(57)【要約】  本発明は、ナノ粒子を含む組成物並びに腫瘍を治療する方法に関する。本発明の一態様では、ナノ粒子のカプセルに封入した抗がん剤を患者に腹腔内投与し、がんを治療する方法に関し、ナノ粒子は抗がん剤をゆっくりとタイムリーに放出して腫瘍細胞を効率的に死滅させる。本発明の他の態様は、ナノ粒子の持続放出性カプセルに封入した抗がん剤を患者に局所投与してがんを治療する方法に関し、抗がん剤を封入したナノ粒子は胸膜内投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗がん剤治療を必要とする患者に対して、ナノ粒子にカプセル化された前記抗がん剤を腹腔内に投与し、がんを治療する方法であって、前記ナノ粒子は生体外（in vitro）放出に基づき、２４時間ごとに３０％以下の率で抗がん剤を放出する、がんの治療方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子は、水素化した天然由来のリン脂質、コレステロール及びｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコールスクシネートの群から選択されるリン脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リン脂質は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノ粒子は、疎水性ブロックと、疎水性ブロックに結合した親水性ブロックと、１以上の双性イオンと、を有する、１以上のブロック共重合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性ブロックは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリバレロラクトン（ＰＶＬ）、ポリ（乳酸−コーグリコライド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリブチルラクトン（ＰＢＬ）、ポリグリコリド又はポリプロピオラクトン（ＰＰＬ）であり、親水性ブロックはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）又はポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＡ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子は、以下の化合式を有するブロック共重合体を含む重合体ミセル（例えばミセルタキソール）である、請求項１に記載の方法
【化３】
2018505224.tif 000007
ここで、Ｒは水素原子、C1-6 アルキル基、ベンジル基又はアシル基であり、ｍ及びｎは、それぞれ１０〜１００の整数である。
【請求項７】
前記重合体ミセルの直径は２０ｎｍから１，０００ｎｍの範囲のである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗がん剤は、ゲムシタビン、イダルビシン/シタラビン、リン酸エトポシド、グリベック、テモゾロミド、ボルテゾミブ、レトロゾール、セツキシマブ、ベバシズマブ、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、ドセタキセル、エルロチニブ、ペメトレキセド、ペメトレキセド／カルボプラチン、パクリタキセル／カルボプラチン、レトロゾール／シクロフォスホアミド、テムシロリムス、ベバシズマブ／テムシロリムス、イピリムマブ、RAD001、パゾパニブ、FOLFIRI、BKM120、GSK1120212、PF-05212384／イリノテカン、AZD2171、PF-04691502、シクロフォスホアミド、シスプラチン、シタラビン／ダウノルビシン、テムシロリムス、エルロチニブ/テムシロリムス、カペシタビン、タモキシフェン、ボルテゾミブ、トラスツズマブ、ドセタキセル／カペシタビン、トラスツズマブ／ティピファーニブ、ティピファーニブ／ゲムシタビン、トゥーテカン並びにこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗がん剤はパクリタキセルである、請求項２、４、６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記がんは卵巣がん、肺がん、肝臓がん、胃がん又は結腸がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記がんは卵巣がん又は結腸がんである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗がん剤治療を必要とする患者に対して、ナノ粒子にカプセル化された前記抗がん剤を局所投与し、がんを治療する方法であって、前記抗がん剤の前記ナノ粒子は生体外（in vitro）放出に基づき、２４時間ごとに３０％以下の率で抗がん剤を放出し、胸膜内に局所投与される、がんの治療方法。
【請求項１３】
前記持続放出されるナノ粒子は、水素化した天然由来のリン脂質、コレステロール及びｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコールスクシネートの群から選択されるリン脂質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リン脂質は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記持続されるナノ粒子は、疎水性ブロックと、疎水性ブロックに結合した親水性ブロックと、１以上の双性イオンと、を有する、１以上のブロック共重合体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記持続されるナノ粒子は、以下の化合式を有するブロック共重合体を含む重合体ミセル（例えばミセルタキソール）である、請求項１２に記載の方法
【化４】
2018505224.tif 000008
ここで、Ｒは水素原子、C1-6アルキル基、ベンジル基又はアシル基であり、ｍ及びｎは、それぞれ１０〜１００の整数である。
【請求項１７】
前記がんは卵巣がん、肺がん、肝臓がん、胃がん又は結腸がんである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記がんは転移性がんである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者の腹腔は著しい癒着を発症している、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗がん剤はパクリタキセルである、請求項１３、１５、１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
卵巣がんは、卵巣で成長するがん腫である。殆どの卵巣がん（９０％以上）は「上皮性」がんであり、卵巣の表面（上皮）から発生すると考えられている。しかし、幾つかの研究では、卵管からも卵巣がんが発生すると示唆している。卵巣及び卵管は互いに繋がっているため、これらの卵管がん細胞が、卵巣がんを模擬していると考えられる。他の種類のがんは、卵細胞（胚細胞腫瘍）又は支持細胞から発生する。
卵巣がんは、婦人科がんの部類に属する。
【０００２】
卵巣がんの治療は、多くの場合、化学療法、手術が必要となり、時に放射線治療が必要とされる。外科治療は、分離可能な悪性腫瘍であり、腫瘍が卵巣に留まっている場合には十分である。腫瘍が卵巣から転移していない場合であっても、活発的な悪性腫瘍に対しては、化学療法が必要となることもある。病状が進んでいる患者には、手術による除去と化学療法との組み合わせが標準的である。
【０００３】
最新の臨床試験結果によれば、腫瘍減量術が成功したステージＩＩＩＣの上皮性卵巣がん患者は、腹腔内（ＩＰ）の化学療法を受けている患者よりも、生存率の中央値が著しく高いことが判明している。この臨床試験の患者は、ＩＰ化学療法に対する適合性が低く、全６サイクルのＩＰ化学療法を受けていた患者の半数以下と申告されている。このように、「ドロップアウト」率（ＩＰ化学療法を完了していない患者を含む）が高いにも関わらず、グループ全体としては、静脈内投与による抗がん剤治療のみを受けていた患者よりも生存率が長かった。ＩＰ化学療法による治療は、卵巣がんの第一選択治療の標準治療として推奨されているにも関わらず、推奨をする基礎となる情報が問題となっており、ステージＩＩＩ及びＩＶの卵巣がん患者にとっては標準治療となっていない。
【０００４】
結腸がんは最も一般的な種類のがんである。結腸がんにおいて、腹膜播種は終末期の症状である。悪性腹水の最も一般的な原因は癌性腹膜炎であり、悪性細胞からの液体の生成及び漏れが、細胞外液が腹腔へ滲出する原因を引き起こす。癌性腹膜炎は、結腸がん患者の主な死亡原因の一つである。
【０００５】
ナノテクノロジーと従来の化学療法との組み合わせは、癌との闘いを前に進めるための、新たな治療戦略に繋がった。現在の臨床試験で使用されている、リポソーム及びアルブミン等のナノ粒子（ＮＰ）は、溶解性及び効率を上げるだけでなく、副作用を軽減することも目的としている。ＥＰＲ効果（enhanced permeability and retention effect）は、ナノメディシンの開発の至適基準となりつつある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第7,485,320号
【特許文献２】米国特許第8,124,128号
【特許文献３】米国特許第8,420,119号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様では、ナノ粒子のカプセルに封入した抗がん剤を患者に腹腔内投与し、がんを治療する方法に関し、ナノ粒子は抗がん剤をゆっくりとタイムリーに放出して腫瘍細胞を効率的に死滅させる。
【０００８】
本発明の他の態様は、ナノ粒子の持続放出性カプセルに封入した抗がん剤を患者に局所投与してがんを治療する方法に関し、抗がん剤を封入したナノ粒子は胸膜内投与される。
【０００９】
＜参照による組み込み＞
本明細書で言及されるすべての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許、または、特許出願が、特異的にかつ個別に参照することによって組み込まれると意図されるのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の特徴および利点は、本発明の原則が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによってより良く理解されるであろう。
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｆは、パクリタキセルリポソームを持続放出する特徴及び相乗効果の例を示す。リポソームの単層形態が透過電子顕微鏡によって表されている。リポソームのサイズの平均は推定１００ｎｍである。
【図１Ｂ】数学的に処理されたインビトロ（in vitro）による薬剤の溶解放出データによると、リポソームからのパクリタキセル放出はヒグチ放出運動論（時間の二乗、R2＝ 0.9864）に従い、２４時間以内の放出が３０％以下であることを示し、特定の拡散制御モデルであることを示す。
【図１Ｃ】全身的投与又は局所投与による、腫瘍内における、ナノ粒子タキソール対タキソール（登録商標）の最適濃度を示す。ナノ粒子タキソールの局所投与は、最大AUC0 -∞を達成する。
【図１Ｄ】ナノ粒子タキソールの局所投与後の腫瘍のアポトーシスアッセイのフローサイメトリーと、卵巣がんに対する現在の標準治療であるタキソールの全身投与後の腫瘍のアポトーシスアッセイのフローサイメトリーとを示す。がん細胞のアポトーシスは、後者のグループ（２３．３％）よりも、前者のグループ（７５．２％）の方が著しく高い。
【図１Ｅ】Chou-Talalayプロット（ｙ軸に併用係数（ＣＩ値）、ｘ軸に効果レベルの機能（Ｆａ）を示した）。６回の実験後の点の薬剤ＣＩ値は全て１以下であり、ナノメディシンと局所投与との間の相乗効果を示した。
【図１Ｆ】標準化されたアイソログラムである。閾値を示す線よりも少ない値は相乗的組み合わせであることを示す。試験は３回繰り返された。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、ナノ粒子タキソールの局所投与による治療効果の例を示す。治療スキームを示す。タキソール及びナノ粒子タキソールは、１回の治療につき、マウス１ｋｇに対して必須医薬品によって１０ｍｇ投与された。
【図２Ｂ】治療効果の評価を示す。１日目に、マウスにＥＳ−２細胞（２ｘ１０５／マウスあたり）を移植し、５日目、８日目及び１１日目に指定された用量の治療を行った。４日目（ベースライン）及び１４日目に生物発光イメージングを行った。タキソール（登録商標）の局所投与は一定の治療効果を示した。しかし、ナノタキソール（登録商標）の局所投与は最も良い治療効果を示した。クレモフォールＥＬは、パクリタキセルの溶媒である。ＥＰは中空粒子を表す。
【図２Ｃ】各グループの全体的な生存率のハザード比を示す。ナノ粒子タキソールの局所投与では、ハザード比が０．４（*、Ｐ＜０．０５）である。
【図２Ｄ】各グループの白血球数を示す。ナノ粒子タキソールを局所投与したグループの白血球カウントの中央値は、タキソール（登録商標）を全身投与したグループの中央値と統計的に変わらない。試験は３回繰り返された。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、ナノプラチンの局所投与による治療効果の例である。図３Ａは治療スキームを表す。シスプラチン及びナノプラチンは、１回の治療につき、マウス１ｋｇに対して必須医薬品によって５ｍｇ投与された。
【図３Ｂ】治療効果の評価を示す。１日目に、マウスにＥＳ−２細胞（２ｘ１０５／マウスあたり）を移植し、５日目及び１０日目に指定された用量による治療を行った。４日目（ベースライン）及び１４日目に生物発光イメージングを行った。シスプラチンの局所投与は一定の治療効果を示した。しかし、ナノプラチンの局所投与は治療効果を全く示さなかった。
【図３Ｃ】各グループの全体的な生存率のハザード比である。
【図３Ｄ】各グループの白血球の数を示す。実験は３回繰り返された。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、ナノトポテカンの局所投与による治療効果の例である。図４Ａは治療スキームを表す。トポテカン及びナノトポテカンは、１回の治療につき、マウス１ｋｇに対して必須医薬品によって１０ｍｇ投与された。
【図４Ｂ】治療効果の評価を示す。１日目に、マウスにＥＳ−２細胞（２ｘ１０５／マウスあたり）を移植し、５日目及び１０日目に指定された用量による治療を行った。４日目（ベースライン）及び１４日目に生物発光イメージングを行った。トポテカンの局所投与は一定の治療効果を示した。しかし、ナノトポテカンの局所投与は最も良い治療効果を示した（＊、Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｃ】各グループの全体的な生存率のハザード比を表す。
