(57)【要約】  本発明は、細菌組成物およびその使用方法に関する。細菌組成物は、フィーカリバクテリウム属、ラクノスピラ属、ベイロネラ属またはロチア属の２種以上の細菌を含むことができる。細菌組成物は、それを必要とする対象における、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーを治療すること、または腸内微生物叢を改変すること、または胃腸管に定植させることにおいて使用され得る。
2018515426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）、ラクノスピラ（Lachnospira）、ベイロネラ（Veillonella）またはロチア（Rothia）属の２種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を、対象に投与することを含む、それを必要とする対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの１つまたは複数を治療する方法。
【請求項２】
フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の２種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における腸内微生物叢を改変する方法。
【請求項３】
フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の２種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の胃腸管に定植させる方法。
【請求項４】
前記対象が抗生物質療法を受けているか、受けるか、または受けたかのいずれかである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記対象がヒト胎児、ヒト乳児、または妊娠女性である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト乳児が１歳未満である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌組成物が予防的に投与される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌組成物が経口または直腸投与される、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌組成物が液体懸濁液として製剤化される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌組成物がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）、ラクノスピラ・マルチパラ（Lachnospira multipara）、ベイロネラ・パルブラ（Veillonella parvula）およびロチア・ムシラギノサ（Rothia mucilaginosa）の２種以上を含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の３種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌組成物がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサの３種以上を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌組成物がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与が対象におけるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の細菌の少なくとも１種または複数種の個体群の増加をもたらす、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記増加が定量的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記増加が前記対象からのサンプル中に存在する代謝産物の検出によってモニターされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
担体と組み合わせた、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の２種以上の細菌を含む細菌組成物。
【請求項１９】
前記細菌が、それを必要とする対象において、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーを治療するため、または腸内微生物叢を改変するため、または胃腸管に定植させるために有効な量で存在する、請求項１８に記載の細菌組成物。
【請求項２０】
それを必要とする対象における、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーの治療、または腸内微生物叢の改変、または胃腸管への定植に使用するためのものである、請求項１８または１９に記載の細菌組成物。
【請求項２１】
前記細菌が実質的に純粋である、請求項１８から２０までのいずれか１項に記載の細菌組成物。
【請求項２２】
対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性を決定する方法であって、前記対象からのサンプル中のフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の２種以上の細菌のレベルを決定すること、および前記レベルを比較対象または健康な対象と比較することを含み、ここで、細菌のレベルの減少が腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性を示す、方法。
【請求項２３】
前記対象からのサンプル中に存在する代謝産物のレベルを決定することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１８または１９に記載の組成物の有効な量を、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性が高いと決定された対象に投与することをさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌組成物およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ぜんそくは、子供において最も蔓延している慢性疾患であり、世界中で２億３５００万人の人々が罹患している1。先進国と発展途上国の間におけるぜんそくの有病率の著しい差異2は、初期の微生物の暴露を変え、免疫過敏症の発症（development）を促進する、乳児期間の食事や抗生物質の使用を含む、環境要因の影響を浮き彫りにする3。腸内微生物の変化（ディスバイオシス）の効果が免疫発達および実験的ぜんそくにおいて最も影響を与える生後の初期の「クリティカル・ウインドウ」が、マウスにおける最近の研究により暗示された4。短鎖脂肪酸（ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ；ＳＣＦＡ）を含む腸内ミクロビオームおよび腸内微生物由来化合物の変化は、ぜんそく6を含む多くの疾患5に関係付けられているものの、これらの変化がぜんそくに先行するか、およびヒトのぜんそくに関わっているか否かは不明確である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、部分的に、細菌組成物およびその使用方法を提供する。細菌組成物は、それを必要とする対象において、腸内微生物叢を改変させ、胃腸管に定植し、または腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーもしくはアトピーを診断もしくは治療するために、制限なく使用され得る。
１つの態様において、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）またはロチア（Ｒｏｔｈｉａ）属の２種以上の細菌を含む、有効な量の細菌組成物を対象に投与することによって、そのような治療を必要とする対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの１種または複数種を治療する方法が提供される。
別の態様において、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の２種以上の細菌を含む、有効な量の細菌組成物を対象に投与することによって、そのような治療を必要とする対象における腸内微生物叢を改変する方法が提供される。
【０００４】
別の態様において、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の２種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することによって、そのような治療を必要とする対象の胃腸管に定植する方法が提供される。
いくつかの実施形態において、対象は抗生物質療法を受けているか、受けるであろうか、または受けたかのいずれかである。
いくつかの実施形態において、対象は、ヒト胎児、ヒト乳児、または妊娠女性である。
いくつかの実施形態において、ヒト乳児は１歳未満である。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は予防的に投与される。
【０００５】
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、経口または直腸投与される。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、液体懸濁液として製剤化される。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、ラクノスピラ・マルチパラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｍｕｌｔｉｐａｒａ）、ベイロネラ・パルブラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ）、またはロチア・ムシラギノサ（Ｒｏｔｈｉａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）の２種以上を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の３種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラ、またはロチア・ムシラギノサの３種以上を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本方法は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサを含む。
いくつかの実施形態において、本投与は、対象におけるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の細菌の少なくとも１種または複数種の個体群の増加をもたらす。
いくつかの実施形態において、増加は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、増加は、前記対象からのサンプル中に存在する代謝産物の検出によってモニターされる。
いくつかの態様において、担体と組み合わせた、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の２種以上の細菌を含む細菌組成物が提供される。
いくつかの実施形態において、細菌は、それを必要とする対象において、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーを治療するため、または腸内微生物叢を改変するため、または胃腸管に定植させるために有効な量で存在する。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、それを必要とする対象における、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーの治療、または腸内微生物叢の改変、または胃腸管への定植に使用するためのものである。
いくつかの実施形態において、細菌は実質的に純粋である。
【０００８】
いくつかの態様において、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性を、前記対象からのサンプル中のフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の２種以上の細菌のレベルを決定し、前記レベルを比較対象または健康な対象と比較することによって決定する方法であって、ここで、細菌のレベルの減少は、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性を示す方法が提供される。
いくつかの実施形態において、本方法は、対象からのサンプル中に存在する代謝産物のレベルを決定することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、請求項１８または１９に記載の組成物の有効な量を、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性が高いと決定された対象に投与することをさらに含む。
この要約は、本発明の全ての特徴を必ずしも記載するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】試験参加者の分類を示す模式図であり、ここで３１９人の選択された対象が、年齢１歳時の皮膚プリック試験および喘鳴データに基づく４つの臨床表現型に分類されていることを示す図である：対照、アトピー＋喘鳴（ＡＷ）、アトピーのみ、および喘鳴のみ。３歳時のデータに基づいて、ぜんそく予測指数（ａｓｔｈｍａ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ；ＡＰＩ）を計算した（対照と比較したオッズ比は、学童期にぜんそくと診断される各群のリスクを計算した（対照と比較したオッズ比：ＡＷ、１３．５［ｐ＜０．００１；９５％ＣＩ：３．２〜５７．４］；喘鳴のみ、２．７（ｎｓ）、アトピーのみ、２．４（ｎｓ））。
【図２Ａ】３カ月での４つの臨床表現型にわたる糞便微生物叢のＰＣＡによる多変量解析を示す図である。４つの表現型の微生物叢の間で差異は観察されなかった。
【図２Ｂ】上側および下側の「ヒンジ」が第１および第３四分位数（２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイル）に対応する、３カ月の４つの臨床表現型の中のアルファ・ダイバーシティ（シャノン多様性指数）のボックスプロットを示す図である。アルファ・ダイバーシティにおける差異は観察されなかった。
【図２Ｃ】３カ月での４つの表現型の中の上位１００個のＯＴＵ内の細菌科の相対存在量を示す図である。４つの群の間の統計解析は、対照群およびアトピー性喘鳴群における低存在量の細菌群の間に有意な差異があることを見出した（バーの拡大部分で示される）。
【図２Ｄ】全てのＡＷ糞便サンプルならびに３カ月（ｎCTRL＝２０  ｎAW＝２１）および１歳（ｎCTRL＝１９  ｎAW＝２１）での無作為に選択された対照糞便サンプルのサブセットにおける、全１６Ｓ増幅と比較した選択された属のｑＰＣＲ定量を示す図である［中心値は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表示される（両側マンホイットニー検定（Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔ）；＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）］。
