(57)【要約】本発明は、サイズ排除クロマトグラフィを用いて、患者試料におけるベドリズマブ及びウステキヌマブなどの生物製剤を測定する高感度かつ特異的な間接的均一移動度シフトアッセイを提供する。本発明のアッセイは、細胞表面タンパク質、膜貫通タンパク質、高度にグリコシル化されたタンパク質、及び多量体タンパク質を含む複雑な、又は大きな抗原、加えて、精製することができない抗原、純粋でない抗原、及び部分的又は実質的に精製された抗原を標的とする生物製剤の存在又はレベルを検出するのに特に有利である。本発明はまた、本明細書に記載された間接的アッセイに用いるのに適している、単離された可溶性α４β７インテグリンヘテロ二量体、及び単離された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０単量体を提供する。【選択図】図１
2018500553.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における生物製剤の存在又はレベルを決定するための方法であって、
（ａ）生物製剤と結合する非標識可溶性抗原と、試料を接触させて、抗原と試料中の生物製剤の非標識複合体を形成するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）からの試料を、生物製剤の標識型と接触させて、抗原と標識生物製剤の標識複合体を形成するステップ；
（ｃ）非標識複合体及び標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィに供して、非標識複合体及び標識複合体を遊離標識生物製剤から分離し、かつ遊離標識生物製剤の量を検出するステップ；並びに
（ｄ）ステップ（ｃ）において検出された遊離標識生物製剤の量を、生物製剤の既知量の標準曲線と比較し、それにより、試料における生物製剤の存在又はレベルを決定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
抗原が、膜結合型タンパク質、グリコシル化タンパク質、多量体タンパク質、不溶性タンパク質、発現させ、若しくは精製することが困難であるタンパク質、及び／又は巨大タンパク質の可溶性の断片、バリアント、又は単量体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原が、細胞表面分子の可溶性断片である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞表面分子が細胞接着分子（ＣＡＭ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞接着分子（ＣＡＭ）が、ＩｇスーパーファミリーＣＡＭ、インテグリン、カドヘリン、及びセレクチンからなる群から選択されるメンバーである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
インテグリンがα４β７インテグリンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
可溶性断片が、配列番号１若しくは配列番号３と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むα４断片、及び／又は配列番号２若しくは配列番号４と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むβ７断片を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生物製剤がベドリズマブである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
抗原がサイトカイン又はその単量体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
サイトカインがＩＬ−１２又はＩＬ−２３のｐ４０サブユニットである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｐ４０サブユニットが、配列番号６、７、１１、１２、又は１３と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生物製剤がウステキヌマブである、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
標準曲線が、抗原と、生物製剤の既知量を段階希釈した標識生物製剤をインキュベートすることにより作成される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
遊離標識生物製剤の曲線下面積（ＡＵＣ）が、生物製剤の既知量の対数に対してプロットされ、試料中の生物製剤のレベルが内挿により計算される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
試料が血清である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
標識生物製剤がフルオロフォア標識生物製剤である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
試料が、生物製剤での治療を受けている対象から得られる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号１と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性α４インテグリンポリペプチド。
【請求項１９】
ＡＣＩＤペプチドをさらに含む、請求項１８に記載の単離された可溶性α４インテグリンポリペプチド。
【請求項２０】
リンカーをさらに含む、請求項１８又は１９に記載の単離された可溶性α４インテグリンポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸配列が配列番号３と少なくとも８０％同一性を有する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の単離された可溶性α４インテグリンポリペプチド。
【請求項２２】
アフィニティタグをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の単離された可溶性α４インテグリンポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチド。
【請求項２４】
ＢＡＳＥペプチドをさらに含む、請求項２３に記載の単離された可溶性β７インテグリンポリペプチド。
【請求項２５】
プロテアーゼ切断部位をさらに含む、請求項２３又は２４に記載の単離された可溶性β７インテグリンポリペプチド。
【請求項２６】
アフィニティタグをさらに含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の単離された可溶性β７インテグリンポリペプチド。
【請求項２７】
リンカーをさらに含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の単離された可溶性β７インテグリンポリペプチド。
【請求項２８】
アミノ酸配列が配列番号４と少なくとも８０％同一性を有する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の単離された可溶性β７インテグリンポリペプチド。
【請求項２９】
（ａ）配列番号１と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を有するα４インテグリンポリペプチドであって、結合ペアの第１のメンバーと連結しているα４インテグリンポリペプチド、及び
（ｂ）配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を有するβ７インテグリンポリペプチドであって、結合ペアの第２のメンバーと連結しているβ７インテグリンポリペプチド
を含む、単離された可溶性α４β７インテグリンポリペプチド。
【請求項３０】
結合ペアが、コイルドコイルペプチド、ロイシンジッパーペプチド、ドックアンドロック（ｄｏｃｋ−ａｎｄ−ｌｏｃｋ）ペプチド、アビジン−ビオチン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２９に記載の単離された可溶性α４β７インテグリンポリペプチド。
【請求項３１】
コイルドコイルペプチドがＡＣＩＤ−ＢＡＳＥペプチドである、請求項３０に記載の単離された可溶性α４β７インテグリンポリペプチド。
【請求項３２】
α４インテグリンポリペプチドとβ７インテグリンポリペプチドが、システイン架橋又はその誘導体を介してヘテロ二量体化している、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の単離された可溶性α４β７インテグリンポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号６、７、１１、１２、又は１３と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド。
【請求項３４】
アフィニティタグをさらに含む、請求項３３に記載の単離された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド。
【請求項３５】
アミノ酸配列が配列番号７と少なくとも８０％同一性を有する、請求項３３又は３４に記載の単離された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]この出願は、２０１４年１２月５日に出願された米国特許仮出願第６２／０８８，４６５号、２０１５年２月６日に出願された米国特許仮出願第６２／１１３，３１７号、及び２０１５年５月８日に出願された米国特許仮出願第６２／１５８，７９１号の優先権を主張し、それらの米国特許仮出願の開示は、全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【背景技術】
【０００２】
[0002]世界中で発生し、何百万人の人々を苦しめている炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、未知の原因の３つの胃腸障害：クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、及び不確定大腸炎（ＩＣ）を記載するために用いられる総称である。ＩＢＤは、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）と合わせると全米国人の半分を冒しており、ＩＢＤについては２６億ドルを超え、ＩＢＳについては８０億ドルを超える費用がかかっている。これらの高い医療費の主な決定因子は、消化性疾患を診断することの困難さ、及びどのようにこれらの疾患が進行するのかを診断することの困難さである。ＩＢＤ及びＩＢＳの費用には、生産性の損失がさらに加わり、これらの障害を患っている人々は、１年で全国平均より少なくとも８日間多く仕事を休んでいる。
【０００３】
[0003]ＩＢＤの処置における抗ＴＮＦα治療の成功にも関わらず、患者の一部は、処置に対して抵抗性であり、新しい治療の、未だ対処されていない医療的必要性を浮き彫りにしている。ベドリズマブは、腸特異的な、α４β７インテグリン中和モノクローナル抗体であり、末梢血細胞数に影響を与えず、全身作用がないように思われる。ベドリズマブは、治療抵抗性患者の管理のための新しい抗炎症性処置の選択肢である。加えて、ウステキヌマブは、ＩＬ１２ｐ４０モノクローナル抗体であり、もう一つの新規なＩＢＤ治療用物質である。しかしながら、ベドリズマブ及びウステキヌマブなどの生物製剤のレベルを正確に測定するための診断検査が利用できることは、ＩＢＤ患者におけるこれらの新規な治療用物質の効果的使用にとって必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0004]それゆえに、薬物治療をモニターするために、及び処置決定を導くために、患者試料におけるベドリズマブ及びウステキヌマブなどの生物製剤の存在又はレベルを検出するためのアッセイが当技術分野において必要とされている。そのようなアッセイは、薬物効力をモニターし、かつそれに応じて治療を最適化する個別化されたアプローチを用いる、潰瘍性大腸炎及びクローン病などの疾患の治療管理に特に有用であり、疾患経過、並びに薬力学、疾患活動性指数、疾病負荷、及び炎症性バイオマーカーなどの臨床パラメータを評価することを含み得る。本発明は、この必要性を満たし、さらに、関連した利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0005]本発明は、試料における生物製剤の存在又はレベルを検出及び測定するための新規な間接的均一移動度シフトアッセイを提供する。本発明のアッセイは、細胞表面タンパク質、膜貫通タンパク質、高度にグリコシル化されたタンパク質、多量体タンパク質などを含む複雑な抗原を標的とする生物製剤の存在又はレベルを検出及び測定するために特に有利である。それゆえに、本発明は、生物学的薬剤での治療を受ける対象についての処置決定を導くための情報を提供し、治療を最適化すること、毒性を低下させること、及び／又は生物療法による治療的処置の効力をモニターすることの正確度を向上させる。本発明はまた、本明細書に記載されたアッセイに用いるのに適している、単離された可溶性α４β７インテグリンヘテロ二量体、及び単離された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０単量体を提供する。
【０００６】
[0006]ある特定の態様において、本発明は、試料における生物製剤の存在又はレベルを決定するための方法であって、
（ａ）生物製剤と結合する非標識可溶性抗原と、試料を接触させて、抗原と試料中の生物製剤の非標識複合体を形成するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）からの試料を、上記生物製剤の標識型と接触させて、抗原と標識生物製剤の標識複合体を形成するステップ；
（ｃ）非標識複合体及び標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィに供して、非標識複合体及び標識複合体を遊離標識生物製剤から分離し、かつ遊離標識生物製剤の量を検出するステップ；並びに
（ｄ）ステップ（ｃ）において検出された遊離標識生物製剤の量を、生物製剤の既知量の標準曲線と比較し、それにより、試料における生物製剤の存在又はレベルを決定するステップ
を含む方法を提供する。
【０００７】
[0007]いくつかの実施形態において、生物製剤には、抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、多価結合タンパク質、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、核酸、糖、それらの組換え型、それらの改変型、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０００８】
[0008]ある特定の実施形態において、抗原は、膜結合型タンパク質、グリコシル化タンパク質、多量体タンパク質、不溶性タンパク質、発現させ、若しくは精製することが困難であるタンパク質、及び／又は巨大タンパク質の可溶性バージョン（例えば、可溶性の断片、バリアント、又は単量体型）である。ある特定の場合において、抗原は、膜結合型タンパク質の可溶性細胞外ドメイン（例えば、可溶性サイトカイン受容体細胞外ドメイン）である。ある特定の他の場合において、抗原は、２つの膜結合型タンパク質の細胞外ドメインを含む可溶性ホモ二量体又はヘテロ二量体（例えば、可溶性インテグリンヘテロ二量体）である。さらに他の場合において、抗原は、多量体を形成せず、一度単離及び／精製された単量体型のままである可溶性タンパク質（例えば、多量体の形成を最小限にし、又は排除するように突然変異した１個又は複数のシステイン残基を有する、可溶性サイトカインバリアント）である。
【０００９】
[0009]他の実施形態において、試料は、例えば生物療法を受けている対象由来の、全血、血清、又は血漿試料である。好ましい実施形態において、試料は血清である。特定の実施形態において、対象は、例えば、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）、炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、又は癌などの疾患又は障害を有する。
【００１０】
[0010]特定の実施形態において、標準曲線は、抗原と、生物製剤の既知量を（例えば、２倍の）段階希釈した標識生物製剤をインキュベートすることにより作成される。ある特定の実施形態において、遊離標識生物製剤の曲線下面積（ＡＵＣ）が、標準曲線から得られる生物製剤の既知量（例えば、それの対数）に対してプロットされ、試料中の生物製剤のレベルは、例えば、遊離標識生物製剤のピーク面積のサイズに基づいた、内挿により計算される。他の実施形態において、標識生物製剤のストック溶液に加えられる遊離標識は、標識生物製剤ローディング対照として用いられる。遊離標識生物製剤の遊離標識に対する比が、生物製剤の既知量に対してプロットされる。
【００１１】
[0011]一つの特定の実施形態において、抗α４β７インテグリン薬物（例えば、ベドリズマブ）の存在及び／又はレベルは、本明細書に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィを用いる間接的均一移動度シフトアッセイで決定される。
【００１２】
[0012]別の特定の実施形態において、抗ＩＬ１２ｐ４０薬物（例えば、ウステキヌマブ）の存在及び／又はレベルは、本明細書に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィを用いる間接的均一移動度シフトアッセイで決定される。
【００１３】
