(57)【要約】本開示は、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を含む方法および組成物を含む。
2018535667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌であって、前記条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子がｃｏｄＡであるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌。
【請求項２】
ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される請求項１に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌。
【請求項３】
アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される請求項２に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌。
【請求項４】
前記植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細菌である請求項３に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌。
【請求項５】
前記植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の細菌である請求項３に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌。
【請求項６】
前記植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である請求項３に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌。
【請求項７】
前記植物形質転換細菌は、栄養要求株である請求項１〜６のいずれか一項に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌。
【請求項８】
前記栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である請求項７に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌。
【請求項９】
前記植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である請求項１、２、７または８のいずれか一項に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌。
【請求項１０】
選択ヌクレオチド配列を植物体にトランスファーする方法であって、前記植物体へトランスファーする選択ヌクレオチド配列をさらに含む請求項１〜９のいずれか一項に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を、前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を組織培養培地で植物細胞と共に共培養し、前記植物細胞に前記選択されたヌクレオチド配列をトランスファーさせ、前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、前記条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地で培養することを含む細菌媒介トランスファーにおいて使用することを含む方法。
【請求項１１】
前記選択組織培養培地は、栄養要求菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細菌媒介ヌクレオチド配列トランスファー後に、植物組織培養物から、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を除去する方法であって、植物組織培養における植物細胞への細菌媒介トランスファーにおいて、前記植物体へトランスファーする選択ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を用意し、ヌクレオチド配列トランスファー後に、前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、前記条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地で培養することを含む方法。
【請求項１３】
前記選択組織培養培地は、栄養要求菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）植物細胞と、前記植物細胞へトランスファーする選択ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌とを、組織培養で共培養すること；
ｂ）前記選択ヌクレオチド配列を前記植物細胞にトランスファーさせること、および
ｃ）前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、前記条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地を加えることを含む植物細胞の形質転換方法。
【請求項１５】
前記選択組織培養培地は、栄養要求菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｃｏｄＡ遺伝子を含む、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を対抗選択する方法であって、前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を、前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、前記条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地と接触させることを含む方法。
【請求項１７】
前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細菌である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の細菌である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される請求項１６、１７、２２または２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記選択組織培養培地は、前記栄養要求菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、例えば、形質転換された植物の組織培養物から、例えば、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌を除去するのに使用するための、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌を用いる植物形質転換方法および植物形質転換用組成物を含む。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２４２８５９号、および２０１５年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／２６９１３９号の利益を主張するものであり、それらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介してテキストファイルで提出された配列表の参照
２０１６年１０月４日作成の「２０１６１００４＿４６７２ＰＣＴ＿ＳＴ２５＿ＳｅｑＬｓｔ．ｔｘｔ」という名の、２３ＫＢのサイズを有するテキストファイルとして提出された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）の規定にしたがって、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌を用いる植物形質転換は、植物細胞へ外因性核酸配列（遺伝情報）を導入する技術として広く使用されている。最も広く使用されているのは、おそらく、アグロバクロテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介植物形質転換であろう。アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、ＤＮＡ配列を植物のゲノムにトランスファーする能力を有するリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌の属である。広く使用されているアグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌種は、植物の腫瘍クラウンゴールの病原体であるアグロバクロテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）である。近い種のアグロバクロテリウム・リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）は毛根病を誘発し、これもまた、植物ゲノムへのＤＮＡトランスファーに使用されている。これらの細菌のＤＮＡの植物へのトランスファー能力は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞内の大きなプラスミド（＞１００ｋｂ）の存在に依存する。これらのプラスミドは、アグロバクロテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびアグロバクロテリウム・リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）においてそれぞれ、Ｔｉ（腫瘍誘発）またはＲｉ（発根）と呼ばれている。細菌から植物ゲノムへのＤＮＡトランスファーは、Ｔｉプラスミドから宿主細胞への特定のＴ−ＤＮＡ（トランスファーＤＮＡ）分子の移行を含む。Ｔ−ＤＮＡ領域は、左境界配列および右境界配列と呼ばれる２５ｂｐによって区切られている。外因性ＤＮＡ配列はアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌のプラスミドに組み込まれ、植物組織培養中の植物細胞にトランスファーされる。
【０００５】
植物ゲノムへＤＮＡ配列をトランスファーする能力を持つリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の他の細菌としては、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌が挙げられる。アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌が接触した植物細胞は、組織培養条件下で増殖し成長することができる。アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌はまたこれらの条件下で増殖し続けるので、植物細胞の成長期間においては、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細胞を取り除くことが重要な工程となる。今日の組織培養の手法では、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細胞を阻害および／または殺滅する戦略として、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌を含む培養は、植物細胞組織培養培地に抗生物質を導入する。いくつかの例では、これらの抗生物質は植物細胞組織の成長発達を妨げる可能性があり、また形質転換プロセスおよび植物組織の成長に要する費用を増大させる。一般に使用されている抗生物質としては、チカルシリン、セフォタキシム、カルベニシリンまたはバンコマイシンが挙げられる。短期間の培養では、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の増殖を制御または止めることができるが、長期の組織培養手順では、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は増殖し続け、ついには植物組織を過成長させ、その結果、全組織培養物および容器の廃棄、ならびに形質転換植物組織作製の失敗に繋がるおそれがある。アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）を媒介として、遺伝子配列を植物細胞へトランスファーした後、植物組織培養条件から、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細胞の増殖を阻害する方法および組成物が要望されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌であって、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子がｃｏｄＡである細菌を含む。一態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される。さらなる態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される。さらなる態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である。さらなる態様においては、栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である。さらなる態様においては、植物形質転換栄養要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細菌である。さらなる態様においては、ＴｈｙＡ要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。
【０００７】
本開示は、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子を含み、さらに植物体へトランスファーする選択ヌクレオチド配列を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を植物細胞と組織培養培地で共培養し、選択ヌクレオチド配列を植物細胞にトランスファーし、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地で培養することを含む細菌媒介トランスファーにおいて使用することを含む、選択ヌクレオチド配列を植物体にトランスファーする方法を含む。一態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な植物形質転換栄養要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なＴｈｙＡ要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、選択組織培養培地は、栄養要求性細菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている。
【０００８】
本開示は、細菌媒介ヌクレオチド配列トランスファー後に、植物組織培養物から、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子を含み、さらに、植物組織培養における植物細胞への細菌媒介トランスファーにおいて、植物体へトランスファーする選択ヌクレオチド配列を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を除く方法であって、ヌクレオチド配列トランスファー後に、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地で培養することを含む方法を含む。一態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される。さらなる態様においては、本法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な植物形質転換栄養要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なＴｈｙＡ要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、選択組織培養培地は、栄養要求性細菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている。
【０００９】
本開示は、植物細胞を形質転換する方法であって、ａ）、植物細胞と、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子を含み、さらに植物細胞へトランスファーする選択ヌクレオチド配列を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌とを、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を、組織培養で共培養すること；ｂ）選択ヌクレオチド配列を植物細胞にトランスファーすること；およびｃ）リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地を加えることを含む方法を含む。一態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される。さらなる態様においては、本法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な植物形質転換栄養要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なＴｈｙＡ要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、選択組織培養培地は、栄養要求性細菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている。
【００１０】
本開示は、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を対抗選択する方法であって、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地と接触させることを含む方法を含む。一態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される。さらなる態様においては、本法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な植物形質転換栄養要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なＴｈｙＡ要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、選択組織培養培地は、栄養要求性細菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている。
【００１１】
