(57)【要約】本明細書は、とりわけ、組み換え微生物、操作された代謝経路、化学的触媒、ならびに記載の方法および物質の使用により産生される生成物に関する。産生された生成物には、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸、および官能基化マロニル-CoA、マロン酸セミアルデヒド、およびアクリル酸、ならびにそれらの塩、エステルおよびラクトンが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸であって、該官能基化アルファ置換が、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>2の場合に選択される官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸と、トランスアミナーゼ（図４、行A）、シンターゼ（図４、行B）、デヒドラターゼ（図４、行C）、ヒドラターゼ（図４、行D）、デヒドロゲナーゼ（図４、行E）、シストランスイソメラーゼ（図４、行F）、シクラーゼ、ラクトナーゼ、ラクタマーゼ（図４、行G）、エステラーゼ（図４、行H）、レダクターゼ（図６、行C）、デカルボキシラーゼ（図６、行D）、およびアルデヒドレダクターゼ（図６、行E）から選択される少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
【請求項２】
前記官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、アルファ-(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、アルファ-(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸、アルファ-(1-ヒドロキシエチル)リンゴ酸およびアルファ-(2-ヒドロキシエチル)リンゴ酸から選択される、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項３】
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸をさらに含み、該官能基化アルファ置換が、2個の水素原子と会合した1個以上の炭素原子を含むスペーサーを追加的に含む、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項４】
前記スペーサーが、-(CH2)2-、-(CH2)3-または-(CH2)4-から選択される、請求項３に記載の組み換え微生物。
【請求項５】
前記官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、アミノ酸側鎖から選択される官能基を含む、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項６】
前記官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項７】
前記組み換え微生物が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される少なくとも2つの官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含む、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項８】
前記組み換え微生物が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される少なくとも3つの官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含む、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項９】
少なくとも2つの前記官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、同じ官能性置換基を含む、請求項５に記載の組み換え微生物。
【請求項１０】
ベータ官能基化アルファケト酸をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１１】
官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１２】
前記組み換え微生物が、少なくとも1つのアミノ酸を選択的に過剰産生する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１３】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、リジン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、トリプトファン、セレノシステイン、セリン、ホモセリン、ホモトレオニン、チロシン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンから選択されるアミノ酸を産生する、請求項１２に記載の組み換え微生物。
【請求項１４】
前記組み換え微生物が、該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を選択的に過剰産生する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１５】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を産生する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１６】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化ベータ置換アルファケト酸を産生する、請求項１０に記載の組み換え微生物。
【請求項１７】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換フマル酸を産生する、請求項８に記載の組み換え微生物。
【請求項１８】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の官能基化アルファ置換マレイン酸を産生する、請求項８に記載の組み換え微生物。
【請求項１９】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換リンゴ酸を産生する、請求項８に記載の組み換え微生物。
【請求項２０】
有機酸輸送体をコードする組み換え核酸配列をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項２１】
前記組み換え微生物が原核生物である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項２２】
前記組み換え微生物が真核生物である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項２３】
官能基化アルファ置換リンゴ酸の製造方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と；該官能基化アルファ置換リンゴ酸またはその塩を分離する工程とを含む、方法。
【請求項２４】
官能基化置換マレイン酸の製造方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と；該官能基化置換マレイン酸またはその塩を分離する工程とを含む、方法。
【請求項２５】
官能基化ベータ置換ケト酸の製造方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と；該官能基化ベータ置換ケト酸またはその塩を分離する工程とを含む、方法。
【請求項２６】
アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸の製造方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と；該官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸またはその塩を分離する工程とを含む、方法。
【請求項２７】
官能基化アルファ置換アクリレート、またはその塩もしくはエステルの製造方法であって、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸または官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸、もしくはそれらの塩、エステルもしくはラクトンを金属触媒と接触させることを含む、方法。
【請求項２８】
式Iの化合物：
【化１】
2018526969.tif 000038
またはその塩の製造方法であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり；
前記方法は、金属触媒を、式II、III、もしくはIVの化合物：
【化２】
2018526969.tif 000039
またはそれらの塩を含む組成物と接触させる工程を含み、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにその保護基から選択され、R2、R3、R4は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である、方法。
【請求項２９】
式Vの化合物：
【化３】
2018526969.tif 000040
またはその塩の製造方法であって、
式中：
各R1はHまたはCH3から選択され、R2およびR3はHまたは保護基から選択され、nは1以上であり；
該方法は、金属触媒を、式VI、VII、もしくはVIIIの化合物：
【化４】
2018526969.tif 000041
またはそれらの塩を含む組成物と接触させる工程を含み、
式中：
各R1はHまたはCH3から選択され、R2、R3、およびR4は個別にHまたは保護基から選択され、nは1以上である、方法。
【請求項３０】
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の誘導体および式Iを有する化合物の製造方法であって、該方法は、式II、IIIおよびIVから選択される化合物またはそれらの塩、エステルもしくはラクトンを金属触媒と接触させる工程を含み、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の前記誘導体は、
【化５】
2018526969.tif 000042
から選択され、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である、方法。
【請求項３１】
式Iを有する化合物：
【化６】
2018526969.tif 000043
またはその塩であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり、nが1より大きい場合、R1はカルボキシレートまたはメチルから選択されることができる化合物と；
官能基化アルファ置換C4カルボン酸の少なくとも1つの誘導体とを含む組成物の製造方法であって；
該方法は、金属触媒を、式II、III、もしくはIVの化合物：
【化７】
2018526969.tif 000044
またはそれらの塩を含む組成物と接触させる工程を含み、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2、R3、R4は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である、方法。
【請求項３２】
少なくとも1つの前記化合物が、官能基化アルファ置換C4カルボン酸の少なくとも2つの誘導体を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
式Iを有する化合物：
【化８】
2018526969.tif 000045
またはその塩の製造方法であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり；
該方法は、金属触媒を、式II、III、もしくはIV、またはそれらの塩もしくはエステルから選択される官能基化アルファ置換ジカルボン酸と接触させる工程を含み、該官能基化アルファ置換ジカルボン酸のベータカルボキシレートが選択的に脱炭酸される、方法。
【請求項３４】
ヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸、またはその塩、ラクトンもしくはエステルの製造方法であって、ヒドロキシアルキルアルファ置換C4ジカルボン酸、またはその塩、エステルもしくはラクトンを金属触媒と接触させる工程を含む、方法。
【請求項３５】
式Iの化合物：
【化９】
2018526969.tif 000046
またはその塩の製造方法であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり；
金属触媒を、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、官能基化アルファ置換フマル酸またはそれらの塩、エステルもしくはラクトンを含む組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項３６】
前記金属触媒が不均一触媒である、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記金属触媒が、Ni、Pd、Pt、Cu、Zn、Rh、Ru、Bi、Fe、Co、Os、Ir、V、および2つ以上のそれらの混合物からなる群より選択される金属を含む、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記金属触媒が、CuまたはPtからなる群より選択される金属を含む、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記金属触媒がCuを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記金属触媒がPtを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記金属触媒が担持触媒である、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記金属触媒が促進剤を含む、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記促進剤が硫黄を含む、方法４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、少なくとも約100℃の温度で実施される、請求項２７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、約100℃〜約250℃の温度で実施される、請求項２７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が、約150℃〜約200℃の温度で実施される、請求項２７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記金属触媒が該接触前に活性化される、請求項２７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記金属触媒が水素ガス下で活性化される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記金属触媒が実質的に水素を含まない、請求項２７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記金属触媒が、約100℃〜約200℃の温度で活性化される、請求項４７または４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
官能基化アルファ置換アクリル酸またはその塩、エステルもしくはラクトン、およびアルファ-(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、アルファ-(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸、アルファ-(1-ヒドロキシエチル)リンゴ酸およびアルファ-(2-ヒドロキシエチル)リンゴ酸またはそれらの塩もしくはエステルから選択される1つ以上の化合物を含む、組成物。
【請求項５２】
官能基化アルファ置換C4カルボン酸の1つ以上の誘導体をさらに含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
式Iの化合物：
【化１０】
2018526969.tif 000047
またはその塩の製造方法であって、
式中：各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり；
官能基化アルファ置換3HPを加熱して官能基化アルファ置換3HPを脱水し、式Iを有する化合物を産生する工程を含む、方法。
【請求項５４】
官能基化アルファ置換アクリル酸であって、該官能基化アルファ置換が、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>2の場合に選択される官能基化アルファ置換アクリル酸と、トランスアミナーゼ（図１２、行A）、シンターゼ（図１２、行B）、デヒドラターゼ（図１２、行C）、ヒドラターゼ（図１２、行D）、デヒドロゲナーゼ（図１２、行E）、シストランスイソメラーゼ（図１２、行F）、シクラーゼ、ラクトナーゼ、ラクタマーゼ（図１２、行G）、エステラーゼ（図１２、行H）、デカルボキシラーゼ（図１２、行I）、レダクターゼ（図１４、行C）、デカルボキシラーゼ（図１４、行D）、レダクターゼ（図１４、行E）、CoAトランスフェラーゼ（図１４、行F）、および3HP-CoAデヒドラターゼ（図１４、行G）から選択される少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
【請求項５５】
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸をさらに含み、該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、アルファ-(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、アルファ-(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸、アルファ-(1-ヒドロキシエチル)リンゴ酸およびアルファ-(2-ヒドロキシエチル)リンゴ酸から選択される、請求項５４に記載の組み換え微生物。
【請求項５６】
前記官能基化アルファ置換が、2個の水素原子と会合した1個以上の炭素原子を含むスペーサーを追加的に含む、請求項５５に記載の組み換え微生物。
【請求項５７】
前記スペーサーが、-(CH2)2-、-(CH2)3-または-(CH2)4-から選択される、請求項５６に記載の組み換え微生物。
【請求項５８】
前記官能基化アルファ置換アクリル酸が、アミノ酸側鎖から選択される官能基を含む、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項５９】
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸をさらに含み、該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される、請求項５４に記載の組み換え微生物。
【請求項６０】
前記組み換え微生物が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される少なくとも2つの官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含む、請求項５９に記載の組み換え微生物。
【請求項６１】
前記組み換え微生物が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される少なくとも3つの官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含む、請求項５９に記載の組み換え微生物。
【請求項６２】
少なくとも2つの前記官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、同じ官能性置換基を含む、請求項６０に記載の組み換え微生物。
【請求項６３】
ベータ官能基化アルファケト酸をさらに含む、請求項５４〜６２のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項６４】
官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸をさらに含む、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項６５】
前記組み換え微生物が、少なくとも1つのアミノ酸を選択的に過剰産生する、請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項６６】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、リジン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、トリプトファン、セレノシステイン、セリン、ホモセリン、ホモトレオニン、チロシン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンから選択されるアミノ酸を産生する、請求項６５に記載の組み換え微生物。
【請求項６７】
前記組み換え微生物が、該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を選択的に過剰産生する、請求項５９に記載の組み換え微生物。
【請求項６８】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を産生する、請求項５９に記載の組み換え微生物。
【請求項６９】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化ベータ置換アルファケト酸を産生する、請求項５９に記載の組み換え微生物。
【請求項７０】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換フマル酸を産生する、請求項５９に記載の組み換え微生物。
【請求項７１】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の官能基化アルファ置換マレイン酸を産生する、請求項５９に記載の組み換え微生物。
【請求項７２】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換リンゴ酸を産生する、請求項５９に記載の組み換え微生物。
【請求項７３】
有機酸輸送体をコードする組み換え核酸配列をさらに含む、請求項５４〜７２のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項７４】
前記組み換え微生物が原核生物である、請求項５４〜７３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項７５】
前記組み換え微生物が真核生物である、請求項５４〜７３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項７６】
官能基化アルファ置換アクリル酸の製造方法であって、請求項５４〜７５のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と；該官能基化アルファ置換アクリル酸またはその塩を分離する工程とを含む、方法。
【請求項７７】
ヒドロキシメチルマロニル-CoAと、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行A）、CoAカルボキシラーゼ（図１６、行B）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行C）、レダクターゼ（図１６、行D）、デヒドロゲナーゼ（図１６、行D）、3HP CoA-デヒドラターゼ（図１６、行E）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行F）、カルボキシラーゼ（図１６、行G）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行H）、オキシレダクターゼ（図１６、行I）、レダクターゼ（図１６、行J）、デヒドラターゼ（図１６、行K）およびCoAトランスフェラーゼ（図１６、行L）から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
【請求項７８】
ヒドロキシメチルマロニル-CoAと、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行A）、CoAカルボキシラーゼ（図１６、行B）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行C）、レダクターゼ（図１６、行D）、デヒドロゲナーゼ（図１６、行D）、3HP CoA-デヒドラターゼ（図１６、行E）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行F）、カルボキシラーゼ（図１６、行G）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行H）、オキシレダクターゼ（図１６、行I）、レダクターゼ（図１６、行J）、およびCoAトランスフェラーゼ（図１６、行L）から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
【請求項７９】
3-ヒドロキシプロピオン酸をさらに含む、請求項７７または７８に記載の組み換え微生物。
【請求項８０】
トランスフェラーゼをコードする組み換え核酸配列をさらに含む、請求項７７〜７９のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項８１】
前記微生物が、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAまたはヒドロキシメチルマロン酸を、0.1g/L/時間を超える速度で追加的に産生する、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項８２】
前記微生物が、3ヒドロキシプロピオン酸を、0.1g/L/時間を超える速度で追加的に産生する、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項８３】
ヒドロキシメチルアクリレートをさらに含む、請求項７７に記載の組み換え細胞。
【請求項８４】
前記微生物が原核生物である、請求項７７〜８３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項８５】
前記微生物が、大腸菌（E. coli）、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バチルス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、リゾビウム属、ビトレオシラ属、およびパラコッカス属から選択される、請求項７７〜８３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項８６】
前記微生物が真核生物である、請求項７７〜８３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項８７】
前記微生物が、カンジダ属、ピキア属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ジゴサッカロミセス属、クルイベロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属、イサタケンキア属、ヤロウイア属およびハンゼヌラ属から選択される、請求項７７〜８３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。特定の宿主酵母細胞の例には、C.ソノレンシス、K.マルキシアヌス、K.サーモトレランス、C.メタンソルボサ、サッカロミセス・ブルデリ（S.ブルデリ）、I.オリエンタリス、C.ランビカ、C.ソルボキシロサ、C.ゼムプリニナ、C.ゲオカレス、P.メンブラニファシエンス、Z.コンブチャエンシス、C.ソルボシボランス、C.ヴァンデルワルティ、C.ソルボフィラ、Z.ビスポラス、Z.レンツス、サッカロミセス・バヤヌス（S.バヤヌス）、D.カステリイ、C.ボイジニイ、C.エトケルシイ、K.ラクチス、P.ジャジニイ、P.アノマラ、サッカロミセス・セレビシエ（S.セレビシエ）、ピキア・ガレイホルミス、ピキア種YB-4149（NRRL指定）、カンジダ・エタノリカ、P.デセルティコラ、P.メンブラニファシエンス、P.ファーメンタンスおよびサッカロマイコプシス・クラタエゲンシス（S.クラタエゲンシス）が挙げられる。
【請求項８８】
アルファヒドロキシメチルアクリレートの製造方法であって、請求項７７に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と；アルファヒドロキシメチルアクリレートを分離する工程とを含む、方法。
【請求項８９】
2-メチレン-スクシニルセミアルデヒド、アルファヒドロキシエチルアクリレートおよびツリパリンAから選択される化合物と、オキシレダクターゼ（図１８、表７、行A）、レダクターゼ（図１８、表７、行B）、シクラーゼ（図１８、表７、行C）、ラクトナーゼ（図１８、表７、行C）、ラクタマーゼ（図１８、表７、行C）およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
【請求項９０】
前記組み換え微生物が、少なくとも10g/Lの、2-メチレン-スクシニルセミアルデヒド、アルファヒドロキシエチルアクリレートおよびツリパリンAから選択される化合物の存在下で生存可能である、請求項８９に記載の組み換え微生物。
