(57)【要約】本発明は、負の電荷を有する支持脂質二重層の製造方法に関する。前記方法は、第一の溶媒に溶解した少なくとも三つの脂質（１，２‐ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ‐Ｌ‐セリン（ＤＯＰＳ）、コレステロール及び、ＤＯＰＳ及びコレステロールとは異なる少なくとも一つの脂質）を含む処方を調製し、  前記第一の溶媒を蒸発させ、メソポーラスシリカナノ粒子の水性配合物を添加し、超音波処理を行い、及び遠心分離を行う工程を含む。  前記方法は、ＤＯＰＳの１当量に対するコレステロールの当量数が２．３０〜２．７０である点で顕著である。本発明はさらに、コレステロール、１，２‐ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ‐Ｌ‐セリン（ＤＯＰＳ）及び、ＤＯＰＳ及びコレステロールとは異なる少なくとも一つの脂質を含むメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層に関する。【選択図】図２０
2018520174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メソポーラスシリカナノ粒子上に負の電荷を有する支持脂質二重層を製造する方法であって、前記方法は下記の、
ａ）脂質の処方を調製し、前記脂質が１，２‐ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン  −Ｌ‐セリン、すなわちＤＯＰＳ、コレステロール及び、ＤＯＰＳ及びコレステロールとは異なる少なくとも１つの脂質であり、前記脂質の処方は第１の溶媒に溶解され；
ｂ）前記第１の溶媒を蒸発させ；
ｃ）メソポーラスシリカナノ粒子の水性処方を添加し；
ｄ）遠心分離を行う；
工程を含み、
前記方法は、さらにｃ工程の後及びｄ工程の前に超音波処理を実行する工程を含み、ＤＯＰＳの１当量に対するコレステロールの当量数が２．３０〜２．７０であることを特徴とする方法。
【請求項２】
ＤＯＰＳの１当量に対する前記コレステロールの当量数は２．３５〜２．６５、好ましくは２．４０〜２．６０、より好ましくは２．４５〜２．５５であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＯＰＳの１当量に対する前記コレステロール当量数は２．５０であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
超音波処理を実施する前記工程は、アルゴン雰囲気下、室温で２０分間実施されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＤＯＰＳ及びコレステロールとは異なる、前記少なくとも一つの脂質は、１，２‐ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、すなわちＤＰＰＣであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＯＰＳの１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は、３．５５〜３．９５、好ましくは３．６０〜３．９０、より好ましくは３．６５〜３．８５、さらに好ましくは３．７０〜３．８０であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＯＰＳの１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は３．７５であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記処方は、さらに、１，２‐ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−アミノ（ポリエチレングリコール）２ＫＤａ、すなわちＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）の１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は、６．７０〜８．３０、好ましくは６．９０〜８．１０、より好ましくは７．１０〜７．９０、さらに好ましくは７．３０〜７．７０であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）の１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は７．５０であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第一の溶媒中の前記脂質の処方は、０．５〜１．５ｍｌ、好ましくは０．７５〜１．２５ｍｌの容量、より好ましくは１．０ｍｌの容量で調製されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一の溶媒はクロロホルムとメタノールの混合物であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
メタノールに対するクロロホルムの当量数は、７〜１１、好ましくは７．５〜１０．５、より好ましくは８〜１０、さらに好ましくは８．５〜９．５であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
メタノールに対するクロロホルムの当量数は９．０であることを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の溶媒中の脂質の濃度は２〜１２ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記メソポーラスシリカナノ粒子は、下記の
ａ）シリカ前駆体、界面活性剤及び縮合剤を第二の溶媒中で縮合させ；
ｂ）オルガノトリエトキシシランを添加して、前記シリカ前駆体に対する前記オルガノトリエトキシシランの部分を５〜１５％し；
ｃ）前記界面活性剤を除去する；
工程から得られることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記部分は、６〜１４％、好ましくは７〜１３％、より好ましくは８〜１２％、さらに好ましくは９〜１１％であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記部分は、１０％であることを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記シリカ前駆体はテトラエチルオルトシリケートであり、前記界面活性剤はセチルトリメチルアンモニウムクロライドであり、前記縮合剤はトリエタノールアミンであり、及び／または前記オルガノトリエトキシシランは（３−アミノプロピル）トリエトキシシランであることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記シリカ前駆体１当量に対する縮合剤の当量数は、１．６〜２．４、好ましくは１．７〜２．３、より好ましくは１．８〜２．２、さらに好ましくは１．９〜２．１であることを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記シリカ前駆体１当量に対する縮合剤の当量数は、２．０であることを特徴とする請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記シリカ前駆体１当量に対する界面活性剤の当量数は、０．２２〜０．３０、好ましくは０．２３〜０．２９、より好ましくは０．２４〜０．２８、さらに好ましくは０．２５〜０．２７であることを特徴とする請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記シリカ前駆体１当量に対する界面活性剤の当量数は、０．２６であることを特徴とする請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記オルガノトリエトキシシランは、１０〜３０分の間、好ましくは１５〜２５分の間、より好ましくは２０分で添加されることを特徴とする請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記界面活性剤を除去する前記工程は、透析プロセスと塩酸中での抽出の組み合わせであることを特徴とする請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶媒はミリＱ水とエタノールとの混合物であることを特徴とする請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記シリカ前駆体の１当量に対するミリＱ水の当量数は、１００〜１３４または２１７〜２５１、好ましくは１０５〜１２９または２２２〜２４６、より好ましくは１１０〜１２４または２２７〜２４１、さらに好ましくは１１６〜１１８または２３３〜２３５であることを特徴とする請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の方法
【請求項２８】
前記シリカ前駆体の１当量に対するミリＱ水の当量数は、１１７．３５または２３４．７であることを特徴とする請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記シリカ前駆体の１当量に対するエタノールの当量数は、２〜８または９〜１４、好ましくは３〜７または１０〜１３、より好ましくは４〜６または１１〜１２であることを特徴とする請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記シリカ前駆体の１当量に対するエタノールの当量数は、５．８８または１１．７６であることを特徴とする請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記メソポーラスシリカナノ粒子は、３〜７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３．５〜６．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは４．０〜６．０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは４．５〜５．５ｍｇ／ｍｌの濃度でミリＱ水に溶解されることを特徴とする請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子は、５．０ｍｇ／ｍｌの濃度でミリＱ水に溶解されることを特徴とする請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子の水性処方は、３．５〜４．５ｍｌの間、好ましくは３．７５〜４．２５ｍｌの間、より好ましくは４．０ｍｌの容量で添加されることを特徴とする請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層であって、前記負の電荷を有する支持脂質二重層は、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン、すなわちＤＯＰＳ、及びＤＯＰＳ及びコレステロールとは異なる少なくとも一つの脂質を含み、前記負の電荷を有する支持脂質二重層は、前記ＤＯＰＳの１当量に対するコレステロールの当量数が２．３０〜２．７０であり、ｐＨ５．８でミリＱ水中で測定したζ電位が−５０ｍＶより低いことを特徴とする支持脂質二重層。