[0013]他の実施形態において、抗α４β７インテグリン薬物及び抗ＩＬ１２ｐ４０薬物、並びに他の生物製剤に対して産生される抗薬物抗体（ＡＤＡ）（例えば、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡなどを含む自己抗体）の存在及び／又はレベルが、例えば、米国特許第８，５７４，８５５号及び第８，８６５，４１７号、並びに米国特許出願公開第２０１４／００５１１８４号及び第２０１４／０１４１９８３号（それらの開示は、全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み入れられている）に記載されているように、均一移動度シフトアッセイで決定される。
【００１４】
[0014]他の態様において、本発明は、配列番号１又は配列番号３と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性α４インテグリンポリペプチドを提供する。さらに他の態様において、本発明は、配列番号２又は配列番号４と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドを提供する。
【００１５】
[0015]特定の実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号１と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を有するα４インテグリンポリペプチドであって、結合ペアの第１のメンバーと連結している（例えば、配列番号３）α４インテグリンポリペプチド、及び
（ｂ）配列番号２と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を有するβ７インテグリンポリペプチドであって、第２のメンバーと連結している（例えば、配列番号４）β７インテグリンポリペプチド
を含む、単離された可溶性α４β７インテグリンヘテロ二量体を提供する。
【００１６】
[0016]ある特定の他の態様において、本発明は、配列番号６、７、１１、１２、又は１３と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを提供する。
【００１７】
[0017]特定の実施形態において、本発明の間接的均一移動度シフトアッセイに用いられる非標識可溶性抗原は、本明細書に記載された、単離された可溶性α４β７インテグリンヘテロ二量体又は単離された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを含む。
【００１８】
[0018]さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載された可溶性ポリペプチドをコードする発現ベクター、上記発現ベクターを含む宿主細胞、及び本明細書に記載された可溶性ポリペプチドを作製するための方法を提供する。
【００１９】
[0019]本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明及び図から当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の間接的均一移動度シフトアッセイ（ＨＭＳＡ）の原理を示す図である。非限定的例としてベドリズマブ（「ＶＬＭ」又は「Ｖｅｄｏ」）を用い、第１ステップにおいて、インテグリンα４β７及び希釈液バッファーと共に血清を９６ウェルプレートに加える。第２ステップにおいて、標識ＶＬＭ（例えば、Ｖｅｄｏアレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８）を加える。その後、試料を、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィへ順次、注入する。
【図２】本発明の一実施形態の、保持時間（ｘ軸）及び発光量（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）（ｙ軸）による、Ｖｅｄｏアレクサ４８８（左）及びＶｅｄｏアレクサ４８８＋インテグリンα４β７抗原（右）のクロマトグラムを示す図である。どちらも４％正常ヒト血清内である。その抗原が、標識ＶＬＭの大部分に結合していることに注目されたい。
【図３】本発明の一実施形態における、ＶＬＭアッセイの様々な構成要素の、保持時間（ｘ軸）及び発光量（ｙ軸）による、標準曲線オーバーレイからのクロマトグラムを示す図である。「Ｖｅｄｏアレクサ４８８／α４β７」＝可溶性α４β７ヘテロ二量体に結合したアレクサフルオル（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）４８８標識ＶＬＭ。「アレクサ４８８」＝ブロックされた（例えば、不活性化された）アレクサフルオル（登録商標）４８８ローディング対照。より多くの治療用ＶＬＭが存在する場合、遊離Ｖｅｄｏアレクサ４８８ピーク面積が、より大きくなることに注目されたい。
【図４】本発明の一実施形態におけるＶＬＭ標準曲線を示す図である。０．１５６２５μｇ／ｍｌ〜８０μｇ／ｍｌの間の濃度範囲でのＶＬＭの段階希釈を用いて、標準曲線を作成した。
【図５】本発明の一実施形態におけるＶＬＭ薬物アッセイ検証を示す図である。０．１５６２５μｇ／ｍｌ〜８０μｇ／ｍｌの間の濃度範囲でのＶＬＭの段階希釈から作成された標準曲線を用いて、ブランクの限界（ＬＯＢ）、検出の限界（ＬＯＤ）、定量の下限（ＬＬＯＱ）、及び定量の上限（ＵＬＯＱ）を計算した。
【図６】本発明の一実施形態におけるＶＬＭ薬物アッセイのアッセイ内精密度及び正確度を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態における、抗ベドリズマブ自己抗体（ＡＴＶ）アッセイの保持時間（ｘ軸）及び発光量（ｙ軸）を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態におけるＡＴＶアッセイの検証を示す図である。
【図９】本発明の一実施形態におけるＡＴＶアッセイの検証を示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態におけるＡＴＶアッセイのアッセイ間精密度を示す図である。
【図１１】本発明の一実施形態におけるウステキヌマブ（ＵＴＫ）薬物アッセイ検証を示す図である。０．０７８μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌの間の濃度範囲でのＵＴＫの段階希釈から作成された標準曲線を用いて、ブランクの限界（ＬＯＢ）、検出の限界（ＬＯＤ）、定量の下限（ＬＬＯＱ）、及び定量の上限（ＵＬＯＱ）を計算した。
【図１２】本発明の一実施形態における、ウステキヌマブに対する自己抗体（ＡＴＵ）についてのアッセイの検証を示す図である。
【図１３】本発明の、可溶性α４インテグリン抗原及び可溶性β７インテグリン抗原の例示的な実施形態の概略図である。左：完全長タンパク質。右：ＡＣＩＤ−ＢＡＳＥペプチドのシステイン架橋を有する、切り詰め型α４β７インテグリンヘテロ二量体。
【図１４】（Ａ）ＶＬＭ及び（Ｂ）ベドリズマブに対する自己抗体（ＡＴＶ）についてのヒト血清における薬物希釈の直線性を示す図である。
【図１５】血清における一般的な干渉物質：（Ａ）溶血した血清干渉；（Ｂ）脂肪血症血清干渉；及び（Ｃ）ＲＦ血清干渉の分析を示す図である。
【図１６】ウステキヌマブ（ＵＴＫ）均一移動度シフトアッセイ（ＨＭＳＡ）の原理を示す図である。
【図１７】（Ａ）ＵＴＫ及び（Ｂ）ウステキヌマブに対する自己抗体（ＡＴＵ）についての正常ヒト血清における希釈の直線性を示す図である。
【図１８】血清における一般的な干渉物質：（Ａ）溶血した血清干渉；（Ｂ）脂肪血症血清干渉；及び（Ｃ）ＲＦ血清干渉の分析を示す図である。
【図１９】本発明のＶＬＭアッセイの一実施形態におけるインテグリンα４β７基質干渉を示す図である。
【図２０】一定量の標識ベドリズマブ（「Ｖｅｄｏ４８８」）及びインテグリンα４β７抗原（上端左）、加えて両方の試薬の２倍に増加した量（上端右）又は４倍に増加した量（下端左）を用いた標準曲線を示す図である。曲線の最高端が、より高いＶＬＭ濃度において飽和していることに注目されたい。同様に、最低端は、ＶＬＭのわずかに高いレベルにおいて平らになっている。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．序論
[0040]本発明は、サイズ排除クロマトグラフィを用いる間接的均一移動度シフトアッセイ（ＨＭＳＡ）が、以下の特性のうちの１つ又は複数を有する抗原を標的とする生物製剤の存在又はレベルを測定するのに特に有利であるという発見に一部、基づいている：細胞表面型又は膜結合型、（高度に）グリコシル化されている、多量体（例えば、ヘテロ二量体、ホモ二量体などを形成する）、不溶性、発現させるのが困難、精製するのが困難、サイズが大きい、及びそれらの組み合わせ。ある特定の態様において、抗原の可溶型（例えば、可溶性の断片、バリアント、又は単量体）の使用により、上記の特性のうちの１つ又は複数を有する抗原に関連した困難及び制限が克服され、その生物製剤での治療を受けた患者由来の試料における関心対象となる任意の生物製剤の精密かつ正確な測定が可能になる。
【００２２】
[0041]本発明の間接的アッセイの背後にある原理は、生物療法を受けている患者から得られた試料（例えば、血清）における（非標識）生物製剤の量が、どれくらいの非標識抗原が遊離のままで、生物製剤の標識型と結合するかを決定することである。遊離（結合していない）標識生物製剤の面積の変化を追跡することにより、患者試料における（非標識）生物製剤の存在又はレベルを決定することができる。より詳細には、標識生物製剤と非標識生物製剤の相対量（例えば、比）が、どれくらいの抗原がそれぞれに結合しているかを決定し、サイズ排除クロマトグラフィ後の遊離標識生物製剤の量（例えば、ピーク面積）を決定する。その後、遊離標識生物製剤の量（例えば、ピーク面積）を、生物製剤の既知量の標準曲線と比較して、高い感度及びダイナミックレンジで患者試料における生物製剤レベルの正確な測定を提供することができる。ある特定の実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィ後の遊離標識生物製剤のピーク面積のサイズを計算し、標準曲線と比較して、患者試料における生物製剤の濃度を内挿する。
【００２３】
[0042]生物製剤の血清中濃度を測定することの重要性は、ＦＤＡが、薬物動態研究及び耐容性（例えば、免疫応答）研究を臨床試験中に実施することを要求するという事実によって説明される。本発明はまた、これらの薬物を受けた患者をモニターして、彼らが正しい用量をとっていること、その薬物が身体からクリアランスされるのが速すぎないこと、及び彼らがその薬物に対する免疫応答を発生していないことを確認するのに有用である。さらに、本発明は、最初の薬物での失敗により異なる薬物間での切り換えを導くのに役に立つ。
【００２４】
ＩＩ．定義
[0043]本明細書で用いられる場合、以下の用語は、他に規定がない限り、それらに与えられた意味を有する。
【００２５】
[0044]本明細書で用いられる場合、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、又は「その（ｔｈｅ）」は、１つのメンバーを有する態様を含むだけでなく、１つより多いメンバーを有する態様もまた含む。例えば、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に指定しない限り、複数の指示対象を含む。
【００２６】
[0045]用語「競合」、「競合に基づいた」。及び「間接的な」は、非標識抗原及び標識生物製剤が試料に（逐次的に）加えられた後に、試料に残存する遊離（結合していない）標識生物製剤の量を検出することに頼る、試料における（非標識）生物製剤の存在又はレベルを決定するための本発明のアッセイを指すのに、本明細書で交換可能に用いられる。
【００２７】
[0046]用語「ＶＬＭ」、「ＶＤＺ」、及び「Ｖｅｄｏ」は、ベドリズマブを指すのに本明細書で交換可能に用いられる。
【００２８】
[0047]本明細書で用いられる場合、用語「生物製剤」又は「生物学的薬剤」又は「生物学的薬物」は、生物学的系（例えば、生きている生物体）から産生又は抽出された生成物及び物質を包含する。生物製剤の非限定的例には、抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質（例えば、Ｉｇ融合タンパク質又はＦｃ融合タンパク質）、多価結合タンパク質（例えば、ＤＶＤ  Ｉｇ）、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、核酸、糖、それらの組換え型、それらの改変型、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２９】
[0048]用語「抗体」は、共有結合性（ジスルフィド）及び非共有結合性相互作用の組み合わせにより一緒に保持されている２つの同一の軽鎖（約２２０アミノ酸）及び２つの同一の重鎖（約４４０アミノ酸）からなる大きな（１５０ｋＤａ）「Ｙ字型」分子を含む。各軽鎖及び重鎖は、１個の鎖内ジスルフィド結合を含有する定常又は可変領域の繰り返しセグメントからなる。可変領域は、軽鎖及び重鎖のＮ末端に位置し、一方、定常ドメインは、軽鎖及び重鎖のＣ末端に位置する。軽鎖及び重鎖のＮ末端は、一緒になって、抗原結合部位を形成する。軽鎖は、１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインで構成され、重鎖は、１つの可変ドメイン及び３つの定常ドメインで構成される。「Ｙ」の末端に位置するのは、２つの同一（二価）の抗原結合部位である。２つの抗原結合部位間の距離は、可動性ヒンジ領域のせいで変動し、結果として、抗原結合効率は非常に増加することができる。抗原結合領域の形成は、重鎖由来の可変領域（ＶＨ）の軽鎖の可変領域（ＶＬ）との対形成により引き起こされる。可変領域のアミノ酸配列のバリエーションが、抗原結合部位の莫大な多様性の原因であり、最も高い可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた、３つの超可変領域を通して生じる。Ｆｃ領域として知られた、抗体のテール領域は、重鎖のそれぞれ由来の２つの定常領域（ＣＨ２及びＣＨ３）で構成される。Ｆｃ領域は、好中球及びマクロファージ上のＦｃ受容体の結合を通してエフェクター機能を動員することに関与する。
【００３０】
[0049]用語「抗原」は、生物製剤と（例えば、特異的に）結合し、又は相互作用する任意の分子、薬剤、又は物質を含む。１つの非限定的例として、抗原は、膜結合型タンパク質、グリコシル化タンパク質、多量体タンパク質、不溶性タンパク質、発現させ、若しくは精製することが困難であるタンパク質、及び／又は巨大タンパク質の可溶性の断片、バリアント、又は単量体を含む。別の非限定的例として、抗原は、インテグリン受容体（例えば、α４β７インテグリン）などの細胞表面分子の可溶性断片であって、対応する完全長分子の１つ又は複数の細胞外ドメインを含有する可溶性断片（例えば、対応する完全長α４及びβ７タンパク質由来の細胞外ドメイン配列を含む可溶性α４β７抗原ヘテロ二量体）を含む。さらに別の非限定的例として、抗原は、ＴＮＦαなどのサイトカイン、又はホモ二量体もヘテロ二量体も形成していないＩＬ−１２ｐ４０などのそのサブユニットを含む。
【００３１】
[0050]用語「サイズ排除クロマトグラフィ」又は「ＳＥＣ」は、溶液中の分子がそれらのサイズ及び／又は水力学的体積に基づいて分離される、クロマトグラフ的方法を含む。それは、タンパク質及びそれらのコンジュゲートなどの大分子又は高分子複合体に適用される。典型的には、試料をカラムの中で移動させるのに水溶液が用いられる場合、その技術はゲル濾過クロマトグラフィとして知られている。
【００３２】
[0051]用語「複合体」は、生物製剤（例えば、非標識又は標識生物製剤）と（例えば、非共有結合性手段により）結合した抗原、及び生物製剤に対する自己抗体と（例えば、非共有結合性手段により）結合した生物製剤（例えば、標識生物製剤）を含む。
【００３３】
[0052]本明細書で用いられる場合、用語「標識された」によって修飾されている実体は、経験的に検出可能である別の分子又は化学的実体とコンジュゲートしている、任意の抗原、分子、タンパク質、酵素、抗体、抗体断片、サイトカイン、又は関連種を含む。標識として適した化学種には、蛍光色素、例えば、アレクサフルオル（登録商標）４８８などのアレクサフルオル（登録商標）色素、量子ドット、光学色素、発光色素、及び放射性核種、例えば、１２５Ｉが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
[0053]句「蛍光標識検出」は、蛍光標識を検出するための手段を含む。検出のための手段には、分光計、蛍光光度計、光度計、非限定的にサイズ排除高速液体クロマトグラフィ（例えば、非限定的に、アジレント−１２００  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ−１２００  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ））などのクロマトグラフィ機器と共に一般的に組み込まれる検出装置が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３５】
[0054]用語「対象」、「患者」、又は「個体」には、典型的には、ヒトが挙げられるが、例えば、他の霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの他の動物もまた挙げられる。
【００３６】
[0055]用語「試料」は、個体から得られる任意の生物学的検体を含む。試料には、全血、血漿、血清、赤血球細胞、白血球細胞（例えば、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、多形核（ＰＭＮ）細胞）、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液（例えば、リンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄液、唾液、尿、糞便（すなわち、大便）、痰、気管支肺胞洗浄液、涙、（例えば、非選択的乳輪周囲（ｐｅｒｉａｒｅｏｌａｒ）穿刺吸引法により採取された）穿刺吸引液、任意の他の体液、炎症部位の生検などの組織試料（例えば、針生検）、それらの細胞抽出物、及びこれらの体液又は組織のうちの１つ又は複数から引き出された免疫グロブリン濃縮画分が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、試料は、全血、血漿、血清、若しくは細胞ペレットなどの血液の分画成分、又は血液の免疫グロブリン濃縮画分である。血清試料などの試料が分析前に希釈され得ることを、当業者は認識しているだろう。ある特定の実施形態において、試料は、当技術分野において知られた任意の技術を用いて、ＰＢＭＣ及び／又はＰＭＮ細胞を単離することにより得られる。ある特定の他の実施形態において、試料は、例えば、胃腸管又は滑膜組織の一部などの炎症部位からの、組織生検である。
