(57)【要約】本発明は三次元細胞及び/又は組織培養物又は細胞クラスタ又は自由浮遊微生物製の試料の形態の空間的広がりの生物試料(1)の動きをインビトロで光検出する方法及び装置に関する。方法は(ａ)試料用の容器、光ビーム源(6)、光学系(7,8)及び検出器(2)を供給する工程を含み、(ａ１)光学系は、光ビーム源から発する電磁線(11)を容器内の試料全体に照射するよう、かつ試料内の任意の点で試料との相互作用によって放射方向、偏光状態及び/又は回折パターンが変化した光ビーム源の電磁線の少なくとも一部を、検出器検出面(2a)に導くよう構成され、(ａ２)検出器は検出電磁線に応じて測定信号(9)を生成するよう構成され、測定信号の時間経過が検出電磁線の強度の時間経過を示し及び/又は測定信号から検出電磁線の強度の時間経過が導出できる。方法は更に(ｂ)試料に光ビーム源からの電磁線を照射する工程、(ｃ)測定信号の時間変化に応じ生物試料の動きを検出する工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
或る三次元細胞および／または組織培養物、または或る細胞クラスタ、または自由浮遊微生物の或る試料の形態の空間的広がりを有する生物試料（１）における動きを光学的にインビトロで検出するための方法であって、
（ａ）前記試料（１）用の容器、光ビーム源（６）、光学系（７、８；３、３ａ、３ｂ、４、５ａ、５ｂ）および検出器（２）を供給する工程を含み、
（ａ１）前記光学系（７、８）は、前記容器内の前記試料全体（１）に前記光ビーム源から放射される電磁線を照射するよう、および、前記試料（１）内の任意の位置で前記試料（１）との相互作用によって放射方向、偏光状態および／または回折パターンが変化した前記光ビーム源（６）からの前記電磁線（１１）の少なくとも一部を、前記検出器（２）の検出面（２ａ）上に導くよう構成され、
（ａ２）前記検出器（２）は前記検出された電磁線に応じて測定信号（９）を生成するよう構成され、前記測定信号の時間的プロファイルが前記検出された電磁線（１１）の強度の時間的プロファイルを示しおよび／または前記測定信号から前記検出された電磁線（１１）の強度の時間的プロファイルが導出でき、
（ｂ）さらに、前記光ビーム源からの電磁線を前記試料（１）に照射する工程と、
（ｃ）前記測定信号（９）の時間的変化に応じて前記生物試料（１）における動きを検出する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記試料の径が、
（ａ）少なくとも１つの空間的方向に少なくとも５０μｍである、または
（ｂ）１００ｍ〜１ｍｍの範囲にある
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、
（ａ）生細胞、例えば筋細胞を含み、および／または
（ｂ）動きを引き起こし得る細胞を含む
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記検出器（２）が単一チャネルの測定信号（９）を放射し、および／または
（ｂ）前記検出器（２）がフォトダイオードであり、および／または
（ｃ）前記検出器（２）が、非画像検出器である、または非空間分解測定信号を有する検出器である
ことを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記試料（１）を透過した前記光ビーム源（６）の電磁線（１２）が前記検出器（２）に達する位置におよび／または前記光ビーム源からの光が前記試料をバイパスしつつ前記検出器に達する位置にビーム経路が存在しない形態で、前記光学系（７、８）が構成されおよび／または前記検出器（２）が前記照射ビーム経路（１０）および前記試料（１）に対して配置され、および／または
（ｂ）前記試料（１）が完全に照射される
ことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記測定信号（９）の変化が所定の閾値を超えた場合、および／または、前記測定信号（９）の時間的変化が周期性を有する場合に、前記試料（１）における動きが検出される
ことを特徴とする、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
（ａ）前記光ビーム源（６）がコヒーレント光を生成し、
（ｂ）前記光学系（７、８）が、前記試料によって回折された前記光ビーム源からの光によって生成された回折パターンの端縁領域を前記検出器上に投影するよう構成される
ことを特徴とする、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記光学系は、前記試料（１）と前記検出器（２）の間に配置されたピンホール遮蔽部（３ｂ）を、前記ピンホール遮蔽部（３ｂ）のピンホール（３ｃ）が前記試料によって生成された回折パターンの端縁領域（Ｒ）に配置される形態で、含んでいるものであることを特徴とする、請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記光学系は、
（ａ）前記光ビーム源と前記試料の間に配置された遮蔽部（３ａ）であって、前記遮蔽部（３ａ）の遮蔽部開口（３ｄ）を通って出る前記光ビーム源（６）からの電磁線が前記ピンホール遮蔽部（３ｂ）の前記ピンホール（３ｃ）に直接達しない形態で設計された遮蔽部（３ａ）、および／または
（ｂ）光ビーム源（６）と前記試料（１）の間に配置された屈折光学要素（４ａ）であって、前記屈折要素（４ａ）によって回折された電磁線が前記ピンホール遮蔽部（３ｂ）の前記ピンホール（３ｃ）に直接達しない形態で設計された屈折光学要素（４ａ）
を含むものであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記光学系は、前記光ビーム源（６）と前記試料（１）の間に配置された第１の偏光フィルタ（５ａ）と、前記試料（１）と前記検出器（２）の間に配置された第２の偏光フィルタ（５ｂ）とを含むものであることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記検出器（２）は、前記試料（１）によって拡散された光をエピ検出するために、前記試料（１）における前記光ビーム源（６）側と同じ側に配置され、および／または
（ｂ）前記検出器（２）は、前記試料（１）の拡散側の電磁線を検出するために、前記照射ビーム経路（１０）の方向に対して前記試料（２）の側方に配置され、および／または
