(57)【要約】円形のシャーレ用の開示されたインサートは、塩橋を立てる液体で満たされたシャーレを横切る、実質的に均一な電場を生成する。インサートは、円形の空間を規定する円形のボトムプレート、およびそれぞれがサイドチャネルと導通する一般に平坦な形状を有する一対の電流整流チャンバを含む。本発明の少なくともいくつかの観点では、塩橋が立てられると、前記ボトムプレートで規定される前記円形の空間が、空間の実質的な全領域の中で実質的に均一な電場を示すように、一対の電流整流チャンバを橋渡しするサイドチャネルの部分は、一対の電流整流チャンバの間の中間に最低点を有する全体に窪んだトッププロファイルをそれぞれ有する。
2018526999.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩橋を設置する液体で満たされたシャーレ全体に実質的に均一な電場を生成するための、円形のシャーレに挿入されるインサートであって、
前記円形のシャーレに取り付けられる円形のボトムプレートであって、前記インサートが前記シャーレに挿入されるとき、前記液体を受け入れるチャネルとして前記シャーレの円形の底面とともに実質的に均一な厚さの円形の空間を規定する前記ボトムプレートと、
前記ボトムプレートの円形の周囲から垂直に立ち上がり、前記液体を受け入れるように前記ボトムプレートで規定された前記円形の空間と連通するサイドチャネルと、
前記サイドチャネルと接続し、かつ導通する全体的に平面形状をそれぞれ有する一対の電流整流チャンバであって、前記円形のボトムプレートの直径に沿って互いに対向するように斜めに配置され、前記直径に対して互いに線対称であり、それぞれが前記サイドチャネルの上端部のそれぞれの部分から内側に延伸し、前記液体を受け入れ、前記塩橋を設置するように前記サイドチャネルを通じて前記ボトムプレートで規定される前記円形の空間に、前記液体を供給するための塩橋ポートを有する前記電流整流チャンバと、を具備し、
前記サイドチャネルのうち前記電流整流チャンバのそれぞれに接続されているそれぞれの部分以外の部分は、前記一対の電流整流チャンバの中間に最低点を有する全体的に凹状の上部の輪郭を有し、かつ、塩橋が設置されると、前記ボトムプレートで規定される前記円形の空間が、その実質的な全領域の中の前記直径の方向において実質的に均一な電場を示すように成形されている、インサート。
【請求項２】
前記円形のシャーレは組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）シャーレである請求項１に記載のインサート。
【請求項３】
前記サイドチャネルの前記全体的に凹状の上部の輪郭は、放物面と円筒形のカラムとの交点で定義される曲線の輪郭を描く請求項１に記載のインサート。
【請求項４】
前記サイドチャネルの前記全体的に凹状の上部の輪郭は、前記曲線の輪郭を描く階段状の形状を有する請求項３に記載のインサート。
【請求項５】
所定の抵抗率を有する液体で満たされた平坦な円形の空間の中に均一な電場を生成するための装置であって、
単一のまたはマルチパートの要素を具備し、
前記要素は、
実質的に均一な厚さの前記平坦な円形の空間と、
前記平坦な円形の空間の円形な周囲から垂直に立ち上がるサイドチャネルと、
それぞれが前記サイドチャネルに接続されかつ導通する一対の平坦なチャンバであって、前記円形のボトムプレートの直径に沿って互いに対向するように斜めに配置され、前記直径に対して互いに線対称であり、それぞれは前記サイドチャネルの上端部のそれぞれの部分から内側に延伸し、前記液体を受け入れ、前記サイドチャネルを通じて前記平坦な円形の空間に前記液体を供給するためのポートを有し、前記平坦な円形の空間、前記サイドチャネルおよび前記平坦なチャンバが前記液体で満たされると、前記ポートのそれぞれには所定の電圧が供給される、前記平坦なチャンバと、を規定し、
前記サイドチャネルのうち前記平坦なチャンバのそれぞれに接続されているそれぞれの部分以外の部分は、前記一対の平坦なチャンバの間の中間に最低点を有する全体的に凹状の上部の輪郭を有し、かつ、前記液体が満たされ、前記所定の電圧が印加されると、前記平坦な円形の空間は、その実質的な全領域の前記所定の直径の方向において実質的に均一な電場を示すように成形されている、装置。
【請求項６】
前記サイドチャネルの前記全体的に凹状の上部の輪郭は、放物面と円筒形のカラムとの交点で定義される曲線の輪郭を描く請求項５に記載のインサート。
【請求項７】
前記サイドチャネルの前記全体的に凹状の上部の輪郭は、前記曲線の輪郭を描く階段状の形状を有する請求項６に記載のインサート。
【請求項８】
前記単一のまたはマルチパートの要素は、インサート、および前記インサートが挿入される円形のシャーレを備え、
これらは前記平坦な円形の空間、前記サイドチャネル、および前記一対の平坦なチャンバを規定する請求項５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および類似の分野における研究開発のための円形の培養皿に関する。２０１５年９月１８日付けの米国仮出願第６２／２２０，８４１号の内容はそっくりそのまま本願に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
弱い直流電流電場（ｄｃＥＦ）は、組織極性により生じる経上皮電位の差によって組織レベルで存在する（非特許文献１）。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方のセッティングにおいて、生理的なｄｃＥＦに反応して、指向性のある移動（走電性）または配向性の変化（電気的なアライメント）を示す。走電性およびｄｃＥＦの刺激は、胚の成長、神経形成、形態形成、および傷の治癒など生理的な過程において極めて重要な役割を果たす（非特許文献１−５）。
【０００３】
電場（ＥＦ）の刺激の下で、多くの細胞シグナル伝達経路が調整されている。さまざまな膜受容体（非特許文献６−１０）またはイオンチャネル（非特許文献１１−１５）は、ＥＦセンサーとして機能し、異なる細胞タイプでの多くの細胞内シグナル伝達カスケードを開始することが示唆されている。走電性の現象の調整におけるＥＦ感覚タンパク質およびシグナル伝達ネットワークの機能的な役割を明らかにするため、さらなる研究が必要である。
【０００４】
シグナル伝達経路のよりよい理解を得るためには、その後の生化学分析を伴う顕微鏡によるイメージングおよび細胞生成物回収のための信頼性の高い便利な電気刺激プラットフォームが必要である。電気的なきっかけは、化学的なきっかけ（非特許文献２２）と同程度の細胞移動を導き、剪断応力のような他の物理的な要因との方向性のある移動を相乗的に促進するが（非特許文献２３）、走電性は走化性よりも研究されておらず、それは走化性でいつも使用されているボイデンチャンバ（非特許文献２４）に相当する便利なＥＦ刺激のための実験ツールの欠如によるのかもしれない。
【０００５】
従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ電気刺激は一般に、電極を用いた直接的な刺激、または塩橋を使ったマイクロ流体チャンバ内での刺激によって実行された。電極の直接的な刺激により生じるＥＦは均一ではなく、細胞はしばしば毒性のある電解生成物にさらされる。このように、従来の走電性の研究では通常、細胞を培養チャンバの底で培養する密閉マイクロ流体チップを採用している（非特許文献２５−３０）。チャンバの微小な断面は、印加可能な電流を制限し、かつ細胞に有害になりうるジュール熱を低減する。
【０００６】
