(57)【要約】本開示は、幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換する方法であって、誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）と選択マーカ（ｉｉ）とを含む少なくとも１つの発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップ（ａ）、および、ステム（ｓｔｅｍ）（ａ）からのトランスフェクトされた幹細胞を、誘導剤で、前記幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換するように誘導するステップ（ｂ）を含む方法を提供する。詳細には、ドキシサイクリン誘導性プロモータに連結されたＳＡ−ＡＳＣＬ１（ホスホミュータント）、ＤＬＸ２、ＬＨＸ６およびｍｉＲ−９／９＊−１２４を用いて幹細胞にトランスフェクトして幹細胞を抑制性ニューロンに転換する方法、ならびにドキシサイクリン誘導性プロモータに連結されたＮｅｕｒｏＤ２を用いてトランスフェクトして幹細胞を興奮性ニューロンに転換する方法を例示する。系譜特異的細胞のあらかじめ選択された活性を調節する１つ以上の因子および／または１つ以上の遺伝子変異をスクリーニングする方法、本発明の方法を使用するキット、ならびに本発明の方法を使用して得られる直接転換可能な幹細胞も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換する方法であって、
（ａ）誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）と選択マーカ（ｉｉ）とを含む少なくとも１つの発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップ、および
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記トランスフェクトされた幹細胞を、誘導剤で、前記幹細胞を少なくとも１つの系譜特異的細胞に直接転換するように誘導するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの発現ベクターが、構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トランスフェクトされた幹細胞を前記選択マーカの発現について選択するステップを、前記細胞を誘導するステップの前にさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記選択マーカが、ピューロマイシン、ブラスチサイジン、ハイグロマイシン、ゼオシンおよびネオマイシンからなる群から選択される抗生物質耐性遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記構成的プロモータが、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、伸長因子１−α（ＥＦ１α）、β−アクチンおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモータ（ＣＡＧ）ならびにユビキチンＣ（ＵＢＣ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
誘導物質の存在下で前記誘導性プロモータを誘導できるトランス活性化因子を含む発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導物質が、ドキシサイクリンおよびクメートからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発現ベクターが、組み込み型ベクターまたは非組み込み型ベクターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組み込み型ベクターが、レトロウイルスまたはレンチウイルス発現ベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非組み込み型ベクターが、センダイウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはエピソームＤＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の選択ステップを使用して選択された細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択ステップが、抗生物質選択、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、または単一クローン単離および増殖からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞が、霊長類または非霊長類幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記霊長類幹細胞が、ヒト幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞が、幹細胞株である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞株が、二次元細胞培養物または三次元細胞培養物として培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記系譜特異的細胞が、少なくとも７０％の効率で生成される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記系譜特異的細胞が、二次元細胞培養物または三次元細胞培養物として培養された細胞の集団である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記系譜特異的細胞が、外胚葉、中胚葉または内胚葉系譜の細胞である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記外胚葉系譜の細胞が、神経系細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記神経系細胞が、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、ドーパミンニューロン、セロトニンニューロン、中型有棘ニューロン、前脳基底核コリン作動性ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイトおよび運動ニューロンからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記神経系細胞が、興奮性ニューロンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経系細胞が、抑制性ニューロンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経系細胞が、皮質神経回路の少なくとも１つの細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記中胚葉系譜の細胞が、心臓細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記心臓細胞が、心筋細胞、内皮細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）および心臓線維芽細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記内胚葉系譜の細胞が、肝臓細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記肝臓細胞が、肝細胞、クッパー細胞、星状細胞および類洞内皮細胞からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記系譜特異的細胞が、細胞の均一な細胞集団の中に存在する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つ以上のリプログラミング因子が、転写因子、クロマチンリモデラー、エピジェネティック修飾因子および／またはノンコーディングＲＮＡからなる群から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ノンコーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記転写因子が、神経転写因子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記神経転写因子が、Ｎｇｎ１、Ｎｇｎ２、Ｎｇｎ３、Ｎｅｕｒｏ  Ｄ１、Ｎｅｕｒｏ  Ｄ２、Ｂｒｎ１ｍ  Ｂｒｎ２ｍ  Ｂｒｎ３Ａ、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｂｒｎ３Ｃ、Ｂｒｎ４、Ｄｌｘ１、Ｄｌｘ２、Ａｓｃｌ１、転写因子Ａｓｃｌ１のｐｈｏｓｐｈｏ−ｄｅａｄ変異体（ＳＡ／ＳＶ−Ａｓｃｌ１）、ＣＴＩＰ２、ＭＹＴ１Ｌ、Ｏｌｉｇ１、Ｚｉｃ１  Ｎｋｘ２．１、ｎｋｘ２．２、Ｌｈｘ２、Ｌｈｘ３、Ｌｈｘ６、Ｌｈｘ８、ＳＡＴＢ１、ＳＡＴＢ２、Ｄｌｘ５、Ｄｌｘ６、Ｆｅｚｆ２、Ｆｅｖ、Ｌｍｘ１ｂ、Ｌｍｘ１ａ、Ｐｉｔｘ３、Ｎｕｒｒ１、ＦｏｘＡ２、Ｓｏｘ１１、Ａｔｏｈ７、Ｏｌｉｇ２、Ｐｔｆ１ａ、ＭＥＦ２ｃ、ｐ５５ＤＤ（ドミナントネガティブ）、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ６．２、Ｓｏｘ１０、ＳＴ１８、Ｍｙｒｆ、Ｍｙｔ１、Ｚｆｐ５３６、ｈｅｓ１、ｈｅｓ５、ｈｅｓ６、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＰＡＸ６、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＸ、ＮＩＣＤ、Ｉｓｌｅｔ１、Ｉｓｌｅｔ２、Ｉｒｘ３、Ｄｂｘ２およびＴＡＬ１からなる群から選択される１つ以上の転写因子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記転写因子が、心臓転写因子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記心臓転写因子が、Ｉｓｌ１、Ｍｅｆ２、Ｇａｔａ４、Ｔｂｘ５、Ｎｐｐａ、Ｃｘ４０、ＭＥＳＰ１、ＭＹＯＣＤおよびＺＦＰＭ２、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｈｏｐｘ、Ｈｒｔ２、Ｐｉｔｘ２ｃおよびｎｋｘ２．５からなる群から選択される１つ以上の転写因子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記転写因子が、肝臓転写因子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記肝臓転写因子が、Ｈｎｆ−１α、Ｈｎｆ−１β、Ｈｎｆ−３β、Ｈｎｆ−３γ、Ｄｂｐ、Ｈｎｆ−４、Ｌｒｈ−１、Ｆｘｒα、Ｃ／Ｅｂｐβ、Ｐｘｒ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ６、ＧＡＴＡ６、ＰＰＡＲＡ、ＺＨＸ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＡＴＦ５、ＵＳＦ２、ＵＳＦ１、ＺＧＰＡＴおよびＮＦＩＡからなる群から選択される１つ以上の転写因子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記マイクロＲＮＡが、マイクロＲＮＡ−９／９＊および／またはマイクロＲＮＡ−１２４、ｍｉＲＮＡ−２１９、ｍｉＲＮＡ−３３８、ｍｉＲＮＡ−１、ｍｉＲＮＡ−１３３およびｍｉＲＮＡ−１８７である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
非系譜特異的細胞の前記集団を、蛍光指示薬を含む発現ベクターと接触させるステップをさらに含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記蛍光指示薬が、カルシウム指示薬である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記カルシウム指示薬が、ＧＣａＭＰ６である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
直接転換可能な幹細胞を生成する方法であって、
（ａ）誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）と構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカ（ｉｉ）とを含む発現ベクターを用いて幹細胞にトランスフェクトするステップ、および
（ｂ）前記トランスフェクトされた幹細胞を前記選択マーカの発現についてスクリーングして、前記直接転換可能な幹細胞を生成するステップ
を含み、前記直接転換可能な幹細胞が、誘導された系譜特異的細胞に直接転換する能力がある、方法。
【請求項４４】
誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上のリプログラミング因子（ｉ）と構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカ（ｉｉ）とを含み、誘導された系譜特異的細胞に直接転換できる、直接転換可能な幹細胞。
【請求項４５】
細胞株である、請求項４４に記載の直接転換可能な幹細胞。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の誘導された系譜特異的細胞のあらかじめ選択された活性を調節する１つ以上の因子および／または１つ以上の遺伝子変異をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記誘導された系譜特異的細胞を１つ以上の因子および／または１つ以上の遺伝子変異の存在下で培養するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の系譜特異的細胞のあらかじめ選択された活性を測定するステップ、および
（ｃ）前記１つ以上の因子または遺伝子変異の存在下で培養されていない系譜特異的細胞の前記あらかじめ選択された活性についての測定値に対してステップ（ｂ）の測定値を比較するステップを含み、ステップ（ｃ）における前記系譜特異的細胞の前記あらかじめ選択された活性についての測定値の差が、前記１つ以上の因子または遺伝子変異が前記系譜特異的細胞の前記あらかじめ選択された活性を調節することを示す、方法。
【請求項４７】
前記１つ以上の因子が、薬物、成長因子、小分子、生物製剤、毒素、ストレッサーまたは細胞からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つ以上の遺伝子変異が、改変された変異または自然発生の変異である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記改変された変異が、部位特異的変異、欠失、重複、逆位、コピー数多型、インプリンティングおよびランダム変異からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記自然発生の変異が、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト多型、小規模挿入／欠失および多型性反復配列からなる群から選択される多型である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記系譜特異的細胞の前記あらかじめ選択された活性が、遺伝的活性、または障害に対する感受性である、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
障害に対する感受性が、Ｃａ２＋イメージング、細胞生存率、固有の発火特性、Ｎａ＋チャネルの測定、Ｃａ２＋チャネルの測定、Ｋ＋チャネルの測定、シナプス活性、樹状突起分枝、軸索伸長および標的化、神経伝達物質放出および取り込み、細胞内Ｃａ２＋活性ならびに細胞外活性からなる群から選択される１つ以上のアッセイによって判定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝的活性が、遺伝子機能獲得、遺伝子機能喪失、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子活性化からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝的活性が、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼによってもたらされる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記障害が、神経障害である、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記神経障害が、統合失調症、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、ＡＤＨＤ、認知症、てんかん、ハンチントン病、アンジェルマン症候群、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）およびドラベ症候群からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
誘導された系譜特異的細胞を生成するためのキットであって、
（ａ）請求項４４または４５に記載の直接転換可能な幹細胞と、
（ｂ）誘導物質と、
場合により、使用説明書と
を含むキット。
【請求項５８】
幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換する方法であって、
構成的プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）を含む少なくとも１つの発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップ
を含む方法。
【請求項５９】
前記少なくとも１つの発現ベクターが、選択マーカをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記選択マーカが、構成的プロモータ作動可能に連結されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換する方法であって、
誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子を含む少なくとも１つの発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップ
を含む方法。
【請求項６２】
（ｉ）ドキシサイクリン誘導性プロモータに連結された、ＳＡ−ＡＳＣＬ１、ＤＬＸ２、ＬＨＸ６およびｍｉＲ−９／９＊−１２４と、
（ｉｉ）構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカと
