(57)【要約】  本発明は、感受性アミノ酸残基の酸化レベルを低減するためにアルブミン融合タンパク質を精製する方法に関する。本方法は、親和性マトリックスクロマトグラフィーステップとアニオン交換クロマトグラフィーステップとを含む。精製されたアルブミン融合タンパク質は、低レベルの酸化を有し、かつその増加されたインビボ半減期とその生物活性とを保持する。一部の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、スキャフォールド、例えばヒトテネイシンＣスキャフォールドを含む。アルブミン融合タンパク質を含む組成物がさらに開示される。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン融合タンパク質における精製中のトリプトファンおよび／またはメチオニンの酸化を低減する方法であって、前記アルブミン融合タンパク質を含む組成物を以下の精製プロセス：
（ａ）親和性マトリックス；
（ｂ）アニオン交換マトリックス
に供するステップを含み、前記アルブミン融合タンパク質が、オクタン酸を含む溶出緩衝液を適用することによって前記親和性マトリックスから溶出される、方法。
【請求項２】
前記溶出緩衝液が約２ｍＭ〜約１００ｍＭのオクタン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
親和性マトリックスが、
（１）約２％〜約２０％の、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、および２−メチル−２，４−ペンタンジオールからなる群から選択されるポリオール；
（２）０．０５Ｍ〜２．０Ｍの、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、および臭化リチウムから選択される塩；
（３）約０．０２Ｍ〜約０．２Ｍの硫酸ナトリウム；
（４）約０．０１％〜約１％の非イオン性界面活性剤；
（５）約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの尿素；または
（６）約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍのニコチンアミド
を含む洗浄用緩衝液で洗浄される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アルブミン融合タンパク質における精製中のトリプトファンおよび／またはメチオニンの酸化を低減する方法であって、前記アルブミン融合タンパク質を含む組成物を以下の精製プロセス：
（ａ）親和性マトリックス；
（ｂ）アニオン交換マトリックス
に供するステップを含み、前記親和性マトリックスが、
（１）約２％〜約２０％の、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、および２−メチル−２，４−ペンタンジオールからなる群から選択されるポリオール；
（２）０．０５Ｍ〜２．０Ｍの、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、および臭化リチウムから選択される塩；
（３）約０．０２Ｍ〜約０．２Ｍの硫酸ナトリウム；
（４）約０．０１％〜約１％の非イオン性界面活性剤；
（５）約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの尿素；または
（６）約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍのニコチンアミド
を含む洗浄用緩衝液で洗浄される、方法。
【請求項５】
前記洗浄用緩衝液が、約５％〜約１５％のポリオール、約０．２Ｍ〜約０．８Ｍの塩、約０．２Ｍ〜約０．８Ｍの硫酸ナトリウム、約０．０２％〜約０．４％の非イオン性界面活性剤、または約０．２Ｍ〜約１．０Ｍの尿素を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリオールが１，２−プロパンジオールであり、前記塩が塩化ナトリウムであり、かつ前記非イオン性界面活性剤がトリトンＸ−１００である、請求項３、４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記洗浄用緩衝液が、（１）約０．５Ｍの塩化ナトリウム；（２）約０．５Ｍの硫酸ナトリウム；または（３）約１０％の１，３−プロパンジオールを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
前記溶出緩衝液が、ビストリス、トリス、リン酸、塩、キレート剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１、２、３、５、６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶出緩衝液が５０ｍＭのビストリスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記洗浄用緩衝液が５．５〜７．０のｐＨである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１１】
前記親和性マトリックスがローディング緩衝液で平衡化される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１２】
前記親和性マトリックスが色素親和性マトリックスである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アニオン交換マトリックスがデキストラン表面増量剤で高度に架橋されたアガロースを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルブミン融合タンパク質がステップ溶出を用いて前記アニオン交換マトリックスから溶出される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルブミン融合タンパク質が勾配溶出を用いてアニオン交換から溶出される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アニオン交換マトリックス溶出緩衝液が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ＨＣｌ、ＬｉＣｌ、ＮａＢｒ、ＫＢｒ、およびＬｉＢｒからなる群から選択される塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記塩がＮａＣｌであり、かつ２０〜４００ｍＭの量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アニオン交換マトリックスが、５０ｍＭのビストリスおよび２０ｍＭのＮａＣｌをｐＨ７．０で含むローディング緩衝液で平衡化される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物を、アニオン交換膜を通過させるステップをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アニオン交換膜が第４級アミンで修飾されたポリエーテルスルホンベース膜である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、１０ｍＭを超える塩濃度と８未満のｐＨとを有するフロースルー緩衝液中で前記アニオン交換膜を通過させられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記フロースルー緩衝液が１０ｍＭ〜２２０ｍＭの塩濃度と６〜８のｐＨとを有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記フロースルー緩衝液が６〜７．５のｐＨで５０ｍＭ〜２２０ｍＭの塩濃度を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アニオン交換マトリックス溶出液をダイアフィルトレーションに供する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ダイアフィルトレーション用の緩衝液がｐＨ７．０で５０ｍＭのビストリスと５０ｍＭのＮａＣｌとを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記膜が予め調整される、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記膜が平衡化される、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物を疎水性相互作用マトリックスに供するステップをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記疎水性相互作用マトリックスまたはマルチモーダルマトリックスが、Ｃａｐｔｏ  Ｂｕｔｙｌ、Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ、Ｃａｐｔｏ  Ｂｕｔｙｌ、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｈｅｘｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｅｔｈｅｒ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ−６００Ｍ、およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ−６００Ｍ、ＴＳＫｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌ、ＴＳＫｇｅｌ  Ｅｔｈｅｒ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＨＣＸ、Ｎｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅ、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記疎水性相互作用マトリックスに、クエン酸塩、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む緩衝液が負荷される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記疎水性相互作用マトリックスが、低レベルのクエン酸塩、［硫酸？］ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む溶出緩衝液で溶出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物を限界濾過に供するステップをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物をダイアフィルトレーションに供するステップをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物をナノ濾過に供するステップをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供するステップをさらに含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ウイルス不活化プロセスをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ウイルス不活化プロセスが、アルブミン融合タンパク質を含む前記組成物をトリトンＸ−１００、ツイーン８０、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ノノキシノール−９、ポリオキサマー、ステアリルアルコール、またはソルビタンモノステアレートで処理するステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ウイルス不活化プロセスが前記ステップ（ａ）のプロセス後および前記ステップ（ｂ）のプロセス前に実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
トリトンＸ−１００が、約３０〜約２４０分にわたって保持される約０．０１％〜約１％のトリトンＸ−１００の最終濃度（ｗ／ｗ）まで添加される、請求項３８に記載の方法。
【請求項３８】
酸化されたトリプトファン残基を本質的に含まないアルブミン融合タンパク質を含む組成物を得る方法であって、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とを含む組成物を疎水性相互作用マトリックスに供するステップを含み、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とが異なる時間に前記疎水性相互作用マトリックスから溶出され、それにより、前記トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質を前記トリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質から分離する、方法。
【請求項３９】
トリプトファン／メチオニン残基の酸化を本質的に含まないアルブミン融合タンパク質を単離する方法であって、アルブミン融合タンパク質を含む組成物を、以下の精製プロセス：
（ａ）親和性マトリックスクロマトグラフィープロセス；
（ｂ）アニオン交換クロマトグラフィープロセス；および
（ｃ）疎水性相互作用マトリックスクロマトグラフィープロセス
に供するステップを含み、オクタン酸を含む溶出緩衝液が前記親和性マトリックスに適用され、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とが異なる時間に前記疎水性相互作用マトリックスから溶出され、それにより、前記トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質を前記トリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質から分離する、方法。
【請求項４０】
アルブミン融合タンパク質を精製する方法であって、アルブミン融合タンパク質を含む組成物を、疎水性相互作用マトリックスおよび以下の精製プロセス：
（ａ）オクタン酸を含む溶出緩衝液が適用される親和性マトリックス；および／または
（ｂ）アニオン交換マトリックス
の１つ以上に供するステップを含み、親和性マトリックスが、（１）約２％〜約２０％の、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，６ヘキサンジオール、および２−メチル−２，４−ペンタンジオールからなる群から選択されるポリオール；（２）０．０５Ｍ〜２．０の、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、および臭化リチウムから選択される塩；（３）約０．０２Ｍ〜約０．２Ｍの硫酸ナトリウム；（４）約０．０１％〜約１％の非イオン性界面活性剤；（５）約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの尿素；または（６）約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍのニコチンアミドを含む洗浄用緩衝液で洗浄され、
得られる精製されたアルブミン融合タンパク質が、酸化されたトリプトファン残基を本質的に含まない、方法。
【請求項４１】
アルブミン融合タンパク質を精製する方法であって、
（ａ）前記アルブミン融合タンパク質を含む組成物を親和性マトリックスに適用するステップと；
（ｂ）前記アルブミン融合タンパク質を前記（ａ）の親和性マトリックスから溶出させて第１の溶出液を得るステップと；
（ｃ）前記第１の溶出液をアニオン交換マトリックスに適用するステップと；
（ｄ）前記アルブミン融合タンパク質を前記アニオン交換マトリックスから溶出させて第２の溶出液を得るステップと；
（ｅ）前記第２の溶出液をアニオン交換膜に適用するステップと；
（ｆ）前記アルブミン融合タンパク質を、アニオン交換膜を通過させてフロースルーを得るステップと；
（ｇ）前記フロースルーを疎水性相互作用マトリックスに適用するステップと；
（ｈ）前記アルブミン融合タンパク質を前記疎水性相互作用マトリックスから溶出させて第３の溶出液を得るステップと
を含み、前記第３の溶出液が前記精製されたアルブミン融合タンパク質を含む、方法。
【請求項４２】
前記アルブミン融合タンパク質中のアルブミンがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＨＳＡが変異体ＨＳＡである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記変異体ＨＳＡのアミノ酸配列が配列番号１３３である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記アルブミン融合タンパク質が、３番目のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）ドメインを含むスキャフォールド部分を含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＦｎＩＩＩドメインがヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３スキャフォールド）由来である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アルブミン融合タンパク質がスキャフォールドを含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記スキャフォールドがトリプトファン残基を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記トリプトファン残基の酸化が前記アルブミン融合タンパク質の活性を低下させる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記スキャフォールドがＣＤ４０Ｌに特異的に結合する、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｔｎ３スキャフォールドが単一のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｔｎ３スキャフォールドがタンデムに連結された２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットが直接的に連結される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットがリンカーによって連結される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記リンカーがペプチドリンカーを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ペプチドリンカーが（ＧmＸ）n配列を含み、ここで、
（ａ）Ｘがセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）であり；
（ｂ）ｍおよびｎが整数であり；
（ｃ）ｍが１、２、３または４であり；かつ
（ｄ）ｎが１、２、３、４、５、６、または７である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドリンカーが配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１４２または配列番号１４３を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記Ｔｎ３スキャフォールドがβストランドを含み、少なくとも１つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットの前記βストランドが配列番号３のβストランドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
前記Ｔｎ３スキャフォールドがβストランドＡを含み、前記βストランドＡが少なくとも１つの突然変異を除いて配列番号１１を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
前記Ｔｎ３スキャフォールドがβストランドＢを含み、前記βストランドＢが少なくとも１つの突然変異を除いて配列番号１２を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
前記Ｔｎ３スキャフォールドがβストランドＣを含み、前記βストランドＣが少なくとも１つの突然変異を除いて配列番号１３または１４を含み、配列番号１３または１４中のシステインが置換されない、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｔｎ３スキャフォールドがβストランドＤを含み、前記βストランドＤが少なくとも１つの突然変異を除いて配列番号１５を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｔｎ３スキャフォールドがＥβとして含み、βストランドＥが少なくとも１つの突然変異を除いて配列番号１６を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｔｎ３スキャフォールドがＦβとして含み、βストランドＤが少なくとも１つの突然変異を除いて配列番号１７を含み、配列番号１７中のシステインが置換されない、請求項４５に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｔｎ３スキャフォールドがβストランドＧを含み、前記βストランドＧが少なくとも１つの突然変異を除いて配列番号１８を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットがアミノ酸配列：
【化１】
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を含み、ここで、
（ａ）ＸAB、ＸBC、ＸCD、ＸDE、ＸEF、およびＸFGがそれぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し；
（ｂ）Ｘ1がアミノ酸残基ＡまたはＴを表し；かつ
（ｃ）前記ループの長さｎが２〜２６の整数である、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＡＢループの前記配列が配列番号４または配列番号１３６を含み、前記ＣＤループの前記配列が配列番号６を含み、かつ前記ＥＦループの前記配列が配列番号８または配列番号１３７を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＢＣループの前記配列が、配列番号８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、および１６８からなる群から選択される配列を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＤＥループの前記配列が、配列番号９４、９５、９６、９７、９８、および１６９からなる群から選択される配列を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＦＧループの前記配列が、配列番号９、９９、１３９、および１７０からなる群から選択される配列を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＢＣループの前記配列が、配列番号１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、および１７４からなる群から選択される配列を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＤＥループの前記配列が、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、および１７５からなる群から選択される配列を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＦＧループの前記配列が、配列番号１２９、１３０、および１７７からなる群から選択される配列を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
（ａ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号８３を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９４を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含むか；
（ｂ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号８３を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９４を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９９を含むか；
（ｃ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号８４を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９５を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含むか；
（ｄ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号８５を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９４を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含むか；
（ｅ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号８６を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９６を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含むか；
（ｆ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号８７を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９７を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含むか；
（ｇ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号８８を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９５を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含むか；
（ｈ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号８９を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９４を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含むか；
（ｉ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号９０を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９４を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含むか；
（ｊ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号９１を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９５を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含むか；
（ｋ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号９２を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９８を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含むか；または
（ｌ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号９３を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号９４を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号９または１３９を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
（ａ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１００を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１１８を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｂ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１０１を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１１９を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｃ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１０２を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２０を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｄ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１０３を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２１を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｅ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１０４を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２２を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｆ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１０５を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２１を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｇ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１０６を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２３を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｈ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１０７を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２３を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｉ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１０８を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１１８を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｊ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１０９を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２３を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｋ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１１０を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２１を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｌ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１１１を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２３を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１３０を含むか；
（ｍ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１０８を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２１を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｎ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１１２を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２４を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｏ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１１３を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２５を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｐ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１１４を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１１８を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｑ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１１５を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２６を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；
（ｒ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１１６を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２７を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含むか；または
（ｓ）前記ＢＣループの前記配列が配列番号１１７を含み、前記ＤＥループの前記配列が配列番号１２８を含み、かつ前記ＦＧループの前記配列が配列番号１２９を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＡＢループが配列番号１３６を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットが、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および１４６からなる群から選択される配列を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットがアミノ酸配列：
【化２】
2018513124.tif 000035
を含み、ここで、
（ａ）Ｘ1がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）を表し；
（ｂ）Ｘ2がアミノ酸残基のアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｃ）Ｘ3がアミノ酸残基のヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し；
（ｄ）Ｘ4がアミノ酸残基のアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｅ）Ｘ5がアミノ酸残基のグルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し；
（ｆ）Ｘ6がアミノ酸残基のフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｇ）Ｘ7がアミノ酸残基のイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｈ）Ｘ8がアミノ酸残基のグリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）またはバリン（Ｖ）を表し；
（ｉ）Ｘ9がアミノ酸残基のトリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｊ）Ｘ10がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｋ）Ｘ11がアミノ酸残基のトリプトファン（Ｗ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；かつ
（ｌ）Ｘ12がアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）を表す、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットが、配列番号４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、および８２からなる群から選択される配列を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットがアミノ酸配列：
【化３】
2018513124.tif 000036
を含み、ここで、
（ａ）Ｘ1がアミノ酸残基のリジン（Ｋ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｂ）Ｘ2がアミノ酸残基のトレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し；
（ｃ）Ｘ3がアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｄ）Ｘ4がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｅ）Ｘ5がアミノ酸残基のチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはセリン（Ｓ）を表し；
（ｆ）Ｘ6がアミノ酸残基のチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｇ）Ｘ7がアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｈ）Ｘ8がアミノ酸残基のロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｉ）Ｘ9がアミノ酸残基のヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｊ）Ｘ10がアミノ酸残基のグリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｋ）
（ｌ）Ｘ11がアミノ酸残基のアラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｍ）Ｘ12がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｒ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｎ）Ｘ13がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｏ）Ｘ14がアミノ酸残基のプロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）もしくはアラニン（Ａ）、またはアミノ酸なしを表し；
（ｐ）Ｘ15がアミノ酸残基のイソロイシン（Ｉ）またはアミノ酸なしを表し；
（ｑ）Ｘ16がアミノ酸残基のグルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）を表し；かつ