【図４Ｄ】各グループの白血球の数を示す。実験は３回繰り返された。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄは、ナノドキソルビシンの局所投与による治療効果の例である。図５Ａは治療スキームを表す。ドキソルビシン及びナノドキソルビシンは、１回の治療につき、マウス１ｋｇに対して必須医薬品によって５ｍｇ投与された。
【図５Ｂ】治療効果の評価を示す。１日目に、マウスにＥＳ−２細胞（２ｘ１０５／マウスあたり）を移植し、５日目及び１０日目に指定された用量の治療を行った。４日目（ベースライン）及び１４日目に生物発光イメージングを行った。ドキソルビシンの局所投与は一定の治療効果を示した。
【図５Ｃ】各グループの全体的な生存率のハザード比を示す。
【図５Ｄ】各グループの白血球の数を示す。実験は３回繰り返された。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄは、アブラキサン（登録商標）の局所投与による治療効果の例である。図６Ａは治療スキームを表す。タキソール及びアブラキサンは、１回の治療につき、マウス１ｋｇに対して必須医薬品によって１０ｍｇ投与された。
【図６Ｂ】治療効果の評価を示す。１日目に、マウスにＥＳ−２細胞（２ｘ１０５／マウスあたり）を移植し、５日目、８日目及び１１日目に指定された用量の治療を行った。４日目（ベースライン）及び１４日目に生物発光イメージングを行った。タキソールの局所投与は一定の治療効果を示した。しかし、アブラキサン（登録商標）の局所投与は腫瘍の死滅を殆ど示さなかった。ＥＰ（empty particle）は、中空粒子（アルブミン）を示す。
【図６Ｃ】各グループの全体的な生存率のハザード比を示す。
【図６Ｄ】各グループの白血球の数を示す。実験は３回繰り返された。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｄは、主要臓器への転移を抑制する、ナノタキソールの局所投与による効果を示す。図７Ａは肝臓への転移の抑制を表す。１日目（ｄ１）に、マウスの脾臓に腫瘍細胞を投与し、肝臓への転移を誘発した。マウスには、指定の群に対し、８日目、１１日目及び１４日目に治療を行った。１８日目に肝臓を取り出した。ナノタキソールの局所投与（腹腔内）は、肝臓転移を最も抑制した。以下、図の説明である。矢印は腫瘍を示す。
【図７Ｂ】肺への転移の抑制を表す。１日目（ｄ１）に、マウスの尾静脈に腫瘍細胞を投与し、肺への転移を誘発した。ナノタキソールの局所投与（腹腔内）による治療を受けたマウスは、肺転移の抑制が最も少なかった。
【図７Ｃ】ナノ粒子タキソールの腹腔内投与によって治療したマウスと、治療されなかったマウス（コントロール）との後腹膜リンパ節転移を示す。
【図７Ｄ】各臓器において、ナノ粒子タキソールの腹腔内投与によって治療したマウスと、治療されなかったマウスとの、全体的な生存率のハザード比分析を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｈは、癌幹細胞をさらに効率的に死滅させる、ナノ粒子タキソールの局所投与の結果を示す。図８Ａは治療された腫瘍が、がん細胞の腫瘍様塊（sphere-forming）を形成する能力を示す。１日目に、マウスにＥＳ−２細胞（２ｘ１０６／マウスあたり）を移植し、５日目、８日目及び１１日目に指定された用量での治療を行った。１４日目に、各グループの腫瘍を取り出した。腫瘍は単細胞浮遊液に引き離され、超低接着ディッシュで１０日間培養された。タキソール（登録商標）が局所投与された腫瘍では、マイクロスフィアフォメーション(microsphere formation)を殆ど示さなかったが、他の3種類の治療群（タキソール（登録商標）静脈内投与、タキソール（登録商標）腹腔内投与、ナノ粒子タキソール静脈内投与）は、マイクロスフィアフォメーションの増加を示した。代表的な図を示す。
【図８Ｂ】がん細胞の腫瘍のスフィアフォメーション(sphere formation)の形成を示す（平均値±ＳＤ）。
【図８Ｃ】Hoechst 33342ステイン細胞のフローサイトメトリー分析、並びにサイドポピュレーション細胞の識別を示す。サイドポピュレーション細胞のパーセンテージを示す。（８Ｄ−８Ｇについて）
【図８Ｄ】幹細胞マーカー発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図８Ｅ】上皮間葉転換（ＥＭＴ）出現と、上皮又は間葉系表現型の発現を誘発する遺伝子を示す。
【図８Ｆ】腫瘍血管新生の遺伝子を示す。
【図８Ｇ】複数の医薬に対抗する遺伝子を示す。
【図８Ｈ】幹細胞におけるＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２発現を示す。腫瘍に対するタキソール（登録商標）の局所投与は、コントロール群と比較して、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２発現の阻害を示した。一方、他の治療を採用する３グループ（タキソール（登録商標）静脈内投与、タキソール（登録商標）腹腔内投与、ナノ粒子タキソール静脈内投与）では、コントロール群と比較して、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２発現が増加した。実験は３回繰り返された。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、腹腔内温熱化学療法の代わりに、ナノ粒子タキソールを局所投与した結果を示す。図９Ａにおいて、再発性腫瘍は回収されHoechst 33342によって染色されたサイドポピュレーション細胞のフローサイトメトリー分析に送られた。サイドポピュレーション細胞の割合は、原発性腫瘍（左図、０．４％）よりも再発性腫瘍（右図、３．６％）の方が著しく、これは再発性腫瘍の方が癌幹細胞を多く持っていることを示している。
【図９Ｂ】腹腔内温熱化学療法の図である。図には、流入ポートと流出ポート、灌流時のマウスの体温を監視するための肛門用の温度プローブが図示されている。マウスには、タキソール（登録商標）（１０ｍｇ／ｋｇ）を１時間、３ｍＬ／分の流量で灌流した。
【図９Ｃ】タキソール（登録商標）の腹腔内温熱化学療法（ＨＩＰＥＣ）及びナノ粒子タキソールの腹腔投与は、再発性腫瘍細胞を有するにも関わらず、良い腫瘍制御を示した。
【図９Ｄ】ＨＩＰＥＣの有害事象は、腸閉塞または腸穿孔を示すＨＩＰＥＣの群よりも高いことを示した図である。有害事象は、ナノ粒子タキソールを腹腔投与した群には現れなかった。実験は３回行われた。
【図１０】本発明の実施形態に従い、適切なナノ粒子を製造するガイダンスを示す。２つの極端な例（結合が強すぎる、弱すぎる）では、ナノメディシンの腫瘍死滅効果が不十分である。結合が弱すぎる例では、適度な効果を示す遊離型医薬のように反応する。結合が強すぎる例では、効果を全く示さない。持続放出型ナノメディシンのタイムリーな局所投与のみが、十分な腫瘍死滅を示す。
【図１１】ＢＬＩと体内における細胞の成長との関係を示す。表示された数のＥＳ２−ｌｕｃ細胞が、細胞培養ディッシュで、摂氏３７度で２４時間培養された。ＢＬＩは２４時間後、ＩＶＩＳ−５０システムを使用して抽出した。
【図１２Ａ】ＢＬＩとＳＣＩＤマウスの細胞培養との間の関連性を示す。
【図１２Ｂ】ＢＬＩとＳＣＩＤマウスの細胞培養との間の関連性を示す。１日目に、マウスにはＥＳ２−ｌｕｃ細胞（５ｘ１０５／マウス）を移植した。ＢＬＩは所定の日に抽出した。１７日目にマウス１匹が死んだ。
【図１３】ナノ粒子タキソール又はミセル−タキソールで腫瘍増殖を抑制した結果を表す。１日目に、マウスにＥＳ２−ｌｕｃ細胞（５ｘ１０５／マウス）を接種し、５日目、８日目、１１日目に所定量のナノ粒子タキソール又はミセル−タキソールによって治療を行った。４日目及び１４日目にＢＬＩを抽出した。ミセル−タキソールの静脈内投与及び腹腔投与後かつＩＶＩＳ分析の前に、マウス１匹が死んだ。
【図１４】Xenogen IVIS-50及びLiving Image software (Caliper Life Sciences社)を使用した、図１３のＢＬＩ結果の数値を示す。データは平均値±ＳＤ、Ｎ＝１１（ナノ粒子タキソール）、Ｎ＝１０（ミセル−タキソール）で示された。
【図１５Ａ】１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソール及び１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールによって腫瘍増殖を抑制した結果の図である。
【図１５Ｂ】１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソール及び１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールによって腫瘍増殖を抑制した結果のグラフである。１日目に、マウスにＥＳ２−ｌｕｃ細胞（５ｘ１０５／マウスあたり）を移植し、５日目、８日目、１１日目に、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソール又はミセル−タキソールによる治療が行われた。４日目（ベースライン）及び１４日目にＢＬＩを抽出した。
【図１６】腫瘍を持つマウスの腹腔を解剖した図である。腫瘍を持つマウスは、異なる程度の腹水が溜まっていることが示された。写真Ａの解剖図（コントロールグループ）及びＢ（ミセル−タキソールを静脈内投与したグループ）は、血液と共に腹水が溜まっていることを最も深刻に示した。ミセル−タキソール又はナノ粒子タキソールの腹腔内投与したグループ（Ｃ〜Ｇ参照）は、Ａ又はＢのグループよりも腹水少ないことが判明した。全てのマウスは、死後解剖された（Ａ、Ｂは１９日目、Ｃ、Ｆ、Ｇは２１日目、Ｄ、Ｅは２６日目）。
【図１７】ＩＶＩＳシステムを使用した、腹水の癌細胞を示す。図１６Ａで示したコントロール群のマウスから抽出された腹水は回収され、細胞培養された。培養された細胞は、ＩＶＩＳシステムにより分析された。細胞はＢＬＩ信号を示し、腹水にはヒトの卵巣がんＥＳ２−ｌｕｃ細胞が含まれていることを示した。
【図１８】図１７に関連する動物試験で使用されたマウスの体重の変化を表す。
【図１９】ＥＳ２−ｌｕｃ細胞が腹腔内投与されたマウスが、ミセル−タキソール又はナノ粒子タキソールによる治療を受けた後の、生存調査の結果を示した図である。１日目に、ＥＳ２−ｌｕｃ細胞（５ｘ１０５細胞）をマウスの腹腔に接種した。溶媒対照群（図では●で示される）として生理食塩水を使用し、５日目、８日目、１１日目にミセル−タキソールを静脈内投与（１０ｍｇ／ｋｇ：図では○で示される）、ミセル−タキソールを腹腔内投与（１０ｍｇ／ｋｇ：図では▼で示される）、ナノ粒子タキソールを腹腔内投与（２ｍｇ／ｋｇ：図では△で示される）、ナノ粒子タキソールを腹腔内投与（５ｍｇ／ｋｇ：図では■で示される）、ナノ粒子タキソールを腹腔内投与（１０ｍｇ／ｋｇ：図では□で示される）又はナノ粒子タキソールを腹腔内投与（２０ｍｇ／ｋｇ：図では◆で示される）し、その後の生存期間を分析した。（ｎ＝１１、ナノ粒子タキソール群；ｎ＝１０、ミセル−タキソール群）この生存率は、図１３のマウスの結果に基づく。
【図２０】ＥＳ２−ｌｕｃ細胞が腹腔内投与されたマウスが、１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソール又はナノ粒子タキソールによる治療を受けた後の、生存調査の結果を示した図である。１日目に、ＥＳ２−ｌｕｃ細胞（５ｘ１０５細胞）をマウスの腹腔に接種した。溶媒対照群（図では●で示される）として生理食塩水を使用し、５日目、８日目、１１日目にミセル−タキソールを静脈内投与（１０ｍｇ／ｋｇ：図では○で示される）又はナノ−タキソールを腹腔内投与（１０ｍｇ／ｋｇ：図では▼で示される）し、その後の生存期間を分析した。（コントロール群、ｎ＝３；ミセル−タキソール及びナノ−タキソール群、ｎ＝７）この生存率は、図１５のマウスの結果に基づく。
【図２１】ＢＬＩと生体外の細胞増殖との関係を示す。表示された数のＥＳ２−ｌｕｃ細胞が、細胞培養ディッシュで、摂氏３７度で２４時間培養された。２４時間後、ＩＶＩＳ−５０システムを使用し、生物発光イメージを撮影した。
【図２２Ａ】ＢＬＩとＳＣＩＤマウスの細胞増殖との関係を示す。
【図２２Ｂ】ＢＬＩとＳＣＩＤマウスの細胞増殖との関係を示す。１日目に、マウスにＣＴ−２６ｌｕｃ細胞を移植した。生物発光イメージは、所定の日に撮影された。
【図２３Ａ】ナノ−タキソール又はＰＴＸによる腫瘍増殖抑制の結果を表す。１日目に、マウスにはＣＴ−２６−ｌｕｃ細胞（１ｘ１０５／マウス）が接種され、４日目、６日目、８日目に所定量のナノ−タキソール又はＰＴＸを投与した。４日目（ベースライン）及び１４日目に生物発光イメージを撮影した。
【図２３Ｂ】Xenogen IVIS-50及びLiving Image software (Caliper Life Sciences社)を使用し、図２３ＡのＢＬＩ結果の数値をグラフ化したものである。データは平均値±ＳＤとして示されており、Ｎ＝８（ナノ−タキソール）、Ｎ＝７（ＰＴＸ、コントロール）である。
【図２４】図２３Ａ〜Ｂに関連する動物試験で使用したマウスの体重の推移を図示したものである。
【図２５】ＣＴ−２６−ｌｕｃ細胞が腹腔内投与されたマウスが、ナノ粒子タキソール又はＰＴＸによる治療を受けた後の、生存調査の結果を示した図である。１日目に、ＣＴ−２６−ｌｕｃ細胞（１ｘ１０５細胞）はマウスの腹腔に投与された。溶媒対照群（図では●で示される）として生理食塩水を使用し、４日目、６日目、８日目に、１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを静脈内投与（図では○で示される）、１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを腹腔内投与（図では▼で示される）、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを静脈内投与（図では△で示される）、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを腹腔内投与し（図では■で示される）、生存期間を分析した（コントロール及びＰＴＸグループ、ｎ＝７、ナノ粒子タキソールグループ、ｎ＝８）。この生存率は、図２３のマウスの結果に基づく。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
全てのナノ粒子（ＮＰ）ベースの医薬品は、指針としてＥＰＲ効果を使用する。理論上、ＮＰの使用は、医薬の生体内半減期を延長することができるため、薬物動態学的な利点を有する。しかし、この薬物動態学的な利点及びナノテクノロジーに関する多数の出版物及び特許によっても、数少ないナノメディシンにおいてのみしか成功が認められない。さらに、腫瘍にターゲットを当てたドラッグデリバリーの分野における大きな落とし穴は、殆どの場合において、ＥＰＲ効果が過大評価されている及び／または誤って理解されている。