を含む抑制性ニューロンに直接転換可能な幹細胞。
【請求項６３】
（ｉ）ドキシサイクリン誘導性プロモータに連結されたＮｅｕｒｏＤ２と、
（ｉｉ）構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカと
を含む興奮性ニューロンに直接転換可能な幹細胞。
【請求項６４】
請求項１〜４５および５８〜６１のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞を使用して薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）前記細胞を前記薬剤と接触させるステップ、
（ｉｉ）前記細胞に対する前記薬剤のあらかじめ選択された活性を測定し、これを、前記薬剤と接触させていない細胞と比較するステップ、および
（ｉｉｉ）前記細胞に対する前記薬剤の活性を検出するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月１０日に出願したシンガポール出願第１０２０１５０２８６９Ｔ号の優先権の利益を主張するものであり、前記シンガポール出願の内容は、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関する。詳細には、本発明は、多能性または複能性幹細胞を複数の細胞系譜に分化させる方法に関する。本発明は、さらに、本明細書に記載の方法を実施する際に使用するための培地およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
発生の複数の岐路で、系譜特異的転写因子（ＴＦ）は、複能性前駆細胞を単一の系譜に帰結するように方向付けし、代替運命を抑止し、それによって一方向系譜決定を確実にする。
【０００４】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）などの幹細胞を運命決定された細胞型に分化させることができることは、細胞置換療法、薬物スクリーニングおよび創薬、機能不全の機構研究ならびに他の下流の応用にとって大きなメリットがある。
【０００５】
幹細胞が分化できる細胞系譜の例は、ニューロン系譜である。幹細胞をニューロン系譜の細胞に分化させる様々な方法が公知である。これらの方法は、ニューロン新生中に起こる発生シグナル伝達を模倣してニューロン前駆細胞を生成し、その後、これらの前駆細胞を機能性ニューロンに分化させる。しかし、これらの方法は、概して、組換え成長因子と小分子の様々な組合せを必要とする複数の中間段階を含み、結局、可変的な機能的特性を有する非神経細胞と神経細胞両方の混合物を生じさせる。ニューロン成熟およびシナプス能力を獲得するのに必要な長期タイムラインがさらなる制約となる。なぜなら、この過程に３０週間ほどもかかることがあるからである。
【０００６】
したがって、上述の欠点の１つ以上を克服する、または少なくとも改善する、幹細胞から機能的な系譜特異的細胞を得る方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換する方法であって、
（ａ）誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）と選択マーカ（ｉｉ）とを含む少なくとも１つの発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップ、および
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記トランスフェクトされた幹細胞を、誘導剤で、前記幹細胞を少なくとも１つの系譜特異的細胞に直接転換するように誘導するステップ
を含む方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、直接転換可能な幹細胞を生成する方法であって、
（ａ）誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）と構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカ（ｉｉ）とを含む発現ベクターを用いて幹細胞にトランスフェクトするステップ、および
（ｂ）前記トランスフェクトされた幹細胞を前記選択マーカの発現についてスクリーングして、前記直接転換可能な幹細胞を生成するステップ
を含み、前記直接転換可能な幹細胞が、誘導された系譜特異的細胞に直接転換する能力がある、方法を提供する。
【０００９】
一態様では、誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上のリプログラミング因子（ｉ）と構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカ（ｉｉ）とを含む直接転換可能な幹細胞であって、誘導された系譜特異的細胞に直接転換できる幹細胞を提供する。
【００１０】
一態様では、前記請求項のいずれか一項に記載の誘導された系譜特異的細胞のあらかじめ選択された活性を調節する、１つ以上の因子および／または１つ以上の遺伝子変異をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記誘導された系譜特異的細胞を１つ以上の因子および／または１つ以上の遺伝子変異の存在下で培養するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の系譜特異的細胞のあらかじめ選択された活性を測定するステップ、および
（ｃ）前記１つ以上の因子または遺伝子変異の存在下で培養されていない系譜特異的細胞のあらかじめ選択された活性についての測定値に対してステップ（ｂ）の測定値を比較するステップ
を含み、ステップ（ｃ）における系譜特異的細胞のあらかじめ選択された測定値の差が、前記１つ以上の因子または遺伝子変異が前記系譜特異的細胞のあらかじめ選択された活性を調節することを示す、方法を提供する。
【００１１】
一態様では、誘導された系譜特異的細胞を生成するためのキットであって、
（ａ）本明細書に記載の直接転換可能な幹細胞と、
（ｂ）誘導物質と、
場合により、使用説明書と
を含むキットを提供する。
【００１２】
一態様では、幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換する方法であって、
構成的プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）を含む少なくとも１つの発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップ
を含む方法を提供する。
【００１３】
一態様では、幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換する方法であって、
誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）を含む少なくとも１つの発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップ
を含む方法を提供する。
【００１４】
一態様では、
（ｉ）ドキシサイクリン誘導性プロモータに連結された、ＳＡ−ＡＳＣＬ１、ＤＬＸ２、ＬＨＸ６およびｍｉＲ−９／９＊−１２４と、
（ｉｉ）構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカと
を含む抑制性ニューロンに直接転換可能な幹細胞を提供する。
【００１５】
一態様では、
（ｉ）ドキシサイクリン誘導性プロモータに連結されたＮｅｕｒｏＤ２と、
（ｉｉ）構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカと
を含む興奮性ニューロンに直接転換可能な幹細胞を提供する。
【００１６】
別の態様では、本明細書で開示する方法によって得られる細胞を使用して薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）前記細胞を前記薬剤と接触させるステップ、
（ｉｉ）前記細胞に対する前記薬剤のあらかじめ選択された活性を測定し、これを、前記薬剤と接触させていない細胞と比較するステップ、および
（ｉｉｉ）前記細胞に対する前記薬剤の活性を検出するステップ
を含む方法を提供する。
定義
【００１７】
本明細書で用いる用語「幹細胞」は、自己複製と分化の両方を行うことで、自己複製する前駆細胞、自己複製しない前駆細胞および最終分化した細胞を含む子孫細胞を産生することを、単一細胞レベルでできる能力により定義される未分化細胞を含むが、これらに限定されない。例えば、「幹細胞」は、（１）全能性幹細胞；（２）多能性幹細胞、（３）複能性幹細胞、（４）少能性幹細胞、および（５）単能性幹細胞を含みうる。
【００１８】
本明細書で用いる用語「全能性」は、胎盤をはじめとする胚体外組織のみならず成人体内のあらゆる細胞にもなる発生能が備わっている細胞を指す。受精卵（接合体）は全能性であり、桑実胚（受精後１６細胞期まで）の細胞（卵割球）も全能性である。
【００１９】
本明細書で用いる用語「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）は、様々な条件下で、細胞の肺葉の３種すべて、すなわち内胚葉（例えば、腸組織）、中胚葉（血液、筋肉および血管を含む）および外胚葉（例えば、皮膚および神経）、に特有の細胞型に分化する発生能が備わっている細胞を指す。３種すべての胚葉に分化できる細胞の発生能力は、例えば、ヌードマウス奇形腫形成アッセイを使用して判定することができる。本明細書に記載の組成物よび方法を使用して生成される細胞または細胞集団の多能性についての好ましい試験は、細胞が、前記３種の胚葉の各々の細胞に分化する発生能を有することを実証するものであるが、一部の実施形態では、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカの発現によって多能性が証明されることもある。
【００２０】
本明細書で用いる用語「誘導多能性幹細胞」またはｉＰＳＣは、３種の胚葉または皮層：胚葉、内胚葉および外胚葉のすべての組織に分化できる細胞に誘導されたまたは変化した、すなわちリプログラミングされた、分化した成熟細胞から、幹細胞が産生されることを意味する。産成されたｉＰＳＣは、自然界で見られる場合の細胞を指さない。
【００２１】
本明細書で用いる用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。そのような細胞は、体細胞核移植から派生する胚盤胞の内部細胞塊から同様に得ることができる。胚性幹細胞は多能性であり、３種の一次肺葉：外胚葉、内胚葉および中胚葉のあらゆる派生物への発達中に生じる。言い換えると、胚性幹細胞は、特定の細胞型にとって必要かつ十分な刺激が与えられると、成人の身体の２００を超える細胞型の各々に発達することができる。胚性幹細胞は、胚体外膜または胎盤には寄与せず、すなわち全能性ではない。
【００２２】
本明細書で用いる用語「複能性幹細胞」は、３種すべてではないが、１種以上の胚葉の細胞に分化する発生能を有する細胞を指す。したがって、複能性細胞を、「ある程度分化した細胞」と言うこともできる。複能性細胞は、当技術分野において周知であり、複能性細胞の例としては、例えば造血幹細胞および神経系幹細胞などの、成熟幹細胞が挙げられる。「複能性」とは、細胞が、ある一定の系譜内の多くの細胞型になることができるだろうるが他の系譜の細胞型になることができないだろうということを示す。例えば、複能性造血細胞は、血液細胞の多くの異なる型（赤血球、白血球、血小板など）になることができるが、ニューロンになることはできない。したがって、用語「複能性」は、発生能の度合いが全能性および多能性より低い、細胞の状態を指す。
【００２３】
本明細書で用いる用語「分化」は、特殊化していない（「運命決定されていない」）または特殊化した度合いの低い細胞が、例えば神経細胞または筋肉細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得する過程である。分化した細胞または分化誘導された細胞は、細胞系譜の範囲内で、より特殊化した（「運命決定された」）状態になったものである。用語「運命決定された」は、分化過程に適用される場合、その分化経路において、通常の環境下で、細胞が特定の細胞型または特定の細胞型サブセットに分化を続けていき、通常の環境下で、異なる細胞型に分化することもできず、より分化程度の低い細胞型に戻ることもできない段階まで進んだ細胞を指す。脱分化は、細胞が、細胞系譜の範囲内で、特殊化した（または運命決定された）程度がより低い状態に戻る過程を指す。本明細書で用いる細胞の系譜は、細胞の遺伝性、すなわち、その細胞がどの細胞に由来するのか、そしてその細胞がどのような細胞を生じさせることができるのかを規定する。細胞の系譜によって、細胞は、発生および分化の遺伝スキームの中でのその位置が決まる。系譜特異的マーカは、対象とする系譜の細胞の表現型と特異的に関連する特徴を指し、そのようなマーカを使用して、対象とする系譜への、運命決定されていない細胞の分化を評価することができる。
【００２４】
本明細書で用いる用語「未分化細胞」は、自己複製特性を有し、かつ複数の細胞型に分化する発生能を有する、未分化状態の細胞を指し、発生能（すなわ、全能性、多能性、複能性など）に関して特別な言外の意味はない。
【００２５】
本明細書で用いる「前駆細胞」は、より大きい発生能を有する、すなわち、分化によって生じうる細胞と比べて原始的である（例えば、発生経路または発生の進行に沿って、より初期の段階に存在する）細胞表現型を有する細胞を指す。多くの場合、前駆細胞は、有意なまたは非常に高い増殖能を有する。前駆細胞は、発生経路および細胞が発生し、分化する環境に依存して、より低い発生能、すなわち分化された細胞型を有する複数の明らかに異なる細胞を生じさせることもあり、または単一の分化された細胞型を生じさせることもある。
【００２６】
細胞または細胞系譜に関して本明細書で用いる用語「リプログラミング」は、特定の細胞型の別の細胞型への転換を指す。したがって、「リプログラミング因子」は、特定の細胞型を別の細胞型にリプログラミングできる分子を指す。
【００２７】
リプログラミングに関して本明細書で用いる用語「効率」とは、特定の細胞型の別の細胞型への転換が、少なくとも約５０％の頻度で起こることを意味する。言い換えると、少なくとも約５０％のリプログラミング効率とは、特定の細胞型の細胞の少なくとも約５０％が別の細胞型に転換されることを意味する。
【００２８】
本明細書で用いる用語「マーカ」は、対象とする細胞において差次的に発現される核酸またはポリペプチド分子を指す。これに関連して、差次的発現とは、陽性マーカレベルの増加および陰性マーカレベルの減少を意味する。検出可能な核酸またはポリペプチドマーカレベルは、対象とする細胞において他の細胞と比較して十分に高くまたは低く、したがって、当技術分野において公知の様々な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を同定し、他の細胞と区別することができる。
【００２９】
プロモータに関して本明細書で用いる用語「誘導性」は、その活性が薬剤によって刺激されうるプロモータを指す。薬剤の存在がプロモータ活性を刺激し、するとその活性によって、この誘導性プロモータの制御下にある遺伝子発現が駆動される。薬剤が存在しない場合、プロモータは不活性であり、その誘導性プロモータの制御下にある遺伝子は発現されない。
【００３０】
プロモータに関して本明細書で用いる用語「構成的」は、構成的に活性であるプロモータを指す。構成的プロモータの制御下にある遺伝子は、継続的に発現される。
【００３１】
本明細書で用いる用語「転写因子」は、ＤＮＡと結合して転写を調節するタンパク質を指す。転写因子は、ＤＮＡの特定の配列を認識し、該配列と結合して転写を調節する、ＤＮＡ結合ドメインを含みうる。転写因子は、通常、プロモータおよび／またはエンハンサー領域を認識し、該領域と結合し、遺伝子発現を活性化することもあり、または抑止することもある。
【００３２】
本明細書で用いる「マイクロＲＮＡ」、または「マイクロＲＮＡ」分子は、転写後レベルで１つ以上の遺伝子の発現を負に調節することができる、短鎖ノンコーディングＲＮＡを指す。
【００３３】
本明細書で用いる句「培地」（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）は、幹細胞および任意の細胞系譜の増殖を支持するために使用される液体物質を指す。一部の実施形態に従って本発明により使用される培地は、塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質、例えばサイトカイン、成長因子およびホルモンなどの物質の組合せを含んでいてもよい、液体ベースの培地、例えば水でありうる。
【００３４】
本明細書で用いる用語「フィーダ細胞」は、幹細胞をフィーダ細胞上で共培養するとき、またはフィーダ細胞によって生成された条件培地の存在下、マトリックス（例えば、細胞外マトリックス、合成マトリックス）上で多能性幹細胞を培養するとき、幹細胞を増殖状態で維持するフィーダ細胞（例えば、線維芽細胞）を指す。フィーダ細胞の支持は、培養中のフィーダ細胞の構造（例えば、組織培養プレートにおいてフィーダ細胞を培養することにより形成される三次元マトリックス）、フィーダ細胞の機能（例えば、フィーダ細胞による成長因子、栄養素およびホルモンの分泌、フィーダ細胞の増殖率、老化するまでのフィーダ細胞の増殖能力）および／またはフィーダ細胞層への幹細胞の接着に依存する。
【００３５】
本明細書で用いる用語「皮質神経回路」は、１つ以上のシナプスを介して相互接続されているニューロン群を指す。皮質神経回路は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのニューロン群を含むこともあり、またはｅｘ  ｖｉｖｏでのニューロン群を含むこともある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの皮質神経回路は、存在するニューロン型のヒト皮質を模倣する。
【００３６】
本開示を通して、ある特定の実施形態は、範囲形式で開示されていることがある。範囲形式での記載は、単に便宜上の、簡略的に表現するためのものに過ぎず、開示範囲の領域に対する確固たる制限と解釈すべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲はもちろん、その範囲内の個々の数値も具体的に開示されていると見なすべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような部分範囲はもちろん、その範囲内の個々の数、例えば１、２，３，４，５および６も具体的に開示されていると見なすべきである。これは、範囲の幅に関係なく当てはまる。
任意選択の実施形態の開示
【００３７】
本発明を説明する前に、本発明は、説明する特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。そのような実施形態は変わることがあるからである。本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態の説明を目的にしたものに過ぎず、限定することを意図したものでないことも理解されたい。本発明の範囲は添付の請求の範囲でのみ限定されるからである。
