(57)【要約】  本発明は、ヘルペス単純ウイルス感染の受動免疫療法に適するモノクローナル抗体の分野に関し、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に結合して、それらを中和する、ヒトモノクローナル抗体または該抗体のフラグメント、およびＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２関連疾患の予防または処置におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の両方を含む、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、該抗体またはそのフラグメントが、配列番号３、配列番号６、配列番号９および配列番号１２からなる群より選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
該重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号１、配列番号４、配列番号７および配列番号１０、またはそれらの直接的等価物からなる群より選択される、請求項１記載のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
該直接的等価物が、該重鎖可変領域（ＶＨ）と少なくとも９５％の全体配列相同性／同一性を有し、それぞれ独立して、５μｇ／ｍｌ未満の濃度でＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２の活性を５０％まで阻害し得る、請求項２記載のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
該軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１および配列番号１３、またはそれらの直接的等価物からなる群より選択される、請求項１から３のいずれか一項記載のＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
該直接的等価物が、該軽鎖可変領域（ＶＬ）と少なくとも９５％の全体配列相同性／同一性を有し、それぞれ独立して、５μｇ／ｍｌ未満の濃度でＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２の活性を５０％まで阻害し得る、請求項４記載のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
該抗体が、配列番号１の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２の軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する、請求項１から５のいずれか一項記載のＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
該抗体がヒト抗体である、請求項１から６のいずれか一項記載のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
該抗体が、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する、請求項１から７のいずれか一項記載のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
該抗体が、ＩｇＧ２重鎖定常領域を有する、請求項１から８のいずれか一項記載のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項記載のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントならびに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
経口投与、局所投与、点眼投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与または吸入投与のための、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの抗ウイルス剤と組み合わせて使用される、請求項１０または１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２関連疾患の処置に使用するための、請求項１から９のいずれか一項記載のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項１４】
該処置が、少なくとも１つの抗ウイルス剤による以前の処置に対して抵抗性または不耐容である患者に対して行われるか、抗ウイルス剤による処置を避けるべきであるか、または該患者が免疫抑制または免疫不全を呈する場合に行われる、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
該処置が予防または治療である、請求項１３または１４記載の使用。
【請求項１６】
該ＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２関連疾患が、急性または慢性疾患であり、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染が、一次感染、非一次感染または再発である、請求項１３から１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項１７】
該ＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２関連疾患が、口腔ヘルペス、ヘルペス性角膜炎、ヘルペス性ひょう疽、闘技ヘルペス、ヘルペス性湿疹、新生児ヘルペス、性器ヘルペス、異型性性器ヘルペス、ヘルペス性子宮頸炎、ヘルペス直腸炎、ヘルペス脳炎、ヘルペス性髄膜炎、ヘルペス性髄膜脳炎、播種性単純ヘルペスウイルス感染症、アルツハイマー病および認知症からなる群より選択される、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
ウイルス排出を減少させ、および感染を予防するのに使用するための、請求項１から９のいずれか一項記載のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）感染症の受動免疫療法に適するモノクローナル抗体の分野に関し、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に結合してそれらを中和する、ヒトモノクローナル抗体または該抗体のフラグメント、ならびにＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２関連疾患の予防または処置におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染関連疾患は、一般集団の高い感染率のために世界的な健康上の問題である。臨床症状としては、皮膚、口、唇、眼または生殖器に影響を及ぼす、小さな痛みのある疱疹、ならびに発熱および倦怠感などの全身症状が挙げられる。ＨＳＶは、宿主の生存中、感覚神経節および自律神経節中に存続し、周期的に再活性化する。臨床的再発は、ストレス、月経周期、発熱または疾患、日光曝露または日焼けなどの幾つかの刺激によって誘発される。ＨＳＶ感染の臨床経過は、新生児および免疫不全患者において重度かつ生命を脅かす感染症を有する宿主の免疫状態に強く影響される。
【０００３】
一般に、アシクロビルのようなウイルスＤＮＡを標的とする抗ウイルス剤は、ＨＳＶ感染症の管理に用いられる。これらの薬剤は、処置に応答しない耐性ウイルス変異体を生じさせ、潜伏性ウイルスを根絶せず、または感染の伝播を防止しない。
【０００４】
予防ワクチンを開発しようとする試みは、これまでＨＳＶに対する免疫応答の複雑さを解明するのに失敗している。
【０００５】
ＨＳＶ感染症に対する抗体ベースの治療は、抗体応答が多くのウイルス感染を防止するために重要であり、また異なるウイルス感染の解消にも寄与し得るので、重要な関心事である。ウイルス感染が起こると、抗体が、多数のウイルスタンパク質上の多くのエピトープに対して産生される。これらの抗体のサブセットは、中和と称されるプロセスによってウイルス感染を阻止し得る。ＨＳＶ感染症と闘うための新たな戦略および選択肢の必要性が増々感じられている。ＨＳＶ中和活性を有する特定のヒトモノクローナル抗体は、ＨＳＶの予防または処置のための新規、安全かつ有効な薬剤を提供し得る。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
一般にウイルスおよび特にＨＳＶによる自然感染は、他のＩｇＧサブクラスより少ないＩｇＧ２アイソタイプを含む抗体応答を誘発する。
【０００７】
本発明者らは、ＩｇＧ２のこの相対的な不足／欠如が、免疫学的圧力を回避するＨＳＶの能力に関連し得ると考えた。加えて、本発明者らは、ＩｇＧ２の不足／欠如が、免疫応答の存在にもかかわらず、再活性化のためのウイルスの能力に寄与し得ると考えた。
【０００８】
従って、本発明者らは、ＨＳＶ血清陽性の対象の小コホートの血清から精製されたＩｇＧ２画分の特性を評価することにより、ＨＳＶに結合し、それを中和することができるＩｇＧ２の存在が、防御能を有するという仮説を検証した。本発明者らは、高頻度の症状発現(episodes)後に口唇ヘルペスの再活性化がないことが報告された１名の対象から精製したＩｇＧ２画分中に高いＨＳＶ中和活性を実証した。
【０００９】
これらの結果により、本発明者らは、ＩｇＧ２サブクラスのヒトモノクローナル抗体を作製するために、この対象のＩｇＧ２レパートリーをファージディスプレイコンビナトリアルベクターでクローニングし、抗ＨＳＶ抗体を選択することを決定した。実際に、本発明者らは、これらの抗体のいくつかが、報告された臨床的改善の分子的基盤を表す可能性があるＨＳＶに対する強力な中和活性を有する可能性を考慮した。
【００１０】
ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントをコードする遺伝子をクローニングし、それらのうちのいくつかは実際にＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に対して顕著に強い中和活性を有することが実証された。
【００１１】
従って、本発明は、ＨＳＶに特異的かつ選択的であり、ＨＳＶ感染を中和することができるＨＳＶ感染の予防または処置のためのヒトモノクローナル抗体に関する。これらの抗体は、当該分野で公知の治療剤に対する有望な新しい代替薬である。
【００１２】
従って、本発明は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に結合し、ＨＳＶ感染を阻害し得る、モノクローナル抗体および該抗体のフラグメントに関する。
【００１３】
第一の面において、本発明は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の両方を含むＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、該抗体またはそのフラグメントが、配列番号３、配列番号６、配列番号９および配列番号１２からなる群より選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、モノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。
【００１４】
配列番号３、配列番号６、配列番号９および配列番号１２からなる群より選択される配列を有する本発明のＣＤＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）に含まれる。
【００１５】
好ましい態様において、本発明は、配列番号１の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２の軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００１６】
本発明の第二の面において、本発明はさらに、本発明のＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメント、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
第三の面において、本発明は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２関連疾患の予防または処置に用いるための、上記のＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００１８】
本発明の詳細な説明においてさらに記載されるように、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染症の両方を中和するという利点を有する。理論はともかく、本発明のモノクローナル抗体は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方による合胞体（syncytia）の形成を減少させるという利点を有する。
【００１９】
本発明によるヒトモノクローナル抗体は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に対して顕著に強力な中和活性を有する。
【００２０】
これらの抗体の予期せぬ驚くべき特性は、ＨＳＶ感染の分野において満たされていない医療ニーズを満たすことができる。本発明によるＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合および中和モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、臨床的に重要であると強く信じられている。本発明による抗体またはそのフラグメントは、現在利用可能な抗ウイルス薬（例えば、アシクロビル、イバシタビン、ペンシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビア、バラシクロビル、フォスカーネット、シドフォビルなど）の活性を回避することができる単純ヘルペスウイルスに特有の治療ギャップ(therapeutic gap)を満たし得る可能性がある。特に、ある種のヘルペスウイルス変異体が、ヘルペス−チミジンキナーゼ（ＴＫ）および／またはヘルペス−ポリメラーゼなどのウイルスタンパク質を変異させることによって抗ＨＳＶ薬物活性を逃れることができることは、医学文献においてよく知られている。さらに、アシクロビル薬剤耐性は、バラシクロビルおよびファムシクロビルに対する交差耐性を示唆する。ウイルスＴＫおよびウイルスポリメラーゼ酵素から多様なＨＳＶタンパク質を標的化することによってＨＳＶを中和することができる抗体は、上記の現在入手可能な抗ＨＳＶ薬の存在下でも複製できるＨＳＶ臨床分離株に典型的な耐性パターンに潜在的に感受性ではない可能性がある。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントはまた、アシクロビル耐性ウイルスを処置するために現在使用されているが、安全性プロフィールが不良である、フォスカーネットおよびシドフォビルに対する有効な代替薬でもある。臨床的治療における抗体の重要性は、実際に広範に実証されている。特に、Ｆａｂフラグメント、二重特異性または三重特異性Ｆａｂ（それぞれＦａｂ２およびＦａｂ３）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖ（Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、三重抗体（三価抗体）、二価ミニボディ、四価ｓｃＦｖ（テトラボディー）、ナノボディおよび組換え免疫グロブリンなどの作製技術に由来する多様な抗体形態を含むモノクローナル抗体は、生物学的および医学的研究において使用される。最も重要なことには、モノクローナル抗体は、癌（すなわち、乳癌および白血病）、関節炎、喘息、クローン病、乾癬、移植拒絶などの多くのヒト疾患の処置のための治療剤としても成功裏に使用されている。さらに、ウイルス、細菌および真菌に起因する感染症の治療のための新規モノクローナル抗体の開発（すなわち、呼吸器多核体ウイルス感染症におけるパルビツズマブ）は、研究分野および微生物（慢性疾患を引き起こすものを含む）に起因する感染症治療のための新しい戦略の開発における主要な課題である。さらに、上記の感染性因子に対するモノクローナル抗体は、微生物病原体に起因する感染症を予防（および／または制限）することを目的とした新たな予防アプローチの開発にも非常に重要である。さらに、新しい抗体ベースの療法の使用は、抗体の免疫調節能力を利用する可能性を明らかにしている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、２０名の異なる対象由来のヒト血清中のＩｇＧ２の存在を示す。星印は、高いＥＬＩＳＡ−Ｏ．Ｄ（光学密度）シグナルを示す血清を示す。黒色ボックスは、対象番号１８に由来するＩｇＧ２画分の高ＥＬＩＳＡ−ＯＤシグナルを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒト血清（１：１０希釈）で実施した抗ヒトＩｇＧ２抗体で検出したウェスタンブロット（ＷＢ）分析の結果を示す。このアッセイにおいても、対象番号１８由来の血清（白色ボックス）は、高ＩｇＧ２含量を示した。ＷＢ分析は、ＥＬＩＳＡアッセイの結果（図１Ａ）と一致する。
