があるが、統計的有意性は達成されなかった（４６日間対３５日間、Ｐ＝０．０８０２）。しかし、非結合ベルツズマブ抗−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、ミラツズマブ抱合体と類似した生存利益をもたらした。本発明者たちは、非結合抱合体による治療結果が、特に高いタンパク質用量で特異的ＣＬ２Ａ連結抱合体と類似しうることを以前に観察したが、特異的及び対照抱合体の滴定は、通常、選択性を明かにした。このように、特異的抱合体のいずれも、この細胞系においてこれらの用量で選択的治療利益を提供しなかった。
【０３５０】
Ｈｅｐ−Ｇ２と類似した表面発現を有するが、細胞質レベルが僅かに低いＨｕＨ−７肝細胞腫細胞系（表１１を参照すること）を使用した別の研究は（示されず）、ｈＭＮ−１５−ＳＮ−３８抱合体が、有意に異なってはいないが、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ抱合体より長い生存利益（３５日間対１８日間）をもたらすことを見出した（Ｐ＝０．２９４４）。ｈＭＮ−１５及びミラツズマブ抱合体が、両方とも食塩水治療動物より有意に良好であったが（それぞれ、Ｐ＝０．００８及び０．００９）、ここでも、いずれの抱合体も非標的化ベルツズマブ−ＳＮ−３８抱合体とこの用量レベルで有意に異なっていなかった（それぞれ、Ｐ＝０．４６０２及び０．９０３３）。ＣＥＡＣＡＭ６表面発現は、この細胞系において比較的低く（ＭＦＩ＝８１）、免疫組織学は、ＣＤ７４（示されず）及びＣＥＡＣＡＭ６（示されず）は、両方とも極めてかすかであり、非常に散乱していた。
【０３５１】
考察
腫瘍選択的化学療法における抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）手法は、現在相当な興味が持たれている分野である（例えば、Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２：８７３−９０、Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０：１１３１−４９）。近年の臨床的な成功（Ｐｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２：１４１５−２１、ＬｏＲｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：４３７−４７）は、主に、以前から使用されてきた従来の化学療法剤の代わりに超毒性薬物を採用することによって発生している。しかし、標的選択、抗体及び薬物リンカーは、ＡＤＣの最適な性能に影響を及ぼす全ての要因である。例えば、トラスツズマブ−ＤＭ１の場合では、ＨＥＲ２は、この抗原を発現する腫瘍において豊富にあり、抗体が内部移行し、抗体それ自体は、抗腫瘍活性を有し、これらの全てが組み合わされて治療結果を向上させることができる。極めて対照的に、ＣＤ７４は細胞の表面にかなり低いレベルで発現するが、その特有の内部移行及び表面再発現特性は、ミラツズマブ抗ＣＤ７４  ＡＤＣを、ドキソルビシンなどの中程度の毒性薬物を伴っていても、造血器癌異種移植片モデルにおいて有効にしている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：６５６７−７１、Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：５２５７−６４）。ドキソルビシンのほうが造血器癌に頻繁に使用され、ＳＮ−３８及び他のカンプトテシンが、固形腫瘍を有する患者に投与されるので、本発明者たちは、固形腫瘍におけるドキソルビシンの有用性及びミラツズマブのＳＮ−３８抱合体の有用性を評価することに決めた。ミラツズマブ−ドキソルビシンは、様々な血液癌の異種移植変モデルに有効であり、その臨床試験をもたらし（ＮＣＴ０１１０１５９４及びＮＣＴ０１５８５６８８）、いくつかのＳＮ−３８抱合体は、固形及び血液腫瘍モデルに有効であり、結腸直症及び多様な上皮癌の第Ｉ相臨床試験において探究された２つの新たなＳＮ−３８抱合体をもたらした（ＮＣＴ０１２７０６９８及びＮＣＴ０１６３１５５２）。
【０３５２】
インビトロにおいて、非抱合ドキソルビシン及びＳＮ−３８は、Ｒａｊｉリンパ腫細胞系に対するドキソルビシンと類似した効力を有したが、ＳＮ−３８は、多数の異なる固形腫瘍細胞系に対してより大きい効力があった。興味深いことに、インビボにおいて、ミラツズマブ−ドキソルビシン抱合体は、ミラツズマブ−ＳＮ−３８抱合体と比較し、Ｒａｊｉにおいて最高の応答をもたらした。しかし、Ｃａｐａｎ−１及びＡ−３７５では、ミラツズマブ−ドキソルビシンは、インビトロ試験が、Ａ３７５が遊離ＳＮ−３８と等しい感受性をドキソルビシンに対して持つことを示したが、遊離ＣＬ２Ａ連結ＳＮ−３８ミラツズマブ抱合体より有効性が低かった。２つの他の細胞系のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌及びＬＳ１７４Ｔ結腸癌も、インビトロにおいて、ＳＮ−３８に類似した効力を遊離ドキソルビシンに有したが、インビトロ試験は、ＳＮ−３８が固形及び血液癌に等しく有効であることを示し、かつ大部分の固形腫瘍細胞系においてドキソルビシンより５〜２０倍高い効力を有するＳＮ−３８が評価されたので、本発明者たちは、固形腫瘍療法のために２つのミラツズマブ−ＳＮ−３８抱合体に集中することを決定した。しかし、ミラツズマブ−ＳＮ−３８抱合体の有用性をより良好に測定するため、本発明者たちは、様々な固形腫瘍に存在する他の抗原に対する抗体により調製したＳＮ−３８  ＡＤＣの比較評価を含めた。
【０３５３】
本発明者たちは、以前にＣａｐａｎ−１細胞系における内部移行ｈＲＳ７抗ＴＲＯＰ−２−ＣＬ２Ａ連結ＳＮ−３８抱合体の治療応答を調査しており（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９）、したがって、ミラツズマブ及びｈＲＳ７  ＳＮ−３８抱合体の有効性を比較した。この研究において、両方の抱合体は、対照抗体と比較して生存期間を有意に改善し、ＣＬ２Ａ連結ＳＮ３８抱合体は、それぞれ、ＣＬ２Ｅ連結抱合体より優れていた。フローサイトメトリーは、Ｃａｐａｎ−１においてＴＲＯＰ−２発現がＣＤ７４より高いことを示しているので、この結果は、例外的であることが知られているＣＤ７４の輸送能力が、ＴＲＯＰ−２より効率的であることを示唆した。しかし、抗原利用性（すなわち、膜対細胞質の生理学的及び「結合部位」障壁）、ならびに腫瘍内の細胞における分布が、標的化治療のあらゆる形態に、特に、個別の細胞への生成物の適切な細胞内送達に依存している形態に影響を及ぼす重要な要素であることが良く知られている（Ｔｈｕｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ  ６０：１４２１−３４）。腫瘍内の細胞に均一に発現していない状況では、ＣＬ２Ａ連結抱合体など、腫瘍内に局在化した後に、負荷量をゆっくりと放出する標的化作用物質を有するものは、非標的化バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）細胞に薬物を拡散して、その有効範囲を増大させることができる。事実、高い抗原発現は、結合部位障壁効果によって腫瘍浸潤を潜在的に妨害することができるが、細胞外放出機構は、薬物の腫瘍内への拡散をもたらすことができる。この機構は、また、本発明者たちが、本明細書に使用されている抗ＣＥＡＣＡＭ５及び抗ＣＥＡＣＡＭ６など、不十分に内部移行する抗体を使用して検査した他の抱合体の有効性を支援すると考えられる。ミラツズマブに基づいた抱合体は、細胞表面の低い存在量を補うことができるＣＤ７４の急速な内部移行及び再発現の利益を利用して、抗体と腫瘍細胞との直的な相互作用により大きく依存している。しかし、この利益は、ＣＤ７４が腫瘍内に高度に散乱したときは軽減され、腫瘍内に抱合体を保持する機構を有さないと、抱合体からの薬物の緩徐放出の利益は失われる。本発明者たちのヒト胃腸腫瘍の以前の総説は、これらが、多くの場合、良好な均一性を伴って高レベルの発現を有することを示唆している（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ４：１−１２）。
【０３５４】
ＳＮ−３８に適したリンカーについての初期評価では、ＣＬ２Ａリンカーに類似してＳＮ−３８の２０ヒドロキシル位置に結合するように設計された「ＣＬ２Ｅ」様リンカーを含む、多数の異なる誘導体が検査された。しかし、抗体抱合体は、十分な抗腫瘍活性を欠き、続行されなかった。ミラツズマの例外的な内部移行特性を考慮して、本発明者たちは、ＣＤ７４抱合体の急速な内部移行がより安定した抱合体の薬物負荷を向上させるという仮説と共に、ＳＮ−３８リンカー化学を再考することに決めた。本発明者たちは、脱離基がフェノール性である場合、環化を促進することができると推測し、したがって、ＣＬ２Ｅリンカーを、ＳＮ３８のフェノール１０位に結合するように設計した。
【０３５５】
