(57)【要約】  本発明は、障害を処置するのに有用であり、多重遺伝子発現ベクターの導入による療法に適した組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、心臓障害の処置のためのポリペプチドをコードするベクターおよびポリヌクレオチドを提供し、前記ポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、および／または血管新生ポリペプチド、またはそれらの機能性誘導体を含み得る。本発明の組成物として、機能性（生物学的に活性な）ポリペプチドを結合し、それを単一の多重遺伝子発現構築物から発現させるのに有用なリンカーもまた、提供される。
2018536405.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１００カルシウム結合タンパク質（Ｓ１００）ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドであって、前記第２の機能性ポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、血管新生ポリペプチド、およびそれらの任意の機能性誘導体のうちの少なくとも１つである、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記Ｓ１００ポリペプチドが、Ｓ１００Ａ１、その断片またはバリアントである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記第２の機能性ポリペプチドが、血管新生ポリペプチドである、請求項１から２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記血管新生ポリペプチドが、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチドである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６、それらの断片およびバリアントからなる群から選択される、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１６５の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項４から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１９１の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項４から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記第２の機能性ポリペプチドが、ケモカインである、請求項１から２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ケモカインが、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ）ポリペプチドである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ＳＤＦポリペプチドが、ＳＤＦ１、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、それらの断片およびバリアントからなる群から選択される、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＳＤＦポリペプチドが、ＳＤＦ１の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項９から１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記Ｓ１００ポリペプチドが、第１のポリペプチドリンカーによって前記第２のポリペプチドに結合される、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチド構築物が、第３の機能性ポリペプチドをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記第３の機能性ポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、血管新生ポリペプチド、およびそれらの任意の機能性誘導体のうちの少なくとも１つである、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記第３の機能性ポリペプチドが、血管新生ポリペプチドである、請求項１４から１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記血管新生ポリペプチドが、ＶＥＧＦポリペプチドである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６、およびそれらの断片またはバリアントからなる群から選択される、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１６５の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項１７から１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１９１の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項１７から１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記第３の機能性ポリペプチドが、ケモカインである、請求項１４から１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ケモカインが、ＳＤＦポリペプチドである、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記ＳＤＦポリペプチドが、ＳＤＦ１、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、それらの断片およびバリアントからなる群から選択される、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記ＳＤＦポリペプチドが、ＳＤＦ１の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項２２から２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記第３の機能性ポリペプチドが、任意選択で切断可能である第２のポリペプチドリンカーによって、前記Ｓ１００ポリペプチドおよび前記第２の機能性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに結合される、請求項１４から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記第１および第２のポリペプチドリンカーが、ｆｐ２ａ、ｐ２ａ、ＧＳＧ−ｐ２ａ、およびｆｍｄｖからなるリストから独立して選択される、請求項１２から２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項２９】
心臓状態を処置する方法であって、細胞を、治療有効量の請求項１から２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと接触させるステップを含む、方法。
【請求項３０】
前記細胞が、心筋細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
対象における心筋症を処置する方法であって、前記対象に、請求項１から２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を提供するステップを含む、方法。
【請求項３２】
前記対象が、ヒト対象である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、少なくとも１つの追加の療法によって処置される、請求項３１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項３５】
少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む少なくとも１つのポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドであって、
ｉ．前記第１のポリペプチドが、血管新生ポリペプチドであり、
ｉｉ．前記第２のポリペプチドが、ケモカインまたはそのバリアントもしくは断片である、ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記血管新生ポリペプチドが、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６、それらの断片およびバリアントからなる群から選択されるＶＥＧＦポリペプチドである、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１６５の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１９１の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記第２のポリペプチドが、ＳＤＦポリペプチドである、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記ＳＤＦポリペプチドが、ＳＤＦ１、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、それらの断片およびバリアントからなる群から選択される、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記ＳＤＦポリペプチドが、ＳＤＦ１の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項３９から４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
対象における血管発生を改善する方法であって、前記対象に、請求項３５から４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む治療有効量の組成物を提供するステップを含む、方法。
【請求項４３】
ＳＤＦ１ポリペプチド、Ｓ１００Ａ１ポリペプチド、ＶＥＧＦポリペプチド、ならびにそれらの断片およびバリアントから選択される少なくとも２つのポリペプチドに作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む発現ベクター。
【請求項４４】
前記少なくとも２つのポリペプチドが、リンカーによって結合される、請求項４３に記載の発現ベクター。
【請求項４５】
前記少なくとも１つのプロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター、ベータアクチンプロモーター、メタロチオニンプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ミオシン軽鎖プロモーター、ミオシン重鎖プロモーター、およびＮＣＸ１プロモーターからなる群から選択される、請求項４３から４４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項４６】
前記発現ベクターが、心臓発現ベクターである、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項４７】
少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むポリペプチド構築物であって、
ｉ．前記第１のポリペプチドが、カルシウム結合タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片であり、
ｉｉ．前記第２のポリペプチドが、血管新生ポリペプチド、ケモカイン、またはそれらのバリアントもしくは断片である、ポリペプチド構築物。
【請求項４８】
少なくとも第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドを含むポリペプチド構築物であって、
ｉ．前記第１のポリペプチドが、血管新生ポリペプチド、またはそのバリアントもしくは断片であり、
ｉｉ．前記第２のポリペプチドが、ケモカイン、またはそのバリアントもしくは断片であり、
ｉｉｉ．前記第３のポリペプチドが、カルシウム結合タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片である、ポリペプチド構築物。
【請求項４９】
Ｓ１００Ａ１、そのバリアントまたは断片を含む、請求項４７から４８のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項５０】
ＳＤＦ１、そのバリアントまたは断片を含む、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項５１】
ＶＥＧＦ、そのバリアントまたは断片を含む、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項５２】
少なくとも１つの受容体と複合体を形成した、請求項４７から５１のいずれか一項に記載の構築物を含む複合体。
【請求項５３】
請求項４７から５１のいずれか一項に記載の構築物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項５４】
対象における心筋症を処置する方法であって、前記対象に、請求項４７から５１のいずれか一項に記載の構築物を含む治療有効量の組成物を提供するステップを含む、方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの心細胞を、少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドと接触させるステップを含み、前記第１のポリペプチドが、血管新生ポリペプチド、そのバリアントまたは断片であり、前記第２のポリペプチドが、ケモカイン、カルシウム結合タンパク質、またはそれらのバリアントもしくは断片である、方法。
【請求項５６】
前記血管新生ポリペプチド、そのバリアントまたは断片が、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６、それらの断片およびバリアントからなる群から選択されるＶＥＧＦポリペプチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１６５の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５８】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１９１の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５９】
前記第２のポリペプチドが、ケモカインである、請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ケモカインが、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ）ポリペプチドである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＳＤＦポリペプチドが、ＳＤＦ１、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、それらの断片およびバリアントからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＳＤＦポリペプチドが、ＳＤＦ１の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項６０から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、エクスビボで導入される、請求項５５から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、インビボで導入される、請求項５５から６２７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記インビボでの導入が、経皮冠状動脈カテーテル法、冠状静脈遮断、心臓再循環、順行性冠状動脈注入、逆行性灌流、直接注射、超音波標的マイクロバブル破壊、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
少なくとも１つの追加の療法の投与をさらに含む、請求項５５から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
対象における血管発生を改善する方法であって、前記対象に、ＶＥＧＦポリペプチド、ならびにＳＤＦポリペプチドおよびＳ１００ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む構築物をコードする、ある量のポリヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項６８】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６、それらの断片およびバリアントからなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１６５の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＶＥＧＦポリペプチドが、ＶＥＧＦ１９１の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＳＤＦポリペプチドが、ＳＤＦ１、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、それらの断片およびバリアントからなる群から選択される、請求項６７から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ｓ１００ポリペプチドが、Ｓ１００Ａ１、その断片またはバリアントである、請求項６７から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象が心筋症を有する、請求項６７から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記心筋症が、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
対象における心血管状態を処置または予防する方法であって、前記対象に、Ｓ１００Ａポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドを含むある量の構築物を投与するステップを含み、前記第２の機能性ポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、および血管新生ポリペプチドのうちの少なくとも１つである、方法。
【請求項７６】
前記投与が、予防的に行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記投与が、治療的に行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記対象への少なくとも１つの追加の処置の投与をさらに含む、請求項７５から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記第２の機能性ポリペプチドが、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ、またはそれらの組合せである、請求項７５から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
遺伝子治療の方法であって、対象に、
ａ．機能性タンパク質またはその部分をコードする少なくとも２つの遺伝子、
ｂ．少なくとも１つのプロモーター、および
ｃ．少なくとも１つの操作された組換え部位
を含む、少なくとも１つの非ウイルスベクターを投与するステップを含み、
前記少なくとも１つのプロモーターが、前記少なくとも２つの遺伝子の発現を駆動する、方法。
【請求項８１】
前記少なくとも１つのプロモーターが、構成的である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記少なくとも１つのプロモーターが、組織特異的である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記少なくとも１つのプロモーターが、誘導性である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも１つの組織特異的プロモーターが、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）プロモーターである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記誘導性プロモーターが、小分子リガンド誘導性２ポリペプチドエクジソン受容体ベース遺伝子スイッチである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記誘導性プロモーターが、前記少なくとも２つの遺伝子の発現の用量調節型制御にリガンドを利用する、請求項８３または８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記リガンドが、エクジステロイド、９シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、オキサジアゾリン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン、Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アリールヒドラジン、アルニドケトン、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、フラメソル、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル、幼若ホルモンＩＩＩ、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド−）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項８０から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記リンカーが、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）、ＧＰＶＫＱ（配列番号４３）、ＶＰＶＫＱ（配列番号４４）、ＩＰＶＫＱ（配列番号４５）、ＭＰＶＫＱ（配列番号４６）、ＡＰＩＫＱ（配列番号４７）、ＧＰＩＫＱ（配列番号４８）、ＶＰＩＫＱ（配列番号４９）、ＩＰＩＫＱ（配列番号５０）、ＭＰＩＫＱ（配列番号５１）、ＡＰＡＫＱ（配列番号５２）、ＧＰＡＫＱ（配列番号５３）、ＶＰＡＫＱ（配列番号５４）、ＩＰＡＫＱ（配列番号５５）、ＭＰＡＫＱ（配列番号５６）、ＡＰＶＲＱ（配列番号５７）、ＧＰＶＲＱ（配列番号５８）、ＶＰＶＲＱ（配列番号５９）、ＩＰＶＲＱ（配列番号６０）、ＭＰＶＲＱ（配列番号６１）、ＡＰＩＲＱ（配列番号６２）、ＧＰＩＲＱ（配列番号６３）、ＶＰＩＲＱ（配列番号６４）、ＩＰＩＲＱ（配列番号６５）、ＭＰＩＲＱ（配列番号６６）、ＡＰＡＲＱ（配列番号６７）、ＧＰＡＲＱ（配列番号６８）、ＶＰＡＲＱ（配列番号６９）、ＩＰＡＲＱ（配列番号７０）、ＭＰＡＲＱ（配列番号７１）、ＡＰＶＫＮ（配列番号７２）、ＧＰＶＫＮ（配列番号７３）、ＶＰＶＫＮ（配列番号７４）、ＩＰＶＫＮ（配列番号７５）、ＭＰＶＫＮ（配列番号７６）、ＡＰＩＫＮ（配列番号７７）、ＧＰＩＫＮ（配列番号７８）、ＶＰＩＫＮ（配列番号７９）、ＩＰＩＫＮ（配列番号８０）、ＭＰＩＫＮ（配列番号８１）、ＡＰＡＫＮ（配列番号８２）、ＧＰＡＫＮ（配列番号８３）、ＶＰＡＫＮ（配列番号８４）、ＩＰＡＫＮ（配列番号８５）、ＭＰＡＫＮ（配列番号８６）、ＡＰＶＲＮ（配列番号８７）、ＧＰＶＲＮ（配列番号８８）、ＶＰＶＲＮ（配列番号８９）、ＩＰＶＲＮ（配列番号９０）、ＭＰＶＲＮ（配列番号９１）、ＡＰＩＲＮ（配列番号９２）、ＧＰＩＲＮ（配列番号９３）、ＶＰＩＲＮ（配列番号９４）、ＩＰＩＲＮ（配列番号９５）、ＭＰＩＲＮ（配列番号９６）、ＡＰＡＲＮ（配列番号９７）、ＧＰＡＲＮ（配列番号９８）、ＶＰＡＲＮ（配列番号９９）、ＩＰＡＲＮ（配列番号１００）またはＭＰＡＲＮ（配列番号１０１）を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記少なくとも１つの組換え部位が、ファージゲノム組換え結合部位（ａｔｔＰ）または細菌ゲノム組換え結合部位（ａｔｔＢ）である、請求項８０から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記対象に、少なくとも１つの二次ベクターを投与することをさらに含む、請求項８０から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記少なくとも１つの二次ベクターが、ｍＲＮＡである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記少なくとも１つの二次ベクターが、プラスミドである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記少なくとも１つの二次ベクターが、少なくとも１つのリコンビナーゼを含む、請求項９１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記リコンビナーゼが、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）ファージリコンビナーゼ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ファージリコンビナーゼ、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ファージリコンビナーゼ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）ファージリコンビナーゼ、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）ファージリコンビナーゼ、およびＳＰＢｃ２リコンビナーゼからなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
前記少なくとも２つの遺伝子が、前記リコンビナーゼによって前記対象のゲノムに組み込まれる、請求項８０から９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記ベクターが、適正製造規範（good manufacturing practices）（ＧＭＰ）適合性である、請求項８０から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号４０からなる群から選択される配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むポリペプチド。
【請求項９９】
配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号４０からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項９８に記載のポリペプチド。
【請求項１００】
配列番号１０２、配列番号１０４、および配列番号１０６からなる群から選択される配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むポリペプチド。
【請求項１０１】
配列番号１０２、配列番号１０４、および配列番号１０６からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１００に記載のポリペプチド。
【請求項１０２】
配列番号１０８の核酸配列によってコードされるポリペプチド配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチド。
【請求項１０３】
配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む第１のリンカーによって結合される第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
前記リンカー配列が、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して８０％または１００％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項１０３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
ＡＰＶＫＱ、ＧＰＶＫＱ、ＶＰＶＫＱ、ＩＰＶＫＱ、ＭＰＶＫＱ、ＡＰＩＫＱ、ＧＰＩＫＱ、ＶＰＩＫＱ、ＩＰＩＫＱ、ＭＰＩＫＱ、ＡＰＡＫＱ、ＧＰＡＫＱ、ＶＰＡＫＱ、ＩＰＡＫＱ、ＭＰＡＫＱ、ＡＰＶＲＱ、ＧＰＶＲＱ、ＶＰＶＲＱ、ＩＰＶＲＱ、ＭＰＶＲＱ、ＡＰＩＲＱ、ＧＰＩＲＱ、ＶＰＩＲＱ、ＩＰＩＲＱ、ＭＰＩＲＱ、ＡＰＡＲＱ、ＧＰＡＲＱ、ＶＰＡＲＱ、ＩＰＡＲＱ、ＭＰＡＲＱ、ＡＰＶＫＮ、ＧＰＶＫＮ、ＶＰＶＫＮ、ＩＰＶＫＮ、ＭＰＶＫＮ、ＡＰＩＫＮ、ＧＰＩＫＮ、ＶＰＩＫＮ、ＩＰＩＫＮ、ＭＰＩＫＮ、ＡＰＡＫＮ、ＧＰＡＫＮ、ＶＰＡＫＮ、ＩＰＡＫＮ、ＭＰＡＫＮ、ＡＰＶＲＮ、ＧＰＶＲＮ、ＶＰＶＲＮ、ＩＰＶＲＮ、ＭＰＶＲＮ、ＡＰＩＲＮ、ＧＰＩＲＮ、ＶＰＩＲＮ、ＩＰＩＲＮ、ＭＰＩＲＮ、ＡＰＡＲＮ、ＧＰＡＲＮ、ＶＰＡＲＮ、ＩＰＡＲＮ、およびＭＰＡＲＮ、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列に対して少なくとも６０％、８０％、または１００％の同一性を有する配列を含む第１のリンカーによって結合される第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
前記第１のリンカーが、剛性リンカー、可動性リンカー、切断可能なリンカー、自己切断型リンカー、ペプチドリンカー、リボソームスキッピングによって切断可能なリンカー、またはそれらの任意の組合せである、請求項１０３から１０５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
前記第１のリンカーが、タンパク質分解によって切断可能である、請求項１０６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
前記第１のリンカーが、１〜１０個の切断部位を含む、請求項１０７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
前記切断が、還元反応、酵素反応、または両方の組合せである、請求項１０７から１０８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
前記切断が、酵素反応を含む、請求項１０９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
酵素反応を含む前記切断が、プロテアーゼによって行われる、請求項１１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
前記プロテアーゼが、フリンおよびカテプシンＢからなる群から選択される、請求項１１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
前記プロテアーゼが、フリンである、請求項１１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
前記フリンが、ＲＡＫＲを切断する、請求項１１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
前記第１の機能性ポリペプチドが、前記第２の機能性ポリペプチドと異なる、請求項１０３から１１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
前記第１および第２の機能性ポリペプチドのうちの少なくとも一方が、タンパク質、ホルモン、糖タンパク質、またはそれらの誘導体もしくは断片である、請求項１０３から１１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
（ＧＳ）ｎ、（ＳＧ）ｎ、（ＧＳＧ）ｎ、および（ＳＧＳ）ｎから選択される少なくとも１つの配列をさらに含み、ｎが、１から１５の数である、請求項１０３から１１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
前記ポリペプチドが、第２のリンカーをさらに含む、請求項１０３から１１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
前記第２のリンカーが、第３の機能性ポリペプチドを前記第１の機能性ポリペプチドまたは前記第２の機能性ポリペプチドに結合する、請求項１１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
第３の機能性ポリペプチドを前記第１の機能性ポリペプチドまたは前記第２の機能性ポリペプチドに結合する前記第２のリンカーが、自己切断型リンカーである、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
前記自己切断型リンカーが、２Ａ配列を含む、請求項１２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
前記２Ａ配列が、Ｆ２Ａ配列またはＰ２Ａ配列である、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
Ｋｏｚａｋ配列をさらに含む、請求項１０３から１２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをさらに含む、請求項１０３から１２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
請求項１０３から１２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、またはその誘導体もしくはバリアント。
【請求項１２６】
請求項１０３から１２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１２７】
配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むポリ核酸を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、処置の方法。
【請求項１２８】
前記配列が、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大１００％の同一性を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ポリ核酸が、機能性ポリペプチドをコードする、請求項１２６から１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記機能性ポリペプチドが、インビボで切断される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
インビボで切断される前記機能性ポリペプチドが、少なくとも２つの機能性タンパク質を産生する、請求項１２９から１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
インビボで切断される前記機能性ポリペプチドが、少なくとも３つの機能性タンパク質を産生する、請求項１２９から１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記少なくとも２つまたは少なくとも３つの機能性タンパク質が、それを必要とする前記対象を処置するための組合せ療法の一部である、請求項１３０から１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記投与が、予防的、治癒的、慣例的、またはそれらの組合せである、請求項１２４から１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記投与が、慣例的である、請求項１２７から１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記投与が、１時間毎の投与、毎日投与、毎週投与、毎月投与、毎年投与、または定期的投与を含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記対象が、急性疾患、慢性疾患、終末期疾患、またはそれらの組合せを有する、請求項１２７から１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記対象が、がん、心臓疾患、糖尿病、神経障害、眼障害、ウイルス障害、またはそれらの任意の組合せを有する、請求項１２４から１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
少なくとも１つの二次処置をさらに含む、請求項１２４から１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む第１のリンカーによって結合される第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドを含むポリヌクレオチドを作製する方法。
【請求項１４１】
配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むベクターから遺伝子を発現させる方法であって、前記遺伝子の切断効率が、質量分析法によって測定すると、少なくとも５０％である、方法。
【請求項１４２】
前記ベクターが、２つの生物学的に活性なポリペプチド、３つの生物学的に活性なポリペプチド、または３つ超の生物学的に活性なポリペプチドの発現のための遺伝子を含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記ベクターが、３つの生物学的に活性なポリペプチドの発現のための遺伝子を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記遺伝子が、切断の後に機能性となる、請求項１４１から１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記遺伝子の前記切断効率が、質量分析法によって測定すると、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または最大１００％を含む、請求項１４１から１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
フリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドであって、前記フリンポリペプチドおよび前記２Ａポリペプチドが、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチドリンカーによって結合される、ポリヌクレオチド。
【請求項１４７】
前記少なくとも３つの疎水性アミノ酸のうちの少なくとも１つが、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）からなるリストから選択される、請求項１４６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４８】
前記ポリペプチドリンカーが、配列ＡＰＶＫＱ、ＧＰＶＫＱ、ＶＰＶＫＱ、ＩＰＶＫＱ、ＭＰＶＫＱ、ＡＰＩＫＱ、ＧＰＩＫＱ、ＶＰＩＫＱ、ＩＰＩＫＱ、ＭＰＩＫＱ、ＡＰＡＫＱ、ＧＰＡＫＱ、ＶＰＡＫＱ、ＩＰＡＫＱ、ＭＰＡＫＱ、ＡＰＶＲＱ、ＧＰＶＲＱ、ＶＰＶＲＱ、ＩＰＶＲＱ、ＭＰＶＲＱ、ＡＰＩＲＱ、ＧＰＩＲＱ、ＶＰＩＲＱ、ＩＰＩＲＱ、ＭＰＩＲＱ、ＡＰＡＲＱ、ＧＰＡＲＱ、ＶＰＡＲＱ、ＩＰＡＲＱ、ＭＰＡＲＱ、ＡＰＶＫＮ、ＧＰＶＫＮ、ＶＰＶＫＮ、ＩＰＶＫＮ、ＭＰＶＫＮ、ＡＰＩＫＮ、ＧＰＩＫＮ、ＶＰＩＫＮ、ＩＰＩＫＮ、ＭＰＩＫＮ、ＡＰＡＫＮ、ＧＰＡＫＮ、ＶＰＡＫＮ、ＩＰＡＫＮ、ＭＰＡＫＮ、ＡＰＶＲＮ、ＧＰＶＲＮ、ＶＰＶＲＮ、ＩＰＶＲＮ、ＭＰＶＲＮ、ＡＰＩＲＮ、ＧＰＩＲＮ、ＶＰＩＲＮ、ＩＰＩＲＮ、ＭＰＩＲＮ、ＡＰＡＲＮ、ＧＰＡＲＮ、ＶＰＡＲＮ、ＩＰＡＲＮまたはＭＰＡＲＮを含む、請求項１４７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４９】
ポリペプチド構築物の改善された発現を得る方法であって、
第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドを含む前記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドを提供するステップであって、前記第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドが、配列ＡＰＶＫＱに対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドリンカーによって結合される、ステップと、
前記ポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるステップであって、前記発現が、配列ＡＰＶＫＱに対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドリンカーを有さない対応するポリペプチド構築物と比較して、前記ポリペプチド構築物の改善された発現をもたらす、ステップと
を含む、方法。
【請求項１５０】
前記改善された発現が、配列ＡＰＶＫＱに対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドリンカーを有さない対応するポリペプチド構築物と比較して、少なくとも１０％、２０％，３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
少なくとも１つのプラスミドマイクロバブル複合体
を含む組成物であって、前記マイクロバブルが、脂質、ガス、ならびに請求項１から２７および３５から４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドを含む、組成物。
【請求項１５２】
前記脂質が、前記ガスおよびプラスミドを封入するシェルを形成する、請求項１５１に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記ガスが、パーフルオロカーボンガスである、請求項１５１から１５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５４】
前記ガスが、パーフルオロプロパンである、請求項１５３に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記マイクロバブル複合体が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンおよび１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミングリセロールのうちの少なくとも１つを含む、請求項１５１から１５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５６】
対象に、請求項１５１から１５５のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップと、
前記対象を、所定の組織または器官における少なくとも１つのマイクロバブルの超音波破壊をもたらすのに十分な超音波エネルギーと接触させるステップと
を含む方法。
【請求項１５７】
前記所定の組織または器官における前記少なくとも１つのマイクロバブルの破壊により、前記プラスミドが前記組織または器官へ送達される、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記組織または器官が、器官であり、前記器官が、心臓である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
対象における心疾患または障害を処置する方法であって、
前記対象に、少なくとも１つのマイクロバブルを含むある量の組成物を投与するステップであって、前記マイクロバブルが、脂質、ガス、ならびに請求項１から２７および３５から４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドを含む、ステップと、
前記対象を、前記少なくとも１つのマイクロバブルの超音波破壊をもたらすのに十分な超音波エネルギーと接触させ、前記プラスミドを前記対象の心臓に送達するステップと
を含む、方法。
【請求項１６０】
前記脂質が、前記ガスおよびプラスミドを封入するシェルを形成する、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ガスが、パーフルオロカーボンガスである、請求項１５９から１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記ガスが、パーフルオロプロパンである、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記マイクロバブルが、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンおよび１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミングリセロールのうちの少なくとも１つを含む、請求項１５９から１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記心疾患または障害が、うっ血性心不全、心筋症、不整脈、心膜疾患、大動脈疾患、マルファン症候群、および冠状動脈疾患のうちの少なくとも１つを含む、請求項１５９から１６３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／２５４，１３９号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年１１月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、ＩＮＸ００３３９ＷＯ＿２０１６１１１１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが２７１，８４３バイトである。
