(57)【要約】本発明は、バイオリアクターのカスケードにおいて生合成産物を生産する改良された方法に関する。具体的には、本発明は、少なくとも２つのバイオリアクターと少なくとも１つの濃縮ユニットとを備えたバイオリアクターシステムの方法及びカスケードに関する。
2018515148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオリアクターのカスケードにおいて生合成産物を生産する方法であって、前記カスケードが、少なくとも１つのバイオマス生産リアクターを備えたバイオマス生産用バイオリアクターシステムと、濃縮装置と流れ接続している少なくとも１つの産物生成リアクターを備えた産物生成用バイオリアクターシステムと、を備え、前記方法が、さらに、
ａ）バイオマスを効果的に増殖させることができ栄養分を豊富に含んだ培養培地を、前記バイオリアクターに供給することによって、バイオマス生産バイオリアクター内で微生物を培養することと、
ｂ）前記ステップａ）の前記バイオマス生産リアクターから微生物培養物の少なくとも一部を取り出し、これを、生合成産物の生成に最適化され栄養分が欠乏した培地を収容する産物生成リアクターに供給することと、
ｃ）前記産物生成リアクター内の栄養分が欠乏した産物生成培地の存在下で生合成産物を生産することと、
を含み、
前記産物生成リアクターの微生物培養物の菌体濃度が、前記産物生成リアクターと流れ接続している濃縮装置を用いることによって増加する、方法。
【請求項２】
濃縮装置が、バイオマス生産リアクターと産物生成リアクターとの間に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオマス生産リアクターから取り出された微生物培養物の少なくとも一部が、バイオマス生産リアクターと産物生成リアクターとの間に配置された濃縮装置に供給され、微生物を豊富に含んだ画分を得て、該画分が産物生成リアクターに供給される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
濃縮装置が、産物生成リアクターの下流に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
方法が、さらに、産物生成リアクターから微生物培養物の少なくとも一部を取り出すことと、これを、バイオマス生産リアクターと産物生成リアクターとの間に配置されるか又は産物生成リアクターの下流に配置された濃縮装置に供給して、微生物を豊富に含んだ画分を得て、該画分を、カスケードの下流にある同じ産物生成リアクター又は後続する産物生成リアクターに供給することと、を含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
バイオマス生産リアクターが、カスケードの最後のバイオマス生産リアクターであり、産物生成リアクターが、カスケードの最初の産物生成リアクターである、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
バイオマス生産用バイオリアクターシステムが、少なくとも２、３、４、５、６、７又は８つのバイオリアクターを備える、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
産物生成用バイオリアクターシステムが、少なくとも２、３、４、５、６、７又は８つのバイオリアクターを備える、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
微生物を豊富に含んだ画分が、遠心分離、ろ過、沈降、凝集、浮選、デカンテーションからなる一覧より選択される手段又は方法を用いることによって得られる、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
バイオリアクターシステム、又は連続連結バイオリアクターのカスケードが、連続式若しくは流加式又はこれらの組合せにより操作される、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
方法が、さらに、
カスケードの１つ以上のバイオマス生産バイオリアクターが、後期対数期における微生物増殖に最適化されること、及び／又は、
バイオマス生産バイオリアクターに後続する産物生成バイオリアクターが、場合により栄養飢餓条件下で、定常増殖期における生合成産物の生成に最適化されること、及び／又は、
付加的な産物生成バイオリアクターが、炭素源の添加を最小限に抑えて、生合成産物の生成に最適化されることを含む、請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
微生物を豊富に含んだ画分が、微生物培養物を取り出したバイオリアクターよりも3〜30℃低い温度において得られ、及び／又は、濃縮装置に供給される微生物培養物の温度が、3〜30℃低下する、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
生合成産物が、
ｉ）培養微生物からのバイオマス、
ｉｉ）一次代謝産物、
ｉｉｉ）二次代謝産物、
ｉｖ）細胞内産物、
ｖ）細胞外産物
のうちの１種以上である、請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
生合成産物が細胞内産物である、請求項１〜１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
生合成産物が、長鎖二酸、ヒドロキシル脂肪酸、長鎖ジオール、脂質、脂肪、油、ワックス、ファルネセン型生成物、ワックスエステル、ステロール、テルペノイド、イソプレノイド、カロテノイド、ポリヒドロキシアルカノエート、核酸、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪酸エステル、脂肪アミン、中鎖及び長鎖ジカルボン酸、エポキシ脂肪酸、長鎖ジオール及びポリオール、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、並びに、アシルグリセロール、例えば、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はモノアシルグリセロールからなる一覧より選択される１種以上の脂質である、請求項１〜１４のうちのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生合成産物生産のための微生物培養に関する。具体的には、本発明は、バイオリアクターのカスケードにおいて微生物細胞内産物を生産する方法に関する。特に、本発明は、少なくとも２つのバイオリアクターと少なくとも１つの濃縮ユニットとを備えたバイオリアクターシステムの方法及びカスケードに関する。
【０００２】
発明の背景
種々の種類の微生物は、当該微生物が自然に生産する産物から、遺伝子操作又は選択された供給源（feed supply）のいずれかにより当該微生物を操作して生産され得る産物に至るまで、種々の多くの種類の産物の生産に用いることができる。特定の微生物は、効果的に、安価な廃棄物に増殖させて、重要な有用産物を生産することができる。
【０００３】
米国特許出願公開第2012/0219993号（Changら）は、多段階バイオリアクターシステム（multi-stage bioreactor system）において揮発性脂肪酸から細胞内産物を生産する微生物であって、増殖リアクター内で増殖させ、続いて、増殖させた微生物を細胞内生合成産物の生産リアクター内で培養する微生物に関する。微生物は、増殖培地中で増殖させ、続いて、細胞内産物の生産のために、炭素源として増殖阻害性の揮発性脂肪酸を含む培地中で培養した。
【０００４】
バッチ式のリアクターにおける発酵又は産物生成は、通常、低い細胞濃度による低い生産性という欠点を有する。このような課題とともに、微生物発酵又は産物生成による有機酸生産時の最終産物阻害という課題を克服する種々の試みがなされている。
【０００５】
米国特許第6,596,521号（Changら）には、連続連結発酵槽（serially connected fermentors）を備えた細胞再循環多段階連続発酵槽であって、発酵リアクター内の微生物の濃度が発酵培地の一部をろ過することによって増加する細胞再循環多段階連続発酵槽が記載されている。
【０００６】
さらに、細胞内又は細胞外のいずれかによって生合成産物を生産するとともに、生合成産物の大規模な微生物生産において費用対効果を向上させる方法が必要である。
【０００７】
発明の概要
本発明は、上述の先行技術を考慮してなされたものであり、本発明の目的のうちの１つは、バイオリアクターシステムにおける生合成産物の生産方法を改良することである。本発明の別の目的は、高い生産性によって生合成産物を生産することが可能な方法を提供することである。
【０００８】
本発明の目的は、独立請求項に記述されていることを特徴とする方法によって達成される。本発明の好適な実施形態は、従属請求項に開示されている。
【０００９】
本発明は、少なくとも１つのバイオマス生産リアクター及び少なくとも１つの産物生成リアクターを利用することによって、バイオリアクター、例えば連続連結バイオリアクターのカスケードにおいて、生合成産物、特に細胞内産物を生産する方法であって、産物生成リアクターが濃縮装置と流れ接続している（in flow connection with）方法を提供する。この方法は、増殖の最適条件下で微生物細胞（すなわち、１種又は複数種の微生物由来の細胞）を培養し、続いて、増殖の最適条件を変更して、細胞が効果的な産物生成フェーズに入ることを可能にすることを含む。微生物を培養するこの過程は、本発明に従って、少なくとも２つの一連のバイオリアクター（例えば、連続的に連結されたもの）を備えたバイオリアクターシステムにおいて行われ、その結果、バイオリアクターのうちの１つにおける微生物培養から得られた細胞が濃縮され、一連のバイオリアクターの同じバイオリアクター又は後続するバイオリアクターに部分的に供給される。
【００１０】
具体的には、本発明は、バイオリアクター（例えば、連続連結バイオリアクター）のカスケードにおいて生合成産物を生産する方法であって、カスケードが、少なくとも１つのバイオマス生産リアクターを備えたバイオマス生産用バイオリアクターシステムと、濃縮装置と流れ接続している少なくとも１つの産物生成リアクターを備えた産物生成用バイオリアクターシステムと、を備え、方法が、
ａ）バイオマスを効果的に増殖させることができ栄養分を豊富に含んだ培養培地（nutrient rich culture medium）を、バイオリアクターに供給することによって、バイオマス生産バイオリアクター内で微生物を培養することと、
ｂ）ステップａ）のバイオマス生産リアクターから微生物培養物の少なくとも一部を取り出し、これを、生合成産物の生成に最適化され栄養分が欠乏した培地（nutrient depleted medium）を収容する産物生成リアクターに供給することと、
ｃ）産物生成リアクター内の栄養分が欠乏した産物生成培地の存在下で生合成産物を生産することと、を含み、
産物生成リアクターの微生物培養物の菌体濃度（cell mass concentration）が、産物生成リアクターと流れ接続している濃縮装置を用いることによって増加する方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、少なくとも２つ又は３つのバイオリアクター（例えば、連続連結バイオリアクター）と、生合成産物を生産する１つ以上の濃縮装置と、を備えたバイオリアクター（例えば、連続連結バイオリアクター）のカスケードの使用であって、１つ以上の濃縮装置が、産物生成リアクターと流れ接続し、２つのバイオリアクターの間に、そして２つのバイオリアクターと並んで配置される使用にも関する。
【００１２】
本発明の発明者らは、バイオマス生産リアクター又は産物生成リアクターから得られた細胞の少なくとも一部を濃縮装置により濃縮することによって、そして、得られた微生物を豊富に含んだ画分を、バイオリアクター（例えば、連続連結バイオリアクター）のカスケードにおける同じ産物生成リアクター又は後続する産物生成リアクターに少なくとも部分的に供給することによって、生合成生産過程の生産性を大幅に向上させることができることを見いだした。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、生合成産物生成のための培養過程の実施形態を示し、ここでは、k（kは1〜xである。）の数のバイオマス生産リアクターを備えたバイオマス生産用の第１の並列バイオリアクター集合を有するバイオリアクターのカスケードを示し、この後に、数m（mは1〜xである。）の並列産物生成リアクターを含む次のステップが続く。このステップにおけるmの数の産物生成リアクターは、産物生成バイオリアクターから取り出された微生物培養物の微生物を豊富に含んだ画分を得るように、濃縮装置と流れ接続しているか又は濃縮装置に接続されている。微生物を豊富に含んだ画分は、同じバイオリアクターに再利用されるが、微生物の少ない画分（microorganism poor fraction）は、この過程から廃棄される。第１の一連の産物生成リアクターの後に、n（nは1〜xである。）の数の産物生成リアクターを含む次のステップが続く。供給原料：供給原料k：kは、バイオマス生産バイオリアクターの数（1…x）であり、供給原料m：mは、濃縮装置と流れ接続しているか又は濃縮装置に接続されている産物生成バイオリアクターの数（1…y）であり、供給原料n：nは、産物生成バイオリアクターの数（1…z）である。個々の供給原料k（1…x）、m（1…y）及びn（1…z）は、同じ組成であり得るか、又は供給原料の一部は同じ組成であるか、若しくは供給原料のすべては異なる組成である。
【図２】図２は、生合成産物生成のための培養過程の実施形態を示し、図１に示されているものに類似するが、バイオマス生産リアクターと産物生成リアクターとの間に濃縮装置が配置されている点が異なる。これは、濃縮ステップによって、依然として、mの数の産物生成リアクター内の細胞濃度が増加するが、mの数の産物生成リアクター内の微生物培養物の組成は、バイオマス生産リアクターの内容物による影響を受けにくく、これらのバイオリアクターから、微生物の少ない画分と微生物を豊富に含んだ画分が分離された後に、ｍの数の産物生成リアクターに入るため、バイオマス生産リアクターからの培地の一部のみが産物生成リアクターに入るという効果を有する。供給原料：供給原料k：kは、バイオマス生産バイオリアクターの数（1…x）であり、供給原料m：mは、濃縮装置と流れ接続しているか又は濃縮装置に接続されている産物生成バイオリアクターの数（1…y）であり、供給原料n：nは、産物生成バイオリアクターの数（1…z）である。個々の供給原料k（1…x）、m（1…y）及びn（1…z）は、同じ組成であり得るか、又は供給原料の一部は同じ組成であるか、若しくは供給原料のすべては異なる組成である。
【図３】図３は、中間濃縮、濃縮ユニット構成１を含む、生合成産物生成のための二段階培養過程の実施形態を示す。
【図４】図４は、中間濃縮、濃縮ユニット構成２を含む、生合成産物生成のための二段階培養過程の実施形態を示す。
【図５】図５は、中間濃縮を含む、生合成産物生成のためのカスケード培養過程の実施形態を示す。
【図６】図６は、中間濃縮を含み供給原料が変化する、生合成産物生成のためのカスケード培養過程の実施形態を示す。
【図７】図７は、栄養分を欠乏させる発酵槽による中間細胞濃縮、濃縮構成１を含む、生合成産物生成のためのカスケード培養過程の実施形態を示す。
【図８】図８は、栄養分を欠乏させる発酵槽による中間細胞濃縮、濃縮構成２を含む、生合成産物生成のためのカスケード培養過程の実施形態を示す。
【図９】図９は、複数の中間濃縮ステップ、濃縮ユニット構成１を含む、生合成産物生成のための培養過程の実施形態を示す。
【図１０】図１０は、複数の中間濃縮ステップ、濃縮ユニット構成２を含む、生合成産物生成のための培養過程の実施形態を示す。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の実施形態を説明する際には、明確にするために、特定の用語により対処される（resorted）。ただし、本発明は、このように選択された特定の用語に限定されるものとはせず、それぞれの特定の用語には、同様の目的を達成するように同様に機能するすべての技術的同等物が含まれることが理解される。