【００３８】
別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。改変及び変形が本開示の趣旨および範囲内に包含されることが理解されるので、本明細書に記載のものと同様または均等のあらゆる方法および材料を本発明の実施および試験の際に使用することができる。
【００３９】
一実施形態では、幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換する方法を提供する。詳細には、この方法は、誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）と選択マーカ（ｉｉ）とを含む少なくとも１つの発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップ；およびステップａ）からの前記トランスフェクトされた幹細胞を、誘導剤で、前記幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換するように誘導するステップを含む。
【００４０】
一実施形態において、少なくとも１つの発現ベクターは、構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカを含んでいてもよい。
【００４１】
本明細書に記載の方法は、トランスフェクトされた幹細胞を選択マーカの発現について選択するステップを、前記細胞を誘導するステップの前にさらに含んでいてもよい。
【００４２】
一部の実施形態において、選択マーカは、ピューロマイシン、ブラスチサイジン、ハイグロマイシン、ゼオシンおよびネオマイシンからなる群から選択される抗生物質耐性遺伝子であってもよい。
【００４３】
好ましい実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、ブラスチサイジンおよび／またはハイグロマイシンである。
【００４４】
構成的プロモータは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、伸長因子１−α（ＥＦ１α）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、β−アクチンおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモータ（ＣＡＧ）からなる群から選択することができる。
【００４５】
好ましい実施形態において、構成的プロモータは、ＰＧＫまたはＥＦ１αである。
【００４６】
一部の実施形態において、前記方法は、誘導物質の存在下で誘導性プロモータを誘導できるトランス活性化因子を含む発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップをさらに含んでいてもよい。誘導剤は、ドキシサイクリンおよびクメートからなる群から選択することができる。当然のことながら、誘導剤がドキシサイクリンである場合、トランス活性化因子は、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）である。同じく当然のことながら、誘導剤がクメートである場合、トランス活性化因子は、リバースクメート活性化因子（ｒｃＴＡ）である。
【００４７】
発現ベクターは、組み込み型ベクターであってもよく、または非組み込み型ベクターであってもよい。一部の実施形態において、組み込み型ベクターは、レトロウイルスまたはレンチウイルス発現ベクターであってもよい。一部の実施形態において、非組み込み型ベクターは、センダイウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはエピソームＤＮＡである。好ましい実施形態において、ベクターは、レンチウイルス発現ベクターである。
【００４８】
本明細書に記載の方法は、１つ以上の選択ステップを使用して選択された細胞を濃縮するステップをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態において、選択ステップは、抗生物質選択、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、または単一クローン単離および増殖からなる群から選択することができる。
【００４９】
幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）であってもよく、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。一部の実施形態において、幹細胞は、霊長類幹細胞であってもよく、または非霊長類幹細胞であってもよい。霊長類幹細胞を選択する場合、幹細胞は、ヒト幹細胞であってもよい。好ましい実施形態において、胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。
【００５０】
一部の実施形態において、幹細胞は、幹細胞株であってもよい。幹細胞株を二次元細胞培養物として培養してもよく、または三次元細胞培養物として培養してもよい。
【００５１】
本明細書に記載の方法の利点は、系譜特異的細胞が、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％および約１００％の効率で生成されることである。好ましい実施形態において、効率は、少なくとも約７０％である。さらに別の好ましい実施形態において、効率は、少なくとも約９９％である。
【００５２】
系譜特異的細胞は、二次元細胞培養物として培養された細胞の集団であってもよく、または三次元細胞培養物として培養された細胞の集団であってもよい。一部の実施形態において、系譜特異的細胞は、外胚葉系譜の細胞であってもよく、中胚葉系譜の細胞であってもよく、または内胚葉系譜の細胞であってもよい。好ましい実施形態において、外胚葉系譜の細胞は、神経系細胞であってもよい。神経系細胞は、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、ドーパミンニューロン、セロトニンニューロン、中型有棘ニューロン、前脳基底核コリン作動性ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイトおよび運動ニューロンからなる群から選択することができる。さらなる好ましい実施形態において、神経系細胞は、興奮性ニューロンであってもよく、または抑制性ニューロンであってもよい。別の実施形態において、神経系細胞は、皮質神経回路の少なくとも１つの細胞である。最小皮質神経回路は、興奮性ニューロンおよび抑制性ニューロンを含む。当然のことながら、皮質神経回路内のニューロン型の比は様々でありうる。例えば、皮質神経回路は、少なくとも約７０％興奮性ニューロンおよび少なくとも約３０％抑制性ニューロン、少なくとも約７５％興奮性ニューロンおよび少なくとも約２５％抑制性ニューロン、少なくとも約８０％興奮性ニューロンおよび少なくとも約２０％抑制性ニューロン、少なくとも約８５％興奮性ニューロンおよび少なくとも約１５％抑制性ニューロン、ならびに少なくとも約９０％興奮性ニューロンおよび少なくとも約１０％抑制性ニューロンを含むことがある。好ましい実施形態において、皮質神経回路は、少なくとも約７５％興奮性ニューロンおよび少なくとも約２５％抑制性ニューロンを含むことがある。さらに別の好ましい実施形態において、皮質神経回路は、少なくとも約８０％興奮性ニューロンおよび少なくとも約２０％抑制性ニューロンを含むことがある。
【００５３】
一実施形態において、抑制性ニューロンは、パルブアルブミン（ＰＶ）型、ソマトスタチン（ＳＯＭ）型、カルビンディン（ＣＢ）型、カルレチニン（Ｃｒ）型、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）型、リーリン型、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）型、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）型および５ＨＴ３ａＲ発現ニューロンからなる群から選択することができる。好ましい実施形態において、抑制性ニューロンは、ＳＯＭ型、ＣＲ型、ＣＢ型またはＮＰＹ型ニューロンである。
【００５４】
一部の実施形態において、中胚葉系譜の細胞は、心臓細胞であってもよい。心臓細胞は、心筋細胞、内皮細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）および心臓線維芽細胞からなる群から選択することができる。
【００５５】
一部の実施形態において、内胚葉系譜の細胞は、肝臓細胞であってもよい。肝臓細胞は、肝細胞、クッパー細胞、星状細胞および類洞内皮細胞からなる群から選択することができる。
【００５６】
一実施形態において、系譜特異的細胞は、細胞の均一な集団の中に存在する。別の実施形態において、系譜特異的細胞は、細胞の実質的に均一な集団の中に存在する。例えば、系譜特異的細胞の実質的に均一な集団は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％均一であることがある。
【００５７】
一部の実施形態では、本発明の方法を使用して生成された系譜特異的細胞の均一な集団を混合することもある。均一な集団を混合することで細胞性ネットワーク、例えば、皮質神経回路を生じさせることができるだろう。
【００５８】
一部の実施形態において、１つ以上のリプログラミング因子は、転写因子、クロマチンリモデラー、エピジェネティック修飾因子および／またはノンコーディングＲＮＡからなる群から選択することができる。ノンコーディングＲＮＡは、マイクロＲＮＡであってもよい。転写因子は、神経転写因子であってもよい。一部の実施形態において、神経転写因子は、Ｎｇｎ１、Ｎｇｎ２、Ｎｇｎ３、Ｎｅｕｒｏ  Ｄ１、Ｎｅｕｒｏ  Ｄ２、Ｂｒｎ１ｍ  Ｂｒｎ２ｍ  Ｂｒｎ３Ａ、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｂｒｎ３Ｃ、Ｂｒｎ４、Ｄｌｘ１、Ｄｌｘ２、Ａｓｃｌ１、転写因子Ａｓｃｌ１のｐｈｏｓｐｈｏ−ｄｅａｄ変異体（ＳＡ／ＳＶ−Ａｓｃｌ１）、ＣＴＩＰ２、ＭＹＴ１Ｌ、Ｏｌｉｇ１、Ｚｉｃ１  Ｎｋｘ２．１、ｎｋｘ２．２、Ｌｈｘ２、Ｌｈｘ３、Ｌｈｘ６、Ｌｈｘ８、ＳＡＴＢ１、ＳＡＴＢ２、Ｄｌｘ５、Ｄｌｘ６、Ｆｅｚｆ２、Ｆｅｖ、Ｌｍｘ１ｂ、Ｌｍｘ１ａ、Ｐｉｔｘ３、Ｎｕｒｒ１、ＦｏｘＡ２、Ｓｏｘ１１、Ａｔｏｈ７、Ｏｌｉｇ２、Ｐｔｆ１ａ、ＭＥＦ２ｃ、ｐ５５ＤＤ（ドミナントネガティブ）、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ６．２、Ｓｏｘ１０、ＳＴ１８、Ｍｙｒｆ、Ｍｙｔ１、Ｚｆｐ５３６、ｈｅｓ１、ｈｅｓ５、ｈｅｓ６、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＰＡＸ６、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＸ、ＮＩＣＤ、Ｉｓｌｅｔ１、Ｉｓｌｅｔ２、Ｉｒｘ３、Ｄｂｘ２およびＴＡＬ１からなる群から選択される１つ以上の転写因子であってもよい。
【００５９】
好ましい実施形態において、１つ以上の転写因子は、Ａｓｃｌ１（ＳＡ／ＳＶ−Ａｓｃｌ１）およびＤｘｌ１２である。さらに好ましい実施形態において、Ａｓｃｌ１（ＳＡ／ＳＶ−Ａｓｃｌ１）およびＤｘｌ１２は、Ｔ２Ａペプチドによって連結されている。別の好ましい実施形態において、転写因子は、ＮｅｕｒｏＤ２である。
【００６０】
転写因子は、心臓転写因子であってもよい。一部の実施形態において、心臓転写因子は、Ｉｓｌ１、Ｍｅｆ２、Ｇａｔａ４、Ｔｂｘ５、Ｎｐｐａ、Ｃｘ４０、ＭＥＳＰ１、ＭＹＯＣＤおよびＺＦＰＭ２、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｈｏｐｘ、Ｈｒｔ２、Ｐｉｔｘ２ｃおよびｎｋｘ２．５からなる群から選択される１つ以上の転写因子である。
【００６１】
一部の実施形態において、転写因子は、肝臓転写因子であってもよい。肝臓転写因子は、Ｈｎｆ−１α、Ｈｎｆ−１β、Ｈｎｆ−３β、Ｈｎｆ−３γ、Ｄｂｐ、Ｈｎｆ−４、Ｌｒｈ−１、Ｆｘｒα、Ｃ／Ｅｂｐβ、Ｐｘｒ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ６、ＧＡＴＡ６、ＰＰＡＲΑ、ＺＨＸ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＡＴＦ５、ＵＳＦ２、ＵＳＦ１、ＺＧＰＡＴおよびＮＦＩＡからなる群から選択される１つ以上の転写因子であってもよい。
【００６２】
一部の実施形態において、マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ−９／９＊および／またはマイクロＲＮＡ−１２４、ｍｉＲＮＡ−２１９、ｍｉＲＮＡ−３３８、ｍｉＲＮＡ−１、ｍｉＲＮＡ−１３３およびｍｉＲＮＡ−１８７である。一実施形態において、マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−１２４であってもよい。一部の実施形態において、１つ以上のマイクロＲＮＡは、レポータ遺伝子に連結されていてもよい。一実施形態において、マイクロＲＮＡ−９およびマイクロＲＮＡ−１２４は、赤色蛍光タンパク質（ＲＰＦ）遺伝子に連結されている。
【００６３】
本明細書に記載の方法は、非系譜特異的細胞の集団を、蛍光指示薬を含む発現ベクターと接触させるステップをさらに含んでいてもよい。蛍光指示薬は、カルシウム指示薬、例えばＧＣａＭＰ６であってもよい。
【００６４】
別の実施形態では、直接転換可能な幹細胞を生成する方法を提供する。詳細には、この方法は、誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）と構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカ（ｉｉ）とを含む発現ベクターを用いて幹細胞にトランスフェクトするステップ；および前記トランスフェクトされた幹細胞を前記選択マーカの発現についてスクリーニングして、直接転換可能な幹細胞を生成するステップを含み、前記直接転換可能な幹細胞は、誘導された系譜特異的細胞に直接転換できる。
【００６５】
別の実施形態では、誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上のリプログラミング因子（ｉ）と構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカ（ｉｉ）とを含み、誘導された系譜特異的細胞に直接転換できる、直接転換可能な幹細胞を提供する。
【００６６】
一部の実施形態において、直接転換可能な幹細胞は、細胞株であってもよい。
【００６７】
別の実施形態では、前記請求項のいずれか一項に記載の誘導された系統特異的細胞のあらかじめ選択された活性を調節する１つ以上の因子および／または１つ以上の遺伝子変異をスクリーニングする方法であって、前記誘導された系列特異的細胞を１つ以上の因子および／または１つ以上の遺伝子変異の存在下で培養するステップ；ステップ（ａ）の系列特異的細胞のあらかじめ選択された活性を測定するステップ；および前記１つ以上の因子または遺伝子変異の存在下で培養されていない系列特異的細胞のあらかじめ選択された活性についての測定値に対してステップ（ｂ）の測定値を比較するステップを含み、ステップ（ｃ）における系譜特異的細胞のあらかじめ選択された活性についての測定値の差が、前記１つ以上の因子または遺伝子変異が前記系譜特異的細胞のあらかじめ選択された活性を調節することを示す、方法を提供する。
【００６８】
一部の実施形態において、前記１つ以上の因子は、薬物、成長因子、小分子、生物製剤、毒素、ストレッサーまたは細胞からなる群から選択することができる。
【００６９】
１つ以上の遺伝子変異は、改変された変異であってもよく、または自然発生の変異であってもよい。一部の実施形態において、改変された変異は、部位特異的変異、欠失、重複、逆位、コピー数多型、インプリンティングおよびランダム変異からなる群から選択することができる。自然発生の変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト多型、小規模挿入／欠失および多型性反復配列からなる群から選択される多型であってもよい。
【００７０】
一部の実施形態において、系譜特異的細胞のあらかじめ選択された活性は、遺伝的活性であってもよく、または障害に対する感受性であってもよい。障害に対する感受性は、Ｃａ２＋イメージング、細胞生存率、固有の発火特性、Ｎａ＋チャネルの測定、Ｃａ２＋チャネルの測定、Ｋ＋チャネルの測定、シナプス活性、樹状突起分枝、軸索伸長および標的化、神経伝達物質放出および取り込み、ならびに細胞内Ｃａ２＋活性からなる群から選択される１つ以上の細胞内もしくは細胞外アッセイまたはこれらの組合せによって判定することができる。
【００７１】
一部の実施形態において、遺伝的活性は、遺伝子獲得機能、遺伝子機能喪失、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子活性化からなる群から選択することができる。遺伝的活性は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼによってもたらされることもある。
【００７２】
一部の実施形態において、障害は、神経障害であってもよい。神経障害は、統合失調症、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、ＡＤＨＤ、認知症、てんかん、ハンチントン病、アンジェルマン症候群、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）およびドラベ症候群からなる群から選択することができる。一般に当然のことながら、運動ニューロン疾患は、これらに限定されるものではないが筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性球麻痺、仮性球麻痺、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症およびポリオ後症候群（ＰＰＳ）を含む、疾患群を包含する。
【００７３】
別の実施形態では、誘導された系譜特異的細胞を生成するためのキットであって、本明細書に記載の直接転換可能な幹細胞と、誘導物質と、場合により使用説明書とを含むキットを提供する。
【００７４】
別の実施形態では、幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換する方法であって、構成的プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）を含む少なくとも１つの発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップを含む方法を提供する。
【００７５】
一部の実施形態において、少なくとも１つの発現ベクターは、構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカを含んでいてもよい。あるいは、選択マーカが構成的プロモータに作動可能に連結されていてもよい。
【００７６】