本開示は、ゲノムに条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を作製し使用するための方法および組成物を含む。本開示の方法は、ゲノムに１つ以上の選択マーカーを含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される細菌を使用して形質転換することを含む。一態様において、開示する形質転換されたリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌は、ゲノムに２つの選択マーカー遺伝子を含んでよく、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子は、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子である。本明細書に開示の方法は、植物細胞を形質転換するための１つ以上の選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を使用すること、および植物細胞祖式培養物から、そのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を除去することを含む。本明細書に開示の方法は、少なくとも１つのネガティブ選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌をネガティブ選択する方法を含む。本明細書に開示の組成物は、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌を含む。一態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌は、２つの選択マーカー遺伝子を含んでよく、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子は、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子である。本明細書に開示の組成物は、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含むベクターを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本明細書に開示のＤＮＡコンストラクトを示す。
【図２】図２は、予測膜貫通ドメイン（灰色の陰影で示す）を有するＩ型毒素のタンパク質配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下の詳細な説明は、当業者が本開示を実施するのを助けるために提示するものであり、当業者であれば本発明発見の精神および範囲から逸脱することなく本明細書に記載する態様に変更および変形を加えることができることから、本発明の態様を過度に限定するものではないと解すべきである。
【００１４】
本願で引用する刊行物、特許、特許出願およびその他の参照文献は全て、あたかもそれらの刊行物、特許、特許出願およびその他の参照文献のそれぞれが、明確にかつ個々に示され、その全体が参照により組み込まれているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１５】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ  ｃｅｌｌ（１つの細胞）」といった場合には、そのような細胞を複数含み、「ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（そのタンパク質）」といった場合には、１種以上のタンパク質および当業者に知られたその均等物を含む。特に明記しない限り、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００１６】
本開示は、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌であって、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子がｃｏｄＡである細菌を含む。一態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される。さらなる態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される。さらなる態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である。さらなる態様においては、栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である。さらなる態様においては、植物形質転換栄養要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細菌である。さらなる態様においては、ＴｈｙＡ要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。
【００１７】
本開示は、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子を含み、さらに植物体へトランスファーする選択ヌクレオチド配列を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を植物細胞と組織培養培地で共培養し、選択ヌクレオチド配列を植物細胞にトランスファーし、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地で培養することを含む細菌媒介トランスファーにおいて使用することを含む、選択ヌクレオチド配列を植物体にトランスファーする方法を含む。一態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される。さらなる態様においては、本法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である。さらなる態様においては、栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な植物形質転換栄養要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なＴｈｙＡ要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、選択組織培養培地は、栄養要求性細菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている。
【００１８】
本開示は、細菌媒介ヌクレオチド配列トランスファー後に、植物組織培養物から、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子を含み、さらに、植物組織培養における植物細胞への細菌媒介トランスファーにおいて、植物体へトランスファーする選択ヌクレオチド配列を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を除く方法であって、ヌクレオチド配列トランスファー後に、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地で培養することを含む方法を含む。一態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される。さらなる態様においては、本法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である。さらなる態様においては、栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な植物形質転換栄養要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なＴｈｙＡ要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、選択組織培養培地は、栄養要求性細菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている。
【００１９】
本開示は、植物細胞を形質転換する方法であって、ａ）、植物細胞と、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子を含み、さらに植物細胞へトランスファーする選択ヌクレオチド配列を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌とを、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を、組織培養で共培養すること；ｂ）選択ヌクレオチド配列を植物細胞にトランスファーすること、およびｃ）リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地を加えることを含む方法を含む。一態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される。さらなる態様においては、本法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な植物形質転換栄養要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なＴｈｙＡ要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、選択組織培養培地は、栄養要求性細菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている。
【００２０】
本開示は、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を対抗選択する方法であって、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌を、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌の増殖および複製を阻害する毒性化合物へ酵素によって変換される、条件付きネガティブ選択マーカーｃｏｄＡ遺伝子に対し非毒性の基質を含む選択組織培養培地と接触させることを含む方法を含む。一態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される。さらなる態様においては、本法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の植物形質転換細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌は、栄養要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な栄養要求株は、ＴｈｙＡ要求株である。さらなる態様においては、本方法に有用な植物形質転換栄養要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、本方法に有用なＴｈｙＡ要求性細菌は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の細菌である。さらなる態様においては、選択組織培養培地は、栄養要求性細菌の増殖および複製に必要な基質を欠いている。
【００２１】
本開示は、ゲノムに条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を作製し使用するための方法および組成物を含む。本開示の方法は、ゲノムに１つ以上の選択マーカーを含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される細菌を使用して形質転換することを含む。一態様において、開示する形質転換されたリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌は、ゲノムに２つの選択マーカー遺伝子を含んでよく、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子は、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子である。本明細書に開示の方法は、植物細胞を形質転換するための１つ以上の選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を使用すること、および植物細胞祖式培養物から、そのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を除去することを含む。本明細書に開示の方法は、少なくとも１つのネガティブ選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌をネガティブ選択する方法を含む。本明細書に開示の組成物は、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌を含む。一態様においては、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌は、２つの選択マーカー遺伝子を含んでよく、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子は、条件付きネガティブ選択マーカー遺伝子である。本明細書に開示の組成物は、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含むベクターを含む。
【００２２】
一態様において、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ）、オクロバクテリウム・デジョネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ルピネ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｌｕｐｉｎｅ）、オクロバクテリウム・オリゼ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、ＬＢＮＬ１２４−Ａ−１０、ＨＴＧ３−Ｃ−０７、オクロバクテリウム・ペクトリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｅｃｔｏｒｉｓ）、オクロバクテリウム・シセリ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉ）、オクロバクテリウム・ガリニファエシス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｇａｌｌｉｎｉｆａｅｃｉｓ）、オクロバクテリウム・グリグノネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ガングゾウエンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｇｕａｎｇｚｈｏｕｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ハエマトフィルム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｍ）、オクロバクテリウム・インターメディウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、オクロバクテリウム・ルピネ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｌｕｐｉｎｉ）、オクロバクテリウム・オリゼ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、オクロバクテリウム・ペコリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｅｃｏｒｉｓ）、オクロバクテリウム・ピツイトスム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｉｔｕｉｔｏｓｕｍ）、オクロバクテリウム・シュードインターメディウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、オクロバクテリウム・シュードグリグノネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・リゾスファエラエ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）、およびオクロバクテリウム・チオフェニボランス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｈｉｏｐｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９１３５号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる））からなる群から選択される。
【００２３】
一態様において、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｄｉ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＳＤ６３０、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＵＳＤＡ１００２、シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）ＵＳＤＡ２０５、シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）ＳＦ５４２Ｇ、シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）ＳＦ４４０４、およびシノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）ＳＭ５４２Ｃ（ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９０５３号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）および米国特許第７８８８５５２号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる））からなる群から選択される。
【００２４】
一態様において、アグロバクロテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、アグロバクロテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（米国特許第７８８８５５２号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる））からなる群から選択される。
【００２５】