近年の研究における電気刺激のためのマイクロ流体チップの使用の成功にも関わらず、これらのマイクロ流体チップには、実際の実験の数日前に、細胞培養皿において特殊な作成の期間を必要とし、これにより一般の研究室への適応性を制限する。さらに、単純な長方形の細胞培養マイクロチャンバは、一般的に、均一のＥＦを発生させるための円形の組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）シャーレの上に配置される。この結果、シャーレ上の細胞培養エリアの大部分が使用されず、このことが低い細胞収率および乏しい細胞生成物回収を引き起こす。細胞培養エリアが増加した矩形のマイクロチャンバの大型化により、近年では高い細胞収率が実現しているが（非特許文献２９および３０）、円形のＴＣＰＳ皿の大部分はまだ活用されていない。円形のエリアでは、細胞が培養されるボトム円形チャンバの、円の直径と任意の平行な弦の長さとの長さの差に起因する、電気抵抗の違いにより、２つの電気的ポテンシャルが生じ、それにより円形の領域では均一のＥＦは２つの電位によって直感的に生成されることができない。例えばマロッタらは、６ウェルプレートを用い、筋細胞を電気的に刺激して収縮を一定にした（非特許文献３１）。コンピュータシミュレーションは、マロッタらが使用した細胞が電解生成物と同様に不均一なＥＦにさらされたことを示す。さらにコンピュータシミュレーションは、市販の電気刺激システムによる組織ペーシングの研究は、類似した欠点を持つことを示す（Ｃディッシュ、イオンオプティクス、ＭＡ、アメリカ）（非特許文献３２−３５）。リンらは、白金電極に接続されたトランスウェルインサートを通じてＥＦを印加することで細胞の走電性を研究するために、改良されたトランスウェルアッセイを使用した（非特許文献３６）。一方、ガルシア−サンチェスらは、マルチウェルプレート内で細胞を刺激するためにパターン化された電極を使用した（非特許文献３７）。彼らのシステムは、高度な微細加工手順を必要とし、電極間の微小なＥＦヌルギャップもＥＦの均一性を低減させる。最近では、アヒルワルらが、非接触指向走電性を実証するためにボイデンチャンバを用いた電磁誘導法を用いたが、不均一なＥＦは持続した（非特許文献３８）。
【０００７】
コンピュータ支援設計およびコンピュータ支援製造（ＣＡＤ／ＣＡＭ）は、モデル構造を正確に設計し、製造プロセスをプログラムするためにコンピュータソフトウェアを使用する。数学的に描かれたワークピースの３Ｄ構造をＣＡＤ／ＣＡＭソフトウェアにより簡単に作成することができ、数値シミュレーションに便利に利用できる。このように、試作品製作ための時間、材料およびマンパワーが大幅に低減される。近年では、積層造形（３Ｄプリンティング）（非特許文献３９）がＣＡＤ／ＣＡＭの利点を利用し、原材料を層ごとに積層することによりワークピースを迅速に試作し、この技術はマイクロ流体チップの製造に利用されている（非特許文献４０−４３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
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【非特許文献６０】Hobbie, R. K. & Roth, B. J. Intermediate Physics for Medicine and Biology (Springer, 2015).
【非特許文献６１】Larson, R. & Edwards, B. H. Calculus Multivariable (Cengage Learning, 2009).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の従来の技術は、円形の培養皿／カルチャーウェア内に信頼性のある均一な電場を生成するための、便利で効率的な手段はいまだ提供していない。
【００１０】
本発明の目的は、円形の培養皿／カルチャーウェア内に均一な電場を生成するための効率的かつ非常に有効な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらまたはほかの利点を達成するため、および本発明の目的にしたがい、実施形態および広く説明されるように、１つの観点では、本発明は、塩橋を設置する液体で満たされたシャーレ全体に実質的に均一な電場を生成するための、円形のシャーレに挿入されるインサートであって、前記円形のシャーレに取り付けられる円形のボトムプレートであって、前記インサートが前記シャーレに挿入されるとき、前記液体を受け入れるチャネルとして前記シャーレの円形の底面とともに実質的に均一な厚さの円形の空間を規定する前記ボトムプレートと、前記ボトムプレートの円形の周囲から垂直に立ち上がり、前記液体を受け入れるように前記ボトムプレートで規定された前記円形の空間と連通するサイドチャネルと、前記サイドチャネルと接続し、かつ導通する全体的に平面形状をそれぞれ有する一対の電流整流チャンバであって、前記円形のボトムプレートの直径に沿って互いに対向するように斜めに配置され、前記直径に対して互いに線対称であり、それぞれが前記サイドチャネルの上端部のそれぞれの部分から内側に延伸し、前記液体を受け入れ、前記塩橋を設置するように前記サイドチャネルを通じて前記ボトムプレートで規定される前記円形の空間に、前記液体を供給するための塩橋ポートを有する前記電流整流チャンバと、を具備し、前記サイドチャネルのうち前記電流整流チャンバのそれぞれに接続されているそれぞれの部分以外の部分は、前記一対の電流整流チャンバの中間に最低点を有する全体的に凹状の上部の輪郭を有し、かつ、塩橋が設置されると、前記ボトムプレートで規定される前記円形の空間が、その実質的な全領域の中の前記直径の方向において実質的に均一な電場を示すように成形されている、インサートを提供する。ここで、前記円形のシャーレは組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）シャーレでもよい。前記サイドチャネルの前記全体的に凹状の上部の輪郭は、放物面と円筒形のカラムとの交点で定義される曲線の輪郭を描いてもよい。さらに、前記サイドチャネルの前記全体的に凹状の上部の輪郭は、前記曲線の輪郭を描く階段状の形状を有してもよい。別の観点では、本発明は、所定の抵抗率を有する液体で満たされた平坦な円形の空間の中に均一な電場を生成するための装置であって、単一のまたはマルチパートの要素を具備し、前記要素は、実質的に均一な厚さの前記平坦な円形の空間と、前記平坦な円形の空間の円形な周囲から垂直に立ち上がるサイドチャネルと、それぞれが前記サイドチャネルに接続されかつ導通する一対の平坦なチャンバであって、前記円形のボトムプレートの直径に沿って互いに対向するように斜めに配置され、前記直径に対して互いに線対称であり、それぞれは前記サイドチャネルの上端部のそれぞれの部分から内側に延伸し、前記液体を受け入れ、前記サイドチャネルを通じて前記平坦な円形の空間に前記液体を供給するためのポートを有し、前記平坦な円形の空間、前記サイドチャネルおよび前記平坦なチャンバが前記液体で満たされると、前記ポートのそれぞれには所定の電圧が供給される、前記平坦なチャンバと、を規定し、前記サイドチャネルのうち前記平坦なチャンバのそれぞれに接続されているそれぞれの部分以外の部分は、前記一対の平坦なチャンバの間の中間に最低点を有する全体的に凹状の上部の輪郭を有し、かつ、前記液体が満たされ、前記所定の電圧が印加されると、前記平坦な円形の空間は、その実質的な全領域の前記所定の直径の方向において実質的に均一な電場を示すように成形されている、装置を提供する。ここで、前記単一のまたはマルチパートの要素は、インサート、および前記インサートが挿入される円形のシャーレを備え、これらは前記平坦な円形の空間、前記サイドチャネル、および前記一対の平坦なチャンバを規定してもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の１つ以上の観点によれば、生物学および類似する学術的および工業的な分野においてさまざまな研究開発の試みに使用することができる円形の培養皿／カルチャーウェア内に、均一な電場を生成することができる。