【０００３】
技術分野
本発明は、疾患、障害、および病態の多重遺伝子治療的処置のための、新規な核酸およびベクター、ならびにそれによってコードされるポリペプチドを提供する。より具体的には、本発明は、心疾患および障害の多重遺伝子的処置および予防のための新規な核酸、ベクター、ポリペプチド、および方法を提供する。さらに、本発明は、疾患、障害、および病態の多重遺伝子治療的処置に有用な、核酸およびベクターからの有利なタンパク質発現をもたらす、新規な核酸およびポリペプチドリンカーを提供する。
【背景技術】
【０００４】
心疾患は、医療上の必要性が著しく対処されていない代表的なものであり、一部の推定では、世界中で少なくとも２５００万人の患者がいることが示されている。さらに、米国（Ｕ．Ｓ．）政府のＣｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）の「Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ」によると、２０１３年の時点で、米国において５００万人を超える人々が、心不全状態を有する。
【０００５】
心不全は、９人に１人の死因であると推定されており、毎年、８２５，０００人もの新しい症例がある。診断後の平均５年生存率は、約４０％であり、あらゆる診断関連群のなかで、最も高い再入院を示す。米国における費用は、１年間で３２０億ドルにもなると推定されている。心不全処置の選択肢としては、投薬、侵襲的デバイス、および心臓移植が挙げられる。
【０００６】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）は、心臓が、身体の代謝要求を満たすのに十分な心拍出量を提供できないことを表す。現在、世界中で２２００万人を超える人々が、ＣＨＦと診断されており、米国には５００万人を超える患者がいる。心臓疾患の発症および重症度は年齢とともに増加するため、全体的な発症は、老年人口に起因して今後増加することが予測される。ＣＨＦを有する患者の予後は、芳しくないままであり、５年死亡率は５０％である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＨＡ）によると、心血管疾患は、２０１３年に米国で８１０，０００人の命を奪い、これは、報告されている死亡の約３人に１人である。終末期心不全の薬理学的管理は、次の３つの目標に焦点を当てている：１）罹患率および死亡率の改善（ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩのＩ型受容体アンタゴニスト、選択的β−遮断剤、およびアルドステロンアンタゴニスト）、２）症状の制御（利尿薬（最終的にはチアジド、加えてループ利尿薬）、ジギタリス剤（低用量）、一時的な変力薬、および選択的抗不整脈薬）、ならびに３）緩和（オピオイド、抗うつ薬、抗不安薬、酸素、および継続的な変力薬）。しかしながら、疾患が進行するにつれ、治療の選択肢は、心臓再同期療法（ＣＲＴ）、植込み型除細動装置（ＩＣＤ）の考慮、心臓移植、および心室補助デバイス（ＶＡＤ）などに制限されるようになり、ＶＡＤは、移植までの架け橋としておよびドナー心臓の不足に起因して次第に最終目的の療法としての両方として使用されている。全体的な５年生存率は、三重免疫抑制療法を受けた心臓移植患者において７０〜８０％であるが、処置の選択肢としての心臓移植は、ドナー心臓の不足が続いていること、移植候補者の数が増えていること、および１年につき１００，０００ドルを超える非常に高い年間費用により、限られたものとなっている。Ｉｎｔｅｒａｇｅｎｃｙ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（ＩＮＴＥＲＭＡＣＳ）が収集したデータは、２００６年６月２３日から２０１３年６月３０日までに、１２，３３５人の患者が、ＦＤＡに承認された耐久性機械的循環補助（ＭＣＳ）デバイスを受け、増加率は、１年間に２，０００人の患者のペースで続いている。
【０００７】
ＣＨＦの処置のための細胞および遺伝子治療に関する研究は増えているが、生物学的作用、細胞保持、送達のタイミング、および機序の欠如、または単一遺伝子作用の制限に付随する問題に起因して、限られた結果しかでていない。それでも、多くの遺伝子治療の臨床試験が、１年で軽度の効果を示している。遺伝子治療は、定義された作用機序を有するが、血管新生の改善、幹細胞ホーミング、または変力作用のための単一遺伝子の使用は、ＣＨＦを処置するには十分でなかった。ＣＨＦは、瘢痕形成、収縮機能の減少、および細胞消失という点で、多因子的であるため、多重遺伝子的アプローチであれば、これらの重症な患者を安全に保ちながら、これらの個々の因子により良好に対処することができる。
【０００８】
従来的には、遺伝子治療のためのベクターは、単一遺伝子である。より複雑な多重遺伝子ベクターの必要性の増加が、近年、生じてきた。特に、この必要性は、がんおよび抗ウイルス処置のための組合せ療法の必要性によって刺激されている。組合せ遺伝子治療は、がんにおける変異および耐性を防止しようという医薬の最良の試みである。２つまたは３つの薬剤を組み合わせることにより、より完全かつ有効な応答を得ることが可能である。
【０００９】
参照による組込み
本明細書におけるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個別の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における開示と、組み込まれている参考文献における開示との間に矛盾が生じた場合には、本開示が優先される。
【発明の概要】
【００１０】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）を有する患者の数が増え続けることにより、治療の選択肢が限られる状態が続いている。例えば、一般的なＣＨＦ処置は、最終目的として左室補助デバイス（ＬＶＡＤ））の留置に至る。したがって、ＣＨＦからの回復を促進する生物学的選択肢を含む異なるアプローチが必要とされている。
【００１１】
心臓障害を処置するための単一遺伝子に基づくアプローチは、固有の遺伝子変異、すなわち、トロポニンＩまたは重鎖ミオシンを有する患者においては妥当である。しかしながら、心臓病態を有するほとんどの患者において、終末期疾患は、複数の因子に起因している。したがって、そのような場合、単一遺伝子のアプローチでは機能する可能性が低い。心臓患者は、通常、細胞動員および／または血管新生を介した積極的なリモデリングを必要とする瘢痕組織を有する。それらは、通常、カルシウムまたは他の経路を介した変力機能の増加も必要とする。したがって、カルシウムの操作、細胞動員、および血管新生を一緒に達成する遺伝子の組合せにより、これらの終末期ＣＨＦ患者を処置および回復させるためにより適した経路が得られる。さらに、心臓障害（ＣＨＦなどであるがこれに限定されない）を処置するために遺伝子に基づくアプローチを考慮する場合、ウイルスベクターの使用は、ヒト免疫系をアンタゴナイズし得るか、または患者がすでにこれまでに形成された抗ウイルス抗体（例えば、抗ＡＡＶ１／ＡＡＶ２抗体）を有している可能性があり、これにより、安全性および有効性の問題が生じ得る。したがって、ヒトにおいて有害な免疫応答が低いかまたはほとんどなく、必要に応じて再投与することができるプラスミドＤＮＡの使用により、治療用遺伝子の有利な送達様態が得られる。
【００１２】
そのため、本発明の一実施形態は、心疾患および障害（例えば、ＣＨＦであるがこれに限定されない）の治療的処置のための三重エフェクター非ウイルスプラスミドに基づくＤＮＡを提供する。一実施形態において、本発明は、三重エフェクター非ウイルスプラスミドに基づくＤＮＡベクター（構築物）を提供する。本発明の特定の実施形態において、ｐＸｏＸと称される発現プラスミドは、生物学的に活性なＳＤＦ１α、Ｓ１００Ａ１、およびＶＥＧＦをコードし、それらを発現し、ここで、これらの３つのエフェクター目的遺伝子（ＧＯＩ）は、本明細書に記載される選択的に設計されたリンカー配列によって分離している。
【００１３】
心疾患および障害（例えば、ＣＨＦであるがこれに限定されない）を処置するための多重遺伝子プラスミドＤＮＡアプローチは、単一遺伝子を利用した他の研究における肯定的なインビトロでの前臨床および臨床のデータに基づく。以下に記載されるそれぞれの目的遺伝子は、変力（例えば、Ｓ１００Ａ１）、細胞ホーミング（例えば、ＳＤＦ−１α）、および血管新生（例えば、ＶＥＧＦ１６５）に特異的な機能を有する。各個別の遺伝子を別個の送達プラスミドに含むのではなく、単一のプラスミド構築物が３つすべての遺伝子を含む理由としては、単一遺伝子（個々の別個のベクターで）が細胞に送達された場合に、各遺伝子が細胞にトランスフェクトされる量を制御することができる手段がないためである。遺伝子送達におけるこの変動性により、本発明の単一の多重遺伝子構築物よりも単純なアプローチとなるとはいえ、療法が安全でなくなり、再現性のないものとなる。したがって、一実施形態において、ｐＸｏＸなどのベクターにより、Ｓ１００Ａ１（細胞内タンパク質）、ＳＤＦ−１α（分泌タンパク質）、およびＶＥＧＦ１６５（分泌タンパク質）を構成的に発現させる。ｐＸｏＸを使用することで、ｐＤＮＡ構築物は、単一のｍＲＮＡとして転写され、これが、フリンおよびＰ２Ａ（ｆｐ２ａ）の組合せ活性による切断を介して、３つの個々の機能性タンパク質として翻訳される。２Ａ自己切断型ペプチドは、「リボソームスキッピング」、「ストップ・ゴー（stop-go）」、および「ストップ・キャリーオン（stop-carry on）」翻訳として知られる翻訳作用を媒介する配列（Ｐ２Ａ）をコードし、これにより、単一のプロモーターの制御下において、単一の転写産物ｍＲＮＡから、複数のタンパク質の共発現がもたらされる。構成的発現は、ＣＡＧプロモーター（ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターをＣＭＶエンハンサーおよびハイブリッドＣＢＡエクソン１／ウサギベータ−グロビンイントロンＢとともに含むハイブリッドプロモーター）などであるがこれに限定されないプロモーターによって駆動される。本発明の構築物に含める３つのエフェクターおよびそれらの原理のさらなる説明を以下に示す。
【００１４】
Ｓ１００Ａ１
Ｓ１００Ａ１は、Ｃａ２＋結合ＥＦハンドタンパク質スーパーファミリーのメンバーである（Rohde et al, J Cardiovasc Transl Res, vol. 3, no. 5, pp. 525-537, 2010）。Ｓ１００Ａ１は、主として心筋細胞においてＣａ２＋に制御されるネットワークおよび流動を調節して、収縮機能、興奮性、代謝、維持、および生存を制御するホモ二量体として機能する１０．４ｋＤａのタンパク質である。動物およびヒトでの研究により、心不全におけるＳ１００Ａ１の発現の減少が示されている（Pleger et al., Circulation, vol. 115, no. 19, pp. 2506-2515, 2007およびRemppis et al., Biochim Biophys Acta, vol. 1313, no. 3, pp. 253-257, 1996）。Ｓ１００Ａ１のウイルス送達は、心不全の大規模な動物モデルにおいて使用が成功している。特に、ブタモデルにおいて評価されているＡＡＶ９−Ｓ１００Ａ１遺伝子治療では、血行動態の悪化からの保護、心臓機能の改善、および心拍の正常化が示されている（Rohde et al, J Mol Cell Cardiol, vol. 50, no. 5, pp. 777-784, 2011）。心不全のブタモデルにおいてＡＡＶ６−Ｓ１００Ａ１を使用した別の研究では、不整脈または右室機能不全の増加を示さず、Ｓ１００Ａ１の過剰発現の安全性が実証されている。しかしながら、左室駆出率および心臓リモデリングの大幅な増加があった（Weber et al, Gene Ther, vol. 21, pp. 131-138, 2014）。これらなどの研究は、終末期心不全を有するヒトにおけるＳ１００Ａ１療法の可能性を裏付ける。
【００１５】
ＳＤＦ−１α
ストロマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）は、間葉幹細胞上の受容体ＣＸＣＲ４と結合することによって、心臓幹細胞の動員、心筋細胞死の阻害、および心臓機能の改善において重要な役割を果たす８ｋＤａのケモカインである（Penn et al, Gene Ther, vol. 19, no. 6, pp. 583-587, 2012）。ヒトＳＤＦ−１αをコードする非ウイルスＤＮＡプラスミドの試験が、いくつかの臨床試験において行われた（Penn et al., Circ Res, vol. 112, no. 5, pp. 816-825, 2013およびChung et al, Eur Heart J, vol. 36, pp. 2228-2238, 2015）。これらの試験による所見では、ＳＤＦ−１αの過剰発現は、不整脈またはさらなる心不全エピソードへの進行を含めて重大な予期せぬ関連有害事象を伴わず、比較的安全であることが示された。このような研究により、ＳＤＦ−１αの過剰発現が、１５ｍｇまたは３０ｍｇの用量でＣＨＦを心膜内注射した患者において機能を改善し得ることも示された。さらに、４５ｍｇの用量での冠状静脈洞を介して逆行性に送達されるプラスミドＤＮＡが安全であることが見出された。
【００１６】
ＶＥＧＦ
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのタンパク質は、新しい血管の形成、内皮細胞の遊走および活性化、幹細胞の動員、ならびに組織再生に関与する（Taimeh et al, Nat Rev Cardiol, vol. 10, no. 9, pp. 519-530, 2013）。血管調節の機能不全は、心不全の病態生理学の重要な要素であり、ＶＥＧＦレベルの低減が、進行性心不全のモデルにおいて観察されている。ＶＥＧＦには多数のアイソフォームが存在する。しかしながら、ＶＥＧＦ１６５が、前臨床モデルおよび臨床モデルの両方において使用されている。心不全の処置の選択肢としてＶＥＧＦを標的とすることの有用性が、側副灌流（collateral perfusion）および全体的な心臓機能の改善を示す動物モデルにおけるネイキッドプラスミドＤＮＡおよびアデノウイルスなどのベクターを用いた遺伝子移入を使用して示されている。ＶＥＧＦ１６５の臨床使用は、直接注射するｐＤＮＡおよびウイルスベクターを介したものの両方として研究されており、肯定的だが限定された結果を得ている。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ  １６５は、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１配列のアミノ酸２７〜１９１を含む配列を有する。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ  １６５は、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１配列のアミノ酸２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４〜１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１を含む配列を有する。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ  １６５は、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１配列のアミノ酸３０〜１８５を含む配列を有する。
【００１７】
それぞれの個別の遺伝子（すなわち、Ｓ１００Ａ１、ＳＤＦ１α、およびＶＥＧＦ１６５）と併せて用いられるＣＡＧプロモーターは、瘢痕組織、心臓機能、およびリモデリングに対して個別の作用を示している。各遺伝子の作用は、心臓組織に固有である。３つすべての遺伝子の潜在的な増強作用は、インビトロにおいてのみ試験されている。しかしながら、ＳＤＦ−１αと組み合わせたＶＥＧＦの局所投与は、後肢虚血のマウスモデルにおいて、内皮前駆細胞に誘導される新血管形成を促進することによって強化されることが示されている（Yu et al, J Vasc Surg, vol. 50, no. 3, pp. 608-616, 2009）。
【００１８】
したがって、第１の機能性（すなわち、生物学的に活性な）ポリペプチド、第２の機能性ポリペプチド、および任意選択で第３の機能性ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物（非ウイルスプラスミドベクターなどであるがこれに限定されない）が、本明細書に提供される。
【００１９】
Ｓ１００ポリペプチド、第２の機能性ポリペプチド、および任意選択で第３の機能性ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物であって、第２および任意選択の第３の機能性ポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、または血管新生ポリペプチドのうちのいずれか１つを含む、ポリヌクレオチド構築物が、本明細書に提供される。
【００２０】
第１および第２の機能性ポリペプチドの分離のため、ならびに任意選択で第２および第３の機能性ポリペプチドの分離のための、ポリペプチドリンカー配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド構築物が、本明細書に提供される。
【００２１】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、提供される。本明細書に記載される少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞もまた、提供される。
【００２２】
心臓状態を処置する方法であって、細胞を、治療有効量の本明細書に記載されるポリヌクレオチドと接触させるステップを含む、方法が、本明細書に提供される。一部の事例において、細胞は、心筋細胞である。
【００２３】
対象における、例えば、うっ血性心不全（ＣＨＦ）であるがこれに限定されない、心疾患および障害を処置する方法であって、対象に、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはベクターを含む治療有効量の組成物を提供するステップを含む、方法が、本明細書に提供される。一部の事例において、対象は、哺乳動物対象またはヒト対象である。一部の事例において、対象には、少なくとも１つの追加の療法が投与される。
【００２４】
本明細書に記載されるポリヌクレオチド、または本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が、本明細書に提供される。
【００２５】
少なくとも１つのプラスミドマイクロバブル複合体を含む組成物であって、マイクロバブルが、脂質、ガス、および本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むプラスミドを含む、組成物が、提供される。一部の実施形態において、脂質は、前記ガスおよびプラスミドを封入するシェルを形成する。一部の事例において、ガスは、パーフルオロカーボンガス、例えば、パーフルオロプロパンである。一部の実施形態において、マイクロバブル複合体は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンおよび１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミングリセロールのうちの少なくとも１つを含む。
【００２６】
対象に、本明細書に記載されるプラスミドマイクロバブル複合体組成物を投与するステップと、対象を、所定の組織または器官における少なくとも１つのマイクロバブルの超音波破壊をもたらすのに十分な超音波エネルギーと接触させるステップとを含む方法が、提供される。一部の事例において、前記所定の組織または器官における少なくとも１つのマイクロバブルの破壊により、前記プラスミドが前記組織または器官に送達される。一部の事例では、組織または器官は、器官であり、これは、心臓、肝臓、または腎臓であり得る。
【００２７】
対象における心疾患または障害（例えば、うっ血性心不全、心筋症、不整脈、心膜疾患、大動脈疾患、マルファン症候群、および冠状動脈疾患であるがこれらに限定されない）を処置する方法であって、対象に、ある量の本明細書に記載されるプラスミドマイクロバブル複合体組成物を投与するステップと、対象を、少なくとも１つのマイクロバブルの超音波破壊をもたらすのに十分な超音波エネルギーと接触させるステップと、プラスミドを対象の心臓に送達するステップとを含む、方法が、提供される。
【００２８】
本発明の独特かつ好ましい特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点を理解することは、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによっても得てもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、心臓エフェクター遺伝子の非ウイルス性送達が、本明細書に記載のリンカー配列を含む新規なベクター構築物の別の構成を介して達成される方法を示す。
【図２】図２は、ＳＰＢｃ２（リコンビナーゼ）トランスフェクションを用いたａｔｔ部位ルシフェラーゼを含むベクターの導入による、初代細胞（インビトロ）における本明細書に記載のリンカーを含む構築物からの心筋細胞におけるルシフェラーゼの持続的発現を示す。ａｔｔ部位またはリコンビナーゼのいずれかが欠如している細胞は、ベースライン発現レベルに急速に戻った。２日目（Ｄ２）、５日目（Ｄ５）、９日目（Ｄ９）、１４日目（Ｄ１４）。
【図３】図３は、本明細書に記載のリンカーによる分離を介して、心臓エフェクター遺伝子（生物学的に活性なＳＤＦ１α、Ｓ１００Ａ１、およびＶＥＧＦをコードするｐＸｏＸ）を発現させ得るプラスミドベクター骨格由来の、齧歯類モデルで達成されたルシフェラーゼ発現のデータを示す。
【図４】図４は、心不全状態および対応する標準介護モードならびに介入および治療のための方法全体にわたる進行の様々な段階を示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、ＨＵＶＥＣ増殖アッセイを示す。Ａ．は、組換えＶＥＧＦ処理後のＨＵＶＥＣ増殖を示し、Ｂ．は、ＶＥＧＦトランスフェクト誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）細胞上清での処理後のＨＵＶＥＣ増殖を示す。ｉＰＳＣ細胞をトランスフェクトし、９６時間インキュベートした。上清を収集し、ＨＵＶＥＣＳを培養するために使用した。ＨＵＶＥＣ増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏによって測定した。
【図６】図６は、トランスフェクトされた心筋細胞−ｉＰＳＣ上清による処理後のＨＵＶＥＣ増殖を示す。本明細書に開示されたリンカーを含む、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる機能性ポリペプチドの発現および活性の成功を実証する、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、肥大性心筋症（ＨＣＭ）または健常対照の患者から、心筋細胞−ｉＰＳＣを得た。
【図７】図７は、本明細書中に開示されるリンカーを含む、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる機能的ポリペプチドの発現および活性の成功を実証する、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の遊走の上昇を示す、単一遺伝子、ダブル遺伝子および三重遺伝子ＳＤＦ１ポリペプチド構築物でトランスフェクトされたｉＰＳＣ−ＣＭを示す。
【図８】図８は、ＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４アンタゴニスト）が、ＳＤＦ１−ＣＸＣＲ４依存性遊走を特異的に阻害した遊走アッセイを示す。データによって、ＡＭＤ３１００の存在下で遊走が減少するので、ＳＤＦ１が二重遺伝子および三重遺伝子構築物において機能的であることが示される。
【図９】図９によって、生物発光画像が、レポータープラスミドの冠状静脈洞を通る逆行性灌流を示し、本明細書に記載のリンカーも組み込んで、２４時間後に心臓への送達および送達されたレポーター遺伝子の発現を生じるブタの研究が示される。ブタ心臓冠状静脈洞を通したルシフェラーゼ発現プラスミドの逆行性注入の２４時間後の放射輝度および分布。３つのプラスミド用量（４０、８０および１２０ｍｇ）を３回試験した。
【図１０】図１０は、ＳＤＦ１を発現する二重遺伝子および三重遺伝子構築物で心筋細胞をトランスフェクトした遊走アッセイを示す。ｉＰＳＣ  ＣＭ由来の上清を使用したＪｕｒｋａｔ細胞の遊走は、トランスフェクトされたＳＤＦ１タンパク質が機能的であり、かつ本明細書に開示されるリンカーを含む本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる機能性ポリペプチドの発現および活性の成功を示す有意な遊走を生じることを示す。
【図１１】図１１は、ＳＤＦ１を発現するダブル遺伝子および三重遺伝子構築物で心筋細胞をトランスフェクトした遊走アッセイを示す。ｉＰＳＣ  ＣＭからの上清を用いたＪｕｒｋａｔ細胞の遊走により、トランスフェクションおよびＳＤＦ１タンパク質が機能的であり、有意な遊走を生じることが示される。データは、Ｊｕｒｋａｔ細胞の用量依存的な遊走を示し、本明細書に開示されるリンカーを含む、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる機能的ポリペプチドの成功した発現および活性を実証する。
【図１２】図１２は、ＳＤＦ１をコードするダブル遺伝子および三重遺伝子構築物でトランスフェクトされた拡張型心筋症対象由来の心筋細胞を示す。データはＳＤＦ１に依存するＪｕｒｋａｔ細胞の遊走を示す。拡張型心筋症ｉＰＳＣ−ＣＭにおけるダブル遺伝子および三重遺伝子ベクター構築物によって発現されるＳＤＦ１は機能的である。
【図１３】図１３は、ＳＤＦ１をコードするダブル遺伝子および三重遺伝子構築物でトランスフェクトされた肥大性心筋症対象由来の心筋細胞を示す。データはＳＤＦ１に依存するＪｕｒｋａｔ細胞の遊走を示す。肥大性心筋症ｉＰＳＣ−ＣＭにおけるダブル遺伝子および三重遺伝子構築物によって発現されるＳＤＦ１は機能的である。
【図１４−Ａ】図１４Ａおよび図１４Ｂは、ＨＵＶＥＣで実施された増殖アッセイを示す。Ａ．は、ダブル遺伝子および三重遺伝子構築物を有するＤＣＭ対象由来のトランスフェクトされた心筋細胞が、ＨＵＶＥＣ増殖を誘導することができる機能的ＶＥＧＦタンパク質を産生することを示す。（注：試料８は、試行１、試行２で試験されなかった）。図１４Ｂは、二重遺伝子および三重遺伝子構築物を有する健常な対象からのトランスフェクトされた心筋細胞が、ＨＵＶＥＣ増殖を誘導し得る機能的ＶＥＧＦタンパク質を産生することを示す。
【図１４−Ｂ】図１４Ａおよび図１４Ｂは、ＨＵＶＥＣで実施された増殖アッセイを示す。Ａ．は、ダブル遺伝子および三重遺伝子構築物を有するＤＣＭ対象由来のトランスフェクトされた心筋細胞が、ＨＵＶＥＣ増殖を誘導することができる機能的ＶＥＧＦタンパク質を産生することを示す。（注：試料８は、試行１、試行２で試験されなかった）。図１４Ｂは、二重遺伝子および三重遺伝子構築物を有する健常な対象からのトランスフェクトされた心筋細胞が、ＨＵＶＥＣ増殖を誘導し得る機能的ＶＥＧＦタンパク質を産生することを示す。
【図１５】図１５Ａおよび図１５Ｂは、Ｓ１００Ａ１−ＳＤＦ１をコードするダブル遺伝子ベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＳＤＦ１タンパク質発現を示す。Ａ．ＳＤＦ１の吸光度を示すＥＬＩＳＡアッセイ標準曲線。Ｂ．２９３Ｔ上清中のＳＤＦ１濃度。データは、本明細書に開示されるリンカーを含む、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる機能的（すなわち、生物学的に活性な）ポリペプチドの発現の成功を実証する。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、Ｓ１００Ａ１−ＶＥＧＦ１９１をコードするダブル遺伝子ベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＶＥＧＦタンパク質発現を示す。Ａ．ＶＥＧＦの吸光度を示すＥＬＩＳＡアッセイ標準曲線。Ｂ．２９３Ｔ上清中のＶＥＧＦ濃度。このデータは、本明細書に開示されるリンカーを含む、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる機能的（すなわち、生物学的に活性な）ポリペプチドの発現の成功を実証する。
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂは、Ｓ１００Ａ１−ＳＤＦ１をコードするダブル遺伝子ベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＳ１００Ａ１タンパク質発現を示す。Ａ．Ｓ１００Ａ１の吸光度を示すＥＬＩＳＡアッセイ標準曲線。Ｂ．２９３Ｔ溶解物中のＳ１００Ａ１濃度。このデータは、本明細書に開示されるリンカーを含む、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる機能的（すなわち、生物学的に活性な）ポリペプチドの発現の成功を実証する。
【図１８】図１８は、単一遺伝子、ダブル遺伝子および三重遺伝子構築物でトランスフェクトされた心筋細胞によって産生されるＳ１００Ａ１濃度の棒グラフを示す。
【図１９】図１９は、単一遺伝子、ダブル遺伝子および三重遺伝子構築物でトランスフェクトされた心筋細胞によって産生されるＳＤＦ−１α濃度の棒グラフを示す。
【図２０】図２０は、単一遺伝子、ダブル遺伝子および三重遺伝子構築物でトランスフェクトした心筋細胞によって産生されるＶＥＧＦ濃度の棒グラフを示す。
【図２１】図２１は、単一遺伝子、ダブル遺伝子および三重遺伝子構築物でトランスフェクトされた心筋細胞によって産生されるＳ１００Ａ１ポリペプチド切断のウエスタンブロット（イムノブロット）検出を示す。
【図２２】図２２は、単一遺伝子、ダブル遺伝子および三重遺伝子構築物でトランスフェクトされた心筋細胞によって産生されたＳＤＦ−１αポリペプチド切断のウエスタンブロット（イムノブロット）検出を示す。
【図２３】図２３は、単一遺伝子、ダブル遺伝子および三重遺伝子構築物でトランスフェクトした心筋細胞によって産生されたＶＥＧＦポリペプチド切断のウエスタンブロット（イムノブロット）検出を示す。
【図２４】図２４は、非変性ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって検出された、本発明のリンカーを用いた三重遺伝子構築物から発現された二量体Ｓ１００Ａ１の形成を示す。
【図２５】図２５Ａおよび図２５Ｂは、拡張型心筋症患者対健常対照由来のｉＰＳＣ細胞の比較を、Ａ．（ｐＳｔｕｆｆｅｒ、ｐＳ１００Ａ１をコードするベクター、または２Ａテールを含むＳ１００Ａ１をコードするベクターでトランスフェクトしたｉＰＳＣ細胞の拍動速度）、Ｂ．（ＰＳｔｕｆｆｅｒ、ｐＳ１００Ａ１をコードするベクター、または２Ａテールを含むＳ１００Ａ１をコードするベクターでトランスフェクトされたｉＰＳＣ細胞の拍動速度の収縮持続時間）に関して示す。このデータは、Ｓ１００Ａ１をコードするベクターの３’末端に２Ａテールが存在することがＳ１００Ａ１の機能に影響しないことを示す。（ｐＳｔｕｆｆｅｒは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、非発現、類似サイズのスタッファー配列で置換された、ｐＸｏＸと同じ骨格構成を有するプラスミドである）。
【図２６】図２６Ａ、図２６Ｂおよび図２６Ｃは、拡張型心筋症患者対健常対照由来のｉＰＳＣ細胞の比較を、Ａ．（ＤＮＡ１（ＣＡＧＳｔｕｆｆｅｒＮＸＢ−Ｖ２）、ＤＮＡ２（ＣＡＧ−Ｓ１００Ａ１（ｋｏｚａｋなし）、ＤＮＡ３（ＣＡＧ−Ｓ１００Ａ１−ｆｐ２ａ−ＳＤＦ１）、ＤＮＡ４（ＣＡＧ−Ｓ１００Ａ１−ｆｐ２ａ−ＳＤＦ１−ｆｐ２ａ−ＶＥＧＦ）、ＤＮＡ５（ＣＡＧ−Ｓ１００Ａ１−ＣＭＶ−ＳＤＦ１−ｆｐ２ａ−ＶＥＧＦ１９１）でトランスフェクトされたｉＰＳＣ細胞、または未トランスフェクト対照の拍動速度）、Ｂ．（ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３、ＤＮＡ４、ＤＮＡ５、またはトランスフェクトしていない対照でトランスフェクトしたｉＰＳＣ細胞の収縮速度）、Ｃ．（ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３、ＤＮＡ４、ＤＮＡ５または非トランスフェクション対照の収縮持続時間）に関して示す。データは、健常対照レベルへのＤＣＭの収縮特性の復旧を示す。
【図２７】図２７Ａおよび図２７Ｂは、Ｓ１００Ａ１、ＳＤＦ−１アルファ、およびＶＥＧＦ１６５をコードする三重遺伝子ベクターを示す。図２７Ａは、生物学的に活性なＳＤＦ１α、Ｓ１００Ａ１、およびＶＥＧＦをコードするｐＸｏＸ三重遺伝子ベクターの模式図を示す。図２７Ｂは、三重遺伝子ベクター中の個々の遺伝子エレメントを同定する。
【図２８】図２８は、リコンビナーゼ滴定実験におけるＶＥＧＦの発現についてのデータを示す。データによって、ＶＥＧＦのゲノムＤＮＡへの組込みが示される。
【図２９】図２９は、リコンビナーゼ滴定実験におけるＳＤＦ−１α発現のデータを示す。データは、ＳＤＦ−１αのゲノムＤＮＡへの組込みを示す。
【図３０】図３０は、リコンビナーゼ滴定実験におけるＳ１００Ａ１の発現のためのデータを示す。データは、Ｓ１００Ａ１のゲノムＤＮＡへの組込みを示す。
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｃは、心臓構造の心エコー測定を介し、および短縮率の関数として、インビボ治療結果を示す。図３１Ａは、パーセント短縮率の関数としての結果を示す。図３１Ｂは、ｐＸｏＸ構築物と比較した、ｐＳｔｕｆｆｅｒ構築物の左心室後壁の厚さ（ｃｍ）を示す。図３１Ｃは、ｐＸｏＸ構築物と比較した、ｐＳｔｕｆｆｅｒ構築物のＩＶＳｄ（ｃｍ）を示す。値は、平均±ＳＥＭとして示す。＊＊Ｐ＜０．００１対ｐＳｔｕｆｆｅｒ。
【図３２】図３２は、心筋細胞の再生を示す心細胞におけるＰＨＨ３（ホスホ−ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０））有糸分裂マーカーシグナルの核局在化の結果を示す。プラスミドあたり８匹のラットのうち４匹の代表的な画像。スケールバーは２５μｍである。
【図３３】図３３は、初期心臓前駆細胞のマーカーであるＩＳＬ−１の陰性結果を示している画像化結果を示しており、これによって、前駆細胞が再生に関与していないことが確認される。したがって、観察された心筋細胞の再生は、ＵＴＭＤ−ｐＸｏＸ遺伝子治療の結果である。プラスミドあたり８匹のラットのうち４匹の代表的な画像。スケールバーは２５μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下の説明および実施例により、本発明の実施形態を詳細に例証する。本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態に制限されるものではなく、したがって、変動し得ることを理解されたい。当業者であれば、本発明の多数の変化形および修正形が存在し、本発明の範囲内に含まれることを認識するであろう。
【００３１】
すべての用語は、当業者によって理解されるであろう通りに理解されることを意図する。別途定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。以下の定義は当業者に補足を提供するものであり、本出願を対象としており、いずれの関係事例または無関係事例、例えば、いずれの共同所有の特許または出願にも帰属するものではない。本明細書に記載されるものに類似またはそれと同等のいずれの方法および材料も、本開示の試験の実施に使用することができるが、好ましい材料および方法が、本明細書に記載されている。したがって、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のものにすぎず、限定することを意図するものではない。
【００３２】
Ｓ１００ファミリーのタンパク質としては、例えば、Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ３、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ５、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１０、Ｓ１００Ａ１１、Ｓ１００Ａ１２、Ｓ１００Ａ１３、Ｓ１００Ａ１４、Ｓ１００Ａ１５、およびＳ１００Ａ１６が挙げられる。一部の事例において、Ｓ１００Ａタンパク質に類似のタンパク質、例えば、Ｓ１００Ａ７Ｌ（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７様）がある。他のＳ１００タンパク質としては、Ｓ１００Ｂ、Ｓ１００Ｇ、Ｓ１００Ｐ、およびＳ１００Ｚ、ならびにそれらのバリアントおよび断片が挙げられ、これらは、本明細書に記載される実施形態に含まれ得る。本明細書に記載されるベクターによって発現され得る偽遺伝子産物の結果であるＳ１００タンパク質もまた、本明細書に記載される実施形態に含まれる［６１］。
【００３３】
ＳＤＦファミリーのタンパク質としては、例えば、インタークリンファミリーのストロマ細胞由来アルファケモカインメンバーをコードし得る抗微生物遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられる［６２］。本明細書に記載される実施形態は、Ｇタンパク質共役型受容体であるケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４のリガンドとして機能し得、胚形成、免疫監視、炎症応答、組織恒常性、ならびに腫瘍の成長および転移を含む、多数の多様な細胞機能において役割を果たし得る、コードされるタンパク質を含み得る。異なるアイソフォームをコードする転写産物バリアントもまた含まれ、前記アイソフォームおよび転写産物バリアントは、本明細書に記載されるベクターによって発現され得る。本明細書に記載される一部の実施形態において、最初の２つのシステイン残基が１つのアミノ酸によって分離されている、ＳＤＦファミリーのタンパク質がある（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン）。以下のタンパク質アイソフォームが、ヒトにおいて特定されており、本明細書に記載されるベクターによって発現され得、本明細書に記載される方法および組成物に含まれ得る：ＳＤＦ−１アルファ、ＳＤＦ−１ベータ、ＳＤＦ−１ガンマ、ＳＤＦ−１デルタ、ＳＤＦ−１イプシロン、およびＳＤＦ−１シータ、ならびにそれらの断片およびバリアント。
【００３４】
本明細書に記載されるＶＥＧＦファミリーのタンパク質には、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ成長因子ファミリーのメンバーが含まれる。例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６のスプライスバリアントおよびアイソフォームおよび断片および誘導体が、本明細書に記載される方法および組成物に含まれ得る［６３］。
【００３５】
一部の事例において、Ｓ１００ポリペプチドは、Ｓ１００Ａ１、およびその任意の機能性誘導体であり得る。一部の実施形態において、第２の機能性ポリペプチドは、血管新生ポリペプチドであり得る。血管新生ポリペプチドは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６、それらの断片およびバリアントからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ  １６５は、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１配列のアミノ酸２７〜１９１を含む配列を有する。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ  １６５は、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１配列のアミノ酸２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４〜１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１を含む配列を有する。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ  １６５は、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１配列のアミノ酸３０〜１８５を含む配列を有する。一部の事例において、本明細書に記載されるＶＥＧＦポリペプチドは、本明細書に開示されるＶＥＧＦ  １９１またはＶＥＧＦ  １６５の配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。一部の事例において、ＶＥＧＦポリペプチドは、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１ポリペプチドの配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００３６】
他の実施形態において、第３の機能性ポリペプチドは、ケモカインであり得る。ケモカインは、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ）ポリペプチドであり得る。ＳＤＦポリペプチドは、ＳＤＦ１、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、それらの断片およびバリアントからなる群から選択され得る［６２］。ＳＤＦポリペプチドは、本明細書に開示されるＳＤＦ１ポリペプチドの配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００３７】
本明細書に記載される一部の実施形態において、Ｓ１００ポリペプチドは、第１のポリペプチドリンカーによって第２のポリペプチドに結合され得る。一部の事例において、ポリペプチドリンカーは、切断可能なリンカーであってもよく、または切断不可能なリンカーであってもよい。
【００３８】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド構築物が、カルシウム結合タンパク質（Ｓ１００）ポリペプチド、第２の機能性ポリペプチドを含み得、さらに、第３の機能性ポリペプチドを含み得る、実施形態が、本明細書に提供される。一部の事例において、第３の機能性ポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、血管新生ポリペプチド、およびそれらの任意の機能性誘導体のうちのいずれか１つであり得る。
【００３９】
ある特定の実施形態において、第３の機能性ポリペプチドは、血管新生ポリペプチドであり得る。一部の実施形態において、血管新生ポリペプチドは、ＶＥＧＦポリペプチドであり得る。ＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６、それらの断片およびバリアントからなる群から選択され得る。ＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦ１６５ポリペプチドの配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。一部の事例において、ＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦ１９１ポリペプチドの配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００４０】
一部の実施形態において、第３の機能性ポリペプチドは、ケモカインであり得る。ある特定の実施形態において、ケモカインは、ＳＤＦポリペプチドであり得る。一部の実施形態において、ＳＤＦポリペプチドは、ＳＤＦ１、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、それらの断片およびバリアントからなる群から選択される。一部の事例において、ＳＤＦポリペプチドは、本明細書に記載されるＳＤＦ１ポリペプチドの配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００４１】
一部の実施形態において、第３の機能性ポリペプチドは、任意選択で切断可能である第２のポリペプチドリンカーによって、前記Ｓ１００ポリペプチドおよび前記第２の機能性ポリペプチドのうちの少なくとも１つに結合され得る。ポリペプチドリンカーは、本明細書に記載されるリンカーから独立して選択され得る。
【００４２】
少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む少なくとも１つのポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドであって、第１のポリペプチドが、血管新生ポリペプチドであり得、第２のポリペプチドが、ケモカインまたはそのバリアントもしくは断片であり得る、ポリヌクレオチドが、本明細書に提供される。一部の事例において、血管新生ポリペプチドは、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６、それらの断片およびバリアントからなる群から選択されるＶＥＧＦポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、ＶＥＧＦポリペプチドの配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００４３】
