(57)【要約】いくつかの態様では、実施形態は、キメラ膜貫通タンパク質に関する組成物および方法に関する。キメラ膜貫通タンパク質は、阻害受容体の細胞外ドメインと、免疫応答を活性化し得る細胞内シグナリングドメインとを含み得る。本発明は、例えば、阻害受容体の細胞外ドメインと、免疫応答を活性化し得る細胞内シグナリングドメインであって、細胞内シグナリングタンパク質の一部を含む細胞内シグナリングドメインとを含む、キメラ膜貫通タンパク質を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
阻害受容体の細胞外ドメインと、
免疫応答を活性化し得る細胞内シグナリングドメインであって、細胞内シグナリングタンパク質の一部を含む細胞内シグナリングドメインとを含む、キメラ膜貫通タンパク質。
【請求項２】
配列番号１０の配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号１１の配列を含む、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号７および配列番号８の配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号９の配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記細胞内シグナリングドメインがキナーゼ活性を含む、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記細胞内シグナリングドメインがリン酸化部位を含む、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記阻害受容体の膜貫通ドメインまたは前記細胞内シグナリングタンパク質の膜貫通ドメインを含む、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記阻害受容体がヒト阻害受容体またはマウス阻害受容体である、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
天然のアゴニストの結合により、前記阻害受容体が免疫活性を減少させる、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
天然のアゴニストの結合により、前記阻害受容体が、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞生存、サイトカイン分泌または免疫細胞溶解活性を減少させ得る、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記阻害受容体がリンパ球阻害受容体である、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記阻害受容体が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３またはＴｉｍ−３である、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記阻害受容体がＰＤ−１である、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記細胞内シグナリングタンパク質がヒトタンパク質またはマウスタンパク質である、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記細胞内シグナリングタンパク質が免疫活性を増加させる、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記細胞内シグナリングタンパク質が、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞生存、サイトカイン分泌または免疫細胞溶解活性を増強し得る、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記細胞内シグナリングタンパク質が膜貫通タンパク質であるか、または前記細胞内シグナリングタンパク質が天然の膜貫通タンパク質に結合し得る、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記細胞内シグナリングタンパク質がリンパ球タンパク質である、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記細胞内シグナリングタンパク質がＣＤ３ζ、４−１ＢＢまたはＣＤ２８である、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記細胞内シグナリングタンパク質が４−１ＢＢである、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２２】
自殺ドメインをさらに含む、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記自殺ドメインがチミジンキナーゼ活性を有するか、または前記自殺ドメインがカスパーゼである、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記自殺ドメインがＨＳＶチミジンキナーゼのチミジンキナーゼドメインであるか、または前記自殺ドメインがカスパーゼ９の一部を含む、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ膜貫通タンパク質をコードする、核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含む、組換え細胞。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ膜貫通タンパク質を含む、組換え細胞。
【請求項２８】
リンパ球である、請求項２６または２７に記載の細胞。
【請求項２９】
Ｔ細胞である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３０】
腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３１】
骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３２】
前記ＭＩＬが低酸素ＭＩＬである、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
組換え細胞を作製するための方法であって、細胞に請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸分子をトランスフェクトまたは感染することを含む、方法。
【請求項３４】
前記細胞がＭＩＬである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞に前記キメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸分子をトランスフェクトまたは感染する前に、低酸素条件下で前記ＭＩＬをインキュベートすることをさらに含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記低酸素条件が約０．５％〜約５％の酸素ガスを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記低酸素条件が約１％〜約２％の酸素ガスを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記低酸素インキュベーションの後に、正常酸素圧条件下で前記細胞をインキュベートすることをさらに含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞と抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズとを接触させることをさらに含む、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
被験体における免疫応答を増加させるための方法であって、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の組換え細胞を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４１】