【請求項３５】
ＤＯＰＳの１当量に対する前記コレステロール当量数は２．３５〜２．６５、好ましくは２．４０〜２．６０、より好ましくは２．４５〜２．５５であることを特徴とする請求項３４に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項３６】
ＤＯＰＳの１当量に対する前記コレステロール当量数は２．５０であることを特徴とする請求項３４または３５に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項３７】
前記ＤＯＰＳ及びコレステロールとは異なる少なくとも一つの脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、すなわちＤＰＰＣであることを特徴とする請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項３８】
前記ＤＯＰＳの１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は、３．５５〜３．９５、好ましくは３．６０〜３．９０、より好ましくは３．６５〜３．８５、さらに好ましくは３．７０〜３．８０であることを特徴とする請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項３９】
前記ＤＯＰＳの１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は３．７５であることを特徴とする請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項４０】
前記支持脂質二重層は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−アミノ（ポリエチレングリコール）２ＫＤａ、すなわちＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）をさらに含むことを特徴とする請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項４１】
前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）の１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は、６．７０〜８．３０、好ましくは６．９０〜８．１０、より好ましくは７．１０〜７．９０、さらに好ましくは７．３０〜７．７０であることを特徴とする請求項４０に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項４２】
前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）の１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は７．５０であることを特徴とする請求項４１に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項４３】
前記正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子は、少なくとも一つのシリカ前駆体及び少なくとも一つのオルガノトリエトキシシラン含み、前記シリカ前駆体に対する前記オルガノトリエトキシシランの部分は５〜１５％であることを特徴とする請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項４４】
前記部分は、６〜１４％、好ましくは７〜１３％、より好ましくは８〜１２％、さらに好ましくは９〜１１％であることを特徴とする請求項４３に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項４５】
前記部分は、１０％であることを特徴とする請求項４３または４４に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項４６】
前記シリカ前駆体はテトラエチルオルトシリケートであり、及び／または前記オルガノトリエトキシシランは（３−アミノプロピル）トリエトキシシランであることを特徴とする請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層。
【請求項４７】
ａ）請求項３４〜４６のいずれか一つに記載のメソポーラスシリカナノ粒子上に負の電荷を有する支持脂質二重層及び、
ｂ）少なくとも一つの活性成分
を含む薬物送達に適合した組成物であって、前記少なくとも一つの活性部分が治療特性を示す分子、好ましくは抗癌特性を示す分子であるか、または前記少なくとも一つの活性部分が造影剤であるか、または前記少なくとも一つの活性部分が美容剤であることを特徴とする組成物。
【請求項４８】
前記抗癌特性を示す分子は、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、任意の有糸分裂阻害剤、シスプラチン、5−ＦＵ、テモゾロミド、または任意の他のものの中から選択されることを特徴とする請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記造影剤は、ガドリニウム誘導体、任意のヨウ素誘導体、任意の金誘導体、インドシアニングリーン、ローダミン、フルオレセイン、メチレンブルー、５−アミノレブリン酸、任意のポルフィリン前駆体または任意の他のものであることを特徴とする請求項４７に記載の組成物。
【請求項５０】
前記美容剤は、レチノイン酸、ビタミンＥ、ニコチン酸、アスコルビン酸、任意のＢビタミン、任意の酸化防止剤、または任意の他のものであることを特徴とする請求項４７に記載の組成物。
【請求項５１】
膜の非対称性および/または赤血球の電気伝導性を模倣するように構成された生体模倣化合物としての、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の正に帯電したメソポーラスシリカナノ粒子上の負に帯電した支持脂質二重層の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カプセル化及び材料の送達のためのナノベクターとして使用されるように適合されたメソポーラスシリカナノ材料の合成の分野に関する。より詳細には、本発明は、支持脂質二重層（ＳＬＢ）によって完全に囲まれたメソポーラスシリカナノ粒子の合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メソポーラスシリカナノ材料は、薬物送達、治療イメージング、及び診断などの様々な生物医学的用途を可能にする。  この文脈において、メソポーラスシリカナノ材料（ＭＮＳＰ）は、薬物送達用途のためのベクターとして広く研究されている。
【０００３】
メソポーラスシリカマイクロまたはナノ粒子は、一般的に、テンプレート支援ゾル−  ゲル法を用いて合成される。
【０００４】
これらのＭＳＮＰの周りに様々な構造、例えば支持脂質二重層（ＳＬＢ）を結合させるために、ＭＳＮＰの外表面上にある反応性部分でＭＳＮＰを官能化することができ、続いてさらなる官能化を可能にする。
【０００５】
様々な方法の中で、非特許文献１は、ＭＳＮＰ、特に官能化されたＭＳＮＰの自己集合を報告している。  自己集合は、シリカ種の縮合速度を遅くすることになる、ポリアルコールを含有するアルカリ性水媒体中で、構造指向剤として使用される界面活性剤、シリカ前駆体、及びナノ粒子の外面上に機能性部分を提供するオルガノトリエトキシシランを混合することによって提供される。
【０００６】
界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムクロライド（ＣＴＡＣｌ）である。
【０００７】
シリカ前駆体は、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）である。
【０００８】
オルガノトリエトキシシランは、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）である。  それは、また、例えば、フェニルトリエトキシシラン（ＰＴＥＳ）であることも可能である。
【０００９】
ポリアルコールは、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）である。
【００１０】
Ｂｅｉｎの研究グループによって提供されるプロトコルは、官能化されたＭＳＮＰの自己集合を提供するために、前記試薬の全ての同時縮合を必要とする。
【００１１】
従って、水中のＴＥＯＳ、ＣＴＡＣｌ、ＴＥＡの第一の混合物が調製され、ＴＥＯＳ及びオルガノトリエトキシシランの混合物と共縮合される。ＴＥＯＳ及びオルガノトリエトキシシランを含む第二の混合物は、常にシラン１８５μｍｏｌ、すなわちＭＳＮＰの調製に関与するシランの総量の２％を含有していた。
【００１２】
第二の混合物は、ナノ粒子の成長に応じて、異なる時間に第一の混合物に添加することが可能である。
【００１３】
この上記の共縮合原理及びそのような比を使用することにより、非凝集官能化ＭＳＮＰが得られた。しかしながら、官能化された収率、すなわちナノ粒子の外面に組み込まれたオルガノトリエトキシシランの収率は、オルガノトリエトキシシランの出発濃度に依存し、常にＭＳＮＰの製造に関与するシランの総量２％未満である。