【００１３】
本発明の添加的又は別個の特徴と利点は、以下の記載において説明され、一部はその記載から明らかであり、あるいは、本発明の実施により習得することができる。本発明の目的と他の利点は添付図面だけでなくその明細書及び特許請求の範囲において特に指摘される構成によって実現され、達成されるだろう。
【００１４】
上述の一般的な説明と、以下に述べる詳細な説明は具体例であって、例示を目的としており、特許請求されている本発明の範囲の詳しい説明を提供することが意図されていることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の実施形態に係る、細胞への均一なＥＦ刺激のための６層ＰＭＭＡインサートを使用する電気刺激装置の模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの層状インサートの概略図を示す（正確な縮尺ではない）。電流整流チャンバ（ＣＲＣ）および３Ｄ  ＣＡＤ構造を含むＰＭＭＡの上部アセンブリは、一片の両面テープにより細胞培養皿に取り付けられ、組み立てられたマイクロ流体チップを形成する。ここで塩橋はＳＢと略す。
【図１Ｃ】図１Ｃは単純な矩形のチャネルチップの概略図を示す（正確な縮尺ではない）。Ｗｏｒｌｄ−ｔｏ−ｃｈｉｐインタフェースを含むＰＭＭＡは、２つの矩形のチャネルを含む一片の両面テープにより、細胞培養皿に取り付けられ、組み立てられたマイクロ流体チップを形成する。
【図２Ａ】図２Ａは流体チャネル、つまり、本発明の実施形態のインサートにより規定され、流体が満たされる空間の全体の３次元構造示す。この図は本発明の実施形態に係る３Ｄ  ＣＡＤの原理を示す。上部アセンブリの構造は暗いグレーで示され、液体カラム（ＬＣ）を２つの放物面（Ｐ１およびＰ２、明るいグレー）と交差させることで形成される。
【図２Ｂ】図２（ｂ）は、本発明の構造を有さない平坦な高分子インサートにより形成される流体チャネルの３次元構造を示す。液体カラムは図示されている。塩橋はＳＢと略す。電流整流チャンバはＣＲＣと略す。図２（ｃ）は、６ウェルプレート内に挿入される、本発明の実施形態に係る高分子インサートにより規定される流体チャネルの３次元構造を示す。図に示すように、このインサートは、理想的な滑らかな側壁プロファイルを有すると仮定されている。図２（ｄ）は、本発明の実施形態に係る高分子インサートにより規定される流体チャネルの３次元構造を示し、ここでは理想的な滑らかな側壁プロファイルよりもより実用的な層状の構造が、図２（ｃ）で示された理想的な構造に近いインサート（すなわち層状の側壁形状）の組み立てに利用される。
【図３】図３は高分子インサートを用いた細胞実験のワークフローを示す。（ａ）に示すように、初めに、インサートを皿に取り付ける。ＰＢＳ、細胞培養液および細胞浮遊液をマイクロ流体チップ中に順次注入する。または、（ｂ）に示すように、泡の取り込みをより避けるため、インサートをＰＢＳ中で皿に取り付けてもよい。その後、バッファを細胞培養液で置換し、それから細胞浮遊液を投入する。
【図４】図４はＣＯＭＳＯＬシミュレーションの結果を示す。（ａ）は平坦な高分子インサート内の電流密度を示す。（ｂ）は本発明の実施形態に係る滑らかな３Ｄ  ＣＡＤインサート内の電流密度を示す。（ｃ）は本発明の実施形態に係る層状ＰＭＭＡインサート内の電流密度を示す。（ｄ）は平坦な高分子インサートを有するチャンバの底におけるＥＦＳを示す。（ｅ）は滑らかな３Ｄ  ＣＡＤインサートを有するチャンバの底におけるＥＦＳを示す。（ｆ）は層状ＰＭＭＡインサートを有するボトムチャンバにおけるＥＦＳを示す。
【図５】図５は、数値シミュレーションで調査された、ＣＡＤインサート内のチャンバの厚さに対するＥＦ均一性の公差示す。ボトムチャンバの厚みを０．２ｍｍから０．３ｍｍまで増加させると、抵抗は減少し、平均ＥＦＳはわずかに増加する（黒丸参照）。しかし、この厚さの範囲のチャンバ内のシミュレーションされた平均ＥＦＳは、意図された値の１００ｍＶ／ｍｍに非常に近くなる。ＥＦＳの不均一性を示す変動係数（ＣＶ）は、意図された０．２６ｍｍの厚さのチャンバで最も低い。それにも関わらず、すべての厚さにおいて調べられたＣＶは３％未満であり、均一なＥＦを生成するためのＣＡＤインサートの安定性を立証する（明るい四角を参照）。
【図６】図６は本発明の実施形態に係る、１００ｍｍのポリスチレンの組織培養皿のための大型化したインサートの数値計算の結果を示す。（ａ）は放物面の滑らかな表面を有するインサートで形成された流体チャネルのＣＡＤモデルを示す。（ｂ）は（ａ）の構造により生成される均一なＥＦを示す。（ｃ）は対応する６層ＰＭＭＡインサートを示し、（ｄ）は（ｃ）の構造で生成される均一なＥＦを示す。（ｂ）の滑らかな３Ｄ  ＣＡＤモデルでは、平均ＥＦＳが９７．４４±１．４７ｍＶ／ｍｍであり、ＥＦＳのＣＶは１．５１％である。（ｄ）の層状インサートでは、平均ＥＦＳが９４．７３±１．５９ｍＶ／ｍｍであり、ＥＦＳのＣＶは１．６７％である。表面の粗さのため、（ｃ）の層状インサートは（ａ）の滑らかな３Ｄ  ＣＡＤモデルよりも相対的に理想的ではないが、ＥＦ刺激の均一性には影響せず、やはり許容できる。
【図７】図７はインサート中で測定されたＥＦＳをメッシュのプロットとして示し、その中で標準偏差は黒いエラーバーで示す。それぞれの位置における誤差は低いことに注意されたい。
【図８】図８は、円形の高分子インサートを用いた５時間の細胞移動およびアライメントの実験後におけるＮＩＨ／３Ｔ３細胞の位相差顕微鏡の画像を示す。（ａ）はＥＦ刺激をせず、（ｂ）では３００ｍＶ／ｍｍのＥＦ刺激を行った。
【図９Ａ】図９Ａは、図８に画像を示したＮＩＨ／３Ｔ３細胞の細胞移動およびアライメントの測定の定量化に用いた、指向性および配向性を計算するための角度の模式的な表示を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、結果として得られた細胞移動の指向性を示し、細胞移動およびアライメントの測定において、ＥＦ刺激を伴うおよびＥＦ刺激を伴わない矩形のチャネルおよび本発明の実施形態の円形のインサートの場合を比較している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、結果として生じる細胞移動の配向性を示し、細胞移動およびアライメントの測定において、ＥＦ刺激を伴うおよびＥＦ刺激を伴わない矩形のチャネルおよび本発明の実施形態の円形のインサートの場合を比較している。４つのアスタリスクはダンの事後検定から得られるｐ＜０．０００１を示す。
【図１０】図１０は、本発明の他の実施形態に係る２４ウェルプレートにおける１５ｍｍウェルのためのインサートの数値計算の結果を示す。（ａ）はシミュレーションによってＥＦの評価が行われた実施形態の流体チャネルの構造を示す。（ｂ）はＥＦの分布のシミュレーション結果を示す。