【００３７】
[0056]核酸又はポリペプチドに適用される場合の用語「単離された」とは、その核酸又はポリペプチドが、それが天然の状態で付随している他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。それは、乾燥物又は水溶液のいずれでもあり得るが、好ましくは均一な状態である。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィなどの分析化学技術を用いて決定される。調製物に存在する主な種であるポリペプチドは実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、関心対象となる遺伝子以外の、その遺伝子に隣接し、かつタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。用語「精製された」とは、核酸又はポリペプチドが、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを意味する。特に、それは、核酸又はポリペプチドが、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９９％純粋であることを意味する。
【００３８】
[0057]ポリペプチドの関連における用語「可溶性の」は、宿主細胞、又は細胞を含まないタンパク質合成系を用いて可溶且つ機能的な形で調製することができるポリペプチドを指す。例えば、可溶性ポリペプチドは、ミスフォールドした、及び／又は機能的不活性なポリペプチドを含む不溶性凝集物を形成しない。
【００３９】
[0058]用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」には、一本鎖か又は二本鎖のいずれかの形をとる、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及びそれらのポリマーが挙げられる。特に限定されない限り、その用語は、参照核酸と類似した結合性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。他に規定がない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列に加えて、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、１個又は複数の選択された（又は全部の）コドンの３番目の位置が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８（１９８５）；及びＣａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に用いられる。
【００４０】
[0059]用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を含むように、本明細書で交換可能に用いられる。その用語は、天然に存在するアミノ酸重合体及び天然に存在しないアミノ酸重合体に加えて、１個又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣体であるアミノ酸重合体に適用される。本明細書で用いられる場合、その用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質、その切り詰め型又は断片を含む。
【００４１】
[0060]用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び非天然アミノ酸、加えて、天然に存在するアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。
【００４２】
[0061]アミノ酸は、それらの名前、それらの一般的に知られた３文字記号によるか、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号によるかのいずれかで、本明細書で呼ばれ得る。加えて、ヌクレオチドは、それらの一般的に認められている一文字コードによって呼ばれ得る。
【００４３】
[0062]本発明の方法のステップは、必ずしも、それらが提示されている特定の順序で実施される必要はない。当業者は、本発明の方法のステップの他の順序付けが、本発明の範囲内に包含されることを理解しているだろう。
【００４４】
[0063]角型括弧「［  ］」は、角型括弧内の種が、それらの濃度によって参照されることを示す。
【００４５】
ＩＩＩ．実施形態の説明
[0064]本発明は、試料における生物製剤の存在又はレベルを検出及び測定するための新規な間接的均一移動度シフトアッセイを提供する。本発明のアッセイは、細胞表面タンパク質、膜貫通タンパク質、高度にグリコシル化されたタンパク質、及び多量体タンパク質を含む複雑な、又は大きな抗原、加えて、精製することができない抗原、純粋でない抗原、及び部分的又は実質的に精製された抗原を標的とする生物製剤の存在又はレベルを検出するために特に有利である。本発明はまた、本明細書に記載されたアッセイに用いるのに適している、単離された可溶性α４β７インテグリンヘテロ二量体、及び単離された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０単量体を提供する。
【００４６】
[0065]一態様において、本発明は、試料における生物製剤の存在又はレベルを決定するための方法であって、
（ａ）生物製剤と結合する非標識可溶性抗原と、試料を接触させて、上記抗原と試料における生物製剤の非標識複合体（例えば、複数の非標識複合体）を形成するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）からの試料を、上記生物製剤の標識型（「標識生物製剤」）と接触させて、上記抗原と標識生物製剤の標識複合体（例えば、複数の標識複合体）を形成するステップ；
（ｃ）（例えば、複数の）非標識複合体及び標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィに供して、（例えば、複数の）非標識複合体及び標識複合体を遊離標識生物製剤から分離し、遊離標識生物製剤の量を検出するステップ；並びに
（ｄ）ステップ（ｃ）において検出された遊離標識生物製剤の量を、生物製剤の既知量の標準曲線と比較して、それにより、試料における生物製剤の存在又はレベルを決定するステップ
を含む方法を提供する。
【００４７】
[0066]いくつかの実施形態において、生物製剤には、抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、多価結合タンパク質、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、核酸、糖、それらの組換え型、それらの改変型、及びそれらの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態において、生物製剤は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、又はその断片（例えば、モノクローナル抗体の抗原結合断片）若しくはそのコンジュゲート（例えば、抗体−薬物コンジュゲート）を含む。抗体に基づいた生物製剤の非限定的例は表１に示されている。
【００４８】
[0067]特定の実施形態において、本発明の方法は、試料において、結合していない（遊離）生物製剤、例えば、生物製剤の（内因性）標的抗原又はその断片と結合していない試料中の生物製剤の集団、の存在を検出し、及び／又はそのレベルを測定する。
【００４９】
[0068]ある特定の実施形態において、抗原は、膜結合型タンパク質、（高度に）グリコシル化されたタンパク質、多量体タンパク質、不溶性タンパク質、発現させ、若しくは精製することが困難であるタンパク質、及び／又は巨大タンパク質の可溶性バージョン（例えば、可溶性の断片、バリアント、又は単量体型）である。ある特定の場合において、抗原は、膜結合型タンパク質の可溶性細胞外ドメイン（例えば、可溶性サイトカイン受容体細胞外ドメイン）である。ある特定の他の場合において、抗原は、２つの膜結合型タンパク質の細胞外ドメインを含む可溶性ホモ二量体又はヘテロ二量体（例えば、可溶性インテグリンヘテロ二量体）である。さらに他の場合において、抗原は、多量体を形成せず、一度単離及び／精製された単量体型のままである可溶性タンパク質（例えば、多量体の形成を最小限にし、又は排除するように突然変異した１個又は複数のシステイン残基を有する、可溶性サイトカインバリアント）である。
【００５０】
[0069]いくつかの実施形態において、抗原は、例えば、細胞接着分子（ＣＡＭ）などの細胞表面分子の可溶性断片（例えば、細胞外ドメイン）である。ＣＡＭの非限定的例には、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ＣＡＭ、インテグリン、カドヘリン、及びセレクチンが挙げられる。
【００５１】
[0070]ＩｇＳＦ  ＣＡＭは、１つ又は複数の免疫グロブリン様フォールドドメインを有する細胞の表面上に位置する様々なポリペプチド又はタンパク質のいずれかであり、細胞間接着及び／又はシグナル伝達において機能する。多くの場合において、ＩｇＳＦ  ＣＡＭは、膜貫通タンパク質である。ＩｇＳＦ  ＣＡＭの非限定的例には、粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭＡＤＣＡＭ１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ；例えば、ＮＣＡＭ−１２０、ＮＣＡＭ−１２５、ＮＣＡＭ−１４０、ＮＣＡＭ−１４５、ＮＣＡＭ−１８０、ＮＣＡＭ−１８５など）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＡＭ−４、及びＩＣＡＭ−５）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ｌ１ＣＡＭとの相同性を有する細胞接着分子（ｃｌｏｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｌ１）（ＣＨＬ１）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ；例えば、ＳＩＧＬＥＣ−１、ＳＩＧＬＥＣ−２、ＳＩＧＬＥＣ−３、ＳＩＧＬＥＣ−４など）、ネクチン（例えば、Ｎｅｃｔｉｎ−１、Ｎｅｃｔｉｎ−２、Ｎｅｃｔｉｎ−３など）、及びネクチン様分子（例えば、Ｎｅｃｌ−１、Ｎｅｃｌ−２、Ｎｅｃｌ−３、Ｎｅｃｌ−４、及びＮｅｃｌ−５）が挙げられる。
【００５２】
[0071]インテグリンは、膜貫通αβヘテロ二量体であり、少なくとも１８個のαサブユニット及び８個のβサブユニットがヒトにおいて知られており、２４個のヘテロ二量体を生じる。α及びβサブユニットは、異なるドメイン構造を有し、各サブユニット由来の細胞外ドメインが、ヘテロ二量体のリガンド結合部位に寄与している。インテグリンの非限定的例には、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α１０β１、α１１β１、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、αＩＩｂβ３、α４β７、αＥβ７、α６β４、αＬβ２、αＭβ２、αＸβ２、及びαＤβ２が挙げられる。
【００５３】
[0072]特定の実施形態において、抗原はα４β７インテグリンであり、生物製剤は、ベドリズマブ（ＶＬＭ）などの抗α４β７インテグリン薬である。ある特定の場合において、抗α４β７インテグリン薬と結合するα４β７インテグリンの可溶性断片は、配列番号１若しくは配列番号３と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むα４断片、及び／又は配列番号２若しくは配列番号４と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含むβ７断片を含む。
【００５４】
[0073]他の実施形態において、抗原はα４β１インテグリンであり、生物製剤は、ナタリズマブなどの抗α４β１インテグリン薬である。ある特定の場合において、抗α４β１インテグリン薬と結合するα４β１インテグリンの可溶性断片は、α４及びβ１サブユニットの細胞外ドメインのヘテロ二量体を含む。
【００５５】
[0074]カドヘリンは、細胞接着において重要な役割を果たすカルシウム依存性膜貫通タンパク質であり、接着結合を形成して、組織内の細胞を一緒に結合する。カドヘリンの非限定的例には、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン２、及びＰ−カドヘリンが挙げられる。
【００５６】
[0075]セレクチンは、フコシル化糖、例えば、ムチンを結合するヘテロフィリックなＣＡＭである。その３つのファミリーメンバーは、Ｅ−セレクチン（内皮）、Ｌ−セレクチン（白血球）、及びＰ−セレクチン（血小板）である。
【００５７】
[0076]他の実施形態において、抗原は、例えば、サイトカイン受容体などの細胞表面分子の可溶性断片（例えば、細胞外ドメイン）である。
【００５８】
[0077]サイトカイン受容体の非限定的例には、Ｉ型サイトカイン受容体、ＩＩ型サイトカイン受容体、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバー、腫瘍壊死因子受容体、ケモカイン受容体、及びＴＧＦβ受容体が挙げられる。Ｉ型サイトカイン受容体の例には、インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１１受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−２１受容体、ＩＬ−２３受容体、ＩＬ−２７受容体など）、コロニー刺激因子受容体（例えば、エリスロポエチン受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体など）、ホルモン受容体又は神経ペプチド受容体（例えば、成長ホルモン受容体、プロラクチン受容体など）、並びにオンコスタチンＭ受容体及び白血病抑制因子受容体などの他のサイトカイン受容体が挙げられるが、それらに限定されない。ＩＩ型サイトカイン受容体の例には、インターフェロン受容体（例えば、インターフェロン−α／β受容体、インターフェロン−γ受容体など）及びインターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−２０受容体、ＩＬ−２２受容体、ＩＬ−２８受容体など）が挙げられるが、それらに限定されない。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー受容体の例には、ＩＬ−１受容体、ＣＳＦ１、ｃ−ｋｉｔ受容体、及びＩＬ−１８受容体が挙げられるが、それらに限定されない。腫瘍壊死因子受容体の例には、ＴＮＦ受容体（ＣＤ１２０）、リンホトキシンβ受容体、ＣＤ１３４、ＣＤ４０、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＲＡＮＫ、オステオプロテゲリン、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、神経成長因子受容体、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ２５、及びエクトジスプラシンＡ２受容体が挙げられるが、それらに限定されない。ケモカイン受容体の例には、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＣケモカイン受容体、Ｃケモカイン受容体、及びＣＸ３Ｃケモカイン受容体が挙げられるが、それらに限定されない。ＴＧＦβ受容体の例には、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、及びＴＧＦβ受容体３が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５９】
[0078]ある特定の実施形態において、抗原はＩＬ−６受容体であり、生物製剤は、トシリズマブなどの抗ＩＬ−６受容体薬である、ある特定の場合において、抗ＩＬ−６受容体薬と結合するＩＬ−６受容体の可溶性断片は、ＩＬ−６受容体の細胞外ドメインを含む。
【００６０】
[0079]さらに他の実施形態において、抗原は表面抗原分類（ＣＤ）分子の可溶性断片（例えば、細胞外ドメイン）である。ＣＤ分子の非限定的例には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ９１、ＣＤ１１４、ＣＤ１１７、ＣＤ１８２などが挙げられる。ある特定の場合において、ＣＤ分子の可溶性断片と結合する生物製剤は、ビシリズマブ、プリリキシマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、ダクリズマブ、及びそれらに組み合わせからなる群から選択されるメンバーである。
【００６１】
[0080]いくつかの実施形態において、抗原はサイトカイン又はその単量体（例えば、多量体の形成を最小限にし、又は排除するように突然変異した１個又は複数のシステイン残基を有する、可溶性サイトカインバリアント）である。
【００６２】
[0081]サイトカインの非限定的例には、ＴＮＦα、ＴＮＦ関連アポトーシス弱誘導因子（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｗｅａｋ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）（ＴＷＥＡＫ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、及びＩＬ−２７）、アディポサイトカイン（例えば、レプチン、アディポネクチン、レシスチン、活性又はトータルプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）、ビスファチン、及びレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４））などが挙げられる。