【図２Ｅ】３カ月齢での、Ｃにおけるサンプルの同じサブセットのＰＩＣＲＵＳｔ解析によって得られた上位３０個の最も顕著な差次的に大量な遺伝子（ＫＯ）のヒートマップを示す図である。ヒートマップ強度は、分散が安定したＫＯの存在量を表す。対象の階層的クラスタリングは、完全連鎖法を用いたユークリッド距離に基づくものであった。
【図２Ｆ】年齢１歳での、Ｃにおけるサンプルの同じサブセットのＰＩＣＲＵＳｔ解析によって得られた上位３０個の最も顕著な差次的に大量な遺伝子（ＫＯ）のヒートマップを示す図である。ヒートマップ強度は、分散が安定したＫＯの存在量を表す。対象の階層的クラスタリングは、完全連鎖法を用いたユークリッド距離に基づくものであった。アトピー性喘鳴患者と対照とを区別するこの解析の能力は、年齢３カ月にのみ生じるが、年齢１歳では生じない。
【図３Ａ】ガスクロマトグラフィーによって測定し、糞便の重量に対して正規化した、３カ月齢でのＡＷと対照サンプルのサブセットの糞便における３つの最も大量なＳＣＦＡの濃度を示す図である（ｎAW＝１３，ｎ対照＝１３）。
【図３Ｂ】３カ月齢での、ＡＷおよび対照サンプルのサブセットの尿中に検出された既知の微生物起源または寄与の代謝産物の相対濃度を示す図である（ｎAW＝１９，ｎ対照＝１６）。メタボロミクスデータは、超高性能液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析によって測定された、浸透圧に正規化されたスケール化した強度として示される。プロットタイトル中の各々の代謝産物の隣の上付き数字は、代謝産物が関与する生化学的経路を示しており、以下の通りである：１）二次的胆汁酸代謝；２）ヘモグロビン代謝；３）フェニルアラニン代謝；４）ヒスチジン代謝；５）食品成分。正規性のためにシャピロ−ウィルク試験（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ  ｔｅｓｔ）が行われた。全てのグラフに示される統計は、両側のマン−ホイットニーウィルコクソン（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）（正規分布していない場合）または不対両側ｔ検定（正規分布の場合）に基づいている；中心値は、平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示された  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図４Ａ】ＡＷ３カ月齢の乳児の糞便（ＡＷ）、または同じサンプルにラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラ、ロチア・ムシラギノサおよびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイの生体の混合物を加えたもの（ＡＷ＋ＦＬＶＲ）を前もって接種した親からのマウス（３週齢の子）からの糞便中の細菌科相対存在量を示す図である。ＦＬＶＲの有無にかかわらず、コロニー形成された動物の間では、科成分の明らかな変化が観察された。
【図４Ｂ】ラクノスピラｓｐ．、ベイロネラｓｐ．、ロチアｓｐ．およびフィーカリバクテリウムｓｐ．のパーセント存在量は、ＦＬＶＲを接種した両親から生まれたマウスの仔で上昇したことを示す図である。
【図４Ｃ】気道炎症を誘発するための、３週間のＯＶＡ免疫化レジームの後に、２つの異なる微生物群集（ＡＷまたはＡＷ＋ＦＬＶＲ）を有するマウスの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）における細胞数を示す。ナイーブなマウスは、生理食塩水を用いた免疫化レジームを受けた。
【図４Ｄ】ＢＡＬにおける全細胞差異数を示す図である。星は、ＡＷ群とＡＷ＋ＦＬＶＲ群との間のリンパ球（＊）および好中球（＊＊＊＊）の有意な減少を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図４Ｅ】全組織病理学的スコアおよび代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色された肺切片を示す図である。矢印は、ＡＷ接種物を与えられたマウスにおける有意な炎症性浸潤物の存在を示す。ＦＬＶＲ細菌を添加した同じ接種物は、炎症性浸潤物の減少をもたらした。スケールバー＝３００μｍ
【図４Ｆ】多重化されたサイトメトリックビーズアレイによって測定され、全タンパク質濃度に対して正規化された肺組織ホモジネート中のサイトカイン濃度を示す図である。
【図４Ｇ】ＥＬＩＳＡによって測定されたＯＶＡ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａの血清濃度を示す図である。Ｃ〜Ｇ）中心値は、２つの独立した実験から平均±ｓ．ｅ．ｍとして記載された（ｎ対照＝８，ｎAW＝１８，ｎAW+FLVR＝２８）。サンプルは生物学的複製物を表す。カッコの付いていない星は、ナイーブなマウスとの比較における有意な差異を示す（ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ多重比較試験、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図５】生後１年における腸内微生物および宿主の代謝変化を示す図である。Ａ）パーマノバ（ｐｅｒｍａｎｏｖａ）によって統計学的に比較した、３１９人の子供の３カ月および１年の腸内微生物叢のＰＣＡによる多変量解析（ｐ＜０．００１）。Ｂ）３カ月齢および１歳での３１９人の子供の腸内微生物の遺伝子組成のＰＣＡ（ｐ＜０．０１）  Ｃ）３カ月齢および１歳での３４人の子供の尿のメタボロミックなプロファイルのＰＣＡ（ｎ3mo＝３５，ｎ1yr＝３３）；ｐ＜０．０１）。
【図６Ａ】シャノン・ダイバーシティ指数（Ｓｈａｎｎｏｎ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）を用いて３カ月齢および１歳で比較したアルファ・ダイバーシティが、両側のマンホイットニーウィルコクソンによって統計的に確認されたことを示す図である（ｐ＜０．０５、上側および下側の「ヒンジ」は、第１および第３四分位数（２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイル）に対応するボックスプロットとして示される）。
【図６Ｂ】８つの細菌科によって表される上位１００個のＯＴＵの相対存在量を示す図であり、３カ月と１歳の間に起こる微生物叢の急激な変化を証拠立てる。
【図６Ｃ】３カ月齢と１歳との間の上位１０個の統計的に有意な（ｍｔ検定；ｐ＜０．００５）差次的に大量なＯＴＵを表すヒートマップを示す図である。各々の矩形は１つの対象である。
【図７Ａ】１歳での４つの臨床表現型の中の腸内微生物叢のＰＣＡおよび表現型の差異による全体的な微生物変化が無いことを示す図である。
【図７Ｂ】１歳での４つの臨床表現型のうちのアルファ・ダイバーシティ（シャノン多様性指数）を示す図である（上側および下側の「ヒンジ」は第１および第３四分位数（２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイル）に対応するボックスプロットとして示した）。４つの群の間で差異は観察されなかった。
【図７Ｃ】１歳での４つの表現型のうちの（上位１００個のＯＴＵ内の）細菌科の相対存在量を示す図である。細菌分類群の存在量の統計解析は、いずれの群の間においても有意な差異を生じなかった。
【図８】３カ月での４つの表現型のうちの上位１００個のＯＴＵ内の細菌属の相対存在量を示す図である。
【図９】１歳での４つの表現型のうちの上位１００個のＯＴＵ内の細菌属の相対存在量を示す図である。
【図１０】ＰＩＣＲＵＳｔ予測ＫＥＧＧ機能別カテゴリーを示す図である。対照とＡＷの間の相対存在量に有意な差異があったＰＩＣＲＵＳｔ予測ＫＥＧＧ機能別カテゴリー（ｎCTRL＝２０，ｎAW＝２１；ウェルチｔ検定（Ｗｅｌｃｈ  ｔ−ｔｅｓｔ），ｑ値＜０．０５）。３カ月で平均割合＞０．０１％の差のあるカテゴリーの棒グラフが表示されている。
【図１１Ａ】フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（ｐｒａｕｓｓｎｉｔｚｉｉ）ＡＴＣＣ  ２７７６６  １６ＳリボソームＲＮＡ、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受入番号Ｘ８５０２２．１（配列番号１）の核酸配列を示す図である。
【図１１Ｂ】フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイＡＴＣＣ  ２７７６８  １６ＳリボソームＲＮＡ、ジェンバンク受入番号ＡＪ４１３９５４．１（配列番号２）の核酸配列を示す図である。
【図１１Ｃ】ラクノスピラ・マルチパラ部分１６ＳリボソームＲＮＡ、型株ＤＳＭ３０７３Ｔ、ジェンバンク受入番号ＦＲ７３３６９９．１（配列番号３）の核酸配列を示す図である。
【図１１Ｄ】ベイロネラ・パルブラ株ＡＴＣＣ  １０７９０  １６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、ＮＣＢＩ参照配列ＮＲ＿０４３３３２．１（配列番号４）の核酸配列を示す図である。
【図１１Ｅ】ロチア・ムシラギノサ株ＤＳＭ２０７４６  １６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０４４８７３．１の核酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、部分的に、細菌組成物およびその使用方法を提供する。細菌組成物は、それを必要とする対象において、腸内微生物叢を改変させ、胃腸管に定植し、または腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーもしくはアトピーを診断もしくは治療するために、限定されることなく使用することができる。
細菌組成物およびその使用
本明細書に記載の細菌組成物は、ルミノコッカス科の１種または複数種の細菌、またはラクノスピラ科の１種または複数種の細菌、またはベイロネラ科の１種または複数種の細菌、またはミクロコッカス科の１種または複数種の細菌を含むことができる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム属の１種または複数種の細菌、ラクノスピラ属の１種または複数種の細菌、ベイロネラ属の１種または複数種の細菌、またはロチア属の１種または複数種の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の２種以上の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の３種以上の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の４種以上の細菌を含むことができる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の細菌の以下の組み合わせを含むことができる：フィーカリバクテリウムおよびラクノスピラ；フィーカリバクテリウムおよびベイロネラ；フィーカリバクテリウムおよびロチア；ラクノスピラおよびベイロネラ；ラクノスピラおよびロチア；ベイロネラおよびロチア；フィーカリバクテリウム、ラクノスピラおよびベイロネラ；フィーカリバクテリウム、ラクノスピラおよびロチア；フィーカリバクテリウム、ベイロネラおよびロチア；ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア；フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム属の細菌は（以前、フソバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、バシラス・ムコサス・アナエロビウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｏｓｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ）もしくはバクテロイデス・プラウスニッツィイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｐｒａｕｓｓｎｉｔｚｉｉ）としても知られている）フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイまたは前記種を包含する操作的分類単位（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ；ＯＴＵ）を含むことができる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウムは、フィーカリバクテリウムｓｐ．ＣＡＧ：１１３８（フィーカリバクテリウムｓｐ．ＭＧＳ：１１３８としても知られている）、フィーカリバクテリウムｓｐ．ＣＡＧ：８２（フィーカリバクテリウムｓｐ．ＭＧＳ：８２としても知られている）、フィーカリバクテリウムｓｐ．ＣＡＧ：７４（フィーカリバクテリウムｓｐ．ＭＧＳ：７４としても知られている）、フィーカリバクテリウムｓｐ．ＤＪＦ＿ＶＲ２０、フィーカリバクテリウムｓｐ．イヌ口腔分類群１４７（ｃａｎｉｎｅ  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ  １４７）、またはフィーカリバクテリウムｓｐ．ＭＣ＿４１を含むことができる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイＬ２−６、フィーカリバクテリウムｃｆ．プラウスニッツィイＫＬＥ１２５５、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイＳＬ３／３、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイＭ２１／２、またはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイＡ２−１６５を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、ＡＴＣＣ  ２７７６６またはＡＴＣＣ  ２７７６８の下でアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイであってもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイＡＴＣＣ  ２７７６６は、ジェンバンク受入番号Ｘ８５０２２．１（配列番号１）に明記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、ジェンバンク受入番号Ｘ８５０２２．１（配列番号１）に明記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイＡＴＣＣ  ２７７６８は、ジェンバンク受入番号ＡＪ４１３９５４．１（配列番号２）に明記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むことができる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、ジェンバンク受入番号ＡＪ４１３９５４．１（配列番号２）に明記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ属の細菌は、（以前にラクノスピラ・マルチパリス（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｍｕｌｔｉｐａｒｉｓ）としても知られている）ラクノスピラ・マルチパラもしくはラクノスピラ・ペクチノシザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｐｅｃｔｉｎｏｓｃｈｉｚａ）または前記種を包含する操作的分類単位（ＯＴＵ）を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラは、ラクノスピラ・マルチパラＤ３２、ラクノスピラ・マルチパラＬＢ２００３、ラクノスピラ・マルチパラＭＣ２００３、またはラクノスピラ・マルチパラＤＳＭ−３０７３であってもよい。