【図２】図２は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２不活性化ウイルスに対するＩｇＧ２反応性を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。対象番号１８由来の血清は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対して高い結合能力を示した。
【図３】図３は、合胞体(syncytia)形成を示すＨＳＶ−１に感染した細胞の１０倍（１０Ｘ）および４０倍（４０Ｘ）の拡大図である。評価は、明視野位相コントラスト光学顕微鏡により定性アッセイで行った。図３ａ：陽性感染（ＨＳＶ−１ウイルスのみ）；図３ｂ：対象番号１８の血清から精製したＩｇＧ２の効果；図３ｃ：対象番号２の血清から精製したＩｇＧ２の効果（陰性試験対照）：図３ｄ：非感染細胞、を示す。
【図４】図４は、合胞体形成を示すＨＳＶ−２に感染した細胞の１０倍（１０Ｘ）および４０倍（４０Ｘ）の拡大図である。評価は、明視野位相コントラスト光学顕微鏡により定性アッセイで行った。図４ａ：陽性感染（ＨＳＶ−２ウイルスのみ）；図４ｂ：対象番号１８の血清から精製したＩｇＧ２の効果；図４ｃ：対象番号２の血清から精製したＩｇＧ２の効果（陰性試験対照）；図４ｄ：非感染細胞、を示す。
【図５】図５は、ＩＩＦ（間接蛍光抗体法）中和アッセイによる定性的中和活性評価を示す。ＩｇＧ２中和能をＨＳＶ−１に対して試験した。図５ａ：陽性感染（ＨＳＶ−１ウイルスのみ）；図５ｂ：対象番号１８の血清から精製したＩｇＧ２の効果；図５ｃ：対象番号２の血清から精製したＩｇＧ２の効果；図５ｄ：非感染細胞、を示す。図５に示すように、ウイルス複製の強力な阻害が、ウイルスを対象番号１８由来の精製ＩｇＧ２と予めインキュベートすることにより観察された（図５ｂに示す通り、緑色蛍光シグナルの不存在は、ウイルス複製の阻害を示す）。矢印は、ＨＳＶ−１に感染した細胞を示す；ヘキスト核染色は、薄い灰色である。
【００２２】
【図６】図６は、ＩＩＦによる定性的中和活性評価アッセイを示す。ＩｇＧ２中和能を、ＨＳＶ−２に対して試験した。図６ａ：陽性感染（ＨＳＶ−２ウイルスのみ）；図６ｂ：対象番号１８の血清から精製したＩｇＧ２の効果；図６ｃ：対象番号１８の血清から精製したＩｇＧ２の効果；図６ｄ：非感染細胞、を示す。矢印は、ＨＳＶ−１に感染した細胞を示す；ヘキスト核染色は、薄い灰色である。
【図７】図７は、プラーク減少技術を用いて行われた定量アッセイを示すヒストグラムである。対象番号１８から精製された（ｐＩｇＧ２−１８） 対 対照（他の複数の対象から精製されたＩｇＧ２）ＩｇＧ２の抗ＨＳＶ−１および抗ＨＳＶ−２中和活性を、このアッセイで評価した。対象番号１８由来の血清から精製されたＩｇＧ２画分は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２試験分離株の両方を強く中和した。
【図８】図８は、用量応答中和アッセイの結果を示すグラフである。このアッセイは、ＩＩＦ技術を用いて行った定量アッセイである（ＨＳＶ感染病巣の正確な数は、ＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  自動化システムを用いて評価した）。用量応答ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２中和アッセイを、ｐＩｇＧ２−１８（対象番号１８の精製したＩｇＧ２）で行った。
【図９】図９は、ＨＳＶ感染細胞におけるバイオパンニングによって選択されたＦａｂクローンの反応性のＩＩＦ分析を示す。構築されたライブラリーから選択されたＦａｂは全て、感染細胞のみを特異的に認識した（緑色のＦＩＴＣシグナルは矢印によって示される）。
【００２３】
【図１０】図１０は、合胞体形成を示すＨＳＶ感染細胞の４０倍（４０Ｘ）の拡大図を示す。評価は明視野位相コントラスト光学顕微鏡により定性アッセイで行った。図１０ａは、非感染細胞を示す：図１０ｂは、ＨＳＶ−１の陽性感染対照を示す；図１０ｃは、ＨＳＶ−２の陽性感染対照を示す；それぞれ、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する精製したＦａｂの効果：Ｆａｂ Ｅｘ２  対  ＨＳＶ−１（１０ｄ）、Ｆａｂ Ｅｘ２  対  ＨＳＶ−２（１０ｅ）；Ｆａｂ Ｅｘ２Ｂ  対  ＨＳＶ−１（１０ｆ）、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｂ  対  ＨＳＶ−２（１０ｇ）；Ｆａｂ Ｅｘ２Ｃ  対  ＨＳＶ−１（１０ｈ）、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｃ  対  ＨＳＶ−２（１０ｉ）；Ｆａｂ Ｅｘ２Ｈ  対  ＨＳＶ−１（１０ｌ）、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｈ  対  ＨＳＶ−２（１０ｍ）、Ｅｘ２Ｉ  対  ＨＳＶ−１（１０ｎ）、およびＦａｂ Ｅｘ２Ｉ  対  ＨＳＶ−２（１０ｏ）。
【図１１】図１１は、５倍（５Ｘ）および２０倍（２０Ｘ）拡大図を示す。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する定性的中和活性を、合胞体形成アッセイにより評価した（感染２１時間後）。画像は、陽性感染（ＨＳＶ−１ウイルスのみ）、非感染細胞、ならびにＦａｂ Ｅｘ２Ｂ、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｃ、Ｆａｂ Ｅｘ２、Ｆａｂ Ｅｘ２ＨおよびＦａｂ Ｅｘ２Ｉ（１０μｇ／ｍＬ）の効果を示す。
【図１２】図１２は、実験セクションで検討したように、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対するＦａｂ Ｅｘ２中和活性評価（ＩＩＦアッセイ）の用量応答曲線を示す。Ｆａｂ Ｅｘ２は、非常に低い濃度（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の試験した分離株の両方について５μｇ／ｍＬ未満）で感染細胞単層に対するＨＳＶ細胞変性効果を５０％低下させた。Ｘ軸は、［Ｌｏｇ１０＊（ｍＡｂのμｇ／ｍＬ）］として表されるＦａｂ濃度を示す。（ＣＩ＝信頼区間）。
【図１３】図１３は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する合胞体形成アッセイによる定性的用量応答中和活性評価の５倍（５Ｘ）および２０倍（２０Ｘ）の拡大写真を示す。画像は、非感染細胞、陽性感染（ウイルスのみ）、１０μｇ／ｍＬ Ｆａｂ Ｅｘ２、５μｇ／ｍＬ Ｆａｂ Ｅｘ２、２．５μｇ／ｍＬ Ｆａｂ Ｅｘ２の効果を示す。ボックスＡおよびＣは、多量のＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２による細胞単層の全破壊を強調する。ＨＳＶ−１感染細胞における細胞毒性作用のＦａｂ Ｅｘ２用量依存的な強力な阻害は、ボックスＢによって強調される。ＨＳＶ−２感染の完全な阻害は、ボックスＤによって強調される。
【００２４】
【図１４】図１４は、プラーク減少アッセイによるＦａｂ Ｅｘ２のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２分離株の両方に対する中和活性を示す。Ｆａｂ Ｅｘ２を、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの濃度で試験した。Ｆａｂ Ｅｘ２は、試験した最低濃度（１μｇ／ｍＬ）でもＨＳＶ−２感染を完全に阻止した。
【図１５Ａ】図１５Ａは、アシクロビルに対する異なる感受性を特徴とするＨＳＶ１およびＨＳＶ２分離株に対するＩｇＧ Ａの中和活性を示す。右側の表は、ＨＳＶの臨床分離株に対するＩｇＧ ＡのＩＣ５０値を示す。赤色のボックスは、ＨＳＶ１および２の対照株を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、血清吸着後アッセイに用いられるＦａｂ ＡおよびＩｇＧ Ａの生物学的活性の比較を示す（子孫ウイルスの中和および細胞間拡散抑制）。
【図１６Ａ】図１６Ａは、カプラン−マイヤー生存曲線を示す。グラフは、致死量ウイルス曝露の２４時間前のＨＳＶ−２曝露に対して（グラフに含まれる対照も同様）、２つの異なる濃度（１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）でＩｇＧ Ａを単回全身投与して処理したマウスの生存率を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、致死量ウイルス曝露の２４時間前のＨＳＶ−２曝露に対して、２つの異なる濃度（１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）でＩｇＧ Ａを単回全身投与して処理したマウスの臨床スコア評価を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、致死量ウイルス曝露の２４時間前のＨＳＶ−２曝露に対して、２つの異なる濃度（１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）でＩｇＧ Ａを単回全身投与して処理したマウスの臨床徴候を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、カプラン−マイヤー生存曲線を示す。グラフは、ＨＳＶ−２曝露に対する両用量群（感染後３０分および２４時間）のマウスの完全な防御（生存率のパーセント）を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＨＳＶ−２曝露に対する両用量群（感染後３０分および２４時間）のマウスの臨床スコア評価を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＨＳＶ−２曝露に対する両用量群（感染後３０分および２４時間）のマウスの臨床徴候を示す。
【００２５】
【図１８Ａ】図１８Ａは、カプラン−マイヤー生存曲線：ＨＳＶ−２曝露の３０分後にＩｇＧ Ａ（単回注射）で処理したマウスコホートの生存率を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＨＳＶ−２曝露の３０分後にＩｇＧ Ａ（単回注射）で処理したマウスコホートの臨床スコア評価を示す。何れかのＩｇＧ Ａ濃度を受容したマウスは、ＨＳＶ臨床徴候を示さなかった。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ＨＳＶ−２曝露の３０分後にＩｇＧ Ａ（単回注射）で処理したマウスコホートの臨床徴候を示す。何れかのＩｇＧ Ａ濃度を受容したマウスは、ＨＳＶ臨床徴候を示さなかった。
【図１９Ａ】図１９Ａは、カプラン−マイヤー生存曲線：ＨＳＶ−２点眼致死曝露後のＩｇＧ Ａの全身投与（単回投与）で処理したマウスの生存率を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＨＳＶ−２またはＨＳＶ−１点眼致死曝露後のＩｇＧ Ａの全身投与（単回投与）で処理したマウスコホートの臨床スコア評価を示す。“Ｙ”軸は、上記の臨床スコアを示す。グラフ上の各値は、各マウス群についての全臨床スコア（０から５）の平均±ＳＥＭを表す。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ＩｇＧ Ａで処理したマウスコホートの臨床徴候を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に結合し、かつＨＳＶ感染性を阻害することができる、モノクローナル抗体および該抗体のフラグメントに関する。
【００２７】
第一の面において、本発明は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の両方を含むＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号３、配列番号６、配列番号９および配列番号１２からなる群より選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体またはそのフラグメントに関する。
【００２８】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、免疫グロブリン（抗体）の可変鎖の一部であり、これらの分子が、その特異的抗原に結合する部位である。ＣＤＲは、分子の最も可変性の部分に対応し、リンパ球によって産生される抗原特異性の多様性にとって重要である。
【００２９】
本発明によるＣＤＲ配列の利点の１つは、これらが、１型（ＨＳＶ−１）および２型（ＨＳＶ−２）の両方のＨＳＶに対する抗体または該抗体のフラグメントの非常に特異的な結合親和性を可能にすることである。
【００３０】
実際、本発明のモノクローナル抗体は、非常に低濃度でも５０％を超えるＨＳＶ阻害能を示す。理論はともかく、この特異性および高いウイルス中和能もまた、ＣＤＲ配列に起因する可能性がある。
【００３１】
さらなる面において、本発明は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、ここで、その重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号１、配列番号４、配列番号７および配列番号１０、またはそれらの直接的等価物からなる群より選択される、抗体またはそのフラグメントに関する。
【００３２】
本明細書で用いる場合、重鎖可変領域（ＶＨ）の直接的等価物とは、好ましくは、該ＶＨ可変領域と少なくとも９５％の全体的な配列類似性、相同性または同一性を有し、それぞれ独立して、５μｇ／ｍｌより低い濃度でＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２の両方の活性を５０％まで阻害する能力を有する、配列を意味する。
【００３３】
本発明のＶＨ可変領域の直接的等価物は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の全体の類似性または相同性を有する。
【００３４】
さらなる面において、本発明は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、ここで、その軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１および配列番号１３、またはそれらの直接的等価物からなる群より選択される、抗体またはそのフラグメントに関する。
【００３５】
本明細書で用いる場合、軽鎖可変領域（ＶＬ）の直接的等価物とは、好ましくは該ＶＬ可変領域と少なくとも９５％の全体的な配列類似性、相同性または同一性を有し、それぞれ独立して、５μｇ／ｍｌより低い濃度でＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２の両方の活性を５０％まで阻害する能力を有する、配列を意味する。
【００３６】
本発明のＶＬ可変領域の直接的等価物は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の全体の類似性または相同性を有する。
【００３７】
本発明において：
−本明細書で用いる用語“ＨＳＶ”は、単純ヘルペスウイルスを意味する。ＨＳＶには、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２という２種のタイプがあり、それらは同様の特性を示す。
−本明細書で用いる用語、ＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に結合する抗体の“フラグメント”は、Ｆａｂ、または対応する抗体に関してより小さなサイズを有する一本鎖抗体フラグメントを意味する。
【００３８】
本発明の目的のために、各抗体領域は以下の対応する配列番号を有する：
配列番号１は、Ｆａｂ Ｅｘ２としても示されるＶＨ１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列に対応する；
配列番号２は、Ｆａｂ Ｅｘ２としても示されるＶＨ１抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に対応する；
配列番号３は、Ｆａｂ Ｅｘ２としても示されるＶＨ１抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号４は、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｂとしても示されるＶＨ３抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列に対応し、そしてＦａｂ Ｅｘ２Ｉとしても示されるＶＨ５１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列に対応する；