【００６３】
[0082]特定の実施形態において、サイトカインはＩＬ−１２又はＩＬ−２３のｐ４０サブユニットであり、生物製剤は、ウステキヌマブ（ＵＴＫ）などの抗ＩＬ−１２ｐ４０薬である。ある特定の場合において、サイトカインは、多量体の形成を最小限にし、又は排除するように突然変異した１個又は複数のシステイン残基を含むｐ４０バリアントである。いくつかの場合において、ｐ４０バリアントは、配列番号６、７、１１、１２、又は１３と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６４】
[0083]他の実施形態において、サイトカインはＴＮＦαであり、生物製剤は抗ＴＮＦα薬である。抗ＴＮＦα薬の非限定的例には、レミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）（登録商標）（インフリキシマブ）、ヒュミラ（ＨＵＭＩＲＡ）（登録商標）（アダリムマブ）、エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（登録商標）（エタネルセプト）、シムジア（ＣＩＭＺＩＡ）（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（ＳＩＭＰＯＮＩ）（ゴリムマブ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６５】
[0084]本明細書に記載された可溶性抗原は、当業者に知られた任意の方法により作製することができ、その方法は、例えば、固相及び液相合成などの合成方法、又は組換え生物学方法などであるが、それらに限定されない。
【００６６】
[0085]いくつかの実施形態において、試料は、例えば生物療法を受けている対象から得られる、全血、血清、又は血漿試料である。好ましい実施形態において、試料は血清である。特定の実施形態において、対象は、例えば、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）、炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、又は癌などの疾患又は障害を有する。
【００６７】
[0086]特定の実施形態において、標準曲線は、抗原と、生物製剤の既知量を（例えば、２倍の）段階希釈した標識生物製剤をインキュベートすることにより作成される。ある特定の実施形態において、遊離標識生物製剤の曲線下面積（ＡＵＣ）が、標準曲線から得られる生物製剤の既知量（例えば、それの対数）に対してプロットされ、試料における生物製剤のレベルは、例えば、遊離標識生物製剤のピーク面積のサイズに基づいた、内挿により計算される。他の実施形態において、遊離標識生物製剤のローディング対照（例えば、遊離標識）に対する比が決定され、標準曲線からの試料における生物製剤のレベルを標準化するために用いられる。
【００６８】
[0087]ある特定の実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）である。特定の実施形態において、（例えば、複数の）非標識及び標識複合体が、まず、固定相を通って溶出され、続いて、遊離標識生物製剤が溶出される。ＳＥＣの根本的な原理は、異なるサイズの分子又は複合体が、異なる速度で固定相を通って溶出する（濾過する）ことである。これは、結果として、サイズに基づいた分子又は複合体の溶液の分離を生じる。分子又は複合体の全てが同時に、又はほぼ同時にロードされるとすれば、同じサイズの分子又は複合体は一緒に溶出する。各サイズ排除カラムは、分離することができる分子量のある範囲を有する。排除限界は、この範囲の上端における分子量と規定し、分子又は複合体が大きすぎて、固定相中に捕捉されない地点である。浸透限界は、分離の範囲の下端における分子量と規定し、十分小さいサイズの分子又は複合体が、固定相の細孔へ完全に浸透することができる地点であり、この分子質量より下の全ての分子又は複合体は、非常に小さいため、単一のバンドとして溶出する。
【００６９】
[0088]いくつかの場合において、溶離液は、一定の体積又は画分に収集される。分子又は複合体のサイズが類似すれば類似するほど、それらは同じ画分にある可能性が高くなり、別々には検出されない。収集された画分は、溶出された分子又は複合体の濃度を決定するために分光学的技術により調べることが好ましい。典型的には、本発明において有用な分光測定検出技術には、蛍光定量法、屈折率（ＲＩ）、及び紫外線（ＵＶ）が挙げられるが、それらに限定されない。ある特定の場合において、溶出体積は、分子の水力学的体積の対数に対しておおよそ線形的に減少する（すなわち、より重い分子又は複合体が最初に落下する）。
【００７０】
[0089]生物製剤（例えば、治療用抗体）は、様々な検出可能な群（複数可）のいずれかで標識することができる。ある特定の実施形態において、生物製剤は、フルオロフォア又は蛍光色素で標識される。他の実施形態において、生物製剤は、発光タグ、金属、放射性核種などで標識される。抗原の標識生物製剤との特異的免疫学的結合、又は遊離標識生物製剤の量が、直接的又は間接的に検出することができる。直接的又は間接的標識からのシグナルは、例えば、発色基質からの色を検出する分光光度計、１２５Ｉの検出のためのガンマカウンターなどの放射線を検出する放射線カウンター、又はある特定の波長の光の存在下で蛍光を検出する蛍光光度計を用いて、分析することができる。
【００７１】
[0090]フルオロフォア又は蛍光色素の非限定的例には、参照により本明細書に組み入れられている、分子プローブカタログ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）に列挙されたものが挙げられる（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、第１０版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（２００５）参照）。そのような例示的なフルオロフォア又は蛍光色素には、アレクサフルオル（登録商標）３５０、アレクサフルオル（登録商標）４０５、アレクサフルオル（登録商標）４３０、アレクサフルオル（登録商標）４８８、アレクサフルオル（登録商標）５１４、アレクサフルオル（登録商標）５３２、アレクサフルオル（登録商標）５４６、アレクサフルオル（登録商標）５５５、アレクサフルオル（登録商標）５６８、アレクサフルオル（登録商標）５９４、アレクサフルオル（登録商標）６１０、アレクサフルオル（登録商標）６３３、アレクサフルオル（登録商標）６３５、アレクサフルオル（登録商標）６４７、アレクサフルオル（登録商標）６６０、アレクサフルオル（登録商標）６８０、アレクサフルオル（登録商標）７００、アレクサフルオル（登録商標）７５０、及び／又はアレクサフルオル（登録商標）７９０などのアレクサフルオル（登録商標）色素、加えて、非限定的に、塩化ダンシル（ＤＮＳ−Ｃｌ）、５−（ヨードアセトアミド）フルオレセイン（５−ＩＡＦ）、フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン５−（及び６−）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イルクロリド（ＮＢＤ−Ｃｌ）、臭化エチジウム、ルシファーイエロー、５−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（商標）スルホニルクロリド、ＢＯＤＩＰＹ（商標）、ナフチルアミンスルホン酸（例えば、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）、６−（ｐ−トルイジニル）ナフタレン−ｅ−２−スルホン酸（ＴＮＳ）など）、アントロイル脂肪酸、ＤＰＨ、パリナリン酸、ＴＭＡ−ＤＰＨ、フルオレニル脂肪酸、フルオレセイン−ホスファチジルエタノールアミン、テキサスレッド−ホスファチジルエタノールアミン、ピレニル−ホスファチジルコリン、フルオレニル−ホスファチジルコリン、メロシアニン５４０，１−（３−スルホナトプロピル）−４−［β−［２［（ジ−ｎ−ブチルアミノ）−６ナフチル］ビニル］ピリジニウムベタイン（ナフチルスチリル）、３，３’ジプロピルチアジカルボシアニン（ｄｉＳ−Ｃ３−（５））、４−（ｐ−ジペンチルアミノスチリル）−ｌ−メチルピリジニウム（ｄｉ−５−ＡＳＰ）、Ｃｙ−３ヨードアセトアミド、Ｃｙ−５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｃｙ−７−イソチオシアネート、ローダミン８００、ＩＲ−１２５、チアゾールオレンジ、アズールＢ、ナイルブルー、Ａｌフタロシアニン、オキサジン１、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（���ＡＰＩ）、ヘキスト３３３４２、ＴＯＴＯ、アクリジンオレンジ、エチジウムホモダイマー、Ｎ（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウム（ＭＱＡＥ）、フラ−２（Ｆｕｒａ−２）、カルシウムグリーン、カルボキシＳＮＡＲＦ−６、ＢＡＰＴＡ、クマリン、フィトフルオル（ｐｈｙｔｏｆｌｕｏｒ）、コロネン、金属−リガンド複合体、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＹ６７６、ＤＹ６８０、ＤＹ６８２、ＤＹ７８０、及びそれらの混合物を含む他のフルオロフォアが挙げられるが、それらに限定されない。追加の適切なフルオロフォアには、酵素補因子；ランタニド、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、又はそれらの突然変異体及び誘導体が挙げられる。
【００７２】
[0091]典型的には、蛍光群は、ポリメチン、フタロシアニン、シアニン、キサンテン、フルオレン、ローダミン、クマリン、フルオレセイン、及びＢＯＤＩＰＹ（商標）を含む色素のカテゴリーから選択されるフルオロフォアである。
【００７３】
[0092]ある特定の実施形態において、蛍光群は、約６５０ｎｍ〜約９００ｎｍの間の範囲で放射する近赤外（ＮＩＲ）フルオロフォアである。近赤外蛍光テクノロジーを用いることは、それが、生体基質の自己蛍光からのバックグラウンドを実質的に排除又は低減するため、生物学的アッセイにおいて有利である。近ＩＲ蛍光テクノロジーの別の利点は、散乱光の強度が波長の４乗に逆比例するので、励起源からの散乱光が、大いに低下することである。低いバックグラウンド蛍光及び低い散乱は、結果として、高い信号雑音比を生じ、それは、高感度の検出に必須である。さらに、生物学的組織における近ＩＲ領域（６５０ｎｍ〜９００ｎｍ）の光学的に透明なウィンドウにより、ＮＩＲ蛍光は、生物学的成分への光の透過を必要とするインビボ画像化及び細胞内検出の適用にとって価値のあるテクノロジーとなっている。この実施形態の態様内において、蛍光群は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、アレクサフルオル（登録商標）６６０、アレクサフルオル（登録商標）６８０、アレクサフルオル（登録商標）７００、アレクサフルオル（登録商標）７５０、アレクサフルオル（登録商標）７９０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＹ６７６、ＤＹ６８０、ＤＹ６８２、及びＤＹ７８０からなる群から選択されることが好ましい。ある特定の実施形態において、近赤外群は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、又はダイノミック（Ｄｙｎｏｍｉｃ）ＤＹ６７６である。
【００７４】
[0093]蛍光標識は、フルオロフォアの化学反応性誘導体を用いて達成することができる。一般的な反応基には、ＦＩＴＣ及びＴＲＩＴＣ（フルオレセイン及びローダミンの誘導体）などのアミン反応性イソチオシアネート誘導体、ＮＨＳ−フルオレセインなどのアミン反応性スクシンイミジルエステル、並びにフルオレセイン−５−マレイミドなどのスルフィドリル反応性マレイミド活性化フルオルが挙げられ、それらの多くは市販されている。これらの反応性色素のいずれかの生物製剤との反応は、フルオロフォアと生物製剤の間で形成される安定な共有結合を生じる。
【００７５】
[0094]ある特定の場合において、蛍光標識反応後、標識標的分子から、反応していないフルオロフォアを除去することがしばしば必要である。これは、フルオロフォアと標識タンパク質のサイズ差を活用するサイズ排除クロマトグラフィによって達成されることが多い。
【００７６】
[0095]反応性蛍光色素は、多くの供給源から入手できる。それらは、標的分子内の様々な官能基への付加のための異なる反応基と共に、入手できる。それらはまた、標識反応を行うための全ての構成要素を含有する標識キットにおいて入手できる。ある特定の場合において、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号  Ａ−１０２３５）社製のアレクサフルオル（登録商標）４８８  ＮＨＳエステルが用いられる。
ＩＶ．間接的均一移動度シフトアッセイ
【００７７】
[0096]本発明は、サイズ排除クロマトグラフィを用いて、試料における生物製剤（「薬物」）の存在又はレベルを検出及び測定するための新規な間接的アッセイを提供する。本発明のアッセイは、細胞表面タンパク質、膜貫通タンパク質、高度にグリコシル化されたタンパク質、及び多量体タンパク質を含む複雑な、又は大きな抗原、加えて、精製することができない抗原、純粋でない抗原、及び部分的又は実質的に精製された抗原を標的とする薬物の存在又はレベルを検出するために特に有利である。抗原は標識されておらず、したがって、患者薬物／抗原複合体はクロマトグラムにおいて出現しない。その間接的アッセイの背後にある原理は、患者薬物の量が、どれくらいの非標識抗原がその薬物の標識バージョンと結合するのに遊離のままであるかを決定することである。遊離（結合していない）標識薬物の面積における変化を追跡することにより、どれくらいの患者薬物が存在するかを決定することができる。
【００７８】
[0097]ある特定の態様において、本明細書に記載された間接的アッセイの第１ステップは、治療薬（例えば、ベドリズマブ（ＶＤＺ））を含有する試料（例えば、血清）を、その薬物に対する一定量の抗原（例えば、可溶性α４β７）とインキュベートすることを含む。第２ステップにおいて、一定量の標識薬物（例えば、アレクサフルオル（登録商標）４８８と連結したＶＤＺ）を加える。試料中の治療薬の量は、どれくらいの抗原が遊離の状態で、標識薬物を結合することに利用可能のままであるかを決定する。これは、次には、どれくらいの標識薬物が遊離であるかを決定する。遊離標識薬物のピーク面積は、試料中の治療薬の量と比例するため、薬物の既知量を含有する標準曲線に対する内挿によって治療薬の量を定量化することができる。
【００７９】
[0098]本発明の間接的アッセイの原理の以下の説明は、例証のみを目的として、治療薬としてベドリズマブ（ＶＤＺ）を用い（図１参照）、患者試料における他の生物製剤の存在又はレベルを検出又は測定するためのアッセイ方法論の範囲を限定することを意図されない：
１．各患者試料（例えば、血清）に、一定量の抗原（例えば、可溶性α４β７）及び標識ＶＤＺを加える。抗原及び標識ＶＤＺの量は、管理された比で各試料に加えることができる。例えば、標識ＶＤＺの約７５〜８０％に結合するだろう抗原の量を加えることは、本アッセイのダイナミックレンジを制限することなく、最適な感度を与える。抗原が標識ＶＤＺに加えられた時、遊離標識ＶＤＺのピークが、約７５〜８０％、低下するように、抗原を一定量の標識ＶＤＺで滴定することにより、標識ＶＤＺに対する抗原の比を決定した（図２参照）。
２．定量化は、標識ＶＤＺピーク面積（Ｒｔ＝７．５〜８．５分）の増加を追跡することにより実施することができる。この面積は、存在する治療薬の量に比例する。トリスでブロッキングされたアレクサ４８８を、ローディング対照として標識ＶＤＺストック溶液に加えることができる。未加工のクロマトグラムは、アジレントケムステーション（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ）に収集し、その後、自動分析のためにプログラム「Ｒ」へエクスポートすることができる。標準曲線は、既知のＶＤＺ試料濃度の対数の関数として標識ＶＤＺピーク面積をプロットすることにより作成することができる。１０点の標準曲線を用いて、５パラメータロジスティック（５−ＰＬ）モデルとフィッティングして、非対称を説明することができる。未知量は、標準曲線から内挿により決定することができる。
【００８０】
[0099]ある特定の実施形態において、試料に加えられる、標識薬物に対する抗原の比は、必要とされる最低の感度と、患者試料における薬物の測定を、希釈を必要とすることなく可能にするダイナミックレンジとの間で最善の妥協をもたらす各試薬の量である。非限定的例として、試料に加えられる、標識薬物に対する抗原の比は、標識薬物の約７５％〜約８０％（例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％）に結合する抗原の量である。いくつかの場合において、試料に加えられる、標識薬物に対する抗原の比は、標識薬物の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％に結合する抗原の量である。他の場合において、試料に加えられる、標識薬物に対する抗原の比は、標識薬物の約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、約５０％〜約８０％、約６０％〜約８０％、約７０％〜約８０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約７０％、又は約５０％〜約６０％に結合する抗原の量である。抗原が標識薬物に加えられた時、遊離標識薬物のピークが、所望のパーセント（例えば、約７５〜８０％）、低下するように、抗原を一定量の標識薬物で滴定することにより、標識薬物に対する抗原の比を決定することができる。
