(57)【要約】  セイヨウアブラナ（Brassica napus）から得られる遺伝子調節要素を用いて植物細胞および／または植物組織において導入遺伝子を発現させるための構築物および方法が提供される。
2018500042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子発現カセットであって、前記プロモーターは、配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、遺伝子発現カセット。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがイントロンを含む、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項４】
前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、５’非翻訳領域を含む、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項６】
前記作動可能に連結された導入遺伝子が、ポリペプチドまたは小型ＲＮＡをコードする、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項７】
前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項８】
３’非翻訳領域をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項９】
前記３’非翻訳領域が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項８に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項１０】
請求項１に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
【請求項１１】
前記ベクターが、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルスおよびバクテリオファージからなる群から選択される、請求項１０に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
【請求項１３】
トランスジェニック植物細胞である、請求項１２に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１５】
単子葉植物または単子葉植物である、請求項１４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
前記双子葉植物が、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項１５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
請求項１４に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
【請求項１８】
前記プロモーターが、組織優先プロモーターである、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項１９】
前記組織優先プロモーターが、または胚珠または種子組織優先プロモーターである、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項２０】
前記プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項２１】
配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする合成ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞。
【請求項２２】
前記合成ポリヌクレオチドが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２３】
前記合成ポリヌクレオチドがイントロンを含む、請求項２１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２４】
前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２５】
前記合成ポリヌクレオチドが、５’非翻訳領域を含む、請求項２１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２６】
前記トランスジェニック細胞が、トランスジェニック植物細胞である、請求項２１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２７】
前記トランスジェニック植物細胞が、植物形質転換法により生成される、請求項２６に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２８】
前記植物形質転換法が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、請求項２７に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２９】
請求項２６に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項３０】
前記トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項２９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３１】
前記双子葉植物が、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項３０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３２】
請求項２９に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
【請求項３３】
前記プロモーターが組織優先プロモーターである、請求項２１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項３４】
前記組織優先プロモーターが、胚珠または種子組織優先プロモーターである、請求項２１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項３５】
前記合成ポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３のポリヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項３６】
配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３７】
前記精製されたポリヌクレオチドが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３６に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３８】
前記精製されたポリヌクレオチドがイントロンを含む、請求項３６に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３９】
前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３６に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項４０】
前記精製されたポリヌクレオチドが５’非翻訳領域を含む、請求項３６に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項４１】
前記精製されたポリヌクレオチド配列が、導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項３６に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項４２】
前記作動可能に連結された導入遺伝子が、ポリペプチドをコードするまたは低分子ＲＮＡである、請求項４１に記載の作動可能に連結された導入遺伝子。
【請求項４３】
３’非翻訳領域に作動可能に連結されている請求項４１に記載の導入遺伝子に作動可能に連結された精製されたポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセット。
【請求項４４】
前記３’非翻訳領域が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項４３に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項４５】
前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、請求項４３に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項４６】
請求項４３に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
【請求項４７】
前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびＢＡＣベクターからなる群から選択される、請求項４６に記載の組換えベクター。
【請求項４８】
請求項４３に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
【請求項４９】
前記トランスジェニック細胞が、トランスジェニック植物細胞である、請求項４８に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項５０】
請求項４９に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項５１】
前記トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項５０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５２】
前記双子葉植物が、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項５１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５３】
請求項５０に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
【請求項５４】
前記精製されたポリヌクレオチド配列が、導入遺伝子の組織優先発現を促進する、請求項３６に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項５５】
前記精製されたポリヌクレオチド配列が、導入遺伝子の胚珠または種子組織優先発現を促進する、請求項５４に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項５６】
前記精製されたポリヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３のポリヌクレオチド配列を含む、請求項３６に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項５７】
トランスジェニック植物において異種コード配列を発現させるための方法であって、
３’非翻訳領域に作動可能に連結された異種コード配列に作動可能に連結された、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換すること；
前記遺伝子発現カセットを含む形質転換された植物細胞を単離すること；
前記形質転換された植物細胞を再生してトランスジェニック植物にすること；および
配列番号１を含む前記ポリヌクレオチド配列を含む前記遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物を得ること
を含む、方法。
【請求項５８】
ポリヌクレオチド配列がイントロンを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリヌクレオチド配列が５’非翻訳領域を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記異種コード配列が、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養価コード配列、ＤＮＡ結合コード配列および選択マーカーコード配列からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
植物細胞を形質転換することが、植物形質転換法である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記植物形質転換法が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記双子葉植物が、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
請求項５７に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
【請求項６７】
前記異種コード配列が、組織において優先的に発現される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
前記異種コード配列が、胚珠または種子組織において発現される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３の配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項７０】
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を単離するための方法であって、
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を同定すること；
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること；
前記複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、ＤＮＡ試料から配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を増幅すること；および
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を単離すること
を含む、方法。
【請求項７１】
前記単離されたポリヌクレオチド配列がイントロンを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記単離されたポリヌクレオチド配列が５’非翻訳領域を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記単離されたポリヌクレオチド配列が、導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記作動可能に連結された導入遺伝子が、ポリペプチドをコードする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
３’非翻訳領域に作動可能に連結されている導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセット。
【請求項７７】
前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養価コード配列、ＤＮＡ結合コード配列および選択マーカーコード配列からなる群から選択される、請求項７６に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項７８】
前記３’非翻訳領域が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項７６に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項７９】
請求項７６に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
【請求項８０】
前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびＢＡＣベクターからなる群から選択される、請求項７９に記載の組換えベクター。
【請求項８１】
請求項７６に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
【請求項８２】
前記トランスジェニック細胞が、トランスジェニック植物細胞である、請求項８１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項８３】
請求項８２に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項８４】
前記トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項８３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項８５】
前記双子葉植物が、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項８４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項８６】
請求項８３に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
【請求項８７】
前記単離されたポリヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３の配列を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８８】
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造するための方法であって、
配列番号１を含むポリヌクレオチド配列を同定すること；
配列番号１を含む前記ポリヌクレオチド配列を単離すること；
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む複数のポリヌクレオチド配列を画定すること；
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること；および
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造すること
を含む、方法。
【請求項８９】
合成することが、
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を同定すること；
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること；
前記複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列をライゲートして、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を合成すること
を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記合成ポリヌクレオチド配列がイントロンを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ポリヌクレオチドが有する、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項９３】
前記合成ポリヌクレオチド配列が５’非翻訳領域を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
前記合成されたポリヌクレオチド配列が、導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
前記作動可能に連結された導入遺伝子が、ポリペプチドをコードする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
３’非翻訳領域に作動可能に連結されている請求項９３に記載の導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成されたポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセット。
【請求項９７】
前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、請求項９６に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項９８】
前記３’非翻訳領域が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９６に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項９９】
請求項９６に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
【請求項１００】
前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびＢＡＣベクターからなる群から選択される、請求項９９に記載の組換えベクター。
【請求項１０１】
請求項９６に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
【請求項１０２】
前記トランスジェニック細胞が、トランスジェニック植物細胞である、請求項１０１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１０４】
前記トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項１０３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０５】
前記双子葉植物が、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項１０４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０６】
請求項１０３に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
【請求項１０７】
前記合成ポリヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３の配列を含む、請求項８８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、その全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１００，３９４号「マイクロアレイ分析によって同定されたセイヨウアブラナ種子特異的プロモーター（BRASSICA NAPUS SEED SPECIFIC PROMOTERS IDENTIFIED BY MICROARRAY ANALYSIS）」の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、概して、植物分子生物学の分野に関し、より具体的には植物における導入遺伝子の発現の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの植物種は、農学的に望ましい形質または特徴を導入するために、導入遺伝子で形質転換することができる。得られるトランスジェニック植物種は、特定の所望の形質を有するように開発および／または改変される。一般的に、所望の形質としては、例えば、栄養価の品質を改善すること、収量を増加させること、害虫または病害抵抗性を付与すること、干ばつおよびストレス耐性を増加させること、園芸品質（例えば、色素形成および成長）を向上させること、除草剤耐性を付与すること、植物由来の工業的に有用な化合物および／または材料の生産を可能にすること、および／または医薬品の生産を可能にすることが挙げられる。
【０００４】
単一のゲノム遺伝子座に積み重ねられた複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物種は、植物形質転換技術を介して製造される。植物形質転換技術は、植物細胞への導入遺伝子の導入、植物ゲノムにおいて安定に組み込まれた導入遺伝子のコピーを含有する稔性トランスジェニック植物の回収をもたらし、ならびに植物ゲノムの転写および翻訳を介したその後の導入遺伝子発現は、所望の形質および表現型を有するトランスジェニック植物をもたらす。しかしながら、形質の積み重ねとして遺伝子操作された複数の導入遺伝子を高度に発現するようにトランスジェニック植物種の生産を可能にする機構が望まれる。
【０００５】
同様に、植物の特定の組織または器官内で導入遺伝子の発現を可能にする機構が望まれる。例えば、土壌媒介性病原体による感染に対する植物の抵抗性の増大は、病原体抵抗性タンパク質が植物の根内で着実に発現されるように、病原体抵抗性遺伝子で植物ゲノムを形質転換することにより達成されてもよい。あるいは、例えば、細胞分裂または伸長などの特定の成長または発達段階にある植物組織において導入遺伝子を発現することが望ましい場合がある。さらに、植物の葉および茎組織において導入遺伝子を発現することが望ましい場合がある。
【０００６】
本明細書には、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター調節要素、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター調節因子を含有する構築物／ベクター、およびセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター調節因子を利用する方法が記載される。
【発明の概要】
【０００７】
植物細胞および／または植物組織において導入遺伝子を発現させるための配列、構築物および方法が本明細書に開示される。一実施形態において、本開示は、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子発現カセットに関し、ここで、該プロモーターは、配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、プロモーターは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。追加の実施形態において、プロモーターは、イントロンを含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、プロモーターは、５’非翻訳領域を含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子は、ポリペプチドまたは小型ＲＮＡをコードする。続く実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。さらに別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、３’非翻訳領域をさらに含む。一実施形態において、３’非翻訳領域は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、組換えベクターは遺伝子発現カセットを含む。実施形態のさらなる態様において、組換えベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルスおよびバクテリオファージからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は遺伝子発現カセットを含む。実施形態の続く局面において、細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。実施形態のさらなる態様において、トランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物である。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子は、トランスジェニック植物から得られる。続く実施形態において、プロモーターは組織優先プロモーターである。さらなる実施形態において、組織優先プロモーターは、胚珠または種子組織優先プロモーターである。一実施形態において、種子組織優先プロモーターは、胚乳組織優先プロモーターである。さらに別の実施形態において、プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３のポリヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