（ｃ）前記検出器（２）は、前記試料（２）によって拡散された光の透過光検出のために、前記試料（１）の透過光方向に配置され、
前記光学系は、
（ｃ１）前記光ビーム源（６）と前記試料（１）の間に配置されていて、前記試料（１）を透過したビームとして前記検出器（２）に達するであろう前記照射ビーム経路における光ビームを遮断するよう設計された遮蔽部（３）を含み、および／または
（ｃ２）前記光ビーム源（６）と前記試料（１）の間に配置されていて、前記試料（１）を透過した光ビームが前記検出器（２）に達しない形態で前記照射ビーム経路の方向を変えるよう設計された屈折要素（４）を含むものである
ことを特徴とする、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記光学系は、前記検出器（２）の前に配置されていて室内光を抑制するよう設計された帯域通過フィルタ（１３）を含むことを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）前記試料用の前記容器が、担体マトリックス、好ましくはバイオポリマー（１５）を含み、および／または
（ｂ）前記試料用の前記容器が懸滴を含む
ことを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記試料用の前記容器が、マルチウェル・プレートまたは懸滴マルチウェル・プレートのウェルであることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
互いに分離された複数の生物試料において動きの並行な光検出が実行され、
前記試料用の前記容器は、行および列に配置された試料を受け入れるための複数のウェルを有するマルチウェル・プレートまたは懸滴マルチウェル・プレートであり、
前記検出器は、検出器アレイとして、好ましくはフォトダイオード・アレイとして、設計され、個々の検出器の格子間隔が前記マルチウェル・プレートの前記複数のウェルの格子間隔に等しい、
ことを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記光ビーム源は、前記複数のウェルにおける前記試料に照射するためのレーザ・ダイオード・アレイとして設計され、個々のレーザ・ダイオードの格子間隔は、前記マルチウェル・プレートの前記複数のウェルの格子間隔に等しく、複数のレンズが前記レーザ・ダイオードの光を前記複数のウェル内に導くことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）前記レーザ・ダイオード・アレイのホルダが、熱伝導性材料で、好ましくはアルミニウムで形成されている、および／または
（ｂ）前記光学系はマイクロ・レンズ・アレイを含み、前記レンズ・アレイの各レンズが前記レーザ・ダイオードの１つに割り当てられる
ことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記光ビーム源の光は、光ファイバ束によって前記試料に照射するために前記試料を含む個々のウェル内に結合されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
或る三次元細胞および／または組織培養物、または或る細胞クラスタ、または自由浮遊微生物の或る試料の形態の空間的広がりを有する生物試料における動きを非接触でインビトロで検出するのための装置であって、
−  前記生物試料（１）用の容器（１５、１６）と、
−  光ビーム源（６）と、
−  検出器（２）と、
−  前記光ビーム源から放射される電磁線を前記容器における前記試料全体に照射するよう、および、前記試料（１）内の任意の位置で前記試料（１）との相互作用によって放射方向、偏光状態および／または回折パターンが変化した前記光ビーム源（６）の前記電磁線（１１）の少なくとも一部を、前記検出器（２）の検出面（２ａ）上に導くよう構成された光学系（７、８）と、
を含み、
前記検出器（２）は、検出された前記電磁線（１１）に応じて測定信号（９）を生成するよう構成され、
前記測定信号の時間的プロファイルが前記検出された電磁線の強度の時間的プロファイルを示し、および／または、前記測定信号から前記検出された電磁線の強度の時間的プロファイルが導出でき、
前記検出器は、さらに、前記検出された電磁線の時間変化を表示しおよび／または評価することによって、前記生物試料における動きを検出するよう構成された評価部を含むものである、
装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、空間的広がりを有する生物試料または生体試料における動きを光学的にインビトロで（in vitro：体外で、管内で）検出するのための方法および装置に関する。
【０００２】
例えば発生生物学、毒性試験および医薬品研究のような諸分野において閉じた三次元細胞および組織培養物のアクティブ・ダイナミックス（aktiven Dynamik：活性動態、能動的動力学）を監視する必要性が存在することが、実務上知られている。
【０００３】
筋（筋肉）組織に分化した胚性幹細胞（ＥＳＣ）から増殖された組織試料または組織片は、例えば、試験すべき物質の有害性を検査するために、毒性試験の枠組みの中で使用される。ここで、筋組織に適用された物質が筋組織の筋収縮に影響を与えるかどうかが調べられ、その筋収縮を物質の毒性の指標とすることができる。このために、細胞クラスタの形態のそのような三次元生物試料における動き、例えば収縮、を検出するための測定方法が必要である。そのような細胞クラスタの典型的な径（直径）は１００乃至４００μｍであり、ミリメートル（ｍｍ）範囲内の径もあり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１２３１５６号
【発明の開示】
【０００５】
これらの研究は、現在、主に視覚的観察によって行われており、ビデオ顕微鏡法およびそれに続く画像分析を用いて行われることはめったにない。前者は、時間がかかり、常に主観的評価と関連している。後者は、複雑な撮像（結像）光学系および相当な研究努力を伴う複雑な画像解析が必要である、という欠点を有する。小さい各変位に対するそれらの固有の感度は、別の欠点である。
【０００６】
