(57)【要約】  本発明は、第３モジュールにおいて機能的アデニル化ドメインを欠く変異型フサリシジンシンテターゼを含む殺真菌性パエニバチルス種株の生物学的に純粋な培養物を含む組成物に関する。本発明はまた、殺真菌性パエニバチルス種株の生物学的に純粋な培養物または少なくとも１種のパエニセリン（Ｐａｅｎｉｓｅｒｉｎｅ）および少なくとも１種のパエニプロリキシン（Ｐａｅｎｉｐｒｏｌｉｘｉｎ）を含むこれらの無細胞抽出物を含む組成物を提供する。また、開示の組成物及び化合物を用いて植物を処理して、植物病害を防除するための単離化合物および方法も提供される。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第３モジュールの機能的アデニル化ドメイン（ＦｕｓＡ−Ａ３）を欠く変異型フサリシジンシンテターゼを含む殺真菌性パエニバチルス種株の生物学的に純粋な培養物を含み、機能的ＦｕｓＡ−Ａ３の欠損が、野生型フサリシジンシンテターゼを含むパエニバチルス種株によるフサリシジンの合成と比較して、アミノ酸残基（３）においてチロシンまたはフェニルアラニンを含むフサリシジンの合成を阻害する組成物。
【請求項２】
前記変異型フサリシジンシンテターゼが、ＦｕｓＡ−Ａ３において基質特異性を決定するアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個の欠失を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アミノ酸残基が、Ａｓｐ２３５、Ａｌａ２３６、Ｓｅｒ２３９、Ｔｈｒ２７８、Ｌｅｕ２９９、Ａｌａ３０１、Ａｌａ／Ｇｌｙ３２２、Ｖａｌ３３０、Ｃｙｓ３３１、Ｌｙｓ５１７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アミノ酸残基が、配列番号１１の３２０３、３２０４、３２０７、３２４６、３２６７、３２６９、３２９０、３２９８、３２９９および／または３４８６位に位置する、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記変異型フサリシジンシンテターゼが、ＦｕｓＡ−Ａ３においてＡｓｐ２３５、Ａｌａ２３６、Ｓｅｒ２３９、Ｔｈｒ２７８、Ｌｅｕ２９９、Ａｌａ３０１、Ａｌａ／Ｇｌｙ３２２、Ｖａｌ３３０、およびＣｙｓ３３１の欠失を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記変異型フサリシジンシンテターゼが配列番号１０を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記殺真菌性パエニバチルス種株が、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を示すＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
殺真菌性パエニバチルス種株の生物学的に純粋な培養物または少なくとも１種のパエニセリン（Ｐａｅｎｉｓｅｒｉｎｅ）および少なくとも１種のパエニプロリキシン（Ｐａｅｎｉｐｒｏｌｉｘｉｎ）を含むこれらの無細胞抽出物を含む組成物。
【請求項９】
少なくとも１つのパエニセリンが、パエニセリン  Ａ１、パエニセリン  Ａ２、パエニセリン  Ａ３、パエニセリン  Ａ４、パエニセリン  Ｂ１、パエニセリン  Ｂ２、パエニセリン  Ｂ３、パエニセリン  Ｂ４、パエニセリン  Ｃ１、パエニセリン  Ｃ２およびパエニセリン  Ｃ３からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも１種のパエニプロリキシンが、パエニプロリキシン  Ａ１、パエニプロリキシン  Ａ２、パエニプロリキシン  Ｂ１、パエニプロリキシン  Ｂ２、パエニプロリキシン  Ｃ１、パエニプロリキシン  Ｄ１、パエニプロリキシン  Ｅ１、パエニプロリキシン  Ｅ２、パエニプロリキシン  Ｆ１、パエニプロリキシン  Ｆ２、パエニプロリキシン  Ｇ１およびパエニプロリキシン  Ｇ２からなる群から選択される、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
フサリシジンＡ、ＬｉＦ０８ａ、パエニセリン  Ａ１、パエニセリン  Ｂ１、パエニプロリキシン  Ａ２およびパエニプロリキシン  Ｂ２を含む、請求項８から１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＬｉＦ０３ａ、ＬｉＦ０３ｂ、ＬｉＦ０３ｃ、ＬｉＦ０３ｄ、ＬｉＦ０７ａ、ＬｉＦ０７ｂ、ＬｉＦ０７ｃおよび／またはＬｉＦ０７ｄを含まない、請求項８から１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
相乗的有効量で、パエニセリン  Ａ１、パエニセリン  Ｂ１、パエニプロリキシン  Ａ２およびパエニプロリキシン  Ｂ２を含む、請求項８から１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
（ａ）パエニセリン  Ａ１およびパエニセリン  Ｂ１と（ｂ）パエニプロリキシン  Ａ２およびパエニプロリキシンＢ２との（ａ）：（ｂ）重量比が、約５００：１から約１：５００の間、約２５０：１〜約１：２５０の間、約１００：１〜約１：１００の間、約５０：１〜約１：５０の間、約１０：１〜約１：１０の間、または約５：１〜約１：５の間である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記（ａ）：（ｂ）重量比が約１：１である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記パエニバチルス種株が、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、またはこれらの殺真菌性突然変異株である、請求項１から１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、またはこれらの殺真菌性突然変異株の発酵産物を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記殺真菌性突然変異株が、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２と約９０％を超える配列同一性を有するゲノム配列を有し、および／または前記殺真菌性突然変異株が、配列番号１２または配列番号１３を含むｓｐｏ０Ａ遺伝子を発現する、請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記殺真菌性突然変異株が、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２と同等またはそれ以上の殺真菌活性ならびに／またはフサリシジン、パエニセリンおよび／もしくはパエニプロリキシンのレベルを有する、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記発酵産物がポリミキシンを含まない、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記発酵産物が液体製剤である、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記液体製剤が、懸濁濃縮液または油分散液である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも約１×１０４ＣＦＵの菌株／ｍＬ液体製剤を含む、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
約１％〜約２５％の発酵固形物を含む、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
構造（Ｉ）：
【化１】
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（式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、
Ｒ３は−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２または−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、
ｎは１３〜２０の整数である）
を有する単離化合物、ならびにこれらの塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、非環式類似体、および混合物。
【請求項２６】
ｎが１４または１６である、請求項２５に記載の単離化合物。
【請求項２７】
【化２】
2018517396.tif 000040
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である、請求項２６に記載の単離化合物。
【請求項２８】
構造（ＩＩ）：
【化３】
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（式中、
Ｒ１は、−ＣＨ２ＯＨまたは−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３であり、
Ｒ２は、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２または−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、ならびに
Ｒ３は、ＨまたはＣＨ３であり、
ただし、Ｒ１が−ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２が−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である場合、Ｒ３はＨである）
を有する単離化合物ならびにこれらの塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、非環式類似体、および混合物。
【請求項２９】
【化４】
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2018517396.tif 000048
である、請求項２８に記載の単離化合物。
【請求項３０】
請求項２５から２９のいずれか１項に記載の単離化合物および農業上許容される担体を含む組成物。
【請求項３１】
前記化合物が少なくとも０．００１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ａ）少なくとも１種のフサリシジン；
ｂ）少なくとも１種のパエニセリンまたは少なくとも１種のパエニプロリキシン、
を相乗的有効量で含む組成物。
【請求項３３】
前記フサリシジンがフサリシジンＡである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記パエニセリンがパエニセリン  Ａ１である、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記パエニプロリキシンがパエニプロリキシン  Ｃ１である、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３６】
植物を処理して病害を防除する方法であって、請求項１から２４のいずれか１項に記載の組成物または請求項２５から２９のいずれか１項に記載の単離化合物の有効量を、前記植物、前記植物の一部および／または前記植物の場所に施用することを含む、方法。
【請求項３７】
前記組成物が、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、またはこれらの殺真菌性突然変異株の発酵産物である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物または単離化合物を葉の植物部分に施用することを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が、約１×１０１０〜約１×１０１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタールのパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、またはこれらの殺真菌性突然変異株で施用される、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が、約０．５ｋｇ〜約５ｋｇの発酵固形物／ヘクタールで施用される、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記植物病害が真菌により引き起こされる、請求項３６から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記植物病害が、かび病またはさび病である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記かび病がうどんこ病またはべと病である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記さび病が、コムギ葉さび病、オオムギの葉さび病、ライムギの葉さび病、赤さび病、冠さび病および黒さび病からなる群から選択される。請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記真菌が、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ボトリティス・シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、コレトトリカム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ）、フサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ファエオスフェリア・ノドラム（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、ジモセプトリア・トリシチ（Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、フィトフトラ・クリプトゲア（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｒｙｐｔｏｇｅａ）、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ピシウム・ウルティムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、マグネポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）、タナテフォルス・ククメリス（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、ウスチラゴ・セゲツム変種アベナエ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｅｇｅｔｕｍ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、ウロミセス・アペンジクラツス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）およびプッキニア・トリシチナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物または単離化合物が、前記植物、前記植物の一部および／前記植物の場所への施用後、少なくとも５日、少なくとも１０日、または少なくとも１５日、前記真菌の防除をもたらす残留活性を有する、請求項４１から４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記植物病害が細菌によって引き起こされる、請求項３６から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細菌が、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびエルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
有用植物において植物病原性生物を防除するための、請求項１から２４のいずれか１項に記載の組成物または請求項２５から２９のいずれか１項に記載の単離化合物の使用。
【請求項５０】
前記組成物が、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、またはこれらの殺真菌性突然変異株の発酵産物を含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記植物病原性生物が、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ボトリティス・シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、コレトトリカム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ）、フサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ファエオスフェリア・ノドラム（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、ジモセプトリア・トリシチ（Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、フィトフトラ・クリプトゲア（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｒｙｐｔｏｇｅａ）、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ピシウム・ウルティムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、マグネポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）、タナテフォルス・ククメリス（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、ウスチラゴ・セゲツム変種アベナエ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｅｇｅｔｕｍ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、ウロミセス・アペンジクラツス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）およびプッキニア・トリシチナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）からなる群から選択される、請求項４９または５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記植物病原性生物が、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびエルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）からなる群から選択される、請求項４９または５０に記載の使用。
【請求項５３】
前記有用植物が、リンゴ、バナナ、柑橘類、キーウィー、メロン、桃、洋なし、パイナップル、仁果類、ザクロ、キャベツ、カリフラワー、キュウリ、ウリ科植物、トマト、ジャガイモ、コムギ、米および大豆からなる群から選択される、請求項４９から５２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５４】
広域スペクトルの抗真菌活性を有する殺真菌性パエニバチルス種株を同定する方法であって、ａ）前記パエニバチルス種株におけるＦｕｓＡ−Ａ３を配列決定して、変異型フサリシジンシンテターゼを特徴付けること；ｂ）前記変異型フサリシジンシンテターゼを有する前記パエニバチルス種株の前記殺真菌活性をアッセイすること；ならびにｃ）前記パエニバチルス種株が、前記変異型フサリシジンシンテターゼを含み、野生型フサリシジンシンテターゼを含む参照パエニバチルス種株と比較して殺真菌活性の増加を示す場合、広域スペクトルの抗真菌活性を有する殺真菌性パエニバチルス種株を選択すること、を含む方法。
【請求項５５】
ｄ）前記殺真菌性パエニバチルス種株を培養して、殺真菌性発酵産物を産生することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記変異型フサリシジンシンテターゼが、ＦｕｓＡ−Ａ３において基質特異性を決定するアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個の欠失を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記アミノ酸残基が、Ａｓｐ２３５、Ａｌａ２３６、Ｓｅｒ２３９、Ｔｈｒ２７８、Ｌｅｕ２９９、Ａｌａ３０１、Ａｌａ／Ｇｌｙ３２２、Ｖａｌ３３０、Ｃｙｓ３３１、Ｌｙｓ５１７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記アミノ酸残基が、配列番号１１の３２０３、３２０４、３２０７、３２４６、３２６７、３２６９、３２９０、３２９８、３２９９および／または３４８６位に位置する、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記パエニバチルス種株によって産生されたパエニセリンおよび／またはパエニプロリキシンを定量すること、ならびに前記パエニバチルス種株が、野生型フサリシジンシンテターゼを含む参照パエニバチルス種株と比較して増加レベルのパエニセリンおよび／またはパエニプロリキシンを産生する場合、広域スペクトルの抗真菌活性を有するパエニバチルス種株を選択すること、をさらに含む、請求項５４から５８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／１３８，７６５号および２０１５年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／２３２，２０５号に対する優先権を主張するものであり、当該特許出願の内容は両方とも、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出された配列リストの参照
配列リストの公式コピーは、２０１６年３月２１日に作成された、６８キロバイトのサイズを有するファイル「ＢＣＳ１５９００２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」をＡＳＣＩＩフォーマットの配列リストとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書に含まれる配列リストは、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、細菌株および植物病害を防除するそれらの能力に関する。特に、本発明は、比較的高レベルの広域スペクトル抗真菌活性を有するパエニバチルス種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
殺真菌剤は、作物保護；食品、飼料、および化粧品防腐剤として；ヒトおよび獣医学の両方のための治療剤としての使用を含む無数の用途を有する。先進国と発展途上国の両方において、作物収量の減少、ヒトおよび動物両方の食物媒介性疾患および真菌感染症が問題となっている。
【０００５】
合成殺虫剤または殺真菌剤は、しばしば非特異的であり、したがって、他の天然に存在する有益な生物を含む、標的以外の生物に作用し得る。それらの化学的性質のために、合成殺虫剤または殺真菌剤は毒性で非生分解性でもあり得る。世界中の消費者は、特に食品中の残留化学物質に関連する潜在的な環境および健康問題をますます意識している。このため、化学的（すなわち、合成）農薬の使用または少なくとも量を減らすための消費者の圧力が高まっている。したがって、効果的な有害生物防除を可能にしながら、食物連鎖の要件を管理する必要がある。
【０００６】
合成殺虫剤または殺真菌剤の使用に伴って生じるさらなる問題は、殺虫剤または殺真菌剤の繰り返しおよび排他的な施用がばしば耐性病原性微生物の選択につながることである。通常、このような菌株は、同じ作用様式を有する他の活性成分に対しても交差耐性である。前記活性化合物による病原体の効果的な防除は、この場合もはや不可能である。しかし、新しい作用機序を有する活性成分は開発が困難で高価である。
【０００７】
病原体集団における耐性発生のリスクと環境およびヒトの健康上の懸念から、植物病害を管理するための合成殺虫剤および殺真菌剤の代替品の特定に関心が高まっている。生物学的防除剤の使用も１つの選択肢である。
【０００８】
フサリシジンなどの非リボソームペプチドは、それらの抗菌特性に関して十分に認識されており、作物保護の分野で使用されている。それらの作用様式のために、非リボソームペプチドはまた、バイオ医薬品および他のバイオテクノロジー用途において潜在的用途を有する。フサリシジンは、パエニバチルス種から単離することができ、１５−グアニジノ−３−ヒドロキシペンタデカン酸に加えて６個のアミノ酸残基を含む環構造を有する。パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）から単離されたフサリシジンは、ＬＩ−Ｆ０３、ＬＩ−Ｆ０４、ＬＩ−Ｆ０５、ＬＩ−Ｆ０７およびＬＩ−Ｆ０８を含み（Ｋｕｒｕｓｕ  Ｋ，Ｏｈｂａ  Ｋ，Ａｒａｉ  Ｔ  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｋ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４０：１５０６−１５１４，１９８７）、さらなるフサリシジンＡ、Ｂ、ＣおよびＤが報告されている（Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９：１２９−１３５，１９９６；Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，５０：２２０−２２８，１９９７）。
