(57)【要約】本発明は、肝臓特異的調節エレメントおよびコドン最適化第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子を含む核酸発現カセットおよびベクター、これらの発現カセットおよびベクターを使用する方法、ならびにこれらの使用に関する。本発明は、特に、血友病ＡおよびＢの治療のために、肝臓指向性遺伝子治療を用いる適用に特に有用である。
2018513678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓特異的プロモーターおよび導入遺伝子に動作可能に連結された、
配列番号５により定義される核酸断片、または前記配列と９５％以上の同一性を有する配列を含んでなる、またはからなる肝臓特異的核酸調節エレメントの好ましくはタンデムに配置されたトリプルリピート、および
配列番号１２により定義される核酸断片、または前記配列と９５％以上の同一性を有する配列を含んでなる、またはからなる核酸調節エレメント
を含んでなる、核酸発現カセット。
【請求項２】
前記肝臓特異的プロモーターが、最小ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍ）、ＡＡＴプロモーター、アルブミン（ＡＬＢ）プロモーターまたは最小プロモーター、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）プロモーターまたは最小プロモーター、補体因子Ｂ（ＣＦＢ）プロモーター、ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）プロモーター、ヘモペキシン（ＨＰＸ）プロモーターまたは最小プロモーター、ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）プロモーターまたは最小プロモーター、（肝臓）カルボキシルエステラーゼ１（ＣＥＳ１）プロモーターまたは最小プロモーター、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）プロモーターまたは最小プロモーター、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）プロモーターまたは最小プロモーター、マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ２）プロモーターまたは最小プロモーター、ヘプシジン抗菌ペプチド（ＨＡＭＰ）プロモーターまたは最小プロモーター、またはＳｅｒｐｉｎペプチダーゼ阻害因子、クレードＣ（アンチトロンビン）、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＣ１）プロモーターまたは最小プロモーターを含んでなる群から選択される、請求項１に記載の核酸発現カセット。
【請求項３】
前記肝臓特異的プロモーターが、配列番号６により定義される最小ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍ）である、請求項１または２に記載の核酸発現カセット。
【請求項４】
前記肝臓特異的プロモーターが、配列番号６４により定義されるＡＡＴプロモーターである、請求項１または２に記載の核酸発現カセット。
【請求項５】
前記トリプルリピートが、配列番号１１により定義される核酸断片または前記配列と９５％以上の同一性を有する配列からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【請求項６】
導入遺伝子に動作可能に連結された配列番号１３により定義される調節エレメント、より好ましくは、プロモーターおよび導入遺伝子に動作可能に連結された配列番号５７により定義される調節エレメントを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【請求項７】
前記導入遺伝子が凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードし、好ましくは、前記導入遺伝子がコドン最適化凝固因子ＦＩＸであるか、または前記凝固因子ＦＩＸが高活性化変異を含み、好ましくは、前記高活性化変異がＲ３３８Ｌアミノ酸置換に相当し、より好ましくは凝固因子ＦＩＸをコードする前記導入遺伝子が配列番号９により定義される塩基配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【請求項８】
前記導入遺伝子が凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードし、好ましくは、前記導入遺伝子がコドン最適化凝固因子ＦＶＩＩＩであるか、または前記凝固第ＶＩＩＩ因子がＢドメインの欠失を有し、好ましくは、前記ＦＶＩＩＩのＢドメインが配列番号５９により定義されるリンカーで置換されており、より好ましくは凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする前記導入遺伝子が配列番号１８により定義される塩基配列を有する、請求項１〜７のい
ずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【請求項９】
前記プロモーターがトランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターであり、配列番号６９により定義されるＴＴＲｅおよびＴＴＲｍ核酸の組合せを含んでなる、請求項１〜３および５〜８のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【請求項１０】
マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、好ましくは配列番号８により定義されるＭＶＭイントロンをさらに含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【請求項１１】
ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）、好ましくは配列番号１０により定義されるＢＧＨｐＡに由来する、もしくはシミアンウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐＡ）、好ましくは配列番号１９により定義されるＳＶ４０ｐＡに由来する転写終結シグナル、または配列番号５６により定義される合成ポリアデニル化シグナルをさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸発現カセットを含んでなるベクターであって、好ましくは、前記ベクターがウイルスベクターであり、より好ましくは、前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する、ベクター。
【請求項１３】
血友病Ａの治療に使用するためのＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含んでなる、請求項１２に記載のベクター、または血友病Ｂの治療に使用するためのＦＩＸ導入遺伝子を含んでなる、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターの対象への形質導入またはトランスフェクション後に、前記対象における１０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療閾値濃度以上の血漿中の第ＩＸ因子またはＦＶＩＩＩのレベルが得られる、請求項１３に記載の使用のためのベクター。
【請求項１５】
前記対象への前記ウイルスベクターの前記形質導入が、２×１０１１ｖｇ／ｋｇ未満の用量で行われる、請求項１４に記載の使用のためのベクター。
【請求項１６】
前記対象への前記ウイルスベクターの前記形質導入が、６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われ、１００ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中の第ＩＸ因子もしくはＦＶＩＩＩのレベルが前記対象において得られる、または、
前記対象への前記ウイルスベクターの前記形質導入が、６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われ、５０ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中の第ＩＸ因子もしくはＦＶＩＩＩのレベルが、前記対象において得られる、または、
前記対象への前記ウイルスベクターの前記形質導入が、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われ、２００ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中の第ＩＸ因子もしくはＦＶＩＩＩのレベルが、前記対象において得られる、または、
前記対象への前記ウイルスベクターの前記形質導入が、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行われ、１５０ｍＵ／ｍｌの治療濃度以上の血漿中の第ＩＸ因子もしくはＦＶＩＩＩのレベルが、前記対象において得られる、
請求項１５に記載の使用のためのベクター。
【請求項１７】
前記ベクター中の前記導入遺伝子がＦＶＩＩＩである場合に、血友病Ａを治療するための活性成分を任意でさらに含んでなり、または、
前記ベクター中の前記導入遺伝子がＦＩＸである場合に、血友病Ｂを治療するための活性成分を任意でさらに含んでなる、
請求項１２に記載のベクターと、薬剤的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓特異的発現能力が向上した遺伝子治療のための核酸発現カセットおよび発現ベクターに関し、詳細には、血友病の治療のための遺伝子治療手段としての使用のための、より詳細には、凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および/または凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠乏をそれぞれ血友病Ｂおよび血友病Ａの肝臓指向性遺伝子治療において回復させるための、核酸発現カセットおよび発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ｂは、凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の欠乏によって引き起こされるＸ連鎖性の劣性出血性疾患である。血友病Ａは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠乏または完全な欠如によって引き起こされる重篤な出血性疾患である。血友病ＡおよびＢの臨床所見は、特発出血および長期出血のエピソードによって特徴付けられる。５，０００人に１人、２０，０００人に１人が、それぞれ血友病ＡおよびＢに罹患していると推定されている。現在、血友病ＡおよびＢは、血漿由来または組換えＦＶＩＩＩまたはＦＩＸのいずれかを用いたタンパク質補充療法で治療されている。タンパク質の補充は血友病に罹患している患者の平均余命を著しく向上させたが、予防的治療は、半減期が短いこと、入手しにくいこと、および精製凝固因子が高コストであり、１００，０００ドル／患者／年に達し得ることによって制限されているため、患者は、重度の出血エピソードおよび慢性的な関節損傷のリスクに依然としてさらされている。さらに、汚染された血液源から得られた血漿由来因子の使用は、ウイルス伝播のリスクを増加させる。治療濃度域が比較的広く、通常の生理的レベルの１％をわずかに上回るレベルが治療的であるため、遺伝子治療は、血友病Ｂの新しい治療法の可能性を与える。成功した場合、遺伝子治療は、この疾患の治癒をもたらす可能性のある定常性のＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの合成を与え得る。血友病の遺伝子治療のための様々な様式が広範にレビューされている（非特許文献１〜３;４;５，６;７，８）。
【０００３】
血友病Ａおよび血友病Ｂの重症度は、国際血栓止血学会の標準化委員会（the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis ）の第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の小委員会によって、それぞれＦＶＩＩＩレベルおよびＦＩＸレベルに応じて３つの型に分類されている：１）重症型（ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸレベルが０．０１国際単位（ＩＵ）／ｍｌ未満、すなわち正常ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸレベルの１％未満）、２）中等度型（ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸレベルが０．０１〜０．０５ＩＵ／ｍｌ、すなわち正常ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸレベルの１〜５％）、および３）軽度型（ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸレベルが０．０５〜０．４ＩＵ／ｍｌより高い、すなわち正常ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸレベルの５〜４０％より高い）。血友病Ａは、最も一般的な遺伝性凝固障害であり、発生率は男性で５０００人に１人に近づいている。
【０００４】
精製または組換えＦＶＩＩＩおよびＦＩＸを用いるタンパク質補充療法（ＰＳＴ）は、患者のクオリティオブライフを有意に改善した。しかし、ＰＳＴは根治的ではなく、患者は、依然として、生命を脅かす可能性のある出血および深刻な関節の炎症を発症するリスクがある。残念なことに、血友病Ａに罹患している多くの患者（４０％以下）は、ＰＳＴ後にＦＶＩＩＩに対する中和抗体（すなわち、「抑制因子」）を発生する。同様に、血友病Ｂに罹患している患者の推定１０％が、ＦＩＸに対する「抑制因子」を発生する。これらの抑制因子は、出血エピソードの管理を複雑にし、さらなるＰＳＴを無効にする可能性がある。ＰＳＴのこれらの制限は、血友病治療のための潜在的な代替手段としての遺伝子治療の開発を正当化する。さらに、ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩ血漿中濃度のほんの軽度の上
昇が治療上の利益のために必要であり、正常レベルの１％を超えるレベルで、特発出血および長期関節症の発生率の著しい低下を達成できる。
【０００５】
肝臓は、ＦＩＸおよびＦＶＩＩＩ合成の主要な生理学的部位であり、したがって、肝実質細胞は、血友病遺伝子治療によく適している標的細胞である。この場所から、ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩタンパク質は、容易に循環に入ることができる。さらに、肝臓ニッチは、導入遺伝子産物に対する免疫寛容の誘導に有利であり得る（非特許文献９;１０;１１;１２;１３;１４）。血友病の肝臓指向性遺伝子治療は、レトロウイルス（非特許文献１５;１６;１７;１８，１９）、レンチウィルス（非特許文献２０;１１;１３）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（非特許文献１２）、およびアデノウイルス（非特許文献２１;２２）のベクターを含む様々なウイルスベクターで達成され得る。特に、ＡＡＶは、一本鎖ＤＮＡゲノムを有する天然の複製欠損非病原性ウイルスである。ＡＡＶベクターは、好ましい安全性プロファイルを有し、持続的導入遺伝子発現を達成することができる。長期発現は、エピソームに保持されたＡＡＶゲノムによって支配的に媒介される。安定して形質導入されたベクターゲノムの９０％以上が、染色体外にあり、主に高分子量コンカテマーとして構成されている。したがって、特に、形質導入細胞の選択的拡大が起こらないと予想される血友病遺伝子治療において、挿入性腫瘍形成のリスクは最小限である。それにもかかわらず、腫瘍形成イベントは、ＡＡＶをベースとする遺伝子導入後に報告されている（非特許文献２３）が、他のモデル系ではこれらの知見を再現することは困難であった（非特許文献２４）。ＡＡＶベクターの主な制限は、機能的ベクターを得るために導入遺伝子発現カセットのサイズを制約するベクター粒子の制限されたパッケージング能力（すなわち、ＡＡＶ逆位末端リピートを含む約５．０ｋｂ）である（非特許文献２５）。血友病遺伝子治療用の大部分のベクターは最も流行していたＡＡＶ血清型２に当初由来していたが、ヒトおよび非ヒト霊長類からいくつかの免疫学的に異なるＡＡＶ血清型が単離されている（非特許文献２６，２７）。先天盲に対するＡＡＶベースの遺伝子治療の最初の臨床上の成功は、この遺伝子導入技術の可能性を強調する（非特許文献２８）。
【０００６】
ＡＡＶ媒介性の肝臓遺伝子導入は、肝臓および筋肉の両方への指向性遺伝子治療のための血友病の遺伝子治療の魅力的な代替方法である(非特許文献２９，１２，３０;３１;３２;３３;２５;３４)。血友病のネズミおよびイヌモデルまたは非ヒト霊長類におけるＡＡＶベクターを用いた前臨床試験では、持続性の治療的発現が示され、血友病モデルにおいて出血表現型の部分的または完全な矯正がもたらされた（非特許文献３５，３６;３７，３８;３９;４０）。特に、肝臓の形質導入は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導を必要とするＦＩＸに対する免疫寛容を好都合に誘導する（非特許文献４１;４２）。肝臓指向性ＡＡＶ２−ＦＩＸ遺伝子治療で治療された抑制因子易発性ヌル変異血友病Ｂのイヌにおいて、抑制因子の発生のない血友病表現型の長期間の矯正が達成された（非特許文献３９）。ベクター用量をさらに減少させるために、より強力なＦＩＸ発現カセットが開発されている。これは、ＡＡＶ形質導入における制限工程の１つ（すなわち、一本鎖から二本鎖ＡＡＶへの変換）を克服する、より強力なプロモーター／エンハンサーエレメント、コドン最適化ＦＩＸ、または自己相補的二本鎖ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）を用いることにより達成され得る(非特許文献４３，４４;４０,４５，４６;４７)。肝実質細胞への形質導入を増加させ、核内ベクター移入を向上し、Ｔ細胞活性化のリスクを低下させ得る代替ＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ８またはＡＡＶ５）を使用し得る（非特許文献２６;４８）が、エピトープが別個のＡＡＶ血清型間で保存されているので、このことが、必然的にヒト対象にも応用されることは確実ではない（非特許文献４９）。ＡＡＶ８またはＡＡＶ９を用いた血友病Ｂのための肝臓指向性遺伝子治療は、少なくともマウスにおいてレンチウイルスベクターが使用される場合よりも効率的であり、炎症が少なくなる（非特許文献５０，５１）。さらに、最近の研究は、表面に露出したチロシン残基の変異により、ベクター粒子がリン酸化およびそれに続くユビキチン化を回避し、それにより、プロテアソーム媒介性の分解を防ぎ、その結果として、マウスにおけるＦＩＸの肝臓発現が１０倍増加する
ことを示している（非特許文献５２）。
【０００７】
これらの肝臓指向性前臨床試験は、重症血友病Ｂを罹患している患者の臨床遺伝子治療にＡＡＶベクターを使用する道を開いた。ＡＡＶ−ＦＩＸベクターの肝臓送達は、肝動脈カテーテル法によりＡＡＶ−ＦＩＸを受けている対象における一過性治療的ＦＩＸレベル（正常レベルの最大１２％）をもたらした（非特許文献３４）。しかしながら、形質導入された肝実質細胞は、ＭＨＣクラスＩによってＡＡＶカプシド由来抗原をＴ細胞に提示することができた（非特許文献５３;４９）。抗原提示は中程度であったが、Ｔ細胞媒介性破壊のために形質導入された肝実質細胞にフラグを立てるには十分であった。最近、血友病のための遺伝子治療が重要な一歩を踏み出した（非特許文献４６;５４）。重症血友病Ｂ（＜１％ＦＩＸ）に罹患している対象に、肝臓特異的プロモーターからコドン最適化ＦＩＸを発現する自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ８ベクターを静脈内注射した。このＡＡＶ８血清型は、既存の抗ＡＡＶ２抗体との交差反応性の低下を示す。興味深いことに、樹状細胞によるその取り込みは、従来のＡＡＶ２ベクターと比較して減少し、Ｔ細胞活性化の低下をもたらし得る（非特許文献４８）。マウスでは、ＡＡＶ８は、ＡＡＶ２と比較して、肝臓の形質導入の実質的な増加を可能にするが、この利点は、イヌ、アカゲザル、およびヒトのような高等動物において失われる可能性がある。対象は、ｓｃＡＡＶ８−ＦＩＸベクターの漸増用量を受け、用量当たり対象は２であった。治療された全対象は、ベクター投与後数ヶ月間、治療的１％の閾値を上回るＦＩＸを発現し、持続的な可変の発現レベル（すなわち正常レベルの２〜１１％）を生じた。これまでの肝臓指向性ＡＡＶ試験との主な相違点は、始めて、持続する治療的ＦＩＸレベルが、遺伝子治療後に達成され得たことである。この進歩にもかかわらず、ＡＡＶ形質導入肝実質細胞のＴ細胞を介した排除が、一部の患者における肝臓酵素レベルの上昇と一致して、依然として懸念される。短期間のグルココルチコイド過程を用いる一過性免疫抑制を、このベクター特異的免疫応答を制限する試みで使用した。
【０００８】
遺伝子治療による血友病Ａの治療のための効率的なウイルス遺伝子送達系の生成における重大な制限の１つは、ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡのサイズが大きいことである。これまでの血友病Ａのためのウイルスベクターをベースとする遺伝子治療研究は、通常、小さいが弱いプロモーターの使用に依存しており、臨床的に関連性のない過剰なベクター用量を必要としたか、またはベクター力価が著しく損なわれていた。ＡＡＶのパッケージング制約を克服するためのスプリットまたはデュアルベクターデザインの使用など、他のいくつかのアドホック戦略が検討されたが、これらのアプローチは全体的に比較的非効率的であり、さらなる免疫原性の懸念を提起した（非特許文献５５でレビューされている）。ＦＶＩＩＩ  Ｂドメインは凝血促進活性のために必要でないことが分かっている。その結果、Ｂドメインが欠失したＦＶＩＩＩコンストラクトは、そのより小さいサイズがより容易にベクターに取り込まれるため、遺伝子導入の目的で使用される。さらに、Ｂドメインの欠失は、ｍＲＮＡおよび一次翻訳産物の１７倍の増加をもたらすことが示されている。Ｂドメインが欠失し、短い１４アミノ酸リンカーで置換されたＦＶＩＩＩは、現在、組換え産物として産生され、臨床使用のためのＲｅｆａｃｔｏ（登録商標）として市販されている（Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａ）（非特許文献５６）。Ｍｉａｏら（２００４）（非特許文献５７）は、分泌を向上させるために、短いＢドメイン配列を、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩに、最適には２２６アミノ酸に加え戻し、Ｎ結合型グリコシル化のための６つの部位を保持した。ＭｃＩｎｔｏｓｈら（２０１３）（非特許文献５８）は、Ｍｉａｏらの２２６アミノ酸スペーサーを、Ｂドメインからの６つのグリコシル化トリプレットが並置された１７アミノ酸ペプチドで置換した。しかし、治療目的にはまだ産生が十分ではなかった。
【０００９】
非ウイルスベクターは、通常、トランスフェクションを容易にする物理化学的方法と潜在的に関連して、裸のＤＮＡのみが送達されるプラスミドをベースとする遺伝子送達系に依存する。その結果、非ウイルスアプローチは、先天性免疫応答が依然として起こり得る
が、免疫原性が低くなり、ウイルスベクターよりも潜在的に安全であり得る。非ウイルス遺伝子導入法は単純であるが、効率性は、大部分のウイルスベクター媒介遺伝子導入アプローチと比較して一般的に低い。非ウイルスベクターの効率的なインビボでの遺伝子送達はボトルネックのままである。通常、肝臓遺伝子送達のために、プラスミドは流体力学的注射によって投与される。この場合、対象の遺伝子を肝臓に送達するために、大量のＤＮＡ液を循環系に急速注射することによって、流体力学的圧力が生じる（非特許文献５９）。遺伝子導入のための局所的な流体力学的圧力を維持しながら注射量を減少させることにより、流体力学的注射を臨床的に意義のある様式に適合させる努力がなされている。ターゲティング可能なナノ粒子をベースとする代替のアプローチが、肝実質細胞へのＦＩＸの標的特異的送達を達成するために探索されている。発現は、長期発現を妨げる細菌のバックボーン配列（すなわち、ミニサークルＤＮＡ）を除去することによって延長され得る。最後に、非ウイルストランスフェクション後のＦＩＸ発現の安定性を高めるために、安定なゲノム導入遺伝子の組み込みをもたらすトランスポゾンを使用し得る。我々およびその他の者は、インビボでの遺伝子治療後に安定な凝固因子発現を得るために、トランスポゾンを使用し得ることを示した（非特許文献６０;６１,６２;６３;６４）。
【００１０】
ＦＩＸの肝臓特異的発現のための最先端技術のベクターの一例が、特許文献１に記載されており、因子ｃＤＮＡを駆動するＴＴＲ／Ｓｅｒｐ調節配列を含む一本鎖ＡＡＶベクターから構成されている。ＦＩＸ第１イントロンは、ポリアデニル化シグナルとともにベクターに含まれていた。前記改良されたベクターを使用すると、約２５〜３０％の安定な循環する第ＩＸ因子が得られた。
【００１１】
血友病のためのウイルスベクターをベースとする遺伝子治療を臨床に応用するためには、大量のベクター用量を肝臓に投与することに伴う安全性の懸念、および大量の臨床グレードのベクターを製造する必要性に対処しなければならない。これらの目標を達成するには、遺伝子導入ベクターの効力（用量当たりの効果）を高めることが重要である。このことは、低用量を使用して治療効果を得ることを可能にし、それにより、インビボ投与に伴う潜在毒性および免疫活性化を低減し、製造ニーズを緩和し得る。
【００１２】
効力を高める一つの方法は、ベクターコピー当たりの発現および生物学的活性を最大にするように導入遺伝子配列自体を設計することである。我々は、コドン使用のために最適化され、凝固亢進および血栓形成傾向に関連するＲ３３８Ｌアミノ酸置換を保有するＦＩＸ導入遺伝子（非特許文献６５）が、検出可能な副作用なしに、レンチウイルスベクターを用いる遺伝子治療の効果を血友病Ｂマウスにおいて最大１５倍増加させ、治療効果を達成するための用量要件を実質的に減少させ、それにより、将来のスケールアップおよびその臨床への応用を促進することを示した（非特許文献６６,６７）。
【００１３】
ヒト第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのコドン最適化も高レベルの発現をもたらす。コドン最適化ｃＤＮＡ配列からＦＶＩＩＩを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した新生児血友病Ａマウスの血漿において、有意に高いレベル（最大４４倍の増加、かつ正常ヒトレベルの２００％を超えるレベル）の活性ＦＶＩＩＩタンパク質が検出され、疾患モデルを成功裏に矯正した（非特許文献２０）。
【００１４】
特許文献２において、ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩをコードするコドン最適化導入遺伝子とロバストなＳｅｒｐｉｎエンハンサーを組み合わせ、それぞれＦＩＸおよびＦＶＩＩＩの肝臓特異的発現の増加をもたらす発現ベクターが記載されている。
【００１５】
本発明の目的は、血友病ＡおよびＢのための肝臓指向性遺伝子治療の有効性および安全性をさらに高めることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００９／１３０２０８号
【特許文献２】国際公開第２０１４／０６４２７７号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Chuah et al., 2012a
【非特許文献２】Chuah et al., 2012b
【非特許文献３】Chuah et al., 2012c
【非特許文献４】VandenDriessche et al., 2012
【非特許文献５】High 2001
【非特許文献６】High 2011
【非特許文献７】Matrai et al., 2010a
【非特許文献８】Matrai et al., 2010b
【非特許文献９】Annoni et al., 2007
【非特許文献１０】Follenzi et al., 2004
【非特許文献１１】Brown et al., 2007
【非特許文献１２】Herzog et al., 1999
【非特許文献１３】Matrai et al., 2011
【非特許文献１４】Matsui et al., 2009
【非特許文献１５】Axelrod et al., 1990
【非特許文献１６】Kay et al., 1992
【非特許文献１７】VandenDriessche et al., 1999
【非特許文献１８】Xu et al., 2003
【非特許文献１９】Xu et al., 2005
【非特許文献２０】Ward et al., 2011
【非特許文献２１】Brown et al., 2004
