(57)【要約】  本発明は微生物発酵法を使用して遊離形の単糖（例えばＬ−フコース）を生産する方法に関する。使用する微生物はヌクレオチド活性化型糖に対してヒドロラーゼ活性を示し、単糖を未修飾遊離形で遊離する。培養した微生物の上清から遊離の単糖を回収する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を使用して遊離形の目的の単糖を生産する方法であって、
ａ）ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒することができ、前記ヌクレオチド活性化単糖から目的の単糖を遊離させる酵素を含む、前記単糖の合成のための微生物を準備する工程と、
ｂ）前記微生物を増殖させるのに適した培地で前記微生物を培養する工程と、ここで、前記微生物は前記単糖を有意な程度まで代謝することができず、培養工程中に目的の前記単糖が蓄積する、
を含む、方法。
【請求項２】
組換え微生物を使用し、前記組換え微生物が、ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒することが可能な酵素をコードする異種核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、グリコシルトランスフェラーゼ、好ましくはフコシルトランスフェラーゼであり、前記酵素が、アクセプター分子の不在下でヌクレオチド活性化単糖ＧＤＰ−フコースの加水分解を触媒することが可能である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｅａ  ｃｏｌｉ）に由来するｗｂｇＬ遺伝子によりコードされる２−フコシルトランスフェラーゼの変異体又はピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に由来するｆｕｔＣ遺伝子によりコードされる１，２−フコシルトランスフェラーゼの変異体であり、前記変異体が、夫々ｗｂｇＬ遺伝子によりコードされる野生型２−フコシルトランスフェラーゼ又はｆｕｔＣ遺伝子によりコードされる野生型１，２−フコシルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１カ所、好ましくは少なくとも２カ所、より好ましくは３カ所以上に変異があり、前記変異が、前記酵素の加水分解活性の増加をもたらす請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１カ所の変異が、アミノ酸置換である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、産生された単糖の分解をもたらす異化経路を不活性化又は大きく減少又は欠損するように更に改変されている請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、Ｌ−フコースの異化に関与する遺伝子を不活性化又は大きく減少又は欠損するように更に改変されている請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が、前記ヌクレオチド活性化単糖の生合成に関与する少なくとも１種の遺伝子を過剰発現し、前記単糖のヌクレオチド活性化単糖の供給を改善するように更に改変されている請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノース又はＧＤＰ−ラムノースの生合成に関与する少なくとも１種の遺伝子が過剰発現され、夫々ＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノース又はＧＤＰ−ラムノースの供給を改善する請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の遺伝子が、異種又は同種である請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、前記ヌクレオチド活性化単糖の競合経路を不活性化又は減少するように更に改変されている請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
生産される前記単糖が、Ｌ−フコース、Ｌ−ラムノース又はＬ−マンノースから選択される請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
グリセロール、スクロース、グルコース、フルクトース、糖蜜、キシロース、セルロース、合成ガス、コーンシロップ又はラクトースから選択されるが、これらに限定されない廉価な炭素源を含有する培地で前記微生物を培養する請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記単糖が前記酵素によりリン酸化形態で遊離される場合には、前記微生物が、ホスファターゼを発現するように更に改変されている請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒し、アクセプター分子の不在下で前記ヌクレオチド活性化単糖から単糖を遊離させることが可能な異種酵素を含む組換え微生物であって、前記酵素が、グリコシルトランスフェラーゼ、好ましくはフコシルトランスフェラーゼである前記組換え微生物。
【請求項１６】
前記酵素が、ｗｂｇＬ遺伝子によりコードされる２−フコシルトランスフェラーゼの変異体又はピロリ菌に由来するｆｕｔＣ遺伝子によりコードされる１，２−フコシルトランスフェラーゼの変異体であり、前記変異体が、夫々ｗｂｇＬ遺伝子によりコードされる野生型２−フコシルトランスフェラーゼ又はｆｕｔＣ遺伝子によりコードされる野生型１，２−フコシルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１カ所、好ましくは少なくとも２カ所、より好ましくは３カ所以上に変異があり、前記変異が、前記酵素の加水分解活性の増加をもたらす請求項１５に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
ホスホマンノムターゼ、マンノース−１−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ及びＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼをコードする異種遺伝子を含むように更に改変されている請求項１５又は１６に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
前記宿主微生物が、大腸菌株、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の株である請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法又は請求項１５から１７のいずれか一項に記載の組換え宿主微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチド活性化糖（ヌクレオチドにより活性化された糖）から遊離形の目的の単糖を生産するための微生物発酵法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖質はエネルギー貯蔵、構造的機能、シグナル伝達、情報蓄積等において極めて重要な役割を担うことにより、あらゆる生命体で役割を果たす。この役割のために、自然界はグルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、Ｎ−アセチルマンノサミン、フルクトース、フコース、リボース、シアル酸、キシロース等の複数の多量に生産される単糖と、より特殊な用途に用いられる複数の希少な単糖（例えばＤ−アロース）を合成している。
【０００３】
Ｌ−フコース（６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース）とフコシル化されたオリゴ糖及び多糖は栄養学的及び生物医学的用途の利用可能性が高いため、化学、化粧品及び製薬産業で非常に重要である（Ｈａｕｂｅｒ，Ｈ．−Ｐ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ｍ．，Ｐｆｏｒｔｅ，Ａ．，Ｍａｃｋ，Ｐ．，Ｚａｂｅｌ，Ｐ．＆  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｕ．（２００８）Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ  ｉｎ  ｃｙｃｔｒｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５，３７１−３７６．；Ｉｓｎａｒｄ，Ｎ．，Ｂｏｕｒｌｅｓ−Ｄａｇｏｎｅｔ  Ｆ．，Ｒｏｂｅｒｔ，Ｌ．＆  Ｒｅｎａｒｄ，Ｇ．（２００５）Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｆ  ｆｕｃｏｓｅ  ｏｎ  ｉｏｄｉｎｅ  ｖａｐｏｒ−ｂｕｒｎｔ  ｒａｂｂｉｔ  ｃｏｒｎｅａｓ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ  ２１９，３２４−３３３；Ｒｏｂｅｒｔ，Ｌ．，Ｆｏｄｉｌ−Ｂｏｕｒａｈｌａ，Ｉ．，Ｂｉｚｂｉｚ，Ｌ．＆  Ｒｏｂｅｒｔ，Ａ．Ｍ．（２００４）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｆｕｃｏｓｅ−ｒｉｃｈ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｎ  ｅｌａｓｔｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５８，１２３−１２８；Ｗｉｌｄ，Ｍ．Ｋ．，Ｌｕｈｎ，Ｋ．，Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｔ．＆  Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ，Ｄ．（２００２）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＩＩ：ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔ．Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １７２，１６１−１７３；Ａｄａｍ，Ｅ．Ｃ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｂ．Ｓ．，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｄ．Ｕ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．＆  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｕ．（１９９７）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＩＩ  ｌｅｃｔｉｎ  ｓｔｏｐｓ  ｈｕｍａｎ  ｃｉｌｉａｒｙ  ｂｅａｔｉｎｇ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５５，２１０２−２１０４）。これらは抗炎症性、抗ウイルス性及び抗腫瘍性をもつと共に、プレバイオティクスとして作用することが知られている。Ｌ−フコースは老化防止効果があるため、化粧品にも重要である（Ｉｓｎａｒｄ，Ｎ．，Ｆｏｄｉｌ−Ｂｏｕｒａｔｈｉａ，Ｉ．，Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍ．＆  Ｒｏｂｅｒｔ，Ｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｆｕｃｏｓｅ  ｒｉｃｈ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５８，２０２−２０４．）。更に、フコシル化誘導体は抗アレルギー性と乳化性をもつことも知られている。