前記組換え細胞を作製することをさらに含み、前記組換え細胞の作製が、細胞に前記キメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトすることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験体から前記細胞を単離することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記被験体が新生物を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記新生物が白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記被験体がヒトである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
被験体における新生物を処置するための方法であって、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の組換え細胞を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４７】
前記組換え細胞を作製することをさらに含み、前記組換え細胞の作製が、細胞に前記キメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトすることを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験体から前記細胞を単離することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験体が新生物を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記新生物が多発性骨髄腫、白血病またはリンパ腫である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体がヒトである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞を前記被験体に投与する前に、
前記細胞と抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズとを接触させること；
低酸素条件下で前記細胞をインキュベートすること；および
正常酸素圧条件下で前記細胞をインキュベートすること
をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
低酸素条件下で前記細胞を約０．５〜約４日間インキュベートする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
正常酸素圧条件下で前記細胞を約０．５〜約４日間インキュベートする、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年６月２９日に出願された米国仮出願第６２／１８６，１０８号の優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
悪性腫瘍患者の大多数は、それらの疾患で死亡する。これらの患者を処置する１つのアプローチは、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）の発現を介して腫瘍細胞において発現される抗原をターゲティングするようにＴ細胞を遺伝子改変することである。ＣＡＲは、ヒト白血球抗原非依存的に細胞表面抗原を認識するように設計された抗原受容体である。ＣＤ１９ターゲティングアプローチの成功の他、ＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞を使用して他の悪性腫瘍を処置する試みは、限定的に成功している。
【０００３】
最近、ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ）およびＰＤ−１（ニボルマブ、ペンブロリズマブ）をターゲティングするチェックポイント阻害抗体は、転移性メラノーマ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）およびホジキンリンパ腫を含む様々な悪性腫瘍の処置においてかなりの活性を示した。これらのデータは、チェックポイント遮断がどのようにして、Ｔ細胞アネルギーを克服することによる有効な免疫療法の主な障害になるかを実証している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
いくつかの態様では、実施形態は、阻害受容体の細胞外ドメインと、免疫応答を活性化し得る細胞内シグナリングドメインとを含むキメラ膜貫通タンパク質に関する。細胞外ドメインは、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３またはＴｉｍ−３由来の細胞外ドメインであり得る。細胞内シグナリングドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内シグナリングドメインであり得る。いくつかの態様では、実施形態は、本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸に関する。
【０００５】
いくつかの態様では、実施形態は、本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸を含む細胞に関する。いくつかの態様では、実施形態は、本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質を含む細胞に関する。
【０００６】
いくつかの態様では、実施形態は、組換え細胞を作製するための方法であって、細胞に本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトすることを含む方法に関する。
【０００７】
いくつかの態様では、実施形態は、被験体における免疫応答を増加させるための方法であって、本明細書に記載される組換え細胞を前記被験体に投与することを含む方法に関する。いくつかの態様では、実施形態は、被験体における新生物を処置するための方法であって、本明細書に記載される組換え細胞を前記被験体に投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】図１は、ＣＤ８由来のリーダーペプチド（「ＣＤ８ａ  ＬＰ」）と、マウスＰＤ−１の細胞外ドメイン（「ＰＤ−１  ＥＣＤ」）と、マウス４−１ＢＢの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（それぞれ「４−１ＢＢ  ＴＭ」および「４−１ＢＢ  ＩＣＤ」）とを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド配列の逆相補体（配列番号２）も示されている。マウスリンパ球における発現のために、コドンを最適化した。
【図１−２】図１は、ＣＤ８由来のリーダーペプチド（「ＣＤ８ａ  ＬＰ」）と、マウスＰＤ−１の細胞外ドメイン（「ＰＤ−１  ＥＣＤ」）と、マウス４−１ＢＢの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（それぞれ「４−１ＢＢ  ＴＭ」および「４−１ＢＢ  ＩＣＤ」）とを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド配列の逆相補体（配列番号２）も示されている。マウスリンパ球における発現のために、コドンを最適化した。
【図１−３】図１は、ＣＤ８由来のリーダーペプチド（「ＣＤ８ａ  ＬＰ」）と、マウスＰＤ−１の細胞外ドメイン（「ＰＤ−１  ＥＣＤ」）と、マウス４−１ＢＢの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（それぞれ「４−１ＢＢ  ＴＭ」および「４−１ＢＢ  ＩＣＤ」）とを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド配列の逆相補体（配列番号２）も示されている。マウスリンパ球における発現のために、コドンを最適化した。
【図１−４】図１は、ＣＤ８由来のリーダーペプチド（「ＣＤ８ａ  ＬＰ」）と、マウスＰＤ−１の細胞外ドメイン（「ＰＤ−１  ＥＣＤ」）と、マウス４−１ＢＢの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（それぞれ「４−１ＢＢ  ＴＭ」および「４−１ＢＢ  ＩＣＤ」）とを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド配列の逆相補体（配列番号２）も示されている。マウスリンパ球における発現のために、コドンを最適化した。