【非特許文献２２】Ehrhardt & Kay, 2002
【非特許文献２３】Donsante et al., 2007
【非特許文献２４】Li et al., 2011
【非特許文献２５】Jiang et al., 2006
【非特許文献２６】Gao et al., 2002
【非特許文献２７】Gao et al., 2004
【非特許文献２８】Bainbridge et al., 2008
【非特許文献２９】Herzog et al., 1997
【非特許文献３０】Herzog et al., 2002
【非特許文献３１】Arruda et al., 2010
【非特許文献３２】Fields et al., 2001
【非特許文献３３】Buchlis et al., 2012
【非特許文献３４】Kay et al., 2000
【非特許文献３５】Snyder et al., 1997
【非特許文献３６】Snyder et al., 1999
【非特許文献３７】Wang et al., 1999
【非特許文献３８】Wang et al., 2000
【非特許文献３９】Mount et al., 2002
【非特許文献４０】Nathwani et al., 2002
【非特許文献４１】Mingozzi et al., 2003
【非特許文献４２】Dobrzynski et al., 2006
【非特許文献４３】McCarty, 2001
【非特許文献４４】McCarty, 2003
【非特許文献４５】Nathwani et al., 2006
【非特許文献４６】Nathwani et al., 2011
【非特許文献４７】Wu et al., 2008
【非特許文献４８】Vandenberghe et al., 2006
【非特許文献４９】Mingozzi et al., 2007
【非特許文献５０】VandenDriessche et al., 2007
【非特許文献５１】VandenDriessche et al., 2002
【非特許文献５２】Zhong et al., 2008
【非特許文献５３】Manno et al., 2006
【非特許文献５４】Commentary by VandenDriessche & Chuah, 2012
【非特許文献５５】Petrus et al., 2010
【非特許文献５６】Sandberg et al., 2001
【非特許文献５７】Miao et al., 2004
【非特許文献５８】MccIntosh et al., 2013
【非特許文献５９】Miao et al., 2000
【非特許文献６０】Yant et al., 2000
【非特許文献６１】Mates, Chuah et al., 2009
【非特許文献６２】VandenDriessche et al., 2009
【非特許文献６３】Kren et al.,2009
【非特許文献６４】Ohlfest et al., 2004
【非特許文献６５】Simioni et al.,2009
【非特許文献６６】Cantore et al., 2012
【非特許文献６７】Nair et al., 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、血友病Ｂのための肝臓指向性遺伝子治療の有効性および安全性を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記の目的は、導入遺伝子、好ましくはヒトＦＩＸ、好ましくは高活性化変異を含むヒトＦＩＸをコードするコドン最適化導入遺伝子の使用と組み合わせて、組織特異性を維持しながら、肝臓指向性遺伝子発現を高める特異的調節エレメントを含んでなる、核酸発現カセットと、ウイルスベクター、特にＡＡＶベースのベクター、または非ウイルスベクターのいずれかのベクターとを与えることによって達成される。
【００２０】
得られたベクターおよび核酸発現カセットは、調節エレメントのその独特の組合せにより、肝臓における予想外に高いＦＩＸの発現レベルをもたらす。これらのエレメントの複合効果は予測できなかった。これまで、我々は、他のベクターエレメントとの併用で、ＦＩＸレベルが２０倍を超えて増加することを示す新しい調節エレメントについて報告した（国際公開第２０１４／０６４２７７号参照）。本発明では、３コピーのｓｅｒｐｉｎエンハンサーを公知の天然ＴＴＲエンハンサーと組み合わせることにより、ＦＩＸ発現が６〜１０倍さらに増加することが示されている。ｈＦＩＸ活性のこの増加は、相乗的であることが示された。本発明の別の目的は、血友病Ａのための肝臓指向性遺伝子治療の有効性および安全性を高めることである。実験の節に示すように、この目的は、コドン最適化ヒトＦＶＩＩＩコンストラクト、特に、最小トランスサイレチンプロモーターから駆動されるコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩコンストラクトの使用と組み合わせて、組織特異性を維持しながら、肝臓指向性遺伝子発現を高める特異的調節エレメントを有する核酸発現カセットを含んでなる、ウイルスベクター、特にＡＡＶベースのベクター、または非ウイルスベクターのいずれかのベクターを与えることによって達成される。得られたＡＡ
Ｖをベースとするベクターおよび核酸発現カセットは、前例のない、生理的レベルを超えるＦＶＩＩＩ発現レベルをもたらした（国際公開第２０１４／０６４２７７号参照）。本発明者らは、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーの３コピーと天然ＴＴＲエンハンサーとの特定の組み合わせと、最小トランスサイレチンプロモーターから駆動されるコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ導入遺伝子またはコドン最適化ｐａｄｕａ変異ＦＩＸ導入遺伝子とが、天然ＴＴＲエンハンサーおよび最小トランスサイレチンプロモーターから駆動されるコドン最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ導入遺伝子またはコドン最適化ｐａｄｕａ変異ＦＩＸ導入遺伝子を含む発現カセットと比べて、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ発現レベルに対して相乗効果を与える。
【００２１】
配列番号５により定義されるＳｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプルリピートと配列番号１２により定義されるトランスサイレチンエンハンサーとの組み合わせは、それに動作可能に連結された導入遺伝子の発現を増加させることにおいて予想外に強力であることが示されている。前記調節エレメントは、配列番号１３によって定義される。前記調節エレメントは、配列番号６によって定義されるトランスサイレチン最小プロモーターとさらに組み合わせることができる。これにより、例えば、配列番号６９により定義される、３×ＳｅｒｐＥｎｈ（３×配列番号５、例えば配列番号１１など）とＴＴＲｅおよびＴＴＲｍ核酸配列との組み合わせが作製される。例えば、このようなコンストラクトは、本明細書中に示されているように、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ導入遺伝子の両方の発現を増加させるかどうか試験された配列番号５８により定義される調節エレメントをもたらす。
【００２２】
したがって、本発明は、以下の態様を与える。
態様１  プロモーターおよび導入遺伝子、好ましくはコドン最適化導入遺伝子に動作可能に連結された、配列番号５により定義される核酸断片、または前記配列と９５％以上の同一性を有する配列を含んでなる、またはからなる肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくは、配列番号５により定義される核酸断片、または前記配列と９５％以上の同一性を有する配列を含んでなる、またはからなる１５０ヌクレオチド以下の肝臓特異的核酸調節エレメントのトリプルリピート、好ましくはタンデムリピート、より好ましくは、配列番号１１により定義される調節エレメント（３×ＳＥＲＰ）を含んでなる核酸発現カセットであって、前記プロモーターが肝臓特異的プロモーターである、前記核酸発現カセット。
【００２３】
前記プロモーターは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターに由来することが好ましく、前記プロモーターは、配列番号６により定義される最小ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍ）であることがより好ましい。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、前記肝臓特異的プロモーターは、例えば配列番号６４により定義される、ＡＡＴプロモーターに由来する。
【００２５】
他の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターまたはＴＴＲ最小プロモーター（ＴＴＲｍ）、アルファ１−抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、アルブミンプロモーター（ＡＬＢ）または最小アルブミンプロモーター（ＡＬＢｍ）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）プロモーター、補体因子Ｂ（ＣＦＢ）プロモーター、ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）プロモーター、ヘモペキシン（ＨＰＸ）プロモーター、ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）プロモーター、（肝臓）カルボキシルエステラーゼ１（ＣＥＳ１）プロモーター、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）プロモーター、マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ２）プロモーター、ヘプシジン抗菌ペプチド（ＨＡＭＰ）プロモーター、またはｓｅｒｐｉｎペプチダーゼ阻害因子、クレードＣ（アンチトロンビン）、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＣ１）プロモーターを含んでなる群から選択される。
【００２６】
態様２  配列番号１２により定義される核酸断片、または前記配列と９５％以上の同一性を有する配列を含んでなる、またはからなる核酸調節エレメント、好ましくは配列番号１２により定義される核酸断片（ＴＴＲｅ）、または前記配列との９５％以上の同一性を有する配列を含んでなる、またはからなる１５０ヌクレオチド以下の核酸調節エレメントをさらに含んでなる、態様１に記載の核酸発現カセット。好ましい実施形態では、ＴＴＲｅおよびＴＴＲｍ核酸モジュールの組み合わせは、配列番号６９により定義される。
【００２７】
態様３  プロモーターおよび導入遺伝子に動作可能に連結された、配列番号１３により定義される核酸調節エレメント、好ましくは、配列番号５７により定義される核酸調節エレメント、または導入遺伝子に動作可能に連結された配列番号５８により定義される核酸調節エレメントを含んでなる、態様２に記載の核酸発現カセット。
【００２８】
態様４  前記導入遺伝子が凝固第ＶＩＩＩ因子または凝固第ＩＸ因子をコードする、態様１〜３のいずれか一つに記載の核酸発現カセット。
【００２９】
態様５  前記凝固第ＶＩＩＩ因子がＢドメインの欠失を有する、態様４に記載の核酸発現カセット。
【００３０】
態様６  前記ＦＶＩＩＩの前記Ｂドメインが配列番号５９により定義されるリンカーで置換されている、態様５に記載の核酸発現カセット。
【００３１】
態様７  凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする前記導入遺伝子が、配列番号１８により定義される、態様４〜６のいずれか一つに記載の核酸発現カセット。
【００３２】
態様８  前記凝固第ＩＸ因子が高活性化変異を含む、態様４に記載の核酸発現カセット。
【００３３】
態様９  凝固第ＩＸ因子中の前記高活性化変異がＲ３３８Ｌアミノ酸置換に相当する、態様８に記載の核酸発現カセット。
【００３４】
態様１０  凝固第ＩＸ因子をコードする前記導入遺伝子が、配列番号９により定義される、態様４、８、または９のいずれか一つに記載の核酸発現カセット。
【００３５】
態様１１  前記プロモーターが、肝臓特異的プロモーター、好ましくはトランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターに由来するプロモーター、好ましくは配列番号６により定義される最小ＴＴＲプロモーターである、態様１〜１０のいずれか一つに記載の核酸発現カセット。
【００３６】
態様１２  マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、好ましくは配列番号８により定義されるＭＶＭイントロンをさらに含んでなる、態様１〜１１のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
【００３７】
態様１３  ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）、好ましくは配列番号１０により定義されるＢＧＨｐＡに由来する、もしくはシミアンウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐＡ）、好ましくは配列番号１９により定義されるＳＶ４０ｐＡに由来する転写終結シグナル、または合成ポリアデニル化シグナル、好ましくは配列番号５６により定義される合成ポリアデニル化シグナルをさらに含んでなる、態様１〜１２のいずれか一つに記載の核酸発現カセット。
【００３８】
態様１４  態様１〜１３のいずれか一つに記載の核酸発現カセットを含んでなるベクター。
【００３９】
態様１５  前記ベクターがウイルスベクターである、態様１４に記載のベクター。
【００４０】
態様１６  前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する、態様１５に記載のベクター。
【００４１】
態様１７  前記ベクターが、一本鎖ＡＡＶベクター、好ましくは一本鎖ＡＡＶ血清型８ベクターである、態様１６に記載のベクター。
【００４２】
態様１８  配列番号１６、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３、好ましくは配列番号２２または配列番号２３、より好ましくは配列番号２２により定義される、態様１４〜１７のいずれか一つに記載のベクター。
【００４３】
態様１９  前記ベクターが、自己相補的ＡＡＶベクター、好ましくは自己相補的ＡＡＶ血清型９ベクターである、態様１６に記載のベクター。
【００４４】
態様２０  配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号２５、好ましくは配列番号４もしくは配列番号２５、より好ましくは配列番号４により定義される、態様１４〜１６もしくは１９のいずれか一つに記載のベクター、または、配列番号６５、配列番号６６、もしくは配列番号６８、好ましくは配列番号６５もしくは６８、より好ましくは配列番号６５により定義される態様１４〜１６もしくは１９のいずれか一つに記載のベクター。
【００４５】
態様２１  前記ベクターが、トランスポゾンをベースとするベクター（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）をベースとするベクターまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）をベースとするベクター）などの非ウイルスベクターである、態様１４に記載のベクター。
【００４６】
態様２２  態様１４〜１８または２１のいずれか一つに記載のベクターの対象への形質導入またはトランスフェクションを含んでなる、対象における１０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療閾値濃度以上の血漿中の第ＶＩＩＩ因子レベルを得る方法。
【００４７】
態様２３  態様１４〜１８または２１のいずれか一つに記載のベクターの対象への形質導入が、２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇ未満の用量で行われる、態様２２に記載の方法。
【００４８】
態様２４  態様１４〜１６または１９〜２１のいずれか一つに記載のベクターの対象への形質導入またはトランスフェクションを含んでなる、対象における１０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療閾値濃度以上の血漿中の第ＩＸ因子レベルを得る方法。
【００４９】
態様２５  態様１４〜１６または１９〜２１のいずれか一つに記載のベクターの対象への形質導入が、２×１０１１ｖｇ／ｋｇ未満の用量で行われる、態様２４に記載の方法。
【００５０】
態様２６  前記形質導入またはトランスフェクションが静脈内投与による、態様２２〜２５のいずれか一つに記載の方法。
【００５１】
態様２７  前記対象が、哺乳類対象、好ましくはヒト対象である、態様２２〜２６のいずれか一つに記載の方法。
【００５２】
態様２８  態様２２、２３、２６、または２７のいずれか一つに記載の方法を実施する
ことを含んでなる、哺乳類対象における血友病Ａの治療方法。
【００５３】
態様２９  血友病Ａを治療するための薬剤の製造のための態様１４〜１８または２１のいずれか一つに記載のベクターの使用。
【００５４】
態様３０  血友病Ａの治療において使用するための態様１４〜１８または２１のいずれか一つに記載のベクター。
【００５５】
態様３１  態様２４〜２７のいずれか一つに記載の方法を実施することを含んでなる、哺乳類対象における血友病Ｂの治療方法。
【００５６】
態様３２  血友病Ｂを治療するための薬剤の製造のための態様１４〜１６または１９〜２１のいずれか一つに記載のベクターの使用。
【００５７】
態様３３  血友病Ｂの治療において使用するための態様１４〜１６または１９〜２１のいずれか一つに記載のベクター。
【００５８】
態様３４  態様１４〜１８または２１のいずれか一つに記載のベクター、および薬剤的に許容できる担体を含んでなり、血友病Ａを治療するための活性成分を任意でさらに含んでなる、医薬組成物。
【００５９】
態様３５  血友病Ａの治療に使用するための態様３４に記載の医薬組成物。
【００６０】
態様３６  前記治療により、治療された対象の血漿中の第ＶＩＩＩ因子のレベルが、対象における１０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療閾値濃度以上となる、態様３５に記載の使用のための医薬組成物、または態様３０に記載の使用のためのベクター。
【００６１】
態様３７  前記治療が、態様１４〜１８のいずれか一つに記載のベクターの、２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量での前記対象への形質導入を含んでなる、態様３５もしくは３５のいずれか一つに記載の使用のための医薬組成物、または態様３０もしくは３６のいずれか一つに記載の使用のためのベクター。
【００６２】
態様３８  態様１４〜１６、１９〜２１のいずれか一つに記載のベクター、および薬剤的に許容できる担体を含んでなり、血友病Ｂを治療するための活性成分を任意でさらに含んでなる、医薬組成物。
【００６３】
態様３９  血友病Ｂの治療に使用するための態様３８に記載の医薬組成物。
【００６４】
態様４０  前記治療により、治療された対象の血漿中の第ＩＸ因子のレベルが、対象における１０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療閾値濃度以上、好ましくは対象における５０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療濃度以上、より好ましくは対象における１００ｍＵ／ｍｌ血漿の治療濃度以上、さらにより好ましくは対象における１５０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療濃度以上、さらにより好ましくは対象における２００ｍＵ／ｍｌ血漿の治療濃度以上となる、態様３９に記載の使用のための医薬組成物、または態様３３に記載の使用のためのベクター。
【００６５】
態様４１  前記治療が、態様１４〜１６、１９または２０のいずれか一つに記載のベクターの、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量での、好ましくは６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量での、より好ましくは２×１０１１Ｖ／ｋｇ以下の用量での前記対象への形質導入を含んでなる、態様３９もしくは４０に記載の使用のための医薬組成物、または態様３３もしくは４０に記載の使用のためのベクター。
【００６６】
本発明は、以下の図面によって例示されており、これらの図は、例示のみを目的としており、本発明を本明細書に開示された実施形態に限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】自己相補的（ｓｃ）二本鎖アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（２５１０ｂｐ）（Ａ）、ＡＡＶｓｃ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（２６８３ｂｐ）（Ｂ）、ＡＡＶｓｃ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（２５４０ｂｐ）（Ｃ）、ＡＡＶｓｃ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（２７６０ｂｐ）（Ｄ）、およびＡＡＶｓｃ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（２５１９ｂｐ）（Ｅ）のデザイン。図１では、自己相補的（ｓｃ）二本鎖アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのうち（Ａ）および（Ｂ）を示す。  最小トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲｍ）は、高活性化、血栓形成傾向ＦＩＸ変異（Ｒ３３８Ｌ）を含むコドン最適化ヒト第ＩＸ因子（ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の発現を駆動している。天然ＴＴＲエンハンサー（ＴＴＲｅ）、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（ＳＥＲＰ）、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプレット（３×ＳＥＲＰ）、またはＳｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプレット（３×ＳＥＲＰ）と天然ＴＴＲエンハンサー（ＴＴＲｅ）との組み合わせのいずれかが、ＴＴＲｍの上流にクローン化されている。マウス微小ウイルスイントロン（ＭＶＭ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ＢＧＨｐＡ）、または合成ポリアデニル化部位（Ｓｙｎｔ．ｐＡ）、および逆方向末端リピート（ＩＴＲ）が示されている。異なるエレメントを隣接させる/連結する配列が示されている。示されたベクターサイズは両方のＩＴＲのサイズを含む。
【図１−２】図１の続きである。図１−２では、自己相補的（ｓｃ）二本鎖アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのうち（Ｃ）〜（Ｅ）を示す。
【図２】一本鎖（ｓｓ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−ΔＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（５１６０ｂｐ）（Ａ）、ＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−ΔＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（５２５２ｂｐ）（Ｂ）、ＡＡＶｓｓ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−ΔＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（５４１０ｂｐ）（Ｃ）、ＡＡＶｓｓ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−ΔＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（５２７２ｂｐ）（Ｄ）、ＡＡＶｓｓ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−ΔＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（５３２５ｂｐ）（Ｅ）、ＡＡＶｓｓ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−ΔＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（５２１７ｂｐ）（Ｆ）、ＡＡＶｓｓ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−ΔＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（５４９３ｂｐ）（Ｇ）、ＡＡＶｓｓ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−ΔＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（５３０７ｂｐ）（Ｈ）、およびＡＡＶｓｓ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−ΔＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（５０８３ｂｐ）（Ｉ）のデザイン。図２では、一本鎖（ｓｓ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのうち（Ａ）〜（Ｃ）を示す。  最小トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲｍ）は、ヒトコドン最適化Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（ｃｏｈＦＶＩＩＩデルタＢ）の発現を駆動している。天然ＴＴＲエンハンサー（ＴＴＲｅ）、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（ＳＥＲＰ）、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプレット（３×ＳＥＲＰ）、またはＳｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプレット（３×ＳＥＲＰ）と天然ＴＴＲエンハンサー（ＴＴＲｅ）との組み合わせが、ＴＴＲｍの上流にクローン化されていることがあり得る。マウス微小ウイルスイントロン（ＭＶＭ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化部位（ＳＶ４０ｐＡ）、または合成ポリアデニル化部位（Ｓｙｎｔ．ｐＡ）、および逆方向末端リピート（ＩＴＲ）が示されている。異なるエレメントを隣接させる/連結する配列が示されている。示されたベクターサイズは両方のＩＴＲのサイズを含む。
【図２−２】図２の続きである。図２−２では、一本鎖（ｓｓ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのうち（Ｄ）〜（Ｆ）を示す。
【図２−３】図２−２の続きである。図２−３では、一本鎖（ｓｓ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのうち（Ｇ）〜（Ｉ）を示す。
【図３】記載のＳＣベクターを形質導入したときのＦＩＸタンパク質レベル。３ａ）：図１に記載の様々なベクター系について、１×１０ｅ９ｖｇ／マウス（低用量）で形質導入したときに達成されたタンパク質発現レベル；３ｂ）：図１に記載の様々なベクター系について、５×１０ｅ９ｖｇ／マウス（高用量）で形質導入したときに達成されたタンパク質発現レベル。
【図４】記載のＳＳベクターを形質導入したときのＦＶＩＩＩタンパク質レベル。４ａ）：図２に記載の様々なベクター系について、１×１０ｅ９ｖｇ／マウス（低用量）で形質導入したときに達成されたタンパク質発現レベル；４ｂ）：図２に記載の様々なベクター系について、５×１０ｅ９ｖｇ／マウス（高用量）で形質導入したときに達成されたタンパク質発現レベル。
【図５】ｐＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡベクターのプラスミドマップ。
【図６】ｐＡＡＶｓｃ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡベクターのプラスミドマップ。
【図７】ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡベクターのプラスミドマップ。
【図８】ｐＡＡＶｓｃ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡベクターのプラスミドマップ。
【図９】ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡベクターのプラスミドマップ。
【図１０】ｐＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡベクターのプラスミドマップ。
【図１１】ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡベクターのプラスミドマップ。
【図１２】ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡベクターのプラスミドマップ。
【図１３】ｐＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号１）；ｐＡＡＶｓｃ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号２）；ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号３）；ｐＡＡＶｓｃ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号４）；Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（ＳｅｒｐＥｎｈ）（配列番号５）；最小トランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーター（配列番号６）；ＴＴＲｍの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（ＴＴＲｍ５’ＵＴＲ）（配列番号７）；マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン（配列番号８）；ヒトＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異をコードするコドン最適化導入遺伝子（Ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）（配列番号９）；ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）（配列番号１０）；Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプルタンデムリピート（３×ＳＥＲＰ）（配列番号１１，リピートを連結するヌクレオチドが太字で示されている）；トランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）（配列番号１２）；トランスサイレチンエンハンサー（イタリック）と連結されたＳｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプルタンデムリピート（下線）（３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ）（配列番号１３）；ｐＡＡＶｓｃ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（配列番号２５）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ（配列番号２６）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ（配列番号２７）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ（配列番号２８）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ（配列番号２９）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ＭＶＭ（配列番号３０）；  Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ（配列番号３１）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（配列番号３２），Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−Ｆｌａｎｋ（配列番号３３）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−Ｆｌａｎｋ−ＢＧＨｐＡ（配列番号３４）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−Ｆｌａｎｋ−ＢＧＨｐＡ−Ｆｌａｎｋ（配列番号３５）；  Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−Ｆｌａｎｋ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（配列番号３６）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−���ＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−Ｆｌａｎｋ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ−Ｆｌａｎｋ（配列番号３７）の塩基配列。図１３では、配列番号１の塩基配列を示す。
【図１３−２】図１３の続きである。図１３−２では、配列番号１および２の塩基配列を示す。
【図１３−３】図１３−２の続きである。図１３−３では、配列番号２の塩基配列を示す。
【図１３−４】図１３−３の続きである。図１３−４では、配列番号２および３の塩基配列を示す。
【図１３−５】図１３−４の続きである。図１３−５では、配列番号３の塩基配列を示す。
【図１３−６】図１３−５の続きである。図１３−６では、配列番号３および４の塩基配列を示す。
【図１３−７】図１３−６の続きである。図１３−７では、配列番号４〜７の塩基配列を示す。
【図１３−８】図１３−７の続きである。図１３−８では、配列番号８〜１３の塩基配列を示す。
【図１３−９】図１３−８の続きである。図１３−９では、配列番号２５の塩基配列を示す。
【図１３−１０】図１３−９の続きである。図１３−１０では、配列番号２５〜２７の塩基配列を示す。
【図１３−１１】図１３−１０の続きである。図１３−１１では、配列番号２８〜３２の塩基配列を示す。
【図１３−１２】図１３−１１の続きである。図１３−１２では、配列番号３２〜３３の塩基配列を示す。
【図１３−１３】図１３−１２の続きである。図１３−１３では、配列番号３３〜３５の塩基配列を示す。
【図１３−１４】図１３−１３の続きである。図１３−１４では、配列番号３５〜３６の塩基配列を示す。
【図１３−１５】図１３−１４の続きである。図１３−１５では、配列番号３６〜３７の塩基配列を示す。
【図１４】ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号１４）；ｐＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号１５）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号１６）；ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号１７）；Ｂドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン最適化導入遺伝子（ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ）（配列番号１８）；シミアンウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ）（配列番号１９）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（配列番号２０）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（配列番号２１）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号２２）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（配列番号２３）；ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（配列番号２４）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ（配列番号３８）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ（配列番号３９）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ（配列番号４０）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ（配列番号４１）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ（配列番号４２）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ（配列番号４３）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｆｌａｎｋ（配列番号４４）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｆｌａｎｋ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号４５）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｆｌａｎｋ−ＳＶ４０ｐＡ−Ｆｌａｎｋ（配列番号４６）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｆｌａｎｋ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（配列番号４７）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｆｌａｎｋ−  ＳｙｎｔｐＡ−Ｆｌａｎｋ（配列番号４８）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ（配列番号４９）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ（配列番号５０）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｆｌａｎｋ（配列番号５��）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｆｌａｎｋ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号５２）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｆｌａｎｋ−ＳＶ４０ｐＡ−Ｆｌａｎｋ（配列番号５３）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｆｌａｎｋ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ（配列番号５４）；Ｆｌａｎｋ−３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−Ｆｌａｎｋ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｆｌａｎｋ−Ｓｙｎｔ．ｐＡ−Ｆｌａｎｋ（配列番号５５）；合成ポリアデニル化シグナル（Ｓｙｎｔ．ｐＡ）（配列番号５６）；３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ（配列番号５７）；３×ＳＥＲＰ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−Ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｍ（配列番号５８）の塩基配列。図１４では、配列番号１４の塩基配列を示す。
【図１４−２】図１４の続きである。図１４−２では、配列番号１４の塩基配列を示す。
【図１４−３】図１４−２の続きである。図１４−３では、配列番号１４および１５の塩基配列を示す。
【図１４−４】図１４−３の続きである。図１４−４では、配列番号１５の塩基配列を示す。
【図１４−５】図１４−４の続きである。図１４−５では、配列番号１５および１６の塩基配列を示す。
【図１４−６】図１４−５の続きである。図１４−６では、配列番号１６の塩基配列を示す。
【図１４−７】図１４−６の続きである。図１４−７では、配列番号１６および１７の塩基配列を示す。
【図１４−８】図１４−７の続きである。図１４−８では、配列番号１７の塩基配列を示す。
【図１４−９】図１４−８の続きである。図１４−９では、配列番号１７および１８の塩基配列を示す。
【図１４−１０】図１４−９の続きである。図１４−１０では、配列番号１８〜２０の塩基配列を示す。
【図１４−１１】図１４−１０の続きである。図１４−１１では、配列番号２０の塩基配列を示す。
【図１４−１２】図１４−１１の続きである。図１４−１２では、配列番号２０〜２１の塩基配列を示す。
【図１４−１３】図１４−１２の続きである。図１４−１３では、配列番号２１の塩基配列を示す。
【図１４−１４】図１４−１３の続きである。図１４−１４では、配列番号２１〜２２の塩基配列を示す。
【図１４−１５】図１４−１４の続きである。図１４−１５では、配列番号２２の塩基配列を示す。
【図１４−１６】図１４−１５の続きである。図１４−１６では、配列番号２２〜２３の塩基配列を示す。
【図１４−１７】図１４−１６の続きである。図１４−１７では、配列番号２３の塩基配列を示す。
【図１４−１８】図１４−１７の続きである。図１４−１８では、配列番号２３の塩基配列を示す。
【図１４−１９】図１４−１８の続きである。図１４−１９では、配列番号２４の塩基配列を示す。
【図１４−２０】図１４−１９の続きである。図１４−２０では、配列番号２４の塩基配列を示す。
【図１４−２１】図１４−２０の続きである。図１４−２１では、配列番号２４、３８〜４３の塩基配列を示す。
【図１４−２２】図１４−２１の続きである。図１４−２２では、配列番号４３の塩基配列を示す。
【図１４−２３】図１４−２２の続きである。図１４−２３では、配列番号４３〜４４の塩基配列を示す。
【図１４−２４】図１４−２３の続きである。図１４−２４では、配列番号４４〜４５の塩基配列を示す。
【図１４−２５】図１４−２４の続きである。図１４−２５では、配列番号４５〜４６の塩基配列を示す。
【図１４−２６】図１４−２５の続きである。図１４−２６では、配列番号４６の塩基配列を示す。
【図１４−２７】図１４−２６の続きである。図１４−２７では、配列番号４６〜４７の塩基配列を示す。
【図１４−２８】図１４−２７の続きである。図１４−２８では、配列番号４７〜４８の塩基配列を示す。
【図１４−２９】図１４−２８の続きである。図１４−２９では、配列番号４８の塩基配列を示す。
【図１４−３０】図１４−２９の続きである。図１４−３０では、配列番号４９〜５０の塩基配列を示す。
【図１４−３１】図１４−３０の続きである。図１４−３１では、配列番号５０〜５１の塩基配列を示す。
【図１４−３２】図１４−３１の続きである。図１４−３２では、配列番号５１の塩基配列を示す。
【図１４−３３】図１４−３２の続きである。図１４−３３では、配列番号５２の塩基配列を示す。
【図１４−３４】図１４−３３の続きである。図１４−３４では、配列番号５２〜５３の塩基配列を示す。
【図１４−３５】図１４−３４の続きである。図１４−３５では、配列番号５３〜５４の塩基配列を示す。
【図１４−３６】図１４−３５の続きである。図１４−３６では、配列番号５４の塩基配列を示す。
【図１４−３７】図１４−３６の続きである。図１４−３７では、配列番号５４〜５５の塩基配列を示す。
【図１４−３８】図１４−３７の続きである。図１４−３８では、配列番号５５〜５８の塩基配列を示す。
【図１５】図２に記載のｐＡＡＶｓｓ−３ＸＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−デルタＢ−ＳＶ４０ｐＡおよびｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−デルタＢ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを注射されたＣ５７ＢＬ６マウスにおけるＦＶＩＩＩタンパク質レベル。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、それぞれのプラスミドを３００ｎｇ注射した。注射後１日目（黒棒）および２日目（白棒）で収集した血漿試料において、ＦＶＩＩＩタンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１６】ｐＡＡＶｓｃ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−Ｓｙｎｔ．ｐＡベクターのプラスミドマップ
【図１７】ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡベクターのプラスミドマップ
【図１８】ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡベクターのプラスミドマップ
【図１９】ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡベクターのプラスミドマップ
【図２０】ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡベクターのプラスミドマップ
【図２１】ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｙｎｔ．ｐＡベクターのプラスミドマップ
【図２２】ｃｏ−ＦＶＩＩＩデルタ−Ｂを発現する自己相補的（ｓｃ）二本鎖アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの比較例のデザイン。以下のベクターを、ＦＶＩＩＩ発現レベルについて比較した：ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号１４）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号号１６）；ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号１７）、およびｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号２２）。
【図２３】ｃｏ−ＦＩＸを発現する自己相補的（ｓｃ）二本鎖アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの比較例のデザイン。以下のベクターを、ＦＩＸ発現について比較した：ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６５）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６６）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６７）；およびｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６８）。
【図２４】ＡＡＴプロモーター（配列番号６４）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６５）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６６）；ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６７）；およびｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６８）の塩基配列。図２４では、配列番号６４〜６５の塩基配列を示す。
【図２４−２】図２４の続きである。図２４−２では、配列番号６５の塩基配列を示す。
【図２４−３】図２４−２の続きである。図２４−３では、配列番号６５〜６６の塩基配列を示す。
【図２４−４】図２４−３の続きである。図２４−４では、配列番号６６の塩基配列を示す。
【図２４−５】図２４−４の続きである。図２４−５では、配列番号６６の塩基配列を示す。
【図２４−６】図２４−５の続きである。図２４−６では、配列番号６６〜６７の塩基配列を示す。
【図２４−７】図２４−６の続きである。図２４−７では、配列番号６７の塩基配列を示す。
【図２４−８】図２４−７の続きである。図２４−８では、配列番号６７〜６８の塩基配列を示す。
【図２４−９】図２４−８の続きである。図２４−９では、配列番号６８の塩基配列を示す。
【図２４−１０】図２４−９の続きである。図２４−１０では、配列番号６８の塩基配列を示す。
【図２４−１１】図２４−１０の続きである。図２４−１１では、配列番号６８〜６９の塩基配列を示す。
【図２５】２５ａ）３００ｎｇのそれぞれのプラスミドを注射したＣ５７ＢＬ６マウスにおけるＦＶＩＩＩ発現の調節におけるＴＴＲｅｎｈ−ＴＴＲｍプロモーターに対する３×Ｓｅｒｐエンハンサーの効果を示すグラフ。１日目に収集した血漿試料において、ＦＶＩＩＩ発現プロファイルを、ＥＬＩＳＡを用いて試験した。３×Ｓｅｒｐエンハンサーの存在は、ＦＶＩＩＩ発現を８倍上昇させるようである。２５ｂ）実施例２に概説したＦＶＩＩＩ発現について試験した様々なコンストラクトを比較するグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
発明の詳細な説明
本発明を、特定の実施形態に関して、特定の図面を参照して説明するが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲中の参照符号は、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。記載の図面は、概略的なものに過ぎず、限定的ではない。図面において、一部の要素のサイズは、説明のために誇張されており、縮尺通りに描かれていない場合がある。
【００６９】
用語「含んでなる」が発明の詳細な説明および特許請求の範囲で使用される場合、他の要素またはステップを排除するものではない。用語「含んでなる」は、「からなる」および「から本質的になる」として定義されるより具体的な実施形態も包含する。
【００７０】
単数名詞に言及するときに不定または定冠詞、例えば「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ
」が使用される場合、これは、何か他のことが具体的に述べられていない限り、その名詞の複数形を含む。
【００７１】
さらに、発明の詳細な説明および特許請求の範囲の第１、第２、第３などの用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも連続的または時間的な順序を説明するためのものではない。
【００７２】
このように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載された本発明の実施形態は、本明細書に記載または図示されている以外の配列で実施可能であることを理解されたい。
【００７３】
以下の用語または定義を、本発明の理解を助けるために与える。本明細書で特に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の技術分野の当業者には同じ意味を有する。実施者は、当該技術分野の定義および用語について、Sambrook et al.,
Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989)；およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)に特に向けられる。
【００７４】
本明細書で与えられる定義は、当業者によって理解されるよりも狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。
【００７５】
本発明は、核酸発現カセット、および（導入）遺伝子の肝臓特異的発現を増強するための前記核酸発現カセットを含んでなる発現ベクターに関する。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸発現カセット」は、１つ以上の所望の細胞型、組織、または器官における（導入）遺伝子発現を指示する、１つ以上の転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、および/または調節エレメント、ポリアデニル化配列、およびイントロンなどであるが、これらに限定されない）を含む核酸分子を表す 。典型的には、本明細書に記載の核酸発現カセットは、本明細書で定義されるＦＩＸ導入遺伝子またはＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含むものとする。
【００７７】
本発明は、プロモーターおよび導入遺伝子に動作可能に連結された１つ以上の肝臓特異的核酸調節エレメントを含んでなる核酸発現カセットを与える。
【００７８】
本明細書で使用される用語「動作可能に連結された」は、エレメントが機能的に連結され、互いと相互作用することができるように、様々な核酸分子エレメントが互いに対して配置されていることを表す。このようなエレメントには、プロモーター、エンハンサーおよび/または調節エレメント、ポリアデニル化配列、１つ以上のイントロンおよび/またはエキソン、および発現させる目的の遺伝子のコード配列（すなわち、導入遺伝子）が含まれ得るが、これらに限定はされない。核酸配列エレメントは、適切に配向されているか、または動作可能に連結されている場合、共に作用して相互の活性を調節し、最終的に導入遺伝子の発現レベルに影響を及ぼし得る。調節とは、特定のエレメントの活性レベルを増加、減少、または維持することを意味する。他のエレメントに対する各エレメントの位置は、各エレメントの５’末端および３’末端に関して表現され得、任意の特定のエレメント間の距離は、エレメント間にあるヌクレオチドまたは塩基対の数によって表され得る。
【００７９】
本明細書で使用される「調節エレメント」は、遺伝子の転写、特に遺伝子の組織特異的転写を調節および/または制御することができる転写制御エレメント、特に非コードシス作用転写制御エレメントを表す。調節エレメントは、１つ以上の転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）、より具体的には、組織特異的転写因子のための１つ以上の結合部位、最も具体的
には、肝臓特異的転写因子のための１つ以上の結合部位を含んでなる。典型的には、本明細書中で使用される調節エレメントは、調節エレメントのないプロモーター単独からの遺伝子の転写と比較したときに、プロモーター駆動遺伝子発現を増加または増強する。したがって、調節エレメントは、具体的には、エンハンサー配列を含んでなるが、転写を増強する調節エレメントは、典型的な遠い上流のエンハンサー配列に限定されず、それらが調節する遺伝子の任意の距離で生じ得ることを理解されたい。実際、転写を調節する配列は、それらがインビボで調節する遺伝子の上流（例えば、プロモーター領域）または下流（例えば、３’ＵＴＲ）のいずれかに位置し得、前記遺伝子のすぐ近く、または前記遺伝子から離れて位置し得ることが当該技術分野で公知となっている。本明細書に開示されている調節エレメントは、典型的には天然に存在する配列であるが、そのような調節エレメント（の一部）の組み合わせ、または調節エレメントの数コピー、すなわち天然に存在しない配列も、それ自体調節エレメントとして想定されることに注目されたい。本明細書で使用される調節エレメントは、転写制御に関与するより大きな配列の一部、例えばプロモーター配列の一部であり得る。しかし、調節エレメントのみでは、転写を開始するには通常十分ではないが、この目的を達成するためにプロモーターが必要である。
【００８０】