一実施形態において、本開示は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズする合成ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞に関する。追加の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。追加の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、イントロンを含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、合成ポリヌクレオチドは５’非翻訳領域を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。続く実施形態において、トランスジェニック植物細胞は、植物形質転換法により生産される。追加の実施形態において、植物形質転換法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物である。他の実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、イネ植物およびコムギ植物からなる群から選択される。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子は、トランスジェニック植物から得られる。さらなる実施形態において、プロモーターは組織優先プロモーターである。さらなる実施形態において、組織優先プロモーターは、胚珠または種子組織優先プロモーターである。一実施形態において、種子組織優先プロモーターは、胚乳組織優先プロモーターである。別の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３のポリヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
一実施形態において、本開示は、精製されたポリヌクレオチドプロモーターに関し、ここで、該プロモーターは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、精製されたポリヌクレオチドプロモーターは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。追加の実施形態において、精製されたポリヌクレオチドプロモーターは、イントロンを含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンに対して少なくとも９０％の同一性を有する。一実施形態において、精製されたポリヌクレオチドプロモーターは５’非翻訳領域を含む。別の実施形態において、精製されたポリヌクレオチドは導入遺伝子に作動可能に連結される。続く実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子は、ポリペプチドをコードするまたは小型ＲＮＡである。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、３’非翻訳領域に作動可能に連結された導入遺伝子に作動可能に連結された、精製されたポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、３’非翻訳領域は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。一実施形態において、組換えベクターは、遺伝子発現カセットを含む。追加の実施形態において、組換えベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびＢＡＣベクターからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は、遺伝子発現カセットを含む。その後の実施形態において、トランスジェニック細胞は、トランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物は、トランスジェニック植物細胞を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は、単子葉植物または双子葉植物である。なおさらなる実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物、およびイネ植物からなる群から選択される。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子は、トランスジェニック植物から得られる。その後の実施形態において、精製されたポリヌクレオチド配列は、導入遺伝子の組織優先発現を促進する。さらなる実施形態において、組織優先プロモーターは、胚珠または種子組織優先プロモーターである。一実施形態において、種子組織優先プロモーターは、胚乳組織優先プロモーターである。他の実施形態において、精製されたポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３のポリヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
一実施形態において、本開示は、トランスジェニック植物において異種コード配列を発現させるための方法であって、
ａ）３’非翻訳領域に作動可能に連結された異種コード配列に作動可能に連結された、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換すること；
ｂ）遺伝子発現カセットを含む形質転換された植物細胞を単離すること；
ｃ）形質転換された植物細胞を再生してトランスジェニック植物にすること；および
ｄ）配列番号１を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物を得ること
を含む、方法に関する。
【００１１】
追加の実施形態において、ポリヌクレオチド配列はイントロンを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる実施形態において、異種コード配列は、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養価コード配列、ＤＮＡ結合コード配列および選択マーカーコード配列からなる群から選択される。追加の実施形態において、植物細胞の形質転換は、植物形質転換法を利用する。なお別の実施形態において、植物形質転換法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される。他の実施形態において、トランスジェニック植物は、単子葉トランスジェニック植物または双子葉トランスジェニック植物である。さらなる実施形態において、単子葉トランスジェニック植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。さらなる実施形態において、異種コード配列は、組織において優先的に発現される。さらなる実施形態において、組織優先プロモーターは、胚珠または種子組織優先プロモーターである。一実施形態において、種子組織優先プロモーターは、胚乳組織優先プロモーターである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３の配列を含む。
【００１２】
一実施形態において、本開示は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を単離するための方法であって、
ａ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること；
ｂ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること；
ｃ）複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、ＤＮＡ試料から配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を増幅すること；および
ｄ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること
を含む、方法に関する。
【００１３】
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチド配列はイントロンを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、ポリヌクレオチド配列は５’非翻訳領域を含む。追加の実施形態において、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む単離されたポリヌクレオチド配列は、導入遺伝子に作動可能に連結されている。さらなる実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子はポリペプチドをコードする。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、３’非翻訳領域に作動可能に連結された導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、３’非翻訳領域は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養価コード配列、ＤＮＡ結合コード配列および選択マーカーコード配列からなる群から選択される。一実施形態において、組換えベクターは遺伝子発現カセットを含む。さらなる実施形態において、ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびＢＡＣベクターからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は遺伝子発現カセットを含む。追加の実施形態において、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。追加の実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物である。さらなる実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３のポリヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
一実施形態において、本開示は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造するための方法であって、
ａ）配列番号１を含むポリヌクレオチド配列を同定すること；
ｂ）配列番号１を含むポリヌクレオチド配列を単離すること；
ｃ）配列番号１の少なくとも９０％の配列同一性を含む複数のポリヌクレオチド配列を画定すること；
ｄ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること；および
ｅ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造すること
を含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、合成することは、
ａ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること；
ｂ）オリゴヌクレオチドプライマー配列が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること；
ｃ）複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列をライゲートして、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること
を含む、方法に関する。
【００１６】
追加の実施形態において、合成されたポリヌクレオチド配列はイントロンを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ（Arabadiopsis thaliana）ユビキチン１０イントロンに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、合成されたポリヌクレオチド配列は５’非翻訳領域を含む。追加の実施形態において、合成されたポリヌクレオチド配列は、導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。なお別の実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子はポリヌクレオチドをコードする。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、３’非翻訳領域に作動可能に連結された導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成されたポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、３’非翻訳領域は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。なお別の実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。一実施形態において、組換えベクターは遺伝子発現カセットを含む。追加の実施形態において、組換えベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびＢＡＣベクターからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は遺伝子発現カセットを含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は、単子葉植物または双子葉植物である。他の実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。他の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド１〜１４８３のポリヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
一実施形態において、構築物は、配列番号１のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子または異種コード配列に作動可能に連結された配列番号１のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号２のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された配列番号２のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号１のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターに作動可能に連結された配列番号２のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子または異種コード配列に作動可能に連結された配列番号１のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを超える導入遺伝子を含む。
【００１８】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、独立して、ａ）配列番号１のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター、およびｂ）配列番号２のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む。
【００１９】
配列番号１のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターおよび配列番号２の３’ＵＴＲを用いて導入遺伝子を発現する植物を成長させる方法が本明細書に開示される。また、配列番号１のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターおよび配列番号２の３’ＵＴＲを用いて導入遺伝子を発現する植物組織および細胞を培養する方法が本明細書に開示される。一実施形態において、本明細書に開示する方法は、植物の葉および茎における組織特異的遺伝子発現を含む。
【００２０】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子から得られた配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ｐＤＡＢ１１３９０４のプラスミドマップを示す図である。
【図２】ｐＤＡＢ９３８１のプラスミドマップを示す図である。
【図３】トランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）植物組織における黄色蛍光タンパク質発現パターンの顕微鏡画像を示す図である。パネルＦに提示された画像は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）植物組織の根内で、ｐＤＡＢ１１３９０４に記載されるように、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸプロモーターによって駆動され、３’ＵＴＲ調節要素によって終結される、ＹＦＰタンパク質の発現を示す。パネルＧに提示された画像は、他の植物組織、例えば、茎生葉、花、小柄、種子および花において、ｐＤＡＢ１１３９０４に記載されるように、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸプロモーターによって駆動され、３’ＵＴＲ調節要素によって終結される、ＹＦＰタンパク質の発現を示す。茎生葉、花、小柄、種子および花組織におけるＹＦＰタンパク質の発現は、多コピー数事象において観察された。パネルＨに提示された画像は、ｐＤＡＢ１１３９０４に記載されるように、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸプロモーターによって駆動され、３’ＵＴＲ調節要素によって終結される、ＹＦＰタンパク質の内胚乳に局在化された初期胚珠発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本明細書で使用するとき、冠詞の「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において明確かつ一義的な他の指示がない限り、複数への言及も含む。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「戻し交配」とは、ブリーダーが雑種子孫をその親の片方と再び交配する方法を指し、例えば、第一世代のＦｌ雑種が、Ｆｌ雑種の親の片方の遺伝子型を有することである。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「イントロン」とは、転写されるが、翻訳はされない遺伝子に含まれる任意の核酸配列（または対象とする発現されたヌクレオチド配列）を指す。イントロンは、ＤＮＡの発現された配列内の非翻訳核酸配列、ならびにそれから転写されたＲＮＡ分子の対応する配列を含む。
【００２５】
本明細書に記載される構築物はまた、イントロンなどの、翻訳および／またはｍＲＮＡの安定性を高める配列を含むことができる。このようなイントロンの１つの例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストン変異体の遺伝子ＩＩの第１イントロン、または任意の他の一般的に知られているイントロン配列である。イントロンは、翻訳および／またはｍＲＮＡの安定性を高めるために、プロモーター配列と組み合わせて使用することができる。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「５’−非翻訳領域」または「５’−ＵＴＲ」とは、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの５’末端における非翻訳セグメントを指す。例えば、成熟したｍＲＮＡに関して、５’−ＵＴＲは、典型的には、その５’上に７−メチルグアノシンキャップを有し、スプライシング、ポリアデニル化、細胞質へのｍＲＮＡの排出、翻訳機構によるｍＲＮＡの５’端の識別、および分解に対するｍＲＮＡの保護などの多数のプロセスに関与する。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「３’−非翻訳領域」または「３’−ＵＴＲ」とは、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’末端における非翻訳セグメントを指す。例えば、成熟したｍＲＮＡに関して、この領域は、ポリ（Ａ）テールを有し、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始およびｍＲＮＡ排出における多数の役割を有することが公知である。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「ポリアデニル化シグナル」とは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下である場合、例えば、ポリ（Ａ）シグナルの下流の１０〜３０塩基に位置した、ポリアデニル化部位上でポリアデニル化されるように転写を可能にするｍＲＮＡ転写物に存在する核酸配列を指す。多数のポリアデニル化シグナルは当該技術分野において公知であり、本発明に有用である。典型的な配列には、ＡＡＵＡＡＡおよびその改変体が含まれ、Loke J., et al, (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468に記載されている。
【００２９】
本明細書で使用するとき、用途「単離された」とは、生物学的成分（例えば、核酸またはタンパク質）が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分（すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡ）から区別された上記生物学的成分を指す。
【００３０】
本明細書で使用するとき、核酸分子に関して「精製された」という用語は、絶対的な純度（例えば、均質な調製）を要求しない；代わりに、それは、配列が、その天然の細胞環境におけるものよりも相対的に純粋であるという指示を表す（天然レベルと比較して、このレベルは、例えば、濃度または遺伝子発現レベルの点で少なくとも２〜５倍大きいことが必要である）。ＤＮＡ分子は、全ゲノムＤＮＡまたは全ゲノムＲＮＡから直接得ることができる。さらに、ｃＤＮＡクローンは天然には存在しないが、むしろ好ましくは、部分的に精製された天然に存在する物質（逆転写酵素ポリメラーゼによって逆転写されるメッセンジャーＲＮＡ）の操作によって得られる。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築は、合成物質（ｃＤＮＡ）を作製することを伴う。個々のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリーを有する細胞のクローン選択により合成ライブラリーから精製することができる。したがって、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築、および異なるｃＤＮＡクローンの精製を伴うプロセスは、天然のメッセージのおよそ１０６倍の精製をもたらす。同様に、プロモーターＤＮＡ配列をプラスミドにクローニングすることができる。このようなクローンは天然に存在しないが、むしろ好ましくは、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの部分的に精製された天然に存在する物質の操作によって、またはゲノムＤＮＡから直接得られる。したがって、少なくとも１桁の、好ましくは２桁または３桁の、より好ましくは４桁または５桁の精製が、これらの技術において好まれる。
【００３１】
同様に、精製は、成分のＤＮＡ配列における化学的または機能的な変化が生じたという指示を表す。「精製」された核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製方法により精製された核酸分子およびタンパク質を含む。用語「精製された」はまた、宿主細胞（例えば、植物細胞）において組換えＤＮＡ法により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドを包含する。
【００３２】
用語「組換え体」は、遺伝子組換えが起こった細胞または生物を指す。また、ヒトの介入により、人工的にまたは合成的に（すなわち、非天然に）改変された分子（例えば、ベクター、プラスミド、核酸、ポリペプチドまたは小型ＲＮＡ）を含む。改変は、その天然の環境もしくは状況内の分子またはそこから取り出された分子について行うことができる。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ（小型ＲＮＡ分子を含む）に転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ（「転写物」とも呼ばれる）が、続いて、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加または減少させる薬剤への細胞、組織または生物の曝露により影響を与える場合がある。また、遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡからタンパク質への経路におけるいずれかの場所で調節され得る。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセッシングに作用する制御を介して、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解、または作製された後の特定のタンパク質の活性化、不活性化、コンパートメント化もしくは分解を介して、あるいはこれらの組合せによって起こる。遺伝子発現は、限定されないが、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはインビトロの、インサイチュのもしくはインビボのタンパク質活性アッセイ（単数または複数）などの当該技術分野において公知の任意の方法により、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」または「ＨＢＧＳ」は、転写遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む総称である。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、プロモーターまたは転写された配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に起因して、それぞれ転写阻害（転写遺伝子サイレンシング；ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（転写後遺伝子サイレンシング；ＰＴＧＳ）に起因し得る。それぞれのプロセスへの異なる細胞コンポーネントの関与は、ｄｓＲＮＡ誘導ＴＧＳおよびＰＴＧＳが、おそらく古代の共通な機構の多様化に起因することを示唆している。しかしながら、ＴＧＳとＰＴＧＳを厳密に比較することは、その比較が一般的に異なるサイレンシング遺伝子座の分析に依拠しているために達成が困難であった。単一トランス遺伝子座は、異なる標的遺伝子のプロモーターおよび転写された配列に対応するｄｓＲＮＡの生成に起因して、ＴＧＳとＰＴＧＳの両方を始動させると説明することができる。