【００１４】
アミノ基を有するナノ粒子の官能化の収率（続いて、オルガノトリエトキシシランとしてＡＰＴＥＳを使用する）は、ζ電位測定を使用して報告された。
【００１５】
ｐＨ６で１０または３０分の粒子成長後に実施されたζ電位実験は、０〜５ｍＶのζ電位を示す。より酸性のｐＨ値では、ζ電位は論理的に増加する（粒子成長の３０分後に、ｐＨ４で１０ｍＶまで、及びｐＨ２で２５ｍＶ以上まで）。
【００１６】
共縮合経路が実施されない時、すなわちオルガノトリエトキシシラン（ＭＳＮＰの調製に関与するシランの総量の２％に等しい濃度で）を直接（ＴＥＯＳとの縮合なしで）添加した時、得られた最終ナノ粒子  は（ＡＰＴＥＳが使用された場合には）凝集されたか、または（ＰＴＥＳが使用された場合には）非官能化されたかのいずれかである。
【００１７】
これらの結果は、オルガノトリエトキシシランをこの濃度で使用すると、形成中のナノ粒子の細孔及びチャネルが閉塞されることを示唆している。  しかしながら、予め共縮合を行うと、オルガノトリエトキシシランが加水分解されてオリゴシリケートアニオンが形成され、その後ナノ粒子成長中に構築されたシリカ壁と反応することが可能である。
【００１８】
ＭＳＮＰは、薬物送達ベクターとしての医療用途にはまだ承認されていない。多様な結果が議論され、毒性及び生体内分布がシリカＮＰ型の形状、構造、官能化及びサイズに依存することが実証されている。
【００１９】
一般的に、ＭＳＮＰは静脈内投与されることが期待され、キャリアとしての将来の能力は薬物送達性能及び生体適合性に依存する。この文脈において、いくつかの報告は、表面官能化、サイズ及び形状にも依存するＭＳＮＰの血中毒性に焦点を当てている。文献では、溶血アッセイの大部分がＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液中で実施されている。  例えば、非特許文献２では、４０〜８０ｎｍのＭＳＮＰ上のタンパク質コロナが溶血抑制を誘導することを実証されている。  しかしながら、溶血がないことは、赤血球（ＲＢＣ）に影響がないことを意味するものではない。  再成形またはストレスピーク形成は、ＲＢＣの変形能及び、したがって、システムの生体適合性を妨げる可能性がある。
【００２０】
ＭＳＮＰによって誘導されたＲＢＣの溶血を減少させるためにいくつかの官能化が試験されている。  ペグ化されたコーティングは、この目的のために極めて効率的であると非特許文献３に記載されている。それにもかかわらず、ＰＥＧコーティングに基づく薬物送達設計では、親水性薬物の大きな「バースト効果」が予測され、疎水性薬物のバースト効果の程度は低いと予測される。この欠点を回避するために、小さなナノ粒子、ポリマークッション、有機コルクまたは脂質を使用することによって、細孔を密封することが可能である。
【００２１】
この文脈において、支持脂質二重層（ＳＬＢ）に基づくコーティングが現れており、薬物放出を制御し、ＭＳＮＰの生体適合性を改善する上で重要な利点を提示する。
【００２２】
この関心にもかかわらず、１００ｎｍ未満のＭＳＮＰ上のＳＬＢの吸着を達成する方法はほとんど記載されていない。  Ｂｒｉｎｋｅｒのグループは、メソポーラスＭＣＭ−４１ナノ粒子を、実行され，精製されたリポソームと混合することによって、いわゆる「プロトセル」に合成される。  その場合、ナノ粒子のサイズは一般的に１００ｎｍより大きく、多孔質マトリックスはハニカム構造のように組織化されていた。Ｂｒｉｎｋｅｒｓ及び共同研究者の方法（非特許文献４）は、カチオン性シリカナノ粒子を用いた陰イオン性リポソームの合成、押出及び機械的撹拌、続いてカチオン性脂質のポスト挿入を含む。  このポスト挿入がなければ、負の電荷を有するＳＬＢがメソポーラスコアを部分的にしか覆わないことが示唆された。  Ｂｅｉｎのグループは溶媒交換法に基づいて５５  ｎｍのＭＳＮＰ上にＳＬＢを形成する新しい方法を提案した（非特許文献５）。  しかし、彼らの研究では、蛍光相互相関（ＦＣＣＳ）法は、ＳＬＢが非欠陥支持二重層であることを直接的に実証することは不可能である。
【００２３】
この種の支持二重層は、材料（例えば薬物）の送達中に異なる種類の問題を抱える。
【００２４】
カチオン性シリカＮＰ、カチオン性金ＮＰまたはポリエチレンイミンポリマーに基づくＮＰなどのカチオン性ＮＰは、いくつかの報告において、原形質膜モデルにおける欠陥を生成するものとして実証された（非特許文献６及び非特許文献７）。
【００２５】
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム  −  プロパン（ＤＯＴＡＰ）脂質を含むカチオン性脂質ＮＰは潜在的に毒性であり、免疫毒性（非特許文献８）及びＲＢＣ溶解（非特許文献９）を誘発する。
【００２６】
非遺伝子送達用途では、カチオン性ＮＰを使用する必要はない。したがって、中性または陰イオン性のＳＬＢを使用することが可能である。  陰イオン性ＳＬＢは、ＲＢＣまたは血漿タンパク質間の相互作用を減少させ、したがって、血液中のＭＳＮＰの安定性を増加させる可能性がある。しかしながら、ＭＳＮＰ上に欠陥のない陰イオン性ＳＬＢを達成する方法は記載されていなかった。
【００２７】
特許文献１には、リン酸脂質二重層を形成するための方法が記載されており、この方法は、シリカ体の懸濁液、例えば予め充填されたシリカ体を適切な溶媒中のリン脂質溶液と接触させることを含む。この文献では、組み合わせた混合物に、例えば、超音波処理を介してエネルギーを供給して、シリカ本体表面をリン脂質二重層でコーティングするのを容易にすることが可能である。１，２‐ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム  −  プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２‐ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ‐Ｌ‐セリン（ＤＯＰＳ）及び１，２‐ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、二重層の形成に適した多数のリン脂質が公知である。
【００２８】
上記方法において、シリカ体と接触するリン脂質リポソームを予備形成する必要はない。サブミクロン構造を形成するプロセスを複雑にし得る脂質相交換を行う必要性を回避するために、シリカ体と接触するのは、むしろ予備形成されたリン脂質膜である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１３８２７８号
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Ｂｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２００８，２０，７２０７−７２１４
【非特許文献２】Ｐａｕｌａ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ，Ｊ．Ｂｒａｚ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１２、２３、１８０７−１８１４）
【非特許文献３】Ｈｅ  Ｑ.  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１０，３１，１０８５−１０９２
【非特許文献４】Ｂｒｉｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００９，１３１，７５６７‐７５６９
【非特許文献５】Ｂｅｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ，２０１０，１０，２４８４−２４９２
【非特許文献６】Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００８，８，４２０―４２４
【非特許文献７】Ｊ.Ｐｈｙｓ.Ｃｈｅｍ．，  １１３，１１１７７‐１１１８５
【非特許文献８】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１０，３１，６８６７−６８７５
【非特許文献９】Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，  ２００５，１３５，１８１―１８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明は、技術的問題として、その構造に欠陥のない陰イオン性ＳＬＢで覆われた非凝集官能化ＭＳＮＰの合成を提供する必要がある。主な目的は、例えば、薬物などの物体のメソポーラスナノ粒子内へのカプセル化を強化することである。目標は比較的安定したＳＬＢを得ることでもある。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明は、メソポーラスシリカナノ粒子上に負の電荷を有する支持脂質二重層を製造する方法であって、前記方法は以下の工程：脂質の処方を調製する工程であって、前記脂質が１，２‐ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン  −Ｌ‐セリン、すなわちＤＯＰＳ、コレステロール及び、ＤＯＰＳ及びコレステロールとは異なる少なくとも１つの脂質であり、前記脂質の処方は第１の溶媒に溶解され；  前記第１の溶媒を蒸発させ；  メソポーラスシリカナノ粒子の水性処方を添加し；超音波処理を行い、及び遠心分離を行う工程を含む  前記方法は、ＤＯＰＳの１当量に対するコレステロールの当量数が２．３０〜２．７０である点で注目に値する。
【００３３】
一実施形態によれば、ＤＯＰＳの１当量に対する前記コレステロールの当量数は２．３５〜２．６５、好ましくは２．４０〜２．６０、より好ましくは２．４５〜２．５５である。
【００３４】
一実施形態では、ＤＯＰＳの１当量に対する前記コレステロール当量数は２．５０である。
【００３５】
一実施形態では、超音波処理を実施する前記工程は、アルゴン雰囲気下、室温で２０分間実施される。
【００３６】
一実施形態では、ＤＯＰＳ及びコレステロールとは異なる、前記少なくとも一つの脂質は、１，２‐ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、すなわちＤＰＰＣである。