本明細書で開示される核酸発現カセットおよびベクターに含まれる１つ以上の調節エレメントは、肝臓特異的であることが好ましい。肝臓特異的調節エレメントの非限定的な例は、国際公開第２００９／１３０２０８号に開示されており、本明細書の一部を構成するものとして具体的に援用する。肝臓特異的調節エレメントの別の例は、本明細書において「ＴＴＲｅ」または「ＴＴＲＥｎｈ」とも呼ばれる配列番号１２により定義される調節エレメントなどのトランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子に由来する調節エレメントである（Wu et al., 2008）。本出願で使用される「肝臓特異的発現」は、他の組織と比較して、肝臓における（導入）遺伝子の（ＲＮＡおよび／またはポリペプチドとしての）優先的または優勢な発現を表す。特定の実施形態において、（導入）遺伝子発現の５０％以上が肝臓内で起こる。より特定の実施形態において、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％の（導入）遺伝子発現が肝臓内で起こる。特定の実施形態において、肝臓特異的発現は、脾臓、筋肉、心臓、および／または肺などの他の臓器への発現された遺伝子産物の「漏出」がないことを必然的に伴う。肝臓特異的発現の特定の形態と見なされ得る肝実質細胞特異的発現についても、必要な変更を加えれば同様である。この出願全体にわたり、発現において肝臓特異的が言及されている場合、肝実質細胞特異的発現も明確に想定される。同様に、本出願において組織特異的発現が使用される場合、組織を主に構成する細胞型の細胞型特異的発現もまた想定される。
【００８１】
本明細書で開示される核酸発現カセットおよびベクター中の１つ以上の調節エレメントは、限定された長さしかないが、完全に機能的であることが好ましい。このことは、ペイロード容量を過度に制限することのないベクターまたは核酸発現カセットでのその使用を可能にする。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で開示される発現カセットおよびベクター中の１つ以上の調節エレメントは、１０００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、または６００ヌクレオチド以下、好ましくは４００ヌクレオチド以下、例えば３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１５０ヌクレオチド以下、または１００ヌクレオチド以下の核酸である（すなわち、核酸調節エレメントは、最大長が、１０００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、または１００ヌクレオチドである）。
【００８２】
しかしながら、開示される核酸調節エレメントは、調節活性を（すなわち、転写の特異性および／または活性に関して）保持し、したがって、具体的には、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド  ４０ヌクレオチド、４５ヌク
レオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、または７０ヌクレオチドの最小長を有することを理解されたい。好ましい実施形態では、本明細書で開示される核酸発現カセットおよびベクター中の１つ以上の調節エレメントは、ＳＥＲＰＩＮＡ１調節エレメント、すなわちインビボでのＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の発現を制御する調節エレメントからの配列を含んでなる。前記調節エレメントは、配列番号５で定義される配列、前記配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、例えば９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片、を含んでなる、から本質的になる、またはからなることが、好ましい。前記調節エレメントは、最大長が、１５０ヌクレオチド以下、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、配列番号５により定義される配列、前記配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、例えば９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片、を含んでなる、から本質的になる、またはからなることも好ましい。配列番号５からなる肝臓特異的核酸調節エレメントは、本明細書において、「Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー」、「ＳｅｒｐＥｎｈ」、または「Ｓｅｒｐ」と呼ばれる。
【００８３】
特に好ましい実施形態では、本明細書で開示される核酸発現カセットおよびベクターは、配列番号５、または前記配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、例えば９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる肝臓特異的調節エレメント、より好ましくは、配列番号５、または前記配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、例えば９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる１５０ヌクレオチド以下、好ましくは１００ヌクレオチド以下、より好ましくは８０ヌクレオチド以下の肝臓特異的調節エレメントの２つ以上、例えば２、３、４、５、または６、好ましくは３つの（タンデム）リピートを含んでなる。配列番号５の３つのタンデムリピートを含んでなる好ましい核酸調節エレメントは、本明細書では「３×Ｓｅｒｐ」と呼ばれ、配列番号１１により定義される。
【００８４】
他の実施形態では、本明細書で開示される核酸発現カセットおよびベクターは、配列番号５、または前記配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、例えば９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる肝臓特異的調節エレメント、好ましくは、配列番号５、または前記配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、例えば９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる１５０ヌクレオチド以下、好ましくは１００ヌクレオチド以下、より好ましくは８０ヌクレオチド以下の肝臓特異的調節エレメントの２つ以上、例えば２、３、４、５、または６、より好ましくは３つの（タンデム）リピート；および、配列番号１２を含んでなる、から本質的になる、またはからなる調節エレメント、好ましくは、配列番号１２を含んでなる、から本質的になる、またはからなる１５０ヌクレオチド以下、好ましくは１２０ヌクレオチド以下の調節エレメントを含んでなる。配列番号５の３つのタンデムリピートおよび配列番号１２を含んでなる好ましい肝臓特異的核酸調節エレメントは、本明細書では「３×Ｓｅｒｐ−ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ」と呼ばれ、配列番号１３により定義される。配列番号５の３つのタンデムリピートおよび配列番号１２を含んでなる他の好ましい肝臓特異的核酸調節エレメントは、本明細書では「３×Ｓｅｒｐ−ｆｌａｎｋ−ＴＴＲｅ−ｆｌａｎｋ」と呼ばれ、配列番号５７によって定義される。本明細書で開示される核酸発現カセットおよびベクター中の肝臓特異的核酸調節エレメントは、配列番号５の３つのタンデムリピート、および配列番号１２、より好ましくは配列番号１３、さらにより好ましくは配列番号５７、例えば配列番号２７または配列番号３９を含んでなることが、好ましい。肝臓特異的調節エレメントの前記の特定の組み合わせは、それらに動作可能に連結された導入遺伝子、特に本明細書に記載のＦＩＸ導入遺伝子または
ＦＶＩＩＩ導入遺伝子の予想外に増強された肝臓特異的発現をもたらしたことが、本明細書で示されている。
【００８５】
他の実施形態では、本明細書で開示される前記核酸発現カセットおよびベクターは、配列番号５の３つのタンデムリピート（例えば、配列番号１３）および配列番号１２により定義される、例えば配列番号１３により定義される、さらなるエンハンサーエレメントＴＴＲｅを、肝臓特異的プロモーターと組み合わせて含んでなる。一つの特定の実施例において、前記プロモーターは、配列番号６により定義されるＴＴＲｍ最小プロモーターである。別の実施形態では、前記肝臓特異的プロモーターは、配列番号６４により定義されるプロモーターなどのＡＡＴプロモーターである。肝臓特異的調節エレメントの前記の特定の組み合わせは、それらに動作可能に連結された導入遺伝子、特に本明細書に記載のＦＩＸ導入遺伝子またはＦＶＩＩＩ導入遺伝子の予想外に増強された肝臓特異的発現をもたらしたことが、本明細書で示されている。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「同一性」および「同一」などの用語は、２つのポリマー分子、例えば２つの核酸分子、例えば２つのＤＮＡ分子の間の配列類似性を表す。配列アラインメントおよび配列同一性の決定は、例えば、Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10)によって最初に記載されたＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、例えばTatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)によって記載された「ブラスト２配列」アルゴリズムを用いて行うことができる。通常、配列同一性のパーセンテージは、配列の全長にわたって計算される。本明細書で使用される場合、用語「実質的に同一」は、９０％以上、好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す。
【００８７】
本出願で使用される用語「機能性断片」は、肝臓特異的発現を調節する能力を保持する、すなわち依然として組織特異性を与え、それらが由来する配列と同じ方法で（同じ程度ではないかもしれないが）（導入）遺伝子の発現を調節することができる、本明細書で開示される配列の断片を表す。断片は、それらが由来する配列からの１０以上の連続したヌクレオチドを含んでなる。他の特定の実施形態では、断片は、それらが由来する配列からの１５以上、２０以上、２５以上、３０個以上、３５個以上、または４０以上の連続したヌクレオチドを含んでなる。また、機能性断片は、１以上、より好ましくは２以上、３以上、または４以上、さらにより好ましくは５以上、１０以上、または１５以上の、それらが由来する配列中に存在する転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を含んでなり得ることが、好ましい。
【００８８】
本出願で使用される場合、用語「プロモーター」は、それらが動作可能に連結される対応する核酸コード配列（例えば導入遺伝子または内在性遺伝子）の転写を直接的または間接的に調節する核酸配列を表す。プロモーターは、単独で機能して転写を調節し得るか、または１つ以上の他の調節配列（例えば、エンハンサーまたはサイレンサー）と協同して作用し得る。本出願において、プロモーターは、典型的には、導入遺伝子の転写を調節する調節エレメントに動作可能に連結されている。
【００８９】
本明細書に記載の調節エレメントがプロモーターおよび導入遺伝子の両方に動作可能に連結されている場合、調節エレメントは、（１）有意な程度のインビボ（および／もしくはインビトロでの肝実質細胞／肝実質細胞株）における肝臓特異的発現を与えることができる、ならびに／または（２）肝臓（および／もしくはインビトロでの肝実質細胞／肝実質細胞株）における導入遺伝子の発現レベルを増加させることができる。
【００９０】
特定の実施形態において、本明細書で開示される核酸発現カセットおよびベクターに含まれるプロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。これは、肝臓特異性を増加させ
、かつ／または他の組織における発現の漏出を避けるためである。他の特定の実施形態において、肝臓特異的プロモーターは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子由来、またはアルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）遺伝子由来である。なおさらなる特定の実施形態において、ＴＴＲプロモーターは、（本明細書でＴＴＲｍまたはＴＲＲｍｉｎとも呼ばれる）最小プロモーター、最も具体的には、配列番号６により定義される最小ＴＴＲプロモーターである。なおさらなる特定の実施形態において、ＡＡＴプロモーターは、配列番号６４で定義されるものである。
【００９１】
特定の実施形態において、本明細書で開示される核酸発現カセットおよびベクター中のプロモーターは、最小プロモーターである。
【００９２】
本明細書で使用される「最小プロモーター」は、発現を駆動することが依然としてできるが、（例えば、組織特異的）発現の調節に寄与する配列の少なくとも一部を欠いている、フルサイズプロモーターの一部である。この定義は、（組織特異的な）調節エレメントが欠失された遺伝子の発現を駆動することができるが、その遺伝子を組織特異的様式で発現する能力を失っているプロモーター、および（組織特異的な）調節エレメントが欠失されており、遺伝子の（おそらく減少した）発現を駆動することができるが、組織特異的様式でその遺伝子を発現する能力が必ずしも失われていないプロモーターの両方を包含する。最小プロモーターは、当該技術分野で広範に記載されており、最小プロモーターの非限定的なリストが、本明細書に与えられている。
【００９３】
用語「肝臓特異的プロモーター」は、肝臓特異的な発現を（導入）遺伝子に与えるあらゆるプロモーターを包含する。肝臓特異的プロモーターの非限定的な例は、肝臓特異的遺伝子プロモーターデータベース（ＬＳＰＤ、http://rulai.cshl.edu/LSPD/）で提供されており、例えば、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターまたはＴＴＲ−最小プロモーター（ＴＴＲｍ）、アルファ１−抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、アルブミン（ＡＬＢ）プロモーターまたは最小プロモーター、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）プロモーターまたは最小プロモーター、補体因子Ｂ（ＣＦＢ）プロモーター、ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）プロモーター、ヘモペキシン（ＨＰＸ）プロモーターまたは最小プロモーター、ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）プロモーターまたは最小プロモーター、（肝臓）カルボキシルエステラーゼ１（ＣＥＳ１）プロモーターまたは最小プロモーター、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）プロモーターまたは最小プロモーター、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）プロモーターまたは最小プロモーター、マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ２）プロモーターまたは最小プロモーター、ヘプシジン抗菌ペプチド（ＨＡＭＰ）プロモーターまたは最小プロモーター、およびｓｅｒｐｉｎペプチダーゼ阻害因子、クレードＣ（アンチトロンビン）、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＣ１）プロモーターまたは最小プロモーターが挙げられる。
【００９４】
特に好ましい実施形態では、プロモーターは、哺乳類の肝臓特異的プロモーター、特にネズミまたはヒトの肝臓特異的プロモーターである。前記プロモーターは、それぞれの最小プロモーターであることが、より好ましい。
【００９５】
本出願で使用される用語「肝臓特異的発現」は、他の（すなわち非肝臓の）組織または細胞と比較して、肝臓、肝臓組織、または肝臓細胞における（導入）遺伝子の（ＲＮＡおよび／またはポリペプチドとしての）優先的または優勢な発現を表す。特定の実施形態において、少なくとも５０％以上、より具体的には、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の（導入）遺伝子発現が肝臓組織または肝臓細胞内で起こる。特定の実施形態において、肝臓特異的発現は、肺、筋肉、脳、腎臓、および／または脾臓などの肝臓以外の臓器または組織への発現された遺伝子産物の「漏出」がないことを必然的に伴う。肝臓特
異的発現の特定の形態と見なされ得る肝実質細胞特異的発現および肝芽細胞特異的発現についても、必要な変更を加えれば同様である。この出願全体にわたり、発現において肝臓特異的が言及されている場合、肝実質細胞特異的発現および肝芽細胞特異的発現も明確に想定される。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「肝臓細胞」は、肝臓を主に占有する細胞を包含し、主に肝実質細胞、卵形細胞、肝臓類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）、および胆管細胞（胆管を形成する上皮細胞）を包含する。
【００９７】
本明細書で使用される用語「肝実質細胞」は、前駆肝芽細胞から分化し、適切な条件下で肝臓特異的表現型を発現することができるようになった細胞を表す。用語「肝実質細胞」は、脱分化している肝実質細胞も表す。この用語には、インビボの細胞およびエキソビボで培養された細胞が含まれ、これらの細胞は、一次細胞であるか継代細胞であるかにかかわらず含まれる。
【００９８】
本明細書で使用される用語「肝芽細胞」は、肝実質細胞、卵形細胞、または胆管細胞を生じるように分化する中胚葉中の胚細胞を表す。この用語には、インビボの細胞およびエキソビボで培養された細胞が含まれ、これらの細胞は、一次細胞であるか継代細胞であるかにかかわらず含まれる。
【００９９】
本明細書で使用される用語「導入遺伝子」または「（導入）遺伝子」は、核酸配列が挿入される細胞において発現されるポリペプチドまたはポリペプチドの一部をコードする特定の核酸配列を表す。しかしながら、導入遺伝子は、典型的には核酸配列が挿入される細胞中の特定のポリペプチドの量を低下させるＲＮＡとして発現されることも可能である。これらのＲＮＡ分子には、ＲＮＡ干渉（ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ調節（ｍｉＲＮＡ）、触媒ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーなどを介して機能を発揮する分子が含まれるが、これらに限定されない。核酸配列がどのようにして細胞に導入されるかは、本発明にとって本質的なことではなく、例えば、ゲノム中またはエピソームプラスミドとしての組み込みによることがあり得る。導入遺伝子の発現は、核酸配列が挿入される細胞のサブセットに限定され得ることに、注目されたい。用語「導入遺伝子」は、（１）細胞内で天然に見出されない核酸配列（すなわち、異種核酸配列）；（２）導入された細胞において天然に見出される核酸配列の変異形態である核酸配列；（３）導入された細胞内に天然に存在する同じ（すなわち、相同な）核酸配列または類似の核酸配列のさらなるコピーの付加として用いられる核酸配列；（４）導入された細胞において発現が誘導されるサイレントな天然に存在するまたは相同な核酸配列を含むことを意味する。「変異型」は、野生型または天然に存在する配列とは異なる１つ以上のヌクレオチドを含む核酸配列を意味し、すなわち、変異核酸配列は、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失、および/または挿入を含む。場合によっては、導入遺伝子は、導入遺伝子産物が細胞から分泌されるように、リーダーペプチドまたはシグナル配列をコードする配列も含み得る。
【０１００】
典型的には、本明細書に記載の発現カセットおよびベクター中の導入遺伝子は、凝固第ＩＸ因子または凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする。
【０１０１】
用語「凝固第ＩＸ因子」は、当該技術分野で公知の意味を有する。凝固第ＩＸ因子の同義語は、「ＦＩＸ」または「クリスマス因子」または「Ｆ９」であり、互換的に使用することができる。特に、用語「凝固第ＩＸ因子」は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１３３に定義されているｍＲＮＡ配列がコードするヒトタンパク質を包含する。
【０１０２】
前記ＦＩＸは、野生型ＦＩＸと比較して、過活動性または高機能性である変異型ＦＩＸであることが、好ましい。ヒト凝固因子の機能的活性の改変は、生物工学によって、例え
ば点変異の導入によって行うことができる。このアプローチにより、インビトロでの活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ＡＰＰＴ）（Chang et al., 1998）において野生型ヒトＦＩＸと比較して３倍増加した凝固活性を示し、変異ＦＩＸ遺伝子を導入された血友病Ｂマウスにおいて２〜６倍高い比活性を示す過活動性Ｒ３３８Ａ変異体が報告された（Schuettrumpf et al., 2005）。より高い凝固活性を有する他の例示的なＦＩＸ点変異体またはドメイン交換変異体：ＥＧＦ−１ドメインがＦＶＩＩ由来のＥＧＦ−１ドメインで置換された、単独の、またはＲ３３８Ａ点変異と組み合わされたＦＩＸ（Brunetti-Pierri et al., 2009）、Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａトリプル変異体（Lin et al., 2010）、Ｙ２５９Ｆ、Ｋ２６５Ｔ、および／またはＹ３４５Ｔシングル、ダブル、またはトリプル変異体（Milanov, et al., 2012）、ならびにＧ１９０Ｖ点変異体（Kao et al., 2010）が記載されており、これらは、全て、本明細書の一部を構成するものとして援用される。特に好ましい実施形態では、ＦＩＸ変異体は、２００９年にＳｉｍｉｏｎｉらによって記載されたものであり、Ｘ連鎖性血栓形成傾向を引き起こす「第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ」変異体と名付けられている。前記突然変異第ＩＸ因子は、過活動性であり、Ｒ３３８Ｌアミノ酸置換を保有する。本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の核酸発現カセットおよび発現ベクターに使用されるＦＩＸ導入遺伝子は、ヒトＦＩＸタンパク質をコードし、最も好ましくは、ＦＩＸ導入遺伝子は、ヒトＦＩＸタンパク質のＰａｄｕａ変異体をコードする。したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、導入遺伝子は、配列番号９（すなわち、ヒトＦＩＸタンパク質のＰａｄｕａ変異体をコードするコドン最適化導入遺伝子）を有する。
【０１０３】
用語「凝固第ＶＩＩＩ因子」は、当該技術分野で公知の意味を有する。凝固第ＶＩＩＩ因子の同義語は、「ＦＶＩＩＩ」または「抗血友病因子」または「ＡＨＦ」であり、本明細書で互換的に使用され得る。用語「凝固第ＶＩＩＩ因子」は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ００４５１に定義されているアミノ酸配列を有するヒトタンパク質を包含する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、前記ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインが欠失しているＦＶＩＩＩである（すなわち、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ、本明細書ではＢＤＤ  ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩΔＢまたはＦＶＩＩＩデルタＢとも呼ばれる）。用語「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」は、例えば、Ｂドメインの全部または一部が欠失したＦＶＩＩＩ変異体およびＢドメインがリンカーで置換されたＦＶＩＩＩ変異体を包含するが、これらに限定されない。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩの非限定的な例は、Ward et al. (2011)および国際公開第２０１１／００５９６８号に記載されており、これらは、本明細書の一部を構成するものとして具体的に援用される。
【０１０５】
好ましい実施形態では、前記ＦＶＩＩＩはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩであり、ここで、Ｂドメインは、以下の配列：ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＴＲＨＱＲ（配列番号５９）（すなわち、Ward et al. (2011)に定義されているＳＱ  ＦＶＩＩＩ）を有するリンカーで置換されている。特に好ましい実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードする前記導入遺伝子は、国際公開第２０１１／００５９６８号にも開示されている、配列番号１８（すなわち、（ｈ）ＦＶＩＩＩｃｏｐｔまたはｃｏ（ｈ）ＦＶＩＩＩデルタＢまたはｃｏ（ｈ）ＦＶＩＩＩデルタＢ導入遺伝子とも呼ばれるＢドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩをコードするコドン最適化導入遺伝子）を有する。
【０１０６】
他の配列もまた、本明細書で開示される核酸発現カセットに組み込まれて、典型的には導入遺伝子産物の発現をさらに増加または安定化し得る（例えば、イントロンおよび/またはポリアデニル化配列）。
【０１０７】
本明細書に記載の発現カセットで、任意のイントロンを利用し得る。用語「イントロン
」は、核のスプライシング器官によって認識されスプライシングされるのに十分な大きさのイントロン全体のいろいろな部分を包含する。典型的には、発現カセットの構築および操作を容易にする、可能な限り小さい発現カセットのサイズを保つために、短い機能性のイントロン配列が好ましい。いくつかの実施形態では、イントロンは、発現カセット内のコード配列がコードするタンパク質をコードする遺伝子から得られる。イントロンは、コード配列の５’側、コード配列の３’側、またはコード配列内に位置することができる。イントロンをコード配列の５’に配置する利点は、イントロンがポリアデニル化シグナルの機能を妨害する可能性を最小にすることである。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される核酸発現カセットは、イントロンをさらに含んでなる。好適なイントロンの非限定的な例は、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、ベータ−グロビンイントロン（ベータＩＶＳ−ＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）イントロンＡ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）スモール−ｔイントロン、およびβ−アクチンイントロンである。イントロンは、ＭＶＭイントロンであることが、好ましく、配列番号８により定義されるＭＶＭミニイントロンであることが、より好ましい。本明細書に記載の核酸発現カセットへのＭＶＭイントロンのクローニングは、それに動作可能に連結された導入遺伝子の予想外に高い発現レベルをもたらすことが示された。
【０１０８】
ポリＡテールの合成を指示する任意のポリアデニル化シグナルが、本明細書に記載の発現カセットにおいて有用であり、それらの例は、当業者に周知である。ポリアデニル化シグナルの例として、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、最小ウサギβ−グロビン（ｍＲＢＧ）遺伝子由来のポリＡ配列、およびLevitt et al. (1989, Genes Dev 3:1019-1025)に記載されている合成ポリＡ（ＳＰＡ）部位（配列番号５６）が挙げられるが、これらに限定はされない。ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号１０）またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル（配列番号１９）であることが、好ましい。
【０１０９】
典型的には、本発明に係る核酸発現カセットは、プロモーター、エンハンサー、（導入）遺伝子、および転写ターミネーターを含んでなる。
【０１１０】
本発明の典型的な実施形態では、核酸発現カセットが、開示され、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（例えば配列番号５）の３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号１１を含んでなる調節エレメント、および配列番号１２により定義されるトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）、
−肝臓特異的プロモーター、ならびに
