(57)【要約】本発明は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための新規プロセスを提供する。プロセスは、（ａ）緩衝剤を含む緩衝溶液中で細胞毒性剤を以下の構造式（Ｉ）によって表される二官能性架橋試薬：【化１】2018505128.tif 000014またはその塩と反応させて、細胞毒性剤−リンカー化合物を含む第１の混合物を得るステップと、緩衝溶液は、高緩衝能を有し；（ｂ）ステップ（ａ）からの細胞毒性剤−リンカー化合物を含む第１の混合物を、４〜９のｐＨを有する溶液中の細胞結合剤と反応させて、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む第２の混合物を得るステップとを含む。本明細書に記載のプロセスに従って調製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートも本発明に含まれる。【選択図】なし
2018505128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）緩衝剤を含む緩衝溶液中で細胞毒性剤を以下の構造式によって表される二官能性架橋試薬：
【化１】
2018505128.tif 000013
またはその塩と反応させて、細胞毒性剤−リンカー化合物を含む第１の混合物を得ること、前記緩衝溶液は、高緩衝能を有し；
（ｂ）ステップ（ａ）から得られた前記第１の混合物中の前記細胞毒性剤−リンカー化合物を、４〜９のｐＨを有する溶液中の細胞結合剤と反応させて、前記細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む第２の混合物を得ること
を含む、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するためのプロセス。
【請求項２】
前記細胞結合剤が、断片化される傾向がある、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記細胞毒性剤が、マイタンシノイドである、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記細胞毒性剤が、ＤＭ４である、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記緩衝剤対前記二官能性架橋試薬のモル比が、１．５：１〜１２．５：１である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記緩衝剤対前記二官能性架橋試薬のモル比が、２：１〜８：１である、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記緩衝剤対前記二官能性架橋試薬のモル比が、４：１〜６：１である、請求項５に記載のプロセス。
【請求項８】
前記緩衝剤対前記二官能性架橋試薬のモル比が、５：１である、請求項５に記載のプロセス。
【請求項９】
前記緩衝溶液が、４〜９のｐＨを有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記緩衝溶液が、７．５〜８．５のｐＨを有する、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記緩衝溶液が、７．９〜８．５、８．０〜８．４、または８．１〜８．３のｐＨを有する、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記緩衝溶液が、８．２のｐＨを有する、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記緩衝剤が、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、及びリン酸緩衝液からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記緩衝剤が、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記緩衝剤が、ＥＰＰＳである、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記緩衝溶液が、塩化ナトリウムをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記緩衝溶液が、有機溶媒をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記有機溶媒が、ＤＭＡである、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記有機溶媒が、前記緩衝溶液の容量で、１〜９９％、５０％〜９９％、６０％〜９９％、または７０％〜９９％の量で存在する、請求項１７または１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記有機溶媒が、前記緩衝溶液の容量で、５０％〜９０％、５５％〜８５％、６０％〜８０％、または６５％〜７５％の量で存在する、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記有機溶媒が、前記緩衝溶液の容量で、７０％の量で存在する、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記二官能性架橋試薬に対してモル過剰量の前記細胞毒性剤をステップ（ａ）の前記反応で使用する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記細胞毒性剤対前記二官能性架橋試薬のモル比が、１．１：１〜２０：１、１．１：１〜１０：１、１．１：１〜５：１、または１．１：１〜２：１である、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記細胞毒性剤対前記二官能性架橋試薬のモル比が、１：１：１〜１．３：１である、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記細胞毒性剤対前記二官能性架橋試薬のモル比が、１．２：１である、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２６】
ステップ（ａ）の前記反応を１時間〜２時間実施する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２７】
ステップ（ａ）の前記反応を２時間〜５時間実施する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２８】
ステップ（ａ）の前記反応を５時間〜２０時間実施する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２９】
ステップ（ａ）の前記反応を５時間〜１５時間実施する、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
ステップ（ａ）の前記反応を４時間〜８時間、または５時間〜７時間実施する、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３１】
ステップ（ａ）の前記反応を６時間実施する、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３２】
ステップ（ａ）の前記反応を１５℃〜２５℃の温度で実施する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３３】
ステップ（ａ）の前記反応を１７℃〜２３℃、１８℃〜２２℃、または１９℃〜２１℃の温度で実施する、請求項３２に記載のプロセス。
【請求項３４】
ステップ（ａ）の前記反応を２０℃の温度で実施する、請求項３２に記載のプロセス。
【請求項３５】
ステップ（ｂ）の前記溶液が、５．０〜９．０、５．５〜９．０、６．０〜９．０、または６．５〜９．０のｐＨを有する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３６】
ステップ（ｂ）の前記溶液が、７．５〜８．５のｐＨを有する、請求項３５に記載のプロセス。
【請求項３７】
ステップ（ｂ）の前記溶液が、８．０〜８．４、または８．１〜８．３のｐＨを有する、請求項３５に記載のプロセス。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）の前記溶液が、８．２のｐＨを有する、請求項３５に記載のプロセス。
【請求項３９】
ステップ（ｂ）の前記溶液が、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、及びリン酸緩衝液からなる群から選択される緩衝剤を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４０】
ステップ（ｂ）の前記溶液が、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝剤を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記緩衝剤が、ＥＰＰＳである、請求項４０に記載のプロセス。
【請求項４２】
ステップ（ｂ）の前記溶液が、有機溶媒をさらに含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４３】
前記有機溶媒が、ＤＭＡである、請求項４２に記載のプロセス。
【請求項４４】
前記有機溶媒が、前記溶液の容量で、１〜２５％、２〜２０％、２〜１５％、または２〜１０％の量で存在する、請求項４２または４３に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記有機溶媒が、前記溶液の容量で、２．５〜７．５％、３〜７％、４〜６％、または４．５〜５．５％の量で存在する、請求項４４に記載のプロセス。
【請求項４６】
前記有機溶媒が、前記溶液の容量で、５％の量で存在する、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項４７】
ステップ（ｂ）の前記溶液中の前記細胞結合剤の濃度が、５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４８】
前記細胞結合剤の濃度が、５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌである、請求項４７に記載のプロセス。
【請求項４９】
前記細胞結合剤の濃度が、１０ｇ／Ｌ〜４０ｇ／Ｌである、請求項４７に記載のプロセス。
【請求項５０】
前記細胞結合剤の濃度が、１５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ〜２２ｇ／Ｌ、または１９ｇ／Ｌ〜２１ｇ／Ｌである、請求項４７に記載のプロセス。
【請求項５１】
前記細胞結合剤の濃度が、２０ｇ／Ｌである、請求項５０に記載のプロセス。
【請求項５２】
ステップ（ｂ）の前記反応を１０時間〜３０時間実施する、請求項１〜５１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５３】
ステップ（ｂ）の前記反応を１５時間〜２５時間実施する、請求項５２に記載のプロセス。
【請求項５４】
ステップ（ｂ）の前記反応を８時間〜２４時間、１２時間〜２０時間、１４時間〜１８時間、または１５時間〜１７時間実施する、請求項５２に記載のプロセス。
【請求項５５】
ステップ（ｂ）の前記反応を１６時間実施する、請求項５４に記載のプロセス。
【請求項５６】
ステップ（ｂ）の前記反応を１８時間〜２６時間、２０時間〜２４時間、または１９時間〜２３時間実施する、請求項５２に記載のプロセス。
【請求項５７】
ステップ（ｂ）の前記反応を２２時間実施する、請求項５２に記載のプロセス。
【請求項５８】
ステップ（ｂ）の前記反応を１５℃〜２５℃の温度で実施する、請求項１〜５７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５９】
ステップ（ｂ）の前記反応を２０℃の温度で実施する、請求項５８に記載のプロセス。
【請求項６０】
前記二官能性架橋試薬対前記細胞結合剤のモル比が、２〜１０である、請求項１〜５９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６１】
前記二官能性架橋試薬対前記細胞結合剤のモル比が、３〜６である、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項６２】
前記二官能性架橋試薬対前記細胞結合剤のモル比が、３．５〜５である、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６３】
前記二官能性架橋試薬対前記細胞結合剤のモル比が、４．０である、請求項６２に記載のプロセス。
【請求項６４】
前記プロセスが、前記溶液のｐＨを５以下に調整することによって、ステップ（ｂ）の前記反応を反応停止するステップをさらに含む、請求項１〜６３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６５】
前記プロセスが、前記第２の混合物を精製して、精製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを得ることをさらに含む、請求項１〜６４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６６】
前記第２の混合物にタンジェント流濾過、選択的析出、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、非吸着クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせを施すことによって、前記混合物を精製する、請求項６５に記載のプロセス。
【請求項６７】
前記第２の混合物にタンジェント流濾過を施すことによって、前記混合物を精製する、請求項６６に記載のプロセス。
【請求項６８】
前記細胞結合剤が、抗体である、請求項１〜６７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６９】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項６７に記載のプロセス。