別の実施形態では、幹細胞を系譜特異的細胞に直接転換する方法であって、誘導性プロモータに作動可能に連結された１つ以上の細胞系譜リプログラミング因子（ｉ）を含む少なくとも１つの発現ベクターを用いて前記幹細胞にトランスフェクトするステップを含む方法を提供する。
【００７７】
別の実施形態では、（ｉ）ドキシサイクリン誘導性プロモータに連結されたＳＡ−ＡＳＣＬ１、ＤＬＸ２、ＬＨＸ６およびｍｉＲ−９／９＊−１２４と（ｉｉ）構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカとを含むＧＡＢＡ作動性ニューロンに直接転換可能な幹細胞を提供する。
【００７８】
別の実施形態では、（ｉ）ドキシサイクリン誘導性プロモータに連結されたＮｅｕｒｏＤ２と（ｉｉ）構成的プロモータに作動可能に連結された選択マーカとを含む興奮性ニューロンに直接転換可能な幹細胞を提供する。
【００７９】
別の実施形態では、本明細書で開示する方法によって得られる細胞を使用して薬剤をスクリーニングする方法であって、（ｉ）前記細胞を前記薬剤と接触させるステップ；（ｉｉ）前記細胞に対する前記薬剤のあらかじめ選択された活性を測定し、これを、前記薬剤と接触させていない細胞と比較するステップ；および（ｉｉｉ）前記細胞に対する前記薬剤の活性を検出するステップを含む方法を提供する。
【００８０】
ここで例示した本発明は、ここで具体的に開示していない、何らかの要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の非存在下で好適に実施されることもある。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などを、広く、制限なく読みとれるものとする。加えて、本明細書で用いる用語および表現は、説明用語として用いており、限定用語として用いておらず、そのような用語および表現の使用には、示したもしくは記載した特徴またはそれらの一部のいかなる均等物も除外する意図がなく、様々な改変が請求項記載の本発明の範囲内で可能であると認識される。したがって、本発明を好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示したが、ここで開示したそのような実施形態および特徴で実施される本発明の改変及び変更を当業者は用いることができるだろうということ、ならびにそのような改変及び変更が本発明の範囲内であると考えられることを理解されたい。
【００８１】
本発明をここでは広く、一般的に説明した。上記一般的開示の範囲内に入る、より狭い種および亜属分類の各々も、本発明の一部を構成する。これには、削除される物質が本明細書に具体的に記載されているか否かを問わず、属から任意の対象物を除去するという条件または否定的限定を伴う本発明の一般的説明が含まれる。
【００８２】
他の実施形態は、下記の特許請求の範囲および非限定的実施例の範囲内である。加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、本発明が、マーカッシュ群の任意の個々の構成員または構成員の部分群によっても記載されていることは、当業者には理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
本発明は、詳細な説明を参照して、非限定的実施例および添付の図面と併せて考慮されると、よりよく理解されるであろう。
【図１Ａ】図１Ａは、ｈＰＳＣを誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）に効率的に転換する遺伝要素の同定を示す図であって、皮質ＧＡＢＡ作動性ニューロンの発生に関与する４つの遺伝子（ＡＳＣＬ１、ＤＬＸ２、ＮＫＸ２．１およびＬＨＸ６）の発現を示す模式図である（Ｄは背側であり、Ｖは腹側であり、ＮＣＸは新皮質を、ＬＧＥは外側基底核隆起を。ＭＧＥは内側基底核隆起を、ＰＯＡは視索前野をそれぞれ示す）。（
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｈＰＳＣを誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）に効率的に転換する遺伝要素の同定を示す図であって、ニューロンへのｈＥＳＣの直接誘導の大略を示す図である。単個細胞として播種した翌日、リプログラミング因子の様々な組合せを用いてレンチウイルスによりｈＥＳＣに形質誘導した。ｈＥＳＣのニューロン転換を概して１０ｄｐｔに評価し、転換したニューロンの詳細な特性解析を４２ｄｐｔ以降に行った。ｄｐｔは形質導入後の日数であり、ｍＴｅＳＲ１は、ｈＰＳＣ培地であり、ＮＭは、ニューロン培地である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｈＰＳＣを誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）に効率的に転換する遺伝要素の同定を示す図であって、１０ｄｐｔにおける単一転写因子過剰発現によるｈＥＳＣ（Ｈ１株）のニューロン転換効率を示す。ＭＰＡ−２陽性細胞の全細胞（ＤＡＰＩ陽性）に対するパーセンテージを示す［Ｌ、ＬＨＸ６；Ｎ、ＮＫＸ２．１；Ｄ、ＤＬＸ２；Ａ、ＡＳＣＬ１；ＡＳＡ、ＡＳＣＬ１ホスホミュータント（ｐｈｏｓｐｈｏｍｕｔａｎｔ）］。データは、平均±ＳＥＭである（独立した実験  ｎ＞３）。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてのＴｕｋｅｙ検定は、有意差を示した、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ｈＰＳＣを誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）に効率的に転換する遺伝要素の同定を示す図であって、１０ｄｐｔにおける示されているＴＦの組合せによるｈＥＳＣ（Ｈ１株）の汎ニューロン転換（黒棒）およびＧＡＢＡ作動性ニューロン転換（白棒）の効率を示す。データは、平均±ＳＥＭである（独立した実験  ｎ＝３）。最適な組合せであるＡＳＡＤＬが赤色で示されている。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ｈＰＳＣを誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）に効率的に転換する遺伝要素の同定を示す図であって、ｍｉＲ−９／９＊−１２４（簡潔にするために本原稿を通してｍｉＲと示す）を用いてまたは用いずに形質導入されたＡＳＡＤＬ転換ｈＥＳＣの１０ｄｐｔにおけるニューロン転換効率を示す。データは、平均±ＳＥＭである（独立した実験  ｎ＞３）。対応のない両側ｔ検定は、有意差を示す、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ｈＰＳＣを誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）に効率的に転換する遺伝要素の同定を示す図であって、１０ｄｐｔにおけるＡＳＡＤＬ＋ｍｉＲによる２種のｈＥＳＣ株（Ｈ１およびＨ９）および３種のｈｉＰＳＣ株（ｉＰＳＣ１〜３）の汎ニューロン転換効率（黒棒）およびＧＡＢＡ作動性ニューロン転換効率（白棒）を示す。データは、平均±ＳＥＭである（独立した実験  ｎ＝３）。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ｈＰＳＣを誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）に効率的に転換する遺伝要素の同定を示す図であって、ＭＡＰ２とニューロン亜型のマーカとで免疫標識された、Ｈ１由来の誘導ＧＡＢＡ陽性神経細胞（ｉＧＮ）の代表画像を示す［ＧＡＢＡ、ガンマ−アミノ酪酸；ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼ；ＣＨＡＴ、コリンアセチルトランスフェラーゼ；５−ＨＴ、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニンとしても公知）；ＶＧＬＵＴ１／２、小胞グルタミン酸輸送体１および２］。データは、４２〜５０ｄｐｔに収集した。スケールバー＝２０μｍ。
【図１Ｈ】図１Ｈは、ｈＰＳＣを誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）に効率的に転換する遺伝要素の同定を示す図であって、ニューロンマーカＭＡＰ２も発現する、ニューロン亜型マーカ陽性細胞のパーセンテージを示す。データは、平均±ＳＥＭである（独立した実験  ｎ＝３）。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてのＴｕｋｅｙ検定は、有意差を示す、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００８４】
【図２Ａ】図２Ａは、ｉＧＮにおける前脳介在ニューロンマーカの発現を示す図であって、パッチピペットによりｉＧＮ単個細胞から吸引した細胞質を用いて行った、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｂｉｏｍａｒｋプラットフォームを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲを示す。ＡＳＡＤＬ＋ｍｉＲ−９／９＊−１２４を過剰発現することによりＨ１  ｈＥＳＣから派生されたｉＧＮを４８〜５２ｄｐｔに収集した。発現レベル（Ｃｔ値として示す）が最下部に色分けされている。解析した遺伝子がそれらの細胞機能と共に右側に示されている。数は、解析した個々のｉＧＮ細胞を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｉＧＮにおける前脳介在ニューロンマーカの発現を示す図であって、ＮｅｕＮ（左、成熟ニューロンマーカ）、ＳＭＩ−３１２（中央、軸索マーカ）およびアンキリンＧ（右、軸索起始部のマーカ）に対する抗体でのｉＧＮの免疫染色を示す。スケールバー＝２０μｍ。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｉＧＮにおける前脳介在ニューロンマーカの発現を示す図であって、左図でｉＧＮは、終脳マーカＦＯＸＧ１を発現したが、右図で線条体ＭＳＮのマーカであるＤＡＲＰＰ−３２を発現しなかった。スケールバー＝２０μｍ。右パネル内の挿入部は、ＤＡＲＰＰ−３２発現ＭＳＮを含有することが分かっている培養ラット線条体ニューロンに対するＤＡＲＰＰ−３２抗体の陽性シグナルを示したものである。挿入部スケールバー＝６０μｍ。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ｉＧＮにおける前脳介在ニューロンマーカの発現を示す図であって、左図はＧＡＤ１抗体（ＧＡＢＡ合成酵素）で染色されたｉＧＮの代表画像、右図は小胞ＧＡＢＡ輸送体ＶＧＡＴ、抑制性シナプス後タンパク質ゲフィリンおよびニューロンマーカＭＡＰ２に対する抗体で染色されたｉＧＮの共焦点画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。挿入図を右側に拡大して、形態学的抑制性シナプスの例証となるＶＧＡＴおよびゲフィリンの並置された終末ボタン様シグナルを示した。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ｉＧＮにおける前脳介在ニューロンマーカの発現を示す図であって、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、カルレチニン（ＣＲ）、カルビンディン（ＣＢ）およびニューロペプチド−Ｙ（ＮＰＹ）およびパルブアルブミン（ＰＶ）を含む介在ニューロン亜型マーカに対する抗体でのｉＧＮの免疫染色を示す。データは、７０〜９０ｄｐｔに収集したＰＶを除いて、４２〜５６ｄｐｔに収集した。スケールバー＝２０μｍ。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ｉＧＮにおける前脳介在ニューロンマーカの発現を示す図であって、リーリン（ＲＥＬＮ）、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）および血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）を含む介在ニューロン亜型マーカに対する抗体でのｉＧＮの免疫染色を示す。矢印は、示されている亜型マーカも発現した神経細胞を指している。スケールバー＝２０μｍ。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ｉＧＮにおける前脳介在ニューロンマーカの発現を示す図であって、図２Ｅおよび図２Ｆに示されていた介在ニューロン亜型マーカのパーセンテージの棒グラフとしての定量を示す。データは、平均±ＳＥＭである（独立した実験  ｎ＝３）。
【００８５】
【図３Ａ】図３Ａは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮの固有の電気生理学的特性を示すが、ｉＧＮにおける電位依存性Ｎａ＋およびＫ＋電流の存在を示す代表トレースである。青い囲み枠は、Ｎａ＋チャネル依存性内向き電流を指摘するものである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮの固有の電気生理学的特性を示すが、４２ｄｐｔ（ｎ＝４１）または５６ｄｐｔ（ｎ＝５３）のどちらかにおいてｉＧＮから記録された、Ｎａ＋およびＫ＋電流について平均した（平均±ＳＥＭ）電流−電位関係（Ｉ／Ｖ曲線）である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮの固有の電気生理学的特性を示すが、４２ｄｐｔ（ｎ＝４１）または５６ｄｐｔ（ｎ＝５３）のどちらかにおいてｉＧＮから記録された膜抵抗（Ｒｍ、左）、膜電気容量（Ｃｍ、中央）および静止膜電位（ＲＭＰ、右）の定量である。統計的有意性を対応のない両側ｔ検定によって評価した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮの固有の電気生理学的特性を示すが、細胞接着モードで５６ｄｐｔにおいてｉＧＮから記録された、自発性活動電位（ＡＰ）の様々なパターンの代表トレースである。解析した細胞の総数：ｎ＝１６。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮの固有の電気生理学的特性を示すが、電流注入（上のパネル）によって引き起こされた、５６ｄｐｔにおいてｉＧＮから記録された複数のＡＰ発生の代表トレース（下のパネル）である。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮの固有の電気生理学的特性を示すが、４２ｄｐｔ（ｎ＝４１）または５６ｄｐｔ（ｎ＝５３）のどちらかにおいてｉＧＮから記録された、スパイク頻度と電流パルス振幅によるＡＰ発生特性の特性解析である。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮからのＧＡＢＡ放出の実証を示すが、ＣｈＥＴＡ発現ｉＧＮとシナプスにより接続されている誘導興奮性ニューロン（ｉＥＮ）に対するパッチングを示す模式図である。
【図３Ｈ】図３Ｈは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮからのＧＡＢＡ放出の実証を示すが、光遺伝学のための誘導ニューロンのマージされた微分干渉（ＤＩＣ）および蛍光（ＥＹＦＰによりｉＧＮが標識されており、ｔｕｒｂｏＲＦＰによりｉＥＮが標識されている）画像である。右の画像は、左の画像から拡大された、ｉＥＮに対するパッチングの選択を描写するものである。スケールバー＝５μｍ。
【図３Ｉ】図３Ｉは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮからのＧＡＢＡ放出の実証を示すが、上のパネルは、ｉＧＮにおける反復シナプス前光刺激（３０ｓごとに５ｍｓ、青色光として示されている）によって誘発されたシナプス応答を示すオーバーレイトレース（上のパネル）である。１０回の刺激のうち２回は、ＩＰＳＣをもたらすことができなかった。下のパネルは、誘発された応答を完全に遮断したビククリン（２０μＭ）の添加である。
【図３Ｊ】図３Ｊは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮからのＧＡＢＡ放出の実証を示すが、ｉＧＮから記録されたＧＡＢＡ（１ｍＭ、１００ｍｓ）誘発応答（黒トレース）をである。この応答は、ビククリン処置によって遮断された（赤トレース）。
【図３Ｋ】図３Ｋは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮからのＧＡＢＡ放出の実証を示すが、ビククリンによって遮断される、ｉＧＮにおいて記録された自発性ＩＰＳＣ（ｓＩＰＳＣ）の代表トレースである。青い囲み枠は、ｓＩＰＳＣの詳細を説明するものである。
【図３Ｌ】図３Ｌは、ｈＥＳＣから誘導されたｉＧＮの電気生理学的特性を示す図であって、ｉＧＮからのＧＡＢＡ放出の実証を示すが、左図は４２および５６ｄｐｔにおいてｉＧＮ（ｎ＝６１）から記録されたｓＩＰＳＣの頻度および右図は振幅の定量である。
【００８６】
【図４Ａ】図４Ａは、マウス皮質における移植されたヒトｉＧＮの機能的成熟および組み込みを示す図であって、マウス皮質の主として第５／６層におけるヒトｉＧＮ（赤）の分布を例証するための全体像を示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｂ】図４Ｂは、マウス皮質における移植されたヒトｉＧＮの機能的成熟および組み込みを示す図であって、図４Ａの白い囲み枠部を３倍拡大した図である。図４Ｂは、ヒトｉＧＮ（赤）の神経突起分枝の例証である。ヒトｉＧＮは、成熟ニューロンマーカＮｅｕＮも発現した。スケールバー＝５０μｍ。
【図４Ｃ】図４Ｃは、マウス皮質における移植されたヒトｉＧＮの機能的成熟および組み込みを示す図であって、汎ニューロンマーカＭＡＰ２、ＧＡＢＡ作動性マーカＧＡＤ６７およびＧＡＢＡ、ならびに介在ニューロン亜型マーカＳＳＴを発現した移植ヒトｉＧＮを示す。スケールバー＝２０μｍ。
【図４Ｄ】図４Ｄは、マウス皮質における移植されたヒトｉＧＮの機能的成熟および組み込みを示す図であって、各マーカに関して陽性のヒト細胞のパーセンテージの定量を示す。データは、動物（ｎ＝３）から、マーカごとに２０個より多くの細胞を計数して得たものである。
【図４Ｅ】図４Ｅは、マウス皮質における移植されたヒトｉＧＮの機能的成熟および組み込みを示す図であって、電流注入（下のパネル）によって引き起こされた、移植ヒトｉＧＮから記録された複数のＡＰ発生の代表トレース（下のパネル）を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、マウス皮質における移植されたヒトｉＧＮの機能的成熟および組み込みを示す図であって、スパイク頻度と電流パルス振幅によるヒトｉＧＮのＡＰ発生特性の特性解析を示す。
【図４Ｇ】図４Ｇは、マウス皮質における移植されたヒトｉＧＮの機能的成熟および組み込みを示す図であって、ＣＮＱＸ（５０μＭ）によって遮断される、ｉＧＮにおいて記録された自発性ＥＰＳＣ（ｓＥＰＳＣ）の代表トレースを示す。青い囲み枠は、ｓＥＰＳＣの詳細を例証するものである。