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラは、ＡＴＣＣ  １９２０７またはＤＳＭ−３０７３の下でＡＴＣＣに寄託されたラクノスピラ・マルチパラであってもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラＤＳＭ−３０７３は、ジェンバンク受入番号ＦＲ７３３６９９．１（配列番号３）に明記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、型株ＤＳＭ３０７３Ｔを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラは、ジェンバンク受入番号ＦＲ７３３６９９．１（配列番号３）に明記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・ペクチノシザは、ラクノスピラ・ペクチノシザ、菌株１５０−１であってもよい。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・ペクチノシザは、ＡＴＣＣ  ４９８２７の下でＡＴＣＣに寄託されたラクノスピラ・ペクチノシザであってもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ベイロネラ属の細菌はベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アチピカ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ａｔｙｐｉｃａ）、ベイロネラ・パルブラ・パルブラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ  ｐａｒｖｕｌａ）、ベイロネラ・ディスパー（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｄｉｓｐａｒ）、ベイロネラ・ロゴサエ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｒｏｇｏｓａｅ）、ベイロネラ・セミナリス（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｅｍｉｎａｌｉｓ）、ベイロネラｓｐ．口腔分類群７８０  ｓｔｒ．Ｆ０４２２（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ  ７８０  ｓｔｒ．Ｆ０４２２）、ベイロネラ・トベツェエンシス（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｔｏｂｅｔｓｕｅｎｓｉｓ）、ベイロネラ・モントペリエレンシス（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒｅｎｓｉｓ）、ベイロネラ・マグナ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｍａｇｎａ）、ベイロネラｓｐ．口腔分類群１５８  ｓｔｒ．Ｆ０４１２（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ  １５８  ｓｔｒ．Ｆ０４１２）、ベイロネラ・ラッティ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｒａｔｔｉ）、ベイロネラ・クリセティ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、または前記種を包含する操作的分類単位（ＯＴＵ）を含むことができる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・パルブラは、ベイロネラ・パルブラＡＴＣＣ  １０７９０／ＤＳＭ  ２００８／ＪＣＭ  １２９７２／Ｔｅ３、ベイロネラ・パルブラＡＣＳ−０６８−Ｖ−Ｓｃｈ１２、ベイロネラ・パルブラＡＴＣＣ  １７７４５、またはベイロネラ・パルブラＨＳＩＶＰ１であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・パルブラは、ＡＴＣＣ  １０７９０の下でＡＴＣＣに寄託されたベイロネラ・パルブラであってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・パルブラＡＴＣＣ  １０７９０は、ジェンバンク受入番号ＮＲ＿０４３３３２．１（配列番号４）に明記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むことができる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・パルブラは、ジェンバンク受入番号ＮＲ＿０４３３３２．１（配列番号４）に明記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・アチピカはベイロネラ・アチピカＫＯＮ／ＡＴＣＣ  １７７４４／ＤＳＭ  ２０７３９／ＮＣＴＣ  １１８３０、ベイロネラ・アチピカＤ１５、ベイロネラ・アチピカＡＣＳ−０４９−Ｖ−Ｓｃｈ６、またはベイロネラ・アチピカＡＣＳ−１３４−Ｖ−Ｃｏｌ７ａであってもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・ディスパーは、ベイロネラ・ディスパーＡＴＣＣ  １７７４８またはベイロネラ・ディスパーＤＯＲＡ＿１１であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・ロゴサエは、ベイロネラ・ロゴサエＣＣＵＧ  ５４２３３／ＤＳＭ  １８９６０／ＪＣＭ  １５６４２／ベイロネラｓｐ．ＮＶＧ  ０５ｃｆ．であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・セミナリスは、（ベイロネラ・ラッティＡＣＳ−２１６−Ｖ−Ｃｏｌ６ｂとしても知られている）ベイロネラ・セミナリスＡＣＳ−２１６−Ｖ−Ｃｏｌ６ｂ、またはベイロネラ・セミナリスＣＩＰ  １０７８１０／ＭＧ  ２８１６２／ベイロネラｓｐ．ＡＤＶ  ４３１３．２／ベイロネラｓｐ．ＶＡ１０９であってもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・トベツェエンシスは、ベイロネラ・トベツェエンシスＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２４００／ＪＣＭ  １７９７６／ベイロネラｓｐ．Ａ１６／ベイロネラｓｐ．Ｂ４／ベイロネラｓｐ．ＩＭ−２０１１／ベイロネラｓｐ．ＪＣＭ  １７９７６／菌株ベイロネラｓｐ．Ｙ６／Ｂ１６であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・モントペリエレンシスは、ベイロネラ・モントペリエレンシスＣＣＵＧ  ４８２９９／ＣＩＰ  １０７９９２／ＤＳＭ  １７２１７／ベイロネラｓｐ．２００１−１１２６６２／ベイロネラｓｐ．ＡＤＶ  ２２１６．０３／ベイロネラｓｐ．ＡＤＶ  ２８１．９９／ベイロネラｓｐ．ＡＤＶ  ３１９８．０３／菌株ＡＤＶ  ２８１．９９、またはベイロネラ・モントペリエレンシスＤＮＦ００３１４であってもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・マグナは、ベイロネラ・マグナＤＳＭ  １９８５７（ベイロネラ・マグナｌａｃ１８としても知られている）であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・ラッティは、ベイロネラ・ラッティＡＴＣＣ  １７７４６／ＤＳＭ  ２０７３６／ＪＣＭ  ６５１２／ＮＣＴＣ  １２０１９であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・クリセティは、ベイロネラ・クリセティＡＴＣＣ  １７７４７／ＤＳＭ  ２０７３４／ＪＣＭ  ６５１１／ＮＣＴＣ  １２０２０であってもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ロチア属の細菌は、ロチア・ムシラギノサ（以前、ストマトコッカス・ムシラギノサス（Ｓｔｏｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ）またはマイクロコッカス・ムシラギノス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｕｓ）として知られている）、ロチア・デントカリオサ（Ｒｏｔｈｉａ  ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ）、ロチア・アエリア（Ｒｏｔｈｉａ  ａｅｒｉａ）、ロチア・ナシムリウム（Ｒｏｔｈｉａ  ｎａｓｉｍｕｒｉｕｍ）、ロチア・マリナ（Ｒｏｔｈｉａ  ｍａｒｉｎａ）、ロチア・テラエ（Ｒｏｔｈｉａ  ｔｅｒｒａｅ）、ロチア・エンドフィチカ（Ｒｏｔｈｉａ  ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａ）、ロチア・アマラエ（Ｒｏｔｈｉａ  ａｍａｒａｅ）、ロチア・アルフィジアエ（Ｒｏｔｈｉａ  ａｒｆｉｄｉａｅ）、ロチアｓｐ．ＣＣＵＧ  ２５６８８（Ｒｏｔｈｉａ  ｓｐ．ＣＣＵＧ  ２５６８８）、ロチアｓｐ．ＣｈＤＣ  Ｂ２０１（Ｒｏｔｈｉａ  ｓｐ．ＣｈＤＣ  Ｂ２０１）、ロチアｓｐ．口腔クローンＢＰ１−６５（Ｒｏｔｈｉａ  ｓｐ．ｏｒａｌ  ｃｌｏｎｅ  ＢＰ１−６５）、または前記種を包含する操作的分類単位（ＯＴＵ）を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサはロチア・ムシラギノサ（菌株ＤＹ−１８）、ロチア・ムシラギノサＡＴＣＣ  ２５２９６／ＣＣＭ  ２４１７／ＣＣＵＧ  ２０９６２／ＣＩＰ  ７１．１４、ロチア・ムシラギノサＭ５０８、ロチア・ムシラギノサＣＣ８７ＬＢ、ロチア・ムシラギノサＭ１７１０であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサは、ＡＴＣＣ  ４９０４０またはＡＴＣＣ  ２５２９６の下でＡＴＣＣに寄託されたロチア・ムシラギノサであってもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサＡＴＣＣ４９０４０は、ジェンバンク受入番号ＮＲ＿０４４８７３．１（配列番号５）に明記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、型株ＤＳＭ２０７４６を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサＡＴＣＣ  ４９０４０は、ジェンバンク受入番号ＮＲ＿０４４８７３．１（配列番号５）に明記の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ロチア・デントカリオサは、ロチア・デントカリオサ（菌株ＡＴＣＣ  １７９３１／ＣＤＣ  Ｘ５９９／ＸＤＩＡ）、ロチア・デントカリオサＭ５６７であってもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ロチア・アエリアは、ロチア・アエリアＦ０４７４、ロチア・アエリアＦ０１８４（ロチアｓｐ．口腔分類群１８８  ｓｔｒ．Ｆ０１８４としても知られている）、ロチア・アエリアＤＳＭ  １４５５６／ＧＴＣ  ８６７／ＪＣＭ  １１４１２／ロチア・アエリウス（Ｒｏｔｈｉａ  ａｅｒｉｕｓ）／菌株Ａ１−１７Ｂであってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・ナシムリウムは、ロチア・ナシムリウムＣＣＵＧ  ３５９５７／ＣＩＰ  １０６９１２／ＪＣＭ  １０９０９／ロチアｓｐ．Ｍ７ＳＷ７ａ／ロチア様ｓｐ．ＣＣＵＧ  ３５９５７であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・マリナは、ロチア・マリナＤＳＭ  ２１０８０／ＫＣＴＣ  １９４３２／ロチアｓｐ．Ｇ７／ロチアｓｐ．ＪＳＭ  ０７８１５１／菌株ＪＳＭ  ０７８１５１であってもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ロチア・テラエは、ロチア・テラエＢＣＲＣ  １７５８８／ＪＣＭ  １５１５８／ＬＭＧ  ２３７０８／ロチアｓｐ．Ｌ−１４３／菌株Ｌ−１４３であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・エンドフィチカは、ロチア・エンドフィチカＤＳＭ  ２６２４７／ＪＣＭ  １８５４１／ロチアｓｐ．ＹＩＭ  ６７０７２／ＹＩＭ  ６７０７２であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・アマラエは、ロチア・アマラエＡＳ  ４．１７２１／ＣＣＵＧ  ４７２９４／ＪＣＭ  １１３７５／コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）ｓｐ．ｊ−１８／菌株Ｊ１８であってもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、以下のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラ、またはロチア・ムシラギノサの組み合わせを含むことができる：フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイおよびラクノスピラ・マルチパラ；フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイおよびベイロネラ・パルブラ；フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイおよびロチア・ムシラギノサ；ラクノスピラ・マルチパラおよびベイロネラ・パルブラ；ラクノスピラ・マルチパラおよびロチア・ムシラギノサ；ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサ；フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラおよびベイロネラ・パルブラ；フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラおよびロチア・ムシラギノサ；フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサ；ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサ；フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサ。
【００２９】