【００３７】
一実施形態では、前記ＤＯＰＳに対する前記ＤＰＰＣの当量数は、３．５５〜３．９５、好ましくは３．６０〜３．９０、より好ましくは３．６５〜３．８５、さらにより好ましくは３．７０〜３．８０である。
【００３８】
一実施形態では、前記ＤＯＰＳに対する前記ＤＰＰＣの当量数は３．７５であ
る。
【００３９】
一実施形態では、前記処方は、さらに、１，２‐ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−アミノ（ポリエチレングリコール）２ＫＤａ、すなわちＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）を含む。
【００４０】
一実施形態では、前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）に対する前記ＤＰＰＣの当量数は、６．７０〜８．３０、好ましくは６．９０〜８．１０、より好ましくは７．１０〜７．９０、さらに好ましくは７．３０〜７．７０である。
【００４１】
一実施形態では、前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）に対する前記ＤＰＰＣの当量数は７．５０である。
【００４２】
一実施形態では、第一の溶媒に溶解された少なくとも三つの脂質を含む前記処方は、０．５〜１．５ｍｌ、好ましくは０．７５〜１．２５ｍｌの容量、より好ましくは１．０ｍｌの容量で調製される。
【００４３】
一実施形態では、前記第一の溶媒はクロロホルムとメタノールの混合物である。
【００４４】
一実施形態では、メタノールに対するクロロホルムの当量数は、７〜１１、好ましくは７．５〜１０．５、より好ましくは８〜１０、さらに好ましくは８．５〜９．５である。
【００４５】
一実施形態では、メタノールに対するクロロホルムの当量数は９．０である。
【００４６】
一実施形態では、前記第一の溶媒中の脂質の濃度は２〜１２ｍｇ／ｍｌである。
【００４７】
一実施形態では、前記メソポーラスシリカナノ粒子は、シリカ前駆体、界面活性剤及び縮合剤を第二の溶媒中で縮合させる工程；オルガノトリエトキシシランを添加して、前記シリカ前駆体に対する前記オルガノトリエトキシシランの部分を５〜１５％にする工程；及び、前記界面活性剤を除去する工程から得られる。
【００４８】
一実施形態によれば、前記部分は、６〜１４％、好ましくは７〜１３％、より好ましくは８〜１２％、さらに好ましくは９〜１１％である。
【００４９】
一実施形態では、前記部分は、１０％である。
【００５０】
一実施形態では、前記シリカ前駆体はテトラエチルオルトシリケートであり、前記界面活性剤はセチルトリメチルアンモニウムクロライドであり、前記縮合剤はトリエタノールアミンであり、及び／または前記オルガノトリエトキシシランは（３−アミノプロピル）トリエトキシシランである。
【００５１】
一実施形態では、前記シリカ前駆体の１当量に対する縮合剤の当量数は、１．６〜２．４、好ましくは１．７〜２．３、より好ましくは１．８〜２．２、さらに好ましくは１．９〜２．１である。
【００５２】
一実施形態では、前記シリカ前駆体の１当量に対する縮合剤の当量数は、２．０である。
【００５３】
一実施形態では、前記シリカ前駆体の１当量に対する界面活性剤の当量数は、０．２２〜０．３０、好ましくは０．２３〜０．２９、より好ましくは０．２４〜０．２８、さらに好ましくは０．２５〜０．２７である。
【００５４】
一実施形態では、前記シリカ前駆体の１当量に対する界面活性剤の当量数は、０．２６である。
【００５５】
一実施形態では、前記オルガノトリエトキシシランは、１０〜３０分の間、好ましくは１５〜２５分の間、より好ましくは２０分で添加される。
【００５６】
一実施形態では、前記界面活性剤を除去する前記工程は、透析プロセスと塩酸中での抽出の組み合わせである。
【００５７】
一実施形態では、前記溶媒はミリＱ水とエタノールとの混合物である。
【００５８】
一実施形態では、前記シリカ前駆体の１当量に対するミリＱ水の当量数は、１００〜１３４または２１７〜２５１、好ましくは１０５〜１２９または２２２〜２４６、より好ましくは１１０〜１２４または２２７〜２４１、さらにより好ましくは１１６〜１１８または２３３〜２３５である。
【００５９】
一実施形態では、前記シリカ前駆体の１当量に対するミリＱ水の当量数は、１１７．３５または２３４．７である。
【００６０】
一実施形態では、前記シリカ前駆体の１当量に対するエタノールの当量数は、２〜８または９〜１４、好ましくは３〜７または１０〜１３、より好ましくは４〜６または１１〜１２である。
【００６１】
一実施形態では、前記シリカ前駆体の１当量に対するエタノールの当量数は、５．８８または１１．７６である。
【００６２】
一実施形態では、前記メソポーラスシリカナノ粒子は、３〜７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３．５〜６．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは４．０〜６．０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは４．５〜５．５ｍｇ／ｍｌの濃度でミリＱ水に溶解される。
【００６３】
一実施形態において、前記メソポーラスシリカナノ粒子は、５．０ｍｇ／ｍｌの濃度でミリＱ水に溶解される。
【００６４】
一実施形態では、前記メソポーラスシリカナノ粒子の水性処方は、３．５〜４．５ｍｌの間、好ましくは３．７５〜４．２５ｍｌの間、より好ましくは４．０ｍｌの容量で添加される。
【００６５】
本発明はさらに、メソポーラスシリカナノ粒子上の負の電荷を有する支持脂質二重層に関する。前記負の電荷を有する支持脂質二重層は、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン、すなわちＤＯＰＳ、及びＤＯＰＳ及びコレステロールとは異なる少なくとも一つの脂質を含む。  前記負の電荷を有する支持脂質二重層は、ＤＯＰＳの１当量に対するコレステロールの当量数が２．３０〜２．７０である点で顕著である。
【００６６】
一実施形態では、ＤＯＰＳの１当量に対する前記コレステロール当量数は２．３５〜２．６５、好ましくは２．４０〜２．６０、より好ましくは２．４５〜２．５５である。
【００６７】
一実施形態では、ＤＯＰＳの１当量に対する前記コレステロール当量数は２．５０である。
【００６８】
一実施形態では、前記ＤＯＰＳ及びコレステロールとは異なる少なくとも一つの脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、すなわちＤＰＰＣである。
【００６９】
一実施形態では、前記ＤＯＰＳの１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は、３．５５〜３．９５、好ましくは３．６０〜３．９０、より好ましくは３．６５〜３．８５、さらに好ましくは３．７０〜３．８０である。
【００７０】
一実施形態では、前記ＤＯＰＳの１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は３．７５である。
【００７１】
一実施形態では、前記負の電荷を有する支持脂質二重層は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−アミノ（ポリエチレングリコール）２ＫＤａ、すなわちＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）をさらに含む。
【００７２】
一実施形態では、前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）の１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は、６．７０〜８．３０、好ましくは６．９０〜８．１０、より好ましくは７．１０〜７．９０、さらに好ましくは７．３０〜７．７０である。
【００７３】
一実施形態では、前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）の１当量に対する前記ＤＰＰＣの当量数は７．５０である。
【００７４】
一実施形態では、前記メソポーラスシリカナノ粒子は、少なくとも一つのシリカ前駆体及び少なくとも一つのオルガノトリエトキシシランを含み、前記シリカ前駆体に対する前記オルガノトリエトキシシランの部分は５〜１５％である。
【００７５】
一実施形態では、前記部分は、６〜１４％、好ましくは７〜１３％、より好ましくは８〜１２％、さらに好ましくは９〜１１％である。
【００７６】
一実施形態では、前記部分は、１０％である。
【００７７】
一実施形態では、前記シリカ前駆体はテトラエチルオルトシリケートであり、及び／または前記オルガノトリエトキシシランは（３−アミノプロピル）トリエトキシシランである。
【００７８】
本発明はさらに、本発明の教示によるメソポーラスシリカナノ粒子上に負の電荷を有する支持脂質二重層及び少なくとも一つの活性成分を含む薬物送達に適合した組成物に関する。前記薬物送達に適合した組成物は、少なくとも一つの活性部分が治療特性を示す分子、好ましくは抗癌特性を示す分子であるか、または前記少なくとも一つの活性部分が造影剤であるか、または前記少なくとも一つの活性部分が美容剤である点で顕著である。
【００７９】
一実施形態では、前記抗癌特性を示す分子は、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、任意の有糸分裂阻害剤、シスプラチン、5−ＦＵ、テモゾロミド、または任意の他のものの中から選択される。
【００８０】
一実施形態では、前記造影剤は、ガドリニウム誘導体、任意のヨウ素誘導体、任意の金誘導体、インドシアニングリーン、ローダミン、フルオレセイン、メチレンブルー、５−アミノレブリン酸、任意のポルフィリン前駆体または任意の他のものである。
【００８１】
一実施形態では、前記美容剤は、レチノイン酸、ビタミンＥ、ニコチン酸、アスコルビン酸、任意のＢビタミン、任意の酸化防止剤、または任意の他のものである。
【００８２】