ＶＥＧＦ１９１の配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＶＥＧＦポリペプチドが、提供される。一部の事例において、第２のポリペプチドは、ＳＤＦポリペプチドであり得る。ＳＤＦポリペプチドは、ＳＤＦ１、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、それらの断片およびバリアントからなる群から選択され得る。一部の事例において、ＳＤＦポリペプチドは、ＳＤＦ１の配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００４４】
対象における血管発生を改善する方法であって、前記対象に、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む治療有効量の組成物を提供するステップを含む、方法が、本明細書に提供される。
【００４５】
ＳＤＦ１ポリペプチド、Ｓ１００Ａ１ポリペプチド、ＶＥＧＦポリペプチド、ならびにそれらの断片およびバリアントから選択される少なくとも２つのポリペプチドに作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む発現ベクターが、本明細書に提供される。一部の事例において、少なくとも２つのポリペプチドは、リンカーによって結合される。一部の事例において、少なくとも１つのプロモーターは、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター、ベータアクチンプロモーター、メタロチオニン（metallothionin）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ミオシン軽鎖プロモーター、ミオシン重鎖プロモーター、ＮＣＸ１プロモーター、および他の好適な心臓のプロモーターからなる群から選択され得る。発現ベクターは、心臓発現ベクターであり得る。
【００４６】
少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むポリペプチド構築物であって、第１のポリペプチドが、カルシウム結合タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片であり得、第２のポリペプチドが、血管新生ポリペプチド、ケモカイン、またはそれらのバリアントもしくは断片であり得る、ポリペプチド構築物が、本明細書に提供される。少なくとも第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドを含むポリペプチド構築物であって、第１のポリペプチドが、血管新生ポリペプチド、またはそのバリアントもしくは断片であり得、第２のポリペプチドが、ケモカイン、またはそのバリアントもしくは断片であり得、第３のポリペプチドが、カルシウム結合タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片であり得る、ポリペプチド構築物もまた、開示される。一部の事例において、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、Ｓ１００Ａ１、そのバリアントまたは断片を含み得る。一部の事例において、ポリペプチド構築物は、ＳＤＦ１、そのバリアントまたは断片を含み得る。さらなる事例において、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、ＶＥＧＦ、そのバリアントまたは断片を含み得る。
【００４７】
本明細書に記載されるポリヌクレオチド、または本明細書に提供されるポリペプチド構築物、または本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド構築物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が、提供される。対象における心疾患および障害を処置する方法であって、対象に、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、または本明細書に提供されるポリペプチド構築物、または本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を提供するステップを含む、方法が、本明細書に提供される。
【００４８】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物は、さらに、第２のリンカーポリペプチドによって第２の機能性ポリペプチドに結合される、第３の機能性ポリペプチドを含む。一部の事例において、第３の機能性ポリペプチドは、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ１、Ｓ１００Ａ１、それらのバリアントおよび誘導体からなるリストから選択され得る。一部の事例において、第２のリンカーは、本明細書に記載される第１のリンカーと同じであってもよく、または異なってもよい。一部の事例において、リンカーおよび機能性ポリペプチドは、インフレームで発現され得る。
【００４９】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む細胞が、本明細書に提供される。
【００５０】
少なくとも１つの心細胞を、少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドと接触させるステップを含み、第１のポリペプチドが、血管新生ポリペプチドバリアントまたはその断片であり、第２のポリペプチドが、ケモカイン、カルシウム結合タンパク質、またはそれらのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも１つである、方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態において、血管新生ポリペプチドバリアントまたはその断片は、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６、それらの断片およびバリアントからなる群から選択されるＶＥＧＦポリペプチドであり得る。ＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦ１６５の配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ  １６５は、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１配列のアミノ酸２７〜１９１を含む配列を有する。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ  １６５は、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１配列のアミノ酸２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４〜１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１を含む配列を有する。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ  １６５は、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１配列のアミノ酸３０〜１８５を含む配列を有する。一部の事例において、本明細書に記載されるＶＥＧＦポリペプチドは、本明細書に開示されるＶＥＧＦ  １９１またはＶＥＧＦ１６５の配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦ１９１の配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。一部の事例において、第２のポリペプチドは、ケモカインであり得る。ケモカインは、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ）ポリペプチドであり得る。一部の事例において、本明細書に提供される組成物および方法において有用なＳＤＦポリペプチドは、ＳＤＦ１、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、それらの断片およびバリアントからなる群から選択され得る。ＳＤＦポリペプチドは、ＳＤＦ１−αに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００５１】
一部の事例において、ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドは、エクスビボで導入され得る。ある特定の実施形態において、ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドは、インビボで導入され得る。インビボでの導入は、経皮冠状動脈カテーテル法、冠状静脈遮断、心臓再循環、順行性冠状動脈注入、逆行性灌流、直接注射、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
【００５２】
対象における心疾患または障害を（例えば、限定されないが、血管発生、心臓機能、または心臓リモデリングを改善することによって）対象において処置する方法であって、前記対象に、ＶＥＧＦポリペプチド、ならびにＳＤＦポリペプチドおよびＳ１００ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む構築物をコードする、ある量のポリヌクレオチドを投与するステップを含む、方法が、本明細書に提供される。本明細書に記載される実施形態におけるＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１９１、ＶＥＧＦ２０６、それらの断片およびバリアントからなる群から選択され得る。ＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦ１６５の配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ  １６５は、本明細書に開示されるＶＥＧＦ１９１配列のアミノ酸２７〜１９１を含む配列を有する。ＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦ１９１の配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＳＤＦポリペプチドは、ＳＤＦ１、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、それらの断片およびバリアントからなる群から選択され得る。Ｓ１００ポリペプチドは、Ｓ１００Ａ１、その断片またはバリアントであり得る。
【００５３】
ある特定の実施形態において、本発明の方法および組成物で処置される対象は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）を有し得る。対象は、左室補助デバイス（ＬＶＡＤ）が留置されている場合がある。対象は、心筋症を有し得る。心筋症は、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
【００５４】
さらなる実施形態において、本発明の方法および組成物で処置される対象は、動脈瘤、アテローム性動脈硬化症、先天性心疾患、心膜障害、急性非代償性心不全、狭心症、動脈硬化性心疾患、スポーツ心臓症候群、動静脈瘻、自己免疫性心疾患、心臓の褐色萎縮、心アミロイドーシス、心臓性不整脈、心臓性喘息、心臓収縮調節、心臓Ｘ症候群、心原性ショック、心臓肥大、心筋症、心臓病恐怖症、心腎症候群、心臓毒性、心血管疾患、心臓炎、慢性リウマチ性心疾患、木靴心、冠状動脈瘤、冠状動脈奇形、冠状動脈疾患、冠状動脈解離、冠状動脈拡張、冠状動脈閉塞、冠盗血、冠状動脈血栓、冠状動脈萎縮、コクサッキーウイルス誘導型心筋症、拡張期心不全、ドレスラー症候群、デュロジ疾患、アイゼンメンゲル症候群、胎児性心音、胎児性リコール（embryonic recall）、心内膜弾性線維症、駆出率が保たれた心不全、心臓新生物、高拍出性心不全、前胸部高拍出量（hyperdynamic precordium）、高血圧性心疾患、特発性巨細胞性心筋炎、炎症性心疾患、心室間同期不全、心室内同期不全、虚血性心疾患、限局性心房アミロイドーシス（isolated atrial amyloidosis）、ケシャン病、ｋｏｕｎｉｓ症候群、マイジカー（mydicar）、心筋橋、心筋錯綜配列（myocardial disarray）、心筋破裂、心筋瘢痕、心筋気絶、心筋炎、非細菌性血栓性心内膜炎、入口部疾患（ostial disease）、末梢動脈疾患、リンおよび非アテローム硬化性心疾患、心膜切開後症候群、圧力制御型間欠性冠状静脈洞閉塞（ｐｉｃｓｏ）、心肺蘇生法からの回復、外傷性心停止からの回復、右軸偏位、リウマチ性心疾患、ロエムヘルド症候群、飽和脂肪酸と心血管疾患の論争、瘢痕−ｆｃ、ショーン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、心臓弁疾患、心室瘤、ならびにウイルス性心筋症のうちの１つまたは複数を有し得る。
【００５５】
対象における心血管状態を処置または予防する方法であって、対象に、Ｓ１００Ａポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドを含むある量の構築物を投与するステップを含み、前記第２の機能性ポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、および血管新生ポリペプチドのうちの少なくとも１つである、方法が、本明細書に提供される。一部の事例において、対象への投与は、予防的に行われ得る。一部の事例において、対象への投与は、治療的に行われ得る。一部の事例において、対象には、前記対象への少なくとも１つの追加の処置が投与され得る。一部の事例において、第２の機能性ポリペプチドは、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ、またはそれらの組合せであり得る。
【００５６】
対象に、少なくとも２つの機能性タンパク質またはそれらの部分を含む本明細書に記載されるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、少なくとも１つのプロモーター、および少なくとも１つの操作された組換え部位を含む、少なくとも１つの非ウイルスベクターを投与するステップを含む方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターが、前記少なくとも２つの機能性タンパク質の発現を駆動する、方法が、本明細書に提供される。一部の事例において、少なくとも１つのプロモーターは、構成的であり得る。一部の事例において、少なくとも１つのプロモーターは、組織特異的であり得る。一部の事例において、少なくとも１つのプロモーターは、誘導性であり得る。一部の事例において、少なくとも１つの組織特異的プロモーターは、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）プロモーターである。一部の事例において、誘導性プロモーターは、小分子リガンド誘導性２ポリペプチドエクジソン受容体ベース遺伝子スイッチ（small molecule ligand-inducible two polypeptide ecdysone receptor-based gene switch）である。
【００５７】
誘導性プロモーターは、前記少なくとも２つの遺伝子の発現の用量調節型制御にリガンドを利用する。一部の事例において、リガンドは、エクジステロイド、９−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、オキサジアゾリン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン、Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン、Ｎ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン、アルニドケトン（arnidoketone）、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、フラメソル（framesol）、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル、幼若ホルモンＩＩＩ、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド−）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。
【００５８】
一部の実施形態において、第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドは、第１のリンカーポリペプチドによって結合され、第１のリンカーポリペプチドは、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、８０％、または１００％の同一性を有する配列を含む。一部の事例において、リンカーポリペプチドは、ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）、ＧＰＶＫＱ（配列番号４３）、ＶＰＶＫＱ（配列番号４４）、ＩＰＶＫＱ（配列番号４５）、ＭＰＶＫＱ（配列番号４６）、ＡＰＩＫＱ（配列番号４７）、ＧＰＩＫＱ（配列番号４８）、ＶＰＩＫＱ（配列番号４９）、ＩＰＩＫＱ（配列番号５０）、ＭＰＩＫＱ（配列番号５１）、ＡＰＡＫＱ（配列番号５２）、ＧＰＡＫＱ（配列番号５３）、ＶＰＡＫＱ（配列番号５４）、ＩＰＡＫＱ（配列番号５５）、ＭＰＡＫＱ（配列番号５６）、ＡＰＶＲＱ（配列番号５７）、ＧＰＶＲＱ（配列番号５８）、ＶＰＶＲＱ（配列番号５９）、ＩＰＶＲＱ（配列番号６０）、ＭＰＶＲＱ（配列番号６１）、ＡＰＩＲＱ（配列番号６２）、ＧＰＩＲＱ（配列番号６３）、ＶＰＩＲＱ（配列番号６４）、ＩＰＩＲＱ（配列番号６５）、ＭＰＩＲＱ（配列番号６６）、ＡＰＡＲＱ（配列番号６７）、ＧＰＡＲＱ（配列番号６８）、ＶＰＡＲＱ（配列番号６９）、ＩＰＡＲＱ（配列番号７０）、ＭＰＡＲＱ（配列番号７１）、ＡＰＶＫＮ（配列番号７２）、ＧＰＶＫＮ（配列番号７３）、ＶＰＶＫＮ（配列番号７４）、ＩＰＶＫＮ（配列番号７５）、ＭＰＶＫＮ（配列番号７６）、ＡＰＩＫＮ（配列番号７７）、ＧＰＩＫＮ（配列番号７８）、ＶＰＩＫＮ（配列番号７９）、ＩＰＩＫＮ（配列番号８０）、ＭＰＩＫＮ（配列番号８１）、ＡＰＡＫＮ（配列番号８２）、ＧＰＡＫＮ（配列番号８３）、ＶＰＡＫＮ（配列番号８４）、ＩＰＡＫＮ（配列番号８５）、ＭＰＡＫＮ（配列番号８６）、ＡＰＶＲＮ（配列番号８７）、ＧＰＶＲＮ（配列番号８８）、ＶＰＶＲＮ（配列番号８９）、ＩＰＶＲＮ（配列番号９０）、ＭＰＶＲＮ（配列番号９１）、ＡＰＩＲＮ（配列番号９２）、ＧＰＩＲＮ（配列番号９３）、ＶＰＩＲＮ（配列番号９４）、ＩＰＩＲＮ（配列番号９５）、ＭＰＩＲＮ（配列番号９６）、ＡＰＡＲＮ（配列番号９７）、ＧＰＡＲＮ（配列番号９８）、ＶＰＡＲＮ（配列番号９９）、ＩＰＡＲＮ（配列番号１００）およびＭＰＡＲＮ（配列番号１０１）からなる群から選択される配列を含む。一部の事例において、ポリペプチドリンカーはまた、１つまたは複数のＧＳリンカー配列、例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号１０９）、（ＳＧ）ｎ（配列番号１１０）、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号１１１）、および（ＳＧＳ）ｎ（配列番号１１２）を含み得、ここで、ｎは、ゼロから１５の任意の数であり得る。一部の実施形態において、第１の機能性ポリペプチドは、第２の機能性ポリペプチドと異なり得る。
【００５９】
一部の実施形態において、方法は、さらに、対象に、少なくとも１つの二次ベクターを投与するステップを含み得る。少なくとも１つの二次ベクターは、ｍＲＮＡであり得る。少なくとも１つの二次ベクターは、プラスミドであり得る。一部の実施形態において、少なくとも１つの二次ベクターは、少なくとも１つのリコンビナーゼを含み得る。リコンビナーゼは、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）ファージリコンビナーゼ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ファージリコンビナーゼ、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ファージリコンビナーゼ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）ファージリコンビナーゼ、およびマイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）ファージリコンビナーゼからなる群から選択され得る。一部の実施形態において、少なくとも２つの遺伝子が、リコンビナーゼによって対象のゲノムに組み込まれ得る。一部の実施形態において、少なくとも１つの組換え部位は、ファージゲノム組換え結合部位（ａｔｔＰ）または細菌ゲノム組換え結合部位（ａｔｔＢ）であり得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される本発明において使用されるリコンビナーゼは、ＳｐＢＣ２などであるがこれに限定されない部位特異的セリンリコンビナーゼを含む（例えば、２０１５年５月１９日に出願された米国特許第９，０３４，６５０号明細書（米国特許出願公開第２００６／０１７２３７７号明細書）を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
ベクターは、適正製造規範（ＧＭＰ）適合性であり得る。
【００６１】
配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号４０からなる群から選択される配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、８０％、または１００％の同一性を有する配列を含むポリペプチドが提供される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号４０からなる群から選択される配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
【００６２】
配列番号１０２、配列番号１０４、および配列番号１０６からなる群から選択される配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、８０％、または１００％の同一性を有する配列を含むポリペプチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号１０２、配列番号１０４、および配列番号１０６からなる群から選択される配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドがある。
【００６３】
配列番号１０８の核酸配列によってコードされるポリペプチド配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドが提供される。
【００６４】
第１のリンカーポリペプチドによって結合される第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドであって、第１のリンカーポリペプチドが、配列ＡＰＶＫＱに対して少なくとも４０％、５０％、６０％、８０％、または１００％の同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチドが、本明細書に提供される。一部の事例において、リンカーポリペプチドは、ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）からなる群から選択される配列を含む。一部の事例において、リンカーポリペプチドは、ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）、ＧＰＶＫＱ（配列番号４３）、ＶＰＶＫＱ（配列番号４４）、ＩＰＶＫＱ（配列番号４５）、ＭＰＶＫＱ（配列番号４６）、ＡＰＩＫＱ（配列番号４７）、ＧＰＩＫＱ（配列番号４８）、ＶＰＩＫＱ（配列番号４９）、ＩＰＩＫＱ（配列番号５０）、ＭＰＩＫＱ（配列番号５１）、ＡＰＡＫＱ（配列番号５２）、ＧＰＡＫＱ（配列番号５３）、ＶＰＡＫＱ（配列番号５４）、ＩＰＡＫＱ（配列番号５５）、ＭＰＡＫＱ（配列番号５６）、ＡＰＶＲＱ（配列番号５７）、ＧＰＶＲＱ（配列番号５８）、ＶＰＶＲＱ（配列番号５９）、ＩＰＶＲＱ（配列番号６０）、ＭＰＶＲＱ（配列番号６１）、ＡＰＩＲＱ（配列番号６２）、ＧＰＩＲＱ（配列番号６３）、ＶＰＩＲＱ（配列番号６４）、ＩＰＩＲＱ（配列番号６５）、ＭＰＩＲＱ（配列番号６６）、ＡＰＡＲＱ（配列番号６７）、ＧＰＡＲＱ（配列番号６８）、ＶＰＡＲＱ（配列番号６９）、ＩＰＡＲＱ（配列番号７０）、ＭＰＡＲＱ（配列番号７１）、ＡＰＶＫＮ（配列番号７２）、ＧＰＶＫＮ（配列番号７３）、ＶＰＶＫＮ（配列番号７４）、ＩＰＶＫＮ（配列番号７５）、ＭＰＶＫＮ（配列番号７６）、ＡＰＩＫＮ（配列番号７７）、ＧＰＩＫＮ（配列番号７８）、ＶＰＩＫＮ（配列番号７９）、ＩＰＩＫＮ（配列番号８０）、ＭＰＩＫＮ（配列番号８１）、ＡＰＡＫＮ（配列番号８２）、ＧＰＡＫＮ（配列番号８３）、ＶＰＡＫＮ（配列番号８４）、ＩＰＡＫＮ（配列番号８５）、ＭＰＡＫＮ（配列番号８６）、ＡＰＶＲＮ（配列番号８７）、ＧＰＶＲＮ（配列番号８８）、ＶＰＶＲＮ（配列番号８９）、ＩＰＶＲＮ（配列番号９０）、ＭＰＶＲＮ（配列番号９１）、ＡＰＩＲＮ（配列番号９２）、ＧＰＩＲＮ（配列番号９３）、ＶＰＩＲＮ（配列番号９４）、ＩＰＩＲＮ（配列番号９５）、ＭＰＩＲＮ（配列番号９６）、ＡＰＡＲＮ（配列番号９７）、ＧＰＡＲＮ（配列番号９８）、ＶＰＡＲＮ（配列番号９９）、ＩＰＡＲＮ（配列番号１００）およびＭＰＡＲＮ（配列番号１０１）からなる群から選択される配列を含む。一部の事例において、ポリペプチドリンカーはまた、１つまたは複数のＧＳリンカー配列、例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号１１３）、（ＳＧ）ｎ（配列番号１１４）、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号１１５）、および（ＳＧＳ）ｎ（配列番号１１６）を含み得、ここで、ｎは、１から１５の任意の数であり得る。一部の実施形態において、第１の機能性ポリペプチドは、第２の機能性ポリペプチドと異なり得る。他の事例において、前記第１および第２の機能性ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、タンパク質、ホルモン、抗体、糖タンパク質、またはそれらの誘導体もしくは断片であり得る。
【００６５】
フリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドであって、フリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドが、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチドリンカーによって結合される、ポリヌクレオチドが、本明細書に提供される。一部の事例において、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ）（Ｇ）、アラニン（Ａｌａ）（Ａ）、バリン（Ｖａｌ）（Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ）（Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）（Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ）（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）（Ｆ）、メチオニン（Ｍｅｔ）（Ｍ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）（Ｗ）からなるリストから選択される。
【００６６】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびこれらのポリペプチドを含む組成物が、提供される。個体を、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはそれにより発現されるポリペプチドまたはそれらの誘導体もしくはコンジュゲートと接触させるステップを含む、治療方法および／または診断方法もまた、提供される。
【００６７】
ポリペプチド構築物の改善された発現を得る方法であって、第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドを含む前記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドを提供するステップであって、前記第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドが、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むリンカーポリペプチドによって結合される、ステップと、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるステップであって、前記発現が、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むリンカーポリペプチドを有さない対応するポリペプチド構築物と比較して、ポリペプチド構築物の改善された発現をもたらす、ステップとを含む、方法が、提供される。
【００６８】
参照される数値およびその文法上の同等物に関する「約」という用語は、本明細書において使用されるとき、数値そのもの、およびその数値から増減１０％の範囲の値を含み得る。例えば、「約１０」という量は、１０および９〜１１の任意の量を含む。例えば、参照される数値に関する「約」という用語は、その値の増減１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲の値も含み得る。
【００６９】
「心血管疾患」および「循環障害」という用語は、互換可能に使用され、循環系に対する損傷によって引き起こされる疾患または障害を示して本明細書に使用され、その損傷は、治療有効量の、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド構築物を、対象の心臓および／または循環系の損傷した領域に提供することによって、低減および／または緩和され得る。本明細書において使用されるとき、「循環損傷」という用語は、多数の疾患または障害のうちのいずれかによって引き起こされ得る循環系への傷害を指して使用される。本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド構築物、ならびに本発明による方法を使用して処置され得る心血管疾患の例としては、例えば、心筋梗塞、心筋症、末梢血管疾患、先天性心疾患、他の遺伝疾患、ならびに虚血、事故、環境的損傷によって引き起こされる傷害または外傷が挙げられる。加えて、治療有効量の、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド構築物は、対象の脳内の部位への血流の不足もしくは虚血によって引き起こされるであろう、または脳および／もしくは脊髄への物理的傷害により生じた、前記対象における心臓発作の中枢神経系への影響を低減および／または排除するために使用され得る。
【００７０】
「ベクター」という用語または文法上の同等物は、本明細書において使用されるとき、目的のポリペプチド構築物の発現を誘導することができ、目的のポリペプチド構築物を標的細胞に移入するのに有用である、任意のポリヌクレオチド構築物を指す。したがって、この用語には、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびに組込みベクターが含まれる。
【００７１】
選択肢が限られた（例えば、一般に、左室補助デバイス（ＬＶＡＤ）療法を最終目標とする要件に至る）うっ血性心不全（ＣＨＦ）を有する患者の数が増え続けていることに基づいて、ＣＨＦからの回復を促進する生物学的選択肢が、必要とされている。したがって、本発明の一実施形態は、心臓の性能（例えば、最終目標のＬＶＡＤＳが植え込まれた患者において、術後少なくとも３０日間、ＬＶＡＤ補助からの一時的な離脱の回数および期間を測定することによって評価される）を改善するための三重エフェクタープラスミドに基づくＤＮＡ−ｐＸｏＸ（ＳＤＦ１α、Ｓ１００Ａ１、およびＶＥＧＦ）を提供する。ＬＶＡＤの植込み単独で、心臓機能の改善がもたらされ得るが、そのほとんどは、植込み後の最初のおよそ３０日以内に生じる。また、通常、外科手術に関連する炎症プロセスは、術後３０日までに新しいベースラインまで回復し、これにより、この危険性の高い患者集団に、ｐＸｏＸを用いた処置の危険性の減少がもたらされ得る。
【００７２】
ｐＸｏＸプラスミドは、ＣＡＧプロモーターの制御下において、３つのタンパク質（Ｓ１００Ａ１、ＳＤＦ−１α、およびＶＥＧＦ１６５）を単一のｍＲＮＡとして、構成的に発現し、これが、翻訳中に、フリンおよび２Ａ自己切断型ペプチド（ｆｐ２ａ）の組合せ活性による切断を介して、個々のエフェクタータンパク質にプロセシングされる。プラスミド骨格は、カナマイシン選択マーカーおよびｐＢＲ３２２に由来する複製起点を含む。ｐＸｏＸプラスミドの例示は、以下に、図２７Ａおよび図２７Ｂに提供される。
【００７３】
本発明はまた、新規な多重遺伝子ベクター、遺伝子配列の組合せ、タンパク質（ポリペプチド）、および本明細書に記載され提供される技法を使用した、例えば、心臓関連の病態、状態、および障害（例えば、心不全、心筋症、不整脈、心膜疾患、大動脈疾患、マルファン症候群、および冠状動脈疾患）の処置に有用な、組成物および方法において使用するためのリンカーを提供する。本明細書において使用されるとき、「リンカー」という用語は、任意の１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を、それぞれ、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に結合するために使用される任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味し得る（例えば、第１のＧＯＩ−リンカー−第２のＧＯＩ−リンカー−第３のＧＯＩ−リンカーなど）。例えば、一部の事例では、リンカーは、第１のポリペプチド配列が、介在アミノ酸配列によって第２のポリペプチド配列（および続けて第３、第４、第５などの同じオープンリーディングフレーム内の後続のポリペプチド）に共有結合で連結（「融合」）されるように、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドオープンリーディングフレームであり得る。本明細書において使用されるとき、「リンカー」はまた、第１のポリヌクレオチドコーディング領域（ＯＲＦ）を第２のポリヌクレオチドコーディング領域（ＯＲＦ）（および続いて第３、第４、第５などの後続のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム）に結合させるように機能する、プロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーターまたはＣＭＶプロモーター）またはＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）などの非コーディング連結ポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００７４】
本明細書において使用される遺伝子治療は、遺伝的または後天的な疾患または状態を処置または予防するために、目的とされる本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を対象に移入することを指す。目的のポリヌクレオチドは、インビボでの産生が所望される産物（例えば、ポリペプチド構築物）をコードし得る。一部の実施形態において、目的のポリヌクレオチドはまた、自殺遺伝子もコードする。一部の事例において、遺伝子治療は、本明細書に記載される心血管状態を処置するために使用され得る。
【００７５】
ベクター
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを使用することを含む、障害の遺伝子治療のためのベクターが、本明細書に提供され得る。ベクターは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなど、外因性核酸を導入するために利用され得る。これらの巨大分子の大きなサイズおよび負の電荷を考慮して、それらの送達は、担体またはベクターによって媒介され得る。目的のベクターとしては、特に、任意のエピソーマルベクター、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体、ミニサークル（mini-circle）などが挙げられる。
【００７６】
遺伝子送達系は、非ウイルス系および組換えウイルス系の２つのカテゴリーに分類することができ、これらのそれぞれは、遺伝子移入発現に関して固有のプロファイルを有し得る。非ウイルスベクターとしては、ネイキッドプラスミドＤＮＡ、リポソームＤＮＡ複合体、ポリマー担持ＤＮＡ、およびオリゴヌクレオチドが挙げられる。プラスミドは、目的のタンパク質をコードする二本鎖環状ＤＮＡ含有導入遺伝子であり得、エンハンサー配列およびプロモーター配列も有し得る。ベクターは、非ウイルスベクターであり得る。
【００７７】
ベクターは、遺伝子またはその断片もしくはバリアントを含み得、ここで、少なくとも１つの遺伝子、その断片、またはバリアントは、本明細書に開示されるリンカーによって、別の遺伝子、その断片、またはバリアントに結合される。ベクターは、単一遺伝子または複数の遺伝子、またはそれらの断片もしくはバリアントを含み得る。ベクターは、遺伝子またはその断片もしくはバリアントを含み得、ここで、少なくとも１つの遺伝子、その断片、またはバリアントは、本明細書に開示されるリンカーによって、別の遺伝子、その断片、またはバリアントに結合され得る。例えば、ベクターは、単一遺伝子、ダブル遺伝子（例えば、表１を参照されたい）、または三重遺伝子であり得、ここで、少なくとも１つの遺伝子、その断片、またはバリアントは、本明細書に開示されるリンカーによって、別の遺伝子、その断片、またはバリアントに結合される。ベクターは、１〜１０個の数の遺伝子またはその断片もしくはバリアントを含み得る。ベクターは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の遺伝子、その断片、またはバリアントを含み得る。三重遺伝子ベクターの例は、図２０Ａおよび図２０Ｂに示されている。例示的なベクター配列は、表５に示される。一部の事例において、ベクターは、同じＲＮＡ転写産物から２つ、３つ、またはそれ以上のポリペプチドを別々に、同時に発現させるのを可能にし得る。ベクターはまた、レポーターポリペプチドを含み得る。例えば、ベクターは、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のポリペプチド、およびレポーターポリペプチドを発現し得る。
【００７８】
一部の事例において、ベクターは、少なくとも１つの遺伝子またはその断片を有して構築され得る。他の事例において、ベクターは、最大１０個の遺伝子またはその断片を含み得る。発現され得る遺伝子またはその断片は、配列番号１０２〜１０７によって示され得る。配列番号１０２〜１０７の任意のホモログ、アイソフォーム、前駆体、または修飾された部分もまた、本明細書に記載されるベクターによって発現され得る。遺伝子またはその任意の断片は、本明細書に記載されるリンカーによって分離され得る。ベクターにおいて利用され得る様々なリンカーは、例えば、配列番号３２〜配列番号４１に示される配列を含み得る。他の事例において、ベクターにおいて利用され得る関連リンカーは、例えば、配列番号４２〜１０１のいずれかに示される配列を含み得る。例えば、遺伝子の一部分は、ＳＤＦ遺伝子（配列番号１０３、またはそれに対して６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の同一性のものによってコードされる）、ＶＥＧＦ遺伝子（配列番号１０５、またはそれに対して６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の同一性のものによってコードされる）、およびＳ１００Ａ遺伝子（配列番号１０７、またはそれに対して６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の同一性のものによってコードされる）のうちの少なくとも１つであり得、これに、第１のリンカー配列、ＳＤＦ遺伝子（配列番号１０３、またはそれに対して６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の同一性のものによってコードされる）、ＶＥＧＦ遺伝子（配列番号１０５、またはそれに対して６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の同一性のものによってコードされる）、およびＳ１００Ａ遺伝子（配列番号１０７、またはそれに対して６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の同一性のものによってコードされる）から選択される第２の遺伝子またはその部分が続き、任意選択で、第２のリンカー配列、ならびに続いてＳＤＦ遺伝子（配列番号１０３、またはそれに対して６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の同一性のものによってコードされる）、ＶＥＧＦ遺伝子（配列番号１０５、またはそれに対して６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の同一性のものによってコードされる）、およびＳ１００Ａ遺伝子（配列番号１０７、またはそれに対して６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の同一性のものによってコードされる）から選択される第３の遺伝子またはその部分が続き得る。これらの構築物の様々な組合せは、例えば、配列番号１〜配列番号３１に記載され、治療目的で利用することができる。
【００７９】
ベクターは、モジュラーであってもよい。モジュラーベクターは、例えば、制限酵素消化を使用して、１つの遺伝子または核酸セグメントと、異なる遺伝子または核酸セグメントとの置換えを可能にし得る。
【００８０】
目的遺伝子またはタンパク質の多重遺伝子発現は、ベクターによって媒介され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを含むがこれらに限定されない、任意のベクター系が使用され得る。宿主の抗ウイルス免疫応答を回避するという点で、プラスミドベクターが有利である。プラスミドは、エピソーマルかつ非組込み型であり得、これにより、ウイルスベクターと比較して、挿入による変異生成の危険性を低減することができる。一部の事例において、エンハンサーが、本発明のポリヌクレオチド構築物において使用され得る。エンハンサーは、転写開始部位から固定でない距離で機能し得る配列を指し、これは、転写単位に対して５’または３’のいずれであってもよい。さらに、エンハンサーは、イントロン内にあってもよく、同様に、コーディング配列自体に含まれてもよい。エンハンサーは、通常、長さが１０〜３００塩基対であり、シスで機能する。エンハンサーは、１０塩基対〜５０塩基対、５０塩基対〜１００塩基対、１００塩基対〜１５０塩基対、１５０塩基対〜２００塩基対、２００塩基対〜２５０塩基対、２５０塩基対〜３００塩基対であり得る。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増加させるように機能し得る。エンハンサーは、転写制御を媒介する応答エレメントも含有し得る。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、およびインスリン）由来の多数のエンハンサー配列が、現在では公知であるが、全般的な発現のために真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用することもできる。エンハンサー−プロモーターの組合せの選択は、導入遺伝子発現のレベルおよび持続期間の両方に対して大きな影響を有する。エンハンサーは、数例挙げると、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）エンハンサー、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ−Ｉ）エンハンサー、ジリス肝炎ウイルス（ＧＨＶ）エンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、ヒトプロトロンビン（ｈＴＨＧＢ）エンハンサー、またはヒト補体Ｃ２遺伝子（ｈＣ２）エンハンサーであり得る。
【００８１】
一部の実施形態において、エンハンサー配列は、遺伝子の発現を増加させるために使用され得る。例えば、ＣＭＶエンハンサーは、異なる細胞特異的プロモーターおよび異なる細胞型下において、導入遺伝子発現を増加させ得るため、導入遺伝子発現レベルを増加させるために広く適用可能なツールとなっている。
【００８２】
一部の事例において、ミニサークルベクターが使用され得る。ミニサークルベクターは、複製起点を欠いていてもよく、細菌プラスミドに一般的に見られる薬物選択マーカー、例えば、β−ラクタマーゼ、ｔｅｔなどを欠いていてもよいという点で、細菌プラスミドベクターと異なり得る。ミニサークルは、リコンビナーゼハイブリッド産物配列、ならびに目的の配列、すなわち、転写される配列および発現に必要な制御配列以外のベクター配列を実質的に含まなくてもよい。一部の事例において、ドッグボーンベクターを利用してもよい。ドッグボーンベクターは、細菌の使用を伴うことなく生成することができ、プラスミドと比較して、低減された細菌エレメントを有し得る。細菌エレメントが低減されることで、細胞、対象、または両方の組合せへのベクター導入の毒性が低減され得る。
【００８３】
本明細書に記載される一部の実施形態は、ベクター（非ウイルスベクターおよびウイルスベクターを含む（ＤＮＡおよびＲＮＡ／ｍＲＮＡベクターを含み、直鎖状ベクターであっても環状ベクターであってもよい））に組み込むことができるポリヌクレオチド（および前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）を含み、ここで、前記ポリヌクレオチドは、