「操作的分類単位」または「ＯＴＵ」は、本明細書中に記載されているか、または当該技術分野で公知の技術を使用して、同一であるかまたは異なるものであるＯＴＵ内の微生物の分類を意味する。ＯＴＵは、系統樹の末端葉を指し、核酸配列、例えば全ゲノム、または特定の遺伝子配列、および種のレベルでこの核酸配列に対し配列同一性を共有する全ての配列によって定義される。いくつかの実施形態において、特定の遺伝子配列は、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列、または１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の一部であってよい。他の実施形態において、２つの生物の全ゲノムを配列決定し、比較することができる。別の実施形態において、多座位配列タグ（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ；ＭＬＳＴ）のような領域、特定の遺伝子、または遺伝子のセットの選択領域を遺伝的に比較することができる。１６Ｓ  ｒＲＮＡの実施形態において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ全体または１６Ｓ  ｒＲＮＡのいくつかの可変領域にわたって＞９７％の平均ヌクレオチド同一性を共有するＯＴＵは、同じＯＴＵとみなされる31-32。完全ゲノムを含む実施形態において、＞９５％の平均ヌクレオチド同一性を共有するＭＬＳＴ、特定遺伝子または遺伝子のセットＯＴＵは、同じＯＴＵとみなされる32-33。いくつかの場合、ＯＴＵは生物間の配列を比較することによって定義される。一般に、９５％未満の配列同一性を有する配列は、同じＯＴＵの一部を形成するとはみなされない。また、ＯＴＵは、ヌクレオチドマーカーの任意の組み合わせまたは遺伝子、特に高度に保存された遺伝子（例えば、「ハウスキーピング」遺伝子）、またはそれらの組み合わせによって特徴付けられてもよい。そのような特徴付けは、例えば、ＷＧＳデータまたは全ゲノム配列を用いる。「１６Ｓ配列決定」または「１６Ｓ−ｒＲＮＡ」または「１６Ｓ」は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を含むヌクレオチドを特徴付けることによって由来する配列を指す。細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡは、およそ１５００ヌクレオチドの長さであり、系統学的アプローチを用いて、１つの細菌分離株の他に対する進化的関係および配列類似性を再構築することに使用される。１６Ｓ配列は、それらが一般的に高度に保存されているように、系統学的な再構築のために使用されるが、真菌と同様にほとんどの細菌の属および種を区別するのに十分なヌクレオチド多様性を抱える特異的超可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＯＴＵｓはＣｒｕｎｃｈＣｌｕｓｔ29を使用して決定し、グリーンジーンズ・データベース（Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ）30に対して９７％の類似性によって分類することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、配列番号１から５までの１つまたは複数に明記の配列と実質的に同一の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む細菌を含むことができる。「実質的に同一」とは、本明細書中で議論されるように、１つまたは複数の保存的置換のみによって、または核酸分子の生物学的機能を破壊しない配列の位置に位置する１つまたは複数の非保存的置換、欠失、または挿入によって、参照配列とは異なる核酸配列を意味する。そのような配列は、例えば、ＦＡＳＴＡを使用した比較について、使用される配列とヌクレオチドレベルで最適に整列された場合に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上、またはより一般的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。核酸分子については、比較配列の長さは、少なくとも５、１０、１５、２０または２５ヌクレオチド、または少なくとも３０、４０または５０ヌクレオチドであってもよい。別の実施形態において、比較配列の長さは、少なくとも６０、７０、８０または９０ヌクレオチド、または１００、２００、または５００ヌクレオチド以上であり得る。配列同一性は、公的に利用可能な配列解析ソフトウェアを用いて容易に測定することができる（例えば、ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐの配列解析ソフトウェアパッケージ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５、または国立医学図書館（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェア、または本明細書に記載のもの）。このようなソフトウェアは、相同性の程度を様々な置換、欠失、置換および他の修飾に割り当てることにより、類似の配列を整合させる。
【００３１】
あるいは、または付加的には、２つの核酸配列は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合に、「実質的に同一」であり得る。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシー条件は、例えば、６５℃の温度における０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、ｐＨ  ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１％ＢＳＡ（画分Ｖ）を含む緩衝液中であるかまたは、４２℃の温度における４８％ホルムアミド、４．８ｘ  ＳＳＣ、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ  ７．６、１ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および０．１％ＳＤＳ中で、少なくとも５００ヌクレオチド長のＤＮＡプローブを用いて起こるハイブリダイゼーションに匹敵するハイブリダイゼーションを可能にする条件である。（これらは、高ストリンジェンシーのノーザンハイブリダイゼーションまたはサザンハイブリダイゼーションの典型的な条件である。ハイブリダイゼーションは、約２０〜３０分、または約２〜６時間、または約１０〜１５時間、または２４時間以上にわたって実施してもよい。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはまた、高ストリンジェンシーＰＣＲ、ＤＮＡシークエンシング、一本鎖高次構造多型解析、およびイン・サイツハイブリダイゼーションのような、分子生物学者によって日常的に行われる多くの技術の成功にも依存する。ノーザンおよびサザンハイブリダイゼーションとは対照的に、これらの技術は、通常、比較的短いプローブ（例えば、通常、ＰＣＲまたは配列決定のためには約１６ヌクレオチドまたはそれ以上、およびイン・サイツハイブリダイゼーションのためには約４０ヌクレオチド以上）で行われる。これらの技術において使用される高ストリンジェンシー条件は、分子生物学の当業者に周知であり、それらの例は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらの文献において見出される34。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、健康なドナーまたは個体からの処理された糞便物質中に存在する、本明細書に記載の細菌を含むことができる。そのような細菌組成物は、糞便物質を得た後に個体群の複製をもたらすか、またはもたらすように意図される任意の培養または他のプロセスに起因するものではない、「直接的に単離された」ものであってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌は、細菌胞子を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、ヒト細菌株を含むことができる。別の実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、ヒトにおいて一般的に見出されない細菌株を含むことができる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、細菌組成物を受ける対象の腸に定着することができる細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、生きている細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび／またはロチア属の実質的に純粋な細菌を含むことができる。「実質的に純粋」または「単離された」とは、例えば、糞便または腸内で、自然に付随する成分から分離されるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび／またはロチア属の細菌を意味する。典型的には、本明細書に記載の細菌組成物は、それがサンプル中の全物質の少なくとも５０質量％、６０質量％、７０質量％、７５質量％、８０質量％、または８５質量％、または９０質量％以上、９５質量％、または９９質量％である場合に、実質的に純粋である。本明細書に記載の実質的に純粋な細菌組成物は、例えば、健康な個体からの糞便物質などの天然源から、または細菌培養物、例えば、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラ、および／またはロチア・ムシラギノサなどの、本明細書に記載の細菌のいずれかの培養物からの抽出によって、得ることができる。
【００３４】
本明細書に記載の細菌組成物は、それを必要とする対象において、腸内微生物叢を改変するため、胃腸管に定植するため、または腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーもしくはアトピーを診断または治療するために使用され得る。いくつかの実施形態において、腸内ディスバイオシスを治療することは、対象におけるぜんそく、アレルギーまたはアトピーの予防をもたらし得る。
ぜんそくという用語は、変動性および再発性の症状、可逆的気流閉塞および気管支けいれんを特徴とする気道の一般的な慢性炎症性疾患を指す。一般的な症状には、喘鳴、咳、胸部圧迫、息切れなどがある。
【００３５】
ディスバイオシス（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）という用語は、体または体内の微生物の不均衡を指し、最も一般的には、消化管または腸における状態を指す。微生物叢またはミクロビオームの健全な（例えば、理想的な）状態からの任意の崩壊は、たとえそのようなディスバイオシスが検出可能な健康の低下をもたらさないとしても、ディスバイオシスとみなすことができる。ディスバイオシスの状態は不健康であるかもしれず、それは単に特定の条件の下において不健康であるかもしれず、またはそれは対象がより健康になることを妨げるかもしれない。ディスバイオシスは、例えば多様性の減少によるものかもしれない。それは、炎症性腸疾患、大腸炎、慢性疲労症候群、肥満、癌およびぜんそくなどの病気に関連してきている。
【００３６】
アトピーという用語は、アレルゲン、例えば、環境アレルゲン、に対する過敏反応に対する遺伝的素因を指す。アトピーには、アトピー性皮膚炎（湿疹）、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アレルギー性ぜんそくならびに食物アレルギー、アレルギー性結膜炎および好酸球性食道炎などのアトピーに関連する疾患が含まれるが、これらに限定されない。
アレルギーという用語は、アレルゲンに対する異常な免疫反応を指す。
「胃腸管に定植する」とは、微生物叢またはミクロビオームの健康的な状態を対象において確立することを意味する。いくつかの実施形態において、胃腸管に定植することは、対象の胃腸管における特定の細菌のレベルを増加または減少させることを含む。いくつかの実施形態において、胃腸管に定植することは、対象の胃腸管において本明細書に記載の細菌のレベルを増加させることを含む。
【００３７】
「腸内微生物叢を改変する」とは、対象における微生物叢またはミクロビオームの増加または減少のいずれかの変化を意味する。いくつかの実施形態において、腸内微生物叢を改変することは、対象の胃腸管などの特定の細菌のレベルを増加または減少させることを含む。いくつかの実施形態において、腸内微生物叢を改変することは、対象の胃腸管において本明細書に記載の細菌のレベルを増加させることを含む。
「増加する」、「増加させる」、「減少する」または「減少させる」とは、対象の胃腸管における特定の細菌のレベルの変化を意味する。増加または減少は、対照と比較した場合に、１０％と１００％との間の変化、または３０％と６０％との間の任意の値の変化、または１００％を超える変化、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくはそれ以上の変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、増加または減少は、対照と比較した場合に、約１倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍またはそれ以上の変化であってもよい。
「微生物叢」は、真核生物、古細菌、細菌およびウイルス（ファージなどの細菌ウイルスを含む）を含む動物対象、典型的にはヒトなどの哺乳動物の体内および身体の上に（持続的または一時的に）発生する微生物の群集を指す。「ミクロビオーム」とは、真核生物、古細菌、細菌、およびウイルス（ファージなどの細菌ウイルスを含む）を含む、持続的かつ一時的にヒトの体内および身体の上に生息する微生物の群集の遺伝的内容を指し、ここで「遺伝的内容」には、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、例えばリボソームＲＮＡ、エピゲノム、プラスミド、および他のタイプの遺伝情報が含まれる。
【００３８】
用語「治療」、「治療する」または「療法」は、本明細書に記載の細菌組成物の予防的、緩和的、治療的および栄養的な投与様式を包含する。したがって、治療には、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーと診断されるかまたは、それらを有することが知られるかあるいは、腸内微生物叢の改変から恩恵を得られるとみなされた対象における１つまたは複数の症状の改善、緩和、逆転または完全な排除が含まれる。いくつかの実施形態において、治療には、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの１つまたは複数の症状の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の低減が含まれる。また、治療には、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの１つまたは複数の症状の発症の予防または遅延も含まれる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、対象は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒまたはチンパンジーなど）、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどの哺乳動物であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は患者である。対象は、１歳未満、または３カ月未満のヒトの乳児のような、乳児であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、１日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、１００日、１１０日、１２０日、１３０日、１４０日、１５０日、１６０日、１７０日、１８０日、１９０日、２００日、２１０日、２２０日、２３０日、２４０日、２５０日、２６０日、２７０日、２８０日、２９０日、３００日、３１０日、３２０日、３３０日、３４０日、または３５０日などの１日から３５０日の任意の年齢のヒト乳児であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は胎児であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、妊娠女性のような女性であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、ぜんそく、アトピー、アレルギーまたは腸内ディスバイオシスの家族歴を有する妊娠女性であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、抗生物質療法を受けていたか、受けているか、または受けようとしているものであってよい。対象は、臨床患者、臨床試験ボランティア、実験動物などであってもよい。対象は、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーに罹患しているか、またはその危険性があると疑われるものであってもよく；腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーと診断されたものであってもよく；あるいは腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーに罹患していないことが確認された対照のための対象であってもよい。腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの診断方法およびそのような診断の臨床的描写は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、対象は、腸内微生物叢の改変によって恩恵を受けると考えられる個体であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、胃腸管の定植によって恩恵を受けると考えられる個体であってもよい。
