(57)【要約】  ナノ粒子はポリマーコアと高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）成分とを含み、ＨＤＬ成分のポリマーコアに対する重量比は約１：９〜約９：１の範囲であり、例えば約７５：２５以下または約７：３以下である。このナノ粒子はミトコンドリアターゲティング部分も含むことができる。このナノ粒子を使用して、アテローム性動脈硬化症を処置するもしくは予防することができる、または脂質恒常性を維持することができる。【選択図】図１
2018500327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーコアと、
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）成分であって、前記ＨＤＬ成分の、前記コアを形成する１種または複数種のポリマーに対する重量比が約１：９〜約９：１の範囲である、ＨＤＬ成分と、
前記コアに付着しているミトコンドリアターゲティング部分と
を含むナノ粒子。
【請求項２】
前記ＨＤＬ成分の、前記コアを形成する１種または複数種のポリマーに対する重量比が約７５：２５以下の範囲である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ＨＤＬ成分の、前記コアを形成する１種または複数種のポリマーに対する重量比が約７：３以下の範囲である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記ＨＤＬ成分の、前記コアを形成する１種または複数種のポリマーに対する重量比が約１：４〜約３：２の範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記ＨＤＬ成分の、前記コアを形成する１種または複数種のポリマーに対する重量比が約２：３である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記コアは少なくとも一部がポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）で形成されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記コアがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）から本質的になる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ＨＤＬ成分がコレステロール部分を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ＨＤＬ成分がオレイン酸コレステロールを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
アポＡ−Ｉ模倣ポリペプチドを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記アポＡ−Ｉ模倣ポリペプチドがＬ−４Ｆポリペプチドを含む、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記アポＡ−Ｉ模倣ポリペプチドがＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記コアに付着しているリン脂質単分子層を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記リン脂質単分子層層は、少なくとも一部がジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）部分もしくはこの誘導体またはカルジオリピンを含む化合物から形成されている、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記ミトコンドリアマトリックスターゲティング部分が、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）部分、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドおよびローダミンカチオンからなる群から選択される部分を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記ミトコンドリアマトリックスターゲティング部分がトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）部分またはこの誘導体を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
脂質恒常性の維持を必要とする対象の脂質恒常性を維持する方法であって、
有効量の請求項１〜１６のいずれか一項に記載のナノ粒子を前記対象に投与すること
を含む方法。
【請求項１８】
脂質恒常性の維持を必要とする対象の脂質恒常性を維持するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載のナノ粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援に関する陳述
本発明を、合衆国政府のＮＩＨのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから受けた認可番号Ｒ５６ＨＬ１２１３９２での政府支援で行なった。合衆国政府は本発明で一定の権利を有する。
【０００２】
更なる支援に関する陳述
本明細書に示す研究は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  Ａｗａｒｄ  １４ＳＤＧ１８６９０００９からも支援された。
【０００３】
関連出願
本出願は、２０１４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／０９５，５９９号明細書および２０１５年１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０９９，９９６号明細書の利益を主張し、これらの仮特許出願は、本明細書に示す開示と矛盾しない限り、それぞれの全体が参照により本明細書に援用される。
【０００４】
分野
本開示は、治療用ナノ粒子（具体的にはコレステロール模倣ナノ粒子）と、この治療用ナノ粒子の使用方法とに関する。
【背景技術】
【０００５】
アテローム性動脈硬化症は西側世界での最も一般的な死因の一つである。細胞レベルでは、泡沫細胞に到るマクロファージ中でのコレステロール恒常性の機能不全が、動脈の内膜層内のアテローム性プラーク形成の一因となる。コレステロールおよびコレステリルエステル（ＣＥ）が高レベルで積載されているマクロファージ由来泡沫細胞は、プラークの安定性および増悪に直接影響を及ぼす。細胞コレステロール流出による泡沫細胞からのコレステロール除去の程度は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体、アポリポタンパク質（例えばアポＡ−Ｉ、アポＥ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）により操作される、組織化された経路（ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ）である。ＡＢＣ輸送体、アポＡ−ＩおよびＨＤＬによる細胞外コレステロール流出がよく研究されている。
【０００６】
しかしながら、泡沫細胞からのコレステロールの効率的な除去は細胞内脂質輸送に依存しており、よく理解されていない。細胞内コレステロール輸送は細胞小器官（例えばミトコンドリア、脂質ラフトおよび膜）中のステロール含有量を調節し、サイトゾルＣＥ液滴の形成に影響を及ぼす。疎水性脂質結合ポケットを有するステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）関連脂質輸送（ＳＴＡＲＴ）ドメインは、細胞コレステロール恒常性の維持に関与する。そのため、細胞外のおよび細胞内のコレステロールの相対的な寄与は、泡沫細胞からの脂質の除去で重要な役割を果たす。しかしながら、これらの事象はよく理解されていない。コレステロールは、ステロイド産生組織中でのステロイドホルモン産生に必須の前駆体として機能する。起源の組織または産生されるステロイドホルモンにかかわらず、コレステロール側鎖の切断によってステロイド産生が開始されてプレグネノロンが産生される。この反応を触媒するタンパク質Ｐ−４５０側鎖切断酵素（Ｐ４５０ｓｃｃ）は、ミトコンドリアマトリックスに面するミトコンドリア内膜（ＩＭＭ）中に位置する。この酵素活性は、このプロセスにおける律速ではなく、代わりに、ミトコンドリアターゲティングシグナルを有するサイトゾルタンパク質であるＳｔＡＲによるコレステロールのミトコンドリアへの送達が律速である。
【０００７】
細胞がコレステロールの大量の異常流出に曝されるアテローム性動脈硬化症の状況下では、ＳｔＡＲタンパク質の効率が低下する。ミトコンドリア外膜（ＯＭＭ）がＩＭＭと比べて多くのコレステロールを含むことから、ミトコンドリアマトリックスに含まれるコレステロールはより少ない。ＳｔＡＲによるコレステロールのＩＭＭへの送達およびＰ４５０ｓｃｃの活性により、ミトコンドリア内でコレステロールからプレグネノロンが生成される。そのため、ＳｔＡＲは、コレステロールをミトコンドリアステロール２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）へと輸送し、転写因子の核内受容体ファミリのメンバーである肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）のオキシステロールリガンドを生成し、マクロファージの脂質量および炎症反応を低下させる。
【０００８】
ＨＤＬと冠動脈心疾患（ＣＨＤ）のリスクとの逆相関は、ＨＤＬレベルを上昇させる能力を有する治療が肯定的な結果につながる可能性があることを示唆する。ＨＤＬはアテローム保護（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）特性を有しており、主な活動として、泡沫細胞からコレステロールを除去することによるおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化を阻害することによる、細胞外コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）経路での直接的な役割が挙げられ、炎症プロセスを制限することにより抗血栓特性を示す。泡沫細胞からのコレステロール流出を促進するアポＥに加えて、ＨＤＬを含むアポＡ−Ｉにより、病変からのコレステロールの輸送が容易になると考えられる。そのため、合成された生分解性のミトコンドリア標的型ＨＤＬ模倣ナノ粒子（ＮＰ）は、過剰なコレステロールの管理ならびに細胞外脂質恒常性および細胞内脂質恒常性の両方の維持に利益をもたらす可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ナノテクノロジーの商業化が拡大し続けるにつれて、粒子製造方法を実験室から工業規模へと変える能力がますます重要となっている。従って、完全に合成された、スケーラブルな、生分解可能なおよびミトコンドリア標的型のＨＤＬ模倣ＮＰの開発により、ＣＨＤ用の独特な治療戦略を提供することができる。このＨＤＬ模倣ＮＰは、ミトコンドリアを標的とすることにより細胞内コレステロール代謝経路で働くプラークマクロファージ中でＨＤＬ模倣物を局所的に蓄積させることにより、プラーク炎症を直接低減する能力を有することができ、ＨＤＬ抗酸化特性を利用することによりミトコンドリアＲＯＳを更に減少させることができる。ミトコンドリア標的型ＨＤＬ模倣ＮＰは、過剰なコレステロールをサイトゾルからミトコンドリアへと輸送して、細胞外のおよび細胞内の脂質恒常性の維持で重要な役割を果たすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書で説明する様々な実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーコアと、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）成分であって、ＨＤＬ成分のポリマーコアに対する重量比が約１：９〜約９：１の範囲である、ＨＤＬ成分とを含む。好ましくは、ＨＤＬ成分のポリマーコアに対する重量比は約７５：２５以下であり、例えば約７：３以下である。即ち、ＨＤＬ成分は、このＨＤＬ成分とポリマーコアとの合計重量の約７５％以下を構成し、例えば約７０％以下を構成する。本ナノ粒子はミトコンドリアターゲティング部分も好ましくは含む。
【００１１】
本明細書で説明するように、ポリマーコアと、相対量が低いＨＤＬ成分（例えば、ポリマーコアおよびＨＤＬ成分の合計重量に対して１０％または２０％のＨＤＬ成分）とを有するナノ粒子の様々な実施形態では、相対量が高いＨＤＬ成分（例えば８０％または９０％）を有するナノ粒子と比べてコレステロール結合が高いことが実証された。同様に、コレステロール結合定数（ｋｄ）は、ＨＤＬ成分の相対量がより高い場合と比べてＨＤＬ成分の相対量がより低い場合に高かった。本明細書で説明するポリマーコアおよびＨＤＬ成分を有するナノ粒子は、低いマイクロモル濃度範囲でコレステロール結合定数を有することが実証され、このコレステロール結合定数は、より低いナノモル濃度範囲でコレステロール結合定数を有することが既に分かっている金コアベースのＨＤＬナノ粒子と比べて実質的に高い。結合したコレステロールは、ＨＤＬ成分の量がより高いナノ粒子と比べて、ＨＤＬ成分の量がより低いナノ粒子から緩やかに放出され、このことは、ナノ粒子中に組み込まれたＨＤＬ成分の相対量を制御することにより放出動力学を変えることができることを示唆する。
【００１２】
驚いたことに、ミトコンドリアターゲティング部分を有するナノ粒子は、同量のＨＤＬ成分を有するがミトコンドリアターゲティング部分を有しない、対応するナノ粒子と比べて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究において実質的に多くのコレステロールと結合することを発見した。
【００１３】
本明細書で説明するナノ粒子の様々な実施形態は、予防的に使用される場合に、または治療的に使用される場合に、マクロファージ中の脂質レベルを効果的に低下させることを示す。このことは驚くべきことである。なぜならば、天然ＨＤＬは予防的に使用される場合に効果が低いからである。下記でより詳細に説明するように、ＨＤＬ成分の相対量がより低いナノ粒子（例えば（ポリマーコアおよびＨＤＬ成分の合計重量に対して）約４０％のＨＤＬ成分を有するナノ粒子）は、本明細書において、予防的および治療的の両方で使用される場合にマクロファージ中の脂質レベルを低下させることが分かっている。ＨＤＬ成分の相対量がより高いナノ粒子（例えば（ポリマーコアおよびＨＤＬ成分の合計重量に対して）約７０％のＨＤＬ成分を有するナノ粒子）は、本明細書において、治療的に使用される場合と比べて予防的に使用される場合にマクロファージ中の脂質レベルを効果的に低下させることが分かっている。これらの結果は、ナノ粒子のＨＤＬ含有量を変更することにより、本明細書で説明するナノ粒子の効果的な使用を変更することができることを示唆する。加えて、または或いは、有するＨＤＬ成分の濃度が異なるナノ粒子を組み合わせて使用して、所望の予防効果または治療効果を達成することができる。
【００１４】
相対量が低いＨＤＬ成分と相対量が高いＨＤＬ成分との両方を有するナノ粒子は、予防的にまたは治療的に使用された場合にマクロファージの泡沫細胞への分化を減少させることできたが、天然ＨＤＬは、治療的に使用された場合にのみ、そのような分化を防止することができた。
【００１５】
更に、有するＨＤＬ成分の相対濃度が異なるナノ粒子は生体内分布プロファイルが異なることが分かった。従って、処置または予防のために所望の組織を標的とすべく、本明細書で説明するナノ粒子のＨＤＬ成分濃度を必要に応じて変更することができる。加えて、または或いは、有するＨＤＬ成分の濃度が異なるナノ粒子を組み合わせて使用して、所望の予防効果または治療効果を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（パネルＡ）Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰの可能な構造的方向性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を示す略図である。（パネルＢ）合成Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰの構築で使用する様々な成分およびこれらの成分の構造を示す図である。（パネルＣ）Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰのライブラリを生成するための成分の変化を漫画で示す図である。（パネルＤ）Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイにより決定した、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰライブラリ中のＣＯの積載割合および％ＥＥを示すグラフである。
【図２】Ｔ−ＨＤＬ  ＮＰおよびＮＴ−ＨＤＬ  ＮＰのライブラリのキャラクタリゼーションを示す図である。（パネルＡ）上部：ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ：ＣＯを変更したＴ−ＨＤＬ−ＮＰの流体力学直径、ゼータ電位およびＰＤＩ。下部：４０％および７０％のＣＯを供給したＴ−ＨＤＬ−ＮＰのＴＥＭ。（パネルＢ）上部：ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ：ＣＯを変更したＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰの流体力学直径、ゼータ電位およびＰＤＩ。下部：４０％および７０％のＣＯを供給したＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰのＴＥＭ。
【図３】（パネルＡ）ＣＯ供給量％を変化させたＴ−ＨＤＬＮＰライブラリの時間依存性ＮＢＤ−コレステロール結合プロファイルの比較を示すグラフである。ＲＦＵ：相対蛍光単位。（パネルＢ）Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰライブラリの６時間でのＮＢＤコレステロール結合定数の比較を示すグラフである。（パネルＣ）ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰおよびｈＨＤＬの選択した製剤の時間依存性ＮＢＤコレステロール結合プロファイルを示すグラフである。Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰ、ＮＴ−ＨＤＬＮＰおよびｈＨＤＬの選択した製剤の６時間でのＮＢＤ−コレステロール結合定数の比較。（パネルＤ）３７℃での７．４の生理的ｐＨ下における、結合したＮＢＤ−コレステロールのＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰからの放出を示すグラフである。
【図４】予防的設定下でおよび治療的設定下で泡沫細胞由来のマクロファージを使用して、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰのＲＣＴ模倣特性を研究するための実験的設計を示す図である。
【図５】共焦点顕微鏡を使用する、治療的設定下でのおよび予防的設定下での泡沫細胞中におけるＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰによる脂質減少を示す写真である。ＡｄｉｐｏＲｅｄを使用して細胞内脂質を染色し、生細胞撮像を実施した。代表的なＡｄｉｐｏＲｅｄ染色（赤色）は、ｏｘＬＤＬでの処置によるＲＡＷ２６４．７マクロファージからの泡沫細胞の形成を示した。予防的設定下でのｏＸＬＤＬの添加前に、および治療的設定下でのｏｘＬＤＬによる処置前に、ｈＨＤＬ、Ｔ−ＣＯ４−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰによる処置を実行した。スケールバー：２５μｍ。
【図６】ｏｘＬＤＬでの処置によるＲＡＷ２６４．７マクロファージからの泡沫細胞の形成を示すグラフである。予防的設定下でのｏｘＬＤＬの添加前に、および治療的設定下でのｏｘＬＤＬによる処置後に、ｈＨＤＬ、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬＮＰによる処置を実行した。（パネルＡ）ＡｄｉｐｏＲｅｄアッセイによる、治療的設定下でのおよび予防的設定下での泡沫細胞中におけるＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰによる脂質減少。ＡｄｉｐｏＲｅｄを使用して細胞内トリグリセリド内容物を染色し、プレートリーダーを使用して定量化した。（パネルＢ）Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰまたはｈＨＤＬによる処置後の、泡沫細胞形成およびその後の泡沫細胞中での酸化的ストレスの低下後のＲＯＳレベルの上昇。＊、＊＊、＊＊＊それぞれＰ値０．０１〜０．０５、０．００１〜０．０１および＜０．００１。ｎｓ：有意ではない。
