(57)【要約】本明細書に記載される技術の態様は、好中球細胞外トラップ（NET）の形成であるNETosisが、創傷において、臓器線維化において、および糖尿病を有する対象において増加するという発見に一部基づくものである。したがって、創傷、線維化、および糖尿病におけるNET関連合併症を処置するための方法が提供される。該方法は、治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物、例えば、PAD4阻害物質、DNase、ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NETのある成分に対する抗体；NET放出の阻害物質、プロテアーゼ阻害物質、またはエラスターゼ阻害物質を、処置を必要とする対象に投与する工程を含む。2018503685.tif 000019
2018503685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における臓器線維化を処置または予防する方法であって、
処置を必要とする対象に、治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程
を含む、方法。
【請求項２】
少なくとも一つの抗NET化合物が、DNase；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；およびPAD4阻害物質からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
PAD4阻害物質が、Cl-アミジンおよびF-アミジンからなる群より選択される、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
治療有効量の抗NET化合物が予防的に投与される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
対象の年齢が、40歳超、30歳超、50歳超、60歳超、および70歳超からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
対象が、心臓疾患、肺疾患、腎疾患、肝疾患、および糖尿病からなる群より選択される疾患と診断される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
治療有効量の抗NET化合物が繰り返し与えられる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
対象が、老化に伴う臓器線維化を有すると診断される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
対象が、心臓線維化、肺線維化、肝臓線維化、腎臓線維化、皮膚線維化、軟組織線維化、および腸線維化からなる群より選択される臓器線維化を有すると診断される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
投与が、線維化を有する臓器中の一つまたは複数の標的部位への局所投与である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
対象が嚢胞性繊維症を有しない、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程を含む、創傷治癒を促進するための方法。
【請求項１３】
抗NET化合物が、DNase；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；およびPAD4阻害物質からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
DNAseと、ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NET放出阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；およびPAD4阻害物質からなる群より選択される追加の抗NET化合物とが投与される、請求項12〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
抗NET化合物がDNaseではない、請求項12〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
PAD4阻害物質が、Cl-アミジンおよびF-アミジンからなる群より選択される、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
治療有効量の抗NET化合物が予防的に投与される、請求項12〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
治療有効量の抗NET化合物が繰り返し与えられる、請求項12〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
対象が糖尿病を有すると診断される、請求項12〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程を含む、糖尿病におけるNET関連炎症および合併症を処置するための方法。
【請求項２１】
抗NET化合物が、DNase；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NET放出阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；およびPAD4阻害からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
抗NET化合物がDNaseではない、請求項20〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
抗NET化合物がエラスターゼ阻害物質ではない、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
PAD4阻害物質が、Cl-アミジンおよびF-アミジンからなる群より選択される、請求項20〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
治療有効量の抗NET化合物が予防的に投与される、請求項20〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
治療有効量の抗NET化合物が繰り返し与えられる、請求項20〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
対象が1型糖尿病を有すると診断される、請求項20〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
対象がII型糖尿病を有すると診断される、請求項20〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
炎症が、処置前の炎症と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも50%低下する、請求項20〜28のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国法典第35編第119条(e)項の下に、2015年1月20日に出願された米国特許仮出願第62/105,342号の恩典を主張するものであり、その内容は参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の補助金
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与された助成金番号第RO1HL102101の下で政府の補助金によって成された。米国政府は、本発明に一定の権利を保有する。
【０００３】
技術分野
本明細書に記載される科学技術は、間質コラーゲン沈着に起因する臓器線維化を処置および予防する方法、ならびに創傷の処置のための方法に、さらには糖尿病におけるNET関連合併症の処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
線維化は、臓器または組織中の、例えばコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分の過剰な形成である。このプロセスでは、機能性の実質臓器組織が線維性組織に置き換わり、これが臓器機能を重度に減衰させる可能性がある。線維化は、典型的には、持続性感染、自己免疫反応、アレルギー応答、化学的損傷、放射線および組織傷害を含む様々な刺激によって誘発された慢性炎症の結果である。
【０００５】
線維化と炎症との間の周知の関係性にもかかわらず、一般に線維化における、特に老化に伴う臓器線維化における、好中性顆粒球の役割は不明のままである。好中球は、損傷後数分以内に傷害の部位に遊走して、炎症プロセスにおける「防御の最前線」を成す。好中球は、食作用およびミエロペルオキシダーゼのような殺菌性タンパク質の放出を含め、病原体に対抗する豊富な防衛機構を保有する（Mayadas et al. (2014) Annu Rev Pathol 9:181-218（非特許文献1））。活性化シグナルに応答して、好中球は、インビトロおよびインビボで効果的にNADPHオキシダーゼ複合体を形成し、これが細胞浸透性の活性酸素種（ROS）の産生を導く（Clark RA (1999) J Infect Dis 179 Suppl 2:S309-317（非特許文献2））。
【０００６】
数年前、好中球の新たな防衛機構である、NETosisと称されるプロセスが発見された。ここで、好中球は、それらのクロマチンを、抗微生物ペプチドで覆われた好中球細胞外トラップ（NET）として放出して、病原体を捕捉および殺傷する（Brinkmann V, et al. (2004) Science 303(5663):1532-1535（非特許文献3））。この機構は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（PAD4）という酵素に大いに依存し、この酵素は、ヒストン尾部上の特異的なアルギニン残基をシトルリン化して、結果としてNETの放出に先立って起こるクロマチンの脱凝縮をもたらす（Wang Y, et al. (2009) J Cell Biol 184(2):205-213（非特許文献4））。不運にも、NETosisはまた、低酸素（De Meyer SF et al. (2012) Arterioscl Thromb Vasc Biol 32(8):1884-1891（非特許文献5））または自己免疫疾患におけるような無菌性炎症（Kolaczkowska E & Kubes P (2013) Nat Rev Immunol 13(3):159-175（非特許文献6））のような非感染状態下でも起こる。ヒストンが強力な細胞毒性および炎症誘発性であり、好中球遊走を促進し、高濃度では宿主死さえ促進するので、NETは内皮および下層組織に傷害性である（Xu J, et al. (2009) Extracellular Histones Are Major Mediators of Death in Sepsis. Nat Med 15(11):1318-1321（非特許文献7））。
【０００７】
加えて、PAD4-/-マウスは、心筋虚血／再潅流傷害（MI/R）のモデルにおいて心臓組織中への減少した好中球浸潤を示し（Savchenko AS, et al. (2014) Blood 123(1):141-148（非特許文献8））、このことは、NETの炎症誘発性の役割に関する追加の証拠を提供する。NET放出はまた、深部静脈血栓（DVT）（Brill A, et al. (2012) J Thromb Haemost 10(1):136-144（非特許文献9）; Martinod K, et al. (2013) Proc Natl Acad Sci U S A 110(21):8674-8679（非特許文献10）; および Fuchs TA, et al. (2010) Proc Natl Acad Sci U S A 107(36):15880-15885（非特許文献11））、輸血関連急性肺傷害（Thomas GM, et al. (2012) Blood 119(26):6335-6343（非特許文献12））、MI/R (Savchenko AS, 上記）および癌（Demers M, et al. (2012) Proc Natl Acad Sci U S A 109(32):13076-13081（非特許文献13）; Cools-Lartigue J, et al. (2013) Neutrophil Extracellular Traps Sequester Circulating Tumor Cells and Promote Metastasis. J Clin Invest（非特許文献14））のような多くの病的状態下でも引き起こされる可能性がある。
【０００８】
臓器線維化は、慢性炎症性疾患および老化と関連する、病的状態である。線維化では、細胞外マトリックス（ECM）の過剰な沈着が、組織の構造および機能を重度に害し、最終的には臓器不全をもたらす。そのプロセスは、主に筋線維芽細胞の誘発によって媒介され、これがECMの主要成分であるコラーゲンIを大量に産生することが解明されている（Satoshi Ueha1 et al., (2012) Front. Immunol., 3:(71)1-6（非特許文献15））。したがって、筋線維芽細胞の起源、発生経路、および調節機構が潜在的な治療標的として注目されているが、他の経路が関与する場合がある。臓器線維化の背後にあるその機構の理解を深めることは、臓器機能に与える破壊的な影響の処置のための新たな標的を提供することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Mayadas et al. (2014) Annu Rev Pathol 9:181-218
【非特許文献２】Clark RA (1999) J Infect Dis 179 Suppl 2:S309-317
【非特許文献３】Brinkmann V, et al. (2004) Science 303(5663):1532-1535
【非特許文献４】Wang Y, et al. (2009) J Cell Biol 184(2):205-213
【非特許文献５】De Meyer SF et al. (2012) Arterioscl Thromb Vasc Biol 32(8):1884-1891
【非特許文献６】Kolaczkowska E & Kubes P (2013) Nat Rev Immunol 13(3):159-175
【非特許文献７】Xu J, et al. (2009) Extracellular Histones Are Major Mediators of Death in Sepsis. Nat Med 15(11):1318-1321
【非特許文献８】Savchenko AS, et al. (2014) Blood 123(1):141-148
【非特許文献９】Brill A, et al. (2012) J Thromb Haemost 10(1):136-144
【非特許文献１０】Martinod K, et al. (2013) Proc Natl Acad Sci U S A 110(21):8674-8679
【非特許文献１１】Fuchs TA, et al. (2010) Proc Natl Acad Sci U S A 107(36):15880-15885
【非特許文献１２】Thomas GM, et al. (2012) Blood 119(26):6335-6343
【非特許文献１３】Demers M, et al. (2012) Proc Natl Acad Sci U S A 109(32):13076-13081
【非特許文献１４】Cools-Lartigue J, et al. (2013) Neutrophil Extracellular Traps Sequester Circulating Tumor Cells and Promote Metastasis. J Clin Invest
【非特許文献１５】Satoshi Ueha1 et al., (2012) Front. Immunol., 3:(71)1-6
【発明の概要】
【００１０】
概要
本明細書において、本発明者らは、老化において顕著であるROSによって調節されるNETosis（Tabas I & Glass CK (2013) Science 339(6116):166-172; and Akong-Moore K, et al. prominent aging (2012) PloS One 7(8):e42984）が線維化と関連性があるかどうかを評価した。本発明の態様は、NETの形成に必要とされる重要な酵素であるペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（PAD4）が老化に伴う臓器線維化を増進させるという発見に一部基づくものである。特に、本発明者らは、老化に伴う臓器線維化および心不全におけるNETの役割を調査した。本発明者らは、好中球数が老齢マウスにおいて増加すること、および、これらの好中球が若齢マウス由来の好中球よりもNETの形成に感受性であることを示す。本発明者らは、若齢および老齢の野生型（WT）マウスならびにNETosisに欠陥があるペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（PAD4）欠損マウスの臓器を研究した。実際に、PAD4-/-マウスは、心エコー検査によって判明したとおり、老化に伴う収縮期および拡張期の心機能の低下から保護されていた。本発明者らは、両方の遺伝子型における左室間質の線維化を評価し、そして、WTマウスの心臓においてのみ老化に伴う間質コラーゲンの増加を見いだした。線維化のレベルは、収縮期心不全の程度と相関していた。線維化からの部分保護は、老齢WTマウスと比較して老齢PAD4-/-マウスの肺において見いだされた。したがって、臓器線維化の病因においてPAD4/NETに普遍的な役割があり、それゆえ、PAD4/NETは、臓器線維化の処置のための新規標的である。
【００１１】
本発明の一局面において、臓器線維化を処置または予防するための方法が本明細書において提供される。該方法は、処置を必要とする対象に、治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程を含む。
【００１２】
特定の態様において、対象は、老化に伴う臓器線維化を有すると診断されるか、または以下からなる群より選択される臓器線維化を有すると診断される；心臓線維化、肺線維化、肝臓線維化、腎臓線維化、皮膚線維化、軟組織線維化、および腸線維化。
【００１３】
特定の態様において、抗NET化合物は、以下からなる群より選択される：DNase；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；およびPAD4阻害物質。特定の態様において、PAD4阻害物質は、以下からなる群より選択される：Cl-アミジンおよびF-アミジン。特定の態様において、該阻害物質は、例えばGSK484およびGSK199を非限定的に含む、可逆性である選択的PAD4阻害物質である（Nat. Chem. Biology, 印刷中）。
【００１４】
特定の態様において、PAD4阻害物質は、例えばSubramanian et al., Design, synthesis and biological evaluation of tetrazole analogs of Cl-amidine as protein arginine deiminase inhibitors J. Med. Chem., DOI: 10.1021/jm501636x Publication Date (Web): January 5, 2015 に記載されているような、テトラゾール類似体である。
【００１５】
一態様において、テトラゾール類似体は、PAD4発現細胞において増強した細胞殺傷を示しかつ好中球細胞外トラップの形成も遮断する、ビフェニルテトラゾール tert-ブチル Cl-アミジン（BTT-Cl-アミジン）である（Subramanian et al., 上記）。
【００１６】
特定の態様において、PAD4阻害物質は、例えばTrabocchi et al. Peptidomimetics as protein arginine deiminase 4 (PAD4) inhibitors, J. Enzyme Inhib. Med. Chem., early online 1-6 (2014): DOI:10.3109/147563662014947976 に記載されているような、例えばベータ-フェニルアラニンおよびグアニジン骨格を包含する1,2,3-トリアゾールペプチドミメティック系誘導体を非限定的に含む、ペプチドミメティック化合物である。また、Trabocchiら（上記）に記載されているような16個のペプチドミメティックPAD4阻害物質、例えば1,2,3-トリアゾールペプチドミメティック系誘導体の化学を説明している図13も参照されたい。
【００１７】
特定の態様において、抗NET化合物は、細胞からのNET放出の阻害物質であり、例えば、Cl-アミジンは、インビトロでNZM好中球からのNET放出を遮断し、他のNET放出の阻害物質は、当業者に公知である。
【００１８】
特定の態様において、PAD4阻害物質は、BB-Cl-アミジンである（Knight et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.Ann Rheum Dis doi:10.1136/annrheumdis-2014-205365, online August 2014）。
【００１９】
特定の態様において、PAD4阻害物質は、Wang et al., (2012) J. Biol. Chem 287(31):25941-53 に記載されているようなYW3-56である。
【００２０】
特定の態様において、治療有効量の抗NET化合物は、線維化の予防のために、対象に予防的に投与、例えば繰り返し投与される。特定の態様において、対象の年齢は、40歳超、30歳超、50歳超、60歳超、および70歳超からなる群より選択され、例えば、予防的投与は、高齢者における線維化の進行または発症を予防する。
【００２１】
特定の態様において、対象は、心臓疾患、肺疾患、腎疾患、肝疾患、および糖尿病からなる群より選択される疾患と診断され、例えば、予防的投与は、それによって該疾患を有する患者における線維化の進行または発症を予防する。特定の態様において、肺疾患は、嚢胞性繊維症ではない。特定の態様において、抗NET化合物は、PAD4阻害物質ではなく、DNase；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、およびエラスターゼ阻害物質からなる群より選択される。
【００２２】
一態様において、抗NET化合物は、線維化を伴うまたは線維化に感受性である臓器中の一つまたは複数の標的部位に、例えば、注射によって、または局所適用によって、局部的に投与される。
【００２３】
特定の態様において、線維化を伴う対象は、嚢胞性繊維症を有しない。
【００２４】
本明細書において、本発明者らはまた、1型および2型糖尿病患者ならびにマウスから単離された好中球がNETosisへとプライミングされたことを解明した。クロマチン脱凝縮において重要な酵素であるペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（PAD4）の発現は、糖尿病の好中球では4倍上昇した。切除術による皮膚創傷を受けた場合、野生型（WT）マウスは、その創傷部位で大量のNETを産生したが、これはPAD4-/-マウスでは起こらなかった。より高いレベルのNETバイオマーカーが糖尿病マウスの創傷中に見いだされ、付随して治癒の著しい遅れが起こった。印象深いことには、PAD4-/-マウスは、WTマウスより速く治癒し、それらの創傷治癒は糖尿病によって悪化しなかった。NETを破壊するDNase 1は、WTマウスにおいて創傷治癒を加速させた。本発明者らは、とりわけ、好中球がNETosisに対してより感受性である糖尿病において、NETが創傷治癒を弱めると結論付ける。それゆえ、NETosisを阻害することまたはNETを開裂することは、糖尿病における創傷治癒を改善しかつNETによって駆動される慢性炎症を低下させる治療戦略である。
【００２５】
したがって、本発明の別の局面において、創傷治癒を促進するための方法が提供される。該方法は、治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程を含む。特定の態様において、創傷治癒を促進するために使用される抗NET化合物は、DNaseではない。
【００２６】
特定の態様において、創傷治癒を促進するために抗NET化合物で処置されるべき対象は、糖尿病を有すると診断される。
【００２７】
本発明のなお別の局面において、糖尿病におけるNET関連合併症を処置するための方法が提供される。該方法は、治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程を含む。特定の態様において、糖尿病と関連する炎症は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも50%減少する。特定の態様において、創傷治癒は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも50%促進される。
【００２８】
特定の態様において、上記局面の各々で、抗NET化合物は、以下からなる群より選択される：DNase；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；およびPAD4阻害物質。
【００２９】
特定の態様において、上記局面の各々で、PAD4阻害物質は、以下からなる群より選択される：Cl-アミジンおよびF-アミジン。特定の態様において、該阻害物質は、例えばGSK484およびGSK199を非限定的に含む、可逆性である選択的PAD4阻害物質である（Nat. Chem. Biology, 印刷中）。
【００３０】
特定の態様において、上記局面の各々で、PAD4阻害物質は、例えばTrabocchi et al. Peptidomimetics as protein arginine deiminase 4 (PAD4) inhibitors, J. Enzyme Inhib. Med. Chem., early online 1-6 (2014): DOI:10.3109/147563662014947976 に記載されているような、例えばベータ-フェニルアラニンおよびグアニジン骨格を包含する1,2,3-トリアゾールペプチドミメティック系誘導体を非限定的に含む、ペプチドミメティック化合物である。また、Trabocchiら（上記）に記載されているような16個のペプチドミメティックPAD4阻害物質、例えば1,2,3-トリアゾールペプチドミメティック系誘導体の化学を説明している図13も参照されたい。
【００３１】
特定の態様において、上記局面の各々で、PAD4阻害物質は、例えばSubramanian et al., Design, synthesis and biological evaluation of tetrazole analogs of Cl-amidine as protein arginine deiminase inhibitors J. Med. Chem., DOI: 10.1021/jm501636x Publication Date (Web): January 5, 2015 に記載されているような、テトラゾール類似体である。
【００３２】
一態様において、上記局面の各々で、テトラゾール類似体は、PAD4発現細胞において増強した細胞殺傷を示しかつ好中球細胞外トラップの形成も遮断する、ビフェニル テトラゾール tert-ブチル Cl-アミジン（BTT-Cl-アミジン）である（Subramanian et al., 上記）。
【００３３】
特定の態様において、上記局面の各々で、PAD4阻害物質は、Wang et al., (2012) J. Biol. Chem 287(31):25941-53 に記載されているようなYW3-56である。