配列番号５は、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｂとしても示されるＶＨ３抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に対する；
配列番号６は、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｂとしても示されるＶＨ３抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列に対応し、およびＦａｂ Ｅｘ２Ｉとしても示されるＶＨ５１抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号７は、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｃとしても示されるＶＨ５抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列に対応する；
配列番号８は、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｃとしても示されるＶＨ５抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に対応する；
配列番号９は、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｃとしても示されるＶＨ５抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号１０は、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｈとしても示されるＶＨ４７抗体の重鎖可変領（ＶＨ）域のアミノ酸配列のアミノ酸配列に対応する；
配列番号１１は、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｈとしても示されるＶＨ４７抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に対応する；
配列番号１２は、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｈとしても示されるＶＨ４７抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号１３は、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｉとしても示されるＶＨ５１抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に対応する。
【００３９】
重鎖および軽鎖がそれぞれ一本鎖抗体中に存在する順序は逆転してもよく、したがって、一本鎖抗体は、重鎖−軽鎖または軽鎖−重鎖によって形成され得て、その活性を、鎖の並び順に基づいて先験的に予測することはできない。
【００４０】
有利には、本発明のモノクローナル抗体は、癌患者および移植レシピエントなどの免疫抑制状態にある個体、および免疫不全患者において使用され、かつ有効であり得る。
【００４１】
有利には、本発明のモノクローナル抗体は、新生児において使用され、かつ有効であり得る。
【００４２】
好ましい態様において、本発明は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、ここで、該抗体が、配列番号１の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２の軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する、抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００４３】
現在、アシクロビル（アシクログアノシン）は、ＨＳＶ感染の処置に使用されている。残念ながら、アシクロビルは、全ての場合に、ウイルス複製および感染を制御するのに有効である訳ではない。実際、アシクロビルは、耐性ウイルス変異体によって引き起こされた感染症を処置するために使用されるとき、またはウイルスチロシンキナーゼ（ＴＫ）の新しい突然変異がこの薬物に耐性を与える場合には、有効ではない。
【００４４】
上記の通り、アシクロビル耐性ＨＳＶ感染症を処置するために使用される抗ウイルス薬のうち、フォスカーネット（ホスホノギ酸）およびシドフォビル、ヌクレオチド類縁体が最も重要である。シドフォビルは、その二リン酸形態への細胞内リン酸化を受けた後、ウイルスＤＮＡポリメラーゼによるデオキシシチジン三リン酸のウイルスＤＮＡへの取り込みを競合的に阻害する。薬物の取り込みは、さらなる鎖伸長を妨害する。シドフォビルは、アシクロビルまたはガンシクロビルなどのヌクレオシド類縁体とは異なり、ウイルスキナーゼによってリン酸化されない（従って、活性化されない）
【００４５】
より詳細には、既に議論され、かつ上記の通り、現在利用可能な抗ヘルペス薬は、臨床関連の欠点を有する。より詳細には、アシクロビル薬剤耐性は、他の抗ヘルペス薬に対する交差耐性を示唆し、その結果、ＨＳＶ感染症を処置するための他の経口療法薬はない。代替の静脈内投与および局所投与薬としては、副作用を有する、フォスカーネットおよびシドフォビル製剤が挙げられる。ビダラビン（ウイルスＤＮＡ合成を優先的に阻害するプリン類縁体）は、ヘルペスウイルスに対する活性を有するが、アシクロビル耐性を有する患者に有効ではなく、他の多くの現在使用されている抗ウイルス薬（アシクロビルなど）よりも毒性が高く、かつ代謝安定性が低い。ビダラビンはまた、耐性ウイルス株が存在するという問題を有する。
【００４６】
最後に、フォスカーネットに対する不耐性を示す患者も記載されている。フォスカーネット（アシクロビル耐性ウイルス感染の場合に使用される）に不耐性の患者、または治療に重度の毒性を示す患者のための治療オプションは限られている：連続高用量アシクロビル（３０〜４５ｍｇ／ｋｇ／日）は、免疫不全患者（すなわち、造血幹細胞移植レシピエント）におけるアシクロビル耐性ヘルペスに成功裏に利用されている。残念ながら、ＨＩＶ感染患者におけるこのアプローチに関するデータはない；局所的なシドフォビル投薬は全く標準化されていないが、局所療法（例えば、シドフォビル）もまた考慮され得る。
【００４７】
実施例部分から明らかなように、本発明によるＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に対して強力な中和活性を有し、有利には、抗ウイルス薬剤耐性、低い有効性および安全性、禁忌または不耐性などの、現在利用可能な抗ウイルス療法剤の欠点に対する代替法を提供する。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は、配列番号４の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５の軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００４９】
なおさらなる態様において、本発明は、配列番号７の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号８の軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００５０】
なおさらなる態様において、本発明は、配列番号１０の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００５１】
なおさらなる態様において、本発明は、配列番号４の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１３の軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００５２】
さらなる面において、本発明は、ヒト抗体である、ＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００５３】
動物モデル由来のｍＡｂは、ヒトの治療または予防における投与のために（キメラ化および／またはヒト化により）最適化され得るとしても、完全なヒトｍＡｂは、投与されたヒトｍＡｂが、動物由来のｍＡｂと比較して副作用をもたらす非自己分子として認識され得るリスクが非常に低いため、動物由来のｍＡｂよりも確実に好ましい。さらに、ウイルスに感染した対象によって産生された抗体は、その真の複製形態のウイルスにより誘発されるが、動物の免疫化は、通常、ウイルスの精製タンパク質または非複製形態の注射からなる。結果として、天然宿主において誘発された抗体は、通常、より強い活性を有し、特定立体構造エピトープに対して指向され、およびウイルスのエスケープ変異体の出現による影響を受けにくい。
【００５４】
さらなる面において、本発明は、モノクローナル抗体である、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００５５】
ポリクローナル血清の代わりにモノクローナル抗体を使用することの臨床上の利点は多く、当技術分野でよく知られている（“モノクローナル抗体 対 ポリクローナル抗体：特徴、適用および情報リソースの区別化” N. S. Lipman et al. ILAR J (2005) 46 (3): 258-268および“感染症に対する受動的抗体療法” A. Casadevall et al. Nature Reviews Microbiology 2, 695-703 (September 2004)）。
【００５６】
なおさらなる面において、本発明のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＩｇＧ２重鎖定常領域を有する。
【００５７】
好ましい面において、本発明のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。
【００５８】
原核および真核（全体ＩｇＧ１）産生系の両方における発現率を最適化するために、本発明のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＩｇＧ１抗体に成功裏に変換された。該抗体の可変領域は、有利には、定常領域重鎖（ＨＣ）を含む改変ベクターにクローニングされた。
【００５９】
本発明の、ＩｇＧ１に変換されたＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＨＳＶ−１および２単離物の両方を高力価で認識し、中和することができる。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、発明のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【００６１】
本発明の抗体は、原発性、非原発性および再発性ＨＳＶ感染症の症状を改善することができる。
【００６２】
本発明の抗体は、種々の患者におけるＨＳＶ感染症およびＨＳＶ関連疾患の治療または予防に適している。
【００６３】
さらに、本発明の抗体は、予防および治療の両方のために、局所使用に適している。それらは、より低い機構的毒性（mechanistic toxicity）を有し、関連のある予期せぬ毒性または副作用が起こりにくいため、薬剤療法が禁忌または望ましくない、および罹患の疑いが低い症例にとりわけ適している。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２中和活性を有する特異的モノクローナル抗体を使用する受動免疫療法に基づく新しい治療戦略であるという利点を有し、ＨＳＶ感染症および関連する疾患の処置に有用である。
【００６５】
さらなる面において、本発明の医薬組成物は、経口投与、局所投与、点眼投与、筋肉内投与、静脈内注射、皮下投与、または吸入投与用である。
【００６６】
さらなる面において、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの抗ウイルス剤と組み合わせて使用または投与される。
【００６７】
好ましい面において、抗ウイルス剤は、例えば、アシクロビル、イバシタビン、ペンシクロビル、ガンシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、フォスカーネットまたはシドフォビルからなる群から選択することができる。
【００６８】
なおさらなる態様において、本発明は、ＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２関連疾患の処置において使用するための、上記のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合抗体またはそのフラグメントに関する。
【００６９】
なおさらなる態様において、本発明は、上記のＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２関連疾患の処置において使用するための、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合抗体またはそのフラグメントに関し、該処置は、少なくとも１つの抗ウイルス剤での以前の処置に抵抗性または不耐容である患者に行われるか、抗ウイルス剤での処置を避けるべき場合、または該患者が免疫不全または免疫抑制されている場合に行われる。
【００７０】
好ましい面において、該ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２関連疾患の処置は、予防的または治療的である。
【００７１】
さらに好ましい面において、該ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２関連疾患は、急性または慢性である。
【００７２】
さらに好ましい面において、ＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２関連感染症は、原発性、非原発性または再発性である。
【００７３】
従って、有利には、本発明のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合抗体は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２感染症の種々の臨床症状において有用である。
【００７４】
有利には、本発明のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合抗体は、ウイルス排出を減少させるのに有用である。
【００７５】
有利には、本発明のＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２結合抗体は、感染症伝播を予防するために有用である。
【００７６】
さらなる面において、本発明は、本発明のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体またはそのフラグメントの使用を提供し、ここで、該ＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２関連疾患は、口腔ヘルペス、ヘルペス性角膜炎、ヘルペス性ひょう疽、闘技ヘルペス（herpes gladiatorum）、ヘルペス性湿疹、新生児ヘルペス、性器ヘルペス、異型性性器ヘルペス、ヘルペス性子宮頸炎、ヘルペス直腸炎、ヘルペス脳炎、ヘルペス性髄膜炎、ヘルペス性髄膜脳炎、播種性単純ヘルペスウイルス感染、アルツハイマー病および認知症からなる群より選択される。
【００７７】
序論で述べた通り、ＨＳＶ感染症の処置のための新規治療法の必要性および重要性がますます感じられている。本発明のモノクローナル抗体は、ＨＳＶ中和活性を有し、それ故に、ＨＳＶ感染症の処置に有用である。
【００７８】
本発明の抗体は、ＨＳＶ感染症の処置のための基礎となり得て、ウイルス複製を阻害し、かつ潜在的にウイルス再活性化により引き起こされる組織損傷を制限することにより、感染の治癒に顕著に寄与し得る。これらの活性は、現在の抗ウイルス薬に耐性のＨＳＶ分離株の場合に非常に有用である。
【００７９】
コールド・ソアとしても公知の口腔ヘルペスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２感染症の結果であり得る。ＨＳＶ−２と性感染症との関連性のため、小児の感染は、通常、ＨＳＶ−１の結果である。
【００８０】
主な診断は、ヘルペス性歯肉口内炎であり、一般的な明確な病変が最初に出現し、次いで、白色の外観を有する潰瘍が出現する。感染はしばしば、唇上で始まり、口腔および咽頭の全ての部分に拡がる。三叉神経節からの再活性化は、コールド・ソアとして知られている病変をもたらし得る。ヘルペス咽頭炎は、上気道の他のウイルス感染と関連していることが多い。この疾患は、ＡＩＤＳ患者などの免疫抑制された人々においてはより重症である。
【００８１】
ヘルペス性角膜炎は、眼の感染症であり、主にＨＳＶ−１によって引き起こされる。再発することがあり、失明に至ることがある。これは、米国における、角膜疾患が原因の失明の主要な原因である。
【００８２】
ヘルペス性ひょう疽は、ヘルペスに感染した体分泌物に接触したヒトに影響を与え、何れのタイプのＨＳＶによっても起こり得る。ＨＳＶは、手または手首の小さな傷を介して体内に入る。これは、性器から手へのＨＳＶ−２の移動によっても引き起こされ得る。
【００８３】