初めは、ＣＬ２Ｅ連結ＳＮ−３８抱合体は、有望であり、Ｒａｊｉ細胞腫においてＣＬ２Ａ抱合体と類似したＩＣ５０を有し、急速に内部移行する場合には、両方の抱合体がＳＮ−３８の活性形態をほぼ同じ速度で放出するという見方と一致していた。しかし、既に記述されているように、ＣＬ２Ａ抱合体のインビトロ活性は、主に、培地へのＳＮ−３８の放出によって影響を受け、無傷の抱合体により取り込みを反映しているとは限らない。ＣＬ２Ｅ連結抱合体が、固形腫瘍細胞系においてＣＬ２Ａ抱合体より効力がかなり少ないことが見出されたとき、このことは、ＣＤ７４の低い表面発現が、ミラツズマブ結合を介したＳＮ−３８の内部移行に影響を与えたことを示唆した。しかし、Ｒａｊｉにおけるインビボ研究が、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８がＣＬ２Ｅ抱合体より優れていることを示したとき、ＣＬ２Ｅの有効性に影響を与えるいくつかの他の要因を考慮する必要があった。１つの可能性のある説明は、ＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８のリンカー設計が、薬物の２０位を非誘導体化のままにし、ラクトン基を開環に対して敏感にすることである。事実、イリノテカンを用いた研究は、ＳＮ−３８の効力が多数の要因によって減少することを示しており、カルボキシレート形態へのラクトン開環は、無傷のラクトン形態の効力のわずか１０％を有する。対照的に、ＣＬ２Ａ連結ＳＮ−３８は、２０ヒドロキシル位置で誘導体化され、これは、生理学的条件下におけるカンプトテシンのラクトン基を安定化する過程である。したがって、ＳＮ−３８のラクトン環は、ＣＬ２Ａによる切断から保護される可能性があるが、ＣＬ２Ｅ抱合体からは保護されない。このように、ラクトン環の不安定化は、インビボにおけるＣＬ２Ｅの有効性の減少の原因でありうる。インビトロ安定性研究及び血清安定性の分析が酸性条件下で実施されるので、本発明者たちは、これらの抱合体のいずれかのＳＮ−３８のカルボキシレート形態を直接測定していない。
【０３５６】
まとめると、インビトロ及びインビボの結果は、ミラツズマブ−ドキソルビシン抱合体が、Ｒａｊｉリンパ腫細胞系においてＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体より優れていることを示し、これは、ＣＬ２Ａと比較して、ドキソルビシン抱合体の改善された安定性を反映している場合がある。しかし、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体が高度に安定したＣＬ２Ｅ−ＳＮ−３８抱合体より有効であったという知見は、薬物の活性化または細胞系の感受性に関する可能性がある他の問題が現れうることを示唆している。
【０３５７】
ＣＤ７４は、細胞生物学において複数の役割を有し、抗原提示細胞では、抗原ペプチドの処理により優位的な役割を有することがあり、固形腫瘍の場合では、その役割は、より生存に関連しうる。これらの異なる役割は、細胞内輸送及びプロセッシングに影響を与える可能性がある。あるいは、ＣＬ２Ｅ連結ＳＮ−３８の低い有効性は、ＳＮ−３８におけるラクトン開環による薬物不活性化を反映している可能性があり、特異的リンカーの重要性を暗示している。最後に、固形腫瘍モデルでは、抗原利用性は、より多く利用可能であり（表面に発現しており）、豊富であった他の内部移行（ｈＲＳ７）または不十分に内部移行する抗体（ｈＭＮ１５）により調製された他の抱合体に対して測定されたとき、ミラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の効力を確定するのに優位な役割を有すると思われる。本発明者たちは、この知見が標的化療法において普遍的であることに疑念があるが、これらの研究は、ＣＤ７４標的化作用物質の特有の内部移行特性が、標的抗原の表面発現が最小であるとしても、有意な有効性を提供できることを少なくとも示している。
【０３５８】
実施例１５．治療耐性転移性結腸癌（ｍＣＲＣ）の治療におけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用
患者は、２０１２年の１月に転移性疾患のために最初に来院した、ｍＣＲＣを有する６２歳の女性であった。彼女は、診断の数週間後に、最初の療法として腹腔鏡下回腸横行結腸切除術を受け、次に、肝臓右葉の転移病変の除去のため、２０１２年３月の右側肝切除術の前に、術前補助設定において４サイクルのＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン）化学療法を受けた。この後に補助ＦＯＬＦＯＸレジメンが続き、２０１２年の６月に再開され、合計１２サイクルのＦＯＬＦＯＸであった。８月には、オキサリプラチンが、神経毒性の悪化のためにレジメンから外された。５−ＦＵの最終サイクルは、２０１２年９月２５日であった。
【０３５９】
２０１３年１月に行ったＣＴは、肝臓への転移を示した。彼女は、ＩＭＭＵ−１３２（ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）調査研究に登録する良い候補として評価された。病歴における共存症には、喘息、真性糖尿病、高血圧症、高コレステロール血症、心雑音、裂孔ヘルニア、甲状腺機能低下症、手根管症候群（ｃａｒｐｅｌ  ｔｕｎｎｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、緑内障、抑うつ症、下肢静止不能症候群及び神経障害が含まれる。手術歴には、卵管結紮（１９７５）、甲状腺摘除術（１９８３）、胆嚢摘出（２００１）、手根管遊離（ｃａｒｐｅｌ  ｔｕｎｎｅｌ  ｒｅｌｅａｓｅ）（２００８）及び緑内障手術が含まれる。
【０３６０】
この試験の参加時には、標的病変は、肝臓の左葉における３．１ｃｍの腫瘍であった。非標的病巣には、肝臓におけるいくつかの低減弱腫瘤が含まれた。ベースラインＣＥＡは、７８１ｎｇ／ｍであった。
【０３６１】
患者がインフォームドコンセントに署名した後、ＩＭＭＵ−１３２が、毎週１回、２週間連続の注入スケジュールで与えられ、次に１週間休止され、このようにして治療サイクルが構成された。このサイクルは、耐容される限り繰り返された。ＩＭＭＵ−１３２（８ｍｇ／ｋｇ）の最初の注入は、２０１３年２月１５日から開始され、特に注目される事象を有することなく完了した。彼女は、第１サイクルの際に悪心（グレード２）及び疲労（グレード２）を経験し、大きな有害事象がなかったので治療は継続された。２０１３年３月には脱毛症及び便秘が報告された。２０１３年４月８日（６用量後）に行った第１回の応答評価は、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）により標的病変の２９％の縮小を示した。ＣＥＡレベルは、２０１３年３月２５日には２３０ｎｇ／ｍｌに減少した。２０１３年５月２３日の第２回の応答評価（１０用量後）では、標的病変は、３９％縮小しており、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分的応答を構成した。２０１３年６月１４日現在では、治療が継続されており、８ｍｇ／ｋｇのｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の１２用量を構成する６サイクルを受けている。全体的な健常及び臨床症状は、この調査的治療を開始してから顕著に改善された。
【０３６２】
実施例１６．治療耐性転移性乳癌の治療におけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用
患者は、２００５年に最初に診断されたステージＩＶの三種陰性乳癌（ＥＲ／ＰＲ陰性、ＨＥＲ−ｎｅｕ陰性）を有する５７歳の女性であった。彼女は、２００５年に左乳房の乳腺腫瘍摘出術を受け、続いて２００５年９月に補助設定の投与集中ＡＣＴを受けた。次に放射線療法を受け、１１月に完了した。患者が２０１２年の初めに反対側（右側）の乳房にしこりを触知したときに、疾患の局所再発が確認され、次にＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル）化学療法により治療された。同年に疾患が再発し、転移性病変は、胸壁の皮膚の中であった。次にカルボプラチン＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）化学療法レジメンを受け、その際に血小板減少症が生じた。疾患は進行し、毎週のドキソルビシンを開始し、６用量まで続けられた。皮膚疾患も進行した。２０１２年９月２６日のＦＤＧ−ＰＥＴスキャンは、胸壁の疾患及び拡大固形腋窩リンパ節への進行を示した。患者には、疼痛管理のためにオキシコドンを与えた。
【０３６３】
胸壁病変が開き、出血したときに、彼女には、２０１２年１０月から２０１３年２月まで（２週間毎で４週間にわたって）Ｉｘｅｍｐｒａ（商標）が与えられた。次にＸｅｌｏｄａ（登録商標）が処方され、これは手及び足における神経障害、ならびに便秘のため、十分に耐容されなかった。皮膚病変は進行性であったので、彼女は、インフォームドコンセントを提出した後、ＩＭＭＵ−１３２試験に登録した。患者は、甲状腺機能亢進症及び視覚障害の病歴とＣＮＳ疾患の高い危険性も有した（しかし、脳ＭＲＩは、ＣＮＳ疾患には陰性であった）。試験の登録時に、右乳房の皮膚病変は、最大直径が４．４ｃｍ及び２．０ｃｍであると測定された。右乳房に別の非標的病変があり、右左の腋窩にそれぞれ１つの拡大リンパ節があった。
【０３６４】