【図１１】図１１は、０度から９０度までθが変化させることで、最短の配線から直径までのボトムチャンバにおける各配線を通じて流れる、任意の各電流線の間の相対抵抗の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上述のように、生理学的範囲でｉｎ  ｖｉｔｒｏで均一な電場（ＥＦ）を印加することは、矩形のマイクロチャネルで達成されている。しかしながら、円形の装置では、円の直径と、細胞が培養されるボトム円形チャンバの任意の平行弦の長さとの間の長さの差に起因して電気抵抗が異なるため、２つの電位から均一なＥＦを生成することが困難だった。この課題に対処するため、本開示は、円形のマルチウェル培養皿／カルチャーウェル内で均一なＥＦを生成するための、３次元（３Ｄ）コンピュータ支援設計（ＣＡＤ）高分子インサートを提供する。いくつかの実施形態では、６ウェルプレートで１．２％の変動係数（ＣＶ）を有する均一なＥＦを生成することができ、有効刺激面積パーセンテージは６９．５％だった。特に、ＮＩＨ／３Ｔ３マウス胎仔線維芽細胞を用いて、円形６ウェルプレート内での３Ｄ設計ポリ（メチルメタクリラート）（ＰＭＭＡ）インサートを検証する。ＣＡＤベースのインサートは、有効刺激面積パーセンテージをさらに増加させるために簡単に大型化でき（すなわち１００ｍｍ皿）、ＥＦ細胞反応および組織再生の研究のような、広く多様なＥＦ関連の研究のための市販で利用できるカルチャーウェアにも適用できる。いくつかの実施形態では、オームの法則を用い、均一なＥＦを生成するために、円形なボトムチャンバで電気抵抗を均一化するための、最適化されたＣＡＤ構造を作り出す。結果として、現代の細胞培養皿の大きな領域を均一なＥＦで刺激することができ、高い細胞収率を得ることができる。
【００１７】
（材料および方法論）
（マイクロ流体チップ構成およびアセンブリ）
本発明の実施形態に係るアセンブリされたマイクロ流体チップを用いる電気刺激装置の模式図を図１Ａに示す。この実施形態においてマイクロ流体アセンブリ全体は２つの主要な区画からなる。底の構造は標準的な組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）皿である。皿は、細胞培養作業に必要な温度制御のための、顕微鏡ステージ上のインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）の透明なヒーターの上に配置されている（非特許文献４４）。インサート部は、皿の内側に貼り付けられた両面テープによりＴＣＰＳ皿に取り付けられた（図１Ｂ参照）（非特許文献３０）。高分子インサートは、電流整流チャンバ（ＣＲＣ）を提供し、入口、出口、および塩橋（ＳＢ）チュービングインタフェースを収容するための３Ｄコンピュータ支援設計に基づいた、層状のポリ（メチルメタクリラート）（ＰＭＭＡ）で作製された。本実施形態のインサートの走電性への有効性を検証するため、矩形のチャネルを有する単純なマイクロデバイスを作製し、比較の目的のための参照システムとして用いた（図１Ｃ）。２つの同じ矩形のチャネル（３０ｍｍ×３ｍｍ×０．０７ｍｍ、Ｌ×Ｗ×Ｈ）が１つのチップ内にデザインされた。同様のチャネル寸法は、多くの細胞株の走電性を研究するために使用されている（非特許文献２８）。
【００１８】
（設計原理）
上述したように、円の直径と任意の平行弦の長さとのの間の長さの違いに起因して電気抵抗が異なることにより、均一なＥＦは円形の領域内では簡単には生成されない。このため、細胞のために可能な限り大きな表面積を有する円形のチャンバ内で均一なＥＦを生成することは難題である。図２Ａに示すように、細胞はボトムチャンバの底の領域を占める（ｙ軸上に重心を有し直径
【数１】
2018526999.tif 000003
のｘｙ平面）。赤い領域の上部のインサートは薄い液体カラム（ＬＣ）を含み、ボトムチャンバの上部に位置する。アセンブリされたマイクロデバイスは、ボトムチャンバ、液体カラム、および電流整流チャンバ（ＣＲＣ、ｗｏｒｌｄ−ｔｏ−ｃｈｉｐインタフェースとも呼ばれる）を含む。例えば図２（ｂ）から図２（ｄ）を参照のこと。図２（ｂ）に示すような側壁チャネルのいかなる構造的な変化もしなければ、１つの塩橋（例えばＡ）から他（例えばＤ）に流れる電流では、ボトムチャンバ内に均一なＥＦを生成することはできない。均一なＥＦを生成するため、構造は、全ての電流がボトムチャンバを必ず均一に流れるように、１つの塩橋からシステムのいずれかの断面を経た他の塩橋までの電気抵抗が同じになるようなものでなければならない。
【００１９】
この課題に取り組むため、本開示は、底の円形チャンバを通るいずれの任意の電流経路を通る電気抵抗が互いに実質的に同じである構造を設計するため、ＣＡＤを使用する。得られる理想的な構造は図２Ａに示され、頂点がミッドライン
【数２】
2018526999.tif 000004
および液体カラムＬＣ（図２Ａ）の交点に位置する２つの理想的な円形放物面（Ｐ１およびＰ２）に液体カラム（つまり円筒形の側壁ＬＣ）を交差させることから得られる。したがって、この円筒形の構造では、側壁の上部の輪郭が交差によって湾曲する。残りの構成は理想的なマイクロ流体チャネルである（つまり流体で満たすことができるチャネル）。この図では、放物面Ｐ１の頂点Ｏは座標系の原点と一致する。放物面は液体カラムと曲線
【数３】
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で交差し（白い破線、図２Ａ）、ここではｘｙ平面へのＡおよびＤを投影した点はＢおよびＣである。電気抵抗は、オームの法則により長さおよび断面積の両方を考慮することで計算することができる（非特許文献４５）。ボトムチャンバ内で均一なＥＦを促進するため、曲線
【数４】
2018526999.tif 000006
を通る電気抵抗は
【数５】
2018526999.tif 000007
を通る経路（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを結ぶ実線）の電気抵抗と等しくなければならない。言い換えれば、放物面
【数６】
2018526999.tif 000008
に沿って流れる電流は、
【数７】
2018526999.tif 000009
を流れる電流と同じ強さを有するべきである。
【００２０】
曲線
【数８】
2018526999.tif 000010
の弧の長さは、多変数微分積分学を用いて決定することができる（非特許文献４６）。詳細な導出および設計原理は、“詳細な設計手順”と題された下記のセクションで説明される。要するに、ｘｚ平面およびｙｚ平面の曲率の大きさを記述する放物面の定数および液体カラムの高さを計算し、市販のＣＡＤソフトウェアパッケージ（ライノセラス、ＵＳＡ）のモデル設計に使用する。得られる構造は図２（ｃ）に図示されている。
【００２１】
図２（ｃ）において、図２Ａに示した理想的な構造は、残りの側壁状チャネルと導通し、例えば一度インサートが円形カルチャーウェアに挿入されると、最終的には底の部分と導通する電流整流チャンバＣＲＣ、および塩橋を有する必要があるため、改良されることに留意されたい。図２（ｂ）と比較して、図２（ｃ）のサイドチャネルの上部の輪郭は交差によって規定された凹形状を有する。
【００２２】
（ＥＦ数値計算）
平坦な高分子インサートのＣＡＤモデルを前述の原理で作成し、ＣＯＭＳＯＬ  マルチフィジックス  ソフトウェア（ＣＯＭＳＯＬ社、ＵＳＡ）にインポートした。モデルは、（上記の図中に示した形状を有する）形成される流体チャネルに充填されるイオン液体として、培養液（ダルベッコ最小必須培地、ＤＭＥＭ）を使用した。塩橋ＳＢ間の電位は、図２（ｂ）および図２（ｃ）（図２（ｂ）は比較例）に示す流体チャネルの構造について、ＣＯＭＳＯＬの交流／直流（ＡＣ／ＤＣ）モジュールを用いて安定状態でのマクスウェル方程式を解くことで数値計算された。ＤＭＥＭの導電率は１．５１５Ｓ／ｍと測定され（３５５３−１０Ｄ導電率プローブを有するＦ７４、堀場、日本）、この値はＣＯＭＳＯＬに入力された。１つの塩橋接続おける境界条件として１００ｍＶ／ｍｍのＥＦを生成するための電流密度３７６．１Ａ／ｍ２を設定し、他の塩橋には接地電位を設定した。１０μｍの高さにおけるＥＦの均一性を評価するために、細胞培養チャンバの底における電場の強さ（ＥＦＳ）を解析した。液体カラムが位置する場所におけるＥＦＳのデータ点は除外した。数値計算の結果をエクスポートし、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（グラフパッド、ＵＳＡ）で解析した。