【請求項９１】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間のイタコン酸を産生する、請求項８９または９０に記載の組み換え微生物。
【請求項９２】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の2-メチレン-スクシニルセミアルデヒドを産生する、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項９３】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間のアルファヒドロキシエチルアクリレートを産生する、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項９４】
前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間のツリパリンAを産生する、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項９５】
2-メチレン-スクシニルセミアルデヒド、アルファヒドロキシエチルアクリレートおよびツリパリンAから選択される化合物の製造方法であって、請求項８９〜９４のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭素源で培養する工程と、該化合物を発酵ブロスから分離する工程とを含む、方法。
【請求項９６】
アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸と、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行A）、CoAカルボキシラーゼ（図１６、行B）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行C）、レダクターゼ（図１６、行D）、デヒドロゲナーゼ（図１６、行D）、カルボキシラーゼ（図１６、行G）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行H）、オキシレダクターゼ（図１６、行I）、およびレダクターゼ（図１６、行J）から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
【請求項９７】
アルファ置換マロニル-CoAと、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行A）、CoAカルボキシラーゼ（図１６、行B）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行C）、レダクターゼ（図１６、行D）、デヒドロゲナーゼ（図１６、行D）、カルボキシラーゼ（図１６、行G）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行H）、オキシレダクターゼ（図１６、行I）、およびレダクターゼ（図１６、行J）から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
【請求項９８】
アルファ置換マロン酸セミアルデヒドと、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行A）、CoAカルボキシラーゼ（図１６、行B）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行C）、レダクターゼ（図１６、行D）、デヒドロゲナーゼ（図１６、行D）、カルボキシラーゼ（図１６、行G）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行H）、オキシレダクターゼ（図１６、行I）、およびレダクターゼ（図１６、行J）から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
【請求項９９】
アルファ置換酢酸をさらに含む、請求項９６〜９８のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１００】
トランスフェラーゼをコードする組み換え核酸配列をさらに含む、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１０１】
前記微生物が、アルファ置換アセチル-CoAまたはアルファ置換マロン酸を、0.1g/L/時間を超える速度で追加的に産生する、請求項９６〜１００のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１０２】
前記微生物が、アルファ置換酢酸を、0.1g/L/時間を超える速度で追加的に産生する、請求項９６〜１０１のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１０３】
前記微生物が原核生物である、請求項９６〜１０２のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１０４】
前記微生物が、大腸菌（E. coli）、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バチルス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、リゾビウム属、ビトレオシラ属、およびパラコッカス属から選択される、請求項９６〜１０２のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１０５】
前記微生物が真核生物である、請求項９６〜１０２のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１０６】
前記微生物が、カンジダ属、ピキア属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ジゴサッカロミセス属、クルイベロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属、イサタケンキア属、ヤロウイア属およびハンゼヌラ属から選択される、請求項９６〜１０２のいずれか一項に記載の組み換え微生物。特定の宿主酵母細胞の例には、C.ソノレンシス、K.マルキシアヌス、K.サーモトレランス、C.メタンソルボサ、サッカロミセス・ブルデリ（S.ブルデリ）、I.オリエンタリス、C.ランビカ、C.ソルボキシロサ、C.ゼムプリニナ、C.ゲオカレス、P.メンブラニファシエンス、Z.コンブチャエンシス、C.ソルボシボランス、C.ヴァンデルワルティ、C.ソルボフィラ、Z.ビスポラス、Z.レンツス、サッカロミセス・バヤヌス（S.バヤヌス）、D.カステリイ、C.ボイジニイ、C.エトケルシイ、K.ラクチス、P.ジャジニイ、P.アノマラ、サッカロミセス・セレビシエ（S.セレビシエ）、ピキア・ガレイホルミス、ピキア種YB-4149（NRRL指定）、カンジダ・エタノリカ、P.デセルティコラ、P.メンブラニファシエンス、P.ファーメンタンスおよびサッカロマイコプシス・クラタエゲンシス（S.クラタエゲンシス）が挙げられる。
【請求項１０７】
以下の式のアルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸：
【化１１】
2018526969.tif 000048
またはその塩の製造方法であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり；
請求項９６〜１０６のいずれか一項で定めた組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と；アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸またはそのエステルもしくは塩を分離する工程とを含む、方法。
【請求項１０８】
以下の式のアルファ置換アクリル酸：
【化１２】
2018526969.tif 000049
またはその塩の製造方法であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり；
アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を脱水してアルファ置換アクリル酸を産生する工程を含む、方法。
【請求項１０９】
請求項１０７に記載の方法によって前記アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を産生する工程をさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
以下の式の化合物：
【化１３】
2018526969.tif 000050
またはその塩であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上である、化合物。
【請求項１１１】
以下の式の化合物：
【化１４】
2018526969.tif 000051
またはその塩であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上である、化合物。
【請求項１１２】
R1がヒドロキシである、請求項１１０または１１１に記載の化合物。
【請求項１１３】
nが1または2である、請求項１１０〜１１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１４】
R1がヒドロキシであり、nが1である、請求項１１０または１１１に記載の化合物。
【請求項１１５】
R1がヒドロキシであり、nが2である、請求項１１０または１１１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、2015年6月4日に出願された米国仮出願第62/171,019号、および2015年6月4日に出願された米国仮特許出願第62/171,029号の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本明細書は、とりわけ、組み換え微生物、操作された代謝経路、化学的触媒、ならびに記載の方法および物質の使用により産生される生成物を提供する。産生された生成物には、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸および官能基化アクリル酸ならびにそれらの塩、エステルおよびラクトンが含まれる。
【背景技術】
【０００３】
現在、多くの炭素含有化学物質は、石油系原料に由来する。石油由来の供給原料への依存は、石油備蓄の枯渇と石油掘削に伴う有害な環境影響につながる。
【０００４】
糖発酵の特定の炭素質生成物は、炭素含有化学物質の製造用の供給原料として使用される石油由来物質の代替物と見なされる。そのような生成物には、例えばヒドロキシメチルアクリル酸、ヒドロキシエチルアクリル酸、イソプロピルアクリル酸などを含む官能基化アルファ置換アクリル酸が挙げられる。官能基化アクリル酸は、今日の全ての商業生産が石油由来である成長市場を象徴する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第6274311号
【特許文献２】国際公開第99/14335号
【特許文献３】国際公開第00/71738号
【特許文献４】国際公開第02/42471号
【特許文献５】国際公開第03/102201号
【特許文献６】国際公開第03/102152号
【特許文献７】国際公開第03/049525号
【特許文献８】国際公開第00/71738号
【特許文献９】国際公開第02/42471号
【特許文献１０】国際公開第03/049525号
【特許文献１１】国際公開第03/102152号
【特許文献１２】国際公開第03/102201号
【特許文献１３】国際公開第2007/061590号
【特許文献１４】国際公開第2009/065778号
【特許文献１５】PCT/US2011/022612
【特許文献１６】国際公開第2012/103261号
【特許文献１７】国際公開第2014164410号
【特許文献１８】国際公開第2008116853号
【特許文献１９】国際公開第2013163292号
【特許文献２０】国際公開第2014/043182号
【特許文献２１】米国特許第6037154号
【特許文献２２】米国特許出願公開第2011294178号
【特許文献２３】国際公開第2010076324号
【特許文献２４】国際公開第2015017721 号
【特許文献２５】WP 0242418 A2
【特許文献２６】米国特許第3544455号
【特許文献２７】中国特許出願公開第102940992号
【特許文献２８】中国特許第101643404号
【特許文献２９】特開平10-218835号公報
【特許文献３０】特開平10-218834号公報
【非特許文献】
【０００６】
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【発明の概要】
【０００７】
本開示は、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸および官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を産生するように設計された組み換え微生物を提供する。明細書および特許請求の範囲全体を通して、有機酸への言及は、文脈が別段に明確に示さない限り、その塩、エステルおよびラクトンを含むものとする。これらの経路における中間体ならびにこれらの経路からの最終生成物は、とりわけ、化学工業において、例えばポリマーの成分としての使用に有用である。これらの経路からの生成物および中間体は、その保護された形態または保護されていない形態のいずれかで、さらなる化学反応の基質としても有用である。例えば、官能基化アルファ置換C4カルボン酸の誘導体は、化学反応によって製造され得ると記載されている。いくつかの実施例では、官能基化アルファ置換アクリル酸は、金属触媒および／または脱水反応の使用によって産生される。
【０００８】
いくつかの例では、組み換え微生物は、官能基化アルファ置換ジカルボン酸および／または官能基化アルファ置換3HPを産生する経路を含むように操作される。当業者は、所与の経路の発現の際に、経路の最終生成物ならびに経路内のいくつかの中間体が生成され、発酵から単離されることを理解するであろう。いくつかの例では、そのような生成物の混合物を次の反応に使用し、最終生成物を生成することができる。本明細書に記載の操作された経路のいくつかは、デカルボキシラーゼ活性（図１１および図１２、行Iを参照）を有する1つ以上のポリペプチドまたは3HP CoAデヒドラターゼ（図１３および図１４、行Gを参照）の発現を含む。
【０００９】
他の実施形態には、2-メチレン-スクシニルセミアルデヒド、アルファヒドロキシエチルアクリレートおよびツリパリンAから選択される化合物を産生するように操作された組み換え微生物が含まれる。そのような組み換え微生物は、以下の活性を有する1つ以上の酵素をコードする核酸配列を含有する：オキシレダクターゼ、レダクターゼ、シクラーゼ、ラクトナーゼ、およびラクタマーゼ活性。これらの活性を得るために使用され得る特定のアミノ酸配列および組み換え微生物、例えばオキシレダクターゼ（図１８、行A）、レダクターゼ（図１８、行B）、シクラーゼ（図１８、行C）、ラクトナーゼ（図１８、行C）、およびラクタマーゼ（図１８、行C）も、本明細書で教示される。これらの組み換え微生物はまた、少なくとも0.5、0.75、1.0、3.0、5.0、7.0、または10g/Lの、2-メチレン-スクシニルセミアルデヒド、アルファヒドロキシエチルアクリレートおよびツリパリンAから選択される化合物の存在下で生存可能であるように選択または操作され得る。これらの組み換え微生物は、少なくとも0.02、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、3.0、5.0、7.0、または10.0g/L/時間の速度で、1つ以上の以下の生成物、イタコン酸、2-メチレン-スクシニルセミアルデヒド、アルファヒドロキシエチルアクリレートまたはツリパリンAを産生することができる。組み換え微生物を発酵ブロス中で発酵させる工程と、生成物（単数または複数）を発酵ブロスから分離する工程とを含む、これらの生成物の製造方法。
【００１０】
当業者は、不純物が所望の生成物と共精製され、イオン交換、蒸留、結晶化などの1つ以上の処理工程を使用して不純物レベルが低下され得ることを理解するであろう。所望の実際の純度レベルは、精製のコストと不純物の最終用途の耐性とのバランスである。例えば、いくつかの用途では、不純物は0.01ppm未満である必要があり得るが、0.01、50、100、150、200ppm未満、または300ppm超の不純物が許容され得る。不純物は、炭水化物、塩、金属、ガス、有機物、細胞破片、およびそれらの組み合わせの形態であり得る。いくつかの例では、不純物は望ましい副作用を有し得る。
【００１１】
本明細書に記載の組み換え微生物は、特定の酵素活性を有するポリペプチドを発現または過剰発現するように操作されている。酵素活性は、基質を生成物に変換する能力であると一般的にいわれている。当業者は、酵素が構造的に無関係であり、異なる補因子を使用し、異なる祖先を有し得るが、同じ基質を同じ生成物に変換できることを理解するであろう。これに照らして、本開示は、組み換え技術を介した特定の酵素活性（例えば、図４および図６の表を参照）を、同じ活性を有する別のポリペプチドとの構造類似性に関わらずに含有する組み換え微生物を含む。これらの組み換え微生物はまた、天然の宿主微生物に見られるものより高い濃度で産生される生成物を含むことになる。いくつかの例では、生成物は、天然宿主微生物には見られない。
【００１２】
典型的な組み換え微生物は、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸などの生成物であって、官能基化アルファ置換が、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>2、n>3、またはn>4の場合に選択される官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸と、トランスアミナーゼ（図４、行A）、シンターゼ（図４、行B）、デヒドラターゼ（図４、行C）、ヒドラターゼ（図４、行D）、デヒドロゲナーゼ（図４、行E）、シストランスイソメラーゼ（図４、行F）、シクラーゼ、ラクトナーゼ、ラクタマーゼ（図４、行G）、エステラーゼ（図４、行H）、レダクターゼ（図６、行C）、デカルボキシラーゼ（図６、行D）およびアルデヒドレダクターゼ（図６、行E）から選択される少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの組み換え核酸配列とを含有する。当業者は、シクラーゼ、ラクトナーゼ、ラクタマーゼおよび／またはエステラーゼを使用して、触媒反応後にアルファ置換アクリル酸生成物をそのラクトンまたはエステル形態に酵素的に変換できることを理解するであろう。官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸は、アルファ-(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、アルファ-(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸、アルファ-(1-ヒドロキシエチル)リンゴ酸および／またはアルファ-(2-ヒドロキシエチル)リンゴ酸であり得る。操作された経路に応じて、組み換え微生物は、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含むことができる（図３および図９の経路を参照）。当業者は、スペーサー経路がアルファ置換基を伸長させるために使用される場合、いくつかの異なる官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が存在し得ることを理解するであろう。多くの場合、所与の組み換え微生物は、リンゴ酸、フマル酸などの複数の官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含み、それら複数の官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸は、同じ官能基化アルファ置換を含む（図３、５、９、および１０を参照）。
【００１３】
典型的な組み換え微生物は、官能基化アルファ置換アクリル酸などの生成物であって、官能基化アルファ置換が、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>2、n>3、またはn>4の場合に選択される官能基化アルファ置換アクリル酸と、トランスアミナーゼ（図１２、行A）、シンターゼ（図１２、行B）、デヒドラターゼ（図１２、行C）、ヒドラターゼ（図１２、行D）、デヒドロゲナーゼ（図１２、行E）、シストランスイソメラーゼ（図１２、行F）、シクラーゼ、ラクトナーゼ、ラクタマーゼ（図１２、行G）、エステラーゼ（図１２、行H）、デカルボキシラーゼ（図１２、行I）、レダクターゼ（図１４、行C）、デカルボキシラーゼ（図１４、行D）、レダクターゼ（図１４、行E）、CoAトランスフェラーゼ（図１４、行F）、および3HP-CoAデヒドラターゼ（図１４、行G）から選択される少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの組み換え核酸配列とを含有する。官能基化アルファ置換アクリル酸は、アルファ-(ヒドロキシメチル)アクリル酸、アルファ-(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸、アルファ-(1-ヒドロキシエチル)アクリル酸および／またはアルファ-(2-ヒドロキシエチル)アクリル酸であり得る。当業者は、スペーサー経路がアルファ置換基を伸長させるために使用される場合、様々な炭素鎖長を官能基において有するいくつかの異なる官能基化アルファ置換アクリル酸が存在し得ることを理解するであろう。
【００１４】
いくつかの実施形態では、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸に存在する官能基は、アミノ酸に由来し得る。図７はこれらの官能基を示しており、当業者は、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が所与のアミノ酸から生成され、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸がその後アクリレートに触媒的に変換される場合、メチレン基がアミノ酸の元のアミンの位置を占めることになることを理解するであろう。アミノ酸を操作された経路の基質として選択する場合、そのアミノ酸を過剰産生するように既に操作された微生物を選択するか、またはそのアミノ酸を自然に過剰産生する微生物を選択することが好都合であり得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、官能基化アルファ置換アクリル酸に存在する官能基は、アミノ酸に由来し得る。図７はこれらの官能基を示しており、当業者は、官能基化アルファ置換アクリル酸のメチレン基が、アミノ酸由来のアミノ基と同じ位置を占めることになることを理解するであろう。アミノ酸を操作された経路の基質として選択する場合、そのアミノ酸を過剰産生するように既に操作された微生物を選択するか、またはそのアミノ酸を自然に過剰産生する微生物を選択することが好都合であり得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、組み換え微生物は、天然に存在するジカルボン酸を、その後の官能基化アルファ置換C4アクリル酸への変換のための基質として使用する。例えば、宿主生物は、3-ホスホヒドロキシピルビン酸（図９を参照）またはイタコン酸（図９を参照）またはイタ酒石酸（図９を参照）を自然に産生することができ、増加したホスファターゼ（E.C. 3.1.3.21）またはイタコン酸オキシダーゼ活性を含むことができる。イタ酒石酸を産生する宿主には、アスペルギルス・テレウスおよびウスティラゴ・メイディス（非特許文献１；非特許文献２および非特許文献３；ならびに非特許文献４）が挙げられる。次いで、これらの出発生成物を、図３、５、９、１０、１１、１３および１５に示されるような操作された経路における3HP基質に導入することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、組み換え微生物は、天然に存在するジカルボン酸を、その後の官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸への変換のための基質として使用する。例えば、宿主生物は、3-ホスホヒドロキシピルビン酸（図９を参照）またはイタコン酸（図９を参照）またはイタ酒石酸（図９を参照）を自然に産生することができる。イタ酒石酸を産生する宿主には、アスペルギルス・テレウスおよびウスティラゴ・メイディス（非特許文献１；非特許文献２および非特許文献３；ならびに非特許文献４）が挙げられる。次いで、これらの出発生成物を、操作された経路に導入することができる。
【００１８】
当業者はまた、本明細書に記載の操作された宿主細胞が、本明細書に提供される表に示される酵素に加えて遺伝子改変を含み得ることを理解するであろう。例えば、生産性（生成物濃度／容量／時間）、収量（生成物濃度／生物に供給される炭素源）、または力価（産生された全生成物）を最適化するために、1つ以上の酵素を減衰させるか、または活性を増加させることができる。トランスクリプトミクス、メタボロミクスなどの様々なよく知られている技術の使用は、組み換え微生物のさらなる改変により、正確な炭素および補因子フラックス（ATP、NADH、NADPH、CO2、O2など）を細胞に強制し、産生を最適化する。
【００１９】
上記のように、本明細書に記載の組み換え微生物は、相当量の所望の中間体を既に産生する微生物（親株または宿主株）から誘導され得る。宿主株は、相当量の中間体を産生するように既に操作されていてもよく、またはそれは相当量の中間体を自然に産生してもよい。例えば、宿主細胞は、少なくとも0.1g/L/時間のアミノ酸、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸、官能基化ベータ置換アルファケト酸、官能基化アルファ置換フマル酸、アルファ置換マロニルCoA、3-ヒドロキシプロピオン酸、ヒドロキシメチルマロン酸、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA、ヒドロキシメチルマロニル-CoA、2-ホルミル3HP-CoA、2-ヒドロキシメチル3HP CoA、ヒドロキシメチルマロン酸セミアルデヒド、2-(ヒドロキシメチル)3HP、アルファヒドロキシメチルアクリル酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および／または官能基化アルファ置換リンゴ酸を産生することができる。他の実施形態では、宿主細胞は、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0g/L/時間またはそれ以上の選択された中間体を産生することができる。中間体には、とりわけ、中心代謝産物、有機酸を挙げることができ、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、リジン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、トリプトファン、セレノシステイン、セリン、ホモセリン、ホモトレオニン、チロシン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
【００２０】
図面に描写され、付随する表に具体的に示される酵素活性に加えて、組み換え微生物はまた、有機酸輸送体または特許文献１のシゾサッカロミセス・ポンべ酵素などのパーミアーゼを発現し得る。さらに、炭水化物の取り込みを、他の輸送体の発現によって変化させることができる。
【００２１】
様々な組み換え配列が導入される宿主細胞を、1つ以上の中間体または生成物に対するその耐性について選択することができる。例えば、生成物を、その生成物の存在下で産生する能力について、宿主細胞を選択することができる。いくつかの例では、宿主細胞は低pHに耐性がある。宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれかであり得る。
【００２２】
様々な官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸または官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸の製造方法が記載されている。これらの方法は、組み換え微生物を炭水化物源の存在下で培養する工程と、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸または官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を発酵ブロスから分離する工程とを包含する。
【００２３】
様々な官能基化アルファ置換アクリル酸の製造方法が記載されている。これらの方法は、組み換え微生物を炭水化物源の存在下で培養する工程と、官能基化アルファ置換アクリル酸を発酵ブロスから分離する工程とを包含する。
【００２４】
本明細書に記載の官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を、官能基化アルファ置換アクリル酸への触媒変換によって（図１を参照）、または官能基化アルファ置換アクリル酸への酵素変換によって（図１１および１３を参照）、化学的に変換することができる。化学変換は、触媒工程として図３、９、および１０に示される。同様に、官能基化アルファ置換3HP酸を、単純な脱水工程により官能基化アルファ置換アクリル酸に化学的に変換することができる（図５を参照）。
【００２５】
アルファ置換C4ジカルボン酸の触媒変換は、少なくとも式Iの化合物：
【化１】
2018526969.tif 000002
またはその塩を産生し、式中：各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり；