【００４０】
医薬品および栄養組成物、用量および投与
本明細書に記載の細菌組成物は、本明細書に記載のように、担体の存在下で、対象への投与に適した形態で、単独または他の化合物もしくは組成物と組み合わせて提供することができる。対象が胎児である場合、本明細書に記載の細菌組成物は、その母親に投与されてもよい（すなわち、対象は妊娠女性であってもよい）。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、治療的、予防的、栄養的またはプロバイオティック的な組成物であってもよい。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび／またはロチア属の細菌を含む治療的、予防的、栄養的またはプロバイオティック的な組成物であってもよい。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよび／またはロチア・ムシラギノサを含む治療的、予防的、栄養的またはプロバイオティック的な組成物であってもよい。
【００４１】
望まれる場合には、本明細書に記載の細菌組成物は、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーのより伝統的および既存の療法と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、短時間作用性気管支拡張薬、ベータ２−アゴニスト、吸入ステロイド、長時間作用性気管支拡張薬、抗ロイコトリエン、抗ＩｇＥ療法、経口コルチコステロイド、またはテオフィリンを制限なく含む、ぜんそくのための１つ以上の療法と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フェノテロール、フォルモテロール、イプラトロピウム、イソプロテレノール、オルシプレナリン、サルブタモール、サルブタモール、テルブタリン、ブデソニド、フルチカゾン、シクレソニド、ベクロメタゾンジプロピオナート、サルメテロール、モンテルカスト、ザフィルルカスト、オマリズマブ、プレドニゾロン、またはプレドニゾンの１つまたは複数と組み合わせることができる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、抗ヒスタミン薬、うっ血除去薬、ステロイド、気管支拡張薬、肥満細胞安定化薬、またはロイコトリエン修飾薬を制限なく含む、アレルギーのための１つまたは複数の療法と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、セチリジン、シクレソニド、ケトチフェン、レボセチリジン、フルチカゾン、フロアート、エピネフリン、クレマスチン、モンテルカスト、ブデソニド、オロパタジン、カルビノキサミンマレアート、モメタゾン、フルニソリド、クロモリン・ナトリウム、トリアムシノロン、オキシメタゾリン、エピナスチン、デキサメタゾン、ロラチジン、デスロラチジン、ジフェンヒドラミン、ベクロメタゾン、アゼラスチン、ロテプレドノール・エタボナート、フェキソフェナジン、またはネオドロクロミル・ナトリウムの１つまたは複数と組み合わせることができる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、抗生物質での治療の前、治療の間、または治療の後に、対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、ストレプトマイシン、アンピシリン、アモキシシリン、イミペネム、ピペラシリン／タゾバクタム、シプロフロキサシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールまたはチカルシリンを制限なく含む、１つまたは複数の抗生物質と組み合わせることができる。
本明細書におけるプロバイオティックという用語は、摂取された際に健康上の有益性をもたらす微生物の１つもしくは複数、またはその混合物を意味することを意図している。
【００４４】
細菌組成物は、慢性的にまたは断続的に提供することができる。「慢性的な」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間維持するために、急性モードとは反対に、連続モードで薬剤を投与することを指す。「断続的な」投与とは、中断することなく連続的に行われるのではなく、むしろ本質的に周期的である治療である。
腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーに罹患しているかまたはその前駆症状性の対象に、本明細書に記載の細菌組成物を投与するのに適した製剤または組成物を提供するために、従来の薬学的または栄養補助的プラクティスを用いることができる。任意の適切な投与経路、例えば、真皮、鼻腔内、吸入エアロゾル、局所、強制経口、直腸または経口投与を用いることができる。
細菌組成物は、様々な形態であり得る。これらの形態には、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体および固体剤形が含まれる。好ましい形態は、部分的に、意図された投与様式および適用様式に依存する。製剤は、液体溶液もしくは懸濁液の形態であってもよく；経口投与としては、製剤は、錠剤もしくはカプセル剤の形態であってもよく：小児用経口投与としては、製剤は、液体もしくは懸濁液の形態であってもよく；または、鼻腔内製剤としては、粉末、点鼻薬、もしくはエアロゾルの形態であってもよい。製剤は徐放性製剤であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌は、液体懸濁液のような小児用製剤として製剤化することができる。
【００４５】
本明細書に記載の細菌組成物は、医療用食品、栄養補助食品または健康補助食品、食用製品または飲料製品などの栄養補助食品組成物として製剤化することができ、栄養補助食品として許容される担体を含むことができる。本明細書で使用される場合、「栄養補助食品として許容される担体」とは、生理学的に適合する任意のならびに全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、ならびにそれらを含む。組成物は、栄養補助食品として許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含むことができる。いくつかの実施形態において、栄養補助食品として許容される担体は、小児科使用に適している。
本明細書に記載の細菌組成物は、医薬組成物として製剤化することができ、医薬的に許容される担体を含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合する任意のならびに全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、ならびにそれらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩、を含むことができる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、小児科使用に適している。
【００４６】
製剤を製造するための当該分野で周知の方法は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏの文献35に見出される。非経口的投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水もしくは生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化したナフタレンを含むことができる。化合物の放出を制御するために、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを使用することができる。他の潜在的に有用な非経口的送達システムには、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームが含まれる。吸入用製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含むことができ、または例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含む水溶液であってもよく、または点鼻薬の形態で投与するための油性溶液であってもよいし、ゲルとしてでもよい。治療的または予防的組成物については、化合物は、障害に依存して、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーを停止または遅延させるための十分な量で対象に投与される。
【００４７】
本発明に記載の細菌組成物の「有効な量」には、例えば、投与後の特定の期間における対象からの、糞便サンプルのようなサンプル中のフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび／またはロチア属の１つまたは複数の細菌の存在を検出することによって決定される適切な期間、対象の腸に定着するために十分な量が含まれる。
いくつかの実施形態において、有効な量は、治療的に有効な量または予防的に有効な量を含む。「治療的に有効な量」とは、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの治療、予防または改善のような、所望の治療結果を達成するために必要な用量および期間における有効な量のことを指す。治療的に有効な量の細菌組成物は、病状、対象の年齢、性別、および体重、ならびに細菌組成物が個体において所望の応答を誘発するための能力などの因子に応じて変化し得る。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調節することができる。また、治療的に有効な量は、治療上有益な効果が、細菌組成物の毒性または有害な効果を上回る量である。
「予防的に有効な量」とは、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの治療、予防または改善のような、所望の予防結果を達成するために必要な用量および期間における有効な量のことを指す。典型的には、予防的に有効な量が治療的に有効な量よりも下回るように、予防的用量が疾患に先んじて、またはその初期に対象において使用される。
【００４８】
「プロバイオティック」な量とは、例えば抗生物質治療後の対象の胃腸管の正常なレベルへの定植のような所望の結果を達成するのに必要な、用量および期間について、有効な量のことを指す。典型的には、プロバイオティックな用量は、大過剰で投与され、予防的に有効な量または治療的に有効な量よりも有意に高くなり得る。
本明細書に記載の細菌組成物の治療的または予防的に有効な量、またはプロバイオティックな量、に適した範囲は、１単位用量について、少なくとも約１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13または１０14個の細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕｓ）を制限なく含むことができる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、栄養型または胞子形態の生きている細菌のための用量は、１用量または組成物につき、約１ｕｇから約１０００ｍｇであってよく、例えば約０．５ｍｇから約５ｍｇ、約１ｍｇから約１０００ｍｇ、約２ｍｇから約２００ｍｇ、約２ｍｇから約１００ｍｇ、約２ｍｇから約５０ｍｇ、約４ｍｇから約２５ｍｇ、約５ｍｇから約２０ｍｇ、約１０ｍｇから約１５ｍｇ、約５０ｍｇから約２００ｍｇ、約２００ｍｇから約１０００ｍｇ、または約１、２、３、４、５もしくは５ｇを超えるような；あるいは、１用量または組成物につき、０．００１ｍｇから１ｍｇ、０．５ｍｇから５ｍｇ、１ｍｇから１０００ｍｇ、２ｍｇから２００ｍｇ、または２ｍｇから１００ｍｇ、または２ｍｇから５０ｍｇ、または４ｍｇから２５ｍｇ、または５ｍｇから２０ｍｇ、または１０ｍｇから１５ｍｇ、または５０ｍｇから２００ｍｇ、または２００ｍｇから１０００ｍｇ、または１、２、３、４、５、もしくは５ｇを超えるようであることができる。
【００５０】
用量の値は、緩和すべき状態の重症度によって変化し得ることに留意されたい。任意の特定の対象について、個人的な必要性および組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って、特定の用量レジメンを長い期間をかけて調整することができる。本明細書に明記されている用量範囲は、例示的なものに過ぎず、医療従事者によって選択され得る用量範囲を限定するものではない。組成物中の活性化合物の量は、疾患状態、年齢、性別、および個人の体重などの因子によって変化し得る。したがって、いくつかの実施形態において、適切な用量には、妊娠女性への投与に適した小児用量または用量が含まれる。いくつかの実施形態において、適切な用量には、プロバイオティック用量、例えば小児プロバイオティック用量が含まれる。用量レジメンは、最適な所望の応答を提供するように調節されてもよい。例えば、単一のボーラスを投与することができ、いくつかの分割用量を長い期間にわたって投与することができ、または状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少または増加させることができる。投与の簡便性および用量の均一性のために、用量単位形態で非経口組成物を製剤化することが有利であり得る。
【００５１】
細菌組成物は、毎日またはより頻繁に、例えば、１日２回以上、投与されてもよい。
細菌組成物は、食物または飲料の摂取の前、間または後に投与されてもよい。
検出方法
また、対象におけるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の一つまたは複数の細菌のレベルを決定し、その決定されたレベルを、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーと診断されていない個体のような、参照個体または健常個体に対して比較することにより、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性を決定する方法であって、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の一つまたは複数の細菌のレベルの低減または減少が、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性の増加を示す方法が、本明細書において提供される。一般的に、対象と参照個体または健康な個体との間の統計的に有意な差異は、対象が腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、対象と参照個体または健康な個体との間の対数スケールでの１または２の差は、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性を示し得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、対象からのサンプル中の、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の２種以上の細菌のレベルを決定することができる。いくつかの実施形態において、対象からのサンプル中の、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の３種以上の細菌のレベルを決定することができる。いくつかの実施形態において、対象からのサンプル中の、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の細菌のレベルを決定することができる。