【請求項７０】
前記抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項６９に記載のプロセス。
【請求項７１】
前記抗体が、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ＣＮＴ０９５、ｈｕＤＳ６、リツキシマブ、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２７Ｌ抗体、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、インテグリン標的化抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗葉酸受容体抗体、抗Ｈｅｒ３抗体、及び抗ＩＧＦＩＲ抗体から選択される、請求項７０に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２０１４年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／０８１，９１４号の出願日の利益を主張し、全ての図面、式、明細書、特許請求の範囲、及び配列表を含むその内容全体を参照によって本願明細書に引用したものとする。
【背景技術】
【０００２】
癌及び他の疾患の治療に有用である抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、一般的に３つの別個の要素：細胞結合剤、リンカー、及び細胞毒性剤からなる。抗体などの細胞結合剤を細胞毒性剤にコンジュゲートする従来の方法は、２つの別個の反応ステップを採用する。第１の反応ステップでは、抗体を二官能性架橋試薬と反応させて、リンカー修飾抗体を生成する。次いで、過剰リンカーまたは加水分解リンカー試薬から修飾抗体生成物を必要に応じて精製する。第２の反応ステップでは、リンカー修飾抗体を、チオールなどの反応性基を含有する細胞毒性剤と反応させて、抗体−細胞毒性剤コンジュゲートを生成し、これをさらなる精製ステップにおいて再精製する。この従来の方法は、２つの精製ステップが必要な場合があり、これは、全体の収率を低下させ、プロセスを煩雑にし、ＡＤＣの大規模製造では非経済的である。
【０００３】
あるいは、細胞毒性剤を二官能性架橋試薬と最初に反応させて、細胞毒性剤−リンカー化合物を形成することができ、次いで、細胞結合剤と反応させて、細胞結合剤−細胞毒性剤コンジュゲートを形成する（コンジュゲーション反応）。細胞毒性剤、二官能性架橋試薬、及び得られた細胞毒性剤−リンカー化合物は一般的に、疎水性化合物であり、水中の溶解度が低い。したがって、細胞毒性剤−リンカー化合物を可溶化するために、ある一定量の有機溶媒がコンジュゲーション反応中に存在する必要がある。一方、多量の有機溶媒の存在は、抗体安定性に悪影響を及ぼし得る。したがって、当該技術のプロセスは、低濃度の細胞結合剤、細胞毒性剤、及び／または二官能性架橋試薬を使用する場合、細胞結合剤−細胞毒性剤コンジュゲートの小規模調製に限定され得る。
【０００４】
前述に鑑みて、高い抗体安定性を有する細胞結合剤−細胞毒性剤コンジュゲートを調製し、大規模生産に適している改善されたプロセスを開発する必要が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、抗体−薬物−コンジュゲート（ＡＤＣ）の大規模生産に適している新規プロセスを提供する。プロセスは、
（ａ）緩衝剤を含む緩衝溶液中で細胞毒性剤を以下の構造式によって表される二官能性架橋試薬：
【化１】
2018505128.tif 000003
またはその塩と反応させて、細胞毒性剤−リンカー化合物を含む第１の混合物を得るステップと、緩衝溶液は、高緩衝能を有し；
（ｂ）ステップ（ａ）からの第１の混合物中の細胞毒性剤−リンカー化合物を、４〜９のｐＨを有する溶液中の細胞結合剤と反応させて、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む第２の混合物を得るステップとを含む。
【０００６】
驚くべきことに、高緩衝能の緩衝溶液をステップ（ａ）の反応で使用する場合、得られた細胞結合剤コンジュゲートは、ステップ（ａ）の反応において低緩衝能の緩衝溶液を用いて調製したコンジュゲートと比較して、抗体断片化が著しく低いことが分かった。それに加えて、高濃度の細胞結合剤（例えば、抗体）をコンジュゲーション反応（すなわち、本プロセスのステップ（ｂ））で使用することができ、プロセスを大規模生産において経済的にさせる。さらに、当該技術のプロセスと比較して、少量の有機溶媒（例えば、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ））がコンジュゲーション溶液中に必要であり、抗体及び得られたコンジュゲートの安定性を増加させ得る。
【０００７】
本発明のプロセスは、高純度及び／または安定性を有する細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを提供する。具体的には、本発明のプロセスは、従来技術で説明されているプロセスと比較して抗体断片化を減少させる。
【０００８】
本発明は、本明細書に記載のプロセスを用いて調製された細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートにも関する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための新規プロセスを提供する。プロセスは、（ａ）緩衝剤を含む緩衝溶液中で細胞毒性剤を以下の構造式によって表される二官能性架橋試薬：
【化２】
2018505128.tif 000004
またはその塩と反応させて、細胞毒性剤−リンカー化合物を含む第１の混合物を得るステップと、緩衝溶液は、高緩衝能を有し；
（ｂ）ステップ（ａ）からの細胞毒性剤−リンカー化合物を含む第１の混合物を、４〜９のｐＨを有する溶液中の細胞結合剤と反応させて、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む第２の混合物を得るステップとを含む。
【００１０】
本明細書で使用する場合、「塩」は、本明細書に記載の化合物の誘導体を指し、親化合物は、それを酸または塩基塩にすることによって修飾される。より具体的には、塩は、誘導体を指し、親化合物は、親化合物をアルカリ性水酸化物またはアルキルアミンなどの無機または有機塩基と反応させることによって修飾される。一実施形態では、塩は、ナトリウム塩である。あるいは、塩は、トリアルキルアンモニウム塩、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウム塩である。
【００１１】
一実施形態では、細胞結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、断片化される傾向がある。本明細書で使用する場合、「断片化」は、タンパク質（例えば、抗体）における共有結合の破壊を指す。一実施形態では、断片化は、遊離チオールの存在下における鎖間ジスルフィド結合の減少を指す。断片化はまた、タンパク質主鎖の開裂、及び側鎖の断片化または修飾を含み得る（例えば、Ｖｌａｓａｋ，  Ｊ．ａｎｄ  Ｉｏｎｅｓｃｕ，Ｒ．Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｂｉｔｏｄｉｅｓ．ｍＡｂｓ  ３：３，２５３−２６３，Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ  ２０１１を参照されたい）。断片化される傾向がある抗体または抗原結合断片の例としては、ＩｇＧ４、λ軽鎖を含む抗体、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２が挙げられるが、これらに限定されない。断片化は、分子のサイズに主に基づいた分離技術、またはアミノ酸側鎖の化学に関連する分離技術を用いて同定することができる。分子のサイズに主に基づいた分離技術としては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及びキャピラリーＳＤＳ電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸側鎖の化学に関連する分離技術としては、逆相ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣ、陽イオン交換ＨＰＬＣ、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）などの液体クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
ある実施形態では、本プロセスのステップ（ａ）で使用した緩衝溶液は、高緩衝能を有する。本明細書で使用する場合、「緩衝能」は、緩衝溶液が、付加酸または塩基の存在下における反応混合物のｐＨの著しい変化を防ぐ能力を指す。
【００１３】
一実施形態では、緩衝溶液が、二官能性架橋試薬に対してモル過剰の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝溶液中の緩衝剤対二官能性架橋試薬のモル比は、１．１：１〜５０：１；１．２：１〜３０：１；１．３：１〜２５：１；または１．５：１〜１２．５：１である。より具体的には、緩衝剤対二官能性架橋試薬のモル比は、２：１〜８：１である。さらにより具体的には、緩衝剤対二官能性架橋試薬のモル比は、４：１〜６：１である。別のさらに具体的な実施形態では、緩衝剤対二官能性架橋試薬のモル比は、５：１である。
【００１４】
ある実施形態では、本プロセスのステップ（ａ）における緩衝溶液は、４〜９のｐＨを有する。より具体的には、ｐＨは、４．５〜８．５、５．０〜８．５、５．５〜８．５、６．０〜８．５、６．５〜８．５、７．０〜８．５、７．１〜８．５、７．２〜８．５、７．３〜８．５、７．４〜８．５、７．５〜８．５、７．５〜８．４、７．５〜８．３、５．０〜６．５、５．０〜６．０、または５．５〜６．５である。具体的な一実施形態では、ｐＨは、７．５〜８．５（例えば、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、または８．５）である。具体的な別の実施形態では、ｐＨは、７．９〜８．５、８．０〜８．４、または８．１〜８．３である。さらにより具体的には、ｐＨは、８．２である。あるいは、ｐＨは、４．５〜５．５（例えば、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５）である。さらに別の実施態様では、ｐＨは、４．７〜５．３、４．８〜５．２、または４．９〜５．１である。さらにより具体的には、ｐＨは、５．０である。
【００１５】
当該技術分野において既知である任意の適当な緩衝剤を使用することができる。適当な緩衝剤としては、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、及びリン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、緩衝剤は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。より具体的には、緩衝剤は、ＥＰＰＳである。
【００１６】
ある実施形態では、緩衝溶液は、緩衝液のイオン強度を維持するために不活性塩をさらに含んでもよい。一実施形態では、緩衝溶液は、塩化ナトリウムをさらに含む。
【００１７】
ある実施形態では、ステップ（ａ）の緩衝溶液は、有機溶媒を含む。より具体的には、有機溶媒は、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）である。一実施形態では、ステップ（ａ）の緩衝溶液は、水と有機溶媒の混合物を含む。より具体的には、ステップ（ａ）の緩衝溶液は、水とＤＭＡの混合物を含む。有機溶媒（例えば、ＤＭＡ）は、緩衝溶液の容量で、１％〜９９％、５％〜９９％、１０％〜９９％、２０％〜９９％、３０％〜９９％、４０％〜９９％、５０％〜９９％、６０％〜９９％、７０％〜９９％、８０％〜９９％、９０％〜９９％の量で存在することができる。一実施形態では、有機溶媒（例えば、ＤＭＡ）は、緩衝溶液の容量で、５０％〜９０％、５５％〜８５％、６０％〜８０％、または６５％〜７５％の量で存在する。より具体的な実施形態では、有機溶媒（例えば、ＤＭＡ）は、緩衝溶液の容量で、７０％の量で存在する。
【００１８】
ある実施形態では、モル等量の細胞毒性剤と二官能性架橋試薬をステップ（ａ）の反応で使用する。ある実施形態では、二官能性架橋試薬に対してモル過剰の細胞毒性剤をステップ（ａ）の反応で使用する。一実施形態では、細胞毒性剤対二官能性架橋試薬のモル比は、１．０１：１〜２０：１、１．１：１〜２０：１、１．１：１〜１０：１、１．１：１〜５：１、１．１：１〜４：１、１．１：１〜３：１、１．１：１〜２：１、１．１：１〜１．５：１、１．１：１〜１．４：１、または１．１：１〜１．３：１である。より具体的には、細胞毒性剤対二官能性架橋試薬のモル比は、１．２：１である。
【００１９】
ある実施形態では、細胞毒性剤に対してモル過剰の二官能性架橋試薬をステップ（ａ）の反応で使用する。一実施形態では、二官能性架橋試薬対細胞毒性剤のモル比は、１．０１：１、１．１：１〜２０：１、１．１：１〜１０：１、１．１：１〜５：１、１．１：１〜４：１、１．１：１〜３：１、１．１：１〜２：１、１．１：１〜１．５：１、１．１：１〜１．４：１、または１．１：１〜１．３：１である。
【００２０】
ある実施形態では、本プロセスのステップ（ａ）の反応は、上述の緩衝溶液中で細胞毒性剤を二官能性架橋試薬ｓＳＰＤＢと混合することによって実施する。反応を２分〜１週、１時間〜４８時間、１時間〜３６時間、１時間〜２４時間、５時間〜２０時間、５時間〜１５時間、６時間〜１４時間、４時間〜８時間、５時間〜７時間、１時間〜５時間、１時間〜４時間、１時間〜２時間、または２時間〜５時間進行させる。一実施形態では、反応を１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間など進行させる。
【００２１】