−導入遺伝子
を含んでなる。
【０１１１】
本発明の典型的な実施形態では、核酸発現カセットが、開示され、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（例えば配列番号５）の３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号１１を含んでなる調節エレメント、および配列番号１２により定義されるトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）、
−（例えば配列番号６により定義される）肝臓特異的ＴＴＲｍプロモーター、ならびに
−導入遺伝子、を含んでなり、ＴＴＲｅおよびＴＴＲｍ核酸の組み合わせが、配列番号６９により定義されることが好ましい。
【０１１２】
本発明の典型的な実施形態では、核酸発現カセットが、開示され、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（例えば配列番
号５）の３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号１１を含んでなる調節エレメント、および配列番号１２により定義されるトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）、
−例えば配列番号６により定義される、肝臓特異的ＴＴＲｍプロモーター、
−イントロン、好ましくは、例えば配列番号８により定義される、ＭＶＭイントロン、ならびに
−導入遺伝子、を含んでなり、ＴＴＲｅおよびＴＴＲｍ核酸の組み合わせが、配列番号６９により定義されることが好ましい。
【０１１３】
本発明の典型的な実施形態では、核酸発現カセットが、開示され、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（例えば配列番号５）の３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号１１を含んでなる調節エレメント、および配列番号１２により定義されるトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）、
−例えば配列番号６により定義される、肝臓特異的ＴＴＲｍプロモーター、
−イントロン、好ましくは、例えば配列番号８により定義される、ＭＶＭイントロン、ならびに
−導入遺伝子、好ましくは本明細書の別のところで定義されているＦＩＸまたはＦＶＩＩＩ導入遺伝子、および本明細書の別のところで定義されている任意の転写ターミネーター、を含んでなり、ＴＴＲｅおよびＴＴＲｍ核酸の組み合わせが、配列番号６９により定義されることが好ましい。
【０１１４】
本発明の別の好ましい実施形態では、核酸発現カセットが、開示され、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（例えば配列番号５）の３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号１１を含んでなる調節エレメント、および配列番号１２により定義されるトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）、
−例えば配列番号６４により定義される、肝臓特異的ＡＡＴプロモーター、ならびに
−導入遺伝子
を含んでなる。
【０１１５】
本発明の別の好ましい実施形態では、核酸発現カセットが、開示され、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（例えば配列番号５）の３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号１１を含んでなる調節エレメント、および配列番号１２により定義されるトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）、
−例えば配列番号６４により定義される、肝臓特異的ＡＡＴプロモーター、ならびに
−イントロン、好ましくは、例えば配列番号８により定義される、ＭＶＭイントロン、ならびに
−導入遺伝子
を含んでなる。
【０１１６】
本発明の別の好ましい実施形態では、核酸発現カセットが、開示され、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（例えば配列番号５）の３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号１１を含んでなる調節エレメント、および配列番号１２により定義されるトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）、
−例えば配列番号６４により定義される、肝臓特異的ＡＡＴプロモーター、ならびに
−イントロン、好ましくは、例えば配列番号８により定義される、ＭＶＭイントロン、ならびに
−導入遺伝子、好ましくは本明細書の別のところで定義されているＦＩＸまたはＦＶＩＩＩ導入遺伝子、および本明細書の別のところで定義されている任意の転写ターミネータ
を含んでなる。
【０１１７】
本発明の典型的な実施形態では、本明細書で開示される前記核酸発現カセットは、
−肝特異的調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（配列番号５）の３つのタンデムリピート、例えば、配列番号１１により定義される調節エレメント、
−プロモーター、好ましくは最小ＴＴＲプロモーター、
−イントロン、好ましくはＭＶＭイントロン、
−導入遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子ｃＤＮＡ、さらにより好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ  ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくは、例えば配列番号１０により定義されるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）、または配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位などのポリアデニル化シグナル、
を含んでなる。
【０１１８】
本発明の他の典型的な実施形態では、本明細書で開示される前記核酸発現カセットは、−肝特異的調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサーの３つのタンデムリピート、およびトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）（例えば、配列番号１３を含んでなる、好ましくは配列番号５７を含んでなる調節エレメント）
−プロモーター、好ましくは最小ＴＴＲプロモーター、
−イントロン、好ましくはＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子ｃＤＮＡ、さらにより好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ  ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくは、例えばウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）、または配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位などのポリアデニル化シグナル、
を含んでなる。
【０１１９】
本発明の別の典型的な実施形態では、本明細書で開示される前記核酸発現カセットは、−肝特異的調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサーの３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント（例えば、配列番号１１を含んでなる調節エレメント）、より好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサーの３つのタンデムリピートおよびトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）（例えば、配列番号１３を含んでなる、好ましくは配列番号５７を含んでなる調節エレメント）、
−プロモーター、好ましくは最小ＴＴＲプロモーター、
−イントロン、好ましくはＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、さらにより好ましくはコドン最適化Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくはシミアン空胞形成ウイルス４０またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル、または配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位などのポリアデニル化シグナル
を含んでなる。
【０１２０】
本発明の別の典型的な実施形態では、本明細書で開示される前記核酸発現カセットは、−肝臓特異的調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（例えば配列番号５）の３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号１１を含んでなる調節エレメント、および配列番号１２により定義されるトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）、例えば配列番号１３を含んでなる、好ましくは配列番号５７を含んでなる調節エレメント、
−プロモーター、好ましくは配列番号６４により定義されるプロモーターなどのＡＡＴプロモーター、
−イントロン、好ましくは、配列番号８により定義されるＭＶＭイントロンなどのＭＶＭイントロン、ならびに
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子ｃＤＮＡ、さらにより好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ  ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくは、配列番号１０により定義されるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）、または配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位などのポリアデニル化シグナル、
を含んでなる。非限定的な例として、このようなベクターは、配列番号６５により定義される（図２５参照）。
【０１２１】
本発明の別の典型的な実施形態では、本明細書で開示される前記核酸発現カセットは、−肝臓特異的調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（例えば配列番号５）の３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント、例えば配列番号１１を含んでなる調節エレメント、
−プロモーター、好ましくは配列番号６４により定義されるプロモーターなどのＡＡＴプロモーター、
−イントロン、好ましくは、配列番号８により定義されるＭＶＭイントロンなどのＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子ｃＤＮＡ、さらにより好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ  ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくは、配列番号１０により定義されるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）、または配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位などのポリアデニル化シグナル、
を含んでなる。非限定的な例として、このようなベクターは、配列番号６６により定義される（図２５参照）。
【０１２２】
本発明の別の典型的な実施形態では、本明細書で開示される前記核酸発現カセットは、−肝臓特異的調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（例えば配列番号５）の３つのタンデムリピートに動作可能に連結された、配列番号１２により定義されるトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）を含んでなる、より好ましくは配列番号１１により定義される、調節エレメント、
−プロモーター、好ましくは配列番号６４により定義されるプロモーターなどのＡＡＴプロモーター、
−イントロン、好ましくは、配列番号８により定義されるＭＶＭイントロンなどのＭＶＭイントロン、ならびに
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子ｃＤＮＡ、さらにより好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ  ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくは、配列番号１０により定義されるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）、または配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位などのポリアデニル化シグナル、
を含んでなる。非限定的な例として、このようなベクターは、配列番号６８により定義される（図２５参照）。
【０１２３】
本明細書で開示される発現カセットは、そのまま使用されてもよく、または典型的には、核酸ベクターの一部であってもよい。したがって、他の態様は、本明細書に記載の核酸発現カセットのベクター、特に核酸ベクターでの使用に関する。
【０１２４】
ある態様では、本発明は、本明細書で開示される核酸発現カセットを含んでなるベクタ
ーも与える。
【０１２５】
本出願で使用される用語「ベクター」は、別の核酸分子（挿入核酸分子）、例えば限定されないがｃＤＮＡ分子が挿入されていてもよい、通常は二本鎖ＤＮＡである核酸分子を表す。ベクターは、挿入核酸分子を適当な宿主細胞に運搬するために使用される。ベクターは、挿入核酸分子の転写、および、必要に応じて転写物のポリペプチドへの翻訳を可能にする必須要素を含み得る。挿入核酸分子は、宿主細胞に由来していてもよく、または異なる細胞もしくは生物に由来していてもよい。一旦宿主細胞内に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡとは独立して、またはそれと同時に複製することができ、ベクターおよびその挿入された核酸分子の数コピーが生成し得る。
【０１２６】
したがって、用語「ベクター」は、標的細胞への遺伝子導入を容易にする遺伝子送達媒体として定義することもできる。この定義には、非ウイルスベクターおよびウイルスベクターの両方が含まれる。非ウイルスベクターには、カチオン性脂質、リポソーム、ナノ粒子、ＰＥＧ、ＰＥＩなどが含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルスなどを含むが、これらに限定されないウイルスに由来する。あるいは、遺伝子送達系を使用して、ナノ粒子またはビロソームなどのウイルスおよび非ウイルス成分を組み合わせることができる（Yamada et al., 2003）。
【０１２７】
典型的には、必ずではないが、ウイルスベクターは、複製に必須のウイルス遺伝子がウイルスベクターから除去されているため、所与の細胞内で増殖する能力を失っているので、複製欠損である。しかしながら、いくつかのウイルスベクターは、例えば癌細胞などの所与の細胞において特異的に複製するように適合されることもでき、典型的には、（癌）細胞特異的腫瘍崩壊を誘発するために使用される。好ましいベクターは、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびアンチウイルスに由来する。
【０１２８】
レトロウイルスおよびアンチウイルスは、感染後に遺伝子を宿主細胞の染色体に挿入する能力を有するＲＮＡウイルスである。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を欠いているが、細胞に感染し、その遺伝子を標的細胞の染色体に挿入する能力を保持しているレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが開発されている（Miller, 1990；Naldini et al., 1996, VandenDriessche et al., 1999）。レンチウイルスベクターと従来のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベースのレトロウイルスベクターとの違いは、レンチウイルスベクターが分裂細胞と非分裂細胞の両方を形質導入できるのに対して、ＭＬＶベースのレトロウイルスベクターは分裂細胞のみを形質導入できることである。
【０１２９】
アデノウイルスベクターは、生きた対象に直接投与されるようにデザインされている。レトロウイルスベクターとは異なり、アデノウイルスベクターゲノムの大部分は、宿主細胞の染色体に組み込まれない。代わりに、アデノウイルスベクターを用いて細胞に導入された遺伝子は、長期間持続する染色体外因子（エピソーム）として核内に維持される。アデノウイルスベクターは、気道上皮細胞、内皮細胞、肝実質細胞、および種々の腫瘍を含む、生体内の多くの様々な組織における分裂および非分裂細胞を形質導入する（Trapnell, 1993；Chuah et al., 2003）。別のウイルスベクターは、大きな二本鎖ＤＮＡウイルスである、単純ヘルペスウイルスに由来する。別のｄｓＤＮＡウイルスであるワクシニアウイルスの組換え型は、大きな挿入断片を収容することができ、相同組換えによって生じる。
【０１３０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する小さなｓｓＤＮＡウイルスであり、疾患を引き起こすことは知られておらず、したがって非常に軽度の免疫応答のみを引き起こす。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する
ことができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。これらの特徴により、ＡＡＶは、ベクターのクローニング能力が比較的限られているにもかかわらず、遺伝子治療のためのウイルスベクターを作製するための非常に魅力的な候補となる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、使用されるベクターは、アデノ随伴ウイルスに由来する（すなわち、ＡＡＶベクター）。
【０１３１】
例えば、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型８、およびＡＡＶ血清型９などの様々な血清型のＡＡＶが単離され、特徴付けられており、全てのＡＡＶ血清型が本明細書において企図されている。特に、本明細書で開示されるＦＩＸ導入遺伝子を含んでなるＡＡＶベクターは、好ましくはＡＡＶ血清型９ベクターであり、本明細書で開示されるＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含んでなるＡＡＶベクターは、好ましくはＡＡＶ血清型８ベクターである。
【０１３２】
本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、一本鎖（すなわち、ｓｓＡＡＶベクター）または自己相補的（すなわち、ｓｃＡＡＶベクター）であり得る。特に、本明細書で開示されるＦＩＸ導入遺伝子を含んでなるＡＡＶベクターは、好ましくは自己相補的であり、本明細書で開示されるＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含んでなるＡＡＶベクターは、好ましくは一本鎖である。用語「自己相補的ＡＡＶ」は、本明細書では、コード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するようにデザインされた組換えＡＡＶ由来ベクターを意味する。
【０１３３】
本明細書で開示されるアデノ随伴ウイルスベクターを用いる遺伝子治療は、ベクターに含まれる導入遺伝子に対して免疫寛容を誘導することが示された。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、本発明に係るベクターは、以下のエレメント： 
−変異されていてもよい逆方向末端リピート配列（ＩＴＲ）、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」または「ＳｅｒｐＥｎｈ」）の３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント（例えば配列番号１１により定義される核酸断片を含んでなる調節エレメント）、
−プロモーター、好ましくは最小ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍ）、
−イントロン、好ましくはＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子ｃＤＮＡ、さらにより好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ  ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくは、ＢＧＨｐＡ、または配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位などのポリアデニル化シグナル、
−逆方向末端リピート配列（ＩＴＲ）
を含んでなる（図６参照）。
【０１３５】
ベクターは、アデノ随伴ウイルス由来ベクターであることが好ましく、自己相補的ＡＡＶベクターであることがより好ましく、自己相補的ＡＡＶ血清型９ベクター、例えば配列番号２により定義されるベクターであることがさらにより好ましい。
【０１３６】
本発明の他の典型的な実施形態では、前記ベクターは、以下のエレメント：
−変異されていてもよい逆方向末端リピート配列（ＩＴＲ）、
−肝特異的調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」または「ＳｅｒｐＥｎｈ」）の３つのタンデムリピート、およびトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）を含んでなる調節エレメント（例えば、配列番号１３を含んでなる、好ましくは配列番号５７を含んでなる調節エレメント）、
−プロモーター、好ましくは最小ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍ）、
−イントロン、好ましくはＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＩＸ因子ｃＤＮＡ、さらにより好ましくは
コドン最適化第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ  ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくは、ＢＧＨｐＡ、または配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位などのポリアデニル化シグナル、ならびに
−逆方向末端リピート配列（ＩＴＲ）、
を含んでなる（図８および図１６参照）。
【０１３７】
前記エレメントの組み合わせは、対象の肝臓において、ＦＩＸ、特にそのＰａｄｕａ変異体の予想外に高い発現レベルをもたらした。ベクターは、アデノ随伴ウイルス由来ベクターであることが好ましく、自己相補的ＡＡＶベクターであることがより好ましく、自己相補的ＡＡＶ血清型９ベクター、例えば配列番号４または配列番号２５により定義されるベクターであることがさらにより好ましい。
【０１３８】
本発明の別の典型的な実施形態では、前記ベクターは、以下のエレメント：
−変異されていてもよい逆方向末端リピート配列（ＩＴＲ）、
−肝臓特異的核酸調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサーの３つのタンデムリピートを含んでなる調節エレメント（例えば配列番号１１を含んでなる調節エレメント）、
−プロモーター、好ましくは最小ＴＴＲプロモーター、
−イントロン、好ましくはＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、さらにより好ましくはコドン最適化Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくはシミアン空胞形成ウイルス４０またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル、または配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位などのポリアデニル化シグナル、および
−逆方向末端リピート配列（ＩＴＲ）、
を含んでなる（図１１、１７、または１８参照）。
【０１３９】
前記エレメントの組み合わせは、特に対象の肝臓において、ＦＶＩＩＩの予想外に高い発現レベルをもたらした。ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ベクターであることが好ましく、一本鎖ＡＡＶベクターであることがより好ましく、一本鎖ＡＡＶ血清型８ベクター、例えば配列番号１６、配列番号２０、または配列番号２１により定義されるベクターであることがさらにより好ましい。
【０１４０】
他の実施形態では、前記ベクターは、以下のエレメント： 
−変異されていてもよい逆方向末端リピート配列（ＩＴＲ）、
−肝特異的調節エレメント、好ましくはＳｅｒｐｉｎエンハンサー（「Ｓｅｒｐ」または「ＳｅｒｐＥｎｈ」）の３つのタンデムリピート、およびトランスサイレチンエンハンサー（ＴＴＲｅ）を含んでなる調節エレメント（例えば、配列番号１３を含んでなる、好ましくは配列番号５７を含んでなる調節エレメント）、
−プロモーター、好ましくは最小ＴＴＲプロモーター、
−イントロン、好ましくはＭＶＭイントロン、
−（導入）遺伝子、好ましくはコドン最適化第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、さらにより好ましくはコドン最適化Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、
−転写ターミネーター、好ましくはシミアン空胞形成ウイルス４０またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル、または配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位などのポリアデニル化シグナル、および
−逆方向末端リピート配列（ＩＴＲ）、
を含んでなる（図１９または２０参照）。
【０１４１】
前記エレメントの組み合わせは、特に対象の肝臓において、ＦＶＩＩＩの予想外に高い
発現レベルをもたらした。ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ベクターであることが好ましく、一本鎖ＡＡＶベクターであることがより好ましく、一本鎖ＡＡＶ血清型８ベクター、例えば配列番号２２または配列番号２３により定義されるベクターであることがさらにより好ましい。
【０１４２】
特定のスペーサー断片を含む配列番号５により定義されるＳｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプルリピートと配列番号１２によって定義されるトランスサイレチンエンハンサーとの組み合わせは、それに動作可能に連結された導入遺伝子の発現を増加させることにおいて予想外に強力であることが示されている。前記調節エレメントは、配列番号１３によって定義される。前記調節エレメントは、配列番号６によって定義されるトランスサイレチン最小プロモーターとさらに組み合わせることができる。これにより、例えば、配列番号６９により定義される、３×ＳｅｒｐＥｎｈ（３×配列番号５、例えば配列番号１１など）とＴＴＲｅおよびＴＴＲｍ核酸配列との組み合わせが作製される。例えば、このようなコンストラクトは、本明細書中に示されているように、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ導入遺伝子の両方の発現を増加加させるかどうか試験された配列番号５８により定義される調節エレメントをもたらす。
【０１４３】
特定の実施形態では、以下のプラスミド/ベクターが与えられる：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
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ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
