(57)【要約】  超分岐重合体は、超分岐疎水性分子コアと、超分岐疎水性分子コアの少なくとも3つの分岐にそれぞれ結合した低分子量ポリエチレンイミン鎖と、超分岐疎水性分子コアの他の少なくとも2つの分岐にそれぞれ結合したポリエチレングリコール鎖と、を含む。超分岐重合体の例は、超分岐ポリプレックスを形成するのに用いることができ、DNA又はRNA送達システムに含まれ得る。
2018517005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超分岐疎水性分子コアと、
前記超分岐疎水性分子コアの2つ以上の分岐にそれぞれ結合した低分子量ポリエチレンイミン鎖と、
前記超分岐疎水性分子コアの他の2つ以上の分岐にそれぞれ結合したポリエチレングリコール鎖と、
を含む超分岐重合体。
【請求項２】
前記超分岐疎水性分子コアが、少なくとも4個の末端ヒドロキシル基を含む超分岐ポリエステルである、請求項１に記載の超分岐重合体。
【請求項３】
前記低分子量ポリエチレンイミン鎖のそれぞれの分子量が、約400 g/mol〜約5,000 g/molの範囲である、請求項１に記載の超分岐重合体。
【請求項４】
ポリエチレングリコール鎖と、
前記ポリエチレングリコール鎖の末端に結合したポリエステル鎖と、
側鎖として前記ポリエステル鎖にそれぞれ結合した低分子量ポリエチレンイミン鎖と、
を含む直鎖状重合体。
【請求項５】
前記ポリエステル鎖が、ポリラクチド、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリ（ホスホエステル）、ポリ無水物及びポリグリコール酸からなる群より選択される、請求項４に記載の直鎖状重合体。
【請求項６】
前記低分子量ポリエチレンイミン鎖のそれぞれの分子量が、約400 g/mol〜約5,000 g/molの範囲である、請求項４に記載の直鎖状重合体。
【請求項７】
第1のポリエチレングリコール鎖群から形成された親水性内側部分と、
第2のポリエチレングリコール鎖群から形成された親水性外側部分と、
中心部分であって、
前記第1のポリエチレングリコール鎖群及び前記第2のポリエチレングリコール鎖群にそれぞれ結合した超分岐疎水性分子コア、
前記超分岐疎水性分子コアの2つ以上の分岐にそれぞれ結合した低分子量ポリエチレンイミン鎖、並びに、
前記低分子量ポリエチレンイミン鎖と複合体を形成したDNA生体分子又はRNA生体分子のうちのいずれか
から形成された前記中心部分と、
を含む超分岐ポリプレックス。
【請求項８】
前記RNA生体分子が、miRNA、mRNA及びsiRNAからなる群より選択される、請求項７に記載の超分岐ポリプレックス。
【請求項９】
前記超分岐疎水性分子コアが、少なくとも4個の末端ヒドロキシル基を含む超分岐ポリエステルである、請求項７に記載の超分岐ポリプレックス。
【請求項１０】
前記低分子量ポリエチレンイミン鎖のそれぞれの分子量が、400 g/mol〜5,000 g/molの範囲である、請求項７に記載の超分岐ポリプレックス。
【請求項１１】
前記DNA生体分子が、pDNA、cDNA、cpDNA、gDNA、msDNA、mtDNA及びrDNAからなる群より選択される、請求項７に記載の超分岐ポリプレックス。
【請求項１２】
生分解性高分子マトリックスと、
前記生分解性高分子マトリックスに埋め込まれた、複数の、請求項７に記載の超分岐ポリプレックスと、
を含む生物分解性球体。
【請求項１３】
足場又はヒドロゲルと、
前記足場又はヒドロゲルに付着した、複数の、請求項１２に記載の生物分解性球体と、
を含む生物分解性又は浸食性構造体。
【請求項１４】
前記足場が、ともに凝集させた複数のナノ繊維を含む多孔質材料と、前記複数のナノ繊維の少なくとも一部の間に画定された細孔と、から形成される、請求項１３に記載の生物分解性又は浸食性構造体。
【請求項１５】
超分岐ポリプレックスの製造方法であって、
超分岐ポリエステルのヒドロキシル基をカルボキシル基に変換することにより、第1の修飾超分岐ポリエステルを形成すること、ポリエチレングリコール鎖及びアジド基を前記第1の修飾超分岐ポリエステル上に導入して、第2の修飾超分岐ポリエステルを形成こと、低分子量ポリエチレンイミン鎖をそれぞれ前記第2の修飾超分岐ポリエステルに結合させることにより、超分岐重合体を形成することと、
前記超分岐重合体の溶液を形成することと、
前記超分岐重合体の前記溶液をDNA溶液又はRNA溶液のうちのいずれかと混合して、混合物を形成することと、
前記混合物をインキュベートすることによって、超分岐ポリプレックスを形成することと、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年4月2日に出願された米国仮出願第62/142,433号の利益を主張し、当該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載(STATEMENT REGARDING FEDERALLY SPONSORED RESEARCH OR DEVELOPMENT)
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)及び米国国立歯科衛生研究所(the National Institute of Dental and Craniofacial Research) (NIDCR)によって契約された助成番号DE015384、DE017689及びDE022327、並びに米国科学財団(NSF)によって契約された助成番号DMR-1206575の下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を保有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
（TGF-βシグナル伝達経路が中心的な役割を果たす）一部のヒトの疾患、例えば、癌、糖尿病、心臓病及び線維性椎間板変性症(fibrotic disc degeneration)では、一部のDNA及びRNA（例えば、マイクロRNA又はmiRNA、メッセンジャーRNA又はmRNA、及び低分子干渉RNA又はsiRNA）が驚くべき役割を果たすことが見いだされている。しかしながら、インビボにおけるDNA又はRNAの送達は、DNA若しくはRNAの特性、又はDNA若しくはRNAの担体システムにより困難であることがある。
【０００４】
例えば、miRNAとその模倣体又は阻害剤（すべて負に帯電している。）は、同様の電荷のクーロン反発により、細胞に侵入して標的遺伝子調節を達成するように、細胞膜（こちらも負に帯電している。）を容易に横断しないことがある。miRNAも、インビボにおいて急速に分解する。ウイルスベクターは、miRNAを効果的に細胞内に送達することができるが、ウイルス因子に対して有害な免疫反応があることがある。一部の非ウイルスベクターは、リポソーム小胞であって、インビトロにおいてRNAを細胞に効果的に輸送し、RNAを内部に封入した脂質二重層（リポプレックスと称する。）からなるリポソーム小胞を形成する。しかしながら、インビボでは、リポプレックスの導入効率は低い。化学修飾は、miRNA模倣体又はその阻害アンチセンスオリゴリボヌクレオチド（miRNA阻害剤）の安定性及び導入効率を向上させ得る。しかしながら、miRNA又はその阻害剤は、いわゆる「agomir」又は「アンタゴミル」を形成するように特異的に修飾される必要があり、これによって、アベイラビリティが低くなり、コストが高くなる。ポリマーベクターも、DNA及びsiRNAの担体用に探索されている。例えば、ポリエチレンイミン(PEI)とその直鎖状共重合体を利用して、miR-145及び／又はmiR-33aの送達を媒介することができる。しかしながら、高分子量（例えば、25000 g/mol）のPEIは、トランスフェクションに有効であるにもかかわらず、細胞に対して毒性があり、低分子量のPEIは毒性が低いだけでなく、導入効率も低いことが見いだされている。本明細書に用いられている「低分子量」とは、2000 g/mol以下を意味する。低分子量PEIの一部の具体例としては、1000 g/mol又は800 g/molが挙げられる。
【０００５】
別の例としては、オーファン核内受容体4A1（NR4A1、NUR77としても知られている。）を投与して、線維症を含む種々の疾患を治療することができる。しかしながら、NR4A1の経口投与によって、正常細胞（及び線維症による影響を受けた細胞）におけるTGF-βシグナル伝達が阻害され、これにより、非特異的毒性（すなわち、意図しない細胞に対する副作用）が生じることがある。
【発明の概要】
【０００６】
本開示の例の特徴は、次の詳細な説明及び図面を参照することによって明らかになり、同様の参照符号は、同一でない可能性があるが同様の構成要素に対応する。簡潔にするために、先述した機能を有する参照符号又は特徴は、これらが現れる他の図面に関して説明されていても、説明されていなくてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図1は、直鎖状重合体及び超分岐重合体、複合体を形成するDNA又はRNAと直鎖状重合体及び超分岐重合体との相互作用、並びにそれぞれのポリプレックスを形成する複合体の自己集合の例の概略図である。
【図２】図2は、本明細書に開示されている直鎖状重合体の例(PEG-PE-PEI)の合成の一例を示す。
【図３Ａ】図3Aは、ともに、本明細書に開示されている超分岐重合体の例(PEG-H20-PEI)の合成の一例を示す。
【図３Ｂ】図3Bは、ともに、本明細書に開示されている超分岐重合体の例(PEG-H20-PEI)の合成の一例を示す。
【図３Ｃ】図3Cは、ともに、本明細書に開示されている超分岐重合体の例(PEG-H20-PEI)の合成の一例を示す。
【図４】図4は、PEI-イン(PEI-yne)の合成の一例を示す。
【図５】図5は、ナノ繊維足場に固定されたポリプレックス埋込み型(polyplex-embedded)ポリ（ラクチド-co-グリコリド）(PLGA)マイクロスフィアからのmiRNAの二段階送達の概略図である。
【図６】図6は、高分子量ポリエチレンイミン(PEI)、低分子量PEI、並びに本明細書に開示されている直鎖状重合体及び超分岐重合体の複数の例についての細胞生存率(%)を示すグラフである。
【図７Ａ】図7Aはそれぞれ、直鎖状重合体とmiRNAとの自己集合複合体から形成されたポリプレックス、及び超分岐重合体とmiRNAの自己集合複合体から形成されたポリプレックスの透過型電子顕微鏡(TEM)の像である。
【図７Ｂ】図7Bはそれぞれ、直鎖状重合体とmiRNAとの自己集合複合体から形成されたポリプレックス、及び超分岐重合体とmiRNAの自己集合複合体から形成されたポリプレックスの透過型電子顕微鏡(TEM)の像である。
【図８】図8は、ポリプレックスの層／部分の厚さが示されている、タングステン(W)組込み型miRNAを有する超分岐重合体(PEG-H40-PEI)から形成されたポリプレックスの例のTEM像である。
【図９】図9は、GelRedを含む0.7%アガロースゲル上でトリス‐酢酸塩(TAE)泳動用緩衝液(pH8)を用いて80Vで45分間電気泳動させた、直鎖状重合体ポリプレックス（左の3つの画像）及び超分岐重合体ポリプレックス（右の3つの画像）の複数の例の、UV可視化(254 nm) RNAバンドの写真である。
【図１０Ａ】図10Aは、超音波処理前のリポフェクタミン/miRNAリポプレックスの動的光散乱(DLS)によって決定されたサイズ分布プロファイルである。
【図１０Ｂ】図10Bは、超音波処理後のリポフェクタミン/miRNAリポプレックスの動的光散乱(DLS)によって決定されたサイズ分布プロファイルである。
【図１０Ｃ】図10Cは、TEM（スケールバー、200 nm）によって特徴づけられた、超音波処理前のリポフェクタミン/miRNAリポプレックスの形態の像である。
【図１０Ｄ】図10Ｄは、TEM（スケールバー、200 nm）によって特徴づけられた、超音波処理後のリポフェクタミン/miRNAリポプレックスの形態の像である。
【図１１Ａ】図11Aは、超音波処理前のHP3/miRNAポリプレックスの動的光散乱(DLS)によって決定されたサイズ分布プロファイルである。
【図１１Ｂ】図11Bは、超音波処理前のHP3/miRNAポリプレックスの動的光散乱(DLS)によって決定されたサイズ分布プロファイルである。
【図１１Ｃ】図11Cは、TEM（スケールバー、100 nm）によって特徴づけられた、超音波処理前のHP3/miRNAポリプレックスの形態の像である。
【図１１Ｄ】図11Dは、TEM（スケールバー、100 nm）によって特徴づけられた、超音波処理後のHP3/miRNAポリプレックスの形態の像である。
【図１２Ａ】図12Aは、高分子量ポリエチレンイミン(PEI)、低分子量PEI、及びN/P比が10（RNAのリン酸塩Pに対するポリマーの窒素原子N）の直鎖状重合体/RNAポリプレックスと超分岐重合体(hyprbranched polymer)/RNAポリプレックスの複数の例の、DLSによって測定された粒径を示すグラフである。
【図１２Ｂ】図12Bは、高分子量ポリエチレンイミン(PEI)、低分子量PEI、及びN/P比が10（RNAのリン酸塩Pに対するポリマーの窒素原子N）の直鎖状重合体/RNAポリプレックスと超分岐重合体(hyprbranched polymer)/RNAポリプレックスの複数の例の、DLSによって測定されたゼータ電位を示すグラフである。
【図１３】図13は、ネイキッド(naked) miRNA、リポフェクタミン/miRNAリポプレックス、argomir miRNA、直鎖状重合体/miRNAポリプレックス、及び超分岐重合体/miRNAポリプレックスを有するPLGAマイクロスフィアのRNA捕捉効率を示すグラフである。
【図１４Ａ】図14Aは、HP3/miRNAポリプレックスが埋め込まれたPLGAマイクロスフィアの例を付着させた、ポリ（L-乳酸）(PLLA)足場の走査型電子顕微鏡(SEM)の像であり、黒色の輪郭線は、この後の図中に示す強調部分を特定している。
【図１４Ｂ】図14Bは、HP3/miRNAポリプレックスが埋め込まれたPLGAマイクロスフィアの例を付着させた、ポリ（L-乳酸）(PLLA)足場の走査型電子顕微鏡(SEM)の像であり、黒色の輪郭線は、この後の図中に示す強調部分を特定している。
【図１４Ｃ】図14Cは、HP3/miRNAポリプレックスが埋め込まれたPLGAマイクロスフィアの例を付着させた、ポリ（L-乳酸）(PLLA)足場の走査型電子顕微鏡(SEM)の像であり、黒色の輪郭線は、この後の図中に示す強調部分を特定している。
【図１４Ｄ】図14Dは、HP3/miRNAポリプレックスが埋め込まれたPLGAマイクロスフィアの例を付着させた、ポリ（L-乳酸）(PLLA)足場の走査型電子顕微鏡(SEM)の像であり、黒色の輪郭線は、この後の図中に示す強調部分を特定している。
【図１５】図15は、PLLA足場及びPLGAマイクロスフィアから放出される前後のHP3/miRNAポリプレックスの径を示すグラフである（* P＜0.05及び** P＜0.01）。
【図１６】図16は、LP3/miRNAポリプレックス又はHP3/miRNAポリプレックスを含むPLGA 6.5k又は64kマイクロスフィアからのmiRNA放出プロファイルを示すグラフである。
【図１７Ａ】図17Aは、インビトロにおける細胞とポリプレックスの複合体及び細胞とリポプレックスの複合体の、共焦点レーザ走査型顕微鏡の白黒像を示す。
【図１７Ｂ】図17Bは、インビトロにおける細胞とポリプレックスの複合体及び細胞とリポプレックスの複合体の、定量蛍光強度を示す。
【図１７Ｃ】図17Cは、インビトロにおける細胞とポリプレックスの複合体及び細胞とリポプレックスの複合体の、miRNA発現レベルを示す。
【図１８Ａ】図18Aは、インビトロにおけるPLGAマイクロスフィアから放出された細胞とポリプレックスの複合体及び細胞とリポプレックスの複合体を含む放出培地(release media)の、共焦点レーザ走査型顕微鏡の白黒像を示す。
【図１８Ｂ】図18Bは、インビトロにおけるPLGAマイクロスフィアから放出された細胞とポリプレックスの複合体及び細胞とリポプレックスの複合体を含む放出培地(release media)の、定量蛍光強度を示す。