いくつかの実施形態において、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性を決定することには、糞便アセテート、尿中ウロビリノーゲンまたは脱共役した胆汁酸のような胆汁酸のような１つまたは複数の代謝産物のレベルを決定することが含まれ、糞便アセテートのレベルの低減または減少、または尿中ウロビリノーゲンもしくは脱共役した胆汁酸のような胆汁酸の増加が、対象が腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーを発症する可能性が高いことを示す。
【００５３】
「決定する」または「検出する」とは、物質の存在もしくは非存在を決定すること、または本明細書に記載の１つもしくは複数の細菌、または本明細書に記載の代謝産物などの物質の量を定量することを含むことを意図する。したがって、この用語は、本明細書に記載されるか、または定性的および定量的決定のための当該技術分野で公知の材料、組成物および方法の使用を指す。増加または減少は、対照と比較した場合、１０％と１００％の間の任意の値の変化、または３０％と６０％の間の任意の値の変化、または１００％を超える変化、例えば約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、増加または減少は、対照と比較した場合、約１倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍またはそれ以上の変化であってもよい。
【００５４】
腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーを発症する可能性があると決定された対象は、本明細書に記載の細菌組成物で治療されてもよい。
いくつかの実施形態において、治療の有効性は、対象からのサンプル中の、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の１つまたは複数の細菌または代謝産物のレベルを決定し、決定されたレベルを対象からの以前の決定と比較することにより、モニターされてもよい。
【００５５】
「サンプル」は、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーを有するか、有することが疑われるかまたは、それらに対する素因を有する哺乳動物から単離されたサンプルのような、対象から単離された任意の器官、組織、細胞、または細胞抽出物であることができる。例えば、サンプルは、患者（ヒトまたは動物）、試験対象、または実験動物から得られた血液、尿、糞便、唾液、または任意の他の試料、またはそれらの任意の抽出物を含むが、これらに限定されない。「対照」は、ベースラインの発現または活性を決定する際に使用するために得られたサンプルを含む。したがって、対照サンプルは、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーと診断されない個体などの健康な個体から得ることができる。対照には、以前に確立された標準または参照も含まれる。したがって、任意の試験またはアッセイを確立された標準と比較することができ、毎回比較のための対照サンプルを得る必要はないかもしれない。フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチアの遺伝子、ゲノム、ポリペプチド、例えばフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子のような核酸分子の存在またはレベルを検出するために、定量的ＰＣＲのような当該技術分野で公知である方法を用いて、サンプルを解析することができる。サンプルを解析して、代謝産物、例えば糞便アセテート、尿中ウロビリノーゲンまたは脱共役した胆汁酸のような胆汁酸の存在またはレベルを検出することができる。
本発明は、以下の例において、さらに説明されるであろう。
【実施例】
【００５６】
物質と方法
方法
研究デザイン、皮膚プリック試験およびサンプル選択：
ＣＨＩＬＤ研究は、カナダの４つの拠点（バンクーバー、エドモントン、マニトバ、トロント）で合計３６２４名の妊娠母親を採用することによる妊娠から年齢５歳までの乳児を追従した、多施設長期縦断、プロスペクティブ、一般集団出生コホート研究である。ＣＨＩＬＤ研究の詳細な特徴は、以前、記載されている1。簡単に述べると、アンケートは、採用時、３６週の妊娠期間、３、６、１２、１８、２４、３０カ月、および３、４、５年に施された。このようにして、環境的曝露、心理社会的ストレス、栄養および一般健康に関するデータを得た。さらに、年齢１、３、５歳で、小児ぜんそくおよびアレルギー国際研究（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｒｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ；ＩＳＡＡＣ）2において認証されたアンケートは、親によって全ての項目が記入された。年齢１、３、５歳で、各々の子供は、アトピー性皮膚炎、鼻炎またはぜんそくの証拠が検査された。訓練を受けたスタッフは、１、３、５年で、標準化された吸入アレルゲンおよび一般的な食物アレルゲンの皮膚試験を行った。この全体コホートについては提出日に利用できなかったため、５年のデータはこの研究には含まれていなかった。ブリティッシュ・コロンビア大学／ブリティッシュ・コロンビア研究倫理委員会の児童・女性保健センターは、ヒトのサンプルに関する研究のための研究プロトコールを承認し、参加した各々の親は、インフォームドコンセントに署名した。
【００５７】
包含／除外基準：
皮膚穿刺試験の結果：年齢１歳で、ＣＨＩＬＤ研究に参加した子供を１０種のアレルゲンで試験した（アルテルナリア・テュニス、猫の毛、犬の上皮、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）、チャバネゴキブリ、ピーナッツ、ダイズ、卵白、および牛乳）。試験した１０種類のアレルゲンのいずれかに≧２ｍｍの膨疹を発生した場合、子供は「アトピー性」と分類された。ヒスタミンを陽性対照として使用し、グリセリンを陰性対照として使用した。ヒスタミンに対して陰性であった対象は、上記の１０種類のアレルゲンの１つに対して陽性（≧２ｍｍの膨疹を有する）が検査されない限り、このコホートに含ませなかった。対象がグリセリンに対して陽性の試験結果であった場合、グリセリンの膨疹のサイズは、任意の陽性のアレルゲン応答の膨疹のサイズから差し引かれた。
【００５８】
喘鳴アンケート：生後１年の間に子供が寒さの有無にかかわらず喘鳴を起こした場合（３カ月、６カ月、１２カ月の両親のアンケート回答で記録した）、その子供は喘鳴群に含ませた。ＣＨＩＬＤの臨床医が１年間の臨床評価中に喘鳴を記録した場合もまた、子供を喘鳴群に含ませた。
生物学的サンプル：このコホートに含まれるためには、各々の子供について３カ月および１年の糞便サンプルが必要であった。対照群については、（血液サンプルのような）追加のサンプルがＣＨＩＬＤ研究によって採取された対象を、これらのサンプルのいずれかを欠いている対象よりも選択した。
【００５９】
出生時の適格基準を満たしている３５４２人の子供のうち、１４２７人の子供が、選択時のＣＨＩＬＤ研究１年間臨床評価を完結した。不完全な皮膚穿刺試験データまたはグリセリンに対する陽性反応、またはヒスタミンおよび他の全てのアレルゲンに対する陰性反応のために、１６３人の対象が除外された。残りの１２６４人の対象を、アトピー＋喘鳴（ＡＷ）（ｎ＝３５）、アトピーのみ（ｎ＝１５０）、喘鳴のみ（ｎ＝２１６）、および対照（ｎ＝８６３）の４つの臨床表現型にグループ分けし、３カ月および１年の糞便サンプルの利用可能性について査定した（利用可能な３カ月および１年の糞便サンプルを有する子供のＮ数値、ＡＷ（ｎ＝２５）、アトピーのみ（ｎ＝１１２）、喘鳴のみ（ｎ＝１７９）および対照（ｎ＝１０６））。次いで、１６Ｓ  ＤＮＡの調製および配列決定の後、配列結果が不十分である場合（すなわち、糞便サンプルあたり十分な配列読み取りがない場合）、研究から対象を除外した（最終Ｎ数値、ＡＷ（ｎ＝２２）、アトピーのみ（ｎ＝８７）、喘鳴のみ（ｎ＝１３６）、および対照（ｎ＝７４））。
【００６０】
ｑＰＣＲ、ＳＣＦＡ、尿メタボロミクス、およびＰＩＣＲＵＳｔ解析のサンプルのサブセットには、利用可能な全てのＡＷサンプルおよび２０以下のランダムに選択された対照サンプルが含まれていた。選択されたサンプルの数は、ヒト乳児のこの研究において非常に限定される傾向にあった糞便または尿サンプルの利用可能性に依存した。
ぜんそく予測指標（Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ；ＡＰＩ）：
我々のサンプルコホート（ｎ＝３１９）の対象もまた、ぜんそく予測指数3に従って分類された。陽性の厳密なＡＰＩは、下記の基準により定義される：２歳から３歳の年齢の間の再発性喘鳴、ならびに２つのメジャー基準の１つ、または３つのマイナー基準のうちの２つ。さらに、子供が３年間の臨床評価でぜんそくと診断された場合、ＡＰＩ基準に合致するか否かにかかわらず、陽性ＡＰＩ群にも含ませた。
再発性喘鳴：再発性喘鳴は、２歳と３歳の年齢の間における喘鳴の≧３回の発症として定義される。２歳と３歳の年齢の間における喘鳴発症の数を定量するために、年齢２４および３０カ月および３歳でのアンケートを使用した。
【００６１】
メジャー基準：ぜんそくの親の履歴（親のいずれか）または２歳から３歳までの年齢のＭ．Ｄ．診断による小児アトピー性皮膚炎。
マイナー基準：≧４％の好酸球増多症、２歳以降の風邪とは別の喘鳴の発症、年齢３歳時のＭ．Ｄ．診断によるアレルギー性鼻炎。
１６Ｓ微生物群集解析
約５０ｍｇの糞便からＤＮＡを抽出したか、または約５０ｍｇの糞便被覆スワブを全スワブから切断した。ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮＡ糞便ミニキットでＤＮＡを抽出する前に、Ｍｏ−ｂｉｏ乾燥ビーズチューブ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびＦａｓｔｐｒｅｐホモジナイザー（ＦａｓｔＰｒｅｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）を用いてサンプルを機械的に溶解した。
【００６２】
以前に記載のように4、全てのサンプルは１６Ｓ遺伝子（表７）のＶ３領域に隣接するバーコードプライマー対を用いて三重にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
【表１】
2018515426.tif 000003
2018515426.tif 000004
【００６３】
各５０μＬのＰＣＲ反応物は、２２ｕＬの水、２５ｕＬのＴｏｐ  Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、０．５ｕＬの順方向および逆方向バーコードプライマー、および２μＬの鋳型ＤＮＡを含んでいた。ＰＣＲプログラムは、９５℃（５分）での初期ＤＮＡ変性工程、２５サイクルの９５℃（１分）でのＤＮＡ変性、５０℃（１分）でのアニール工程、および７２℃（１分）での伸長工程、ならびに７２℃（７分）の最終伸長工程からなる。汚染が起きていないことを確証するために、鋳型ＤＮＡを含まない対照を含めた。適切な増幅を確証するために、２％アガロースゲル上でアンプリコンを流した。約１６０ｋｂのバンドを示すアンプリコンを、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。精製したサンプルを１：５０に希釈し、ＰＩＣＯＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＴＥＣＡＮ  Ｍ２００（励起４８０ｎｍ、発光５２０ｎｍ）中で定量した。
【００６４】
イルミナシーケンシング：
プールされたＰＣＲアンプリコンを２０ｎｇ／μＬに希釈し、Ｈｉ−Ｓｅｑ  ２０００双方向イルミナシーケンシングおよびＣｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔ  ｖ４（Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、ソウル、韓国）を用いて、Ｖ３超可変領域を配列決定した。ライブラリー調製は、１００ｎｇのＤＮＡサンプル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）およびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ  １０００ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるＱＣライブラリーを用い、ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｖ２キットを使用して行った。
【００６５】
バイオインフォマティクス：
サンプルは、前処理し、ノイズを除去し、Ｍｏｔｈｕｒ5を使用して、サイズにより品質フィルターした（ｑｕａｌｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ）。代表的な配列を、ＣｒｕｎｃｈＣｌｕｓｔ6を用いて操作的分類単位（ＯＴＵ）にクラスター化し、９７％の類似性に従ってＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ7に対して分類した。全てのサンプルのうち５倍未満を示すＯＴＵが解析から除外された。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応：
以下の属について群特異的１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子プライマーを用い、上記の１６Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｖ３アンプリコンで特定の腸内細菌属の存在量を測定した；ラクノスピラ、ベイロネラ、ロチア、フィーカリバクテリウム、およびビフィドバクテリウム属（表８）。
【００６６】
【表２】
2018515426.tif 000005
【００６７】
全てのＡＷサンプルおよび無作為に選択された同数の対照サンプルを定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって解析した。全ての反応は、７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）またはＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）で行った。各々の１０μＬ反応物には、５μＬのＩＱ  ＳＹＢＲ緑色スーパーミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、５μＬ）、０．１μＬの各フォワードおよびリバースプライマー、０．８μＬのヌクレアーゼフリー水、および４μＬのＶ３アンプリコンが含まれていた。ｑＰＣＲプログラムは、９５℃（１５分）での初期工程、９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、および７２℃で３０秒の４０サイクル、ならびに１５秒での９５℃、１分での６０℃、１５秒での９５℃および１５秒での６０℃の最終サイクルからなる。プライマーのセットごとに、少なくとも２回の希釈をサンプルごとに行い、全ての希釈は重複して行った。サンプルは、参照遺伝子として全１６Ｓ  ｒＤＮＡを用いてΔＣT法に従って標準化した。
【００６８】
ＰＩＣＲＵＳｔ：