【０００４】
単糖には妥当なコストで大量に自然界から得られるものもある（例えばグルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン及びフルクトース）が、例えばＬ−フコース（６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース）等の大半の単糖はむしろ希少であり、自然界には少量しか認められない。
【０００５】
単糖の商業的生産には、ほぼ例外なく自然界から得られたオリゴ糖が原料として使用されている。これらのオリゴ糖を酸加水分解し、遊離された単糖から個々の糖を精製している。単糖は化学的類似性が高い（大半は個々の水酸基の向きが相互に異なるだけである）ため、個々の単糖を純粋な形態で分離するには相当の労力と費用が必要になる。
【０００６】
Ｌ−フコースはこのような希少糖に相当し、現時点では藻類又は細菌に由来する複雑なオリゴ糖の加水分解により得られている。複雑な加水分解物から個々の単糖を精製するためには、例えば酢酸鉛や過剰量の有機溶媒等の有害な薬品を利用しなければならないことが多い（Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ，Ｒ．Ｇ．（１９６６）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  α−Ｌ−ｆｕｃｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｆｒｏｍ  ｆｕｃｏｉｄａｎ．米国特許第３，２４０，７７５号）。従って、オリゴ糖の複雑な加水分解物から個々の単糖を分離するのは（遊離される個々の単糖の化学的類似性が高いため）難題であり、（炭酸鉛等の毒性の薬品を過剰に使用するため）環境に有害である。また、所定の糖を多く含有するオリゴ糖の入手可能性は自然界ではかなり限られており、季節変化による変動も大きい。Ｌ−フコースはこのような希少単糖に相当し、従来ではフコースを含有する多糖の酸加水分解により得られている。フコースはヒバマタ科（Ｆｕｃａｃｅａｅ）とコンブ科（Ｌａｍｉｎａｒｉａｃｅａｅ）を含む全ての一般的な褐藻類に含まれるフカン一硫酸塩である多糖フコイダンから主に得られる（Ｂｌａｃｋ，Ｗ．Ａ．Ｐ（１９５４）：Ｔｈｅ  ｓｅａｓｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｌａｍｉｎａｒｉａｃｅａｅ  ａｎｄ  Ｆｕｃａｃｅａｅ．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．５，４４５−４４８）。ヒバマタ科に属する褐藻類は世界中に分布し、大西洋のヨーロッパ側海岸に多く見られるが、今日、Ｌ−フコースは主にこれらの褐藻類の採集により大量に得られている。海岸からの褐藻類の大規模な収穫は環境問題となり、環境保護法により制限されている。
【０００７】
例えば、特開２０００−３５１７９０はフコイダンを抽出し、抽出したフコイダンからフコース含有オリゴ糖を取得・分離する方法を開示している。
【０００８】
褐藻類に由来するフコイダンの加水分解以外に、最近では天然に存在するＬ−フコース含有細菌性多糖の加水分解でもＬ−フコースを取得できることが特許公開に示されており、ＷＯ２０１２／０３４９９６Ａ１はＬ−フコースを含有する細胞外多糖を産生することが可能な腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する株を開示している。Ｌ−フコースを生産するためには、前記株により産生された多糖を回収し、例えば硫酸又はトリフルオロ酢酸で処理することにより加水分解する。
【０００９】
ＷＯ２０１４０６７６９６Ａ１は協働して遊離形のＬ−フコースを合成するグリコシルトランスフェラーゼとグリコシダーゼを併有した組換え微生物を使用することによるＬ−フコースの生産方法を初めて記載している。この方法は２種類の酵素とアクセプター分子を必要とする。グリコシルトランスフェラーゼはＧＤＰ−Ｌ−フコースからアクセプターへのフコースの転移を触媒し、例えばラクチュロースに転移させてフコシルラクチュロースを合成する。フコシル化されたアクセプター（例えばフコシルラクチュロース）を次にグリコシダーゼによりアクセプター分子とＬ−フコースに加水分解する。その後、利用したフコシルトランスフェラーゼによりアクセプターを再びフコシル化できる。その後、培地に移すことにより細胞からＬ−フコースを遊離させ、上清から回収することができる。このようにしてＧＤＰ−フコース経路のフィードバック阻害を容易に解決することができ、有意量（数ｇ／ｌ）の遊離のＬ−フコースを微生物発酵により取得することができる。
【００１０】
多糖又はオリゴ糖加水分解物からＬ−フコースを抽出する方法以外に、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンノース及びＤ−グルコース等の他の単糖から出発した複数のＬ−フコース合成経路が開発されている。Ｄｅｆｒａｙｅら（１９８４）により開発された最も効率的な合成経路では、希少単糖であるＬ−ラムノースから出発している（Ｄｅｆａｙｅ，Ｊ．，Ｇａｄｅｌｌｅ，Ａ．＆  Ａｎｇｙａｌ，Ｓ．（１９８４）Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  Ｌ−（４−２Ｈ）ｆｕｃｏｓｅ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１２６，１６５−１６９）。一般に、これらの化学合成の収率はかなり低く、複数の化学的工程を要することが多い。複数の化学的工程を要することに加え、Ｌ−フコースの化学合成には強力な保護基を用いる化学反応を使用する必要がある。一般に、単糖の大規模な化学合成は自然界から採集した多糖からＬ−フコースを抽出する方法に比較して経済的に実現可能であることが証明されていない。
【００１１】
従って、現時点では、単糖を純粋な形態で製造するには目的の単糖から他の単糖を除去するのに多大な労力が必要であり、多くの場合には大量の有機溶媒や他の毒性の薬品が必要である。従って、例えばＬ−フコース等の単一の所望の単糖のみを蓄積できるならば、極めて有用であろう。しかし、大半の微生物は資化できる単糖の種類が限られている。更に、炭素源として複数の単糖を同時に利用できる場合には所定の単糖を著しく優先することが多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第３，２４０，７７５号明細書
【特許文献２】特開２０００−３５１７９０号公報
【特許文献３】国際公開第２０１２／０３４９９６号
【特許文献４】国際公開第２０１４／０６７６９６号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈａｕｂｅｒ，Ｈ．−Ｐ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ｍ．，Ｐｆｏｒｔｅ，Ａ．，Ｍａｃｋ，Ｐ．，Ｚａｂｅｌ，Ｐ．＆  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｕ．（２００８）Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ  ｉｎ  ｃｙｃｔｒｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５，３７１−３７６
【非特許文献２】Ｉｓｎａｒｄ，Ｎ．，Ｂｏｕｒｌｅｓ−Ｄａｇｏｎｅｔ  Ｆ．，Ｒｏｂｅｒｔ，Ｌ．＆  Ｒｅｎａｒｄ，Ｇ．（２００５）Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｆ  ｆｕｃｏｓｅ  ｏｎ  ｉｏｄｉｎｅ  ｖａｐｏｒ−ｂｕｒｎｔ  ｒａｂｂｉｔ  ｃｏｒｎｅａｓ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ  ２１９，３２４−３３３
【非特許文献３】Ｒｏｂｅｒｔ，Ｌ．，Ｆｏｄｉｌ−Ｂｏｕｒａｈｌａ，Ｉ．，Ｂｉｚｂｉｚ，Ｌ．＆  Ｒｏｂｅｒｔ，Ａ．Ｍ．（２００４）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｆｕｃｏｓｅ−ｒｉｃｈ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｎ  ｅｌａｓｔｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５８，１２３−１２８
【非特許文献４】Ｗｉｌｄ，Ｍ．Ｋ．，Ｌｕｈｎ，Ｋ．，Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｔ．＆  Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ，Ｄ．（２００２）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＩＩ：ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔ．Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １７２，１６１−１７３
【非特許文献５】Ａｄａｍ，Ｅ．Ｃ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｂ．Ｓ．，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｄ．Ｕ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．＆  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｕ．（１９９７）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＩＩ  ｌｅｃｔｉｎ  ｓｔｏｐｓ  ｈｕｍａｎ  ｃｉｌｉａｒｙ  ｂｅａｔｉｎｇ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５５，２１０２−２１０４