【０００９】
【図２−１】図２は、ＣＤ８由来のリーダーペプチド（「ＣＤ８ａ  ＬＰ」）と、ヒトＰＤ−１の細胞外ドメイン（「ＰＤ−１  ＥＣＤ」）と、ヒト４−１ＢＢの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（それぞれ「４−１ＢＢ  ＴＭ」および「４−１ＢＢ  ＩＣＤ」）とを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。ヌクレオチド配列の逆相補体（配列番号４）も示されている。ヒトリンパ球における発現のために、コドンを最適化した。
【図２−２】図２は、ＣＤ８由来のリーダーペプチド（「ＣＤ８ａ  ＬＰ」）と、ヒトＰＤ−１の細胞外ドメイン（「ＰＤ−１  ＥＣＤ」）と、ヒト４−１ＢＢの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（それぞれ「４−１ＢＢ  ＴＭ」および「４−１ＢＢ  ＩＣＤ」）とを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。ヌクレオチド配列の逆相補体（配列番号４）も示されている。ヒトリンパ球における発現のために、コドンを最適化した。
【図２−３】図２は、ＣＤ８由来のリーダーペプチド（「ＣＤ８ａ  ＬＰ」）と、ヒトＰＤ−１の細胞外ドメイン（「ＰＤ−１  ＥＣＤ」）と、ヒト４−１ＢＢの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（それぞれ「４−１ＢＢ  ＴＭ」および「４−１ＢＢ  ＩＣＤ」）とを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。ヌクレオチド配列の逆相補体（配列番号４）も示されている。ヒトリンパ球における発現のために、コドンを最適化した。
【図２−４】図２は、ＣＤ８由来のリーダーペプチド（「ＣＤ８ａ  ＬＰ」）と、ヒトＰＤ−１の細胞外ドメイン（「ＰＤ−１  ＥＣＤ」）と、ヒト４−１ＢＢの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（それぞれ「４−１ＢＢ  ＴＭ」および「４−１ＢＢ  ＩＣＤ」）とを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。ヌクレオチド配列の逆相補体（配列番号４）も示されている。ヒトリンパ球における発現のために、コドンを最適化した。
【００１０】
【図３】図３は、以下の実施例２に記載されているトランスフェクションプロトコールを使用してｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子と、ＰＤ−１の細胞外ドメインを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸（配列番号１）とをトランスフェクトしたＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞に関するフローサイトメトリーの結果を示す。図３は、核酸が２９３Ｔ細胞において発現されることを示す。
【００１１】
【図４】図４は、以下の実施例１に記載されている形質導入プロトコールを使用してｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子と、ＰＤ−１の細胞外ドメインおよび４−１ＢＢの細胞内ドメインを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸（配列番号１）とを形質導入したＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞に関するフローサイトメトリーの結果を示す。６ウェルプレートの１ウェル中で、１．９ｍＬのウイルスを細胞に形質導入した。図４は、核酸が２９３Ｔ細胞において発現されることを示す。
【００１２】
【図５】図５は、以下の実施例１に記載されている形質導入プロトコールを使用してｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子と、ＰＤ−１の細胞外ドメインおよび４−１ＢＢの細胞内ドメインを含むキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸（配列番号１）とを形質導入したＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞に関するフローサイトメトリーの結果を示す。６ウェルプレートの１ウェル中で、０．３８ｍＬのウイルスを細胞に形質導入した。図５は、核酸が２９３Ｔ細胞において発現されることを示す。
【００１３】
【図６】パネルＡおよびパネルＢは、ＰＤ−１細胞外ドメインと、４−１ＢＢ膜貫通ドメインと、４−１ＢＢ細胞内ドメインとを有するキメラ受容体を含むＭＩＬが腫瘍特異性に悪影響を与えないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
ＣＡＲ療法は、これまでに大きな展望を示している。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）およびより最近では急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）をターゲティングするＣＤ１９  ＣＡＲは、顕著な成功を収めている。興味深いことに、他の抗原をターゲティングするＣＡＲは、同様の臨床応答を提供しなかった。このような抗原標的アプローチの１つの限界は、特定の表面受容体を発現する疾患のみに限定されるというそれらの治療適用性であり、単一の腫瘍抗原をターゲティングするという限界は、抗原喪失変異体では再発をもたらしている。
【００１５】
腫瘍免疫学における主な障害は、多くの細胞ベースのアプローチの固有の抗腫瘍効果を制限する腫瘍特異的寛容の誘導である。最近の研究では、チェックポイント阻害因子をターゲティングして、転移性メラノーマに対する抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１の承認をもたらすことによる有意な臨床効果が示されている。いくつかの態様では、実施形態は、チェックポイント阻害因子を発現し、細胞内ドメインを活性化する細胞外ドメインを含むキメラ受容体に関する。これは、寛容原性機構をハイジャックして活性化シグナルにするという利点を有する。このアプローチは、Ｔ細胞アネルギーが疾患の病因の主な側面であるすべての臨床状況であって、抗原特異性が内因性Ｔ細胞レパートリーによって提供されるすべての臨床状況において使用され得る。
【００１６】
いくつかの態様では、実施形態は、阻害受容体の細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナリングドメインとを含むキメラ膜貫通タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、免疫応答を活性化し得る。細胞内シグナリングドメインは、細胞内シグナリングタンパク質の一部を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、Ｔ細胞などの細胞の活性化を維持するために使用され得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、シグナルを細胞内シグナリングドメインに伝達し得る。例えば、細胞外ドメインは、天然の阻害受容体のアゴニストの結合により、シグナルを細胞内シグナリングドメインに伝達し得る。
【００１８】
シグナル伝達は、タンパク質のオリゴマー化を含み得る。オリゴマー化は、ホモオリゴマー化またはヘテロオリゴマー化を含み得る。オリゴマー化は、タンパク質のダイマー化（すなわち、第２のキメラ膜貫通タンパク質とのホモダイマー化または異なるタンパク質とのヘテロダイマー化）を含み得る。
【００１９】
シグナル伝達は、リン酸化を含み得る。例えば、細胞内シグナリングドメインは、キナーゼ活性および／またはリン酸化部位を含み得る。シグナル伝達は、自己リン酸化、例えば細胞内シグナリングドメインの自己リン酸化を含み得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、完全な膜タンパク質である。例えば、タンパク質は、１型膜タンパク質、２型膜タンパク質または複数回膜貫通タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、阻害受容体の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞内シグナリングタンパク質の膜貫通ドメインを含む。キメラ膜貫通タンパク質は、例えば、細胞膜を通過して細胞外ドメインを移行させるシグナルペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、