【００３４】
特定の態様において、上記局面の各々で、PAD4阻害物質は、例えばTrabocchi et al. Peptidomimetics as protein arginine deiminase 4 (PAD4) inhibitors, J. Enzyme Inhib. Med. Chem., early online 1-6 (2014): DOI:10.3109/147563662014947976 に記載されているような、例えばベータ−フェニルアラニンおよびグアニジン骨格を包含する1,2,3-トリアゾールペプチドミメティック系誘導体を非限定的に含む、ペプチドミメティック化合物である。また、Trabocchiら（上記）に記載されているような16個のペプチドミメティックPAD4阻害物質、例えば1,2,3-トリアゾールペプチドミメティック系誘導体の化学を説明している図13も参照されたい。
【００３５】
特定の態様において、上記局面の各々で、抗NET化合物は、細胞からのNET放出の阻害物質であり、例えば、Cl-アミジンは、インビトロでNZM好中球からのNET放出を遮断し、他のNET放出の阻害物質は、当業者に公知である。
【００３６】
特定の態様において、本発明の上記局面の各々で、投与される抗NET化合物は、DNaseではない。
【００３７】
特定の態様において、本発明の上記局面の各々で、抗NET化合物は、エラスターゼ阻害物質ではない。
【００３８】
特定の態様において、本発明の上記局面の各々で、1つよりも多い抗NET化合物、例えばPAD4阻害物質およびDNase、またはPAD4阻害物質およびエラスターゼ阻害物質が投与される。
【００３９】
特定の態様において、本発明の上記局面の各々で、治療有効量の抗NET化合物は、予防的に投与される。
【００４０】
特定の態様において、本発明の上記局面の各々で、治療有効量の抗NET化合物は、単回用量の投与として与えられる。特定の態様において、該用量は、繰り返し与えられる。
【００４１】
特定の態様において、本発明の上記局面の各々で、少なくとも一つの抗NET化合物を含む組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。さらなる態様において、少なくとも一つの抗NET化合物を含む組成物は、処置されるべき病態、例えば、創傷、線維化または糖尿病におけるNETによって駆動される炎症および遅延した創傷治癒を処置または予防する際に有用である、別の化合物をさらに含む。
【００４２】
本発明の種々の態様の詳細は、以下の記載において説明される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、本記載および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。ここに引用される全ての参考文献は、本明細書において、開示の目的のために参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図1a〜1kは、糖尿病またはインビトロの高グルコース濃度が、ヒトおよびネズミの好中球をプライミングしてNETosisを起こすことを示す。図1a〜図1cは、募集されて新鮮全血から末梢好中球が単離された、健康な対象（黒色）および真性糖尿病（DM）（桃色、1型DM；紫色、2型DM）の患者中のHbA1cのグラフである。（図1a）全ての糖尿病患者は、HbA1c>6.5%を有していた。図1bは、糖尿病患者から単離されたより多くの好中球が、イオノマイシン（4μM）で刺激されたとき、インビトロでNETを形成したことを示すグラフであり、図1cは、これらの好中球が、はめ込み図（inlay）のウエスタンブロッティングによって反映されるとおり、健康な対象由来の好中球と比較してより多くのPAD4を発現したことを示すグラフである；糖尿病の第一のレーンは、1型糖尿病であり、レーン2およびレーン3は、II型糖尿病である。図1dは、高グルコース（HG）で処置した健康な対象由来のより多くの好中球が、刺激の有無に関係なく、正常グルコース（NG）またはマンニトール（M）の場合よりもNETを産生したことを示すグラフである。1条件当たりn＝5。図1e〜図1iは、ストレプトゾトシン（STZ）で誘発された糖尿病マウス（図1e〜図1g）またはdb/db糖尿病マウス（図1h〜図1i）から好中球を単離して、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来のLPSを用いて表示濃度で2.5時間刺激したグラフである。STZで誘発された糖尿病マウスまたはdb/dbマウス由来のより多くの好中球が、H3Cithighであり（図1e、図1h）、正常血糖のビヒクル処置対照（図1e、図1f）またはm+/dbマウス（図1h、図1i）と比較してNETを形成した（図1f、図1i）。US、未刺激。ビヒクルについてn＝12、STZについてn＝10；m+/dbについてn＝6〜7；db/dbについてn＝7〜8。図1gは、標識によって示したとおりの、ビヒクルまたはSTZで処置したマウス由来の単離好中球の代表的な画像である。好中球を、LPS（25μg/mL）に2.5時間曝露させた。矢印は、NETを示す。スケール、50μm。図1jおよび図1kは、正常血糖の野生型マウスから単離してインビトロで高グルコースに曝露させたより多くの好中球が、（図1j）H3Cithighであり、（図1k）NETを産生したことを説明するグラフである。培地条件当たりn=10。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。（図1a〜図1c、図1h、図1i）マンホイットニー検定（Mann-Whitney test）；（図1d、図1j、図1k）反復測定分散分析（repeated measures ANOVA）、続く、ボンフェローニ事後検定（Bonferroni's post test）；（図1e、図1f）スチューデントt検定（Student's t test)。
【図２】図2a〜2bは、好中球H3Citおよび細胞外クロマチンがWTマウスの創傷中に観察されることを説明するウエスタンブロットおよびグラフであり、これは、NETの形成を示している。図2aは、皮膚傷害後のH3Cit出現の時間経過を示すウエスタンブロットである。マウスの背部皮膚に生検パンチで創傷を発生させた。疥癬および周辺の0.5mmの皮膚を表示時間で採取した。H3Citは、創傷形成後1日目から検出可能であり、3〜7日目に最大となった。H3Citは、対照の非創傷皮膚（Ctrl）では存在しなかった。H3、ヒストンH3。Ctrlに対して**P<0.01、スチューデントt検定、n＝3〜5。3日目の疥癬の直下にある創傷床の免疫蛍光画像は、細胞の大部分がLy6GおよびH3Citに陽性であったことを示した（データ示さず）。共焦点顕微鏡検査を使用した3日目の創傷の代表的な画像は、H3Citが、疥癬中のLy6G（赤色）陽性領域で細胞外DNAと共局在化したことを示した（データ示さず）。図2bは、白血球動員に欠陥があるマウス（CD18-/-、左）および抗Ly6G抗体を使用して好中球が枯渇したマウス（右、n＝7の代表）から採取された3日目の創傷のウエスタンブロットである。H3Citは、これらの創傷中で著しく低下した。IgG、抗Ly6G抗体についてのIgGアイソタイプ対照。
【図３】図3a〜3eは、PAD4欠損が正常血糖マウスにおいて創傷修復を促進することを示す。図3aは、WT（+/+）およびPAD4-/-（-/-）マウス由来の創傷の代表的なウエスタンブロットである。H3Citは、PAD4-/-マウス由来の創傷中に存在しなかった。創傷中のLy6Gレベルは、両方の遺伝子型で類似していた（また、図12a、図12bを参照のこと）。図3bは、WTおよびPAD4-/-マウスの創傷の写真のパネルである。PAD4-/-の創傷がより早く治癒し、そして、両方とも明らかな感染の徴候なく治癒した。スケール、5mm。図3cは、0日目と比較した創傷領域の変化を示すグラフである。創傷領域は、創傷形成後1日目からPAD4-/-マウスにおいてより早く減少した。WTに対して*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、スチューデントt検定、n＝9〜16。図3dは、有意により多くのPAD4-/-マウスが14日目までに完全に閉鎖した創傷を有していたことを示すグラフである。**P<0.01、フィッシャーの両側直接確率検定（two-tailed Fisher's exact test）。図3eは、WTおよびPAD4-/-マウス由来の3日目の創傷に対するH&E染色から解明された再上皮化のグラフであり（データ示さず）、再上皮化は、PAD4-/-マウスにおいてより速く起こった。***P<0.001、スチューデントt検定、n＝6〜9。WTおよびPAD4-/-マウス由来の3日目の創傷のH&E染色および共焦点顕微鏡検査の画像。H&Eは、WTマウスの疥癬中に細胞外DNAの存在を明らかにし、一方で、PAD4-/-疥癬中に無傷（輪状）で出現した好中球を明らかにした（データ示さず）。共焦点免疫蛍光画像（下のパネル）は、WTマウスの疥癬中のNETと比較して、PAD4-/-マウスの疥癬中の無傷の好中球形態およびH3Citの非存在を示した（データ示さず）。
【図４】図4a〜4iは、PAD4欠損またはDNase 1処置が糖尿病マウスにおいて創傷治癒を増強することを示すグラフおよびウエスタンブロットである。WTおよびPAD4-/-マウスを、ビヒクルまたはSTZで処置した。糖尿病の誘発後8週目に創傷を作った。全てのマウスに、創傷形成後直ちに飲料水中の抗生物質（2.5%サルファトリム（Sulfatrim））を与えた（図4a〜図4h）。図4a〜図4cは、創傷領域の減少を示すグラフである。図4d〜図4fは、時間当たりの開放創傷を有するマウスのパーセントを示すグラフである（図4a〜図4h）。全ての群のデータを複数の実験で同時に得たが、比較を容易にするために3つのグラフに分割した（図4a〜図4cおよび図4d〜図4f）。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、それぞれの創傷形成後の日数における群間（図4a〜図4c、スチューデントt検定）または曲線間（図4d〜図4f、ログランク検定）、n＝6〜9。（図4a）正常血糖マウス（ビヒクル）と比較して、STZで誘発された糖尿病のWTマウスにおいて創傷治癒が弱められた。（図4b）PAD4-/-マウスは、糖尿病状態下のWTより極めて速い創傷修復を有していた。（図4c）糖尿病は、PAD4-/-マウスにおいて創傷修復を弱めることはなかった。（図4d）STZで誘発された糖尿病のWTマウスは、正常血糖マウス（ビヒクル）と比較して遅延した創傷閉鎖を有していた。（図4e）STZで処置したPAD4-/-マウスは、STZで処置したWTマウスより早く完全な創傷閉鎖に至った。（図4f）創傷閉鎖は、正常血糖マウス（ビヒクル）と糖尿病（STZ）PAD4-/-マウス間で有意差はなかった（NS）。図4gは、創傷形成後1日目のSTZで誘発された糖尿病マウス由来の創傷中のより高いH3Citレベルを示す代表的なウエスタンブロットおよび要約データ（ビヒクルの平均に対して正規化された）である。（図4h、図4i）DNase 1（ドルナーゼアルファ（dornase alfa））処置は、（図4h）糖尿病のWTマウスおよび（図4i）正常血糖のWTマウスの両方において、創傷領域の減少（上のパネル）および再上皮化（下のパネル）を促進した。（図4h）DNase 1処置は、糖尿病のPAD4-/-マウスにおいて創傷治癒に関する追加の利益を提供しなかった。（図4h）*P<0.05、***P<0.001およびNS 有意でない、クラスカル−ウォリス検定（Kruskal-Wallis test）、続く、ダンの事後検定（Dunn's post test）を使用、#P<0.05、##P<0.01、マンホイットニー検定を使用、n＝5〜9。（図4i）*P<0.05、スチューデントt検定、n＝9〜10。
【図５】図5A〜5Eは、好中球および血小板の数が、老化WTマウスにおいて増加し、かつ、NETを産生する好中球の感受性も増加することを示すグラフである：図5Aは、若齢（8週齢）対老齢（24月齢）WTマウスの末梢血中の好中球数のグラフである。n＝6〜8。図5Bは、若齢（8週齢）対老齢（24月齢）WTマウス中の血小板数のグラフである。n＝6〜8。図5Cは、赤血球枯渇血液細胞の免疫染色したサイトスピンの閾値化分析による、H3Cit陽性好中球のパーセントの定量化のグラフである。n＝6〜8。図5Dは、全白血球サイトスピン集団中のLy6G陽性好中球の定量化のグラフである。n＝6〜8。CおよびDでは、若齢マウスは6〜8週齢であり、老齢マウスは15〜20月齢であった。図5Eは、ビヒクル（未刺激、US）、4μM イオノマイシン（iono）、または100nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート（PMA）と3.5時間インキュベートした後の、NETを形成する末梢血好中球の百分率のグラフである。老齢（24〜27月齢）マウス由来の好中球は、全ての条件下で、若齢（2〜5月齢）マウス由来の好中球よりも有意に多くのNETを形成した。n＝5。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
【図６】図6A〜6Eは、PAD4-/-マウスが、WTマウスと比較して、老化に伴う収縮期および拡張期の心機能の低下から保護されることを示すグラフおよび画像である：図6Aは、収縮期機能の尺度としての左室駆出率（LVEF）の4つのグラフであり、WTおよびPAD4-/-繁殖引退個体（1217月齢）の心臓径（IVS；d、LVPW；dおよびLVID；d）を経胸壁心エコー検査によって測定した。WT繁殖引退個体は、PAD4-/-繁殖引退個体と比較して有意に低下したLVEFを示した。心臓径は、WTとPAD4-/-の繁殖引退個体間で有意差はなかった。n＝7〜11。図6Bは、同じLVEFの心エコー測定値および心臓径が、標準の実験動物用飼料を与え続けた若齢（6〜8週齢）および老齢（14〜18月齢）WTおよびPAD4-/-マウスの一群において繰り返された、4つのグラフである。測定は、繁殖引退個体の場合と類似の結果を示し、老齢WTと老齢PAD4-/-マウスのLVEF間で有意差があった（左パネル）。老齢PAD4-/-マウスのLVEFは、若齢PAD4-/-マウスと同程度であった。老齢WTおよびPAD4-/-は、類似の心臓径を有していた。n＝4〜7。図6Cは、左室の代表的な超音波Mモード画像であり、老齢WTマウスと比較してPAD4-/-マウスにおいてより良好な収縮性を示した。S、収縮期；D、拡張期。図6Dは、若齢WTおよびPAD4-/-（6〜8週齢）マウスならびに老齢WTおよびPAD4-/-マウス（15〜20月齢）において心室拡張機能不全を評価したグラフである。Pulsed Wave Dopplerモードを使用して僧帽弁を横断する流動パターンを評価し、そして、心室充満パターンをE波とA波の間の比として計算した。老齢WTマウスだけが、平均E/A比が1未満の弱められた心室弛緩の証拠を示した。n＝4〜6。図6Eは、EおよびA波のPulsed Wave Doppler測定の特徴的な画像であり、老齢PAD4-/-マウスにおいて正常なE’Aパターン（E>A）を示し、老齢WTマウスにおいて1未満の比を導く反転したパターン（E<A）を示した。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
【図７】図7A〜7Dは、PAD4欠損が老化に伴う心臓線維化を低下させたことを示すグラフおよび画像である：図7Aは、心間質線維化を、WTおよびPAD4-/-繁殖引退個体（1217月齢）の心臓の左室の切片のコラーゲン繊維についてのシリウスレッド染色によって評価した、間質コラーゲンのグラフである。心臓組織中の線維性領域の百分率を、図7Cに示されるImageJによって定量化した（血管周囲の線維化を除く）。PAD4-/-繁殖引退個体では、間質線維化がWT繁殖引退個体よりも有意に少なかった。n＝6。図7Bは、間質コラーゲンを示すグラフである。標準飼料を与えた若齢（6〜8週齢）WTおよび若齢PAD4-/-マウスについてならびに老齢（14〜18月齢）WTおよび老齢PAD4-/-マウスについて同じ分析を実施した。シリウスレッド染色の定量化も同様に、老齢WTマウスと比較して老齢PAD4-/-マウスにおいてより少ない線維化を示した。老齢PAD4-/-マウスでは、間質コラーゲンの百分率は、若齢PAD4-/-マウスと同程度のままであった。n＝7〜8。図7Cは、心臓組織のシリウスレッド染色がPAD4-/-繁殖引退個体と比較してWT繁殖引退個体の心筋においてより多くの線維性ストランドを示した画像である。ImageJ MosaicJソフトウェアを使用して左室の合成画像を作成した；代表的なモザイクを提示する。スケールバー＝100μm。矢頭は、染色されたコラーゲンストランドを示す。図7Dは、PAD4-/-繁殖引退個体と比較したWT繁殖引退個体における心筋の間質コラーゲン繊維の増加を、コラーゲンのシリウスレッド染色（左）およびマッソントリクローム染色（右、コラーゲン繊維は、青色である（矢印を参照のこと））にてより高い倍率でより明瞭に見ることができた画像である。スケールバー＝100μm。矢頭は、コラーゲン繊維を指す。*P<0.05、**P<0.01。
【図８】図8A〜8Cは、老齢PAD4-/-マウスが老齢WTマウスよりもそれらの肺で有意に少ないコラーゲン染色を有するグラフおよび画像である。図8Aは、WTおよびPAD4-/-繁殖引退個体（12〜17月齢）の肺組織中のコラーゲン陽性領域の百分率をコラーゲンのマッソントリクローム染色およびその後の青色の繊維のカラーゲーティングを使用して定量化したことを示すグラフである。引退WT繁殖個体は、引退PAD4-/-繁殖個体よりも有意に高い肺組織中のコラーゲン百分率を有していた。n＝6〜7。図8Bは、間質コラーゲン／肺組織の%のグラフである；若齢（6〜8週齢）WTおよびPAD4-/-マウスならびに老齢（14〜18月齢）WTおよびPAD4-/-マウスについて、肺組織内のコラーゲン繊維に対して同じ分析を実施した。コラーゲン含量は、WTおよびPAD4-/-マウスの両方で、若齢マウスから老齢マウスに向かって増加したが、この増加は、老齢WTマウスにおいて有意により高かった。n＝4。図8Cは、マッソントリクローム染色で染色した肺切片の代表的な写真のパネルである。スケールバー＝20μm。*P<0.05、**P<0.01、****P<0.0001。
【図９】図9a〜9fは、WTおよびPAD4-/-マウスにおけるSTZで誘発された糖尿病の基礎パラメーターのグラフおよび画像を示す。マウスに、ビヒクルまたはSTZ（1日当たり50mg/kg）を5日連続腹腔内（i.p.)注射した。体重および食後血糖を、注射の完了の1週間後から開始して調べた。図9aは、経時的な体重のグラフであり、STZで処置したマウスの体重増加はビヒクル対照と比較して小さかった。図9bは、経時的なグルコースのグラフである。糖尿病は、食後血糖>300mg/dL（青色の点線で示される）として定義された。STZで処置したマウスは、処置後の最初の週に糖尿病になった。（図9a、図9b）ビヒクルとSTZの間で1週目から開始して全ての時点で***P<0.001、スチューデントt検定、ビヒクルについてn＝15、STZについてn＝13。図9cは、糖尿病誘発を検証する画像である。STZで処置したマウスの膵臓中のインスリン産生β細胞の際立った低下および破壊された島形態を示す代表的な免疫蛍光画像。図9dおよび図9eは、PAD4-/-マウスは、STZ注射後のWTに類似の体重（図9d）および食後血糖値（図9e）に達したことを示す。ABは、抗生物質処置（創傷形成後）の期間を示し、これはいずれの群においても食後血糖値に影響を与えなかった（図9e）。（図9d、図9e）WTビヒクルとWT STZの間で1週目から開始して全ての時点で***P<0.001、PAD4-/-ビヒクルとPAD4-/- STZの間で１週目から開始して全ての時点で###P<0.001、スチューデントt検定、WTビヒクルについてn＝7、WT STZについてn＝9、PAD4-/-ビヒクルについてn＝5、PAD4-/- STZについてn＝6。図9fは、糖尿病を誘発されたマウスのパーセントのグラフである。カイ二乗検定（Chi-square test）は、STZを使用した糖尿病誘発性においてWTとPAD4-/-の間に差がないことを示す。P＝1.00。
【図１０】図10a〜10bは、経時的な創傷治癒のグラフである。抗生物質は、創傷治癒に対するPAD4欠損の有益効果を無効にしない。抗生物質処置下で、PAD4-/-マウスは、（図10a）創傷領域の減少および（図10b）完全な創傷閉鎖に必要な日数に関して依然としてより良好であった。同じ日の群間または曲線間で*P<0.05、**P<0.01、スチューデントt検定、WTビヒクルについてn＝7、PAD4-/-ビヒクルについてn＝5。
【図１１】図11は、NETのパーセントのグラフを示す。高グルコース（HG）は、PMA（100 nM）で刺激されたNET形成を、正常グルコース（NG）培地またはマンニトール（M）（浸透圧対照）に曝露された好中球と比較して、健康な対象から単離された好中球において増強する。**P<0.01、反復測定分散分析、1条件当たりn＝5。
【図１２】図12aおよび12bは、PAD4-/-マウスの創傷において、H3Cit（図12a）が存在しないが好中球動員（図12b）が影響を受けないことを示す、ウエスタンブロットおよび定量グラフである。図3aのまとめたウエスタンブロットデータ、+/+、WT;-/-、PAD4-/-。1日目のWTに対して**P<0.01、それぞれの日のWTに対して###P<0.001、スチューデントt検定、WTについてn＝5〜8、PAD4-/-についてn＝5〜9。
【図１３】図13は、本発明において有用なペプチドミメティックPAD4阻害物質、例えば化合物1〜16を得るための化学反応の図式である。この図は、本明細書に記載される化合物1〜16を説明するために、Trabocchi et al. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., early online 1-6 (2014): DOI:10.3109/147563662014947976から得た。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
詳細な説明
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語および語句の意味を以下に提供する。当技術分野における用語の使用と本明細書に提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内に提供される定義が優先されるものとする。
【００４５】
細胞生物学および分子生物学における一般的な用語の定義は、'The Merck Manual of Diagnosis and Therapy', 18th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); The ELISA guidebook (Methods in molecular biology 149) by Crowther J. R. (2000); Fundamentals of RIA and Other Ligand Assays by Jeffrey Travis, 1979, Scientific Newsletters; Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006. Definitions of common terms in molecular biology are also be found in Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) and Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds に見いだすことができる。
【００４６】
特に指定のない限り、本発明は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; または、例えば、Methods in Enzymology Seriesの最新版、Editor: John Abelson, Melvin Simon, Anna Pyle, Elsevier Science Publishing Inc. New York に見いだされる標準的な実験室技術を使用して実施した。
【００４７】
用語「減少させる（decrease）」、「低下した（reduced）」、「低下（reduction）」、「減少させる（decrease）」または「阻害する（inhibit）」は全て、一般に、統計的に有意な量の減少を意味するように本明細書において使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「低下した（reduced）」、「低下（reduction）」または「減少させる（decrease）」または「阻害する（inhibit）」は、基準レベル、例えば、薬剤の非存在下と比較して、少なくとも10%の減少、例えば、少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%の減少を意味する。
【００４８】
用語「増加した（increased）」、「増加する（increase）」、または「増強する（enhance）」または「活性化する（activate）」は全て、一般に、統計的に有意な量の増加を意味するように本明細書において使用される；あらゆる誤解を避けるために、用語「増加した（increased）」、「増加する（increase）」、または「増強する（enhance）」または「活性化する（activate）」は、基準レベル、例えば、薬剤の非存在下と比較して、少なくとも10%の増加、例えば、少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%の増加、または少なくとも約2倍、または少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍の増加、または基準レベルと比較して2倍〜10倍の間の任意の増加またはそれ以上を意味する。
【００４９】
用語「統計的に有意な」または「有意に」は、統計的有意性を指し、一般に、マーカーの濃度が正常よりも低い、またはそれ未満である二標準偏差（2SD）を意味する。該用語は、差があるという統計的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真であるときに帰無仮説を棄却する判断を下す確率として定義される。この判断は多くの場合、p値を使用して行われる。
【００５０】
操作例における場合以外、または他に指示される場合を除き、本明細書において使用される成分の数量または反応条件を表す数字は全て、いかなる場合にも用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。用語「約」は、百分率と共に使用されるときには±1%を意味することができる。
【００５１】
単数形の用語「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に他のことを指示していない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、単語「または」は、文脈が明確に他のことを指示していない限り、「および」を含むことを意図する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。略称「例えば（e.g.）」は、例えば（Latin exempli gratia）に由来するものであり、本明細書において非限定的な例を指すために使用される。それゆえ、略称「例えば（e.g.）」は、用語「例えば（for example）」と同義である。
【００５２】