【非特許文献６】Ｉｓｎａｒｄ，Ｎ．，Ｆｏｄｉｌ−Ｂｏｕｒａｔｈｉａ，Ｉ．，Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍ．＆  Ｒｏｂｅｒｔ，Ｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｆｕｃｏｓｅ  ｒｉｃｈ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５８，２０２−２０４
【非特許文献７】Ｂｌａｃｋ，Ｗ．Ａ．Ｐ（１９５４）：Ｔｈｅ  ｓｅａｓｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｌａｍｉｎａｒｉａｃｅａｅ  ａｎｄ  Ｆｕｃａｃｅａｅ．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．５，４４５−４４８
【非特許文献８】Ｄｅｆａｙｅ，Ｊ．，Ｇａｄｅｌｌｅ，Ａ．＆  Ａｎｇｙａｌ，Ｓ．（１９８４）Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  Ｌ−（４−２Ｈ）ｆｕｃｏｓｅ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１２６，１６５−１６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記に鑑み、本発明の目的は遊離形の単一の所望の単糖を生産するための新規方法として、前記単糖を迅速且つ効率的に回収できる方法、即ち環境に負の影響を与えることなく、大規模で費用効果が高く回収できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記及び他の目的は微生物を使用して遊離形の目的の単糖を大規模に生産する方法により達成され、前記方法は、
ａ）ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒することができ、前記ヌクレオチド活性化単糖から目的の前記単糖を遊離させる酵素を含む、前記単糖の合成のための微生物を準備する工程と、
ｂ）前記微生物を増殖させるのに適した培地で前記微生物を培養する工程、ここで、前記微生物は前記単糖を有意な程度まで代謝することができず、培養工程中に目的の前記単糖が遊離形で産生され、蓄積する、
を含む。
【００１６】
こうして本発明の基本的な目的は完全に解決される。
【００１７】
本出願人による上記のような方法は従来記載されておらず、ヌクレオチド活性化単糖を加水分解して遊離の単糖を蓄積する酵素を含有し、発現する微生物を利用するものである。ヌクレオチド活性化糖に対して加水分解活性をもつ酵素は例えばフコシルトランスフェラーゼとすることができ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｅａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１２６のｗｂｇＬ遺伝子（アクセッション番号ＡＤＮ４３８４７）によりコードされるα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ又はピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に由来する１，２−フコシルトランスフェラーゼｆｕｔＣ（アクセッション番号ＡＡＤ２９８６８）の変異体が好ましい。上記の酵素特徴をもつ未改変の微生物も本発明の範囲内で利用することができるが、本発明の１態様によると、前記微生物は組換え微生物であり、ここで、前記組換え微生物はヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒することが可能な酵素をコードし且つ天然では前記微生物に存在しない少なくとも１種の核酸配列を含有し、発現するように形質転換されている。
【発明の効果】
【００１８】
当分野で公知の従来の方法は単糖を供与体基質からアクセプター基質へと転移させる少なくとも１種の酵素を利用し、後続工程でグリコシダーゼにより前記単糖を前記アクセプターから遊離されるが、このような従来の方法とは対照的に、ヌクレオチド活性化糖（即ち単糖）の加水分解を触媒すること、即ち前記ヌクレオチド糖を加水分解することが可能な単一の酵素を使用して前記単糖が遊離される。本発明では後続工程が不要であるため、目的の単糖の生産方法が容易になる。従って、本発明の方法では、ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒し、「アクセプターの不在下で」遊離形の前記単糖を遊離させることが可能な酵素を使用する。また、本発明によると、本発明の方法は前記単糖をアクセプター基質から遊離させることが可能なグリコシダーゼを特に使用せずに実施される。
【００１９】
本願により新規に提供される方法及び新規に提供される組換え型又は非組換え型の微生物を用いると、薬品や複雑な工程を必要とせずに遊離形の所望の単糖を大量に生産することが可能である。本発明の方法は希少単糖又は他の単糖の工業的な大規模生産で利用するのに適した微生物発酵法に相当し、前記微生物を培養する培地から前記単糖を容易に回収することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本願で使用する「単糖」なる用語は本発明の分野で一般に理解されているように、糖質の最も基本的な単位を意味する。単糖は最も単純な形の糖であり、通常では無色で水溶性の結晶質固体である。単糖の例としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、マンノース、フコース、ラムノース及びリボースが挙げられる。単糖はスクロース等の二糖と、セルロースや澱粉等の多糖の構成単位である。本願で使用する「オリゴ糖」なる用語は当分野で一般に理解されている通り、２個以上の単糖を含む糖鎖ポリマーを意味する。
【００２１】
「〜をコードする核酸配列」なる用語は一般に未改変のＲＮＡ又はＤＮＡでも改変型ＲＮＡ又はＤＮＡでもよいあらゆるポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、一般に所定のポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を表す。この用語は限定されないが、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖領域と２本鎖領域の混合物又は１本鎖領域と２本鎖領域と３本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖領域と２本鎖領域の混合物であるＲＮＡを包含し、更に１本鎖領域、又はより一般的には２本鎖領域又は３本鎖領域でもよいし、１本鎖領域と２本鎖領域の混合物でもよいＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含する。この用語は更に、コーディング配列及び／又は非コーディング配列を含んでいてもよい他の領域と共に、（例えば、組込まれたファージ又は挿入配列又は編集を挿入された）ポリペプチドをコードする単一の連続領域又は不連続領域を含むポリヌクレオチドも包含する。
【００２２】
この文脈で「ポリペプチド」なる用語はペプチド結合又は改変型ペプチド結合により相互に結合した２個以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチド又はタンパク質を意味する。「ポリペプチド」とはペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと一般に呼ばれる短鎖と、タンパク質と一般に呼ばれる長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは２０種類の遺伝子によりコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」はプロセッシングや他の翻訳後修飾等の自然プロセスだけでなく、化学的修飾技術により修飾されたポリペプチドも含む。当然のことながら、ポリペプチドの活性を本質的に変えない限り、同一種の修飾が所与のポリペプチドの複数の位置に同一程度又は異なる程度で存在していてもよい。また、所与のポリペプチドが多種の修飾を含んでいてもよい。修飾はペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含めてポリペプチドのどの位置でもよい。
【００２３】
本発明において、「ヌクレオチド活性化単糖」と共に使用する「ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒することが可能な酵素」又は「ヌクレオチド活性化単糖を加水分解することが可能な酵素」なる用語はヌクレオチド活性化単糖に対して触媒活性をもち、加水分解により所望の単糖が遊離される酵素を意味する。これに関連して、「グリコシルトランスフェラーゼ」なる用語はヌクレオチド活性化単糖（「グリコシル基供与体」）からグリコシル基アクセプター分子への単糖分子の転移を触媒する酵素を意味し包含する。本発明において、本発明の方法及び微生物で使用されるグリコシルトランスフェラーゼはアクセプター分子の不在下でヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒する。本発明の１態様によると、ヌクレオチド活性化糖ヒドロラーゼは細菌性フコシルトランスフェラーゼであると特に好ましく、大腸菌Ｏ１２６のｗｂｇＬ遺伝子（アクセッション番号ＡＤＮ４３８４７）によりコードされるα−１，２−フコシルトランスフェラーゼの変異体又はアクセプター分子の不在下でＧＤＰ−Ｌ−フコースの加水分解を触媒する他のフコシルトランスフェラーゼが好ましい。
【００２４】
従って、ヌクレオチド活性化糖ヒドロラーゼ又はヌクレオチド活性化糖ヒドロラーゼをコードする核酸／ポリヌクレオチドなる用語は、ＧＤＰ−フコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−ラムノース及び他の天然に存在する糖ヌクレオチド等のヌクレオチド活性化型糖の加水分解を触媒する酵素を意味する。このヌクレオチド活性化糖ヒドロラーゼは前記単糖をアクセプター分子へと転移させない又は顕著に転移させないグリコシルトランスフェラーゼであることが好ましい。ＧＤＰ−Ｌ−フコースの場合、ヌクレオチド活性化単糖を加水分解することが可能な酵素はフコシルトランスフェラーゼであり、限定されないが、例えばα−１，２−フコシルトランスフェラーゼである。
