(57)【要約】本発明は、その表面にＣＤ４７を有し、また、治療剤（例えば、治療用タンパク質、抗体、阻害性ＲＮＡ、および／または小分子薬物）を含む、脂質に基づくナノ粒子（例えば、リポソームまたはエキソソーム）を提供する。さらに、本発明は、そのような脂質に基づくナノ粒子の、療法における使用を提供する。１つの実施形態では、本発明は、脂質に基づくナノ粒子と賦形剤とを含む医薬組成物に関し、この医薬組成物は、脂質に基づくナノ粒子がその表面にＣＤ４７を含み、かつ前記脂質に基づくナノ粒子が治療剤を含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質に基づくナノ粒子と賦形剤とを含む医薬組成物であって、前記脂質に基づくナノ粒子がその表面にＣＤ４７を含み、かつ前記脂質に基づくナノ粒子が治療剤を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記脂質に基づくナノ粒子が、リポソームまたはエキソソームである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記エキソソームが、ＣＤ４７を過剰発現している細胞から単離される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記エキソソームが、線維芽細胞から単離される、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記リポソームが、単層リポソームである、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記リポソームが、多重層リポソームである、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記治療剤が、治療用タンパク質、抗体、阻害性ＲＮＡ、または小分子薬物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体が、細胞内抗原に結合する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体が、全長抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ）２、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記阻害性ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記治療用タンパク質が、キナーゼ、ホスファターゼ、または転写因子である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記小分子薬物が、イメージング剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
非経口投与用に製剤化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または腹腔内注射用に製剤化されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
抗菌剤をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗菌剤が、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
それを必要とする患者における疾患を治療する方法であって、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与するステップであって、それにより、前記患者における前記疾患を治療するステップを含む方法。
【請求項１８】
前記疾患が、癌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療剤が、発癌遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記阻害性ＲＮＡが、ＫｒａｓＧ１２Ｄを標的とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療剤が、腫瘍抑制因子タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも第２の療法を前記患者に投与することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者が、ヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
患者における疾患の治療に使用するための、脂質に基づくナノ粒子と賦形剤とを含む組成物であって、前記脂質に基づくナノ粒子がその表面にＣＤ４７を含み、前記脂質に基づくナノ粒子が治療剤を含む、組成物。
【請求項２６】
前記疾患が、癌である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記治療剤が、発癌遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記阻害性ＲＮＡが、ＫｒａｓＧ１２Ｄを標的とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記治療剤が、腫瘍抑制因子タンパク質である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
非経口投与用に製剤化されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３１】
静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または腹腔内注射用に製剤化されている、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
抗菌剤をさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗菌剤が、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
少なくとも第２の療法をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３５】
前記第２の療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記患者が、ヒトである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３７】
疾患を治療するための医薬品の製造における、脂質に基づくナノ粒子の使用であって、かつ前記脂質に基づくナノ粒子がその表面にＣＤ４７を含み、前記脂質に基づくナノ粒子が治療剤を含む、使用。
【請求項３８】
前記疾患が、癌である、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記治療剤が、発癌遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡである、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記阻害性ＲＮＡが、ＫｒａｓＧ１２Ｄを標的とする、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記治療剤が、腫瘍抑制因子タンパク質である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４２】
前記医薬品が、非経口投与用に製剤化されている、請求項３７に記載の使用。
【請求項４３】
前記医薬品が、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または腹腔内注射用に製剤化されている、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記医薬品が、抗菌剤を含む、請求項３７に記載の使用。
【請求項４５】
前記抗菌剤が、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールである、請求項４４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年６月１０日に出願された米国仮出願番号第６２／１７３，８３８号の優先権の利益を主張しており、その全体の内容は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、一般に、医薬および腫瘍学の分野に関する。より詳細には、本発明は、治療の方法におけるエキソソームの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（２．先行技術の記載）
エキソソームは、身体の全ての細胞によって放出される、エンドソーム起源の、脂質二重層を有する小さな（４０〜１５０ｎｍ）膜小胞である（Kowalら、２０１４年；El-Andaloussiら、２０１３年；Theryら、２００２年）。エキソソームは、タンパク質、脂質、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびゲノムＤＮＡを含有する（Valadiら、２００７年；Peinadoら、２０１２年；Lugaら、２０１２年；Kahlertら、２０１４年）。リポソームおよび他の合成薬物ナノ粒子担体とは異なり、エキソソームは、エンドサイトーシスおよび／またはレシピエント細胞の原形質膜との直接融合を増強し、したがって、カーゴ送達を増強する可能性がある多くの膜貫通タンパク質および膜アンカータンパク質を含有する（Marcusら、２０１３年；van  den  Boornら、２０１３年；Johnsenら、２０１４年）。エキソソーム天然原形質膜様のリン脂質組成物（細胞質側のホスファチジルセリンおよびコレステロールを含む）ならびに膜結合タンパク質組成物も、循環からのクリアランスを低減すること（一部において、食作用に関してオプソニンとマクロファージによって認識される凝固および補体因子との相互作用を欠くことにより）および免疫原性応答を最小化することにより、合成ナノ粒子（例えば、リポソームなど）と比較して優れた全身循環中での安定性をもたらす（Claytonら、２００３年；van  der  Meelら、２０１４年；Gomes-da-Silvaら、２０１２年）。これらの特徴により、合成ナノ粒子をｉｎ  ｖｉｖｏで使用する場合に観察される細胞傷害効果も最小限になる可能性がある（Simoesら、２００５年）。最後に、エキソソームの生成に関与するエンドソームおよび細胞間小胞輸送機構もレシピエント細胞により取り込まれるエキソソームにおいて使用され得、それにより、おそらくカーゴの放出（およびＲＮＡｉ遺伝子サイレンシング機構への組み入れ）が増強され、その結果、任意の治療剤（例えば、遺伝子を標的とするもの）の有効性が強化される。最近の試験により、療法のためのＲＮＡｉ担体としてのエキソソームの有効性が評価され、また、エキソソームの全身性の注射により、ｓｉＲＮＡを脳内に送達することが可能になり、それにより、標的遺伝子のロバストな下方制御が導かれることが示された（Cooperら、２０１４年；Alvarez-Ervitiら、２０１１年）。さらに、ヒト血漿由来エキソソームによってもレシピエント細胞へのＲＮＡｉ送達が可能になることが報告されており（Wahlgrenら、２０１２年）、それにより、標的細胞における遺伝子発現を改変するためのＲＮＡｉ送達におけるそれらの潜在的な治療的有用性が支持される。
ＫＲＡＳにおける一塩基多様性（ＫｒａｓＧ１２Ｄ／Ｒ／Ｖ変異）が膵臓腫瘍の９６％までにもおいて見いだされており（Changら、２０１４年）、Ｋｒａｓ変異は、膵臓の悪性転換を駆動し、維持する初期の新生物事象であると考えられる（Yingら、２０１２年；Collinら、２０１２年；Collinsら、２０１２年；Smakmanら、２００５年）。ナノ粒子を使用した、Ｋｒａｓ発現および下流のシグナル伝達のＲＮＡｉに基づく標的化により、肺癌および結腸直腸癌モデルにおける腫瘍量が低減することが最近報告された（Pecotら、２０１４年；Yuanら、２０１４年；Xueら、２０１４年）。発癌性Ｋｒａｓの特異的標的化に焦点を当てる試みとは異なり、これらの手法では、慎重な投薬およびモニタリングが必要になる細胞傷害効果が誘導される可能性がある。発癌性Ｋｒａｓの特異的標的化は、膵癌の異種移植モデルにおける電気穿孔（Rejibaら、２００７年）またはバイオポリマー埋め込み（Zorde  Khvalevskyら、２０１３年）による送達に限定されている。治療剤または診断剤を送達するための改善された手法が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kowalら,  Biogenesis  and  secretion  of  exosomes.  Current  Opinion  in  Cell  Biology,  29:116-125,  2014.
【非特許文献２】El-Andaloussiら,  Extracellular  vesicles:  biology  and  emerging  therapeutic  opportunities.  Nature  Reviews  Drug  Discovery,  12:347-357,  2013.
【非特許文献３】Theryら,  Exosomes:  composition,  biogenesis  and  function.  Nature  Reviews  Immunology,  2:569-579,  2002.
【非特許文献４】Valadiら,  Exosome-mediated  transfer  of  mRNAs  and  microRNAs  is  a  novel  mechanism  of  genetic  exchange  between  cells.  Nature  Cell  Biology,  9:654-659,  2007.
【非特許文献５】Peinadoら,  Melanoma  exosomes  educate  bone  marrow  progenitor  cells  toward  a  pro-metastatic  phenotype  through  MET.  Nature  Medicine,  18:883-891,  2012.
【非特許文献６】Lugaら,  Exosomes  mediate  stromal  mobilization  of  autocrine  Wnt-PCP  signaling  in  breast  cancer  cell  migration.  Cell,  151:1542-1556,  2012.
【非特許文献７】Kahlertら,  Identification  of  Double  Stranded  Genomic  DNA  Spanning  all  Chromosomes  with  Mutated  KRAS  and  p53  DNA  in  the  Serum  Exosomes  of  Patients  with  Pancreatic  Cancer.  The  Journal  of  biological  chemistry  2014.
【非特許文献８】MarcusおよびLeonard,  FedExosomes:  Engineering  Therapeutic  Biological  Nanoparticles  that  Truly  Deliver.  Pharmaceuticals  (Basel),  6:659-680,  2013.
【非特許文献９】van  den  Boornら,  Exosomes  as  nucleic  acid  nanocarriers.  Advanced  Drug  Delivery  Reviews,  65:331-335,  2013.
【非特許文献１０】Johnsenら,  A  comprehensive  overview  of  exosomes  as  drug  delivery  vehicles  -  endogenous  nanocarriers  for  targeted  cancer  therapy.  Biochimica  et  Biophysica  Acta,  1846:75-87,  2014.
【非特許文献１１】Claytonら,  Antigen-presenting  cell  exosomes  are  protected  from  complement-mediated  lysis  by  expression  of  CD55  and  CD59.  European  Journal  of  Immunology,  33:522-531,  2003.
【非特許文献１２】van  der  Meelら,  Extracellular  vesicles  as  drug  delivery  systems:  Lessons  from  the  liposome  field.  Journal  of  Controlled  Release,  195:72-85,  2014.
【非特許文献１３】Gomes-da-Silvaら,  Lipid-based  nanoparticles  for  siRNA  delivery  in  cancer  therapy:  paradigms  and  challenges.  Accounts  of  Chemical  Research,  45:1163-1171,  2012.
【非特許文献１４】Simoesら,  Cationic  liposomes  for  gene  delivery.  Expert  Opinion  on  Drug  Delivery,  2:237-254,  2005.
【非特許文献１５】Cooperら,  Systemic  exosomal  siRNA  delivery  reduced  alpha-synuclein  aggregates  in  brains  of  transgenic  mice.  Movement  Disorders,  29:1476-1485,  2014.
【非特許文献１６】Alvarez-Ervitiら,  Delivery  of  siRNA  to  the  mouse  brain  by  systemic  injection  of  targeted  exosomes.  Nature  Biotechnology,  29:341-345,  2011.
【非特許文献１７】Wahlgrenら,  Plasma  exosomes  can  deliver  exogenous  short  interfering  RNA  to  monocytes  and  lymphocytes.  Nucleic  Acids  Research,  40:e130,  2012.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
癌を処置するための送達系として、操作されたリポソームおよびエキソソームを使用する方法および薬物が提供される。
【０００６】
一実施形態では、脂質に基づくナノ粒子と賦形剤とを含む医薬組成物であって、脂質に基づくナノ粒子がその表面にＣＤ４７を含み、かつ脂質に基づくナノ粒子が治療剤を含む、医薬組成物が提供される。一部の態様では、脂質に基づくナノ粒子は、リポソームまたはエキソソームである。ある特定の態様では、エキソソームは、ＣＤ４７を過剰発現している細胞から単離される。一部の態様では、エキソソームは、治療を必要とする患者から単離される。一部の態様では、エキソソームは、線維芽細胞から単離される。一部の態様では、リポソームは、単層（ｓｉｎｇｌｅ  ｌａｍｅｌｌａｒ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）リポソームである。一部の態様では、リポソームは、多重層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソームである。
【０００７】
種々の態様では、治療剤は、治療用タンパク質、抗体（例えば、全長抗体、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディ）、阻害性ＲＮＡ、または小分子薬物である。一部の態様では、治療用タンパク質は、例えば、腫瘍抑制因子、キナーゼ、ホスファターゼ、または転写因子などの、その喪失または不活化が治療される疾患に関連することが分かっているタンパク質である。一部の態様では、抗体は、細胞内抗原に結合する。そのような細胞内抗原は、発癌遺伝子などの細胞増殖および／または生存のためにその活性が必要であるタンパク質であり得る。一部の場合では、抗体により、抗原の機能が妨げられる。一部の場合では、抗体により、タンパク質間相互作用が乱される。一部の態様では、阻害性ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。種々の態様では、阻害性ＲＮＡにより、例えば発癌遺伝子などの、その活性がある特定の病態の維持に必要であるタンパク質の発現が妨げられる。発癌遺伝子がある遺伝子の変異型である場合には、阻害性ＲＮＡにより、変異体発癌遺伝子の発現が優先的に妨げられ得、野生型タンパク質は妨げられない。一部の態様では、小分子薬物はイメージング剤である。一部の態様では、小分子薬物は化学療法剤である。
【０００８】
一部の態様では、組成物は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または腹腔内注射などの、非経口投与用に製剤化されている。
【０００９】
一部の態様では、組成物は、抗菌剤を含む。抗菌剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド（centrimide）、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン（exetidine）、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀（phenlymercuric  nitrate）、プロピレングリコール、またはチメロサールであってよい。
【００１０】
一部の態様では、単一の脂質に基づくナノ粒子は、治療剤と診断剤、１つ超の治療剤、または１つ超の診断剤などの、１つ超の薬剤を含む。
【００１１】
一実施形態では、それを必要とする患者における疾患を治療するための方法であって、本実施形態のいずれかの組成物を患者に投与し、それにより、患者における疾患を処置するステップを含む方法が提供される。一部の態様では、疾患は、癌である。一部の態様では、患者は、ヒトである。一部の態様では、患者は、以前に腫瘍を外科的に除去したことのある患者である。
【００１２】
一部の態様では、治療剤は、発癌遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡである。ある特定の態様では、阻害性ＲＮＡは、ＫｒａｓＧ１２Ｄを標的とする。一部の態様では、治療剤は、腫瘍抑制因子タンパク質である。
【００１３】
一部の態様では、方法は、少なくとも第２の療法を患者に投与することをさらに含む。種々の態様では、第２の療法は、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む。
【００１４】
一実施形態では、それを必要とする患者における疾患を処置するための方法であって、リポソームまたはエキソソームに治療剤（例えば、モノクローナル抗体）を電気穿孔し、電気穿孔されたリポソームまたはエキソソームを患者に提供し、それにより、患者における疾患を処置するステップを含む方法が提供される。一部の態様では、リポソームまたはエキソソームは、それらの表面にＣＤ４７を含む。一部の態様では、疾患は、癌である。一部の態様では、モノクローナル抗体は、細胞内抗原に特異的または選択的に結合する。
【００１５】
一実施形態では、それを必要とする患者に治療用タンパク質を投与するための方法であって、エキソソームに治療用タンパク質（例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片）をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）をトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされたエキソソームを、治療用タンパク質をエキソソーム内で発現させることを可能にする条件下でインキュベートするステップと、インキュベートしたエキソソームを患者に提供するステップであって、それにより、治療用タンパク質を患者に投与するステップを含む方法が提供される。
【００１６】
一実施形態では、治療用抗体を細胞に投与するための方法であって、細胞に、細胞内抗原に特異的または選択的に結合する抗体を含む脂質に基づくナノ粒子を接触させるステップを含む方法が提供される。一部の場合では、細胞は患者内に含まれ、方法は、脂質に基づくナノ粒子を患者に投与するステップを含む。
【００１７】
一実施形態では、患者における癌を治療するための方法であって、治療有効量の脂質に基づくナノ粒子を患者に投与するステップであって、ナノ粒子が、変異体Ｋｒａｓ（例えば、ＫｒａｓＧ１２Ｄ）を特異的または選択的に標的とする阻害性ＲＮＡであるステップを含む方法が提供される。一部の態様では、癌は、肺癌、結腸直腸癌、または膵癌である。一部の態様では、癌は、膵管腺癌である。一部の態様では、脂質に基づくナノ粒子は、リポソームまたはエキソソームである。ある特定の態様では、エキソソームは、患者独自の細胞に由来する。一部の態様では、脂質に基づくナノ粒子は、その表面にＣＤ４７を含む。一部の態様では、阻害性ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。一部の態様では、ＫｒａｓＧ１２ＤｍＲＮＡの特異的標的化を促進するために、阻害性ＲＮＡ配列を、標的領域内に特定のＧからＡへのヌクレオチドの偏位を含有するように設計する（例えば、配列番号１において見いだされる通り）。一部の態様では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２による配列を有する標的領域を含む。
【００１８】
一実施形態では、患者における疾患の処置に使用するための、脂質に基づくナノ粒子と賦形剤とを含む組成物が提供される。一部の態様では、脂質に基づくナノ粒子は、その表面にＣＤ４７を含む。一部の態様では、脂質に基づくナノ粒子は、治療剤を含む。一部の態様では、疾患は、癌であってよい。一部の態様では、治療剤は、発癌遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡである。一部の態様では、阻害性ＲＮＡは、ＫｒａｓＧ１２Ｄを標的とする。一部の態様では、治療剤は、腫瘍抑制因子タンパク質である。一部の態様では、組成物は、少なくとも第２の療法をさらに含む。一部の態様では、第２の療法は、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法である。一部の態様では、患者は、ヒトである。
【００１９】
一部の態様では、組成物は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または腹腔内注射などの非経口投与用に製剤化されている。
【００２０】
一部の態様では、組成物は、抗菌剤を含む。抗菌剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールであってよい。
【００２１】
一実施形態では、疾患を処置するための医薬品の製造における、脂質に基づくナノ粒子の使用が提供される。一部の態様では、脂質に基づくナノ粒子は、その表面にＣＤ４７を含む。一部の態様では、脂質に基づくナノ粒子は、治療剤を含む。一部の態様では、疾患は、癌である。一部の態様では、治療剤は、発癌遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡである。一部の態様では、阻害性ＲＮＡは、ＫｒａｓＧ１２Ｄを標的とする。一部の態様では、治療剤は、腫瘍抑制因子タンパク質である。
【００２２】
一部の態様では、医薬品は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または腹腔内注射などの非経口投与用に製剤化されている。
【００２３】
一部の態様では、医薬品は、抗菌剤を含む。抗菌剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールであってよい。
【００２４】
本明細書で使用される場合、指定の成分に関して「本質的に含まない」とは、本明細書では、指定の成分のいずれも組成物中に意図的に製剤化されておらず、かつ／または、汚染物質としてまたは微量でのみ存在することを意味するために使用される。したがって、任意の意図されたものではない組成物の汚染に起因する指定の成分の総量は、０．０５％未満であり、好ましくは０．０１％未満である。標準の分析方法を用いていかなる量の指定の成分も検出することができない組成物が最も好ましい。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」という特定は、１つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と同時に使用される場合、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」という単語は、１つまたは１つ超を意味し得る。
【００２６】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すかまたは代替物が相互排他的であることが明示されていなければ、「および／または」の意味を示すために使用されるが、本開示は、代替物のみ、ならびに「および／または」を指すという定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」とは、少なくとも第２のまたはそれ超を意味し得る。
【００２７】
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、その値を決定するために使用されるデバイス、方法に固有の誤差の変動、または試験対象の中で存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００２８】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この発明の詳細な説明から本発明の主旨および範囲内の様々な変化および改変が当業者に明らかになるので、発明の詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、単に例示として示されていることが理解されるべきである。
【００２９】
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を、本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによってよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソーム内にパッケージングされたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡによって媒介されるＫｒａｓＧ１２Ｄの標的化により、癌細胞死が誘導されることを示す図である。（図１Ａ）ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ核標識を用いて染色したＰａｎｃ−１細胞の共焦点顕微鏡写真の定量化およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたｓｉＲＮＡを含有する内部移行したエキソソーム（ｅｘｏｓ）およびリポソーム（ｌｉｐｏｓ）の可視化。Ｐａｎｃ−１細胞を、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴ってプレインキュベートした後、および、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴わずにプレインキュベートした後に、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７タグを付けたｓｉＲＮＡに曝露させた。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図１Ｂ〜Ｃ）ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＫｒａｓＧ１２ＤまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＳｃｒｂｌまたはｓｈＳｃｒｂｌ、または電気穿孔されていないｅｘｏｓ（空のカーゴ、対照ｅｘｏｓ）を用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ（図１Ｂ）または野生型ＫＲＡＳ（図１Ｃ）転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図１Ｄ）無処理のＰａｎｃ−１由来の溶解物（対照）およびｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて処理したＰａｎｃ−１細胞由来の溶解物の、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）およびアクチン（ローディング対照）についてのウエスタンブロッティング。（図１Ｅ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＰａｎｃ−１細胞の相対数。（図１Ｆ）列挙されている処理に曝露したＰａｎｃ−１細胞におけるアポトーシスマーカーＴＵＮＥＬについて実施した免疫染色顕微鏡写真の定量化。ピューロマイシンを陽性対照として使用した。（０）は、ＴＵＮＥＬについて陽性の細胞が検出されなかったことを示す。対照：未処理の対照ｅｘｏｓ：電気穿孔されていない（ｓｉＲＮＡカーゴを有さない）ｅｘｏｓ。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。平均が＋／−ＳＥＭとともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソーム内にパッケージングされたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡによって媒介されるＫｒａｓＧ１２Ｄの標的化により、癌細胞死が誘導されることを示す図である。（図１Ａ）ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ核標識を用いて染色したＰａｎｃ−１細胞の共焦点顕微鏡写真の定量化およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたｓｉＲＮＡを含有する内部移行したエキソソーム（ｅｘｏｓ）およびリポソーム（ｌｉｐｏｓ）の可視化。Ｐａｎｃ−１細胞を、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴ってプレインキュベートした後、および、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴わずにプレインキュベートした後に、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７タグを付けたｓｉＲＮＡに曝露させた。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図１Ｂ〜Ｃ）ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＫｒａｓＧ１２ＤまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＳｃｒｂｌまたはｓｈＳｃｒｂｌ、または電気穿孔されていないｅｘｏｓ（空のカーゴ、対照ｅｘｏｓ）を用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ（図１Ｂ）または野生型ＫＲＡＳ（図１Ｃ）転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図１Ｄ）無処理のＰａｎｃ−１由来の溶解物（対照）およびｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて処理したＰａｎｃ−１細胞由来の溶解物の、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）およびアクチン（ローディング対照）についてのウエスタンブロッティング。（図１Ｅ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＰａｎｃ−１細胞の相対数。（図１Ｆ）列挙されている処理に曝露したＰａｎｃ−１細胞におけるアポトーシスマーカーＴＵＮＥＬについて実施した免疫染色顕微鏡写真の定量化。ピューロマイシンを陽性対照として使用した。（０）は、ＴＵＮＥＬについて陽性の細胞が検出されなかったことを示す。対照：未処理の対照ｅｘｏｓ：電気穿孔されていない（ｓｉＲＮＡカーゴを有さない）ｅｘｏｓ。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。平均が＋／−ＳＥＭとともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソーム内にパッケージングされたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡによって媒介されるＫｒａｓＧ１２Ｄの標的化により、癌細胞死が誘導されることを示す図である。（図１Ａ）ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ核標識を用いて染色したＰａｎｃ−１細胞の共焦点顕微鏡写真の定量化およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたｓｉＲＮＡを含有する内部移行したエキソソーム（ｅｘｏｓ）およびリポソーム（ｌｉｐｏｓ）の可視化。Ｐａｎｃ−１細胞を、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴ってプレインキュベートした後、および、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴わずにプレインキュベートした後に、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７タグを付けたｓｉＲＮＡに曝露させた。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図１Ｂ〜Ｃ）ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＫｒａｓＧ１２ＤまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＳｃｒｂｌまたはｓｈＳｃｒｂｌ、または電気穿孔されていないｅｘｏｓ（空のカーゴ、対照ｅｘｏｓ）を用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ（図１Ｂ）または野生型ＫＲＡＳ（図１Ｃ）転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図１Ｄ）無処理のＰａｎｃ−１由来の溶解物（対照）およびｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて処理したＰａｎｃ−１細胞由来の溶解物の、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）およびアクチン（ローディング対照）についてのウエスタンブロッティング。（図１Ｅ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＰａｎｃ−１細胞の相対数。（図１Ｆ）列挙されている処理に曝露したＰａｎｃ−１細胞におけるアポトーシスマーカーＴＵＮＥＬについて実施した免疫染色顕微鏡写真の定量化。ピューロマイシンを陽性対照として使用した。（０）は、ＴＵＮＥＬについて陽性の細胞が検出されなかったことを示す。対照：未処理の対照ｅｘｏｓ：電気穿孔されていない（ｓｉＲＮＡカーゴを有さない）ｅｘｏｓ。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。平均が＋／−ＳＥＭとともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソーム内にパッケージングされたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡによって媒介されるＫｒａｓＧ１２Ｄの標的化により、癌細胞死が誘導されることを示す図である。（図１Ａ）ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ核標識を用いて染色したＰａｎｃ−１細胞の共焦点顕微鏡写真の定量化およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたｓｉＲＮＡを含有する内部移行したエキソソーム（ｅｘｏｓ）およびリポソーム（ｌｉｐｏｓ）の可視化。Ｐａｎｃ−１細胞を、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴ってプレインキュベートした後、および、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴わずにプレインキュベートした後に、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７タグを付けたｓｉＲＮＡに曝露させた。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図１Ｂ〜Ｃ）ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＫｒａｓＧ１２ＤまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＳｃｒｂｌまたはｓｈＳｃｒｂｌ、または電気穿孔されていないｅｘｏｓ（空のカーゴ、対照ｅｘｏｓ）を用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ（図１Ｂ）または野生型ＫＲＡＳ（図１Ｃ）転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図１Ｄ）無処理のＰａｎｃ−１由来の溶解物（対照）およびｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて処理したＰａｎｃ−１細胞由来の溶解物の、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）およびアクチン（ローディング対照）についてのウエスタンブロッティング。（図１Ｅ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＰａｎｃ−１細胞の相対数。（図１Ｆ）列挙されている処理に曝露したＰａｎｃ−１細胞におけるアポトーシスマーカーＴＵＮＥＬについて実施した免疫染色顕微鏡写真の定量化。ピューロマイシンを陽性対照として使用した。（０）は、ＴＵＮＥＬについて陽性の細胞が検出されなかったことを示す。対照：未処理の対照ｅｘｏｓ：電気穿孔されていない（ｓｉＲＮＡカーゴを有さない）ｅｘｏｓ。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。平均が＋／−ＳＥＭとともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない。