【図１８Ｃ】図18Cは、インビトロにおけるPLGAマイクロスフィアから放出された細胞とポリプレックスの複合体及び細胞とリポプレックスの複合体を含む放出培地(release media)の、miRNA発現レベルを示す。
【図１９Ａ】図19Aは、インビボにおいて試験した細胞とポリプレックスの複合体及び細胞とリポプレックスの複合体の、共焦点レーザ走査型顕微鏡の白黒像を示す。
【図１９Ｂ】図19Bは、インビボにおいて試験した細胞とポリプレックスの複合体及び細胞とリポプレックスの複合体の、共焦点レーザ走査型顕微鏡の定量蛍光強度を示す。
【図１９Ｃ】図19Cは、インビボにおいて試験した細胞とポリプレックスの複合体及び細胞とリポプレックスの複合体の、miRNA発現レベルを示す。
【図２０】図20(a)は、HP3/miR-26a又は負の対照のポリプレックスを直接付着させた無細胞PLLA足場の、マイクロCT白黒画像並びにH&E染色画像である。図20(b)は、PLGA 6.5kマイクロスフィアに搭載したHP3/miR-26a又は負の対照のポリプレックスを付着させた無細胞PLLA足場の、マイクロCT白黒画像並びにH&E染色画像である。図20(c)は、PLGA 64kマイクロスフィアに搭載したHP3/miR-26a又は負の対照のポリプレックスを付着させた無細胞PLLA足場の、マイクロCT白黒画像並びにH&E染色画像である。
【図２０Ｄ】図20Dは、定量分析を示すグラフであり、それぞれ、図20A〜20Cにおいて用いられた群からの骨形成及び骨密度の量を示す。ここで、* P＜0.05、** P＜0.01、# P＜0.05、## P＜0.01である（図20A〜20Eにおいて、すべての実験は3回繰り返して行った。1群当たりn=5。データは平均±s.dである。スケールバー、5 mm（図20A〜20CのマイクロCT画像）、2.0 mm（図20A〜20C右側のH&E画像）、及び200 μm（図20A〜20C右端の高倍率H&E画像））。
【図２０Ｅ】図20Eは、定量分析を示すグラフであり、それぞれ、図20A〜20Cにおいて用いられた群からの骨形成及び骨密度の量を示す。ここで、* P＜0.05、** P＜0.01、# P＜0.05、## P＜0.01である（図20A〜20Eにおいて、すべての実験は3回繰り返して行った。1群当たりn=5。データは平均±s.dである。スケールバー、5 mm（図20A〜20CのマイクロCT画像）、2.0 mm（図20A〜20C右側のH&E画像）、及び200 μm（図20A〜20C右端の高倍率H&E画像））。
【図２１】図21は、種々のポリマー/pDNAのN/P比における直鎖状重合体（左）及び超分岐重合体（右）のDNAポリプレックスについてのアガロースゲル電気泳動遅延度アッセイを示すグラフである。
【図２２】図22は、モックコントロール(mock control)、及びmiR-140をトランスフェクションし、多孔質NF PLLA足場に接種した細胞の白黒により示した染色画像であり、細胞／足場構築物は、軟骨細胞培地(chondrogenic medium)で5週間培養した。
【図２３Ａ】図23Aは、フローサイトメトリーによって分析されたFoxp3+ T細胞の割合を示すグラフであり、miR-10aがTregsの分化を、0 μMのCD4+ T細胞において、11.81±0.19%まで促進したことを示し、P＜0.01である。
【図２３Ｂ】図23Bは、フローサイトメトリーによって分析されたFoxp3+ T細胞の割合を示すグラフであり、miR-10aがTregsの分化を、20 μMのCD4+ T細胞において、16.02±0.01%まで促進したことを示し、P＜0.01である。
【図２３Ｃ】図23Cは、フローサイトメトリーによって分析されたFoxp3+ T細胞の割合を示すグラフであり、miR-10aがTregsの分化を40 μMのCD4+ T細胞において、15.96±0.21%まで促進したことを示し、P＜0.01である。
【図２３Ｄ】図23Dは、フローサイトメトリーによって分析されたFoxp3+ T細胞の割合を示すグラフであり、miR-10aがTregsの分化を80 μMのCD4+ T細胞において、15.74±0.21%まで促進したことを示し、P＜0.01である。
【図２４】図24は、図23A〜23Dの結果をともに示すグラフである。
【図２５Ａ】図25Aは、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアのSEM像である。
【図２５Ｂ】図25Bは、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたナノ繊維海綿状マイクロスフィア(NF-SMS)（倍率1000倍）のSEM像である。
【図２５Ｃ】図25Cは、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたナノ繊維海綿状マイクロスフィア(NF-SMS)（倍率5000倍）のSEM像である。
【図２５Ｄ】図25Dは、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアを付着させたNF-SMS（倍率2000倍）のSEM像である。
【図２５Ｅ】図25Eは、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアを付着させたNF-SMS（倍率5000倍）のSEM像である
【図２６Ａ】図26Aは、トランスフェクションの48時間後にポリマー/NR4A1ポリプレックスをトランスフェクトした髄核(NP)細胞の共焦点レーザ走査型顕微鏡の白黒像を示し、それぞれ、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗体及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)によって、NR4A1（もとは緑色）及び核（もとは青色）を染色した。
【図２６Ｂ】図26Bは、トランスフェクションの48時間後にポリマー/NR4A1ポリプレックスをトランスフェクトした髄核(NP)細胞を示し、それぞれ、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗体及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)によって、NR4A1（もとは緑色）及び核（もとは青色）を染色した。
【図２６Ｃ】図26Cは、トランスフェクションの48時間後にポリマー/NR4A1ポリプレックスをトランスフェクトした髄核(NP)細胞の共焦点レーザ走査型顕微鏡の白黒像を示し、それぞれ、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗体及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)によって、NR4A1（もとは緑色）及び核（もとは青色）を染色した。
【図２６Ｄ】図26Dは、超分岐重合体のブランクベクターをトランスフェクトしたNP細胞の共焦点レーザ走査型顕微鏡の白黒像を示し、それぞれ、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗体及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)によって、NR4A1（もとは緑色）及び核（もとは青色）を染色した。
【図２６Ｅ】図26Eは、超分岐重合体のブランクベクターをトランスフェクトしたNP細胞の共焦点レーザ走査型顕微鏡の白黒像を示し、それぞれ、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗体及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)によって、NR4A1（もとは緑色）及び核（もとは青色）を染色した。
【図２６Ｆ】図26Fは、超分岐重合体のブランクベクターをトランスフェクトしたNP細胞の共焦点レーザ走査型顕微鏡の白黒像を示し、それぞれ、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗体及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)によって、NR4A1（もとは緑色）及び核（もとは青色）を染色した。
【図２６Ｇ】図26Gは、トランスフェクション後のNP細胞におけるNR4A1発現のリアルタイムPCRを示すグラフである（エラーバーは、平均の標準誤差を表し、* P＜0.05である。）。
【図２６Ｈ】図26Hは、トランスフェクション後のNP細胞におけるNR4A1発現のウエスタンブロットアッセイを示すグラフである。
【図２７】図27は、健常NP組織及び変性NP組織におけるNR4A1 mRNA発現の倍数変化を示すグラフである。
【図２８Ａ】図28Aは、TGF-β1（10 ng・ml-1）及び重合体/NR4A1ポリプレックス又は超分岐重合体のブランクベクターのいずれかとともにインキュベートしたヒトNP細胞における、α-平滑筋アクチン発現及びストレス線維形成の倍数変化を示すグラフである。
【図２８Ｂ】図28Bは、TGF-β1（10 ng・ml-1）及び重合体/NR4A1ポリプレックス又は超分岐重合体のブランクベクターのいずれかとともにインキュベートしたヒトNP細胞における、α-平滑筋アクチン発現及びストレス線維形成の倍数変化を示すグラフである。
【図２９Ａ】図29Aは、正常対照ラットの仙骨棘(caudal spine)の全体外観を表す。
【図２９Ｂ】図29Bは、正常対照ラットの仙骨棘(caudal spine)の全体外観を表す。
【図２９Ｃ】図29Cは、ラットの仙骨棘を穿刺し、超分岐重合体のブランクベクターを付着させたNF-SMSによって処理したもの、の全体外観を表す。
【図２９Ｄ】図29Dは、ラットの仙骨棘を穿刺し、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアを付着させたNF-SMSによって処理したものの全体外観を表す。
【図２９Ｅ】図29Eは、正常対照ラットの仙骨棘（図29E）のマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)画像である。
【図２９Ｆ】図29Ｆは、ラットの仙骨棘を穿刺し、処理しなかったもの（変性モデル群）のマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)画像である。
【図２９Ｇ】図29Gは、ラットの仙骨棘を穿刺し、超分岐重合体のブランクベクターを付着させたNF-SMSによって処理したもののマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)画像である。
【図２９Ｈ】図29Hは、ラットの仙骨棘を穿刺し、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアを付着させたNF-SMSによって処理したもののマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)画像である。
【図３０】図30(a)〜30(h)は、正常対照ラットの仙骨棘（図30a、30e）、ラットの仙骨棘を穿刺し、処理しなかったもの（変性モデル群）（図30b、30f）、ラットの仙骨棘を穿刺し、超分岐重合体のブランクベクターを付着させたNF-SMSによって処理したもの（図30c、30g）、並びに、ラットの仙骨棘を穿刺し、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアを付着させたNF-SMSによって処理したもの（図30d、30h）のヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色椎間板画像（倍率4倍及び20倍）である（スケールバー：図30a〜30d=250 μm、及び図30e〜30h=100 μm）。  図30(i)〜30(l)は、正常対照ラットの仙骨棘（図30i）、ラットの仙骨棘を穿刺し、処理しなかったもの（変性モデル群）（図30j）、ラットの仙骨棘を穿刺し、超分岐重合体のブランクベクターを付着させたNF-SMSによって処理したもの（図30k）、並びに、ラットの仙骨棘を穿刺し、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアを付着させたNF-SMSによって処理したもの（図30l）のサフラニンO染色椎間板画像（倍率4倍）である（スケールバー：図30i〜30l=250 μm）。
【図３１】図31(a)〜31(h)は、正常対照ラットの仙骨棘（図31a、31e）、ラットの仙骨棘を穿刺し、処理しなかったもの（変性モデル群）（図31b、31f）、ラットの仙骨棘を穿刺し、超分岐重合体のブランクベクターを付着させたNF-SMSによって処理したもの（図31c、31g）、並びに、ラットの仙骨棘を穿刺し、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアを付着させたNF-SMSによって処理したもの（図31d、31h）のマッソントリクローム染色椎間板画像（倍率4倍及び20倍）である（スケールバー：図31a〜31d=150 μm、及び図31e〜31h=60 μm）。図31(i)〜31(l)は、正常対照ラットの仙骨棘（図31i）、ラットの仙骨棘を穿刺し、処理しなかったもの（変性モデル群）（図31j）、ラットの仙骨棘を穿刺し、超分岐重合体のブランクベクターを付着させたNF-SMSによって処理したもの（図31k）、並びに、ラットの仙骨棘を穿刺し、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアを付着させたNF-SMSによって処理したもの（図31l）の免疫組織化学染色（コラーゲンI用）椎間板画像（倍率20倍）である（スケールバー：図31i〜31l=60 μm）。図31(m)〜31(p)は、正常対照ラットの仙骨棘（図31m）、ラットの仙骨棘を穿刺し、処理しなかったもの（変性モデル群）（図31n）、ラットの仙骨棘を穿刺し、超分岐重合体のブランクベクターを付着させたNF-SMSによって処理したもの（図31o）、並びに、ラットの仙骨棘を穿刺し、ポリマー/NR4A1ポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアを付着させたNF-SMSによって処理したもの（図31p）の免疫組織化学染色（α-SMA用）椎間板画像（倍率20倍）である（スケールバー：図31m〜31p=60 μm）。
【図３２】図32(a)〜32(f)は、24時間の細胞接種前（図32a）及び接種後（図32d）のナノ繊維海綿状マイクロスフィア、24時間の細胞接種前（図32b）及び接種後（図32e）のナノ繊維マイクロスフィア、並びに、24時間の細胞接種前（図32c）及び接種後（図32f）の固体マイクロスフィアのSEM像である（球体の径は30〜60 μmの範囲であり、スケールバー：図32a〜32c=20 μm、及び図32d〜32f=10 μm）。
【図３３】図33(a)〜33(i)は、第1の対照群（図33a、33d及び33g）、第2の対照群（図33b、33e及び33h）、並びに8週間の皮下埋め込み後の細胞/PLGA NS/NF-SMS構築物（図33c、33f及び33i）の、H&E染色画像（図33a〜33c）、サフラニンO染色画像（図33d〜33f）、並びにフォンコッサ染色画像（図33g〜33i）である（スケールバー：50 μm）。
【図３４】図34(a)〜34(d)は、正常対照ウサギの腰椎（図34a）、ウサギの腰椎を穿刺し、処理しなかったもの（偽群）（図34b）、ウサギの腰椎を穿刺し、NF-SMS及び超分岐重合体のブランクベクターによって処理したもの（図34c）、並びに、ウサギの腰椎を穿刺し、NF-SMS及びポリマー/抗miR199aポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアによって処理したもの（図34d）の全体外観を表す。図34e〜34hは、正常対照ウサギの腰椎（図34e）、ウサギの腰椎を穿刺し、処理しなかったもの（偽群）（図34f）、ウサギの腰椎を穿刺し、NF-SMS及び超分岐重合体のブランクベクターによって処理したもの（図34g）、並びに、ウサギの腰椎を穿刺し、NF-SMS及びポリマー/抗miR199aポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアによって処理したもの（図34h）のマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)画像である。