我々は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＯＴＵデータから（メタゲノム予測を介して）推定機能のプロファイルを生成するためにＰＩＣＲＵＳｔ8を使用した。ｑＰＣＲによって解析された同じサンプルからの予測されたメタゲノムは、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙレベル３の機能によって分類された。ＡＷと対照サンプルの間の機能的カテゴリー存在量における有意差を試験するために、我々はＳＴＡＭＰのウェルチのｔ検定導入を使用した9。我々はまた、ＤＥｓｅｑ２10を用いて、差次的に豊富なメタゲノムについて、デフォルト設定で試験した。試験の統計のｐ値は、ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ11の手順を用いて、複数の試験について調整した（誤発見率閾値＝５％）。
【００６９】
短鎖脂肪酸解析：
糞便サンプルを２５％リン酸と混合し、ボルテックスし、透明な上清が得られるまで遠心分離した。上清をＧＣ解析のために、アルバータ大学（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｂｅｒｔａ）の農業、食品および栄養学科に提出した。１３のＡＷサンプルのみが解析として十分な物質が含まれており、この解析のために１３の追加対照サンプルが無作為に選択された。サンプルを、改訂を伴い以前に記載されたように解析した12。簡単に述べると、サンプルを内部標準として４−メチル吉草酸と混合し、０．２ｍｌをＳｔａｂｉｌｗａｘ−ＤＡ  ３０ｍ×０．５３ｍｍ×０．５ｕｍカラム（Ｒｅｓｔｅｋ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）を用いたＢｒｕｋｅｒ  Ｓｃｉｏｎ  ４５６ガスクロマトグラフに注入した。内部標準と組み合わせて、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、およびカプロン酸を含む標準溶液を毎回の施行に注入した。
ＰＴＶインジェクタおよびＦＩＤ検出器の温度は、全体の施行について２５０℃に保持された。オーブンを８０℃で開始し、直ちに２１０℃まで４５℃／分で上昇させ、５．１１分保持した。全施行時間は８．００分であった。ヘリウムを２０．００ｍｌ／分の一定流量で使用した。
【００７０】
尿メタボロミクス：
対象１人あたり２５０μＬの尿を、メタボロミクス解析のためにＭｅｔａｂｏｌｏｎ  Ｉｎｃ．（ダーラム、ノースカロライナ州）に提出した。ｑＰＣＲ解析のために選択されたサンプルのサブセットから、１６−１８ＡＷおよび対照尿サンプルがメタボロミクス解析に利用可能であった。サンプル調製は、以前に記載したように行った13。簡単に述べると、品質管理プロセスのための抽出プロセスの最初の工程の前に、回収基準が追加された。メタノールで２分間激しく振盪しながら除去し（Ｇｌｅｎ  Ｍｉｌｌｓ  Ｇｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ  ２０００）、タンパク質を沈殿させ、続いて遠心分離させた。得られた抽出液を５つの画分に分けた：超高速液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ；陽イオン化）による解析のために１つ、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（陰イオン化）による解析のために１つ、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ極性プラットフォーム（陰イオン化）による解析のために１つ、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）のために１つ、および１つのサンプルはバックアップのために保持された。
以下の対照を実験サンプルで解析した：Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．によって広範に特徴付けられたヒト尿のプールから生成されたサンプル、および装置性能モニタリングを可能にした解析された各サンプルに添加された標準のカクテル。実験のサンプルおよび対照は、プラットフォームの実行にわたって無作為化された。
【００７１】
質量分析法の解析
抽出物をＧＣ−ＭＳまたはＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳのいずれかに供した。ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳプラットフォームは、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８−２．１×１００ｍｍ、１．７μｍカラムを備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣおよび加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ−ＩＩ）源でインターフェースしたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ高分解能／精密質量分析計および３５０００質量分解能で操作されたＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を用いた。サンプル抽出物を乾燥させ、酸性または塩基性のＬＣ適合性溶媒中で再構成し、その各々は、注入およびクロマトグラフィーの一貫性を確証するために８つ以上の注入標準を固定濃度で含ませた。酸性条件で再構成された抽出物は、０．１％ギ酸を含む水およびメタノールを用いて勾配溶出したが、水／メタノールを使用した塩基性抽出物は６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムを含んでいた。第３のアリコートは、１０ｍＭギ酸アンモニウムを含む水およびアセトニトリルからなる勾配を用いて、ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ  ２．１ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍ）からの溶出後の陰イオン化を介して解析した。ＭＳ解析は、動的排除を使用してＭＳとデータ依存ＭＳ2スキャンとの間を交互に行い、スキャン範囲は８０〜１０００ｍ／ｚからであった。
【００７２】
ＧＣ−ＭＳによる解析を目的としたサンプルを、乾燥窒素下でビストリメチル−シリルトリフルオロアセトアミドを用いて誘導体化させる前に、真空乾燥下で最低１８時間乾燥させた。誘導体化されたサンプルを、担体ガスとしてヘリウムを用い、１７．５分の時間で６０〜３４０℃の温度上昇にて、５％ジフェニル／９５％ジメチルポリシロキサン溶融シリカカラム（２０ｍ×０．１８ｍｍ  ＩＤ；０．１８ｕｍ膜厚）で分離した。全てのサンプルを、電子衝撃イオン化（ＥＩ）を用い、単位質量分解能で操作したＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｒａｃｅ  ＤＳＱ高速スキャニング単一四重極ＭＳで解析した。走査範囲は５０〜７５０ｍ／ｚからであった。
【００７３】
化合物の同定、定量化、およびデータのキュレーション
代謝産物は、保持時間、分子量（ｍ／ｚ）、好ましい付加物、およびインソースフラグメント（ｉｎ−ｓｏｕｒｃｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）ならびに関連するＭＳスペクトルを含む化学標準品の参照ライブラリーに対して、実験サンプル中のイオン特徴を自動比較することによって同定され、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ14で開発されたソフトウェアを使用した、品質管理のため目視検査によってキュレーションされた。既知の化学物質の同定は、精製された標準物質のメタボロームライブラリエントリとの比較に基づいている。検出可能な特徴の決定のために、商業的に入手可能な精製された標準化合物は取得され、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＧＣ−ＭＳの両方のプラットフォームの両方に配布のためにＬＩＭＳに登録されている。ピークは、曲線下の領域を用いて定量した。各々のサンプル中の各々の代謝産物の未加工の領域数を正規化して、各々の施行日の中央値による器具の日中の調整の差異に起因する変動を補正し、したがって、各々の施行について中央値を１．０に設定した。欠落値は、正規化後に観察された最小値に帰属させた。全ての値を各々のサンプルの浸透圧でさらに正規化した。
【００７４】
実験的マウスアレルギー性ぜんそくのヒト微生物叢モデル：
細菌接種物の調製および接種：
３カ月齢で採取された１人のぜんそく小児の凍結した糞便を使用して、無菌マウスに経口接種した。糞便材料の凍結片を滅菌メスでこすり落とし、０．０５％システイン−ＨＣｌで還元したＰＢＳ１ｍｌと混合して嫌気性種を保護することによって糞便スラリーを調製した。このタイプの養子移植は、ヒト微生物叢をマウスに移入することに有効であることが示されている15。サンプルをボルテックスし、３０００ｇで遠心分離して残渣を除去した。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（ＡＴＣＣ  ２７７６６）、ベイロネラ・パルブラ（ＡＴＣＣ  １０７９０）、ロチア・ムシラギノサ（ＡＴＣＣ  ４９０４０）とラクノスピラ・マルチパラ（ＤＳＭ−３０７３）の固体培養物を嫌気的条件下、３７℃で偏好性嫌気性菌（ファスティデアス・アナエローベ（Ｆａｓｔｉｄｉｏｕｓ  Ａｎａｅｒｏｂｅ；ＦＡ））寒天上で増殖させた。各々の培養物の１コロニーを２ｍｌ液体ＦＡ培地に添加し、２４時間増殖させた。糞便スラリーおよびＦＬＶＲ培養液の細胞濃度を、６００ｎｍの濁度測定によって計算し、還元ＰＢＳでＯＤ＝０．３に正規化した。
【００７５】
４匹の雌および４匹の雄の６週齢の無菌マウス（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）をＴａｃｏｎｉｃ（Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）から購入した。到着直後に、２匹の雌マウスおよび２匹の雄マウスを無作為に選択し、５０μｌの糞便スラリー（ＡＷ）で経口強制飼養し、残りのマウスには１０μｌのＦＬＶＲ培養物と組み合わせた４０μｌの同じ糞便スラリーを接種した。微生物処理での経口強制飼養を、到着後３、７および１４日目に繰り返した。２回目の接種後、交配のためにマウスをペアにした。実験用接種物でのＦ１マウスの微生物コロニー形成をさらに増加させるために、母親の腹部および乳頭領域を、出生後３日目および７日目に対応する細菌製剤で塗布した。
【００７６】
実験的アレルギー性ぜんそくモデル：
軽微な改訂を施して以前に記載されるように16、７〜８週齢で、各々の繁殖ペアに対して２つの引き続きの同腹仔からの全てのＦ１マウスにおいて、実験マウスのアレルギー性ぜんそくが誘導された。このモデルはヒトアレルギー性ぜんそくの表現型を完全に要約しているわけではないが、この肺炎症の多くの側面を評価するための有用なモデルである。動物実験におけるサンプルサイズを推定するために統計的方法は用いられなかった。合計８匹の対照、１８匹のＡＷおよび２８匹のＡＷ＋ＦＬＶＲマウスを、２つの組み合わせた実験において使用した。マウスを０日目および７日目に１０μｇのグレードＶ  ＯＶＡおよび１．３ｍｇの水酸化アルミニウム（両方ともＳｉｇｍａから）で腹腔内に感作させた。２１日目、２２日目、２３日目および２４日目に、ＰＢＳ中に５０μｇのＬＰＳを含まないＯＶＡを、２５日目および２６日目に１００μｇのグレードＶ  ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ）を鼻腔内にチャレンジした。２７日目に、２００ｍｇ  ｋｇ−１のケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）および１０ｍｇ  ｋｇ−１のキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）でマウスを麻酔し、血液を心臓穿刺によって収集した。屠殺後、ＢＡＬをＰＢＳで１ｍｌ洗浄を、３回行った。血球計数器で細胞を計数することにより、全ＢＡＬカウントを盲目的に評価した。好酸球、好中球、マクロファージおよびリンパ球を、標準的な形態学的基準に基づいてＨｅｍａＳｔａｉｎ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色したサイトスピン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）から定量した。これらの実験で使用された全てのプロトコールは、ブリティッシュ・コロンビア大学の動物ケア委員会によって承認された。
【００７７】
血清ＯＶＡ特異的Ｉｇの決定：
血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａを、酵素連結免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）によって測定した。
【００７８】
組織学：
肺を収集し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋し、長軸方向に５μｍの切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した  。１つの切片につき５つの分野から炎症を盲目的に評価し、各々は下記のパラメーターについて、各々１から５の尺度で段階付けされた（１＝疾病の徴候なし、５＝深刻な疾病）：最大スコア２５について（１）気管支周囲の浸潤、（２）血管周囲浸潤、（３）実質性の浸潤、および（４）上皮損傷。
【００７９】
サイトカイン：
肺組織ホモジェネートを１６０００ｇで２回遠心分離し、上清を−８０℃で保存した。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１７Ａのレベルは、サイトメトリックビーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ；ＣＢＡ）アッセイＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７キット（カタログ番号５６０４８５  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて決定した。ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３のレベルは、製造者の取扱説明書に従って、ＣＢＡフレックスセット（カタログ番号５５８３０２、５５８３４８および５５８３４９、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）によって決定した。サイトカイン濃度は、ブラッドフォードアッセイ法（Ｓｉｇｍａ）によって計算されたタンパク質濃度に対して標準化された。ＩＬ−９およびＩＬ−１３解析は、アッセイの感度限界を超える結果をもたらさなかった。
【００８０】
統計分析：
