(57)【要約】本開示は、式（Ｉ）によるニクロサミド誘導体を使用してｐ５３欠損細胞を治療する方法を記載する。本開示はさらに、式Ｉによる化合物を使用してがんを治療する方法、ならびにｐ５３が欠損しているかまたは機能しない細胞を選択的に標的とする化合物を特定するためにスクリーニングする方法を記載する。【化１】2018535190.tif 000017 【選択図】なし
2018535190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉに定義される化合物：
【化１】
2018535190.tif 000012
（式中、ＤはＮまたはＣＲ９であり；ＥはＮまたはＣＲ１０であり；ＦはＮまたはＣＲ１１であり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン化物、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４、Ｒ１５、
【化２】
2018535190.tif 000013
であり、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨまたはＯＲ１２であり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、もしくはＣ１−７ヘテロアルキルであるか；またはＲ２およびＲ３は一緒になって、
【化３】
2018535190.tif 000014
によって１位が４位と結合する６員環を形成し；
Ｒ４およびＲ８は各々独立して、Ｈ、ハロゲン化物、ＣＦ３、ＯＲ２８、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルから選択され；
Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は各々独立して、Ｈ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキル、ハロゲン化物、ＮＯ２、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＣＦ３、ＣＮ、ＯＲ２９、ＳＲ３０、
【化４】
2018535190.tif 000015
から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々は独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ３８であり；
Ｙは、ＣＲ２５Ｒ２６、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ２７であり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ５０Ｒ５１であり；
各々のＱは独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ５２であり；
Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ１２、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ１−７ヘテロアルキル、ハロゲン化物、またはＮＯ２であり、
Ｒ１２およびＲ１３は各々独立して、アシル、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであり；
Ｒ１７、Ｒ２２、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８およびＲ５２は各々独立して、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであり；
Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４は各々独立して、Ｈ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであり；Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５０およびＲ５１は各々独立して、Ｈ、ハロゲン化物、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＦ３、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルである）
またはその誘導体を使用してがんを治療する方法であって、前記がんはｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を含む、方法。
【請求項２】
Ｘ１が酸素原子であり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３がＨである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１がＨまたはハロゲン化物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１がＣｌである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ４およびＲ８が独立してＨ、ハロゲン化物またはＣＦ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ４がＣｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ８がＨである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が独立して、Ｈ、ハロゲン化物、ＮＯ２、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＣＦ３またはＣＮである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ５がＨである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ６がＮＯ２である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ７がＨである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｘ１がＯであり、Ｒ１がＣｌであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３がＨであり、Ｒ４がＣｌであり、Ｒ５がＨであり、Ｒ６がＮＯ２であり、Ｒ７がＨであり、Ｒ８がＨである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、
【化５】
2018535190.tif 000016
またはその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物を使用してがんを治療する方法であって、前記がんがｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を含む、方法。
【請求項１５】
前記化合物が、２’，５−ジクロロ−４’−ニトロサリチルアニリド（ニクロサミド）、またはその誘導体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
患者が治療に対して反応する可能性が高いかまたは低いかを特定する方法であって、前記治療は請求項１〜１３のいずれか一項に定義される化合物の投与を含み、前記方法は、患者から得られた細胞または組織試料が、ａ）ｐ５３陽性もしくはｐ５３欠損細胞またはｂ）機能しないｐ５３を含むかどうかを決定することを含み、ｐ５３欠損としての細胞もしくは組織試料または機能しないｐ５３を含有する細胞もしくは組織試料の特定は治療に対する反応が高い患者を特定し、ｐ５３陽性としての前記試料の特定は治療に対する反応が低い患者を特定する、方法。
【請求項１７】
前記化合物が、２’，５−ジクロロ−４’−ニトロサリチルアニリド（ニクロサミド）またはその誘導体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、基底細胞がん（ＢＣＣ）、扁平上皮がん（ＳＣＣ）もしくは黒色種などの皮膚がん、乳がん、脳腫瘍などの頭頸部がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）などの肺がん、卵巣がん、腎がん、前立腺がん、肝がん、および子宮頸がんなどのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連がんからなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記がんが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、基底細胞がん（ＢＣＣ）、扁平上皮がん（ＳＣＣ）もしくは黒色種などの皮膚がん、脳腫瘍などの頭頸部がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）などの肺がん、卵巣がん、腎がん、前立腺がん、肝がん、および子宮頸がんなどのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連がんからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか一項に定義される化合物が、さらなる治療剤と共に投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記さらなる治療剤が、化学療法剤、細胞成長、生存、血管形成、接着、移動、浸潤、転移、細胞周期進行および／もしくは細胞分化を標的化できる抗がん剤；細胞成長、生存、血管形成、接着、移動、浸潤、転移、細胞周期進行および／もしくは細胞分化を標的化できる低分子薬；転移性骨がん治療のためのビスホスフォネート薬；ペプチド治療剤ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記化学療法剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシド、アブラキサン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、イマチニブ、イリノテカン、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、メトトレキサート、クロラムブシル、ダカルバジン、シクロホスファミド、パクリタキセル、５−フルオウラシル、ゲムシタビン、ビンクリスチン、ドセタキセル、ビノレルビンまたはエポチロンＢからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記さらなる治療剤が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物の投与と同時に、連続して、またはその投与後に後で投与される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
がんを治療するための医薬の製造における請求項１〜１３のいずれか一項に定義される化合物、またはその誘導体の使用であって、前記がんはｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を含む、使用。
【請求項２５】
前記化合物が、２’，５−ジクロロ−４’−ニトロサリチルアニリド（ニクロサミド）、またはその誘導体である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
第１の細胞種類または第２の細胞種類を選択的に標的とする化合物を特定するためにスクリーニングする方法であって、前記第１の細胞種類はｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞であり、前記第２の細胞種類はｐ５３陽性細胞であり、前記第１の細胞種類は第１の検出可能なマーカーで標識され、前記第２の細胞種類は第２の検出可能なマーカーで標識され、前記方法は、
Ａ．前記第１の細胞種類および前記第２の細胞種類を前記化合物と接触させる工程；ならびに
Ｂ．前記第１の検出可能なマーカーおよび前記第２の検出可能なマーカーの相対量を決定する工程を含み、
前記第１の検出可能なマーカーおよび前記第２の検出可能なマーカーは独立して検出可能であり、第２のマーカーの量と比較した第１のマーカーの量の相対的増加は、ｐ５３陽性細胞を選択的に標的化する化合物の指標であり、第２のマーカーの量の相対的増加は、ｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を選択的に標的化する化合物の指標である、方法。
【請求項２７】
前記検出可能なマーカーは、蛍光化合物、放射性同位体化合物、非放射性同位体化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート化合物、発色化合物、Ｘ線撮影化合物、および酵素からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記蛍光化合物が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の細胞種類が赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）で標識され、前記第２の細胞種類が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞種類が、インビトロまたはエキソビボで請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物と接触する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のマーカーおよび第２のマーカーの相対量が、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）または定量的画像化顕微鏡法を使用して決定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物と、さらなる治療剤とを含むキット。
【請求項３３】
前記さらなる治療剤が、化学療法剤、細胞成長、生存、血管形成、接着、移動、浸潤、転移、細胞周期進行および／もしくは細胞分化を標的化できる抗がん剤；細胞成長、生存、血管形成、接着、移動、浸潤、転移、細胞周期進行および／もしくは細胞分化を標的化できる低分子薬；転移性骨がん治療のためのビスホスフォネート薬；ペプチド治療剤ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記化学療法剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシド、アブラキサン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、イマチニブ、イリノテカン、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、メトトレキサート、クロラムブシル、ダカルバジン、シクロホスファミド、パクリタキセル、５−フルオウラシル、ゲムシタビン、ビンクリスチン、ドセタキセル、ビノレルビンおよびエポチロンＢからなる群から選択される、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記さらなる治療剤が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物の投与と同時に、連続して、またはその投与後に後で投与される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月１６日に出願されたシンガポール仮出願第１０２０１５０７７１６Ｑ号の優先権の利益を主張し、その内容は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して分子生物学の分野に関する。特に本発明はｐ５３欠損細胞の治療のための化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
一般にｐ５３としても知られているＴＰ５３は、ヒトのがんにおける最も一般的に変異されている腫瘍抑制遺伝子のうちの１つである。当該分野において公知のように、ｐ５３は、ゲノム安定性および細胞死を維持するための生殖および発生から、多くの重要な生物活性がｐ５３遺伝子の転写活性によって調節されるという点で多数のシグナル伝達経路における節として機能する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