例えばインピーダンス測定のような非光学的方法は、試料との接触においてだけ機能する。しかし、試料の形状または形態が、平面（Ebene）（接着性の単層）から逸脱しまたは三次元的であり、かつ媒質（培地）中で自由に浮遊または遊泳する場合、上述の技術は適用できない。
【０００７】
自動撮像（結像）法は、例えば、１０μｍの焦点深度および１００乃至４００μｍの細胞クラスタの上述の典型的なサイズについて、その試料の１０乃至４０個の像平面を測定しなければならない、という欠点を有する。動きを検出することができるための典型的な最小測定時間を約１０秒とし、再位置決めまたは焦点合わせに必要な追加時間が与えられた場合、そのような方法は、多数の試料を迅速に監視するのに適していない。
【０００８】
生物的動力学の時間スケールに起因するかなり長い監視期間を考慮した、多数の試料の一連の測定は、一般的には示されていない。しかし、実務上、例えば９６または３８４個のキャビティ（ウェル）を有する例えばマイクロタイタ・プレート（Mikrotiterplatte）としても知られているマルチウェル・プレートに保存された、互いに分離した複数の試料について、そのような動き検出を行う必要がある。幾何学的な理由および構造空間の欠如のために、マルチウェル・プレートの各ウェルにおいて撮像光学装置の配置を実現することが困難であるので、撮像方法は、そのような複数の試料の並行的または並列的な測定に適していない。
【０００９】
従って、本発明の目的は、空間的広がりを有する生物（生体）試料における動きを検出するための改良された方法、を実現することであり、それによって通常の技術の欠点を回避することができる。本発明は、特に、複雑な画像解析を必要としない動き検出のための強固で非接触の方法を実現するという目的に基づく。本発明の別の目的は、スクリーニング（検査）環境における複数の試料の並行（同時）分析に適した方法を実現することである。別の目的は、通常の装置の欠点を回避することができる、空間的広がりを有する生物試料における動きを検出するための装置、を実現することである。
【００１０】
これらの目的は、独立請求項の特徴を有する装置および方法によって解決される。本発明の有利な実施形態および適用例が、従属請求項に記載されており、図面を部分的に参照して以下の説明においてより詳細に説明される。
【００１１】
本発明は、光学的方法が非接触監視に最も適しており、試料における可能性ある動きの正確な位置が事前に分からないので、試料全体に照射する必要がある、という技術的な洞察に基づいている。試料は、通常、深さのかなりの広がり、即ち撮像光学系の焦点深度より大きい深さのかなりの広がりを有するので、光と試料との相互作用は、試料を通してその全長に沿って累積的に測定されなければならない。ここでは、従って、特に光の非相互作用的な部分が測定されるであろうし、予測される変動が、この技術を鈍感にするであろう強い背景ノイズおよび干渉を伴うであろうから、（光の）伝達方法が不適切である。従って、本発明による手法（アプローチ）は、照射された試料の散乱放射、偏光（偏波）放射および／または回折放射（電磁線）の検出に基づいており、その際、試料との相互作用によって放射方向、偏光状態および／または回折パターンが変化する光の一部において、試料の動きによって生じる変動が探索される。ここで、散乱された偏光および／または回折電磁線（放射光）から、透過光（伝達光）を適切なフィルタによって分離することが、有利である。また、“光”という用語は、本発明の一部として“電磁線”（Strahlung：放射線、放射光）という用語の代わりに使用される。両用語は、本発明の一部として同等または均等であるとみなすことができ、可視、赤外線（ＩＲ）および紫外線（ＵＶ）の範囲の電磁放射線（elektromagnetische Strahlung：輻射線、電磁放射光）を含んでいる。
【００１２】
従って、本発明の一般的な態様（観点）によれば、空間的広がりを有する生物試料における動きを光学的にインビトロで検出するのための方法が実現される。
【００１３】
本発明による方法は、試料用の容器（レセプタクル）、光ビーム源、光学系および検出器を供給しまたは設けることを含んでいる。ここで、その光学系は、光ビーム源から放射される電磁線を容器内の試料全体に照射するよう構成され、および、試料との相互作用によって試料内部の任意の点（位置）において（電磁線の一部の）放射方向、偏光状態および／または回折パターンが変化したその光ビーム源の電磁線（放射光）の少なくとも一部を、検出器の検出面上に導くよう構成されて、光ビーム源から放射される電磁線と試料との相互作用が、試料中のその経路全体に沿って累積的に測定されるようにされる。検出器は、検出された電磁線に応じた測定信号を生成するよう構成され、それ（信号）の時間的プロファイル（Verlauf：推移、経過）は、検出された電磁線の強度の時間的プロファイルを表し、および／または、それ（信号）から、検出された電磁線の強度の時間的プロファイルを導出することができる。
【００１４】
本発明による方法は、さらに、光ビーム源からの電磁線を試料に照射すること、および測定信号の時間的変化に応じて生物試料における動きを検出すること、を含んでいる。
【００１５】
本発明による手法の１つの特定の利点は、試料との相互作用によって光の一部の放射方向、偏光状態および／または回折パターンが変化したその光の一部における試料の動きによって生じる変動が、測定信号における変動として直接見えるので、試料の動力学（動態）をその方法の測定値から直接導出できること、である。従って、撮像（結像）方法で必要とされる測定データの複雑な処理を省略することができる。
【００１６】
その方法は、例えば、測定信号における変化が所定の閾値を超えた場合に、試料における動きを検出するよう、設計することができる。さらに、筋組織における収縮を検査したときに、測定信号の時間的変化が周期性を有する場合に、動きを検出することができる。
【００１７】
その方法は、比較的単純な光学要素（光学素子）を用いて実施してもよい。個々の像平面（レベル）上に焦点合わせし試料体積を連続的に走査するための光学系は、必要でない。従って、その方法を実施するための装置は、費用効率的に実現でき、コンパクトな（小型の）構造のものとすることができる。
【００１８】
また、測定信号の簡単な評価およびコンパクトな構造のおかげで、その方法は、複数の試料の並行的（同時的）監視にも適しており、スクリーニング環境にまたは自動化された高いスループットの処理に、例えば高いスループットのスクリーニング処理に、効率的な形態で、統合化または一体化されてもよい。