闘技ヘルペスは、レスラーによく見いだされる。これは、直接接触することにより、１人のレスラーの皮膚病変から対戦相手に拡がることが明らかであり、通常、頭部および頸部領域（レスリングのホールド技で頻繁に接触する部位）に現れる。奇妙なことに、この病変は、身体の右側にあることが多い（おそらくほとんどのレスラーが右利きであるため）。これは、スクラムポックスとして知られているラグビーのような他の接触スポーツでも見られる。
【００８４】
ヘルペス性湿疹は、活動性湿疹（active eczema）または既存のアトピー性皮膚炎を有する小児に見出される小児の病状である。ＨＳＶは、湿疹病変の部位の皮膚で拡がることがある。このウイルスは、肝臓などの他の臓器にも感染する可能性がある。
【００８５】
新生児ヘルペスは、ＨＳＶ−２の重症疾患であり、致命的であることが多いが、かかる感染はまれである。母親が分娩時にウイルスを流出させる場合、とりわけ感染の可能性がある。ウイルスは、子宮内でまたは分娩時のいずれかで接触され得る。新生児は、未発達の免疫系を有するため、ウイルスは、多くの末梢臓器（例えば、肺および肝臓）に急速に拡がり、中枢神経系に感染し得る。
【００８６】
性器ヘルペスおよびヘルペス直腸炎は、通常、ＨＳＶ−２感染の結果であり、症例の約１０％がＨＳＶ−１の結果である。一次感染は無症候性であることが多いが、多くの痛みを伴う病変が、男性の陰茎の亀頭または中間部分（shaft）および女性の外陰、膣、子宮頸部および肛門周囲に発生し得て、膣分泌物を伴うことがある。種々の感染症はまた、直腸炎を引き起こす。仙骨神経節におけるウイルスの再活性化の結果である、性器ヘルペスの副次的な出現は、最初の出現よりも重症でないことが多い（後の出現は、より短期間である）。再発は、通常、一次ＨＳＶ−２感染に起因する。明らかな活動性疾患があるか否かに関わらず、感染患者は、明白な症状なしに感染したままである。
【００８７】
ＨＳＶ脳炎は、ＨＳＶ−１感染の結果であり、最も一般的な散発性ウイルス脳炎である。ＨＳＶ脳炎は、発熱し、結果として、脊髄液中の血液および発作により臨床的に特徴づけられる、側頭葉の１つに損傷をもたらし得る。この疾患は致死的であり、米国において、年間１０００未満の症例が報告されている。
【００８８】
ＨＳＶ髄膜炎は、ＨＳＶ−２感染の結果である。
播種性単純ヘルペスウイルス感染症は、全身の感染の拡がりである。これは、免疫系の障害を有する患者におけるＨＳＶの深刻かつ声明を脅かす合併症である。
【００８９】
ＨＳＶ−１は、その向神経性、一般集団における感染率の高さ、および神経細胞における、特にアルツハイマー病（ＡＤ）において通常は変化する同じ脳領域における終生持続性のために、ＡＤの病因に役割を果たすことが長い間疑われてきた。
【００９０】
最近のデータ（“β−アミロイドペプチドが、ヒトアルツハイマー病に関連する単純ヘルペスウイルス−１に対して防御活性を示す” Bourgade K et al. Biogerontology. 2014年11月7日）は、アルツハイマー病（ＡＤ）の特徴であるアミロイド斑が、原線維β−アミロイド（Ａβ）１−４０および１−４２ペプチドを含むことを示唆する。ＨＳＶ−１は、危険因子として関与しており、アミロイド斑の中に共局在することが見いだされた。Ａβ１−４０およびＡβ１−４２は、抗細菌活性、抗酵母活性および抗ウイルス活性を示す。
【００９１】
他のデータ（“単純ヘルペスウイルス−１特異的抗体力価と、アルツハイマー病における皮質脳損傷および健忘型軽度認知障害との関係” Mancuso R, et al. Front Aging Neurosci. 2014年10月15日;6:285）は、強力なＨＳＶ−１特異的体液性応答が、ＡＤ関連皮質損傷に対して防御的であり得ることを示唆する。
【００９２】
さらに、ミニボディおよびナノボディのような他の人工形態の小型化（miniaturized）抗体を調製することができる。これらの代替形態は、本発明の抗体から出発して成功裏に調製され、使用され得る。
【００９３】
上記の本発明の種々の態様および側面、ならびに添付の特許請求の範囲も記載される発明は、以下の実施例部分で実施を支持するために見出される。
【実施例】
【００９４】
実施例
上記の説明と共に本発明のいくつかの態様を説明する、以下の実施例に言及する。
特に、以下の部分に記載の通り、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に結合し、かつ中和するモノクローナル抗体の同定のために実施した試験は、以下のようにまとめることができる：
１．対象のポリクローナル血清の分析；
２．ＩｇＧ２画分の精製；
３．血清から精製されたＩｇＧ２の量の評価；
４．ＨＳＶに対するＩｇＧ２結合および中和活性の評価；
５．対象選択；
６．選択された対象からのＩｇＧ２ライブラリー構築；
７．ライブラリバリデーションおよびバイオパニングの最適化；
８．凍結および解凍におけるＦａｂ産生後に選択されたＩｇＧ２抗体クローンの予備スクリーニング；
９．Ｆａｂ ＩｇＧ２クローン精製、配列決定およびＨＳＶに対する中和活性の予備評価；
１０．Ｆａｂ ＩｇＧ１へのクローンの変換；
１１．ＩｇＧ１形質転換クローンの精製および配列決定；それらの中和活性の網羅的かつ定量的な評価（全てのクローンについて中和活性を評価したが、中和活性の網羅的かつ詳細な評価はＦａｂ−Ｅｘ２についてのみ行った）。
【００９５】
対象の選択：基準および結果
選択した対象コホート由来の末梢血サンプルから、ＩｇＧ２画分を収集し、検出し、精製した。
選択基準は以下の通りである：
１）ＩｇＧ２の高含量、２）ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２を認識する能力、および３）ＨＳＶ再活性化の病歴。
【００９６】
対象番号１８からの血清は、全ての上記の第一の選択基準を満たし得る唯一のサンプルであった（図１Ａ、１Ｂおよび２）。対象番号１８は、最近の、かつ自発的な臨床的改善と共に、口唇ＨＳＶの頻繁な再活性化の以前の病歴を報告した。
【００９７】
選択した対象からのＩｇＧ２画分の精製および特徴付け
対象番号１８の血清から精製したＩｇＧ２の量が多く、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＨＳＶ−１および２の両方を認識するその能力を考慮して、この対象の精製ＩｇＧ２のＨＳＶ−１および２感染を中和する能力を調べるために、該対象を選択した。ドナー番号１８からのＩｇＧ２画分を、下記の材料および方法部分に記載のプロトコル（ＩｇＧ２精製および定量プロトコル）を用いて精製した。
【００９８】
【表１】
2018505181.tif 000002
【００９９】
対象番号１８由来のＩｇＧ２画分（ｐＩｇＧ２−１８）は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に対して異常な中和活性を示した。特に、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２試験ウイルスに対するｐＩｇＧ２−１８中和活性を、定性アッセイ（明視野位相コントラスト光学顕微鏡および免疫蛍光アッセイによる合胞体形成評価、図３−６）および定量アッセイ（プラーク減少アッセイおよび間接免疫蛍光（ＩＩＦ）による定量的中和活性評価；図７−８）の両方を用いて評価および確認した。
【０１００】
図３は、異なる実験条件下でのＨＳＶ−１感染細胞の形態を示す。
特に：
−  ＨＳＶ−１感染細胞（陽性感染対照）は、非感染細胞と比較して、ウイルスによって引き起こされた、明らかな細胞単層破壊および合胞体の存在を示す。
−  対照対象からの精製ＩｇＧ２と共にプレインキュベートしたＨＳＶ−１に感染させた細胞は、ウイルスによって引き起こされた、細胞単層破壊および播種性合胞体を示す。
−  対象番号１８からの精製ＩｇＧ２と共にプレインキュベートしたＨＳＶ−１に感染させた細胞は、正常な細胞形態を維持し、合胞体形成の有意な減少を示し、ＨＳＶ−１感染の強力な阻害を示唆する。
【０１０１】
図４は、異なる実験条件下でのＨＳＶ−２感染細胞の形態を示す。
特に：
−  ＨＳＶ−２感染細胞（陽性感染対照）は、非感染細胞と比較して、ウイルスによって引き起こされた、細胞単層破壊および合胞体の強い存在を示す。
−  対照対象からの精製ＩｇＧ２と共にプレインキュベートしたＨＳＶ−２に感染させた細胞は、ウイルスによって引き起こされた、重大な細胞単層破壊および合胞体の存在を示す。
−  対象番号１８からの精製ＩｇＧ２と共にプレインキュベートしたＨＳＶ−２に感染させた細胞は、対照（非感染細胞）と比較して、ほとんど完全な細胞形態の維持を示す。さらに、合胞体形成の顕著に有意な減少があり、ＨＳＶ−２感染の強力な阻害が示唆される。
【０１０２】
図５および６は、異なる実験条件における異なる蛍光パターンを示す。
特に：
−陽性対照は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２によって形成される合胞体に典型的な拡散した細胞質蛍光パターンを示す。
−  対照対象からの精製ＩｇＧ２と共にプレインキュベートしたＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に感染させた細胞は、陽性感染対照において観察されたものと同様の細胞質蛍光パターンを示す。
−  対象番号１８からの精製ＩｇＧ２と共にプレインキュベートしたＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に感染させた細胞は、免疫蛍光シグナルを示さず、ＨＳＶ−１感染の強力な阻害が示唆される。
【０１０３】
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２抗原に対する抗ＨＳＶヒトモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの選択および作製ならびに配列特性決定
ａ．選択された対象由来のファージミドＩｇＧ２ Ｆａｂライブラリー構築
対象番号１８は、その血清から精製されたＩｇＧ２画分により示される、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２試験分離株に対する高い中和活性、およびＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染ＶＥＲＯ−Ｅ６細胞における合胞体形成の阻害のためにＢリンパ球供給源として選択された。
【０１０４】
対象番号１８から、そのＢリンパ球を単離するために、新たな血液サンプルを採取した。これらの細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写した後、ＩｇＧ２  ＨＣ（重鎖）およびＬＣ（軽鎖）を、ファージミドベクターにクローニングした（L Solforosi, et al. “ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの作製およびモノクローナル抗体フラグメントの分子クローニングに最適化されたファージディスプレイベクター” (2012) New Microbiologica 35 (3), 289-294.）。
【０１０５】
ヒトのコンビナトリアルファージディスプレイ抗体ライブラリーを、以下の材料および方法部分に記載のようにして得た。
【０１０６】
ｂ．ライブラリーバイオパニング条件：ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方を認識し、かつ中和できる抗ＨＳＶヒトモノクローナル抗体の分子選択およびクローニングを可能にするバイオパニング条件の開発
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方を交差認識および中和することができるヒトＦａｂフラグメントのクローニングを、そのような生物学的特性を特徴とするヒトＦａｂの分子クローニングを可能にする最適化されたバイオパニング法によって得た。選択ラウンドのスクリーニングを、以下の材料および方法部分に記載の凍結融解法により行った。
【０１０７】
この選択戦略から、５つのヒトモノクローナルＩｇＧ２ Ｆａｂフラグメントを作製した。すなわち：
Ｆａｂ Ｅｘ２：配列番号１および配列番号２に対応する；
Ｆａｂ Ｅｘ２Ｂ：配列番号４および配列番号５に対応する；
Ｆａｂ Ｅｘ２Ｃ：配列番号７および配列番号８に対応する；
Ｆａｂ Ｅｘ２Ｈ：配列番号１０および配列番号１１に対応する；
Ｆａｂ Ｅｘ２Ｉ：配列番号４および配列番号１３に対応する。
【０１０８】
これらの５つのモノクローナルＩｇＧ２ Ｆａｂフラグメントを選択し、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染細胞に対するＩＩＦにおいて試験した（図９）。全ての選択されたクローンは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染細胞の両方を選択的に認識した。
【０１０９】
選択されたＩｇＧ２（Ｇ２）Ｆａｂの産生および親和性クロマトグラフィー精製
選択されたＦａｂは、原核生物系で産生され、以下の材料および方法の部分に記載されるように親和性クロマトグラフィーにより精製された。
【０１１０】
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する精製された選択されたクローンの生物学的活性評価
精製Ｆａｂ（Ｅｘ２（Ｇ２）、Ｅｘ２Ｂ（Ｇ２）、Ｅｘ２Ｃ（Ｇ２）、Ｅｘ２Ｈ（Ｇ２）およびＥｘ２Ｉ（Ｇ２））を、標準量（１０μｇ／ｍＬ）のＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２分離株と共にプレインキュベートした。適当な実験対照も含まれた。異なる“感染混合物(infection-mix)”を用いて、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞を感染させた（培地交換前に２時間吸着）。
【０１１１】
２０時間後、細胞単層を、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２分離株の両方に対するＦａｂ生物学的活性の初期定性評価を可能にするクリスタルバイオレット含有溶液を用いて、固定し、透過性化した（材料および方法部分に記載の方法）。合胞体形成の減少を、明視野位相差光学顕微鏡法によって評価した（図１０）。上記のように、このアッセイは、Ｆａｂ効力の初期評価を可能にした。特に図１０から、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に対するＥｘ２（Ｇ２）の高い中和効力を評価することが可能である。しかしながら、他の４つのＦａｂもまた、ＨＳＶ−１および２分離株の両方に対して良好な中和活性を示した。Ｅｘ２Ｃ（Ｇ２）およびＥｘ２Ｈ（Ｇ２）のみが、Ｅｘ２（Ｇ２）および他のＦａｂと比較したとき、ＨＳＶ−２に対して低い効力を示した。
【０１１２】
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２（５つのＦａｂ）の両方に対するＩｇＧ２選択ＦａｂフラグメントのＩｇＧ１ Ｆａｂへの変換、発現および産生
原核および真核（全体ＩｇＧ１）産生系の両方における発現率を最適化するために、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に対して指向された選択されたＩｇＧ２−Ｆａｂは全て、ＩｇＧ１ Ｆａｂに成功裏に変換された。選択されたＦａｂおよびＬＣに属する重鎖（ＨＣ）上の可変領域は、ＩｇＧ１の定常領域（ＣＨ１）を含む修飾ベクター中に成功裏にクローニングされた（材料および方法部分に記載された方法）。明示的に、または（Ｇ２）によって記載されていないとき、本明細書に記載のＦａｂは、記載の通り、ＩｇＧ２ ＦａｂがＩｇＧ１に変換される。
【０１１３】
ＩｇＧ２選択Ｆａｂを特徴付けるために使用される全ての方法は、選択されたＦａｂのＩｇＧ１形態を特徴付けるために反復されて、ＩｇＧ２およびＩｇＧ１  Ｆａｂ形態のそれぞれの生物学的特性を比較するのを可能にした。
【０１１４】
生物学的活性アッセイから、ＩｇＧ１変換Ｆａｂが依然として高い効力でＨＳＶ−１および２分離株の両方を認識し、中和することができることが実証された。さらに、Ｆａｂ Ｅｘ２のＩｇＧ１形態は、元のクローン形態と比べて増加した効力でＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方を中和することを示すことができた。
【０１１５】
実施された生物学的アッセイを以下に示す：
合胞体形成評価：ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対するＩｇＧ１形態のＦａｂクローンの活性を評価するために行った定性アッセイ
定性アッセイ（材料および方法部分に記載）を、選択された抗ＨＳＶ−１および２  ＦａｂのＩｇＧ１形態で実施した（図１１）。これらのアッセイは、選択されたＦａｂのＩｇＧ１形態もまた、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方を中和することができることを示した（表２）。
【０１１６】
【表２】
2018505181.tif 000003
【０１１７】
抗ＨＳＶ−１および２中和Ｆａｂ（ＩｇＧ１形態）で行った定量アッセイ：
これらのアッセイを実行し、選択された抗ＨＳＶ  Ｆａｂパネルの効力を定量化した。ＨＳＶ−１および２に対するＦａｂ生物活性は全て、ＩＩＦ分析によって最初に評価された。