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ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＣＥＳ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＣＥＳ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＥＳ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＥＳ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏｄｅｌｔａＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏｄｅｌｔａＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ。
【０１４４】
前記プラスミドのいずれか１つにおいて、ポリアデニル化シグナルを、任意の他のポリアデニル化シグナル、例えば、配列番号５６により定義される合成ポリＡ部位（Ｓｙｎｔｈ．ｐＡ）と置換することができる。
【０１４５】
他の実施形態では、ベクターは、トランスポゾンベースのベクターなどの非ウイルスベクターである。前記トランスポゾンベースのベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）またはＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）に由来することが、好ましい。好ましいＳＢトランスポゾンは、Ivics et al. (1997)に記載されており、ＳＢ１００Ｘなどのその過活動型がMates et al. (2009)に記載されている。ＰｉｇｇｙＢａｃベースのトランスポゾンは、腫瘍原形成リスクを高めるものではないという点で安全なベクターである。さらに、これらのベクターを用いる肝臓指向性遺伝子治療は、ベクターに含まれる導入遺伝子、特にｈＦＩＸまたはｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子に対する免疫寛容を誘導することが示された。
【０１４６】
トランスポゾンベースのベクターは、遺伝子治療のためのトランスポザーゼをコードするベクターと組み合わせて投与されることが、好ましい。例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ由来トランスポゾンベースのベクターは、野生型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（Ｐｂａｓｅ）またはマウスコドン最適化ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（ｍＰＢａｓｅ）と共に投与することができる。前記トランスポザーゼは、過活動性トランスポザーゼ、例えば、本明細書の一部を構成するものとして具体的に援用されるYusa et al. (2011)に記載されている７つのアミノ酸置換（Ｉ３０Ｖ、Ｓ１０３Ｐ、Ｇ１６５Ｓ、Ｍ２８２Ｖ、Ｓ５０９Ｇ、Ｎ５３８Ｋ、Ｎ５７０Ｓ）を含む過活動性ＰＢ（ｈｙＰＢ）トランスポザーゼなどであることが好ましい。
【０１４７】
トランスポゾン/トランスポザーゼコンストラクトは、流体力学的注射によって、または非ウイルス性ナノ粒子を用いて肝実質細胞をトランスフェクトすることによって送達することができる。
【０１４８】
他の態様では、本明細書に記載の核酸調節エレメント、核酸発現カセット、およびベクターは、遺伝子治療に使用することができる。インビトロで、しかしまた特にインビボで標的細胞において治療的遺伝子産物発現を達成することを意図した遺伝子治療プロトコルは、当該技術分野において広範に記載されている。これらには、（裸またはリポソーム中の）プラスミドＤＮＡの筋肉内注射、間質注射、気道内点滴、内皮への適用、肝内実質、および静脈内または動脈内投与（例えば、肝内動脈、肝内静脈）が含まれるが、これらに限定はされない。標的細胞へのＤＮＡの利用可能性を高めるための様々な装置が開発されている。簡単なアプローチは、ＤＮＡを含むカテーテルまたは移植可能な材料で標的細胞と物理的に接触させることである。別のアプローチは、高圧下で液体のカラムを直接標的組織中に発射する無針ジェット注射装置を利用することである。これらの送達パラダイムは、ウイルスベクターを送達するためにも使用され得る。標的化遺伝子送達に対する別のアプローチは、核酸またはＤＮＡ結合剤が細胞に核酸の特異的標的化のために結合されたタンパク質または合成リガンドからなる分子コンジュゲートの使用である（Cristiano et
al., 1993）。
【０１４９】
特定の実施形態において、本明細書に記載の核酸発現カセットおよびベクターの使用は、肝臓細胞の遺伝子治療（すなわち、肝臓指向性遺伝子治療）のために想定される。他の特定の実施形態において、調節エレメント、発現カセット、またはベクターの使用は、インビボでの遺伝子治療、特に肝臓指向性遺伝子治療のためのものである。さらに他の特定の実施形態において、当該使用は、血友病を治療する、特に血友病Ｂまたは血友病Ａを治療するための、遺伝子治療、特に肝臓指向性遺伝子治療の方法のためのものである。
【０１５０】
エキソビボおよびインビボの手順の両方を用いて、哺乳類肝実質細胞への遺伝子導入が行われてきた。エキソビボアプローチでは、肝臓細胞の採取、長期発現ベクターを用いるインビトロ形質導入、および導入肝実質細胞の門脈循環への再導入が必要である（Kay et
al., 1992; Chowdhury et al., 1991）。インビボ標的化は、ＤＮＡまたはウイルスベクターを肝実質、肝動脈、または門脈に注射することにより、および転写標的化を介することにより、行われている（Kuriyama et al., 1991; Kistner et al., 1996）。最近の方法には、裸のＤＮＡの門脈内送達（Budker et al., 1996)）および流体力学的尾静脈トランスフェクション（Liu et al., 1999; Zhang et al., 1999）も含まれる。
【０１５１】
他の態様において、本明細書に記載の核酸発現カセットまたはベクターを肝臓細胞に導入するステップ、および肝臓細胞で導入遺伝子タンパク質産物を発現させるステップを含んでなる、肝臓細胞でタンパク質を発現させる方法が与えられる。これらの方法は、インビトロおよびインビボの両方で行い得る。
【０１５２】
治療用タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットを対象の肝臓に導入するステップ、治療量の治療用タンパク質を肝臓で発現させるステップを含んでなる、治療を必要とする対象のための遺伝子治療方法もまた与えられる。他の実施形態において、当該方法は、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットを含んでなるベクターを対象の肝臓に導入するステップ、治療量の治療用タンパク質を肝臓で発現させるステップを含んでなる。
【０１５３】
非常に特定の実施形態において、核酸発現カセットまたはベクター中の導入遺伝子がコードする治療用タンパク質は、第ＩＸ因子であり、当該方法は、血友病Ｂを治療するための方法である。遺伝子治療を介して肝臓に第ＩＸ因子を発現させることにより、血友病Ｂを治療することができる（Snyder et al., 1999）。別の非常に特定の実施形態において、核酸発現カセットまたはベクター中の導入遺伝子がコードする治療用タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子であり、当該方法は、血友病Ａを治療するための方法である。
【０１５４】
別の記載がされている場合を除いて、用語「対象」または「患者」は、互換的に使用され、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳類を意味し、具体的には、ヒト患者および非ヒト哺乳類、例えばマウスなどが含まれる。好ましい患者または対象は、ヒト対象である。
【０１５５】
本明細書中で使用される場合、用語「治療する」または「治療」は、治療的処置および予防措置の両方を表し、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害、例えば増殖性疾患、例えば癌の発症または拡散を防止する、または緩徐にすることである。有益なまたは望ましい臨床結果には、検出可能または検出不可能である、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の進行の遅延または遅滞、疾患状態の改善または緩和、および（部分的または全体的）寛解が含まれるが、これらに限定はされない。「治療」は、治療を受けていない場合の予想される生存期間と比較して、生存期間を延長させることも意味し得る。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「治療を必要とする対象」などの句には、血友病Ｂまたは血友病Ａなどの所与の状態の治療から効能を得ることになる哺乳類対象などの対象が含まれる。このような対象には、典型的には、状態を有すると診断されたもの、前記状態を有しやすいか、または発症しやすいもの、および/または状態が予防されるべきものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
用語「治療有効量」は、対象における疾患または障害を治療するために、すなわち所望の局所的または全身的な効果および性能を得るために有効な化合物または医薬組成物の量を表す。特定の実施形態では、当該用語は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つに係るベクターの対象への形質導入またはトランスフェクションによって、１０ｍＵ／ｍｌ（ミリ単位毎ミリリットル）血漿、５０ｍＵ／ｍｌ血漿、１００ｍＵ／ｍｌ血漿、１５０ｍＵ／ｍｌ、または２００ｍＵ／ｍｌ血漿の治療閾値濃度以上の血漿中の第ＩＸ因子のレベルを得ることができることを意味する。本発明のベクターおよび核酸発現カセットの非常に高い効率のために、対象における第ＩＸ因子のこの高い生理学的レベルは、比較的低い用量のベクターを投与することによってさえも得ることができる。別の実施形態では、当該用語は、本明細書で開示されるベクターのいずれかを対象へ形質導入またはトランスフェクションすることによって、１０ｍＵ／ｍｌ（ミリ単位毎ミリリットル）血漿、５０ｍＵ／ｍｌ血漿、１００ｍＵ／ｍｌ血漿、１５０ｍＵ／ｍｌ血漿、２００ｍＵ／ｍｌ血漿、またはそれ以上の治療閾値濃度以上の血漿中の第ＶＩＩＩ因子のレベルを得ることができることを意味する。本発明で開示されるベクターおよび核酸発現カセットの非常に高い効率のために、対象における第ＶＩＩＩ因子のこれらの高い生理学的レベルは、比較的低
い用量のベクターを投与することによってさえも得ることができる。したがって、当該用語は、治療される血友病の症状の緩和を含む、研究者、獣医師、医師、または他の臨床家が求めている組織、系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘発する化合物または医薬組成物の量を表す。特に、これらの用語は、血友病、特に血友病Ｂまたは血友病Ａに関連する臨床的障害、症状、または合併症を予防、治癒、寛解、または少なくとも最小化するために必要な本発明に係る化合物または医薬組成物の単回または複数回投与での量を表す。
【０１５８】
特に、本明細書に定義されている実施形態のいずれか１つに係るベクターの対象への形質導入は、対象において１０ｍＵ／ｍｌ血漿または５０ｍＵ／ｍｌ血漿の治療的第ＩＸ因子レベルを得るために、２×１０１１ｖｇ／ｋｇ（ウイルスゲノム毎キログラム）未満の用量で行うことができる。
【０１５９】
あるいは、対象において１００ｍＵ／ｍｌ血漿の第ＩＸ因子レベルに達する必要がある場合、本明細書に定義されている実施形態のいずれか１つに係るベクターの対象への形質導入は、６×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行うことができる。
【０１６０】
さらに、１５０ｍＵ／ｍｌ血漿以上に等しい第ＩＸ因子のレベルに達する必要がある場合、本明細書に定義されている実施形態のいずれか１つに係るベクターの対象への形質導入は、２×１０１２ｖｇ以下／ｋｇ以下の用量で行うことができる。
【０１６１】
好ましい実施形態では、本明細書に定義されている実施形態のいずれか１つに係るベクターの対象への形質導入を、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行う場合に、２００ｍＵ／ｍｌ血漿以上の第ＩＸ因子レベルが対象において達成され得る。
【０１６２】
特に、本明細書に定義されている実施形態のいずれか１つに係るベクターの対象への形質導入は、１０ｍＵ／ｍｌ血漿、５０ｍＵ／ｍｌ血漿、１００ｍＵ／ｍｌ血漿、１５０ｍＵ／ｍｌ血漿、２００ｍＵ／ｍｌ血漿、またはそれ以上の対象における治療的第ＶＩＩＩ因子レベルを得るために、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ（ウイルスゲノム毎キログラム）以下、例えば１×１０１２ｋｇ、５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、５×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、５×１０９ｖｇ／ｋｇ、または１×１０９ｖｇ／ｋｇ以下の用量で、好ましくは２．５×１０１１ｖｇ／ｋｇ以下の用量で行うことができる。
【０１６３】
血友病治療では、治療の効果は、例えば、対象における血友病による出血を評価することによって測定することができる。インビトロ試験、例えば、限定はされないが、インビトロでの活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ＡＰＰＴ）、試験第ＩＸ因子発色活性アッセイ、血液凝固時間、第ＩＸ因子またはヒト第ＶＩＩＩ因子特異的ＥＬＩＳＡも利用可能である。もちろん、当該技術分野で公知の治療の効果を評価するための他の試験も使用することができる。
【０１６４】
本発明の核酸発現カセット、ベクター、または医薬組成物を、単独で、または組換えもしくは精製凝固因子の投与などの公知の血友病治療のいずれかと組み合わせて使用してもよい。したがって、本発明の核酸発現カセット、ベクター、または医薬組成物は、単独で、または１つ以上の活性化合物と組み合わせて投与することができる。後者は、前記薬剤の投与の前、後、または同時に投与することができる。
【０１６５】
本発明のさらなる目的は、治療有効量の本明細書で定義されている核酸発現カセットまたは発現ベクター、ならびに薬剤的に許容できる担体、すなわち、例えば、緩衝剤、担体、賦形剤、安定剤などの１種以上の薬剤的に許容できる担体物質および/または添加剤を
含んでなる製剤である。本明細書で使用される用語「薬剤的に許容できる」は、当該技術分野と矛盾がなく、医薬組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではないことを意味する。本明細書で使用される用語「薬剤に許容できる塩」は、塩酸塩、硫酸塩、およびリン酸塩などの無機酸付加塩、または酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、およびクエン酸塩などの有機酸付加塩を意味する。薬剤的に許容できる金属塩の例は、ナトリウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、ならびに亜鉛塩である。薬剤的に許容できるアンモニウム塩の例は、アンモニウム塩およびテトラメチルアンモニウム塩である。薬剤的に許容できる有機アミン付加塩の例は、モルホリンおよびピペリジンとの塩である。薬剤的に許容できるアミノ酸付加塩の例は、リシン、グリシン、およびフェニルアラニンとの塩である。本発明に係る医薬組成物は、例えば、丸剤、錠剤、ラッカー錠剤（lacquered tablet）、糖衣錠、顆粒剤、硬質および軟質ゼラチンカプセル剤、水性、アルコール性、もしくは油性溶液、シロップ、エマルジョン、もしくは懸濁液の形態で経口投与することができ、または直腸に、例えば坐剤の形態で投与することができる。注射または注入のための溶液の形態で非経口的に、例えば皮下、筋肉内、または静脈内に投与を行うこともできる。他の好適な投与形態は、例えば、経皮もしくは局所投与、例えば、軟膏、チンキ、スプレー、もしくは経皮治療システムの形態、または鼻噴霧もしくはエアロゾル混合物の形態の吸入投与、または例えばマイクロカプセル 、インプラント、またはロッドである。医薬組成物は、当業者にそれ自体公知の方法で調製することができる。この目的のために、本明細書で定義されている核酸発現カセットまたは発現ベクター、１種以上の固体または液体の薬剤的に許容できる賦形剤を、必要に応じて他の薬剤的に活性な化合物と組み合わせて、ヒトの医学または獣医学における医薬品として使用することができる適当な投与形態または剤形にする。
【０１６６】
別の態様において、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットと、薬剤的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物が与えられる。別の実施形態において、医薬組成物は、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸発現カセットを含むベクターと、薬剤的に許容できる担体とを含んでなる。他の特定の実施形態において、導入遺伝子は、第ＩＸ因子をコードし、医薬組成物は、血友病Ｂの治療用であるか、または、導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子をコードし、医薬組成物は、血友病Ａの治療用である。
【０１６７】
血友病、好ましくは血友病Ｂまたは血友病Ａの治療に用いるためのこれらの医薬組成物の製造のための、本明細書で開示される核酸発現カセット、その調節エレメント、およびベクター成分の使用もまた想定される。
【０１６８】
特定の実施形態、特定の構造および構成、ならびに材料は、本発明に係る方法および用途について本明細書で論じられてきたが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、形態および細部における様々な変更または修正がなされ得る。
【０１６９】
以下の実施例は、特定の実施形態をよりよく説明するために与えられ、本出願を限定するものとみなされるべきではない。出願は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１７０】
実施例１：使用するＡＡＶベクターのデザイン
自己相補的（ｓｃ）二本鎖アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのデザインを図１に示す。最小トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲｍ）は、高活性化、血栓形成傾向ＦＩＸ変異（Ｒ３３８Ｌ）を含むヒトコドン最適化第ＩＸ因子（ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の発現を駆動している。最小ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍ）は、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（ＳＥＲＰ）、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプルリピート（３×ＳＥＲＰ）、天
然ＴＴＲエンハンサー（ＴＴＲｅ）、またはＳｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプルリピートおよび天然ＴＴＲエンハンサーの組み合わせ（３×ＳＥＲＰ−ＴＴＲｅ）のいずれかと共に使用される。マウス微小ウイルスイントロン（ＭＶＭ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ＢＧＨｐＡ）または合成ポリアデニル化部位（Ｓｙｎｔ．ｐＡ）、および逆方向末端リピート（ＩＴＲ）が示されており、３×ＳｅｒｐＥｎｈは、このエレメントがＴＴＲｍの上流のトリプルリピートとしてクローン化されたことを意味する。ベクターサイズ（両方のＩＴＲのサイズを含む）が示されている。
【０１７１】
図２は、一本鎖（ｓｓ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのデザインを示す。最小トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲｍ）は、ヒトコドン最適化Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（ｃｏｈＦＶＩＩＩデルタＢ）の発現を駆動している。必要に応じて、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー（ＳＥＲＰ）、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプルリピート（３×ＳＥＲＰ）、天然ＴＴＲエンハンサー（ＴＴＲｅ）、またはＳｅｒｐｉｎエンハンサーのトリプルリピートと天然ＴＴＲエンハンサーとの組み合わせ（３×ＳＥＲＰ−ＴＴＲｅ）は、ＴＴＲｍの上流にクローン化されている。マウス微小ウイルスイントロン（ＭＶＭ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化部位（Ｓｖ４０ｐＡ）または合成ポリアデニル化部位（Ｓｙｎｔ．ｐＡ）、および逆方向末端リピート（ＩＴＲ）が示されている。ベクターサイズ（両方のＩＴＲのサイズを含む）が示されている。
【０１７２】
材料および方法：
クローニング法
ＦＩＸコンストラクト：基本的なＡＡＶｓｃ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡプラスミド（Nair et al. Blood, 2014）を使用して、他のＡＡＶ−ＦＩＸコンストラクトを作製した。このプラスミドは、Ｓｅｒｐエンハンサー（ＳｅｒｐＥｎｈ）、肝臓特異的トランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーター、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）小イントロン、Ｒ３３８Ｌ変異を含むコドン最適化ヒトＦＩＸ導入遺伝子、およびウシ成長ホルモンポリＡ（ＢＧＨｐＡ）を含む。ＧｅｎｅＡｒｔ（ライフテクノロジーズ、ドイツ、レーゲンスブルク）によって３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ配列を合成し、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩを用いる基本コンストラクトにクローン化し、それによりＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭを置換し、ｐＡＡＶｓｃ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡを作製した。このプラスミドに、３×ＳｅｒｐＥｎｈ配列をＴＴＲエンハンサー（ＴＴＲＥｎｈ）または（ＧｅｎｅＡｒｔで構築した）３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈで置換し、それにより、ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡおよびｐＡＡＶｓｃ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡをそれぞれ作製した。
【０１７３】
ＦＶＩＩＩコンストラクト：基本的なＡＡＶｓｓ−ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−Ｓｖ４０ｐＡプラスミドを使用して、他のＡＡＶ−ＦＶＩＩＩコンストラクトを作製した。このプラスミドは、Ｓｅｒｐエンハンサー（ＳｅｒｐＥｎｈ）、肝臓特異的トランスサイレチン（ＴＴＲｍ）プロモーター、ＭＶＭイントロン、コドン最適化ヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子(Di Matteo et al., 2014）、およびＳＶ４０ポリＡを含む。ＳｅｒｐＥｎｈをＫｐｎＩを用いて除去し、続いて骨格の再連結を行い、それにより、ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−Ｓｖ４０ｐＡを作製した。ｐＡＡＶｓｃ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−Ｓｖ４０ｐＡを作製するために、３×ＳｅｒｐＥｎｈを最初に異なる骨格を有するＦＶＩＩＩｃｏｐｔプラスミドにクローン化した後、発現カセット全体（３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−Ｓｖ４０ｐＡ）をＮｏｔＩおよびＸｈｏＩを用いてＡＡＶｓｓ骨格にクローン化した。この最終プラスミドから、３×ＳｅｒｐＥｎｈを除去し、（ＧｅｎｅＡｒｔによって構築した）ＴＴＲＥｎｈで置換し、それによってｐＡＡＶｓｓ−
ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏｐｔ−Ｓｖ４０ｐＡを作製した。ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏｈＦＶＩＩＩデルタＢ−ＳＶ４０ｐＡ（５４９３ｂｐ）を得るために、ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏｈＦＶＩＩＩデルタＢ−ＳＶ４０ｐＡ（ベクター）をＮｏｔＩ−Ａｃｃ６５Ｉで制限酵素切断した。ＮｏｔＩ／Ａｃｃ６５Ｉに挟まれる３×Ｓｅｒｐを有する断片をＧｅｎＡｒｔにより合成し、制限酵素切断したベクターに連結した。
【０１７４】
ＡＡＶベクターの製造、精製、および力価測定
ＡＡＶベクターを、先に記載したように（VandenDriessche et al, 2007, VandenDriessche et al; 2007, J. Thromb. Haemost. JTH 5:16-24）、ＡＡＶ−２９３ヒト胚性腎臓癌細胞（ストラタジーン、カリフォルニア州カールスバッド，カタログ番号２４００７３）を、対象のｐＡＡＶプラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、およびＡＡＶ２
Ｒｅｐ遺伝子をＡＡＶ８またはＡＡＶ９  Ｃａｐ遺伝子とともに送達するキメラパッケージングコンストラクトで、リン酸カルシウム（インビトロジェン、カルフォルニア州カールスバッド）同時トランスフェクションすることにより製造した。ＡＡＶ−ＦＩＸベクターについては、ＡＡＶ９血清型を使用し、ＡＡＶ−ＦＶＩＩＩベクターについては、ＡＡＶ８血清型を使用した。ＡＡＶ−２９３細胞は、ＰＣＲによりマイコプラズマの検出について判定される微生物汚染がないものである。簡潔に述べると、トランスフェクションの２日後、細胞を採取し、等密度遠心法を用いてベクター粒子を精製した。採取した細胞を、連続した凍結／融解サイクルおよび超音波処理によって溶解し、ベンゾナーゼ（benzonase）（ノバジェン、ウィスコンシン州マディソン）およびデオキシコール酸（シグマアルドリッチ、ミズーリ州セントルイス）で処理し、続いて塩化セシウム（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）の２回連続の密度勾配超遠心に付した。ＡＡＶベクターを含む画分を集め、ダルベッコ（Dulbecco）のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）中の１ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で濃縮し、−８０℃で保存した。ベクター力価（ウイルスゲノム中（ｖｇ）／ｍｌ）を、特異的プライマーを用いた定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。ＦＩＸベクターについては、ウシ成長ホルモンポリＡ配列に特異的なプライマーを使用した。用いたフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ５’−ＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴ−３’（配列番号６０）および５’−ＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号６１）であった。ＦＶＩＩＩベクターについては、ＦＶＩＩＩ遺伝子配列に特異的なプライマーを使用した。用いたフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ５’−ＡＡＣＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＡＡＧ  −３’（配列番号６２）および５’−ＧＡＴＡＧＧＧＣＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号６３）であった。反応は、ＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライド  バイオシステムズ、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ）でＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライド  バイオシステムズ、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ）で行った。適切なｃＤＮＡを保有する対応するＡＡＶベクターを生じさせるために使用されたそれぞれのベクタープラスミドの既知のコピー数（１０２〜１０７）を用いて標準曲線を作成した。