【００８１】
[0100]ある特定の他の実施形態において、本明細書に記載された間接的アッセイのダイナミックレンジは、試料に加えられる、抗原及び標識薬物の両方の量を比例して増加させることにより向上させることができる。いくつかの場合において、抗原及び標識薬物の両方の量は、抗原及び標識薬物の参照量の約１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、又は１０倍であり得る。非限定的例として、標識ＶＤＺの参照量は、約７５ｎｇであり得、増加した量の標識ＶＤＺは、約１２０ｎｇ（すなわち、参照量の１．６倍）であり得る。
【００８２】
[0101]いくつかの実施形態において、本明細書に記載された間接的アッセイの定量の下限（ＬＬＯＱ）は、約０．１２５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．３７５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．６２５μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬ、０．８７５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、１．７５μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、又は５μｇ／ｍＬである。他の実施形態において、本明細書に記載された間接的アッセイの定量の上限（ＵＬＯＱ）は、約８μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１１μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ、１３μｇ／ｍＬ、１４μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、１７μｇ／ｍＬ、１８μｇ／ｍＬ、１９μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２１μｇ／ｍＬ、２２μｇ／ｍＬ、２３μｇ／ｍＬ、２４μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、２６μｇ／ｍＬ、２７μｇ／ｍＬ、２８μｇ／ｍＬ、２９μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬ、又は５０μｇ／ｍＬである。特定の実施形態において、ＬＬＯＱは約１μｇ／ｍＬであり、ＵＬＯＱは約２５μｇ／ｍＬである。
Ｖ．可溶性α４β７インテグリンポリペプチド抗原
【００８３】
[0102]一態様において、本発明は、配列番号１と少なくとも８０％配列同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性α４インテグリンポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、単離された可溶性α４インテグリンポリペプチドは、ヒトα４インテグリン細胞外ドメインのβ−プロペラリピート（すなわち、リピート１〜７）及びｔｈｉｇｈドメイン（図１３参照；「α４Δ６２０」）、又はその細胞外ドメインの断片を含む。他の実施形態において、単離された可溶性α４インテグリンポリペプチドは、ヒトα４インテグリン細胞外ドメインのβ−プロペラリピート、ｔｈｉｇｈドメイン、及び１つ若しくは両方のＣａｌｆドメイン（すなわち、Ｃａｌｆ−１及び／又はＣａｌｆ−２）、又はその断片を含む。さらに他の実施形態において、単離された可溶性α４インテグリンポリペプチドは、ヒトα４インテグリン細胞外ドメイン全体を含む切り詰められた受容体である。本明細書に記載された、単離された可溶性α４インテグリンポリペプチドは、リガンド結合ドメイン又はその一部を含む。
【００８４】
[0103]いくつかの実施形態において、単離された可溶性α４インテグリンポリペプチドはまた、ＡＣＩＤペプチドを含む。そのようなペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％配列同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＡＣＩＤペプチドは、ＢＡＳＥペプチドとαヘリックスのコイルドコイル立体構造を形成することができる。いくつかの実施形態において、ＡＣＩＤペプチドは、ＢＡＳＥペプチド上のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を含む。酸性コイルドコイル領域ペプチド（ＡＣＩＤペプチド）及び塩基性コイルドコイル領域ペプチド（ＢＡＳＥペプチド）は、例えば、Ｏ’Ｓｈｅａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、１９９３、３：６５８〜６６７、Ｊｕｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００１、９８（１２）：６８３０〜６８３５、Ｔａｋａｇｉら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２００１、８：４１２〜４１６、Ｎｉｓｈｉｄａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００６、２５：５８３〜５９４、及びＤｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２、５１（４４）：８８１４〜８８２８に記載されている。
【００８５】
[0104]いくつかの実施形態において、単離された可溶性α４インテグリンポリペプチドは、１個又は複数のアミノ酸残基、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上のアミノ酸残基などのリンカーを含む。リンカーは、細胞外ドメインの末端とＡＣＩＤペプチドの間に位置することができる。
【００８６】
[0105]いくつかの実施形態において、単離された可溶性α４インテグリンポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％配列同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８７】
[0106]可溶性α４インテグリンポリペプチドはまた、ヒスチジンタグ、アビジンタグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、切断可能なタグなどのアフィニティタグ又はエピトープタグを含むことができる。いくつかの場合において、可溶性α４インテグリンポリペプチドは、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰなどの蛍光タグ、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどの他の検出可能なタグを含むことができる。
【００８８】
[0107]別の態様において、本発明は、配列番号２と少なくとも８０％配列同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドは、ヒトβ７インテグリン細胞外ドメインのＰＳＩドメイン、Ｉ様ドメイン、ハイブリッドドメイン、及びＩ−ＥＧＦ  １ドメイン（図１３；「β７Δ５２７」参照）、又はその断片を含む。他の実施形態において、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドは、ヒトβ７インテグリン細胞外ドメインのＰＳＩドメイン、Ｉ様ドメイン、及び１つ若しくは両方のハイブリッドドメインのうちの１つ若しくは複数、又はその断片を含む。さらに他の実施形態において、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドは、ヒトβ７インテグリン細胞外ドメインのＰＳＩドメイン、Ｉ様ドメイン、ハイブリッドドメイン、Ｉ−ＥＧＦドメイン（すなわち、ドメイン１〜４）、及び任意選択で、βテール、又はその断片を含む。さらなる実施形態において、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドは、ヒトβ７インテグリン細胞外ドメイン全体を含む切り詰められた受容体である。本明細書に記載された可溶性β７インテグリンポリペプチドは、リガンド結合ドメイン又はその一部を含む。
【００８９】
[0108]いくつかの実施形態において、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドはまた、ＢＡＳＥペプチドを含む。そのようなペプチドは、配列番号９と少なくとも８０％配列同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＢＡＳＥペプチドは、ＡＣＩＤペプチドとαヘリックスのコイルドコイル立体構造を形成することができる。
【００９０】
[0109]いくつかの実施形態において、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドは、プロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの場合において、切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位である。ＴＥＶ部位は、アミノ酸配列ＥＸＸＹＸＱ／Ｓ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）（配列番号１０）を含み得る。ＴＥＶ部位はＢＡＳＥペプチドの上流に位置し得る。
【００９１】
[0110]いくつかの実施形態において、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドは、１個又は複数のアミノ酸残基、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上のアミノ酸残基などのリンカーを含む。リンカーは、β７インテグリン細胞外ドメインのＥＧＦ−Ｉドメインの末端と切断部位の間に位置することができる。
【００９２】
[0111]いくつかの実施形態において、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドは、アフィニティタグ又はエピトープタグをさらに含む。有用なアフィニティタグ又はエピトープタグには、ヒスチジンタグ、アビジンタグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、切断可能なタグなどが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの場合において、可溶性β７インテグリンポリペプチドには、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰなどの蛍光タグ、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどの他の検出可能なタグを挙げることができる。
【００９３】
[0112]いくつかの実施形態において、単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８０％配列同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９４】
[0113]単離された可溶性β７インテグリンポリペプチドは、本明細書に記載された可溶性α４インテグリンポリペプチドと会合して、共有結合性に連結したヘテロ二量体などの複合体を形成することができる。いくつかの場合において、α４β７インテグリン複合体は、非限定的にＶＣＡＭ−１及びＭＡｄＣＡＭ−１などのα４β７リガンド、並びに、非限定的にベドリズマブ、ナタリズマブ、及びエトロリズマブなどの、α４β７インテグリンに対して方向づけられた抗体と結合することができる。
【００９５】
[0114]いくつかの態様において、本発明は、配列番号１と少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する可溶性α４インテグリンポリペプチドであって、結合ペアの第１のメンバーと連結している可溶性α４インテグリンポリペプチド、及び配列番号２と少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する可溶性β７インテグリンポリペプチドであって、上記結合ペアの第２のメンバーと連結している可溶性β７インテグリンポリペプチドを含む、単離された可溶性α４β７インテグリンポリペプチドを提供する。
【００９６】
[0115]いくつかの実施形態において、結合ペアは、α４サブユニットとβ７サブユニットが、共有結合性に連結したヘテロ二量体などのヘテロ二量体を形成するのを可能にすることができる任意のペプチド、分子、モチーフ、及び化合物であり得る。α４β７ヘテロ二量体は、非限定的にＶＣＡＭ−１及びＭＡｄＣＡＭ−１などのα４β７リガンド、並びに、非限定的にベドリズマブ、ナタリズマブ、及びエトロリズマブなどの、α４β７インテグリンに対して方向づけられた抗体と結合することができる。可溶性α４インテグリンポリペプチド及び可溶性β７インテグリンポリペプチドは、システイン架橋又はその誘導体を介してヘテロ二量体化することができる（図１３参照）。いくつかの実施形態において、結合ペアは、コイルドコイルペプチド、ロイシンジッパーペプチド、ドックアンドロック（ｄｏｃｋ−ａｎｄ−ｌｏｃｋ）ペプチド、アビジン−ビオチン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの場合において、コイルドコイルペプチドはＡＣＩＤ−ＢＡＳＥペプチドである。
【００９７】
[0116]本明細書に記載されたポリペプチドは、非限定的に、固相及び液相合成などの合成方法、又は本明細書に記載されたものなどの組換え生物学方法などの、当業者に知られた任意の方法により作製することができる。
【００９８】
[0117]他の態様において、本発明は、配列番号１と少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する可溶性α４インテグリンポリペプチドをコードする核酸配列、及び結合ペアの第１のメンバーをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、並びに配列番号２と少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する可溶性β７インテグリンポリペプチドをコードする核酸配列、及び上記結合ペアの第２のメンバーをコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチド配列を含む可溶性α４β７インテグリンポリペプチドをコードする発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、結合ペアの第１のメンバーはＡＣＩＤペプチドである。いくつかの実施形態において、結合ペアの第１のメンバーはＢＡＳＥペプチドである。いくつかの場合において、第２のポリヌクレオチド配列は、ヒスチジンタグなどのアフィニティタグをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの場合において、第２のポリヌクレオチド配列は、ＴＥＶ部位などのプロテアーゼ切断部位をコードする核酸配列をさらに含む。
【００９９】
[0118]いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチド配列は、配列番号４と少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【０１００】
[0119]いくつかの実施形態において、発現ベクターは、優先的に特定の細胞型において、ポリヌクレオチド配列の発現を指揮する能力がある。発現ベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、酵母プラスミドなどであり得る。発現ベクターはまた、プロモーターを含み得る。有用なプロモーターには、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターが挙げられる。発現ベクターの第１のポリヌクレオチド配列及び／又は第２のポリヌクレオチド配列は、プロモーターへ作動可能に連結され得る。プロモーターは、発現ベクターを含有する宿主細胞、又は本明細書に記載された発現ベクターによりコードされる可溶性α４β７インテグリンポリペプチドを作製若しくは産生するために用いられる宿主細胞に依存して選択することができる。発現ベクターは、制御エレメント、選択マーカーカセット、抗生物質抵抗性カセット、又は宿主細胞によるポリペプチドの発現を促進する任意の他のコンポーネントを含み得る。
【０１０１】
[0120]いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリヌクレオチド配列は、単一の発現ベクターに見出される。そのようなポリヌクレオチド配列は、ベクターにおいて、ＩＲＥＳ配列が第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列の間に位置しているように、バイシストロニック性発現ベクターに位置することができる。単一のプロモーターが、両方のポリヌクレオチド配列の発現を駆動させることができる。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチド配列は、プロモーターへ作動可能に連結され、第２のポリヌクレオチド配列のすぐ上流にあるウイルス２Ａペプチドなどのリボソームスキップをコードする核酸配列からすぐ上流に位置する。他の実施形態において、第２のポリヌクレオチド配列は、プロモーターへ作動可能に連結され、第１のポリヌクレオチド配列のすぐ上流にあるリボソームスキップをコードする核酸配列からすぐ上流に位置する。可溶性α４インテグリンポリペプチド及び可溶性β７インテグリンポリペプチドは、１つの発現ベクターから生じることができる。
【０１０２】