ステップ（ａ）の反応は、任意の適当な温度で実施することができる。一実施形態では、反応は、１０℃〜５０℃、１０℃〜４０℃、または１０℃〜３０℃の温度で実施することができる。別の実施形態では、反応は、１５℃〜２５℃、１６℃〜２４℃、１７℃〜２３℃、１８℃〜２２℃、または１９℃〜２１℃の温度で実施することができる。さらに別の実施形態では、反応は、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、または２５℃で実施することができる。あるいは、反応は、１０℃未満または０℃未満などの低温で実施することができる（但し、溶液は、例えば、細胞毒性剤及び／または二官能性架橋試薬を溶解するのに使用した有機溶媒の存在によって凍結するのを防止する）。一実施形態では、反応は、−１０℃〜０℃、０℃〜１０℃、または０℃〜５℃の温度で実施することができる。
【００２２】
ある実施形態では、本プロセスのステップ（ａ）において細胞毒性剤と二官能性架橋試薬を反応させることから得られた第１の混合物は、細胞結合剤と反応させる前に、長期間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週、２週、３週、１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、１年間、２年間、または５年間）保存することができる。第１の混合物は、低温（例えば、１０℃以下、５℃以下または０℃以下、または−１０℃〜０℃、０℃〜１０℃、または０℃〜５℃の温度で）にて、凍結状態で保存することができる。あるいは、第１の混合物は、ステップ（ａ）の反応の完了時に、室温または１０℃〜２５℃、１５℃〜２５℃、または２０℃〜２５℃の温度で保存することができる。
【００２３】
ある実施形態では、第１の混合物は、細胞毒性剤−リンカー化合物、未反応の細胞毒性剤、未反応の二官能性架橋試薬などの不純物、及び加水分解二官能性架橋試薬及び／または細胞毒性剤の二量体などの反応副生成物を含む。
【００２４】
ある実施形態では、第１の反応混合物は、本プロセスのステップ（ｂ）において第１の混合物中の細胞毒性剤−リンカー化合物を細胞結合剤と反応させる前に実質的に精製されない。本明細書で使用する場合、用語「実質的に精製された」は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の不純物（例えば、未反応の細胞毒性剤、未反応の二官能性架橋試薬、及び加水分解二官能性架橋試薬及び／または細胞毒性剤の二量体などの反応副生成物）を、本プロセスのステップ（ｂ）において第１の反応混合物中の細胞毒性剤−リンカー化合物を細胞結合剤と反応させる前に除去することを意味する。
【００２５】
ある実施形態では、本プロセスのステップ（ａ）から得られた第１の混合物を、４〜９、５〜９、５．５〜９、６〜９、６．３〜９、または６．３〜８．７、６．４〜８．６、６．５〜８．５、７．３〜８．７、または７．４〜８．６のｐＨを有する溶液（例えば、コンジュゲーション緩衝溶液）中の細胞結合剤と反応させて、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートを含む第２の混合物を得る。より具体的には、溶液は、７．５〜８．５（例えば、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、または８．５）のｐＨを有する。別のさらに具体的な実施形態では、溶液は、７．９〜８．５、８．０〜８．４、または８．１〜８．３のｐＨを有する。さらにより具体的な実施形態では、溶液は、８．２のｐＨを有する。具体的な別の実施形態では、溶液は、６．５〜７．５（例えば、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５）のｐＨを有する。
【００２６】
ある実施形態では、ステップ（ｂ）の溶液は、緩衝剤を含む。当該技術分野において既知である任意の適当な緩衝剤を使用することができる。適当な緩衝剤としては、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、及びリン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、緩衝剤が、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。より具体的には、緩衝剤は、ＥＰＰＳである。溶液は、緩衝液のイオン強度を維持するために不活性塩をさらに含んでもよい。一実施形態では、緩衝溶液は、塩化ナトリウムをさらに含む。
【００２７】
ある実施形態では、本プロセスのステップ（ｂ）の溶液は、有機溶媒をさらに含む。より具体的には、有機溶媒は、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）である。一実施形態では、ステップ（ｂ）の溶液は、水と有機溶媒の混合物を含む。より具体的には、ステップ（ｂ）の溶液は、水とＤＭＡの混合物を含む。有機溶媒（例えば、ＤＭＡ）は、溶液の容量で、１％〜９９％、１％〜９０％、１％〜８０％、１％〜７０％、１％〜６０％、１％〜５０％、１％〜４０％、１％〜３０％、１％〜２５％、２％〜２０％、２％〜１５％、２％〜１０％、２．５％〜７．５％、３％〜７％、４％〜６％、または４．５％〜５．５％の量で存在することができる。より具体的には、有機溶媒（例えば、ＤＭＡ）は、溶液の容量で、５％の量で存在する。
【００２８】
ある実施形態では、本プロセスのステップ（ｂ）において、細胞結合剤を含む水溶液を本プロセスのステップ（ａ）から得られた第１の混合物に添加することによって、第１の混合物を細胞結合剤と反応させる。あるいは、ステップ（ａ）から得られた第１の混合物を、細胞結合剤を含む水溶液に添加する。ある実施形態では、ステップ（ａ）から得られた第１の混合物は、細胞結合剤と反応させる前にｐＨ調整される。一実施形態では、第１の混合物は、細胞結合剤と反応させる前に細胞結合剤を含む水溶液のｐＨに等しいｐＨを有するようにｐＨ調整される。
【００２９】
ある実施形態では、ステップ（ｂ）の反応を高濃度の細胞結合剤で実施する。一実施形態では、ステップ（ｂ）の溶液中の細胞結合剤の濃度は、５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである。より具体的には、濃度は、５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ〜４０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ〜４０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、または１５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌである。より具体的な実施形態では、濃度は、１５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ〜２２ｇ／Ｌ、または１９ｇ／Ｌ〜２１ｇ／Ｌである。さらにより具体的な実施形態では、濃度は、２０ｇ／Ｌである。
【００３０】
ある実施形態では、細胞結合剤に対して過剰量の二官能性架橋試薬を本発明のプロセスで使用する。一実施形態では、二官能性架橋試薬対細胞結合剤のモル比は、１〜２０、２〜１０、３〜８、または３〜６の範囲である。別の実施形態では、二官能性架橋試薬対細胞結合剤のモル比は、３．５〜５、例えば、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０である。
【００３１】
ある実施形態では、ステップ（ｂ）の反応を５時間〜４８時間、１０時間〜４８時間、１０時間〜３０時間、１５時間〜２５時間進行させる。具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）の反応を８時間〜２４時間、１２時間〜２０時間、１４時間〜１８時間、または１５時間〜１７時間進行させる。より具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）の反応を１６時間進行させる。別の実施形態では、ステップ（ｂ）の反応を１４時間〜３０時間、１８時間〜２６時間、２０時間〜２４時間、または１９時間〜２３時間進行させる。より具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）の反応を２２時間進行させる。
【００３２】
ステップ（ｂ）の反応は、任意の適当な温度で実施することができる。一実施形態では、反応は、１０℃〜５０℃、１０℃〜４０℃、または１０℃〜３０℃の温度で実施することができる。別の実施形態では、反応は、１５℃〜２５℃、１６℃〜２４℃、１７℃〜２３℃、１８℃〜２２℃、または１９℃〜２１℃の温度で実施することができる。さらに別の実施形態では、反応は、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、または２５℃で実施することができる。あるいは、反応は、１０℃未満または０℃未満などの低温で実施することができる（但し、溶液は、例えば、細胞毒性剤及び／または二官能性架橋試薬を溶解するのに使用した有機溶媒の存在によって凍結するのを防止する）。一実施形態では、反応は、−１０℃〜０℃、０℃〜１０℃、または０℃〜５℃の温度で実施することができる。
【００３３】
ある実施形態では、本発明のプロセスは、ステップ（ｂ）後に反応停止ステップをさらに含む。一実施形態では、反応停止ステップは、ステップ（ｂ）から得られた第２の混合物のｐＨを低ｐＨ（例えば、６．５以下、６．０以下、５．５以下、５．４以下、５．３以下、５．２以下、５．１以下、５．０以下のｐＨ）に迅速に調整することによって達成される。一実施形態では、第２の混合物のｐＨは、４．０〜６．５、４．５〜６．０、４．５〜５．５、４．６〜５．４、４．７〜５．３、４．８〜５．２または４．９〜５．１のｐＨに調整される。より具体的な実施形態では、第２の混合物のｐＨは、５．０のｐＨに調整される。第２の混合物のｐＨは、酸を第２の混合物に添加することによって調整することができる。より具体的には、第２の混合物のｐＨは、酢酸を第２の混合物に添加することによって調整することができる。
【００３４】
別の実施形態では、反応停止ステップは、１つ以上の反応停止剤を第２の混合物に添加して、任意の未反応の細胞毒性剤及び／または未反応の二官能性架橋試薬を反応停止することによって達成される。本明細書で使用する場合、用語「反応停止剤」は、遊離細胞毒性剤及び／または二官能性架橋試薬と反応する試薬を指す。
【００３５】
一実施形態では、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、またはヨードアセトアミドプロピオン酸などのマレイミドまたはハロアセトアミド反応停止試薬は、細胞毒性剤中の任意の未反応の基（チオールなど）が、反応停止されるのを確実にするために使用することができる。反応停止ステップは、細胞毒性剤、特に、未反応のチオール基を有する細胞毒性剤（ＤＭ１など）のダイマー化を防止するのに役立つことができる。ダイマー化された細胞毒性剤は、除去することが困難であり得る。反応停止ステップは、天然の抗体ジスルフィド基との任意の不要なチオール−ジスルフィド交換反応を最小化することもできる。極性の荷電チオール−反応停止試薬（４−マレイミド酪酸または３−マレイミドプロピオン酸など）で反応停止すると、過剰の未反応の細胞毒性剤は、精製ステップ中に共有的に連結されたコンジュゲートから容易に分離することができる極性の荷電水溶性付加物へと変換される。非極性の中性チオール−反応停止試薬を用いた反応停止も使用することができる。
【００３６】
一実施形態では、混合物は、混合物を未反応の二官能性架橋試薬と反応する反応停止試薬と接触させることによって反応停止される。例えば、任意の未反応の二官能性架橋試薬を反応停止するために、求核試薬を混合物に添加することができる。求核試薬は好ましくは、リジン、タウリン、及びヒドロキシルアミンなどの、アミノ基を含有する求核試薬である。
【００３７】
ある実施形態では、ステップ（ｂ）の反応は、反応停止ステップ前に、すなわち、ｐＨを調整する前に、及び／または、第２の混合物を上述の反応停止剤と接触させる前に、完了まで進行される。
【００３８】
反応ステップ（ｂ）の後、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、精製ステップに供される。この点に関して、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、タンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）、例えば、膜ベースタンジェント流濾過プロセス、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、または選択的析出、または任意の他の適当な精製プロセス、及びこれらの組み合わせを使用して、混合物の他の成分（例えば、遊離二官能性架橋剤、遊離細胞毒性剤、及び反応副生成物）から精製することができる。
【００３９】
本発明の一実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、単一精製ステップ（例えば、ＴＦＦ）を用いて精製される。好ましくは、コンジュゲートは、単一精製ステップ（例えば、ＴＦＦ）を用いて、精製され、適切な製剤に交換される。本発明の別の実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、２つの連続精製ステップを用いて精製される。例えば、コンジュゲートは、選択的析出、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、または非吸着クロマトグラフィーで最初に精製された後に、ＴＦＦで精製することができる。当業者であれば、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートの精製により、細胞毒性剤に化学的に連結した細胞結合剤を含む安定的なコンジュゲートを単離することができることが理解されるであろう。
【００４０】
ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．）、ザルトコンカセット（Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，Ｎ．Ｙ．）、及びセントラセット（Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ）型システム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，Ｎ．Ｙ．）を含む任意の適当なＴＦＦシステムが、精製のために利用されてもよい。
【００４１】
任意の適当な吸着クロマトグラフィー樹脂が、精製のために利用されてもよい。好ましい吸着クロマトグラフィー樹脂としては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及びこれらの組み合わせが挙げられる。適当なヒドロキシアパタイト樹脂の例としては、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ  Ｉ型及びＩＩ型、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ．Ａ．）、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，Ｎ．Ｙ．）、及びセラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴ  Ｉ型及びＩＩ型、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。適当なＨＣＩＣ樹脂の例は、ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，Ｎ．Ｙ．）である。適当なＨＩＣ樹脂の例としては、ブチル−セファロース、ヘキシル−セファロース、フェニル−セファロース、及びオクチルセファロース樹脂（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．より）、並びにＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐメチル及びＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｔ−ブチル樹脂（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。適当なイオン交換樹脂の例としては、ＳＰ−セファロース、ＣＭ−セファロース、及びＱ−セファロース樹脂（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．より）、及びＵｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。適当な混合モードイオン交換器の例としては、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘ樹脂（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ  Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。適当なＩＭＡＣ樹脂の例としては、キレート化セファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）及びＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。適当な色素リガンド樹脂の例としては、ブルーセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）及びＡｆｆｉ−ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。適当なアフィニティ樹脂の例としては、細胞結合剤が抗体である場合、プロテインＡセファロース樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、また細胞結合剤が適切なレクチン結合部位を有する場合、レクチンアフィニティ樹脂、例えば、レンチルレクチンセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。あるいは、細胞結合剤に特異的な抗体が、使用されてもよい。かかる抗体は、例えば、セファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）に固定化され得る。適当な逆相樹脂の例としては、Ｃ４、Ｃ８、及びＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００４２】
任意の適当な非吸着クロマトグラフィー樹脂が、精製のために利用されてよい。適当な非吸着クロマトグラフィー樹脂の例としては、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂（例えば、Ｓ−２００及びＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５及びＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０、及びＰ−１００）、及び当業者に既知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明のプロセスによって調製された細胞結合剤−細胞毒性剤コンジュゲートは、実質的に高純度及び安定性を有する。本発明の一態様では、実質的に高純度の細胞結合剤−細胞毒性剤コンジュゲートは、次の特徴のうちの１つ以上を有する：（ａ）２５％未満、２０％未満、１５％未満（例えば、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以下）の抗体断片化、（ｂ）コンジュゲート種の約９０％超（例えば、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以上）、好ましくは９５％超が、モノマーである、（ｃ）コンジュゲート調製物中の非結合リンカーレベルが、（総リンカーに対して）約１０％未満（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％）である、（ｄ）コンジュゲート種の１０％未満が、架橋されている（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％）、（ｅ）コンジュゲート調製物中の遊離細胞毒性剤レベルが、（総細胞毒性剤に対するｍｏｌ／ｍｏｌ）約２％未満（例えば、約１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％以下、または０％）である、及び／または（ｆ）保管（例えば、約１週、約２週、約３週、約１ヵ月、約２ヵ月、約３ヵ月、約４ヵ月、約５ヵ月、約６ヵ月、約１年、約２年、または約５年後）に際し、遊離細胞毒性剤のレベルにおける実質的な増加が無い。遊離細胞毒性剤のレベルにおける「実質的な増加」は、ある特定の保管時間（例えば、約１週、約２週、約３週、約１ヵ月、約２ヵ月、約３ヵ月、約４ヵ月、約５ヵ月、約６ヵ月、約１年、約２年、約３年、約４年、または約５年）の後に、遊離細胞毒性剤のレベルにおける増加が、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．２％、約２．５％、約２．７％、約３．０％、約３．２％、約３．５％、約３．７％、または約４．０％未満であることを意味する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「非コンジュゲート合リンカー」は、二官能性架橋試薬に共有的に連結された細胞結合剤であって、該細胞結合剤は、二官能性架橋試薬のリンカーを介して細胞毒性剤に共有的に結合されていない、細胞結合剤を指す（すなわち、「非コンジュゲートリンカー」は、ＣＢＡ−Ｌによって表すことができ、ここで、ＣＢＡは、細胞結合剤を表し、Ｌは、二官能性架橋試薬を表す。対照的に、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートは、ＣＢＡ−Ｌ−Ｄによって表すことができ、ここで、Ｄは細胞毒性剤を表す）。
【００４５】
一実施形態では、細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲート中の細胞毒性剤対細胞結合剤（すなわち、ＤＡＲ）の平均モル比は、約１〜約１０、約２〜約７、約３〜約５、約２．５〜約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５）、約３．０〜約４．０、約３．２〜約４．２、または約４．５〜５．５（例えば、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、または約５．５）である。
【００４６】
細胞結合剤
本発明のプロセスで使用するために、細胞結合剤は、細胞、典型的に及び好ましくは、動物細胞（例えば、ヒト細胞）に結合する、任意の適当な薬剤であり得る。細胞結合剤は好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドである。適当な細胞結合剤としては、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体及びその断片）、インターフェロン（例えば、α、β、γ）、リンホカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６）、ホルモン（例えば、インスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、アンドロゲン及びエストロゲンなどのステロイドホルモン）、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ５：１５５−１５８（１９８４））などの増殖因子及びコロニー刺激因子、栄養輸送分子（例えば、トランスフェリン）、ビタミン（例えば、葉酸）、及び細胞の表面で標的分子に特異的に結合する任意の他の薬剤または分子が挙げられる。
【００４７】
細胞結合剤が抗体である場合、それは、ポリペプチドまたはグリコトープであり、膜貫通分子（例えば、受容体）または増殖因子などのリガンドであってもよい抗原に結合する。例示的な抗原としては、レニンなどの分子；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む、成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；ｖｍｃ因子（ｆａｃｔｏｒ  ｖｍｃ）、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、及びフォンヴィルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿性因子；肺表面活性物質；ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化で調節され、通常はＴ細胞で発現され、分泌される）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子のための受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）などの神経栄養因子、またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦなどの線維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−α、及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−βなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＥｐＣＡＭ；ＧＤ３；ＦＬＴ３；ＰＳＭＡ；ＰＳＣＡ；ＭＵＣ１；ＭＵＣ１６；ＳＴＥＡＰ；ＣＥＡ；ＴＥＮＢ２；ＥｐｈＡ受容体；ＥｐｈＢ受容体；葉酸受容体；ＦＯＬＲ１；メソテリン；クリプト；αｖβ６；インテグリン；ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ；ＥＧＦＲ；線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）（例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４）；トランスフェリン受容体；ＩＲＴＡ１；ＩＲＴＡ２；ＩＲＴＡ３；ＩＲＴＡ４；ＩＲＴＡ５；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２などのＣＤタンパク質、または米国特許出願���開第２００８／０１７１０４０号または米国特許出願公開第２００８／０３０５０４４号に開示され、参照によりその全体が組み込まれる、１つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合する抗体；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、及び−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＨＩＶエンベロープの一部などのウイルス性抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、及びＶＣＡＭなどのインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；エンドグリン；ｃ−Ｍｅｔ；ＩＧＦ１Ｒ；例えば、ＰＣＡ３、ＰＳＡ、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＴＭＥＦＦ２、及びＳＴＥＡＰ１などの前立腺抗原；ＬＧＲ５；Ｂ７Ｈ４；及び上に列挙されるポリペプチドのいずれかの断片が挙げられる。
【００４８】
それに加えて、骨髄細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦは、急性骨髄性白血病を罹病した細胞に対する細胞結合剤として使用することができる。活性化Ｔ細胞に結合するＩＬ−２は、移植片拒絶の防止のため、移植片対宿主疾患の療法及び防止のため、並びに急性Ｔ細胞白血病の治療のために使用することができる。メラニン細胞に結合するＭＳＨは、メラノーマに関する抗体が使用され得るように、メラノーマの治療のために使用することができる。葉酸は、卵巣及び他の腫瘍上に発現される葉酸受容体を標的するために使用することができる。表皮増殖因子は、肺及び頭頸部などの扁平上皮癌を標的するために使用することができる。ソマトスタチンは、神経芽細胞腫及び他の腫瘍型を標的するために使用することができる。