【００２５】
より具体的には、６９位のアスパラギンをセリン、１２４位のヒスチジンをアラニン、２１５位のグルタミン酸をグリシン、及び２６８位のイソロイシンをプロリンにアミノ酸残基置換した大腸菌：１２６に由来するα−１，２−フコシルトランスフェラーゼＷｂｇＬ、又はピロリ菌に由来する１，２−フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＣ、又はアクセプター分子の不在下でＧＤＰ−Ｌ−フコースに対して加水分解活性を示す他のフコシルトランスフェラーゼを使用すると好ましい。
【００２６】
本発明の範囲内では、大腸菌Ｏ１２６のｗｂｇＬ遺伝子（アクセッション番号ＡＤＮ４３８４７）によりコードされるα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ又はピロリ菌のｆｕｔＣ（アクセッション番号ＡＡＤ２９８６８）のアミノ酸配列に対して好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸、２００アミノ酸又は３００アミノ酸以上の領域でアミノ酸配列一致度が約６０％超、アミノ酸配列一致度が６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上であるアミノ酸配列をもつ核酸／ポリヌクレオチド及びポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体及び種間ホモログもこれらの用語に含まれる。
【００２７】
更に、その活性を改変するために、ペプチド配列の付加又は欠失により加水分解酵素のポリペプチドを改変してもよい。例えば、他の酵素活性を付与するために前記酵素ポリペプチドにポリペプチド配列を融合してもよい。
【００２８】
更に、ヌクレオチド活性化単糖を加水分解することが可能な酵素をコードする遺伝子を改変し、遺伝子産物が機能的に等価の遺伝子産物に相当するタンパク質又はポリペプチドを含むようにしてもよい。このような等価のヒドロラーゼ遺伝子産物は上記ヒドロラーゼ遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列内にサイレントな変異をもたらすアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含んでいてもよく、こうしてヌクレオチド活性化単糖を加水分解することが可能な酵素をコードする機能的に等価の遺伝子産物となる。アミノ酸置換は置換する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ、平面性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられ、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。
【００２９】
本発明の文脈内において、本願で使用する「機能的に等価」とは、限定されないが、抗原性（即ちヌクレオチド抗活性化糖ヒドロラーゼ抗体と結合する能力）、免疫原性（即ちヌクレオチド活性化単糖ヒドロラーゼタンパク質又はポリペプチドと結合することが可能な抗体を産生する能力）及び酵素活性を含む多数の基準のいずれかにより判断した場合に、上記ヒドロラーゼ遺伝子配列によりコードされる内在性ヒドロラーゼ遺伝子産物と実質的に同様のインビボヒドロラーゼ活性をヌクレオチド活性化糖に対して示すことが可能なポリペプチドを意味する。従って、本発明は具体的に開示するものと機能的に等価な酵素も含む。
【００３０】
また、本発明から当業者に容易に理解される通り、本願に記載する酵素の加水分解活性の増加に繋がるものであれば、本願に開示する酵素の如何なる改変も本発明の方法及び微生物の範囲内で使用することができる。従って、未改変のものに比較して加水分解活性の増加を示すこのような改変型酵素も本発明に含まれる。
【００３１】
翻訳中又は翻訳後に区別可能に改変されたヌクレオチド活性化糖ヒドロラーゼタンパク質、ポリペプチド及び誘導体（断片を含む）も本発明の範囲内に含まれる。更に、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体を置換又は付加として前記酵素ポリペプチド配列に導入することもできる。
【００３２】
本発明の方法の好ましい実施形態によると、前記酵素はｗｂｇＬ遺伝子によりコードされる２−フコシルトランスフェラーゼの変異体又はピロリ菌に由来するｆｕｔＣ遺伝子によりコードされる１，２−フコシルトランスフェラーゼの変異体であり、前記変異体は夫々ｗｂｇＬ遺伝子によりコードされる野生型２−フコシルトランスフェラーゼ又はｆｕｔＣ遺伝子によりコードされる野生型１，２−フコシルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１カ所、好ましくは少なくとも２カ所、より好ましくは３カ所以上に変異があり、前記変異が前記酵素の加水分解活性の増加をもたらす。
【００３３】
ヌクレオチド活性化糖を加水分解することが可能な酵素は当分野で周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術により作製することができる。当業者に周知の方法を使用し、酵素コーディング配列と、ヌクレオチド活性化糖の加水分解を触媒する酵素の合成を可能にする適切な転写翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えばインビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている技術を参照されたい。
【００３４】
本発明の方法の１実施形態によると、前記少なくとも１カ所の変異はアミノ酸置換である。別の実施形態によると、前記変異は少なくとも１カ所、２カ所又は３カ所以上、特に３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所又は１０カ所のアミノ酸置換であり、ヌクレオチド活性化単糖を加水分解することが可能な酵素は改変後に未改変の野生型酵素に比較してヌクレオチド活性化単糖に対する加水分解活性が増加する。
【００３５】
１実施形態によると、６９位のアスパラギンをセリン、１２４位のヒスチジンをアラニン、２１５位のグルタミン酸をグリシン、及び２６８位のイソロイシンをプロリンにアミノ酸残基置換した大腸菌：１２６に由来するα−１，２−フコシルトランスフェラーゼＷｂｇＬ、又はピロリ菌に由来する１，２−フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＣ、又はアクセプター分子の不在下でＧＤＰ−Ｌ−フコースに対して加水分解活性を示す他のフコシルトランスフェラーゼを使用すると好ましい。
【００３６】
本発明の開示から当業者に自明の通り、改変後の酵素が未改変の野生型酵素に比較してヌクレオチド活性化単糖に対する加水分解活性を増加する限り、上記に具体的に記載したような特定の置換だけでなく、これらの具体的に記載した酵素の他の変異、特に他の置換も本発明に含まれる。適切であると考えられる他の置換についても上記により一般的に記載したが、これらも本願に適用される。
【００３７】
本願において、及び本発明の全体を通して、「組換え」とはある種に由来する遺伝子を別の種の宿主微生物の細胞に移植又はスプライシングすることにより作製される遺伝子組換えＤＮＡを意味する。このようなＤＮＡは宿主の遺伝子構造の一部となり、複製される。
【００３８】
本願において「微生物」とは本発明の方法で利用するのに適した単細胞、細胞クラスター又は比較的複雑な多細胞生物を含むあらゆる顕微鏡的大きさの生物を意味・包含し、特に細菌と酵母が挙げられる。本発明により利用されるような微生物は液体培地で培養することができ、増殖・複製させるためには一般に培地に炭素源が必要である。
【００３９】
従って、「組換え宿主微生物」とは、グリコシルトランスフェラーゼもしくはヌクレオチド活性化糖ヒドロラーゼをコードする核酸配列又はフコシルトランスフェラーゼもしくはＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼをコードする核酸配列を含むあらゆる微生物を意味するものであり、これらの酵素をコードする前記核酸配列は組換え（宿主）細胞に外来性である／天然では存在しない核酸配列であり、前記微生物に外来性である／天然では存在しない配列が宿主微生物細胞のゲノムに組込まれている。従って、「天然に存在しない」とは、前記核酸配列が前記宿主微生物細胞に対して外来性であること、即ち前記核酸配列が前記微生物宿主細胞に対して異種であることを意味する。前記異種配列は例えばトランスフェクション、形質転換又は形質導入により前記宿主微生物細胞のゲノムに安定的に導入することができ、前記配列を導入しようとする宿主細胞に応じた技術を適用することができる。種々の技術が当業者に公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，前出に開示されている。こうして、異種配列を導入された宿主細胞は本発明の核酸配列によりコードされる異種タンパク質を産生する。
【００４０】
組換え生産のためには、発現システム又はその部分と本発明の核酸配列を組込むように宿主細胞を遺伝子操作することができる。宿主微生物細胞への核酸配列の導入はＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８６）やＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，前出等の多くの標準実験室マニュアルに記載されている方法により実施することができる。
【００４１】
こうして、例えば宿主微生物細胞に安定的に形質転換／トランスフェクトするベクターに本発明の核酸配列を担持させることができる。
【００４２】
本発明のポリペプチドを産生させるには非常に多様な発現システムを使用することができる。このようなベクターとしては、特に染色体、エピソーム及びウイルス由来ベクターが挙げられ、例えば細菌プラスミド由来ベクター、バクテリオファージ由来ベクター、トランスポゾン由来ベクター、酵母エピソーム由来ベクター、挿入成分由来ベクター、酵母染色体成分由来ベクター、ウイルス由来ベクター、及びその組合わせに由来するベクター、例えばプラスミドとバクテリオファージの遺伝子成分（例えばコスミドとファージミド）に由来するベクターが挙げられる。発現システム構築物は発現を調節・誘発する制御領域を含むことができる。一般に、この関連では、ポリヌクレオチドを維持、増殖又は発現させ、ポリペプチドを宿主で合成するのに適したあらゆるシステム又はベクターを発現用に使用することができる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出に記載されているもの等の種々の周知の日常的な技術のいずれかにより、適切なＤＮＡ配列を発現システムに挿入することができる。
【００４３】