【図１Ｅ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソーム内にパッケージングされたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡによって媒介されるＫｒａｓＧ１２Ｄの標的化により、癌細胞死が誘導されることを示す図である。（図１Ａ）ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ核標識を用いて染色したＰａｎｃ−１細胞の共焦点顕微鏡写真の定量化およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたｓｉＲＮＡを含有する内部移行したエキソソーム（ｅｘｏｓ）およびリポソーム（ｌｉｐｏｓ）の可視化。Ｐａｎｃ−１細胞を、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴ってプレインキュベートした後、および、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴わずにプレインキュベートした後に、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７タグを付けたｓｉＲＮＡに曝露させた。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図１Ｂ〜Ｃ）ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＫｒａｓＧ１２ＤまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＳｃｒｂｌまたはｓｈＳｃｒｂｌ、または電気穿孔されていないｅｘｏｓ（空のカーゴ、対照ｅｘｏｓ）を用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ（図１Ｂ）または野生型ＫＲＡＳ（図１Ｃ）転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図１Ｄ）無処理のＰａｎｃ−１由来の溶解物（対照）およびｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて処理したＰａｎｃ−１細胞由来の溶解物の、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）およびアクチン（ローディング対照）についてのウエスタンブロッティング。（図１Ｅ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＰａｎｃ−１細胞の相対数。（図１Ｆ）列挙されている処理に曝露したＰａｎｃ−１細胞におけるアポトーシスマーカーＴＵＮＥＬについて実施した免疫染色顕微鏡写真の定量化。ピューロマイシンを陽性対照として使用した。（０）は、ＴＵＮＥＬについて陽性の細胞が検出されなかったことを示す。対照：未処理の対照ｅｘｏｓ：電気穿孔されていない（ｓｉＲＮＡカーゴを有さない）ｅｘｏｓ。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。平均が＋／−ＳＥＭとともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない。
【図１Ｆ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソーム内にパッケージングされたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡによって媒介されるＫｒａｓＧ１２Ｄの標的化により、癌細胞死が誘導されることを示す図である。（図１Ａ）ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ核標識を用いて染色したＰａｎｃ−１細胞の共焦点顕微鏡写真の定量化およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたｓｉＲＮＡを含有する内部移行したエキソソーム（ｅｘｏｓ）およびリポソーム（ｌｉｐｏｓ）の可視化。Ｐａｎｃ−１細胞を、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴ってプレインキュベートした後、および、プロテイナーゼＫまたはトリプシンを伴わずにプレインキュベートした後に、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７タグを付けたｓｉＲＮＡに曝露させた。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図１Ｂ〜Ｃ）ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＫｒａｓＧ１２ＤまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ、ｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓを含有するｓｉＳｃｒｂｌまたはｓｈＳｃｒｂｌ、または電気穿孔されていないｅｘｏｓ（空のカーゴ、対照ｅｘｏｓ）を用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ（図１Ｂ）または野生型ＫＲＡＳ（図１Ｃ）転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図１Ｄ）無処理のＰａｎｃ−１由来の溶解物（対照）およびｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて処理したＰａｎｃ−１細胞由来の溶解物の、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）およびアクチン（ローディング対照）についてのウエスタンブロッティング。（図１Ｅ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＰａｎｃ−１細胞の相対数。（図１Ｆ）列挙されている処理に曝露したＰａｎｃ−１細胞におけるアポトーシスマーカーＴＵＮＥＬについて実施した免疫染色顕微鏡写真の定量化。ピューロマイシンを陽性対照として使用した。（０）は、ＴＵＮＥＬについて陽性の細胞が検出されなかったことを示す。対照：未処理の対照ｅｘｏｓ：電気穿孔されていない（ｓｉＲＮＡカーゴを有さない）ｅｘｏｓ。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。平均が＋／−ＳＥＭとともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない。
【００３１】
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｇは、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄカーゴを含有するエキソソームを用いた処理により、持続的なＰａｎｃ−１同所性腫瘍退縮がもたらされることを示すグラフである。（図２Ａ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。実験エンドポイント時（癌細胞注射後２８日目）にＰＢＳ群と比較したｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ群を例外として、癌細胞注射後４２日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；中央の線の対はｌｉｐｏｓである；下の線の対はｅｘｏｓである。（図２Ｂ）経時的な生物発光ＢｘＰＣ３同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３。癌細胞注射後７７日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。（図２Ｃ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。実験群はＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７で開始し、マウスが瀕死になり安楽死させるにしたがい次第に減少した（ＰＢＳおよび対照ｅｘｏｓ群）。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した膵臓において、癌細胞の小さな病巣が見られたが、膵臓の大部分は組織学的に注目すべきものではなかった。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；下の線の対は、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである。（図２Ｄ）同所性Ｐａｎｃ−１腫瘍についての、癌細胞注射後７７日目の測定された生物発光の放射輝度の比較分析。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｅ）実験群における膵臓腫瘍におけるｐ−ＥＲＫ免疫標識の定量化（スケールバー：５０μｍ）およびパーセントｐ−ＥＲＫ染色。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における測定可能な程度に小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。独立両側スチューデントｔ検定を使用して両群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｆ）示されている実験群における、安楽死時（ＰＢＳ：６２〜１３０日目、対照ｅｘｏｓ：３０〜１３２日目、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：２００日目）の腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｇ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した、ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。平均が＋／−ＳＥＭともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０���０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｇは、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄカーゴを含有するエキソソームを用いた処理により、持続的なＰａｎｃ−１同所性腫瘍退縮がもたらされることを示すグラフである。（図２Ａ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。実験エンドポイント時（癌細胞注射後２８日目）にＰＢＳ群と比較したｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ群を例外として、癌細胞注射後４２日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；中央の線の対はｌｉｐｏｓである；下の線の対はｅｘｏｓである。（図２Ｂ）経時的な生物発光ＢｘＰＣ３同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３。癌細胞注射後７７日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。（図２Ｃ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。実験群はＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７で開始し、マウスが瀕死になり安楽死させるにしたがい次第に減少した（ＰＢＳおよび対照ｅｘｏｓ群）。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した膵臓において、癌細胞の小さな病巣が見られたが、膵臓の大部分は組織学的に注目すべきものではなかった。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；下の線の対は、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである。（図２Ｄ）同所性Ｐａｎｃ−１腫瘍についての、癌細胞注射後７７日目の測定された生物発光の放射輝度の比較分析。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｅ）実験群における膵臓腫瘍におけるｐ−ＥＲＫ免疫標識の定量化（スケールバー：５０μｍ）およびパーセントｐ−ＥＲＫ染色。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における測定可能な程度に小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。独立両側スチューデントｔ検定を使用して両群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｆ）示されている実験群における、安楽死時（ＰＢＳ：６２〜１３０日目、対照ｅｘｏｓ：３０〜１３２日目、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：２００日目）の腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｇ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した、ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。平均が＋／−ＳＥＭともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０���０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｇは、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄカーゴを含有するエキソソームを用いた処理により、持続的なＰａｎｃ−１同所性腫瘍退縮がもたらされることを示すグラフである。（図２Ａ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。実験エンドポイント時（癌細胞注射後２８日目）にＰＢＳ群と比較したｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ群を例外として、癌細胞注射後４２日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；中央の線の対はｌｉｐｏｓである；下の線の対はｅｘｏｓである。（図２Ｂ）経時的な生物発光ＢｘＰＣ３同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３。癌細胞注射後７７日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。（図２Ｃ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。実験群はＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７で開始し、マウスが瀕死になり安楽死させるにしたがい次第に減少した（ＰＢＳおよび対照ｅｘｏｓ群）。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した膵臓において、癌細胞の小さな病巣が見られたが、膵臓の大部分は組織学的に注目すべきものではなかった。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；下の線の対は、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである。（図２Ｄ）同所性Ｐａｎｃ−１腫瘍についての、癌細胞注射後７７日目の測定された生物発光の放射輝度の比較分析。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｅ）実験群における膵臓腫瘍におけるｐ−ＥＲＫ免疫標識の定量化（スケールバー：５０μｍ）およびパーセントｐ−ＥＲＫ染色。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における測定可能な程度に小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。独立両側スチューデントｔ検定を使用して両群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｆ）示されている実験群における、安楽死時（ＰＢＳ：６２〜１３０日目、対照ｅｘｏｓ：３０〜１３２日目、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：２００日目）の腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｇ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した、ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。平均が＋／−ＳＥＭともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０���０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｇは、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄカーゴを含有するエキソソームを用いた処理により、持続的なＰａｎｃ−１同所性腫瘍退縮がもたらされることを示すグラフである。（図２Ａ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。実験エンドポイント時（癌細胞注射後２８日目）にＰＢＳ群と比較したｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ群を例外として、癌細胞注射後４２日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；中央の線の対はｌｉｐｏｓである；下の線の対はｅｘｏｓである。（図２Ｂ）経時的な生物発光ＢｘＰＣ３同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３。癌細胞注射後７７日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。（図２Ｃ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。実験群はＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７で開始し、マウスが瀕死になり安楽死させるにしたがい次第に減少した（ＰＢＳおよび対照ｅｘｏｓ群）。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した膵臓において、癌細胞の小さな病巣が見られたが、膵臓の大部分は組織学的に注目すべきものではなかった。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；下の線の対は、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである。（図２Ｄ）同所性Ｐａｎｃ−１腫瘍についての、癌細胞注射後７７日目の測定された生物発光の放射輝度の比較分析。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｅ）実験群における膵臓腫瘍におけるｐ−ＥＲＫ免疫標識の定量化（スケールバー：５０μｍ）およびパーセントｐ−ＥＲＫ染色。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における測定可能な程度に小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。独立両側スチューデントｔ検定を使用して両群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｆ）示されている実験群における、安楽死時（ＰＢＳ：６２〜１３０日目、対照ｅｘｏｓ：３０〜１３２日目、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：２００日目）の腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｇ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した、ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。平均が＋／−ＳＥＭともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０���０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図２Ｅ】図２Ａ〜Ｇは、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄカーゴを含有するエキソソームを用いた処理により、持続的なＰａｎｃ−１同所性腫瘍退縮がもたらされることを示すグラフである。（図２Ａ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。実験エンドポイント時（癌細胞注射後２８日目）にＰＢＳ群と比較したｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ群を例外として、癌細胞注射後４２日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；中央の線の対はｌｉｐｏｓである；下の線の対はｅｘｏｓである。（図２Ｂ）経時的な生物発光ＢｘＰＣ３同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３。癌細胞注射後７７日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。（図２Ｃ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。実験群はＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７で開始し、マウスが瀕死になり安楽死させるにしたがい次第に減少した（ＰＢＳおよび対照ｅｘｏｓ群）。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した膵臓において、癌細胞の小さな病巣が見られたが、膵臓の大部分は組織学的に注目すべきものではなかった。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；下の線の対は、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである。（図２Ｄ）同所性Ｐａｎｃ−１腫瘍についての、癌細胞注射後７７日目の測定された生物発光の放射輝度の比較分析。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｅ）実験群における膵臓腫瘍におけるｐ−ＥＲＫ免疫標識の定量化（スケールバー：５０μｍ）およびパーセントｐ−ＥＲＫ染色。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における測定可能な程度に小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。独立両側スチューデントｔ検定を使用して両群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｆ）示されている実験群における、安楽死時（ＰＢＳ：６２〜１３０日目、対照ｅｘｏｓ：３０〜１３２日目、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：２００日目）の腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｇ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した、ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。平均が＋／−ＳＥＭともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０���０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図２Ｆ】図２Ａ〜Ｇは、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄカーゴを含有するエキソソームを用いた処理により、持続的なＰａｎｃ−１同所性腫瘍退縮がもたらされることを示すグラフである。（図２Ａ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。実験エンドポイント時（癌細胞注射後２８日目）にＰＢＳ群と比較したｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ群を例外として、癌細胞注射後４２日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；中央の線の対はｌｉｐｏｓである；下の線の対はｅｘｏｓである。（図２Ｂ）経時的な生物発光ＢｘＰＣ３同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３。癌細胞注射後７７日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。（図２Ｃ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。実験群はＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７で開始し、マウスが瀕死になり安楽死させるにしたがい次第に減少した（ＰＢＳおよび対照ｅｘｏｓ群）。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した膵臓において、癌細胞の小さな病巣が見られたが、膵臓の大部分は組織学的に注目すべきものではなかった。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；下の線の対は、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである。（図２Ｄ）同所性Ｐａｎｃ−１腫瘍についての、癌細胞注射後７７日目の測定された生物発光の放射輝度の比較分析。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｅ）実験群における膵臓腫瘍におけるｐ−ＥＲＫ免疫標識の定量化（スケールバー：５０μｍ）およびパーセントｐ−ＥＲＫ染色。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における測定可能な程度に小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。独立両側スチューデントｔ検定を使用して両群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｆ）示されている実験群における、安楽死時（ＰＢＳ：６２〜１３０日目、対照ｅｘｏｓ：３０〜１３２日目、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：２００日目）の腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｇ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した、ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。平均が＋／−ＳＥＭともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０���０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図２Ｇ】図２Ａ〜Ｇは、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄカーゴを含有するエキソソームを用いた処理により、持続的なＰａｎｃ−１同所性腫瘍退縮がもたらされることを示すグラフである。（図２Ａ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。実験エンドポイント時（癌細胞注射後２８日目）にＰＢＳ群と比較したｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ群を例外として、癌細胞注射後４２日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；中央の線の対はｌｉｐｏｓである；下の線の対はｅｘｏｓである。（図２Ｂ）経時的な生物発光ＢｘＰＣ３同所性腫瘍の相対的な放射輝度。ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３。癌細胞注射後７７日目の、処置群とＰＢＳ対照群を比較した統計的検定結果が示されている。（図２Ｃ）経時的な生物発光Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍の相対的な放射輝度。実験群はＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７で開始し、マウスが瀕死になり安楽死させるにしたがい次第に減少した（ＰＢＳおよび対照ｅｘｏｓ群）。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した膵臓において、癌細胞の小さな病巣が見られたが、膵臓の大部分は組織学的に注目すべきものではなかった。上の線の対は、ＰＢＳおよび対照Ｅｘｏｓである；下の線の対は、ｓｉ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである。（図２Ｄ）同所性Ｐａｎｃ−１腫瘍についての、癌細胞注射後７７日目の測定された生物発光の放射輝度の比較分析。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｅ）実験群における膵臓腫瘍におけるｐ−ＥＲＫ免疫標識の定量化（スケールバー：５０μｍ）およびパーセントｐ−ＥＲＫ染色。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における測定可能な程度に小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。独立両側スチューデントｔ検定を使用して両群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｆ）示されている実験群における、安楽死時（ＰＢＳ：６２〜１３０日目、対照ｅｘｏｓ：３０〜１３２日目、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：２００日目）の腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。独立両側スチューデントｔ検定を使用して群間の統計的有意性を決定した。（図２Ｇ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した、ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。平均が＋／−ＳＥＭともに示されている。別段の指定のない限り、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０���０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【００３２】