該方法は、金属触媒を、式II、III、もしくはIVの化合物：
【化２】
2018526969.tif 000003
またはそれらの塩を含む組成物と接触させる工程を含み、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2、R3、R4は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である。
【００２６】
特定の実施例では、ヒドロキシ官能基化アルファ置換アクリル酸は、1つ以上の官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の触媒変換により形成することができる。これらのヒドロキシ官能基化アルファ置換アクリル酸は、式V：
【化３】
2018526969.tif 000004
またはその塩を有することができ、式中：各R1はHまたはCH3から選択され、R2およびR3はHまたは保護基から選択され、nは1以上である。式Vを有する化合物の形成方法は、金属触媒を、式VI、VII、VIIIの化合物：
【化４】
2018526969.tif 000005
またはそれらの塩を含む組成物と接触させる工程を含み、式中：各R1はHまたはCH3から選択され、R2、R3、およびR4は個別にHまたは保護基から選択され、nは1以上である。
【００２７】
下記表Aに示すように、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の誘導体の製造方法も本明細書に記載されている。これらの方法は、式II、IIIおよびIVから選択される化合物またはそれらの塩、エステルもしくはラクトンを金属触媒と接触させる工程を含む。
表A
官能基化アルファ置換C4カルボン酸の誘導体
【化５】
2018526969.tif 000006
【００２８】
表Aに示す構造中のR基は、R1が、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、R2が個別にHおよび保護基から選択され、R2が個別にHおよび保護基から選択され、nが1以上であるとして定義される。
【００２９】
本明細書に記載するのは、式Iの化合物
【化６】
2018526969.tif 000007
またはその塩であって、式中：各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり、nが1より大きい場合、R1はカルボキシレートまたはメチルから選択されることができる化合物と；少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つの、表Aに示される官能基化アルファ置換C4カルボン酸の誘導体との製造方法である。これらの方法は：
金属触媒を、以下にそれぞれ示すような式II、III、もしくはIVの化合物
【化７】
2018526969.tif 000008
またはそれらの塩を含む組成物と接触させる工程を包含し、式中：各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2、R3、R4は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である。
【００３０】
さらに他の実施形態では、式Iの化合物：
【化８】
2018526969.tif 000009
またはその塩の形成を含む方法が提供され、式中：各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートならびにそれらの保護基から選択され、nは1以上である。これらの方法は、式II、III、もしくはIV、またはそれらの塩もしくはエステルから選択される官能基化アルファ置換ジカルボン酸のベータカルボキシレートの、そのような基質を触媒と接触させることによる選択的脱炭酸を含む。
【００３１】
図９に示され、実施例２、３、４、５、６、７、および１４に記載のような特定の実施形態では、ヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸、またはその塩、ラクトンもしくはエステルの製造方法が教示されており、本方法は、ヒドロキシアルキルアルファ置換C4ジカルボン酸、またはその塩、エステル、もしくはラクトンを、金属触媒と接触させる工程を含む。
【００３２】
さらに他の特定の実施形態では、式Iを有する化合物、またはその塩の製造方法が提供され、式中：各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり；これらの方法は、金属触媒を、クエン酸、ホモクエン酸、イソプロピルリンゴ酸またはそれらの塩、エステルもしくはラクトンを含む組成物と接触させる工程を含む。
【００３３】
本明細書に記載の金属触媒は、不均一であってもよい。金属触媒は、Ni、Pd、Pt、Cu、Zn、Rh、Ru、Bi、Fe、Co、Os、Ir、V、および2つ以上のこれら金属の混合物を含むことができる。特定の実施例では、金属触媒は、Cu、Ptまたはそれらの組み合わせである。金属触媒は担持されてもよく、促進剤または修飾因子と併用することができる。促進剤は、存在する場合、硫黄を含み得る。
【００３４】
基質を本明細書に教示される方法に記載の金属触媒と接触させる工程は、基質が所望の生成物に変換するのを可能にする任意の温度で行うことができる。例えば、接触工程は、少なくとも約100℃の温度、または約100℃〜約250℃の温度、または約150℃〜約200℃の温度で行うことができる。いくつかの例では、触媒は、基質（単数または複数）と接触する前に活性化される。活性化は、触媒を水素ガスで処理する工程を含むことができ、約100℃〜約200℃などの高温で活性化させる工程を含むことができる。他の実施形態では、金属触媒は実質的に水素を含まない。
【００３５】
一実施形態では、本出願は、ヒドロキシメチルマロニル-CoAと、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行A）、CoAカルボキシラーゼ（図１６、行B）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行C）、レダクターゼ（図１６、行D）、デヒドロゲナーゼ（図１６、行D）、3HP CoA-デヒドラターゼ（図１６、行E）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行F）、カルボキシラーゼ（図１６、行G）、CoAトランスフェラーゼ（図１６、行H）、オキシレダクターゼ（図１６、行I）、レダクターゼ（図１６、行J）、デヒドラターゼ（図１６、行K）、およびcoAトランスフェラーゼ（図１６、行L）から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む組み換え微生物に関する。例えば、組み換え核酸配列は、CoAトランスフェラーゼ、CoAカルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、レダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、3HP CoA-デヒドラターゼ、CoAトランスフェラーゼ、カルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、オキシレダクターゼ、レダクターゼ、およびCoAトランスフェラーゼから選択される酵素をコードする。あるいは、組み換え核酸配列は、CoAトランスフェラーゼ、CoAカルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、レダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、カルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、オキシレダクターゼ、およびレダクターゼから選択される酵素をコードする。
【００３６】
別の実施形態では、本出願は、アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸と、CoAトランスフェラーゼ、CoAカルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、レダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、カルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、オキシレダクターゼ、およびレダクターゼから選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む組み換え微生物に関する。本出願はまた、アルファ置換マロニル-CoAと、CoAトランスフェラーゼ、CoAカルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、レダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、カルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、オキシレダクターゼ、およびレダクターゼから選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む組み換え微生物に関する。本出願はまた、アルファ置換マロン酸セミアルデヒドと、CoAトランスフェラーゼ、CoAカルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、レダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、カルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、オキシレダクターゼ、およびレダクターゼから選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む組み換え微生物に関する。
【００３７】
一実施形態では、微生物は原核生物であり、例えば、大腸菌（E. coli）、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バチルス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、リゾビウム属、ビトレオシラ属、およびパラコッカス属から選択される。別の実施形態では、微生物は真核生物であり、例えば、カンジダ属、ピキア属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ジゴサッカロミセス属、クルイベロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属、イサタケンキア属、ヤロウイア属およびハンゼヌラ属から選択される。特定の宿主酵母細胞の例には、C.ソノレンシス、K.マルキシアヌス、K.サーモトレランス、C.メタンソルボサ、サッカロミセス・ブルデリ（S.ブルデリ）、I.オリエンタリス、C.ランビカ、C.ソルボキシロサ、C.ゼムプリニナ、C.ゲオカレス、P.メンブラニファシエンス、Z.コンブチャエンシス、C.ソルボシボランス、C.ヴァンデルワルティ、C.ソルボフィラ、Z.ビスポラス、Z.レンツス、サッカロミセス・バヤヌス（S.バヤヌス）、D.カステリイ、C.ボイジニイ、C.エトケルシイ、K.ラクチス、P.ジャジニイ、P.アノマラ、サッカロミセス・セレビシエ（S.セレビシエ）、ピキア・ガレイホルミス、ピキア種YB-4149（NRRL指定）、カンジダ・エタノリカ、P.デセルティコラ、P.メンブラニファシエンス、P.ファーメンタンスおよびサッカロマイコプシス・クラタエゲンシス（S.クラタエゲンシス）が挙げられる。
【００３８】
さらなる実施形態では、本出願はさらに、以下の式のアルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸：
【化９】
2018526969.tif 000010
またはその塩の製造方法に関し、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり；
本方法は、前述の実施形態のいずれか1つで定めた組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と；アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸またはそのエステルもしくは塩を分離する工程とを含む。
【００３９】
さらなる実施形態では、本出願はさらに、以下の式のアルファ置換アクリル酸：
【化１０】
2018526969.tif 000011
またはその塩の製造方法に関し、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり；
本方法は、アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を脱水してアルファ置換アクリル酸を産生する工程を含む。例えば、本方法は、上記の実施形態で定めた方法によってアルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を産生する工程をさらに含む。
【００４０】
他の実施形態において、本出願は、以下の式の化合物：
【化１１】
2018526969.tif 000012
もしくはその塩に関し、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり；
または以下の式の化合物：
【化１２】
2018526969.tif 000013
もしくはその塩に関し、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上、例えば1〜6である。一実施形態では、R1はヒドロキシである。別の実施形態では、nは1または2である。例えば、R1はヒドロキシであり、nは1であるか、またはR1はヒドロキシであり、nは2である。
【００４１】
当業者は、組成物も本明細書で提供され、これらの組成物は、1つより多くの化合物、例えば官能基化アルファ置換アクリル酸またはその塩、エステルもしくはラクトン、ならびにアルファ-(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、アルファ-(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸、アルファ-(1-ヒドロキシエチル)リンゴ酸およびアルファ-（2-ヒドロキシエチル)リンゴ酸またはそれらの塩もしくはエステルから選択される1つ以上の化合物を含むことを理解するであろう。本明細書に記載の他の組成物は、官能基化アルファ置換アクリル酸と官能基化アルファ置換C4カルボン酸の1つ以上の誘導体との組み合わせを含む。
【００４２】
より詳細には、本発明は、光学材料、塗料、反応性希釈剤、界面活性剤の出発物質、医薬品／農薬の製造用の中間体、樹脂の出発物質、ポリマー中のメチルアクリレートのコモノマーなど、およびそれによって得られる他の置換アクリル酸エステルなどの様々な用途に有用な有機化学物質の製造方法に関する。
【００４３】
本発明のこれらおよび他の態様は、図面および実施例を含む以下の発明を実施するための形態に照らして容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】一実施形態による官能基化（R1）アルファ置換アクリル酸の、保護基（R2）の有無に関わらない一般構造を示す図である。
【図２】官能基化アルファ置換有機酸（中間体とも呼ばれる）の構造を示す図である。図２（ａ）は、官能基化（n個の炭素（単数または複数）の有無に関わらないR1）アルファ置換リンゴ酸の、保護基（単数または複数）（R2、R3、および／またはR4）の有無に関わらない構造を示す図であり、図２（ｂ）は、官能基化（n個の炭素（単数または複数）の有無に関わらないR1）アルファ置換マレイン酸の、保護基（単数または複数）（R2および／またはR3）の有無に関わらない構造を示す図であり；図２（ｃ）は、官能基化（n個の炭素（単数または複数）の有無に関わらないR1）アルファ置換フマル酸の、保護基（単数または複数）（R2および／またはR3）の有無に関わらない構造を示す図である。図２（d）は、保護基（R2および／またはR3）の有無に関わらない官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を示す図である。図２（ａ）〜（ｄ）に示すR基は、発明を実施するための形態においてさらに記載されている。
【図３】アルファ置換アクリル酸に化学的に変換することができる官能基化アルファ置換ジカルボン酸（官能基化中間体）の製造に有用な経路を示す図である。
【図４】官能基化アルファ置換ジカルボン酸ならびに官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸およびそれらの塩およびエステルを産生するように操作された、原核細胞および真核細胞を含む組み換え細胞に包含され得る例示的な酵素、例えば、図３に示す経路で使用され得る酵素を提供する表を示す図である。
【図５】アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を製造するのに有用な経路を示す図である。そのような官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸は、とりわけアクリレートへの化学変換のための基質として使用することができる。
【図６】官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を、例えば図５に示される経路を介して産生するように操作された原核細胞および真核細胞を含む組み換え細胞に包含され得る例示的な酵素を列挙する表を示す図である。いくつかの例では、官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を、アルファ置換アクリル酸に化学的に変換することができる。
【図７】官能基化アルファ置換ジカルボン酸、官能基化（R1）アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸に含まれるように操作することができ、したがって官能基化アルファ置換アクリレートに含まれる様々な可能性のある官能基を示す図である。当業者は、図３および５に示される経路におけるアミノ酸の使用から生じる任意のアクリレートは、メチレン基が最初のアミノ酸残渣のアミノ基と同じ位置にあるアクリレートであることを理解するであろう。1つ以上のスペーサー炭素を含むように設計された経路では、スペーサー炭素はメチレン基と元のアミノ酸側鎖の間に挿入されることになる。
【図８】発明を実施するための形態において様々な化合物を記載するために使用される命名法を提供する表を示す図である。当業者は、単一の化合物がIUPAC名から通称に及ぶ様々な名称によって同定され得ることを理解するであろう。
【図９】ヒドロキシメチル置換C4ジカルボン酸およびヒドロキシエチル置換C4ジカルボン酸を製造するための例示的な経路を示す図である。これらの生成物を、ヒドロキシアルキル置換アクリル酸（例えば、HMAおよびHEA）に化学的に変換することができ、次いで、ツリパリンに酵素的にまたは化学的に変換することができる。実施例２、３、４、５、６、７、および１４も参照。
【図１０】メチル2-メチレン-4-ブチロラクトン（MeMBL）を製造するための例示的な経路を示す図である。図１０に示される特定の酵素は、実施例８および１５にさらに記載されている。特定の酵素段階を同定するために使用される文字は、図４の表に示される酵素に対応する。
【図１１】官能基化アルファ置換アクリル酸および官能基化中間体を製造するための完全な生物学的経路を示す図である。これらの完全な生物学的経路は、「I」で示される触媒工程の包含によって同定することができる。官能基化アルファ置換アクリル酸への完全な生物学的経路の包含はまた、環化生成物およびエステルへの完全な生物学的経路を可能にする。
【図１２】図４の表と実質的に同様の表を示すが、図１２の表は、図１１に示す完全な生物学的経路に有用な特異的酵素を包含する。
【図１３】アルファ置換3HP中間体を用いたアルファ置換アクリル酸への完全な生物学的経路を示す。この図は、生成物への完全な生物学的経路を提供することを除いて、図５に示すものと同様である。
【図１４】組み換え微生物に、官能基化アルファ置換アクリル酸を図１３に記載のアルファ置換3HP中間体から産生させるために使用され得る特定の酵素を包含する表を示す図である。
【図１５】アルファヒドロキシメチルアクリル酸またはその中間体をアルファ置換マロニルCoA経路を介して製造するための完全なまたは部分的な生物学的経路を示す図である。
【図１６】組み換え微生物に、図１５または図１９に示す経路を使用して官能基化アルファ置換アクリル酸を3HPから産生させるために使用され得る特定の酵素を包含する表を示す図である。
【図１７】イタコン酸中間体を用いたアルファヒドロキシエチルアクリル酸への完全な生物学的経路を示す図である。アルファヒドロキシエチルアクリル酸を、図１８の行Cの表に記載の活性を有する酵素によって、ラクトン型のツリパリンAに変換することができる。
【図１８】組み換え微生物に、アルファヒドロキシエチルアクリル酸および／またはツリパリンAをイタコン酸から、例えば、図１７に示す経路を介して産生させるために使用され得る特定の酵素を包含する表を示す図である。
【図１９】図１５に示す経路と同様に、アルファ置換アクリル酸またはその中間体を製造するための完全なまたは部分的な生物学的経路を示す図である。
【図２０】実施例２に記載の実験からのシンターゼ活性の結果を示す図である：（ａ）様々な候補細胞のシンターゼ活性は、空ベクターを含む細胞と比較した場合、ヒドロキシピルビン酸を基質として使用するシンターゼ遺伝子を包含する；（ｂ）野生型および変異型シンターゼ活性のヒドロキシピルビン酸との比較結果。
【図２１】（ａ）pH3、pH5、およびpH7でのU.メイディス；ならびに（ｂ）経時的なpH3でのアスペルギルス・テレウスにおけるヒドロキシパラコン酸産生を示す図である（実施例４も参照）。
【図２２】デヒドラターゼ候補物質のイタ酒石酸（ITT）との活性を示す図であり、各グルーピング内で、右棒線は「無基質」を表し、左棒線はITTを表す：（ａ）デヒドラターゼ候補物質を発現する細胞における無基質対照と比較したITT脱水生成物のレベル（イタ酒石酸（ITT）ありまたはなしで一晩30℃でインキュベートした溶解物、試料はHPLCで分析した）；（ｂ）ITT標準および脱水ITT生成物を含む溶解物のNMR結果（上2行）、ならびにITTおよびその脱水生成物の類似体のNMR結果、シトラマル酸→シトラコン酸、クエン酸→シスアコニット酸、リンゴ酸→マレイン酸、ホモクエン酸→ホモアコニット酸 - 脱水生成物の特性ピークの領域を示す上部バー（実施例５も参照）。
【図２３】空ベクター（ptrc）または内因性大腸菌デヒドラターゼ、acnAもしくはacnBを発現するプラスミドのいずれかを発現する、acnAまたはacnB欠損の大腸菌細胞における無基質対照と比較したデヒドラターゼ産物のレベルを示す図である（実施例５も参照、イタ酒石酸（ITT）ありまたはなしで一晩30℃でインキュベートした表示の溶解物、HPLCで分析した試料）。
【図２４】Pt/Al2O3によって触媒されたホモクエン酸ナトリウムによって生成された結果のGC/MSクロマトグラムを示す図である（実施例１２も参照）。
【図２５】（ａ）および（ｂ）は、図２４のクロマトグラムにおける保持時間が6.68分の2-メチルグルタル酸ピークの質量スペクトルを示す図である。
【図２６】図２４のクロマトグラムにおいて保持時間が9.612分の1,2,4-ブタントリカルボン酸ピークの質量スペクトルを示す図である。
【図２７】（ａ）Cu系触媒およびホモクエン酸ナトリウムによって触媒される反応からの実施例１２の2-メチレングルタル酸のGC-MSクロマトグラム；（ｂ）および（ｃ）Cu系触媒とホモクエン酸ナトリウムで得られた2-メチレングルタル酸の質量スペクトルを示す図である。
【図２８】実施例１３において、2-イソプロピルリンゴ酸のCu系触媒とのH2下での反応（反応条件：180℃、金属Cu（50重量%）、16時間、450psiのH2、基質（0.121mmol）、H2O）から得られた結果を示す図であり、（ａ）GC/MSクロマトグラム；ならびに（ｂ）および（ｃ）保持時間が3.901分のブタン酸2,3-ジメチル,メチルエステルの質量スペクトルを示している。
【図２９】実施例１３において、2-イソプロピルリンゴ酸のCu触媒とのH2O中での反応（反応条件：2-イソプロピルリンゴ酸（0.12mmol）Cu#2触媒（Cu-0860、酸化物として供給、BASF）；180℃で16時間、H2O（1mL）、N2（450psi））から得られた結果を示す図であり、（ａ）反応生成物のGC/MSクロマトグラム；（ｂ）2-イソプロピルアクリル酸（メチルエステル誘導体）のGC/MSクロマトグラム；および（ｃ）保持時間が3.967分の2-イソプロピルアクリル酸（メチルエステル誘導体）ピーク（（ｂ）において）の質量スペクトルを示している。
【図３０】保持時間が7.329分の2-イソプロピルリンゴ酸（メチルエステル誘導体）の（ａ）GC-MSクロマトグラムおよび（ｂ）質量スペクトルを示す図である（実施例１３も参照）。
【図３１】4-メチル-2-ペンテン酸（誘導体化後の基準試料）の（ａ）GC-MSクロマトグラムおよび（ｂ）質量スペクトルを示す図である（実施例１３も参照）。
【図３２】（ａ）および（ｂ）は、メチルエステル誘導体化後の反応混合物からの4-メチル-2-ペンタン酸の質量スペクトルを示し；（ｃ）2-(1-メチルエチル)-2-ブテン二酸メチルエステル誘導体、保持時間が6.975分のピークの質量スペクトルを示す図である（実施例１３も参照）。
【図３３】（ａ）は、可能性のある宿主生物の3-ヒドロキシメチル-3-ヒドロキシプロピオン酸（HM3HP）に対する比較耐性データを提示する図であり、ここでKm=K.マルキシアヌス、Sc=S.セレビシエ、Ec=大腸菌である（実施例１７より）。各グルーピング内で、右棒線はEcを表し、左棒線はKmを表し、中間棒線はScを表す。図３３（ｂ）は、実施例２１のPCCピルビン酸蓄積共役アッセイを用いて得られた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
以下の実施例における分子生物学的処置の一般的方法ならびに緩衝液、溶液、および培地の配合は、非特許文献５に記載されている。記載されている場合、個々の製造業者からの指示をいくつかの処置に使用した。制限酵素は、特に明記しない限り、New England Biolabs（イプスウィッチ、マサチューセッツ州）から購入し、製造業者が提言するように適切な緩衝液中で使用した。全ての化学物質は、特に明記しない限り、Sigma Aldrich（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。
【００４６】
この出願においては、本明細書において代謝経路に関して使用する「天然」は、野生型宿主株において存在し、活性な代謝経路を指す。コード領域、遺伝子、プロモーターおよびターミネーターなどの遺伝物質は、遺伝物質が（機能に影響を及ぼさない個体間変異以外に）野生型宿主細胞のゲノムに存在する遺伝子成分と同一の配列を有する場合、本出願においては「天然」である（すなわち、外因性遺伝子成分は内因性遺伝子成分と同一である）。
【００４７】
この明細書においては、コード領域、遺伝子、プロモーターおよびターミネーターなどの遺伝物質は、それが（i）細胞に天然であり、（ii）その遺伝物質が野生型細胞中に存在する場合と同じ位置に存在し、および（iii）その天然プロモーターおよびその天然ターミネーターの調節制御下にあり、ならびに（iv）直接的にまたは指示された選択過程によって変更されていない場合、細胞に対して「内因性」である。
【００４８】
この出願においては、コード配列、遺伝子、プロモーターおよびターミネーターなどの遺伝物質は、それらが（i）細胞に天然ではないおよび／または（ii）その細胞に天然であるが、その遺伝物質が野生型細胞において存在する場所とは異なる位置に存在するおよび／または（iii）非天然プロモーターおよび／または非天然ターミネーターの調節制御下にある場合、細胞に対して「外因性」である。天然遺伝物質の余分なコピーは、この明細書においては、たとえそのような余分なコピーが、遺伝物質が野生型宿主株に存在するのと同じ遺伝子座に存在していても、および／または（iv）それらが直接的にまたは選択過程によって変更されても、「外因性」とみなされる。
【００４９】
本明細書で使用される用語「制御配列」は、エンハンサー配列、ターミネーター配列およびプロモーターを包含する。本明細書で使用される「プロモーター」は、遺伝子の翻訳開始コドンの上流（すなわち、5'）に位置し、その遺伝子の転写の開始を制御する非翻訳配列（一般に、約1〜1500塩基対（bp）、好ましくは約100〜1000bp、特に約200〜1000bpの配列）を指す。プロモーターが非天然である場合、それらは、1つ以上の天然プロモーターと同一であり得るか、または高度の配列同一性（すなわち、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%）を持ち得る。他の適切なプロモーターおよびターミネーターには、例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６および特許文献７に記載のものが挙げられる。
【００５０】
本明細書で使用される用語「ターミネーター」は、遺伝子の翻訳終止コドンの下流（すなわち、3'）に位置し、その遺伝子の転写の終わりを制御する非翻訳配列（一般に、約1〜1500bp、好ましくは約100〜1000bp、特に約200〜500bpの配列）を指す。本明細書で提供される酵母細胞の1つ以上の外因性遺伝子に連結され得るターミネーターの例には、限定されないが、PDC1、XR、XDH、トランスアルドラーゼ（TAL）、トランスケトラーゼ（TKL）、リボース5-リン酸ケトールイソメラーゼ（RKI）、CYB2、またはイソ-2-シトクロムc（CYC）遺伝子またはガラクトースファミリーの遺伝子（特にGAL 10ターミネーター）のターミネーター、ならびに以下の様々な実施例に記載の任意のものが挙げられる。ターミネーターが非天然である場合、それらは、1つ以上の天然ターミネーターと同一であり得るか、または高度の配列同一性（すなわち、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%）を持ち得る。