【００１９】
特に好ましい実施形態によれば、検出器は、単一チャネル検出器として提供されるか、または検出器は単一チャネル測定信号を生成する。その測定信号は、単位時間当りのその検出面上に衝突する電磁線の強度だけを示すことが好ましい。従って、試料における動きは、信号の時間的変化または変動によって直接検出することができる。
【００２０】
検出器は、非画像（非撮像）検出器または非空間分解型の測定信号を有する検出器、例えば非空間分解型の光検出器、例えばフォトダイオードであることが好ましい。そのような検出器は、コンパクトで費用効果が高い。
【００２１】
空間的広がりを有する生物試料は、三次元生物試料として、例えば、或る三次元細胞および／または組織培養物、または或る細胞クラスタの形態の三次元生物試料として理解される。
【００２２】
生物試料の径（直径）は、少なくとも１つの空間的方向に少なくとも５０μｍ、より好ましくは空間的全方向において少なくとも５０μｍであり、しばしば空間的全方向において１００μｍより大きい。
【００２３】
試料の径（直径）は、１００μｍ乃至５ｍｍの範囲内にあることが好ましく、１００μｍ乃至１ｍｍの範囲内にあることがより好ましい。生物試料は、特に筋組織のおよび／または生細胞（生きている細胞）の試料、即ちアクティブ・ダイナミックス（動態）を有する細胞の試料、即ち動きを引き起こすことができる細胞の試料であってもよい。
【００２４】
生物試料における動きの検出は、特に、生物試料内の動きまたは生物試料の試料成分の動きの検出として理解されるべきである。換言すれば、空間的広がりを有する生物試料におけるまたは生物試料内の動的現象は、一般に検出可能であるはずである。筋細胞の細胞培養物では、そのような動きは、例えば個々の筋細胞の収縮によって引き起こされ得る。
【００２５】
しかし、生物試料は、自由に浮遊する微生物（自由浮遊微生物）の或る試料、例えば精子であってもよい。この場合、自由に浮遊する微生物の動きを検出するための方法は、例えば精子の場合、例えば精子の運動性（Spermienmotilitaet：精子モビリティ）を決定または測定するために、使用することができる。
【００２６】
光学系は照射側に配置された照射光学系を含んでもよく、その照射光学系を用いて、光ビーム源の電磁線（放射光）が、試料に完全にかつ可能な限り均一に照射されるように、試料全体に方向付けられる。
【００２７】
また、光学系は検出光学系も含んでもよく、その検出光学系で、試料から放射される光は、試料との相互作用によってその放射方向、偏光状態および／または回折パターンが変化して、検出器の検出面に導かれる。
【００２８】
光学系のこの機能的特性は、他の実施形態の例を参照して以下で説明するように、例えば、ここではフィルタ、レンズ、遮蔽部または遮光部、屈折要素、等のような、１つ以上の適切に配置されおよび設計された既知の光学的構成要素および部品を用いて、実現されてもよい。
【００２９】
ここで１つの有利な実施形態の変形例の想定では、試料中を透過した光ビーム源の透過電磁線（放射光）が検出器に達するようなおよび／または光ビーム源からの光が試料をバイパスしつつ検出器に達するようなビーム経路が存在しない形態で、光学系が構成されおよび／または検出器が照射ビーム経路および試料に対して配置される。
【００３０】
従って、この実施形態によれば、試料との相互作用によって放射方向、偏光状態および／または回折パターンが変化した光ビーム源からの光だけが検出器に達し、その一方で、光学系は、透過した電磁線、または試料をバイパスした電磁線が、検出器の検出面に達するのを防止する。このようにして、干渉する背景信号が減少し、測定の感度が向上する。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、試料における動きは、回折パターンの変化によって検出または認識される。この実施形態によれば、光ビーム源はコヒーレント光を生成する。また、光学系は、例えば空間フィルタによって、試料によって回折された光ビーム源からの光によって生成された回折パターンの端縁領域またはエッジ領域を、検出器上に投影またはマップするよう構成される。試料内の動きは、回折パターンの、例えばスペックル（speckle）パターンの、変化を生成する。本発明の一部として実施された調査では、回折パターンの変化をその中心で測定することは、放射強度の相対的変化が小さいので、困難であること、が示された。しかし、端縁領域では、その変化は確実に認識または検出することができ、例えば、その変化によって、回折パターンにおいて局所的な回折最大（極大）から局所的な回折最小（極小）までの一時的なまたは短期間の変化またはその逆の変化が生じる。回折パターンでは、パターンの各点に、試料全体の回折情報を含んでいる。
【００３２】
この実施形態の１つの有利な変形例では、光学系は、ピンホール遮蔽部（Lochblende）を含み、それ（遮蔽部）は、試料によって生成される回折パターンの端縁領域にピンホール遮蔽部のピンホールが配置される形態で、試料と検出器の間に配置される。
【００３３】
ピンホール遮蔽部は、孔形状の開口（Oeffnung）、好ましくは小さい孔形状の開口として、好ましくはレンズなしのものとして、理解される。ピンホール遮蔽部は、局所的に限定された光の収集に役立つ。光ファイバの前面側は、特に共焦点顕微鏡において、同じ目的のために長期間使用されてきた。
【００３４】
透過光が受光されない全ての観察角度は、好ましくは、回折パターンの端縁領域とみなされるべきである。回折パターンは、物体上で、ここでは試料上で、回折された光波の正および負の干渉によって生じる。それは、干渉が正か負かにかかわらず、物体の大きさ、光の波長、および観察角度に依存する。相互作用なしで試料を通過する光、即ち透過光、バリスティック光子は、０度の観察角度を有し、回折パターンの中心に達する。回折パターンは、透過光よりも弱く光り、Ｓ／Ｂ（Ｓ／Ｂ：信号対背景、信号背景）比およびＳ／Ｎ（Ｓ／Ｎ：信号対ノイズ、信号ノイズ）比が激しく低下する。従って、透過光が受光されない全ての観察角度は、好ましくは、回折パターンの端縁領域を表すと考えられるべきである。ここで試料全体が照射され、照射はコリメート（平行光化）されないので、透過した電磁線の“受取り（受光）領域”は唯一の１点よりも大きい（広い）。
【００３５】