本発明は、メソポーラスシリカナノ粒子上に負の電荷を有する支持脂質二重層を製造する方法であって、前記ナノ粒子を完全に覆う支持脂質二重層を製造する方法を開示する点で特に興味深い。  前記ナノ粒子の完全な被覆に加えて、この方法はまた、重要なコロイド安定性を有する負の電荷を有する支持脂質二重層を提供する。したがって、例えば薬物などの物体のカプセル化及びこれらの物体の選択的な位置への送達は、これらの安定した支持脂質二重層によって完全に覆われたこの種のナノ粒子を使用することによってかなり強化される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１はＭＳＮＰのＳＥＭ（走査電子顕微鏡）画像であり、そのサイズは５３±６ｎｍ（５０カウント、スケールバー＝５０ｎｍ）である。
【図２】図２はＭＳＮＰのＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）画像であり、そのサイズは５３±６ｎｍ（スケールバー＝５０ｎｍ）である。第二の実施態様による熱装置の概略図である。
【図３】図３はＭＳＮＰのＳＥＭ画像であり、そのサイズは３５±６ｎｍ（５０カウント、スケールバー＝３５ｎｍ）である。
【図４】図４はＭＳＮＰのＴＥＭ画像であり、そのサイズは３５±６ｎｍ（スケールバー＝３５ｎｍ）である。
【図５】図５はＭＳＮＰのＮＴＡ（ナノトラッキング分析）であり、そのサイズは３５±６ｎｍである。
【図６】図６はＭＳＮＰ＋のＳＥＭ画像であり、そのサイズは５０．９±３．６ｎｍ（５０カウント、スケールバー＝５０ｎｍ）である。
【図７】図７はＭＳＮＰ＋のＴＥＭ画像であり、そのサイズは５０．９±３．６ｎｍ（スケールバー＝５０ｎｍ）である。
【図８】図８はＭＳＮＰ＋のＳＥＭ画像であり、そのサイズは３６．５±５ｎｍ（５０カウント、スケールバー＝１００ｎｍ）である。
【図９】図９はＭＳＮＰ＋のＮＴＡ分析であり、そのサイズは３６．５±５ｎｍである。
【図１０】図１０はＣＴＡＣｌテンプレートの存在及びナノ粒子間の凝集を示すＭＳＮＰの硝酸アンモニウム抽出での精製のＳＥＭ画像（スケールバー＝２００ｎｍ）である。
【図１１】図１１は酸透析プロセス後のＭＳＮＰのＳＥＭ画像（スケールバー＝２００ｎｍ）である。
【図１２】図１２は全抽出後の水中に分散したＭＳＮＰのＳＥＭ画像（スケールバー＝２００ｎｍ）である。
【図１３】図１３はＳＬＢによって被覆されたＭＳＮＰのＣＲＹＯ−ＴＥＭ写真で、そのサイズは６２．３±６．５ｎｍであり、ＳＬＢサイズは約４．７±０．６ｎｍである。
【図１４】図１４はＳＬＢの完全性を示す、ＳＬＢによって被覆されたＭＳＮＰのＣＲＹＯ−ＴＥＭ写真である。
【図１５】図１５はＳＬＢによって被覆されたＭＳＮＰのＣＲＹＯ−ＴＥＭ写真であり、ＭＳＮＰ周辺のリポソームの出現を示している。
【図１６】図１６はＳＬＢＰＥＧで覆われたＭＳＮＰのＣＲＹＯ−ＴＥＭ写真であり、そのサイズは６５．３±１．６ｎｍである。
【図１７】図１７は従来技術のプロトコルに従って行われた合成のＮＴＡ（Ｎａｎｏ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）である。
【図１８】図１８は従来技術のプロトコルに従って行われた合成のＣＲＹＯ−ＴＥＭ写真である。
【図１９】図１９は３５±６ｎｍのサイズを有するＭＳＮＰのＮＴＡ分析である。ミリＱ水中でのＭＮＳＰ＋のＮＴＡ分析を示している。
【図２０】図２０は、３５±６ｎｍのＭＳＮＰサイズを有する、ＳＬＢによって被覆されたＭＳＮＰのＣＲＹＯ−ＴＥＭ写真である。
【図２１】図２１は３５±６ｎｍのＭＳＮＰサイズを有する、ＳＬＢによって被覆されたＭＳＮＰのＣＲＹＯ−ＴＥＭ写真（１つのリポソーム内のＭＳＮＰ上のズーム領域）である。
【図２２】図２２はナノトラッキング分析（ＮＴＡ）によるシリカナノ粒子のサイズ分析である。
【図２３】図２３はＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ上で実行されたＭＳＮＰ上のＭＳＮＰ、ＭＳＮＰ＋、ＳＬＢ及びＭＳＮＰ上のＳＬＢＰＥＧのζ−電位グラフである。  データは平均±ＳＥであり、3つの独立した実験を表す。
【図２４】図２４はＨＥＰＥＳ緩衝液中のＭＳＮＰ上のＳＬＢのＮＴＡ分析を示している。
【図２５】図２５はＨＥＰＥＳ緩衝液中のＭＳＮＰ上のＳＬＢＰＥＧのＮＴＡ分析を示している。
【図２６】図２６はヒト血清中のＭＳＮＰに関するＮＴＡ分析のフレームを示している。
【図２７】図２７はＰＢＳ緩衝液中の溶血のパーセンテージで表示された放出されたヘモグロビンの定量を示している。列の高さは平均値±ＳＥに対応する。Ｃｔｒｌ  −  ：陰性対照（ＰＢＳ単独）Ｃｔｒｌ  ＋：陽性対照（ミリＱ水のみ）。
【図２８】図２８はＳＬＢ−  ＠  ＭＳＮＰ、ＳＬＢ−/ＰＥＧ＠ＭＳＮＰ、ＭＳＮＰ＋及びＭＳＮＰの表面上の吸着された血漿タンパク質の定量を示している。データは平均±ＳＥである。列間の比較は、３回の独立した実験で実行されたｐ＜０．００１を提供する。ＮＰをヒト血漿中で１時間培養した。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
メソポーラス構造の自己集合は、シリカ前駆体としてテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、細孔テンプレートとして界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムクロライド溶液（ＣＴＡＣＩ）、及び縮合剤としてトリエタノールアミン（ＴＥＡ）を用いた放射状成長によって実現された。
【００８５】
この合成によって、ＴＥＭ及びＳＥＭ写真（図１及び２）によって示されるように、約５４ｎｍの乾燥サイズを有する非凝集ＭＳＮＰが形成された。
【００８６】
より小さいＭＳＮＰは、血液脳関門などの生物学的障壁を横断するための視点で潜在的な関心を有する。この目的のために、２つの試薬を希釈して、約３５ｎｍのサイズの粒子を得ることによってＭＳＮＰのサイズを減少させた。  反応物質の濃度が減少すると、シリカ核の縮合が遅くなり、それが、これらのＭＳＮＰのサイズの減少を説明することができる（図３及び図４）。
【００８７】
流体力学的サイズの研究中に、Ｎａｎｏ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＮＴＡ）（図５）を使用することによって、３５ｎｍのＭＳＮＰの少なくはあるが依然として有意な粒子間凝集が観察された。３５ｎｍのＭＳＮＰは、それらのサイズが小さいため、５５ｎｍのものよりも水中で凝集する傾向がある。
【００８８】
アミノ部分を有するＭＳＮＰの官能化は、正の電荷を有するナノ粒子を提供する。  これらの正の電荷を有するナノ粒子（ＭＳＮＰ＋）は、負の電荷を有する支持脂質二重層などの負の電荷を有する構造に取り込まれるために使用される。
【００８９】
高濃度のアミノ部分は、負の電荷を有する支持脂質二重層及びＭＳＮＰ＋間の静電相互作用を強化することが期待される。  このようなアミノコーティングを達成するために、ＭＳＮＰ５５及び３５ｎｍ合成の開始の２０分後に（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を添加した。  孔を覆うテンプレートＣＴＡＣｌの存在により、このプロセスは、内側面の前に外側ナノ粒子表面を官能化することを可能にする。しかしながら、ＡＰＴＥＳのナノ粒子内部への拡散のために内面の官能化を排除することは不可能である。
【００９０】
図６及び図７は、各々、５０．９±３．６ｎｍのサイズを有するＭＳＮＰ＋のＳＥＭ及びＴＥＭ画像を示している。
【００９１】
官能化されていないＭＳＮＰと比較して、サイズのわずかな増加が観察される。  ３５ｎｍのＭＳＮＰについても同様のアミノコーティングプロセスが開発された。  ＭＳＮＰ＋（３５ｎｍ）のＳＥＭ特性を図８に示す。これらの粒子の乾燥サイズは、３５ｎｍの非官能化ＭＳＮＰと比較して有意に変化しない。  それにもかかわらず、水中では、ＭＳＮＰ＋（３５ｎｍ））は、図９に示すＮＴＡ分析に示されるように、ＭＳＮＰ（３５ｎｍ）よりも凝集する傾向がある。
【００９２】
ＭＳＮＰ＋及びＭＳＮＰ内のテンプレートを除去するために、いくつかの抽出方法を試験した。酸性条件及びイオン性競合に基づくテンプレート抽出は、テンプレート焼成と比較して粒子凝集を減少させることが記載されている。  エタノール／  ＨＣｌ抽出、酸透析または硝酸アンモニウム抽出のいずれかに基づくいくつかの方法は既に公開されている。
【００９３】
しかしながら、我々のＮＰにこれらの方法を適用すると、ＳＥＭ分析によって示すように（図１０及び１１）、テンプレートを完全に除去することができない。
【００９４】
酸透析及びエタノール／  ＨＣｌ中の抽出の成功した組み合わせは、全抽出後に水中に分散したＭＳＮＰのＳＥＭ写真を示す図１２に表示するように非常に効率的であった。
【００９５】
官能化されたＭＳＮＰ上のアニオン性支持脂質二重層（ＳＬＢ）を、超音波処理を用いてワンポットプロセスで合成した。  超音波処理プロセスは、実際にＳＬＢ内にＭＳＮＰ＋を組み込むことを可能にする。
【００９６】
メソポーラスシリカナノ粒子を被覆する支持脂質二重層の脂質配合物は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ‐Ｌ‐セリン（ＤＯＰＳ）、１，２‐ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−  ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、及びコレステロールが含まれる。
【００９７】
ＰＥＧコーティングを得るために、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−」ホスホエタノールアミン−Ｎ‐（ポリエチレングリコール）−２ＫＤa（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００））をさらに添加する。
【００９８】
処方を調製する場合、脂質を溶媒、好ましくはクロロホルム/メタノールの混合物に９／１のモル比で溶解させる。
【００９９】
薄い脂質フィルムを形成するために、前記処方１ｍｌを蒸発させて前記溶媒を除去する。
【０１００】
このようにしてＤＰＰＣ／ＤＯＰＳ／コレステロールまたはＤＰＰＣ／ＤＯＰＳ  ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）により構成される脂質膜を、５０．９±３．６のナノ粒子サイズを有する官能化されたＭＳＮＰの水溶液４ｍｌの存在下で超音波処理した。
【０１０１】