本願で使用する「回収」なる用語は本発明の微生物により産生された単糖を微生物培養液から単離、採取、採集又は他の方法で分離することを意味する。
【００４４】
本発明の方法の好ましい実施形態によると、前記微生物は産生された単糖の分解をもたらす異化経路を不活性化又は大きく減少又は欠損するように更に改変されている。
【００４５】
更に別の実施形態によると、前記微生物はＬ−フコースの異化に関与する遺伝子を不活性化又は大きく減少又は欠損するように更に改変されている。
【００４６】
別の実施形態によると、前記微生物は前記ヌクレオチド活性化単糖の生合成に関与する少なくとも１種の遺伝子を過剰発現し、前記単糖のヌクレオチド活性化単糖の供給を改善するように更に改変されている。この関連では、前記少なくとも１種の遺伝子が異種又は同種であると好ましい。
【００４７】
本発明の方法の別の実施形態によると、ＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノース又はＧＤＰ−ラムノースの生合成に関与する少なくとも１種の遺伝子が過剰発現され、夫々ＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノース又はＧＤＰ−ラムノースの供給を改善する。この関連では、前記少なくとも１種の遺伝子が異種又は同種であると好ましい。
【００４８】
本発明の方法の別の実施形態によると、前記微生物は前記ヌクレオチド活性化単糖の競合経路を不活性化又は減少するように更に改変されている。
【００４９】
本発明の方法の別の実施形態によると、前記単糖を前記酵素によりリン酸化形態で遊離される場合には、前記微生物はホスファターゼを発現するように更に改変されている。
【００５０】
本発明の全体を通して、生産する遊離の単糖はＬ−フコース、Ｌ−ラムノース又はＬ−マンノースから選択すると特に好ましい。
【００５１】
好ましい実施形態では、グリセロール、スクロース、酢酸塩、グルコース、フルクトース、糖蜜、ラクトース、キシロース、セルロース、合成ガス、二酸化炭素又は一酸化炭素から選択される炭素源を含有する培地で前記微生物を培養する。この文脈では、当然のことながら、好ましくは低コストの他のあらゆる発酵基質を炭素源として利用することができ、当業者は所望の単糖を大規模に生産するように前記微生物を増殖させるために本発明の範囲内で適切な炭素源を容易に利用することができよう。
【００５２】
本発明の１態様によると、前記微生物（例えば組換え微生物）の培養工程中に前記培地に炭素源を絶えず添加する。
【００５３】
培養工程中に炭素源を絶えず添加することにより、前記単糖の安定した有効な生産が実現される。
【００５４】
本発明の別の態様によると、前記単糖は培養した組換え宿主微生物の上清から回収され、前記上清は培養した宿主微生物を遠心して上清と宿主微生物ペレットとすることにより得られる。
【００５５】
本願により新規に提供される方法によると、微生物細胞中で産生される単糖を培地に移すので、前記微生物の細胞が培養培地から分離されると、上清から単糖を無理なく回収することが可能になり、従って、宿主微生物を培養する培地から産生された単糖を回収することが可能である。
【００５６】
所望の単糖の合成中に前記微生物で産生される可能性のある他の単糖又はオリゴ糖のうち、前記所望の単糖の回収／精製工程を阻害／妨害する単糖又はオリゴ糖は前記微生物により代謝させることができるため、前記所望の単糖の回収工程は更に改善・助長される。従って、本発明の方法の最後に外部から糖代謝酵素を培地に添加／供給してもよい。こうすると、望ましくない糖は蓄積することができず、所望の単糖の回収を妨害しない。望ましくない妨害性の単糖を代謝させるためには、代謝経路又は酵素をコードする遺伝子を前記微生物で発現させることができ、産生させようとする単糖に応じて制御解除／活性化又は供給するのに適した他の経路又は酵素は本発明の読了後に当業者に容易に理解されよう。
【００５７】
本発明の別の態様によると、本発明の方法は、
ａ）微生物を増殖させるのに適した培地に、前記微生物に天然では存在しないヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒する酵素をコードする核酸配列を含むように形質転換されており、産生させようとする単糖を有意量で代謝することができない組換え宿主微生物を提供する工程と、
ｂ）前記組換え宿主微生物を前記培地で培養することにより、前記単糖を遊離形で産生させる工程と、
ｃ）前記遊離の単糖を前記培地から回収する工程を含む。
【００５８】
即ち、先述の各段落に記載したような方法は更に前記培地から前記遊離の単糖を回収する工程を含む。
【００５９】
本発明の別の態様によると、微生物が開示及び請求される。
【００６０】
方法に関連して特定の用語について上記に使用及び記載した定義は前記方法中に言及する組換え微生物にも適用される。
【００６１】
好ましい実施形態によると、本発明の方法で使用及び言及される微生物はその加水分解により所望の単糖を取得できるヌクレオチド活性化糖を合成することが可能な細菌又は酵母株から選択される。細菌として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、酵母としてサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属は実験室環境で容易且つ廉価に増殖させることができ、これらの細菌と酵母は多年にわたりよく研究されているという利点がある。
【００６２】
従って、好ましい実施形態において、本発明の方法で使用及び言及される宿主微生物は細菌と酵母から構成される群から選択され、大腸菌株が好ましい。
【００６３】
本発明の１実施形態では、所望の単糖の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子（所望の単糖がＬ−フコースである場合には、Ｌ−フクロースキナーゼ、Ｌ−フコースイソメラーゼ、フクロース−１−リン酸アルドラーゼ及びＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子）を欠損するように前記組換え宿主微生物を更に改変すると更に好ましい。更に、好ましい実施形態によると、前記ヌクレオチド活性化単糖を多糖の合成用基質として使用するグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えばフコシルトランスフェラーゼ又はコラン酸等のフコシル化オリゴ糖の合成に関与する酵素）を欠損させる。
【００６４】
更に、ヌクレオチド活性化型糖の合成を改善する遺伝子が過剰発現されることが好ましい。ＧＤＰ−Ｌ−フコースの場合には、大腸菌に由来するホスホマンノムターゼ（ｍａｎＢ）、マンノース−１−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ（ｍａｎＣ）、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ｇｍｄ）及びＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ｗｃａＧ）をコードする遺伝子又は他の生物に由来する適切な遺伝子が夫々の微生物で過剰発現される。
【００６５】
この実施形態は産生された単糖Ｌ−フコースの細胞内分解とコラン酸の産生を防ぐと共に、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成が改善するという利点がある。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、前記組換え宿主微生物がスクロース又はグリセロールを単独炭素源として増殖できるようにする遺伝子を含むように前記組換え宿主微生物を更に形質転換させ、大腸菌Ｗ株（アクセッション番号ＣＰ００２１８５１）の遺伝子スクロースペルメアーゼ、フルクトキナーゼ、スクロースヒドロラーゼ及び転写リプレッサー（夫々遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲ）を含むｃｓｃ遺伝子クラスターを宿主微生物のゲノムに組込むと特に好ましく、形質転換後の微生物はスクロースを単独炭素源として増殖できるようになる。
【００６７】
これに関連して、本発明の方法に好ましいものとして挙げた実施形態は適用可能であるならば、請求する微生物にも全て適用されることに留意されたい。
【００６８】
従って、本発明はヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒する酵素を有する微生物の使用にも関し、前記微生物は前記単糖を代謝することができず、本発明は更に単糖、特にＬ−フコースの生産用としての本発明の組換え微生物の使用にも関する。
【００６９】
なお、本発明の方法の所定の用語を説明するために上述した定義は請求項及び明細書に記載するような組換え型又は未改変の前記微生物にも適用される。
【００７０】
あるいは、本発明の単糖生産方法は本発明の酵素と適切な基質を水性反応媒質中で混合する無細胞システムにも適用できる。酵素は溶液に遊離した状態で利用することもできるし、ポリマー等の担体に結合又は固定化し、基質を担体に添加してもよい。担体は例えばカラムに充填してもよい。
【００７１】
特に、本発明は組換え大腸菌株を組換え宿主微生物として使用する方法に関し、前記組換え大腸菌株はＬ−フコースイソメラーゼ遺伝子、Ｌ−フクロースキナーゼ遺伝子及びＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコースホスホトランスフェラーゼを欠損しており、前記組換え大腸菌株は、ａ）前記大腸菌株がスクロース又はグリセロールを単独炭素源として増殖できるように、夫々スクロースペルメアーゼ、フルクトキナーゼ、スクロースヒドロラーゼ及び転写リプレッサーをコードする遺伝子と、ｂ）大腸菌又は他の生物に由来するホスホマンノムターゼ、マンノース−１−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ及びＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼをコードする遺伝子と、ｃ）ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒する酵素（例えばアクセプター分子の不在下でＧＤＰ−Ｌ−フコースを加水分解するフコシルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子を含むように形質転換されている。その他の利点については、以下の実施形態に関する記載と添付図面から理解されよう。
【００７２】
当然のことながら、本発明の範囲から逸脱しない限り、上記特徴及び以下に説明する特徴は夫々具体的に記載する組合わせだけでなく、他の組合わせで使用することもできるし、単独で使用することもできる。同様に当然のことながら、従属項に記載する個々の特徴を本発明の範囲内で別のように相互に組合わせることもでき、従って、本発明は従属項の特徴の他のあらゆる可能な組合わせを含む他の実施形態も具体的に対象としているとみなすべきである。