【０００９】
特定のフサリシジンは、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびペニシリウム・トミイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｈｏｍｉｉ）などの植物病原性真菌に対して殺菌活性を有することが知られている。いくつかのフサリシジンはまた、スタフィロコッカス・オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含むグラム陽性細菌に対して殺菌活性を有する（Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９：１２９−１３５，１９９６；Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，５０：２２０−２２８，１９９７）。さらに、特定のフサリシジンは、キャノーラの黒色根腐れ病を引き起こすレプトスファエリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）に対する抗真菌活性を有することが見出された（Ｂｅａｔｔｙ  ＰＨ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ  ＳＥ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８：１５９−１６９，２００２）。フサリシジン化合物をさらに特徴付け、比較的低い施用量で広域スペクトルの抗真菌活性を提供するこれらのフサリシジンを産生するパエニバチルス種の菌株を同定する必要が存在する。
【００１０】
フサリシジンおよび他の抗真菌代謝産物は、パエニバチルス種の発酵によって得ることができる。しかし、多くのパエニバチルス種株は、ポリミキシンとして知られる抗生物質もまた産生する。ポリミキシンは、グラム陰性細菌に対して選択的に毒性であり、ヒト患者に投与された場合、神経毒性または腎毒性効果を有し得る。抗菌剤耐性の促進およびポリミキシンの相対毒性というグローバルな問題は、これらの抗生物質の慎重な使用と投与を要求する。この理由のために、  農業で使用するために開発されたパエニバチルス種株は、比較的高レベルのフサリシジンを発現し、検出可能なポリミキシンは発現しないことが非常に望ましい。このような菌株は、研究者および消費者にリスクをほとんど、または全く与えないと思われる。さらに、広域スペクトルの活性を示すパエニバチルス種株を同定する必要がある。既存の殺真菌剤、特に真菌耐性の発生を受けにくい殺真菌剤の効力の改善が非常に望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｕｒｕｓｕ  Ｋ，Ｏｈｂａ  Ｋ，Ａｒａｉ  Ｔ  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｋ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４０：１５０６−１５１４，１９８７
【非特許文献２】Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９：１２９−１３５，１９９６
【非特許文献３】Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，５０：２２０−２２８，１９９７
【非特許文献４】Ｂｅａｔｔｙ  ＰＨ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ  ＳＥ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８：１５９−１６９，２００２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、第３モジュール（ＦｕｓＡ−Ａ３）において機能的アデニル化ドメインを欠く変異型フサリシジンシンテターゼを含む殺真菌性パエニバチルス種株の生物学的に純粋な培養物を含む組成物に関し、機能的ＦｕｓＡ−Ａ３の欠損は、野生型フサリシジンシンテターゼを含むパエニバチルス種株によるフサリシジンの合成と比較して、アミノ酸残基（３）においてチロシンまたはフェニルアラニンを含むフサリシジンの合成を阻害する。特定の態様において、変異型フサリシジンシンテターゼは、ＦｕｓＡ−Ａ３において基質特異性を決定するアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個の欠失を含む。他の態様において、このアミノ酸残基は、Ａｓｐ２３５、Ａｌａ２３６、Ｓｅｒ２３９、Ｔｈｒ２７８、Ｌｅｕ２９９、Ａｌａ３０１、Ａｌａ／Ｇｌｙ３２２、Ｖａｌ３３０、Ｃｙｓ３３１、Ｌｙｓ５１７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１３】
一実施形態において、このアミノ酸残基は、配列番号１１の３２０３、３２０４、３２０７、３２４６、３２６７、３２６９、３２９０、３２９８、３２９９および／または３４８６位に位置する。別の実施形態において、変異型フサリシジンシンテターゼは、ＦｕｓＡ−Ａ３においてＡｓｐ２３５、Ａｌａ２３６、Ｓｅｒ２３９、Ｔｈｒ２７８、Ｌｅｕ２９９、Ａｌａ３０１、Ａｌａ／Ｇｌｙ３２２、Ｖａｌ３３０、およびＣｙｓ３３１の欠失を含む。いくつかの実施形態において、変異型フサリシジンシンテターゼは、配列番号１０を含む。
【００１４】
本発明はまた、殺真菌性パエニバチルス種株の生物学的に純粋な培養物または少なくとも１種のパエニセリン（Ｐａｅｎｉｓｅｒｉｎｅ）および少なくとも１種のパエニプロリキシン（Ｐａｅｎｉｐｒｏｌｉｘｉｎ）を含むこれらの無細胞抽出物を含む組成物を提供する。
【００１５】
特定の態様において、少なくとも１つのパエニセリン  は、パエニセリン  Ａ１、パエニセリン  Ａ２、パエニセリン  Ａ３、パエニセリン  Ａ４、パエニセリン  Ｂ１、パエニセリン  Ｂ２、パエニセリン  Ｂ３、パエニセリン  Ｂ４、パエニセリン  Ｃ１、パエニセリン  Ｃ２およびパエニセリン  Ｃ３からなる群から選択される。
【００１６】
他の態様において、少なくとも１種のパエニプロリキシンは、パエニプロリキシン  Ａ１、パエニプロリキシン  Ａ２、パエニプロリキシン  Ｂ１、パエニプロリキシン  Ｂ２、パエニプロリキシン  Ｃ１、パエニプロリキシン  Ｄ１、パエニプロリキシン  Ｅ１、パエニプロリキシン  Ｅ２、パエニプロリキシン  Ｆ１、パエニプロリキシン  Ｆ２、パエニプロリキシン  Ｇ１およびパエニプロリキシン  Ｇ２からなる群から選択される。
【００１７】
特定の実施形態において、組成物は、フサリシジンＡ、ＬｉＦ０８ａ、パエニセリン  Ａ１、パエニセリン  Ｂ１、パエニプロリキシン  Ａ２およびパエニプロリキシン  Ｂ２を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、組成物は、ＬｉＦ０３ａ、ＬｉＦ０３ｂ、ＬｉＦ０３ｃ、ＬｉＦ０３ｄ、ＬｉＦ０７ａ、ＬｉＦ０７ｂ、ＬｉＦ０７ｃおよび／またはＬｉＦ０７ｄを含まない。他の実施形態において、組成物は、相乗的有効量で、パエニセリン  Ａ１、パエニセリン  Ｂ１、パエニプロリキシン  Ａ２およびパエニプロリキシン  Ｂ２を含む。
【００１９】
ある態様において、本発明は、パエニバチルス種株が、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、またはこれらの殺真菌性突然変異株である組成物に関する。組成物は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、またはこれらの殺真菌性突然変異株の発酵産物を含むことができる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、殺真菌性突然変異株は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２に対して約９０％を超える配列同一性を有するゲノム配列を有する。他の実施形態において、殺真菌性突然変異株は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２と同等またはそれ以上の殺真菌活性ならびに／またはフサリシジン、パエニセリンおよび／もしくはパエニプロリキシンのレベルを有する。さらに他の実施形態において、発酵産物はポリミキシンを含まない。
【００２１】
いくつかの態様において、発酵産物は液体製剤である。液体製剤は、懸濁濃縮液または油分散液であってもよい。一実施形態において、組成物は、少なくとも約１×１０４  ＣＦＵの菌株／ｍＬ液体製剤を含む。別の実施形態において、組成物は約１％〜約２５％の発酵固形物を含む。
【００２２】
他の態様において、本発明は、ａ）少なくとも１種のフサリシジン；ｂ）少なくとも１種のパエニセリンまたは少なくとも１種のパエニプロリキシンを、相乗的有効量で含む。一実施形態において、パエニセリンは、パエニセリン  Ａ１、パエニセリン  Ａ２、パエニセリン  Ａ３、パエニセリン  Ａ４、パエニセリン  Ｂ１、パエニセリン  Ｂ２、パエニセリン  Ｂ３、パエニセリン  Ｂ４、パエニセリン  Ｃ１、パエニセリン  Ｃ２およびパエニセリン  Ｃ３の少なくとも１つである。別の実施形態において、パエニプロリキシンは、パエニプロリキシン  Ａ１、パエニプロリキシン  Ａ２、パエニプロリキシン  Ｂ１、パエニプロリキシン  Ｂ２、パエニプロリキシン  Ｃ１、パエニプロリキシン  Ｄ１、パエニプロリキシン  Ｅ１、パエニプロリキシン  Ｅ２、パエニプロリキシン  Ｆ１、パエニプロリキシン  Ｆ２、パエニプロリキシン  Ｇ１およびパエニプロリキシン  Ｇ２の少なくとも１つである。
【００２３】
特に、一実施形態において、少なくとも１種のフサリシジンと少なくとも１種のパエニセリンまたは少なくとも１種のパエニプロリキシンとの相乗比は、１：１０００〜１０００：１の範囲、好ましくは１：５００〜５００：１、より好ましくは１：２５０〜２５０：１の範囲である。別の実施形態において、少なくとも１種のフサリシジンと少なくとも１種のパエニセリンまたは少なくとも１種のパエニプロリキシンとの相乗重量比は、１：１００〜１００：１の範囲、好ましくは１：１００〜１０：１の範囲またはさらに１：５０〜２５：１の範囲である。一態様において、フサリシジンはフサリシジンＡである。別の態様において、パエニセリンはパエニセリン  Ａ１である。さらに別の態様において、パエニプロリキシンは、パエニプロリキシン  Ｃ１である。
【００２４】
他の態様において、本発明は、構造（Ｉ）：
【化１】
2018517396.tif 000003
【００２５】
（式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であり、
Ｒ３は−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２または−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、
ｎは１３〜２０の整数である）
を有する単離化合物、ならびにこれらの塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、非環式類似体、および混合物に関する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、Ｒ３は−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。他の実施形態において、Ｒ３は−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。一態様において、Ｒ１は−ＣＨ（ＣＨ３）２である。別の態様において、Ｒ１は−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である。一態様において、Ｒ２は−ＣＨ（ＣＨ３）２である。さらに別の態様において、Ｒ２は−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である。
【００２７】
さらに他の態様において、本発明は、構造（ＩＩ）：
【化２】
2018517396.tif 000004
【００２８】
（式中、
Ｒ１は、−ＣＨ２ＯＨまたは−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３であり、
Ｒ２は、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２または−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、ならびに
Ｒ３は、ＨまたはＣＨ３であり、
ただし、Ｒ１が−ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２が−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である場合、Ｒ３はＨである）
を有する単離化合物ならびにこれらの塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、非環式類似体、および混合物に関する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、Ｒ３はＣＨ３である。他の実施形態において、Ｒ３はＨである。一態様において、Ｒ１は−ＣＨ２ＯＨである。別の態様において、Ｒ１は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３である。一態様において、Ｒ２は−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。さらに別の態様において、Ｒ２は−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。
【００３０】
一実施形態において、本発明は、本明細書に開示される単離化合物および農業上許容される担体を含む組成物に関する。
【００３１】
特定の実施形態において、本発明は、構造（Ｉ）の化合物を、少なくとも０．００１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で含む溶液を対象とする。別の実施形態において、本発明は、構造（ＩＩ）の化合物を、少なくとも０．００１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で含む溶液を対象とする。特定の態様において、開示の溶液は、農業上許容される担体をさらに含む。
【００３２】
さらに別の実施形態において、本発明は、病害を防除するための植物の処理方法であって、有効量の本明細書に開示の組成物を、植物、植物の一部および／または植物の場所に施用することを含む方法に関する。特定の態様において、本組成物は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、またはこれらの殺真菌性突然変異株の発酵産物である。他の態様において、本方法は、組成物を葉の植物部分に施用することを含む。さらに他の態様において、組成物は、約１×１０１０〜約１×１０１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ヘクタールのパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、またはこれらの殺真菌性突然変異株で施用される。一実施形態において、組成物は、約０．５ｋｇ〜約５ｋｇの発酵固形物／ヘクタールで施用される。
【００３３】
いくつかの態様において、植物病害は真菌によって引き起こされる。他の態様において、植物病害は、かびまたはさび病である。一実施形態において、かび病は、うどんこ病またはべと病である。別の実施形態において、さび病は、コムギ葉さび病、オオムギの葉さび病、ライムギの葉さび病、赤さび病、冠さび病および黒さび病からなる群から選択される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、真菌は、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ボトリティス・シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、コレトトリカム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ）、フサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ファエオスフェリア・ノドラム（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、ジモセプトリア・トリシチ（Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、フィトフトラ・クリプトゲア（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｒｙｐｔｏｇｅａ）、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ピシウム・ウルティムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、マグネポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）、タナテフォルス・ククメリス（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、ウスチラゴ・セゲツム変種アベナエ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｅｇｅｔｕｍ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、ウロミセス・アペンジクラツス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）およびプッキニア・トリシチナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）からなる群から選択される。
【００３５】
他の実施形態において、植物病害は細菌によって引き起こされる。一態様において、細菌は、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびエルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）からなる群から選択される。
【００３６】
本発明はまた、有用植物において植物病原性生物を防除するための開示組成物の使用に関する。特定の態様において、植物病原性生物は、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ボトリティス・シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、コレトトリカム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ）、フサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ファエオスフェリア・ノドラム（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、ジモセプトリア・トリシチ（Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、フィトフトラ・クリプトゲア（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｒｙｐｔｏｇｅａ）、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ピシウム・ウルティムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、マグネポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）、タナテフォルス・ククメリス（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、ウスチラゴ・セゲツム変種アベナエ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｅｇｅｔｕｍ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、ウロミセス・アペンジクラツス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）およびプッキニア・トリシチナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）からなる群から選択される。他の態様において、植物病原性生物は、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびエルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）からなる群から選択される。
【００３７】
さらに他の態様において、有用植物は、リンゴ、バナナ、柑橘類、キーウィー、メロン、桃、洋なし、パイナップル、仁果類、ザクロ、キャベツ、カリフラワー、キュウリ、ウリ科植物、トマト、ジャガイモ、コムギ、米および大豆からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】トマト疫病（ＰＨＹＴＩＮ）、灰色かび病（ＢＯＴＲＣＩ）、およびコムギ葉さび病（ＰＵＣＣＲＴ）に対するパエニバチルス種株の全ブロスの植物体殺真菌活性を示す。
【図２】アルテルナリア・アルテルナータ（ＡＬＴＥＡＬ）、ボトリティス・シネリア（ＢＯＴＲＣＩ）、フサリウム・クルモルム（ＦＵＳＡＣＵ）、ファエオスフェリア・ノドラム（ＬＥＰＴＮＯ）、ジモセプトリア・トリシチ（ＳＥＰＰＴＲ）、フィトフトラ・クリプトゲア（ＰＨＹＴＣＲ）、フィトフトラ・インフェスタンス（ＰＨＹＴＩＮ）、ピシウム・ウルティムム（ＰＹＴＨＵＬ）マグネポルテ・オリゼ（ＰＹＲＩＯＲ）、タナテフォルス・ククメリス（ＲＨＩＺＳＯ）、ウスチラゴ・セゲツム変種アベナエ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｅｇｅｔｕｍ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）（ＵＳＴＩＡＶ）、およびウロミセス・アペンジクラツス（ＵＲＯＭＡＰ）に対するパエニバチルス種株の全ブロス由来フサリシジン抽出物のインビトロ抗真菌活性を示す。
【図３】非環式類似体、ＬｉＦ０４ｃを生成するためのＬｉＦ０４ａ（フサリシジンＡとしても知られている）の環構造の開裂を示す。フサリシジンおよびフサリシジン様化合物の各々の非環式類似体も同様の様式で生じる。
【図４Ａ】位置（１）、（４）および（６）において保存されたアミノ酸が同定され、アミノ酸の変化がＡＡ（アミノ酸）として示されている公知のフサリシジンの構造を概説する図を示す。１５−グアニジノ−３−ヒドロキシペンタデカン酸（ＧＨＰＤ）尾部は、位置（１）のＬ−スレオニンのＮ末端とアミド結合を形成する。位置（６）のＤ−アラニンのＣ末端は、「Ｏ」を指し示す矢印で示される位置（１）のＬ−スレオニンのヒドロキシル基とエステル結合を形成する。
【図４Ｂ】公知のフサリシジンが同定されているパエニバチルス種の細胞抽出物のＨＰＬＣ／ＭＳ  ＴＯＦクロマトグラムを示す。
【図４Ｃ】パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株および／またはこれから誘導された株由来の細胞抽出物において検出可能な公知のフサリシジンを示す。
【図５Ａ】パエニセリンの構造を概説する図を示す。この種の化合物は、位置（１）および位置（４）の保存スレオニンの一方または両方がセリンで置換されていることを除いて、前記フサリシジンと同様である。
【図５Ｂ】パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株および／またはこれから誘導された、その中にパエニセリンが同定された株由来の細胞抽出物のＨＰＬＣ／ＭＳ  ＴＯＦクロマトグラムを示す。
【図５Ｃ】パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株および／またはこれから誘導された株由来の細胞抽出物において検出可能なパエニセリンを示す。検出されたすべての化合物について、ｍ／ｚ値および保持時間（ＲＴ）を示す。
【図６Ａ】図６Ｂに示されるＵＰＬＣ／ＭＳ  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦスペクトルから誘導されたパエニセリン  Ａ１の化学構造を示す。
【図７Ａ】図７Ｂに示されるＵＰＬＣ／ＭＳ  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦスペクトルから誘導されたパエニセリン  Ｂ１の化学構造を示す。
【図８Ａ】パエニプロリキシンの構造を概説する図を示す。この種の化合物は、ＧＨＰＤ尾部の長さが−（ＣＨ２）１２−から−（ＣＨ２）１４−または−（ＣＨ２）１６−に伸長される以外は、フサリシジンと同様である。