【図７】（パネルＡ）正常なブタの、大動脈中でのＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰの蓄積および心臓中でのＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰの蓄積を示す図である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタを麻酔し、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰ（ＮＰに対して１．２５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。血漿サンプルおよび臓器サンプルのＩＣＰ−ＭＳ分析およびＩＶＩＳ分析によりＮＰを定量化して、ＰＫパラメータおよびｂｉｏＤプロファイルを決定した。＊＊＊の場合、Ｐ値＜０．００１、ｎｓ：有意ではない。（パネルＢ）Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰを投与した子ブタでの血漿の総コレステロールおよびトリグリセリドのレベルを示すグラフである。＊、＊＊、＊＊＊はそれぞれＰ値０．０１〜０．０５、０．００１〜０．０１および＜０．００１。ｎｓ：有意ではない。（パネルＣ）子ブタにおけるＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰの抗炎症特性の分析用のブタ血漿サンプルからのサイトカインシグナルを示すグラフである。＊＊、＊＊＊はそれぞれＰ値０．００１〜０．０１および＜０．００１。
【図Ｓ１】Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰの（パネルＡ）直径および（パネルＢ）ゼータ電位のＤＬＳプロットを重ね合わせて示すグラフである。
【図Ｓ２】ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰの（パネルＡ）直径、（パネルＢ）ゼータ電位、（パネルＣ）ＣＯの積載割合および（パネルＤ）ＣＯの封入効率（ＥＥ）割合のＤＬＳプロットを重ねて示すグラフである。
【図Ｓ３】Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰのライブラリのＴＥＭ画像を示す写真である。
【図Ｓ４】ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰのライブラリのＴＥＭ画像を示す写真である。
【図Ｓ５】ＣＯ供給量％を変化させたＮＴＨＤＬ−ＮＰ（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）ライブラリの時間依存性ＮＢＤ−コレステロール結合プロファイルの比較を示すグラフである。ＲＦＵ：相対蛍光単位。
【図Ｓ６】ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰライブラリの６時間でのＮＢＤ−コレステロール結合定数の比較を示すグラフである。
【図Ｓ７】正常なブタの、大動脈中でのＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰの蓄積および心臓中でのＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰの蓄積を％ＩＤ／組織ｇの単位で示すグラフである。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタを麻酔し、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰ（ＮＰに対して１．２５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。ＩＣＰ−ＭＳでＮＰを定量化した。
【図Ｓ８】全ての動物からの心臓および大動脈の画像を示す写真である。イソフルオランを使用してＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタ（４週齢）を麻酔し、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰを耳介静脈ＩＶ経由で投与した。心臓全体および大動脈のＩＶＩＳ分析を実施することにより、ＮＰの分布を研究した。データは、各群からの全ての動物の画像を示す。
【図Ｓ９】全ての動物からの心臓および大動脈の画像を示す写真である。イソフルオランを使用してＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタ（４週齢）を麻酔し、Ｔ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰを耳介静脈ＩＶ経由で投与した。心臓全体および大動脈のＩＶＩＳ分析を実施することにより、ＮＰの分布を研究した。データは、各群からの全ての動物の画像を示す。
【図Ｓ１０Ａ】（Ａ）通常の飼料を給餌したアポＥ−／−マウスモデルでのＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰの治療有効性を示すグラフである。静脈内注射により１週間に２回（総ＮＰに対して）１０ｍｇ／ｋｇの用量でＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで動物を処置した。トリグリセリド、総コレステロール、ＬＤＬおよびＨＤＬを定量化することにより、処置間で血漿脂質レベルを比較した。
【図Ｓ１０Ｂ】（Ｂ）生理食塩水で処置したアポＥ−／−動物、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物およびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの大動脈弁のオイルレッドＯ染色を示す写真である。
【図Ｓ１０Ｃ．Ｓ１０Ｄ】（Ｃ）生理食塩水で処置したアポＥ−／−動物、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物およびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの大動脈および心筋からの切断カスパーゼ−３−陽性領域の量を示す写真である。（Ｄ）Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物およびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からのＨ染色したおよびＥ染色した大動脈および大動脈弁を示す写真である。
【図Ｓ１０Ｅ】（Ｅ）有意な毒性がないことを示す、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物およびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの全ての主要な臓器のＨ染色画像およびＥ染色画像を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で示す概略図は必ずしも一定の縮尺ではない。
【００１８】
下記の詳細な説明では添付図面を参照し、この添付部面は本明細書の一部を形成し、装置、システムおよび方法のいくつかの具体的な実施形態を実例として示す。本開示の範囲および趣旨から逸脱することなくその他の実施形態が意図されているおよび行なわれ得ることを理解しなければならない。従って、下記の詳細な説明を限定的な意味で理解してはならない。
【００１９】
本開示は、特に子ブタモデルを使用して、ミトコンドリア標的型ＨＤＬ模倣物のキャラクタリゼーション、スケールアップおよび治療可能性を特に説明する。本明細書で説明する様々な実施形態では、ＨＤＬ模倣ナノ粒子は、合成ではあるが生分解性のＨＤＬ模倣物を生成するために、生体適合性ポリマーおよび脂質を含む。本明細書に示すように、低コストの小分子ベースのターゲティング戦略は、高い特異性および副作用の低減等の明らかな利点を提供することができる。過去数十年、再構成されたＨＤＬ（ｒＨＤＬ）が薬物送達システムとして研究されている。ｒＨＤＬの治療適用の主な制限は、ヒト血清からＨＤＬアポリポタンパク質を単離する必要性があることまたは組換えヒトアポＡ−Ｉを分泌する細胞発現系を用いる必要性があることである。一部の実施形態では、細胞外脂質恒常性および細胞内脂質恒常性の両方に関与する可能性がある、完全に合成された、生分解性のおよびミトコンドリア標的型のＨＤＬ模倣ナノ粒子（ＮＰ）が本明細書で説明されている。
【００２０】
本明細書で説明するナノ粒子は、ポリマーコアと、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）成分であって、ＨＤＬ成分のポリマーコアに対する重量比が約１：９〜約９：１の範囲である、ＨＤＬ成分とを含む。好ましくは、ＨＤＬ成分のポリマーコアに対する重量比は約７５：２５以下であり、例えば約７：３以下である。即ち、ＨＤＬ成分は、このＨＤＬ成分とポリマーコアとの合計重量の約７５％以下を構成し、例えば約７０％以下を構成する。本ナノ粒子はミトコンドリアターゲティング部分も好ましくは含み、本ナノ粒子の標的を適切な細胞（例えば、マクロファージ、泡沫細胞または同様なもの）に設定するための１種または複数種の追加のターゲティング部分を任意選択で含むことができる。このターゲティング部分は、細胞成分との相互作用が可能であるようにコアから外方に好ましくは延びており、この相互作用により、本ナノ粒子の標的を適切な細胞、細胞小器官または同様なものに設定することができる。このターゲティング部分は、コアまたはコアと相互作用する成分に繋留され得る。
【００２１】
本明細書で説明するナノ粒子は、ＨＤＬ成分に加えて、１種もしくは複数種の造影剤または１種もしくは複数種の治療薬を含むことができる。一部の実施形態では、この造影剤または治療薬はコア内に含まれている、またはコア内に包埋されている。本ナノ粒子が治療薬を含む場合、この治療薬は好ましくは所望の速度でコアから放出される。一部の実施形態では、コアは生分解性であり、このコアが分解されるとまたは浸食されると治療薬を放出する。
【００２２】
Ｉ．ポリマー成分
本明細書で説明するナノ粒子は１種または複数種のポリマーを含むことができる。好ましくは、本ナノ粒子は、少なくとも１種のポリマーで形成されているコアを含む。本開示では、少なくとも１種のポリマーを含むコアを「ポリマーコア」と称する。本明細書で説明するナノ粒子は、このポリマーコアを囲むポリマー層またはポリマーシェルも任意選択で含むことができる。様々な実施形態では、このポリマーコアは、疎水性ポリマーまたはポリマーの疎水性部分を含む。一部の実施形態では、このシェルは、親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分を含む。疎水性部分はコアを形成することができ、親水性領域は下記のようなシェルを形成することができ、このシェルは、本ナノ粒子が免疫系による認識を回避するのに役立つ、および循環半減期を延ばす。例えば、両親媒性ブロックコポリマーの疎水性部分がコアまたはコアの一部を形成することができ、両親媒性ブロックコポリマーの親水性部分がシェルまたはシェルの一部を形成することができる。そのような両親媒性ブロックコポリマーは下記のような疎水性部分および親水性部分を有し、これら疎水性部分および親水性部分は、水性環境中において、疎水性コアとこのコアの周囲の親水性表面とを有する粒子へと自己構築することができる。
【００２３】
両親媒性ポリマーの例として、疎水性ブロックと親水性ブロックとを有するブロックコポリマーが挙げられる。複数の実施形態では、コアは、ブロックコポリマーの疎水性部分、疎水性ポリマーまたはこれらの組合せで形成されている。
【００２４】
一部の実施形態では、コア、シェル（存在する場合）、またはコアおよびシェル（存在する場合）は、１種もしくは複数種の生分解性ポリマーまたは生分解性部分を有するポリマーを含む。
【００２５】
任意の適切な合成されたまたは天然の生体吸収性ポリマーを使用することができる。当業者はそのようなポリマーを認識することができる、および同定することができる。合成された生体吸収性ポリマーの非限定的な例として下記が挙げられる：ポリ（アミド）、例えばポリ（アミノ酸）およびポリ（ペプチド）；ポリ（エステル）、例えばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ））（ＰＬＧＡ）およびポリ（カプロラクトン）；ポリ（無水物）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（カーボネート）；ならびにこれらの化学誘導体（化学基（例えばアルキル、アルキレン）の置換、付加、水酸化、酸化および当業者が通常行なうその他の改変）、フィブリン、フィブリノーゲン、セルロース、デンプン、コラーゲンおよびヒアルロン酸、これらのコポリマーおよび混合物。これらのおよびその他の適切なポリマーの特性および放出プロファイル（例えば、ポリマーを含むポリマーマトリックス中に含有される化合物の放出プロファイル）は既知である、または容易に明らかにされ得る。
【００２６】
本明細書で説明する様々な実施形態では、コアはＰＬＧＡを含む。ＰＬＧＡは、所望の速度で治療薬を送達するためにおよび放出するために使用される公知のおよび充分に研究されている疎水性の生分解性ポリマーである。
【００２７】
ナノ粒子のコアまたはシェルの形成に使用され得るポリマーの非限定的な例として、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ尿素、ポリスチレンおよび／またはポリアミンの内の１種または複数種が挙げられる。一部の実施形態では、ポリマーコアはポリエステルを含む。一部の実施形態では、ポリマーマトリックスは、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはこれらのコポリマーを含むことができる。
【００２８】
ポリマーは、天然のまたは非天然の（合成された）ポリマーであることができる。ポリマーは、ホモポリマー、または２種以上のモノマーを含むコポリマーであることができる。配列に関して、コポリマーはランダム、ブロックであることができる、またはランダム配列およびブロック配列の組合せを含むことができる。典型的には、ポリマー成分を有するナノ粒子は有機ポリマーを含むことができる。
【００２９】
ポリマーの例として、ポリエチレン、ポリカーボネート（例えばポリ（１，３−ジオキサン−２オン））、ポリ無水物（例えばポリ（セバシン酸無水物）（ｐｏｌｙ（ｓｅｂａｃｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ））、ポリヒドロキシ酸（例えばポリ（β−ヒドロキシアルカノエート））、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド（例えばポリカプロラクタム）、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル（例えばポリラクチド、ポリグリコリド）、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ尿素、ポリスチレンおよびポリアミンが挙げられる。一部の実施形態では、本発明に従うポリマーとして、２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１７７．２６００下でＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）によりヒトでの使用が認可されているポリマーが挙げられ、ポリエステル（例えばポリ乳酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（１，３−ジオキサン−２オン））；ポリ無水物（例えばポリ（セバシン酸無水物））；ポリエーテル（例えばポリエチレングリコール）；ポリウレタン；ポリメタクリレート；ポリアクリレート；およびポリシアノアクリレートが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ポリマーは親水性であることができる。例えば、ポリマーは、アニオン性基（例えばリン酸基、硫酸基、カルボン酸基）；カチオン性基（例えば第四級アミン基）；または極性基（例えば水酸基、チオール基、アミン基）を含むことができる。
【００３０】
一部の実施形態では、ポリマーを、１種もしくは複数種の部分で、１種もしくは複数種の官能基で、または１種もしくは複数種の部分と１種もしくは複数種の官能基とで修飾することができる。あらゆる適切な部分または官能基を使用することができる。一部の実施形態では、ポリマーを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、炭水化物、多糖由来の非環状ポリアセタールまたは同様なもので修飾することができる。一部の実施形態では、ポリマーはＰＥＧで修飾されている。
【００３１】
一部の実施形態では、ポリマーを脂質または脂肪酸基で修飾することができる。一部の実施形態では、脂肪酸基は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸またはリグノセリン酸の内の１種または複数種であることができる。一部の実施形態では、脂肪酸基は、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、アルファ−リノール酸、ガンマ−リノール酸、アラキドン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸またはエルカ酸の内の１種または複数種であることができる。
【００３２】
一部の実施形態では、ポリマーはポリエステルであることができ、ポリエステルとして、乳酸単位およびグリコール酸単位を含むコポリマー、例えばポリ（乳酸−コ−グリコール酸）およびポリ（ラクチド−コ−グリコシド）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ））（本明細書ではまとめて「ＰＬＧＡ」と称する）；ならびにグリコール酸単位を含むホモポリマー（本明細書では「ＰＧＡ」と称する」）ならびに乳酸単位を含むホモポリマー、例えばポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチドおよびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド（本明細書ではまとめて「ＰＬＡ」と称する）が挙げられる。一部の実施形態では、例示的なポリエステルとして、例えば、ポリヒドロキシ酸；ＰＥＧ化ポリマーおよびラクチドとグリコシドとのコポリマー（例えばＰＥＧ化ＰＬＡ、ＰＥＧ化ＰＧＡ、ＰＥＧ化ＰＬＧＡならびにこれらの誘導体が挙げられる。一部の実施形態では、ポリエステルとして、例えば、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）ＰＥＧ化ポリ（オルトエステル）、ポリ（カプロラクトン）、ＰＥＧ化ポリ（カプロラクトン）、ポリリシン、ＰＥＧ化ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ＰＥＧ化ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、ポリ［α−（４−アミノブチル−Ｌ−グリコール酸］およびこれらの誘導体が挙げられる。
【００３３】
一部の実施形態では、ポリマーはＰＬＧＡであることができる。ＰＬＧＡは、乳酸とグリコール酸との生体適合性のおよび生分解性のコポリマーであり、様々な形態のＰＬＧＡが乳酸：グリコール酸の比を特徴とする。乳酸は、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸またはＤ，Ｌ−乳酸であることができる。乳酸：グリコール酸の比を変更することにより、ＰＬＧＡの分解速度を調節することができる。一部の実施形態では、本発明に従って使用されるＰＬＧＡは、約８５：１５の、約７５：２５の、約６０：４０の、約５０：５０の、約４０：６０の、約２５：７５のまたは約１５：８５の乳酸：グリコール酸の比を特徴とする。
【００３４】
一部の実施形態では、ポリマーは１種または複数種のアクリルポリマーであることができる。ある特定の実施形態では、アクリルポリマーとして、例えば、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、メタクリル酸アルキルアミドコポリマー、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（メタクリル酸無水物）、メチルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）コポリマー、ポリアクリルアミド、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、グリシジルメタクリレートコポリマー、ポリシアノアクリレートおよび上記のポリマーの内の１種または複数種を含む組合せが挙げられる。このアクリルポリマーは、第四級アンモニウム基の含有量が低い、アクリル酸エステルとメタクリル酸エステルとの完全に重合したコポリマーを含むことができる。
【００３５】