【００５１】
プロモーターまたはターミネーターは、コード配列のそれに対するゲノム中のその位置が、そのプロモーターまたはターミネーターが場合によってはその転写制御機能を実行するようになっている場合、コード配列に「作動的に連結」されている。当業者はまた、DNA配列が、翻訳を調節するRNA配列を生じる領域を包含し得ることを理解するであろう。
【００５２】
酵素活性に関する「増加または減少」活性は、野生型株で見られる酵素活性よりも大きい活性（増加活性）を指すか、または野生型株で見られる酵素活性よりも低い活性（減少活性または減衰と呼ばれる）を指す。当業者は、活性の調節を、（i）ポリペプチド：ポリペプチド相互作用を制御することによって、（ii）ポリペプチド：代謝産物相互作用（フィードバック阻害）によって、（iii）ポリペプチド／核酸相互作用によって、（iv）アミノ酸配列を改変して酵素活性を増加させることによって、および（iiv）核酸相互作用によって達成できることを理解するであろう。
【００５３】
遺伝子に関する「欠失または破壊」は、遺伝子の全コード領域が欠失している（欠失）か、または遺伝子のコード領域、そのプロモーター、および／もしくはそのターミネーター領域が、遺伝子がもはや活性酵素を産生しないように、著しく減少した量の酵素（少なくとも75%の減少、好ましくは少なくとも85%の減少、より好ましくは少なくとも95%の減少）を産生するように、または著しく低下（少なくとも75%低下、好ましくは少なくとも85%低下、より好ましくは少なくとも95%低下）した活性の酵素を産生するように改変されている（欠失、挿入、または突然変異によるなど）ことを意味する。遺伝子の欠失または破壊は、例えば、強制進化、突然変異誘発または遺伝子工学的方法、続いて適切な選択またはスクリーニングにより所望の突然変異体を同定することによって達成できる。
【００５４】
「過剰発現」は、量を増加させた酵素の人工的な発現を意味する。酵素の過剰発現は、1つ以上の外因性遺伝子（単数または複数）の存在、内因性遺伝子の発現を増加させる遺伝子操作、または他の条件から生じ得る。本発明においては、少なくとも1つの外因性遺伝子を含む酵母細胞は、そのような外因性遺伝子（単数または複数）によってコードされる酵素（単数または複数）を過剰発現すると考えられる。
【００５５】
「組み換え微生物」は、ヒトの介入によって、前駆微生物に見られるものと同じではない配列を包含するように改変されたヌクレオチド配列を有する真核生物または原核生物の微生物である。当業者は、そのような核酸配列改変を、例えば、突然変異および選択、形質転換、交配、相同組み換えなどを含む様々な方法によって導入することができることを理解するであろう。当該技術分野で知られている任意の方法を使用して、そのような組み換え微生物を生み出すことができる。さらに、核酸配列の変化は、染色体または染色体外であり得る。
【００５６】
組み換え真核細胞は、特定の遺伝子改変を含む酵母または真菌細胞であり得る。宿主酵母または真菌細胞は、野生型株として天然に少なくとも1つの糖をピルビン酸に代謝できるものである。適切な宿主酵母細胞には、カンジダ属、ピキア属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ジゴサッカロミセス属、クルイベロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属、イサタケンキア属、ヤロウイア属およびハンゼヌラ属に分類される酵母細胞が挙げられる（しかし、これらに限定されない）。特定の宿主酵母細胞の例には、C.ソノレンシス、K.マルキシアヌス、K.サーモトレランス、C.メタンソルボサ、サッカロミセス・ブルデリ（S.ブルデリ）、I.オリエンタリス、C.ランビカ、C.ソルボキシロサ、C.ゼムプリニナ、C.ゲオカレス、P.メンブラニファシエンス、Z.コンブチャエンシス、C.ソルボシボランス、C.ヴァンデルワルティ、C.ソルボフィラ、Z.ビスポラス、Z.レンツス、サッカロミセス・バヤヌス（S.バヤヌス）、D.カステリイ、C.ボイジニイ、C.エトケルシイ、K.ラクチス、P.ジャジニイ、P.アノマラ、サッカロミセス・セレビシエ（S.セレビシエ）、ピキア・ガレイホルミス、ピキア種YB-4149（NRRL指定）、カンジダ・エタノリカ、P.デセルティコラ、P.メンブラニファシエンス、P.ファーメンタンスおよびサッカロマイコプシス・クラタエゲンシス（S.クラタエゲンシス）が挙げられる。K.マルキシアヌスおよびC.ソノレンシスの適切な株には、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１および特許文献１２に記載のものが挙げられる。I.オリエンタリスの適切な株は、ATCC株32196およびATCC株PTA-6648である。さらに、真菌には、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・オリゼ、ウスティラゴ・メイディス、ウスティラゴ・シノドンティス、または他の真菌が含まれ得る。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、野生型株としてクラブトリー陰性である。クラブトリー効果は、高い比増殖速度（長期効果）または高濃度のグルコースの存在下（短期効果）で培養した場合の微生物による酸素消費の阻害に起因する好気性条件下での発酵代謝の発生として定義される。クラブトリー陰性表現型はこの効果を示さず、したがって高濃度のグルコースの存在下または高い増殖速度でも酸素を消費することができる。
【００５８】
本明細書に記載の宿主細胞のゲノムに対する改変（挿入、欠失および／または破壊）は、当該技術分野で知られている方法を用いて実施することができる。外因性遺伝子は、例えば、よく知られている電気穿孔法および化学的方法（塩化カルシウムおよび／または酢酸リチウム法を含む）を用いて、標的化してまたは無作為にゲノムに組み込まれ得る。外因性遺伝子が標的化して組み込まれる実施形態では、外因性遺伝子の組み込みが天然遺伝子の欠失または破壊と結びつくように、それは特定の天然遺伝子座に組み込まれ得る。あるいは、外因性遺伝子は、遺伝子に相当しない天然ゲノムの一部に組み込まれ得る。酵母細胞の外因性構築物での形質転換方法は、例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献１３、特許文献１４、および特許文献１５に記載されている。外因性遺伝子の挿入は、一般に、細胞を1つ以上の組み込み構築物または断片で形質転換することによって実施される。用語「構築物」および「断片」は、本明細書において互換的に使用され、細胞を形質転換するために使用されるDNA配列を指す。構築物または断片は、例えば、環状プラスミドもしくはベクター、環状プラスミドもしくはベクターの一部（制限酵素消化産物など）、線状プラスミドもしくはベクター、またはプラスミドもしくはゲノムDNAを鋳型として使用して調製されたPCR産物であり得る。組み込み構築物は、挿入部位標的由来の2つのクローニングされた標的DNA配列を用いて組み立てることができる。2つの標的DNA配列は、天然宿主ゲノムにおいて連続的であっても非連続的であってもよい。ここでいう「非連続」は、DNA配列が天然ゲノムにおいて互いに直接隣接していないが、その代わりに欠失される領域によって分離されていることを意味する。本明細書で使用される「連続的」配列は、天然ゲノムにおいて直接互いに隣接している。標的化された組み込みが標的遺伝子の欠失または破壊と結びつく場合、組み込み構築物は欠失構築物としても機能する。そのような組み込み／欠失構築物では、標的配列の1つは、標的遺伝子のプロモーターの5'領域、プロモーター領域の全部または一部、標的遺伝子コード配列の全部または一部、またはいくつかのそれらの組み合わせを含み得る。その他の標的配列は、標的遺伝子のターミネーターの3'領域、ターミネーター領域の全部または一部、および／または標的遺伝子コード配列の全部または一部を含み得る。標的化された組み込みが天然遺伝子の欠失または破壊に結びつかない場合、標的配列は、介在配列の挿入が天然遺伝子の発現を破壊しないように選択される。2つの標的配列が、それらが宿主細胞のゲノムに天然に出現する場合と同じ方向に互いに対して配向されるように、組み込みまたは欠失構築物が調製される。遺伝子発現カセットは、2つの標的遺伝子配列間の構築物にクローニングされ、外因性遺伝子の発現を可能にする。遺伝子発現カセットは外因性遺伝子を含み、外因性遺伝子に作動的に連結されたプロモーターまたはターミネーターなどの1つ以上の調節配列をさらに含み得る。
【００５９】
欠失構築物が機能的選択マーカーカセットも含むことが通常は望ましい。単一欠失構築物が使用される場合、マーカーカセットは、標的遺伝子座からの5'配列の下流（すなわち、3'方向）および標的遺伝子座からの3'配列の上流（すなわち、5'方向）のベクター上に存在する。成功した形質転換体は、選択マーカーカセットを含み、これは、形質転換に成功した細胞に、選択の基準を与えるいくつかの特性を付与する。
【００６０】
細胞は、化合物に対して、その物質の存在下で生存可能である場合、「耐性」であるとみなされる。いくつかの例では、耐性細胞は、化合物の存在下で増殖および増加することができ得る。例えば、1つ以上の官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を産生するように操作された組み換え微生物などの宿主細胞は、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の存在下で生存可能であるならば、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸に対して耐性である。例えば、組み換え微生物は、少なくとも1%、3%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含む培地の存在下で生存可能であるならば、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸に対して耐性である。化合物に対する微生物の耐性を決定するための試験方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、特許文献１６の実施例１Ａおよび／または下記の実施例１に記載の試験方法を使用することができる。
【００６１】
同様に、1つ以上の官能基化アルファ置換アクリル酸を産生するように操作された組み換え微生物などの宿主細胞も、官能基化アルファ置換アクリル酸の存在下で生存可能であれば、官能基化アルファ置換アクリル酸に対して耐性である。例えば、組み換え微生物は、少なくとも1%、3%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の官能基化アルファ置換アクリル酸を含む培地の存在下で生存可能であるならば、官能基化アルファ置換アクリル酸に対して耐性である。化合物に対する微生物の耐性を決定するための試験方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、特許文献１６の実施例１Ａおよび／または下記の実施例１７に記載の試験方法を使用することができる。
【００６２】
「選択マーカー遺伝子」は、選択培養培地中での形質転換細胞の生存および／または増殖に必要なタンパク質をコードし得る。典型的な選択マーカー遺伝子は、（a）抗生物質または他の毒素（例えば、ゼオシン（ストレプトアロテイカス・ヒンズスタヌスbleブレオマイシン耐性遺伝子）、G418（Tn903のカナマイシン耐性遺伝子）またはハイグロマイシン（大腸菌由来のアミノグリコシド抗生物質耐性遺伝子）など）への耐性を付与する、（b）細胞の栄養要求性欠損（例えば、アミノ酸ロイシン欠損（K.マルキシアヌスLEU 2遺伝子）またはウラシル欠損（例えば、K.マルキシアヌスもしくはS.セレビシエURA3遺伝子）など）を補完する；（c）細胞が単純培地から入手できない重要な栄養素を合成することを可能にする、または（d）細胞が特定の炭素源で増殖する能力を付与する（例えば、S.セレビシエ由来のMEL5遺伝子などであって、これはアルファガラクトシダーゼ（メリビアーゼ）酵素をコードし、メリビオースを唯一の炭素源として増殖する能力を付与する）タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーには、ゼオシン耐性遺伝子、G418耐性遺伝子、MEL5遺伝子、URA3遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。別の好ましい選択マーカーは、L-ラクターゼ：宿主細胞が天然にそのような遺伝子を欠いているか、またはその天然のCYB2遺伝子（単数または複数）が最初に欠損または破壊されていれば、フェリチトクロムCオキシドレダクターゼ（CYB2）遺伝子カセットである。
【００６３】
構築物は、選択マーカーカセットが、その後の相同組み換え事象の結果として自発的に欠失し得るように設計され得る。これを達成する簡便な方法は、選択マーカー遺伝子カセットが直接反復配列に隣接するようにベクターを設計することである。直接反復配列は同一DNA配列であり、宿主細胞に天然または非天然であり、構築物上に互いに同じ方向に配向されている。直接反復配列は、有利には約50〜1500bpの長さである。直接反復配列が何かをコードする必要はない。この構築物は、相同組み換え事象が起こることを可能にする。この事象は、低頻度で起こり、選択マーカー遺伝子の欠失および直接反復配列の1つを含む細胞を生じる。形質転換体を非選択または選択培地上で数回増殖させ、いくつかの細胞において自発的相同組み換えを起こさせることが必要な場合がある。選択マーカー遺伝子によって付与された選択特性の喪失に基づいて、またはPCRもしくはサザン分析法を用いて選択マーカーの喪失を確認することにより、選択マーカー遺伝子が自発的に欠失した細胞を選択またはスクリーニングすることができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、単一断片ではなく、2つ以上の組み込み断片由来のDNAを用いて外来遺伝子が挿入され得る。これらの実施形態では、1つの組み込み断片の3'末端は、別の組み込み断片の5'末端と相同の領域を含む。断片の1つは、標的遺伝子座に対する第1の相同領域を含み、もう一方の断片は、標的遺伝子座に対する第2の相同領域を含む。挿入される遺伝子カセットは一方の断片に存在することができ、またはそれぞれの断片の3'および5'末端の相同領域で断片に分け、機能遺伝子カセット全体が交差事象の際に産生されるようにすることができる。細胞は、これらの断片で同時に形質転換される。選択マーカーは、任意の断片の1つに存在してもよく、または記載のように、相同領域で断片に分けられてもよい。他の実施形態では、3つ以上の構築物からの形質転換を同様に使用して、外因性遺伝物質を組み込むことができる。
【００６５】
天然遺伝子の欠失および／または破壊は、形質転換法、突然変異誘発および／または強制進化法によって実施することができる。突然変異誘発法では、高い細胞殺傷率（60〜99.9%、好ましくは90〜99.9%）を達成するのに十分な条件下で、細胞を紫外線または突然変異誘発物質にばく露する。次いで、生存細胞をプレーティングし、代謝活性が欠損または破壊された細胞について選択もしくはスクリーニングする。所望の天然遺伝子（単数または複数）の破壊または欠失は、PCRまたはサザン分析法によって確認することができる。
【００６６】
本発明の細胞を培養し、中間体、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸、および／または官能基化アルファ置換アクリル酸ならびにそれらの対応するエステルもしくはラクトンを、遊離酸形態または塩形態（もしくは両方）で産生することができる。組み換え細胞は、細胞によって発酵され得る少なくとも1つの炭素源を含む培地で培養される。例としては、限定されないが、スクロースなどの12炭素糖、グルコースもしくはフルクトースなどのヘキソース糖、グリカン、スターチ、またはその他のグルコースのポリマー、マルトース、マルトトリオースおよびイソマルトトリオース、パノースなどのグルコースオリゴマー、およびフルクトースオリゴマー、ならびにキシロース、キシラン、その他のキシロースのオリゴマー、またはアラビノースなどのペントース糖が挙げられる。
【００６７】
培地は、典型的には、炭素源に加えて、窒素源（アミノ酸、タンパク質、アンモニアまたはアンモニウム塩などの無機窒素源など）、および様々なビタミン、ミネラルなどを含む、特定の細胞によって必要とされる栄養素を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の細胞を、既知成分培地で培養することができる。
【００６８】
温度、細胞密度、基質（単数または複数）の選択、栄養素の選択などの他の培養条件は、本発明にとって不可欠であるとはみなされず、一般的に経済的な方法をもたらすように選択される。増殖段階および産生段階のそれぞれの間の温度は、培地の凍結温度を上回る温度から約50℃までの範囲であり得るが、これは、株の高温に耐えられる能力にある程度依存する。好ましい温度は、特に産生段階の間では、約27〜45℃である。
【００６９】
培養中、通気および撹拌条件を選択し、所望の酸素摂取速度を生じさせることができる。培養は、経路要求に応じて、好気的に、微好気的に、または嫌気的に行うことができる。いくつかの実施形態では、培養条件は、約2〜25mmol/L/時間、好ましくは約5〜20mmol/L/時間、より好ましくは約8〜15mmol/L/時間の酸素摂取速度を生じさせるように選択される。本明細書で使用される「酸素摂取速度」または「OUR」は、発酵中に酸素が消費される体積速度を指す。吸引および排出酸素濃度は、例えば質量分析計などの排気ガス分析によって測定することができる。OURは、非特許文献６の式Iに記載の直接法を使用して計算することができる。
【００７０】
培養は、炭素源での所望の生成物の収率が、例えば、理論収率の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または70%超になるまで継続してもよい。生成物の収率は、理論収率の少なくとも80%または少なくとも90%であり得る。培養で産生された生成物の濃度または力価は、収量ならびに炭素源の出発濃度の関数である。特定の実施形態では、力価は、発酵中のある時点で、好ましくは発酵の終わりに、少なくとも1、少なくとも3、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、または50g/L超に達し得る。
【００７１】
用語「変換する」は、第1中間体を第2中間体に変化させる反応における化学的手段またはポリペプチドの使用を指す。用語「化学的変換」は、ポリペプチドによって活発に促進されない反応を指す。用語「生物学的変換」は、ポリペプチドによって活発に促進される反応を指す。変換はin vivoまたはin vitroで行うことができる。生物学的変換を使用する場合、ポリペプチドおよび／または細胞を、ポリマー支持体上の化学的付着などによって支持体上に固定することができる。変換は、当業者に知られている任意の反応器、例えばバッチ式または連続式反応器を用いて達成することができる。
【００７２】
第1ポリペプチドを基質と接触させて第1生成物を生成する工程と、次いで生成した第1生成物を第2ポリペプチドと接触させて第2生成物を生成する工程と、次いで生成した第2生成物を第3ポリペプチドと接触させて第3生成物を生成する工程などを含む方法も提供される。中間体を、経路中の次の生成物または次の中間体に変換するために使用されるポリペプチドは、図４（図３、９および１０に示される変換に使用され得る酵素を記載する）ならびに図６（図５に示される変換に使用され得る酵素を記載する）ならびに図１２、１４、１６、および１８に記載されている。
【００７３】
用語「塩」は、化合物の任意のイオン形態および1つ以上の対イオン種（カチオンおよび／またはアニオン）を含む。塩は、双性イオン化合物（すなわち、1つ以上のカチオン種およびアニオン種を含む分子、例えば双性イオンアミノ酸）も含む。塩中に存在する対イオンは、任意のカチオン性、アニオン性、または双性イオン種を含むことができる。例示的なアニオンには、限定されないが、以下が挙げられる：塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸、硫酸、重硫酸、亜硫酸、重亜硫酸、リン酸、酸性リン酸、過塩素酸、塩素酸、亜塩素酸、次亜塩素酸、過ヨウ素酸、ヨウ素酸、亜ヨウ素酸、次亜ヨウ素酸、炭酸、重炭酸、イソニコチン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、サリチル酸、クエン酸、酒石酸、パントテン酸、重酒石酸、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ゲンチシン酸、フマル酸、グルコン酸、グルカロン酸、サッカリン酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、トリフルオルメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、p-トリフルオロメチルベンゼンスルホン酸、水酸化物、アルミン酸およびホウ酸。典型的なカチオンには、限定されないが、以下が挙げられる：リチウム、ナトリウム、カリウム、およびセシウムなどの一価アルカリ金属カチオン、ならびにベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、およびバリウムなどの二価アルカリ土類金属。また、金、銀、銅および亜鉛などの遷移金属カチオン、ならびにアンモニウム塩などの非金属カチオンも含まれる。当業者は、完全な生物学的経路を使用して化合物を産生する場合、化合物のpKaおよび培地のpHに応じて、化合物は実質的に酸形態または塩形態となることを理解するであろう。
【００７４】
本明細書で使用される「エステル」は、非限定的な例として、メチルエステル、エチルエステル、およびイソプロピルエステル、ならびに対応するカルボキシル部位上の保護基の付加から生じるエステルを含む。
【００７５】
本明細書で使用される「ラクトン」は、本明細書で提供される化合物上のアルコール基とカルボン酸基との縮合から生じる環状エステル化合物を指す。非限定的な例は、ホモクエン酸、またはその塩の縮合から生じるラクトン（すなわち、ホモクエン酸ラクトン）である。
【００７６】
本明細書で使用される、太線および破線の結合
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で描かれた1つ以上の立体中心を含む化学構造は、化学構造中に存在する立体中心（単数または複数）の絶対立体化学を示すことを意味する。本明細書で使用される、単純な線で象徴される結合は、立体優先を示すものではない。反対に別段に示されない限り、絶対立体配置または相対立体配置を示さずに本明細書に例示される1つ以上の立体中心を含む化学構造は、化合物の全ての可能な立体異性体（例えば、ジアステレオマー、エナンチオマー）およびそれらの混合物を包含する。単一の太線または破線、および少なくとも1つの追加の単純な線を有する構造は、全ての可能なジアステレオマーの単一のエナンチオマー系を包含する。
【００７７】
本明細書に記載の化合物は、中間体または最終化合物中に存在する原子の全ての同位体も含み得る。同位体には、原子番号は同じであるが質量数が異なる原子が挙げられる。例えば、水素の同位体には、三重水素および重水素が含まれる。
【００７８】
本明細書で使用される用語「化合物」は、描写された構造の全ての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むことを意味する。名称または構造により1つの特定の互変異性体形態として同定される本明細書の化合物は、他に特定しない限り、他の互変異性体形態を含むことが意図される。全ての化合物、それらの塩、エステルおよびラクトンは、水および溶媒（例えば、水和物および溶媒和物）などの他の物質と共に見られ得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物、またはそれらの塩、エステル、もしくはラクトンは、実質的に単離される。「実質的に単離される」とは、化合物が、形成または検出された環境から少なくとも部分的にまたは実質的に分離されることを意味する。部分的分離は、例えば、本発明の化合物に富む組成物を挙げることができる。実質的な分離には、少なくとも約50重量%、少なくとも約60重量%、少なくとも約70重量%、少なくとも約80重量%、少なくとも約90重量%、少なくとも約95重量%、少なくとも約97%、または少なくとも約99重量%の本発明の化合物、またはそれらの塩を含む組成物を挙げることができる。化合物およびそれらの塩の単離方法は、当該技術分野において型にはまったものである。
【００８０】
別々の実施形態の文脈で説明される本開示の特定の特徴は、明確にするために、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴も、簡潔にするために、別々にまたは任意の適切な部分的組み合わせで提供され得る。
【００８１】
用語「例えば」および「などの」ならびにそれらの文法上の等価物に関して、「およびこれらに限定されない」という句は、別段に明示的に述べられていない限り、以下のように理解される。本明細書で使用される用語「約」は、実験誤差による変動を説明することを意味する。本明細書に報告される全ての測定値は、用語が明示的に使用されているか否かにかかわらず、別段に明示的に述べられていない限り、用語「約」によって修飾されると理解される。本明細書で使用される単数形（「a」、「an」および「the」）は、文脈が別段に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００８２】
I.操作された経路
本明細書中に記載の組み換え微生物は、それらが非天然量の図２に示される官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を生成することを可能にする酵素活性を提示する。いくつかの例では、組み換え微生物は、1種類より多くのアルファ置換ジカルボン酸、図２（ａ）、図２（ｂ）、および図２（ｃ）に示されているようなものなどを産生する。語句「非天然」量は、本明細書に記載の組み換え微生物が、組み換え核酸配列を導入するための出発点として使用された出発宿主細胞と比較して、より高濃度のアルファ置換C4ジカルボン酸を産生するという事実を指す。
【００８３】
本明細書に記載の組み換え微生物は、それらが非天然量の官能基化アルファ置換アクリル酸／または塩およびその対応するエステルもしくはラクトンを生成することを可能にする酵素活性を提示する。いくつかの例では、組み換え微生物は、1種類より多くのアルファ置換アクリル酸を産生する。語句「非天然」量は、本明細書に記載の組み換え微生物が、組み換え核酸配列を導入するための出発点として使用された出発宿主細胞と比較して、より高濃度のアルファ置換アクリル酸を産生するという事実を指す。
【００８４】
本明細書で使用される用語「官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸」は、アルファ官能基化ジカルボン酸中のカルボン酸に対してアルファである炭素が、少なくとも4つの非水素原子との結合を含むという事実を指す。例えば、図２（ａ）に関しては、アルファ官能基化リンゴ酸が示されており、カルボン酸由来のアルファ炭素は、以下の結合、-COOH、-CH2-、-OR4、および-[n]R1を含む。対照的に、非官能基化リンゴ酸は、以下の結合、-COOH、-CH2-、-Hおよび-OHを含むアルファ炭素を有することになる。官能基化された基である-[n]R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>2の場合に選択される任意の基、ならびに図７および８に示されるものであり得る。別の例では、図２（ｂ）および図２（ｃ）に関しては、アルファ官能基化マレイン酸（シス）またはアルファ官能基化フマル酸（トランス）がそれぞれ示されており、カルボン酸由来のアルファ炭素は、以下の結合、-COOH、=CH-、および-[n]R1を含む。対照的に、非官能基化マレイン酸またはフマル酸は、以下の結合、-COOH、=CH-、および-Hを含むアルファ炭素を有することになる。官能基化された基である-[n]R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>2の場合に選択される任意の基、ならびに図７および８に示されるものであり得る。当業者は、有機酸への言及が、文脈が別段に明確に指示しない限り、酸、ならびにその塩または対応するエステルおよび保護基を含むと理解されることを認識するであろう。例えば、図２（ａ）、２（ｂ）、および２（ｃ）は、R2およびR3を使用してこれらの可能性を示唆する。さらに、当業者は、より一般的には、ヒドロキシルが存在する場合、アルコールへの言及が、保護基を有するアルコールへの言及も含むことを理解するであろう。
【００８５】
本明細書で使用される用語「官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸（3HP）」は、官能基化アルファ置換3HP中のカルボン酸に対してアルファである炭素が、少なくとも3つの非水素原子との結合を含むという事実を指す。例えば、図２（ｄ）に関しては、官能基化アルファ置換3HPが示されており、カルボン酸由来のアルファ炭素は、以下の結合、-COOH、-CH2OH、-Hおよび-[n]R1を含む。対照的に、非官能基化3HPは、以下の結合、-COOH、-CH2OH、-H、および-Hを含むアルファ炭素を有することになる。官能基化された基である-[n]R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>2の場合に選択される任意の基、ならびに図７および８に示されるものであり得る。前述と同様に、有機酸への言及は、文脈が別段に明確に指示しない限り、酸、ならびにその塩または対応するエステルおよび保護基を含むと理解される。官能基化アルファ置換3HPの場合、第3の炭素上のヒドロキシル基への言及は、保護基が存在する場合も含むと理解されるものとする。
【００８６】