第１回のＩＭＭＵ−１３２注入（１２ｍｇ／ｋｇ）は、２０１３年３月１２日に開始され、十分に耐容された。第２回の注入は、１週間後の注入スケジュールの当日に、グレード３の好中球絶対数（ＡＮＣ）の低減（０．９）のために遅延された。１週間の遅延の後及びＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）を受けた後、第２回のＩＭＭＵ−１３２が投与され、用量は２５％低減されて９ｍｇ／ｋｇであった。その後、ＩＭＭＵ−１３２を、毎週１回で２週間、次に１週間休止するプロトコールに従ってスケジュール通りに受けた。３回の治療サイクルの後に２０１３年５月１７日の第１回の応答評価は、標的病変の長いほうの直径の合計に４３％の減少を示し、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分的応答を構成した。９ｍｇ／ｋｇの用量レベルで治療が継続されている。全体的な健常及び臨床症状は、ＩＭＭＵ−１３２による治療を開始してから顕著に改善された。
【０３６５】
実施例１７．難治性で転移性の非小細胞肺癌の治療におけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用
非小細胞肺癌が診断された６０歳の男性である。この患者には、６か月間のカルボプラチンとベバシズマブの化学療法レジメンが与えられ、応答を示し、次に進行後には、２年間にわたるカルボプラチン、エトポシド、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、ゲムシタビンの化学療法の更なる過程を受け、不定期の応答が２か月以下にわたって続いた。次に患者は、６．５×４ｃｍの寸法の左側縦隔腫瘤及び胸水を表す。
【０３６６】
インフォームドコンセントに署名した後、患者にはＩＭＭＵ−１３２が１８ｍｇ／ｋｇの用量で隔週に与えられる。最初の２回の注入の際に、短時間の好中球減少症及び下痢を経験し、４時間以内に４回の便通であったが、これらは対処投薬により２日以内に回復または応答している。６回のＩＭＭＵ−１３２の注入の後、指標病変のＣＴ評価は、２２％の低減を示し、部分応答を僅かに下回るが、明確な腫瘍縮小である。患者は、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分応答を構成する指標病巣の直径の合計の４５％腫瘍縮小という部分応答がＣＴにより示されると、この療法を更に２か月間継続する。
【０３６７】
実施例１８．難治性で転移性の小細胞肺癌の治療におけるｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の使用
左肺、縦隔リンパ節、及び左頭頂脳葉への転移のＭＲＩの証拠を伴う小細胞肺癌が診断された６５歳の女性である。以前の化学療法には、カルボプラチン、エトポシド及びトポテカンが含まれるが、応答は認められていない。放射線療法も疾患の制御に失敗している。そこで彼女には、ＩＭＭＵ−１３２を１８ｍｇ／ｋｇの用量で３週間に１回、合計５回の注入により与えられる。第２回の用量の後、高血圧及びグレード２の好中球減少症を経験し、次の注入の前に改善している。５番目の注入の後、ＣＴ研究は、標的左肺腫瘤の１３％の縮小を示している。脳のＭＲＩも、この転移の１０％の低減を示している。ＩＭＭＵ−１３２投与を３週間毎に更に３か月間続け、状態の客観的及び主観的な改善を示し続けており、左肺腫瘤の２５％の低減及び脳転移の２１％の低減である。
【０３６８】
実施例１９．ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）によるステージＩＶの転移性疾患の胃癌患者の治療
この患者は、喫煙歴があり、４０年を超える過剰アルコール摂取期間がある６０歳の男性である。彼は、体重減、摂食不快感、制酸薬により緩和されない疼痛、頻繁な胃痛、腰痛、及び最近、両方の腋窩に触知節を経験している。医師の助言を求めており、検査後に、胃内視鏡による生検基づいて、食道胃接合部に、いくらかのの扁平上皮の特徴を含む腺癌を有することが示されている。放射線研究（ＣＴ及びＦＤＧ−ＰＥＴ）も、左右の腋窩、縦隔領域、腰椎及び肝臓に転移性疾患を明らかにしている（２つの腫瘍が右葉にあり、１つの腫瘍が左葉にあり、すべて直径が２〜４ｃｍの寸法である）。胃癌は切除され、次にエピルビシン、シスプラチン及び５−フルオロウラシルの化学療法の過程を受けている。４か月間及び休止期間の６週間の後に、ドセタキセル化学療法に替えられ、これも、転移性腫瘍のＣＴ測定及びいくらかの悪化により確認された進行に基づくと、疾患の制御に失敗している。
【０３６９】
次に患者には、合計で６用量が隔週毎に注入される１０ｍｇ／ｋｇの用量のＩＭＭＵ−１３２（ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）による療法を与え、その後、ＣＴ研究を行って、この疾患の状態を評価する。これらの注入は、十分に耐容されており、いくらかの軽度の悪心及び下痢があり、対処投薬によって制御されている。ＣＴ研究は、この指標転移性病変の合計が２８％減少したことを明らかにし、したがって、彼はこの療法を更に５回続けている。追跡ＣＴ研究は、疾患がＩＭＭＵ−１３２療法の前、ベースライン測定からＲＥＣＩＳＴ基準により約３５％低減したままであることを示し、一般的な状態も改善したと思われ、疾患が管理下にあるという自信を取り戻し、楽観的になっている。
【０３７０】
実施例２０．ＩＭＭＵ−１３０（ラベツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）のみを使用した以前の化学免疫療法に難治性の進行型結腸癌の療法
患者は、２００８年に最初に診断され、原発性及び転移性結腸癌について結腸切除術及び部分肝切除術をそれぞれ受けた、ステージＩＶ転移性結腸癌を有する５０歳の男性であった。図８に示されているように、彼は化学療法をほぼ２年間にわたって受け、化学療法には、イリノテカン、オキサリプラチン、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン）及びベバシズマブ、ならびに５−フルオロウラシル／ロイコボリンと組み合わせたベバシズマブが含まれた。その後、セツキシマブを単独で、またはＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、５−フルオロウラシル、イリノテカン）化学療法と組み合わせて、次の１年以上にわたって与えられた。２００９年には、化学免疫療法下で肝臓転移に高周波アブレーション療法を受け、２０１０年の後期には、肺転移の楔状切除術を受け、数か月後の２０１１年の初期に再度受けた。２０１１年の化学免疫療法にもかかわらず、新たな肺転移が２０１１年の末期に現れ、２０１２年には肺及び肝臓転移は両方とも視覚化した。ＩＭＭＵ−１３０の抗体薬物療法を受ける直前のベースライン血漿癌胎児性抗原（ＣＥＡ）力価は、１２．５ｎｇ／ｍＬであった。コンピュータ断層撮影法により腫瘍サイズの変化を測定するため放射線科医により選択された指標病変は、右肺の中葉及び肝臓転移であり、両方とも、ＩＭＭＵ−１３０（抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）療法の前に、ベースラインの最長直径の合計が９１ｍｍであった。
【０３７１】
この患者は、１６ｍｇ／ｋｇの用量のＩＭＭＵ−１３０を緩徐ＩＶ注入により隔週に合計１７治療用量で受けた。患者は、この療法を十分に耐容し、最初の治療の後に、僅かにグレード１の悪心、下痢及び疲労を有し、これらの副作用のために投薬を受けたので、第４及び５の治療後に生じたが、その後はなかった。第３の治療の後、脱毛症（グレード２）を示し、これは、続く療法の際にも存在した。悪心、下痢及び時々の嘔吐は、僅か２〜３日間続き、最初の注入後の広は、２週間続いた。そうでなければ、患者は療法を良好に耐容した。このＳＮ−３８と抱合させたヒト化（ＣＤＲグラフト化）抗体を長期間にわたって受けたので、血液を抗ラベツズマブ抗体で測定し、１６用量後であっても、何も検出されなかった。
【０３７２】
最初のコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）測定を、４回の治療後に行い、指標病変において、この療法の前のベースラインで行った測定の合計から２８．６％の変化を示した。８回の治療の後、この低減は４０．６％になり、したがって、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分寛解を構成した。この応答は更に２か月間にわたって維持され、ＣＴ測定は、指標病変がベースライン測定より３１．９％少ないが、以前に測定された減少の４０．６％よりいくらか高いことを示した。このように、肺及び肝臓の指標病変における注意深いＣＴ測定に基づいて、イリノテカン（ＳＮ−３８の親分子）を含む以前の化学療法及び免疫療法が失敗したこの患者は、抗ＣＥＡＣＡＭ５ヒト化抗体ラベツズマブ（ｈＭＮ−１４）を介して標的化されたとき、イリノテカンの活性代謝産物（または、カンプトテシン）であるＳＮ−３８への客観的応答を示した。イリノテカン（ＣＰＴ−１１）がＳＮ−３８をインビボで放出するように作用するが、ＳＮ−３８抱合抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体は、患者が最後のイリノテカン含有療法への初期応答に失敗した後に、部分的応答を誘導することによって、結腸直症癌患者に有効であることを実証した。患者の血漿ＣＥＡ力価の低減も、ＣＴ知見を裏付けており、第３回治療用量の後で１２．６ｎｇ／ｍＬ〜２．１ｎｇ／ｍＬのベイルラインレベルにあり、８用量から１２用量では１．７〜３．６ｎｇ／ｍＬであった。ＣＥＡの正常な血漿力価は、通常、２．５〜５．０ｎｇ／ｍＬであると考慮されるので、この療法は血中のＣＥＡ力価の正常化に効果があった。