【図４Ｈ】図４Ｈは、マウス皮質における移植されたヒトｉＧＮの機能的成熟および組み込みを示す図であって、ｉＧＮ（ｎ＝９）から記録されたｓＥＰＳＣ頻度（左）および振幅（右）の定量を示す。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【００８７】
【図５Ａ】図５Ａは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、哺乳動物の皮質に見られる比を模倣するためのヒト誘導興奮性ニューロン（ｉＥＮ、８０％）および抑制性ニューロン（ｉＧＮ、２０％）の共培養を例証する模式図である。ｉＧＮがＡＳＡＤＬ＋ｍｉＲ−９／９＊−１２４の過剰発現によって生成され、ｉＥＮがＮｅｕｒｏＤ２の過剰発現によって生成された（補足の材料および方法も参照されたい）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、ｓＩＰＳＣおよびｓＥＰＳＣ両方が、ビククリンおよびＣＮＱＸによってそれぞれ遮断される混合ｉＥＮ／ｉＧＮを含有するカバーガラス上で培養したｉＧＮから記録されたものである。データは、５６ｄｐｔに収集した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、図５Ｂの囲み枠１〜３についての拡大表示トレースである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、ベースライン記録の２分後にビククリンを添加した（赤で示されている）、ｉＥＮにおけるカルシウムスパイクの代表ラスタープロットである。
【図５Ｅ】図５Ｄは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、ベースライン記録の２分後にビククリンを添加した（赤で示されている）、混合ｉＥＮ／ｉＧＮ回路網におけるカルシウムスパイクの代表ラスタープロットである。
【図５Ｆ】図５Ｆは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、ｉＥＮ（左）または混合ｉＥＮ／ｉＧＮ培養物（右）（ｉＥＮおよびｉＥＮ／ｉＧＮについてそれぞれｎ＝５および４）のバースト数（上）および同期度（下）の統計解析を示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、対照またはＭＤＧＡ１過剰発現を有するｉＧＮのＶＧＡＴ免疫蛍光染色の代表画像を示す。スケールバー＝５μｍ。
【図５Ｈ】図５Ｈは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、無作為に選んだ領域の終末ボタン数（左）と同様の樹状突起分枝（右）（対照およびＭＤＧＡ１過剰発現両方についてｎ＝８）によって示される、ＶＧＡＴ陽性終末ボタン密度の定量を示す。
【図５Ｉ】図５Ｉは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、対照（左）またはＭＤＧＡ１（右）過剰発現を有するｉＧＮにおいて記録されたｓＩＰＳＣの代表トレースを示す。
【００８８】
【図５Ｊ】図５Ｊは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、対照またはＭＤＧＡ１過剰発現（対照およびＭＤＧＡ１過剰発現についてそれぞれｎ＝１３および１２）を有するｉＧＮにおいて記録されたｓＩＰＳＣ頻度の累積プロットおよびヒストグラムを示す。すべてのヒストグラムデータを平均±ＳＥＭとして示す。統計的有意性は、対応のある両側ｔ検定によって評価した（Ｆ）を除いて、対応のない両側ｔ検定によって評価した（＊ｐ＜０．０５）。
【図５Ｋ】図５Ｋは、神経回路網の活動の研究への、および抑制性シナプスに対して特異的に影響を与える遺伝子の機能性調査への、ｉＧＮの応用を示す図であって、対照またはＭＤＧＡ１過剰発現（対照およびＭＤＧＡ１過剰発現についてそれぞれｎ＝１３および１２）を有するｉＧＮにおいて記録された振幅の累積プロットおよびヒストグラムを示す。すべてのヒストグラムデータを平均±ＳＥＭとして示す。統計的有意性は、対応のある両側ｔ検定によって評価した（Ｆ）を除いて、対応のない両側ｔ検定によって評価した（＊ｐ＜０．０５）。
【００８９】
【図６】図６は、多能性マーカおよび神経系前駆細胞マーカに対する特異的抗体での免疫染色によるｈＰＳＣ株の特性解析を示す図である。２種のｈＥＳＣ株（Ｈ１およびＨ９）および３種のヒトｉＰＳＣ株（ｈｉＰＳＣ１〜３）は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２を含む多能性マーカを発現したが神経系前駆細胞マーカＮＥＳＴＩＮおよびＭＵＳＡＳＨＩを発現しなかった。２つの挿入図は、陽性対照としてのＮＥＳＴＩＮ（左下の挿入図、赤）およびＭＵＳＡＳＨＩ（右下の挿入図、緑）に対する特異的抗体で免疫染色されたヒト神経系前駆細胞の画像である。
【００９０】
【図７Ａ】図７Ａは、ｈＰＳＣからのＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）の効率的分化のための遺伝要素の同定および得られたｉＧＮの分子的特性解析を示す図であって、ＤＡＰＩ陽性シグナルに対するＭＡＰ２陽性細胞のパーセンテージによって表われた、複数の転写因子の組合せによるニューロン転換効率の定量を示す。Ａを伴わないＤ、ＮおよびＬの組合せが有意な数のニューロンを産生できなかったことに注目されたい。データは、１０ｄｐｔに収集した。データは、平均±ＳＥＭである（独立した実験  ｎ＝４）。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてのＴｕｋｅｙ検定は、有意差を示す、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｈＰＳＣからのＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）の効率的分化のための遺伝要素の同定および得られたｉＧＮの分子的特性解析を示す図であって、１０ｄｐｔにおいてｍｉＲ−９／９＊−１２４（簡潔にするために本原稿を通してｍｉＲと示す）と共にまたは無しでＡＳＡＤＬ因子を用いて形質導入したｈＥＳＣの代表画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。ニューロン転換効率を（Ｈ）に示す。データは、平均±ＳＥＭである（独立した実験  ｎ＝３）。対応のない両側ｔ検定は、有意差を示す、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ｈＰＳＣからのＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）の効率的分化のための遺伝要素の同定および得られたｉＧＮの分子的特性解析を示す図であって、１０ｄｐｔにおいてＡＳＡＤＬまたはＡＳＡＤＬ＋ｍｉＲによって形質導入されたＨ１  ｈＥＳＣにおけるＭＡＰ２染色の解析に基づく全樹状突起長（左）および一次枝数（右）の定量を示す。各場合、６０〜８０個の細胞を解析した。対応のない両側ｔ検定は、有意差を示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ｈＰＳＣからのＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）の効率的分化のための遺伝要素の同定および得られたｉＧＮの分子的特性解析を示す図であって、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析が、ｉＧＮ（ＡＳＡＤＬ＋ｍｉＲ−９／９＊−１２４によって形質導入されたもの）が、ＧＡＢＡ輸送および合成に必要な遺伝子（ＶＧＡＴ、ＧＡＤ１およびＧＡＤ２）を１４ｄｐｔに発現すること、および３つすべての遺伝子の発現が３５ｄｐｔには確実にさらに増加していたことを示したことを示している。約１０〜１５％のＧＡＢＡ作動性ニューロンを含有し、陽性対照としての役割を果したＨＮ（胎児ヒトニューロン、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌから購入したもの）に正規化して結果を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ｈＰＳＣからのＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）の効率的分化のための遺伝要素の同定および得られたｉＧＮの分子的特性解析を示す図であって、介在ニューロン亜型マーカＳＳＴおよびＣＲをそれぞれ発現したｉＧＮもあり、その一方で両方のマーカを発現した細胞もあることを示す免疫染色画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。
【００９１】
【図８Ａ】図８Ａは、ｉＧＮの電気生理学的特性解析を示す図であって、さらなるｈＰＳＣ細胞株から転換されたｉＧＮの発火特性を示すが、電流注入（下のパネル）によって引き起こされた、５０ｄｐｔにおいてｉＧＮ（Ｈ９  ｈＥＳＣ由来のもの）から記録された複数のＡＰ発生の代表トレース（上のパネル）を示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ｉＧＮの電気生理学的特性解析を示す図であって、さらなるｈＰＳＣ細胞株から転換されたｉＧＮの発火特性を示すが、５０ｄｐｔ（ｎ＝１２）においてｉＧＮ（Ｈ９  ｈＥＳＣ由来のもの）から記録された、スパイク頻度と電流パルス振幅によるＡＰ発生特性の定量を示している。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ｉＧＮの電気生理学的特性解析を示す図であって、さらなるｈＰＳＣ細胞株から転換されたｉＧＮの発火特性を示すが、電流注入（下のパネル）によって引き起こされた、５０ｄｐｔにおいてｉＧＮ（ｈｉＰＳＣ＃１由来のもの）から記録された複数のＡＰ発生の代表トレース（上のパネル）を示している。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ｉＧＮの電気生理学的特性解析を示す図であって、さらなるｈＰＳＣ細胞株から転換されたｉＧＮの発火特性を示すが、５０ｄｐｔ（ｎ＝１３）においてｉＧＮ（ｈｉＰＳＣ＃１由来のもの）から記録された、スパイク頻度と電流パルス振幅によるＡＰ発生特性の定量を示している。
【図８Ｅ】図８Ｅは、ｉＧＮの電気生理学的特性解析を示す図であって、４２〜５６ｄｐｔにおいて記録されたｉＧＮの４つの異なるＡＰ発火パターンの特性解析を示すが、４２〜５６ｄｐｔにおけるｉＧＮにおいて記録された４つの異なるＡＰ発火パターン：適応（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ）、非適応（ｎｏｎ−ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ）、抗適応（ａｎｔｉ−ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ）および単一スパイクの代表トレースを示している。
【図８Ｆ】図８Ｆは、ｉＧＮの電気生理学的特性解析を示す図であって、４２〜５６ｄｐｔにおいて記録されたｉＧＮの４つの異なるＡＰ発火パターンの特性解析を示すが、４２〜５６ｄｐｔにおいてｉＧＮで観察された各発火パターン（合計ｎ＝９）の比率を図示する円グラフである。
【図８Ｇ】図８Ｇは、ｉＧＮの電気生理学的特性解析を示す図であって、４２〜５６ｄｐｔにおいて記録されたｉＧＮの４つの異なるＡＰ発火パターンの特性解析を示すが、適応（タイプＩ）または非適応（タイプＩＩ）発火パターンを示すｉＧＮ（４２〜５６ｄｐｔ）の活動電位（ＡＰ）閾値（左）ＡＰ半値幅（中央）および過分極後（ＡＨＰ、右）の定量を示している。統計的有意性を対応のない両側ｔ検定によって評価した、＊＊ｐ＜０．０１。（
【図８Ｈ】図８Ｈは、図８Ｇは、ｉＧＮの電気生理学的特性解析を示す図であって、４２〜５６ｄｐｔにおいて記録されたｉＧＮの４つの異なるＡＰ発火パターンの特性解析を示すが、適応（タイプＩ）または非適応（タイプＩＩ）発火パターンを示すｉＧＮのスパイク頻度と電流パルス振幅の特性解析を示している。すべてのデータを平均±ＳＥＭとして示す。
【００９２】
【図９Ａ】図９Ａは、ヒト誘導興奮性ニューロン（ｉＥＮ）の分子的および電気生理学的特性解析を示す図であって、３５ｄｐｔにおいてｉＥＮ（ｈＥＳＣにおけるＮｅｕｒｏＤ２の強制異所発現により分化させたもの）は、グルタミン酸輸送を担当する遺伝子ＶＧＬＵＴ１およびＶＧＬＵＴ２を高レベルで発現するが、ＧＡＢＡ輸送および合成に関わるもの（ＶＧＡＴ、ＧＡＤ１およびＧＡＤ２）を発現しなかったことを示す、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を示している。示されている結果は、ＨＮ（胎児ヒトニューロン、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌから購入したものであり、陽性対照としての役割を果した）における遺伝子発現レベルに正規化したものである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ヒト誘導興奮性ニューロン（ｉＥＮ）の分子的および電気生理学的特性解析を示す図であって、ｄｐｔ２１におけるｉＥＮの電気生理学的特性を示すが、Ｎａ＋およびＫ＋電流（ｎ＝３４）についての平均した電流と電位の関係（Ｉ／Ｖ曲線）を示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ヒト誘導興奮性ニューロン（ｉＥＮ）の分子的および電気生理学的特性解析を示す図であって、ｄｐｔ２１におけるｉＥＮの電気生理学的特性を示すが、電流注入パラダイム（下のパネル）によって引き起こされた、ｉＥＮから記録された複数のＡＰ発生の代表トレース（上のパネル）を示している。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ヒト誘導興奮性ニューロン（ｉＥＮ）の分子的および電気生理学的特性解析を示す図であって、ｄｐｔ２１におけるｉＥＮの電気生理学的特性を示すが、ＡＰスパイク頻度と電流注入ステップの特性解析（ｎ＝３４）を示している。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ヒト誘導興奮性ニューロン（ｉＥＮ）の分子的および電気生理学的特性解析を示す図であって、ｄｐｔ２１におけるｉＥＮの電気生理学的特性を示すが、２１ｄｐｔにおいてｉＥＮから記録された自発性ＥＰＳＣ（ｓＥＰＳＣ）の代表トレースを示している。ｓＥＰＳＣの詳細なトレースを例証するために囲み枠部（青）拡大を使用した。
【図９Ｆ】図９Ｆは、ヒト誘導興奮性ニューロン（ｉＥＮ）の分子的および電気生理学的特性解析を示す図であって、ｄｐｔ２１におけるｉＥＮの電気生理学的特性を示すが、ｉＥＮ間のシナプス伝達の大部分が興奮性グルタミン酸作動性シナプス伝達であったことを示す、２１ｄｐｔのｉＥＮにおけるｓＥＰＳＣを完全に消失させたＣＮＱＸ（２０μＭ）の適用を示している。
【図９Ｇ】図９Ｇは、ヒト誘導興奮性ニューロン（ｉＥＮ）の分子的および電気生理学的特性解析を示す図であって、ｄｐｔ２１におけるｉＥＮの電気生理学的特性を示すが、ｉＥＮから記録されたｓＥＰＳＣ頻度（左）および振幅（右）の定量を示している。
【００９３】
【図１０Ａ】図１０Ａは、ｈＥＳＣから誘導されたＣｈＥＴＡ発現ｉＧＮの、光刺激により誘発された応答の定量を示す図であって、ＣｈＥＴＡを発現する誘導ｉＧＮに関するホールセルパッチクランプ記録を示す模式図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ｈＥＳＣから誘導されたＣｈＥＴＡ発現ｉＧＮの、光刺激により誘発された応答の定量を示す図であって、ＣｈＥＴＡを発現するｉＧＮにおいて５６ｄｐｔに記録された、電位固定下での光刺激により引き起こされた内向き電流（上パネル）を示している。ナトリウムチャネルブロッカーＴＴＸ（１μＭ）の適用は、これらの光誘発電流を遮断することができなかった（下のパネル）。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ｈＥＳＣから誘導されたＣｈＥＴＡ発現ｉＧＮの、光刺激により誘発された応答の定量を示す図であって、様々な強度（０．２５ｍＷ〜１．００ｍＷ）での光刺激により誘導された内向き電流を示している。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ｈＥＳＣから誘導されたＣｈＥＴＡ発現ｉＧＮの、光刺激により誘発された応答の定量を示す図であって、電流固定モード下で光刺激（１Ｈｚ）によって引き起こされたＡＰを示している。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、ｈＥＳＣから誘導されたＣｈＥＴＡ発現ｉＧＮの、光刺激により誘発された応答の定量を示す図であって、ＣｈＥＴＡを発現していない誘導ｉＧＮに関するホールセルパッチクランプ記録を示す模式図である。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、ｈＥＳＣから誘導されたＣｈＥＴＡ発現ｉＧＮの、光刺激により誘発された応答の定量を示す図であって、ＣｈＥＴＡを発現していないｉＧＮでは光刺激時に内向き電流が記録されなかったことを示している。
【００９４】
【図１１】図１１は、マウスの大脳皮質に移植されたｉＧＮの電子顕微鏡検査を示す図である。（Ａ〜Ｃ）は、シナプス前終末ボタン（黄色アスタリスク）を有するシナプス（矢印）を構成する、ＲＦＰ／ＤＡＢで染色されたｉＧＮ樹状突起（Ｄという表示が付いているもの、黄色）の超微細構造を明示する３つの連続した一連の画像（１〜３）である。スケールバー＝１μｍ。
【００９５】
【図１２Ａ】図１２Ａは、ｉＥＮにおけるＭＤＧＡ１の過剰発現が興奮性シナプスの形成を変化させなかったことを示す図であって、対照（左）またはＭＤＧＡ１過剰発現（右）を有するｉＧＮにおいて記録されたｓＥＰＳＣの代表トレースを示している。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ｉＥＮにおけるＭＤＧＡ１の過剰発現が興奮性シナプスの形成を変化させなかったことを示す図であって、対照を有するｉＥＮ（灰色）またはＭＤＧＡ１過剰発現を有するｉＥＮ（黒）（対照：ｎ＝１１；ＭＤＧＡ１過剰発現：ｎ＝１０）からのｓＩＰＳＣの頻度（Ｂ）についての累積プロットおよびヒストグラムを示す。すべてのデータは、Ｈ１  ｈＥＳＣ由来の２１ｄｐｔ  ｉＥＮから収集した。統計的有意性を対応のない両側ｔ検定によって評価した。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ｉＥＮにおけるＭＤＧＡ１の過剰発現が興奮性シナプスの形成を変化させなかったことを示す図であって、対照を有するｉＥＮ（灰色）またはＭＤＧＡ１過剰発現を有するｉＥＮ（黒）（対照：ｎ＝１１；ＭＤＧＡ１過剰発現：ｎ＝１０）からのｓＩＰＳＣの振幅についての累積プロットおよびヒストグラムを示す。すべてのデータは、Ｈ１  ｈＥＳＣ由来の２１ｄｐｔ  ｉＥＮから収集した。統計的有意性を対応のない両側ｔ検定によって評価した。
【００９６】