規定される全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明と共に使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を記載および開示する目的で、参照によって本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日の前に単にそれらの開示のために提供される。これに関して、本発明者らが、先行発明によってまたは任意の他の理由で、係る開示に先行する資格を有しないことを承認するものと解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関する声明または内容に関する表示は全て、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性に関するいかなる承認も認められない。
【００５３】
本明細書において使用される場合、用語「投与する」は、所望の効果がもたらされるように、組成物を所望の部位に少なくとも部分的に局在化させる方法または経路によって、組成物を対象内へ挿入することを指す。本明細書に記載される化合物または組成物は、経口または非経口経路（静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻腔、直腸、および局所（口腔および舌下を含む）投与を含む）を非限定的に含む、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与することができる。特定の態様において、抗NET化合物は、局所投与、例えば局部注射、または臓器内の標的部位への送達を可能にする他の方法によって投与される。本明細書において使用される場合、用語「局部」は、臓器または創傷に局在化させることを意味し、すなわち全身投与ではない。
【００５４】
幾つかの例示的な投与の様式は、注射、注入、点滴、吸入、または経口摂取を含むが、これらに限定されるわけではない。「注射」は、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊椎内、脳脊髄内（intracerebro spinal）、および胸骨内の注射および注入を含む。好ましい態様において、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。該用語はまた、二本の免疫グロブリン重鎖および二本の免疫グロブリン軽鎖からなる抗体だけでなく、抗体外の様々な形態；例えば、Fv、Fab、およびF(ab)'2、ならびに二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)）および単鎖（例えば、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) and Bird et al., Science 242, 423-426 (1988））（参照によって本明細書に組み入れられる）も指す（一般に、参照によって本明細書に組み入れられる、Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2ND ed. (1984), Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) and Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986) を参照のこと）。
【００５６】
発現の文脈において、本明細書において使用される場合、用語「処置する（treat）」、「処置（treatment）」、「処置すること（treating）」などは、本発明の文脈において、それが、本明細書に列挙される病態（例えば、線維化、糖尿病（例えば、糖尿病におけるNETによって駆動される炎症および遅延した創傷治癒））のいずれかに関する限り、そのような病態（例えば、線維化、糖尿病（例えば、糖尿病におけるNETによって駆動される炎症および遅延した創傷治癒））と関連する少なくとも一つの症状または合併症の進行、悪化、劣化、進行、予測される進行または重症度を軽減、緩和、改善、阻害、減速、逆行、または停止することを意味する。一態様において、病態の症状は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%緩和される。
【００５７】
疾患マーカーまたは症状の文脈における「低下させる（lower）」とは、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。その減少は、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%またはそれ以上であることができ、かつ、これは、好ましくは、そのような障害を持たない個体にとって正常な範囲内であるとして許容されるレベルまで低減する。
【００５８】
本明細書において使用される場合、語句「治療有効量」または「有効用量」は、NETによって引き起こされる病態（例えば、線維化または創傷治癒の阻害、または糖尿病の処置）の処置、予防、または管理において治療的利益を提供する量、例えば、該病態の少なくとも一つの症状（例えば、コラーゲン沈着または遅い創傷治癒、または糖尿病の炎症）の統計的に有意な減少を提供する量を指す。治療有効量の決定は、当業者の技能の十分に範囲内にある。一般に、治療有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性別だけでなく、対象における医学的状態の重症度および種類、ならびに他の薬学的に活性な薬剤の投与によって変化することができる。
【００５９】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的組成物」は、製薬業界において通常使用される化学物質および化合物の薬学的に許容し得る担体と組み合わされた活性な薬剤を指す。
【００６０】
語句「薬学的に許容し得る」は、本明細書において、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合いながらも、過度の毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適する化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
【００６１】
語句「薬学的に許容し得る担体」は、本明細書において使用される場合、主題の薬剤を一つの臓器、または身体の一部から、別の臓器、または身体の一部へと運ぶまたは輸送する際に関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などの薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合可能であるという意味で「許容し得る」ものでなければならず、例えば、担体は、処置に対する薬剤の影響を低下させない。言い換えれば、担体は、薬学的に不活性である。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。一態様において、動物は、霊長類、齧歯類、家畜、鳥類、魚類または狩猟動物のような脊椎動物である。用語「患者」、「個体」および「対象」は、本明細書において互換的に使用される。
【００６３】
好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒトまたは非ヒト霊長類であることができる。ヒト以外の哺乳類を、線維化、創傷治癒または糖尿病状態の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。加えて、本明細書に記載される方法を使用して、家畜化された動物および／又またはペットを処置することができる。
【００６４】
対象は、臓器線維化、もしくは糖尿病と過去に診断されている対象、または臓器線維化もしくは糖尿病に関連する一つまたは複数の合併症を有すると特定されたが、任意で、該病態、または該病態に関連する一つまたは複数の合併症に対する処置をまだ受ける必要のなかった対象であることができる。
【００６５】
対象はまた、該病態、例えば線維化、または糖尿病に罹患していない対象でもあることができる。例えば、対象は、線維化または糖尿病の一つまたは複数のリスク因子を示す；例えば、該疾患の家族歴を有する対象、または高齢である、例えば30歳超、もしくは40歳超、もしくは50歳超の対象であることができる。したがって、臓器線維化の形成を予防するための方法もまた提供され、該方法は、線維化のリスクを有すると判断された対象を抗NET化合物で処置する工程を含む。特定の態様において、線維化のリスクを有する患者は、少なくとも40歳、少なくとも50歳、少なくとも60歳、または少なくとも70歳である。特定の態様において、線維化のリスクを有する患者は、放射線に曝露される予定の患者、例えば任意の年齢の患者である。
【００６６】
NETosis
本明細書に記載される科学技術の態様は、対象中のNETosisが創傷治癒プロセスを遅らせ、かつ、NETosisが臓器線維化におけるコラーゲン沈着と関連性があるという発見に一部基づくものである。また、増加したNETosisが糖尿病において存在することも本明細書において解明された。
【００６７】
本明細書において使用される場合、用語「NET」は、ヌクレオソームとタンパク質、例えば抗微生物活性を有するタンパク質との細胞外複合体を指す。ヌクレオソームは、好中球、肥満細胞、好酸球、単球、または白血球に由来し得る。「NETosis」は、脱凝縮したクロマチンおよび顆粒内容物の細胞外空間への放出によって特徴付けられるユニークな形態の細胞死を介したNETの形成を指す。
【００６８】
本明細書において、本発明者らは、NETosisが創傷中および糖尿病を有する対象中で上昇することを解明した。本発明者らは、さらに、NETosisが老化において顕著であることを解明し、かつ、NETosisの発生率と臓器線維化との間の関係性を見いだした。特に、本発明者らは、NETの形成に必要とされる重要な酵素であるペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（PAD4）が老化に伴う臓器線維化を増進することを解明した。それゆえ、創傷、糖尿病および線維化を処置するための方法が提供される。該方法は、治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物（例えば、PAD4阻害物質；DNase、ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、またはエラスターゼ阻害物質、またはプロテアーゼ阻害物質）を、処置を必要とする対象に投与する工程を含む。
【００６９】
抗NET化合物
幾つかの態様は、抗NET化合物を用いた、患者における臓器線維化、または糖尿病におけるNET関連合併症（例えば、増加した炎症および遅延した創傷治癒）の処置または予防のための方法に向けられる。他の態様は、抗NET化合物を投与する工程を含む、対象における創傷治癒を促進するための方法に向けられる。特定の態様において、抗NET化合物は、創傷へ直接送達される。本明細書において使用される場合、「抗NET化合物」は、NETの任意の成分を分解するもしくは分解を標的とする、および／またはNETの形成を防止する、任意の化合物（例えば、PAD4阻害物質）を含むことができる。また、別の方法でNET成分の活性を阻害するまたは細胞のNET形成能を損なう（例えば、NET形成に必要とされるPAD4の阻害）化合物も含まれる。抗NET化合物は、核酸（DNAまたはRNA）、低分子、脂質、炭水化物、タンパク質、ペプチド、抗体、または抗体断片であることができる。幾つかの態様において、抗NET化合物は、酵素、例として、例えば核酸、タンパク質、ポリペプチド、または炭水化物を開裂および／または分解する酵素である。
【００７０】
本明細書において使用される場合、用語「低分子」は、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、約10,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機および有機金属化合物を含む）、約5,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約1,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約500グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容し得る形態を非限定的に含むことができる化学物質を指す。
【００７１】
特定の態様において、抗NET化合物は、以下からなる群より選択される；DNase、ヘパリン、抗体（すなわち、ヒストン類に対するまたは特定のヒストンに対する抗体）、ヒストン分解酵素（すなわち、肥満細胞タンパク質分解酵素1（Gene ID:1215））、プラスミン（Gene ID: 5340）、カテプシンD（Gene ID:1509）または活性化タンパク質C（Gene ID:5624））またはクロマチン脱凝縮の阻害物質（すなわち、スタウロスポリン、HDAC阻害物質（すなわち、M344）、PAD4阻害物質、プロテアーゼ阻害物質、またはエラスターゼ阻害物質（すなわち、Gelin（登録商標）））。
【００７２】
一態様において、抗NET化合物は、ヘパリンではない。一態様において、抗NET化合物は、DNaseではない。幾つかの態様において、抗NET化合物は、以下からなる群より選択される；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；またはPAD4阻害物質。
【００７３】
抗NET化合物は、当業者に周知の方法を使用して組み換え産生され得る（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989) を参照のこと）。代替的に、抗NET化合物は、市販されている。例えば、Pulmozyme（登録商標）（Genentech; San Francisco, California）、DNase（#D5319 Sigma-Aldrich; St. Louis, MO）（#90083 Thermo Scientific; Rockford, IL）、RNAse（#R4642 Sigma-Aldrich; St. Louis, MO）、ヘパリン（登録商標）（Celsus; Cincinatti, OH）、抗ヒストン抗体（ab1791, ab8580, ab8898, ab6002, ab1790, ab9053, ab10158, ab71594, ab4269 Abcam; Cambridge, MA）、肥満細胞タンパク質分解酵素1（5146-SE-010 R&D Systems; Minneapolis, MN）、トロンビン（HCT-0020 Haematologic Technologies; Essex Junction, VT）、プラスミン（HCPM-0140 Haematologic Technologies; Essex Junction, VT）、カテプシンD（1014-AS-010 R&D Systems; Minneapolis, MN）、活性化タンパク質C（AEZ004B Aniara; Mason, OH）、スタウロスポリン（S4400 Sigma-Aldrich; St. Louis, MO）、M344（M5820 Sigma-Aldrich; St. Louis, MO）またはGelin（登録商標）（G0528 Sigma-Aldrich; St. Louis, MO）。
【００７４】
特定の態様において、抗NET化合物は、モノクローナル抗体である（一般に、参照によって本明細書に組み入れられる、Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2ND ed. (1984), Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) and Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986) を参照のこと）。
【００７５】
幾つかの態様において、抗NET作用物質は、PAD4阻害物質である。本明細書において使用される場合、「PAD4」は、脱イミノ化反応を介してタンパク質のアルギニン残基をシトルリンへと変換する酵素であるペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（例えば、SEQ ID NO:01（mRNA）およびSEQ ID NO:02（タンパク質））を指す。
【００７６】
特定の態様において、抗NET作用物質は、一般的なPAD阻害物質であり、すなわち、1つよりも多い種類のPAD酵素、例えばPAD1、および／もしくはPAD2、および／もしくはPAD3、または、および／もしくはPAD4を阻害する阻害物質である。例えば、Wang et al., Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity J Biol Chem. 2012 Jul 27;287(31):25941-53;例えばYW3-56を参照されたい。また、「peptidylarginine deiminases (pad) inhibitors」という表題のPCT公開 WO/2014/188193号を参照されたい。
【００７７】
PAD4は、核内局在化シグナルを有し、それゆえ、核に侵入してヒストンをシトルリン化することが可能であるという点で、他のPADファミリー酵素から区別されている。本明細書に記載されるとおり、PAD4活性の喪失は、マウスにおいて減少したNET形成および減少したDVTをもたらす。PAD4阻害物質は、PAD4の発現または活性を減少させることができる。
【００７８】
PAD4の阻害は、PAD4活性を測定することによってモニタリングすることができる。PAD4活性のアッセイの非限定例は、以下のとおりである：100mM HEPES（pH 7.6）、50mM NaCl、および0.5mM トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を含む反応緩衝液中の候補阻害物質を、PAD4（0.2μM）（10 mM CaCl2の存在下または非存在下）と37℃で15分間プレインキュベートし、その後、基質のN-α-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル（BAEE）（終濃度10mM）（および、CaCl2がプレインキュベート中に存在しない場合に10mM CaCl2）を添加して、反応を開始することができる。15分後、液体窒素中で急速冷凍することによって反応をクエンチすることができる。発色現像のために、新たに調製したCOLDER溶液（2.25M H3PO4、4.5M H2SO4、1.5mM NH4Fe(SO4)、20mM ジアセチルモノキシム、および1.5mM チオセミカルバジド）200μLを、クエンチした反応物の各々に加え、完全な混合を確実にするためにボルテックスし、次いで、95℃で30分間インキュベートすることができる。次いで、540nmでの吸光度を測定し、そして、シトルリン標準曲線と比較して、反応過程で産生されたシトルリンの濃度を決定することができる（PAD4は、BAEE基質を脱イミノ化する）。濃度−応答データを方程式（1）に当て嵌めることによってIC50値を決定することができる。
PAD4の活性分率＝1／（1＋（［候補阻害物質］／IC50））（方程式1）
【００７９】
中間点（活性分率＝0.5）に相当する阻害物質の濃度は、IC50と称することができる。また、PAD4活性を測定するためのキットも市販されている。例えば、Cat No. 7000560, Cayman Chemical; Ann Arbor, MI。
【００８０】
PAD4の任意の阻害物質を本明細書に記載される方法において使用することができる。例えば、幾つかの態様において、PAD4阻害物質は、低分子阻害物質であることができる。PAD4の低分子阻害物質は、当技術分野において公知であり（例えば、Luo et al. Biochemistry 2006; 米国特許第7,964.636号;ならびに米国特許公報第2007/0276040号および第2011/0142868号を参照のこと；その各々は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）、非限定例として、Cl-アミジンおよびF-アミジンを含む。幾つかの態様において、PAD4阻害物質は、PAD4に特異的であることができる。幾つかの態様において、PAD4阻害物質は、PADファミリー阻害物質であることができる。PAD4阻害物質は、市販されている。例えば、Cl-アミジン（Catalog number 10599, CAS 913723-61-2, Cayman Chemical; Ann Arbor, MI）およびF-アミジン（Catalog number 10610; Cayman Chemica; Ann Arbor, MI）。
【００８１】
本明細書において使用される場合、「Cl-アミニジン」は、式Iの構造を有する化合物を指す。
2018503685.tif 000003
【００８２】
本明細書において使用される場合、「Fl-アミジン」は、式IIの構造を有する化合物を指す。
2018503685.tif 000004
【００８３】
幾つかの態様において、PAD4阻害物質は、抗体、抗体の断片を含むポリペプチド、または核酸であることができる。抗体、およびそれらを製造する方法は、本明細書で上述される。
【００８４】
特定の態様において、該阻害物質は、例えばGSK484およびGSK199を非限定的に含む、可逆性である選択的PAD4阻害物質である（Nat. Chem. Biology, 印刷中）。
【００８５】
特定の態様において、PAD4阻害物質は、例えばSubramanian et al., Design, synthesis and biological evaluation of tetrazole analogs of Cl-amidine as protein arginine deiminase inhibitors J. Med. Chem., DOI: 10.1021/jm501636x Publication Date (Web): January 5, 2015 に記載されているような、テトラゾール類似体である。
【００８６】
一態様において、テトラゾール類似体は、PAD4発現細胞において増強した細胞殺傷を示しかつ好中球細胞外トラップの形成も遮断する、ビフェニル テトラゾール tert-ブチル Cl-アミジン（BTT-Cl-アミジン）である（Subramanian et al., 上記）。
【００８７】
特定の態様において、PAD4阻害物質は、例えばTrabocchi et al. Peptidomimetics as protein arginine deiminase 4 (PAD4) inhibitors, J. Enzyme Inhib. Med. Chem., early online 1-6 (2014): DOI:10.3109/147563662014947976 に記載されているような、例えばベータ-フェニルアラニンおよびグアニジン骨格を包含する1,2,3-トリアゾールペプチドミメティック系誘導体を非限定的に含む、ペプチドミメティック化合物である。また、Trabocchi等（上記）に記載されているような16個のペプチドミメティックPAD4阻害物質、例えば1,2,3-トリアゾールペプチドミメティック系誘導体の化学を説明している図13も参照されたい。
【００８８】
特定の態様において、抗NET化合物は、細胞からのNET放出の阻害物質であり、例えば、Cl-アミジンは、インビトロでNZM好中球からのNET放出を遮断し、他のNET放出の阻害物質は、当業者に公知である。
【００８９】
特定の態様において、PAD4阻害物質は、BB-Cl-アミジンである（Knight et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.Ann Rheum Dis doi:10.1136/annrheumdis-2014-205365, online August 2014）。
【００９０】
特定の態様において、PAD4阻害物質は、Wang et al., (2012) J. Biol. Chem 287(31):25941-53 に記載されているようなYW3-56である。
【００９１】
核酸を含むPAD4阻害物質は、RNAi作用物質および／または遺伝子サイレンシング作用物質であることができる。本明細書において使用される場合、「遺伝子サイレンシング」または「遺伝子サイレンシングされた」は、RNAi分子、例えばsiRNAまたはmiRNAの活性に関して、標的遺伝子に関する細胞中のmRNAレベルが、miRNAまたはRNA干渉分子が存在しない場合の細胞中に見いだされるmRNAレベルの少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%またはそれ以上減少することを指す。好ましい一態様において、mRNAレベルは、少なくとも約70%、約80%、約90%、約95%、約99%またはそれ以上減少する。
【００９２】
本明細書において使用される場合、用語「RNAi」は、siRNAi、shRNAi、内因性マイクロRNAおよび人工マイクロRNAを非限定的に含む任意の種類の干渉RNAを指す。例として、それは、RNAの下流プロセッシングの機構に関係なく、siRNAとして過去に同定されている配列を含む（すなわち、siRNAは、mRNAの開裂をもたらす特異的なインビボプロセッシング法を有すると考えられているが、そのような配列は、本明細書に記載されるフランキング配列に関してベクター中に組み込まれることができる）。本発明の作用物質に関する用語「RNAi」および「RNA干渉」は、本明細書において互換的に使用される。
【００９３】
本明細書において使用される場合、「siRNA」は、二本鎖RNAを形成する核酸を指し、その二本鎖RNAは、siRNAが標的遺伝子sEHと同じ細胞内に存在するかまたは発現されるときに、遺伝子または標的遺伝子の発現を低減または阻害する能力を有する。二本鎖RNA siRNAは、相補鎖によって形成することができる。一態様において、siRNAは、二本鎖siRNAを形成することができる核酸を指す。siRNAの配列は、完全長標的遺伝子、またはそのサブ配列に相当することができる。典型的には、siRNAは、少なくとも約15〜50ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖siRNAの各相補配列は、約15〜50ヌクレオチド長であり、そして、二本鎖siRNAは、約15〜50塩基対長、好ましくは約19〜30塩基ヌクレオチド、好ましくは約20〜25ヌクレオチド長、例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である）。
【００９４】
本明細書において使用される場合、「shRNA」または「短ヘアピンRNA」（ステムループとも呼ばれる）は、siRNAの一種である。一態様において、これらのshRNAは、短い、例えば約19〜約25ヌクレオチドのアンチセンス鎖、その後に続く約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖から構成される。代替的に、センス鎖がヌクレオチドループ構造の前にあり、アンチセンス鎖がその後にあることができる。
【００９５】
用語「マイクロRNA」または「miRNA」は、本明細書において互換的に使用され、内因性RNAであり、その幾つかは、タンパク質コード遺伝子の発現を転写後レベルで調節することが公知である。内因性マイクロRNAは、mRNAの生産的利用をモジュレートすることが可能な、ゲノム中に天然に存在する小さいRNAである。人工マイクロRNAという用語は、mRNAの生産的利用をモジュレートすることが可能な、内因性マイクロRNA以外の任意の種類のRNA配列を含む。マイクロRNA配列は、Lim, et al., Genes & Development, 17, p. 991-1008 (2003), Lim et al Science 299, 1540 (2003), Lee and Ambros Science, 294, 862 (2001), Lau et al., Science 294, 858-861 (2001), Lagos-Quintana et al, Current Biology, 12, 735-739 (2002), Lagos Quintana et al, Science 294, 853-857 (2001), and Lagos-Quintana et al, RNA, 9, 175-179 (2003) のような刊行物に記載されており、これらは参照によって組み入れられる。また、複数のマイクロRNAを前駆体分子中に組み込むことができる。さらに、miRNAおよび／またはRNAi経路を介して内因性遺伝子の発現をモジュレートする目的で、人工miRNAおよび短い干渉RNA（siRNA）を送達するためのビヒクルとして、miRNA様ステムループを細胞中に発現させることができる。