前記官能化されたＭＳＮＰ水溶液の濃度は、５ｍｇ／ｍＬに固定される。
【０１０２】
水中での脂質膜の超音波処理は、非常に高いせん断力を誘発し、マルチラメラベシクル（ＭＬＶ）からスモールラメラベシクル（ＳＵＶ）の形成を引き起こす。  ＭＳＮＰ＋のようなカチオン性メソポーラスマトリックスの存在下で、脂質の再編成は二つの異なる方法で起こりうる。
【０１０３】
第一のメカニズムは、Ｂｒｉｓｓｏｎ及び共同研究者によって提案されたメカニズムに従って、速やかにメソポーラスコアに吸着されるＳＵＶの現場形成を含むことができる。
【０１０４】
第二の仮説では、ＭＳＮＰを脂質ベシクルの内部に充填することができる。次いで、脂質二重層は、静電気力及び／または水素結合によって、ＭＳＮＰの外層と混合する。
【０１０５】
そのプロセスの最後に、安定なコロイド懸濁液を遠心分離して過剰のリポソームを除去し、粒子を水中に懸濁させた。
【０１０６】
ＳＬＢの完全性を視覚化するために、ＳＬＢ（ＳＬＢ＠ＭＳＮＰ）によって被覆されたＭＳＮＰの懸濁液についてＣＲＹＯ−ＴＥＭ実験を行った（図１３）。すべてのＭＳＮＰ＋（５１ｎｍ）は、負の脂質二重層ＤＰＰＣ／ＤＯＰＳ／コレステロールによって完全にカプセル化され、平均サイズは６２．３±６．５ｎｍになった。二重層のサイズは約４．７±０．６ｎｍである。
【０１０７】
図１４に示すように、ＣＲＹＯ−ＴＥＭ写真から脂質二重層内部の欠陥は観察されなかった。
【０１０８】
興味深いことに、図１５は、ＭＳＮＰ＋の一つがアニオン性リポソームに捕捉されることになる「中間」粒子を示している。この画像は、相互作用のメカニズムが静電気力によって引き起こされ、形成中のリポソーム内のＭＳＮＰ＋のローディング、それに続くカチオン性ＭＳＮＰ＋上のアニオン性二重層の吸着を含む二段階機構に適合し得ることを示唆している。
【０１０９】
超音波処理を用いて、ペグ化ＳＬＢもまたＣＲＹＯ−ＴＥＭ（図１６）によって測定された６５．３±１．６ｎｍのＭＳＮＰ上で合成された。
【０１１０】
処方後、脂質を抽出し、次いで液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法を用いて定量した。  表１は、ＳＬＢ内またはＳＬＢＰＥＧ内のいずれかに取り込まれたＭＳＮＰの合成前後の各脂質の異なるモル比をまとめたものである。
【０１１１】
表１：合成前の各脂質の初期モル比、及びＳＬＢまたはＳＬＢＰＥＧのいずれかを用いたＭＳＮＰの合成及び精製後の最終比。  
データは、３回の独立した実験においてＬＣ−ＭＳにより実施された平均±ＳＥである。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
超音波処理前の脂質モル比及び合成後のＬＣ−ＭＳによって見出された最終比間の変化を見ることができる。ＳＬＢ中のコレステロールの最終モル比は３４％から５０％に増加するが、ＳＬＢＰＥＧを使用するとほとんど変化しないままである。  両方の処方物中のＤＯＰＳの最終モル比はほぼ２で除される。  ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２ＫＤａの最終モル比は初期比に比べて２倍であり、ＤＳＰＥ−ＰＥＧがＭＳＮＰ上のＳＬＢＰＥＧ（ＳＬＢＰＥＧ  ＠ＭＳＮＰ）内にうまく統合されていることが証明されている。
【０１１４】
最終ＳＬＢ中のこの高い量のコレステロール（３６〜５０％）は、ＳＬＢにコロイド安定性を与えるために必要である。  これは、最初のモル比として１当量のＤＯＰＳに対するコレステロールの当量数（２．５０）によって提供される。
【０１１５】
これらの傾向は、超音波処理プロセス中の異なる脂質成分間の動的交換に起因する。  負の電荷を有するＤＯＰＳは、シラノールドメインと比較してアンモニウム部分との親和性がより高いのに対し、ＤＰＰＣはシラノール官能基に吸着されやすい可能性がある。  従って、超音波処理の間に、過剰な脂質は自己集合して、合成の前後の脂質モル比の間のこれらの変動を説明することができる最も熱力学的に安定なＳＬＢを構築することが可能である。
【０１１６】
Ｂｒｉｎｋｅｒ及び共同研究者（Ｊ.Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１３，１６８，２０９−２２４）によって使用された方法と比較して、超音波処理プロセスが、ＭＳＮＰ上のＳＬＢの合成を改善するかどうかを評価するために、  ＳＵＶリポソームＤＰＰＣ  ／  ＤＯＰＳ／コレステロール（８０ｎｍ）を水中でＭＳＮＰ＋（５５ｎｍ）と機械的に混合した。  リポソーム過剰及び粒子再分散の除去後、ナノトラッキング分析（ＮＴＡ）を用いてサイズを分析すると、凝集（図１７）及びＣＲＹＯ−ＴＥＭを示し、ＳＬＢの合成を全く示さなかった（図１８）。  これらの結果は、本発明による超音波処理ステップを介してＭＳＮＰを取り込むＳＬＢは、ナノ粒子のシリカ表面上の予め形成されたリポソームの単純な吸着よりも大きな安定性を提供することを実証している。
【０１１７】
３６．５±５ｎｍのサイズを有するＭＳＮＰ＋を用いると、ＭＳＮＰ上に安定したコロイド懸濁液が得られない。実際、ナノトラッキング分析（ＮＴＡ）（図１９）を使用することにより、流体力学的研究中に、３５ｎｍのＭＳＮＰのわずかではあるが依然として有意な粒子間凝集が観察された。
【０１１８】
ＳＬＢで３５ｎｍのＭＳＮＰを被覆すると、精製後の粒子の強力な凝集が生じる。  これは、ＭＳＮＰ＋３５ｎｍの最初の粒子間凝集及び５５ｎｍのＭＳＮＰよりも有意に高いＮＰ湾曲によって説明することが可能である。これは、カチオン性シリカドメイン及びＳＬＢの負の電荷を有するドメイン間のＳＬＢ及び付随する粒子間凝集における欠陥を誘発し得る。それにもかかわらず、ＭＳＮＰ＋（３５ｎｍ）上の完全なまたは部分的なＳＬＢの存在は、ＣＲＹＯ−ＴＥＭ画像（図２０及び２１）によって示されるように、集合体で見ることができる。
【０１１９】
ＭＳＮＰ上のＳＬＢまたはＳＬＢＰＥＧのζ電位を、異なる培地（ミリＱ水、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びヒト血清）で調べ、ＭＳＮＰ及びＭＳＮＰ＋の類似の物理化学的性質と比較した（図２２及び２３）。  これらの測定は、分析前に濾過またはサイズ排除を実施せずに行った。  サイズはＮＴＡを使用して測定され、ζ電位はＭａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）を使用して測定されている。  ミリＱ水中では、５．８のｐＨ値で、ＭＳＮＰ＋は２６．４７ｍＶの電荷を有するが、ＭＳＮＰ上のＳＬＢまたはＭＳＮＰ上のＳＬＢＰＥＧはそれぞれ−５２及び−５０ｍＶの電荷を有する。  これは、ＭＳＮＰ＋がＳＬＢまたはＳＬＢＰＥＧによって完全に被覆されていることを示すＣＲＹＯ−ＴＥＭ写真（図１４及び図１６）と一致する。
【０１２０】
Ｂｅｉｎの研究グループによって得られた結果と比較して、同様のｐＨ値について、本発明のＭＳＮＰ＋のζ電位は、有意に高い。  実際に、ｐＨ値６．０で、Ｂｅｉｎのナノ粒子のζ電位は０〜５ｍＶ間に含まれる。  これは、発明によるプロトコルに従うと、オルガノトリエトキシシラン、すなわち（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）によるＭＳＮＰの官能化が、すなわちその外表面に反応性有機基を有するナノ粒子中に、ＭＳＮＰ＋をもたらすことが、より有効な方法で進行することを明確に示している。
【０１２１】
さらなる結果（図示せず）は、ｐＨ値４．０で、ζ電位測定値が＋３７ｍＶの電荷をＭＳＮＰ＋に表示することを示している。
【０１２２】
ＭＳＮＰの外表面に多数の反応性有機基が存在すると、最終的なＳＬＢ中の多量のコレステロールと結合した多数のアミノ基の存在が、組み込みを促進し、これらのナノ粒子のＳＬＢへの安定性、より詳細には、自己集合メソポーラスシリカナノ粒子は、ＳＬＢによって完全に覆われている。
【０１２３】
したがって、自己集合ナノ粒子内の任意のタイプの物体のカプセル化は、かなり向上する。
【０１２４】
水中のＭＳＮＰ＋のサイズは約９９ｎｍである。これは、粒子間にＮＨ３＋／Ｓｉ−ＯＨ静電気または水素結合による少数の粒子間凝集体の存在に起因する可能性がある。  ＭＳＮＰ上のＳＬＢは、ＭＳＮＰ＋の水中に配合され、その結果、ＭＳＮＰ＋よりも高い１２７ｎｍのサイズが得られた。これは、ＭＳＮＰ＋の表面に存在する脂質コーティングによって説明することができる。
【０１２５】
ＭＳＮＰ上のＳＬＢ及びＭＮＳＰ上のＳＬＢＰＥＧは、それぞれ１２７ｎｍ及び１４９ｎｍ付近の単分散分布を有するＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ＝  ７．４）において安定である（図２４及び２５）。
【０１２６】
粒子がヒト血清（ｐＨ  ＝  ７．４）中に懸濁されている場合、ζ電位はナノ粒子の種類にかかわらず−１０ｍＶに近い値を有する。  これは、タンパク質コロナによってマスクされた電荷によって説明することができる。  しかしながら、ヒト血清中の単分散は、ＭＳＮＰ及びＭＳＮＰ上のＳＬＢについて維持され、これらの粒子の高い安定性を示唆しているが、ＭＳＮＰ＋のサイズは、１μｍ以上の強い凝集のためにＮＴＡによって測定することができない（図２６）。  これらの結果から、ＭＳＮＰ上のＳＬＢ及びＭＳＮＰ上のＳＬＢＰＥＧは、ＭＳＮＰ＋（ＳＬＢなし）と比較して、この生物学的流体において優れたコロイド安定性を有することが示される。
【０１２７】
ＭＳＮＰとＳＬＢ＠ＭＳＮＰの生物実験
ナノテクノロジーに基づくドラッグデリバリープラットフォームの全身投与は、これらの材料のバイオセーフティーによって緩和される。例えば小分子と比較して。薬物または造影剤は、それらの物理的性質が細胞及び血液成分との相互作用を誘導することができる。カチオン性リポソーム及びカチオン性粒子はそもそも遺伝子送達ベクターとして設計されていた。しかしながら、カチオン性脂質の毒性は、特に薬剤送達用途のための問題として残っている。将来の静脈内薬物送達適用のためにこれらの負の電荷を有する粒子を使用するために、ＭＳＮＰ上のＳＬＢ及びＭＳＮＰ上のＳＬＢＰＥＧの細胞傷害性が調査されている。ＳＬＢナノ粒子の毒性をＭＳＮＰ及びＭＳＮＰ＋と比較した。溶血アッセイは、単離されたヒト赤血球（ＲＢＣ）膜に対するナノ粒子の影響を評価することができる。遠心分離後の上清中の５４０ｎｍでの放出されたヘモグロビンの吸光度を測定することにより、ＲＢＣの破壊を定量した（図２７）。