ａ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（リンカー）−ＳＤＦ−（リンカー）−ＶＥＧＦ−３’；
ｂ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（リンカー）−ＶＥＧＦ−（リンカー）−ＳＤＦ−３’；
ｃ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＳＤＦ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ−３’；
ｄ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ−（リンカー）−ＳＤＦ１−３’；
ｅ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＳＤＦ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｆ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ１６５−（リンカー）−ＳＤＦ１−３’；
ｇ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＳＤＦ１α−（リンカー）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｈ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ１６５−（リンカー）−ＳＤＦ１α−３’；
ｉ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＳＤＦ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｊ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−（リンカー）−ＳＤＦ１−３’；
ｋ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＳＤＦ１α−（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｌ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−（リンカー）−ＳＤＦ１α−３’；
ｍ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ−（リンカー）−ＶＥＧＦ−３’；
ｎ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−（リンカー）−ＳＤＦ−３’；
ｏ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ−３’；
ｐ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−（リンカー）−ＳＤＦ１−３’；
ｑ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｒ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（リンカー）−ＳＤＦ１−３’；
ｓ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（リンカー）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｔ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（リンカー）−ＳＤＦ１α−３’；
ｕ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｖ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（リンカー）−ＳＤＦ１−３’；
ｗ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｘ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（リンカー）−ＳＤＦ１α−３’；
ｙ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−３’；
ｚ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ−３’；
ａａ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−３’；
ａｂ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−３’；
ａｃ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ａｄ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−３’；
ａｅ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ａｆ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’；
ａｇ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ａｈ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−３’；
ａｉ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ａｊ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’；
ａｋ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ−（ｆｍｄｖ）−ＶＥＧＦ−３’；
ａｌ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−（ｆｍｄｖ）−ＳＤＦ−３’；
ａｍ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ｆｍｄｖ）−ＶＥＧＦ−３’；
ａｎ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−（ｆｍｄｖ）−ＳＤＦ１−３’；
ａｏ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ｆｍｄｖ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ａｐ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ｆｍｄｖ）−ＳＤＦ１−３’；
ａｑ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｆｍｄｖ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ａｒ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ｆｍｄｖ）−ＳＤＦ１α−３’；
ａｓ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ｆｍｄｖ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ａｔ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ｆｍｄｖ）−ＳＤＦ１−３’；
ａｕ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｆｍｄｖ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ａｖ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ｆｍｄｖ）−ＳＤＦ１α−３’；
ａｗ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ−（ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−３’；
ａｘ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−（ｐ２ａ）−ＳＤＦ−３’；
ａｙ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−３’；
ａｚ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−（ｐ２ａ）−ＳＤＦ１−３’；
ｂａ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｂｂ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ｐ２ａ）−ＳＤＦ１−３’；
ｂｃ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｄｂ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’；
ｂｅ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｂｆ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ｐ２ａ）−ＳＤＦ１−３’；
ｂｇ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｂｈ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’、
ｂｉ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−３’；
ｂｋ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＳＤＦ−３’；
ｂｌ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−３’；
ｂｍ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＳＤＦ１−３’；
ｂｎ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｂｏ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＳＤＦ１−３’；
ｂｐ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｂｑ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’；
ｂｒ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｂｓ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＳＤＦ１−３’；
ｂｔ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；および
ｂｕ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’
からなる群から選択される構築物構成を含み、
「プロモーター」は、任意の転写プロモーター配列であり、
「Ｓ１００」は、Ｓ１００タンパク質ファミリー内の任意のポリペプチド、そのアイソフォーム、または断片をコードし、
「ＳＤＦ」は、ＳＤＦタンパク質ファミリー内の任意のポリペプチド、そのアイソフォーム、または断片をコードし、
「ＶＥＧＦ」は、ＶＥＧＦタンパク質ファミリー内の任意のポリペプチド、そのアイソフォーム、または断片をコードし、
括弧符号「（」および「）」は、コーディング配列か非コーディング配列かに関係なく、任意の数の追加のヌクレオチド（ｎｔ）（０〜１０００ｎｔ）を示し、
「リンカー」は、隣接する生物学的に活性なポリペプチドの発現に有用な任意のリンカーを示し、
「Ｓ１００Ａ１」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号１０５のヌクレオチド配列または配列番号１０４のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一であるか、または１００％同一であり、
「ＳＤＦ−１α」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号１０３のヌクレオチド配列または配列番号１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一であるか、または１００％同一であり、
「ＶＥＧＦ１６５」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号１２７のヌクレオチド配列または配列番号１２６のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一であるか、または１００％同一であり、
「ＶＥＧＦ１９１」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号１０７のヌクレオチド配列または配列番号１０６のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一であるか、または１００％同一であり、
「ｆｐ２ａ」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号４１のヌクレオチド配列または配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるか、または１００％同一であり、
「ｆｍｄｖ」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号３５のヌクレオチド配列または配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるか、または１００％同一であり、
「ｐ２ａ」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号３７のヌクレオチド配列または配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるか、または１００％同一であり、
「ＧＳＧ−ｐ２ａ」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号３９のヌクレオチド配列または配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるか、または１００％同一である。
一部の実施形態において、有力候補の本発明の治療用ポリヌクレオチドは、ベクター（非ウイルスベクターおよびウイルスベクターを含む（ＤＮＡおよびＲＮＡ／ｍＲＮＡベクターを含み、直鎖状ベクターであっても環状ベクターであってもよい））に組み込むことができるポリヌクレオチド（および前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）を含み、ここで、前記ポリヌクレオチドは、
ａ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＳＤＦ１α−（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｂ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−（リンカー）−ＳＤＦ１α−３’；
ｃ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＳＤＦ１α−（リンカー）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｄ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（リンカー）−ＶＥＧＦ１６５−（リンカー）−ＳＤＦ１α−３’；
ｅ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｆ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（リンカー）−ＳＤＦ１α−３’；
ｇ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（リンカー）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｈ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（リンカー）−ＳＤＦ１α−３’；
ｉ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｊ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’；
ｋ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｌ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’；
ｍ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｆｍｄｖ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｎ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ｆｍｄｖ）−ＳＤＦ１α−３’；
ｏ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｆｍｄｖ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｐ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ｆｍｄｖ）−ＳＤＦ１α−３’；
ｑ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｒ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’；
ｓ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；
ｔ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’；
ｕ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−３’；
ｖ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１９１−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’；
ｗ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−３’；および
ｘ）  ５’−（プロモーター）−Ｓ１００Ａ１−（ｆｐ２ａ）−ＶＥＧＦ１６５−（ＧＳＧ−ｐ２ａ）−ＳＤＦ１α−３’
からなる群から選択される構築物構成を含み、
「プロモーター」は、任意の転写プロモーター配列であり、
「Ｓ１００」は、Ｓ１００タンパク質ファミリー内の任意のポリペプチド、そのアイソフォーム、または断片をコードし、
「ＳＤＦ」は、ＳＤＦタンパク質ファミリー内の任意のポリペプチド、そのアイソフォーム、または断片をコードし、
「ＶＥＧＦ」は、ＶＥＧＦタンパク質ファミリー内の任意のポリペプチド、そのアイソフォーム、または断片をコードし、
括弧符号「（」および「）」は、コーディング配列か非コーディング配列かに関係なく、任意の数の追加のヌクレオチド（ｎｔ）（０〜１０００ｎｔ）を示し、
「リンカー」は、隣接する生物学的に活性なポリペプチドの発現に有用な任意のリンカーを示し、
「Ｓ１００Ａ１」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号１０５のヌクレオチド配列または配列番号１０４のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一であるか、または１００％同一であり、
「ＳＤＦ−１α」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号１０３のヌクレオチド配列または配列番号１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一であるか、または１００％同一であり、
「ＶＥＧＦ１６５」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号１２７のヌクレオチド配列または配列番号１２６のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一であるか、または１００％同一であり、
「ＶＥＧＦ１９１」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号１０７のヌクレオチド配列または配列番号１０６のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一であるか、または１００％同一であり、
「ｆｐ２ａ」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号４１のヌクレオチド配列または配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるか、または１００％同一であり、
「ｆｍｄｖ」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号３５のヌクレオチド配列または配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるか、または１００％同一であり、
「ｐ２ａ」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号３７のヌクレオチド配列または配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるか、または１００％同一であり、
「ＧＳＧ−ｐ２ａ」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、それぞれ、配列番号３９のヌクレオチド配列または配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるか、または１００％同一である。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、うっ血性心不全を処置するために使用され得る（例えば、本発明の組成物は、最終目標として左室補助デバイス（ＬＶＡＤ）が植え込まれた患者におけるうっ血性心不全を処置するために使用され得る）。
【００８５】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、逆行性冠状静脈洞注入（ＲＣＳＩ）を通じて患者に投与される。
【００８６】
一実施形態において、本発明の組成物は、動物モデル（例えば、ブタ（ブタモデル）であるがこれに限定されない）に投与され、ここで、心筋虚血の動物モデルの研究には、逆行性冠状静脈洞注入（ＲＣＳＩ）が使用される。
【００８７】
ある特定の実施形態において、ｐＸｏＸにおける各エフェクターの機能性を、トランスフェクトした健常者および罹患患者の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する心筋細胞において、エフェクター特異的アッセイを使用して検証した。特に、Ｓ１００Ａ１は、収縮特性の改善を呈した。ＳＤＦ−１αは、ＣＸＣＲ４依存性のＪｕｒｋａｔ細胞および末梢リンパ球（ＰＢＬ）の遊走を誘導することが示された。ＶＥＧＦ１６５は、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖の増加を呈した。
【００８８】
別の実施形態において、健常者および罹患患者の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の心筋細胞におけるインビトロでのｐＸｏＸのトランスフェクションの安全性の試験は、心電図（ＥＣＧ）のＱＴ時間に対する作用と緊密に相関するフィールド電位間隔（ＭＥＡ）における変化の評価に基づいて、心伝導に対する悪影響の危険性を示さなかった。
【００８９】
別の実施形態において、ｐＸｏＸのトランスフェクションにより、拡張型心筋症患者のｉＰＳＣ−ＣＭにおいて、心拍数、収縮間隔、および収縮速度が、健常な表現型由来のｉＰＳＣ−ＣＭにおいて見られるものに匹敵するレベルまで、回復した。好ましい実施形態において、収縮特性における最良の改善が、単一または二重エフェクターのプラスミドと比較して、ｐＸｏＸ三重エフェクタープラスミドで観察された。
【００９０】
ある特定の実施形態において、本発明のベクターおよびポリヌクレオチド構築物は、表１に記載されるものなど、二重遺伝子（ダブル遺伝子）配列（および、それによってコードされるポリペプチド）を含む。
【００９１】
【表１−１】
2018536405.tif 000003
【００９２】
【表１−２】
2018536405.tif 000004
「ＣＡＧ」および「ＮＸＢ−Ｖ２」ベクターエレメントの配列
【００９３】
2018536405.tif 000005
【００９４】
プロモーター
プロモーターは、発現の全体的な強度ならびに細胞特異性を決定し得る、ベクターゲノム設計内における主要なシス作用エレメントである。プロモーターは、偏在的プロモーター、細胞特異的プロモーター、またはそれらの組合せであり得る。偏在的プロモーターまたは構成的プロモーターは、数例挙げると、ＣＭＶ、ＣＢＡ（ＣＡＧおよびＣＢｈ）、ＥＦ−１アルファ、ＰＫＧ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ（ｈＧＢｐ）、ＵＣＯＥであり得る。プロモーターは、目的とされる標的細胞内において活性を有するプロモーター、例えば、心臓関連プロモーターであり得る。一部の事例において、プロモーターは、ＣＡＧである。他の事例において、プロモーターは、Ｅｆ１ａなどの構成的プロモーターである。プロモーターは、ヒトＥｆ１ａ（ｈＥｆ１ａ）などのヒトプロモーターであり得る。双方向性プロモーターを使用することもできる。例えば、構成的双方向性プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターであり得る。
【００９５】
遺伝子産物ポリペプチドが分泌されるものなど、一部の実施形態において、すべての細胞型または選択的細胞型における偏在的発現が、所望される場合がある。ヒト伸長因子１α−サブユニット（ＥＦ１α）、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）、およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）などの構成的プロモーターは、ほとんどの組織において発現を促進するために使用することができる（Husain et al., 2009、Qin et al., 2010、Norrman et al., 2010）。一般に、ＣＢＡおよびＣＡＧは、構成的プロモーターの中でも、より大きな発現を促進するが（Xu et al., 2001、Yin et al., 2011）、しかしながら、約１．７ｋｂというサイズは、ＣＭＶ（約０．８ｋｂ）またはＥＦ１α（約１．２ｋｂ）と比較して、パッケージングの制約を有するベクターでは使用が限定され得る。一部の事例において、ＧＵＳＢまたはＵＢＣプロモーターは、それぞれ、３７８塩基対および４０３塩基対というより小さなサイズで、偏在的な遺伝子発現をもたらすことができるが、それらは、ＣＭＶまたはＣＢＡプロモーターよりも大幅に微弱であり得る（Husain et al., 2009、Qin et al., 2010）。したがって、発現に影響を及ぼすことなくサイズを縮小するために、構成的プロモーターに対する修飾が続けられており、例えば、ＣＢｈ（約８００塩基対）およびミニＣＢＡ（約８００塩基対）などの例では、選択された組織において、同程度またはより高い発現を促進することができる（Gray et al., 2011）。一部の事例において、「偏在的」プロモーターは、サイレンシングを受けやすい可能性があるか、または選択された細胞型における差次的発現強度を促進し得る（McCown et al., 1996、Klein et al., 1998、Gray et al., 2011）。
【００９６】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するウイルスエンハンサーおよびプロモーターを使用して、心筋細胞など、広範な哺乳動物細胞型および組織型において、高レベルの発現を達成することができる。ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターおよび真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）プロモーターなどの構成的哺乳動物プロモーターは、より持続的な発現を有し得る。組織特異的プロモーターは、標的外の導入遺伝子発現を低減させるために利用することができる。ポリアデニル化シグナル、イントロン、および足場／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）５２を含む、多数のシス作用配列は、一部の事例において、導入遺伝子発現のレベルおよび持続性を増加させ得る。
【００９７】
細菌骨格を欠く小型のＤＮＡベクター（例えば、ミニサークル）は、完全長ＤＮＡプラスミドと比較して、優れた遺伝子発現のレベルおよび持続期間を維持し得る。ドッグボーンベクターもまた、利用され得る。ドッグボーンベクターは、細菌の使用を伴うことなく生成することができる。一部の事例において、脂質に基づくＤＮＡベクターもまた、使用され得、一部の事例においては、トランスポゾン系が、利用され得る。例えば、トランスポジション系（transposition system）は、リコンビナーゼｐｈｉＣ３１、ＰｉｇｇｙＢａｃ５７、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、またはそれらの組合せであり得るか、またはそれらに基づくものであり得る。
【００９８】
一部の事例において、本明細書に記載される心臓遺伝子エフェクターベクターは、リコンビナーゼの使用を介して細胞ゲノムに組み込まれ得る（図２）。リコンビナーゼは、結合部位リコンビナーゼであり得る。一部の事例において、リコンビナーゼは、米国特許第９，０３４，６５０号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０２７５２３２号明細書、国際公開第２００８／０７３１５４号パンフレットに記載されているリコンビナーゼから選択され得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９９】
リコンビナーゼは、リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを介して細胞に導入され得る。ある特定の実施形態において、細胞ゲノムへのリコンビナーゼの組込みは、リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡの使用を介したリコンビナーゼの導入および発現によって防止され得る。一部の事例において、リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡまたはｃＧＭＰ−グレードのｍＲＮＡであり得る（図１）。
【０１００】
一部の事例において、リコンビナーゼは、「自殺遺伝子」およびリコンビナーゼをコードする遺伝子を含む発現プラスミドを介して、細胞に導入され得る。ある特定の実施形態において、自殺遺伝子およびリコンビナーゼ遺伝子は、介在する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離され得る。
【０１０１】
一部の事例において、ベクターが導入され、ゲノムに組み込まれる（例えば、リコンビナーゼを介して）細胞は、初代細胞（例えば、心筋細胞などであるがこれに限定されない（図２））であり得る。一部の事例において、ベクター内のコードされる遺伝子は、細胞において標的とされるゲノム位置で、ゲノムに挿入され得る。
【０１０２】
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントは、１つの転写産物から複数の遺伝子の発現を可能にし得る（Mountford and Smith 1995）。「ＩＲＥＳ」という用語は、本明細書において使用されるとき、内部リボソーム進入部位を意味することが意図され得る。ＩＲＥＳ配列を含むベクターにおいて、第１の遺伝子は、キャップ依存性のリボソームスキャニング機構によって、それ自体の５’−ＵＴＲとともに翻訳され得、一方で後続の遺伝子の翻訳は、キャップ非依存的様式で、ＩＲＥＳにリボソームを直接動員することによって、達成され得る。
【０１０３】
ＩＲＥＳ配列により、真核生物リボソームが結合し、５’キャップ末端への結合を伴うことなく翻訳を開始することが可能となり得る。ある特定の事例において、ＩＲＥＳ領域は、ピコルナウイルス、脳心筋炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどのウイルスのＩＲＥＳ配列に由来し得る。他の事例において、ＩＲＥＳ配列は、脳心筋炎ウイルスに由来し得る。「ＥＭＣＶ」または「脳心筋炎ウイルス」という用語は、本明細書において使用されるとき、ピコルナウイルス科の属の脳心筋炎ウイルス種の任意の分離株または株を指す。例としては、ＥＭＣＶ−Ｒ（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ）株ウイルス、コロンビアＳＫウイルスである。一部の事例において、細胞ＩＲＥＳエレメント、例えば、真核生物開始因子４Ｇ、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子、血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子−１  ＩＲＥＳ、またはこれらの任意の組合せもしくは修飾形態が、使用され得る。一部の事例において、細胞ＩＲＥＳは、ウイルスＩＲＥＳと比較した場合に、遺伝子発現の増加を有し得る。
【０１０４】
「ＣＡＰ」または「キャップ」という用語は、本明細書において使用されるとき、修飾されたヌクレオチド、一般に、７−メチルグアノシンが３’から５’（７ｍｅＧ−ｐｐｐ−Ｇ）で真核生物ｍＲＮＡの５’末端に結合したものを指し、そのｍＲＮＡからのタンパク質の発現の際に、通常の翻訳開始経路において必要とされるエレメントとして機能する。
【０１０５】
ウイルス、細胞、またはそれらの組合せのＩＲＥＳ配列が、ベクターにおいて利用され得る。ＩＲＥＳは、脳心筋炎（ＥＭＣＶ）またはポリオウイルス（ＰＶ）由来であり得る。
【０１０６】
一部の事例において、ＩＲＥＳエレメントは、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳脊髄炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１）、アイチウイルス（ＡｉＶ）、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、潜伏型ヒトサイトメガロウイルス（ｐＵＬ１３８）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＮＡ−１）、マレック病ヘルペスウイルス（ＭＤＶ  ＲＬＯＲＦ９）、ポリシストロン性ＳＶ４０  １９Ｓ（ＳＶ４０  １９Ｓ）、ムギクビレアブラムシ（Rhopalosiphum padi）ウイルス（ＲｈＰＶ）、コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、ウスジロエダシャク（Ectropis obliqua）ピコルナ様ウイルス（ＥｏＰＶ）、チャバネアオカメムシ（Plautia stali）消化管ウイルス（ＰＳＩＶ）、サシガメウイルス（ＴｒＶ）、ハチ麻痺ジシストロウイルス（ＩＡＰＶ、ＫＢＶ）、クロフサスグリ退化（Black currant reversion）ウイルス（ＢＲＶ）、テンジクアオイ（Pelargonium）花片モザイク（flower break）ウイルス（ＰＦＢＶ）、ハイビスカス退緑斑（Hibiscus chlorotic ringspot）ウイルス（ＨＣＲＳＶ）、アブラナ感染性トバモウイルス（Crucifer-infecting tobamovirus）（ＣｒＴＭＶ）、ジャガイモ葉巻ポレロウイルス（ＰＬＲＶ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ジアルジアウイルス（ＧＬＶ）、リーシュマニアＲＮＡウイルス−１（ＬＲＶ−１）、およびそれらの組合せまたは修飾形態からなる群から選択される。
【０１０７】
一部の事例において、ＩＲＥＳは、Ａｐａｆ−１、ＸＩＡＰ、ＨＩＡＰ２／ｃ−ＩＡＰ１、ＤＡＰ５、Ｂｃｌ−２、ｃ−ｍｙｃ、ＣＡＴ−１、ＩＮＲ、分化ＬＥＦ−１、ＰＤＧＦ２、ＨＩＦ−１ａ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＢｉＰ、ＢＡＧ−１、ＣＩＲＰ、ｐ５３、ＳＨＭＴ１、ＰＩＴＳＬＲＥｐ５８、ＣＤＫ１、Ｒｐｒ、ｈｉｄ、ｈｓｐ７０、ｇｒｉｍ、ｓｋｌ、アンテナペディア、ｄＦｏｘＯ、ｄＩｎＲ、Ａｄｈ−Ａｄｈｒ、ＨＳＰ１０１、ＡＤＨ、ＵＲＥ−２，ＧＰＲ１、ＮＣＥ１０２、ＹＭＲ１８１ａ、ＭＳＮ１、ＢＯＩ１、ＦＬＯ８、ＧＩＣ１、およびそれらの任意の組合せまたは修飾形態からなる群から選択される。
【０１０８】
ＩＲＥＳエレメントが、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間に含まれる場合、翻訳の開始は、第１のＯＲＦにおけるカノニカル５’−ｍ７ＧｐｐｐＮキャップ依存性機構、およびＩＲＥＳエレメントの下流の第２のＯＲＦのキャップ非依存性機構によって生じ得る。
【０１０９】
一部の事例において、遺伝子は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結され得る。ＩＲＥＳは、複数の遺伝子の同時発現を可能にし得る。例えば、ＩＲＥＳ配列は、単一のｍＲＮＡ転写産物からの複数のタンパク質の産生を可能にし得る。リボソームは、５’−キャップ非依存性様式でＩＲＥＳに結合し、翻訳を開始し得る。
【０１１０】
一部の事例において、ＩＲＥＳ配列は、約５００塩基対であり得るか。ＩＲＥＳ配列は、３００塩基対〜１０００塩基対であり得る。例えば、ＩＲＥＳは、３００塩基対、３５０塩基対、４００塩基対、４５０塩基対、５００塩基対、５５０塩基対、６００塩基対、６５０塩基対、７００塩基対、７５０塩基対、８００塩基対、８５０塩基対、９００塩基対、９５０塩基対、または１０００塩基対の長さであり得る。
【０１１１】
一部の事例において、ＩＲＥＳ配列を含むベクター内の下流の遺伝子の発現が、低減され得る。例えば、ＩＲＥＳ配列に続く遺伝子は、ＩＲＥＳ配列に先行する遺伝子よりも発現が低減され得る。発現の低減は、先行する遺伝子よりも１％〜９９％の低減であり得る。
【０１１２】
一部の事例において、ウイルス２Ａ配列が使用され得る。２Ａ配列は、ピコルナウイルス２Ａ配列に由来し得る。ピコルナウイルス２Ａ配列は、エンテロウイルス２Ａ配列、ライノウイルス２Ａ配列、カルジオウイルス２Ａ配列、アフトウイルス２Ａ配列、肝炎ウイルス２Ａ配列、エルボウイルス２Ａ配列、コブウイルス２Ａ配列、テッショウウイルス２Ａ配列、およびパレコウイルス２Ａ配列からなる群から選択され得る。
【０１１３】
２Ａエレメントは、ＩＲＥＳよりも短くてもよく、５〜１００塩基対を有する。一部の事例において、２Ａ配列は、長さが５塩基対、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、３５塩基対、４０塩基対、４５塩基対、５０塩基対、５５塩基対、６０塩基対、６５塩基対、７０塩基対、７５塩基対、８０塩基対、８５塩基対、９０塩基対、または１００塩基対であり得る。２Ａが連結された遺伝子は、単一のオープンリーディングフレームにおいて発現され得、「自己切断」が、２ＡポリペプチドのＣ末端において、最後の２つのアミノ酸であるＧＰの間で同時翻訳的に生じ、等量のタンパク質の共発現が生じ得る。一部の事例において、２Ａ配列を含むポリペプチドは、切断後に等量のタンパク質を生じない場合がある。一部の事例において、第１のタンパク質は、第２のタンパク質と比較して、濃度が、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または最大１００％高い場合がある。一部の事例において、第２のタンパク質は、第２のタンパク質と比較して、濃度が、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または最大１００％高い場合がある。
【０１１４】
ウイルス２Ａ配列は、約２０個のアミノ酸であり得る。一部の事例において、ウイルス２Ａ配列は、コンセンサスモチーフＡｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１１７）を含み得る。コンセンサスモチーフ配列は、同時翻訳的に作用し得る。例えば、グリシン残基とプロリン残基との間の通常のペプチド結合の形成は、保存され得、これにより、リボソームスキッピングが生じ、それによって、発生するポリペプチドの「切断」が生じ得る。この作用により、等モルレベルで複数の遺伝子が産生され得る。
【０１１５】
２Ａペプチドは、単一のオープンリーディングフレームにおける複数のタンパク質のポリペプチドへの翻訳を可能にし得、このポリペプチドが、続いて、リボソームスキッピング機構を通じて個々のポリペプチドに「切断」され得る（Funston, Kallioinen et al. 2008）。一部の実施形態において、「２Ａ」配列としては、ｐ２ａ、ＧＳＧ−ｐ２ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ、ならびにそれらの任意の組合せを挙げることができる。
【０１１６】
ベクターはまた、ポリペプチド産物の酵素切断によって、例えば、第２の遺伝子を起源とする発現産物の産生を可能にする、ポリシストロン遺伝子の間に位置する追加の２Ａ／フリン配列を含み得る。一部の事例において、多重遺伝子ベクターにおいて複数の遺伝子の間の切断を促進するために、追加のリンカーが利用され得る。
【０１１７】
一部の事例において、ベクターは、ＩＲＥＳ配列および２Ａ配列を含み得る。他の事例において、２Ａペプチドが連結された複数の遺伝子の発現は、２Ａペプチドよりも前のスペーサー配列（ＧＳＧ）によって促進され得る。一部の事例において、構築物は、スペーサー、リンカー、アダプター、プロモーター、またはそれらの組合せを組み合わせることができる。例えば、構築物は、スペーサー（ＳＧＳＧ（配列番号１１８）またはＧＳＧ）およびフリンリンカー（ＲＡＫＲ（配列番号３２））切断部位を、異なる２Ａペプチドとともに有し得る。スペーサーは、Ｉ−Ｃｅｕｉ（イントロンコーディングエンドヌクレアーゼ）であり得る。ある特定の実施形態において、心臓関連エフェクター遺伝子のうちの２つ以上は、介在する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。
【０１１８】
ポリヌクレオチドリンカー
本明細書に記載された実施形態において、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書に記載されたポリヌクレオチドにおいて利用することができる。ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターに適合する末端構造を作成するために添加されてもよい所望の制限部位を含有するＤＮＡの二本鎖セグメントであり得る。一部の事例において、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターを改変するのに有用であり得る。例えば、ポリヌクレオチドリンカーを含むベクターの改変は、マルチクローニングサイトの変化、またはポリヒスチジンテールの付加であり得る。インサートＤＮＡの平滑末端に適応させるためにポリヌクレオチドリンカーを使用して、制限酵素で切断された粘着最終末端を有するベクターにクローニングすることもできる。ポリヌクレオチドリンカーの使用は、ベクターへのブラントライゲーションよりも効率的である場合があり、下流での適用において、ベクターからインサートを放出させる方法を提供することができる。一部の事例において、インサートは、治療用途に有用なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であり得る（例えば、ＳＤＦ１ポリペプチド、Ｓ１００Ａ１ポリペプチド、ＶＥＧＦポリペプチド並びにその断片およびバリアント）。
【０１１９】
ポリヌクレオチドリンカーは、オリゴマーであり得る。例えば、リンカーは、５から２０ヌクレオチド長であり得る。ポリヌクレオチドリンカーは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド長であってもよく、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド長であってもよい。ポリヌクレオチドリンカーは、ＤＮＡ二本鎖、一本鎖、またはそれらの組合せであり得る。一部の事例において、リンカーは、ＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドリンカーは、一部の事例において、Ｔ４リガーゼによって、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターにライゲーションすることができる。ライゲーションを促進するために、過剰なポリヌクレオチドリンカーをインサートおよびベクターを含む組成物に添加することができる。一部の事例において、インサートおよびベクターは、リンカーを導入する前に前処置される。例えば、メチラーゼを用いる前処置により、インサートＤＮＡの望ましくない切断を予防することができる。
【０１２０】
ポリペプチドリンカー