研究により、ｐ５３は、選択的スプライシングに供され得るファミリーの部分であることが示されている。ｐ５３はがん遺伝子と最初に記載されていた事実が、実際に腫瘍進行および転移を駆動する機能特性の増加を示すことが示されている突然変異ｐ５３により元に戻ったようである。したがってｐ５３は治療的に重要であり、多数の戦略が腫瘍におけるその発現を再構成するために利用されている。今まで、ｐ５３の生物活性および機能について多くのことが知られているが、突然変異ｐ５３を有するかまたはｐ５３機能を喪失している細胞を標的とする戦略は依然として知られていない。したがって、腫瘍における高頻度のｐ５３突然変異を考慮して、ｐ５３機能の喪失を示す腫瘍を標的とし、治療する治療的アプローチを見出す必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、式Ｉに定義される化合物：
【化１】
2018535190.tif 000003
（式中、ＤはＮまたはＣＲ９であり；ＥはＮまたはＣＲ１０であり；ＦはＮまたはＣＲ１１であり；Ｒ１はＨ、ハロゲン化物、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４、Ｒ１５、
【化２】
2018535190.tif 000004
であり；Ｒ２はＨ、ＯＨまたはＯＲ１２であり；Ｒ３はＨ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル；Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル；Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）もしくはＣ１−７ヘテロアルキルであるか；またはＲ２およびＲ３は一緒になって、
【化３】
2018535190.tif 000005
によって１位が４位と結合する６員環を形成し；Ｒ４およびＲ８の各々は、独立して、Ｈ、ハロゲン化物、ＣＦ３、ＯＲ２８、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルから選択され；Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、独立して、Ｈ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキル、ハロゲン化物、ＮＯ２、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＣＦ３、ＣＮ、ＯＲ２９、ＳＲ３０、
【化４】
2018535190.tif 000006
から選択され、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ３８であり；ＹはＣＲ２５Ｒ２６、Ｏ、ＳまたはＮＲ２７であり；ＺはＯ、ＳまたはＣＲ５０Ｒ５１であり；各々のＱは、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ５２であり；Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１の各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ１２、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ１−７ヘテロアルキル、ハロゲン化物、またはＮＯ２であり；Ｒ１２およびＲ１３の各々は、独立して、アシル、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであり；Ｒ１７、Ｒ２２、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８およびＲ５２の各々は、独立して、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであり；Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４の各々は、独立して、Ｈ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであり；Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５０およびＲ５１の各々は、独立して、Ｈ、ハロゲン化物、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＦ３、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルである）
またはその誘導体を使用してがんを治療する方法であって、がんは、ｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を含む、方法に関する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、本明細書に定義される化合物を使用してがんを治療する方法であって、がんは、ｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を含む、方法に関する。
【０００７】
さらに別の態様において、本発明は、患者が治療に対して反応する可能性が高いかまたは低いかを特定する方法であって、その治療は本明細書に定義される化合物の投与を含み、その方法は、患者から得られた細胞または組織試料が、ａ）ｐ５３陽性もしくはｐ５３欠損細胞またはｂ）機能しないｐ５３を含むかどうかを決定することを含み、ｐ５３欠損としての細胞もしくは組織試料または機能しないｐ５３を含有する細胞もしくは組織試料の特定は、治療に対する反応が高い患者を特定し、ｐ５３陽性としての前記試料の特定は、治療に対する反応が低い患者を特定する、方法に関する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、がんを治療するための医薬の製造における、本明細書に定義される化合物またはその誘導体の使用であって、がんはｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を含む、使用に関する。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、第１の細胞種類または第２の細胞種類を選択的に標的とする化合物を特定するためにスクリーニングする方法であって、第１の細胞種類はｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞であり、第２の細胞種類はｐ５３陽性細胞であり、第１の細胞種類は第１の検出可能なマーカーで標識され、第２の細胞種類は第２の検出可能なマーカーで標識され、その方法は、Ａ．第１の細胞種類および第２の細胞種類を化合物と接触させる工程；ならびにＢ．第１の検出可能なマーカーおよび第２の検出可能なマーカーの相対量を決定する工程を含み、第１の検出可能なマーカーおよび第２の検出可能なマーカーは独立して検出可能であり、第２のマーカーの量と比較した第１のマーカーの量の相対的増加は、ｐ５３陽性細胞を選択的に標的化する化合物の指標であり、第２のマーカーの量の相対的増加は、ｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を選択的に標的化する化合物の指標である、方法に関する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義される化合物と、さらなる治療剤とを含むキットに関する。
【００１１】
本発明は、非限定的な実施例および添付の図面と併せて考慮される場合、詳細な説明を参照して、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を使用した細胞の蛍光画像を示す。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰにより標識したＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋およびＨ２ＢＲＦＰにより標識したＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の蛍光画像を捕捉し、細胞数を定量する。これらの画像（単数および融合）は、ｐ５３の存在または不在に応じた細胞の特異的標識化を示す。
【図２Ａ】組み合わせた棒グラフおよび線グラフを示す。図２Ａは、Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を使用して画像化した細胞を示す。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰにより標識したＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋およびＨ２Ｂ−ＲＦＰにより標識したＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の共培養物を、示した濃度のニクロサミドで４８時間処理する。細胞を画像化の前に７日間回復させたままにした。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰにより標識したＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋およびＨ２Ｂ−ＲＦＰ標識化の相対パーセンテージを定量し、グラフで表す。
【図２Ｂ】細胞生存率に対するニクロサミドの影響を示す線グラフである。
【図２Ｃ】クリスタルバイオレット染色細胞の顕微鏡写真である。ＨＣＴ１１６  ｐ５３突然変異体およびそれ自体の野性型またはＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋を非標的化（ＮＴ）ｓｈＲＮＡ、またはｐ５３特異的ｓｈＲＮＡ（ｐ５３  ｓｈ  Ｉおよびｐ５３  ｓｈ  ＩＩ）のいずれかでトランスフェクトした。細胞を示した濃度のニクロサミドで４８時間処理し、新鮮な培地中で１２日間回復させた。クリスタルバイオレットで染色した細胞培養プレートにおける細胞のコロニーの画像を示す。クリスタルバイオレットは染色時に生きていた細胞のみを染色する。したがって、脱染色の増加は細胞死を示す。このデータは、ＨＣＴ１６６細胞、特にＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の生存率に対するニクロサミド処理の効果を示す。
【図２Ｄ】クリスタルバイオレット染色細胞の顕微鏡写真である。ＨＣＴ１１６  ｐ５３突然変異体およびそれ自体の野性型またはＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋を非標的化（ＮＴ）ｓｈＲＮＡ、またはｐ５３特異的ｓｈＲＮＡ（ｐ５３  ｓｈ  Ｉおよびｐ５３  ｓｈ  ＩＩ）のいずれかでトランスフェクトした。細胞を示した濃度のニクロサミドで４８時間処理し、新鮮な培地中で１２日間回復させた。クリスタルバイオレットで染色した細胞培養プレートにおける細胞のコロニーの画像を示す。クリスタルバイオレットは染色時に生きていた細胞のみを染色する。したがって、脱染色の増加は細胞死を示す。このデータは、ＨＣＴ１６６細胞、特にＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の生存率に対するニクロサミド処理の効果を示す。
【図３Ａ】野性型ヒト線維芽細胞と比較したｐ５３欠損ヒト線維芽細胞のアポトーシス作用に対するニクロサミドの効果を決定する際に収集した実験データを示す。図３Ａは、細胞をニクロサミドで処理してから７日後に撮像した正常な初代ヒト線維芽細胞の明視野画像を示す。Ｓｈｃｏｎｔｒｏｌ、ｓｈｐ５３（ＩＩＩ）およびｓｈｐ５３（ＩＩ）とは、ｓｈＲＮＡ対照およびｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするベクターでトランスフェクトした細胞を指す。
【図３Ｂ】Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣアッセイからのデータを示す複数のフローサイトメトリーのグラフを示す。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣアッセイは、ｓｈＲＮＡ対照またはｐ５３特異的ｓｈＲＮＡでトランスフェクトした正常なヒト線維芽細胞で実施した。細胞を示した濃度のニクロサミド（１〜４μＭ）で処理し、４８時間後に新鮮な培地中で回復させた。７日後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ  ＦＩＴＣを使用して細胞を染色し、フローサイトメトリーを使用してＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ  ＦＩＴＣ陽性集団のパーセンテージを定量した。まとめると、図３に示したデータは、ｐ５３欠損細胞が、ニクロサミド処理に対して増加した感度／感受性を有し、その結果、ｐ５３欠損細胞の優先的な殺傷を生じることを示す。
【図４Ａ】ニクロサミド感度についての野性型ｐ５３またはｐ５３突然変異体保有（＋／Ｒ１７２またはＲ１７２／Ｒ１７２）のいずれかによるマウス胎児線維芽（ＭＥＦ）細胞の試験結果を示す。図４Ａは明視野画像データを示し、これは、野性型細胞と異なり、ｐ５３突然変異細胞がニクロサミドに対して感度があることを示唆している。
【図４Ｂ】ヒト線維芽細胞と同様に、これらの細胞もまた、アポトーシス細胞死について試験し、そのデータを図４Ｂに示すグラフに示す。
【図４Ｃ】細胞のクリスタルバイオレット染色の画像により、ｐ５３突然変異ＭＥＦ細胞が図４Ｃに示すようにニクロサミドに対して感度があることが示された。
【図４Ｄ】野性型ｐ５３を有するＨＣＴ１１６細胞およびｐ５３欠損のＨＣＴ１１６細胞をニクロサミドにより処理し、タンパク質試料をカスパーゼ−３抗体で免疫ブロットした。ｐ５３マイナス（これはｐ５３欠損である）細胞における切断したカスパーゼの明確な誘導により、これらの細胞におけるアポトーシス細胞死が示される。このデータは、図４Ｄに示されるようにウェスタンブロットの画像で示され、表される。
【図５】共培養物中で増殖させ、示した濃度のニクロサミドとインキュベートしたＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識化）細胞およびＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−（赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）標識化）細胞の蛍光顕微鏡捕捉画像を示す。図５に示されるデータは、ｐ５３欠損細胞のスフェロイド増殖を優先的に減少させるニクロサミドの能力を示す。
【図６】ｐ５３−／−腫瘍細胞を処理する際のニクロサミドの使用を試験するためのインビボマウス腫瘍モデルにおけるセットアップおよび収集したデータを示す。図６Ａは実験の概略設計図を示す。図６Ｂは、右脇腹（Ｒ：ＤＭＳＯ処理した対照細胞（陰性対照））、より低い程度であるが、左脇腹（Ｌ：ニクロサミドで処理した細胞）における腫瘍増殖を露出するために解剖したヌードマウスの写真を示す。図６Ｃは切除した腫瘍の写真を示し、その重量を量り、その測定を右側のグラフに示す。Ｒ：右脇腹：ＤＭＳＯ処理した対照細胞（陰性対照）。Ｌ：左脇腹：ニクロサミドで処理した細胞。図６に示したデータは、ニクロサミドがインビボにおいて抗腫瘍効果を有し、ニクロサミドによる腫瘍の処理がインビボでの腫瘍体積の有意な増殖の減少を生じることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の化合物の一般的記述において、置換基における特定の種類の原子数は一般に、ある範囲として、例えば１〜７個の炭素原子を含有するアルキル基またはＣ１−７アルキルとして与えられる。このような範囲に対する参照は、特定の範囲内の整数の原子の各々を有する基に対する特定の参照を含むことを意図する。例えば、１〜７個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、２〜３個、２〜４個、２〜５個、２〜６個、２〜７個、３〜４個、３〜５個、３〜６個、３〜７個、４〜５個、４〜６個、４〜７個、５〜６個、５〜７個、６〜７個の炭素原子のアルキル基は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６およびＣ７の各々を含む。Ｃ１−７ヘテロアルキルは、例えば、１個または複数のヘテロ原子に加えて、１〜６個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、２〜３個、２〜４個、２〜５個、２〜６個、３〜４個、３〜５個、３〜６個、４〜５個、４〜６個、５〜６個の炭素原子を含む。他の数の原子および他の種類の原子は同様の方法で示され得る。
【００１４】