本明細書で使用される用語「官能基化アルファ置換アクリル酸」は、官能基化アルファ置換アクリル酸中のメチレン基に対してアルファである炭素が、4つの非水素原子との結合を含むという事実を指す。例えば、図１に関しては、官能基化アルファ置換アクリレートが示されており、メチレン基由来のアルファ炭素は、以下の結合、-COOH、=CH2、および-[n]R1を含む。対照的に、非官能基化アルファ置換アクリル酸は、以下の結合、COOH、=CH2、および-Hを含むアルファ炭素を有することになる。官能基化された基である-[n]R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>2の場合に選択される任意の基、ならびに図７および８に示されるものであり得る。前述と同様に、有機酸への言及は、文脈が別段に明確に指示しない限り、酸、ならびにその塩または対応するエステルおよび保護基を含むと理解される。図１から明らかなように、R2は保護基であってもよく、R1が酸性部位またはヒドロキシルを含む場合、R2は追加的に塩または保護基を含み得ると理解される。
【００８７】
代謝工学の当業者は、本明細書に提供される図が、同じ官能基化アルファ置換アクリレート、ジカルボン酸およびそれらの中間体を得るために使用され得る複数の異なる経路を表すことを理解するであろう。これらの経路は、内因性酵素活性に依存する酵素段階を含むことができ、例えば図３の工程Aに関して、宿主細胞が大腸菌細胞である場合、最初のトランスアミナーゼ段階は、内因性大腸菌トランスアミナーゼ（genbank番号CAA27279）に依存し得る。同様に、内因性遺伝子の活性を組み換え技術によって変化させ、宿主細胞における内因性トランスアミナーゼ活性を増加または減少させることができる。
【００８８】
図３、５、９、および１０は、官能基化アルファ置換ジカルボン酸および官能基化アルファ置換3HPなどの中間体および最終生成物を産生する経路を示す。例えば、ある中間体から別の中間体への変換、例えばアミノ酸からアルファケト酸、アルファケト酸からアルファ置換リンゴ酸、およびアルファ置換リンゴ酸からアルファ置換マレイン酸、アルファ置換マレイン酸からベータ置換リンゴ酸、ベータ置換リンゴ酸からベータ置換オキサロ酢酸、ベータ置換オキサロ酢酸から置換マロン酸セミアルデヒド、置換マロン酸セミアルデヒドからアルファ置換3HP、アルファ置換マレイン酸からアルファ置換フマル酸、およびベータ置換リンゴ酸からアルファケト酸。これらの変換は、化学的または生物学的に促進することができる。
【００８９】
図１１、１３、１５、１７および１９は、図３、５、９および１０に関して上述したような中間体および最終生成物を産生する経路を示す。しかしながら、図１１、１３、１５、１７および１９は、官能基化アルファ置換アクリル酸ならびにその塩、エステルおよびラクトンを生成するのに有用な完全な生物学的代謝経路も示す。関連する図において特定された変換は、化学的または生物学的に促進することができる。
【００９０】
例えば、図１５は、アルファヒドロキシメチルアクリル酸を生成するための完全なまたは部分的な生物学的経路を示す。この経路を、3-ヒドロキシプロピオン酸を生成するように設計されているか、または天然に生成する任意の宿主内に操作することができる。図１６の行GおよびAにそれぞれ記載の酵素活性を有するポリペプチドを用いて、3HPをヒドロキシメチルマロン酸および／または3-ヒドロキシプロピオニル-CoAに変換することができる。図１６の行HおよびBにそれぞれ記載の酵素活性を有するポリペプチドを用いて、ヒドロキシメチルマロン酸および／または3-ヒドロキシプロピオニル-CoAをヒドロキシメチルマロニル-CoAに変換することができる。図１６の行Iに記載の酵素活性を有するポリペプチドを用いて、ヒドロキシメチルマロニル-CoAをヒドロキシメチルマロン酸セミアルデヒドに変換することができる。
【００９１】
図１６の行Cに記載の活性を有するポリペプチドを用いて、ヒドロキシメチルマロン酸セミアルデヒドを2-ホルミル3HP-CoAに変換することができる。図１６の行Dに記載の活性を有するポリペプチドを用いて、2-ホルミル3HP-CoAを2-ヒドロキシメチル3HP-CoAに変換することができる。図１６の行Eに記載の活性を有するポリペプチドを用いて、2-ヒドロキシメチル3HP-CoAをアルファヒドロキシメチルアクリル酸に変換することができる。図１６の行Fに記載の活性を有するポリペプチドを用いて、アルファヒドロキシメチルアクリリル酸をアルファヒドロキシメチルアクリル酸に変換することができる。
【００９２】
図１６の行Jに記載の活性を有するポリペプチドを用いて、ヒドロキシメチルマロン酸セミアルデヒドを2-(ヒドロキシメチル)3HPに変換することができる。図１６の行KおよびLにそれぞれ記載の活性を有するポリペプチド（単数または複数）を用いて、ポリペプチドを用いて、2-ヒドロキシメチル3HPをアルファヒドロキシメチルアクリル酸および／または2-ヒドロキシメチル3HP-CoAに変換することができる。2-ヒドロキシメチル3HP-CoAは、アルファ置換アクリル酸への上記経路に従うことができる。図１６の行Kに記載の活性を有する酵素を用いて、2-(ヒドロキシメチル)-3HPのアルファヒドロキシメチルアクリル酸への変換を達成することができる。
【００９３】
一代替形態では、2-(ヒドロキシメチル)-3HPを単離し、例えば、図１５の工程Kが化学的脱水工程である化学的脱水により、アルファヒドロキシメチルアクリル酸に変換する。
【００９４】
同様に、図１９は、アルファ置換アクリル酸またはその中間体を生成する完全なまたは部分的な生物学的経路を示す。例えば、工程A〜Lは、図１６に示す通りである。一代替形態では、中間体アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を単離し、例えば、図１９の工程Kが化学的脱水工程を指す化学的脱水により、アルファ置換アクリル酸に変換する。
【００９５】
当業者は、図面および本明細書の他の箇所で特定された酵素（本明細書で使用される酵素は、活性を有するポリペプチドと互換的に呼ばれる）が例示的な酵素であり、それらの活性および基質特異性が容易に試験および改変され得ることを理解するであろう。さらに、同じ活性を有する新たな酵素は将来特定されることになり、そのような将来発見される酵素を記載の経路に使用することができる。
【００９６】
いくつかの例では、ポリペプチドの基質特異性および／または活性の改変を可能にする1つ以上の点突然変異を有するポリペプチドを使用して、中間体および生成物を生成する。
【００９７】
図３に関して明確にするために、1つ以上の官能基化アルファ置換ジカルボン酸およびアルファ置換3HP分子を生じさせることができる複数の経路を示す。これらの経路は、特定の所望の生成物に応じて変化する。明確にするために、図９および１０は、特定の生成物を生成するための経路の使用を図解する構造および酵素を提供する。
【００９８】
図９は、アルファ(ヒドロキシメチル)ジカルボン酸を、セリン、3-ホスホヒドロキシピルビン酸またはイタコン酸から出発して生成するために使用できる経路を示す。図９はまた、どのようにスペーサー経路（図３を参照）を使用して炭素をアルファ(ヒドロキシメチル)マレイン酸由来のアルファ官能基に加え、アルファ(ヒドロキシエチル)マレイン酸および／またはアルファ(ヒドロキシエチル)フマル酸を産生することができるかの一例を提供する。
【００９９】
同様に、図１０は、アルファ(2-ヒドロキシプロピル)ジカルボン酸およびアルファ(2-ヒドロキシプロピル)3HPを、ホモトレオニン、トレオニンから出発して、追加のスペーサー経路工程またはピルビン酸を介して産生するために使用され得る経路を示す。
【０１００】
当業者は、官能基化アルファ置換ジカルボン酸および3HPの混合物を組み換え微生物によって産生することができることと、混合物を官能基化アルファ置換アクリレートに化学的に変換することができることを理解するであろう。官能基化アルファ置換アクリレートはその後に続いて、図３、９および１０に示されるように、エステルまたはラクトンに化学的にまたは酵素的に変換することができる。これらの変換に関与する酵素を、図４の行HおよびGに示す。
【０１０１】
様々な異なる炭素源を使用して、本明細書に記載の組み換え微生物を生み出すために選択される株に応じて所望の生成物を生成することができる。例えば、所望の経路の導入時に生成物を特定の炭素源から産生することができるように、有機酸、糖アルコール、および／またはセルロースを天然に利用することができる宿主株を使用することができる。使用され得る様々な異なる炭素源は、図３に示す複数の積み重ねた矢印によって示される。当業者は、様々な異なる酵素活性が組み換え微生物によって利用される必要があることと、特定の活性が必要とされるかどうかは、使用される炭水化物の供給源に依存することを矢印は示していることを理解するであろう。さらに、組み換え微生物を操作し、組み換え微生物内に既知酵素活性を操作することによって特定の炭素源を利用することができる。例えば、生成物をキシロースから産生することが望ましい場合、特許文献１７に記載の酵素活性を組み換え微生物に導入することができる。同様に、メタン、メタノール、グルコース、酢酸、ならびに他の有機分子は、組み換え微生物により、特異的輸送体の導入および他の酵素活性を介して使用され得る。
【０１０２】
本明細書に記載の生合成経路を、経路内で中間体を天然に過剰生成する宿主生物、または過剰生成するように既に操作された宿主生物内に操作することができる。例えば、高濃度のピルビン酸、イタコン酸、またはアミノ酸を既に産生している宿主細胞を、1つ以上の組み換え核酸配列を組み込む組み換え宿主細胞として使用するために選択し、所望の官能基化アルファ置換ジカルボン酸および官能基化アルファ置換3HPを産生することができる。例えば、以下のアミノ酸の力価は、様々な発酵によって既に得られている。
表B.アミノ酸発酵の最高力価*
【表１】
2018526969.tif 000015
【０１０３】
当業者は、組み換え微生物の増殖を支えるために発酵ブロス中で使用される炭素源（単数または複数）にかかわらず、経済的現実としては、その炭素源（単数または複数）からの炭素利用を最大限に高めることが生成物産生のために望まれることを理解するであろう。一般的に、これは、野生型宿主株に天然にある望ましくない生合成経路を減衰させるかまたは完全に破壊することによって行われる。操作された経路は、宿主細胞中に通常見られる基質に対する酵素活性のレベルを上昇させるため、所望の経路は炭素流を分流するように操作される。例えば、組み換え微生物は、アルファケトグルタル酸か、あるいはアミノ酸の活性の増加を提示し得る。次いで、当業者は、どの経路が、中心代謝上流、または操作された経路の分岐点前からの炭素の分流を引き起こすかを検討することができる。より多くの炭素が所望の生成物に流入するように、これらの分流経路をその後減衰させるまたはノックアウトすることができる。減衰またはノックアウトされ得る経路の例には、エタノール、酢酸、グリセロールなどの産物への経路が挙げられる（特許文献１８の実施例を参照）。減衰され得る活性のより具体的な例には、以下の酵素に関連するものが含まれる：ピルビン酸オキシダーゼ（poxB）、ピルビン酸-ギ酸リアーゼ（pflB）、ホスホトランスアセチラーゼ（pta）、酢酸キナーゼ（ackA）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldB）、アルコールデヒドロゲナーゼ（adhE）、アルコールデヒドロゲナーゼ（adhP）、メチルグリオキサールシンターゼ（mgsA）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（ldhA）。これらの酵素の減衰ならびに官能基化アルファ置換ジカルボン酸および官能基化3-ヒドロキシプロピオン酸の生成物を増加させるために使用され得る他の方法は、特許文献１９に記載されている。Man Kit Lauの特許文献１９は、ケト酸、アルファケトアジピン酸をアルファケトピメリン酸に伸長させる、図３に示すスペーサー経路の使用も説明している。この同じ経路を使用し、官能基化アルファ置換ジカルボン酸を伸長させることができる（特許文献１９は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０４】
商業的に実現可能な生合成経路の設計は、消費される炭素源と比較して十分な収率の生成物を有する必要があり、また、生成物をバランスよく産生することができる必要がある。すなわち、組み換え微生物によって消費され産生される生成物および補因子全体が、宿主細胞の生成物を産生する能力に負担をかけることになる正味の剰余分または欠損を引き起こさない必要がある。例えば、経路全体がアセチルCoAを消費する場合、追加のアセチルCoA供給源を経路内に操作する必要があり得る。あるいは、過剰の特定の副生成物、例えばH2O2が生じる場合、副生成物を輸送するための、または副生成物を消費するための適切な機構が経路に含まれる必要がある。
【０１０５】
II.化学触媒
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、その範囲を限定することを意図しない。全ての部およびパーセンテージは、別段に指示がない限り重量による。
【０１０６】
本明細書で提供される方法は、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の、官能基化アクリル酸および官能基化アルファ置換C4有機酸の誘導体への変換に関する（上記表Aを参照）。例えば、官能基化アクリル酸の調製は、スキーム1に示される通りであり得る。
【化１３】
2018526969.tif 000016
式中、化合物の各々は、それらの塩またはエステルとして存在してもよい。
【０１０７】
したがって、官能基化アクリル酸、またはその塩もしくはエステルの製造方法が本明細書で提供され、本方法は官能基化アルファ置換C4酸、またはその塩、エステル、もしくはラクトンを金属触媒と接触させる工程を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、式Iの化合物：
【化１４】
2018526969.tif 000017
またはその塩の製造方法であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である。
本方法は、金属触媒を、式II、III、IVの化合物：
【化１５】
2018526969.tif 000018
またはそれらの塩を含む組成物と接触させる工程を含み、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにその保護基から選択され、R2、R3、R4は個別にHおよび保護基から選択され、nは1より大きい。
【０１０９】
スキーム1に示されるように、式Iの化合物、またはその塩は、いくつかの実施形態において、式II、III、またはIVの化合物のベータカルボキシレートの選択的脱炭酸により式Iの化合物、またはその塩を調製する工程を含む方法によって調製することができると考えられる。
【０１１０】
本開示は、官能基化アクリル酸、またはその塩もしくはエステルの製造方法であって、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を金属触媒と接触させる工程を含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、式Iの化合物、またはその塩の製造方法は、金属触媒を、式II、III、IVの化合物、またはそれらの塩を含む組成物と接触させる工程を含む。例えば、式Iの化合物、またはその塩の製造方法は、式II、III、IVの化合物を選択的脱炭酸して式Iの化合物、またはその塩を生成する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような方法は、単一の反応容器内で金属触媒の存在下で実施される。
【０１１１】
上記の表Aに描写されている化合物、またはそれらの塩もしくはエステルの製造方法も本明細書で提供される。本方法は、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸、またはその塩、エステル、もしくはラクトンを金属触媒と接触させる工程を含み得る。いくつかの実施形態では、以下から選択される化合物：
【化１６】
2018526969.tif 000019
またはそれらの塩の製造方法であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である方法。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、上記表Aに描写されている化合物、またはそれらの塩の製造方法は、式II、III、IVの化合物を選択的脱炭酸して式Iの化合物、またはその塩を生成する工程を含み得る。
【０１１３】
さらなる実施形態では、以下の式のアルファ置換アクリル酸：
【化１７】
2018526969.tif 000020
またはその塩もしくはエステルの製造方法であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり；
本方法は、アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を脱水してアルファ置換アクリル酸を産生する工程を含み、ここで、アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸は以下の式：
【化１８】
2018526969.tif 000021
またはその塩であって、
式中：
各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上である。例えば、3-ヒドロキシプロピオン酸は、本明細書で定めた組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と；アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸またはそのエステルもしくは塩を分離する工程とを含む方法によって産生される。
【０１１４】
本明細書で提供される方法を使用して、本明細書に記載の1つ以上の化合物を調製することができる。例えば、本明細書に記載の方法を用いて、表Aに描写されている化合物、またはそれらの塩もしくはエステルからなる群より選択される2つ以上の化合物を含む組成物を調製することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸、またはその塩、エステル、もしくはラクトンを金属触媒と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、表Aに示される化合物：またはそれらの塩からなる群より選択される2つ以上の化合物を含む組成物の製造方法が提供され、式中：各R1は、アルキル（メチルよりも長い）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、本方法は、金属触媒を、式II、III、IVの化合物、またはそれらの塩を含む組成物と接触させる工程を含む。当業者は、いくつかの官能基が触媒添加に敏感であり得ることを認識するであろう。R1などで、保護基の導入が必要な場合がある。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、式Iの化合物および表Aに描写されている1つ以上の化合物、またはそれらの塩を含む組成物の製造方法は、式II、III、またはIVの化合物のベータカルボキシレートの選択的脱炭酸を含み得る。
【０１１６】
上記の化合物（すなわち、式I、II、III、IVの化合物）では、保護基について言及されている。いくつかの実施形態では、カルボキシル基は保護されていてもよい（例えば、R1、R2、およびR3について）。この目的のために、R2、R3、およびR4は、限定されないが、エステル、アミド、またはヒドラジン保護基を含む任意の適切なカルボキシル保護基を含み得る。保護基の各出現は、同じでも異なっていてもよい。
【０１１７】
特に、エステル保護基としては、メチル、メトキシメチル（MOM）、ベンジルオキシメチル（BOM）、メトキシエトキシメチル（MEM）、2-(トリメチルシリル)エトキシメチル（SEM）、メチルチオメチル（MTM）、フェニルチオメチル（PTM）、アジドメチル、シアノメチル、2,2-ジクロロ-1,1-ジフルオロエチル、2-クロロエチル、2-ブロモエチル、テトラヒドロピラニル（THP）、1-エトキシエチル（EE）、フェナシル、4-ブロモフェナシル、シクロプロピルメチル、アリル、プロパルギル、イソプロピル、シクロヘキシル、t-ブチル、ベンジル、2,6-ジメチルベンジル、4-メトキシベンジル（MPM-OAr）、o-ニトロベンジル、2,6-ジクロロベンジル、3,4-ジクロロベンジル、4-(ジメチルアミノ)カルボニルベンジル、4-メチルスルフィニルベンジル（Msib）、9-アントリルメチル、4-ピコリル、ヘプタフルオロ-p-トリル、テトラフルオロ-4-ピリジル、トリメチルシリル（TMS）、t-ブチルジメチルシリル（TBDMS）、t-ブチルジフェニルシリル（TBDPS）、およびトリイソプロピルシリル（TIPS）保護基が挙げられ得る。
【０１１８】
アミドおよびヒドラジン保護基としては、N,N-ジメチルアミド、N-7-ニトロインドイルアミド、ヒドラジド、N-フェニルヒドラジド、およびN,N'-ジイソプロピルヒドラジドが挙げられ得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ヒドロキシル基は保護されていてもよい（例えば、R1またはR4について）。この目的のために、R4は、限定されないが、エーテル、エステル、炭酸またはスルホン酸保護基を含む任意の適切なヒドロキシル保護基を含み得る。保護基の各出現は、同じでも異なっていてもよい。
【０１２０】
特に、エーテル保護基としては、メチル、メトキシメチル（MOM）、ベンジルオキシメチル（BOM）、メトキシエトキシメチル（MEM）、2-(トリメチルシリル)エトキシメチル（SEM）、メチルチオメチル（MTM）、フェニルチオメチル（PTM）、アジドメチル、シアノメチル、2,2-ジクロロ-1,1-ジフルオロエチル、2-クロロエチル、2-ブロモエチル、テトラヒドロピラニル（THP）、1-エトキシエチル（EE）、フェナシル、4-ブロモフェナシル、シクロプロピルメチル、アリル、プロパルギル、イソプロピル、シクロヘキシル、t-ブチル、ベンジル、2,6-ジメチルベンジル、4-メトキシベンジル（MPM-OAr）、o-ニトロベンジル、2,6-ジクロロベンジル、3,4-ジクロロベンジル、4-(ジメチルアミノ)カルボニルベンジル、4-メチルスルフィニルベンジル（Msib）、9-アントリルメチル、4-ピコリル、ヘプタフルオロ-p-トリル、テトラフルオロ-4-ピリジル、トリメチルシリル（TMS）、t-ブチルジメチルシリル（TBDMS）、t-ブチルジフェニルシリル（TBDPS）、およびトリイソプロピルシリル（TIPS）保護基が挙げられ得る。
【０１２１】
エステル保護基としては、アセトキシ（OAc）、ギ酸アリール、酢酸アリール、レブリン酸アリール、ピバロ酸アリール、安息香酸アリール、および9-フルオロエンカルボン酸アリールが挙げられ得る。一実施形態では、エステル保護基はアセトキシ基である。
【０１２２】
炭酸保護基としては、アリールメチルカーボネート、1-アダマンチルカーボネート（Adoc-OAr）、t-ブチルカーボネート（BOC-OAr）、4-メチルスルフィニルベンジルカーボネート（Msz-OAr）、2,4-ジメチルペント-3-イルカーボネート（Doc-OAr）、アリール2,2,2-トリクロロエチルカーボネート、アリールビニルカーボネート、アリールベンジルカーボネート、およびアリールカルバメートが挙げられ得る。
【０１２３】
スルホン酸保護基としては、アリールメタンスルホネート、アリールトルエンスルホネート、およびアリール2-ホルミルベンゼンスルホネートが挙げられ得る。
【０１２４】
本明細書に記載の化合物の調製は、様々な化学基の保護および脱保護を伴い得る。保護および脱保護の必要性、ならびに適切な保護基の選択は、当業者によって容易に決定され得る。保護基の化学は、例えば、非特許文献８；非特許文献９；および非特許文献１０（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において見られる。
【０１２５】
上記方法では、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸、またはその塩、エステル、もしくはラクトンを、当業者に知られている方法によって得てもよい。例えば、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸、またはその塩、エステル、もしくはラクトンは、商業的に入手され得るか、または合成的に産生され得る。いくつかの実施形態では、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸、またはその塩、エステル、もしくはラクトンは、BioAmber社に譲渡され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる特許文献２０に記載されているような発酵方法を用いて調製され得る。
【０１２６】
本明細書で使用される金属触媒には、任意の適切な金属触媒を挙げることができる。例えば、適切な金属触媒には、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸、またはその塩、エステル、もしくはラクトンの、1つ以上の官能基化アクリル酸、その塩、エステルまたはラクトンへの変換を促進できるものが挙げられるであろう。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本方法に適した金属触媒は、不均一（または固体）触媒である。金属触媒（例えば、不均一系触媒）を、少なくとも1つの触媒担体上に担持することができる（本明細書では「担持金属触媒」と称する）。使用される場合、金属触媒用の少なくとも1つの担体は、反応条件下で不活性である任意の固体物質であってよく、限定されないが、シリカ、アルミナおよびチタニアなどの酸化物、それらの化合物またはそれらの組み合せ；硫酸バリウム；ジルコニア；炭素（例えば、酸洗浄された炭素）；およびそれらの組み合わせが挙げられる。酸洗浄された炭素は、硝酸、硫酸または酢酸などの酸で洗浄され、不純物が除去されている炭素である。担体は、粉末、顆粒、ペレットなどの形態であり得る。噴霧、浸漬または物理的混合、その後の乾燥、か焼、ならびに必要に応じて、加熱、還元および／または酸化などの方法による活性化などの当業者によく知られている任意の数の方法により金属触媒を担体上に堆積させることによって、担持金属触媒を調製することができる。いくつかの実施形態では、水素ガスの存在下で触媒の活性化を実施することができる。例えば、水素流または圧力（例えば、約200psiの水素圧）の下で活性化を実施することができる。いくつかの実施形態では、金属触媒は、約100℃〜約500℃（例えば、約100℃〜約500℃）の温度で活性化される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、少なくとも1つの金属触媒の少なくとも1つの担体への充填は、少なくとも1つの酸触媒と少なくとも1つの担体との合計重量に基づいて約0.1重量%〜約20重量%である。例えば、少なくとも1つの金属触媒の少なくとも1つの担体への充填は、約5重量%であり得る。
【０１２９】
金属触媒には、ニッケル、パラジウム、白金、銅、亜鉛、ロジウム、ルテニウム、ビスマス、鉄、コバルト、オスミウム、イリジウム、バナジウム、および2つ以上のそれらの組合せから選択される金属を挙げることができる。いくつかの実施形態では、金属触媒は、銅または白金を含む。例えば、金属触媒は白金を含むことができる。
【０１３０】
化学促進剤を使用して触媒の活性を増大させることができる。触媒成分の化学的処理における任意の工程の間に、促進剤を触媒に組み込むことができる。化学促進剤は一般に、触媒剤の物理的または化学的機能を高めるが、望ましくない副反応を遅らせるために添加することもできる。適切な促進剤は、例えば、硫黄（例えば、硫化物）およびリン（例えば、リン酸）を含む。いくつかの実施形態では、促進剤は硫黄を含む。
【０１３１】
本明細書に記載の適切な金属触媒の非限定的な例を表Cに示す。
表C.
【表２−１】
2018526969.tif 000022
【表２−２】
2018526969.tif 000023
【表２−３】
2018526969.tif 000024
【表２−４】
2018526969.tif 000025
【０１３２】
温度、溶媒、触媒、反応器構成、圧力および混合速度全てが、本明細書に記載の変換に影響を及ぼす可能性があるパラメーターである。これらのパラメーター間の関係は、本方法の反応における所望の変換、反応速度、および選択性をもたらすように調節されてもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約25℃〜約350℃の温度で実施される。例えば、本方法は、少なくとも約100℃の温度で実施することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約100℃〜約200℃の温度で実施される。例えば、本方法を約150℃〜約180℃の温度で実施することができる。
【０１３４】
本明細書に記載の方法は、そのままで、水中で、または有機溶媒の存在下で実施され得る。いくつかの実施形態では、反応溶媒は水を含む。典型的な有機溶媒には、炭化水素、エーテル、およびアルコールが挙げられる。いくつかの実施形態では、アルコール、例えば、メタノールおよびエタノールなどの低級アルカノールを使用することができる。反応溶媒は、2つ以上の溶媒の混合物であってもよい。例えば、溶媒は、水とアルコールとの混合物であってもよい。
【０１３５】
本明細書で提供される方法は、不活性雰囲気下（例えば、N2およびAr）で実施することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は窒素下で実施される。例えば、本方法は、約20psi〜約1000psiの窒素圧力下で実施することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、約200psiの窒素圧力下で実施される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、追加の反応物を本明細書に記載の方法に加えることができる。例えば、NaOHなどの塩基を反応に添加することができる。