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｇは、ＰＫＴマウスにおいて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡをパッケージングしたエキソソームおよびＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｈＲＮＡをパッケージングしたエキソソームの注射により、より遅い腫瘍の進行および生存の増加が誘導されることを示す図である。（図３Ａ）Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスにおける、実験処置点を伴う腫瘍の進行の時系列の略図。ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームを用いた処置を３３日目に開始し、その後、２日に１回、マウス実験エンドポイントに到達するまでまたは瀕死になり安楽死が必要になるまで継続した。対照群は、同じ濃度の電気穿孔されていないＢＪエキソソーム（対照ｅｘｏｓ）を用いて処置した。（図３Ｂ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した。各群ｎ＝５。（図３Ｃ）４４日齢時の、示されている実験群における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝３。（図３Ｄ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄを含有するｅｘｏｓまたは電気穿孔されていない対照ｅｘｏｓを用いて処置した４４日齢ＰＫＴマウス、ｎ＝３由来のＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真から決定された相対百分率の定量化。一元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図３Ｅ〜Ｆ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（ＰＫＴ由来の線維芽細胞由来のエキソソーム、各群ｎ＝５；左側の線は対照Ｅｘｏｓであり、右側の線はｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである）（図３Ｅ）、および（図３Ｆ）腫瘍量、ｎ＝５。カプランマイヤー曲線の比較に関する統計解析のためにログランクマンテル・コックス検定を実施した。（図３Ｇ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴ膵臓腫瘍からの、アポトーシスマーカーＴＵＮＥＬ、増殖マーカーＫｉ−６７、およびリン酸化ＥＲＫについてのマッソントリクローム染色（ＭＴＳ）および免疫標識の顕微鏡写真の定量化。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｇは、ＰＫＴマウスにおいて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡをパッケージングしたエキソソームおよびＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｈＲＮＡをパッケージングしたエキソソームの注射により、より遅い腫瘍の進行および生存の増加が誘導されることを示す図である。（図３Ａ）Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスにおける、実験処置点を伴う腫瘍の進行の時系列の略図。ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームを用いた処置を３３日目に開始し、その後、２日に１回、マウス実験エンドポイントに到達するまでまたは瀕死になり安楽死が必要になるまで継続した。対照群は、同じ濃度の電気穿孔されていないＢＪエキソソーム（対照ｅｘｏｓ）を用いて処置した。（図３Ｂ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した。各群ｎ＝５。（図３Ｃ）４４日齢時の、示されている実験群における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝３。（図３Ｄ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄを含有するｅｘｏｓまたは電気穿孔されていない対照ｅｘｏｓを用いて処置した４４日齢ＰＫＴマウス、ｎ＝３由来のＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真から決定された相対百分率の定量化。一元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図３Ｅ〜Ｆ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（ＰＫＴ由来の線維芽細胞由来のエキソソーム、各群ｎ＝５；左側の線は対照Ｅｘｏｓであり、右側の線はｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである）（図３Ｅ）、および（図３Ｆ）腫瘍量、ｎ＝５。カプランマイヤー曲線の比較に関する統計解析のためにログランクマンテル・コックス検定を実施した。（図３Ｇ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴ膵臓腫瘍からの、アポトーシスマーカーＴＵＮＥＬ、増殖マーカーＫｉ−６７、およびリン酸化ＥＲＫについてのマッソントリクローム染色（ＭＴＳ）および免疫標識の顕微鏡写真の定量化。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｇは、ＰＫＴマウスにおいて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡをパッケージングしたエキソソームおよびＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｈＲＮＡをパッケージングしたエキソソームの注射により、より遅い腫瘍の進行および生存の増加が誘導されることを示す図である。（図３Ａ）Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスにおける、実験処置点を伴う腫瘍の進行の時系列の略図。ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームを用いた処置を３３日目に開始し、その後、２日に１回、マウス実験エンドポイントに到達するまでまたは瀕死になり安楽死が必要になるまで継続した。対照群は、同じ濃度の電気穿孔されていないＢＪエキソソーム（対照ｅｘｏｓ）を用いて処置した。（図３Ｂ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した。各群ｎ＝５。（図３Ｃ）４４日齢時の、示されている実験群における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝３。（図３Ｄ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄを含有するｅｘｏｓまたは電気穿孔されていない対照ｅｘｏｓを用いて処置した４４日齢ＰＫＴマウス、ｎ＝３由来のＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真から決定された相対百分率の定量化。一元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図３Ｅ〜Ｆ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（ＰＫＴ由来の線維芽細胞由来のエキソソーム、各群ｎ＝５；左側の線は対照Ｅｘｏｓであり、右側の線はｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである）（図３Ｅ）、および（図３Ｆ）腫瘍量、ｎ＝５。カプランマイヤー曲線の比較に関する統計解析のためにログランクマンテル・コックス検定を実施した。（図３Ｇ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴ膵臓腫瘍からの、アポトーシスマーカーＴＵＮＥＬ、増殖マーカーＫｉ−６７、およびリン酸化ＥＲＫについてのマッソントリクローム染色（ＭＴＳ）および免疫標識の顕微鏡写真の定量化。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｇは、ＰＫＴマウスにおいて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡをパッケージングしたエキソソームおよびＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｈＲＮＡをパッケージングしたエキソソームの注射により、より遅い腫瘍の進行および生存の増加が誘導されることを示す図である。（図３Ａ）Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスにおける、実験処置点を伴う腫瘍の進行の時系列の略図。ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームを用いた処置を３３日目に開始し、その後、２日に１回、マウス実験エンドポイントに到達するまでまたは瀕死になり安楽死が必要になるまで継続した。対照群は、同じ濃度の電気穿孔されていないＢＪエキソソーム（対照ｅｘｏｓ）を用いて処置した。（図３Ｂ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した。各群ｎ＝５。（図３Ｃ）４４日齢時の、示されている実験群における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝３。（図３Ｄ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄを含有するｅｘｏｓまたは電気穿孔されていない対照ｅｘｏｓを用いて処置した４４日齢ＰＫＴマウス、ｎ＝３由来のＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真から決定された相対百分率の定量化。一元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図３Ｅ〜Ｆ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（ＰＫＴ由来の線維芽細胞由来のエキソソーム、各群ｎ＝５；左側の線は対照Ｅｘｏｓであり、右側の線はｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである）（図３Ｅ）、および（図３Ｆ）腫瘍量、ｎ＝５。カプランマイヤー曲線の比較に関する統計解析のためにログランクマンテル・コックス検定を実施した。（図３Ｇ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴ膵臓腫瘍からの、アポトーシスマーカーＴＵＮＥＬ、増殖マーカーＫｉ−６７、およびリン酸化ＥＲＫについてのマッソントリクローム染色（ＭＴＳ）および免疫標識の顕微鏡写真の定量化。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３Ｅ】図３Ａ〜Ｇは、ＰＫＴマウスにおいて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡをパッケージングしたエキソソームおよびＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｈＲＮＡをパッケージングしたエキソソームの注射により、より遅い腫瘍の進行および生存の増加が誘導されることを示す図である。（図３Ａ）Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスにおける、実験処置点を伴う腫瘍の進行の時系列の略図。ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームを用いた処置を３３日目に開始し、その後、２日に１回、マウス実験エンドポイントに到達するまでまたは瀕死になり安楽死が必要になるまで継続した。対照群は、同じ濃度の電気穿孔されていないＢＪエキソソーム（対照ｅｘｏｓ）を用いて処置した。（図３Ｂ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した。各群ｎ＝５。（図３Ｃ）４４日齢時の、示されている実験群における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝３。（図３Ｄ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄを含有するｅｘｏｓまたは電気穿孔されていない対照ｅｘｏｓを用いて処置した４４日齢ＰＫＴマウス、ｎ＝３由来のＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真から決定された相対百分率の定量化。一元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図３Ｅ〜Ｆ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（ＰＫＴ由来の線維芽細胞由来のエキソソーム、各群ｎ＝５；左側の線は対照Ｅｘｏｓであり、右側の線はｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである）（図３Ｅ）、および（図３Ｆ）腫瘍量、ｎ＝５。カプランマイヤー曲線の比較に関する統計解析のためにログランクマンテル・コックス検定を実施した。（図３Ｇ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴ膵臓腫瘍からの、アポトーシスマーカーＴＵＮＥＬ、増殖マーカーＫｉ−６７、およびリン酸化ＥＲＫについてのマッソントリクローム染色（ＭＴＳ）および免疫標識の顕微鏡写真の定量化。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３Ｆ】図３Ａ〜Ｇは、ＰＫＴマウスにおいて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡをパッケージングしたエキソソームおよびＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｈＲＮＡをパッケージングしたエキソソームの注射により、より遅い腫瘍の進行および生存の増加が誘導されることを示す図である。（図３Ａ）Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスにおける、実験処置点を伴う腫瘍の進行の時系列の略図。ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームを用いた処置を３３日目に開始し、その後、２日に１回、マウス実験エンドポイントに到達するまでまたは瀕死になり安楽死が必要になるまで継続した。対照群は、同じ濃度の電気穿孔されていないＢＪエキソソーム（対照ｅｘｏｓ）を用いて処置した。（図３Ｂ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した。各群ｎ＝５。（図３Ｃ）４４日齢時の、示されている実験群における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝３。（図３Ｄ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄを含有するｅｘｏｓまたは電気穿孔されていない対照ｅｘｏｓを用いて処置した４４日齢ＰＫＴマウス、ｎ＝３由来のＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真から決定された相対百分率の定量化。一元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図３Ｅ〜Ｆ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（ＰＫＴ由来の線維芽細胞由来のエキソソーム、各群ｎ＝５；左側の線は対照Ｅｘｏｓであり、右側の線はｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである）（図３Ｅ）、および（図３Ｆ）腫瘍量、ｎ＝５。カプランマイヤー曲線の比較に関する統計解析のためにログランクマンテル・コックス検定を実施した。（図３Ｇ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴ膵臓腫瘍からの、アポトーシスマーカーＴＵＮＥＬ、増殖マーカーＫｉ−６７、およびリン酸化ＥＲＫについてのマッソントリクローム染色（ＭＴＳ）および免疫標識の顕微鏡写真の定量化。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３Ｇ】図３Ａ〜Ｇは、ＰＫＴマウスにおいて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡをパッケージングしたエキソソームおよびＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｈＲＮＡをパッケージングしたエキソソームの注射により、より遅い腫瘍の進行および生存の増加が誘導されることを示す図である。（図３Ａ）Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスにおける、実験処置点を伴う腫瘍の進行の時系列の略図。ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームを用いた処置を３３日目に開始し、その後、２日に１回、マウス実験エンドポイントに到達するまでまたは瀕死になり安楽死が必要になるまで継続した。対照群は、同じ濃度の電気穿孔されていないＢＪエキソソーム（対照ｅｘｏｓ）を用いて処置した。（図３Ｂ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較および統計学的差異を、ログランクマンテル・コックス検定を使用して評価した。各群ｎ＝５。（図３Ｃ）４４日齢時の、示されている実験群における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝３。（図３Ｄ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄを含有するｅｘｏｓまたは電気穿孔されていない対照ｅｘｏｓを用いて処置した４４日齢ＰＫＴマウス、ｎ＝３由来のＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真から決定された相対百分率の定量化。一元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図３Ｅ〜Ｆ）示されている実験群のマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（ＰＫＴ由来の線維芽細胞由来のエキソソーム、各群ｎ＝５；左側の線は対照Ｅｘｏｓであり、右側の線はｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓである）（図３Ｅ）、および（図３Ｆ）腫瘍量、ｎ＝５。カプランマイヤー曲線の比較に関する統計解析のためにログランクマンテル・コックス検定を実施した。（図３Ｇ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴ膵臓腫瘍からの、アポトーシスマーカーＴＵＮＥＬ、増殖マーカーＫｉ−６７、およびリン酸化ＥＲＫについてのマッソントリクローム染色（ＭＴＳ）および免疫標識の顕微鏡写真の定量化。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００３３】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｉは、エキソソームを使用した特異的ＫｒａｓＧ１２Ｄ標的化を示す図である。（図４Ａ）ＲＮＡｉのエキソソームへの電気穿孔の略図。示されているＲＮＡｉは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたものである。（図４Ｂ）エキソソームの数およびサイズ分布−ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用。（図４Ｃ〜Ｄ）ＢＪ線維芽細胞から精製されたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（図４Ｃ）および免疫金によるＣＤ９についての染色（図４Ｄ）。（図４Ｅ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームのスクロース勾配のノーザンブロット。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアの蛍光の検出がブロットに示されている。（図４Ｆ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｉＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓまたはｓｈＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓを用いて３時間、ｌｉｐｏｓの濃度を増大させて（１×、１０×、１００×）処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにＰａｎｃ−１細胞の処理時間を増大させた場合（２４時間）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した、無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｇ）図１Ｂに示されている通り、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにｅｘｏｓの濃度を増大させた場合（細胞当たり約４００個のｅｘｏｓの代わりに、細胞当たり約７００個のｅｘｏｓ）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｈ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＢｘＰＣ−３細胞における野生型ＫＲＡＳ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＢｘＰＣ３細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｉ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＢＸＰＣ−３細胞の相対数。独立両側スチューデントｔ検定を最終時点で使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｉは、エキソソームを使用した特異的ＫｒａｓＧ１２Ｄ標的化を示す図である。（図４Ａ）ＲＮＡｉのエキソソームへの電気穿孔の略図。示されているＲＮＡｉは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたものである。（図４Ｂ）エキソソームの数およびサイズ分布−ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用。（図４Ｃ〜Ｄ）ＢＪ線維芽細胞から精製されたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（図４Ｃ）および免疫金によるＣＤ９についての染色（図４Ｄ）。（図４Ｅ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームのスクロース勾配のノーザンブロット。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアの蛍光の検出がブロットに示されている。（図４Ｆ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｉＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓまたはｓｈＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓを用いて３時間、ｌｉｐｏｓの濃度を増大させて（１×、１０×、１００×）処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにＰａｎｃ−１細胞の処理時間を増大させた場合（２４時間）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した、無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｇ）図１Ｂに示されている通り、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにｅｘｏｓの濃度を増大させた場合（細胞当たり約４００個のｅｘｏｓの代わりに、細胞当たり約７００個のｅｘｏｓ）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｈ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＢｘＰＣ−３細胞における野生型ＫＲＡＳ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＢｘＰＣ３細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｉ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＢＸＰＣ−３細胞の相対数。独立両側スチューデントｔ検定を最終時点で使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｉは、エキソソームを使用した特異的ＫｒａｓＧ１２Ｄ標的化を示す図である。（図４Ａ）ＲＮＡｉのエキソソームへの電気穿孔の略図。示されているＲＮＡｉは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたものである。（図４Ｂ）エキソソームの数およびサイズ分布−ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用。（図４Ｃ〜Ｄ）ＢＪ線維芽細胞から精製されたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（図４Ｃ）および免疫金によるＣＤ９についての染色（図４Ｄ）。（図４Ｅ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームのスクロース勾配のノーザンブロット。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアの蛍光の検出がブロットに示されている。（図４Ｆ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｉＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓまたはｓｈＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓを用いて３時間、ｌｉｐｏｓの濃度を増大させて（１×、１０×、１００×）処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにＰａｎｃ−１細胞の処理時間を増大させた場合（２４時間）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した、無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｇ）図１Ｂに示されている通り、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにｅｘｏｓの濃度を増大させた場合（細胞当たり約４００個のｅｘｏｓの代わりに、細胞当たり約７００個のｅｘｏｓ）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｈ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＢｘＰＣ−３細胞における野生型ＫＲＡＳ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＢｘＰＣ３細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｉ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＢＸＰＣ−３細胞の相対数。独立両側スチューデントｔ検定を最終時点で使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｉは、エキソソームを使用した特異的ＫｒａｓＧ１２Ｄ標的化を示す図である。（図４Ａ）ＲＮＡｉのエキソソームへの電気穿孔の略図。示されているＲＮＡｉは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたものである。（図４Ｂ）エキソソームの数およびサイズ分布−ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用。（図４Ｃ〜Ｄ）ＢＪ線維芽細胞から精製されたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（図４Ｃ）および免疫金によるＣＤ９についての染色（図４Ｄ）。（図４Ｅ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームのスクロース勾配のノーザンブロット。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアの蛍光の検出がブロットに示されている。（図４Ｆ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｉＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓまたはｓｈＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓを用いて３時間、ｌｉｐｏｓの濃度を増大させて（１×、１０×、１００×）処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにＰａｎｃ−１細胞の処理時間を増大させた場合（２４時間）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した、無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｇ）図１Ｂに示されている通り、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにｅｘｏｓの濃度を増大させた場合（細胞当たり約４００個のｅｘｏｓの代わりに、細胞当たり約７００個のｅｘｏｓ）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｈ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＢｘＰＣ−３細胞における野生型ＫＲＡＳ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＢｘＰＣ３細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｉ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＢＸＰＣ−３細胞の相対数。独立両側スチューデントｔ検定を最終時点で使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図４Ｅ】図４Ａ〜Ｉは、エキソソームを使用した特異的ＫｒａｓＧ１２Ｄ標的化を示す図である。（図４Ａ）ＲＮＡｉのエキソソームへの電気穿孔の略図。示されているＲＮＡｉは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたものである。（図４Ｂ）エキソソームの数およびサイズ分布−ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用。（図４Ｃ〜Ｄ）ＢＪ線維芽細胞から精製されたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（図４Ｃ）および免疫金によるＣＤ９についての染色（図４Ｄ）。（図４Ｅ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームのスクロース勾配のノーザンブロット。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアの蛍光の検出がブロットに示されている。（図４Ｆ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｉＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓまたはｓｈＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓを用いて３時間、ｌｉｐｏｓの濃度を増大させて（１×、１０×、１００×）処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにＰａｎｃ−１細胞の処理時間を増大させた場合（２４時間）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した、無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｇ）図１Ｂに示されている通り、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにｅｘｏｓの濃度を増大させた場合（細胞当たり約４００個のｅｘｏｓの代わりに、細胞当たり約７００個のｅｘｏｓ）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｈ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＢｘＰＣ−３細胞における野生型ＫＲＡＳ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＢｘＰＣ３細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｉ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＢＸＰＣ−３細胞の相対数。独立両側スチューデントｔ検定を最終時点で使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図４Ｆ】図４Ａ〜Ｉは、エキソソームを使用した特異的ＫｒａｓＧ１２Ｄ標的化を示す図である。（図４Ａ）ＲＮＡｉのエキソソームへの電気穿孔の略図。示されているＲＮＡｉは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたものである。（図４Ｂ）エキソソームの数およびサイズ分布−ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用。（図４Ｃ〜Ｄ）ＢＪ線維芽細胞から精製されたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（図４Ｃ）および免疫金によるＣＤ９についての染色（図４Ｄ）。（図４Ｅ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームのスクロース勾配のノーザンブロット。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアの蛍光の検出がブロットに示されている。（図４Ｆ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｉＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓまたはｓｈＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓを用いて３時間、ｌｉｐｏｓの濃度を増大させて（１×、１０×、１００×）処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにＰａｎｃ−１細胞の処理時間を増大させた場合（２４時間）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した、無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｇ）図１Ｂに示されている通り、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにｅｘｏｓの濃度を増大させた場合（細胞当たり約４００個のｅｘｏｓの代わりに、細胞当たり約７００個のｅｘｏｓ）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｈ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＢｘＰＣ−３細胞における野生型ＫＲＡＳ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＢｘＰＣ３細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｉ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＢＸＰＣ−３細胞の相対数。独立両側スチューデントｔ検定を最終時点で使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図４Ｇ】図４Ａ〜Ｉは、エキソソームを使用した特異的ＫｒａｓＧ１２Ｄ標的化を示す図である。（図４Ａ）ＲＮＡｉのエキソソームへの電気穿孔の略図。示されているＲＮＡｉは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたものである。（図４Ｂ）エキソソームの数およびサイズ分布−ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用。（図４Ｃ〜Ｄ）ＢＪ線維芽細胞から精製されたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（図４Ｃ）および免疫金によるＣＤ９についての染色（図４Ｄ）。（図４Ｅ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームのスクロース勾配のノーザンブロット。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアの蛍光の検出がブロットに示されている。（図４Ｆ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｉＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓまたはｓｈＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓを用いて３時間、ｌｉｐｏｓの濃度を増大させて（１×、１０×、１００×）処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにＰａｎｃ−１細胞の処理時間を増大させた場合（２４時間）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した、無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｇ）図１Ｂに示されている通り、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにｅｘｏｓの濃度を増大させた場合（細胞当たり約４００個のｅｘｏｓの代わりに、細胞当たり約７００個のｅｘｏｓ）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｈ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＢｘＰＣ−３細胞における野生型ＫＲＡＳ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＢｘＰＣ３細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｉ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＢＸＰＣ−３細胞の相対数。独立両側スチューデントｔ検定を最終時点で使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図４Ｈ】図４Ａ〜Ｉは、エキソソームを使用した特異的ＫｒａｓＧ１２Ｄ標的化を示す図である。（図４Ａ）ＲＮＡｉのエキソソームへの電気穿孔の略図。示されているＲＮＡｉは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたものである。（図４Ｂ）エキソソームの数およびサイズ分布−ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用。（図４Ｃ〜Ｄ）ＢＪ線維芽細胞から精製されたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（図４Ｃ）および免疫金によるＣＤ９についての染色（図４Ｄ）。（図４Ｅ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームのスクロース勾配のノーザンブロット。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアの蛍光の検出がブロットに示されている。（図４Ｆ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｉＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓまたはｓｈＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓを用いて３時間、ｌｉｐｏｓの濃度を増大させて（１×、１０×、１００×）処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにＰａｎｃ−１細胞の処理時間を増大させた場合（２４時間）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した、無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｇ）図１Ｂに示されている通り、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにｅｘｏｓの濃度を増大させた場合（細胞当たり約４００個のｅｘｏｓの代わりに、細胞当たり約７００個のｅｘｏｓ）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｈ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＢｘＰＣ−３細胞における野生型ＫＲＡＳ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＢｘＰＣ３細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｉ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＢＸＰＣ−３細胞の相対数。独立両側スチューデントｔ検定を最終時点で使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図４Ｉ】図４Ａ〜Ｉは、エキソソームを使用した特異的ＫｒａｓＧ１２Ｄ標的化を示す図である。（図４Ａ）ＲＮＡｉのエキソソームへの電気穿孔の略図。示されているＲＮＡｉは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でタグ付けされたものである。（図４Ｂ）エキソソームの数およびサイズ分布−ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用。（図４Ｃ〜Ｄ）ＢＪ線維芽細胞から精製されたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（図４Ｃ）および免疫金によるＣＤ９についての染色（図４Ｄ）。（図４Ｅ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するＢＪ線維芽細胞エキソソームのスクロース勾配のノーザンブロット。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアの蛍光の検出がブロットに示されている。（図４Ｆ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ、ｓｉＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓまたはｓｈＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓを用いて３時間、ｌｉｐｏｓの濃度を増大させて（１×、１０×、１００×）処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにＰａｎｃ−１細胞の処理時間を増大させた場合（２４時間）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。任意に１に設定した、無処理のＰａｎｃ−１細胞の発現（対照）と相対的な比が示されている。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｇ）図１Ｂに示されている通り、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＰａｎｃ−１細胞におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベル、ならびにｅｘｏｓの濃度を増大させた場合（細胞当たり約４００個のｅｘｏｓの代わりに、細胞当たり約７００個のｅｘｏｓ）のＫＲＡＳＧ１２Ｄ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＰａｎｃ−１細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｈ）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて３時間処理したＢｘＰＣ−３細胞における野生型ＫＲＡＳ転写物レベルのリアルタイムＰＣＲ分析。独立両側スチューデントｔ検定を使用して、無処理のＢｘＰＣ３細胞における転写物レベルと比較した統計的有意性を決定した。（図４Ｉ）列挙されている処理に曝露した後の経時的なＢＸＰＣ−３細胞の相対数。独立両側スチューデントｔ検定を最終時点で使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【００３４】