この実施形態の別の変形例によれば、ピンホール遮蔽部は、回折パターンの端縁領域にそれぞれが位置する形態で回折パターンに対して配置された幾つか（複数）のピンホールを有していもよい。このために、それらのピンホールは、各ピンホールを通して検出器に衝突する回折電磁線（放射光）の重なりが、回折効果を劣化（悪化）させることなく、回折効果を増大させる形態で、配置されるべきである。
【００３６】
回折パターンの変化によって試料における動きを検出するその実施形態の別の変形例によれば、光学系は光ビーム源と試料の間に遮蔽部を含んでもよく、その遮蔽部は、遮蔽部の開口を通って出る光ビーム源からの電磁線（放射光）が、ピンホール遮蔽部中のピンホール上に直接衝突せず、即ち試料をバイパスする形態で、構成される。光学系は、さらに、屈折光学要素（素子）を含み、即ち、光ビーム源と試料の間に配置された例えば凸レンズまたはプリズムのような、電磁線を屈折させる要素を含み、その要素は、屈折要素によって偏向された電磁線が、ピンホール遮蔽部におけるピンホール上に直接衝突しない形態で、即ち試料をバイパスすることによって、構成される。これらの変形例は、調整が容易であり回折された電磁線だけをピンホール遮蔽部のピンホールに導く光学系、の費用効率の高い例を表す。
【００３７】
別の好ましい実施形態によれば、試料における動きは、その動きによって生じる偏光された光の変動によって、検出される。この実施形態によれば、光学系は、異なる偏光方向を有する第１の偏光フィルタおよび第２の偏光フィルタを含み、第１の偏光フィルタは光ビーム源と試料の間に配置され、第２の偏光フィルタは試料と検出器の間に配置される。試料における動きは、偏光された光と試料との間に相互作用の変化を生じさせ、偏光状態に変化を生じさせ、それが検出器信号に変動を生じさせる。
【００３８】
ここで、検出器および第２の偏光フィルタは、光ビーム源（側）に対して試料における反対側（試料において光ビーム源側とは反対の側）に、試料の側方に、または（試料における）光ビーム源側と同じ側に、配置されてもよい。
【００３９】
別の好ましい実施形態によれば、試料における動きは、その動きによって引き起こされる、試料によって散乱される光の変動、によって、検出される。ここで、検出器は、試料によって散乱された光をエピ検出（epidetection：後方検出、光源側で検出）するのために試料（１）において光ビーム源側と同じ側に配置されてもよい。代替形態として、検出器は、試料の側方へ散乱された電磁線を検出するために、照射ビーム経路の方向および／または試料の側方に対して、傾斜角で配置されてもよい。
【００４０】
これらの変形例は、透過電磁線が検出器上に当たるのを防止するであろう、例えば各遮蔽部のような各光学部品が不要である、という利点を提供する。
【００４１】
検出器は、さらに、試料によって散乱された光の透過光検出のために、試料に対して透過光方向に配置されてもよい。この変形例によれば、光学系は遮蔽部を含み、その遮蔽部は、光ビーム源と試料の間に配置されて、試料中を透過したビームとして検出器上に当たるであろう照射ビーム経路における光ビームを遮断するよう構成される。代替的にまたはそれに加えて、光学系は屈折光学要素を含んでもよく、その屈折光学要素は、光ビーム源と試料の間に配置されて、試料を透過した光ビームが検出器上に当たらない形態で照射ビーム経路の方向を変えるよう構成される。
【００４２】
また、光学系が、検出器の前に配置され室内光を抑制するよう設計された帯域通過フィルタを有すれば、有利である。このようにして検出の感度をさらに増大させてもよい。
【００４３】
別の好ましい変形例によれば、特に光学系、特に照射光学系は、アキシコンを含んでいる。アキシコンの焦点は唯一の点の代わりに光軸に沿って伸びるので、アキシコンの使用によって、通常のレンズと比較して空間的に“より深い”試料により均質に照射するという利点が提供される。アキシコンの別の利点は、光軸に対して一定の角度で回折されるので、入来する光（影響を受けていない光）の空間的濾波が容易なことである。
【００４４】
本発明による実現の１つの可能性による想定では、試料は担体マトリックス上に位置してもよい。従って、試料の容器（レセプタクル）は、担体マトリックス、好ましくはバイオポリマーを含むことができる。また、試料は懸滴中に位置することもできる。従って、試料の容器は懸滴を含むことができる。試料の容器は、さらに、懸滴中に位置する担体マトリックスとして設計することができ、担体マトリックスは、例えばアルギン酸塩（Alginat）のようなバイオポリマー（生物高分子）であることが好ましい。
【００４５】
試料用の容器は、スクリーニング（検査）環境でその方法を使用するためのマルチウェル・プレート（マイクロタイタ・プレート）のウェル（キャビティ）であってもよい。また、容器は、個々のウェル（所謂、懸滴マルチウェル・プレート）上に懸滴を形成するよう設計されたマルチウェル・プレートのウェルであってもよい。そのような懸滴マルチウェル・プレートは、例えば、スイス８９５２シュリーレンにある会社であるインスフェロ社（Insphero AG）により“グラヴィティプラス（GravityPLUS（登録商標））３Ｄ培養およびアッセイ（試験）プラットフォーム”の名称で提供されている。特許文献の欧州特許第２３４２３１７号（Ｂ１）にはそのようなプレートが開示されている。
【００４６】
既に上述したように、その方法は、複数の試料の、例えば自動化された高スループットの方法の一部として検査または試験される試料の、並行監視に特に適している。
【００４７】
従って、その方法の有利な別の展開形態による想定では、それを用いて、動きの並行な光学検出が、互いに分離された複数の生物試料において実施される。生物試料用の容器は、ここではマルチウェル・プレートであることが好ましく、それ（プレート）は試料を受け入れるための行と列に配置された複数のウェルを有する。検出器は、検出器アレイとして、好ましくはフォトダイオード・アレイとして、設計され、個々の検出器の格子間隔（距離）は、マルチウェル・プレートのウェルの格子間隔（距離）に等しい。
【００４８】
光ビーム源は、個々のウェルに照射されるよう構成される。有利な変形例によれば、各ウェル内の各試料に照射するための光ビーム源はレーザ・ダイオード・アレイとして構成され、個々のレーザ・ダイオードの格子間隔（距離）はマルチウェル・プレートのウェルの格子間隔（距離）に等しい。レーザ・ダイオード・アレイは、省スペースでエネルギ効率の良い照射源を表す。
【００４９】