【図３５】図35は、正常対照ウサギの腰椎、ウサギの腰椎を穿刺し、処理しなかったもの（偽群）、ウサギの腰椎を穿刺し、NF-SMS及び超分岐重合体のブランクベクターによって処理したもの、並びに、ウサギの腰椎を穿刺し、NF-SMS及びポリマー/抗miR199aポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアによって処理したものの骨棘の骨量を示すグラフである。
【図３６】図36(a)〜36(p)は、正常対照ウサギの腰椎（図36a、36e、36i及び36m）、ウサギの腰椎を穿刺し、処理しなかったもの（図36b、36f、36j及び36n）、ウサギの腰椎を穿刺し、NF-SMS及び超分岐重合体のブランクベクターによって処理したもの（図36c、36g、36k及び36o）、並びに、ウサギの腰椎を穿刺し、NF-SMS及びポリマー/抗miR199aポリプレックスが埋め込まれたPLGAナノスフィアによって処理したもの（図36d、36h、36l及び36p）の、H&E染色画像（図36a〜36d及び図36m〜36p）並びにサフラニンO画像（図36e〜36l）である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
本明細書には、インビボ及びインビトロにおいて細胞へDNA又はRNAを送達するポリマーベクターとして機能することが可能な直鎖状重合体及び超分岐重合体が開示されている。直鎖状重合体と超分岐重合体は、ともに、低分子量のカチオン性PEI、直鎖状又は超分岐ポリエステル、及びポリエチレングリコール(PEG)鎖を組み合わせた共重合体である。直鎖状重合体と超分岐重合体は、ともに、DNA又はRNAと複合体を形成するとともに、球状構造体（すなわち、ポリプレックス）に自己集合することが可能である。球状構造体は、生分解性高分子に埋め込まれて、生分解性マイクロスフィア又はナノスフィアを形成することができ、これによって、DNA又はRNAの徐放を呈する。埋め込まれたマイクロスフィア又はナノスフィアは、二段階遺伝子送達戦略をもたらし、第1段階時に球体からポリプレックスが放出され、第2段階時にポリプレックスが細胞に入る。この二段階遺伝子送達戦略によって、持続時間が制御可能になるとともに、高い導入効率が可能になる。
【０００９】
生物分解性マイクロスフィア又はナノスフィアは、生分解性又は侵食性の支持システム又は構造体（例えば、ナノ繊維足場、ナノ繊維海綿状マイクロスフィア、他の多孔質材料、若しくはヒドロゲル）と混合するか又はこれらに固定することもできる。生分解性の支持システム又は構造体に生分解性マイクロスフィア又はナノスフィアを局在化させることによって、外因性細胞を導入することなく、内因性細胞を空間的及び時間的に制御して、骨、組織などを再生することができる。これによって、オフターゲット細胞におけるDNA又はRNAの意図しない送達を有効に防止することができる。
【００１０】
ここで図1を参照すると、直鎖状重合体10及び超分岐重合体10'、並びに直鎖状重合体及び超分岐重合体から形成されたポリプレックス20、20'の概略図が描写されている。直鎖状重合体10には、親水性PEG鎖12と、親水性PEG鎖12に結合した直鎖状疎水性鎖14と、直鎖状疎水性鎖14に結合した低分子量PEI鎖16と、が含まれている。超分岐重合体10'には、超分岐疎水性分子コア14'と、超分岐疎水性分子コア14'の2つ以上の分岐にそれぞれ結合した低分子量PEI鎖16と、超分岐疎水性分子コア14'の他の2つ以上の分岐にそれぞれ結合した親水性PEG鎖12と、が含まれている。
【００１１】
親水性PEG鎖12には、2〜50,000の繰り返しエチレンオキシド単位が含まれ得る。例において、親水性PEG鎖12には、2〜1,000の繰り返しエチレンオキシド単位が含まれていてもよい。
【００１２】
直鎖状疎水性鎖14は、生分解性ポリエステルである。生分解性ポリエステルの一部の例としては、ポリラクチド、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリ（ホスホエステル）、ポリ無水物及びポリグリコール酸が挙げられる。
【００１３】
超分岐疎水性分子コア14'は、少なくとも4個の末端ヒドロキシル基を含む超分岐脂肪族ポリエステルである。超分岐疎水性分子コア14'の複数の例を以下に示す。
【００１４】
【化１】
2018517005.tif 000003
【００１５】
【化２】
2018517005.tif 000004
【００１６】
【化３】
2018517005.tif 000005
【００１７】
超分岐疎水性分子コア14'の別の例は、超分岐ビス-MPAポリエステル-8-ヒドロキシル（第1世代）である。
【００１８】
低分子量PEI（ポリエチレンイミン）鎖16の分子量は、約400 g/mol〜約5,000 g/molの範囲である。例において、PEI鎖16の低分子量は、約800 Da（すなわち、800 g/mol）である。
【００１９】
直鎖状重合体10の形成方法の例を図2に示す。この例において、PEG-P(N3CL-CL)（式中、CLはカプロラクトン）が、開始剤としてのPEG及びバルクの触媒としてSn(Oct)2を用いて、α-N3-ε-CL及びε-CLを開環重合(ROP)することにより合成される。次いで、クリックケミストリー（クリック）により、PEG-P(N3CL-CL)をPEI-イン（ニトリル末端基に結合したPEI）と結合させて、PEG-PE-PEI（直鎖状重合体10の一例）を得る。図2では、r=2〜50,000、p=2〜20,000、q=2〜20,000、s=1〜20,000、t=1〜20,000、m=2〜200、及びn=2〜200である。
【００２０】
超分岐重合体10'の形成方法の例を図3A〜3Cに示す。この例において、超分岐ビス-MPAポリエステル（H20:16ヒドロキシル）のヒドロキシル基は、室温において無水コハク酸との反応により、カルボキシル基に移行する（図3A）。次いで、アジド(azido)（すなわち、アジド(azide)）基及びPEG鎖が、（N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)及びp-ジメチルアミノピリジン(DMAP)中）室温（例えば、約18℃〜約25℃）においてH20-COOHのカルボキシル基と、2,2-ビス（アジドメチル）プロパン-1,3-ジオールのヒドロキシル基と、PEGの縮合反応により、修飾H20 (H-20-COOH)に結合する。これによって、図3Bに示されているようなPEG-H20-N3が形成される。図3Cに示されているように、クリックケミストリー（クリック）により、PEI-インをPEG-H20-N3に結合させて、PEG-H20-PEI（超分岐重合体10'の一例）を得る。図3A〜3Cでは、r=2〜50,000、m=2〜200、及びn=2〜200である。形成された超分岐重合体10'は、約20%〜約80%、又は約30%〜約70%の親水性PEG鎖12から構成され得る。
【００２１】
直鎖状重合体10又は超分岐重合体10'のいずれかの合成に用いられるPEI-インは、図4に示されている方法によって形成することができる。この例では、室温においてプロパルギルアルコールを1,1'-カルボニルジイミダゾール(CDI)と反応させて、カルボニルイミダゾールのプロパルギルエステル(PPA-CI)を得る。次いで、ポリエチレンイミン（PEI、分子量800 Da）をPPA-CIと反応させて、PEI-インを生成する。本明細書に示されている範囲内の他の分子量のポリエチレンイミンを用いてもよいことが理解される。
【００２２】
ポリエステルは不安定であり、アミノ化合物PEIと反応させると、分解する可能性があるため、図4と2及び図4と3に示されている合成の組合せは、クリックケミストリーによる穏やかな反応条件を用いて設計されている。穏やかな条件には、室温及び撹拌が含まれる。穏やかな反応条件によって、望ましくないポリマー分解を伴わずに、カチオン性重合体PEIをポリエステルに結合させることができる。
【００２３】
図1に戻り参照すると、直鎖状重合体10又は超分岐重合体10'は、DNA又はRNA 18と複合体を形成し得る。RNAの例としては、miRNA、mRNA及び／又はsiRNAが挙げられる。DNAの例としては、pDNA、cDNA、cpDNA、gDNA、msDNA、mtDNA及び／又はrDNAが挙げられる。DNA又はRNA 18は、静電相互作用によって、直鎖状重合体10又は超分岐重合体10'の低分子量PEI 16に結合する。
【００２４】
図1に描写されているように、直鎖状重合体10又は超分岐重合体10'及びDNA又はRNA 18の自己集合によって、直鎖状重合体ポリプレックス20及び超分岐重合体ポリプレックス20'を形成することができる。ポリプレックス20、20'は、直鎖状重合体10又は超分岐重合体10'の溶液を、DNA又はRNA 18の溶液に加えることによって、形成することができる。両方の溶液は、水ベースの溶液であり得る。合わせた混合物を、室温（例えば、約18℃〜約25℃）において所定時間（例えば、少なくとも約30分間）インキュベートする。図1に示されているように、ポリプレックス20、20'は球状であり得る。ポリプレックス20は、PEG鎖12に囲まれた固体球であるのに対して、ポリプレックス20'は、内側PEG鎖12と外側PEG鎖12との間に挟まれた球状中心部分であり得る。
【００２５】
具体的には、直鎖状重合体10及びDNA又はRNA 18が自己集合する場合、生体適合性親水性PEG鎖12は、ポリプレックス20の内側部分を保護するように外殻を形成することができる。ポリプレックス20の内側部分には、直鎖状疎水性（例えば、ポリエステル）鎖14と、低分子量PEI鎖16と、複合化(complexed)DNA又はRNA 18と、が含まれている。加えて、超分岐重合体10'及びDNA又はRNA 18が自己集合する場合、超分岐疎水性分子コア14'、低分子量PEI鎖16、及び複合化DNA又はRNA 18は、中心部分22であって、第1の親水性PEG鎖群12（ポリプレックス20'の親水性内側部分を構成する。）と、第2の親水性PEG鎖群12（ポリプレックス20'の親水性外側部分を構成する。）との間に挟まれた中心部分22を形成する。
【００２６】
自己集合超分岐重合体10'は、二重殻様電荷(double shell-like charge)分布であって、毒性（電荷密度）を低下させ、そしてDNA又はRNA 18への電荷の利用可能性を増加させ得る二重殻様電荷分布を形成する。このため、（ポリプレックス20'の形態の）超分岐重合体10'は、DNA又はRNA 18送達担体として機能することが好適であり得る。
【００２７】
ポリプレックス20、20'は、生分解性高分子マトリックス内に封入され、生分解性球体を形成することができる。一つには、封入材料は徐放持続時間を可能にするため、封入は、現在のDNA又はRNA送達システムの制御されない持続時間による欠点を克服し得る。
【００２８】
これらの生分解性球体は、ナノスケール寸法（1 nmから最大1000 nm）、又はミクロンスケール寸法（例えば、1 μm〜約100 μm）を有し得る。封入は、二重エマルジョン法、例えば水中油中水型二重エマルジョンによって行うことができる。また、封入は、例えば、単純なエマルジョン法、押出、相分離、噴霧乾燥などによっても行うことができる。
【００２９】
生分解性高分子マトリックスとして、あらゆる適切な生分解性又は浸食性材料を用いることができ、例えば、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）（ポリ（ラクチド-co-グリコリド）(PLGA)としても知られている。）を用いてもよい。生分解性高分子の他の適切な例としては、ポリ（L-乳酸）(PLLA)、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ酸無水物、ポリ（オルトエーテル）、ポリカプロラクトン、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（プロピレンフマレート)、ポリホスファゼン、ポリカーボネート、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、これらの共重合体、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
生分解性球体はそのまま用いてもよいし、支持構造体と混合しても、支持構造体に固定してもよい。支持構造体の例としては、ともに凝集させた複数のナノ繊維と、ナノ繊維の少なくとも一部の間に画定された細孔と、から形成された足場が挙げられる。ナノ繊維は、細胞外マトリックス(ECM)の構造を模倣するため、組織再生を促進し得る。加えて、足場は、遺伝子送達ビヒクル搭載効率(gene delivery vehicle-loading efficiency)を増加させる可能性があり、分解産物の量を減少させ、細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用を促進し、そして、ともに相乗的に組織再生及び宿主との一体性を高める栄養素及び代謝性老廃物移動の容易な経路を提供する。
【００３１】
足場の一具体例は、ナノ繊維足場と称する。ナノ繊維足場は、規則的な球状マクロスケール細孔（約250 μm〜約425 μmの範囲の径）、約100μmのマイクロスケールの細孔間開口部(interpore openings)（すなわち、一方のマクロスケール細孔をもう一方のマクロスケール細孔に接続する開口部）、及びナノ繊維間の空間（2 μm未満の径）を有するマルチレベル細孔構造体が特徴である。足場の細孔は、マクロスケールであるか又はそれよりも小さく、足場自体は更に大きな寸法を有する。例えば、足場の厚さは1 mm以上であり、足場の長さ及び／又は幅は、3 mm以上であってもよい。
【００３２】
足場の別の具体例は、ナノ繊維中空マイクロスフィア(NF-HMS)と称する。ナノ繊維中空マイクロスフィアは、ナノ繊維シェルに囲まれた単一の中空コア、及びナノ繊維シェルに形成された1つ以上の開口部を有する中空構造体が特徴である。中空構造体全体の径は、約5 μm〜約1000 μmの範囲であり、開口部の径は、約5 μm〜約50 μmの範囲である。また、ナノ繊維シェルには、ナノ繊維間に存在する空間（2 μm未満の径）も含まれる。
【００３３】
足場の更に別の具体例は、ナノ繊維海綿状マイクロスフィア(NF-SMS)と称する。NF-SMSは、ナノ繊維足場及びナノ繊維中空マイクロスフィアに類似しているが、これは、NF-SMSには、ナノ繊維アーキテクチャ又は部分的なナノ繊維アーキテクチャも含まれ、約5 μm〜約1000 μmの範囲の径を有するからである。ただし、NF-SMSは、海綿状であるため、ナノ繊維足場及びナノ繊維中空マイクロスフィアとは異なる。「海綿状」とは、NF-SMSが、マイクロスフィア全体にわたって海綿質様のアーキテクチャを有することを意味する。海綿質様アーキテクチャには、相互接続された多孔質壁と、相互接続された多孔質壁間に形成されたマイクロスケール細孔と、が含まれる。
【００３４】
海綿質様アーキテクチャには、多孔質壁であって、NF-SMSの内側を通って延び、さらに、NF-SMSの外側も画定する多孔質壁が含まれる。多孔質壁は、相互接続されたナノ繊維と、相互接続されたナノ繊維間に形成された空間（2 μm未満の径）と、からなる。また、海綿質様アーキテクチャには、複数のマイクロスケール細孔（約1 μm〜約100 μmの範囲の径）と、細孔間開口部（すなわち、一方のマクロスケール細孔20をもう一方のマクロスケール細孔20に接続する開口部）と、先述したように、ナノ繊維間に空間も含まれる。
【００３５】