【００９６】
本明細書において使用される場合、「二本鎖RNA」または「dsRNA」は、二本鎖からなるRNA分子を指す。二本鎖分子は、自らを折りたたんで二本鎖構造を形成する単一のRNA分子からなるものを含む。例えば、プレmiRNAと呼ばれる一本鎖miRNAが誘導される前駆分子のステムループ構造（Bartel et al. 2004. Cell 116:281-297）は、dsRNA分子を含む。
【００９７】
本明細書において使用される場合、用語「相補的」または「相補塩基対」は、DNAにおけるA：TおよびG：C、ならびにRNAにおけるA：Uを指す。大部分のDNAは、たった4個の窒素塩基：塩基または塩基性のアデニン（A）、チミン（T）、グアニン（G）、およびシトシン（C）のヌクレオチドの配列からなる。これらの塩基は一緒になって遺伝的アルファベットを形成し、そして、それらの長い規則正しい配列は、コードされた形態で、遺伝子中に存在する情報の多くを含有する。大部分のRNAもまた4個の塩基のみの配列からなる。しかしながら、RNAでは、チミンがウリジン（U）に置き換えられている。
【００９８】
本明細書において使用される場合、用語「核酸」または「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはその類似体の単位を組み込んでいる、任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであることができる。一本鎖核酸は、変性二本鎖DNAの一本鎖核酸であることができる。代替的に、それは、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸であることができる。一局面において、鋳型核酸は、DNAである。別の局面において、鋳型は、RNAである。好適な核酸分子は、ゲノムDNA、リボソームDNAおよびcDNAを含むDNAである。他の好適な核酸分子は、mRNA、rRNAおよびtRNAを含むRNAである。核酸分子は、ゲノムDNA中のように天然に存在することができるか、または、それは、合成物、すなわち、人為的に調製され得るか、またはその二つの組み合わせであり得る。核酸分子はまた、米国特許出願第20070213292号に記載されているような2'-デオキシ、2'-デオキシ-2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル（2'-O-MOE）、2'-O-アミノプロピル（2'-O-AP）、2'-O-ジメチルアミノエチル（2'-O-DMAOE）、2'-O-ジメチルアミノプロピル（2'-O-DMAP）、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル（2'-O-DMAEOE）、または2'-O--N-メチルアセトアミド（2'-O-NMA）、コレステロール付加、およびホスホロチオアート主鎖のような特定の修飾；ならびに米国特許第6,268,490号に記載されているような2'-酸素と4'-炭素原子との間がメチレン単位で連結されている特定のリボヌクレオシドを有することができ、該特許および特許出願はいずれも参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【００９９】
幾つかの態様において、PAD4阻害物質であるかまたはPAD4阻害物質をコードする核酸は、ベクターをさらに含む。用語「ベクター」は、本明細書において使用される場合、宿主細胞に送達するためにまたは異なる宿主細胞間で輸送するために設計されている、核酸構築物を指す。本明細書において使用される場合、ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスであることができる。用語「ベクター」は、適切な制御要素と会合するとき複製が可能である任意の遺伝要素および遺伝子配列を細胞に輸送することができる任意の遺伝要素を包含する。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどを含むことができるが、これらに限定されるわけではない。
【０１００】
本明細書において使用される場合、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写制御配列に連結している配列からのRNAまたはポリペプチドの発現を指令するベクターを指す。発現される配列は、細胞に対して異種である場合が多いが、その必要はない。発現ベクターは、追加の要素を含み得、例えば、発現ベクターは、2つの複製系を有し得、それゆえ、発現ベクターが、2つの生物、例えば、発現のためにヒト細胞中に、そして、クローニングおよび増幅ために原核生物宿主中に維持されることが可能である。本明細書において使用される場合、用語「ウイルスベクター」は、少なくとも一つのウイルス起源の要素を含みかつウイルスベクター粒子中にパッケージングされる能力を有する、核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、不必要なウイルス遺伝子の代わりにPAD4阻害物質を含有することができる。ベクターおよび／または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで任意の核酸を細胞中に輸送する目的に利用され得る。ウイルスベクターの多数の形態が当技術分野において公知である。本明細書に記載される方法において有用なベクターは、プラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびポックスウイルスベクターを含むことができるが、これらに限定されるわけではない。
【０１０１】
用語「複製不全」は、ウイルスベクターに関して使用されるとき、ウイルスベクターがそのゲノムをさらに複製およびパッケージングできないことを意味する。例えば、対象の細胞が複製不全の組み換えアデノ−随伴ウイルス（rAAV）ビリオンに感染すると、異種（導入遺伝子としても公知）遺伝子が患者の細胞中で発現されるが、rAAVは複製欠陥があり（例えば、ウイルスをパッケージングするための必須タンパク質をコードするアクセサリー遺伝子を欠いている）、ウイルス粒子は、患者の細胞中に形成されることができない。用語「形質導入」は、本明細書において使用される場合、外因性核酸を細胞中に導入するためのウイルス粒子またはウイルスの使用を指す。用語「トランスフェクション」は、化学的方法のような方法に関して本明細書において使用される場合、本明細書に記載されるPAD4の活性および／またはレベルを減少させる作用物質をコードする核酸配列のような外因性核酸を細胞中に導入することである。本明細書において使用される場合、トランスフェクションという用語は、外因性核酸を細胞中に導入するウイルスベースの方法を包含しない。トランスフェクションの方法は、物理的処理（電気穿孔法、ナノ粒子、マグネトフェクション）、および化学ベースのトランスフェクション法を含む。化学ベースのトランスフェクション法は、シクロデキストリン、ポリマー、リポソーム、ナノ粒子、陽イオン性脂質またはそれらの混合物（例えば、DOPA、LipofectamineおよびUptiFectin）、およびDEAE-デキストランもしくはポリエチレンイミンなどの陽イオン性ポリマーを使用する方法を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１０２】
PAD4の発現および／または活性を阻害するRNAi作用物質を製造する方法は、当技術分野において周知である。PAD4をコードするmRNA（すなわち、SEQ ID NO: 1）に相補的な配列を使用して、本明細書に上述したとおりのRNAi作用物質を設計することができる。
【０１０３】
NETの破壊は、インビボまたはインビトロでモニタリングすることができる。一態様において、NETの破壊は、試験化合物の存在下および非存在下での保存血液中のNETの放出レベルを評価することによって、例えば、ELISAおよび／またはDNA濃度の決定によって本明細書に記載されるとおりモニタリングされる。一態様において、NETを破壊する試験化合物の能力は、インビボで、例えば、血小板接着および凝集を防止する能力を決定することによってモニタリングされる。
【０１０４】
処置の方法
糖尿病（例えば、糖尿病におけるNET関連炎症および遅延した創傷治癒）、線維化、および皮膚創傷のような病態を処置する方法が本明細書に記載される。本明細書において解明されるとおり、これらの病態は、増加したNETosisと関連しており、それゆえ、NETを、これらの障害の処置のために標的とすることができる。
【０１０５】
一態様において、対象における臓器線維化を処置または予防する方法が提供される。該方法は、処置を必要とする対象に、治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程を含む。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、「臓器線維化」は、あらゆる臓器で起こり得る線維性沈着を指す。線維性沈着（線維化）は、細胞外マトリックスタンパク質の過剰な合成および蓄積、組織恒常性の喪失ならびに臓器不全によって特徴付けられる病的状態である。
【０１０７】
本明細書において使用される場合、「老化に伴う臓器線維化」は、あらゆる基礎疾患とも関連していなかった臓器で起こる線維化、すなわち、老化の結果として起こる線維化、例えば特発性臓器線維化、非限定例で、特発性肺線維化（IPF）を指す。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、用語「予防する」は、それが線維化に関するとき、間質コラーゲン沈着の阻害を指す。一態様において、コラーゲンの沈着は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%減少する。コラーゲンの沈着は、例えば、実施例2に記載されているような当業者に周知の方法を使用して、またはmRNAをモニタリングすることによって決定することができる（例えば、Casey et al. (1996) Biology of Reproduction, 55, 1253-1260 を参照のこと）。コラーゲン沈着はまた、例えば組織試料中での、組織学アッセイを使用してモニタリングすることができる。コラーゲン抗体は、Rockland immunochemical corporation（Limerick, PA）から（例えば、I型コラーゲン抗体600-401-103-0.5）、またはSanta Cruz Biotechnology（Dallas, Texas）から市販されている。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、「処置する」は、それが臓器線維化に関するとき、臓器線維化の少なくとも一つの測定可能な症状を低減することを指す。一態様において、測定可能な症状は、臓器機能の喪失である。したがって、特定の態様において、線維化の症状は、罹患された臓器、例えば、腎臓、肝臓、心臓、肺に依存する。当業者であれば、適切な臓器機能を検出することによく精通していよう。非限定例は、血液を評価して腎臓の糸球体濾過率（腎機能）もしくは肝臓酵素のレベル（肝機能）を決定する工程、または血中の酸素およびCO2のレベル（肺機能）を決定する工程；または、例えば老化に伴う心臓の線維化の場合には、例えば心臓の心エコー図、もしくはEKGを実施する工程を含む。臓器機能を測定するための技術は、当技術分野において標準である。特定の態様において、臓器機能は、抗NET化合物での処置前の機能と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%増加または改善される。
【０１１０】
線維化の診断のための方法は、周知であり、例えば、コラーゲン沈着についての組織切片の検査、画像研究、および臓器機能の評価を含む。
【０１１１】
糖尿病
また、糖尿病におけるNET関連合併症（例えば、炎症および遅延した創傷治癒）を処置するための方法も提供される。該方法は、治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程を含む。幾つかの態様において、対象は、1型、1.5型もしくは2型糖尿病と診断されているか、または前糖尿病状態を有すると判断されている。
【０１１２】
用語「糖尿病」および「真性糖尿病」は、本明細書において互換的に使用される。「前糖尿病状態」は、正常なグルコース恒常性、代謝、および明白な真性糖尿病で見られる状態の中間である代謝状態を指す。前糖尿病状態は、非限定的に、メタボリック症候群（「X症候群」）、耐糖能異常（IGT）、および空腹時血糖異常（IFG）を含む。IGTは、グルコース調節の食後異常を指し、一方で、IFGは空腹状態で測定される異常を指す。世界保健機構（World Health Organization）は、IFGの値を空腹時血漿グルコース濃度6.1mmol/L（100mg/dL）以上（全血では5.6mmol/L;100mg/dL）、7.0mmol/L（126mg/dL）未満（全血では6.1mmol/L;110mg/dL）と規定している。米国コレステロール教育プログラム（National Cholesterol Education Program）（NCEP）基準に従うメタボリック症候群は、以下の少なくとも3つを有すると規定されている：血圧130/85mm Hg以上；空腹時血漿グルコース6.1mmol/L以上；ウエスト周り>102cm（男性）または>88cm（女性）；トリグリセリド1.7mmol/L以上；およびHDLコレステロール<1.0mmol/L（男性）または1.3mmol/L（女性）。
【０１１３】
1型糖尿病は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の破壊をもたらす自己免疫疾患である。インスリンの欠乏は、空腹時血糖（非糖尿病の人でおよそ70〜120mg/dL）の上昇を引き起こし、これは、腎限界値（ほとんどの人で約190〜200mg/dl）を超えると尿中に現れ始める。世界保健機構は、真性糖尿病の空腹時血漿グルコース濃度の診断値を7.0mmol/l（126mg/dl）以上（全血では6.1mmol/lまたは110 mg/dl）、または2時間グルコースレベルを11.1mmol/L以上（200mg/dL以上）と規定している。
【０１１４】
１型糖尿病は、以下を非限定的に含む、様々な診断検査を使用して診断することができる：（1）糖化ヘモグロビン（A1C）検査、（2）無作為血糖検査、および／または（3）空腹時血糖検査。
【０１１５】
糖化ヘモグロビン（A1C）検査は、過去2〜3か月間の対象の平均血糖値を反映する血液検査である。この検査は、ヘモグロビンに結合している血糖の百分率を測定し、これは血糖値と相関する（例えば、血糖値が高いほどより多くのヘモグロビンが糖化される）。2回の別々の検査での6.5パーセント以上のA1Cレベルは糖尿病を示している。6〜6.5パーセントの間の結果は、前糖尿病と見なされ、これは糖尿病を発症するリスクが高いことを示す。
【０１１６】
無作為血糖検査は、糖尿病を有することが疑われる対象から無作為の時点で血液試料を得ることを含む。血糖値は、デシリットル当たりのミリグラム（mg/dL）またはリットル当たりのミリモル（mmol/L）で表わすことができる。無作為血糖値200mg/dL（11.1mmol/L）以上は、とりわけ頻回の排尿および極度の口渇のような糖尿病の任意の徴候および症状と一緒になっているときには、対象が糖尿病を有する可能性が高いことを示す。
【０１１７】
空腹時血糖検査のために、一晩絶食後に血液試料を得る。100mg/dL（5.6mmol/L）未満の空腹時血糖値は、正常と見なされる。100〜125mg/dL（5.6〜6.9mmol/L）の空腹時血糖値は、前糖尿病と見なされるが、2回の別々の検査での126mg/dL（7mmol/L）以上のレベルは糖尿病を示す。1型糖尿病は、内因性インスリン産生の尺度であるC-ペプチドアッセイを使用して2型糖尿病から区別することができる。また、多くの2型糖尿病がインスリンを体内で産生し続け、そして、全てがある程度のインスリン耐性を有するため、抗島抗体（グルタミン酸デカルボキシラーゼ、インスリノーマ関連ペプチド-2またはインスリンに対する）の存在、または耐糖能検査によって判断されるインスリン耐性の欠如も、1型糖尿病の指標となる。
【０１１８】
免疫系が1型糖尿病の病因に関与していると思われるため、1型糖尿病と2型糖尿病とを識別するための改善された検査としてGAD 65抗体の検査が提唱されている。1.5型（LADA糖尿病としても公知）は、抗LADA抗体の存在を決定することによって実施される。
【０１１９】
糖尿病状態の各々は、重複した症状を有する。糖尿病の例示的な症状は、過度の口渇（多渇症）、頻回の排尿（多尿症）、極度の空腹（過食症）、極度の疲労、体重減少、過血糖症、低レベルのインスリン、高血糖（例えば、250mg超、300mg超の糖値）、尿中に存在するケトン類の存在、疲労、乾燥および／または敏感肌、かすみ目、切り傷または痛みの治癒の遅れ、通常より多くの感染、足の痺れおよび刺痛、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、失明、記憶喪失、腎不全、心血管疾患（冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患、アテローム性動脈硬化、および高血圧を含む）、神経障害、自律神経機能不全、高血糖性高浸透圧性昏睡、ならびにそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１２０】
抗NET化合物の治療有効量は、NET関与を有する1型、1.5型または2型糖尿病の症状、例えば増加した炎症または遅延した創傷治癒の統計的に有意な測定可能な変化をもたらすのに十分な、対象に投与される化合物の量である。
【０１２１】
特定の態様において、NET関与を有する糖尿病の症状は、抗NET化合物での処置の前の症状と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%改善される。
【０１２２】
特定の態様において、NET関与を有する糖尿病の症状は、創傷治癒の遅延である。
【０１２３】
特定の態様において、NET関与を有する糖尿病の症状は、炎症である。炎症の低減は、身体検査だけでなく、炎症マーカーの存在の低下によってもモニタリングすることができる。当業者に公知の急性炎症マーカーは、C-反応性タンパク質（CRP）、フィブリノゲン、D-ダイマー、血清アミロイドA（SAA）、妊娠関連ポリペプチドA（PAPP-A）、細胞間接着分子（例えば、ICAM-1、VCAM-1）、IL-1-ベータ、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18/IL-18b；TNF-アルファ；ミエロペルオキシダーゼ（MPO）；TF；単球走化性タンパク質1（MCP-1）；P-セレクチン；E-セレクチン；血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（PAF-AH）；フォン・ヴィレブランド因子（vWF）を含む。本明細書に記載される方法における使用のための急性炎症の好ましいマーカーは、CRP、フィブリノゲン、D-ダイマーおよびSAAであり、そのうち、CRPおよびD-ダイマーがより好んで使用される。D-ダイマーは血栓溶解のマーカーであり、その生成はNET依存性であり得る。
【０１２４】
特定の態様において、糖尿病を処置するために使用される薬剤および少なくとも一つの抗NET化合物の治療有効量の投与を含む、糖尿病の処置のための方法が提供される。一態様において、糖尿病を処置するために使用される薬剤は、インスリンである。糖尿病を処置するために使用される他の薬剤は、ビグアニド類、メトホルミン（Glucophage）、メトホルミン液体（Riomet）、メトホルミン徐放剤（Glucophage XR、Fortamet、Glumetza）、スルホニル尿素類、グリメピリド（Amaryl）、グリブリド（Diabeta、Micronase）、グリピジド（Glucotrol、Glucotrol XL）、微粒子化グリブリド（Glynase）、メグリチニド類、レパグリニド（Prandin）、D-フェニルアラニン誘導体、ナテグリニド（Starlix）、チアゾリジンジオン類、ピオグリタゾン（TZDs）、ピオグリタゾン（Actos）、DPP-4阻害物質、シタグリプチン（Januvia）、サキサグリプチン（Onglyza）、リナグリプチン（Tradjenta）、アルファ−グルコシダーゼ、アカルボース（Precose）、ミグリトール（Glyset）、胆汁酸封鎖剤、コレセベラム（Welchol）、ピオグリタゾン＆メトホルミン）（Actoplus Met）、グリブリド＆メトホルミン（Glucovance）、グリピジド＆メトホルミン（Metaglip）、シタグリプチン＆メトホルミン（Janumet）、サキサグリプチン＆メトホルミン（kombiglyze）、レパグリニド＆メトホルミン（Prandimet）、およびピオグリタゾン＆グリメピリド（Duetact）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１２５】
創傷治癒
また、創傷の処置のための方法が提供される。特定の態様において、創傷の処置のために抗net化合物が投与される患者は、糖尿病と過去に診断されている。
【０１２６】
本明細書において使用される場合、「創傷治癒」は、皮膚（または別の臓器−組織）が傷害後にそれ自体を修復する複雑なプロセスを指す。創傷治癒の古典的なモデルは、3つまたは4つの連続的な、さらには重複する以下の期：（1）止血期、このとき凝塊が出血を止める、（2）炎症期、（3）増殖期および（4）再構成期に分けられる。皮膚が傷害を受けると、一連の複合的な生化学的事象が厳密に統合されたカスケードで起こり損傷を修復する（例えば、Stadelmann, WK; Digenis, AG; Tobin, GR (1998). 'Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds'. American journal of surgery 176 (2A Suppl): 26S-38S を参照のこと）。炎症期では、細菌および細胞残屑が、白血球によって貪食されて創傷から取り除かれる。血小板由来成長因子（血小板のアルファ顆粒中に保存される）が創傷中に放出されて、これが増殖期に細胞の遊走および分裂を引き起こす。増殖期は、血管新生、コラーゲン沈着、肉芽組織形成、上皮化、および創収縮によって特徴付けられる（Midwood, K.S.; (2004). 'Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix'. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36 (6): 1031-1037）。新たな血管が形成され、そして、線維芽細胞が成長し、コラーゲンおよびフィブロネクチンを分泌することによって新たな一時的な細胞外マトリックス（ECM）を形成する。同時に、表皮の再上皮化が起こり、その中で、上皮細胞が増殖して、創傷床の上に「ゆっくりと広がり」、新たな組織のための被覆層を提供する。
【０１２７】
創傷部位周辺の組織の成長は、細胞の遊走およびこれらの細胞によるコラーゲン沈着によるものである。コラーゲンの整列は、瘢痕化の程度を説明するものであり；コラーゲンのバスケットウィーブ配向は、正常な皮膚の特徴であるのに対して、整列したコラーゲン繊維は顕著な瘢痕化を導く。
【０１２８】
本明細書において使用される場合、用語「創傷治癒を促進する」は、正常な創傷治癒のプロセスを加速すること、および／または創傷治癒プロセスから生じる瘢痕組織の形成の量を抑制することを指す。
【０１２９】
特定の態様において、有効な処置はまた、創傷の直径を経時的に測定することによって決定することができる。特定の態様において、創傷の直径は、創傷治癒のプロセス中の患者において通常観察される単位時間当たりの直径の減少と比較して、単位時間当たり少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%減少する。
【０１３０】
特定の態様において、瘢痕組織の形成は、抗NET化合物の非存在下で予測される治癒プロセスと比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%低減される。
【０１３１】
特定の態様において、抗NET化合物は、薬学的に許容し得る担体中に提供され、時間と共に放出されるか、または皮膚移植片、もしくは送達デバイス中に組み込まれる。
【０１３２】
特定の態様において、創傷の処置は、創傷中のNETの溶解をモニタリングすることによって評価される。
【０１３３】
幾つかの態様は、糖尿病の処置、線維化の処置のための、または創傷治癒を促進するための、少なくとも一つの抗NET化合物および少なくとも一つのそのような抗NET化合物を含有する組成物の使用に関する。抗NET化合物を含有する組成物は、処置されるべき病態の重症度、継続期間、または前記病態と関連する症状の数を低減するために使用される。
【０１３４】
一態様において、抗NET化合物の単回投与は、線維化の、指標、症状、またはマーカーのレベルを、抗NET化合物での処置の前の心血管病態の、指標、症状、またはマーカーのレベルと比較して、少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%またはそれを上回って減少させる。
【０１３５】
特定の態様において、患者への抗NET化合物の単回投与は、患者の臓器中の間質コラーゲンの沈着を、抗NET化合物での処置がない場合のコラーゲンの存在と比較して、少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%またはそれを上回って減少させる。
【０１３６】
一態様において、患者の群への抗NET化合物の単回投与は、創傷治癒を、抗NET化合物を投与していない患者の群における創傷治癒の比率と比較して、少なくとも10%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%またはそれを上回って促進する。
【０１３７】
本明細書に記載される方法は、処置のための少なくとも一つの抗NET化合物または薬学的組成物の使用に関する。特定の態様において、少なくとも一つの抗NET化合物は、予防として投与され、すなわち本明細書に記載される病態の症状、マーカー、または指標を示す患者を、該病態の進行を予防もしくは逆行するために、または該病態の将来の症状、マーカー、もしくは指標の重症度を低下させるために、少なくとも一つの抗NET化合物で処置することができる。
【０１３８】
特定の態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも一つの抗NET化合物の使用を伴う。さらなる態様において、本明細書に提供される方法は、二つまたはそれを上回る抗NET化合物（非限定例 − PAD4阻害物質およびDNase）の使用を伴う。
【０１３９】
特定の態様において、有効用量の少なくとも一つの抗NET化合物は、患者に繰り返し投与される。
【０１４０】
特定の態様において、単回用量の抗NET化合物を患者に投与することは、標的部位（例えば、臓器または創傷）でのNETの濃度を、抗NET化合物での処置の前のNETのレベルと比較して、少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%またはそれを上回って減少させる。
【０１４１】
一態様において、患者への抗NET化合物の単回投与は、本明細書に記載される病態の、指標、症状、またはマーカーのレベルを、抗NET化合物での処置の前の病態の、指標、症状、またはマーカーのレベルと比較して、少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%を上回って減少させる。