【０１３７】
反応は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法に従ってモニターすることができる。例えば、生成物の形成は、核磁気共鳴分光法（例えば、1Hまたは13C）、赤外分光法、分光光度法（例えばUV-可視）、質量分析法などの分光学的手段によって、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、液体クロマトグラフィー-質量分析（LCMS）もしくは薄層クロマトグラフィー（TLC）などのクロマトグラフィー法によってモニターすることができる。化合物は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１１）および順相シリカクロマトグラフィーを含む様々な方法によって当業者により精製することができる。
【実施例】
【０１３８】
（実施例１-中間体に耐性のある細胞。）
アルファ置換C4ジカルボン酸への記載経路の潜在的な宿主を、図２に示すように、官能基化アルファ置換ジカルボン酸に対する耐性を決定することによって特定した。特定の官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸化合物を選択し、細菌および真核生物宿主の耐性を評価した。
【０１３９】
2つの真核生物株、I.オリエンタリスおよびS.セレビシエを、pH3およびpH5で試験した。3つの細菌株を、それらの個々の最適条件を用いて試験した。大腸菌およびC.グルタミカムをpH8および30℃で試験し、B.フィルムスをpH9および37℃で試験した。I.オリエンタリスを、5g/L硫酸アンモニウム、0.5g/L硫酸マグネシウム七水和物、3g/L第一リン酸カリウム、10g/Lデキストロース、1mL/Lの10%グリセロールストック、1mL/Lの1000倍トレースからなる既知成分酵母培地で増殖させた。1000倍トレースストック溶液は、4g/LのZnSO4.7H2O、2g/LのFeSO4.7H2O、1g/LのMnSO4.H2O、0.2g/LのCuSO4.5H2O、および0.8mL/LのH2SO4を含有する。S.セレビシエを、50g/Lのデキストロース、5g/Lの酵母抽出物、および40mL/Lの25倍DM塩からなる緩衝既知成分デキストロース培地で増殖させた。25倍DM塩ストック溶液は、125g/Lの硫酸アンモニウム、12.5g/Lの硫酸マグネシウム七水和物、75g/Lの第一リン酸カリウム、および787.5g/Lの水を含有する。細菌株を、10g/Lのバクト-トリプトン、5g/Lの酵母抽出物、10g/LのNaCl、および20g/Lのデキストロースからなる標準LB培地で、20g/Lのグルコースを添加して増殖させた。
【０１４０】
少なくとも8時間および最大24時間にわたって時点を取り、増殖速度を計算した。比増殖速度は、時間に対する細胞数の自然対数をプロットすることによって決定した。耐性は、化合物の非存在下と比較した、化合物の存在下での細胞の増殖速度によって決定した。得点方法を表Dに示す。耐性試験の結果を表EおよびFに示す。左から2番目の列は、増殖が検出された表示化合物の最大濃度を示す。結果は、S.セレビシエが本研究で試験した官能基化アルファ置換C4二酸化合物のいずれかを産生するのに適した宿主であることを示唆している。I.オリエンタリスは、ほとんどの化合物に適した宿主でもある。結果は、大腸菌がホモクエン酸ラクトンを産生するのに適した宿主であり、C.グルタミカムが試験条件下でホモクエン酸を産生するのに適した宿主であることを示唆している。
【０１４１】
表D.特定の化学物質が細胞増殖速度に与える影響を評価するために使用される主観システム
【表３】
2018526969.tif 000026
表E.潜在的な酵母宿主の耐性。
【表４】
2018526969.tif 000027
表F.潜在的な細菌宿主の耐性。
【表５】
2018526969.tif 000028
【０１４２】
（実施例２-セリン過剰産生微生物を利用したアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸の産生のための組み換え微生物の構築。）
アルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸の産生に使用される微生物を、酵母および糸状菌を含む真菌ならびに細菌から選択することができる。非特許文献１２に記載の微生物を、細菌の産生が望ましい場合のその後の遺伝子操作工程用のセリン過剰産生出発株として使用することができる。同様に、非特許文献１３および特許文献２１に記載の微生物を、真核生物の産生が望まれる場合のその後の遺伝子操作工程の出発株として使用することができる。
【０１４３】
トランスアミナーゼ（図４、行A）およびシンターゼ（図４、行B）をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。遺伝子候補およびそれらの配列を、図４の右端列に示す。トランスアミナーゼおよびシンターゼ活性は、組み換え微生物において、適切なプロモーターおよびターミネーターの制御下での、特定された核酸配列をコードする組み換え核酸配列の導入によって増加する。具体的には、トランスアミナーゼ遺伝子はシロイヌナズナ由来のセリン-グリオキシル酸トランスアミナーゼ（EC2.6.1.45）であり、シンターゼはシゾサッカロミセス・ポンべ由来のホモクエン酸シンターゼ（2.3.3.14）である。全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、セリン過剰産生微生物に形質転換する。
【０１４４】
さらに、アルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸輸送体をコードするDNA断片の発現は、アルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸の産生を促進する。具体的には、輸送体遺伝子は、リンゴ酸輸送遺伝子、大腸菌由来のtehA（UNIPROT E0IVN4）、S.ポンべ由来のmae1（非特許文献１４）、および枯草菌由来のykxJ（非特許文献１５）、またはそれらのホモログから選択される。
【０１４５】
トランスアミナーゼ活性アッセイ
当業者は、多くのトランスアミナーゼ酵素の活性が特性評価されており、トランスアミナーゼ活性検出のための当該技術分野で知られている任意の方法が使用され得ることを理解するであろう。具体的には、シロイヌナズナトランスアミナーゼの発現時に、非特許文献１６により記載されているアッセイを用いてその活性を特性評価することができる。グリシンをアミノ基供与体として使用する反応量は、反応停止後に残った2-オキソ酸基質を測定することによって推定され、これはNADHおよび乳酸デヒドロゲナーゼを用いる分光光度法によって決定される。
【０１４６】
シンターゼ活性アッセイ
シンターゼをコードする大腸菌最適化遺伝子を合成し、pTrcHisA（Life Technologies（旧Invitrogen））にクローニングした。試験したシンターゼ遺伝子は、表Gで見られる。最適化シンターゼ遺伝子を含むプラスミドをBL21大腸菌細胞に形質転換した。空プラスミドpTrcHisAも陰性対照として形質転換した。発現および特性評価実験のために、40mLのTBを含有する振とうフラスコを一晩培養物から5%で接種した。フラスコを30℃、250rpmで2時間振とうし、その後タンパク質産生を0.2mMのIPTGで誘導し、さらに4時間30℃で振とうさせながらインキュベートした。細胞を遠心分離により収穫し、ペレットを-80℃で保存した。
【０１４７】
シンターゼ候補の活性を、DTNB（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）を指標として使用するin vitroアッセイで評価した。無基質で、またはヒドロキシピルビン酸を基質として使用し、酵素活性を試験した。DTNBは、アセチル-CoAと存在する基質との縮合によって生成される遊離チオと相互作用する。特に明記しない限り、全ての化学物質は、ミズーリ州セントルイスのSigma-Aldrich Chemical社から購入した。
【０１４８】
BeadBeater（BopSpec products、バートルズビル、オクラホマ州）を使用し、製造元の指示に従って機械的破壊を使用して細胞を溶解した。細胞溶解物を、遠心分離（14,000Gで5分間）により部分的に清澄化した。得られた清澄化溶解物のタンパク質濃度を、BioRad total Proteinアッセイにより、製造元の指示に従って測定した。溶解物を、100mMトリス緩衝液中のタンパク質濃度によって標準化した。標準化された溶解物を、100mMトリス緩衝液中で1〜7に希釈した。20μlの溶解物を、96ウェルプレートアッセイ用の各ウェルに添加した。各条件を3連で実施した。
【０１４９】
反応混合物は、100mMのTris pH7.4、5mMのMgSO4、0.2mMアセチル-CoA、0.5mMのDTNB、0.5mM基質、ヒドロキシピルビン酸を含有する。反応を開始するために、180μlの反応混合物を、既に20μlの溶解物を含有する各ウェルに添加した。これらのマイクロプレート中での反応を412nmでモニターした。9秒毎に10分間読み取りを行い、データを用いて各酵素の活性を計算した。結果を図２０（ａ）に示す。ヒドロキシピルビン酸が基質である場合、空ベクターを含む細胞と比較して、シンターゼ活性が観察された（図２０（ａ）、表G）。同じ反応により無基質で測定されたバックグラウンド吸光度を差し引いた。グラフのエラーバーは、3連で実施した各条件の平均について計算された標準偏差を反映している。特定の突然変異は、試験した酵素の活性を変化させる（図２０（ｂ）、表H）。さらなる酵素操作は、所望の酵素反応の特異性および活性を促進することになる。
【０１５０】
表G.候補シンターゼのリストおよびヒドロキシピルビン酸との活性
【表６】
2018526969.tif 000029
【０１５１】
表H.突然変異候補シンターゼのリストおよびヒドロキシピルビン酸との活性および野生型シンターゼとの比較
【表７】
2018526969.tif 000030
【０１５２】
経路酵素をコードする核酸配列を含有するプラスミドでの大腸菌の形質転換
プラスミドDNA分子を、化学的形質転換または電気穿孔法によって、上記実施例２に記載の参照経路で操作した標的大腸菌細胞に導入する。化学的形質転換では、600nmでの光学密度（0.5〜0.8）によって決定されるように、細胞を対数増殖段階中期まで増殖する。細胞を採取、洗浄し、最後にCaCl2で処理する。これらの大腸菌を化学的に形質転換させるために、精製されたプラスミドDNAを、氷上で微量遠心管内の細胞懸濁液と混合させる。熱ショックを混合物に与え、その後富栄養培地中での30〜60分間の回復インキュベーションが続く。電気穿孔法では、対数増殖段階中期まで増殖させた大腸菌細胞を水で数回洗浄し、最後に10%グリセロール溶液に再懸濁する。DNAをこれらの細胞に電気穿孔するために、細胞とDNAとの混合物を、電極を含有する使い捨てプラスチックキュベットにピペットで入れる。短い電気パルスを細胞に加え、DNAが入ることができる小さな穴を膜に形成する。次いで、細胞懸濁液を富栄養液体培地でインキュベートし、続いて固体寒天プレート上にプレートする。詳細なプロトコルは、非特許文献５で得ることができる。
【０１５３】
BL21株の大腸菌細胞を、記載のプラスミドまたは複数プラスミドで形質転換する。BL21は、遺伝子型：B F-dcm ompT hsdS（rB-mB-）gal[malB+]K-12（λS）を有する大腸菌株である。
【０１５４】
全ての溶液は、蒸留された脱イオン水で調製されている。LB培地（1L）は、バクトトリプトン（すなわち、カゼインの酵素消化物）（10g）、バクト酵母抽出物（すなわち、自己消化酵母細胞の水溶性部分）（5g）、およびNaCl（10g）を含有していた。LB-グルコース培地は、グルコース（10g）、MgSO4（0.12g）、およびチアミン塩酸塩（0.001g）を1LのLB培地に含有していた。LB凍結緩衝液は、K2HPO4（6.3g）、KH2PO4（1.8g）、MgSO4（1.0g）、(NH4)2SO4（0.9g）、クエン酸ナトリウム脱水物（0.5g）およびグリセロール（44mL）を1LのLB培地中に含有する。M9塩（1L）は、Na2HPO4（6g）、KH2PO4（3g）、NH4Cl（1g）、およびNaCl（0.5g）を含有する。M9最少培地は、D-グルコース（10g）、MgSO4（0.12g）、およびチアミン塩酸塩（0.001g）を1LのM9塩に含有する。適切な場合、抗生物質を以下の最終濃度に追加する：アンピシリン（Ap）、50μg/mL；クロラムフェニコール（Cm）、20μg/mL；カナマイシン（Kan）、50μg/mL；テトラサイクリン（Tc）、12.5μg/mL。95%エタノールで調製されたクロラムフェニコールおよび50%水性エタノールで調製されたテトラサイクリンを除いて、抗生物質のストック溶液は水中で調製される。イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）の水性ストック溶液を様々な濃度で調製する。
【０１５５】
標準発酵培地（1L）は、K2HPO4（7.5g）、クエン酸アンモニウム鉄(III)（0.3g）、クエン酸一水和物（2.1g）、および濃H2SO4（1.2mL）を含有する。オートクレーブ前の濃縮NH4OHの添加により、発酵培地をpH7.0に調整する。以下のサプリメントを、発酵の開始直前に添加する：D-グルコース、MgSO4（0.24g）、カリウムならびに(NH4)6(Mo7O24).4H2O（0.0037g）、ZnSO4.7H2O（0.0029g）、H3BO3（0.0247g）、CuSO4.5H2O（0.0025g）、およびMnCl2・4H2O（0.0158g）を含む微量ミネラル。IPTGストック溶液を、必要に応じて（例えば、600nmでの光学濃度が15〜20の間にある場合）、表示の最終濃度まで加える。グルコース供給溶液およびMgSO4（1M）溶液を別々にオートクレーブする。グルコース供給溶液（650g/L）を、300gのグルコースと280mLのH2Oを合わせることによって調製する。微量ミネラルおよびIPTGの溶液を、0.22-μm膜に通して滅菌する。消泡剤（Sigma 204）を、必要に応じて発酵ブロスに添加する。
【０１５６】
シード接種は、LB寒天プレートから採取した単一コロニーを50mLのTB培地（1.2%w/vバクトトリプトン、2.4%w/vバクト酵母抽出物、0.4%v/vグリセロール、0.017MのKH2PO4、0.072MのK2HPO4）に導入することにより開始した。培養物を、混濁するまで、250rpmで撹拌しながら37℃で一晩培養する。生合成経路遺伝子を含むプラスミドが維持され、宿主細胞内で発現されることを確実にするための適切な選択圧が全ての培養条件に含まれる。この培養物の2.5mLアリコートを、続いて50mLの新しいTB培地に移す。37℃および250rpmでさらに3時間培養した後、IPTGを0.2mMの最終濃度まで添加する。得られた培養物を30℃で4時間増殖させる。細胞を採取し、PBS培地で2回洗浄し、グルコース（2g/L）を補充した0.5元容量のM9培地に再懸濁する。次いで、全細胞懸濁液を30℃で48時間インキュベートする。試料を採取し、GC/MSおよび1H-NMRによって分析する。
【０１５７】
（実施例３-ヒドロキシピルビン酸から出発するアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸の産生のための組み換え微生物の構築。）
実施例２に記載のDNA断片に加えて、ホスファターゼをコードするDNA断片が含まれる。ホスファターゼ遺伝子は、大腸菌由来のyeaB遺伝子またはSセレビシエ由来のGPP2から選択されるホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼである（特許文献２２、特許文献２３）。得られたプラスミドは、ヒドロキシピルビン酸から出発するアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸の産生のための全経路遺伝子の転写に成功する。
【０１５８】
アルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸の産生に使用される微生物は、酵母および糸状菌を含む真菌ならびに細菌から選択することができる。ヒドロキシピルビン酸過剰産生微生物を構築するために、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするserC（Uniprot P23721）遺伝子を欠失させる。serCの欠失は、3-ホスホヒドロキシピルビン酸の過剰産生をもたらし、これはyeaBまたはGPP2によってヒドロキシピルビン酸に変換される。この遺伝子戦略は、細菌または真核生物の産生が望まれる場合のその後の遺伝子操作工程の出発株を構築するために使用される。本明細書に記載のヒドロキシピルビン酸過剰産生生物は、実施例２に記載のセリン過剰産生生物の代替として使用されてもよい。
【０１５９】
ホスファターゼ活性は、当該技術分野で知られている任意の方法を用いて検出することができる。例えば、非特許文献１７に記載のアッセイを用いて、ホスファターゼ活性を測定することができる。さらに、ホスファターゼ活性を測定するために一般的に使用されるいくつかの市販のキットがある。
【０１６０】
（実施例４-イタ酒石酸および／またはヒドロキシパラコン酸の産生のための組み換え微生物の構築。）
イタ酒石酸とも呼ばれるアルファアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸を過剰産生する株を培養する。イタコン酸およびイタ酒石酸を過剰産生する株ならびに培養条件は、非特許文献１；非特許文献２および非特許文献３；ならびに非特許文献４に記載されている。別の繰り返しでは、イタコン酸オキシダーゼをコードするDNA断片が過剰産生される。イタコン酸オキシダーゼ遺伝子は、アスペルギルス属またはウスティラゴ属由来である（非特許文献１；非特許文献２および非特許文献３；ならびに非特許文献４）。得られたプラスミドは、イタ酒石酸とも呼ばれるアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸の産生のための全経路遺伝子の転写に成功する。イタコン酸オキシダーゼ遺伝子の突然変異型は、活性の増加を示す（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。ラクトン形態のヒドロキシパラコン酸も産生される。
【０１６１】
イタ酒石酸へのイタコン酸変換に必要なプラスミド発現遺伝子は、イタコン酸過剰産生宿主に形質転換される。例えば、宿主として、アスペルギルス属およびウスティラゴ属株、具体的にはアスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・ニガー、ウスティラゴ・シノドンティス、またはウスティラゴ・メイディスが用いられる。イタコン酸オキシダーゼ活性は天然に、野生型酵素から、野生型遺伝子の過剰発現から、または突然変異イタコン酸オキシダーゼ遺伝子の発現から生じる。非特許文献２１に記載のように、イタコン酸を過剰産生する操作された大腸菌は、イタコン酸オキシダーゼ遺伝子で形質転換し、イタ酒石酸を産生することができた。
【０１６２】
イタコン酸オキシダーゼ活性は、当該技術分野で知られている任意の方法を用いて検出することができる。例えば、非特許文献４に記載のアッセイを用い、HPLCアッセイによって生成物イタ酒石酸を検出することにより、イタコン酸オキシダーゼ活性を測定することができる。
【０１６３】
ウスティラゴ・メイディスおよびアスペルギルス・テレウスを既知成分培地で、最大9日間30℃で増殖させた。増殖培地は、1リットルあたり120gグルコース、1g尿素、0.2gのKH2PO4、1gのMgSO4.7H2O、1g酵母抽出物、1mLの1000倍微量金属溶液からなっており、表示pHに調整されていた。1000倍微量金属溶液は、0.125gのZnSO4および1.25gのFeSO4.7H2Oを250mLの水に添加することによって作製した。U.メイディスはpH3、pH5、およびpH7の培地で増殖させ、一方でA.テレウスはpH3培地で増殖させた。約24時間毎に時点を取り、上清をHPLCで分析した。イタ酒石酸は、主にそのラクトン形態であるヒドロキシパラコン酸（HP）で存在することが観察された。HP生成物のレベルは、異なる量の合成ITT/HP標準との比較により推定した。ウスティラゴ・メイディスおよびアスペルギルス・テレウスの両方がHPを産生した（図２１（ａ）および（ｂ））。
【０１６４】
（実施例５-アルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸から出発するアルファ(ヒドロキシメチル)マレイン酸の産生のための組み換え微生物の構築。）
実施例２および３に列挙されたDNA断片に加えて、デヒドラターゼ（図４、行C）をコードするDNA断片が含まれる。概して図３に、およびより詳細には図９の工程Cに示されるように、デヒドラターゼ活性は、組み換え微生物において、組み換え核酸配列の導入によって増加する。具体的には、デヒドラターゼ遺伝子は、大腸菌由来のアコニット酸ヒドラターゼ（EC 4.2.1.3）である。アルファ(ヒドロキシルメチル)リンゴ酸から出発してアルファ(ヒドロキシルメチル)マレイン酸を産生するための全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、実施例２、３、および４に記載の生物に形質転換する。
【０１６５】
デヒドラターゼアッセイ
デヒドラターゼをコードする大腸菌最適化遺伝子を合成し、pTrcHisA（Life Technologies（旧Invitrogen））にクローニングする。デヒドラターゼ候補は、表Iで見られる。最適化シンターゼ遺伝子を含むプラスミドをBL21大腸菌細胞に形質転換させる。空プラスミドpTrcHisAも陰性対照として形質転換する。発現および特性評価実験のために、40mLのTBを含有する振とうフラスコを一晩培養物から5%で接種する。フラスコを30℃、250rpmで2時間振とうした後、タンパク質産生を0.2mMのIPTGで誘導し、さらに4時間30℃で振とうさせながらインキュベートする。細胞を遠心分離により収穫し、ペレットを-80℃で保存する。
表I.デヒドラターゼ候補。
【表８】
2018526969.tif 000031
【０１６６】
235nmにおいてUV分光計で測定した、アルファ置換リンゴ酸基質中の単結合の、アルファ置換マレイン酸生成物中の二重結合への変換を使用し、デヒドラターゼ候補の活性をin vitroアッセイで評価する。酵素活性は、無基質で、またはアルファ置換リンゴ酸を基質として使用して試験する。二重結合の形成は、235nmにおける吸収の増加を引き起こす。反応は、二重結合から単結合への反対方向でも試験することができ、その場合235nmでの吸収が減少する。フォワードまたはリバースのいずれも、所望の反応のためのデヒドラターゼ候補の活性を計算することができる情報を与える。特に明記しない限り、全ての化学物質は、ミズーリ州セントルイスのSigma-Aldrich Chemical社から購入する。
【０１６７】
BeadBeater（BopSpec products、バートルズビル、オクラホマ州）を使用し、製造元の指示に従って機械的破壊を使用して細胞を溶解する。細胞溶解物を遠心分離（14,000Gで5分間）により部分的に清澄化する。得られた清澄化溶解物のタンパク質濃度を、BioRad total Proteinアッセイにより、製造者の指示に従って測定する。溶解物を、100mMのTAPS緩衝液中のタンパク質濃度によって標準化する。標準化された溶解物を、100mMのTAPS緩衝液中で1〜10に希釈する。10μlの溶解物を、96ウェルプレートアッセイ用の各ウェルに添加した。各条件を3連で実施した。
【０１６８】
反応混合物は、100mMのTAPS緩衝液pH6.8、100mMのKCl、100mM基質アルファ(ヒドロキシメチル)マレイン酸を含有する。デヒドラターゼ溶解物を1mM硫酸第一鉄アンモニウムおよび5mMのDTTの存在下でインキュベートし、酵素の鉄-硫黄クラスターを30分間かけて再構成する。反応を開始するために、90μlの反応混合物を、既に10μlの溶解物を含有する各ウェルに添加する。これらのマイクロプレート中での反応を235nmでモニターする。9秒毎に10分間読み取りを行い、データを用いて各酵素の活性を計算する。バックグラウンド吸光度は、存在する基質が差し引かれていない同じ反応によって測定される。
【０１６９】
同じ反応を行い、一晩30℃でインキュベートする。試料を100℃で5分間煮沸し、タンパク質を変性させる。試料を遠心分離してタンパク質断片を除去し、得られた上清をHPLCで分析し、所望の生成物の形成を測定する。
【０１７０】
溶解物を、既知量の合成ITTありまたはなしで、一晩30℃でインキュベートし、次いで試料をHPLCで分析した。大腸菌細胞をITTの存在下でインキュベートすると、ピークが顕著に増加することが観察された（図２２（ａ））。試料をNMR分析にかけた。結果は、ITT基質が添加された溶解物のみにおいて生成物が形成されていることを示している。ホモクエン酸およびその脱水形態のホモアコニット酸、ならびにクエン酸対シスアコニット酸、シトラマル酸対シトラコン酸などの構造類似体との比較で、脱水生成物のピーク特性の存在を確認した（図２２（ｂ））。結果は、空ベクター対照細胞における脱水生成物の存在によって示されるように、内在性大腸菌デヒドラターゼがITT脱水反応を触媒することができることを示唆している。ノックアウト大腸菌株の研究は、大腸菌アコニターゼacnAが、観察された脱水生成物を産生することができることを実証した（図２３）。
【０１７１】
図２３には、空ベクター（ptrc）または内因性大腸菌デヒドラターゼ、acnAまたはacnBを発現するプラスミドのいずれかを発現する、acnAまたはacnB欠損の大腸菌細胞における無基質対照と比較したデヒドラターゼ産物のレベルが示されている。表示の溶解物を、一晩30℃でイタ酒石酸（ITT）ありまたはなしでインキュベートした。試料をHPLCで分析した。
【０１７２】
（実施例６-アルファ(ヒドロキシメチル)マレイン酸から出発するアルファ(ヒドロキシメチル)フマル酸の産生のための組み換え微生物の構築。）
実施例５に列挙されたDNA断片に加えて、イソメラーゼ（図４、行F）をコードするDNA断片が含まれる。概して図３に、およびより詳細には図９の工程Fに示されるように、イソメラーゼ活性は、組み換え微生物において、組み換え核酸配列の導入によって増加する。具体的には、イソメラーゼ遺伝子は、シュードモナス・プチダ由来のシス-トランスイソメラーゼ（EC 5.2.1.1）およびシェワネラ・オネイデンシス由来のprpF（非特許文献２２）から選択される。3番目の候補は、ウスティラゴ・メイディス由来のAdi1（UMAG_11777）である（非特許文献２３）。アルファ(ヒドロキシメチル)マレイン酸から出発してアルファ(ヒドロキシメチル)フマル酸を産生するための全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、実施例５に記載の生物に形質転換する。
【０１７３】
別の繰り返しでは、メタノサエタ・サーモフィラまたはメタノコックス・ヤンナスキイ由来のトランス-ホモアコニテートシンターゼ、aksAをコードするDNA断片が含まれる。aksAの発現は、ヒドロキシピルビン酸からアルファ(ヒドロキシメチル)フマル酸を産生する（非特許文献２４）。
【０１７４】
アルファ(ヒドロキシメチル)フマル酸輸送体をコードするDNA断片の添加は、アルファ(ヒドロキシメチル)フマル酸産生を増加させる。具体的には、輸送体遺伝子は、フマル酸輸送遺伝子、枯草菌由来のydbHである（非特許文献２５）。
【０１７５】
（実施例７-セリン過剰産生微生物中のスペーサー経路を利用したアルファ(ヒドロキシエチル)リンゴ酸の産生のための組み換え微生物の構築。）
セリン産生生物は実施例２に記載されている。実施例２、３、４、および５に列挙されたDNA断片に加えて、ヒドラターゼ（図４、行D）、デヒドロゲナーゼ（図４、行E）、シンターゼ（図４、行B）、デヒドラターゼ（図４、行C）をコードするDNA断片が含まれる。概して図３に、ならびにより詳細には図９の工程B、C、D、およびEに示されるように、ヒドラターゼ、デヒドロゲナーゼ、シンターゼ、およびデヒドラターゼ活性は、組み換え微生物において、組み換え核酸配列の導入によって増加する。具体的には、ヒドラターゼはシゾサッカロミセス・ポンべ由来のホモアコニット酸ヒドラターゼ（EC 4.2.1.36）であり、デヒドロゲナーゼはメタノカルドコックス・ヤンナスキイ由来のホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.87）であり、シンターゼはシゾサッカロミセス・ポンべ由来のホモクエン酸シンターゼ（2.3.3.14）であり、デヒドラターゼは大腸菌由来のアコニット酸ヒドラターゼ（4.2.1.3）である。これらの酵素の操作された突然変異体が、スペーサー経路の中間体に対する特異性を高めるために構築される。
【０１７６】
セリン過剰産生微生物の「スペーサー経路」を利用して、アルファ(ヒドロキシエチル)リンゴ酸の産生のための全経路遺伝子の転写に成功する得られたプラスミドを、実施例２、３、４、および５に記載の生物に形質転換する。
【０１７７】
さらに、アルファ(ヒドロキシエチル)リンゴ酸輸送体をコードするDNA断片の発現は、アルファ(ヒドロキシエチル)リンゴ酸の産生を促進する。具体的には、輸送体遺伝子は、リンゴ酸輸送遺伝子、大腸菌由来のtehA（UNIPROT E0IVN4）、S.ポンべ由来のmae1（非特許文献１４）、および枯草菌由来のykxJ（非特許文献１５）、またはそれらのホモログから選択される。
【０１７８】
（実施例８-アルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸の産生のための組み換え微生物の構築。）
アルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸の産生に使用される微生物は、酵母および糸状菌を含む真菌ならびに細菌から選択することができる。実施例７に記載のスペーサー経路を使用し、トレオニン過剰産生微生物を利用して、ホモトレオニンを産生することができる。別の繰り返しでは、ilvA、leuA、leuCD、およびleuBの発現は、中間体4-ヒドロキシ-2-オキソ-ペンタン酸の産生をもたらす（非特許文献２６）。この繰り返しは、非特許文献７による総説に記載のように、トレオニン過剰産生株で利用される。細菌の産生が望ましい場合、大腸菌またはセラチア・マルケンセンを、その後の遺伝子操作工程の出発株として使用することができる。同様に、非特許文献２７に記載の微生物を、真核生物の産生が望まれる場合のその後の遺伝子操作工程の出発株として使用することができる。
【０１７９】
上記例のホモトレオニン過剰発現細胞に加えて、中間体4-ヒドロキシ-2-オキソ-ペンタン酸は、いくつかの代替方法によって産生される。1回の繰り返しでは、ピルビン酸アルドラーゼ（EC 4.1.3.39）の発現は、中間体4-ヒドロキシ-2-オキソ-ペンタン酸を産生する（非特許文献２８）。
【０１８０】
ホモトレオニン過剰発現株では、トランスアミナーゼ（図４、行A）およびシンターゼ（図４、行B）をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。遺伝子候補およびそれらの配列を、図４の右端列に示す。概して図３に、ならびにより詳細には図１０の工程AおよびBに示されるように、トランスアミナーゼおよびシンターゼ活性は、組み換え微生物において、組み換え核酸配列の導入によって増加する。具体的には、トランスアミナーゼ遺伝子は、シゾサッカロミセス・ポンベ由来の分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（EC 2.6.1.42）であり、シンターゼは、シロイヌナズナ由来の2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（2.3.3.13）である。得られたプラスミドは、全経路遺伝子の転写に成功する。
【０１８１】
さらに、アルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸輸送体をコードするDNA断片の発現は、アルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸の産生を促進する。具体的には、輸送体遺伝子は、イソプロピルリンゴ酸輸送遺伝子、S.セレビシエ由来のOac1P（非特許文献２９）、またはそのホモログから選択される。
【０１８２】
（実施例９-アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸の産生のための組み換え微生物の構築。）
実施例２、３、および４に列挙されたDNA断片に加えて、デヒドラターゼ（図６、行A）、ヒドラターゼ（図６、行B）、レダクターゼ（図６、行C）、デカルボキシラーゼ（図６、行D）、およびアルデヒドレダクターゼ（図６、行E）をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。遺伝子候補およびそれらの配列を、図６の右端列に示す。具体的には、デヒドラターゼ遺伝子は、大腸菌由来のアコニット酸ヒドラターゼ（EC4.2.1.3）であり、ヒドラターゼ遺伝子は、S.ポンべ由来のホモアコニット酸ヒドラターゼ（EC 4.2.1.36）であり、レダクターゼ遺伝子は、S.セレビシエ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.37）であり、デカルボキシラーゼ遺伝子は、S.セレビシエ由来の分枝鎖2-オキソ酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.72）であり、アルデヒドレダクターゼ遺伝子は、S.セレビシエ由来のアルデヒドレダクターゼ（EC 1.1.1.21）である。全経路遺伝子の転写に成功する得られたプラスミドを、実施例２、３、または４に記載の宿主生物に形質転換する。
【０１８３】
工程A、B、およびCの具体例を、アルファ置換リンゴ酸が2-イソプロピルリンゴ酸であるロイシン合成経路に示す。酵素3-イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼは、水和およびデヒドラターゼ工程の両方を行い、3-イソプロピルリンゴ酸を生じる。酵素3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、工程Cに示されるレダクターゼ作用を提供する。これらの酵素は、酵母を含む多くの種に存在する（非特許文献３０）。工程D、デカルボキシラーゼの例については、酵素は2-ケト酸デカルボキシラーゼであってもよい。複数の2-オキソ酸デカルボキシラーゼが、自然界および利用可能な異なる特異性を有する単一生物内に存在する（非特許文献３１）。特異性を変化させるための2-ケト酸デカルボキシラーゼの操作も、例えば非特許文献３２により実証されている。レダクターゼ（工程E）の例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、adhであり得る。アルデヒドレダクターゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、例えば大腸菌において、広い特異性を有することが非特許文献３３により実証されている。
【０１８４】
（実施例１０-発酵）
流加発酵を、2Lの作業容量の発酵槽で実施する。温度、pHおよび溶存酸素は、PID制御ループによって制御する。増殖段階で発酵槽を囲むジャケットを通る温度調節された水の流れによって温度を37℃に維持し、その後産生段階が始まると27℃に調節する。pHを、5NのKOHおよび3NのH3PO4の添加によって所望のレベルに維持する。溶存酸素（DO）レベルは、空気供給量ならびに撹拌速度を調整することにより、空気飽和の20%に維持する。
【０１８５】
接種は、LB寒天プレートから採取した単一コロニーを50mLのTB培地に導入することによって開始する。培地が混濁するまで、培養物を250rpmで撹拌しながら37℃で培養する。続いて、100mLのシード培養物を新しいM9グルコース培地に移す。37℃および250rpmでさらに10時間培養した後、接種物（OD600=6〜8）のアリコート（50mL）を発酵容器に移し、回分発酵を開始した。発酵培地中の初期グルコース濃度は約40g/Lである。
【０１８６】
発酵槽制御条件下での培養は、2つの段階に分けられる。第1段階では、空気流を300ccmに保ち、インペラ速度を100から1000rpmに増加させ、DOを20%に維持する。インペラ速度が1000rpmの予め設定された最大値に達したら、質量流コントローラーは0〜100%の純粋なO2の酸素補給によってDOを維持し始める。
【０１８７】
グルコースの初期回分は約12時間で枯渇し、グルコース供給（650g/L）を開始し、容器内のグルコース濃度を5〜20g/Lに維持する。OD600=20〜25で、IPTGストック溶液を最終濃度0.2mMになるまで培地に添加する。温度設定を37℃から27℃に下げ、産生段階（すなわち、第2段階）を開始する。産生段階の発酵を48時間行い、試料を取り出して細胞密度を測定し、代謝産物を定量する。特定の生成物の産生は、GS/MSによって測定される。
【０１８８】
（実施例１１-分離）
実施例２、３、および４に記載のように細胞培養物から産生されたアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、すなわちイタ酒石酸を含有する発酵ブロスを、非特許文献３に記載の手順を用いて処理し、所望の生成物を分離する。発酵ブロスを濾過して細胞を除去し、次いで濃縮してシロップにする。得られたシロップを70℃で6時間減圧下で加熱し、アルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、すなわちイタタール酸の、環化型のヒドロキシパラコン酸（HP）へのラクトン化を触媒する。加熱酢酸エチルに激しい撹拌下で溶解した固体塊が得られる。溶媒層を分離し、次いで濃縮させ、結晶塊が形成されるまで乾燥させる。HPのさらなる精製は、酢酸エチルおよびクロロホルムでの結晶化によって実施される。最終生成物の純度をHPLCにより分析する。イタ酒石酸ナトリウム塩は、再結晶HPから、冷H2Oに溶解させて0.05NのNaOHで滴定することにより調製される。溶液を沸騰水浴中で10分間加熱し、次いで減圧下で濃縮し、最後に105℃のオーブン中で乾燥させる。最終生成物の純度をHPLCにより分析する。
【０１８９】
ホモクエン酸を含む他のアルファ置換リンゴ酸中間体は、種々のカルボン酸について開発された方法を用いて分離される。そのような方法には、アニオン交換、限外濾過、蒸留、電気透析、逆浸透を用いる分離、および非特許文献３４で概説されるような様々な抽出方法が挙げられる。
【０１９０】
（実施例１２-ホモクエン酸の2-メチレングルタル酸への変換）
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の官能基化アルファ置換アクリル酸への変換を、Pt系触媒をホモクエン酸ナトリウムと接触させて2-メチレングルタル酸を産生することによって実施した。
【０１９１】
原料および方法
実験は、5%Pt/Al2O3および0.1NのNaOH塩基の添加を用いて行った。触媒充填量は2.5mol%（Pt金属の乾燥粉末基準で計算）であり、使用した溶媒は0.1NのNaOHであった。450psiのN2下で、180℃の温度において、反応時間を16時間とした。別の反応は、純水中、Cu系触媒（Cu-金属に対して50mol%）で、オートクレーブ中でsod.ホモクエン酸塩を用いて500psiのH2ガス下で行った。
【０１９２】
GC/MS（Agilent、5975B、不活性、XL、EI/CI）を用いて反応生成物を分析した。触媒の評価は、GC/MSデータの定性的結果に基づくものであった。試験した他の触媒には、5%Pd/CaCO3、5%Pd/BaSO4、Cu-0860（予備還元）BASF、Cu-0860（未還元）BASF、Cu/Zn/Al（予備還元）が挙げられる。全てのPtおよびPd担持触媒では、金属担持量は2.5mol%であったが、この組の反応の乾燥金属標準で50重量%使用されたCu系触媒を除く。市販の触媒は、使用直前に活性化した。触媒活性化は、CCRIハイスループット施設において、Symyxハイスループットリアクターを用いて以下のプロトコルにより行った：
a. 180℃、400psiのN2下で2時間アニーリングし、
b. 180℃、200psiのH2下で2時間アニーリングする。
【０１９３】
Symyx High Throughput Module（Symyx Discovery Tools）を使用して反応を実施した。典型的な実験では、ホモクエン酸ナトリウム（0.12mmol、0.032g）を、マグネチックスターラーバーを備えたガラスバイアル中の0.1NのNaOH1mLに加えた。室温で撹拌することにより、基質を0.1NのNaOH水溶液に溶解させた。次いで、得られた溶液を、24ウェルプレート上に置いたバイアル中の予備活性化触媒（2.5mol%PtもしくはPdまたは50重量%のCu乾燥金属標準）に添加し、Core Moduleに充填した。反応混合物を450psiのN2ガスで加圧し、180℃の温度で16時間連続的に撹拌しながら加熱した。反応後、反応バイアルからの上清200μLをオーブン乾燥バイアルに移し、凍結乾燥機で完全に乾燥させた。
【０１９４】
GC-MS分析を開始するために、乾燥試料を誘導体化に使用した。
【０１９５】
メタノール500μLと1滴の硫酸を、完全に乾燥した試料（反応バイアルからの上清200μL）に添加し、密封し、撹拌し、試料を70℃で90分間加熱した。冷却後、約30〜40mgの固体重炭酸ナトリウムを、mg-スクープを用いて試料に手動で添加し、5〜10分間撹拌した。ブライン300μLおよび水300μLを加え、得られた混合物をさらに5分間撹拌した。ACSグレードの酢酸エチル600μLを添加し、次に試料を十分に混合して2相の完全な接触を確保し、分配平衡を確立した（5〜10分間の静止後に十分に分離した相）。最後に200μLを上部有機相から除去し、GC-MS分析用に希釈して1000μLにした（MeOHを用いて）。
【０１９６】
結果および考察
ホモクエン酸三ナトリウム塩を種々の金属触媒と接触させ、アルファ置換アクリル酸、特に2-メチレングルタル酸への変換を促進した。ホモクエン酸ナトリウムを5%Pt/Al2O3と接触させた実験の結果を、図２４のクロマトグラムに示す。既知ピークには、出発原料、ホモクエン酸エステル、および所望のアクリレート生成物の水素化形態である2-メチルグルタル酸が含まれる。他の同定された生成物には、9.6分での1,2,4-ブタントリカルボン酸および9.834分でのラクトンエステルが、メチルエステル誘導体化後の保持時間10.044分での出発ホモクエン酸と共に含まれる。これらのピークのいくつかの質量スペクトル結果を、図２５（ａ）、図２５（ｂ）および図２６に示す。
【０１９７】
反応を、純水中、Cu系触媒（Cu金属に対して50mol%）で、オートクレーブ中でホモクエン酸ナトリウム塩を使用して500 psiのH2ガス下で実施した場合、GC-MSクロマトグラムは、主要ピークとしての2-メチレングルタル酸の形成を示した。図２７（ａ）は、Cu系触媒で、ホモクエン酸ナトリウムとの、水中、500psiのH2ガス圧下でのオートクレーブ（5mL）反応のGC-MSクロマトグラムを示し、一方で図２７（ｂ）／（ｃ）は、産生した2-メチレングルタル酸の質量スペクトルを示す。
【０１９８】
（実施例１３-2-イソプロピルリンゴ酸のアルファイソプロピルアクリル酸への変換）
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の官能基化アルファ置換アクリル酸への変換は、Cu系触媒を2-イソプロピルリンゴ酸と接触させてアルファイソプロピルアクリル酸を得る工程によって成し遂げられた。
【０１９９】
原料および方法
実験は、Cu触媒を用い、H2またはN2のいずれかの下で行った。触媒充填量は50重量%（乾燥粉末基準で計算）であり、使用した溶媒はH2Oであった。前述の通り、450psiのH2またはN2下で、180℃の温度において、反応時間を16時間とした。GC/MS（Agilent、5975B、不活性、XL、EI/CI）を用いて反応生成物を分析した。触媒の評価は、GC/MSデータの定性的結果に基づくものであった。
【０２００】
市販のCuO触媒は、使用直前に活性化した。触媒活性化は、CCRIハイスループット施設において、Symyxハイスループットリアクターを用いて以下のプロトコルにより行った：
a. 180℃、400psiのN2下で2時間アニーリングし、
b. 180℃、200psiのH2下で2時間アニーリングする。
【０２０１】
Symyx High Throughput Module（Symyx Discovery Tools）を使用して反応を実施した。典型的な実験では、2-イソプロピルリンゴ酸（0.12mmol、0.0213g）を、マグネチックスターラーバーを備えたガラスバイアル中のH2O1mLに加えた。室温で撹拌することにより、基質を水に溶解させた。次いで、得られた溶液を、24ウェルプレート上に置いたバイアル中の予備活性化触媒（50重量%、0.01065g）に添加し、Core Moduleに充填した。反応混合物を最初に450psiのH2またはN2ガスで加圧し、180℃の温度で16時間連続的に撹拌しながら加熱した。反応後、反応バイアルからの上清200μLをオーブン乾燥バイアルに移し、凍結乾燥機で完全に乾燥させた。
【０２０２】
GC-MS分析を開始するために、乾燥試料を誘導体化に使用した。メタノール500μLと1滴の硫酸を、完全に乾燥した試料（反応バイアルからの上清200μL）に添加し、密封し、撹拌し、試料を70℃で90分間加熱した。冷却後、約30〜40mgの固体重炭酸ナトリウムを、mg-スクープを用いて試料に手動で添加し、5〜10分間撹拌した。ブライン300μLおよび水300μLを加え、得られた混合物をさらに5分間撹拌した。ACSグレードの酢酸エチル600μLを添加し、次に試料を十分に混合して2相の完全な接触を確保し、分配平衡を確立した（5〜10分間の静止後に十分に分離した相）。最後に200μLを上部有機相から除去し、GC-MS分析用に希釈して1000μLにした（MeOHを用いて）。
【０２０３】
結果および考察
出発原料の2-イソプロピルリンゴ酸をCu系触媒と接触させ、アルファ置換アクリル酸のアルファイソプロピルアクリル酸への変換を促進した。2-イソプロピルリンゴ酸を、H2下でCu系触媒と接触させた実験の結果を、図２８（ａ）のクロマトグラムに示す。既知ピークには、所望のアルファ置換アクリル酸の水素化生成物であるブタン酸2,3-ジメチル,メチルエステルが含まれる。ブタン酸2,3-ジメチル,メチルエステルの質量スペクトルを、図２８（ｂ）／（ｃ）の質量スペクトルに示す。別のピークは脱水されている可能性が高いと判断され、2-イソプロピルリンゴ酸の水素化誘導体、ジメチルエステル(1-メチルエチル)-ブタン二酸が続いた。7.435分のピークは、未反応の出発物質である、特定の反応条件下での2-イソプロピルリンゴ酸である（注：GCカラムの整備前に試料を分析したため、7.435分の保持時間は、図３０（ａ）の7.329分の基準試料とわずかに異なる）。
【０２０４】
所望のアルファ置換アクリル酸のメチレン基の水素化を防ぐために、H2の代わりにN2下で反応を繰り返した。その他の条件は全て同じであった。反応は、所望の生成物であるイソプロピルアクリル酸（図２９（ａ）のクロマトグラム）の産生をもたらした。イソプロピルアクリル酸の質量スペクトルを図２９（ｂ）／（ｃ）に示す。出発物質である2-イソプロピルリンゴ酸のスペクトルを図３０（ａ）／（ｂ）に示す。他のピークは、4-メチル-2-ペンテン酸および2-(1-メチルエチル)-2-ブテン二酸と同定された（図３１（ａ）／（ｂ）および図３２（ｃ））。
【０２０５】
（実施例１４-ヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸のヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸への変換）
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の官能基化アルファ置換アクリル酸への変換は、CuまたはPt触媒をヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸と接触させてヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸を産生する工程によって行われる。具体的には、ヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸はアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸であり、生成物はアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸である。
【０２０６】
原料および方法
実験は、CuまたはPt触媒を用いてN2またはH2下で行う。触媒がCuである場合、触媒充填量は50重量%（乾燥粉末基準で計算）であり、使用される溶媒はH2Oである。触媒が5%Pt/Al2O3である場合、触媒充填量は2.5モル%（乾燥粉末基準で計算）であり、使用する溶媒は0.1NのNaOHである。いずれの触媒条件においても、450psiのN2またはH2下で、180℃の温度において、反応時間を16時間とする。反応は、実施例１２および１３に記載のように実施する。反応生成物を、GC/MS（Agilent、5975B、不活性、XL、EI/CI）を用いて分析する。触媒の評価は、GC/MSデータの定性的結果に基づいている。分析は、実施例１２および１３に記載のように実施する。
【０２０７】
結果および考察
ヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸をCu系またはPt系触媒と接触させ、ヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸への変換を促進する。具体的には、ヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸はアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸であり、生成物はアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸である。
【０２０８】
（実施例１５-アルファ(2-ヒドロキシエチル)リンゴ酸からツリパリンへの変換。）
実施例７の生成物であるアルファヒドロキシエチルリンゴ酸の、官能基化アルファ置換アクリル酸であるアルファヒドロキシエチルアクリル酸への変換は、CuまたはPt系触媒をヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸であるアルファヒドロキシエチルリンゴ酸と接触させてヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸であるアルファ(2-ヒドロキシエチル)アクリル酸を産生する工程によって行われる。ヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸生成物であるアルファ(2-ヒドロキシエチル)アクリル酸は、ラクトン化されてツリパリンとなる。当業者には理解されるように、ラクトン化は、硫酸、塩酸などの任意の強酸触媒を用いて行われる。
【０２０９】
原料および方法
実験は、CuまたはPt触媒を用いてN2またはH2下で行う。触媒がCuである場合、触媒充填量は50重量%（乾燥粉末基準で計算）であり、使用される溶媒はH2Oである。触媒が5%Pt/Al2O3である場合、触媒充填量は2.5モル%（乾燥粉末基準で計算）であり、使用する溶媒は0.1NのNaOHである。いずれの触媒条件においても、450psiのN2またはH2下で、180℃の温度において、反応時間を16時間とする。反応は、実施例１２および１３に記載のように実施する。反応生成物を、GC/MS（Agilent、5975B、不活性、XL、EI/CI）を用いて分析する。触媒の評価は、GC/MSデータの定性的結果に基づいている。分析は、実施例１２および１３に記載のように実施する。
【０２１０】
結果および考察
アルファ(2-ヒドロキシエチル)C4二酸をCu系またはPt系触媒と接触させ、アルファ-(2-ヒドロキシエチル)アクリル酸への変換を促進する。アルファ(2-ヒドロキシエチル)アクリル酸生成物は、ラクトン化されてツリパリンとなる。
【０２１１】
（実施例１６-アルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸のMeMBLへの変換。）
実施例８の生成物であるアルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸の、官能基化アルファ置換アクリル酸であるアルファ(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸への変換は、CuまたはPt系触媒をアルファ置換C4二酸であるアルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸と接触させて、アルファ置換アクリル酸であるアルファ(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸を産生する工程によって行われる。アルファ置換アクリル酸生成物であるアルファ(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸は、ラクトン化されてMeMBLとなる。当業者には理解されるように、ラクトン化は、硫酸、塩酸などの任意の強酸触媒を用いて行われる。
【０２１２】
原料および方法
実験は、CuまたはPt触媒を用いてN2またはH2下で行う。触媒がCuである場合、触媒充填量は50重量%（乾燥粉末基準で計算）であり、使用される溶媒はH2Oである。触媒が5%Pt/Al2O3である場合、触媒充填量は2.5モル%（乾燥粉末基準で計算）であり、使用する溶媒は0.1NのNaOHである。いずれの触媒条件においても、450psiのN2またはH2下で、180℃の温度において、反応時間を16時間とする。反応は、実施例１２および１３に記載のように実施する。反応生成物を、GC/MS（Agilent、5975B、不活性、XL、EI/CI）を用いて分析する。触媒の評価は、GC/MSデータの定性的結果に基づいている。分析は、実施例１２および１３に記載のように実施する。
【０２１３】
結果および考察
アルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸をCu系またはPt系触媒と接触させ、アルファ(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸への変換を促進する。アルファ(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸生成物は、ラクトン化されてMeMBLとなる。
【０２１４】
（実施例１７-官能基化アルファ置換アクリル酸の操作のための宿主の選択）
アルファ置換アクリル酸への表示の経路の潜在的な宿主は、概して図１および図３に、より詳細には図９および１０に示されるように、官能基化アルファ置換アクリル酸最終生成物に対する耐性を決定することによって同定した。表示の官能基化アルファ置換アクリル酸、官能基化アルファ置換アクリル酸エステル、および官能基化アルファ置換アクリル酸ラクトンを選択し、細菌および真核生物宿主の耐性を評価した（表KおよびL）。
【０２１５】
2つの真核生物株、I.オリエンタリスおよびS.セレビシエを、選択された化合物に対する耐性についてpH3およびpH5で試験した。細菌株を、それらの個々の最適条件で増殖させ、大腸菌およびC.グルタミカムをpH8および30℃で増殖させ、B.フィルムスおよびB.コーニイをpH9および37℃で増殖させた。I.オリエンタリスを、5g/L硫酸アンモニウム、0.5g/L硫酸マグネシウム七水和物、3g/L第一リン酸カリウム、10g/Lデキストロース、1mL/Lの10%グリセロールストック、1mL/Lの1000倍トレースからなる既知成分酵母培地で増殖させた。1000倍トレースストック溶液は、4g/LのZnSO4.7H2O、2g/LのFeSO4.7H2O、1g/LのMnSO4.H2O、0.2g/LのCuSO4.5H2O、および0.8mL/LのH2SO4を含有する。S.セレビシエを、50g/Lデキストロース、5g/L酵母抽出物、および40mL/Lの25倍DM塩からなる緩衝既知成分デキストロース培地で増殖させた。25倍DM塩ストック溶液は、125g/Lの硫酸アンモニウム、12.5g/Lの硫酸マグネシウム七水和物、75g/Lの第一リン酸カリウム、および787.5g/Lの水を含有する。細菌株を、10g/Lバクト-トリプトン、5g/L酵母抽出物、10g/LNaCl、および20g/Lデキストロースからなる標準LB培地で、20g/Lグルコースを添加して増殖させた。
【０２１６】
少なくとも8時間および最大24時間にわたって時点を取り、増殖速度を計算した。比増殖速度は、時間に対する細胞数の自然対数をプロットすることによって決定した。耐性は、化合物の非存在下と比較した、化合物の存在下での細胞の増殖速度によって決定した。得点方法を表Jに示す。耐性試験の結果を表KおよびLに示す。左から2番目の列は、増殖が検出された表示化合物の最大濃度を示す。結果は、選択細菌宿主が、アルファ置換アクリレートの産生に適切な宿主であり得ることを示唆し、具体的にはヒドロキシメチルアクリレートには大腸菌、ヒドロキシエチルアクリレートおよびメチルヒドロキシエチルアクリレートにはC.グルタミカムおよびB.フィルムスが適切であり得ることを示唆する。
【０２１７】
表J.特定の化学物質が細胞増殖速度に与える影響を評価するために使用される主観システム
【表９】
2018526969.tif 000032
【０２１８】
表K.潜在的な酵母宿主の耐性
【表１０】
2018526969.tif 000033
【０２１９】
表L.潜在的な細菌宿主の耐性
【表１１】
2018526969.tif 000034
【０２２０】
一実施形態では、アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸は、宿主生物によって産生される。特定の実施形態では、アルファ-ヒドロキシメチル3-ヒドロキシプロピオン酸は、宿主生物によって産生される。宿主生物を評価するために、上記プロトコルを使用した。30℃で24時間のインキュベーション終了時の相対ODを、クルイベロミセス・マルキシアヌス、S.セレビシエ、および大腸菌について、異なる量のヒドロキシメチル-3HPの存在下で比較した（図３３（ａ））。3つ全ての生物は、アルファ-ヒドロキシメチル-3-ヒドロキシプロピオン酸に少なくとも60g/Lまで耐性であることができた。K.マルキシアヌスは、この化合物について試験した生物の最良の耐性を示した。
【０２２１】
一旦宿主生物が選択されると、合成遺伝子に使用されるコドンは、宿主細胞のそれに合わせてカスタマイズされることが理解される。
【０２２２】
（実施例１８-アルファ(ヒドロキシメチル)C4ジカルボン酸をアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸および対応するエステルに変換するための組み換え微生物の構築。）
実施例５に記載のDNA断片に加えて、デカルボキシラーゼ（図１２、行I）をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。遺伝子候補およびそれらの配列を、図１２の右端列に示す。具体的には、デカルボキシラーゼ遺伝子は、アスペルギルス・ニガー由来のシスアコニターゼデカルボキシラーゼ、cadA（EC 4.1.1.6）である。全経路遺伝子の転写に成功する得られたプラスミドを、実施例５に記載のようにアルファ(ヒドロキシメチル)マレイン酸を産生する組み換え微生物に形質転換し、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸を得る。デカルボキシラーゼプラスミドはまた、実施例６に記載のようにアルファ(ヒドロキシメチル)フマル酸を産生する細胞中で発現され、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸を生じる。