マイクロスケール細孔は、多孔質壁によって少なくとも部分的に画定され、NF-SMS全体にわたって形成される。このため、マイクロスケール細孔の一部は、NF-SMSの外側に配置され、その他の部分は、NF-SMSの内側に配置される。マイクロスケール細孔はそれぞれ、少なくとも1つの細孔間開口部を有する。細孔間開口部は、隣接する2つのマイクロスケール細孔を接続する。換言すると、細孔間開口部は、一方のマイクロスケール細孔をもう一方のマイクロスケール細孔に通じさせるようにする。NF-SMSのそれぞれの細孔間開口部は、径が約2 μm〜約80 μmの範囲である。マイクロスケール細孔の一部は、マイクロスケール細孔をNF-SMSの周囲環境に通じさせるように、付加的な開口部も有する。NF-SMSの内部に配置されたマイクロスケール細孔には、細孔間開口部が含まれるが、付加的な開口部が含まれないことが理解される。
【００３６】
足場は、先述した生分解性高分子マトリックス材料のうちのいずれかから形成されてもよく、あらゆる適切な技術によって形成されてもよい。例として、ナノ繊維足場及びNF-HMSは、相分離と糖浸出の組合せによって形成されてもよい。NF-SMSの例は、高グリセロール親和性高分子(highly glycerol-philic polymer)、例えば、i) X個のヒドロキシル基を有する星型ポリ（L-乳酸）（式中、X≧4、そして1/Yの基本ヒドロキシル密度(original hydroxyl density)を有し、Yは、ポリマーを形成するのに用いられる開始剤のヒドロキシルの数に対する、ポリマーを形成するのに使いられるモノマーの供給比であり、Yは≧100である。）、又は、ii) 5%以上のアミノ酸（例えば、リジン）含有量若しくはペプチド（例えば、RGD (Arg-Gly-Asp）含有量を有する星型ポリ（L-乳酸）-ブロック-ポリ（L-アミノ酸）、又は、iii)ポリ（L-乳酸）とのグラフト共重合体（例えば、ポリ（（ヒドロキシエチル）メタクリレート）-グラフト-ポリ（L-乳酸）(PHEMA-g-PLLA)、ポリ（（ヒドロキシエチル）プロピルメタクリレート-グラフト-ポリ（L-乳酸）、ポリ（（ヒドロキシエチル）ブチルアクリレート）-グラフト-ポリ（L-乳酸）など）を用いて、逆乳化法により、形成することができる。NF-SMSの他の例は、X個のヒドロキシル基を有する星型ポリ（L-乳酸）（式中、X＞16、そして、基本ヒドロキシル密度(1/Y)が約1/150〜1/100の範囲である。）を用いて、従来の乳化法により、形成することができる。
【００３７】
足場又は他の支持構造体に適した他の材料としては、無機材料又はポリマー／無機材料複合材料が挙げられる。また、支持構造体は、別の高度に多孔性の（例えば、約80%〜約99%の細孔を有する）構造体又はヒドロゲルであってもよい。
【００３８】
生分解性球体は、支持構造体と混合することができる。支持体材料に対する生分解性球体の重量比は、0.01% (1:10000)〜100% (1:1)の範囲である。一例として、支持体材料に対する生分解性球体の重量比は、1% (1:100)であってもよい。
【００３９】
足場における生分解性球体の固定は、ポストシード法(post seeding method)によって行うことができる。実施形態において、生分解性球体は、生分解性球体と足場の両方の非溶媒又は貧溶媒中に分散する。この分散液を足場上に滴下して接種することができる。接種された足場を、所定の時間、混合溶媒蒸気に暴露させて、生分解性球体を足場に強力に接着させることができる。通常、混合溶媒蒸気は、足場又は生分解性球体のいずれかを溶解せず、足場若しくは生分解性球体のうちの一方又は両方を部分的に溶解することによって、足場及び生分解性球体を接着させる。混合溶媒蒸気には、ヘキサン／テトラヒドロフラン(THF)の蒸気が、0:1〜1:0の範囲の容積比で含まれ得る。一例として、ヘキサン／テトラヒドロフランは、約9:1の容積比であってもよい。そして、足場を乾燥させて溶媒を除去し得る。足場における生分解性球体固定の他の例としては、高温処理、（部分）溶媒暴露、又はこれらの組合せが挙げられる。
【００４０】
足場における生分解性球体の固定及び局在化は、オフターゲット細胞へのDNA又はRNAの意図しない送達を防止するのに有用であり得る。
【００４１】
図5は、高分子足場26上に及びその全体に固定された生分解性球体24（その中に封入された複数のポリプレックス20'を含む。）の例を概略的に描写している。また、図5は、インビトロ及びインビボにおけるPLLAナノ繊維足場26に固定されたPLGAマイクロスフィア24から細胞へのmiRNA（RNA 18の一例）の二段階送達も示している。本明細書に開示されているカチオン性ポリプレックスは、miRNA（又は他のRNA若しくはDNA）を、細胞への長い移動時の細胞外分解から保護するのに利用され得る。図5に示されているように、PLGAマイクロスフィア組込み型PLLA足場は、マウス又はラットの皮下に埋め込まれ得る。例において、マイクロスフィア組込み型足場は、マウス又はラットの尾の髄核領域に注入されてもよい。（PLLA足場26上の）PLGAマイクロスフィア24から放出されたポリプレックス20'は、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ得る。ポリプレックス20'は、エンドソームに貪食される。ATP媒介プロトン蓄積は、エンドソームの酸性度を約5.0〜約6.2の範囲のpHに上昇させ、これは、細胞質ゾル又は細胞内空間のpH値(pH7.4)よりも有意に低い。ポリプレックス10'は、PEIのプロトン緩衝作用によってエンドソーム小胞を緩衝する能力を有している。換言すると、ポリマー/miRNAポリプレックス20'が細胞膜を横断してエンドソームに包まれた後、カチオン性PEI構成部分は、エンドソーム小胞の酸性環境を緩衝し、miRNAの生物活性を維持し、エンドソームを膨潤及び溶解させ、これによって、ポリプレックス20'が細胞質に放出される。ポリマー分解後の細胞質ゾルにおけるDNA又はRNA 18（図5ではmiR-26aとして示されている。）の細胞内放出によって、その遺伝子発現を調節することができる。
【００４２】
本開示を更に例示するために、実施例を本明細書に示す。これらの実施例は例示の目的で示され、そして、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが理解される。
【実施例】
【００４３】
実施例1
材料
ポリエチレンイミン（PEI、分子量800 Da及び25 kDa）、ポリエチレングリコールメチルエーテル（PEG、分子量2000、5000、10000及び20000 Da）、並びに超分岐ビス-MPAポリエステル（本実施例では、Hxと称し、式中、HxはH20:16ヒドロキシル、H30:32ヒドロキシル、又はH40:64ヒドロキシルである。）は、Sigma-Aldrich社から購入し、入手した状態で用いた。蛍光性類似体であるNBDコレステロールは、プローブであって、膜内部に局在し、脂質輸送プロセス及び脂質-タンパク質相互作用を調査するのに有用なプローブである。この蛍光性類似体は、life technologies社から購入した。α-アジド-ε-カプロラクトン(α-N3-ε-CL)は、Fuhrmann, K.らの文献「PEG nanocages as non-sheddable stabilizers for drug nanocrystals」ACS nano 6, 1667-1676 (2012)に記載されているように、合成した。本実施例では、miRNAとして市販のmiR-26a模倣体を用いた。
【００４４】
PEI-インの合成
1,1'-カルボニルジイミダゾール（CDI、7.30g、45 mmol）を、50 mLのジクロロメタン中に溶解した。プロパルギルアルコール（1.50 mL、26 mmol）を滴加した。この反応混合物を室温において約1時間撹拌し、40 mLの水によって3回洗浄した。無水硫酸マグネシウムによって有機相を乾燥し、ろ液を減圧下で濃縮して、カルボニルイミダゾールのプロパルギルエステル(PPA-CI)を白色固体として得た。収率：89%。1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): 8.17 (s, 1H, NCHN), 7.46 (s, 1H, NCHCHN), 7.10 (s, 1H, NCHCHN), 5.01 (s, 2H, OCH2C), 2.65 (s, 1H, C≡CH).
【００４５】
ポリエチレンイミン（PEI、分子量800 Da、2.40g、3.0 mmol）を、クロロホルム(25 mL)とメタノール(5 mL)の混合物中に溶解した。4.5 mLクロロホルム中PPA-CI（0.45g、3.0 mmol）の溶液を、氷冷した温度において30分にわたり滴加した。この混合物を約6時間還流した後、溶媒を回転蒸発によって除去した。残渣を10 mLの水中に溶解した。次いで、溶液を1M塩酸標準溶液によって中和し、5 mLのクロロホルムによって3回洗浄した。水相を凍結乾燥させて、PEI-インを黄色固体として得た。収率：85%。FT-IR (KBr, cm-1): 2130 (vC≡CH). 1H NMR (400 MHz, D2O, ppm): 4.68 (s, 2H, OCH2C), 3.81-2.60 (m, 74H, NCH2), 2.47 (s, 1H, C≡CH).
【００４６】
PEG-Hx-N3の合成
Hx (2.00g)及びトリエチルアミン(0.5 mL)を50 mLのTHF中に溶解した。無水コハク酸（3.50g、2倍モル過剰）を加えた。この反応混合物を室温において約24時間撹拌し、溶液から沈殿して得られたフロック状固体を、THF及びジエチルエーテルにより洗浄して、残留無水コハク酸を除去した。残渣を真空下で乾燥して、Hx-COOHを白色固体として得た。収率：62〜73%。FT-IR (KBr, cm-1): 1740 (vC=O).  1H NMR (400 MHz, D2O, ppm): 4.29 (br s, CH2O), 2.84-2.51 (m, CH2CH2COOH), 1.27 (s, CH3).
【００４７】
Hx-COOH（3.2 mmolのカルボキシル基）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（0.990g、4.8 mmol）、及び4-ジメチルアミノピリジン（0.586g、4.8 mmol）を、50 mLのジメチルホルムアミド中に溶解した。2,2-ビス（アジドメチル）プロパン-1,3-ジオール（0.300g、1.6 mmol）及びPEG（分子量2000 Da、3.200g、1.6 mmol）を加えた。この反応物を室温において24時間撹拌した。反応混合物をろ過し、濃縮した。次いで、残渣を透析バッグ（分画分子量(MWCO) 3500 Da）に移し、脱イオン水の連続流に対して2日間透析し、その間、8時間ごとに水を交換した。凍結乾燥によって生成物を得て、綿状固体を得た。収率：34〜46%。FT-IR (KBr, cm-1): 2105 (vN3), 1742 (vC=O). 1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): 4.22 (br s, CH2O of Hx), 4.06 (br s, CCH2OH and CCH2OOC), 3.88-3.56 (m, OCH2CH2 of PEG), 3.46 (br s, CH2N3), 3.38 (s, CH3 of PEG), 2.78-2.56 (m, CH2CH2COO of Hx), 1.25 (s, CH3 of Hx).
【００４８】
クリックケミストリーによるPEG-Hx-PEI（超分岐重合体10'）の合成
PEG-Hx-N3（1当量のN3）、PEI-イン（2当量のアルキニル）、臭化銅(I)（2当量）及びトリエチルアミン（2当量）を、THF-水混合物(1:1容積)中に溶解した。この混合物を35℃で約3時間撹拌した。次いで、溶液を透析バッグ（分画分子量3500 Da）に移し、脱イオン水の連続流に対して2日間透析し、その間、8時間ごとに水を交換した。凍結乾燥によって生成物を得て、綿状固体を得た。収率：44〜60%。FT-IR (KBr, cm-1): 2106 (vN3), 1743 (vC=O), 1635 (vtriazole).  1H NMR (400 MHz, D2O, ppm): 3.79-3.58 (m, OCH2CH2 of PEG), 3.58-2.60 (m, NCH2 of PEI). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 4.15 (br s, CH2O of Hx), 3.99 (br s, CCH2OH and CCH2OOC), 3.73-3.46 (m, OCH2CH2 of PEG), 2.72-2.54 (m, CH2CH2COO of Hx), 1.18 (s, CH3 of Hx).
【００４９】
開環重合によるPEG-P (N3CL-CL)の合成
トリメチルクロロシランによって前処理した丸底フラスコに、1.0gのPEG（分子量5000、10000又は20000 Da）を入れ、100℃で約4時間、減圧下（オイルポンプ）で加熱した。α-N3-ε-CL（0.33g、2.0 mmol）、ε-カプロラクトン（ε-CL、0.456g、4.0 mmol）、及び無水トルエン中0.1M Sn(Oct)2溶液60μLを加えた。フラスコを真空にし、窒素を3回充填した後、中に磁気撹拌子を入れ真空下で密封した。混合物を130℃で約24時間撹拌した後、フラスコを冷水浴中に浸すことによって重合を停止させた。生成物を、冷却メタノール-ジエチルエーテル混合物（1:1容積）によって、クロロホルムから3回沈殿させて精製し、真空下で乾燥させて白色固体を得た。収率：84〜88%。FT-IR (KBr, cm-1): 2111 (vN3), 1749 (vC=O).  1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): 4.22-4.11 (t, OCOCH(N3)CH2CH2CH2CH2), 4.08-3.96 (t, OCOCH2CH2CH2CH2CH2), 3.88-3.80 (t, OCOCH(N3)CH2CH2CH2CH2), 3.74-3.58 (br s, OCH2CH2 of PEG), 3.38 (s, CH3 of PEG), 2.38-2.22 (t, OCOCH2CH2CH2CH2CH2), 1.83-1.58 (m, CH2CH2CH2CH2O of N3CL and CL), 1.45-1.28 (m, CH2CH2CH2CH2O of N3CL and CL).
【００５０】
クリックケミストリーによるPEG-PE-PEI（直鎖状重合体10）の合成
PEG-P (N3CL-CL)（0.16 mmolのN3）、PEI-イン（0.162g、0.55 mmolのアルキニル）、臭化銅(I)（0.066g、0.46 mmol）、及びトリエチルアミン（0.047g、0.46 mmol）を、THF-水混合物（1:1容積）中に溶解した。この混合物を35℃で約3時間撹拌した。次いで、溶液を透析バッグ（分画分子量3500 Da）に移し、脱イオン水の連続流に対して2日間透析し、その間、8時間ごとに水を交換した。凍結乾燥によって生成物を得て、綿状固体を得た。収率：68〜75%。FT-IR (KBr, cm-1): 2109 (vN3), 1750 (vC=O), 1637 (vtriazole).  1H NMR (400 MHz, D2O, ppm): 3.883.60 (m, OCH2CH2 of PEG), 3.60 2.72 (m, NCH2 of PEI). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 4.144.03 (m, OCOCH2CH2CH2CH2CH2), 3.62 (br s, OCH2CH2 of PEG), 2.352.20 (t, OCOCH2CH2CH2CH2CH2), 1.841.56 (m, CH2CH2CH and CL).