【化１】
2018520679.tif 000002
の配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通タンパク質は、ＣＤ８由来のシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８リーダーペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、
【化２】
2018520679.tif 000003
を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、阻害受容体の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、リガンド結合ドメイン、例えば阻害受容体のアゴニスト結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、リガンド結合に応じて膜を通過してシグナルを伝達するために十分な構造を含む。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、多価リガンドによって媒介されるオリゴマー化によってシグナルを伝達する阻害受容体の場合、単に存在するリガンド結合ドメインは、リガンド結合に応じて膜を通過してシグナルを伝達するために十分な構造であり得る。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、細胞膜に対する膜貫通ドメインの方向を変化させることによってシグナルを伝達する阻害受容体の場合、細胞外ドメインは、リガンド結合に応じて膜を通過してシグナルを伝達するために、リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の天然の構造を必要とし得る。例えば、細胞外ドメインは、そのリガンド結合ドメインからその膜貫通ドメインまでの阻害受容体の天然の配列を含み得る。
【００２２】
天然の阻害受容体は、ヒト阻害受容体またはマウス阻害受容体であり得る。したがって、細胞外ドメインは、ヒトアミノ酸配列またはマウスアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、天然の阻害受容体の起源は、例えば、キメラ膜貫通タンパク質に対する免疫応答を回避するために、処置される被験体の種に一致するように選択される。それにもかかわらず、天然の阻害受容体は、例えば便宜上異なる種から選択され得る。したがって、キメラタンパク質は、タンパク質が発現される細胞の種またはタンパク質が投与される被検体のいずれかにとって異種由来のものでもよいし、または異種由来のものではなくてもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態では、天然の阻害受容体は、天然のアゴニストの結合により免疫活性を減少させるタンパク質から選択される。例えば、天然の阻害受容体は、天然のアゴニストの結合により、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞生存、サイトカイン分泌または免疫細胞溶解活性を減少させ得る。天然の阻害受容体は、リンパ球阻害受容体であり得る（すなわち、阻害受容体は、Ｔ細胞などのリンパ球において発現され得る）。例えば、天然の阻害受容体はＴ細胞において発現され得、天然の阻害受容体に対するアゴニストの結合は、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞生存、サイトカイン分泌または免疫細胞溶解活性に不利な細胞シグナリングを引き起こし得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、天然の阻害受容体は、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質；ＣＤ１５２）、ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１；ＣＤ２７９）、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３；ＣＤ２２３）またはＴｉｍ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３）であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３またはＴｉｍ−３由来の細胞外ドメインであり得る。阻害受容体は、ＰＤ−１であり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通タンパク質は、ＰＤ−１の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインの配列は、
【化３】
2018520679.tif 000004
を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、細胞内シグナリングタンパク質のシグナリングドメインである。いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、キナーゼ活性またはリン酸化部位を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、例えば細胞膜を通過するシグナル伝達後に、キナーゼまたはホスホリラーゼなどのシグナリング分子を活性化し得る。細胞内シグナリングドメインは、下流のキナーゼまたはホスホリラーゼを介してシグナリングし得る。
【００２６】
細胞内シグナリングタンパク質は、ヒトタンパク質またはマウスタンパク質であり得る。したがって、細胞内シグナリングドメインは、ヒトアミノ酸配列またはマウスアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングタンパク質は、例えば、シグナリングドメインが細胞の細胞質機構を利用して下流のシグナリング分子を活性化し得るように、処置に使用される被験体および細胞の種に一致するように選択される。それにもかかわらず、細胞内シグナリングタンパク質は、例えば、上記のように便宜上異なる種から選択され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングタンパク質は、免疫活性を増加させる。したがって、キメラ膜貫通タンパク質を介したシグナル伝達は、細胞内シグナリングドメインが細胞内シグナリングカスケードを媒介する免疫活性を増加させるシグナルカスケードをもたらし得る。いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングタンパク質は、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞生存、サイトカイン分泌または免疫細胞溶解活性を増強し得る。いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングタンパク質は膜貫通タンパク質であるか、または細胞内シグナリングタンパク質は天然の膜貫通タンパク質に結合し得る。細胞内シグナリングタンパク質は、リンパ球タンパク質であり得る（すなわち、細胞内シグナリングタンパク質は、Ｔ細胞などのリンパ球において発現され得る）。
【００２８】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングタンパク質は、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ζ鎖；ＣＤ２４７）、４−１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９；ＣＤ１３７）またはＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８；Ｔｐ４４）である。したがって、細胞内シグナリングタンパク質は、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢ、またはＣＤ２８のシグナリングドメインを含み得る。細胞内シグナリングタンパク質は、４−１ＢＢであり得る。したがって、細胞内シグナリングタンパク質は、４−１ＢＢ由来のシグナリングドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、