一態様において、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）Ｍａｄｉｓｏｎ、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＵＳＤＡ２３７０、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＵＳＤＡ２４０８、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＵＳＤＡ２６６８、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２３７０Ｇ、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２３７０ＬＢＡ、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２０４８Ｇ、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２０４８ＬＢＡ、リゾビウム・レグミノサーラム・ビーブィ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）、リゾビウム・レグミノサーラム・ビーブィ・ファセオリ（Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）２６６８Ｇ、リゾビウム・レグミノサーラム・ビーブィ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）２６６８ＬＢＡ、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＲＬ５４２Ｃ、リゾビウム・レグミノサーラム・ビーブィ・ビシアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）、リゾビウム・レグミノサーラム・ビーブィ・トリフォリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）ＵＳＤＡ９０３２、リゾビウム・エトリ・ビーブィ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）およびリゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｉ）（米国特許第７８８８５５２号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる））からなる群から選択される。
【００２６】
一態様において、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ＭＬ５４２Ｇ、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ＭＬ４４０４（米国特許第７８８８５５２号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる））からなる群から選択される。
【００２７】
一態様において、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は、ブラディリゾビウム・ビウムヤポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ６、およびブラディリゾビウム・ヤポニクム（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ１１０（米国特許第７８８８５５２号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる））からなる群から選択される。
【００２８】
本開示は、少なくとも１つの選択マーカー、および／また有害な配列もしくはタンパク質を含むリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌を含む方法および組成物を含む。一態様において、少なくとも１つの選択マーカーは、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌の増殖阻害または殺滅に有効なネガティブ選択マーカーである。例えば、本明細書には、ＣＯＤＡタンパク質（配列番号４）をコードするネガティブ選択マーカー、ｃｏｄＡ、５−フルオロシトシン（非毒性化合物）を５−フルオロウラシル（アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌に対し毒性を有する化合物）に変換する条件付き選択マーカーの遺伝子を含むアグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌が開示されている。
【００２９】
ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌は、ＤＮＡ配列を植物細胞に挿入するのに使用される。植物細胞はその後、植物組織培養で成育され、挿入されたＤＮＡ配列を含む植物組織または全植物体が生成される。植物細胞は組織培養条件下で成育するため、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌の増殖が阻害されるか、あるいはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌が殺滅されなければ、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌は、培養物中に植物体と共に残る。今日、培養物中のブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌の増殖を制御するためには、培養物中に抗生物質を加えている。トウモロコシの葉などのある特定の植物組織は、ストレスおよび／または損傷を受けると、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴＨＹ−変異株、ＬＢＡ４４０４ｔｈｙ−株（Ｒａｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２、米国特許第８３３４４２９Ｂ２号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）、培地中に外来のチミジンがなければ、ほとんど増殖しないか、または全く増殖しないチミジン要求株などのアグロバクロテリウム属（Ａｇ��ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖に非常に好ましい代謝産物を漏出する。二次培養プロセスの初期段階（すなわち、１週）では細菌の増殖を阻害することができるが、トランスジェニックトウモロコシカルスの回収に必要な長期の組織培養形態の間（６〜１０週）には、病原性が非常に強いアグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えばＡＧＬ０またはＡＧＬ１（アグロバクロテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ａ２８１株起源の追加のｖｉｒ遺伝子を持つＴｉプラスミドのｐＴｉＢｏ５４２を含むように遺伝子操作された菌株）は、トウモロコシ葉由来のカルスの最適な成長に必要な特定の糖またはＣｕ＋＋などのイオンを高濃度で含むトウモロコシ組織培養培地では強力に増殖するので、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌の異常増殖がさらに進む。アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌の異常増殖は、トウモロコシ細胞の培養反応を阻害し（細胞死反応の増強および活性フリーラジカルの放出によると仮定される）、現段階では、組織培養で現在使用されている抗生物質の従来の組み合わせを使用して細胞の異常増殖を制御することは、不可能ではないにしても、非常に困難である。外植体が初めにブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌によって形質転換されていることと関係なく（例えば、未熟胚、成熟種子由来の胚または葉組織）、トウモロコシ近交系細胞の大半は、非常に密で弱くないカルスを作り、それが、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌の、抗生物質の選択を難しくする問題を長引かせている。
【００３０】
本開示の一態様では、野生型または栄養要求性のアグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌を使用することによって、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌の植物組織培養における増殖を抑制もしくは阻害する方法および組成物であって、１）アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌中の１つ以上の選択マーカー、例えば、ｃｏｄＡ遺伝子の構成的発現もしくは誘導的発現、および／または２）アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌中の有害なタンパク質もしくは配列の構成的もしくは誘導的作動を含む方法および組成物が提供される。例えば、ネガティブ選択マーカーで、通常、非毒性基質を含む培養培地に存在する酵素を発現する核酸配列を含むアグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌において、選択マーカー酵素が非毒性基質を阻害物質に変換し、かくしてアグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌の条件付き選択および／または対抗選択を提供する。
【００３１】
本開示は、植物細胞を形質転換する方法、開示した方法に有用な発現コンストラクトおよび細菌の作製方法を提供する。本開示は、発現すると細菌に有害なタンパク質をコードする配列、もしくはヌクレオチド配列の、または、ネガティブ選択マーカーなどの少なくとも１つの選択マーカーをコードする配列の、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌、特に、アグロバクロテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への挿入を含み、この挿入は、誘導性調節配列の制御下にあってもなくてもよい。いくつかの態様では、本開示は、培養培地に抗生物質を添加せずに、効率の良い細菌の対抗選択を行う。
【００３２】
一態様において、本開示は、異種ポリヌクレオチド配列を宿主細胞へトランスファーするのに有用なリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌を提供する。細菌は、そのゲノムの一部として、ネガティブ選択マーカーとして機能する酵素などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え核酸配列を、細菌染色体またはプラスミドに有する。一態様において、ヌクレオチド配列は、調節配列に作動可能に連結していてもよい。一態様において、開示する細菌は、小分子の毒素を抑制することができるヌクレオチド配列を含む組み換え核酸配列を含む。一態様において、ヌクレオチド配列は、調節配列に作動可能に連結していてもよい。一態様において、開示する細菌は、細菌由来の毒素タンパク質であるタンパク質をコードする組み換え核酸配列と、抗毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む。一態様において、これらのヌクレオチド配列の１つ以上は、調節配列に作動可能に連結していてもよい。一態様において、開示する細菌は、例えば、増殖および再生に特定の基質を必要とする栄養要求株であってもよい。そのような基質は、細菌が晒される培地に加えられてもよく、それが存在すると、細菌は良好に成長する。基質が存在しないと、細菌は成長しないか、または死滅する。一態様において、細菌は誘導性栄養要求株であってよい。核酸配列は、他の核酸配列と機能的関係に置かれる、それに作動可能に連結される。
【００３３】
本明細書で使用する場合、細菌の成長または生存にネガティブに作用するタンパク質またはヌクレオチド配列は、有害なタンパク質または配列と呼ばれる。そのような有害なタンパク質または配列としては、限定はされないが、ネガティブ選択マーカー、対抗選択マーカー、栄養要求性細菌を生じさせる遺伝子の変異または変更、細菌由来の毒素遺伝子またはタンパク質、有害な配列をサイレンシングするアンチセンス配列、コリシンおよびミクロシンなどの抗菌ペプチド、対の毒素、および、抗毒素または解毒タンパク質が挙げられる。本明細書に開示の有害タンパク質を制御またはコードする有害な遺伝子または核酸配列、および当業者に知られたそのような遺伝子またはペプチドは、細菌の染色体、または細菌内のプラスミドもしくは他の遺伝子コンストラクトに位置してもよい。本明細書で使用する場合、用語「コード領域」は、ポリペプチドに翻訳可能な遺伝子のヌクレオチド配列を指す。そのようなヌクレオチド配列を含むコンストラクトを作製する方法は、当該技術分野ではよく知られている。
【００３４】
本明細書で使用される場合、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の植物形質転換細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌によって形質転換可能な植物細胞としては、限定はされないが、植物種子、成熟種子、子葉、葉外植片、苗、茎および根などの外植体材料が挙げられる。その外植体材料は、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌と接触している。
【００３５】
本開示では、本明細書に開示の調節配列および当業者に知られた調節配列を検討している。例えば、調節配列は、構造的にヌクレオチド配列の複製、転写または翻訳（コードされたタンパク質の発現）を引き起こすプロモーター、またはその組み合わせであってよく、あるいは、プロモーターは、例えば、培地中の基質により、または他の調節配列により誘導可能なものであってよい。例えば、調節配列は、誘導性プロモーターを含むことができ、この誘導性プロモーターを、オペレーター配列、他の調節配列と組み合せてもよい。本明細書で使用する場合、用語「オペレーター」または「オペレーター配列」は、リプレッサータンパク質または核酸が結合し、これによりプロモーターにより調節される遺伝子またはヌクレオチド配列の発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を指す。リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌内で機能する任意の誘導性プロモーターを使用することができる。一態様において、調節配列は、アグロバクロテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のメンバーで、特に、アグロバクロテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で機能するものである。調節配列の例としては、限定はされないが、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｌａｃプロモーターおよびＰｌａｃオペレーター、Ｐｉ２（ｎｏｃ）の転写活性化因子をコードし、ｎｏｃ１オペロンの存在下に、アグロバクロテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリン輸送系コードするｎｏｃＲ遺伝子（Ｖｏｎ  Ｌｉｎｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、４：３７０−３７８）、ならびにエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰＢＡＤプロモーターおよびａｒａＣオペレーター（Ｇａｌｌｅｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６１：３９３−４１０）が挙げられる。誘導性プロモーターの他の非限定的例としては、乳糖プロモーター、アラビノースプロモーター、ラムノースプロモーターおよびキシロースプロモーター由来のものが挙げられる。さらなる誘導性プロモーターとしては、温度誘導またはテトラサイクリンプロモーターに支配されるラムダラムダファージｐＲプロモーター／ｃＩ８５７リプレッサーシステムが挙げられる。
【００３６】
本開示の一態様では、条件致死遺伝子の構成的発現を提供するプロモーターに作動可能に連結した条件致死遺伝子に関する方法および組成物を提供する。非致死性の前駆体分子を培地に添加すると、発現した条件致死遺伝子の作用によって、致死性の生成物分子に変換される。
【００３７】
本開示の一態様では、図１に示すように、配列番号１を含む組み換え核酸コンストラクトを提供する。図１に示すように、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＢＬＡ；配列番号５）からのベータ−ラクタマーゼプロモーターを使用して、下流のエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ７の３’末端調節配列（配列番号６）が続く、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）−コドン−最適化ｃｏｄＡ遺伝子（エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＯＤＡタンパク質をコードする；配列番号２）の転写を駆動した。６）を得た。あるいは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）−コドン−非最適化ｃｏｄＡ遺伝子（配列番号３）をコンストラクト中で使用することができる。この核酸コンストラクトは、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えば、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌では、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する酵素をコードする有害な配列である。５−フルオロシトシンはリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌、例えばブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の細菌に対して非毒性であるが、５−フルオロウラシルはそのような細菌に対して毒性を有する。核酸配列を植物組織状態にある植物細胞にトランスファーするために、例えば、配列番号１の核酸コンストラクトを含み、かつ構成的に、または誘導的制御下で遺伝子産物を発現する細菌を使用し得る。細菌が５−フルオロシトシンを含む培地に曝されるか、またはその中で培養されると、遺伝子産物は５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換し、そして細菌の増殖および再生が阻害され、その結果、例えば、細菌は殺滅され、組織培養物から除去されて、植物組織は細菌に汚染されずに増殖および成長を続けることができる。本開示の組成物は、配列番号１の核酸コンストラクトを含む細菌、例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を含む。本開示の方法は、ＤＮＡ核酸を少なくとも１つの植物細胞へ細菌トランスファーする方法において、配列番号１の核酸コンストラクトを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）などの細菌を使用すること、核酸コンストラ���ト（例えば、ＣＯＤＡタンパク質酵素を発現するポリヌクレオチド配列）の遺伝子産物が５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルへ変換するように、５−フルオロシトシンなどのネガティブ選択マーカー用の基質を含む培地中で植物細胞を増殖させること、および細菌が植物組織培養物から除去されるように、細菌の増殖再生を阻害することを含む。当業者は、配列番号１の遺伝子配列および発現タンパク質を、他の知られた選択マーカーに置き換えることができる。