【００２３】
組織内の製造設備の限界から、滑らかな放物面の表面を有する３Ｄ  ＣＡＤモデルに基づくアセンブリされたマイクロ流体チップは、この作業では製造されなかった。その代わり、図２（ｂ）に示した、ＰＭＭＡ熱可塑性プラスチックの製造手順と互換性のある近似的な６層モデルが提供された。この６層ＰＭＭＡインサートは、オリジナルの平坦な３Ｄ  ＣＡＤモデルと同じ厚さ（６ｍｍ）を有し、同じ放物面パラメータが製造に採用された。この概念実証研究に基づき、３Ｄ  ＣＡＤインサートは将来にはコンピュータ数値制御（ＣＮＣ）製造技術により容易に製造することができる。層状インサートを使用した均一ＥＦの生成の安定性を検証するため、０．２−０．３ｍｍの範囲の細胞チャンバの異なる厚さに対するＥＦＳの公差および均一性も、図２（ｄ）に示す構造においてシミュレートした。
【００２４】
（装置製造およびＥＦ測定）
６ウェルプレートおよび３５ｍｍ皿の両方に対する６層状の近似的なモデルは、インサートの製造に用いられた。パターンはＡｕｔｏＣＡＤソフトウェア（オートデスク、ＵＳＡ）で設計され、厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ基板（コモグラス、クラレ、日本）は、３Ｄ設計に基づいて、ＣＯ２レーザカッター（ＶＬＳ２．３０、ユニバーサルレーザシステム、ＵＳＡ）を使用して切り出された。層は配列され、熱接合および高分子テープで接着された（図１Ｂ）。以前に報告されたものと同じ製造手順（非特許文献４７および４８）を使用した。詳細はこれらの文献を参照のこと。フィッティング接続のためのアダプタは、インサート上に強力接着剤（４０６プリズムインスタント接着剤、ロックタイト、ＵＳＡ）で接着した。その後、インサート向けの両面テープをインサートの底に貼り付けた（０．２６ｍｍの厚さのＦ９４７３ＰＣ、３Ｍ、ＵＳＡ）。図１Ｃに示した単純な矩形のチャネルチップの製造工程は、円形インサートの製造工程と同じ手順にしたがった。
【００２５】
インサート中でのボトムチャンバのＥＦを測定するため、１ｍｍ厚さのＰＭＭＡ基板（非特許文献２５および２８）に直径０．３ｍｍの穴の列をドリルで開けた。穴の間の間隔は３ｍｍであった。穴は一時的にカプトンテープでシールされた。インサートはダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ、１２８０００１７、ギブコ、ＵＳＡ）で満たされた。ＤＣ電源（Ｅ３６４１Ａ、キーサイトテクノロジー、ＵＳＡ）により、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極（２５ｍｍ×１００ｍｍ）を通じて４６Ｖの電気的ポテンシャルが供給された。非特許文献３０に記載されているＡｇ／ＡｇＣｌ電極の作製を使用した。電圧の差を測定するため、２つのＡｇ／ＡｇＣｌ配線ベースの電極（０．３ｍｍの直径）を、テープカバーに開けた後の隣接する２つの穴に挿入した。チャンバ内で２つの電極間の電圧の違いを、各位置において２０サンプルずつ、デジタルマルチメータ（２１００、ケースレーインスツルメンツ、ＵＳＡ）により、メーカー（ＫＩ−ＬＩＮＫ、ケースレーインスツルメンツ、ＵＳＡ）から提供されるＥｘｃｅｌアドイン関数を用いて測定した。そしてＥＦＳは、電圧の差をそれぞれの電極間の距離で割ることにより計算することができる。平均ＥＦＳおよび標準偏差の結果を計算し、カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプト（マスワーク、ＵＳＡ）にエクスポートした。下記の表１を参照せよ。
【００２６】
（細胞培養および細胞維持）
三日のトランスファプロトコルを有するスイスマウス胎仔線維芽細胞株、ＮＩＨ／３Ｔ３（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を使用し、上述の高分子円形インサートおよび矩形マイクロチャネルの電気的な刺激の機能を実証した。細胞は、５％のＣＯ２が補充された９５％の相対湿度の大気中で、摂氏３７度において、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマアルドリッチ、ＵＳＡ）が補充されたＤＭＥＭ内のＴＣＰＳ皿で培養された。細胞は、トリプシンＥＤＴＡ（ライフテクノロジーズ、ＵＳＡ）を用いて、推奨される継代比率で一週間に二回継代培養した。長期間の保存のため、１０％のジメチルスルホキシドが補充された細胞を液体窒素中で凍結保存した。
【００２７】
（ＥＦ刺激および顕微鏡解析）
６層ＰＭＭＡインサートのそれぞれは消毒された後、６ウェルＴＣＰＳプレートの個々のウェルまたは１００ｍｍＴＣＰＳ皿（図１Ｂ参照）に取り付けられた。同様の手順は単純な矩形のチャネルチップにも適用された。ＥＦの均一性を損なうことがあり、また細胞死を引き起こすこともある泡の混入を防ぐため、アセンブルされたマイクロ流体チップはＣＯ２ガスで準備され、図３（ａ）に示すようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ライフテクノロジーズ、ＵＳＡ）で満たされた。または、両面テープはプロテインフリーの緩衝液中では限定された接着力しか持たないことから、泡の混入をさらに減らすために図３（ｂ）に示すようにＰＢＳの存在下でウェルの底にインサートを取り付けることもできる。
【００２８】
細胞実験を始めるため、ＰＢＳが事前充填されたチャンバを血清が含まれた細胞培養液で置き換え、重力送給により塩橋ポートを通じてチャンバに５×１０５の細胞懸濁液を引き続いて供給した。細胞接着および成長のための一晩の培養の後、培養液を供給するためであって、塩橋（ＰＢＳ中に１．２％のアガロース（ＬＥアガロース、ロンザ、ＵＳＡ）を含む）のための接手が、インサートの上部に接続される。細胞で作用する類似した剪断応力を得るため、円形インサートに対して１００μＬ／ｈの流量および矩形のチャネルに対して２０μＬ／ｈの流量でのタイムラプス実験の間に、シリンジポンプ（ＹＳＰ−２０２、ＹＭＣ、日本）を使用して細胞培養液を交換した。ＤＣ電圧および電流は高電圧源メータユニット（２４１０、ケースレーインスツルメンツ、ＵＳＡ）によりＰＢＳ内のＡｇ／ＡｇＣｌ電極を通じて供給され、かつ測定された。直径３０ｍｍ、厚さ０．２６ｍｍのチャンバ内において、３００ｍＶ／ｍｍのＥＦのために要求される電流は３．５４５ｍＡであった。
【００２９】
タイムラプス走電性実験は自動化された顕微鏡で実行された（Ｔｉ−Ｅ、ニコン、日本）。細胞の位相差画像は、５分間隔で装置全体において異なる位置で撮影された。細胞のモルフォロジーおよび重心は、ＩｍａｇｅＪ解析ソフトウェアパッケージを使用して５時間の継続時間の間、手動で追跡された。３組の実験からのすべてのデータは平均で９５％の信頼区間で表され、これは平均で１．９６の標準誤差である。バートレットの検定からサンプルデータの非ガウス分布が得られたとき、ダンの多重比較事後検定を用いた順位検定の差異のクラスカル・ワリスの一元配置分散分析を行った。２つのデータセット間の帰無仮説を排除する信頼区間は９５％に設定された。０．０５未満のｐ値（真の帰無仮説の確率）は、９５％の信頼度で統計的優位性を表す。
【００３０】
（結果および考察）
（均一なＥＦ生成のための３Ｄ  ＣＡＤ最適化）