一部の実施形態では、ポリマーは炭水化物であることができる。一部の実施形態では、炭水化物は、当分野で既知であるように、グリコシド結合により結合している単糖（またはこの誘導体）を含む多糖であることができる。一部の実施形態では、炭水化物は、プルラン、セルロース、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシセルロース、メチルセルロース、デキストラン、シクロデキストラン、グリコーゲン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カラギーナン（ｃａｒａｇｅｅｎａｎ）、グリコン（ｇｌｙｃｏｎ）、アミロース、キトサン、Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン、アルギンおよびアルギン酸、デンプン、キチン、ヘパリン、コンニャク、グルコマンナン（ｇｌｕｃｏｍｍａｎｎａｎ）、プスツラン（ｐｕｓｔｕｌａｎ）、ヘパリン、ヒアルロン酸、カードランおよびキサンタンの内の１種または複数種であることができる。
【００３６】
一部の実施形態では、ポリマーはタンパク質またはペプチドであることができ、これらの特性を下記でより詳細に説明する。本発明に従って使用することができる例示的タンパク質として、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、ヘモグロビン、ポリ（アミノ酸）（例えばポリリシン）、抗体等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
一部の実施形態では、ポリマーは直鎖のまたは分枝したポリマーであることができる。一部の実施形態では、ポリマーはデンドリマーであることができる。一部の実施形態では、ポリマーは互いに実質的に架橋され得る。一部の実施形態では、ポリマーは実質的に架橋していない。一部の実施形態では、ポリマーを、架橋工程を経ることなく本発明に従って使用することができる。
【００３８】
ポリマーとして、上述したポリマーおよびその他のポリマーのいずれかのブロックコポリマー、グラフトコポリマー、ブレンド、混合物および／または付加物を挙げることができることも更に理解しなければならない。本明細書中で列挙されているポリマーは、本発明に従って有用であり得るポリマーの（網羅的ではない）例示的リストを表すことが当業者に理解されるだろう。
【００３９】
ポリマーベースのナノ粒子の有望な一例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ブロックコポリマー（一般名称「ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）」でも知られている）のクラスで表される。このブロックコポリマーは、Ａ−Ｂ−Ａ３重ブロック構造：ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯで並んでいる、親水性ポリ（エチレンオキシド）ＰＥＯのブロックおよび疎水性ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）のブロックからなる。
【００４０】
任意の適切な親水性ポリマーがブロックコポリマーの親水性ブロックを形成することができる。適切な親水性ポリマーの例として、多糖、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシメタクリレートおよび同様なものが挙げられる。複数の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ブロックコポリマーの親水性部分として機能するように使用される親水性ポリマーである。
【００４１】
一部の実施形態では、コアは、１種または複数種の脂質または分子（例えばリン脂質）の脂質部分を含む。リン脂質は、疎水性コアと親水性外表面とを有するミセルを形成することができる。
【００４２】
ＩＩ．ターゲティング部分
本明細書で説明するナノ粒子は、このナノ粒子の標的を所望の細胞型、細胞小器官または同様なものに設定する１種または複数種の部分を含む。ターゲティング部分は、コアの一部を形成する分子への結合またはコアに結合している分子への結合等の任意の適切な方法でコアに繋留され得る。
【００４３】
複数の実施形態では、ターゲティング部分は、コアの一部を形成するポリマーに結合している、もしくはコアの一部を形成するポリマーに結合しているポリマーに結合している、またはコアに結合しているもしくはコアの一部を形成する脂質（例えばリン脂質）に結合しているポリマーに結合している。複数の実施形態では、ターゲティング部分は、コアの一部を形成する疎水性ブロックを有するブロックコポリマーの親水性部分に結合している。
【００４４】
ポリマーまたはこの一部は、このポリマーの官能基との反応および結合に適した官能基を有するまたは有するように改変されているターゲティング部分との反応およびこのターゲティング部分への結合に適した官能基（例えば−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨまたは同様なもの）を含み得る、またはこの官能基を含むように改変され得る。
【００４５】
起こり得る反応および繋留のタイプを説明するために、ポリマーおよび脂質に繋留されているターゲティング部分の例を本開示全体にわたって示す。しかしながら、ポリマー、脂質、ポリペプチドまたは同様なものへのターゲティング部分の繋留を、多くの既知の化学反応プロセスのいずれかに従って実行することができることを当業者は理解するだろう。
【００４６】
ターゲティング部分は、任意の適切な濃度で本ナノ粒子中に存在することができる。複数の実施形態では、この濃度を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究または使用の前に最適化するための最初のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分析に基づいて容易に変更することができる。複数の実施形態では、ターゲティング部分は、約１０％〜約１００％の表面被覆率を有することができる。
【００４７】
本明細書で説明するナノ粒子は、ミトコンドリアマトリックス中でのこのナノ粒子の蓄積を促進するミトコンドリアターゲティング部分を含むことができる。ミトコンドリア内膜全体にわたり維持される実質的に負の電気化学的電位［ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）］に起因して、非局在化された親油性カチオンは、疎水性膜の横断およびミトコンドリアマトリックス中での蓄積で有効である。
【００４８】
一例の適切なミトコンドリアターゲティング非局在化親油性カチオン（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｅｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｃａｔｉｏｎ）は、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンである。ＴＰＰ含有化合物は、ミトコンドリアマトリックス内で１００倍を超えて蓄積することができる。任意の適切なＴＰＰ含有化合物をミトコンドリアマトリックスターゲティング部分として使用することができる。ＴＰＰベース部分の代表例は、下記の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【化１】
2018500327.tif 000003
【化２】
2018500327.tif 000004
で示す構造を有することができ、式Ｉ〜式ＩＩＩ中、アミン（示される場合）を、本ナノ粒子中への組み込み用のポリマー、脂質または同様なものに共役させることができる。
【００４９】
コア中への組み込み用の疎水性テール（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｔａｉｌ）を有するＴＰＰベース部分を有する化合物の別の例を、式ＩＶ：
【化３】
2018500327.tif 000005
に示し、式ＩＶ中、ｎは５〜５０の整数であり、例えば１０〜３０または１５〜２０の整数である。
【００５０】
複数の実施形態では、ミトコンドリアマトリックスを標的とするための非局在化親油性カチオンはローダミンカチオンであり、例えば下記に示す式Ｖ：
【化４】
2018500327.tif 000006
を有するＲｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３であり、式Ｖ中、第二級アミン（示される場合）を、本ナノ粒子中への組み込み用のポリマー、脂質または同様なものに共役させることができる。加えて、または或いは、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３含有化合物は、コア中への組み込み用の疎水性部分（例えば長鎖アルカン）を含むことができる。
【００５１】
当然のことながら、非カチオン性化合物はターゲティングおよびミトコンドリアマトリックス中での蓄積に役立つことができる。例として、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドは、ターゲティングおよびミトコンドリアマトリックス中でのナノ粒子の蓄積に役立つことができる。任意の適切なＳｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドを、ミトコンドリアマトリックスターゲティング部分として用いることができる。適切なＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドの非限定的な例として、下記に示す式ＩＸおよび式Ｘ：
【化５】
2018500327.tif 000007
をそれぞれ有するＳＳ−０２およびＳＳ−３１が挙げられ、式ＩＸおよび式Ｘ中、第二級アミン（示される場合）を、本ナノ粒子中への組み込み用のポリマー、脂質または同様なものに共役させることができる。加えて、または或いは、Ｓｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチド含有化合物は、コア中への組み込み用の疎水性部分（例えば長鎖アルカン）を含むことができる。
【００５２】
例示として、ジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧ−ＴＰＰの合成用の反応スキームを下記のスキームＩに示す。その他のスキームを用いてＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＴＰＰを合成することができること、および類似の反応スキームを用いてその他のミトコンドリアターゲティング部分をＤＳＰ−ＰＥＧに繋留することができることまたはこのミトコンドリアターゲティング部分をその他のポリマー、コポリマーもしくは脂質に繋留することができることが理解されるだろう。
【化６】
2018500327.tif 000008
【００５３】
一部の実施形態では、本明細書で説明するナノ粒子はマクロファージターゲティング部分を含む。マクロファージはアテローム性動脈硬化症の病変中に特徴的に存在することから、および／またはマクロファージは脂質恒常性において重要であり得ることから、本明細書で説明するナノ粒子の標的をマクロファージに設定することが望ましい場合がある。
【００５４】
任意の適切な部分を使用して、マクロファージ細胞に対するナノ粒子の親和性を高めることができる。例えば、マンノース部分またはその他の単糖部分を、ターゲティング部分として本ナノ粒子中に組み込むことができる。マンノースおよびガラクトース等の単糖は、受容体を介してマクロファージと選択的に相互作用することができる。例えば、マクロファージは、マクロファージマンノース受容体と、ガラクトースに選択的に結合するレクチン（マクロファージガラクトース結合レクチン）とを含む。この選択的相互作用を介して、そのような単糖またはそのような単糖を含む化合物の存在を使用して、本ナノ粒子の標的をマクロファージに設定することができる。複数の実施形態では、マクロファージターゲティング部分は、マンノース、ガラクトースまたはラクトビオン酸を含む。
【００５５】
単糖の存在により本ナノ粒子とマクロファージとの相互作用が促進されることから、網内皮系（ＲＥＳ）への露出を最小限に抑えるために、本ナノ粒子が所望の位置（例えばアテローム性プラーク）に到達するまで、この糖部分が本ナノ粒子中に遮蔽されていることが望ましい。
【００５６】
この糖部分を、任意の適切な方法で一時的に遮蔽することができる。複数の実施形態では、この糖部分は、親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリマーの親水性部分、例えばＰＥＧブロックを含むブロックコポリマー；コアに結合している脂質もしくはコアを少なくとも部分的に形成する化合物の一部である脂質に結合している親水性ポリマー；または同様なものにより遮蔽されている。遮蔽ポリマーは、（例えば、このポリマーがブロックコポリマーであり、このポリマーの疎水性ブロックがコアの形成に寄与する場合に）本ナノ粒子のコアの一部を形成し得る、または別の方法でコアに結合され得る。
【００５７】
好ましくは、この遮蔽ポリマーは、本ナノ粒子がその標的位置（例えばアテローム性プラーク）に到達した場合に本ナノ粒子から放出可能であり、マクロファージターゲティング部分を露出させる。例えば、この遮蔽ポリマーを、切断可能リンカーにより、コア、ポリマー、脂質または同様なものに結合させることができる。この切断可能リンカーは、標的位置に到達した際に切断され得る。あらゆる適切な切断可能リンカーを用いることができる。複数の実施形態では、この切断可能リンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により切断可能なペプチドリンカーである。ＭＭＰ２により切断可能なペプチドリンカーの一例は、アミノ酸配列ＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号２）を有するポリペプチドである。用いるリンカーに関係なく、好ましくは、切断は、アテローム性プラーク中に存在する切断酵素（例えばＭＭＰ）濃度以下で起こる。複数の実施形態では、この切断可能リンカーの切断は、マクロファージターゲティング部分を露出させる表面スイッチングを誘発する。
【００５８】
用いることができるその他の切断可能リンカーは、グルタチオン、ｐＨ変化、温度変化または同様なものにより切断されやすいものである。
【００５９】
ポリマー、脂質または同様なものに結合しているマクロファージターゲティング部分の非限定的な例として、短い親水性ポリマー鎖（例えばＰＥＧ５００）に結合しているマンノース、ガラクトースまたはラクトビオン酸が挙げられる。複数の実施形態では、この短い親水性ポリマー鎖は、脂質または親水性ポリマーによりコアに結合している。例えば、ＰＥＧ５００を、コアの一部を形成する疎水性ポリマー（例えばＰＬＧＡ）に結合させることができる。複数の実施形態では、この短い親水性ポリマーは、コアに結合しているまたはコアの一部を形成する親水性ポリマーに結合している脂質（例えばジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ））に結合している。より大きい親水性鎖（例えばＰＥＧ３４００）は遮蔽ポリマーとして機能することができる。この遮蔽ポリマーを、疎水性ポリマー、脂質または同様なものによりコアに結合させることができる。この遮蔽ポリマーを、切断可能リンカーにより、疎水性ポリマー、脂質または同様なものに結合させることができる。
【００６０】
複数の実施形態では、マクロファージターゲティング部分は、ＰＬＧＡに結合しているＰＥＧ（例えばＰＥＧ５００）に結合している（即ち、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ターゲティング部分）。複数の実施形態では、マクロファージターゲティング部分は、ＤＳＰＥに結合しているＰＥＧ（例えばＰＥＧ５００）に結合している（即ち、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ターゲティング部分）。
【００６１】
複数の実施形態では、遮蔽ポリマー（例えばＰＥＧ３４００）はＰＬＧＡに結合しており（即ち、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）、切断可能リンカーによりＰＬＧＡに結合され得る（即ち、ＰＬＧＡ−リンカー−ＰＥＧ）。複数の実施形態では、遮蔽ポリマー（例えばＰＥＧ３４００）はＤＳＰＥに結合しており（即ちＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、切断可能リンカーによりＤＳＰＥに結合され得る（即ち、ＤＳＰＥ−リンカー−ＰＥＧ）。
【００６２】
マクロファージターゲティング部分を任意の適切な方法でポリマーまたは脂質に結合させることができる。例として、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノースを、例えば下記の反応スキーム：
【化７】
2018500327.tif 000009
で示すように、Ｄ−マンノサミン塩酸塩とＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨとのアミドカップリングにより合成することができ、このスキーム中、ＥＤＣとは１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノ）−プロピル）カルボジイミドのことである。
【００６３】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ラクトビオン酸を、下記の反応スキーム：
【化８】
2018500327.tif 000010
に従って合成することができる。
【００６４】
スキームＩＩおよびスキームＩＩＩに示す反応スキームは例示を目的としており、その他の反応スキームを用いることができ、その他のリン脂質、ポリマーまたはマンノースもしくはガラクトースを含む化合物も用いることができることが理解されるだろう。
【００６５】
適切な繋留されたターゲティング部分の別の例は、マンノシルアルキルトリアゾール（ｍａｎｎｏｓｙｌ  ａｌｋｙｌｔｒｉａｚｏｌｅ）である。そのような繋留されたターゲティング部分を合成するための反応スキームを下記の反応スキームＩＶ〜ＶＩＩに示す。
【化９】
2018500327.tif 000011
【００６６】
スキームＩＶ〜ＶＩを改変して、アルキル鎖中の炭素の数を変更することができる、分枝鎖アルキルを含むことができる、または同様のことができる。
【００６７】
アルキル鎖を例えばナノ粒子の脂質層中に包埋させて、繋留されたターゲティング部分をこのナノ粒子中で保持することができる。
【００６８】
例えば任意のその他の所望のおよび適切なターゲティング部分（例えば泡沫細胞ターゲティング部分）を、本明細書で説明するナノ粒子中に組み込むことができることが理解されるだろう。上記で説明する反応スキームと類似する反応スキームまたはその他の適切な反応スキームを用いて、ターゲティング部分を、ナノ粒子中への組み込みに適した成分に繋留することができることも理解されるだろう。
【００６９】
ＩＩＩ．リン脂質単分子層
複数の実施形態では、本ナノ粒子は脂質単分子層またはリン脂質単分子層を含み、これらの単分子層は、本ナノ粒子の疎水性コアと親水性シェルとの界面で存在することができる。この単分子層のリン脂質は、本ナノ粒子の疎水性コアと相互作用する疎水性テールを有する。そのため、このリン脂質を使用して様々な成分（例えばターゲティング部分または造影剤）をコアに繋留することができる。この脂質層またはリン脂質層は、コア中の薬剤がこのコアから自由に拡散することを防止するのに役立つこともでき、コア中への水の浸透を低減することができる。
【００７０】
あらゆる適切な脂質またはリン脂質を用いることができる。用いることができる脂質またはリン脂質の例として、レシチン、様々な鎖長のジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、カルジオリピン、分枝したＰＥＧを含むＤＳＰＥもしくは同様なものまたはこれらの混合物が挙げられる。好ましくは、この脂質は生分解性である。複数の実施形態では、ＤＳＰＥ、カルジオリピン、またはＤＳＰＥとカルジオリピンとの混合物を使用してリン脂質単分子層を形成する。
【００７１】
上記で論じたように、この脂質を使用して、様々な成分をコアに繋留することができる。複数の実施形態では、繋留される成分は、介在するポリマーにより、好ましくはＰＥＧ等の親水性ポリマーにより、更に繋留される。この脂質は、様々なポリマー（適切な反応基を有する、もしくはこの反応基を有するように改変され得る）またはその他の成分（適切な反応基を有する、もしくはこの反応基を有するように改変され得る）との反応および結合のために、反応基を含み得る、または反応基を含むように改変され得る。
【００７２】
脂質をベースとして繋留されている分子の例として、上記で論じたＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＴＰＰが挙げられる。その他のリン脂質および親水性ポリマー（ＤＳＰＥおよびＰＥＧ以外）を用いることができることが理解されるだろう。複数の部分を、同様の方法で、介在する親水性ポリマーによりまたはこの親水性ポリマーを用いることなくリン脂質に繋留することができることが更に理解されるだろう。
【００７３】
ＩＶ．ＨＤＬ成分