【００３８】
一態様では、本開示は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）などの栄養要求性細菌について、上で開示した組成物および方法を含む。例えば、ネガティブ選択マーカータンパク質を発現する配列番号１の核酸コンストラクト、または類似の核酸コンストラクトを、細菌に１種以上の基質に対する栄養要求性を与えるために、細菌の染色体などのＤＮＡに挿入することができる。一態様では、ネガティブ選択マーカータンパク質を発現する、配列番号１の核酸コンストラクト、または類似の核酸コンストラクトは、栄養要求性細菌の染色体、または栄養要求性細菌中の他のＤＮＡ上、例えば、栄養要求性細菌中のプラスミド上に位置させることができる。本開示の方法は、栄養要求性アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特に栄養要求性アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）などの栄養要求性細菌であって、その細菌が栄養要求性を示す基質の非存在下では、ゆっくりと再生するか、または全く再生せず、かつ、配列番号１の核酸コンストラクトを含む細菌を、少なくとも１つの植物細胞にＤＮＡ核酸を細菌トランスファーする方法において使用すること；細菌が栄養要求性を示す基質を欠く培地（例えば、選択培地）であって、核酸コンストラクトの遺伝子産物が５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルへ変換するように、５−フルオロシトシンなどのネガティブ選択マーカー用基質を含む培地中で植物細胞を培養すること、および、細菌が植物組織培養物から除去されるように、細菌の増殖再生を阻害することを含む。当業者は、配列番号１の遺伝子配列およびタンパク質を、他の知られた選択マーカーに置き換えることができる。そのような２種以上の選択マーカー、または栄養要求性などの細菌にとって有害な条件の使用は、多重選択の方法において有用であり、殺滅が困難なアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株の制御（増殖の阻害もしくは殺滅）に、かつまたは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を制御するのが困難な増殖条件下での、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖の阻害もしくは殺滅に使用することができる。
【００３９】
核酸コンストラクトは、細菌のネガティブ選択マーカーであるレバンスクラーゼをコードする配列番号７を含むことができる。
【００４０】
本明細書で開示した方法および組成物に含めるために、本開示では、当該技術分野で知られている選択マーカーを検討している。植物細胞にネガティブ選択を使用することは、当該技術分野で知られており、Ｓｃｈｌａｍａｎ＆Ｈｏｏｙｋａｓ，１９９７．Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １１：１３７７−８６．（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｃｏｄＡ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）；Ｇｌｅａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．  ＰＭＢ  ４０：２２３−３５，（Ｕｓｅ  ｏｆ  ＣＲＥ／ｌｏｘＰ  ｔｏ  ｅｘｃｉｓｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｄＡ  ｆｏｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｕｎｅｘｃｉｓｅｄ  ｌｏｃｕｓ）；Ｓｔｏｕｇａａｒｄ，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３：７５５−６１，（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｏｄＡ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ａｓ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ）を参照されたい。
【００４１】
植物細胞の選択法における既知の選択マーカーとしては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）骨格の排除選択をするために、Ｔ−ＤＮＡ境界の外側で使用するマーカー（米国特許第７５７５９１７号明細書。Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、植物細胞に対して毒性を有するマーカー（米国特許出願公開第２００９／０３２８２５３号明細書。Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、相同組み換え配列の外側で使用するマーカー（米国特許第５５０１９６７号明細書）が挙げられる。ネガティブマーカーは、植物の相同組み換え法（米国特許出願公開第２００５／０１７２３６５号明細書；米国特許出願公開第２００５／００６６３８６号明細書）；選択マーカーを相同組み換え配列の内側とし、アンチセンス配列を相同組み換え配列の外側にした方法（米国特許第５５２７６７４号明細書）；マーカー配列を相同配列の外側にした方法、（Ｄｕｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏ  ７５：１２１１−４）；および、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属からのｄｈｌＡ遺伝子（アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属において１，２−ジクロロエタンを有毒なハロゲン化アルコールに変換する）を含む方法（Ｎａｅｓｔｅｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １８：５７１−５７６）で使用されてきた。ポジティブマーカーまたはネガティブマーカーとして植物で使用するために開発された、Ｄ−イソロイシンを変換するｄａｏ１遺伝子を使用する方法が知られている（Ｅｒｉｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２：４５５−５８）。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を阻害または殺滅するためのレバンスクラーゼの誘導発現を含む、グラム陰性菌に対する対抗選択法が米国特許出願公開第２００２／００６１５７９号明細書に開示されている。ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｌａｃＹ、ｇａｔａ−１およびｃｃｄＢなどの対抗選択マーカーを使用する方法は、細菌遺伝学および発病論では知られている（Ｒｅｙｒａｔ、Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９８）６６（９）：４０１１−４０１７）。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、乳酸菌、酵母および哺乳動物細胞におけるポジティブ選択ベクターの方法が知られている（Ｙｏｕｎｇ−Ｊｕｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２２（３）：２２５−２４４）。
【００４２】
ネガティブ選択マーカーは、例えば、マーカー遺伝子を含む、配列の削除に成功した生物の選択を可能にする（Ｋｏｐｒｅｋ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９（６）：７１９−７２６）。そしてネガティブマーカーとしては、ＴＫチミジンキナーゼ（ＴＫ）およびジフテリア毒素Ａの断片（ＤＴ−Ａ）；シトシンデアミラーゼをコードするｃｏｄＡ遺伝子（Ｇｌｅｖｅ  Ａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４０（２）：２２３−３５；Ｐｅｒｅａｔ  Ｒ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ２３（４）：７９３−７９９；Ｓｔｏｕｇａａｒｄ  Ｊ；（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ３：７５５−７６１）；シトクロムＰ４５０遺伝子（Ｋｏｐｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：７１９−７２６）；ハロアルカンデハロゲナーゼをコードする遺伝子（Ｎａｅｓｔｅｄ  Ｈ（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１８：５７１−５７６）；ｉａａＨ遺伝子（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ９：１７９７−１８１０）；およびｔｍｓ２遺伝子（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ  Ｎ  Ｖ＆Ｓｍｉｔｈ  Ｄ  Ｌ  １９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３：２７３−２８９）を挙げることができる。追加の適切な毒素、およびそれらのポリペプチド配列（配列番号８−２８）を図２に示す。
【００４３】
本明細書で開示するネガティブ選択マーカーは、遺伝子ｃｏｄＡにより発現するタンパク質ＣＯＤＡであり、その遺伝子が、その遺伝子を有する生物に悪影響を及ぼさずにＣＯＤＡタンパク質を発現することができるという点で、条件付きの選択マーカーとすることができる。しかしながら、非毒性基質（この場合は、５−フルオロシトシン）が培養培地に加えられると、ＣＯＤＡタンパク質がそれを５−フルオロウラシルに変換する。これは有毒であり、増殖を阻害するか、またはその遺伝子を含む生物を殺滅する。植物では、条件付きネガティブ選択用の植物導入遺伝子としてｃｏｄＡが使われてきた。例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．７０：４０９−４２２；Ｇａｌｌｅｇｏ，Ｍ．，Ｓｉｒｎａｄ−Ｐｕｇｎｅｔ，Ｐ．ａｎｄ  Ｃ．Ｗｈｉｔｅ．１９９９，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔ−ＤＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ  ３９（１）：８３−９３；Ｋｏｐｅｋ，Ｔ．，ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｄ．，Ｌｏｕｗｅｒｓｅ，Ｊ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｃａｒｒｉｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｐ．Ｌｅｍａｕｘ，１９９９，Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｂａｒｌｅｙ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  Ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｄＡ−  ａｎｄ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｇｅｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６（６）：７１９−７２６；Ｃｏｒｎｅｉｌｌｅ，Ｓ．，Ｌｕｔｚ，Ｋ．，Ｓｖａｂ．Ａｎｄ  Ｐ．ｍａｌｉｇａ，２００１，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｔｉｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＣＲＥ−ｌｏｘ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２７（２）：１７１−１７８；Ｐａｒｋ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｙ．，Ｋａｎｇ，Ｂ  ａｎｄ  Ｗ．Ｃｈｕｎｇ，２００４，Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｋｅｒ  ｇｅｎｅ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ，  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．１０９（８）：１５６２−１５６７；Ｋｏｎｄｒａｋ，Ｍ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ，Ｉ．ａｎｄ  Ｚ．Ｂａｎｆａｌｖｉ，２００６．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｒｋｅｒ−ａｎｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｏｔａｔｏｅｓ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａ  ｎｏｎ−ｒｅｇｕｌａｒ  ｏｎｅ−ｂｏｒｄｅｒ  Ａｇ���ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１５：７２９−７３７，Ｙａｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｃ．Ｒｏｍｍｅｎｓ，２００７，Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４３：５７０−５７８；Ｄｕｔｔ，Ｍ，Ｌｉ  Ｚ．，Ｄｈｅｋｎｅｙ  Ｓ．ａｎｄ  Ｄ．Ｇｒａｙ，２０１２，Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８４７：２０１−２１３を参照されたい。
【００４４】
細菌中でネガティブ選択マーカーとして使用できる遺伝子の例としては、誘導的なものであるか構成的なものであるかにかかわらず、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。選択マーカーは、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｐｈｅＳ遺伝子の変異版（これは、基質特異性が緩和されたＰＨＥ−ｔＲＮＡ合成酵素のアルファｓ−サブユニットをコードする）とすることができる。この選択マーカーは、これを含む細菌を、フェニルアラニン類似物であるｐ−クロロフェニルアラニンに感受性を有するものとする。細菌はこの類似物を、細菌に対して毒性を有するタンパク質に組込む。変異はタンパク質のＡｌａ２９４からＧｌｙ２９４への変異である（Ｋａｓｔ  ａｎｄ  Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，１９９１．Ｇｅｎｅ４４：２５３−２６３）。細菌用の選択マーカーは、レバンスクラーゼ酵素（この酵素の基質はスクロースである）をコードするバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子（ｓａｃＢ）とすることができる。データは、コロニーが増殖を続けることができるという点で、このネガティブ選択マーカーは完全には有効でないことを示している（Ｂａｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９６，１７８（４）：１１５４）。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を完全には制御できない、ｓａｃＢ遺伝子などの有効性の低い選択マーカーは、１つ以上の他の有害なタンパク質もしくは配列と組み合わせるか、または、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の栄養要求条件と組み合わせることにより、植物の形質転換に有効なアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であって、有害なタンパク質またはヌクレオチド配列の発現を活性化する基質を含み、かつ／または栄養要求株によって必要とされる基質を欠く選択培地中の組織培養物から除去され得るアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を提供することができる。有効性の低い選択マーカーは、細菌の増殖を完全には阻害しないマーカーであるので、細菌は組織培養物から除去されず、ゆっくりした速度で増殖再生を続ける。そのような有効性の低い選択マーカーは、制御され得る細菌、すなわち組織培養物から除去され得る細菌を提供するために、正常細菌もしくは栄養要求性細菌中で、１つ以上の他の選択マーカーおよび／または有害なタンパク質配列もしくはヌクレオチド配列と組み合わせることができる。この制御は、従来の組織培養抗生物質を使用せずに行い得る。
【００４５】
一態様では、本明細書で使用するネガティブ選択マーカーは誘導的または構成的であり得る。細菌に挿入された有害なプロモーターまたはヌクレオチド配列は誘導的であり得る。有害なタンパク質の、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの細菌中での発現としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。細菌由来の毒素遺伝子は、細菌の対抗選択に使用し得る。例えば、大部分の細菌プラスミドは、細胞集団の中での安定した維持を確実にするためのメカニズムを有している。これには、娘細胞への分離およびプラスミドが欠失した細胞の殺滅などの機能が含まれる。細胞殺滅に対するこれらのメカニズムは、これらの殺滅機能を誘発する基質を使用することにより、集団中の不要な細胞の殺滅に使用するために適合させ得る。殺滅方法の１つの種類は、コリシンおよびミクロシンなどの抗生物質ペプチドの分泌である。（Ｐａｔｔｕｓ，Ｆ．，Ｄ．Ｍａｓｓｏｔｔｅ，Ｈ．Ｕ．Ｗｉｌｍｓｅｎ，Ｊ．Ｌａｋｅｙ，Ｄ．Ｔｓｅｒｎｏｇｌｏｕ，Ａ．Ｔｕｃｋｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．Ｗ．Ｐａｒｋｅｒ．１９９０．Ｃｏｌｉｃｉｎｓ：ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｋｉｌｌｅｒ−ｐｏｒｅｓ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ４６：１８０−１９２．Ｂａｑｕｅｒｏ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｆ．Ｍｏｒｅｎｏ．１９８４．Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｃｉｎｓ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３：１１７−１７５）。バクテリオシンまたはミクロシンを産生し、プラスミドを有する細胞は、それらが産生した抗生物質に免疫を有するが、プラスミドを失った集団中の細胞は、その毒素への免疫を失い殺滅される。