【０１４２】
特定の態様において、少なくとも一つの抗NET化合物を含む組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。抗生物質の非限定例は、例えば、カナマイシン、アクチノマイシンD、ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびミトラマイシンを含む。抗生物質は、当業者に周知である。
【０１４３】
幾つかの態様において、少なくとも一つの抗NET化合物またはその薬学的組成物は、別の薬学的に活性な薬剤、例えば、創傷、線維化または糖尿病を有する患者を処置するための薬学的に活性な薬剤と共に投与される。抗NET化合物は、他の医薬品および／または他の治療法の処置と組み合わせて同時に投与することができる。
【０１４４】
幾つかの態様において、投与される追加の薬剤は、例えば、抗NET化合物が創傷治癒を促進するために使用される場合には、抗生物質である。
【０１４５】
幾つかの態様において、投与される追加の薬剤は、抗炎症剤であり、多数の抗炎症剤が当技術分野において公知であり、それらの非限定例は、アルクロフェナク（Alclofenac）；ジプロピオン酸アルクロメタゾン（Alclometasone Dipropionate）；アルゲストンアセトニド（Algestone Acetonide）；アルファアミラーゼ（Alpha Amylase）；アムシナファル（Amcinafal）；アムシナフィド（Amcinafide）；アンフェナクナトリウム（Amfenac Sodium）；塩酸アミプリロース（Amiprilose Hydrochloride）；アナキンラ（Anakinra）；アニロラク（Anirolac）；アニトラザフェン（Anitrazafen）；アパゾン（Apazone）；バルサラジド二ナトリウム（Balsalazide Disodium）；ベンダザック（Bendazac）；ベノキサプロフェン（Benoxaprofen）；塩酸ベンジダミン（Benzydamine Hydrochloride）；ブロメライン類（Bromelains）；ブロペラモール（Broperamole）；ブデソニド（Budesonide）；カルプロフェン（Carprofen）；シクロプロフェン（Cicloprofen）；シンタゾン（Cintazone）；クリプロフェン（Cliprofen）；プロピオン酸クロベタゾール（Clobetasol Propionate）；酪酸クロベタゾン（Clobetasone Butyrate）；クロピラク（Clopirac）；プロピオン酸クロチカゾン（Cloticasone Propionate）；酢酸コルメタゾン（Cormethasone Acetate）；コルトドキソン（Cortodoxone）；デフラザコルト（Deflazacort）；デソニド（Desonide）；デスオキシメタゾン（Desoximetasone）；ジプロピオン酸デキサメタゾン（Dexamethasone Dipropionate）；ジクロフェナクカリウム（Diclofenac Potassium）；ジクロフェナクナトリウム（Diclofenac Sodium）；二酢酸ジフロラゾン（Diflorasone Diacetate）；ジフルミドンナトリウム（Diflumidone Sodium）；ジフルニサル（Diflunisal）；ジフルプレドナート（Difluprednate）；ジフタロン（Diftalone）、ジメチルスルホキシド（Dimethyl Sulfoxide）；ドロシノニド（Drocinonide）；エンドリゾン（Endrysone）；エンリモマブ（Enlimomab）；エノリカムナトリウム（Enolicam Sodium）；エピリゾール（Epirizole）；エトドラク（Etodolac）；エトフェナマート（Etofenamate）；フェルビナク（Felbinac）；フェナモール（Fenamole）；フェンブフェン（Fenbufen）；フェンクロフェナク（Fenclofenac）；フェンクロラク（Fenclorac）；フェンドザル（Fendosal）；フェンピパロン（Fenpipalone）；フェンチアザク（Fentiazac）；フラザロン（Flazalone）；フルアザコルト（Fluazacort）；フルフェナム酸（Flufenamic Acid）；フルミゾール（Flumizole）；酢酸フルニソリド（Flunisolide Acetate）；フルニキシン（Flunixin）；フルニキシンメグルミン（Flunixin Meglumine）；フルオコルチンブチル（Fluocortin Butyl）；酢酸フルオロメトロン（Fluorometholone Acetate）；フルクアゾン（Fluquazone）；フルルビプロフェン（Flurbiprofen）；フルレトフェン（Fluretofen）；プロピオン酸フルチカゾン（Fluticasone Propionate）；フラプロフェン（Furaprofen）；フロブフェン（Furobufen）；ハルシノニド（Halcinonide）；プロピオン酸ハロベタソール（Halobetasol Propionate）；酢酸ハロプレドン（Halopredone Acetate）；イブフェナック（Ibufenac）；イブプロフェン（Ibuprofen）；イブプロフェンアルミニウム（Ibuprofen Aluminum）；イブプロフェンピコノール（Ibuprofen Piconol）；イロニダプ（Ilonidap）；インドメタシン（Indomethacin）；インドメタシンナトリウム（Indomethacin Sodium）；インドプロフェン（Indoprofen）；インドキソール（Indoxole）；イントラゾール（Intrazole）；酢酸イソフルプレドン（Isoflupredone Acetate）；イソキセパック（Isoxepac）；イソキシカム（Isoxicam）；ケトプロフェン（Ketoprofen）；塩酸ロフェミゾール（Lofemizole Hydrochloride）；ロモキシカム（Lomoxicam）；エタボン酸ロテプレドノール（Loteprednol Etabonate）；メクロフェナム酸ナトリウム（Meclofenamate Sodium）；メクロフェナム酸（Meclofenamic Acid）；二酪酸メクロリゾン（Meclorisone Dibutyrate）；メフェナム酸（Mefenamic Acid)；メサラミン（Mesalamine）；メセクラゾン（Meseclazone）；スレプタン酸メチルプレドニゾロン（Methylprednisolone Suleptanate）；モルニフルマート（Morniflumate）；ナブメトン（Nabumetone）；ナプロキセン（Naproxen）；ナプロキセンナトリウム（Naproxen Sodium）；ナプロキソール（Naproxol）；ニマゾン（Nimazone）；オルサラジンナトリウム（Olsalazine Sodium）；オルゴテイン（Orgotein）；オルパノキシン（Orpanoxin）；オキサプロジン（Oxaprozin）；オキシフェンブタゾン（Oxyphenbutazone）；塩酸パラニリン（Paranyline Hydrochloride）；ペントサンポリ硫酸ナトリウム（Pentosan Polysulfate Sodium）；フェンブタゾングリセリン酸ナトリウム（Phenbutazone Sodium Glycerate）；ピルフェニドン（Pirfenidone）；ピロキシカム（Piroxicam）；ケイ皮酸ピロキシカム（Piroxicam Cinnamate）；ピロキシカムオラミン（Piroxicam Olamine）；ピルプロフェン（Pirprofen）；プレドナザート（Prednazate）；プリフェロン（Prifelone）；プロドール酸（Prodolic Acid）；プロカゾン（Proquazone）；プロキサゾール（Proxazole）；クエン酸プロキサゾール（Proxazole Citrate）；リメキソロン（Rimexolone）；ロマザリット（Romazarit）；サルコレクス（Salcolex）；サルナセジン（Salnacedin）；サルサラート（Salsalate）；サリチラート類（Salycilates）；塩化サングイナリウム（Sanguinarium Chloride）；セクラゾン（Seclazone）；セルメタシン（Sermetacin）；スドキシカム（Sudoxicam）；スリンダク（Sulindac）；スプロフェン（Suprofen）；タルメタシン（Talmetacin）；タルニフルマート（Talniflumate）；タロサラート（Talosalate）；テブフェロン（Tebufelone）；テニダップ（Tenidap）；テニダップナトリウム（Tenidap Sodium）；テノキシカム（Tenoxicam）；テシカム（Tesicam）；テシミド（Tesimide）；テトリダミン（Tetrydamine）；チオピナック（Tiopinac）；ピバル酸チクソコルトール（Tixocortol Pivalate）；トルメチン（Tolmetin）；トルメチンナトリウム（Tolmetin Sodium）；トリクロニド（Triclonide）；トリフルミダート（Triflumidate）；ジドメタシン（Zidometacin）；グルココルチコイド類（Glucocorticoids）；ゾメピラクナトリウム（Zomepirac Sodium）である。
【０１４６】
幾つかの態様において、投与される追加の薬剤は、抗線維分解剤が投与される。追加の抗線維素溶解剤は、例えば、プラスミノゲン、プレカリクレイン、キニノーゲン類、XII因子、XIIIa因子、プラスミノゲンプロアクチベーター、組織プラスミノゲンアクチベーター［TPA］、ストレプトキナーゼ（Streptokinase）；ウロキナーゼ（Urokinase）：アニソイル化プラスミノゲン−ストレプトキナーゼアクチベーター複合体（Anisoylated Plasminogen-Streptokinase Activator Complex）；プロウロキナーゼ（Pro-Urokinase）；（Pro-UK）；rTPA（アルテプラーゼまたはアクチバーゼ；rは、組み換えを示す）、rPro-UK；アボキナーゼ（Abbokinase）；エミナーゼ（Eminase）；塩酸スレプターゼアナグレリド（Sreptase Anagrelide Hydrochloride）；ビバリルジン（Bivalirudin）；ダルテパリンナトリウム（Dalteparin Sodium）；ダナパロイドナトリウム（Danaparoid Sodium）；塩酸ダゾキシベン；硫酸エフェガトラン（Efegatran Sulfate）；エノキサパリンナトリウム（Enoxaparin Sodium）；イフェトロバン（Ifetroban）；フェトロバンナトリウム（Ifetroban Sodium）；チンザパリンナトリウム（Tinzaparin Sodium）；テネクテプラーゼ、レタプラーゼ；トリフェナグレル（Trifenagrel）；ワルファリン（Warfarin）；デキストラン類（Dextrans）を含む。
【０１４７】
幾つかの態様において、投与される追加の薬剤は、糖尿病を処置するための薬剤である。そのような薬剤は、糖尿病の処置のためのおよび／または抗過血糖活性を有するための当技術分野において公知の薬剤、例えば、ジペプチジルペプチダーゼ4（DPP-4）の阻害剤（例えば、アログリプチン（Alogliptin）、リナグリプチン（Linagliptin）、サキサグリプチン（Saxagliptin）、シタグリプチン（Sitagliptin）、ビルダグリプチン（Vildagliptin）、およびベルベリン（Berberine））、ビグアニド類（例えば、メトホルミン（Metformin）、ブホルミン（Buformin）およびフェンホルミン（Phenformin））、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（PPAR）モジュレーター、例えば、チアゾリジンジオン類（TZD）（例えば、ピオグリタゾン（Pioglitazone）、リボグリタゾン（Rivoglitazone）、ロシグリタゾン（Rosiglitazone）およびトログリタゾン（Troglitazone））、二重PPAR作動薬（例えば、アレグリタザル（Aleglitazar）、ムラグリタザル（Muraglitazar）およびテサグリタザル（Tesaglitazar））、スルホニル尿類（例えば、アセトヘキサミド（Acetohexamide）、カルブタミド（Carbutamide）、クロルプロパミド（Chlorpropamide）、グリクラジド（Gliclazide）、トルブタミド（Tolbutamide）、トラザミド（Tolazamide）、グリベンクラミド（Glibenclamide）（グリブリド）、グリピジド（Glipizide）、グリキドン（Gliquidone）、グリクロピラミド（Glyclopyramide）、およびグリメピリド（Glimepiride））、メグリチニド類（「グリニド類」）（例えば、ナテグリニド（Nateglinide）、レパグリニド（Repaglinide）およびミチグリニド（Mitiglinide））、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）および類似体（例えば、エキセンジン-4（Exendin-4）、エキセナチド（Exenatide）、リラグルチド（Liraglutide）、アルビグルチド（Albiglutide））、インスリンおよびインスリン類似体（例えば、インスリンリスプロ（Insulin lispro）、インスリンアスパルト（Insulin aspart）、インスリングルリジン（Insluin glulisine）、インスリングラルジン（Insulin glargine）、インスリンデテミル（Insulin detemir）、エクスベラ（Exubera）およびNPHインスリン）、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース（Acarbose）、ミグリトール（Miglitol）およびボグリボース（Voglibose））、アミリン類似体（例えば、プラムリンチド（Pramlintide））、ナトリウム依存性グルコース共輸送体T2（SGLT T2）阻害剤（例えば、ダプグリフロジン（Dapgliflozin）、レモグリフロジン（Remogliflozin）およびセルグリフロジン（Sergliflozin））ならびに他（例えば、ベンフルオレクス（Benfluorex）およびトルレスタット（Tolrestat））を含む。
【０１４８】
抗NET化合物および薬学的に活性な薬剤は、同じ薬学的組成物または異なる薬学的組成物に入れて（同じ時点または異なる時点）で対象に投与することができる。異なる時点で投与されるとき、抗NET化合物および薬学的に活性な薬剤は、その他の投与の5分、10分、20分、60分、2時間、3時間、4時間、8時間、12時間、24時間以内に投与することができる。抗NET化合物および薬学的に活性な薬剤を異なる薬学的組成物に入れて投与するとき、投与の経路は異なることができる。例えば、抗NET化合物は、経口または非経口経路（静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻腔、直腸、および局所（口腔および舌下を含む）投与を含む）を非限定的に含む、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与され、薬学的に活性な薬剤は、異なる経路、例えば、前記薬学的に活性な薬剤の投与のための当技術分野において通常使用される経路によって投与される。非限定例では、抗NET化合物を経口投与することができ、一方で、薬学的に活性な薬剤を皮下投与することができる。
【０１４９】
疾患の処置または予防の有効性は、例えば、該病態のマーカー、指標、もしくは症状、または適切な任意の他の測定可能なパラメーターを測定することによって評価することができる。そのようなパラメーターのいずれか一つ、またはパラメーターの任意の組み合わせを測定することによって処置または予防の有効性をモニタリングすることは、当業者の技能の十分に範囲内にある。
【０１５０】
一つまたは複数の健康パラメーターの統計的に有意な改善があるとき、または別の点では症状が予測される場面で症状が悪化もしくは発生しなければ、処置は確実である。一例として、線維化、創傷治癒、または糖尿病の測定可能なパラメーターの少なくとも10%、好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、50%、またはそれ以上の有利な変化が有効な処置の指標となることができる。所与の抗NET化合物またはその薬物の製剤についての有効性はまた、当技術分野において公知のとおり、本明細書に記載される病態の実験動物モデルを使用して判断することができる。実験動物モデルを使用するとき、処置の有効性は、マーカーの統計的に有意な増加が観察される場合に証明される。
【０１５１】
抗NET化合物の投与に関する投与量範囲は、該化合物の形態、その効力、および本明細書に記載される病態の、症状、マーカー、または指標が低減されることが望まれる範囲、例えば、コラーゲン沈着、炎症、瘢痕サイズの所望の低下率に依存する。投与量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全などのような有害な副作用を引き起こすほど大量であってはならない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、および性別によって変化し、当業者によって決定されることができる。投与量はまた、任意の合併症が生じた場合には、個々の医師によって調整されることができる。
【０１５２】
例えば0.5ng/kg、1.0ng/kg、2.0ng/kg、2.5ng/kg、5ng/kg、10ng/kg、15ng/kg、20ng/kg、25ng/kg、30ng/kg、40ng/kgまたは50ng/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kgまたは50mg/kgなどの治療量の抗NET化合物を患者に投与することができる。抗NET化合物は、例えば、ある期間にわたる、例えば、5分間、10分間、15分間、20分間、または25分間にわたる静脈内注入によって投与することができる。投与は、例えば、定期的に、例えば3時間毎、6時間毎、12時間毎もしくはそれ以上、または例えば隔週（すなわち、二週間毎）で一か月、二か月、三か月、四か月またはそれ以上繰り返される。初期の処置レジメン後は、より少ない頻度で処置を施すことができる。例えば、隔週で三か月投与した後、投与を、一か月、六か月または一年またはそれより長い期間当たり一回繰り返すことができる。抗NET化合物の投与は、本明細書に記載される病態、例えば、炎症またはコラーゲン沈着のマーカーまたは症状のレベルを、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60％、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%またはそれを上回って低減させることができる。
【０１５３】
抗NET化合物の全用量の投与の前に、5%注入のようなより少ない用量を患者に投与し、アレルギー反応のような有害作用についてモニタリングすることができる。
【０１５４】
一般に、所与の処置の有効性は、増加したNETが本明細書に記載される病態と関連しているため、NETの破壊を評価することによってモニタリングすることができる。NETの低下は、組織分析および抗Net抗体によって決定することができる。しかしながら、処置は、本明細書に記載される化合物での処置後に、本明細書に記載される病態の徴候または症状のいずれか一つまたは全てが有益な様式で変化し、他の臨床的に許容された症状が向上するか、またはさらに、例えば少なくとも10%改善される場合に、「有効な処置」であると見なされ、該用語は本明細書においてそのように使用される。有効性はまた、入院、または医学的介入の必要性（すなわち、疾患の進行が停止される）によって評価した際に、個体が悪化しないことによっても測定することができる。本明細書に記載される処置の有効性の別のマーカーは生存である。本明細書に記載される特定の病態についての統計的生存率は、十分に確立されている − 本明細書に記載される方法に従って処置された個体または個体の群が予想される時間より長くまたは予想される割合を超えて生存する場合、その処置は有効であると見なすことができる。
【０１５５】
薬学的組成物
対象への投与のために、前記化合物を薬学的に許容し得る組成物の状態で提供することができる。これらの薬学的に許容し得る組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容し得る担体（添加物）および／または希釈剤と一緒に製剤化された、上述した治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を含む。以下に詳述するとおり、本明細書に記載される薬学的組成物は、以下に適合されたものを含む、固体または液体形態での投与のために具体的に製剤化することができる：（1）経口投与用、例えば、飲薬（水性または非水性の液剤または懸濁剤）、トローチ剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、錠剤（例えば、口腔、舌下、および全身吸収を標的としたもの）、ボーラス剤、粉剤、顆粒剤、舌への適用のためのペースト剤；（2）非経口投与用（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による）、例えば、滅菌の液剤もしくは懸濁剤、または徐放製剤；（3）局所適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム剤、ローション剤、ジェル剤、軟膏剤、または制御放出パッチもしくはスプレー剤；（4）膣内または直腸内用、例えば、ペッサリー剤、クリーム剤、坐剤または泡剤；（5）舌下用；（6）経眼用；（7）経皮用；（8）経粘膜用；または（9）鼻腔用。追加的に、化合物は、患者に埋め込まれるかまたは薬物送達システムを使用して注射され得る。コーティングされた送達デバイスもまた有用であることができる。例えば、Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. 'Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals' (Plenum Press, New York, 1981)；米国特許第3,773,919号；米国特許第6,747,014号；および米国特許第35 3,270,960号を参照されたい。
【０１５６】
ここで使用される場合、用語「薬学的に許容し得る」は、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合いながらも、過度の毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適する、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【０１５７】
ここで使用される場合、用語「薬学的に許容し得る担体」は、主題の化合物を一つの臓器、または身体の一部から別の臓器、または身体の一部へと運ぶまたは輸送する際に関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステリン酸）、または溶媒封入材料のような、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤のその他の成分と適合可能であるという意味で「許容し得る」ものでなければならず、患者に対して傷害性であってはならない。薬学的に許容し得る担体として役割を果たすことができる材料の幾つかの例は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：（1）糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（2）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（3）セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロース；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（8）賦形剤、例えばココアバターおよび坐剤用蝋；（9）油、例えば落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（10）グリコール類、例えばプロピレングリコール；（11）ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）；（12）エステル類、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（13）寒天；（14）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（15）アルギン酸；（16）発熱物質不含水（17）等張生理食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝液；（21）ポリエステル類、ポリカーボネート類および／またはポリ無水物；（22）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸；（23）血清成分、例えば血清アルブミン、HDLおよびLDL；（22）C2-C12アルコール類、例えばエタノール；ならびに（23）薬学的製剤中に用いられる他の無毒の適合性物質。また、湿潤剤、結合剤、充填剤、滑剤、着色剤、崩壊剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、着香剤、保存料、水、塩溶液、アルコール類、酸化防止剤、ポリエチレングリコール類、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなども製剤中に存在することができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容し得る担体」などのような用語は、本明細書において互換的に使用される。
【０１５８】
多くの組織化された界面活性剤構造が研究されており、薬物の製剤化に使用されている。これらは、単層、ミセル、二層および小胞を含む。リポソームのような小胞は、薬剤送達の観点から、それらが提供する特異性および作用期間のために多大な関心を集めている。リポソームは、脂溶性の材料と水性の内部とから形成された膜を有する、単層状または多層状の小胞である。水性部分は、送達されるべき組成物を含有する。リポソームは、陽イオン性（Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985）、陰イオン性（Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274）、または非イオン性（Hu et al. S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466）であることができる。リポソームは、ある種の用途に有用な特定の特性を付与することができかつ当技術分野に記載されている、多数の異なるリン脂質、脂質、糖脂質、および／またはポリマーを含むことができる（Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765; Papahadjopoulos et al. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64; Gabizon et al. PNAS, 1988, 85, 6949; Klibanov et al. FEBS Lett., 1990, 268, 235; Sunamoto et al. Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778; Illum et al. FEBS Lett., 1984, 167, 79; Blume et al. Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91; 米国特許第4,837,028号; 第5,543,152号; 第4,426,330号; 第4,534,899号; 第5,013,556号; 第5,356,633号; 第5,213,804号; 第5,225,212号; 第5,540,935号; 第5,556,948号; 第5,264,221号; 第5,665,710号; 欧州特許第EP 0 445 131 B1号; 第EP 0 496 813 B1号; および欧州特許公報第WO 88/04924号; 第WO 97/13499号; 第WO 90/04384号; 第WO 91/05545号; 第WO 94/20073号; 第WO 96/10391号; 第WO 96/40062号; 第WO 97/0478号）。