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｄは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するエキソソームにより、Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍成長が抑制されることを示す図である。（図５Ａ）ｉ．ｐ．注射の２４時間後のｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスの血清から単離されたエキソソームのフローサイトメトリー分析。標識されたエキソソームを、０．４μｍのビーズへの結合後に含有されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたＲＮＡｉを使用して検出した。（図５Ｂ）Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７タグを付けたＲＮＡｉを含有するｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓのｉ．ｐ．注射の１２時間後のマウスの血液におけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７＋／ＣＤ１１ｂ＋マクロファージのフローサイトメトリー分析および百分率の定量化。（図５Ｃ）リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）について免疫標識した膵臓腫瘍の顕微鏡写真におけるパーセントｐ−ＡＫＴ染色領域の定量化。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における比較的小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。（図５Ｄ）示されている実験群、ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３における、ＢｘＰＣ−３同所性腫瘍を有するマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（この解析にはログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用した）。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。特に断りのない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｄは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するエキソソームにより、Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍成長が抑制されることを示す図である。（図５Ａ）ｉ．ｐ．注射の２４時間後のｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスの血清から単離されたエキソソームのフローサイトメトリー分析。標識されたエキソソームを、０．４μｍのビーズへの結合後に含有されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたＲＮＡｉを使用して検出した。（図５Ｂ）Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７タグを付けたＲＮＡｉを含有するｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓのｉ．ｐ．注射の１２時間後のマウスの血液におけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７＋／ＣＤ１１ｂ＋マクロファージのフローサイトメトリー分析および百分率の定量化。（図５Ｃ）リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）について免疫標識した膵臓腫瘍の顕微鏡写真におけるパーセントｐ−ＡＫＴ染色領域の定量化。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における比較的小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。（図５Ｄ）示されている実験群、ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３における、ＢｘＰＣ−３同所性腫瘍を有するマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（この解析にはログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用した）。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。特に断りのない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｄは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するエキソソームにより、Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍成長が抑制されることを示す図である。（図５Ａ）ｉ．ｐ．注射の２４時間後のｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスの血清から単離されたエキソソームのフローサイトメトリー分析。標識されたエキソソームを、０．４μｍのビーズへの結合後に含有されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたＲＮＡｉを使用して検出した。（図５Ｂ）Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７タグを付けたＲＮＡｉを含有するｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓのｉ．ｐ．注射の１２時間後のマウスの血液におけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７＋／ＣＤ１１ｂ＋マクロファージのフローサイトメトリー分析および百分率の定量化。（図５Ｃ）リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）について免疫標識した膵臓腫瘍の顕微鏡写真におけるパーセントｐ−ＡＫＴ染色領域の定量化。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における比較的小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。（図５Ｄ）示されている実験群、ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３における、ＢｘＰＣ−３同所性腫瘍を有するマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（この解析にはログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用した）。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。特に断りのない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｄは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉを含有するエキソソームにより、Ｐａｎｃ−１同所性腫瘍成長が抑制されることを示す図である。（図５Ａ）ｉ．ｐ．注射の２４時間後のｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスの血清から単離されたエキソソームのフローサイトメトリー分析。標識されたエキソソームを、０．４μｍのビーズへの結合後に含有されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたＲＮＡｉを使用して検出した。（図５Ｂ）Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７タグを付けたＲＮＡｉを含有するｅｘｏｓまたはｌｉｐｏｓのｉ．ｐ．注射の１２時間後のマウスの血液におけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７＋／ＣＤ１１ｂ＋マクロファージのフローサイトメトリー分析および百分率の定量化。（図５Ｃ）リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）について免疫標識した膵臓腫瘍の顕微鏡写真におけるパーセントｐ−ＡＫＴ染色領域の定量化。ｎ＝６。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した群における比較的小さな腫瘍領域に対して定量化を実施したことに留意されたい。（図５Ｄ）示されている実験群、ＰＢＳ：ｎ＝３、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝３における、ＢｘＰＣ−３同所性腫瘍を有するマウスの生存に関するカプランマイヤー曲線の比較（この解析にはログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用した）。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。特に断りのない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。
【００３５】
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｂは、Ｐａｎｃ−１腫瘍の進行を示すグラフである。（図６Ａ）７７日目に測定された生物発光の放射輝度の比較分析。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。７７日目の独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。（図６Ｂ）個々の腫瘍を示すスパイダープロット。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｂは、Ｐａｎｃ−１腫瘍の進行を示すグラフである。（図６Ａ）７７日目に測定された生物発光の放射輝度の比較分析。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。７７日目の独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意でない。（図６Ｂ）個々の腫瘍を示すスパイダープロット。ＰＢＳ：ｎ＝７、対照ｅｘｏｓ：ｎ＝６、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：ｎ＝７。
【００３６】
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｄは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉ  ｅｘｏｓで処置したＰＫＴマウスの組織学的分析を示すグラフである。（図７Ａ）実験エンドポイント（対照ｅｘｏｓ：生存期間中央値４３日、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：生存期間中央値６０日）における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝５。（図７Ｂ〜Ｃ）示されている実験エンドポイントでの、（図７Ｂ）ＢＪ線維芽細胞に由来するｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓおよび（図７Ｃ）ＰＫＴ線維芽細胞に由来するｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたは電気穿孔されていないｅｘｏｓ（対照ｅｘｏｓ）を用いて処理したＰＫＴマウスのＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真における組織学的表現型の相対百分率の定量化。ｎ＝５。二元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図７Ｄ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴマウスに由来する、リン酸化ＡＫＴについて免疫標識された腫瘍の顕微鏡写真の定量化。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｄは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉ  ｅｘｏｓで処置したＰＫＴマウスの組織学的分析を示すグラフである。（図７Ａ）実験エンドポイント（対照ｅｘｏｓ：生存期間中央値４３日、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：生存期間中央値６０日）における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝５。（図７Ｂ〜Ｃ）示されている実験エンドポイントでの、（図７Ｂ）ＢＪ線維芽細胞に由来するｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓおよび（図７Ｃ）ＰＫＴ線維芽細胞に由来するｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたは電気穿孔されていないｅｘｏｓ（対照ｅｘｏｓ）を用いて処理したＰＫＴマウスのＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真における組織学的表現型の相対百分率の定量化。ｎ＝５。二元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図７Ｄ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴマウスに由来する、リン酸化ＡＫＴについて免疫標識された腫瘍の顕微鏡写真の定量化。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｄは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉ  ｅｘｏｓで処置したＰＫＴマウスの組織学的分析を示すグラフである。（図７Ａ）実験エンドポイント（対照ｅｘｏｓ：生存期間中央値４３日、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：生存期間中央値６０日）における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝５。（図７Ｂ〜Ｃ）示されている実験エンドポイントでの、（図７Ｂ）ＢＪ線維芽細胞に由来するｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓおよび（図７Ｃ）ＰＫＴ線維芽細胞に由来するｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたは電気穿孔されていないｅｘｏｓ（対照ｅｘｏｓ）を用いて処理したＰＫＴマウスのＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真における組織学的表現型の相対百分率の定量化。ｎ＝５。二元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図７Ｄ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴマウスに由来する、リン酸化ＡＫＴについて免疫標識された腫瘍の顕微鏡写真の定量化。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ｄ】図７Ａ〜Ｄは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ＲＮＡｉ  ｅｘｏｓで処置したＰＫＴマウスの組織学的分析を示すグラフである。（図７Ａ）実験エンドポイント（対照ｅｘｏｓ：生存期間中央値４３日、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ：生存期間中央値６０日）における腫瘍量（体重に対する膵臓の相対質量）。各群ｎ＝５。（図７Ｂ〜Ｃ）示されている実験エンドポイントでの、（図７Ｂ）ＢＪ線維芽細胞に由来するｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓおよび（図７Ｃ）ＰＫＴ線維芽細胞に由来するｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたは電気穿孔されていないｅｘｏｓ（対照ｅｘｏｓ）を用いて処理したＰＫＴマウスのＨ＆Ｅ染色された腫瘍の顕微鏡写真における組織学的表現型の相対百分率の定量化。ｎ＝５。二元配置ＡＮＯＶＡを統計比較のために使用した。（図７Ｄ）示されている実験群における、４４日齢ＰＫＴマウスに由来する、リン酸化ＡＫＴについて免疫標識された腫瘍の顕微鏡写真の定量化。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。別段の指定のない限り、独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００３７】
【図８】図８Ａ〜Ｂは、循環単球が、ｉＬｉｐｏｓｏｍｅｓ（すなわち、阻害性ＲＮＡなどの薬物物質を含むリポソーム）をｉＥｘｏｓｏｍｅｓ（すなわち、阻害性ＲＮＡなどの薬物物質を含むエキソソーム）よりも効率的に貪食することを示すグラフである。（図８Ａ）上のプロットは、総生細胞集団からのＣＤ１１ｂ陽性細胞の％を示す。下のプロットは、総生細胞集団からのＡ６４７およびＣＤ１１ｂ二重陽性細胞の％を示す。（図８Ｂ）図８Ａに提示されているＦＡＣＳプロットの定量化。
【００３８】
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｃは、ＣＤ４７がエキソソームでは検出されるがエキソソームでは検出されないことを示す図である。（図９Ａ）ＢＪ線維芽細胞から単離されたエキソソーム。上のプロットは、二次抗体のみを用いた染色を示し、下のプロットは、ＣＤ６３またはＣＤ４７のいずれかについての染色を示す。（図９Ｂ）二次抗体のみを用いてまたはＣＤ６３またはＣＤ４７に対する抗体を用いて染色されたリポソーム（１００ｎｍ）。（図９Ｃ）２つの異なる方法によって３つの異なる細胞株から単離されたエキソソームによるＣＤ４７の発現。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｃは、ＣＤ４７がエキソソームでは検出されるがエキソソームでは検出されないことを示す図である。（図９Ａ）ＢＪ線維芽細胞から単離されたエキソソーム。上のプロットは、二次抗体のみを用いた染色を示し、下のプロットは、ＣＤ６３またはＣＤ４７のいずれかについての染色を示す。（図９Ｂ）二次抗体のみを用いてまたはＣＤ６３またはＣＤ４７に対する抗体を用いて染色されたリポソーム（１００ｎｍ）。（図９Ｃ）２つの異なる方法によって３つの異なる細胞株から単離されたエキソソームによるＣＤ４７の発現。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｃは、ＣＤ４７がエキソソームでは検出されるがエキソソームでは検出されないことを示す図である。（図９Ａ）ＢＪ線維芽細胞から単離されたエキソソーム。上のプロットは、二次抗体のみを用いた染色を示し、下のプロットは、ＣＤ６３またはＣＤ４７のいずれかについての染色を示す。（図９Ｂ）二次抗体のみを用いてまたはＣＤ６３またはＣＤ４７に対する抗体を用いて染色されたリポソーム（１００ｎｍ）。（図９Ｃ）２つの異なる方法によって３つの異なる細胞株から単離されたエキソソームによるＣＤ４７の発現。
【００３９】
【図１０】図１０は、抗ＣＤ４７抗体により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける循環単球によるエキソソーム取り込みが刺激されることを示すグラフである。抗ＣＤ４７抗体を用いてエキソソームを処理し、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける循環単球によるエキソソームの取り込みが可能になった。
【００４０】
【図１１】図１１は、膵臓癌細胞の亜集団およびそれらのそれぞれのエキソソーム中に存在するタンパク質を示すベン図である。タンパク質を膵臓癌細胞株Ｔ３Ｍ４の亜集団およびそれらのそれぞれのエキソソームから抽出した。質量分析を使用して、細胞およびそれぞれのエキソソームにおいて発現されたタンパク質を識別した。各試料についてタンパク質のリストを識別した。細胞とそれぞれのエキソソームの比較により、細胞には存在するがエキソソームには存在しないタンパク質（各円の対の左側）、細胞およびそれぞれのエキソソームに存在するタンパク質（円間の交差）および細胞と比較してエキソソームにおいて濃縮されているタンパク質（各円の対の右側）を識別した。細胞は、エキソソームでは出現しないタンパク質を発現する。また、エキソソームは、起源とする細胞と比較して濃縮されたタンパク質を含有する。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
（例示の実施形態の説明）
現行の標準治療にもかかわらず、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の生存期間中央値は転移性の患者について６カ月であり、５年後に生存するのはたった６．７％である（Siegelら、２０１４年；Howladerら、２０１３年）。したがって、ＰＤＡＣには、有効な新しい療法が緊急に必要とされている。ＰＤＡＣの遺伝子解析から、低分子ＧＴＰアーゼのＲＡＳファミリーにおける変異（ＫｒａｓＧ１２／Ｄ／Ｒ／Ｖ）が患者の７０％〜９６％に生じ（Biankinら、２０１２年；Hrubanら、１９９３年；Almogueraら、１９８８年；Changら、２０１４年）、腫瘍成長および転移の重要な駆動体である（Yingら、２０１２年；Hingoraniら、２００５年；Collinsら、２０１２年a；Collinsら、２０１２年b；Eserら、２０１４年）ことが示されている。マウスにおける遺伝子操作により、発癌性ＫＲＡＳを弱めることにより、腫瘍の進行が逆転することが示されている（Yingら、２０１２年；Collinsら、２０１２年a；Collinsら、２０１２年b；Smakmanら、２００５年）。発癌性ＫＲＡＳシグナル伝達およびＲＡＳ活性の増大は、膵臓新生物（ｐａｎｃｒｅａｓ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）の開始駆動体として現れた（Collinsら、２０１２年a；Eserら、２０１４年；Jiら、２００９年）；しかし、ＲＡＳは処理しにくい標的であり、療法課題のままである（Gysinら、２０１１年）。本発明では、正常な線維芽細胞に由来するエキソソームを、標的発癌性ＫＲＡＳＧ１２Ｄに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ペイロードを有するように操作する。ＫｒａｓＧ１２Ｄに対する、ＴＴにリンクしたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有するエキソソームは、癌細胞に効率的に侵入し、発癌性Ｒａｓを特異的に抑制し、ＥＲＫ活性化を低下させ、増殖を阻害し、癌細胞アポトーシスを誘導した。ＫｒａｓＧ１２Ｄ標的化カーゴを伴うエキソソームの全身送達により、ｓｉ／ｓｈＲＮＡを含有するリポソームおよびスクランブルされたＲＮＡｉ構築物を有するエキソソームと比較して、ロバストな膵臓局在化、ならびに、以前に確立された同所性ヒト膵臓腫瘍ならびに膵臓癌の遺伝子操作されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）における腫瘍抑制が、生存の改善と共に示される。ｓｉ／ｓｈＲＮＡを含有するエキソソームを用いて処置したマウスの腫瘍では、下流のＲＡＳシグナルメディエーターの有意な低減および通常の膵臓組織学的検査を用いた病理組織学的所見の改善が示された。ヒト線維芽細胞に由来するエキソソームにより、ＰＤＡＣ  ＧＥＭＭにおけるマウス線維芽細胞に由来するエキソソームと同様の有効性が示され、したがって、潜在的な毒性の副作用を最小化しながら効率的なＲＮＡｉ送達を可能するために、患者特異的エキソソームの必要はない可能性があることが示唆される。そのような戦略により、オフターゲットの効果を最低限にしながら発癌性遺伝子発現および下流のシグナル伝達を抑制するための新規かつ効率的な手段がもたらされる。
【００４２】
ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質）は、大多数の組織および細胞に発現する膜貫通タンパク質である。ＣＤ４７は、マクロファージおよび樹状細胞などの食細胞に発現するシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰ−α）のリ癌ドである。活性化されたＣＤ４７−ＳＩＲＰ−αにより、食作用を阻害するシグナル伝達カスケードが開始される。エキソソーム注射の前にＣＤ４７に対するモノクローナル抗体をマウスに注射すること、または注射前にＣＤ４７中和抗体を有するエキソソームを用いて処置することは、いずれも、ＣＤ４７をブロックし、マクロファージまたは単球によるエキソソームの貪食が可能になる。したがって、エキソソームの表面上のＣＤ４７の発現により、マクロファージによる食作用が妨げられる。
【００４３】
Ｉ．脂質に基づくナノ粒子
一部の実施形態では、脂質に基づくナノ粒子は、リポソーム、エキソソーム、脂質調製物、または、脂質に基づく小胞（例えば、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞）などの別の脂質に基づくナノ粒子である。脂質に基づくナノ粒子は、正に荷電したものであっても、負に荷電したものであっても中性のものであってもよい。
【００４４】
Ａ．リポソーム
「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される種々の単層脂質ビヒクルおよび多重層脂質ビヒクルを包含する一般的な用語である。リポソームは、一般にリン脂質を含む二分子膜と、一般に水性組成物を含む内部の媒体とを有する小胞構造を有すると特徴付けることができる。本明細書で提示されるリポソームは、単層リポソーム、多重層リポソーム、および多胞体リポソームを含む。本明細書で提示されるリポソームは、正に荷電したもの、負に荷電したもの、または中性に荷電したものであり得る。ある特定の実施形態では、リポソームの電荷は中性である。
【００４５】
多重層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。そのようなリポソームは、リン脂質を含む脂質を過剰の水溶液に懸濁すると自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造が形成される前に自己再構成し、脂質二重層の間に水および溶解した溶質をトラップする。親油性分子または親油性領域を有する分子も脂質二重層内に溶解されるまたはそれと会合する。
【００４６】
特定の態様では、ポリペプチド、核酸、または小分子薬物は、例えば、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在され、リポソームおよびポリペプチド／核酸と会合する分子と連結されることによってリポソームに付着され、リポソーム内にトラップされ、リポソームと複合体を形成され得る。
【００４７】
本実施形態に従って使用されるリポソームは、当業者に公知の通り、種々の方法によって作出することができる。例えば、リン脂質、例えば、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）などをｔｅｒｔ−ブタノール中に溶解させる。次いで、脂質（単数または複数）をポリペプチド、核酸、および／または他の成分（単数または複数）と混合する。Ｔｗｅｅｎ２０を脂質混合物にＴｗｅｅｎ２０が組成物の重量の約５％になるように添加する。過剰量のｔｅｒｔ−ブタノールをこの混合物にｔｅｒｔ−ブタノールの体積が少なくとも９５％になるように添加する。混合物をボルテックスし、ドライアイス／アセトンバス中で凍結させ、終夜凍結乾燥させた。凍結乾燥した調製物を−２０℃で保管し、最大３カ月間使用することができる。必要であれば、凍結乾燥したリポソームを０．９％生理食塩水中に再構成する。
【００４８】
あるいは、リポソームは、容器、例えば、ガラス洋ナシ形フラスコ中、溶媒と脂質を混合することによって調製することができる。容器の体積は予測されるリポソームの懸濁液の体積の１０倍であるべきである。ロータリーエバポレーターを使用して、およそ４０℃、陰圧下で溶媒を除去する。通常、所望のリポソームの体積に応じて、約５分〜２時間以内に溶媒を除去する。組成物をさらにデシケーター減圧下で乾燥することができる。一般に、乾燥脂質は、時間と共に変質する傾向があるので、約１週間後に廃棄する。
【００４９】
乾燥脂質は、全ての脂質フィルムが再懸濁するまで振盪することにより、滅菌パイロジェンフリー水中およそ２５〜５０ｍＭのリン脂質まで水和することができる。次いで、水性リポソームをアリコートに分離し、それぞれをバイアルに入れ、凍結乾燥し、減圧下で密閉することができる。
【００５０】
上記の通り調製された、乾燥脂質または凍結乾燥リポソームは、脱水し、タンパク質またはペプチドの溶液中に再構成し、適切な溶媒、例えば、ＤＰＢＳを用いて適切な濃度に希釈することができる。次いで、混合物をボルテックスミキサーで勢いよく振盪する。これだけに限定されないが、ホルモン、薬物、核酸構築物などを含めた薬剤の封入されていない追加的な材料を２９，０００×ｇで遠心分離することによって除去し、リポソームペレットを洗浄した。洗浄したリポソームを適切な総リン脂質濃度、例えば、約５０〜２００ｍＭで再懸濁させる。封入される追加的な材料または活性薬剤の量は、標準の方法に従って決定することができる。リポソーム調製物中に封入される追加的な材料または活性薬剤の量を決定した後、リポソームを適切な濃度に希釈し、使用するまで４℃で保管することができる。リポソームを含む医薬組成物は、通常、滅菌された、水または生理食塩水溶液などの薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【００５１】
本実施形態で有用であり得る追加的なリポソームとしては、例えば、その全てが、ディスクレーマーを伴わずにそれらの全体がこれによって参照により組み込まれるＷＯ０２／１００４３５Ａ１、米国特許第５，９６２，０１６号、米国特許出願第２００４／０２０８９２１号、ＷＯ０３／０１５７５７Ａ１、ＷＯ０４０２９２１３Ａ２、米国特許第５，０３０，４５３号、および米国特許第６，６８０，０６８号に記載されている、カチオン性リポソームが挙げられる。
【００５２】
そのようなリポソームの調製において、本明細書に記載されているまたは当業者に公知の任意のプロトコールを使用することができる。リポソームの調製の非限定的なさらなる例は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７２８，５７８号、同第４，７２８，５７５号、同第４，７３７，３２３号、同第４，５３３，２５４号、同第４，１６２，２８２号、同第４，３１０，５０５号、および同第４，９２１，７０６号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１およびＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０に記載されている。
【００５３】
ある特定の実施形態では、脂質に基づくナノ粒子は、中性リポソーム（例えば、ＤＯＰＣリポソーム）である。「中性リポソーム」または「非荷電リポソーム」とは、本明細書で使用される場合、本質的に中性の、正味の電荷を生じる（実質的に非荷電）１つまたは複数の脂質成分を有するリポソームと定義される。「本質的に中性」または「本質的に非荷電」とは、もしあれば、所与の集団（例えば、リポソームの集団）内の少数の脂質成分が、別の成分の逆の電荷によって取り消されない電荷を含む（すなわち、成分の１０％未満、より好ましくは５％未満、および最も好ましくは１％未満が、取り消されない電荷を含む）ことを意味する。ある特定の実施形態では、中性リポソームは、生理的条件下で（すなわち、約ｐＨ７で）それ自体が中性である主に脂質および／またはリン脂質を含み得る。
【００５４】
本実施形態のリポソームおよび／または脂質に基づくナノ粒子は、リン脂質を含み得る。ある特定の実施形態では、単一の種類のリン脂質をリポソームの創出に使用することができる（例えば、ＤＯＰＣなどの中性リン脂質を中性リポソームの生成に使用することができる）。他の実施形態では、１つ超の種類のリン脂質をリポソームの創出に使用することができる。リン脂質は、天然供給源に由来するものであっても合成供給源に由来するものであってもよい。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンは、生理的条件下で（すなわち、約ｐＨ７で）非荷電であるので、これらの化合物は、中性リポソームを生成するために特に有用であり得る。ある特定の実施形態では、リン脂質ＤＯＰＣを使用して非荷電リポソームを作製する。ある特定の実施形態では、リン脂質ではない脂質（例えば、コレステロール）を使用することができる。
【００５５】
リン脂質は、グリセロリン脂質およびある特定のスフィンゴ脂質を含む。リン脂質としては、これだけに限定されないが、ジオレオイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」）、卵ホスファチジルコリン（「ＥＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルコリン（dilauryloylphosphatidylcholine）（「ＤＬＰＣ」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＭＰＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（「ＰＭＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（「ＰＳＰＣ」）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＳＰＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（dilauryloylphosphatidylglycerol）（「ＤＬＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（「ＤＳＳＰ」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジン酸（「ＤＭＰＡ」）、ジパルミトイルホスファチジン酸（「ＤＰＰＡ」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、ジミリストイルホスファチジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、脳ホスファチジルセリン（「ＢＰＳ」）、脳スフィンゴミエリン（「ＢＳＰ」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「ＤＰＳＰ」）、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＡＰＣ」）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＢＰＣ」）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＥＰＣ」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、パルミトイルオレオイル（palmitoyloeoyl）ホスファチジルコリン（「ＰＯＰＣ」）、パルミトイルオエオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＰＯＰＥ」）、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【００５６】