【０１１８】
Ｆａｂ Ｅｘ２、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｂ、Ｆａｂ Ｅｘ２Ｃ、Ｆａｂ Ｅｘ２ＨおよびＦａｂ Ｅｘ２Ｉの中和活性を、全てのＦａｂのＩＣ５０を形成し、用量応答曲線を得るために、ＩｎＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ自動カウントシステムを用いて評価した。用量−応答曲線を得るために、異なるＦａｂのいくつかの希釈液を用いた。中和実験の全てのセットにおいて、ウイルス感染を阻害することができるＦａｂの正確な量を得るために、生物学的化合物の限界希釈を用いることしかできなかったため、いくつかのＦａｂ希釈を行った。
【０１１９】
さらに、同じ“用量−応答”曲線により、インビトロでのＦａｂ効力を効果的に表すＦａｂ ＩＣ５０の計算が可能になった。ＩＣ５０は、標準量のウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）による細胞単層の感染に起因する細胞損傷を５０％減少させることができるＦａｂ濃度である。
【０１２０】
言い換えれば、低いＩＣ５０は、ウイルス感染を阻害するために必要とされるＦａｂの量が非常に少ないことを意味する。
Ｆａｂ Ｅｘ２をトリプリケートで試験した（エラーバーは、異なるトリプリケートの平均偏差を示す）（図１２）。
【０１２１】
図１２は、上記の定性アッセイにおいて既に試験したＦａｂ Ｅｘ２の用量応答曲線（希釈）を示す。同じグラフから、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ）を用いて抗体のＩＣ５０を計算した。
【０１２２】
Ｆａｂ Ｅｘ２のＩＣ５０を以下にまとめる：
【表３】
2018505181.tif 000004
【０１２３】
ＩｇＧ１ Ｆａｂ Ｅｘ２中和活性の網羅的試験
Ｆａｂ Ｅｘ２は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対して最も有望な結果を示した。
その生物学的活性をさらに特徴付け、確認するために、以下の材料および方法部分に記載の手順に従って、いくつかの中和実験を行った。
【０１２４】
合胞体形成アッセイによる定性的中和活性評価
このアッセイは、Ｆａｂ Ｅｘ２の存在下または不存在下での細胞変性効果（細胞形態の完全破壊）の有無を評価することを可能にする、Ｆａｂの効果的効力を示す。
Ｅｘ２の効力を評価するために、異なる希釈を用いた定性アッセイを行った。合胞体形成アッセイにより、ＨＳＶ−１および２に対して、３種類の異なる濃度のＥｘ２（１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌ）を試験した。
【０１２５】
図１３に明確に示される通り、Ｆａｂ Ｅｘ２は、用量依存的に、ＨＳＶ−１感染を引き起こす、細胞破壊および合胞体形成を強く阻害し、かつ非常に低濃度でＨＳＶ−２感染を完全に阻害することができた。
Ｅｘ２の不存在下での細胞に対するＨＳＶ分離株の細胞変性効果を図１３に示す。
【０１２６】
細胞単層の感染に先立って、Ｆａｂ Ｅｘ２を異なる濃度で同じ感染用量のＨＳＶ−１または２に添加したとき、細胞形態学破壊は、明らかにＦａｂ Ｅｘ２濃度に反比例していた。
合胞体形成アッセイの阻害を伴うFab Ex2について観察された極めて良好な結果は、以下に記載されるFab A中和効力の定量的評価と一致する。
合胞体形成アッセイの阻害を伴うＦａｂ Ｅｘ２について観察された極めて良好な結果は、以下に記載されるＦａｂ Ａ中和効力の定量的評価と一致する。
【０１２７】
プラーク減少アッセイによる定量的中和活性評価
用量応答定量アッセイ：Ｆａｂ Ｅｘ２の存在下または不存在下でのＨＳＶ感染による細胞単層上の溶解プラークの存在を評価することにより、ＨＳＶ感染を阻害するＦａｂ Ｅｘ２の能力を評価した。ＩＩＦ中和データを確認するために、プラーク減少アッセイを定量的評価として行った。文献に広く記載されているように、該プラークアッセイは、ＨＳＶ感染に対する中和活性のインビトロ評価のための選択された実験とみなされ、現在、ｍＡｂ  ＩＣ５０の評価のための至適基準（gold standard）である。
【０１２８】
図１４に示す通り、ＨＳＶ−１および２に対するＦａｂ Ｅｘ２の生物学的活性の用量依存的定量的評価は、前記の定性的結果を裏付けただけではなく、Ｆａｂ Ｅｘ２効率が予想外に高いことも示した。実際、グラフに明らかに示されているように、非常に低い濃度（１μｇ／ｍＬ）でさえも、Ｆａｂ Ｅｘ２は、ＰＦＵ（プラーク形成単位）として測定されたＨＳＶ−１プラーク形成を阻害した。図１４（ＨＳＶ−２中和アッセイ）に示されるように、ＨＳＶ−２分離株に対するＦａｂ Ｅｘ２中和効力がさらに大きいことが実証された。さらに、ＨＳＶ−１中和アッセイは、定性的用量依存アッセイによって既に証明されているように、Ｆａｂ Ｅｘ２用量応答効果を示した。
【０１２９】
Ｆａｂ Ｅｘ２の非常に高い効力のために、用量応答効果は、ＨＳＶ−２分離株を用いて実施された中和アッセイによって測定できなかった。
【０１３０】
選択されたＦａｂクローンの配列試験および遺伝子使用頻度解析
選択されたＦａｂからのＨＣおよびＬＣの両方の配列は、全ての鎖が正しくフレーム上にあり、それらの発現レベルに影響を及ぼし得る終始コドンがないことが明らかにされた。
免疫グロブリン配列の参照データベース（ＩＭＧＴ−http://www.imgt.org）を用いて行われた遺伝子使用分析は、選択されたクローンの、それらの生殖系列配列と比較した場合の突然変異率の予備試験を可能にした（表４）．
【０１３１】
選択された全てのＦａｂクローンは、それぞれの生殖系列配列と比較した場合、それらのＣＤＲ(相補性決定領域)において変異されていた。このことは、異なるクローンが、抗原との接触後に成熟した独特の体細胞変異を示すことを意味する。これは、通常、より特異的な抗原認識を可能にする。
【０１３２】
【表４】
2018505181.tif 000005
【０１３３】
ＩｇＧ Ａとして同定された、完全ＩｇＧ１へのＩｇＧ１ Ｆａｂ Ｅｘ２の変換
一本鎖抗体Ａ（ＳｃＦｖＡ）の産生および評価
ＩｇＧ ＡのＳｃＦｖ遺伝子を成功裏に構築し、発現ベクター内にクローニングした。ＩｇＧ ＡのＳｃＦｖ形態小規模生産を行った。ＳｃＦｖ Ａの結合活性を、ＨＳＶ感染細胞に対するＩＩＦアッセイによって評価した。ＳｃＦｖ Ａは、ＨＳＶ感染細胞を認識することができた。しかしながら、ＳｃＦｖ Ａは、高いＩＩＦバックグラウンドシグナルおよび低い結合性を示した。
Ｆａｂ Ｅｘ２：配列番号１および配列番号２に対応する。
【０１３４】
ＩｇＧ Ａの生物学的活性のインビトロ評価
臨床分離株に対する中和活性
ＦａｂＡまたはＩｇＧ Ａの中和活性は、ＩｇＧ Ａをウイルスと共にプレインキュベート(３７℃にて１時間)し、ＩｇＧ Ａ／ウイルス混合物を細胞単層に添加することにより、評価した。
【０１３５】
結果
ＩｇＧ Ａは、試験した全てのＨＳＶ−１および２分離株を強力に中和する。重要なことには、中和アッセイを実施するために使用されたＨＳＶ分離株は、アシクロビル（ＡＣＶ）抗ＨＳＶ薬に対する異なる感受性を有していた。上記のＨＳＶ分離株を中和するためのＩｇＧ Ａの能力は、ＩｇＧ Ａの異常に高い生物学的活性が、別のＨＳＶ試験分離株によって示されたＡＣＶに対する感受性とは完全に独立していることを示し、ＡＣＶ耐性分離株によって引き起こされるＨＳＶ感染の治療のためにＩｇＧ Ａを使用する可能性を示唆する（図１５Ａ）。
【０１３６】
感染の吸着後阻害の評価
宿主内でのウイルス能動的複製の開始後、ＨＳＶ感染の処置のためのＩｇＧ Ａの可能な投与を推測するために、吸着後アッセイが開発されている。
ＦａｂＡまたはＩｇＧ ＡのＨＳＶ吸着後の評価を伴う、実験アプローチの第一工程は、前もってＦａｂＡまたはＩｇＧ Ａで処理されていない、標準量のＨＳＶでＶＥＲＯ  Ｅ６細胞を感染させることである。
【０１３７】
ウイルス感染から僅か３０分後に、ＦａｂＡまたはＩｇＧ Ａを感染細胞に添加する。次いで、ＶＥＲＯ  Ｅ６細胞上のＨＳＶ溶解プラークを評価するために、感染を４８時間続ける。実験結果は、ウイルス実験陽性対照と比較して、（ＨＳＶ感染後）ＦａｂＡまたはＩｇＧ Ａを受容した感染細胞についてのプラークを計数することによって評価した。
【０１３８】
吸着後アッセイで試験したＦａｂは、それぞれＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２試験分離株に対して５０および２００ｕｇ／ｍＬの濃度で使用された＊。
吸着後アッセイで試験したＩｇＧは、それぞれＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２試験分離株に対して２５および１００ｕｇ／ｍＬの濃度で使用された＊。
＊  ｍＡｂ濃度は科学文献から推定した。
【０１３９】
結果
吸着後アッセイで示されるように、ＩｇＧ Ａは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の新たな感染事象の両方を強力に阻害し、また、ウイルス対照と比較してプラークを生じる感染巣(infectious foci)の数を阻害する。ＩｇＧ Ａ阻害強度は、ＦａｂＡで観察されたものよりも高かった（図１５Ｂ）。
【０１４０】
細胞間感染メカニズムの阻害
ＨＳＶ感染戦略のうち、重要なものは、いわゆる“細胞間”感染戦略である。
ＦａｂＡまたはＩｇＧ Ａで処理したか、または処理していない感染細胞に起因するプラーク領域を測定することによって、“細胞間”感染を阻害する際のＩｇＧ Ａの寄与を評価するために、吸着後アッセイを行った。
吸着後の細胞間感染阻害アッセイで試験したＦａｂもまた、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２試験分離株に対してそれぞれ５０および２００ｕｇ／ｍＬの濃度で前もって使用された＊。
吸着後の“細胞間”感染阻害アッセイで試験したＩｇＧもまた、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２試験分離株に対してそれぞれ２５および１００ｕｇ／ｍＬの濃度で前もって使用された＊。
＊  ｍＡｂ濃度は科学文献から推定した。
【０１４１】
結果
吸着後アッセイによって示されるように、Ｆａｂ Ａは、プラーク領域のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方を阻害する。プラーク領域のＩｇＧ Ａ阻害は、Ｆａｂ Ａ阻害活性よりもさらに高い。これらのデータは、ＩｇＧ Ａ感染後の投与が“細胞間”ＨＳＶ感染もまた強力に阻害する方法を明らかに実証した（図１５Ｂ）。
【０１４２】
ｍＡｂ Ａの選択圧下におけるエスケープ変異体の出現の評価
ＩｇＧ Ａの選択圧下で生成されたエスケープウイルス変異体の存在を評価するために、ＨＳＶ−１感染ＶＥＲＯ−Ｅ６細胞を、Ｆａｂ Ａの濃度を増加させながら処理した。詳細には、ＶＥＲＯ細胞を、Ｔ２５フラスコ中で、先行文献に広く記載されている実験的条件下で培養した（“ウイルス増殖技術”）。次いで、細胞単層を、５０ｐｆｕ／ｍＬの無細胞ウイルスを用いてＨＳＶ−１ ＨＦ株に感染させた。ウイルスの完全な吸着後、感染細胞を、０．２ｕｇ／ｍＬおよび１ｕｇ／ｍＬのＩｇＧ Ａで３日間処理した。実験対照、無関係のＩｇＧ（０．２ｕｇ／ｍＬおよび１ｕｇ／ｍＬの濃度）およびウイルス“単独”もまた、実験に含めた。新しい細胞感染ラウンドに遠心した培地の上清を使用するために、３日後、感染細胞培地を集めて遠心した。これらの新しい感染ラウンドは、０．２ｕｇ／ｍＬおよび１ｕｇ／ｍＬのＩｇＧ Ａならびに実験対照の存在下で実施された。５つの連続した同一の感染ラウンドを、上記の２つの濃度のＩｇＧ Ａおよび対照ＩｇＧの存在下で実行した。その後、最後の感染ラウンドの細胞上清を遠心して、増加濃度のＩｇＧ Ａ（５ｕｇ／ｍＬおよび１０ｕｇ／ｍＬ）の存在下で５回の新しい感染ラウンドを実施するために使用した。ＩｇＧ Ａ阻害活性から逃れる一定のＩｇＧ Ａの存在下で培養されたウイルスの能力を試験するために、ＩｇＧ Ａの存在下での最終感染に属する細胞を含まない上清を、高いＩｇＧ Ａ濃度の存在下で、３７℃にて１時間、インキュベートした。プレインキュベーション後、中和混合物を使用して、新たなＶＥＲＯ−Ｅ６細胞を感染させた。
【０１４３】
結果
ＨＳＶとプレインキュベートしたＩｇＧ Ａは、依然としてウイルス分離株を中和することができ、“エスケープ変異体”が、５および１０ｕｇ／ｍＬで、ＩｇＧ Ａ選択圧下で、産生されなかったことを示している。
これは次のことを示している：これらの実験で試験されたＨＦ ＨＳＶ−１分離株は、本発明者らの抗体によって認識される領域において、ＩｇＧ Ａの抗ウイルス活性から逃れることを可能にするアミノ酸変異を起こしにくい（アッセイを実施するために使用される２種の濃度のＩｇＧ Ａの存在下で）。
【０１４４】
結論
“エスケープ変異体”は、ＩｇＧ Ａ選択的圧下では産生されなかった。この結果の可能性のある説明は次のようにまとめられる：これらの実験で試験されたＨＦ ＨＳＶ−１分離株は、ＩｇＧ Ａの抗ウイルス活性から逃れることを可能にするアミノ酸変異を容易には受けない（アッセイを実施するために使用される２種の濃度のＩｇＧ Ａの存在下で）。
【０１４５】
ＩｇＧ Ａの抗ウイルス活性のインビボ評価：
全体的に、マウスＨＳＶの経膣曝露の異なるコホートにおけるＩｇＧ Ａの生物学的効果を、（ｉ）生存率、および（ｉｉ）臨床スコアを評価することにより、評価した。マウスの異なるコホートの臨床状態を定義するために使用される臨床スコアは、０＝症状なし、１−１．５＝軽度の生殖器の紅斑と浮腫、２−２．５：中等度の生殖器の炎症、非化膿性の生殖器病変、３−３．５＝化膿性生殖器病変および／または後肢麻痺、４＝死亡。
【０１４６】
ＨＳＶ経膣曝露：ウイルス曝露前の２４時間、全身ＩｇＧ Ａ（予防）
予防実験では、ＩｇＧ Ａを側方尾静脈注射により全身投与した。
ＩｇＧ Ａを、ＭＳ−ＨＳＶ−２ウイルスの１０７  ＴＣＩＤ５０のウイルスの１半数致死量−ＬＤ５０値−（ＬＤ５０は、感染したマウスの５０％を殺すことができるウイルス用量である）に略相当する用量での経膣曝露の２４時間前に、単回用量として、それぞれ５および１５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ Ａを受容する異なるマウスのコホートについて２つの異なる濃度で静脈内投与した。ウイルス曝露のみを受けるマウスコホートおよび無関係なヒトＩｇＧ陰性対照（１５ｍｇ／ｋｇ）を受けるコホートからなる実験対照も、同様に含まれている。実験は、不必要かつ違法にマウスが苦しむのを避けるために、ＨＳＶ−２曝露後の８日間実施した。
【０１４７】
結果
両用量のＩｇＧ Ａは、ＨＳＶ−２感染に対するＣ５７ＢＬ／６マウスの防御を示した（図１６Ａ）。５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇの両抗体濃度は、ＨＳＶ−２感染の死亡率および臨床徴候の両方を有意に阻害した（図１６Ｂおよび１６Ｃ）。
５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ Ａで処理したマウスは全て、生存した（１００％生存率）。対照的に、１５ｍｇ／ｋｇの無関係のヒトＩｇＧを受容したマウスコホートおよびウイルス曝露のみを受けたマウスコホートの両方で検出された死亡率は、ＨＳＶ−２  ＬＤ曝露のものと完全に一致していた。
【０１４８】
ＨＳＶ経膣曝露：ウイルス曝露の３０分後および２４時間後の、全身ＩｇＧ Ａ（治療）
ヒト抗体ＩｇＧ Ａの保護活性をさらに試験するために、ＨＳＶ−２感染Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＨＳＶ−２曝露の３０分後および２４時間後に治療用全身的ＩｇＧ Ａを受容した（ＩｇＧ Ａは、側尾静脈注射により投与された）。
ＩｇＧ Ａを、ＭＳ−ＨＳＶ−２ウイルスの１０７  ＴＣＩＤ５０の１ＬＤ５０に略相当する用量での経膣曝露の３０分後および２４時間後に、それぞれ５および１５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ Ａを受ける２つの異なるマウスのコホートのために２つの異なる濃度で静脈内投与した。ウイルス曝露のみを受けるマウスコホートおよび無関係なヒトＩｇＧ陰性対照（１５ｍｇ／ｋｇ）を受けるコホートおよびＡＣＶ標準療法（５０ｍｇ／ｋｇ  ２Ｘ  ｄｉｅの腹腔内注射）を受けたマウスからなる実験対照も、同様に含まれている。これらのコホートでは、実験を、不必要かつ違法にマウスが苦しむのを避けるために、ＨＳＶ−２曝露の１２日間実施した。
【０１４９】
結果
両用量のＩｇＧ Ａは、ＨＳＶ−２感染に対するＣ５７ＢＬ／６マウスの保護を示した（図１７Ａ）。５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇの両抗体濃度は、ＨＳＶ−２感染の死亡率および臨床徴候の両方を有意に阻害した（図１７Ｂおよび１７Ｃ）。
この場合においても、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ Ａで処理したマウスの全てが生存した（１００％生存率）。反対に、１５ｍｇ／ｋｇの無関係のヒトＩｇＧを受容したマウスコホートおよびウイルス曝露のみを受けたマウスコホートの両方で検出された死亡率は、ＨＳＶ−２ ＬＤ曝露のものと完全に一致していた。
【０１５０】