【００１２】
例を挙げると、最初のＦＤＡ認可されたナノメディシンである、ペグ化リポソーム内包ドキソルビシン（DOXIL, Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C., Raritan, NJ; CAELYX, Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ）では、腫瘍組織での集積が確認されたが、転移性乳がんの治療において、ドキシル（登録商標）と遊離性ドキソルビシンとを比較した２回の第ＩＩＩ相試験では、ＥＰＲ効果は、実際は、腫瘍反応割合及び全体の生存率に対する統計的な著しい改善には繋がらなかった。ＥＰＲベースのアルブミン結合パクリタキセルであり、別の認可されたナノメディシンであるアブラキサン（登録商標）は、腫瘍反応率及び進行停止を達成させるためには、遊離パクリタキセルよりも５０％多い量を投与する必要があるが、それでも転移性乳がんにおいては、生存率の増加が達成できなかった（６５．０週間対５５．７週間、Ｐ＝０．３７４）。さらに、転移性の非小肺がんの治療に使用されるアブラキサン（登録商標）の認証に繋がる第ＩＩＩ相試験では、アブラキサン（登録商標）使用時の全体生存期間の中央値は１２．１か月であり、従来のパクリタキセル使用時の生存期間の中央値が１１．２か月であることから、０．９か月の違いしか見られない（Ｐ＝０．２７１）。医薬の評価において、全体的な生存率は至適基準であることから、ＥＰＲ効果の調査は、現在認可されているナノメディシンの大半において、実際の抗腫瘍効率にしか変換されない。
【００１３】
パクリタキセルは、卵巣がん、乳がん、すい臓がん並びに他のがんを治療するために使用される医薬である。パクリタキセルは、アメリカ国立がん研究所によって出資されたスクリーニングプログラムによって発見され、太平洋イチイ（Taxus brevifolia）の皮から抽出されたことから、「タキソール」と呼ばれている。タキソールはBristol-Myers Squibb社によって商用的に開発され、属名が「パクリタキセル」に変更され、商標「タキソール」と名付けられた。他の商標はアブラキサン（登録商標）が掲げられる。「パクリタキセル」は固有識別子ではないことから、この名称の使用が推奨されない場合、臨床医は「ＰＴＸ」の略称を使用する。従って、特定又は明記されている場合を除き、パクリタキセルをタキソール、タキソール、アブラキサン（登録商標）、ＰＴＸ又はパクリタキセルと同じ構造を持つ名称を指す。
【００１４】
局所化学療法、例えば腹腔内温熱化学療法は、腹膜から血漿の領域と腫瘍が発生している腹腔とのアンダーカーブ比における薬物動態学的な利点を持つ。局所化学療法の合理的な使用による臨床対応例には、卵巣がん患者へのシスプラチンの腹腔内投与（全身コンパートメントと比較し、腹腔への露出が２０倍増加する）及びフロクスウリジンの肝動脈点滴（薬品の門静脈への点滴比較し、腫瘍医薬品のレベルが１５倍増加する）が存在する。しかし、これらの薬物動態学的な利点にも関わらず、腹腔内治療の臨床的使用は、腹腔からの分子量が小さい薬品の早期クリアランス、目的組織の未特定、目的組織に対する医薬の浸透が不十分等の課題があった。
【００１５】
ナノテクノロジーと局所化学療法との組み合わせ、例えばナノメディシンの局所投与は、互いの限界を補完しあう。これには、幾つかの潜在的な利点が存在する。第一に、ナノメディシンの局所投与は、局所化学療法とＮＰとの組み合わせによる、二重の薬物動態学的な利点を持つ。第二に、疎水性、水溶性が低い化学療法剤の局所投与としての使用は重大な課題を伴い、水溶性が低いことにより吸収性が低く、生物学的利用能の低下に繋がるが、ナノテクノロジーは溶解性が低い医薬の水溶性を改善することができ、局所化学療法において使用する薬品の候補を増やすことができる。第三に、従来の薬品、例えば５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、パクリタキセル及びカンプトテシンの抗がん活性は、主に細胞周期に依拠しており、長い露出時間を設ける必要がある。ナノメディシンの持続放出機能は、この固有の制限を解消することができる。第四に、クリアランスが速いと、従来の抗がん剤治療による局所投与の露出を制限することとなり、連続した投与が必要となる。さらに、従来の抗がん剤治療では、腹腔での薬品の濃度が高くなるため、腹腔内投与は局所毒性を生じる。ナノテクノロジーでは、従来からの課題を解決し、局所化学療法の持続放出性をポテンシャルとすることができる。
【００１６】
ナノテクノロジーと従来の化学療法との組み合わせは、がんに対抗するために重大な利点となる新たな治療計画を与える。現在の臨床試験において使用されているリポソーム及びアルブミンなどのナノ粒子（ＮＰ）は、溶解性及び効率性を向上しつつ、副作用を低下させることを目的としている。ＥＰＲ効果（enhanced permeability and retention effect）は、これらのナノメディシンを開発するためのスタンダードとなっている。
【００１７】
医薬開発を促進させ、ＥＰＲ効果のバイパスがナノメディシンの治療効果に与える影響を調査するために、この作業では、幾つかの認証された、又は開発中のナノメディシンについて試験を行った。医薬には、リポソーム化パクリタキセル（ナノ粒子タキソール、台湾、台湾工業技術研究院によって命名）シスプラチンと結合された高分子ミセル（ナノプラチン、千葉県柏市、ナノキャリア株式会社によって命名）、重合体ミセルトポテカン（ナノ−トポテカン、台湾、Taiwan Liposomal Companyによって命名）、ペグ化リポソーム内包ドキソルビシン（ナノ−ドキソルビシン、アメリカ、ニュージャージー州、ホワイトステーション、ドキシル/Caelyx, Merck & Co.,によって命名）及びアルブミン結合されたパクリタキセル（アブラキサン（登録商標）、アメリカ、ニュージャージー州、セルゲン）が使用された。Ａ２−ファクター要因分析は、ファクター１（全身投与に対する局所投与）、ファクター２（遊離型医薬に対するナノメディシン）が実行された。
各要因分析において、活性医薬は同量投与された。
【００１８】
例えば卵巣がん、結腸がん、その他のがんを治療するために選択されたナノ粒子を腹腔内に投与する生体内実験が行われた。
【００１９】
本発明の実行に従い、抗がん剤を腹腔内投与する化学療法に伴う問題点は、特別にデザインされた放出マトリックスを適用し、本明細書で説明されているナノメディシンを使用して、薬剤の継続的な放出を促すことによって解決できる。ナノメディシン、例えばナノ粒子タキソール及びミセルタキソールは、腹腔内投与の後、生体内で卵巣腫瘍の増殖を抑制する（例７を参照）。ナノ粒子タキソールは、用量依存の抗腫瘍活性を示し、マウスに２０ｍｇ／ｋｇを投与することにより、１１匹中８匹のマウスにおいて腹腔の卵巣がんを完全に死滅させた。１０ｍｇ／ｋｇの投与では、１１匹中３匹のマウスにおいて腹腔の卵巣がんを完全に死滅させ、１１匹中８匹のマウスにおいて腫瘍の数を減少させた。
反応率は１００％であった。
【００２０】
ナノ粒子タキソールの腹腔内投与は、ヒト腫瘍細胞を異種移植したマウスに対する卵巣がんの治療において、有効であることを示した（例７を参照）。他の腹部のがんにナノ粒子タキソールを腹腔内投与した場合の効果を観察するために、結腸がんを移植した同種マウスモデルに、ナノ粒子タキソールを腹腔内投与（i.p.）又は静脈内投与（i.v.）した場合の抗がん性を観察した（例８を参照）。その結果、腹腔内投与の後、ナノ粒子タキソールは結腸がんCT-26-luc細胞を生体内で抑制することが判明した。
【００２１】
一実施形態では、ナノ粒子のカプセルに封入した抗がん剤を患者に投与し、患者の腹腔内のがんを治療する方法に関し、ナノ粒子は抗がん剤をゆっくりとタイムリーに放出して腫瘍細胞を効率的に死滅させる。一実施形態では、前記ナノ粒子はゆっくりと抗がん剤を放出する特徴を有し、生体外（インビトロ、in vitro）放出試験では２４時間ごとに３０％以下の率で抗がん剤を放出する。一実施形態では、がんは卵巣がん、肺がん、肝臓がん、胃がん又は結腸がんをいう。特定の実施形態では、がんは卵巣がんを指す。別の実施形態では、がんは結腸がんを指す。
【００２２】
一実施形態では、抗がん剤は例えば、ゲムシタビン、イダルビシン／シタラビン、リン酸エトポシド、グリベック、テモゾロミド、ボルテゾミブ、レトロゾール、セツキシマブ、ベバシズマブ、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、ドセタキセル、エルロチニブ、ペメトレキセド、ペメトレキセド／カルボプラチン、パクリタキセル／カルボプラチン、レトロゾール／シクロフォスホアミド、テムシロリムス、ベバシズマブ／テムシロリムス、イピリムマブ、RAD001、パゾパニブ、FOLFIRI、BKM120、GSK1120212, PF-05212384／イリノテカン、AZD2171、PF-04691502、シクロフォスホアミド、シスプラチン、シタラビン／ダウノルビシン、テムシロリムス、エルロチニブ/テムシロリムス、カペシタビン、タモキシフェン、ボルテゾミブ、トラスツズマブ、ドセタキセル／カペシタビン、トラスツズマブ／ティピファーニブ、ティピファーニブ／ゲムシタビン、トゥーテカン並びにこれらの組み合わせである。特定の実施形態では、抗がん剤はパクリタキセルである。
【００２３】
一実施形態では、前述のナノ粒子（抗がん剤がカプセル化されている）は、水素化した天然由来のリン脂質と、長い炭素鎖（−（ＣＨ２）ｎ−、ｎは最低でも１４である）を持つ飽和リン脂質の群から選択され、相転移温度Ｔｇｌの幅が摂氏４０〜７４度である第一リン脂質と；不飽和リン脂質と、短い炭素鎖（−（ＣＨ２）ｎ−、ｎは最大でも１４である）を持つ飽和リン脂質から選択され、相転移温度Ｔｇ２の幅が摂氏−３０〜１０度である第二リン脂質と；第一リン脂質と第二リン脂質とが不混和性相で互いに存在し、複数の連続しない領域を形成し、第一リン脂質と第二リン脂質とのモル比は３：１６である、リポソーム形成物と；を有し、リポソームに含まれる前記抗がん剤の量は少なくとも２０モル％であり、リポソームを形成する。一実施形態では、ナノ粒子は、６か月またはそれ以上の期間の取込効率は、少なくとも約７０％である。一実施形態では、第一リン脂質ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の群から選択される。他の実施形態では、第一リン脂質は、水素添加卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）及びジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジスアロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）及びジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）の群から選択される。本明細書で説明される、ナノ粒子の非排他的な一例としては、ナノ粒子タキソールが挙げられる。
【００２４】
一実施形態では、本明細書で開示された、がんを腹腔内投与によって治療するために適したナノ粒子は、疎水性ブロックと、疎水性ブロックに結合した親水性ブロックと、１以上の双性イオンと、を有する、１以上のブロック共重合体を含む。一実施形態では、１分子内に１つの正電荷と負電荷とを持つ双性イオンは、疎水性ブロックの末端に結合される。一実施形態では、疎水性ブロックはポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリバレロラクトン （ＰＶＬ）、ポリ（乳酸−コーグリコライド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリブチルラクトン（ＰＢＬ）、ポリグリコリド又はポリプロピオラクトン（ＰＰＬ）であり、親水性ブロックはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）又はポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＡ）である。
【００２５】
一実施形態では、本明細書で開示された、がんを腹腔内投与によって治療するために適したナノ粒子は、下記の化合式を有するブロック共重合体を含む重合体ミセル（例えばミセルタキソール）を含む。
【化１】
2018505224.tif 000002
ここで、Ｒは水素原子、Ｃ1-6 アルキル基、ベンジル基又はアシル基であり、ｍ及びｎは、それぞれ１０〜１００の整数である。
一実施形態において、重合体ミセルは約２０ｎｍから１，０００ｎｍの範囲の直径を有する。
一実施形態において、重合体ミセルは疎水性の内部と親水性表面とを有する。
【００２６】
一実施形態では、持続放出性ナノ粒子によってカプセル封入した抗がん剤を患者に局所投与し、患者のがんを治療する方法に関し、抗がん剤を含有するナノ粒子を胸膜内に投与する。
一実施形態では、がんは卵巣がん、肺がん、肝臓がん、胃がん又は結腸がんである。
一実施形態では、前記がんは転移性がんである。
一実施形態では、患者の腹腔には著しい癒着が見られる。一実施形態では、前記抗がん剤はパクリタキセルである。
【００２７】
＜薬学および医学用語＞
特に明記しない限り、明細書と請求項を含む本出願に用いられる次の用語は、下記の定義を備える。明細書および添付の請求項内で用いられる通り、単数形「a」、「an」および「the」は、その文脈が他に明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。特に指示がない限り、質量分析、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ＨＰＣＬ（高速液体クロマトグラフィー）、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来の方法が使用される。本出願において、「または」、或いは「および」の使用は特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含んでいる（including）」並びに「含む（include）」、「含む（Includes）」、および「含まれる（included）」は、範囲を制限するものではない。本明細書に使用されたセクション表題は、組織的な目的だけのためで、記載された主題を制限すると解釈されるものではない。
【００２８】
本明細書で使用される、製剤、組成物、または、成分に対する「許容可能な（Acceptable）」の語は、処置される被験体の一般的な健康に対して持続的な悪影響がないことを意味する。
【００２９】
用語「担体（Carrier）」は、本明細書で使用されるように、細胞または組織へ化合物の取り込みを促進する、相対的に無毒な化学化合物または薬剤を指す。