良好な熱放散を可能にするために、レーザ・ダイオード・アレイのブラケットは、熱伝導材料で、好ましくはアルミニウムで、形成されてもよい。また、この変形例による光学系は、レンズ・アレイ、例えばマイクロ・レンズ・アレイを含み、レンズ・アレイの各レンズは複数のレーザ・ダイオードの１つに割り当てられ、複数のレンズは複数のレーザ・ダイオードの光を複数のウェル内に導く。
【００５０】
また、光ビーム源は、レーザ・ダイオード・アレイの代わりの光ビーム源として、通常の光源（レーザ、アーク灯、等）として設計することができ、光ビーム源の光は、光ファイバ束によって試料に照射するために、試料を含む個々のウェル内に結合または供給される。各光ファイバは、ここで１つのウェルに割り当てられる。これによる利点として、試料付近での過剰な熱の発生を避けるために、光源は試料から充分離れた位置で動作させることができる。
【００５１】
別の代替的な変形例によれば、光ビーム源は対応する性能能力を有していなければならないので、単純な実現変形例を表すがエネルギ効率の欠点を有する光ビーム源を、マルチウェル・プレートに表面照射する可能性もある。ここで、その光が、適切に設計された集光光学系を介し、可能性として角度依存の平行化された通過フィルタを介して、導かれ、ウェルを標的とされれば、有利である。
【００５２】
本発明の別の態様（側面）によれば、空間的広がりを有する生物試料における動きを非接触でインビトロで検出するための装置が実現される。その装置は、生物試料用の容器と、光ビーム源と、検出器と、光学系とを含み、光ビーム源から放射される電磁線を容器内の試料全体に照射するよう構成され、および、試料内の任意の点（位置）における試料との相互作用によって放射方向、偏光状態および／または回折パターンが変化した光ビーム源の電磁線の少なくとも一部を、検出器の検出面上に導くよう構成される。検出器は、検出された電磁線に応じて測定信号を生成するよう構成される。その測定信号は検出電磁線の強度の時間的プロファイル（時間経過）を表すものであり、および／または、その測定信号から検出電磁線の強度の時間的プロファイルを導出できる。
【００５３】
また、その装置は、検出された電磁線の時間的変化を表示しおよび／または評価することによって、生物試料における動きを検出するように装備された評価部（ユニット）、を有してもよい。
【００５４】
また、純粋に方法の一部として開示された特徴は、繰り返しを避けるために、装置について開示され請求項に記載されていると見なすべきである。本発明の上述の態様および特徴は、特に、光学系、検出器、容器、例えば、マルチウェル・プレート、懸滴または懸滴マルチウェル・プレート、および、光ビーム源の設計に関して、装置にも適用される。
【００５５】
本発明の前述の好ましい実施形態および特徴は、必要に応じて、互いに組み合わせることができる。本発明の他の詳細および利点を、添付の図面を参照して以下説明する。
【００５６】
本発明の他の詳細および利点を、図面を参照して以下で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本発明の実施形態による方法および装置の非常に概略的な図である。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｅは、動き検出のために試料によって散乱された光を用いる本発明の実施形態である。
【図２Ｂ】.
【図２Ｃ】.
【図２Ｄ】.
【図２Ｅ】.
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、動き検出のために偏光された光を用いる本発明の実施形態である。
【図３Ｂ】.
【図３Ｃ】.
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、動き検出のために試料の回折パターンを用いる本発明の実施形態である。
【図４Ｂ】.
【図４Ｃ】.
【図５】図５Ａは、担体マトリックス上の心筋組織モデルの形態の試料を示している。図５Ｂは、連続的な２つの時点におけるスペックル・パターンの図である。図５Ｃは、測定信号の例の時間的プロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
各図において、同じ部分には同じ参照番号が付され、別に説明はしない。
【００５９】
図１は、本発明の一実施形態による方法および装置の非常に概略的な図を示している。
【００６０】
その方法を実施するために、空間的広がり（Ausdehnung：広さ、範囲）を有する生物（biologischen：生体）試料１における動きを光学的にインビトロで検出するための装置１００が設けられる。
【００６１】
装置１００は、三次元の試料１用の容器（レセプタクル）（図示せず）、光ビーム源６、光学系７、８、および検出器２を含んでいる。
【００６２】
容器（レセプタクル）は、特定の種類の容器に限定されることなく、試料の用途および種類に応じて、例えば、キャリア（担体）として、キャリア・プレートとして、容器（Gefaes）として、マルチウェル・プレートのウェルとして、またはバイオポリマーの形態の担体マトリックス（基質）として、例えばアルギン酸塩として、適切に（適宜）設計してもよく、その上で試料が培養される。
【００６３】
光源６は、コヒーレント光源、例えばレーザとすることができるが、そうである必要はない。動き検出のために試料の回折パターンを使用する実施形態の変形例（図４Ａ〜４Ｃ、５Ａ〜５Ｃを比較されたい）のみが、コヒーレント電磁線または放射光を必要とする。
【００６４】
図１における光学系７、８の図は、単に概略的なものであり、後の図で幾つかが例として示される複数の特定の光学的な実施形態の変形例が原則として可能なので、特定の光学要素（素子）ではなく光学系の機能特性を例示することを意図している。
【００６５】
光学系のこの機能的特性は、例えば、フィルタ、レンズ、遮蔽部（遮光部、アパーチャ）、屈折要素（素子）、等のような、１つ以上の適切に配置され設計された既知の光学的構成要素および部品を用いて、実現されてもよい。
【００６６】
光学系７、８は、照射側に配置された照射（照明）光学系７を含み、それ（光学系）で、光ビーム源６の電磁線１０が、試料１全体に導かれて、試料に完全にかつできるだけ均一に照射されるようにされている。その照射光学系は、これ（光学系）のために電磁線を形成するための、例えば、遮蔽部、レンズおよび／またはフィルタのような、適切な光学要素または部品を含んでもよい。アキシコン（Axicons：円錐形プリズムまたはレンズ、回転対称プリズム）の使用は特に有利である。