複数の実施形態では、本ナノ粒子はＨＤＬまたはＨＤＬ模倣成分を含み、これらＨＤＬおよびＨＤＬ模倣成分を本明細書ではまとめて「ＨＤＬ成分」と称する。ＨＤＬは、泡沫細胞からコレステロールを除去することにより、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化を阻害することにより、およびアテローム性動脈硬化症の基礎となる炎症プロセスを制限することにより、アテローム性動脈硬化症に直接対抗することができる。ＨＤＬはまた、抗血栓形成特性も有することができる。そのため、ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）は、いくつかの主要段階でアテローム発生のプロセスを中断することができる。泡沫細胞からのコレステロール流出を促進するアポＥに加えて、ＨＤＬを含むアポＡ−１により、病変からのコレステロールの輸送が容易になると考えられる。従って、アテローム性病変を標的とするナノ粒子中へのＨＤＬ成分および関連成分（例えばアポＡ−Ｉタンパク質またはこの合成模倣物）の組み込みは、患者に大きな利益をもたらすことができる。
【００７４】
複数の実施形態では、本ナノ粒子中に組み込まれているＨＤＬ成分は、コレステロール（例えばオレイン酸コレステロール）、ヒト血漿から再構成されたＨＤＬまたは同様なものを含む。複数の実施形態では、コレステロールは本ナノ粒子の疎水性コア中に組み込まれている、またはこの疎水性コアの一部を形成する。複数の実施形態では、コレステロールは、本ナノ粒子中に存在する場合にはリン脂質単分子層中に組み込まれ得る。
【００７５】
様々な実施形態では、ＨＤＬ成分の、ナノ粒子のコアを形成するポリマーに対する比は、脂質恒常性の維持等の所望の結果を達成するように調整されている。一部の実施形態では、ＨＤＬ成分のコアポリマー成分に対する比は約１：９〜約９：１の範囲である。好ましくは、ＨＤＬ成分のポリマーコアに対する重量比は約７５：２５以下であり、例えば約７：３以下である。即ち、ＨＤＬ成分は、ＨＤＬ成分とポリマーコアとの合計重量の約７５％以下を構成し、例えば約７０％以下を構成する。一部の実施形態では、ＨＤＬ成分のコアポリマー成分に対する比は約１：４〜約３：２の範囲である。一部の実施形態では、ＨＤＬ成分のコアポリマー成分に対する比は２：３である。本開示の目的では、ＨＤＬ成分のコアポリマー成分または「ポリマーコア」に対する重量比は、ＨＤＬ成分のコアのポリマー部分に対する重量比を意味する。従って、コアがポリマー成分以外の成分を含む場合、追加の成分の重量は、ＨＤＬ成分：ポリマーコアの重量比の算出では考慮されない。加えて、ポリマーが、コアの少なくとも一部を形成する第１の部分と、本ナノ粒子の別の部分（例えばコアを囲むシェル）を形成する別の部分とを含む場合、本開示では、ＨＤＬ成分：ポリマー成分の重量比の決定に、ポリマーにおいてコアを形成する部分のみの重量が考慮される。
【００７６】
一部の実施形態では、ＨＤＬ成分はオレイン酸コレステロールを含み、コアポリマーはＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ等のＰＬＧＡを含む。一部の実施形態では、ＨＤＬ成分はオレイン酸コレステロールから本質的になり、コアポリマーはＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ等のＰＬＧＡから本質的になる。
【００７７】
本ナノ粒子中に、アポＡ−１またはあらゆる適切なアポＡ−１ペプチド模倣物を組み込むことができる。アポＡ−１ペプチド模倣物の一例は、アミノ酸配列ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ（配列番号１）を有するポリペプチドである。アポＡ−１またはアポＡ−１模倣物は、特に本ナノ粒子がリン脂質単分子層を含む場合に本ナノ粒子へと自己構築する傾向があり、そのため、ポリマーまたは脂質等のその他の成分に繋留される必要はない。しかしながら、そのようなポリペプチドがポリマーまたは脂質に繋留されていてもよい。
【００７８】
複数の実施形態では、ナノ粒子は、自己構築したアポＡ−１ペプチドネットワークを含み、コロイド状のリン脂質単分子層は、血漿由来のＨＤＬを模倣する。
【００７９】
Ｖ．造影剤
本明細書で説明するナノ粒子（ＮＰ）は、撮像、可視化または診断のために１種または複数種の造影剤を含むことができる。あらゆる適切な造影剤を用いることができる。複数の実施形態では、この造影剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）に適しており、例えば酸化鉄（ＩＯ）ナノ結晶である。複数の実施形態では、この造影剤は、ｅｘ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏでの光学的撮像に適しており、例えば量子ドット（ＱＤ）（蛍光）、ｃｄｏｔｓ、ｐｄｏｔｓまたは同様なものである。複数の実施形態では、本ナノ粒子は、ＭＲＩ用の造影剤と蛍光光学的撮像用の造影剤との両方を含む。
【００８０】
補完的造影剤を含む単一構築物はアテローム性動脈硬化症に非常に役立つ可能性がある。蛍光（ＱＤ）プローブとＭＲＩ（ＩＯ）プローブとの両方を担持する能力を有するＮＰは独特のプラットフォームを表し、数例を挙げると、炎症性のアテローム性動脈硬化症、梗塞後の治癒、移植拒絶反応および初期の大動脈弁疾患の研究において広い前臨床用途を見出すことができる。この造影剤は、蛍光による高い撮像感度とＭＲＩによる高い空間分解能との両方の達成を可能にし、蛍光撮像の限られた撮像深度を補うのにも役立つ。脆弱なプラーク中のアポトーシスマクロファージ撮像を可能にするための、蛍光造影剤とＭＲＩ造影剤との両方を含む標的型単一ＮＰプラットフォーム（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ＮＰ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）は、脆弱な冠動脈プラークと関連した微少血栓の撮像等の多くの有望なヒト適用への門戸を開くのに役立つ可能性がある。
【００８１】
ＱＤおよびＩＯの両方を同じサイズ範囲でおよび類似のキャッピングリガンドで合成することができることから、このＮＰプラットフォームは均一になり、ＮＰの全体的な特性を大きく変更することなく成分の簡易交換を可能にすることができる。このプラットフォームを使用してｅｘ  ｖｉｖｏで見られるより高い蛍光シグナルの局在化領域は、ＭＲＩによりｉｎ  ｖｉｖｏで同定される脆弱なプラークと相関することから有用であり得る。
【００８２】
造影剤を任意の適切な方法でＮＰ中に組み込むことができる。複数の実施形態では、造影剤はコア中に組み込まれている、またはコア内に含まれている。複数の実施形態では、造影剤は、脂質、ポリマー、タンパク質または本ナノ粒子のその他の成分に繋留されている。そのような繋留を、本ナノ粒子のその他の成分（例えばターゲティング部分）に関して上記で説明したように実行することができる。
【００８３】
例として、本明細書で説明するように、ＱＤは、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤを生成するためにＰＬＧＡ−ＣＯＯＨに共役されたＱＤ共役アミン末端ＰＥＧ（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＱＤ）を形成するためにＰＥＧに共役されている。
【００８４】
造影剤は、任意の適切な量でナノ粒子中に存在することができる。複数の実施形態では、造影剤は、ナノ粒子の約０．０５重量％〜約２０重量％でナノ粒子中に存在する。
【００８５】
ＶＩ．治療薬
一部の実施形態では、本ナノ粒子は別の治療薬を有しておらず、ＨＤＬ成分および任意選択でアポＡ−１模倣成分を有する本ナノ粒子自体が治療薬として機能する。
【００８６】
しかしながら、ナノ粒子は、本明細書で説明するように、任意の１種または複数種の治療薬を含んでもよい。この治療薬は、本ナノ粒子のコア中に包埋されていてもよいし、このコア内に含まれていてもよい。好ましくは、この治療薬は所望の速度でコアから放出される。コアが公知のおよび十分に研究されているポリマー（例えばＰＬＧＡ）またはポリマーの組合せから形成されている場合、この放出速度を容易に制御することができる。
【００８７】
複数の実施形態では、治療薬またはこの前駆体は、ターゲティング部分に関して上記で説明した方法でポリマー、脂質等に共役されている。本ナノ粒子が標的部位（例えばアポトーシスマクロファージ）に到達した際に治療薬が放出され得るように、切断可能リンカーにより治療薬を共役させることができる。
【００８８】
治療薬は、任意の適切な濃度で本ナノ粒子中に存在することができる。例えば、治療薬は、本ナノ粒子の約０．０１重量％〜約２０重量％の濃度で本ナノ粒子中に存在することができる。
【００８９】
複数の実施形態では、本ナノ粒子は、血管プラーク、アテローム性動脈硬化症の処置に有用なまたは脂質恒常性の維持に有用な１種または複数種の治療薬を含む。例えば、ナノ粒子は、１種もしくは複数種のスタチン、１種もしくは複数種のフィブラートまたはこれらの組合せを含むことができる。適切なスタチンとして、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔｉｎ）、シンバスタチンおよびロバスタチンが挙げられる。適切なフィブラートとして、ベザフィブラート、フェノフィブラートおよびゲムフィブリゾル（ｇｅｍｆｉｂｒｉｚｏｌ）が挙げられる。複数の実施形態では、アトルバスタチンは、シンバスタチン、ロバスタチン、ベザフィブラート、フェノフィブラートまたはゲムフィブリゾルの内の１種または複数種との組合せで存在する。
【００９０】
一部の実施形態では、ナノ粒子は１種または複数種の抗酸化剤を含み、この抗酸化剤として、α−トコフェロールアセテート、グルタチオン、リポ酸、尿酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン、ｄ−α−トコフェロール、モノチオグリセロール、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、トコフェロール、アセトン亜硫酸水素ナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、システイン、ノルジヒドログアヤレチン酸（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｕｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソール、システイン塩酸塩、ジチオスレイトール、没食子酸プロピル、二亜硫酸ナトリウム、チオ尿素および同様なものが挙げられる。一部の実施形態では、ナノ粒子はＣｏＱ１０を含む。
【００９１】
複数の実施形態では、ナノ粒子は、ケノデオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｌｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）またはＰＣＳＫ９の別のリプレッサー（例えばｓｉＲＮＡ）を含む。ＰＣＳＫ９の抑制により、肝臓のＬＤＬ受容体分解が促進され、組み合わせて使用される場合にスタチンまたはフィブラートの有効性が増強され得る。
【００９２】
ＶＩＩ．ナノ粒子のサイズ
本明細書で説明するナノ粒子は任意の適切なサイズであることができる。通常、本ナノ粒子は直径の寸法が約９９９ナノメートル未満であり、例えば約７５０ｎｍ未満であり、約６００ｎｍ未満であり、約５００ｎｍ未満であり、約４００ｎｍ未満であり、約３００ｎｍ未満であり、または約２００ｎｍである。加えて、または或いは、本ナノ粒子は直径の寸法が約５ｎｍ超であることができる。複数の実施形態では、本ナノ粒子は直径が約３０ｎｍ〜約３００ｎｍである。複数の実施形態では、本ナノ粒子はサイズに従って分離され、例えば約２０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍまたは約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍに分離される。一部の実施形態では、本ナノ粒子の平均サイズは約５０ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲であり、例えば約７５ｎｍ〜約１５０ｎｍの範囲である。
【００９３】
本ナノ粒子のサイズは、適切な場合には、生体内分布およびミトコンドリア取込みに影響を及ぼす可能性がある一要素である。
【００９４】
ＶＩＩＩ．ゼータ電位
本明細書で説明するナノ粒子は、任意の適切なゼータ電位を有することができる。ゼータ電位は、コロイド系での界面動電位を指す用語である。ゼータ電位を直接測定することはできないが、ゼータ電位を、電気泳動移動度、動的電気泳動移動度または同様なものを使用して経験的に決定することができる。ゼータ電位は、ナノ粒子がミトコンドリア中で蓄積する能力において役割を果たすことができ、より高いゼータ電位は通常、ミトコンドリア中での蓄積の増加をもたらす。
【００９５】
一部の実施形態では、本明細書で説明するナノ粒子はゼータ電位が０ｍＶ超であり、例えば１０ｍＶ超、２０ｍＶ超、３０ｍＶ超または４０ｍＶ超である。ナノ粒子はゼータ電位が１００ｍＶ未満であることができる。一部の実施形態では、ナノ粒子はゼータ電位が約０ｍＶ〜約６０ｍＶの範囲であり、例えば約１０ｍＶ〜約５０ｍＶの範囲である。一部の実施形態では、ナノ粒子はゼータ電位が約４０ｍＶである。
【００９６】
生理学的条件下で帯電し得る任意の適切な部分は、親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分の一部であり得る、またはこれらに付着され得る。複数の実施形態では、この部分はポリマーの末端またはポリマーの親水性部分に存在している。当然のことながら、この部分は、末端以外の位置でポリマー骨格に直接的にまたは間接的に結合していてもよい。ミトコンドリア内膜全体にわたり維持される実質的に負の電気化学的電位に起因して、カチオンは、特に非局在化されている場合に、疎水性膜の横断およびミトコンドリアマトリックス中での蓄積で有効である。ミトコンドリアターゲティングを容易にすることが知られているカチオン性部分を、上記でより詳細に論じている。しかしながら、選択的なミトコンドリアターゲティングに特に有効ではないカチオン性部分がナノ粒子に含まれていてもよい、または親水性ポリマーもしくはポリマーの親水性部分に結合していてもよい。複数の実施形態では、アニオン性部分は、親水性ポリマーもしくはポリマーの親水性部分の一部を形成し得る、または親水性ポリマーもしくはポリマーの親水性部分に付着され得る。必要に応じて、ゼータ電位を調整するために、アニオン性部分またはアニオン性部分を含むポリマーをナノ粒子中に含めることができる。複数の実施形態では、親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分は、生理学的水性環境中に置かれた場合に酸素アニオンになり得るヒドロキシル基を含む。複数の実施形態では、ポリマーはＰＥＧ−ＯＨを含み、このＯＨは生理学的条件下で帯電部分として機能する。
【００９７】
ゼータ電位の役割に関する更なる考察を、２０１３年８月２２日に公開された「ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥＳ  ＦＯＲ  ＭＩＴＯＣＨＯＮＲＩＡＬ  ＴＲＡＦＦＩＣＫＩＮＧ  ＯＦ  ＡＧＥＮＴＳ」という標題の公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１３／０２６２９９号パンフレット中に見出すことができる。
【００９８】
ＩＸ．ナノ粒子の合成
本明細書で説明するナノ粒子を、任意の適切なプロセスで合成することができる、または構築することができる。好ましくは、プロセスによる変動を最小限に抑えるために、本ナノ粒子を単一工程で構築する。単一工程プロセスは、ナノ沈殿および自己構築を含むことができる。
【００９９】
通常、有機溶媒に、好ましくは沈殿に使用する水性溶媒中で混和性である溶媒に、疎水性成分を溶解させるまたは懸濁させることにより、本ナノ粒子を合成することができる、または構築することができる。複数の実施形態では、この有機溶媒としてアセトニトリルを使用するが、あらゆる適切な溶媒を使用することができる。親水性成分を適切な水性溶媒（例えば水、４重量％エタノールまたは同様なもの）に溶解させる。有機相溶液を水相溶液に滴下して、疎水性成分をナノ沈殿させて水性溶媒中での本ナノ粒子の自己構築を可能にすることができる。
【０１００】
本ナノ粒子を形成するのに適した条件を決定するプロセスは下記の通りであることができる。簡潔に言うと、官能化ポリマーおよびリン脂質を有機溶媒混合物に共溶解させることができる（複数の実施形態では、リン脂質または官能化リン脂質を水性溶媒に溶解させる）。この溶液を熱い（例えば６５℃の）水性溶媒（例えば水、４重量％エタノール等）に滴下することができ、この溶媒が蒸発するとすぐに、リン脂質で被覆された疎水性コアを有するナノ粒子が生成される。この段階で使用するリン脂質は、ＰＥＧ等の親水性ポリマー成分も含むことができる、非官能化リン脂質および官能化リン脂質（例えばターゲティング部分に共役している）の混合物であることができる。高（例えば＞７５％）レベルのターゲティング部分表面積載が達成されている一連の条件の時点で、造影剤または治療薬を、本ナノ粒子のナノ沈殿および自己構築に含めることができる。
【０１０１】
手動による混合で結果を望ましいように再現できない場合には、微小流体チャンネルを使用してもよい。
【０１０２】
（ａ）ポリマー溶液の組成を調節することにより、ならびに（ｂ）混合条件（例えば混合時間、温度および水の有機溶媒に対する比）を調節することにより、ＮＰ特性を調節することができる。合成に必要な処理工程の数と共にＮＰ特性の変動の可能性が高まる。
【０１０３】
生成されるナノ粒子のサイズを、疎水性コアの両親媒性シェル成分に対する比を変更することにより変えることができる。ＰＥＧ化脂質と二分子層を形成するリン脂質との選択が、生じるナノ粒子サイズに影響を及ぼす可能性がある。ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖により表面張力が付与されることから、小さいミセル構造を形成することが知られている。ポリマーの長さを変更することによっても、混合時間を変更することによっても、および有機の相に対する比を調整することによっても、ＮＰサイズを調節することができる。様々な長さのＰＬＡＧ−ｂ−ＰＥＧからのＮＰによる事前の経験から、ＮＰサイズは、短いポリマー（例えばＰＬＧＡ３０００−ＰＥＧ７５０）の場合の最小値約２０ｎｍから長いポリマー（例えばＰＬＧＡ１００，０００−ＰＥＧ１０，０００）の場合の最大値約１５０ｎｍまで増加し得ることが示唆される。そのため、ポリマー分子量はサイズを調整するのに役立つことができる。
【０１０４】
適切に帯電している末端基を有するポリマーを混合することにより、ＮＰ表面電荷を調節することができる。更に、様々な親水性ポリマー長を有するポリマー、分枝した親水性ポリマーを混合することにより、または疎水性ポリマーを添加することにより、組成および表面化学を調節することができる。
【０１０５】
形成すると、遠心分離、遠心限界ろ過または同様なものにより、本ナノ粒子を回収するおよび洗浄することができる。凝集が起こる場合には、ＮＰを、透析により精製することができる、より低速でより長い遠心分離により精製することができる、界面活性剤を使用して精製することができる、または同様にして精製することができる。
【０１０６】
回収すると、残留するあらゆる溶媒を除去して粒子を乾燥させることができ、このことは、成分のあらゆる早期の分解または放出を最小限に抑えるのに役立つはずである。ＮＰを、マンニトール等の増量剤を使用して凍結乾燥させてもよいし、使用前にその他の方法で貯蔵用に調製してもよい。
【０１０７】
ナノ粒子を合成するプロセスに関する有用な考察が、例えば２０１３年３月７日に公開されたＰＣＴ特許出願国際公開第２０１３／０３３５１３号パンフレット「ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ−ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥＳ」中におよび２０１３年８月２２日に公開された「ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥＳ  ＦＯＲ  ＭＩＴＯＣＨＯＮＲＩＡＬ  ＴＲＡＦＦＩＣＫＩＮＧ  ＯＦ  ＡＧＥＮＴＳ」という標題の公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１３／０２６２９９号パンフレット中に提示されている。
【０１０８】
Ｘ．使用
通常、本明細書で説明するナノ粒子をあらゆる適切な目的に使用することができる。本ナノ粒子を、可視化、撮像、モニタリング、診断または処置に使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で説明するナノ粒子を使用して、脂質恒常性の機能不全と関連する状態を処置する、または脂質恒常性を維持する。一部の実施形態では、本明細書で説明するナノ粒子を使用してアテローム性プラークを処置する。
【０１０９】