【化４】
2018520679.tif 000005
を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通タンパク質は、自殺ドメインを含む（すなわち、前記タンパク質を含む組換え細胞を殺傷する）。自殺ドメインは、チミジンキナーゼ活性またはカスパーゼ活性を含み得る。例えば、自殺ドメインは、チミジンキナーゼまたはカスパーゼであり得る。いくつかの実施形態では、自殺ドメインは、ＨＳＶチミジンキナーゼのチミジンキナーゼドメイン（「ＨＳＶ−ＴＫ」）であるか、または自殺ドメインは、カスパーゼ９の一部を含む。
【００３０】
いくつかの態様では、実施形態は、本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸分子に関する。核酸分子は、例えば、組換え細胞におけるキメラ膜貫通タンパク質の発現のために、キメラ膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
【００３１】
核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に記載されている配列を含み得る。核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に記載されている配列における連続する少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００または７００ヌクレオチドを含み得る。核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に記載されているヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に記載されているヌクレオチド配列における連続する少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００または７００ヌクレオチドと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。例えば、核酸分子は、配列番号３に記載されているヌクレオチド配列における連続する少なくとも１００ヌクレオチドと少なくとも９５％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、本明細書および／または図面に記載されているアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に記載されているアミノ酸配列の１つまたはそれより多くを含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、本明細書および／または図面に記載されているヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。タンパク質の文脈では、相同性は、同一性または類似性であり得る。核酸分子の文脈では、配列相同性は、配列同一性を指し得る。相同性は、デフォルト設定を使用したルーチンツール、例えばＥｘｐａｓｙ、ＢＬＡＳＴｐ、Ｃｌｕｓｔａｌなどを用いることによって使用され得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通タンパク質は、以下の表に記載されている１つまたはそれを超えるアミノ酸配列を含む：
【表１】
2018520679.tif 000006
【００３４】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通タンパク質は、本明細書に記載されるアミノ酸配列の１つと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本明細書に記載されるアミノ酸配列の変異体は、様々な実施形態に含められ得る。「変異体」という用語は、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と比較して１つまたはそれを超える（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなどの）アミノ酸置換、欠失および／または挿入が存在するタンパク質またはポリペプチドを指し、この用語は、タンパク質またはポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体および選択的スプライス変異体を含む。「変異体」という用語は、アミノ酸配列における１つまたはそれを超えるアミノ酸を類似もしくは相同アミノ酸または非類似アミノ酸で置き換えることを含む。いくつかの変異体は、アミノ酸配列における１つまたはそれを超えるアミノ酸位置におけるアラニン置換を含む。他の置換としては、タンパク質の総正味電荷、極性または疎水性にほとんどまたは全く影響を及ぼさない保存的置換が挙げられる。保存的置換は、キメラ膜貫通タンパク質の機能にわずかな影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、リンパ球、例えば実施例３に記載されている骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）において発現される場合、機能は、タンパク質の特異性であり得る。当業者は、実施例３と同一または類似のプロトコールを使用して、本明細書で提供される配列と比較することによって、置換がキメラ膜貫通タンパク質の機能に影響を与えるかを決定し得る。非限定的で例示的な保存的置換は、以下の表に記載されている。いくつかの実施形態によれば、キメラ膜貫通タンパク質は、本明細書に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【表２】
2018520679.tif 000007
【００３６】
以下の表は、保存的アミノ酸置換の別のスキームを示す。
【表３】
2018520679.tif 000008
【００３７】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個は、保存的置換で改変される。いくつかの実施形態では、１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸残基のみが、保存的置換で置換される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通タンパク質は、配列番号１０もしくは配列番号１１の配列またはその変異体を含む。配列番号１０は、配列番号５、７および８の組み合わせである。配列番号１１は、配列番号５、６、７および８の組み合わせである。いくつかの実施形態では、配列番号６の配列は、細胞外膜へのキメラ膜貫通タンパク質の輸送を支援し得る別のシグナルペプチドまたはリーダー配列で置き換えられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン、例えば配列番号５は、異なる膜貫通タンパク質で置き換えられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤ−１の膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、４−１ＢＢの膜貫通ドメインである。
【００３９】
いくつかの態様では、実施形態は、本明細書に開示される核酸を含む組換え細胞に関する。いくつかの実施形態では、実施形態は、本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質を含む組換え細胞に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号５、６、７、８、９、１０もしくは１１のタンパク質またはその変異体を含むキメラタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球である。細胞は、Ｔ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）または骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）であり得る。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質を含む細胞は、被験体に投与された場合、キメラ膜貫通タンパク質を含まない細胞と比較して、被験体において長く存続し、および／または活性状態を長く保持する。
【００４１】