【０１７５】
動物研究と採血
ＡＡＶベクターの投与は、以下に詳述するように、成体Ｃ５７Ｂ６マウスに対して、マウス１匹当たり１×１０９（低用量）および５×１０９（高用量）のベクターゲノム（ｖｇ）という２つの異なる用量で尾静脈注射によって行う。ＦＩＸ／ＦＶＩＩＩ遺伝子発現を評価するために、遺伝子導入後の様々な時点でマウスを採血した。ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−デルタＢ−ＳＶ４０ｐＡおよびｐＡＡＶｓｓ−３ＸＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−デルタＢ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドコンストラクトを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの流体力学的送達によって、マウス１匹あたり３００ｎｇの用量で投与した。イソフルランを用
いて動物を麻酔し、眼窩後方出血により血液試料をクエン酸三ナトリウム上に採取した。４℃で１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離することにより、採血直後に血漿を調製した。さらなる分析のために、血漿をすぐに−８０℃で保存した。
【０１７６】
ＦＩＸ  ＥＬＩＳＡ
クエン酸処理した血漿中のｈＦＩＸ抗原の濃度を、製造業者のプロトコル（ダイアグノスティカ  スターゴ、フランス）を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。ｈＦＩＸ標準（キットで入手可能）を希釈緩衝液を用いて連続的に希釈し、較正に使用した。ここで標準の１００％は、５０００ｎｇのＦＩＸタンパク質に相当する。血漿試料のアリコートを解凍し、希釈して、それらの読み取り値が標準の直線範囲内に入るようにした。次に、標準および試料を、一次抗ヒトＦＩＸ抗体でプレコートした９６ウェルプレートに加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼに結合した二次抗体を含む溶液を添加し、続いて室温でさらに１時間インキュベートした。インキュベーション後、ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（発色溶液）を加え、発色させた。正確に５分間のインキュベーションの後、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を全てのウェルに添加して反応を停止させた。１５分のインキュベーション後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。得られた標準曲線を用いて、ＦＩＸレベルを決定した。
【０１７７】
ＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡ
クエン酸処理した血漿中のｈＦＶＩＩＩ抗原の濃度を、製造業者のプロトコル（ダイアグノスティカ  スターゴ、フランス）を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。ｈＦＶＩＩＩ標準（キットで入手可能）を希釈緩衝液を用いて連続的に希釈し、較正に使用した。ここで標準の１００％は、２００ｎｇのＦＶＩＩＩタンパク質に相当する。血漿試料のアリコートを解凍し、希釈して、それらの読み取り値が標準の直線範囲内に入るようにした。次に、標準および試料を、一次抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体でプレコートした９６ウェルプレートに加えた。室温で2時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼに結合した二次抗体を含む溶液を添加し、続いて室温でさらに2時間インキュベートした。インキュベーション後、ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（発色溶液）を加え、発色させた。正確に５分間のインキュベーションの後、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を全てのウェルに添加して反応を停止させた。１５分のインキュベーション後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。得られた標準曲線を用いて、ＦＩＸレベルを決定した。
【０１７８】
統計
データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓパッケージを使用して分析した。図３および図４に示す値は、平均＋ＳＥＭである。有意性値を、ｔ検定を用いた比較によって得た。
【０１７９】
ウイルス投与
オス成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１８〜２０グラム）に、１×１０９ｖｇ／マウスおよび５×１０９ｖｇ／マウスの用量で尾静脈注射により、ＡＡＶ９  ＦＩＸベクター（以下の表参照）を投与した。
【０１８０】
【表１】
2018513678.tif 000003
【０１８１】
オス成体ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（１８〜２０グラム）に、１×１０９ｖｇ／マウスおよび５×１０９ｖｇ／マウスの用量で尾静脈注射により、ＡＡＶ８  ＸＶＩＩＩベクター（以下の表参照）を投与した。
【０１８２】
【表２】
2018513678.tif 000004
【０１８３】
プラスミド投与
オス成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２２〜２４グラム）に、それぞれのプラスミド（以下の表を参照）を３００ｎｇの用量での流体力学的尾静脈注射によって、投与した。
【０１８４】
【表３】
2018513678.tif 000005
【０１８５】
結果：
第ＩＸ因子：
天然ＴＴＲｅエンハンサーと結合しており、ＴＴＲｍプロモーターと組み合わされた３コピーのＳｅｒｐエンハンサーを有する３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍを含むＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター注射後少なくとも３９日までの４つの時点で、他の発現カセットのいずれかと比較して最高のＦＩＸレベルをもたらした。ＦＩＸ発現は経時的に連続的な増加を示した。
【０１８６】
最もロバストな３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ調節エレメントを含むＡＡＶベクターは、ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍエンハンサー／プロモーターから（すなわち、ＳｅｒｐＥｎｈエンハンサーを欠いている）ＦＩＸを発現する対照ＡＡＶベクターと比較した場合、約１１〜６倍（それぞれ低および高ベクター用量で）高いＦＩＸ発現を示した。
【０１８７】
最もロバストな３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ調節エレメントを含むＡＡＶベクターは、Ｓｅｒｐエンハンサーの３コピーではなく１つのみを含み、ＴＴＲｅを含まないＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍエンハンサー／プロモーターからＦＩＸを発現するベクターと比較した場合、約４〜３倍（それぞれ低および高ベクター用量で）高いＦＩＸ発現を示した。
【０１８８】
最もロバストな３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍを含むＡＡＶベクターは、Ｓｅｒｐエンハンサーの３コピーを含むが、ＴＴＲエンハンサーを欠く３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍエンハンサー／プロモーターからＦＩＸを発現するベクターと比較した場合、約３〜２倍（それぞれ低および高ベクター用量で）高い発現を示した。
【０１８９】
第ＶＩＩＩ因子：
３コピーのＳｅｒｐエンハンサーを有する３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍを含むＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター注射後少なくとも４０日まで、他の発現カセットのいずれか
と比較して最も高いＦＶＩＩＩレベルをもたらした。ＦＶＩＩＩ発現は経時的に連続的な増加を示した。
【０１９０】
３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ調節エレメントを含むＡＡＶベクターは、ＴＴＲ最小プロモーターのみからなりエンハンサーを含まない基準対照カセット（ＴＴＲｍ）と比較した場合、約３０〜１２倍（それぞれ低および高ベクター用量）高いＦＶＩＩＩ発現を示した。
【０１９１】
３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ調節エレメントを含むＡＡＶベクターは、Ｓｅｒｐエンハンサーの１コピーのみを有するＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍを含むＡＡＶベクターと比較した場合、約１０〜１．５倍（それぞれ低および高ベクター用量）高いＦＶＩＩＩ発現を示した。
【０１９２】
３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ調節エレメントを含むＡＡＶベクターは、ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍエンハンサー／プロモーターを含むＡＡＶベクターと比較した場合、約５〜２倍（それぞれ低および高ベクター用量）高い発現を示した。３×ＳｅｒｐＥｎｈ調節エレメントは、ＴＴＲｅｎｈ−ＴＴＲｍエンハンサー／プロモーターからのＦＶＩＩＩ発現をさらに増加させることができた（図１５）。ＦＶＩＩＩタンパク質レベルは、ｐＡＡＶｓｓ−３×ＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−デルタＢ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを注射したマウスにおいて、ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏ−ｈＦＶＩＩＩ−デルタＢ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドと比較して約８〜５倍高かった。
【０１９３】
実施例２  ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスへの流体力学的注射（２ｍｌ）による種々のコンストラクトにおけるＦＶＩＩＩ発現に対する３×ＣＲＭ８およびＴＴＲエンハンサーのインビボでの効果の研究
【０１９４】
本実施例の目的は、ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスへの流体力学的注射（２ｍｌ）による種々のコンストラクトにおけるＦＶＩＩＩ発現に対する３×ＣＲＭ８およびＴＴＲエンハンサーのインビボでの効果を研究することである。
【０１９５】
コンストラクト：以下のベクターを、ＦＶＩＩＩ発現レベルについて比較した（図２２参照）：
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号１４）；
ｐＡＡＶｓｓ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号１６）；
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号１７）；および
ｐＡＡＶｓｓ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭ−ｃｏＦＶＩＩＩデルタＢ−Ｓｖ４０ｐＡ（配列番号：２２）。
【０１９６】
第１の実験では、以下の条件を使用した。
マウスモデル：１８〜２０グラムのＣＢ１７−ＳＣＩＤオス成体マウス
用量：１５０ｎｇプラスミド／マウス
分析時点：１日目に血液収集
マウスの数：条件当り３
デザイン：以下の表を参照
【０１９７】
【表４】
2018513678.tif 000006
【０１９８】
結果：ＦＶＩＩＩの発現レベルを分析し、比較した。図２５ａの例は、３００ｎｇのそれぞれのプラスミドを注射したＣ５７ＢＬ６マウスにおけるＦＶＩＩＩ発現の調節におけるＴＴＲｅｎｈ−ＴＴＲｍプロモーターに対する３×Ｓｅｒｐエンハンサーの効果を表すグラフを示す。１日目に収集した血漿試料において、ＦＶＩＩＩ発現プロファイルを、ＥＬＩＳＡを用いて試験した。３×Ｓｅｒｐエンハンサーの存在は、ＦＶＩＩＩ発現を８倍上昇させるようである。
【０１９９】
第２の実験では、以下の条件を使用した。
マウスモデル：１８〜２０グラムのＣＢ１７−ＳＣＩＤオス成体マウス
用量：１５０ｎｇプラスミド／マウス
分析時点：１日目に血液収集
マウスの数：条件当り３
デザイン：以下の表を参照
【０２００】
【表５】
2018513678.tif 000007
【０２０１】
結果：図２５ｂは、４つのコンストラクトの比較からまとめたデータを示す（実際のＦＶＩＩＩ発現値については以下の表を参照）。３×ＳＥＲＰのＴＴＲｍコンストラクトへの
追加は、ＦＶＩＩＩ発現を１７倍に増強する。３×ＳＥＲＰのＴＴＲｅ−ＴＴＲｍコンストラクトへの添加は、ＦＶＩＩＩ発現を１３倍に増強する。さらに、ＴＴＲｅの３×ＳＥＲＰ−ＴＴＲｍコンストラクトへの追加は、ＦＶＩＩＩ発現を４倍に増強する。
【０２０２】
【表６】
2018513678.tif 000008
【０２０３】
実施例３：Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの流体力学的注射（２ｍｌ）による種々のコンストラクトにおけるＦＩＸ発現に対するＡＡＴプロモーターと組み合わせた３×ＣＲＭ８およびＴＴＲエンハンサーのインビボでの効果の研究
【０２０４】
本実験では、ＴＴＲｍ最小プロモーターは、別の肝臓特異的プロモーターにより置換され、調節エレメントの多機能性を示す。
【０２０５】
第１の例として、ＡＡＴ肝臓特異的プロモーター（ＡＡＴ）を試験する。
【０２０６】
コンストラクト：図２３に示すように４つの異なるコンストラクトを調製した（配列は図２４に示されている）：
ｐＡＡＶｓｓ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６５）；
ｐＡＡＶｓｓ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６６）；
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６７）；および
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３ｘＳｅｒｐＥｎｈ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ｃｏ−ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ（配列番号６８）。
試験された全てのコンストラクトは、ＡＡＴプロモーター（配列番号６４）を使用する。
【０２０７】
マウスモデル：１８〜２０グラムのＣＢ５７ＢＬ／６オス成体マウス
用量：１μｇおよび２μｇプラスミド／マウス
分析時点：Ｄ１、Ｄ２に血液収集
マウスの数：条件当り３
デザイン：以下の表を参照
【０２０８】
【表７】
2018513678.tif 000009
【０２０９】
また、対応するＦＶＩＩＩコンストラクトは、ＡＡＴプロモーターを用いるＦＶＩＩＩ発現について試験され、したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ．
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ．
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡおよび
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＡＴ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２１０】
同様に、以下の実施例は、上記のＡＡＴプロモーターを用いた実施例の概要に従うが、毎回異なる肝臓特異的プロモーターまたは最小プロモーターを用いる。
【０２１１】
他の実施例において、アルブミンプロモーター（ＡＬＢｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＬＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２１２】
他の実施例において、アポリポタンパク質Ａ１プロモーター（ＡＰＯＡ１ｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＡ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２１３】
他の実施例において、補体因子Ｂプロモーター（ＣＦＢｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＦＢｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２１４】
他の実施例において、ケトヘキソキナーゼプロモーター（ＫＨＫｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＫＨＫｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２１５】
他の実施例において、ヘモペキシンプロモーター（ＨＰＸｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＰＸｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２１６】
他の実施例において、ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼプロモーター（ＮＮＭＴｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＮＮＭＴｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２１７】
他の実施例において、（肝臓）カルボキシルエステラーゼ１プロモーター（ＣＥＳ１ｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＥＳ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＥＳ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＣＥＳ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＣＥＳ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＥＳ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＣＥＳ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２１８】
他の実施例において、プロテインＣプロモーター（ＰＲＯＣｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＰＲＯＣｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２１９】
他の実施例において、アポリポタンパク質Ｃ３プロモーター（ＡＰＯＣ３ｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＡＰＯＣ３ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２２０】
他の実施例において、マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ２ｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＭＡＳＰ２ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２２１】
他の実施例において、ｓｅｒｐｉｎペプチダーゼ阻害因子、クレードＣ（アンチトロンビン）プロモーター（ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクト：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＳＥＲＰＩＮＣ１ｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
を包含する。
【０２２２】
他の実施例において、ｓｅｒｐｉｎペプチダーゼ阻害因子プロモーター（ＨＡＭＰｐ）を使用して前記コンストラクト中のＴＴＲｍプロモーターを置換する。したがって、以下のコンストラクトを：
ｐＡＡＶｓｃ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−３×ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
ｐＡＡＶｓｃ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，
ｐＡＡＶｓｓ−ＴＴＲｅ−３×ＣＲＭ８−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ，
ｐＡＡＶｓｃ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＩＸｃｏＲ３３８Ｌ−ＢＧＨｐＡ，または
ｐＡＡＶｓｓ−ＣＲＭ８−ＴＴＲｅ−ＨＡＭＰｐ−ＭＶＭ−ＦＶＩＩＩｃｏデルタＢ−ｓｖ４０ｐＡ
包含する。
【０２２３】
結果：実施例２で説明したように、ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩの発現レベルを分析し、比較する。
【０２２４】
［参考文献］
ANNONI A, BROWN BD, CANTORE A, SERGI LS,  NALDINI L,  and  RONCAROLO MG. (2009).
In vivo delivery of a microRNA-regulated transgene induces antigen-specific regulatory T cells and promotes immunologic tolerance. Blood 114, 5152-5161
ARRUDA VR, STEDMAN HH, HAURIGOT V, and BUCHLIS G. (2010). Peripheral transvenular delivery of adeno-associated viral vectors to skeletal muscle as a novel therapy for hemophilia B. Blood 115, 4678-88.
AXELROD JH, READ MS, BRINKHOUS KM, and VERMA IM. (1990). Phenotypic correction of factor IX deficiency in skin fibroblasts of hemophilic dogs. Proc Natl Acad Sci USA; 87, 5173-7.
BROWN BD, SHI CX, POWELL S HURLBUT D, GRAHAM FL, and LILLICRAP D. (2004). Helper-dependent adenoviral vectors mediate therapeutic factor VIII expression for sev
eral months with minimal accompanying toxicity in a canine model of severe hemophilia A. Blood 103, 804-10.
BROWN BD, CANTORE A, ANNONI A, SERGI LS, LOMBARDO A, DELLA VALLE P, D'ANGELO A, and NALDINI L. (2007). A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood 110, 4144-52.
Brunetti-Pierri N, Grove NC, Zuo Y, Edwards R, Palmer D, Cerullo V, Teruya J, Ng
P.
Bioengineered factor IX molecules with increased catalytic activity improve the therapeutic index of gene therapy vectors for hemophilia B. Hum Gene Ther. 2009 May;20(5):479-85.
BUCHLIS G, PODSAKOFF GM, RADU A, HAWK SM, FLAKE AW, MINGOZZI F, and HIGH KA. (2012). Factor IX expression in skeletal muscle of a severe hemophilia B patient 10
years after AAV-mediated gene transfer. Blood 119, 3038-41.
Budker V, Zhang G, Knechtle S, Wolff JA. Naked DNA delivered intraportally expresses efficiently in hepatocytes. (1996) Gene Ther. Jul;3(7):593-8. 
Cantore A, Nair N, Della Valle P, Di Matteo M, Matrai J, Sanvito F, Brombin C, Di Serio C, D'Angelo A, Chuah M, Naldini L, Vandendriessche T. Hyper-functional coagulation factor IX improves the efficacy of gene therapy in hemophilic mice. Blood. 2012. Oct 4.
Chang, J., Jin, J., Lollar, P., Bode, W., Brandstetter, H., Hamaguchi, N., Straight, D. L. &Stafford, D. W. (1998). Changing residue 338 in human factor IX from
arginine to alanine causes an increase in catalytic activity. J Biol Chem 273(20): 12089-12094. 
Chowdhury JR, Grossman M, Gupta S, Chowdhury NR, Baker JR Jr, Wilson JM. (1991) Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. Dec 20;254(5039):1802-5.
CHUAH MK, SCHIEDNER G, THORREZ L, BROWN B, JOHNSTON M, GILLIJNS V, HERTEL S, VAN
ROOIJEN N, LILLICRAP D, COLLEN D, VANDENDRIESSCHE T, and KOCHANEK S. (2003). Therapeutic factor VIII levels and negligible toxicity in mouse and dog models of hemophilia A following gene therapy with high-capacity adenoviral vectors. Blood
101, 1734-43. 