【０１５９】
本明細書に記載される組成物は、エマルションまたはマイクロエマルションとして調製および製剤化することができる。エマルションは、典型的には、ある液体が別の液体中に通常直径0.1μmを超える液滴の形態で分散されている不均質系であり、当技術分野に記載されている。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性でかつ熱力学的に安定な溶液である、水、油および両親媒性物質の系として定義することができ、これは、界面活性剤および共界面活性剤を含むことができる。これらの薬物送達手段は共に、当技術分野に記載されている（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 199, 245, & 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301; Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215; Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; 米国特許第6,191,105号; 第7,063,860号; 第7,070,802号; 第7,157,099号を参照のこと）。
【０１６０】
一態様において、リポソームまたはエマルション製剤は、界面活性剤を含む。界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソームのような製剤中に広く適用されている。親水性基（「ヘッド」としても公知）の性質は、製剤中に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。好適な界面活性剤は、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩を含む。特定の態様において、界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、または非イオン性であることができる。薬品、製剤およびエマルション中の界面活性剤の使用が概説されている（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
【０１６１】
幾つかの態様において、細胞膜を横断する効率的な抗NET化合物の送達を達成するために種々の浸透促進剤が用いられることができる。浸透促進剤は、5つの広範なカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の1つに属するものとして分類され得、それらは全て他で記載されている（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252; Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583; Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339; Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51 を参照のこと）。
【０１６２】
経口製剤およびそれらの調製物は、米国特許第6,887,906号、米国公報第20030027780号、および米国特許第6,747,014号に詳述されており、その各々は参照によって本明細書に組み入れられる。非経口、実質内（脳内への）、髄腔内、心室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は、滅菌水溶液を含むことができ、この水溶液はまた、緩衝剤、希釈剤および他の好適な添加剤（例えば、限定されるわけではないが、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容し得る担体または賦形剤）を含有することができる。水性懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有することができる。懸濁液はまた、安定剤を含有することもできる。
【０１６３】
少なくとも一つの抗NET化合物を含む組成物は、エアロゾルの形態でまたは噴霧化によって対象の気道に直接投与され得る。エアロゾルとしての使用のために、溶液または懸濁液中の抗NET化合物は、従来のアジュバントと共に、好適な推進剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素推進剤と一緒に、加圧式エアロゾル容器内にパッケージングされ得る。抗NET化合物はまた、ネブライザーまたはアトマイザーのような非加圧式形態で投与することもできる。
【０１６４】
抗NET化合物はまた、乾燥粉末の形態で気道に直接投与され得る。乾燥粉末としての使用のために、抗NET化合物は、吸入器の使用によって投与することができる。例示的な吸入器は、定量吸入器および乾燥粉末吸入器を含む。
【０１６５】
呼吸器への送達のためのエアロゾルは、当技術分野において公知であり（例えば、Adjei, A. and Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990); Zanen, P. and Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995); Gonda, I. 'Aerosols for delivery of therapeutic an diagnostic agents to the respiratory tract,' in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990); Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989) を参照）、加えて、ペプチドおよびタンパク質の全身送達のための可能性を有する(Patton and Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:179-196 (1992)); Timsina et. al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995); and Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4:26-29 (1994); French, D. L., Edwards, D. A. and Niven, R. W., Aerosol Sci., 27: 769-783 (1996); Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989)); Rudt, S. and R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992); Tabata, Y, and Y. Ikada, Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988); Wall, D. A., Drug Delivery, 2: 10 1-20 1995); Patton, J. and Platz, R., Adv. Drug Del. Rev., 8: 179-196 (1992); Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990); Patton, J. S., et al., Controlled Release, 28: 15 79-85 (1994); Damms, B. and Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., et al., Pharm. Res., 12(9); 1343-1349 (1995); および Kobayashi, S., et al., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996)）。その全ての内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１６６】
組成物はまた、線維性組織および臓器に、注射によって、例えば局部的に送達することができる。特定の態様において、組成物は、創傷の処置のプロセスにおいて使用されるデバイス、または包帯を使用して送達される。
【０１６７】
本明細書に記載される組成物は、追加的に、薬学的組成物中に従来見いだされる他の付加的な成分をそれらの当技術分野で確立された使用レベルで含有することができる。それゆえ、例えば、組成物は、例えば痒み止め、収斂剤、局部麻酔剤もしくは抗炎症剤のような追加の適合可能な薬学的に活性な材料を含有することができるか、または、染料、着香剤、保存料、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定剤のような、本明細書に記載される組成物の種々の剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の材料を含有することができる。しかしながら、そのような材料は、添加される場合、本明細書に記載される組成物の成分の生物学的活性と過度に干渉すべきではない。製剤は、滅菌され、所望であれば、製剤の抗NET化合物と有害に相互作用しない補助剤、例えば、滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色剤、着香剤および／または芳香剤などと混合することができる。
【０１６８】
本明細書において使用される場合、語句「処置を必要とする対象」は、処置されるべき病態、例えば、線維化、糖尿病または創傷を有するまたは発症するリスクを有すると診断されたまたは罹患していると特定された対象を指す。
【０１６９】
毒性および治療有効性は、例えば、LD50（集団の50%を致死させる用量）およびED50（集団の50%において治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50の比で表され得る。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。ネズミの遺伝学および外科的手法は、線維化および糖尿病の研究のための多数のマウスモデルまたはNETの濃度を制限する能力が損なわれたマウスを作製した。そのようなモデルを、抗NET化合物のインビボ試験に、ならびに治療有効用量を決定するために使用することができる。好適なマウスモデルは、例えば、本明細書に記載されるDNase-/-マウスまたは本明細書に記載される卒中のマウスモデルである。
【０１７０】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するための投与量の範囲を算定する際に使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないか全くない、ED50を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化することができる。
【０１７１】
治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるとおり、IC50（すなわち、症状の半最大阻害を達成する治療薬の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて算定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、好適なバイオアッセイによってモニタリングすることができる。
【０１７２】
担体材料と組み合わせて単一剤形を生成することができる抗NET化合物の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量であろう。一般に、100パーセントのうち、この量は、約0.1%〜99%、好ましくは約5%〜約70%、最も好ましくは10%〜約30%の化合物の範囲であろう。
【０１７３】
投与量は、医師によって決定され、必要に応じて、観察された処置効果に適合するように調整することができる。一般に、組成物は、抗NET化合物が1μg/kg〜150mg/kg、1μg/kg〜100mg/kg、1μg/kg〜50mg/kg、1μg/kg〜20mg/kg、1μg/kg〜10mg/kg、1μg/kg〜1mg/kg、100μg/kg〜100mg/kg、100μg/kg〜50mg/kg、100μg/kg〜20mg/kg、100μg/kg〜10mg/kg、100μg/kg〜1mg/kg、1mg/kg〜100mg/kg、1mg/kg〜50mg/kg、1mg/kg〜20mg/kg、1mg/kg〜10mg/kg、10mg/kg〜100mg/kg、10mg/kg〜50mg/kg、または10mg/kg〜20mg/kgの用量で与えられるように投与される。ここで与えられる範囲は、全ての中間範囲を含み、例えば、1mg/kg〜10mg/kgの範囲は、1mg/kg〜2mg/kg、1mg/kg〜3mg/kg、1mg/kg〜4mg/kg、1mg/kg〜5mg/kg、1mg/kg〜6mg/kg、1mg/kg〜7mg/kg、1mg/kg〜8mg/kg、1mg/kg〜9mg/kg、2mg/kg〜10mg/kg、3mg/kg〜10mg/kg、4mg/kg〜10mg/kg、5mg/kg〜10mg/kg、6mg/kg〜10mg/kg、7mg/kg〜10mg/kg、8mg/kg〜10mg/kg、9mg/kg〜10mg/kgなどを含むことを理解されたい。さらに、上記の中間にある範囲もまた、本明細書に記載される方法および組成物の範囲内であることを理解されたい（例えば、1mg/kg〜10mg/kgの範囲では、用量は2mg/kg〜8mg/kg、3mg/kg〜7mg/kg、4mg/kg〜6mg/kgなどの範囲におよぶ）。
【０１７４】
処置の期間および頻度に関して、処置が治療的利益を提供するときを判断するために、ならびに投与量を増加もしくは減少させるかどうか、投与頻度を増加もしくは減少させるかどうか、処置を中断するかどうか、処置を再開するかどうか、または処置レジメンを他のものに変更するかどうかを判断するために対象をモニタリングすることは、熟練の臨床医にとって一般的なことである。投薬スケジュールは、抗NET化合物に対する対象の感受性のような多数の臨床学的要因に応じて、週に一回〜毎日の間で変化することができる。所望の用量は、一回で、または分割用量、例えば一定期間にわたって2〜4つの分割用量に分けて投与することができ、例えば一日を通して適切な間隔でまたは他の適切なスケジュールで投与することができる。そのような分割用量は、単位剤形として投与することができる。幾つかの態様において、投与は、長期的に、例えば、一つまたは複数の用量を数週間または数か月にわたって毎日行われ得る。投薬スケジュールの例は、一週間、二週間、三週間、四週間、一か月、二か月、三か月、四か月、五か月または六か月、またはそれより長い期間にわたって、毎日、一日二回、一日三回または一日四回、またはそれより多く投与することである。所望の用量は、制御放出製剤を介した連続注入または送達を使用して投与することができる。その場合、各分割用量中に含有される抗NET化合物は、総一日投与量を達成するために、これに相応してより少量でなければならない。投与量単位はまた、例えば、数日かけて抗NET化合物の徐放をもたらす従来の徐放製剤を使用して、数日かけて送達するために調合することができる。徐放製剤は、当技術分野において周知であり、特定の部位における薬剤の送達に特に有用であり、例えば本明細書に記載される薬剤と共に使用することもできる。この態様において、投与量単位は、対応する複数の一日用量を含有する。
【０１７５】
対象の疾患または障害の重症度、過去の処置、総合的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を非限定的に含む、特定の要因が、対象を効果的に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響を与えうることが当業者に明らかであろう。さらに、治療有効量の組成物での対象の処置は、単回処置または一連の処置を含むことができる。本明細書に記載される抗NET化合物についての有効投与量およびインビボ半減期の推定は、本明細書の他の箇所に記載のとおり、従来の方法論を使用してまたは適切な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて行うことができる。
【０１７６】
抗NET処置の有効性を評価する方法
本明細書に記載されるとおり、本発明者らは、増加したNETのレベルが、弱められた創傷治癒、糖尿病および線維化と関連すること見いだし、一つまたは複数の抗NET化合物を投与することによるこれらの障害を処置または予防する方法を提供している。したがって、幾つかの態様は、一般に、一つまたは複数の抗NET化合物の投与の有効性を評価するためのアッセイおよび方法に関する。特定の態様において、該アッセイおよび方法は、対象の生物学的試料中のNETのレベルの決定に向けられる。
【０１７７】
本明細書に記載される方法およびアッセイは、一つまたは複数の抗NET化合物での処置の前後の患者から得られた試料中のNETのレベルを決定する工程を含み、ここで、抗NET化合物での処置後のNETのレベルの低下は、有効性の指標となる。
【０１７８】
患者から得られる試料は、血液または血液産物を含むことができるが、これらに限定されるわけではない。患者から得られる試料に関連する血液産物は、患者の血液の任意の成分（例えば、血漿）および／または処置または処理（例えば、抗凝固剤または保存料を用いる）されている血液もしくはその成分を含むことができるが、これらに限定されるわけではない。
【０１７９】
特定の態様において、一つまたは複数の抗NET化合物での処置前の患者から得られる試料は、抗NET化合物の投与前の任意の時点、例えば、処置の約１分前、処置の約10分前、処置の約1時間前、処置の約1日前、処置の約1週間前、処置の約2週間前、処置の約1か月前、またはより早い時点で得ることができる。特定の態様において、一つまたは複数の抗NET化合物での処置後の患者から得られる試料は、抗NET化合物の投与後の任意の時点、例えば、処置の約10分後、処置の約1時間後、処置の約1日後、処置の約1週間後、処置の約2週間後、またはより遅い時点で得ることができる。
【０１８０】
特定の態様において、NETのレベルは、標識されたDNA検出試薬（すなわち、Hoechst 33258またはSytoxGreen）、シトルリン化ヒストンの免疫検出、ヌクレオソームおよび／もしくはその成分の検出（すなわち、細胞死検出キット、Roche）、または血漿DNAの電気泳動を使用して決定される。
【０１８１】
本発明の幾つかの態様は、以下の番号付けされた項のいずれかに定義され得る：
項１．対象における臓器線維化を処置または予防する方法であって、
処置を必要とする対象に、治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程
を含む、方法。
項２．少なくとも一つの抗NET化合物が、DNase；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；およびPAD4阻害物質からなる群より選択される、項1記載の方法。
項３．PAD4阻害物質が、Cl-アミジンおよびF-アミジンからなる群より選択される、項1〜2のいずれか一項記載の方法。
項４．治療有効量の抗NET化合物が予防的に投与される、項1〜3のいずれか一項記載の方法。
項５．対象の年齢が、40歳超、30歳超、50歳超、60歳超、および70歳超からなる群より選択される、項1〜4のいずれか一項記載の方法。
項６．対象が、心臓疾患、肺疾患、腎疾患、肝疾患、および糖尿病からなる群より選択される疾患と診断される、項1〜5のいずれか一項記載の方法。
項７．治療有効量の抗NET化合物が繰り返し与えられる、項1〜6のいずれか一項記載の方法。
項８．対象が、老化に伴う臓器線維化を有すると診断される、項1〜7のいずれか一項記載の方法。
項９．対象が、心臓線維化、肺線維化、肝臓線維化、腎臓線維化、皮膚線維化、軟組織線維化、および腸線維化からなる群より選択される臓器線維化を有すると診断される、項1〜8のいずれか一項記載の方法。
項１０．投与が、線維化を有する臓器中の一つまたは複数の標的部位への局所投与である、項1〜9のいずれか一項記載の方法。
項１１．対象が嚢胞性繊維症を有しない、項1〜10のいずれか一項記載の方法。
項１２．治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程を含む、創傷治癒を促進するための方法。
項１３．抗NET化合物が、DNase；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；およびPAD4阻害物質からなる群より選択される、項12記載の方法。
項１４．DNAseと、ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NET放出阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；およびPAD4阻害物質からなる群より選択される追加の抗NET化合物とが投与される、項12〜13のいずれか一項記載の方法。
項１５．抗NET化合物がDNaseではない、項12〜13のいずれか一項記載の方法。
項１６．PAD4阻害物質が、Cl-アミジンおよびF-アミジンからなる群より選択される、項12〜15のいずれか一項記載の方法。
項１７．治療有効量の抗NET化合物が予防的に投与される、項12〜16のいずれか一項記載の方法。
項１８．治療有効量の抗NET化合物が繰り返し与えられる、項12〜17のいずれか一項記載の方法。
項１９．対象が糖尿病を有すると診断される、項12〜18のいずれか一項記載の方法。
項２０．治療有効量の少なくとも一つの抗NET化合物を投与する工程を含む、糖尿病におけるNET関連炎症および合併症を処置するための方法。
項２１．抗NET化合物が、DNase；ヒストン分解酵素；クロマチン脱凝縮の阻害物質；NET放出阻害物質；NETのある成分に対する抗体；プロテアーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質；およびPAD4阻害からなる群より選択される、項20記載の方法。
項２２．抗NET化合物がDNaseではない、項20〜21のいずれか一項記載の方法。
項２３．抗NET化合物がエラスターゼ阻害物質ではない、項20〜22のいずれか一項記載の方法。
項２４．PAD4阻害物質が、Cl-アミジンおよびF-アミジンからなる群より選択される、項20〜23のいずれか一項記載の方法。
項２５．治療有効量の抗NET化合物が予防的に投与される、項20〜24のいずれか一項記載の方法。
項２６．治療有効量の抗NET化合物が繰り返し与えられる、項20〜25のいずれか一項記載の方法。
項２７．対象が1型糖尿病を有すると診断される、項20〜26のいずれか一項記載の方法。
項２８．対象がII型糖尿病を有すると診断される、項20〜27のいずれか一項記載の方法。
項２９．炎症が、処置前の炎症と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも50%低下する、項20〜28のいずれか一項記載の方法。
【実施例】
【０１８２】
実施例1：NETは、とりわけ糖尿病において、創傷治癒を弱める
方法
動物
全ての動物の取り扱いは、ボストン小児病院（Boston Children's Hospital）の動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって審査および承認された。CD18-/-マウスおよびPAD4-/-マウスは、C57BL/6Jバックグラウンドであり、これをJackson Laboratory（Bar Harbor, ME）社のWTマウスとルーチンに交配させた。年齢および性が一致した対照マウスには、該二系統およびJackson Laboratoryから購入したC57BL/6JのWT同腹仔を含めた。9週齢の雄の糖尿病db/dbマウスおよび正常血糖の対照m+/dbマウスをJackson Laboratoryから購入した。全てのマウスに標準の実験動物用飼料を与え、特定病原体フリーの標準の実験室条件下で維持した。試料サイズを、動物系統および動物モデルの過去の経験に基づいて選択した。動物の遺伝子型は調査員に公開された。
【０１８３】
ヒト血球試料
研究は、ボストン小児病院およびジョスリン糖尿病センター（Joslin Diabetes Center）の治験審査委員会（Institutional Review Board）によって承認されており、ヘルシンキ宣言（Declaration of Helsinki）に概説されている原則に準拠した。インフォームドコンセントを得た後に血液試料を得た。糖尿病患者は、70歳未満、ステロイド剤または他の免疫抑制薬治療を受けていない、活動性感染のいかなる徴候（発熱、高白血球数および感染の診断）も示さない、過去5年間で癌の診断なし、および顕性心不全なしの制約下で募集した。
【０１８４】
糖尿病ネズミモデルの誘発
ストレプトゾトシン（STZ）の複数回の低用量注射を使用してマウスに糖尿病を誘発させた。6〜8週齢の雄のC57BL/6またはPAD4-/-マウスを、基準値におけるそれらの血糖値および体重に従ってビヒクルまたはSTZのいずれかの処置群に無作為化した。マウスを5時間絶食させ、次いで、ビヒクルまたはSTZ（i.p.（腹腔内）、一日当たり50mg/kg、pH 4、0.1M クエン酸ナトリウム緩衝液中に溶解）を5日連続で注射した。食後血糖値を1週間後から測定した。食後血糖値が300mg/dLを超えるマウスを糖尿病と見なし、これらをさらなる実験に使用した。ウサギポリクローナル抗インスリン抗体（1:500、Cell Signaling、カタログ番号4590）を使用してインスリンについて膵島を染色した。
【０１８５】
マウスサイトスピンにおける基礎H3Citの測定
後眼窩静脈叢を介してネズミの全血を採取した。ACK溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解した。遠心分離後、細胞を7.5% BSA/PBSに再懸濁し、1600rpmで4分間スライド上にスピンし、直ちに4%PFAで4℃にて一晩固定し、次いで、ウサギポリクローナル抗H3Cit（1:1,000、abcam、カタログ番号ab5103）およびラットモノクローナル抗マウスLy6G（1:500、BD Pharmingen、カタログ番号551459）を使用して染色した。ImageJソフトウェア（NIH）を使用した閾値化分析によってH3Cit+好中球を測定した。
【０１８６】
マウス好中球単離およびNETosisアッセイ