いくつかの態様では、実施形態は、組換え細胞を作製するための方法であって、細胞に本明細書に記載される核酸分子をトランスフェクトすることを含む方法に関する。いくつかの態様では、実施形態は、組換え細胞を作製するための方法であって、細胞に本明細書に記載されるアミノ酸配列をコードする核酸分子をトランスフェクトすることを含む方法に関する。核酸分子は、プラスミドであり得る。細胞は、１つまたはそれを超える本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含むプラスミドによってトランスフェクトされ得る。細胞はまた、核酸分子を含むウイルスまたはウイルス様粒子で感染され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＩＬまたはＭＩＬである。いくつかの実施形態では、ＭＩＬは、活性化ＭＩＬである。ＭＩＬは、例えば低酸素条件下で、例えばそれらを抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズおよび適切なサイトカインと共にインキュベートすることによって活性化され得る。低酸素条件下におけるＭＩＬの成長の例は、例えば、国際公開第２０１６０３７０５４号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見られ得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載される低酸素環境下で細胞をインキュベートした後に、細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、低酸素環境下で細胞を約１日間、２日間、３日間、４日間または５日間インキュベートした後に、細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、次いで、細胞は、正常酸素圧（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）条件下で約１日間、２日間、３日間、４日間または５日間インキュベートされる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通タンパク質を含むＭＩＬは、国際公開第２０１６０３７０５４号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法にしたがって調製される。いくつかの実施形態では、前記方法は、被験体由来の骨髄、リンパ球および／または骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）中の細胞を摘出すること；低酸素環境下で前記細胞をインキュベートし、それにより、活性化ＭＩＬを生産すること；ならびに前記活性化ＭＩＬを被験体に投与することを含み得る。細胞はまた、本明細書に記載される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体およびサイトカインの存在下で活性化され得る。キメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸分子（例えば、本明細書に記載されるものの１つ）は、低酸素環境下でＭＩＬをインキュベートする前または後に、細胞にトランスフェクトまたは感染され得る。
【００４３】
低酸素環境は、約２１％未満の酸素、例えば約２０％未満、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％または約３％未満の酸素を含み得る。例えば、低酸素環境は、約０％の酸素〜約２０％の酸素、例えば約０％の酸素〜約１９％の酸素、約０％の酸素〜約１８％の酸素、約０％の酸素〜約１７％の酸素、約０％の酸素〜約１６％の酸素、約０％の酸素〜約１５％の酸素、約０％の酸素〜約１４％の酸素、約０％の酸素〜約１３％の酸素、約０％の酸素〜約１２％の酸素、約０％の酸素〜約１１％の酸素、約０％の酸素〜約１０％の酸素、約０％の酸素〜約９％の酸素、約０％の酸素〜約８％の酸素、約０％の酸素〜約７％の酸素、約０％の酸素〜約６％の酸素、約０％の酸素〜約５％の酸素、約０％の酸素〜約４％の酸素または約０％の酸素〜約３％の酸素を含み得る。いくつかの実施形態では、低酸素環境は、約１％〜約７％の酸素を含む。いくつかの実施形態では、低酸素環境は、約１％〜約２％の酸素である。いくつかの実施形態では、低酸素環境は、約０．５％〜約１．５％の酸素である。いくつかの実施形態では、低酸素環境は、約０．５％〜約２％の酸素である。低酸素環境は、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または約０％の酸素を含み得る。いくつかの実施形態では、低酸素環境は、約７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の酸素を含む。
【００４４】
低酸素環境下におけるＭＩＬのインキュベートは、例えば、組織培養培地中でＭＩＬを少なくとも約１時間、例えば少なくとも約１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、６０時間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間またはさらに少なくとも約１４日間インキュベートすることを含み得る。インキュベートは、ＭＩＬを約１時間〜約３０日間、例えば約１日間〜約２０日間、約１日間〜約１４日間または約１日間〜約１２日間インキュベートすることを含み得る。いくつかの実施形態では、低酸素環境下におけるＭＩＬのインキュベートは、低酸素環境下でＭＩＬを約２日間〜約５日間インキュベートすることを含む。前記方法は、低酸素環境下でＭＩＬを約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間または１４日間インキュベートすることを含み得る。いくつかの実施形態では、前記方法は、低酸素環境下でＭＩＬを約３日間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、低酸素環境下でＭＩＬを約２日間〜約４日間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、低酸素環境下でＭＩＬを約３日〜約４日間インキュベートすることを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、前記方法は、例えば、低酸素環境下でＭＩＬをインキュベートした後に、正常酸素圧環境下でＭＩＬをインキュベートすることをさらに含む。
【００４６】
正常酸素圧環境は、少なくとも約２１％の酸素を含み得る。正常酸素圧環境は、約５％の酸素〜約３０％の酸素、例えば約１０％の酸素〜約３０％の酸素、約１５％の酸素〜約２５％の酸素、約１８％の酸素〜約２４％の酸素、約１９％の酸素〜約２３％の酸素または約２０％の酸素〜約２２％の酸素を含み得る。いくつかの実施形態では、正常酸素圧環境は、約２１％の酸素を含む。
【００４７】
正常酸素圧環境下におけるＭＩＬのインキュベートは、例えば、組織培養培地中でＭＩＬを少なくとも約１時間、例えば少なくとも約１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、６０時間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間またはさらに少なくとも約１４日間インキュベートすることを含み得る。インキュベートは、ＭＩＬを約１時間〜約３０日間、例えば約１日間〜約２０日間、約１日間〜約１４日間、約１日間〜約１２日間または約２日間〜約１２日間インキュベートすることを含み得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、細胞は、正常酸素圧環境下に置かれた後に、または正常酸素圧環境に置かれる前に、本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸分子をトランスフェクトまたは感染される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＭＩＬは、被験体から骨髄サンプルを抽出し、本明細書に記載されるように細胞を培養／インキュベートすることによって得られる。いくつかの実施形態では、骨髄サンプルは、赤血球を除去するために遠心分離される。いくつかの実施形態では、骨髄サンプルは、アフェレーシスに供されない。いくつかの実施形態では、骨髄サンプルは、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を含まないか、または骨髄サンプルは、ＰＢＬを実質的に含まない。