Ｂ．エキソソーム
「微小胞」および「エキソソーム」という用語は、本明細書で使用される場合、直径（または粒子が球状でない場合には最大寸法）が約１０ｎｍから約５０００ｎｍの間、より一般には３０ｎｍから１０００ｎｍの間、最も典型的には約５０ｎｍから７５０ｎｍの間の膜様粒子を指し、エキソソームの膜の少なくとも一部は、細胞から直接得られる。最も一般的には、エキソソームのサイズ（平均直径）は、ドナー細胞のサイズの最大５％である。したがって、特に意図されているエキソソームとして、細胞から発せられるものが挙げられる。
【００５７】
エキソソームは、例えば体液などの任意の適切な試料型から検出または単離することができる。本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、その天然の環境からの分離を指し、少なくとも部分的な精製を包含するものとし、また、実質的な精製を含み得る。本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、本発明によって提供される方法に適した任意の試料を指す。試料は、検出または単離に適したエキソソームを含む任意の試料であってよい。試料の供給源としては、血液、骨髄、胸膜液、腹腔液（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ）、母乳、汗、涙、滑液（ｊｏｉｎｔ  ｆｌｕｉｄ）、および気管支洗浄液が挙げられる。一態様では、試料は、例えば、全血または任意のその画分または成分を含めた血液試料である。本発明と共に使用するのに適した血液試料は、例えば、静脈、動脈、末梢、組織、臍帯などの血液細胞またはその成分を含む公知の任意の供給源から抽出することができる。例えば、試料は、周知の常套的な臨床的方法（例えば、全血を抜き取り処理するための手順）を使用して入手し、処理することができる。一態様では、例示的な試料は、がんを有する被験体から抜き取られた末梢血であり得る。
【００５８】
エキソソームは、外科的試料、生検試料、組織、糞便、および培養細胞などの組織試料から単離することもできる。エキソソームを組織供給源から単離する場合には、単一細胞懸濁物を得るために組織を均質化し、その後に細胞を溶解してエキソソームを放出させることが必要な場合がある。エキソソームを組織試料から単離する場合には、エキソソームの破壊をもたらさない均質化および溶解手順を選択することが重要である。本明細書において意図されているエキソソームは、生理的に許容される溶液、例えば、緩衝生理食塩水、増殖培地、種々の水性培地などの中の体液から単離することが好ましい。
【００５９】
エキソソームは、新しく採取した試料から単離することもでき、冷凍または冷蔵で保管されている試料から単離することもできる。一部の実施形態では、エキソソームは、細胞培養培地から単離することができる。必要ではないが、体液試料を清澄化した後に体積排除ポリマーを用いて沈殿させて試料に由来するあらゆる残屑を除去すると、より純度の高いエキソソームを得ることができる。清澄化の方法としては、遠心分離、超遠心分離、濾過、または限外濾過が挙げられる。最も典型的に、エキソソームは、当技術分野で周知の多数の方法によって単離することができる。１つの好ましい方法は、体液または細胞培養上清からの分画遠心分離である。エキソソームを単離するための例示的な方法は、（Ｌｏｓｃｈｅら、２００４年；ＭｅｓｒｉおよびＡｌｔｉｅｒｉ、１９９８年；Ｍｏｒｅｌら、２００４年）に記載されている。あるいは、エキソソームは、（Ｃｏｍｂｅｓら、１９９７年）に記載の通りフローサイトメトリーによって単離することもできる。
【００６０】
エキソソームを単離するための許容されるプロトコールの１つとして、比較的低密度のエキソソームを浮遊させるための、スクロース密度勾配またはスクロースクッション（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｃｕｓｈｉｏｎ）と組み合わせることも多い超遠心分離が挙げられる。逐次的な分画遠心分離によるエキソソームの単離は、他の微小胞または高分子複合体とサイズ分布が重複している可能性によって複雑になる。さらに遠心分離は、それらのサイズに基づいて小胞を分離するための手段としては不十分となる可能性がある。しかし、逐次的な遠心分離は、スクロース勾配超遠心分離と組み合わせれば、エキソソームの高濃縮を達成することができる。
【００６１】
別の選択肢は、超遠心分離経路に対する代替法を使用したサイズに基づくエキソソームの単離である。超遠心分離よりも時間がかからず、また、特別な設備を使用する必要がない限外濾過手順を使用したエキソソーム精製の成功が報告されている。同様に、流体を駆動する陽圧を使用して１つのマイクロフィルターでの細胞、血小板、および細胞の残屑の除去、ならびに第２のマイクロフィルターへの３０ｎｍよりも大きな小胞の捕捉を可能にする市販のキットが利用可能である（ＥＸＯＭＩＲ（商標）、Ｂｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。しかし、このプロセスに関しては、エキソソームは回収せず、それらのＲＮＡ内容物を第２のマイクロフィルターに捕捉した材料から直接抽出し、次いでそのＲＮＡ内容物をＰＣＲ分析に使用することができる。ＨＰＬＣに基づくプロトコールにより、高度に純粋なエキソソームを得ることを潜在的に可能にすることができるが、これらのプロセスは専用の設備を必要とし、スケールアップが難しい。重大な問題は、血液と細胞培養培地がどちらも多数のナノ粒子（一部は非小胞）を同じサイズ範囲内にエキソソームとして含有することである。例えば、一部のｍｉＲＮＡは、エキソソームではなく細胞外タンパク質複合体内に含有され得るが、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を用いた処理を行ってあらゆる可能性のある「エキソソーム外」タンパク質による汚染を排除することができる。
【００６２】
別の実施形態では、がん細胞由来エキソソームは、免疫特異性相互作用（例えば、免疫磁気捕捉）を伴うものなどの、試料をエキソソームについて濃縮するために一般に使用される技法によって捕捉することができる。免疫磁気捕捉は、免疫磁気細胞分離としても公知であり、一般には、特定の細胞型に見いだされるタンパク質に指向される抗体を小さな常磁性ビーズに付着させることを伴う。抗体をコーティングしたビーズを血液などの試料と混合すると、それらのビーズは特定の細胞に付着し、それを取り囲む。次いで、試料を強力な磁場に置き、それにより、ビーズを一方の側面にペレット化させる。血液を除去した後、捕捉された細胞はビーズと共に保持される。この一般的な方法の多くの変形が当技術分野で周知であり、エキソソームを単離するための使用に適する。一実施例では、エキソソームを磁気ビーズ（例えば、アルデヒド／硫酸塩ビーズ）に付着させ、次いで、抗体を混合物に添加して、ビーズに付着したエキソソームの表面上のエピトープを認識させることができる。癌細胞由来エキソソームにおいて見いだされることが公知である例示的なタンパク質としては、ＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＡメンバー６（ＡＢＣＡ６）、テトラスパニン−４（ＴＳＰＡＮ４）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質４（ＳＬＩＴＲＫ４）、推定プロトカドヘリンベータ−１８（ＰＣＤＨＢ１８）、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３（ＣＤ３３）、およびグリピカン−１（ＧＰＣ１）が挙げられる。例えば、これらのタンパク質のうちの１つまたは複数に対する抗体またはアプタマーを使用して、癌細胞由来エキソソームを単離することができる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、分析とは、エキソソームの直接または間接的な可視化を可能にする任意の方法を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものであってもｅｘ  ｖｉｖｏにおけるものであってもよい。例えば、分析としては、これだけに限定されないが、固体基質に結合したエキソソームのｅｘ  ｖｉｖｏにおける顕微鏡または血球計算による検出および可視化、フローサイトメトリー、蛍光イメージングなどを挙げることができる。例示的な態様では、癌細胞由来エキソソームを、ＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＡメンバー６（ＡＢＣＡ６）、テトラスパニン−４（ＴＳＰＡＮ４）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質４（ＳＬＩＴＲＫ４）、推定プロトカドヘリンベータ−１８（ＰＣＤＨＢ１８）、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３（ＣＤ３３）、グリピカン−１（ＧＰＣ１）、ヒストンＨ２Ａ  ２型−Ａ（ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＡ）、ヒストンＨ２Ａ  １型−Ａ（ＨＩＳＴ１Ｈ１ＡＡ）、ヒストンＨ３．３（Ｈ３Ｆ３Ａ）、ヒストンＨ３．１（ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ）、ジンクフィンガータンパク質３７ホモログ（ＺＦＰ３７）、ラミニンサブユニットベータ−１（ＬＡＭＢ１）、尿細管間質性腎炎抗原様（ＴＩＮＡＧＬ１）、ペルオキシレドキシン−４（ＰＲＤＸ４）、コラーゲンアルファ−２（ＩＶ）鎖（ＣＯＬ４Ａ２）、推定タンパク質Ｃ３Ｐ１（Ｃ３Ｐ１）、ヘミセンチン−１（ＨＭＣＮ１）、推定ローフィリン（ｒｈｏｐｈｉｌｉｎ）−２様タンパク質（ＲＨＰＮ２Ｐ１）、アンキリンリピートドメイン含有タンパク質６２（ＡＮＫＲＤ６２）、三分子モチーフ（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｍｏｔｉｆ）を含有するタンパク質４２（ＴＲＩＭ４２）、ジャンクションプラコグロビン（ＪＵＰ）、チューブリンベータ２Ｂ鎖（ＴＵＢＢ２Ｂ）、エンドリボヌクレアーゼダイサー（ＤＩＣＥＲ１）、Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼＴＲＩＭ７１（ＴＲＩＭ７１）、カタニンｐ６０  ＡＴＰアーゼ含有サブユニットＡ様２（ＫＡＴＮＡＬ２）、タンパク質Ｓ１００−Ａ６（Ｓ１００Ａ６）、５’−ヌクレオチダーゼドメイン含有タンパク質３（ＮＴ５ＤＣ３）、バリン−ｔＲＮＡリガーゼ（ＶＡＲＳ）、カズリン（ＫＡＺＮ）、ＥＬＡＶ様タンパク質４（ＥＬＡＶＬ４）、リングフィンガータンパク質１６６（ＲＮＦ１６６）、ＦＥＲＭおよびＰＤＺドメイン含有タンパク質１（ＦＲＭＰＤ１）、７８ｋＤａグルコース調節タンパク質（ＨＳＰＡ５）、輸送タンパク質粒子複合体サブユニット６Ａ（ＴＲＡＰＰＣ６Ａ）、スクアレンモノオキシゲナーゼ（ＳＱＬＥ）、腫瘍感受性遺伝子１０１タンパク質（ＴＳＧ１０１）、液胞タンパク質選別２８ホモログ（ＶＰＳ２８）、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）、イソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア（ＡＣＡＤ８）、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット６Ｂ（ＰＳＭＣ４）、伸長因子１−癌マ（ＥＥＦ１Ｇ）、タイチン（ＴＴＮ）、チロシン−プロテインホスファターゼ１３型（ＰＴＰＮ１３）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、またはカルボキシペプチダーゼＥ（ＣＰＥ）のうちの１つまたは複数を対象とする抗体を使用して検出し、その後、固体基質に結合させ、かつ／または顕微鏡または血球計���による検出を使用して可視化する。
【００６４】
細胞において発現される全てのタンパク質がその細胞から分泌されるエキソソーム中に見いだされるとは限らないことに留意するべきである（図１１を参照されたい）。例えば、カルネキシン、ＧＭ１３０、およびＬＡＭＰ−２は全てＭＣＦ−７細胞において発現されるタンパク質であるが、ＭＣＦ−７細胞から分泌されるエキソソーム中には見いだされない（Baiettiら、２０１２年）。別の例として、１つの試験により、膵管腺癌患者１９０名中１９０名が健康な対照よりも高いレベルのＧＰＣ１＋エキソソームを有した（Meloら、２０１５年、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。特に、ＧＰＣ１＋エキソソームを有した健康な対照は平均でたった２．３％であった。
【００６５】
１．細胞培養物からエキソソームを採取するための例示的なプロトコール
１日目に、十分な細胞（例えば、約５百万個の細胞）を、Ｔ２２５フラスコ中、１０％ＦＢＳを含有する培地に、次の日に細胞が約７０％集密になるように播種する。２日目に、細胞上の培地を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、基本培地（すなわち、ＰｅｎＳｔｒｅｐまたはＦＢＳを含まない）２５〜３０ｍＬを細胞に添加する。細胞を２４〜４８時間インキュベートする。４８時間インキュベートすることが好ましいが、一部の細胞株は、無血清培地に対してより感受性が高く、したがって、インキュベーション時間を２４時間に減少させるべきである。ＦＢＳは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔの結果を重度に歪めるエキソソームを含有することに留意されたい。
【００６６】
３／４日目に、培地を採取し、室温、８００×ｇで５分遠心分離して、死細胞および大きな残屑をペレット化する。上清を新しい円錐管に移し、再度培地を２０００×ｇで１０分遠心分離して他の大きな残屑および大きな小胞を除去する。培地を０．２μｍのフィルターに通し、次いで、超遠心分離チューブ（例えば、２５×８９ｍｍ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ）に、チューブ当たり３５ｍＬを使用してアリコートにする。チューブ当たりの培地の体積が３５ｍＬ未満である場合には、チューブの残りをＰＢＳで満たして３５ｍＬに達するようにする。培地を、ＳＷ  ３２  Ｔｉローター（ｋファクター２６６．７、最大ＲＣＦ１３３，９０７）を使用して４℃、２８，０００ｒｐｍで２〜４時間にわたって超遠心分離する。残りの液体がおよそ１インチになるまで上清を慎重に吸引する。チューブを傾け、残りの培地をアスピレーターピペットにゆっくりと進入させる。所望であれば、エキソソームペレットをＰＢＳに再懸濁させ、２８，０００ｒｐｍでの超遠心分離を１〜２時間にわたって繰り返して、エキソソームの集団をさらに精製する。
【００６７】
最後に、エキソソームペレットを２１０μＬのＰＢＳに再懸濁させる。各試料について複数の超遠心分離チューブが存在する場合、同じ２１０μＬのＰＢＳを使用して各エキソソームペレットを段階的に再懸濁させる。各試料について１０μＬを取り、９９０μＬのＨ２Ｏに添加して、ナノ粒子追跡分析に使用する。残りのエキソソーム含有懸濁液２００μＬは下流のプロセスに使用するか、またはすぐに−８０℃で保管する。
【００６８】
２．血清試料からエキソソームを抽出するための例示的なプロトコール
まず、血清試料を氷上で解凍する。次いで、無細胞血清試料２５０μＬを１１ｍＬのＰＢＳ中に希釈し、０．２μｍのポアフィルターを通して濾過する。希釈試料を４℃、１５０，０００×ｇで終夜、超遠心分離する。次の日に、上清を慎重に廃棄し、エキソソームペレットを１１ｍＬのＰＢＳで洗浄する。第２ラウンドの超遠心分離を４℃、１５０，０００×ｇで２時間にわたって実施する。最後に、上清を慎重に廃棄し、エキソソームペレットを分析のために１００μＬのＰＢＳに再懸濁させる。
【００６９】
Ｃ．エキソソームおよびリポソームの電気穿孔のための例示的なプロトコール
１×１０８個のエキソソーム（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ分析により測定）または１００ｎｍのリポソーム（例えば、Ｅｎｃａｐｓｕｌａ  Ｎａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入したもの）と１μｇのｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）またはｓｈＲＮＡを電気穿孔緩衝液（１．１５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．２、２５ｍＭの塩化カリウム、２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）４００μＬ中で混合する。４ｍｍのキュベットを使用してエキソソームまたはリポソームに電気穿孔する（例えば、Alvarez-Ervitiら、２０１１年；El-Andaloussiら、２０１２年を参照されたい）。電気穿孔後、エキソソームまたはリポソームをプロテアーゼフリーＲＮＡｓｅで処理し、その後、１０×濃縮したＲＮａｓｅ阻害剤を添加する。最後に、エキソソームまたはリポソームを上記の通り超遠心分離法の下でＰＢＳを用いて洗浄する。
【００７０】
ＩＩ．疾患の診断、予後判定、および処置
本発明の方法を使用したがん細胞由来エキソソームの検出、単離、および特徴付けは、がんの予後の評価において、および疾患の再発を導き得る治療失敗を早期検出するための治療有効性のモニタリングにおいて有用である。さらに、本発明に従ったがん細胞由来エキソソーム分析により、治療過程が完了している前駆症状性患者における早期再発の検出が可能になる。これは、がん細胞由来エキソソームの存在が、ある期間にわたって腫瘍の進行および拡散、療法に対する不十分な応答、疾患の再発、および／または生存の減少に伴う、かつ／または相関する可能性があるので、可能である。したがって、がん細胞由来エキソソームの数え上げおよび特徴付けにより、患者を、療法に対する応答に基づいて最初のリスクおよびその後のリスクを予測するベースライン特性について層別化する方法がもたらされる。
【００７１】
本発明に開示されている方法に従って単離されたがん細胞由来エキソソームを分析して、被験体におけるがんの診断または予後判定を行うことができる。そのように、本発明の方法は、例えば、がん患者およびがんのリスクがある者を評価するために使用することができる。本明細書に記載されている診断または予後判定の方法のいずれにおいても、ゲノムの変異もしくはがん特異的エキソソーム表面マーカーなどのがんの１つもしくは複数の指標、または任意の他の障害の１つもしくは複数の指標の、存在または非存在のいずれかを、診断または予後判定を行うために使用することができる。
【００７２】
一態様では、血液試料を患者から抜き取り、本明細書に記載の通り癌細胞由来エキソソームを検出し、かつ／または単離する。例えば、エキソソームをＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＡメンバー６（ＡＢＣＡ６）、テトラスパニン−４（ＴＳＰＡＮ４）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質４（ＳＬＩＴＲＫ４）、推定プロトカドヘリンベータ−１８（ＰＣＤＨＢ１８）、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３（ＣＤ３３）、および／またはグリピカン−１（ＧＰＣ１）に結合する１つまたは複数の抗体またはアプタマーで標識することができ、抗体には蛍光標識が共有結合していてよい。次いで、分析を実施して、試料中の癌細胞由来エキソソーム数および特徴付けを決定することができ、この測定から、最初の血液試料中に存在する癌細胞由来エキソソームの数を決定することができる。癌細胞由来エキソソームと識別されたエキソソームは、癌細胞由来エキソソームにおいて選択的にまたは特異的に見いだされることが公知の第２の（またはそれ超の）マーカー、例えば、ヒストンＨ２Ａ  ２型−Ａ（ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＡ）、ヒストンＨ２Ａ  １型−Ａ（ＨＩＳＴ１Ｈ１ＡＡ）、ヒストンＨ３．３（Ｈ３Ｆ３Ａ）、ヒストンＨ３．１（ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ）、ジンクフィンガータンパク質３７ホモログ（ＺＦＰ３７）、ラミニンサブユニットベータ−１（ＬＡＭＢ１）、尿細管間質性腎炎抗原様（ＴＩＮＡＧＬ１）、ペルオキシレドキシン−４（ＰＲＤＸ４）、コラーゲンアルファ−２（ＩＶ）鎖（ＣＯＬ４Ａ２）、推定タンパク質Ｃ３Ｐ１（Ｃ３Ｐ１）、ヘミセンチン−１（ＨＭＣＮ１）、推定ローフィリン（ｒｈｏｐｈｉｌｉｎ）−２様タンパク質（ＲＨＰＮ２Ｐ１）、アンキリンリピートドメイン含有タンパク質６２（ＡＮＫＲＤ６２）、三分子モチーフ（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｍｏｔｉｆ）を含有するタンパク質４２（ＴＲＩＭ４２）、ジャンクションプラコグロビン（ＪＵＰ）、チューブリンベータ２Ｂ鎖（ＴＵＢＢ２Ｂ）、エンドリボヌクレアーゼダイサー（ＤＩＣＥＲ１）、Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼＴＲＩＭ７１（ＴＲＩＭ７１）、カタニンｐ６０  ＡＴＰアーゼ含有サブユニットＡ様２（ＫＡＴＮＡＬ２）、タンパク質Ｓ１００−Ａ６（Ｓ１００Ａ６）、５’−ヌクレオチダーゼドメイン含有タンパク質３（ＮＴ５ＤＣ３）、バリン−ｔＲＮＡリガーゼ（ＶＡＲＳ）、カズリン（ＫＡＺＮ）、ＥＬＡＶ様タンパク質４（ＥＬＡＶＬ４）、リングフィンガータンパク質１６６（ＲＮＦ１６６）、ＦＥＲＭおよびＰＤＺドメイン含有タンパク質１（ＦＲＭＰＤ１）、７８ｋＤａグルコース調節タンパク質（ＨＳＰＡ５）、輸送タンパク質粒子複合体サブユニット６Ａ（ＴＲＡＰＰＣ６Ａ）、スクアレンモノオキシゲナーゼ（ＳＱＬＥ）、腫瘍感受性遺伝子１０１タンパク質（ＴＳＧ１０１）、液胞タンパク質選別２８ホモログ（ＶＰＳ２８）、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）、イソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア（ＡＣＡＤ８）、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット６Ｂ（ＰＳＭＣ４）、伸長因子１−癌マ（ＥＥＦ１Ｇ）、タイチン（ＴＴＮ）、チロシン−プロテインホスファターゼ１３型（ＰＴＰＮ１３）、トリオースリン酸イソメラ���ゼ（ＴＰＩ１）、またはカルボキシペプチダーゼＥ（ＣＰＥ）などを検出することにより、そうであることを検証することができる。癌細胞由来エキソソームの数は、エキソソームを視覚的に定量化し、特徴付けるための血球計算または顕微鏡による技法によって決定することができる。癌細胞由来エキソソームは、当技術分野で公知の他の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって検出し、定量化することができる。
【００７３】
種々の態様では、被験体のがん細胞由来エキソソームの数および特徴付けの分析は、被験体の進行および病態を評価するために特定の時間経過にわたって、種々の間隔で行う。例えば、分析は、がん細胞由来エキソソームのレベルおよび特徴付けを時間に応じて追跡するために、１日、２日、３日、１週間、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、または１年などの定期的な間隔で実施することができる。現存するがん患者の場合では、これにより、疾患の進行の有用な指示がもたらされ、医療実施者ががん細胞由来エキソソームの増加、減少、または変化がないことに基づいて適切な治療上の選択を行う助けとなる。がん細胞由来エキソソームの時間をわたっての２倍、５倍、１０倍またはそれ超の任意の増加により、患者の予後が低下し、これは、患者が療法を変化させるべきであるという早期指標である。同様に、２倍、５倍、１０倍またはそれ超の任意の増加により、患者が、予後および療法に対する応答をさらに評価するためにイメージングなどのさらなる検査を受けるべきであることが示される。がん細胞由来エキソソームにおける時間をわたっての２倍、５倍、１０倍またはそれ超である任意の減少により、疾患の安定化および患者の療法に対する応答が示され、これは、療法を変化させないことの指標である。がんのリスクがある者については、検出されるがん細胞由来エキソソームの数が突発的に増加することにより、患者に腫瘍が発生しているという早期警告がもたらされ得、したがって、これにより、早期診断がもたらされる。一実施形態では、がん細胞由来エキソソームの検出は、がんの病期分類と共に増加する。
【００７４】
本明細書において提供される方法のいずれにおいても、追加的な臨床的評価をもたらすために、追加的な分析も実施してがん細胞由来エキソソームを特徴付けることができる。例えば、画像解析およびバルク数測定に加えて、特定のがんマーカーに特異的なプライマーを用いた多重化などのＰＣＲ技法を使用して、がん細胞由来エキソソームが由来する腫瘍の型、転移の状態、および悪性疾患の程度などの情報を得ることができる。さらに、患者のがんの特徴付けに関する追加的な情報を評価する手段として、ＤＮＡまたはＲＮＡ分析、プロテオーム解析、またはメタボローム解析を実施することができる。
【００７５】
例えば、追加的な分析により、特定の治療レジメンに対する被験体の応答性の決定を行うため、またはがんの治療における候補薬剤の効果を決定するために十分なデータがもたらされる。したがって、本発明は、本明細書に記載の通り被験体のがん細胞由来エキソソームを検出／単離し、前記がん細胞由来エキソソームを分析することによって特定の治療レジメンに対する被験体の応答性またはがんの治療における候補薬剤の効果を決定する方法を提供する。例えば、薬物治療を患者に施したら、本発明の方法を使用して薬物治療の有効性を決定することが可能である。例えば、薬物治療前に患者から取得した試料、ならびに薬物治療と同時にまたはその後に患者から取得した１つまたは複数の試料を、本発明の方法を使用して処理することができる。処理した試料それぞれの分析結果を比較することにより、薬物治療の有効性または薬剤に対する患者の応答性を決定することができる。このように、失敗した化合物の早期同定を行うこともでき、有望な化合物の早期検証を行うこともできる。
【００７６】
本発明のある特定の態様は、治療剤または診断剤を発現するか、または含むエキソソームを用いた患者の治療を提供する。「治療剤」とは、本明細書で使用される場合、癌または他の状態の治療において有用な原子、分子、または化合物である。治療剤の例としては、これだけに限定されないが、薬物、化学療法剤、治療用抗体および抗体断片、毒素、放射性同位元素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性薬剤、および色素が挙げられる。「診断剤」とは、本明細書で使用される場合、疾患の診断、検出または可視化において有用な原子、分子、または化合物である。本明細書に記載の実施形態によると、診断剤として、これだけに限定されないが、放射性物質（例えば、放射性同位元素、放射性核種、放射標識または放射性トレーサー）、色素、造影剤、蛍光化合物または分子、生物発光化合物または分子、酵素および増強剤（例えば、常磁性イオン）を挙げることができる。
【００７７】
一部の態様では、治療用組換えタンパク質は、患者の細胞では失われる活性を有するタンパク質、所望の酵素活性を有するタンパク質、所望の阻害活性を有するタンパク質などであってよい。例えば、タンパク質は、転写因子、酵素、タンパク質毒素、抗体、モノクローナル抗体などであってよい。モノクローナル抗体は、細胞内抗原に特異的または選択的に結合するものであってよい。モノクローナル抗体は、細胞内抗原の機能を阻害し、かつ／またはタンパク質間相互作用を乱すものであってよい。本発明の他の態様は、患者試料中の癌細胞由来エキソソームの存在に基づく疾患の診断を提供する。
【００７８】
エキソソームは完全なｍＲＮＡ転写およびタンパク質翻訳に必要な機構を含むことが公知であるので（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６８６３０、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡ核酸をエキソソームにトランスフェクトすることができる。あるいは、治療用タンパク質自体をエキソソームに電気穿孔するか、またはリポソームに直接組み入れることができる。例示的な治療用タンパク質としては、これだけに限定されないが、腫瘍抑制因子タンパク質、ペプチド、変異タンパク質の野生型タンパク質対応物、ＤＮＡ修復タンパク質、タンパク質分解酵素、タンパク質性毒素、細胞内タンパク質の活性を阻害することができるタンパク質、細胞内タンパク質の活性を活性化することができるタンパク質、または機能喪失が再構成される必要がある任意のタンパク質が挙げられる。例示的な治療用タンパク質の特定の例としては、１２３Ｆ２、Ａｂｃｂ４、Ａｂｃｃ１、Ａｂｃｇ２、Ａｃｔｂ、Ａｄａ、Ａｈｒ、Ａｋｔ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、Ａｍｈｒ２、Ａｎｘａ７、Ａｐｃ、Ａｒ、Ａｔｍ、Ａｘｉｎ２、Ｂ２ｍ、Ｂａｒｄ１、Ｂｃｌ２ｌ１、Ｂｅｃｎ１、Ｂｈｌｈａｌ５、Ｂｉｎ１、Ｂｌｍ、Ｂｒａｆ、Ｂｒｃａ１、Ｂｒｃａ２、Ｂｒｃａ３、Ｂｒａｆ、Ｂｒｃａｔａ、Ｂｒｉｎｐ３、Ｂｒｉｐ１、Ｂｕｂ１ｂ、Ｂｗｓｃｒ１ａ、Ｃａｄｍ３、Ｃａｓｃ１、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ７、Ｃａｓｐ８、Ｃａｖ１、Ｃｃａｍ、Ｃｃｎｄ１、Ｃｃｒ４、Ｃｃｓ１、Ｃｄ２８、Ｃｄｃ２５ａ、Ｃｄ９５、Ｃｄｈ１、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ１ｂ、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｃｄｋｎ２ｂ、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｆｔｒ、Ｃｈｅｋ１、Ｃｈｅｋ２、Ｃｒｃｓ１、Ｃｒｃｓ１０、Ｃｒｃｓ１１、Ｃｒｃｓ２、Ｃｒｃｓ３、Ｃｒｃｓ４、Ｃｒｃｓ５、Ｃｒｃｓ６、Ｃｒｃｓ７、Ｃｒｃｓ８、Ｃｒｃｓ９、Ｃｔｎｎｂ１、Ｃｔｓ１、Ｃｙｐ１ａ１、Ｃｙｐ２ａ６、Ｃｙｐ２ｂ２、Ｃｙｌｄ、Ｄｃｃ、Ｄｋｃ１、Ｄｉｃｅｒ１、Ｄｍｔｆ１、Ｄｎｍｔ１、Ｄｐｃ４、Ｅ２ｆ１、Ｅａｆ２、Ｅｅｆ１ａ１、Ｅｇｆｒ、Ｅｇｆｒ４、Ｅｒｂｂ２、Ｅｒｂｂ４、Ｅｒｃｃ２、Ｅｒｃｃ６、Ｅｒｃｃ８、Ｅｒｒｆｉ１、Ｅｓｒ１、Ｅｔｖ４、Ｆａｓｌｇ、Ｆｂｘｏ１０、Ｆｃｃ、Ｆｇｆｒ３、Ｆｎｔｂ、Ｆｏｘｍ１、Ｆｏｘｎ１、Ｆｕｓ１、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｒ１、Ｇａｄｄ４５ａ、Ｇａｓｔ、Ｇｎａｉ２、Ｇｐｃ１、Ｇｐｒ１２４、Ｇｐｒ８７、Ｇｐｒｃ５ａ、Ｇｐｒｃ５ｄ、Ｇｒｂ２、Ｇｓｔｍ１、Ｇｓｔｍ５、Ｇｓｔｐ１、Ｇｓｔｔ１、Ｈ１９、Ｈ２ａｆｘ、Ｈｃｋ、Ｌｉｍｓ１、Ｈｄａｃ、Ｈｅｘａ、Ｈｉｃ１、Ｈｉｎ１、Ｈｍｍｒ、Ｈｎｐｃｃ８、Ｈｐｒｔ、Ｈｒａｓ、Ｈｔａｔｉｐ２、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ１０、Ｉｌ２、Ｉｌ６、Ｉｌ８ｒｂ  Ｉｎｈａ、Ｉｔｇａｖ、Ｊｕｎ、Ｊａｋ３、Ｋｉｔ、Ｋｌｆ４、Ｋｒａｓ、Ｋｒａｓ２、Ｋｒａｓ２ｂ、Ｌｉｇ１、Ｌｉｇ４、Ｌｋｂ１、Ｌｍｏ７、Ｌｎｃｒ１、Ｌｎｃｒ２、Ｌｎｃｒ３、Ｌｎｃｒ４、Ｌｔｂｐ４、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、Ｌｙｚ２、Ｌｚｔｓ１、Ｍａｄ１ｌ１、Ｍａｄ２ｌ１、Ｍａｄｒ２／Ｊｖ１８、Ｍａｐｋ１４、Ｍｃｃ、Ｍｃｍ４、Ｍｅｎ１、Ｍｅｎ２、Ｍｅｔ、Ｍｇａｔ５、Ｍｉｆ、Ｍｌｈ１、Ｍｌｈ３、Ｍｍａ���１、Ｍｍｐ８、Ｍｎｔ、Ｍｐｏ、Ｍｓｈ２、Ｍｓｈ３、Ｍｓｈ６、Ｍｓｍｂ、Ｍｔｈｆｒ、Ｍｔｓ１、Ｍｕｔｙｈ、Ｍｙｈ１１、Ｎａｔ２、Ｎｂｎ、Ｎｃｏａ３、Ｎｅｉｌ１、Ｎｆ１、Ｎｆ２、Ｎｆｅ２ｌ１、Ｎｈｅｊ１、Ｎｋｘ２−１、Ｎｋｘ２−９、Ｎｋｘ３−１、Ｎｐｒｌ２、Ｎｑｏ１、Ｎｒａｓ、Ｎｕｄｔ１、Ｏｇｇ１、Ｏｘｇｒ１、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐ２７ｍｔ、ｐ５７、ｐ１４ＡＲＦ、Ｐａｌｂ２、Ｐａｒｋ２、Ｐｇｇｔ１ｂ、Ｐｇｒ、Ｐｉ３ｋ、Ｐｉｋ３ｃａ、Ｐｉｗｉｌ２、Ｐｌ６、Ｐｌａ２ｇ２ａ、Ｐｌｇ、Ｐｌｋ３、Ｐｍｓ１、Ｐｍｓ２、Ｐｏｌｄ１、Ｐｏｌｅ、Ｐｐａｒｄ、Ｐｐａｒｇ、Ｐｐｆｉａ２、Ｐｐｍ１ｄ、Ｐｒｄｍ２、Ｐｒｄｘ１、Ｐｒｋａｒ１ａ、Ｐｔｃｈ、Ｐｔｅｎ、Ｐｒｏｍ１、Ｐｓｃａ、Ｐｔｃｈ１、Ｐｔｆ１ａ、Ｐｔｇｅｒ２、Ｐｔｐｎ１３、Ｐｔｐｒｊ、Ｒａｒａ、Ｒａｄ５１、Ｒａｓｓｆ１、Ｒｂ、Ｒｂ１、Ｒｂ１ｃｃ１、Ｒｂ１２、Ｒｅｃｇｌ４、Ｒｅｔ、Ｒｇｓ５、Ｒｈｏｃ、Ｒｉｎｔ１、Ｒｏｂｏ１、Ｒｐｌ３８、Ｓ１００ａ４、ＳＣＧＢ１Ａ１、Ｓｋｐ２、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｒｃｂ１、Ｓｍｏ、Ｓｎｘ２５、Ｓｐａｔａ１３、Ｓｒｐｘ、Ｓｓｉｃ１、Ｓｓｔｒ２、Ｓｓｔｒ５、Ｓｔａｔ３、Ｓｔ５、Ｓｔ７、Ｓｔ１４、Ｓｔｋ１１、Ｓｕｄｓ３、Ｔａｐ１、Ｔｂｘ２１、Ｔｅｒｃ、Ｔｎｆ、Ｔｐ５３、Ｔｐ７３、Ｔｒｐｍ５、Ｔｓｃ２、Ｔｓｃ１、Ｖｈｌ、Ｗｒｎ、Ｗｔ１、Ｗｔ２、Ｘｒｃｃ１、Ｘｒｃｃ５、Ｘｒｃｃ６、およびＺａｃ１が挙げられる。
【００７９】
疾患細胞の細胞内空間に導入するのに望ましい可能性があるタンパク質の１つの特定の型は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。そのような抗体は、細胞内タンパク質の機能を乱し、かつ／または細胞内タンパク質間相互作用を乱すものであってよい。そのようなモノクローナル抗体の例示的な標的としては、これだけに限定されないが、ＲＮＡｉ経路に関与するタンパク質、テロメラーゼ、疾患過程を制御する転写因子、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ合成に必要なタンパク質、タンパク質翻訳に必要なタンパク質が挙げられる。例示的な治療用抗体の標的の特定の例としては、以下の遺伝子によりコードされるタンパク質が挙げられる：Ｄｉｃｅｒ、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ｔｒｂｐ、Ｒａｓ、ｒａｆ、ｗｎｔ、ｂｔｋ、Ｂｃｌ−２、Ａｋｔ、Ｓｉｓ、ｓｒｃ、Ｎｏｔｃｈ、Ｓｔａｔｈｍｉｎ、ｍｄｍ２、ａｂｌ、ｈＴＥＲＴ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、ｅｒｂＢ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ｍｅｔ、ｃ−ｒｅｔ、ｆｌｔ３、ＡＰＩ、ＡＭＬｌ、ａｘｌ、ａｌｋ、ｆｉｎｓ、ｆｐｓ、ｇｉｐ、ｌｃｋ、Ｓｔａｔ、Ｈｏｘ、ＭＬＭ、ＰＲＡＤ−Ｉ、およびｔｒｋ。モノクローナル抗体に加えて、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ペプチボディ、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディなどの任意のその抗原結合性断片も意図されている。そのような抗体または抗体断片はいずれも、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。
【００８０】
エキソソームは、ＤＩＣＥＲおよび活性なＲＮＡプロセシングＲＩＳＣ複合体を含むことが公知であるので（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１５２６２２号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、エキソソームにトランスフェクトされたｓｈＲＮＡは、エキソソーム自体を用いて、ＲＩＳＣ−複合体と結合したｓｉＲＮＡに成熟し得る。あるいは、成熟ｓｉＲＮＡ自体をエキソソームまたはリポソームにトランスフェクトすることができる。したがって、例として、以下が、本発明の方法において標的遺伝子発現を調節または弱めるために使用することができる可能性のある標的遺伝子のクラスである：野生型または変異体バージョンの発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、翼状らせんファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンフォカインおよびそれらの受容体、成長または分化因子およびそれらの受容体、神経伝達物質およびそれらの受容体）、腫瘍抑制因子遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＣＹＬＤ、ＨＩＮ−１、ＫＲＡＳ２ｂ、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐ２７ｍｔ、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ＰＴＥＮ、Ｒｂ、Ｕｔｅｒｏｇｌｏｂｉｎ、Ｓｋｐ２、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＣＨＫ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＣＣ、ＤＰＣ４、ＭＡＤＲ２／ＪＶ１８、ＭＥＮ１、ＭＥＮ２、ＭＴＳ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＶＨＬ、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＣＦＴＲ、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｒａｓ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＦＵＳ１、Ｇｅｎｅ  ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊（ＢＬＵ）、Ｌｕｃａ−１（ＨＹＡＬ１）、Ｌｕｃａ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ  ２１（ＮＰＲＬ２）、またはＳＥＭ  Ａ３ポリペプチドをコードする遺伝子）、アポトーシス促進遺伝子（例えば、ＣＤ９５、カスパーゼ−３、Ｂａｘ、Ｂａｇ−１、ＣＲＡＤＤ、ＴＳＳＣ３、ｂａｘ、ｈｉｄ、Ｂａｋ、ＭＫＰ−７、ＰＡＲＰ、ｂａｄ、ｂｃｌ−２、ＭＳＴ１、ｂｂｃ３、Ｓａｘ、ＢＩＫ、およびＢＩＤ）、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２  ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＰＤＧＦ、およびｍｄａ７）、発癌遺伝子（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３およびＹＥＳ）、ならびに酵素（例えば、ＡＣＰデサチュラーゼおよびヒ��ロキシラーゼ（hycroxylase）、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（dehycrogenase）、アミラーゼ、アミログリコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、ヘミセルラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ヌクレアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ（peptidease）、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ）。一部の場合では、ｓｈ／ｓｉＲＮＡを、癌細胞において発現される遺伝子の変異体バージョンを特異的に標的とし、一方で対応する野生型バージョンの発現には影響を及ぼさないように設計することができる。実際、阻害性核酸が目的のタンパク質の検証された下方制御因子であることが任意の供給源により見いだされていれば、任意のそのような阻害性核酸を本発明の組成物および方法に適用することができる。