【００６７】
光学系７、８は、さらに検出光学系８を含み、それ（検出光学系）によって、試料から放射される光１１、即ち、試料１との相互作用によって放射方向、偏光状態および／または回折パターンに変化が生じた光ビーム源６からの光が、検出器２の検出面２ａ上に導かれる。図１において、例えば、点（位置）Ｐ１における散乱現象（過程）が示されており、そこ（点）で、光１１は、検出器２の方向に散乱され、検出光学系８によって検出器２上に投影（マップ）される。試料１全体が均等に照射されると、試料１内の任意の点において入来光１０の相互作用が生じて、その光と試料との相互作用が、試料を通るその経路（光路）全体にわたって、検出器２によって累積的形態で測定される。
【００６８】
検出光学系８は、さらに、試料との相互作用によって（光の）放射方向、偏光状態および／または回折パターンについて変化しなかった光が検出器２に到達することがないことを確実にする光学要素を、含むことができる。検出光学系８は、例えば、検出器入口の前に配置された帯域通過フィルタを含み、それ（フィルタ）は、室内光を濾波して除去するまたは抑圧するが、光ビーム源６の波長を有する光を通過させる。これは、特定の光波長だけを試料に照射するために、単色光ビーム源が使用されること、または対応するフィルタが光ビーム源の出口に配置されること、を前提にしている。
【００６９】
また、検出光学系８は、遮蔽部、レンズ、等によってビーム経路を遮断することができ、そこ（光学系）では、試料１を透過した光ビーム源６からの透過電磁線が検出器に達するであろう、および／または、光ビーム源６からの光が試料をバイパスして（避けて、透過せずに）検出器２に達するであろう。
【００７０】
追加的にまたは代替的に、検出器は、例えば、図１に示すように、検出器２を照射ビーム経路１０に対して側方に配置することによって、透過（伝達）した光１２が検出面２ａに達しない形態で、配置されてもよい。
【００７１】
検出器２は、検出された電磁線１１に応じて測定信号９を生成するよう構成され、それ（信号）の時間的プロファイルは、検出された電磁線１１の強度の時間的プロファイル（変化）を示す。
【００７２】
従って、検出器信号９は、試料の体積測定値（全体積測定値）に等しい。検出器２は、単一チャネル検出器であることが好ましく、単位時間当りの検出器で記録された光強度の変動に等しい１つの測定パラメータ９だけが生成されるようにされる。検出器２は、例えば通常のフォトダイオード２である。
【００７３】
試料１は、図１に示された装置１００で照射され、対応する測定信号９が評価される。
【００７４】
今、試料１において動きが生じた場合、例えば培養筋組織の事例において収縮が生じた場合、試料１に到達した光と試料１との相互作用も、その動きによって変化し、即ち、試料に当たって、試料１との相互作用によって放射方向、偏光状態および／または回折パターンが変化する光１１の割合が、変化し、検出器信号９に変化を生じさせる。従って、その方法によれば、生物試料における動きは、検出器信号９における変動によって検出することができる。
【００７５】
図１に示された解決手法の特定の設計を表す本発明の実施形態の幾つかの例を、以下で説明する。光ビーム源６は、図２Ａ乃至３Ｃに示されていないが、図示の光学系および検出器の配置の上に位置し、これはビーム経路１０から明らかである。
【００７６】
図２Ａ乃至２Ｅは、動き検出のために、試料によって散乱された光を使用する本発明の実施形態を示している。図２Ａ乃至２Ｂにおいて、検出器２は、試料１に向けて透過光の方向に、試料１の散乱光１１の透過光を検出するように配置されている。試料１を透過したビームが検出器２に達するのを防ぐために、図２Ａには、試料１を透過したビームとして検出器２に達するであろう光ビーム、または試料の側方を通過して検出器２に達することができるであろう光ビーム、を遮断する遮蔽部（Blende：遮光部、絞り部）３が示されている。従って、照射光学系は、遮蔽部３の形態で、検出器２に達しない試料を透過する電磁線１２のみを通過させる。
【００７７】
図２Ｂに示された実施形態の特質（特殊性）は、大きい遮蔽部３の代わりにより小さい遮蔽部３が使用され、その後に、例えば、レンズ、アキシコン、等の屈折光学要素が使用され、それ（光学要素）が、試料１を透過したビーム１２が検出器２に達することができない形態で、遮蔽部３を通過した照射ビーム経路１０の方向を変える。
【００７８】
図２Ｃに示された実施形態の特質は、検出器２が、試料１からの反射の形態の散乱光をエピ検出する（epidetection：後方検出）ために、試料１において光ビーム源６側と同じ側に（試料１に対して光ビーム源６側と同じ側に）配置され、検出面２ａは試料１に面している。これによって、透過光を遮断するための遮蔽部が不要になるという利点が得られる。それにもかかわらず、ここで、干渉光の影響を低減することができる検出器２を囲む遮蔽部を設けることが想定される。
【００７９】
図２Ｄおよび２Ｅに図示された実施形態の変形例の特質は、散乱光１１が側方で検出されることである。このために、検出器２は照射方向の側方に配置される。図２Ｄにおいて、屈折光学要素、例えばレンズまたはプリズム４が、光ビーム源と試料１の間に配置され、照射ビーム経路１０の光が、試料１をバイパスしつつ検出器２に直接達することができない形態で、ビーム経路の方向を変化させる。
【００８０】
図２Ｅに示された実施形態が図２Ｄ（Ｅ）における変形例と異なっているのは、ビーム経路１０を狭めるように開口部を有する遮蔽部３ａが、屈折光学要素４の代わりに使用されて、照射ビーム経路１０の光が、前述の場合と同様に、検出器２に直接達しないようになっていて、即ち試料１をバイパスする点である。
【００８１】
図３Ａ乃至３Ｃは、動き検出のために偏光された光を使用する本発明の実施形態を示している。このために、照射光学系は、光ビーム源と試料１の間に配置された第１の偏光フィルタ５ａを含んでいる。検出光学系は、第１の偏光フィルタ５ａと比べて異なる偏光方向を有し、かつ試料１と検出器２の間に、好ましくは検出器入口に、配置された第２の偏光フィルタ５ｂを含んでいる。
【００８２】
検出器２および第２の偏光フィルタ５ｂは、光ビーム源に対して、試料１における反対側に配置されても、試料１の側方に配置されても、または（試料１における）光ビーム源側と同じ側に配置されてもよく、これは図３Ａ乃至３Ｃに異なる変形例で示されている。