[0121]発現ベクターを構築するための方法は、当業者に知られている。プロトコール及び方法の詳細な説明は、例えば、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０１２）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺９９）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１２）；Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９８７）；並びにＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、（１９９０）に記載されている。
【０１０３】
[0122]他の態様において、本発明は、本明細書に記載された可溶性α４β７インテグリンポリペプチドをコードする発現ベクターのいずれか１つを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、非限定的にＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ジャーカット細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及びそれらの誘導体などの安定細胞株であり得る。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳類細胞、非ヒト細胞、又はヒト細胞であり得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、（１９９０）に記載されている。
【０１０４】
[0123]発現ベクターは、非限定的に形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、又は脂質：ポリヌクレオチドコンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により増強されたＤＮＡの取り込みを含む方法によって宿主細胞へ導入することができる。
【０１０５】
[0124]さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載された発現ベクターのいずれか１つによりコードされる可溶性α４β７インテグリンポリペプチドを作製する方法を提供する。方法は、（ａ）可溶性α４β７インテグリンポリペプチドをコードする発現ベクターを宿主細胞へ導入するステップ、（ｂ）生じた宿主細胞を、可溶性α４β７インテグリンポリペプチドを産生する条件下で培養するステップ、及び（ｃ）可溶性α４β７インテグリンポリペプチドを単離するステップを含む。
【０１０６】
[0125]発現ベクターを含有する細胞は、可溶性α４β７インテグリンポリペプチドの産生を可能にし、促進し、又は誘導する条件下で培養することができる。
【０１０７】
[0126]可溶性α４インテグリンポリペプチド、可溶性β７インテグリンポリペプチド、及び可溶性α４β７インテグリンポリペプチドは、当技術分野において知られた標準方法に従って、例えば、細胞培養上清、又は細胞抽出物の可溶性画分から精製することができ、その標準方法には、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動的手順（例えば、調製用等電点電気泳動）、分別溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は実質的に純粋なポリペプチドを得る抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｊ．Ｃ．  Ｊａｎｓｏｎ及びＬａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ編、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８９）参照）が挙げられるが、それらに限定されない。タンパク質精製、クロマトグラフィ、電気泳動、遠心分離、及び結晶化のための方法は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（２０００）に記載されている。
【０１０８】
[0127]可溶性組換えα４β７インテグリンポリペプチドは、野生型の完全長α４β７インテグリンと特異的に結合するリガンドなどのそれの同族リガンドと複合体を形成することができる。可溶性組換えα４β７インテグリンポリペプチドは、抗α４β７インテグリン抗体に対する抗原であり得る。
ＶＩ．可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド抗原
【０１０９】
[0128]一態様において、本発明は、配列番号６、１１、１２、又は１３と少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドはアフィニティタグをさらに含む。他の実施形態において、単離された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、アフィニティタグをさらに含む。特定の実施形態において、可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドは、単量体であり、二量体化できず、又は多量体を形成することができない。
【０１１０】
[0129]別の態様において、本発明は、配列番号６、１１、１２、又は１３と少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド配列を含む可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドをコードする発現ベクターを提供する。上記ポリヌクレオチド配列は、アフィニティタグをコードする核酸配列をさらに含むことができる。そのようなアフィニティタグは、ヘキサヒスチジンなどのヒスチジンタグであり得る。アフィニティタグの他の非限定的例には、アビジンタグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、切断可能なタグなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号７と少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【０１１１】
[0130]いくつかの実施形態において、発現ベクターは、優先的に特定の細胞型において、ポリヌクレオチド配列の発現を指揮する能力がある。発現ベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、酵母プラスミドなどであり得る。発現ベクターはまた、プロモーターを含み得る。有用なプロモーターには、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターが挙げられる。発現ベクターのポリヌクレオチド配列は、プロモーターへ作動可能に連結され得る。プロモーターは、本明細書に記載された発現ベクターによりコードされる可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを作製又は産生するために選択された宿主細胞に依存して選択することができる。発現ベクターは、制御エレメント、選択マーカーカセット、抗生物質抵抗性カセット、又はポリペプチドの発現を促進する任意の他のコンポーネントを含み得る。
【０１１２】
[0131]発現ベクターを構築するための方法は当業者に知られている。プロトコール及び方法の詳細な説明は、例えば、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０１２）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺９９）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１２）；Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９８７）；並びにＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、（１９９０）に記載されている。
【０１１３】
[0132]他の態様において、本発明は、本明細書に記載された可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドをコードする発現ベクターのいずれか１つを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、非限定的にＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ジャーカット細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及びそれらの誘導体などの安定細胞株であり得る。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳類細胞、非ヒト細胞、又はヒト細胞であり得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、（１９９０）に記載されている。
【０１１４】
[0133]発現ベクターは、非限定的に形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、又は脂質：ポリヌクレオチドコンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により増強されたＤＮＡの取り込みを含む方法によって宿主細胞へ導入することができる。
【０１１５】
[0134]さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載された発現ベクターのいずれか１つによりコードされる可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを作製する方法を提供する。方法は、（ａ）可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドをコードする発現ベクターを宿主細胞へ導入するステップ、（ｂ）生じた宿主細胞を、可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを産生する条件下で培養するステップ、及び（ｃ）可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを単離するステップを含む。
【０１１６】
[0135]発現ベクターを含有する細胞は、可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドの産生を可能にし、促進し、又は誘導する条件下で培養することができる。
【０１１７】
[0136]可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドは、当技術分野において知られた標準方法に従って、例えば、細胞培養上清、又は細胞抽出物の可溶性画分から精製することができ、その標準方法には、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動的手順（例えば、調製用等電点電気泳動）、分別溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は実質的に純粋なポリペプチドを得る抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｊ．Ｃ．  Ｊａｎｓｏｎ及びＬａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ編、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８９）参照）が挙げられるが、それらに限定されない。タンパク質精製、クロマトグラフィ、電気泳動、遠心分離、及び結晶化のための方法は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（２０００）に記載されている。
【０１１８】
[0137]野生型ＩＬ−１２ｐ４０とは違って、本明細書に記載された可溶性組換えＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドは、二量体も三量体もオリゴマーも形成することができない。特定の実施形態において、野生型ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド配列におけるシステインのアラチンへの２つの置換（配列番号６）か又はシステインのセリンへの２つの置換（配列番号１１）のいずれかの存在は、ＩＬ−１２ｐ４０抗原がオリゴマー化するのを防ぐ。他の実施形態において、可溶性ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド単量体は、システインからアラニンへの１つの置換、及びシステインのアラニンへの１つの置換を有する、野生型ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド配列（配列番号１２又は１３）を有する。ウステキヌマブなどの抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体は、可溶性組換えＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドと特異的に結合することができる。
ＶＩＩ．生物療法
【０１１９】
[0138]本発明の間接的均一移動度シフトアッセイは、対象（例えば、生物療法を受けている対象）由来の試料における生物製剤の存在又はレベルを検出及び／又は測定するのに適している。生物製剤の非限定的例には、抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質（例えば、Ｉｇ融合タンパク質又はＦｃ融合タンパク質）、多価結合タンパク質（例えば、ＤＶＤ  Ｉｇ）、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、核酸、糖、それらの組換え型、それらの改変型、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２０】
[0139]抗体に基づいた生物製剤の例には、診断用又は治療用モノクローナル抗体、及びそれらの抗原結合断片又はコンジュゲートが挙げられるが、それらに限定されない。ある特定の実施形態において、抗体は、抗α４β７インテグリン薬（例えば、ベドリズマブ（エンティビオ（ＥＮＴＹＶＩＯ）（商標））、エトロリズマブ）及び／又は抗α４β１インテグリン薬（例えば、ナタリズマブ（タイサブリ（ＴＹＳＡＢＲＩ）（登録商標）））などの抗インテグリン薬を含む。他の実施形態において、抗体は、抗ＩＬ１２ｐ４０薬（例えば、ウステキヌマブ（ステラーラ（ＳＴＥＬＡＲＡ）（登録商標）））などの抗サイトカイン薬を含む。さらに他の実施形態において、抗体は、抗ＩＬ−６受容体薬（例えば、トシリズマブ（アクテムラ（ＡＣＴＥＭＲＡ）（登録商標）））などの抗サイトカイン受容体薬を含む。さらなる実施形態において、抗体は、抗ＣＤ３受容体薬（例えば、ビシリズマブ）、抗ＣＤ４受容体薬（例えば、プリリキシマブ）、抗ＣＤ２０受容体薬（例えば、リツキシマブ（リツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ）（登録商標））、オファツムマブ（アーゼラ（ＡＲＺＥＲＲＡ）（登録商標））、オビヌツズマブ（ガジーバ（ＧＡＺＹＶＡ）（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ゼバリン（ＺＥＶＡＬＩＮ）（登録商標））、トシツモマブ（ベキサール（ＢＥＸＸＡＲ）（登録商標））、オクレリズマブ、ベルツズマブ、抗ＣＤ２５受容体薬（例えば、ダクリズマブ（ゼナパックス（ＺＥＮＡＰＡＸ）（登録商標）））、又はそれらの組み合わせなどの抗ＣＤ受容体薬を含む。他の実施形態において、抗体は、インフリキシマブ（レミケード（登録商標））、アダリムマブ（ヒュミラ（登録商標））、エタネルセプト（エンブレル（登録商標））、ゴリムマブ（シンポニー（登録商標））、セルトリズマブペゴール（シムジア（登録商標））、又はそれらの組み合わせなどの抗ＴＮＦα薬を含む。抗体に基づいた生物製剤の追加の例には、ブレンツキシマブベドチン（アドセトリス（ＡＤＣＥＴＲＩＳ）（登録商標））などの抗体−薬物コンジュゲートが挙げられる。
【０１２１】
[0140]表１は、認可されているか、又は現在、開発中であるかのいずれかである診断用及び治療用モノクローナル抗体の例示的かつ非包括的リストを提供する。臨床開発中及び認可された製造物における、モノクローナル抗体に基づいた治療用物質及び診断用物質を含む生物学的医薬の広範なリストは、「４１８  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｐｒｏｍｉｓｅ  ｔｏ  Ｂｏｌｓｔｅｒ  ｔｈｅ  Ａｒｓｅｎａｌ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題した２００６  ＰｈＲＭＡ報告書、及び「Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  −  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」と題した２０１３  ＰｈＲＭＡ報告書に提供されており、それらの開示は、全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【表１】
2018500553.tif 000003
2018500553.tif 000004
2018500553.tif 000005
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【０１２２】