【００３５】
本明細書で使用するとき、用語「核酸分子」、「核酸」または「ポリヌクレオチド」（３つ全ての用語は互いに同義である）とは、ヌクレオチドのポリマー形態を指し、これには、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成形態のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の混合ポリマーを含み得る。「ヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの改変された形態を指してもよい。核酸分子は、通常、他に指定されなければ、少なくとも１０塩基長である。これらの用語は、未定長のＲＮＡまたはＤＮＡの分子を指してもよい。これらの用語には、一本鎖形態および二本鎖形態のＤＮＡが含まれる。核酸分子は、天然に存在するおよび／または天然には存在しないヌクレオチド連鎖により互いに連結された天然に存在するおよび改変されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含んでもよい。
【００３６】
核酸分子は、当業者により容易に認識されるように、化学的にもしくは生化学的に改変されてもよく、または非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。このような修飾には、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合：例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど；荷電結合：例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど；ペンダント部分：例えば、ペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソラレンなど；キレート剤；アルキル化剤；および修飾された結合：例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。また、用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、部分的な二重鎖、三重鎖、ヘアピン、環状、およびパドロックコンフォメーションなどの任意の位相的コンフォメーションを含む。
【００３７】
転写は、ＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進行する。これは、ＲＮＡが、成長している鎖の３’末端へのリボヌクレオチド−５’−三リン酸の連続付加（ピロリン酸の不可欠な除去とともに）により作製されることを示す。線形または環状の核酸分子のいずれかにおいて、別々の要素（例えば、特定のヌクレオチド配列）は、その要素から５’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合することになるのであれば、さらなる要素に対して「上流」にあると呼んでもよい。同様に、別々のエレメントは、そのエレメントから３’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合することになるのであれば、さらなる要素に対して「下流」にあることになり得る。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「塩基位置」とは、指定された核酸内の所与の塩基またはヌクレオチド残基の位置を指す。指定された核酸は、参照核酸とのアライメントにより定義されてもよい。
【００３９】
本明細書で使用するとき、用語「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴヌクレオチドとそれらの類似体が水素結合によりハイブリダイズするプロセスを指し、水素結合としては、相補的塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合が含まれる。一般的に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリン間で水素結合を形成し、プリンへのピリミジンの結合は「塩基対合」と呼ばれる。さらに具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合する。「相補的」とは、２つの異なる核酸配列間または同じ核酸配列の２つの異なる領域間で起こる塩基対合を指す。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間で、安定であり特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を指す。特異的にハイブリダイズするために、オリゴヌクレオチドは、その標的配列に１００％相補的である必要はない。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチドの結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能と干渉し、特異的結合が望ましい条件下で、例えば、インビボのアッセイまたは系の場合の生理的条件下で非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在するとき、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。特定の程度のストリンジェンシーを生じるハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダイゼーション法の性質、ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化する。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ２＋濃度）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに寄与するが、洗浄時間もまたストリンジェンシーに影響を与える。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989で考察されている。
【００４１】
本明細書で使用するとき、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間のミスマッチが５０％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」には、さらに特定レベルのストリンジェンシーが含まれる。したがって、本明細書で使用するとき、「中程度のストリンジェンシー」条件とは、５０％を超える配列ミスマッチを有する分子ではハイブリダイズしない条件であり；「高ストリンジェンシー」の条件とは、２０％を超えるミスマッチを有する配列ではハイブリダイズしない条件であり；「超高ストリンジェンシー」の条件とは、１０％を超えるミスマッチを有する配列ではハイブリダイズしない条件である。
【００４２】
特定の実施形態において、ストリンジェントな条件は、６５℃でのハイブリダイゼーション、続く、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いた６５℃での４０分間の洗浄を含むことができる。以下は、代表的な非限定的ハイブリダイゼーション条件である：
超高ストリンジェンシー：５×ＳＳＣ緩衝液中、６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ緩衝液中、室温でそれぞれ１５分間の洗浄２回；および０．５×ＳＳＣ緩衝液中、６５℃でそれぞれ２０分間の洗浄２回。
高ストリンジェンシー：５〜６×ＳＳＣ緩衝液中、６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ緩衝液中、室温でそれぞれ５〜２０分間の洗浄２回；および１×ＳＳＣ緩衝液中、５５〜７０℃でそれぞれ３０分間の洗浄を２回。
中程度ストリンジェンシー：６×ＳＳＣ緩衝液中、室温から５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×〜３×ＳＳＣ緩衝液中、室温から５５℃でそれぞれ２０〜３０分間の洗浄を少なくとも２回。
【００４３】
一実施形態において、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、超高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。一実施形態において、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。一実施形態において、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、中程度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド」とは、短い核酸ポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、さらに長い核酸セグメントを切断することにより、または個々のヌクレオチド前駆体を重合することにより形成し得る。自動合成装置により、最大数百塩基対長のオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるため、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用し得る。ＤＮＡで構成されているオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、小型ＤＮＡ配列の増幅のための技術であるポリメラーゼ連鎖反応において使用し得る。ポリメラーゼ連鎖反応において、オリゴヌクレオチドは、典型的には、「プライマー」と呼ばれ、これによりＤＮＡポリメラーゼはオリゴヌクレオチドを伸長し、相補鎖を複製することができる。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡが、米国特許第４，６８３，１９５号明細書に記載されたように増幅される手順または技術を一般に指す。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーが設計できるように、目的とする領域の末端からのまたはそれを超えた配列情報を入手できる必要がある；これらのプライマーは、増幅されるべき鋳型の対向する鎖と配列が同一または類似している。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅された材料の末端と一致してもよい。ＰＣＲを用いて、特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列、および全細胞性ＲＮＡ、バクテリオファージ配列またはプラスミド配列から転写されたｃＤＮＡなどを増幅することができる。一般に、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51 :263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)を参照されたい。
【００４６】
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」とは、条件がプライマー伸長産物の合成に適している場合、相補鎖に沿った合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。合成条件には、４つの異なるデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼなどの少なくとも１つの重合誘導剤の存在が含まれる。これらは、適切な緩衝液中に存在し、該緩衝液は、補因子である、または様々な適切な温度でｐＨなどの条件に影響を与える構成物質を含んでもよい。プライマーは、好ましくは一本鎖配列であり、それにより、増幅効率が最適化されるが、二本鎖配列を利用することができる。
【００４７】
本明細書で使用するとき、用語「プローブ」とは、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を指す。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）またはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）形式のアッセイ手法において、プローブは、２つのプライマーのアニーリング部位間に位置する標的の部分にハイブリダイズする。プローブは、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチドまたは約５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プローブは、約８ヌクレオチドから約１５ヌクレオチドを含む。
【００４８】
サザンブロットアッセイ手法において、プローブは、メンブレンに結合されたＤＮＡ断片にハイブリダイズする。プローブは、約１０個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド、約２５０個のヌクレオチド、約５００個のヌクレオチド、約１，０００個のヌクレオチド、約２，５００個のヌクレオチド、または約５，０００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プローブは、約５００個のヌクレオチド〜約２，５００個のヌクレオチドを含む。
【００４９】
プローブは、検出可能な標識、例えば、放射性標識、ビオチン化標識、フルオロフォア（ＴＥＸＡＳ−ＲＥＤ（登録商標）、フルオレセインイソチオシアネートなど）をさらに含むことができる。検出可能な標識は、例えば、プローブの５’末端またはプローブの３’末端に位置したプローブオリゴヌクレオチドに直接、共有結合され得る。また、フルオロフォアを含むプローブはまた、クエンチャー、例えば、ＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）、ＩＯＷＡ  ＢＬＡＣＫ（商標）などをさらに含むことができる。
【００５０】
本明細書で使用するとき、用語「配列同一性」または「同一性」は交換可能に使用され得、ポリヌクレオチドまたはタンパク質断片のいずれかについて特定の比較ウィンドウにわたって、最大一致となるように整列させた場合に、類似の塩基組成を共有する２つの配列の核酸残基を指す。
【００５１】
本明細書で使用するとき、用語「配列同一性の割合」とは、比較ウィンドウにわたって、２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）を比較することにより決定される値を指し、ここで、比較ウィンドウにおける配列の一部は、この２つの配列の最適アライメントの（付加または欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。割合は、同一の核酸またはアミノ酸の残基が両方の配列に生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を算出し、マッチした位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を算出することにより計算される。比較のために配列を整列させる方法は周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al., (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al., (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al., (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。
【００５２】
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ベーシックローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ；Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10）は、複数の配列分析プログラムと連結して使用するために、複数の供給元、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から、および、インターネット上で入手可能である。このプログラムを使用する配列同一性の決定方法の説明は、インターネット上で、ＢＬＡＳＴの「ｈｅｌｐ」欄で利用可能である。核酸配列の比較について、ＢＬＡＳＴ（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能を、デフォルトパラメーターを用いて採用することができる。参照配列に対してより一層大きな類似性を有する核酸配列は、この方法により評価した場合、同一性の割合が高くなることを示す。
【００５３】
本明細書で使用するとき、用語「作動可能に連結された」とは、別の核酸と機能的な関係に置かれた核酸を指す。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結された核酸が連続していることを意味し得る。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成することができる。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが核酸にライゲートまたはアニーリングされ、連続したポリヌクレオチド断片を連結させるために使用される。しかしながら、作動可能に連結しようとする要素は、必ずしも連続していなくてもよい。
【００５４】
本明細書で使用するとき、用語「プロモーター」とは、遺伝子の上流（遺伝子の５’領域方向）に一般的に配置されているＤＮＡの領域を指し、該遺伝子の転写を開始および駆動するため必要とされる。プロモーターは、それが調節する遺伝子を適切に活性化または抑制することができる。プロモーターは、転写因子によって認識される特定配列を含有し得る。これらの因子は、プロモーターＤＮＡ配列に結合してもよく、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素である、ＲＮＡポリメラーゼの漸増をもたらす。プロモーターは、一般的に、上流プロモーター、５’−ＵＴＲ、イントロンおよびリーダー配列を含む、遺伝子の上流に配置された全ての遺伝子調節要素を指す。
【００５５】
本明細書で使用するとき、用語「上流プロモーター」とは、転写の開始を指向するのに十分である連続したポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用するとき、上流プロモーターは、ＴＡＴＡボックス、イニシエーター配列、ＴＦＩＩＢ認識要素および他のプロモーターモチーフを含む、いくつかの配列モチーフを有する転写の開始部位を包含する（Jennifer, E.F. et al., (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592）。上流プロモーターは、ＴＦＩＩＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＨのような基本のまたは一般的な転写因子を含むマルチサブユニット酵素であるＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する作用部位を提供する。これらの因子は、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡの合成を触媒する転写開始前の複合体に集合する。
【００５６】
上流プロモーターの活性化は、様々なタンパク質が結合し、続いて、遺伝子発現を活性化するために、転写開始複合体と相互作用する調節ＤＮＡ配列要素の追加配列によって行われる。これらの遺伝子調節要素配列は、特異的ＤＮＡ結合因子と相互作用する。これらの配列モチーフは、しばしば、シス要素と呼ばれることがある。このようなシス要素は、それに組織特異的または発生特異的な転写因子が結合するが、個々にまたは組み合わせて、転写レベルでプロモーターの時空間的発現パターンを決定することができる。これらのシス要素は、それらが作動可能に連結された遺伝子に影響を与える制御の種類の点で大きく異なる。いくつかの要素は、環境応答（例えば、温度、湿度および創傷）に応答して、作動可能に連結された遺伝子の転写を増大させるように作用する。他のシス要素は、発生の合図（例えば、発芽、種子成熟および開花）または空間情報（例えば、組織特異性）に応答することができる。例えば、Langridge et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23を参照されたい。これらのシス要素は転写開始点から様々な距離に配置され、いくつかのシス要素（近位要素と呼ばれる）は最小コアプロモーター領域に隣接し、一方、他の要素は、プロモーター（エンハンサー）の数キロベース上流または下流に位置する場合もある。
【００５７】
「ＤＮＡ結合導入遺伝子」は、ＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドコード配列である。ＤＮＡ結合タンパク質は、続いて、別の分子に結合することができる。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合において、それは自分自身に結合する（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）ことができる、および／またはそれは異なるタンパク質もしくは複数のタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１より多い種類の結合活性を有してもよい。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００５８】
ＤＮＡ結合タンパク質の例としては、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝性操作され」得るメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥ結合ドメインが含まれる。典型的には、遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主として合理的基準によってもたらされる、天然には生じないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；および同第６，５３４，２６１号明細書；さらに国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；同第９８／５３０５９号パンフレット；同第９８／５３０６０号パンフレット；同第０２／０１６５３６号パンフレットおよび同第０３／０１６４９６号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書、同第２０１１０２３９３１５号明細書および同第２０１１９１４５９４０号明細書を参照されたい。
【００５９】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上のジンクフィンガーにより配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質なる用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略されることが多い。ジンクフィンガー結合ドメインを「遺伝子操作」して、所定のヌクレオチド配列に結合させることができる。ジンクフィンガータンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定な例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、設計／組成が主に合理的基準に基づく自然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書、第６，４５３，２４２号明細書、第６，５３４，２６１号明細書および第６，７９４，１３６号明細書を参照されたい。さらに、国際公開第９８／５３０５８号パンフレット、国際公開第９８／５３０５９号パンフレット、国際公開第９８／５３０６０号パンフレット、国際公開第０２／０１６５３６号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットも参照されたい。
【００６０】
他の例において、１つ以上のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは遺伝子操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。キサントモナス（Xanthomonas）属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことが知られている。キサントモナス（Xanthomonas）の病原性は、植物細胞内により多くの異なるエフェクタータンパク質を注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様（ＴＡＬＥＮ）エフェクターがある（Kay et al., (2007) Science 318:648-651を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けされたＴＡＬエフェクターの１つは、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリア（Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria）に由来するＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al., (1989) Mol Gen Genet 218: 127- 136および国際公開第２０１００７９４３０号パンフレットを参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、タンデム反復の集中ドメインを含有し、各反復が、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の要である約３４個のアミノ酸を含有する。さらに、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Schornack S, et al., (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照されたい）。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌（Ralstonia solanacearum）において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と表記される２つの遺伝子が、青枯病菌（R. solanacearum）の次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００において、キサントモナス（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Heuer et al., (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384を参照されたい）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、キサントモナス（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。