【０１２８】
ＰＢＳ中のＭＳＮＰは、高濃度で水の陽性対照効果（溶血の１００％）と同程度まで低濃度であっても高い溶血速度を誘発する。
【０１２９】
アミノ基によるＭＳＮＰのコーティングは、それらの溶血効果（ｐ値＜０．００１）を抑制し、それぞれ０．５及び１ｍｇ／ｍＬについて２０％及び４０％にとどまる。  逆に、非常に高濃度（１ｍｇ  /  ｍｌ）でもＭＳＮＰ上のＳＬＢ及びＭＳＮＰ上のＳＬＢＰＥＧではＲＢＣの溶血は観察されなかった。  ＭＳＮＰと比較して、ＰＢＳにおける溶血効果のこの興味深い欠如は、ＭＳＮＰ及びＭＳＮＰ＋と比較して、ＳＬＢの低い表面エネルギーと相関し得る。
【０１３０】
ナノ粒子合成
化学物質
セチルトリメチルアンモニウムクロライド（ＣＴＡＣｌ）、ＴＥＡ：トリエタノールアミン、テトラオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ.から購入した。リン脂質１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＤＯＰＳ）、１，２‐ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）及び１，２‐ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−  〔アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００〕  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２ＫＤａ）はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ.（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から購入した。  酢酸アンモニウム及びメタノールはＢｉｏｓｏｌｖｅから購入した。
【０１３１】
５５ｎｍメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮＰ５５ｎｍ）の合成
Ｒａｄｉｅｙｓ  Ｔｅｃｈ（登録商標）カルーセル中で、アルゴン雰囲気下で１０分間攪拌することにより、１３．７５ｍＬ（７６２．８ｍｍｏｌ）のミリＱ水、２．２３ｍＬ（３８．２ｍｍｏｌ）の無水エタノール及び２．２３ｍＬ（１．６９ｍｍｏｌ）の２５％ＣＴＡＣｌを混合することによって、原液を調製した  。次に、ＴＥＡ（１．７８ｍＬ；  １３．３７ｍｍｏｌ）を添加し、完全に溶解するまで原液と混合した。原液を６０℃で加熱し、次にＴＥＯＳ（１．４５４ｍＬ；  ６．５ｍｍｏｌ）を２〜３分間かけて滴下した。  反応物をアルゴン雰囲気下で２時間撹拌した。  この反応のモル比は、ＴＥＯＳ／ＣＴＡＣｌ／ＴＥＡ／Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ  １／０．２６／  ２／１  １７．３５／５．８８である。
形成されたメソポーラスシリカナノ粒子は、ワームホール型マトリックスを呈する。
【０１３２】
３５ｎｍメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮＰ５５ｎｍ）の合成
この反応の間、試薬混合物を二倍に希釈した。Ｒａｄｉｅｙｓ  Ｔｅｃｈ（登録商標）カルーセル中で、アルゴン雰囲気下で１０分間、２７．５ｍＬ（１．５２ｍｏｌ）のミリＱ水、４．４６ｍＬ（７６．４ｍｍｏｌ）の無水エタノール及び２．２３ｍＬ（１．６９ｍｍｏｌ）の２５％ＣＴＡＣｌを混合することによって、原液を調製した  。次に、ＴＥＡ（１．７８ｍＬ；  １３．３７ｍｍｏｌ）を添加し、完全に溶解するまで原液と混合した。原液を６０℃で加熱し、次に、モル比、ＴＥＯＳ／ＣＴＡＣｌ／ＴＥＡ／Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ  １／０．２６／  ２／２３４．７／１１．７６で、ＭＮＳＰ５５ｎｍと同一の合成プロセスを適用した。
形成されたメソポーラスシリカナノ粒子は、ワームホール型マトリックスを呈する。
【０１３３】
正の電荷を有するメソポーラスシリカナノ粒子の合成（ＭＳＮＰ＋）
ＭＳＮＰ５５ｎｍ反応の２０分後、ＡＰＴＥＳ１５０μｌ（０．６４ｍｍｏｌ）を溶液の内部に添加した。  反応物をアルゴン雰囲気下で２時間撹拌した。この反応物のモル比は、ＴＥＯＳ／ＣＴＡＣｌ／ＴＥＡ／Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ／ＡＰＴＥＳ  １／０．２６／  ２／１１７．３５／５．８８／０．１である。
【０１３４】
テンプレート抽出
テンプレート抽出は、透析法と塩酸洗浄とを組み合わせて実施した。  透析法では、５０ｍＬのメソポーラスシリカナノ粒子を、セルロース（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈ  Ｃｕｔ  Ｏｆｆ＝１５０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）からなる透析膜に移した。ナノ粒子を、３Ｍ酢酸及びエタノール（１：１）を含む混合物１Ｌに対して２４時間、洗浄して、ナノ粒子細孔の中からＣＴＡＣｌを除去した。このプロセスを５回繰り返した。  残留界面活性剤を除去するために、ＮＰをＨＣｌ／エタノール（１００ｍＬのＥｔＯＨ中の２５ｍＬの濃縮ＨＣｌ）溶液中で洗浄し、続いて、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＭ  Ａｌｌｅｇｒａ（登録商標）６４Ｒによって４５０００ｇでの２０分間の遠心分離を実施した。ＮＰを超音波処理下で２時間、抽出溶液中で５回洗浄した。  そして最後に水洗いを一回行った。
【０１３５】
メソポーラスシリカナノ粒子（MSNP）上の支持脂質二重層（SLB）の合成
リン脂質を２〜１２ｍｇ  /  ｍＬの濃度のクロロホルム／メタノール９：１に溶解した。ＭＳＮＰ上のＳＬＢについて、リン脂質比はＤＰＰＣ／ＤＯＰＳ／コレステロール７５／２０／５０であった。  また、ＭＳＮＰのＳＬＢＰＥＧについては、ＤＰＰＣ／ＤＯＰＳ/コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ７５／２０／５０／１０であった。  脂質混合物の全体積は１ｍＬであった。次に、これらの脂質を蒸発させて脂質膜を生成させた。  ５ｍｇ／ｍＬのＭＳＮＰ４ｍＬを脂質フィルムと混合した。  懸濁液を、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ  Ｓｏｎｉｃｓ  Ｖｉｂｒａ  ｃｅｌｌ（登録商標）を用いて、振幅パルスモード１０ｓ／１０ｓの２９％のアルゴン流下、室温で２０分間超音波処理した。  Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＭ  Ａｌｌｅｇｒａ（登録商標）６４Ｒ遠心分離機により４５０００ｇで遠心分離した後、過剰のリポソームを除去した。得られたＭＳＮＰ上のＳＬＢをアルゴン下で４℃で保存した
【０１３６】
ナノ粒子の特性評価
ＸＲＤ分析
ＭＳＮＰ及びＭＳＮＰ＋試料を凍結乾燥によって乾燥させ、１００ｍｇの粉末を得た。シリカナノ材料は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ８  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（登録商標）ＨＲ  ＸＲＤのＸ線回折（ＸＲＤ）によって特徴付けられた。細孔径はＢｒａｇｇの法則ｎλ＝２ｄ  ｓｉｎ  θ（１）により計算した。但し、ｎは回折次数（ｎ＝  １）、λは回折波長（すなわち銅Ｘ線源、λＣｏｐｐｅｒ  =１．５４）、ｄは原子格子面間の格子間隔、θは入射ビーム及び散乱面間の角度である。
【０１３７】
ＢＥＴ実験
ＭＳＮＰ及びＭＳＮＰ＋試料を凍結乾燥によって蒸発させて１００ｍｇの粉末を得た。  ＢＥＴ（Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ）比表面積（ＳＢＥＴ）、比細孔容積（Ｖｐ）及び細孔径（Ｄｐ）を含むテクスチャ特性を、ＡＳＡＰ  ２０１０マイクロメトリクス装置を用いて収集した低温Ｎ２吸着−脱着測定から決定した。  分析前に、静圧が６．６×１０−４Ｐａ未満になるまで１５０℃で、真空下で試料を脱ガスした。比表面積は、ＢＥＴ方程式を使用し、物理的に吸着されたＮ２分子（０．１６２０ｎｍ  ２）の断面積を考慮に入れて、Ｎ２収着等温線から計算した。細孔直径及び細孔径分布は、Ｂａｒｒｅｔ−Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ（ＢＪＨ）法を用いて等温線の脱着分岐線から計算した。
【０１３８】
ＤＬＳ分析
Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）は、動的光散乱サイズ（ＤＬＳ）を使用してＮＰのサイズとζ電位を測定する。  分析は各試料について０．１ｍｇ  /  ｍＬで行った。
【０１３９】
ＮＴＡ分析。
ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）は、ブラウン運動の速度を粒子サイズに関連付ける光散乱法を用いた。この方法は、液体中のＮＰの直接的及びリアルタイムの可視化及び分析を可能にする。ＮＴＡ測定中、ＮＰは集束レーザビームによって照射され、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラのイメージセンサ上で顕微鏡内の個々の粒子によって散乱された光によって分析される。カメラは、溶液中の粒子のフレームを可視化し、記録する。  ＮＴＡソフトウェアは、ブラウン運動下で移動する粒子を識別し、個々に追跡する。この測定は、Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式を用いて粒子サイズを計算するために、液体の温度及び粘度を使用する。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（登録商標）は、３０〜１μｍのサイズ範囲の粒子を分析する。分析のために試料を０．０１ｍｇ  /  ｍＬに希釈した。
【０１４０】
ＦＴ-ＩＲ分光法