【０３７３】
実施例２１．ＩＩＭＭＵ−１３０による進行型結腸癌を有する患者の療法
患者は、最初に転移性結腸癌（ステージＩＶ）が診断された７５歳の女性である。彼女は、部分的な右半結腸切除及び小腸切除を有し、後膣円蓋や網までの疾患の拡散、骨盤における腹水、及び右側胸腔への胸水を有する疾患の進行を示したとき、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ＋ベバシズマブ、ＦＯＬＦＩＲＩ＋ラムシルマブ及びＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブの療法を１年半にわたって受けている。この療法の直前のベースラインＣＥＡ力価は、１５ｎｇ／ｍＬである。６ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ−１３０（抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）を毎週２回で２週間連続して与えられ、次に１週間休止し（３週間サイクル）、２０用量を超えて与えられ、あらゆる大きな血液毒性または非血液毒性を有することなく非常に良好に耐性されている。療法の２か月以内に、血清ＣＥＡ力価は、１．３ｎｇ／ｍＬに穏やかに縮小したが、８週間の評価では、指標腫瘍病変に２１％の縮小を示し、１３週目には２７％の縮小に増加している。驚くべきことに、患者の腹水及び胸水は、この時点で両方とも減少し（後者は消滅している）、このように、患者の全体的な状態は顕著に改善されている。患者は、治験療法を続けている。
【０３７４】
実施例２２．ＩＭＭＵ−１３０により治療されるステージＩＶ転移性疾患を有する胃癌患者
患者は、６年間にわたる摂食関連の胃の不快感及び疼痛、ならびに過去１２か月間の体重減のため、医師の助言を求めてきた５２歳の男性である。腹部の触診は、硬いしこりを明らかにし、次に胃内視鏡によって、胃の下部に潰瘍性の塊を明らかにしている。これは生検され、胃腺癌と診断される。臨床検査は、肝機能検査を除いて特に異常な変化を明らかにせず、ＬＤＨ及びＣＥＡが上昇しており、後者は１０．２ｎｇ／ｍＬである。次に患者は、全身ＰＥＴスキャンを受け、これは、胃腫瘍に加えて、左腋窩及び肝臓の右葉への転移性疾患（２つの小さな転移）を明らかにしている胃腫瘍を切除し、転移性腫瘍のベースラインＣＴ測定を受ける。外科手術の４週間後、シスプラチン及び５−フルオロウラシル（ＣＦ）のレジメンから構成される併用化学療法の３過程を受けるが、これには良好に耐容しないので、ドセタキセルに替えた。ＣＴスキャンによると、疾患は約４か月間にわたって安定していると思われるが、患者は、更なる体重減、腹痛、食欲不振及び極度の疲労を訴え、ＣＴ研究を繰り返して、合計して２０％の転移のサイズの増加及び最初の胃切除の部位に疑わしい病変を示す。
【０３７５】
次に患者には、ＩＭＭＵ−１３０（抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）による８ｍｇ／ｋｇの毎週スケジュールでの実験的治療が与えられる。これには良好に耐容するが、３週間後には、グレード２の好中球減少症及びグレード１の下痢を示す。４回目の注入は１週間延期され、次に毎週の注入が再構成され、次に４回の注入では下痢または好中球減少症の証拠はない。次に患者は、転移性腫瘍のサイズを測定するため及び最初の胃切除域を観察するために、ＣＴ研究を受ける。放射線科医は、ＲＥＣＩＳＴ基準に従って、ＩＭＭＵ−１３０療法の前のベースラインと比較した転移性病変の合計の減少を、２３％と測定する。最初の胃切除の区域に明確な病変はないと思われる。患者のＣＥＡ力価は、この時点で７．２ｎｇ／ｍＬであり、前ＩＭＭＵ−１３０のベースライン値の１４．５ｎｇ／ｍＬよりかなり低減されている。患者は、毎週のＩＭＭＵ−１３０療法を同じ用量の８．０ｍｇ／ｋｇで続け、合計で１３回の注入の後、ＣＴ研究は、１つの肝臓転移が消滅し、全ての転移性病変の合計が４１％減少して、ＲＥＣＩＳＴの部分応答を構成していることを示している。患者の一般的な状態は改善され、維持療法の８ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ−１３０を３週間毎に更に４回の注入を受けながら、通常の活動を再開している。血中ＣＥＡの最後の測定では、値は４．８ｎｇ／ｍＬであり、これは喫煙者の正常範囲内であり、この患者も喫煙者である。
【０３７６】
実施例２３．ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８による再発性の転移性三種陰性乳癌患者の療法
以前にベバシズマブ＋パクリタキセルで治療され、応答のなかった転移性三種陰性乳癌を有する５８歳の女性は、いくつかの肋骨や腰椎への転移、左肺に直径３ｃｍの孤立性病変、著しい骨痛及び疲労示す。ＩｇＧ１つあたり６分子のＳＮ−３８が抱合された抗ＣＥＡＣＡＭ６ヒト化モノクローナル抗体のｈＭＮ−１５  ＩｇＧによる実験的治療が与えられる。３週間毎に１２ｍｇ／ｋｇの注入が与えられ、治療の過程で４用量繰り返される。一過性のグレード２の好中球減少症及び初期の下痢を除いて、彼女は、療法を良好に耐容し、２か月間の休止の後に更なる過程が繰り返される。放射線検査は、指標病変の直径の合計が３９％減少しているので、ＲＥＣＩＳＴ基準の部分応答を有することを示す。骨痛を含む一般的な状態は改善され、疾病前とほぼ同じレベルの活動に戻っている。
【０３７７】
実施例２４．ｈＭＮ−１５−ＳＮ−３８による再発性の一般的に難治性の転移性結腸癌の療法
４６歳の女性は、ステージＩＶの転移性結腸癌を有し、肝臓の両方の葉に同時肝臓転移も有した原発性病変の切除、ならびに右葉へ拡散した単一病巣の以前の病歴を有し、これらの転移は、ＣＴにより測定して２〜５ｃｍの直径であった。５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、セツキシマブ及びベバシズマブを含む様々な化学療法過程を、３年間にわたって受けている。２つの場合では、疾患の安定化または短時間の応答の証拠があるが、測定された病変に３０％を超える低減はない。ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８療法の前のベースラインでの血漿ＣＥＡ力価は、４６ｎｇ／ｍＬであり、合計指標病変測定は、合計で９２ｍｍである。
【０３７８】
ｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８による療法は、２１日サイクルの範囲内で毎週１２ｍｇ／ｋｇを２週間、その後の１週間の休止期間から構成される。このサイクルを３回繰り返し、一過性の好中球減少症及び胃腸の副作用（悪心、嘔吐、下痢）のみであった。驚くべきことに、ＦＯＬＦＩＲＩ療法（イリノテカンまたはＣＰＴ−１１）への応答に失敗しているにもかかわらず、患者は、療法の完了後にＲＥＣＩＳＴ基準の部分応答を示している。１６ｍｇ／ｋｇの用量で毎月１回を次の６か月間による、この療法の維持スケジュール下に置かれる。追跡スキャンは、彼女の疾患が部分応答（ＰＲ）として制御下にあること及び患者が一般に９０％のカルノフスキーパフォーマンスステータス（Ｋａａａｒｎｏｆｓｋｙ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｔａｔｕｓ）を有する良好な状態であることを示している。
【０３７９】
実施例２５．抗ＣＳＡｐ−ＳＮ−３８抱合体により治療されるステージＩＶ転移性疾患を有する結腸癌患者
この患者は、９ｃｍのＳ状結腸腺癌を切除し、続いてＦＯＬＩＦＩＲＩ及びセツキシマブの化学免疫療法を６か月間にわたって受け、次に、ＦＯＬＦＯＸ、続いてベバシズマブを更に約９か月間にわたって受けた後、肝臓の左葉及び両方の肺への結腸癌転移を示している。最初の切除及び次の治療を開始した１０か月後、安定して提示されていると思われた疾患は、病変の増殖及び左副腎腺に現れた新たな転移による進行を示す。血漿ＣＥＡは、この時点で５２ｎｇ／ｍＬであり、一般的な状態は悪化していると思われ、腹痛、疲労及び境界型貧血を有し、内出血の可能性を示唆している。
【０３８０】
現在、毎週１２ｍｇ／ｋｇの用量のｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ）抗体のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体を２週間、１週間の休止の治療サイクルにより与えられ、次に更なる治療サイクルが繰り返され、毎週血球数が測定され、胃腸反応のためにアトロピン投薬を受けている。グレード２の脱毛症が最初の治療サイクルの後に注目されたが、わずかにグレード１の好中球減少症である。３回の治療サイクルの後、血漿ＣＥＡ力価は、１９ｎｇ／ｍＬに低減し、この時点でＣＴ測定は、肝臓及び肺における指標病変が２４．１％減少したことを示す。更に３回の治療経過の後、指標病変の３１．４％のＣＴ低減及び副腎腫瘤サイズの約４０％の減少を示している。この患者は、抗ＣＳＡｐ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抗体−薬物療法に応答していると考慮され、この療法が継続されている。一般的な状態は改善されていると思われ、疲労が少なく、腹痛または腹部不快感がなく、一般的により精力的になっている。