【図１３Ａ】図１３Ａは、Ｄｏｘ誘導性ｉＧＮ  ｈＥＳＣ株を示す図であって、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ、１μｇ／ｍｌ）処置に基づく、示されている日における誘導性ｉＧＮ  ｈＳＥＣ株（Ｈ１由来）の形態変化を例証する微分干渉（ＤＩＣ）画像を示す。スケールバー＝４０μｍ。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、Ｄｏｘ誘導性ｉＧＮ  ｈＥＳＣ株を示す図であって、Ｄｏｘ処置に基づく、示されている日におけるニューロンマーカＭＡＰ２（赤）およびＮｅｕＮ（緑）に対する特異的抗体でのＤｏｘ誘導性ｉＧＮの免疫染色を示す。スケールバー＝２０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
実験セクション
最良のモードを含む本発明の非限定的実施例、および比較例を、特定の実施例への言及によってさらに、より詳細に説明するが、これらの実施例をいかなる点においても本発明の範囲を限定するものと見なすべきではない。
【００９８】
材料および方法
【００９９】
プラスミド構築物の生成
【０１００】
記載通りのバイシストロン性レンチウイルス骨格（ａｄｄｇｅｎｅ  ＃３１７８０）を使用して、ＥＦ１ａプロモータ下で、ｈＡＳＣＬ１（ＮＭ＿００４３１６．３）、ｈＡＳＣＬ１−ホスホミュータント、ｈＮＫＸ２．１（ＮＭ＿００３３１７．３）、ｈＤＬＸ２（ＮＭ＿００４４０５．３）、ｈＬＨＸ６（ＮＭ＿０１４３６８．４）およびｈＮｅｕｒｏＤ２（ａｄｄｇｅｎｅ  ＃３１７８０）をコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングした。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性レンチウイルスｍｉＲ−９／９＊−１２４構築物は、記載通りであった（ａｄｄｇｅｎｅ  ＃３１８７４）。ｒｔＴＡのレンチウイルス発現ベクターは、ａｄｄｇｅｎｅ  ＃２０３４２（ＦＵＷ−ｒｔＴＡ−ｐＧＫ−ハイグロマイシン）から改良した。
【０１０１】
最適な遺伝要素（ＡＳＡＤＬ＋ｍｉＲ−９／９＊−１２４）を同定したら、４つのリプログラミング因子を２つのｄｏｘ誘導性レンチウイルス構築物（ａｄｄｇｅｎｅ  ＃２７１５１から改良したＴｅｔＯ−ＡＳＡ−Ｔ２Ａ−ＤＬＸ２−ｐＧＫ−ブラスチサイジン、およびａｄｄｇｅｎｅ  ＃３１８７４から改良したｐＴｉｇｈｔ−ｈＬＨＸ６−ｍｉＲ−９／９＊−１２４−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ）にパッキングした。
【０１０２】
光遺伝学的実験のために、ＣｈＥＴＡ−ＥＹＦＰをコードするｃＤＮＡをＡｄｄｇｅｎｅ  ＃２６９６７から得て、ヒトシナプシンプロモータ（シナプシン−ＣｈＥＴＡ−ＥＹＦＰ）を用いてレンチウイルス構築物にサブクローニングした。ＭＤＧＡ１過剰発現のために、ヒトＭＤＧＡ１をコードするｃＤＮＡをａｄｄｇｅｎｅ  ＃２０３４２（ＦＵＷ−ＭＤＧＡ１）のレンチウイルス骨格にサブクローニングした。
【０１０３】
レンチウイルス粒子を生成するために、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してレンチウイルス発現ベクターをｐｓＰＡＸ２と共に、およびｐＭＤ２．Ｇと共に、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にコトランスフェクトした。上清を培地から収集し、ＰＥＧ−ｉｔキット（＃  ＬＶ８１０Ａ−１、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の手順書に従って使用してレンチウイルス粒子を濃縮した。
【０１０４】
ｈＰＳＣ細胞培養
【０１０５】
ヒトＥＳＣ  Ｈ１およびＨ９株は、元々はＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手したものであり、それを研究室で維持している。ｈｉＰＳＣ株＃１は、Ｋｅｒａｆａｓｔ（ＡＧ１−０）から入手した。ｈｉＰＳＣ株＃２および＃３は、それぞれＧＭ２３３３８およびＧＭ２３２７９であり、両方ともＣｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。すべての株（ｈＥＳＣｓ、ｈｉＰＳＣｓおよびｉＧＮ誘導性株をフィーダーフリー条件下、マトリゲル被覆細胞培養プレートにおいてｍＴｅＳＲ１培地で培養した。そしてＤｉｓｐａｓｅまたはＲｅＬｅＳＲ（すべてＳｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのもの）を使用してそれらの株を定期的に継代させる（１：６〜１：１０）。使用したすべての株は、正常な核型を提示した。
【０１０６】
ｈＰＳＣからの誘導神経細胞の生成
【０１０７】
ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣを、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で解離させて単個細胞にし、マトリゲル被覆細胞培養プレート上の、チアゾビビン（１μＭ、ＴＯＣＲＩＳ）を補充したｍＴｅＳＲ１培地に播種した。翌日、本研究の中で示すような様々な転写因子およびマイクロＲＮＡを発現するレンチウイルスを用いて細胞に形質導入した。これを第０日と指定する。翌日、培地のＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｅｄｉａ（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ）への交換を完了し、それを実験終了まで使用した。Ｄｏｘ誘導ｉＧＮ株を使用する実験については、ドキシサイクリンを１μｇ／ｍｌで培地に添加し、３週間維持した。細胞を３〜７ｄｐｔに適切な抗生物質で選択して、形質導入細胞を濃縮した。誘導ニューロン（ｄｐｔ１４以降）の分子的および機能的特性解析のために、細胞を７〜１０ｄｐｔに解離させ、ポリ−Ｌ−リシン／ラミニン被覆カバーガラス上に、または細胞培養プレート上に播種した。ヒト誘導神経細胞に、該誘導ニューロンの生存およびシナプス成熟を増進するために、初代ラットグリア細胞（Ｐ１新生仔ラット皮質由来のものであって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２継代より多くの継代にわたり培養したもの）および神経栄養因子（ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ３およびＩＧＦ１、各々１０ｎｇ／ｍｌ、すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈからのもの）を１４〜２０ｄｐｔに添加した。
【０１０８】
誘導性ｉＥＮ／ｉＧＮ  ｈＥＳＣ株の生成のために、ｒｔＴＡを安定的に発現するＨ１  ｈＥＳＣを先ず樹立した（ｈＵｂｃ−ｒｔＴＡ−ｐＧＫ−ｈｙｇｒｏでのレンチウイルス形質導入、そしてその後、ハイグロマイシンで選択した）。この株に、ＴｅｔＯ−ｈＮｅｕｒｏＤ２−ｐＧＫ−ｐｕｒｏでさらに形質導入し、ピューロマイシンで選択して誘導性ｉＥＮ株を生成した。同様に、本発明者らは、ＴｅｔＯ−ＡＳＡ−Ｔ２Ａ−ＤＬＸ２−ｐＧＫ−ブラスチサイジンおよびＴｅｔＯ−ｍｉＲ−９／９＊−１２４−ｐＧＫ−ピューロマイシンで上述のｒｔＴＡ発現Ｈ１株に形質導入することによりｄｏｘ誘導性ｉＧＮ株を生成し、ブラスチサイジンおよびピューロマイシンで安定的に選択した。
【０１０９】
蛍光免疫細胞化学（培養細胞）
【０１１０】
免疫染色実験を行った。細胞を４％ＰＦＡ中で２０分間固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間、透過処理した後、６０分間ブロッキングした。ブロッキング用緩衝液は、ＰＢＳ中、５％ＢＳＡおよび２％ＦＢＳで構成した。一次抗体をブロッキング用緩衝液で希釈し、細胞を一晩、４度でインキュベートした。二次抗体は、Ａｌｅｘａ−４８８、Ａｌｅｘａ−５９４またはＡｌｅｘａ−６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と結合したロバまたはヤギ抗ウサギ、マウスまたはニワトリＩｇＧであった。次の一次抗体を使用した：ニワトリ抗ＭＡＰ２（Ａｂｃａｍ  ＡＢ５３９２）、マウス抗ＭＡＰ２（Ａｂｃａｍ  ＡＢ１１２６７０）、マウス抗ベータＩＩＩチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ、ＭＭＳ−４３５Ｐ）、マウス抗ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ３７７）、マウス抗アンキリンＧ（ＮｅｕｒｏＭａｂ  ７５−１４６）、マウス抗ＳＭＩ−３１２（Ｃｏｖａｎｃｅ  ＳＭＩ−３１２Ｒ）、ウサギ抗ＦＯＸＧ１（Ａｂｃａｍ  ＡＢ１８２５９）、マウス抗リーリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ５３６４）、ヤギ抗ＣｈａＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ１４４Ｐ）、モルモット抗ＶＧＬＵＴ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ５９０５）、モルモット抗ＶＧＬＵＴ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ５９０７）、ウサギ抗ＤＡＲＰＰ−３２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−１１３６４）、マウス抗ゲフィリン（ＳＹＳＹ  １４７０２１）、ウサギ抗シナプシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ３５５）、ウサギ抗ｎＮＯＳ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ，２４２８７）、マウス抗ＧＡＤ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ５４０６）、ウサギ抗ＶＧＡＴ（ＳＹＳＹ  １３１００３）、ウサギ抗ＮＰＹ（Ａｂｃａｍ  １０９８０）、ウサギ抗ＶＩＰ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ  ２００７７）、マウス抗ＰＶ（ＳＷＡＮＴ，ＰＶ２３５）、ヤギ抗カルレチニン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ１５５０）、マウス抗カルビンディン１（ＳＷＡＮＴ  ３００）、ウサギ抗ＳＳＴ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ／Ｂａｃｈｅｍ  Ｔ４１０３）、ウサギ抗ＧＡＢＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ２０５２）、マウス抗ＴＨ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ  ２２９４１）、ウサギ抗５−ＨＴ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ  ２００８０）。画像は、Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ．１またはＬＳＭ  ７１０（Ｚｅｉｓｓ）を使用して獲得した。ＶＧＡＴおよびゲフィリン終末ボタンを、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）およびＩｍａｇｅ  Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）で解析した。ＶＧＡＴ密度解析のために、同様のニューロン密度を有する領域を無作為に選んだ。（面積が）０．２２μｍ２未満であるＶＧＡＴ蛍光シグナルは、分析から除外した。同じ強度閾値を対照およびＭＤＧＡ１過剰発現ニューロン両方に使用した。選んだ各領域内のＭＡＰ２シグナルを使用して全密度長を定量して、画像面積に考慮することによりこのＶＧＡＴ密度計算が信頼できることを確証した。
【０１１１】
遺伝子発現解析
【０１１２】
プールされた培養細胞の定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析のために、ＤｉｒｅｃｔＺｏｌ（Ｚｙｍｏ）を使用してＲＮＡを抽出し、デオキシリボヌクレアーゼで処置し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｃＤＮＡに転換させた。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムを使用して、リアルタイムＰＣＲアッセイを行った。マルチプレックスシングルセルｑＰＣＲを実行した。カバーガラス上で増殖している単個誘導神経細胞の細胞質（形質導入の７週間後）をパッチピペットに吸引し、２Ｘ  ＣｅｌｌｓＤｉｒｅｃｔ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に排出し、急速冷凍し、処理するまで−８０℃で保持した。解凍した細胞質を逆転写（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に付し、標的遺伝子（ＳＴＡ）に特異的なプールされたプライマーを用いて１８サイクルのＰＣＲによる前増幅に付した。次いで、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、ＰＮ  Ｍ０２９３）を使用して未使用のプライマーを消化した。製造業者の手順書に従って、示されているプライマー対（図２、完全プライマーの情報については表１を参照されたい）およびＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｗｉｔｈ  Ｌｏｗ  ＲＯＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するＢｉｏｍａｒｋ  ＨＤ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）のＢｉｏｍｒｋ  ９６：９６  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を用いるリアルタイムＰＣＲ解析のために、個々の細胞の浄化されたｃＤＮＡを処理した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、データを収集し、解析した。図２Ａに示されている色分けされたＣｔ値を使用して、結果をヒートマップとして表した。使用したプライマーは、特異的融解曲線を確保する前に試験し、ヒトニューロンから調製されたヒトｃＤＮＡライブラリー（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を使用することによってさらに検証した。吸引した細胞を、ＧＡＰＤＨ発現に基づいて確認した。
【０１１３】
2018513686.tif 000003
【０１１４】
電気生理学
【０１１５】
ｉＧＮおよびｉＥＮに関して電位および電流固定モードでホールセルパッチクランプ記録を行った。４〜６ＭΩの抵抗を有する記録ピペットに内部溶液を充填し、この内部溶液は、（ｍＭで）１２０  グルコン酸Ｋ、９  ＫＣｌ、１０  ＫＯＨ、３．４８  ＭｇＣｌ２、４  ＮａＣｌ、１０  ＨＥＰＥＳ、４  Ｎａ２ＡＴＰ、０．４  Ｎａ３ＧＴＰ、１７．５  スクロース、０．５  ＥＧＴＡを含有し、２９０ｍＯｓｍのモル浸透圧濃度およびｐＨ７．３を有した。ニューロンを細胞外溶液に浸漬し、この細胞外溶液は、（ｍＭで）１２４  ＮａＣｌ、３  ＫＣｌ、１．３  ＮａＨ２ＰＯ４、１０  デキストロース、２  ＭｇＣｌ２、２  ＣａＣｌ２、１０  ＨＥＰＥＳを含有し、ｐＨ  ７．４であった。ビククリン（２０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）およびＣＮＱＸ（５０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）を使用して、抑制性または興奮性シナプス応答をそれぞれ遮断した。ニューロンは、別段の指示がある場合を除いて−７０ｍＶで保持したか、またはＡｘｏｎ  ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して必要電流で保持した。シグナルを４０ｋＨｚでサンプリングし、２ｋＨｚでフィルタリングした（Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。２０ＭΩより高い直列抵抗を有するか、または２００ｐＡより大きいリーク電流を有する記録は、解析しなかった。データは、ＣｌａｍｐＦｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）またはＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ）を使用してオフラインで解析した。電位固定を使用して、保持電位を−８０ｍＶからステップごとに１０ｍＶ増加させる実施手順を使用してＮａ／Ｋ電流のＩ／Ｖ曲線を記録した。パッチニューロンの膜電位は、自発性シナプス電流のために−７０ｍＶで保持した。Ｃｌ−イオンの逆転電位は、本発明者らの記録システムでは、単純化したネルンストの式：Ｅ（Ｃｌ−）＝−５９＊ｌｏｇ（細胞外［Ｃｌ−］／細胞内［Ｃｌ−］）、（Ｔ＝２５℃）を使用して算出して、−４９ｍＶであった。自発性活動電位は、Ｉ＝０モードで記録した。電流固定モード下での電流注入によって膜電位を約−７０ｍＶに手作業で調整した後、８００ｍｓ続く１０ｐＡでのステップでの電流注入によって、活動電位も誘導した。細胞接着記録のために、２〜４ＭΩの抵抗を有するピペットに上記の細胞外溶液を充填した。５０〜２００ＭΩのシール抵抗を用いてピペットとニューロン膜間の接着を形成した。電位固定モードを使用して、ピペットを０ｍＶで保持して自発性スパイク発火による電流応答を記録した。
【０１１６】
ＧＡＢＡ誘発ＩＰＳＣの光遺伝学的または化学的記録
【０１１７】
シナプシン−ＣｈＥＴＡ−ＥＹＦＰを用いて前もって形質導入したｉＧＮを、ｔｕｒｂｏＲＦＰ（ＦＵＷ−ｔＲＦＰ）を発現するｉＥＮと共培養した。誘発ＩＰＳＣの光遺伝学的記録のために、ＥＹＦＰおよびｔＲＦＰをそれぞれ有する２つの近接ニューロンを、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社）とＤＩＣを用いて視覚的に同定した。パッチクランプ記録を、誘発ＩＰＳＣのためにｔＲＦＰ陽性ニューロンに関して、またはＣｈＥＴＡによって媒介される光刺激の同定のためにＥＹＦＰ陽性ニューロンに関して行った。光学刺激（継続時間５ｍｓ、間隔３０ｓ）を、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）からのデジタル入力によって制御される青色（４７０ｎｍ）ＬＥＤ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｍ４７０Ｆ１）によって与えた。
【０１１８】