疾患の処置または予防を目的とする場合、有効量のナノ粒子を、必要とする対象に投与することができる。「有効量」とは、ナノ粒子を対象に投与した場合に有益な臨床転帰が達成されるナノ粒子の量のことである。対象に投与するナノ粒子の正確な量は、疾患または状態の種類および重症度と、対象の特徴（例えば全体的な健康、年齢、性別、体重および薬物耐性）とに依存するだろう。対象に投与するナノ粒子の正確な量は、疾患の程度、重症度および種類にも依存する可能性がある。当業者は、これらのおよびその他の因子に応じて適切な投与量を決定することができるだろう。開示するナノ粒子の有効量は、１日当たり約１ｍｇ／ｍｍ２〜１日当たり約１０グラム／ｍｍ２の範囲であることができる。当然のことながら、有効量はこの範囲外でもよい。
【０１１０】
様々な実施形態では、本明細書で説明するナノ粒子は、薬学的に許容される担体または希釈剤も含むことができる医薬組成物に含まれ得る。適切な薬学的に許容される担体は、好ましくはナノ粒子の生物学的活性を阻害しない不活性成分を含むことができる。薬学的に許容される担体は、好ましくは生体適合性（即ち非毒性、非炎症性、非免疫原性）であり、対象への投与時にその他の望ましくない反応を欠いている。標準的な医薬製剤化技術を用いることができ、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａで説明されている医薬製剤技術を用いることができる。投与する化合物の剤形を、選択した投与経路に従って変えることができる（例えば溶液、乳濁液、カプセル）。非経口投与に適した医薬担体として、例えば、滅菌水、生理食塩水、静菌性生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含む生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、リンゲル乳酸塩および同様なものが挙げられる。（例えば硬質ゼラチンまたはシクロデキストリンのコーティング中に）組成物を封入する方法は当分野で既知である（Ｂａｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９８６）。
【０１１１】
ナノ粒子を任意の適切な経路で投与することができ、例えば、カプセル、懸濁液もしくは錠剤で経口的にまたは非経口投与により投与することができる。非経口投与として、例えば、例えば筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射または腹腔内注射による全身投与を挙げることができる。本発明の化合物を、処置するがんの種類に応じて、経口的に（例えば食事により）、局所的に、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、経口吸入もしくは鼻腔内滴下）により、または直腸内に投与することもできる。
【０１１２】
定義
本明細書で使用する全ての科学用語および技術用語は、別途指定しない限り、当分野で一般に使用される意味を有する。本明細書に記載する定義は、本明細書で頻繁に使用されるある特定の用語の理解を容易にするためのものであり、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。
【０１１３】
本明細書および添付する特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が別途明確に規定しない限り、複数の指示対象を有する実施形態を包含する。本明細書および添付する特許請求の範囲で使用する場合、用語「または（ｏｒ）は、内容が別途明確に規定しない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む意味で通常は用いられる。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または同様なものはオープンエンドの意味で使用され、通常は「含むが限定されない」を意味する。「から本質的になる」、「からなる」および同様なものは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および同様なものに包含されることが理解されるだろう。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、「処置する」または同様なものは、疾患または状態の１種または複数種の症状を治癒する、予防する、または寛解させることを意味する。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、「脂質」はリン脂質を含む。
【０１１７】
「ペプチド」および「ポリペプチド」は本明細書において互換的に使用される。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、「疎水性」である化合物とは、水に不溶である化合物または水への溶解度が１マイクログラム／リットル未満である化合物のことである。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、「親水性」である化合物とは、水溶性である化合物または水への溶解度が１０ｍｇ／リットル超である化合物のことである。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、「結合する」、「結合している」または同様なものは、任意の適切な種類の結合（例えば共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力または同様なもの）により連結されている化学的実体を意味する。「結合する」、「結合している」および同様なものは、本明細書では、「付着する」、「付着している」および同様なものと互換的に使用される。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、ナノ粒子のコアに「付着している」部分に対する分子は、コア中に包埋され得る、コア内に含まれ得る、コアの少なくとも一部を形成する分子に付着され得る、コアに付着している分子に付着され得る、またはコアに直接付着され得る。従って、コアに付着している分子または部分（例えばＨＤＬ成分）は、コアに存在することができる、ナノ粒子の外表面に存在することができる、またはコアとナノ粒子の外表面との間に存在することができる。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、化合物の「誘導体」とは、誘導体になる化合物に構造的に類似する化合物のことである。多くの誘導体は機能的誘導体である。即ち、誘導体は通常、誘導体になる化合物に類似する所望の機能を有する。例として、本明細書では、マクロファージターゲティング部分としてマンノースを説明しており、なべならば、マンノースはマクロファージマンノース受容体に結合するからである。従って、機能的マンノース誘導体とは、マンノースと同じまたは類似の親和性でマクロファージマンノース受容体に結合することができるマンノース誘導体（例えば、マンノースの解離定数の約１００倍の範囲内（例えばマンノースの解離定数の約１０倍の範囲内）である解離定数を有する）のことである。更なる例として、本明細書では、ミトコンドリアターゲティング部分としてトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンを説明しており、なぜならば、ＴＰＰが、ミトコンドリアマトリックス中で、蓄積することができるからである、またはＴＰＰが結合している化合物もしくは複合体（例えばナノ粒子）を蓄積させることができるからである。従って、ＴＰＰの機能的誘導体とは、ＴＰＰと同様の濃度（例えば、約１００倍の濃度範囲内（例えば約１０倍の濃度範囲内））で、ミトコンドリアマトリックス中で、蓄積することができるまたは結合している化合物もしくは複合体を蓄積させることができるＴＰＰの誘導体のことである。
【０１２３】
下記では、代表的なナノ粒子、ナノ粒子を製造する方法、およびナノ粒子を使用する方法の様々な実施形態を説明する非限定的な実施例を示す。
【実施例】
【０１２４】
結果および考察
効率的なコレステロール流出用のミトコンドリア標的型ＨＤＬ模倣ＮＰ。Ｍａｒｒａｃｈｅ，Ｓ．；Ｄｈａｒ，Ｓ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１３，１１０，９４４５−９４５０で説明されているように、オレイン酸コレステロール（ＣＯ）と生分解性のおよびＦＤＡにより認可されたポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマーとを含む疎水性コアを有するミトコンドリア標的型ＨＤＬ模倣ポリマー−脂質ハイブリッドＮＰ（Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰ）が近年開発された（図１Ａ）。このコアは、ＣＯが包埋されている１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧ脂質層、Ａｃ−ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ（配列番号１）配列を有するアポＡ−Ｉ模倣Ｌ−４Ｆペプチド、ＩＭＭ全体にわたり存在する実施的に負のミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を利用することによるミトコンドリアターゲティング用の親油性非局在化ＴＰＰカチオンを有するステアリル−トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンで囲まれていた（図１Ｂ）。非標的型コントロール（ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰ）の場合、ステアリル−ＴＰＰの代わりにポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を使用した。これらのＮＰは１００〜１５０ｎｍのサイズ範囲であり、このサイズ範囲は、腎臓によるまたは血管外漏出による急速なクリアランスを回避するのに有利である天然ＨＤＬのサイズ範囲の約１０倍大きく、これらのＮＰは、有利な生体内分布（ｂｉｏＤ）および薬物動態（ｐＫ）パラメータを伴う長期循環を示した。ＮＰの分析により、天然ＨＤＬとの組成類似性が実証され、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰが非毒性および非免疫原性であることが分かった。Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰは、マクロファージのミトコンドリアを標的とする独特の能力を示しており、ミトコンドリア内では、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰはミトコンドリアマトリックス中でおよび膜間腔（ＩＭＳ）中で主に局在化しており、このことは、このＴ−ＨＤＬ−ＮＰが細胞内コレステロール輸送経路に関与し得る可能性を有することを示す。
【０１２５】
２２−（Ｎ−（７−ニトロベンザ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２３，２４−ビスノル−５−コレン−３β−オール（ＮＢＤ−コレステロール）での予備研究により、ミトコンドリア標的型（Ｔ）−ＨＤＬ−ＮＰのコレステロール結合特性が示された。本発明者らは、オレイン酸コレステロール（ＣＯ）のＰＬＧＡに対する比を変更することによりＴ−ＨＤＬ−ＮＰのライブラリを合成し、最大コレステロール結合に適したサイズおよびゼータ電位を伴う効果的なＣＯとアポＡＩとの積載比を決定した（図１Ｃ）。ＣＯの供給割合が増加するに伴い、ＣＯ積載％およびアポＡ−Ｉ積載％が増加し、ＣＯ供給量の増加によりＣＯ封入効率（ＥＥ）％が減少した（図１Ｄ、表Ｓ１）。しかしながら、このＮＰライブラリのサイズおよびゼータ電位の傾向は、適切な量のＰＬＧＡを添加することにより、適切なサイズおよび電荷を有する安定したＮＰを達成することができることを示した（図２Ａ、図Ｓ１、表Ｓ１）。ＰＬＧＡのＣＯに対する比を変更して、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰに関して説明した改変ナノ沈殿により、ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ、ＣＯ、ＰＶＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨおよび４Ｆペプチドから非標的型（ＮＴ）−ＨＤＬ−ＮＰのライブラリを構築した（表Ｓ２、図２Ｂ、図Ｓ２）。ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰは、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰで見られたのと同様のサイズ範囲を示したが、ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰは負のゼータ電位を有した。Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰのライブラリの形態を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で確認した（図２Ａ、図Ｓ３）。このライブラリでのＴＥＭ研究により、ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰ全体にわたり同様の形態が示された。Ｔ−ＨＤＬ  ＮＰの形態とＮＴ−ＨＤＬ  ＮＰの形態との比較により、同様のパターンが示された（図１、図２、図Ｓ１、図Ｓ３および図Ｓ４）。
【０１２６】
コレステロールの結合用のおよび流出用のＨＤＬ模倣ＮＰ。ＮＢＤ−コレステロールとＮＰライブラリとを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコレステロール結合アッセイにより、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰのコレステロール結合能力の効率を最大化するためのＣＯ：ＰＬＧＡの比に関する洞察を得た（図３Ａ）。時間依存性コレステロール結合アッセイは、ＰＬＧＡに対してＣＯ供給量％が低いＴ−ＨＤＬ−ＮＰが最も高いコレステロール結合能力を示すことを示した。ＣＯ供給量％が増加するに伴い、コレステロール結合特性が低下した（図３Ａ）。
【０１２７】
方程式：ＲＦＵ＝（Ｂｍａｘ＊［ＮＢＤ−コレステロール］）／（ｋｄ＋［ＮＢＤ−コレステロール］）を使用するＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェア中の「ｏｎｅ  ｓｉｔｅ  ｔｏｔａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ」機能により６時間の一定時点でＴ−ＨＤＬ−ＮＰから得た結合曲線を分析することによる結合定数（ｋｄ）の決定により、コレステロール結合が低ＣＯ供給量で高く、結合パターンが４０〜７０％のＣＯ供給量の範囲で中程度であることが示された（図３Ｂ）。ヒトＨＤＬ（ｈＨＤＬ）のＮＢＤ−コレステロール結合能力もコントロールとして役立つことを研究した（図３Ｃ）。ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰは、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰと比較して有意に低下したコレステロール結合特性を示した（図３Ｃ、図Ｓ５、図Ｓ６）。このことは、ミトコンドリア標的型ＨＤＬ模倣ＮＰの使用がコレステロール流出で有利であり得ることを更に支持した。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰ、Ｔ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰ、ＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰ、ＮＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰおよびｈＨＤＬのｋｄ値の比較から、ｈＨＤＬと比較しておよび対応するＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰと比べて有意に高いＴ−ＨＤＬ−ＮＰの優れたコレステロール結合能力が示された（図３Ｄ）。本発明者らはまた、金コアをベースとするＨＤＬ  ＮＰが、より低いナノモル濃度範囲の結合定数を有することが文献で報告されていることも強調したい。ＣＯ供給量が４０〜７０％であるＮＰは有利なＮＰサイズを示しており、従って、サイズおよびコレステロール結合を共に調べて、本発明者らは、本発明者らの将来の研究のために、ＣＯ供給量が４０％（Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰ）および７０％（Ｔ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰ）であるＮＰを使用することを決定した。ミトコンドリア標的型Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰは高マイクロモル濃度範囲で結合定数を示しており、この特性をｉｎ  ｖｉｖｏで有効なＲＣＴ特性へと変換することができた。
【０１２８】
本発明者らは、結合したＮＢＤ−コレステロールのＴ−ＨＤＬ−ＮＰからの放出動態を調べた（図３Ｄ）。結合したＮＢＤ−コレステロールのＴ−ＨＤＬ−ＮＰからの放出は、３７℃での７．４の生理的ｐＨ下における、ＣＯ供給量が７０％であるＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬＮＰと比較してより制御された様式で、ＣＯ含有量がより低いＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰが、結合したコレステロールを放出することを示した（図３Ｄ）。これら２種の製剤がコレステロール結合能力の差異および結合したコレステロールの異なる放出動態を示したことから、これら２種の製剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される場合に独特の治療可能性を示すことが独特であり得る。従って、本発明者らは、これら２種の製剤によるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの治療研究を実行することに決定した。
【０１２９】
泡沫細胞を使用するＴ−ＨＤＬ−ＮＰの治療可能性。動脈壁マクロファージ中でのコレステロール蓄積により泡沫細胞が形成される。この段階はアテローム発生の初期段階の１つである。泡沫細胞の形成中では、マクロファージ中でのコレステロールの流入および流出のバランスが機能不全になる。十分に維持されたコレステロール恒常性環境下では、コレステロールの流入と流出との間のバランスは、スカベンジャー受容体を介したコレステロールの流入と、過剰なコレステロールを流出すべく血管壁中の沈着マクロファージから肝臓へと輸送するためのＲＣＴを介した流出との制限に依存している。チトクロムＰ４５０コレステロール２７−ヒドロキシラーゼ、ＡＢＣトランスポーターおよび肝臓Ｘ受容体等の多くのタンパク質が共同してＲＣＴを達成する。ＲＣＴのある段階は、アポＡ−Ｉ含有ＨＤＬ等の血漿中での脂質欠乏分子へのコレステロールの移動である。マクロファージは、過剰なコレステロールの除去をＲＣＴに依存する。動脈壁中でのコレステロール蓄積の減少により、アテローム性動脈硬化症の発症を遅延させることができる、または予防することができる。本発明者らは、酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）により形成されるＲＡＷ２６４．７マクロファージ由来泡沫細胞上のＴ−ＨＤＬ−ＮＰのアテローム保護効果を調べた。ＲＡＷマクロファージをｏｘＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）で処置して泡沫細胞形成を誘発した（図４）。ｏｘＬＤＬの存在下でのマクロファージに由来する泡沫細胞は、初期のアテローム性病変の特徴と類似する炎症性シグナル伝達、コレステロール蓄積および酸化ストレスを示す。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰを使用し、分化の６時間前におよび６時間後にＮＰ処置を実行して、これらのＮＰの予防可能性および治療可能性の両方に関する洞察を得た。コントロールとして、治療的設定および予防的設定の両方下で、血液バンクから生成したヒト血漿から単離したｈＨＤＬを使用した。泡沫細胞に対するこれらのＮＰおよびｈＨＤＬの総コレステロール、トリグリセリド、抗炎症および抗酸化効果への影響を研究した（図４）。
【０１３０】
ＡｄｉｐｏＲｅｄを使用して細胞内トリグリセリドを染色し、Ｔ−ＨＤＬＮＰまたはｈＨＤＬの非存在下でおよび存在下で生細胞撮像を実施して泡沫細胞中の脂質滴を分析した（図５）。両方の処置方法は、これらの細胞中における脂質滴の生細胞撮像により見られるように、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰがマクロファージ中での脂質レベルを低下させる能力を有することを示した（図５）。両方の処置方法は、Ｔ−Ｃ４０−ＨＤＬ−ＮＰがマクロファージ中での脂質レベルを低下させる能力を有することを示した。Ｔ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰの脂質低下能力は、治療的処置下で見られる能力と比較して予防的設定下で良好であることが分かった（図５）。天然ｈＨＤＬは、治療的処置下で、より効率的な脂質低下プロファイルを示した（図５）。ＡｄｉｐｏＲｅｄアッセイを使用する細胞内トリグリセリド含有量の定量化を使用して、ｏｘＬＤＬの存在下で泡沫細胞へのマクロファージの分化の程度を定量化した（図６Ａ）。