（ｒ）Ｘ17がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を表す、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記Ｔｎ３スキャフォールドが、配列番号１３４、１３５、２０５、２０６、２０７および２０８からなる群から選択される配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｔｎ３スキャフォールドが、配列番号２０１、２０２、２０３、および２０４からなる群から選択される配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＣＤ４０ＬがヒトＣＤ４０Ｌである、請求項５０に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＣＤ４０Ｌが、膜結合ＣＤ４０Ｌ（配列番号１）、可溶性ＣＤ４０Ｌ（配列番号２）、またはその断片である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記スキャフォールドがＣＤ４０Ｌに結合し、かつＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を阻止する、請求項５０〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記スキャフォールドがＣＤ４０Ｌに結合し、かつＣＤ４０媒介性シグナル伝達を破壊する、請求項５０〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記スキャフォールドが、約１μＭ以下、または約５００ｎＭ以下、または約１００ｎＭ以下、または約５０ｎＭ以下、または約２５ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下、または約５ｎＭ以下、または約２ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でＣＤ４０Ｌに結合する、請求項５０〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットが、配列番号２の１４２〜１５５位、２００〜２３０位、または２４７〜２５１位に位置するアミノ酸を含むＣＤ４０Ｌエピトープに特異的に結合する、請求項５０〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法によって得られるアルブミン融合タンパク質組成物。
【請求項９０】
前記精製されたアルブミン融合タンパク質の相対効力が＞９０％である、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、２０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質を有し、トリプトファン残基の１５％未満が酸化されている、組成物。
【請求項９２】
前記トリプトファン残基の５％未満が酸化されている、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
総タンパク質に対する５％未満のアミノ酸残基が酸化されている、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９４】
アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、５×１０-3ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡを有し、トリプトファン残基の１５％未満が酸化されている、組成物。
【請求項９５】
前記トリプトファン残基の５％未満が酸化されている、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
総タンパク質に対する２０％未満の前記アミノ酸残基が酸化されている、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、２０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質を有し、前記アルブミン融合タンパク質が＞９０％の相対活性を有する、組成物。
【請求項９８】
アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、５×１０-3ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡを有し、前記アルブミン融合タンパク質が＞９０％の相対活性を有する、組成物。
【請求項９９】
配列番号１３４、１３５、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７または２０８のアルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、２０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質を有し、４６位、１５１位または両方のトリプトファンが酸化されない、組成物。
【請求項１００】
（ａ）請求項９０〜９９のいずれか一項に記載の組成物；
（ｂ）緩衝液；
（ｃ）糖；および
（ｄ）乳化剤
を含む薬学的に許容できる製剤。
【請求項１０１】
前記緩衝液がリン酸ナトリウム緩衝液であり、前記糖がスクロースであり、かつ前記乳化剤がポリソルベート８０である、請求項１００に記載の製剤。
【請求項１０２】
凍結乾燥される、請求項１００または１０１に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本願は、２０１５年３月１２日に作成され、２２８キロバイトのサイズを有する、「ＣＤ４０Ｌ−３００Ｐ１＿ＳＬ．ＴＸＴ」という名称のテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本願とともに提出された配列表を参照により援用する。
【０００２】
本発明は、概して、アルブミン融合タンパク質のトリプトファンおよび／またはメチオニン残基の低レベルの酸化を有するアルブミン融合タンパク質を精製する方法に関する。これらの残基の低レベルの酸化は、精製されたアルブミン融合タンパク質がその相対効力および生物活性を保持することを可能にする。そのアルブミン融合タンパク質は、スキャフォールド、例えば有用なヒトテネイシンＣの３番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン由来のものなどを含んでもよい。本発明は、アブミン融合タンパク質を精製する方法、その方法から得られる精製されたタンパク質、および精製されたアルブミン融合タンパク質を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、有望な治療薬としてタンパク質の使用への関心が高まっている。タンパク質薬の１つの不都合が、インビボで短い半減期を有する傾向がある点である。この課題を克服するため、タンパク質およびペプチドは、他の分子と複合または融合され得る。半減期を延長するための１つの選択肢は、ポリ（エチレングリコール）、すなわちＰＥＧが幾つかの利用可能な化学反応を通じてタンパク質に共有結合される過程であるペグ化によるものである。ペグ化はまた、半減期延長に加えて、おそらく不活性ＰＥＧ鎖によるタンパク質表面の遮蔽に起因して免疫原性を低下させる場合がある。ペグ化の不都合は、それが複合反応ステップと、多くは未反応のＰＥＧ鎖を除去するためのさらなる精製ステップとを必要とする点である。これらの課題に反し、幾つかの市販の生物医薬品におけるペグ化技術の利用は成功している。
【０００４】
半減期を延長させるための第２の選択肢は融合タンパク質技術である。この場合、治療用タンパク質は、インビボでの半減期を延長するように設計された第２のタンパク質に遺伝的に融合される。この選択肢はペグ化と同様に半減期の延長をもたらすが、融合タンパク質が単一の実体として発現され、精製されることから、それはさらなる作製ステップ（複合反応およびそれに関連する精製）を必要としない。融合タンパク質の例として、Ｆｃ融合体、トランスフェリン融合体、およびアルブミン融合体が挙げられる。それらのタンパク質はすべてヒト血漿中に高レベルに見出され、薬剤に起因するレベル上昇の影響を緩和する。
【０００５】
半減期延長および作製の容易性の利点に加えて、融合タンパク質はまた、精製のためのプラットフォーム手法を利用することができる場合がある。これは、多くの場合に担体タンパク質が融合タンパク質の大部分を構成し、したがって様々な融合タンパク質間の生理化学的特性が類似しているためである。プラットフォーム手法が成功するように、精製操作は担体タンパク質に対して選択的でなければならない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、アルブミン融合タンパク質を精製する方法に関する。
【０００７】
本明細書中の参考文献に対する引用または考察は、それが本発明に対する先行技術であることの承認として解釈されるべきでない。
【０００８】
特定の態様では、本明細書中の開示は、アルブミン融合タンパク質における精製中のトリプトファンおよび／またはメチオニンの酸化を低減する方法であって、アルブミン融合タンパク質を含む組成物を、以下の精製プロセス：（ａ）親和性マトリックス；（ｂ）アニオン交換マトリックスに供するステップを含み、アルブミン融合タンパク質が、オクタン酸を含む溶出緩衝液を適用することによって親和性マトリックスから溶出される、方法に関する。
【０００９】
さらなる態様では、本明細書中の開示は、アルブミン融合タンパク質における精製中のトリプトファンおよび／またはメチオニンの酸化を低減する方法であって、アルブミン融合タンパク質を含む組成物を、以下の精製プロセス：（ａ）親和性マトリックス；（ｂ）アニオン交換マトリックスに供するステップを含み、親和性マトリックスが、（１）約２％〜約２０％の、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、および２−メチル−２，４−ペンタンジオールからなる群から選択されるポリオール；（２）０．０５Ｍ〜２．０Ｍの、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、および臭化リチウムから選択される塩；（３）約０．０２Ｍ〜約０．２Ｍの硫酸ナトリウム；（４）約０．０１％〜約１％の非イオン性界面活性剤；（５）約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの尿素；または（６）約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍのニコチンアミドを含む洗浄用緩衝液で洗浄される、方法に関する。
【００１０】
さらなる態様では、本明細書中の開示は、酸化されたトリプトファン残基を本質的に含まないアルブミン融合タンパク質を含む組成物を得る方法であって、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とを含む組成物を、疎水性相互作用マトリックスに供するステップを含み、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とが異なる時間に疎水性相互作用マトリックスから溶出され、それにより、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質をトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質から分離する、方法に関する。
【００１１】
特定の態様では、本明細書中の開示は、トリプトファン／メチオニン残基の酸化を本質的に含まないアルブミン融合タンパク質を単離する方法であって、アルブミン融合タンパク質を含む組成物を、以下の精製プロセス：（ａ）親和性マトリックスクロマトグラフィープロセス；（ｂ）アニオン交換クロマトグラフィープロセス；および（ｃ）疎水性相互作用マトリックスクロマトグラフィープロセスに供するステップを含み、オクタン酸を含む溶出緩衝液が親和性マトリックスに適用され、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とが異なる時間に疎水性相互作用マトリックスから溶出され、それにより、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質をトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質から分離する、方法に関する。
【００１２】
さらなる態様では、本明細書中の開示は、アルブミン融合タンパク質を精製する方法であって、アルブミン融合タンパク質を含む組成物を、疎水性相互作用マトリックスおよび以下の精製プロセス：（ａ）オクタン酸を含む溶出緩衝液が適用される親和性マトリックス；および／または（ｂ）アニオン交換マトリックスの１つ以上に供するステップを含み、親和性マトリックスが、（１）約２％〜約２０％の、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，６ヘキサンジオール、および２−メチル−２，４−ペンタンジオールからなる群から選択されるポリオール；（２）０．０５Ｍ〜２．０の、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、および臭化リチウムから選択される塩；（３）約０．０２Ｍ〜約０．２Ｍの硫酸ナトリウム；（４）約０．０１％〜約１％の非イオン性界面活性剤；（５）約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの尿素；または（６）約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍのニコチンアミドを含む洗浄用緩衝液で洗浄され、得られる精製されたアルブミン融合タンパク質が、酸化されたトリプトファン残基を本質的に含まない、方法に関する。
【００１３】
さらなる態様では、本明細書中の開示は、アルブミン融合タンパク質を精製する方法であって、（ａ）アルブミン融合タンパク質を含む組成物を親和性マトリックスに適用するステップと；（ｂ）アルブミン融合タンパク質を（ａ）の親和性マトリックスから溶出させて第１の溶出液を得るステップと；（ｃ）第１の溶出液をアニオン交換マトリックスに適用するステップと；（ｄ）アルブミン融合タンパク質をアニオン交換マトリックスから溶出させて第２の溶出液を得るステップと；（ｅ）第２の溶出液をアニオン交換膜に適用するステップと；アルブミン融合タンパク質を、アニオン交換膜を通過させてフロースルーを得るステップと；（ｆ）フロースルーを疎水性相互作用マトリックスに適用するステップと；アルブミン融合タンパク質を疎水性相互作用マトリックスから溶出させて第３の溶出液を得るステップとを含み、第３の溶出液が精製されたアルブミン融合タンパク質を含む、方法に関する。
【００１４】
本明細書中の開示はまた、本明細書で開示される方法のいずれかによって得られるアルブミン融合タンパク質組成物に関する。
【００１５】
本明細書中の開示は、アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、２０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質を有し、トリプトファン残基の１５％未満が酸化される、組成物にさらに関する。
【００１６】
本明細書中の開示は、アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、５×１０-3ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡを有し、トリプトファン残基の１５％未満が酸化される、組成物にさらに関する。
【００１７】
本明細書中の開示は、アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、２０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質を有し、アルブミン融合タンパク質が＞９０％の相対活性を有する、組成物にさらに関する。
【００１８】
本明細書中の開示はまた、アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、５×１０−３ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡを有し、アルブミン融合タンパク質が＞９０％の相対活性を有する、組成物に関する。
【００１９】
本明細書中の開示は、配列番号１３４、１３５、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７または２０８のアルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、２０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質を有し、４６位、１５１位または両方のトリプトファンが酸化されない、組成物にさらに関する。
【００２０】
本明細書中の開示はまた、（ａ）本明細書で開示される任意の組成物、（ｂ）緩衝液、（ｃ）糖、および（ｄ）乳化剤を含む薬学的に許容できる製剤に関する。
【００２１】
本発明を例示することを目的に、本発明の特定の実施形態が図示される。しかし、本発明は、図示される実施形態の正確な配置および手段に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ｒＨＳＡ精製プロセスの一実施形態のフローチャートを示す。
【図２】３００ｃｍ／時で操作されるｒＨＳＡに対するＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィーの代表的なクロマトグラムを示す。
【図３】アルブミン融合体精製プロセスの一実施形態のフローチャートを示す。
【図４】３００ｃｍ／時で操作されるアルブミン融合タンパク質＃１（ＡＦＰ−１）に対するＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィーの代表的なクロマトグラムを示す。
【図５】３００ｃｍ／時で操作されるＡＦＰ−１に対する代表的なＣａｐｔｏ  Ｑクロマトグラムを示す。
【図６】１０ＭＶ／時で操作される代表的なＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜クロマトグラムを示す。
【図７】１３０ｃｍ／時、結合および溶出モードで操作される代表的なＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ−６００Ｍクロマトグラムを示す。
【図８】（Ａ）２５ｍＭのオクタン酸および（Ｂ）２ＭのＮａＣｌ溶出緩衝液を用いるアルブミン融合タンパク質のＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィーを示す。
【図９】Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜クロマトグラフィーにおけるｐＨおよびＮａＣｌ濃度の関数としてのステップ収率（図７Ａ）およびＤＮＡのログ減少値（ＬＲＶ）（図７Ｂ）を示す。
【図１０】酸化の関数としてのアルブミン融合タンパク質の相対効力を示す。□はＡＦＰ−１のメチオニンＭ４９８を表し；白丸はＡＦＰ−１のトリプトファンＷ４６／Ｗ１５１を表し；◇はＡＦＰ−１のメチオニン残基Ｍ７４／Ｍ１７９を表し；かつΔはＡＦＰ−１のメチオニンＭ５２９を表す。
【図１１】ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる測定としてのＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（「Ｂｌｕｅ」）およびＣａｐｔｏ  Ｑ（「Ｑ」）プロセスからのプロセス中間体における時間（日）にわたるトリプトファン酸化の概要を示す。
【図１２】
【図１３】Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ−６００Ｍ、およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍを含む、ＡＦＰ−１に対する代表的なＨＩＣクロマトグラムを示す。
【図１４】Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（黒丸）またはＰＰＧ−６００Ｍ（白丸）クロマトグラフィーの実行中に取得されたＨＩＣ画分中のＨＩＣ−ＨＰＬＣ初期種含量の関数としての精製されたアルブミン融合タンパク質の相対効力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明を詳述する前に、本発明は、具体的な組成物またはプロセスステップに限定されず、したがって変更可能であることが理解されるべきである。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」が本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるとき、文脈が特に明示しない限り、複数の参照対象を含むことに留意する必要がある。用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）ならびに用語「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書で交換可能に用いられ得る。
【００２４】
さらに、「および／または」は、本明細書で用いられる場合、２つの具体的な特徴または要素の各々の、他方の有無を無関係とする特定の開示として解釈されるべきである。したがって、用語「および／または」は、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句中で用いられるとき、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句中で用いられるとき、以下の実施形態、すなわち、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包含することが意図される。
【００２５】
特に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明に関連する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本発明で用いられる多数の用語の一般的辞書を当業者に提供する。
【００２６】
単位、接頭辞、および記号は、それらのＳｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）に承認された形式で表される。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。別段の指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右へ記述される。本明細書に提供される表題は、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、全体として本明細書を参照することにより含まれ得る。したがって、直後に定義される用語は、全体的に本明細書を参照することにより、より十分に定義される。
【００２７】
実施形態が用語「含む」で本明細書中に記載される場合はいずれも、「からなる」および／または「本質的に〜からなる」の観点で記述されるそれ以外の同様の実施形態も提供されることは理解される。
【００２８】
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されるそれらの周知の３文字記号または１文字記号のいずれかによって本明細書中で参照される。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に認められた１文字コードによって参照される。
【００２９】
用語「エピトープ」は、本明細書で用いられるとき、本発明のスキャフォールドに結合する能力があるタンパク質決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面集団からなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の荷電特性を有する。立体構造および非立体構造エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われる点で区別される。
【００３０】
用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）ドメイン」、「ＦｎＩＩＩドメイン」および「ＦｎＩＩＩスキャフォールド」は、２個のβシート間に分散する少なくとも７つのβストランドを有するヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに対して相同なポリペプチドを指し、βシート自体、互いに包装されてタンパク質のコアを形成し、さらにβストランドを互いに接続し、溶媒曝露であるループを含む。βシートサンドイッチの各端に少なくとも３つのかかるループが存在し、かかる端は、βストランドの方向に垂直なタンパク質の境界である。特定の実施形態では、ＦｎＩＩＩドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧと名付けられた６つのループ領域に接続されるＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと名付けられた７つのβストランドを含み、ループ領域は各βストランドを接続する。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「Ｔｎ３スキャフォールド」は、少なくとも１つのＦｎＩＩＩスキャフォールドを含む分子を指し、βストランドＡは配列番号１１を含み、βストランドＢは配列番号１２を含み、βストランドＣは配列番号１３もしくは１４を含み、βストランドＤは配列番号１５を含み、βストランドＥは配列番号１６を含み、βストランドＦは配列番号１７を含み、かつβストランドＧは配列番号１８を含み、少なくとも１つのループは、「親Ｔｎ３スキャフォールド」におけるループの非天然変異体である。特定の実施形態では、Ｔｎ３モジュールのβストランドの１つ以上は、βストランドＣ内のシステイン残基（例えば、配列番号１３もしくは１４内のシステイン）およびβストランドＦ（配列番号１７）が置換されない点を除いて、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００３２】
用語「親Ｔｎ３」は、本明細書で用いられるとき、配列番号３を含むＦｎＩＩＩスキャフォールド、すなわちヒトテネイシンＣの３番目のＦｎＩＩＩドメイン由来の熱安定化されたシステインが改変されたＦｎＩＩＩスキャフォールドを指す。
【００３３】
用語「多量体」または「多量体スキャフォールド」は、関連の少なくとも２つのＦｎＩＩＩスキャフォールドを含む分子を指す。多量体スキャフォールドを形成するスキャフォールドは、各スキャフォールドが独立的に機能することを可能にするリンカーを介して接続され得る。
【００３４】
用語「単量体」、「単量体サブユニット」または「単量体スキャフォールド」は、唯一のＦｎＩＩＩスキャフォールドを含む分子を指す。
【００３５】
用語「ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニット」は、本明細書で用いられるとき、「親Ｔｎ３」由来のＴｎ３単量体を指し、Ｔｎ３単量体は、ＣＤ４０Ｌまたはその断片、例えばＣＤ４０Ｌの可溶性形態に特異的に結合する。
【００３６】
用語「ＤＮＡ」は、２つ以上の共有結合された、天然に存在するまたは修飾されたデオキシリボヌクレオチドの配列を指す。
【００３７】
用語「融合タンパク質」は、（ｉ）１つ以上の治療用タンパク質もしくは断片が（ｉｉ）第２の異なるタンパク質（すなわち「異種」タンパク質）に結合したものを含むタンパク質を指す。本発明の範囲内に、アルブミン（ＨＳＡ、変異体ＨＳＡ、または断片ＨＳＡ）が治療用タンパク質または断片と結合される。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
用語「異種部分」は、本発明のＴｎ３スキャフォールドへの組成物の付加を示すように本明細書で用いられ、組成物は常にＦｎＩＩＩドメインの一部とは限らない。例示的な異種部分として、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬剤、毒素、イメージング剤、放射性化合物、有機および無機ポリマー、ならびにＦｎＩＩＩドメイン自体において固有でない活性をもたらし得る任意の他の組成物、例えば限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞毒性薬、放射性核種、イメージング剤、ビオチン、二量体化ドメイン（例えば、ロイシンジッパードメイン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくはそのＦｃＲｎ結合部分、抗体のドメインもしくは断片（例えば、抗体可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、Ｃκドメイン、Ｃλドメイン、ＣＨ２、もしくはＣＨ３ドメイン）、一本鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、ＩｇＧ分子、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩスキャフォールド、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカインなどが挙げられる。
【００４０】
用語「リンカー」は、本明細書で用いられるとき、２つ以上のスキャフォールドを結合または接続する任意の分子集合体を指す。リンカーは、スキャフォールド内のモジュール間の「スペーサー」として作用する機能を有する分子であり得るか、または追加的な機能（すなわち「機能的部分」）を有する分子でもあり得る。「異種部分」の定義に含まれる分子もリンカーとして機能し得る。
【００４１】
用語「接続される」、「複合される」および「融合される」は、交換可能に用いられる。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含むあらゆる手段により、２つ以上のスキャフォールド、異種部分、またはリンカーを一緒に結合することを指す。
【００４２】
用語「ドメイン」または「タンパク質ドメイン」は、安定な三次元構造にフォールディングでき、しばしばタンパク質の残りと独立し、かつ特定の機能が与えられ得るタンパク質の領域を指す。この構造は、元のタンパク質内部でドメインの機能に関連した特定の機能、例えば、酵素活性、別の分子に対する認識モチーフの作出、またはタンパク質の特定の環境内に存在するようなタンパク質にとって必要な構成成分を提供することを維持する。タンパク質ファミリー内部と関連のタンパク質スーパーファミリー内部の両方で、タンパク質ドメインは進化的に保存された領域であり得る。多量体スキャフォールドの成分について説明するとき、用語「ドメイン」、「単量体スキャフォールド」、「単量体サブユニット」、および「モジュール」は交換可能に用いることができる。「天然ＦｎＩＩＩドメイン」は、生体によってコードされる任意の非組換えＦｎＩＩＩドメインを意味する。
【００４３】
「タンパク質配列」または「アミノ酸配列」は、アミノ末端からカルボキシル末端方向へのポリペプチド中のアミノ酸成分の線状表現を意味し、その表現における互いに隣接する残基はポリペプチドの一次構造において近接している。
【００４４】
用語「核酸」は、任意の２つ以上の共有結合されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体もしくは誘導体を指す。この用語は、本明細書で用いられるとき、限定はされないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡを含む。「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書で交換可能に用いられる。
【００４５】
用語「ポリヌクレオチド」は、唯一の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。用語「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然環境から取り除かれている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。例えば、ベクター内に含まれる、例えば本発明のスキャフォールドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたと考えられる。さらに、単離されたポリヌクレオチドの例として、異種宿主細胞内で維持された組換えポリヌクレオチド、または溶液で（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む。本発明に従う単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されたような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントであり得るかまたはそれを含み得る。
【００４６】
用語「薬学的に許容できる」は、有意な有害な医学的帰結を伴わない、動物（例えば哺乳動物）に投与可能な化合物またはタンパク質を指す。
【００４７】
用語「生理学的に許容できる担体」は、治療された宿主に対する有意な有害な影響を有しない、またそれとともに投与される化合物の治療的特性を保持する担体を指す。１つの例示的な生理学的に許容できる担体は生理食塩水である。他の生理学的に許容できる担体とその製剤は、当業者に公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００４８】
「ポリペプチド」は、長さ、翻訳後修飾、または機能にかかわらず、アミド結合（ペプチド結合）により直線状に連結された２つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で交換可能に用いられる。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはオリゴペプチドは、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれと交換可能に用いることができる。用語「ポリペプチド」はまた、限定はされないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すように意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来し得るか、または組換え技術により生成され得るが、指定の核酸配列から必ずしも翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、任意の方法で、例えば化学合成により作製され得る。
【００４９】
本発明のポリペプチドとして含まれるものとして、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。変異体は、天然に存在し得る、または天然に存在しない可能性がある。天然に存在しない変異体は、当該技術分野で公知の突然変異誘発技術を用いて生成され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。また、「誘導体」として含まれるものとして、２０の標準アミノ酸の１つ以上の天然アミノ酸誘導体を含むようなペプチドが挙げられる。
【００５０】
「無作為化された」または「突然変異された」は、鋳型配列に対する欠失、置換または付加を含む１つ以上のアミノ酸改変を含むことを意味する。「無作為化する」または「突然変異する」は、ある配列にかかるアミノ酸改変を導入する過程を意味する。無作為化または突然変異は、一般に核酸コード配列の、意図的、盲目的、または自発的な配列変異を通じて達成され得、任意の技術、例えば、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、または化学的ＤＮＡ合成により生じ得る。用語「無作為化する」、「無作為化された」、「突然変異する」、「突然変異された」などは、本明細書で交換可能に用いられる。
【００５１】
「同族の」または「同族の非突然変異タンパク質」は、変異体タンパク質に導入されるアミノ酸突然変異（ここで、変異体タンパク質は無作為化または突然変異される）を除き、配列が変異体タンパク質と同一のタンパク質を意味する。
【００５２】
「ＲＮＡ」は、２つ以上の共有結合された天然に存在するかまたは修飾されたリボヌクレオチドの配列を意味する。この用語の範囲内に含まれる修飾されたＲＮＡの一例がホスホロチオエートＲＮＡである。
【００５３】
用語１つまたは複数の「本発明のスキャフォールド」は、本明細書で用いられるとき、多量体Ｔｎ３スキャフォールドおよび単量体Ｔｎ３スキャフォールドを指す。用語「標的」は、本発明の特定のスキャフォールドによって認識される化合物を指す。用語「標的」および「抗原」は、本明細書で交換可能に用いられる。用語「特異性」は、本明細書中、例えば用語「特異的に結合する」または「特異的結合」で用いられるとき、本発明のＴｎ３スキャフォールドが１つ以上の抗原に１つ以上の抗原結合ドメインを介して結合する場合の相対的親和性を指し、かつ結合に１つ以上の抗原結合ドメインと１つ以上の抗原との間でのいくらかの相補性を伴うことを指す。この定義によると、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、ランダムな無関係のエピトープに結合する場合よりも容易にあるエピトープに結合するとき、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。
【００５４】
「親和性成熟」スキャフォールドは、一般にはループ内に１つ以上の改変（それらの改変を有しない親Ｔｎ３スキャフォールドと比べてＴｎ３スキャフォールドのエピトープに対する親和性における改善をもたらす）を有するスキャフォールドである。
【００５５】
用語「親和性」は、本明細書で用いられるとき、本発明の特定のＴｎ３スキャフォールドの個別のエピトープへの結合の強さの尺度を指す。
【００５６】
用語「結合活性」は、本明細書で用いられるとき、本発明のＴｎ３スキャフォールドの集団と特定のエピトープとの複合体の全体的安定性、すなわち複数のＴｎ３スキャフォールドと抗原との結合の機能的に組み合わされた力を指す。結合活性は、個別の抗原結合ドメインと特異的エピトープとの親和性とさらに本発明のスキャフォールドの結合価の両方に関する。
【００５７】
用語「標的に対する作用」は、本発明のＴｎ３スキャフォールドの１つ以上の標的への結合と、かかる結合に起因する生物学的効果を指す。これに関連して、Ｔｎ３スキャフォールド内の複数の抗原結合単位は、種々の標的および／またはエピトープと相互作用し、例えば、２つの標的を物理的に接近させ、明確な標的との相互作用を通じて代謝カスケードを誘発することなどができる。ＣＤ４０Ｌを参照すると、「標的に対する作用」は、例えばＣＤ４０Ｌの１つ以上の生物学的活性の増強、刺激または活性化により達成される効果を指す。
【００５８】
用語「結合価」は、本明細書で用いられるとき、有望な抗原結合モジュールの数、例えば本発明のスキャフォールド内のＦｎＩＩＩモジュールの数を指す。本発明のＴｎ３スキャフォールドが２つ以上の抗原結合モジュールを含むとき、各結合モジュールは、同じ標的または異なる標的における、例えば同じエピトープまたは異なるエピトープに特異的に結合し得る。
【００５９】
用語「ジスルフィド結合」は、本明細書で用いられるとき、２つの硫黄原子間で形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成し得るチオール基を含む。
【００６０】
用語「免疫グロブリン」および「抗体」は、生化学的に区別され得るポリペプチドの様々な広範なクラスを含む。当業者は、重鎖がγ、μ、α、δ、またはεとして分類されることを理解するであろう。それは、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとしての抗体の「クラス」を決定するこの鎖の性質である。これらのクラスの各々の修飾バージョンは、当業者にとって容易に識別可能である。本明細書で用いられるとき、用語「抗体」は、限定はされないが、インタクト抗体、修飾抗体、抗体ＶＬもしくはＶＬドメイン、ＣＨｌドメイン、Ｃκドメイン、Ｃλドメイン、Ｆｃドメイン（下記参照）、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインを含む。
【００６１】
本明細書で用いられるとき、用語「Ｆｃドメイン」のドメインは、抗体定常領域の一部を指す。従来から、Ｆｃドメインという用語は、抗体の対合されるＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域を包含するプロテアーゼ（例えばパパイン）切断生成物を指す。本開示との関連で、ＦｃドメインまたはＦｃという用語は、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域の全部もしくは一部を含む、産生手段にかかわらない任意のポリペプチド（またはかかるポリペプチドをコードする核酸）を指す。
【００６２】
本明細書で用いられるとき、用語「修飾抗体」は、天然に存在しないように改変された抗体の合成形態、例えば、２つの完全重鎖でない少なくとも２つの重鎖部分を含む抗体（例えば、ドメインが欠失した抗体またはミニボディのようなもの）；２つ以上の抗原または単一抗原の異なるエピトープに結合するように改変された抗体の多特異性形態（例えば、二重特異性、三重特異性など））を含む。さらに、用語「修飾抗体」は、抗体の多価形態（例えば同じ抗原の３つ以上のコピーに対する三価、四価などの抗体）を含む（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ＆Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，２０１０，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒを参照）。
【００６３】