【０２２３】
さらに、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸輸送体をコードするDNA断片の発現は、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸の産生を促進する。具体的には、輸送体遺伝子は、アスペルギルス・テレウス由来の推定上の主要ファシリテータースーパーファミリータンパク質をコードするmsfA（UNIPROT Q0C8L2）である。
【０２２４】
デカルボキシラーゼ活性アッセイ
デカルボキシラーゼをコードする大腸菌最適化遺伝子を合成し、pTrcHisA（Life Technologies（旧Invitrogen））にクローニングする。デカルボキシラーゼ候補は表Mに見られる。最適化シンターゼ遺伝子を含むプラスミドを、BL21大腸菌細胞に形質転換した。空プラスミドpTrcHisAも陰性対照として形質転換する。発現および特性評価実験のために、40mLのTBを含有する振とうフラスコを一晩培養物から5%で接種する。フラスコを30℃、250rpmで2時間振とうした後、タンパク質産生を0.2mMのIPTGで誘導し、さらに4時間または一晩30℃で振とうしながらインキュベートする。細胞を遠心分離により収穫し、ペレットを-80℃で保存する。
【０２２５】
デカルボキシラーゼ候補の活性をin vitro溶解物アッセイで評価するが、アクリレート生成物はHPLCを用いて検出する。酵素活性は、無基質で、またはアルファ置換マレイン酸を基質として使用して試験する。アクリレート生成物は、Benson有機酸カラム（300×7.8mm、部品#2000-0 BP-OA）を用いて検出し、4%アセトニトリル+0.025N硫酸移動相の2つのBensonカラムをタンデムで使用して行う。特に明記しない限り、全ての化学物質は、ミズーリ州セントルイスのSigma-Aldrich Chemical社から購入する。
【０２２６】
BeadBeater（商標）（BopSpec products、バートルズビル、オクラホマ州）を使用し、製造元の指示に従って機械的破壊を使用して細胞を溶解する。細胞溶解物を遠心分離（14,000Gで5分間）により部分的に清澄化する。得られた清澄化溶解物のタンパク質濃度を、BioRad total Proteinアッセイにより、製造者の指示に従って測定する。溶解物を、100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.3中のタンパク質濃度によって標準化する。
【０２２７】
反応混合物は、100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.3、1μlのDTT、および10mMの基質アルファ（置換）マレイン酸を含有する。反応物を一晩30℃でインキュベートする。試料を5分間100℃で煮沸し、タンパク質を変性させる。試料を遠心分離してタンパク質断片を除去し、得られた上清をHPLCで分析して所望の生成物の形成を測定する。空ベクターを含有する細胞と比較して、デカルボキシラーゼ活性は基質と共に観察される。
【０２２８】
あるいは、デカルボキシラーゼ候補は、ヒドロキシメチルフマル酸などのアルファ置換フマル酸を基質として取り込み得る。例えば、この候補は、ウスティラゴ・メイディス由来のtad1（UMAG_05076）であり得る（非特許文献２３）。
【０２２９】
表M.例示的なデカルボキシラーゼ配列のリスト
【表１２】
2018526969.tif 000035
【０２３０】
（アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸から出発するアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸エステルの産生のための組み換え微生物の構築。）
この実施例で上に列挙されたDNA断片に加えて、エステラーゼ（図１２、行H）をコードするDNA断片が含まれる。具体的には、エステラーゼは、大腸菌由来のカルボキシルエステラーゼ（EC 3.1.1.1）である。アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸から出発するアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸エステルの産生のための全経路遺伝子の転写に成功する得られたプラスミドを、上記のアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸を産生する生物に形質転換する。
【０２３１】
さらに、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸輸送体をコードするDNA断片の発現は、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸の産生を促進する。具体的には、輸送体遺伝子は、アスペルギルス・テレウス由来の推定上の主要ファシリテータースーパーファミリータンパク質をコードするmsfA（UNIPROT Q0C8L2）である。
【０２３２】
（実施例１９-アルファ(ヒドロキシメチル)3HPから出発するアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸の産生のための組み換え微生物の構築。）
実施例９に列挙されたDNA断片に加えて、coAトランスフェラーゼ（図１４、行F）、3HP-CoAデヒドラターゼ（図１４、行G）、およびCoAトランスフェラーゼ（図１４、行F）をコードするDNA断片が含まれる。具体的には、CoAトランスフェラーゼは、クロロフレクサス・アウランティアクス由来のスクシニル-CoA-D-シトラマル酸CoAトランスフェラーゼ（EC 2.8.3.20）であり、3HP-CoAデヒドラターゼは、メタッロスパエラ・セデュラ由来の3-ヒドロキシピリオニル-CoAデヒドラターゼ（EC 4.2.1.116）であり、CoAトランスフェラーゼは、ドブネズミ由来のコハク酸ヒドロキシメチルグルタル酸CoAトランスフェラーゼ（2.8.3.13）である。得られたプラスミドは、アルファ(ヒドロキシメチル)3-ヒドロキシプロピオン酸から出発するアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸の産生のための全経路遺伝子の転写に成功する。
【０２３３】
遺伝子は、非特許文献３５に記載のように、M.セデュラから選択され得る。これらの遺伝子は、非特許文献３６に記載のように、シロイヌナズナからも選択される。非特許文献３６に記載のように、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするシロイヌナズナ遺伝子はCoAトランスフェラーゼ活性に適しており（図１４、行F）、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼおよびイソバレリル-CoAデヒドロゲナーゼは3HPデヒドラターゼ活性に適している（図１４、行G）。
【０２３４】
さらに、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸輸送体をコードするDNA断片の発現は、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸の産生を促進する。具体的には、輸送体遺伝子は、アスペルギルス・テレウス由来の推定上の主要ファシリテータースーパーファミリータンパク質をコードするmsfA（UNIPROT Q0C8L2）である。
【０２３５】
（実施例２０-アルファ(ヒドロキシエチル)C4ジカルボン酸のアルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸および対応するラクトンへの変換のための組み換え微生物の構築。）
デカルボキシラーゼ（図１２、行I）をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。遺伝子候補およびそれらの配列を、図１２の右端列に示す。具体的には、デカルボキシラーゼ遺伝子は、アスペルギルス・ニガー由来のシス-アコニターゼデカルボキシラーゼ、cadA（EC 4.1.1.6）である。全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、実施例５に記載のように、アルファ(ヒドロキシエチル)リンゴ酸、アルファ(ヒドロキシエチル)マレイン酸、またはアルファ(ヒドロキシエチル)フマル酸を産生する組み換え微生物に形質転換する。
【０２３６】
さらに、アルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸輸送体をコードするDNA断片の発現は、アルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸の産生を促進する。具体的には、輸送体遺伝子は、アスペルギルス・テレウス由来の推定上の主要ファシリテータースーパーファミリータンパク質をコードするmsfA（UNIPROT Q0C8L2）である。
【０２３７】
（アルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸から出発するツリパリンの産生のための組み換え微生物の構築。）
この実施例で上に列挙されたDNA断片に加えて、ラクトナーゼ（図１２、行G）をコードするDNA断片が含まれる。具体的には、エステラーゼは、ホモ・サピエンス由来の1,4-ラクトナーゼ（EC 3.1.1.25）である。アルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸から出発するツリパリンの産生のための全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、上記のアルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸を産生する生物に形質転換する。
【０２３８】
（実施例２１-アルファ置換酢酸からのアルファ置換アクリル酸の産生のための組み換え生物の構築。）
微生物は、アルファ置換酢酸をアルファ置換アクリル酸に変換するのに必要な全酵素を発現する。一実施形態では、3-ヒドロキシプロピオン酸をアルファヒドロキシメチル3-ヒドロキシプロピオン酸に変換する。CoAトランスフェラーゼ（図１６、行A）、CoAカルボキシラーゼ（図１６、行B）、オキシレダクターゼ（図１６、行I）、レダクターゼ（図１６、行J）、CoAトランスフェラーゼ図１６、行L）、3HP CoA-デヒドラターゼ（図１６、行E）、およびCoAトランスフェラーゼ（図１６、行F）をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。遺伝子候補およびそれらの配列を、図１６の右端列に示す。
【０２３９】
特定の酵素および参考文献は、以下の表（表N）に示され、以下の添付テキストに記載されている。具体的には、CoAトランスフェラーゼ（工程A）は、メタッロスパエラ・セデュラ由来の3-ヒドロキシプロピオニル-CoAシンテターゼであり、CoAカルボキシラーゼ（工程B）は、ルエゲリア・ポメロモイ由来のプロピオニル-CoAカルボキシラーゼであり、オキシレダクターゼ（工程I）およびマロニル-CoAレダクターゼ／スクシニル-CoAレダクターゼ（工程J）は、クロロフレクサス・アウランティアクス由来の二官能性マロニル-CoAレダクターゼであり、CoAトランスフェラーゼ（工程L）は、メタッロスパエラ・セデュラ由来の3-ヒドロキシプロピオニル-CoAシンテターゼであり、3HP CoA-デヒドラターゼ（工程E）は、メタッロスパエラ・セデュラ由来（工程E）であり、CoAトランスフェラーゼ（工程F）は、クロロフレクサス・アウランティアクス由来のスクシニル-CoA-L-リンゴ酸CoAトランスフェラーゼである。全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、3-ヒドロキシプロピオン酸を過剰産生する微生物に形質転換する。3-ヒドロキシプロピオン酸を過剰産生する微生物は、特許文献２４、特許文献２５を含む数多くの特許に記載されており、非特許文献３７に概説されている。微生物は、細菌性または真核性であり得る。宿主には、大腸菌、クレブシエラ肺炎、シュードモナス・デントリフィカンス、およびS.セレビシエを含む酵母株が挙げられる。
【０２４０】
表N.アルファ置換マロニルCoA経路の酵素および参考文献
【表１３】
2018526969.tif 000036
【０２４１】
工程A：メタッロスパエラ・セデュラ由来の3HP CoAシンテターゼは、非特許文献３８によって特性評価されている。この酵素は、この生物の3-ヒドロキシプロピオン酸サイクル独立栄養CO2固定経路の一部である。クロロフレクサス・アウランティアクスでは、この工程は、独立して進化し、同じ機能を果たすようである三機能性タンパク質のドメインによって行われる（非特許文献４５）。3HP CoAシンテターゼ活性を含むドメインを単離して発現させることができ、あるいは、3HP CoAシンテターゼ活性を有さない2つのドメインを突然変異させてそれらの活性を阻害することができる。
【０２４２】
工程B：細菌プロピオニル-CoAカルボキシラーゼの結晶構造が解明されている（非特許文献３９）。構造から、カルボキシラーゼトランスフェラーゼ活性部位は大きな峡谷であることが観察される。構造は、幾分大きな基質を収容できることを示唆している。解明された構造は、本発明者らが標的とするアミノ酸を選択し、末端ヒドロキシ基を収容することができる酵素を設計することを可能にする。例えば、部位特異的突然変異誘発を用い、活性部位のこの部分をより親水性にする。
【０２４３】
工程C：非特許文献３８に記載の3HP coAシンテターゼの特異性は、3-ヒドロキシプロピオネートを標準カップリングアッセイにおいて他の潜在的基質と置き換えることによって決定した。M.セデュラ由来の3HP coAシンセターゼは、プロピオネート、アクリレート、アセテート、およびブチレートを含む様々な基質で活性を示した。S.トコダイイ由来の3-HP CoAシンテターゼも特性評価され、プロピオネート、アクリレート、アセテート、ブチレート、グリコレート、3-メルカプトプロピオネート、および3-クロロプロピオネートで活性を有することが報告された。これらの酵素の基質の多様性は、その酵素がその特異性において乱雑であることを示唆している。この明らかな乱雑さは、その酵素が、目的の基質との十分なCoAトランスフェラーゼ活性を既に有している可能性があることを示唆している。別の候補CoAトランスフェラーゼを工程Fに記載している。
【０２４４】
工程D：M.セデュラの3HP／4HBサイクルに関与する酵素である3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼを精製し、非特許文献４０で報告されているように特性評価した。酵素ファミリーのより広い観点では、ヒドロキシアシル補酵素Aデヒドロゲナーゼは、早くも1950年代に発表された論文、例えば非特許文献４６に示されるように、数十年にわたり多くのグループによって研究されてきた。デヒドロゲナーゼは、4〜12個の炭素を含む基質を触媒することができる幅広い特異性を有する。この酵素によって触媒される反応は可逆的である。当該分野におけるこの酵素の広範な知識のために、この酵素は、操作により特異性を高めるのに有望な標的となる。
【０２４５】
工程E：メタッロスパエラ・セデュラ由来の3HP CoAデヒドラターゼは、非特許文献３５によって特性評価されている。この酵素は、この生物の3-ヒドロキシプロピオン酸サイクル独立栄養CO2固定経路の一部である。クロロフレクサス・アウランティアクスでは、この工程は、独立して進化し、同じ機能を果たすようである三機能性タンパク質のドメインによって行われる（非特許文献４５）。自然反応は、アクリロイル-CoAを形成する3-ヒドロキシプロピオニル-CoAからの水の排除である。この酵素はまた、3-ヒドロキシブチリル-CoAのクロトニル-CoAへの変換を触媒することができ、活性部位が異なるサイズの基質を収容することができることを示唆している。
【０２４６】
工程F：非特許文献４１は、クロロフレクサス・アウランティアク由来のスクシニル-CoA：L-リンゴ酸補酵素AトランスフェラーゼがCoA供与体としてのスクシニル-CoAの使用に特異的であるが、天然には1つより多くのCoA受容体、リンゴ酸またはシトラマル酸を利用することを実証した。酵素の天然の二重機能は、ポケットが異なるサイズの基質を受容するのに十分な柔軟性を有することを示唆している。また、この反応を実施する可能性のある候補である可逆的CoAトランスフェラーゼ反応も記載している工程A、C、H、およびIについての記載も参照されたい。
【０２４７】
工程G：酵素2-オキソグルタル酸カルボキシラーゼは、非特許文献４７によって同定され、非特許文献４２によりハイドロゲノバクター・サーモフィルスにおいてさらに特性評価されている。この酵素によって触媒される反応は、独立栄養生物によって使用される還元的TCAサイクルにとって重要であり、ATPを必要とする。この反応をモニターするための最も直接的な方法は、クロマトグラフィーを介して生成物を検出することである。非特許文献４２に記載のように、リアルタイム分光計アッセイも使用することができる。2-オキソグルタル酸カルボキシラーゼは、ピルビン酸カルボキシラーゼと構造的に類似しており、おそらく共通のタンパク質から進化したと報告されている。ピルビン酸カルボキシラーゼの結晶構造は解明され、目的の基質および構造的に類似する2-オキソグルタル酸カルボキシラーゼに対する特異性の増加を操作するために使用することができた（非特許文献４８）。
【０２４８】
工程H：工程CおよびFの説明を参照。
【０２４９】
工程I：クロロフレクサス・アウランティアク由来のマロニル-CoAレダクターゼは二官能性であり、CoA活性化カルボン酸カルボン酸の還元およびセミアルデヒドの還元を触媒することができる（非特許文献４３）。対照的に、M.セデュラ由来のマロン酸セミアルデヒドレダクターゼは、CoAカルボン酸からセミアルデヒド、例えばスクシニル-CoAからコハク酸セミアルデヒドへの還元を触媒するだけである（非特許文献４９）。スクシニル-CoAを基質として使用することに加えて、この酵素はマロニル-CoAレダクターゼ活性も有する。その酵素のさらなる特性評価は、NADH依存性酵素がその選択性において無差別であり、よく研究されたアスパラギン酸レダクターゼデヒドロゲナーゼに関連していることを示唆した。
【０２５０】
工程J：工程Iに付随する記載において上述したように、クロロフレクサス・アウランティアク由来のマロニル-CoAレダクターゼは二官能性であり、CoA活性化カルボン酸の還元およびセミアルデヒドの還元を触媒することができる（非特許文献４３）。メタッロスパエラ・セデュラでは、この工程はマロン酸セミアルデヒドレダクターゼによって行われる（非特許文献４９）。触媒機構は、Alberらによって提案されており、保存システインおよびヒスチジンを利用する（非特許文献４３）。この情報および酵素の他のアルデヒドデヒドロゲナーゼとの類似性は、本発明者らの目的の中間体を受け入れるこの酵素を設計するために使用される洞察を提供する。あるいは、大腸菌は、この反応における活性についてスクリーニングされ得るいくつかのアルデヒドレダクターゼを発現する。例えば、大腸菌YqhD由来のアルデヒドレダクターゼは、広範な基質を有し、バイオテクノロジー用途に使用されることが実証されている（非特許文献３３）。同様に、S.セレビシエ由来のadh2遺伝子を用いて、この反応を触媒することができた。
【０２５１】
工程K：大腸菌由来の酵素prpDは、クエン酸メチルの2-メチルアコニット酸への脱水を触媒することができる（非特許文献４４）。この酵素は内因性経路で使用されてプロピオン酸をピルビン酸に酸化し、大腸菌がプロピオン酸で増殖する場合にのみ存在する。非特許文献４４は、大腸菌prpDが、アコニット酸とのいくらかの活性を有することを示した。少量の活性がクエン酸およびイソクエン酸でも観察され、酵素が異なる基質を使用する可能性があることが示唆された。
【０２５２】
サルモネラ・エンテリカ由来のprpDの結晶構造が解明されている（非特許文献５０）。この構造は、この工程の特異性を改変し、ヒドロキシメチルアクリル酸への経路上で必要に応じて、2-(ヒドロキシメチル)-3-ヒドロキシプロピオン酸を脱水するのに有用である。
【０２５３】
工程L：工程CおよびFの説明を参照
【０２５４】
代替の繰り返しを構築し、3-ヒドロキシプロピオン酸からアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸を産生する。一方の経路には、工程A、B、I、C、D、E、およびFに記載の酵素が含まれる。別の経路には、工程A、B、I、J、およびKに記載の酵素が含まれる。別の経路には、工程G、H、I、C、D、E、およびFに記載の酵素が含まれる。別の経路には、工程G、H、I、J、L、E、およびFに記載の酵素が含まれる。別の経路には、工程G、H、I、J、およびKに記載の酵素が含まれる。別の経路には、工程A、B、I、J、L、E、およびFに記載の酵素が含まれる。
【０２５５】
さらに、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸輸送体をコードするDNA断片の発現は、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸の産生を促進する。具体的には、輸送体遺伝子は、アスペルギルス・テレウス由来の推定上の主要ファシリテータースーパーファミリータンパク質をコードするmsfA（UNIPROT Q0C8L2）である。
【０２５６】
カルボキシラーゼアッセイ
ヒドロキシメチルマロニル-CoAに変換された3HP-CoAの量を、ピルビン酸蓄積をもたらす共役反応を用いて測定した。大腸菌細胞を空ベクター（ptrc）またはRpPCCのいずれかで形質転換した。BeadBeater（BopSpec products、バートルズビル、オクラホマ州）を使用する機械的破壊を使用して、製造元の指示に従って細胞を溶解した。細胞溶解物を、遠心分離（14,000Gで5分間）により部分的に清澄化した。得られた清澄化溶解物のタンパク質濃度を、BioRad total Proteinアッセイにより、製造元の指示に従って測定した。溶解物を、100mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.6中のタンパク質濃度によって標準化した。ピルビン酸共役カルボキシラーゼ反応アッセイは、100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.6）、5μlピルビン酸キナーゼ（2.5単位/μl）、5mMホスホエノールピルビン酸、0.3mg/mlのBSA、5mMのMsCl2、50mMのNaHCO3、5mMのATP、および5mMの3HP-CoA基質を含む。反応混合物に添加した25μlの溶解物を用いて反応を開始し、総量100μlを得た。ピルビン酸蓄積をHPLCにより評価した。経時的にピルビン酸を蓄積したRpPCCを発現する溶解物は、ヒドロキシメチルマロニル-CoAを生じる3HP-CoAのカルボキシラーゼを表した（図３３（ｂ））。
【０２５７】
（実施例２２-アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸をアルファ置換アクリル酸に変換する方法。）
実施例９および２１においてなど、アルファ置換3-ヒドロキシメチル酸を産生する微生物の場合、この化合物を脱水してアルファ置換アクリル酸にする。一実施形態では、アルファ-ヒドロキシメチル3-ヒドロキシプロピオン酸（HM3HP）を脱水してアルファ-ヒドロキシメチルアクリル酸（HMA）にする。既知量のHM3HPを緩衝溶液に溶解した。溶液を3つのアリコートに分割し、それらをpH3、pH5、またはpH7に調整した。試料を-20℃、30℃、または70℃で一晩インキュベートした。NMR分析を使用し、脱水されてHMAになったHM3HPの量を測定した。最も多くのHMAへの変換がpH10で観察された（表O）。結果は、より塩基性のpHが、HM3HPのHMAへの変換を促進することを示している。溶液のpHは、HMAへの変換に対して、温度の変化よりも大きな影響を与えた。
【０２５８】
表O.アルファヒドロキシメチル3-ヒドロキシプロピオン酸から変換されたヒドロキシメチルアクリル酸（HMA）の、異なる温度およびpHでの比較
【表１４】
2018526969.tif 000037
【０２５９】
（実施例２３-イタコン酸から出発するアルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸の産生のための組み換え微生物の構築。）
イタコン酸からのアルファ(ヒドロキシエチル)リンゴ酸の産生に使用される微生物は、実施例４に記載のイタコン酸を産生する宿主から選択することができ、酵母および糸状菌ならびに細菌が含まれる。そのような生物には、S.セレビシエ、大腸菌、ならびにアスペルギルス株およびウスティラゴ株などの真菌株が含まれる。特定の真菌株には、A.ニガー、A.テレウス、およびウスティラゴ・メイディスが含まれる。イタコン酸産生は、生物に天然にあるか、またはクエン酸シンターゼ、アコニターゼ、およびシス-アコニット酸デカルボキシラーゼを含む、内因性および／または外因性の関連遺伝子を発現および／または過剰発現することによって産生される（非特許文献２１、非特許文献５１、非特許文献５２）。
【０２６０】
オキシレダクターゼ（図１８、行A）およびレダクターゼ（図１８、行B）をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。具体的には、オキシレダクターゼは、大腸菌由来のコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、レダクターゼは、大腸菌またはS.セレビシエ由来のアルデヒドレダクターゼである。レダクターゼ活性は、非特許文献４９に記載のようにアッセイすることができる。図１７に示すように、イタコン酸をアルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸に変換する活性をコードするプラスミドを、上記の宿主生物に形質転換する。さらに、アルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸トランスポーターをコードするDNA断片の発現は、アルファ（ヒドロキシルメチル）アクリル酸の産生を促進する。具体的には、輸送体遺伝子は、アスペルギルス・テレウス由来の推定上の主要ファシリテータースーパーファミリータンパク質をコードするmsfA（UNIPROT Q0C8L2）である。
【０２６１】
この実施例で上に列挙されたDNA断片に加えて、ラクトナーゼ（図１８、行C）をコードするDNA断片が含まれる。具体的には、ラクトナーゼは、ホモ・サピエンス由来の1,4-ラクトナーゼ（EC 3.1.1.25）である。イタコン酸から出発するツリパリンの産生のための全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、上記のイタコン酸産生生物に形質転換する。
【０２６２】
（実施例２４-官能基化アルファ置換アクリル酸を発酵させ、分離する方法）
官能基化アルファ置換アクリル酸の産生のための発酵方法を、実施例１０に記載のように実施する。官能基化アルファ置換アクリル酸の分離は、アニオン交換、逆浸透、結晶化、および膜抽出などの、発酵ブロスからイタコン酸を分離するために使用されるものと同様の方法により実施する（特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８）。より具体的には、ヒドロキシアルキルアクリル酸を調製する方法は、特許文献２９および特許文献３０に記載されている。
【図１】
2018526969.tif 000052
【図２（ａ）】
2018526969.tif 000053
【図２（ｂ）】
2018526969.tif 000054
【図２（ｃ）】
2018526969.tif 000055
【図２（ｄ）】
2018526969.tif 000056
【図３】
2018526969.tif 000057
【図４】
2018526969.tif 000058
【図５】
2018526969.tif 000059
【図６】
2018526969.tif 000060
【図７】
2018526969.tif 000061
【図８】
2018526969.tif 000062
【図９】
2018526969.tif 000063
【図１０】
2018526969.tif 000064
【図１１】
2018526969.tif 000065
【図１２】
2018526969.tif 000066
【図１３】
2018526969.tif 000067
【図１４】
2018526969.tif 000068
【図１５】
2018526969.tif 000069
【図１６】
2018526969.tif 000070
【図１７】
2018526969.tif 000071
【図１８】
2018526969.tif 000072
【図１９】
2018526969.tif 000073
【図２０】
2018526969.tif 000074
【図２１】
2018526969.tif 000075
【図２２】
2018526969.tif 000076
【図２３】
2018526969.tif 000077
【図２４】
2018526969.tif 000078
【図２５】
2018526969.tif 000079
【図２６】
2018526969.tif 000080
【図２７】
2018526969.tif 000081
【図２８】
2018526969.tif 000082
【図２９】
2018526969.tif 000083
【図３０】
2018526969.tif 000084
【図３１】
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【図３２】
2018526969.tif 000086
【図３３】
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【国際調査報告】
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