【図８Ｂ】パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株および／またはこれから誘導された、その中にパエニプロリキシンが同定された株由来の細胞抽出物のＨＰＬＣ／ＭＳ  ＴＯＦクロマトグラムを示す。
【図８Ｃ】パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株および／またはこれから誘導された株由来の細胞抽出物において検出可能なパエニプロリキシンを示す。検出されたすべての化合物について、ｍ／ｚ値および保持時間（ＲＴ）を示す。
【図９Ａ】図９Ｂに示されるＵＰＬＣ／ＭＳ  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦスペクトルから誘導されたパエニプロリキシン  Ｃ１の化学構造を示す。
【図１０Ａ】図１０Ｂに示されるＵＰＬＣ／ＭＳ  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦスペクトルから誘導されたパエニプロリキシン  Ｄ１の化学構造を示す。
【図１１】フサリシジンＡおよびＢ（「ＡＢ」）、パエニセリン  Ａ１およびＢ１（「８６８」）、パエニプロリキシン  Ａ２およびＢ２（「９３８」）、または８６８および９３８の組み合わせを寒天プレート上全体に拡がったコレトトリカム・ラゲナリウム（ＣＯＬＬＬＡ）の胞子に適用した、Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ抗生物質ディスク拡散アッセイを示す。真菌増殖の阻害ゾーンを有する各ディスクの直径は、ミリメートルで示される。
【図１２】図１２Ａは、フサリシジンＡの化学構造およびこの構造の単純化された描写を示す。図１２Ｂ〜１２Ｅは、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびこれから誘導された株によって産生されたフサリシジン、パエニセリンおよび／またはパエニプロリキシンの組み合わせの単純化された描写を示す。これらの組み合わせは、相乗的抗真菌効果を生じ、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびそれから誘導された株で観察される比較的高い効力および広域スペクトルの抗真菌活性に関与する。
【図１３】以下のパニエバチルス種株：パニエバチルス、ペオリエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｏｒｉａｅ）Ａ（配列番号１）；パエニバチルス・ポリミキサＡ（配列番号２）；パエニバチルス・ポリミキサＰＫＢ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢＱ９６３８４．２；配列番号３）；パエニバチルス・ポリミキサＥ６８１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＤＭ６７９８５．１；配列番号４）；パエニバチルス・ポリミキサＢ（配列番号５）；パエニバチルス・ポリミキサＳＱＲ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨＭ６３８１２．１；配列番号６）；パエニバチルス・ポリミキサＣ（配列番号７）；パエニバチルス・ポリミキサＭ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＣＣ８３０１５．１；配列番号８）；パエニバチルス・ポリミキサＳＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＡ０９７３３．２；配列番号９）；パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株（配列番号１０）；およびパエニバチルス種Ａ株（配列番号１１）によって発現されるＦｕｓＡフサリシジンシンテターゼのセグメントの多重配列アライメントを示す。基質特異性を決定するアミノ酸残基は、黒色の輪郭で識別される（表１も参照されたい）。これらのアミノ酸残基は、配列番号１〜５および１１の３２０３、３２０４、３２０７、３２４６、３２６７、３２６９、３２９０、３２９８、３２９９および３４８６位、ならびに配列番号６〜９の３２０４、３２０５、３２０８、３２４７、３２６８、３２７０、３２９１、３２９９、３３００、および３４８７位に位置する。
【図１４】パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびパエニバチルス種Ａ株（「Ａ株」）におけるフサリシジン遺伝子クラスターを示す。矢印は、クラスター内の個々の遺伝子を表す（すなわち、ｆｕｓＧは矢印「Ｇ」で表され、ｆｕｓＦは矢印「Ｆ」によって表されるなど）。最大の矢印は、以下の略号および記号を有するｆｕｓＡフサリシジンシンテターゼ遺伝子を表す：Ａ＝アデニル化ドメイン（基質認識および活性化）；Ｃ＝縮合ドメイン（ペプチド結合形成）；Ｅ＝エピマー化ドメイン（基質ラセミ化）；ＴＥ＝チオエステラーゼドメイン（生成物放出）；文字のない楕円形＝チオール化（Ｔ）ドメイン（ペプチドキャリアタンパク質）。ｆｕｓＡ遺伝子は、各遺伝子クラスターの上または下のボックスに示されるアミノ酸を組み込む役割を果たす６つのモジュールを有する。Ａ株は典型的なフサリシジン遺伝子クラスターを有するが、パエニバチルス種ＮＲＲＬＢ−５０９７２株フサリシジン遺伝子クラスターは、モジュール３において機能的Ａドメインを欠いている。結果として、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株によって産生されるフサリシジンは、位置（３）にチロシンおよびフェニルアラニンを欠き、バリンまたはイソロイシンのみを組み込む。
【図１５】パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株（配列番号１２）およびパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株（配列番号１３）におけるｓｐｏ０Ａ遺伝子の配列アライメントを示す。
【図１６】パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株コード配列におけるヌクレオチド変化が、保存領域において単一のアミノ酸置換をもたらすことを示す、内生胞子形成細菌由来のＳｐｏ０Ａオルソログの配列アライメントを示す。アライメントされたＳｐｏ０Ａオルソログ配列は：パエニバチルス・テラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅ）Ｓｐｏ０Ａ（配列番号１４）、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株Ｓｐｏ０Ａ（配列番号１５）、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株Ｓｐｏ０Ａ（配列番号１６）、パエニバチルス・ポリミキサＳｐｏ０Ａ（配列番号１７）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｓｐｏ０Ａ（配列番号１８）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）Ｓｐｏ０Ａ（配列番号１９）およびクロストリジウム・パステリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）Ｓｐｏ０Ａ（配列番号２０）である。
【図１７】真菌病原体アルテルナリア・ソラニ（ＡＬＴＥＳＯ）およびコレトトリカム・ラゲナリウム（ＣＯＬＬＬＡ）を用いたいくつかのフサリシジン、パエニセリンおよびパエニプロリキシンの８０％最小発育阻止濃度（ＭＩＣ８０）値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこれから誘導される殺真菌性突然変異体（菌株）を提供する。パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株は、植物病原体に対して広域スペクトルの活性を有することが見出された。
【００４０】
本明細書に記載される微生物および特定の株は、特に断らない限り、すべて自然から分離され、振盪フラスコ培養において、または例えば生物活性代謝産物の生産を最大化するためにバイオリアクターなどのスケールアップされた製造プロセスなどによって人工的条件下で増殖される。このような条件下での増殖は、菌株の「順化」をもたらす。一般に、このような「順化」株は、天然環境で見出される選択圧に曝されず、むしろ人為的選択圧に曝される均質な集団として培養されるという点で、自然界に見られるその対応物とは異なる。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」は、全ブロスまたは発酵産物に富んだまたは濃縮されているか、または全ブロスまたは発酵産物から部分的にまたは実質的に精製された化合物を指す。
【００４２】
一実施形態において、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の突然変異株が提供される。用語「突然変異体」は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株から誘導された遺伝子変異体を指す。一実施形態において、突然変異体は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の１または複数またはすべての識別（機能的）特徴を有する。特定の例では、突然変異体またはこの発酵産物は、（識別機能的特徴として）真菌、卵菌類および／または細菌を少なくともパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株と同様に防除する。このような突然変異体は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株と約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９８％超または約９９％超の配列同一性を有するゲノム配列を有する遺伝子変異体であり得る。突然変異体は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の細胞を、化学物質または放射線照射で処理することによって、またはパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の細胞集団から自発的突然変異体（ファージ耐性または抗生物質耐性突然変異体など）を選択することによって、または当業者に周知の他の手段によって得ることができる。
【００４３】
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびこの突然変異体は、広範囲の植物病原体に対して活性を有する。一態様において、この菌株は、キュウリ炭疽病、キュウリうどんこ病、コムギ葉さび病、オオムギうどんこ病およびボトリティス病などの真菌；トマト疫病、キュウリべと病およびアブラナ属べと病などの卵菌類；および／またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）およびエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）などの細菌に対する活性を有する。
【００４４】
特定の態様において、パエニバチルス種株は、配列番号１０と少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を示すＤＮＡ配列を含む。
【００４５】
特定の態様において、本発明は、フサリシジン、パエニセリン、および／またはパエニプロリキシンを産生するパエニバチルス種株を含む発酵産物を対象とする。フサリシジンは、１５−グアニジノ−３−ヒドロキシペンタデカン酸（ＧＨＰＤ）尾部およびこれらの線形対応物を有するデプシペプチドのファミリーである。フサリシジンの特異的保存特性は、このＧＨＰＤ尾部、ならびに配列中の６つのアミノ酸のうちの３つ、すなわち（１）スレオニン、（４）スレオニンおよび（６）アラニンである。
【００４６】
元々は１９７０年代半ばにＮａｋａｊｉｍａら（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９７２，２５，２４３−２４７）によって最初に発見されたが特徴付けられておらず、フサリシジンは１９８０年代後半にＫｕｒｕｓｕら（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，１９８７，４０，１５０６−１５１４）によって記載された。フサリシジンは１９９０年代半ばから２０００年代初頭にかけて、Ｋａｊｉｍｕｒａら（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，１９９６，４９，１２９−１３５；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，１９９７  ５０，２２０−２２８）、Ｋｕｒｏｄａら（Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，２０００，５３，１５３３−１５４９；Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００１，３６，３０−３７）およびＢｅａｔｔｙら（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００２，４８，１５９−１６９）によってさらに研究された。この重厚な調査期間中、これらの化合物は著者に応じて数回改名された（フサリシジンＡはＬｉＦ０４ａ、Ｇａｔａｖａｌｉｎ、またはＫＴ−６２９１Ａとしても知られている）。この話題には多くの刊行物が存在するが、２４の公知のフサリシジンの同じ群からの選択化合物が毎回記述されている。
【００４７】
この話題に関してしばらくの沈黙期間があった後、Ｖａｔｅｒら（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２０１５，２６，１１３０−１１４１）は、質量分析によるフサリシジンの構造解明について記載し、そのファミリーのいくつかの類似体を記載した。Ｖａｔｅｒらは、７アミノ酸（すなわち、ペプチド配列中の（４）スレオニン残基に連結された余分なアラニン）を有する新規なクラスのフサリシジン様化合物を同定した。本明細書で使用する用語「非環式類似体」は、フサリシジンまたはフサリシジン様化合物（例えば、パエニセリンまたはパエニプロリキシン）に対応するが、エステル結合を欠き、線形構造を生じる化合物を指す。
【００４８】
フサリシジンのアミノ酸鎖は、非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）によって１つに連結または改変される。マルチドメインＮＲＰＳは、最大１５，０００個のアミノ酸からなり、したがって、事実上最も長いタンパク質の１つであると考えられている（Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．２０，２７５−２８７）。ＮＲＰＳ取り込みは、リボソームによって翻訳される２１個の標準アミノ酸に限定されず、この乱雑さは、非リボソームペプチドの大きな構造的多様性および生物活性に寄与する（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，（２００８））。パエニバチルス・ポリミキサＰＫＢ１によるフサリシジンの非リボソーム生合成は、ｄ−アミノ酸の直接活性化を伴う（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１５，１１８−１２７）。
【００４９】
Ｐ．ポリミキサＥ６８では、フサリシジン生合成遺伝子クラスター（ｆｕｓＧＦＥＤＣＢＡ）が特徴付けられ、クラスター中の最大のコードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）であるＮＲＰＳコード配列が６モジュールペプチドをコードすることが観察された（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  Ｅ６８１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３６５，８９−９５；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  Ｅ６８１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３６５，８９−９５；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）．Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ＳＱＲ−２１．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９７，９４７９−９４８９）。生合成クラスターは、脂質部分の生合成を担う他のＣＤＳを含むが、トランスポーター遺伝子を含まない（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，（２００８）．Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎｓ  ｂｙ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ＰＫＢ１  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１５，１１８−１２７）。Ｐ．ポリミキサでは、ｆｕｓオペロンのプロモーターが同定され、これまでの研究により胞子形成の調節因子として関与する転写リプレッサー（ＡｂｒＢ）によって結合されることが示されており、このことは、フサリシジンが胞子形成中に合成され、微生物の二次代謝をそのライフサイクルで調整することが観察されたので興味深い（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）．Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ＳＱＲ−２１．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９７，９４７９−９４８９）。
【００５０】
対立遺伝子多様性は、典型的には化学的多様性の発生に関与していると考えられている。しかし、ｆｕｓクラスターの興味深い特徴は、組み込まれたアミノ酸（Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、Ｐｈｅ）が異なる多様なフサリシジンがｆｕｓＡの単一の対立遺伝子によって産生され得ることであり、根底にある機序は、アミノ酸の認識に関与するＮＲＰＳ  Ａドメインが基質特異性を緩和したことである（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎ  Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎ  Ａｎａｌｏｇｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３４，１３２７−１３３４；Ｍｏｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ａｎｔｉ−Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，Ｆｒｏｎｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．２０１５；６：２３１）。
【００５１】
ｆｕｓＡ遺伝子における基質認識および活性化を担うＡドメインの構造は、Ｘ線結晶学を用いてＧｒｓＡから決定され、基質特異性を決定する１０個のアミノ酸残基（Ａｓｐ２３５，Ａｌａ２３６，Ｔｒｐ２３９，Ｔｈｒ２７８，Ｉｌｅ２９９，Ａｌａ３０１，Ａｌａ３２２，Ｉｌｅ３３０，Ｃｙｓ３３１およびＬｙｓ５１７）が同定されている（Ｃｈａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ７：２１１−２２４；Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ６：４９３−５０５）。これらの１０個のシグネチャー残基は、基質結合部位内のそれらの機能に基づいて３つのサブグループに分類することができる。Ａｓｐ２３５およびＬｙｓ５１７はそれぞれ基質のカルボキシル末端およびアミノ末端と相互作用し、配列分析によりＮＲＰＳのＡドメインにおけるそれらの位置が不変であることが明らかにされた。Ａｌａ２３６、Ａｌａ３０１およびＩｌｅ３３０は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸基質に特異的なＡドメイン内で中程度に可変である。Ｔｒｐ２３９、Ｔｈｒ２７８、Ｉｌｅ２９９、Ａｌａ３２２およびＣｙｓ３３１は非常に位置可変であり、異なる基質の識別および選択において重要であると考えられている（Ｃｈａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ７：２１１−２２４；Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ６：４９３−５０５）。Ｉｌｅ２９９は、基質特異性を付与する配列内のすべてのうちで最も位置可変性であった（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ６：４９３−５０５）。
【００５２】
フサリシジンシンテターゼにおける基質特異性を決定する１０個のアミノ酸残基を表１に示す。シンテターゼの６つのモジュールの各々のアデニル化ドメイン（Ａドメイン）は、第１のモジュールのＦｕｓＡ−Ａ１、第２のモジュールのＦｕｓＡ−Ａ２、第３のモジュールのＦｕｓＡ−Ａ３として知られている。これらの１０個のアミノ酸残基は、図１３に示す種々のパエニバチルス種株由来のＦｕｓＡの多重配列アラインメントにおいても同定されている。
【表１】
2018517396.tif 000005
【００５３】
特定の態様において、殺真菌性パエニバチルス種株は、ＦｕｓＡ−Ａ３において基質特異性を決定するアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個すべての欠失を含む変異型フサリシジンシンテターゼを発現する。他の態様において、殺真菌性パエニバチルス種株は、ＦｕｓＡ−Ａ３においてＡｓｐ２３５、Ａｌａ２３６、Ｓｅｒ２３９、Ｔｈｒ２７８、Ｌｅｕ２９９、Ａｌａ３０１、Ａｌａ／Ｇｌｙ３２２、Ｖａｌ３３０、Ｃｙｓ３３１、Ｌｙｓ５１７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を有するフサリシジンシンテターゼを発現する。
【００５４】
本明細書に開示されたＦｕｓＡ−Ａ３における欠失は、フサリジジンまたはフサリシジン様化合物中のペプチド環のアミノ酸位置（３）に特異的アミノ酸を組み込むためのフサリジジンシンテターゼの能力に影響を及ぼす。例えば、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株は、ＦｕｓＡ−Ａ３に欠失を含み、アミノ酸位置（３）にチロシンアミノ酸またはフェニルアラニンアミノ酸を有するフサリシジン化合物を産生することができない。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ＦｕｓＡ−Ａ３における欠失は、代謝を古典的なフサリシジンの生合成から離して、パエニセリンｓおよびパエニプロリキシンなどのフサリシジン様化合物の生合成にシフトさせることができる。
【００５５】
特定の実施形態において、本発明は、第３モジュールの機能的アデニル化ドメイン（ＦｕｓＡ−Ａ３）を欠く変異型フサリシジンシンテターゼを含み、少なくとも１種のパエニセリンおよび少なくとも１種のパエニプロリキシンをさらに含む殺真菌性パエニバチルス種株の生物学的に純粋な培養物を含む組成物を対象とする。特定の態様において、少なくとも１種のパエニセリンおよび少なくとも１種のパエニプロリキシンは、組成物中で単離または濃縮される。
【００５６】
いくつかの実施形態において、単離された化合物またはパエニプロリキシンは以下ものである
【化３】
2018517396.tif 000006
2018517396.tif 000007
2018517396.tif 000008
2018517396.tif 000009
2018517396.tif 000010
【００５７】
いくつかの実施形態において、単離された化合物またはパエニセリンは以下のものである、
【化４】
2018517396.tif 000011
2018517396.tif 000012
2018517396.tif 000013
【００５８】
他の態様において、本発明は、殺真菌性パエニバチルス種株を同定する、および／または対応する発酵産物を産生する方法に関する。この方法は、変異型フサリシジンシンテターゼを特徴付け、パエニバチルス種株の殺真菌活性をアッセイするための、パエニバチルス種株におけるＦｕｓＡ−Ａ３の配列決定を含む。特定の態様において、ＦｕｓＡ−Ａ３は、図１３に示される１または複数の配列に基づくプライマー（すなわち、配列番号１〜１１）を用いて配列決定される。いくつかの実施形態において、スクリーニングの前に、細胞を増殖させ、以下の特徴の１または複数を有する細胞を選択する：野生型フサリシジンシンテターゼを含む参照パエニバチルス種株（すなわち、機能的ＦｕｓＡ−Ａ３を発現する）において定量されたフサリシジンと比較した、アミノ酸残基（３）にチロシンまたはフェニルアラニンを有するフサリシジン（例えば、ＬｉＦ０３ａ、ＬｉＦ０３ｂ、ＬｉＦ０３ｃ、ＬｉＦ０３ｄ、ＬｉＦ０７ａ、ＬｉＦ０７ｂ、ＬｉＦ０７ｃ、および／またはＬｉＦ０７ｄ）のレベルの低減または検出不能；および／または野生型フサリシジンシンテターゼを含む参照パエニバチルス種株（すなわち、機能的ＦｕｓＡ−Ａ３を発現する）において定量されたものと比較した、パエニセリン（例えば、パエニセリン  Ａ１および／またはパエニセリン  Ｂ１）および／またはパエニプロリキシンのレベルの増大。