【００４６】
一態様では、本開示は、ネガティブ選択マーカーとして使用するために、毒素と抗毒素すなわち解毒剤のペアを含む、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を制御する方法を提供する。抗毒素は、毒素の活性を遮断するが、毒素より安定性が本質的に低い。抗毒素発現の喪失により、毒素が活性化し細胞を殺滅する。最新のレビューとしては、Ｈａｙｅｓ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１；１４９６およびＢｕｋｏｗｓｋｉ，２０１１  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｐｏｌ．２０１１；５８（１）：１−９を参照されたい。毒素システムの他のファミリーでは、毒素はアンチセンスＲＮＡによって調節される。例えば、Ｆｏｚｏ，２００８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｅｃ．２００８，ｐ．５７９−５８９を参照されたい。これらの毒素／抗毒素のファミリーは、大部分のプラスミドに、そしてまた大部分の細菌および古細菌の染色体に見出される。染色体ファミリーとしては、ｒｅｌＢＥ、ｖａｐＢＣ、ｈｉｃＡＢ、ｍａｚＥＦおよびｐｈｄ／ｄｏｃファミリーが挙げられる。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の染色体は、少なくとも１２のそうした遺伝子座を有する。これらの毒素の活動には、リボヌクレアーゼ、翻訳阻害剤、ジャイレース阻害剤、キナーゼおよび細胞膜の潜在力を破壊する細孔形成ペプチドが含まれる。
【００４７】
一態様では、本開示は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌の増殖を制御する方法であって、誘導プロモーターまたは発現活性化のためのプロモーター（ネガティブ選択マーカーとして使用するため）の制御下に、毒素またはその抗毒素の発現を含む方法を提供する。適切な外因性試薬、例えば化学的誘導剤によるプロモーターの誘導は、適切な時期での毒素発現、および細胞の殺滅を可能にする。好適な誘導プロモーターは、当業者に知られており、また本明細書に記載されている。
【００４８】
目的遺伝子の発現を活性化する各種プロモーターシステムが知られている。例えば、遺伝子は、毒素または選択マーカーの発現を抑制するために、リガンドの存在が必要なプロモーターに作動可能に連結することができる。目的遺伝子の発現を活性化するためのプロモーターおよびリガンドの例としては、発現を抑制するためにテトラサイクリン誘導体（ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンなど）を必要とするＴｅｔ−Ｏｎシステム、すなわちｒｔＴＡ依存性システムが挙げられる。このシステムでは、テトラサイクリン誘導体を除去すると目的遺伝子の発現が活性化する。さらなる態様では、ＩＰＴＧ誘導（ｌａｃＺ）プロモーターおよびアラビノース誘導（Ｐｂａｄ）プロモーターもまた、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のこの種の制御に使用できるであろう。
【００４９】
目的遺伝子の発現を誘導的に制御するために、各種プロモーターシステムが知られている。例えば、目的遺伝子は、毒素または選択マーカーの発現を誘導するために、リガンドの存在が必要なプロモーターに作動可能に連結することができる。目的遺伝子の発現を活性化するためのプロモーターおよびリガンドの例としては、発現を誘導するためにテトラサイクリン誘導体を必要とするＴｅｔ−Ｏｆｆシステム、すなわちｔＴＡ依存性システムが挙げられる。このシステムでは、テトラサイクリン誘導体が存在すると目的遺伝子の発現が活性化する。他の誘導システムとしては、エタメツルフロン（「ＥＭＲ」）抑制システムが挙げられる。
【００５０】
したがって、一態様では、本開示は、毒素および抗毒素のペアを含む、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌の増殖を制御する方法であって、毒素遺伝子が構成的プロモーターに作動可能に連結しており、抗毒素遺伝子が誘導的プロモーターまたは本明細書に記載の発現活性化のためのプロモーターに作動可能に連結している方法を提供する。
【００５１】
一態様では、本開示は、誘導的プロモーターまたは本明細書に記載の発現活性化のためのプロモーターに作動可能に連結した毒素遺伝子を含む、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌の増殖を制御する方法を提供する。
【００５２】
【表１】
2018535667.tif 000003
【００５３】
【表２】
2018535667.tif 000004
【００５４】
一態様では、本開示は、低分子毒素タンパク質と、毒素タンパク質の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡのペアを含む、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌の増殖を制御する方法を提供する。調節制御下のアンチセンスＲＮＡの発現は、アンチセンスＲＮＡが発現されないように、調節制御を不活性化または活性化する基質により誘導され、そしてアンチセンスＲＮＡの非存在下では、毒素タンパク質が発現され細菌は死滅する。例えば、本明細書には、図２に開示されているものなどの１種以上の低分子毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および低分子毒素タンパク質の発現を抑制する１種以上の対応するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌が開示されている。選択されたＤＮＡ配列を植物細胞にトランスファーするために、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などの、そうしたリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を使用する方法は、１種以上の低分子毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および低分子毒素タンパク質の発現を抑制する、１種以上の対応するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌（このブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌はまた、植物細胞にトランスファーする選択ヌクレオチド配列を含む）を植物細胞と、組織培養物中で選択ヌクレオチド配列を植物細胞にトランスファーするのに十分な時間共培養することを含み；その組織培養物に、アンチセンスＲＮＡの発現停止を誘導し、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌の増殖を阻害するか、または殺滅するように低分子毒素タンパク質を発現させる基質を含む選択培地を加える方法である。組織培養物中で、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を制御する方法は、１種以上の低分子毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および低分子毒素タンパク質の発現を抑制する１種以上の対応するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を含む組織培養物に、アンチセンスＲＮＡの発現停止を誘導し、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌の増殖を阻害するか、または殺滅するように低分子毒素タンパク質を発現させる基質を含む選択培地を与えることを含む。
【００５５】
各種の態様では、本開示の方法は、調節プロモーターの制御下に、必須遺伝子、例えば、開示した必須遺伝子を条件発現させることを含む。調節プロモーターの誘導を含む開示の方法では、適切な誘導剤の存在下で、細菌の正常な増殖に必要な必須遺伝子産物が発現される。培地中の誘導剤の欠乏は、必須遺伝子の発現を遮断するために使用することができ、これは細胞死をもたらす。
【００５６】
各種の態様では、本開示の方法は、必須遺伝子、例えば開示した必須遺伝子の発現を標的とするアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを条件発現させることを含む。そのような開示した方法では、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの誘導は、必須遺伝子の転写産物を不活性化の標的とし、したがって、必須遺伝子の発現を遮断するために使用することができる。
【００５７】
各種の態様では、本開示の方法は、バクテリオファージ溶解遺伝子を条件発現させることを含む（例えば、Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９２）ｐ．４３０−４８１；Ｋａｌｏｕｓｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９４）３３：１５−１９；およびＨｅｎｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，（１９９５）１５４：５１−５４を参照）。
【００５８】
各種の態様では、本開示の方法は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を条件発現させることを含む。
【００５９】
各種の態様では、本開示の方法は、炭水化物または他の外因性物質に対する感受性を適切に操作することを含む。例えば、ｇａｌＴおよびｇａｌＫを条件発現させることにより、ｇａｌＥヌル細胞におけるガラクトース感受性を操作することができる。ｇａｌｅが発現されないときは、ｇａｌＴおよびｇａｌＫの発現はＵＤＰ−ガラクトース毒素の蓄積をもたらす（Ａｈｍｅｄ、Ｇｅｎｅ（１９８４）２８：３７−４３を参照）。
【００６０】
発現コンストラクトまたは発現カセットとも呼ばれる核酸コンストラクトは、当業者によく知られた方法を用いて作製され、その方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５などの標準テキストに見出すことができる。一般に、コンストラクトまたは発現カセットは、所望の構成に構築された配列をもたらす、一連の制限酵素の消化とライゲーション反応により作製される。適切な制限部位が利用できない場合は、所望の組み換えコンストラクトを構築するために、代替戦略、例えば、当業者によく知られ、上で引用した文献に記載されている、合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびアダプターの使用を採用することができる。当業者に知られているように、要求される正確な制限酵素、リンカーおよび／またはアダプター、ならびに正確な反応条件は、配列および使用する戦略によって変わってくるであろう。しかしながら、組み換えコンストラクトの構築は、当該技術分野ではルーチンワークであり、過度の実験を行わずに、熟練した技術者であれば容易に実施することができる。
【００６１】
一度構築されれば、発現コンストラクトは、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）細菌のゲノムに挿入することができるか、または宿主細胞の形質転換に使用するブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌の自己複製プラスミドに別に導入することができる。１つの態様では、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）である。
【００６２】
発現コンストラクトを細菌のベクターのゲノムに導入することができる任意の方法を使用することができる。一態様では、相同組み換え、特にＲｕｖｋｕｎ  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ（（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ，２８９：８５−８８）の方法を使用して、コンストラクトを挿入することができる。この方法では、開示した組み換えコンストラクトの形態の変異は、相同交換組み換えによって染色体上の特定の遺伝子座に誘導される。挿入されたヌクレオチド配列の発現が可能な任意の遺伝子座を使用することができる。
【００６３】
本開示の一態様は、選択されたヌクレオチド配列を挿入するためのベクターとして、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を使用した、植物細胞の形質転換方法を提供する。一般に、この方法は、有害なタンパク質を発現する、本明細書で開示したヌクレオチド配列を含むか、または本明細書で開示したヌクレオチド配列を含むブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）株などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌を提供することを含む。有害なタンパク質またはヌクレオチド配列は、調節配列に作動可能に連結することができ、毒素タンパク質またはヌクレオチド配列の発現は構成的または誘導的とすることができる。植物細胞にトランスファーされるべき目的のヌクレオチド配列は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌のＴ−ＤＮＡ構成要素内に挿入することができ、例えば、常在性Ｔｉプラスミドへ直接に、またはバイナリープラスミド戦略を使用して別々に植物細胞に導入することができる。植物細胞を形質転換するために、外因性ヌクレオチド配列をＴ−ＤＮＡ構成要素に導入する方法、および得られたブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）細菌の接合完了体の使用は、当該技術分野でよく知られている（Ｍａｌｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５および米国���許第７８８８５５２号明細書（参照によりその全体が本明細書に組込まれる）を参照）。ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌は、続いて、直接注入により、または開示した細菌と個々の植物細胞もしくは葉ディスクなどの植物片との共培養によって、植物細胞に植菌するために使用される。植物と、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌との共培養は、Ｔ−ＤＮＡ構成要素が細菌から植物細胞のゲノムに移動するのに十分な時間をかけて培地中で行われる。共培養期間は、特定の植物種で変化し得るが、その決定は当該技術分野ではルーチンワークであり、当業者は過度の実験を行わずに実施することができる。共培養に続いて、形質転換細菌は、例えば、植物細胞が全植物体にまで再生する前に、対抗選択されるか、または組織培養物から除去される。この時点で、選択マーカー用の基質、選択マーカーを誘導する基質、または調節領域を活性化させる基質を含有し、かつ／または栄養要求性細菌のための基質を含有しない選択培地を使用することができる。
【００６４】
本開示にはまた、本明細書で開示した１種以上の細菌を含むキットが含まれる。１種以上の細菌を、本明細書で開示した方法を完成させるための取扱説明書とともに、キットの構成要素としてパッケージ化することができる。本開示のキットは、本明細書で開示した１種以上の細菌の任意の組み合わせ、および適切な取扱説明書（記述資料、および／または聴覚、視覚もしくは視聴覚資料として提供）を含むことができる。一態様では、キットは、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌などの、１種以上の細菌を使用するための植物用形質転換キットに関する。選択された配列を植物にトランスファーし、その後、細菌の増殖を制御するために、本明細書で開示された任意の細菌を使用するキットが提供される。例えば、そのキットは、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の特定の細菌を含むことができ、特定の細菌は少なくとも以下の１つを含む：ａ）ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌は、少なくとも１種の選択マーカーを含む；ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌は栄養要求株である；あるいはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはメソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の細菌は、有害なタンパク質または誘導調節制御下に発現するヌクレオチド配列を含む。本キットは、本方法を行うために必要ないくつかの試薬および材料、例えば、選択培地に必要な基質などを含むことができる。
【００６５】
定義
用語「植物」は、本明細書では任意の植物、組織または器官（例えば、植物の部分）を含めるために使用される。植物の部分としては、限定はされないが、全植物体へと培養することができる、細胞、茎、根、花、胚珠、雄ずい、種子、葉が挙げられる。植物細胞は、種子もしくは植物体から直接採取したか、または植物体から採取した細胞の培養により得られた植物の細胞である。再生植物の子孫、多様体および変異体は、導入されたポリヌクレオチドをこれらの部分が含むならば、本開示の範囲に含まれる。
【００６６】
一態様では、本開示の方法で使用される植物には、限定はされないが単子葉植物および双子葉植物を含む任意の植物種の形質転換体が含まれるが、これに限定されない。目的の植物の例としては、限定はされないが、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ブラッシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の種（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ））、特に、種子油の供給源として有用なブラッシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、キビ（例えば、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔａｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、カンキツ樹（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グァバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、カラスムギ、オオムギ、野菜、観葉植物およびコニファーが挙げられる。
【００６７】