【００６１】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデム反復に見出される配列に依存する。反復した配列は、およそ１０２ｂｐを含み、反復は、典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Bonas et al.、同書）。反復の多型性は、通常、１２および１３位に位置し、１２および１３位の超可変ジ残基の正体と、ＴＡＬエフェクターの標的配列における連続したヌクレオチドの正体との間に１対１の対応関係が存在するようである（Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501およびBoch et al., (2009) Science 326: 1509-1512を参照されたい）。１２および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、およびＩＮＧがＴに結合するように、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードが実験的に決定されている。これらのＤＮＡ結合反復を、新たな反復の組合せおよび数を用いてタンパク質へと組み立てて、新たな配列と相互作用し、植物細胞内の非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することが可能である人工転写因子を作製した（Boch et al.、同書）。遺伝子操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結して、酵母レポーターアッセイ（プラスミドベースの標的）において活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合（ＴＡＬＥＮ）を得た。
【００６２】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された等間隔短鎖回文反復（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats））／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系は、ゲノム遺伝子操作に使用され得る細菌系に基づいて、最近遺伝子操作されたヌクレアーゼ系である。それは、多くの細菌および古細菌の適応的免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入するとき、侵入体のＤＮＡのセグメントは、「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次に、このｃｒＲＮＡは、部分的に相補的な領域を通じて、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡにおけるｃｒＲＮＡと相同な領域に導く。Ｃａｓ９は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有される２０ヌクレオチドガイド配列によって特定される部位でＤＳＢの平滑末端を生成する。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識および切断のために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。この系は、今では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが１つの分子に組み合わされ得るように遺伝子操作されており（「単一ガイドＲＮＡ」）、単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡに匹敵する部分は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが任意の所望の配列を標的とするように導くように遺伝子操作され得る（Jinek et al., (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471, およびDavid Segal, (2013) eLife 2:e00563を参照されたい）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノム内の所望の標的において二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製するように遺伝子操作することができ、ＤＳＢの修復は、修復阻害因子を使用して、誤りがちな修復の増加を引き起こすことによって影響を受け得る。
【００６３】
他の例において、ＤＮＡ結合導入遺伝子は、遺伝子操作された（天然に存在しない）メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとも呼ばれる）を含む部位特異的ヌクレアーゼである。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号明細書；米国特許第６，８３３，２５２号明細書；Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388; Dujon et al., (1989) Gene 82:115-118; Perler et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al., (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al., (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびNew England Biolabsカタログを参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように遺伝子操作することができる。例えば、Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10:895-905；Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res. 5 31 :2952-2962；Ashworth et al., (2006) Nature 441: 656-659；Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号明細書を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてのヌクレアーゼという文脈において改変され得る（すなわち、ヌクレアーゼが同族の切断ドメインを含むように）または異種の切断ドメインに融合され得る。
【００６４】
本明細書で使用するとき、用語「形質転換」は、核酸分子をこのような細胞内に導入することができる全ての技術を包含する。例としては、限定されないが、ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；エレクトロポレーション、リポフェクション；マイクロインジェクション（Mueller et al., (1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介による移入；ＤＮＡ直接取り込み；ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介による形質転換；および微粒子銃が挙げられる。これらの技術は、植物細胞の安定した形質転換と一過性の形質転換の両方に使用することができる。「安定した形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝的形質をもたらす宿主生物のゲノムへの核酸断片の導入を指す。安定に形質転換されると、核酸断片は、宿主生物およびいずれかの後続世代のゲノムに安定に組み込まれる。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」生物と呼ばれる。「一過性の形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝的形質なしに遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核またはＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断片の導入を指す。
【００６５】
本明細書で使用するとき、用語「導入遺伝子」とは外因性核酸配列を指す。一例において、導入遺伝子は、遺伝子配列（例えば、除草剤抵抗性遺伝子）、工業的もしくは薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業形質をコードする遺伝子である。さらに別の例において、導入遺伝子は、小型ＲＮＡ配列、例えば、アンチセンス核酸配列であり、ここで、小型ＲＮＡの発現は、標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入遺伝子に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーター、イントロンまたは３’−ＵＴＲ）を含有し得る。いくつかの実施形態において、目的とする核酸（または目的とする遺伝子として代替的に記載される）は導入遺伝子である。しかしながら、他の実施形態において、目的とする核酸は、内因性核酸の付加的なゲノムコピーが所望される内因性核酸、または宿主生物における標的核酸の配列に対してアンチセンス方向である核酸である。
【００６６】
本明細書で使用するとき、用語「小型ＲＮＡ」とは、いくつかの種類の非コードリボ核酸（ｎｃＲＮＡ）を指す。小型ＲＮＡなる用語は、細菌細胞、動物、植物および菌類において生成されるｎｃＲＮＡの短鎖を記述する。ｎｃＲＮＡのこれらの短鎖は、細胞内で天然に生成され得て、または短鎖もしくはｎｃＲＮＡを発現する外因性配列を導入することにより生成され得る。小型ＲＮＡ配列は、タンパク質を直接コードせず、小型ＲＮＡ配列が転写されるのみであり、翻訳されない点で他のＲＮＡと機能において相違する。小型ＲＮＡ配列は、遺伝子発現および修飾を含む、他の細胞機能に関与する。小型ＲＮＡ分子は、通常、約２０〜３０ヌクレオチドから構成される。小型ＲＮＡ配列は、より長い前駆体から誘導することができる。前駆体は、自己相補性領域において、互いに折り畳む構造を形成する；次に、それらは、動物のヌクレアーゼであるダイサーまたは植物のＤＣＬ１により処理される。
【００６７】
多種類の小型ＲＮＡは、天然に存在しまたは人工的に生成され、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および短鎖核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）が含まれる。マイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなどのある種の小型ＲＮＡは、遺伝子サイレンシングおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において重要である。遺伝子サイレンシングは、正常に発現される遺伝子が、細胞内の要素、この場合は小型ＲＮＡによって「止め」られる遺伝子調節のプロセスである。通常、この遺伝情報によって形成されるタンパク質は、干渉により形成されず、該遺伝子においてコードされる情報は発現からブロックされる。
【００６８】
本明細書で使用するとき、用語「小型ＲＮＡ」には、文献に記載されているＲＮＡ分子が包含され、例えば、「小さなＲＮＡ」（Storz, (2002) Science 296: 1260-3; Illangasekare et al., (1999) RNA 5 : 1482-1489）；原核生物の「小型ＲＮＡ」（ｓＲＮＡ）（Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45）；真核生物の「非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）」：「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」；「小型非ｍＲＮＡ（ｓｍｍＲＮＡ）」、「機能的ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）」、「転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）」、「触媒ＲＮＡ」［例えば、リボザイム、例えば自己アシル化リボザイム（Illangaskare et al., (1999) RNA 5 : 1482-1489）］；「小型核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）」、「ｔｍＲＮＡ」（別名「１０Ｓ  ＲＮＡ」、Muto et al., (1998) Trends Biochem Set. 23 :25-29;およびGillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885）；限定されないが、「小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」を含むＲＮＡｉ分子、「エンドヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅ−ｓｉＲＮＡ）」、「短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」、および「小型一時的調節ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）」、「角切りｓｉＲＮＡ（ｄ−ｓｉＲＮＡ）」、ならびにアプタマー、オリゴヌクレオチド、および少なくとも１つのウラシル塩基を含む他の合成核酸が挙げられる。
【００６９】
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」とは、細胞内に導入されると形質転換細胞を生成する核酸分子を指す。ベクターは、複製起点などの宿主細胞中での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。例としては、限定されないが、細胞内に外来ＤＮＡを運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはウイルスが含まれる。また、ベクターは、１つ以上の遺伝子、アンチセンス分子および／または選択マーカー遺伝子、ならびに当該技術分野において公知の他の遺伝的要素を含むことができる。ベクターは、細胞を形質導入すること、形質転換すること、または細胞に感染することが可能であり、それによって、細胞が、ベクターによってコードされた核酸分子および／またはタンパク質を発現するようにさせる。ベクターは、場合により、細胞への核酸分子の侵入を達成するのを助けるための材料（例えば、リポソーム）を含んでもよい。
【００７０】
本明細書で使用するとき、用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」は、特定の制限部位で、または相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡのセグメントは、目的とする小型ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする目的とする遺伝子を含有するポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳に適切なリーディングフレームにカセットの挿入を確実にするために設計される。一実施形態において、発現カセットは、目的とする小型ＲＮＡまたはポリペプチドをコードし、ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を含むことができる。一実施形態において、遺伝子発現カセットはまた、宿主細胞において目的とするポリペプチドをコードする小型ＲＮＡまたはポリヌクレオチドの発現を増強され得る要素を含んでもよい。これらの要素は、限定されないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答要素、イントロン、５’−非翻訳領域配列、３’−非翻訳領域配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などを含んでもよい。
【００７１】
本明細書で使用するとき、用語「異種コード配列」は、宿主生物に通常は存在しないが、適切な条件下で宿主細胞において発現されることができる、ペプチドまたはタンパク質またはその等価なアミノ酸配列、例えば酵素をコードするまたは最終的にコードする、任意のポリヌクレオチドを示すために使用される。したがって、「異種コード配列」は、宿主細胞に通常存在しないコード配列の１つまたは追加のコピーを含んでもよく、よって該細胞は、該細胞に通常存在しないコード配列の追加のコピーを発現している。異種コード配列は、ＲＮＡもしくはその任意の種類、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡもしくはその任意の種類、例えば、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドであり得る。コード配列の例としては、限定されないが、コード配列、イントロン、プロモーター領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲおよびエンハンサー領域などのような特徴を含む完全長の転写単位が挙げられる。
【００７２】
「異種コード配列」はまた、ペプチドまたは酵素のコード部分、すなわち、ペプチドまたは酵素のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列、ならびに、完全長の転写単位のコード部分、すなわち、イントロンおよびエクソンを含む遺伝子、ならびに、酵素をコードするもしくはその等価なアミノ酸配列をコードする「コドン最適化された」配列、切断された配列、または他の形態の改変された配列を含み、ただし、等価なアミノ酸配列は、機能的タンパク質を生成する。このような等価なアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失を有することができ、この欠失はＮ末端、Ｃ末端またはその中間である。切断された形態は、それらが本明細書に示された触媒能を有する限り想定される。
【００７３】
本明細書で使用するとき、用語「対照」は、比較目的で分析手法において使用される試料を指す。対照は、「陽性」または「陰性」であり得る。例えば、分析手法の目的が、細胞または組織中で示差的に発現された転写物またはポリペプチドを検出することである場合、一般的に、所望の発現を示す公知の植物からの試料などの陽性対照を含み、所望の発現を欠いている公知の植物由来の試料などの陰性対照を含むことが好ましい。
【００７４】
本明細書で使用するとき、用語「植物」には、植物および植物の部分が含まれ、限定されないが、植物細胞および植物組織、例えば、葉、茎、根、花、花粉および種子が挙げられる。本発明において使用することができる植物の種類は、一般的に、被子植物、裸子植物、シダおよび多細胞藻類を含む突然変異誘発に適した、高等植物および下等植物の種類と同程度に広い。したがって、「植物」とは、双子葉植物および単子葉植物を含む。双子葉植物の例としては、タバコ、アラビドプシス属（Arabidopsis）、ダイズ、トマト、パパイヤ、キャノーラ、ヒマワリ、綿、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウの木、キマメ、エンドウ、アブラナ属（Brassica）、ヒヨコマメ、テンサイ、ナタネ、スイカ、メロン、ペッパー、ピーナッツ、カボチャ、ダイコン、ホウレンソウ、スクワッシュ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、白菜、キュウリ、ナスおよびレタスが挙げられる。単子葉植物の例としては、トウモロコシ、イネ、キムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、ラン、竹、バナナ、ガマ、ユリ、オートムギ、タマネギ、キビおよびライコムギが挙げられる。
【００７５】
本明細書で使用するとき、用語「植物材料」とは、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養物、または植物の任意の他の部分または生成物を指す。一実施形態において、植物材料は、子葉および葉を含む。一実施形態において、植物材料には、種子、胚または胚珠が含まれる。一実施形態において、植物材料は、根組織、地下に位置する他の植物組織を含む。
【００７６】
本明細書で使用するとき、用語「選択マーカー遺伝子」とは、例えば、選択剤から植物細胞を保護し、または選択剤に対して抵抗性／耐性を提供するために、場合により植物形質転換に使用される遺伝子を指す。さらに、「選択マーカー遺伝子」は、レポーター遺伝子を包含することを意味する。機能的選択マーカーを受け入れるそれらの細胞または植物だけが、選択剤を有する条件下で分裂または成長することができる。選択剤の例としては、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびハイグロマイシンなどの抗生物質を挙げることができる。これらの選択マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を付与する酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ  ＩＩ）、ならびにハイグロマイシンに抵抗性を付与する酵素を発現する、関連抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびＧ４１８またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）の遺伝子が含まれる。他の選択マーカー遺伝子は、ｂａｒまたはｐａｔ（グルホシネートアンモニウムまたはホスフィノトリシンに対する抵抗性）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ、分岐鎖アミノ酸の合成における第一段階を妨げる、スルホニルウレア（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭｌ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）およびスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する抵抗性）、グリホサート、２，４−Ｄ、および金属抵抗性または感受性を含む除草剤抵抗性をコードする遺伝子を含むことができる。選択マーカー遺伝子として使用することができる「レポーター遺伝子」の例には、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどをコードするタンパク質などの発現するレポーター遺伝子タンパク質の目視観察が含まれる。成句「マーカー陽性」とは、選択マーカー遺伝子を含むように形質転換された植物を指す。
【００７７】
本明細書で使用するとき、用語「検出可能なマーカー」とは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素などの検出を可能にする標識を指す。検出可能なマーカーの例としては、限定されないが、以下：蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられる。一実施形態において、検出可能なマーカーは、潜在的な立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって結合させることができる。
【００７８】
本明細書で使用するとき、用語「検出」は、特定の分子の定性的測定と定量的測定の両方、例えば、特定のポリペプチドの測定を含むために、最も広い意味で使用される。
【００７９】
他に特に説明がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術的用語は、本開示が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994; Kendrew et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994;およびMeyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995において見出すことができる。
【００８０】
調節要素
基礎研究またはバイオテクノロジー用途に使用される植物プロモーターは、一般的に、一方向性であり、その３’末端（下流）に融合した導入遺伝子の発現を指示する。代謝工学および形質の積み重ねに関して、植物内で導入遺伝子を確実に発現させることがしばしば必要である。さらに、複数の新規なプロモーターは、典型的には、複数の遺伝子の発現を駆動するためにトランスジェニック作物において必要とされる。本明細書には、３’末端（下流）に融合した第１の遺伝子の発現を指向することができるプロモーターが開示される。
【００８１】
トランスジェニック産物の開発は、ますます複雑になり、確実に導入遺伝子を発現させ、単一の遺伝子座に複数の導入遺伝子を積み重ねる必要がある。伝統的に、それぞれの導入遺伝子は、発現のために固有のプロモーターを必要とし、複数のプロモーターが、１つの遺伝子の積み重ね内に異なる導入遺伝子を発現させるために必要とされる。サイズが増加した遺伝子の積み重ねを用いることは、多くの場合、単一の多遺伝子形質の発現のための異なる導入遺伝子の発現パターンの類似のレベルを得るために、同一のプロモーターの反復使用をもたらす。同じプロモーターによって駆動される多重遺伝子構築物は、この分野において、有効性が低いトランスジェニック産物を生じさせる遺伝子サイレンシングを引き起こすことは公知である。プロモーターの反復に起因した過剰の転写因子（ＴＦ）結合部位は、転写不活性化をもたらす内因性ＴＦの枯渇を引き起こす可能性がある。導入遺伝子のサイレンシングは、おそらくは、導入遺伝子を発現するように生成されたトランスジェニック植物の性能に不必要に影響を及ぼす。導入遺伝子内の反復配列は、ポリヌクレオチドの再配列をもたらす遺伝子内の遺伝子座相同組換えをもたらす可能性がある。
【００８２】