Chuah MK, Nair N, VandenDriessche T. Recent progress in gene therapy for hemophilia.
Hum Gene Ther. 2012a Jun;23(6):557-65.
Chuah MK, Nair N, VandenDriessche T. Recent progress in gene therapy for hemophilia.
Hum Gene Ther. 2012b Jun;23(6):557-65.
Chuah MK, VandenDriessche T. Platelet-directed gene therapy overcomes inhibitory
antibodies to factor VIII. J Thromb Haemost. 2012c Aug;10(8):1566-9
DONSANTE A, MILLER DG, LI Y, VOGLER C, BRUNT EM, RUSSELL DW, and SANDS MS. (2007). AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science 317, 477.
DOBRZYNSKI E, FITZGERALD JC, CAO O, MINGOZZI F, WANG L, and HERZOG RW (2006) Prevention of cytotoxic T lymphocyte responses to factor IX-expressing hepatocytes by gene transfer-induced regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci USA 103, 4592 - 4597. 
EHRHARDT A, and KAY MA. (2002). A new adenoviral helper-dependent vector results
in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood 99, 3923-30.
FIELDS PA, ARRUDA VR, ARMSTRONG E, KIRK CHU, MINGOZZI, F.  HAGSTROM, J., HERZOG 
R, HIGH KA. (2001). Risk and prevention of anti-factor IX formation in AAV-mediated gene transfer in the context of a large deletion of F9. Mol. Ther. 4, 201-210. 
FOLLENZI A, BATTAGLIA M, LOMBARDO A, ANNONI A, RONCAROLO MG, and NALDINI L. (2004). Targeting lentiviral vector expression to hepatocytes limits transgene-specific immune response and establishes long-term expression of human antihemophilic
factor IX in mice. Blood 103, 3700-9. 
GAO GP, ALVIRA MR, WANG L, JOHNSTON J, WILSON JM. (2002). Novel adeno-associated
viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11854 -9.
GAO G, VANDENBERGH LH, ALVIRA MR LU Y, CALCEDO R, ZHOU X, and WILSON JM. (2004).
Clades of Adeno- associated viruses are widely disseminated in human tissues. J. Viro l78, 6381 - 6388.
HERZOG RW, YANG EY, COUTO LB, HAGSTROM JN, ELWELL D, FIELDS PA, BURTON M, BELLINGER DA, READ MS, BRINKHOUS KM, PODSAKOFF GM, NICHOLS TC, KURTZMAN GJ, and HIGH KA. (1999). Long-term correction of canine hemophilia B by gene transfer of blood
coagulation factor IX mediated by adeno-associated viral vector. Nat Med. 5, 56-63. 
HERZOG RW, MOUNT JD, ARRUDA VR, HIGH KA, and LOTHROP CD Jr. (2001). Muscle-directed gene transfer and transient immune suppression result in sustained partial correction of canine hemophilia B caused by a null mutation. Mol Ther. 4, 192-200. 
HERZOG RW, HAGSTROM JN, KUNG SH, TAI SJ, WILSON JM, FISHER KJ, and HIGH KA. (1997) Stable gene transfer and expression of human blood coagulation factor IX after intramuscular injection of recombinant adeno-associated virus. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 5804 - 5809.
HERZOG RW, FIELDS PA, ARRUDA VR, BRUBAKER JO, ARMSTRONG E, MCCLINTOCK D, BELLINGER DA, COUTO LB, NICHOLS TC, HIGH KA (2002) Influence of vector dose on factor IX-specific T and B cell responses in muscle- directed gene therapy. Hum Gene Ther 13, 1281-1291. 
HIGH KA. (2001). Gene Transfer as an approach to treating Hemophilia. Circ Res. 88, 137-144.
HIGH KA. (2011) Gene therapy for hemophilia: a long and winding road. J Thromb Haemost. 9  Suppl. 1:  2-11.
BAINBRIDGE J, SMITH AJ, BARKER S, et al. (2008) Effect of Gene Therapy on Visual
Function in Leber's Congenital Amaurosis. N Engl J Med. 358, 2231-2239.
JIANG H, LILLICRAP D, and PATARROYO-WHITE S. (2006). Multiyear therapeutic benefit of AAV serotypes 2, 6, and 8 delivering factor VIII to hemophilia A mice and dogs. Blood. 108, 107-15.
Kao, C. Y., Lin, C. N., Yu, I. S., Tao, M. H., Wu, H. L., Shi, G. Y., Yang, Y. L., Kao, J. T. &Lin, S. W. (2010). FIX-Triple, a gain-of-function factor IX variant, improves haemostasis in mouse models without increased risk of thrombosis. Thromb Haemost 104(2): 355-365.
Kay MA, Baley P, Rothenberg S, Leland F, Fleming L, Ponder KP, Liu T, Finegold M, Darlington G, Pokorny W, Woo SLC. (1992) Expression of human alpha 1 -antitrypsin in dogs after autologous transplantation of retroviral transduced hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. Jan 1 ;89(1 ):89-93.
KAY MA, MANNO CS, RAGNI MV, COUTO LB, MCCLELLAND A, GLADER B, CHEW AJ, TAI SJ, HERZOG RW, ARRUDA V, JOHNSON F, SCALLAN C, SKARSGARD E, FLAKE AW, and HIGH KA. (2000). Evidence for gene transfer and expression of factor IX in hemophilia B pat
ients treated with an AAV vector. Nat Genet. 24,  257- 61.
Kistner A, Gossen M, Zimmermann F, Jerecic J, Ullmer C, Lybbert H, Bujard H. (1996) Doxycycline- mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. Oct 1;93(20): 10933-8.
KREN BT, UNGER GM, SJEKLOCHA L, TROSSEN AA, KORMAN V, DIETHELEM-OKITA BM, REDING
MT, and STEER CJ. (2009). Nanocapsule-delivered Sleeping Beauty mediates therapeutic Factor VIII expression in liver sinusoidal endothelial cells of hemophilia
A mice. J Clin Invest. 19,  2086-99. 
Kuriyama S, Yoshikawa M, Ishizaka S, Tsujii T, lkenaka K, Kagawa T, Morita N, Mikoshiba K. (1991) A potential approach for gene therapy targeting hepatoma using
a liver-specific promoter on a retroviral vector. Cell Struct Funct. Dec;16(6):503-10.
LI H, MALANI N, HAMILTON SR, SCHLACHTERMAN A, BUSSADORI G, EDMONSON SE, SHAH R, ARRUDA VR, MINGOZZI F, WRIGHT JF, BUSHMAN FD, and HIGH KA. (2011). Assessing the
potential for AAV vector genotoxicity in a murine model. Blood. 117, 3311-9. 
Lin, C. N., Kao, C. Y., Miao, C. H., Hamaguchi, N., Wu, H. L., Shi, G. Y., Liu, Y. L., High, K. A. &Lin, S. W. (2010). Generation of a novel factor IX with augmented clotting activities in vitro and in vivo. J Thromb Haemost 8(8): 1773-1783. 
Liu F, Song Y, Liu D. (1999) Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. Jul;6(7):1258-66.
MANNO CS, PIERCE GF, and ARRUDA VR. (2006). Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response.
Nat Med. 12,  342-7.
MATES L, CHUAH MK, BELAY E, JERCHOW B, MANOJ N, ACOSTA-SANCHEZ A, GRZELA DP, SCHMITT A, BECKER K, MATRAI J, MA L, SAMARA-KUKO E, GYSEMANS C, PRYPUTNIEWICZ D, MISKEY C, FLETCHER B, VANDENDRIESSCHE T,, IVICS Z, and IZSVAK Z. (2009). Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41, 753-61.
MATRAI J, CHUAH MK, and VANDENDRIESSCHE T. (2010a). Pre clinical and clinical progress in hemophilia gene therapy. Curr Opin Hematol. 17, 387-92. 
MATRAI J, CHUAH MK, and VANDENDRIESSCHE T. (2010b). Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol Ther. 18, 477-90.
MATRAI J, CANTORE A, BARTHOLOMAE CC, ANNONI A, WANG W, ACOSTA-SANCHEZ A, SAMARA-KUKO E, DE WAELE L, MA L, GENOVESE P, DAMO M, ARENS A, GOUDY K, NICHOLS TC, VON KALLE C, L CHUAH MK, RONCAROLO MG, SCHMIDT M, VANDENDRIESSCHE T, and NALDINI L. (2011). Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors
induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology 53, 1696-707. 
MATSUI H, SHIBATA M, BROWN B, LABELLE A, HEGADRON C, ANDREWS C, CHUAH M, VANDENDRIESSCHE T, MIAO CH, HOUGH C, and LILLICRAP D. (2009). A murine model for induction of long-term immunologic tolerance to factor VIII does not require persistent detectable levels of plasma factor VIII and involves contributions from Foxp3+
T regulatory cells. Blood. 114,  677-85. 
MATSUI H, HEGADORN C, OZELO M, BURNETT E, TUTTLE A, LABELLE A, McCARY PB Jr., NALDINI L, BROWN B, HOUGH C, and LILLICRAP D. (2011). A microRNA-regulated and GP64-pseudotyped lentiviral vector mediates stable expression of FVIII in a murine model of Hemophilia A. Mol Ther. 19, 723-30.
McCARTY DM, MONAHAN PE, and SAMULSKI RJ. (2001). Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independen
tly of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-54.
McCARTY DM, FU H, MONAHAN PE, TOULSON CE, NAIK P, and SAMULSKI RJ.  (2003). Adeno-associated virus terminal repeat (TR) mutant generates self-complementary vectors to overcome the rate-limiting step to transduction in vivo. Gene Ther. 10, 2112-8. 
McIntosh, J. et al. Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral vein administration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant. Blood (2013).
MIAO CH, OHASHI K, PATIJN GA, MEUSE L, YE X, THOMPSON AR, and KAY MA .(2000). Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro. Mol Ther. 1,  522-32.
MIAO H.Z., SIRACHAINAN N., PALMER L., et al. (2004). Bioengineering of coagulation factor VIII for improved secretion. Blood 103(9):3412-3419.
Milanov, et al., 2012 Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice Blood 119:602-611.
Miller AD. (1990) Retrovirus packaging cells. Hum Gene Ther. Spring;1 (1 ):5-14.
MINGOZZI F, LIU YL, DOBRZYNSKI E, KAUFHOLD A, LIU JH, WANG Y, ARRUDA VR, HIGH KA, and HERZOG RW. (2003).  Induction of immune tolerance to coagulation factor IX
antigen by in vivo hepatic gene transfer. J Clin Invest. 111, 1347-56.
MINGOZZI F, MAUS MV, HUI DJ, SABATINO DE, MURPHY SL, RASKO JE, RAGINI MV, MANNO CS, SOMMER J, JIANG H, PIERCE GF, ERTL HC, and HIGH KA. (2007).  CD8(+) T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med. 13, 419-22. 
MOUNT JD, HERZOG RW, TILLSON DM, GOODMAN SA, ROBINSON N, MCCLELAND ML, BELLINGER
D, NICHOLS TC, ARRUDA VR, LOTHROP CD JR, and HIGH KA. (2002). Sustained phenotypic correction of hemophilia B dogs with a factor IX null mutation by liver-directed gene therapy. Blood 99,  2670-6.
Nair N, Rincon MY, Evens H, Sarcar S, Dastidar S, Samara-Kuko E, Ghandeharian O,
Man Viecelli H, Thony B, De Bleser P, VandenDriessche T, Chuah MK. (2014). Computationally designed liver-specific transcriptional modules and hyperactive factor IX improve hepatic gene therapy. Blood 123,3195-9.
Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D. (1996) In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. Apr 12;272(5259):263-7.
NATHWANI AC, DAVIDOFF AM, HANAWA H, YUNYU HU,  HOFFER FA,  NIKANOROV A, SLAUGHTER C,  NG CYC,  ZHOU J,   LOZIER J, MANDRELL TD,  VANIN EF, and NIENHUIS AW. (2002). Sustained high- level expression of human factor IX (hFIX) after liver-targeted delivery of recombinant adeno-associated virus encoding the hFIX gene in rhesus macaques. Blood 100, 1662-1669. 
NATHWANI AC, GRAY JT, NG CY, ZHOU J, SPENCE Y, WADDINGTON SN, TUDDENHAM EG, KEMBALL COOK G, McINTOSH J, BOON-SPIJKER M, MERTENS K, DAVIDOFF AM. (2006).Self-complementary adeno-associated virus vectors containing a novel liver-specific human
factor IX expression cassette enable highly efficient transduction of murine and nonhuman primate liver. Blood 107, 2653-61.
NATHWANI AC, TUDDENHAM EG, RANGARAJAN S, ROSALES C, MCINTOSH J, LINCH DC, CHOWDARY P, RIDDELL A, PIE AJ, HARRINGTON C, O'BEIRNE J, SMITH K, PASI J, GLADER B, RUSTAGI P, NG CY, KAY MA, ZHOU J, SPENCE Y, MORTON CL, ALLAY J, COLEMAN J, SLEEP S, CUNNINGHAM JM, SRIVASTAVA D, BASNER-TSCHAKARJAN E, MINGOZZI F, HIGH KA, GRAY JT, REISS UM, NIENHUIS AW, and DAVIDOFF AM. (2011). Adenovirus-associated virus v
ector-mediated gene transfer in hemophilia B. N Engl J Med. 365, 2357-2365.
OHLFEST JR, FRANDSEN JL, FRITZ S, LOBITZ PD, PERKINSON SG, CLARK KJ, NELSESTUEN G, KEY NS, MCLVOR RS, HACKETT PB, and LARGAESPADA DA. (2004). Phenotypic correction and long-term expression of factor VIII in hemophilic mice by immunotolerization and nonviral gene transfer using the Sleeping Beauty transposon system. Blood 105, 2691-8. 
Petrus, I., Chuah, M. & VandenDriessche, T. Gene therapy strategies for hemophilia: benefits versus risks. J Gene Med 12, 797-809 (2010).SANDBERG H, ALMSTEDT A,
BRANDT J, et al. (2001). Structural and functional characteristics of the B domain-deleted recombinant factor VIII proteint, r-VIII SQ. Thromb Haemost. 85(1): 93-100.
Schuettrumpf, J., Herzog, R. W., Schlachterman, A., Kaufhold, A., Stafford, D. W. &Arruda, V. R. (2005). Factor IX variants improve gene therapy efficacy for hemophilia B. Blood 105(6): 2316-2323.
Simioni, P., Tormene, D., Tognin, G., Gavasso, S., Bulato, C., Iacobelli, N. P.,
Finn, J. D., Spiezia, L., Radu, C. &Arruda, V. R. (2009). X-linked thrombophilia with a mutant factor IX (factor IX Padua). N Engl J Med 361(17): 1671-1675.
SNYDER RO, MIAO CH, PATIJN GA, SPRATT SK, DANOS O, NAGY D, GOWN AM, WINTHER B, MEUSE L, COHEN LK, THOMPSON AR, and KAY MA. (1997). Persistent and therapeutic concentrations of human factor IX in mice after hepatic gene transfer of recombinant AAV vectors. Nat Genet.  16, 270 - 276.
SNYDER RO, MIAO C, MEUSE L, TUBB J, DONAHUE BA, HUI-FENG LIN, STAFFORD DW, PATEL
S, THOMPSON AR, NICHOLS T, READ MS , BELLINGER DA, BRINKHOUS KM, and KAY MA. (1999). Correction of hemophilia B in canine and murine models using recombinant adeno- associated viral vectors. Nat Med. 5,  64-70. 
Trapnell BC. (1993) Adenoviral vectors for gene transfer. Adv. Drug Del. Rev. 12: 185-199.
VANDENBERGHE LH, WANG L, SOMANATHAN S, ZHI Y, FIGUEREDO J, CALCEDO R, SANMIGUEL J, DESAI RA, CHEN CS, JOHNSTON J, GRANT RL, GAO G, and WILSON JM. (2006). Heparin binding directs activation of T cells against adeno-associated virus serotype 2 capsid. Nat Med. 12, 967-71.
VANDENDRIESSCHE T, VANSLEMBROUCK V, GOOVAERTS I, ZWINNEN H, VANDERHAEGHEN ML, COLLEN D, and CHUAH MK. (1999).  Long-term expression of human coagulation factor VIII and correction of hemophilia A after in vivo retroviral gene transfer in factor VIII-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 10379-84.
VANDENDRIESSCHE T, THORREZ L, NALDINI L, FOLLENZI A, MOONS L, ZWI BERNEMAN, COLLEN D, and CHUAH MK. (2002). Lentiviral vectors containing the human immunodeficiency virus type-1 central polypurine tract can efficiently transduce nondividing
hepatocytes and antigen-presenting cells in vivo. Blood 100, 813-22.
VANDENDRIESSCHE T, THORREZ L, ACOSTA-SANCHEZ A, PETRUS I, WANG L, MA L, DE WAELE
L, IWASAKI Y, GILLIJNS V, WILSON JM, COLLEN D, and CHUAH MK. (2007). Efficacy and safety of adeno-associated viral vectors based on serotype 8 and 9 vs. lentiviral vectors for hemophilia B gene therapy. J Thromb Haemost. 5, 16-24.
VANDENDRIESSCHE T, IVICS Z, IZSVAK Z, and CHUAH MK. (2009). Emerging potential of transposons for gene therapy and generation of induced pluripotent stem cells.
Blood 114, 1461-8.
VANDENDRIESSCHE T, and CHUAH MK. (2012). Clinical progress in gene therapy: sustained partial correction of the bleeding disorder in patients suffering from severe hemophilia B. Hum Gene Ther. 23, 4-6. 
WANG L, TAKABE K, BIDLINGMAIER SM, ILL CR, and VERMA IM. (1999). Sustained corre
ction of bleeding disorder in hemophilia B mice by gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 96, 3906-3910. 
WANG L, NICHOLS TC, READ MS, BELLINGER DA, and VERMA IM. (2000). Sustained expression of therapeutic level of factor IX in hemophilia B dogs by AAV-mediated gene therapy in liver. Mol Ther. 1,  154-158. 
WANG L, CAO O, SWALM B, DOBRZYNSKI E, MINGOZZI F, and HERZOG RW (2005) Major role of local immune responses in antibody formation to factor IX in AAV gene transfer. Gene Ther 12, 1453-464.
WARD NJ, BUCKLEY SM, WADDINGTON SN, VANDENDRIESSCHE T, CHUAH MK, NATHWANI AC, McLNTOSH J, TUDDENHAM EG, KINNON C, THRASHER AJ, and McVEY JH (2010) Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression. Blood 117,  798-807. 
Ward, N.J. et al. Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression. Blood 117, 798-807 (2011).
WU Z, SUN J, ZHANG T, YIN C, YIN F, VAN DYKE T, SAMULSKI RJ, and MONAHAN PE. (2008). Optimization of self-complementary AAV vectors for liver-directed expression results in sustained correction of hemophilia B at low vector dose. Mol Ther. 16, 280-9.
XU L, GAO C, and SANDS MS. (2003). Neonatal or hepatocyte growth factor-potentiated adult gene therapy with a retroviral vector results in therapeutic levels of
canine factor IX for hemophilia B. Blood 101,  3924 - 3932.
XU L, NICHOLS TC, SARKAR R, Mc CORQUODALE S, BELLINGER DA, PONDER KP. (2005). Absence of a desmopressin response after therapeutic expression of factor VIII in hemophilia A dogs with liver-directed neonatal gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 102,  6080-6085.
Yamada T, Iwasaki Y, Tada H, Iwabuki H, Chuah MK, VandenDriessche T, Fukuda H, Kondo A, Ueda M, Seno M, Tanizawa K, Kuroda S. (2003) Nanoparticles for the delivery of genes and drugs to human hepatocytes. Nat Biotechnol. Aug;21 (8):885-90.
YANT SR, MEUSE L, CHIU W, IVICS Z, IZSVAK Z, and KAY MA. (2000). Somatic integration and long-term transgene expression in normal and haemophilic mice using a DNA transposon system. Nat Genet. 25, 35-41.
Yusa et al. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(4):1531-6.
Zhang G, Budker V, Wolff JA. (1999) High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. JuI 1 ;10(10):1735-7.
ZHONG L, LI B, MAH CS, GOVINDASAMY L, AGBANDJE-MCKENNA,  COOPER M, HERZOG RW, ZOLOTUKHIN I, WARRINGTON JR. KH,  WEIGEL-VAN AKEN K, HOBBS JA, ZOLOTUKHIN S, MUZYCZKA N, and  SRIVASTAVA A (2008). Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower
doses. Proc Natl Acad Sci USA 105, 7827-32.
【図１】
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【図１−２】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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