図２（ｂ）に示した平坦な高分子インサート、図２（ｃ）に示した、本発明の実施形態に係る、放物面と液体カラムとが交差するように設計された３Ｄ構造を有する滑らかな高分子インサート、および図２（ｄ）に示した、本発明の実施形態に係るＰＭＭＡインサートの層状近似について、チャンバの底における電流密度をシミュレートした。液体カラム高さ０．５ｍｍの場合、厚さ６ｍｍのインサートを用いて０．２６ｍｍの厚さのチャンバにおいて均一なＥＦが得られた。厚さ６ｍｍのインサートは、液体カラムの厚さを０．２５ｍｍまで小さくすることで、０．１３ｍｍの厚さのチャンバ用にも設計することができる。
【００３１】
平坦な高分子インサート、滑らかな３Ｄ  ＣＡＤインサートおよび層状３Ｄ  ＣＡＤインサートにおける、計算されたＥＦの結果が図４に示されている。図４は、本発明の実施形態に係る３Ｄ設計された構造がなければ、電流の大部分が、細胞の位置するボトムチャンバを通らずに液体カラム（側壁チャネル）を通り（図４（ａ））、不均一なＥＦを生成することを示している（図４（ｄ））。３Ｄで設計された構造では、電流線がボトムチャンバにおいて均一に分布し、均一かつ指向性のＥＦが生成されたことを示した（図４（ｂ））。インサートを用いて生成される高い指向性のＥＦは、インサートが細胞刺激だけでなく走電性の研究にも適していることも示唆する。図４（ｅ）は、滑らかな３Ｄ  ＣＡＤインサートにおけるＥＦＳの優れた均一性を示す。さらに、ボトムチャンバでの所望の一様な電位の低下が確認された。図４（ｃ）および図４（ｆ）は、近似された層状ＰＭＭＡインサートおよび図２（ｄ）に図示された流体チャネル構造により均一な指向性のＥＦが生成されたことを示す。
【００３２】
【表１】
2018526999.tif 000011
【００３３】
表１においてシミュレーション結果がまとめられている。３Ｄ設計された構造を持たない平坦な高分子インサートでは、ＥＦは不均一であり、平均ＥＦＳおよび変動係数（ＣＶ、標準偏差と平均との比率で定義される）は７５．０３ｍＶ／ｍｍおよび７．９１％である。滑らかなＣＡＤ設計インサートを有する６ウェルプレート（または３５ｍｍ皿）では、平均ＥＦＳが９６．１ｍＶ／ｍｍのＥＦがＣＶ１．２２％で生成される。表１に示すように、層状近似ＰＭＭＡインサートにおける粗い表面によって、滑らかな放物面の表面を持つ滑らかな３Ｄ  ＣＡＤインサートのものよりＥＦは不均一である。しかし、層状ＰＭＭＡインサートはなおも、許容できる８９．１ｍＶ／ｍｍの平均ＥＦＳおよび１．３０％のＣＶを有する、非常に均一で指向的なＥＦを生成することができる。
【００３４】
この研究に用いた両面テープは、圧縮および引っ張りに対して変形しやすい感圧性の接着剤である。ＥＦの均一性に対するチャンバ厚さのわずかな変形の影響を数値シミュレーションによって調べた。図５は０．２ｍｍから０．３ｍｍの範囲のチャンバ厚さにおける平均ＥＦＳおよびＣＶの公差を示す。高さ０．２６ｍｍのチャンバは最小のＣＶを有するが、ＣＶのすべてのシミュレーションデータは３％未満であり、ここで提供された３Ｄ  ＣＡＤインサートの汎用性を実証している。
【００３５】
３Ｄ  ＣＡＤアプローチは、１００ｍｍＴＣＰＳ皿のようなより大型のシャーレのためのインサートのさらなる大型化にも、容易に適応できる。均一なＥＦは、上記の表１および図６に示すように、１００ｍｍ皿向けの高さ１０ｍｍの、理論的な滑らかな３Ｄインサート、および近似的な層状ＰＭＭＡインサートの両方において生成される。このことは、円形の装置内で均一なＥＦを生成するための、本発明に係る３Ｄ  ＣＡＤの手順および原理の柔軟性を示している。
【００３６】
（チャンバ内でのＥＦ均一性の検証）
図７は、Ａｇ／ＡｇＣｌワイヤ電極により実験的に測定されたボトムチャンバ内のＥＦＳを示す。ＥＦＳは電流ベクトルに平行な隣接する穴の間で測定した。結果は、すべての測定のＥＦＳはＣＶ０．９２％で１４１．４±１．３ｍＶ／ｍｍであり、ボトムチャンバに極めて均一なＥＦが生成されることを示唆している。４６Ｖの電位がボトムチャンバ内で予想される１５０ｍＶ／ｍｍのＥＦＳを生成した。測定された平均ＥＦＳは予測値の約９４．３％であり、先行研究（非特許文献２９および３０）で報告された測定誤差と一致する。測定されたＥＦＳのＣＶは、数値計算から予測される１．３０％という値と同程度である（上記の表１参照）。この値は、以前に報告された最も大型で矩形の電気刺激装置からの測定されたＥＦＳの２．３％のＣＶにも匹敵する（非特許文献３０）。最終的に、電流ベクトルに対して垂直方向に沿うＥＦＳは、水平方向のわずか３％である４．６８±１．９０ｍＶ／ｍｍと測定される。このように、電場の強さの実際の測定は本発明の有効性を確認する。
【００３７】
（ハイパフォーマンス細胞ＥＦ刺激）
従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ電気刺激装置は、細胞を均一に刺激するために培養エリアを犠牲にするか、または不均一なＥＦで細胞の広い領域を刺激してきた。一方、本開示で明らかにされた高分子円形インサートは、細胞の大きな面積パーセンテージに対して均一なＥＦ刺激を付与することができる。有効刺激面積は、ボトムチャンバの面積から液体カラムが位置する領域を差し引いたものと定義される。有効刺激面積パーセンテージは、ＴＣＰＳ皿の全表面積に対する有効刺激面積の比率である。
【００３８】
以下の表２は、本開示の高分子インサートおよび他の文献で報告されたものを使った有効刺激面積パーセンテージを示す。表２に示すように、ほとんどの既存の装置では、全細胞培養面積の５０％以上において均一なＥＦ刺激を達成することができない。これに対して、本発明の実施形態に係る高分子インサートは、６ウェルプレート（または３５ｍｍ皿）の全面積の６９％以上において、また１００ｍｍシャーレの９０％まで、均一なＥＦ刺激を与えることができる。このように、電気刺激に本発明の高分子インサートを使用すると細胞収率が上昇する。より高い細胞収率は、生化学的および分子生物学的な解析に大いに恩恵をもたらす。
【００３９】
【表２】
2018526999.tif 000012
【００４０】
（均一なＥＦ刺激下における細胞移動およびアライメント）
ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞は、刺激の後にＥＦベクトルに対して垂直に整列することで知られており、陰極の走電性を示す（非特許文献４９−５１）ため、本発明の実施形態に係るインサートの性能をさらに検証するために使用された。５時間以上にわたって３００ｍＶ／ｍｍのＥＦ刺激下に置かれた細胞の位相差顕微鏡画像を撮影し、解析した。図８は円形高分子インサートでの５時間の実験後のＮＩＨ／３Ｔ３細胞の位相差顕微鏡画像を示し、（ａ）はＥＦ刺激がない場合、（ｂ）は３００ｍＶ／ｍｍのＥＦ刺激を行った場合を示す。
【００４１】
これらの細胞の細胞移動およびアライメントを定量化するため、２つのパラメータ、すなわち指向性および配向性を以下の定義で用いる。図７（ａ）を参照のこと。
【００４２】
細胞の走電性の指向性は
【数９】
2018526999.tif 000013
の平均として定義される。ここでΦｉは各細胞移動のユークリッドベクトルと印加された（陽極から陰極への）ＥＦのベクトルとの間の角度であり、ｎは解析された細胞の合計数である（図７（ａ）を参照）。陽極に移動する細胞のグループは−１の指向性を有し、陰極に移動する細胞のグループは＋１の指向性を有する。ランダムに移動する細胞のグループについて、指向性は０である。
【００４３】
配向性は
【数１０】
2018526999.tif 000014
の平均として定義される。ここでθｉは印加されたＥＦのベクトルと与えられた細胞の長軸との間の角度であり、ｎは解析された細胞の合計数である。ＥＦに垂直に整列する細胞のグループは−１の配向性を有し、供給されたＥＦに水平に整列する細胞のグループは＋１の配向性を有する。ランダムな形の細胞のグループについて、平均の配向性は０である。