用語「インビボ半減期」は、その正式な意味、すなわち、ポリペプチドの生物学的活性の５０％が依然として身体／標的臓器に存在する時間、またはポリペプチドの活性がその初期値の５０％である時間として用いられる。機能的なインビボ半減期を測定するための選択肢として、「血清半減期」、すなわちポリペプチド分子の５０％が排除される前に血漿中または血流中を循環する時間を測定してもよい。血清半減期の測定は機能的インビボ半減期の測定よりも単純であることが多く、血清半減期の規模は、通常、機能的インビボ半減期の規模の良好な指標である。血清半減期に対する代替用語は、「血漿半減期」、循環半減期、循環性半減期、血清クリアランス、血漿クリアランス、およびクリアランス半減期を含む。保持されるべき機能性は、通常、凝血原、タンパク質分解性、共同因子結合、受容体結合活性、または特定のタンパク質に関連した他のタイプの生物学的活性から選択される。
【００６４】
機能的インビボ半減期または血漿半減期に関連した用語「増加した」は、ポリペプチドに関連した半減期が参照分子（例えば未修飾ポリペプチド）の半減期と比べて、同等の条件下での測定として統計学的に有意に増加することを示すように用いられる。
【００６５】
機能的インビボ半減期または血漿半減期に関連した用語「減少した」は、ポリペプチドに関連した半減期が参照分子（例えば未修飾ポリペプチド）の半減期と比べて、同等の条件下での測定として統計学的に有意に減少することを示すように用いられる。
【００６６】
用語「発現」は、本明細書で用いられるとき、遺伝子が生化学物質、例えば本発明のスキャフォールドまたはその断片を生成する過程を指す。その過程は、限定はされないが遺伝子ノックダウンならびに一過性発現と安定的発現の両方を含む、細胞内部での遺伝子の機能的存在の任意の発現を含む。それは、限定はされないが遺伝子の１つ以上のｍＲＮＡへの転写、およびかかるｍＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳を含む。最終の所望される生成物が生化学物質である場合、発現はその生化学物質および任意の前駆物質の作出を含む。
【００６７】
「発現生成物」は、核酸、例えば遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、またはポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の発現生成物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化を伴う核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加（他のタンパク質サブユニット、タンパク質分解切断などと関連）を伴うポリペプチドをさらに含む。
【００６８】
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞に導入され、宿主細胞内で所望される発現生成物を発現するための媒体として、本発明に従って用いられるベクターを意味するように本明細書で用いられる。当業者に公知であるように、かかるベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。一般に、本発明と適合できるベクターは、選択マーカー、適切な制限部位を含み、所望される核酸のクローニング、および真核生物または原核生物細胞中に侵入する、および／または複製する能力を促進することになる。
【００６９】
用語「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの発現生成物をコードするベクターを保有する細胞を指す。組換え宿主からの発現生成物の単離のための過程の説明では、用語「細胞」および「細胞培養物」は、特に明確に特定されない限り、発現生成物の供給源を意味するように交換可能に用いられる、すなわち、「細胞」からの発現生成物の回収は、遠心沈殿された全細胞からの回収、または培地と懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からの回収のいずれかを意味する。
【００７０】
用語「治療する」または「治療」は、本明細書で用いられるとき、治療的処置と予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置の両方を指し、ここで、目的は、被験者における望まれない生理学的変化または障害、例えば炎症性疾患または状態の進行を予防または緩徐化（軽減）することである。有利であるまたは所望される臨床結果として、限定はされないが、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化した（すなわち悪化していない）状態、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の回復または緩和、および寛解（部分または全体）、検出可能または検出不能のいずれかが挙げられる。
【００７１】
用語「治療」はまた、治療を受けていない場合での想定される生存と比べた生存の延長を意味する。治療を必要とする者は、その状態もしくは障害を既に有する者、ならびにその状態もしくは障害を有する傾向がある者またはその状態もしくは障害が予防されるべきである者を含む。
【００７２】
用語「被験者」、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が所望される場合の任意の個体、患者または動物、特に哺乳類被験者を指す。哺乳類被験者は、ヒト、飼育動物、家畜、および動物園の動物、スポーツ用動物、またはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシなどを含む。
【００７３】
用語「ＣＤ４０Ｌ」は、本明細書で用いられるとき、限定はされないが、Ｔ細胞の表面上で発現されるＣＤ４０Ｌ、組換え的に発現されるＣＤ４０Ｌ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の好適な組換えタンパク質発現系から発現され、精製されるＣＤ４０Ｌ、脱グリコシル化されたＣＤ４０Ｌ、およびＣＤ４０Ｌの可溶性断片を指す。本明細書で用いられるとき、「ＣＤ４０Ｌ」はまた、ＭｅｇａＣＤ４０Ｌを指す。ＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（商標）は、２つの三量体ＣＤ４０リガンドがＡＣＲＰ３０／アディポネクチンのコラーゲンドメインを介して人工的に連結された高活性構築物である。この構築物は、ＣＤ４０Ｌのインビボでの生体膜に補助された凝集を極めて有効に模擬する。それは、［ＣＤ４０Ｌ＋エンハンサー］の組み合わせ（Ａｌｅｘｉｓ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に対する単純かつ等しく強力な代替物を提供する。用語「ＣＤ４０Ｌ」は、ＣＤ４０Ｌの単量体形態およびオリゴマー形態、例えば三量体ＣＤ４０Ｌを指す。
【００７４】
用語「ＣＤ４０Ｌ」は、完全長ＣＤ４０Ｌと可溶性断片、例えばタンパク質加水分解に起因するＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン形態の両方を指す。ヒトＣＤ４０Ｌ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ２９９６５）の膜結合形態および可溶性形態のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２で示される。
【００７５】
用語「ＣＤ４０Ｌ拮抗剤」または「拮抗剤」は、最も広い意味で用いられ、ＣＤ４０Ｌ、およびその生物活性変異体の１つ以上の生物学的活性をインビトロ、原位置、またはインビボで部分的または完全に阻害、低減または不活化する任意の分子を含む。例えば、ＣＤ４０Ｌ拮抗剤は、ＣＤ４０Ｌへのその結合の結果として、１つ以上のＣＤ４０Ｌ分子、またはＣＤ４０もしくは他の標的に結合された１つ以上のＣＤ４０Ｌ分子の１つ以上の生物学的活性をインビボ、インビトロまたは原位置で部分的または完全に阻害、低減または不活化するように機能し得る。
【００７６】
用語「ＣＤ４０Ｌ作動薬」または「作動薬」は、最も広い意味で用いられ、ＣＤ４０Ｌ、およびその生物活性変異体の１つ以上の生物学的活性をインビトロ、原位置、またはインビボで部分的または完全に増強、刺激または活性化する任意の分子を含む。例えば、ＣＤ４０Ｌ作動薬は、ＣＤ４０Ｌへのその結合の結果として、１つ以上のＣＤ４０Ｌ分子、またはＣＤ４０Ｒもしくは他の標的に結合された１つ以上のＣＤ４０Ｌ分子の１つ以上の生物学的活性をインビボ、インビトロまたは原位置で部分的または完全に増強、刺激または活性化するように機能し得る。
【００７７】
用語「結晶」は、本明細書で用いられるとき、原子が三次元で周期的に繰り返すパターンで配置され、典型的には格子を形成する物質の固体状態の一形態を指す。
【００７８】
用語「空間群対称性」は、本明細書で用いられるとき、結晶格子の並進対称性を点群対称性と組み合わせる結晶の全対称性を指す。「空間群」は、格子群を識別する大文字（Ｐ、Ａ、Ｆなど）に続く回転および反射要素がらせん軸および映進面を含むように拡張される点群記号により指定される。所与の空間群についての点群対称性が、空間群の格子中心記号を除去し、すべてのらせん軸を類似の回転軸により置き換え、すべての映進面を鏡面により置き換えることにより決定され得ることは留意すべきである。空間群についての点群対称性は、その逆格子の真の対称性を説明する。
【００７９】
用語「単位格子」は、本明細書で用いられるとき、規則的な繰り返しパターンで配置される結晶中の原子を意味し、それにおいて最小繰り返し単位が単位格子と称される。構造全体は、３つの長さ（ａ、ｂ、およびｃ）および３つの角度（α、β、およびγ）により特徴付けられる単位格子の情報から再構築され得る。量ａおよびｂは格子の底辺の長さであり、γはこれら２辺間の角度である。量ｃは単位格子の高さである。角度αおよびβは、単位格子の底辺と垂直辺との間の角度を表す。
【００８０】
用語「機械可読データ格納媒体」は、本明細書で用いられるとき、機械可読データが符号化されたデータ保存材料であって、機械がこのようなデータを使用するための命令によりプログラムされ、データを所望のフォーマット、例えば、分子または分子複合体のグラフ三次元表示で表示し得るデータ保存材料を意味する。
【００８１】
用語「Ｘ線回折パターン」は、結晶中の分子または原子の周期的集合体のＸ線散乱から取得されるパターンを意味する。Ｘ線結晶学は、Ｘ線が結晶により回折されるという事実を利用する技術である。Ｘ線は、同等サイズの原子の電子雲により散乱されるのに適切な波長（オングストローム範囲内、約１０-8ｃｍ）を有する。結晶中の分子または原子の周期的集合体のＸ線散乱から取得される回折パターンに基づき、電子密度が再構築され得る。追加の位相情報は、回折データからまたは再構築を完了させるために回折実験を補足することから抽出され得る（結晶学における位相問題）。モデルを実験的電子密度に進行的に組み込み、データに対して精密化することで正確な分子構造を生成する。Ｘ線構造座標は空間中の点の特有の構成を規定する。当業者は、タンパク質またはタンパク質−リガンド複合体、またはその一部についての構造座標セットが相対的な点セットを規定し、次いでそれが三次元中の構成を規定することを理解する。類似または同一の構成は、全く異なる座標セットにより規定され得るが、但し、座標間の距離および角度が本質的に同一のままであることを条件とする。さらに、点の構成は、座標間の距離をスカラー因子により増加または減少させる一方、角度を本質的に同一に保持することにより規定され得る。
【００８２】
用語「結晶構造」は、結晶質材料中で原子または分子単位を反復させた三次元または格子間隔配置を指す。結晶質材料の結晶構造は、Ｘ線結晶学的方法により決定することができ、例えば、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｘ−Ｒａｙ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”ｂｙ  Ｊａｎ  Ｄｒｅｎｔｈ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｘｔｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９，ＩＳＢＮ：０３８７９８５８７５、および“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”ｂｙ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｏｃｔ．１８，２００２，ＩＳＢＮ：０４７１２５１２２４を参照されたい。
【００８３】
用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し得、抗体アイソタイプに応じて変化する抗体または抗体断片の生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御；およびＢ細胞活性化が挙げられる。
【００８４】
用語「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合される分泌性Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原含有標的細胞に特異的に結合し、続いて標的細胞を細胞毒で殺滅することを可能にする場合の細胞傷害性の形態を指す。
【００８５】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を示す。ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲであり得る。ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合し得、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体、例えばこれらの受容体の対立遺伝子変異体あるいはスプライスされた形態を含む。同用語はまた、新生児受容体ＦｃＲｎを含む。
【００８６】
用語「コンセンサス配列」は、複数の配列の整列化後の特定の位置での最も一般的なアミノ酸を示すタンパク質配列を指す。コンセンサス配列は、関連配列が互いに比較される場合に複数の配列の整列化の結果を表す方法である。コンセンサス配列は、各位置での整列化においていずれの残基が最も豊富であるか、また各位置での可変性の程度を示す。
【００８７】
用語「本質的に含まない」は、タンパク質中のアミノ酸残基の総数に対して１０％未満の酸化されたトリプトファン残基、タンパク質中のアミノ酸残基の総数に対して８％未満の酸化されたトリプトファン残基、タンパク質中のアミノ酸残基の総数に対して５％未満の酸化されたトリプトファン残基、タンパク質中のアミノ酸残基の総数に対して４％未満の酸化されたトリプトファン残基、タンパク質中のアミノ酸残基の総数に対して３％未満の酸化されたトリプトファン残基、タンパク質中のアミノ酸残基の総数に対して２％未満の酸化されたトリプトファン残基、タンパク質中のアミノ酸残基の総数に対して１％未満の酸化されたトリプトファン残基を有する組成物を指す。一部の実施形態では、用語「本質的に含まない」は、タンパク質中のアミノ酸残基の総数に対して５％未満の酸化されたトリプトファン残基を有する組成物を指す。
【００８８】
用語「生物活性」または「活性」は、治療用タンパク質、例えばＴＮ３スキャフォールドの生物学的活性、およびインビボでその意図される方法で機能する、例えばＣＤ４０Ｌに結合するその能力を指す。一部の実施形態では、活性は、「相対活性」、すなわち精製された治療用タンパク質の酸化されていない治療用タンパク質に対する活性を指す。一部の実施形態では、精製された治療用タンパク質の相対活性は、８０％超、８５％超、９０％超、９２％超、９４％超、９５％超、９８％超または９９％超である。
【００８９】
アルブミンの治療用タンパク質への融合は、融合された治療用タンパク質のインビボもしくは血清半減期を増加または延長させることが見出されている。しかし、かかるアルブミン融合タンパク質の精製中、特定のアミノ酸残基が酸化を受けやすく、それによりアルブミン融合タンパク質の生物活性を低減または制限する場合があることが見出されている。本発明は、アルブミン融合タンパク質中の感受性アミノ酸残基の酸化を低減する方法とかかるアルブミン融合タンパク質の精製を対象とする。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質はスキャフォールドを含む。別の実施形態では、スキャフォールドはＦｎ３ドメインを含む。さらに別の実施形態では、スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌに結合する能力があるヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）スキャフォールドを含む。
【００９０】
アルブミン融合タンパク質の酸化を低減するためのプロセス
アルブミン融合タンパク質の精製プロセス中、特定のアミノ酸残基が酸化を受けやすくなる場合があり、それによりアルブミン融合タンパク質の生物活性および相対効力が阻害され得る。例えば、１つ以上のトリプトファン残基および／またはメチオニン残基が酸化を受けやすくなる場合がある。本発明によると、アルブミン融合タンパク質の感受性アミノ酸残基の酸化は、アルブミン融合タンパク質を含む溶液に適切な条件下で親和性クロマトグラフィーマトリックスおよびアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスに供することにより低減される。
【００９１】
親和性マトリックスクロマトグラフィー
親和性クロマトグラフィーステップでは、アルブミンに優先的に結合する親和性マトリックスが用いられる。例えば、好適なマトリックスは、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅ  ２、Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｂｌｕｅ  ＨＢ、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＡＦ−Ｂｌｕｅ  ＨＣ−６５０Ｍ、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｂｌｕｅ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｂｌｕｅ  １、Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｂｌｕｅ  ＳＡ、Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｂｌｕｅ  ＳＡ  ＨＬおよび他のアントラキノン型化合物、ニトロセルロースマトリックス、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔなどの抗体に基づくマトリックス、脂肪酸に基づくマトリックスを含む。一実施形態では、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィーは、アルブミン融合タンパク質を細胞培地からアルブミンに対するその親和性により精製するための理想的な選択である。多数のＣｉｂｒａｃｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィー樹脂が市販されているが、それらの多くがアルブミン融合タンパク質の大規模精製にとって理想的とは言えない。大規模精製の場合、樹脂は、宿主関連不純物との非特異的相互作用を最小化する材料からなり、良好な圧力−フロー特性を有し、また衛生化を目的としてｐＨ極値で安定である（腐食性条件下で好ましくは安定である）必要がある。これらの特性に留意して、幾つかの市販のＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィー樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＣａｐｔｏ  ＢｌｕｅおよびＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）、およびＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｂｌｕｅ  ＨＣ−６５０Ｍ）が臨床および工業規模での精製における有望な樹脂として注目されている。一部の実施形態では、２つのＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅオプションのうちのｈｉｇｈ  ｓｕｂバージョンが、そのより高いリガンド密度と、したがってより高い結合能力とのために好ましい。
【００９２】
典型的な精製プロセスでは、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素カラムは、中性ｐＨまたは弱酸性ｐＨ付近での緩衝液（例えば、リン酸塩、トリス、ビストリスなど）で平衡化され、次にアルブミン融合タンパク質を含有する清澄化細胞培養液またはプロセス中間体（Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素カラムが初期精製ステップでない場合）が負荷される。
【００９３】
様々な量のタンパク質がカラム上に負荷され得る。一部の実施形態では、約５ｇのタンパク質／Ｌの樹脂〜約１００ｇのタンパク質／Ｌの樹脂、約１０ｇのタンパク質／Ｌ〜約５０ｇのタンパク質／Ｌの樹脂、または約２５ｇのタンパク質／Ｌの樹脂は、親和性カラム上に負荷され得る。
【００９４】
試料を負荷後、（非特異的相互作用を通じて）カラムに結合されるかまたは（タンパク質−タンパク質相互作用を通じて）アルブミン融合タンパク質に結合される宿主細胞不純物をさらに除去するため、結合されたアルブミン融合タンパク質を含有する親和性クロマトグラフィーカラムは任意選択的に再平衡化され、次にはより強い緩衝液でさらに洗浄され得る。これらの不純物を除去するため、洗浄用緩衝液は最適化され得る。一実施形態では、洗浄用緩衝液は、ポリオール；塩；硫酸ナトリウム；非イオン性界面活性剤；尿素；および／またはニコチンアミドを含有する。
【００９５】
一実施形態では、洗浄用緩衝液は、約２％〜約２０％のポリオールを含む。ポリオールは、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、および２−メチル−２，４−ペンタンジオールからなる群から選択され得る。
【００９６】
様々な濃度の塩が洗浄用緩衝液中に存在し得る。一部の実施形態では、塩は、適量で、例えば、約０．０５Ｍ〜約２．０Ｍの塩、約０．１Ｍ〜約１．８Ｍの塩、約０．２Ｍ〜約１．５Ｍの塩、約０．３Ｍ〜約１．０Ｍの塩、約０．４Ｍ〜約０．８Ｍの塩、または約０．５Ｍの塩で存在する。塩は、当該技術分野で一般的に用いられるもの、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、および臭化リチウムから選択され得る。
【００９７】
様々な濃度の硫酸ナトリウムが使用可能である。硫酸ナトリウムは、約０．０１Ｍ〜約０．５Ｍ、０．０２Ｍ〜約０．３Ｍ、約０．０４Ｍ〜約０．２Ｍ、または約０．０５Ｍ〜約０．１Ｍの量で存在してもよい。
【００９８】
様々な非イオン性界面活性剤が使用可能である。例えば、一部の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、トリトンＸ−１００、ツイーン８０、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ノノキシノール９、ポリオキサマー、ステアリルアルコール、またはソルビタンモノステアレートからなる群から選択され得る。様々な濃度の非イオン性界面活性剤が使用可能である。例えば、一部の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、洗浄用緩衝液中に約０．０１％〜約１％、約０．０２％、約０．４％、約０．０５％〜約０．２％、または約０．０８％〜約０．０１％の濃度で存在する。
【００９９】
様々なカオトロピック剤は当該技術分野で公知である。本発明では、尿素は洗浄用緩衝液中で用いられるべきカオトロピック剤である。尿素は、洗浄用緩衝液の約０．０２Ｍ〜約１．５Ｍ、約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍ、または約０．０８Ｍ〜約１．０Ｍの量で存在し得る。
【０１００】
一部の実施形態では、ニコチンアミドが洗浄用緩衝液中で用いられる。ニコチンアミドは、洗浄用緩衝液の約０．０１Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．０４Ｍ〜約０．３Ｍ、約０．０６Ｍ〜約０．２Ｍ、または約０．１Ｍの量で存在し得る。
【０１０１】
洗浄用緩衝液は、様々なｐＨレベルを有し得る。一部の実施形態では、洗浄用緩衝液のｐＨは、約５．０超、約５．５超、または約６．０超である。一部の実施形態では、洗浄用緩衝液のｐＨは、約８．０未満、約７．５未満、約７．０未満、または約６．５未満である。一部の実施形態では、洗浄用緩衝液のｐＨは、約５．０〜約８．０、約５．５〜約７．５、約５．５〜約７．０、約６．０〜約７．０または約６．５〜約７．０である。
【０１０２】
本発明の別の実施形態では、洗浄用緩衝液は、約５％〜約１５％のポリオール、約０．２Ｍ〜約０．８Ｍの塩、約０．２Ｍ〜約０．８Ｍの硫酸ナトリウム、約０．０２％〜約０．２％の非イオン性界面活性剤、および／または約０．２Ｍ〜約１．０Ｍの尿素を含む。本発明の一態様では、洗浄用緩衝液は、ポリオール、１，２−プロパンジオール、塩、塩化ナトリウム、および非イオン性界面活性剤、トリトンＸ−１００を含む。本発明の別の態様では、洗浄用緩衝液は、約０．５Ｍの塩化ナトリウム；約０．５Ｍの硫酸ナトリウム；または約１０％の１，３−プロパンジオールを含む。本発明の一態様によると、洗浄用緩衝液は約５．５〜約７．０のｐＨを有する。
【０１０３】
一部の実施形態では、洗浄用緩衝液は、ＤＮＡ濃度を約５×１０2ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡ、約２×１０2ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡ、または約５０ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡまで低減するのに適する。一部の実施形態では、洗浄用緩衝液は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を５０，０００ｎｇ／ｍｇ未満、２０，０００ｎｇ／ｍｇ未満、または１０，０００ｎｇ／ｍｇ未満まで低減するのに適する。
【０１０４】
一部の実施形態では、精製生成物は、親和性マトリックスカラムから、生成物の結合を破壊するため、高ｐＨ緩衝液をカラムに適用するか、または高濃度の塩、穏やかな有機溶媒、または組み合わせを添加することにより溶出される。一実施形態では、溶出緩衝液は、基剤、例えばビストリス、トリス、またはリン酸基剤を含む。本発明の別の態様では、溶出緩衝液の基剤は５０ｍＭのビストリスである。別の実施形態では、溶出緩衝液は、溶出塩、例えばオクタン酸塩、ＮａＣｌ、またはカプリル酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、もしくはノナン酸のナトリウム塩および／もしくはカリウム塩を含む。一部の実施形態では、溶出緩衝液はカプリル酸ナトリウムを含む。塩は、溶出緩衝液中に約５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭもしくは約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの量で存在してもよい。別の実施形態では、溶出緩衝液は、ＥＤＴＡ、または他のキレート剤を含む。一実施形態では、親和性マトリックス溶出緩衝液は、ＥＤＴＡを適量、例えば約２ｍＭ〜約２０ｍＭのＥＤＴＡで含む。さらなる実施形態では、親和性マトリックス溶出緩衝液はオクタン酸を含む。
【０１０５】
本発明によると、親和性クロマトグラフィーは、酸化生成物を低レベルで有する。一実施形態では、親和性クロマトグラフィー後にアルブミン融合タンパク質を含有する中間代謝物は、総タンパク質に対して、約１００％未満、約９０％未満、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、または約４％未満の酸化生成物を有する。別の実施形態では、親和性クロマトグラフィー後にアルブミン融合タンパク質を含有する中間代謝物は、トリプトファン残基の総数に対して、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、または約４％未満の酸化されたトリプトファン残基を有する。別の実施形態では、親和性マトリックスステップは、少なくとも１桁、２桁、３桁、１〜２桁、もしくは２〜３桁の宿主細胞タンパク質を元の試料から除去する。本発明の一実施形態では、親和性マトリックスステップは、少なくとも１桁、２桁、３桁、４桁、１〜２桁、２〜３桁、３〜４桁のＤＮＡ不純物を元の試料から除去する。
【０１０６】
ウイルス不活化
本発明の一実施形態では、アルブミン融合タンパク質を含有する画分または試料は、存在し得るウイルスを不活化するように処理してもよい。このように、その画分／試料は、ウイルス不活化剤、例えば、トリトンＸ−１００、ツイーン８０、ツイーン２０、リン酸トリ−ｎ−ブチル、または尿素で処理してもよい。一実施形態では、ウイルス不活化ステップは、親和性クロマトグラフィーとアニオン交換クロマトグラフィーとのステップの間に実施される。このように、ウイルス不活化剤、例えばトリトンＸ−１００は、約１秒〜約１０時間、約３０秒〜約５時間、約３０分〜約３時間、または約２時間の期間中、約０．０５％〜約３％、約０．０１％〜約１％、または約０．１％〜約０．５％の量で添加してもよい。一実施形態では、ウイルス不活化剤は、約３０分〜約２４０分、例えば１３０分にわたり保持される０．５％トリトンＸ−１００（ｗ／ｗ）である。
【０１０７】
アニオン交換クロマトグラフィー
本発明の別の態様では、アルブミン融合タンパク質を含有する画分または試料にアニオン交換クロマトグラフィーが施される。アニオン交換は、結合および溶出システムまたはフロースルーシステムまたは両方を介して実施してもよい。任意の好適なアニオン交換マトリックスを用いてもよい。一実施形態では、アニオン交換マトリックスは、樹脂、例えばアガロースもしくはセファローズなど、または合成微孔膜もしくはマクロ細孔膜であってもよい。好適なアニオン交換結合および溶出マトリックスとして、例えば、Ｑ−ｒｅｓｉｎ、第４級アミン、ＤＥＡＥが挙げられる。市販のマトリックスとして、例えば、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ、ＡＮＸ、ＤＥＡＥ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、Ｑ−Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＱＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＴＭＡＥ、ＤＭＡＥ、またはＤＥＡＥ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ、またはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ  ＰＡが挙げられる。かかるマトリックスは、高度に架橋されたアガロースを含み得るか、または例えば、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、メタクリレート、もしくはポリプロピレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌａｔｅ）基材を有する重合体であり得る。カラム負荷（ｌｏａｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）は、約０．１〜約５０ｇ／Ｌ、約０．５〜約４０ｇ／Ｌ、約１〜約３０ｇ／Ｌ、または約５〜約２５ｇ／Ｌの範囲内である。膜負荷は、約０．１〜約１０ｇ／ｍＬ、約０．２〜約５．０ｇ／ｍＬ、約０．５〜約２．５ｇ／ｍＬ、または約１．０〜約２．０ｇ／ｍＬの範囲内である。
【０１０８】
別の実施形態では、マトリックスは、アルブミン融合タンパク質の精製を増強するように修飾される。例えば、一実施形態では、マトリックスは、デキストラン表面増量剤を有する高度に架橋されたアガロースである。別の実施形態では、ポリエーテルスルホン基剤マトリックスは第４級アミンで修飾される。別の実施形態では、ポリプロピレン基剤マトリックスは第４級アミンで修飾される。
【０１０９】
結合および溶出システムを用いるとき、アニオン交換クロマトグラフィーステップは、中性もしくは弱酸性ｐＨでのリン酸、トリス、およびビストリスなどの緩衝液を用いる平衡化ステップを含んでもよい。試料が負荷され、マトリックスは任意選択的に再平衡化される。ローディング緩衝液は、当該技術分野で公知のように、また標的アルブミン融合タンパク質の分離を最適化するため、ｐＨと用いられている樹脂とに基づいて最適化される。好適なローディング緩衝液は、基剤、例えばトリスまたはビストリスを約５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、または約５０ｍＭの範囲内で、ならびに塩、例えばＮａＣｌまたはオクタン酸を約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約２０ｍＭの量で含む。一実施形態では、アニオン交換に適したローディング緩衝液は、ｐＨ７．０で５０ｍＭのビストリス、２０ｍＭのＮａＣｌを含む。
【０１１０】
結合および溶出システムでは、アニオン交換マトリックスの平衡化後、アルブミン融合タンパク質を含有する試料が負荷され、所望されるタンパク質がアニオン交換マトリックスに結合される。アルブミン融合タンパク質以外の溶液中に存在する材料を除去するため、結合されたアルブミン融合タンパク質を含有する親和性クロマトグラフィーカラムは洗浄用緩衝液で洗浄される。一部の実施形態では、洗浄用緩衝液はローディング緩衝液と同じである。一部の実施形態では、洗浄用緩衝液は、ｐＨ７．０で５０ｍＭのビストリス、２０ｍＭのＮａＣｌを含む。
【０１１１】
結合されたアルブミン融合タンパク質は、アニオン交換マトリックスからステップ溶出または勾配溶出のいずれかによって溶出される。一実施形態では、アニオン交換マトリックス溶出緩衝液には、塩、例えばＮａＣｌ、ＣａＣｌ2、またはＫＣｌが用いられる。緩衝液の塩濃度は、約１０ｍＭ超、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１４０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１３０Ｍ、約４０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの範囲である。溶出におけるｐＨ範囲は、約９未満、約６〜約８、約６〜約７．５、約６〜約７、または約６．５〜約７のｐＨで変化する。一部の実施形態では、結合されたアルブミン融合タンパク質は、約１０ｍＭ〜約６００ｍＭの塩、例えばＮａＣｌ、または約２０ｍＭ〜約４００ｍＭの塩、例えばＮａＣｌの直線勾配を用いてマトリックスから溶出される。
【０１１２】
本発明によると、アニオン交換結合および溶出システムは、凝集生成物を低減することによって単量体含量の増加をもたらし、アルブミン融合タンパク質の酸化に関与しかつ酸化生成物を低レベルで有する不純物を除去する。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質を含有するこのステップからの中間代謝物は、総タンパク質に対して、約１００％未満、約９０％未満、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満または約２％未満の酸化生成物を有する。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質を含有するこのステップからの中間代謝物は、トリプトファン残基の総数に対して、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満または約２％未満の酸化されたトリプトファン残基を有する。別の実施形態では、アニオン交換結合および溶出ステップは、５桁超、１０桁、１５桁、２０桁、もしくは３０桁または少なくとも５〜３０桁、１０〜３０桁、１０〜４０桁、１５〜３０桁、１５〜４０桁、２０〜３０桁、もしくは２０〜４０桁の宿主細胞タンパク質を元の試料から除去する。本発明の一実施形態では、アニオン交換結合および溶出ステップは、少なくとも３桁、４桁、５桁、もしくは６桁または１〜２桁、２〜３桁、３〜４桁のＤＮＡ不純物を元の試料から除去する。
【０１１３】
一部の実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックスは、膜を用いるフロースルーモードである。一部の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックスとアニオン交換膜の両方に施される。膜は、負荷前に予め調整され、平衡化されてもよい。さらに、標的アルブミン融合タンパク質がアニオン交換マトリックスに結合しないように、ローディング緩衝液のｐＨを調節してもよい。このように、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ウイルス、および小分子不純物を含む任意の汚染材料は、標的アルブミン融合タンパク質から分離してもよい。
【０１１４】
本発明によると、一実施形態では、膜は、約９未満、約６〜約８、約６．５〜約７．５、約６〜約７．５、もしくは約７〜約７．５の範囲のｐＨ、または約６、７、８もしくは９のｐＨで機能する。別の実施形態では、緩衝液の塩濃度は、１０ｍＭ超または約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１８０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約６０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約６０ｍＭ〜約８０ｍＭの範囲となる。一部の実施形態では、緩衝液の塩濃度は、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、または約７０ｍＭである。他の実施形態では、フロースルー緩衝液は、１０ｍＭ〜１５０ｍＭの塩濃度および６〜８のｐＨを有する。別の実施形態では、フロースルー緩衝液は、１０ｍＭ超の塩濃度および８未満のｐＨを有する。特に、収率とＤＮＡクリアランスの両方が、低いｐＨ、例えば約７〜約７．５と、より高い塩濃度、例えば６０ｍＭ超の塩でのアルブミン融合タンパク質において最適であることが認められた。
【０１１５】
本発明によると、アニオン交換フロースルーシステムは、低レベルの酸化生成物を伴う単量体含量の増加と、ＨＣＰおよびＤＮＡを含む不純物の除去をもたらす。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質を含有するこのステップからの生成物は、総タンパク質に対して、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満または約２％未満の酸化生成物を有する。別の実施形態では、アルブミン融合タンパク質を含有するこのステップからの生成物は、トリプトファン残基の総数に対して、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満または約２％未満の酸化されたトリプトファン残基を有する。別の実施形態では、フロースルーアニオン交換ステップは、１桁超または２桁超の宿主細胞タンパク質を元の試料から除去する。本発明の一実施形態では、フロースルーアニオン交換ステップは、少なくとも３桁、４桁、５桁、もしくは６桁、８桁、９桁、もしくは１０桁、または３〜６桁、４〜６桁、もしくは５〜６桁、８〜１０桁もしくは９〜１０桁のＤＮＡ不純物を元の試料から除去する。
【０１１６】
本発明によると、アニオン交換の結合および溶出モードは、アニオン交換のフロースルーモードと組み合わせて実施してもよい。さらなる任意選択的な精製ステップは、アニオン交換ステップの前、間、または後に実施してもよい。例えば、エンベロープウイルスを不活化するため、アルブミン融合タンパク質を含む試料をトリトンＸ−１００で処理してもよい。あるいは、試料はダイアフィルトレーションまたは限界濾過を受けてもよい。塩は好適な濃度で添加してもよい。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質を含有する溶出液は、ｐＨ７．０での５０ｍＭのビストリス、２０ｍＭのＮａＣｌに対してダイアフィルトレーションされる。
【０１１７】
追加的な精製ステップ