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されたポリヌクレオチドによってコードされた２個以上のポリペプチドをリンカーポリペプチドをコードする介在配列によって分離することができる。ある特定の実施形態において、リンカーは、切断されやすいリンカーである。一部の実施形態において、目的のポリペプチドは、切断されやすいリンカーポリペプチドによって連結された融合タンパク質として発現される。ある特定の実施形態において、切断されやすいリンカーポリペプチドは、以下のうちの任意の１つまたは２つであり得る：以下に記載したフリンリンク、ｆｍｄｖ、ｐ２ａ、ＧＳＧ−ｐ２ａ、および／またはｆｐ２ａ。一部の事例において、リンカーは、ＡＰＶＫＱＧＳＧ（配列番号１１９）である。
【０１２１】
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、アミノ酸配列「ＲＡＫＲ」（配列番号３２）を含み得る。ある特定の場合には、フリンリンカーポリペプチドは、「ＣＧＴＧＣＡＡＡＧＣＧＴ」を含むポリヌクレオチド配列（配列番号３３）によってコードされ得る。
【０１２２】
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、以下の表に開示された配列を含むリンカーであり得る。
【０１２３】
【表２】
2018536405.tif 000006
【０１２４】
一部の実施形態において、リンカーは、本明細書に記載されたポリヌクレオチドにおいて利用され得る。リンカーは、可動性リンカー、剛性リンカー、インビボで切断可能なリンカー、またはそれらの任意の組合せであり得る。一部の事例において、リンカーは、（可動性および剛性リンカーと同様に）機能性ドメインを一緒に連結してもよく、またはインビボで切断可能なリンカーと同様に、インビボで遊離の機能性ドメインを放出してもよい。
【０１２５】
リンカーは、生物学的活性を改善し、発現量を増加させ、望ましい薬物動態プロファイルを達成してもよい。リンカーは、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテル（thioesther）を含むこともできる。
【０１２６】
一部の事例において、本明細書に記載されたリンカー配列は、可動性リンカーを含むことができる。可動性リンカーは、結合されたドメインによってある特定の動きの度合いまたは相互作用が要求される場合に適用され得る。可動性リンカーは、小さな、非極性（例えば、Ｇｌｙ）または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）のアミノ酸から構成され得る。可動性リンカーは、主に一連のＧｌｙおよびＳｅｒ残基からなる配列（「ＧＳ」リンカー）を有する場合がある。可動性リンカーの例は、配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１２０）を有する場合がある。コピー数「ｎ」を調整することによって、この例示のＧＳリンカーの長さを最適化して、機能性ドメインの適当な分離を実現するか、または必要なドメイン内相互作用を維持することができる。ＧＳリンカー以外に、他の可動性リンカーを組換え融合タンパク質のために利用することができる。一部の事例において、可動性リンカーには、ＧｌｙおよびＳｅｒなどの小さいかまたは極性のアミノ酸が豊富に含まれる場合もあるが、可動性を維持するために、ＴｈｒおよびＡｌａなどの追加のアミノ酸を含有することはできない。他の事例において、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性のアミノ酸を使用して、可溶性を改善することができる。
【０１２７】
本明細書に記載されたリンカー配列に含まれる可動性リンカーは、良好な可動性および溶解性をもたらすために、ＧｌｙおよびＳｅｒなどの小さいかまたは極性のアミノ酸を豊富に含むことができる。可動性リンカーは、融合タンパク質ドメインに関して、ある特定の動きまたは相互作用が所望される場合に適切な選択肢となり得る。さらに、可動性リンカーは、剛性の構造を有さなくてもよいが、機能性ドメイン間の距離を保つために、受動性リンカーとしての役割を果たすことができる。可動性リンカーの長さは、融合タンパク質の妥当なフォールディングを可能とするか、または最適な生物学的活性を実現するために調整することができる。
【０１２８】
本明細書に記載されたリンカーは、一部の事例において、剛性リンカーをさらに含むことができる。剛性リンカーは、ポリペプチドのドメイン間の固定距離を維持するために利用されてもよい。剛性リンカーの例は：いくつか例を挙げると、アルファヘリックス形成リンカー、プロリッチ配列、（ＸＰ）ｎ（配列番号１２１）、Ｘ−Ｐｒｏ  ｂａｃｋｂｏｎｅ、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号１２２）。剛性リンカーは、αヘリックス構造を取り入れることによって、または一部の事例において、複数のＰｒｏ残基を含有することによって、比較的硬い構造を示すことができる。
【０１２９】
本明細書に記載されたリンカーは、一部の事例において、切断可能であり得る。他の事例において、リンカーは切断可能ではない。切断可能ではないリンカーは、機能性ドメインと一緒に、共有結合により結合し、インビボプロセスまたはエクスビボプロセス全体を通して、１つの分子として作用する場合がある。切断可能なリンカーは、インビボで遊離の機能性ドメインを放出するために導入することができる。切断可能なリンカーは、いくつか例を挙げると、還元剤、プロテアーゼの存在によって切断され得る。例えば、ジスルフィド結合の還元を利用して切断可能なリンカーを生成してもよい。ジスルフィドリンカーの場合には、グルタチオンなどのチオールを用いるジスルフィド交換を介した切断事象により切断が生じ得る。他の事例において、組換え融合タンパク質におけるリンカーのインビボでの切断は、特定の細胞または組織において、病的状態下（例えば、がんまたは炎症）、インビボで発現され得るプロテアーゼによって実行され、ある特定の細胞区画内に限定される。一部の事例において、切断可能なリンカーは、標的化された切断を可能とする場合がある。例えば、多くのプロテアーゼの特異性により、限定された区画内でのリンカーのより緩徐な切断がもたらされ得る。切断可能なリンカーは、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテルを含むこともできる。例えば、ヒドラゾンは、血清の安定性を付与することができる。他の事例において、ヒドラゾンは、酸性区画内での切断を可能とすることができる。酸性区画は、最大７のｐＨを有し得る。リンカーは、チオエーテルを含むこともできる。チオエーテルは、非還元性であってもよい。チオエーテルは、細胞内のタンパク質分解のために設計することができる。
【０１３０】
ある特定の実施形態において、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、配列番号３４と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る配列を含む。ある特定の実施形態において、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、２つ以上の融合タンパク質を連結する単一のベクターにコードされた１つまたは複数のリンカーである。ある特定の場合には、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列によってコードされ得る。一部の事例において、ｆｍｄｖをコードするＯＲＦは、配列番号３５を含むかまたは配列番号３５からなる。ある特定の実施形態において、ｆｍｄｖをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３５と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１３１】
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、「ｐ２ａ」リンカーであり得る。ある特定の実施形態において、ｐ２ａポリペプチドは、配列番号３６と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る配列を含むことができる。ある特定の実施形態において、ｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つ以上の融合タンパク質を連結する単一のベクターにコードされた１つまたは複数のリンカーであり得る。一部の事例において、ｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列によってコードされ得る。ある特定の実施形態において、ｐ２ａをコードするＯＲＦは、配列番号３７を含むかまたは配列番号３７からなる。ある特定の場合には、ｐ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３７と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるか、または配列番号３７と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。
【０１３２】
一部の事例において、リンカーポリペプチドは、「ＧＳＧ−ｐ２ａ」リンカーであり得る。ある特定の実施形態において、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、配列番号３８と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る配列を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つ以上の融合タンパク質を連結する単一のベクターにコードされた１つまたは複数のリンカーであり得る。一部の事例において、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列によってコードされ得る。ＧＳＧ−ｐ２ａをコードするＯＲＦは、配列番号３９の配列を含むことができる。一部の事例において、ＧＳＧ−ｐ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３９と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるか、または配列番号３９と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。
【０１３３】
リンカーポリペプチドは、本明細書で提供される「ｆｐ２ａ」リンカーであり得る。ある特定の実施形態において、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、配列番号４０と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る配列を含むことができる。ある特定の場合には、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つ以上の融合タンパク質を連結する単一のベクターにコードされた１つまたは複数のリンカーであり得る。一部の事例において、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列によってコードされ得る。ある特定の実施形態において、ｆｐ２ａリンカーをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４１と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるか、または配列番号４１と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。
【０１３４】
一部の事例において、リンカーは、操作され得る。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含むように設計され得る。一部の事例において、少なくとも２つのリンカー配列によって、同じタンパク質が生成され得る。配列は、配列番号４２から配列番号１０１までの配列と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるか、または配列番号４２から配列番号１０１までの配列と少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。他の事例において、複数のリンカーをベクターにおいて使用することができる。例えば、目的遺伝子（例えば、Ｓ１００Ａ１、ＳＤＦ−１α、およびＶＥＧＦ１６５）は、図２０Ａおよび図２０Ｂに示されるように、少なくとも２つのリンカーによって分離され得る。一部の事例において、遺伝子は、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個のリンカーによって分離され得る。
【０１３５】
リンカーは、操作されたリンカーであり得る。リンカーを設計する方法は、コンピューターの計算によるものであってもよい。一部の事例において、コンピューターによる計算方法は、グラフィック技法を含むことができる。コンピューターによる計算方法を使用して、データベースに由来する三次元ペプチド構造のライブラリーから適切なペプチドを検索することができる。例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）を使用して、リンカーの選択されたアミノ酸間の空間の距離を測ることができる。
【０１３６】
【表３−１】
2018536405.tif 000007
【０１３７】
【表３−２】
2018536405.tif 000008
【０１３８】
一部の実施形態は、フリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドであって、フリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドが、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチドリンカーによって結合しているポリヌクレオチドである。一部の事例において、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ）（Ｇ）、アラニン（Ａｌａ）（Ａ）、バリン（Ｖａｌ）（Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ）（Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）（Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ）（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）（Ｆ）、メチオニン（Ｍｅｔ）（Ｍ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）（Ｗ）からなるリストから選択される。一部の事例において、リンカーは、本明細書に開示された表３に提供される配列を含む。一部の事例において、ポリペプチドリンカーは、１種または複数のＧＳリンカー配列、例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号：１０９）、（ＳＧ）ｎ（配列番号１１０）、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号１１１）および（ＳＧＳ）ｎ（配列番号１１２）（ｎは、０から１５までの任意の数であり得る）を含んでもよい。
【０１３９】
ポリペプチド構築物の改善された発現を得る方法であって、第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドを含む前記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドを提供するステップであって、前記第１の機能性ポリペプチドおよび第２の機能性ポリペプチドが、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むリンカーポリペプチドによって結合される、ステップと、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるステップであって、前記発現が、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むリンカーポリペプチドを有さない対応するポリペプチド構築物と比較して、ポリペプチド構築物の改善された発現をもたらす、発現させるステップとを含む方法が提供される。一部の事例において、リンカーは、本明細書で開示された表３に提供される配列を含む。一部の事例において、ポリペプチドリンカーは、１種または複数のＧＳリンカー配列、例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号１０９）、（ＳＧ）ｎ（配列番号１１０）、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号１１１）および（ＳＧＳ）ｎ（配列番号１１２）（ｎは、０から１５までの任意の数であり得る）を含んでもよい。一部の事例において、改善された発現は、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号４２）に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むリンカーポリペプチドを有さない対応するポリペプチド構築物と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％高い。
【０１４０】
好ましい実施形態において、本発明の特有の態様が提供され、本発明の構築物によってコードされたポリペプチドの特異的な順番によって可能となる。したがって、本発明の一態様では、Ｓ１００Ａ１タンパク質を特異的に配置することは、最初に、Ｓ１００Ａ１に残存する２ＡテールがＳ１００Ａ１の生物学的活性に干渉しないことが驚くべきことに発見されたので、生物学的に活性なＳ１００Ａ１分子の機能的発現を達成し、可能とする。これに対して、第２の遺伝子としてＳ１００Ａ１を配置することにより、構築物を介して発現した遺伝子の不完全な切断が生じることが発見された。
【０１４１】
したがって、以下の表１３に示されるように、質量分析法を使用するｐＸｏＸ発現の分析により、Ｓ１００Ａ１が、Ｃ末端２Ａペプチドの除去をもたらすフリンの切断を示さない唯一のエフェクターであることが示された。よって、ＳＤＦ１αまたはＶＥＧＦに残された２ＡのＣ末端テールは存在しない。Ｓ１００Ａ１のみが存在する２Ａリンカーテールを有する。適格な終末のアミノ酸配列は、ＰＧである。終末のＰＧＰ配列のＧとＰの間が切断される。よって、ｐＸｏＸから発現したＳ１００Ａ１のＣ末端リンカーテールは、本明細書において「２Ａテール」と称される場合のある（Ｎ末端）−ＲＡＫＲＡＰＶＫＱＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ−（Ｃ末端）（配列番号１２３）に融合したＳ１０１Ａ１ポリペプチドの配列（ＮからＣ末端）を含む。例えば、一実施形態において、Ｓ１００Ａ１の最初のメチオニンから切断されたＣ末端終末のｆｐ２ａリンカーのテールまで、本発明の最初のＧＯＩは、配列：
ＭＧＳＥＬＥＴＡＭＥＴＬＩＮＶＦＨＡＨＳＧＫＥＧＤＫＹＫＬＳＫＫＥＬＫＥＬＬＱＴＥＬＳＧＦＬＤＡＱＫＤＶＤＡＶＤＫＶＭＫＥＬＤＥＮＧＤＧＥＶＤＦＱＥＹＶＶＬＶＡＡＬＴＶＡＣＮＮＦＦＷＥＮＳＲＡＫＲＡＰＶＫＱＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号１２４）を含み、これは、ポリヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＣＧＣＧＣＡＴＡＧＣＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＴＧＴＣＡＡＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＡＴＴＧＡＧＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＧＡＴＧＴＣＧＡＴＧＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＧＡＣＧＡＧＡＡＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＴＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＡＣＴＧＴＡＧＣＡＴＧＣＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＣＡＣＧＴＧＣＡＡＡＧＣＧＴＧＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡ（配列番号１２５）によってコードされる場合があるか、または上記で言及した２Ａテールと同じアミノ酸配列、もしくは上記で言及した２Ａテールと少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり得るアミノ酸配列もしくは核酸配列をコードするポリヌクレオチドを変性する場合がある。
【０１４２】
しかしながら、本明細書で提示されたデータによって提供されるように、このＳ１００Ａ１テールは「不活性」であり、すなわち、Ｓ１００Ａ１の機能（生物学的活性）に影響を及ぼさないことが実証された。
【０１４３】
ベクターの修飾
本明細書に記載された方法および組成物に対して有用なポリヌクレオチドベクターは、適正製造規範（ＧＭＰ）適合性ベクターであり得る。例えば、ＧＭＰベクターは、非ＧＭＰベクターより純粋であってもよい。一部の事例において、純度は、バイオバーデンによって測定され得る。例えば、バイオバーデンは、ベクター組成物における好気性菌、嫌気性菌、胞子菌、真菌、またはそれらの組合せの有無であり得る。一部の事例において、純粋なベクターは、エンドトキシンが少量であるか、またはエンドトキシンを含まない可能性がある。純度は、二本鎖プライマーウォーキングシークエンスによっても測定され得る。プラスミドの同一性は、ベクターの純度を決定する情報源となり得る。本発明のＧＭＰベクターは、非ＧＭＰベクターより１０％から９９％より高い純度であり得る。ＧＭＰベクターは、バイオバーデン、エンドトキシン、シークエンシング、またはそれらの組合せの存在によって測定すると、非ＧＭＰベクターより１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％高い純度となり得る。
【０１４４】
一部の事例において、第１の遺伝子プログラムの終わりのターミネーター配列が使用される。ターミネーター配列により、第２の遺伝子プログラムが開始する前に転写が終結することを確実にすることができる。例えば、発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含有してもよい。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’の非翻訳領域から通常利用でき、場合によっては、３’から利用できる。これらの領域は、ｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有し得る。発現ベクターを含む細胞は、インビボまたはインビトロのいずれかで、所望のポリペプチドの発現をもたらす条件下で成長する。
【０１４５】
一部の事例において、ベクターのポリヌクレオチドによってコードされた第１のポリペプチドの末端において、スペーサー配列を使用することができる。他の事例において、ベクターの第２の遺伝子の末端において、スペーサー配列を使用することができる。スペーサー配列は、ベクターの第１の遺伝子および第２の遺伝子の後でも使用され得る。
【０１４６】
目的遺伝子、または目的遺伝子の部分によってコードされたポリペプチドを発現させるために、これらのベクターを使用することができる。遺伝子の部分または遺伝子は、ウイルスまたは非ウイルス性の任意の方法を使用することによって挿入され得る。例えば、方法は、非ウイルスベースの技法であり得る。
【０１４７】
一部の事例において、ベクターの改変がなされ得る。例えば、改変として、制御された遺伝子の発現を誘導する遺伝子スイッチの付加、順序の変化、および／または組み合わされる心臓のエフェクター遺伝子の選択、プロモーターの置き換え（例えば、強力な、左心室の特異的発現）、およびそれらの組合せを挙げることができる。
【０１４８】
ある特定の実施形態において、本発明のベクターにおいて、心臓のエフェクターポリペプチドをコードする配列に先行する翻訳開始配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含む。これは、本明細書で与えられる説明において、「Ｋｏｚａｋ」＝「Ｙｅｓ」として示される場合がある。
【０１４９】
ある特定の実施形態において、本発明のベクターにおいて、心臓のエフェクターポリペプチドをコードする配列に先行する翻訳開始配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含まない。これは、本明細書で与えられる説明において、「Ｋｏｚａｋ」＝「Ｎｏ」として示される場合がある。
【０１５０】
ある特定の実施形態において、任意の１、２、または３つの心臓のエフェクターポリペプチド（ＳＤＦ１、ｓ１００Ａ１およびＶＥＧＦ１９１など）の発現が、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを介して駆動される場合がある。ある特定の場合には、少なくとも２つの遺伝子の発現は等しい。他の事例において、少なくとも２つの遺伝子の発現は等しくない。一部の事例において、上流の遺伝子は、下流の遺伝子よりも高い濃度で発現する場合がある。他の事例において、下流の遺伝子は、上流の遺伝子よりも高い濃度で発現する場合がある。リンカーは、発現レベルを制御するのに関与する場合がある。例えば、切断可能なリンカーは、切断がより効率的であるか、またはより非効率的であるように操作されてもよい。
【０１５１】
一部の事例において、誘導性プロモーターは、小分子リガンド誘導性２ポリペプチドエクジソン受容体ベース遺伝子スイッチであり得る。一部の事例において、遺伝子スイッチは、これらに限定されないが、以下に記載されたシステムのいずれかに記載されたエクジソンベースの受容体成分から選択され得る：それぞれ、参照によりその全体が組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００１／００９０５０（国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット）；米国特許第７，０９１，０３８号明細書；同第７，７７６，５８７号明細書；同第７，８０７，４１７号明細書；同第８，２０２，７１８号明細書；ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０３０６０８（国際公開第２００２／０２９０７５号パンフレット）；米国特許第８，１０５，８２５号明細書；同第８，１６８，４２６号明細書；ＰＣＴ／１Ｊ５２００２／００５２３５（国際公開第２００２／０６６６１３号パンフレット）；米国特許出願第１０／４６８，２００号明細書（米国特許出願公開第２０１２０１６７２３９号明細書）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５７０６（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）；米国特許第７，５３１，３２６号明細書；同第８，２３６，５５６号明細書；同第８，５９８，４０９号明細書；ＰＣＴ／Ｕ５２００２／００５０９０（国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット）；米国特許第８，７１５，９５９号明細書（米国特許出願公開第２００６０１００４１６）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５２３４（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）；米国特許第７，６０１，５０８号明細書；同第７，８２９，６７６号明細書；同第７，９１９，２６９号明細書；同第８，０３０，０６７号明細書；ＰＣＴ／Ｕ５２００２／００５７０８（国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）；米国特許出願第１０／４６８，１９２号明細書（米国特許出願公開第２０１１０２１２５２８号明細書）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０２６（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）；米国特許第７，５６３，８７９号明細書；同第８，０２１，８７８号明細書；同第８，４９７，０９３号明細書；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５０８９（国際公開第２００５／１０８６１７号パンフレット）；米国特許第７，９３５，５１０号明細書；同第８，０７６，４５４号明細書；ＰＣＴ／Ｕ５２００８／０１１２７０（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）；米国特許出願第１２／２４１，０１８号明細書（米国特許出願公開第２００９０１３６４６５号明細書）；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１５６３（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット）；米国特許出願第１２／２４７，７３８号明細書（米国特許出願公開第２００９０１２３４４１号明細書）；ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５５１０（国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット）；米国特許出願第１３／１２３，１２９号明細書（米国特許出願公開第２０１１０２６８７６６号明細書）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２９６８２（国際公開第２０１１／１１９７７３号パンフレット）；米国特許出願第１３／６３６，４７３号明細書（米国特許出願公開第２０１３０１９５８００号明細書）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２７５１５（国際公開第２０１２／１２２０２５号パンフレット）；および米国特許出願第１４／００１，９４３号明細書（米国特許出願公開第２０１４０３０８２４７号明細書）。
【０１５２】
一部の事例において、エクジソン受容体ベース誘導性遺伝子スイッチ調節の用量調節型制御に使用されるリガンドは、これらに限定されないが、エクジステロイド、例えば、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡなど、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、例えば、米国特許第６，０１３，８３６号明細書；同第５，１１７，０５７号明細書；同第５，５３０，０２８号明細書；および同第５，３７８，７２６号明細書ならびに米国特許出願公開第２００５／０２０９２８３号明細書および同第２００６／００２０１４６号明細書に開示されたもの；米国特許出願公開第２００４／０１７１６５１号明細書に記載されたオキサジアゾリン；ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、例えば、欧州特許出願公開第４６１，８０９号明細書に開示されたもの；Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン、例えば、米国特許第５，２２５，４４３号明細書に開示されたもの；Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン、例えば、欧州特許出願公開第２３４，９９４号明細書に開示されたもの；Ｎ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン、例えば、米国特許第４，９８５，４６１号明細書に開示されたもの；アルニドケトン、例えば、米国特許出願公開第２００４／００４９０３７号明細書に開示されたもの（文献のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）ならびに３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、フラメソル、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル、幼若ホルモンＩＩＩなどを含む他の同様の材料のいずれかから選択され得る。本発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例として、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸  Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド−  ）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸  Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）が挙げられる。例えば、両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／１５５，１１１号明細書、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７５７号を参照のこと。
【０１５３】
一部の実施形態において、目的のポリペプチドを発現する２または３つの目的遺伝子（例えば、これらに限定されないが、心臓のエフェクター遺伝子）は、単一のプロモーターの制御下で、単一のベクターに組み込まれ、および／またはそれから発現され得る。ある特定の実施形態において、単一のプロモーターは構成的プロモーターである。ある特定の実施形態において、単一のプロモーターは小分子リガンド誘導性エクジソン受容体ベースプロモーターである。
【０１５４】
ある特定の実施形態において、遺伝子スイッチポリペプチドの発現は、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）プロモーターの制御下にある。
【０１５５】
ベクターは、以下に記載するように、対象への投与により、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所投与により、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、エクスビボで、細胞、例えば、対象から外植された細胞（例えば、心筋細胞、心組織生検）に送達された後、通常はベクターが組み込まれた細胞を選択した後、対象に細胞を再移植され得る。選択の前または後に細胞は増殖され得る。
【０１５６】
本明細書に記載されたいずれかの核酸送達プラットフォーム、例えば、ヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションを用いる細胞のトランスフェクション効率は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９％より高いか、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９％より高い場合がある。
【０１５７】
遺伝子の細胞（例えば、これらに限定されないが、心筋細胞）への組込み効率は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９％より高いか、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９％より高い場合がある。
【０１５８】
本明細書に開示されたある特定の態様では、ベクターを利用することができる。例えば、使用できるベクターとして、これらに限定されないが、バクテリアの：ｐＢｓ、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４Ｏ、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。真核生物の：ｐＷＬ−ｎｅｏ、ｐＳｖ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰｖ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍｉａｃｉａ）。任意の他のプラスミドおよびベクターも、選択された宿主内で複製可能であり生存可能である限り、使用することができる。任意のベクターおよび市販のもの（ならびにそのバリアントまたは誘導体）は、本方法において使用するための１つまたは複数の組換え部位を含むように操作され得る。このようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから入手することができる。目的の他のベクターとして、真核生物発現ベクター、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、ならびにｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、ならびにｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ならびにｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、ならびにｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）、ならびにｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ  Ａ、Ｂ、およびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ１１１、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３  ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ならびにｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｒｐ．）、ならびにそれらのバリアントまたは誘導体が挙げられる。他のベクターとして、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、ｃｏｓｍｉｄｓ、ｐｈａｇｅｍｉｄｓ、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（バクテリア人工染色体）、Ｐ１（大腸菌（Escherichia coli）ファージ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３���３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０およびｐＳＹＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにそれらのバリアントまたは誘導体が挙げられる。目的のさらなるベクターとして、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡ０８１Ｓ、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺＡ、ｐＰＩＣＺＢ、ｐＰＩＣＺＣ、ｐＧＡＰＺＡ、ｐＧＡＰＺＢ、ｐＧＡＰＺＣ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒ０１．１、ｐＺＥｒＯ−２．１、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／  ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ  １０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ、およびｐＣＲＢａｃ；ＰｈａｒｍａｃｉａからのＸ  ＥｘＣｅｌｌ、Ｘ  ｇｔ１１、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−１Ｘ  Ｔ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、およびｐＵＣ４Ｋ；ＮｏｖａｇｅｎからのｐＳＣＲＥＥＮ−ｌｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、ｐＣＩＴＥ−４−ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ−２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ−３２Ｌ１Ｃ、ｐＥＴ−３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ−２  ｃｐ  ＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２  ｃｐ  ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２  ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、Ｘ  ＳＣＲＥＥＮ−１、Ｘ  Ｂ１ｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴ１１  ａｂｃｄ、ｐＥＴ１２ａｂｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ−ｐＥＴ−１７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａｂｃｄ  （＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ−１、ｐＢＡＣ４ｘ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１、ｐＢＡＣ−３  ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２  ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｒｆ−１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌ  ｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｈｙｇ、およびＳｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｇｐｔ；ＣｌｏｎｔｅｃｈからのｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ  ＧＬ、ｐＧＡＤ  ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＥＧＦＰＮ、ｐＥＧＦＰ−Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＳＥＡＰ２−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐ  Ｉ３ｇａｌ  −Ｂａｓｉｃ、ｐｌ３ｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐ  Ｉ３ｇａｌ  −Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐ  Ｉ３ｇａｌ  −Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＭＶ、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＴＫ−Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ−１／２／３、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、２Ｘｇｔ１０、Ｘｇｔ１１、ｐＷＥ１５、およびＸ  ＴｒｉｐｌＥｘ；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＬａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋／−、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋／−、ｐＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４  Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、Ｌａｍｂｄａ  ＦＩＸ  ＩＩ、Ｌａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ、Ｌａｍｂｄａ  ＥＭＢＬ３、Ｌａｍｂｄａ  ＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｇｔ  Ａｍｐ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｄｉｒｅｃｔ、ｐＢＳ＋／−、ｐＢＣ  ＫＳ＋／−、ｐＢＣ  ＳＫ＋／−、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｋｃ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−ｌｌａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ３  ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、ｐＭＣｌｎｅｏ  Ｐｏｌｙ  Ａ、ｐＯＧ４４、ｐ０Ｇ４５、ｐＦＲＴＩ３ＧＡＬ、ｐＮＥ０Ｉ３ＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、およびｐＲＳ４１６、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩｓｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐ、ならびにそれらのバリアントまたは誘導体も挙げることができる。
【０１５９】
療法の指標