【００４９】
乳がん及び睾丸の癌は、細胞結合剤として、それぞれ、エストロゲン（またはエストロゲン類似体）またはアンドロゲン（またはアンドロゲン類似体）を用いて、成功裏に標的されることができる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、任意の免疫グロブリン、任意の免疫グロブリン断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ（Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５−２９０２（１９８３）；Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：４７０−４７８（１９７４）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０−２４４（１９６０），Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，７：２４８６−２４９７（２００８），Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｓ．，６：３４３−３５７（２００６））、または、細胞の表面上で抗原に結合することができる免疫グロブリンキメラ（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有するもの）を指す。任意の適当な抗体が、細胞結合剤として使用することができる。当業者は、適切な抗体の選択は、標的される細胞集団に依存するであろうことを理解するであろう。この点に関して、特定の細胞集団（典型的に及び好ましくは、罹病細胞集団）内で選択的に発現される細胞表面分子（すなわち、抗原）の型及び数は、本発明の組成物における使用のための適切な抗体の選択に決定的な影響を及ぼすであろう。細胞表面発現プロファイルは、腫瘍細胞型を含む多様な細胞型に関して既知であり、未知である場合は、通常の分子生物学及び組織化学技術を使用して決定することができる。
【００５１】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得るが、最も好ましくは、モノクローナル抗体である。本明細書で使用する場合、「ポリクローナル」抗体は、典型的には免疫動物の血清中に含有される、抗体分子の不均質な集団を指す。「モノクローナル」抗体は、特定の抗原に特異的である抗体分子の均質な集団を指す。モノクローナル抗体は典型的には、Ｂリンパ球（「Ｂ細胞」）の単一クローンによって生成される。モノクローナル抗体は、標準ハイブリドーマ技術を含む、当業者に既知である種々の技術を使用して得ることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：５１１−５１９（１９７６），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、及びＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００１）を参照されたい）。手短に述べると、モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ方法は典型的には、任意の適当な動物、典型的に及び好ましくは、マウスに、抗原（すなわち、「免疫原」）を注射することを含む。その後、動物を屠殺し、その脾臓から単離したＢ細胞を、ヒト骨髄腫細胞と融合させる。ハイブリッド細胞が生成され（すなわち、「ハイブリドーマ」）、これは、無制限に増殖し、所望のインビトロの特異性を有する高力価の抗体を連続的に分泌する。当該技術分野において既知である任意の適切な方法が、所望の特異性を有する抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定するために使用することができる。かかる方法としては、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット分析、及び放射免疫測定法が挙げられる。ハイブリドーマの集団は、個々のクローンを単離するためにスクリーニングされ、その各々は、抗原に対する単一の抗体種を分泌する。各ハイブリドーマは、単一のＢ細胞との融合に由来するクローンであるため、それが生成する全ての抗体分子は、その抗原結合部位及びアイソタイプを含め、構造が同一である。モノクローナル抗体はまた、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（例えば、Ｈａｓｋａｒｄ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２）：３６１−６７（１９８４）、及びＲｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：１４０−６７（１９８６）を参照されたい）、バクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−８１（１９８９）を参照されたい）、またはＦａｂ及びｓｃＦｖ（一本鎖可変領域）などの抗体断片を含むファージディスプレイライブラリ（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号及び同第５，９６９，１０８号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ９２／０１０４７号及び同第ＷＯ９９／０６５８７号を参照されたい）を含む、他の適当な技術を使用して生成されてもよい。
【００５２】
モノクローナル抗体は、任意の適当な動物から単離するか、または任意の適当な動物内で産生することができるが、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、マウスまたはヒト、また最も好ましくは、ヒト内で産生される。マウス内で抗体を産生するための方法は、当業者に周知であり、本明細書に説明される。ヒト抗体に関して、当業者は、ポリクローナル抗体は、適切な抗原を用いてワクチン接種または免疫化されたヒト対象の血清から単離することができることを理解するであろう。あるいは、ヒト抗体は、マウスなどの非ヒト動物内でヒト抗体を産生するための既知の技術を適合することによって生成させることができる（例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、及び同第５，７１４，３５２号、並びに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号を参照されたい）。
【００５３】
ヒトにおける治療的用途に理想的な選択ではあるが、ヒト抗体、特にヒトモノクローナル抗体は、典型的には、マウスモノクローナル抗体よりも生成することが困難である。マウスモノクローナル抗体は、しかしながら、ヒトに投与される場合、迅速な宿主抗体応答を誘発し、これは、抗体−細胞毒性剤コンジュゲートの治療的または診断的潜在性を低減させる可能性がある。これらの厄介な問題を回避するために、モノクローナル抗体は好ましくは、ヒト免疫系によって「異物」であると認識されない。
【００５４】
この目的を達成するために、ファージディスプレイが、抗体を生成するために使用することができる。この点に関して、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコード化するファージライブラリは、標準的な分子生物学及び組み換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照されたい）。所望の特異性を有する可変領域をコード化するファージは、所望の抗原への特異的結合に関して選択され、選択される可変ドメインを含む完全ヒト抗体が再構成される。再構成された抗体をコード化する核酸配列は、ハイブリドーマ産生に使用される骨髄腫細胞などの適当な細胞株内に導入され、その結果、モノクローナル抗体の特徴を有するヒト抗体が、細胞によって分泌される（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、及び米国特許第６，２６５，１５０号を参照されたい）。あるいは、モノクローナル抗体は、特定のヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックであるマウスから生成することができる。かかる方法は、当該技術分野において既知であり、また例えば、米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号、並びにＪａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照に説明される。
【００５５】
最も好ましくは、抗体は、ヒト化抗体である。本明細書で使用する場合、「ヒト化」抗体は、抗体の抗原結合ループを形成するマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体分子のフレームワーク上にグラフト化される抗体である。マウス及びヒト抗体のフレームワークの類似性のため、このアプローチは、ヒト抗体と抗原的に同一であるが、ＣＤＲ配列が由来するマウスモノクローナル抗体と同一の抗原に結合するモノクローナル抗体を産生することが、当該技術分野において一般的に受け入れられている。ヒト化抗体を生成するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、及び同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００Ｂ１号、並びに英国特許第２１８８６３８号に詳細に説明される。ヒト化抗体はまた、米国特許第５，６３９，６４１号及びＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５：９５９−９７３（１９９４）に説明される抗体再表面化技術を使用して生成することもできる。本発明の組成物のコンジュゲートに採用される抗体は、最も好ましくは、ヒト化モノクローナル抗体であるが、ヒトモノクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体もまた、上に説明される通り本発明の範囲内である。
【００５６】
少なくとも１つの抗原結合部位を有し、したがって、標的細胞の表面上に存在する少なくとも１つの抗原または受容体を認識及び結合する抗体断片もまた、本発明の範囲内である。この点に関して、インタクトな抗体分子のタンパク質分解的切断は、抗原を認識及び結合する能力を保つ種々の抗体断片を生成することができる。例えば、プロテアーゼパパインによる抗体分子の限定消化は、典型的には３つの断片を生成し、そのうちの２つは、同一であり、親抗体分子の抗原結合活性を保つため、Ｆａｂ断片と称される。酵素ペプシンによる抗体分子の切断は、通常、２つの抗体断片を生成し、そのうちの１つは、抗体分子の抗原結合アームを保ち、したがってＦ（ａｂ’）２断片と称される。ジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンによるＦ（ａｂ’）２断片の還元は、Ｆａｂ’断片と称される断片を生成する。一本鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片は、合成ペプチドを介して抗体軽鎖の可変（Ｖ）ドメインに連結された抗体重鎖のＶドメインを含む切断されたＦａｂ断片からなり、通常の組み換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照されたい）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組み換えＤＮＡ技術によって調製することができる（例えば、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４（１９９４）を参照されたい）。しかしながら、本発明の文脈における抗体断片は、これらの例示的な抗体断片の型に限定されない。所望の細胞表面受容体または抗原を認識及び結合する任意の適当な抗体断片が、採用され得る。抗体断片は、例えば、Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２８９５−２９０２（１９８３）、Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１３：４７０−４７８（１９７４）、及びＮｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０−２４４（１９６０）にさらに説明される。抗体−抗原結合は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降、及び競合的阻害アッセイ（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照及び米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号を参照されたい）などの当該技術分野において既知である任意の適当な方法を使用して分析することができる。
【００５７】
それに加えて、抗体は、キメラ抗体またはその抗原結合断片であり得る。「キメラ」とは、抗体が、少なくとも２つの異なる種（例えば、マウス免疫グロブリン可変領域と組み合わされたヒト免疫グロブリン定常領域などの２つの異なる免疫グロブリン）から得られた、またはそれらに由来する、少なくとも２つの免疫グロブリンまたはその断片を含むことを意味する。抗体はまた、ドメイン抗体（ｄＡｂ）またはその抗原結合断片であり得、例えば、ラクダ抗体（例えば、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：７５２，（１９９６）を参照されたい）、またはサメ抗体、例えば、新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）など（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４：１６８（１９９５）、及びＳｔａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５：１７７０−１７７３（２００４）を参照されたい）である。