本明細書に使用される場合、「アルキル」という用語および「アルク−（ａｌｋ−）」という接頭辞は、直鎖および分枝鎖基の両方ならびに非環式および環式基、すなわちシクロアルキルを含む。環状基は単環であっても、多環であってもよく、包括的に３〜６個の環炭素原子を有してもよい。例示的な環状基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシル基が挙げられる。例えば、Ｃ１−７アルキル基は、置換であっても、非置換であってもよい。例示的な置換基としては、限定されないが、アルコキシ；アリールオキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、ハロゲン化物、ヒドロキシル、フルオロアルキル、パーフルオロアルキル、アミノ、アミノアルキル、二置換アミノ、第四級アミノ、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、およびカルボキシル基が挙げられる。Ｃ１−７アルキルとしては、限定されないが、メチル；エチル；ｎ−プロピル；イソプロピル；シクロプロピル；シクロプロピルメチル；シクロプロピルエチル；ｎ−ブチル；イソ−ブチル；ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；シクロブチル；シクロブチルメチル；シクロブチルエチル；ｎ−ペンチル；シクロペンチル；シクロペンチルメチル；シクロペンチルエチル；１−メチルブチル；２−メチルブチル；３−メチルブチル；２，２−ジメチルプロピル；１−エチルプロピル；１，１−ジメチルプロピル；１，２−ジメチルプロピル；１−メチルペンチル；２−メチルペンチル；３−メチルペンチル；４−メチルペンチル；１，１−ジメチルブチル；１，２−ジメチルブチル；１，３−ジメチルブチル；２，２−ジメチルブチル；２，３−ジメチルブチル；３，３−ジメチルブチル；１−エチルブチル；２−エチルブチル；１，１，２−トリメチルプロピル；１，２，２−トリメチルプロピル；１−エチル−１−メチルプロピル；１−エチル−２−メチルプロピル；およびシクロヘキシルが挙げられる。
【００１５】
本明細書に使用される場合、「Ｃ２−７アルケニル」という用語は、１つ以上の二重結合を含有し、２〜７個の炭素原子を有する分枝または非分枝炭化水素基を指す。Ｃ２−７アルケニルは、任意に非環式、単環式または多環式環を含んでもよく、各環は望ましくは３〜６員を有する。Ｃ２−７アルケニル基は置換であっても、非置換であってもよい。例示的な置換基としては、限定されないが、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、ハロゲン化物、ヒドロキシル、フルオロアルキル、パーフルオロアルキル、アミノ、アミノアルキル、二置換アミノ、第四級アミノ、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、およびカルボキシル基が挙げられる。Ｃ２−７アルケニルとしては、限定されないが、ビニル；アリル；２−シクロプロピル−１−エテニル；１−プロペニル；１−ブテニル；２−ブテニル；３−ブテニル；２−メチル−１−プロペニル；２−メチル−２−プロペニル；１−ペンテニル；２−ペンテニル；３−ペンテニル；４−ペンテニル；３−メチル−１−ブテニル；３−メチル−２−ブテニル；３−メチル−３−ブテニル；２−メチル−１−ブテニル；２−メチル−２−ブテニル；２−メチル−３−ブテニル；２−エチル−２−プロペニル；１−メチル−１−ブテニル；１−メチル−２−ブテニル；１−メチル−３−ブテニル；２−メチル−２−ペンテニル；３−メチル−２−ペンテニル；４−メチル−２−ペンテニル；２−メチル−３−ペンテニル；３−メチル−３−ペンテニル；４−メチル−３−ペンテニル；２−メチル−４−ペンテニル；３−メチル−４−ペンテニル；１，２−ジメチル−１−プロペニル；１，２−ジメチル−１−ブテニル；１，３−ジメチル−１−ブテニル；１，２−ジメチル−２−ブテニル；１，１−ジメチル−２−ブテニル；２，３−ジメチル−２−ブテニル；２，３−ジメチル−３−ブテニル；１，３−ジメチル−３−ブテニル；１，１−ジメチル−３−ブテニルおよび２，２−ジメチル−３−ブテニルが挙げられる。
【００１６】
本明細書に使用される場合、「Ｃ２−７アルキニル」という用語は、１つ以上の三重結合を含有し、２〜７個の炭素原子を有する分枝または非分枝炭化水素基を指す。Ｃ２−７アルキニルは、任意に非環式、単環式、二環式、または三環式環を含んでもよく、各環は望ましくは５または６員を有する。Ｃ２−７アルキニル基は置換であっても、非置換であってもよい。例示的な置換基としては、限定されないが、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、ハロゲン化物、ヒドロキシ、フルオロアルキル、パーフルオロアルキル、アミノ、アミノアルキル、二置換アミノ、第四級アミノ、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、およびカルボキシル基が挙げられる。Ｃ２−７アルキニルとしては、限定されないが、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、５−ヘキセン−１−イニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル；１−メチル−２−プロピニル；１−メチル−２−ブチニル；１−メチル−３−ブチニル；２−メチル−３−ブチニル；１，２−ジメチル−３−ブチニル；２，２−ジメチル−３−ブチニル；１−メチル−２−ペンチニル；２−メチル−３−ペンチニル；１−メチル−４−ペンチニル；２−メチル−４−ペンチニル；および３−メチル−４−ペンチニルが挙げられる。
【００１７】
本明細書に使用される場合、「Ｃ２−６ヘテロシクリル」という用語は、飽和、部分的に不飽和または不飽和（芳香族）であり、２〜６個の炭素原子ならびにＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１、２、３または４個のヘテロ原子からなり、上記に定義した複素環のいずれかがベンゼン環と縮合している任意の二環式基を含む、安定な５〜７員単環または７〜１４員二環式複素環を指す。ヘテロシクリル基は置換であっても、非置換であってもよい。例示的な置換基としては、限定されないが、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、ハロゲン化物、ヒドロキシ、フルオロアルキル、パーフルオロアルキル、アミノ、アミノアルキル、二置換アミノ、第四級アミノ、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、およびカルボキシル基が挙げられる。窒素および硫黄ヘテロ原子は任意に酸化されてもよい。複素環は、安定な構造を生じる任意のヘテロ原子または炭素原子を介して共有結合されてもよく、例えば、イミダゾリニル環は環炭素原子位置または窒素原子のいずれかで結合されてもよい。複素環における窒素原子は任意に四級化されてもよい。一例において、複素環におけるＳおよびＯ原子の総数が１を超える場合、これらのヘテロ原子は互いに隣接しない。複素環としては、限定されないが、１Ｈ−インダゾール、２−ピロリドニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４−ピペリジニル、４ａＨ−カルバゾール、４Ｈ−キノリジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、アクリジニル、アゾシニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソオキサゾル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイミダゾリニル（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚａｌｏｎｙｌ）、カルバゾリル、４ａＨ−カルバゾリル、ｂ−カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３−ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ−インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニルピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチオニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、プテリジニル、ピペリドニル、４−ピペリドニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾリル、ピリドイミダゾリル、ピリドチアゾリル、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノキサニル、キヌクリジニル、カルボリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニル、トリアジニル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，５−トリアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、キサンテニルが挙げられる。一例において、５〜１０員複素環としては、限定されないが、ピリジニル、ピリミジニル、トリアジニル、フラニル、チエニル、チアゾリル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、１Ｈ−インダゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾオキサゾリニル、キノリニル、およびイソキノリニルが挙げられる。一例において、５〜６員複素環としては、限定されないが、ピリジニル、ピリミジニル、トリアジニル、フラニル、チエニル、チアゾリル、ピロリル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、およびテトラゾリルが挙げられる。
【００１８】
本明細書に使用される場合、「Ｃ６−１２アリール」という用語は、共役π電子を有する炭素原子から構成される環系を有する芳香族基（例えばフェニル）を指す。アリール基は６〜１２個の炭素原子を有してもよい。アリール基は任意に、各環が望ましくは５または６員を有する、単環、二環、または三環を含んでもよい。アリール基は置換されていても、置換されていなくてもよい。例示的な置換基としては、限定されないが、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、ハロゲン化物、フルオロアルキル、カルボキシル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、一置換アミノ、二置換アミノ、および第四級アミノ基が挙げられる。
【００１９】
本明細書に使用される場合、「Ｃ７−１４アルカリル」という用語は、７〜１４個の炭素原子を有するアリール基によって置換されているアルキル（例えば、ベンジル、フェネチル、または３，４−ジクロロフェネチル）を指す。
【００２０】
本明細書に使用される場合、「Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル」という用語は、１個または複数のヘテロ原子に加えて３〜１０個の炭素原子を有するアルキル置換複素環基（例えば、限定されないが、３−フラニルメチル、２−フラニルメチル、３−テトラヒドロフラニルメチル、または２−テトラヒドロフラニルメチル）を指す。
【００２１】
本明細書に使用される場合、「Ｃ１−７ヘテロアルキル」という用語は、１個または複数のヘテロ原子に加えて１〜７個の炭素原子を有する分枝または非分枝アルキル、アルケニル、またはアルキニル基を指し、１個以上のメチレン（ＣＨ２）またはメチン（ＣＨ）は、窒素、酸素、硫黄、カルボニル、チオカルボニル、ホスホリル、またはスルホニルと置き換えられる。
【００２２】
ヘテロアルキルとしては、限定されないが、第三級アミン、第二級アミン、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、カルバメート、チオカルバメート、ホスホロアミダート、スルホンアミド、およびジスルフィドが挙げられる。ヘテロアルキルは任意に、単環、二環、または三環を含んでもよく、各々の環は望ましくは３〜６員を有する。ヘテロアルキル基は、置換されていても、置換されていなくてもよい。例示的な置換基としては、限定されないが、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、ハロゲン化物、ヒドロキシル、フルオロアルキル、パーフルオロアルキル、アミノ、アミノアルキル、二置換アミノ、第四級アミノ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、およびカルボキシル基が挙げられる。
【００２３】
本明細書に使用される場合、「アシル」という用語は、式Ｒ−Ｃ（Ｏ）−を有する化学部分を指し、式中、Ｒは、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルから選択される。
【００２４】
本明細書に使用される場合、「ハロゲン化物」という用語は、臭素、塩素、ヨウ素、またはフッ素を指す。
【００２５】
本明細書に使用される場合、「フルオロアルキル」という用語は、フッ素により置換されているアルキル基を指す。
【００２６】
本明細書に使用される場合、「パーフルオロアルキル」という用語は、炭素およびフッ素原子のみからなるアルキル基を指す。
【００２７】
本明細書に使用される場合、「カルボキシアルキル」という用語は、式−（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する化学部分を指し、式中、Ｒは、限定されないが、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであってもよい。
【００２８】
本明細書に使用される場合、「ヒドロキシアルキル」という用語は、式−（Ｒ）−ＯＨを有する化学部分を指し、式中、Ｒは、限定されないが、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであってもよい。
【００２９】
本明細書に使用される場合、「アルコキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を指し、式中、Ｒは、限定されないが、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであってもよい。
【００３０】
本明細書に使用される場合、「アリールオキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を指し、式中、Ｒは、例えば、Ｃ６−１２アリール基である。
【００３１】
本明細書に使用される場合、「アルキルチオ」という用語は、式−ＳＲの化学置換基を指し、式中、Ｒは、限定されないが、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであってもよい。
【００３２】
本明細書に使用される場合、「アリールチオ」という用語は、式−ＳＲの化学置換基を指し、式中、Ｒは、例えば、Ｃ６−１２アリール基である。
【００３３】
本明細書に使用される場合、「第四級アミノ」という用語は、式−（Ｒ）−Ｎ（Ｒ’）（Ｒ’’）（Ｒ’’’）＋の化学置換基を指し、式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は各々独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリール基である。Ｒは、置換基として第四級アミノ窒素原子を別の部分に連結しているアルキル基であってもよい。窒素原子Ｎはアルキルおよび／またはアリール基の４個の炭素原子に共有結合しており、窒素原子において正電荷を生じる。
【００３４】
本明細書に使用される場合、「突然変異」という用語は、突然変異を引き起こす可能性のあり得る細胞の遺伝物質の突然のランダム変化ならびに正常な突然変異されていない種類と出現および作用（すなわち表現型）が異なる突然変異から誘導された全ての細胞を指す。突然変異によって影響を受ける生物（特に視覚効果を有する生物）は突然変異体と記載される。体細胞変異は非生殖細胞に影響を与えるので、単一生物の組織に制限されるが、生殖細胞またはそれらの前駆体において発生する生殖細胞系突然変異は、生物の子孫に伝えられ、異常な発生を引き起こし得る。本出願において、突然変異とは、生物、ウイルスもしくは染色体外ＤＮＡのゲノムのヌクレオチド配列または他の遺伝要素の恒久的な変化を指す。突然変異はＤＮＡに対する損傷から生じ、次いでそれはエラープローン修復を受け得るか、または修復の間にエラーを引き起こし得る。突然変異はまた、可動遺伝要素に起因するＤＮＡのセグメントの挿入または欠失から生じ得る。異なる種類の突然変異には、限定されないが、置換変異、一塩基置換、サイレント変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、中立突然変異、挿入、欠失、増幅、染色体転座、中間部欠失、および染色体逆位がある。突然変異はまた、それらの結果、すなわち、例えば、遺伝子産物の突然変異していない型と比較して機能を全く有さないか、またはほとんど有さない遺伝子産物を生じる機能喪失型突然変異（不活性化変異としても知られている）に応じて分類され得る。したがって機能獲得突然変異（活性化変異としても知られている）は突然変異されていない遺伝子産物の特性の増強を生じる。