【００３０】
「同時投与（co-administration）」などの用語は、本明細書で使用されるように、一人の患者に対して選択した治療薬の投与を含むことを意味し、同じまたは異なる投与経路によって、あるいは、同じまたは異なる時間に、治療薬が投与される治療レジメンを含むことを意図している。
【００３１】
用語「希釈剤（diluent）」は、送達前に所望の化合物を希釈するために使用される化学化合物を指す。希釈剤は、より安定した環境を提供できるため、化合物を安定させるために使用され得る。緩衝液中に溶解する塩（pHの制御または維持を提供することもできる）は、当技術分野における希釈剤として利用され、これはリン酸緩衝生理食塩溶液を含むが、限定的ではない。
【００３２】
本明細書で使用される用語「有効な量」または「治療上有効な量」は、治療される疾患または疾病の１以上の症状をある程度和らげる、投与される十分な量の薬剤または化合物をいう。結果は、疾患の徴候、症状、または原因が減少および／または軽減され得るか、あるいは、生物系の任意の他の所望の変化がもたらされ得る。例えば、治療上の使用のための「有効な量」とは、疾患の症状を臨床的に有意に減少させるために必要とされる、本明細書で開示される化合物を含む組成物の量である。個々のケースにおける適切な「有効な」量は、用量増加試験などの技術を使用して定められてよい。
【００３３】
本明細書で使用される用語「増強する（enhance）」または「増強すること（enhancing）」は、効力または持続時間のいずれかにおいて、所望の効果を増加または延長させることを意味する。従って、治療薬の効果を増強することに関して、用語「増強すること」は、効力または持続時間のいずれかにおいて、系に対する他の治療薬の効果を増加または延長させる能力をいう。本明細書で使用される「増強させる有効な量」は、所望の系において別の治療薬の効果を増強するのに十分な量を指す。
【００３４】
本明細書に使用される用語「薬学的な組み合わせ（Pharmaceutical Combination）」は、１以上の活性成分の混合または組み合わせから結果的に生じる生成物を意味し、活性成分の固定された組み合わせと固定していない組み合わせとの両方を含む。用語「固定された組み合わせ」は、活性成分、例えば、本願で説明されているナノ粒子にカプセル化された抗がん剤と助剤とが、単一の実体の形態または単一用量の形態で、患者に同時投与されることを意味する。用語「固定していない組み合わせ」は、活性成分、例えば、本明細書で開示されているナノ粒子にカプセル化された抗がん剤と助剤とが、特別な時間制限なく、平行して同時に、または、連続して、別の実体として患者に投与されることを意味し、このような投与は、患者の身体に有効レベルの２つの化合物を与える。後者の用語は、例えば３以上の活性成分の投与する、カクテル療法にも当てはまる。
【００３５】
用語「医薬組成物（pharmaceutical composition）」は、本明細書で説明されているナノ粒子にカプセル化された抗がん剤と、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、および／または、賦形剤などの他の化学成分との混合物を指す。医薬組成物は、有機体への化合物の投与を促進する。化合物を投与する多くの技術は、限定的ではないが、以下の技術：静脈内、経口、噴霧、非経口、眼、肺、および局所投与を含む技術に存在する。
【００３６】
用語「被験体」または「患者」は、哺乳動物を含む。哺乳動物の例は、限定されないが、哺乳類の分類の任意の群を含む：ヒト、チンパンジーのようなヒト以外の霊長類、および、他の類人猿およびサル類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタのような家畜；ウサギ、イヌ、および、ネコのような家庭動物；ラット、マウスおよびモルモットのようなげっ歯類などを含む実験動物。
一実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００３７】
用語「処置する、治療する（treat）」、「処置すること、治療すること（treating）」、および「処置、治療（treatment）」は、本明細書で使用されるように、疾患または疾病の少なくとも１つの症状を軽減、緩和、または改善すること、さらなる症状を予防すること、疾患または疾病を抑制すること、例えば、疾患または疾病の進行を停止すること、疾患または疾病を和らげること、疾患または疾病を退行させること、疾患または疾病によって引き起こされる状態を和らげること、または、予防的および／または治療的に疾患または疾病の症状を止めることを含む。
【００３８】
＜医薬組成物の調製＞
一実施形態では、米国特許第7,485,320号、米国特許第8,124,128号、米国特許第8,420,119号に基づき調製された、治療に有効な量のナノ粒子化したパクリタキセルを有する医薬組成物を開示する（それぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００３９】
一実施形態では、前述のナノ粒子（抗がん剤がカプセル化されている）は、水素化した天然由来のリン脂質と、長い炭素鎖（−（ＣＨ２）ｎ−、ｎは最低でも１４である）を持つ飽和リン脂質の群から選択され、相転移温度Ｔｇｌの幅が摂氏４０〜７４度である第一リン脂質と；不飽和リン脂質と、短い炭素鎖（−（ＣＨ２）ｎ−、ｎは最大でも１４である）を持つ飽和リン脂質から選択され、相転移温度Ｔｇ２の幅が摂氏−３０〜１０度である第二リン脂質と；第一リン脂質と第二リン脂質とが不混和性相で互いに存在し、複数の連続しない領域を形成し、第一リン脂質と第二リン脂質とのモル比は３：１６である、リポソーム形成物と；を有し、リポソームに含まれる前記抗がん剤の量は少なくとも２０モル％であり、リポソームを形成する。
一実施形態では、調製されるナノ粒子は、６か月の取込効率が少なくとも約７０％である。
一実施形態では、第一リン脂質ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の群から選択される。他の実施形態では、第一リン脂質は、水素添加卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）及びジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジスアロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）及びジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）の群から選択される。本明細書で説明される、ナノ粒子の包括的ではない一例としてはナノ粒子タキソールが挙げられる。
【００４０】
一実施形態では、本明細書で開示された、カプセル化したナノ粒子に含有された抗がん剤（パクリタキセル等）は、疎水性ブロックと、疎水性ブロックに結合した親水性ブロックと、１以上の双性イオンと、を有する１以上のブロック共重合体を含む。双性イオンは、１分子内に１つの正電荷と負電荷とを持ち、疎水性ブロックの末端に結合される。疎水性ブロックは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリバレロラクトン（ＰＶＬ）、ポリ（乳酸−コーグリコライド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリブチルラクトン（ＰＢＬ）、ポリグリコリド又はポリプロピオラクトン（ＰＰＬ）であり、親水性ブロックはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）又はポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＡ）である。
【００４１】
一実施形態では、ナノ粒子の発明には、例えばミセルタキソール等、重合体ミセルにカプセル化された抗がん剤（例：パクリタキセル）が含まれ、前記発明は、下記の化合式を有するブロック共重合体が含まれる。
【化２】
2018505224.tif 000003
ここで、Ｒは水素原子、Ｃ1-6 アルキル基、ベンジル基又はアシル基であり、ｍ及びｎは、それぞれ１０〜１００の整数である。
【００４２】
抗がん剤は例えば、ゲムシタビン、イダルビシン／シタラビン、リン酸エトポシド、グリベック、テモゾロミド、ボルテゾミブ、レトロゾール、セツキシマブ、ベバシズマブ、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、ドセタキセル、エルロチニブ、ペメトレキセド、ペメトレキセド／カルボプラチン、パクリタキセル／カルボプラチン、レトロゾール／シクロフォスホアミド、テムシロリムス、ベバシズマブ／テムシロリムス、イピリムマブ、RAD001、パゾパニブ、FOLFIRI、BKM120、GSK1120212、PF-05212384／イリノテカン、AZD2171、PF-04691502、シクロフォスホアミド、シスプラチン、シタラビン／ダウノルビシン、テムシロリムス、エルロチニブ/テムシロリムス、カペシタビン、タモキシフェン、ボルテゾミブ、トラスツズマブ、ドセタキセル／カペシタビン、トラスツズマブ／ティピファーニブ、ティピファーニブ／ゲムシタビン、トゥーテカン並びにこれらの組み合わせが含まれる。当業者であれば本発明の慣例に基づき、他の適した抗がん剤を容易に選択できる。特定の実施形態では、抗がん剤はパクリタキセルである。
【００４３】
一実施形態では、ナノ粒子の発明には適したナノ粒子にカプセル化されたあらゆる抗がん剤（例えばナノタキソール）又は高分子ミセル（例えばミセルタキソール）が含まれ、上記抗がん剤は、腫瘍細胞を効率よく死滅させるように、図１０に図示されるように、持続的に放出される。
【００４４】
一実施形態では、ナノ粒子化したパクリタキセルの発明には、適したナノ粒子（例えばナノ粒子タキソール）又は高分子ミセル（例えばミセルタキソール）にカプセル化されたパクリタキセルを含み、上記パクリタキセルは、腫瘍細胞を効率よく死滅させるように、図１０に図示されるように、持続的に放出される。
【００４５】
一実施形態では、透析に基づき、ナノ粒子は８時間ごと、３０％またはそれ以下の速度で、ゆっくりと抗がん剤を放出する。詳しくは、米国特許第８，４２０，１１９号の例（図１、表２）を参照。
【００４６】
一実施例において提供される医薬組成物は、本明細書中に記載されているように、ナノ粒子の発明と担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、及び／または賦形剤等の化合物との混合物を含む。一実施形態では、医薬組成物は化合物の組織への投与を促進する。他の実施形態では、治療方法の実施または本明細書で説明されている使用において、本明細書に記載の治療に有効な量のナノ粒子は、疾患を持つまたは治療が必要な状態の哺乳類に、医薬組成物として投与される。
一実施形態において、哺乳類はヒトである。
一実施形態において、治療に有効な量は、疾患の重大性、年齢、患者の相対的健康度、使用される抗がん剤の潜在性、その他の要因によって異なる。
本明細書で説明されるナノ粒子は、担体または混合物の構成要素として１又は複数の治療薬の組み合わせで使用される。
【００４７】
本明細書中に記載されているナノ粒子を含む組成物の調製方法は、固体、半固体、または液体を形成するために、１以上の不活性な薬学的に許容可能な賦形剤または担体とともにナノ粒子を調製する工程を含む。
本明細書に記載される医薬組成物の形態は、液体溶液または懸濁液、使用前に液体に溶解又は懸濁することに適した固形、またはエマルジョンを含む。これらの組成物は、任意に、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの、微量の非毒性補助物質を含む。
【００４８】
医薬組成物は、ナノ粒子の溶解を促進するために、任意で可溶化剤を含んでいる。用語「可溶化剤」は、一般的に、薬剤のミセル溶液または真性溶液をもたらす薬剤を含む。特定の許容可能な非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０は可溶化剤として使用可能であり、眼科用として許容可能なグリコール、ポリグリコール、例えばポリエチレングリコール４００、およびグリコールエーテルも使用可能である。
【００４９】
さらに、一実施形態における医薬組成物は、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、塩酸などの酸を含む１以上のｐＨ調節剤または緩衝剤；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基；クエン酸塩／デキストロース、炭酸水素ナトリウムおよび塩化アンモニウムなどの緩衝液を任意に含む。このような酸、塩基、および緩衝液は、組成物のｐＨを許容可能な範囲で維持することに必要とされる量で含有される。
【００５０】
さらに、医薬組成物は、組成物の浸透圧を許容可能な範囲にするために必要な量の１またはそれ以上の塩を任意に含む。このような塩は、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、またはアンモニウムカチオンおよび塩化物アニオン、クエン酸塩アニオン、アスコルビン酸塩アニオン、ほう酸塩アニオン、リン酸塩アニオン、重炭酸塩アニオン、硫酸塩アニオン、チオ硫酸塩アニオンまたは亜硫酸水素塩アニオンを有するものを含み、適切な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、および、硫酸アンモニウムを含む。
【００５１】
他の医薬組成物は、微生物の活性を抑制する１以上の保存剤を任意に含む。適切な保存剤は、メルフェン（merfen）及びチオマーサルなどの水銀含有物質；安定した二酸化塩素；および、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアミン、および、塩化セチルピリジウムなどの四級アンモニウム化合物を含む。
【００５２】
さらなる他の医薬組成物は、物理的安定性を増強するために、または他の目的のために、１以上の界面活性剤を含む。適切な非イオン界面活性剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド及び植物油（例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油）、並びにポリオキシエチレンアルキルエーテル及びアルキルフェニルエーテル（例えばオクトキシノール１０、オクトキシノール４０）を含む。
【００５３】
さらなる他の医薬組成物は、必要に応じて、化学安定性を増強する１またはそれ以上の抗酸化剤を含んでもよい。適切な抗酸化剤は、一例であるが、アスコルビン酸および二亜硫酸ナトリウムを含む。
【００５４】
特定の形態において、薬学的な水性懸濁組成物は、単回用量分の再密閉できない容器に入れられる。もしくは、複数回用量分の再密閉できる容器が使用され、この場合は、組成物中に保存剤を含むことが一般的である。