対象における血管発生を改善するための方法および組成物が本明細書で提供される。心血管疾患に対する処置のための方法および組成物も提供される。一部の事例において、心血管疾患は心筋症であり得る。心筋症は、病理学的に異常な心筋によって定義され得る。心筋症の４つの主要な分類が存在する：拡張型（ＤＣＭ）、肥大型（ＨＣＭ）、拘束型（ＲＣＭ）、および不整脈原性ＲＶ（ＡＲＶＣ）。本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターを使用して、遺伝子治療を使用して心筋症を処置することができる。一部の事例において、少なくとも１つの追加の療法もまた、遺伝子治療の処置の前、間、後、またはその任意の組合せで投与される。
【０１６０】
一部の事例において、ポリペプチドを本明細書に記載されたポリヌクレオチド配列に組み込むことができ、障害を有するかまたは血管発生の改善を必要とする対象に導入することができる。例えば、対象は、心筋症障害を有する場合があり、この障害を処置するために、本明細書に記載されたポリヌクレオチドの投与により処置され得る。一部の事例において、本明細書に記載された遺伝子またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、遺伝子治療によって導入することができる。心筋症を有する対象に導入され得る遺伝子およびポリペプチドとして、例えば、以下のものを挙げることができる：ＡＴＰ−結合カセット，サブファミリーＣ，メンバー９（ＡＢＣＣ９）、アクチン，α，心筋１（ＡＣＴＣ１）、アクチニン，α２（ＡＣＴＮ２）、アンキリン反復ドメイン１（心筋）（ＡＮＫＲＤ１）、ＢＣＬ２−関連アタノジーン３（ＢＡＧ３）、カルセケストリン２（心筋）（ＣＡＳＱ２）、カベオリン３（ＣＡＶ３）、ＣＯＸ１５ホモログ，シトクロムｃオキシダーゼアセンブリタンパク質（ＣＯＸ１５）、クリスタリンα  Ｂシステインおよびグリシンリッチタンパク質３（ＣＲＹＡＢ）、システインおよびグリシンリッチタンパク質３（ＣＳＲＰ３）、カルジオトロフィン１（ＣＴＦ１）、デスミン（ＤＥＳ）、ジストロフィン（ＤＭＤ）、ＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）ホモログ，サブファミリーＣ，メンバー１９（ＤＮＡＪＣ１９）、デスモコリン２（ＤＳＣ２）、デスモグレイン２（ＤＳＧ２）、デスモプラキン（ＤＳＰ）、ジストロブレビン，α（ＤＴＮＡ）、エメリン（ＥＭＤ）、Ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ４（ＥＹＡ４）、４．５ＬＩＭドメイン２（ＦＨＬ２）、フクチン（ＦＫＴＮ）、フォークヘッドＤ４（ＦＯＸＤ４）、ガラクトシダーゼ，α（ＧＬＡ）、ジャンクションプラコグロビン（ＪＵＰ）、ラミニン，α４（ＬＡＭＡ４）、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）、ＬＩＭドメイン結合３（ＬＤＢ３）、Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ（ＬＭＮＡ）、ミオシン結合タンパク質Ｃ，心臓（ＭＹＢＰＣ３）、ミオシン，重鎖６，心筋，α（ＭＹＨ６）、ミオシン，重鎖７，心筋，α（ＭＹＨ７）、ミオシン，軽鎖２，調節性，心臓，遅筋型（ＭＹＨｌ２）、ミオシン，軽鎖３，アルカリ；心室性，骨格，遅筋型（ＭＹＬ３）、ミオシン軽鎖キナーゼ２（ＭＹＬＫ２）、ミオゼニン２（ＭＹＯＺ２）、ネキシリン（Ｆアクチン結合タンパク質）（ＮＥＸＮ）、プラコフィリン２（ＰＫＰ２）、ホスホランバン（ＰＬＮ）、タンパク質キナーゼ，ＡＭＰ−活性化，γ２，非触媒性サブユニット（ＰＲＫＡＧ２）、プレゼニリン１（ＰＳＥＮ１）、プレゼニリン２（ＰＳＥＮ２）、ＲＮＡ結合モチーフタンパク質２０（ＲＢＭ２０）、リアノジン受容体２（心臓）（ＲＹＲ２）、ナトリウムチャネル，電位作動型，タイプＶ，αサブユニット（ＳＣＮ５Ａ）コハク酸脱水素酵素複合体，サブユニットＡ，フラビンタンパク質（ＳＤＨＡ）、サルコグリカン，δ（ＳＧＣＤ，）スペクトリン反復含有，核エンベロープ１（ＳＹＮＥ  １）、スペクトリン反復含有，核エンベロープ２（ＳＹＮＥ２）、タファジン（ＴＡＺ）、チチン−キャップ（テレトニン）（ＴＣＡＰ）、膜貫通タンパク質４３（ＴＭＥＭ４３）、チモポエチン（ＴＭＰＯ）、トロポニンＣタイプ１（遅筋型）（ＴＮＮＣ１）、トロポニンＩタイプ３（心臓）（ＴＮＮｉ３）、トロポニンＴタイプ２（心臓）（ＴＮＮＴ２）、トロポミオシン１（α）チチン（ＴＰＭ１）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、チチン（ＴＴＮ）、ビンクリン（ＶＣＬ）、およびそれらの部分の任意の組合せ。心血管状態の処置および／または血管発生の改善のために導入され得るポリペプチドまたは遺伝子は、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ１、Ｓ１００Ａ１、もしくはその部分またはそれらの組合せであり得る。
【０１６１】
本明細書で開示されたリンカー構築物によって結合した機能性ポリペプチドを含むポリヌクレオチド構築物が本明細書で提供される。対象に、本明細書に記載されたポリヌクレオチド、またはそれによってコードされたポリペプチド、またはそのコンジュゲートもしくは誘導体を使用することまたは投与するステップを含む、処置、診断および他の療法目的のための方法も提供される。開示された方法および組成物は、疾患および状態の処置のために適用されてもよい。状態の例はがんであり得る。がんまたは悪性腫瘍として、これらに限定されないが、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞がん、成人（原発性）肝がん、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝がん、成人軟部組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性腫瘍、肛門がん、星状細胞腫、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、腎盂尿管がん、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児（原発性）肝細胞がん、小児（原発性）肝がん、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝がん、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視経路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜がん、上衣腫、上皮がん、食道がん、ユーイング肉腫および関連する腫瘍、膵外分泌がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、女性乳がん、ゴーシェ病、胆嚢がん、胃がん（gastric cancer）、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、毛様細胞性白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭がん、腸がん、眼球内黒色腫、膵島細胞癌、島細胞膵がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、唇および口腔がん、肝がん、肺がん、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳がん、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性原発不明扁平上皮性頸部がん、転移性原発性扁平上皮性頸部がん、転移性扁平上皮性頸部がん、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫、骨髄異形成症候群、ミエロイド性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽腔がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、中咽頭がん、骨線維肉腫／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、パラプロテイン血症、紫斑病、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝がん���前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管のがん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮性頸部がん、胃がん（stomach cancer）、テント上原始神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行細胞がん、腎盂尿管移行上皮がん、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂細胞のがん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、腟がん、視経路および視床下部膠腫、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに上に列挙した器官系に位置する、新生物を除く、任意の他の過剰増殖性疾患を挙げることができる。
【０１６２】
本明細書で開示されたリンカーポリペプチドによって結合された機能性ポリペプチドは、本明細書に記載された方法および組成物において有用である場合があり、悪性または前悪性の状態を処置し、これらに限定されないが、上述の障害を含む新生物性または悪性の状態の進行を防止するために使用してもよい。このような使用は、上記の新生物またはがんへの進行が知られたかまたは疑われる状態において、特に、過形成、化生からなる非新生物性細胞成長、または、とりわけ異形成が起こった場合に必要とされる。異形成はがんの前兆であることが多く、主に、上皮中に見出される。異形成は、非新生物性細胞成長の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性、および細胞の構造的配向の喪失を伴う。異形成は、慢性の刺激または炎症が存在する場所で発生することを特徴とする。処置することができる異形成障害として、これらに限定されないが、無汗性外胚葉異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、脳異形成、子宮頚部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、半肢骨端異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、下顎の家族性線維性異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、線維性骨異形成、開花性骨異形成、遺伝性腎−網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少症性外胚葉異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成（metaphysical dysplasia）、モンディーニ型内耳異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯原性異形成、眼下顎四肢異形成、根尖性セメント質異形成、多発性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成、および心室橈骨異形成が挙げられる。処置することができるさらなる前新生物性障害として、これらに限定されないが、良性異常増殖性障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性病態状態、組織肥大、腸ポリープまたはアデノーマ、および食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、太陽性口唇炎、および日光角化症が挙げられる。一部の実施形態において、本明細書で開示されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド構築物は、本明細書で開示されたリンカーによって結合された少なくとも２つの機能性ポリペプチドを含み、がん、特に上に列挙したがんの成長、進行、および／または転移を阻害するために使用される。さらなる過剰増殖性疾患、障害、および／または状態として、これらに限定されないが、悪性腫瘍および関連する障害、例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、な��びに肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺腫、皮脂腺腫、乳頭腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝がん、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない固形腫瘍の進行、および／または転移が挙げられる。
【０１６３】
一部の実施形態において、本明細書で開示されたリンカーによって結合された少なくとも２つの機能性ポリペプチドを含む、本明細書で開示されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド構築物は、これらに限定されないが、クラスＩＩＩ自己免疫疾患、例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病などの免疫媒介性血小板減少、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、レンサ球菌感染後の腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多型性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチュア症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、関節リウマチ、多発性筋炎／皮膚筋炎、胆汁過多、尋常性天疱瘡、ヴェグナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨大細胞動脈炎／多筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化性肺胞炎、および若年性糖尿病を含む、免疫調節異常疾患および関連自己免疫疾患を含む疾患を処置するために使用される。
【０１６４】
一部の実施形態において、本明細書で開示されたリンカーによって結合された少なくとも２つの機能性ポリペプチドを含む、本明細書で開示されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド構築物は、感染性疾患を処置するために使用される。感染性疾患は、バクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、プロトゾア、真菌、ウイルス、寄生虫、または他の微生物剤などの病原体による感染であり得る。例としては、ＡＩＤＳの原因であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、結核のマイコバクテリウム、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、レジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophilia）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、大腸菌（Escherichia coli）、ナイセリア・ゴノレー（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitides）、肺炎球菌（Pneumococcus）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ヘモフィリスインフルエンザＢ（Hemophilis influenzae B）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、ライム病スピロヘータ（Lyme disease spirochetes）、ウエストナイルウイルス（West Nile virus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、らい菌（Mycobacterium leprae）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、狂犬病ウイルス（rabies virus）、インフルエンザウイルス（influenza virus）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus）、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus）Ｉ、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus）ＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス（human serum parvo-like virus）、呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial virus）、水痘帯状疱疹ウイルス（varicella-zoster virus）、Ｂ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus）、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus）、麻疹ウイルス（measles virus）、アデノウイルス（adenovirus）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（human T-cell leukemia virus）、エプスタイン・バールウイルス（Epstein-Barr virus）、マウス白血病ウイルス（murine leukemia virus）、ムンプスウイルス（mumps virus）、水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus）、シンドビスウイルス（sindbis virus）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（lymphocytic choriomeningitis virus）、疣ウイルス（wart virus）、ブルータングウイルス（blue tongue virus）、センダイウイルス（Sendai virus）、ネコ白血病ウイルス（feline leukemia virus）、レオウイルス（reo virus）、ポリオウイルス（polio virus）、シミアンウイルス（simian virus）４０、マウス乳がんウイルス（mouse mammary tumor virus）、デングウイルス（dengue virus）、風疹ウイルス（rubella virus）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、ランゲルトリパノソーマ（Trypanosoma rangeli）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、ローデシアトリパノソーマ（Trypanosoma rhodesiensei）、ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、日本住血吸虫（Schistosoma japanicum）、ウシバベシア（Babesia bovis）、鶏盲腸コクシジウム（Elmeria tenella）、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、熱帯リーシュマニア（Leishmania tropica）、旋毛虫（Trichinella spiralisｓ）、タイレリア・パルバ（Theileria parva）、胞状条虫（Taenia hydatigena）、ヒツジ条虫（Taenia ovis）、無鉤条虫（Taenia saginata）、単包条虫（Echinococcus granulosus）、メソセストイド・コルチ（Mesocestoides corti）、マイコプラズマ・アルスリチジス（Mycoplasma arthritidis）、マイコプラズマ・ヒオルヒニス（M. hyorhinis）、マイコプラズマ・オラレ（M. orale）、マイコプラズマ・アルギニニ（M. arginini）、アコレプラズマ・ライドラウィー（Acholeplasma laidlawii）、マイコプラズマ・サリバリウム（M. salivarium）および肺炎マイコプラズマ（M. pneumoniae）が挙げられる。
【０１６５】
一部の実施形態において、本明細書で開示されたリンカーによって結合された少なくとも２つの機能性ポリペプチドを含む、本明細書で開示されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド構築物は、化学療法剤とコンジュゲーションして、または化学療法剤に加えて、または化学療法剤と同時に使用される。「化学療法剤」または「化学療法化合物」およびその文法上の同義語は、本明細書で使用される場合、がんの処置において有用な化学化合物であり得る。
【０１６６】
遺伝子治療に有用なポリヌクレオチドによってコードされた遺伝子およびポリペプチドは、連続して、同時に、またはその組合せによって、対象に導入され得る。対象に投与される遺伝子およびポリペプチドは、単一のポリヌクレオチドベクター上か、または別々のポリヌクレオチドベクター上に存在し得る。一部の事例において、多重遺伝子ベクターは、単一のベクター構築物を使用して多重遺伝子を導入するために使用される。
【０１６７】
本明細書に記載されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド構築物
本明細書に記載されたポリペプチド構築物を利用して、対象における心血管疾患を処置し、および／または血管発生を改善することができる。例えば、心血管療法に対する分子標的は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ４、筋小胞体Ｃａ２＋  ＡＴＰａｓｅ、Ｓ１００Ａ１、ベータ−アドレナリン受容体、アデニリル−シクラーゼ６、またはそれらの組合せであり得る。一部の事例において、心血管遺伝子治療で導入される遺伝子は、ＳＤＦ１、Ｓ１００Ａ１、ＶＥＧＦ１９１、またはそれらの任意の組合せであり得る。
【０１６８】
Ｓ１００は、細胞内調節活性に関係するＣａβ＋によってモジュレートされるタンパク質のファミリーの部分である。Ｓ１００Ａ１は、心臓で最も豊富なＳ１００タンパク質アイソフォームであり得る。Ｓ１００Ａ１は、リアノジン受容体（ＲＹＲ）とＳＥＲＣＡ２ａの両方の活性を強化することによって、心臓の収縮および弛緩機能を促進することができる。
【０１６９】
Ｓ１００は、ベータ−アドレナリン刺激とは無関係に、心筋細胞Ｃａ２＋の恒常性および筋フィラメント機能のモジュレーションを介して、顕著なイオンチャネルの作用を発揮することができる。Ｓ１００Ａ１は、Ｃａ２＋から独立した方式で、ＲｙＲと相互作用することができ、ＳＥＲＣＡ２ａ−ＰＬＮ複合体を安定化させる。Ｓ１００Ａ１は、Ｃａ２＋の弛緩性の漏出を減少させることもでき、心臓のチチンおよびミトコンドリアＦ１−ＡＴＰａｓｅに影響を及ぼす。
【０１７０】
一部の実施形態において、血管新生ポリペプチドまたは遺伝子は、本明細書に記載された心血管療法または血管発生の改善のために利用することができる。ＶＥＧＦ−Ａ１６５、アンジオポエチン、ＦＧＦ、１２６、ＨＩＦ−１ａ２６、またはそれらの組合せなどの血管新生成長因子をコードするポリヌクレオチドの投与。これらのポリペプチドは、慢性重症虚血肢、心筋虚血症、アンギーナ、または末梢動脈閉塞性疾患などの虚血関連状態における側副血管の発生を促進させることができる。血管新生因子は、新たな血管網の形成を誘導することもでき、急性冠動脈症候群および末梢血管疾患を処置するための適切な療法の選択肢となり得る。いくつかのタイプの血管新生因子は、心血管疾患に対する療法の適用において調査された様々な特性を示す可能性がある。例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦのサブタイプを使用することができる。ＶＥＧＦのサブタイプは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、またはそれらの組合せを含む場合がある。これらの因子のいくつかによって、別個のアイソフォームも得られる。これらのＶＥＧＦサブタイプの細胞内シグナルは、３つの異なるチロシンキナーゼ受容体：ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３によって、主に媒介され得る。これらのＶＥＧＦサブタイプとその同種の細胞受容体の間の特異的な相互作用によって、内皮細胞および心筋細胞における差次的な細胞応答が惹起され得る。一部の事例において、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のアイソフォームは、血管新生性が高い。ＶＥＧＦ−Ａ１６５は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２と相互作用し得る。内皮細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ１６５のＶＥＧＦＲ１との相互作用は、新たに形成された血管の血管安定性に寄与し得る。内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ２との相互作用によって、血管新生、血管発生、および動脈形成、血管拡張、細胞生存、および細胞膜透過性の増大が誘導され得る。新たに形成された心筋細胞におけるＶＥＧＦＲ２の活性化によって、抗アポトーシスタンパク質の発現が増大され、アポトーシス促進タンパク質の発現が低減され得る。一部の事例において、ＶＥＧＦＲ２の活性化によって、虚血領域における局所的な心臓幹細胞の動員が誘導され得る。
【０１７１】
血管新生促進因子または遺伝子は、本発明のベクターと共に発現され得る。例えば、血管新生促進因子は、ＶＥＧＦ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、または形質転換成長因子β−１（ＴＧＦβ−１）、酸性線維芽細胞成長因子、アンジオゲニン、肝細胞成長因子、インターロイキン−８、胎盤成長因子、血小板由来成長因子、プレイオトロピン、プロリフェリン、腫瘍壊死因子−アルファ、およびそれらの任意の組合せであり得る。
【０１７２】
一部の事例において、本発明の心臓発現ベクターに使用され、組み込まれる心臓のエフェクター遺伝子またはポリペプチドは、ＳＤＦ１、Ｓ１００Ａ１およびＶＥＧＦ１９１のうちのいずれか１つから選択され得る。ある特定の場合には、本発明の心臓発現ベクターは、ベクターにおける順番の任意の組合せで、ＳＤＦ１、Ｓ１００Ａ１およびＶＥＧＦ１９１から選択される任意の２つの遺伝子を含むかまたはこれらからなる。ある特定の実施形態において、心臓発現ベクターは、ベクターにおける順番の任意の組合せで、ＳＤＦ１、Ｓ１００Ａ１およびＶＥＧＦ１９１をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１７３】
ある特定の実施形態において、ＳＤＦ１をコードする配列は、ＳＤＦ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＳＤＦ１ポリペプチドは、配列番号１０２と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。ある特定の場合には、ＳＤＦ１をコードする配列は、ＳＤＦ１コドン最適化オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、配列番号１０３を含む。
【０１７４】
ある特定の実施形態において、ＳＤＦ１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０３と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１７５】
ある特定の場合には、Ｓ１００Ａ１をコードする配列は、Ｓ１００Ａ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、Ｓ１００Ａ１ポリペプチドは、配列番号１０４と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。ある特定の実施形態において、Ｓ１００Ａ１をコードする配列は、Ｓ１００Ａ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むかまたはこれらからなる。ある特定の場合には、Ｓ１００Ａ１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０５と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１７６】
ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ１９１をコードする配列は、ＶＥＧＦ１９１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ１９１ポリヌクレオチドは、配列番号１０６と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１７７】
ある特定の場合には、ＶＥＧＦ１９１をコードする配列は、ＶＥＧＦ１９１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦ１９１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０７と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１７８】
【表４−１】
2018536405.tif 000009
【０１７９】
【表４−２】
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【０１８０】
【表４−３】
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【０１８１】
医薬組成物および製剤：
全体を通して記載された組成物は、医薬品への製剤となり、疾患、例えば、心血管疾患を有すると診断された、それを必要とするヒトまたは哺乳動物を処置するために使用することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載された心血管療法または血管発生の改善のために利用された、本明細書に記載された組成物。これらの医薬は、１つまたは複数のベクターと同時投与され得る。
【０１８２】
操作されたＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、トランスポゾン系、ＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子、トランスポゾンおよび／またはトランスジーンをコードする核酸を含有するウイルスまたは非ウイルスベクターを含む、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターは、インビボで細胞のトランスフェクションまたは形質導入に関する生物に直接投与することもできる。あるいは、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むネイキッドＤＮＡまたはｍＲＮＡを投与することもできる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるよう導入するために通常使用される任意の経路によるものであり、これらに限定されないが、注射、注入、局所投与およびエレクトロポレーションが挙げられる。１つ以上の経路を使用して、特定の組成物を投与することもできる。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。
【０１８３】
一部の事例において、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターは、第２の療法と併せて、または別々に、それを必要とする対象に投与することができる。第２の療法は、血管発生、肺高血圧の改善のための薬剤、アルドステロン受容体アンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体ブロッカー、アンジオテンシン受容体ブロッカーおよびネプリライシンの阻害剤、抗アドレナリン薬、中枢作用性抗アドレナリン薬、末梢作用性抗アドレナリン薬、抗不整脈剤、Ｉ群抗不整脈剤、ＩＩ群抗不整脈薬、ＩＩＩ群抗不整脈薬、ＩＶ群抗不整脈薬、Ｖ群抗不整脈薬、抗コリン性変時性薬、抗高血圧薬の組合せ、カルシウムチャネル遮断薬を伴うＡＣＥ阻害剤、チアジドを伴うＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャネルブロッカーを伴うアンジオテンシンＩＩ阻害剤、チアジドを伴うアンジオテンシンＩＩ阻害剤、チアジドを伴う抗アドレナリン薬（中枢）、チアジドを伴う抗アドレナリン薬（末梢）、チアジドを伴うベータブロッカー、チアジドを伴うカリウム保持性利尿薬、ベータ−アドレナリン遮断薬、心選択性ベータブロッカー、非心選択性ベータブロッカー、カルシウムチャネル遮断薬、カテコールアミン、利尿薬、炭酸脱水酵素阻害剤、ループ利尿薬、カリウム保持性利尿薬、チアジド利尿薬、変力剤、末梢血管拡張薬、レニン阻害剤、硬化剤、血管拡張薬、バソプレッシンアンタゴニスト、昇圧薬であり得る。
【０１８４】
抗血管新生剤は、本明細書に記載されたポリヌクレオチドと併せて使用することもできる。開示された方法および組成物において使用するのに適する抗血管新生剤として、ヒト化およびキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。一部の事例において、例えば、がんを処置する組成物、製剤および方法において、投与される組成物または製剤の単位投薬量は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｍｇであり得る。
【０１８５】
血管新生の他の阻害剤として、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（αおよびβを含む）  インターロイキン１２、レチノイン酸、およびメタロプロテイナーゼ１および２の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１および２）が挙げられる。抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるラゾキサンなどのトポイソメラーゼを含む小分子を使用することもできる。
【０１８６】
一部の事例において、例えば、がんを処置する組成物、製剤および方法において、投与される組成物または製剤の単位投薬量は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｍｇであり得る。一部の事例において、投与される組成物または製剤の総量は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｇであり得る。
【０１８７】
方法および指標
本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターを、本明細書に記載されるように構築し、対象に導入することができる。これらのベクターは、遺伝子治療に使用することができる。これらのベクターを使用して、レシピエント（例えば、ヒト）の疾患を処置することができる。例えば、本明細書に記載されたポリヌクレオチドおよび／または本明細書に記載されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを対象に投与して、心血管疾患を処置するか、または対象における血管発生を改善することができる。本明細書に記載された方法によって、または本明細書に記載された組成物と接触させるかもしくはこれを投与することによって処置される対象は、ヒト対象、非ヒト霊長類、イヌ科哺乳類、ネコ科哺乳類または任意の他の哺乳類である場合がある哺乳動物対象である場合がある。
【０１８８】
レシピエントにおける疾患（例えば、心血管疾患）を処置する方法であって、本明細書に記載された少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのベクターを、心血管疾患を有する対象に導入するステップを含む方法が、本明細書に記載されている。一部の事例において、ベクターは細胞に導入される。
【０１８９】
一部の事例において、心血管疾患は心筋症であり得る。心筋症は、病理学的に異常な心筋によって定義され得る。心筋症の４つの主要な分類が存在する：拡張型（ＤＣＭ）、肥大型（ＨＣＭ）、拘束型（ＲＣＭ）、および不整脈原性ＲＶ（ＡＲＶＣ）。心筋症は、心エコーまたは、増加傾向にある心臓ＭＲＩのいずれかを用いるインビボ画像化により診断され得る。ＤＣＭは、心臓の拡大を指す場合があり、特に疾患の後期に、４つすべての心室に影響を及ぼすことが多い。最も一般的には、ＤＣＭはＬＶ機能または収縮機能の低下を伴うが、疾患の初期には、ＬＶは広がっている場合もあるが、最小限の機能低下しか示さない。対照的に、ＨＣＭは、ＬＶ壁の肥厚によって特徴付けることができ、ＲＶからＬＶを分離する隔壁が標的とされることが多い。ＲＣＭは、一部の事例において、分かりにくい場合があり、これは、部分的には、心臓が形態的に通常に近い外観である場合があり、壁の肥厚もわずかで、ＬＶの駆出率も穏やかにしか低下していないからである。ＲＣＭの根底にある浸潤プロセスは、最も感度の高い画像化技法を用いても、インビボで容易に検出できない場合がある。ＲＣＭは、心拍出量を低減する、拡張機能障害として知られる心臓の充満度が損なわれることによって特徴付けることができる。ＡＲＶＣは、機能低下と、ＭＲＩで見ることのできる線維脂肪性浸潤を有するＲＶの薄化によって特徴付けることができる。一部の事例において、心筋症の患者を本発明のベクターで処置することができる。
【０１９０】
本明細書で提供される方法は、これらに限定されないが、がん、心血管疾患、肺疾患、肝疾患、皮膚疾患、または神経疾患を含む疾患を処置または予防するために使用され得る。本明細書で提供される方法は、対象の血管発生を改善するために使用され得る。
【０１９１】
「改善する」およびその文法上の同義語は、本明細書で使用される場合、当業者によって認識される任意の改善を意味し得る。例えば、心血管疾患を改善することは、望ましくない作用または症状の低下、減少、または減退を包含し得る不整脈の減少を意味する場合がある。別の例では、疾患を改善することは、望ましくない作用または症状の低下、減少、または減退を包含し得る腫瘍量の減少を意味する場合がある。例えば、いくつか改善例を挙げると、対象は、腫瘍量の低減、生存の延長、完全寛解、安定化を経験する場合がある。
【０１９２】
改善の別の指標は、対象が療法を必要としない日数である場合がある。例えば、本明細書で提供される処置を投与した後、レシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより長い日数、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより長い日数の間、療法を必要としない場合がある。このことにより、処置が成功したことを示すことができる。このことにより、本明細書に記載されたポリ核酸の投与に関連する毒性が存在しないことを示すこともできる。
【０１９３】
対象は、少なくとも１日の間療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくとも７日間療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくとも１４日間療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくとも２１日間療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくとも２８日間療法を必要としない場合がある。
レシピエントは、少なくとも６０日間療法を必要としない場合がある。さらに、レシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年またはそれより長い間療法を必要としない場合がある。
【０１９４】
改善の別の指標は、レシピエントが療法の低減を必要とする日数である場合がある。例えば、本明細書で提供される処置の後、レシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより長い日数、療法の投与の低減を必要とする場合がある。このことにより、処置が成功したことを示すことができる。
【０１９５】
例えば、レシピエントは、少なくとも１日の間療法の低減を必要とする場合がある。レシピエントは、少なくとも７日間療法の低減を必要とする場合もある。レシピエントは、少なくとも１４日間療法の低減を必要とする場合がある。レシピエントは、少なくとも２１日間療法の低減を必要とする場合がある。レシピエントは、少なくとも２８日間療法の低減を必要とする場合がある。レシピエントは、少なくとも６０日間療法の低減を必要とする場合がある。さらに、レシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年またはそれより長い間療法の低減を必要とする場合がある。
【０１９６】
心疾患の処置では、経皮の冠状動脈カテーテル法は、心臓の各区域への均一な遺伝子送達を可能にすることができる、低侵襲性の手段であり得る。一部の事例において、重篤な冠状動脈疾患を有する患者では、遺伝子送達が妨害される場合がある。例えば、冠状動脈への注入の間、冠状血流を中断することなく、ベクターをカテーテルに注射することができる。
【０１９７】
一部の事例において、冠循環におけるベクター滞留時間の亢進は、冠状静脈の閉鎖により実現可能であり得る。例えば、心筋の遺伝子発現を増強した冠状動脈と冠状静脈の両方を短期間閉塞させて順行性に冠血管に注入することにより、ベクター滞留時間を亢進することができる。
【０１９８】
他の事例において、全身への分布を最小限にしながら内皮へのベクターの曝露期間を最大にするために、心臓再循環手法を使用することができる。この場合には、体外装置が、閉塞用カテーテルを使用して冠静脈洞から血液を排出し、ぜん動ポンプにより酸素化した環状静脈血を左主幹冠動脈に戻すことができる（Ｖ−Ｆｏｃｕｓ；Ｏｓｐｒｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）。この方法を利用することにより、全身的副作用なしで、内皮透過剤を選択的に投与することが可能となり得る。
【０１９９】
一部の事例において、トランスフェクション効率は、冠状血流量ならびに曝露時間およびベクター濃度と相関し得る。例えば、動脈内バルーンポンプを使用して、例えば、冠状血流量を増加させることによって支持される、順行性冠状動脈注入により、心臓の遺伝子移入がさらに高まる。
【０２００】
一部の事例において、心臓へのベクターの直接注射が実施され得る。ベクターは、標的領域に、心外膜または心内膜注射され得る。一部の事例において、直接注射により内皮バリアを回避することができる。これは、注射部位において高い局所濃度を生じ得る。一部の事例において、直接注射により循環血液への曝露を避けることができる。他の事例において、心臓へのベクターの直接注射により、循環ＤＮａｓｅまたは中和抗体によりベクターの不活性化を避けることができる。ベクターの直接注射は、非標的器官へのベクターの曝露を低減することもできるが、局所投与により、一部の全身的なベクターの分布を完全に避けることができる訳ではない。高いベクター濃度で少量用いることにより、心筋におけるベクターの滞留が増加する場合もある。
【０２０１】
一部の事例において、開胸術の間にベクターを導入することができる。ベクターは、心膜から導入することもできる。一部の事例において、例えば、図９に開示されているように、逆行性灌流を使用してベクターを導入することもできる。
【０２０２】
遺伝子治療の後、トランスフェクト細胞は、レシピエントにおいて機能性となり得る。機能性により、一部の事例において、遺伝子治療が成功であったか否かを決定することができる。例えば、トランスフェクト細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより長い日数、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより長い日数の間、機能性となり得る。このことは、遺伝子治療が成功したことを示し得る。このことは、移植細胞またはベクターが拒絶されていないことも示すことができる。
【０２０３】
ある特定の場合には、トランスフェクト細胞は、少なくとも１日の間機能性となり得る。トランスフェクト細胞はまた、少なくとも７日間機能性となり得る。トランスフェクト細胞は、少なくとも１４日間機能性となり得る。トランスフェクト細胞は、少なくとも２１日間機能性となり得る。トランスフェクト細胞は、少なくとも２８日間機能性となり得る。トランスフェクト細胞は、少なくとも６０日間機能性となり得る。
【０２０４】
投与経路
以前は、心臓への療法の送達技術には、心筋内投与（経心外膜的にまたは経心内膜的に）または冠状動脈への順行性の送達が含まれた。経心外膜経路では、外科的侵襲性という欠点を被る。経心内膜手法は、この技法は穿孔を引き起こす場合があるため、薄化した心筋を有する患者に適用されないＮＯＧＡデバイスなどのシステムを使用する複雑な電磁マッピングを必要とする。Ｂｉｏｃａｒｄｉａ−ヘリカル注入カテーテルまたはＣｅｌｙａｄ−Ｃ−Ｃａｔｈなどの他のデバイスは、壁厚の制限も有する。
【０２０５】
冠状動脈への順行性の投与は、心筋内投与と比較して、低い生体保持を伴う［１２］。さらに、冠状動脈への生物製剤の投与は、冠動脈塞栓およびＳＴ部分上昇のリスクの増加を示した［１３］［１４］［１５］［１６］［１７］。ｐＤＮＡ投与に関しても、多量の血液量と直接接触させることで、標的組織に侵入する前に作用を低下させる場合がある。
【０２０６】
逆行性投与