【００１５】
定義
本明細書に用いられる「バイオリアクター（bioreactor）」という用語は、微生物が増殖するか、又は微生物が生合成産物を生産するリアクターを意味する。培養条件の最適化に関して種々の利点をもたらす、種々の種類のバイオリアクターを用いることができる。本発明の一実施形態では、エアリフトバイオリアクター（air-lift bioreactors）がカスケードにおいて用いられる。本発明の別の実施形態によれば、撹拌タンクバイオリアクター（stirred tank bioreactors）とエアリフトバイオリアクターの両方を、カスケードにおいて用いることができる。本発明の別の実施形態によれば、撹拌タンクバイオリアクターのみがカスケードにおいて用いられる。
【００１６】
本明細書に用いられる「リアクター（reactor）」及び「バイオリアクター（bioreactor）」という用語は、互いに置き換え可能に用いられる。 
【００１７】
本明細書に用いられる「産物（Product）」という用語は、「生合成産物（biosynthetic product）」とも呼ばれ、一次代謝産物又は二次代謝産物のいずれかであり得る細胞内産物と細胞外産物をともに含む天然代謝及び／又は遺伝子組換え代謝を介して合成される生合成産物を意味する。
【００１８】
「脂質（lipid）」という用語は、脂肪性物質であって、その分子が、概して、脂肪族炭化水素鎖を部分的に含有し、非極性有機溶媒に溶解するが、水には溶解しにくい脂肪性物質を意味する。脂質は、生存細胞における巨大分子の本質的な群である。脂質は、例えば、長鎖二酸、ヒドロキシル脂肪酸、長鎖ジオール、脂質、脂肪、油、ワックス、ファルネセン型生成物（farnesene type products）、ワックスエステル、ステロール、テルペノイド、イソプレノイド、カロテノイド、ポリヒドロキシアルカノエート、核酸、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪酸エステル、脂肪アミン、中鎖及び長鎖ジカルボン酸、エポキシ脂肪酸、長鎖ジオール及びポリオール、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、並びに、アシルグリセロール、例えば、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はモノアシルグリセロールである。「脂質（lipid）」、「油（oil）」及び「脂肪（fat）」という用語は、本明細書において同義語として用いられる。「アシルグリセロール（acyglycerol）」という用語は、グリセロールと脂肪酸とのエステルを意味する。アシルグリセロールは、脂肪及び脂肪油として天然に存在する。アシルグリセロールの例としては、トリアシルグリセロール（TAG、トリグリセリド）、ジアシルグリセロール（ジグリセリド）、及びモノアシルグリセロール（モノグリセリド）が挙げられる。
【００１９】
「微生物脂質（microbial lipid）」又は「微生物油（microbial oil）」という用語は、微生物によって生産され、変換されるか又は改変された脂質を意味する。「微生物脂質」という用語は、「発酵油脂（single cell oil）」というカテゴリーを包含する。
【００２０】
生産性（g/(l*h)）において、lは、リットルにより測定されるバイオリアクターの容量であり、gは、産物の質量をグラムにより表したものである。
【００２１】
「細胞増殖曲線（cell growth curve）」という用語は、微生物細胞がどの増殖状態にあるか、例えば、指数増殖期又は後期対数期（late exponential phase）又は定常期にあるかを意味する。この状態は、栄養、温度及び通気に関するどの条件がその時点の細胞に最適であるかを示す。「細胞増殖曲線による個々のバイオリアクターにおける過程の条件の最適化」を参照すると、細胞を他の条件に移すように、細胞を次のフェーズに移行させるように、例えば指数増殖期から後期指数増殖期へ移行させるように、培養条件を改めることが有益であり得ることを意味する。
【００２２】
「細胞分離ステップ（cell separation step）」又は「分離（separation）」という用語は、微生物培養物の一部が別の部分から分離され、その結果、分離ステップの前と比較して細胞密度が増加する細胞濃縮のステップである。細胞濃縮は、種々の手段、例えば、ろ過、遠心分離、デカンテーション、沈降、凝集及び／又は浮選（例えば、単位操作）によって実現することができる。本発明では、種々の多くの種類の細胞濃縮装置を用いることができ、当業者であれば、適切な手段を選択することができる。
【００２３】
「濃縮装置（concentration device）」という用語は、微生物培養物の微生物を豊富に含んだ画分を得るのに用いられる装置を意味する。場合により、微生物を豊富に含んだ画分に加えて、微生物の少ない画分も得られる。細胞濃縮は、種々の手段、例えば、ろ過、遠心分離又はデカンテーションによって実現することができる。本発明では、種々の多くの種類の細胞濃縮装置を用いることができ、当業者であれば、適切な手段を選択することができる。「産物生成リアクターと流れ接続している濃縮装置（A concentration device being in flow connection with the product formation reactor）」とは、流れ接続が微生物培養物を濃縮装置に送達するためのものであるか、又は濃縮装置から産物生成リアクターに細胞集団を送達するためのものであるという状況を意味する。
【００２４】
「微生物培養物の菌体濃度の増加（increased cell mass concentration of the microorganism culture）」という用語は、（重量%、g/l、cfu（コロニー形成単位）により、又は吸光度によって測定した場合）分離ステップ前の微生物培養物と比較して、微生物培養物のバイオマス濃度が増加することを意味する。
【００２５】
「産物生成曲線（product formation curve）」という用語は、産物生成の種々のフェーズを意味する。細胞培養又は発酵条件は種異なるフェーズの間において異なっていてもよいが、これは、例えば糖などの好ましくない栄養素の利用を誘導するには、栄養飢餓を誘導する培地の変更が有益であり得るためである。例えば、特定の栄養条件又は通気条件とすることによって、細胞を産物生成モードに保つことができる。
【００２６】
「バイオマス生産リアクター（biomass production reactor）」という用語は、温度、pH、栄養及び通気条件が細胞分裂を最適化するようなバイオリアクターを意味する。バイオマス生産リアクターの主な目的は、バイオマスを生産することである。嫌気的増殖の場合、バイオリアクターの通気は行われない。
【００２７】
「産物生成リアクター（product formation reactor）」という用語は、栄養、温度、pH及び通気条件が産物生成に最適化されているバイオリアクターを意味する。嫌気的増殖の場合、バイオリアクターの通気は行われない。
【００２８】
「好気的（aerobic）」という用語は、例えば、微生物が酸化的呼吸（oxidative respiration）によってATPの形態によりエネルギーを発生させることができる好気的条件下での細胞培養を意味する。本発明の方法は、好気的、嫌気的又は微好気的条件下で行うことができる。
【００２９】
「嫌気的（anaerobic）」という用語は、例えば、 酸素を用いない細胞培養又は発酵を意味する。嫌気発酵過程は、本明細書において、酸素が存在しない状態、又は実質的に酸素が消費されない状態で行われ、そして、有機分子が電子供与体と電子受容体の両方として機能する発酵過程と定義される。
【００３０】
「微好気的（micro aerobic）」という用語は、酸素制限条件、すなわち、酸素濃度が空気中よりも少ない環境を意味する。酸素制限法は、気体から液体への酸素の移行によって酸素の消費が制限される方法である。酸素制限の程度は、導入気体流の量及び組成とともに、用いられる発酵装置の実際の混合／物質移動特性によって決定される。
【００３１】
「生産（production）」という用語は、微生物産物又は生合成産物の細胞代謝合成、例えば、化合物の微生物変換（例えば、脂肪酸から二酸へ）、又はデノボ合成によるものを意味する。
【００３２】
本明細書に用いられる「細胞内産物（intracellular products）」とは、微生物によって生産され、細胞内に残存する産物を意味する。「細胞内産物」は、「細胞外産物（extracellular products）」とは対照的に用いられる。
【００３３】
本明細書に用いられる「細胞外産物」とは、微生物によって生産され、細胞外に（例えば、原形質膜の外側に）移動するか又は輸送される産物を意味する。
【００３４】
本明細書に用いられる「二次代謝産物（Secondary metabolite）」という用語は、増殖期の終了付近又は定常増殖期に微生物によって細胞内又は細胞外に生産される産物を意味する。
【００３５】
本明細書に用いられる「一次代謝産物（Primary metabolite）」という用語は、増殖、成長及び生殖に関与する代謝産物であって、通常、エタノール及び乳酸などのエネルギー代謝関連産物である代謝産物を含む、増殖期の微生物によって細胞内又は細胞外で生産される産物を意味する。
【００３６】
「増殖（Growth）」という用語は、細胞数の増加又は微生物量の増加を意味し、「増殖期（growth phase）」とも呼ばれる。
【００３７】
本明細書に用いられる「指数増殖（Exponential growth）」という用語は、細胞数が一定時間内に２倍になる微生物の増殖を意味する。
【００３８】
本明細書に用いられる「指数増殖期（Exponential growth phase）」という用語は、増殖が指数関数的な割合で増加する集団の増殖サイクルの期間を意味する。また、対数期とも呼ばれる。
【００３９】
本明細書に用いられる「定常増殖期（Stationary growth phase）」又は「定常期（stationary phase）」という用語は、増殖が停止する、微生物集団の増殖サイクル時の期間を意味するが、細胞数又は微生物量の正味の増加又は減少を意味しない。本発明に関連して、定常増殖期は、緩やかであるが指数関数的ではなく、細胞数又は微生物量の正味の増加が生じる、微生物集団の増殖サイクル時のフェーズを意味するのにも用いられ、「後期指数増殖期（late exponential growth phase）」若しくは「後期指数増殖期（late stage exponential growth phase）」、又は「初期定常増殖期（early stationary growth phase）」とも呼ばれる。通常、一部の増殖栄養素が増殖制限をするようになるか、又は阻害性代謝産物の蓄積が細胞増殖を阻害すると、定常増殖期に達する。定常増殖期では、多くの細胞機能、例えば、エネルギー代謝及び一部の生合成過程が継続し得る。
【００４０】
本明細書に用いられる「休止細胞（Resting cells）」という用語は、休眠中の細胞、胞子、又は他の微生物の休止、増殖していない細胞形態を意味する。本発明に関連して、休止細胞では増殖は生じないが、生合成産物を生産する一部の代謝及び／又は生合成過程が生じ得る。
【００４１】
「産物生成フェーズ（product formation phase）」という用語は、通常、最終産物の少なくとも80%が生成するフェーズと定義することができる。
【００４２】
「培地（media）」又は「培養培地（culturing media）」という用語は、本発明に用いられる種々の種類の培地を意味する。培地又は培養培地は、例えば、バイオマス生産又は産物生成に適している。本発明の一部の実施形態において、産物生成用の培地は、バイオマス生産用の培地と同じであり得る。
【００４３】
「微生物を豊富に含んだ画分（microorganism rich fraction）」又は「細胞を豊富に含んだ画分（cell rich fraction）」という用語は、微生物培養物の画分であって、分離後、すなわち、細胞分離ステップ又は濃縮ステップにおいて、分離ステップ前の微生物培養物と比較してバイオマス濃度が増加する画分である。
【００４４】
本明細書に用いられる「微生物の（microbial）」又は「微生物（microorganism）」は、互いに置き換え可能に用いられる。
【００４５】
本明細書に用いられる「培養する（culturing）」という用語は、微生物培養の最適条件下で微生物細胞を増殖させる過程を意味する。本発明の一実施形態において、「培養する」とは、本発明の方法のステップ、例えば、微生物細胞が本発明のバイオマス又は生合成産物を生産する種々のフェーズの間を意味する。
【００４６】
本明細書に用いられる「培養条件（culturing conditions）」という用語は、増殖若しくは産物生成において、又は増殖若しくは産物生成の異なるフェーズ間の微生物細胞の推移において、微生物細胞の最適な性能に影響を及ぼす、すべての条件を意味する。例として、「培養条件」には、好気的、嫌気的又は微好気的条件が挙げられる。
【００４７】
「微生物培養物（microorganism culture）」という用語は、微生物、及び微生物細胞を培養する培地（例えば、バイオマス生産又は産物生成）を含む培養物を意味する。本発明の一部の実施形態において、培養物は生合成産物も含む。
【００４８】
本明細書に用いられる「発酵（fermentation）」という用語は、生合成産物を生成する、微生物細胞の嫌気発酵を意味する。
【００４９】
「カスケード（cascade）」又は「カスケード過程（cascade process）」という用語は、生合成産物生産のための微生物細胞培養過程を意味する。この過程は、バイオリアクターの集合（例えば、カスケード）において行われ、微生物細胞はバイオリアクター間を移動して、過程の種々のステップに従って細胞の培養条件又は発酵条件を変更することができる。カスケードという用語は、バイオリアクターシステムを通る細胞の流れを意味し、これによって、連続培養又は流加培養及び産物生成過程が可能になる。
【００５０】
本明細書に用いられる「発酵油脂（Single cell oil）」という用語は、脂肪性物質であって、その分子が、概して、脂肪族炭化水素鎖を部分的に含有し、非極性有機溶媒に溶解するが、水には溶解しにくい脂肪性物質を意味する。発酵油脂は、生存細胞における巨大分子の本質的な群である。発酵油脂は、例えば、脂質、脂肪、ワックス、ワックスエステル、ステロール、テルペノイド、イソプレノイド、カロテノイド、ポリヒドロキシアルカノエート、核酸、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪酸エステル、脂肪アミン、中鎖及び長鎖ジカルボン酸、エポキシ脂肪酸、長鎖ジオール及びポリオール、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、並びに、アシルグリセロール、例えば、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はモノアシルグリセロールである。本発明に関連して、発酵油脂とは、デノボ合成を介して、そして、培養培地成分の微生物変換によって生産される細胞内発酵油脂産物と細胞外発酵油脂産物の両方を意味する。本発明に関連して、「脂質（lipid）」と「発酵油脂（microbial oil）」は、発酵油脂の同義語として用いられる。
【００５１】
「微生物（microorganism）」という用語は、生合成産物を生産することが可能な微生物を包含し、例えば、糸状菌又は酵母、従属栄養性藻類、細菌又は古細菌のような菌類を包含する。１種又は複数種の異なる微生物を本発明に利用することができる。
【００５２】
本発明の方法に用いる微生物は、