【０１３１】
両方の処置方法は、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＭＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰが泡沫細胞へのマクロファージの分化を低下させる能力を有することを示した（図６Ａ）。天然ｈＨＤＬは治療的設定下でのみ、この分化を停止することができた（図６Ａ）。泡沫細胞中での活性酸素種（ＲＯＳ）レベルの定量化は、正常なマクロファージと比較して細胞中でのＲＯＳレベルの上昇を示した（図６Ｂ）。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰまたはｈＨＤＬによる泡沫細胞の処置により、泡沫細胞中でのＲＯＳレベルの上昇が減弱された。ＮＰによるＲＯＳレベルの低下は、天然ｈＨＤＬにより示される効果と同程度であった（図６Ｂ）。
【０１３２】
子ブタでのＴ−ＨＤＬ−ＮＰのＢｉｏＤおよびＰＫ。本発明者ら（Ｍａｒｒａｃｈｅ，Ｓ．；Ｄｈａｒ，Ｓ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１３，１１０，９４４５〜９４５０）は、Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるＴ−ＣＯ７５−ＨＤＬ−ＮＰのＰＫおよびｂｉｏＤの研究を既に報告しており、この研究は、有利なＰＫプロファイルおよびｂｉｏＤプロファイルを示した。ＴＨＤＬ−ＮＰは大部分が心臓中に分布していた。しかしながら、ブタの心臓はヒトにより類似している。ブタでの冠状動脈系による血液供給の分布は、ヒトの血液供給の分布とほぼ同一である。ブタでの心臓および血管のサイズは、イヌ、ウサギまたは非ヒト霊長類のいずれよりもヒトに類似している。これらは全て、治療結果に影響を及ぼすであろう因子であり、ブタで見られる結果をヒトへとより変換可能であることを示唆する。従って、本発明者らは、子ブタで、２種の注意深く選択した製剤Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰのＰＫ特性およびｂｉｏＤ特性を評価した。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタ（４週齢）に、検出用の量子ドット（ＱＤ）を含むＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰを全ＮＰに対して１．２５ｍｇ／ｋｇの用量（Ｃｄに対して４０％−ＣＯの場合には０．１８１ｍｇ／ｋｇおよび７０％−ＣＯの場合には０．１６５ｍｇ／ｋｇ）で静脈注射により投与した（図７Ａ）。本発明者らは、これらのＮＰ製剤で、ＱＤに共役したポリマーＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤを使用した。ＩＣＰ−ＭＳによるＣｄ用血漿サンプルの分析および１コンパートメント静脈内入力モデル（ｏｎｅ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｐｕｔ  ｍｏｄｅｌ）によるＰＫパラメータの定量化により、両方の製剤に関して非常に類似したＰＫプロファイルが明らかとなった（図７Ａ、表１）。両方の製剤は、長い流出半減期（ｔ１／２）、より低いクリアランス（ＣＬ）および非常に高い曲線下面積（ＡＵＣ）から明らかなように有利なＰＫパラメータを示した。加えて、最大血清濃度（Ｃｍａｘ）は、これらのＮＰが、子ブタなどのより大きな動物モデルにおいても非常に効果的に血流へと送達されることを示した。投与から２４時間後に動物を屠殺し、ｉｎ  ｖｉｖｏ撮像システム（ＩＶＩＳ）を使用する蛍光顕微鏡観察を実施することにより、および誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）による様々な臓器サンプル中でのＣｄの定量化により、ｂｉｏＤを研究した（図７Ａ）。ＩＶＩＳを使用する蛍光顕微鏡観察では、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬＮＰは大部分が大動脈中におよび心臓中に分布しており、Ｔ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰは大部分が心臓中に分布していることを示した（図７Ａ）。ＩＣＰ−ＭＳによる有意に異なる投与から２４時間後での組織（例えば脳、腎臓、心臓、大動脈、肝臓、肺および脾臓）中におけるＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰの分布プロファイルは、２種のＮＰ製剤の特異な分布を更に��持した（図７Ａ）。定量分析から、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰは大部分が大動脈中におよび心臓中に分布していることが分かり、注入用量（ＩＤ）の３０±６．５％を大動脈中で見出し、ＩＤの１３．３±１．１５％を心臓中で見出した（図７Ａ）。Ｔ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰは大部分が心臓中に分布しており、ＩＤの５１．６±４．７％を心臓中で見出し、ＩＤの１．４８±１．１７％のみを大動脈中で見出した。本発明者らはまた、脳、腎臓、心臓、大動脈、肝臓、肺および脾臓における組織１グラム当たりのＩＤ％（％ＩＤ／ｇ）の差異を観察した（図Ｓ７）。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰのこの特異な分布は、研究した全ての動物で一貫していた（図Ｓ８および図Ｓ９）。２種の製剤の特異な分布は、これらのＮＰが異なる治療プロファイルおよび脂質低下プロファイルを示す可能性があることを示した。
【０１３３】
子ブタでのＴ−ＨＤＬ−ＮＰによる脂質減少。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰで処置した子ブタの総コレステロールおよびトリグリセリドのレベルは非常に異なるプロファイルを示した（図７Ｂ）。両方のＮＰの投与後に時間依存性脂質プロファイルを分析した。Ｔ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰは４時間でコレステロールを一時的に減少させ、８時間後にレベルが処置前の状態に戻った。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置した子ブタでの総コレステロールは、２４時間後に劇的に減少した。この動物でのトリグリセリドレベルでも同様のパターンを観察した（図７Ｂ）。本発明者らは、大動脈中でのＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰのより高い保持、プラーク蓄積位置およびより効率的にコレステロールを取り込む能力が、コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルの低下での顕著な効率に関与している可能性があると考えている。
【０１３４】
子ブタでのＴ−ＨＤＬ−ＮＰの抗炎症特性。天然ＨＤＬは抗炎症特性を示すことが知られている。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰで処置した子ブタからの血漿サンプル中で、炎症促進性インターロイキン（ＩＬ）−６および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αサイトカインレベルおよび抗炎症性ＩＬ−１０レベルを測定した（図７Ｃ）。これら２種の製剤は異なる抗炎症特性を示した。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰによる炎症促進性サイトカインの減少はＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰと比べて低く、これらの製剤のいずれによってもＩＬ−１０レベルでは有意な変化を観測しなかった。これらの研究を正常なブタで２４時間だけ実行したことから、研究期間中ではおそらくベースラインのサイトカインレベルのみが存在し、そのため、これらのＮＰはＩＬ−１０レベルで変化を示さなかった。
【０１３５】
【表１】
2018500327.tif 000012
【０１３６】
アポＥ−／−マウスでの治療有効性。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰの治療有効性を、通常の飼料を給餌したアポＥ−／−マウスモデルで試験した。静脈内注射により１週間に２回（総ＮＰに対して）１０ｍｇ／ｋｇの用量でＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで動物を処置した。トリグリセリド、総コレステロール、ＬＤＬおよびＨＤＬを定量化することにより、処置間で血漿脂質レベルを比較した。結果を図Ｓ１０Ａに示す。
【０１３７】
生理食塩水、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの大動脈弁のオイルレッドＯ染色を図Ｓ１０Ｂに示す。生理食塩水、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの大動脈および心筋からの切断カスパーゼ−３−陽性領域の量を図Ｓ１０Ｃに示す。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からのＨ染色したおよびＥ染色した大動脈および大動脈弁を図Ｓ１０Ｆに示す。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの全ての主要な臓器のＨ染色画像およびＥ染色画像を図１０Ｅに示し、これらの画像は、有意な毒性がないことを示す。
【０１３８】
下記の表は、アポＥ−／−マウスでの治療有効性を試験する研究で使用したナノ粒子の特性を示す。
【０１３９】
【表２】
2018500327.tif 000013
【０１４０】
結論
本明細書で示すＮＰプラットフォームは、プラークマクロファージ中でＨＤＬ模倣物を局所的に蓄積させ、ミトコンドリアを標的にすることにより細胞内コレステロール代謝経路で機能させることにより、プラーク炎症を直接減少させることができた。コレステロールのミトコンドリアへの送達は、肝臓中でのコレステロール分解の律速段階である。従って、ミトコンドリア標的型ＴＨＤＬ−ＮＰは、過剰なコレステロールをサイトゾルからミトコンドリアへと運び、細胞外脂質恒常性および細胞内脂質恒常性の両方の維持で重要な役割を果たすことができる。この技術は、生体適合性ポリマーおよび脂質を使用して、合成ではあるが生分解性であるＨＤＬ模倣物を生成する。コレステロールは、細胞内において十分に説明されている多くの役割を果たすが、これらの役割を果たすためにコレステロールが重要な細胞小器官へとおよびこの細胞小器官からどのように移動するかはよく分かっていない。本明細書で示す技術は、細胞内脂質恒常性に関与している可能性を有する、合成であり生分解性であるミトコンドリア標的型ＨＤＬ模倣ＮＰである。
【０１４１】
実験セクション
動物。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタ（４週齢）をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆａｒｍから得て、Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ（ＡＷＡ）およびその他の適用可能な連邦政府のおよび州のガイドラインに従って取り扱った。本明細書に示す全ての動物研究は、米国のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の承認を受けた。
【０１４２】
ＣＯ供給量が様々なＴ−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰのライブラリの合成。改変ナノ沈殿によるＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ、ＣＯ、ステアリル−ＴＰＰ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨおよびアポＡ−１模倣Ｌ−４Ｆペプチドの自己構築により、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰを調製した。ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ（１０〜９０μＬ、ＣＨ３ＣＮ中に２５ｍｇ／ｍＬ）およびＣＯ（９０〜１０μＬ、ＤＭＳＯ／ＴＨＦ＝９：１中に２５ｍｇ／ｍＬ）を混合し、ＰＬＧＡおよびＣＯの合計体積を１００μＬにした。ＰＬＧＡポリマーに対する重量比が１６％であるステアリル−ＴＰＰ（５ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（１ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を、４％エタノール水溶液に溶解させた。ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰのライブライを調製するため、改変ナノ沈殿プロセス中に、ステアリル−ＴＰＰの代わりにＰＶＡ（４％水性エタノール中に５ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を使用した。この脂質溶液を６５℃に加熱し、全ての脂質を非集合状態にした。予め加熱した脂質溶液を激しく撹拌しつつＰＬＧＡ／ＣＯ溶液を滴下した。この混合溶液を３分にわたり激しくボルテックスし、その後室温で２時間にわたり激しく撹拌した。１００，０００Ｄａの分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心フィルタを使用してＮＰ溶液を３回洗浄することにより、残余の有機溶媒および遊離分子を除去した。ＮＰを、アポＡ−Ｉ模倣Ｌ−４Ｆペプチド（１ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）と共に４℃で１２〜１４時間にわたりインキュベートした。１００，０００Ｄａの分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心フィルタを使用してＮＰを更に３回洗浄して、未結合のペプチドを除去した。ＮＰサイズ（直径、ｎｍ）、ＰＤＩおよび表面電荷（ゼータ電位、ｍＶ）を、３回の独立した測定から得た。ＴＥＭ研究のために、ＮＰ溶液８μＬを水１８７μＬで希釈し、次いでこの溶液に４％酢酸ウラニル５μＬを添加してＮＰを染色した。この混合物を数秒にわたりボルテックスし、混合物４μＬを銅グリッド中に滴下してサンプルを乾燥させた。２００ｋＶで作動するＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ透過型電子顕微鏡でＴＥＭ画像を記録した。ＮＰ中のＱＤ積載をＩＣＰ−ＭＳにより定量化した。ＮＰ中に存在するコレステロールの量をＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイにより測定した。
【０１４３】
ＮＰ中でのコレステロールの定量化。ＮＰのコレステロール含有量をＡｍｐｌｅｘＲｅｄコレステロール定量化キットで定量化した。ＮＰ溶液（５０μＬ）を、ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ（３００μＭ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（０．２Ｕ／ｍＬ）、コレステロールオキシダーゼ（２Ｕ／ｍＬ）およびコレステロールエステラーゼ（０．２Ｕ／ｍＬ）で構成されているワーキング試薬溶液と共に暗所にて３７℃で３０分にわたりインキュベートした。５６０ｎｍの励起および５９０ｎｍの発光でプレートリーダーを使用して蛍光を測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、オレイン酸コレステロールの標準曲線を使用してコレステロール定量化に変換した。
【０１４４】
ＮＢＤ−コレステロール結合研究。ＤＭＦ中の様々な濃度のＮＢＤ−コレステロール（０、０．０００７８、０．００１５６、０．００３１２、０．００６２５、０．０１２５、０．０２５ｍｇ／ｍＬ）５μＬを、水中のＮＰ（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）９９５μＬに添加することにより、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰ、ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰおよびｈＨＤＬに結合するコレステロールを測定した。これらの溶液をボルテックスし、５分、３０分、１時間、６時間および２４時間にわたりインキュベートした。励起波長４７３ｎｍおよび５６０ｎｍの発光でプレートリーダーにより蛍光を定量化した。
【０１４５】
ＲＡＷマクロファージからの泡沫細胞の形成および予防。ＲＡＷマクロファージを、ＲＰＭＩ中に２．０×１０６個／ウェルの密度で２４ウェルプレート上に蒔き、コンフルエントまで増殖させた。培地を除去して脂質枯渇ＤＭＥＭ（１０％リポタンパク質欠乏ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）培地を添加し、細胞を更に２４時間にわたり増殖させた。予防的処置の場合、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰまたはｈＨＤＬ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加して６時間にわたり内部移行させた。培地を交換し、酸化ＬＤＬ（Ｏｘ−ＬＤＬ）（１００μｇ／ｍＬ）を補充した新鮮なＲＰＭＩを添加した。この細胞を２４時間にわたり更にインキュベートした。治療的泡沫細胞処置の場合、脂質欠乏培地による２４時間の処置後に、この培地を、Ｏｘ−ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩに置き換え、細胞を１２時間にわたりインキュベートした。その後、培地を除去し、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰまたはｈＨＤＬ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加して２４時間にわたり内部移行させた。両方の場合に培地を除去し、１×ＰＢＳで洗浄した（３回）。泡沫細胞を撮像するために、ＰＢＳ中のＡｄｉｐｏＲｅｄを各ウェルに添加して１０分にわたりインキュベートした。ＡｄｉｐｏＲｅｄを除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した（５回）。次いで、プレートを、相対蛍光単位に関してプレートリーダーで読み取った、または共焦点共焦点顕微鏡（ＴＲＩＴＣ、５００ｍｓ）で撮像した。
【０１４６】
泡沫細胞中でのＲＯＳ検出。ＲＡＷ２６４．７マクロファージを、ＲＰＭＩ中に２．０×１０６個の細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレート上に蒔き、コンフルエントまで増殖させた。培地を除去して脂質枯渇ＤＭＥＭ（１０％リポタンパク質欠乏ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）培地を添加し、細胞を更に２４時間にわたり増殖させた。培地を交換し、Ｏｘ−ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を補充した新鮮なＲＰＭＩを添加した。細胞を更に２４時間にわたりインキュベートした。脂質欠乏培地による２４時間の処置後に、この培地を、Ｏｘ−ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩに置き換え、細胞を１２時間にわたりインキュベートした。その後、この培地を除去し、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰまたはｈＨＤＬ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加して２４時間にわたり内部移行させた。その後、ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）のＲＰＭＩ溶液を添加し、暗所にて室温で３０分にわたりインキュベートした。培地を除去し、次いでＤＭＳＯを使用して細胞をホモジナイズした。次いで、細胞溶解物（５０μＬ）を９６ウェルプレートに移し、プレートリーダー（４８０ｎｍ励起、５３０ｎｍ発光）で蛍光を測定した。
【０１４７】