[0141]タンパク質に基づいた、又はポリペプチドに基づいた生物製剤の非限定的例には、サイトカイン（例えば、インターロイキン）、ケモカイン、増殖因子、血液産生刺激タンパク質（例えば、エリスロポエチン）、ホルモン（例えば、エロンバ（Ｅｌｏｎｖａ）（登録商標）（卵胞刺激ホルモン）、成長ホルモン）、酵素（例えば、プルモザイム（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）（登録商標）（ドルナーゼアルファ））、凝固因子、インスリン、アルブミン、それらの断片、それらの保存的に改変されたバリアント、それらの類似体、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２３】
[0142]サイトカインの例には、ＴＮＦα、ＴＮＦ関連アポトーシス弱誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、及びＩＬ−２７）、アディポサイトカイン（例えば、レプチン、アディポネクチン、レシスチン、活性型又はトータルプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）、ビスファチン、及びレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４））、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、インターロイキンは、プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標）（アルデスロイキン；組換えＩＬ−２）などのＩＬ−２を含む。
【０１２４】
[0143]ケモカインの例には、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯ２、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯ３、ＣＸＣＬ４／ＰＦ−４、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１３／ＢＣＡ−１、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７／ＤＭＣ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−５、ＣＣＬ１６／ＬＥＣ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＭＩＰ−４、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＣＣＬ２１／ＳＬＣ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ１、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ２８／ＭＥＣ、ＣＬ１、ＣＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２５】
[0144]増殖因子の非限定的例には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ；ＳＥＲＰＩＮＦ１としても知られている）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ；シュワン細胞腫由来増殖因子としても知られている（ＳＤＧＦ））、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３など）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ；ＦＧＦ７としても知られている）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ１−ＢＭＰ１５）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、β−神経成長因子（β−ＮＧＦ）、神経栄養因子（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）など）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２６】
[0145]受容体構築物に基づいた、又は融合タンパク質に基づいた生物製剤の例には、免疫グロブリンフレームに連結した天然に存在する受容体（例えば、オレンシア（Ｏｒｅｎｃｉａ）（登録商標）（アバタセプト；免疫グロブリンＣＴＬＡ−４融合タンパク質）、アメビブ（Ａｍｅｖｉｖｅ）（登録商標）（アレファセプト；ＩｇＧ１融合タンパク質）、エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（登録商標）（エタネルセプト；組換えヒトＴＮＦ−受容体融合タンパク質）、２つの異なるポリペプチド種を組み合わせる改変タンパク質（例えば、オンタック（Ｏｎｔａｋ）（登録商標）（デニロイキンジフチトクス；インターロイキン−２とジフテリア毒素を含む改変タンパク質）、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２７】
[0146]したがって、本発明は、以下のうちの１つ又は複数を含む、本明細書及び表１に言及された疾患又は障害のうちの１つ又は複数について生物療法を受けている対象由来の試料における生物製剤の存在又はレベルを検出及び測定するための方法に用いることができる：
【０１２８】
[0147]炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ））、ぶどう膜炎、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫症、及び中心的特徴として炎症を有する他の疾患などの炎症性疾患；
【０１２９】
[0148]関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強直性脊椎炎（ベヒテレフ病）、ループス、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、乾癬、エリテマトーデス、及びセリアック病などの自己免疫疾患；
【０１３０】
[0149]消化器系及び胃腸癌（例えば、結腸直腸癌、小腸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（小腸（ｓｍａｌｌ  ｂｏｗｅｌ））癌；胃腸間質性腫瘍、胃腸カロチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、胃の（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌；食道癌；虫垂癌など）；胆嚢癌；肝臓癌；膵臓癌；乳癌；肺癌（例えば、非小細胞肺癌）；前立腺癌；卵巣癌；腎臓癌（例えば、腎細胞癌）；中枢神経系の癌；皮膚癌；絨毛癌；頭頚部癌；血液悪性腫瘍（例えば、白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫）；骨肉腫（例えば、ユーイング肉腫）；軟組織肉腫（例えば、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、横紋筋肉腫）；他の軟組織悪性腫瘍、及び甲状腺乳頭癌などの癌；
【０１３１】
[0150]クロストリジウム・ディフィシル疾患、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、ＨＩＶ感染症、炭疽菌感染症、カンジダ症、ブドウ球菌感染症、及びＣ型肝炎などの感染性疾患；
【０１３２】
[0151]敗血症、敗血症性ショック、発作性夜間血色素尿症、及び溶血性尿毒症症候群などの血液障害；
【０１３３】
[0152]アテローム性動脈硬化症、急性心筋梗塞、心肺バイパス、及び狭心症などの循環器疾患；
【０１３４】
[0153]糖尿病、例えば、１型真性糖尿病及び２型糖尿病などの代謝障害
【０１３５】
[0154]発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）などの遺伝的障害；
【０１３６】
[0155]変形性関節症の痛み及びアルツハイマー病などの神経学的障害
【０１３７】
[0156]喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鼻ポリープ、及び小児喘息などの呼吸器障害；
【０１３８】
[0157]慢性の中等症から重症の尋常性乾癬を含む乾癬などの皮膚疾患；
【０１３９】
[0158]急性腎臓移植拒絶反応、心臓及び肝臓の移植拒絶反応の回復、腎臓移植拒絶反応の防止、急性腎臓移植拒絶反応の予防、及び腎臓移植拒絶反応などの移植拒絶反応；並びに／又は
【０１４０】
[0159]腎炎、閉経後骨粗鬆症（骨障害）、好酸球増加症候群、好酸球性食道炎、及びピーナッツアレルギーなどの他の障害。
【０１４１】
[0160]特定の実施形態において、対象は、炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ））又は自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）を有する。
【実施例】
【０１４２】
[0161]以下の実施例は、例証を目的として提供され、いかなる形においても、本発明を限定することは意図されない。当業者は、本質的に同じ結果を生じるように変化又は改変することができる様々な重要ではないパラメータを容易に認識しているだろう。
【０１４３】
実施例１
[0162]この実施例は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者血清におけるベドリズマブ（ＶＬＭ）及び抗ＶＬＭ抗体（ＡＴＶ）の測定のための均一移動度シフトアッセイ（ＨＭＳＡ）の検証を例示する。
【０１４４】
[0163]α４β７インテグリンアンタゴニストであるベドリズマブ（ＶＬＭ）は、通常の治療又はＴＮＦαアンタゴニストに対して十分な応答を示すことができなかった中等症から重症の潰瘍性大腸炎又はクローン病患者における使用が最近、認可された治療用モノクローナル抗体である。α４β７インテグリンは、腸管の血管内皮に発現した粘膜アドレシン細胞接着分子−１（ＭａｄＣａｍ−１）とのその相互作用を介して、腸内の炎症部位へ白血球がホーミングするのに重要である腸特異的ヘテロ二量体糖タンパク質である。ＶＬＭ薬レベル及び抗ＶＬＭ抗体を正確に測定する診断検査が利用できることは、ＩＢＤ患者におけるこの新規な治療用物質の効果的な使用に必要である。本発明者らの抗ＴＮＦα治療薬モニタリングアッセイに続いて、本発明者らは今や、患者血清におけるＶＬＭ及び抗ＶＬＭレベルを測定するためのアッセイを開発し、検証した。
【０１４５】
方法
[0164]可溶性α４β７タンパク質ヘテロ二量体を発現させ、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）から精製した。特に、インテグリンα４サブユニットを、ｔｈｉｇｈドメインの後を切り詰め（α４Δ６２０）、インテグリンβ７を、Ｉ−ＥＧＦ  １ドメインの後を切り詰めた（β７Δ５２７）（図１３参照）。そのヘテロ二量体を安定化させるために、１個のジスルフィド架橋形成Ｃｙｓ残基を含有する酸性／塩基性αヘリックス状のコイルドコイルペプチドを、そのサブユニットのＣ末端に付加させた（Ｔａｋａｇｉら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．、１８：４６０７〜４６１５（２００３）；Ｏ’Ｓｈｅａら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、３：６５８〜６６７（１９９３））。精製を容易にするために、ヘキサヒスチジンタグをその塩基性ペプチドのＣ末端に融合させた。「競合」に基づいた均一移動度シフトアッセイ（ＨＭＳＡ）型式にこの組換えヘテロ二量体を用いて、ＶＬＭ治療中の患者の血清におけるＶＬＭレベルを測定した。患者血清をα４β７と混合し、治療用ＶＬＭをα４β７と結合させた。その後、蛍光標識ＶＬＭを、それの標的α４β７との結合において患者血清中の非標識ＶＬＭと競合させ、続いて、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィにおいて分離した。「遊離」ＶＬＭ−アレクサフルオルの量は、患者血清中のＶＬＭレベルを決定した。抗ＶＬＭアッセイについて、ウサギ抗ＶＬＭ抗体の既知量を含有する正常ヒト血清を蛍光標識ＶＬＭとインキュベートすることにより標準曲線を作成し、その後、結合したＶＬＭ及び遊離ＶＬＭを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分離した。方法の検証を、業界推奨に従って決定した。
【０１４６】
結果
[0165]ＶＬＭについての感度は０．３５μｇ／ｍＬであった。定量の下限及び上限（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱ）は、それぞれ、０．６２５μｇ／ｍｌ及び１４μｇ／ｍＬであると決定された。抗ＶＬＭについて、ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱは、それぞれ、３．１３Ｕ／ｍｌ及び１５０Ｕ／ｍｌであった。各アッセイについて作成された標準曲線は、高い再現性及び感度を示した。アッセイ間及びアッセイ内の精密度は、１０％未満ＣＶを示し、正確度は２０％以内であった。脂肪血症、溶血化、又はリウマトイド因子（Ｒｆ）の血清からの有意な干渉はなかった。図４〜１０参照。
【０１４７】
結論
[0166]ＩＢＤについて処置を受けている患者におけるＶＬＭ及び抗ＶＬＭレベルを測定するための高感度かつ特異的なアッセイを開発し、検証した。そのアッセイ型式は、薬物標的としての大きなヘテロ二量体の、高度にグリコシル化された膜結合型抗原の複雑さのせいで独特なアプローチを必要とした。薬物アッセイと抗薬物アッセイのどちらも、既知の干渉物質に対する高い許容度と共に、高感度で、高い正確度及び精密度を示している。そのアッセイは、個々の患者における臨床的モニタリング及び薬物最適化に有用である。
【０１４８】
実施例２
[0167]この実施例は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者血清におけるウステキヌマブ（ＵＴＫ）及びウステキヌマブに対する抗体（ＡＴＵ）の測定のための均一移動度シフトアッセイ（ＨＭＳＡ）の検証を例示する。
【０１４９】
[0168]ウステキヌマブは、通常の治療又はＴＮＦαアンタゴニストに対して応答することができなかった患者におけるＩＢＤの処置において潜在的有用性を有する治療用モノクローナル抗体である。ウステキヌマブは、インターロイキン１２及びインターロイキン２３に対して、それらの共通のｐ４０サブユニットを介しての特異性を有するモノクローナル抗体であり、これらの経路を通して炎症をブロックする。ここで、本発明者らは、ＵＴＫ、及びウステキヌマブに対する抗体を測定するためのＨＰＬＣに基づいた高移動度シフトアッセイの分析的検証を記載する。
【０１５０】
方法
[0169]組換えの可溶性ＩＬ１２ｐ４０サブユニット（例えば、配列番号７）を発現させ、哺乳類細胞から精製した。そのアッセイは、蛍光標識ＵＴＫが、ＩＬ１２ｐ４０との結合において患者血清中の非標識ＵＴＫと競合することを利用する。患者血清の組換えＩＬ１２ｐ４０とのインキュベーション後、ＵＴＫ−アレクサフルオル４８８を加え、その後、ＩＬ１２ｐ４０と結合しているＵＴＫ−アレクサフルオル４８８から「遊離」ＵＴＫ−アレクサフルオル４８８を分離するＨＰＬＣサイズ排除カラムに試料を流した。「遊離」ＵＴＫ−アレクサフルオル４８８の量は、患者血清中の治療用ＵＴＫの量の尺度である。「遊離」ＵＴＫ−アレクサフルオル４８８の曲線下面積（ＡＵＣ）を、既知の標準試料におけるＵＴＫ濃度の対数に対してプロットし、患者血清中のＵＴＫ濃度を内挿により計算する。ＡＴＵアッセイについて、標準曲線を、ウサギＡＴＵの既知量を含有する正常ヒト血清を蛍光標識ＵＴＫとインキュベートすることにより作成し、その後、結合したＧＬＭ及び遊離ＧＬＭをＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分離した。方法の検証を、業界推奨に従って決定した。
【０１５１】
結果
[0170]ＵＴＫについての感度は０．１５μｇ／ｍＬであった。定量の上限（ＵＬＯＱ）は、８μｇ／ｍＬであると決定され、定量の下限（ＬＬＯＱ）は、０．６２５μｇ／ｍｌであると決定された。ＡＴＵについて、ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱは、それぞれ、３．１３Ｕ／ｍｌ及び１５０Ｕ／ｍｌであった。各アッセイについて作成された標準曲線は、高い再現性及び感度を示した。アッセイ間及びアッセイ内の精密度は、１０％未満ＣＶを示し、正確度は２０％以内であった。脂肪血症、溶血化、又はリウマトイド因子（Ｒｆ）の血清からの有意な干渉はなかった。図１１〜１２参照。
【０１５２】
結論
[0171]この研究は、ＩＢＤについて処置を受けている患者におけるウステキヌマブレベルを測定するための新規な「競合」に基づいたアッセイの検証を記載する。そのアッセイ型式は、血清においてホモ二量体及びヘテロ二量体を形成するこの抗原の傾向による、この抗原を扱う上での複雑さ（それが通常のＨＭＳＡアッセイの使用を困難にさせている）のせいで、独特なアプローチを必要とした。
【０１５３】
[0172]競合に基づいたＨＭＳＡアッセイは、高感度で、高い正確度及び精密度を示した。加えて、そのアッセイは、既知の干渉物質に対する高い許容度を有する。これらのアッセイは、個々の患者における臨床的モニタリング及び薬物最適化に有用である。
【０１５４】
実施例３
[0173]この実施例は、本発明の例示的なベドリズマブ（ＶＬＭ）競合に基づいたアッセイ方法論を例示する。この実施例に記載されたアッセイ方法論が、ウステキヌマブ（ＵＴＫ）、及び生物製剤と結合する抗原を扱う上での複雑さ（例えば、抗原が膜結合型タンパク質、グリコシル化タンパク質、多量体タンパク質、不溶性タンパク質、発現させ、若しくは精製することが困難であるタンパク質、及び／又は巨大タンパク質である）によりその抗原の可溶型（例えば、可溶性の断片、バリアント、又は単量体）の使用を必要とする状況での試料中の他の生物製剤の存在又はレベルを決定することに適用できることを当業者は認識しているだろう。
【０１５５】