糸状菌：ペニシリウム属（Penicillium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、リゾプス属（Rhizopus）、フミコーラ属（Humicola）、接合菌門（Zycomycota）、子嚢菌門（Ascomycota）、ムコール属（Mucor）、モルチエレラ属（Mortierella）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、クロコウジカビ（アスペルギルス・ニガー）（Aspergillus niger）、又はアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）などの種、
酵母：サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidium）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・スチピリス（Pichia stipilis）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、又はロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）などの種、細菌：エシェリキア属（Escherichia）、バチルス属（Bacillus）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、放線菌属（Actinomyces）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、ノカルジア属（Nocardia）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、カプリアビダス属（Cupriviadus）、ザイモモナス属（Zymomonas）、クロストリジウム属（Clostridium）、連鎖球菌属（Streptococcus）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ラルストニア属（Ralstonia）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、大腸菌（エシェリキア・コリ）（Escherichia coli）、枯草菌（バチルス・スブチリス）（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、カプリアビダス・ネカトール（Cupriviadus necator）（ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropHa））、ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（クロストリジウム・ベイジェリンキ）などの種のうちのいずれか１種であり得る。
【００５３】
非限定的な例において、本発明に適切な微細藻類としては、緑藻類（ChloropHyceae）（リコイリング藻類（recoiling algae））、渦鞭毛虫類（DinopHyceae）（渦鞭毛藻類）、プリムネシウム藻類（PrymnesiopHyceae）（ハプト藻類）、パブロバ亜綱（PavlovopHyceae）、黄金色藻綱（ChrysopHyceae）（黄藻類）、珪藻綱（DiatomopHyceae）（珪藻）、真正眼点藻綱 （EustigmatopHyceae）、ラフィド藻綱（RhapidopHyceae）、ユーグレナ藻綱（EuglenopHyceae）、ペディノモナス藻綱（PedinopHyceae）、プラシノ藻綱（PrasinopHyceae）、及び緑藻綱（ChloropHyceae）が挙げられる。具体的には、微細藻類は、ドゥナリエラ属（Dunaliella）、クロレラ属（Chlorella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、クラミドモナス属（Chlamydomas）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、イソクリシス属（Isochrysis）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、パブロバ属（Pavlova）、フェオダクチラム属（PHaeodactylum）、プロトテカ属（Prototheca）、シゾキトリウム属（Schizochytrium）、スケレトネマ属（Skeletonema）、キートケロス属（Chaetoceros）、ニッチア属（Nitzschia）、ナンノクロロプシス属（Nannochloropsis）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、及びシネコシスティス属（Synechocystis）からなる群より選択することができる。
【００５４】
一部の実施形態では、脂質又は酵素を生産することが可能な微生物が用いられる。このような微生物は、通常、菌類であり、具体的には、糸状菌（カビ）又は酵母、微細藻類又は細菌である。脂質産生カビ、二形性カビ（dimorpHic molds）及び糸状菌は、非限定的な例として、アブシディア属（Absidia）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ブラケスラ属（Blakeslea）、ケトミウム属（Chaetomium）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、麦角菌属（Claviceps）、クロドスポリジウム属（Clodosporidium）、クスダマカビ属（Cunninghamella）、エメリセラ属（Emericella）、ハエカビ属（EntomopHthora）、フザリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、グロムス属（Glomus）、フミコーラ属（Humicola）、ムコール属（Mucor）、モルチエレラ属（Mortierella）、ペシロマイセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、プッキア属（Puccia）、フハイカビ属（Pythium）、リゾプス属（Rhizopus）、ミズカビ属（Saprolegnia）、トリコデルマ属（Trichoderma）、ウンベロプシス属（Umbelopsis）、ウスチラゴ属（Ustilago）、及びジゴリンクス属（Zygorhynchus）、のもの、例えば、アブシディア・スピノサ（Absidia spinosa）、アスペルギルス属（Aspergillus）のカビ、例えば、アスペルギルス・フィシェリ（A. ficheri）、アスペルギルス・フラバス（A. flavus）、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、クロコウジカビ（アスペルギルス・ニガー）（A. niger）、アスペルギルス・オクラセウス（A. ochraceus）、コウジカビ（アスペルギルス・オリゼ）（A. oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（A. sojae）、及びアスペルギルス・テレウス（A. terreus）、ブラケスラ・トリスポラ（Blakeslea trispora）、ケトミウム・グロボスム（Chaetomium globosum）、クラドスポリジウム・ハーバルム（Cladosporidium herbarum）、クラビセプス・プルプレア（Claviceps purpurea）、クスダマカビ属（Cunninghamella）のカビ、例えば、クニンガメラ・エチヌラータ（C. echinulata）、クニンガメラ・ジャポニカ（C. japonica）、及びクニンガメラ・エレガンス（C. elegans）、エントモフトラ・コロナタ（EntomopHthora coronata）、フザリウム・ブルギゲヌム（Fusarium bulbigenum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム属（Fusarium）の種、ジベレラ・フジクロイ（Gibberella fujikuroi）、グロムス・カレドニウス（Glomus caledonius）、フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、フミコーラ・グリセア（Humicola grisea）、ムコール属（Mucor）属のカビ、例えば、ムコール・シルシネロイデス（M. circinelloides）、ムコール・プルムベウス（M. plumbeus）、及びムコール・ルキシー（M. rouxii）、モルチエレラ属（Mortierella）属のカビ、例えば、モルチエレラ・イサベリナ（M. isabellina）、モルチエレラ・アルピナ（M. alpina）、及びモルチエレラ・ラマニアナ（M. ramanniana）、ペニシリウム属（Penicillium）属のカビ、例えば、ペニシリウム・ヤバニクム（P. javanicum）、ペニシリウム・リラシナム（P. lilacinum）、ペニシリウム・スピニュロサム（P. spinulosum）、及びペニシリウム・ソッピ（P. soppii）、ペシロマイセス・リラシナス（Paecilomyces lilacinus）、プッキア・コロナタ（Puccia coronata）、ピシウム・ウルティマム（Pythium ultimum）、ピシウム・イレグラレ（Pythium irregulare）、リゾプス・アリズス （Rhizopus arrhizus）、リゾプス・デレマ（Rhizopus delemar）、リゾプス・オリ��（Rhizopus oryzae）、ウスチラゴ・ゼアー（Ustilago zeae）、トウモロコシ黒穂病菌（ウスチラゴ・マイディス）（Ustilago maydis）、ジゴリンクス・モエレリ（Zygorhynchus moelleri）、並びに、マルブランケア・プルケラ（Malbranchea pulchella）、ミロテシウム属（Myrothecium）の種、スクレロチウム・バタチコラ（Sclerotium bataticola）、ペリキュラリア・プラチコラ（Pellicularia practicola）、スファセロテカ・レイリアナ（SpHacelothea reiliana）、ティロポスポリジウム・エーレン・ベルギー（Tyloposporidium ehren bergii）、アクルヤ・アメリカーナ（Achyla americana）、レピスタ・ヌダ（Lepista nuda）、チレチア・コントロベルサ（Tilletia controversa）、クロナルティウム・フシホルム（Cronartium fusiform）、ウンベロプシス・イサベリナ（Umbelopsis isabellina）及びウンベロプシス・ラマニアナ（Umbelopsis ramanniana）、ウンベロプシス・ビナセア（Umbelopsis vinaceae）及びウンベロプシス・アングラリス（Umbelopsis angularis）を含む。
【００５５】
酵母は、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、アピオトリカム属（Apiotrichum）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、リポマイセス属（Lipomyces）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidium）、カンジダ属（Candida）、ヤロウイア属（Yarrowia）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces）、スポリデオボルス属（Sporidiobolus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、トルロプシス属（Torulopsis）、ワルトマイセス属（Waltomyces）、エンドマイセス属 （Endomyces）、ガラクトマイセス属（Galactomyces）、ピチア属（Pichia）、又はクリプトコッカス属（Cryptococcus）のもの、例えば、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、クリプトコッカス・テリコルス（C. terricolus）、トリコスポロン・クタネウム（Trichosproron cutaneum）、リポマイセス・スターキー（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・リポフェラ（L. lipofera）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、カンジダ・カルバタ（Candida curvata）、ヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、ロドトルラ・グラチニス（Rhodotorula glutinis）、ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）、ロドスポリジウム・ジオボバタム（Rhodosporidium diobovatum）、ロドスポリジウム・クラトクビロバエ（Rhodosporidium kratochvilovae）、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces）、カンジダ属（Candida）、カンジダ属の種107、リポマイセス属（Lipomyces）の種33、ロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）、トリコスポロン・プルラン（Trichosporon pullulans）、又はトリコスポロン・ファーメンタンス（T. fermentans）も用いることができるが、これらに限定されない。
【００５６】
生合成産物の生産
本発明は、培養微生物を用いる生合成産物、特に細胞内産物を生産する、新規で費用効率の高い培養方法について説明する。
【００５７】
微生物は、誘導するか又は誘導しないで、例えば、炭素源若しくはビタミン類などの特定の栄養因子又は培地中の他の因子の有無といった環境条件、又は、温度、pH、溶存酸素若しくは他のものの変化による誘導を介して、生合成産物を生産することができる。加えて、一部の実施形態において、微生物は、生合成産物を生産できるように、例えば、所望の生合成産物をコードすることが可能な組換え遺伝子、又は、所望の生合成産物の合成を触媒することが可能な酵素を発現する組換え遺伝子の導入によって、遺伝子組換えをすることができる。遺伝子組換え微生物を作製する組換えDNA技術は、SambrookとRusselの文献「Molecular Cloning: A laboratory Manual」（第３版）（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（2001）のように、当技術分野において周知である。
【００５８】
培養過程は、バイオリアクターカスケードであって、連続的に連結された少なくとも２つのバイオリアクター（すなわち、バイオマス生産バイオリアクター、及び産物生成バイオリアクター）と、２つの連続連結バイオリアクターの間に、そしてこれらの連続連結バイオリアクターと並んで配置された１つ以上の細胞濃縮装置と、を備えたバイオリアクターカスケードの使用に基づく。細胞濃縮装置は、最後のバイオリアクターの後に、又はバイオリアクターに接続するように配置することもできる。
【００５９】
少なくとも２つの連続連結バイオリアクターからなるバイオリアクターカスケードは、具体的には、カスケード過程として操作され得る。カスケード過程は、種々の過程のフェーズ、例えば、増殖フェーズ及び生産フェーズにおいて種々の種類の供給原料が必要な場合に、容易に調整することができる。種々の供給原料が必要であり、例えば、バイオマスの培養には栄養分が豊富な供給原料が必要であり、また、産物生成フェーズでは、例えば栄養飢餓を達成するように、栄養分が不十分な供給原料が必要である。産物生成は、培養条件、例えば、pH、温度、通気条件又は誘発性化学物質（inducing chemical）の添加における他の変化によっても誘導され得る。バイオマスの培養は糖依存性でもあるが、産物生成フェーズでは、種々の種類の供給原料が必要であり、例えば、供給原料中に油及び脂肪が必要であり得る。