これらの方法は、ＴＩＬとして公知のものと同じものではない細胞を選択する。したがって、ＭＩＬはＴＩＬではない。ＴＩＬは、当業者に公知の方法によって選択され得、ＴＩＬが本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質を発現し得るように、本明細書に記載される核酸分子をトランスフェクトまたは感染され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、細胞はまた、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体と共に培養することによって活性化される。これは、例えば、市販されているかまたは当業者によって作製され得る抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと共に細胞をインキュベートすることによって実施され得る。次いで、細胞は、プレート、フラスコまたはバッグにプレーティングされ得る。低酸素条件は、９５％窒素および５％ＣＯ２ガス混合物で低酸素チャンバーまたは細胞培養バッグのいずれかを３分間フラッシュすることによって達成され得る。これは、例えば、容器内のＯ２ガスを１〜２％またはそれ未満にし得る。次いで、細胞は、本明細書または国際公開第２０１６０３７０５４号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）の例に記載されているように培養され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質を含む低酸素ＭＩＬが提供される。いくつかの実施形態では、低酸素ＭＩＬは、約０．５％〜約５％の酸素ガスの環境下にある。いくつかの実施形態では、低酸素ＭＩＬは、約１％〜約２％の酸素ガスの環境下にある。いくつかの実施形態では、低酸素ＭＩＬは、約１％〜約３％の酸素ガスの環境下にある。いくつかの実施形態では、低酸素ＭＩＬは、約１％〜約４％の酸素ガスの環境下にある。低酸素ＭＩＬは、低酸素環境（例えば、本明細書に記載される環境）下で一定期間（例えば、本明細書に記載される期間）インキュベートされたＭＩＬである。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、低酸素ＭＩＬは、ＭＩＬの抗腫瘍能力に影響を与えるタンパク質および／または遺伝子発現の変化を受ける。本明細書に記載されるように、低酸素ＭＩＬはまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズまたは他の類似の活性化試薬の存在下で活性化され得る。したがって、低酸素ＭＩＬはまた、活性化低酸素ＭＩＬであり得る。
【００５２】
いくつかの態様では、実施形態は、被験体における免疫応答を増加させるための方法であって、本明細書に記載される組換え細胞を前記被験体に投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、実施形態は、被験体における新生物を処置するための方法であって、本明細書に記載される組換え細胞を前記被験体に投与することを含む方法に関する。新生物は、良性新生物、悪性新生物または二次新生物であり得る。新生物は、癌であり得る。新生物は、リンパ腫または白血病、例えば慢性リンパ球性白血病（「ＣＬＬ」）または急性リンパ芽球性白血病（「ＡＬＬ」）であり得る。新生物は、多発性骨髄腫および任意の固形腫瘍（例えば、乳癌、前立腺癌、肺癌、食道癌、脳癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、骨肉腫など）であり得る。
【００５３】
前記方法は、複数の本明細書に記載される組換え細胞を被験体に投与することを含み得る。前記方法は、有効量の本明細書に記載される組換え細胞を被験体に投与することを含み得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、細胞は、被験体から得られる。トランスフェクトまたは感染される細胞は、被験体から得られ得る。細胞は、本明細書に記載されるように得られ得る。例えば、投与される細胞は、被験体にとって自己であり得る。いくつかの実施形態では、投与される細胞は、被験体にとって同種である。細胞は、被験体から得られ、本明細書に記載されるキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトまたは感染され得る。細胞は、娘細胞の親が被験体から得られた娘細胞であり得る。組換え細胞は、核酸をトランスフェクトもしくは感染されたものであり得るか、または組換え細胞の親は、核酸をトランスフェクトもしくは感染されたものであり得る。いくつかの実施形態では、トランスフェクトまたは感染された後の細胞は、本明細書に記載されるアミノ配列の１つまたはそれよりも多くを含むタンパク質を発現する。
【００５５】
前記方法は、組換え細胞を作製することをさらに含み得、組換え細胞の作製は、細胞に本明細書に記載されるものなどのキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトまたは感染することを含む。いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通タンパク質は、配列番号５、６、７、８、９、１０もしくは１１のいずれか１つに記載されているアミノ酸配列またはその変異体を含む。同様に、前記方法は、複数の組換え細胞を作製することをさらに含み得、複数の組換え細胞の作製は、複数の細胞に本明細書に記載されるものなどのキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトまたは感染することを含む。前記方法は、親細胞をエクスパンションすることをさらに含み得る（例えば、組換え細胞は、親細胞の娘細胞であり得る）。前記方法は、細胞の集団をエクスパンションすることを含み得る（例えば、前記方法は、複数の本明細書に記載される組換え細胞を被験体に投与することを含み得、複数の組換え細胞の各細胞は、親細胞の娘細胞であり得る）。
【００５６】
前記方法は、被験体から細胞または親細胞を単離することをさらに含み得る。
【００５７】
前記方法は、例えば、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）または磁気活性化細胞選別（「ＭＡＣＳ」）によって、細胞を選別することをさらに含み得る。
【００５８】
細胞は、例えば、薬学的に許容され得る組成物で、任意の適切な経路によって被験体に投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、パイロジェンフリーである。例えば、細胞の投与は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して行われ得る。例えば、投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、脳室内、嚢内、髄腔内、嚢内、腹腔内、脳室内または髄腔内であり得る。非経口投与の場合、細胞は、静脈内注射、皮下注射または筋肉内注射のいずれかによって、薬学的に許容され得るビヒクルまたは担体を含む組成物で投与され得る。細胞は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルの懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとり得、製剤化剤、例えば懸濁剤、安定剤および／または分散剤を含有し得る。
【００５９】
注射による投与の場合、緩衝剤または保存剤などの他の溶質と、溶液を等張性にするための十分な量の薬学的に許容され得る塩またはグルコースとをさらに含有し得る滅菌水性ビヒクルの細胞溶液を使用することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体と共に製剤化され得、注射投与用の滅菌溶液または懸濁液を提供する。特に、注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液として、またはエマルジョンとして従来の形態で調製され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩などである。加えて、所望により、注射用医薬組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤、ｐＨ緩衝剤などを含有し得る。適切な医薬担体は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。