組織特異的（すなわち、組織優先）または器官特異的プロモーターは、植物の胚珠、胚、種子、仁、根、葉またはタペータムなどの特定の組織における遺伝子発現を駆動する。組織および発育段階の特異的プロモーターは、特定の組織においてまたは植物の発育中の特定の期間に発現される遺伝子の発現を導く。組織特異的プロモーターは、トランスジェニック植物産業における特定の用途に必要とされ、組織および／または発育段階の選択的方法で異種遺伝子の特異的発現を可能にするために望ましく、様々な器官、組織および／または時間で示差的に異種遺伝子の発現を示し、その他は示さない。例えば、土壌媒介性病原体による感染に対する植物の抵抗性の増加は、病原体抵抗性遺伝子で植物ゲノムを形質転換することによって達成され得、それにより、病原体抵抗性タンパク質は植物の根内で確実に発現される。あるいは、例えば、細胞の分裂または伸長などの特定の成長または発達時期にある植物組織において導入遺伝子を発現することが望ましい場合がある。別の用途は、例えば、木部の発育において農業形質をコードする導入遺伝子の発現を付与するように、望ましくは組織特異的プロモーターを用いることである。別の用途は、種子、胚珠、または胚内の導入遺伝子の発現を駆動するためのものである。組織特異的プロモーターの同定において残された１つの特定の課題は、潜在的に最も重要な遺伝子およびそれらの対応するプロモーターをどのように同定し、細胞の特定の発生特性にこれらがどのように関連するのかということである。別の課題は、クローニングされたＤＮＡ断片が望まれる特定の発現パターンにおいて転写を駆動するように、全ての関連するシス作用の転写調節要素をクローニングすることである。具体的な課題は、他の植物組織では発現されない植物の特定の細胞型、発育段階および／または機能に関連する組織特異的プロモーターを同定することである。
【００８３】
セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター調節要素を用いて、植物に導入遺伝子を発現させるための方法および構築物が提供される。一実施形態において、プロモーターは、以下のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターであり得る：
【００８４】
【化１】
2018500042.tif 000003
【００８５】
一実施形態において、遺伝子発現カセットはプロモーターを含む。一実施形態において、プロモーターは、本開示のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターであり得る。一実施形態において、遺伝子発現カセットはプロモーターを含み、該プロモーターは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む。一実施形態において、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットは、２つ以上の導入遺伝子の発現を駆動し得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含み、ここで、該導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【００８６】
導入遺伝子発現はまた、遺伝子のコード配列の下流に位置する３’非翻訳遺伝子領域（すなわち、３’ＵＴＲ）によって調節され得る。プロモーターと３’ＵＴＲの両方が導入遺伝子発現を調節することができる。プロモーターは転写を駆動するために必要であるが、３’ＵＴＲ遺伝子領域は転写を終結させ、翻訳およびタンパク質合成のために得られたｍＲＮＡ転写物のポリアデニル化を開始することができる。３’ＵＴＲ遺伝子領域は、導入遺伝子の安定した発現を助ける。一実施形態において、３’ＵＴＲは、以下のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲであり得る：
【００８７】
【化２】
2018500042.tif 000004
【００８８】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは３’ＵＴＲを含む。一実施形態において、３’ＵＴＲは、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲであり得る。一実施形態において、遺伝子発現カセットは３’ＵＴＲを含み、ここで、３’ＵＴＲは、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されている３’−ＵＴＲを含み、ここで、該導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【００８９】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子から精製されたプロモーターおよび３’−ＵＴＲを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、ａ）配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるイントロン；および／またはｂ）配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である３’−ＵＴＲを含む。
【００９０】
例えば、遺伝子発現カセットは、プロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは配列番号１のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは配列番号２のポリヌクレオチドである。遺伝子発現カセットが１つ以上の導入遺伝子を含む場合、プロモーターおよび３’−ＵＴＲは、遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子に作動可能に連結することができる。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター（配列番号１）を含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲ（配列番号２）を含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであり得る。
【００９１】
一実施形態において、ベクターは、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、ウイルス、またはドナーＤＮＡなどの形質転換もしくは遺伝子標的において使用するための切り出されたポリヌクレオチド断片であり得る。
【００９２】
一実施形態において、細胞または植物は、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、細胞または植物は、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージまたはウイルスであり得る。それにより、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む細胞または植物は、それぞれトランスジェニック細胞またはトランスジェニック植物である。一実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物であり得る。一実施形態において、トランスジェニック単子葉植物は、限定されないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、オートムギ、ライムギ、バナナ、サトウキビおよびキビであり得る。一実施形態において、トランスジェニック植物は双子葉植物であり得る。一実施形態において、トランスジェニック双子葉植物は、限定されないが、ダイズ、綿、ヒマワリおよびカノーラであり得る。また、実施形態は、本明細書に開示されるトランスジェニック植物からのトランスジェニック種子を含む。
【００９３】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、２つ以上の導入遺伝子を含む。２つ以上の導入遺伝子は、本明細書に開示されるセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターまたは３’−ＵＴＲに作動可能に連結されていてもよい。一実施形態において、遺伝子発現カセットは１つ以上の導入遺伝子を含む。１つ以上の導入遺伝子を有する実施形態において、少なくとも１つの導入遺伝子は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターもしくは３’−ＵＴＲまたは本開示に作動可能に連結されている。
【００９４】
選択マーカー
レポーター遺伝子としても記載される様々な選択マーカーは、形質転換植物（「形質転換体」）の同定および選択を可能にする選ばれた発現ベクターに組み込むことができる。形質転換植物における選択マーカーの発現を確認するために、多数の方法が利用可能であり、例えば、ＤＮＡ配列決定およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティング、ベクターから発現されたタンパク質、例えば、ホスフィノトリシン抵抗性を媒介する沈殿タンパク質を検出するための免疫学的方法、または他のタンパク質、例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどをコードするレポーター遺伝子などの他のタンパク質の目視観察が挙げられる（その全体が参照により本明細書に組み込まれるSambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001を参照されたい）。
【００９５】
選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または組織の選択に利用される。選択マーカー遺伝子としては、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮｐｔＩＩ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの、ならびに除草剤化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子が挙げられる。除草剤抵抗性遺伝子は、一般的に、除草剤に対して非感受性の修飾された標的タンパク質をコードしている、または植物中の除草剤をそれが作用し得る前に分解もしくは解毒する酵素をコードしている。例えば、グリホサートに対する抵抗性は、突然変異型標的酵素、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を使用することによって得られた。ＥＰＳＰＳについての遺伝子および突然変異体は周知であり、下記でさらに説明される。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニルおよび２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性は、それぞれの除草剤を解毒する、ｐａｔもしくはＤＳＭ−２をコードする細菌遺伝子、ニトリラーゼ、ａａｄ−１またはａａｄ−１２遺伝子を使用することによって得られた。
【００９６】
一実施形態において、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含む除草剤は、生長点または分裂組織を阻害することができ、これらの除草剤に対するアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の抵抗性／耐性のための遺伝子は周知である。グリホサート抵抗性遺伝子としては、突然変異５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰｓ）およびｄｇｔ−２８遺伝子（組換え核酸の導入および／もしくは天然ＥＰＳＰｓ遺伝子の様々な形態のインビボ突然変異誘発による）、ａｒｏＡ遺伝子ならびにグルホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子がそれぞれ挙げられる）。他のホスホノ化合物に対する抵抗性遺伝子としては、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトマイセス属（Streptomyces）種からのｂａｒ遺伝子、ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＡＣアーゼ阻害剤コード遺伝子）が挙げられる。シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（ハロキシフォップ、ジクロホップ、フェノキシプロプ、フルアジホップ、キザロホップを含む）に対する抵抗性を付与する例示的遺伝子としては、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）の遺伝子−−Ａｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３が挙げられる。一実施形態において、トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベントニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む除草剤は、光合成を阻害することができる。
【００９７】
一実施形態において、選択マーカー遺伝子としては、限定されないが、以下をコードする遺伝子が挙げられる：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ；シアナミドヒドラターゼ；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ；トリプトファンデカルボキシラーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼおよび脱感作型アスパラギン酸キナーゼ；ｂａｒ遺伝子；トリプトファンデカルボキシラーゼ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）；ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ；アセトヒドロキシ酸シンターゼ；５−エノールピルビルシキミ酸−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）；ハロアリールニトリラーゼ；アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ；ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌ  Ｉ）；および３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）。
【００９８】
一実施形態はまた、２，４−Ｄ；クロラムフェニコール；メトトレキサート；ハイグロマイシン；スペクチノマイシン；ブロモキシニル；グリホサート；およびホスフィノスリシンに対する耐性をコードする遺伝子を含む。
【００９９】
選択マーカー遺伝子の上記リストは、限定を意図したものではない。任意のレポーターまたは選択可能マーカー遺伝子が本発明によって包含される。
【０１００】
選択マーカー遺伝子は、植物における最適な発現のために合成される。例えば、一実施形態において、遺伝子のコード配列は、植物における発現を高めるためにコドン最適化によって修飾されている。選択マーカー遺伝子は、特定の植物種における発現のために最適化され得、または代替的に双子葉植物もしくは単子葉植物における最適な発現のために修飾され得る。植物の好ましいコドンは、目的とする特定の植物種において最大量で発現されるタンパク質における最高の頻度のコドンから決定されてもよい。一実施形態において、選択マーカー遺伝子は、より高い形質転換効率をもたらす、より高いレベルで植物中に発現されるように設計される。遺伝子の植物最適化のための方法は周知である。合成ポリヌクレオチド配列の最適化および製造に関する指針は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３０１６５４６号パンフレット、同第２０１１１４６５２４号パンフレット、同第１９９７０１３４０２号パンフレット、米国特許第６１６６３０２号明細書、および同第５，３８０，８３１号明細書に見出すことができる。
【０１０１】
導入遺伝子
開示されている方法および組成物は、植物ゲノム内でポリヌクレオチド遺伝子配列を発現させるために使用することができる。したがって、除草剤耐性、害虫抵抗性、栄養分、抗生物質または治療用分子をコードする遺伝子の発現を植物プロモーターによって駆動することができる。
【０１０２】
一実施形態において、本開示のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子調節要素は、グリホサートまたは別の除草剤に対する抵抗性または耐性を付与するポリヌクレオチド配列をコードする遺伝子と組み合わせられまたはそれに作動可能に連結され、ならびに／あるいは害虫もしくは病害に対する抵抗性および／または栄養強化、および／または改善された農業特性、および／または食事、食物、産業上、医薬的もしくは他の使用に有用なタンパク質もしくは他の生産物を与える。導入遺伝子は、植物ゲノム内の目的とする２つ以上の核酸配列と「積み重ね」ることができる。積み重ねは、２つ以上の事象を用いた従来の植物育種、目的とする配列を含有する構築物を用いた植物の形質転換、トランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによる標的組み込みを介した新しい形質の付与によって達成され得る。
【０１０３】
目的とするこのようなポリヌクレオチド配列としては、限定されないが、以下に示す例が含まれる：
１．有害生物または病害に対して抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列（例えば、ｉＲＮＡ）
（Ａ）植物病害抵抗性遺伝子。植物防御は、多くの場合、植物中の病害抵抗性遺伝子（Ｒ）の生成物と、病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の生成物間の特定の相互作用によって活性化される。ある植物種を、クローニングされた抵抗性遺伝子で形質転換し、特定の病原体株に対して抵抗性である植物に遺伝子操作することができる。このような遺伝子の例として、クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvum）に対する抵抗性のためのトマトＣｆ−９遺伝子（Jones et al., 1994 Science 266:789）、トマト斑葉細菌病（Pseudomonas syringae pv. tomato）に対する抵抗性のためのプロテインキナーゼをコードするトマトＰｔｏ遺伝子（Martin et al., 1993 Science 262: 1432）およびシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のための、アラビドプシス属ＲＳＳＰ２遺伝子（Mindrinos et al., 1994 Cell 78: 1089）が挙げられる。
（Ｂ）Ｂｔδ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列などの、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体またはそれをモデルにした合成ポリペプチド（Geiser et al., 1986 Gene 48:109）および栄養型殺虫性（ＶＩＰ）遺伝子（例えば、Estruch et al., (1996)、Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94を参照されたい）。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）からＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５および３１９９８の下で購入可能である。
（Ｃ）いくつかのクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列などのレクチン（Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825）。
（Ｄ）昆虫有害生物に対する幼虫駆除剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体などのビタミン結合タンパク質。米国特許第５，６５９，０２６号明細書を参照されたい。
（Ｅ）酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。このような遺伝子の例には、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤（Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793）、タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ（Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985）、およびα−アミラーゼ阻害剤（Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243）が挙げられる。
（Ｆ）昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドおよび幼若ホルモンその改変体、それをベースとした模倣体またはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活化（Hammock et al., 1990 Nature 344:458）。
（Ｇ）発現すると、影響を受ける有害生物の生理学を撹乱する、昆虫特異的ペプチドまたはニューロペプチド（J. Biol. Chem. 269:9）。このような遺伝子の例として、昆虫利尿ホルモン受容体（Regan, 1994）、ディプロプテラ・プンクタータ（Diploptera punctata）において同定されたアロスタチン（Pratt, 1989）および昆虫特異的、麻痺性神経毒（米国特許第５，２６６，３６１号明細書）が挙げられる。
（Ｈ）ヘビ、スズメバチなどによって天然に産生される昆虫特異的毒液、例えば、サソリ昆虫毒ペプチド（Pang, 1992 Gene 116:165）。
（Ｉ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積に関与している酵素。
（Ｊ）生物学的に活性な分子の翻訳後修飾を含めた、修飾に関与している酵素、例えば、天然または合成にかかわらず、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼおよびエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。このような遺伝子の例として、ｃａｌｌａｓ遺伝子（ＰＣＴ公開出願第９３／０２１９７号パンフレット）、キチナーゼをコードする配列（例えば、ＡＴＣＣから受託番号３９９９６３７および６７１５２の下で入手できる）、タバコ鉤虫キチナーゼ（Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691）およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子（Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673）が挙げられる。
（Ｋ）シグナル変換をシミュレートする分子。このような分子の例として、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757）およびトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467）が挙げられる。
（Ｌ）疎水性モーメントペプチド。米国特許第５，６５９，０２６号明細書および第５，６０７，９１４号明細書を参照されたい；後者は、病害抵抗性を付与する合成抗菌ペプチドを教示している。
（Ｍ）膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤、例えば、トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対して抵抗性にする、セクロピン−ベータ溶菌性ペプチド類似体（Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43）。
（Ｎ）ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染および／またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスによって、ならびに関連ウイルスによって達成される病害発生に対する抵抗性を与える。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して、コートタンパク質媒介性抵抗性が形質転換植物に付与されている。例えば、Beachy et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451を参照されたい。
（Ｏ）昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸において重大な代謝機能にターゲッティングされる抗体は、影響を受ける酵素を不活化し、昆虫を死滅させる。例えば、Taylor et al., (1994), Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片の製造によるトランスジェニックタバコにおける酵素性不活性化を示す。
（Ｐ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ウイルス攻撃から保護されるということを示すTavladoraki et al., (1993)、Nature 266:469を参照されたい。
（Ｑ）病原体または寄生生物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質。したがって、真菌エンドα−１，４−Ｄポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌コロニー形成および植物栄養放出を促進する（Lamb et al., 1992）, Bio/Technology 10:1436。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害性タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特性決定が、Toubartら（1992 Plant J. 2:367）に記載されている。
（Ｒ）植物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質、例えば、真菌病害に対する増大した抵抗性を提供するオオムギリボソーム不活化遺伝子（Longemann et al., 1992）, Bio/Technology 10:3305。
（Ｓ）ＲＮＡ分子が、標的遺伝子の発現を阻害するために使用される、ＲＮＡ干渉。一例では、ＲＮＡ分子は、部分的または完全に二本鎖であり、サイレンシング反応を引き起こし、ｄｓＲＮＡの低分子干渉ＲＮＡへの切断をもたらし、次いで、これが、相同ｍＲＮＡを破壊するターゲッティング複合体中に組み込まれる。例えば、Fire et al., 米国特許第６，５０６，５５９号明細書；Graham et al., 米国特許第６，５７３，０９９号明細書を参照されたい。
【０１０４】
２．除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子