【００５８】
任意の適当な抗体が、本発明の文脈において使用することができる。例えば、モノクローナル抗体Ｊ５は、急性リンパ芽球性白血病共通抗原（ＣＡＬＬＡ）に対して特異的であるマウスＩｇＧ２ａ抗体であり（Ｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８３：５８３−５８５（１９８０））、ＣＡＬＬＡを発現する細胞を標的するために使用することができる（例えば、急性リンパ芽球性白血病細胞）。モノクローナル抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原に特異的に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ．，８：５２１（１９８４））、ＣＤ３３を発現する細胞を標的するために使用することができる（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞）。
【００５９】
同様に、モノクローナル抗体抗Ｂ４（Ｂ４とも称される）は、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２４４−２５０（１９８３））、Ｂ細胞またはＣＤ１９を発現する罹病細胞を標的するために使用することができる（例えば、非ホジキンリンパ腫細胞及び慢性リンパ芽球性白血病細胞）。Ｎ９０１は、小細胞肺癌を含む、神経内分泌起源（ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｏｒｉｇｉｎ）の細胞上に見出されるＣＤ５６（神経細胞接着分子）抗原に結合するマウスモノクローナル抗体であり、薬物が神経内分泌起源の細胞を標的とするようコンジュゲートにおいて使用することができる。Ｊ５、ＭＹ９、及びＢ４抗体は、好ましくは、コンジュゲートの一部としてのそれらの使用の前に、再表面化またはヒト化される。抗体の再表面化またはヒト化は、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９６９−７３（１９９４）に説明される。
【００６０】
それに加えて、モノクローナル抗体Ｃ２４２は、ＣａｎＡｇ抗原に結合し（例えば、米国特許第５，５５２，２９３号を参照されたい）、コンジュゲートが、大腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、及び胃癌などの、ＣａｎＡｇ発現腫瘍を標的するために使用することができる。ＨｕＣ２４２は、モノクローナル抗体Ｃ２４２のヒト化形態である（例えば、米国特許第５，５５２，２９３号を参照されたい）。ＨｕＣ２４２が生成されるハイブリドーマは、ＥＣＡＣＣ識別番号９００１２６０１で寄託されている。ＨｕＣ２４２は、ＣＤＲグラフト化手法（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、及び同第５，６９３，７６２号を参照されたい）または再表面化技術（例えば、米国特許第５，６３９，６４１号を参照されたい）を使用して調製することができる。ＨｕＣ２４２は、コンジュゲートが、例えば、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、非小細胞肺癌細胞、及び胃癌細胞などのＣａｎＡｇ抗原を発現する腫瘍細胞を標的するために使用することができる。
【００６１】
卵巣癌及び前立腺癌細胞を標的するために、抗ＭＵＣ１抗体が、コンジュゲート中の細胞結合剤として使用することができる。抗ＭＵＣ１抗体としては、例えば、抗ＨＭＦＧ−２（例えば、Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２８：１７−２１（１９８１）を参照されたい）、ｈＣＴＭＯ１（例えば、ｖａｎ  Ｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：５１７９−５１８５（１９９６）を参照されたい）、及びＤＳ６が挙げられる。前立腺癌細胞はまた、抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）をＪ５９１などの細胞結合剤として使用することによって、コンジュゲートを用いて標的することもできる（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：３６２９−３６３４（１９９７）を参照されたい）。さらに、乳癌、前立腺癌、及び卵巣癌などのＨｅｒ２抗原を発現する癌細胞は、抗Ｈｅｒ２抗体、例えば、トラスツズマブを細胞結合剤として使用することによって、コンジュゲートを用いて標的することができる。ＩＩＩ型欠失変異体、ＥＧＦＲｖＩＩＩなどの表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）及びその変異型を発現する細胞は、抗ＥＧＦＲ抗体を使用することによって、コンジュゲートを用いて標的することができる。抗ＥＧＦＲ抗体は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８３８５号及び同第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８３７８号に説明される。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、米国特許第７，７３６，６４４号及び同第７，６２８，９８６号、並びに米国特許出願公開第２０１０／０１１１９７９号、同第２００９／０２４００３８号、同第２００９／０１７５８８７号、同第２００９／０１５６７９０号、及び同第２００９／０１５５２８２号に説明される。米国特許第７，９８２，０２４号に説明されるものなどのインスリン様増殖因子受容体に結合する抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体もまた、コンジュゲートにおいて使用することができる。ＣＤ２７Ｌ、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＥｐｈＡ２、インテグリン、ＣＤ３７、葉酸、ＣＤ２０、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＣＡ、ＴＭＥＦＦ２、ＳＴＥＡＰ１、エンドグリン、及びＨｅｒ３に結合する抗体もまた、コンジュゲートにおいて使用することができる。
【００６２】
一実施形態では、抗体は、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）、ビバツズマブ、シブロツズマブ、リツキシマブ、ｈｕＤＳ６、国際特許出願公開第２０１０／１２４７９７号に説明される抗メソテリン抗体（ＭＦ−Ｔなど）、米国特許出願公開第２０１０／００９３９８０号に説明される抗クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）抗体（ｈｕＢ３Ｆ６など）、米国特許出願公開第２００７／０１８３９７１号に説明される抗ＣＤ１３８抗体（ｈｕＢ−Ｂ４など）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８，３８５号及び同第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８，３７８号に説明される抗ＥＧＦＲ抗体（ＥＧＦＲ−７など）、米国特許第７，７３６，６４４号及び同第７，６２８，９８６号並びに米国特許出願公開第２０１０／０１１１９７９号、同第２００９／０２４００３８号、同第２００９／０１７５８８７号、同第２００９／０１５６７９０号、及び同第２００９／０１５５２８２号に説明される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／０３９７２１号及び同第ＷＯ２０１１／０３９７２４号に説明されるヒト化ＥｐｈＡ２抗体（２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４など）；国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０４７２４２号に説明される抗ＣＤ３８抗体（ｈｕ３８ＳＢ１９など）、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／１０６５２８号、及び米国特許出願公開第２０１２／０００９１８１号に説明される抗葉酸抗体（例えば、ｈｕＭｏｖ１９）；米国特許第５，９５８，８７２号、同第６，５９６，７４３号、及び同第７，９８２，０２４号に説明される抗ＩＧＦ１Ｒ抗体；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５３号に説明される抗ＣＤ３７抗体（例えば、ｈｕＣＤ３７−３）、米国特許出願公開第２００６／０１２７４０７号に説明される抗インテグリンαｖβ６抗体（例えば、ＣＮＴＯ９５）；並びに国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０１９０２４号に説明される抗Ｈｅｒ３抗体からなる群から選択される。一実施形態では、細胞結合剤が、ＦＧＦＲ２に結合する抗体またはその抗原結合断片である（例えば、ＵＳ２０１４／０３０８２０に記載のもの、その教示全体を参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、細胞結合剤は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ４に結合する抗体またはその抗原結合断片である（例えば、ＵＳ２０１４／３０１９４６に記載のもの、その教示全体は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６３】
さらに別の実施形態では、細胞結合剤は、ヒトＦＧＦＲ３（配列番号１１）に結合する。より具体的には、細胞結合剤は、ヒトＦＧＦＲ３（配列番号１１）に結合し、配列ＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有するＣＤＲＨ１、配列ＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ２、配列ＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ３、配列ＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨ（配列番号４）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＤＴＥＲＰＳ（配列番号５）を有するＣＤＲＬ２、及び配列ＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶ（配列番号６）を有するＣＤＲＬ３を含む。さらにより具体的には、細胞結合剤は、
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＶＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）の可変重アミノ酸配列、及び
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＬＳＶＡＰＧＫＴＡＴＦＴＣＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨＷＹＲＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＬＤＴＥＲＰＳＧＩＰＥＲＭＳＧＳＮＦＧＮＴＡＴＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号８）の可変軽アミノ酸配列をさらに含む。
別のさらに具体的な実施形態では、細胞結合剤は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む。別の実施形態では、細胞結合剤は、各々が配列番号１０のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、及び各々が配列番号９のアミノ酸配列を含む２つの重鎖をさらに含む。
【００６４】
特に好ましい抗体は、本明細書に記載のヒト化モノクローナル抗体である。例としては、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、ヒト化モノクローナル抗Ｈｅｒ２抗体（例えば、トラスツズマブ）、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、及びリツキシマブ（例えば、米国特許第５，６３９，６４１、及び５，６６５，３５７、米国仮特許出願第６０／４２４，３３２号（米国特許第７，５５７，１８９に関連する）、国際（ＰＣＴ）特許出願公開第ＷＯ０２／１６４０１号、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、Ｃｏｌｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，１９：４９−５６（２００１），Ｈｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ：２３８５−２３９１（１９９５）、Ｗｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２：１１９３−１２０３（１９９４）、及びＭａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９０：２１８８−２１９５（１９９７）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。他のヒト化モノクローナル抗体が、当該技術分野において既知であり、本発明と組み合わせて使用することができる。
【００６５】