マルコフ鎖モンテカルロ（Ｍａｒｋｏｖ  Ｃｈａｉｎ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ；ＭＣＭＣ）サンプリング17-19に基づく正確なロジスティック回帰モデルが開発され、オッズ比（ＯＲ）が、特定の臨床データに従ってＡＷ群と関連したリスクを評価するために使用された。ＯＲならびに補正した下側および上側信頼区間は、それぞれ、下記の式ｅ(ln(OR))およびｅ(ln(CI)に従って計算した。ｌｎ（ＣＩ）は、拡張データ表１の正確な上側および下側信頼区間に等しい。全てのデータが利用可能な対象のみがモデルに含まれた（ｎAW＝２１、ｎ対照＝７４）。Ｐｈｙｌｏｓｅｑ20と共にＲスタジオ（Ｒ−Ｓｔｕｄｉｏ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）における追加のＲベースのコンピュータ計算ツール21-26を使用して、糞便の微生物多様性と細菌分類群の相対存在量を評価した。ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ27,28を使用して、主成分解析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＰＣＡ）を行い、パーマノバ（ｐｅｒｍａｎｏｖａ）20によって統計的に確認された。シャノン多様性指数はＰｈｙｌｏｓｅｑ20を用いて計算し、マン−ホイットニー（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン５ｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって統計的に確認した。Ｐｈｙｌｓｏｅｑ20の’ｍｔ’機能を使用して、３カ月目と１年目のサンプルとの間および４つの表現型：ＡＷ、アトピーのみ、喘鳴のみ、および対照、の間に差次的に大量なＯＴＵを同定するために多重推論補正Ｐ値を計算した。対照群とＡＷ群との差は、ｑＰＣＲについてマン−ホイットニーにより決定された。全てのＳＣＦＡおよび尿代謝産物は、正常性についてのシャピローウィルク試験（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ  ｔｅｓｔ）に供せられ、対照群とＡＷ群との間の差は、ｔ検定（硫酸グリココーレナートおよびグリコヒヨコラート；ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｅｎａｔｅ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｈｙｏｃｈｏｌａｔｅ）またはマンホイットニーウィルコクソンによって決定された。ヒトのサンプルは統計的試験から除外しなかった。ヒトのサンプルを用いた解析では、Ｆ検定は群の変動間に有意差がないことがわかった。マウス実験におけるＡＷ、ＡＷ＋ＦＬＶＲおよびナイーブ群の間の差を、ＢＡＬカウント、ＢＡＬ細胞差、組織学的スコアリング、肺サイトカインおよび血清免疫グロブリン濃度についてＡＮＯＶＡによって決定した。グラフ中の全てのデータポイントは生物学的複製物を表す。異常値は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  ＰｒｉｓｍのＲＯＵＴ法（Ｑ＝１％）を用いて、マウス実験データのみから検出され、除外された。統計的有意性は、Ｐ≦０．０５として定義された。
【００８１】
結果
我々は腸ミクロビオーム解析のために、このコホートから３１９人の子供を選択し、本明細書に記載のように、アレルギー皮膚プリック試験（すなわち、アトピー）と年齢１歳での臨床データ（すなわち、喘鳴）に基づいて、４つの臨床的に明確な表現型に分類した：アトピー＋喘鳴（ＡＷ、ｎ＝２２）アトピーのみ（ｎ＝８７）、喘鳴のみ（ｎ＝１３６）および対照（ｎ＝７４）（図１）。さらに、２歳および３歳の臨床データを使用して、厳密なぜんそく予測指標（Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ；ＡＰＩ）、学童期での活動性ぜんそくの存在についての臨床的に有効な予測指標である表現型を適用し7、これらの１年間の臨床的意義を確認した。年齢３歳における陽性の厳格なＡＰＩは、年齢６歳から１３歳の間の活動性ぜんそくの７７％の確率と関連している8。年齢１歳でのＡＷ群のＣＨＩＬＤ研究対象は、対照群（９５％ＣＩ：３．２から５７．４）よりも１３．５倍、陽性の厳格なＡＰＩを有する可能性が高かった（図１）。アトピーのみと喘鳴のみの表現型と比較して、ＡＷグループはまた、陽性ＡＰＩカテゴリーにおいて有意に豊富であり、これらの子供を学童期における活動性ぜんそくのリスクが最も高いと同定した。
【００８２】
他のぜんそく疫学研究9と一致して、正確なロジスティック回帰解析により、対照群と比較して、ＡＷ群に分類される対象のリスクを増加させる因子として、生後１年での抗生物質曝露［ＯＲ：５．６、ｐ＝０．００９］および１年でのアトピー性皮膚炎［ＯＲ：６．４、ｐ＝０．００５］が同定された（表１）。
【００８３】
【表３】
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帝王切開出産10、排他的な人工栄養10、および幼児期における抗生物質の曝露11もまた、腸内の微生物のディスバイオシスに関連付けられた一般的な要因であり、３カ月と１年の糞便微生物叢の我々の評価にそれらを含ませることを促したが、これらはこのサブ集団において重要な要因ではなかった。
他の若い子供のコホートにおけるミクロビオーム研究と一致して12、主成分解析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＰＣＡ）により、このコホートにおいて微生物および代謝変化の主要な推進力として年齢が同定された（図５および６ならびに表２）。
【００８４】
【表４】
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３カ月および１歳のサンプルのＰＣＡによって示されるように（図２Ａ、図７Ａ）、全体的な腸内群集成分は臨床表現型の間で実質的に異なっていなかった。３カ月および１歳の対照と比較して、ＡＷ群における多様性の有意でない減少が観察された（図２Ｂ、図７Ｂ）。それにもかかわらず、臨床表現型に従った相対的な分類群の比較（図２Ｃ）により、３カ月の糞便サンプル中のいくつかの大量ではない細菌分類群（すなわち、マイクロコッカス属およびベイロネラ属）の有病率における差異が同定された。その差異は１歳では存在しなかった（図７Ｃ）。これらの差異は、排他的に３カ月でＡＷ群がフィーカリバクテリウム属、ラクノスピラ属、ロチア属、ベイロネラ属の低存在量を示す、属レベル（図８および９）においてさらに顕著であった。表現型にわたる上位５０のＯＴＵの統計的解析は、３カ月で８個の差次的に大量なＯＴＵをもたらし、１歳で１個のみであった（表３；ｍｔ検定、未加工のｐ＜０．０５）。
【００８５】
【表５】
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これらの結果を検証するために、サンプルのサブセット（ｎAW＝２１，ｎCTRL＝２０）を使用して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、ベイロネラ、ラクノスピラ、ロチア、フィーカリバクテリウム、およびビフィドバクテリウム属の存在量を決定した。３カ月のＡＷ糞便サンプルにおけるベイロネラ、ラクノスピラ、ロチアおよびフィーカリバクテリウムの有意な低存在量が、再び、ｑＰＣＲにより明らかになった（図２Ｄ、マン−ホイットニー  Ｐ＜０．００１）。１６Ｓシークエンシングの結果と一致して、これらの差異は１歳の糞便では明確ではなかった（ベイロネラおよびラクノスピラは有意な差異がより小さく（Ｐ＜０．０５）、他の３つの属は有意に異ならなかった）。このことは、乳児が３カ月齢に達する前のこれらの細菌分類群の低存在量は、年齢１歳でのアトピーおよび喘鳴に関連することを示している。さらに、ＡＷ表現型の子供が対照群よりも陽性のＡＰＩを有する可能性が１３．５倍高いことから（図１）、我々の研究の結果はまた、生後初期におけるこれらの分類群の低存在量が、学童期の活動性ぜんそくの高いリスクに関連することを示唆する。
【００８６】
ぜんそくのリスクが最も高い乳児におけるこの生後初期のディスバイオシスの重要性を判定するために、マーカー遺伝子データおよび参照細菌ゲノムに基づいて微生物群集の機能的メタゲノムを推測するアルゴリズムであるＰＩＣＲＵＳｔを用いて、糞便微生物叢の機能的可能性を予測した。ｑＰＣＲのために選択されたサンプルの同一サブセット内の糞便微生物叢の推論遺伝的組成を比較した（図２Ｅ〜Ｆ）。ＡＷ表現型に関連した多数の遺伝子が観察された。調査した全６９１１の遺伝子（ＫＥＧＧオルソログ；ＫＯと定義される）のうち、３カ月において２３６４個の遺伝子が顕著に異なり、１歳では１２５のみであった（ワルド試験（Ｗａｌｄ  ｔｅｓｔ）およびＦＤＲ、ｐ＜０．０５）。上位３０個の差次的な遺伝子（最も低いｐ値に基づく；表４）は、３カ月（図２Ｅ）ではＡＷ群と対照とを区別する能力が目立つが、年齢１歳においてはそれが無い（図２Ｆ）。
【００８７】
【表６】
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【表７】
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３カ月での糞便サンプルのこの機能的差異は、群集がぜんそく発症に影響を及ぼす可能性を示唆している。ＡＷ群集における機能的な差異は、多様な代謝機能を有する遺伝子を含んでいた（遺伝子複製、炭素代謝、輸送体、アミノ酸生合成など；表５）。
【００８８】
【表８】
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【００８９】
これらの遺伝子が特定の代謝経路に組織化されると、リポ多糖（ＬＰＳ）の生合成が、ＡＷ群と対照群の間で最も異なっている経路であった（ウェルチのｔ検定、図１０）。再び、臨床群間の特定の代謝経路における有意な差異は、１歳のサンプルにおいて見られなかった。３カ月で検出された腸内細菌の大部分がグラム陽性（腸内細菌科およびベイロネラ属以外の全て）であることを考慮すると、ベイロネラ種の違いがＡＷ群におけるＬＰＳ生合成遺伝子の違いを説明することができる可能性がある。
糞便および尿中のＳＣＦＡレベルならびに尿メタボロミクスを測定することにより、ＡＷ小児における腸内群集の機能的影響をさらに調査した。年齢３カ月で、ＡＷ小児の糞便サンプルは酢酸塩の濃度が有意に低かった（図３Ａおよび表６）。
【００９０】
【表９】
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ぜんそくの動物モデルにおいて、プロピオン酸塩6、酢酸塩6、酪酸塩14は全て気道炎症を防御することが示されており、この防御効果はＴｈ２型免疫応答を阻止することができる調節性Ｔ細胞および樹状細胞の刺激に起因している15。
尿メタボロミクス解析を用いて、宿主および微生物起源の両方の代謝の差異を同定した16。この技術は、ヒト17およびモルモット18のぜんそく患者および対照患者を区別するために高精度で使用されてきた。ＡＷと対照の対象からの尿を比較することにより、２つの表現型の間に、微妙ではあるが有意な代謝シグナルが検出された（同定された５８０代謝物のうち、３カ月では３９が有意に異なり、１歳では２８が異なっていた）。この論文の目的として、我々は微生物起源または寄与の代謝産物に焦点を当てた。年齢３カ月では、対照と比較して、細菌の代謝に影響を受ける８種類の代謝産物がＡＷ小児の尿中に差次的に排泄されたが、１歳では２つのみが差次的に検出され、初期の乳児期の微生物のディスバイオシスの影響を再び反映していた。３カ月では、硫酸化胆汁酸グリコリトコラート（ｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ  ｇｌｙｃｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌａｔｅ）、グリココーレナート（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｅｎａｔｅ）およびグリコヒヨコラート（ｇｌｙｃｏｈｙｏｃｈｏｌａｔｅ）の排泄がＡＷの小児において高かったが、タウロウルソデオキシコール酸（ｔａｕｒｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）の排泄は低下した（図３Ｂ）。この排泄物の変化は、胆汁酸の宿主産生の増加および／または一次胆汁酸における微生物酵素活性の変化から起こりうる。ＡＷ小児の腸内微生物群集のいくつかの種の差異を考慮すると、胆汁酸排泄物の差異の少なくとも一部は微生物のディスバイオシスに起因する可能性が高い19。おそらく、ＡＷ小児の尿中で観察された最も顕著な代謝の差異は、ウロビリノーゲン、腸内微生物叢の特定産物、の１４倍の増加であった。ウロビリノーゲンは、ヘム異化の分解産物であるビリルビンの減少によって形成される。クロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ）は、ビリルビン変換が可能である唯一の既知の細菌であり20,21、この研究においては、クロストリジウムｓｐｐ．は３カ月でのＡＷ群で存在量（ＮＳ）を減少させた（図８）。これは、ウロビリノーゲン排泄の大きな上昇が、むしろ宿主のビリルビン代謝の変化に起因し得ることを示唆している。赤血球は胆汁酸の膜損傷作用の影響を特に受けやすいので、ＡＷ群の胆汁酸濃度が高いほどビリルビンの増加をもたらす可能性がある22。興味深いことに、他の胆汁酸とは異なり、タウロウルソデオキシコール酸塩は、対照群での高いレベルと一致する他の胆汁酸の存在下で赤血球および肝細胞に対して細胞保護効果を有することが示されている23,24（図３Ｂ）。胆汁酸代謝に観察される差異は、３カ月でのＡＷ小児の尿中のウロビリノーゲン排泄の増加と相関する。これらの代謝変化がぜんそくの病因に関連しているか否か、そしてどのように関連しているかは不明である。それにもかかわらず、それらは尿中で検出することができ、ぜんそくの危険性と関連する初期の幼児期における腸内ディスバイオシスのマーカーとなる。
【００９１】
ぜんそく感受性におけるフィーカリバクテリウムｓｐ．、ラクノスピラｓｐ．、ベイロネラｓｐ．およびロチアｓｐ．（総じてＦＬＶＲと略記される）の役割は、ヒト化された微生物叢を有する気道炎症のネズミモデルにおいて調査された。成人無菌（ＧＦ）マウス（ｎ＝４）に、３カ月で採取した１人のＡＷ対象からの糞便、または生きたＦＬＶＲを意図的に補填した同じヒト接種物を接種した。このＡＷ対象は、３カ月の糞便におけるこれらの４つの分類群の非常に低い存在量、陽性の厳格なＡＰＩ、および年齢３歳までのぜんそくの正式な診断に基づいて選ばれた。ＦＬＶＲを有する両親から生まれたマウスは、これらの株を保持することに成功した。ラクノスピラｓｐ．は、他の３株よりも非常に高い存在量でコロニー形成していた（図４Ａ、Ｂ）。Ｆ１世代を、７−８週齢でオボアルブミン（ＯＶＡ）により免疫化し、気道炎症反応を誘導した。ＡＷ微生物叢を接種したマウスは、好中球、好酸球、マクロファージおよびリンパ球からなる混合肺浸潤を特徴とする、ＯＶＡに対する重度の肺炎症応答を示した。しかし、ＡＷ微生物叢をＦＬＶＲで補填することにより、気管支肺胞洗浄における全肺細胞浸潤が有意に減少した（ＢＡＬ；ｐ＜０．０５）（図４Ｃ、Ｄ）。病理組織学的スコアリングにより、ＦＬＶＲを補填すると気道炎症が減少することが確認された（図４Ｅ；ｐ＜０．０１）。さらに、ＦＬＶＲ補填は、主要な前炎症性サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−６およびＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａの濃度を有意に減少させた（図４Ｆ、Ｇ；ｐ＜０．０１−０．０００１）。このサイトカインパターンは、好中球レベルの増加を伴う重度のヒトぜんそくに関連するＴＮＦ、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−６の上昇を連想させる25-27。まとめると、これらのデータは、ＡＷサンプルからの微生物叢が混合Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７肺炎症応答を誘導し、計画的で治療的なＦＬＶＲでのコロニー形成が免疫応答のＴｈ１／Ｔｈ１７成分を有意に減少させたことを示す。
【００９２】
本発明は、１つまたは複数の実施形態に関して記載されてきた。しかしながら、特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱することなく、多くの改変および修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。
全ての引用は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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