各試料を１．５：１００の重量比でＫＢｒと混合した。試料を２分間粉砕し、次いで４５０ｋｇ．ｃｍ-３下でプレスしてペレットにした。  スペクトルは、減衰全反射（ＡＴＲ）を介してＭＣＴ検出器を備えたＦＴＩＲ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＶＥＲＴＥＸ  ７０で行い、ＫＢｒバックグラウンドを差し引く。
【０１４１】
ナノ粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析
各シリカ試料（ＭＳＮＰ＋及びＭＳＮＰ）の一滴を銅支持体上に堆積させ、３時間乾燥させた。２ｋＶで動作するＦＥＩ  ＨＥＬＩＯＳ  ＮａｎｏＬａｂ  ６５０（登録商標）走査型電子顕微鏡で画像を取得した。
【０１４２】
ナノ粒子の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析
ＭＳＮＰの関連する分散を保証するために、１５ｎｍの窒化物単分子層を有するＮａｎｏＰｌｕｓＧｒｉｄを分析支持体として使用した。各シリカ試料の１滴をグリッド上に堆積させ、測定前に完全に乾燥させた。ナノ粒子の形状、多孔度及びサイズは、２００ｋＶで動作するＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｌ（登録商標）透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって特徴付けた。
【０１４３】
ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＣＲＹＯ−ＴＥＭ）分析
ＣＲＹＯ−ＴＥＭ分析の目的は、シリカＮＰを取り囲む脂質二重層の存在を決定することである。  試料を調製するために、ＦＥＩ  ｔｏｏｌ（登録商標）によりカーボングリッド中の液体窒素で試料を凍結させた。  ２００ｋＶで操作されるＦＥＩ  Ｔｉｔａｎ  Ｋｒｉｏｓ（登録商標）ＣＲＹＯ−ＴＥＭを用いて分析を行った。
【０１４４】
ＬＣ−ＭＳ実験
ＬＣ−ＭＳ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｉｏｎｅｘ  ＢＩＯ  ＬＣシステムは、ＬＴＱＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅの質量と結合される。  システムは、熱コンパートメントのオーブンカラムを有するＧＳ５０グラジエントポンプＡＳ５０  Ａｕｔｏ  Ｓａｍｐｌｅｒで構成されている。分離は、３００及び１０００の走査質量を有するＤｉｏｎｅｘ  Ｂｉｏ  ＬＣからＧＲＡＣＥビジョンＨＴ  Ｃ１８  ＨＬカラム（１５０×２．１ｍｍ、３μｍ）上で、４０℃で行った。流速は、移動相で０．２５ｍＬ／分（移動相Ｃ、水中の５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．０）及び移動相Ｄ、メタノール中の５ｍＭ酢酸アンモニウム）であった。二元線形勾配は、Ｃ２０％及びＤ８０％の混合物から開始し、Ｄ１００％で終了した。ＭＳＮＰ上のＳＬＢ及びＭＳＮＰ上のＳＬＢＰＥＧ試料は、ジクロロメタン／メタノール（９：１）の溶液中で直接混合され、  ＭＳＮＰの周りの脂質二重層を不安定化させた。  Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＭ  Ａｌｌｅｇｒａ（登録商標）６４Ｒ遠心分離機によりＮＰを除去し、試料をメタノールで希釈した。  較正範囲は、メタノール中で脂質混合物の濃度１、１０、２５、５０、７５及び１００ｇ／  ｍｏｌで実施した。  試料注入量は５０μＬであった。データ解析は、ソフトウェアＴｈｅｒｍｏＸｃａｌｉｂｕｒ  Ｑｕａｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて行った。  減衰は±６ｐｐｍであった。
【０１４５】
溶血アッセイ
溶血アッセイは、ＰＢＳ緩衝液及びヒト血漿の二つの条件で行った。同意書に署名した健康なドナーからヒト全血を、ＥＤＴＡを含むチューブに新たに採取した。健康なドナー血液の採取と使用は、ルクセンブルグ国立倫理委員会（ＣＮＥＲ）によって承認されている。血液４ｍＬをダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）８ｍＬで希釈した。  赤血球（ＲＢＣ）を２  ５００ｇで１０分間の遠心分離によって単離し、ＰＢＳで３回洗浄した。  次いで、ＲＢＣをＰＢＳ４０ｍＬで希釈した。ヒト血漿は、血液の最初の遠心分離後に採取した。ナノ粒子を、１２５ｍＬ、６２５ｍＬ及び１  ２５０ｍＬ  /  ｍＬの濃度のＰＢＳ０．８ｍＬまたはヒト血漿に希釈し、希釈ＲＢＣ０．２ｍＬを添加して、０．１,０．５及び１ｍｇ  /  ｍＬの最終濃度とした。陽性対照及び陰性対照のために、ＲＢＣ０．２ｍＬを０．８ｍＬの水またはＰＢＳ／ヒト血漿にそれぞれ添加した。溶液を短時間混合し、静的条件で、室温で２時間放置した。次いで、溶液を短時間混合し、５分間、２５００ｇで遠心分離した。  １００μＬの各試料の上清を９６−ウェルプレートに移した。シリカ材料を用いたＲＢＣ懸濁液を、参照波長６４０ｎｍ（ＦｌｕｏＳＴＡＲ  Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）で５４０ｎｍでのヘモグロビンの吸光度で分析した。溶血率は、溶血％=  ［（試料吸光度−陰性対照）／（陽性対照−  陰性対照）〕×１００％の式を用いて計算した。実験を４回繰り返した。
【０１４６】
赤血球（ＲＢＣ）の生体泳動における負の電荷を有する支持脂質二重層（ＳＬＢ）の使用
メソポーラスシリカナノ粒子上の支持脂質二重層（ＳＬＢ）は、複数の用途（薬物送達、イメージングのための造影剤など）のためのナノベクターとして使用することができる。  この目的のために、メソポーラスシリカを貨物として使用することができ、多孔質シリカに吸着されたＳＬＢはゲートキーパの役割を果たす。
【０１４７】
この系の主な欠点の一つは、支持脂質二重層の基質として使用されるＭＳＮＰが７０ｎｍに近いかまたはそれ未満である時のコロイド安定性である。そのような小さなＭＳＮＰの湾曲及びそれらのアニオン電荷の影響は、脂質二重層の被覆に影響を及ぼし、脂質二重層及び／または粒子間凝集の欠陥をもたらし得る。
【０１４８】
これを回避するために、シリカ上の脂質コーティングを安定化するための合成カチオン性脂質（ＤＯＴＡＰなど）の使用、及び／またはペグ化−１，２‐ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などのペグ化リン脂質の使用を複数の報告書が提案している。  カチオン性支持脂質二重層は、血液循環から迅速に除去され、免疫毒性及び細胞膜欠損を誘発し得る。  ペグ化リポソームなどのペグ化脂質二重層は、多重注入後にＣＡＲＰＡ（補体活性化関連偽アレルギー）または他の免疫反応を誘導すると思われる。
【０１４９】
本発明により提案される解決策は、ホスファチジルセリンの非対称性を模倣する生体模倣支持脂質二重層及び赤血球膜の電荷を小さなカチオン性メソポーラスシリカに吸着させることである。この目的のために、高度にアミノ化されたメソポーラスシリカを、室温で超音波処理プロセスの間に、コレステロール３３％、ＤＯＰＳ１３．５％、及びＤＰＰＣ５３．５％から構成される支持脂質二重層によって被覆する（以下の表ＩＩ、  列４を参照）。
【０１５０】
したがって、表２は、コロイド安定性に対する脂質商標の影響を示す：
【０１５１】
【表２】
2018520174.tif 000004
【０１５２】
これらの比は、本発明の表１（コレステロール３４％、ＤＯＰＳ１４％及びＤＰＰＣ５２％）に記載されているように、ＳＬＢを組み込んだＭＳＮＰの合成に使用される比に等しい。
【０１５３】
したがって、１当量のＤＯＰＳに対するコレステロールの当量数は、２．３０〜２．７０であり、この数は好ましくは２．５０に等しい。
【０１５４】
シリカ表面の強い陽イオン電荷は、ＲＢＣ膜と同様にＤＯＰＳを支持脂質二重層の内側リーフレットに引きつけ、ＤＯＰＳ非対称支持脂質二重層を生じる。
【０１５５】
全体の電荷は、ＲＢＣ膜の場合と同様にアニオン性である。
【０１５６】
この特別な目的のために、高度にアミノ化されたメソポーラスシリカ及びＤＯＰＳリポソームが、超音波処理または他のエネルギー源を加えることなく接触しているときに現れるナノ粒子凝集を抑制するために、超音波処理が必要とされる。ＤＯＰＳ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣの速度は、ＳＬＢ中に正孔を誘発する欠陥及びナノ粒子凝集を伴わずにメソポーラスシリカを被覆するために、強い程度のＳＬＢ安定性に達するように設計されている。これらの「アニオ細胞」ナノ粒子は、血漿タンパク質（ペグ化支持脂質二重層と同様）に対して非常に低い結合力を有し、血液細胞（すなわち、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び／またはＲＢＣ）に対して無毒であり、血漿中でさえ良好なコロイド安定性を維持する。提案された支持脂質二重層の無欠陥構造は、メソポーラスシリカに充填された活性成分の拡散を遅延させる（ゲートキーパ活性）。これらの特定の特性は、製造プロセスならびに生体模倣膜を有するように選択された脂質組成物から生じる。
【０１５７】
シリカ表面への血漿タンパク質の吸着は、ＮＰの周りのタンパク質コロナを形成する。  ＭＳＮＰ＋  ＠ＳＬＢ―の抗生物付着特性を調べるために、ＮＰの表面に結合したタンパク質の量を測定した（図２８）。
【０１５８】
注目すべきことに、ＭＳＮＰ  +  ＠  ＳＬＢ―  及びＭＳＮＰ  +  @  ＳＬＢ―／ＰＥＧは、裸のＭＳＮＰと比較して、その表面に５倍少ないタンパク質吸着を示す。
【０１５９】
ＳＬＢ―は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ官能化脂質に類似するタンパク質の非特異的結合を減少させる抗生物付着層のように作用する。この防汚特性は、古典的リポソームと比較して、その結果ＳＬＢ―の異なる挙動を示唆する。これらの結果は、ＳＬＢ―が血中のＭＳＮＰの安定性を改善し、細網内皮系（ＲＥＳ）による望ましくない食作用を減少させることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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