本開示では、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、別途限定されていなければ、既知の、天然ヌクレオチドに不可欠の性質を有し、天然のヌクレオチドに類似の仕方で一本鎖核酸にハイブリダイズする点で類似している類似物（例えば、ペプチド核酸）を包含する。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「調節配列」は、遺伝子の発現制御と関係しているＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、ターミネーター、オペレーターおよびアテニュエーターを意味する。調節配列は、潜在的に細胞の生合成装置と連動して活動することができる。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、ホスホジエステル結合により少なくとも２つのヌクレオチドが結合したポリマーを意味し、リボヌクレオチドで構成されてもデオキシリボヌクレオチドで構成されてもよい。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「配列」は、ポリマー中のモノマーの直線的な順序、例えば、ポリペプチド中のアミノ酸の順序、またはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序を意味する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」および「タンパク質」は互換的に使用され、ペプチド結合により連結された２種以上のアミノ酸から構成される化合物を意味する。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「レバンスクラーゼ」は、タンパク質、タンパク質の断片またはペプチドを意味し、スクロースを基質として使用して、フルクトース残基の繰り返しから構成される炭水化物ポリマーを合成する特性を有する。フルクトース残基の繰り返しは、ベータ−１結合もしくはベータ−２−６結合、またはこの２つの結合タイプの組み合わせにより結合することができる。フルクトース単位の繰り返しからなるポリマーは、スクロース分子に由来する１つの末端グルコース残基と少なくとも２つのフルクトース残基を含み得る。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「誘導剤」は、直接または間接的に調節配列と相互作用して、調節配列により制御されるヌクレオチド配列の転写速度を増大させる物質を意味する。
【００７４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基からなるポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的類似物であるアミノ酸ポリマー、および天然のアミノ酸ポリマーに適用される。本開示のポリペプチドは、本明細書で開示した核酸から、または標準の分子生物学的手法の使用により産生させることができる。
【００７５】
例えば、本開示のトランケートタンパク質は、適切な宿主細胞において本態様の組み換え核酸の発現により、あるいは、プロテアーゼの消化および精製などの生体外手順の組み合わせにより産生させることができる。
【００７６】
用語「コードする」は、本明細書では、ヌクレオチド配列（例えばマメ科植物の配列）の特定のタンパク質への翻を指示するのに必要な、コドンの使用によって特定される情報を、核酸が含むことを意味するために使用される。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含んでもよく、あるいはそのような介在非翻訳配列を含まなくてもよい（例えば、ｃＤＮＡにおけるように）。
【００７７】
本開示の態様は、単離された、または実質的に単離されたポリヌクレオチドまたはタンパク質の組成物を包含する。「単離された」または「精製された」ポリヌクレオチドもしくはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、通常、その自然発生的環境で見られるような、そのポリヌクレオチドまたはタンパク質と同時に生じる、またはそれらと相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まない。したがって、単離された、または精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組み換え技術（例えば、ＰＣＲ増幅）によって産生された場合には、他の細胞形質成分または培養培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成された場合には、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが得られた生物のゲノムＤＮＡ中、自然にそのポリヌクレオチド（すなわち、そのポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に位置する配列）に隣接する配列（例えば、タンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、本開示のいくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドが含有する、そのポリヌクレオチドが得られた細胞のゲノムＤＮＡ中、自然にそのヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列は、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満の、約０．５ｋｂ未満の、または約０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列であり得る。実質的に細胞形質成分を含まないタンパク質としては、汚染タンパク質の含有量が、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満（乾燥重量で）の調製物が挙げられる。本態様のタンパク質、またはその生物学的に活性な部分が組み換えにより産生されたとき、最適には、培養培地に含まれる化学的前駆体、または非目的タンパク質の化学物質は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満（乾燥重量で）である。
【００７８】
ヌクレオチド配列およびコードされたタンパク質に関係する断片および多様体は本開示の範囲に含まれる。「断片」は、ヌクレオチド配列の部分またはアミノ酸配列の部分、および、したがってそれによりコードされたタンパク質を指す。ヌクレオチド配列の断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持し、植物に耐性（すなわち、真菌耐性）を付与する能力を有する、タンパク質の断片をコードすることができる。あるいは、ハイブリダイゼーションのプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、生物学的活性を保持する断片タンパク質を必ずしもコードしない。したがって、ヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１５ヌクレオチドから、少なくとも約５０ヌクレオチドから、少なくとも約１００ヌクレオチドから、そして、本開示のポリペプチドをコードする完全長ヌクレオチド配列までの範囲であり得る。
【００７９】
本開示のポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１５、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約４５もしくは少なくとも約５０の連続したアミノ酸を、または開示した態様の完全長ポリペプチド中に存在するアミノ酸の総数までをコードすることができる。ハイブリダイゼーションのプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用なヌクレオチド配列の断片は、一般に、タンパク質の生物学的に活性な部分をコードする必要がない。
【００８０】
用語「完全長配列」は、ある特定のポリヌクレオチドを指すときは、天然配列の核酸配列全体を有することを意味する。「天然配列」は、本明細書では、ある生物のゲノム中に見出される内因性配列、すなわち操作されていない配列を意味するために使用される。したがって、本開示のヌクレオチド配列の断片は、ポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードすることができるか、または、下に開示する方法で用いる、ハイブリダイゼーションのプローブもしくはＰＣＲプライマーとして使用することができる断片であり得る。耐性を付与するポリペプチドの生物学的に活性な部分は、本態様の１つのヌクレオチド配列の部分を単離し、タンパク質のコードされた部分を発現させ、タンパク質のコードされた部分の、植物の真菌耐性を付与または強化する能力を評価することにより調製できる。本態様のヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００もしくは少なくとも約１５０のヌクレオチド、または本明細書で開示した完全長ヌクレオチド中に存在する数までのヌクレオチドを含む。
【００８１】
用語「多様体」は実質的に類似の配列を意味する。ポリヌクレオチドでは、多様体は、天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の部位で、１つ以上のヌクレオチドの欠失および／もしくは追加、ならびに／または天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の部位で、１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で使用する場合、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ天然に存在するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。当業者は、本態様の核酸の多様体が、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されるであろうことを認識することができる。ポリヌクレオチドでは、遺伝子コードの縮重のために、保存的多様体には本態様の１つのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。これらの自然に発生したアルレ多様体は、良く知られた分子生物学手法、例えば、以下で概要を述べるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション手法を用いて同定することができる。変異型ポリヌクレオチドはまた、合成で得られた、例えば、部位特異的変異誘発により作製されたものなどのポリヌクレオチドであって、依然、本態様のタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。一般に、本開示の特定のポリヌクレオチドの多様体は、当該技術分野でよく知られている配列アライメントプログラムによる測定で、その特定のポリヌクレオチドに対して、少なくとも、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
【００８２】
本態様の特定のポリヌクレオチド（すなわち、基準のポリヌクレオチド）の多様体はまた、ポリヌクレオチド多様体によりコードされたポリペプチドと、基準ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの配列同一性パーセントを比較することによって評価することができる。任意の２つのポリペプチドの配列同一性パーセントは、当該技術分野で知られている、配列アライメントプログラムを使用して算出することができる。本開示の所与のポリヌクレオチド対を、それらがコードする２つのポリペプチドにより共有される配列同一性のパーセントを比較することにより評価する場合、コードされた２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、少なくとも、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上である。
【００８３】
「タンパク質多様体」は、天然タンパク質から、天然タンパク質の１つ以上の部位で、１つ以上のアミノ酸を欠失もしくは挿入することによって、かつ／または天然タンパク質の１つ以上の部位で、１つ以上のアミノ酸を置換することによって得られるタンパク質を意味する。タンパク質多様体、例えば、開示された毒素または抗毒素ポリペプチドとして包含されている多様体形態は、本開示により熟考されている。多様体は、部位特異的またはランダムな変異誘発法により調製することができ、所望の生物学的活性を選別することができる。すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性を継続して所有するが、その生物学的活性とは本明細書に記載されるように、毒素または抗毒素を付与または強化する能力である。天然タンパク質の生物学的に活性な多様体、例えば、本態様の、開示された毒素または抗毒素ポリペプチドは、当該技術分野で知られている配列アライメントプログラムによる測定で、天然タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上の配列同一性を有し得る。本開示のタンパク質の生物学的に活性な多様体は、元のタンパク質とは、わずかに約１〜１５個のアミノ酸残基、約６〜１０個などの、わずかに約１〜１０個、わずかに約５個、わずかに４個、３個、２個または１個のアミノ酸残基だけが異なり得る。
【００８４】
本明細書で開示するタンパク質は、例えばアミノ酸の置換、欠失、トランケーションおよび挿入などによって変更することができる。そのような操作方法は当該技術分野で知られている。例えば、アミノ酸配列多様体および耐性タンパク質断片は、ＤＮＡの変異により調製することができる。変異誘発法およびポリヌクレオチド変更法は、当該技術分野で知られている。
【００８５】
ポリヌクレオチドおよびタンパク質の多様体はまた、限定はされないが、ＤＮＡシャフリングなどの手順を含む、変異誘発または組み換え手法で得られた、配列およびタンパク質を包含する。組み換えポリヌクレオチドのライブラリーは、かなりの配列同一性を示し、かつインビトロまたはインビボで相同的に組み換えることができる配列領域を含む、関連する配列のポリヌクレオチド集団から作製することができる。
【００８６】
本明細書に記載の全体配列に対する、またはそれらの多様体および断片に対する配列同一性に基づいて分離された配列は、本開示に包含される。そのような配列には、開示された配列の相同分子種である配列が含まれる。用語「相同分子種」は共通祖先遺伝子由来の遺伝子を指し、これは種分化の結果、異なる種の中に見出される。異なる種の中に見出される遺伝子は、それらのヌクレオチド配列および／またはそれらがコードするタンパク質配列が、少なくとも約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上の配列同一性を共有するとき、相同分子種とみなされる。相同分子種の機能は、種の間で高度に保存されていることが多い。
【００８７】
ＰＣＲアプローチでは、目的生物から抽出したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから、対応するＤＮＡ配列を増幅するＰＣＲ反応で使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲプライマーの設計およびＰＣＲクローニングの方法は、当該技術分野で知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）に開示されている。既知のＰＣＲ方法としては、限定はされないが、ペアードプライマー、ネスティッドプライマー、単一の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチのプライマーなどを使用する方法が挙げられる。
【００８８】
ハイブリダイゼーション法では、選ばれた生物からクローニングされた、ゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片（すなわち、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）の集団に存在する、他の対応するポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするプローブとして、既知のポリヌクレオチドの全てまたは一部が使用される。ハイブリダイゼーションのプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、または他のオリゴヌクレオチドであり得、３２Ｐまたは任意の他の検出マーカーなどの検出可能な群で標識化することができる。このように、例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブは、本態様のポリヌクレオチドをベースとする合成オリゴヌクレオチドを標識化することにより作製することができる。ハイブリダイゼーション用、ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリー構築用プローブの調製方法は、当該技術分野で知られている。
【００８９】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の特定の配列が存在するか、または存在しないかをチェックするには、各種の方法を使用することができる。それらには、例えば、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ分析法が含まれる。これらの方法は、当該技術分野でよく知られている。
【００９０】
本開示の組成物および方法は、ある細菌の１つ以上のタンパク質の発現レベルを調節するのに有用である。用語「調節」は本明細書では、遺伝子的に変更された（すなわち形質転換された）細菌内におけるタンパク質レベルの、対応する形質転換されていない細菌（すなわち、本開示の方法にしたがって遺伝子的に変更されていない細菌）のタンパク質レベルに対する、上昇または低下を意味するために使用される。
【００９１】
用語「阻害する」、「阻害」、「阻害すること」、「低減した」、「低減」などは、本明細書で使用する場合、遺伝子産物の発現または機能の皆無を含む、そこまでの発現または機能の相対的低減を含む、遺伝子産物の発現または機能の低減を意味する。用語「阻害する」、「阻害」、「阻害すること」、「低減した」、「低減」などは、本明細書で使用する場合、細菌の死滅または殺滅と呼ばれる、細菌の増殖と再生産の皆無を含む、そこまでの細菌の増殖の低減および／または再生産の低減を意味する。組織培養における細菌の殺滅はまた、細菌の「制御」と呼ばれる。
【００９２】
用語「亢進させる」、「亢進」、「強化する」、「強化」などは、本明細書では、遺伝子産物の発現、機能または活性の増大、増進または上昇を意味する。さらに、用語「誘発する」または「増加する」は、本明細書で使用する場合、本開示の遺伝子またはタンパク質を欠失している細胞よりも、発現のレベルが１０％以上、５０％以上、または１００％増加するような、遺伝子産物のより高い発現を意味することができる。
【００９３】