追加的な精製ステップは、アルブミン融合タンパク質を含む溶出液／画分に疎水性相互作用またはマルチモーダルマトリックスに供することを含んでもよい。疎水性相互作用マトリックスは任意の好適なマトリックスであってもよい。場合により、疎水性相互作用マトリックスは、フェニル、オクチルまたはブチル疎水基を含む。疎水性相互作用マトリックスは、市販されており、当業者に公知であり、例えば、Ｃａｐｔｏ  Ｂｕｔｙｌ、Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ、Ｃａｐｔｏ  Ｂｕｔｙｌ、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｓｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｈｅｘｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｅｔｈｅｒ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ−６００Ｍ、およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ−６００Ｍ、ＴＳＫｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌ、ＴＳＫｇｅｌ  Ｅｔｈｅｒ（ＴＯＳＯＨ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。マルチモーダルマトリックスは任意の好適なマトリックスであってもよい。場合により、マルチモーダルマトリックスは、カチオンまたはアニオン交換基とともに、フェニル、オクチルまたはブチル疎水基を含む。マルチモーダルマトリックスは、市販されており、当業者に公知であり、例えば、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＨＣＸ、Ｎｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅ、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍが挙げられる。アルブミン融合タンパク質が、任意選択的に、塩、例えば、カチオンとして、アンモニウム塩、リチウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、もしくはグアニジウム塩、および／またはアニオンとして、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、もしくは塩素酸塩を含有する緩衝液で平衡化されることは見出されている。例えば、一部の実施形態では、塩は、適量の塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、または硫酸アンモニウムであり、例えば、約１００ｍＭ〜約２Ｍ、約２００ｍＭ〜約１．５Ｍ、約３００ｍＭ〜約１Ｍ、約４００ｍＭ〜約８００ｍＭの塩、例えばクエン酸塩である。平衡化後、アルブミン融合タンパク質を含有する試料／画分はカラム上に負荷される。一実施形態では、カラムは再平衡化され、次に低下した塩濃度を有する緩衝液に対する段階または勾配を用いて溶出される。
【０１１８】
別の実施形態では、画分は、アルブミン融合タンパク質を含む溶出液／画分をナノ濾過に供することにより、さらに精製してもよい。一部の実施形態では、潜在的なウイルス粒子を除去するため、ナノ濾過を用いることができ、当業者にとって標準的な方法で実施することができる。
【０１１９】
他の実施形態では、アルブミン融合タンパク質をさらに精製するため、画分にサイズ排除クロマトグラフィーを施してもよい。
【０１２０】
本発明の別の実施形態では、酸化されたトリプトファン残基を本質的に含まないアルブミン融合タンパク質を含む組成物を得る方法が提供される。本実施形態によると、本方法は、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とを含む組成物を疎水性相互作用マトリックスに供するステップを含み、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とが異なる時間に疎水性相互作用マトリックスから溶出され、それにより、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質をトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質から分離する。
【０１２１】
本発明の別の実施形態は、トリプトファン残基および／またはメチオニン残基の酸化を本質的に含まないアルブミン融合タンパク質を単離する方法を対象とする。本実施形態によると、アルブミン融合タンパク質を含む組成物に以下の精製プロセス：（ａ）親和性マトリックスクロマトグラフィープロセス；（ｂ）アニオン交換クロマトグラフィープロセス；および（ｃ）疎水性相互作用マトリックスクロマトグラフィープロセスが施される。カプリル酸／オクタン酸を含む親和性マトリックスクロマトグラフィープロセス用の溶出緩衝液と、一部の実施形態ではさらにＥＤＴＡとが親和性マトリックスに適用される。さらに、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とが異なる時間に疎水性相互作用マトリックスから溶出され、それにより、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質をトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質から分離する。
【０１２２】
本発明の別の態様は、アルブミン融合タンパク質を精製する方法であって、アルブミン融合タンパク質を含む組成物を、疎水性相互作用マトリックスおよび以下の精製プロセス：（ａ）カプリル酸／オクタン酸を含む溶出緩衝液と一部の実施形態ではさらにＥＤＴＡとが適用される親和性マトリックス；および／または（ｂ）アニオン交換マトリックスの１つ以上に供するステップを含む、方法である。本実施形態によると、親和性マトリックスは、（１）約２％〜約２０％の、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、および２−メチル−２，４−ペンタンジオールからなる群から選択されるポリオール；（２）０．０５Ｍ〜２．０の、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、および臭化リチウムから選択される塩；（３）約０．０２Ｍ〜約１Ｍの硫酸ナトリウム；（４）約０．０１％〜約１％の非イオン性界面活性剤；（５）約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの尿素；および／または（６）約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍのニコチンアミドを含む洗浄用緩衝液で洗浄され得る。得られる精製されたアルブミン融合タンパク質は、酸化されたトリプトファン残基を本質的に含まない。
【０１２３】
アルブミン融合タンパク質を精製する方法は、アルブミン融合タンパク質を含む組成物を親和性マトリックスに適用するステップと；アルブミン融合タンパク質を親和性マトリックスから溶出させて第１の溶出液を得るステップと；第１の溶出液をアニオン交換マトリックスに適用するステップと；アルブミン融合タンパク質をアニオン交換マトリックスから溶出させて第２の溶出液を得るステップと；第２の溶出液をアニオン交換膜に適用するステップと；アルブミン融合タンパク質を、アニオン交換膜を通過させてフロースルーを得るステップと；フロースルーを疎水性相互作用マトリックスに適用するステップと；アルブミン融合タンパク質を疎水性相互作用マトリックスから溶出させて第３の溶出液を得るステップとを含み、第３の溶出液が精製されたアルブミン融合タンパク質を含む。本実施形態によると、得られる精製されたアルブミン融合タンパク質は、５％以下の酸化されたトリプトファン残基を有する。
【０１２４】
精製されたアルブミン融合タンパク質の組成物
精製されたアルブミン融合タンパク質を含む組成物は、本発明の範囲内に含まれる。これらの組成物は、低レベルの宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、およびウイルス活性という特質がある。加えて、精製されたアルブミン融合タンパク質を含むこれらの組成物は、低レベルの酸化および保持された生物活性を有する。
【０１２５】
本発明に従って精製されたアルブミン融合タンパク質を含む組成物または画分は、約１０００ｎｇ／ｍｇ未満、２００ｎｇ／ｍｇ、１００ｎｇ／ｍｇ、５０ｎｇ／ｍｇ、４０ｎｇ／ｍｇ、３０ｎｇ／ｍｇ、２０ｎｇ／ｍｇもしくは１０ｎｇ／ｍｇの宿主細胞タンパク質を有する。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質含有組成物は、２０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質を有する。一部の実施形態では、アルブミン融合タンパク質組成物は、ヒト被験者への投与のため、政府組織、例えばアメリカ食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に対して許容できるレベルの宿主細胞タンパク質を有する。
【０１２６】
さらに、本発明に従って精製されたアルブミン融合タンパク質を含む組成物または画分は、約５×１０-2未満、１×１０-2、５×１０-3、１×１０-3、５×１０-4、もしくは１×１０-4ｎｇ／ｍｇを有する。一実施形態では、本発明に従って精製されたアルブミン融合タンパク質は、５×１０-3ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡを有する。一部の実施形態では、アルブミン融合タンパク質組成物は、ヒト被験者への投与のため、政府組織、例えばアメリカ食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に対して許容できるレベルのＤＮＡを有する。
【０１２７】
アルブミン融合タンパク質に対するトリプトファン／メチオニン残基の酸化がタンパク質の生物活性および相対効力に影響し得ることが見出されている。本発明の方法に従って精製され、得られたアルブミン融合タンパク質は、低レベルの酸化を有する。本発明の一実施形態では、アルブミン融合タンパク質の相対効力は、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％もしくは少なくとも９５％である。別の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、タンパク質中のトリプトファン残基の総量に対して、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、もしくは５％未満の酸化されたトリプトファン残基を有する。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、タンパク質の総量に対して約２０％未満の酸化されたトリプトファン残基を有する。別の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、タンパク質中のトリプトファン残基の総数に対して、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満もしくは５％未満の酸化されたトリプトファン残基を有する。本発明の一実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、タンパク質中のトリプトファン残基の総数に対して約５％未満の酸化されたトリプトファン残基を有する。
【０１２８】
本発明の範囲内の組成物はアルブミン融合タンパク質を含み、組成物は５×１０-3ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡを有し、１５％未満のトリプトファン残基が酸化される。一実施形態では、組成物は５×１０-3ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡを有し、５％未満のトリプトファン残基が酸化されたアルブミン融合タンパク質を有する。
【０１２９】
本発明の別の組成物はアルブミン融合タンパク質を含み、組成物は２０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質を有し、アルブミン融合タンパク質は＞９０％の相対活性を有する。
【０１３０】
本発明の一実施形態はアルブミン融合タンパク質を含む組成物であり、組成物は５×１０-3ｎｇ／ｍｇ未満のＤＮＡを有し、アルブミン融合タンパク質は＞９０％の相対活性を有する。
【０１３１】
アルブミン融合タンパク質
アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその断片もしくは変異体は、血流中のタンパク質の半減期および／またはその組織透過性を増加または延長させるため、治療用タンパク質に融合または複合させてもよい。一部の実施形態では、ＨＳＡ変異体との複合によって改善される特性は血漿半減期である。アルブミン融合タンパク質の血漿半減期における改善は、血漿半減期の増加または減少などのその特性における改変、または他の薬物動態パラメータにおける変化であり得る。
【０１３２】
治療用タンパク質のインビボまたは血清半減期を延長または増加させるアルブミンまたはＨＳＡの断片もしくは変異体は、本発明の範囲内に含まれる。少なくともアミノ酸の置換、欠失、または配列切断を含むＨＳＡ変異体、すなわち完全長ＨＳＡ（配列番号１３９）由来の分子は、先行的に開示されている。例えば、以下の公開、すなわち、国際公開第２０１１／１０３０７６号パンフレット、国際公開第２０１１／０５１４８９号パンフレット、および国際公開第２０１２／１１２１８８号パンフレットは、用いてもよいＨＳＡ変異体について記載している。一実施形態では、アルブミンはＨＳＡである。別の実施形態では、アルブミンは変異体ＨＳＡである。
【０１３３】
一部の実施形態では、ＨＳＡ変異体は完全長ＨＳＡ（配列番号１３８）由来の突然変異体である。具体的な実施形態では、ＨＳＡ変異体は、３４位のシステインとセリンとの置換を含む（配列番号１３３）。例えば、Ｔｎ３スキャフォールドの血漿半減期を修飾するのに使用可能なＨＳＡ変異体は、例えば国際公開第２０１１／１０３０７６号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０５１４８９号パンフレット（これらの両方はそれら全体が参照により援用される）に記載されている。一部の実施形態では、本発明の治療用タンパク質の血漿半減期は、それをＨＳＡのドメインＩＩＩ内に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＨＳＡ変異体と融合することにより増加される。別の実施形態は、変異体ＨＳＡのアミノ酸配列が配列番号１３３である場合を含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、４０７、４１５、４６３、５００、５０６、５０８、５０９、５１１、５１２、５１５、５１６、５２１、５２３、５２４、５２６、５３５、５５０、５５７、５７３、５７４、および５８０からなる群から選択される位置での、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して付番された、少なくとも１つのアミノ酸置換を除き、完全長成熟ＨＳＡの配列（配列番号１３８）を含むＨＳＡ変異体またはその断片を含み；ここで、少なくとも１つのアミノ酸置換は５７３位でのリジン（Ｋ）からグルタミン酸（Ｅ）を含まず、また治療用タンパク質は、ＨＳＡ変異体に複合されない同じ治療用タンパク質の血漿半減期より長い血漿半減期を有する。
【０１３５】
一部の他の実施形態では、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して付番された少なくとも１つのアミノ酸置換は、４６３、５０８、５２３、および５２４からなる群から選択される位置であり、ここで、治療用タンパク質は、ＨＳＡ変異体に複合されない治療用タンパク質の血漿半減期より長い血漿半減期を有する。
【０１３６】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、
（ａ）４０７位のロイシン（Ｌ）とアスパラギン（Ｎ）またはチロシン（Ｙ）との置換；
（ｂ）４１５位のバリン（Ｖ）とトレオニン（Ｔ）との置換；
（ｃ）４６３位のロイシン（Ｌ）とアスパラギン（Ｎ）との置換；
（ｄ）５００位のリジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）との置換；
（ｅ）５０６位のトレオニン（Ｔ）とチロシン（Ｙ）との置換；
（ｆ）５０８位のトレオニン（Ｔ）とアルギニン（Ｒ）との置換；
（ｇ）５０９位のフェニルアラニン（Ｆ）とメチオニン（Ｍ）またはトリプトファン（Ｗ）との置換；
（ｈ）５１１位のアラニン（Ａ）とフェニルアラニン（Ｆ）との置換；
（ｉ）５１２位のアスパラギン酸（Ｄ）とチロシン（Ｙ）との置換；
（ｊ）５１５位のトレオニン（Ｔ）とグルタミン（Ｑ）との置換；
（ｋ）５１６位のロイシン（Ｌ）とトレオニン（Ｔ）またはトリプトファン（Ｗ）との置換；
（ｌ）５２１位のアルギニン（Ｒ）とトリプトファン（Ｗ）との置換；
（ｍ）５２３位のイソロイシン（Ｉ）とアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）との置換；
（ｎ）５２４位のリジン（Ｋ）とロイシン（Ｌ）との置換；
（ｏ）５２６位のグルタミン（Ｑ）とメチオニン（Ｍ）との置換；
（ｐ）５３５位のヒスチジン（Ｈ）とプロリン（Ｐ）との置換；
（ｑ）５５０位のアスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）との置換；
（ｒ）５５７位のリジン（Ｋ）とグリシン（Ｇ）との置換；
（ｓ）５７３位のリジン（Ｋ）とフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）、またはチロシン（Ｙ）との置換；
（ｔ）５７４位のリジン（Ｋ）とアスパラギン（Ｎ）との置換；
（ｕ）５８０位のグルタミン（Ｑ）とリジン（Ｋ）との置換；および
（ｖ）前記置換の２つ以上の組み合わせ
からなる群から選択される、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して付番された、少なくとも１つのアミノ酸置換を除き、完全長成熟ＨＳＡの配列（配列番号１３３または１３８）を含むＨＳＡ変異体またはその断片を含み、ここで、治療用タンパク質は、前記ＨＳＡ変異体に複合されない同じ治療用タンパク質の血漿半減期より長い血漿半減期を有する。
【０１３７】
一部の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、
（ａ）４６３位のロイシン（Ｌ）とアスパラギン（Ｎ）との置換；
（ｂ）５０８位のトレオニン（Ｔ）とアルギニン（Ｒ）との置換；
（ｃ）５２３位のイソロイシン（Ｉ）とアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）との置換；
（ｄ）５２４位のリジン（Ｋ）とロイシン（Ｌ）との置換；および
（ｅ）前記置換の２つ以上の組み合わせ
からなる群から選択される、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対して付番された、少なくとも１つのアミノ酸置換を除き、完全長成熟ＨＳＡの配列（配列番号１３３または１３８）を含むＨＳＡ変異体またはその断片を含み、ここで、前記治療用タンパク質は、前記ＨＳＡ変異体に複合されない同じ治療用タンパク質の血漿半減期より長い血漿半減期を有する。
【０１３８】
アルブミン融合タンパク質は、標準技術により、例えば公的に利用可能な遺伝子配列を用いて構築された組換え融合遺伝子からの融合タンパク質の発現により作製してもよい。
【０１３９】
治療用タンパク質は、その半減期を増加または延長するためにアルブミンに融合または複合され得る任意のタンパク質であってもよい。一実施形態では、治療用タンパク質は、トリプトファン残基を含むスキャフォールド部分を含み、ここで、トリプトファンの酸化はアルブミン融合タンパク質の生物学的活性を低下させる。別の実施形態では、タンパク質はＣＤ４０Ｌに結合する能力がある。別の実施形態では、治療用タンパク質は、ＣＤ４０Ｌに結合する能力があるスキャフォールド部分である。別の実施形態は、スキャフォールド部分が３番目のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）ドメインを含むことを可能にする。ＦｎＩＩＩドメインを含むスキャフォールドは、例えば、国際公開第９８／５６９１５号パンフレット、国際公開第２００９／０２３１８４号パンフレット、国際公開第２００９／０５３７９号パンフレット、国際公開第２０１０／０５１２７４号パンフレット、国際公開第２０１０／０９３６２７号パンフレット）に先行的に記載されている。一部の実施形態では、ＦｎＩＩＩドメインは、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３スキャフォールド）に由来してもよい。かかるＴｎ３スキャフォールドは、例えば、国際公開第２００９／０５３７９号パンフレット、国際公開第２０１０／０５１２７４号パンフレット、および国際公開第２０１３／０５５７４５号パンフレットに記載されている。
【０１４０】
スキャフォールドに融合されるアルブミン
本発明の一実施形態では、アルブミン融合タンパク質はスキャフォールドを含む。例えば、スキャフォールドは、少なくとも１つの天然に存在しない分子内ジスルフィド結合が改変されている、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）の３番目のＦｎＩＩＩドメインに由来するＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含んでもよい。本発明のＴｎ３スキャフォールドを形成する単量体サブユニットは、互いに独立して正確にフォールディングし、それらの結合特異性および親和性を保持し、単量体スキャフォールドの各々はその機能的特性を保持する。単量体サブユニットが高い結合価の多量体Ｔｎ３スキャフォールドにおいて構築される場合、単量体サブユニットは、互いに独立して正確にフォールディングし、それらの結合特異性および親和性を保持し、単量体の各々はその機能的特性を保持する。
【０１４１】
２つ以上の単量体サブユニットを含む本発明のスキャフォールドは、複数のエピトープに結合する、例えば、（ｉ）単一の標的中の複数のエピトープに結合する、（ｉｉ）複数の標的中の単一のエピトープに結合する、（ｉｉｉ）１つの標的の異なるサブユニット上に位置する複数のエピトープに結合する、または（ｉｖ）複数の標的上の複数のエピトープに結合することができ、そのため、結合活性が増強される。
【０１４２】
さらに、リンカーを介した複数の単量体間の距離が変動する可能性に起因し、多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、表面上（同じ細胞／表面上または異なる細胞／表面内のいずれか）の複数の標的分子に結合する能力を有する。同時に２つ以上の標的に結合するその能力の結果として、本発明のＴｎ３多量体スキャフォールドは、複数の経路を調節し、細胞表面上の受容体に架橋し、別々の細胞上の細胞表面受容体に結合し、かつ／または標的分子もしくは細胞を基材に結合させるために用いることができる。
【０１４３】
さらに、本発明は、親和性成熟スキャフォールドを提供し、ここで、スキャフォールドの特異的標的に対する親和性は突然変異を介して調節される。さらに、本発明は、本発明のスキャフォールドを作製するための方法とともに、望ましい物理化学的、薬理学的、または免疫学的特性を有するスキャフォールドに改変するための方法を提供する。さらに、本発明は、かかるスキャフォールドにおける使用、ならびに治療的、予防的、および診断的使用のための方法を提供する。
【０１４４】
一実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、Ｔｎ３スキャフォールド、例えば２０１２年１０月１０日に出願されたＰＣＴ出願公開の国際公開第２０１３／０５５７４５号パンフレットに記載されかつ参照により本明細書に援用されるものを有する。アルブミン−Ｔｎ３スキャフォールド融合タンパク質を精製するとき、トリプトファンおよびメチオニン残基が酸化を受けやすいことが見出されている。例えば、Ｔｎ３スキャフォールドが、配列番号１３４、１３５、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７もしくは２０８のアルブミン融合タンパク質から選択される場合、精製プロセス中、酸化がＴｎ３の結合ループ上のトリプトファンアミノ酸残基Ｗ４６／１５１、ならびにＴｎ３およびヒト血清アルブミン上のメチオニンアミノ酸残基Ｍ７４／１７９、Ｍ４９８、Ｍ５２９で生じ得ることが見出されている。影響研究によると、アルブミン−Ｔｎ３スキャフォールドタンパク質のＷ４６／１５１、Ｍ７４／１７９、Ｍ４９８、およびＭ５２９での酸化が生物活性に影響し得ることが示された。特に、Ｔｎ３の結合ループ上のＷ４６／１５１での酸化がＭＥＤＩ４９２０の生物活性および相対効力に負の影響を与えることが見出された。しかし、Ｍ７４／１７９、Ｍ４９８、およびＭ５２９での酸化が有する融合タンパク質の生物活性への影響はより少なかった。それにもかかわらず、本発明の目標は、アルブミン融合タンパク質の感受性アミノ酸の酸化を制御することを意図して、精製プロセスを通じてアルブミン融合タンパク質の酸化種を低減することである。
【０１４５】
ＦｎＩＩＩ構造モチーフ
本発明の好適なスキャフォールドは、生物およびウイルスの３つすべてのドメインを通じて、また多数のタンパク質クラス内に広範に見出されるドメインであるＩＩＩ型フィブロネクチンモジュール（ＦｎＩＩＩ）の構造に基づくものを含む。特定の実施形態では、本発明のスキャフォールドは、ヒトテネイシンＣの３番目のＦｎＩＩＩドメインに由来する（国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレットとして公開された国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００８／０１２３９８号明細書；国際公開第２０１１／１３０３２４号パンフレットとして公開されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０３２１８４号明細書；および国際公開第２０１１１３０３２８号パンフレットとして公開された国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０３２１８８号明細書を参照）。
【０１４６】
具体的な一実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、親Ｔｎ３スキャフォールド由来のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含む。単量体の三次元フォールド全体は、ラクダおよびラクダ類（例えばラマ）の単一ドメイン抗体中に全抗原認識単位を含む、最小機能抗体断片である重鎖の可変領域（ＶＨ）のそれに密接に関連する。
【０１４７】
本発明のＴｎ３単量体サブユニットとテネイシンＣ由来の天然ＦｎＩＩＩドメインは、同じ三次元構造、すなわち、一方に３つのβストランド（Ａ、Ｂ、およびＥ）ともう一方に４つのβストランド（Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧ）を有するβサンドイッチ構造が６つのループ領域によって連結される構造によって特徴付けられる。これらのループ領域は、各ループのＮ末端およびＣ末端に連結されたβストランドに応じて名付けられる。したがって、ＡＢループはβストランドＡおよびＢ間に位置し、ＢＣループはストランドＢおよびＣ間に位置し、ＣＤループはβストランドＣおよびＤ間に位置し、ＤＥループはβストランドＤおよびＥ間に位置し、ＥＦループはβストランドＥおよびＦ間に位置し、かつＦＧループはβストランドＦおよびＧ間に位置する。ＦｎＩＩＩドメインは、無作為化に耐性がある溶媒に曝露されたループを有し、特異的標的に高い親和性で結合する能力があるタンパク質スキャフォールドの多様なプールの作製が容易になる。
【０１４８】
本発明の一態様では、Ｔｎ３単量体サブユニットに、抗体可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似するループの１つ以上を無作為化するように設計された定向進化が施される。かかる定向進化手法は、目的の標的、例えばＣＤ４０Ｌに対して高い親和性を有する抗体様分子の産生をもたらす。
【０１４９】
さらに、一部の実施形態では、かかる導入されたループに結合する分子の進化を導くため、本明細書に記載のＴｎ３スキャフォールドは、規定の曝露されたループ（例えば、標的結合に基づいて予め無作為化および選択がなされたループ）を提示するように用いることができる。任意の個別のＣＤＲ様ループに対する認識分子を同定するため、あるいは、非線形エピトープ結合部分に複合された２つもしくは３つすべてのＣＤＲ様ループを認識するため、このタイプの選択を実施することができる。特異的な標的結合をもたらし得る（ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧと名付けられた）３つのループのセットは、それぞれストランドＢおよびＣ間；ストランドＤおよびＥ間、かつβストランドＦおよびＧ間で作動する。ヒトテネイシンＣの３番目のＦｎＩＩＩドメインのＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、アミノ酸残基長がそれぞれ９、６、および１０である。これらのループの長さは、抗体重鎖内に見出される同族抗原認識ループの狭い範囲内、すなわちそれぞれ７〜１０、４〜８、および４〜２８アミノ酸長に該当する。同様に、ループの第２のセットであるＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループ（それぞれ７、７、および８アミノ酸長）は、それぞれβストランドＡおよびＢ間；βストランドＣおよびＤ間；かつβストランドＥおよびＦ間で作動する。
【０１５０】
Ｔｎ３単量体スキャフォールド内のループは、標的に対する高親和性結合に向けて無作為化および選択がなされると、抗体中の同族ＣＤＲループの接触と同等に標的と接触する場合がある。したがって、一部の実施形態では、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは、１つ以上の標的、例えばＣＤ４０Ｌへの高親和性結合に向けて無作為化および選択がなされる。一部の実施形態では、この無作為化および選択プロセスはＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの無作為化と並行して実施してもよいが、他の実施形態では、この無作為化および選択プロセスは順番に実施される。
【０１５１】
ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニット
本発明は、複数のループ領域に連結された複数のβストランドドメインを含む、ＣＤ４０Ｌに特異的な天然に存在しない組換えＴｎ３スキャフォールドを提供し、ここで、前記ループ領域の１つ以上は、野生型Ｔｎ３（配列番号３）内の同族ループからの少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換または付加によって変化する（表１を参照）。
【０１５２】
新規な結合特性を有する改善されたＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体サブユニットを作製するため、親Ｔｎ３にアミノ酸付加、欠失または置換が施される。ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体サブユニットの配列を親Ｔｎ３の配列と比較するとき、βストランドおよびループの同じ定義が用いられることは理解されるであろう。一部の実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体サブユニットは、アミノ酸配列：
【化１】
2018513124.tif 000004
を含み、ここで、
（ａ）ＸAB、ＸBC、ＸCD、ＸDE、ＸEF、およびＸFGがそれぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループの配列内に存在するアミノ酸残基を表し；
（ｂ）Ｘ1がアミノ酸残基のアラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；かつ
（ｃ）ループの長さｎが２〜２６の整数である。
【０１５３】
【表２】
2018513124.tif 000005
【０１５４】
【表３】
2018513124.tif 000006
【０１５５】
一部の実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体サブユニットは、アミノ酸配列：
【化２】
2018513124.tif 000007
からなり、ここで、
（ａ）ＸAB、ＸBC、ＸCD、ＸDE、ＸEF、およびＸFGがそれぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループの配列内に存在するアミノ酸残基を表し；
（ｂ）Ｘ1がアミノ酸残基アラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；かつ
（ｃ）ループの長さｎが２〜２６の整数である。
【０１５６】
一実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体スキャフォールドのβストランドは、親Ｔｎ３スキャフォールドのβストランド（配列番号３）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。配列同一性のかかる百分率を計算するため、アミノ酸配列は当該技術分野で公知の方法を適用して整列される。配列同一性の百分率は、（ａ）配列整列化において同一であるβストランド内に位置するアミノ酸の数と（ｂ）βストランド内に位置するアミノ酸の総数との比として定義される。
【０１５７】
一実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号４または配列番号１３６を含む。別の実施形態では、ＣＤループの配列は配列番号６を含む。別の実施形態では、ＥＦループの配列は配列番号８または配列番号１３７を含む。一実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号４または配列番号１３６からなる。別の実施形態では、ＣＤループの配列は配列番号６からなる。別の実施形態では、ＥＦループの配列は配列番号８または配列番号１３７からなる。
【０１５８】
一実施形態では、ＢＣループの配列は、配列番号８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２および９３からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、ＢＣループの配列は、配列番号８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２および９３からなる群から選択される配列からなる。
【０１５９】
一実施形態では、ＤＥループの配列は、配列番号９４、９５、９６、９７および９８からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、ＤＥループの配列は、配列番号９４、９５、９６、９７および９８からなる群から選択される配列からなる。
【０１６０】
一実施形態では、ＦＧループの配列は、配列番号９、９９、および１３９からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、ＦＧループの配列は、配列番号９、９９、および１３９からなる群から選択される配列からなる。
【０１６１】
一実施形態では、ＢＣループの配列は、配列番号１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６および１１７からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、ＢＣループの配列は、配列番号１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６および１１７からなる群から選択される配列からなる。
【０１６２】
一部の実施形態では、ＤＥループの配列は、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７および１２８からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態では、ＤＥループの配列は、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７および１２８からなる群から選択される配列からなる。
【０１６３】
一部の実施形態では、ＦＧループの配列は、配列番号１２９および１３０からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態では、ＦＧループの配列は、配列番号１２９および１３０からなる群から選択される配列からなる。
【０１６４】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８３を含み、ＤＥループの配列は配列番号９４を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８３からなり、ＤＥループの配列は配列番号９４からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１６５】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８３を含み、ＤＥループの配列は配列番号９４を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８３からなり、ＤＥループの配列は配列番号９４からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９９からなる。
【０１６６】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８４を含み、ＤＥループの配列は配列番号９５を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８４からなり、ＤＥループの配列は配列番号９５からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１６７】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８５を含み、ＤＥループの配列は配列番号９４を含み、ＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８５からなり、ＤＥループの配列は配列番号９４からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１６８】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８６を含み、ＤＥループの配列は配列番号９６を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８６からなり、ＤＥループの配列は配列番号９６からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１６９】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８７を含み、ＤＥループの配列は配列番号９７を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８７からなり、ＤＥループの配列は配列番号９７からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１７０】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８８を含み、ＤＥループの配列は配列番号９５を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８８からなり、ＤＥループの配列は配列番号９５からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１７１】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８９を含み、ＤＥループの配列は配列番号９４を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号８９からなり、ＤＥループの配列は配列番号９４からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１７２】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号９０を含み、ＤＥループの配列は配列番号９４を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号９０からなり、ＤＥループの配列は配列番号９４からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１７３】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号９１を含み、ＤＥループの配列は配列番号９５を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号９１からなり、ＤＥループの配列は配列番号９５からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１７４】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号９２を含み、ＤＥループの配列は配列番号９８を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号９２からなり、ＤＥループの配列は配列番号９８からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１７５】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号９３を含み、ＤＥループの配列は配列番号９４を含み、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号９３からなり、ＤＥループの配列は配列番号９４からなり、かつＦＧループの配列は配列番号９または１３９からなる。