【００６０】
生合成産物の生産は、概して、２つのフェーズ、すなわち、バイオマスの量が増加する増殖フェーズと、生合成産物の大部分が生成する生産フェーズというフェーズを含むようにもたらされ得る。増殖フェーズは、１つ以上のバイオリアクター（増殖リアクター）内で行うことができ、生産フェーズは、１つ以上のバイオリアクター内で行うことができる。培養培地をバイオマス生産バイオリアクターに供給し、産物生成用の培地を産物生成リアクターに供給することができる。または、産物生成用の培養培地又は培地を、付加的なバイオリアクターにも供給してもよい。
【００６１】
本発明は、互いに流れ（又は流体）連通している少なくとも２つのバイオリアクターを備えたバイオリアクターのカスケードにおける生合成産物の生産方法であって、
培養培地と培養微生物とを含有する培養混合物を、バイオマス生産バイオリアクターに供給することと、
（バイオマス生産バイオリアクターの後に配置された）産物生成リアクターに、産物生成用培地と微生物とを含有する混合物を供給することと、
培養混合物の少なくとも一部をバイオリアクターに供給することと、を含み、バイオリアクター内の細胞の濃度が、バイオリアクターの前に又はバイオリアクターに接続するように配置された濃縮装置を用いて増加する方法を提供する。
【００６２】
一部の実施形態において、該方法は、さらに、バイオマス生産バイオリアクターから培養混合物の一部を取り出すことと、バイオマス生産バイオリアクターから取り出された培養混合物を濃縮して、液体画分及び微生物を豊富に含んだ画分を得ることと、微生物を豊富に含んだ画分を後続するバイオリアクターに供給することと、を含む。
【００６３】
一部の実施形態において、該方法は、さらに、生合成産物生成用バイオリアクターから混合物の一部を取り出すことと、バイオリアクターから取り出された混合物を濃縮して、液体画分及び微生物を豊富に含んだ画分を得ることと、微生物を豊富に含んだ画分を、バイオリアクターシステムのバイオリアクター又は後続するバイオリアクターに供給することと、を含む。
【００６４】
本発明に用いられる、それぞれのバイオリアクターは、単純な容器又はタンク（例えば、エアリフト型又は撹拌容器又はタンク）であり得る。バイオリアクターは、バイオマスを増殖させる増殖リアクターとしても、生合成産物を生成する産物生成リアクターとしても用いることができる。嫌気発酵では、バイオリアクターの通気は行われない。温度、pH、通気（好気性リアクターの場合）、振盪（agitation）、圧力、流速、希釈率、撹拌（stirring）、入口、出口、酸化還元電位、細胞密度及び栄養素含有量などの１つ以上のパラメータを制御できることが好ましく、細胞が増殖する又は生産されるか否かなどの細胞の状態は、これらの因子に依存し得る。具体的には、生合成産物の生産において、微生物細胞培養物が増殖フェーズから生産フェーズへ移行するフェーズは、上述した因子のうちの１つ以上を変化させること、又は化学物質などの誘導因子を加えることによる誘導操作を介して生じる。産物は、一次代謝又は二次代謝によって生成し得る。特定の実施形態において、微生物増殖フェーズ及び産物生成フェーズは、培養条件及び産物生成条件を都合よくかつ正確に制御できるように、そして、連続生産システムとすることができるように、別個のバイオリアクター内で行われる。さらに、生合成産物は、細胞内産物又は細胞外産物として生産されてもよく、通常、細胞内産物が生産される。
【００６５】
生産フェーズの産物は、気体であり得る。この技術的な革新における利点は、生産フェーズにおいて高い細胞密度を用いることによって、生成気体中の産物濃度が増加することである。
【００６６】
微生物は、少なくとも２つの一連のバイオリアクター内で培養及び／又は発酵される。これらの少なくとも２つのバイオリアクターは、互いに流体連通しており、例えば、弁を有する適切な導管と接続されていてもよく、そして、バイオリアクター間の他の中間手段、例えば分離段階を介して接続される。本発明の一実施形態において、それぞれのバイオリアクターは、カスケードにおける後続する及び前のバイオリアクターとのみ流体接続しており、産物生成用バイオリアクターシステムは、バイオマス生産用バイオリアクターシステムの下流に配置される。細胞を連続的に移すことができるバイオリアクターのカスケードが介在することによって、増殖時と産物生成時の両方において、細胞の最適な条件下で連続細胞生産、産物生成及び採取が可能になる。一部の実施形態において、産物生成ステップが行われるバイオリアクターは、連続式、流加式、又は連続式と流加式との組合せのうちのいずれか１つとして操作される。一実施形態において、微生物細胞は、１つのバイオリアクター内で流加方式によって生産され、微生物を豊富に含んだ画分が得られ、さらに、微生物を豊富に含んだ画分は、別のバイオリアクター内で生合成産物を生産するのに利用される。
【００６７】
一部の実施形態において、一連のバイオリアクターは、３つ若しくは４つ、又は更に多くのバイオリアクターを含み、これによって、特定の利点がもたらされ得る。図６を参照すると、５つの一連のバイオリアクターが示されており、これは、二次代謝産物の生産に最適化することができる。図６では、２つのバイオマス生産リアクターが用いられ、続いて濃縮ステップが行われ、その後、細胞濃縮物（すなわち、微生物を豊富に含んだ画分）が、３つの産物生成リアクターのうちの１番目のものに投入される。このような種類の設備によって、第１のバイオマス生産リアクターを指数増殖に最適化することができ、第１のバイオマス生産リアクターから、細胞と培地（すなわち、培養混合物）が第２のバイオマス生産リアクターに移され、最初の栄養欠乏を可能にする第２の種類の増殖培地（供給原料２）が加えられ、これによって、細胞が産物生成フェーズに変わる。第２のリアクターの後、細胞は、濃縮ステップにおいて濃縮され、培地浸透物（微生物を豊富に含んだ画分）と、細胞濃縮物（微生物の少ない画分）と、が生成する。細胞濃縮物は、第１の産物生成リアクターである第３のバイオリアクターに供給され、栄養欠乏培地が細胞に加えられる。細胞濃縮ステップからの培地浸透物は、再利用又は廃棄することができる。第３のバイオリアクターから、細胞は第４のバイオリアクターに流入し、そこから第５のバイオリアクターに流入し、その後、細胞は、更なるリアクターに移されるか、又は産物の抽出のために採取され得る。それぞれの更なるバイオリアクターでは、種々の栄養成分を有する培地が存在して、栄養利用及び産物生成を最適化することができる。例として、細胞は、炭素飢餓状態であってもよく、これによって、好まれない糖が利用される。一部の実施形態において、生合成産物は細胞外産物であり、培地浸透物から抽出することができる。
【００６８】
したがって、本方法は、次のステップのうちの１つ以上を含む。
【００６９】
ステップＡ
バイオマス生産リアクターにおいて培養培地の存在下で微生物を培養するステップａ）。
【００７０】
バイオマス生産リアクターは、専ら、特定の微生物の指数増殖を誘導することができる。バイオリアクターを増殖リアクターとして操作する場合、最適量の栄養素を含む培養培地を供給することによって、操作を行うことができる。これは、バイオリアクターに新しい培養培地を連続的に供給し、細胞を次のバイオリアクターに連続的に流すことによって実現することができる。
【００７１】
微生物は、増殖時に、培地中に含まれる栄養素を代謝することによって培養培地を利用するが、これに従って、第１のバイオリアクターは、微生物培養物（すなわち、培養混合物）を収容する。培養混合物は、培地とともに、培養微生物を含む。連続バイオリアクター設備における、このステップの利点は、細胞増殖を一定して高いレベルに保つことができること、そして、更なるバイオマス生産リアクターか産物生成リアクターであるかを問わず、細胞を次のバイオリアクターに連続的に供給できることである。微生物細胞は、バイオマス生産リアクター内で流加方式によっても生産され得る。
【００７２】
ステップａ）に続いて、バイオマス生産リアクターから濃縮装置（すなわち、微生物細胞を濃縮するもの）に微生物培養物流が供給される。実際に、微生物培養物の少なくとも一部は、バイオマス生産リアクターから取り出されて、濃縮装置に供給される。バイオマス生産リアクターから微生物培養物を取り出すことは、例えば、バイオマス生産リアクターにおける高い細胞密度又は栄養欠乏のいずれかに応じて行われてもよい。連続バイオリアクターシステムにおいて、細胞密度及び栄養素含有量が監視され、そして、このような因子を、指数関数的に細胞を増殖させるレベルに保つように、バイオマス生産リアクターから培養混合物が取り出される速度は、調節され得る。細胞密度が非常に高い場合は、培養混合物を除去し、新しい培地を加えることができる。
【００７３】
このように、バイオマス生産リアクターから濃縮装置に微生物培養物流を供給するステップには、バイオマス生産リアクターから微生物培養物（すなわち、バイオマス生産リアクターの混合物）を取り出すことと、バイオマス生産リアクターから取り出された微生物培養物より培養微生物を分離することによって、微生物培養物の微生物を豊富に含んだ画分、及び微生物培養物の微生物の少ない画分を得ることと、が含まれる。
【００７４】
ステップＢ及びＣ
ステップｂ）は供給に関し、これは、産物生成リアクターへ、ステップａ）のバイオマス生産リアクターから一定量の微生物培養物、又は微生物培養物の一定量の微生物を豊富に含んだ画分、及び産物生成に最適化された培地を移すことを意味する。ステップｃ）は、産物生成リアクターにおける産物生成培地の存在下での生合成産物の生成に関する。産物生成用の培地を利用する微生物細胞は、産物生成フェーズではわずかしか増殖せず、培地中の栄養素を生合成産物の生産に利用する。バイオマス生産リアクターの微生物培養から得られた微生物を豊富に含んだ画分を、産物生成リアクターに供給する利点は、特定の栄養素が、産物生成のために培地中に少量存在する必要が多くあること、そして、濃縮／分離ステップにおいて培地の一部を除去することによって、特定の栄養素を少量含む培地を産物生成用培地として加えて、例えば産物生成用培地中の窒素の濃度を調整し、これによって、生合成産物の生成を刺激することである。
【００７５】
このようにして、微生物を豊富に含んだ画分と産物生成用培地とを混合し、これによって、産物生成バイオリアクターは、微生物及び細胞内又は細胞外のいずれかであり得る生合成産物とともに、産物生成に最適化された培地を含む微生物培養物（すなわち、産物生成バイオリアクターの混合物）を収容する。
【００７６】
本発明の一実施形態は、産物生成リアクターから混合物の一部を取り出すステップと、この混合物から微生物を分離することによって、微生物を豊富に含んだ画分、及び微生物の少ない画分を得るステップと、を含む。
【００７７】
本発明の一実施形態は、微生物を豊富に含んだ画分を産物生成リアクターに再循環させるステップを含む。微生物を豊富に含んだ画分を産物生成リアクターに再循環させるか又は供給することによって、産物生成用培地の更なる栄養欠乏が可能になり、これによって、好まれない栄養素、例えば糖の利用が誘導され、その結果、産物生成用培地が完全に利用される。さらに、この利点は、例に示されているように、微生物の生産性が増加し得ることである。
【００７８】
特定の実施形態において、濃縮／分離ステップは、増殖リアクターと産物生成リアクターとの間に、又はこれらと並んで配置される。増殖リアクターから得られた細胞を濃縮してから、これらを産物生成リアクターに供給する場合に、又は、産物生成リアクターから得られた細胞を濃縮してから、これらを産物生成リアクターに再循環させるか、若しくはこれらを後続する産物生成リアクターに供給し、これによって、産物生成リアクター内の細胞濃度を増加させる場合に、過程の生産性が有意に向上することが見いだされている。この効果は、生合成産物が二次代謝産物の反応経路を介して生産される場合に特に重要であり、例えば過程の条件を変更することによって、増殖フェーズから生産フェーズへの移行を誘導する必要がある。微生物は、過程の条件を変更して、例えば、産物生成用培地中の１種以上の栄養素の含有量を（栄養飢餓によって）変更して、又は、誘導因子の添加若しくはバイオリアクター容量の削減のような他の手段によって、増殖ステップから生産ステップへ移行するように誘導することができる。
【００７９】
濃縮ステップから得られた微生物培養物又は培養混合物の微生物を豊富に含んだ画分は、（重量%、g/l、cfu（コロニー形成単位）により、又は吸光度によって測定した場合の）少なくとも50%、具体的には少なくとも100%、例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%のうちのいずれか１つ、又は具体的には少なくとも100%の混合物から開始したバイオリアクター内のバイオマス濃度と比較して、バイオマス濃度が増加し得る。
【００８０】
本発明の１つの設備の例が図４に示されており、バイオマス生産リアクターの一定量の培養混合物が、産物生成リアクターに供給され（図４では、産物生成、栄養欠乏、濃縮と表示されている。）、また、産物生成用培地が加えられても加えられていなくてもよい（図４では、供給原料２と表示されている。）。産物生成リアクターの細胞濃縮物は、同じ産物生成リアクターに再循環される。図４に描写されているバイオリアクター設備は、細胞内産物に特によく適しており、濃縮ステップは、阻害性化合物を除去するのに有用であり、産物生成フェーズ時にバイオリアクター内の培地組成又は微生物培養及び細胞密度を調整することができる。
【００８１】
本発明の別の設備の例が図３に示されており、バイオマス生産リアクターの一定量の微生物を豊富に含んだ画分が、産物生成リアクターに供給され（図３では、産物生成、栄養欠乏と表示されている。）、また、産物生成用培地が加えられても加えられていなくてもよい（図４では、供給原料２と表示されている。）。ここで、バイオマス生産フェーズと産物生成フェーズとの間の又は産物生成フェーズ後の分離／濃縮ステップによって、増殖に最適化された培地又は微生物培養物から、生産に最適化された培地又は微生物培養物へ、培地又は微生物培養物を交換することができる。これは、例えば、増殖培地又は微生物培養物が、産物生成を阻害し得るか、又は細胞／微生物の増殖状態に影響を及ぼし得る代謝産物若しくは栄養素を含み、これによって、産物生成の誘導を阻害する場合に、有効であり得る。代謝産物又は栄養素によるこのような阻害効果は、当技術分野において周知である。図３に示されている方法は、細胞外産物の生産に特に適している。
【００８２】
本発明の一部の実施形態では、微生物培養物の少なくとも一部をバイオマス生産リアクターから取り出し、これを、バイオマス生産リアクターと産物生成リアクターとの間に配置された濃縮装置に供給して微生物を豊富に含んだ画分を得て、この画分は、産物生成リアクターに供給され、また、産物生成リアクターから微生物培養物の少なくとも一部を取り出し、これを、産物生成リアクターの下流に配置された濃縮装置に供給して微生物を豊富に含んだ画分を得て、この画分は、カスケード（の下流）における後続する産物生成リアクターに供給される。利点の一つは、バイオリアクター間の産物を生成する培養／培地の効果的な変更、阻害性化合物の除去、及び細胞密度の維持であり得る。また、この設備によって、細胞の増殖フェーズから生産フェーズへ効果的に切り替えることもできる。
【００８３】
本発明の一部の実施形態において、一定量の微生物を豊富に含んだ画分は、バイオマス生産リアクター又は産物生成リアクターに再循環され、例えば0%〜50%、例えば、少なくとも40%、又は少なくとも30%、又は少なくとも20%、又は少なくとも10%が、バイオマス生産リアクター又は産物生成リアクターに再循環され、50%〜100%、例えば、バイオマス生産リアクター又は産物生成リアクターにそれぞれ再循環されない細胞はすべて、次のバイオリアクターに運搬される。
【００８４】
一部の実施形態において、栄養素の含有量が最適でない場合、産物生成バイオリアクターの培養培地又は微生物培養物を除去することができ、新しい培地を加えて、関連する栄養素の含有量を変更することができる。
【００８５】