[0174]ベドリズマブ（ＶＬＭ）の既知量でスパイクされた正常ヒト血清（ＮＨＳ）試料を段階希釈する。８０μｇ／ｍｌ  ＶＬＭから開始する２倍段階希釈を、ＮＨＳ中に希釈して、１０点曲線を作成する（すなわち、８０μｇ／ｍｌ〜０．１５６２５μｇ／ｍｌ）。１２、４、及び１μｇ／ｍｌ  ＶＬＭでスパイクされたＮＨＳを陽性対照として用いる。標準血清試料、陽性対照、及び患者試料を９６ウェルプレートに加える。患者試料を、ＮＨＳ中に、希釈せずに、又はアッセイダイナミックレンジを増加させるために４×若しくは８×希釈して、加える。可溶性α４β７抗原及びアッセイ希釈剤を加える。プレートを振盪機に置き、室温で１時間、インキュベートする。１時間後、標識ＶＬＭ（例えば、ＶＬＭ−アレクサフルオル（登録商標）４８８）を加える。プレートを再び、１時間のインキュベーションのために、振盪機に置く。試料を、０．２μｍフィルタープレートを用いて濾過する。試料を、ＨＰＬＣオートサンプラー上へロードし、可溶性α４β７抗原と結合した標識ＶＬＭから遊離標識ＶＬＭ（例えば、ＶＬＭ−アレクサフルオル（登録商標）４８８）を分離するサイズ排除クロマトグラフィカラム（例えば、フェノメネックス  バイオセップ−ＳＥＣ−ｓ３０００（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−ｓ３０００）カラム）に順次かける。
【０１５６】
[0175]Ｒプログラミング言語で書かれたソフトウェアを用いて、遊離標識ＶＬＭ（例えば、ＶＬＭ−アレクサフルオル（登録商標）４８８）を表すピークを同定し、かつピークの面積を決定する。このピークの面積は、患者血清中にＶＬＭがある場合、より大きくなる。このピークのサイズを標準曲線と比較することにより、患者のＶＬＭレベルを内挿することができる。
【０１５７】
[0176]プリズム（Ｐｒｉｓｍ）（例えば、グラフパッドプリズム６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６））は、血清中ＶＬＭレベルの関数として遊離標識ＶＬＭ（例えば、ＶＬＭ−アレクサフルオル（登録商標）４８８）の面積をプロットすることにより標準曲線を作成するために用いられる。このピークのサイズを標準曲線と比較することにより、患者のＶＬＭ薬濃度を内挿することができる。
【０１５８】
[0177]この実施例に記載されたアッセイは、ＶＬＭ治療を受けた患者由来の試料におけるＶＬＭと、試料反応物に加えられた標識ＶＬＭとの間の、可溶性α４β７抗原との結合における競合を前提としている。標識ＶＬＭと非標識ＶＬＭの相対的比は、どれくらいのα４β７抗原がそれぞれに結合しているかを決定し、遊離標識ＶＬＭ（例えば、ＶＬＭ−アレクサフルオル（登録商標）４８８）ピーク面積を決定する。患者試料に存在する薬物が多ければ多いほど、α４β７抗原と結合したものに対立するものとして、より多くの標識ＶＬＭが遊離のままである。
【０１５９】
実施例４
[0178]この実施例は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者血清におけるベドリズマブ（ＶＬＭ）及び抗ＶＬＭ抗体（ＡＴＶ）の測定のための均一移動度シフトアッセイ（ＨＭＳＡ）の検証を例示する。
【０１６０】
背景及び目的
[0179]α４β７インテグリンアンタゴニストであるベドリズマブは、通常の治療又はＴＮＦαアンタゴニストに対して十分な応答を示すことができなかった中等症から重症の潰瘍性大腸炎及びクローン病患者における使用を最近、認可された治療用モノクローナル抗体である。血清中ＶＬＭ及び抗ＶＬＭ（ＡＴＶ）レベルを正確に測定する診断検査が利用できることは、ＩＢＤ患者におけるこの新規な治療用物質の効果的な使用に必要である。ここで、本発明者らは、患者血清におけるＶＤＭ及びＡＴＶレベルを測定するために開発されたＨＭＳＡの分析的検証、並びにそれの臨床的有用性を記載する。
方法
【０１６１】
[0180]可溶性α４β７ヘテロ二量体（例えば、α４Δ６２０／β７Δ５２７ヘテロ二量体；図１３参照）を発現させ、哺乳類細胞から精製した。「競合」に基づいたＨＭＳＡ型式にこの組換えヘテロ二量体を用いて、ＶＬＭ治療中の患者における血清中ＶＬＭレベルを測定した。患者血清をα４β７と混合し、治療用ＶＬＭをα４β７と結合させた。その後、蛍光標識ＶＬＭを、それの標的α４β７との結合において患者血清中の非標識ＶＬＭと競合させ、続いて、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィにおいて分離した（図１参照）。抗ＶＬＭアッセイについて、ウサギ抗ＶＬＭ抗体の既知量を含有する正常ヒト血清を蛍光標識ＶＬＭとインキュベートすることにより標準曲線を作成し、その後、結合したＶＬＭ及び遊離ＶＬＭを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分離した。検証を、業界推奨に従って実施した（Ｓｈａｎｋａｒ，Ｇ．ら、２００８）。
【０１６２】
結果
[0181]ＶＬＭ及びＡＴＶアッセイは、高いアッセイ内精密度及び正確度を示している。アッセイ内精密度は１０％未満であり、アッセイ内正確度は１５％未満の誤差である。実行間、装置間、及び分析者間の変動は、１５％未満ＣＶであり、ほとんど全ての場合において２０％未満の誤差である（表２）。ＶＬＭについての感度は０．３４８μｇ／ｍＬで、０．６２５〜１４μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有した（表３）。ＡＴＶアッセイについての検出の限界は＜１．５６Ｕ／ｍＬである。精密な値は、本発明者らの曲線に内挿するには低すぎるため、決定することができなかった。ＡＴＶについてのダイナミックレンジは、非希釈血清において３．１３〜１５０Ｕ／ｍＬであった（表３）。ＶＬＭ又はＡＴＶでスパイクされた正常ヒト血清は、段階希釈溶液にわたって、良い直線性及び回収率を示した（図１４）。ＡＴＶは、ＶＬＭの２０μｇ／ｍＬのレベルにおいて高い薬物耐性を示している（表４）。患者血清における一般的な干渉物質が試験され、ＩＢＤ患者で見られたレベルにおいて、干渉しなかった（図１５）。
【表２】
2018500553.tif 000025
【表３】
2018500553.tif 000026
【表４】
2018500553.tif 000027
【０１６３】
結論
[0182]ＩＢＤについて処置を受けている患者におけるＶＬＭ及び抗ＶＬＭレベルを測定するための高感度かつ特異的なアッセイを開発し、検証した。そのアッセイ型式は、薬物標的として大きなヘテロ二量体の、高度にグリコシル化された膜タンパク質の複雑さのせいで独特なアプローチを必要とした。薬物アッセイと抗薬物アッセイのどちらも、既知の干渉物質に対する許容度と共に、高い正確度及び精密度を示している。ＶＬＭアッセイ及び抗ＶＬＭアッセイの開発は、個々の患者における臨床的モニタリング及び薬物最適化に有用である。
【０１６４】
実施例５
[0183]この実施例は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者血清におけるウステキヌマブ（ＵＴＫ）及びウステキヌマブに対する抗体（ＡＴＵ）の測定のための均一移動度シフトアッセイ（ＨＭＳＡ）の検証を例示する。
【０１６５】
背景及び目的
[0184]ウステキヌマブは、通常の治療又はＴＮＦαアンタゴニストに対して応答することができなかったＩＢＤ患者の処置において潜在的有用性を有する治療用モノクローナル抗体である。ウステキヌマブは、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３に対して、それらの共通のｐ４０サブユニットを介して特異的であり、これらの経路を通して炎症をブロックする。血清中ＵＳＴ及び抗ＵＳＴ（ＡＴＵ）レベルを正確に測定する診断検査が利用できることは、ＩＢＤ患者におけるこの新規な治療用物質の効果的な使用に必要である。ここで、本発明者らは、ＵＴＫレベルを測定するために開発された「競合」に基づいたＨＭＳＡ、及び患者血清におけるＡＴＵレベルを測定するための通常のＨＭＳＡの分析的検証を記載する。
【０１６６】
方法
[0185]組換えの可溶性ＩＬ１２ｐ４０（例えば、配列番号７）を発現させ、哺乳類細胞から精製した。「競合」に基づいたＨＭＳＡ型式に組換えＩＬ１２ｐ４０を用いて、ＵＴＫ治療中の患者における血清中ＵＴＫレベルを測定した。患者血清をｒＩＬ１２ｐ４０と混合し、治療用ＵＴＫをｒＩＬ１２ｐ４０と結合させた。その後、蛍光標識ＵＴＫを、それの標的ｒＩＬ１２ｐ４０との結合において患者血清中の非標識ＵＴＫと競合させ、続いて、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィにおいて分離した（図１６参照）。抗ＵＴＫアッセイについて、ウサギ抗ＵＴＫ抗体の既知量を含有する正常ヒト血清を蛍光標識ＵＴＫとインキュベートすることにより標準曲線を作成し、その後、結合したＵＴＫ及び遊離ＵＴＫを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分離した。
【０１６７】
結果
[0186]ＵＴＫ及びＡＴＵアッセイは、高いアッセイ内精密度及び正確度を示している。アッセイ内精密度は１０％未満であり、アッセイ内正確度は１５％未満の誤差である。実行間、装置間、及び分析者間の変動は、１５％未満ＣＶであり、２０％未満の誤差である（表５）。ＵＴＫについての感度は０．２２４μｇ／ｍＬで、０．６２５〜１０μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有する（表６）。ＡＴＵアッセイについての検出の限界は＜１．５６Ｕ／ｍＬである。精密な値は、標準曲線から内挿するには低すぎるため、決定することができなかった。ＡＴＵについてのダイナミックレンジは、非希釈血清において３．１３〜１５０Ｕ／ｍＬである（表６）。ＵＴＫ又はＡＴＵでスパイクされた正常ヒト血清は、アッセイのダイナミックレンジ内で、段階希釈溶液にわたって、良い直線性及び回収率を示した（図１７）。ＡＴＵは、高い薬物耐性を示している。ＵＴＫの２０μｇ／ｍＬのレベルは、ＡＴＵ検出に有意には干渉しない（表７）。患者血清における一般的な干渉物質が試験され、ＩＢＤ患者で見られたレベルにおいて、干渉しなかった。非常に溶血した血清だけは、干渉する可能性があり得るが、患者血清において通常見られるレベルにおいては干渉しない（図１８）。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【０１６８】
結論
[0187]ＵＴＫ及びＡＴＵについてのＨＭＳＡは、広いダイナミックレンジにわたって高い正確度及び精密度を示した。ＨＭＳＡプラットフォームは、ＥＬＩＳＡ／ＥＣＬＩＡ方法の有用性を制限することが知られている干渉物質の存在下でさえもＵＴＫ及びＡＴＵの検出を可能にした。新しい「競合」に基づいたＨＭＳＡプラットフォームの開発は、通常のＨＭＳＡが実現できない場合の治療的薬物レベルの測定を可能にする。
【０１６９】
実施例６
[0188]この実施例は、ベドリズマブ（ＶＤＺ）の測定のための均一移動度シフトアッセイ（ＨＭＳＡ）のダイナミックレンジを向上させるために実施された実験を例示する。
【０１７０】
[0189]アッセイのダイナミックレンジを向上させるための努力において、アッセイに用いられるＶＤＺ−アレクサ４８８の量を１．６倍、増加させることにより、アッセイを改変した。標識ＶＤＺの量を増加させること、及びα４β７抗原（例えば、α４Δ６２０／β７Δ５２７ヘテロ二量体、図１３参照）の量を比例して増加させることは、アッセイのダイナミックレンジを増加させた。加えて、標識ＶＤＺに対するα４β７の量を変化させることは、定量の下限に影響した。標識ＶＤＺに対して過剰な抗原は、アッセイの、患者血清中の薬物に対する感度を相対的に低くさせ、定量の下限を上昇させた。逆に、標識ＶＤＺに対して少なすぎる抗原は、定量の上限を低下させるという影響を生じた。標識ＶＤＺの量を７５ｎｇ／ウェルから１２０ｎｇ／ウェルへ（１．６倍）増加させ、抗原の存在が標識ＶＤＺの７５〜８０％に結合するように抗原を滴定することにより、必要とされる最低限の感度と、たいていの場合希釈を必要とすることなく患者血清中の薬物の測定を可能にするだろうダイナミックレンジの向上との間での最善の妥協をもたらした。
【０１７１】
[0190]加えて、（ブロックされたアレクサ４８８対照ピーク面積によって割られることなく）ＶＤＺ−アレクサ４８８ピークの面積がＶＤＺ濃度の対数に対してプロットされる形で、データがプロットされる。
【０１７２】
１．アッセイ限界
ブランクの限界
[0191]ブランクの限界（ＬＯＢ）を、標準曲線ブランクの３０個のレプリケートから決定した。全てのアッセイにおける標準曲線ブランク（陰性対照）は、１００μＬ注入あたり４％正常ヒト血清＋４０ｎｇ  ＶＤＺ−アレクサ４８８＋１６５ｎｇ  α４β７からなった。ＶＤＺ−アレクサ４８８ピーク面積の平均（ａｖｅｒａｇｅ）（相加平均（ｍｅａｎ））＋１．６４５ＳＤを計算し、その後、ＬＯＤの計算に用いた。
【表８】
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【０１７３】
検出の限界
[0192]検出の限界（ＬＯＤ）を、測定されたＬＯＢ、及びＬＯＢを近似する低濃度でＶＤＺを含有する血清のレプリケートを利用することにより決定した。曲線上で、かつＬＯＢに最も近い最低点であるという理由により、標準の１０個を選択した。ＬＯＤを、方程式：ＬＯＤ＝ＬＯＢ＋１．６４５（ＳＤ低濃度試料）（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら、２００８）を用いて計算した。その後、その値は、その計算に用いられた実験の平均標準曲線から内挿されて、μｇ／ｍｌでの濃度をもたらした。
【表９】
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【０１７４】
定量の限界
[0193]定量の下限（ＬＬＯＱ）を、低濃度ＶＤＺ陽性試料の３０個のレプリケートの内挿された濃度を分析することにより決定した。この場合、標準の８個（０．６２５μｇ／ｍＬの有効血清濃度）を選択した。定量の上限（ＵＬＯＱ）を、高濃度ＶＤＺ陽性試料（１４μｇ／ｍＬと等しい有効血清濃度）の３０個のレプリケートを分析することにより決定した。ＬＬＯＱは、誤差≦２５％でＣＶ≦２０％を生じる濃度として定義され、したがって、低い分析物濃度でのアッセイの精密度及び正確度を測定する。ＵＬＯＱもまた、誤差≦２５％でＣＶ≦２０％により認定された。
【表１０】
2018500553.tif 000033
これらの判定基準は、アッセイ限界についての以下の値を生じた。
【表１１】
2018500553.tif 000034
【０１７５】
２．干渉
ベドリズマブに対する抗体（ＡＴＶ）干渉
[0194]この実験において、正常ヒト血清か又は様々な濃度のウサギＡＴＶ陽性血清のいずれかに２．５、５、１０、及び２０μｇ／ｍＬ  ＶＤＺを加えた。その後、これらの試料を、アッセイを用いて分析し、％回収率を計算した。
【表１２】
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【０１７６】
[0195]ＡＴＶに対するアッセイ許容度は、この実験において最高６．２５Ｕ／ｍｌまでである。中和ＡＴＶが、患者ＶＤＺとの結合においてα４β７と競合するだろうことから、ＡＴＶ干渉が予想される。非中和ＡＴＶに結合したＶＤＺのみが、検出されることが予想される。
【０１７７】
インテグリンα４β７基質干渉
[0196]α４β７の干渉を試験するために、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で滴定を実施した。ＶＤＺ濃度を、各干渉物質のゼロ濃度に対応するＸ軸の切片にプロットした（図１９）。
【表１３】
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【０１７８】
[0197]ＶＤＺで処置されている患者由来の血清に見出されると予想されるだろうレベルをはるかに超えるα４β７のレベルからの有意な干渉はなかった。
【０１７９】
３．抗原の安定性
[0198]α４β７抗原の安定性を、４度（４℃）で１週間の保存を通して評価した。１週間後、α４β７を４℃保存から取り出し、−７０℃で保存された新鮮なアリコートに対して分析した。その後、４℃保存試料からのデータを、保存前に得られたデータと比較し、パーセント誤差を計算した。誤差が２５％以内であったならば、そのアリコートは、４℃で安定と見なされた。
【表１４】
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【０１８０】
[0199]α４β７の安定性の促進。−７０℃で保存された抗原をアッセイに用いて、ＶＤＺ陽性対照を試験した。対照は、規格（誤差≦２５％及びＣＶ≦２５％）内に現れた。４℃で保存された抗原をアッセイに用いて、ＶＤＺ陽性対照を試験した。これらの対照もまた、規格内に現れた。加えて、−７０℃に対して、４℃で保存されることの結果としての抗原力価の明らかな損失はなかった。
【０１８１】
４．追加のダイナミックレンジ実験
[0200]１×量の標識ＶＤＺ（例えば、７５ｎｇ／ウェルのＶＤＺ−アレクサ４８８）、加えて２×及び４×量を用いて、３つの標準曲線を作成した。図２０は、アッセイに用いられるＶＤＺ−アレクサ４８８及びインテグリンα４β７の両方の濃度を比例的に増加させることが、アッセイのダイナミックレンジを増加させることを示している。そのことはまた、抗薬物抗体の許容度を増加させる。１μｇ／ｍＬの最大ＬＬＯＱがこのアッセイについての判定基準であった。特に、標識ＶＤＺ及びα４β７の量を１．６倍、増加させることは、１μｇ／ｍＬの最大ＬＬＯＱを可能にし、同時に、２５μｇ／ｍＬの上限範囲の向上をもたらした（表１１参照）。
【０１８２】
[0201]前述の発明は、理解の明瞭さのために例証及び例としてかなり詳細に記載されているが、ある特定の変化及び改変が、添付された特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることを当業者は認識しているだろう。加えて、本明細書に提供された各参考文献は、あたかも各参考文献が個々に参照により組み入れられているのと同じ程度に全体が参照により組み入れられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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