【０１７６】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号１６８を含み、ＤＥループの配列は配列番号１６９を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１７０を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号１６８からなり、ＤＥループの配列は配列番号１６９からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１７０からなる。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号１００を含み、ＤＥループの配列は配列番号１１８を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号１００からなり、ＤＥループの配列は配列番号１１８からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１７８】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１０１を含み、ＤＥループの配列は配列番号１１９を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１０１からなり、ＤＥループの配列は配列番号１１９からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１７９】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１０２を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２０を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１０２からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２０からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１８０】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１０３を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２１を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１０３からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２１からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１８１】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１０４を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２２を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１０４からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２２からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１８２】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１０５を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２１を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１０５からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２１からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１８３】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１０６を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２３を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１０６からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２３からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１８４】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１０７を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２３を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１０７からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２３からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１８５】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１０８を含み、ＤＥループの配列は配列番号１１８を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１０８からなり、ＤＥループの配列は配列番号１１８からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１８６】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１０９を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２３を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１０９からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２３からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１８７】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１１０を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２１を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１１０からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２１からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１８８】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１１１を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２３を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１３０を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１１１からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２３からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１３０からなる。
【０１８９】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１０８を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２１を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１０８からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２１からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１９０】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１１２を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２４を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１１２からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２４からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１９１】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１１３を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２５を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１１３からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２５からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１９２】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１１４を含み、ＤＥループの配列は配列番号１１８を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１１４からなり、ＤＥループの配列は配列番号１１８からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１９３】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１１５を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２６を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１１５からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２６からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１９４】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１１６を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２７を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１１６からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２７からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１９５】
一部の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６を含み、ＢＣループの配列は配列番号１１７を含み、ＤＥループの配列は配列番号１２８を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１２９を含む。他の実施形態では、ＡＢループの配列は配列番号１３６からなり、ＢＣループの配列は配列番号１１７からなり、ＤＥループの配列は配列番号１２８からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１２９からなる。
【０１９６】
一部の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号１７４を含み、ＤＥループの配列は配列番号１７５を含み、かつＦＧループの配列は配列番号１７７を含む。他の実施形態では、ＢＣループの配列は配列番号１７４からなり、ＤＥループの配列は配列番号１７５からなり、かつＦＧループの配列は配列番号１７７からなる。
【０１９７】
一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および１４６からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および１４６からなる群から選択される配列からなる。
【０１９８】
一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、配列番号２８または１４６を含む。他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、配列番号２８または１４６からなる。
【０１９９】
一部の実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体サブユニットは、アミノ酸配列：
【化３】
2018513124.tif 000008
を含み、ここで、
（ａ）Ｘ1がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）を表し；
（ｂ）Ｘ2がアミノ酸残基のアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｃ）Ｘ3がアミノ酸残基のヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し；
（ｄ）Ｘ4がアミノ酸残基のアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｅ）Ｘ5がアミノ酸残基のグルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し；
（ｆ）Ｘ6がアミノ酸残基のフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｇ）Ｘ7がアミノ酸残基のイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｈ）Ｘ8がアミノ酸残基のグリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）またはバリン（Ｖ）を表し；
（ｉ）Ｘ9がアミノ酸残基のトリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｊ）Ｘ10がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｋ）Ｘ11がアミノ酸残基のトリプトファン（Ｗ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；かつ
（ｌ）Ｘ12がアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）を表す。
【０２００】
一部の実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体サブユニットは、アミノ酸配列：
【化４】
2018513124.tif 000009
からなり、ここで、
（ａ）Ｘ1がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）を表し；
（ｂ）Ｘ2がアミノ酸残基のアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｃ）Ｘ3がアミノ酸残基のヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し；
（ｄ）Ｘ4がアミノ酸残基のアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｅ）Ｘ5がアミノ酸残基のグルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し；
（ｆ）Ｘ6がアミノ酸残基のフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｇ）Ｘ7がアミノ酸残基のイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｈ）Ｘ8がアミノ酸残基のグリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）またはバリン（Ｖ）を表し；
（ｉ）Ｘ9がアミノ酸残基のトリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｊ）Ｘ10がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｋ）Ｘ11がアミノ酸残基のトリプトファン（Ｗ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；かつ
（ｌ）Ｘ12がアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）を表す。
【０２０１】
一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、配列番号４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、および８２からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、配列番号４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、および８２からなる群から選択される配列からなる。
【０２０２】
一部の実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体サブユニットは、アミノ酸配列：
【化５】
2018513124.tif 000010
を含み、ここで、
（ａ）Ｘ1がアミノ酸残基のリジン（Ｋ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｂ）Ｘ2がアミノ酸残基のトレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し；
（ｃ）Ｘ3がアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｄ）Ｘ4がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｅ）Ｘ5がアミノ酸残基のチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはセリン（Ｓ）を表し；
（ｆ）Ｘ6がアミノ酸残基のチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｇ）Ｘ7がアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｈ）Ｘ8がアミノ酸残基のロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｉ）Ｘ9がアミノ酸残基のヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｊ）Ｘ10がアミノ酸残基のグリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｋ）Ｘ11がアミノ酸残基のアラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｌ）Ｘ12がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｒ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｍ）Ｘ13がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｎ）Ｘ14がアミノ酸残基のプロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）もしくはアラニン（Ａ）、またはアミノ酸なしを表し；
（ｏ）Ｘ15がアミノ酸残基のイソロイシン（Ｉ）またはアミノ酸なしを表し；
（ｐ）Ｘ16がアミノ酸残基のグルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）を表し；かつ
（ｑ）Ｘ17がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を表す。
【０２０３】
一部の実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体サブユニットは、アミノ酸配列：
【化６】
2018513124.tif 000011
からなり、ここで、
（ａ）Ｘ1がアミノ酸残基のリジン（Ｋ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｂ）Ｘ2がアミノ酸残基のトレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し；
（ｃ）Ｘ3がアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｄ）Ｘ4がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｅ）Ｘ5がアミノ酸残基のチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはセリン（Ｓ）を表し；
（ｆ）Ｘ6がアミノ酸残基のチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｇ）Ｘ7がアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｈ）Ｘ8がアミノ酸残基のロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｉ）Ｘ9がアミノ酸残基のヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｊ）Ｘ10がアミノ酸残基のグリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｋ）Ｘ11がアミノ酸残基のアラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｌ）Ｘ12がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｒ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｍ）Ｘ13がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｎ）Ｘ14がアミノ酸残基のプロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）もしくはアラニン（Ａ）、またはアミノ酸なしを表し；
（ｏ）Ｘ15がアミノ酸残基のイソロイシン（Ｉ）またはアミノ酸なしを表し；
（ｐ）Ｘ16がアミノ酸残基のグルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）を表し；かつ
（ｑ）Ｘ17がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を表す。
【０２０４】
一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体スキャフォールドはＴｎ３モジュールを含み、ここで、βストランドの１つ以上は、βストランドＣおよびβストランドＦ（それぞれ配列番号１３または１４；および配列番号１７）におけるシステイン残基が置換されない場合があることを除き、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０２０５】
ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットの様々なβストランドに連結するループは、長さおよび／または配列多様性について無作為化され得る。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、長さおよび／または配列多様性について無作為化された少なくとも１つのループを有する。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのループが、長さおよび／または配列多様性について無作為化される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットの少なくとも１つのループが、長さおよび／または配列多様性について一定に維持される一方、少なくとも１つのさらなるループが無作為化される。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてが、長さおよび／または配列多様性について一定に維持される一方、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてが無作為化される。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてが、長さおよび／または配列多様性について無作為化される一方、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてが無作為化される。さらに別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦ、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つのループ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つすべてが、長さまたは配列多様性について無作為化される。
【０２０６】
一部の実施形態では、ループ内部の１つ以上の残基が、長さおよび／または配列多様性について一定に維持される一方、他の残基は無作為化される。一部の実施形態では、ループ内部の１つ以上の残基が長さおよび／または配列多様性について所定の限られた数の異なるアミノ酸に維持される一方、他の残基は無作為化される。したがって、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、縮重コンセンサス配列および／または１つ以上のインバリアントアミノ酸残基を有する１つ以上のループを含み得る。
【０２０７】
一実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、無作為化されたＡＢループを含む。別の実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、無作為化されたＢＣループを含む。一実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、無作為化されたＣＤループを含む。一実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、無作為化されたＤＥループを含む。一実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、無作為化されたＥＦループを含む。
【０２０８】
特定の実施形態では、本発明のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、少なくとも１つのアミノ酸残基がヒトテネイシンＣの３番目のＦｎＩＩＩドメインの同族ＦＧループより短く維持され、１つ以上の位置でさらに無作為化されたＦＧループを含む。
【０２０９】
特定の実施形態では、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つが無作為化され、ここで、βストランドＡは配列番号１０または１１を含み、βストランドＢは配列番号１２を含み、βストランドＣは配列番号１３または１４を含み、βストランドＤは配列番号１５を含み、βストランドＥは配列番号１６を含み、βストランドＦは配列番号１７を含み、かつβストランドＧは配列番号１８を含み、ＡＢループは配列番号４または１３６を含み、ＣＤループは配列番号６を含み、かつＥＦループは配列番号８または１３７を含む。
【０２１０】
他の具体的な実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの少なくとも１つが無作為化され、ここで、βストランドＡは配列番号１０または１１を含み、βストランドＢは配列番号１２を含み、βストランドＣは配列番号１３または１４を含み、βストランドＤは配列番号１５を含み、βストランドＥは配列番号１６を含み、βストランドＦは配列番号１７を含み、かつβストランドＧは配列番号１８を含み、ＢＣループは配列番号５を含み、ＤＥループは配列番号７を含み、かつＦＧループは配列番号９または１３９を含む。
【０２１１】
本発明のＴｎ３スキャフォールドの安定性は、多種の手法により高められる場合がある。一部の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、Ｎおよび／またはＣ末端領域を伸長することによって安定化され得る。Ｎおよび／またはＣ末端領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０アミノ酸または１０を超えるアミノ酸が伸長され得る。他の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、本明細書に記載のように、血清半減期を増加させるような改変を導入することによって安定化され得る。さらに別の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、スキャフォールドの疎水性コアを安定化させるための少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含む。
【０２１２】
本発明のＴｎ３スキャフォールドは、国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０３２１８４号明細書に開示のように、非天然ジスルフィド結合を改変することにより効果的に安定化され得る。一部の実施形態では、本発明のスキャフォールドは、ＰＣＴ公開の国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレットに記載のように、非天然ジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合を改変するのに適した候補位置を同定するため、バイオインフォマティクス手法を用いてもよい。
【０２１３】
一実施形態では、本発明のＴｎ３単量体サブユニットは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの天然に存在しない分子内ジスルフィド結合を含む。一実施形態では、本発明のＴｎ３単量体サブユニットは、単量体を安定化させる、少なくとも１つの天然に存在しない分子内ジスルフィド結合を含む。さらに別の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、少なくとも１つの天然に存在しないジスルフィド結合を含み、ここで、その結合は２つの異なる単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールド間に位置する、すなわちジスルフィド結合は分子間ジスルフィド結合である。例えば、ジスルフィド結合は、異なるスキャフォールド（例えば２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体スキャフォールド）、Ｔｎ３スキャフォールドとリンカー、Ｔｎ３スキャフォールドとＦｃドメイン、またはＴｎ３スキャフォールドとその抗体もしくは断片を連結し得る。
【０２１４】
一部の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、Ｔｎ３単量体サブユニットと単離された異種部分、Ｔｎ３単量体サブユニットと同じＴｎ３スキャフォールドに融合または複合された異種部分、またはＴｎ３単量体サブユニットと異なるＴｎ３スキャフォールドに融合または複合された異種部分を連結する、少なくとも１つの天然に存在しない分子間ジスルフィド結合を含む。
【０２１５】
一部の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはより多くの単量体サブユニットのＴｎ３多量体スキャフォールドを形成するジスルフィド結合を含む。
【０２１６】
別の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、Ｎおよび／またはＣ末端領域の伸長を含んでもよい。一実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、本明細書に記載のように、血清半減期を増加させるための改変を含む。さらに別の実施形態では、本発明のスキャフォールドは、スキャフォールドの疎水性コアを安定化させるための少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含む。
【０２１７】
多量体Ｔｎ３スキャフォールド
本発明の一態様は、タンデムに連結された本発明の少なくとも２つのＴｎ３単量体サブユニットを含む多量体Ｔｎ３スキャフォールドを提供し、ここで、単量体の少なくとも１つはＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットである。かかる多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、複数の形式で構築され得る。具体的な態様では、本発明は、多量体Ｔｎ３スキャフォールドを提供し、ここで、少なくとも２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結される。一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、標的結合の結合価および／または結合活性、または標的の他の作用における増加を呈する。一部の実施形態では、標的結合の結合価および／または結合活性における増加は、複数の単量体サブユニットが同じ標的に結合するときに達成される。一部の実施形態では、結合価における増加は、標的に対する特異的作用を改善し、例えば標的タンパク質の二量体化を増強する。
【０２１８】
具体的な実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、タンデムに連結された少なくとも２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含み、ここで、各々のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは少なくとも１つの標的に結合し、また各々のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは複数のループ領域に連結された複数のβストランドを含み、ここで、少なくとも１つのループは、親Ｔｎ３スキャフォールド（配列番号３）における同族ループの天然に存在しない変異体である。
【０２１９】
一実施形態では、多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニット間の共有結合を通じて、例えばＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを直接的に連結することにより、またはリンカー、例えばペプチドリンカーを含めることにより作製される。特定例では、共有結合されたＴｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットをコードする融合遺伝子を構築することにより、あるいはシステイン残基に対するコドンをＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニット内に改変し、ジスルフィド結合の形成が発現生成物間で生じることを可能にすることにより作製される。
【０２２０】
一実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、少なくとも２つの、追加的な介在性アミノ酸を全く有しないで互いに直接的に連結されたＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含む。別の実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、少なくとも２つの、リンカー、例えばペプチドリンカーを介してタンデムに連結されたＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含む。
【０２２１】
具体的な実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、少なくとも２つの、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されたＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含み、ここで、ペプチドリンカーは、１〜約１０００、もしくは１〜約５００、もしくは１〜約２５０、もしくは１〜約１００、もしくは１〜約５０、もしくは１〜約２５のアミノ酸を含む。具体的な実施形態では、多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、少なくとも２つの、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されたＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含み、ここで、ペプチドリンカーは、１〜約２０、もしくは１〜約１５、もしくは１〜約１０、もしくは１〜約５のアミノ酸を含む。
【０２２２】
具体的な実施形態では、多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、リンカー、例えばペプチドリンカーを介してタンデムに連結された少なくとも２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含み、ここで、リンカーは機能的部分である。機能的部分は、多量体Ｔｎ３スキャフォールドの所望される機能および／または特性に基づいて選択されることになる。例えば、精製にとって有用な機能的部分（例えばヒスチジンタグ）はリンカーとして用いてもよい。リンカーとして有用な機能的部分は、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞毒性薬、放射性核種、イメージング剤、ビオチン、二量体化ドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくはそのＦｃＲｎ結合部分、抗体のドメインもしくは断片、一本鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、ＩｇＧ分子、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非Ｔｎ３スキャフォールド、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカインなどを含む。リンカーとして用いてもよい具体的なペプチドリンカーおよび機能的部分が以下に開示される。
【０２２３】
特定の実施形態では、機能的部分は、免疫グロブリンまたはその断片である。一部の実施形態では、免疫グロブリンまたはその断片はＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、少なくとも１つのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）を誘導することができない。少なくとも１つのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能を低減または除去するため、Ｆｃドメインを改変してもよいことは当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第６，７３７，０５６号明細書を参照されたい。
【０２２４】
一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、１つ以上のリンカーを介して連結された少なくとも２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含み、ここで、各々のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニット間に挿入されるリンカーは、同じリンカーまたは異なるリンカーであり得る。一部の実施形態では、リンカーは複数のリンカーを含み得、それらは同じリンカーまたは異なるリンカーであり得る。一部の実施形態では、複数のリンカーが連鎖状であるとき、リンカーの一部もしくは全部は機能的部分であり得る。
【０２２５】
スキャフォールド結合の化学量論
一部の実施形態では、単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、異なるエピトープに対してＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含み得、それは単一のＣＤ４０Ｌ分子上または異なるＣＤ４０Ｌ標的分子上の異なるエピトープであり得る。一部の実施形態では、多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含み得、ここで、各サブユニットは、１つ以上のＣＤ４０Ｌ分子上の１つ以上の異なるエピトープを標的にする。
【０２２６】
他の実施形態では、単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、同じＣＤ４０Ｌ分子上の２つ以上の異なるエピトープに結合し得る。一部の実施形態では、異なるエピトープは非重複エピトープである。他の実施形態では、異なるエピトープは重複エピトープである。
【０２２７】