本発明の一部の実施形態では、産物生成リアクターに連続的に連結された、第３のバイオリアクターが提供される。第３のバイオリアクターを用いて配列を拡張することによって、本発明の方法の更なる生産及び多様性が可能になる。濃縮ステップは、例えば図１０に示されているように、産物生成リアクターと第３のバイオリアクターとの間に存在するが、産物生成リアクターと第３のバイオリアクターとの間には、濃縮ステップが同様に存在していなくてもよい。分離ステップの存在は、生産リアクター内の微生物／細胞濃度を増加させるため、炭素源を更に速く又は更に効果的に利用することができ、これによって、生産過程の生産性が向上する。生合成産物、特に細胞内産物の比生産性（g/(g*h)）が低いか、又は微生物の増殖が遅い過程では、生産フェーズにおける細胞の濃度を増加させることによって、更に高い生産性が可能になる。
【００８６】
本発明の一部の実施形態では、一連のバイオリアクターが３つ、４つ又は更に多くのバイオリアクターからなる場合、最後のバイオマス生産リアクターと第１の産物生成リアクターとの間に、又は図５、６及び７に例示されているような第１の産物生成リアクターに接続するように、単一の分離手段（濃縮手段）のみが存在する。３つ、４つ又は更に多くの一連のバイオリアクターが用いられる一部の実施形態では、図１０に示されているように、第３の、第４の又はいずれかの後続するバイオリアクターの後に、細胞を豊富に含んだ画分をバイオリアクター３に戻す、更なる分離／濃縮手段が存在し得る。
【００８７】
本発明の一部の実施形態において、方法は、さらに、ｉ）産物生成リアクターから混合物の一部を取り出すことと、ｉｉ）産物生成リアクターから取り出された混合物より微生物を分離することによって、混合物の微生物を豊富に含んだ画分、及び混合物の微生物の少ない画分を得ることと、ｉｉｉ）先のステップの一定量の微生物を豊富に含んだ画分を、場合により、産物生成用の第２の培地と、又は同じ種類の培地とともに、微生物を収容する第３のバイオリアクターに供給し、微生物が産物生成用培地を利用し、これによって、第３のバイオリアクターが、培地と微生物と生合成産物とを含んだ、第３のバイオリアクターの微生物培養物（すなわち、混合物）を収容することと、を含む。この分離／濃縮手順によって、培養条件を変更するか、又は後期生産フェーズにおいて特定の栄養素を補充することができ、これにより、細胞は、例えば先行するバイオリアクターにおいて用いられたものとは異なる炭素源を代謝するように切り替えることができる。
【００８８】
本発明の一部の実施形態において、バイオリアクターのカスケードは、さらに、第３のバイオリアクターに連続的に連結された、第４のバイオリアクターを備える。一例が図５に示されており、４つの連続連結バイオリアクターを備え、これらのうちの１番目のものは、バイオマス生産リアクターであり、３つのバイオリアクターは産物生成リアクターである。分離／濃縮ステップは、バイオリアクターのうちのいずれかの間に、そして第４のバイオリアクターの後に存在し得る。濃縮ステップは、産物生成リアクターと第３のバイオリアクターとの間に存在していてもよく、細胞濃縮物（すなわち、微生物を豊富に含んだ画分）のすべて若しくは一部を産物生成リアクターに再循環させるか、又は、細胞濃縮物のすべて若しくは一部を第３のバイオリアクターに転送する。このバイオリアクター設備によって、それぞれのステップにおいて培養条件又は産物生成条件を変更することができる４つのステップを有する生産方法が可能になる。これには、例えば、指数増殖条件によるバイオマス生産リアクターにおけるバイオマス生産ステップと、高濃度の細胞及び栄養欠乏による産物生成リアクター、産物を生成する第３及び第４のバイオリアクターにおける産物生成ステップと、が含まれる。この後者の産物生成の過程では、条件は、図９に示されているような、同じ供給原料がバイオリアクター２〜４において用いられるものであってもよいし、バイオリアクター２、３及び４に種々の供給原料を加える過程であってもよい。後者の状況によって、条件を変更し、生産性を向上させ、そして、種々の炭素源を利用することができる。
【００８９】
本発明の一部の実施形態において、方法は、さらに、ｇ）第３のバイオリアクターから混合物の一部を取り出すことと、ｈ）第３のバイオリアクターから取り出された混合物より微生物を分離することによって、混合物の微生物を豊富に含んだ画分、及び混合物の微生物の少ない画分を得ることと、ｉ）一定量の微生物を豊富に含んだ画分を、場合により、産物生成用の（第３の）培地とともに、微生物を収容する第４のバイオリアクターに供給し、微生物が産物生成用培地を利用し、これによって、第４のバイオリアクターが、培地と微生物と生合成産物とを含んだ、第４のバイオリアクターの微生物培養物（すなわち、混合物）を収容することと、を含む。
【００９０】
本発明の一部の実施形態では、付加的なバイオリアクターが提供され、それぞれの付加的なバイオリアクターが、先行するバイオリアクターに連続的に連結され、そして、付加的なバイオリアクターの数が、1、2、3、4、5又は6である。細胞分離又は濃縮ステップは、いずれか２つのバイオリアクター間に存在していてもよく、第３及び第４のバイオリアクターに関して本明細書に説明されているように、細胞を豊富に含んだ画分を、先行するバイオリアクター又は次のバイオリアクターのいずれかに供給することができる。
【００９１】
本発明の一部の実施形態において、分離、例えば、バイオマス生産リアクターと産物生成リアクターとの間に配置された濃縮装置における分離、及び／又は産物生成リアクターと第３のバイオリアクターとの間に配置された濃縮装置における分離、及び／又はステップｈ）における分離は、遠心分離、ろ過、沈降、凝集、浮選、デカンテーションからなる一覧より選択される手段を用いて行われる。特定の実施形態において、培養細胞は、ろ過又は遠心分離又はデカンテーションのうちのいずれか１つによって濃縮される。特定の実施形態において、細胞濃度は、細胞が生じたバイオリアクターの濃度と比較して、濃縮ステップにおいて、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、具体的には、少なくとも100%増加する。本発明者らは、細胞を少なくとも10%濃縮して、生合成産物、特に細胞内産物の生産性が向上した過程を得ることができることを見いだした。本段落において説明したように配置された濃縮装置から得られた微生物を豊富に含んだ画分は、同じバイオリアクターに再循環させることができ、後続するバイオリアクターから微生物培養物を取り出すか、又は後続するバイオリアクターに微生物培養物を供給した。
【００９２】
本発明の一部の実施形態において、分離は、連続的、半連続的に又はバッチ式により操作される濃縮装置を含み得る技術水準によって操作される。これは、上で提案した分離手段、例えば、遠心分離、ろ過、デカンテーション、沈降、凝集又は浮選のうちのいずれか１つを用いることによって達成されてもよい。適切な遠心分離、ろ過（例えば、深層ろ過、又は精密ろ過、限外ろ過、ナノろ過、ダイアフィルトレーション、デッドエンド型とクロスフロー型の両方の構造を含む逆浸透などの膜ろ過）、デカンテーション、沈降、凝集又は浮選の方法及び手段は、当業者に周知であり、本発明において利用することができる。
【００９３】
バイオリアクターシステム全体は、連続的に操作することもでき、分離ステップの連続操作に加えて、すべてのバイオリアクターも連続モードにより運転する。分離ステップを連続的に行う手段に加えて、バイオリアクター間の連続的な細胞の流れを可能にする手段も利用する必要がある。または、本発明の方法は、流加式により操作することができ、濃縮は、用いられる濃縮法に応じてバッチ式により又は連続的に操作することができる。
【００９４】
本発明の一部の実施形態において、それぞれの連続連結バイオリアクターにおける一定量の微生物培養物は、一連の連続連結バイオリアクターの後続するバイオリアクターに供給される。この手順は、微生物を終始バイオリアクターシステム中に流し、微生物を種々のバイオリアクター内ですべての種々の条件にさらし、これによって、微生物は、生合成産物、特に細胞内産物を効果的に生産するようになる。また、培養ステップにおいて得られた一定量の新鮮な微生物を、すべてのバイオリアクター中に連続的に運搬することもできる。
【００９５】
本発明の一部の実施形態では、バイオリアクターに、特定の反応条件がもたらされる。例えば、バイオマス生産バイオリアクター、産物生成リアクター、並びに第３及び第４のバイオリアクター（存在する場合）は、互いに独立して、次のようにして最適化されてもよい。バイオマス生産リアクターに先行して、そして、バイオマス生産リアクターに連続的に接続されているか、又はバイオマス生産リアクターと流れ接続しているバイオリアクターが、さらに、存在し、微生物増殖に最適化され得る。バイオマス生産リアクターは、後期対数期における微生物増殖に最適化され、及び／又は、例えば栄養飢餓によって、生合成産物生成の誘導に最適化され得る。産物生成リアクターは、場合により栄養飢餓条件下で、定常増殖期における生合成産物の生成に最適化され得る。第３のバイオリアクターは、炭素源の添加を最小限に抑えて、生合成産物の生成に最適化され得る。
【００９６】
一部の実施形態において、方法は、ｊ）バイオマス生産リアクターに先行して、そして、バイオマス生産リアクターに連続的に接続されているか、又はバイオマス生産リアクターと流れ接続しているバイオリアクターであって、バイオマス生産リアクターに先行しているバイオリアクターが、微生物増殖に最適化されるステップと、ｋ）バイオマス生産リアクターが、後期対数期における微生物増殖に最適化され、及び／又は栄養飢餓の誘導に最適化されるステップと、ｌ）産物生成リアクターが、場合により栄養飢餓条件下で、定常増殖期における生合成産物の生成に最適化されるステップと、ｍ）第３のバイオリアクターが、炭素源の添加を最小限に抑えて、生合成産物の生成に最適化され、その結果、残留糖が消費されるステップと、を含む。一実施形態において、この手順は、細胞分離ステップが、培地、微生物培養及び培養条件をそれぞれのステップの間で確実に変更できるようにする流加培養であり得る。手順は、ステップｊ）〜ｍ）がカスケードにおいて行われるカスケードバイオリアクターシステム、例えば、流加又は連続培養バイオリアクター設備において行われる。
【００９７】
一部の実施形態では、（ｊ）先行するバイオリアクター、（ｋ）バイオマス生産バイオリアクター、（ｌ）産物生成バイオリアクター、及び（ｍ）第３のバイオリアクターのうちの２つ又は３つのみが存在する。
【００９８】
一部の実施形態において、方法は、ステップｊ）、ｋ）、ｌ）及びｍ）とともに、ステップｋ）とｌ）との間に細胞分離ステップを含み、例えば、図７に示された配列に示されているように、細胞を豊富に含んだ画分がステップｌ）に供給される。
【００９９】
一部の実施形態において、方法は、ステップｊ）、ｌ）及びｍ）とともに、ｌ）及びｍ）のそれぞれの後に細胞分離ステップを含み、例えば、図１０に示された配列に示されているように、細胞を豊富に含んだ画分が、ｌ）及びｍ）のそれぞれに戻される。
【０１００】
本発明の一部の実施形態において、菌体濃度は、１つ以上の方法のステップ、又は１つ以上の濃縮装置によって増加し、微生物を豊富に含んだ画分は、微生物培養物を取り出したバイオリアクターよりも3〜80℃（例えば、3〜30℃若しくは31〜80℃）低い温度において得られ、及び／又は、濃縮装置に供給される微生物培養物の温度は、3〜80℃（例えば、3〜30℃若しくは31〜80℃）低下する。
【０１０１】
本発明の一部の実施形態において、微生物を豊富に含んだ画分と微生物の少ない画分との１つ以上の分離は、分離される混合物を取り出したバイオリアクターよりも1〜30℃低い（例えば、3〜30℃低い）、及び／又は分離される混合物の温度が1〜30℃低下する（例えば、3〜30℃低下する）温度範囲において行われる。特定の実施形態において、バイオリアクターから得られた微生物培養物の温度は、濃縮ステップの前に及び／又は濃縮ステップ時に低下する。特定の理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、濃縮ステップが細胞にストレスを引き起こし、これによって、後のステップにおいて生産性を低下させ、そして、微生物／細胞の温度低下は、温度低下がない場合と比較して、ある程度ストレスを緩和すると考えている。これによって、細胞の活性が維持され、バイオリアクター内の細胞の生産効率が向上する。
【０１０２】
特定の実施形態において、微生物培養物の温度は、濃縮ステップの前に又は濃縮ステップ時に、少なくとも1℃、例えば、1〜5℃、又は1〜10℃、又は1〜15℃、又は1〜20℃、又は1〜30℃、例えば、5〜15℃、又は15〜25℃低下する。
【０１０３】
別の特定の実施形態において、温度は、℃により測定して、細胞が得られたバイオリアクターの温度の、少なくとも1%だけ、例えば、少なくとも2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%のうちのいずれか１つ、又は少なくとも90%だけ低下する。特定の実施形態において、温度は、濃縮ステップの後に標準化され、すなわち、元の温度に戻されるか、又は産物生成に最適化された特定の温度に変更され、その温度は、通常、20℃〜80℃、具体的には25℃〜37℃である。温度低下ステップに関連するいくつか利点によって、濃縮ステップ時の細胞損失を大幅に低くすることができる。さらに、温度低下ステップは、微生物／細胞を定常期に移行させることができ、これによって、生合成産物の生成が促進する。
【０１０４】
さらに、本発明の一部の実施形態において、微生物がトランスジェニック生物であり、そして、産物が、熱ショックプロモーターなどの熱感受性プロモーターによって制御される導入遺伝子の産物である場合、温度変化（すなわち、温度の上昇）を用いて、産物の発現を誘導することができる。このような場合、濃縮ステップ時及び／又は濃縮ステップの後の温度変化を用いて、産物の発現を誘導することができる。種々の熱ショックプロモーターは、種々の温度変化レベルを活性化させる必要があり得る。例として、ゼブラフィッシュでは、温度が28.5℃から38℃まで9.5℃上昇することによって、熱ショック調節遺伝子において遺伝子発現が大幅に誘導される。ショウジョウバエ細胞では、最適温度変化は、例えば、25℃から36℃と37℃との間であるのに対して、サッカロミセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）では、最適温度変化は、例えば、25℃から39℃と40℃との間である。このため、一部の実施形態において、本発明に用いられる微生物は、トランスジェニック微生物又はトランスフェクトされた微生物であって、導入遺伝子DNA又はトランスフェクトされたDNAが、生合成産物生産についての関心対象の遺伝子を含み、熱ショックプロモーターによって関心対象の遺伝子の発現が制御される、トランスジェニック微生物又はトランスフェクトされた微生物である。熱ショックプロモーターによって関心対象の遺伝子が制御される、このような実施形態では、生産フェーズの前に又は生産ステップ時の温度は、少なくとも2℃、例えば、少なくとも3℃、又は少なくとも4℃、例えば、少なくとも5℃、例えば、2〜15℃、又は5〜15℃、例えば、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃若しくは15℃のうちのいずれか１つだけ上昇し得る。温度の上昇は、発現を誘導するように一時的であり得るか、又は、生産ステップ時に恒久的であり得る。
【０１０５】
一部の実施形態において、関心対象の導入遺伝子の発現は、炭素源依存性プロモーターによって、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）中で制御され、特定のプロモーターは、グルコース欠乏によって誘導され得る（Weinhandlらの文献、Microbial Cell Factories, 2014, 13:5）。種々の因子によって誘導され得る他の有用なプロモーターは、当技術分野において周知であり、このようなプロモーターは、非限定的な例として、テトラサイクリンの添加によって誘導可能な酵母Tetプロモーターであってもよい。銅イオン誘導性プロモーター系も当技術分野において公知であり、本発明における関心対象の遺伝子の発現を調節するのに用いることができる。一部の実施形態では、恒常活性型プロモーター（constitutively active promoters）を用いて、生合成産物生産についての関心対象の遺伝子を発現させることができる。