ヒトでは、冠静脈洞は、心収縮の大半を担う心室腔の静脈系を排出する。冠静脈洞への逆行性送達技術は、順行性送達と比較して、心筋全体への溶液の優れた分布に一部起因して、心停止液の投与に対して広く使用されてきた［１８］。さらに、この手順は、リスクの高い経皮的冠動脈形成術の間の酸素化血液投与に対する臨床上の安全性を実証した［１９］［２０］［２１］。冠静脈洞への逆行性投与プロセスは、バルーンカテーテルとその後の流出血液に対する投与によって、求心的な冠循環の一時的な閉塞に関与する。これは、後毛細管細静脈により心筋に侵入する溶液を生じる。小動脈または毛細管に対して、後毛細管細静脈は、最小の血管経を有し、物質が間質に最も多く移入することを概念的に可能にする［２２］。生理的に、後毛細管細静脈は、ＥＬＡＭ−１［２３］、ＩＣＡＭ−１［２４］、ＣＤ１８［２５］、およびＣＤ４４［２６］などの接着分子の発現に一部起因して、および一部生体力学特性のために、内皮を横切る免疫／炎症細胞の移動の主要な標的であることが知られている。Ｐａｔｅｌらは、ＲＥＶＩＶＥ  Ｔｒｉａｌにおいて、この前臨床試験で提案されたものと同じ送達カテーテル（Ｃｏｏｋ  Ｒｅｇｅｎｔｅｃ）を使用して、３０億個を超える有核細胞が、最終ステージＣＨＦを有する患者の冠静脈洞へ６０ｃｃの用量で安全に送達され得ることを実証した［２７］。
【０２０７】
逆行性投与による遺伝子治療
いくつかの研究により、心筋再生の領域で、逆行性投与を利用することに成功した。Ｂｏｅｋｓｔｅｇｅｒｓら［３２］は、冠状動脈への順行性の送達または前心臓静脈を介した逆行性送達と比較して、ベータ−ｇａｌおよびルシフェラーゼを発現するアデノウイルスをブタの心筋に送達した。順行性に比べて、均一な様式の梗塞組織における著しく高い遺伝子発現が、逆行性方法を介して観察された。同様の結果が、ネイキッドＤＮＡを用いる逆行性方式で注射したブタの心臓におけるｅＧＦＰの間質発現を観察したＡｌｉｎｏら［３３］によって再現された。別の研究では、ブタにおいて逆行性方法を使用するベータ−ｇａｌをコードするプラスミドの投与により、順行性の筋肉内投与と比較して高い心筋の遺伝子発現を生じた［３４］。心筋内送達と比較した、この優れたレベルの遺伝子発現は、他の研究でも再度報告された［３５］。逆行性投与の使用は、タンパク質療法の送達を実施するのに成功した。Ｖｏｎ  Ｄｅｇｅｎｆｅｌｄら［３６］は、ＦＧＦ−２タンパク質の逆行性投与を使用して、実験的に誘導される狭窄を予防したブタでの研究を報告した。逆行性で処理したブタの心筋の放射標識したＦＧＦ−２のレベルは、順行性の注入を使用して達成したレベルのほぼ２倍であった。さらに、ＦＧＦ−２が逆行性方法により投与された場合に、経壁血流および部分的心筋機能の顕著な改善が報告された。心不全患者のＳＤＦ−１α  ｐ−ＤＮＡの逆行性送達の安全な使用についても報告された（ＲＥＴＲＯ−ＨＦ）。
【０２０８】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、冠静脈洞を介した逆行性投与の使用を含む。本発明の別の実施形態は、冠動脈内または心筋内投与経路の使用を含む。
【０２０９】
超音波標的マイクロバブル破壊遺伝子送達（ＵＴＭＤ）
ガスを封入したマイクロバブルは、有用な超音波造影剤である。一部の実施形態において、マイクロバブルは、本明細書に記載されたベクター、遺伝子および／または構築物を対象の組織および／または器官に送達するために使用される。［６５］一部の事例において、送達は、器官または組織特異的であり得る。共鳴周波数付近の超音波で処理した場合、マイクロバブルは振動する。より高い超音波エネルギーでは、振動の振幅が増大し、マイクロバブルの破壊を導く。この現象を使用して、例えば、本明細書に記載された組成物または遺伝子治療ベクターに負荷されたマイクロバブルを投与し（例えば、静脈内注射によって）、次に、標的部位でマイクロバブルの破壊を生じる超音波エネルギーに曝露することによって、本明細書に記載されたベクターまたは組成物を標的器官に送達する。
【０２１０】
ＵＴＭＤの実施形態において、本明細書に記載されたプラスミドベクター、本明細書に記載された遺伝子構築物をコードするポリヌクレオチドなどの生理活性分子を、例えば、脂質マイクロバブル造影剤のカチオン性シェルに添加する。これらのベクターを保有するマイクロバブルは、対象に対して、例えば、他の投与選択肢の中でも、静脈内に、または心臓の左心室に直接投与され得る。一部の対象では、マイクロバブルであるそれらは、冠動脈内カテーテルを介して注入され得る。血液の循環から標的器官への次の送達は、マイクロバブルの共鳴周波数における音波キャビテーションによって起こる。一部の実施形態において、マイクロバブルの破壊によって生じる力学的エネルギーは、標的化部分の微小血管系の内皮細胞内または内皮細胞間に一時的なポア形成を生じる場合がある。一部の実施形態において、内皮細胞へのおよび内皮細胞を横切るトランスフェクション効率が増大し、導入遺伝子をコードするベクターが周囲組織に堆積される。このように、本明細書に記載されたベクターがＵＴＭＤによって送達される一部の事例において、血液の循環中に残存するさらなるプラスミドＤＮＡは、血液中のヌクレアーゼによって分解される可能性があり、それによって、超音波処理に曝露された器官への高度に特異的な標的器官トランスフェクションを生じ、非超音波処理組織への送達の可能性を低減する。
実施例
【実施例１】
【０２１１】
Ａｔｔ部位介在性組換えのための心筋細胞のトランスフェクション
心筋細胞を、ａｔｔ部位を伴うまたは伴わない（すなわちプラス（＋）またはマイナス、およびプラス（＋）またはマイナス（−）のＳｐＢＣ２リコンビナーゼ（−））のルシフェラーゼベクターを用いてトランスフェクトした。その後、ルシフェラーゼ発現を経時的にモニターしてａｔｔ部位介在性組換えを評価した。ＳｐＢＣ２およびその提案された活性部位（Ａｔｔ部位）の部位特異性および効力を決定するために、心筋細胞を、ＳｐＢＣ２プラスミドおよびホタルルシフェラーゼ（「ＦＬＵＣ」または「Ｌｕｃ」）プラスミドベクター（目的遺伝子周囲のａｔｔ部位を含む）で同時トランスフェクトした。含まれた対照は、ＳｐＢＣ２を含まないＡｔｔ−Ｌｕｃプラスミド（無作為な組込みを測定するため）、ＳｐＢＣ２を有するＮｏ−Ａｔｔ−Ｌｕｃプラスミド（非ａｔｔ部位の特異的組込みを測定するため）、およびＳｐＢＣ２を含まないＮｏ−Ａｔｔ−Ｌｕｃプラスミド（一過性発現を測定するため）であった。細胞をＤＮＡフェクチン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を介してトランスフェクトし、１４日間培養し、細胞を周期的に継代培養し、ルシフェラーゼアッセイによって細胞を試験し、ｑＰＣＲアッセイのために細胞を採取した。
【０２１２】
トランスフェクションは、完全増殖培地およびトランスフェクション培地（ＦＢＳ／抗生物質を含まないＰｒｉｇｒｏｗ  Ｉ）を利用して行った。トランスフェクションの少なくとも１時間前に、培地を、心筋細胞から取り出し、新鮮な増殖培地と交換した。６ウェルプレートでは３ｍＬ／ウェル、または１２ウェルプレートでは１．５ｍＬ／ウェルである。使用前にＤＮＡフェクチン試薬を室温まで温め、短時間ボルテックスして混合した。ＤＮＡフェクチン−プラスミドＤＮＡ複合体の様々な組合せを、以下のようにトランスフェクション培地中で調製した：
【０２１３】
2018536405.tif 000012
【０２１４】
ＤＮＡをトランスフェクション培地に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートした。３００μＬ／ウェルのＤＮＡフェクチン−ＤＮＡ複合体を細胞に添加した。
【０２１５】
ｑＰＣＲ、ルシフェラーゼアッセイのための継代および採取
トランスフェクションの４８時間後、培地を１２ウェルプレート中の細胞から除去した。細胞をトリプシン処理し、微量遠心管に採取した。次いで、細胞を１ｍＬの新鮮な増殖培地に再懸濁した。細胞を５ｅ４細胞／ウェルで新しい１２ウェルプレートに播種し、ルシフェラーゼを測定した。残りの細胞をｑＰＣＲのために採取した。
【０２１６】
結果：
２週間の経過にまたがって、Ａｔｔ−Ｌｕｃ＋ＳＰＢｃ２リコンビナーゼからのＦＬＵＣ発現は、ほぼ１０倍低下したが、他のトランスフェクション条件（ａｔｔ部位なしまたはリコンビナーゼなしのいずれか）からのＦＬＵＣ発現は１００〜１０００倍減少し、バックグラウンドレベルの発現までほぼ戻った（データは示されていない）。心筋細胞ゲノムへのＦＬＵＣ  ＧＯＩ（目的遺伝子）のａｔｔ部位介在性組換えも観察された（データは示されていない）。
【実施例２】
【０２１７】
ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイを使用して、ｐＸｏＸによって発現されるＶＥＧＦ１６５の機能性を評価した。血清飢餓状態のＨＵＶＥＣを、ｐＸｏＸまたは単一のエフェクター対照（ｐＶＥＧＦ１６５陽性対照、ｐＳＤＦ−１α陰性対照）でトランスフェクトした患者（拡張型、肥大性）または健常なｉＰＳＣ由来の心筋細胞からの馴化培地で処置した。インキュベーションの９６時間後、発光アッセイを用いてＨＵＶＥＣ増殖を定量した。アッセイを３回繰り返した（例えば、ＣＭ−１、ＣＭ−２、ＣＭ−３）。
【０２１８】
誘導された多能性幹細胞
ｉＰＳＣ心筋細胞を、Ｓ１００Ａ１およびＶＥＧＦ；Ｓ１００Ａ１、ＳＤＦ１、およびＶＥＧＦ；またはＶＥＧＦのみをコードする単一遺伝子、二重遺伝子、または三重遺伝子ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞上清を収集した。ＨＵＶＥＣを、トランスフェクトされたｉＰＳＣ細胞から収集された上清中に、約１：１０，１：１００、および１：１０００の密度で６ウェルプレートに播種した。上清が導入されてから９６時間後、ＨＵＶＥＣ増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙによって測定した。図５Ａおよび図５Ｂは、実験データを示す。図１４および図１４Ｂは、拡張型心筋症患者由来のｉＰＳＣ細胞について同様の結果を示す。
【０２１９】
心筋症患者および健常対照由来の心筋細胞
心筋細胞−ｉＰＳＣ細胞は、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、肥大性心筋症（ＨＣＭ）または健常対照を有する患者から得た。ｉＰＳＣ細胞を、Ｓ１００Ａ１およびＶＥＧＦ；Ｓ１００Ａ１、ＳＤＦ１、およびＶＥＧＦ；またはＶＥＧＦのみをコードする単一遺伝子、二重遺伝子、または三重遺伝子ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞上清を収集した。ＨＵＶＥＣを、トランスフェクトされたｉＰＳＣ細胞から収集された上清中に、約１：１０、１：１００、および１：１０００の密度で６ウェルプレートに播種した。上清が導入されてから９６時間後、ＨＵＶＥＣ増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙによって測定し、図６は実験データを示す。
【０２２０】
結果
単一遺伝子、二重遺伝子、または三重遺伝子ベクター構築物でトランスフェクトしたｉＰＳＣ−ＣＭは、両方の場合においてＨＵＶＥＣ増殖の４〜１０倍の増大を示した。したがって、結果によって、本明細書で提供されるリンカーを使用する場合（すなわち、単一のＶＥＧＦ１６５エフェクタープラスミドを用いて観察されるものと同様のＨＵＶＥＣ増殖を誘導する場合）、二重遺伝子および三重遺伝子発現ベクターからの多重遺伝子連結構築物の一部として発現されるとき、ＶＥＧＦが機能的（すなわち、生物学的に活性）であることが首尾良く実証される。
【実施例３】
【０２２１】
内皮管形成アッセイ
ＨＵＶＥＣ増殖アッセイに加えて、内皮管形成アッセイ（ＣＢＡ２００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用する。ＥＣＭゲルを、４℃で解凍し、冷却ピペットチップを使用して均一に混合する。細胞培養プレート（９６ウェル）を、ＥＣＭゲルの薄層を用いて底部にコーティングし（５０μｌ／ウェル）、これを３７℃で６０分間重合させた。本明細書に記載のリンカーによって連結されているＳ１００Ａ１およびＶＥＧＦ；本明細書に記載のリンカーによって連結されているＳ１００Ａ１、ＳＤＦ１、およびＶＥＧＦ；またはＶＥＧＦのみをコードする単一遺伝子、二重遺伝子または三重遺伝子ベクターでトランスフェクトされたｉＰＳＣ心筋細胞から収集した上清中の細胞培養プレートにＨＵＶＥＣ（２〜３×１０4個の細胞）を播種する。１５０μｌの上清−ＨＵＶＥＣ混合物を、固化したＥＣＭゲル上の各ウェルに加える。そのプレートを３７℃で１２〜１８時間インキュベートする。Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭで染色した後、蛍光顕微鏡を用いて内皮管を定量する。３つの顕微鏡視野を無作為に選択し、撮影する。チューブ形成能力は、４×対物レンズおよびウェル当たり４つの異なる視野の下で、細胞クラスター（ノット）および分枝の総数を数えることによって定量する。結果は、対照群と比較した分岐の平均倍数変化として表される。各実験は少なくとも３回実施する。
【実施例４】
【０２２２】
ＳＤＦ−１α機能−遊走アッセイ
２４ウェルトランスウェル走化性チャンバ技術（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて走化性実験を行った。要約すると、健常ボランティアから得た試料から末梢血白血球（ＰＢＬ）を単離し、本明細書に記載のリンカーにより連結されたＳ１００Ａ１およびＶＥＧＦ、または本明細書に記載のリンカーにより結合されたＳ１００Ａ１、ＳＤＦ１およびＶＥＧＦをコードするダブル遺伝子または三重遺伝子ベクターでトランスフェクトした。２００μＬの培地中の合計１×１０5ＰＢＬを、上部チャンバ（孔径８μｍ）に播種した。阻害実験のために、ＰＢＬの半分を、１０ｎｍｏｌ／ＬのＣＸＣＲ４アンタゴニスト（ＡＭＤ３１００）と３０分間プレインキュベートしてから播種した。次いで、ＰＢＬおよび培地を上部チャンバに移した。次に、チャンバを、５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中、３７℃で１２時間インキュベートした。膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を除去し、その上面を綿棒で拭き取り、固定のＰＢＬを除去した。次に膜を中性ホルマリン中で、室温で１０分間固定し、次いで０．１％クリスタルバイオレットで５分間染色した。膜の下面に移動したＰＢＬの数を、光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）下で１０のランダム高倍率視野（ＨＰＦ）で計数した。
【０２２３】
化学走性指数（ＣＩ）を算出して、刺激遊走：ＣＩ＝刺激遊走（ＨＰＦあたりのＣＳＣの数）／ランダム遊走（ＨＰＦあたりのＣＳＣの数）を表した。各アッセイは３つのウェルで行った。
【０２２４】
結果
ＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４アンタゴニスト）を用いたＳＤＦ１特異的遊走の検証は成功した。ＡＭＤ３１００は、ＳＤＦ１−ＣＸＣＲ４依存性遊走の完全な阻害を示した（試料番号２、６）。ｉＰＳＣ−ＣＭで発現されるＳＤＦ１は、ＡＭＤ３１００の存在下で遊走が減少するので、本発明者らのダブル遺伝子および三重遺伝子構築物において機能的である（試料番号７、１２、１３）。図７および図８は、実験データを示す。ＶＥＧＦ発現ベクター構築物を用いて行った同様の実験によって、同様の結果が示される（図６）。したがって、これらの結果は、本明細書で提供されるリンカーを使用する場合、二重遺伝子および三重遺伝子発現ベクターからの多重遺伝子連結構築物の一部として発現されるとき、ＳＤＦ−１αが機能的（すなわち、生物学的に活性）であることを首尾良く実証する。
【実施例５】
【０２２５】
実施例５Ａ  ＳＤＦ−１α機能−Ｊｕｒｋａｔ遊走アッセイ
トランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞は、細胞遊走を支援する機能的ＳＤＦ１タンパク質を産生する
ＳＤＦ−１αを、Ｊｕｒｋａｔ細胞および末梢血リンパ球（ＰＢＬ）という２つの細胞型のＣＸＣＲ４媒介遊走を実証することによって、機能性について調べた。Ｊｕｒｋａｔ細胞の遊走に関しては、無血清培地中の細胞を、トランスウェルインサートの上部に播種した。下部チャンバは、ｐＸｏＸまたは単一のエフェクター対照でトランスフェクトされた患者（拡張型、肥大型）または健常なｉＰＳＣ由来の心筋細胞からの馴化培地で満たした。２時間後に馴化培地を含有する下部チャンバにトランスウェル挿入物を通って遊走した細胞の数を、発光アッセイを用いて定量した。
【０２２６】
Ｊｕｒｋａｔ細胞に、ＳＤＦ１をコードする単一遺伝子、ダブル遺伝子、および三重遺伝子遺伝子構築物をトランスフェクトした。Ｊｕｒｋａｔ対照細胞およびＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４アンタゴニスト）に暴露されたＪｕｒｋａｔを、薬物添加の２時間後に遊走効率について測定した。図８および図１０は実験データを示す。ＳＤＦ１をコードするダブル遺伝子および三重遺伝子ベクターを用いてトランスフェクトされたヒトｉＰＳＣ由来の上清と共に培養されたＪｕｒｋａｔ細胞で実施された同様の実験は、同様の結果を示す（図１１）。
【０２２７】
結果
組換えＳＤＦ１へのＪｕｒｋａｔの遊走は、ＣＸＣＲ４依存性である。したがって、これらの結果は、本明細書で提供されるリンカーを用いる場合、二重遺伝子および三重遺伝子発現ベクターからの多重遺伝子連結構築物の一部として発現されるとき、ＳＤＦ−１αが機能的（すなわち、生物学的に活性）であること実証するのに成功している。
【０２２８】
実施例５Ｂ  心筋症患者からのトランスフェクトされた心筋細胞は、細胞遊走を支持する機能性ＳＤＦ１タンパク質を産生する
心筋細胞−ｉＰＳＣ細胞（ｉＰＳＣ−ＣＭ）は、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、肥大型心筋症（ＨＣＭ）を有する患者または健常対照から得た。ｉＰＳＣ細胞に、本明細書に記載のリンカーによって連結されたＳ１００Ａ１およびＶＥＧＦ；本明細書に記載のリンカーによって連結されているＳ１００Ａ１、ＳＤＦ１、およびＶＥＧＦ；またはＶＥＧＦのみをコードする単一遺伝子、二重遺伝子（ダブル遺伝子）、または三重遺伝子ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞上清を収集した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、トランスフェクトされたｉＰＳＣ細胞から収集された上清中に、約１：１０，１：１００、および１：１０００の密度で、６ウェルプレートに播種した。上清が導入されてから９６時間後、Ｊｕｒｋａｔ細胞遊走を測定した。図１２は、拡張型心筋症モデルにおける実験データを示す。図１３は、肥大型心筋症モデルにおける実験データを示す。
【０２２９】
結果
単一遺伝子、二重遺伝子または三重遺伝子ベクター構築物でトランスフェクトされたｉＰＳＣ−ＣＭは、両方の場合においてＨＵＶＥＣ増殖の４〜１０倍の増大を示した。
【実施例６】
【０２３０】
ＥＬＩＳＡ
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞は、定量可能なタンパク質レベルを産生する
２９３Ｔ細胞を、Ｘｏｇｅｎｅｘ単一遺伝子、二重遺伝子（ダブル遺伝子）、三重（三重遺伝子）遺伝子構築物および適切な対照構築物でＦｕｇｅｎｅ  ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を介してトランスフェクトした。所望の時点（複数可）で細胞上清および溶解物を採取した。２９３Ｔ細胞を、図１５〜１７にまとめたように、Ｋｏｚａｋ配列の存在または非存在、リンカー（フリン−ＡＰ−Ｆ２Ａ、ＧＳＧ−Ｐ２Ａ、フリン−ＡＰＶＫＱＧＳＧ−Ｐ２Ａ）（配列番号１１９）またはなしという点で異なるベクターを利用して、本明細書に記載のリンカーによって結合されるＳ１００Ａ、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ１９１またはそれらの種々の組合せをコードするベクター構築物でトランスフェクトした。
【０２３１】
結果
Ｓ１００Ａ、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ１９１、またはそれらの様々な組合せをコードするダブル遺伝子ベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞は、測定可能なレベルのタンパク質を産生する。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＳＤＦ１タンパク質のレベルを示す。図１６Ａおよび図４１６Ｂは、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを示す。図１７Ａおよび図１７Ｂは、Ｓ１００Ａ１タンパク質のレベルを示す。
【実施例７】
【０２３２】
三重遺伝子発現構築物
二重遺伝子（ダブル遺伝子）、三重遺伝子、および四重遺伝子（四遺伝子）構築物のマトリックス（多様性）を以下の表５に示すように設計した。
【０２３３】
【表５】
2018536405.tif 000013
【０２３４】
拡張型心筋症および肥大性心筋症を有する健常なドナー、ドナー（患者）の各々からのモデル細胞型（すなわち、２９３Ｔ細胞、ＳＶ４０形質転換心筋細胞、およびｉＰＳＣ由来の心筋細胞）においてポリペプチド発現および切断効率を試験した。発現の結果、切断効率の結果、および種々のリンカー（すなわち、連結配列）の組合せに関する発現の考慮のまとめを、以下の表６に示す。
【０２３５】
【表６】
2018536405.tif 000014
【０２３６】
リード構築物の構成：
（５’）−ＣＡＧプロモーター−Ｓ１００Ａ１−ｆｐ２ａ（リンカー）−ＳＤＦ１α−ｆｐ２ａ（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−（３’）
（５’）−ＣＡＧプロモーター−Ｓ１００Ａ１−ｆｐ２ａ（リンカー）−ＶＥＧＦ１９１−ｆｐ２ａ（リンカー）−ＳＤＦ１α−（３’）
【０２３７】
ＥＬＩＳＡアッセイ−三重遺伝子構築物からのＳ１００Ａ１の発現
ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、単一遺伝子ｐＸｏＸ対照および以前に同定されたリード候補である二重遺伝子構築物と比較して、三重遺伝子ｐＸｏＸ構築物からのＳ１００Ａ１の発現を定量した。ＳＶ４０形質転換心筋細胞を、試験プラスミド構築物の各々でトランスフェクトし、細胞上清および溶解物を所望の時点（複数可）で採取した。心筋細胞を、本明細書に記載され、それぞれ第１、第２および第３のリンカー配列（例えば、ｆｐ２ａ、ｆｍｄｖ、ｐ２ａ、ＩＲＥＳ、ＣＭＶ、または連結配列なし）として下記の表７に示すリンカー配列によって連結されたＳ１００Ａ、ＳＤＦ１α、ＶＥＧＦ１９１またはそれらの様々な組合せをコードするベクター構築物でトランスフェクトした。産生されたタンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。図１８を参照のこと；試料番号は、下記の表７に示す試料番号に対応する。
【０２３８】
構築物およびＳ１００Ａ１発現結果の構成を表７（下記）に示す。
【０２３９】
【表７】
2018536405.tif 000015
【０２４０】
ＥＬＩＳＡアッセイ−三重遺伝子構築物からのＳＤＦ１αの発現
ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、単一遺伝子ｐＸｏＸ対照および以前に同定されたリード候補、二重遺伝子構築物と比較して、三重遺伝子ｐＸｏＸ構築物からのＳＤＦ１αの発現を定量した。ＳＶ４０形質転換心筋細胞を、試験プラスミド構築物の各々でトランスフェクトし、細胞上清および溶解物を、所望の時点（複数可）で採取した。心筋細胞を、本明細書に記載され、それぞれ第１、第２、および第３のリンカー配列（例えば、ｆｐ２ａ、ｆｍｄｖ、ｐ２ａ、ＩＲＥＳ、ＣＭＶ、または連結配列なし）として下記の表８に示されるリンカー配列によって連結されたＳ１００Ａ、ＳＤＦ１α、ＶＥＧＦ１９１またはそれらの様々な組合せをコードするベクター構築物でトランスフェクトした。産生されたタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。図１９を参照のこと；試料番号は、下記の表８に示す試料番号に対応する。
【０２４１】
【表８】
2018536405.tif 000016
【０２４２】
ＥＬＩＳＡアッセイ−三重遺伝子構築物からのＶＥＧＦ１９１の発現
ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、単一遺伝子ｐＸｏＸ対照および以前に同定されたリード候補、二重遺伝子構築物と比較して、三重遺伝子ｐＸｏＸ構築物からのＶＥＧＦ１９１の発現を定量した。ＳＶ４０形質転換心筋細胞を、試験プラスミド構築物の各々でトランスフェクトし、細胞上清および溶解物を、所望の時点（複数可）で採取した。本明細書に記載の、および下記の表９に、それぞれ第１のリンカー配列、第２のリンカー配列および第３のリンカー配列（例えば、ｆｐ２ａ、ｆｍｄｖ、ｐ２ａ、ＩＲＥＳ、ＣＭＶ、または連結配列なし）として示される、リンカー配列によって連結されたＳ１００Ａ、ＳＤＦ１α、ＶＥＧＦ１９１またはそれらの様々な組合せをコードするベクター構築物で心筋細胞をトランスフェクトした。産生されたタンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。図２０を参照のこと；試料番号は、下記の表９に示す試料番号に対応する。
【０２４３】
【表９】
2018536405.tif 000017
【０２４４】
ウエスタンブロット（イムノブロット）アッセイで、三重遺伝子構築物からのＳ１００Ａ１、ＳＤＦ−１ａおよびＶＥＧＦ１９１の効率的な切断を確認する
関連する細胞型内の個々のエフェクタータンパク質の適切なサイズおよび配列の確認は、イムノブロットおよび質量分析によって実証された（本明細書中でさらに記載されるように）。複数の妥当な細胞系を、ｐＸｏＸでトランスフェクトし、細胞溶解物（Ｓ１００Ａ１について）または馴化培地（ＳＤＦ−１αおよびＶＥＧＦ１６５について）のいずれかを分析した。イムノブロット分析用の対照は、適切な単一エフェクター（ｐＳ１００Ａ１、ｐＳＤＦ−１α、ｐＶＥＧＦ１６５）および対応する市販の精製された組換えタンパク質でトランスフェクトされた細胞由来の溶解物／馴化培地であった。
【０２４５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／イムノブロットの結果は、試験した全ての細胞系（２９３Ｔ、ＳＶ４０不死化心筋細胞、健常個体、拡張型心筋症患者、肥大性心筋症患者由来のｉＰＳＣ）にまたがって一貫していた。ＳＶ４０不死化心筋細胞からのイムノブロットデータを、以下の図２１〜図２３に示しており、ここでは、指示されたエフェクタータンパク質の各々の予想されるサイズを矢印で示す。
【０２４６】
各ＧＯＩについて、イムノブロット解析を、製造業者の指示に従って標準的な手順を用いて行った。検出試薬条件は以下のとおりであった：
Ｓ１００Ａ１検出−抗Ｓ１００Ａ１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を１：２００に希釈し、ブロットで、４℃で一晩インキュベートし；１：２０，０００に希釈した抗ヒツジＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）抗体（ＫＰＬ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を、ブロットで、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートし；ＬＵＭＩＧＬＯ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（ＫＰＬ  Ｉｎｃ．）によりシグナル検出；
ＳＤＦ−１α検出−１：２０００に希釈した抗ＳＤＦ−１α抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）をブロットで、４℃で一晩インキュベートした；１：２０，０００に希釈した抗ヤギＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖ、ＰＡ、ＵＳＡ）抗体を、ブロットで、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした；ＬＵＭＩＧＬＯ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（ＫＰＬ  Ｉｎｃ．）によるシグナル検出。
ＶＥＧＦ検出−抗ＶＥＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｐｌｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を１：２０００に希釈し、ブロットで、４℃で一晩インキュベートした；１：２０，０００に希釈した抗ウサギＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）抗体をブロットで、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした；ＬＵＭＩＧＬＯ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（ＫＰＬ  Ｉｎｃ．）によるシグナル検出。
【０２４７】
例示的なイムノブロットを図２１、図２２および図２３に示す
【０２４８】
【表１０】
2018536405.tif 000018
【０２４９】
結果は、３つのＧＯＩのそれぞれが、三重遺伝子構築物から発現されるにつれて効率的に切断されることを示す。
【０２５０】
質量分析アッセイ−多重遺伝子発現産物を質量分析法によって評価した。
リード候補の切断産物を、質量分析法を用いて検証した。トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼ消化を、標準的な手順を用いて行った。各ゲル消化物を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）にインターフェースした、Ｗａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ＊によりさらに分析した。データは、マスコット（Ｍａｓｃｏｔ）データベースを使用して処理した。マスコットＤＡＴファイルは、検証、フィルタリングのため、および試料ごとに非冗長リストを作成するために、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェアで解析した。データは、９０％の最小タンパク質値、５０％の最小ペプチド値（Ｐｒｏｐｈｅｔスコア）を用いおよびタンパク質あたり少なくとも２つのユニークなペプチドを必要とする条件で濾過した。上記のウエスタンブロット（イムノブロット）分析と一致して、リード二重遺伝子および三重遺伝子構築物から発現された場合、質量分析の結果によりＳ１００Ａ１、ＳＤＦ−１およびＶＥＧＦのタンパク質分解切断がさらに確認された。表１１を参照のこと。
＊ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、質量分析計（ＭＳ）による液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を示す。ＭＳ／ＭＳは、１つの質量分析装置に２つの質量分析器を組み合わせたものである。第１のＭＳは、前駆イオンを濾過し、続いて高エネルギーを有する前駆イオン、および例えば窒素ガスの断片化が続いた。次いで、第２の質量分析器は、断片化によって生成された生成イオンをフィルタリングする。ＭＳ／ＭＳの利点は感度の向上である。
【０２５１】
【表１１】
2018536405.tif 000019
【０２５２】
質量分析（ＭＳ）を用いて、各ＧＯＩの末端（Ｃ末端）でリンカーアミノ酸残基の有無を評価した。ＭＳは上記のように実施した。結果を以下の表１２に示す。
【０２５３】
【表１２】
2018536405.tif 000020
【０２５４】
Ｓ１００Ａ１ポリペプチド二量体化のウエスタンブロット（イムノブロット）解析
二重遺伝子および三重遺伝子構築物から発現されたＳ１００Ａ１ポリペプチドの二量体形成を評価するために、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実施した。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の馴化培地を、Ｓ１００Ａ１の単量体レベルおよび二量体レベルについてのネイティブＰＡＧＥ／イムノブロットによって分析した。結果は、リード二重およびリード三重候補から切断されたＳ１００Ａ１が、主に二量体型である一方、単一エフェクター構築物ｐＳ１００Ａ１およびＳ１００Ａ１に対してＣＭＶリンカーＣ末端を有する三重遺伝子構築物によって発現されるＳ１００Ａ１が、主として単量体であることを示す。図２４を参照のこと。
【０２５５】
特に、本発明の独特の態様が提供され、本発明の構築物によってコードされるポリペプチドの特定の連続的な順序によって可能になる。したがって、本発明の一態様では、Ｓ１００Ａ１タンパク質を特異的に配置することは、最初に、Ｓ１００Ａ１に残存する２ＡテールがＳ１００Ａ１の生物学的活性に干渉しないことが驚くべきことに発見されたので、生物学的に活性なＳ１００Ａ１分子の機能的発現を達成し、可能とする。これに対して、第２の遺伝子としてＳ１００Ａ１を配置することにより、構築物を介して発現した遺伝子の不完全な切断が生じることが発見された。
【０２５６】
したがって、以下の表１３に示されるように、質量分析を用いたｐＸｏＸ発現の分析によって、Ｓ１００Ａ１が、Ｃ末端２Ａペプチドの除去をもたらすフリン切断を示さない唯一のエフェクターであることが示された。したがって、ＳＤＦ１αまたはＶＥＧＦ上には２ＡのＣ末端テールが残っていない。Ｓ１００Ａ１のみが２Ａのリンカー−テールを有する。正確な終結アミノ酸配列は、ＰＧである。それはＰＧＰ配列の終わりをＧとＰの間で切断する。したがって、ｐＸｏＸから発現されるＳ１００Ａ１上のＣ末端リンカーテールは、ＲＡＫＲＡＰＶＫＱＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号１２３）に融合された配列（Ｎ末端からＣ末端への）Ｓ１０１Ａ１ポリペプチドを含む；これを本明細書では「２Ａテール」と呼ぶ場合がある。例えば、一実施形態では、Ｓ１００Ａ１の最初のメチオニンからｆｐ２ａ切断リンカーテールのＣ末端まで、本発明の第１のＧＯＩは、以下の配列を含む：
ＭＧＳＥＬＥＴＡＭＥＴＬＩＮＶＦＨＡＨＳＧＫＥＧＤＫＹＫＬＳＫＫＥＬＫＥＬＬＱＴＥＬＳＧＦＬＤＡＱＫＤＶＤＡＶＤＫＶＭＫＥＬＤＥＮＧＤＧＥＶＤＦＱＥＹＶＶＬＶＡＡＬＴＶＡＣＮＮＦＦＷＥＮＳＲＡＫＲＡＰＶＫＱＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号１２４）
【０２５７】
しかしながら、本明細書中に提示されるデータを介して提供されるように、このＳ１００Ａ１テールは「不活性」である、すなわちＳ１００Ａ１の機能（生物学的活性）に影響しないことが実証されている。
【０２５８】
【表１３】
2018536405.tif 000021
【実施例８】
【０２５９】
三重遺伝子ベクタートランスフェクション
２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレートに１ウェルあたり７５０，０００細胞でプレートし、プレートで一晩、３７℃／５％ＣＯ2までインキュベーターで一晩インキュベートした。翌日、ＯｐｔｉＭＥＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈した１００ｎｇ／ｍｌでプラスミドベクターを用いて、単一（単一遺伝子）、二重（ダブル遺伝子）、三重（三重遺伝子）、表１４、遺伝子構築物および適切な対照構築物を有するＦｕＧＥＮＥ  ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をインキュベートした。細胞上清および溶解物を必要に応じて７２時間で採取した。
【０２６０】
【表１４−１】
2018536405.tif 000022
【０２６１】
【表１４−２】
2018536405.tif 000023
【０２６２】
【表１４−３】
2018536405.tif 000024
【０２６３】
【表１４−４】
2018536405.tif 000025
【０２６４】
【表１４−５】
2018536405.tif 000026
【表１４−６】
2018536405.tif 000027
【０２６５】
【表１５】
2018536405.tif 000028
【０２６６】
結果
ｐＸｏＸ由来のエフェクターが単一の多重遺伝子ｍＲＮＡとして発現されるので、各エフェクターの相対的発現は固定される。ｐＸｏＸの各エフェクターの相対発現レベルを決定するために、いくつかの関連する細胞株をトランスフェクトし、タンパク質発現をＥＬＩＳＡによって評価した。個々のエフェクター（ｐＳ１００Ａ１、ｐＳＤＦ−１αまたはｐＶＥＧＦ１６５）のそれぞれまたは３つのエフェクター（ｐＸｏＸ）の全てについて、細胞をプラスミドでトランスフェクトした。
【０２６７】
したがって、表１６に示すように、Ｓ１００Ａ１、ＳＤＦ−１αおよびＶＥＧＦ１６５をコードするｐＸｏＸ三重遺伝子ベクターでトランスフェクトされた様々な細胞は、ＥＬＩＳＡアッセイによって検出されるように、測定可能なレベルのタンパク質を産生した。試験した細胞型は、２９３Ｔ細胞、ＳＶ４０形質転換心筋細胞、健常個体由来のｉＰＳＣ−ＣＭ（心筋細胞）、拡張型心筋症患者由来のｉＰＳＣ−ＣＭ、および肥大型心筋症患者由来のｉＰＳＣ−ＣＭを含んだ。
【０２６８】
トランスフェクションの７２時間後、培地および細胞溶解物を収集し、別々に分析して、分泌タンパク質（ＶＥＧＦ１６５およびＳＤＦ−１α）または細胞内タンパク質（Ｓ１００Ａ１）の発現を評価した。以下の表１６は、各エフェクターを個別に発現するプラスミドによって達成されるレベルと比較した、各エフェクターのタンパク質レベルを、ｎｇ／ｍＬとして表す。
【０２６９】
【表１６】
2018536405.tif 000029
【０２７０】
実施例８  心筋細胞トランスフェクション
ＳＶ４０不死化心筋細胞
ＳＶ４０不死化心筋細胞を、少なくとも２つの遺伝子が本明細書に記載のリンカーによって連結されているＸｏｇｅｎｅｘ単一遺伝子、二重遺伝子（ダブル遺伝子）、三重遺伝子構築物、および適切な対照構築物を用いてＤＮＡフェクチン  Ｐｌｕｓ（ＡＢＭ）を介してトランスフェクトした。６ウェルプレートを、細胞外マトリックス（ＡＢＭ）で一晩コーティングした。２４時間後、心筋細胞を、各ＥＣＭコーティングウェル中に２２５，０００細胞／ウェルで、６ウェルプレートに播種した。その細胞を３７℃／５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。７２時間後、培地を細胞から２ｍＬの深いウェルブロックに集め、タンパク質産生の検出および定量のためにＥＬＩＳＡ用に保存した。
【０２７１】
ｉＰＳＣ心筋細胞
ｉＰＳＣ心筋細胞を、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒトランスフェクション試薬（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介してＸｏｇｅｎｅｘ単一遺伝子、二重遺伝子（ダブル遺伝子）、三重遺伝子構築物および適切な対照構築物でトランスフェクトした。１２ウェルプレートを、フィブロネクチン（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でコーティングし、３７℃／５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。ＤＮａｓｅを超純水中で１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に再構成した。心筋細胞を、ＴｒｙｐＬＥおよび１Ｘ  ＤＮａｓｅ  Ｉを用いてトリプシン処理し、３７℃で５分間または細胞がフラスコから剥がれるまでインキュベートした。ｉＰＳＣ細胞を、１２ウェルプレートの各フィブロネクチンコーティングウェルに４ｅ５細胞／ウェルで播種した。プレートした細胞を、３７℃／５％ＣＯ2インキュベーターで２４時間インキュベートした。翌日、心筋細胞を、プラスミドＤＮＡを用いて２μｇでトランスフェクトした（ｐＸｏＸおよび対照）。
【０２７２】
結果
Ｓ１００Ａ、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ１６５をコードする三重遺伝子ベクターでトランスフェクトした不死化および一次心筋細胞は、測定可能なレベルのタンパク質を産生した（図２１）。
【実施例９】
【０２７３】
トランスフェクトされた心筋細胞によるタンパク質産生の定量化
２９３Ｔ細胞、ＳＶ４０  ＣＭおよびｉＰＳＣ  ＣＭ由来の溶解産物を、ＢｕＰＨ炭酸塩−重炭酸緩衝液パック（０．２Ｍ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で１：１００に希釈し、ＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。
【０２７４】
結果
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞、ＳＶ４０  ＣＭおよびｉＰＳＣ  ＣＭの細胞溶解物において、Ｓ１００Ａ１、ＳＤＦ−１α、およびＶＥＧＦ１６５タンパク質が検出された（図２１）。
【実施例１０】
【０２７５】
拍動速度および収縮持続時間
ｐＸｏＸの有効性およびｐＸｏＸによって発現されるＳ１００Ａ１の機能を評価するために、ｐＸｏＸまたは適切な対照でトランスフェクトされた健常な個体および拡張型心筋症患者由来のｉＰＳＣ−心筋細胞（心臓ＴＮＮＴ２遺伝子におけるＲ１７３Ｗ突然変異を有する）の収縮特性を、Ｓｏｎｙ  ＳＩ８０００  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍで測定した。細胞収縮は、高解像度および高フレームレートの映像（２０４８×２０４８ピクセル、１５０ｆｐｓ、１ウェルあたり１０秒）として記録された。収縮映像をさらにソニーＳ１８０００Ｃアナライザソフトウェアで分析し、収縮パラメータを、個々のウェルごとに取り出した。インキュベーションの３０分以内に記録された収縮特性に基づいて、β−アドレナリン刺激（イソプロテレノール（ＩＳＯ、１００ｎＭ））に対するｉＰＳＣ−ＣＭの応答性を測定した。研究の間に３つの収縮パラメータ、すなわち拍動速度、収縮速度（速度）および収縮持続時間を評価した。
【０２７６】
結果
拍動速度および収縮持続時間によって、Ｓ１００Ａ１をコードするベクターの３’末端に２Ａテールが存在することがＳ１００Ａ１の機能に影響しないことが示される（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。別の実験では、示された拍動速度および収縮持続時間（図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ）は、トランスフェクトされたｉＰＳＣ−ＣＭ細胞から産生されたタンパク質による健常な対照レベルへのＤＣＭ収縮特性の回復を示す。
【０２７７】
したがって、これらの結果は、拡張型心筋症患者に由来するｉＰＳＣ−心筋細胞のインビトロ収縮特性が、ｐＳｔｕｆｆｅｒおよび非トランスフェクション対照と比較して、ｐＳ１００Ａ１、ｐＳ１００Ａ１−ＳＤＦ−１α、およびｐＸｏＸで改善されたことを実証する。（ｐＳｔｕｆｆｅｒは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が非発現、類似サイズのスタッファー配列で置換された、ｐＸｏＸと同じ骨格構成を有するプラスミドである）。
【０２７８】
ｐＳ１００Ａ１およびｐＳ１００Ａ１−ＳＤＦ−１αは、匹敵する機能的出力（拍動速度の増大、収縮持続時間の改善）を示しており、これによって、ｐＳ１００Ａ１−ＳＤＦ−１αおよびｐＸｏＸにおけるＳ１００Ａ１の３’末端の２Ａテールの存在がＳ１００Ａ１機能に影響を及ぼさないことが示唆されている。
【０２７９】
ｐＸｏＸは、拡張型心筋症患者の収縮特性を健常な個体で観察されるレベルに回復するのに最も有効であり、これによってｐＸｏＸのエフェクターが相補的であることが示唆されている。
【実施例１１】
【０２８０】
リコンビナーゼ滴定
図２８では、ｐＸｏＸ三重遺伝子発現ベクターとリコンビナーゼとの様々な比を有する、ＳＶ４０形質転換心筋細胞にトランスフェクトした場合の、ＶＥＧＦの発現の持続性を検出するためにＥＬＩＳＡ分析を行ったリコンビナーゼ滴定実験におけるＶＥＧＦの発現データを示す。トランスフェクション後３日目に、ＳＰＢｃ２群とＳｔｕｆｆｅｒ群との間にＶＥＧＦ発現に有意差はなかった。トランスフェクション後１０、１７、および２４日目に、ルシフェラーゼ：リコンビナーゼ比が１：０．２〜１：０．０４である場合、ＳＰＢｃ２群は、対照（Ｓｔｕｆｆｅｒ）群より有意に多くのＶＥＧＦ分泌を示した。
【０２８１】
図２９は、リコンビナーゼ滴定実験におけるＳＤＦ−１α発現のデータを示しており、ここでは、ＥＬＩＳＡ分析を行って、ＳＶ４０形質転換心筋細胞にトランスフェクトされたときのＳＤＦ−１αの発現の持続性を、ｐＸｏＸ三重遺伝子発現ベクターとリコンビナーゼとの様々な比で検出した。トランスフェクション後３日目に、ＳＰＢｃ２群とＳｔｕｆｆｅｒ群との間のＳＤＦ１発現に有意差はなかった。ＳＤＦ１タンパク質レベルは、トランスフェクションの１０日後および１７日後の検出の限界未満であった。ＳＤＦ１タンパク質レベルは、トランスフェクション後２４日で検出され、このポイントでは、ルシフェラーゼ：リコンビナーゼ比が１：０．２〜１：０．０４である場合、ＳＰＢｃ２群が、対照（Ｓｔｕｆｆｅｒ）群より有意に多くのＳＤＦ１分泌を示した。
【０２８２】
図３０は、リコンビナーゼの有無でトランスフェクトした心筋細胞におけるＳ１００Ａ１の発現のデータを示す。トランスフェクション後３日目に、ＳＰＢｃ２群とＳｔｕｆｆｅｒ群との間でＳ１００Ａ１発現の有意差はなかった。トランスフェクション後、１０、１７および２４日目に、ＳＰＢｃ２群は、対照（Ｓｔｕｆｆｅｒ）群よりも有意に多くのＳ１００Ａ１分泌を示した。
【実施例１２】
【０２８３】
ラットにおけるプラスミド骨格発現研究
ｐＸｏＸは、カナマイシン耐性遺伝子を有する標準的なプラスミド骨格を有する。さらに、エフェクタータンパク質の発現は、ハイブリッドＣＡＧプロモーターによって駆動され、表１５に記載されるような合成３’ＵＴＲ／ポリＡテールを利用する。この骨格構成が心臓における遺伝子発現を維持する能力を経時的に検証するために、ｐＸｏＸ中のエフェクターＯＲＦをルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）レポーター遺伝子（ｐＣＡＧ−ｆＬｕｃ）に置き換え、心臓へのプラスミド注入後のルシフェラーゼ発現持続時間中の生きた動物の画像化によって評価した。プラスミドサイズおよびバックグラウンドｆＬｕｃ発現の対照として、ＣＭＶプロモーターおよび非発現スタッファー配列（ｐＣＭＶ−stuffer）を有する同様のプラスミドを用いた。