さらに別の具体的な実施形態では、単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、あるＣＤ４０Ｌ分子上の１つ以上のエピトープに結合し、さらに第２のＣＤ４０Ｌ分子上の１つ以上のエピトープに結合し得る。一部の実施形態では、異なる標的分子は、オリゴマー複合体、例えば三量体ＣＤ４０Ｌ複合体の一部である。
【０２２８】
さらに別の具体的な実施形態では、単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌ三量体上の単一のエピトープに結合し得る。さらに別の実施形態では、単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、少なくとも２つのＣＤ４０Ｌ三量体上の同じエピトープに結合し得る。
【０２２９】
特定の実施形態では、単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、隣接する細胞表面上のＣＤ４０Ｌ分子の２つ以上のコピー上の同じエピトープに結合し得る。特定の実施形態では、単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、溶液中のＣＤ４０Ｌ分子の２つ以上のコピー上の同じエピトープに結合し得る。一部の実施形態では、単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌ上の同じエピトープまたは異なるエピトープに同じまたは異なる結合親和性および／または結合活性で結合し得る。
【０２３０】
別の実施形態では、単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌの１つ以上のコピー上のエピトープに結合し、標的に対する所望される作用を（例えば相乗的に）達成または増強し、例えば受容体への結合を阻止するかまたはオリゴマー化を阻止することができる。
【０２３１】
さらに、本発明の単量体または多量体Ｔｎ３スキャフォールドが複数のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニット、例えば、各単量体がＣＤ４０Ｌ上の異なるエピトープを標的する場合の異なる単量体を含むとき、かかる単量体サブユニットは、特定の生物学的効果を達成または増強するように特定のパターンまたは特別な配向性に従って配置され得る。単量体サブユニットのかかる組み合わせは、当該技術分野で公知の方法を用いて構築され、次いで評価され得る。
【０２３２】
さらに、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、精製を促進するため、マーカー配列、例えばペプチドに融合され得る。一部の実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、ポリヒスチジンペプチド（Ｈｉｓ−タグ）、例えば、オクタヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−８タグ）またはヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−６−タグ）、例えば幾つかあるベクターのなかでもｐＱＥ発現ベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ，９１３１１）において提供されるタグであり、それらの多くが市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４，１９８９に記載のように、ポリヒスチジンは融合タンパク質の便益的な精製をもたらす。精製にとって有用な他のペプチドタグとして、限定はされないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７，１９８４を参照）、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ｍｙｃ−タグ、Ｖ５タグ、ＧＦＰタグ、ＡＵ１タグ、ＡＵ５タグ、ＥＣＳタグ、ＧＳＴタグ、またはＯＬＬＡＳタグが挙げられる。
【０２３３】
本発明のＴｎ３スキャフォールドを含むさらなる融合タンパク質は、遺伝子混合、モチーフ混合、エクソン混合、および／またはコドン混合（「ＤＮＡ混合」と総称される）の技術を通じて作製してもよい。
【０２３４】
標的に対するＴｎ３スキャフォールドの作用を改変する（例えば、より高い親和性とより低い解離速度を有するスキャフォールドを作製する）ため、ＤＮＡ混合を用いてもよい。Ｔｎ３スキャフォールドは、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入、または組換えに先立つ他の方法によるランダム突然変異誘発により改変してもよい。特異的標的に結合するスキャフォールドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の部分は、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、断片などと組み換えてもよい。
【０２３５】
抗体およびＦｃドメイン融合体
一部の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、限定はされないがＦｃドメインを含む、抗体（例えばＩｇＧ）のドメインまたは断片に融合されたＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含む。
【０２３６】
一部の実施形態では、単に１つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットが、抗体のドメインまたは断片に複合または融合される。例えば、単一のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、抗体のドメインまたは断片（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）のポリペプチドのＮ末端に融合され得る。他の実施形態では、Ｔｎ３スキャフォールドは、１つ以上のＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを抗体のドメインまたは断片（例えば、抗体の重鎖および／または軽鎖、またはＦｃドメイン）のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合または複合させることによって作出される。
【０２３７】
一部の実施形態では、抗体のドメインまたは断片に融合されたＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットの一部または全部は同一である。一部の他の実施形態では、抗体のドメインまたは断片に融合されたＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットの一部または全部は異なる。
【０２３８】
具体的な実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、Ｆｃドメインに融合された１つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含む。他の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、Ｆｃドメインに融合された少なくとも２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含む。具体的な一実施形態では、Ｆｃドメインに融合されたＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットの２つは同一である。具体的な一実施形態では、Ｆｃドメインに融合されたＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットの２つは異なる。具体的な一実施形態では、Ｆｃドメインに融合された２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、互いにタンデムに連結され、かつＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットの１つはＦｃドメインに融合される。
【０２３９】
一部の実施形態では、本発明の異なるＴｎ３スキャフォールドは、ヘテロ二量体の形成を支持するＦｃドメインの突然変異の使用により二量体化され得る。Ｆｃ領域の変異体（例えば、アミノ酸の置換および／または付加および／または欠失）が抗体のエフェクター機能を増強または低減させ、かつ抗体の薬物動態特性（例えば半減期）を改変し得ることは当該技術分野で公知である。したがって、特定の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、Ｔｎ３スキャフォールドの機能特性および／または薬物動態特性を改変するため、１つ以上の改変がＦｃ領域内でなされている場合の改変されたＦｃ領域を含むＦｃドメインを含む。特定の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、少なくとも１つのＦｃ□Ｒ媒介性エフェクター機能を低下させるかまたは除去するため、１つ以上の改変がＦｃ領域内でなされている場合の改変されたＦｃ領域を含むＦｃドメインを含む。
【０２４０】
エフェクター機能および／または抗炎症活性を増強または減弱させるようにＦｃ領域のグリコシル化が修飾され得ることも公知である。したがって、一実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、Ｔｎ３スキャフォールドの細胞傷害性特性および／または抗炎症特性を改変するため、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化を伴うＦｃ領域を含む。
【０２４１】
Ｔｎ３スキャフォールドの形態
本発明のＴｎ３スキャフォールドは、任意の好適な空間的配置で、Ｆｃドメイン、抗体軽鎖、および抗体重鎖のＣ末端に融合され得る。検討されたスキャフォールドの形態の詳細な説明については、例えば国際公開第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０３２１８４号明細書を参照されたい。
【０２４２】
スキャフォールドの作製
本明細書に記載のＴｎ３スキャフォールドは、新規のまたは改善された標的結合タンパク質を進化させるための任意の技術で用いてもよい。一特定例では、標的は固体支持体、例えばカラム樹脂またはマイクロタイタープレートウェルの上で固定化され、かつ標的は候補スキャフォールドに基づく結合タンパク質のライブラリーと接触される。かかるライブラリーは、Ｔｎ３スキャフォールドからＣＤＲ様ループの配列および／または長さの無作為化を通じて構築されるクローンからなってもよい。
【０２４３】
これに関して、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大規模オリゴペプチドライブラリーをスクリーニングし、標的に特異的に結合する能力があるライブラリーのメンバーを同定することを可能にする１つの周知の技術である。ファージディスプレイは、変異体ポリペプチドが融合タンパク質としてバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に提示されるための技術である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６）。天然に存在するＦｎＩＩＩドメインのループ長および多様性の優先度を判定するため、バイオインフォマティクス手法を用いてもよい。この分析を用いて、ループ長および配列多様性における優先度を「制限された無作為化」手法を開発するために用いてもよい。この制限された無作為化では、相対的なループ長および配列の優先度がライブラリー方法の開発に組み込まれる。ループ長および配列多様性分析をライブラリー開発に統合することにより、制限された無作為化が得られる（すなわち、無作為化されたループ内部の特定の位置が、アミノ酸がその位置に存在し得るように制限される）。
【０２４４】
本発明はまた、天然に存在しないＴｎ３スキャフォールドの多様な集団を含む組換えライブラリーを提供する。一実施形態では、ライブラリーは、複数のループ領域に連結された複数のβストランドドメインを含む天然に存在しないＴｎ３スキャフォールドを含み、ここで、前記ループの１つ以上は、欠失、置換または付加により、少なくとも１つのアミノ酸だけ変化する。具体的な実施形態では、ライブラリーは、野生型Ｔｎ３スキャフォールド由来のＴｎ３スキャフォールドを含む。
【０２４５】
上で詳述のとおり、スキャフォールドの様々なβストランドに連結するループは、長さおよび／または配列多様性について無作為化してもよい。一実施形態では、本発明のライブラリーは、長さおよび／または配列多様性について無作為化された少なくとも１つのループを有するＴｎ３スキャフォールドを含む。一実施形態では、Ｔｎ３スキャフォールドの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのループは、長さおよび／または配列多様性について無作為化される。一実施形態では、少なくとも１つのループが、長さおよび／または配列多様性について一定に維持される一方、少なくとも１つのさらなるループが無作為化される。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてが、長さまたは配列多様性について一定に維持される一方、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてが無作為化される。別の実施形態では、ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてが、長さおよび／または配列多様性について無作為化される一方、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてが無作為化される。
【０２４６】
具体的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩスキャフォールドを含み、ここで、βストランドＡは配列番号１０または１１を含み、βストランドＢは配列番号１２を含み、βストランドＣは配列番号１３または１４を含み、βストランドＤは配列番号１５を含み、βストランドＥは配列番号１６を含み、βストランドＦは配列番号１７を含み、かつβストランドＧは配列番号１８を含む。
【０２４７】
具体的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩスキャフォールドを含み、ここで、βストランドＡは配列番号１０または１１からなり、βストランドＢは配列番号１２からなり、βストランドＣは配列番号１３または１４からなり、βストランドＤは配列番号１５からなり、βストランドＥは配列番号１６からなり、βストランドＦは配列番号１７からなり、かつβストランドＧは配列番号１８からなる。
【０２４８】
具体的な実施形態では、本発明のライブラリーはＦｎＩＩＩスキャフォールドを含み、ここで、βストランドＡは本質的に配列番号１０または１１からなり、βストランドＢは本質的に配列番号１２からなり、βストランドＣは本質的に配列番号１３または１４からなり、βストランドＤは本質的に配列番号１５からなり、βストランドＥは本質的に配列番号１６からなり、βストランドＦは本質的に配列番号１７からなり、かつβストランドＧは本質的に配列番号１８からなる。
【０２４９】
上で詳述のとおり、ループ内部の１つ以上の残基が長さおよび／または配列多様性について一定に維持され得る一方、他の残基は無作為化される。任意選択的または代替的に、ループ内部の１つ以上の残基が長さおよび／または配列多様性について所定の限られた数の異なるアミノ酸に維持され得る一方、他の残基は無作為化される。したがって、本発明のライブラリーは、縮重コンセンサス配列および／または１つ以上のインバリアントアミノ酸残基を有する１つ以上のループを含み得るＴｎ３スキャフォールドを含む。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、無作為化されたＢＣループを有するＴｎ３スキャフォールドを含む。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、無作為化されたＢＣループを有するＴｎ３スキャフォールドを含む。さらに別の実施形態では、本発明のライブラリーは、無作為化されたＢＣループを有するＴｎ３スキャフォールドを含む。
【０２５０】
一実施形態では本発明のライブラリーは、無作為化されたＤＥループを有するＴｎ３スキャフォールドを含む。一実施形態では、本発明のライブラリーは、無作為化されたＦＧループを有するＴｎ３スキャフォールドを含む。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、無作為化されたＦＧループを有するＦｎＩＩＩスキャフォールドを含む。
【０２５１】
具体的な実施形態では、本発明のライブラリーは、アミノ酸配列：
【化７】
2018513124.tif 000012
を含むスキャフォールドを含み、ここで、
（ａ）ＸAB、ＸBC、ＸCD、ＸDE、ＸEF、およびＸFGがそれぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループの配列内に存在するアミノ酸残基を表し；
（ｂ）Ｘ1がアミノ酸残基のＡまたはＴを表し；かつ
（ｃ）ループの長さｎが２〜２６の整数である。
【０２５２】
一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、アミノ酸配列：
【化８】
2018513124.tif 000013
を含む本発明のＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体サブユニットを含み、ここで、
（ａ）Ｘ1がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）を表し；
（ｂ）Ｘ2がアミノ酸残基のアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｃ）Ｘ3がアミノ酸残基のヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し；
（ｄ）Ｘ4がアミノ酸残基のアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｅ）Ｘ5がアミノ酸残基のグルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し；
（ｆ）Ｘ6がアミノ酸残基のフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｇ）Ｘ7がアミノ酸残基のイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｈ）Ｘ8がアミノ酸残基のグリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）またはバリン（Ｖ）を表し；
（ｉ）Ｘ9がアミノ酸残基のトリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｊ）Ｘ10がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｋ）Ｘ11がアミノ酸残基のトリプトファン（Ｗ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；かつ
（ｌ）Ｘ12がアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）を表す。
【０２５３】
一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、アミノ酸配列：
【化９】
2018513124.tif 000014
を含む本発明のＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３単量体サブユニットを含み、ここで、
（ａ）Ｘ1がアミノ酸残基のリジン（Ｋ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し；
（ｂ）Ｘ2がアミノ酸残基のトレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し；
（ｃ）Ｘ3がアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｄ）Ｘ4がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｅ）Ｘ5がアミノ酸残基のチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）またはセリン（Ｓ）を表し；
（ｆ）Ｘ6がアミノ酸残基のチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し；
（ｇ）Ｘ7がアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｈ）Ｘ8がアミノ酸残基のロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｉ）Ｘ9がアミノ酸残基のヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｊ）Ｘ10がアミノ酸残基のグリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはチロシン（Ｙ）を表し；
（ｋ）Ｘ11がアミノ酸残基のアラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；
（ｌ）Ｘ12がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｒ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し；
（ｍ）Ｘ13がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアラニン（Ａ）を表し；
（ｎ）Ｘ14がアミノ酸残基のプロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）もしくはアラニン（Ａ）、またはアミノ酸なしを表し；
（ｏ）Ｘ15がアミノ酸残基のイソロイシン（Ｉ）またはアミノ酸なしを表し；
（ｐ）Ｘ16がアミノ酸残基のグルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）を表し；かつ
（ｑ）Ｘ17がアミノ酸残基のセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を表す。
【０２５４】
本発明は、標的、例えばＣＤ４０Ｌに結合し、かつ親Ｔｎ３スキャフォールドと比べると、標的、例えばＣＤ４０Ｌに対する増強された安定性または改善された作用を有する組換えＴｎ３スキャフォールドを、本発明のライブラリーをスクリーニングすることにより同定するための方法をさらに提供する。
【０２５５】
特定の実施形態では、親Ｔｎ３スキャフォールドと比べると増強されたタンパク質安定性を有し、かつ標的に特異的に結合する組換えＴｎ３スキャフォールドを同定するための方法は、
標的リガンドをスキャフォールド：標的リガンド複合体の形成に適した条件下で本発明のライブラリーと接触させるステップと；
複合体から、標的リガンドに結合するスキャフォールドを得るステップと；
ステップ（ｂ）で得られたスキャフォールドの安定性が野生型Ｔｎ３スキャフォールドの安定性より高いか否かを判定するステップと
を含む。
【０２５６】
標的に対する改善された結合親和性、結合活性などを有する組換えＴｎ３スキャフォールドを同定するため、同じ方法を用いることができる。一実施形態では、ステップ（ａ）で本発明のスキャフォールドライブラリーが固定化標的とともにインキュベートされる。一実施形態では、ステップ（ｂ）で、非特異的結合剤を除去するため、スキャフォールド：標的リガンド複合体が洗浄され、また最も強力な結合剤が非常にストリンジェントな条件下で溶出され、配列情報を回収するため、ＰＣＲにかけられる。本明細書で開示される方法または当業者に公知の方法を用いて新しいライブラリーを作成するため、ステップ（ｂ）で得られる結合剤および／または配列情報を用いることができ、配列のさらなる突然変異誘発の有無にかかわらず、選択プロセスを繰り返すために用いてもよいことは詳細に検討される。一部の実施形態では、抗原に対して十分な親和性がある結合剤が得られるまで、選択を何回か実施してもよい。
【０２５７】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のスキャフォールドを含むライブラリーをコードする単離された核酸分子の収集であり、上記の通りである。
【０２５８】
本発明のスキャフォールドは、親和性成熟を経てもよい。当該技術分野で認められた方法では、特異的な結合タンパク質は、特異的標的に対する親和性増加について選択するスキームに従う（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５（１１）：６０３７−４２を参照）。得られる本発明のスキャフォールドは、親和性成熟前のスキャフォールドと比べて少なくとも同程度に高い結合特性を呈し得る。
【０２５９】
本発明はまた、スキャフォールド：標的複合体を形成するように標的に結合する能力があるタンパク質スキャフォールドのアミノ酸配列を同定する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、（ａ）本発明のライブラリーを固定化されたまたは分離可能な標的と接触させるステップと；（ｂ）スキャフォールド：標的複合体を遊離スキャフォールドから分離するステップと；（ｃ）低下した多様性を有することにより、また標的に結合する能力がある提示されたスキャフォールド内に豊富に存在することにより（ａ）におけるライブラリーと識別される新しいポリペプチドディスプレイライブラリーを得るため、（ｂ）の分離されたスキャフォールドの複製を引き起こすステップと；ｄ）任意選択的に（ｃ）の新しいライブラリーを伴うステップ（ａ）とステップ（ｂ）を繰り返すステップと；ｅ）（ｄ）から得られる種の提示されるスキャフォールドをコードする領域の核酸配列を決定し、したがって標的に結合する能力があるペプチド配列を推定するステップとを含む。
【０２６０】
別の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、ライブラリースクリーンからの同定後、さらに無作為化してもよい。一実施形態では、本発明の方法は、ライブラリーから同定されるスキャフォールドの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのループを本明細書に記載の方法を用いてさらに無作為化するステップを含む。別の実施形態では、さらに無作為化されたスキャフォールドは、標的に結合する能力があるスキャフォールドを同定する後続の方法に従う。この方法は、（ａ）前記のさらに無作為化されたスキャフォールドを固定化されたまたは分離可能な標的と接触させるステップと、（ｂ）さらに無作為化されたスキャフォールド：標的複合体を遊離スキャフォールドから分離するステップと、（ｃ）（ｂ）の分離されたスキャフォールドの複製を引き起こすステップと、任意選択的にステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップと、（ｄ）前記のさらに無作為化されたスキャフォールドをコードする領域の核酸配列を決定し、したがって標的に結合する能力があるペプチド配列を推定するステップとを含む。
【０２６１】
さらなる実施形態では、さらに無作為化されたスキャフォールドは、最初のライブラリーにおいて予め無作為化された、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの無作為化されたループを含む。他のさらなる実施形態では、さらに無作為化されたスキャフォールドは、最初のライブラリーにおいて予め無作為化されなかった、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの無作為化されたループを含む。
【０２６２】
本発明はまた、少なくとも１つ以上の標的に結合する少なくとも２つのＴｎ３スキャフォールドを得るための方法を提供する。この方法は、特定の応答を誘発するように協同的に作用する薬剤のスクリーニングを可能にする。２つ以上のスキャフォールドの協同を必要とするアゴニスト活性が要求されるとき、かかるスクリーニングを用いることが有利な場合がある。この方法は、多量体複合体を形成するためのライブラリーの再編成を伴わない協同的な薬剤のスクリーニングを可能にする。一実施形態では、本発明の方法は、標的リガンドを本発明のライブラリーとスキャフォールド：標的リガンド複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップと、前記スキャフォールドを（少なくとも２つの同一のまたは異なるスキャフォールドを極めて接近させて結び付ける薬剤と定義される）架橋剤と会合させる（スキャフォールドの架橋は検出可能な応答を誘発する）ステップと、複合体から標的に結合する前記スキャフォールドを得るステップとを含む。さらなる実施形態では、架橋剤は、スキャフォールドに特異的な抗体、またはその断片、その断片のエピトープタグに特異的な抗体、二量体化ドメイン、例えばＦｃ領域、コイルドコイルモチーフ（例えば限定はされないが、ロイシンジッパー）、化学架橋剤、または当該技術分野で公知の別の二量体化ドメインである。
【０２６３】
親和性成熟
本発明のＴｎ３スキャフォールドの発生は、１つ以上のインビトロまたはインビボ親和性成熟ステップを含んでもよい。一部の実施形態では、Ｔｎ３単量体サブユニットは、単一の親和性成熟ステップを経ることができる。他の実施形態では、Ｔｎ３単量体サブユニットは、２つ以上の親和性成熟ステップを経ることができる。一般には親Ｔｎ３スキャフォールドにおけるアミノ酸変化、または詳細には親和性成熟Ｔｎ３スキャフォールドの所望される抗原への結合を改善する親Ｔｎ３スキャフォールドのループにおけるアミノ酸変化をもたらすような任意の親和性成熟手法を用いることができる。
【０２６４】
これらのアミノ酸変化は、例えば、ランダム突然変異誘発、「ウォークスルー」突然変異誘発、および「ルックスルー」突然変異誘発を介して達成され得る。かかる突然変異誘発は、例えば、エラープローンＰＣＲ、酵母または細菌の「ミューテーター」株、ＦｎＩＩＩに基づく結合分子の全部もしくは一部のアブイニシオ合成中の無作為なまたは規定された核酸変化の取り込みを用いることによって達成され得る。親和性成熟および／または突然変異誘発を実施するための方法は、例えば、米国特許第７，１９５，８８０号明細書；米国特許第６，９５１，７２５号明細書；米国特許第７，０７８，１９７号明細書；米国特許第７，０２２，４７９号明細書；米国特許第５，９２２，５４５号明細書；米国特許第５，８３０，７２１号明細書；米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８３０，６５０号明細書；米国特許第６，１９４，５５０号明細書；米国特許第６，６９９，６５８号明細書；米国特許第７，０６３，９４３号明細書；米国特許第５，８６６，３４４号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第０６０２３１４４号パンフレットに記載されている。
【０２６５】
かかる親和性成熟方法は、抗原に対する改善された親和性を有するＴｎ３スキャフォールドを選択するため、抗原結合スクリーニングアッセイのストリンジェンシーを高めることをさらに必要とする場合がある。ここで、タンパク質−タンパク質相互作用アッセイのストリンジェンシーを高めるための当該技術分野で理解されている方法を用いることができる。一実施形態では、Ｔｎ３スキャフォールドの所望される抗原に対する親和性を低減するため、アッセイ条件の１つ以上が変更される（例えばアッセイ緩衝液の塩濃度）。別の実施形態では、Ｔｎ３スキャフォールドが所望される抗原に結合するのに許容される時間の長さが減少する。
【０２６６】
別の実施形態では、競合的結合ステップをタンパク質−タンパク質相互作用アッセイに加えることができる。例えば、Ｔｎ３スキャフォールドは、まず所望される固定化抗原に結合することが可能になり得る。次に、抗原に対して最低の親和性を有するＴｎ３スキャフォールドが固定化抗原から溶出され、改善された抗原結合親和性を有するＴｎ３スキャフォールドの選択をもたらすように、固定化抗原との結合に対して競合することに役立つ特定濃度の非固定化抗原が添加される。アッセイ条件のストリンジェンシーは、アッセイに添加される非固定化抗原の濃度を増加させることにより、さらに高めることができる。
【０２６７】
スクリーニング方法はまた、改善された抗原結合性を有する１つ以上のＴｎ３スキャフォールドに対して濃縮するため、複数回の選択を必要とすることがある。一実施形態では、選択の各回において、さらなるアミノ酸突然変異がＴｎ３スキャフォールドに導入される。別の実施形態では、抗原に対する増加した親和性を有するＴｎ３スキャフォールドを選択するため、選択の各回において所望される抗原に結合するストリンジェンシーが高められる。
【０２６８】
一部の実施形態では、親和性成熟は、Ｔｎ３のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループ部分の飽和突然変異誘発によって実施される。一部の実施形態では、飽和突然変異誘発は、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発を用いて実施される。他の実施形態では、飽和突然変異誘発は、ＰＣＲを用いることにより実施される。
【０２６９】
一部の実施形態では、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、または５回を超える親和性成熟が適用される。一部の実施形態では、飽和突然変異誘発は１つのループのみに適用されるが、一部の他の実施形態では、１つのループのみまたはループの一部が１回の親和性成熟中に突然変異を受ける。一部の実施形態では、２つ以上のループまたは１つ以上のループの一部が同一回の親和性成熟中に突然変異を受ける。
【０２７０】
他の実施形態では、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、同一回の親和性成熟中に同時に突然変異を受ける。
【０２７１】
同じ標的の異なるエピトープに結合する多量体Ｔｎ３スキャフォールドを構築するための単量体の場合、各結合特異性は独立的にスクリーニングすることができる。
【０２７２】
一部の実施形態では、ループはファージディスプレイライブラリーを用いて無作為化される。一部の実施形態では、Ｔｎ３スキャフォールドの所望される標的への結合は、当該技術分野で理解された方法を用いて判定され得る。さらに、スクリーニングにおいて同定されたＴｎ３スキャフォールドのアミノ酸配列は、当該技術分野で理解された方法を用いて決定することができる。
【０２７３】
一部の実施形態では、本発明の親和性成熟した単量体のスキャフォールドは、表面プラズモン共鳴または当該技術分野で公知の他のアッセイによる測定として、ＣＤ４０Ｌに対する親和性における、親和性成熟前の同じＴｎ３スキャフォールドと比べて、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、または少なくとも１００倍以上の増加を呈する。一部の実施形態では、本発明の親和性成熟した単量体のスキャフォールドは、表面プラズモン共鳴または当該技術分野で公知の他のアッセイによる測定として、５μＭ未満、１μＭ未満、５００μＭ未満、２５０μＭ未満、１００μＭ未満、または５０μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０２７４】
望ましい改善された結合特性、例えば、増加した親和性または他の望ましい特性、例えば好ましい薬物動態特性、高い効力、低い免疫原性、増加もしくは低減された交差反応性などを有するＴｎ３スキャフォールドを開発するため、これらの親和性成熟方法を適用することができる。
【０２７５】
タンデムリピートの作製
タンデム構築物の連結物、すなわち２つのＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを連結することによって形成される二量体は、限定はされないがＩＩ型およびＩＩＳ型制限酵素を含む、当該技術分野で公知の制限酵素を用いてのオリゴヌクレオチドの制限部位でのライゲーションにより作製してもよい。
【０２７６】
本発明の多量体Ｔｎ３スキャフォールドは、Ｃ末端および／またはＮ末端および／または本明細書に記載のようなドメイン間にリンカーを含んでもよい。さらに、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたはポリペプチドスキャフォールドを含む本発明のスキャフォールドは、限定はされないが、
（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；
（ｉｉ）１つ以上のシステイン残基をＣＨ１ドメインのＣ末端に有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；
（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；
（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインならびに１つ以上のシステイン残基をＣＨ１ドメインのＣ末端に有するＦｄ’断片；
（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片；
（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；
（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；
（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；
（ｉｘ）一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）；
（ｘ）同じポリペプチド鎖内に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する「二重特異性抗体」；
（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって抗原結合領域の対を形成する、タンデムＦｄセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「線状抗体」；
（ｘｉｉ）全長抗体；および
（ｘｉｉｉ）ヒンジ領域および／またはＣＨ１領域の全部もしくは一部をさらに含んでもよい、ＣＨ２−ＣＨ３を含むＦｃ領域
から選択される抗体部分を含む二量体化ドメインに融合または複合されてもよい。
【０２７７】
Ｔｎ３スキャフォールドの生成
本発明のＴｎ３スキャフォールドの組換え発現は、Ｔｎ３スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターの構築を必要とする。Ｔｎ３スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドが得られていると、Ｔｎ３スキャフォールドの生成用のベクターは、組換えＤＮＡ技術により当該技術分野で周知の技術を用いて生成してもよい。したがって、Ｔｎ３スキャフォールドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法が本明細書に記載される。スキャフォールドポリペプチドをコードする配列を有する発現ベクターと適切な転写および翻訳制御シグナルを構築するため、当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法として、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明のＴｎ３スキャフォールドをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
【０２７８】
本発明のＴｎ３スキャフォールドを生成するため、発現ベクターは従来技術によって宿主細胞に移され、次に遺伝子導入細胞は従来技術によって培養される。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された本発明のスキャフォールドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。好適な宿主細胞として、限定はされないが、細菌（例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物が挙げられる。
【０２７９】
本発明のＴｎ３スキャフォールドを発現させるため、種々の宿主−発現ベクター系を利用してもよい。かかる宿主−発現系は、目的のコード配列が生成され、続いて精製され得るための媒体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列の形質転換または遺伝子導入の際、本発明のスキャフォールドを原位置で発現し得る細胞も表す。これらは、限定はされないが、スキャフォールドコード配列を有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換される細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物または哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳＯ、および３Ｔ３細胞）を含む。
【０２８０】
本発明のＴｎ３スキャフォールドの生成にとって有用な方法が、例えば、国際特許出願公開の国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレットに開示されている。本発明のスキャフォールドが組換え発現により生成されていると、それはタンパク質の精製についての当該技術分野で公知の任意の方法により精製してもよい。