【００５１】
ポリマーの特性評価
FT-IRスペクトルをパーキンエルマーBX分光計で記録した。1H NMR分析を、室温において作動するVarian INOVA-400分光計で行った。分子量及び分子量分布を、35℃でWaters 440ゲル浸透クロマトグラフ(GPC)によって測定した。THFを、流速1.0 mL/分で溶離液として用いた。狭い分布を有するポリスチレン標準を用いて、検量線を作成した。元素分析は、Atlantic Microlab社によって行われた。ポリマー中のPEI含有量は、元素分析を用いて決定した窒素含有量から算出した。次いで、核磁気共鳴(NMR)を用いてポリマーの分子量を推定し、この分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を用いて測定したものと一致していた。
【００５２】
表1は、生成した3つの直鎖状重合体(LP)、及び生成した3つの超分岐重合体(HP)の特性を示している。
【００５３】
【表１】
2018517005.tif 000006
【００５４】
ポリマーの細胞毒性試験
骨芽細胞に対するMTTアッセイに基づいて、細胞毒性試験を行った。骨芽細胞を、96穴プレートに、200 μLのDMEM完全培地中5000細胞/ウェルの初期密度で接種した。細胞を24時間増殖させた。元の培地を、100 μLの新しい培地と交換した。PEG-PE-PEI、PEG-Hx-PEI、PEI 800 Da、又はPEI 25 kDa溶液を、培地中10 μg/mLの窒素原子濃度で培地に加えた。それぞれの用量を4ウェル内で反復させた。処理した細胞を、95%空気及び5% CO2の加湿雰囲気下、37℃で24時間インキュベートした。MTT試薬（PBS中20 μL、5 mg/mL）をそれぞれのウェルに加え、細胞を更に37℃で4時間インキュベートした。すべての結晶が溶解するまで、100 μLのDMSOをそれぞれのウェルに加えた。
【００５５】
それぞれのウェル内の溶液の570 nmにおける吸光度を、ThermoElectron 3001 Varioskan Flash Spectral Scanning Microplate Readerを用いて記録した。
細胞生存率を次式に従って算出した。細胞生存率(%)=(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100（式中、ODsampleは、ポリマー又はPEIとともに培養した細胞の溶液の吸光度であり、ODblankは培地の吸光度であり、そして、ODcontrolは、培地のみで培養した細胞の溶液の吸光度である。結果を図6に示す。描写されているように、PEI 25 kDaは非常に高い毒性を有していたが、PEI 800は無毒性であった。PEI結合後、直鎖状重合体と超分岐重合体はともに、非常に低い細胞毒性を有していた。超分岐カチオン性重合体は、これらのエステル結合の加水分解によって分解し得る。
【００５６】
ポリマー/RNAポリプレックスの一般調製
【００５７】
設計されたポリマー溶液(1.0 mg/mL)を、60 pmolのRNAを含むRNA溶液に徐々に加えた。加えたポリマーの量を、ポリマー/RNAの選択されたN/P比（RNAのリン酸塩Pに対するポリマーの窒素原子N）に基づいて算出した。混合物を室温において30分間インキュベートして、複合体を形成させた。
【００５８】
ポリマー/miRNAポリプレックスの調製及び特性評価
【００５９】
miRNA中のリン(P)原子とタングステン酸中のタングステン(W)原子との間のカップリング相互作用を利用して、新たに調製したタングステン酸によりmiRNAを標識した。Wは重元素であり、TEM画像化の陰性染色試薬として用いることができる。10 mLのタングステン酸ナトリウム水溶液(0.15 mol/L)を、室温において、6 mLのHCl水溶液(0.8 mol/L)に滴加した。沈殿物を回収し、これを洗浄して活性化タングステン酸を得た。活性化タングステン酸を、W/Pモル比3のmiRNA水溶液に加えた。W組込み型miRNA溶液を遠心分離によって精製し、-80℃で保存した。
【００６０】
W組込み型miRNA溶液を用いて、直鎖状重合体(LP)と超分岐重合体(HP)をともに有するポリマー/miRNAポリプレックスを調製した。N/P比が10であるポリプレックスを、適切な量のW組込み型miRNA溶液を適切な量のポリマー溶液(1.0 mg/mL)に加え、そして室温で30分間インキュベートすることによって調製した。1滴のポリマー/miRNAポリプレックス溶液を、炭素被覆銅グリッド上に加えた。グリッドを周囲条件下で乾燥させた。JEOL JEM-3011透過型電子顕微鏡を用いて、ポリマー/miRNAポリプレックスの形態を特徴づけた。
【００６１】
図7A及び7Bはそれぞれ、直鎖状重合体(LP3)/miRNA及び超分岐重合体(HP3)/miRNAのTEM像を示している。TEM像は、LP/miRNAポリプレックスとHP/miRNAポリプレックスとの間の明確な相違を示す。TEM像中の暗い領域はW標識miRNAであり、白色領域はポリマー（PEG及びポリエステル）であった。球状コアにLP/miRNAポリプレックス中のmiRNAが凝集し、これはTEM下で暗い球体として現れた（図7A）。しかしながら、HPについては、miRNAは、最初に、超分岐ポリエステルコアの外殻上にPEIと複合体を形成した。HP分子コアとPEI/miRNAシェルは、ともに、3層ナノスフィアの外側PEG鎖と内側PEGコアとの間の疎水性シェルに集合した。HP分子コアとPEI/miRNAシェルは、ともに、TEM下で暗い中空球状円として現れた（図7B）。
【００６２】
外側層／部分の厚さ、及び内側コア／部分の半径は、PEG鎖の理論上の長さとほぼ同じ桁であることが分かった。W組込み型miRNAを用いたHP3のTEM像からの種々の層の厚さを図8に示す。PEGのそれぞれの繰り返し単位には、2つのC-O (143 pm)及びC-C (154 pm)結合が存在する。C-C-OとC-O-Cの結合角は、ともに約110°である。そこで、PEGの長さ（分子量2000）を次式に従って算出した。
L = (2・143・sin55 + 154・sin55)・45 = 16 nm。
図8に描写されているように、外側部分及び内側部分の厚さは約16 nm (±2)であり、これは、外側部分と内側部分がともにPEGからなる親水性部分であったことを示す。疎水性ポリエステル及びポリプレックスは、外側部分と内側部分との間にあった。これらの結果は、miRNAを有するHP3が3層ナノ粒子を形成することを示す。
【００６３】
アガロースゲル遅延度
二重殻様電荷(PEI)分布は、（高分子量PEIと比較して）局在電荷密度を低下させ、このため、より低い細胞毒性を達成することができ、miRNA結合のPEIのより高い利用可能性を付与することもでき、したがって、直鎖状重合体中のカチオン性基よりも高い複合体形成効率(complexing efficiency)を達成することができる。この仮説を検証するために、これらのカチオン性重合体によるRNAとの複合体形成能を、アガロースゲル電気泳動を用いて検討した。カチオン性重合体及びRNAが、正の表面電位を有する安定なポリプレックスを形成する場合、RNAバンドは、電気泳動後の元の位置に留まり、すなわち、カチオン性重合体は、RNAの移動を遅延させる。
【００６４】
4 μLの1倍ローディング緩衝液と混合したポリプレックス溶液の10 μL試料を、アガロースゲルにロードした。ポリプレックスを、GelRedを含む0.7%アガロースゲル上で、トリス‐酢酸塩(TAE)泳動用緩衝液(pH8)を用いて、80Vで45分間、電気泳動させた。RNAバンドをUV (254 nm)照射器によって視覚化し、BioSpectrum Imaging System（米国）によって撮影した。画像を図9に示す。超分岐重合体（HP1、HP2、HP3）は、同様の分子量及び窒素含有量を有する場合、直鎖状重合体よりも少ないポリマー量でRNA移動を遅延させることが分かった。
【００６５】
HPポリプレックスとリポプレックス及びLPポリプレックスとの比較
HP/miRNAポリプレックス、及び市販製品であるリポフェクタミン2000/miRNAリポプレックスの安定性を、動的光散乱(DLS)及びTEMを用い、並行して検討した。リポフェクタミン2000/miRNAリポプレックスの結果を図10A〜10Dに示し、HP/miRNAポリプレックスの結果を図11A〜図11Dに示す。
【００６６】
図10A及び10Bにはそれぞれ、超音波処理前及び超音波処理後の、リポフェクタミン/miRNAリポプレックスについてDLSにより決定されたサイズ分布プロファイルが示されている。超音波処理前のリポフェクタミン/miRNAリポプレックスの形態の画像（TEM（スケールバー、200 nm）によって特徴づけられた。）を図10Cに示し、超音波処理後のものを図10Dに示す。リポプレックスは、超音波処理後に大きくなり広くなり、このことは、超音波処理下でリポプレックスが不安定であることを示した。具体的には、リポプレックスは、平均径が約653 nmであり、超音波処理下では不安定であり、その結果、断片化及び凝集により、サイズ分布が更に広くなり、1341 nmまでサイズが増加した。
【００６７】
図11A及び図11Bにはそれぞれ、超音波処理前及び超音波処理後の、HP/miRNAポリプレックスについてDLSにより決定されたサイズ分布プロファイルが示されている。超音波処理前のHP/miRNAポリプレックスの形態の画像（TEM（スケールバー、100 nm）によって特徴づけられた。）を図11Cに示し、超音波処理後のものを図11Dに示す。リポプレックスとは対照的に、HP3/miRNAポリプレックス及びPDIのサイズは、超音波処理下ではほとんど変化がみられず、このことは、HP3/miRNAポリプレックスが非常に安定していることを示した。具体的には、HP/miRNAポリプレックスはサイズが小さく、初期平均径が約224 nmであり、超音波処理下では安定しており、その結果、おそらくは機械的に誘導された密な充填により、サイズ分布が更に狭くなり、超音波処理下で152 nmまで平均サイズがわずかに減少した。
【００６８】
HP/miRNAポリプレックスとLP/miRNAポリプレックスも比較した。具体的には、ポリプレックスの粒径及びゼータ電位を、Beckman Coulter DelsaNano C Submicron Particle Size Analyzerにおける動的光散乱(DLS)により室温で測定した。上述したように、適切な量のRNA溶液を適切な量のポリマー溶液(1.0 mg/mL)に加えることによってN/P比10のポリプレックスを調製し、これを室温において30分間インキュベートした。これらの測定については、その後、ポリプレックスを、RNアーゼを含まない水によって1.0 mL容量に希釈してから測定した。また、高分子量PEI 25 kDa及び低分子量PEI 800 Daも試験した。
【００６９】
粒径の結果を図12Aに示す。粒径の結果は、HP/miRNAポリプレックスの径が直鎖状重合体/miRNAポリプレックスよりも小さいことを示した（PEG／ポリエステルの比がそれぞれのポリマーにおいて同じに保たれた場合）。このことは、HPの高度に濃縮された樹状構造、及びより短いPEG鎖によるものである可能性がある。
【００７０】
ゼータ電位の結果を図12Bに示す。HP/miRNA及びLP/miRNAポリプレックスのゼータ電位は、低PEI (PEI 800 Da)よりも高かったが、高分子量PEI (PEI 25 kDa)よりも低く、ポリエステルの分子量及び分岐度の増加とともに上昇した。
【００７１】
図12A及び図12Bの結果は、ともに、PEI 25 kDaが、高電位においてRNAを有する約100 nmの安定なナノ粒子を形成することができ、PEI 800が低電位において大きなサイズを有していたことを示している。直鎖状重合体又は超分岐重合体/RNAポリプレックスの径及びゼータ電位は、PEI 25 kDaのものとPEI 800Daのものとの間にあった。
【００７２】
ポリマー/miRNAポリプレックス及びMS組込み型PLLAナノ繊維足場（MS足場）を含むPLGAマイクロスフィア(MS)の調製
【００７３】
LP（LP1、LP2若しくはLP3）又はHP（HP1、HP2、HP3）ポリマー/miRNAポリプレックスを含むPLGA（ポリ（ラクチド-co-グリコリド））マイクロスフィア(MS)を、改良水中油中水型(w/o/w)二重エマルジョン法を用いて作製した。簡潔には、30 mgのPLGAを1 mLのジクロロメタン中に溶解した。1.8 nmolの蛍光(fluroesence) miRNAを含む、N/Pが10であるポリマー/miRNAポリプレックスの100 μL水溶液を上述の溶液に添加し、これを、50Wにおいてプローブソニケーター（Virsonic 100、Gardiner社（ニューヨーク州）製）によって乳化させた。次いで、この一次w/oエマルジョンを、90Wの超音波処理下で10 mLのPVA溶液（1重量%/vol）に乳化させて、w/o/wエマルジョンを形成した。得られた二次エマルジョンを室温において約12時間磁気撹拌して、溶媒を蒸発させた。遠心分離によってPLGAマイクロスフィアを回収し、水によって3回洗浄し、凍結乾燥させた。
【００７４】
比較のために、非蛍光miRNAポリプレックスを有するPLGAマイクロスフィア、蛍光miRNA（すなわち、ネイキッド）を含むPLGAマイクロスフィア、蛍光argomir miRNAを含むPLGAマイクロスフィア、及びリポフェクタミン/miRNAリポプレックスを含むPLGAマイクロスフィアを、LP又はHPポリマー/miRNAポリプレックスを含むPLGAマイクロスフィアと同様に調製した。
【００７５】
遠心分離後、非蛍光miRNAポリプレックスを有するPLGAマイクロスフィアは、非常に透明な溶液を形成したことが注目された。蛍光miRNA（すなわち、ネイキッド）及び蛍光argomir miRNAは、遠心分離後のそれぞれの沈殿物中の非常に薄い赤色によって証明されるように、低い効率でPLGAマイクロスフィアに捕捉された。対照的に、HP3/miRNAポリプレックスは、遠心分離後の沈殿物中の非常に強い赤色によって証明されるように、高い効率でPLGAマイクロスフィアに捕捉された。
【００７６】
miRNA搭載含有量及び封入効率を、UV分光光度分析によって決定した。最初に、1.0 mgのそれぞれのPLGAマイクロスフィアを、1.0 mLのジクロロメタン中に溶解した。次いで、RNアーゼを含まない水0.5mLを加えて、miRNAを抽出した。抽出過程は数回繰り返した。ThermoElectron 3001 Varioskan Flash Spectral Scanning Microplate Readerを用いて、miRNA濃度を測定した。比較例及び実施例のPLGAマイクロスフィアのRNA捕捉効率を図13に示す。具体的には、図13は、ネイキッドmiRNA、リポフェクタミン/miRNAリポプレックス、argomir miRNA、直鎖状重合体及び高分岐重合体/miRNAポリプレックスの、PLGAマイクロスフィアへのRNA捕捉効率を示している。ネイキッドmiRNA、リポフェクタミン/miRNAリポプレックス、及びargomir miRNAの効率は、非常に低かった(＜10%)。対照的に、直鎖状重合体/miRNAポリプレックス及び高分岐重合体/miRNAポリプレックスは、高いRNA捕捉効率を有していた。さらに、高分岐重合体（特に、HP2及びHP3）を有するmiRNAポリプレックスの効率は、直鎖状重合体を有するものよりも実質的に高かった。
【００７７】
相分離法と糖浸出法の組合せによって、径5 mm、厚さ2 mmの寸法を有するPLLA（ポリ（L-乳酸））ナノ繊維足場をあらかじめ作製した。ポストシード法を用いて、PLGA MSをPLLA NF足場に組み込んだ。簡潔には、PLGA MSを、0.1%スパン80を含むヘキサン中に分散させ、NF足場上に滴下して接種した。次いで、足場を、ヘキサン／THF（9:1容積）の混合溶媒の蒸気に30分間供した。足場を真空下で3日間乾燥させて、溶媒を除去した。
【００７８】
MS組み込み前後の足場の形態及びサイズを、走査型電子顕微鏡(Philips XL30 FEG SEM)によって特徴づけた。スパッタコーター（DeskII、Denton vacuum社製）を用いて、足場に金を被覆した。金被覆過程において、ガス圧は50 mtorrであり、電流は40 mAであった。被覆時間は120秒であった。試料を15 kVで分析した。
【００７９】
HP3/miRNAポリプレックスを含むPLGAマイクロスフィアを付着させたPLLAナノ繊維足場のSEM像を図14A〜図14Dに示し、図14Bは、図14Aに概略を示した部分の高倍率像であり、図14Cは、図14Bに概略を示した部分の高倍率像であり、そして、図14Dは、図14Cに概略を示した部分の高倍率像である。PLLAナノ繊維足場の径は5 mmであり、孔径は、約250 μm〜約425 μmの範囲であった。PLGAマイクロスフィアは、約3 μmであった。PLGAマイクロスフィアは、PLLA足場の表面及び細孔内に分散していた。
【００８０】
SEM像は、細胞接種又は移動に好適な足場中の細孔と、組織再生に好適なナノ繊維形態との間のインターコネクティビティが、PLGA MS固定手順後に保持されることを示した。さらに、これらの像は、PLGA MSが足場全体に良好に分散していることを確認した。
【００８１】
インビトロmiRNA放出
【００８２】