【００５９】
一態様において、本発明は、広域スペクトル抗真菌活性を有する発酵産物を産生するための方法であって、変異型フサリシジンシンテターゼを有するパエニバチルス種株を培養して、胞子形成させることを含む方法を包含する。
【００６０】
別の実施形態において、本発明は、広域スペクトルの抗真菌活性を有する殺真菌性パエニバチルス種株を同定する方法であって、ａ）パエニバチルス種株におけるＦｕｓＡ−Ａ３を配列決定して、変異型フサリシジンシンテターゼを特徴付けること；ｂ）変異型フサリシジンシンテターゼを有するパエニバチルス種株の殺真菌活性をアッセイすること；ならびにｃ）パエニバチルス種株が、変異型フサテリシジンシンテターゼを含み、野生型フサリシジンシンテターゼを含む参照パエニバチルス種株と比較して殺真菌活性の増加を示す場合、広域スペクトルの抗真菌活性を有する殺真菌性パエニバチルス種株を選択すること、を含む方法に関する。この方法は、パエニバチルス種株によって産生されたパエニセリンおよび／またはパエニプロリキシンを定量すること、ならびにパエニバチルス種株が、野生型フサリシジンシンテターゼを含む参照パエニバチルス種株と比較して増加レベルのパエニセリンおよび／またはパエニプロリキシンを産生する場合、広域スペクトルの抗真菌活性を有するパエニバチルス種株を選択すること、をさらに含む。別の態様において、この方法は、殺真菌性パエニバチルス種株を培養して、殺真菌性発酵産物を産生することをさらに含む。
【００６１】
一実施形態において、本発明は、広域スペクトルの抗真菌活性を有する殺真菌性パエニバチルス種株を含む抗真菌発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を産生する方法であって、ａ）パエニバチルス種株におけるＦｕｓＡ−Ａ３を配列決定して、変異型フサリシジンシンテターゼを特徴付けること；ｂ）変異型フサリシジンシンテターゼを有するパエニバチルス種株の殺真菌活性をアッセイすること；ｃ）パエニバチルス種株が、変異型フサリシジンシンテターゼを含み、野生型フサリシジンシンテターゼを含む参照パエニバチルス種株と比較して殺真菌活性の増加を示す場合、広域スペクトルの抗真菌活性を有する殺真菌性パエニバチルス種株を選択すること、ならびにｄ）殺真菌性パエニバチルス種株を培養して、殺真菌性発酵産物を産生すること、を含む方法に関する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、変異型フサリシジンシンテターゼは、ＦｕｓＡ−Ａ３において基質特異性を決定するアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個すべての欠失を含む。他の態様において、変異型フサリシジンシンテターゼは、ＦｕｓＡ−Ａ３において、Ａｓｐ２３５、Ａｌａ２３６、Ｓｅｒ２３９、Ｔｈｒ２７８、Ｌｅｕ２９９、Ａｌａ３０１、Ａｌａ／Ｇｌｙ３２２、Ｖａｌ３３０、Ｃｙｓ３３１、Ｌｙｓ５１７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含む。
【００６３】
本発明はまた、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの突然変異体もしくはこの無細胞調製物もしくは代謝産物を、葉、茎、花、果実、根、または種子などの植物もしくは植物部分に投与することによって、または植物または植物部分が生育する場所、例えば土壌に施用することによって、植物を処理して、植物病病害防除する方法も包含する。
【００６４】
本発明による方法において、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異体を含む組成物は、植物を成長させるために使用される任意のタイプの培地（例えば、土壌、バーミキュライト、細断された厚紙および水）において成長した任意の植物もしくは任意の植物の任意の部分に施用するか、または蘭やビカクシダなどの空気中で増殖する植物もしくは植物の部分に施用することができる。組成物は、例えば、噴霧（ｓｐｒａｙｉｎｇ）、霧化（ａｔｏｍｉｚｉｎｇ）、気化（ｖａｐｏｒｉｚｉｎｇ）、散布（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、散粉（ｄｕｓｔｉｎｇ）、散水（ｗａｔｅｒｉｎｇ）、吹きかけ（ｓｑｕｉｒｔｉｎｇ）、振りかけ（ｓｐｒｉｎｋｌｉｎｇ）、注ぎ（ｐｏｕｒｉｎｇ）または燻蒸（ｆｕｍｉｇａｔｉｎｇ）によって施用することができる。既に上述したように、農業、園芸、森林、プランテーション、果樹園、苗床、有機的に栽培された作物、芝草および都市環境など、目的の植物が位置する任意の所望の場所で施用を行うことができる。
【００６５】
本発明の組成物は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこれから誘導される殺真菌性突然変異体（株）を、以下の実施例に記載されている培地および他の方法を使用することを含む当分野において周知の方法により培養することによって得ることができる。従来の大規模な微生物培養プロセスには、液中発酵、固相発酵または液体表面培養が含まれる。発酵の終わりに向かって、栄養素が枯渇すると、細胞は増殖期から胞子形成期への移行を開始し、発酵の最終産物は主に胞子、代謝産物および残留発酵培地である。胞子形成は、パエニバチルスの自然ライフサイクルの一部であり、一般に、栄養制限に応答して細胞によって開始される。発酵は、高レベルのコロニー形成単位を獲得し、胞子形成を促進するように構成される。発酵から生じる培養培地中の細菌細胞、胞子および代謝産物は、直接使用するか、または遠心分離、接線流濾過、深層濾過、および蒸発などの従来の工業的方法によって濃縮することができる。
【００６６】
本発明の組成物は、発酵産物を含む。いくつかの実施形態において、濃縮発酵ブロスを、例えば、透析濾過プロセスを介して洗浄して、残留発酵ブロスおよび代謝産物を除去する。本明細書で使用される用語「ブロス濃縮液」は、上記のような従来の工業的方法によって濃縮されたが、液体形態のままである全ブロス（発酵ブロス）を指す。本明細書で使用される用語「発酵固形物」は、発酵ブロスが乾燥した後に残る固体物質を指す。本明細書で使用される用語「発酵産物」は、全ブロス、ブロス濃縮物および／または発酵固形物を指す。本発明の組成物は、発酵産物を含む。
【００６７】
発酵ブロスまたはブロス濃縮物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、トレイ乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥、または蒸発などの従来の乾燥プロセスまたは方法を使用して、担体の添加の有無にかかわらず乾燥させることができる。
【００６８】
得られた乾燥生成物は、粉砕または顆粒化などによりさらに加工して、特定の粒径または物理的フォーマットを達成することができる。以下に記載する担体は、乾燥後に添加することもできる。
【００６９】
本発明の菌株の発酵ブロスの無細胞調製物は、発酵ブロスの抽出、遠心分離および／または濾過のような当技術分野で公知の任意の手段によって得ることができる。当業者であれば、いわゆる無細胞調製物は、細胞を欠いていなくてもよく、むしろ、細胞を除去するために使用される技術（例えば、遠心分離の速度）に応じて、ほとんど無細胞または本質的に無細胞であることを認識するであろう。得られた無細胞調製物は、乾燥および／または植物または植物成長培地への施用を助ける成分と配合することができる。発酵ブロスのための上記の濃縮方法および乾燥技術は、無細胞調製物にも適用可能である。
【００７０】
一実施形態において、発酵産物は、少なくとも約１×１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（例えば、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株）／ｍＬブロスを含む。別の実施形態において、発酵産物は、少なくとも約１×１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（例えば、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株）／ｍＬブロスを含む。別の実施形態において、発酵産物は、少なくとも約１×１０６  ＣＦＵの微生物（例えば、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株）／ｍＬブロスを含む。さらに別の実施形態において、発酵産物は、少なくとも約１×１０７  ＣＦＵの微生物（例えば、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株）／ｍＬブロスを含む。別の実施形態において、発酵産物は、少なくとも約１×１０８  ＣＦＵの微生物（例えば、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株）／ｍＬブロスを含む。別の実施形態において、発酵産物は、少なくとも約１×１０９  ＣＦＵの微生物（例えば、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株）／ｍＬブロスを含む。別の実施形態において、発酵産物は、少なくとも約１×１０１０  ＣＦＵの微生物（例えば、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株）／ｍＬブロスを含む。別の実施形態において、発酵産物は、少なくとも約１×１０１１  ＣＦＵの微生物（例えば、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株）／ｍＬブロスを含む。
【００７１】
本発明の組成物は、その特定の物理的および／または化学的性質に応じて、それらの配合物の形態またはこれらから調製される使用形態、例えば、エアロゾル、カプセル懸濁液、冷煙霧濃厚剤（ｃｏｌｄ−ｆｏｇｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）、温煙霧濃厚剤（ｗａｒｍ−ｆｏｇｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）、カプセル化顆粒、細粒、種子処理のための流動性濃縮物、即時使用可能な溶液、散粉剤、乳剤、水中油型乳剤、油中水型乳剤、顆粒剤、微粒剤、油分散性散剤、油混和性流動性濃縮物、油混和性液剤、ガス剤（加圧下）、ガス発生剤、フォーム、ペースト、殺虫剤被覆種子、懸濁濃縮物、油性分散物、サスポエマルジョン濃縮物、可溶性濃縮物、懸濁液、湿潤散剤、可溶性散剤、粉剤および顆粒剤、水溶性および水分散性の顆粒または錠剤、種子処理用の水溶性および水分散性の散剤、湿潤散剤、活性成分に含浸させた天然生成物および合成物質、ならびに種子のためのポリマー物質およびコーティング材料中のマイクロカプセル化、ならびにＵＬＶ冷煙霧および温煙霧製剤で使用することができる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は液体製剤である。液体製剤の非限定的な例としては、懸濁濃縮液および油分散液が挙げられる。他の実施形態において、本発明の組成物は固形製剤である。液体製剤の非限定的な例としては、凍結乾燥粉末および噴霧乾燥粉末が挙げられる。
【００７３】
本発明の組成物は、効力、安定性および有用性を改善するために、および／または加工、包装および最終用途への適用を容易にするために、細胞、無細胞調製物または代謝産物を含む組成物に添加された製剤用不活性成分（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｅｒｔ）を含み得る。このような製剤用不活性成分および成分は、個々にまたは組み合わせて添加可能な担体、安定剤、栄養素、または物理的特性改変剤を含み得る。いくつかの実施形態において、担体としては、水、油、および他の有機または無機溶媒などの液体材料、ならびに生物学的または化学合成によって誘導された無機物、ポリマーまたはポリマー複合体などの固体材料を挙げることができる。いくつかの実施形態において、担体は、種子または根などの植物部分への組成物の付着を促進する結合剤または接着剤である。例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：３２１−３３９（１９９０）を参照されたい。安定剤は、固結防止剤、抗酸化剤、乾燥剤、保護剤または防腐剤を含み得る。栄養素としては、糖、多糖、油、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸およびリン酸などの炭素、窒素、およびリン源を挙げることができる。物理的特性改変剤としては、増量剤、湿潤剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、レオロジー調節剤、分散剤、アジュバント、界面活性剤、不凍剤または着色剤を挙げることができる。いくつかの実施形態において、発酵により生成された細胞、無細胞調製物または代謝産物を含む組成物は、希釈剤として水と共に、または水なしで、任意の他の製剤調製をせずに直接使用することができる。いくつかの実施形態において、製剤用不活性成分は、発酵ブロスを濃縮した後、および乾燥中および／または乾燥後に添加される。
【００７４】
すべての植物および植物部分は、本発明に従って処理することができる。本文脈では、植物は、所望および望ましくない野生植物または作物植物（天然に存在する作物植物を含む）などの、すべての植物および植物集団を意味すると理解される。作物植物は、伝統的な育種および最適化法によって、またはバイオテクノロジーおよび組換え法、またはこれらの方法の組み合わせによって得られ得る植物であり、トランスジェニック植物および植物品種改良者の権利によって保護され得るまたはされない植物種を含む。植物部分は、苗条、葉、花および根などの植物の空中および地下の部分および器官のすべてを意味するものとして理解され、例としては、葉、針葉、花軸、茎、花、子実体、果実および種子ならびに根、塊茎および根茎を挙げることができる。植物部分はまた、作物材料および栄養繁殖材料および生殖繁殖材料、例えば、切穂、塊茎、根茎、接ぎ穂および種子を含む。
【００７５】
既に上述したように、すべての植物およびこれらの部分は、本発明に従って処理することができる。好ましい実施形態において、野生株またはハイブリッド形成もしくはプロトプラスト融合などの伝統的な生物学的育種法によって得られる植物種および植物品種、およびそれらの部分が処理される。さらに好ましい実施形態において、適切であれば伝統的な方法（遺伝子組換え生物）と組み合わせて、組換え法によって得られたトランスジェニック植物および植物品種ならびにそれらの部分が処理される。「部分」または「植物の部分」または「植物部分」という用語は、本明細書に上述してある。いずれの場合も市販されているか、または使用中である植物品種の植物は、本発明に従って特に好ましく処理される。植物品種は、伝統的な育種、突然変異誘発または組換えＤＮＡ技術のいずれかによって育種された新規な形質を有する植物を意味すると理解される。これらは品種、種属、生物型、遺伝子型の形をとっている。
【００７６】
本発明による組成物による植物および植物部分の処理は、直接または慣用の処理方法、例えば浸漬、噴霧、霧化、ミスト化、気化、散粉、煙霧、散布、発泡、塗布、拡散、注入、潅注、液滴灌漑、などによって環境、生息場所または貯蔵空間に作用することによって行われ、繁殖材料の場合、特に種子の場合にはさらに、乾燥種子処理方法、湿式種子処理方法、スラリー処理方法、皮殻形成によって、１つまたは複数のコーティングなどでコーティングすることによって行われる。さらに、超低容量法によって活性物質を施用すること、または活性物質調製物または活性物質自体を土壌に注入することが可能である。
【００７７】
植物の好ましい直接処理は、葉塗布処理であり、すなわち、本発明による組成物を葉に施用し、処理頻度および施用量を問題の病原体の感染圧に合わせることが可能である。
【００７８】
全身的に活性な化合物の場合、本発明による組成物は、根系を介して植物に到達する。この場合、植物の処理は、本発明による組成物を植物の環境に作用させることによって行うことができる。これは、例えば土壌または栄養溶液に組み込む潅注、すなわち植物の位置（例えば土壌または水耕栽培システム）に本発明による組成物の液体形態を含浸させることによって、または土壌施用、すなわち、本発明による組成物を、固体形態（例えば、顆粒の形態）で植物の位置に組み込むことによって行うことができる。水稲栽培の場合、これは、本発明による組成物を固体使用形態（例えば、顆粒の形態）で浸水した水田に計量することによって行うこともできる。
【００７９】
好ましい植物は、有用植物、観賞植物、芝、公共および家庭内で観賞植物として用いられる一般に使用される樹木、および森林樹木の群からの植物である。森林樹木は、木材、セルロース、紙および木の一部から作られた製品の生産のための木を含む。
【００８０】
本文脈において使用される用語「有用植物」は、食料、飼料、燃料を得るための、または工業目的のための植物として使用される作物植物を指す。
【００８１】
本発明の組成物および方法で処理および／または改良することができる有用植物としては、例えば、以下のタイプの植物を挙げることができる：芝、ブドウ、穀物、例えばコムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、米、トウモロコシおよびキビ／ソルガム；ビート、例えばテンサイおよび飼料ビート；果実、例えば、仁果類、核果および軟質果実、例えば、リンゴ、ナシ、プラム、桃、アーモンド、サクランボおよびベリー類、例えば、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリーなど；豆科植物、例えば、豆類、レンズ豆、エンドウ豆および大豆；油糧種子、例えば、ナタネ、マスタード、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマシ油植物、カカオおよびピーナッツ；ウリ科植物、例えば、カボチャ／スカッシュ、キュウリおよびメロン；繊維植物、例えば綿、亜麻、麻およびジュート；柑橘類、例えば、オレンジ、レモン、グレープフルーツおよびタンジェリン；野菜類、例えば、ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ種、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモおよびピーマン；クスノキ科、例えば、アボカド、シナモン、樟脳、またはタバコ、ナッツ、コーヒー、ナス、サトウキビ、茶、コショウ、ブドウ、ホップ、バナナ、ラテックス植物および観賞植物、例えば花、低木、落葉樹および針葉樹などの他の植物。この列挙は限定的ではない。
【００８２】
以下の植物は、本発明の組成物および方法を適用するための特に適切な標的作物であると考えられる：綿、ナス、芝、仁果類、核果、軟質果実、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、キュウリ、タバコ、ブドウ、米、穀類、ナシ、豆類、大豆、アブラナ、トマト、ピーマン、メロン、キャベツ、ジャガイモおよびリンゴ。
【００８３】
本発明の方法に従って改良することができる樹木の例は、モミ属種（Ａｂｉｅｓ  ｓｐ．）、ユーカリ属種（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐ．）、トウヒ属種（Ｐｉｃｅａ  ｓｐ．）、マツ属種（Ｐｉｎｕｓ  ｓｐ．）、トチノキ属種（Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｓｐ．）、スズカケノキ属種（Ｐｌａｔａｎｕｓ  ｓｐ．）、シナノキ属種（Ｔｉｌｉａ  ｓｐ．）、カエデ属種（Ａｃｅｒ  ｓｐ．）、ツガ属種（Ｔｓｕｇａ  ｓｐ．）、トリネコ属種（Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｓｐ．）、ナナカマド属種（Ｓｏｒｂｕｓ  ｓｐ．）、カバノキ属種（Ｂｅｔｕｌａ  ｓｐ．）、サンザシ属種（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ  ｓｐ．）、ニレ属種（Ｕｌｍｕｓ  ｓｐ．）、コナラ属種（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｐ．）、ブナ属種（Ｆａｇｕｓ  ｓｐ．）、ヤナギ属種（Ｓａｌｉｘ  ｓｐ．）ハコヤナギ属種（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐ．）である。
【００８４】
本発明の方法に従って改良することができる好ましい樹木は、樹木種トチノキ属（Ａｅｓｃｕｌｕｓ）由来：Ａ．ヒッポカスタヌム（Ａ．ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）、Ａ．パリフロラ（Ａ．ｐａｒｉｆｌｏｒａ）、Ａ．カルネア（Ａ．ｃａｒｎｅａ）；樹木種スズカケノキ属（Ｐｌａｔａｎｕｓ）由来：Ｐ．アセリフロラ（Ｐ．ａｃｅｒｉｆｌｏｒａ）、Ｐ．オクシデンタリス（Ｐ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、Ｐ．ラセモア（Ｐ．ｒａｃｅｍｏｓａ）；樹木種トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）由来：Ｐ．アビエス（Ｐ．ａｂｉｅｓ）；樹種マツ属（Ｐｉｎｕｓ）由来：Ｐ．ラジアータ（Ｐ．ｒａｄｉａｔａ）、Ｐ．ポンデローサ（Ｐ．ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、Ｐ．コントルタ（Ｐ．ｃｏｎｔｏｒｔａ）、Ｐ．シルヴェストル（Ｐ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ）、Ｐ．エリオッティ（Ｐ．ｅｌｌｉｏｔｔｉｉ）、Ｐ．モンチコラ（Ｐ．ｍｏｎｔｅｃｏｌａ）、Ｐ．アルビカウリス（Ｐ．ａｌｂｉｃａｕｌｉｓ）、Ｐ．レジノーサ（Ｐ．ｒｅｓｉｎｏｓａ）、Ｐ．パルストリス（Ｐ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、Ｐ．テーダ（Ｐ．ｔａｅｄａ）、Ｐ．フレキシリス（Ｐ．ｆｌｅｘｉｌｉｓ）、Ｐ．ジェフレギ（Ｐ．ｊｅｆｆｒｅｇｉ）、Ｐ．バクシアナ（Ｐ．ｂａｋｓｉａｎａ）、Ｐ．ストロブス（Ｐ．ｓｔｒｏｂｕｓ）；樹木種ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）由来：Ｅ．グランディス（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）、Ｅ．グロブルス（Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、Ｅ．カマデンチス（Ｅ．ｃａｍａｄｅｎｔｉｓ）、Ｅ．ニテンス（Ｅ．ｎｉｔｅｎｓ）、Ｅ．オブリクア（Ｅ．ｏｂｌｉｑｕａ）、Ｅ．レグナンス（Ｅ．ｒｅｇｎａｎｓ）、Ｅ．ピルラルス（Ｅ．ｐｉｌｕｌａｒｕｓ）から得ることができる。
【００８５】
本発明の方法に従って改良することができる特に好ましい樹木は、樹木種マツ属（Ｐｉｎｕｓ）由来：Ｐ．ラジオタ、Ｐ．ポンデローサ、Ｐ．コントルタ、Ｐ．シベレス、Ｐ．ストロバス；樹木種ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）由来：Ｅ．グランディス、Ｅ．グロブルス、Ｅ．カマデンチスである。
【００８６】
本発明の方法に従って改善することができる非常に特に好ましい樹木は、セイヨウトチノキ、スズカケノキ科（Ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）、菩提樹、楓である。
【００８７】
本発明は、寒地型芝草および暖地型芝草を含む任意の芝草に施用することもできる。寒地型芝草の例としては、ケンタッキーブルーグラス（ポア・プラテンシスＬ．（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ  Ｌ．））、オオスズメノカタビラ（ポア・トリビアリスＬ．（Ｐｏａ  ｔｒｉｖｉａｌｉｓ  Ｌ．））、カナダブルーグラス（ポア・コンプレッサＬ．（Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ  Ｌ．））、スズメノカタビラ（ポア・アンヌアＬ．（Ｐｏａ  ａｎｎｕａ  Ｌ．））、アップランドブルーグラス（ポア・グラウカンタ  ガウジン（Ｐｏａ  ｇｌａｕｃａｎｔｈａ  Ｇａｕｄｉｎ））、ウッドブルーグラス（ポア・ネモラリスＬ．（Ｐｏａ  ｎｅｍｏｒａｌｉｓ  Ｌ．））およびバルバスブルーグラス（ポア・ブルボサＬ．（Ｐｏａ  ｂｕｌｂｏｓａ  Ｌ．））などのブルーグラス類（ポア属種（Ｐｏａ  ｓｐｐ．））；クリーピングベントグラス（アグロスティス・パルストリスＨｕｄｓ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｈｕｄｓ．））、コロニアルベントグラス（アグロスティス・テヌイスＳｉｂｔｈ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｎｕｉｓ  Ｓｉｂｔｈ．））、ベルベットベントグラス（アグロスティス・カニナＬ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｎｉｎａ  Ｌ．））、サウスジャーマンミックスドベントグラス（アグロスティス・テニウスＳｉｂｔｈ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｎｉｕｓ  Ｓｉｂｔｈ．）、アグロスティス・カニナＬ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｎｉｎａ  Ｌ．）およびアグロスティス・パルストリスＨｕｄｓ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｈｕｄｓ．））を含むアグロスティス属種（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、およびコヌカグサ（アグロスティス・アルバＬ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ  Ｌ．））などのベントグラス類（アグロスティス属種（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｐｐ．））；