【００７３】
本発明の数種の実施形態を図面に示し、以下の記載でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】エラープローンＰＣＲによるｗｂｇＬのランダム突然変異誘発後のｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬライブラリーを含む産生用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の培養上清における遊離Ｌ−フコースの検出。ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（エラープローン）クローンを保持する産生用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に由来する培養液の上清を比色法によるＬ−フコースデヒドロゲナーゼアッセイに供した（アッセイの説明については、後記段落［００８９］参照）。「ＷＴ」と記したウェルには、未改変のｗｂｇＬ遺伝子を発現する産生用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ培養液の上清を加えた。「Ｄ１」及び「Ｈ２」と記したウェルには、ＷｂｇＬ変異体（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）及びＷｂｇＬ（Ｎ６９Ｓ，Ｉ２６８Ｐ）を合成するクローン（夫々クローンＤ１及びクローンＨ２）に由来する培養上清を加えた。
【図２】ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）（クローンＤ１）及びｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（Ｎ６９Ｓ，Ｉ２６８Ｐ）（クローンＨ２）を保持する産生用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の培養上清のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。クローンＤ１及びクローンＨ２により夫々４．３ｇ／Ｌと２．５ｇ／ＬのＬ−フコースが産生された。
【図３】ＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性によりＧＤＰ−Ｌ−フコースから遊離されるＬ−フコースの検出。５ｍＭ  ＧＤＰ−Ｌ−フコースを含有するインビトロＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼアッセイ反応液に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＤＥＳＴ：ｆｕｔＣ及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）の細胞溶解液を加えた。比色法によるＬ−フコースデヒドロゲナーゼアッセイで遊離のＬ−フコースを検出した（アッセイの説明については、後記段落［００８９］参照）。ウェル１のアッセイ反応液にはＦｕｔＣ０．２７単位を加え、ウェル２にはＷｂｇＬ（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）０．３２単位を加えた。ＧＤＰ−Ｌ−フコースの安定性を確認するために、ウシ血清アルブミンを使用したアッセイも実施した（ウェル３）。
【図４Ａ−１】＜Ｐｔｅｔ−ｍａｎＣＢ−ＰＴ５−ｇｍｄ，ｗｃａＧ−ｄｈｆｒ＞（配列番号１）（Ａ）の配列を示す。
【図４Ａ−２】＜Ｐｔｅｔ−ｍａｎＣＢ−ＰＴ５−ｇｍｄ，ｗｃａＧ−ｄｈｆｒ＞（配列番号１）（Ａ）の配列を示す。
【図４Ａ−３】＜Ｐｔｅｔ−ｍａｎＣＢ−ＰＴ５−ｇｍｄ，ｗｃａＧ−ｄｈｆｒ＞（配列番号１）（Ａ）の配列を示す。
【図４Ｂ−１】＜ｃｓｃＢ−ｃｓｃＫ−ｃｓｃＡ−ｃｓｃＲ＞（配列番号２）（Ｂ）の配列を示す。
【図４Ｂ−２】＜ｃｓｃＢ−ｃｓｃＫ−ｃｓｃＡ−ｃｓｃＲ＞（配列番号２）（Ｂ）の配列を示す。
【図４Ｂ−３】＜ｃｓｃＢ−ｃｓｃＫ−ｃｓｃＡ−ｃｓｃＲ＞（配列番号２）（Ｂ）の配列を示す。
【図４Ｃ】＜ｗｂｇＬ＞（配列番号３）（Ｃ）の配列を示す。
【図４Ｄ】＜ｆｕｔＣ＞（配列番号４）（Ｄ）の配列を示す。
【実施例】
【００７５】
フコース産生大腸菌株の構築
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｅａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）を使用して遺伝子操作し、フコース産生株を構築した。フコースはＧＤＰ−Ｌ−フコースの加水分解により産生されるので、大腸菌Ｋ１２  ＤＨ５αに由来するホスホマンノムターゼ（ｍａｎＢ）、マンノース−１−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ（ｍａｎＣ）、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ｇｍｄ）及びＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ｗｃａＧ）をコードする遺伝子のゲノム組込みと過剰発現によりＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成を亢進させる。オペロンｍａｎＣ−ｍａｎＢをＰｔｅｔプロモーターの転写制御下におき、オペロンｇｍｄ−ｗｃａＧをＰＴ５プロモーターから発現させる。遺伝子クラスター＜Ｐｔｅｔ−ｍａｎＣＢ−ＰＴ５−ｇｍｄ，ｗｃａＧ−ｄｈｆｒ＞（配列番号１；図４Ａ）は更にトリメトプリム耐性を成分に付与するジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするｄｈｆｒ遺伝子を含む。クラスターを転位により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムに組込むために、ｍａｒｉｎｅｒファミリー転位因子Ｈｉｍａｒ１により特異的に認識される逆向きの反復配列をクラスターの両末端に付加する。更に、大腸菌Ｗ株のｃｓｃ遺伝子クラスターを宿主生物のゲノムに導入した。この遺伝子クラスターはスクロースペルメアーゼ（ｃｓｃＢ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）、スクロースヒドロラーゼ（ｃｓｃＡ）及び転写リプレッサー（ｃｓｃＲ）の遺伝子を含む。Ｈｉｍａｒ１に特異的な逆向きの反復配列をクラスター＜ｃｓｃＢ−ｃｓｃＫ−ｃｓｃＡ−ｃｓｃＲ＞（配列番号２；図４Ｂ）の両末端に付加してＨｉｍａｒ１転位により組込みを実施し、スクロースを単独炭素源として増殖する能力を宿主生物に付与する（Ｃｈｏｉ，Ｋ．−Ｈ．ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｋ．−Ｊ．（２００９）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，２１７−２２８）。
【００７６】
コラン酸の形成によるＧＤＰ−Ｌ−フコース減少を防ぐために、ＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸トランスフェラーゼをコードすると予測される遺伝子ｗｃａＪをＤａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｒｎｅｒの方法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．ａｎｄ  Ｗａｒｎｅｒ  Ｂ．Ｌ．（２０００）Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，６６４０−６６４５）に従って大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムから欠損させた。ＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸トランスフェラーゼはコラン酸合成の第１段階を触媒する（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｇ．，Ａｎｄｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｋ．，Ｈｏｂｂｓ，Ｍ．ａｎｄ  Ｒｅｅｖｅｓ，Ｐ．Ｒ．（１９９６）Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，４８８５−４８９３）。更に、夫々フコースイソメラーゼとフクロースキナーゼをコードするフコース異化経路の遺伝子ｆｕｃＩ及びｆｕｃＫをゲノムノックアウトにより不活性化させ、Ｌ−フコースの分解を減少させた。
【００７７】
２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｗｂｇＬ及びｆｕｔＣのクローニングとｗｂｇＬの突然変異誘発
大腸菌Ｏ１２６に由来する２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｗｂｇＬ（アクセッション番号ＡＮＤ４３８４７）（配列番号３；図４Ｃ）のコドン最適化と合成をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，米国）に委託した。また、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に由来する１，２−フコシルトランスフェラーゼをコードするｆｕｔＣ遺伝子（アクセッション番号ＡＡＤ２９８６８）（配列番号４；図４Ｄ）も合成し、大腸菌での発現に適合するようにコドン最適化した。ベクターｐＤＥＳＴ１４にクローニングするために、夫々ｗｂｇＬにはプライマー６１２８（配列番号５）及び６１２９（配列番号６）を使用し、ｆｕｔＣにはプライマー６１９５（配列番号７）及び６１９６（配列番号８）を使用してこれらの遺伝子を増幅した（プライマー配列については、下表１参照）。
【００７８】
【表１】
2018503383.tif 000002
【００７９】
プライマー６１２８及び６１２９を使用すると共に、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（Ｒ）ＰＣＲランダム突然変異誘発キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，米国）を製造業者の指示に従って使用してエラープローンＰＣＲを数ラウンド繰返すことによりｗｂｇＬ遺伝子に突然変異を導入した。エラープローンＰＣＲ産物を精製してベクターｐＤＥＳＴ１４にクローニングし、ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（エラープローン）を得た。ベクターｐＤＥＳＴ１４へのクローニングは一般にＧａｔｅｗａｙ技術（Ｇａｔｅｗａｙ（Ｒ）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙマニュアル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，米国））を使用して実施した。ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｂｅｒｌｉｎ，ドイツ）に委託してプラスミドの配列決定を行った。組換えプラスミドをエレクトロポレーションにより適切な大腸菌宿主に形質転換した。