ＨＳＶ経膣曝露：ウイルス曝露の３０分後の全身ＩｇＧ Ａ（治療）
ヒト抗体ＩｇＧ Ａの保護活性を試験するために、ＨＳＶ−２感染Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＨＳＶ−２曝露の３０分後に治療用全身的ＩｇＧ Ａを受容した（ＩｇＧ Ａは、側尾静脈注射により投与された）。
ＩｇＧ Ａを、１ＬＤ５０値に略相当する用量のＭＳ−ＨＳＶ−２  ウイルスの１０７  ＴＣＩＤ５０での経膣曝露の３０分後に、それぞれ５および１５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ Ａを受容した異なるマウスのコホートのための２つの異なる濃度で静脈内投与した。ウイルス曝露のみを受けるマウスコホートおよび無関係なヒトＩｇＧ陰性対照（１５ｍｇ／ｋｇ）を受けるコホートからなる実験対照も、同様に含まれている。実験は、不必要かつ違法にマウスが苦しむのを避けるために、ＨＳＶ−２曝露後の８日間実施した。
【０１５１】
結果
両用量のＩｇＧ Ａは、ＨＳＶ−２感染に対するＣ５７ＢＬ／６マウスの保護を示した（図１８Ａ）。５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇの両抗体濃度は、ＨＳＶ−２感染の死亡率および臨床徴候の両方を有意に阻害した（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。この場合においても、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ Ａで処理したマウスの全てが生存した（１００％生存率）。反対に、１５ｍｇ／ｋｇの無関係のヒトＩｇＧを受容したマウスコホートおよびウイルス曝露のみを受けたマウスコホートの両方で検出された死亡率は、ＨＳＶ−２  ＬＤ曝露のものと完全に一致していた。
【０１５２】
ＨＳＶの眼への曝露：全身投与（静脈内（ｉ．ｖ．）注射）したＩｇＧ Ａの生物学的活性の評価
ＨＳＶ−２またはＨＳＶ−１の眼への曝露後のＩｇＧ Ａの静脈内投与によって付与される全身的な保護を、２タイプのＨＳＶをインビボで試験することにより評価した。
ＨＳＶ−２またはＨＳＶ−１感染Ｃ５７ＢＬ／６マウス（角膜瘢痕化後の眼感染症）は、ＨＳＶ曝露の３０分後に単回増強治療用全身性ＩｇＧ Ａを受けた（ＩｇＧ Ａは、側尾静脈注射により投与された）。
【０１５３】
ＭＳ−ＨＳＶ−２の１０７ ＴＣＩＤ５０（１ＬＤ５０値に略相当する量）またはＬＶ−ＨＳＶ−１の１０８ ＴＣＩＤ５０（１ＬＤ５０値に略相当する量）のウイルス点眼曝露の３０分後に、１５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ Ａを静脈内投与した。ウイルス曝露のみを受けるマウスコホートおよび無関係なヒトＩｇＧ陰性対照（１５ｍｇ／ｋｇ）を受けるコホートからなる実験対照も、同様に含まれている。
【０１５４】
マウスの異なるコホートにおけるＩｇＧ Ａの生物学的効果を、（ｉ）生存率、および（ｉｉ）以下の“臨床スコア表”（Berdugo M. Antimicrob Agents Chemother. 2012年3月）で説明されている臨床スコア、を評価することにより評価した。全てのマウスを、ＨＳＶ感染の臨床徴候について毎日観察した。
【０１５５】
【表５】
2018505181.tif 000006
【０１５６】
これらのコホートでは、実験は、不必要かつ違法にマウスが苦しむのを避けるために、ＨＳＶ−２曝露後の８日間実施した。
【０１５７】
結果
ＩｇＧ Ａの全身投与は、ＨＳＶ−２およびＨＳＶ−１致死性眼感染症からＣ５７ＢＬ／６マウスを効果的に保護する。
特に、図１９Ａは、ＩｇＧ Ａ単回増強全身投与が、角膜の瘢痕形成による事前のＨＳＶ−２ウイルス感染マウスを、如何に完全に保護する（１００％生存率）かを示す。
【０１５８】
さらに、図１９Ｂおよび１９Ｃは、ＩｇＧ Ａの全身投与が、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の眼感染に由来する重度の臨床徴候を、如何に顕著に低減し得るかを明確に示している。
【０１５９】
結論
致死性ウイルス眼への曝露からの、ＩｇＧ Ａの保護能力を、全身経路によるＩｇＧ Ａの投与によって評価した。眼のＨＳＶ感染からのＩｇＧ Ａの全身的な保護は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方について評価された。この一連の実験において、ＩｇＧ Ａは、１型または２型ウイルスに感染したマウスを死から完全に保護した（１００％保護）。このことは、全身性のｍＡｂ Ａにより、播種性ウイルス複製がほぼ完全に阻害されることを示す。さらに、無関係の対照ｍＡｂまたはウイルス曝露のみを受けた感染マウスによって示される神経学的臨床徴候の観察によって示唆されるように、全身性ＩｇＧ Ａを受けたマウスコホートは、神経学的徴候の発現を完全に排除した。重要なことには、ＩｇＧ Ａはまた、ＨＳＶ−１および２の両方の感染の臨床徴候を強力に阻害する（臨床スコアリング）。
【０１６０】
材料および方法
真核細胞およびウイルス
ＶＥＲＯ−Ｅ６細胞株を用いて、真核細胞での全ての実験手順を実施した。
ＶＥＲＯ−Ｅ６細胞で培養したＨＳＶ−１分離株：ＨＦ株（ＶＲ−２６０ ＡＴＣＣ）
ＶＥＲＯ−Ｅ６細胞で培養したＨＳＶ−２分離株：ＭＳ株（ＶＲ−５４０ ＡＴＣＣ）。
【０１６１】
ＩｇＧ２画分検出プロトコールのためのＥＬＩＳＡ：
−  マイクロタイター９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ）を、陰性対照を含む、ＰＢＳで希釈した回収した血清でコーティングした（４℃にて一晩）。
−  １％ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液でプレートを（３７℃にて１時間）インキュベートすることにより、非特異的部位をブロッキングした。
−  （０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma-Aldrich）を含むＰＢＳ溶液）で洗浄後、市販のマウス抗ヒトＩｇＧ２特異的モノクローナル抗体を、製造元の指示書に従って添加した（３７℃にて１時間）。
−  ０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄する。
−  ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Sigma-Aldrich）を添加した（３７℃にて４５分）。
−  ０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄後、ＴＭＢ基質キット（Thermo Scientific）を添加し、プレートを３７℃で５分間インキュベートした。
−  その後、１Ｎ硫酸を添加して、反応を停止させた。
−  シグナルを、４５０ｎｍ波長で検出した。
【０１６２】
ＩｇＧ２画分検出プロトコールのためのウェスタンブロット：
−  集めた血清を、２種の異なる希釈液（それぞれ１：１０および１：１００）で、８％  トリス−グリシンゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分析した。
−  タンパク質を、４℃にて３０Ｖで１５時間、ＰＶＤＦ膜（PerkinElmer）に移した。
−  ０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma-Aldrich）および５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含むＰＢＳ溶液中、４℃にて一晩、該膜をインキュベートすることにより、非特異的部位をブロッキングした。
−  市販のマウスｍＡｂ特異的ヒトＩｇＧ２を一次試薬として、室温で１時間インキュベートして使用した。
−  ０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄する。
−  ブロットを、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Sigma-Aldrich）を用いてプローブした（室温にて４５分）。
−  ペルオキシダーゼ結合Ａｂを、化学発光基質（Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Scientific））を用いて検出した。
【０１６３】
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２被覆不活性化ウイルスに対するＥＬＩＳＡアッセイ
−  マイクロタイター９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ）を、陰性対照を含む、ＥＣＢで（１：１０）希釈した熱不活性化ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２でコーティングした（４℃にて一晩）。
−  １％ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液でプレートを（３７℃にて１時間）インキュベートすることにより、非特異的部位をブロッキングした。
−  （０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma-Aldrich）を含むＰＢＳ溶液）で洗浄後、ＰＢＳ／ＢＳＡで（１：２００）希釈した回収した血清を添加した（３７℃にて１時間）。
−  ０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄する。
−  ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Sigma-Aldrich）を添加した（３７℃にて４５分）。
−  ０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄後、ＴＭＢ基質キット（Thermo Scientific）を添加し、プレートを３７℃で５分間インキュベートした。
その後、１Ｎ硫酸を添加して、反応を停止させた。
−  シグナルを、４５０ｎｍ波長で検出した。
【０１６４】
ＩｇＧ２精製および定量プロトコール：
ＩｇＧ２画分を精製および分析するために、選択した血清を２つの異なる工程を用いて精製した。初めに、全量のＩｇＧを、親和性カラムを用いて精製した。次に、溶出した全量ＩｇＧ含量を、ＩｇＧ２画分に特異的な親和性カラムを用いてさらに精製した。
【０１６５】
ａ）全ＩｇＧ親和性精製カラムの調製：カラム１調製プロトコール
−  １ｍＬのｇａｍｍａｂｉｎｄセファロース樹脂（ＰＢＳ １Ｘ−エタノール２０％中４℃にて保存）を、３０−４０ｍＬのＰＢＳ １Ｘで３回洗浄して、過剰のエタノールを除去した（室温にて２５００ｒｐｍで５分遠心、２−３回加速および減速）。
−  抗ヒトＩｇＧ（Ｃｆ＝４ｍｇ／ｍＬ）を該樹脂に添加し、室温で９０分間穏やかに撹拌した。
−  該樹脂を、１０容量（１容量＝樹脂１ｍＬ）の０．２Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）で３回洗浄した。２５００ｒｐｍで１５分間遠心。
−  最初の遠心後、上清をさらなる分析のために回収した。
−  該樹脂を１０容量の０．２Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）に再懸濁し、振とうした（shacked）。
−  少量のビーズをプレ架橋結合試験のために取り出した。
−  ＤＭＰ（ジメチル−ピメリミデート）を２０ｍＭ（終濃度）まで添加した。この工程では、ＩｇＧと樹脂のタンパク質Ｇとの間で架橋が生じる。室温にて３０分間穏やかに撹拌する。
−  少量のポスト架橋結合試験のために取り出した。
−  １５分間の遠心（２５００ｒｐｍ）後、上清を除去し、樹脂を２０容量の０．２Ｍエタノールアミン（ｐＨ８）で洗浄した。
−  この工程を３回繰り返した。この工程は、新たな共有結合の安定化を可能にする。
−  対で、樹脂を２０容量のエタノールアミン（０．２Ｍ ｐＨ８）で洗浄し、室温にて１２０分間穏やかに撹拌した。
−  １５分間の遠心（２５００ｒｐｍ）後、上清を除去し、樹脂を３０ｍＬ ＰＢＳ １Ｘで３回洗浄した。
−  １５分間の遠心（２５００ｒｐｍ）後、上清を除去し、ＮａＮ３（終濃度０．０５％）を添加した２０ｍＬのＰＢＳ １Ｘを添加した。
−  最後に、樹脂をクロマトグラフィーカラムに充填して、その後、４℃で保存した。
【０１６６】
ｂ）ＩｇＧ２画分親和性精製カラムの調製：カラム２調製プロトコール
上記の全ＩｇＧ−親和性精製カラムの調製のためのプロトコールを使用して、ＩｇＧ２画分の精製を可能にする新しいカラムを調製した。１つの改変を該プロトコールに行った（上記のカラム１調製プロトコールの第２工程）。
特に：
−  市販のマウス抗ヒトＩｇＧ２Ｆｃモノクローナル抗体（Acris Antibodies）を、終濃度３ｍｇ／ｍＬで樹脂に添加し、室温にて９０分間穏やかに撹拌した。
【０１６７】
ｃ）親和性精製法：カラム１／カラム２の工程
−  回収した血清を、“カラム番号１”（全ＩｇＧ精製カラム）において最初に精製した。要すれば、室温にて種々の血清をインキュベートした後、カラムをＰＢＳ １Ｘで洗浄して、非特異的血清タンパク質を溶出させた。次いで、カラムのｐＨ（ｐＨ２．２）を変えることによりＩｇＧ画分を溶出させた。
−  溶出後、全ＩｇＧ含有溶液を中和し（ｐＨ７．０）、再度、“カラム番号２”（ＩｇＧ２画分精製カラム）に充填した。カラム１の精製について記載したように、カラム２溶出サンプルを中和し、さらなる分析のために４℃で保存した。
【０１６８】
ｄ）精製ＩｇＧ２の評価
上記の親和性カラムは、ヒト血清からのＩｇＧ２の精製を可能にした。精製されたサンプルの質を評価するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイを行い、次いでクマシー染色を行った：
−  サンプルを、４−１５％トリス−グリシンプレキャスト−ゲル（Bio-Rad）で分析した。
−  電気泳動を２００Ｖで１時間行った。
−  電気泳動ゲルを、クーマシーブルー溶液で２０分間染色した。
−  クマシー染色したゲルを、デステナ含有溶液中で２時間洗浄し、次いで、水道水で洗浄した。
【０１６９】
明視野位相コントラスト光学顕微鏡プロトコールによる合胞体形成評価：
−  １０４  Ｖｅｒｏ細胞／ウェルを、完全ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、９６ウェルプレート中にて、１００％コンフルエントまで増殖させた。
−  ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルスストック希釈液（それぞれ３倍および２倍希釈）を、３７℃にて１時間、最終容量１００μＬの完全ＤＭＥＭ中、異なる濃度（１０、５および２．５μｇ／ｍＬ）の目的の精製Ｆａｂと共に予めインキュベートした。
−  実験対照も加えられた。
−  細胞をＰＢＳ １Ｘ溶液で洗浄後、ウイルス溶液を単層に添加し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２時間、吸着のためにインキュベートした。
−  各ウェルをＰＢＳ １Ｘで１回洗浄し、次いで、２％ＦＣＳを添加した完全ＤＭＥＭを各ウェルに添加して、３７℃にて５％ＣＯ２下で２２時間インキュベートした。
−  細胞単層を固定し、１ｍＬの、７０％メタノールおよび１％クリスタルバイオレットの水性溶液で染色した。５分間インキュベート後に固定／染色溶液を除去し、次いで、細胞単層をＨ２Ｏで１回洗浄して乾燥させた。
−  合胞体形成の減少を、明視野位相コントラスト光学顕微鏡で評価した。特に、ＦａｂまたはＩｇＧ１ Ｆａｂで処理したウイルスで感染させた細胞単層において観察された細胞形態を、ウイルス対照（精製ＩｇＧ２を含まない同量のウイルス）感染細胞の形態と比較した。
【０１７０】
定性免疫蛍光（ＩＩＦ）アッセイプロトコール：
−  １０４ Ｖｅｒｏ細胞／ウェルを、完全ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、９６ウェルプレート中にて、１００％コンフルエントまで増殖させた。
−  細胞を、中和アッセイで用いたのと同じＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルスストック希釈液で感染させて、次いで、吸着およびインキュベーションを、ウイルス滴定について上記の通りに実施した。
−  培地を除去し、細胞単層をＰＢＳ １Ｘで１回洗浄し、２００μＬ／ウェルの１：１＝アセトン：メタノール氷冷溶液で固定した。固定溶液を除去した。プレートを−２０℃で保存した。
−  ＩＩＦ染色を、市販の抗ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ ｇＤ２タンパク質ｍＡｂを添加することによって行った（暗湿潤チャンバー中、３７℃にて１時間）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ １Ｘ中、５分）。
−  ＦＩＴＣ結合二次ｍＡｂを、一次染色液に添加した（暗湿潤チャンバー中、３７℃にて１時間）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ １Ｘ中、５分）。