【０２８１】
一部の実施形態では、本発明のスキャフォールドは、組換え発現中にグリコシル化され得るアミノ酸残基を置換することにより、脱グリコシル化形態で生成され得る。具体的な一実施形態では、組換え発現中のグリコシル化を阻止するため、グリシン−セリンリンカー（例えば、配列番号１３１または配列番号１３２）中のセリンアミノ酸が、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシンもしくはバリンなどの他のアミノ酸残基によって置換され得る（例えば、配列番号１４０、１４１、１４２および１４３を参照）。一部の具体的な実施形態では、Ｎ−グリコシル化部位は本発明のＴｎ３スキャフォールドから除去される。他の実施形態では、本発明のスキャフォールドは、組換え発現後、脱グリコシル化され得る。例えば酵素カクテルを用いての組換え発現後のインビトロ脱グリコシル化の方法は当該技術分野で公知である（例えば、ＱＡ−ｂｉｏ，Ｐａｌｍ  Ｄｅｓｅｒｔ，ＣＡによって市販されているＰＦＧａｓｅ  Ｆ、Ｅｎｏｄｏ  Ｆ  Ｍｕｌｔｉ、Ｏｒｅｌａ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ＣａｒｂｏＲｅｌｅａｓｅ、およびＥｎｚｙｍａｔｉｃ  ＤｅＧｌｙｃｏＭｘ脱グリコシル化キット）。
【０２８２】
米国特許公開の米国特許出願公開第２０１０−０２９８５４１Ａ１号明細書に記載のように、研究室における本発明のＴｎ３スキャフォールドの生成は、分析用スケールリアクターまたは生成用スケールリアクターにおいてスキャフォールドを生成するため、スケールアップすることができる。
【０２８３】
分泌されるＴｎ３スキャフォールドのスケーラブルな生成
本発明のＴｎ３スキャフォールドは、細胞内にまたは分泌形態として生成され得る。一部の実施形態では、分泌されるスキャフォールドは、適切にフォールディングされ、完全に機能的である。本発明のＴｎ３スキャフォールドは、スケーラブルなプロセスにより生成され得る。一部の実施形態では、スキャフォールドは、分析用スケールバイオリアクター（例えば限定はされないが、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、３０Ｌ、もしくは５０Ｌのバイオリアクター）において本発明のスキャフォールドを生成するためにスケールアップ可能である、研究室における本発明のスケーラブルなプロセスにより生成され得る。他の実施形態では、Ｔｎ３スキャフォールドは、生成用スケールバイオリアクター（例えば限定はされないが、７５Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、３００Ｌ、もしくは５００Ｌ）において本発明のＴｎ３スキャフォールドを生成するためにスケールアップ可能である、研究室における本発明のスケーラブルなプロセスにより生成され得る。一部の実施形態では、本発明のスケーラブルなプロセスは、研究室において実施される生成プロセスと比べて、生成効率における低下をほとんどもたらさない。
【０２８４】
リンカー
多量体Ｔｎ３スキャフォールドにおける単量体サブユニットは、タンパク質および／または非タンパク質リンカーによって連結され得、ここで、各リンカーは少なくとも２つの単量体サブユニットに融合される。好適なリンカーは、タンパク質リンカー、非タンパク質リンカー、およびそれらの組み合わせからなり得る。リンカーの組み合わせは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。一部の実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３スキャフォールドは複数の単量体サブユニットを含み、ここで、すべてのリンカーは同一である。他の実施形態では、多量体Ｔｎ３スキャフォールドは複数の単量体サブユニットを含み、リンカーの少なくとも１つは、残りのリンカーとは機能的または構造的に異なる。一部の実施形態では、リンカーは、標的への結合に直接的または間接的に関与することにより、多量体Ｔｎ３スキャフォールドの活性に自ら寄与し得る。
【０２８５】
一部の実施形態では、タンパク質リンカーはポリペプチドである。リンカーポリペプチドは、２つ以上の単量体サブユニットを、それらが所望される活性を保持するように互いに対して正確な立体構造をとるような方法で連結させるのに十分な長さを有する必要がある。
【０２８６】
一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、１〜約１０００のアミノ酸残基、１〜約５０のアミノ酸残基、１〜２５のアミノ酸残基、１〜２０のアミノ酸残基、１〜１５のアミノ酸残基、１〜１０のアミノ酸残基、１〜５のアミノ酸残基、１〜３のアミノ酸残基を含む。本発明はまた、ポリペプチドリンカー配列をコードする核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方の組み合わせを提供する。ポリペプチドリンカーに含めるために選択されるアミノ酸残基は、本発明の多量体Ｔｎ３スキャフォールドの活性または機能と有意に干渉しない特性を呈する必要がある。したがって、ポリペプチドリンカーは、全体として、本発明のＴｎ３多量体スキャフォールドの活性もしくは機能と合致しない、または内部フォールディングに干渉する、または本発明の多量体Ｔｎ３スキャフォールドのＣＤ４０Ｌへの結合を著しく妨害することになる１つ以上の単量体サブユニット内のアミノ酸残基と結合もしくは他の相互作用を形成することになる変化を呈さない必要がある。
【０２８７】
ポリペプチドを連結し、新規な連結された融合ポリペプチドにするための天然および人工ペプチドリンカーの使用は、文献において周知である。したがって、２つ以上の単量体サブユニットを融合するリンカーは、天然リンカー、人工リンカー、またはその組み合わせである。一部の実施形態では、本発明のＴｎ３多量体スキャフォールド内に存在するすべてのペプチドリンカーのアミノ酸配列は同一である。他の実施形態では、本発明の多量体Ｔｎ３スキャフォールド内に存在するペプチドリンカーの少なくとも２つのアミノ酸配列は異なる。
【０２８８】
一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、立体構造的柔軟性を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｘ）m（式中、×はアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）であり、ｍは正の整数である）アミノ酸配列を含む（例えば配列番号２０９を参照）。具体的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）m（式中、ｍは正の整数である）アミノ酸配列を含む（例えば配列番号１４７を参照）。別の具体的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ）m（式中、ｍは正の整数である）アミノ酸配列を含む（例えば配列番号１４８を参照）。さらに別の具体的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ）m（式中、ｍは正の整数である）アミノ酸配列を含む（例えば配列番号１４９を参照）。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、本質的に不定形の天然または人工ポリペプチドである（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６−１１９０，２００９を参照；Ｓｉｃｋｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：Ｄ７８６−９３，２００７も参照）。
【０２８９】
ペプチドリンカーは、非ポリペプチド部分に対する付着基を含むアミノ酸残基が導入されるような方法で修飾され得る。かかるアミノ酸残基の例は、システイン残基であってもよく（次に非ポリペプチド部分が引き続いて付着される）、またはアミノ酸配列は、インビボＮ−グリコシル化部位を含んでもよい（それにより、ペプチドリンカーに対して糖部分（インビボ）が付着する）。
【０２９０】
一部の実施形態では、ポリペプチド多量体中に存在するすべてのペプチドリンカーのアミノ酸配列は同一である。あるいは、ポリペプチド多量体中に存在するすべてのペプチドリンカーのアミノ酸配列は異なってもよい。
【０２９１】
本発明は、治療部分に複合されるＴｎ３スキャフォールドの使用をさらに包含する。Ｔｎ３スキャフォールドは、治療部分、例えば細胞毒、例えば細胞分裂阻害剤または細胞破壊剤、治療薬または放射性金属イオン、例えばαエミッタに複合させてもよい。細胞毒または細胞毒性薬は、細胞に対して有害な任意の作用物質を含む。
【０２９２】
ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールド
本発明は、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合するＴｎ３スキャフォールドを提供する。具体的な実施形態では、本発明のスキャフォールドは、ヒトＣＤ４０Ｌに特異的に結合する。他の具体的な実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、マウス、ニワトリ、アカゲザル、カニクイザル、ラット、またはウサギに由来するＣＤ４０Ｌ相同体に結合する。一部の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌの曝露されたエピトープに結合する。かかる実施形態は、細胞上で内因性に発現されるＣＤ４０Ｌおよび／または受容体を異所性に発現するように遺伝子導入された細胞を含む。
【０２９３】
一部の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、単量体ＣＤ４０Ｌ上に提示されるエピトープを認識する。他の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、三量体型のＣＤ４０Ｌ上に提示されるエピトープを認識する。他の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、膜結合ＣＤ４０Ｌ上に提示されるエピトープを認識する。他の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、可溶性ＣＤ４０Ｌ上に提示されるエピトープを認識する。
【０２９４】
さらに他の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、単量体ＣＤ４０Ｌに結合し、ＣＤ４０Ｌ分子のオリゴマー化を阻止するかまたはそれに干渉する。さらに他の実施形態では、本発明のスキャフォールドは、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用を低減または阻害する。他の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌによって媒介される細胞シグナル伝達を刺激する。さらに他の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌによって媒介される細胞シグナル伝達に拮抗する。
【０２９５】
本発明はまた、本明細書に記載のＴｎ３スキャフォールドを用いてＣＤ４０Ｌ活性を調節する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明の方法は、ＣＤ４０ＬをＣＤ４０Ｌに特異的なスキャフォールドと接触させるステップと、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの間の相互作用を遮断するステップとを含む。他の実施形態では、本発明の方法は、ＣＤ４０Ｌを発現する細胞をＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドと接触させるステップと、細胞表面からのＣＤ４０Ｌのタンパク質分解切断を阻止するステップとを含む。他の実施形態では、本発明の方法は、ＣＤ４０Ｌ単量体をＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドと接触させるステップと、ＣＤ４０Ｌのオリゴマー化を阻止するステップとを含む。他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌの二量体化またはオリゴマー化は、多量体Ｔｎ３スキャフォールドの使用を通じて達成してもよい。
【０２９６】
一部の実施形態では、本発明の方法は、当該技術分野で公知のルーチンアッセイによる測定として、ＣＤ４０媒介性免疫応答（例えば、Ｅｌｑｕｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．２２９：１５２−１７２，２００９を参照）、またはＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合によって開始される下流シグナル伝達経路を低下させる、ＣＤ４０Ｌに特異的なスキャフォールドの投与を含む。
【０２９７】
何らの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明のＣＤ４０Ｌスキャフォールドは、例えば、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を阻止することにより、可溶性ＣＤ４０Ｌに結合して隔離することにより、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用を改変しても結合を阻止しないことにより、可溶性ＣＤ４０Ｌを得るため、細胞表面からのＣＤ４０Ｌのメタロプロテアーゼ媒介性酵素切断を阻止または増強することにより、細胞表面ＣＤ４０Ｌエンドサイトーシスを阻止または増強することにより機能しうる。
【０２９８】
特定のＣＤ４０Ｌに結合する配列
一部の実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌに結合する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのループ配列を含む、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットを含む。
【０２９９】
一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、３０９（ナイーブＴｎ３ライブラリーから単離された親３０９ファミリークローン；配列番号２０）、３０９ＦＧｗｔ（ヒト化ＦＧループを有する親３０９クローン；配列番号２２）、３４０（親和性成熟３０９クローン；配列番号２４）、３４１（親和性成熟３０９クローン；配列番号２６）、３４２（親和性成熟３０９クローン；配列番号２８または配列番号１４６）、３４３（親和性成熟３０９クローン；配列番号３０）、３４４（親和性成熟３０９クローン；配列番号３２）、３４５（親和性成熟３０９クローン；配列番号３４）、３４６（親和性成熟３０９クローン；配列番号３６）、３４７（親和性成熟３０９クローン；配列番号３８）、３４８（親和性成熟３０９クローン；配列番号４０）、３４９（親和性成熟３０９クローン；配列番号４２）、３１１（ナイーブＴｎ３ライブラリーから単離された親３１１ファミリークローン；配列番号４４）、３１１Ｋ４Ｅ（親和性成熟の１回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号４６）；３１１Ｋ４Ｅ＿１（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号４８）、３１１Ｋ４Ｅ＿２（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号５０）、３１１Ｋ４Ｅ＿３（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号５２）、３１１Ｋ４Ｅ＿４（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号５４）、３１１Ｋ４Ｅ＿５（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号５６）、３１１Ｋ４Ｅ＿７（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号５８）、３１１Ｋ４Ｅ＿８（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号６０）、３１１Ｋ４Ｅ＿９（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号６２）、３１１Ｋ４Ｅ＿１０（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号６４）、３１１Ｋ４Ｅ＿１１（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号６６）、３１１Ｋ４Ｅ＿１２（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号６８）、３１１Ｋ４Ｅ＿１３（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号７０）、３１１Ｋ４Ｅ＿１４（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号７２）、３１１Ｋ４Ｅ＿１５（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号７４）、３１１Ｋ４Ｅ＿１６（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号７６）、３１１Ｋ４Ｅ＿１９（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号７８）、３１１Ｋ４Ｅ＿２０（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号８０）、および３１１Ｋ４Ｅ＿２１（親和性成熟の２回目からの変異体３１１ファミリークローン；配列番号８２）から選択されるＣＤ４０Ｌに結合する単量体クローンの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのループ配列を含む。
【０３００】
一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、表２に列挙されるループ配列から選択される少なくとも１つのループ配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、表２に列挙されるＢＣループ配列から選択される少なくとも１つのＢＣループ配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、表２に列挙されるＤＥループ配列から選択される少なくとも１つのＤＥループ配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、表２に列挙されるＦＧループ配列から選択される少なくとも１つのＦＧループ配列を含む。
【０３０１】
一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、表２に列挙されるＢＣループ配列から選択されるＢＣループ配列；および表２に列挙されるＤＥループ配列から選択されるＤＥループ配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、表２に列挙されるＢＣループ配列から選択されるＢＣループ配列；および表２に列挙されるＦＧループ配列から選択されるＦＧループ配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、表２に列挙されるＤＥループ配列から選択されるＤＥループ配列；および表２に列挙されるＦＧループ配列から選択されるＦＧループ配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体サブユニットは、１つ、２つまたは３つの異なるＴｎ３クローンに由来するループ配列に対応するループ配列を含む。
【０３０２】
特定の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的な単量体スキャフォールド配列が、配列のＣ末端にリンカーおよび／またはヒスチジンタグ（例えばＨｉｓ−８タグ）、または追加的なＮ末端アミノ酸を含む場合、これらのＣ末端のリンカーおよび／またはヒスチジンタグと追加的なＮ末端アミノ酸は除去され得ることから、対応するアミノ酸配列は、Ｃ末端のリンカーおよびＨｉｓタグ配列とＮ末端の追加的な１つもしくは複数のアミノ酸の欠失を含む。
【０３０３】
一部の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、単一の単量体サブユニット、例えば３４２クローン配列（親和性成熟３０９クローン；配列番号２８および／または配列番号１４６）を含む。他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なスキャフォールドは、２つ以上の単量体サブユニット、例えば２つの３４２クローン単量体サブユニット（配列番号２８および／または配列番号１４６）をタンデムに含む（例えば配列番号１３５を参照）。具体的な実施形態では、本発明のＴｎ３スキャフォールドは変異体ＨＳＡ（例えば配列番号１３４および配列番号１３５を参照）に複合される。さらなる実施形態では、ＨＳＡは多量体Ｔｎ３スキャフォールドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに複合され得る。
【０３０４】
具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、単一の３１１Ｋ４Ｅ＿１２単量体サブユニット、ＧＳリンカー、およびＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号２０１を参照）を含む。別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、βストランドＣ  ＣＥＬＴＹＧ変異体を有する単一の３１１Ｋ４Ｅ＿１２単量体サブユニット、全グリシンリンカー、およびＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号２０２を参照）を含む。別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、タンデムでの２つの３１１Ｋ４Ｅ＿１２サブユニット、および２つのＧＳリンカーを含み、ここで、第１のＧＳリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２のＧＳリンカーは１つのサブユニットをＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号２０３を参照）に連結する。さらに別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、タンデムでの２つの３１１Ｋ４Ｅ＿１２サブユニット、および２つの全グリシンリンカーを含み、ここで、第１の全グリシンリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２の全グリシンリンカーは１つのサブユニットをＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号２０４を参照）に連結する。
【０３０５】
具体的な一実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、ＧＳリンカー（例えば配列番号２０５を参照）を介してタンデムに連結された２つの３０９サブユニットを含む。別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、Ｃ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号２０６を参照）に連結された単一の３０９サブユニットを含む。別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、タンデムでの２つの３０９サブユニット、および２つのＧＳリンカーを含み、ここで、第１のＧＳリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２のＧＳリンカーは１つのサブユニットをＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号２０７を参照）に連結する。
【０３０６】
具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、単一の３４２単量体サブユニット、ＧＳリンカー、およびＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号１３４を参照）を含む。別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、単一の３４２単量体サブユニット、全グリシンリンカー、およびＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号１４４を参照）を含む。別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、タンデムでの２つの３４２サブユニット、および２つのＧＳリンカーを含み、ここで、第１のＧＳリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２のＧＳリンカーは１つのサブユニットをＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号１３５を参照）に連結する。さらに別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、タンデムでの２つの３４２サブユニット、および２つの全グリシンリンカーを含み、ここで、第１の全グリシンリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２の全グリシンリンカーは１つのサブユニットをＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号１４５を参照）に連結する。さらに別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、ＧＳリンカー（例えば配列番号２０８を参照）によってタンデムに連結された２つの３４２サブユニットを含む。
【０３０７】
具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは含む。別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、タンデムでの、３１１サブユニット、または３１１由来のサブユニット（例えば３１１Ｋ４Ｅ＿１２）および３０９サブユニット、または３０９由来のサブユニット（例えば３４２）と、２つのＧＳリンカーを含み、ここで、第１のＧＳリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２のＧＳリンカーは１つのサブユニットをＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号１３５を参照）に連結する。さらに別の具体的な実施形態では、ＣＤ４０Ｌに特異的なＴｎ３スキャフォールドは、タンデムでの、３１１サブユニット、または３１１由来のサブユニット（例えば３１１Ｋ４Ｅ＿１２）および３０９サブユニット、または３０９由来のサブユニット（例えば３４２）と、２つの全グリシンリンカーを含み、ここで、第１の全グリシンリンカーはサブユニットを互いに連結し、第２の全グリシンリンカーは１つのサブユニットをＣ３４Ｓ  ＨＳＡ変異体（例えば配列番号１４５を参照）に連結する。
【０３０８】
ＣＤ４０Ｌに特異的なタンデム二価Ｔｎ３スキャフォールドと血清アルブミン（ＳＡ）の融合体の例が図２Ａに示される（図９Ａも参照）。具体的なリンカーが図２Ａに提供されるが、他のリンカーが本明細書中に提供されるものとして検討される。野生型成熟ＳＡ、例えばマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いてもよいが、成熟ＳＡ中の１つ以上のシステイン（Ｃ）アミノ酸残基を例えばセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）などと置換してもよいことは検討される。
【０３０９】
代表的な構築物が下記に示される。ＳＡの配列には下線が引かれる。リンカーはボックスで示される。極めて多数の変形形態が本発明の範囲内に含まれることは理解されるであろう。例えば、リンカーが改変されてもよい（幾つかの非限定例が本明細書中に提供される）、１番目もしくは２番目のＮ末端アミノ酸残基（ＳＱ）が不在であってもよい、かつ／または代わりのアミノ酸残基と置換されてもよい、タグ（例えば６ｘＨｉｓタグ）が組み込まれてもよい、代わりのＣＤ４０Ｌに特異的なスキャフォールド（例えばフィブロネクチンの１０番目のＦｎ３ドメインに基づくもの）が類似の構築物中で用いられてもよいなどである。
【０３１０】
３４２一価ＨＳＡ構築物１（配列番号１３４）
［３４２単量体］−（Ｇ4Ｓ）2リンカー−ＨＳＡC34S
【化１０】
2018513124.tif 000015
【０３１１】
３４２一価ＨＳＡ構築物２（配列番号１４４）
［３４２単量体］−Ｇ10リンカー−ＨＳＡC34S：
【化１１】
2018513124.tif 000016
【０３１２】
３４２二価ＨＳＡ構築物１（配列番号１３５）
［３４２単量体］−（Ｇ4Ｓ）3リンカー−［３４２単量体］−（Ｇ4Ｓ）2リンカー−ＨＳＡC34S：
【化１２】
2018513124.tif 000017
【０３１３】
３４２二価ＨＳＡ構築物２（配列番号１４５）
［３４２単量体］−Ｇ15リンカー−［３４２単量体］−Ｇ10リンカー−ＨＳＡC34S：
【化１３】
2018513124.tif 000018
【０３１４】
３１１Ｋ４Ｅ＿１２一価ＨＳＡ構築物１（配列番号２０１）
［３１１Ｋ４Ｅ＿１２単量体］−（Ｇ4Ｓ）2リンカー−ＨＳＡC34S：
【化１４】
2018513124.tif 000019
【０３１５】
３１１Ｋ４Ｅ＿１２一価ＨＳＡ構築物２（配列番号２０２）
［３１１Ｋ４Ｅ＿１２単量体］−Ｇ10リンカー−ＨＳＡC34S：
【化１５】
2018513124.tif 000020
【０３１６】
３１１Ｋ４Ｅ＿１２二価ＨＳＡ構築物１（配列番号２０３）
［３１１Ｋ４Ｅ＿１２単量体］−Ｇ4Ｓ3リンカー−［３１１Ｋ４Ｅ＿１２単量体］−（Ｇ4Ｓ）2リンカー−ＨＳＡC34S：
【化１６】
2018513124.tif 000021
【０３１７】
３１１Ｋ４Ｅ＿１２二価ＨＳＡ構築物２（配列番号２０４）
［３１１Ｋ４Ｅ＿１２単量体］−Ｇ15リンカー−［３１１Ｋ４Ｅ＿１２単量体］−Ｇ10リンカー−ＨＳＡC34S：
【化１７】
2018513124.tif 000022
【０３１８】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体と一緒に調合された本発明のアルブミン融合タンパク質の１つもしくは組み合わせを含有する組成物、例えば限定はされないが医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、スキャフォールド、例えばＴｎ３スキャフォールドを有するアルブミン融合タンパク質を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１３４、１３５、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７もしくは２０８のアルブミン融合タンパク質を含み、ここで、その組成物は２０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質を有し、また４６位、１５１位もしくは両方でのトリプトファンは酸化されない。他の実施形態は、本発明に従って精製されたアルブミン融合タンパク質を含む薬学的に許容できる製剤に関する。その製剤は、好適には緩衝液、糖、および乳化剤を含んでもよい。一実施形態では、緩衝液はリン酸ナトリウム緩衝液であり、糖はスクロースであり、かつ乳化剤はポリソルベート８０である。請求項１００または１０１に記載の医薬製剤は凍結乾燥される。
【０３１９】
均等物
当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多数の均等物を理解するか、または単にルーチン実験を用いるのみで確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０３２０】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々個別の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書中に援用されることが詳細かつ個別に示されるのと同程度まで、ここで参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０３２１】
ここで、本発明は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例はあくまで例示的なものであり、本発明は、決してこれらの実施例に限定されるものとして解釈されるべきでないばかりか、本明細書に提供される教示内容の結果として明白になるあらゆる変形形態を包含するように解釈されるべきである。
【０３２２】
実施例１
化学物質
プロピレングリコールはＡｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。スクロースはＰｆａｎｓｔｉｅｈｌ（Ｗａｕｋｅｇａｎ，Ｉｌ，ＵＳＡ）から入手した。トリトンＸ−１００および硫酸ナトリウムはＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。ビストリス、ビストリスＨＣｌ、およびニコチンアミドはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。氷酢酸、アルギニン、グリシン、酢酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス、および尿素は、ＪＴ  Ｂａｋｅｒ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【０３２３】
タンパク質
本研究で用いられるタンパク質のアルブミン融合タンパク質＃１（ＡＦＰ−１）（配列番号１４５）は、ヒト血清アルブミンに融合された、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型タンパク質ドメインに由来する２つの同一のテネイシンＣ（ＴｎＣ）ドメインからなるＣＤ４０Ｌ拮抗剤である。（ヒトＴｎＣの３番目のフィブロネクチンＩＩＩ型タンパク質ドメイン由来の）各Ｔｎ３ドメインは、ヒトＣＤ４０Ｌに結合し、ヒトＣＤ４０とのその相互作用を阻害する。ヒト血清アルブミン融合体は、その分子の好適な薬物動態特性を保証する。そのタンパク質は、当業者が精通した技術を用いて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現される。組換えヒトアルブミン（ｒＨＳＡ；米において発現される）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから凍結乾燥粉末として購入した（カタログ番号Ａ９７３１）。表３は、ｒＨＳＡおよびＡＦＰ−１の特性の概要である。
【０３２４】
【表４】
2018513124.tif 000023
【０３２５】
総タンパク質濃度の測定
すべてのプロセス中間体（清澄化培地および場合によりＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィープールを除く）におけるタンパク質濃度を、業界で共通の標準的な分光光度的手順を用いて２８０ｎｍでの吸光度により測定した。吸光係数として、ＡＦＰ−１に対して０．９８（ｍｇ／ｍＬ）-1ｃｍ-1、ｒＨＳＡに対して０．５３１（ｍｇ／ｍＬ）-1ｃｍ-1を用いた。
【０３２６】
ＨＳＡ親和性高性能液体クロマトグラフィー
分析用高性能ＨＳＡ親和性クロマトグラフィー（ＨＳＡ−ＨＰＬＣ）をＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステム（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ，ＵＳＡ）から入手したＰｏｒｏｓ  ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＨＳＡカラムを用いて実施した。平衡化緩衝液相は１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３．５ｍＬ／分でｐＨ７．２であり、生成物は１００ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０緩衝液で溶出させた。１０〜１００ｕｇの試料を適切に注射し、溶出特性を２８０ｎｍでの分光光度計を用いて監視した。データを収集し、Ａｇｉｌｅｎｔ製のＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析し、生成物に特異的な濃度を、精製タンパク質を用いて作成した検量線から判定した。
【０３２７】
色素親和性クロマトグラフィー
Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素親和性クロマトグラフィーは、２０ｃｍのベッド高を有する小規模クロマトグラフィーカラム内で典型的な結合および溶出条件下で実施した。すべての実行は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）製のＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステムを用いて実行し、カラムは３００ｃｍ／時で操作した。ベースライン条件下において、カラムは、５０ｍＭのビストリス（またはリン酸塩）、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化し、次に（清澄化細胞培養液中のＨＳＡ−ＨＰＬＣ力価に基づいて）樹脂１Ｌあたり最大２５ｇのタンパク質を負荷した。負荷後、カラムを再平衡化し、５０ｍＭのビストリス（またはリン酸塩）、ｐＨ７．０で洗浄し、次に５０ｍＭのビストリス（またはリン酸塩）、２５ｍＭのオクタン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０で溶出した。生成物ピークを生成物ピークのリーディング側とテーリング側での１００ｍＡＵの吸光度基準に基づいて収集した。最適化（実施例２参照）中、追加洗浄を再平衡化と５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７洗浄中にカラムに適用した。Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）から入手した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｂｌｕｅ  ＨＣ−６５０Ｍ樹脂はＴｏｓｈｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【０３２８】
アニオン交換クロマトグラフィー
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）は、２０ｃｍのベッド高に充填された小型クロマトグラフィーカラム内で典型的な結合および溶出条件下で実施した。すべての実行は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステムを用いて実行し、カラムは３００ｃｍ／時で操作した。ベースライン条件下において、カラムは、５０ｍＭのビストリス、２０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化し、タンパク質を負荷し、次に平衡化緩衝液で洗浄した。カラムをｐＨ７．０でのビストリス緩衝液中で２０〜４００ｍＭの塩化ナトリウムの段階的または１０カラム容積（ＣＶ）線形勾配を用いて溶出した。生成物ピークは、生成物ピークのリーディング側およびテーリング側に対する１００ｍＡＵの吸光度基準に基づいて収集した。Ｃａｐｔｏ  Ｑ樹脂は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）から入手した。
【０３２９】
アニオン交換膜クロマトグラフィー
アニオン交換膜クロマトグラフィー（ＡＥＭＣ）を典型的なフロースルー条件下で実施した。すべての実行は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステムを用いて実行し、カラムは１０ＭＶ／分で操作した。ベースライン条件下において、膜は５０ｍＭのビストリス、５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化し、次に負荷材料は膜を通過させた。フロースルー生成物ピークは、生成物ピークのリーディング側およびテーリング側に対する１００ｍＡＵの吸光度基準に基づいて収集した。最適化（実施例２を参照）中、１０〜２２０ｍＭのＮａＣｌおよびｐＨ６〜８の緩衝液条件を用いた。Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜は、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）から入手した。