レッドフェスク（フェストゥカ・ルブラＬ．属種ルブラ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ  Ｌ．ｓｐｐ．ｒｕｂｒａ））、クリーピングフェスク（フェストゥカ・ルブラＬ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ  Ｌ．））、チューイングスフェスク（フェストゥカ・ルブラ・コミュタタＧａｕｄ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ  ｃｏｍｍｕｔａｔａ  Ｇａｕｄ．））、シープフェスク（フェストゥカ・オビナＬ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｏｖｉｎａ  Ｌ．））、ハードフェスク（フェストゥカ・ロンギホリアＴｈｕｉｌｌ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ  Ｔｈｕｉｌｌ．））、ヘアフェスク（フェストゥカ・カピラタＬａｍ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｃａｐｉｌｌａｔａ  Ｌａｍ．））、トールフェスク（フェストゥカ・アルンジナセアＳｃｈｒｅｂ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ  Ｓｃｈｒｅｂ．））およびメドウフェスク（フェストゥカ・エラノルＬ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｎｏｒ  Ｌ．））などのウシノケグサ類（フェストゥカ属種（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｓｐｐ．））；
ネズミムギ（ロリウム・ムルチフロルムＬａｍ．（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌａｍ．））、ホソムギ（ロリウム・ペレンＬ．（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ  Ｌ．））およびイタリアンライグラス（ロリウム・ムルチフロルムＬａｍ．（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌａｍ．））などのドクムギ類（ロリウム属種（Ｌｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．））；
ならびにフェアウェイウィートグラス（アグロピュロン・クリスタツム（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ．（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｃｒｉｓｔａｔｕｍ（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ．））、クレステッドウィートグラス（アグロピュロン・デセルトルム（Ｆｉｓｃｈ．）Ｓｃｈｕｌｔ．（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｄｅｓｅｒｔｏｒｕｍ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｓｃｈｕｌｔ．）およびウェスタンウィートグラス（アグロピュロン・スミチイＲｙｄｂ．（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｓｍｉｔｈｉｉ  Ｒｙｄｂ．））などのカモジグサ類（アグロピュロン属種（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｓｐｐ．））である。
【００８８】
さらなる寒地型芝草の例は、ビーチグラス（アンモフィラ・ブレビリグラタＦｅｒｎ．（Ａｍｍｏｐｈｉｌａ  ｂｒｅｖｉｌｉｇｕｌａｔａ  Ｆｅｒｎ．））、スムーズブロムグラス（ブロムス・イネルミスＬｅｙｓｓ．（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ  Ｌｅｙｓｓ．））、オオアワガエリ（プレウム・プラテンスＬ．（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ  Ｌ．））、サンドカットテイル（プレウム・スブラツムＬ．（Ｐｈｌｅｕｍ  ｓｕｂｕｌａｔｕｍ  Ｌ．））、カモガヤ（ダクチルイス・グロメラタＬ．（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ  Ｌ．））、アレチタチドジョウツナギ（プッシネリア・ジスタンス（Ｌ．）Ｐａｒｌ．（Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ  ｄｉｓｔａｎｓ（Ｌ．）Ｐａｒｌ．））およびクシガヤ（シノスルス・クリスタツスＬ．（Ｃｙｎｏｓｕｒｕｓ  ｃｒｉｓｔａｔｕｓ  Ｌ．））などのガマである。
【００８９】
暖地型芝草の例は、ギョウギシバ（キュノドン属種Ｌ．Ｃ．Ｒｉｃｈ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｓｐｐ．Ｌ．Ｃ．Ｒｉｃｈ））、ノシバ（ゾイシア属種Ｗｉｌｌｄ．（Ｚｏｙｓｉａ  ｓｐｐ．Ｗｉｌｌｄ．））、イヌシバ（ステノタフルム・セクンダツム・ワルト・クントズ（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ  ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ  Ｗａｌｔ  Ｋｕｎｔｚｅ））、センチピードグラス（エレモクロア・オフィウロイデス・ムンロＨａｃｋ．（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ  ｏｐｈｉｕｒｏｉｄｅｓ  Ｍｕｎｒｏ  Ｈａｃｋ．））、カーペットグラス（アキソノプス・アフィニス・カーゼ（Ａｘｏｎｏｐｕｓ  ａｆｆｉｎｉｓ  Ｃｈａｓｅ））、バヒアグラス（パスパルム・ノタツム・フルッグ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ  Ｆｌｕｇｇｅ））、キクユグラス（ペンニセツム・クランデスチヌムＨｏｃｈｓｔ．ｅｘ  Ｃｈｉｏｖ．（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｃｌａｎｄｅｓｔｉｎｕｍ  Ｈｏｃｈｓｔ．ｅｘ  Ｃｈｉｏｖ．））、バッファローグラス（ブクロ・ダクチルオイドス（Ｎｕｔｔ．）Ｅｎｇｅｌｍ．（Ｂｕｃｈｌｏｅ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｓ（Ｎｕｔｔ．）Ｅｎｇｅｌｍ．））、メダカスゲ（ボウテロウア・グラシリス（Ｈ．Ｂ．Ｋ．）Ｌａｇ．ｅｘ  グリフィトス（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ（Ｈ．Ｂ．Ｋ．）Ｌａｇ．ｅｘ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ））、シーショアパスパラム（パスパルム・バギナツム・スワルトズ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｖａｇｉｎａｔｕｍ  Ｓｗａｒｔｚ））およびアゼガヤモドキ（ボウテロウア・クルチペンズラ（Ｍｉｃｈｘ．Ｔｏｒｒ．）（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｃｕｒｔｉｐｅｎｄｕｌａ（Ｍｉｃｈｘ．Ｔｏｒｒ．）））である。寒地型芝草は概して、本発明による使用に好ましい。特に好ましいのは、ブルーグラス、ベントグラスおよびコヌカグサ、ウシノケグサ類およびドクムギ類である。ベントグラスが特に好ましい。
【００９０】
本発明の組成物は、強力な殺菌活性を有し、作物保護および材料の保護における望ましくない微生物、例えば、真菌および細菌の防除に使用することができる。
【００９１】
本発明はまた、本発明の組成物が、植物病原性真菌、植物病原性細菌および／またはこれらの生息地に施用されることを特徴とする、望ましくない微生物を防除する方法に関する。
【００９２】
殺真菌剤は、植物病原性真菌の防除のための作物保護に使用することができる。それらは、特に、ネコブカビ類（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ペロノスポラミセテス（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）（異名卵菌類）、ツボカビ類（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌類（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）および不完全菌類（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）（異名Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）のメンバーである土壌媒介性病原体を含む、広域スペクトルの植物病性真菌に対する傑出した効力により特徴付けられる。いくつかの殺真菌剤は、全身的に活性であり、葉面、種子粉衣または土壌殺真菌剤として植物保護に使用することができる。さらに、それらはとりわけ木材または植物の根に蔓延する真菌との戦いに適している。
【００９３】
殺菌剤は、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ツツジ科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、コリネバクテリア科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）およびストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）の防除のための作物保護に使用することができる。
【００９４】
本発明に従って処理することができる真菌病害の病原体の非限定的な例には以下のものが含まれる：
うどんこ病病原体により引き起こされる病害、例えば、ブルメリア属種（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）；ポドスパエラ属種（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばポドスパエラ・レウコトリカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）；スパエロテカ属種（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばスパエロテカ・フリギネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）；ウンキヌラ属種（Ｕｎｃｉｎｕｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばウンキヌラ・ネカトル（Ｕｎｃｉｎｕｌａ  ｎｅｃａｔｏｒ）；
さび病病原体により引き起こされる病害、例えば、ギュムノスポランギウム属種（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばギュムノスポランギウム・サビナエ（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｓａｂｉｎａｅ）；ヘミレイア属種（Ｈｅｍｉｌｅｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばヘミレイア・ワスタトリクス（Ｈｅｍｉｌｅｉａ  ｖａｓｔａｔｒｉｘ）；パコプソラ属種（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばパコプソラ・パキュリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）およびパコプソラ・メイボミアエ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｍｅｉｂｏｍｉａｅ）；プッキニア属種（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばプッキニア・レコンジタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔｅ）、Ｐ．トリチシナ（Ｐ．ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）、Ｐ．グラミニス（Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）またはＰ．ストリフォルミス（Ｐ．ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）；ウロミセス属種（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばウロミセス・アペンジクラツス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）；
卵菌類の群由来の病原体により引き起こされる病害、例えば、アルブゴ属種（Ａｌｂｕｇｏ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアルブゴ・カンディダ（Ａｌｇｕｂｏ  ｃａｎｄｉｄａ）；ブレミア属種（Ｂｒｅｍｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばブレミア・ラクトゥカエ（Ｂｒｅｍｉａ  ｌａｃｔｕｃａｅ）；ペロノスポラ属種（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばペロノスポラ・ピシ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｉｓｉ）またはＰ．ブラシカエ（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ）；フィトフトラ属種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）；プラスモパラ属各種（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばプラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ）；シュードペロノスポラ属種（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばシュードペロノスポラ・フムリ（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｕｍｕｌｉ）またはシュードペロノスポラ・クベンシス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）；ピシウム属種（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばピシウム・ウルティムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）；
例えば以下のものより引き起こされる斑点病および葉萎凋病、アルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；セルコスポラ属種（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばセルコスポラ・ベティコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）；クラジオスポリウム属各種（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばクラジオスポリウム・ククメリヌム（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）；コクリオボラス属種（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばコクリオボラス・サティバス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（分生子形態：ドレクスレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、異名：ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））、コクリオボラス・ミヤベアヌス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ）；コレトトリカム属種（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばコレトトリカム・リンデムタニウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌｉｎｄｅｍｕｔｈａｎｉｕｍ）；シクロコニウム属種（Ｃｙｃｌｏｃｏｎｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばシクロコニウム・オレアギヌム（Ｃｙｃｌｏｃｏｎｉｕｍ  ｏｌｅａｇｉｎｕｍ）；ディアポルテ属種（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばディアポルテ・シトリ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｃｉｔｒｉ）；エルシノエ属種（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばエルシノエ・ファウセッチイ（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｆａｗｃｅｔｔｉｉ）；グロエオスポリウム属種（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばグロエオスポリウム・ラエチコロル（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌａｅｔｉｃｏｌｏｒ）；グロメレラ属種（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばグロメレラ・シングラータ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ）；グイグナルディア属種（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばグイグナルディア・ビドウェリ（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ  ｂｉｄｗｅｌｌｉ）；レプトスファエリア属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばレプトスファエリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）、レプトスファエリア・ノドラム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）；マグナポルテ属種（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）；マルソニア属種（Ｍａｒｓｓｏｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばマルソニア・コロナリア（Ｍａｒｓｓｏｎｉａ  ｃｏｒｏｎａｒｉａ）；ミクロドキウム属種（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）；ミコスフェレラ属種（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、Ｍ．アラキジコラ（Ｍ．ａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ）およびＭ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）；ファエオスフェリア属種（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ���、例えばファエオスフェリア・ノドラム（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）；ピレノフォラ属種（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばピレノフォラ・テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｅｒｅｓ）、ピレノフォラ・トリチシ・リペンティス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｒｉｔｉｃｉ  ｒｅｐｅｎｔｉｓ）；ラムラリア属種（Ｒａｍｕｌａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばラムラリア・コロ−シグニ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ  ｃｏｌｌｏ−ｃｙｇｎｉ）、ラムラリア・アレオラ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ  ａｒｅｏｌａ）；リンコスポリウム属種（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばリンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｅｃａｌｉｓ）；セプトリア属種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばセプトリア・アピイ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ａｐｉｉ）、セプトリア・リコペルシイ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｉ）；チフラ属種（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばチフラ・インカルナタ（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）；ベンツリア属種（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばベンツリア・イナエカリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）；
例えば以下のものにより引き起こされる根および茎の病害、コルシキウム属種（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばコルシキウム・グラミネアルム（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）；フサリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）；ゲウマノミセス属種（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）；リゾクトニア属種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；例えばサロクラジウム・オリゼ（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）により引き起こされるサロクラジウム病；例えばスクレロチウム・オリゼ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）により引き起こされるスクレロチウム病；タペシア属種（Ｔａｐｅｓｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばタペシア・アクフォルミス（Ｔａｐｅｓｉａ  ａｃｕｆｏｒｍｉｓ）；チエラビオプシス属種（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばチエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｂａｓｉｃｏｌａ）；
例えば以下のものに引き起こされる穂および円錐花序の病害（トウモロコシ穂軸を含める。）、アルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）例えば、アルテルナリア種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｐ．）；アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）；クラドスポリウム属種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばクラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）；クラビセプス属種（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばクラビセプス・プルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）；フサリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）；ジベレラ属種（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）；モノグラフェラ属種（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばモノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｉｓ）；セプトリア属種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばセプトリア・ノドルム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）；
例えば以下のものなどの黒穂菌類により引き起こされる病害、スファセロテカ属種（Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばスファセロテカ・レイリアナ（Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ  ｒｅｉｌｉａｎａ）；チレチア属種（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばチレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）、Ｔ．コントロベルサ（Ｔ．ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）；ウロシスティス属種（Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばウロシスティス・オックルタ（Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｏｃｃｕｌｔａ）；ウスティラゴ属種（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばウスティラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｎｕｄａ）、Ｕ．ヌダ  トリチシ（Ｕ．ｎｕｄａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）；
例えば以下のものにより引き起こされる果実腐敗、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）；ボトリティス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばボトリティス・シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）；ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばペニシリウム・エクスパンスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）およびＰ．プルプロゲヌム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）；スクレロチニア属種（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばスクレロチニア・スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）；バーティシリウム属種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばバーティシリウム・アルボアトルム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ  ａｌｂｏａｔｒｕｍ）；
例えば以下のものにより引き起こされる種子および土壌媒介性の腐敗、カビ、萎凋、腐敗および苗立ち枯れ病、アルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアルテルナリア・ブラシキコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）；アファノミセス属種（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアファノミセス・エウテイケス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｔｅｉｃｈｅｓ）により引き起こされる；アスコキタ属種（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアスコキタ・レンティス（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｌｅｎｔｉｓ）により引き起こされる；アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）により引き起こされる；クラドスポリウム属種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばクラドスポリウム・ヘルバルム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）により引き起こされる；コクリオボルス属種（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばコクリオボルス・サチブス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、（分生子形態：ドレクスレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）異名：ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））により引き起こされる；コレトトリカム属種（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばコレトトリカム・コッコデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｏｃｃｏｄｅｓ）により引き起こされる；フサリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）により引き起こされる；ジベレラ属種（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）により引き起こされる；マクロフォミナ属種（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばマクロフォミナ・ファゼオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）により引き起こされる；モノグラフェラ属種（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばモノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｉｓ）により引き起こされる；ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばペニシリウム・エクスパンスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）により引き起こされる；フォーマ属種（Ｐｈｏｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフォーマ・リンガム（Ｐｈｏｍａ  ｌｉｎｇａｍ）により引き起こされる；フォモプシス属種（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフォモプシス・ソイヤエ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｏｊａｅ）により引き起こされる；フィトフトラ属種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフィトフトラ・カクトルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｃｔｏｒｕｍ）により引き起こされる；ピュレノフォラ属種（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばピュレノフォラ・グラミネア（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｇｒａｍｉｎｅａ）により引き起こされる；ピリクラリア属種（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばピリクラリア・オリゼ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）により引き起こされる；ピシウム属種（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばピシウム・ウルティムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）により引き起こされる；リゾクトニア属種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）により引き起こされる；リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）により引き起こされる；スクレロチウム属種（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばスクレロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）により引き起こされる；セプトリア属種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばセプトリア・ノドルム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）により引き起こされる；テュプラ属各種（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばテュプラ・インカルナタ（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）により引き起こされる；ウェルティキッリウム属各種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばウェルティキッリウム・ダリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）により引き起こされる；
例えばネクトリア属種（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばネクトリア・ガリゲナ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｇａｌｌｉｇｅｎａ）により引き起こされるがん腫病、虫こぶおよびてんぐ巣病、；
例えばモニリニア属種（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばモニリニア・ラクサ（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｌａｘａ）により引き起こされる萎凋、；
例えば、エクソバシディウム属種（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばエクソバシディウム・ベクサンス（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｖｅｘａｎｓ）により引き起こされる葉のブリスターまたはリーフカール病害、；
タフリナ属種（Ｔａｐｈｒｉｎａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばタフリナ・デフォルマンス（Ｔａｐｈｒｉｎａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）；
例えば以下のものにより引き起こされる木本植物の衰退性病害、例えばパエモニエラ・クラミドスポラ（Ｐｈａｅｍｏｎｉｅｌｌａ  ｃｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ）、パエオアクレモニウム・アレオピルム（Ｐｈａｅｏａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｅｏｐｈｉｌｕｍ）およびフォミチポリア・メジテラネア（Ｆｏｍｉｔｉｐｏｒｉａ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）により引き起こされるエスカ病；ユーティパ・ラタ（Ｅｕｔｙｐａ  ｌａｔａ）によって引き起こされるユーティパダイバック（Ｅｕｔｙｐａ  ｄｙｅｂａｃｋ）；ガノデルマ・ボニネンス（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）によって引き起こされる霊芝病；例えばリジドポルス・リグノサス（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｕｓ）によって引き起こされるリジドポラス病；
例えばボトリティス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばボトリティス・シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）により引き起こされる花および種子の病害、；
例えば以下のものにより引き起こされる塊茎の病害、リゾクトニア属種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；ヘルミントスポリウム属種（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばヘルミントスポリウム・ソラニ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）；
例えば、プラスモディオフォラ属種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、プラスモディオフォラ・ブラシカエ（Ｐｌａｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）により引き起こされる根こぶ、；
例えば以下のものなどの細菌性病原体により引き起こされる病害、キサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばキサントモナス・カンペストリス・パソバー・オリゼ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）；シュードドモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばシュードモナス・シリンゲ・パソバー・ラクリマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｌａｃｈｒｙｍａｎｓ）；エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばエルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）。
【００９５】
以下の大豆の病害を優先的に防除することができる：
例えば、以下のものにより引き起こされる、葉、茎、さやおよび種子における真菌性病害、アルテルナリア斑点病（アルテルナリア属種アトランス・テヌイシッマ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｅｃ．ａｔｒａｎｓ  ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ））、炭疽病（コレトトリカム・グロエオスポロイデス・デマチウム変種トルンカツム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｏｉｄｅｓ  ｄｅｍａｔｉｕｍ  ｖａｒ．ｔｒｕｎｃａｔｕｍ））、褐斑病（セプトリア・グリシネス（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、紫斑病（セルコスポラ・キクチイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｋｉｋｕｃｈｉｉ））、コアネフォラ葉枯病（コアネフォラ・インフンディブリフェラ・トリスポラ（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ  ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｉｆｅｒａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）（異名））、ダクツリオフォラ斑点病（ダクツリオフォラ・グリシネス（Ｄａｃｔｕｌｉｏｐｈｏｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、べと病（ペロノスポラ・マンスリカ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ））、ドレクスレラ胴枯病（ドレクスレラ・グリシニ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｉ））、斑点病（セルコスポラ・ソイナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｊｉｎａ））、そばかす病（レプトスファエルリナ・トリフォリイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ））、灰星病（フィロスチクタ・ソジャエコラ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ  ｓｏｊａｅｃｏｌａ））、黒点病（フォモプシス・ソジャエ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｏｊａｅ））、うどんこ病（ミクロスファエラ・ディフサ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ  ｄｉｆｆｕｓａ））、ピレノカエタ斑点病（ピレノカエタ・グリシネス（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、葉腐病（リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ））、さび病（ファコプソラ・パキリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、ファコプソラ・メイボミアエ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｍｅｉｂｏｍｉａｅ））、黒星病（スファセロマ・グリシネス（Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、ステムフィリウム葉枯病（ステムフィリウム・ボトリオスム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｂｏｔｒｙｏｓｕｍ））、褐色輪紋病（コリネスポラ・カッシコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ  ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ））。
【００９６】
例えば以下のものに引き起こされる根および茎基部における真菌性病害、黒根腐病（カロネクトリア・クロタラリアエ（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ  ｃｒｏｔａｌａｒｉａｅ））、炭腐病（マクロフォミナ・ファゼオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ））、赤かび病（フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・オルトセラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｒｔｈｏｃｅｒａｓ）、フサリウム・セミテクタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ）、フサリウム・エクイセチ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ））、ミコレプトジスクス根腐病（ミュコレプトジスカス・テレストリス（Ｍｙｃｏｌｅｐｔｏｄｉｓｃｕｓ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ））、根腐病（ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ））、黒点病（ディアポルテ・パセオロルム（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ））、茎腐爛病（ディアポルテ・ファセオロルム・変種カウリボラ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ  ｖａｒ．ｃａｕｌｉｖｏｒａ））、茎疫病（フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ））、落葉病（ピアロファオラ・グレガタ（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ））、根茎腐敗病（ピシウム・アファニデルマトム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、ピシウム・イッレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ピシウム・デバリアヌム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ）、ピシウム・ミリオチルム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｍｙｒｉｏｔｙｌｕｍ）、ピシウム・ウルティムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ））、リゾクトニア根腐病（リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ））、菌核病（スクレロチニア・スクレロチオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ））、スクレロチニアサウザンブライト病（スクレロチニア・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｒｏｌｆｓｉｉ））、チエラビオプシス根腐病（ティエラウィオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｂａｓｉｃｏｌａ））。
【００９７】
本発明の殺真菌性組成物は、植物病原性真菌の治癒的または防御的／予防的防除に使用することができる。したがって、本発明はまた、種子、植物もしくは植物部分、果実または植物が成長する土壌に施用される本発明の組成物の使用によって植物病原性真菌を防除するための治癒的および防御的方法に関する。
【００９８】
組成物が、植物病害を防除するために必要な濃度で植物に十分耐容されているという事実は、植物の地上部分、繁殖ストックおよび種子および土壌の処理を可能にする。
【００９９】
本発明によれば、栽培品種および植物品種（植物品種または植物育種者の権利によって保護可能であるか否かにかかわらず）を含む、すべての植物および植物部分を処理することができる。栽培品種および植物品種は、倍加半数体、プロトプラスト融合体、ランダムおよび指向性突然変異誘発、分子または遺伝子マーカーの使用による、または生物工学および遺伝子工学による、１または複数のバイオテクノロジー方法によって支援または補完できる従来の増殖および育種法によって得られる植物であり得る。
【０１００】
特定の態様において、本発明の組成物は、約１×１０８〜約１×１０１４コロニー形成単位（ＣＦＵ）の殺真菌性パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株／ヘクタールで施用される。他の態様において、本発明の組成物は、約１×１０９〜約１×１０１３コロニー形成単位（ＣＦＵ）の殺真菌性パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株／ヘクタールで施用される。さらに他の態様において、本発明の組成物は、約１×１０１０〜約１×１０１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）の殺真菌性パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはこの殺真菌性突然変異株／ヘクタールで施用される。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、約０．１ｋｇ〜約１０ｋｇの発酵固形分／ヘクタールで施用される。他の実施形態において、本発明の組成物は、約０．２５ｋｇ〜約７．５ｋｇの発酵固形分／ヘクタールで施用される。さらに他の実施形態において、本発明の組成物は、約０．５ｋｇ〜約５ｋｇの発酵固形分／ヘクタールで施用される。本発明の組成物は、約１ｋｇまたは約２ｋｇの発酵固形分／ヘクタールで施用することもできる。