【００５５】
特定の実施形態において、本明細書中に記載される製剤は、１またはそれ以上の抗酸化剤、金属キレート剤、チオール含有化合物、および／または、他の一般的な安定剤を含む。これら安定剤の例としては、限定されるものではないが、（ａ）約０．５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％〜約２％の／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）０．００３％〜約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％〜約０．０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）硫酸デキストラン、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ペントサンポリ硫酸ナトリウムおよび他のヘパリン類似物質、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛のような二価カチオン、または（ｎ）上記の組み合わせが挙げられる。
【００５６】
＜併用処方における一般的な留意事項＞
一般に、本明細書に記載の組成物と、本明細書の投与方法で併用治療が用いられる実施形態における他の薬剤は、同じ医薬組成物において他の薬剤が投与される必要がなく、実施形態によっては、物理的および化学的特性が異なるため、異なる経路によって投与される。幾つかの実施形態では、初回の投与は、確立された手順に従って実行され、その後、観察された効果に基づき、投与量、投与方法、投与時間は、熟練した臨床医によって修正される。
【００５７】
幾つかの実施形態では、薬物が併用療法で使用される場合、治療上有効な投与量は変動する。併用処置には、さらに、患者の臨床管理を援助するために様々な時点で開始および停止される定期的処置も含まれる。本明細書に記載されている併用療法に関して、同時投与される化合物の投与量は、用いられる同時投与薬の種類、用いられる特定の薬、処置される疾患または疾病などによって異なる。
【００５８】
実施形態によっては、緩和が求められる疾病を治療、予防、または改善するための投与法は、様々な要因に従って修正されることが理解される。これらの要因は、年齢、体重、被検体の性別、食事および病状と同様に被検体が苦しむ障害も含む。したがって、他の実施形態では、実際に用いられる投与法は幅広く、それ故、本明細書で説明される投与法からは逸脱する。
【実施例】
【００５９】
＜実施例１．腫瘍を生成するための動物モデル及び腫瘍株の準備＞
０日目（ｄ０）に、生後５週間の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（ＣＢ．１７ scid/scid）に、ヒト卵巣がん腫瘍株ＥＳ−２（各マウスに対し２ｘ１０５細胞  ＡＴＣＣ  no. CRL-1978）を腹腔内に単回投与して腫瘍を発生させ、腫瘍は３週間後に腹部膨満感及び悪性腹水が見られたことにより確認された。マウスは台北市にある台湾国家実験動物センターから購入し、台北栄民総医院（台湾台北市）の動物腫瘍施設にて管理された。動物は施設の動物健康管理規則に準拠して使用され、全ての動物実験手順は動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可されたもの準拠する。腫瘍を接種したマウスは、毛羽立ち、心拍数の増加、身体を丸めた姿勢、活動の低下、腹水の増加など、苦痛のサインが認められたエンドポイントで安楽死された。マウスの群には治療が施された。Ａ２−ファクター要因分析は、ファクター１（全身的投与に対する局所投与）及びファクター２（遊離型医薬に対するナノメディシン）で実行された。各要因分析において、活性医薬は同量で投与された。幾つかの認可された又は開発中のナノメディシンが投与され、これには以下を含む：例えばナノ粒子化したパクリタキセル（例えばリポソームに封入したパクリタキセルであり、台湾にある台湾工業技術研究院によってナノ粒子タキソールと名付けられた）、シスプラチン内包高分子ミセル（柏市に営業所を有するナノキャリア株式会社によって、ナノプラチンと名付けられた）、トポテカン内包重合体ミセル（台湾のTaiwan Liposomal Companyによってナノ−トポテカンと名付けられた）、ペグ化リポソームのドキソルビシン（アメリカ、ニュージャージー州ホワイトハウスステーションに営業所を有するメルク・アンド・カンパニーによって、ナノ−ドキソルビシン、ドキシル／Caelyxと名付けられた）及びアルブミン懸濁型パクリタキセル（アメリカ、ニュージャージー州に営業所を有するセルジーンによって、アブラキサン（登録商標）と名付けられた）。各医薬のペア（遊離型医薬及びナノメディシン）の投与スケジュールは、予備試験に基づき、抵抗可能な最大量が投与された。腫瘍細胞を尾静脈に投与することによって肺転移を引き起こし、脾臓投与によって肝転移を引き起こし、子宮内投与によって後腹膜リンパ節転移を引き起こした。各ナノメディシンの組成は各ナノメディシンから見つけられ、各ナノメディシンのソースに基づく。例えば、ナノ粒子タキソールは、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）と、コレステロールと、ｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコールスクシネートと、を含む。
【００６０】
＜実施例２．腫瘍組織におけるパクリタキセルアッセイ＞
＜＜ＨＰＬＣによるナノ粒子化パクリタキセルの生体外（In vitro）放出による活動＞＞
ナノ粒子化したパクリタキセル（例：リポソーム状のパクリタキセル）の放出は、室温での透析方法で実施され、ナノ粒子化されていないパクリタキセル（遊離パクリタキセル）と比較された。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でフリーズドライし、１．５ｍｇ／ｍＬに調製したリポソームを再構成した後、分散した一定分量のリポソームが透析管（イスラエルに営業所を有するGene Bio-Application Ltd.によるMWCO 6000-8000）に入れられ、密閉された。その後、管は２００ｍＬの遊離剤、例えば０．１％（ｖ／ｖ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）Ｔｗｅｅｎ８０に浸され、浸水した状態に保たれた。マグネチックスターラーを使用して遊離剤を３００ｒｐｍで攪拌している間、遊離剤からサンプル（０．５ｍＬ）を所定の時間間隔で２４時間抽出し、同量の溶媒で再充填された。パクリタキセルの濃度は、アセトニトリルによる適切な希釈の後、処理をすることなく、ＨＰＬＣによって判定された。
【００６１】
パクリタキセル濃度の分析には、クロマトグラフィーシステムのAgilent 1100シリーズ（アメリカ、カリフォルニア州パロアルトに営業所を有するアジレント・テクノロジーズ製）を用いた。クロマトグラフィー分離は、グレース社（マサチューセッツ州グレースに営業所を有する）Ｃ18Altima（商標）カラム（４．６ｍｍ ＩＤ、１５０ｍｍ；5μｍ）で達成され、フェノメネックス（登録商標）SecurityGuard（商標）インラインフィルターフリット（カリフォルニア州トーランス）で保護された。移動相は水、メタノール、アセトニトリルを含む（２５：３５：４０ｖ／ｖ）。移動相は０．４５μｍフィルター（マサチューセッツ州ベッドフォードに営業所を有するミリポア社製）によってフィルターされ、分析前に脱気した。高性能の液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムは、室温で流量１．０ｍＬ／分で作動し、曲線のピークにおける定量分析は波長２３０ｎｍにおいて行われ、クロマトグラフィーの作動時間は８分である。パクリタキセルを定量化するためのカリブレーション曲線は、パクリタキセルの典型的な濃度領域において５０〜５０，０００ｎｇ／ｍＬで直線状であり、相関係数はR2＝0.999であった。検出限界濃度は５０ｎｇ／ｍＬであった。
【００６２】
この実験において、持続放出機能を提供するために、ナノ粒子タキソールが主な試験医薬として使用された。この医薬の透過電子顕微鏡による画像も提供されている（図１Ａ参照）。運動方程式モデルを適用するにあたり、放出過程は０次、１次、ヒグチ方程式（T. Higuchi, Rate of release of medicaments from ointment bases containing drugs in suspension, Journal of pharmaceutical sciences, 50 (1961) 874-875）によって、放出プロファイルを数学的に処理することによって計算された。ヒグチ方程式では、更に高い相関係数を示しており、生体外（インビトロ、in vitro）薬品放出に基づく遊離性医薬は持続放出されており、生体外放出試験では２４時間ごとに３０％以下の率で放出する拡散制御メカニズムを示し、他のリポソーム製品と同様に、プロットは高い直線性を示し、相関係数値（Ｒ２）は０．９８６４と高い（図１Ｂ）。ナノ粒子タキソールを局所投与したグループでは、腫瘍内における医薬の最適濃度を示す、曲線下の領域の増加（図１Ｃ）、アポトーシス（図１Ｄ）が見られた。
【００６３】
＜実施例３．Chou-Talalay方法によるナノメディシンの局所投与の相乗性の特定＞
相乗性を評価するために、６段階の投与レベルが使用された。医薬の組み合わせによる効果を計算するにあたり、Chou-Talalayの併用係数（Combination Index、CI）−アイソボログラム方法が使用された。組み合わせによる効果を特定するために、ナノ粒子化したパクリタキセル（例えばナノ粒子タキソール）の局所投与を確認しつつ、単独投与の効果を特定するために、ナノ粒子タキソールの全身投与又は遊離パクリタキセル（タキソール（登録商標））の局所投与を確認した。Chou-Talalay方法では、median-effect式を使用し、多量希釈された濃縮液を、各治療薬に対する線量効果曲線及びこれらの組み合わせでプロットし、実験効果が相加作用によって期待される効果とどのように異なるかを計算する。ＣＩ値＝１は相加作用を示し、１未満のＣＩ値（＜1）は相乗作用を示し、１を超えるＣＩ値（＞1）は拮抗作用を示す。ＣＩ値は異なる効果及び異なる用量によって特定でき、アイソボログラムは市販のソフトウェアCompuSynを利用して自動的に決定することができる。
【００６４】
医薬の併用係数（combination index、ＣＩ）を示すＦａ−ＣＩプロットは全て１以下であり、ナノ粒子タキソールの局所投与は医薬単独（ナノ粒子タキソールの全身投与又は遊離タキソール（登録商標）の局所投与）よりも相乗的に腫瘍死滅を図ることができる（図１Ｅ参照）ことを示す。さらに、異なる組み合わせ比率による通常化されたアイソボグラムの組み合わせによっても、相乗的な腫瘍の死滅を図ることができる（図１Ｆ参照）ことを示す。
【００６５】
次に、相乗的な腫瘍の死滅効果が実際の腫瘍死滅に適用できるかを検査した。治療スキームにおいて（図２Ａ参照）、持続放出するナノ粒子タキソールの局所投与は、他の治療法と比較して最も腫瘍死滅効果が高い（図２Ｂ参照）。ナノトポテカンの局所投与も同様の治療効果を示した（図４参照）。しかし、このような治療効果は、ナノプラチン（図３）、ナノドキソルビシン（図５）、アブラキサン（登録商標）（図６）の局所投与には現れなかった。記述すべき点は、この試験において、タキソール（登録商標）（図２Ｂ）、シスプラチン（図３）、トポテカン（図４）及びドキソルビシン（図５）の腹腔内投与では、一定の治療効果が見られ、この結果は対応する治験でも同様であった（sD.S. Alberts, P.Y. Liu, E.V. Hannigan, R. O'Toole, S.D. Williams, J.A. Young, E.W. Franklin, D.L. Clarke-Pearson, V.K. Malviya, B. DuBeshter, Intraperitoneal cisplatin plus intravenous cyclophosphamide versus intravenous cisplatin plus intravenous cyclophosphamide for stage III ovarian cancer, The New England journal of medicine, 335 (1996) 1950-1955.-28; D.K. Armstrong, B. Bundy, L. Wenzel, H.Q. Huang, R. Baergen, S. Lele, L.J. Copeland, J.L. Walker, R.A. Burger, G. Gynecologic Oncology, Intraperitoneal cisplatin and paclitaxel in ovarian cancer, The New England journal of medicine, 354 (2006) 34-43; H.G. Muntz, T.W. Malpass, K.F. McGonigle, M.D. Robertson, P.L. Weiden, Phase 2 study of intraperitoneal topotecan as consolidation chemotherapy in ovarian and primary peritoneal carcinoma, Cancer, 113 (2008) 490-496; G. Delgado, R.K. Potkul, J.A. Treat, G.S. Lewandowski, J.F. Barter, D. Forst, A. Rahman, A phase I/II study of intraperitoneally administered doxorubicin entrapped in cardiolipin liposomes in patients with ovarian cancer, American journal of obstetrics and gynecology, 160 (1989) 812-817; discussion 817-819を参照）。
【００６６】
詳しく見ると、本発明は、ナノメディシンの全身投与（例えばＥＰＲ効果の利用）は、対応する遊離型医薬と比較して治療的効果を示さないことから、ＥＰＲ効果の利用は実際の治療効果に殆ど対応しないことを示唆した。さらに、全ての遊離型医薬の局所投与において、ある程度の治療効果を示したものの、ナノメディシンの全ての局所投与において治療効果を示しておらず（ナノ粒子タキソール及びナノトポテカンは効果を示したが、ナノドキソルビシン及びアブラキサン（登録商標）は効果を示さなかった）、ナノドキソルビシン及びアブラキサン（登録商標）の遊離型医薬とＮＰとの結合が安定しすぎており、腹腔内の腫瘍を制御するために遊離型医薬をタイムリーに放出していないことを示した。よって、全てのナノメディシンが局所治療に適している訳ではないことが判明した。