【０１０６】
本発明によって生産される生合成産物は、通常、細胞内産物であるが、ｉ）培養微生物からのバイオマス、ｉｉ）一次代謝産物、ｉｉｉ）二次代謝産物、ｉｖ）細胞外産物のうちの１種以上であり得る。生合成産物は、アルコール、酸、酵素、脂質、抗生物質、タンパク質、ポリマー又はこれらの混合物からなる一覧より選択される、１つ以上の分類の化合物から選択することができる。産物は、細胞の遺伝子操作の結果として生じる物であってもよく、その作製方法は、当技術分野において周知である。遺伝子操作された細胞において、産物の生産は、培地中の特定の因子の存在によって若しくは温度変化によって誘導されるか、又は、産物は、誘導せずに常時発現させる（constitutively expressed）ことができる。さらに、産物は、特定の条件、例えば、特定の栄養素の有無、温度又はpHなどによってその生産が誘発されるものであり得る。上述したように、生合成産物は、微生物によって生産される１種以上の有機化合物であり得る。特定の実施形態において、生合成産物は、脂質、アルコール、酵素、抗生物質、タンパク質、ポリマー、酸、二酸又はこれらの混合物のうちのいずれか１種を含む。
【０１０７】
温度、栄養素レベル、pHなどの、特定の過程の条件は、微生物が広範囲の種々の有機化合物を生産するようにもたらされ得る。これらの化合物は、細胞内産物又は細胞外産物が考慮され得る。細胞内産物の例は、カタラーゼ及び他の多くのもののような微生物酵素であり得る。また、組換えタンパク質、例えば、B型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなども細胞内産物である。ただし、ほとんどの酵素は、細胞外産物として生産される。
【０１０８】
一次代謝による特定の細胞内産物は、例えば、藻類、酵母、菌類又は細菌などの種々の多くの微生物によって生産され得る発酵タンパク質（single cell protein）であってもよい。一次代謝による特定の細胞内産物についての可能性のある使用の例としては、ヒト用と動物用両方の供給原料へのタンパク質添加物を挙げることができる。二次代謝産物である細胞内産物の生産も好ましく、非限定的な例として、微生物油（例えば、N、P、S、Feなどの飢餓条件下で生産されるもの）、ワックスエステル（例えば、Nの飢餓条件下で生産されるもの）、及びポリヒドロキシアルカノエート（PHA）（例えば、N、P、S、Feなどの飢餓条件下で生産されるもの）を包含し、好気的又は嫌気的条件のいずれであってもよい。種々の微生物は、短鎖長PHA又は中鎖長PHAのいずれかの生産能について周知である。また、微生物クラビセプス・プルプレア（Claviceps purpurea）によって生産されるエルゴタミンも、開示されている過程の産物として関心対象の二次代謝産物である。
【０１０９】
細胞外産物には、一次代謝産物と二次代謝産物とが含まれる。一次代謝産物は、好気的又は嫌気的生産によって生産され得る。場合によっては、生産過程時には、嫌気的から好気的条件へ、又は好気的から嫌気的／微好気的条件への変更が必要である。
【０１１０】
細胞外生合成産物としては、例えば、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、微生物油（例えば、N、P、S、Feなどの飢餓条件下で生産されるもの）、イソプレノイド（例えば、Nの飢餓条件下で生産されるもの）、エタノール、酢酸、酪酸、コハク酸、乳酸、プロピオン酸、リンゴ酸、フマル酸、ピルビン酸、n‐ブタノール、イソブタノール、1,3‐プロパンジオール、1,4‐ブタンジオール、ABE又はIBE発酵（二段階過程であり、好適なものである。）クエン酸（例えば、Feの飢餓条件下で生産されるもの）、アミノ酸、グルタミン酸（例えば、栄養欠乏及び低ビオチン条件下のもの）、酢（エタノールから生産される酢酸）、3‐ヒドロキシプロピオン酸（HPA）、3‐ヒドロキシ酪酸、2,3‐ブタンジオール、イソプロパノール、L‐イソプロパノール、イタコン酸（例えば、Pの飢餓条件下で生産されるもの）、グルコン酸、アジピン酸、微生物脂質、イタコン酸（Iitaconic acid）、酵素、抗生物質、脂肪酸誘導体、テルペノイド、炭化水素、ヒドロキシアルカン酸（とその誘導体）、イソブテン、及びリボフラビンなどのビタミン類が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
炭素源は、増殖フェーズ時の糖、及び産物生成ステップ時の油であり得る。炭素源は、糖（例えば、糖蜜又はリグノセルロース由来の糖）、脂肪又は油又は脂質（例えば、ワックス、ワックスエステル、ステロール、テルペノイド、イソプレノイド、カロテノイド、ポリヒドロキシアルカノエート、核酸、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪酸エステル、脂肪アミン、中鎖及び長鎖ジカルボン酸、エポキシ脂肪酸、長鎖ジオール及びポリオール、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、又はアシルグリセロール、例えば、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はモノアシルグリセロール、ガス（例えば、合成ガス）、及びこれらの組合せからなる群より選択することができる。ただし、本発明に適切な炭素源は、上述の群に限定されない。本発明の方法の種々のステップにおいて、炭素源は、他の方法のステップに用いられる他の炭素源から独立して選択することができる。
【０１１２】
一実施形態において、炭素源は気体である。この技術革新による利点は、産物生成フェーズにおいて高い細胞密度を有することによって、気相からの炭素源の取り込み割合が向上し、このため、発酵におけるガス中の残留炭素源濃度が低いことである。また、これによって、供給炭素源に対する産物の全体的な収率も向上する。
【０１１３】
二次代謝による生合成産物の生成は、本発明の方法によって達成され得る。このような産物は、通常、後期指数増殖期又は定常増殖期に生成し、例えば、酵素（誘導が必要である。）、抗生物質、脂肪酸誘導体、イソプレノイド、テルペノイドなど、炭化水素、ヒドロキシアルカン酸（とその誘導体、イソブテン、気体生成物）、及びリボフラビンなどのビタミン類からなる一覧より選択されてもよい。
【０１１４】
本発明の一部の実施形態において、生合成産物は、長鎖二酸、ヒドロキシル脂肪酸、長鎖ジオール、脂肪、油、ワックス、ファルネセン型生成物、ワックスエステル、ステロール、テルペノイド、イソプレノイド、カロテノイド、ポリヒドロキシアルカノエート、核酸、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪酸エステル、脂肪アミン、中鎖及び長鎖ジカルボン酸、エポキシ脂肪酸、長鎖ジオール及びポリオール、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、並びにアシルグリセロール、例えば、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はモノアシルグリセロールからなる一覧より選択される、１種以上の脂質である。このような化合物を生産することが可能な微生物は、当技術分野において周知である。本発明は、これらの種類の化合物を効果的に生産する好都合な方法を用いることができる、費用効果的なバイオリアクター設備を提供する。
【０１１５】
また、本発明は、連続連結バイオリアクター又はバイオリアクターシステムのカスケードであって、少なくとも２つの連続連結バイオリアクターと、一連のバイオリアクターの２つの連続連結バイオリアクターの間に、そして、これらと並んで又はこれらに接続するように配置された１つ以上の細胞濃縮装置と、を備えたカスケードも提供する。このようなバイオリアクターは、生合成産物の好気的生産についての特定の実施形態において、撹拌及び通気手段を有するか、又はエアリフトバイオリアクターであり得る。発酵が嫌気的である、一部の特定の実施形態では、撹拌型バイオリアクター、又は細胞を振盪するのにエアリフトを用いないバイオリアクターを利用することができる。発酵が嫌気的であり、そして炭素源が気体である、一部の他の特定の実施形態では、エアリフト型バイオリアクター（例えば、気泡塔）を利用することができる。
【０１１６】
本発明の一部の実施形態において、１つ以上の細胞濃縮装置は、一連のバイオリアクターの２つの連続連結バイオリアクターの間に、そしてこれらとそれぞれ並んで配置される。
【０１１７】
本発明の一部の実施形態では、一連の、少なくとも３つの連続連結バイオリアクターが提供される。このようなバイオリアクター設備は、細胞を、少なくとも３つの異なる培養条件にさらすことができ、そして、バイオリアクターを連続的に、又は流加方式により運転させることができる。このことは、細胞が、例えば、個々のバイオリアクターにおける指数増殖、後期指数増殖及び生産についての条件に供されてもよいことを意味する。
【０１１８】
本発明の一部の実施形態では、一連の、少なくとも４つの連続連結バイオリアクターが提供される。このようなバイオリアクター設備は、バイオリアクターを連続的に運転させる場合、細胞を、少なくとも４つの異なる培養条件にさらすことができる。このことは、細胞が、指数増殖、後期指数増殖生産及び生産についての条件に供されてもよいことを意味する。
【０１１９】
一部の実施形態において、本発明は、次の図１（実施形態Ａ）及び図２（実施形態Ｂ）に示されているステップを含む、生合成産物の生産方法を提供する。
【０１２０】
実施形態Ａ：互いに連続的に連結された手段のカスケードを含む、微生物産物又は生合成産物の生産方法であって、第１の手段が、kの数の並列バイオマス生産リアクターと、この後に、mの数の第１の並列産物生成リアクターと、そして、この後に、nの数の第２の並列産物生成リアクターと、を備え、第１の産物生成リアクターは、１つ以上の濃縮装置であって、第１の生産リアクターから微生物を豊富に含んだ画分及び微生物の少ない画分を抽出して、微生物を豊富に含んだ画分を第１の産物生成リアクターに再循環させるように配置された濃縮装置に接続されているか又は濃縮装置と流れ接続している方法。
【０１２１】
実施形態Ａ．１：実施形態Ａに係る方法であって、Kが1-xであり、例えば1〜50のうちのいずれか１つ、例えば1〜25のうちのいずれか１つ、例えば1〜10のうちのいずれか１つ、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のうちのいずれか１つである方法。
【０１２２】
実施形態Ａ．２：実施形態Ａ又はＡ．１に係る方法であって、mが1-yであり、例えば1〜50のうちのいずれか１つ、例えば1〜25のうちのいずれか１つ、例えば1〜10のうちのいずれか１つ、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のうちのいずれか１つである方法。
【０１２３】
実施形態Ａ．３：実施形態Ａ、Ａ．１又はＡ．２に係る方法であって、nが0-ｚであり、例えば0〜50のうちのいずれか１つ、例えば1〜25のうちのいずれか１つ、例えば1〜10のうちのいずれか１つ、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のうちのいずれか１つである方法。
【０１２４】
実施形態Ａ．４：実施形態Ａ、Ａ．１、Ａ．２又はＡ．３のうちのいずれか１つに係る方法であって、バイオリアクターk、m及びnへの個々の供給原料が、同じ組成である方法。
【０１２５】
実施形態Ａ．５：実施形態Ａ、Ａ．１、Ａ．２又はＡ．３のうちのいずれか１つに係る方法であって、バイオリアクターk、m及びnへの個々の供給原料が、異なる組成である方法。
【０１２６】
実施形態Ｂ：手段のカスケードを含む、微生物産物又は生合成産物の生産方法であって、第１の手段が、kの数の並列バイオマス生産リアクターと、この後に、mの数の第１の産物生成リアクターと、そして、この後に、nの数の第２の産物生成リアクターと、を備え、１つ以上の濃縮装置が、バイオマス生産リアクターから微生物を豊富に含んだ画分及び微生物の少ない画分を抽出して、微生物を豊富に含んだ画分を第１の産物生成リアクターに送るように、バイオマス生産リアクターと第１の産物生成リアクターとの間に配置される方法。
【０１２７】
実施形態Ｂ．１：実施形態Ｂに係る方法であって、Kが1-xであり、例えば1〜50のうちのいずれか１つ、例えば1〜25のうちのいずれか１つ、例えば1〜10のうちのいずれか１つ、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のうちのいずれか１つである方法。
【０１２８】
実施形態Ｂ．２：実施形態Ｂ又はＢ．１に係る方法であって、mが1-yであり、例えば1〜50のうちのいずれか１つ、例えば1〜25のうちのいずれか１つ、例えば1〜10のうちのいずれか１つ、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のうちのいずれか１つである方法。
【０１２９】
実施形態Ｂ．３：実施形態Ｂ、Ｂ．１又はＢ．２に係る方法であって、nが0-ｚであり、例えば0〜50のうちのいずれか１つ、例えば0〜25のうちのいずれか１つ、例えば0〜10のうちのいずれか１つ、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のうちのいずれか１つである方法。
【０１３０】
実施形態Ｂ．４：実施形態Ｂ、Ｂ．１、Ｂ．２又はＢ．３のうちのいずれか１つに係る方法であって、バイオリアクターk、m及びnへの個々の供給原料が、同じ組成である方法。
【０１３１】
実施形態Ｂ．５：実施形態Ｂ、Ｂ．１、Ｂ．２又はＢ．３のうちのいずれか１つに係る方法であって、バイオリアクターk、m及びnへの個々の供給原料が、異なる組成である方法。
【０１３２】
実施形態Ａ〜Ｂ５のうちのいずれか１つに係る一部の実施形態において、第１の増殖ステップは指数増殖に最適化され、第２の増殖ステップは後期指数増殖に最適化される。
【０１３３】
実施形態Ａ〜Ｂ５のうちのいずれか１つに係る一部の実施形態において、第１の産物生成ステップは、生合成産物を生産するためのものであり、そして、第２の産物生成ステップは、栄養飢餓下で生合成産物を生産するためのものである。
【０１３４】
実施形態Ａ〜Ｂ５のうちのいずれか１つに係る一部の実施形態において、増殖に関する微生物細胞の状態は、栄養素、pH、温度、細胞密度、阻害性代謝老廃物の量、炭素源の利用可能性、培地中の酸素含有量（好気性リアクターの場合）、振盪、圧力、流速、希釈率、撹拌、入口、出口及び酸化還元電位のうちの１つ以上によって制御される。
【０１３５】
実施形態Ａ〜Ｂ５のうちのいずれか１つに係る一部の実施形態において、生合成産物の生産に関する微生物細胞の状態は、栄養素、pH、温度、細胞密度、阻害性代謝老廃物の量、炭素源の利用可能性、培地中の酸素含有量（好気性リアクターの場合）、生産誘導因子、振盪、圧力、流速、希釈率、撹拌、入口、出口及び酸化還元電位のうちの１つ以上によって制御される。
【０１３６】
一部の実施形態において、本発明は、微生物油の生産に用いられる。これは、次のものに例示されている。
【０１３７】
培養は、空気が供給されるあらゆる種類のバイオリアクター、例えば、撹拌タンクバイオリアクター又はエアリフトバイオリアクターにおいて行われる。バイオリアクターの種類は、過程の要件に基づいて最適化することができ、種々のバイオリアクターの種類を、１つのカスケードにおいて用いることができる。通常、バイオマス生産フェーズ（カスケード又はバイオマス生産リアクターの第１のバイオリアクター）は、最も高い酸素移動速度が必要であるが、油生産フェーズでは、高い酸素移動速度は必要ではない。本発明の一実施形態によれば、エアリフトバイオリアクターは、カスケードにおいて用いられる。本発明の別の実施形態によれば、撹拌タンクバイオリアクターとエアリフトバイオリアクターはともに、カスケードにおいて用いることができる。
【０１３８】