【０１０２】
本発明の組成物は、植物が良好な耐容性を示す場合、好都合な恒温毒性を有し、環境に十分認容性であり、植物および植物器官を保護し、収穫高を向上させ、収穫した材料の品質を改善するのに適している。本発明の組成物は、好ましくは、作物保護組成物として使用することができる。それらは、通常の感受性の高い種および耐性の種に対して、ならびに発達の全段階またはいくつかの段階に対して活性である。
【０１０３】
本発明に従って処理可能な植物としては、下記の主要な作物が挙げられる：トウモロコシ、大豆、アルファルファ、綿、ヒマワリ、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（例えばキャノーラ、ナタネ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、Ｂ．ジャンクア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）例えば、（菜の花、カラシナ）およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）などのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）油種子、ヤシ科種（Ａｒｅｃａｃｅａｅ  ｓｐ．）（アブラヤシ、ココナッツ）、米、コムギ、テンサイ、サトウキビ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、キビおよびモロコシ、ライコムギ、亜麻、ナッツ、ブドウおよびブドウの木および種々の植物分類群、例えば、ロサケアエ属種（Ｒｏｓａｃｅａｅ  ｓｐ．）からのさまざまな果実および野菜（例えば、リンゴおよびナシのような仁果類だけでなく、アンズ、サクランボ、アーモンド、プラムおよび桃などの核果類、ならびにイチゴ、ラズベリー、レッドカーラントラントおよびブラックカーラントならびにグーズベリーなどのベリー果実）、リベシオイダエ属種（Ｒｉｂｅｓｉｏｉｄａｅ  ｓｐ．）、ユグランダセアエ属種（Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ  ｓｐ．）、ベトゥラセアエ属種（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ  ｓｐ．）、アナカルディアセアエ属種（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）、ファガセアエ属種（Ｆａｇａｃｅａｅ  ｓｐ．）、モラセアエ属種（Ｍｏｒａｃｅａｅ  ｓｐ．）、オレアセアエ属種（Ｏｌｅａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えばオリーブの木）、アクティニダケアエ属種（Ａｃｔｉｎｉｄａｃｅａｅ  ｓｐ．）、ラウラセアエ属種（Ｌａｕｒａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えばアボカド、シナモン、ショウノウ）、ムサセアエ属種（Ｍｕｓａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えば、バナナの木およびバナナプランテーション）、ルビアセアエ属種（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えば、コーヒー）、テアセアエ属種（Ｔｈｅａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えば茶）、ステルクリセアエ属種（Ｓｔｅｒｃｕｌｉｃｅａｅ  ｓｐ．）、ルタセアエ属種（Ｒｕｔａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えば、レモン、オレンジ、マンダリンおよびグレープフルーツ）；ソラナセアエ属種（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えば、トマト、ジャガイモ、ペッパー、トウガラシ、ナス、タバコ）、リリアセアエ属種（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）、コンポジタエ属種（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ  ｓｐ．）（例えば、レタス、アーティチョークおびチコリ、例えばルートチコリ、エンダイブおよび一般的チコリ）、ウムベリフェラエ属種（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ  ｓｐ．）（例えば、ニンジン、パセリ、セロリおよび根用セロリ）、ククルビタケアエ属種（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えば、キュウリ、例えば、ガーキン、カボチャ、スイカ、ヒョウタンおよびメロン）、アッリアケアエ属種（Ａｌｌｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えば、ニラネギおよびタマネギ）、クルキフェラエ属種（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ  ｓｐ．）（白キャベツ、赤キャベツ、ブロッコリ、カリフラワー、芽キャベツ、チンゲンサイ、コールラビ、ダイコン、ホースラディッシュ、クレスおよびハクサイ）、レグミノサエ属種（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ  ｓｐ．）（例えば、ピーナッツ、エンドウ豆、レンズ豆および豆類、例えばインゲン豆およびソラ豆）、ケノポディアケアエ属種（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えば、スイス・チャード、飼料用ビート、ホウレンソウ、ビートルート）、亜麻科（Ｌｉｎａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えば麻）、アサ科（Ｃａｎｎａｂｅａｃｅａ  ｓｐ．）（例えば大麻）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例えばオクラ、ココア）、パパビリセワエ（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）（例えばケシ）、アスパラガセアエ（Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ）（例えば、アスパラガス）；および芝草、芝生、草を含む庭および森林の有用植物および観賞植物およびステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）；ならびにいずれの場合もこれらの植物の遺伝子改変型。
【０１０４】
特定の態様において、発酵産物は、さらに、製剤成分を含む。製剤成分は、湿潤剤、増量剤、溶媒、自発性促進剤、乳化剤、分散剤、霜防止剤、増粘剤、および／またはアジュバントであってよい。一実施形態において、製剤成分は湿潤剤である。他の態様において、発酵産物は、凍結乾燥粉末または噴霧乾燥粉末である。
【０１０５】
本発明の組成物は、回復、効力または物理的特性を改善するために、および／または加工、包装および投与を助けるために、本発明の組成物に添加される製剤成分を含み得る。このような製剤成分は、個別にまたは組み合わせて添加することができる。
【０１０６】
製剤成分は、効力、安定性および物理的特性、有用性を改善するために、および／または加工、包装および最終用途への適用を容易にするために、細胞、無細胞調製物、単離化合物および／または代謝産物を含む組成物に添加することができる。このような製剤成分は、農業的に許容される担体、不活性成分、安定剤、防腐剤、栄養素または物理的特性改変剤を含み得、個別にまたは組み合わせて添加することができる。いくつかの実施形態において、担体としては、水、油、および他の有機または無機溶媒などの液体材料、ならびに生物学的または化学合成によって誘導された無機物、ポリマーまたはポリマー複合体などの固体材料を挙げることができる。いくつかの実施形態において、製剤成分は、葉、種子、または根などの植物部分への組成物の付着を促進する結合剤、アジュバント、または接着剤である。例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，２８：３２１−３３９（１９９０）を参照されたい。安定剤は、固結防止剤、抗酸化剤、沈降防止剤、消泡剤、乾燥剤、保護剤または防腐剤を含み得る。栄養素は、糖、多糖、油、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸およびリン酸などの炭素、窒素、およびリン源を含むことができる。物理的特性改変剤としては、増量剤、湿潤剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、レオロジー調整剤、分散剤、アジュバント、界面活性剤、フィルム形成剤、ヒドロトロープ、ビルダー、不凍剤または着色剤を挙げることができる。いくつかの実施形態において、発酵により製造された細胞、無細胞調製物および／または代謝産物を含む組成物は、他の製剤調製なしに希釈剤として水と共にまたは水なしで直接使用することができる。特定の実施形態において、凍結乾燥粉末または噴霧乾燥粉末などの発酵固形物に、湿潤剤または分散剤が添加される。湿潤剤は、拡散特性および浸透特性を増加させ、または分散剤は、それが表面に適用されたときに活性成分（一度希釈された）の分散性および溶解性を増加させる。例示的な湿潤剤は、当業者に公知であり、ＭＵＬＴＩＷＥＴ（商標）ＭＯ−７０Ｒ（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）などのスルホコハク酸塩および誘導体；ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）（Ｅｖｏｎｉｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などのシロキサン；ＡＴＬＯＸ（商標）４８９４（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）などの非イオン性化合物；ＴＥＲＷＥＴ（登録商標）３００１（Ｈｕｎｔｓｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ、Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ）などのアルキルポリグルコシド；ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）１５−Ｓ−１５（Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）などのＣ１２−Ｃ１４アルコールエトキシレート；ＲＨＯＤＡＦＡＣ（登録商標）ＢＧ−５１０（Ｒｈｏｄｉａ、Ｉｎｃ．）などのリン酸エステル；ならびにＥＭＵＬＳＯＧＥＮ（商標）ＬＳ（Ｃｌａｒｉａｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）などのアルキルエーテルカルボキシレートが挙げられる。
【０１０７】
寄託情報
本発明のパエニバチルス種株の試料は、米国農業研究センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＮＲＲＬ）、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ  ６１６０４、ＵＳＡ）にある農業研究サービスカルチャーコレクションに寄託され、２０１４年８月２８日にブダペスト条約の下、以下の受託番号：ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２を割り当てられている。
【０１０８】
安定したコロニー形態を示すパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株由来のパエニバチルス種の試料は、米国農業研究センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＮＲＲＬ）、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ  ６１６０４、ＵＳＡ）にある農業研究サービスカルチャーコレクションに寄託され、２０１５年９月１日にブダペスト条約の下で寄託され、以下の受託番号：ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９が割り当てられている。
【０１０９】
パエニバチルス種株は、本特許出願の係属中に、特許商標庁の長官が３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２に基づき権利を有すると決定したものへのアクセスが確保されることを保証する条件下で寄託されている。しかし、寄託物の入手可能性は、政府の行為によって付与された特許権を逸脱して本発明を実施するためのライセンスを構成するものではないことを理解されたい。
【０１１０】
以下の実施例は、単に本発明の例示的かつ非限定的な目的のために提供される。
【０１１１】
［実施例］
実施例１．パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の選択
いくつかのパエニバチルス種株のゲノムを配列決定した。ゲノムデータを分析して、フサリシジン生合成遺伝子クラスターを有するが、ポリミキシンシンテターゼ遺伝子クラスターを欠く菌株を同定した。フサリシジン生合成に関与する遺伝子クラスター（ｆｕｓＡ）は、以前にポリミキシンシンテターゼ遺伝子クラスターを有することが同定され、特徴付けられていた。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎｓ  ｂｙ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ＰＫＢ１  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄ−Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５：１１８−１２７（２００８）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ＳＱＲ−２１，”Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９７：９４７９−９４８９（２０１３）；ａｎｄ  Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９１（１０）：３３５０−３３５８（２００９）を参照されたい。
【０１１２】
この分析で同定された菌株をさらに評価して、フサリシジン産生を確認した。簡潔に述べると、各菌株を大豆ベースの培地で培養し、ブロス全体の親油性画分を抽出した。全ブロス抽出物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、フサリシジンＡの存在を、フサリシジンＡを含有する標準試料で生成されたＨＰＬＣプロファイルに基づいて同定した。
【０１１３】
実施例２．植物体におけるパエニバチルス種株の全ブロスの抗真菌活性
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株を含む選択されたパエニバチルス種株を、大豆ベースの培地中で増殖させて、全ブロス培養物を生成した。蒸留水を全ブロスの各々に添加して１０％最終希釈液を作製した。
【０１１４】
希釈された全ブロスを若い植物の葉に施用し、次いでトマト疫病（ＰＨＹＴＩＮ）、灰色かび病（ＢＯＴＲＣＩ）、またはコムギ葉さび病（ＰＵＣＣＲＴ）の真菌接種物に曝露した。各アッセイにおいて比較の目的で、未処理対照を含めた。真菌接種物に曝露して数日後、各植物を、未処理の対照植物と比較して病原体の防除パーセントについてスコア化した。各処理を３回反復して、図１に示される各パエニバチルス種株の全ブロスを用いて平均防除パーセントを評価した。
【０１１５】
ＰＨＹＴＩＮ、ＢＯＴＲＣＩおよびＰＵＣＣＲＴに対する抗真菌活性について試験した２３株のうち、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株は、３種すべての真菌病原体に対して比較的高いレベルの活性を有する数少ない菌株の１つであった。
【０１１６】
実施例３．パエニバチルスＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株のフサリシジン抽出物のインビトロにおける生物学的効力
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２を含むいくつかのパエニバチルス種株の全ブロス培養物を、大豆ベースの培地を用いて調製した。フサリシジンを含む親油性画分を全ブロスから抽出した。さまざまなフサリシジンおよび抗真菌代謝産物を含有する３つの別々の画分（すなわち、画分１、画分２および画分３）を、最初のパエニバチルス種株由来の全ブロスから抽出した。パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株由来の抽出物はさらには分離しなかった。
【０１１７】
各菌株由来のフサリシジン含有画分を以下の１２種の真菌病原体に対して試験した：アルテルナリア・アルテルナータ（ＡＬＴＥＡＬ）、ボトリティス・シネリア（ＢＯＴＲＣＩ）、フサリウム・クルモルム（ＦＵＳＡＣＵ）、ファエオスフェリア・ノドラム（ＬＥＰＴＮＯ）、ジモセプトリア・トリシチ（ＳＥＰＰＴＲ）、フィトフトラ・クリプトゲア（ＰＨＹＴＣＲ）、フィトフトラ・インフェスタンス（ＰＨＹＴＩＮ）、ピシウム・ウルティムム（ＰＹＴＨＵＬ）マグネポルテ・オリゼ（ＰＹＲＩＯＲ）、タナテフォルス・ククメリス（ＲＨＩＺＳＯ）、ウスチラゴ・セゲツム変種アベナエ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｅｇｅｔｕｍ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）（ＵＳＴＩＡＶ）、およびウロミセス・アペンジクラツス（ＵＲＯＭＡＰ）。さまざまな画分による真菌細胞増殖の阻害を、大豆ベースの培地で評価し、未処理対照の増殖と比較した。各画分の８回の投与量を０．００５ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲で試験した。５０％阻害（ＥＤ５０）および８０％阻害（ＥＤ８０）を生じる有効用量を図２の表に報告する。
【０１１８】
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株のフサリシジン含有画分は、他のパエニバチルス種株由来の画分では観察されなかった、１２のアッセイにわたる広域スペクトルの抗真菌活性を示した。パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の画分もまた、他のパエニバチルス種株由来の画分で観察されたものよりも、このアッセイにおいてはるかに大きな活性を示した（図２参照）。
【０１１９】
実施例４．フィトフトラに感染したトマトのインビトロ予防試験
この植物病原体温室アッセイでは、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の発酵産物を試験し、先のスクリーニングアッセイにおいて比較的高い抗真菌活性を示した他の３種のパエニバチルス種と比較した。この化合物の適切な調製物を製造するために、大豆培地中で培養した各菌株由来の全ブロスの噴霧乾燥粉末１重量部を、水および０．１重量部の乳化剤（アルキルアリールポリグリコールエーテル）と混合し、続いて水で希釈して所望の濃度にした。
【０１２０】
予防活性を試験するために、若い植物に化合物調製物を記載された施用率で噴霧した。噴霧コーティングを乾燥させた後、植物にフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の水性胞子懸濁液を接種した。次いで、植物を約２０℃および相対大気湿度１００％のインキュベーションキャビネットに置いた。
【０１２１】
接種の３日後に試験を評価した。０％は、未処置対照の効力に相当する効力を意味し、１００％の効力は、病害が観察されないことを意味する。
【表２】
2018517396.tif 000014
【０１２２】
実施例５．プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）に感染したブドウの木のインビボ予防試験
この植物病原体温室アッセイでは、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の発酵産物を試験し、先のスクリーニングアッセイにおいて比較的高い抗真菌活性を示した他の３種のパエニバチルス種と比較した。この化合物の適切な製剤を製造するために、実施例５に記載のように調製した噴霧乾燥粉末１重量部を、水および０．１重量部の乳化剤（アルキルアリールポリグリコールエーテル）と混合し、続いて水で希釈して所望の濃度にした。
【０１２３】
予防活性を試験するために、若い植物に化合物調製物を記載された施用率で噴霧した。噴霧コーティングを乾燥させた後、プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ）の水性胞子懸濁液を植物に接種し、次いで約２０℃および相対大気湿度１００％のインキュベーションキャビネット内に１日間放置した。続いて、植物を約２１℃および相対大気湿度約９０％の温室内に４日間置いた。次いで、植物に霧を吹きかけ、インキュベーションキャビネット中に１日間置いた。
【０１２４】
接種６日後に試験を評価した。０％は、未処置対照の効力に相当する効力を意味し、１００％の効力は、病害が観察されないことを意味する。
【表３】
2018517396.tif 000015
【０１２５】
実施例６．ウロミセスに感染した豆に対するインビボ予防試験
この植物病原体温室アッセイでは、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の発酵産物を試験し、先のスクリーニングアッセイにおいて比較的高い抗真菌活性を示した他の３種のパエニバチルス種と比較した。この化合物の適切な製剤を製造するために、実施例５に記載のように調製した噴霧乾燥粉末１重量部を、水および０．１重量部の乳化剤（アルキルアリールポリグリコールエーテル）と混合し、続いて水で希釈して所望の濃度にした。
【０１２６】
予防活性を試験するために、若い植物に化合物調製物を記載された施用率で噴霧した。噴霧コーティングを乾燥させた後、植物にマメさび病の原因物質（ウロミセス・アペンジクラツス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ））の水性胞子懸濁液を接種し、約２０℃および相対大気湿度１００％のインキュベーションキャビネット内に１日間放置した。
【０１２７】
次いで、植物を約２１℃および相対大気湿度約９０％の温室内に置いた。
【０１２８】
接種の１０日後に試験を評価した。０％は、未処置対照の効力に相当する効力を意味し、１００％の効力は、病害が観察されないことを意味する。
【表４】
2018517396.tif 000016
【０１２９】
実施例７．うどんこ病菌（スパエロテカ・フリギネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ））に感染したズッキーニ野外試験におけるパエニバチルス属株の比較
スパエロテカ・フリギネアを人工的に接種したズッキーニの２回の野外試験を実施した。５回の処理は、大豆ベースの培地で培養した各パエニバチルス種株由来の全ブロスの噴霧乾燥粉末を水に再懸濁し、１０００Ｌ／ｈａの施用量で、表６に概略を示したように、ＢＢＣＨ５９〜ＢＢＣＨ７２の成長段階で４〜８日間隔で７月１５日〜８月８日の間植物に施用した。表５に示されている病害防除パーセントは、最終施用の１０日後に行われた、病害症状を肉眼で観察した最後の評価の結果である。０％は、未処置対照の効力に相当する効力を意味し、１００％の効力は、病害が観察されないことを意味した。
【表５】
2018517396.tif 000017
【表６】
2018517396.tif 000018
【０１３０】
表４の結果は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の観察された活性が、以前のスクリーニングアッセイにおいて比較的高い抗真菌活性を示した、この野外試験で試験した他の菌株と比較して優れていることを明らかに示している。
【０１３１】
実施例８．うどんこ病（ウンシヌラ・ネクトル（Ｕｎｃｉｎｕｌａ  Ｎｅｃａｔｏｒ））に感染したブドウの木の野外試験におけるパエニバチルス株の比較
ウンシヌラ・ネクトルに自然感染したブドウの木による２回の野外試験が実施された。６回の処理は、実施例８に記載の噴霧乾燥粉末を水に再懸濁し、１０００Ｌ／ｈａの施用量で、６月３日〜７月１日の間にＢＢＣＨ５７〜ＢＢＣＨ７５の成長段階で５〜７日間隔で表８に示したように植物に施用した。表７に示されている病害防除パーセントは、最終施用の１５日後に行われた、病害症状を肉眼で観察した最後の評価の結果である。０％は、未処置対照の効力に相当する効力を意味し、１００％の効力は、病害が観察されないことを意味した。