【００３５】
本明細書に使用される場合、「多型」という用語は、種のメンバーのいくつかにおいて生じる遺伝領域の配列の変化または相違を指す。バリアント配列は、種についての任意または任意ではない標準配列に対する参照と定義され得る。したがって多型は、多型の存在に起因するという点で「アレル」であると言われ、種のいくつかのメンバーは「標準的な」配列（すなわち標準的な「アレル」）を有する場合があるが、他のメンバーはバリアント配列（すなわちバリアント「アレル」）を有する場合がある。したがって、本明細書に使用される場合、アレルは、染色体上の特定の位置における遺伝子または他の遺伝領域の２つ以上の別の型のうちの１つである。最も簡単な場合、１つのバリアント配列のみが存在してもよく、したがって多型は両アレルと言われる。他の場合、種の集団は複数のアレルを含有してもよく、多型はトリアレルと呼ばれる、などである。単一の遺伝子または遺伝領域は複数の異なる非関連多型を有してもよい。例えば、それは、１つの部位において１つの両アレル多型、別の部位において別の両アレル多型、およびさらに別の部位において複数のアレル多型を有してもよい。植物の染色体座におけるアレルの群についての全ての配列が同じである場合、アレルはその座において「ホモ接合性」と言われる。植物の特定の座における任意のアレルの配列が異なる場合、アレルの集団はその座において「ヘテロ接合性」と言われる。表現型特質は環境および／または遺伝要因に起因して変化し得る。例えば、特定の染色体座における多型はその座に関連する表現型特質に影響を与え得る。
【００３６】
本明細書に使用される場合、「誘導体」という用語は、化学反応によって類似化合物から誘導される化合物を指す。誘導体はまた、構造的または機能的アナログとしても知られ得る。
【００３７】
本明細書において、疾患を予防するとは、例えば、疾患にかかりやすい傾向を有することが知られているヒトにおける疾患の発生または進行を完全にまたは部分的に阻害することを指す。既知の傾向を有するヒトの例は、家族にがんの病歴を有するヒト、または腫瘍が発生しやすい要因に曝露されているヒトである。
【００３８】
また、本明細書において、疾患を治療するとは、腫瘍の成長を阻害するか、もしくは抑制する、腫瘍を根絶する、疾患もしくは病状の少なくとも１つの兆候もしくは症状を改善する、または疾患もしくは病状が発生し始めた後、病態生理学的過程を妨げる、治療的介入を指す。
【００３９】
本明細書に使用される場合、「合成致死性」という用語は、２つ以上の遺伝子における突然変異の組み合わせが細胞死を導く、すなわちそれらの２つ以上の遺伝子における突然変異の最高点が細胞に対して致死性である状況を指す。しかしながら、突然変異が合成致死性である場合、各々の突然変異単独の発生は細胞死を生じない。例えば、宿主における２つの遺伝子、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂに関して、遺伝子ＡおよびＢの各々に存在する突然変異が細胞死を生じる場合、突然変異は合成致死性であるとみなされる。細胞における遺伝子Ａの突然変異ではないコピーおよび遺伝子Ｂのみの突然変異コピー（またはその逆、すなわち遺伝子Ａの突然変異コピーおよび遺伝子Ｂの突然変異ではないコピー）の存在は前記細胞に対して致死性ではない。このような状況（すなわち、例えば遺伝子Ａの突然変異ではない型が遺伝子Ｂの突然変異型と共に存在する場合）において、これは、突然変異の組み合わせ（遺伝的事象とも呼ばれる）が宿主における適応度の非致死性減少を生じる場合である合成病気を生じる可能性がある。したがって、合成致死性は、マージンの誤差を維持するおよび／またはスキームを緩衝する生物の能力の結果であり、これにより次に、遺伝的変異、環境変化および突然変異などのランダム事象にもかかわらず表現型安定性が可能となる。全てのこれらの要因は生物の全体的（遺伝学的）頑健性において役割を果たす。
【００４０】
本発明の詳細な説明
取られた手法は、ｐ５３機能の喪失を有する細胞に対して合成致死性である分子を発見するためのスループットスクリーニングを実施することであった。このスループットスクリーニングは、蛍光標識化した、ＨＣＴ１１６野性型およびＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞からなる細胞ベースの競合アッセイを使用して実施した。１６００超の化合物からなるｐｈａｒｍａｋｏｎライブラリーを、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の生存に対する化合物の異なる活性についてスクリーニングした。二次スクリーニングを、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞のそれらの優先的な殺傷に基づいて選択した候補化合物を検証するために実施した。
【００４１】
１６００個の異なるＦＤＡにより承認された化合物からなる、ＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のいわゆるｐｈａｍａｒｋｏｎライブラリーを使用した独立した薬物スクリーニングにおいて、本明細書に記載される化合物に従う化合物、例えばニクロサミドおよびその誘導体は、ｐ５３欠損細胞を殺傷するのに効果的であることが示された。特定の疾患、例えばがんを止めるおよび／または治療する際の化合物の有効性は、疾患細胞に対する前記化合物の効果および疾患がない細胞に対する前記化合物の効果を比較することによって決定され得る。疾患細胞は、疾患に罹患している患者または対象から得られ得るが、また、細胞培養物における特定の（疾患）細胞株であってもよい。例えば顕微鏡分析においてその表現型に基づいて非疾患細胞と疾患細胞を見分けることは可能であるが、異なるマーカーで異なる種類の細胞を各々標識することも可能であり、次いで問題となる化合物による処置後に生じる細胞集団の異なる分析においてこれらのマーカーを使用する。したがって、他の細胞種類より１つの細胞種類の標識化シグナルの増加および／または減少は、有効性に関する強度（必要とされる時間および用量を調べる場合）、および分析される化合物の致死性の指標である。したがって、一例において、第１の細胞種類または第２の細胞種類を選択的に標的とする化合物を特定するためにスクリーニングする方法であって、第１の細胞種類はｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞であり、第２の細胞種類はｐ５３陽性細胞であり、第１の細胞種類は第１の検出可能なマーカーで標識され、第２の細胞種類は第２の検出可能なマーカーで標識され、その方法は、（ａ）第１および第２の細胞種類を化合物と接触させる工程と、（ｂ）第１および第２の検出可能なマーカーの相対量を決定する工程とを含み、第１および第２の検出可能なマーカーは独立して検出可能であり、第２のマーカーの量と比較して第１のマーカーの量の相対的増加はｐ５３陽性細胞を選択的に標的化する化合物の指標であり、第２のマーカーの量の相対的増加はｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を選択的に標的化する化合物の指標である、方法が本明細書に開示される。一例において、検出可能なマーカーは、限定されないが、蛍光化合物、放射性同位体化合物、非放射性同位体化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート化合物、発色化合物、Ｘ線撮影化合物、および酵素である。別の例において、蛍光化合物には、限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。別の例において、第１の細胞種類は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）で標識され、第２の細胞種類は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識される。別の例において、細胞種類は、インビトロ、エキソビボまたはインビボで化合物と接触される。別の例において、第１および第２のマーカーの相対量は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）または定量的画像化顕微鏡法を使用して決定される。
【００４２】
ｐ５３は、この遺伝子およびそれをコードするタンパク質の活性が宿主における腫瘍の形成を停止することを意味する、腫瘍抑制遺伝子として当該分野において公知である。転写調節、ＤＮＡ修復の活性化、細胞周期の停止および修復不可能な細胞におけるアポトーシスの開始などの細胞機構はｐ５３遺伝子の抗がん特性に起因する。
【００４３】
例えば、化合物ニクロサミドは、ｐ５３野性型細胞において観察されるものより大きい程度でｐ５３欠損細胞においてアポトーシスを活性化することが見出された。これは、ｐ５３欠損細胞を標的とする際の薬物としてのニクロサミドの機能を提供する。注目すべきことに、ｐ５３欠損は全ての腫瘍の５０％より多くで見出され、それによってニクロサミドが、阻害する場合、ｐ５３欠損細胞について合成致死性である細胞経路を標的とすることが示される。したがって、一例において、本明細書において請求される化合物はｐ５３欠損細胞の選択的殺傷において使用され得る。別の例において、抗がん治療においてｐ５３欠損腫瘍細胞を標的とする際の単一化合物の使用が本明細書に開示される。別の例において、化合物はニクロサミドまたはその誘導体である。さらに別の例において、本明細書に記載される化合物を使用してがんを治療する方法が開示され、がんはｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を含む。別の例において、がんを治療する方法は、本明細書において定義される２’，５−ジクロロ−４’−ニトロサリチルアニリド（ニクロサミド）またはその誘導体を使用して開示され、がんはｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を含む。別の例において、がんを治療するための医薬の製造における本明細書に開示される化合物またはその誘導体の使用が開示され、がんはｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を含む。本明細書に開示される例のいずれかにおいて、化合物は２’，５−ジクロロ−４’−ニトロサリチルアニリド（ニクロサミド）またはその誘導体である。
【００４４】
また、ｐ５３欠損細胞を標的とする薬物による治療に対する対象の感受性を決定する方法も本明細書に開示される。これは、例えば、疾患対象から得られた試料中の特定の遺伝子の存在または不在を比較すること、および前記分析された遺伝子のレベルを、その疾患を罹患していない対象（すなわちその対象は健康であるとみなされる）から採取された試料において決定された同じ遺伝子のレベルと比較することによって行われる。この決定はまた、前記標的遺伝子の翻訳および／または転写産物、例えば限定されないが、ｍＲＮＡ転写産物、ＲＮＡ転写産物、タンパク質、異性体およびそれらの変化型において実施され得る。別の例において、遺伝子はｐ５３と同じ経路において役割を果たす遺伝子であり得る。一例において、遺伝子はｐ５３である。別の例において、決定は、ｐ５３の転写産物、すなわちｐ５３によってコードされるタンパク質で実施される。したがって、一例において、がん患者が治療に反応する可能性が高いかまたは低いかどうかを特定する方法が本明細書において開示され、治療は、本明細書に開示される化合物または本明細書に定義されるその誘導体の投与を含み、その方法は、患者由来の細胞または組織試料が、ａ）ｐ５３陽性もしくはｐ５３欠損細胞またはｂ）機能しないｐ５３を含むかどうかを決定する工程を含み、ｐ５３欠損としての細胞もしくは組織試料または機能しないｐ５３を含有する細胞もしくは組織試料の特定は、治療に反応する可能性が高い患者を特定し、ｐ５３陽性としての前記試料の特定は治療に反応する可能性が低い患者を特定する。一例において、化合物は２’，５−ジクロロ−４’−ニトロサリチルアニリド（ニクロサミド）またはその誘導体である。
【００４５】
ｐ５３遺伝子の突然変異または欠失は、種々の疾患、例えばがんを引き起こすことが知られている。一例において、がんは、限定されないが、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、肺がん、頸がん、肝がん、腎がん、血管細胞のがん（例えば白血病）、前立腺がん、結腸がん、直腸がん、大腸がん、腎臓がん、肝がん、腸がん、皮膚がん、上皮がん、骨がん、膵臓がん、リンパ腫、卵巣がん、直腸がん、肉腫、精巣がん、子宮がんおよび軟骨がんであってもよい。別の例において、がんは、限定されないが、黒色腫、骨髄腫、がん腫、肉腫、リンパ腫、芽細胞腫および生殖細胞腫瘍であってもよい。さらに別の例において、がんは、限定されないが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、基底細胞がん（ＢＣＣ）、扁平上皮がん（ＳＣＣ）もしくは黒色種などの皮膚がん、乳がん、脳腫瘍などの頭頸部がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）などの肺がん、卵巣がん、腎がん、前立腺がん、肝がん、および子宮頸がんなどのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連がんである。
【００４６】
一例において、本明細書において、式Ｉに定義される化合物：
【化５】
2018535190.tif 000007
（式中、ＤはＮまたはＣＲ９であり；ＥはＮまたはＣＲ１０であり；ＦはＮまたはＣＲ１１であり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン化物、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４、Ｒ１５、
【化６】
2018535190.tif 000008
であり、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨまたはＯＲ１２であり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、もしくはＣ１−７ヘテロアルキルであるか；またはＲ２およびＲ３は一緒になって、
【化７】
2018535190.tif 000009
によって１位が４位と結合する６員環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は各々独立して、Ｈ、ハロゲン化物、ＣＦ３、ＯＲ２８、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルから選択され；
Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は各々独立して、Ｈ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキル、ハロゲン化物、ＮＯ２、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＣＦ３、ＣＮ、ＯＲ２９、ＳＲ３０、
【化８】
2018535190.tif 000010
から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々は独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ３８であり；
Ｙは、ＣＲ２５Ｒ２６、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ２７であり；
Ｚは、Ｏ、ＳまたはＣＲ５０Ｒ５１であり；
各々のＱは独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ５２であり；
Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１は各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ１２、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ１−７ヘテロアルキル、ハロゲン化物、またはＮＯ２であり；
Ｒ１２およびＲ１３は各々独立して、アシル、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであり；
Ｒ１７、Ｒ２２、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８、およびＲ５２は各々独立して、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであり、
Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４は各々独立して、Ｈ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルであり；Ｒ３９、Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５０およびＲ５１は各々独立して、Ｈ、ハロゲン化物、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＦ３、Ｃ１−７アルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル、Ｃ２−６ヘテロシクリル、Ｃ６−１２アリール、Ｃ７−１４アルカリル、Ｃ３−１０アルクヘテロシクリル、またはＣ１−７ヘテロアルキルである）
またはその誘導体を使用してがんを治療する方法が開示され、がんはｐ５３欠損細胞またはｐ５３が機能しない細胞を含む。一例において、Ｘ１は酸素原子であり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＨである。別の例において、Ｄ、ＥおよびＦは各々独立してＣＨである。別の例において、Ｒ１はＨまたはハロゲン化物である。別の例において、Ｒ１はＣｌである。一例において、Ｒ４およびＲ８は独立してＨ、ハロゲン化物またはＣＦ３である。別の例において、Ｒ４はＣｌである。別の例において、Ｒ８はＨである。一例において、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｈ、ハロゲン化物、ＮＯ２、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＣＦ３またはＣＮである。一例において、Ｒ５はＨである。別の例において、Ｒ６はＮＯ２である。さらに別の例において、Ｒ７はＨである。一例において、Ｘ１は酸素原子であり、Ｒ１はＣｌであり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＣｌであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＮＯ２であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８はＨである。
【００４７】
一例において、Ｄ、ＥおよびＦは各々独立してＣＨであり；Ｘ１は酸素原子であり、Ｒ１はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４、またはＲ１５のいずれか１つであり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＣｌであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＮＯ２であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８はＨである。別の一例において、Ｄ、ＥおよびＦは各々独立してＣＨであり；Ｘ１は酸素原子であり、Ｒ１はＣｌであり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４またはＲ１５のうちのいずれか１つであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＮＯ２であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８はＨである。さらに別の例において、Ｄ、ＥおよびＦは各々独立してＣＨであり；Ｘ１は酸素原子であり、Ｒ１はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｈ、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４、またはＲ１５のうちのいずれか１つであり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｈ、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４、またはＲ１５のいずれか１つであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＮＯ２であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８はＨである。一例において、Ｄ、ＥおよびＦは各々独立してＣＨであり；Ｘ１は酸素原子であり、Ｒ１はＣｌであり、Ｒ２はＨ、ＯＨまたはＯＲ１２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＣｌであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＮＯ２であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８はＨである。さらに別の例において、Ｄ、ＥおよびＦは各々独立してＣＨであり；Ｘ１は酸素原子であり、Ｒ１はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｈ、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４、またはＲ１５のうちのいずれか１つであり、Ｒ２はＨ、ＯＨまたはＯＲ１２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｈ、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４、またはＲ１５のうちのいずれか１つであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＮＯ２であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８はＨである。さらなる例において、Ｄ、ＥおよびＦは各々独立してＣＨであり；Ｘ１は酸素原子であり、Ｒ１はＣｌであり、Ｒ２はＨ、ＯＨまたはＯＲ１２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｈ、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４またはＲ１５のうちのいずれか１つであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＮＯ２であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８はＨである。さらに別の例において、Ｄ、ＥおよびＦは各々独立してＣＨであり；Ｘ１は酸素原子であり、Ｒ１はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｈ、ＯＲ１２、ＳＲ１３、ＮＲ１４、またはＲ１５のうちのいずれか１つであり、Ｒ２はＨ、ＯＨまたはＯＲ１２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＣｌであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＮＯ２であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８はＨである。別の例において、化合物はニクロサミドである。別の例において、化合物は以下の構造
【化９】
2018535190.tif 000011
またはその誘導体による。別の例において、本明細書において請求される化合物は抗がん療法に使用される。別の例において、本明細書に開示される化合物またはその誘導体と、本明細書に記載されるさらなる治療剤とを含むキットが本明細書に開示される。
【００４８】
本発明の一例において、上記に概説した化合物は薬学的に許容可能な塩として提示される。「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本発明の化合物の塩を指す。本発明の化合物の適切な薬学的に許容可能な塩は、例えば、本発明の化合物の溶液を、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸などの薬学的に許容可能な酸の溶液と混合することによって形成され得る酸付加塩を含む。さらに、本発明の化合物が酸性部分を保有する場合、その適切な薬学的に許容可能な塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムまたはカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムまたはマグネシウム塩）；および適切な有機リガンドにより形成される塩（例えば、アンモニウム、第四級アンモニウムならびにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸アルキルおよびアリールスルホン酸塩などの対アニオンを使用して形成されるアミンカチオン）が挙げられ得る。薬学的に許容可能な塩の例示的な例としては、限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、ショウノウ酸塩（ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ）、カンファースルホネート、カンシラート、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、エタンスルホネート、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプテート、グルコヘプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニレート（ｇｌｙｃｏｌｙｌａｒｓａｎｉｌａｔｅ）、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホネート、ヒドロキシナフトエート、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシラート、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、２−ナフタレンスルホネート、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボナート）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチネート、過硫酸塩、３−フェニルプロピオネート、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシレート、トリエチオジド、ウンデカノエート、吉草酸塩などが挙げられる。本発明のある特定の化合物は、化合物を塩基または酸付加塩に変換することができる塩基性および酸性機能の両方を含む。
【００４９】
化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させ、従来のように親化合物単離することによって再生され得る。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解度などの特定の物理的性質において様々な塩形態と異なるが、別様では塩は本発明の目的のための化合物の親形態と同等である。
【００５０】
塩形態に加えて、本発明はプロドラッグ形態である化合物を提供する。本明細書に記載される化合物のプロドラッグは、本明細書に記載される化合物を提供するために生理的条件下で容易に化学変化を受けるそれらの化合物である。プロドラッグは、患者へのプロドラッグの投与後、加水分解、代謝などのインビボ生理的作用により、本発明の化合物に化学的に変換される薬理学的に活性または不活性な化合物である。さらに、プロドラッグは、エキソビボ環境において化学的または生化学的方法によって本発明の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは、適切な酵素を有する経皮パッチリザーバーに配置される場合、本発明の化合物にゆっくり変換され得る。プロドラッグを作製し、使用する際に関係する適合性および技術は当業者に周知である。マスクされた酸性アニオンの例としては、アルキル（例えば、メチル、エチル）、シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル）、アラルキル（例えば、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル）、およびアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、ピバロイルオキシメチル）などの様々なエステルが挙げられる。アミンは、遊離薬物およびホルムアルデヒドをインビボで放出するエステラーゼによって切断されるアリールカルボニルオキシメチル置換誘導体としてマスクされている。また、イミダゾール、イミド、インドールなどの酸性ＮＨ基を含有する薬物は、Ｎ−アシルオキシメチル基によりマスクされている。ヒドロキシ基はエステルおよびエーテルとしてマスクされている。さらに、１つの立体化学（例えば（Ｒ））を有する化合物は、多くの場合、周知の方法を使用して、例えば反転によって反対の立体化学（すなわち（Ｓ））を有する化合物を生成するために利用され得る。
【００５１】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態および水和形態を含む溶媒和形態で存在してもよい。一般に、溶媒和形態は非溶媒和形態と同等であり、本発明の範囲内に包含されることを意図する。本発明の特定の化合物は複数の結晶または非結晶質形態で存在してもよい。一般に、全ての物理形態は本発明に企図される使用について等価であり、それらは本発明の範囲内であることを意図する。
【００５２】
本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有する。ラセミ化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体は全て本発明の範囲内に含まれることを意図する。したがって、本発明の化合物は、立体異性体の混合物、特にエナンチオマーの混合物、および精製された立体異性体、特に精製されたエナンチオマー、または立体異性的に豊富な混合物、特にエナンチオマー的に豊富な混合物を含む。また、本明細書に開示される化合物の個々の異性体、およびそれらの任意の完全または部分的に平衡化した混合物も本発明の範囲内に含まれる。本発明はまた、１つ以上のキラル中心が反転している、それらの異性体を有する混合物として本明細書に開示される式によって表される化合物の個々の異性体を含む。また、本明細書に開示される化合物の全ての互変異性体および互変異性体の混合物も本明細書に開示される化合物の範囲内に含まれると理解される。
【００５３】
得られたラセミ化合物は、それ自体公知の方法によって機械的または化学的に異性体に分割され得る。ジアステレオマーは好ましくは、光学的に活性な分割剤との反応によってラセミ混合物から形成される。
【００５４】
適切な分割剤の例は、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸またはカンファースルホン酸などの種々の光学的に活性なカンファースルホン酸のＤおよびＬ型などの光学的に活性な酸である。また、光学的に活性な分割剤（例えばジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を充填したカラムを用いたエナンチオマー分割も有益であり、適切な溶離液の例はヘキサン／イソプロパノール／アセトニトリル混合物である。
【００５５】
また、ジアステレオマー分割は、例えば、クロマトグラフィーまたは分別結晶などの標準的な精製プロセスによって実施され得る。
【００５６】
本発明によれば有用な化合物または組成物内の化合物は、塩またはエステル、例えば薬学的に許容可能な塩またはエステルとして存在してもよい。本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩としては、適切なその酸付加または塩基性塩が挙げられる。塩は、例えば、鉱酸、例えば、硫酸、リン酸またはハロゲン化水素酸などの強無機酸；酢酸などの、置換されていないか、または置換されている（例えばハロゲンによって）１〜４個の炭素原子のアルカンカルボン酸などの強有機カルボン酸；飽和または不飽和ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸またはテトラフタル酸；ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはクエン酸；アミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸；安息香酸；またはメタン−もしくはｐ−トルエン硫酸などの、置換されていないか、もしくは置換されている（例えば、ハロゲンによって）（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−もしくはアリール−スルホン酸などの有機スルホン酸により形成される。
【００５７】