【００８１】
ＲＮＡｉの設計では、ｓｉＲＮＡの性質、サイレンシング効果の持続性、および送達系の選択などのいくつかの因子を考慮する必要がある。ＲＮＡｉ効果を生じさせるために、生物体に導入されるｓｉＲＮＡは一般にはエクソン配列を含有する。さらに、ＲＮＡｉプロセスは相同性依存的であり、したがって、配列を、遺伝子特異性が最大になり、同時に、相同であるが遺伝子特異的ではない配列間の交差干渉の可能性が最小化されるように慎重に選択しなければならない。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの配列と阻害される遺伝子の間で８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、またはさらには１００％の同一性を示すものであることが好ましい。標的遺伝子に対する同一性が約８０％未満の配列は、実質的に有効性が低い。したがって、ｓｉＲＮＡと阻害される遺伝子の間の相同性が大きいほど、無関係の遺伝子の発現が影響を受ける可能性が低い。
【００８２】
タンパク質に基づく治療薬および核酸に基づく治療薬に加えて、エキソソームは、単独で、または任意のタンパク質に基づく治療薬または核酸に基づく治療薬と組み合わせてのいずれかで、小分子薬物を送達するために使用することもできる。本実施形態における使用が意図されている例示的な小分子薬物としては、これだけに限定されないが、毒素、化学療法剤、細胞内タンパク質の活性を阻害する薬剤、細胞内タンパク質の活性を活性化する薬剤、再狭窄を予防するための薬剤、腎疾患を治療するための薬剤、間欠性跛行に対して使用される薬剤、低血圧およびショックの治療に使用される薬剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗狭心症剤、抗不整脈薬、抗高血圧剤、アンジオテンシンｉｉ受容体アンタゴニスト、抗血小板薬、ｂ−遮断薬ｂ１選択的、ベータ遮断薬、心血管適応症に対する植物性製品、カルシウムチャネル遮断薬、心血管／診断薬、中心アルファ−２アゴニスト、冠状動脈血管拡張薬、利尿薬および尿細管阻害剤、中性エンドペプチダーゼ／アンジオテンシン変換酵素阻害剤、末梢血管拡張薬、カリウムチャネル開口薬、カリウム塩、抗痙攣薬、鎮吐薬、制吐薬、抗パーキンソン病剤、抗痙攣剤、大脳刺激薬、外傷の治療に適用することができる薬剤、アルツハイマー病または認知症の治療に適用することができる薬剤、片頭痛の治療に適用することができる薬剤、神経変性疾患の治療に適用することができる薬剤、カポジ肉腫の治療に適用することができる薬剤、ＡＩＤＳの治療に適用することができる薬剤、癌化学療法剤、免疫障害の治療に適用することができる薬剤、精神障害の治療に適用することができる薬剤、鎮痛薬、硬膜外およびくも膜下腔内麻酔剤、全身的、局所的、領域的神経筋遮断鎮静薬、麻酔前副腎／ａｃｔｈ、アナボリックステロイド、糖尿病の治療に適用することができる薬剤、ドパミン、成長ホルモンおよび類似体、高血糖剤、低血糖剤、経口用インスリン、体積の大きな非経口薬（ｌｖｐｓ）、脂質変質剤、代謝試験および先天性代謝異常、栄養分／アミノ酸、栄養ｌｖｐｓ、肥満症薬（食欲低下薬）、ソマトスタチン、甲状腺剤、バソプレシン、ビタミン、コルチコステロイド、粘液溶解剤、肺抗炎症剤、肺界面活性物質、制酸薬、抗コリン薬、止瀉薬、鎮吐薬、胆石溶解剤、炎症性腸疾患に対する薬剤、過敏性腸症候群に対する薬剤、肝臓に対する薬剤、金属キレート化剤、種々雑多な胃液分泌に対する薬剤、膵炎に対する薬剤、膵臓酵素、プロスタグランジン、プロスタグランジン、プロトンポンプ阻害剤、硬化剤、スクラルファート、抗プロゲスチン、避妊薬、経口避妊薬、非経口ドパミン、エストロゲン、ゴナドトロピン、ＧＮＲＨ、ＧＨＲＨアンタゴニスト、分娩促進薬、プロゲスチン、子宮作用剤、抗貧血薬、抗凝固薬、抗線溶薬、抗血小板薬、アンチトロンビン薬、凝固薬、線維素溶解薬、血液学的薬物、ヘパリン阻害剤、金属キレート化剤、プロスタグランジン、ビタミンＫ、抗アンドロゲン薬、アミノグリコシド、抗菌剤、スルホンアミド、セファロスポリン、クリンダマイシン、外皮用薬、界面活性剤、エリスロマイシン、駆虫剤、抗真菌剤、抗マラリア薬、抗マイコバクテリア剤、抗寄生虫剤、抗原虫剤、抗トリコモナス薬、抗結核剤、免疫調節物質、免疫賦活剤、マクロライド、抗寄生虫剤、コルチコステロイド、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、酵素遮断薬、リウマチ性疾患に対する免疫調節物質、メタロプロテイナーゼ阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤）、鎮痛薬、解熱薬、アルファアドレナリン作動性アゴニスト／遮断薬、抗生物質、抗ウイルス薬、ベータアドレナリン作動性遮断薬、炭酸脱水素酵素阻害剤、コルチコステロイド、免疫系調節因子、肥満細胞阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤、およびプロスタグランジンが挙げられる。
【００８３】
エキソソームは、診断剤を送達するために使用することができる。例示的な診断剤としては、これだけに限定されないが、磁気共鳴画像増強剤、陽電子放出断層撮影用製品、放射性診断剤、放射性治療剤、放射線不透過性造影剤、放射性医薬品、超音波イメージング剤、および血管造影診断剤が挙げられる。
【００８４】
「被験体」という用語は、本明細書で使用される場合、本主題の方法が実行される任意の個体または患者を指す。一般に、被験体はヒトであるが、当業者には理解される通り、被験体は動物であってよい。したがって、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、農場動物（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む）、および霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）などの哺乳動物を含めた他の動物が被験体の定義の範囲内に含まれる。
【００８５】
「治療」および「治療すること」とは、疾患または健康に関連する状態に関する治療的利益を得るために治療剤を被験体に投与もしくは適用することまたは手順もしくはモダリティを被験体に対して実施することを指す。例えば、治療は、化学療法、免疫療法、もしくは照射療法を施すこと、外科手術を実施すること、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【００８６】
「治療的利益」または「治療的に有効」という用語は、本明細書で使用される場合、この状態の医学的治療に関して、被験体の健康（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）を促進または増強する任意のものを指す。これは、これだけに限定されないが、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低下を含む。例えば、がんの治療は、例えば、腫瘍の侵襲性の低下、がんの成長速度の低下、または転移の予防を伴い得る。がんの治療とは、がんを有する被験体の生存の延長を指す場合もある。
【００８７】
「がん」という用語は、本明細書で使用される場合、固形腫瘍、転移性がん、または非転移性のがんを記載するために使用することができる。ある特定の実施形態では、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮において生じるものであり得る。
【００８８】
がんは、具体的には以下の組織型のものであり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘体細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮腫（ｐｉｌｏｍａｔｒｉｘ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌および胆管癌；柱状腺癌（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；腺様嚢胞癌；腺腫様ポリープ内腺癌；腺癌、大腸家族性ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺癌（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ−ａｌｖｅｏｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；乳頭状濾胞性腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌（ｃｅｒｕｍｉｎｏｕｓ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；粘液性類表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性腺管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌ｗ／扁平上皮化生；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫（ｇｌｏｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎生期癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル芽細胞歯牙肉腫（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ  ｏｄｏｎｔｏｓａｒｃｏｍａ）；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫（ｐａｒａｇｒａｎｕｌｏｍａ）；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；特定された他の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病（ｌｙｍｐｈｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病（ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）；骨髄性肉腫；およびヘアリー細胞白血病。それにもかかわらず、本発明を非癌性疾患（例えば、真菌感染症、細菌感染、ウイルス感染、神経変性疾患、および／または遺伝障害）を治療するために使用することもできることも理解される。
【００８９】
「接触される」および「曝露される」という用語は、細胞に適用される場合、本明細書では、治療剤を標的細胞に送達するまたは標的細胞の直接近位に置くプロセスを記載するために使用される。細胞死滅を達成するために、例えば、１つまたは複数の薬剤を、細胞を死滅させるまたは細胞が分裂するのを防ぐために有効な量で細胞に送達する。
【００９０】
治療に対する患者の有効な応答または患者の「応答性」とは、疾患または障害のリスクがあるまたはそれに罹患している患者にもたらされる臨床的または治療的利益を指す。そのような利益としては、細胞応答または生物学的応答、完全奏効、部分奏効、安定病態（進行も再発もない）、または後の再発を伴う応答を挙げることができる。例えば、有効な応答は、がんと診断された患者における腫瘍サイズの縮小または無増悪生存であり得る。
【００９１】
本明細書に記載の方法により、治療転帰を予測およびモニタリングし、かつ／またはそのような治療の利益を得る患者を同定または選択することができる。
【００９２】
腫瘍性状態の治療に関しては、腫瘍性状態の病期に応じて、腫瘍性状態の治療は、以下の療法のうちの１つまたはそれらの組合せを伴う：腫瘍性組織を除去するための外科手術、放射線療法、および化学療法。他の治療レジメンを、抗がん剤、例えば、治療用組成物および化学療法剤の投与と組み合わせることができる。例えば、そのような抗がん剤を用いて治療される患者は、放射線療法も受けることができ、かつ／または外科手術も受けることができる。
【００９３】
疾患の治療に関して、治療用組成物の適切な投与量は、上で定義した治療される疾患の型、重症度および疾患の経過、患者の臨床的な病歴および薬剤に対する応答、および主治医の裁量に左右される。薬剤は、一度にまたは一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
【００９４】
治療的なおよび予防的な方法および組成物は、所望の効果を達成するために有効な組み合わせた量でもたらすことができる。組織、腫瘍、もしくは細胞は、１つもしくは複数の薬剤を含む１つもしくは複数の組成物もしくは薬理学的製剤（複数可）と接触させることができる、または組織、腫瘍、および／もしくは細胞を２つもしくはそれ超の別個の組成物もしくは製剤と接触させる。また、そのような併用療法を化学療法、照射療法、外科療法、または免疫療法と併せて使用することができることが意図されている。
【００９５】
組合せでの投与としては、２つまたはそれ超の薬剤を同じ剤形で同時に投与すること、別々の剤形で同時に投与すること、および別々に投与することが挙げられる。すなわち、対象とする治療用組成物および別の治療剤を共に同じ剤形に製剤化し、同時に投与することができる。あるいは、対象とする治療用組成物および別の治療剤を同時に投与することができ、この場合、両剤は別々の製剤中に存在する。別の代替法では、治療剤が投与され、直後に他の治療剤が投与され得るか、または逆もまた同じである。別々の投与プロトコールでは、対象とする治療用組成物および別の治療剤は、数分離して、または数時間離して、または数日離して投与することができる。
【００９６】
第１の抗がん治療（例えば、組換えタンパク質を発現するエキソソームまたはエキソソームから単離された組換えタンパク質を有するエキソソーム）は、第２の抗がん治療よりも前に、その間に、その後に、または種々の組合せで投与することができる。投与は、同時〜数分〜数日〜数週間にわたる間隔であってよい。第１の治療を第２の治療と別々に患者にもたらす実施形態では、一般に、各送達の時間の間に著しい期間が過ぎず、したがって、２つの化合物がなお有利に組み合わさった効果を患者に対して発揮できることを確実にする。そのような例では、患者に第１の療法と第２の療法を互いと約１２時間〜２４時間または７２時間以内に、より詳細には、互いと約６〜１２時間以内にもたらすことが意図されている。いくつかの状況では、それぞれの投与の間に数日（２日、３日、４日、５日、６日、または７日）〜数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間）が経過する場合に治療の期間を相当に延長することが望ましい。
【００９７】
ある特定の実施形態では、治療の過程は、１〜９０日間またはそれ超（この範囲は間にある日を含む）続く。１つの薬剤を１日目〜９０日目（この範囲は間にある日を含む）のいずれかまたはそれらの任意の組合せの日にもたらすことができ、別の薬剤を１日目〜９０日目（この範囲は間にある日を含む）のいずれかまたはそれらの任意の組合せの日にもたらすことが意図されている。１日の中で（２４時間の期間）、患者に薬剤（複数可）を１回または多数回投与することができる。さらに、治療の過程後に、抗がん治療を投与しない期間があることが意図されている。この期間は、例えば患者の予後、耐久力、健康などの患者の状態に応じて１〜７日、および／または１〜５週間、および／または１〜１２カ月またはそれ超（この範囲は間にある日を含む）であり得る。治療サイクルを必要に応じて繰り返すことが予想される。
【００９８】
種々の組合せを使用することができる。以下の例に関しては第１の抗がん療法が「Ａ」であり、第２の抗がん療法が「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ      Ｂ／Ａ／Ｂ      Ｂ／Ｂ／Ａ      Ａ／Ａ／Ｂ      Ａ／Ｂ／Ｂ      Ｂ／Ａ／Ａ      Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ      Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ      Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ      Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ      Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ      Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ      Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ      Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ      Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ      Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ      Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ      Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【００９９】
本発明の任意の化合物または療法の患者への投与は、そのような化合物を投与するための一般的なプロトコールに従い、もしあれば、薬剤の毒性を考慮に入れる。したがって、一部の実施形態では、併用療法に起因する毒性をモニタリングするステップが存在する。
【０１００】
１．化学療法
多種多様な化学療法剤を本発明に従って使用することができる。「化学療法」という用語は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」とは、がんの治療において投与される化合物または組成物を示すために使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内でのそれらの活性の様式、例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすかどうか、およびどの段階に影響を及ぼすかによってカテゴリー化される。あるいは、薬剤は、ＤＮＡと直接架橋結合する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、または核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けることができる。
【０１０１】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）など；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチルオロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン合成類似体、カルゼレシン合成類似体およびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）など；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマＩＩおよびカリチアマイシンオメガＩＩ）など；ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含めたジネミシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネートなど；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗菌性発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラルナイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソル��シンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシンなど；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、およびチオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトンなど；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、ミトタンおよびトリロスタンなど；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）など；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウム酢酸塩（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）など；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル・ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シ���プラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸など；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【０１０２】
２．照射療法
ＤＮＡ損傷を引き起こすものであり、広範囲にわたって使用されている他の因子としては、一般に、γ線、Ｘ線、および／または放射性同位元素の腫瘍細胞への指向性送達として公知のものが挙げられる。マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）、およびＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷性因子も意図されている。これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対する広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたって５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回線量までにわたる。放射性同位元素の投与量範囲は広範に変動し、同位元素の半減期、放出される放射線の強度および型、および腫瘍性細胞による取り込みに左右される。
【０１０３】
３．免疫療法
追加的な免疫療法を本発明の方法と組み合わせてまたは併せて使用することができることが当業者には理解されよう。がん治療の文脈において、免疫療法薬は、一般に、がん細胞を標的化し破壊する免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））がそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であってよい。抗体は、単独では、療法のエフェクターとしての機能を果たし得る、または他の細胞を動員して実際に細胞死滅に影響を及ぼし得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）とコンジュゲートすることもでき、ただ単に標的化薬剤として機能する。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってよい。種々のエフェクター細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０１０４】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化に適している、すなわち、大多数の他の細胞には存在しないマーカーをいくつか有するものでなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはいずれも、本発明の文脈において、標的化するのに適し得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、およびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替の態様は、抗がん効果と免疫賦活効果を組み合わせることである。サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮなど、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８など、および増殖因子、例えばＦＬＴ３リガンドなどを含めた免疫賦活分子も存在する。
【０１０５】
現在調査されているまたは使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；ＨｕｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８年；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓら、１９９８年）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉら、１９９８年；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９８年；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄら、１９９８年）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびｐ５３（Ｑｉｎら、１９９８年；Ａｕｓｔｉｎ−ＷａｒｄおよびＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８年；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、２０１３年；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉら、１９９８年；米国特許第５，８２４，３１１号）である。１つまたは複数の抗がん療法を本明細書に記載されている抗体療法と共に使用することができることが意図されている。
【０１０６】
４．外科手術
がんを有する人のおよそ６０％が、予防的外科手術、診断的または病期分類外科手術、治癒的外科手術、および待機的外科手術を含めた、何らかの型の外科手術を受ける。治癒的外科手術は、がん性組織の全部または一部を物理的に除去する、切り取る、および／または破壊する切除を含み、本発明の治療、化学療法、照射療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替療法などの他の療法と併せて使用することができる。腫瘍の切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍の切除に加えて、外科手術による治療としては、レーザー外科手術、冷凍外科、電気外科、および顕微鏡下手術（モース手術）が挙げられる。
【０１０７】
がん性細胞、組織、または腫瘍の一部または全部を切除すると、体内に腔が形成され得る。追加的な抗がん療法を用いた、その領域への灌流、直接注射、または局所的な適用によって治療を達成することができる。そのような治療は、例えば、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、もしくは７日毎に、または１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、および５週間毎に、または１カ月毎、２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、５カ月毎、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、または１２カ月毎に繰り返すことができる。これらの治療は、同様に投与量が変動するものである。
【０１０８】
５．他の薬剤
他の薬剤を本発明のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の有効性を改善することができることが意図されている。これらの追加的な薬剤としては、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑制剤および分化誘導剤（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、細胞接着阻害剤、過剰増殖性細胞のアポトーシス誘導因子への感受性を上昇させる薬剤、または他の生物学的薬剤が挙げられる。ギャップ結合の数を増加させることによる細胞間シグナル伝達の増加により、近くの過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果が増大する。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化誘導剤を本発明のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の抗過剰増殖の有効性を改善することができる。細胞接着阻害剤により本発明の有効性を改善することが意図されている。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。さらに、抗体ｃ２２５などの、過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増大させる他の薬剤を本発明のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療有効性を改善することができることが意図されている。
【０１０９】
ＩＩＩ．医薬組成物
組換えタンパク質、阻害性ＲＮＡ、および／または小分子薬物を発現するか、または含むエキソソームを、局所進行性または転移性癌を有する癌患者における腫瘍細胞成長を阻害するため、および、最も好ましくは、癌細胞を死滅させるために、全身的にまたは局所的に投与することができることが意図されている。当該エキソソームは、静脈内、くも膜下腔内、および／または腹腔内に投与することができる。当該エキソソームを、単独で、または抗増殖薬と組み合わせて投与することができる。一実施形態では、当該エキソソームを、外科手術または他の手順の前に、患者における癌負荷量を減少させるために投与することができる。あるいは、当該エキソソームを、残りの癌（例えば、外科手術により排除することができなかった癌）のいずれも生存しないことを確実にするために、外科手術後に投与することができる。
【０１１０】
本発明は、治療用調製物の特定の性質によって限定されるとは意図されない。例えば、そのような組成物は、生理的に許容される液体、ゲル、固体担体、希釈剤、または賦形剤と共に製剤でもたらすことができる。これらの治療用調製物は、家畜動物を用いたものなどの獣医学的な使用、および他の治療剤と同様にヒトにおける臨床使用に関して哺乳動物に投与することができる。一般に、治療有効性のために必要な投与量は、使用の型および投与形式、ならびに個々の被験体の特定の要件に応じて変動する。
【０１１１】
臨床的適用が意図されている場合、意図された適用に適した形態の組換えタンパク質および／またはエキソソームを含む医薬組成物を調製することが必要な場合がある。一般に、非経口製剤であり得る医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散させた、有効量の１つまたは複数の組換えタンパク質および／またはエキソソームおよび／または追加的な薬剤を含んでよい。「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、必要に応じて、例えばヒトなどの動物に投与した際に有害な反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。本明細書に開示されている組換えタンパク質および／またはエキソソーム、または追加的な活性成分を含む医薬組成物の調製は、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるRemington’s  Pharmaceutical  Sciences、第１８版、１９９０年に例示されている。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与に関しては、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより求められる無菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たすべきであることが理解されよう。
【０１１２】
さらに本発明のある特定の態様によると、投与に適した組成物は、不活性な希釈剤を伴ってまたは伴わずに、薬学的に許容される担体中でもたらすことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、当業者にとって公知であるような任意のかつ全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、エタノール、食塩溶液、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、脂肪、油、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなど）、脂質、リポソーム、分散媒、コーティング（例えば、レシチン）、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガス、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはこれらの組合せ）、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）（例えば、糖および塩化ナトリウム）、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、樹脂、充填剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、流体および栄養分補充剤、同様の材料およびこれらの組合せを含む。担体は、同化できるものであるべきであり、それらとして、液体担体、半固体担体、すなわちペースト剤、または固体担体が挙げられる。さらに、所望であれば、組成物は、微量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、安定化剤、またはｐＨ緩衝剤などを含有してよい。医薬組成物中の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに応じて調整する。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散物の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。
【０１１３】
薬学的に許容される担体は、特に、ヒトへの投与用に製剤化されるが、ある特定の実施形態では、非ヒト動物への投与用に製剤化されたものであり、ヒトへの投与は許容されない（例えば、政府の規制によって）薬学的に許容される担体を使用することが望ましい。任意の従来の担体が活性成分と適合しない（例えば、レシピエントまたは担体に含有される組成物の治療効果に対して有害である）場合を除き、治療用組成物または医薬組成物への担体の使用が意図されている。本発明のある特定の態様によると、組成物を担体と任意の都合がよく実用的な様式で、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、封入、吸収などによって組み合わせる。そのような手順は当業者には常套的なものである。
【０１１４】
本発明のある特定の実施形態は、それを固体形態で投与するか、液体形態で投与するか、またはエアロゾル形態で投与するか、および、注射などの投与経路のために滅菌する必要があるかどうかに応じて異なる型の担体を含み得る。組成物は、静脈内に、皮内に、経皮的に、くも膜下腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、粘膜を通じて、経口的に、局部的に、局所的に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）によって、注射によって、注入によって、持続注入によって、直接標的細胞を浸漬する限局的灌流によって、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物（例えば、リポソーム）中で、または、例えば、参照により本明細書に組み込まれるRemington’s  Pharmaceutical  Sciences、第１８版、１９９０年に記載されている当業者に公知の他の方法または上記の任意の組合せによって投与することができる。
【０１１５】
活性化合物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、またはさらには腹腔内経路による注射用に製剤化することができる。したがって、実施形態は、非経口製剤を含む。一般には、そのような組成物は、溶液または懸濁液として調製することができ、注射前に液体を添加して溶液または懸濁物を調製するために使用するのに適した固体形態を調製することもでき、調製物はまた、乳化されていてもよい。
【０１１６】
対象とする実施形態に応じて、非経口製剤は、本明細書に開示されているエキソソームを１つまたは複数の溶質および／または溶媒、１つまたは複数の緩衝剤および／または１つまたは複数の抗菌剤、またはそれらの任意の組合せと一緒に含み得る。一部の態様では、溶媒として、水、水混和性溶媒、例えば、エチルアルコール、液体ポリエチレングリコール、および／もしくはプロピレングリコール、ならびに／または、例えば、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、および／もしくはゴマ油を含めた不揮発性油などの水不混和性溶媒を挙げることができる。ある特定のバージョンでは、溶質として、１つまたは複数の抗菌剤、緩衝液、抗酸化剤、等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）、凍結保護物質および／または凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を挙げることができる。