ＧＡＢＡ誘発ＩＰＳＣの化学的記録のために、作製したてのＧＡＢＡ（１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）を充填した硝子ピペットの尖端を、記録するニューロンの樹状突起に沿って神経体細胞からおおよそ１００μｍ離して配置した。ＧＡＢＡ放出を始動させるためのエアーパフは、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａによって制御されるＰＩＣＯＳＰＲＩＴＺＥＲ  ＩＩＩ（Ｐａｒｋｅｒ）で与えた。
【０１１９】
移植
【０１２０】
移植研究および育種に使用した免疫不全ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスは、Ｄｕｋｅ−ＮＵＳ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＤｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｖｉｒｓｈｕｐからの好意の贈答品であった。１２時間昼／夜サイクル（０７００時に点灯）で食餌と水が自由に得られる２２℃、湿度５５％下で維持された、特定病原体の無い環境でマウスを飼育した。すべての手順は、科学的目的での実験動物の管理および使用に関する国の指針とＤｕｋｅ−ＮＵＳ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌの施設内動物実験委員会から承認された実験実施計画に従った。
【０１２１】
Ｐ１  ＮＳＧ仔に氷上で１〜２分間麻酔した後、予冷したアイスブロック上に仔をテープで固定した。ヒトｉＧＮを、説明したようにＲＦＰで前もって標識し、８ｄｐｔにトリプシン処理して単個細胞にした。濃縮細胞懸濁液（約２．５〜５×１０４細胞／μｌ）をマイクロタイターシリンジ（２６ｓゲージ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）にフロントローディングし、前／後軸の中心部付近の０．２ｍｍの深さに、正中線から１ｍｍ離して両側に注射した（２００ｎｌ、２５０ｎｌ／分）。
【０１２２】
スライス記録
【０１２３】
イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）での麻酔後、脳を迅速に切り出し、振動ミクロトーム（ＶＦ−２００  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎａｒｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して３００μｍ冠状スライスを作った。スライスを回復のために人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中で少なくとも１時間、３０℃でインキュベートし、このＡＣＳＦは、３０〜３２℃で９５％Ｏ２および５％ＣＯ２で飽和させた、（ｍＭで）１２５  ＮａＣｌ、２．５  ＫＣｌ、１．２５  ＮａＨ２ＰＯ４、２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、２６  ＮａＨＣＯ３および１０  グルコースを含有するものであった。記録中は、ＡＣＳＦにて持続的に灌流される記録チャンバ内にスライスを保持した。ＣＮＱＸ（５０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）を使用してｓＥＰＳＣをブロッキングした。パッチ記録は、６０倍の水浸対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５２ＷＩ正立顕微鏡でＩＲ−ＤＩＣ可視化技術を使用して行った。パッチクランプ記録方法は、培養細胞での記録方法と同じであった。
【０１２４】
蛍光免疫細胞化学（脳スライス）
【０１２５】
移植の２ヶ月後、氷冷ＰＢＳ用い、続いて０．１Ｍ  ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いてマウスの経心腔的灌流を行った。一晩、４％ＰＦＡ中で固定した後、脳を切開し、それらが沈むまで０．１Ｍ  ＰＢ中の３０％スクロースを用いて凍結保護した。３０μｍ厚切片をスライド式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）で切断し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いて１０分間、透過処理し、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、５％ロバ血清（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中、室温で１時間ブロッキングし、その後、一晩、一次抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、切片を０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−６４７（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）と結合したヤギ抗ウサギ、マウスまたはニワトリＩｇＧと共に２時間、室温でインキュベートした。切片を０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで２回洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に１０分間インキュベートし、その後、さらに２回洗浄した。Ｆｌｕｏｒ  Ｓａｖｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて切片をスライドガラスにマウントした。
【０１２６】
電子顕微鏡検査
【０１２７】
マウスに麻酔し、０．１５Ｍカコジル酸緩衝液中の２％パラホルムアルデヒドおよび２．５％グルタルアルデヒドを用いて経心腔的灌流を行った。頭蓋から脳を取り出し、その後、一晩、同じ固定液で後固定した。ＲＦＰ発現ｉＧＮを移植した皮質組織を、ビブラトーム（約１００μｍ）を使用してスライスした。落斜蛍光顕微鏡下で蛍光シグナルの位置に狙いを定めた後、皮質スライスをウサギポリクローナル抗ＲＦＰ抗体（ＭＢＬ、１：５００）、ビオチン標識ヤギ抗ウサギ二次抗体、およびＡＢＣ−ペルオキシダーゼキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いて免疫染色し、ＤＡＢおよび過酸化水素酵素を用いて現像した。スライスをシリアルブロックフェイスＳＥＭ（ＳＢＦ−ＳＥＭ）観察用にさらに調製した。簡単に言うと、免疫染色されたスライスの小片を、０．１５Ｍカコジル酸緩衝液中の１．５％フェロシアン化カリウムと２ｍＭ塩化カルシウムとを含有する２％四酸化オスミウム中で後固定し、その後、チオカルボヒドラジド溶液中でインキュベートした。２％四酸化オスミウムへの２回目の曝露後、組織試料を１％酢酸ウラニル（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）中でｅｎ  ｂｌｏｃｋ染色し、アスパラギン酸鉛溶液中でインキュベートし、その後、エタノール溶液の上昇系列で脱水した。試料をアセトンに移入し、Ｅｐｏｎ−８１２（ＥＭＳ）に平板包埋した。ＤＡＢ標識ニューロンを含有するエポン包埋標本をアルミニウムスタブ（Ｇａｔａｎ）上に接着し、コロイド銀ペースト（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）で着色し、その後、人工産物の投入量を低減させるために金／パラジウムをスパッタコーティングした。Ｇａｔａｎ  ３Ｖｉｅｗ２ダイヤモンドナイフ切断システムと結合された走査型電子顕微鏡（Ｍｅｒｌｉｎ  ＶＰ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＮＴＳ  ＧｍｂＨ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を１．５ｋＶの加速電圧で使用して、１１スタックの連続画像（数十から数百の３０ｎｍ厚切片／スタック）を得た。大きい領域をカバーするために、カラムの後方散乱検出器と二次電子検出器の両方を用いて試料ブロックの低倍率画像を獲得した。
【０１２８】
カルシウムイメージング
【０１２９】
画像を獲得する前に３０分間、ニューロンをインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内の細胞外溶液中でＦｌｕｏ−４  ＡＭ（２μＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆ−１４２０１）と共にインキュベートし、この細胞外溶液は、（ｍＭで）１２４  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１．３  ＮａＨ２ＰＯ４、１０  デキストロース、２  ＭｇＣｌ２、４  ＣａＣｌ２、１０  ＨＥＰＥＳを含有し、ｐＨ４であった。イメージング溶液は、細胞外溶液と同一であった。１Ｈｚ、３７℃で、２０倍対物レンズを使用するＬＳＭ７１０（Ｚｅｉｓｓ）共焦点顕微鏡検査を用いて、ライブ画像を獲得した。カルシウムスパイクの選別および解析は、以前の研究６、７を参照して行った。個々のニューロンに関して蛍光ベースラインの２０％より大きい変化があるカルシウムスパイクを同定した。±２フレーム以下の間隔での２つのニューロンからのスパイクは、同時に起こったものと見なした。回路網内に同時にカルシウムスパイクを有するニューロンが５０％あった場合、バーストと見なした。回路網の同期を推定するために、２ニューロンの対各々について対で同期度を計算して、対での相関係数またはスパイクの瞬時位相（これらは一致した結果を与える）のどちらかに基づいて同期行列を得た。回路網の同期度は、同期行列の固有値から得た。同期度が高いほど、神経回路網における同期活動が多いことを意味した。
【０１３０】
【実施例１】
【０１３１】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）をＧＡＢＡ作動性ニューロンに直接転換する遺伝要素の同定。
【０１３２】
ｈＥＳＣをＧＡＢＡ作動性ニューロンに直接転換することができる遺伝要素を同定するために、４つの転写因子（ＴＦ）：ＡＳＣＬ１、ＤＬＸ２、ＮＫＸ２．１およびＬＨＸ６に焦点を合わせた。これらのＴＦは、ＧＡＢＡ作動性ニューロン新生の主要部位である内側基底核隆起（ＭＧＥ）において発現され、皮質介在ニューロンの分化および機能的成熟にとって重要である（図１Ａ）。ＡＳＣＬ１（ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体様ホモログ１、またＭＡＳＨ１としても公知）は、胎児脳腹側部において広範に発現され、そこでニューロン前駆細胞のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンへの分化を促進する、前神経ｂＨＬＨ因子である。ＤＬＸ２（ディスタル・レス・ホメオボックス２）は、前駆細胞のグリア細胞への分化を抑制し、ＧＡＢＡ作動性ニューロンへのそれらの分化を促進する、多機能性ＴＦである。ＮＫＸ２．１（ＮＫ２ホメオボックス１）は、終脳介在ニューロンの移動を制御し、ＭＧＥ内の介在ニューロン前駆細胞の亜型のアイデンティティも決定する。ＬＨＸ６（ＬＩＭホメオボックス６）は、ＮＫＸ２．１の直接的標的であり、パルブアルブミン（ＰＶ）またはソマトスタチン（ＳＳＴ）を発現する皮質介在ニューロンへのＭＧＥ前駆細胞の指定に必要とされる。
【０１３３】
前記４つのＴＦの各々を発現するレンチウイルスに感染したｈＥＳＣ（Ｈ１株）を生成し、神経細胞へのそれらの転換を、形質導入後１０日目（ｄｐｔ）に細胞の汎ニューロンマーカＭＡＰ２を染色することにより評価した（図１Ｂ）。最初、ｈＥＳＣは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２などの多能性マーカを高度に発現したが、神経系前駆細胞マーカＮＥＳＴＩＮおよびＭＵＳＡＳＨＩを発現しなかった（図６）。興味深いことに、ＡＳＣＬ１（Ａと示される）単独での発現は、１０ｄｐｔにｈＳＥＣの１１．３±０．８％をＭＡＰ２陽性細胞に転換したが、他のＴＦ［ＤＬＸ２（Ｄ）、ＬＨＸ６（Ｌ）およびＮＫＸ２．１（Ｎ）］は、有意なＭＡＰ２シグナルを生じさせることができなかった（図１Ｃ）。同様の結果が、別のニューロンマーカβＩＩＩチューブリンの免疫組織化学的染色後に得られた（データを示さない）。その後、Ｄ  ＴＦとＮ  ＴＦとＬ  ＴＦのすべての可能な組合せを試験したが、ニューロン転換は観察されなかった（図７Ａ）。これは、以前の報告と一致して、ＡＳＣＬ１がｈＥＳＣのニューロンへの転換に有益な役割を果すことを示す。
【０１３４】
ＡＳＣＬ１のホスホミュータント形（ＡＳＡで示される、５つのセリン残基がアラニンで置換されている形態）は、アフリカツメガエルの胚内への異所性ニューロン導入に関して、およびヒト線維芽細胞のニューロンへの分化転換に関して、野生型ＡＳＬＣ１より強力である。したがって、ＡＳＡは、ｈＥＣＳにおいて過剰発現され、Ａよりおおよそ２倍多いＭＡＰ２陽性ニューロンの産生をもたらすことが判明した（図１Ｃ）。これらの結果に基づいて、ＡＳＡを、ｈＥＳＣのＧＡＢＡ作動性ニューロンへの分化を誘導するのに必要である神経原性ＴＦとして含めた。
【０１３５】
次に、他の因子を加えることでニューロン転換およびより具体的にはＧＡＢＡ作動性ニューロン転換を増進することができる可能性を調査した。そのために、必須の因子としてのＡＳＡと共に他の３つＴＦ（Ｄ、ＮおよびＬ）の様々な組合せを含有するレンチウイルスの多様なプールを用いてｈＥＳＣに形質導入し、１０ｄｐｔにＭＡＰ２陽性およびＧＡＢＡ陽性細胞を定量した（図１Ｄ）。ＴＦの組合せの大部分は、単独でのＡＳＡよりニューロン転換を有意に増進した（図１Ｄ）。意外なことに、それらのサブセットも、ＧＡＢＡ作動性ニューロン転換を劇的に増加させ、ＡＳＡＤＬは、最高パーセンテージ（６９．１±３．６％）のＧＡＢＡおよびＭＡＰ２二重陽性細胞を生じさせた（図１Ｄ）。考え合わせると、これらの結果は、ＤおよびＬがＡＳＡと相乗作用して、ｈＥＳＣからＧＡＢＡ作動性ニューロンを優先的に生じさせることを示す。
【０１３６】
総合的転換効率をさらに向上させるために、本発明者らが非神経細胞からのニューロン転換を増加させるｍｉＲ−９／９＊−１２４を、ＡＳＡ、ＤおよびＬ  ＴＦと一緒に共発現させた。際だったことに、ｍｉＲ−９／９＊−１２４の追加は、高いＧＡＢＡ＋／ＭＡＰ２＋比を維持しながら（図１Ｆ）、ＭＡＰ２陽性細胞のパーセンテージを５０．３±４．７％から８１．３±３．１％へと有意に増加させた（図１Ｅ）。さらに、ｍｉＲ−９／９＊−１２４の発現は、全樹状突起長の増加および転換されたニューロンの一次枝数の増加（図７Ｃ）によって立証されるように、樹状突起分枝を増進した（図７Ｂ）。重要なこととして、ニューロン転換効率の同様の増加が、２種のヒトＥＳＣ（Ｈ１およびＨ９）および３種の異なるヒトｉＰＳＣを含む、複数のｈＰＳＣ株にわたって観察された（図１Ｆおよび図６）。ニューロン転換率は増加し続け、複数の細胞株にわたって３５ｄｐｔ後には９０％超に達した（データを示さない）。単独でのｍｉＲ−９／９＊−１２４でのｈＥＳＣへの形質導入は、神経細胞を誘導することができなかった（データを示さない）。これらの結果により、ＡＳＡ、Ｄ、ＬおよびｍｉＲ−９／９＊−１２４（ＡＳＡＤＬ＋ｍｉＲ−９／９＊−１２４）はｈＰＳＣからのＧＡＢＡ作動性ニューロンの誘導の最適な因子であると結論付けた。
【０１３７】
生存率および機能的成熟を向上させるために、ＡＳＡＤＬ＋ｍｉＲ−９／９＊−１２４で形質導入された細胞をラットグリアと共培養した。４２ｄｐｔにおける免疫染色により、誘導神経細胞の大部分（８４．５±３．５％）がＧＡＢＡ作動性であることが明らかになった（図１Ｇおよび１Ｈ）。転換神経細胞のごく一部は、他のニューロンマーカ、例えば、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、ドーパミン作動性ニューロンのマーカ）およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ、コリン作動性ニューロンのマーカ）を発現した（図１Ｇおよび１Ｈ）。事実上、いずれの転換神経細胞も、興奮性グルタミン酸作動性ニューロン、例えば小胞グルタミン酸輸送体１および２（ＶＧＬＵＴ１／２）を発現せず、セロトニン作動性ニューロンのマーカ５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）も発現しなかった（図１Ｇおよび１Ｈ）。考え合わせると、これらの結果は、ＡＳＡＤＬ＋ｍｉＲ−９／９＊−１２４が、ｈＰＳＣをＧＡＢＡ産生神経細胞（すなわちｉＧＮ）の比較的均一な集団に分化するように確実に誘導することができることを実証している。
【０１３８】
ヒト誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ｉＧＮ）の分子的特性解析
【０１３９】
ｉＧＮが抑制性ニューロンへの運命を獲得する方法の動態への洞察を得るために、ＧＡＢＡ作動性表現型の原因となる肝要な遺伝子（ＶＧＡＴ、ＧＡＤ１およびＧＡＤ２）のｍＲＮＡレベルを、１４および３５ｄｐｔに定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用してｉＧＮにおいて測定した。１４ｄｐｔでは、ｉＧＮは、おおよそ１０〜１５％ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを含有する胎児ヒト脳において観察されるものと同様のレベルで、３つすべてのマーカを発現した（図７Ｄ）。３５ｄｐｔまで、３つすべての遺伝子発現は顕著に増加した（６倍〜１３倍増加）。これは、ｉＧＮのさらなる成熟を示す（図７Ｄ）。
【０１４０】
ｉＧＮをさらに特性解析するために、単一ｉＧＮの多重遺伝子発現解析を４８〜５２ｄｐｔに行った（図２Ａおよび表１）。多能性マーカ（ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧ）の徹底的抹消が、汎ニューロンマーカ（ＭＡＰＴ、ＮＣＡＭ、ＭＡＰ２およびＡＮＫ２）の並行した均一な発現と共に観察された（図２Ａ）。神経系前駆細胞のマーカ（ＳＯＸ２およびＮＥＳＴＩＮ）、アストロサイトのマーカ（ＧＦＡＰ）およびオリゴデンドロサイトのマーカ（ＯＬＩＧ２）の発現は、無視できるほどのものであった（図２Ａ）。ｉＧＮは、終脳マーカＦＯＸＧ１を発現したが、小脳において高度に発現される遺伝子であるＰＣＰ２およびＧＲＰを発現しなかった。さらに、免疫染色データと一致して、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンのマーカ（ＧＡＤ１、ＧＡＤ２、ＶＧＡＴ、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５およびＤＬＸ６）は、事実上、すべての細胞で発現されたが、他のニューロン系譜を示すマーカ（ドーパミン作動性：ＤＡＴおよびＥＮ１；セロトニン作動性：ＴＰＨ１、ＴＰＨ２およびＳＥＲＴ；グルタミン酸作動性：ＶＧＬＵＴ１およびＶＧＬＵＴ２）の発現は、ほとんど存在しなかった（図２Ａ）。ｉＧＮの大部分は、シナプスマーカ（ＳＹＮ１、ＰＳＤ９５およびＧＰＨＮ）ならびにＡＭＰＡおよびＮＭＤＡ受容体（ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＮ１、ＧＲＩＮ２ＡおよびＧＲＩＮ２Ｂ）を確実に発現した。それらは、介在ニューロンの機能にとって重要であることが以前に証明されている遺伝子、例えば、ＳＣＮ１Ａ、ＥＲＢＢ４およびＳＡＴＢ１も発現した（図２Ａ）。最後に、ｉＧＮの大部分は、皮質の、ＭＧＥ由来の、介在ニューロンマーカ、例えば、ＺＥＢ２およびＳＯＸ６を発現した。しかし、ｉＧＮの大部分は、ＳＰ８、ＣＯＵＰＴＦ１およびＰＲＯＸ１も、代替発生場所（ＣＧＥ、ＬＧＥおよびＰＯＡ）を有する介在ニューロンのマーカも、線条体中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）の定義マーカであるＤＡＲＰＰ−３２も、発現しなかった。まとめると、これらのデータは、ｉＧＮが、皮質ＧＡＢＡ作動性ニューロンのほぼ均一な集団の構成要素となったことを強く示している。