特定の実施形態において、バイオリアクターシステムは、少なくとも２つのバイオリアクターを備え、これらのバイオリアクターは、カスケード、及び、微生物油を生産するバイオマス増殖フェーズと油生産フェーズとの間に計画される細胞濃縮ステップ（図３を参照）において用いられる。または、濃縮手段を生産リアクターの後に配置してもよく、この場合、細胞濃縮物は生産リアクターに戻される（図４）。特定の実施形態において、バイオリアクターシステムは、少なくとも３つのバイオリアクター、更に具体的には、少なくとも４つのバイオリアクターを備え、これらのバイオリアクターは、次のような設備によってカスケードにおいて用いられ、連続方式により操作される（図５）。微生物油を生産する例示的な培養過程でのカスケードにおける４つのバイオリアクターを備えた種々のバイオリアクターの操作を、さらに、以下に説明する。
【０１３９】
バイオリアクター１（カスケードの第１のバイオリアクター）は、微生物バイオマスを培養するのに用いられ、バイオマスを効果的に増殖させることができる、適切な量の栄養素を含有する培養培地が供給される。このため、バイオリアクター１は、増殖曲線の最大増殖期において操作される。バイオリアクター内の細胞濃度は、少なくとも10 g/l、具体的には少なくとも20 g/l、更に具体的には少なくとも40 g/lである。バイオリアクター１内の微生物バイオマスの脂質含有量は、通常、細胞乾燥重量の20%未満である。どの微生物が用いられるかに応じて、培地中には異なる栄養素含有量が含まれていてもよく、例えば、通常、窒素に対する炭素の比が100未満である。
【０１４０】
第１のバイオリアクターの後に、細胞濃縮、例えば、遠心分離、デカンテーション又はろ過が行われ、その結果、（重量%、g/l、cfu（コロニー形成単位）により、又は吸光度によって測定した場合の）少なくとも50%、具体的には少なくとも100%、例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%のうちのいずれか１つ、又は具体的には少なくとも100%の混合物から開始したバイオリアクター内のバイオマス濃度と比較して、バイオマス濃度が増加する。
【０１４１】
バイオリアクター２（第２のバイオリアクター）の目的は、微生物の栄養飢餓及び脂質生産を誘導することである。このため、バイオリアクターは、増殖曲線の後期対数期において操作される。具体的には、バイオリアクター２は、微生物によって窒素（又は、P、Fe若しくはSなどの他の栄養素）が消費されるように操作される。バイオリアクター２内のバイオマス濃度は、具体的には少なくとも30 g/L、更に具体的には少なくとも60 g/L、更に具体的には少なくとも80 g/Lである。バイオリアクター２内の微生物バイオマスの脂質含有量は、通常、細胞乾燥重量の20%未満である。
【０１４２】
バイオリアクター３（第３のバイオリアクター）の目的は、二次代謝において油を生産することである。バイオリアクターは、増殖曲線の定常増殖期において操作される。具体的には、バイオリアクター３は、効果的な脂質生産を達成するように、窒素（又は、P、Fe若しくはSなどの他の栄養素）の飢餓状態下で操作される。バイオリアクター３内のバイオマス濃度は、具体的には少なくとも50 g/l、更に具体的には少なくとも80 g/l、更に具体的には少なくとも120 g/lである。バイオリアクター３内の微生物バイオマスの脂質含有量は、通常、細胞乾燥重量の30%、具体的には少なくとも40%である。
【０１４３】
バイオリアクター４（第４のバイオリアクター）の目的は、油を生産し、増殖培地から残留糖を消費することである。バイオリアクターは、増殖曲線の（後期）定常増殖期において操作される。具体的には、バイオリアクター４は、窒素（又は、P、Fe若しくはSなどの他の栄養素）の飢餓状態下で操作され、炭素源の添加が最小限に抑えられ、すなわち、バイオリアクター４は、炭素源の限界付近において運転する。特に、増殖培地に混合糖が含まれる場合、微生物が利用することが更に困難な炭素成分は、最後のバイオリアクターにおいて利用される。
【０１４４】
バイオリアクター４は、微生物に好まれない糖を含む残留糖を微生物が利用できることによって、糖損失を最小限にするのに用いられる。バイオリアクター３内のバイオマス濃度は、具体的には少なくとも60 g/l、更に具体的には少なくとも100 g/l、更に具体的には少なくとも150 g/lである。バイオリアクター４内の微生物バイオマスの脂質含有量は、通常、細胞乾燥重量の30%超、具体的には細胞乾燥重量の少なくとも40%、更に具体的には少なくとも50%、更に具体的には少なくとも60%である。
【０１４５】
バイオリアクター４の後に、微生物細胞は微生物培養物から回収され、生合成産物（例えば、微生物の脂質）が回収される。生合成産物が微生物脂質である場合、本発明による培養にわたって（全過程にわたって）算出された全脂質生産性は、少なくとも0.3 g/(l*h)、具体的には少なくとも0.5 g/(l*h)、更に具体的には少なくとも1.0 g/(l*h)、更に具体的には少なくとも1.5 g/(l*h)、更に具体的には少なくとも2.0 g/(l*h)、更に具体的には少なくとも2.5 g/(l*h)である。
【０１４６】
本発明の実施形態を説明する場合、すべての考えられる実施形態の組合せ及び置換は、明示的に説明されていない。しかしながら、特定の手段が相互に異なる従属請求項に記載されているか、又は異なる実施形態に説明されているという事実のみでは、これらの手段の組合せを好適に用いることができないことを示すわけではない。本発明は、説明されている実施形態のすべての考えられる組合せ及び置換を想定する。
【０１４７】
本明細書の「含む（comprising）」、「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」という用語は、それぞれの場合において、本発明者らが、場合により、それぞれ「〜からなる（consisting of）」、「〜からなる（consist of）」及び「〜からなる（consists of）」という用語に置き換え可能であるものとする。
【０１４８】
実施例
実施例１‐ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）、流加培養における脂質生産
ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）CBS 9465株を、微生物油を生産するために、グルコース流加培養により10 l規模のバイオリアクター内で培養した。
【０１４９】
接種菌液を作製するために、（水1リットル当たり）グルコース40 g、酵母エキス5 g、(NH4)2SO42.5 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4×7H2O 1.0 g、CaCl2・2H2O 0.1 gからなる前培養培地を調製した。培地を50 mlのバッチに分け、121℃で15分間、オートクレーブによって滅菌した。前培養培地に1%の接種菌液を接種し、これを、30℃の温度で18時間インキュベートした。
【０１５０】
培養培地は、水1リットル当たり、グルコース40 g、酵母エキス8 g、(NH4)2SO43.5 g、KH2PO4 7 g、MgSO4・7H2O 2.5 g、CaCl2・2H2O 0.1 g、ZnSO4・7H2O 0.0008 g、CuCl2・2H2O 0.00008 g、MnSO4・H2O 0.0008 g、FeSO4 0.0004 g、及びNaHPO4 0.5 gから構成されていた。培地を121℃で15分間、その場で滅菌した（in situ sterilized）。
【０１５１】
培養培地に10%の接種菌液を接種し、接種後の出発容量は8 lであった。培養は、30℃の温度において行った。培養時に、3M NaOHを用いて調整することによって、pHを6に維持した。通気速度は1 vvmであり、そして、pO2（溶存酸素）を、最大1000 rpmの振盪速度を有する振盪カスケードを用いて、20%以上に維持した。消泡剤としてストラクトール（Struktol）J647を用い、これを、培養全体にわたって周期的に瞬時に加えた（pulsed）。２３時間培養後に、さらに、培養培地に4 g/lの酵母エキスを加えた。培養時に、54%グルコース溶液を培養物に供給して、グルコース濃度を5〜60 g/lに維持した。全培養時間は、95時間であった。
【０１５２】
95時間の培養時に、61%の脂質含有量（乾燥重量当たり）を有する全85 g/lのバイオマスが生成し、培養終了時の全容積測定脂質生産性（overall volumetric lipid productivity）は、0.54 g/(lh)であった。58%の脂質を含有する75 g/lの細胞乾燥重量含有量を、76.5時間インキュベーションした後に、0.56 g/(lh)の最大容積測定脂質生産性に達した。
【０１５３】
実施例２‐ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）、中間濃縮を含む二段階流加培養における脂質生産
ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）CBS 9465株を、微生物油を生産するために、中間濃縮を含む二段階グルコース流加培養により培養した。
【０１５４】
接種菌液を作製するために、（水1リットル当たり）グルコース40 g、酵母エキス5 g、(NH4)2SO42.5 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4・7H2O 1.0 g、CaCl2・2H2O 0.1 gからなる培養培地を調製した。培地を50 mlのバッチに分け、121℃で15分間、オートクレーブによって滅菌した。前培養培地に1%の接種菌液を接種し、これを、30℃の温度で18時間インキュベートした。
【０１５５】
バイオマス生産ステップの培養培地は、（水道水1リットル当たり）グルコース40 g、酵母エキス8 g、(NH4)2SO42.5 g、MgSO4・7H2O 1.5 g、KH2PO4 5.0 g、CaCl2・2H2O 0.1 gから構成されていた。培地を121℃で15分間、その場で滅菌した。滅菌後、エタノール中に懸濁させたクロラムフェニコールを培地に加え、クロラムフェニコール濃度を0.1 g/lにした。
【０１５６】
十分なバイオリアクター容量を得るために、２つの並列バイオリアクターにおいてバイオマス生産を行った。バイオリアクターに10%の接種菌液を接種し、接種後の両バイオリアクターの出発容量は10 lであり、このため、バイオマス生産の全容量は20 lであった。バイオマス生産ステップ及び濃縮ステップの培養パラメータは、次のとおりであった。すなわち、温度は30℃であり、pHを、3M NaOHを用いて調整することによって6に維持し、通気速度は1 vvmであり、そして、pO2（溶存酸素）を、最大1000 rpmの振盪速度を有する撹拌カスケードを用いて、30%以上に維持した。54%グルコース溶液を培養物に供給して、グルコース濃度を5〜60 g/lに維持した。
【０１５７】
18時間培養後に、細胞濃縮ステップを開始した。バイオリアクターに接続されたクロスフローフィルタ（２つのDurapore 0.45 μmカセットを有するPellicon 2 Mini）を用いて、細胞を濃縮した。濃縮時に、並行培養物を１つのバイオリアクターに合わせた。濃縮時間は6時間であり、濃縮後の全培養物の量は7 lであった。
【０１５８】
濃縮ステップの後に、20 mlの水中7 gのMgSO4・7H2O、20 mlの水中21 gのKH2PO4、及び、600 mlの水中、硫酸アンモニウムとアミノ酸とを含まない34 gの酵母窒素ベースからなる補充栄養溶液を、バイオリアクターに加えた。
【０１５９】
濃縮ステップの後の培養パラメータは、次のとおりであった。すなわち、温度は30℃であり、pHを、3M NaOHを用いて調整することによって6に維持し、通気速度は1 vvmであり、そして、pO2を、最大1000 rpmの振盪速度を有する撹拌カスケードを用いて、20%以上に維持した。54%グルコース溶液又は乾燥グルコースを培養物に供給して、グルコース濃度を5〜60 g/lに維持した。この脂質生産フェーズを67時間続けた。培養終了時の培養物の量は、9.5 lであった。
【０１６０】
18時間のバイオマス生産ステップ後のバイオマス濃度は、29 g/lであった。濃縮ステップ時に、バイオマスを95 g/lの濃度まで濃縮した。濃縮後、バイオマス及び脂質生産を継続し、最終バイオマス濃度は148 g/lであり、そのうち42%が脂質であった。全脂質生産性は、0.60 g/(l*h)であった。バッチ培養と比較して、容積測定脂質生産性の7%の向上を達成した。
【０１６１】
実施例３‐ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）、中間濃縮を含む二段階流加培養における脂質生産
ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）CBS 9465株を、微生物油を生産するために、中間濃縮を含む二段階グルコース流加培養により培養した。
【０１６２】
接種菌液を作製するために、（水1リットル当たり）グルコース40 g、酵母エキス5 g、(NH4)2SO42.5 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4×7H2O 1.0 g、CaCl2・2H2O 0.1 gからなる培養培地を調製した。100 mlのバッチに分けた培地を、121℃で15分間、オートクレーブによって滅菌した。前培養培地に1%の接種菌液を接種し、これを、29℃の温度で18時間インキュベートした。
【０１６３】
バイオマス生産ステップの培養培地は、（水道水1リットル当たり）グルコース40 g、酵母エキス8 g、(NH4)2SO42.5 g、MgSO4・7H2O 1.5 g、KH2PO4 5.0 g、CaCl2・2H2O 0.1 gから構成されていた。培地を121℃で15分間、その場で滅菌した。滅菌後、エタノール中に懸濁させたクロラムフェニコールを培地に加え、クロラムフェニコール濃度を0.1 g/lにした。
【０１６４】
バイオマス生産は、15%の接種菌液を接種した後、4、10及び10Lの有効容量を有する３つの並列バイオリアクターにおいて同時に行った。このため、バイオマス生産の全容量は24 lであった。バイオマス生産ステップの培養パラメータは、次のとおりであった。すなわち、温度は29℃であり、pHを、3M NaOHを用いて調整することによって6に維持し、通気速度は1 vvmであり、そして、pO2を、最大1000 rpmの振盪速度を有する撹拌カスケードを用いて、30%以上に維持した。54%グルコース溶液を培養物に供給して、グルコース濃度を5〜60 g/lに維持した。
【０１６５】
26時間培養後に、細胞濃縮ステップを開始した。バイオリアクターに接続されたクロスフローフィルタ（３つのDurapore 0.45 μmカセットを有するPellicon 2 Mini）を用いて、細胞を濃縮した。濃縮ステップ時に、培養温度を20℃に維持した。濃縮時間は6時間であり、濃縮ステップ後に、１つの10Lバイオリアクターに合わせた全培養物の量は、6Lであった。
【０１６６】
濃縮ステップの後に、20 mlの水中7 gのMgSO4・7H2O、20 mlの水中21 gのKH2PO4、及び、600 mlの水中、硫酸アンモニウムとアミノ酸とを含まない34 gの酵母窒素ベースからなる補充栄養溶液を、バイオリアクターに加えた。
【０１６７】
濃縮ステップの後の培養パラメータは、次のとおりであった。すなわち、温度は29℃であり、pHを、3M NaOHを用いて調整することによって6に維持し、通気速度は1 vvmであり、そして、pO2を、最大1000 rpmの振盪速度を有する撹拌カスケードを用いて、20%以上に維持した。54%グルコース溶液又は乾燥グルコースを培養物に供給して、グルコース濃度を5〜60 g/lに維持した。この脂質生産フェーズを67.5時間続けた。培養終了時の培養物の量は、8.8 lであった。
【０１６８】
18時間のバイオマス生産ステップ後のバイオマス濃度は、29 g/lであった。濃縮ステップ時に、バイオマスを137 g/lの濃度まで濃縮した。濃縮後、バイオマス及び脂質生産を継続し、最終バイオマス濃度は189 g/lであり、そのうち69%が脂質であった。