−  核染色を、Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液を添加することによって行った（暗湿潤チャンバー中、３７℃にて１５分）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ １Ｘ中、５分）。
−  感染巣を、ＩｎＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒシステムで解析した。
【０１７１】
プラーク減少アッセイプロトコールによる定量中和活性評価：
−  ７ｘ１０５  Ｖｅｒｏ細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＣＳを添加した適当な完全培地で増殖させた。１００％コンフルエントで細胞を用いて実験を行った。
−  ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルスストック希釈液（それぞれ５倍および４倍希釈）を、最終容量８００μＬの完全ＤＭＥＭ中、異なる濃度（５、２．５および１μｇ／ｍＬ）で、目的の精製Ｆａｂと共に、３７℃にて５％ＣＯ２下で１時間、プレインキュベートした。
−  実験対照も加えられた。
−  細胞をＰＢＳ １Ｘ溶液で洗浄後、ウイルス溶液を単層に添加し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２時間、吸着のためにインキュベートした。
−  各ウェルをＰＢＳ １Ｘで１回洗浄し、次いで、２％ＦＣＳおよび１％アガロースを添加した２ｍＬの完全ＤＭＥＭを各ウェルに添加して、３７℃にて５％ＣＯ２下で４６時間インキュベートした。
−  アガロース層を除去し、細胞単層を固定し、１ｍＬの、７０％メタノールおよび１％クリスタルバイオレットの水性溶液で染色した。５分間インキュベート後に固定／染色溶液を除去し、次いで、細胞単層をＨ２Ｏで１回洗浄して乾燥させた。
−  次いで、プラーク形成単位（ＰＦＵ）を計数することによって中和活性を評価した。特に、Ｆａｂ処理したウイルスで感染させた細胞単層におけるＰＦＵ数を、ウイルス対照（同量のウイルス）について計数したＰＦＵと比較した。
【０１７２】
間接免疫蛍光（ＩＩＦ）アッセイプロトコールによる定量中和活性評価：
−  １０４  Ｖｅｒｏ細胞／ウェルを、完全ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、９６ウェルプレート中にて、１００％コンフルエントまで増殖させた。
−  ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルスストック希釈液（それぞれ４倍および２倍希釈）を、３７℃および５％ＣＯ２下で１時間、最終容量１００μＬの完全ＤＭＥＭ中、異なる濃度の目的の精製Ｆａｂと共に予めインキュベートした。
−  実験対照も加えられた。
−  細胞をＰＢＳ １ｘ溶液で洗浄後、ウイルス溶液を単層に添加し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２時間、吸着のためにインキュベートした。
−  各ウェルをＰＢＳ １Ｘで１回洗浄し、次いで、２％ＦＣＳを添加した完全ＤＭＥＭを各ウェルに添加して、３７℃にて５％ＣＯ２下で２２時間インキュベートした。
−  培地を除去し、細胞単層をＰＢＳ １Ｘで１回洗浄し、２００μＬ／ウェルの１：１＝アセトン：メタノール氷冷溶液で固定した。固定溶液を除去した。プレートを−２０℃で保存した。
−  ＩＩＦ染色を、市販の抗ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ｍＡｂを添加することによって行った（暗湿潤チャンバー中、３７℃にて１時間）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ １Ｘ中、５分）。
−  ＦＩＴＣ結合二次ｍＡｂを、一次染色液に添加した（暗湿潤チャンバー中、３７℃にて１時間）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ １Ｘ中、５分）。
−  核染色を、Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液を添加することによって行った（暗湿潤チャンバー中、３７℃にて１５分）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ １Ｘ中、５分）。
−  次いで、ＩｎＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒシステムで免疫蛍光感染巣を計数することにより中和活性を評価した。
−  異なるＦａｂ調製物で処理したウイルスで感染させた細胞単層における感染巣の数を、ウイルス対照（同量のウイルス）について計数した感染巣と比較した。
−  次いで、中和の割合を評価し、平均からの標準偏差も計算した（実験をトリプリケートで行った）。
【０１７３】
ヒトコンビナトリアルファージディスプレイ抗体ライブラリー構築プロトコール：
血液細胞分離のために設計されたフィコールグラディエント（ficoll gradient）溶液であるHistopaque 1077（Sigma）を用いて、血液サンプルからＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を分離した。
Rneasy Mini Kit (Qiagen)を用いて、単離したリンパ球からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ ＡＭＶ（Roche）用のトランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キットを業者指示書に基づいて用いてｃＤＮＡに逆転写した。
【０１７４】
以前に得られたｃＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして用いた。特に、Solforosiら(2012)の、“ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの作製およびモノクローナル抗体フラグメントの分子クローニングのために最適化されたファージディスプレイベクター” New Microbiologica 35 (3), 289-294に記載の特定のプライマーセットを用いて、ＩｇＧ２サブクラスに属する免疫グロブリンの軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）の増幅を行った（プライマー配列についてはＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ １のセクションを参照のこと）。
【０１７５】
全ての増幅されたＨＣおよびＬＣを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ抽出キット（Qiagen）を用いた電気泳動アガロースゲル“泳動”の後に精製した。精製工程後、両鎖を定量し（ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００、ハイスループット、全スペクトルマイクロボリュームＵＶ−Ｖｉｓ測定器、ThermoScientific）、選択された制限酵素で消化して（酵素消化反応混合物を説明する次の２つの表で強調する）、それらを既に記載したプロトコールにしたがって、ｐＣＭベクターにクローニングした（Solforosi et al. (2012) “ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの作製およびモノクローナル抗体フラグメントの分子クローニングに最適化されたファージディスプレイベクター” New Microbiologica 35 (3), 289-294）。
【０１７６】
より詳細には、ＬＣおよびｐＣＭを、表５に示すプロトコールに従い、ＳａｃＩおよびＸｂａＩ制限酵素（ＮＥＢ）で消化した：
【表６】
2018505181.tif 000007
【０１７７】
消化は、３７℃にて、それぞれ４５分（ベクター）および３時間（ＬＣ）行い、次いで、消化産物をＳｙｂｒ Ｓａｆｅ染色によってチェックした。
正しい分子量（それぞれ３５００および６７０ｂｐ）を示す、消化したｐＣＭおよびＬＣ ＤＮＡを、ゲルから抽出し、精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）し、その後、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした（室温にて、２時間）。次いで、ライゲーション産物を用いて、エレクトロコンピテント細胞（大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞、Stratagene）を形質転換した。
【０１７８】
次いで、ｐＣＭ含有ＬＣ（ｐＣＭＬｃ）を、該形質転換細胞から精製した（QIAGEN Plasmid Midi キット、Qiagen）。
【０１７９】
ｐＣＭＬｃベクターおよび以前に増幅したＨＣもまた、消化条件を示す次の表で説明するように消化した。
【０１８０】
ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素（ＮＥＢ）を、以下の表６に記載の通りに用いた：
【表７】
2018505181.tif 000008
【０１８１】
消化を、３７℃にて、それぞれ４５分（ベクター）および３時間（ＨＣ）行い、次いで、消化産物をＳｙｂｒ Ｓａｆｅ染色によってチェックした（図１０）。
【０１８２】
正しい分子量（それぞれ４０００および７３０ｂｐ）を示す、消化したｐＣＭおよびＨＣ ＤＮＡを、アガロースゲルから抽出し、精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）し、その後、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした（室温にて、２時間）。次いで、ライゲーション産物を用いて、“ｈｏｍｅｍａｄｅ”ＸＬ−１ Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞を形質転換した。
【０１８３】
その後、形質転換された細胞から、ｐＣＭ含有ＬＣおよびＨＣ（ｐＣＭＬｃＨｃ）を精製した（QIAGEN Plasmid Midi キット、Qiagen）。
【０１８４】
バイオパニングプロトコル：
１日目
−  ＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞のアリコートを、ライブラリーＤＮＡで形質転換する。
−  ２ｍＬのＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、および２０ｍＭ グルコース）中で撹拌しながら３７℃にて６０分間回復させた後、それを、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンおよび２０μｇ／ｍＬのアンピシリン（“Ｌｏｗ Ａｍｐ”）を含む１０ｍＬのＳＢ培地（３．２％トリプトン、２％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム−ｐＨ：７．０±０．２）に添加する。
−  ライブラリー滴定：Ｔｅｔ−Ａｍｐ寒天プレート上に１０−２から１０−５まで連続希釈して播種。
−  ３７℃にて６０分間、撹拌しながらＬｏｗ Ａｍｐをインキュベートする。
−  １００μｇ／ｍＬのアンピシリン（“Ｈｉｇｈ Ａｍｐ”）を含む５０ｍＬのＳＢ培地を添加し、３７℃にて６０分間、撹拌しながらインキュベートする。
−  １０１２ ＰＦＵ（プラーク形成単位：単位体積あたりのプラーク形成能を有する粒子数の測定）のヘルパーファージ（自家作作製および滴定）を添加し、３７℃にて６０分間、撹拌しながらインキュベートする。
−  ７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加し、３０℃にて一晩（ＯＮ）インキュベートする。
−  ファージの親和性選択のためのプレート調製
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞をＣｏｓｔａｒ(商標)９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートに、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、４ｘ１０４細胞／ウェルで、各感染について４ウェル、播種し、３７℃にて５％ＣＯ２下で一晩（ＯＮ）インキュベートする。翌日、ＨＳＶ−１（ＨＦ株）ストックを、ＦＢＳ不含有ＤＭＥＭで１０−２希釈し、細胞上に２時間播種して吸着させる。次いで、培地含有培地をＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳと交換し、プレートを、３７℃にて、５％ＣＯ２下で、２０時間インキュベートした。感染細胞を、４０ｕＬ／ウェルのパラホルムアルデヒド溶液（Invitrogen ＩＣ固定緩衝液−ＦＢ００１）を室温にて１５分間用いて固定した。インキュベーション時間後、溶液を、１００μＬ／ウェルのＰＢＳと交換した。
【０１８５】
２日目
−  次の式を用いて１日目のファージ力価を計算する：１０４ｘ（希釈計数）ｘプレート上の（コロニー数）／μＬ。
−  １０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＳＢにＸＬ１−Ｂｌｕｅコロニーを接種し（各抗原４ｍＬ、Ｏｕｔｐｕｔファージでの感染用に２ｍＬおよびＩｎｐｕｔファージ感染用に２ｍＬ）、３７℃にて撹拌しながら、５５０ｎｍ波長での光学密度（ＯＤ）が０．５に達するまで、インキュベートする。
【０１８６】
ファージ調製：
−   (一晩)ＯＮの細菌培養増殖物の遠心分離（４℃にて４０分間、ＲＣＦ：１５４０ ｘ ｇ）後、８ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を含む滅菌５０ｍＬチューブに上清を注ぎ、氷上で３０分間インキュベートして、ファージを沈殿させる。
−  遠心分離後（４℃にて２５分間、ＲＣＦ：１２１３０ ｘ ｇ）、上清を捨て、１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ １％溶液でペレットを静かに再懸濁する。
−  遠心分離後（室温にて５分間、ＲＣＦ：２１３８０ ｘ ｇ）、上清（“パニングされていない（unpanned）ファージ”）を回収する。
【０１８７】
選択解除プロセス：
−  １００％コンフルエントのＴ７５フラスコから得られたＶｅｒｏ Ｅ６細胞の懸濁液を、室温にて１５分間、５００μＬのパラホルムアルデヒド溶液（Invitrogen IC 固定緩衝液−ＦＢ００１）を用いて固定した。インキュベーション時間後、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄した。処理したＨＳＶ感染細胞を含むプレートに再懸濁したファージを添加する（選択工程）前に、ファージ溶液を、３７℃にて６０分間、撹拌しながら、１．５ｘ１０６細胞／ウェルでプレインキュベートした（選択解除工程）。遠心分離（室温にて２分間、ＲＣＦ：２１３８０ ｘ ｇ）後、上清を回収し、ＨＳＶ感染細胞を固定し、かつ透過性にした該プレートに添加した。
【０１８８】
パニング：
−  ３７℃にて１２０分間、７０μＬ／ウェルのパニングされていないファージをインキュベートする。
−  各抗原の４つのウェルから“Ｉｎｐｕｔ”として上清を集め、氷上で保存する。
−  ウェル毎に１００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ０．５％溶液で、３７℃にて、各１０回ピペッティングして１０回洗浄する。
−  ５０μＬ／ウェルの溶出緩衝液（０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２）を添加し、１分間インキュベートし、ウェルの底から剥がし取る（scrape）。
−  溶出したファージを中和緩衝液（２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を用いて“Ｏｕｔｐｕｔ”として集め、氷上で保存する。
【０１８９】
ＦａｂのＤＮＡライブラリーから得られたファージ集団から顕著な抗原結合活性を有するクローンを高親和性選択で得るためには、通常５回の選択ラウンド（６日間）が必要である。
【０１９０】
重要なことに、最初のパニング選択ラウンドにおけるＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染細胞上のファージ抗体ライブラリーの交差選択を行った。
【０１９１】
凍結および融解手順を用いるスクリーニングプロトコール：
１日目：
−  ４および５ラウンドのＨｉｇｈ Ａｍｐから得られたＤＮＡを抽出し、ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩ制限酵素（ＮＥＢ）で、３７℃にて６０分間、二重消化する。
−  Ｆａｂに予め融合させたファージタンパク質（ｃｐＩＩＩ）から目的のＤＮＡ（ＨＣおよびＬＣの両方を含むプラスミド）を分離し、アガロース１％ゲル電気泳動（８５Ｖで３時間）を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて抽出する。