【００８３】
２つの偏光フィルタ５ａ、５ｂの偏光方向が異なるため、偏光フィルタ５ｂは、試料との相互作用によって“偏光解消された”（depolarisiert）光だけを通過させる。従って、２つの偏光フィルタ５ａおよび５ｂの配置によって、確実に、試料を透過した光または試料をバイパスした光が検出されないようにされる。
【００８４】
試料における動きは、偏光解消される光の割合を変化させ、検出器信号に変動を生じさせて、次いで試料１における動きが検出器信号の変動から直接検出できるようになる。
【００８５】
照射ビーム経路１０を試料上に集束させる屈折光学要素４、例えば凸レンズまたはプリズムを、第１の偏光フィルタ５ａの前に配置して、散乱光の影響を低減してもよい（図３Ａおよび３Ｃ）。
【００８６】
図３Ｂの実施形態において、検出器２は、試料１からの反射の形態の散乱光をエピ検出するために、試料１における光ビーム源６側と同じ側に配置される。干渉光の影響を低減できるように、検出器２を包囲する遮蔽部３を設けることが想定されてもよい。
【００８７】
図４Ａ乃至４Ｃは、動き検出のために、例えばスペックル・パターンの形態の試料の回折パターンを使用する本発明の実施形態を示している。光源６は、コヒーレント光源であり、例えばレーザ・ダイオードである。試料で回折された光ビーム源６の光は、高い強度の中心Ｚおよび低い強度の端縁領域Ｒを有する回折パターンを生成する。
【００８８】
検出光学系は、ピンホール遮蔽部３ｂのピンホール３ｃが試料によって生成された回折パターンの端縁領域Ｒに配置される形態で試料１と検出器２の間に配置されていて、検出器２の正面に配置されたピンホール遮蔽部３ｂ、を含んでいる。
【００８９】
図４Ａの変形例によれば、照射光学系は、光ビーム源６から遮蔽部３ａの遮蔽部開口３ｄを通って出る電磁線がピンホール遮蔽部３ｂのピンホール３ｃに直接達しない形態で構成された、光ビーム源と試料の間に配置された遮蔽部３ａ、を含んでいる。
【００９０】
図４Ｂおよび４Ｃの変形例によれば、照射光学系は、光ビーム源６と試料１の間に屈折光学要素４ａ、例えば凸レンズ、を含み、それ（要素）は、屈折光学要素４ａによって回折された電磁線が、ピンホール遮蔽部３ｂのピンホール３ｃに直接達せず、即ち一方で試料をバイパスする形態で、設計される。
【００９１】
図４Ｃの変形例において、試料１とピンホール遮蔽部３ｂの間に、光ビーム源６の波長と等しくない室内光を濾波して除去する帯域通過フィルタ１３も配置される。図４Ｃに示された構成を用いて、心筋拍動を、目視観察（顕微鏡を用いる）に匹敵する感度で現在検出することができる。
【００９２】
図５Ａは、細胞クラスタの形態の試料１の例を示している。細胞クラスタは、懸滴内に位置し、図５Ａにおいて、懸滴マルチタイタ・プレートのウェル内に形成されたその一部だけが見える。試料は、幹細胞から分化した心筋組織モデルからなり、それ（試料）はアルギン酸塩の形態で担体ビーズ１５に接着する。図５Ａに示された試料は、約１ｍｍの径（直径）を有する。
【００９３】
試料１は、レーザ・ダイオードを用いて波長６５０ｎｍの光が完全に照射される。異なるサイズ・スケールで構造化された試料１は、コヒーレント光を様々な形態で回折し、透過光方向に複雑な回折パターン（所謂“スペックル・パターン”）を生成する。局所的な心筋収縮によって生じる組織内のこれらの構造における小さい変形または歪みは、スペックル・パターン全体に変化をもたらす。
【００９４】
図５Ｂは、収縮の最小および最大の変形または偏向状態のスペックル・パターンの２つの異なる状態を示す例としての画像１７ａおよび１７ｂを示している。画像１７aおよび１７ｂは、単に明確化のために使用され、別の実験に由来し、図５Ａの試料１のスペックル・パターンを示していない。しかし、測定原理は同じである。回折パターン１７ａ、１７ｂの端縁領域Ｒにおける一点は、空間フィルタ、例えばピンホール遮蔽部３ｂによって、検出器２上に結像される。次に、パターン１７ａ、１７ｂの変化は、ピンホール遮蔽部３ｂが通過させた変動する光量を生じさせ、従って、図５Ｃに示されているような変動する検出器信号９を生じさせる。信号９の周期的な変動は、筋組織における周期的な収縮に等しい。また、図５Ｃの図は、単に明確化のために使用され、図１Ａに示された試料の照射期間中に測定された測定信号を示してはいない。
【００９５】
本発明を特定の実施形態の例を参照して説明してきたが、この分野の専門家にとって、本発明の範囲を逸脱することなく、異なる変更を施し、均等物を代替物として使用してもよいことは明らかである。さらに、関連する分野から逸脱することなく、多くの変形を施してもよい。従って、本発明は、開示された実施形態の例に限定されるものではなく、開示された特許請求の範囲に含まれる実施形態の全ての例を包含することが意図されている。特に、本発明は、引用される請求項に関係なく、従属請求項の構成および特徴に対する保護をも請求するものである。
【図１】
2018515787.tif 000003
【図２Ａ】
2018515787.tif 000004
【図２Ｂ】
2018515787.tif 000005
【図２Ｃ】
2018515787.tif 000006
【図２Ｄ】
2018515787.tif 000007
【図２Ｅ】
2018515787.tif 000008
【図３Ａ】
2018515787.tif 000009
【図３Ｂ】
2018515787.tif 000010
【図３Ｃ】
2018515787.tif 000011
【図４Ａ】
2018515787.tif 000012
【図４Ｂ】
2018515787.tif 000013
【図４Ｃ】
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【図５】
2018515787.tif 000015
【国際調査報告】
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2018515787.tif 000017
2018515787.tif 000018
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2018515787.tif 000021
2018515787.tif 000022
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