【０３８１】
実施例２６．抗ＣＥＡＣＡＭ６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫抱合体による乳癌の治療
この患者は、過去３年間にわたるいくつかの異なる療法の後に再発している三種陰性（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、またはＨｅｒ２／ｎｅｕを発現しない）転移性乳癌を有する。彼女は、いくつかの小さい腫瘍を両方の肺に、同様に、Ｃ４、Ｃ５、Ｔ２及びＴ３の椎骨、ならびに両側のいくつかの肋骨に転移を示している。溶骨性病変は標準的な療法下にあり、ここで、１６ｍｇ／ｋｇの用量のｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の毎週１回で３週間、１週間の休止による治療を開始し、次に更に２回の３週間サイクルの療法を再開する。療法の２週間後、ＣＴスキャンを実施して、応答を評価し、小さな肺転移のうちの２つが消滅した、一方、大きな病変の１つが約４０％減少したことが示されている。椎骨への転移は依然として存在しているが、Ｃ４及びＣ５病変は、約２５％小さくなっていると思われる。肋骨の転移では、６つの小さい病変のうち２つのサイズが非常に減少していると思われ、生存しているか、または瘢痕もしくは壊死の小さな部域か確実ではない。患者の腫瘍マーカー、ならびにＬＤＨ力価は、安定または低減したレベルを示していると思われ、疾患進行が停止したことを示しており、疾患低減のいくつかの証拠も存在する。主観的には、患者はかなり気分が良く、疲労及び骨痛が少なく、呼吸が改善している。それぞれの療法の後で、いくつかの極小さな悪心及び嘔吐を経験し、１週間以内に回復した。他の副作用は、一過性の血小板減少症のみであり、これも７日以内に回復した。観察下にあり、２か月以内に治療サイクルが再開される。
【０３８２】
実施例２７．抗ＣＥＡＣＡＭ５及び抗ＣＥＡＣＡＭ６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫抱合体による転移性結腸癌の治療
この患者は、肝臓に疾患のＣＴによる証拠（右葉に５ｃｍの病変及び左葉に３ｃｍの病変）、ならびに右肺に２つの転移（２〜３ｃｍのサイズ）を持つ、転移性結腸癌を有する。結腸の原発癌は以前に切除されており、患者は、肝臓及び肺への異時性転移のため、術後療法の経過を有した。治療の際、肝臓転移は増殖し、１つの肺転移は２つになったので、患者は実験的化学免疫療法の候補になる。次に、二重抗体−薬物抱合体のラベツズマブ（ｈＭＮ−１４）−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を開始し、それぞれ、隔日に、８ｍｇ／ｋｇの用量を毎週１回で２週間、毎月１回で４か月間にわたって与えた。治療の２週間後、患者の状態は、ＣＴ及び臨床検査により評価される。ＣＴスキャンは、肝臓右葉の大きな腫瘍が５０％低減し、左葉の腫瘍が約３３％低減し、肺転移が両方の腫瘍で累積して約２０％低減している。血中ＣＥＡ力価は、療法の開始時の２２ｎｇ／ｍＬから、この追跡時の６ｎｇ／ｍＬに減少している。主観的には、患者は力強さを感じ、日常の活動でも活気があると思われる。副作用は、一過性の血小板減少症及び白血球減少症であり、療法の２週間後に正常範囲に戻り、いくつかの悪心及び嘔吐の発作であり、制吐薬の投薬によって管理されている。患者は、もう１回疾患状態を検査した後に、これらの治療サイクルに約２か月以内に戻ることが計画されている。
【０３８３】
実施例２８．抗体−薬物抱合体の連続注入
患者は、以前に直腸癌を切除しており、術前及び術後放射線療法を通常の治療として受けている。彼女は、４年間にわたって無腫瘍であったが、現在、右葉への３つの小さな転移性病変を示しており、これは、日常的なＣＴにより、続く、初期療法後の３．０ｎｇ／ｍＬから６．３ｎｇ／ｍＬに上昇した血中ＣＥＡ値により発見された。彼女には留置カテーテが与えられ、ラベツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の２ｍｇ／ｋｇの用量が１７日間にわたって連続注入される。次に、５週間後に繰り返しの連続注入療法を受け、ここでは３週間にわたって１ｍｇ／ｋｇである。３週間後、ＣＴスキャン及び血中ＣＥＡモニターは、肝臓転移のうちの１つが消滅し、他の２つが同じである、または僅かに小さくなっていることを明らかにしている。ここで血中ＣＥＡ力価は、２．４ｎｇ／ｍＬと測定される。症候性ではなく、治療中にグレード２の悪心及び嘔吐、ならびにグレード２のの好中球減少症のみを経験し、経時的に回復している。
【０３８４】
実施例２９．抗ＣＥＡＣＡＭ５免疫抱合体による進行型転移性結腸癌の療法
患者は、転移性結腸癌の以前の治療に失敗している５０歳の男性である。第１選択治療は、第１サイクルのＩＲＯＸ（イリノテカン＋オキサリプラチン）から出発したＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ＋Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（段階的増量）である。この治療を開始した後、患者はＣＴを受け、肝臓転移サイズの減少を示す。この後の外科手術により、腫瘍組織を除去する。補助化学療法は、第１選択レジメン（ＩＲＯＸ部分のない）の継続であり、一過性の無再発をもたらす。約１年の間隔を置いて、ＣＴは、肝臓転移の再発を明らかにする。このことは、第２選択レジメン（ＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブ）の開始をもたらす。別のＣＴは、肝臓転移に応答を示す。次に肝臓転移のＲＦアブレーションを実施し、続いてＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ＋セツキシマブの補助化学療法を継続し、続いてセツキシマブをおよそ１年間維持する。別のＣＴスキャンは、疾患の証拠がないことを示す。更なるスキャンは肺小結節の可能性を示し、確認される。このことは、肺小結節の楔状切除をもたらす。続いて、ＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブが再開され、継続される。後のＣＴスキャンは、肺及び肝臓の両方への転移を示す。
【０３８５】
ｈＭＮ−１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体の投与時には、患者は、進行型転移性結腸癌を有し、肺及び肝臓の両方への転移があり、イリノテカン（カンプトテシン）には無応答である。ｈＭＮ−１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８抱合体は、１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、隔週に繰り返される。患者はＲＥＣＩＳＴ基準の転移性腫瘍の低減による、部分応答を示す。
【０３８６】
この１２ｍｇ／ｋｇ（隔週に与えた）のコホートでは、１人の患者だけがグレード２の血液学（好中球減少症）を示し、大部分の患者がグレード１または２の悪心、嘔吐、もしくは脱毛症を示し、これらは抗体−薬物抱合体の活性の徴候であるが、十分に耐性されていることに留意されたい。カンプトテシンへの標的化の改善における抗体部分の効果は、非抱合イリノテカンに以前は抵抗性であった癌における、ＳＮ−３８有効性によって説明される。
【０３８７】
実施例３０．抗ＭＵＣ５ａｃ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫抱合体による転移性膵癌の治療
この４４歳の患者は、膵頭に手術不能な膵管腺癌を有し、かつ肝臓の左及び右葉に転移を示す、転移性膵癌の病歴を有し、前者は３×４ｃｍの寸法があり、後者は２×３ｃｍの寸法である。患者には、ゲムシタビンの治療が与えられたが、客観的応答は示されていない。４週間後には、ｈＰＡＭ４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の静注が８ｍｇ／ｋｇの用量で毎週２回、２週間にわたって与えられ、１週間休止し、次に更に２サイクル繰り返される。ＣＴ研究が１週間後に行われ、腫瘍量の全低減（全ての部位）の３２％（部分応答）を示し、それと共に、血中ＣＡ１９−９力価がベースラインの２２０から放射線評価時の７５に低下した。患者は、抗体−薬物抱合体によるそれぞれの治療の後にグレード１の悪心及び嘔吐、ならびにサイゴン治療サイクルの終了時にグレート２の好中球減少症のみを示し、４週間後に回復している。注入反応を予防する前投薬は、与えられていない。
【０３８８】
実施例３１．治療耐性転移性結腸癌（ｍＣＲＣ）の治療におけるｈＬ２４３−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の使用