【０１４１】
ｍＲＮＡ発現データを確認し、裏づけるために、ｉＧＮの免疫染色分析を行った。ｉＧＮは、成熟ニューロンマーカであるＮｅｕＮと、軸索マーカＳＭＩ−３１２と、軸索起始部マーカであるアンキリンＧとを強く発現したる（図２Ｂ）。驚くほどのことではないが、ｉＧＮの大部分は、前脳マーカであるＦＯＸＧ１に関して陽性染色されたが、ＭＳＮのマーカであるＤＡＲＰＰ−３２に関して陰性であった（図２Ｃ）。誘導細胞のＧＡＢＡ作動性の性質と一致して、ＧＡＤ１は、ｉＧＮにおいて容易に検出された（図２Ｄ）。重要なこととして、ゲフィリン陽性の斑点がｉＧＮの樹状突起に沿ってＶＧＡＴ陽性の斑点に隣り合って並んでいるのが観察された。これは、ＧＡＢＡ作動性シナプシンの形態的指標になる（図２Ｄ）。
【０１４２】
成熟皮質介在ニューロンは、ＳＳＴ、ＰＶ、カルレチニン（ＣＲ）、カルビンディン（ＣＢ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、リーリン（ＲＥＬＮ）、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）および血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）をはじめとする、ニューロペプチドおよびカルシウム結合タンパク質の該ニューロンによる発現に基づいて異なる部分群に分けることができる。免疫染色により、ｉＧＮのサブセットがＳＳＴ（２４．３％）、ＣＲ（１１．６％）、ＣＢ（６．５％）およびＮＰＹ（５．４％）を発現したことが明らかになった（図２Ｅおよび２Ｇ）。ＭＡＰ２＋細胞の約１０％は、ＳＳＴおよびＣＲに関して二重陽性であることが判明した（図７Ｅ）が、ＳＳＴとＣＢの二重陽性細胞は存在しなかった。ＰＶ陽性シグナルは、７０ｄｐｔ後にのみ、少数のｉＧＮ（＜１％、５７６ニューロンのうちの５ニューロン）でだが、一貫して観察することができた（図２Ｅおよび２Ｇ）。ＶＩＰ（４％）、ｎＮＯＳ（２％）およびＲＥＬＮ（＜１％）（図２Ｆおよび２Ｇ）をはじめとする他のＧＡＢＡ作動性亜型マーカを検査し、それらがほとんど存在しないことが判明した。考え合わせると、これらの結果は、ｉＧＮの集団がＳＴＴ発現ＧＡＢＡ作動性ニューロンを多く含んでいたことを示す。
【０１４３】
誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロンの機能的特性解析
【０１４４】
ｉＧＮが、ニューロンのものと同様の機能的膜特性を示すかどうかを探究するために、４２および５６ｄｐｔにｉＧＮのパッチクランプ記録を行った。電位固定モードで、ｉＧＮは、電位依存性カリウム（Ｋ＋）およびナトリウム（Ｎａ＋）チャネルの開口にそれぞれ対応する可能性が高い、高速の不活性化内向きおよび外向き電流を示した（図３Ａ）。電位依存性Ｎａ＋およびＫ＋電流のピークは、４２ｄｐｔから５６ｄｐｔへと有意に増加した（図３Ｂ）。この発見と一致して、膜抵抗（Ｒｍ）の有意な減少、膜電気容量（Ｃｍ）の有意な増加、およびより大きい過分極静止膜電位（ＲＭＰ）が観察された。これは、ｉＧＮが５６ｄｐｔにおいて、より成熟していたことを示す（図３Ｃおよび補足情報、表２）。これらのデータは、ｉＧＮが、ニューロンとして機能するのに必要な基本的構造成分を有していたことを示す。
【０１４５】
2018513686.tif 000004
2018513686.tif 000005
下線が引かれている＃：４２ｄｐｔ  ｉＧＮ；下線が引かれていない＃：５６ｄｐｔ  ｉＧＮ。
【０１４６】
次に、自発性および誘発活動電位（ＡＰ）両方をｉＧＮから細胞接着モードで（図３Ｄ）および電流固定モードで（図３ＥおよびＦ）それぞれ記録した。電流を注入すると、５６ｄｐｔにおけるｉＧＮは、ＡＰ発火を増進した（図３Ｆ）。さらなる細胞株に由来するｉＧＮからの電気生理学的記録を行い、同様の結果が観察された（図８Ａ〜Ｄ）。ｉＧＮをそれらのＡＰ発火パターンに基づいてさらに特性解析した（図８Ｅ）。ｉＧＮをそれらのＡＰ発火に基づいて分類すると、大部分は、適応パターン（タイプＩ、４７％）または非適応パターン（タイプＩＩ、３８％）を示したが、抗適応（タイプＩＩＩ、６％）および単一ＡＰ発火（タイプＩＶ、９％）パターンもｉＧＮの小サブセットで観察された（図８Ｆ）。これらの観察は、新皮質におけるＳＴＴ陽性ニューロンの大部分についてのＡＰ発火が適応パターンを表示することを示した以前の研究と一致する。ＡＰの高速スパイキングおよびバーストは、ｉＧＮからの記録において検出されなかった（データを示さない）。しかし、非適応ｉＧＮは、適応ｉＧＮと比較して高い発火頻度および大きいＡＨＰを示した（図８Ｇおよび８Ｈ）。さらに、小規模な電流注入（＜７０ｐＡ）は、タイプＩＩの細胞よりタイプＩの細胞でのほうが高頻度のＡＰ発火を誘導したが、タイプＩＩの細胞は、より大規模な電流注入（＞１００ｐＡ）に応じて、より多くのＡＰを発火させた（図８Ｈ）。考え合わせると、これらのデータは、ｉＧＮが、皮質介在ニューロンと同様の、異なるタイプのＡＰ発火パターンを提示したことを示す。
【０１４７】
次に、ｉＧＮが、ＧＡＢＡの放出および抑制性シナプス後応答の誘導に必要な機能的シナプス前機構を発現したことをさらに確認するために、前の研究で使用したものと同様の実施手順によって生成したｉＥＮとｉＧＮを共培養した（図９）。先ず、操作されたチャネルロドプシンバリアントであるＣｈＥＴＡを、ｉＧＮでのみ発現させ、次いで、そのＣｈＥＴＡ発現ｉＧＮを、高強度青色発光ダイオード（ＬＥＤ）に連結された光ファイバーで刺激した（図３Ｇおよび３Ｈ）。青色ＬＥＤ照明（４７０ｎｍ）は、ｉＧＮにおいてＣｈＥＴＡ媒介内向き電流およびＡＰ発火を誘導したが、ＣｈＥＴＡを発現しないニューロンでは同じ光刺激がそのような電流を誘導しなかった。これは、このアプローチを使用してｉＧＮを選択的に活性化することができたことを実証する（図１０）。これらの条件下で、ＣｈＥＴＡ発現ｉＧＮを活性化する光刺激の短パルスがｉＥＮではシナプス後応答を誘導した（図３Ｉ）。記録されたシナプス後電流は、短いシナプス遅延を示した。これは、そのような電流が単シナプス的に誘導されたことを示す（図３Ｉ）。さらに、これらの光誘発シナプス応答は、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるビククリンによって完全に抑制された（図３Ｉ）。これらの結果は、ｉＧＮの活性化が、共培養したｉＥＮにおいて抑制性シナプス後応答を生じさせることができるだろうということを示す。
【０１４８】
ｉＧＮが、生体内原位置でのシナプス伝達を可能にする機能的シナプス後メカニズムを示すかどうかをさらに調査した。第一に、ＧＡＢＡ（１ｍＭ、１００ｍｓ）の外因的適用は、ｉＧＮにおいて抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）を引き起こした（図３Ｊ）。これらのＩＰＳＣもまたビククリンによって完全に遮断された。これは、ｉＧＮが機能性ＧＡＢＡＡ受容体を発現したことを示す（図３Ｊ）。第二に、４２および５６ｄｐｔにおいて、ｉＧＮの大部分は、自発性抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）を１．４７Ｈｚの平均頻度（１．４７±０．１８Ｈｚ、ｎ＝６１）で示した（図３Ｋおよび３Ｌ）。平均ｓＩＰＳＣ振幅は、培養齧歯動物皮質ニューロンにおいて見られたものに匹敵する、１９．５±１．３８ｐＡであった（図３Ｋおよび３Ｌ）（データを示さない）。これらのｓＩＰＳＣは、ビククリンにより完全に抑制された（図３Ｋ）。これは、ヒトｉＧＮが、シナプス後機構を有し、抑制性シナプス入力を受けたことを示す。
【０１４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトｉＧＮの機能的成熟およびシナプス統合
【０１５０】
ｉＧＮが、ｉｎ  ｖｉｖｏでシナプス成熟および機能的統合を経ることができるかどうかを試験するために、ＲＦＰ発現ｉＧＮを８ｄｐｔにＰ１新生仔免疫不全ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスの皮質に定位的に移植した。２ヶ月後、ＮｅｕＮ発現ｉＧＮがマウス皮質の主として第５／６層に分布していた（図４ＡおよびＢ）。定量により、ｉＧＮの大部分が、ニューロンマーカＭＡＰ２ならびにＧＡＢＡ作動性マーカＧＡＤ６７およびＧＡＢＡに関して陽性であることが明らかになった。これは、ＧＡＢＡ作動性ニューロンのアイデンティティの確立成功を示す（図４Ｃおよび３Ｄ）。移植ｉＧＮのおおよそ２０％がＳＳＴを発現した。ＰＶ陽性ヒト細胞も観察することができたが、それらのシグナルは、内因性マウスＰＶ陽性ニューロンよりはるかに弱かった（データを示さない）。これらの結果は、培養ｉＧＮに関しての本発明者らの定量と一致し、本発明者らの実施手順により主としてＳＳＴ＋介在ニューロンが得られることを示した。
【０１５１】
移植ｉＧＮが機能性ニューロンに発達し、宿主神経回路に統合されるかどうかを判定するために、移植したマウスから得た急性皮質スライスでのホールセルパッチクランプ記録を使用した。ＲＦＰ発現によって同定された移植ｉＧＮは、反復ＡＰ発火を提示した（図４Ｅおよび４Ｆ）。さらに、電位固定モードで−７０ｍＶで自発性興奮性シナプス後電流を急性皮質スライスの移植ｉＧＮから測定することができ、これらのシナプス電流は、ＡＭＰＡ／カイニン酸型グルタミン酸受容体アンタゴニストであるＣＮＱＸの存在下で消失された（図４Ｇおよび４Ｈ）。宿主ｉＧＮと移植ｉＧＮ間の機能性シナプス形成をさらに確認するために、シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡（ＳＢＦ−ＳＥＭ）を使用して超微細構造解析を行った。ＲＦＰをジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で染色した脳スライスの皮質領域の検査は、移植ｉＧＮへのシナプス結合を示した（図１１）。これらの結果は、移植ヒトｉＧＮが、電気的興奮性であり、機能性シナプスを形成することにより宿主神経回路に統合することが可能であることを実証する。
【０１５２】
大集団カルシウムイメージングおよび介在ニューロン特異的機構研究にｉＧＮを使用できる可能性
【０１５３】
細胞型特異的薬効の評価またはヒト病状のモデル化にｉＧＮを使用できる可能性を探究するために、ｉＧＮを試験して、ｉＧＮが他の興奮性グルタミン酸作動性ニューロンと機能性シナプス結合を形成することができるかどうかを確かめた。哺乳動物皮質神経回路に見られる比率を模倣する、ｉＧＮ（２０％）とｉＥＮ（８０％）を共培養し、ｉＧＮからの自発性ＰＳＣを測定した（図５Ａ）。興味深いことに、ニューロンを−７０ｍＶで固定したとき、２つの明らかに異なるＰＳＣパターンを測定することができた（図５Ｂおよび５Ｃ）。ビククリンでの処置は、ｓＩＰＳＣに似た緩徐減衰ＰＳＣを除去し、ＡＭＰＡ／カイニン酸型グルタミン酸受容体アンタゴニストであるＣＮＱＸでのさらなる処置は、ＡＭＰＡ受容体媒介ＰＳＣに対応する可能性が最も高い、残存する急上昇し急減衰するＰＳＣを、完全に消失させた（図５Ｂおよび５Ｃ）。これらのデータは、ｉＧＮが他の興奮性グルタミン酸作動性ニューロンと機能性シナプス結合を形成することができるだろうということを示す。
【０１５４】
次に、自発活動依存性Ｃａ２＋トランジェントを、ｉＥＮの均一な集団または８０％ｉＥＮと２０％ｉＧＮの混合物のどちらかに関して検査した。ｉＥＮの均一な集団では、ビククリンの添加は、個々のＣａ２＋トランジェントの同期により測定して、回路網の活動を変化させなかった（図５Ｄ、５Ｆ）。興味深いことに、ｉＥＮとｉＧＮの混合集団では、ビククリンの添加が、Ｃａ２＋トランジェントのバースト頻度の増加およびより高い同期度によって、回路網全体の活動の同期を増加させた（図５Ｅ、５Ｆ）。これは、ビククリンが、ニューロン回路網内のｉＧＮの抑制の効果を除去したことを示す。この結果は、培養齧歯動物ニューロンの以前の研究と一致する。これらのＣａ２＋イメージングデータは、薬物スクリーニング中に細胞の大集団内のｉＧＮまたはｉＥＮの回路網自発活動のモニタリングにｉＧＮをｉＥＮと共に使用できる可能性を実証する。
【０１５５】
さらに、ｉＧＮを介在ニューロン特異的機構研究に使用することができるかどうかを試験した。ＭＤＧＡ１（ＭＡＭドメイン含有グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー１）の過剰発現は、自閉症および統合失調症と関連付けられており、皮質ニューロンでは抑制性シナプス数を低減させた。しかし、興奮性ニューロンまたは抑制性ニューロンにおけるＭＤＧＡ１の過剰発現が抑制性シナプスインプットを低減させる結果となるかどうかは、依然として不明であった。このために、ＭＤＧＡ１をレンチウイルス形質導入によりｉＧＮの均一な集団において発現させ、ＶＧＡＴ陽性クラスターの数に基づいて抑制性シナプス密度を測定した。ＭＤＧＡ１過剰発現は、抑制性シナプス密度を有意に低下させることが観察された（図５Ｇおよび５Ｈ）。さらに、対照細胞と比較して、ＭＤＧＡ１を発現するｉＧＮは、ｓＩＰＳＣの（振幅ではなく）頻度の有意な低減を提示した（対照：１．７１±０．２９Ｈｚ、ＭＤＧＡ１：０．９２±０．２５Ｈｚ、ｐ＜０．０５；対照：２０．１±１．５８ｐＡ、ＭＤＧＡ１：１６．６６±１．３８ｐＡ）（図５Ｉ〜５Ｋ）。しかし、ｉＥＮにおけるＭＤＧＡ１の発現は、ｓＥＰＳＣにより評価して、興奮性シナプス伝達に影響を与えなかった（図１２）。総合して、これらの結果は、ＭＤＧＡ１過剰発現が介在ニューロンシナプスに特異的にかつ自主的に影響を与えることを示しており、したがって、この研究からのｉＧＮは、遺伝子の細胞型特異的機構研究を可能にすることができるだろう。
【０１５６】
本研究では、ヒト前脳ＧＡＢＡ作動性神経細胞（ｉＧＮ）のほぼ純粋な集団を生成する、シングルステップの効率的な再現性のある方法を、選択されたＴＦおよびマイクロＲＮＡの過剰発現に基づいて説明する。ｈＰＳＣから出発して、本発明者らは、脳腹側部において広範に発現される前神経ｂＨＬＨ因子であるＡＳＣＬ１が、以前の報告と一致して、７〜１０日以内にＭＡＰ２発現神経細胞のごく一部を誘導できるという証拠（図１Ｃ）を提供した。ＡＳＡの、他の因子、特にＤＬＸ２およびＬＨＸ６との共発現は、ニューロンの形質転換を有意に増進させ、その上、結果として得られるニューロンをほぼ排他的にＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに分化させるように偏らせた。これらの結果は、ＡＳＣＬ１の前神経活動を支持し、ＤＬＸ２およびＬＨＸ６などの他の因子が、ＡＳＣＬ１と共に発現されると、ｈＰＳＣ由来のニューロンにＧＡＢＡ作動性の運命を付与することを示す。ｍｉＲ−９／９＊−１２４は、これらのＴＦと相乗作用して、ｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣのいずれかからＧＡＢＡ作動性ニューロンをより効率的に生成した（図１Ｅ）。これらの観察の裏づけとして、ＧＡＢＡ作動性ニューロンを複数のｈＰＳＣ型から確実に生成することができ、さらなるｈＰＳＣ株から転換されたｉＧＮにおける成熟ニューロンレパートリが記録された（図８Ａ〜Ｄ）。ｉＧＮは、一般的な前脳ＧＡＢＡ作動性ニューロンマーカを不均一に発現するように見えたが、ＳＳＴ、ＣＲ、ＣＢまたはＮＰＹを発現する複数の亜型が見つかった（図２Ｅおよび２Ｇ）。驚くべきことに、同じくＭＧＥに由来する治療上重要な介在ニューロン亜型であるＰＶ陽性ニューロンは、ｉＧＮ中に存在しなかった。
【０１５７】
ヒトの非神経細胞からＧＡＢＡ作動性ニューロンを派生させるための以前の試みと比較して、本方法にはいくつかの利点ある。第一に、この遺伝子機能獲得型アプローチは、神経系前駆細胞段階を迂回することによって、様々なパターン形成因子および組換えタンパク質の必要を無くす（費用を節減し、実験的変動性を低減させる）。第二に、この実施手順は、有意に短い期間（１０〜３０週間と比較して、６〜８週間）内に機能性ｉＧＮを生成し、このことが、実験のより迅速な改善を可能にする。第三に、この方法は、主としてＧＡＢＡ作動性ニューロンを生成し、他の系譜の細胞を殆ど生じさせない。これらの顕著な特徴が、被定義アイデンティティおよび被定義密度のニューロンを有する超小型回路をｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てるまたとない機会を可能にする。
【０１５８】
実際、別個のパーセンテージのヒト興奮性ニューロン（ｉＥＮ）またはヒト抑制性ニューロン（ｉＧＮ）が入っている皿において明らかに異なるニューロン回路網自発活動パターンが観察され、Ｃａ２＋イメージング（図５Ｄ〜Ｆ）を使用してｅｎ  ｂｌｏｃで回路網の活動の薬物誘導変化を記録した。これらの原理証明実験は、より複雑な回路および回路網挙動の形成を調べるためにそのようなシステムを利用することの実現可能性を明白に実証した。
【０１５９】
より重要なこととして、本方法のシングルステップの性質により、ｄｏｘを加えるとＧＡＢＡ作動性ニューロンに同調的に分化させることができる、ｄｏｘ誘導性ｉＧＮ（およびｉＥＮ）ｈＥＳＣ株の生成が可能になった（図１３）。このシングルステップ誘導性システムは、従来の多段階分化実施手順とは対照的に、より短期間で大量の均一な誘導ニューロンを産生することができ、そのため、ハイスループットスクリーニングの理想的なプラットフォームとなる。最後に、本方法は、疾患モデル化のための特定の遺伝子の機能についてのニューロン亜型特異的特性解析を可能にする。例えば、統合失調症および双極性障害感受性遺伝子であるＭＤＧＡ１のｉＧＮにおける過剰発現は、興奮性シナプス伝達を変化させることなく抑制性シナプス伝達を特異的に低減させることが判明した（図５Ｇ〜Ｋ、および図１２）。これまでは、この細胞型特異的表現型決定は、特定のＣｒｅドライバー株の生成およびｌｏｘＰが導入されたアレルの生成を必要とするＣｒｅ−ｌｏｘシステムの使用によってしか、または蛍光に基づくレポータ細胞株の生成およびその後の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が介在する特定の細胞型の濃縮によってしか達成できなかった。それ故、本方法が機構研究および橋渡し研究を可能にする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【国際調査報告】
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