【０１１７】
本開示による抗菌剤としては、本開示の他の箇所に提示されているもの、ならびにベンジルアルコール、フェノール、水銀および／またはパラベンを挙げることができる。抗菌剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサール、またはそれらの任意の組合せを挙げることができる。抗菌剤は、種々の態様では、医薬品に必要な無菌性を確実にするために必要な濃度で存在してよい。例えば、薬剤は、調製物、例えば、複数回用量容器に含有される調製物中に静菌または静真菌濃度で存在してよい。種々の実施形態では、薬剤は、防腐剤であってよく、かつ／または使用時に、例えば、内容物の一部を皮下針およびシリンジで抜き取る間に調製物中に偶発的に導入された微生物などの微生物の増加を防ぐために適した濃度で存在してよい。種々の態様では、薬剤は、最大の体積および／または濃度限界を有する（例えば、硝酸フェニル水銀およびチメロサール０．０１％、塩化ベンゼトニウムおよび塩化ベンザルコニウム０．０１％、フェノールまたはクレゾール０．５％、およびクロロブタノール０．５％）。種々の例において、硝酸フェニル水銀などの薬剤を０．００２％の濃度で使用する。ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル０．１８％とｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル０．０２％の組合せ、およびベンジルアルコール２％も実施形態に従って適用することができる。抗菌剤は、ヘキシルレゾルシノール０．５％、安息香酸フェニル水銀０．１％、および／または治療用化合物を含むものであってもよい。
【０１１８】
本開示による抗酸化剤としては、アスコルビン酸および／またはその塩、および／またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩を挙げることができる。本明細書に記載の等張化剤としては、電解質および／または単糖もしくは二糖を挙げることができる。凍結保護物質および／または凍結乾燥保護剤は、生物製剤をフリーズドライ処理の間の製品の凍結および／または乾燥に起因する有害な影響から保護する添加剤である。凍結保護物質および／または凍結乾燥保護剤としては、全て可能性のある凍結保護物質または凍結乾燥保護剤である、スクロースまたはトレハロースなどの糖（非還元）、グリシンまたはリシンなどのアミノ酸、液体ポリエチレングリコールまたはデキストランなどのポリマー、およびマンニトールまたはソルビトールなどのポリオールを挙げることができる。対象とする実施形態は、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸、またはそれらの任意の組合せなどの抗真菌剤も含んでよい。本開示、ならびに対象とする非経口製剤を作出する方法の態様において使用することができる追加的な溶質および抗菌剤、緩衝液、抗酸化剤、等張化剤、凍結保護物質または凍結乾燥保護剤およびその特性は、例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるRemington’s  Pharmaceutical  Sciences、第２１版、２００５年、例えば、第４１章に記載されている。
【０１１９】
注射での使用に適した医薬形態は、滅菌した水溶液または分散物；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含めた製剤；および滅菌された注射用溶液または分散物を即時調製するための滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は、滅菌しなければならず、容易に注射することができる程度に流体でなければならない。形態はまた、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。
【０１２０】
治療薬は、遊離塩基、中性、または塩の形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質様組成物の遊離のアミノ基を用いて形成されるもの、または、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、またはマンデル酸などの有機酸を用いて形成されるものが挙げられる。同様に、遊離のカルボキシ基を用いて形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化第二鉄などの無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、またはプロカインなどの有機塩基に由来するものであってよい。製剤化されたら、溶液を投薬製剤（ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と適合する様式で、治療的に有効な量で投与する。製剤は、注射溶液などの非経口投与用に製剤化されたもの、または肺に送達するためのエアロゾル、または薬物放出カプセル剤などの食事による投与用に製剤化されたものなどの種々の剤形で容易に投与される。
【０１２１】
本発明の特定の実施形態では、組成物を半固体または固体担体と徹底的に組み合わせるまたは混合する。混合は、粉砕などの任意の都合のよい様式で行うことができる。組成物を治療的活性の喪失、すなわち、胃における変性から保護するために、混合プロセスに安定化剤を加えることもできる。組成物に使用するための安定剤の例としては、緩衝液、グリシンおよびリシンなどのアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどの炭水化物が挙げられる。
【０１２２】
さらなる実施形態では、本発明は、１つまたは複数の脂質および水性溶媒を含む医薬脂質ビヒクル組成物の使用に関し得る。本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、特徴的に水に不溶性であり、有機溶媒を用いて抽出可能である広範囲の物質をいずれも含むものと定義される。この広範なクラスの化合物は当業者には周知であり、「脂質」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の特定の構造に限定されない。例として、長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然に存在するものであっても合成されたもの（すなわち、人間が設計または作製したもの）であってもよい。しかし、脂質は、通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野で周知であり、それらとして、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄ）、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド（ｓｕｌｐｈａｔｉｄｅ）、エーテルと連結した脂肪酸およびエステルと連結した脂肪酸を有する脂質、重合可能な脂質、およびこれらの組合せが挙げられる。当然、本明細書に具体的に記載されているもの以外の、当業者に脂質であると理解される化合物も組成物および方法に包含される。
【０１２３】
当業者は、組成物を脂質ビヒクル中に分散させるために使用することができる技法の範囲に詳しいであろう。例えば、治療剤を、当業者に公知の任意の手段により、脂質を含有する溶液に分散させること、脂質を用いて溶解させること、脂質を用いて乳化すること、脂質と混合すること、脂質と組み合わせること、脂質と共有結合させること、脂質に懸濁物として含有させること、ミセルまたはリポソームに含有させるもしくはそれと複合体を形成すること、または他のやり方で脂質または脂質構造と結び付けることができる。分散によりリポソームの形成がもたらされてもよく、もたらされなくてもよい。
【０１２４】
「単位用量」または「投与量」という用語は、被験体における使用に適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路および治療レジメンに伴って上記で検討した所望の応答が生じるように算出された所定の量の治療用組成物を含有する。治療回数および単位用量の両方に応じて投与される量は、所望の効果に左右される。患者または被験体に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、被験体の体重、年齢、健康、および性別などの身体的因子および生理的因子、治療される疾患の型、疾患の侵入の程度、以前または同時の治療介入、患者の特発性疾患、投与経路、ならびに特定の治療用物質の効力、安定性、および毒性によって決定することができる。例えば、用量は、投与当たり約１μｇ／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重（この範囲は、間に入る用量を含む）またはそれ超、およびその中で導き出せる任意の範囲を構成し得る。本明細書において列挙されている数から導き出せる範囲の非限定的な例では、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などの範囲で投与することができる。いずれにしても、投与の責任がある実施者が、個々の被験体に対する組成物中の活性成分（複数可）の濃度および適切な用量（複数可）を決定する。
【０１２５】
動物患者に投与される組成物の実際の投与量は、体重などの身体的因子および生理的因子、状態の重症度、治療される疾患の型、以前または同時の治療介入、患者の特発性疾患、および投与経路によって決定することができる。投与量および投与経路に応じて、好ましい投与量および／または有効量の投与の回数は、被験体の応答に応じて変動し得る。いずれにしても、投与の責任がある実施者が、個々の被験体に対する組成物中の活性成分（複数可）の濃度および適切な用量（複数可）を決定する。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、単位の重量の約２％〜約７５％、または約２５％〜約６０％、例えば、およびその中で導き出せる任意の範囲を構成し得る。当然、治療的に有用な組成物それぞれの中の活性化合物（複数可）の量は、化合物の任意の所与の単位用量で適切な投与量が得られるように調製することができる。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命、ならびに他の薬理学的考察事項などの因子が、そのような医薬製剤を調製する当業者により考慮され、したがって、種々の投与量および治療レジメンが望ましい可能性がある。
【０１２７】
他の非限定的な例では、用量は、投与当たり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重またはそれ超まで、およびその中で導き出せる任意の範囲も含み得る。本明細書において列挙されている数から導き出せる範囲の非限定的な例では、上記の数に基づいて約５ミリグラム／ｋｇ／体重〜約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲で投与することができる。
【０１２８】
ＩＶ．核酸およびベクター
本発明のある特定の態様では、治療用タンパク質をコードする核酸配列または治療用タンパク質を含有する融合タンパク質をコードする核酸配列が開示され得る。どんな発現系を使用するかに応じて、核酸配列を従来の方法に基づいて選択することができる。例えば、それぞれの遺伝子またはその改変体は、ある特定の系において発現させるためにコドン最適化することができる。目的のタンパク質を発現させるために、種々のベクターを使用することもできる。例示的なベクターとしては、これだけに限定されないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソームに基づくベクターが挙げられる。
【０１２９】
Ｖ．組換えタンパク質および阻害性ＲＮＡ
一部の実施形態は、組換えタンパク質およびポリペプチドに関する。特定の実施形態は、少なくとも１つの治療的活性を示す組換えタンパク質またはポリペプチドに関する。一部の実施形態では、組換えタンパク質またはポリペプチドは、治療用抗体であってよい。一部の態様では、治療用抗体は、細胞内タンパク質に特異的または選択的に結合する抗体であってよい。別の態様では、タンパク質またはポリペプチドを、血清中での安定性が増大するように修飾することができる。したがって、本出願で「改変タンパク質」または「改変ポリペプチド」の機能または活性に言及する場合、これは、例えば、修飾されていないタンパク質またはポリペプチドに対して追加的な利点を有するタンパク質またはポリペプチドを含むことが当業者には理解されよう。「改変タンパク質」に関する実施形態は、「改変ポリペプチド」について実施され得、逆もまた同じであることが明確に意図されている。
【０１３０】
組換えタンパク質は、アミノ酸の欠失および／または置換を有し得、したがって、欠失を有するタンパク質、置換を有するタンパク質、および欠失と置換を有するタンパク質は、改変タンパク質である。一部の実施形態では、これらのタンパク質は、アミノ酸の挿入または付加をさらに含んでよく、例えば融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質である。「改変欠失タンパク質」は、天然のタンパク質の１つまたは複数の残基を欠くが、天然のタンパク質の特異性および／または活性を有し得る。「改変欠失タンパク質」はまた、免疫原性または抗原性が低下したものであり得る。改変欠失タンパク質の例は、少なくとも１つの抗原性領域、すなわち、改変タンパク質を投与することができる生物体の型などの特定の生物体において抗原性であることが決定されたタンパク質の領域からアミノ酸残基が欠失したものである。
【０１３１】
置換または置き換え改変体は、一般には、タンパク質内の１つまたは複数の部位において１つのアミノ酸と別のアミノ酸の交換を含有し、ポリペプチドの１つまたは複数の性質、特に、そのエフェクター機能および／または生物学的利用能を調節するために設計することができるものである。置換は、保存的なもの、すなわち、１つのアミノ酸が形状および電荷が同様のアミノ酸で置き換えられたものであってもよく、保存的なものでなくてもよい。保存的置換は当技術分野で周知であり、それらとして、例えば、アラニンからセリンへの変化；アルギニンからリシンへの変化；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの変化；アスパラギン酸からグルタミン酸への変化；システインからセリンへの変化；グルタミンからアスパラギンへの変化；グルタミン酸からアスパラギン酸への変化；グリシンからプロリンへの変化；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの変化；イソロイシンからロイシンまたはバリンへの変化；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの変化；リシンからアルギニンへの変化；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの変化；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニンへの変化；セリンからトレオニンへの変化；トレオニンからセリンへの変化；トリプトファンからチロシンへの変化；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変化；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化が挙げられる。
【０１３２】
欠失または置換に加えて、改変タンパク質は、残基の挿入を有し得、これは、一般には、ポリペプチド内の少なくとも１つの残基の付加を伴う。これは、標的化ペプチドまたはポリペプチドまたは単に単一の残基の挿入を含む。融合タンパク質と称される末端付加を以下に考察する。
【０１３３】
「生物学的機能的に同等」という用語は、当技術分野においてよく理解され、本明細書においてさらに詳細に定義される。したがって、タンパク質の生物活性が維持されることを条件に、対照ポリペプチドのアミノ酸と同一であるまたは機能的に同等であるアミノ酸を約７０％から約８０％の間、または約８１％から約９０％の間、またはさらには約９１％から約９９％の間有する配列が含まれる。ある特定の態様では、組換えタンパク質は、その天然の対応物と生物学的機能的に同等である。
【０１３４】
アミノ酸および核酸配列は、追加的なＮ末端またはＣ末端アミノ酸または５’配列または３’配列などの追加的な残基を含んでよく、それでも、配列が、タンパク質の発現に関する場合には生物学的なタンパク質の活性の維持を含めた、上記の基準を満たす限りは、本明細書に開示されている配列のうちの１つに記載されているものと本質的に同様であることも理解されよう。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の５’部分もしくは３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得る、または遺伝子内に存在することが公知である種々の内部配列、すなわちイントロンを含み得る核酸配列に当てはまる。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、タンパク質またはペプチドは、一般には、これだけに限定されないが、約２００アミノ酸超、最大で遺伝子から翻訳される全長配列のタンパク質；約１００アミノ酸超のポリペプチド；および／または約３アミノ酸から約１００アミノ酸までのペプチドを指す。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸残基」とは、当技術分野で公知の任意の天然に存在するアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣物を指す。ある特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基は連続しており、いかなる非アミノ酸によってもアミノ酸残基の配列が遮られていない。他の実施形態では、配列は１つまたは複数の非アミノ酸部分を含んでよい。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、１つまたは複数の非アミノ酸部分で遮られていてよい。
【０１３７】
したがって、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質、または少なくとも１つの修飾されたまたは通常のものではないアミノ酸に見いだされる２０種の共通のアミノ酸の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を包含する。
【０１３８】
本発明のある特定の実施形態は、融合タンパク質に関する。これらの分子は、Ｎ末端またはＣ末端において異種ドメインと連結した治療用タンパク質を有し得る。例えば、融合物に他の種由来のリーダー配列を使用して、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にすることもできる。別の有用な融合としては、融合タンパク質の精製を容易にするために切断可能であることが好ましい、血清アルブミンアフィニティータグもしくは６ヒスチジン残基などのタンパク質アフィニティータグ、または抗体エピトープなどの免疫学的に活性なドメインの付加が挙げられる。非限定的なアフィニティータグとして、ポリヒスチジン、キチン結合性タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【０１３９】
特定の実施形態では、治療用タンパク質を、ＸＴＥＮポリペプチド（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００９年）、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、アルブミン、またはアルブミン結合性ペプチドなどの、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増大させるペプチドに連結することができる。
【０１４０】
融合タンパク質を生成する方法は当業者には周知である。そのようなタンパク質は、例えば、完全な融合タンパク質の新規合成によって、または異種ドメインをコードするＤＮＡ配列を付着させ、その後、インタクトな融合タンパク質を発現させることによって、作製することができる。
【０１４１】
親タンパク質の機能活性が回復する融合タンパク質の作製は、遺伝子を、タンデムに接続したポリペプチド間でスプライスされるペプチドリンカーをコードする架橋ＤＮＡセグメントと接続することによって容易にすることができる。リンカーは、生じる融合タンパク質の適切なフォールディングを可能にするのに十分な長さのものであってよい。
【０１４２】
ｓｉＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は当技術分野で周知である。例えば、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡは、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５０６，５５９号および同第６，５７３，０９９号、ならびに米国特許出願第２００３／００５１２６３号、同第２００３／００５５０２０号、同第２００４／０２６５８３９号、同第２００２／０１６８７０７号、同第２００３／０１５９１６１号、および同第２００４／００６４８４２号に記載されている。
【０１４３】
ｓｉＮＡ内で、核酸の成分は、全体を通して同じ型または同種である必要はない（例えば、ｓｉＮＡは、ヌクレオチドおよび核酸またはヌクレオチド類似体を含んでよい）。一般には、ｓｉＮＡは、二本鎖構造を形成し、二本鎖構造は、部分的に、または完全に相補的な２つの別々の核酸から生じるものであってよい。本発明のある特定の実施形態では、ｓｉＮＡは、単一の核酸（ポリヌクレオチド）または核酸類似体のみを含み、それ自体と相補することによって二本鎖構造を形成する（例えば、ヘアピンループを形成する）ものであってよい。ｓｉＮＡの二本鎖構造は、その中の全ての範囲を含め、１６個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個またはそれ超の連続した核酸塩基を含む。ｓｉＮＡは、相補的な核酸（同じ核酸の別の部分であっても別の相補的な核酸であってもよい）とハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、１７〜３５個の連続した核酸塩基、より好ましくは１８〜３０個の連続した核酸塩基、より好ましくは１９〜２５個の核酸塩基、より好ましくは２０〜２３個の連続した核酸塩基、または２０〜２２個の連続した核酸塩基、または２１個の連続した核酸塩基を含んでよい。
【０１４４】
本発明の方法の実施に有用な本発明の薬剤としては、これだけに限定されないが、ｓｉＲＮＡが挙げられる。一般には、本明細書では代替的に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称され得る二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入により、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される現象である、強力かつ特異的な遺伝子サイレンシングが誘導される。ＲＮＡ干渉は、「共抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「転写後遺伝子サイレンシング」、「センス抑制」、および「鎮圧（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）」と称されている。ＲＮＡｉは、特定の遺伝子の活性をノックアウトするための手段をもたらすので、魅力的なバイオテクノロジーツールである。
【０１４５】
ＲＮＡｉの設計では、ｓｉＲＮＡの性質、サイレンシング効果の持続性、および送達系の選択などのいくつかの因子を考慮する必要がある。ＲＮＡｉ効果を生じさせるために、生物体に導入されるｓｉＲＮＡは一般にはエクソン配列を含有する。さらに、ＲＮＡｉプロセスは相同性依存的であり、したがって、配列を、遺伝子特異性が最大になり、同時に、相同であるが遺伝子特異的ではない配列間の交差干渉の可能性が最小化されるように慎重に選択しなければならない。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの配列と阻害される遺伝子の間で８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、またはさらには１００％の同一性を示すものであることが好ましい。標的遺伝子に対する同一性が約８０％未満の配列は、実質的に有効性が低い。したがって、ｓｉＲＮＡと阻害される遺伝子の間の相同性が大きいほど、無関係の遺伝子の発現が影響を受ける可能性が低い。
【０１４６】
さらに、ｓｉＲＮＡのサイズは、重要な考慮事項である。一部の実施形態では、本発明は、少なくとも約１９〜２５ヌクレオチドを含み、遺伝子発現を調節することができるｓｉＲＮＡ分子に関する。本発明に関しては、ｓｉＲＮＡは、５００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、または２５ヌクレオチド未満の長さであることが好ましい。ｓｉＲＮＡは、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さであることがより好ましい。
【０１４７】
標的遺伝子とは、一般に、ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、または、ポリペプチドの発現に重要な複製、転写、もしくは翻訳もしくは他のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域、または、ポリペプチドをコードする領域と、それに作動可能に連結した、発現を調節する領域の両方を含むポリヌクレオチドを意味する。細胞において発現される任意の遺伝子を標的とすることができる。標的遺伝子は、疾患にとって重要な細胞活性の進行に関与するもしくは関連するもの、または研究目的として特に興味深いものであることが好ましい。
【０１４８】
ｓｉＲＮＡは、商業的供給源、天然の供給源から入手することもでき、当業者に周知のいくつもの技法のいずれかを使用して合成することもできる。例えば、予め設計されたｓｉＲＮＡの商業的供給源の１つは、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘである。別の商業的供給源は、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）である。本発明の組成物および方法に適用することができる阻害性核酸は、任意の供給源により目的のタンパク質の下方制御因子であることが検証されている任意の核酸配列であり得る。過度な実験を伴わず、本発明の開示を使用して、追加的なｓｉＲＮＡを設計し、本発明の方法を実施するために使用することができることが理解される。
【０１４９】
ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数のヌクレオチドの変更を含んでもよい。そのような変更は、例えば１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡの末端（単数または複数）または内部（ＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチド）に対してなどの、非ヌクレオチド材料の付加を含んでよい。ある特定の態様では、ＲＮＡ分子は、３’−ヒドロキシル基を含有する。本発明のＲＮＡ分子内のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含めた非標準ヌクレオチドも含んでよい。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当技術分野で公知の他の修飾された骨格を含有してもよく、非天然ヌクレオシド間結合を含有してもよい。ｓｉＲＮＡの追加的な修飾（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および反転デオキシ脱塩基残基組み入れ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））は、米国特許出願公開第２００４／００１９００１号および米国特許第６，６７３，６１１号（そのそれぞれの全体が参照によって組み込まれる）において見いだすことができる。集合的に、上記のそのような変更された核酸またはＲＮＡは全て修飾ｓｉＲＮＡと称される。
【０１５０】
ＶＩ．キットおよび診断薬
本発明の種々の態様では、体液または組織培養培地からエキソソームを精製するために必要な成分を含有するキットが構想される。他の態様では、エキソソームを単離し、それに治療用核酸、治療用タンパク質、または治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトするために必要な成分を含有するキットが構想される。さらに他の態様では、エキソソームを単離し、単離されたエキソソーム内の癌細胞由来エキソソームに特異的なマーカーの存在を決定するために必要な成分を含有するキットが構想される。
【０１５１】
キットは、そのような成分のいずれかを含有する１つまたは複数の密閉されたバイアルを含んでよい。一部の実施形態では、キットは、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ビン、またはチューブなどの、キットの成分と反応しない容器である適切な容器手段も含んでよい。容器は、プラスチックまたはガラスなどの滅菌可能な材料から作製されていてもよい。
【０１５２】
キットは、本明細書に記載の方法の手順ステップの概要を示す指示書をさらに含んでよく、本明細書に記載されているまたは当業者に公知である実質的に同じ手順に従い得る。指示情報は、コンピュータを使用して実行されると、試料からエキソソームを精製し、エキソソームに治療用核酸をトランスフェクトする、エキソソームにおいて組換えタンパク質を発現させる、エキソソームに組換えタンパク質を電気穿孔する、またはエキソソーム内もしくはエキソソーム上の癌細胞由来マーカーを識別する実際または仮想の手順を表示させる機械可読指示を含有するコンピュータ可読媒体に入っていてよい。
【実施例】
【０１５３】
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明者により、本発明の実施においてよく機能することが発見された技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【０１５４】
材料および方法
エキソソームの単離および精製。エキソソームを、以前に記載されている通り分画遠心分離プロセスによって精製した（Alvarez-Ervitiら、２０１１年；El-Andaloussiら、２０１２年）。エキソソーム枯渇ＦＢＳを含有する培地で４８時間培養した細胞から上清を採取し、その後、８００ｇで５分、および２０００ｇで１０分の逐次的な遠心分離ステップに供した。次いで、これにより得られた上清を、培養ビン中で０．２μｍのフィルターを使用して濾過し、ＳＷ  ３２  Ｔｉ  ローターにおいて２８，０００ｇで２時間にわたって超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ）した後にペレットを回収した。上清を吸引し、ペレットをＰＢＳに再懸濁させ、その後、さらに２時間にわたって超遠心分離した。次いで、精製されたエキソソームを分析し、実験手順に使用した。
【０１５５】
エキソソームおよびリポソームの電気穿孔。１×１０８個のエキソソーム（ｎａｎｏｓｉｇｈｔ分析により測定）および１μｇのｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）またはｓｈＲＮＡを電気穿孔緩衝液（１．１５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．２、２５ｍＭの塩化カリウム、２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標））４００μｌ中で混合した。エキソソームを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、４ｍｍのキュベットを使用して、以前に記載されている通り電気穿孔した（Alvarez-Ervitiら、２０１１年；El-Andaloussiら、２０１２年）。同様の手順を、リポソーム（１００ｎｍ、Ｅｎｃａｐｓｕｌａ  Ｎａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入したもの）を使用して実施した。電気穿孔後、プロテアーゼフリーＲＮＡｓｅ  Ａ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてエキソソームを処理し、その後、１０×濃縮ＲＮａｓｅ阻害剤（Ａｍｂｉｏｎ）を添加し、上記の通り超遠心分離法の下でＰＢＳを用いて洗浄した。
【０１５６】
免疫金標識および電子顕微鏡。最適な濃度で固定した検体を３００メッシュの炭素／ホルムバールでコーティングしたグリッドに置き、最低でも１分間ホルムバールに吸収させた。免疫金染色のために、グリッドをブロッキング／透過処理ステップのためのブロッキング緩衝液に１時間入れた。グリッドを、すすがずにすぐに適切な希釈度の一次抗体に入れて４℃で終夜置いた（モノクローナル抗ＣＤ９、１：１０、Ａｂｃａｍ）。対照として、一部のグリッドは一次抗体に曝露させなかった。次の日に、グリッドの全てをＰＢＳですすぎ、次いで、１０ｎｍの金粒子（ＡＵＲＩＯＮ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を付着させた適切な二次抗体の液滴に室温で２時間浮遊させた。グリッドをＰＢＳですすぎ、０．１Ｍのリン酸緩衝液中２．５％グルタルアルデヒドに１５分入れた。ＰＢＳおよび蒸留水ですすいだ後、グリッドを乾燥させ、酢酸ウラニルを使用して対比のために染色した。試料をＴｅｃｎａｉ（商標）Ｂｉｏ  Ｔｗｉｎ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）を用いて調べ、ＡＭＴ  ＣＣＤ  Ｃａｍｅｒａ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を用いて画像を取得した。
【０１５７】
エキソソームまたはリポソームで処理した細胞におけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の定量化。ＢＪ線維芽細胞から単離されたエキソソームにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、配列番号１）を電気穿孔し、ＰＢＳ、プロテイナーゼＫ処理（Ｑｉａｇｅｎ、１×、室温で１５分、およびＰＢＳを用いて４℃で１時間にわたって超遠心分離）、またはトリプシン処理（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１０×、室温で１５分、およびＰＢＳを用いて４℃で１時間にわたって超遠心分離）を行い、ＰＢＳで２時間にわたって洗浄し、ガラスカバーガラス上のＰａｎｃ−１細胞培養物に添加して３時間置いた。次いで、冷たいＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡと一緒に室温で２０分インキュベートすることによって細胞を固定した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリトンＸと一緒に１０分インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）ｇｒｅｅｎ核染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。次いで、カバーガラスを蛍光封入剤によってガラススライドに搭載した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の巣状滞留をＺｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１倒立顕微鏡を使用して可視化した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識を有する細胞の数を視野（４００×）ごとに計数し、結果を、視野当たりの計数された細胞の総数のうちの陽性標識を有する細胞の百分率として表した。
【０１５８】
リアルタイムＰＣＲ分析。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造者の指示に従って全ＲＮＡ精製を行った後、ＲＮＡを、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびオリゴ−ｄ（Ｔ）プライマーを用いてレトロ転写した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７３００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔにおいて、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してリアルタイムＰＣＲ分析を実施した。目的の転写物を１８Ｓ転写レベルに対して正規化した。ＫｒａｓＧ１２Ｄに対するプライマーを記載されている通り設計し（Rachaganiら、２０１１年）、Ｋｒａｓ野生型プライマーを記載されている通り設計した（Polisenoら、２０１０年）。各測定値を３連で実施した。閾値サイクル数、増幅された標的の量が固定閾値に達するフラクショナルサイクル数を決定し、発現を、２−ΔＣｔ式を使用して測定した。プライマー配列を表１に列挙する。
【表１】
2018520125.tif 000002
【０１５９】
細胞培養。ヒト包皮線維芽細胞（ＢＪ）細胞を、２０％エキソソーム枯渇ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。Ｐａｎｃ−１およびＢｘＰＣ−３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］から入手）をＲＰＭＩ  １０％ＦＢＳ中で培養した。Ｐａｎｃ−１およびＢｘＰＣ３細胞（ルシフェラーゼプロモーターをトランスフェクトしたもの）は、Ｔｈｉｒｕ博士  Ａｒｕｍｕｇａｍ、ＵＴ  ＭＤＡＣＣからの好意の寄贈品であった。Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（ＰＫＴ）線維芽細胞を、ＰＫＴマウスの膵臓から、補充していないＤＭＥＭおよびコラゲナーゼ４（４００単位／ｍｌ）中で単離された腫瘍を細かく切り、終夜インキュベートすることによって単離した。次いで、次の日に培地を吸引し、その後、細胞を、２０％エキソソーム枯渇ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン−アンピシリンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【０１６０】
ＲＮＡｉ戦略。
【化１】
2018520125.tif 000003