患者は、転移性結腸癌を示す６７歳の男性である。診断のすぐ後の横行結腸切除術に続いて、患者は、肝臓の左葉の転移性病変を除去する部分肝切除術の前に、術前補助設定において４サイクルのＦＯＬＦＯＸ化学療法を受ける。この後に、合計１０サイクルのＦＯＬＦＯＸの補助ＦＯＬＦＯＸレジメンが続く。
【０３８９】
ＣＴスキャンは、肝臓への転移を示す。標的病変は、肝臓の左葉における３．０ｃｍの腫瘍である。非標的病巣には、肝臓におけるいくつかの低減弱腫瘤が含まれた。ベースラインＣＥＡは、６８５ｎｇ／ｍＬである
【０３９０】
患者がインフォームドコンセントに署名した後、ｈＬ２４３−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（１０ｍｇ／ｋｇ）が隔週で４か月間にわたって与えられる。患者は、最初の治療の後に悪心（グレード２）及び疲労（グレード２）を経験し、大きな有害事象がなかったので治療は継続されている。行われた第１回の応答評価（８用量後）は、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）によると、標的病変の２６％の縮小を示し、ＣＥＡレベルは２４５ｎｇ／ｍＬに減少している。第２回の応答評価（１２用量後）では、標的病変は３５％縮小している。全体的な健康及び臨床症状は、顕著に改善されている。
【０３９１】
実施例３２．ＩＭＭＵ−１１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＳＮ−３８）にる再発性の濾胞性リンパ腫の治療
様々な限局性リンパ節（頸部、腋窩、縦隔、鼠径部、腹部）及び骨髄関与の広範囲な疾患を示す濾胞性リンパ腫のためにＲ−ＣＨＯＰ化学療法を受けた後、この６８歳の男性は、実験的作用物質であるＩＭＭＵ−１１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で３週間にわたって受け、３週間休止して、更に３週間にわたって第２回の治療を受ける。次にＣＴにより指標腫瘍病変における変化を評価し、ＣＨＥＳＯＮ基準に従って２３％の低減を示す。治療は、更に２回繰り返され、ＣＴによると５５％の低減が示され、これは部分応答である。
【０３９２】
実施例３３．ＩＭＭＵ−１１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８による再発性の慢性リンパ性白血病の治療
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ及びＷｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎの分類により定義されたＣＬＬの病歴を有する６７歳の男性は、フルダラビン、デキサメタゾン及びリツキシマブ、ならびにＣＶＰレジメンによる以前の療法の後に再発した疾患を示す。彼は、全身性リンパ節拡大、ヘモグロビン及び血小板産生の低減、ならびに白血球数の急速な上昇を伴った、発熱及び寝汗を有する。ＬＤＨは、上昇しており、ベータ−２−ミクログロブリンは、正常のほぼ２倍である。患者には、毎週８ｍｇ／ｋｇで４週間、２週間の休止、次にサイクルを再び繰り返す投与スケジュールより、ＩＭＭＵ−１１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いる療法を与える。評価は、患者の血液学的パラメーターが改善されていること及び循環ＣＬＬ細胞の数が減少していると思われることを示す。療法は更に３サイクルが再開され、その後の血液学的及び臨床数値は、部分応答を有することを示している。
【０３９３】
実施例３４．難治性で転移性の非小細胞肺癌の治療におけるｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の使用
この患者は、非小細胞肺癌が診断された５８歳の男性である。彼には、６か月間のカルボプラチンとベバシズマブの化学療法レジメンが与えられ、応答を示し、次に進行後には、２年間にわたるカルボプラチン、エトポシド、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、ゲムシタビンの化学療法の更なる過程を受け、不定期の応答が２か月以下にわたって続いている。次に患者は、５．５×３．５ｃｍの寸法の左側縦隔腫瘤及び胸水を表す。
【０３９４】
インフォームドコンセントに署名した後、患者にはｈＭＮ−１５−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が１２ｍｇ／ｋｇの用量で隔週に与えられる。最初の２回の注入の際に、短時間の好中球減少症及び下痢を経験し、これらは対処投薬により２日以内に回復または応答している。ｈＭＮ−１５−ＳＮ−３８の合計６回の注入の後、標的病変のＣＴ評価は、２２％の低減を示す。患者は、部分応答の４５％がＣＴにより示される場合、この療法を更に２か月間継続する。
【０３９５】
実施例３５．ｈＡ１９−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８による濾胞性リンパ腫患者の治療
６０歳の男性は、腹痛及び触知腫瘤の存在を示す。患者は、ＣＴ及びＦＤＧ−ＰＥＴ研究を受け、縦隔、腋窩及び頸部リンパ節に病的腺腫大を伴う腫瘤の存在が確認される。臨床検査は、ＬＤＬ及びベータ−２−ミクログロブリンの上昇以外は、顕著なものはない。骨髄生検は、いくつかの傍骨梁（ｐａｒａｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）及び血管周囲リンパ球凝集を明らかにしている。これらのリンパ性であり、免疫染色によるＣＤ２０、ＣＤ１９およびＣＤ１０の発現を伴う。最終診断は、グレード２の濾胞性リンパ腫でステージＩＶＡであり、ＦＬＩＰＩスコアは４である。最大関与リンパ節の最長直径は、７ｃｍである。患者には、ＣＬ２Ａリンカーを有するＳＮ−３８と抱合させた（ＩｇＧ１つあたり６つの薬物分子）ヒト化抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＩｇＧ（ｈＡ１９）が与えられる。投与は、毎週６ｍｇ／ｋｇの４週間連続、２週間の休止、次に４週間の治療サイクルを６週間毎に繰り返す。５サイクル後に、骨髄及び画像化（ＣＴ）評価は部分応答を示し、測定可能な病変は約６０％減少し、骨髄の浸潤はかなり少なくなっている。また、ＬＤＨ及びベータ−２−ミクログロブリンの力価も減少している。
【０３９６】
実施例３６．ｈＡ１９−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８による再発性前駆体Ｂ細胞ＡＬＬの治療
この５１歳の女性は、前駆体フィラデルフィア染色体陰性Ｂ細胞ＡＬＬのために治療下にあり、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ３８及びＣＤ４５のＡＬＬ細胞染色を示している。２０％を超える骨髄及び血中リンパ芽球が、ＣＤ１９及びＣＤ２０を発現する。患者は、クロファラビン及びシタラビンによる以前の療法を受け、顕著な血液毒性がもたらされたが、応答はなかった。高用量のシタラビン（ａｒａ−Ｃ）治療も開始されたが、患者は耐容することができなかった。彼女には、ｈＡ１９−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８療法が注入により６ｍｇ／ｋｇの毎週用量で５週間にわたって与えられ、次に２週間休止され、この療法は更に２回繰り返される。驚くべきことに、血球及び骨髄細胞数に改善が見られ、部分応答が認められるのに十分である。好中球減少症（グレード３）のために２か月間休止した後、療法を更に４回の隔週での８ｍｇ／ｋｇによって再開した。この時点で、かなり改善されており、維持療法を試して、幹細胞移植の候補になりうる段階にすることが考慮されている。
【０３９７】
実施例３７．抗ＣＤ２２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８免疫抱合体によるリンパ腫の治療
患者は、再発性のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する６２歳の男性である。Ｒ−ＣＨＯＰ化学免疫療法の６過程の後、彼は縦隔、腋窩及び鼠径部リンパ節における広範囲のリンパ節拡大を示している。エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（抗ＣＤ２２）が１２ｍｇ／ｋｇの用量で毎週×３回与えられ、１週間休止し、次に更に２サイクル繰り返される。１週間後、患者は、ＣＴ画像化により評価され、総腫瘍嵩高が測定され、３５％の減少（部分応答）を示し、次の３か月間にわたって維持されていると思われる。副作用は、療法後の血小板減少症、ならびにグレード１の悪心及び嘔吐のみであり、２週間以内に回復している。注入反応を低減する前治療は、与えられていない。
【０３９８】
実施例３８．第一線設定のベルツズマブ及びエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８による濾胞性リンパ腫の併用療法