【００６７】
全体生存率のハザード比では、ナノ粒子タキソールの局所投与が最も長い生存率となることを示す（図２Ｃ）。治療群ごとでは、白血球の数の減少は著しく変化していない（図２Ｄ）。
【００６８】
一実施形態では、持続放出するナノメディシンの局所投与を行い、ナノメディシンは生体器官への転移を妨げる。
【００６９】
直接的な腹腔内の散布は非常に一般的であるが、卵巣がんはリンパ管及び血液ルートを通じて転移することもある。結果的に生じた生体器官への転移（例えば肝臓又は肺）の結果は、現在の標準治療でもあるタキソール（登録商標）の全体投与にも関わらず、予後は悪い。タキソール（登録商標）の全体投与と比較し、ナノ粒子タキソールの腹腔内投与は肝臓への転移を著しく抑制した（図７Ａ）。
【００７０】
本発明の実施形態に従い、ナノ粒子タキソールの局所投与による卵巣がん腫瘍の死滅によって、本発明のナノ粒子の局所投与は、例えば肺転移など、他の癌の治療にも適用できることが発見された。例えば、肺転移（マウスモデル）の動物試験では、ナノ粒子タキソールの胸膜内投与が、肺転移を最も制御した（図７Ｂ）。一方、現在の標準治療である、タキソール（登録商標）の全体投与は、腫瘍制御においては安定的ではなかった。タキソール（登録商標）の胸膜内投与は一定の治療効果を示すものの、本発明に従ったナノ粒子タキソールの局所投与は、タキソール（登録商標）の局所投与の効果を上回った。現在、標準的な全身治療にも関わらず、卵巣がんが肺へ転移した場合の予後は悪い。ナノ粒子タキソールの胸膜内投与は肺転移を十分に抑制し、さらに腹腔への転移を抑制する。
【００７１】
いかなる論理にも拘束されることなく、本明細書で発見された内容に基づき、ナノメディシンの局所投与はリザーバーへのナノメディシンの投与であると見られる。例えば（人体の最も大きな空洞である）腹腔でのがん腫瘍によって誘発された強い癒着によって、腹腔をリザーバーとして使用できなくなった場合、本発明に基づき、ナノメディシンを投与するためのリザーバーとして、腹腔の代わりに胸膜腔を使用できる。リザーバーから安定して遊離型医薬を持続放出することにより、局所腫瘍（例：肺転移）のみならず、遠隔転移（例：腹腔内の転移）を効率的に制御できる。
【００７２】
進行型卵巣がんがリンパ節に転移すると、患者の予後が良くないことは知られている。現在、タキソールの（登録商標）全身投与を除き、リンパ節転移に対する特定の治療は存在せず、最大限の細胞切除をするため一手段としての、後腹膜リンパ節の手術による切除の役割も不明確である（E. Halkia, J. Spiliotis, P. Sugarbaker, Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer, Gastroenterology research and practice, 2012 (2012) 541842を参照）。上記の発見に基づき、ナノ粒子タキソールの腹腔内投与は、リンパ節転移の制御においては、タキソール（登録商標）の全身投与よりも効果を発揮する（図７Ｃ参照）。全体的な生存率のハザード比分析では、ナノ粒子タキソール（登録商標）の局所投与によって、重要な臓器への転移を制御できる治療効果を示している（図７Ｄ参照）。
【００７３】
本発明に基づき、ナノ粒子化したパクリタキセルは、後腹膜リンパ節転移及び肝転移を効果的に抑制することが判明した。例えば、試験の１日目（ｄ１）にマウスの子宮に腫瘍細胞を投与して肝転移を誘発し、８日目、１１日目、１４日目に治療を実施し、１８日目にマウスを犠牲にした動物実験では、ナノ粒子タキソール（登録商標）の（腹腔内）局所投与は、後腹膜リンパ節への転移を最も効果的に制御した（図７Ｄ参照）。
【００７４】
一実施形態では、がん治療を必要とする被検体に、持続放出ナノ粒子にカプセル化された抗がん剤（例えばナノ粒子タキソール、ミセル−タキソール）を胸膜内に局所投与することにより、がんを治療する方法を提供する。一実施形態では、がんは転移性がんである。
【００７５】
一実施形態では、ナノ粒子タキソールなどのナノ粒子化したパクリタキセルの局所投与は、癌幹細胞を効率的に死滅させる。
【００７６】
癌幹細胞（ＣＳＣ）は、再発において不可欠な役割を果たす重大ながん幹細胞である。特徴的な分子構造は、化学療法に対する抵抗を可能とする。ＣＳＣの消耗又はＣＳＣの分子指標の抑制は、再発を低下させ、治療結果を向上させる（Nguyen, et al, “Cancer stem cells: an evolving concept” Nature reviews. Cancer, 12 (2012) 133-143参照)。癌細胞は治療の後、変化に適用し、医薬への抵抗を強くすることがある。上皮がんでは、このような変化は、少なくとも上皮から上皮間葉転換（ＥＭＴ）への変化を伴う。策略的には、ＥＭＴはＣＳＣ表現型への逆戻りを誘発し、ＥＭＴ、ＣＳＣ、医薬抵抗の間の関連を与えることがある。
【００７７】
ナノ粒子タキソールの持続放出による局所投与は、腫瘍のスフィアフォメーション（sphere formation）（図８Ａ、８Ｂ）及びサイドポピュレーション（図８Ｃ）を最も効果的に制御した。また、他の発見と並行して、タキソール（登録商標）の全身投与及び局所投与の両方において、がん細胞の腫瘍のスフィアフォメーション及びサイドポピュレーションの増加を示しており、これは従来の化学療法の後の腫瘍微小環境におけるＣＳＣの増加を示す。特徴的な点としては、記載の通り、ナノ粒子タキソールの局所投与は、腫瘍微小環境における、幹細胞性マーカーの値（図８Ｄ）、ＥＭＴドライバー及び発現（図８Ｅ）、血管新生シグナル（図８Ｆ）、複数の医薬に対する対抗性シグナル（図８Ｇ）を著しく下げた。
【００７８】
一実施形態は、ナノメディシンの持続放出による局所投与方法であり、前述のナノメディシンは腹腔内温熱化学療法（ＨＩＰＥＣ）と同等の効果を示した。
【００７９】
卵巣がんに対する腹腔内温熱化学療法（ＨＩＰＥＣ）は、癌性腹膜炎に対する主要治療の一つである。癌性腹膜炎は、胃がん患者で最も頻繁に再発し（１５〜４０％）、結腸がん患者でその次に頻繁に再発する。一態様では、特定の理論に拘束されることなく、腹膜に温熱療法及び化学療法剤を組み合わせることによる、最も重要な薬理学的理論は、薬品の浸透を深くすることである。幾つかの論文では、ＨＩＰＥＣは、進行を抑制でき、全体的な生存率の増加に繋がることが証明されている。（例えば、T.D. Yan, D. Black, R. Savady, P.H. Sugarbaker, A systematic review on the efficacy of cytoreductive surgery and perioperative intraperitoneal chemotherapy for pseudomyxoma peritonei, Annals of surgical oncology, 14 (2007) 484-492; T.D. Yan, D. Black, R. Savady, P.H. Sugarbaker, Systematic review on the efficacy of cytoreductive surgery combined with perioperative intraperitoneal chemotherapy for peritoneal carcinomatosis from colorectal carcinoma, Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 24 (2006) 4011-4019を参照）。しかし、ＨＩＰＥＣには時間がかかり、看護師及び治療スタッフによる労力が必要であり、生命の危機に繋がる潜在的な複雑性を引き起こすこともある。
一般的に知られている複雑性は、縫合不全、縫合線から離れた腸穿孔による消化器系のフィスチュラである。
【００８０】
ナノ粒子タキソール（ＨＩＰＥＣよりも所要時間及び労力が少ない）の局所投与とＨＩＰＥＣとを比較すると、再発性卵巣がんモデルが発達し、癌性腹膜炎が誘発された。Hoechst 33342染色によるフローサイトメトリー分析は、再発性腫瘍のサイドポピュレーションは、原発性腫瘍よりも高いことを示し、再発性腫瘍の化学療法に対する抵抗性が高いことを示した（図９Ａ）。ＨＩＰＥＣの手順は、図９Ｂに示されている。ナノ粒子タキソールの局所投与及びＨＩＰＥＣは比較可能な化学療法有効性を有することを示し（図９Ｃ）、前者は毒性が低い（図５Ｄ）を示す。よって、持続放出機能は高熱に相当する有効性がある。
【００８１】
本明細書の記載によると、ナノメディシンの全身投与によるＥＰＲ効果は、低い治療効果を示した。ＥＰＲ効果は腫瘍微小環境において確立された現象であるものの、この効果は対応する遊離型医薬の同量の投与と比較すると、顕著な治療効果を示すことができなかった。比較して、持続放出機能を利用し、ナノメディシンの局所投与によりＥＰＲ効果をバイパスすると（例：本明細書に記載のナノ粒子）、腫瘍制御においては、全身投与よりも高い効果を示した。
【００８２】
しかし、全てのナノメディシンが局所投与に適している訳ではない。
【００８３】
本発明の実施において、幾つかのナノメディシンの局所投与では効果的な腫瘍死滅を示すことができず（例：今回の実験においては、ナノプラチン、ナノ−ドキソルビシン及びアブラキサン（登録商標））、これは、共有結合性又は非共有結合性の遊離型医薬及びナノ粒子の反応に伴う安定的な相互作用（例えば結合が強い）によるものであり、その結果、遊離型医薬をタイムリーに放出できなかったものである。例えば、特定のナノメディシンの局所投与は、遊離型医薬を極端に早く放出し、ナノメディシンが遊離型医薬のように活動し（ナノ粒子の利点又は効果が発揮できない）、または、遊離型医薬を極端に遅く放出し、腫瘍増殖の抑制がされず、つまり効果が弱くなる。両極の間であり、タイムリーな持続放出を達成できるナノメディシンにおいてのみ、腫瘍細胞を効率的に死滅させることができる（図１０参照）。
【００８４】
＜実施例４：卵巣がん治療における反応性試験＞
この試験は、大学で定められた動物実験の論理指針に従い、アメリカ国立衛生研究所から発行されている「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」（NIH publication no. 85-23, revised 1996）の記載に準拠して実施された。動物実験施設は温度（摂氏）２２度（±１度）、（湿度）６０％（±５％）で制御され、明暗サイクルが１２時間ずつ実施され、食料及び水へのアクセスは自由とされた。試験では、生後５週間の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）雌マウスに、ナノ粒子タキソール又はミセル−タキソールでの治療を行った。腫瘍株はＥＳ２／Ｌｕｃを使用した。
【００８５】
マウスは以下の表に基づいてグループ化された。各グループから、少なくとも１０データポイントを収集するために、１５匹のマウスが使用された。
【表１】
2018505224.tif 000004
【００８６】
＜手順＞
公知の方法により、マウスに卵巣がんを引き起こした。生後６週間のマウスに対し、０日目（Ｄ０）にＥＳ２／ｌｕｃ（100ｕｌ ＨＢＳＳに対し、細胞数5 x 105）の腹腔内投与を行った。癌細胞を移植した４日目（Ｄ４）に、IVIS（登録商標） spectrumを使用し、各マウスの腫瘍細胞の成長を測定、評価した。８日目（Ｄ８）及び１１日目（Ｄ１１）に、上記の表に従ってマウスを治療するために、ナノ粒子タキソール及びミセル−タキソールを投与した。
【００８７】
１４日目（Ｄ１４）に、IVIS（登録商標） spectrumを使用して、各マウスの腫瘍細胞の成長を再度測定し、各マウスの治療効果を評価した。各グループの生存率は、その後も監視された。
【００８８】
＜実施例５：結腸がん及び胃がん治療における反応性試験＞
この試験は、大学で定められた動物実験の論理指針に従い、アメリカ国立衛生研究所から発行されている「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」（NIH publication no. 85-23, revised 1996）の記載に準拠して実施された。
試験では、生後５週間の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）雌マウスに、ナノ粒子タキソール又はミセル−タキソールでの治療を行った。癌細胞株は、HT-29-luc（結腸がんの腫瘍株）及びNCI-N87-luc 2-GFP（胃がんの腫瘍株）を使用した。
【００８９】
マウスは以下の表に基づいてグループ化された。各グループから、少なくとも１０データポイントを収集するために、１５匹のマウスが使用された。
【表２】
2018505224.tif 000005
【００９０】
＜手順＞
公知の方法により、マウスに結腸がん及び胃がんを誘発した。生後６週間のマウスに対し、０日目（Ｄ０）にHT-29-luc又はNCI-N87-luc 2-GFPの細胞株 （100μｌ HBSSに対し、細胞数1 x 106）の腹腔内投与を行った。適切なタイミングで、例えば癌細胞を移植した４日目（Ｄ４）に、IVIS（登録商標） spectrum（インビトロイメージシステムによる）を使用し、各マウスの腫瘍測定を行った。適切なタイミングで、例えば８日目（Ｄ８）及び１１日目（Ｄ１１）に、上記の表に従ってマウスを治療するために、異なる量のナノ粒子タキソール及びミセル−タキソールを使用した。
【００９１】
１４日目（Ｄ１４）に、IVIS（登録商標） spectrumを使用して、各マウスの腫瘍細胞の成長を再度測定し、各マウスの治療効果を評価した。各グループの生存率は、その後も監視された。
【００９２】
＜実施例６：結腸がん治療におけるナノ粒子タキソール及び遊離パクリタキセルの比較＞
この試験は、大学で定められた動物実験の論理指針に従い、アメリカ国立衛生研究所から発行されている「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」（NIH publication no. 85-23, revised 1996）の記載に準拠して実施された。試験では、生後５週間の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）雌マウスに、ナノ粒子タキソール又は遊離パクリタキセルでの治療を行った。癌細胞株は、HT-29-luc（結腸がんの腫瘍株）を使用した。
【００９３】
マウスは以下の表に基づいてグループ化された（全部で５グループ）。各グループから、少なくとも１０データポイントを収集するために、１５匹のマウスを使用した。
【表３】
2018505224.tif 000006
【００９４】