HP3/miRNAポリプレックス搭載PLGA MS足場の放出プロファイルを、PBS（pH7.4、0.1M）中で調査した。足場を0.2 mLのPBS中に入れ、37℃で50 rpm振盪させた。所定の時間間隔において、放出培地を回収し、予熱した新しいPBSと交換した。足場上のマイクロスフィアから放出されたmiRNAの量を、ThermoElectron 3001 Varioskan Flash Spectral Scanning Microplate Readerを用いて分析した。
【００８３】
足場から放出される前後のHP3/miRNAポリプレックスの径を図15に示す。放出後、HP3/miRNAポリプレックスは、ナノ粒子の形状を維持し、径に関してはほとんど変化がみられなかった。放出されたHP3/miRNAポリプレックスは、約200 nmの平均径を有し、最初に組み込まれたポリプレックス(152 nm)よりも大きいことが分かった。これらの結果は、ポリプレックスがPLGAマイクロスフィアに捕捉され、そこから放出された場合であっても、非常に安定していることを示した。
【００８４】
LP3/miRNAポリプレックス搭載PLGAマイクロスフィア、及びHP3/miRNAポリプレックス搭載PLGAマイクロスフィアの放出プロファイルを、異なる分子量のPLGA、すなわち、6.5k PLGA及び64k PLGAによって調査した。放出プロファイルを、上述したように、PBS（pH7.4、0.1M、37℃）中で調査した。その結果を図16に示す。図示されているように、分子量6.5kのPLGAからなるMSは、短期放出を達成したのに対して、分子量64kのPLGAからなるMSは、長期放出を達成した。1日目において、PLGA 6.5k MSからのLP/miRNA又はHP/miRNAポリプレックスのいずれかの約60%のバースト放出に続いて、ポリプレックスのおよそ2週間の実質的なレベルでの持続放出があった。対照的に、PLGA64k MSからのLP/miRNA又はHP/miRNAポリプレックスのいずれかでは、1日目において、約25%〜30%のバースト放出に続いて、1か月以上ポリプレックスの持続放出が続いた。
【００８５】
インビトロ及び／又はインビボにおける細胞取り込み及びmiRNA発現
【００８６】
インビトロにおけるmiRNA/ポリマー複合体及びリポフェクタミン2000/miRNAリポプレックスの細胞取り込み及びmiRNA発現分析のために、それぞれの構成部分を最初に標準的なプロトコルに従って標識した。miRNA及びagomirをCy3（オレンジレッド）によって標識し、ポリマー（ベクター）をFITC（緑色）によって標識し、細胞（骨芽細胞）核をDAPI（青色）によって染色した。例として、メタノール(2 mL)中のFITC (2.0 mg)及びポリマー(16.0 mg)を、室温において一晩撹拌した。次いで、溶液を透析バッグ（分画分子量3500 Da）に移し、脱イオン水の連続流に対して2日間透析し、その間、水を8時間ごとに交換した。凍結乾燥によって生成物を得て、綿状固体FITCポリマーを得た。同様に骨芽細胞をDAPIによって染色して、その核を明らかにした。リポフェクタミン2000を標識するために、NBDコレステロール（10重量%）をリポプレックス溶液に加えた。
【００８７】
ポリプレックス及びリポプレックスのインビトロ導入効率を、骨芽細胞において評価した。染色した骨芽細胞を、8チャンバカバーガラス(8 chambered coverglass)（Nunc社（米国）製）に4000細胞/ウェルの密度で接種し、細胞が約70%コンフルエンスに達するまで、95%空気及び5% CO2の加湿雰囲気中で、37℃でインキュベートした。トランスフェクションの時点で、それぞれのウェルの培地を、400 μLの新しいDMEM培地と交換した。FITC標識ポリマー又はNBDコレステロール標識リポソームを（先述したものと同様に）Cy3標識miRNAと組み合わせて、ポリプレックス又はリポプレックスを形成し、次いで、これを加えて、細胞とともに37℃でインキュベートした。負の対照は、生物活性のないmiRNAをスクランブルしたものであった。
【００８８】
トランスフェクションの48時間後に、共焦点レーザ走査型顕微鏡（Nikon C1-si TE2000（日本））（図17Aでは白黒により示されている。）を用いて細胞を観察し、更なるリアルタイムRT-PCR試験のためにRNAを抽出した。蛍光強度（図17B）及びmiRNA発現レベル（図17C）を定量することによって、インビトロにおけるポリプレックス及びリポプレックスの生体機能トランスフェクションの効率を決定した。細胞へのポリプレックス又はリポプレックスの量を定量するために、FITC/NBD/miRNA由来の蛍光を取り込み、Image-pro plus 6.0画像解析ソフトウェアによって分析して、FITC/NBD/miRNA由来蛍光の強度を測定し、核内のDAPI由来蛍光を発現する領域と比較した。これらの結果を図17Bに示す。HPは、共焦点顕微鏡観察を用いて細胞内に見られる最大量のmiRNAポリプレックス（図17A）、及びリアルタイムPCRを用いて定量されたより高いレベルのmiRNA発現（図17C）によって証明されるように、LP又はリポフェクタミン2000よりもはるかに高い導入効率を有していた。これらの図において、MIMはmiRNA-26a模倣物を指し、NCはmi-RNA-26aの負の対照を指す。
【００８９】
先述したように、標識したポリプレックス及びリポプレックスをPLGAマイクロスフィアに組み込み、そして、先述したように、埋め込まれたPLGAマイクロスフィアをPLLAナノ繊維足場に固定した。足場を0.2 mLのPBS中に入れ、37℃で50 rpm振盪させた。2日後、放出培地を回収し、上述の条件下で骨芽細胞とともに培養した。
【００９０】
トランスフェクションの48時間後に、共焦点レーザ走査型顕微鏡（Nikon C1-si TE2000（日本））（図18Aでは白黒により示されている。）を用いて細胞を観察し、更なるリアルタイムRT-PCR試験のためにRNAを抽出した。上述した蛍光強度（図18Bに示されている結果）及びmiRNA発現レベル（図18Cに示されている結果）を定量することによって、インビトロにおける放出ポリプレックス及びリポプレックスの生体機能トランスフェクションの効率を決定した。共焦点画像（図18A）、蛍光強度定量（図18B）、及びリアルタイムPCRを用いて定量したmiRNA発現（図18C）では、HP/miRNAポリプレックスが高い導入効率を有し、その結果、細胞内のmiRNA発現が、LP/miRNAポリプレックス及びリポフェクタミン2000よりも高いことを示した。
【００９１】
インビボにおけるCy3標識ポリプレックス又はCy3標識agomirの細胞取り込み及びmiRNA発現分析のために、FITC標識ポリプレックス又はCy3標識agomirを含むPLGAマイクロスフィアを固定したPLLA足場を、ヌードマウスの皮下ポケットに埋め込んだ。手術後2週目に、観察された蛍光画像及びRNA抽出のために、埋込物を取り出した。
【００９２】
共焦点レーザ走査型顕微鏡（Nikon C1-si TE2000（日本））（図19Aでは白黒により示されている。）を用いて抽出細胞を観察し、更なるリアルタイムRT-PCR試験のためにRNAを抽出した。上述した蛍光強度（図19Bに示されている結果）及びmiRNA発現レベル（図19Cに示されている結果）を定量することによって、インビボにおける放出ポリプレックス及びリポプレックスの生体機能トランスフェクションの効率を決定した。共焦点画像（図19A）、蛍光強度定量（図19B）、及びリアルタイムPCRを用いて定量したmiRNA発現（図19C）では、HP/miRNAポリプレックスが高い導入効率を有し、その結果、細胞内のmiRNA発現が、LP/miRNAポリプレックス及びリポフェクタミン2000よりも高いことを示した。
【００９３】
頭蓋冠骨(Calvarial bone)欠損モデルの構築
C57BL/6Jマウスを無作為に3つの群に分けた。イソフルランを2%吸入させて動物を麻酔した。鼻骨から後頭部まで直線的な頭皮切開を行い、全層弁を上げた。頭蓋冠骨を覆う骨膜を完全に切除した。頭頂部頭蓋冠骨(parietal calvarial bone)を中心とする5 mmの開頭術上の欠損を作製するのにトレフィンを用い、穿孔中にハンクスの平衡塩類溶液によって傷口を十分に洗浄した。頭蓋冠板(calvarial disk)を、その下にある硬膜又は脳への損傷を避けるように、慎重に取り出した。
【００９４】
慎重に止血した後、欠損物内に無細胞miRNA連続送達システムを配置した。これらの送達システムには、非埋込み型HP/miRNAポリプレックスが固定されたPLLA足場、及びHP/miRNAポリプレックス埋込み型PLGAマイクロスフィアが固定されたPLLA足場が含まれていた。PLGA 6.5kを短期放出に用い、PLGA 64kを長期放出に用いた。足場は欠損全体を充填した。
【００９５】
切開部を4-0編組(Braided)吸収性縫合糸（Covidien社（米国）製）によって閉じ、マウスを加熱パッド上で麻酔から回復させた。すべてのマウスを屠殺し、埋め込み後8週目に頭蓋冠を取り出した。
【００９６】
マイクロCT分析及び骨組織学的分析
マイクロCTを用いた近位脛骨分析において、検体を1%アガロース中に埋め込み、19 mm管に入れ、マイクロCTシステム（μCT100、Scanco Medical社（バッサードルフ(Basserdorf)、スイス）製）を用いて、脛骨の全長にわたって走査した。走査の設定は、ボクセルサイズ15 mm、70 kVp、114 mA、0.5 mm ALフィルタ、及び積分時間500msであった。マイクロCT分析は、メーカーの評価ソフトウェアを用いて行い、皮質骨については、28%（0〜1000のグレースケールにおいて280）の固定グローバル閾値を、海綿骨については、非骨から骨を分割するのに18%の固定グローバル閾値を用いた。海綿骨の0.75 mm領域を増殖プレートの真下で分析し、そして、0.5 mm皮質領域を脛腓関節の3 mm近位に配置して分析した。頭蓋冠骨分析において、頭頂部頭蓋冠骨の領域を固定グローバル閾値20%（0〜1000のグレースケールにおいて200）によって走査した。選択されたそれぞれの薄片からのすべての海綿骨を三次元再構築のために分けて、次のパラメータを算出した。骨密度（BMD、図20E）、及び相対骨量（骨量/総面積、図20D）。
【００９７】
マイクロCT（Siemens AG社（ドイツ）製）を用いた頭蓋冠骨欠損修復検出のために、検体を、水平位置にした頭蓋冠骨の冠状側面を含む円筒状試料ホルダ内に入れた。検体を、頭蓋冠骨の厚さ全体を覆うように、12 mmの固定同位体ボクセルサイズにおいて、頭蓋冠骨の冠状側面と平行な走査方向により走査した。メーカーの評価ソフトウェア及び25%の固定グローバル閾値（0〜1000のグレースケールにおいて250）を用いて、分析を行った。分析のための関心対象である5 mmの円形関心領域は、欠損の震央を中心とした。検体の三次元画像上で、欠損部位の骨量(mm3)及びBMDを直接測定した。
【００９８】
骨組織学的分析のために、（皮下埋込物及び頭蓋冠骨欠損修復モデルからの）検体を4%ホルマリンによって固定し、10% EDTAによって脱灰し、続いて、パラフィンに包埋した。冠状切片（厚さ6 μm）を、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)によって染色した。欠損領域の新たに形成された組織におけるOCN（オステオカルシン）発現の免疫蛍光分析のために、スライドを脱パラフィン化し、次いで、クエン酸緩衝液（2.1Mクエン酸、pH6.0）中で、120℃で30分間加熱処理し、抗原を回収した。血清中でブロックした後、切片を、OCN（1:100、Abcam社製）に対するウサギポリクローナル一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。PBS中で3回洗浄した後、切片を、ウサギIgG（1:400、Santa Cruz社製）に対するFITC結合ロバ抗体とともに1時間インキュベートした。負の対照試験は、一次抗体を省略して行った。DAPI（Vector Laboratories社製）を含む培地に切片を載せ、共焦点顕微鏡（Eclipse C1 Plus、株式会社ニコン（日本）製）下で検査した。
【００９９】
マイクロCT分析及び骨組織学的分析の結果は、本明細書に開示されている足場が、骨形成主要因子発現を高レベルで長期間維持することによって、臨界サイズの頭蓋冠骨欠損修復を有意に改善したことを示す。
【０１００】
図20(a)は、非埋込み型HP/miRNAポリプレックスを有するPLLA足場の低倍率及び高倍率におけるマイクロCT画像及びH&E染色画像を（白黒により）示している。HP/miRNAポリプレックス（「miR-26a-bolus」と表示され、称される。）と、負の対照ポリプレックス（「NC-bolus」と表示され、称される。）の両方の結果を示している。
【０１０１】
図20（b）は、HP/miRNAポリプレックス埋込み型PLGA 6.5kマイクロスフィアを有するPLLA足場の低倍率及び高倍率によるマイクロCT画像及びH&E染色画像を（白黒により）示している。HP/miRNAポリプレックス埋込み型PLGA 6.5kマイクロスフィア（「miR-26a-HP-short」と表示され、称される。）と、負の対照ポリプレックス（「NC-HP-short」と表示され、称される。）の両方の結果を示している。
【０１０２】
図20(c)は、HP/miRNAポリプレックス埋込み型PLGA 64kマイクロスフィアを有するPLLA足場の低倍率及び高倍率によるマイクロCT画像及びH&E染色画像を（白黒により）示している。HP/miRNAポリプレックス埋込み型PLGA 64kマイクロスフィア（「miR-26a-HP-long」と表示され、称される。）と、負の対照ポリプレックス（「NC-HP-long」と表示され、称される。）の両方の結果を示している。
【０１０３】
上述したように、図20D及び図20Eは、それぞれの試料についての相対骨量（骨量/総面積）及び骨密度（BMD、図20E）を示すグラフである。
【０１０４】
マイクロCT及びHE染色組織学的画像は、すべてのNC送達群の頭蓋冠欠損において、非常に少量の新しい骨形成が存在したことを示す（図20A〜20E）。miR-26a-bolus送達は、新しい骨形成をわずかに改善したが、統計的に有意なレベルでは改善しなかった（図20A、20D及び20E）。短期持続性miR-26a送達（すなわち、miR-26a-HP-short）は、統計学的に有意なレベルにおいて新しい骨形成を促進した（図20B、20D及び20E）。長期持続性miR-26a送達（すなわち、miR-26a-HP-long）によって、欠損が完全に修復する（図20C）とともに、骨量が劇的に増加した（図20D）。
【０１０５】
定量的マイクロCT分析は、新たな骨の量の有意な増加と一致し、さらに、短期及び長期持続性miR-26a放出群の骨密度(BMD)も上昇する（図20E）ことを示した。
【０１０６】
実施例1のRNA抽出及びリアルタイム(RT)-PCR
実施例1を通して、RNA抽出及びリアルタイムPCRを数回行った。それぞれの場合において、回収した細胞の全miRNAを、miRNeasy Mini Kit（Qiagen社（米国）製）を用いて抽出した。簡潔には、細胞を反応管に集め、700 μLのQIAzolによって溶解し、140 μLのクロロホルムと混合した。12,000gで、4℃で15分間、遠心分離した後、上部の水相を、2 mLの収集管内のRNeasy Miniスピンカラムに移し、100%エタノールと混合した。700 μLのBuffer RWT及び500 μLのBuffer RPEによって洗浄した後、リアルタイムPCR分析のために全miRNAを回収した。
【０１０７】
相補DNA (cDNA)を、Geneamp PCR（Applied Biosystems社製）を用い、TaqMan逆転写試薬を使用し、25℃で10分間インキュベーションし、48℃で30分間逆転写し、そして95℃で5分間不活性化して合成した。1マイクロリットルのcDNAを、Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen社製）を用いてPCR増幅させた。合成されたcDNAの1:10希釈液2マイクロリットルを、リアルタイムPCRに用いた。
【０１０８】
実施例1の統計分析
実施例1の全数値データを平均±s.dとして表した。SPSS 13.0を用いて、すべての統計分析を行った。一元配置分散分析(one-way ANOVA)によって、群間の統計的有意差 を分析した。スチューデントのt検定によって、2つの群間の統計的有意差を決定した。P＜0.05は、統計的に有意であると考えられた。
【０１０９】
実施例2
DNAに対するHP及びLPの親和性
1 μgのDNA（pUC18 DNA、Thermo Scientific社製）を含むDNA溶液に、実施例1の超分岐重合体溶液及び直鎖状重合体溶液(1.0 mg/mL)をそれぞれ、徐々に加えた。加えたポリマー溶液の量を、ポリマー／DNA混合物の選択されたN/P比（N/P=DNAのリン原子数に対するポリマーの窒素原子数）に基づいて算出した。混合物を室温において30分間インキュベートし、ポリプレックスを形成させた。
【０１１０】
4 μLの1倍ローディング緩衝液と混合したポリプレックス溶液の10 μL試料を、アガロースゲルにロードした。ポリプレックスを、GelRedを含む0.7%アガロースゲル上で、トリス‐酢酸塩(TAE)泳動用緩衝液(pH8)を用いて、80Vで45分間、電気泳動させた。DNAバンドをUV (254 nm)照射器を用いて視覚化し、BioSpectrum Imaging System（米国）によって撮影した。その結果を図21に示す。