ブタ中でのＮＰのＢｉｏＤおよびＰＫ。イソフルオランを使用してＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタ（４週齢、１群当たり３匹）を麻酔した。耳介静脈中に留置した静脈内カテーテルにより、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰ、Ｔ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰ（総ＮＰに対して１．２５ｍｇ／ｋｇ、Ｃｄに対して４０％−ＣＯの場合０．１８１ｍｇ／ｋｇおよび７０％−ＣＯの場合０．１６５ｍｇ／ｋｇ）ならびに生理食塩水を投与した。注射の０時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後および２４時間後に血液サンプルをヘパリン化チューブ中に採取し、後で使用するまで４℃で保存した。血液サンプルを４℃にて２０分にわたり２０００ｒｐｍで遠心分離して、血漿を単離した。ブタの場合には血液が体重の３．５％を構成して血漿が血液量の５５％を構成することを考慮して、ＮＰからのＱＤの割合を算出した。血漿中におけるＱＤからのＣｄの量をＩＣＰ−ＭＳで算出した。注射の２４時間後、５％イソフルオランおよび酸素を使用して子ブタを麻酔し、次いでＣＯ２吸入により安楽死させた。ｂｉｏＤ研究では、心臓、大動脈、肺、肝臓、腎臓および脾臓を摘出し、後で使用するまで−８０℃で保存した。濃硝酸を穏やかに振とうしつつ５０℃で使用して、摘出した臓器の一部を溶解させた。ＩＣＰ−ＭＳで各臓器中でのＣｄの量を分析することにより、全体的なｂｉｏＤを算出した。また、心臓および大動脈を、１秒の曝露時間でＣｙ５．５発光および５００ｎｍ励起を使用するＩＶＩＳで撮像した。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアでＡＵＣ、Ｃｍａｘ、ＴｍａｘおよびＣＬ（ｔ＝０）を算出した。１コンパートメントモデル方程式を使用してデータをフィットさせることにより、ＰＫパラメータを決定した。
【０１４８】
ブタ血清サンプルによる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。製造業者のプロトコルに従って採取した各時点後に、サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αのレベルを測定した。使用前に、全ての化学物質および標準溶液を室温まで温めた。捕捉抗体プレコートストリップに、アッセイ希釈液（５０μＬ）を添加した。このストリップに、標準サンプルまたは血清サンプル（５０μＬ）を添加した。次いで、このプレートを添付の接着剤ストリップで密封し、オービタルシェーカー上で室温にて２時間にわたりインキュベートした。次いで、ウェルを吸引し、洗浄バッファー（各洗浄約３００μＬ）で５回洗浄した。次いで、新たに洗浄したプレートを、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＴＮＦ−α共役物（１００μＬ）のいずれかと共にインキュベートした。再度、それらを、オービタルシェーカー上で室温にて２時間にわたり添付の接着剤ストリップで密封した。溶液を吸引し、洗浄バッファーで５回洗浄した。次いで、ウェルを、暗所にて室温で３０分にわたり基質溶液（１００μＬ）と共にインキュベートした。３０分後、穏やかに混合しつつ停止溶液（１００μＬ）で反応を停止させて、均一溶液を確保した。次いで、４５０ｎｍでプレートリーダーを使用して、このプレートの吸光度を読み取った。
【０１４９】
ブタ血清サンプルによるトリグリセリド定量化。各時点で単離した血漿サンプル（５０μＬ）を、９６ウェルプレート中で室温にて２０分にわたりＡｄｉｐｏＲｅｄ（５μＬ）と共にインキュベートした。次いで、４８５ｎｍの励起波長および５７２ｎｍの発光波長でプレートの蛍光を読み取った。
【０１５０】
ブタの血清サンプルによるコレステロール定量化。ＡｍｐｌｅｘＲｅｄコレステロール定量化キットで血清コレステロール濃度を定量化した。各時点で単離した血漿サンプル（５０μＬ）を、暗所にて３７℃にて３０分にわたり、ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ（３００μＭ）、ＨＲＰ（０．２Ｕ／ｍＬ）、コレステロールオキシダーゼ（２Ｕ／ｍＬ）およびコレステロールエステラーゼ（０．２Ｕ／ｍＬ）で構成されているワーキング試薬溶液と共にインキュベートした。５６０ｎｍの励起および５９０ｎｍの発光でプレートリーダーを使用して蛍光を測定した。コレステロール参照標準の標準曲線を使用して、ＲＦＵをコレステロール濃度に変換した。
【０１５１】
統計。全てのデータを平均±Ｓ．Ｄ（標準偏差）として表した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアｖ．５．００を使用して統計解析を実施した。対応のないスチューデントｔ検定を使用して２つの値の比較を実施した。事後Ｔｕｋｅｙ検定（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙ  ｔｅｓｔ）による一元ＡＮＯＶＡを使用して、群間の有意差を同定した。
【０１５２】
補足情報
材料および器具類。特記しない限り、全ての化学物質を受け取り、更に精製することなく使用した。固有粘度が０．１５〜０．２５ｄＬ／ｇのＰＬＧＡ−ＣＯＯＨをＬａｃｔｅｌから購入した。オレイン酸コレステロール（ＣＯ）および硝酸をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｓｏｌｖａｂｌｅ（製品番号：６ＮＥ９１００）をＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから購入した。ＮＢＤ−コレステロール、ＱＤｏｔ  ７０５  ＩＴＫアミノＰＥＧ−ＱＤおよびＡｍｐｌｅｘＲｅｄコレステロール定量化キットをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。アポＡ−Ｉ模倣ペプチドＬ−４ＦペプチドＡｃ−ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ−ＣＯＯＨ（配列番号１）をＲＳ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓでカスタム合成し、ＭＡＬＤＩおよびＨＰＬＣでキャラクタライズした。カルボン酸１，２−ジステアロイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［カルボキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃから購入した。Ｍａｒｒａｃｈｅ，Ｓ．＆Ｄｈａｒ，Ｓ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０，９４４５−９４５０（２０１３）により既に説明されている方法に従って、ステアリルトリフェニルホスホニウムブロミド（ステアリル−ＴＰＰ）およびＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤを合成した。低分子量（平均分子量１０，０００〜２６，０００）のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（８６〜８９％が加水分解されている）をＡｌｆａ  Ａｅｓａｒから購入した。ＡｄｉｐｏＲｅｄをＬｏｎｚａから購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の超高純度リポ多糖（ＬＰＳ）をＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した。ヒト血漿由来の天然ＨＤＬ（ＢＴ−９１４）をＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。リポタンパク質欠乏ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＲＰ−０５６）および改変ヒトリポタンパク質酸化ＬＤＬ（ＲＰ−０４７）をＩｎｔｒａｃｅｌｌから入手した。ブタ研究用サイトカインを、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのブタＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットで測定した。ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）細胞内ＲＯＳアッセイキットを使用して活性酸素種（ＲＯＳ）を測定した。
【０１５３】
蒸留水を、０．２２μｍフィルタを含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｂｉｏｃｅｌ水精製システム（１８．２ＭΩ）に通して精製した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得たＣｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動細胞計数器を使用して細胞を計数した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳシステムを使用して動的光散乱（ＤＬＳ）測定を実行した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計を使用して光学測定を実行した。Ｐｈｉｌｉｐｓ／ＦＥＩ  Ｔｅｃｈｎａｉ  ２０顕微鏡を使用して、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を得た。誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）研究をＶＧ  ＰｌａｓｍａＱｕａｄ  ３  ＩＣＰ質量分析計で実施した。Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダーでプレートリーダー分析を実施した。Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４分析器（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して抗酸化ストレスアッセイを実行した。Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａシステムで心臓サンプルおよび大動脈サンプルの蛍光撮像を実行した。
【０１５４】
細胞株および細胞培養。マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。５％ＣＯ２中で３７℃にて、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳバッファーおよびピルビン酸ナトリウムを補充したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地中でＲＡＷ２６４．７細胞を増殖させた。細胞を２〜３日毎に通し、２０回の通貨に達すると凍結ストックから再開させた。
【０１５５】
ステアリル−ＴＰＰの合成。Ｍａｒｒａｃｈｅ，Ｓ．＆Ｄｈａｒ，Ｓ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０，９４４５−９４５０（２０１３）で既に報告されている下記の方法により、ステアリル−ＴＰＰを合成してキャラクタライズした。
【０１５６】
【表３】
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【０１５７】
【表４】
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【０１５８】
下記の表Ｘは、本明細書で示す教示に従って形成され得るナノ粒子のオレイン酸コレステロール（ＣＯ）のポリマーコア（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ／ＰＬＧＡ−ＣＯＯＣＨ３）に対する様々な比、ＣＯ対アポＡ１、アポＡ１対ポリマーコアおよびＣＯ対ＨＤＬ（全てをまとめる）を説明する。
【０１５９】
【表５】
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【０１６０】
【表６】
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【０１６１】
【表７】
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【０１６２】
通常、ＣＯのより低い割合により、ナノ粒子がコア中により多くのコレステロールを収容することが可能になることを本発明者らは発見した。
【０１６３】
そのため、脂質恒常性用のナノ粒子の実施形態を開示する。本明細書で説明するナノ粒子および方法は、開示するナノ粒子および方法以外の実施形態で実施され得ることを当業者は認識するだろう。開示する実施形態を、限定ではなく例示を目的として提示する。
【０１６４】
本明細書で言及した全ての雑誌論文、特許および公開特許出願は、本開示と矛盾しない限り、それぞれの全体が参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図Ｓ１】
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【図Ｓ２】
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【図Ｓ３】
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【図Ｓ４】
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【図Ｓ５】
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【図Ｓ６】
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【図Ｓ７】
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【図Ｓ８】
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【図Ｓ９】
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【図Ｓ１０Ａ】
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【図Ｓ１０Ｂ】
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【図Ｓ１０Ｃ．Ｓ１０Ｄ】
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【図Ｓ１０Ｅ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月10日(2017.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【図１】（パネルＡ）Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰの可能な構造的方向性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を示す略図である。（パネルＢ）合成Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰの構築で使用する、ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ（配列番号１）を含む様々な成分およびこれらの成分の構造を示す図である。（パネルＣ）Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰのライブラリを生成するための成分の変化を漫画で示す図である。（パネルＤ）Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイにより決定した、Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰライブラリ中のＣＯの積載割合および％ＥＥを示すグラフである。
【図２】Ｔ−ＨＤＬ  ＮＰおよびＮＴ−ＨＤＬ  ＮＰのライブラリのキャラクタリゼーションを示す図である。（パネルＡ）上部：ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ：ＣＯを変更したＴ−ＨＤＬ−ＮＰの流体力学直径、ゼータ電位およびＰＤＩ。下部：４０％および７０％のＣＯを供給したＴ−ＨＤＬ−ＮＰのＴＥＭ。（パネルＢ）上部：ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ：ＣＯを変更したＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰの流体力学直径、ゼータ電位およびＰＤＩ。下部：４０％および７０％のＣＯを供給したＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰのＴＥＭ。
【図３】（パネルＡ）ＣＯ供給量％を変化させたＴ−ＨＤＬＮＰライブラリの時間依存性ＮＢＤ−コレステロール結合プロファイルの比較を示すグラフである。ＲＦＵ：相対蛍光単位。（パネルＢ）Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰライブラリの６時間でのＮＢＤコレステロール結合定数の比較を示すグラフである。（パネルＣ）ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰおよびｈＨＤＬの選択した製剤の時間依存性ＮＢＤコレステロール結合プロファイルを示すグラフである。Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰ、ＮＴ−ＨＤＬＮＰおよびｈＨＤＬの選択した製剤の６時間でのＮＢＤ−コレステロール結合定数の比較。（パネルＤ）３７℃での７．４の生理的ｐＨ下における、結合したＮＢＤ−コレステロールのＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰからの放出を示すグラフである。
【図４】予防的設定下でおよび治療的設定下で泡沫細胞由来のマクロファージを使用して、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰのＲＣＴ模倣特性を研究するための実験的設計を示す図である。
【図５】共焦点顕微鏡を使用する、治療的設定下でのおよび予防的設定下での泡沫細胞中におけるＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰによる脂質減少を示す写真である。ＡｄｉｐｏＲｅｄを使用して細胞内脂質を染色し、生細胞撮像を実施した。代表的なＡｄｉｐｏＲｅｄ染色（赤色）は、ｏｘＬＤＬでの処置によるＲＡＷ２６４．７マクロファージからの泡沫細胞の形成を示した。予防的設定下でのｏＸＬＤＬの添加前に、および治療的設定下でのｏｘＬＤＬによる処置前に、ｈＨＤＬ、Ｔ−ＣＯ４−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰによる処置を実行した。スケールバー：２５μｍ。
【図６】ｏｘＬＤＬでの処置によるＲＡＷ２６４．７マクロファージからの泡沫細胞の形成を示すグラフである。予防的設定下でのｏｘＬＤＬの添加前に、および治療的設定下でのｏｘＬＤＬによる処置後に、ｈＨＤＬ、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬＮＰによる処置を実行した。（パネルＡ）ＡｄｉｐｏＲｅｄアッセイによる、治療的設定下でのおよび予防的設定下での泡沫細胞中におけるＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰによる脂質減少。ＡｄｉｐｏＲｅｄを使用して細胞内トリグリセリド内容物を染色し、プレートリーダーを使用して定量化した。（パネルＢ）Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰまたはｈＨＤＬによる処置後の、泡沫細胞形成およびその後の泡沫細胞中での酸化的ストレスの低下後のＲＯＳレベルの上昇。＊、＊＊、＊＊＊それぞれＰ値０．０１〜０．０５、０．００１〜０．０１および＜０．００１。ｎｓ：有意ではない。
【図７】（パネルＡ）正常なブタの、大動脈中でのＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰの蓄積および心臓中でのＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰの蓄積を示す図である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタを麻酔し、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰ（ＮＰに対して１．２５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。血漿サンプルおよび臓器サンプルのＩＣＰ−ＭＳ分析およびＩＶＩＳ分析によりＮＰを定量化して、ＰＫパラメータおよびｂｉｏＤプロファイルを決定した。＊＊＊の場合、Ｐ値＜０．００１、ｎｓ：有意ではない。（パネルＢ）Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰを投与した子ブタでの血漿の総コレステロールおよびトリグリセリドのレベルを示すグラフである。＊、＊＊、＊＊＊はそれぞれＰ値０．０１〜０．０５、０．００１〜０．０１および＜０．００１。ｎｓ：有意ではない。（パネルＣ）子ブタにおけるＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰの抗炎症特性の分析用のブタ血漿サンプルからのサイトカインシグナルを示すグラフである。＊＊、＊＊＊はそれぞれＰ値０．００１〜０．０１および＜０．００１。