【０２８４】
この発現研究のために、プラスミドＤＮＡ（２５０μｇ）を、１２〜１４週齢の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの左室壁に注射した（１群あたりｎ＝５）。ラットを経時的にモニターし、生存インビボ画像化システム（ＩＶＩＳ）を用いてルシフェラーゼ発現レベルを測定した。ｐＣＡＧ−ｆＬｕｃを注射したラットにおけるルシフェラーゼ活性は、対照ｐＣＭＶ−ｆＬｕｃ構築物を注射したラットで観察されたバックグラウンドレベルよりも最初に２対数高かった。発現レベルは、一時的にプラスミドを発現することで期待されるように、投薬後２８日にわたって徐々に低下した。これらの知見によって、このプラスミド骨格が、２８日目に対照レベル近くまで徐々に減少するタンパク質発現を開始することができることが示されている。データは示さず。
【実施例１３】
【０２８５】
送達方法−豚の冠状静脈洞を通る逆行性注入
冠状静脈洞を介した逆行性注入は、非ウイルスプラスミド構築物（限定されないが、ｐＸｏＸなど）の心臓への送達の提案された方法である。この送達方法の技術的な複雑性によって、マウスおよびラットのような小動物モデルではその評価が不可能になる。したがって、薬理学および毒物学／生体内分布研究での使用のためにはブタが提案されている。この方法の実現可能性を試験するために、試験対象としてブタでパイロット研究を行った。標準的な介入技術を用いて、バルーンカテーテル（Ｃｏｏｋ  Ｒｅｇｅｎｔｅｃ）を、ワイヤーを介して冠状静脈洞に入れた。バルーンを膨らませ、閉塞を確認し、ルシフェラーゼレポータープラスミドの注入を続けた。３つの異なる用量（４０ｍｇ、８０ｍｇおよび１２０ｍｇ）を、１ｍｇ／ｍＬのプラスミド濃度で試験した。合計９匹の動物を研究し、各用量について３回繰り返した。各動物において、全ての容量が投与されるまで、１０ｍＬ刻みで注入を行った。注入は、１０ｍＬ／分であり、注入後のバルーン閉塞は１０分間であった。
【０２８６】
プラスミド注入の約２４時間後、大きな心臓静脈をカテーテル挿入し、Ｄ−ルシフェリン基質溶液（約０．１２５ｍｇ／ｍｌ濃度）を、冠動脈系に注入した。次いで、動物を安楽死させ、心臓を外植した。外植された心臓を、続いて、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ画像化システムを用いて、ＣＣＤカメラカウントを介して生物発光について評価した。単離された心臓の注入後２４時間でのルシフェラーゼ放射強度および分布を示す生物発光画像を図９に示し、これは、投与後２４時間以内に心臓細胞によるプラスミド媒介ルシフェラーゼ発現が起こることを示している。
【０２８７】
プラスミド媒介性ルシフェラーゼ発現のさらなる生体内分布を、心臓および肺組織切片において研究した。ＲＴ−ＰＣＲデータは、１２０ｍｇ処置群のブタの心臓左心室においてのみルシフェラーゼ発現をさらに確認した（データ示さず）。予定された屠殺の前に死ぬ動物はいなかった。したがって、この研究によって、ｐＸｏＸなどの非ウイルスプラスミドの送達が安全で実用的であり、プラスミドの全身分布が制限されることが実証された。
【実施例１４】
【０２８８】
超音波標的マイクロバブル破壊（ＵＴＭＤ）法［６４］を用いたラットにおけるアドリアマイシン誘発心筋症におけるｐＸｏＸによるインビボの心筋細胞再生
心筋症を誘発するアドリアマイシンは、うっ血性心不全（ＣＨＦ）の十分に確立されたモデルである。アドリアマイシン誘発性心筋症においてラット心臓にｐＸｏＸ（生物学的に活性なＳＤＦ１α、Ｓ１００Ａ１、およびＶＥＧＦを発現する）を送達するために、超音波標的マイクロバブル破壊（ＵＴＭＤ）法を使用した。確立されたアドリアマイシン誘発性心筋症を有する合計１６匹のラットを、８匹の２つの群に分けた。各群は：（１）ｐＳｔｕｆｆｅｒまたは（２）ｐＸｏＸの２つのプラスミドのうちの１つで処理した。ｐＳｔｕｆｆｅｒは、非発現の類似のサイズの「ｓｔｕｆｆｅｒ」配列で置換したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する、ｐＸｏＸと同じ骨格構成を有する陰性対照プラスミドである。リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）５０ｍｌに溶解した２ｍｇのプラスミドと混合した、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン２．５ｍｇ／ｍｌ、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン０．５ｍｇ／ｍｌ、および１０％グリセロールの溶液中で、プラスミド含有脂質安定化マイクロバブルを調製した。０．５ｍｌのこのリン脂質−プラスミド溶液のアリコートを、１．５ｍｌの透明なバイアルに入れた；残りのヘッドスペースを、パーフルオロプロパンガス（Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）で充填した。各バイアルを、４℃で３０分間インキュベートした後、歯科用アマルガム装置（Ｖｉａｌｍｉｘ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｎ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により３０秒間機械的に振とうした。左心室ビューの２Ｄ胸骨短軸の下で、Ｍモードで１２ＭＨｚ広帯域トランスデューサ（Ｓ１２プローブ、Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）で取得したデジタル画像から、短縮率、ＬＶ後壁厚、および心室中隔拡張末期および収縮末期（ＩＶＳｄ）の心エコー測定を行った。
【０２８９】
心臓の構造および機能の心エコー測定の結果、ＵＴＭＤ−ｐＸｏＸ遺伝子治療が、短縮率指数、ＬＶ後壁径、およびＩＶＳｄを回復させることが実証される（図３１Ａ、図３１Ｂ、および図３１Ｃ）。値は、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊Ｐ＜０．００１対ｐＳｔｕｆｆｅｒ。結果によって、心エコー検査により、単一のＵＴＭＤ−ｐＸｏＸ処置後の確立されたＡＤＭ心筋症の逆転が実証されたことが示され、それにより生物学的に活性なＳＤＦ１α、Ｓ１００Ａ１、およびＶＥＧＦを発現する（リンカーを有する三重遺伝子）ｐＸｏＸ構築物の投与によるうっ血性心不全モデルにおける心筋症のインビボ治療の成功が示される。
【０２９０】
ｐＳｔｕｆｆｅｒまたはｐＸｏＸプラスミドを投与されたラットの心細胞におけるＰＨＨ３（リン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０））有糸分裂マーカーシグナルの核局在の結果を図３２に示しており、これは、心筋細胞の再生を示す。ＰＨＨ３有糸分裂マーカーは、ＵＴＭＤ−ｐＸｏＸを用いて、確立された心不全を有する成体ラット心筋細胞の増殖を確認した。早期心臓前駆細胞のマーカーであるＩＳＬ−１の陰性の結果は、前駆細胞が同じラットにおいて再生に関与しないことを確認している（図３３）。心筋細胞の再生が確認されたＩＳＬ−１の陰性の結果は、真にＵＴＭＤ−ｐＸｏＸ遺伝子治療の結果である。
【０２９１】
これらの結果により、生物学的に活性なＳＤＦ１α、Ｓ１００Ａ１、およびＶＥＧＦを発現するｐＸｏＸ構築物の投与が、うっ血性心不全モデルにおける心筋細胞再生および心筋症の良好な処置に有用であることが示される。この結果によってまた、超音波標的マイクロバブル破壊（ＵＴＭＤ）が、例えば心臓病および他の病状の治療のためのｐＸｏＸなどの多重遺伝子構築物を含む、本明細書に記載のベクターおよび遺伝子構築物を投与する首尾良い方法であることも示されている。
【０２９２】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され説明されたが、当業者には、そのような実施形態は単なる例示として提供されることは明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者にはここで数多くの変形、変更、および置換が可能である。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施において採用され得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義していること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がその特許請求の範囲によってカバーされることが意図される。
【０２９３】
参考文献
[1]   J. L. Hellawell and K. B. Marguiles, "Myocardial reverse remodeling," Cardiovasc Ther, vol. 30, no. 3, pp. 172-181, 2012. 
[2]   D. Rohde, J. Ritterhoff, M. Voelkers, H. Katus, T. G. Parker and P. Most, "S100A1: a multifaceted therapeutic target in cardiovascular disease," J Cardiovasc Transl Res, vol. 3, no. 5, pp. 525-537, 2010. 
[3]   S. T. Pleger, P. Most, M. Boucher and S. Soltys, "Stable myocardial-specific AAV6-S100A1 gene therapy results in chronic functional heart failure rescue," Circulation, vol. 115, no. 19, pp. 2506-2515, 2007.
[4]   A. Remppis, T. Greten, B. Schafer and P. Hunziker, "Altered expression of the Ca 2+-binding protein S100A1 in human cardiomyopathy," Biochim Biophys Acta, vol. 1313, no. 3, pp. 253-257, 1996. 
[5]   D. Rohde, H. Brinks, J. Ritterhoff, G. Qui, S. Ren and P. Most, "S100A1 gene therapy for heart failure: a novel strategy on the verge of clinical trials," J Mol Cell Cardiol, vol. 50, no. 5, pp. 777-784, 2011. 
[6]   C. Weber, I. Neacsu, B. Krautz, P. Schlegel, S. Sauer, P. Raake, J. Ritterhoff, A. Jungmann, A. B. Remppis, M. Stangassinger, W. J. Koch, H. A. Katus, O. J. Muller, P. Most and S. T. Pleger, "Therapeutic safety of high myocardial expression levels of the molecular inotrope S100A1 in a preclinical heart failure model," Gene Ther, vol. 21, pp. 131-138, 2014.
[7]   M. S. Penn, J. Pastore, T. Miller and R. Aras, "SDF-1 in myocardial repair," Gene Ther, vol. 19, no. 6, pp. 583-587, 2012.
[8]   M. S. Penn, F. O. Mendelsohn, G. L. Schaer, W. Sherman, M. Farr, J. Pastore, D. Rouy, R. Clemens, R. Aras and D. W. Losordo, "An open-label dose escalation study to evaluate the safety of administration of nonviral stromal cell-derived factor-1 plasmid to treat symptomatic ischemic heart failure," Circ Res, vol. 112, no. 5, pp. 816-825, 2013.
[9]   E. S. Chung, L. Miller, A. N. Patel, R. D. Anderson, F. O. Mendelsohn, J. Traverse, K. H. Silver, J. Shin, G. Ewald, M. J. Farr and S. Anwaruddin, "Changes in ventricular remodelling and clinical status during the year following a single administration of stromal cell-derived factor-1 non-viral gene therapy in chronic ischaemic heart failure patients: the STOP-HF randomized Phase II trial," Eur Heart J, vol. 36, pp. 2228-2238, 2015.
[10]  Z. Taimeh, J. Loughran, E. J. Birks and R. Bolli, "Vascular endothelial growth factor in heart failure," Nat Rev Cardiol, vol. 10, no. 9, pp. 519-530, 2013.
[11]  J. X. Yu, X. F. Huang, W. M. Lv, C. S. Ye, X. Z. Peng, H. Zhang, L. B. Xiao and S. M. Wang, "Combination of stromal-derived factor-1α and vascular endothelial growth factor gene-modified endothelial progenitor cells is more effective for ischemic neovascularization," J Vasc Surg, vol. 50, no. 3, pp. 608-616, 2009.
[12]  E. Perin, G. V. Silva, J. A. Assad, D. Vela, L. M. Buja, A. L. Sousa, S. Litovsky , J. Lin, W. K. Vaughn, S. Coulter and M. R. Fernandes, "Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction," J Mol Cell Cardiol, vol. 44, no. 3, pp. 486-95, 2008. 
[13]  S. Robinson, P. W. Cho, H. I. Levitsky, J. L. Olson, R. H. Hruban, M. A. Acker and P. D. Kessler, "Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts," Cell Transplant, vol. 5, no. 1, pp. 77-91, 1996. 
[14]  K. Suzuki, N. J. Brand, R. T. Smolenski, J. Jayakumar, B. Murtuza and M. H. Yacoub, "Development of a novel method for cell transplantation through the coronary artery," Circulation, vol. 102, no. 19 Suppl 3, pp. III359-64, 2000. 
[15]  K. Suzuki, B. Murtuza, N. Suzuki, R. T. Smolenski and M. H. Yacoub, "Intracoronary infusion of skeletal myoblasts improves cardiac function in doxorubicin-induced heart failure," Circulation, vol. 104, no. 12 Suppl 1, pp. I213-7, 2001. 
[16]  P. Musialek, L. Tekieli, M. Kostkiewicz, M. Majka, W. Szot, Z. Walter and M. Olszowska, "Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity," J Nuclear Cardiol, vol. 18, no. 1, pp. 104-16, 2011.
[17]  P. W. Musialek, A. B. Tracz, K. Skotnicki, P. Zmudka, Z. Pieniazek and W. M. Szostek , "Transcoronary stem cell delivery using physiological endothelium-targeting perfusion technique: the rationale and a pilot study involving a comparison with conventional over-the-wire balloon coronary occlusions in patients after recent myocardial infarcti," Kardiol Pol, vol. 64, no. 5, pp. 489-98, 2006.
[18]  L. Noyez, J. A. van Son, J. T. Van Der Werf, J. Knape, J. Gimbrere, W. N. van Asten, L. K. Lacquet and W. Flameng, "Retrograde versus antegrade delivery of cardioplegic solution in myocardial revascularization. A clinical trial in patients with three-vessel coronary artery disease who underwent myocardial revascularization with extensive use of the internal mammary art," J Thorac Cardiovasc Surg, vol. 105, no. 5, pp. 854-63, 1993.
[19]  P. Boekstegers, W. Giehrl, G. von Degenfeld and G. Steinbeck, "Selective suction and pressure-regulated retroinfusion: an effective and safe approach to retrograde protection against myocardial ischemia in patients undergoing normal and high risk percutaneous transluminal coronary angioplasty," J Am Coll Cardiol, vol. 31, no. 7, pp. 1525-33, 1998. 
[20]  T. Pohl, W. Giehrl, B. Reichart, C. Kupatt, P. Raake, S. Paul, H. Reichenspurner, G. Steinbeck and P. Boekstegers, "Retroinfusion-supported stenting in high-risk patients for percutaneous intervention and bypass surgery: results of the prospective randomized myoprotect I study," Cath Cardiovasc Intervent, vol. 62, no. 3, pp. 323-30, 2004.
[21]  R. Incorvati, S. G. Tauberg, M. J. Pecora, R. S. Macherey, S. B. Dianzumba, B. C. Donohue and M. W. Krucoff, "Clinical applications of coronary sinus retroperfusion during high risk percutaneous transluminal coronary angioplasty," J Am Coll Cardiol, vol. 22, no. 1, pp. 127-34, 1993. 
[22]  Z. a. G. M. Lokmic, "Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels," Histolog Histopathol, vol. 26, no. 6, pp. 781-96, 2011.
[23]  D. Rohde, W. Schluter-Wigger, V. Mielke , P. von den Driesch, B. von Gaudecker and W. Sterry, "Infiltration of both T cells and neutrophils in the skin is accompanied by the expression of endothelial leukocyte adhesion molecule-1 (ELAM-1): an immunohistochemical and ultrastructural study," J Invest Dermatol, vol. 98, no. 5, pp. 794-9, 1992.
[24]  S. Anderson, R. Shiner, M. D. Brown and O. Hudlicka, "ICAM-1 expression and leukocyte behavior in the microcirculation of chronically ischemic rat skeletal muscles," Microvasc Res, vol. 71, no. 3, pp. 205-11, 2006.
[25]  H. Habazettl, C. Kupatt, S. Zahler, B. F. Becker and K. Messmer, "Selectins and beta 2-integrins mediate post-ischaemic venular adhesion of polymorphonuclear leukocytes, but not capillary plugging, in isolated hearts," Pflugers Arch, vol. 438, no. 4, pp. 479-85, 1999.
[26]  J. Lesley, I. Gal, D. J. Mahoney, M. R. Cordell, M. S. Rugg, R. Hyman, A. J. Day and K. Mikecz, "TSG-6 modulates the interaction between hyaluronan and cell surface CD44," J Biol Chem, vol. 279, no. 24, pp. 25745-54, 2004.
[27]  A. N. Patel, S. Mittal, G. Turan, A. A. Winters, T. D. Henry, H. Ince and N. Trehan, "REVIVE Trial: Retrograde Delivery of Autologous Bone Marrow in Patients With Heart Failure," Stem Cells Transl Med, vol. 4, pp. 1021-1027, 2015.
[28]  R. E. Henschler, E. Deak and E. Seifried, "Homing of Mesenchymal Stem Cells," Infusionsther Transfusionsmed, vol. 35, no. 4, pp. 306-312, 2008. 
[29]  B. Ruster, S. Gottig, R. J. Ludwig, R. Bistrian, S. Muller, E. Seifried, J. Gille and R. Henschler, "Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells," Blood, vol. 108, no. 12, pp. 3938-44, 2006.
[30]  C. Hart, D. Drewel, G. Mueller, J. Grassinger, M. Zaiss, L. A. Kunz‐Schughart, R. Andreesen, A. Reichle, E. Holler and B. Hennemann, "Expression and function of homing-essential molecules and enhanced in vivo homing ability of human peripheral blood-derived hematopoietic progenitor cells after stimulation with stem cell factor," Stem Cells, vol. 22, no. 4, pp. 580-9, 2004. 
[31]  C. Rampon, N. Weiss, C. Deboux, N. Chaverot, F. Miller, D. Buchet, H. Tricoire‐Leignel, S. Cazaubon, B.-V. Evercooren and P.-0. Couraud, "Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44," Stem Cells, vol. 26, no. 7, pp. 1673-82, 2008.
[32]  E. Bachrach, A. L. Perez, Y. H. Choi, B. M. Illigens, S. J. Jun, P. D. Nido, F. X. McGowan, S. Li, A. Flint, J. Chamberlain and L. M. Kunkel, "Muscle engraftment of myogenic progenitor cells following intraarterial transplantation," Muscle Nerve, vol. 34, no. 1, pp. 44-52, 2006. 
[33]  P. Boekstegers, G. Von Degenfeld, D. Giehrl, R. Heinrich, C. Hullin, G. Kupatt, G. Steinbeck, G. Baretton, G. Middeler, H. Katus and W. M. Franz, "Myocardial gene transfer by selective pressure-regulated retroinfusion of coronary veins," Gene Ther, vol. 7, no. 3, pp. 232-40, 2000. 
[34]  S. Alino, M. Jose Herrero, V. Bodi, I. Noguera, L. Mainar, F. Dasi, A. Sempere, M. Sanchez, A. Diaz, L. Sabater and S. Lledo, "Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization," J Gene Med, vol. 12, no. 11, pp. 920-6, 2010. 
[35]  E. Youssef, P. Zhang, P. I. Rogers, P. Tremble, J. Rokovich, B. H. Johnstone, K. L. March and D. Hou, "Enhancing myocardial plasmid expression by retrograde coronary venous delivery," Cath Cardiovasc Intervent, vol. 65, no. 4, pp. 528-34, 2005.
[36]  P. Raake, G. von Degenfeld, R. Hinkel, R. Vachenauer, T. Sandner, S. Beller, M. Andrees, C. Kupatt, G. Schuler and P. Boekstegers, "Myocardial gene transfer by selective pressure-regulated retroinfusion of coronary veins: comparison with surgical and percutaneous intramyocardial gene delivery," J Am Coll Cardiol, vol. 44, no. 5, pp. 1124-9, 2004.
[37]  G. von Degenfeld, P. Raake, C. Kupatt, C. Leberhz, R. Hinkel, F. J. Gildehaus, W. Munzing , A. Kranz, J. Waltenberger, M. Simoes and M. Schwaiger, "Selective pressure-regulated retroinfusion of fibroblast growth factor-2 into the coronary vein enhances regional myocardial blood flow and function in pigs with chronic myocardial ischemia," J Am Coll Cardiol, vol. 42, no. 6, pp. 1120-8, 2003.
[38]  K. Suzuki, B. Murtuza, S. Fukushima, R. T. Smolenski, A. Varela-Carver, S. R. Coppen and M. H. Yacoub, "Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function," Circulation, vol. 110, no. 11 Suppl 1, pp. II225-30, 2004. 
[39]  J. George, J. Goldberg, M. Joseph, N. Abdulhameed, J. Crist, H. Das and V. J. Pompili, "Transvenous intramyocardial cellular delivery increases retention in comparison to intracoronary delivery in a porcine model of acute myocardial infarction," J Interv Cardiol, vol. 21, no. 5, pp. 424-31, 2008. 
[40]  C. Thompson, B. A. Nasseri, J. Makower, S. Houser, M. McGarry, T. Lamson, I. Pomerantseva , J. Y. Chang, H. K. Gold, J. P. Vacanti and S. N. Oesterle, "Percutaneous transvenous cellular cardiomyoplasty: A novel nonsurgical approach for myocardial cell transplantation," J Am Coll Cardiol, vol. 41, no. 11, pp. 1964-71, 2003.
[41]  P. W. Raake , R. Hinkel , S. Muller , S. Delker , R. Kreuzpointner , C. Kupatt , H. A. Katus, J. A. Kleinschmidt , P. Boekstegers and O. J. Muller , "Cardio-specific long-term gene expression in a porcine model after selective pressure-regulated retroinfusion of adeno-associated viral (AAV) vectors," Gene Ther, vol. 15, no. 1, pp. 12-7, 2008.
[42]  J. Tuma, R. Fernandez-Vina, A. Carrasco, J. Castillo, C. Cruz, A. Carrillo, J. Ercilla, C. Yarleque, J. Cunza, T. D. Henry and A. N. Patel, "Safety and feasibility of percutaneous retrograde coronary sinus delivery of autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with chronic refractory angina," J Transl Med, vol. 9, p. 183, 2011.
[43]  N. T. Wright, K. M. Varney, K. C. Ellis, J. Markowitz, R. K. Gitti, D. B. Zimmer and D. J. Weber, "The three-dimensional solution structure of Ca(2+)-bound S100A1 as determined by NMR spectroscopy," J Mol Biol, vol. 353, no. 2, pp. 410-426, 2005.
[44]  R. Donato, "Functional roles of S100 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type," Biochim Biophys Acta, vol. 1450, no. 3, pp. 191-231, 1999.
[45]  D. B. Zimmer, P. Wright Sadosky and D. J. Weber, "Molecular mechanisms of S100-target protein interactions," Microsc Res Tech, vol. 60, no. 6, pp. 552-559, 2003. 
[46]  L. Hove-Madsen and D. M. Bers, "Sarcoplasmic reticulum Ca2+ uptake and thapsigargin sensitivity in permeabilized rabbit and rat ventricular myocytes," Circ Res, vol. 73, no. 5, pp. 820-828, 1993. 
[47]  J. James, Y. Zhang, K. Wright, S. Witt and E. Glascock, "Transgenic rabbits expressing mutant essential light chain do not develop hypertrophic cardiomyopathy.," J Mol Cell Cardiol, vol. 34, no. 7, pp. 872-882, 2002.
[48]  J. Woda, S. J. Fisher, J. Pastore and A. N. Patel, "Coronary Sinus Delivery of SDF-1 Plasmid for the Treatment of Heart Failure," American Society of Gene and Cell Therapy, p. poster presentation, 2014.
[49]  M. Hedman, J. Hartikainen, M. Syvanne, J. Stjernvall, A. Hedman, A. Kivela, E. Vanninen, H. Mussalo, E. Kauppila, S. Simula and O. Narvanen, "Safety and Feasibility of Catheter-Based Local Intracoronary Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transfer in the Prevention of Postangioplasty and In-Stent Restenosis and in the Treatment of Chronic Myocardial Ischemia. Phase II Results of the Kuopio," Circulation, vol. 107, pp. 2677-2683, 2003.
[50]  M. G. Katz, A. S. Fargnoli, A. P. Kendle, R. J. Hajjar and C. R. Bridges, "Gene Therapy in Cardiac Surgery: Clinical Trials, Challenges and Perspectives," Ann Thorac Surg, vol. 101, pp. 2407-2416, 2016.
[51]  P. Kolsut, M. Malecki, P. Zelazny, B. Teresinska, P. Firek, P. Janik and Z. Religa, "Gene therapy of coronary artery disease with phvegf165-early outcome," Kardiol Pol, vol. 59, pp. 373-384, 2003.
[52]  M. Ruel, R. S. Beanlands, M. Lortie, V. Chan, N. Camack, E. J. Suuronen, F. D. Rubens, J. N. DaSilva, F. W. Sellke, D. J. Stewart and T. G. Mesana, "Concomitant treatment with oral L-arginine improves the efficacy of surgical angiogenesis in patients with severe diffuse coronary artery disease: the Endothelial Modulation in Angiogenic Therapy randomized controlled trial," J Thorac Cardiovasc Surg, vol. 135, pp. 762-770, 2008. 
[53]  S. T. Pleger, C. Shan, J. Ksienzyk, R. Bekeredjian, P. Boekstegers, R. Hinkel, S. Schinkel, B. Leuchs, J. Ludwig, G. Qiu and C. Weber, "Cardiac AAV9-S100A1 gene therapy rescues post-ischemic heart failure in a preclinical large animal model," Sci Transl Med, vol. 3, no. 92, pp. 92ra64-92ra64, 2011. 
[54]  R. J. Lee, M. L. Springer, W. E. Blanco-Bose, R. Shaw, P. C. Ursell and H. M. Blau, "VEGF Gene Delivery to Myocardium: Deleterious Effects of Unregulated Expression," Circulation, vol. 102, pp. 898-901, 2000.
[55]  J. J. Lopez, R. Laham, A. Stamler, J. D. Pearlman, S. Bunting, A. Kaplan, J. P. Carrozza, F. W. Sellke and M. Simons, "VEGF administration in chronic myocardial ischemia in pigs," Cardiovasc Res, pp. 272-281, 1998.
[56]  M. Katz, A. Fargnoli, R. Williams and C. Bridges, "Gene Therapy Delivery Systems for Enhancing Viral and Nonviral Vectors for Cardiac Diseases:and Nonviral Vectors for Cardiac Diseases: Current Concepts and Future Applications," Human Gene Ther, vol. 24, pp. 914-927, 2013. 
[57]  Brinks H, D. Rohde, M. Voelkers, G. Qiu and S. Pleger, "S100A1 genetically targeted therapy reverses dysfunction of human failing cardiomyocytes," J Am Coll Cardiol, vol. 58, no. 9, pp. 966-973, 2011.
[58]  F. J. Giordano, "Retrograde coronary perfusion: a superior route to deliver therapeutics to the heart?," J Am Coll Cardiol, vol. 42, no. 6, pp. 1129-1131, 2003.
[59]  Y. Wang, F. Wang, R. Wang, P. Zhao and Q. Xia, "2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori," Sci Rep, vol. 5, no. 16273, pp. 1-10, 2015. 
[60]  M. C. Scimia, A. M. Gumpert and W. J. Koch, "Cardiovascular gene therapy for myocardial infarction," Expert Opin Biol Ther, vol. 14, no. 2, pp. 183-195, 2014.
[61]  I. Marenholz, C. W. Heizmann, G. Fritz, "S100 proteins in mouse and man: from evolution to function and pathology (including an update of the nomenclature)," Biochem Biophys Res Commun. vol. 322, no. 4, pp. 1111-22, 2004.
[62]  T. Nagasawa, "CXCL12/SDF-1 and CXCR4," Front. Immunol, vol. 6, pp. 301, 2015.
[63]  David I.R. Holmes, I. Zachary, "The Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Family: Angiogenic Factors in Health and Disease." Genome Biol. Vol. 6, no.2, pp. 209, (2005).
[64]  S. Chen, J. Chen, P Huang, XL Meng, . Clayton, JS Shen, PA Graybum, "Myocardial regeneration in adriamycin cardiomyopathy by nuclear expression of GLP1 using ultrasound targeted microbubble destruction." Biochem Biophys Res Commun. Vol. 458, no. 4, pp. 823-9, 2015.
[65]  C.R. Mayer, N.A. Geis, H.A. Katus, R. Bekeredjian, "Ultrasound targeted microbubble destruction for drug and gene delivery." Expert Opin Drug Deliv., vol. 5, no.10, pp.1121-38, 2008.
【図１】
2018536405.tif 000030
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−Ａ】
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【図１４−Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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