公知の方法により、マウスに結腸がんを誘発した。生後６週間のマウスに対し、０日目（Ｄ０）にHT-29-lucの細胞株（１ｘ１０６ cells in 100ｕｌ HBSS）の腹腔内投与を行った。適切なタイミングで、例えば癌細胞を移植した１１日目（Ｄ１１）に、IVIS（登録商標）spectrum（インビトロイメージシステムによる）で、各マウスの腫瘍測定を行った。適切なタイミングで、例えば１２日目（Ｄ１２）、１５日目（Ｄ１５）及び１８日目（Ｄ１８）に、異なるドラッグデリバリー経路で、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソール又はパクリタキセルを使用した。２１日目（Ｄ２１）以降、ナノ粒子タキソール又はパクリタキセルの効果は、ＩＶＩＳシステムを使用し、腫瘍細胞の成長を確認することによって評価された。各グループの生存率は記録された。
【００９５】
＜実施例７：卵巣がんを異種移植したマウスモデルにおけるナノ粒子タキソール及びミセル−タキソールの抗腫瘍活性の評価＞
アメリカ合衆国では、上皮卵巣がんは、２番目に多い婦人科系がんであり、婦人科系がんのうちの最も多い死亡原因である。２０１４年には、推定２１，９８０件の卵巣がんが報告され、卵巣がんによる死亡者数は１４，２７０名であった（２０１４年  アメリカがん協会の記録による）。卵巣がん患者は、病院での診察を受けた時点において、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの卵巣がんに罹患している。台湾では、ＮＨＲＩ（２０１１年）の報告書によると、毎年推定１，０００件の卵巣がんが報告されている。
【００９６】
腹腔内温熱化学療法等の局所化学療法は、腫瘍を持つ腹腔(Lancet Oncol. 2003; Nat Rev Clin Oncol. 2010)における、腹膜からプラズマの領域にかけての発生に対して薬物動態学的な利点を持つ。このように、薬物動態学的な利点があるにも関わらず、腹腔の臨床的治療は、腹腔から分子量が小さい薬品の早期クリアランス、目的組織の未特定、目的組織に対する医薬の浸透が不十分等の問題によって妨げられる（Nat Rev Cancer. 2006参照）。理論的には、抗がん剤による腹腔内化学療法に関連する欠点は、医薬の持続的放出を促進する、医薬を特別に設計された投与マトリックスと結合することによって回避できる。腹腔に医薬を持続放出することにより、抗がん剤が長時間、細胞に露出され、その結果、効率的な細胞の死滅に繋がる。タムラ及びその同僚は、腹膜腫瘍を有するマウスは、ポリ（Ｄ, Ｌ−乳酸）微粒子による抗がん剤を腹腔内に投与することにより、持続的な腫瘍増殖抑制及び長期間の生存率に繋がったことを発見した(Eur J Pharm Biopharm. 2002参考)。
【００９７】
この試験は、異種移植腫瘍を有するマウスモデルを使用し、卵巣がんを治療するために、異なる量のナノ粒子タキソール及びミセル−タキソールを静脈内投与又は腹腔内投与することによる調査を目的としている。
【００９８】
＜試験のデザイン＞
これらのナノ粒子医薬が腹腔内に播種された卵巣がんの治療に適しているかを評価するために、腹腔内投与により、ＥＳ２−ｌｕｃ細胞をＳＣＩＤマウスの腹腔に接種した。腫瘍細胞の成長は、ＩＶＩＳシステムを使用し、発光イメージ（ＢＬＩ）を測定することにより判定した。腫瘍播種（発光の活性度によって判断される）が基準値に達した時点で、治療を開始した。マウスには３日置きに、グループごとに２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを腹腔内投与し、又は１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソールを腹腔内投与又は静脈内投与するサイクルを３回繰り返した。１４日目（Ｄ１４）に、ナノ粒子タキソール又はミセル−タキソールの抗腫瘍活性は、ＢＬＩの減少によって評価された。これらのマウスの生存率が記録された。
【００９９】
＜実験の手順＞
表示されたＥＳ２−ｌｕｃ細胞数が、細胞培養ディッシュで、摂氏３７度で２４時間培養された。ＢＬＩは２４時間後、ＩＶＩＳ−５０システムを使用して抽出した。発光の活性度と細胞の成長との関連性は、図１１に図示されている。
【０１００】
生後５週間のＳＣＩＤ雌マウス（ＣＢ．１７  ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤ）は、台湾国家実験動物センターから購入し、台北栄民総医院（台湾台北市）の動物腫瘍施設で管理された。これらの動物は、施設の動物健康管理規則に準拠して使用された。
【０１０１】
ＳＣＩＤマウス（生後６週間）に対し、０日目（Ｄ０）に対し、１００μｌのopti-MEMに、５ｘ１０５ ＥＳ２−ｌｕｃ細胞を加えて投与した。４日目（Ｄ４）以降に、各マウスのIVISシステム（ベースライン）を使用し、腫瘍細胞の成長を測定、確認した。コントロール群には、０．９％食塩水を１００μｌ投与した。各グループのＢＬＩは治療の前に標準化された。５日目（Ｄ５）、８日目（Ｄ８）、１１日目（Ｄ１１）に、マウスにはグループごとに、溶媒、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールの腹腔内投与、又は１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソールを腹腔内投与又は静脈内投与した。１４日目（Ｄ１４）に、ナノ粒子タキソール又はミセル−タキソールの抗腫瘍活性は、ＢＬＩの減少によって評価された。これらのマウスは、生存率を評価するために固体ごとに監視された。
【０１０２】
＜生物発光イメージ（ＢＬＩ）測定＞
各マウスはＩＶＩＳ−５０システム（カリフォルニア州アラメーダ、Xenogen社）によってイメージングされた。１日目に、各マウスにＥＳ２−ｌｕｃ細胞（５ｘ１０５/マウスあたり）を移植した。ＢＬＩは表示された日に撮影された。１７日目に１匹のマウスが死んだ。生物発光イメージ（ＢＬＩ）とマウスの細胞成長との関連性は、図１２Ａ〜１２Ｂに示されている。
【０１０３】
＜統計的分析＞
結果は、少なくとも３回の実験に基づく平均値及び標準偏差（±）で算出された。全体的な生存率は、腫瘍を移植した日からマウスが死亡した日までの間の時間を計算し、カプラン−マイヤー法による生存率曲線として表された。
【０１０４】
＜腫瘍成長の評価＞
腹腔内投与の後、ナノ粒子タキソールは用量依存性の抗腫瘍活性を示し、卵巣腫瘍増殖を抑制した（図１３、１４）。ナノ粒子タキソールを２０ｍｇ／ｋｇ投与することにより、１１匹中８匹のマウスにおいて腹腔の卵巣がんを殆ど死滅させた（図１３）。１１匹中２匹のマウスにおいて、腫瘍の数を５０％以上減少させた。ナノ粒子タキソールを１０ｍｇ／ｋｇ投与することにより、１１匹中３匹のマウスにおいて腹腔の腫瘍を死滅させ（図１３）、１１匹中８匹のマウスにおいて、腫瘍の数を５０％以上減少させた。２ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを投与することにより、コントロールと比較すると、抗腫瘍活性が発見された（図１３）。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ率）は、２０ｍｇ／ｋｇの投与において１００％に達し、２ｍｇ／ｋｇの投与で９５％以上を達成した（図１３、１４）。ミセル−タキソールも、腹腔内投与の後、ＥＳ２細胞の増殖を抑制したが、静脈内投与によっては増殖を抑制しなかった。腹腔内投与の後のＴＧＩ率は、９８％であった（図１３、１４）。
【０１０５】
腹腔内投与後のミセル−タキソール及びナノ粒子タキソールの腫瘍増殖抑制効果を確認するために、上記のスケジュールと同じ内容で、第２回目の実験を行った（図１５Ａ〜１５Ｂ）。腹腔内投与後、ナノ粒子タキソール及びミセル−タキソールは、卵巣腫瘍の増殖を抑制した。ナノ粒子タキソールを１０ｍｇ／ｋｇ投与することにより、７匹中２匹のマウスにおいて腹腔の腫瘍を死滅させ、７匹中５匹のマウスにおいて、腫瘍の数を減少させた。ミセル−タキソールにおいても、同様の結果が見られた。ナノ粒子タキソールを１０ｍｇ／ｋｇ投与したマウス及びミセル−タキソールを１０ｍｇ／ｋｇ投与したマウスにおいて、ＴＧＩ率はいずれも約１００％であった（図１５Ａ〜１５Ｂ）。
【０１０６】
ＥＳ２−ｌｕｃ細胞によって発光していることを確認するために、マウスは死亡した日に解剖された。図１６に示す通り、コントロールマウス（１６Ａ）及びミセル−タキソールが静脈内投与されたマウス（１６Ｂ）には、最も激しい腹水の発症が見られた。コントロールマウス（１６Ａ）の腹水は回収され、細胞培養された。培養された細胞は、その後ＩＶＩＳシステムを使用して分析された。細胞はＢＬＩを示し、腹水はヒトの卵巣がん細胞であるＥＳ２−ｌｕｃ細胞（図１７）が確認された。腹腔内投与によるミセル−タキソール又はナノ粒子タキソールによる治療後（１６Ｃ〜１６Ｇ）、投与量が増えるにつれて腹水が減少した。
【０１０７】
図１８で示される通り、この試験における治療によっては、マウスの体重の著しい増加は見られなかった。
【０１０８】
＜生存率の評価＞
マウスにＥＳ２−ｌｕｃ細胞（５ｘ１０５／マウス）を接種した後、コントロールマウスの生存期間は２１日であった（図１９）。１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソールを静脈内投与した後、マウスの生存期間は２１日であった。１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソールを腹腔内投与した後、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを投与した後、マウスの生存期間は、それぞれ３３日、３２日、３３日、４５日、４９日であった（図１９）。ナノ粒子タキソール及びミセル−タキソールの腹腔内投与によって、コントロールマウスと比較して、生存期間が１２日以上も延長した。しかし、違いは、コントロールマウスと、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを投与したマウスとの間においてのみ顕著であった（ｐ＜０．０５）。１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソールを腹腔内投与したマウスと比較して、ナノ粒子タキソールの腹腔内投与したマウスは、生存期間が１２日以上も長かった（ｐ＜０．０５）。
【０１０９】
コントロールマウス及び１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソールを静脈内投与したマウスの生存期間は、平均で１９日であった。１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソールを腹腔内投与した後、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを投与した後、マウスの生存期間は、それぞれ２８日、２７日、２９日、３７日、３７日であった（図１９）。
【０１１０】
追加実験においては、５ｘ１０５ＥＳ２−ｌｕｃ細胞を接種した後、コントロールマウスの生存期間は１９日であった。１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソールを腹腔内投与した後、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを投与した後、マウスの生存期間は、それぞれ３０日、３８日であった（図２０）。コントロールマウスと比較して、ナノ粒子タキソールの腹腔内投与したマウス及びミセル−タキソールを腹腔内投与したマウスは、１１日以上も生存期間が長かった（ｐ＜０．０５）。１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソールを腹腔内投与したマウスと比較して、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを投与したマウスは、生存期間が８日も長かった（図２０）。
【０１１１】
コントロールマウス、１０ｍｇ／ｋｇのミセル−タキソールを腹腔内投与したマウス、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを投与したマウスの生存期間の平均値は、それぞれ１８日、２７日、３１日であった（図２０）。
【０１１２】
＜結論＞
腹腔内投与の後、ナノ粒子タキソール及びミセル−タキソールは、いずれも抗腫瘍活性を示した。ナノ粒子タキソールは用量依存の抗腫瘍活性を示し、２０ｍｇ／ｋｇを投与した場合、１１匹のマウスのうち８匹において腹腔の卵巣がんを死滅させた。１０ｍｇ／ｋｇの投与では、１１匹中３匹のマウスにおいて腹腔の卵巣がんを完全に死滅させ、１１匹中８匹のマウスにおいて腫瘍の数を減少させた。反応率は１００％であった。よって、最小有効量は１０ｍｇ／ｋｇであると考えられる。
【０１１３】
以上の通り、ナノ粒子タキソール及びミセルタキソールは、腹腔内の卵巣がんを治療することができる。
【０１１４】
＜実施例８：結腸がんを移植した同種マウスモデルにおけるナノ粒子タキソールの抗腫瘍活性の評価＞
腹腔内で播種した結腸がんの治療において、ナノ粒子タキソールの有効性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔にＣＴ−２６−ｌｕｃ細胞を腹腔内投与した。腫瘍細胞の成長は、ＩＶＩＳシステムを使用し、発光イメージ（ＢＬＩ）を測定することにより判定した。腫瘍播種（発光の活性度によって判断される）が基準値に達した時点で、治療を開始した。マウスには、２日に1回、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを腹腔内投与または静脈内投与、又は１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル（ＰＴＸ）を腹腔内投与または静脈内投与を３回投与することによって治療した。１１日目（Ｄ１１）に、ＢＬＩの減少によって、ナノ粒子タキソール又はＰＴＸの抗腫瘍活性を評価した。これらのマウスの生存率が記録された。
【０１１５】
CT-26-luc細胞は、細胞培養ディッシュで、摂氏３７度で２４時間培養された。２４時間後、ＩＶＩＳ−５０システムを使用し、生物発光イメージを撮影した。図２１において、発光の活性度と細胞の成長との関係性を示す。
【０１１６】
＜手順＞
生後５週間のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスは、台湾国家実験動物センターから購入し、台北栄民総医院（台湾台北市）の動物腫瘍施設で管理された。動物は施設の動物健康管理規則に準拠して使用され、全ての動物実験手順は動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可されたものである。
【０１１７】
各マウスに対し、所定の濃度において、１００ｕｌ（腹腔内投与）又は２００ｕｌ（静脈内投与）のナノ粒子タキソール又はＰＴＸを投与した。正確な投与量は、マウスの体重を測定して算出した。コントロールには、０．９％食塩水を１００ul投与した。