−  抽出したＤＮＡをＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションし、ＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞のアリコートを形質転換する。
−  ＳＯＣ培地での回収後、ＬＢ寒天上に播種する。
２日目：
−  １日目に得られたコロニーを、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＳＢ培地に１つずつ接種する。陰性対照として、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンのみを含む３ｍＬのＳＢ培地に、形質転換していないＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロポロコンピテント細胞のコロニーを添加する。接種物を、３７℃にて撹拌しながら、５５０ｎｍ波長での光学密度（ＯＤ）が０．５に達するまでインキュベートする。
−  ＩＰＴＧ（イソプロピル β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド−Sigma I6758）を１：１０００の推奨希釈倍率で添加してＦａｂの産生を誘導し、３０℃にて撹拌しながら、一晩（ＯＮ）インキュベートする。
３日目：
−  一晩（ＯＮ）の細菌培養物の遠心分離（４℃にて２０分間、ＲＣＦ：１５４０ ｘ ｇ）後、上清を捨て、ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁する。
−  プロテアーゼ阻害剤を添加し、凍結および融解手順に従って３回行う。
○  完全凍結するまでドライアイス上でインキュベートする
○    完全に融解するまで、３７℃にて撹拌しながらインキュベートする。
−  遠心分離（室温にて１０分間、ＲＣＦ：２１３８０ ｘ ｇ）後、タンパク質（Ｆａｂ）発現スクリーニングのために上清を使用し、ペレットをＤＮＡ抽出および分析のために使用する。
【０１９２】
バイオパニング手順プロトコール中に選択されたＦａｂクローンの精製：
１日目：
−  １０μＬのアンピシリン（Ｃｆ＝５０μｇ／ｍＬ、Ｃ.ストック＝１００ｍｇ／ｍＬ）および２０μＬのテトラサイクリン（Ｃｆ＝１００μｇ／ｍＬ、Ｃ.ストック＝５ｍｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＬのＳＢ（Super Broth）に新鮮なプレートコロニーを接種し、回転シェーカー（１８０ｒｐｍ）中、３７℃にて一晩、インキュベートする。
２日目：
−  ５００μＬのアンピシリン（Ｃｆ＝５０μｇ／ｍＬ、Ｃ.ストック＝１００ｍｇ／ｍＬ）および１ｍＬのテトラサイクリン（Ｃｆ＝１００μｇ／ｍＬ、Ｃ．ストック＝５ｍｇ／ｍＬ）を含む５００ｍＬのＳＢ（Super Broth）に、５ｍＬの接種物を接種し（Sub-inoculate）、回転シェーカー（１８０ｒｐｍ）中、３７℃にて６−８時間、インキュベートする。
−  培養ＯＤが０．８−１（指数関数的増殖）に達したとき、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を、終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌで添加する。
−  回転シェーカー（１８０ｒｐｍ）中、３０℃で一晩インキュベートする。
３日目：
−  清潔な２５０ｍＬボトルに細菌培養物を移す。
−  ４℃または室温にて、遠心分離する（３５００−４５００ｒｐｍで２０−３０分間）。
−  最終容量２５ｍＬのＰＢＳ １Ｘに再懸濁した細胞ペレットをファルコンの５０ｍＬチューブに入れ、プロテアーゼ阻害剤を添加し、該ファルコンチューブを４℃に置く。
−  該ファルコンチューブを氷上で維持し、細胞懸濁液を９０秒間超音波処理し、６０秒間静置する。これを３−４回繰り返す。
−  細菌溶解物をボトル（３０ｍＬ）に移す。４℃にて１５，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離することにより細胞破片を除去する。
−  シリンジ５０ｍＬを用いて上清を濾過し、０．４５ｕｍ、次いで０．２ｕｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＶＤＦを用いて濾過する濾液をファルコン５０ｍＬに集める。
−  ４℃で保存する。
【０１９３】
免疫親和性クロマトグラフィーによるＦａｂの精製：
−  ２０ｍＬ  ＰＢＳ １Ｘでカラムを洗浄する。２回繰り返す。
−  １０ｍＬの溶出緩衝液ｐＨ２．２で溶出する。
−  ＰＢＳ １ＸでカラムのｐＨを再調整し、ｐＨを調べる。
−  カラムキャップを閉める。カラムにサンプルを、一度に２−４ｍＬ充填する。数分待って、カラムを再度開く。
−  ５０ｍＬのＰＢＳ １Ｘでカラムを洗浄する。
−  カラムキャップを閉じる。該カラムに１０ｍＬの溶出緩衝液ｐＨ２．２を、一度に２−４ｍＬ充填する。数分待ち、カラムを再度開く。
−  中和緩衝液ｐＨ１１を含むファルコンチューブに溶出液を集める。
−  ｐＨを確認し、中和緩衝液ｐＨ１１を用いて溶液を中和する（ｐＨ７−８）
−  ＰＢＳ １ＸでカラムのｐＨを再調整する。
−  １０ｍＬの溶出緩衝液ｐＨ２．２で溶出する。
−  ＰＢＳ １ＸでカラムのｐＨを再調整し、ｐＨを確認する。
−  ２０ｍＬのＰＢＳ １Ｘ＋２００μＬのＮａＮ３１００Ｘを添加し、カラムを４℃で保存する。
【０１９４】
ＰＢＳ １ＸでＣｅｎｔｒｉｃｏｎを洗浄する：４０００ｒｐｍで１０−１５分間遠心する。その後、４０００ｒｐｍで１０−１５分間遠心して、Ｆａｂを濃縮する。
フィルターによって保持されたＦａｂ精製物を採取し、４℃で保存する。
精製Ｆａｂの正確な発現および濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシー染色によって（ＩｇＧ２精製および定量プロトコールで既に記載されているように）それぞれ計算した。
【０１９５】
ＩｇＧ２ ＦａｂフラグメントのＩｇＧ１ Ｆａｂプロトコールへの変換
このクローニング手順は、ＩｇＧ１抗体のＨＣおよびＬＣ配列を既に含むｐＣＭベクター（Solforosi et al. (2012) “ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの作製およびモノクローナル抗体フラグメントの分子クローニングのために最適化されたファージディスプレイベクター” New Microbiologica 35 (3), 289-294）を用いて実行される。ＮｈｅＩ制限部位を、上記ＩｇＧ１−ＦａｂのＶＨ配列とＣＨ１配列の間に導入して、ＨＣのＶＨフラグメントのみの分子クローニングを可能にした。
【０１９６】
選択された抗ＨＳＶ ＦａｂのＶＨ配列を、ＩｇＧ１−ＣＨ１とインフレームでクローン化した。より詳しくは、ＮｈｅＩ制限部位を、該制限部位を含む特異的に設計されたプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって、選択されたＦａｂ ＶＨ配列の３’末端に付加した。
【０１９７】
全ての増幅したＶＨを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製した。精製工程後、ＶＨ鎖をまた定量し（ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００、ハイスループット、ハイスループット、全スペクトルマイクロボリュームＵＶ−Ｖｉｓ測定器、ThermoScientific）、選択された制限酵素で消化して、それらを既に記載したプロトコールにしたがって、発現ベクターにクローニングした。
【０１９８】
より詳しくは、増幅されたＶＨおよびベクターの両方を、表７のプロトコールにしたがって、ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩ制限酵素（ＮＥＢ）で消化した：
【表８】
2018505181.tif 000009
【０１９９】
消化は３７℃にて１時間行い、次いで、消化産物をＳｙｂｒ Ｓａｆｅ染色で検査した。
正確な分子量（ＶＨ消化ベクターについて４４７４ｂｐおよびＶＨについて４２６ｂｐ）を示す消化産物を、アガロースゲルから抽出し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）、その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした（室温で１０分間）。その後、ライゲーション産物を使用して、エレクトロコンピテント細胞（大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞、Stratagene）を形質転換した。
【０２００】
その後、ＩｇＧ１−ＣＨ１（ｐＶＨ−ＣＨ１−ＩｇＧ１）を有するフレームにライゲーションされたＶＨを含むプラスミドを、形質転換細胞から精製し（Qiagen Plasmid Midi Kit、Qiagen）、正しい挿入を、プライマーの特定のサブセットで目的の部分を配列決定することにより分析した。
【０２０１】
ｐＶＨ−ＣＨ１−ＩｇＧ１構築物およびＨＳＶ Ｆａｂパネルに属するＬＣもまた、消化条件を示す表８で説明したように消化した。
【表９】
2018505181.tif 000010
【０２０２】
消化は３７℃にて１時間行い、次いで、消化産物をＳｙｂｒ Ｓａｆｅ染色で検査した。
正確な分子量を示す消化ｐＶＨ−ＣＨ１−ＩｇＧ１およびＬＣ ＤＮＡ（それぞれ４２３０ｂｐおよび６７０ｂｐ）を、アガロースゲルから抽出し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）、その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした（室温で１０分間）。その後、ライゲーション産物を使用して、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。異なる抗ＨＳＶクローン（ｐＶＨ−ＣＨ１＿ＬＣ−ＩｇＧ１Ｆａｂ）のＬＣおよびＨＣを含むプラスミドを、形質転換細胞から精製し（Qiagen Plasmid Midi Kit、Qiagen）、正しい挿入を、プライマーの特定のサブセットで目的の部分を配列決定することにより分析した。
【０２０３】
クローニングプロトコールの部分に記載の通り、ＶＨ−ＨＣおよびＬＣの正しい挿入をチェックするために、全ての新しいＩｇＧ１ Ｆａｂクローンを配列決定した。
【０２０４】
ＳｃＦｖＡコンストラクション
種々の形式のｍＡｂ Ａ（またはＥｘ２）の特徴を広範囲に特徴付けるために、ｍＡｂを、一本鎖抗体Ａ（ＳｃＦｖＡ）としても発現させた。
Ｆａｂ Ａの可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を増幅させ、一本鎖（ＳｃＦｖ）のコンストラクションに用いた。
【０２０５】
ＳｃＦｖ遺伝子カセットは、以下からなる：
ａ）Ｆａｂ Ａ ＶＬおよびＶＨをコードするＤＮＡ
ｂ）リンカー領域［（Ｇｌｙｘ３Ｓｅｒ）ｘ３］をコードするＤＮＡ
ｃ）タンパク質ｔａｇ（ポリ−ヒスチジン）をコードするＤＮＡ。
【０２０６】
ＳｃＦｖ Ｆａｂ Ａ（Ｆａｂ Ｅｘ２）遺伝子カセットを、以下の通りに構築した：
ａ）Ｆａｂ Ａ ＶＬおよびＶＨをコードするＤＮＡ
上記のように、軽鎖および重鎖（それぞれＶＬおよびＶＨ）のＦａｂ Ａ可変領域を、ｍＡｂ Ａ軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡテンプレートからＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により成功裏に増幅させた。ＤＮＡテンプレートからｍＡｂ Ａ ＬＣおよびＨＣを増幅するために用いたプライマーには、以下が含まれる：
５’ ＶＬ末端に、ＳｃＦｖ遺伝子カセット全体をベクターに挿入するために用いられる、制限部位ＳａｃＩ（New England Biolabs、NEB）。
３’  ＶＬ末端に、リンカー領域（リンカー重複領域）をコードするＤＮＡ配列の一部
５’  ＶＨ部分に、リンカー領域（リンカー重複領域）をコードするＤＮＡ配列の一部
３’ＶＨ部分に、Ｈｉｓタグおよび発現ベクターへのＳｃＦｖ遺伝子カセット全体の挿入に使用するための制限部位ＳｐｅＩ（ＮＥＢ）をコードするＤＮＡ配列。上記の通り増幅された全ての遺伝子フラグメントを、全長ＳｃＦｖ遺伝子カセットを構築するために重複ＰＣＲを実施するのに使用した。
【０２０７】
ｂ）リンカー領域［（Ｇｌｙｘ３Ｓｅｒ）ｘ３］をコードするＤＮＡ
リンカー領域（ＬＣとＨＣとの間）の主な機能は、構造的であり、特に［（Ｇｌｙ）３Ｓｅｒ］３からなるリンカー領域は、発現後に適当なＳｃＦｖ折り畳みを可能にする高い柔軟性を特徴とする。リンカー領域は、ＰＣＲ重複技術によってＶＬとＶＨとの間に付加されている。
ｃ）タンパク質ラグ（ポリ−ヒスチジン）をコードするＤＮＡ
ポリ−ヒスチジンタグ領域（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）は、親和性クロマトグラフィーによるＳｃＦｖ精製の基本である。特に、この領域は、Ｈｉｓタグ含有タンパク質を精製するために常套的に使用されるＮｉ２＋ＮｉＮｔａ樹脂（市販されている、ＱＩＡＧＥＮ）によって選択的に結合される。ＨｉｓタグＤＮＡ配列は、ＳｐｅＩ制限部位を既に含む３’ＶＨプライマーにポリＨｉｓ  ＤＮＡをコードする配列を導入するＳｃＦｖ遺伝子カセットに付加されている。
【０２０８】
次いで、以下のプロトコールを用いて、遺伝子カセットベクターにクローニングし、ＳｃＦｖＡを産生した：
１．ＳｃＦｖ含有ベクターによる細菌（XL-1 Blue、Stratagene）の形質転換
ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細菌を、ＳｃＦｖ Ａ遺伝子カセットを含むベクターで（エレクトロポレーションにより）形質転換した。
２．ＳｃＦｖベクターを含む細菌の選択的培養
ＳｃＦｖベクターで正しく形質転換されたＸＬ１ Ｂｌｕｅ細菌を培養し、該ベクターにより担持されるａｍｐｒ（アンピシリン耐性遺伝子）耐性マーカーにより、抗生物質（アンピシリン）で選択した。
３．ＳｃＦｖ発現誘導
ＳｃＦｖ Ａの発現を、いわゆる“誘導因子”（ＩＰＴＧ）を、ＳｃＦｖ形質転換細菌を含む培養液に添加することによって誘導した。
４．培養細菌の超音波処理
誘導工程後に細菌によって産生されたＳｃＦｖを集めるために、ＳｃＦｖＡ発現細菌を超音波処理して、細菌壁を破壊し、細菌によって産生されたＳｃＦｖＡを放出させた。
５．無細胞上清を遠心分離して細胞破片をペレット化する。超音波処理された細菌産物を、細菌細胞破片をペレット化するために、完全に遠心分離した。
６．Ｎｉ２＋親和性クロマトグラフィー精製
工程５で得られた上清を回収し、Ｈｉｓタグに関してＳｃＦｖを精製するために、Ｎｉ２＋親和性クロマトグラフィーカラムに充填した。
７．ＳｃＦｖ収集
その後、精製ＳｃＦｖを集め、−２０℃で保存した。
【図１Ａ】
2018505181.tif 000011
【図１Ｂ】
2018505181.tif 000012
【図２】
2018505181.tif 000013
【図３】
2018505181.tif 000014
【図４】
2018505181.tif 000015
【図５】
2018505181.tif 000016
【図６】
2018505181.tif 000017
【図７】
2018505181.tif 000018
【図８】
2018505181.tif 000019
【図９】
2018505181.tif 000020
【図１０】
2018505181.tif 000021
【図１１−１】
2018505181.tif 000022
【図１１−２】
2018505181.tif 000023
【図１２】
2018505181.tif 000024
【図１３】
2018505181.tif 000025
【図１４】
2018505181.tif 000026
【図１５Ａ−１】
2018505181.tif 000027
【図１５Ａ−２】
2018505181.tif 000028
【図１５Ｂ】
2018505181.tif 000029
【図１６Ａ】
2018505181.tif 000030
【図１６Ｂ】
2018505181.tif 000031
【図１６Ｃ】
2018505181.tif 000032
【図１７Ａ】
2018505181.tif 000033
【図１７Ｂ】
2018505181.tif 000034
【図１７Ｃ】
2018505181.tif 000035
【図１８Ａ】
2018505181.tif 000036
【図１８Ｂ】
2018505181.tif 000037
【図１８Ｃ】
2018505181.tif 000038
【図１９Ａ】
2018505181.tif 000039
【図１９Ｂ−１】
2018505181.tif 000040
【図１９Ｂ−２】
2018505181.tif 000041
【図１９Ｃ】
2018505181.tif 000042
【配列表】
2018505181000001.app
【国際調査報告】
2018505181.tif 000043
2018505181.tif 000044
2018505181.tif 000045