【００４４】
上述の定義で評価された、ＥＦ刺激のある場合とない場合における細胞の指向性および配向性を、図９に示す。ＮＩＨ／３Ｔ３は、矩形のマイクロ流体チップおよび円形インサート（ｐ＜０．０００１、ＥＦ刺激をしない各制御と比較）の両方において、５時間の３００ｍＶ／ｍｍのＥＦのもとで、陰極への強い走電性を示す（図９Ｂ）。高分子インサート中でのＮＩＨ／３Ｔ３の指向性は矩形チャネル中よりもわずかに低いが（０．７８±０．０２対０．８７±０．０１）、これらの間の統計的な有意性はなかった（ｐ＞０．０５）。この偏差は、最適化されていない細胞培養液の流量に起因する可能性がある。高分子インサート装置内および矩形チャネル内の剪断応力は同じオーダーである一方で、円形インサートではその大きな断面積のため、培養液の補充にはより長い時間がかかる。
【００４５】
ＥＦ刺激の前では、矩形チャネルおよび円形インサートの両方において細胞はランダムな配向性（０．０５から０．０９）を示した。３００ｍＶ／ｍｍのＥＦ刺激の後、矩形チャネルおよび円形インサートにおける細胞の配向性は−０．６０±０．０５および−０．４９±０．０６に減少し、垂直なアライメントを示した（図９Ｃ）。矩形チャネルと円形インサートにおける細胞アライメントの差は、刺激の前後で有意である（ｐ＜０．０００１）。矩形チャネルおよび円形インサート両方での対照細胞はいかなるアライメントも示さない。
【００４６】
詳細な細胞移動および指向性のデータを以下の図３に示す。これらの結果は、本発明の実施形態に係るインサートの走電性の実験のための性能が、矩形チャネルの性能に匹敵し得るものであることを実証した。しかし、円形インサートは、矩形チャネルに比べ、少なくとも２つの高い有効刺激率を有する。つまり、本発明の円形インサートを使用することで、より高い細胞収率を達成することができる。
【００４７】
【表３】
2018526999.tif 000015
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態では、粘着テープとインサートとの間にペルフルオロポリマーがコートされた層を加えることで作られる、着脱式の高分子インサートが、ＥＦ刺激直後の細胞回収を促進する（非特許文献３０）。または、着脱式のインサートは、インサート材料としてポリジメチルシロキサンを用いることで製造することができる。シリコンゴムは、トランスウェルインサートの場合と同様に、クリップ留め設計による気密封止で、ＴＣＰＳ皿に対して可逆的に接着することができる。
【００４９】
（追加的な実施形態）
本発明の実施形態として、２４ウェルプレートの直径１５ｍｍのウェル向けのインサートを製造し、検証した。この実施形態では、市販で利用できるソフトウェアであるＭａｔｈｅｍａｔｉｃａによる計算および評価に基づき、以下の放物面パラメータＰ１は０．１ｍｍの厚さのシェルを有する高さ２．３ｍｍの円筒形を修正するために使われた。ボトムチャンバの厚さは０．０５ｍｍに設定された。非常に薄いボトムチャンバは、低電流の入力で高い電場の強さを生じることができる。
【数１１】
2018526999.tif 000016
【００５０】
直径１５ｍｍのカルチャーウェア内における、この３Ｄ構造のインサートの小さなサイズは、インサートの製造において二光子重合の使用を可能とする。このため、層ごとの近似的な多層構造ではなく、滑らかな構造を製造可能であり、有利である。
【００５１】
２４ウェル皿の小型の形状のため、インサートは最小化された２つのインタフェースを有するように設計され、そこでは塩橋が入口ポートおよび出口ポートと同じインタフェースを共有する。この設計は、より簡単かつ高品質なイメージングのための広い空間も可能とする。
【００５２】
図１０において、（ａ）は新たなインタフェース設計を有する改善されたモデルを示す。図１０において、（ｂ）は新たな設計のインサートの底における、ＣＯＭＳＯＬ  マルチフィジックスで計算された電場の分布を示す。１５ｍｍモデルの数値計算では電場の変動係数（ＣＶ）は１．４７％であり、優れている。
【００５３】
上記のさまざまな実施形態を以下の表４にまとめる。
【表４】
2018526999.tif 000017
【００５４】
（詳細な設計手順）
矩形のチャンバを利用した従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＦ刺激システムとは対照的に、円形チャンバ内（例えば組織培養ポリスチレンシャーレ）で均一なＥＦを生成することは非常に困難である。このセクションでは、例えばマイクロ流体システムにおいて、細胞が培養され刺激されるボトムチャンバ内で均一なＥＦを生成することを目的とした、図２（ｃ）に示したタイプの３Ｄ  ＣＡＤ  インサートの設計原理を説明する。
【００５５】
生化学的な解析のための細胞生産物を最大化するように、所与の高さを有する円形チャンバ（図２Ａに示す円形ボトムチャネル）内で刺激される細胞の量を増加させるために、培養エリアの可能な限り多くの部分を使うことが望ましい。インサートを通ってボトムチャンバの周囲長を囲む液体ボリュームの薄膜を介して電場が印加され、液体ボリュームは薄い液体カラムとして扱うことができる（図２ＡのＬＣ）。しかし、この液体カラム（円筒の側面チャネル）の上部に２つの電位を印加することで均一なＥＦを生成することはできない。
【００５６】
均一なＥＦを生成するため、システムの任意の断面を通る１つの電極から他の電極までの電気抵抗は同じでなければならない。この問題に対処するため、ボトム円形チャンバを通過する任意の電流線を通る電気抵抗を等しくするように、３次元（３Ｄ）設計構造が考案される。こうした構造は、２つのポテンシャルの中間点と液体カラムと交点において（図２（ｂ））、２つの同じ円形の放物面（Ｐ１およびＰ２）に交わる液体カラム（ＬＣ）として近似することができる。電気抵抗を等しくするために得られた３Ｄ  ＣＡＤ構造は、円形放物面使用して液体カラム（すなわち円筒形サイドチャネル）をトリミングすることで形成することができる。このステップを実行するため、ＣＡＤソフトウェアでブール微分ツールを使用した。３Ｄ  ＣＡＤモデルはさらに、アセンブルされたマイクロ流体チップにおいて均一なＥＦを生成するために使用することが可能である。オームの法則により、電気抵抗Ｒは次のように記述することができる（非特許文献６０）。
【数１２】
2018526999.tif 000018
ここでρは抵抗率、ｌは長さ、Ａｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎは導電体の断面積である。電気抵抗を計算するために、このシステムでは曲線の弧長を特定する必要がある。極座標系を使用し、ボトムチャンバ（図２Ａ、底の円）はｘｙ平面に位置し、上部の液体カラム（円筒の側壁の部分）は直径
【数１３】
2018526999.tif 000019
を有する。放物面Ｐ１について、頂点が液体カラムおよびｙｚ平面内で原点Ｏに位置する。放物面は曲線
【数１４】
2018526999.tif 000020
で液体カラムと交差する（図２Ａの白い破線）。点ＡおよびＤのｘｙ平面へ投影した点はＢおよびＣである。点Ａから点Ｄまでの電流を考える。オームの法則によれば、チャンバの底で均一なＥＦを得るためには、
【数１５】
2018526999.tif 000021
の電気抵抗（図２Ａの破線の経路）は、
【数１６】
2018526999.tif 000022
の電気抵抗と等しくなければならず、同等に
【数１７】
2018526999.tif 000023
である。
サンプル全体で抵抗率が一定だと仮定すると、さらに次式が成り立つ。
【数１８】