３５歳の女性は、低悪性度及び良好なＦＬＩＰＩスコアの濾胞性リンパ腫と診断され、頸部リンパ腫、両方の腋窩及び縦隔に示されている。脾臓は腫大しておらず、骨髄生検は、疾患の関与を表していない。症候的にはあまり罹患しておらず、一定期間の体温上昇、寝汗及び通常よりいくらか多い疲労を伴っている。彼女の担当医は、成り行きを見守る（ｗａｔｃｈ−ａｎｄ−ｗａｉｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ）ことはしないで、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のベルツズマブの毎週×４週間（２００ｍｇ／ｍ２）の皮下治療を２週間治療の抗ＣＤ２２であるエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と組み合わせた侵襲性の少ない療法を与え、それぞれの注入は、８ｍｇ／ｋｇの用量である。この併用療法を２か月後に繰り返し、その後、患者をＣＴ及びＦＤＧ−ＰＥＴ画像化研究、ならびに骨髄生検により評価する。驚くべきことに、約９０％の低減が全ての疾患において見られ、４週間休止した後、この併用療法の別の過程が与えられている。４週間後の評価は、放射線学的に（及び骨髄生検によると）完全な応答を示している。担当医は、この治療過程を８か月後に繰り返すことを決め、放射線学的／病理学的検査は、持続的な完全寛解を示している。
【０３９９】
実施例３９．ベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を使用する濾胞性リンパ腫のフロントライン療法
４１歳の患者は、低悪性度濾胞性リンパ腫を示し、測定可能な両側頸部及び腋窩リンパ節（それぞれ、２〜３ｃｍ）、直径４ｃｍの縦隔腫瘤、ならびに脾臓腫大を有している。彼女にはベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（抗ＣＤ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）療法の３過程が与えられ、それぞれの過程は、３週間毎に注入される１０ｍｇ／ｋｇから構成されている。療法が完了した後、ＣＴによる腫瘍測定は、８０％の低減を示している。２つの追加の治療過程が与えられ、ＣＴ測定は、完全応答が達成されたことを示している。これは、ＦＤＧ−ＰＥＴ画像化によって確認されている。
【０４００】
実施例４０．ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と抱合させた１Ｆ５ヒト化抗体による再発性ＤＬＢＣＬの療法
５３歳の女性は、６サイクルで与えられたＲ−ＣＨＯＰ化学療法に部分応答を示した８か月後に、再発性のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を縦隔及び腹部傍大動脈部位に示している。彼女は、更なる細胞傷害性化学療法を受けることを拒否したので、ＣＬ２Ａリンカーを有する抗体分子１つあたり約６つのＳＮ−２８分子に抱合させた、約１０ｍｇ／ｋｇのヒト化１Ｆ５抗ＣＤ２０モノクローナル抗体から構成される穏やかな療法が、毎週１回隔週で５週間にわたって与えられる。ＣＴ及びＦＤＧ−ＰＥＴ研究は、リンパ腫が更に４０％低減されたことを示したので、４週間の休止期間の後、治療が３週間毎の８ｍｇ／ｋｇの用量で合計５回の注入により再開される。疾患の評価は、約８０％の低減を明らかにしている。
【０４０１】
実施例４１．リツキシマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８による再発性の慢性リンパ性白血病の療法
過去にフルダラビン、シクロホスファミド及びリツキシマブ療法に応答し、再発後にイブルチニブへの部分応答が９か月間続いた、８年間のＣＬＬの病歴がある６２歳の男性は、進行性疾患を示している。患者には、リツキシマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８単独療法が２週間毎に１２ｍｇ／ｋｇを３過程、隔週に８ｍｇ／ｋｇに低減して更に４過程のスケジュールで与えられる。５０％を超える、または１デシリットルあたり１１ｇを超えるヘモグロビンレベルによって反映されている、血球減少症における持続的改善、１ｃｍｍあたり１５００細胞を超える好中球絶対数、または１１ｋ／ｃｍｍを超える血小板数が観察されており、これらは約９か月間にわたって持続した。
【０４０２】
実施例４２．ベンダムスチンと組み合わせたベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８によるＤＬＢＣＬの第一線療法
５９歳の男性は、ＣＴ、ＦＤＧ−ＰＥＴ及び免疫組織学／病理学的診断により確認すると、胸部、腹部、鼠径部のリンパ節を含む複数部位のＤＬＢＣＬ、ならびに腫大脾臓を示しうる。ベンダムスチンが、４週間毎に７日目及び１４日目に６ｍｇ／ｋｇの用量で与えられるベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８との組み合わせによって、１日目及び２日目に９０ｍｇ／ｍ２の用量で４サイクル与えられる。その後の放射線評価は、部分応答を示している。２か月間休止した後、療法を更に２サイクル繰り返し、放射線評価は、完全応答を示している。ほとんどが好中球減少症である血球減少症は、管理可能であり、グレード３のレベルに達していない。
【０４０３】
実施例４３．レナリドミドと組み合わせたベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８によるマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）の第一線療法
患者は、ＧＩ愁訴及び嗜眠を示した後にＭＣＬが診断された６８歳の男性である。結腸内視鏡検査は、７ｃｍの盲腸腫瘤を明らかにし、検査は、ステージＩＶ疾患を有することを明らかにしている。２８日毎に１日目から２１日目まで毎日２５ｍｇの経口レナリドミドの併用療法が与えられる。２サイクルの後、ベルツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、隔週に１０ｍｇ／ｋｇの用量により３回の治療で与えられ、２週間の休止期間がある。これは繰り返される。この療法が完了した２週間後、患者は、測定された指標病変に部分応答及び視覚化された他のリンパ腫の低減を示している。４か月後、レナリドミド療法が２１日間繰り返され、その後にベルツズマブ−ＳＮ−３８の２過程が続く。疾患が更に低減されたことが示されているが、まだ完全応答ではない。
【０４０４】
実施例４４．再発性／難治性のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する患者のエプラツズマブ−ＳＮ−３８療法
体重減の症状を有する６５歳の男性は、上腹部腫瘤の生検を受け、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と診断されている。６サイクルの標準的Ｒ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン）により治療されている。軽度の血小板減少症（５０〜７０ｋ／ｍＬ）を伴う長期間の持続性好中球減少症（７００ＡＮＣ）を有するが、実際の貧血はない。ＩＰＩは高い。上腹部腫瘤は、この療法の抗ＣＤ２２後に何も変化を示さず、エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の軽度治療レジメン下に置かれる。これは、隔週毎に４回の注入、次に３週間毎に更に３回の注入により注入される４ｍｇ／ｋｇのレジメンである。上腹部リンパ腫は、１週間後にＣＴによって測定され、５２％の著しい低減を示している。患者はこの治療を３週間毎に更に３か月間にわたって続け、体重が安定し、活力及び活動に改善を伴って、リンパ腫腫瘤にこの低減を示し続けている。
【０４０５】
実施例４５．再発性濾胞性リンパ腫を有する患者のヒト化ＲＦＢ４療法
４２歳の女性は、下腹部に鋭い持続性の激痛を示し、背中まで放散している。臨床検査では顕著なものはないが、腹部超音波は、前側の左下に異種固形腫瘤を示し、７．５×６．２×７．０ｃｍの寸法である。ＣＴスキャンは、小腸左側腸間膜内に大きな腫瘤を明らかにし、隣接するリンパ腫の関与を伴っている。腫瘤のＣＴ誘導針生検は、グレード３の濾胞性リンパ腫であることを示している。免疫組織化学は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−６の結果が陽性であるＢ細胞型を示している。ＰＥＴ研究は、隔膜より上方、骨髄の中、または脾臓の中に疾患がないことを明らかにしているが、骨髄生検は、リンパ腫の関与を確認している。患者は、６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ化学療法を受け、４か月後にはこの療法に完全な応答をもたらしている。しかし、１０か月後に再発し、ＰＥＴ及び生検研究により決定すると、腹部腫瘤の再発、ならびの隣接リンパ節と腫大脾臓及びより多くの骨髄の関与を伴っている。ここで、ＣＬ２Ａリンカーを使用してＩｇＧ１つあたり６つのＳＮ−３８分子で抱合されたヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体のＲＦＢ４の毎週８ｍｇ／ｋｇ用量による３週間、次に隔週８ｍｇ／ｋｇ用量による更に４回の治療を用いる療法過程を開始した。２週間後、ＣＴ及びＦＤＧ−ＰＥＴ研究を受け、腹部病変及び脾臓は、４０％の低減及び骨髄関与の一般的な低減を示している。４週間休止した後、毎週４ｍｇ／ｋｇで４週間、続いて隔週６ｍｇ／ｋｇで更に５回の治療を実施し、測定した病変全てのサイズの合計の測定可能低減は、合計で６０％である。患者は、毎月１回の８ｍｇ／ｋｇによるｈＲＦＢ４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の維持療法を次の５か月間にわたって続け、治療応答を維持している。