【００８０】
増殖培地及び細胞培養
炭素源として１％（ｖ／ｖ）グリセロールと１％（ｖ／ｖ）スクロースを含有する無機塩培地でｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（エラープローン）プラスミドライブラリーを保持する産生用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を増殖させた。培地はＮＨ４Ｈ２ＰＯ４  ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ７ｇ／Ｌ、ＫＯＨ  ２ｇ／Ｌ、クエン酸０．３ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．９８ｇ／Ｌ、及びＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／Ｌから構成される。これに１リットル当たり１ミリリットルの微量元素溶液（クエン酸鉄アンモニウム５４．４ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ９．８ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １．６ｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  １．９ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ９ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  １．１ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ３  １．５ｇ／Ｌ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ  １．５ｇ／Ｌ）を添加する。選択のために、トリメトプリム１０μｇ／ｍＬとアンピシリン１００μｇ／ｍＬを加えた。９６ウェルマイクロタイタープレートで細胞を２４時間３０℃にて振盪下に増殖させた。０．３ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した新鮮なＨＥＰＥＳ緩衝液（１００ｍＭ）培地４００μｌを入れた９６ウェルプレートに予備培養液５０μｌを移し、ｐＤＥＳＴにおけるｗｂｇＬ遺伝子の発現を誘導した。誘導した培養液を２日間３０℃にて振盪下に増殖させた。細胞を遠心により沈降させ、遊離Ｌ−フコースの検出に上清を使用した。
【００８１】
夫々ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）及びｐＤＥＳＴ：ｆｕｔＣを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を２ＹＴブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）で３０℃にてアンピシリン１００μｇ／ｍＬの存在下にＯＤ６００ｎｍが０．３になるまで増殖させた。０．３ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によりｗｂｇＬ（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）とｆｕｔＣの転写を誘導した。誘導から２０時間後に細胞を遠心により回収した。細胞をインビトロＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性の分析に使用した。
【００８２】
遊離Ｌ−フコースとインビトロＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性を検出するための酵素アッセイ
Ｌ−フコースからＬ−フコノ−１，５−ラクトンへのＮＡＤＰ依存性変換を触媒するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属Ｎｏ．１１４３に由来するＬ−フコースデヒドロゲナーゼ（ＦｕＤＨ）（アクセッション番号Ｄ３２０４２）を使用して比色アッセイで遊離のＬ−フコースを測定した。この比色アッセイでは、フェナジンメトサルフェートの共存下でニトロブルーテトラゾリウムをＮＡＤＰＨにより青紫色のホルマザンへと還元する。ホルマザンの形成を５７１ｎｍでモニターする。（Ｍａｙｅｒ，Ｋ．Ｍ．ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．（２００２）Ａ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｔｏ  Ｑｕａｎｔｉｆｙ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｒｕｄｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．７，１３５−１４０）。
【００８３】
シュードモナス属Ｎｏ．１１４３に由来するｆｕＤＨ遺伝子が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で過剰発現される。Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＴＭ）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｏｌｌａｒｄｓ  Ｗｏｏｄ，英国）を使用して固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより粗抽出液からＮ末端Ｈｉｓ６タグを含む組換えＦｕＤＨタンパク質を精製した。
【００８４】
ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（エラープローン）を保持するフコース産生用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の培養液における遊離のＬ−フコースを検出するために、反応液２００μｌ当たりの量が０．１３％（ｗ／ｖ）ゼラチンを添加した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中に０．８ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、０．３ｍＭニトロブルーテトラゾリウム、０．０３ｍＭフェナジンメトサルフェート及びＨｉｓ６−ＦｕＤＨ  ４．７単位からなる試薬溶液１５０μｌと、細胞培養液上清５０μｌとなるようにＬ−フコースデヒドロゲナーゼアッセイ反応液を調製した（全薬品はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，米国から購入した）。室温で１０分間インキュベーション後に５７１ｎｍにて青紫色のホルマザンの形成を測定した。
【００８５】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）と大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＤＥＳＴ：ｆｕｔＣの細胞溶解液におけるＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性を検出するために、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を添加した５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に細胞を再懸濁し、ガラスビーズとＭｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，米国）を使用して破砕した。ＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼアッセイ反応液中でＬ−フコースをＧＤＰ−Ｌ−フコースから切断した。ヒドロラーゼアッセイ反応液は２００μｌ当たりの量が、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を添加した５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に１００ｍＭ  ＧＤＰ−Ｌ−フコース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，米国）を含有する試薬１２．５μｌと、無細胞抽出液５０μｌとなるようにした。
【００８６】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースの安定性を検証するために、粗抽出液の代わりにウシ血清アルブミン（３０ｍｇ／ｍＬ）５０μｌを使用したヒドロラーゼアッセイも実施した。市販色素溶液（Ｒｏｔｉ−Ｑｕａｎｔ（Ｒ），Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ドイツ）を使用してブラッドフォード法によりタンパク質濃度を推定した。３０℃で１時間インキュベーション後に、９５℃まで１０分間加熱してＧＤＰ−Ｌ−フコースアッセイ反応液中の酵素を不活性化させた。ＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼアッセイ反応混合液５０μｌを使用し、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼアッセイを使用して遊離のＬ−フコースを検出した。このアッセイ反応液は上記のように調製し、室温で２４時間インキュベートした。
【００８７】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ＬＣトリプル四重極型ＭＳ検出システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−ＭＳ  ８０５０）（島津製作所，京都）を使用してＭＲＭ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：多重反応モニタリング）により質量分析を行った。四重極１で前駆体イオンを選択・分析し、コリジョンセルでアルゴンをＣＩＤガスとして使用して断片化を行い、四重極３でフラグメントイオンの選択を行う。