【０１１１】
上述のアガロースゲル電気泳動アッセイを用いて、DNAに対する超分岐重合体及び直鎖状重合体の結合親和性を検討した。図21の結果は、超分岐重合体が、対応する直鎖状重合体よりも低いN/P比においてDNA移動を遅延させ得ることを示した。これらの結果は、超分岐重合体が、対応する直鎖状重合体よりもDNAに対する親和性が高く、これによって、超分岐重合体/DNAポリプレックス中のDNAを高い効率で搭載できることを実証する。また、これらの結果は、高分子量のポリマーが、低い分子量のポリマーよりも、DNAに対する親和性が高いことも実証する。これらの結論は、直鎖状重合体よりも超分岐重合体におけるRNAの高い結合親和性及び高い搭載効率と一致する。
【０１１２】
実施例3
マイクロRNA-140のHP送達による、幹細胞の軟骨形成の促進、及び軟骨内肥大の防止
P3ヒトBMSC (ATCC)を、φ100 mm皿中の10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したα-MEMとともに培養した。細胞が90%コンフルエンスに達したら、細胞にマイクロRNA-140をトランスフェクションした。具体的には、13.7 μLのHP3ポリマー(1 mg/mL)を12.5 μLの20 μM miR-140と混合し、1時間後、細胞培養物にトランスフェクション混合物を加えた。1日後、miR-140をトランスフェクトした細胞、及びモックコントロールをトリプシン処理し、孔径150 nm〜225 nmの多孔質NF PLLA足場に接種した。細胞／足場構築物を、軟骨細胞培地（1% FBS、0.1 mMアスコルビン酸、1倍ITSプレミックス、0.1 μM Dex、及び10 ng/mL TGF-β1を添加したHG-DMEM）とともに、更に5週間培養した。次いで、構築物を4%パラホルムアルデヒドによって一晩固定し、パラフィン切片化を行って、7 μmの切片を得た。
【０１１３】
軟骨形成及び肥厚性変化(hypertrophic alteration)を評価するために、サフラニンO及びファストグリーン並びに免疫組織（Col II、X及びMMP-13）染色を行った。図22に示されているように、モックコントロールと比較して、miR-140によるプレトランスフェクションは、細胞軟骨形成（サフラニンO及びファストグリーン、Col II）の維持を促進し、細胞肥大をある程度防止した（バースケール：図22では100 μm）。
【０１１４】
実施例4
HPポリマーによって送達されるmiR-10aによる、マウスのFoxp3+調節性T細胞のインビトロ分化の促進
Foxp3+調節性T細胞(Tregs)は、主に他の免疫細胞によって引き起こされる免疫反応及び炎症を抑制することができるT細胞の亜集団である。Tregsは、免疫寛容の維持に重要な役割を果たすと考えられている。Tregsは、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)及びインターロイキン-2 (IL-2)の誘導によって、CD4+ T細胞から分化され得る。Tregsの量を高めることは、自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療する新しい方法であり得る。マイクロRNA (miRNA)は、Tregsの安定性及び機能に寄与する。miR-10aは、Tregsでは発現するが、他のT細胞では発現しないことが報告されている。本実施例では、miR-10aが、Tregsの分化を促進できると仮定した。
【０１１５】
このインビトロ試験では、マウス脾臓のCD4+ T細胞を、正の選択磁気マイクロビーズによって濃縮した。プレートに結合した抗CD3抗体及び可溶性抗CD28抗体を収容する96穴プレートに、10%のFBSを含むRPMI 1640培地によって細胞を培養した。Tregs分化のために、5 ng/mlのTGF-β1及び50 U/mlのIL-2を培地に加えた。
【０１１６】
miR-10a (20〜80 μM)を、実施例1のHP3ポリマー溶液(1.0 mg/ml)とともに30分間インキュベートし、次いで、ポリプレックスを用いてCD4+ T細胞をトランスフェクトさせた。誘導4日後に、細胞を回収し、1 μg/mlのFoxp3抗体によって染色し、Foxp3+ T細胞の割合をフローサイトメトリーによって分析した。結果は、miR-10aが、20 μM、40 μM及び80 μMで、CD4+ T細胞において、Tregsの分化をそれぞれ、11.81±0.19%（図23A）から16.02±0.01%（図23B）、15.96±0.21%（図23C）及び15.74±0.21%（図23D）(P＜0.01)に促進することを示した。これらのデータは、20 μM以上の用量によってHPポリマーを用いるmiR-10a送達が、インビトロにおいて調節性T細胞の分化を改善し、既存の薬剤と同様のレベルに達することを示唆している。図23A〜23Dの結果は、図24のグラフに示されている。miR-10aのHP送達は、自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療する潜在的に有効な代替物である。
【０１１７】
実施例5
ポリマー/NR4A1ポリプレックスの調製
超分岐重合体(HP)を、実施例1に説明したものと同様に形成した。本実施例では、ポリエチレンイミン（PEI、分子量800 Da）、ポリエチレングリコールメチルエーテル（PEG、分子量2000 Da）、及び超分岐ビス-MPAポリエステル（H40:64ヒドロキシル）を用いた。
【０１１８】
設計されたH40ポリマー溶液(1.0 mg/mL)を、60 pmolのNR4Aを含むDNA溶液に徐々に加えた。加えたポリマーの量を、ポリマー／DNAの選択されたN/P比（DNAのリン酸塩Pに対するポリマーの窒素原子N）に基づいて算出した。混合物を室温において30分間インキュベートして、ポリプレックスを形成させた。
【０１１９】
NR4A1は、最初に、超分岐ポリエステルコアの外殻上にPEIと複合体を形成した。HP分子コアとPEI/NR4A1シェルは、ともに、3層ナノスフィアの内側PEGコアと外側PEG鎖との間に挟まれた疎水性球状シェルに集合した。
【０１２０】
ポリマー/NR4A1ポリプレックス及びNS組込み型ナノ繊維海綿状マイクロスフィア(NF-SMS)を含むPLGAナノスフィア(NS)の調製
【０１２１】
ポリマー/NR4A1ポリプレックスを含むPLGA（ポリ（ラクチド-co-グリコリド）、平均分子量64,000）ナノスフィア(NS)を、改良水中油中水型(w/o/w)二重エマルジョン法を用いて作製した。簡潔には、30 mgのPLGAを1 mLのジクロロメタン中に溶解した。N/Pが8であるポリマー/NR4A1ポリプレックスの100 μL水溶液を上述の溶液に添加し、これを、50Wにおいてプローブソニケーター（Virsonic 100、Gardiner社（ニューヨーク州）製）によって乳化させた。次いで、この一次w/oエマルジョンを、90Wの超音波処理下で10 mLのPVA溶液（1重量%/vol）に乳化させて、w/o/wエマルジョンを形成した。得られた二次エマルジョンを室温において約12時間磁気撹拌して、溶媒を蒸発させた。遠心分離によってPLGA NS（平均径300 nm）を回収し、水によって3回洗浄し、凍結乾燥させた。
【０１２２】
データは示されていないが、PLGA 64kによって形成されたPLGA NSは、1日目において、バースト放出後1か月以上の間、ポリマー/NR4A1ポリプレックスの持続放出を呈した。
【０１２３】
星型ポリ（L-乳酸）-co-ポリHEMA（SS-PLLA-co-ポリHEMA）を合成し、乳化法及び相分離法を用いて、ナノ繊維海綿状マイクロスフィア(NF-SMS)に集合させた。具体的には、ポリマー(0.4g)を、2% w/vの濃度で、50℃においてTHF中に溶解した。厳格な機械的撹拌（Speed 9、Fisher Science社製）下で、3倍量の星型PLLA溶液を含むグリセロール(50℃)を、ポリマー溶液に徐々に加えた。5分間撹拌した後、混合物を液体窒素に迅速に注いだ。10分後、溶媒交換のために、水-氷混合物(1L)を24時間にわたり加えた。マイクロスフィアをふるいにかけ、蒸留水によって8回洗浄して、球体上の残留グリセロールを除去した。次いで、球体を3日間凍結乾燥させた。
【０１２４】
ポストシード法を用いて、PLGA NSをNF-SMSに固定した。簡潔には、PLGA NSを、0.1%スパン80を含むヘキサン中に分散させ、NF-SMS上に滴下して接種した。次いで、NF-SMSを、ヘキサン／THF（9:1容積）の混合溶媒の蒸気に30分間供した。NF-SMSを真空下で3日間乾燥させて、溶媒を除去した。
【０１２５】
NS組み込み前後のPLGA NS及びNF-SMSの形態及びサイズを、走査型電子顕微鏡(Philips XL30 FEG SEM)によって特徴づけた。スパッタコーター（DeskII、Denton vacuum社製）を用いて、PLGA NS及びNF-SMSに金を被覆した。金被覆過程において、ガス圧は50 mtorrであり、電流は40 mAであった。被覆時間は120秒であった。試料を15 kVで分析した。
【０１２６】
NS組み込み前後のPLGA NS及びNF-SMSのSEM像を、図25A〜25Eに示す。図25Aは、ポリマー/NR4A1ポリプレックスを含むPLGA NSのSEMである。図25B及び25Cは、PLGA NS組み込み前のNF-SMSのSEM像であり、それぞれ、1000倍及び5000倍の倍率である。これらの像は、細孔壁（図25C）上のNF-SMS（図25B）及びナノ繊維（平均径100 nm）の相互接続された多孔質構造を具体的に示している。図25D及び25Eは、PLGA NS組み込み後のNF-SMSのSEM像であり、それぞれ、2000倍及び5000倍の倍率である。
【０１２７】
SEM像は、細胞移動及び物質移動に好適なNF-SMSにおける細孔間開口部及び細孔インターコネクティビティ、並びに組織再生に好適なナノ繊維の形態が、PLGA NS固定手順後に保持されることを示した。さらに、これらの像は、PLGA NSがNF-SMS全体に良好に分散していることを確認した。
【０１２８】
髄核(NP)細胞へのインビトロ導入効率
本実施例のHPのNR4A1遺伝子に対する導入効率を検討するために、NP細胞に、N/P比8のポリマー/NR4A1ポリプレックスをトランスフェクトした。負の対照として、NR4A1発現がないブランクプラスミドDNAのHP搭載を用いた。トランスフェクションの48時間後に、負の対照と比較して、ポリマー/NR4A1ポリプレックスをトランスフェクトした細胞では、NR4A1の顕著に強い蛍光染色が見られた（図26A〜26Fを参照）。ポリマー/NR4A1ポリプレックスをトランスフェクトしたNP細胞は、一貫して、リアルタイムPCRによって検出される対照細胞よりも有意に高いレベルのNR4A1 mRNAを発現した（図26G）。これに並行して、これらのNP細胞も、ウエスタンブロッティングによって検出される対照細胞よりも有意に高いレベルのNR4A1タンパク質を発現した（図26H）。
【０１２９】
NP細胞におけるNR4A1の抗線維化効果
抗体を、健常及び変性ヒトNP組織において、NR4A1タンパク質及び線維症マーカー、α平滑筋アクチン（α-SMA、遺伝子ACTA2によってコードされる。）を染色するのに用いた。染色結果は示されていないが、NR4A1タンパク質が、健常NP組織において高度に発現するのに対して、変性NP組織では、弱く発現することが分かった。図27のグラフに示されているように、NR4A1 mRNAレベルは、一貫して、健常NP組織において、変性NP組織よりも有意に高いことが分かった。
【０１３０】
NR4A1の過剰発現が、TGF-βシグナル伝達経路によって誘導される線維化反応に対する保護効果をもたらし得ることを検証するために、α-SMA発現及びストレス線維の形成を、TGF-β1 (10 ng・ml-1)及びポリマー/NR4A1ポリプレックス又は超分岐重合体のブランクベクターのいずれかとともにインキュベートしたヒトNP細胞において検討した。免疫蛍光染色の結果は示されていないが、α-SMA及びストレス線維の免疫蛍光染色は、ブランクpDNA群（ブランクプラスミドDNAが搭載されたHP）と比較して、ポリマー/NR4A1ポリプレックストランスフェクション群（NR4A1 pDNAが搭載されたHP）において、劇的に減少することが分かった。α-SMA発現に対する効果を図28Aのグラフに示し、ストレス線維形成に対する効果を図28Bのグラフに示す。これらの結果は、TGF-βの線維化効果が、NR4A1の過剰発現によって低減することを示した。
【０１３１】
インビボ遺伝子治療の有効性
ラットの尾の針穿刺を用いて、仙骨棘の椎間板変性（椎間板線維症）を誘発させた。1つの群は未処置のままにし（変性モデル群と称する。）、別の群をNS組込み型NF-SMS（すなわち、HP-NR4A1/NF-SMS）によって処置し、更に別の群を、超分岐重合体のブランクベクターを組み込んだNF-SMS（すなわち、HP-ブランク/NF-SMS）によって処置した。正常対照群には、穿刺も処置もしなかった。具体的には、最初の針穿刺の4週間後、処置群には、元の針穿刺付近でラットの尾に、NS組込み型NF-SMS又はブランクベクター組込み型NF-SMSを注入した。注入後、注入された懸濁液の血管外漏出を防ぐために、穴に粒状ゼラチンフォームを充填した。
【０１３２】
4週間の処置又は8週間の未処置の後、種々の群からの試料を、最初に肉眼所見の点から評価し、そして、μCT画像化を用いて評価した。これらの結果を図29A〜29Hに示す。図29B及び図29Fに示されているように、変性モデル群では、NPはほぼ完全に消失し、最も重篤な線維症がNP組織の中心領域において生じた。μCT画像は、変性モデル群（図29F）及びブランクベクター組込み型NF-SMS群（図29G）と比較して、NS組込み型NF-SMS処置群（図29H）では、椎間板高さが大きな椎間板再生の特徴を示した。また、注目すべきことに、NS組込み型NF-SMS群は、肉眼所見により、大きな半透明椎間板マトリックス領域と、少ない線維組織も示した（図29D）。肉眼所見及びμCT画像データに基づいて、ブランクベクター組込み型NF-SMS群の椎間板は、狭い椎間板空間及び線維組織浸潤を有する変性モデル群に類似していた（図29C及び29Gと図29B及び29Fの比較）。
【０１３３】
NS組込み型NF-SMSの注入後4週間において、組織学的分析を用いて治療有効性を更に評価した（図30a〜30lを参照）。正常対照群のインタクトな椎間板において、楕円形のNPは、HE染色によって確認されるように、正中矢状面において大きな容積の椎間板空間を占めていた（図30a及び30e）。NP領域は、サフラニンOによって強く染色され、このことは、高いグリコサミノグリカン(GAG)含有量を示した（図30i）。変性モデル群では、椎間板空間が崩壊するとともに、明らかな線維組織浸潤を示した（図30b、30f及び30j）。NS組込み型NF-SMS (HP-NR4A1/NF-SMS)群の椎間板は、依然として、ある程度の変性の特徴を示していた（図30d、30h及び30l）が、変性モデル（図30b、図30f及び図30j）又はブランクベクター組込み型NF-SMS（HP-ブランク/NF-SMS）群（図30c、30g及び30k）と比較して明らかな治療有効性があった。NS組込み型NF-SMS群のNP領域は、正常対照と類似しており、サフラニンOによって陽性に染色された（図30l）。ブランクベクター組込み型NF-SMS群では、不均質な線維組織が見られ、NP領域は、サフラニンOに対して陰性に染色された（図30c、30g及び30k）。
【０１３４】
インビボにおいて線維組織形成を評価するのに、細胞外マトリックス中のコラーゲンに対するマッソントリクローム染色、及びI型コラーゲン及びα-SMAに対する免疫組織化学染色を用いた（図31a〜31p）。正常対照群のインタクトな椎間板において、NP領域は、マッソントリクローム（コラーゲン）、I型コラーゲン及びα-SMAに対して陰性に染色された（図31a、31e、31i及び31m）。変性モデル群では、NP領域は、マッソントリクローム、I型コラーゲン及びα-SMAに対して陽性に染色された（図31b、31f、31j及び31n）。また、ブランクベクター組込み型NF-SMS（HP-ブランク/NF-SMS）群においても、NP領域は、マッソントリクローム、I型コラーゲン及びα-SMAに対して陽性に染色された（図31c、31g、31k及び31o）。これらの線維組織染色は、NS組込み型NF-SMS (HP-NR4A1/NF-SMS)群では弱かった（図31d、31h、31l及び31p）。
【０１３５】
本実施例のデータは、注入可能な二段階NR4A1プラスミドDNA (pDNA)送達ナノ繊維海綿状マイクロスフィア(NF-SMS)が、線維性変性を退行させ(reverse)、椎間板再生を促進するという結論を裏付けている。
【０１３６】
実施例6
支持構造体の調製
星型ポリ（L-乳酸）-co-ポリHEMA（SS-PLLA-co-ポリHEMA）を合成し、乳化法及び相分離法を用いて、ナノ繊維海綿状マイクロスフィア(NF-SMS)に集合させた。具体的には、ポリマー(0.4g)を、2% w/vの濃度で、50℃においてTHF中に溶解した。厳格な機械的撹拌（Speed 9、Fisher Science社製）下で、3倍量の星型PLLA溶液を含むグリセロール(50℃)を、ポリマー溶液に徐々に加えた。5分間撹拌した後、混合物を液体窒素に迅速に注いだ。10分後、溶媒交換のために、水-氷混合物(1L)を24時間にわたり加えた。マイクロスフィアをふるいにかけ、蒸留水によって8回洗浄して、球体上の残留グリセロールを除去した。次いで、球体を3日間凍結乾燥させた。