エステルは、エステル化される官能基に応じて有機酸またはアルコール／水酸化物のいずれかを使用して形成される。有機酸としては、酢酸などの、置換されていないか、または置換されている（例えばハロゲンによって）１〜１２個の炭素原子のアルカンカルボン酸などのカルボン酸；飽和または不飽和ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸またはテトラフタル酸；ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはクエン酸；アミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸；安息香酸；または有機スルホン酸、例えば、メタン−もしくはｐ−トルエンスルホン酸などの、置換されていないか、もしくは置換されている（例えばハロゲンによって）（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−もしくはアリール−スルホン酸が挙げられる。適切な水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウムなどの無機水酸化物が挙げられる。アルコールとしては、置換されていないか、または置換されていてもよい（例えばハロゲンによって）１〜１２個の炭素原子のアルカンアルコールが挙げられる。
【００５８】
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する１つ以上の原子において非天然の割合の原子同位体を含有してもよい。本発明の薬剤またはその薬学的に許容可能な塩の同位体バリエーションは、少なくとも１つの原子が、同じ原子番号を有するが、原子質量が天然に通常見出される原子質量と異なる原子と置き換えられるものと定義される。薬剤およびその薬学的に許容可能な塩に組み込まれ得る同位体の例としては、それぞれ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆおよび３６Ｃｌなどの、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体が挙げられる。薬剤およびその薬学的に許容可能な塩、例えば、３Ｈまたは１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれるもの特定の同位体バリエーションは、薬物および／または基質組織分布研究において有用であるものである。トリチウム化、すなわち、３Ｈおよび炭素−１４、すなわち、１４Ｃ同位体が、それらの調製および検出可能性の容易さのために使用される。さらに、重水素、すなわち、３Ｈなどの同位体による置換は、より大きな代謝安定性、例えば、インビボ半減期の増加または必要投薬量の低減に起因する特定の治療有益性をもたらすことができるので、一部の状況において実施されてもよい。本発明の薬剤およびその薬学的に許容可能な塩の同位体バリエーションは一般に、適切な試薬の適切な同位体バリエーションを使用して従来の手順によって調製され得る。
【００５９】
放射性であるかないかに関わらず、本発明の化合物および組成物の全ての同位体バリエーションは本発明の範囲内に含まれることを意図する。
【００６０】
本発明はまた、本発明に従って有用な本明細書に開示される化合物による化合物または組成物内の化合物の溶媒和物形態を含む。請求項に使用される用語はこれらの形態を包含する。
【００６１】
本発明はさらに、種々の結晶形態、多形体および（無）水和形態における本発明に従って有用な本明細書に開示される化合物による化合物または本発明の組成物内の化合物に関する。化学的化合物は、そのような化合物の合成調製に使用される溶媒からの精製および／または単離の方法をわずかに変化させることによってそのような形態のいずれかで単離され得ることは製薬工業において十分に確立されている。
【００６２】
本出願において言及されている「医薬組成物」は、本発明の少なくとも１種の化合物および少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体を含む。本発明の化合物から医薬組成物を調製するために、薬学的に許容可能な担体は固体または液体のいずれであってもよい。固体形態調製物としては、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒が挙げられる。固体担体は、希釈剤、矯味矯臭剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤、または封入剤としても作用し得る１種以上の物質であってもよい。
【００６３】
粉剤において、担体は、微粉化した活性成分を有する混合物である、微粉化した固体である。錠剤において、活性成分は、適切な割合で必要な結合特性を有する担体と混合され、所望の形状およびサイズに小型化される。
【００６４】
粉剤および錠剤は５％〜８０％または２０％〜７０％の活性化合物（複数も含む）を含有してもよい。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどである。「調製物」という用語は、他の担体を有しても有さなくてもよい活性成分が担体によって囲まれ、したがって担体と会合しているカプセル剤を提供する担体として封入材料を有する活性化合物の製剤を含むことを意図する。同様に、カシェ剤およびドロップ剤が含まれる。錠剤、粉剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤およびドロップ剤は、経口投与用の固体投薬形態として使用され得る。
【００６５】
坐剤を調製するために、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物などの低融点ワックスが最初に融解され、活性成分が撹拌によってその中に均一に分散される。次いで融解された均一な混合物は都合の良いサイズの型に注がれ、冷却され、それによって凝固する。液体形態調製物としては、液剤、懸濁剤、およびエマルション、例えば、水または水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。液体形態は眼への局所適用にとって特に好ましい。非経口注射のために、液体調製物は水性ポリエチレングリコール溶液の溶液中で製剤化され得る。
【００６６】
経口使用に適した水性溶液は、活性成分を水中に溶解し、所望のように適切な着色剤、香味料、安定剤および増粘剤を加えることによって調製され得る。経口使用に適した水性懸濁剤は、微粉化された活性成分を、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび他の周知の懸濁化剤などの粘着性物質を有する水に分散することによって作製され得る。
【００６７】
また、使用直前に、経口投与用の液体形態調製物に変換することを意図する固体形態調製物も含まれる。そのような液体形態としては、液剤、懸濁剤およびエマルションが含まれる。これらの調製物は、活性成分に加えて、着色剤、香味料、安定剤、緩衝剤、人口および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含有してもよい。
【００６８】
医薬調製物は単位投薬形態であってもよい。このような形態において、調製物は適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分される。単位投薬形態は、パッケージ化された調製物、バイアルまたはアンプル中のパッケージ化された錠剤、カプセル剤および粉剤などの別々の量の調製物を含有するパッケージであってもよい。また、単位投薬形態は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、もしくはドロップ剤自体であってもよいか、またはそれはパッケージ化された形態の適切な数のそれらの任意のものであってもよい。
【００６９】
一例において、本明細書に開示される方法によれば、化合物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０００ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１７．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜７．５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１２．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１７．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１２００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１３００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１４００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１６００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１７００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１８００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１９００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２２００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２３００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２４００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２５００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２６００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２７００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２８００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２９００ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約３００ｍｇ／ｋｇの濃度（または用量）で投与される。一例において、化合物は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。別の例において、化合物は２’，５−ジクロロ−４’−ニトロサリチルアニリド（ニクロサミド）またはその誘導体である。
【００７０】
組み合わせの各成分の投薬量、投与頻度および投与様式は独立して制御され得る。例えば、１つの化合物、例えば、ニクロサミドは１日に１回経口投与されるが、第２の化合物、例えば、抗増殖または治療剤は、１日に２回静脈内投与される。治療は休止期間を含むオンおよびオフサイクルで与えられ得る。それにより患者の身体は今までのところ予想されない副作用から回復する機会を有する。化合物はまた、１回の投与が両方の化合物を送達するように一緒に製剤化されてもよい。したがって、本明細書に開示される式のいずれかを有する化合物は、同時に、または例えば本明細書に記載される疾患のいずれか、例えばがんを治療するために、例えば本明細書に開示される１種以上の治療剤の投与から１４日以内に投与されてもよい。
【００７１】
本発明の特定の方法は、さらなる治療剤（すなわち、本発明の化合物以外の治療剤）の投与をさらに含む。一例において、本明細書に開示される化合物は少なくとも１種のさらなる治療剤をさらに含んでもよい。別の例において、２’，５−ジクロロ−４’−ニトロサリチルアニリド（ニクロサミド）、またはその誘導体がさらなる治療剤と共に投与される。治療剤の種類の例としては、限定されないが、化学療法剤、細胞成長を標的化できる抗がん剤、細胞増殖抑制剤もしくは細胞毒性化合物、生存、血管形成、接着、移動、浸潤、転移、細胞周期進行および／もしくは細胞分化を標的化できる抗がん剤；細胞成長、生存、血管形成、接着、移動、浸潤、転移、細胞周期進行および／もしくは細胞分化を標的化できる低分子薬；転移性骨がん治療のためのビスホスフォネート薬；アルキル化物質、代謝拮抗物質、抗生物質、エポチロン、核内受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、抗アンドロゲン剤、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモンおよび抗ホルモン、インターフェロンおよび細胞周期依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＫ）の阻害剤、シクロオキシゲナーゼおよび／もしくはリポキシゲナーゼの阻害剤、プロスタノイドおよびロイコトリエンを含む生体脂肪酸および脂肪酸誘導体、タンパク質キナーゼの阻害剤、タンパク質ホスファターゼの阻害剤、脂質キナーゼの阻害剤、白金配位錯体、エチレンイミン、メチルメラミン、トラジン（ｔｒａｚｉｎｅ）、ビンカアルカロイド、ピリミジン類似体、プリン類似体、アルキルスルホネート、葉酸類似体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン、誘導体ペプチド治療剤ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００７２】
治療剤の例としては、限定されないが、１０−ヒドロキシカンプトテシン、アブラキサン、アセジアスルホン、アクラルビシン、塩酸アクラビン、アンバゾン、アムサクリン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、塩酸アンシタビン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、フォリン酸カルシウム、カルボプラチン、カルペシタビン（ｃａｒｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダプソン、ダウノルビシン、ジブロムプロパミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エメチン、エンジイン、エピルビシン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、リン酸エストラムスチン、エストロゲン、エチニルエストラジオール、エトポシド、エピルビシン塩酸塩、ファソロデックス、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミドホスフェストロール、フラゾリドン、ガンボギン酸アミド、ガンボギン酸、ゲムシタビン、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、ハーセプチン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンγ、イリノテカン、イマチニブ、イリノテカン、レトロゾール、リュープロリド、ロムスチン、ラルトテカン、マフェニドスルフェートオラミド、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロンアセテート、メガストロールアセテート（ｍｅｇａｓｔｒｏｌａｃｅｔａｔｅ）、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトロニダゾール、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド、ニフララジン、ニフルチモックス、ニムスチン、ニノラゾール（ｎｉｎｏｒａｚｏｌｅ）、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムシン（ｏｌｅｏｍｕｃｉｎ）、オキソリン酸、オキサリプラチン、ウワバイン、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチゾール、酢酸フェニル水銀、ピクロポドフィロトキシン、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プロイシン、プリスチメリン、プロカルバジン、ピリメタミン、塩酸キナクリン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロテノン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、ラロキシフェン、サラゾスルファピリジン、スクリフラビニウムクロリド、セムスチン、ストレプトゾシン、スルファカルバミド、スルファセタミド、スルファクロピリダジン（ｓｕｌｆａｃｈｌｏｐｙｒｉｄａｚｉｎｅ）、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノ−ル、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コトリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、���ルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフィソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テモゾリミド（ｔｅｍｏｚｏｌｉｍｉｄｅ）、テニポシド、テルチポシド（ｔｅｒｔｉｐｏｓｉｄｅ）、テストラクトン、テストステロンプロピオネート、チメロサール、チオグアニン、チオテパ、イミダゾール、トポテカン、トラスツズマブ、トリアジクオン、トレオサルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、ＵＣＮ−０１、ビンブラスチン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン、ビノレルビン、およびゾルビシン、またはそれらの誘導体またはそれらの類似体である。一例において、化学療法剤は、限定されないが、シスプラチン、エトポシド、アブラキサン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、イマチニブ、イリノテカン、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、メトトレキサート、クロラムブシル、ドキソルビシン、ダカルバジン、シクロホスファミド、パクリタキセル、５−フルオウラシル、ゲムシタビン、ビンクリスチン、ドセタキセル、ビノレルビンまたはエポチロンＢである。