【００８８】
培養上清とインビトロアッセイからの反応混合液を夫々１０μｇ／ｍＬマルトトリオース水溶液（ＬＣ／ＭＳグレード）で１００倍に希釈後に、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ａｍｉｄｅ  ＨＰＬＣカラム（３．５μｍ，２．１×５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ，米国）とＸＢｒｉｄｇｅ  Ａｍｉｄｅガードカートリッジ（３．５μｍ，２．１×１０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ，米国）を使用してフコースとマルトトリオースのクロマトグラフィー分離を行った。ＨＰＬＣシステムはＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２  ＳＩＬ−３０ＡＣＭＰオートサンプラーを８℃で運転し、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−２０ＡＤ送液ポンプを使用すると共に、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブン（島津製作所，京都）を３０℃で運転した。移動相はアセトニトリル：Ｈ２Ｏ（６２：３８％（ｖ／ｖ））に１０ｍＭ酢酸アンモニウムを添加した。１μｌのサンプルを機器に注入し、流速３００μｌ／ｍｉｎで３分間送液した。Ｌ−フコースと（正規化用の内部標準として加えた）マルトトリオースをＥＳＩ負イオン化モードでＭＲＭにより分析した。質量分析計はユニット分解能で運転した。フコースはｍ／ｚ１６３．２［Ｍ−Ｈ］のイオンを形成し、マルトトリオースはｍ／ｚ５０３．２［Ｍ−Ｈ］のイオンを形成する。Ｌ−フコースの前駆体イオンをコリジョンセルで更に断片化し、ｍ／ｚ８８．９、ｍ／ｚ７０．８及びｍ／ｚ５８．９のフラグメントイオンとした。マルトトリオースの分子イオン（ｍ／ｚ５０３．２）をｍ／ｚ３４１．１、ｍ／ｚ１６１．０５及びｍ／ｚ１００．９に断片化した。コリジョンエネルギー、Ｑ１及びＱ３  Ｐｒｅ  Ｂｉａｓは分析物毎に個々に最適化した。
【００８９】
結果
フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する産生用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株による遊離Ｌ−フコースの合成
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるＧＤＰ−Ｌ−フコース合成を亢進させるために、ホスホマンノムターゼ、マンノース−１−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ及びＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼをコードする異種遺伝子をゲノムに組込み、過剰発現された。更に、スクロースでの増殖能をＢＬ２１（ＤＥ３）株に付与するために、大腸菌Ｗ株に由来するスクロースペルメアーゼ、フルクトキナーゼ、スクロースヒドロラーゼ及び転写リプレッサーをコードするｃｓｃ遺伝子クラスターをゲノムに組込んだ。
【００９０】
２−フコシルトランスフェラーゼＷｂｇＬは供与体分子であるＧＤＰ−Ｌ−フコースからアクセプターであるオリゴ糖へのＬ−フコースの転移を触媒する。一方、ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬを保持する産生用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を適切な培地で増殖させると、アクセプター分子の不在下で細菌培養液の上清中に遊離のＬ−フコースを検出することができた。遊離のＬ−フコースはＷｂｇＬのＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性によりＧＤＰ−フコースから遊離される。
【００９１】
ＷｂｇＬのＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性を更に改善するために、エラープローンＰＣＲを使用してｗｂｇＬ遺伝子をランダム突然変異誘発させた。ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（エラープローン）クローンを保持する産生用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株約５０００株のライブラリーをＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性の改善について試験した。Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼアッセイを使用して培養上清の分析により判定した場合に、２種類のクローン（クローンＤ１及びＨ２）が遊離Ｌ−フコースの産生増加を示した（図１）。これらの２種類のクローンの各々のＷｂｇＬ配列には２カ所のアミノ酸置換が認められた。クローンＤ１のＷｂｇＬ変異体は１２４位のヒスチジンからアラニン及び２１５位のグルタミン酸からグリシンへのアミノ酸置換を含んでおり、クローンＨ２のＷｂｇＬ変異体では６９位のアスパラギン残基がセリンに置換し、２６８位のイソロイシンがプロリンに置換していた。
【００９２】
プラスミドｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ、ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）Ｄ１及びｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（Ｎ６９Ｓ，Ｉ２６８Ｐ）Ｈ２を保持する産生用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の上清を更にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。各サンプルでＭＲＭ分析によりＬ−フコースが確認された。正規化用の内部標準としてマルトトリオースを使用して遊離のＬ−フコースの量を定量した。野生型ｗｂｇＬ遺伝子を発現する株では、培養上清中に０．１２ｇ／ＬのＬ−フコースが測定された。ＷｂｇＬ変異体（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）及び（Ｎ６９Ｓ，Ｉ２６８Ｐ）の加水分解活性は明らかに増加していた。クローンＤ１及びＨ２は夫々０．４３ｇ／Ｌと０．２５ｇ／ＬのＬ−フコースを産生した（図２）。
【００９３】
フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する微生物の細胞溶解液におけるＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性の検出
転写インデューサーＩＰＴＧの存在下で増殖させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＤＥＳＴ：ｗｂｇＬ（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＤＥＳＴ：ｆｕｔＣの無細胞抽出液におけるＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性を分析した。２−フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＣはオリゴ糖基質の不在下でＧＤＰ−Ｌ−フコースを加水分解すると記載されている（Ｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｌｉｎ  Ｙ．−Ｎ．，Ｌｉｎ，Ｃ．−Ｈ．（２００８）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  α１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．３５０，２３１３−２３２１）。５ｍＭ  ＧＤＰ−Ｌ−フコースと夫々の株の細胞溶解液を含有するヒドロラーゼアッセイ反応液中でＧＤＰ−Ｌ−フコースを開裂させた。Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼアッセイを使用して遊離のＬ−フコースを検出した。粗抽出液の代わりにウシ血清アルブミンを含有するアッセイ反応液中に遊離のＬ−フコースは検出されず、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの安定性が実証された（図３）。
【００９４】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースのインビトロ加水分解により遊離されるＬ−フコースを定量するために、イオン交換カートリッジ（Ｓｔｒａｔａ  ＡＢＷ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，ドイツ）を使用して固相抽出法によりヒドロラーゼアッセイを行い、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ｆｕｔＣとｗｂｇＬ（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）を発現する株の細胞溶解液を含有するアッセイ反応液では、１時間インキュベーション後に夫々０．３８ｇ／Ｌと０．３２ｇ／ＬのＬ−フコースが測定され、これはＦｕｔＣでは０．１８Ｕ／ｍｇ、ＷｂｇＬ（Ｈ１２４Ａ，Ｅ２１５Ｇ）では０．２１Ｕ／ｍｇの特異的ＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性に相当する。
【図１】
2018503383.tif 000003
【図２】
2018503383.tif 000004
【図３】
2018503383.tif 000005
【図４Ａ−１】
2018503383.tif 000006
【図４Ａ−２】
2018503383.tif 000007
【図４Ａ−３】
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【図４Ｂ−１】
2018503383.tif 000009
【図４Ｂ−２】
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【図４Ｂ−３】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2018503383.tif 000013
【配列表】
2018503383000001.app
【国際調査報告】
2018503383.tif 000014
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