【０１３７】
マイクロスケールにおいて、NF-SMSは、マイクロスフィア全体にわたって相互接続された細孔構造を有していた（図32a）。NF-SMSの細孔は、平均径がおよそ15 μmであり、高度に相互接続されていた（細孔間の細孔間開口部は、約10 μmのサイズであった。）。ナノスケールでは、NF-SMSは、完全にECM模倣ナノ繊維から構成されていた。生体模倣ナノ繊維と高度に多孔性の構造の共同提示(co-presentation)により、NF-SMSは、MSCの接種と付着を同時に促進するという仮説が立てられた。この仮説を検討するための対照として、多孔質構造のないナノ繊維マイクロスフィア（図32b）、及びNF構造のない従来の滑らかなマイクロスフィア（図32c）を用いた。
【０１３８】
24時間の細胞接種後、ウサギ間葉系幹細胞(MSC)は、更に球状の3D形態を有するNF-SMSの外面と内孔の両方に付着した（図32d）。MSCは、更に球状の形態を有していても、ナノ繊維マイクロスフィアの外面のみに付着することができた（図32e）。滑らかなマイクロスフィア上では、表面上の細胞はわずかであったが、広がっていると考えられた（図32f）。
【０１３９】
ポリマー/抗miR-199aポリプレックスの調製
超分岐重合体(HP)を、実施例1に説明したものと同様に形成した。本実施例では、ポリエチレンイミン（PEI、分子量800 Da）、ポリエチレングリコールメチルエーテル（PEG、分子量2000 Da）、及び超分岐ビス-MPAポリエステル（H40:64ヒドロキシル）を用いた。
【０１４０】
設計されたH40ポリマー溶液(1.0 mg/mL)を、60 pmolの抗miR-199aを含むRNA溶液に徐々に加えた。加えたポリマーの量を、ポリマー/RNAの選択されたN/P比（RNAのリン酸塩Pに対するポリマーの窒素原子N）に基づいて算出した。混合物を室温において30分間インキュベートして、ポリプレックスを形成させた。
【０１４１】
抗miR-199aは、最初に、超分岐ポリエステルコアの外殻上にPEIと複合体を形成した。HP分子コアとPEI/抗miR-199aシェルは、ともに、3層ナノスフィアの内側PEGコアと外側PEG鎖との間に挟まれた疎水性球状シェルに集合した。
【０１４２】
ポリマー/抗miR-199aポリプレックスを含むPLGAナノスフィア(NS)の調製
ポリマー/抗miR-199aポリプレックスを含むPLGA（ポリ（ラクチド-co-グリコリド）、平均分子量64,000）ナノスフィア(NS)を、改良水中油中水型(w/o/w)二重エマルジョン法を用いて作製した。簡潔には、30 mgのPLGAを1 mLのジクロロメタン中に溶解した。N/Pが10であるポリマー/抗miR-199aポリプレックスの100 μL水溶液を上述の溶液に添加し、これを、50Wにおいてプローブソニケーター（Virsonic 100、Gardiner社（ニューヨーク州）製）によって乳化させた。次いで、この一次w/oエマルジョンを、90Wの超音波処理下で10 mLのPVA溶液（1重量%/vol）に乳化させて、w/o/wエマルジョンを形成した。得られた二次エマルジョンを室温において約12時間磁気撹拌して、溶媒を蒸発させた。遠心分離によってPLGA（抗miR-199a）NS（平均径300 nm）を回収し、水によって3回洗浄し、凍結乾燥させた。
【０１４３】
細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物の形成
PLGA（抗miR-199a）NS（そこに埋め込まれたポリマー/抗miR-199aポリプレックスを含む。）を、ウサギ間葉系幹細胞(MSC)を付着させたNF-SMSと混合した（図32dに示す。）。
【０１４４】
一部の試験の対照として、超分岐重合体のブランクベクターを、ウサギ間葉系幹細胞(MSC)を付着させたNF-SMSと混合した（図32dに示す。）。これらの構築物は、本実施例を通して、細胞/ブランクHP/NF-SMS構築物と称する。
【０１４５】
細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物の皮下埋め込み
設計された髄核様表現型の長期安定性を調査するために、細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物を、インビトロにおいてTGF-β1とともに3週間培養し、次いで、これをヌードマウスの皮下に埋め込んだ。TGF-β1誘導を伴わない細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物を第1の対照として用い、TGF-β1誘導を伴う細胞/ブランクHP/NF-SMS構築物を第2の対照として用いた。
【０１４６】
埋め込み8週間後に、インビボにおいて髄核様表現型の維持に対する抗miR-199aの効果を検討するために、種々の構築物を回収した。種々の構築物をH&E、サフラニンO及びフォンコッサ法によって染色した。第1の対照の結果を図33a、33d及び33gに示す。第2の対照の結果を図33b、33e及び33hに示す。細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物の結果を、図33c、33f及び33iに示す。
【０１４７】
TGF-β1誘導を伴う細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物では、サフラニンOによるグリコサミノグリカン(GAG)に対する強い陽性染色が観察された（図33f）。これらの同じ構築物は、（フォンコッサ法による）石灰化に対して陰性に染色された（図33i）。対照的に、TGF-β1誘導（第2の対照）を伴う埋め込まれた細胞/ブランクHP/NF-SMS構築物は、広い領域の骨化した組織からなり、サフラニンO（図33e）及びフォンコッサ法（図33h）をそれぞれ用い、GAG及び石灰化に対して陽性に染色された。TGF-β1誘導（第1の対照）を伴わない埋め込まれた細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物を、サフラニンO（図33d）及びフォンコッサ法（図33g）を用い、GAG及び石灰化に対して陰性に染色された。これらの結果は、抗miR-199aが、髄核様表現型を維持し、そして皮下埋め込み後に石灰化を防止するうえで、重要な役割を果たすことを示した。
【０１４８】
経皮的穿刺による変性椎間板モデル及びmiRNA（抗miR-199A）送達
麻酔後、ウサギを蛍光透視撮影台上に横方向位置に置いた。Cアーム画像の案内下で、18ゲージのスパイナル針を、正中棘突起(midline spinous process)に対して1〜2 cm横方向の点、及び背骨に対して30〜45度の角度において、後外側進入路を用いて椎間板(IVD)に挿入した。針を、骨棘形成を避けるように、椎体に触れずにIVD空間の側縁まで慎重に進行させた。椎間板空間に針を穏やかに挿入した。Cアーム突出部からの前後方向及び側面画像を用いて、針をIVDの中心に配置するようにガイドした。針がIVDにあることを確認した後、約0.005〜0.008gの髄核を吸引して、椎間板変性モデルを誘導した。吸引された椎間板断片を解剖顕微鏡下で慎重に検査して、髄核のみが吸引されたことを確認した。
【０１４９】
最初の手術の4週間後、反対側の同じIVDに25G針を挿入するように、同じ手法をとった。1つの群において、NF-SMS及びウサギMSC（すなわち、細胞/PLGA (miRNA) NS/NF-SMS構築物）と組み合わせたPLGAナノ粒子に埋め込まれたポリプレックス（HP-抗miR-199a）を注入して、針穿刺誘発腰椎椎間板変性を処置した。別の群では、NF-SMS及びウサギMSC（すなわち、細胞/ブランクHP/NF-SMS構築物）と組み合わせたPLGAナノ粒子に埋め込まれた超分岐重合体を注入した。これらの注入後、注入懸濁液の血管外漏出を防ぐために、カニューレによって穴に粒状ゼラチンフォームを充填した。この経皮的手法を介して針がIVD空間に挿入されたことを示すのに、蛍光透視画像化を用いた。
【０１５０】
更に別の群は、未処置のままにした（偽群と称する。）。正常対照群には、穿刺も処置もしなかった。
【０１５１】
細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物注入のインビボ効果
6週間の処置後、正常対照、偽群、細胞/ブランクHP/NF-SMS構築物によって処置した群、及び細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物によって処置した群から、試料を採集した。肉眼所見及び蛍光透視画像を用いて、治療有効性を評価した（図34a〜hを参照）。偽群（処置なしで穿刺）では、NPは、ほぼ完全に消失したが、異所性骨形成がIVD空間の周囲に見られた（図34b及び34f）。偽群（図34f）と比較して、細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物群（図34h）では、椎間板高さが大きな椎間板再生の特徴がみられた。注目すべきことに、細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物群は、肉眼所見により多くの正常な半透明椎間板マトリックス（図34d）と、蛍光透視画像において少ない異所性骨形成を示した（図34h）。蛍光透視画像及び肉眼所見から、細胞/ブランクHP/NF-SMS構築物群の椎間板は、細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物群と類似していた。しかしながら、細胞/ブランクHP/NF-SMS構築物群（図34g）の椎間板空間は、細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物群（図34h）の椎間板空間よりも狭いことが分かった。
【０１５２】
結果は示されていないが、種々の群のウサギ脊椎の三次元(3D)再構築及びμCTスキャンの断面を生成した。μCT装置のソフトウェアを用いたそれぞれの群の骨棘の骨量の結果を図35に示す。結果は、正常対照群における異所性骨化の完全な欠如を確認した。細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物群における異所性骨化領域は、偽群及び細胞/ブランクHP/NF-SMS構築物群よりも有意に小さかった。
【０１５３】
構築物の注入後6週間において、組織学的分析を用い、治療有効性を評価した（図36a〜36pを参照）。H&E及びサフラニンO染色を種々の試料において行った。（正常）対照群（図36a、36e、36i及び36m）のインタクトな椎間板において、楕円形のNPは、HE染色によって明らかにされるように、正中矢状面において大きな容積の椎間板空間を占めていた（図36a）。NP領域は、サフラニンOによって強く染色されることを示し、このことは、高いグリコサミノグリカン(GAG)含有量を示した（図36e及び36i）。偽群（図36b、36f、36j及び36n）では、椎間板空間が崩壊するとともに、明らかな線維組織浸潤を示した。細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物群の椎間板は、依然として、変性の特徴をある程度まで示していた（図36d、36h、36l及び36p）が、偽群（図36b、36f、36j及び36n）と比較して、治療有効性は明らかであった。細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物群のNP領域は、正常対照群と類似しており、サフラニンOによって陽性に染色された（図36h及び36l）。細胞/ブランクHP/NF-SMS構築物群（図36c、36g、36k及び36o）では、NP領域は、細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物群と比較して、サフラニンOによって弱く染色された。偽群（図36n）、及び細胞/ブランクHP/NF-SMS構築群（図36o）では、細胞/PLGA（抗miR-199a）NS/NF-SMS構築物群（図36p）と比較して、骨端板(BEP)の厚さ、及び異常／端板石灰化は有意に高かった。
【０１５４】
結論として、抗miR-199Aの持続送達は、NP線維症及び異常石灰化を実質的に抑制し、NP変性を有意に減少させた。
【０１５５】
実施例6では、PLGA NS（そこに埋め込まれたポリマー/抗miR-199aポリプレックスを含む。）、細胞及びNF-SMSをともに混合した。ただし、細胞及びPLGA NSは、ポストシード法を用いてNF-SMSに固定できることが理解される。例として、ウサギMSC及びPLGA（抗miR-199a）NSをヘキサン中に分散させ、NF-SMS上に滴下して接種してもよい。そして、NF-SMSを、ヘキサン／THF（9:1容積）の混合溶媒の蒸気に30分間供してもよい。NF-SMSを真空下で3日間乾燥させて、溶媒を除去してもよい。このような種類の方法の結果として、細胞及びPLGA NSは、NF-SMSに固定されるようになる。
【０１５６】
本明細書に開示されている例では、直鎖状ポリエステル系共重合体及び超分岐ポリエステル系共重合体が開発されている。超分岐共重合体は、非常に高いmiRNA又はpDNA結合親和性と、非常に低い毒性を示す。超分岐樹状ポリエステルコアは、疎水性を提供し、共重合体の高分子量に寄与する。共重合体では、低分子量PEI（低毒性）は、樹状超分岐ポリエステルコアの表面にグラフト化され、その正電荷を分配する。また、低分子量PEIは、グラフト化された長いPEG鎖によって覆われている。
【０１５７】
例を通して示したように、HP/miRNAポリプレックスは、3層ナノ粒子に自己集合し、HP/miRNAポリプレックスは、内側PEGコア／部分と外側PEG層／部分との間に挟まれたナノサイズの球状シェルを形成する。二重殻様電荷分布は、厳格な超音波処理下であっても非常に安定しており、細胞毒性を無視することができ、細胞をトランスフェクションするのに非常に効果的であることが分かった。
【０１５８】
加えて、本明細書の例は、これらのポリプレックスが、生分解性PLGAマイクロスフィア中に安定的に封入され、長期間にわたって制御可能に放出され得ることを実証する。封入時であっても、ポリプレックスは特定のナノ構造を保持し、これらの生物活性を保持する。ポリプレックス埋込み型マイクロスフィアは、PLLAナノ繊維足場（又は他の支持構造体）に付着することもでき、放出されたHP/miRNAポリプレックスは、内因性細胞を局所的に活性化させて、外部導入された細胞を有することなく、重大なサイズの骨欠損を完全に再生することができる。
【０１５９】
本明細書を通して、「一例(one example)」、「別の例(another example)」、「例(example)」などは、例に関連して説明した特定の要素（例えば、特徴、構造及び／又は特性）が、本明細書に説明されている少なくとも1つの例に含まれ、他の例には存在していても存在していなくてもよいことを意味する。加えて、あらゆる例の説明されている要素は、文脈上他に明確に指示されていない限り、種々の例において、適切に組み合わせてもよいことが理解される。
【０１６０】
本明細書に示されている範囲には、記述されている範囲及び記述されている範囲内のあらゆる値又は部分範囲(sub-range)が含まれることが理解される。例えば、約30%〜約70%という範囲は、約30%〜約70%という明示的に列挙された限界を含むだけでなく、32%、44.5%、68%などの個々の値、及び約35%〜約65%、約40%〜約60%などの部分範囲も含むものと解釈される。さらに、値を説明するのに「約(about)」が用いられる場合、これは、記述されている値からのわずかな変動（最大+/-10%）を包含することを意味する。
【０１６１】
本明細書に開示されている例の説明及び記述(claiming)において、単数形「a」、「an」及び「the」には、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれる。
【０１６２】
複数の例を詳細に説明してきたが、開示されている例は変更してもよいことが理解される。したがって、上述の説明は、非限定的であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２６Ｆ】
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【図２６Ｇ】
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【図２６Ｈ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【図２９Ｆ】
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【図２９Ｇ】
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【図２９Ｈ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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