2018526999.tif 000024
【００５７】
式２は、液体カラムの断面積に対する曲線Ｍ’の修正の比率が、ボトムチャンバの断面積に対する
【数１９】
2018526999.tif 000025
に加えて、液体カラムの断面積に対する
【数２０】
2018526999.tif 000026
の比率に等しいとき、均一なＥＦ分布が可能となることを示す。全電流が十分に薄い経路を通るものと仮定すると、次式が満足される。
【数２１】
2018526999.tif 000027
【００５８】
【数２２】
2018526999.tif 000028
および
【数２３】
2018526999.tif 000029
は簡単に測定できるため、その後にＭ’の値は式３を用いて導出することができる。Ｍ’の情報とともに、円形放物面Ｐ１およびＰ２の形状は次のように定めることができる。
【００５９】
円形放物面Ｐ１およびＰ２の形状は
【数２４】
2018526999.tif 000030
として記述される。ここでａ２／ｂは放物面のｘｚ平面およびｙｚ平面の曲率の程度を表す定数であり、放物面の形状を定義する。
液体カラムに対する式は
【数２５】
2018526999.tif 000031
と考えることができる。ここでｒはカラムの半径である（円形ボトムチャンバの半径でもある）。点Ｏ、ＡおよびＤの座標はパラメトリック形式
【数２６】
2018526999.tif 000032
で与えることができ、
【数２７】
2018526999.tif 000033
である。
【００６０】
放物面Ｐ１に沿った曲線Ｍ’の修正は、媒介変数方程式の積分（非特許文献６１）
【数２８】
2018526999.tif 000034
によって計算することができる。放物面の定数
【数２９】
2018526999.tif 000035
は式３を解くことで求められる。式３は、放物面Ｐ１に沿ったＭ’に関する第２種の楕円積分であるため（式７）、明示的に解くのは難しい。しかし、計算を簡単にするために定数を
【数３０】
2018526999.tif 000036
と表記することで（ｒは円形ボトムチャンバの半径）、以下のコード（リスト１）を用いたＭａｔｈｅｍａｔｉｃａを使用し、式３を評価することができる。
【００６１】
リスト１：放物面Ｐ１の記述を見つけるためのコードの例
【数３１】
2018526999.tif 000037
【００６２】
６ウェルプレート用のインサートを設計するため、液体カラムの厚さは０．５ｍｍ、ボトムチャンバの直径は３０ｍｍ、ボトムチャンバの厚さは０．２６ｍｍとし、パラメータ（放物面Ｐ１の定数を含む）
【数３２】
2018526999.tif 000038
が評価され、さらなる数値計算および装置製造のため、市販のＣＡＤソフトウェアで３Ｄモデル（以下で説明される）を生成するためにこのパラメータを使用することができる。
【数３３】
2018526999.tif 000039
【数３４】
2018526999.tif 000040
【００６３】
この設計原理では２つの極端なケースを考えることができる。すなわち、電流が最短の弦を流れるケースおよび最長の弦（すなわち直径）を流れるケースであり、これらは均一なＥＦを達成するために要求される放物面の定数および液体カラムの高さを与えるであろう。最短の弦（θ＝９０、ここでθは極座標の方位）の間のそれぞれ異なる経路（例えば図２Ａの経路曲線Ｍ”、Ｍ＊＊、Ｍ＊、およびＭ’）を通る、すべての任意の電流線についての電気抵抗を知るため、リスト２の次の式を用いることができる。
【００６４】
リスト２：すべてのＭ経路についてのコードの例
【数３５】
2018526999.tif 000041
【００６５】
【数３６】
2018526999.tif 000042
における計算された抵抗範囲は図１１にプロットされる。
【数３７】
2018526999.tif 000043
の相対抵抗はθ＝０に対応し、
【数３８】
2018526999.tif 000044
の相対抵抗はθ＝９０に対応する。この結果は、すべての経路の電気抵抗が両方の極端なケースに向けて収束し、このモデルが円形チャンバにおける均一なＥＦを達成するためのよい近似を提供することを示す。二次の面積分もこの設計原理をさらに改善するために有用であろう。
【００６６】
要約していえば、円形のマイクロデバイスにおいて均一なＥＦを生成することは極めて難しく、このため既存のＥＦ刺激装置の大部分は単純な矩形のチャンバを使用することでこの問題を回避している。矩形の形状には市販の実験器具に適するための変形が必要とされ、細胞培養皿の小さな部分のみが細胞培養に使用され、このため細胞収率が限られていた。円形の細胞培養チャンバに本発明の実施例に係る３Ｄ  ＣＡＤベースのインサートを加えることで、本開示は装置全体の電気抵抗を調節することで円形の領域内で均一なＥＦを生成できることを実証した。
【００６７】
本発明のいくつかの観点では、以下の特徴に注目することができ、そのいくつかは上述した。
（１）インサートを用いた有効刺激面積パーセンテージは、既存のＥＦ刺激装置の少なくとも２倍高い。さらなる生化学的な解析のために、細胞およびその生産物の収率を向上させることができる。
（２）同様のＣＡＤ設計原理は、異なるサイズのＴＣＰＳ皿用に設計インサートを適合させるために、容易に大型化または小型化することができる。高分子インサートの大量生産はＣＮＣ製造、射出成型または他の類似の技術で達成することができる。高分子インサートは、高い有効刺激面積パーセンテージおよび使用の容易さから、一般の研究室における電気刺激の研究への適応に有用である。
（３）高分子インサートはさまざまな研究に適用可能である。再生医学については、ＥＦ刺激が同期的に収縮する心臓組織を誘発することが報告されている（非特許文献５２および５４−５７）。間葉系幹細胞から骨芽細胞の分化はＥＦ刺激の下で促進することが可能である（非特許文献５８）。円形の領域への均一なＥＦ刺激は脳切片全体または組織切片全体を刺激することにも有効である。
【００６８】
本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な修正及び変形を行えることは当業者には自明であろう。すなわち、本発明は添付の特許請求の範囲とその均等物の範囲内で生じるさまざまな修正及び変形を包含することが意図されている。特に、上述したいずれか２以上の実施形態及びその修正のいずれかの一部又は全体が結合されて本発明の範囲内でみなされることは明示的に熟慮される。
【図１Ａ】
2018526999.tif 000045
【図１Ｂ】
2018526999.tif 000046
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2018526999.tif 000049
【図３】
2018526999.tif 000050
【図４】
2018526999.tif 000051
【図５】
2018526999.tif 000052
【図６】
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【図７】
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【図８】
2018526999.tif 000055
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
2018526999.tif 000059
【図１１】
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【国際調査報告】
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