【０１６９】
培養78時間後の最大生産性は、0.90 g/(l*h)であった。この方法により、バッチ培養と比較して、容積測定脂質生産性の38%の増加を達成した。
【０１７０】
実施例４‐ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）、二段階連続培養における脂質生産
ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）CBS 9465株を、微生物油を生産するために、二段階連続培養により培養した。
【０１７１】
培養に用いられる装置の全体的な図を図５に示す。培養培地を、培地滅菌タンク内のバッチとして調製し、これを、貯蔵のために培地タンクに移した。微生物細胞培養を、連続操作の開始前に細胞を増殖させるために、バイオマス生産バイオリアクターのバッチフェーズによって開始した。同様のバイオマス増殖は、油生産バイオリアクターでは行わなかった。
【０１７２】
適切な増殖時間の後、生合成産物生成のための連続培養を開始した。培地貯蔵タンクから培地を、バイオマス生産バイオリアクターに連続的に供給した。バイオマス生産バイオリアクターをオーバーフローモードにより操作し、培養物を、ディップチューブを介して前方に連続的に移した。
【０１７３】
デモンストレーションに用いられたバイオリアクターのサイズが非常に異なっていたため、油生産バイオリアクターにおいて目的とする希釈率を達成するように、バイオマス生産による培養物の一部のみを油生産の対象とした。バイオマス生産バイオリアクターの残りの培養物は、バイオマス廃棄物収集タンクに送られた。バイオマス生産バイオリアクターから連続的に移された培養物に加えて、50%グルコース溶液も、油生産バイオリアクターに連続的に加えた。バイオマス生産と同様に、油生産をオーバーフローモードにより操作し、培養物を、ディップチューブを介して収集タンクに連続的に移した。
【０１７４】
接種菌液を作製するために、（水1リットル当たり）40 gのグルコース、5 gの酵母エキス、2.5 gの(NH4)2SO4、0.83 gのMgCl2×6H2O、0.53 gのK2HPO4、1 gのKH2PO4、及び0.2 gのCaCl2×2H2Oからなる培養培地を調製した。培地成分を水道水中に溶解した。50 mlのバッチに分けた培地を、121℃で20分間、オートクレーブによって滅菌した。前培養培地に、ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）CBS 9465酵母の1%接種菌液を接種し、これを、250 rpmの振盪速度を用いオービタルシェーカーにおいて、30℃の温度で27時間、インキュベートした。
【０１７５】
バッチバイオマス増殖用の培養培地は、（水1リットル当たり）5 gの酵母エキス、2 gの(NH4)2SO4、2 gのMgCl2×6H2O、7 gのKH2PO4、0.4 gのCaCl2×2H2O、0.03 gのMnSO4×H2O、0.0003 gのZnSO4×7H2O、0.0002 gのCuCl×2H2O、0.0002 gのNa2MoO4・2H2O、及び0.2 gのストラクトールJ647から構成されていた。培地の量は、60 lであった。成分を水道水中に溶解し、培地を121℃で30分間、その場で滅菌した。滅菌後、6 kgの滅菌50%グルコースシロップを、培地に無菌的に加えた。油生産バイオリアクターに水を充填し、これを滅菌した。
【０１７６】
バイオマス増殖培地に1.7%の前培養物を接種した。バイオマス増殖の培養パラメータは、次のとおりであった。すなわち、温度は30℃であり、pHを、3M NH4OHを用いて調整することによって5.5に維持し、通気速度は1.2 vvmであり、そして、振盪速度は200 rpmであった。
【０１７７】
バイオマス生産バイオリアクターにおける21時間の細胞増殖後、連続的な二段階培養は、培地貯蔵タンクからバイオマス生産バイオリアクターへ培地供給を開始し、バイオマス生産バイオリアクターから油生産バイオリアクター及び収集タンクへ培養物を移し、油生産バイオリアクターから収集タンクへバイオマスを移し、そして、油生産バイオリアクターにグルコースを供給することによって開始した。
【０１７８】
連続操作時にバイオマス生産バイオリアクターに供給される培養培地は、（水1リットル当たり）54.5 gのグルコース、8 gの酵母エキス、7 gのKH2PO4、1.5 g（又は1.8 g）のMgCl2×6H2O（又はMgSO4×7H2O）、0.5 gの(NH4)2SO4、0.03 gのMnSO4×H2O（又はMnCl2×4H2O）、0.0005 gのZnSO4×7H2O、0.0002gのCuCl×2H2O、0.0002 gのNa2MoO4・2H2O、0.002 gのFeSO4・7H2O、0.1 gのクロラムフェニコール、0.0125.10〜3 gのビオチン、0.00125 gのチアミンHCl、0.00025 gのビタミンB12、0.00125 gのパントテン酸、及び0.06〜0.18 gのストラクトールJ647から構成されていた。アンモニア塩及びマグネシウム塩を除いて、全無機物、グルコース、酵母エキス及びストラクトールを水道水中に溶解し、培地ベースを、121℃で30分間、培地滅菌タンク内でその場で滅菌し、培地ベースを生成した。アンモニウム塩及びマグネシウム塩の別々の原液を調製した。溶液を、121℃で20分間、オートクレーブによって滅菌し、これを、滅菌した培地ベースに無菌的に加えた。ビタミン類をMQ水中に溶解し、滅菌ろ過し、これを、滅菌した培地ベースに無菌的に加えた。クロラムフェニコールをエタノール中に溶解し、これを、滅菌した培地ベースに無菌的に加えた。
【０１７９】
連続操作時のバイオマス生産の培養パラメータは、次のとおりであった。バイオマス生産バイオリアクターへの流速は11 l/h（希釈率0.21 h-1）であり、温度は29〜30℃であり、pHを、3M NH4OHを用いて5.0に調整し、そして、自動的及び周期的な手動消泡剤添加物（ストラクトールJ647）によって、発泡を制御した。培養時に、振盪、通気及び圧力を手動で調整することによって、pO2飽和を1%以上に維持した。振盪速度は200〜460 rpmであり、通気は70〜80 l/分であり、そして、過剰圧力は0〜250 mbarであった。培養活性量（Cultivation active volume）は、52 kgであった。
【０１８０】
連続操作時の油生産の培養パラメータは、次のとおりであった。希釈率0.04 h-1（グルコース添加を含まないバイオマス生産ステップからの供給原料のみを含み、バイオマス生産の100 mlのオーバーフローを、15分ごとに油生産バイオリアクターに供給した。）容量はおよそ9 lであり、温度は29〜30℃であり、pHを、3M NaOHを用いて4.0に調整し、そして、自動的及び周期的な手動消泡剤添加物（ストラクトールJ647）によって、発泡を制御した。培養時に、振盪及び通気を手動で調整することによって、pO2飽和を5〜20%に維持した。振盪速度は450〜590 rpmであり、通気は8 l/分であった。油生産培養物に、滅菌50%グルコース溶液を供給して、グルコース濃度を5〜60 g/lに維持した。
【０１８１】
油生産性を、希釈率に基づいて算出した。
【０１８２】
バイオマス生産において、バイオリアクターのバイオマス濃度は、連続培養時に18から21 g/lの間で変化した。油生産バイオリアクターでは、バイオマス濃度は48〜58 g/lであり、バイオマスの油含有量は、31から40%の間のCDWで変化した。145時間の連続操作における平均全微生物油生産性は、0.98 g/(l*h)であった。
【０１８３】
実施例５‐ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）、中間濃縮を含む二段階連続培養における脂質生産
培養培地を、培地滅菌タンク内のバッチとして調製し、これを、貯蔵のために培地タンクに移した。微生物培養を、連続操作の開始前に細胞を増殖させるために、バイオマス生産バイオリアクターのバッチフェーズによって開始した。同様のバイオマス増殖は、油生産バイオリアクターでは行わなかった。
【０１８４】
適切な増殖時間の後、連続培養を開始した。培地貯蔵タンクから培地を、バイオマス生産バイオリアクターに連続的に供給した。バイオマス生産バイオリアクターをオーバーフローモードにより操作し、培養物を、ディップチューブを介して前方に連続的に移した。
【０１８５】
デモンストレーションに用いられたバイオリアクターのサイズが非常に異なっていたため、油生産バイオリアクターにおいて目的とする希釈率を達成するように、バイオマス生産による培養物の一部のみを油生産の対象とした。バイオマス生産バイオリアクターの残りの培養物は、バイオマス廃棄物収集タンクに送られた。連続操作時に、油生産バイオリアクターにも、グルコース溶液を連続的に供給した。供給速度は、糖消費に依存していた。バイオマス生産と同様に、油生産をオーバーフローモードにより操作し、培養物を、ディップチューブを介して収集タンクに連続的に移した。
【０１８６】
連続操作開始後、バイオマスの中間濃縮を開始した。油生産バイオリアクターに膜ろ過ユニットを接続した。油生産バイオリアクターからの培養物を、ポンプによって膜フィルタに送り出し、残余分をバイオリアクターに循環させ、バイオリアクターの連続操作を維持しながら、浸透物を収集タンクに移した。
【０１８７】
実験室接種菌液作製用の培養培地は、（水1リットル当たり）40 gのグルコース、5 gの酵母エキス、2.5 gの(NH4)2SO4、0.83 gのMgCl2×6H2O、0.53 gのK2HPO4、1 gのKH2PO4、及び0.2 gのCaCl2×2H2Oから構成されていた。培地成分を水道水中に溶解した。50 mlのバッチに分けた培地を、121℃で20分間、オートクレーブによって滅菌した。前培養培地に、ロドスポリジウム・フルビアレ（Rhodosporidium fluviale）CBS 9465酵母の1%接種菌液を接種し、これを、250 rpmの振盪速度を用いオービタルシェーカーにおいて、29℃の温度で26時間、インキュベートした。
【０１８８】
細胞増殖培養用及び産物生成を開始する連続培養用の培養培地は、60 gのグルコース、5 gの酵母エキス、4.6 gのKH2PO4、0.03 gのMnSO4×H2O、0.08 gのCaCl2×2H2O、0.0008 gのZnSO4×7H2O、0.00025 gのCuCl×2H2O、0.0002 gのNa2MoO4×2H2O、0.0024 gのFeSO4×7H2O、0.19 gのストラクトール、0.5 gの(NH4)2SO4、0.5 gのMgSO4×7H2O、0.8 gのMgCl2×6H2O、0.1 gのクロラムフェニコール、0.0000125 gのビオチン、0.00125 gのチアミンHCl、0.00025 gのビタミンB12、0.00125 gのパントテン酸から構成されていた。アンモニア塩及びマグネシウム塩を除いて、全無機物、グルコース、酵母エキス及びストラクトールを水道水中に溶解し、培地ベースを、121℃で30分間、その場で滅菌し、培地ベースを生成した。アンモニウム塩及びマグネシウム塩の別々の原液を調製した。溶液を、121℃で20分間、オートクレーブによって滅菌し、これを、滅菌した培地ベースに無菌的に加えた。ビタミン類をMQ水中に溶解し、滅菌ろ過し、これを、滅菌した培地ベースに無菌的に加えた。クロラムフェニコールをエタノール中に溶解し、これを、滅菌した培地ベースに無菌的に加えた。油生産バイオリアクターに水を充填し、滅菌した。
【０１８９】
バイオマス増殖培地に、1.4%の前培養物を接種した。培養物の有効容量は、70 lであった。バイオマス増殖培養の培養パラメータは、次のとおりであった。すなわち、温度は29℃であり、pHを、3M NH4OHを用いて調整することによって5.5に維持し、通気速度は1 vvmであり、そして、振盪速度は250 rpmであった。
【０１９０】
バイオマス生産バイオリアクターにおける21時間の細胞増殖後、連続的な二段階発酵は、培地貯蔵タンクからバイオマス生産バイオリアクターへ培地供給を開始し、バイオマス生産バイオリアクターから油生産バイオリアクター及び収集タンクへ培養物を移し、油生産バイオリアクターから収集タンクへバイオマスを移し、そして、油生産バイオリアクターにグルコースを供給することによって開始した。
【０１９１】
連続培養の開始後、培養培地は、（水1リットル当たり）70 gのグルコース、8 gの酵母エキス、7 gのKH2PO4、0.03 gのMnSO4×H2O、0.08 gのCaCl2×2H2O、0.0008 gのZnSO4×7H2O、0.00025 gのCuCl×2H2O、0.0002 gのNa2MoO4×2H2O、0.0024 gのFeSO4×7H2O、0.19〜0.38 gのストラクトール、0.5 gの(NH4)2SO4、0.06〜1.47 gのMgSO4×7H2O、0〜1.16 gのMgCl2×6H2O、0.1 gのクロラムフェニコール、0.0000125 gのビオチン、0.00125 gのチアミンHCl、0.00025 gのビタミンB12、0.00125 gのパントテン酸から構成されていた。培地の調製は、前培養培地の調製と同様であった。
【０１９２】
連続操作時のバイオマス生産の培養パラメータは、次のとおりであった。連続操作時に、バイオマス生産バイオリアクターへの流速は、14.3 l/hであった。温度は29℃であり、pHを、3M NH4OHを用いて5.0に調整し、そして、自動的及び周期的な手動消泡剤添加物（ストラクトールJ647）によって、発泡を制御した。培養時に、振盪、通気及び圧力を手動で調整することによって、pO2飽和を20%以上に維持した。振盪速度は200〜400 rpmであり、通気は65〜70 l/分であり、そして、過剰圧力は22〜178 mbarであった。培養活性量は、34から66 kgの間で変化した。
【０１９３】
連続操作時の油生産の培養パラメータは、次のとおりであった。希釈率は0〜0.13 h-1であり、活性培養量はおよそ7.6 lであり、温度は29℃であり、そして、自動的及び周期的な手動消泡剤添加物（ストラクトールJ647）によって、発泡を制御した。培養時に、振盪及び通気を手動で調整することによって、pO2飽和を5〜30%に維持した。振盪速度は150〜830 rpmであり、通気速度は6〜8 l/分であった。油生産培養には、滅菌40%グルコース溶液を連続的に供給して、グルコース濃度を10〜60 g/lに維持した。
【０１９４】
165時間の培養後に、油生産バイオリアクターにおける濃縮ステップを開始した。油生産バイオリアクターに、膜ろ過ユニット（３つのMillipore Durapore 0.45μmカセットを有するPellicon 2 Mini）を接続した。油生産バイオリアクターからの培養物を、ポンプによって膜フィルタに送り出し、残余分をバイオリアクターに循環させ、バイオリアクターの連続操作を維持しながら、浸透物を収集タンクに移した。供給流速は、濃縮性能に基づいて調整した。希釈率は、0から0.13 h-1の間で変化させた。周期的に、ろ過ユニットを、洗浄及びメンテナンスのために、バイオリアクターシステムから外した。
【０１９５】
油生産性は、希釈率に基づいて算出した。
【０１９６】
バイオマス生産において、バイオリアクターのバイオマス濃度は、連続培養時に19から36 g/lの間で変化した。同様に、油生産バイオリアクターでは、バイオマス濃度は、42から85 g/lの間で変化し、バイオマスの油含有量は、32から45%の間のCDWで変化した。ろ過システムが周期的にメンテナンスによりシステムから分離されたため、純粋な定常状態の操作は達成されなかった。しかしながら、平均して、システムを、中間濃縮を伴って316時間操作した場合、脂質生産性は1.15 g/(l*h)であった。平均時間には停止時間が含まれ、これは、例えば、フィルタユニットのメンテナンスによるものであった。停止時間を無視すると、平均全脂質生産性は1.22 g/(l*h）であった。これは、中間濃縮を含まない二段階連続培養と比較して、20%の生産性の増加であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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