【０１１８】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後６週）に対し、０日目（Ｄ０）に、２５０ｕｌのopti-MEMに、１ｘ１０５のＣＴ−２６ｌｕｃ細胞を加えて投与した。４日目（Ｄ４）以降に、各マウスのIVISシステム（基準値）を使用して腫瘍細胞の成長を測定、確認した。各グループのＢＬＩは、治療の前に全マウスのＢＬＩの平均に標準化された。４日目（Ｄ４）、６日目（Ｄ６）、８日目（Ｄ８）に、マウスは溶媒、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールの腹腔内投与、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールの静脈内投与、１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸの腹腔内投与、１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸの静脈内投与によって治療された。１１日目（Ｄ１１）に、ナノ粒子タキソール又はＰＴＸの抗腫瘍活性は、発光の増減によって評価した。これらのマウスは、生存率を評価するために固体ごとに監視された。
【０１１９】
各マウスはＩＶＩＳ−５０システム（カリフォルニア州アラメーダ、Ｘｅｎｏｇｅｎ社）によってイメージングされた。生物発光イメージ（ＢＬＩ）とマウスの細胞成長との関連性は、図２２Ａ〜２２Ｂに示されている。
【０１２０】
＜測定結果＞
結果は、少なくとも３回の実験に基づく平均値及び標準偏差（±）で算出された。全体的な生存率は、腫瘍を移植した日からマウスが死亡した日までの間の時間を計算し、カプラン−マイヤー法による生存率曲線として表された。
【０１２１】
＜結果及び結論＞
＜＜腫瘍成長の評価＞＞
結腸がんに対するナノ粒子タキソールの効果を評価するために、播種した結腸がんの異所性移植モデルが形成された。図２２Ａ〜２２Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＢＬＩとＣＴ−２６細胞の成長との間の関係性を示す。ナノ粒子タキソールの腹腔内投与の後、結腸がんの進行が抑制されたが、静脈内投与では同様の結果が得られなかった（図２３Ａ〜２３Ｂ）。１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを腹腔内投与することにより、８匹中６匹のマウスにおいて、腫瘍が約７５％減少したが、腫瘍の死滅は見られなかった（図２３Ｂ）。さらに、図２３Ａ〜２３Ｂにおいて示される通り、ＰＴＸの腹腔内投与または静脈内投与によっては、結腸腫瘍の成長を示さなかった。
【０１２２】
図２４は、全ての治療において、マウスの体重が著しく減少しなかったことを示している。
【０１２３】
＜生存の評価＞
マウスに１ｘ１０５のＣＴ−２６−ｌｕｃ細胞を接種させた後、コントロールマウスの生存期間は２７日であった（図２４）。１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを静脈内投与した後、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを腹腔内投与した後、１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを腹腔内投与した後、マウスの生存期間は２７日であった（図２４）。１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを腹腔内投与した後、マウスの生存期間は４０日であった（図２４）。コントロールマウスと比較して、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを腹腔内投与したマウスは、生存期間が１３日も長かった（ｐ＜０．０５）。
【０１２４】
コントロールマウスの生存期間は、平均で２４日であった。１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを静脈内投与又は腹腔内投与した後、マウスの生存期間は、平均でそれぞれ２４日、２６日であった。１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを静脈内投与又は腹腔内投与した後、マウスの生存期間は、平均でそれぞれ２６日、３５日であった（図２５）。結腸がんＣＴ−２６−ｌｕｃ細胞に対し、ナノ粒子タキソールが腹腔内投与された場合にのみ、生体内で抑制することが判明した。８匹中６匹のマウスにおいて、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールを腹腔内投与することにより、腫瘍を減少するが、死滅させることは確認できなかった。反応率は７５％であった。
【０１２５】
結論としては、腹腔内投与において、播種した結腸がんの異所性移植モデルは、１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子タキソールが適切な抗腫瘍活性を示した。
【０１２６】
本明細書には本発明の実施形態を例示しているが、これらの実施例は一態様として提供されていることは、当業者にとっては明らかである。様々な変形例、変更及び代替は、本発明の範囲を逸脱することなく、当業者にとって自明の範囲において発生し得る。本発明を実施するにあたり、実施形態に対する様々な変形を適用し得る。本発明の単純な変形乃至変更はいずれも本発明の領域に属するものであり、本発明の具体的な保護範囲は添付の特許請求の範囲により明確になるであろう。
【図１Ａ】
2018505224.tif 000009
【図１Ｂ】
2018505224.tif 000010
【図１Ｃ】
2018505224.tif 000011
【図１Ｄ】
2018505224.tif 000012
【図１Ｅ】
2018505224.tif 000013
【図１Ｆ】
2018505224.tif 000014
【図２Ａ】
2018505224.tif 000015
【図２Ｂ】
2018505224.tif 000016
【図２Ｃ】
2018505224.tif 000017
【図２Ｄ】
2018505224.tif 000018
【図３Ａ】
2018505224.tif 000019
【図３Ｂ】
2018505224.tif 000020
【図３Ｃ】
2018505224.tif 000021
【図３Ｄ】
2018505224.tif 000022
【図４Ａ】
2018505224.tif 000023
【図４Ｂ】
2018505224.tif 000024
【図４Ｃ】
2018505224.tif 000025
【図４Ｄ】
2018505224.tif 000026
【図５Ａ】
2018505224.tif 000027
【図５Ｂ】
2018505224.tif 000028
【図５Ｃ】
2018505224.tif 000029
【図５Ｄ】
2018505224.tif 000030
【図６Ａ】
2018505224.tif 000031
【図６Ｂ】
2018505224.tif 000032
【図６Ｃ】
2018505224.tif 000033
【図６Ｄ】
2018505224.tif 000034
【図７Ａ】
2018505224.tif 000035
【図７Ｂ】
2018505224.tif 000036
【図７Ｃ】
2018505224.tif 000037
【図７Ｄ】
2018505224.tif 000038
【図８Ａ】
2018505224.tif 000039
【図８Ｂ】
2018505224.tif 000040
【図８Ｃ】
2018505224.tif 000041
【図８Ｄ】
2018505224.tif 000042
【図８Ｅ】
2018505224.tif 000043
【図８Ｆ】
2018505224.tif 000044
【図８Ｇ】
2018505224.tif 000045
【図８Ｈ】
2018505224.tif 000046
【図９Ａ】
2018505224.tif 000047
【図９Ｂ】
2018505224.tif 000048
【図９Ｃ】
2018505224.tif 000049
【図９Ｄ】
2018505224.tif 000050
【図１０】
2018505224.tif 000051
【図１１】
2018505224.tif 000052
【図１２Ａ】
2018505224.tif 000053
【図１２Ｂ】
2018505224.tif 000054
【図１３】
2018505224.tif 000055
【図１４】
2018505224.tif 000056
【図１５Ａ】
2018505224.tif 000057
【図１５Ｂ】
2018505224.tif 000058
【図１６】
2018505224.tif 000059
【図１７】
2018505224.tif 000060
【図１８】
2018505224.tif 000061
【図１９】
2018505224.tif 000062
【図２０】
2018505224.tif 000063
【図２１】
2018505224.tif 000064
【図２２Ａ】
2018505224.tif 000065
【図２２Ｂ】
2018505224.tif 000066
【図２３Ａ】
2018505224.tif 000067
【図２３Ｂ】
2018505224.tif 000068
【図２４】
2018505224.tif 000069
【図２５】
2018505224.tif 000070
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月26日(2017.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子カプセルには治療上有効な量の抗がん剤が含まれており、前記抗がん剤は患者の腹腔内に投与され、前記ナノ粒子は生体外（in vitro）放出に基づき、２４時間ごとに３０％以下の率で抗がん剤を放出する、医薬組成物。
【請求項２】
前記ナノ粒子は、水素化した天然由来のリン脂質、コレステロール及びｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコールスクシネートの群から選択されるリン脂質を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記リン脂質は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗がん剤は、ゲムシタビン、イダルビシン/シタラビン、リン酸エトポシド、グリベック、テモゾロミド、ボルテゾミブ、レトロゾール、セツキシマブ、ベバシズマブ、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、ドセタキセル、エルロチニブ、ペメトレキセド、ペメトレキセド／カルボプラチン、パクリタキセル／カルボプラチン、レトロゾール／シクロフォスホアミド、テムシロリムス、ベバシズマブ／テムシロリムス、イピリムマブ、RAD001、パゾパニブ、FOLFIRI、BKM120、GSK1120212, PF-05212384／イリノテカン、AZD2171、PF-04691502、シクロフォスホアミド、シスプラチン、シタラビン／ダウノルビシン、テムシロリムス、エルロチニブ/テムシロリムス、カペシタビン、タモキシフェン、ボルテゾミブ、トラスツズマブ、ドセタキセル／カペシタビン、トラスツズマブ／ティピファーニブ、ティピファーニブ／ゲムシタビン、トゥーテカン、及びこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗がん剤はパクリタキセルである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記がんは卵巣がん、肺がん、肝臓がん、胃がん又は結腸がんである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記がんは卵巣がん又は結腸がんである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
持続放出性のナノ粒子カプセルには治療上有効な量の抗がん剤が含まれており、前記抗がん剤は胸膜内に局所投与され、前記ナノ粒子は生体外（in vitro）放出に基づき、２４時間ごとに３０％以下の率で抗がん剤を放出する、医薬組成物。
【請求項９】
前記ナノ粒子は、水素化した天然由来のリン脂質、コレステロール及びｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコールスクシネートの群から選択されるリン脂質を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記リン脂質は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗がん剤は、ゲムシタビン、イダルビシン/シタラビン、リン酸エトポシド、グリベック、テモゾロミド、ボルテゾミブ、レトロゾール、セツキシマブ、ベバシズマブ、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、ドセタキセル、エルロチニブ、ペメトレキセド、ペメトレキセド／カルボプラチン、パクリタキセル／カルボプラチン、レトロゾール／シクロフォスホアミド、テムシロリムス、ベバシズマブ／テムシロリムス、イピリムマブ、RAD001、パゾパニブ、FOLFIRI、BKM120、GSK1120212, PF-05212384／イリノテカン、AZD2171、PF-04691502、シクロフォスホアミド、シスプラチン、シタラビン／ダウノルビシン、テムシロリムス、エルロチニブ/テムシロリムス、カペシタビン、タモキシフェン、ボルテゾミブ、トラスツズマブ、ドセタキセル／カペシタビン、トラスツズマブ／ティピファーニブ、ティピファーニブ／ゲムシタビン、トゥーテカン及びこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記がんは卵巣がん、肺がん、肝臓がん、胃がん又は結腸がんである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記がんは転移性がんである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記患者の腹腔は著しい癒着を発症している、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗がん剤はパクリタキセルである、請求項８に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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