一実施形態では、細胞結合剤は、ｈｕＭｙ９−６または他の関連抗体であり、米国特許第７，３４２，１１０号、及び同第７，５５７，１８９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００６６】
別の実施形態では、細胞結合剤は、米国仮特許出願第６１／３０７，７９７号、同第６１／３４６，５９５号、同第６１／４１３，１７２号、及び米国出願第１３／０３３，７２３号（ＵＳ２０１２−０００９１８１Ａｌとして公開）に記載される抗葉酸受容体抗体である。これら全ての出願の教示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００６７】
別の実施形態では、細胞結合剤は、ヒト葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）に特異的に結合するヒト化抗葉酸抗体またはその抗原結合断片であり、抗体は、（ａ）ＧＹＦＭＮを含む重鎖ＣＤＲ１；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａａ１ＦＸａａ２Ｘａａ３を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹを含む重鎖ＣＤＲ３；及び（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨを含む軽鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮＬＥＡを含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含み；Ｘａａ１は、Ｋ、Ｑ、Ｈ、及びＲから選択され；Ｘａａ２は、Ｑ、Ｈ、Ｎ、及びＲから選択され；及びＸａａ３は、Ｇ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ａ、及びＶから選択される。好ましくは、重鎖ＣＤＲ２配列は、ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧを含む。
【００６８】
別の実施形態では、抗葉酸抗体は、ヒト葉酸受容体１に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＦＭＮＷＶＫＱＳＰＧＱＳＬＥＷＩＧＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＨＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＦＡＶＹＹＣＴＲＹＤＧＳＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【００６９】
別の実施形態では、抗葉酸抗体は、２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０７７２及びＰＴＡ−１０７７３または１０７７４を有するプラスミドＤＮＡによってコードされるヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
【００７０】
別の実施形態では、抗葉酸抗体は、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＦＭＮＷＶＫＱＳＰＧＱＳＬＥＷＩＧＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＨＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＦＡＶＹＹＣＴＲＹＤＧＳＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳに対して少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％同一である重鎖可変ドメイン、及び
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＮＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ；またはＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＴＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲに対して少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
【００７１】
細胞結合剤は、好ましくは抗体であるが、細胞結合剤はまた、非抗体分子であることもできる。適当な非抗体分子としては、例えば、インターフェロン（例えば、α、β、またはγインターフェロン）、リンホカイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、またはＩＬ−６）、ホルモン（例えば、インスリン）、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦ）、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦ（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，５：１５５−１５８（１９８４）を参照されたい）、ソマトスタチン、及びトランスフェリン（例えば、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：９３２−９３７（１９８５）を参照されたい）が挙げられる。例えば、骨髄細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦは、急性骨髄性白血病細胞を標的するための細胞結合剤として使用することができる。それに加えて、活性化Ｔ細胞に結合するＩＬ−２は、移植片拒絶の防止のため、移植片対宿主疾患の療法及び防止のため、並びに急性Ｔ細胞白血病の治療のために使用することができる。表皮増殖因子（ＥＧＦ）は、肺癌及び頭頸部癌などの扁平上皮癌を標的するために使用することができる。ソマトスタチンは、神経芽腫細胞及び他の腫瘍細胞型を標的するために使用することができる。
【００７２】
細胞毒性剤
本明細書で使用する場合、「細胞毒性剤」は、細胞の死をもたらす、細胞死を誘発する、または細胞生存を減少させる任意の化合物を指す。適当な細胞毒性剤としては、例えば、マイタンシノイド及びコンジュゲート可能なアンサマイトシン（例えば、２０１１年１１月３日出願の国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５９１３１号を参照されたい）、タキソイド、ＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５類似体、並びにドラスタチン及びドラスタチン類似体が挙げられる。本発明の具体的な実施形態では、細胞毒性剤は、マイタンシノール及びマイタンシノール類似体を含む、マイタンシノイドである。マイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、哺乳類細胞に対して毒性の高い化合物である。適当なマイタンシノール類似体の例としては、修飾芳香環を有するもの、及び他の位置に修飾を有するものが挙げられる。かかるマイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，２５６，７４６号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６２，６６３号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，３７１，５３３号、同第４，４５０，２５４号、同第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、及び同第６，３３３，４１０号に説明される。
【００７３】
修飾芳香環を有するマイタンシノール類似体の例としては、（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元によって調製される）、（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号及び同第４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセスまたはアクチノミセスを用いた脱メチル化、またはＬＡＨを用いた脱塩素処理によって調製される）、及び（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化によって調製される）が挙げられる。
【００７４】
芳香環以外の位置に修飾を有するマイタンシノール類似体の例としては、（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（マイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応によって調製される）、（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（Ｎｏｃａｒｄｉａから調製される）、（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイセスによるマイタンシノールの変換によって調製される）、（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号及び同第４，３１５，９２９号）（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｉｆｌｏｒａから単離される）、（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号及び同第４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセスによるマイタンシノールの脱メチル化によって調製される）、及び（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（三塩化チタン／マイタンシノールのＬＡＨ還元によって調製される）が挙げられる。
【００７５】
本発明の具体的な実施形態では、本発明のプロセスにおいて使用することができる細胞毒性剤は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシンとしても既知であるチオール含有マイタンシノイドＤＭ１である。ＤＭ１の構造は、式（Ｉ）によって表される：
【化３】
2018505128.tif 000005
【００７６】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明のプロセスにおいて使用することができる細胞毒性剤は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシンとしても既知であるチオール含有マイタンシノイドＤＭ１である。ＤＭ４の構造は、式（ＩＩ）によって表される：
【化４】
2018505128.tif 000006
【００７７】
他のマイタンシノイドが、本発明の文脈において使用されてもよく、例えば、硫黄原子を担持する炭素原子上のモノアルキルまたはジアルキル置換を担持するチオール及びジスルフィド含有マイタンシノイドが挙げられる。特に好ましいのは、Ｃ−３位に、（ａ）Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチル官能性を有するマイタンシノイド、及び（ｂ）ヒンダードスルフヒドリル基を担持するアシル基を有するアシル化されたアミノ酸側鎖を有するマイタンシノイドであって、チオール官能性を担持するアシル基の炭素原子が、１つまたは２つの置換基を有し、その置換基が、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、さらに、置換基のうちの１つが、Ｈであり得、アシル基が、カルボニル官能性と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を有する、マイタンシノイドである。
【００７８】
本発明の文脈における使用のためのさらなるマイタンシノイドとしては、式（ＩＩＩ）：
【化５】
2018505128.tif 000007
によって表される化合物が挙げられ、式中、Ｙ’は、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｏ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ２はまた、Ｈであり得、Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換アリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、各々独立して、Ｈ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔは、各々独立して、０または１〜５の整数であるが、但し、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔのうちの少なくとも２つは常に０ではなく、Ｚは、Ｈ、ＳＲ、もしくはＣＯＲであり、Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルである。式（ＩＩＩ）の好ましい実施形態としては、（ａ）Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、メチルであり、Ｚは、Ｈである、（ｂ）Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｚは、Ｈである、（ｃ）Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、メチルであり、Ｚは、−ＳＣＨ３である、並びに（ｄ）Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｚは、−ＳＣＨ３である、式（ＩＩＩ）の化合物が挙げられる。
【００７９】
かかるさらなるマイタンシノイドとしてはまた、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）、または（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）：