（Ａ）成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノン（imidazalinone）、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的遺伝子は、突然変異体アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）をコードし（Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241）、これは、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素としても知られている（Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449）。
（Ｂ）突然変異体ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡ遺伝子によって、またはＤＧＴ−２８、２ｍＥＰＳＰＳ、ＧＡＴ（グリホサートアセチルトランスフェラーゼ）もしくはＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）などの遺伝子およびグルホシネート（ｐａｔ、ｂａｒ、およびｄｓｍ−２遺伝子）などのその他のホスホノ化合物ならびにアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）による代謝不活性化によって与えられる、グリホサートに対する抵抗性または耐性をコードする１つ以上のさらなる遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を付与できるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照のこと。突然変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得ることができ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，７６９，０６１号明細書に開示されている。欧州特許出願公開第０３３３０３３号明細書および米国特許第４，９７５，３７４号明細書には、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願公開第０２４２２４６号明細書に提供されている。De Greef et al., (1989), Bio/Technology 7:61には、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性のためにキメラｂａｒ遺伝子コーディングを発現するトランスジェニック植物の製造が記載されている。アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびセトキシジムおよびハロキシフォップなどのシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を付与する遺伝子の例示的なものとして、Marshall et al., (1992), Theor. Appl. Genet. 83:435に記載される、Ａｃｃｌ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子がある。
（Ｃ）光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジンに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）。Przibilla et al., (1991), Plant Cell 3:169には、クラミドモナス（Chlamydomonas）を形質転換するための突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドの使用が記載されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，８１０，６４８号明細書に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１および６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのＤＮＡコーディングのクローニングおよび発現は、Hayes et al., (1992), Biochem. J. 285:173に記載されている。
（Ｄ）ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に形質転換される反応を触媒する酵素と結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これは、イソキサゾール（欧州特許第４１８１７５号明細書、欧州特許第４７０８５６号明細書、欧州特許第４８７３５２号明細書、欧州特許第５２７０３６号明細書、欧州特許第５６０４８２号明細書、欧州特許第６８２６５９号明細書、米国特許第５，４２４，２７６号明細書）、特に、トウモロコシの選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル（欧州特許第４９６６３０号明細書、欧州特許第４９６６３１号明細書）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（欧州特許第６２５５０５号明細書、欧州特許第６２５５０８号明細書、米国特許第５，５０６，１９５号明細書）、特に、スルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤を含む。例えば、米国特許第６，２６８，５４９号明細書および同６，２４５，９６８号明細書および米国特許出願公開第２００３００６６１０２号明細書に記載される遺伝子を含めた、植物において過剰量のＨＰＰＤを生成する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を提供し得る。
（Ｅ）フェノキシオーキシン除草剤、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、米国特許第７，８３８，７３３号明細書に記載される、α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素（ａａｄ−１）遺伝子が挙げられる。
（Ｆ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、国際公開第２００７／０５３４８２号パンフレットに記載されるα−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ａａｄ−１２）が挙げられる。
（Ｇ）ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（例えば、米国特許公開第２００３０１３５８７９号明細書を参照されたい）。
（Ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子（米国特許第５，７６７，３７３号明細書を参照されたい）。
（Ｉ）光化学系ＩＩ反応中心（ＰＳ  ＩＩ）のコアタンパク質と結合する、トリアジン除草剤（アトラジンなど）および尿素誘導体（ジウロンなど）除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子（Brussian et al., (1989), EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245を参照されたい。
【０１０５】
３．価値が付加された形質を付与するまたはそれに貢献する遺伝子
（Ａ）植物のステアリン酸含量を増大させるために、例えば、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素で、トウモロコシまたはアブラナ属（Brassica）を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝（Knultzon et al., 1992）, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624。
（Ｂ）減少したフィチン酸含量
（１）クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子などのフィターゼをコードする遺伝子の導入（Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87）は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸を形質転換植物に付加する。
（２）フィチン酸含量を低下させる遺伝子は導入され得る。トウモロコシにおいて、これは、例えば、クローニングすることおよび次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体に関与する単一の対立遺伝子と関連しているＤＮＡを再導入することによって達成され得る（Raboy et al., 1990 Maydica 35:383）。
（Ｃ）例えば、植物を、デンプンの分岐パターンを変更する酵素をコードする遺伝子で形質転換することによって達成される修飾された炭水化物組成物。このような酵素の例として、ストレプトコッカス・ミューカス（Streptococcus mucus）のフルクトース転移酵素遺伝子（Shiroza et al., 1988） J. Bacteriol. 170:810、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のレバンスクラーゼ遺伝子（Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ（Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292）、トマトインベルターゼ遺伝子（Elliot et al., 1993）、オオムギアミラーゼ遺伝子（Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480）およびトウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素ＩＩ（Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450）が挙げられる。
【０１０６】
形質転換
植物の形質転換に適した方法は、ＤＮＡが細胞内に導入され得る任意の方法を含み、例えば、限定されないが、エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号明細書参照）、微粒子銃（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号明細書；第５，５５０，３１８号明細書；第５，５３８，８８０号明細書；第６，１６０，２０８号明細書；第６，３９９，８６１号明細書；および第６，４０３，８６５号明細書参照）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換（例えば、米国特許第５，６３５，０５５号明細書；第５，８２４，８７７号明細書；第５，５９１，６１６号明細書；第５，９８１，８４０号明細書；および第６，３８４，３０１号明細書参照）；およびプロトプラスト形質転換（例えば、米国特許５，５０８，１８４号明細書参照）が挙げられる。これらの方法は、植物を安定的に形質転換しまたは一過性に形質転換するために使用されてもよい。
【０１０７】
ＤＮＡ構築物は、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌などの技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡ内に直接導入されてもよく（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号明細書および第５，４６４，７６５号明細書参照）、またはＤＮＡパーティクル銃などのバイオリスティック法を用いて、植物組織に直接導入することができる（例えば、Klein et al., (1987) Nature 327:70-73参照）。あるいは、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換を介して植物細胞に導入することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９／０１０４７００号明細書を参照されたい）。
【０１０８】
さらに、遺伝子導入は、リゾビウム属（Rhizobium）種のＮＧＲ２３４、アルファルファ根粒菌（Sinorhizoboium meliloti）、ミヤコグサ根粒菌（Mesorhizobium loti）、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスおよび／またはタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム属（Agrobacterium）細菌またはウイルスを用いて達成されてもよい。
【０１０９】
形質転換技術の適用により、実質的に任意の植物種の細胞を安定に形質転換してもよいし、これらの細胞を周知技術によってトランスジェニック植物に発育させてもよい。例えば、綿の形質転換との関連で特に有用であり得る技術は米国特許第５，８４６，７９７号明細書、第５，１５９，１３５号明細書、第５，００４，８６３号明細書、および第６，６２４，３４４号明細書に記載されている；アブラナ属（Brassica）植物を形質転換するための技術は、例えば、米国特許第５，７５０，８７１号明細書に詳細に記載されている；ダイズを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第６，３８４，３０１号明細書に記載されている；トウモロコシを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号明細書および第５，５９１，６１６号明細書、ならびに国際ＰＣＴ出願公開第９５／０６７２２号パンフレットに記載されている。
【０１１０】
レシピエント細胞への外因性核酸の送達を行った後、形質転換された細胞は、一般的に、さらに培養および植物再生のために識別される。形質転換体を同定する能力を改善するために、形質転換体を生成するために使用される形質転換ベクターとともに選択マーカー遺伝子を使用することが望まれる場合がある。例示的な実施形態において、形質転換された細胞集団は、選択剤（単数または複数）に細胞を暴露することによってアッセイすることができ、または細胞は、所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。
【０１１１】
選択剤への暴露に対して生き残った細胞、またはスクリーニングアッセイにおいて陽性のスコアが示された細胞は、植物の再生を支持する培地で培養することができる。一実施形態において、任意の適切な植物組織培地は、成長調節因子などのさらなる物質を含むことによって修飾されてもよい。組織は、十分な組織が植物の再生取り組みを開始するために利用可能になるまで、または反復ラウンドの手動選択後、組織の形態学が再生に適切であり（例えば、少なくとも２週間）、続いてシュート形成を促す培地に移されるまで、成長調節剤を含む基礎培地に維持することができる。十分シュート形成が起こるまで、培養物を定期的に移す。シュートが形成されると、それらは根形成を促す培地に移される。十分な根が形成されると、植物はさらなる成長と成熟のために土壌に移され得る。
【０１１２】
再生中の植物に付与される構築物を含む所望の核酸の存在を確認するために、様々なアッセイを行ってもよい。このようなアッセイには、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロットおよびノーザンブロットならびにＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、タンパク質産物の存在を、例えば、免疫学的方法（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび／またはＬＣ−ＭＳ  ＭＳ分光光度法）により、または酵素機能により検出するアッセイ；植物部分アッセイ、例えば、葉または根アッセイ；および／または再生した植物全体の表現型の分析などが挙げられる。
【０１１３】
トランスジェニック事象は、例えば、目的とする核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングすることができる。ＰＣＲ遺伝子型決定には、限定されないが、ゲノムに組み込まれた目的とする核酸分子を含むことが予期された、単離された宿主植物カルス組織由来のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、続く、ＰＣＲ増幅産物の標準的なクローニングおよび配列分析が含まれることは理解される。ＰＣＲ遺伝子型決定の手段は、十分に報告され（例えば、Rios et al., (2002) Plant J. 32:243-53）、任意の植物種または組織タイプ由来のゲノムＤＮＡに適用されてもよく、細胞培養が含まれる。標的配列と導入された配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを順次使用しまたはＰＣＲ増幅反応において多重化されてもよい。標的部位にアニーリングするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸配列を導入し、および／またはこれらの２つの組合せが生成され得る。したがって、ＰＣＲ遺伝子型決定の戦略は、例えば、限定されないが、植物ゲノム中の特定の配列の増幅；植物ゲノム中の複数の特定の配列の増幅；植物ゲノム中の非特異的配列の増幅；および上記の任意の組合せを含んでもよい。当業者は、ゲノムを調べるために、プライマーおよび増幅反応の追加の組合せを考案することができる。例えば、フォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドプライマーのセットは、導入された核酸配列の境界外で標的に特異的である核酸配列（単数または複数）にアニーリングするように設計されてもよい。
【０１１４】
フォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、そこに含まれる目的とするヌクレオチド配列内のコード領域に対応する配列、または核酸分子の他の部分で、導入された核酸分子に特異的にアニーリングするように設計されてもよい。プライマーは、本明細書に記載されるプライマーと組み合わせて使用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、所望の配列に従って合成されてもよく、（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡから）市販されている。増幅は、クローニングおよび配列決定、または増幅産物の直接的な配列分析に続いてもよい。一実施形態において、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅において採用する。
【０１１５】
導入遺伝子を発現させる方法
一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターおよび３’ＵＴＲを含む植物を成長させることを含む。
【０１１６】
一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターおよびセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。
【０１１７】
一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）クロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。
【０１１８】
一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターおよびセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。
【０１１９】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター（上流プロモーターも含む）を含む。一実施形態において、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターは配列番号１であり得る。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、プロモーターは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せを含み得る。
【０１２０】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲは、配列番号２のポリヌクレオチドである。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ１遺伝子３’ＵＴＲは、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含み、ここで、プロモーターは、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター、または植物が起源であるプロモーター（例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター）、ウイルスが起源であるプロモーター（例えば、キャサバベインモザイクウイルスプロモーター）または細菌が起源であるプロモーター（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）デルタマス）である。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な実施形態において、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せを含み得る。
【０１２１】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターおよびセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。プロモーターおよび３’−ＵＴＲは、遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む場合、遺伝子発現カセット内で異なる導入遺伝子に作動可能に連結され得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’−ＵＴＲを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１２２】
一実施形態において、本明細書に記載される方法を用いた導入遺伝子発現は、植物の胚珠および種子組織内で発現される。一実施形態において、導入遺伝子発現は、植物の胚珠および種子組織において発現される１を超える導入遺伝子を含む。一実施形態において、本明細書に記載されるトランスジェニック植物を成長させる方法は、胚珠および種子の好ましい導入遺伝子発現を含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において導入遺伝子を発現させる方法は、胚珠および種子の好ましい組織ならびに胚珠および種子の好ましい細胞を含む。一実施形態において、胚珠および種子の好ましい発現には、双子葉および茎の好ましい発現が含まれる。
【０１２３】
さらなる実施形態において、本明細書に記載される方法を用いた導入遺伝子発現は、地上の植物組織（例えば、胚珠または種子）内で発現される。一実施形態において、導入遺伝子発現は、胚珠または種子などの地上の植物組織において発現される１を超える導入遺伝子を含む。他の実施形態において、導入遺伝子の発現は、種子の内胚乳組織内である。一実施形態において、本明細書に記載されるトランスジェニック植物を成長させる方法は、地上の植物組織の導入遺伝子発現を含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において導入遺伝子を発現させる方法は、地上の植物組織および地上の植物細胞を含む。一実施形態において、地上の植物組織発現は、双子葉植物の地上の植物組織発現を含む。
【０１２４】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、本明細書に開示されるセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター、または３’−ＵＴＲ調節要素を含むベクターを含む。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されている、本明細書に開示されるセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター、または３’−ＵＴＲ調節要素を含むベクターを含む。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージまたはウイルス断片であり得る。
【０１２５】
一実施形態において、本明細書に開示される方法に係る植物、植物組織または植物細胞は単子葉植物であり得る。単子葉植物、植物組織または植物細胞は、限定されないが、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、ラン、竹、バナナ、ガマ、ユリ、オートムギ、タマネギ、キビおよびライコムギであり得る。
【０１２６】
一実施形態において、本明細書に開示される方法に係る植物、植物組織または植物細胞は双子葉植物であり得る。双子葉植物、植物組織または植物細胞は、限定されないが、ナタネ、カノーラ、カラシナ、エチオピアカラシ、ダイズ、ヒマワリおよび綿であり得る。
【０１２７】
遺伝的に修飾された植物の作製に関して、植物を遺伝子操作するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、植物形質転換のための多数の方法が開発されており、双子葉植物および単子葉植物についての生物学的および物理学的な形質転換プロトコルが挙げられる（例えば、Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 77:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)）。さらに、植物細胞または組織の形質転換および植物の再生のためのベクターおよびインビトロ培養法は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)において利用可能である。
【０１２８】
当業者は、外因性配列がトランスジェニック植物に安定に導入され、作動可能であることが確認された後、それを有性交配によって他の植物に導入することができることを認識する。多数の標準的な育種技術のうちのいずれかは、交配される種に応じて使用することができる。
【０１２９】
形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物を同定し、ＤＮＡの形質転換時に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質について遺伝子操作された植物材料を選択またはスクリーニングすることによって単離し得る。例えば、選択は、形質転換遺伝子構築物が抵抗性を付与する抗生物質または除草剤の阻害量を含む培地上で、遺伝子操作された植物材料を成長させることによって行うことができる。さらに、形質転換された細胞はまた、組換え核酸構築物に存在し得る任意の可視マーカー遺伝子（例えば、ｙｆｐ、ｇｆｐ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣＩ遺伝子）の活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。このような選択およびスクリーニング法は、当業者に周知である。
【０１３０】