【００７３】
本開示はまた、併用療法および組成物を記載しており、すなわち、本明細書に記載される化合物は、さらなる治療剤と同時に、連続して、もしくは別々にまたはそれらの組み合わせで投与され得る。したがって、一例において、投与は同時であり、すなわち、本明細書に開示される化合物、例えばニクロサミド、およびさらなる治療剤の両方は同時に投与される。別の例において、本明細書に開示される化合物、例えばニクロサミド、およびさらなる治療剤は別々に投与される。さらに別の例において、組換えデルマトポンチンおよびさらなる治療剤は別々に投与され、すなわち、例えばニクロサミドが最初に投与されてもよく、続いてさらなる治療化合物が投与されてもよい。あるいは、別の例において、さらなる治療剤が最初に投与されてもよく、続いて例えばニクロサミドが投与されてもよい。さらに別の例において、第１の治療剤が投与され、その後、本明細書に開示される化合物、例えばニクロサミドが投与され、続いて第２の治療剤が投与される。さらなる例において、１つの治療剤が投与され、続いて組換えデルマトポンチンの後の投与が第２の治療剤と同時になされる。一例において、さらなる治療剤は、本明細書に定義される化合物の投与と同時に、別々にまたはその投与後、連続して投与される。別の例において、さらなる治療剤は、２’，５−ジクロロ−４’−ニトロサリチルアニリド（ニクロサミド）の投与と同時に、別々にまたはその投与後、連続して投与される。
【００７４】
本発明による化合物は、経口、直腸、胃内、頭蓋内および非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、経鼻、皮内、皮下、蓄積注射および同様の投与経路を含む、種々の周知の経路によって投与されてもよい。投与経路に応じて、異なる医薬製剤が必要とされ、それらのいくつかは、例えば消化管における本発明の化合物の分解を防ぐために保護コーティングが薬物製剤に適用されることを必要とし得る。一例において、治療方法は、限定されないが、経口、脂肪内（ｉｎｔｒａａｄｉｐｏｓａｌｌｙ）、動脈内、関節内、脳内、皮内、病巣内、筋肉内、鼻内、眼内（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒａｌｌｙ）、心膜内、腹腔内、胸膜内、腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ）、腸内、髄腔内、気管内、腫瘍内、臍下、膣内、静脈内、小胞内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｌｙ）、硝子体内、リポソーム的（ｌｉｐｏｓｏｍａｌｌｙ）、局部、粘膜、経口、非経口、直腸、結膜下、皮下、舌下、局所、経頬、経皮、膣、クリーム剤、脂質組成物、カテーテル経由、洗浄液経由、持続注入、注入、吸入、注射、局部送達、局部かん流、標的細胞を直接浸して、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい、１つ以上の投与経路を含んでもよい。一例において、本明細書に開示される化合物は経口投与される。別の例において、本明細書に開示される化合物は経皮または局所投与される。
【００７５】
上記に開示した投与経路によれば、本発明の化合物は、シロップ剤、注入または注射溶液、錠剤、カプセル剤、カプレット、ドロップ剤、リポソーム、坐剤、プラスター、バンドエイド、遅延カプセル剤、粉剤、または持続放出製剤として製剤化されてもよい。一例において、化合物２’，５−ジクロロ−４’−ニトロサリチルアニリド（ニクロサミド）またはその誘導体は、限定されないが、以下のいずれか１つに従って製剤化される：錠剤、カプレット、カプセル剤、硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、軟質弾性ゼラチンカプセル剤、硬質ゼラチンカプセル剤、カシェ剤、トローチ剤、ドロップ剤、分散剤、坐剤、軟膏、パップ剤、湿布、ペースト、粉剤、包帯剤、クリーム剤、プラスター、液剤、パッチ、エアロゾル、鼻腔用スプレー、吸入剤、ゲル、懸濁剤、水性液体懸濁剤、非水性液体懸濁剤、水中油エマルション、油中水液体エマルション、液剤、滅菌固形剤、結晶性固形剤、非晶質固形剤、再構成用固形剤またはそれらの組み合わせ。
【００７６】
請求される化合物の投薬量は、限定されないが、投与方法、治療される疾患、疾患の重症度、疾患が治療または予防されるかどうか、ならびに治療される患者の年齢、体重および健康を含む、いくつかの要因に依存する。
【００７７】
上記のように、本明細書に記載される化合物は、例えば、限定されないが、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、もしくはシロップ剤の形態での経口、または坐剤の形態での直腸の種々の形態で投与されてもよい。化合物の非経口投与は、好適には、例えば、生理食塩水の形態またはリポソームに組み込まれた化合物で実施される。化合物それ自体が十分に溶解しない場合、エタノールなどの可溶化剤が適用されてもよい。以下の段落において、例示および説明目的のために、ニクロサミドの投薬量が記載される。当業者は、代替の化合物がニクロサミドの代わりになる場合、正確な投薬量は、細胞増殖アッセイにおいて化合物の有効性、および哺乳動物、例えばヒトにおけるその毒性を調べることによって決定され得ることを理解するであろう。局所投与のために、ニクロサミドは１〜２５０ｇ／Ｌの液剤、クリーム剤、またはゲルで提供される。非経口または腸内投与のために、ニクロサミドは約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日で投与される。経口投与のために、ニクロサミドは約１０〜３０００ｍｇ／日で投与される。
【００７８】
経口投与のために、本明細書に開示される化合物、例えばニクロサミドの投薬量は１回の投与量につき約０．００１ｍｇ〜３０００ｍｇである。一例において、経口投薬量は約０．０５ｍｇ〜２０００ｍｇである。別の例において、経口投薬量は約０．５ｍｇ〜１０００ｍｇである。別の例において、経口投薬量は１日に１〜１０回投与される。別の例において、経口投薬量は１日に１〜５回投与される。別の例において、経口投薬量は１日に１〜３回投与される。投薬量は、本明細書に開示される化合物、例えばニクロサミドが投与されない時間の間が存在するようなサイクルで与えられてもよい。一例において、この期間は、例えば、限定されないが、１日に約１回、１週間に約１回、１ヶ月に約１回、または１年に約１回、またはそれ以上に約１回のいずれかであってもよい。
【００７９】
感染を防ぐための直腸用途に適合される組成物のために、いくらかのより多くの量の化合物が通常好ましい。したがって、一例において、本明細書に開示される化合物の直腸投薬量、例えばニクロサミドの投薬量は、１回の用量につき約０．５ｍｇ〜２５００ｍｇである。別の例において、直腸投薬量は約０．５ｍｇ〜１５００ｍｇである。別の例において、直腸投薬量は１日に１〜４回投与される。治療期間は経口投与について上記した通りである。
【００８０】
本明細書に開示される化合物、例えばニクロサミドの静脈内または筋肉内投与のために、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量が推奨される。別の例において、推奨される用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである。さらに別の例において、推奨される用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。
【００８１】
化合物は最大で約６ヶ月〜１２ヶ月またはそれ以上の間、毎日投与されてもよい。化合物は１〜３時間にわたって投与されることが望ましい。一例において、この期間は少なくとも２４時間またはそれ以上に延ばされてもよい。
【００８２】
吸入のために、本明細書に開示される化合物、例えばニクロサミドは、毎日約０．００１ｍｇ〜５０００ｍｇの用量で投与される。一例において、吸入用量は毎日約０．５ｍｇ〜２０００ｍｇである。
【００８３】
本明細書に開示される化合物、例えばニクロサミドの局所／経皮投与のために、約１ｍｇ〜約５ｍｇの用量が、１週〜１２ヶ月の期間にわたって１日に１〜１０回投与される。
【００８４】
本発明の化合物の投与のための医薬品形態は、注射可能な用途に適した形態であり、滅菌水溶液または分散系および滅菌注射溶液または分散系の即時調製用の滅菌粉剤を含む。全ての場合、最終溶液または分散形態は滅菌され、流体でなければならない。典型的に、このような溶液または分散系は、例えば、水により緩衝化された水溶液、例えば生体適合性緩衝液、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、それらの適切な混合物、界面活性剤または植物油を含有する、溶媒または分散媒体を含む。本発明の化合物はまた、特に非経口投与のためのリポソームに製剤化されてもよい。リポソームは、遊離薬物と比較して循環中の高い半減期および封入薬物の長期のより均一な放出の利点を提供する。
【００８５】
注入または注射溶液の滅菌は、限定されないが、抗菌または抗真菌剤のような防腐剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサール（ｔｈｉｍｅｒｓａｌ）の添加を含む、いくつもの当該分野において認識されている技術によって達成され得る。さらに、糖または塩などの等張剤、特に塩化ナトリウムが注入または注射溶液に組み込まれてもよい。本発明の化合物の１つまたは複数を含有する滅菌注射溶液の生成は、上記に列挙した種々の成分を有する適切な溶媒中に必要な量のそれぞれの化合物を組み込み、必要に応じてその後、滅菌することによって達成される。滅菌粉剤を得るために、上記の溶液は必要に応じて真空乾燥または凍結乾燥される。本発明の希釈剤は、限定されないが、水、生理学的に許容可能な緩衝剤、生理学的に許容可能な緩衝塩溶液または塩溶液である。担体は、限定されないが、ココアバターおよびビテベソール（ｖｉｔｅｂｅｓｏｌｅ）である。既に上記で述べた賦形剤以外に、限定されないが、本発明の化合物の種々の医薬品形態と共に使用される以下の賦形剤も選択されてもよい：
ａ）ラクトース、マンニトール、結晶性ソルビトール、二塩基性リン酸、リン酸カルシウム、糖、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；
ｂ）ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、硬化植物油、ロイシン、グリセリドおよびステアリルフマル酸ナトリウムなどの潤滑剤、
ｃ）デンプン、クロスカルメロース（ｃｒｏｓｃａｒａｍｅｌｌｏｓｅ）、メチルセルロースナトリウム、寒天、ベントナイト、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの崩壊剤。
【００８６】
他の適切な賦形剤は当該分野において知られている見解に従って決定され得る。障害の重症度および本発明の化合物の１つで治療可能な特定の種類、ならびに治療されるそれぞれの患者、例えば患者の全身の健康状態などに応じて、それぞれの化合物の異なる用量が治療的または予防的効果を引き出すために必要とされることは理解される。適切な用量の決定は担当医の裁量の範囲内である。当該分野において知られているように、所与の組成物の薬学的に有効な量もまた、投与経路に依存する。一般に、必要とされる量は、例えば、坐剤、直腸または胃内プローブによって投与が消化管を経由する場合、より高くなり、投与経路が非経口、例えば静脈内である場合、より低くなる。
【００８７】
本発明の意味において、置換基または可変物の組み合わせは、そのような組み合わせが安定なまたは化学的に実現可能な化合物を生じる場合にのみ許容される。安定な化合物または化学的に実現可能な化合物は、水分または他の化学的反応条件の不在下で４０℃未満の温度にて維持する場合、少なくとも１週間、実質的に変化しない化合物である。本発明はまた、本明細書に開示される化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化（ｑｕａｒｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ）を想定する。水もしくは油溶性または分散性生成物がこのような四級化によって得られ得る。
【００８８】
化合物は、経口、静脈内、髄腔内または実質内投与用に製剤化され得る。本明細書に開示される化合物およびその誘導体は経口投与されるので、それらの化合物は経口投与用に製剤化され得る。この場合、適切な量の化合物またはその誘導体は、最も有効な濃度が疾患部位、例えば腫瘍にて同時に達成されるような同時投与のために容易に組み合わされてもよい。
【００８９】
本明細書に例示的に記載される本発明は、好適には、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（複数も含む）、制限（複数も含む）の不在下で実施されてもよい。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」などの用語は、拡張的に読まれ、限定ではない。さらに、本明細書に利用される用語および表現は、説明の用語として使用され、限定ではなく、示され、記載される特徴の任意の等価物またはその部分を排除するこのような用語および表現の使用を意図しないが、種々の修飾が本特許請求の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、例および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書において具現化される本発明の修飾および変更が当業者によって再分類されてもよく、そのような修飾および変更は本発明の範囲内であるとみなされることは理解されるべきである。
【００９０】
本発明は本明細書において広範におよび総称的に記載されている。総称的な開示の範囲内に含まれるより狭い種および亜属の分類の各々も本発明の一部を形成する。これは、取り除いた事柄が本明細書に具体的に列挙されているか否かに関わらず、条件付きでまたは属から任意の主題を除く否定的限定で本発明の一般的記述を含む。
【００９１】
他の実施形態は添付の特許請求の範囲および非限定的な実施例の範囲内である。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の表現で記載されている場合、当業者は、本発明がまた、マーカッシュ群の任意の個々の要素または要素の下位集団に関して記載されていることを認識するであろう。
【実施例】
【００９２】
ニクロサミドはｐ５３欠損細胞を感作する
本明細書に開示される化合物、例えばニクロサミドまたはその誘導体は、ｐ５３欠損細胞の優先的な感作を誘導することが示された。ニクロサミドは、野性型ｐ５３を保有しているＨＣＴ１１６および正常なヒト線維芽細胞と比較して、ＨＣＴ１１６  ｐ５３ノックアウト細胞およびｐ５３遺伝子がｐ５３特異的ｓｈＲＮＡを使用してノックダウンしている正常なヒト線維芽細胞の増加したアポトーシスを生じる。野性型ｐ５３機能を有さない細胞の生存の喪失は、ヌードマウスにおける減少したスフェロイド増殖および低減した腫瘍増殖に変換される。
【００９３】
ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−細胞を使用した薬物化合物のスクリーニング