はどちらも、ＫｒａｓＧ１２Ｄ変異におけるグリシンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換を特異的に標的とし、また、サイレンシング効率を促進するためのＴＴヌクレオチド突出部を含むように、野生型Ｋｒａｓ遺伝子配列からのＧからＡへのヌクレオチドの偏差を反映する。このＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡにおける偏差されたヌクレオチドの中心的な位置により、野生型ｍＲＮＡ配列に対するその特異性が増強される。これを、その送達を追跡するために、センス鎖の３’末端においてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアでも標識した。ｓｉＲＮＡはＱｉａｇｅｎから入手した（カタログ番号１０２７４２４）。スクランブルされたｓｉＲＮＡとして使用するために、Ａｌｌ  Ｓｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｉＲＮＡをＱｉａｇｅｎから入手した（カタログ番号１０２７２８７）。ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡをスクランブルされたｓｈＲＮＡとして使用した。
【０１６１】
エキソソームトランスフェクション。エキソソームおよびリポソームを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションのために、どちらも上記の通り電気穿孔し、ＰＢＳで洗浄し、６ウェルプレート中２００，０００個の細胞を、エキソソームおよびリポソームを用いて、各アッセイについて記載されている必要な時間にわたって処理し、その後、ＰＢＳで洗浄し、さらなる分析に使用した。
【０１６２】
成長カイネティクスおよびアポトーシスアッセイ。Ｐａｎｃ−１およびＢｘＰＣ−３細胞を、６ウェルプレートに播種し（２．５×１０５）、１２時間成長させ、その後、ｓｉ／ｓｈＲＮＡを電気穿孔したエキソソームを用いて処理した。その後、２４時間ごとに、細胞をトリプシン処理し、トリパンブルーと混合した後、血球計算器を使用して細胞計数することによって生存細胞の数を計数した。このプロセスを、播種の８４時間後まで、２４時間ごとに繰り返した。ＴＵＮＥＬによるアポトーシスを、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｋｉｔ、ＴＭＲ  ｒｅｄ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って使用して評価した。細胞を上記の通り固定し、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＢＳ中１：１０，０００、室温で１０分）を使用して核を染色した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡を使用して画像を取得し、視野（４００×）当たりのＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を計数することによって定量化し、結果を、視野当たりの計数された細胞の総数のうちの陽性標識を有する細胞の百分率として表した。
【０１６３】
ウエスタンブロット。エキソソームを用いた処理の２４時間後の細胞のタンパク質発現を推定するために、Ｐａｎｃ−１細胞をＲＩＰＡ緩衝液中に収集し、タンパク質溶解物を、ブラッドフォード法による定量化を使用して正規化した。溶解物４０μｇを、変性条件下でのタンパク質の電気泳動による分離のためにアクリルアミドゲルにローディングし、湿式電気泳動トランスファーによってＰＶＤＦ膜（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ）に移した。次いで、膜を、ＰＢＳ中５％脱脂粉乳／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて室温で１時間にわたってブロッキングし、以下の一次抗体と一緒に４℃で終夜インキュベートした：抗ウサギｐ−Ｅｒｋ−ｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４３７６、１：１０００）、抗ウサギｐ−ＡＫＴ−抗ＡＫＴ１（ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓ４７３）（Ａｂｃａｍ、ａｂ８１２８３、１：５０００）、抗ウサギβ−アクチン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４９６７、１：１０００）。二次抗体を室温で１時間インキュベートした。抗体をインキュベートした後、１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０を用いた洗浄をオービタルシェーカーにおいて、１５分間隔で３回実施した。Ｐｉｅｒｃｅからの化学発光試薬を、製造者の指示に従って用いて膜を現像し、化学発光をフィルム上で捕捉した。
【０１６４】
ノーザンブロット。尿素／アクリルアミド１５％ゲルを使用して、２０μｇのスクロース勾配エキソソームＲＮＡを１×ＲＮＡローディング色素と一緒に９５℃で２分、その後、氷上で２分、ローディングした。ＭｉｃｒｏＲＮＡマーカーを製造者の指示に従って使用した（Ｎ２１０２、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）。１×ＴＢＥを使用して４℃で３時間にわたって電気泳動を行った。ＷｈａｔｍａｎブロッティングペーパーおよびＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ（登録商標）−Ｐｌｕｓ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  Ｃｈａｒｇｅｄ  Ｎｙｌｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、０．５×ＴＢＥを用いて４℃で２時間にわたってトランスファーを実施した。ＵＶトランスイルミネーターを使用して２０分にわたってＲＮＡを膜に架橋結合させた。膜をＡｍｂｉｏｎのＵＬＴＲＡｈｙｂ（登録商標）−Ｏｌｉｇｏハイブリダイゼーション溶液（Ａｍｂｉｏｎ）中、４２℃で１時間にわたって回転させることによってプレハイブリダイズを行った。次いで、プローブを氷上で解凍し、９５℃で５分間インキュベートした後、ハイブリダイゼーション緩衝液１ｍＬ当たり１５０ｎｇを添加し、その後、膜を４２℃で終夜回転させた。以下の洗浄ステップを行った：２×ＳＳＰＥ／０．５％ＳＤＳ−１５分、２回；０．２×ＳＳＰＥ／０．５％ＳＤＳ−３０分、２回、および２×ＳＳＰＥ−５分。これらの最初の洗浄ステップの後にさらなる洗浄を行い、次いで、ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ（登録商標）ＢｉｏＤｅｔｅｃｔ（商標）Ｋｉｔを製造者の指示（Ａｍｂｉｏｎ）に従って使用してブロットを現像した。ブロットを４段重ねのフィルムに終夜曝した。ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアを直接検出した。
【０１６５】
免疫細胞化学。細胞をカバーガラス上にプレーティングし、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡを電気穿孔したエキソソームまたはリポソームのいずれかを用いて３時間にわたって処理した。次いで、カバーガラスを低温１×ＰＢＳで洗浄し、細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２０分にわたって固定し、ＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００を用いて室温で１０分にわたって透過処理し、２％ＢＳＡに再懸濁させたＳｙｔｏｘ  ｇｒｅｅｎを用いて核を染色した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０  Ｕｐｒｉｇｈｔ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍを使用し、同一の設定を維持するためにリサイクルツールを使用して、画像を得た。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有する凝集したエキソソームにより、共焦点顕微鏡によって検出可能な標識の巣状滞留を可視化することが可能になった。データ解析のために、画像を、少なくとも２つの独立した実験から引き出されたプールから選択した。視野（×４００）当たりのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識を有する細胞の数を計数し、結果を、視野当たりの計数された細胞の総数のうちの陽性標識を有する細胞の百分率として表した。
【０１６６】
マウスおよびイメージング。４〜６週齢の雌胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ）を個別換気ケージ内に、１２時間の明暗サイクル、２１〜２３℃および湿度４０％〜６０％で収容した。マウスに照射食餌および滅菌水を自由に摂らせた。全身麻酔下で、Ｐａｎｃ−１細胞またはＢＸＰＣ−３細胞（１０６個、１０μｌのＰＢＳに再懸濁）を、２７ゲージのシリンジを使用して膵臓の尾部に注射した。ルシフェラーゼ発現を検出するために、マウスに、イメージングの１２〜１５分前に１００ｍｇ／ｋｇのルシフェリン（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌを２００μｌ）をｉ．ｐ．注射し、イソフルランで麻酔し、ＩＶＩＳ（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を使用してイメージングした。同所性腫瘍分析のために、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅバージョン４．４（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して全ての腫瘍算出を定量化した。膵臓周囲の円形の関心領域（ＲＯＩ）および腫瘍を規定し、同じ実験群内の全ての画像を比較するための標準として設定した。さらに、露出条件（時間、口径、ステージの位置、ビニング）を全ての実験群において全ての測定について同一に保った。次いで、その後の腫瘍測定（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を全ての実験群について同じ条件で得た。マウスを定期的にイメージングし、処置群にランダムに分け、マウスに、ＰＢＳ体積１００μｌ中２×１０８個のエキソソームまたはリポソームｉ．ｐ．を２日に１回受けさせた。エキソソームまたはリポソームに２μｇのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを電気穿孔し、ＰＢＳで洗浄した後、注射した。ＰＫＴ（Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）（Ozdemirら、２０１４年）遺伝子操作マウスを使用する場合、エキソソームによる処置を３３日齢時、マウスがＰａＮＩＮおよびＰＤＡＣ病変を示した時に開始した。動物手順は全て、ＵＴ  ＭＤＡＣＣにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより精査され認可された。
【０１６７】
マクロファージクリアランス。免疫応答性成体マウスに、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するエキソソームまたはリポソームのいずれかをｉ．ｐ．注射した。これらのマウスの血液を注入の１２時間後に採取し、フローサイトメトリー分析のために処理した。ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＢＣを枯渇させ、末梢細胞をＦＣ  ｂｌｏｃｋ（１：１０００、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でブロッキングし、Ｓｙｔｏｘ  ｇｒｅｅｎ（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣＤ１１ｂ（１：２００、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙｅ  ５．５）抗体で３０分にわたって染色し、ＰＢＳで洗浄し、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ−２０セルアナライザーを使用して分析した。特異的抗体を用いた染色の前に、マウス細胞懸濁液をＦＣ  Ｂｌｏｃｋと一緒に数分間プレインキュベートすることにより、観察される染色がいずれも抗体の抗原結合性部分と細胞表面上の抗原の相互作用に起因するものになることが保証される。
【０１６８】
組織学的検査、病理組織検査、および免疫組織化学的検査。組織をホルマリン中に固定し、パラフィン包埋処理した。厚さ５μｍの組織切片を切り取り、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにマッソントリクローム（ＭＴＳ）（Ｌｅｉｃａ）について染色した。病理組織学的スコアリングのために、Ｈ＆Ｅ染色したスライドを、膵臓癌の形態学的病期に基づいてスコア化した：正常、膵上皮内腫瘍（ＰａＮＩＮ）および膵管腺癌（ＰＤＡＣ）。各組織切片について、３つの病期（正常、ＰａＮＩＮ、ＰＤＡＣ）のそれぞれについての百分率スコアを、膵臓組織学的検査の専門家により手動で、盲検式で得、次いでそれを平均して、各コホートについて１００のからの全体的なスコアを得た。次いで、それぞれのコホート内の各マウスについてこれらの百分率スコアの平均をとった。
【０１６９】
マウスにおける線維症の分析のために、各ＭＴＳ染色された膵臓切片について８つの２００×視野をランダムに選択し、線維症を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用してグリッド交差解析によって手動で評価した。各像の評価のために、四角１００個のグリッドを各像にオーバーラップさせ、青色（線維化領域）および紫色／赤色（非線維化領域）について各交差を計数した。次いで、各組織切片について百分率スコアを得た。組織切片を、免疫染色の前に抗原回復にも供した（１０ｎＭのクエン酸緩衝液中、ｐＨ６および９８℃で１５分）。組織切片を、ＴＢＳまたはＰＢＳ中、４％ＣＷＦＳゼラチン（Ａｕｒｉｏｎ）と一緒に１時間インキュベートした後、一次抗体と一緒に終夜インキュベートした。以下の一次抗体を染色のために使用した：抗ウサギｐ−Ｅｒｋ−ｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４３７６、１：４００）、抗ウサギｐ−ＡＫＴ−抗ＡＫＴ１（ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓ４７３）（Ａｂｃａｍ、ａｂ８１２８３、１：１００）、抗ウサギＫｉ−６７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＲＭ−９１０６−Ｓ、１：４００）。全ての染色について、切片を、ビオチン化ヤギ抗ウサギおよびストレプトアビジンＨＲＰ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）と一緒に、それぞれ１０分にわたってインキュベートし、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。ＤＡＢ陽性を分析した。Ｋｉ−６７染色は、視野（４００×）当たりの陽性染色された核の数を計数することによって定量化し、一方、ｐ−Ｅｒｋおよびｐ−ＡＫＴ染色は、ＩｍａｇｅＪを用い、それぞれの抗体について、像の濃く染色された部分のみを含め、次いで、それを陽性染色領域とみなすようにマクロを設計することによって定量化した。これを、組織切片当たり８つの２００×像について実施し、各組織切片について陽性スコアの平均を得た。ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検出キット、ＴＭＲ  Ｒｅｄ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って使用してＴＵＮＥＬアッセイを実施した。凍結させた組織切片上のＡｌｅｘａ  ６４７を、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）ｇｒｅｅｎ（ＰＢＳ中１：１０，０００、１０分間）を用いた組織の核の染色によって検出した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡を使用して画像を取得し、視野（×４００）当たりのＴＵＮＥＬ陽性の細胞の数を計数することによって定量化し、結果を、視野当たりの計数された細胞の総数のうちの陽性標識を有する細胞の百分率として表した。
【０１７０】
統計解析。使用した統計解析は、図の説明文においてで詳述されている。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用し、一元配置ＡＮＯＶＡまたは独立両側スチューデントのｔ検定を使用して、統計的有意性を確立した。生存分析については、カプランマイヤープロットを作成し、ログランクマンテル・コックス検定を使用して統計学的差異を評価した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【０１７１】
（実施例１）
阻害性ＲＮＡを含有するエキソソームの抗腫瘍性
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ構築物を、ＫｒａｓＧ１２Ｄを特異的に標的とするように設計した。
【化２】
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は、細胞株および動物モデルにおいて見いだされるＫｒａｓＧ１２Ｄ変異におけるグリシンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換を特異的に標的とするための野生型Ｋｒａｓ遺伝子配列からのＧからＡへのヌクレオチドの偏差（下線が引かれているおよび太字）、およびサイレンシング効率を促進するためのＴＴヌクレオチド突出部（下線が引かれている）を反映する（Rejibaら、２００７年；Maら、２００４年；Duら、２００５年）。このＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド偏差物の中心的な位置により、野生型ｍＲＮＡ配列に対するその特異性が増強される（Duら、２００５年）。ｓｈＲＮＡ配列（配列番号２）を、ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｍＲＮＡの特異的標的化を促進するために、種配列に特定のＧからＡへのヌクレオチドの偏差が含有されるように設計した。また、ＫｒａｓＧ１２Ｄに対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、それらの送達を追跡するために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアで標識した（図４Ａ）。
【０１７２】
エキソソームを機能的に傷つけることなくｓｈＲＮＡ構築物およびｓｉＲＮＡ構築物をエキソソームに挿入するために（ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ）、新しい電気穿孔法を開発し、最適化した（図４Ａ〜Ｃ）。この目的のために、エキソソームを、確立された超遠心分離法（Kahlertら、２０１４年）を使用してヒト包皮線維芽細胞（ＢＪ線維芽細胞）から単離した。エキソソームの純度および均一性（直径８０〜１５０ｎｍの粒子）を、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（商標）測定（図４Ｂ）、透過型電子顕微鏡（図４Ｃ）、およびＣＤ９免疫金標識（図４Ｄ）によって検証した。スクロース勾配超遠心分離およびノーザンブロットによってもエキソソーム抽出の純度ならびにエキソソーム内のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の存在を検証した（図４Ｅ）。スクランブルｓｉＲＮＡおよびスクランブルｓｈＲＮＡを含有するエキソソーム（ｓｉＳｃｒｂｌ／ｓｈＳｃｒｂｌ  ｅｘｏｓ）、スクランブルｓｉＲＮＡおよびスクランブルｓｈＲＮＡを含有するリポソーム（ｓｉＳｃｒｂｌ／ｓｈＳｃｒｂｌ）、およびＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを含有するリポソーム（ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ／ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓ）も生成した。腫瘍形成性ヒト膵臓Ｐａｎｃ−１（Ｋｒａｓａｓｐ１２（Rejibaら、２００７年；Sunら、２００１年））細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されたｓｉＲＮＡを含有するエキソソームおよびリポソームと一緒に３時間インキュベートし、免疫蛍光イメージングにより、エキソソームで処理した細胞において、リポソームで処理した細胞と比較してかなりの数の標識の巣状滞留が明らかになった（図１Ａ）。エキソソームをプロテイナーゼＫまたはトリプシンで処理することにより、細胞の染色が減弱したが、リポソームのプロテイナーゼＫまたはトリプシンによる処理では、低細胞染色が維持され、これにより、エキソソーム表面タンパク質により、標識されたｓｉＲＮＡの細胞への送達が増強されることが裏付けられる（図１Ａ）。ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓでの処理およびｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓでの処理により、ｓｉＳｃｒｂｌ／ｓｈＳｃｒｂｌ  ｅｘｏｓまたは電気穿孔されていない（対照、ＲＮＡｉペイロードを有さない）ｅｘｏｓと比較して、Ｐａｎｃ−１細胞におけるＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｍＲＮＡレベルが低下した（それぞれ約７０％および約５０％の低下）（図１Ｂ）。ｓｉＫｒａｓＧ１２ＤおよびｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓでの処理によっても、ｓｉＳｃｒｂｌ／ｓｈＳｃｒｂｌ  ｌｉｐｏｓと比較して、Ｐａｎｃ−１細胞におけるＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｍＲＮＡレベルが低下した（それぞれ約２０％の低下）（図１Ｂ）。変異体ＫｒａｓＧ１２Ｄ転写物の特異的なノックダウンを、ＫｒａｓＧ１２Ｄを特異的に増幅させるが野生型Ｋｒａｓは増幅させないプライマーを用い、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して測定し（表１）、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓおよびｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓでの処理により、野生型Ｋｒａｓ  ｍＲＮＡレベルは低下せず、これにより、本方法体系を用いたＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｍＲＮＡ特異的標的化が裏付けられる（図１Ｃ）。変異体ＫｒａｓＧ��２Ｄ転写物のノックダウンの有効性は、リポソームの代わりにエキソソームを使用した場合により大きく（図１Ｂ）、これはおそらく、エキソソームと比較してリポソームの送達が損なわれたことを反映する（図１Ａ）。ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓおよびｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓの濃度またはリポソームをＰａｎｃ−１細胞と一緒にインキュベートする時間を増大させることによりＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｍＲＮＡ標的化の効率は改善されず（図４Ｆ）、これにより、有効なｍＲＮＡ標的化のためのＲＮＡｉカーゴの送達において、エキソソームの内因性の性質がリポソームよりも優れていることが裏付けられる。さらなる実験最適化により、ＫｒａｓＧ１２Ｄ転写物レベルを抑制するためには、Ｐａｎｃ−１細胞当たりおよそ４００個のエキソソームの比率の方が、Ｐａｎｃ−１細胞当たり７００個のエキソソームの比率よりも優れていることが明らかになった（図４Ｇ）。最後に、ＫｒａｓＧ１２Ｄ変異を有さないＢｘＰＣ３膵臓癌細胞（Ｋｒａｓｗｔ，Ｇｌｙ（Sunら、２００１年））を対照として使用して、ｓｉＫｒａｓＧ１２ＤおよびｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓでの処理により、これらの細胞における野生型Ｋｒａｓ発現は抑制されず（図４Ｈ）、これにより、発癌性Ｋｒａｓ  ｍＲＮＡレベルの抑制に対するＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｉＲＮＡ構築物およびＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｓｈＲＮＡ構築物の特異性がさらに裏付けられる。ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを用いて処理したＰａｎｃ−１細胞における発癌性Ｋｒａｓ抑制は、リン酸化ＥＲＫタンパク質レベルおよびリン酸化ＡＫＴタンパク質レベルの低下と関連し、これにより、発癌性Ｋｒａｓの下流のシグナル伝達が低減したことが裏付けられる（図１Ｄ）。ｓｈＳｃｒｂｌ  ｅｘｏｓまたは電気穿孔されていない対照ｅｘｏｓで処理したＰａｎｃ−１細胞とは対照的に、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓとインキュベートしたＰａｎｃ−１細胞の増殖は有意に低減した（図１Ｅ）。対照的に、ＢｘＰＣ３細胞の増殖はｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓでの処理による影響を受けなかった（図４Ｉ）。最後に、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処理したＰａｎｃ−１細胞の増殖の低減は、ＴＵＮＥＬアッセイによって測定されるアポトーシスの増強と関連し、これにより、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処理した場合のこれらの細胞の増殖の低減が確証される（図１Ｅ）。
【０１７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓにより、発癌性Ｋｒａｓが特異的に標的化され、下流の発癌性Ｋｒａｓシグナル伝達が損なわれることによりアポトーシスが誘導されることが示唆された。次に、ｓｉＫｒａｓＧ１２ＤまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄを含有するエキソソームの、膵臓腫瘍におけるＫｒａｓＧ１２Ｄ発現をサイレンシングする能力を探究した。マウスに腹腔内注射したエキソソームに由来するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたｓｉＲＮＡの巣状滞留が注入の２４時間後に膵臓組織において検出された。さらに、ｉ．ｐ．注射の２４時間後のマウスの血清におけるフローサイトメトリーを使用して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたｓｉＲＮＡを含有するエキソソームが検出された（図５Ａ）。これらの結果により、マウスにｉ．ｐ．投与されたエキソソームが体循環中に進入し、膵臓に到達することが示唆される。かなりの数のエキソソームが膵臓の実質に接近することが確認された後、１×１０６個のルシフェラーゼ発現Ｐａｎｃ−１ヒト膵臓（Ｐａｎｃ−１−ｌｕｃ）細胞を、エキソソームまたはリポソームのｉ．ｐ．注射で処置したヌードマウスに同所性に埋め込んだ。癌細胞の注射の１０日後、全てのマウスで生物発光イメージングによって検出可能な腫瘍が示され、放射輝度は１×１０５ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒから１×１０６ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒの間であった。マウスをランダム化し、４８時間ごとの１×１０６個のエキソソームまたはリポソームのｉ．ｐ．注射の反復に供した。使用したリポソームは、エキソソームのサイズ範囲に近い１００ｎｍのサイズであり、エキソソームと同様の濃度および投与量で注射したことに留意されたい。マウスのコホートに、ＰＢＳビヒクルおよび電気穿孔されていないエキソソームも注射した。ＰＢＳまたは電気穿孔されていないエキソソームを投与したマウスの腫瘍は、指数関数的速度で成長し、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスの腫瘍は、処置開始の３０日後にベースライン生物発光検出レベルまで有意に低下した（図２Ａ）。ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｌｉｐｏｓで処置したマウスにおいても腫瘍成長が鈍ったが、エキソソームを使用した場合よりもはるかに低い程度であった（図２Ａ）。また、エキソソームと比較してリポソームのマクロファージクリアランスの増大が検出され、ここで、標識されたＲＮＡｉを含有するエキソソームで処置したマウスと比較して、標識されたＲＮＡｉを含有するリポソームで処置したマウスの体循環中に、より多数の、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたＲＮＡｉを含有するマクロファージが認められた（図５Ａ）。ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓは同所性ＢｘＰＣ３腫瘍成長（図２Ｂ）にも全生存（図５Ｄ）にも影響を及ぼさず、これにより、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓでの処置の、ＫｒａｓＧ１２Ｄ変異を有する癌細胞に対する特異的な抗腫瘍効果が裏付けられることに留意されたい。日数を釣り合わせた、ＰＢＳで処置したマウスおよびｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスにおける病理組織学的所見では、早ければ癌細胞注射の２６日後に、短期（１６日）ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ処置後の膵癌疾患の有意な低減が示された。癌細胞注射後７７日目に、ＰＢＳで処置した対照マウスでは生物発光イメージングによってアッセイされる広範囲にわたる腫瘍量が示されたが、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスの腫瘍量はほぼ検出不可能なレベルまで減少した（図２Ｃ、図６Ｂ）。ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを使用して長期間にわたる処置を行い、ＰＢＳで処置した、および対照ｅｘｏｓで処置した、Ｐａｎｃ−１腫瘍を担持するマウスは全て、癌細胞注射の１３０日後に、瀕死基準または過剰な腫瘍量に基づいて安楽死が必要になり、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスは全て健康であり、癌細胞注射の２００日後に生物発光イメージングによって検出される最小の腫瘍量を示した（図２Ｄ、図６Ｂ）。腫瘍をｐ−ＥＲＫ（図２Ｅ）およびｐ−ＡＫＴ（図５Ｃ）について免疫標識することにより、対照（ＰＢＳ処置した）マウスと比較して、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスの腫瘍におけるＫｒａｓシグナル伝達が抑制されることも明らかになった。これらのデータにより、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄのエキソソームによる送達により、腫瘍成長の低減がもたらされ、また、腫瘍成長の抑制が維持されることが示された。これらの時点での膵臓の病理組織学的分析から、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスでは膵臓の大部分が関係せず腫瘍病巣が小さいこととは対照的に、ＰＢＳで処置したマウスでは膵臓の全てが関与する腫瘍の進行（１３０日）が示された（図２Ｄ）。パーセント腫瘍量（実験エンドポイント時の膵臓の質量に基づいて）（図２Ｆ）および生存（図２Ｇ）も、Ｐａｎｃ−１腫瘍を担持するマウスにおいてｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ後にはるかに改善され、全ての対照マウスは膵臓腫瘍量に屈した。ＰＢＳ処置群および対照ｅｘｏｓ処置群では、癌細胞埋め込みの８８〜１３０日後に、マウスが瀕死の状態に達した時に安楽死させたが、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓ処置群では、ほぼ全てのマウスが、癌細胞埋め込みの２００日後に健全であり、生存していた（５９日目に１匹のマウスの死亡が見いだされたが、剖検分析により、このマウスにおける腫瘍量は最小であることが明らかになり、また、剖検分析により、死亡が癌と無関係であることが裏付けられた）。
【０１７４】
Ｐａｎｃ−１腫瘍を有するヌードマウスにおけるｓｉＲＮＡ  ｉＥｘｏｓｏｍｅｓ（すなわち、ｓｉＲＮＡなどの薬物物質を含むエキソソーム）での処置の抗腫瘍性がＰＤＡＣの遺伝子操作マウスモデル（ＧＥＭＭ）におけるさらなる評価の根拠となった。急速進行性Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（ＰＫＴマウス（Ozdemirら、２０１４年））をｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置した。これらのマウスでは、ヒト膵臓癌の臨床的および病理組織学的性質を確実に再現する膵臓腺癌が自然発生する（Ozdemirら、２０１４年）。このモデルは、十分に浸潤性であり、疾患の進行はマウスにわたって高度に同等である（Ozdemirら、２０１４年）。ＰＫＴマウスでは、約２８日齢で膵上皮内腫瘍（ＰａＮＩＮ）病期が発生し、約３２日齢で浸潤性腺癌が発生し、４５〜５５日齢で死亡する。マウスに、電気穿孔されていない対照エキソソームまたはｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓを、３３日齢（マウスはＰＤＡＣを有する）で開始し、４８時間ごとにｉ．ｐ．注射した（図３Ａ）。屠殺時にマウスの膵臓腫瘍において、タグを付けたｓｉＲＮＡを含有するｅｘｏｓに由来するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識の巣状滞留を検出した。ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓまたはｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスでは、寿命の有意な延長が示され、平均生存は、ｓｈＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスについては５０日であり、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスについては６０日であり、それらと比較して、対照ｅｘｏｓで処置したマウスで示された平均生存は４３日であった（図３Ｂ）。生存の増大は、年齢を釣り合わせた時点（図３Ｃ）およびそれぞれの実験エンドポイント（図７Ａ）の両方において、対照ｅｘｏｓで処置したマウスと比較してｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスにおける腫瘍量の有意な減少と関連した。有意な生存優位性（図３Ｂ）に加えて、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウス（４４日齢時の対照ｅｘｏｓで処置したマウスと年齢を釣り合わせた）の腫瘍の病理組織学的特徴から、４４日齢時の対照マウスにおける膵臓から浸潤特徴を伴う癌性組織へのほぼ完全な転換と対比して、正常な実質性およびＰａＮＩＮ病期の病変の相対的な増大が明らかになった（図３Ｄ）。中央値の６０日齢（実験エンドポイント）におけるｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓで処置したマウスの膵臓では、なお、対照マウスと比較して改善された病理組織学的特徴が実証された（図７Ｂ）。ＢＪヒト線維芽細胞に由来するエキソソームを使用して、ＧＥＭＭを用いた実験を最初に行った。ＧＥＭＭにおけるｓｉＲＮＡ  ｅｘｏｓの有効性における種差の潜在的影響に取り組むために、同系線維芽細胞をＰＫＴマウスの膵臓から単離し、ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓをこれらの初代細胞培養物から生成した。マウス線維芽細胞由来ｓｉＲＮＡ  ｅｘｏｓを使用した場合に、ＢＪ線維芽細胞由来ｓｉＲＮＡ  ｅｘｏｓを使用した場合および対照ｅｘｏｓで処置したマウスと比較して、生存、腫瘍量、および病理組織学的特徴の同様の改善が認められた���図３Ｅ〜Ｆ；図７Ｃ）。ｓｉＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｅｘｏｓでの処置により、ＰＫＴマウスにおける膵癌進行に関連する線維形成反応が有意に低減した（ＰＫＴ腫瘍における線維症に関連する細胞外マトリックス沈着が低減し、ＴＵＮＥＬ染色によってアッセイされる癌細胞アポトーシスが増大し、癌細胞増殖が低減し（Ｋｉ６７染色の低減））、また、腫瘍におけるリン酸化ＥＲＫおよびリン酸化ＡＫＴ染色が低減した（図３Ｇ、図７Ｄ）。
【０１７５】
（実施例２）
ＣＤ４７により、循環単球によるエキソソームの取り込みが妨げられる
循環単球は、リポソーム（１００ｎｍ；Ｅｎｃａｐｓｕｌａ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）を貪食するが、エキソソームは貪食しないことが見いだされた（図８Ａ〜８Ｂ）。ＢＪ線維芽細胞から単離されたエキソソームは、それらの表面にＣＤ４７を含むことが見いだされたが（図９Ａおよび９Ｃ）、リポソームは、それらの表面にＣＤ４７を欠くことが決定された（図９Ｂ）。エキソソームを抗ＣＤ４７抗体で処理することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける循環単球による、エキソソームの取り込みが刺激されることが見いだされた（図１０）。
【０１７６】
本明細書において開示され、特許請求されている方法は全て、本開示に照らして、過度な実験を伴わずに作製し実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および方法のステップまたは一連のステップに変形を適用することができることが当業者には明らかになろう。より詳細には、化学的にかつ生理的に関連するある特定の薬剤で本明細書に記載されている薬剤を置換することができるが、同じまたは同様の結果が達成されることが明らかになろう。当業者に対して明らかであるそのような同様の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の主旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【０１７７】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されている事項を補足する例示的な手続き上のまたは他の詳細をもたらす範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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