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、遺伝子産物の転写および／または翻訳を含む、例えば、ポリヌクレオチドを産生する生合成またはプロセスを指す。例えば、本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写産物へと）、および／または転写されたｍＲＮＡをその後ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳するプロセスからから転写することができる。用語「遺伝子産物」は、例えば、転写産物およびコードされたポリペプチドを指すことができる。遺伝子産物（すなわち、目的の遺伝子産物）の発現または機能の阻害（または亢進）は、任意の２つの細菌、例えば、遺伝子的に変更された細菌における遺伝子産物の発現または機能と、対応する野生型細菌における遺伝子産物の発現または機能とを比較する文脈の中で使用することができる。野生型細菌の遺伝子産物の発現レベルは、ゼロのこともある。
【００９４】
遺伝子産物の発現または機能を阻害するために、転写または翻訳のいずれかの段階で、遺伝子産物の発現を下方調節するか、または、遺伝子産物の機能的活性を下方調節する、任意の方法または組成物を使用することができる。同様に、遺伝子またはタンパク質の発現または機能を亢進させるために、転写または翻訳のいずれかの段階で、遺伝子産物の発現を誘発または上方調節するか、または遺伝子産物の機能的活性を亢進もしくは活性化する、すなわち上方調節する、任意の方法または組成物を使用することができる。遺伝子の発現を阻害または亢進する方法は、当該技術分野でよく知られている。
【００９５】
本開示の遺伝子およびポリヌクレオチドは、天然起源の配列および変異型または変更された形態を含み、それらの変種、断片および改変された形態を含み得る。本明細書で開示するタンパク質はまた天然起源のタンパク質およびその変種、断片および改変された形態を包含する。そのような多様体および断片は、条件付きか否かを問わず、ポジティブかネガティブかを問わず選択マーカーとして、かつ／または有害なタンパク質またはヌクレオチド配列として使用される、所望の能力を継続して保有するであろう。一態様では、多様体または断片をコードするＤＮＡ中でなされた変異は、一般に、その配列を読み取り枠の外部に配置しない。
【００９６】
本開示の特徴は、細菌へのポリヌクレオチドの導入を含む方法にある。本明細書で使用する場合、用語「導入する」は、例えばポリヌクレオチドを細菌に提供することを指す。本開示のいくつかの態様では、配列が、植物ゲノムへの挿入の可能性を含む、植物細胞の内部への立ち入りを行うか、またはプラスミド上に位置するような仕方でポリヌクレオチドを提供することができる。本開示の方法は、ポリヌクレオチドが少なくとも１つの細胞の内部に立ち入るだけでよく、配列を細菌に導入する特定の方法に依存しない。ポリヌクレオチドを細菌に導入する方法は、当該技術分野で知られている。
【００９７】
用語「形質転換」は、本明細書では、遺伝子的に安定な継承をもたらす、宿主生物ゲノムへの、例えば核酸断片のトランスファーを意味するために使用される。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と称する。用語「宿主細胞」は組み換えＤＮＡコンストラクトの形質転換が起こる細胞を指し、酵母細胞、細菌細胞および／または植物細胞を含むことができる。植物の形質転換法の例として、後で、当業者に知られた方法により形質転換植物の再生に使用することができる、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換法が挙げられる。
【００９８】
ポリヌクレオチドは、一時的にまたは安定して宿主細胞に導入することができ、組み込まれないで、例えばプラスミドとして維持することができる。「安定な形質転換」または「安定に形質転換された」とは、細菌に導入されたヌクレオチドコンストラクトを、細菌の子孫が継承できることを意味する。本明細書で使用する「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドが細菌内に導入され、そして子孫の細胞中に見出されるようなポリヌクレオチドの安定な再生ができないことを意味する。
【００９９】
本開示はまた、目的の細菌中で発現させるために、発現カセットまたはＤＮＡコンストラクトに入れて提供することができる、本明細書に記載の配列を含む。一態様では、このカセットは、本明細書で開示した配列に作動可能に連結した５’および３’末端の異種調節配列を含む。用語「作動可能に連結した」は、本明細書では、核酸を発現させるような仕方で、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーおよび／または他の発現制御要素を含む調節配列に、発現されるべき核酸が連結していることを意味するために使用される。そうした調節配列は当該技術分野でよく知られており、多くの種類の宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、およびある条件下でヌクレオチド配列の発現を誘導するものが含まれる。ベクターの設計は、例えば、形質転換される宿主細胞の種類または所望する核酸の発現レベルに依存し得る。カセットは、植物中で共形質転換される、１つ以上の追加の遺伝子を含むことができる。そして、任意の追加の遺伝子を、多重発現カセットに載せて提供することができる。
【０１００】
本開示の発現カセットは、調節領域の転写調節下にあるべきヌクレオチド配列の挿入用に、多くの制限部位を含むことができる。発現カセットはまた、選択マーカー遺伝子を含有することができる。
【０１０１】
発現カセットは、さらに、細菌中で機能する、転写および翻訳開始領域、すなわち開示のＤＮＡ配列ならびに転写および翻訳停止領域を、５’−３’の転写方向に含むことができる。転写開始領域、プロモーターは宿主細胞に生得のもの、類似のもの、外来のものまたは異種のものとすることができる。さらに、プロモーターは自然配列または二者択一的に合成配列とすることができる。用語「外来の」は、転写開始領域が導入される野生型細胞中に、転写開始領域が見出されないことを意味する。本明細書で使用する場合、キメラ遺伝子は、転写開始領域に作動可能に連結したコード配列を含む（転写開始領域はコード配列に対して異種である）。
【０１０２】
非相同プロモーターを使用して配列を発現させることが好ましいけれど、相同プロモーターまたは野生型プロモーター配列も使用することができる。そのようなコンストラクトは、宿主細胞の発現レベルを変更し得る。
【０１０３】
停止領域は、転写開始領域とともに野生型とするか、作動可能に連結した目的のＤＮＡ配列とともに野生型とするか、または別のものから得ることができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の使いやすい停止領域、例えば、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ停止領域などを使用することができる。
【０１０４】
形質転換された細菌中での発現を亢進させるために、必要に応じて遺伝子を最適化することができる。言い換えれば、発現を改善するために細菌が好むコドンを使用して、遺伝子を合成することができる。細菌が好む遺伝子の合成方法は当該技術分野で知られている。
【０１０５】
細胞宿主中で遺伝子の発現を亢進させるために、追加的に配列を改変することが知られている。これらには、遺伝子の発現に有害となり得る、配列の削除が含まれる。配列のＧ−Ｃ含有率を、所与の細胞宿主の平均的なレベル（宿主細胞中に発現される既知の遺伝子を参照して計算される）に調節することができる。可能であれば、予想されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるよう配列を改変する。
【０１０６】
発現カセットは、発現カセットコンストラクト内に、追加の５’末端リーダー配列を含有することができる。そのようなリーダー配列は、翻訳を促進するよう作用する。翻訳リーダーは当該技術分野で知られており、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’末端の非コード領域）；ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）およびタンパク質（ＢｉＰ）に結合しているヒト免疫グロブリン重鎖；アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）の外皮タンパク質ｍＲＮＡからの非翻訳リーダー；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）；およびトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２  ３８５）が挙げられる。イントロンなどの、翻訳を促進することが知られている他の方法も、使用することができる。
【０１０７】
ＤＮＡ配列が適切な配向で存在し、かつ必要に応じて適切な読み取り枠中に存在することを確実にするために、発現カセットを調製する間に、各種ＤＮＡ断片を操作することができる。この目的に向けて、アダプターまたはリンカーを使用して、ＤＮＡ断片に連結させることができる。あるいは、他の操作を使用して、使いやすい制限部位の提供、過剰なＤＮＡの削除、または制限部位の削除を行うことができる。この目的のために、インビトロの変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、移行およびトランスバージョンを関与させることができる。
【０１０８】
一般に、発現カセットは、形質転換された細胞を選択するために、選択マーカー遺伝子を含むことができる。選択マーカー遺伝子は、形質転換された細胞を選択するために使用される。
【０１０９】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、植物細胞中で発現を誘導する、プロモーターに作動可能に連結することができる。本開示の方法では、当該技術分野で知られている任意のプロモーターを使用することができる。方法は、調節遺伝子または別のそのような調節配列から得られるプロモーターを含む、誘導プロモーターから遺伝子を発現させる工程を含み得る。外因性の化学調節剤の適用によって遺伝子発現を調節するために、化学調節プロモーターを使用することができる。目的によって、プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学誘導性プロモーターか、または化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学抑制性プロモーターとすることができる。
【０１１０】
本発明の態様、その原理および実際的応用を当業者に知らせるために、図面および実施例を通して本発明の態様を詳細に説明してきたことは理解されるべきである。本発明の態様の特定の処方およびプロセスは、提示された特定の態様の記述に限定されるものではなく、むしろ記述および実施例は、以下に示す請求項およびそれらと均等物の観点から読まれるべきである。
【０１１１】
記載されている本発明の特定の態様は、本発明の態様を総括または限定することを意図するものではなく、また、先の実施例および詳細な説明に照らして、当業者には多くの変更、修正および変化が明らかであることもさらに理解される。したがって、本発明の態様は、以下に示す請求項の精神と範囲から逸脱しない、全てのそのような変更、修正および変化を包含することを意図するものである。
【実施例】
【０１１２】
実施例１．アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）におけるｃｏｄＡ発現用コンストラクト
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｃｏｄＡ遺伝子のコドンを、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）での発現用に最適化した。Ａｇｒｏ最適化遺伝子配列（エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＯＤＡタンパク質をコードする）を、固有のＡｖｒＩＩおよびＭＦｅＩ／ＮｏｔＩフランキング制限酵素認識部位により、ベータ−ラクタマーゼプロモーター（ＢＬＡ  ＰＲＯ）配列とＴ７ターミネーター配列との間に挿入し、この全発現カセットを合成した。固有のフランキング制限酵素認識部位により、合成遺伝子カセットを内因性アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＡＧＬ０チミジル酸合成酵素（ｔｈｙＡ）遺伝子の５’配列および３’配列にフランキングした。その後、相同組み換えにより発現カセットをＡＧＬ０ゲノムに導入し、チミジル酸合成酵素遺伝子を破壊した（ＴＨＹ−栄養要求性変異体を作った）。図１を参照。当業者であれば、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）のチミジル酸合成酵素遺伝子の５’配列および３’配列により、ｃｏｄＡ発現カセット（ＢＬＡ  ＰＲＯ：：ｃｏｄＡ：：Ｔ７Ｔｅｒｍ）をオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）およびエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）へ導入し、ｔｈｙＡ遺伝子を破壊し、ｃｏｄＡ機能遺伝子を有するＴＨＹ−栄養要求性株を作ることができる。それ以外にも、当業者は、同様の戦略により、限定はされないが、ＣＹＳ−、ＬＥＵ−、ＴＲＰ−およびＳＥＲ−などのさらなる栄養要求性株を作ることができる。
【０１１３】
実施例２．５−フルオロシトシンを含有する培地のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖の許容、および５−フルオロウラシルによる増殖阻害の実証。
アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）生育試験の全てで、添加剤なし（コントロール処理として）か、または５−フルオロシトシン、５−フルオロウラシルもしくはチミジンを添加した、標準アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）最少培地を使用した。これらの試験を開始するにあたり、野生型と変異型のＡＧＬ０アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の、５−フルオロシトシン（５−フルオロシトシン、ＣＯＤＡタンパク質の非毒性基質）または５−フルオロウラシル（５−フルオロウラシル、毒性産物）上における増殖試験を行った。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物は、対数期に到達するまで最小液体培地で増殖させ、その後、基本コントロール培地（５−フルオロシトシンもしくは５−フルオロウラシルを含まない）、５−フルオロシトシン５００μｇ／ｍｌ、５−フルオロシトシン１０００μｇ／ｍｌ、５−フルオロウラシル０．１μｇ／ｍｌ、５−フルオロウラシル１μｇ／ｍｌ、または５−フルオロウラシル３μｇ／ｍｌを含有する固形培地で、種々の密度（１×１０４個または４×１０７個の細胞またはコロニー形成単位（「ＣＦＵ」））まで漸増させた。結果を表３に要約する。試験した４種のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株（ＡＧＬ０、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１およびＥＨＡ１０５）は、非毒性基質５−フルオロシトシン上では、試験した最高濃度（１０００μｇ／ｍｌ）まで明らかな増殖阻害は認められなかった。しかしながら、５−フルオロウラシルでは、非常に低濃度で、４株全てで増殖が完全に阻害された。０．１μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシル上に低密度（１×１０４ＣＦＵ）でプレーティングされた４株の増殖を比較すると、ＡＧＬ０およびＥＨＡ１０５が最大の増殖阻害を示し、次いで、ＥＨＡ１０１およびＬＢＡ４４０４であった。１μｇ／ｍｌでは、低密度でプレーティングされた４株全てが増殖せず、さらに、当初、高密度（４×１０７ＣＦＵ）でプレーティングされたＡＧＬ０の増殖では、生成された目に見えるコロニーの数は、コントロール処理より少なかった。最大濃度の３μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルでは、全ての株で増殖は観察されなかった。５−フルオロウラシルでは、試験した５−フルオロシトシンの最高濃度（１０００μｇ／ｍｌ）（目に見える増殖阻害が生じない）の１／３００未満の（３μｇ／ｍｌ）の濃度で、試験した株全ての増殖が完全に阻害されたという実験結果は、第１に、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が無害の基質５−フルオロシトシンを毒性産物の５−フルオロウラシルに変換する能力を持たないこと、また、第２に、ＣＯＤＡタンパク質による酵素変換がある程度効率よく行われるなら、培地中、この実験で使用した濃度より低い濃度で５−フルオロシトシンを使用することができることを示唆している。
【０１１４】
【表３】
2018535667.tif 000005
【０１１５】
５−フルオロウラシル上におけるＡＧＬ０株のより詳細な殺菌曲線の結果を表４に示す。１×１０３〜１×１０８ＣＦＵ／プレートの範囲のプレーティング密度では、初期プレーティング密度にかかわらず、０．３μｇ／ｍｌ上で非常に僅かのコロニーが増殖しただけであり、１μｇ／ｍｌまたはそれ以上の５−フルオロウラシルでは、全てのプレーティング密度で、増殖は完全に阻害された。この結果により、野生型のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌株ＡＧＬ０は極めて低濃度の５−フルオロウラシルに感受性を有することが確かめられた。最後に、野生型ＡＧＬ０、またはチミジル酸合成酵素をコードする遺伝子を不活化して、チミジンがなければ増殖できない細菌としたＡＧＬ０栄養要求性変異株（この菌株を、ＡＧＬ０  ＴＨＹ−と称した）を用いて第３の実験を行った。結果を表５に要約する。これらの２つの菌株を、５−フルオロウラシルを０．１または３μｇ／ｍｌの濃度で含有する培地に、高密度（１０６または１０８ＣＦＵ／プレート）でプレーティングした（これらの３種類の処理のそれぞれに、チミジンを０または５０ｍｇ／ｌ含有させた）。２４時間後、野生型ＡＧＬ０株では、培地中の外因性チミジンの有無に関わらず、５−フルオロウラシルが含まれない場合に、緩やかな増殖が観察された。対照的に、ＴＨＹ−変異種は、５−フルオロウラシルが含まれない場合であっても、チミジンが存在したときのみ同様の増殖率を示し、チミジンの非存在下では増殖することができなかった。１μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌでは、野生型ＡＧＬ０株もＴＨＹ−ＡＧＬ０株も増殖は観察されなかった。
【０１１６】