安定に発現するＨ２Ｂ−ＧＦＰ−ＨＣＴｐ５３＋／＋細胞（野性型ｐ５３細胞）およびＨ２Ｂ−ＲＦＰ−ＨＣＴｐ５３−／−細胞（ｐ５３を欠く細胞）を、野性型ｐ５３細胞またはｐ５３陰性細胞のいずれかを感作する薬物化合物をスクリーニングするために共培養物中で増殖させた。簡潔に述べると、ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびＨＣＴ１１６ｐ５３−／−各々の２００個の細胞を、１つのウェル当たり８０μｌの最終体積にて１つのウェル当たり４００個の細胞の最終細胞密度にてプレコートした３８４ウェル薬物プレートに平板培養した。細胞をそれぞれのウェルで平板培養した後、プレートを６日間インキュベートした。薬物インキュベーションの６日後、プレートを、ＦＩＴＣ染色を適用してＧＦＰ陽性細胞を計数し、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ染色を適用してＲＦＰ陽性細胞を計数する、マルチチャネル読み取りを実施することによってＩｎｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２００機器において画像化した。画像化後、生データをＩｎｃｅｌｌ−Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェアにより処理してＧＦＰ陽性およびＲＦＰ陽性細胞の数を計数した。図１に示したデータはラージスケール画像化からの生データである。
【００９４】
ＨＣＴ１１６  ｐ５３の共培養を使用したケミカルバイオロジースクリーニングにより、ニクロサミドをＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞を選択的に標的化すると特定する。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰを発現する野性型ＨＣＴ１１６細胞を、Ｈ２Ｂ−ＲＦＰを発現するＨＣＴ１１５  ｐ５３−／−細胞と共培養した。細胞をニクロサミドで処理し、４８時間インキュベートし、その後、細胞を、薬物を含まない培地で７日間回復させた。ＧＦＰ（ＨＣＴ１１６野性型）およびＲＦＰ（ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−）細胞の相対的パーセンテージを決定するためにＩＮＣＥＬＬ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を使用して生存細胞を画像化した。
【００９５】
可能性のある薬物化合物を検証するための二次スクリーニング
Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ−ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびＨ２Ｂ−ＲＦＰ−ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−各々の２０００個の細胞を、１００μｌの全体積で９６ウェルプレートにおいて共培養物として増殖させた。翌日、これらの細胞をＤＭＳＯまたは７つの異なる濃度のニクロサミドのいずれかで処理した（図２ｂに示す）。薬物インキュベーションの４８時間後、細胞培地を、回復を開始するために変化させた。回復の６日後、細胞をＩｎｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００機器において画像化し、生存細胞のパーセンテージを決定し、実験に使用した薬物濃度に対してプロットした。
【００９６】
同系細胞株におけるニクロサミド感作分析
別の例において、陰性対照スクランブルｓｈＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃１８６４）、ｐ５３標的化ｐＬＫＯ−ｐ５３−ｓｈＲＮＡ−９４１（Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃２５６３７）およびｐ５３標的化ｓｈｐ５３  ｐＬＫＯ．１  ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃１９１１９）を使用して異なるレンチウイルスを産生した。各々は以前に記載したｓｈＲＮＡ構築物の１つを含有する。ＨＣＴ１１６Ｐ５３＋／＋細胞株を使用して、細胞を、陰性対照スクランブルｓｈＲＮＡを含有する対照ウイルスまたはｐ５３遺伝子を標的化する２つの異なるウイルスで感染させた。一部の場合、ＨＣＴ１１６細胞株を２つの独立したｓｈＲＮＡで感染させた。各々は別々にｐ５３発現を標的化する。したがって、これらの独立したｐ５３発現標的化ｓｈＲＮＡをｓｈＲＮＡ（Ｉ）およびｓｈＲＮＡ（ＩＩ）と命名した。１つ以上のウイルスを、臭化ヘキサジメトリン（ポリブレン）媒介性ウイルス形質導入において２の感染多重度（ＭＯＩ２）にて使用した。感染の１８時間後、培養培地を変化させた。感染の２日後、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有する細胞培養培地に細胞を加えた。２週後、新たに形成した抗生物質耐性クローンをトリプシン処理し、ピューロマイシンを有する新たな細胞培養ディッシュに移した。これらの細胞をウェスタンブロット分析によってｐ５３欠損について試験した。最大で９０％までのｐ５３ノックダウンの検出を、免疫ブロッティングによって検出した。
【００９７】
ＨＣＴ１１６−ｐ５３＋／＋ＮＴｓｈＲＮＡ、ＨＣＴ１１６−ｓｈｐ５３（Ｉ）およびＨＣＴ１１６−ｓｈｐ５３（ＩＩ）をさらに使用して、コロニー形成アッセイによってニクロサミド処理後、細胞生存率を分析した。簡潔に述べると、１０，０００個の細胞を２ｍｌの細胞培養培地を有する６ウェル細胞培養プレートに入れた。翌日、細胞を陰性対照としてＤＭＳＯまたは５つの異なる濃度のニクロサミド、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭおよび３μＭのうちの１つで処理した。４８時間の薬物インキュベーション後、薬物含有培地を新たな細胞培養培地と置き換え、細胞をさらに７日間増殖させた。回復の８日目に、細胞を２時間、クリスタルバイオレットおよびグルタルアルデヒド溶液で染色し、普通の水で脱染した。
【００９８】
ニクロサミド処理により、薬物処理の４８時間後、ＨＣＴ１１６  ｐ５３野性型細胞より大きな程度でＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の生存率の減少が生じることが示され、一方で、ＤＭＳＯ処理した対照は、ＨＣＴ１１６野性型およびＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の同等の細胞生存率を示す。このことは、細胞生存アッセイ（図２ａ）およびコロニー形成アッセイ（図２ｂ）において実証される。
【００９９】
ニクロサミドはｐ５３欠損ヒト皮膚線維芽細胞を感作する
ヒト皮膚線維芽細胞（ＴＯＢＡ細胞）を、対照ｓｈＲＮＡレンチウイルスまたはｐ５３標的化ｓｈＲＮＡウイルスのいずれかで感染させた（以前の段落に記載されるように）。安定なｐ５３ノックダウン（ｐｕｒｏ選択を使用した）の生成後、細胞を、異なる用量のニクロサミドに応答する細胞生存率について分析した。簡潔に述べると、野性型Ｔｏｂａ細胞、およびｐ５３欠失細胞を２０，０００個の細胞密度にて６ウェルプレートに入れた。翌日、細胞をＤＭＳＯまたは種々の用量のニクロサミドのいずれかで処理した。薬物インキュベーションの４８時間後、薬物含有培地を、回復を開始するために新たな細胞培養培地と置き換えた。回復の８日後、細胞を１０倍の対物レンズにて光学顕微鏡で画像化した。
【０１００】
上記のように、ＤＭＳＯおよびニクロサミドで処理した細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色によってアポトーシス細胞死の存在について分析した。円形の浮遊（すなわち死または乾燥細胞）および接着細胞（すなわち生細胞）の両方を含むウェル内の全ての細胞をトリプシン処理によって注意深く採取し、４００ｇにて５分間遠心分離した。ペレットを２００μｌのインキュベーション緩衝液中に再懸濁し、再懸濁後、洗浄した試料ペレットを回収するために上記と同じ速度にて遠心分離した。次いでこれらのペレットを、インキュベーション緩衝液（９９０μｌのインキュベーション緩衝液中で混合した１０μｌのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ）と予め混合したＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ溶液で、室温にて暗所で２０分間、インキュベートした。インキュベーション後、２５０μｌのインキュベーション緩衝液を各ペレットに加え、ＦＡＣＳ分析を実施して死細胞の量を測定した。
【０１０１】
ニクロサミドは、正常な野性型ヒト線維芽細胞と比較してｐ５３欠損ヒト線維芽細胞の大きな程度のアポトーシスを生じることが示され（図３）、ｐ５３欠損細胞におけるニクロサミドの増加した感作が異なる遺伝的バックグラウンドにわたって一致していることを示唆している。
【０１０２】
ニクロサミドはｐ５３欠損大腸がん細胞のスフェロイド増殖を阻害する
Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ−ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびＨ２Ｂ−ＲＦＰ−ｐ５３−／−細胞を、スフェロイド形成を促進するために超低接着９６ウェル細胞培養プレート中で共培養物として増殖させた。簡潔に述べると、３Ｄ多細胞スフェロイドを生成するために、Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ発現野性型（ＷＴ）ｐ５３細胞およびＨ２Ｂ−ＲＦＰ発現ｐ５３陰性細胞の各々を、１００μｌの培養培地当たり２５０個の細胞にて９６ウェル丸底プレートに播種し、沈降させた（１０００ｇ、５分）。播種した細胞は、３７℃にて５％ＣＯ２加湿雰囲気において２日間培養した。３日目に、細胞をＤＭＳＯまたは異なる用量のニクロサミドのいずれかで処理した。薬物インキュベーションの４８時間後、スフェロイドを培地交換により非毒性濃度に希釈した。次いで処理したスフェロイドをさらに６日間さらに培養した。ＦＩＴＣおよびＴｅｘａｓ−Ｒｅｄチャネルを備えたＩｎｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｅｒ  ２０００においてスフェロイドを画像化した。
【０１０３】
３Ｄ培養スフェロイドアッセイはインビボ腫瘍増殖の模倣物としての役割を果たし、２Ｄ培養より腫瘍減少に対する薬物の効果をより正確に反映することができることが示された。ニクロサミドは、正常な野性型ヒトスフェロイドと比較した場合、野性型スフェロイドより３Ｄ  ｐ５３欠損ＨＣＴ１１６スフェロイド増殖の多くの減少を生じることが実証された（図４）。
【０１０４】
ニクロサミドはｐ５３ヌルおよびｐ５３突然変異がん細胞においてアポトーシス細胞死を強力に誘導する
ニクロサミドが、機能的ｐ５３遺伝子を有するがん細胞と比較して、ｐ５３突然変異またはｐ５３ヌルがん細胞を有するがん細胞に対して強力なアポトーシス効果を有することが、インビトロ細胞培養において示された。この目的のために、種々のがん細胞株／種類を同時にコンフルエントになるようにそれらの増殖速度に応じて播種した。これらの細胞株を各々、異なるニクロサミド濃度で４８時間処理した。次いで細胞をそれらのそれぞれの培地中で６日間回復させ、その後、アポトーシス細胞死アッセイを実施した。各試料において得られたアポトーシス細胞のパーセンテージを３Ｄグラフにプロットした（データは示さず）。ｐ５３ヌルおよびｐ５３突然変異がん細胞の両方は、用量依存的にニクロサミドによる処理に強く影響を受けたことが示され、特定の細胞種はニクロサミド処理に対してすぐに感作されることが示される。さらに、ニクロサミドは、特定の細胞株において残存細胞の細胞生存率を異なって低減させることも示され、最初のニクロサミド処理で生存した細胞は、最初のニクロサミド処理に対して遅延した治療反応を示すことが示された（データは示さず）。これらの少ない生存細胞は処理後になくなり、さらなる用量のニクロサミドを必要とせず、ニクロサミドの可能な二次殺傷効果の存在を示すことに留意されたい。
【０１０５】
ニクロサミドはマウスにおけるｐ５３欠損腫瘍を標的とする
ｐ５３Ｋ０突然変異を保有するマウス胚幹細胞を、２μＭの濃度にて４８時間、ＤＭＳＯまたはニクロサミドのいずれかで処理した。次いで得られたトリプシン処理した細胞をリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁した。細胞を計数し、１×１０６個の細胞／１００μｌの最終細胞濃度を生じるように再懸濁した。計数直後、細胞をヌードマウス注射のための動物施設に移した。１００μｌのＤＭＳＯで処理した細胞を右鼠径部に注射し、１００μｌのニクロサミドで処理した細胞を各マウスの左鼠径部に注射した。注射の２４日後、腫瘍増殖を観察した。生じた奇形腫を外科的に取り除き、分析して腫瘍増殖を阻害するニクロサミドの能力を観察した。
【０１０６】
ニクロサミドがインビボで抗腫瘍効果を有することを実証するために実験を行った。したがって、ヌードマウスにおけるインビボ腫瘍モデルを利用した。対照として、マウス胚幹（ｍＥＳ）細胞をヌードマウスに注射し、マウスを腫瘍増殖（奇形腫）の存在についてモニターした。ニクロサミドで処理したｍＥＳ細胞またはＤＭＳＯで処理した対照細胞をヌードマウスに注射し、腫瘍増殖を３週間後にモニターした。この結果により、ニクロサミドが、ＤＭＳＯ対照のみで処置したマウスにおける奇形腫のサイズと比較して、奇形腫のサイズの有意な減少を生じたので、有効な抗がん剤であることが実証された（データは示さず）。
【０１０７】
患者由来の異種移植マウスモデルを使用した実験も実施した。これらの実験において、患者生検試料由来の卵巣腫瘍試料をマウスの左または右脇腹のいずれかに移植した。これらの腫瘍をマウスにおいて確立し、腫瘍体積を、移植後２日毎に標準的な実施に従って測定した。約２００ｍｍ３の最小閾値サイズに到達した後、マウスを、１５０ｍｇ／ｋｇの濃度にてニクロサミドで静脈内により１回処置した。腫瘍体積の変化を処置後さらに３０日の間に測定した。同様の設定の以前のインビボ実験において示されるように、ニクロサミドによる腫瘍保有マウスの処置が、ＰＢＳで処置した陰性対照マウスと比較して腫瘍増殖の減少を生じたことが示された。
【０１０８】
使用した細胞培養物およびスフェロイド培養
Ｔｏｂａ野生型細胞およびｓｈｐ５３欠損Ｔｏｂａ細胞株
【０１０９】
使用した細胞培養培地：１０％ウシ胎児血清およびＰｅｎｓｔｒｅｐ抗生物質を補足したＤＭＥＭ高グルコース培地；１０％ウシ胎児血清およびＰｅｎｓｔｒｅｐ抗生物質を補足したＭｙｃｏｓ  ５Ａ。
【０１１０】
利用した細胞株は、ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−、ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−Ｈ２Ｂ−ＲＦＰである。ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−はＢｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｌａｂ（Ｂｕｎｚ，Ｆ．，Ｄｕｔｒｉａｕｘ，Ａ．，Ｌｅｎｇａｕｅｒ，Ｃ．，Ｗａｌｄｍａｎ，Ｔ．，Ｚｈｏｕ，Ｓ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｓｅｄｉｖｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１４９７−１５０１）によって生成された。ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞株は学術研究のために自由に利用可能であり、広範に配布されている。ＨＣＴ１１６バックグラウンドにおける／に基づいたＨ２Ｂ−ＧＦＰおよびＨ２Ｂ−ＲＦＰ細胞株は社内で生成した。
【０１１１】
ピューロマイシンを、ｐ５３欠損ＴＯＢＡ細胞株およびＨＣＴ１１６細胞株を選択するために、レンチウイルス形質導入の２日後、それぞれの細胞培養培地において使用した。
【図１】
2018535190.tif 000018
【図２Ａ】
2018535190.tif 000019
【図２Ｂ】
2018535190.tif 000020
【図２Ｃ】
2018535190.tif 000021
【図２Ｄ】
2018535190.tif 000022
【図３Ａ】
2018535190.tif 000023
【図３Ｂ】
2018535190.tif 000024
【図４Ａ】
2018535190.tif 000025
【図４Ｂ】
2018535190.tif 000026
【図４Ｃ】
2018535190.tif 000027
【図４Ｄ】
2018535190.tif 000028
【図５】
2018535190.tif 000029
【図６】
2018535190.tif 000030
【国際調査報告】
2018535190.tif 000031
2018535190.tif 000032
2018535190.tif 000033
2018535190.tif 000034
2018535190.tif 000035
2018535190.tif 000036