物理的および生化学的方法もまた、挿入された遺伝子構築物を含む植物または植物細胞の形質転換体を同定するために使用することができる。特定の実施形態において、本開示は、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットなどのゲノムＤＮＡの修飾を確認することを含む方法に関する。特定の実施形態において、このようなゲノムの修飾を確認する方法には、ＰＣＲベースのアッセイ、サザンブロットアッセイ、ノーザンブロットアッセイ、タンパク質発現アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、または次世代シーケンシングアッセイによる確認が含まれる。
【０１３１】
したがって、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットなどのゲノムＤＮＡの修飾は、その配列のプライマーまたはプローブの使用を含む様々な方法で確認することができる。特定の実施形態において、安定に組み込まれた導入遺伝子は、植物のいくつかの組織もしくはいくつかの発育段階で導入遺伝子の構成的または選択的発現に基づいて検出され得るか、あるいは導入遺伝子は、実質的に全ての植物組織において、実質的にその全ライフサイクルに沿って発現され得る。
【０１３２】
植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットの確認は、任意の適切な増幅方法によって行うことができる。一般的には、Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990)を参照されたい。適切な増幅技術の例には、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅（一般的には、G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)を参照されたい）、転写ベース増幅（D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)を参照されたい）、自家持続配列複製（または「３ＳＲ」）（J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)を参照されたい）、Ｑβレプリカーゼシステム（P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)を参照されたい）、核酸配列ベース増幅（または「ＮＡＳＢＡ」）（R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)を参照されたい）、修復鎖反応（または「ＲＣＲ」）（R. Lewis、上記参照）、およびブーメランＤＮＡ増幅（または「ＢＤＡ」）（R. Lewis、上記参照）が挙げられる。一般的には、ポリメラーゼ連鎖反応が好ましい。
【０１３３】
「増幅」は、鋳型特異性を伴う核酸複製の特別な場合である。これは、非特異的な鋳型複製（すなわち、鋳型依存性であるが、特定の鋳型に依存しない複製）と対照的である。鋳型特異性は、ここでは、複製（すなわち、適切なポリヌクレオチド配列の合成）およびヌクレオチド（リボまたはデオキシリボ）特異性の忠実度から区別される。鋳型特異性は、「標的」特異性に関して頻繁に記載される。
【０１３４】
本明細書で使用するとき、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」および「ＰＣＲ」は、一般的に、クローニングおよび精製なしにゲノムＤＮＡの混合物中で標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法を指す（米国特許第４，６８３，１９５号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；同第４，９６５，１８８号明細書；参照により本明細書に組み込まれる）。標的配列を増幅するこの方法は、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に対して、過剰な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、続いて、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でサーマルサイクリングを正確に繰り返すことを含む。２つのプライマーは、二本鎖標的配列の個々の鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物を変性し、次に、プライマーと標的分子内の相補的配列がアニーリングする。アニーリング後に、ポリメラーゼでプライマーを伸長させ、新しい相補鎖対を形成する。所望の標的配列の増幅セグメントを高い濃度で得るために、変性ステップ、プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼによる伸長を多数回繰り返すことができる（すなわち、変性、アニーリング、および伸長が１回の「サイクル」を構成する；多数回の「サイクル」が存在し得る）。所望の標的配列における増幅セグメントの長さは、プライマー相互の相対位置で決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメーターである。このプロセスの繰り返しの態様により、本方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントは、混合物中で（濃度に関して）主たる配列となるため、「ＰＣＲ増幅した」と表現される。
【０１３５】
用語「逆転写酵素」または「ＲＴ−ＰＣＲ」は、出発物質がｍＲＮＡである一種のＰＣＲを意味する。開始ｍＲＮＡは、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡまたは「ｃＤＮＡ」に酵素的に変換される。次に、ｃＤＮＡを「ＰＣＲ」反応の「鋳型」として使用する。
【０１３６】
一実施形態において、増幅反応を定量化する。他の実施形態において、増幅反応は、シグネチャープロファイルが融解温度または蛍光シグネチャープロファイルからなる群から選択されるシグネチャープロファイルを用いて定量化される。
【０１３７】
本開示の実施形態の核酸分子またはそのセグメントは、ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用することができる。ＰＣＲ増幅を実施する際に、ある程度のミスマッチが、プライマーと鋳型の間で許容され得る。したがって、例示されたプライマーの突然変異、欠失および挿入（特に、５’または３’末端へのヌクレオチドの付加）は、本開示の範囲内である。突然変異、挿入および欠失は、当業者に公知である方法によって所定のプライマー中に生成することができる。
【０１３８】
分子ビーコンは、配列検出に使用するために記載されている。簡単に述べると、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは、隣接ゲノムおよび挿入ＤＮＡ接合と重複するように設計される。ＦＲＥＴプローブの固有の構造は、蛍光および消光部分を近接して保持する二次構造を含有する結果となる。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列中の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の１つのプライマー）は、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルされる。ＰＣＲ増幅の成功に続いて、ＦＲＥＴプローブ（単数または複数）の標的配列へのハイブリダイゼーションは、プローブ二次構造の除去、ならびに蛍光部分および消光部分の空間的分離をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションに起因する隣接ゲノム／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。増幅反応としての検出のためのこのような分子ビーコンアッセイは、本開示の実施形態である。
【０１３９】
加水分解プローブアッセイは、他にはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）として知られ、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法である。簡単に述べると、事象特異的検出のために、導入遺伝子内に１つのオリゴおよび隣接ゲノム配列に１つのオリゴを用いて、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列中の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の１つのプライマー）は、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルされる。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションは、ＦＲＥＴプローブ上の消光部分から離れた蛍光部分の切断および放出をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションに起因する隣接する／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。増幅反応としての検出のためのこのような加水分解プローブアッセイは、本開示の実施形態である。
【０１４０】
ＫＡＳＰＡＲ（登録商標）アッセイは、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法である。簡単に述べると、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットを含むゲノムＤＮＡ試料は、ＫＡＳＰＡＲ（登録商標）アッセイシステムとして知られるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイを用いてスクリーニングされる。本開示の実施において使用されるＫＡＳＰＡＲ（登録商標）アッセイは、複数のプライマーを含有するＫＡＳＰＡＲ（登録商標）ＰＣＲアッセイ混合物を利用することができる。ＰＣＲアッセイ混合物において使用されるプライマーは、少なくとも１つのフォワードプライマーおよび少なくとも１つのリバースプライマーを含むことができる。フォワードプライマーは、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの特定の領域に対応する配列を含有し、リバースプライマーは、ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。さらに、ＰＣＲアッセイ混合物において使用されるプライマーは、少なくとも１つのフォワードプライマーおよび少なくとも１つのリバースプライマーを含むことができる。例えば、ＫＡＳＰＡＲ（登録商標）ＰＣＲアッセイ混合物は、２つの異なる対立遺伝子に対応する２つのフォワードプライマー、および１つのリバースプライマーを使用することができる。フォワードプライマーの１つは、内因性ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。第２のフォワードプライマーは、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの特定の領域に対応する配列を含有する。リバースプライマーは、ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。増幅反応の検出のためのこのようなＫＡＳＰＡＲ（登録商標）アッセイは、本開示の実施形態である。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、蛍光シグナルまたは蛍光色素は、ＨＥＸ蛍光色素、ＦＡＭ蛍光色素、ＪＯＥ蛍光色素、ＴＥＴ蛍光色素、Ｃｙ３蛍光色素、Ｃｙ３．５蛍光色素、Ｃｙ５蛍光色素、Ｃｙ５．５蛍光色素、Ｃｙ７蛍光色素、およびＲＯＸ蛍光色素からなる群から選択される。
【０１４２】
他の実施形態において、増幅反応は、フローサイトメトリーによって検出可能な濃度範囲で細胞ＤＮＡを染色することができ、リアルタイムサーモサイクラーによって検出可能な蛍光発光スペクトルを有する適切な第２の蛍光ＤＮＡ色素を用いて実施される。当業者であれば、他の核酸色素が公知であり、絶えず同定されていることを理解すべきである。適切な励起および発光スペクトルを有する任意の適切な核酸色素を使用することができ、例えば、ＹＯ−ＰＲＯ−１（登録商標）、ＳＹＴＯＸ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＴＯ１１（登録商標）、ＳＹＴＯ１２（登録商標）、ＳＹＴＯ１３（登録商標）、ＢＯＢＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）およびＴＯＴＯ（登録商標）が挙げられる。一実施形態において、第２の蛍光ＤＮＡ色素は、１０μＭ未満、４μＭ未満、または２．７μＭ未満で使用されるＳＹＴＯ１３（登録商標）である。
【０１４３】
さらなる実施形態において、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットを確認するために使用することができる。Brautigma et al., 2010に記載されるように、ＤＮＡ配列分析を用いて、単離され、増幅された断片のヌクレオチド配列を決定することができる。増幅された断片を単離し、ベクターにサブクローニングし、鎖ターミネーター法（サンガー配列決定とも呼ばれる）または色素ターミネーター配列決定を用いて配列決定することができる。さらに、アンプリコンは、次世代シーケンシングで配列決定することができる。ＮＧＳ技術は、サブクローニングステップを必要とせず、複数のシーケンシングリードを１回の反応で完了することができる。３つのＮＧＳプラットフォームが市販されている：４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＲｏｃｈｅのＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ、ＳｏｌｅｘａのＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ（「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」の頭字語）。さらに、現在開発中の２つの単一分子配列決定法が存在する。これには、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの真のＳｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）、およびＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＳＭＲＴ）が含まれる。
【０１４４】
４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅによって市販されているＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ＦＬＸは、長いリードのＮＧＳであり、エマルジョンＰＣＲおよびパイロシーケンシングを使用してシーケンシングリードを生成する。３００〜８００ｂｐのＤＮＡ断片、または３〜２０ｋｂｐの断片を含有するライブラリーを用いることができる。反応は、実施１回あたり１００万個超の約２５０〜４００塩基のリードを生成することができ、全収量は２５０〜４００メガ塩基になる。この技術は、最長リードを生成するが、実施１回あたり全シーケンスのアウトプットは他のＮＧＳ技術に比べて低くなる。
【０１４５】
Ｓｏｌｅｘａによって市販されているＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒは、蛍光色素で標識されたリバーシブルターミネーターヌクレオチドを用いた合成アプローチによる配列決定を使用し、固相ブリッジＰＣＲに基づく短いリードのＮＧＳである。最大１０ｋｂのＤＮＡ断片を含有する対になった末端配列決定ライブラリーの構築を使用することができる。この反応は、長さが３５〜７６塩基である１億超の短いリードを生成する。このデータは、実施１回あたり３〜６ギガ塩基を生成することができる。
【０１４６】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって市販されているＯｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）システムによる配列決定は、短いリード技術である。このＮＧＳ技術は、長さが最大１０ｋｂｐの断片化された二本鎖ＤＮＡを用いる。このシステムは、色素標識されたオリゴヌクレオチドプライマーのライゲーションによる配列決定およびエマルジョンＰＣＲを使用して、１０億の短いリードを生成し、結果として、実施１回あたり最大３０ギガ塩基の全シーケンスのアウトプットをもたらす。
【０１４７】
Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのｔＳＭＳおよびＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴは、配列反応に単一のＤＮＡ分子を用いる異なるアプローチを適用する。ｔＳＭＳ  Ｈｅｌｉｃｏｓシステムは、最大８億の短いリードを生成し、実施１回あたり２１ギガ塩基をもたらす。これらの反応は、「合成による配列決定」アプローチとして記載されている蛍光色素標識された仮想ターミネーターヌクレオチドを使用して完了する。
【０１４８】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって市販されているＳＭＲＴ次世代シーケンシングシステムは、合成によるリアルタイムシーケンシングを使用する。この技術は、リバーシブルターミネーターに制限されない結果、長さが最大１０００ｂｐのリードを生成することができる。この技術を用いて、１日あたり二倍体ヒトゲノムの１倍のカバレッジに等しい生のリードスループットを生成することができる。
【０１４９】
別の実施形態において、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットの確認は、ウェスタンブロット、ノーザンブロットおよびサザンブロットなどのブロッティングアッセイを用いて完了することができる。このようなブロッティングアッセイは、生物学的試料の同定および定量のための生物学的研究において一般的に使用されている技術である。これらのアッセイは、最初に、電気泳動法によってゲル中で試料成分を分離し、その後、電気泳動により分離された成分をゲルからニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）またはナイロンなどの材料から作製された転写膜に転写することを含む。また、分析物は、これらの支持体上に直接スポットされてもよく、または予め分離せずに、真空、毛細管作用または圧力を適用することによって、支持体上の特定の領域に指向させてもよい。次に、転写膜は、視覚的にまたは自動化されたリーダーによって、分析物が互いに区別されて検出される能力を高めるために、通常、転写後処理に供される。
【０１５０】
さらなる実施形態において、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットの確認は、固相酵素イムノアッセイを用いて、液体試料または湿潤試料中の物質、通常は抗原、の存在を検出するＥＬＩＳＡアッセイを用いて完了させることができる。試料由来の抗原は、プレートの表面に付着する。次に、さらなる特異的な抗体は、抗原に結合することができるように表面上に適用される。この抗体は酵素に連結され、最終段階で酵素基質を含有する物質が添加される。続く反応は、検出可能なシグナルを生成し、最も一般的には、基質における色の変化を生成する。
【０１５１】
本開示はまた、種子が導入遺伝子または遺伝子発現カセットを含む、上述のトランスジェニック植物の種子を包含する。本開示は、さらに、子孫、クローン、細胞株または細胞が導入遺伝子または遺伝子構築体を含む、上述のトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株または細胞を包含する。
【０１５２】
本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記載されているが、様々な修正および変更が、本発明から逸脱することなしに行うことができることは理解されよう。
［実施例］
【実施例１】
【０１５３】
セイヨウアブラナ（Brassica napus）からの調節要素の同定
セイヨウアブラナ（Brassica napus）遺伝子調節要素は、マイクロアレイプロファイリングアプローチによって同定された。次に、調節要素を単離し、クローニングして、トランスジェニック植物において使用するための調節要素の発現プロファイルを特徴付けた。Ｐｈｉｙｆｐ遺伝子およびｐａｔ選択マーカー遺伝子で安定に形質転換されたトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）系統を生成し、導入遺伝子発現レベルおよび組織特異性を評価した。このようなものとして、セイヨウアブラナ（Brassica napus）調節要素が同定され、特徴付けられた。遺伝子発現構築物において使用するためのプロモーターおよび３’ＵＴＲ調節要素が初めて開示される。
【０１５４】
マイクロアレイプロファイリングアプローチ
発育中のセイヨウアブラナ（Brassica napus）種子は、受粉後の１５日、２０日、２５日、３０日、３５日および４２日目（ＤＡＰ）に、トランスジェニックホモ接合体系統と非形質転換野生型植物の両方から採取された。次に、種子を単一色の全体的な遺伝子発現プロファイリング設計により分析して、規定された各時点について遺伝子発現の全体レベルを決定した。個々の６０マーのオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の３つの同一複製物を、各試料からの増幅したＣｙ３標識ｃＲＮＡとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを実施するために、カスタム設計された６０マーの包括的トランスクリプトーム−ワイドキャノーラオリゴヌクレオチドアレイ（ｅＡｒｒａｙ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用した。オリゴヌクレオチドアレイは、公開されたデータ源（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から得られた３７，０００個を超える様々なキャノーラ転写物を含有する。
【０１５５】
６０マーのオリゴヌクレオチドは、製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）からのＳＵＲＥ−ＰＲＩＮＴ（商標）技術を用いてインサイチュで合成された。各転写物の発現レベルを効率的に測定するために、アレイ中に存在するオリゴヌクレオチドは、予測された標的配列と効率的にハイブリダイズするように、各標的に対して固有であり、特異的であるように設計された。１を超える転写物を有する二重鎖を形成したオリゴヌクレオチドは、アレイから排除された。各オリゴヌクレオチドはまた、マイクロアレイ処理にわたって最適な性能に必要とされる化学的および物理的特性を満たした。加えて、新たに導入された遺伝子、ならびに目的とする他のいくつかの他の遺伝子を表す特異的であり、固有のオリゴヌクレオチドはまた、カスタム設計されたキャノーラオリゴヌクレオチドアレイに含まれた。これらの基準を用いて、カスタム設計された６０マーの包括的トランスクリプトーム−ワイドキャノーラオリゴヌクレオチドアレイを生成した。
【０１５６】
発育中の種子の試料は、各遺伝子型の複数の植物（ＮＥＸ７１０（登録商標）野生型およびＡｎＤ９ＤＳトランスジェニック系統）からの受粉後の１５日、２０日、２５日、３０日、３５日および４２日（ＤＡＰ）に得られた。種子を凍結し、ＲＮＡ単離および精製用の出発物質として使用するためにプールした。標識について、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｏｎｅ−Ｃｏｌｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙベースの遺伝子発現ＱｕｉｃｋＡｍｐ標識プロトコル（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に続いて、各試料から精製された合計１．０μｇの総ＲＮＡを逆転写し、増幅し、Ｃｙ３  ＣＴＰで標識した。オリゴヌクレオチド遺伝子発現アレイをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商標）およびＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ  ＫＩＴ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、完全に自動化されたＴＥＣＡＮ  ＨＳ４８００  ＰＲＯ（商標）（ＴＥＣＡＮ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）ハイブリダイゼーションステーション上で実施された。
【０１５７】
走査および特徴抽出後、生データファイルをＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）  ＧＸバージョン１０．０．２（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）にアップロードした。ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）によるレポートを作成する前に、生成されたデータが十分な品質であることを確認するために、スパイクインコントロールに基づく試料の品質管理を実施した。次に、結果として得られたデータは、体系的な非生物学的差異を最小化し、相互比較のためにアレイを標準化するために、グローバルパーセンタイルシフト標準化法を用いて標準化された。次に、調査中の全ての単一の試料において「存在」とフラグ付けされた物体を選択し、「限界」または「不在」とフラグ付けされた物体を排除することによって、標準化されたデータをフィルタリングした。標準化およびフィルタリングしたリストを、パラメーターとしてＤＡＰおよび遺伝子型を定義するｐ＜０．０５の補正されたｐ値カットオフを用いた２元ＡＮＯＶＡ法を使用した統計分析のためのインプットとして使用した。セイヨウアブラナ（Brassica napus）種子発生の全体的な遺伝子発現プロファイルは、調査における全ての時点で画定された。初期のセイヨウアブラナ（Brassica napus）種子の発生中に全試料において高レベル（＞５０，０００ピクセル／スポット）で一貫して発現する遺伝子を同定するために、選択基準の追加セットを適用した。
【０１５８】