末梢血好中球を、Percoll（GE Healthcare）勾配を用いて記載のとおり単離した39。ライト−ギムザ（Wright-Giemsa）染色によって判明したとおり細胞の純度は>90%であった。好中球を、高グルコースに対しての実験用にHBSS（カルシウム、マグネシウムおよび5.5mM グルコースを含有）に再懸濁し；それ以外は好中球をHEPES緩衝RPMI培地に再懸濁した。好中球を、96ウェルのガラスボトムプレート中に50,000細胞／ウェルでプレーティングし、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）LPS（Sigma）で表示濃度にて2.5時間刺激した。高グルコース実験のために、好中球を正常血糖マウスから単離し、正常（5.5mM）または高（22mM）グルコース濃度の培地中で1時間プレインキュベートした。22mMは、396mg/dLに相当し、これは、STZで誘発されたマウス中の誘発後8週間の食後血糖値に類似している（376.3±26.9mg/dL）。マンニトール（5.5mM グルコースを含有する培地中16.5mM)を浸透圧対照として用いた。LPS（それぞれの培地中）を加え、好中球をさらに2.5時間インキュベートした。次いで、細胞を2%PFA中で固定し、透過処理し、ブロッキングし、抗H3Cit（1:1,000、abcam、カタログ番号ab5103）、Alexa Fluor 488コンジュゲート抗ウサギ二次抗体（1:1,500、Invitrogen）およびHoechst 33342（1:10,000、Invitrogen）で染色した。H3Cithigh細胞およびNETの百分率を1ウェル当たり5〜6個の重複しない視野から決定し、全ての実験において条件ごとに二連または三連から平均を取った。H3CitおよびDNAについての露光時間は、同じ実験内の全ての処置で同一であった。拡大したNETを、単一チャンネル中でDNAについて計数した。このチャンネルの画像を、定量化用のより良好なコントラストのために白黒で転送した。
【０１８７】
ヒト好中球単離およびNETosisアッセイ
健康な対象または糖尿病患者からEDTA被覆チューブ中に採血した。単離の間、好中球の活性化を最小限に抑える方法である、Histopaque（登録商標）-1119（Sigma）およびPercoll Plus（登録商標）（GE Healthcare）勾配を使用して好中球を記載のとおり単離した19。細胞の純度は、ライト−ギムザ染色によって判明したとおり>95%であった。高グルコースに対しての実験のために、好中球を、5.5mM（正常）グルコース、22mM（高）グルコースまたは5.5mM グルコース+16.5mM マンニトール（浸透圧対照）と2%非働化処理済ウシ胎児血清を補充したグルコース不含HEPES緩衝RPMIに再懸濁した。好中球を、96ウェルのCellbind（登録商標）プレート（Corning）中に10,000細胞／ウェルでプレーティングした。それぞれの培地中での１時間のインキュベーション後、細胞をイオノマイシン（4μM）またはPMA（100nM）で2.5時間刺激した。高グルコースを伴わない実験のために、細胞を、2%非働化処理済ウシ胎児血清を補充したHEPES緩衝RPMI培地（11mM グルコース）に再懸濁し、10,000細胞／ウェルでプレーティングし、イオノマイシン（4μM）と2.5時間インキュベートした。次いで、細胞を、NET定量化のために、33342（1:10,000）を含有する2%PFA中で直ちに固定した。NETの百分率を1ウェル当たり6個の重複しない視野から決定し、そして、全ての実験において条件ごとに三連から平均を取った。分析は、処置条件が伏せられた実験者によって実施された。
【０１８８】
創傷形成および肉眼による治癒評価
記載のとおり、無菌条件下で背部皮膚上に全厚切除創傷を作製した22。マウスにケタミンおよびキシラジン（それぞれ100mg/kgおよび10mg/kg、i.p.）で麻酔をかけた。除毛して、70%エタノールおよびベタジンで皮膚を洗浄した。次いで、背部皮膚のひだを正中線に沿って持ち上げ、歯科用ワックス上に載せ、4mmのディスポーザブルの滅菌生検パンチ（Miltex）を用いて1回のパンチで2つの創傷が生成するように穴を開けた。この手順を繰り返し、それによってマウス一匹当たり4つの創傷を作製した。創傷形成後、マウスを個別に収容した。糖尿病マウスに対しての実験では、全てのマウスに、飲料水中の抗生物質（2.5%サルファトリム）を自由に与えた。Sony Camcorderを使用して創傷をデジタル撮像し、ImageJソフトウェアを使用して総創傷領域を計算した。創傷領域を、創傷が作製されたときの0日目の領域と比較した百分率として表した。
【０１８９】
ウエスタンブロット分析
マウス創傷のH3CitおよびLy6Gのレベルならびにヒト好中球中のPAD4発現をウエスタンブロットによって定量化した。マウス創傷の採取またはヒト好中球の単離後、試料を急速凍結し、氷上で、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma）を補充したRIPA緩衝液中でホモジナイズした。4℃、20,000gで20分間の遠心分離後、上清のタンパク質含量をビシンコニン酸タンパク質アッセイによって測定し、試料当たりの等量のタンパク質を勾配ゲル（4〜20%、Lonza）上で分割し、PVDF膜上にエレクトロブロットして、次いで、これを、一次抗体（ウサギポリクローナル抗H3Cit、1:1,000、abcam、カタログ番号ab5103；ウサギポリクローナル抗H3、1:6,000、abcam、カタログ番号ab1791；ラットモノクローナル抗マウスLy6G、1:500、BD Pharmingen、カタログ番号551459；マウスモノクローナル抗ヒトPAD4、1:2,000、abcam、カタログ番号ab128086）と4℃で一晩、その後、適切なHRPコンジュゲート二次抗体と室温で2時間インキュベートした。ブロットを高感度化学発光基質で発光させた。等量ローディングは、GAPDH（1:40,000、Ambion；カタログ番号AM4300）についてプロービングすることによって確認した。ImageJソフトウェアを使用してブロットを定量化した。
【０１９０】
広視野および共焦点免疫蛍光顕微鏡検査
創傷中のH3Citおよび好中球の局在化を、免疫蛍光顕微鏡検査によって調べた。創傷を解剖し、半分にカットし、直ちにOCT中に包埋した。組織を、広視野および共焦点免疫蛍光顕微鏡検査用にそれぞれ10μmおよび20μmの切片に凍結切片化した。その切片を、亜鉛固定剤（100mM Tris-HCl、37mM 塩化亜鉛、23mM 酢酸亜鉛、3.2mM 酢酸カルシウム）中で後固定し、透過処理し、H3Citに対する一次抗体（1:1,000、abcam、カタログ番号ab5103）およびLy6Gに対する一次抗体（1:500、BD Pharmingen、カタログ番号551459）と4℃で一晩、次いで、Alexa Fluorコンジュゲート二次抗体（1:1,500、Invitrogen）と室温で2時間インキュベートした。Hoechst 33342（1:10,000）を使用して、DNAを染色した。画像を、Axiocam MRm単色CCDカメラ（Zeiss）に接続されたAxiovert 200広視野蛍光顕微鏡（Zeiss）を使用してZeiss Axiovisionソフトウェアで、またはOlympus IX 81共焦点顕微鏡を使用してOlympus Fluoviewソフトウェアで取得した。
【０１９１】
組織学検査
好中球動員および再上皮化をH&E染色切片で調べた。創傷を半分にカットし、亜鉛固定剤中で一晩固定し、パラフィン包埋した。組織を10μmで切片化して、H&Eで染色した。画像を、カラーZeiss HRcカメラに接続されたAxioplan光学顕微鏡を使用してZeiss Axiovisionソフトウェアで取得した。
【０１９２】
好中球枯渇
10週齢のWTマウスの好中球を、創傷形成の前日に、特異的な抗好中球抗体（超低エンドトキシンおよびアジド不含のラット抗Ly6G、1A8クローン、Biolegend、カタログ番号127632）の、マウス1g当たり5μgの用量の静脈内（i.v.）注射によって枯渇させた。対照マウスにラットIgGを注射した。第一の注射の2日後に、マウス1g当たり2.5μgをマウスに再投与した。血中好中球のレベルを、FITCコンジュゲートラットモノクローナル抗マウス好中球抗体（1:300、抗7/4、abcam、カタログ番号ab53453）を使用したフローサイトメトリー（BD FACSCanto II）によって評価し、FlowJoソフトウェアを使用して解析した。3日間の創傷治癒を通して血中好中球の約80%が枯渇した。
【０１９３】
DNase 1処置
処置に割り当てる前に血糖値よって無作為化した正常血糖および糖尿病のWTマウスに、DNase 1（ドルナーゼアルファ、Genentech）を、創傷形成の30分前に10μg（i.v.）および50μg（i.p.）、次いで、3日目の創傷採取まで12時間毎に50μg（i.p.）注射した。対照マウスにビヒクル（8.77mg/mL 塩化ナトリウムおよび0.15mg/mL 塩化カルシウム）を注射した40。
【０１９４】
統計的分析
データは、少なくとも2つの独立した実験の平均±s.e.m.として表され、必要に応じて、マンホイットニー検定、両側スチューデントt検定（対応のない）、クラスカル−ウォリス検定、続く、ダンの事後検定、またはボンフェローニ事後検定と共に反復測定分散分析を使用して分析した。完全な創傷閉鎖を有するマウスの百分率およびWTとPAD4-/-との間の糖尿病誘発率を、分割表のフィッシャーの両側直接確率検定で分析した。開放創傷を有するマウスの百分率を、カプラン・マイヤー（Kaplan-Meier）曲線を作成した後にログランク検定で分析した。全ての分析は、GraphPad Prismソフトウェア（Version 5.0）を使用して実施した。結果は、P<0.05であるときに有意であるとした。
【０１９５】
NETは、当初、好中球がそれらの核および顆粒内容物を放出して病原体を閉じ込めて殺傷する宿主防衛機構として認識された1。リポ多糖（LPS）のような細菌性エンドトキシンは、NETの放出を刺激し1、これが細胞毒性ヒストンおよび殺菌性プロテアーゼで被覆された広大なDNAの網を形成する1,2。NETosisの必須要件は、PAD4によるシトルリンへのヒストンのアルギニン残基の修飾であり、これがヒストンの電荷を変化させ、大規模なクロマチン脱凝縮を導く3,4。最近、無菌性炎症中においてもNETが形成することが明らかになった5。NETは、病的血栓において重要な骨組みであり、マウスおよびヒトにおいて心血管疾患、炎症性疾患および血栓性疾患を増幅する5,6。
【０１９６】
糖尿病状態下、好中球は、より多くの超酸化物７およびサイトカイン8を産生する。NETosisのために好中球をプライミングする腫瘍壊死因子α9,10は、糖尿病患者において増加する11。糖尿病の微小環境は、それゆえ、NETosis促進性（pro-NETotic）である。糖尿病が好中球にNETosisを起こし易くさせるかどうかを試験するために、本発明者らは、軽度の持続性過血糖症を示す糖化ヘモグロビン（HbA1c）が>6.5%であった1型および2型の両糖尿病患者から得た新鮮全血から好中球を単離した（図1a）。これらの患者由来の好中球は、実際に、カルシウムイオノフォアであるイオノマイシンで刺激されたときNETosisにより感受性だった（図1b）。PAD4は、カルシウム依存性の酵素であり12、これはNETosisの媒介において重要である13。ウエスタンブロッティングは、糖尿病患者由来の好中球においてPAD4タンパク質発現の4倍の上方調節を明らかにし（図1c）、これは、NET形成に対するそれらのより高い感受性を説明し得る。本発明者らの今回の知見は、血中NET関連バイオマーカーであるヌクレオソーム、無細胞二本鎖DNAおよび好中球エラスターゼが、2型糖尿病患者の血清中で増加していること、ならびに、ヌクレオソームが患者のHbA1cレベルと正に相関していることを示している最近の報告によって補完される14。
【０１９７】
過血糖症が1型および2型の両糖尿病に共通しているため、健康な対照に比べ糖尿病コホートにおいて有意に高いHbA1cによって示されるとおり（図1a、［表1］）、本発明者らは、高グルコースが好中球プライミングに寄与し得ると仮説を立てた。そのため、本発明者らは、健康なドナーから好中球を単離し、それらを、活性酸素種（ROS）の産生を起こすイオノマイシンまたはホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート（PMA）での刺激の前に、正常または高グルコース濃度の培地中でプレインキュベートした。イオノマイシンおよびPMAは共に、正常グルコースまたは等濃度の代謝可能でない糖アルコールであるマンニトールとのプレインキュベーションと比較して、高グルコースに曝露された好中球のより多くを刺激して、NETを産生した（図1d、データ示さず）。それゆえ、糖尿病の好中球のNETosisに対する感受性の増加は、血糖の上昇に少なくとも部分的に起因する。本発明者らの観察は、高グルコース／糖尿病がNETosisに影響を与えないまたはそれを害さないことを示唆した先の報告15,16とは異なる。この相違は、培養前にROS産生およびNET形成を誘発することができる方法17,18であり、過去の研究において調製プロセス中にプライミングされた好中球集団の喪失をもたらした可能性がある、デキストラン沈降による単離中のヒト好中球の予備活性化に起因する可能性が高い。ヒト好中球単離にHistopaque/Percoll勾配を使用して19、本発明者らは、NETosisに対する糖尿病または高グルコースによる明白なプライミング効果を見いだした。
【０１９８】
（表１）健康な対象および糖尿病患者のパラメーター
2018503685.tif 000005
**P<0.01、（a）健康な対象に対してP=0.0542
【０１９９】
次いで、本発明者らは、糖尿病の創傷治癒におけるPAD4の役割およびNETの影響を研究するために必要な実験に適する糖尿病マウスモデルにおける、NETosisに対する感受性を調べた。ストレプトゾトシン（STZ）で誘発された糖尿病マウス（１型糖尿病のモデル）由来の新鮮な血液細胞の免疫染色（データ示さず）は、NETosisのバイオマーカーであるシトルリン化ヒストンH3（H3Cit）に陽性の好中球が、正常血糖マウスと比較して約4倍増加することを明らかにした（データ示さず）。約4.5倍多い糖尿病マウス由来の単離好中球は、H3Cithighであり（図1e）、刺激なしのインビトロインキュベーション後にNETを約2%産生したが、一方で、正常血糖の対照では<0.2%のNETが認められた（図1f）。LPSは、ビヒクル処置正常血糖マウスと比較して、STZで誘発された糖尿病マウス由来のより多くの好中球を、H3Cithighになるように（図1e、図1g）、かつNETを形成するようにさらに刺激した（図1f、図1g）。それゆえ、ヒトと同様に、糖尿病は、マウス好中球がNETosisを起こし易くする炎症性または代謝性成分を有する。PAD4タンパク質発現が糖尿病によって増加するかどうかを評価するための特異的な抗マウスPAD4抗体はないが、上昇したヒストンH3シトルリン化によって示されるとおり、好中球プライミングはまた、増加したPAD4活性にも起因しうる4（図1e、データ示さず）。類似のNETosisアッセイを、2型糖尿病モデルである遺伝子改変db/dbマウス由来の好中球を用いて実施した（データ示さず）。これらの好中球はまた、正常血糖の対照m+/dbマウス由来の好中球と比較して、ヒストンH3を過シトルリン化し易く、かつNETを形成し易かったが（図1h、図1i）、このことは、本発明者らがヒト病態で観察したとおり、増強したNETosisが種類または病因にかかわらずネズミ糖尿病における共通の現象であることを示している。LPSは、この場合も同様に、正常血糖のWTマウス由来の高グルコースに曝露された好中球のより多くを、ヒストン過シトルリン化（図1j）およびNET産生（図1k）へと刺激し、このことは、高グルコースの潜在的なプライミングの役割を示している。それゆえ、糖尿病のマウスモデルは、NETosisに対する感受性およびPAD4活性の誘発に関してヒト病態を十分に表す。
【０２００】
マウスにおける好中球の枯渇は、非感染性糖尿病の創傷の再上皮化を加速すると過去に示された20。NETが組織に傷害性である可能性があるため21、本発明者らは、創傷においてNETが形成し、これが治癒に影響を及ぼすかどうかを求めた。本発明者らは、正常血糖のWTマウス由来の切除創傷を調べた22。H&E染色は、白血球（主に、好中球）の動員が、再上皮化を導くケラチノサイト増殖期と重複することを確認した（データ示さず）。そのため、好中球またはNETは、治癒と干渉する可能性がある。ウエスタンブロッティングによる創傷タンパク質の分析は、創傷形成の3〜7日後に最大となった漸増レベルのH3Citを示した（図2a）。3日目の創傷の免疫蛍光画像は、過シトルリン化した好中球が疥癬の直下にある創傷床中に存在したことを示した（データ示さず）。共焦点顕微鏡検査は、皮膚創傷中のNETの存在を立証した。外在化したDNAは、好中球膜マーカーLy6Gの強染色と関連する領域中に、H3Citと共局在化した（データ示さず）。注目すべきは、H3Citおよび好中球は、非創傷皮膚の表面層中に存在しなかった（データ示さず）。皮膚は、PADアイソフォーム1〜3を発現し23、これが疥癬中で細胞外タンパク質をシトルリン化し得る。H3Citの細胞供給源を検証するために、本発明者らは、白血球動員に欠陥があるCD18（132インテグリン）欠損（CD18-/-）マウスに創傷を作った。これらのマウスでは、WT創傷ではH3Citが最大になった時点（図2a）の3日目の創傷において、H3CitとLy6Gは共にウエスタンブロッティングによって検出できず（図2b、左パネル）、このことはH3Citが白血球起源であることを示している。H&E染色および免疫蛍光顕微鏡検査は、これらの創傷中に存在するわずかなCD18-/-好中球がH3Cit+であり、NETを産生したことを示した（データ示さず）。実際に、CD18-/-好中球は、インビトロでNETを効果的に産生し（データ示さず）、このことは、132インテグリンがNETosisに必要なかったことを示している。好中球が枯渇したWTマウス由来の創傷はまた、著しく低下したH3Citを示した（図2b、右パネル）。それゆえ、本発明者らのデータは、好中球が、創傷中に存在するH3Citの供給源であることを示す。
【０２０１】
創傷治癒におけるNETの役割を確立するために、本発明者らは、WTマウスとPAD4-/-マウスの創傷を比較した。WTマウスでは共焦点顕微鏡検査によってH3Citおよび細胞外クロマチンパターンが認められたが（データ示さず）、PAD4-/-疥癬中にはH&Eによって顕著な細胞外DNA構造は観察されなかった（データ示さず）。WT創傷中の強固なH3Citシグナルとは対照的に、正常な好中球動員にもかかわらずPAD4-/-マウス由来の創傷中にH3Citは検出されなかった（図3aおよびデータ示さず）。日和見感染24および弱められた創傷治癒22を有する好中球動員に欠陥があるP-/E-セレクチン二重変異体とは異なり、PAD4-/-マウスにおける創傷は、感染の明白な徴候を示さず（図3b）、WTより速く治癒した（図3b、図3c）。これは、PAD4-/-好中球では食作用13、脱果粒およびROS産生のような他の好中球機能（本発明者らの未発表の観察）が無傷であるので、これらの好中球が他の宿主防衛機構を十分に実施可能であることが理由である可能性が高い。WT対照がわずか25%であるのに対して、PAD4-/-マウスの約80%が、14日目に全ての創傷が治癒した（図3d）。創傷治癒に対するPAD4欠損の有益効果が傷害後非常に早くに観察され（図3c）、このことは、NETがケラチノサイト遊走のような初期治癒プロセスの発生を害した可能性があることを示している。この仮説と一致して、再上皮化がPAD4-/-マウスにおいてWTと比較して3倍速く進行した（図3e、およびデータ示さず）。Ki67（増殖マーカー）およびTUNEL（アポトーシスの指標）の免疫蛍光染色は、WTおよびPAD4-/-マウス由来の3日目の創傷間で相違はなかった（データ示さず）。それゆえ、おそらくNETによって誘発されるマトリックスタンパク質の修飾に起因して、遊走それ自体が影響を受ける可能性が高い。WTおよびPAD4-/-好中球はまたPAD2およびPAD3を発現するが13、本発明者らのデータは、PAD4（唯一の核PAD）が、皮膚創傷におけるヒストンH3シトルリン化およびNETosisに必須であることを実証している。Coudaneら25は、PAD4がWTマウス由来の創傷の疥癬中に検出される主要なPADアイソフォームであり、かつ、PAD2欠損マウスにおいて観察されるとおりPAD2が疥癬タンパク質のシトルリン化に不必要であり、これが創傷中のPAD4のユニークな脱イミノ化の役割をさらに強化していることを報告した。
【０２０２】
次に、本発明者らは、NETが糖尿病の創傷治癒に干渉するかどうかを調べた。STZによってWTおよびPAD4-/-マウスで1型糖尿病を誘発し、8週間後にこれらのマウスに創傷を作った。体重、食後血糖および糖尿病誘発率の変化は、2つの遺伝子型間で類似していた（図9d〜f］）。予想どおり、糖尿病のWTマウスは、正常血糖の対照よりも遅く治癒した（図4a）。全ての正常血糖のWTマウスは16日目までに治癒したが、糖尿病マウスの約20%は19日目にも依然として開放創傷を有していた（図4d）。糖尿病のPAD4-/-マウスは、7日目に糖尿病のWTマウスより>35%速く治癒し（図4b）、15日目までに全ての創傷が閉鎖した（図4e）。特に、糖尿病は、PAD4-/-マウスにおいて創傷治癒を弱めることはなく（図4c、f）、このことは、NETが糖尿病マウスにおいて治癒を遅延する主要決定因子であると強調する。創傷形成後1日目に、正常血糖のWTマウスと比較して、STZで誘発された糖尿病マウスの創傷中でより高いH3Citレベルが検出された（図4g）。インビボでの増強したNETosisは、本発明者らのインビトロ観察を再現しており（図1e〜g）、これは、糖尿病の創傷修復の遅延におけるNETの役割をさらに支持している。慢性創傷を有する糖尿病患者の医療レジメンを模倣するために提供される抗生物質は、PAD4欠損の有益効果を無効にしなかった（［補遺図10］）。
【０２０３】
PAD4-/-マウスにおける増強した創傷治癒は、NETが、創傷修復を損なう余剰な宿主防衛機構であり得ることを示唆している。NETおよびヒストンは、上皮および内皮の細胞死を直接誘発し21、カルシウム流入を介してインビトロおよびインビボで細胞毒性を引き起こす26。NETの一成分である好中球エラスターゼの高い濃度1,2は、創傷マトリックスの分解を引き起こして、治癒を遅延させ得る27。NETによって産生されるそのような細胞毒性環境は、WTマウスの創傷床中のより遅いケラチノサイト再増殖を説明し得る。PAD4は皮膚で発現されないため23、創傷に対するその負の効果は、浸潤している好中球に起因する可能性が最も高い。実際に、創傷治癒中、病原菌を防ぐためにNETを使用することが、あまり効果的ではない場合がある。その理由は、糖尿病の創傷中に非常に豊富にいるスタフィロコッカス属（Staphylococcus）の種28が、捕捉を回避するためにNETを分解し29、そして、そのNET分解産物が適切な治癒プロセスに影響を与える可能性があるからである30,31。それゆえ、NETおよび／または細菌感染から生じるその分解産物の非選択的な細胞毒性は、創傷治癒を大いに遅延させ得る。
【０２０４】
FarreraおよびFadeelは、DNase 1でのNETの前消化がインビトロでのマクロファージによるそれらのクリアランスを加速させたことを報告した32。創傷中の促進されたNETのクリアランスは、それらの毒性を低下させ、かつケラチノサイトの指向性遊走に必須である創傷マトリックス分解を減衰し得る33。それゆえ、本発明者らは、全身性のDNase 1処置が、抗生物質治療を継続した糖尿病マウスにおいて創傷治癒を加速させることができるかどうかを試験した。DNase 1処置なしでは、糖尿病のPAD4-/-マウスは、創傷形成後3日目に検査したところ、糖尿病のWTマウスと比較して創傷領域のより大きな減少（図4h、上のパネル）およびより多くの再上皮化（図4h、下のパネル）の両方の点からより良好に治癒した。DNase 1の投与は、糖尿病のWTマウスにおいて、創傷領域の減少を>20%増進し、かつ再上皮化を>75%増強させ、これは、DNase 1で処置した正常血糖のWTマウスのそれと同程度であった（図4h）。興味深いことに、DNase 1処置は、糖尿病のPAD4-/-マウスの創傷治癒においてさらなる利益を提供しなかった（図4h）。これらのデータは、NETが創傷治癒を妨げる細胞外DNAの主要供給源であることを示す。そのようなDNase 1の有益効果は、糖尿病の創傷に限定されなかった。創傷形成の3日後、DNase 1で処置した正常血糖のマウス中の創傷領域は、ビヒクルで処置したものより小さかった（図4i、上のパネル）。また、DNase 1処置群において再上皮化が約54%増強したが（図4i、下のパネル）、一方で、好中球動員は影響を受けなかった（データ示さず）。本発明者らの現在の知見は、ヒストンの細胞毒性を分解および低下させ34かつ慢性創傷35および糖尿病性潰瘍36の治癒を促進する活性化タンパク質C（APC）を用いた、パイロット臨床試験の良好な結果を裏付けている。フィブリノリジンおよびDNase（Elase）を含有する軟膏剤を用いた局所処置が創傷壊死組織切除に臨床的に使用される。壊死組織の除去に加えて、本発明者らの知見は、DNase成分がまた、NETを開裂して、細胞毒性を低下および創傷回復を増強し得ることを示唆している。
【０２０５】
まとめると、本発明者らのデータは、糖尿病が好中球を活性化してPAD4およびNETを過剰産生することを実証し、NETが創傷治癒を遅延させる重要な因子であると同定する。PAD4阻害およびDNase 1によるNETの開裂は、糖尿病におけるだけでなく、正常血糖患者の外科手術のような無菌操作から生じる創傷にも対する、創傷解消への新規の治療アプローチとなることもできる。本発明者らは、ヒト疾患におけるPAD4の重要性をさらに検証し、かつ糖尿病患者におけるPAD4の上方調節を報告しており、それゆえ、特異的なPAD4阻害物質を開発するための新たな論理的根拠を提供する。PAD4およびNET形成が、糖尿病患者において顕著である37,38炎症性疾患および血栓性疾患に寄与するため5,6、抗NET療法が追加の利益を有することもできる。糖尿病における増加したNETosisは、NETがこれらの障害を増幅し得、NETosisを阻害することまたはNETの開裂がそれらを低下させ得ることを示唆している。
【０２０６】
実施例1の参考文献
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2018503685.tif 000007
2018503685.tif 000008
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【０２０７】
実施例2：PAD4は、線維化を増進する
方法
動物
インビトロNETosis研究用の24〜27月齢C57BL/6マウスを、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）の米国国立老化研究所（National Institute on Aging）のAged Rodent Colonyから得て、Charles River Laboratoriesで維持した。これらの実験用の若齢マウス（8〜16週齢）を同じコロニーから得た。
【０２０８】
PAD4-/-および対応する野生型（WT）マウスは、C57BL/6Jバックグラウンドであった。繁殖引退個体に、6〜10週齢から屠殺の時点まで、成長および繁殖用のより高い脂肪分で強化されたLabDiet PicoLab Mouse Diet 20を与え続けた（21.635%のカロリーが脂肪によって提供される）。非繁殖個体および全ての若齢マウスに標準の実験動物用飼料（LabDiet Prolab IsoPro RMH 3000、14.276%のカロリーが脂肪によって提供される）を一生にわたって与え続けた。若齢動物は6〜8週齢であり、繁殖引退個体は12〜17月齢であり、そして、標準の実験動物用飼料を与え続けた老齢マウスは14〜18月齢であった。拡張期測定用の老齢マウスは、PAD4-/-マウスでは18月齢であり、老齢WTマウスでは15〜20月齢であったが、一方で、この実験の若齢マウスは8週齢であった。
【０２０９】
全ての群は、年齢および性が一致しており、水を自由に摂取させた。全ての実験手順は、ボストン小児病院（Boston Children's Hospital）の動物実験委員会（Institutional Animal Care）によって審査および承認された（プロトコール番号14-03-2631R）。
【０２１０】
末梢血およびサイトスピンの分析
麻酔下のマウスから後眼窩洞を介してEDTA被覆キャピラリーチューブに採血し、これをHemavet 950FS（Drew Scientific）によって全血球数について分析した。
【０２１１】