当業者であれば、上記と同様の方法を使用して、種々の濃度の５−フルオロシトシン（５００−１００μｇ／ｍｌ）および種々の濃度の５−フルオロウラシル（０．１−３μｇ／ｍｌ）を含む増殖培地によるオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属またはエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属の野生型株の増殖阻害を試験することができ、また、それらの種の（５−フルオロシトシンから５−フルオロウラシルへの）内因性の変換能力、および毒性化合物５−フルオロウラシルを追加した培地での増殖能力を試験することができる。同様の方法は、５−フルオロシトシンおよび５−フルオロウラシルを加えた培地中におけるオクトバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属のＴＨＹ−／ｃｏｄａ＋株の増殖評価に使用することができる。５−フルオロシトシンを５００ｕｇ／ｍｌまたは１０００ｕｇ／ｍｌ含有する培地で、オクトバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の野生型株の増殖試験を行った場合、１μｇ／ｍｌまたは３μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルに晒した場合（両野生型株で増殖が妨げられると予想される）と対照的に、増殖阻害は観測されないと予想される。両菌株ともに、５−フルオロシトシンの最高濃度（目に見える増殖阻害を生じない）の１／３００未満の濃度の５−フルオロウラシルで完全に阻害されると予想されることは、第１に、オクトバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属またはエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属が無害の基質５−フルオロシトシンを毒性産物の５−フルオロウラシルに変換する内因性能力を持たないこと、また、第２に、ＣＯＤＡタンパク質による酵素変換がある程度効率よく行われるなら、培地中、より低い濃度で５−フルオロシトシンを使用することができることを示唆している。
【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
実施例３．５−フルオロシトシン上の、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株ＡＧＬ０  ＴＨＹ−／ｃｏｄＡ＋の増殖。
新しく開発したＡＧＬ０変異株（ＴＨＹ−／ｃｏｄＡ＋、実施例１を参照）の増殖を評価するため、種々の濃度の５−フルオロシトシン上にプレーティングした。この菌株を、野生型ＡＧＬ０とともに、液体培地で終夜培養し、１０７ＣＦＵにまで希釈し、その後、１００μｌの懸濁液を、全８処理のために、０、１００、２００または３００μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシンを含むＡｇｒｏ最小培地＋／−チミジンにプレーティングした。２８℃で７２時間保持した後、それらのプレートについて、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を採点した。
【０１２０】
野生型（非変異）ＡＧＬ０は、全ての５−フルオロシトシン濃度で増殖し（これは、有害な５−フルオロウラシルが生成されなかったことを示す）、また、チミジンを含まない培地でも増殖した。５０ｍｇ／ｌのチミジン存在下では、新アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＴＨＹ−／ｃｏｄＡ＋株は、５−フルオロシトシンが含まれない場合、７２時間後、コンフルエントな菌叢のコロニーを形成した。しかしながら、ＴＨＹ−／ｃｏｄＡ＋株は、全ての５−フルオロシトシン濃度で（たとえ、チミジンが含まれていても）増殖せず、試験した最小濃度の５−フルオロシトシン（１００μｇ／ｍｌ）においてさえも増殖しなかった。
【０１２１】
さらに、ＴＨＹ−／ｃｏｄＡ＋株は、チミジンを含まない培地では、５−フルオロシトシンが含まれない場合であっても、増殖せず、この新しいアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴＨＹ−／ｃｏｄＡ＋株が、遺伝子的に、２つの異なる形態の対抗選択を受けやすいように改変され、今や、植物細胞の形質転換後のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌のより厳しい除去に同時に適用し得ることを示した。
【０１２２】
上記と同様の戦略を使用して、遺伝子的に、２つの異なる形態の対抗選択を受けやすいように改変され、今や、植物細胞の形質転換後のオクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）菌のより厳しい除去に同時に適用し得るオクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）のＴＨＹ−／ｃｏｄＡ＋株の有効性を評価することができる。これらの新しく開発されたオクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）のＴＨＹ−／ｃｏｄａ＋株を、５−フルオロシトシンを含有する培地にプレーティングした場合に、試験する最小濃度（１００μｇ／ｍｌ）であっても、増殖は観察されないであろうと予想される。これらのオクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）のＴＨＹ−／ｃｏｄａ＋株を、チミジンを含有しない培地にプレーティングした場合にも、増殖は阻害されると予想され、これは、これらの新しいオクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）のＴＨＹ−／ｃｏｄａ＋株が、遺伝子的に、２つの異なる形態の対抗選択を受けやすいように改変され、植物細胞の形質転換後のオクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）菌のより厳しい除去に同時に適用し得ることを示す。
【０１２３】
実施例４．２つの異なる濃度の５−フルオロシトシン上におけるトウモロコシの未熟胚からのカルスの開始。
アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は基質（５−フルオロシトシン）に耐性があり、低濃度の変換産物（５−フルオロウラシル）で阻害された。トウモロコシの未熟胚および成長したカルスが、基質、５−フルオロシトシンに感受性を示すか否かを決定する実験を行った。２つの近交系の未熟胚（ＨＣ９６またはＰＨＨ５Ｇ、代表的な非硬茎および硬茎Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｈｉ−Ｂｒｅｄ近交系）を、５−フルオロシトシンを０、１００、２５０または４００μｇ／ｍｌで添加した、適切なカルス培養培地（表６を参照）にプレーティングし、３週間培養した。表７に示したように、培養３週間後では、各近交系間には、カルス開始頻度およびカルス成長速度に認識できるような相違は観察されず、トウモロコシ未熟胚からのカルス開始および持続的カルス成長は、これらの濃度の５−フルオロシトシンでは阻害されない（トウモロコシのカルスが非毒性基質５−フルオロシトシンを毒性産物５−フルオロウラシルに変換する内因性酵素能力を持たないことを示す）ことが示された。
【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
実施例５．ＡＧＬ０／ＴＨＹ−／ｃｏｄＡ＋アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を使用したトウモロコシの葉の形質転換。
単子葉植物の葉組織（下記に示す）からのトランスジェニックイベントの回収を許容するように設計されたＴ−ＤＮＡを、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＡＧＬ０株および新しいＡＧＬ０（ＴＨＹ−／ｃｏｄＡ＋）株の両方のｐＳＢ１（Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９６）１０（１）：１６５−１７４）に導入した。
【０１２７】
単子葉植物のゲノムに組み込まれると、このＴ−ＤＮＡ（ＲＢ−ｌｏｘＰ−ＲＡＢ１７ＰＲＯ：：ｍｏＣＲＥ：：ｐｉｎＩＩ＋ＮＯＳ  ＰＲＯ：：ＺｍＷＵＳ２：：ｐｉｎＩＩ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺｍＯＤＰ２：：ｐｉｎＩＩ−ｌｏｘＰ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺｓＧＲＥＥＮ：：ｐｉｎＩＩ：：Ｓｂ−ＡＣＴＩＮ  ＴＥＲＭ＋Ｓｂ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＰＭＩ：：Ｓｂ−ＵＢＩ  ＴＥＲＭ−ＬＢ）は、カルスの成長を刺激し、葉組織から伸びたトランスジェニックセクターのポジティブ選択を提供する（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２０１１／０１６７５１６号明細書を参照）。再生に先立って、ＣＲＥ発現を誘導し、Ｔ−ＤＮＡのｌｏｘＰフランキング部分を切除した。
【０１２８】
葉におけるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換を、基本的に、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：３８１−３９６）に記載されるように、但し、以下の変更を加えて行った。トウモロコシの種子を、５０％Ｃｌｏｒｏｘ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液中で２０分間撹拌しながら、その表面を殺菌し、その後、滅菌蒸留水で３回洗浄した。この種子を、その後、寒天を加えて固形化したＭＳ培地で７〜１４日間、発芽させた。この段階で、中茎上の葉組織の最初の２ｃｍを取り、約１ｍｍの切片にダイスカットした。その後、これらの葉切片を、１０ｍＭのＭｇＳＯ４＋５０ｍｇ／ｌのチミジン＋２００μＭのアセトシリンゴン＋０．０２％のＳｉｌｗｅｔ（登録商標）中、ＯＤ０．６にまで希釈しておいたアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌懸濁液に加え、室温２５℃で３０分間インキュベートした。その後、胚をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌懸濁液から、チミジン５０ｍｇ／ｌを加えた７１０Ｉ培地（培地組成物は表８を参照）のプレートに移し、２１℃で２日間共培養した。２日間の共培養の後、胚を６０５Ｔ培地（培地組成物は表８を参照）のプレートに移し、２週間後、ゲル化剤として、ＰｈｙｔａｇｅｌＴＭを添加した１３２６５Ａ培地（培地組成物は表８を参照）に移した。この時点で、胚を、チミジンを含有せず、５−フルオロシトシンを１００μｇ／ｍｌ含有する培地に移行させた。胚を２週毎に同じ培地で継代培養した。
【０１２９】
【表８】
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【０１３０】
この比較で使用した両近交系（ＧＲ２ＨＴおよびＨＮ０４Ｐ）では、トランスジェニックカルスイベントは、３種のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を用いて容易に回収された（表９を参照）。しかしながら、形質転換に野生型ＡＧＬ０を使用した場合、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌はこの６週間に亘って増殖し続け、トランスジェニックカルスは、壊死性を増し、最終的に壊死した。ＡＧＬ０／ＴＨＹ−株の使用では、細菌の増殖は阻害されたが、カルスの周囲には依然として細菌が増殖し、カルスが壊死することはなかったが、汚染により廃棄しなければならなかった。ＡＧＬ０／ＴＨＹ−／ｃｏｄＡ＋の使用では、他の株に比べて、細菌の増殖もなく、良好な形質転換（形成されたカルスイベントの数に基づく）が行われた。したがって、ｃｏｄＡ条件対抗選択系の添加は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌の持続性およびトウモロコシのカルス培養物の異常増殖を除去する有効な手段を提供する。
【０１３１】
【表９】
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【０１３２】
当業者であれば、上記と同様の戦略を使用して、あらゆる外植体（例えば、限定はされないが、未熟胚または葉の外植体など）の形質転換における、改変したオクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の改変ＴＨＹ−／ｃｏｄａ＋株の異常増殖および持続性を制御することができる。オクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の野生型株を使用してＴ−ＤＮＡ（ＲＢ−ｌｏｘＰ−ＲＡＢ１７ＰＲＯ：：ｍｏＣＲＥ：：ｐｉｎＩＩ＋ＮＯＳ  ＰＲＯ：：ＺｍＷＵＳ２：：ｐｉｎＩＩ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺｍＯＤＰ２：：ｐｉｎＩＩ−ｌｏｘＰ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺｓＧＲＥＥＮ：：ｐｉｎＩＩ；Ｓｂ−ＡＣＴＩＮ  ＴＥＲＭ＋Ｓｂ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＰＭＩ：：Ｓｂ−ＵＢＩ  ＴＥＲＭ−ＬＢ）を、Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＨＮ０４Ｐの葉組織に導入すると、カルスイベントが刺激されて成長するが、培養を続けると、細菌の異常増殖により、カルスは壊死しやすくなり、死に至ると予想される。対照的に、オクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）のＴＨＹ−／ｃｏｄａ＋株を使用して、同じＴ−ＤＮＡ（ＲＢ−ｌｏｘＰ−ＲＡＢ１７ＰＲＯ：：ｍｏＣＲＥ：：ｐｉｎＩＩ＋ＮＯＳ  ＰＲＯ：：ＺｍＷＵＳ２：：ｐｉｎＩＩ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺｍＯＤＰ２：：ｐｉｎＩＩ−ｌｏｘＰ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺｓＧＲＥＥＮ：：ｐｉｎＩＩ；Ｓｂ−ＡＣＴＩＮ  ＴＥＲＭ＋Ｓｂ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＰＭＩ：：Ｓｂ−ＵＢＩ  ＴＥＲＭ−ＬＢ）をＰｉｏｎｅｅｒ近交系ＨＮ０４Ｐの葉組織に導入すると、チミジンを含有せず、１００ｕｇ／ｍｌの５−フルオロシトシンを含有する培地に移されたカルスイベントは、細菌の増殖を伴わずに成長し続けると予想される。
【０１３３】
実施例６．アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）対抗選択のための増殖阻害遺伝子の誘導発現。
バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）バーナーゼ遺伝子の発現を駆動する誘導性ｌａｃプロモーターを含有する発現カセットを構築する。発現カセットをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株ＡＧＬ０のチミジル酸合成酵素遺伝子に導入して、この内因性遺伝子を破壊し、ＴＨＹ−／ＢＡＲＮＡＳＥ＋株を作る。この新しい菌株をトウモロコシ葉組織の形質転換に使用し、感染および共培養期間後、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に加えてバーナーゼ発現を誘導し、細菌を死滅させる。ＩＰＴＧは、培地１３２６５＋ＴＣ−寒天（培地組成物は表１０を参照）などのトウモロコシカルス継代培養培地に保持し、後の再生培地中に添加して、植物体が土壌に移植される際、細菌に確実に汚染されないようにすることもできる。
【０１３４】
【表１０】
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【０１３５】
実施例７．オクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）またはエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属中の条件付きネガティブ選択マーカーによる植物形質転換  オクトバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換による植物の遺伝的改良が実証されている（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９１３５号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）媒介形質転換による植物の遺伝的改良が実証されている（米国特許第９３６５８５８号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１３６】
ｃｏｄＡ遺伝子の遺伝子産物をコードする条件付きネガティブ選択マーカーを使用して、植物細胞培養物中のオクトバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の異常増殖またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）の異常増殖を制御することができる。結果としてのゲノム改変植物体は、その後のプロセス、例えば、オクトバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介もしくはエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）媒介ランダム形質転換、オクトバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介もしくはエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）媒介部位特異的イベント形成、または、オクトバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介もしくはエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）媒介ゲノム改変イベント形成のいずれか（ゲノム改変イベント形成の場合に目的の改変遺伝子を含み、オクトバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介もしくはエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）媒介ランダム形質転換、またはオクトバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介もしくはエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）媒介部位特異的イベント形成の場合には、ヘルパープラスミドの有無にかかわらずＴ−ＤＮＡバイナリー上に目的の遺伝子を含む）によって作られ得る。これらの形質転換および／またはゲノム変換に有用な植物材料は、単子葉植物（限定はされないが、トウモロコシ、コムギ、イネおよびオオムギなど）、および双子葉植物（限定はされないが、ヒマワリ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ベニバナ、ダイズ、アルファルファ、キャノーラ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）およびワタなど）であり得る。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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