【図Ｓ１】Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰの（パネルＡ）直径および（パネルＢ）ゼータ電位のＤＬＳプロットを重ね合わせて示すグラフである。
【図Ｓ２】ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰの（パネルＡ）直径、（パネルＢ）ゼータ電位、（パネルＣ）ＣＯの積載割合および（パネルＤ）ＣＯの封入効率（ＥＥ）割合のＤＬＳプロットを重ねて示すグラフである。
【図Ｓ３】Ｔ−ＨＤＬ−ＮＰのライブラリのＴＥＭ画像を示す写真である。
【図Ｓ４】ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰのライブラリのＴＥＭ画像を示す写真である。
【図Ｓ５】ＣＯ供給量％を変化させたＮＴＨＤＬ−ＮＰ（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）ライブラリの時間依存性ＮＢＤ−コレステロール結合プロファイルの比較を示すグラフである。ＲＦＵ：相対蛍光単位。
【図Ｓ６】ＮＴ−ＨＤＬ−ＮＰライブラリの６時間でのＮＢＤ−コレステロール結合定数の比較を示すグラフである。
【図Ｓ７】正常なブタの、大動脈中でのＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰの蓄積および心臓中でのＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰの蓄積を％ＩＤ／組織ｇの単位で示すグラフである。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタを麻酔し、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰ（ＮＰに対して１．２５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。ＩＣＰ−ＭＳでＮＰを定量化した。
【図Ｓ８】全ての動物からの心臓および大動脈の画像を示す写真である。イソフルオランを使用してＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタ（４週齢）を麻酔し、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰを耳介静脈ＩＶ経由で投与した。心臓全体および大動脈のＩＶＩＳ分析を実施することにより、ＮＰの分布を研究した。データは、各群からの全ての動物の画像を示す。
【図Ｓ９】全ての動物からの心臓および大動脈の画像を示す写真である。イソフルオランを使用してＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ子ブタ（４週齢）を麻酔し、Ｔ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰを耳介静脈ＩＶ経由で投与した。心臓全体および大動脈のＩＶＩＳ分析を実施することにより、ＮＰの分布を研究した。データは、各群からの全ての動物の画像を示す。
【図Ｓ１０Ａ】（Ａ）通常の飼料を給餌したアポＥ−／−マウスモデルでのＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰの治療有効性を示すグラフである。静脈内注射により１週間に２回（総ＮＰに対して）１０ｍｇ／ｋｇの用量でＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで動物を処置した。トリグリセリド、総コレステロール、ＬＤＬおよびＨＤＬを定量化することにより、処置間で血漿脂質レベルを比較した。
【図Ｓ１０Ｂ】（Ｂ）生理食塩水で処置したアポＥ−／−動物、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物およびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの大動脈弁のオイルレッドＯ染色を示す写真である。
【図Ｓ１０Ｃ．Ｓ１０Ｄ】（Ｃ）生理食塩水で処置したアポＥ−／−動物、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物およびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの大動脈および心筋からの切断カスパーゼ−３−陽性領域の量を示す写真である。（Ｄ）Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物およびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からのＨ染色したおよびＥ染色した大動脈および大動脈弁を示す写真である。
【図Ｓ１０Ｅ】（Ｅ）有意な毒性がないことを示す、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物およびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの全ての主要な臓器のＨ染色画像およびＥ染色画像を示す写真である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
一部の実施形態では、ポリマーはポリエステルであることができ、ポリエステルとして、乳酸単位およびグリコール酸単位を含むコポリマー、例えばポリ（乳酸−コ−グリコール酸）およびポリ（ラクチド−コ−グリコシド）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ））（本明細書ではまとめて「ＰＬＧＡ」と称する）；ならびにグリコール酸単位を含むホモポリマー（本明細書では「ＰＧＡ」と称する」）ならびに乳酸単位を含むホモポリマー、例えばポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチドおよびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド（本明細書ではまとめて「ＰＬＡ」と称する）が挙げられる。一部の実施形態では、例示的なポリエステルとして、例えば、ポリヒドロキシ酸；ＰＥＧ化ポリマーおよびラクチドとグリコシドとのコポリマー（例えばＰＥＧ化ＰＬＡ、ＰＥＧ化ＰＧＡ、ＰＥＧ化ＰＬＧＡ）ならびにこれらの誘導体が挙げられる。一部の実施形態では、ポリエステルとして、例えば、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、ＰＥＧ化ポリ（オルトエステル）、ポリ（カプロラクトン）、ＰＥＧ化ポリ（カプロラクトン）、ポリリシン、ＰＥＧ化ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ＰＥＧ化ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、ポリ［α−（４−アミノブチル−Ｌ−グリコール酸］およびこれらの誘導体が挙げられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
一部の実施形態では、ポリマーは炭水化物であることができる。一部の実施形態では、炭水化物は、当分野で既知であるように、グリコシド結合により結合している単糖（またはこの誘導体）を含む多糖であることができる。一部の実施形態では、炭水化物は、プルラン、セルロース、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシセルロース、メチルセルロース、デキストラン、シクロデキストラン、グリコーゲン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カラギーナン（ｃａｒａｇｅｅｎａｎ）、グリコン（ｇｌｙｃｏｎ）、アミロース、キトサン、Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン、アルギンおよびアルギン酸、キチン、コンニャク、グルコマンナン（ｇｌｕｃｏｍｍａｎｎａｎ）、プスツラン（ｐｕｓｔｕｌａｎ）、ヘパリン、ヒアルロン酸、カードランおよびキサンタンの内の１種または複数種であることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
当然のことながら、非カチオン性化合物はターゲティングおよびミトコンドリアマトリックス中での蓄積に役立つことができる。例として、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドは、ターゲティングおよびミトコンドリアマトリックス中でのナノ粒子の蓄積に役立つことができる。任意の適切なＳｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドを、ミトコンドリアマトリックスターゲティング部分として用いることができる。適切なＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドの非限定的な例として、下記に示す式ＶＩおよび式ＶＩＩ：
【化５】
2018500327.tif 000039
をそれぞれ有するＳＳ−０２およびＳＳ−３１が挙げられ、式ＶＩおよび式ＶＩＩ中、第二級アミン（示される場合）を、本ナノ粒子中への組み込み用のポリマー、脂質または同様なものに共役させることができる。加えて、または或いは、Ｓｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチド含有化合物は、コア中への組み込み用の疎水性部分（例えば長鎖アルカン）を含むことができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
ナノ粒子を任意の適切な経路で投与することができ、例えば、カプセル、懸濁液もしくは錠剤で経口的にまたは非経口投与により投与することができる。非経口投与として、例えば、例えば筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射または腹腔内注射による全身投与を挙げることができる。本発明の化合物を、処置するアテローム性動脈硬化の種類に応じて、経口的に（例えば食事により）、局所的に、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、経口吸入もしくは鼻腔内滴下）により、または直腸内に投与することもできる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
生理食塩水、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの大動脈弁のオイルレッドＯ染色を図Ｓ１０Ｂに示す。生理食塩水、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの大動脈および心筋からの切断カスパーゼ−３−陽性領域の量を図Ｓ１０Ｃに示す。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からのＨ染色したおよびＥ染色した大動脈および大動脈弁を図Ｓ１０Ｄに示す。Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰおよびＮＴ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰで処置したアポＥ−／−動物からの全ての主要な臓器のＨ染色画像およびＥ染色画像を図１０Ｅに示し、これらの画像は、有意な毒性がないことを示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
ＲＡＷマクロファージからの泡沫細胞の形成および予防。ＲＡＷマクロファージを、ＲＰＭＩ中に２．０×１０６個／ウェルの密度で２４ウェルプレート上に蒔き、コンフルエントまで増殖させた。培地を除去して脂質枯渇ＤＭＥＭ（１０％リポタンパク質欠乏ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）培地を添加し、細胞を更に２４時間にわたり増殖させた。予防的処置の場合、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰまたはｈＨＤＬ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加して６時間にわたり内部移行させた。培地を交換し、酸化ＬＤＬ（Ｏｘ−ＬＤＬ）（１００μｇ／ｍＬ）を補充した新鮮なＲＰＭＩを添加した。この細胞を２４時間にわたり更にインキュベートした。治療的泡沫細胞処置の場合、脂質欠乏培地による２４時間の処置後に、この培地を、Ｏｘ−ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩに置き換え、細胞を１２時間にわたりインキュベートした。その後、培地を除去し、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰまたはｈＨＤＬ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加して２４時間にわたり内部移行させた。両方の場合に培地を除去し、１×ＰＢＳで洗浄した（３回）。泡沫細胞を撮像するために、ＰＢＳ中のＡｄｉｐｏＲｅｄを各ウェルに添加して１０分にわたりインキュベートした。ＡｄｉｐｏＲｅｄを除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した（５回）。次いで、プレートを、相対蛍光単位に関してプレートリーダーで読み取った、または共焦点顕微鏡（ＴＲＩＴＣ、５００ｍｓ）で撮像した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
泡沫細胞中でのＲＯＳ検出。ＲＡＷ２６４．７マクロファージを、ＲＰＭＩ中に２．０×１０６個の細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレート上に蒔き、コンフルエントまで増殖させた。培地を除去して脂質枯渇ＤＭＥＭ（１０％リポタンパク質欠乏ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）培地を添加し、細胞を更に２４時間にわたり増殖させた。培地を交換し、Ｏｘ−ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を補充した新鮮なＲＰＭＩを添加した。細胞を更に２４時間にわたりインキュベートした。脂質欠乏培地による２４時間の処置後に、この培地を、Ｏｘ−ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩに置き換え、細胞を１２時間にわたりインキュベートした。その後、この培地を除去し、Ｔ−ＣＯ４０−ＨＤＬ−ＮＰまたはＴ−ＣＯ７０−ＨＤＬ−ＮＰまたはｈＨＤＬ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加して２４時間にわたり内部移行させた。その後、ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）のＲＰＭＩ溶液を添加し、暗所にて室温で３０分にわたりインキュベートした。培地を除去し、次いでＤＭＳＯを使用して細胞をホモジナイズした。次いで、細胞溶解物（５０μＬ）を９６ウェルプレートに移し、プレートリーダー（４８０ｎｍ励起、５３０ｎｍ発光）で蛍光を測定した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーコアと、
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）成分であって、前記ＨＤＬ成分の、前記コアを形成する１種または複数種のポリマーに対する重量比が１：９〜９：１の範囲である、ＨＤＬ成分と、
前記コアに付着しているミトコンドリアマトリックスターゲティング部分と
を含むナノ粒子。
【請求項２】
前記ＨＤＬ成分の、前記コアを形成する１種または複数種のポリマーに対する重量比が７５：２５以下の範囲である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ＨＤＬ成分の、前記コアを形成する１種または複数種のポリマーに対する重量比が７：３以下の範囲である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記ＨＤＬ成分の、前記コアを形成する１種または複数種のポリマーに対する重量比が１：４〜３：２の範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記ＨＤＬ成分の、前記コアを形成する１種または複数種のポリマーに対する重量比が２：３である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記コアは少なくとも一部がポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）で形成されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記コアがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ＨＤＬ成分がコレステロール部分を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ＨＤＬ成分がオレイン酸コレステロールを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
アポＡ−Ｉ模倣ポリペプチドを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記アポＡ−Ｉ模倣ポリペプチドがＬ−４Ｆポリペプチドを含む、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記アポＡ−Ｉ模倣ポリペプチドがＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記コアに付着しているリン脂質単分子層を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記リン脂質単分子層は、少なくとも一部がジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）部分もしくはこの誘導体またはカルジオリピンを含む化合物から形成されている、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記ミトコンドリアマトリックスターゲティング部分が、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）部分、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドおよびローダミンカチオンからなる群から選択される部分を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記ミトコンドリアマトリックスターゲティング部分がトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）部分またはこの誘導体を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
脂質恒常性の維持を必要とする対象の脂質恒常性を維持するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2018500327.tif 000040
【図２】
2018500327.tif 000041
【図３】
2018500327.tif 000042
【図４】
2018500327.tif 000043
【図５】
2018500327.tif 000044
【図６】
2018500327.tif 000045
【図７】
2018500327.tif 000046
【図Ｓ１】
2018500327.tif 000047
【図Ｓ２】
2018500327.tif 000048
【図Ｓ５】
2018500327.tif 000049
【図Ｓ６】
2018500327.tif 000050
【図Ｓ７】
2018500327.tif 000051
【図Ｓ８】
2018500327.tif 000052
【図Ｓ９】
2018500327.tif 000053
【図Ｓ１０Ａ】
2018500327.tif 000054
【図Ｓ１０Ｂ】
2018500327.tif 000055
【図Ｓ１０Ｃ．Ｓ１０Ｄ】
2018500327.tif 000056
【図Ｓ１０Ｅ】
2018500327.tif 000057
【国際調査報告】
2018500327.tif 000058
2018500327.tif 000059
2018500327.tif 000060