【０３３０】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、２０ｃｍのベッド高を有する小規模クロマトグラフィーカラム内で典型的な結合および溶出条件下で実施した。すべての実行は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪＵＳＡ）製のＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステムを用いて実行し、カラムは１３０〜３００ｃｍ／時で操作した。ベースライン条件下において、カラムは５０ｍＭのビストリス、１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化した。負荷物は１（重量）部のタンパク質溶液を２重量部の５０ｍＭのビストリス、２Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で希釈することにより調製し、次にカラムに樹脂１Ｌあたり最大２５ｇのタンパク質を負荷した。負荷後、カラムを平衡化緩衝液で再平衡化し、次に２０カラム容積にわたる１Ｍから０ｍＭのクエン酸ナトリウムでのクエン酸ナトリウムの線形勾配で溶出した。生成物ピークを画分で収集するとともに、早期に溶出する材料を酸化生成物中で濃縮した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ  ６００ＭおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ樹脂は、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）製であり；Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣおよびＢｕｔｙｌ−Ｓ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）製であった。
【０３３１】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
分析用高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステム（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ  ＵＳＡ）から入手したＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を用いて実施した。移動相は、３０℃、０．８ｍＬ／分で２２分間、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１Ｍの硫酸ナトリウム、１０％イソプロパノール、ｐＨ６．８であった。２５０ｕｇの試料を適切に注射し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ＵＳＡ）からの分子量標準を用いてカラムを較正した。２８０ｎｍでの分光光度計を用いて溶出特性を監視し、データを収集し、Ａｇｉｌｅｎｔ製のＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。結果は、約１２分後に認められた緩衝液関連ピークを除き、すべての他のピークと比べた生成物単量体ピークの面積パーセントとして報告する。移動相に１０％のイソプロパノールを伴わずにＳＥＣ−ＨＰＬＣ法を実行するとき、トリプトファン酸化単量体として同定された単量体ピークに対するフロントショルダー（完全には溶解されない）が認められる。したがって、単量体および凝集体を測定するかまたはトリプトファン酸化を推定するため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣアッセイの操作方法に応じてそれを用いることができる。
【０３３２】
実施例２
アルブミン融合タンパク質の精製（５００Ｌ規模）
組換えヒトアルブミン（ｒＨＳＡ）は、フロースルークロマトグラフィー膜、トリトンウイルス不活化ステップ、および限界濾過／ダイアフィルトレーションステップといった３つの結合および溶出クロマトグラフィーカラムを含むプロセスで精製した。ｒＨＳＡプロセス用の出発物質を作製するため、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）プロセスからの細胞培養上清において、プロテインＡクロマトグラフィーの実行中、非結合材料を回収することにより抗体を枯渇させ、次に凍結乾燥したｒＨＳＡ粉末を、抗体を含まない上清中に溶解させた。この出発物質は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、および小分子不純物を含み、それらは典型的にはＣＨＯ細胞培養下で発現されるアルブミン融合タンパク質の細胞培養上清中に存在することになる。
【０３３３】
図１に示すｒＨＳＡ精製プロセスは、約７００ｍＬの上清を精製するために用いた。表４は１Ｌ規模の精製からの性能パラメータを示す。表でわかるように、クロマトグラフィー単位操作に対するステップ収率は、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）を例外として一般に高かった。図２は、ｒＨＳＡのＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）色素親和性クロマトグラムを示す。図でわかるように、大きい吸光度ピークが負荷中および０．５ＭのＮａＣｌ洗浄中に認められる。この実行単独から、低収率は、カラムへの過剰負荷（すなわち、カラムがｒＨＳＡで飽和され、ｒＨＳＡのすべてが上清から捕捉されたのではなかったこと）が原因であったか、または０．５ＭのＮａＣｌ洗浄が理由であったかは未知である。いすれの場合でも、収率低下がカラム負荷および洗浄ステップ条件の最適化により最少化され得る可能性は高い。
【０３３４】
【表５】
2018513124.tif 000024
【０３３５】
ｒＨＳＡプロセス中間体の生成物品質属性の概要を表５に示す。表でわかるように、ＨＣＰおよびＤＮＡは、精製プロセスとともに低レベルまで十分に制御され、完全に精製された材料中でＨＣＰは＜１０ｎｇ／ｍｇで測定され、ＤＮＡは１．７×１０-4ｎｇ／ｍｇで測定される。ＨＣＰはＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅカラムよりも２ログ超、ＣａｐｔｏＱおよびＰＰＧ−６００Ｍカラムからさらに１ログ（以上）減少する。５ログ超のＤＮＡがＣａｐｔｏＱカラムにより除去され、さらに１ログ（以上）がＣａｐｔｏ  ＢｌｕｅおよびＭｕｓｔａｎｇ  Ｑステップにより除去される。さらなる凝集体の除去が精製プロセス中の複数のステップにわたり認められた。全体として、プロセスはｒＨＳＡの精製に非常に成功し、アルブミン融合タンパク質の精製のための開始点として用いることができた。
【０３３６】
【表６】
2018513124.tif 000025
【０３３７】
実施例３
アルブミン融合タンパク質の精製（５００Ｌ規模）
組換えヒト血清アルブミン融合タンパク質ＡＦＰ−１（ＨＳＡ融合体またはアルブミン融合体）をＣＨＯ細胞内で発現させ、フロースルークロマトグラフィー膜、トリトンウイルス不活化ステップ、ナノフィルターといった３つの結合および溶出クロマトグラフィーカラム、および２つの中間的な限界濾過／ダイアフィルトレーションステップを含むプロセスを用いて精製する。
【０３３８】
アルブミン融合体精製プロセスを図３に示す。図３に示す精製プロセスは、２つの５００Ｌのバイオリアクターを精製するためにスケールアップした。表６は、２つの５００Ｌのバイオリアクター規模の精製から得られた性能パラメータを示す。表でわかるように、クロマトグラフィー単位操作のためのステップ収率およびプール容積は、ロット間で一致している。ロット１およびロット２における全プロセス収率（ＵＦ／ＤＦおよびナノ濾過を含む）は、それぞれ４８％および５３％であった。プロセス中間体の生成物品質属性の概要を表７に示す。全体的性能（すなわちプロセス収率）および生成物品質（絶対レベルおよびＬＲＶ）は、ｒＨＳＡの精製に用いられる精製プロセスとまさに同等である。これは特に、ＨＣＰ除去（Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）およびＣａｐｔｏ  Ｑ）およびＤＮＡクリアランス（Ｃａｐｔｏ  ＱおよびＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ）の大部分に関与するステップに該当する。
【０３３９】
【表７】
2018513124.tif 000026
【０３４０】
【表８】
2018513124.tif 000027
【０３４１】
Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）樹脂を用いるＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素親和性クロマトグラフィーをＡＦＰ−１精製プロセス用の捕捉カラムとして用いる。図４は、３００ｃｍ／時で操作されたＡＦＰ−１におけるＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィーの代表的なクロマトグラフを示す。図４でわかるように、約６カラム容積（ＣＶ）から始まる大きいＯＤシグナルによって示されるように、負荷中に大きいフロースルーピークが見られる。このフロースルーピークは、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡを含む条件培地中に存在するプロセス関連不純物の大部分を含む。負荷後、カラムを再平衡化し、次に異なる緩衝液、すなわち、最初にｐＨ６．０で０．５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液、その後の再平衡化に続く、ｐＨ７．０で１０％プロピレングリコールを含有する緩衝液で洗浄する。その洗浄により、生成物プール中のＨＣＰおよびＤＮＡレベルが、これら不純物をＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素リガンドおよび／またはアルブミン融合タンパク質から解離させることにより低下する。次に、カラムをオクタン酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを含有する緩衝液で溶出する。表７でわかるように、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）クロマトグラフィー後、生成物中間体は、条件培地と比べてより少ないＤＮＡ（０．６〜０．７ログのクリアランス）とより少ないＨＣＰ（２．７〜２．９ログのクリアランス）とを有する。さらに、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）生成物は、高単量体（≧９８．０％）と低レベルの酸化生成物とを有する。
【０３４２】
Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィーでの初期捕捉後、潜在的なエンベロープウイルスを不活化するため、生成物をトリトンＸ−１００で処理する。本実施例では、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）プールに１０％トリトンＸ−１００を最終濃度が０．５％トリトンＸ−１００（ｗ／ｗ）になるまで添加し、室温で１３０分間維持する。これらの条件下で効率的なウイルス不活化が達成される（詳細は実施例５を参照）。
【０３４３】
トリトンＸ−１００処理後、アルブミン融合タンパク質を、結合および溶出モードでのＣａｐｔｏ  Ｑカラムを用いるアニオン交換クロマトグラフィーで精製する。図５は、３００ｃｍ／時で操作したＡＦＰ−１における代表的なＣａｐｔｏ  Ｑクロマトグラムを示す。図５でわかるように、約７ＣＶから始まる大きいＯＤシグナルによって示されるように、負荷中に大きいフロースルーピークが見られる。このフロースルーピークは、先行ステップからのトリトンＸ−１００を含有する。負荷後、カラムを再平衡化し、次に（ｐＨ７．０で）１０ＣＶにわたる０．４ＭのＮａＣｌへの線形ＮａＣｌ勾配で溶出する。表７でわかるように、Ｃａｐｔｏ  Ｑ中間体は、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）プールよりも少ないＨＣＰ（１．３〜１．５ログのクリアランス）と著しくより少ないＤＮＡ（６〜６．７ログのクリアランス）を有する。Ｃａｐｔｏ  Ｑが（凝集生成物を低減することにより）単量体含量を増加させる能力を有し、またＡＦＰ−１の酸化に関与する不純物を除去することも認めることができる（詳細は実施例７を参照）。
【０３４４】
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜クロマトグラフィーステップを用いる精製のために調製するため、Ｃａｐｔｏ  Ｑ生成物を５０ｍＭのビストリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対してダイアフィルトレーションする。図６は、１０ＭＶ／時で操作した代表的なＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜クロマトグラムを示す。膜の事前の調整および平衡化後、生成物を膜に適用し、フロースルー中で収集する一方、不純物を膜に結合させる。２ＭのＮａＣｌでストリップするとき、不純物と一部の生成物との両方を含む大きいピークが認められる（ストリップピークは図６中のクロマトグラムに含まれない）。表７でわかるように、ＤＮＡはＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜によりさらに減少する（０．６〜１ログのクリアランス）。
【０３４５】
最終のクロマトグラフィーステップは、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ−６００Ｍを用いる疎水性相互作用カラムである。図７は、１３０ｃｍ／時で操作したＡＦＰ−１における代表的なＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ−６００Ｍクロマトグラムを示す。１Ｍクエン酸塩を含有する緩衝液で平衡化後、生成物をカラム上に負荷する。生成物が精製プロセスにおけるこの段階までかなり純粋であることから、フロースルーピークは全く認められない。負荷後、カラムを再平衡化し、次にクエン酸塩を全く含有しない緩衝液に対する勾配で溶出する。生成物を鋭いピークで溶出させ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより酸化生成物含量についてアッセイされる画分で回収する。ＨＩＣ−ＨＰＬＣによる１５％未満の酸化種を含有する全画分をプールし、先にナノ濾過を行う。
【０３４６】
Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｖｐｒｏ＋を用いるナノ濾過を、タンパク質精製の当業者にとって標準的な技術を用いて実施する。ナノ濾過の目標は、潜在的なウイルス粒子を除去することである。ナノ濾過後、生成物を濃縮し、ダイアフィルトレーションし、かつ１０ｍＭリン酸塩、２５０ｍＭスクロース、０．０２％ポリソベート８０中で調合する。ナノ濾過の完了（または調合）後、生成物プールを精製プロセス中に生成物に導入されるさらなる不純物について試験する。表８は、プロセス関連不純物試験の概要である。表８に見られるように、初期プロセスステップ（ブルー色素クロマトグラフィーおよびウイルス不活化ステップ）におけるプロセスに導入される緩衝液成分とＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素リガンドとは、その後の精製ステップにより、非常に低いレベルまで減少する。
【０３４７】
【表９】
2018513124.tif 000028
【０３４８】
実施例４
Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素親和性クロマトグラフィー
Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）とＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｂｌｕｅ  ＨＣ−６５０Ｍとを結合能力の観点で比較し、不純物を清澄化細胞培養液から除去した。表９は、清澄化細胞培養液中でのＡＦＰ−１の動的結合能力の概要である。Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）では、動的結合能力はｐＨと間接的な相関を示し、この場合、ｐＨ５は最高の結合能力（樹脂１Ｌあたり３７．４ｇのＡＦＰ−１）を有し、ｐＨ８は最低の結合能力（１２．３ｇ／Ｌ）を有した。高い結合能力が望ましい一方、ｐＨ５での操作は、ｐＨ６以下での分子において凝集割合が増加することに起因し、それほど望ましくない（データは示さず）。したがって、高い結合能力と生成物安定性を均衡させるため、ｐＨ６を最適ｐＨとして選択した。Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｂｌｕｅ  ＨＣ−６５０Ｍにおける動的結合能力の比較によると、ｐＨ６でのＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）における動的結合能力がほぼ２倍であることが示された。
【０３４９】
【表１０】
2018513124.tif 000029
【０３５０】
これら２つの樹脂を清澄化細胞培養液からの不純物クリアランスについて比較するため、各カラムをベースライン条件下で操作し、カラムにその動的結合能力の７５〜８０％まで充填し（Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）に対して１７．５ｇ／Ｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｂｌｕｅ  ＨＣ−６５０Ｍに対して１０．０ｇ／Ｌ）、２５ｍＭのオクタン酸ナトリウムを用いてカラムから溶出させた。表１０は、清澄化細胞培養液からのＡＦＰ−１の捕捉および精製に用いた２つのＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素樹脂の比較を示す。表１０でわかるように、両方の樹脂に対する収率は類似し（２５ｍＭのオクタン酸を用いる溶出の場合）、典型的な収率は＞９０％である。さらに、両方の樹脂はＨＣＰおよびＤＮＡのレベルを清澄化細胞培養液から有効に低下させるが、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−Ｂｌｕｅ  ＨＣ−６５０Ｍクロマトグラフィーは、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）と比べて、わずかにより良好なＨＣＰおよびＤＮＡクリアランスを示した。
【０３５１】
【表１１】
2018513124.tif 000030
【０３５２】
ＡＦＰ−１では、作製プロセスとして、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）樹脂をそのより高い結合能力のために選択した。Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）を用いる捕捉ステップを最適化するため、カラム負荷ならびに洗浄および溶出用緩衝液組成物を含む幾つかの要素を検討した。表１０でわかるように、カラム負荷はＤＮＡに対する効果を全く有しなかったが、ＨＣＰクリアランスに対してわずかな効果を示した。試験したカラム負荷の極値（１０ｇ／Ｌまたは２５ｇ／Ｌの負荷）でのＨＣＰクリアランスは、中間的負荷（１７．５ｇ／Ｌの負荷）での場合よりも有効である。したがって、スループットを増加させ、さらにＨＣＰ除去を増加させるため、その動的結合能力またはその近傍でカラムを操作することは有利である。
【０３５３】
溶出緩衝液組成物をＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィー捕捉ステップに対して最適化した。図８は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィー用の溶出緩衝液の比較を示す。図８および表１０でわかるように、オクタン酸は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素カラムからの溶出において、２Ｍ  ＮａＣｌと比べてはるかにより有効な選択である。本実施例の場合、２Ｍ  ＮａＣｌは、６０％の収率およびクロマトグラムで見られる広範な溶出特性に基いてカラムからのＡＦＰ−１の不完全な溶出を示した。実行した２Ｍ  ＮａＣｌの生成物品質によると、２５ｍＭのオクタン酸を用いる溶出と比べて、ＨＣＰレベルがはるかにより高く、単量体レベルがはるかにより低いことが示された。さらに、２Ｍ  ＮａＣｌ（単独または溶媒との組み合わせ）を用いる場合、これらの溶出緩衝液がコスト高になり、プロセス内での次のクロマトグラフィーカラムへの結合を促進するための緩衝液交換ステップがプロセスに必要であり得ることから、作製上の観点からそれほど望ましくないことになる。
【０３５４】
Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素捕捉ステップの展開における最終ステップは洗浄最適化であった。アルブミンが多種の分子に結合でき、同じことがアルブミン融合タンパク質にも言えることは周知である。したがって、不純物（ＨＣＰおよびＤＮＡなど）がアルブミン融合タンパク質と相互作用し、所望される生成物と同時精製し得ることが想定される。不純物クリアランスを改善する目的で、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィー樹脂に対するアルブミン融合タンパク質の強力な結合を利用し、数回の洗浄について、不純物とＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素リガンドとの間または不純物とリガンドに結合されたアルブミン融合タンパク質との間の相互作用を破壊することにより試験した。イオン剤、カオトロピック剤、コスモトロピック剤、界面活性剤および弱溶剤を含む様々なタイプの洗浄を用いた。さらに、ｐＨのいくらかなりの効果を判定するため、各洗浄はｐＨ６およびｐＨ７で試験した。
【０３５５】
表１１は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィーに対して試験した洗浄の概要である。表１１でわかるように、洗浄のｐＨはＨＣＰ除去にとって極めて重要である。ｐＨ７では、試験したすべての洗浄がＨＣＰ低減により有効であり、ほとんどの洗浄がＨＣＰをｐＨ６での同一の洗浄と比べて２倍以上低減した。試験した洗浄のうち、ｐＨ７での０．５Ｍ  ＮａＣｌはＨＣＰ低減に最も有効であり、対照実行と比べて、ＨＣＰにおける７倍を超える低減を示した。ＨＣＰクリアランスと異なり、ＤＮＡクリアランスは、ｐＨ６〜７のｐＨによる影響を受けなかった。試験したすべての洗浄のうち、イオン洗浄（ＮａＣｌおよびＮａ2ＳＯ4）のみが対照実行と比べて改善されたＤＮＡクリアランスを示した。これらの場合、対照実行と比べて、ＤＮＡにおける４〜５倍の低減が認められた。１０％プロピレングリコールを含有する実行の場合により高い単量体レベルが認められたが、試験した幾つかの洗浄の場合に単量体レベルにおけるわずかな増加が認められたことも注目すべきである。ｐＨに伴う単量体純度における影響は全く認められなかった。
【０３５６】
表１１中のデータに基づき、０．５Ｍ  ＮａＣｌはＨＣＰおよびＤＮＡクリアランスの観点で非常に有効な洗浄であり、１０％プロピレングリコールは単量体純度を増加させるのに有効な洗浄である。ここで、１０％プロピレングリコール洗浄は、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅプールにおける生成物の酸化の可能性を低下させるのにも有効であったことは注目されるべきである（さらなる詳細については実施例７を参照）。収率は、０．５Ｍ  ＮａＣｌ洗浄による負の影響を最も受け、収率はｐＨ６および７でそれぞれ５％および１４％低下した。興味深いことに、試験した他の洗浄では収率低下が全く認められなかった。これらの結果に基づき、ｐＨ６で０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する洗浄およびｐＨ７で１０％プロピレングリコールを含有する洗浄を実施例３における作製プロセスに組み込んだ。
【０３５７】
【表１２】
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【０３５８】
実施例５
トリトンＸ−１００ウイルス不活化
５．４〜５．５の範囲内の等電点を有するアルブミン融合分子であるＡＦＰ−１の場合、低ｐＨ処理は分子の生成物品質に対して（凝集および沈殿が認められ）有害であると判定した。したがって、ウイルス不活化についてはトリトンＸ−１００処理を選択した。低ｐＨ処理と同様、トリトンＸ−１００の添加は、ウイルスの周りのエンベロープを破壊し、ウイルスを不活化することになる。低ｐＨ処理と異なり、トリトンＸ−１００は、ＡＦＰ−１の生成物品質に対して測定可能な影響を有しない。
【０３５９】
トリトンＸ−１００によるウイルス不活化を、エンベロープウイルスモデルとして異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）を用いて試験した。すなわち、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィーにより精製した材料を１０％（ｗ／ｗ）のトリトンＸ−１００とともにトリトンＸ−１００の最終濃度が０．５％（ｗ／ｗ）になるまで添加し、所定時間インキュベートし、次に感染性について当業者に周地のプレートに基づく方法を用いて試験した。ログ減少値（ＬＲＶ）をトリトンＸ−１００処理の前後に試料に対して実行した感染性アッセイからのＸＭｕＬＶ力価に基づいて計算した。
【０３６０】
表１２は、ＸＭｕＬＶウイルス不活化において得られたＬＲＶの概要である。表でわかるように、０．５％（ｗ／ｗ）トリトンＸ−１００による処理は、ＸＭｕＬＶ不活化のための有効な方法である。トリトンＸ−１００処理の直後に測定した試料では、４．７３および＞５．１５のＬＲＶ値が二連実験において得られた。１２０分のインキュベーション終了までに、両方の試験は、＞５．１５ログのＸＭｕＬＶの不活化を示した。これらのＬＲＶは、モノクローナル抗体に対する低ｐＨ処理で得られた値と同じ範囲内である。
【０３６１】
【表１３】
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【０３６２】
トリトンＸ−１００処理後、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて生成物を精製する（精製プロセスについては図３を参照）。アニオン交換クロマトグラフィー中、アルブミン融合体は固定相に強力に結合される一方、一部の不純物はカラムをフロースルーする。トリトンＸ−１００はアニオン交換カラムにより保持されず、２８０ｎｍでのその吸光度に起因し、アニオン交換カラムのフロースルー中に認めることができる。図５は、カラム充填中に強い２８０ｎｍの吸光度シグナルを伴う代表的なアニオン交換クロマトグラムを示す。トリトンＸ−１００のさらなるクリアランスが疎水性相互作用クロマトグラフィー中に達成されることがあるが、トリトンＸ−１００は、生成物とともに疎水性カラムに結合することが想定される。したがって、生成物からのトリトンＸ−１００の除去は、それほど強固でなく、トリトンＸ−１００とアルブミン融合タンパク質との間の選択性に左右される。図３に示すプロセスによる精製後、トリトンＸ−１００レベルが０．１μｇ／ｍＬ未満で測定された（表５を参照）。
【０３６３】
実施例６
アニオン交換膜クロマトグラフィー
フロースルーモードで操作されるアニオン交換（ＡＥＸ）膜は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、およびウイルスなどの宿主細胞不純物の優れた除去をもたらし得る。ｐＩが典型的には７．５〜９．５の範囲内である場合のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）では、フロースルーＡＥＸ膜がおよそ中性ｐＨで操作され、収率がしばしば（塩濃度または伝導率とは無関係に）＞９５％であるとき、生成物結合はほとんど重要でない。ｐＨがｍＡｂのｐＩに接近すると、結合が生じる可能性があり、収率が低下する場合がある。ｍＡｂでは、宿主細胞の不純物クリアランスは高ｐＨおよび低塩（または伝導率）の条件下で達成される。したがって、典型的なｍＡｂでは、操作条件は、伝導率が最小化され、ｐＨが可能な限り高い一方でｐＩ未満を維持するように最適化される。
【０３６４】
低いｐＩを有するアルブミン融合タンパク質では、フロースルーＡＥＸ膜クロマトグラフィーステップの展開および最適化はより複雑であり、事前に予測することができない。典型的なｍＡｂと異なり、中性付近のあらゆるｐＨ値で標的分子のＡＥＸ膜への結合が一部存在する可能性が高く、（より少ないタンパク質変化に起因して）より低いｐＨおよび（アルブミン融合タンパク質とクロマトグラフィーリガンドとの間の相互作用を遮蔽することになる）より高い塩濃度で結合低下が想定される。したがって、より高い収率は、より低いｐＨおよびより高い塩濃度で想定されることになる。他方、塩およびｐＨに関連した不純物クリアランスにおける傾向は、より高いｐＨおよびより低い塩濃度がより高い不純物クリアランスをもたらす場合のｍＡｂで見られる傾向を反映するものと想定される。したがって、高収率（低ｐＨおよび高塩）と高純度（高ｐＨおよび低塩）との間で均衡させる必要があり、ｐＨ、塩濃度、および膜負荷を所与の生成物に対して最適化する必要がある。
【０３６５】
ＡＦＰ−１におけるＡＥＸ膜クロマトグラフィーステップを最適化するため、ｐＨ（ｐＨ６．０〜８．０）、ＮａＣｌ濃度（１０〜２２０ｍＭ）、および膜負荷（０．５〜２．５ｇ／ｍＬの膜）を多変量実験設計（ＤｏＥ）において検討した。この試験では、ステップ収率および不純物クリアランスに対する効果を判定するためのエッジに沿う２つの中央ポイント条件および２つの追加ポイントとともに設計空間のコーナーが試験される場合でのスクリーニング設計を用いた。表１３は、ＡＦＰ−１におけるＡＥＸ膜最適化実験の概要である。表１３でわかるように、収率は３つすべての要素による影響を受け、また一般に、より高い収率が低ｐＨ、低塩、およびより高い負荷で得られると想定される傾向に従った。他方、ＤＮＡクリアランスは、より良好なクリアランスがより高いｐＨおよびより低い塩で得られると想定される傾向に従わなかった。その代わり、ＤＮＡクリアランスは、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で最悪であることが認められた。興味深いことに、その効果は単一の要素によって引き起こされなかった。例えば、不純物クリアランスの増加は、強い結合条件（ｐＨ８．０、１０ｍＭのＮａＣｌ）と比べると、弱い（ｐＨ６、２２０ｍＭのＮａＣｌ）および中程度の（ｐＨ６、１０ｍＭのＮａＣｌまたはｐＨ８、１１０ｍＭのＮａＣｌ）結合条件下で認められた。試験した最強の結合条件下に限り、不純物クリアランスが負の影響を受けた。この結果に対する１つの説明が、アルブミン融合タンパク質と不純物との間の競合的結合であってもよい。強い結合条件下において、アルブミン融合タンパク質は、ＤＮＡに対するより低い結合能力および生成物に対するより低い収率をもたらすことになる結合部位に対する競合で優位に立つ場合がある。試験したすべての条件において、ＨＣＰクリアランスが全く認められず、凝集体レベルが比較的不変のままであったことも注目すべきである。
【０３６６】
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑステップにおける上記の最適化試験を完了させる前、収率と不純物クリアランスとの間で均衡させることが必要になることは想定された。しかし、実際に試験では逆のことが認められた。図９は、ｐＨとＮａＣｌ濃度の関数としてのステップ収率およびＤＮＡのログ減少値（ＬＲＶ）の概要である。図でわかるように、収率とＤＮＡクリアランスとの両方は、低ｐＨおよびより高いＮａＣｌ濃度（赤の輪郭によって示される）で最適であることが示された。これはＤＮＡにおける想定外の発見であったが、同様の効果がウイルスクリアランスの場合に認められる場合がある。
【０３６７】
【表１４】
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【０３６８】
実施例７
疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる酸化変異体の制御
本研究で用いたタンパク質は、組換えヒト血清アルブミンに連結された２つのＴｎ３スキャフォールドを含むアルブミン融合タンパク質である。各Ｔｎ３スキャフォールドは、ＣＤ４０Ｌリガンドに結合する能力がある活性部位を含む。アルブミン融合タンパク質は、８つのメチオニン残基（分子のアルブミン部分に６つと、各Ｔｎ３スキャフォールドに１つ）および７つのトリプトファン残基（分子のアルブミン部分に５つ、および各Ｔｎ３スキャフォールドに１つ）を含む。表面領域近傍にあるメチオニン残基およびトリプトファン残基は、細胞培養および／または精製プロセス中に酸化され得る。図１０は、ペプチドマッピング質量分析によって決定される酸化の関数としての相対の効力を示す。明らかなように、分子のアルブミン（Ｍ４９８およびＭ５２９）またはＴｎ３（Ｍ７４およびＭ１７）部分に対するメチオニン酸化は、効力低下に寄与しない。他方、分子の（ＢＣループ上の）活性部位近傍のＴｎ３スキャフォールド上で生じるトリプトファン酸化（Ｗ４６およびＷ１５１）は、分子における効力の低下をもたらす。したがって、トリプトファン酸化は、作製プロセス全体を通して十分に制御される必要がある。
【０３６９】
ＡＦＰ−１の展開および作製中のトリプトファン酸化を監視するため、ペプチドマッピング質量分析、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、およびＨＩＣ−ＨＰＬＣを展開の様々な段階で用いた。メチオニンレベルおよびトリプトファンレベルをかなり正確に測定するために質量分析が使用可能であるが、それは低スループットであり、より多くの時間および資源を伴うことから、典型的には重要な試料の特徴付けのためにそれは用いられる。他方、インプロセス試験ではより迅速なＨＰＬＣ法が使用可能であるが、両方のＨＰＬＣアッセイは欠点を有する。例えば、ＳＥＣ−ＨＰＬＣはトリプトファン酸化を測定可能であるが、トリプトファンショルダーが天然分子から完全に分離されるわけでないことから推定に過ぎない一方、ＨＩＣ−ＨＰＬＣは酸化レベルを正確に測定可能であるが、メチオニン酸化とトリプトファン酸化との間を識別することができない。ＡＦＰ−１酸化のより十分な理解を得るため、展開および作製中に３つすべての方法を利用した。ＡＦＰ酸化定量の特異性を改善することを意図して、ＴＮ３トリプトファン（Ｗ４６およびＷ１５１）酸化を含むペプチドの検出を注視するため、ＲＰ−ＨＰＬＣ法を開発した。その方法は、ＡＦＰ−１の将来のインプロセス試験および品質管理のために用いることができる。
【０３７０】
良好な結果をもたらす酸化制御方法は、酸化の阻害と作製プロセス中に形成する酸化種の除去との両方を包含する。図１１は、Ｃａｐｔｏ  ＢｌｕｅおよびＣａｐｔｏ  Ｑプールにおける時間の関数としてのトリプトファン酸化を示す。これらの実行では、プールは、名目上、精製プロセスにおける作動ｐＨの典型であるｐＨ７〜ｐＨ８であった。図１１でわかるように、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅプールにおける（ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される）トリプトファン酸化は、バイオリアクターに応じて変動し、１０％プロピレングリコール洗浄を用いたときに加え、プールをより低い温度で貯蔵したときに低下した。さらに、１０ｍＭ  ＥＤＴＡのＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅプールへの添加によってもトリプトファン酸化が緩徐化した（データは示さず）。図９でわかるように、Ｃａｐｔｏ  Ｑプールにおけるトリプトファン酸化は無視できるように思われ、Ｃａｐｔｏ  Ｑプールは室温であってもかなり安定的である。
【０３７１】
ＡＦＰ−１のトリプトファン酸化の根本原因をさらに試験するため、Ｃｉｂｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ色素の存在および／または高塩濃度が酸化を引き起こさないことを示すための実験を実施した。ＡＦＰ−１のトリプトファン酸化が初期プロセス試料（条件培地またはＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅプール）中に見出される成分での特有の組み合わせと露光を必要とすることが認められた。トリプトファン酸化の１つの有望な供給源が酵素、例えばトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）またはトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）であり、それら両方はトリプトファンを特異的に酸化し得る。ＴＤＯ２が抗ＴＤＯ２ウエスタンブロットを用いてＣＭ中で陽性に同定されており（図１２参照）、ＡＦＰ−１のトリプトファン酸化を引き起こす可能性がある点は注目すべきである。
【０３７２】
初期プロセスステップ中に酸化が生じると、酸化変異体のレベルは、後の下流プロセスにおいて制御される必要があり得る。ＡＦＰ−１では、トリプトファン酸化を含む過剰量の酸化を除去するため、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップを利用した。図１３は、ＡＦＰ−１における代表的なＨＩＣクロマトグラムを示す。図でわかるように、複数のＨＩＣ樹脂およびマルチモーダルな（カチオン交換／ＨＩＣ）樹脂をＡＦＰ−１の精製について検討した。試験したすべての樹脂において、ＡＦＰ−１は勾配の中央近くで溶出し、トリプトファン酸化の除去に好適であった。ＨＩＣをＡＦＰ−１における勾配溶出中に用いるとき、（メチオニンおよびトリプトファン酸化を含む）酸化生成物は天然生成物より早期に溶出し、ピークの前に濃縮される。調製用スケール条件下において、酸化種がピークの前に濃縮されるが、明確な酸化生成物ピークを見るための分解能が十分でない。
【０３７３】
展開中、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｂｕｔｙｌ−Ｓ）とＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ−６００Ｍ（ＰＰＧ−６００Ｍ）との両方を、酸化生成物を除去するために各カラムが使用可能か否かを見るためにスケールアップし、線形勾配モードで操作した。それぞれの場合、溶出プールを０．５カラム容積の断片でピーク最大まで分画し、次に残存する生成物ピークを単一の最終画分で収集した。両方の実行では、それら画分の酸化された含量（ＨＩＣ−ＨＰＬＣによる）および効力について試験した。図１４は、Ｂｕｔｙｌ−ＳまたはＰＰＧ−６００Ｍクロマトグラフィーの実行中に採取した画分における相対効力対ＨＩＣ−ＨＰＬＣ初期種含量を示す。両方の場合において、（図の右側から始まる）早期に溶出する画分は、（ＨＩＣ−ＨＰＬＣによる測定として）より多くの酸化生成物を含有し、後に溶出する画分（図の左側）よりも低い効力を有した。これらの条件下において、分取ＨＩＣを用いて酸化レベルを制御し、結果として生成物の効力を制御することができる。
【０３７４】
結論
上記は、臨床的または商業的製造に適し得るスケーラブルな技術を用いて、組換えヒトアルブミン（ｒＨＳＡ）およびアルブミン融合タンパク質を精製するための様々な手法を概説している。宿主関連不純物、例えばＨＣＰ、ＤＮＡ、およびウイルスを低減するため、プロセス中の初期ステップを最適化した。Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ色素クロマトグラフィー捕捉ステップは、ＨＣＰを低減するための徹底した洗浄を含み、オクタン酸を伴う選択的溶出を用いた。トリトンＸ−１００ウイルス不活化は、生成物品質に影響を与えることのないエンベロープウイルスの不活化にとって強固な方法であることが示された。ＤＮＡを極めて低いレベルまで低減するため、ＡＥＸカラムおよび膜クロマトグラフィーステップを最適化した。興味深いことに、膜クロマトグラフィーステップは、本研究の前に想定された低ｐＨおよび高塩で最適であることが示された。最終的に、精製プロセスは、それほど強力でないことが示される酸化変異体のレベルを制御するように設計した。制御方法は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅクロマトグラフィーステップ中のプロピレングリコール洗浄と、トリプトファン酸化を制限しやすくするためのＥＤＴＡの溶出緩衝液への添加とを含んだ。さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーを酸化生成物の除去のための有効な選択肢として用いた。精製プロセスは、５００Ｌのバイオリアクターを精製するためにスケールアップし、バッチ間の収率および生成物品質の観点で一貫していることが示された。
【０３７５】
上に示される実施例は、本発明の様々な態様および本発明の方法の実行について例示する。これらの実施例は、本発明の多種の実施形態の詳細な説明を提供することを意図していない。したがって、理解を明確化することを目的に、本発明が例示および実施例によって一部が詳述されているが、当業者は、多数の変化形態および修正形態が添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなくなされ得ることを容易に理解するであろう。
【０３７６】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の個別の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書中に援用されることが詳細かつ個別に示されるのと同程度まで、ここで参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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