【化６】
2018505128.tif 000008
によって表される化合物が挙げられ、式中、Ｙは、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ２はまた、Ｈであり得、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、各々独立して、Ｈ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、ｌ、ｍ、及びｎは、各々独立して、１〜５の整数であり、さらにｎは０であり得、Ｚは、Ｈ、ＳＲ、またはＣＯＲであり、Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチルに側鎖を担持するマイタンシノイドを表す。式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）、及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態としては、（ａ）Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは各々、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、Ｈである、（ｂ）Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、Ｈである、（ｃ）Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは各々、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、−ＳＣＨ３である、または（ｄ）Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、−ＳＣＨ３である、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）、及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物が挙げられる。好ましい細胞毒性剤は、式（ＩＶ−Ｌ）によって表される。
【００８０】
さらなる好ましいマイタンシノイドとしてはまた、式（Ｖ）：
【化７】
2018505128.tif 000009
によって表される化合物も挙げられ、式中、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、ここでＲ１及びＲ２は、各々独立して、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ２はまた、Ｈであり得、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、各々独立して、Ｈ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、ｌ、ｍ、及びｎは、各々独立して、１〜５の整数であり、さらにｎは０であり得、Ｚは、Ｈ、ＳＲ、またはＣＯＲであり、Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチルに側鎖を担持するマイタンシノイドを表す。
【００８１】
式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）、及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態としては、（ａ）Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは各々、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、Ｈである、（ｂ）Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、Ｈである、（ｃ）Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは各々、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、−ＳＣＨ３である、または（ｄ）Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、−ＳＣＨ３である、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）、及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物が挙げられる。式（Ｖ）の好ましい実施形態としては、（ａ）Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは各々、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、Ｈである、（ｂ）Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、Ｈである、（ｃ）Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは各々、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、−ＳＣＨ３である、または（ｄ）Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、Ｈであり、ｌ及びｍは、１であり、ｎは、０であり、Ｚは、−ＳＣＨ３である、式（Ｖ）の化合物が挙げられる。
【００８２】
マイタンシノイドに加えて、コンジュゲートにおいて使用される細胞毒性剤は、タキサンまたはその誘導体であることができる。タキサンは、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（細胞毒性天然物）とドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））（半合成誘導体）とを含む化合物のファミリーであり、これらはいずれも、癌の治療において幅広く使用される。タキサンは、チューブリンの脱重合を阻害し、細胞死をもたらす有糸分裂紡錘体毒である。ドセタキセル及びパクリタキセルは、癌の治療に有用な薬剤であるが、その抗腫瘍活性は、正常な細胞に対するその非特異的毒性のため、制限される。さらに、パクリタキセル及びドセタキセルのような化合物は、それ自身、細胞結合剤のコンジュゲートとして使用するには十分な効能がない。
【００８３】
本明細書に記載の本発明をより完全に理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は説明の目的のみであり、いかなる様式においても本発明を限定するものとみなすべきではないことを理解すべきである。
【実施例】
【００８４】
実施例１
分析方法：
抗体及びコンジュゲートの濃度は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍでの抗体及びＤＭ４成分の経験的に決定されたまたは算出された消衰係数を用いて測定した。
【００８５】
モノマー、高分子量種は、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ）、５ｕｍ粒径カラムを用いて、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定した。移動相は、１５％イソプロパノールを含有する、１６０ｍＭのリン酸カリウム、２１２ｍＭの塩化カリウムｐＨ７．０であり、０．５ｍＬ／分の流量で実施し、２８０ｎｍでの吸光度で検出した。
【００８６】
抗体断片は、タンパク質２３０キット（パート＃５０８７−１５１８）を用いて、２１００  Ｅｘｐｅｒｔソフトウェアを有するＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。１．６ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含有するように補った変性緩衝液を添加することで変性サンプルを調製し、サンプルを５分間７０℃に加熱する。希釈、サンプル及びラダーローディング、及び分析を含む全ての他のステップは、Ａｇｉｌｅｎｔタンパク質２３０キット指示書に従って行う。抗体の断片化率は、全ての抗体関連のピークの合計で割った抗体モノマー種（公知のグリコシル化アーチファクトを除く）よりも小さい全てのピークの合計によって算出する。
【００８７】
Ｉｎ  Ｓｉｔｕ反応調製（本プロセスのステップ（ａ））
細胞毒性剤−リンカー化合物を調製するためのＩｎ  ｓｉｔｕ反応は、７０．０％（ｖ／ｖ）のＤＭＡ、及び３０％（ｖ／ｖ）の４つの試験緩衝液（２００ｍＭコハク酸塩、ｐＨ５．０；２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ５．０；１６７ｍＭ  ＥＰＰＳ、６７ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．２；２０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．２）の１つの緩衝液中で、ＤＭ４（１２ｍＭ）をＳＰＤＢまたはスルホ−ＳＰＤＢリンカー（１０ｍＭ）と反応させることによって実施した。混合物を渦撹拌し、２０．０℃で６時間インキュベートし、任意の精製をせずに直ちに使用した。
【００８８】
コンジュゲート調製（本プロセスのステップ（ｂ））：
適切な量のコンジュゲーション緩衝液（５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、２０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２）を算出量のＤＭＡと混合することによってコンジュゲーション混合物を調製し、最終ＤＭＡレベルを２．５％または１０％に到達させた。ゲル濾過クロマトグラフィーによってコンジュゲーション緩衝液に予めバッファー交換されている抗体１、抗ＦＯＬＲ１抗体を次いでこの混合物に添加し、最終標的抗体濃度を達成した。３〜４のマイタンシノイド対抗体比（ＭＡＲ）を達成するのに必要な算出量のｉｎ  ｓｉｔｕ反応混合物を添加し、反応物を直ちに混合した。次に、オービタルシェーカー上で１６０ｒｐｍにて混合しながら、コンジュゲーション反応を２０．０℃で２２時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、ｐＨ８．２の反応混合物を、６．５％（ｖ／ｖ）の１Ｍ酢酸を添加することによってｐＨ調整し、０．２２ｕｍのＰＶＤＦフィルターを通して濾過した。濾過し、ｐＨ調整した反応混合物をゲル濾過によって精製し、精製されたコンジュゲートを、ＵＶ／可視吸光分光法、高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によるサイズ排除クロマトグラフィー、及び非還元ＣＥ−ＳＤＳ（ＧｅｌＣｈｉｐ）によって分析した。
【表１】
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【表２】
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【００８９】
表１及び２に示すように、高緩衝能を有する緩衝溶液をｓＳＰＤＢ及びＤＭ４のｉｎ  ｓｉｔｕ反応（すなわち、ステップ（ａ）の反応）に使用する場合、得られたコンジュゲートは、低緩衝能の緩衝液を使用することで調製したコンジュゲートと比較して、抗体断片化が有意に低い。対照的に、ＳＰＤＢを二官能性架橋試薬として使用する場合、緩衝能は、抗体断片化に有意な効果を有さない。ＳＰＤＢリンカー構造を以下に示す：
【化８】
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【００９０】
実施例２
配列番号１０のアミノ酸配列を持つ軽鎖と配列番号９のアミノ酸配列を持つ重鎖を有する抗体２、抗ＦＧＦＲ３抗体を３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、透析濾過して、１０透析容量の反応緩衝液（５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、２０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２）にし、４５ｇ／Ｌにさらに濃縮した。スルホ−ＳＰＤＢ（１０ｍＭ）に対して１．２モル比のＤＭ４（１２ｍＭ）は、１６７ｍＭ  ＥＰＰＳ、６６．７ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２、及び７０．０％（ｖ／ｖ）ＤＭＡ中の抗体に対して４．６８モル比のスルホ−ＳＰＤＢと反応させた。ｉｎ−ｓｉｔｕ反応を２０±３℃で１０±４時間実施した後、ＤＭＡを有する抗体２に添加し、５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２±０．２、及び５．０％ＤＭＡ（ｖ／ｖ）中の２０ｍｇ／ｍＬの最終Ａｂ濃度を達成した。コンジュゲーション反応は、２０．０±３．０℃で１６±８時間実施した。反応後、６．５％（ｖ／ｖ）の１Ｍ酢酸を添加することによって、コンジュゲーション混合物のｐＨを５．０に迅速に調整した。ｐＨ調整した混合物を２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１６ダイア容量の基礎配合緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．０±０．１）に対して透析フィルター濾過した。精製されたコンジュゲートを、スクロース（４５％、ｗ／ｖ）及びポリソルベート−２０（１０％、ｗ／ｖ）の原液を用いて、１０ｍＭ酢酸塩、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ｐＨ５．０中に５．０ｍｇ／ｍＬで配合した。
【配列表】
2018505128000001.app
【国際調査報告】
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2018505128.tif 000016