25マイクロリットルの全血を、ACK（塩化アンモニウムカリウム）溶解緩衝液中、氷上で10分間インキュベートし、次いで、Statspin Cytofuge 2を使用して細胞遠心分離した。試料を、4%パラホルムアルデヒド中、室温で2時間直ちに固定し、次いで、以前に記載したとおりH3CitおよびLy6Gを免疫染色した（16）。Zeiss Axiovert倒立落射蛍光顕微鏡およびZeiss Axiovisionソフトウェアを使用して、200×の倍率で10〜15個の視野から細胞の画像を取得した。ImageJソフトウェアを使用して閾値化分析を実施して、試料毎のH3Cit陽性好中球の集団を計算した。
【０２１２】
末梢血好中球の単離およびNET誘発
末梢血好中球を記載のとおり単離し（16）、カルシウムイオノフォア（4μM）またはPMA（100nM）で3.5時間刺激した。細胞を2%（vol/vol）パラホルムアルデヒドで固定し、そして、落射蛍光Axiovert顕微鏡（Zeiss）を使用したNETの可視化のためにDNAをHoechst 33342（Invitrogen）で染色した。三連ウェル中の5個の別個の視野からNETを計数し、これを視野中の総細胞数当たりのNET形成細胞の百分率として表した。
【０２１３】
血漿採取
麻酔下のマウス（3.5%イソフルランを使用）の後眼窩叢からクエン酸ナトリウム抗凝血剤（10% vol/vol）中に採血した。全血を6000rpmで5分間遠心分離し、血漿を採取して、再度13200rpmで5分間遠心分離して、任意の残留細胞成分を除去した。分析まで血漿試料を直ちに-80℃で保存した。
【０２１４】
心エコー検査
心機能および心臓径を記載のとおり測定した（11）。Mモードを使用して、拡張末期および収縮末期における左室（LV）内径（LVID）、LV心室中隔（LVIS）、およびLV後壁厚（LVPW）を評価した。心エコー図を、デジタル形式で保存し、そして、Vevostrainソフトウェア（VisualSonics）を使用して駆出率（LVEF；百分率）を計算した。僧帽弁を横断する流動パターンを、Pulsed Wave（PW）Dopplerモードを使用して4腔像で測定して、弱められた心室弛緩の証拠を見つけ出した。心室充満パターンは、E波とA波の間の比（E/A）として表される。
【０２１５】
血圧測定
IITC 12M22931非侵襲血圧システム（IITC Life Science）を使用して収縮期血圧を測定した。測定条件に順化させるために測定前の数日間、マウスを2回訓練した。測定のために、マウスを抑制帯内に置き、10分間落ち着かせた。収縮期血圧を、34℃のチャンバー内で尾切断法によって決定した。血圧を5回測定し、そして、得られた値の平均を提示する（表2）。
【０２１６】
（表２）
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【０２１７】
組織の調製および分析
麻酔下のマウスを頚椎脱臼によって屠殺し、肺および心臓を取り出し、そして、10%中性緩衝ホルマリン溶液中に少なくとも24時間貯蔵した。臓器をパラフィン包埋し、切片化し、そして再水和した。心臓組織中のコラーゲン含量を評価するために、ピクリン酸飽和水溶液（Sigma）500ml中のDirect Red 80（Sigma）粉末0.5gを用いてシリウスレッド染色溶液を調製した。シリウスレッドは、そのスルホン酸基を介してコラーゲン分子の塩基性基と反応することによって、コラーゲンI、IIおよびIIIを染色する（32）。スライドを60分間染色し、酸性水（5% v/v 酢酸）中で2回洗浄し、脱水し、そして、樹脂性封入剤を使用して封入した。左室心臓組織の少なくとも5個の写真を、盲検下、明視野顕微鏡検査で250×の倍率で撮った。一切片当たりの赤色の繊維（コラーゲン）の含量を、ImageJソフトウェアを使用して決定し、そして、血管周囲の線維化を計算から除外した。スライドの一部を、シリウスレッド染色の前にワイゲルト（Weigert）のヘマトキシリンで染色し、これを心臓組織の代表的な写真の作成に使用した。定量化のために、核染色なしのスライドを使用して、ヘマトキシリンの定量化アルゴリズムの干渉を回避した。左室の代表的な領域のモザイクを、ImageJのMosaicJ pluginを使用して生成した（33）。肺組織のトリクローム染色のために、マッソントリクローム染色キット（Sigma）を製造業者のプロトコールに従って使用した。核は、コラーゲン含量の定量化の干渉を回避するためにヘマトキシリンで染色しなかった。定量化のために、試料の正体が伏せられた調査員が肺実質の少なくとも6個の写真を明視野顕微鏡検査によって撮った。肺組織（空の肺胞腔を除く）当たりの青色の繊維（コラーゲン）の領域を、ImageJソフトウェアを使用して計算した。トリクローム染色による心臓組織の染色を並行して行った。これらの後者のスライドを定量化に使用しなかったので、ワイゲルトのヘマトキシリンを使用して核を染色した。
【０２１８】
統計的分析
データを平均±SEMとして提示した。統計的検定のため、二つの群を比較するときに、両側スチューデントt検定またはマンホイットニーU検定（Mann-Whitney U-test）を使用した。二群より多い比較には、ボンフェローニ事後検定と共に一元配置分散分析（one-way ANOVA）を適用した。相関分析を、GraphPad Prism 6.0dソフトウェアを使用して心臓線維化のレベルとEFとの間で実施した。0.05未満の全てのP値を有意であるとした。
【０２１９】
線維化および炎症の両方は、老化と密接に関連している（18）。老化を伴う細胞劣化に関与する複雑な機構は、DNA損傷の蓄積、ミトコンドリア機能不全、アポトーシスに対する増加した感受性、テロメア長の短縮、エピジェネティック変化、ならびに酸化ストレスを含む（19、20）。高齢者は、適応免疫応答と自然免疫応答との間の不均衡を生み出す適応免疫系の低下を含め、免疫系の機能の有意な変化を経験することが公知である（21）。一般に、老化は、より炎症誘発性な環境の原因となり（22）、ここで、より多くの好中球数およびROS産生の増加（5、20）は、病原体に対する増加した感受性および炎症性疾患（21）、例えば、神経変性障害、関節リウマチ、骨粗鬆症、糖尿病、心血管疾患ならびに血栓症（23）のより高い発生率と関連している。興味深いことに、これらの疾病の多くは、NETに関与すると報告されている。
【０２２０】
心臓および肺の両方は、老化に伴う線維化に感受性であるように思われる。心臓の老化において、線維再構成は、増加した心室硬度に起因する拡張期機能不全、および場合によっては収縮期心不全の原因となり得（26）、この収縮期心不全は、65歳を超える患者の入院の最も一般的な原因である（27）。加えて、冠動脈疾患または心膜心筋炎による心傷害を老化心臓の線維性変化に加えることができ、このことは、このプロセスの根底にある機構を理解することをさらにより重要にしている。
【０２２１】
線維性肺疾患は、肺胞壁を含む気道内の増強したコラーゲン沈着、およびその後の肺の気体交換の変調によって特徴付けられる。過剰な線維性組織の再構成は、多くの慢性肺疾患の優勢な特徴である。線維性肺疾患は、高齢者集団の大部分に影響を及ぼし（28〜30）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性または慢性肺感染後の線維形成反応、肺刺激物の吸入、自己免疫またはアレルギー性疾患および特発性肺線維化（IPF）（実績のある処置選択肢のない肺線維化の侵襲型形態）を含む。重要なことに、COPDおよびIPFは共に、これもまた老化と明らかに関連している（30、31）。炎症を線維化および老化と関連付ける複雑な機構のより良好な理解が必要であると仮定すると、この研究の目標は、PAD4/NET、線維化および老化の間に相互作用があるかを解明することであった。
【０２２２】
結果
NETを形成する好中球の感受性は、マウスの年齢と共に増加する
リンパ系の細胞に対比して骨髄系の造血幹細胞の増加を含め、老化免疫系において起こる多くの変化がある（34）。マウスにおける老化の効果をさらに研究するために、本発明者らは、NIH（米国国立衛生研究所）のNIA（米国国立老化研究所）のC57BL/6 Aged Rodent Colonyから得た若齢（8〜16週齢）および老齢（24〜27月齢）マウス由来の血液および好中球を調べた。本発明者らは、これらのマウスにおいて、好中球数が年齢と共に（図5A）、血小板数と連動して（図5B）上昇したことを確認することできた。PAD4活性のバイオマーカーとしてのシトルリン化ヒストンH3（H3Cit）およびNETosisのための好中球プライミングを使用して、本発明者らは、血中H3Cit+細胞の基礎レベルを調べ、老齢マウスにおいてより多くの割合の好中球がNETosisへ向けてプライミングされたことを見いだした（図5C）。本発明者らはまた、好中球特異的マーカーLy6Gを使用して、老齢マウスにおいて血中白血球のより多くの割合が好中球であったことを認めた（図5D）。老齢動物由来の好中球がNETを放出する傾向がより高いかどうかを評価するために、本発明者らは、末梢血好中球を単離して、これらをカルシウムイオノフォアまたはPMAで刺激した。本発明者らは、インキュベーション後、老齢マウス由来の刺激ありまたは刺激なしの好中球がどちらも、顕微鏡検査によって定量化した際、NETを形成する傾向がより高かったことを見いだした（図5E）。まとめると、これらの観察は、老化マウスにおいて、NET形成が激化される可能性が高いことを示す。本発明者らは、増加したNETosisおよびNET形成の有害作用が臓器線維化を導き得るという仮説を立てた。これを研究するために、本発明者らは、マウスの自然老化と共に起こる自然発生的な臓器線維化に焦点を当てた。
【０２２３】
PAD4-/-マウスは、老化に伴う心機能の低下から保護される
C57BL/6マウスでは、NETosisは、ヒストン修飾酵素PAD4に依存する。PAD4-/-マウスまたはWTマウスにおけるDNase 1注入を使用して、本発明者らのグループは、細胞外DNA/NETが急性心筋傷害の状況下の心機能に対して有害作用を有することを過去に示している（11）。そのため、本発明者らは、老齢WTマウスにおける増加したNETosisが心筋にとって慢性損傷となって結果として心機能の低下をもたらし得ること、およびPAD4-/-マウスにおけるNETosisの低下が保護効果を有し得るという仮説を立てた。本発明者らは、年齢および性が一致した雄および雌の群を使用して、WTおよびPAD4-/-繁殖引退個体（12〜17月齢）で心エコー検査実施した。マウスを同じ動物飼育室内に収容し、一生にわたって強化「繁殖用飼料」を与えた。2つの遺伝子型間で血球数、体重および血圧に有意差はなかった（表2）。本発明者らは、これらの動物の左室駆出率（LVEF）を評価し（図6A）、そして、WT繁殖引退個体が50.7%までのLVEFの低下を示したことを見いだし、これは老化WTマウスの心機能に関する文献と一致していた（35）。しかしながら、驚いたことに、老齢PAD4-/-繁殖引退個体は、有意により良好な心機能を保持し、平均LVEFが若齢マウスのLVEFと同程度の61.2%であった（図6B、第一のパネル）。雄と雌のマウスの間で相違は認められなかった。心室中隔の直径（IVS;d）、左室後壁厚（LVPW;d）および左室内径（LVID;d）のような心臓の拡張末期径を両方のマウス群で評価して（図2A）、観察された心機能の変化の根底にありうる重度の心室拡張または壁肥大のような潜在的な有意な寸法差を照合した。測定した構造パラメーターのいずれも2つの遺伝子型間で有意差をもたらさず、このことは、心筋収縮性、ひいては心機能それ自体が老齢WT繁殖個体で悪化するが、PAD4-/-繁殖個体では悪化しないことを示唆している。
【０２２４】
繁殖引退個体に与えられた繁殖用飼料の潜在的な影響を除外するために、本発明者らは、標準の実験動物用飼料を与えて老化させたWTおよびPAD4-/-マウスの群で全ての心エコー測定を繰り返した（図6B、6C）。老齢WTおよびPAD4-/-マウスは、年齢および性の一致した14〜18月齢であり、これを同じ動物飼育室内に収容した。加えて、標準飼料を与えた若齢の性が一致したマウス（6〜8週齢）でLVEFを測定した。この場合もまた、老齢WTマウスは、若齢WTマウスと比較してLVEFの低下を示し（図6B）、引退WT繁殖個体において観察されたものと類似のLVEF値であった。これは、老齢マウスにおける心機能の低下が本発明者らの研究において飼料因子と無関係であったことを示している。この第二の群では、老齢PAD4-/-マウスは、この場合もまた、若齢PAD4-/-またはWTマウスにおいて認められた平均と同程度の有意により高い平均LVEFを有しており（図6B、第一のパネル）、このことは、PAD4-/-マウスが年齢依存性の収縮期心機能の低下から保護されることを裏付けている。構造パラメーターの測定は、この場合もまた、標準飼料を与えた老齢WTおよびPAD4-/-マウスについて類似の心臓径を示し、IVS;d、LVPW;dおよびLVID;dについて有意差はなかった（図6B、6C)。
【０２２５】
老齢のマウスにおいて認められたLVEFの顕著な低下とは対照的に、ヒトでは、年齢に関連した心機能の低下は、大部分は拡張期機能不全と関連している（36、37）。その理由から、本発明者らは、標準飼料を与えた一連の老齢WT（14〜20月齢）および老齢PAD4-/-（18月齢）マウスで拡張期機能不全の徴候を評価し、これを若齢WTおよびPAD4-/-（2月齢）マウスと比較した。具体的には、僧帽弁流入パターンを心エコー検査によって測定し（図6Dおよび6E）、E波（拡張期中の心室の初期の受動的充満を表す）とA波（心房収縮による心室の能動的充満を表す）との間の比を計算した。代表的な画像を図6Eに示す。一般に、1未満のE’A比は、心臓の増加した硬度によって引き起こされる可能性がある、弱められた心室弛緩、ゆえに、拡張期機能不全の徴候と見なされる。老齢のWT非繁殖マウスでは、平均E’A比は0.83であり、これは、本発明者らの過去のこれらのマウスにおける心不全の観察を裏付けていた（図6Dおよび6E、左パネル）。対照的に、PAD4-/-老齢非繁殖個体のいずれも、拡張期機能不全の徴候を示さなかった：平均E’A比は1.44であり、老齢WTマウスと比較して有意に高かった（図6Dおよび6E、右パネル）。老齢WTマウスとは異なり、老齢PAD4-/-は、若齢PAD4-/-マウスと比較してE’A比の有意な低下を有していなかった。それゆえ、PAD4-/-マウスでのみ、老齢で心機能が保持された。
【０２２６】
PAD4-/-マウスは、WTマウスよりも有意に少ない間質性心筋線維化を有する
老齢WTマウスは、心臓径の有意な変化のない老齢PAD4-/-マウスと比較して、明らかに低下した心機能を有していたので、本発明者らは、心筋の組織変化があったかどうかを解明することを目指した。臓器線維化は、老齢および慢性炎症としばしば関連する組織再構成の一形態であるので、機能的変化が、年齢と共に心筋線維化が増加することに起因した可能性が強い。そのため、本発明者らは、WTおよびPAD4-/-繁殖引退個体（n＝6）の心臓を摘出し、心臓組織中のコラーゲンを同定および定量するために使用されるシリウスレッド染色によって間質性の心臓線維化を評価した（32、38、39）（図7A、7Cおよび7D、左パネル）。血管周囲の染色をこの分析から除外した。興味深いことに、WT繁殖引退個体は、年齢の一致した12〜17月齢PAD4-/-マウスよりも有意に多くの間質線維化を示した（図7A）。対照的に、PAD4-/-繁殖個体の心臓中のシリウスレッド陽性のコラーゲン繊維は、主に血管周辺に位置しており、間質線維化がほとんどなかった（図7C）。本発明者らは、老齢WTおよびPAD4-/-非繁殖個体で同じ分析を実施し、WTマウスとPAD4-/-マウスとの間で類似の相違を見いだした（図7B）。追加的に、若齢WTおよびPAD4-/-マウスの心臓を評価して、遺伝子型間での線維化の相違が若齢時に既に存在していたかどうかを解明した。6〜8週齢時に、WTおよびPAD4-/-マウスは、同程度の小さい間質性の心臓線維化を有していて（図7B）、このことは、WTマウスとPAD4-/-マウスとの間で観察された相違が実際に老化に伴う現象であったことを示している。意外なことに、老齢のPAD4-/-非繁殖個体では、線維性組織の量は、若齢のPAD4-またはWTマウスのそれに依然として類似しており、このことは、その老齢マウスが老化に伴う心筋の間質線維化から保護されたことを示している。老齢PAD4-/-の心筋と比較して老齢WTにおける増加した線維化は、コラーゲンおよび線維性組織の変化を可視化するために通常使用される別の種類の染色であるマッソントリクローム染色（40、41）によって定性的に観察することもできる（図7D、右パネル）。
【０２２７】
老齢のWTマウスとPAD4-/-マウスとの間の間質線維化の有意な可視的相違にもかかわらず、決定された間質の線維性領域の百分率は低いようであった。そのため、本発明者らは、心臓内の線維性組織の相違が二つの群における機能性の相違を説明できるかどうかを考えた。全てのマウスの心臓線維化のレベルとLVEFとの相関分析を実施し、実際に、相関係数（r）が-0.44の有意（P<0.03）な負の相関を示した。この結果は、心不全発生の追加的な要因を除外しないが、線維化がこれらのマウスにおいて強度などの組織の特性（26、42）、ひいては臓器機能を決定する可能性が極めて高い。
【０２２８】
老化に伴う間質性の肺線維化は、WTマウスと比較して、PAD4-/-マウスにおいて低下する
PAD4-/-マウスが老齢で心筋の間質線維化から保護されたという驚くべき知見の後、本発明者らは、自身の研究を、年齢／炎症性疾患に関連する線維化に高度に感受性である第二の臓器系に拡張しようとした。本発明者らは、繁殖引退個体において、同様に老齢非繁殖個体および若齢マウスにおいて、WTとPAD4-/-の両遺伝子型について肺の間質線維化を評価した。引退PAD4-/-繁殖個体の肺もまた、マッソントリクローム染色によって評価した際、WT繁殖引退個体と比較して有意に少ない臓器線維化を有していた（図8A）。標準の実験動物用飼料を与えた老齢マウスでは、その相違はまた極めて大きかった（図8B、8C）。若齢マウスと比較して、WTおよびPAD4-/-の両老齢マウスは、肺において老化に伴うコラーゲン沈着の増加を示した（図8A）。しかしながら、WTマウスでは、この増加は、より顕著であった。
【０２２９】
それゆえ、本発明者らのデータは、コラーゲンについての二つの異なる組織化学的系統によって判明したとおり、老化が、異なる臓器における間質線維化の増加と関連することを示す。PAD4-/-マウスは、この年齢に関連する線維化からかなりの程度保護される。
【０２３０】
考察
老化に伴う臓器機能不全へと導く機構を理解することは、我々の急速な高齢化社会への適切な対処を提供するために必須である。それゆえ、本研究の目標は、老化、PAD4/NETおよび臓器機能の間の相互作用を調査することであった。
【０２３１】
感染性疾患におけるそれらの提唱された保護的役割（6）にもかかわらず、NETおよびそれらの成分は、細胞毒性、炎症誘発性および血栓形成促進性である（10、12、43）。上昇したNETのレベルは、自己免疫疾患（44〜46）、動脈硬化症（47）、癌（16）、DVT（14、48）および心筋梗塞（11）のような多数の非感染性疾患と関連しており、これらの疾患の発生率が年齢と共に劇的に増加するので、その全ては医療制度にとって深刻さを増す問題となっている。過剰なNET形成は、本発明者らが最近MI/Rの急性モデルにおいて示したとおり、これらの疾患の副産物であるだけでなく、NETそれ自体も臓器機能に負の影響を与える可能性がある（11）。酵素PAD4を欠くためにNETの形成に欠陥があるマウスは、急性MI/R後に有意により良好な心機能を維持し（11）、かつ、低酸素（49）によっても引き起こされる静脈血栓からも保護される（13）。
【０２３２】
NETが関係しているこれらの疾患は老齢においてより高い発生率を有するが、好中球機能およびNETそれ自体を形成し易い傾向は、老化個体において変化し得る。先天免疫と適応免疫との間のバランスは、高齢者おいて、好中球数の増加または未変化のいずれかを伴って、リンパ球の減少と共に先天免疫へとシフトすることが公知である（50、51）。好中球数および総白血球に対する好中球の割合の増加は、本発明者らの研究では若齢マウスと比較して老齢マウスにおいて見いだされた。ヒトでは、好中球集団の増大は、好中球によるROS産生の増加を伴う（5）。興味深いことに、ROSは、NETosisの誘発因子であることが示されており（25、52）、これによって老齢とNETosisとの間の潜在的な関連性が提供される。加えて、本発明者らの動物モデルで同じく示されたとおり、老齢のヒトが上昇した血小板数を有することが公知である。興味深いことに、TLR4を介した血小板の活性化、およびそれらのその後の好中球との相互作用は、NETosisを刺激すると提唱されている（53）。本発明者らの研究では、老齢マウス由来の好中球のPAD4媒介ヒストンシトルリン化およびNET形成の傾向は、PMA（NETosisのROS依存性誘発因子）およびイオノマイシン（細胞内へのカルシウム流入を直接誘発してPAD4を活性化するROS非依存性刺激因子）（25）への曝露後、若齢マウスと比較して有意に上昇した。刺激なしであっても、老齢マウス由来の好中球は、より高いH3Citの基準値を有しており、単離後より多くのNETを産生していた。本発明者らが知る限りでは、これは、老化マウス由来の末梢血好中球中のNET形成を評価する最初の研究である。過去の刊行物は、老齢マウスにおいて、腹膜内へ溢出した好中球がNETを形成する傾向の低下を有したことを示したが（54）、この動員された腹膜の好中球集団は、遊出によって修飾／活性化される可能性が高く、NETを形成する可能性が低い（55）。
【０２３３】
細胞毒性のNETを形成する老齢マウスの過度の能力が老齢での臓器機能に影響を与えたかどうかを評価するために、本発明者らは、繁殖引退個体および一生にわたって標準の実験動物用飼料を与えたマウスの両方において、NETを形成することができる（WT）またはNETosisに欠陥があった（PAD4-/-）老齢マウスにおける心機能を測定した。本発明者らのグループは、MI/Rの急性モデルにおいて、PAD4-/-マウスがWTマウスと比較して心機能の低下から保護されることを過去に示しているので、本発明者らはこの臓器系を選択する。老化は、ミトコンドリアが豊富な心筋細胞によって過剰なROS産生を介して心筋損傷を引き起こす可能性があり（56）、細胞外ROSは好中球−内皮相互作用を増大させる（57）。それゆえ、本発明者らは、上昇したNETosisの活性化を伴う老齢において、NETの長期放出も心機能の相違の原因となるかどうかに興味を持った。興味深いことに、本発明者らは、老齢WTマウス対老齢PAD4-/-マウスにおける収縮期と拡張期の両方の機能性の測定間で有意差を観察した。WTマウスは、文献で過去に報告された値に非常に類似した値の、老化に伴う予想されるLVEFの低下を有していたが（35）、老齢PAD4-/-マウスにおけるLVEFは、収縮期（LVEF）ならびに拡張期（E/A比；）パラメーターの両方について、若齢マウスのそれと同程度のままであった。したがって、老化マウスの心臓は、心筋梗塞などの特定の事象の非存在下であっても心機能に負の影響を与える、経時的な、NET形成に起因する慢性傷害を受けている可能性がある。
【０２３４】
ヒトの心臓の老化に伴う構造再構成および心機能の低下は、心筋細胞肥大および間質線維化と関連する。若齢では、健康な心臓、筋細胞および心筋束は、それぞれ、結合組織の薄層、筋内膜および筋周膜に囲まれている。対照的に、年齢と共に、細胞外マトリックスタンパク質は間質中に蓄積し、そして、結果として筋内膜および筋周膜の線維化を生じる（42）。本発明者らは、シリウスレッド染色を使用して、心筋中のコラーゲンを同定し、老齢および若齢のWTマウスにおける間質線維化を評価した。本発明者らは、老齢WTマウスにおける間質線維化の増加を見いだした。しかしながら、そのような老化に伴う増加は、老齢PAD4-/-マウスでは存在しなかった。コラーゲンおよび他の細胞外マトリックス（ECM）成分は、組織完全性を維持するうえで重要な役割を担っており、かつ「健全なシグナル伝達（healthy signaling）」を提供するが、本発明者らが老齢WTマウスにおいて認めたとおり、過剰なECM蓄積は心室コンプライアンスを低下させ、かつ拡張期および収縮期の両方の心機能を弱める可能性が高い（42）。間質線維化の増加が老化に伴うWTの心機能の低下における関連因子であることが、間質線維化の範囲とマウスのLVEFとの間の逆相関によってさらに裏付けられた。
【０２３５】
線維化に高度に感受性である別の臓器は、肺である（28、30）。しかしながら、ここで、本発明者らが観察した老化に伴う線維化は、PAD4発現に部分的に依存性であったにすぎなかった。呼吸は、肺の気道を外部世界に曝し、そして、線維化へと導く傷害は、傷害性サイトカインの産生を生じる軽度の感染および／または粒子状物質の吸入が原因である可能性もある。しかしながら、老齢の肺であっても、PAD4欠損は線維化を有意に低下させ、これは改善された肺性能を導き得る。
【０２３６】
PAD4-/-マウスにおける間質コラーゲンの低下および心機能不全からの保護は、特筆すべきことであり、なぜPAD4-/-マウスが老齢における線維化から保護されるかに関する疑問を提起する。上に述べたように、NETの主要タンパク質成分であるヒストン（58）は、内皮および上皮に対して細胞毒性作用を有することが示されている（10、59）。そのため、組織中のこれらの成分の慢性的な上昇は、永続的な傷害および過剰なECMの形成を導き得るだろう。さらに、NETと共に放出されるプロテアーゼである好中球エラスターゼは、ブレオマイシンで誘発された肺傷害の動物モデルにおいて、肺線維化に直接寄与することが示されている（60）。最近公表された研究は、NETと線維化との間の直接的な関連性を提唱している（61）。この研究では、NETは、培養した肺線維芽細胞の筋線維芽細胞表現型への分化を増進し、この筋線維芽細胞表現型は、増加した結合組織成長因子の発現、コラーゲン産生および増殖／遊走を実証した。そのため、インビボで、NETが細胞挙動を同様に改変し、それによって線維化を増進し得ると仮説を立てることが妥当である。
【０２３７】
本発明者らの結果は、老齢それ自体が、生物にとってNET依存性の影響を伴う「NET誘発状態」と見なすことができることを示唆している。しかしながら、老齢マウスまたは老齢のヒトの臓器機能を調べると、任意の臓器系への損傷は、一生にわたる損傷の合計である可能性が高い。臓器機能不全に寄与し得るNET誘発事象は、低酸素、機械的傷害および種々の種類の感染を含む。ヒトは、保護された特定病原体の無い環境中に生存しているマウスよりも極めて多くそのようなストレスに曝されるので、一生のあいだの好ましくない作用が実験室マウスよりもヒトではさらにより重大であると予想されるだろう。
【０２３８】
マウスにおける老化に関する本発明者らの研究は、とりわけ老齢における、公知のNET誘発疾患においてPAD4活性および過剰なNET産生を制限することが有益であろうことを示す。NETを標的とした治療薬は、NETをDNaseで消化する工程、それらの形成をPAD4阻害物質のような作用物質で阻害する工程、またはヒストンもしくはエラスターゼのようなそれらの毒性成分を中和する工程を含むことができる（10、62）。これらのアプローチは、臓器機能に対して、おそらくは個体の寿命にも、良好な長期効果を有するだろう。
【０２３９】
実施例2の参考文献
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【０２４０】
配列表
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2018503685.tif 000018
【図１Ａ】
2018503685.tif 000020
【図１Ｂ】
2018503685.tif 000021
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2018503685.tif 000023
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月21日(2017.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018503685000001.app
【国際調査報告】
2018503685.tif 000056
2018503685.tif 000057
2018503685.tif 000058