【０４０６】
実施例４６．再発性／難治性急性リンパ芽球白血病を有する患者のエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８療法
ＣＤ２２＋前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）を有する２９歳の男性は、改変Ｌａｒｓｏｎプロトコールによる誘導／維持療法として与えられた、ＰＥＧ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、ダウノルビシン、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、ビンクリスチン、ロイコボリン、プレドニゾン、メトトレキセート及び６−メルカプトプリンによる療法、ならびにＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）による支持療法に応答しなかった。患者の白血病は、フィラデルフィア染色体陰性である。血中及び骨髄白血病芽球数に基づいて、患者は最小の応答のみを示し、疾患は４か月後に進行している。次に、最初の６ｍｇ／ｋｇスケジュールで毎週投与されるエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を４週間、次に６ｍｇ／ｋｇに低減して、隔週で更に６回の注入が与えられる。次に患者は、血中及び骨髄白血病芽球、ならびに脾臓サイズ及び骨髄関与のＦＤＧ研究により評価され、部分応答が達成されていると思われ、患者の一般的な徴候及び症状の改善を伴っている。この療法は次の８か月間にわたって継続されるが、隔週５ｍｇ／ｋｇによる３週間の療法、２週間の休止であり、完全寛解が達成されている。患者は、造血幹細胞移植の候補として評価されている。
【０４０７】
実施例４７．再発性／難治性急性リンパ芽球白血病を有する患者のヒト化ＲＦＢ４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８療法
ＨＩＤＡＣ（高用量ａｒａ−Ｃ療法）への応答に失敗した後、前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球白血病を有する２０歳の男性には、ＳＮ−３８に抱合された（ＩｇＧ１つあたり平均して６つの薬物分子）ｈＲＦＢ４  ＩｇＧを用いるヒト化抗ＣＤ２２療法が、毎週１０ｍｇ／ｋｇの２週間、次に１週間の休止、続いて隔週１０ｍｇ／ｋｇ注入の更に５回の治療による投与スケジュールで与えられる。患者は、血中及び骨髄白血病芽球細胞の存在について評価され、＞９０％の低減を示している。４週間休止した後、この療法過程を繰り返し、４週間後の評価は、ＰＣＲにより測定して、最小残留疾患を伴うことなく完全応答を示している。
【０４０８】
実施例４８．Ｒ−ＣＨＯＰ化学療法を受けているＤＬＢＣＬ患者におけるエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８との強化療法
両側頸部腫大及び１．５〜２．０ｃｍの寸法の頸部リンパ節、ならびに３ｃｍの右腋窩リンパ節、ならびに２．５〜３．０ｃｍの後腹膜及び両側骨盤リンパ節を有する、この５６歳の女性は、ＣＤ２０及びＣＤ２２が陽性のステージ３のびまん性Ｂ細胞リンパ腫と診断されている。彼女は、フィルグラスチム及び予防的抗生物質を用いる２１日毎に与えられる標準的なＲ−ＣＨＯＰ化学療法レジメン下に置かれる。この療法の６サイクルを受けた後、患者には、２か月間の休止期間が与えられ、次に隔週８ｍｇ／ｋｇのエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が注入される３回の治療を伴う強化療法下に置かれる。Ｒ−ＣＨＯＰ化学療法後の応答は最小であるが（測定病変において３０％未満の変化）、エプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８との強化療法は、部分応答（指標病変の合計の＞５０％減少）をもたらしている。３か月間の休止の後、このエプラツズマブ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を用いる療法過程を繰り返し、患者に再びフィルグラスチム及び予防的抗生物質を与えると、良好な寛解が維持されている。
【０４０９】
実施例４９．ＩＭＭＵ−３１−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８による再発性の転移性精巣癌の治療
患者は、右側精巣の切除精巣癌の病歴を有し、併用化学療法に良好の応答した、両方の肺への同時転移を有する、３０歳の男性である。診断時には、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血中力価は、１，１１０ｎｇ／ｍＬに上昇しているが、治療が成功した後には１０９ｎｇ／ｍＬに減少している。現在、彼は３年間にわたってＡＦＰ力価のゆっくりとした上昇を示しており、身体のＣＴ及びＦＤＧ−ＰＥＴスキャンを行って、両方の肺への肺転移の再発が明らかとなっている。ＩｇＧ１つあたり６つの薬物分子でＳＮ−３８と抱合された、抗ＡＦＰ抗体であるＩＭＭＵ−３１  ＩｇＧによる療法を受けている。彼は、この抗体−薬物抱合体の１２ｍｇ／ｋｇの毎週用量を３週間にわたって４週間サイクルで受け、もう１サイクル繰り返されるが、治療薬が１０ｍｇ／ｋｇに低減される。これは、更に２サイクル繰り返される。２週間後、肺の放射線検査は、転移が消滅したことを明らかにしている。血中ＡＦＰ力価は、１８ｎｇ／ｍＬである。患者の通常の活動に戻り、完全応答が達成されている。
【０４１０】
実施例５０．ＩＭＭＵ−３１−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８による再発性の転移性肝細胞癌の治療
Ｂ型肝炎感染の病歴、過剰アルコール及び喫煙のある５８歳の男性には、最初に肝硬変がもたらされ、次に肝細胞癌がもたらされている。肝臓の部分切除を受けた後に来院した時点では、限局リンパ節も関与している。患者は、ソラフェニブ療法の過程を受け、いくらかの一般的な改善を示すが、限局リンパ節または２つの肺（右肺）転移に低減は何もなかった。肝臓のＣＴは、残りの肝実質に再発がありうることも示唆している。この患者には、ＩＭＭＵ−３１−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の３つの療法過程が与えられており、それぞれ、毎週１６ｍｇ／ｋｇの２週間による４週間サイクルのスケジュールを含む。６用量を含む３過程の後、患者は再評価され、循環ＡＦＰ力価が、ベースライン値の２，０００ｎｇ／ｍＬから１７０ｎｇ／ｍＬに減少したこと、ならびに測定された指標病変の合計が２０％低減したことを示している。２か月間にわたって休止した後、３サイクルの別の療法過程が、用量を注入１回あたり１ｍｇ／ｋｇに低減して構成されている。１か月後には、ベースラインの３５％への全ての測定病変の大きな低減、ならびに１００ｎｇ／ｍＬへのＡＦＰ血中力価の僅かな減少がある。患者には、疾患進行または制限毒性のない限り、１か月あたり１用量の位置療法が継続されている。
【０４１１】
実施例５１．免疫抱合体の貯蔵
実施例２に記載された抱合体を精製し、緩衝液を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６．５に交換し、トレハロース（最終濃度２５ｍＭ）及びポリソルベート８０（最終濃度０．０１％ｖ／ｖ）を更に配合し、賦形剤添加の結果として、最終緩衝液濃度が２２．２５ｍＭとなった。配合抱合体を凍結乾燥し、密閉バイアルにより２℃〜８℃の貯蔵庫に貯蔵した。凍結乾燥免疫抱合体は、貯蔵条件下で安定し、生理学的活性を維持した。
【０４１２】
前述の記載から、当業者は、本発明の本質的な特質を容易に確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修正を、過剰な実験を行うことなく様々な用途及び条件に適合するよう行うことができる。本明細書に引用されている全ての特許、特許出願及び出版物は、参照として本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年3月15日(2018.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
下記の構造の化合物ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を生成する方法であって、
【化１】
2018520148.tif 000033
下記に示されている反応スキームを実施することを含む、前記方法。
【化２】
2018520148.tif 000034
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【国際調査報告】
2018520148.tif 000036