【００６０】
被験体は、免疫細胞を含む任意の生物であり得る。例えば、被験体は、齧歯類、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマおよび霊長類から選択され得る。被験体は、マウスまたはヒトであり得る。
【００６１】
被験体は、新生物を有し得る。新生物は、良性新生物、悪性新生物または二次新生物であり得る。新生物は、癌であり得る。新生物は、リンパ腫または白血病、例えば慢性リンパ球性白血病（「ＣＬＬ」）または急性リンパ芽球性白血病（「ＡＬＬ」）であり得る。被験体は、神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、乳癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、カポジ肉腫、急性骨髄性白血病およびＢ系統悪性腫瘍を有し得る。被験体は、多発性骨髄腫を有し得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、被験体は、「それを必要とする」被験体である。本明細書で使用される場合、「それを必要とする」という語句は、被験体が、特定の方法または処置の必要性を有すると特定されているかまたは疑われていることを意味する。いくつかの実施形態では、特定は、任意の診断手段によって行われ得る。本明細書に記載される方法および処置ではいずれも、被験体は、それを必要とするものであり得る。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの用語は、文脈上特に明確な要求がない限り、単数形および複数形の指示対象を含む。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびそれらの活用形は、本明細書で使用される場合、「限定されないが、・・・を含む」を意味する。様々な構成要素または工程を「含む」（「限定されないが、・・・を含む」の意味として解釈される）という意味において、様々な組成物および方法が記載されるが、組成物、方法およびデバイスはまた、様々な構成要素および工程「から本質的になり」得るか、または様々な構成要素および工程「からなり」得、このような専門用語は、本質的に限定された要素群を定義するものとして解釈されるべきである。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置された」または「処置すること」という用語は、対象が望ましくない生理学的症状、障害もしくは疾患を減速させる（低減する）か、または有益なもしくは所望の臨床結果を得る両方の治療処置を意味する。本明細書に記載される実施形態の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されないが、症候の緩和；症状、障害もしくは疾患の程度の縮小；症状、障害もしくは疾患の状態の安定化（すなわち、非悪化）；症状、障害もしくは疾患の発症の遅延もしくはその進行の減速；検出可能または検出不可能にかかわらず、症状、障害もしくは疾患の状態の向上もしくはその（部分的または完全にかかわらず）寛解；患者によって必ずしも認識されない少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの向上；または症状、障害もしくは疾患の増強もしくは改善が挙げられる。したがって、「癌の処置」または「癌を処置すること」は、癌または本明細書に記載される他の症状に関連する一次現象または二次症候のいずれかを緩和または向上する行為を意味する。いくつかの実施形態では、処置される癌は、本明細書に列挙される癌の１つである。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例は、本明細書に記載される方法および組成物の例示であり、限定するものではない。治療において通常直面する様々な条件およびパラメータに関する他の適切な改変および適合であって、当業者に明らかな改変および適合は、実施形態の思想および範囲内である。
【００６７】
実施例１：ＣＡＲ形質導入プロトコール
形質導入の１６〜２４時間前に、Ｔ細胞を適切な培地にプレーティングし、ＣＤ３、ＣＤ２８およびＩＬ−２で刺激した。次いで、細胞をインキュベーター（３７℃／５％ＣＯ２）に一晩入れた。１６〜２４時間後、細胞を損なわずに、可能な限り多くの培地を除去した。次いで、ＣＡＲウイルスを細胞に追加し、インキュベーターに４〜１２時間戻した。４〜１２時間後、ＩＬ−２を含有する適切な体積の培地を細胞に戻し、次いで、インキュベーターに戻した。細胞をインキュベーター内で放置し、必要な場合には培地を分割および交換して、３〜１２日間成長させた。限定されないが、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、または蛍光レポーター遺伝子を使用した場合には蛍光顕微鏡法を含む様々な方法によって、ＣＡＲ形質導入をチェックし得る。
【００６８】
実施例２：ＣＡＲトランスフェクションプロトコール
ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、８０％コンフルエントを決して超えない細胞密度で、２９３Ｔ細胞を２日毎に少なくとも３継代にわたって継代した。トランスフェクションの１日前に、２４時間後（トランスフェクションの日）に約８０％コンフルエントになる密度で、２９３Ｔ細胞を播種した。トランスフェクションの日に培地を除去し、十分な新鮮培地を追加して細胞をカバーした。別のチューブにおいて、ＶＳＶ−Ｇ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ＆Ｒｅｖプラスミド、トランスフェクション試薬およびＣＡＲプラスミドを混ぜ合わせ、室温で１０〜２０分間インキュベートした。次いで、この混合物を２９３Ｔ細胞に滴下し、一晩インキュベートした。トランスフェクションの１２〜２４時間後、培地を完全に交換し、またはさらなる新鮮培地を追加した。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後の両方に、細胞由来のウイルス含有培地を収集し、新鮮培地を細胞に補充した。収集した培地中の細胞を、遠心分離またはろ過によって除去した。次いで、収集した培地を超遠心分離でスピンして、ウイルスをペレット化した。過剰な培地を除去し、ウイルスをＤＭＥＭまたはＨＢＳＳに再懸濁し、滅菌チューブに等分し、使用まで−８０℃で保存した。
【００６９】
実施例３：ＭＩＬの機能および成長は、キメラ受容体タンパク質の存在によって悪影響を受けない。
被験体から得たＭＩＬを、本明細書に記載されるように活性化およびエクスパンションした。簡潔に言えば、被験体から骨髄サンプルを得た後、国際公開第２０１６０３７０５４号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、低酸素条件下、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズおよびサイトカインの存在下で、細胞をインキュベートした。次いで、配列番号１１を含むキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸分子を含むウイルスをＭＩＬに感染させた。次いで、正常酸素圧条件下で細胞を成長させ、エクスパンションした。対照ＭＩＬおよび感染ＭＩＬを異なる細胞型と接触させた。ＭＩＬのエクスパンションおよびＭＩＬの抗原認識能力は、キメラ膜貫通タンパク質の存在によって悪影響を受けなかった。これらの結果は、ＭＩＬへのキメラ膜貫通タンパク質の添加が、その機能および成長に有害ではないことを実証している。結果は、２人の異なる患者からの図６パネルＡおよびＢに示されている。
【００７０】
要約すると、本明細書で提供される実施形態および実施例は、キメラ膜貫通タンパク質を発現する細胞を有効に使用して癌を処置し、および／または免疫応答を調節し得ることを示している。
【００７１】
本明細書で言及され、および／または出願書類に列挙されている米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献（ＣＡＳ番号を含む）はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月2日(2018.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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