さらなる遺伝子を遺伝子注釈に基づいて手動で選択して、全候補プールを８８個の標的にした。このプールを改良するために、発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を用いて公知の油生合成遺伝子発現レベルに対して確認された。１５および２０ＤＡＰ時点からのＲＮＡを調べ、若いキャノーラの葉から総ＲＮＡを抽出および精製した。ＲＴ−ｑＰＣＲのｃＤＮＡ合成はＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩＩ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲ反応は、ＡｂＧｅｎｅ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｂｌｕｅ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０機器（商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で行った。ＲＴ−ｑＰＣＲのプライマーは、ＰＲＩＭＥＲ３（商標）（ＭＩＴ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて設計した。プライマーは、６０℃の最適Ｔｍに設計された。アンプリコンのサイズは、１００〜２２４ｂｐの範囲であった。プライマーを選択して、転写された標的配列の３’領域にアンプリコンを生成した。標準化の目的で、４つの内因性油生合成遺伝子はまた測定され、ＢｎＡＣＰ０５（アシル−担体タンパク質）、ＢｎＫＣＳ（ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ）、ＢｎＫＡＳＩＩＩ（ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ）、およびＢｎＳＡＤ（ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ）が含まれた。
【０１５９】
候補プールをさらにろ過するために、ＡＣＰ０５（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ１６１１４．１）より高い初期種子で発現を示す遺伝子を選択した。遺伝子はまた、ＫＡＳＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２４４５２０．１）の種子／葉の発現差よりも大きい葉から初期種子への発現増加を示すことが必要であった。これらのフィルターは、標的プロモーターの同定のために候補のリストを特定の遺伝子にまで減少させた。したがって、マイクロアレイアッセイを用いて、１５ＤＡＰでｃＤＮＡを高度に発現し、種子中で優先的に発現されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のプロモーターおよび３’ＵＴＲ遺伝子調節要素を同定した。
【実施例２】
【０１６０】
遺伝子調節要素の同定
上記のスクリーニングパラメーターを用いて、セイヨウアブラナ（Brassica napus）マイクロアレイ生成データから特定の配列を選択した。セイヨウアブラナ（Brassica napus）ｃ．ｖ．Ｎｅｘ７１０由来の特異的プロモーターおよび３’ＵＴＲ配列を単離するためにＰＣＲ反応を使用した。ＰＣＲプライマーは、公的に入手可能なＥＳＴ  Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＶ００１０８１．１、ＣＤ８１３１８６．１、ＥＳ９８９９０２．１およびＥＶ０８８５８３．１から組み立てられた、発現配列タグコンティグ２７１６０、およびＥＳＴコンティグ２７１６０に相同性を有するものとして同定された、芽キャベツ（Brassica oleracea）ｃ．ｖ．ＴＯ１０００からのゲノムコンティグｃｔｇ７１８０００９８３７４１６から設計された。抽出されたプロモーターおよび３’−ＵＴＲセイヨウアブラナ（Brassica napus）調節配列を得て、ＤＮＡ配列決定によりさらに特徴付けた。セイヨウアブラナ（Brassica napus）ｃ．ｖ．Ｎｅｘ７１０ゲノム由来のＡＣＣ  ＯＸとして表示されるセイヨウアブラナ（Brassica napus）遺伝子のプロモーター配列は、配列番号１の１４８３ｂｐのプロモーター配列として提供される。５００ｂｐの３’ＵＴＲ配列は、配列番号２として以下に提供される。
【０１６１】
【化３】
2018500042.tif 000005
【０１６２】
【化４】
2018500042.tif 000006
【実施例３】
【０１６３】
セイヨウアブラナ（Brassica napus）プロモーターおよび３’ＵＴＲ構築物
配列番号１の全長セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーター、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、軽度特異的組織誘導性ＬＳ−１遺伝子（ＳＴ−ＬＳ１イントロン；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ番号Ｘ０４７５３）を含有する黄色蛍光タンパク質遺伝子（Ｐｈｉｙｆｐ；Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol 21; 841-50）、および配列番号２のセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ  ３’ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて構築された。この遺伝子発現カセットはａｔｔ部位が隣接した。次に、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターの制御下で、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’−ＵＴＲによって終結された、ｙｆｐ遺伝子発現カセットを含有する、得られたエントリープラスミド、および最終発現ベクターｐＤＡＢ１１３９０４に至るデスティネーションベクターを用いて、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ  ＩＩ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）反応を行った。デスティネーションベクターは、キャサバベインモザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーター；Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31:1129-1139; 1996）によって駆動され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム１の３’ＵＴＲ（ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ；Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822; 1990）によって終結されるｐａｔ遺伝子（Wohlleben et al., Gene 70:25-37; 1988）を含む選択マーカーカセットを含有した。得られた構築物ｐＤＡＢ１１３９０４は、ｙｆｐ遺伝子発現カセット（配列番号３）を含有する異種発現構築物であり、ｐａｔ遺伝子発現構築物（配列番号４）は、図１のプラスミドマップとして提示される。
【０１６４】
配列番号３（ｐＤＡＢ１１３９０４由来の黄色蛍光タンパク質遺伝子発現カセットの核酸配列を提供する）
【０１６５】
【化５】
2018500042.tif 000007
【０１６６】
配列番号４（ｐＤＡＢ１１３９０４由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子発現カセットの核酸配列を提供する）
【０１６７】
【化６】
2018500042.tif 000008
【０１６８】
黄色蛍光タンパク質（ｙｆｐ）遺伝子発現カセットおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子発現カセットを含有する陽性対照構築物ｐＤＡＢ９３８１を組み立てた。具体的には、黄色蛍光タンパク質遺伝子発現カセットは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０遺伝子プロモーター（Ｕｂｉ１０プロモーター；Callis et al., 1990, J Biol Chem 265:12486- 12493）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、軽度特異的組織誘導性ＬＳ−１遺伝子（ＳＴ  ＬＳ１イントロン；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ番号Ｘ０４７５３）を含有する黄色蛍光タンパク質コード配列（ＰｈｉＹＦＰ；Shagin et al., 2004 Molecular Biology and Evolution, 21(5), 841-850）を含有し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム２３  ３’−非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’−ＵＴＲ）で終結される。選択マーカー遺伝子発現カセットは、キャサバベインモザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーター；Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31:1129-1139; 1996）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ；Wohlleben et al., Gene 70:25-37; 1988）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＯＲＦ１  ３’−非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１  ３’−ＵＴＲ；Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822; 1990）を含有する。得られた構築物ｐＤＡＢ９３８１は、ｙｆｐ遺伝子発現カセット（配列番号５）を含有する異種発現構築物であり、ｐａｔ遺伝子発現構築物（配列番号５）は図２に提示される。
【０１６９】
配列番号５（ｐＤＡＢ９３８１由来の黄色蛍光タンパク質遺伝子発現カセットの核酸配列を提供する）
【０１７０】
【化７】
2018500042.tif 000009
【０１７１】
配列番号６（ｐＤＢ９３８１由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子発現カセットの核酸配列を提供する）
【０１７２】
【化８】
2018500042.tif 000010
【実施例４】
【０１７３】
植物の形質転換および分子確認
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の調製
次に、上記のバイナリープラスミドのうちいずれか１つを含有する、５０％グリセロール（予め調製し、−８０℃で凍結した）中の６０μｌのアグロバクテリウム（Agrobacterium）菌株を用いて、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（１０ｍｇ／Ｌ）を含有するＹＥＰ液の５ｍｌスターター培養物（ＢＡＣＴＯ  ＰＥＰＴＯＮＥ（商標）１０．０ｇｍ／Ｌ、酵母エキス１０．０ｇｍ／Ｌおよび塩化ナトリウム５．０ｇｍ／Ｌ）を調製し、通気しながら２８℃で一晩インキュベートした。次に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）スターターは、滅菌５００ｍＬバッフルフラスコ（単数または複数）中で、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（１０ｍｇ／Ｌ）を含む３００ｍＬのＹＥＰ液体に接種され、２００ｒｐｍ、２８℃で一晩振とうされた。培養物を６０００ｒｐｍで遠心分離し、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖、１０μｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリンおよび０．０３％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７を含有する等体積の１／２×ＭＳ培地に再懸濁し、その後、植物組織を形質転換した。
【０１７４】
アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換
アラビドプシス属（Arabidopsis）は、ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ（１９９８）から適応されたフローラルディップ法を用いて形質転換された。上記バイナリープラスミドの１つを含有する、確認されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）グリセロールストックを使用して、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（１０ｍｇ／Ｌ）を含有するＹＥＰブロスの５ｍＬ前培養物に接種した。培養物を通気しながら２８℃で一晩インキュベートした。次に、前培養物を同じ抗生物質選択物で３００ｍＬまで嵩張らせ、２２５ｒｐｍで一定の撹拌をしながら再び２８℃でインキュベートした。細胞を約５，０００×ｇ、４℃で１５分間ペレット化し、上清を捨てた。細胞ペレットは、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖、１０μｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン、および０．０３％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７を含有する３００ｍＬ接種培地に静かに再懸濁された。４１日齢の植物（３５日目に切断した初代花序）を逆さにして培地に浸漬した。植物（ここではＴ０と表示される）を一晩、透明な覆われたプラスチック製タブに入れ、次に、翌日成長チャンバーに直立させた。植物を２２℃、１６時間の明期／８時間の暗期で成長させた。浸漬の４週間後、水を切り、植物をＴ１種子収集の準備として１週間乾燥させた。
【０１７５】
Ｔ１種子を１０．５インチ×２１インチ発芽トレイに播種し、それぞれに、予め０．１％寒天溶液４０ｍＬ中に懸濁させた層状化されたＴ１種子（約１０，０００種子）の２００ｍｇアリコートを与え、４℃で２日間保存し、同期した種子発芽（春化）を確実にした。
【０１７６】
サンシャインミックスＬＰ５土壌培地は、微細なバーミキュライトで覆われ、湿った状態になるまでホーグランドの溶液で地下潅漑され、重力排水を可能にした。層状化された種子の各４０ｍＬアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均等に播種され、湿度ドームで４〜５日間覆った。グルホシネート（リバティー）を用いて最初の形質転換体選択の１日前にドームを外した。
【０１７７】
植え付けの７日後（ＤＡＰ）および再度９ＤＡＰにて、Ｔ１植物（それぞれ、子葉および２〜４葉期）に０．２％リバティー除草剤溶液（２００ｇ  ａｉ／Ｌグルホシネート、Ｂａｙｅｒ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）で、適用あたり２８０ｇ  ａｉ／ｈａグルホシネートの有効速度を送達するために、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮空気噴霧先端を使用して１０ｍｌ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧容量で噴霧した。最後の噴霧の３日後に生存している生存植物（活動的に成長している推定の形質転換植物）を同定し、最終噴霧選択（１６ＤＡＰ）の７日後に温室内でサンシャインミックスＬＰ５で調製した３インチのポットに個々に移植した。移植体を温室内で飼育した（２２±５℃、５０±３０％室温、１４時間の明期：１０時間の暗、最低５００μＥ／ｍ２ｓ１の自然光＋補助光）。生存しているＴ１植物について分子生物学的分析を完了し、ｐａｔ除草剤選択マーカー遺伝子が植物のゲノムに組み込まれたことを確認した。
【０１７８】
分子確認
推定トランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、ｐａｔについて定量的ＰＣＲアッセイを使用して、導入遺伝子の存在を検出するためにサンプリングされた。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ９６  Ｋｉｔ  ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造者の指示に従って使用して、葉試料から総ＤＮＡを抽出した。
【０１７９】
目的とする遺伝子を検出するために、ｐａｔ遺伝子のＣｙ５標識した蛍光プローブおよび内因性ＴａｆＩＩ−１５参照遺伝子対照（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＣ  ００３０７５；Duarte et al., BMC Evol. Biol., 10:61）のＨＥＸ標識した蛍光プローブを含有する、加水分解（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に類似する）プライマー／プローブセットを用いて遺伝子特異的ＤＮＡ断片を増幅した。ｐａｔおよび内因性ＴａｆＩＩ−１５参照遺伝子増幅のために以下のプライマーを使用した。プライマー配列は以下の通りであった：
ｐａｔプライマー／プローブ：
Ｐａｔフォワードプライマー：ＴＱＰＡＴＳ：ＡＣＡＡＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴ（配列番号７）
Ｐａｔリバースプライマー：ＴＱＰＡＴＡ：ＣＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＴＧＡＣＡＣＧＴＡＡＡＣＡＧＴ（配列番号８）、および
Ｐａｔプローブ：５’−／５Ｃｙ５／ＡＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＴＴＡＣＧＣＴ／３ＢＨＱ＿２／−３’（配列番号９）
ＴａｆＩＩ−１５プライマー／プローブ：
フォワードプライマー：ＴａｆＩＩ−１５  Ｆ：ＧＡＧＧＡＴＴＡＧＧＧＴＴＴＣＡＡＣＧＧＡＧ（配列番号１０）
リバースプライマー：ＴａｆＩＩ−１５  Ｒ：ＧＡＧＡＡＴＴＧＡＧＣＴＧＡＧＡＣＧＡＧＧ（配列番号１１）、および
ＴａｆＩＩ−１５プローブ：５’−／５ＨＥＸ／ＡＧＡＧＡＡＧＴＴＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣ／３ＢＨＱ＿２／−３’（配列番号１２）  
【０１８０】
次に、ｑＰＣＲ反応は、５μｌのＲｏｃｈｅ  ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；１０μＭストックから４００ｎＭの最終濃度までの各０．４μｌのＴＱＰＡＴＡ、ＴＱＰＡＴＳ、ＴａｆＩＩ−１５ＦプライマーおよびＴａｆＩＩ−１５Ｒプライマー；５μＭストックから２００ｎＭの最終濃度までの各０．４μｌのＰａｔプローブおよびＴａｆＩＩ−１５プローブ；水の１：５に希釈した２μｌのゲノムＤＮＡ、および０．５μＬの水を含有する１０μｌ反応の最終容量で実施された。ＤＮＡをＲｏｃｈｅ  ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システムで、以下の条件下で増幅した：９５℃で１０分間の１サイクル、続いて以下の３ステップ：９５℃で１０秒間；６０℃で４０秒間および７２℃で１秒間の４０サイクル。ｐａｔコピー数は、未知試料（ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０によるアウトプット）についての標的（目的とする遺伝子）／参照（インベルターゼ遺伝子）値とｐａｔコピー数対照の標的／参照値を比較することによって決定された。
【０１８１】
分子確認から、上記のプラスミドの単一導入遺伝子挿入物を含有する特異的なアラビドプシス属（Arabidopsis）トランスジェニック事象が同定された。これらの植物を自己受精させ、得られたＴ１種子を植えて、Ｔ１実生をモニタリングし、異なる発育段階の異なる植物組織におけるＹＦＰタンパク質発現についてアッセイした。
【実施例５】
【０１８２】
トランスジェニック植物発現スクリーニング
アラビドプシス属（Arabidopsis）Ｔ１トランスジェニック事象を実生に成長させ、蛍光顕微鏡検査および目視観察により１５ＤＡＰでＹＦＰ蛍光について評価した。アラビドプシス属（Arabidopsis）Ｔ１トランスジェニック事象のさらなる観察は、植え付けから７週間後に完了し、ここで、葉、花序および絹糸を蛍光顕微鏡検査および目視観察によって観察した。最後に、アラビドプシス属（Arabidopsis）Ｔ１トランスジェニック事象の観察は、植え付けから１０週間後に完了し、ここで、発育中の実生を蛍光顕微鏡検査および目視観察によって観察した。実生および発育中の種子は、以下の設定（例えば、最大励起−５２５ｎｍおよび最大発光−４８２ｎｍ）を有するＬｅｉｃａ  ＤＦＣ３１０  ＦＸ  Ｓｔｅｒｅｏｓｃｏｐｅ（商標）（Ｌｅｉｃａ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を用いて画像化された。葉、花序および絹糸は、以下の設定（例えば、Ｂｌｕｅ  ４８８ｎｍレーザー、クロロフィル（chllorophyll）の場合は６７０ＢＰ  ３０、Ｐｈｉｙｆｐの場合は５２０ＢＰ  ４０、３５０ＰＭＴ）を有するＴＹＰＨＯＯＮ  ＳＣＡＮＮＥＲ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて画像化された。
【０１８３】
Ｔ１実生および植物組織のＹＦＰ画像は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子プロモーターの制御下で発現され、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子３’ＵＴＲによって終結される該タンパク質の種子優先的発現が、単一コピー事象で検出されることを示した。目視観察は、これらの調節要素によって駆動される発現が、初期の種子発育および初期の花発育に特異的であることを示唆している。このように、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ調節要素によって駆動される発現パターンは、花序を発達させる胚珠内で観察された（図３）。ＹＦＰタンパク質組織の発現は、アラビドプシス属（Arabidopsis）植物内の種子の発育中に胚乳組織内に局在化する可能性が最も高い。胚乳組織における発現は、この組織型が初期の種子発育中に種子組織の大部分を占めるため、重要である。ＹＦＰタンパク質のさらなる発現は、ｙｆｐ導入遺伝子の複数のコピーを含有するトランスジェニック事象の花、茎、葉および種子において観察された。
【実施例６】
【０１８４】
アラビドプシス属（Arabidopsis）における発現タンパク質の定量化
アラビドプシス属（Arabidopsis）植物種子の試料は、ＰｈｉＹＦＰ  ＥＬＩＳＡによりアッセイされ、種子は採取され、ビーズミルに供された。約１０ｍｇの種子材料を、ＫＬＥＣＣＯ（商標）ビーズミルにおいて、２つのＢＢ（４．５ｍｍ鋼球；Ｄａｉｓｙ；Ｒｏｇｅｒｓ，ＡＲ）を用いて１分間叩いた。３００μｌの抽出緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０および０．０５％ウシ血清アルブミンが補充されたＰＢＳ）を添加した。試料を穏やかにタッピングしながら懸濁させ、プラットフォームシェーカー上で室温にて３０分間揺らした。次に、試料を遠心分離機で１４，０００×ｇにて５分間スピンダウンした。上清を除去し、ＥＬＩＳＡによって分析した。Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、１×ＰＢＳ中の１．０μｇ／ｍｌの濃度で抗ＹＦＰモノクローナル抗体（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＃ＴＡ１５００２８）を用いてコーティングされた。４℃で一晩インキュベーション後、プレートは、０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）を用いて３７℃にて２時間ブロックされた。分析前に、プレートは、洗浄ごとに３５０μＬのＰＢＳＴを用いてプレート洗浄機で４回洗浄された。精製されたタンパク質の参照抗原（Ｅｖｒｏｇｅｎ）をブロッキング緩衝液中に２ｎｇ／ｍｌになるまで希釈し、２ｎｇ／ｍｌ〜０．０３１３ｎｇ／ｍｌの連続希釈による標準曲線を作成するために使用した。試料は、１：４の開始希釈までブロッキング緩衝液中に希釈され、１：４の比率でさらに３倍に希釈された（１：４、１：１６、１：６４、１：２５６）。次に、１００μｌの全ての標準および試料希釈液をＥＬＩＳＡプレート上に二連でローディングした。試料をＥＬＩＳＡプレート上で室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを上記のように洗浄した。ウサギ抗ＰｈｉＹＦＰポリクローナル抗体（Ｅｖｒｏｇｅｎ）をブロッキング緩衝液中で１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルでプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした後、洗浄した。抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした検出抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を１：５０００希釈でプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、上記のように洗浄した。次に、１ステップＵｌｔｒａ  ＴＭＢ基質（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１００μｌ／ウェルでプレートに添加した。標準曲線の最も低い希釈を有するウェルが青色を示し始めたため、５０μｌの停止溶液（０．４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を添加することによって反応を停止させた。プレートは、４５０ｎｍの波長から６５０ｎｍの参照を差し引いてＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏ  ｖ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。試験試料のＰｈｉＹＦＰ濃度は、二次標準曲線の線形回帰によって計算された。
【０１８５】
ＹＦＰの発現レベルを定量し、以下の表１に提示する。セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ調節要素によるＹＦＰの発現は、低コピー数事象（すなわち、１〜２コピー）を含有するトランスジェニック事象について、アラビドプシス属（Arabidopsis）種子内で０．００４〜０．０２０ｎｇ／ｍｇの範囲であった。さらに、この結果は、低コピー数事象の平均発現が約０．００８７５ｎｇ／ｍｇであることを示した。最後に、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＣＣ  ＯＸ調節要素によるＹＦＰの発現は、高いコピー数事象（すなわち、２コピーを超える）を含有するトランスジェニック事象についてアラビドプシス属（Arabidopsis）種子内で１．０７９ｎｇ／ｍｇであった。
【０１８６】
【表１】
2018500042.tif 000011
【０１８７】
このように、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ＡＣＣ  ＯＸ遺伝子調節要素が同定され、特徴付けられた。遺伝子発現構築物において使用するための新規なプロモーターおよび３’−ＵＴＲ調節要素が初めて開示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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