【表７】
2018517396.tif 000019
【表８】
2018517396.tif 000020
【０１３２】
表７の結果は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の観察された活性が、以前のスクリーニングアッセイにおいて比較的高い抗真菌活性を示した、この野外試験で試験した他の菌株と比較して優れていることを明らかに示している。
【０１３３】
実施例９．夏疫病（アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ））に感染したトマトの野外試験におけるパエニバチルス株の比較
アルテルナリア・ソラニを人工的に接種したトマト植物を用いた２回の野外試験を行った。３回の処理は、実施例８に記載の噴霧乾燥粉末を水に再懸濁し、１０００Ｌ／ｈａの施用量で、６月２６日〜７月１０日の間にＢＢＣＨ５１〜ＢＢＣＨ５９の成長段階で６〜８日間隔で表１０に示したように植物に施用した。表９に示されている病害防除パーセントは、最終施用の８日後に行われた、病害症状を肉眼で観察した最後の評価の結果である。０％は、未処置対照の効力に相当する効力を意味し、１００％の効力は、病害が観察されないことを意味した。
【表９】
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【表１０】
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【０１３４】
表９の結果は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の観察された活性が、以前のスクリーニングアッセイにおいて比較的高い抗真菌活性を示した、この野外試験で試験した他の菌株と比較して優れていることを明らかに示している。
【０１３５】
実施例１０．夏疫病（アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ））に感染したジャガイモの野外試験におけるパエニバチルス株の比較
アルテルナリア・ソラニを人工的に接種したジャガイモ植物を用いた１回の野外試験を行った。５回の処理は、実施例８に記載の噴霧乾燥粉末を水に再懸濁し、５００Ｌ／ｈａの施用量で、６月２６日〜７月１９日の間にＢＢＣＨ３７〜ＢＢＣＨ５５の成長段階で４〜８日間隔で表１２に示したように植物に施用した。表１１に示されている病害防除パーセントは、最終施用の６日後に行われた、病害症状を肉眼で観察した最後の評価の結果である。０％は、未処置対照の効力に相当する効力を意味し、１００％の効力は、病害が観察されないことを意味した。
【表１１】
2018517396.tif 000023
【表１２】
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【０１３６】
表１１の結果は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の観察された活性が、以前のスクリーニングアッセイにおいて比較的高い抗真菌活性を示した、この野外試験で試験した他の菌株と比較して優れていることを明らかに示している。
【０１３７】
実施例１１．夏疫病（アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ））に感染したジャガイモの野外試験におけるパエニバチルス株の比較
アルテルナリア・ソラニを人工的に接種したジャガイモ植物を用いた１回の野外試験を行った。３回の処理は、実施例８に記載の噴霧乾燥粉末を水に再懸濁し、５００Ｌ／ｈａの施用量で７月２４日〜８月５日の間にＢＢＣＨ３７〜ＢＢＣＨ５１の成長段階において６日間隔で表１４に示したように植物に施用した。表１３に示されている病害防除パーセントは、最終施用の６日後に行われた、病害症状を肉眼で観察した最後の評価の結果である。０％は、未処置対照の効力に相当する効力を意味し、１００％の効力は、病害が観察されないことを意味した。
【表１３】
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【表１４】
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【０１３８】
表１３の結果は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の観察された活性が、以前のスクリーニングアッセイにおいて比較的高い抗真菌活性を示した、この野外試験で試験した他の菌株と比較して優れていることを明らかに示している。
【０１３９】
実施例１２．パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株におけるｆｕｓＡ変異の同定
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株をさらに特徴付けるために、ＦｕｓＡフサリシジンシンテターゼをコードするｆｕｓＡ遺伝子のゲノム配列を標準的な配列決定法で決定し、関連するアミノ酸配列を同定した。パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株によって発現されるＦｕｓＡ由来のアミノ酸配列を、以下の刊行物に記載されているものを含むいくつかの他のパエニバチルス株のそれと比較した：Ｌｉ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）．“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ＳＱＲ−２１，ａ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ−Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ａｂｉｌｉｔｙ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ，２（２）：ＨＡＳＨ（０ｘ７４３ｄｂ２８８）；Ｎｉｕ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）．“Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ−Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  Ｍ−１  Ｃｏｎｔａｉｎｓ  Ｎｉｎｅ  Ｓｉｔｅｓ  Ｄｅｄｉｃａｔｅｄ  ｔｏ  Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ，”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９３（２０）：５８６２−３；Ｍａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ＳＣ２，Ａ  Ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ−Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  Ｂｒｏａｄ−Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９３（１）：３１１−２；ａｎｄ  Ｌｉ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，（２００８）．Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎｓ  ｂｙ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ＰＫＢ１  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄ−ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１５，１１８−１２７。
【０１４０】
図１３に示すアラインメントは、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２によって発現される変異型ＦｕｓＡフサリシジンシンテターゼにおける有意な欠失を明らかにした。第１の欠失は、パエニバチルス種Ａ株の対応する配列（配列番号１１）の３００９位から３０３７位に及ぶ。第２の欠失は、パエニバチルス種Ａ株の対応する配列（配列番号１１）の３０４７位から３３１７位に及ぶ。両方の欠失は、ＦｕｓＡフサリシジンシンテターゼの第３モジュールのＡドメイン（すなわち、ＦｕｓＡ−Ａ３）内に入る。
【０１４１】
上に説明したように、Ａドメインの各々は、基質認識および活性化に関与する１０個の保存されたアミノ酸残基を含む（表１参照）。これらの保存されたアミノ酸残基を、図１３に示されたアラインメントに概説する。パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株によって発現される変異型ＦｕｓＡフサリシジンシンテターゼにおいて同定された欠失は、最後の保存されたアミノ酸残基（すなわち、配列番号１１の３４８６位のＬｙｓ５１７）以外のすべてを除去する。
【０１４２】
変異型ＦｕｓＡフサリシジンシンテターゼにおけるこれら２つの欠失は、本明細書においてパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株と命名された安定なコロニー形態を有する変異株を含むパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株由来の菌株に存在する。野生型ＦｕｓＡ−Ａ３への復帰は広範囲に及ぶ欠失の性質のためにまず起こり得ないので、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株に由来するランダム突然変異株は変異型ＦｕｓＡ−Ａ３においてこの欠失を一般に維持すると思われる。
【０１４３】
実施例１３．パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびパエニバチルス種Ａ株におけるフサリシジン産生の比較
変異型ＦｕｓＡ−Ａ３の効果を決定するために、フサリシジンおよびパエニセリンのパネルを、実施例１４に記載の方法を用いてパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株（変異型ＦｕｓＡ−Ａ３を発現する）およびパエニバチルス種Ａ株（野生型ＦｕｓＡ−Ａ３を発現する）で定量した。各化合物の同一性は、その固有の保持時間および質量によって決定した。スペクトルにおける各ピークの相対シグナル強度を表１５に示す。精製された標準物質がない場合、絶対定量は不可能であった。しかし、同様の量の各細胞抽出物を注入し、化合物の相対量を得られたシグナル強度から推定することができる。
【表１５】
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【０１４４】
野生型ＦｕｓＡフサリシジンシンテターゼにおいて、ＦｕｓＡ−Ａ３はアミノ酸位置（３）のフサリシジン化合物にＬ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−ＩｌｅまたはＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを組み込む役割を果たす（表１参照）。パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株における変異型ＦｕｓＡ−Ａ３は、検出可能なフサリシジンＣ、フサリシジンＤ、ＬｉＦ０７ａ、またはＬｉＦ０７ｂを含まない抽出物をもたらした。フサリシジンＣおよびフサリシジンＤは両方ともアミノ酸位置（３）にチロシンを有し、ＬｉＦ０７ａおよびＬｉＦ０７ｂは両方ともアミノ酸位置（３）にフェニルアラニンを有する。これらの実験データは、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株によって発現されるＦｕｓＡ−Ａ３の遺伝子変異が、アミノ酸位置（３）にチロシンまたはフェニルアラニンを有するフサリシジンの生合成を阻害することを示す（図１４参照）。
【０１４５】
したがって、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株由来の変異株は、アミノ酸位置（３）にチロシンまたはフェニルアラニンを有する検出可能な量のフサリシジンまたはフサリシジン様化合物（例えば、フサリシジンＣおよびＤまたはＬｉＦ０７ａおよびＬｉＦ０７ｂ）を生成することができない。パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株における変異型ＦｕｓＡ−Ａ３の分析は、この菌株およびその変異体が、アミノ酸位置（３）にチロシンアミノ酸またはフェニルアラニンアミノ酸を含むペプチド環を有するフサリシジンまたはフサリシジン類似体を遺伝的に産生することができないことを示す。
【０１４６】
分析した２種のパエニセリンのうち、パエニバチルス種Ａ株に検出可能なものは１種だけであり、そのシグナル強度は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株抽出物で観察された対応するシグナル強度の半分未満であった。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ＦｕｓＡ−Ａ３における最初の９個の保存されたアミノ酸（すなわち、Ａｓｐ２３５、Ａｌａ２３６、Ｓｅｒ２３９、Ｔｈｒ２７８、Ｌｅｕ２９９、Ａｌａ３０１、Ａｌａ／Ｇｌｙ３２２、Ｖａｌ３３０、およびＣｙｓ３３１）の１または複数は、フサリシジン化合物の位置（３）のチロシンおよびフェニルアラニンの認識および活性化を担う。さらに、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株によって発現される変異型ＦｕｓＡ−Ａ３は、代謝中間体を特定のフサリシジンの産生から、より広い範囲のフサリシジン様化合物（例えば、パエニセリン）の生合成にシフトさせることができる。
【０１４７】
実施例１４．パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびパエニバチルス種Ａ株の生物活性の比較
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株（変異型ＦｕｓＡ−Ａ３を発現する）およびパエニバチルス種Ａ株（野生型ＦｕｓＡ−Ａ３を発現する）を大豆ベースの培地で培養して、全ブロスを生成した。全ブロスを、水と有機溶媒の混合物で１０％、５％、２．５％、および１．２５％の濃度に希釈した。希釈した全ブロスを、若い植物に施用し、続いてプッキニア・トリシチナ（ＰＵＣＣＲＴ）、ボトリティス・シネリア（ＢＯＴＲＣＩ）、またはフィトフトラ・インフェスタンス（ＰＨＹＴＩＮ）の接種物に曝露した。植物病原菌の接種物に曝露して数日後、各植物を、未処理の対照植物と比較して病原体の防除パーセントについてスコア化した。各処置を３回反復して評価し、平均防除パーセントを記録した（表１６〜１８参照）。
【０１４８】
各アッセイにおいて、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株はパエニバチルス種Ａ株を上回る優れた防除を示した。これらの実験データは、変異型フサリシジンシンテターゼならびにその結果生じるフサリシジンおよびフサリシジン様化合物の生合成における変化が、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２による植物病原体の防除の強化をもたらすことを示唆している。
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【０１４９】
実施例１５．パエニバチルス種の細胞抽出物におけるフサリシジンの同定
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株および／またはそれに由来する株を大豆ベースの培地中で定常期に達するまで増殖させ、その時点で全ブロス培養物を収穫し、有機溶媒で抽出して細胞抽出物を生成した。
【０１５０】
高速液体クロマトグラフィー／質量分析法飛行時間型（ＨＰＬＣ／ＭＳ  ＴＯＦ）を用いたクロマトグラフィー法を開発し、多くのフサリシジン様分子を細胞抽出物から分離した：カラム：ＹＭＣ（商標）Ｂａｓｉｃ  ４．６×２５０ｍｍ、５μｍ；水（０．１％ＦＡ）およびアセトニトリル（０．１％ギ酸（ＦＡ））；勾配（％Ｂ）：０〜９分２８〜３０％；９〜１４分３０〜３３％；１４〜３４分３３〜５０％；洗浄
公知のフサリシジンが同定されている細胞抽出物からのクロマトグラムを図４Ｂに示す。フサリシジンの一般構造を図４Ａに示す。各環式フサリシジンは、対応する非環式類似体を有する。
【０１５１】
細胞抽出物中の検出可能なすべてのフサリシジンは、それらの保持時間およびｍ／ｚ値に基づき同定された（図４Ｃ参照）。興味深いことに、位置（３）のアミノ酸がチロシンまたはフェニルアラニンであるフサリシジンＣおよびＤならびに他のフサリシジンは、細胞抽出物中で検出されなかった。
【０１５２】
実施例１６．パエニバチルス種細胞抽出物中のパエニセリンｓの特徴付け
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株および／またはこれに由来する菌株の細胞抽出物中の他の化合物を同定するために、超高速液体クロマトグラフィー／質量分析トリプル飛行時間型（ＵＰＬＣ／ＭＳ  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ）を用いたクロマトグラフィー法を開発して、多数のフサリシジン様分子を断片化した：カラム：ＺＯＲＢＡＸ（商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ、２．１×１００ｍｍ、１．８μｍ；水（０．１％ＦＡ）およびアセトニトリル（０．１％ＦＡ）。勾配（％Ｂ）：０〜５分１０〜９５％；洗浄。
【０１５３】
この方法を用いて、本出願人は、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＴＲＩＰＬＥ  ＴＯＦ（登録商標）質量分析計から得られた質量断片化パターンを調べることによって、ならびに公開された文献とスペクトルを比較することによって、フサリシジンの新規なパエニセリンファミリーを特徴付けた。出願人はこの新しいファミリーをパエニセリン（Ｐａｅｎｉｓｅｒｉｎｅ）と名付けた。パエニセリン  Ａ１およびパエニセリン  Ｂ１の代表的なＵＰＬＣ／ＭＳ  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ断片化パターンおよび対応する化学構造をそれぞれ図５および６に示す。同様の分析を、細胞抽出物中に検出された各パエニセリンについて行った。
【０１５４】
パエニセリンは、１または複数のセリン置換を有するフサリシジン骨格からの重要な出発のためにこのように命名した（図５Ａ参照）。歴史的には、フサリシジンは、（１）スレオニン、（４）スレオニン、および（６）アラニンの３つの保存されたアミノ酸を含むペプチド配列であると考えられる。しかし、パエニセリンは、（１）および（４）のスレオニン残基の一方または両方がセリンで置き換えられた、新しい置換を示す。出願人が特徴付けしたパエニセリンにおいて、位置（２）および（３）のアミノ酸はいずれもバリンである。パエニセリンに対応するピークが同定されたクロマトグラムを図５Ｂに示す。
【０１５５】
出願人はまた、細胞抽出物中のセリン置換されたフサリシジン様化合物のファミリーを、それらの保持時間およびｍ／ｚ値に基づいて特徴付けた（図５Ｃ参照）。パエニセリン  Ｃ４は検出できなかったが、以前に特徴付けられたフサリシジンの構造に基づいて産生されると予想することが合理的である。フサリシジンと同様に、各環式パエニセリンは、対応する非環式類似体を有する。
【０１５６】
出願人が特徴付けたパエニセリンは、（２）および（３）残基にバリンアミノ酸を有するが、それらの位置に変異を有する化合物が存在する可能性があることに留意することが重要である。これらの潜在的な変異は、（２）および（３）残基としてイソロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンなどのアミノ酸を有するフサリシジン／ＬｉＦ類似体と同様であると思われる。さらに、ＧＨＰＤの尾部を上に記載しているが、尾部の長さにパエニプロリキシンファミリーと同様の変化を有する化合物が存在する可能性が高い（実施例１７参照）。
【０１５７】
実施例１７．パエニバチルス種細胞抽出物中のパエニプロリキシンの特徴付け
パエニバチルス種のＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株および／またはこれに由来する株細胞抽出物を、実施例１４に記載のクロマトグラフィー法でさらに分析した。フサリシジンの新しいファミリーを、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＴＲＩＰＬＥ  ＴＯＦ（登録商標）質量分析計から得られた質量断片化パターンを調べることによって、ならびに公開された文献とスペクトルを比較することによって特徴付けた。出願人はこの新しいファミリーパエニプロリキシン（Ｐａｅｎｉｐｒｏｌｉｘｉｎ）と名付けた。パエニプロリキシン  Ｃ１およびパエニプロリキシン  Ｄ１の代表的なＵＰＬＣ／ＭＳ  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ断片化パターンおよび対応する化学構造をそれぞれ図８および９に示す。同様の分析を、細胞抽出物中に検出された各パエニプロリキシンについて行った。
【０１５８】
パエニプロリキシンは、脂肪族尾部におけるフサリシジン骨格からの別の重要な出発点に起因するラテン語のｐｒｏｌｉｘ（長いを意味する）から命名された。すなわち、パエニプロリキシンは、フサリシジンより長い尾部を有する。歴史的に、フサリシジンは、特有のＧＨＰＤ尾部を有することが観察されているに過ぎない。これは、本件に関する最新の出版物（例えば、Ｖａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２０１５，２６，１１３０−１１４１）においても一貫していることが示されており、この著者らは、「「ＧＨＰＤの尾部は厳密に保存されている」というこの発見は、文献に報告されている他の多くのリポペプチドとは対照的であり、脂肪酸部分はサーファクチン、イタリン、フェンギシンなどの構造変化の主な標的である」と主張している。出願人は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の細胞抽出物中のより長い尾部（すなわち、１７−グアニジノ−３−ヒドロキシヘプタデカン酸またはＧＨＰＤ＋２ＣＨ２および１９−グアニジノ−３−ヒドロキシノナデカン酸またはＧＨＰＤ＋４ＣＨ２）フサリシジン様化合物のファミリーを同定した（図８Ａ参照）。パエニセリンとは異なり、パエニプロリキシンは、位置（１）にＬ−スレオニン、位置（４）にＤ−ａｌｌｏ−スレオニンの保存されたアミノ酸残基を維持する。
【０１５９】
出願人が特徴付けたパエニプロリキシンは、（２）および（３）残基にバリンまたはイソロイシンのいずれかのアミノ酸を有するが、それらの位置に変異を有する化合物が存在する可能性があることに留意することが重要である。これらの潜在的な変異は、（２）および（３）残基としてバリン、イソロイシン、またはフェニルアラニンおよびチロシンなどの他のアミノ酸の他の組み合わせなどのフサリシジン／ＬｉＦ類似体と同様であると思われる。さらに、より長い長さの尾部を有する上記のパエニセリンとのハイブリッドの組み合わせが存在する可能性がある。
【０１６０】
パエニプロリキシンに対応するピークが同定されたクロマトグラムを図８Ｂに示す。より長いＧＨＰＤ尾部を有するフサリシジン様化合物のこのファミリーも、これらの保持時間およびｍ／ｚ値に基づいて特徴付けた（図８Ｃ参照）。パエニプロリキシン  Ｃ２およびＤ２は検出できなかったが、以前に特徴付けられたフサリシジンの構造に基づいて産生されると予想することが合理的である。フサリシジンの場合と同様に、各環式パエニプロリキシンは、対応する非環式類似体を有する。
【０１６１】
実施例１８．パエニセリン、パエニプロリキシン、およびその他のフサリシジンの抗真菌性生物活性プロファイル
表１９に示す試料は、パエニバチルス種細胞から単離した。発酵全ブロスを遠心分離して上清を除去した。次いで、得られたペレットをメタノールで抽出した。得られた抽出物を逆相中圧液体クロマトグラフィーを用いて分画した。次いで、分画を、逆相分取高圧液体クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。
【表１９】
2018517396.tif 000031
【０１６２】
インビトロ抗真菌９６ウェルプレートアッセイは、真菌増殖の指標としてレサズリンベースの細胞生存性試薬ＰＲＥＳＴＯＢＬＵＥ（登録商標）を利用する。真菌胞子から出発して、このアッセイは、真菌胞子の発芽および／または真菌細胞の増殖を阻害するための試料の効力を測定する。このアッセイは、３種の農業関連真菌性病害、すなわちアルテルナリア・ソラニ（ＡＬＴＥＳＯ）、コレトトリカム・ラゲナリウム（ＣＯＬＬＬＡ）およびボトリティス・シネリア（ＢＯＴＲＣＩ）を用いて調製した。
【０１６３】
表１９に概説されているすべての試料は、農業関連の真菌性病害に対して活性であることが証明されている（表２０の各試料に関する１００万分の１（ｐｐｍ）単位の８０％最小発育阻害濃度（ＭＩＣ８０）値を参照）。興味深いことに、ある種の化合物は特定の病害に対してさまざまな活性を有すると思われる。例えば、試料３のアスパラギン類似体はＡＬＴＥＳＯを防除する上で重要であると思われるが、試料４の同種の化合物のグルタミン対応物はＣＯＬＬＬＡの防除により多く関与していた。試料６のより長い尾部の類似体は、ＣＯＬＬＬＡの最も強力な阻害剤であった。このことは、すべてが自ら活性である一方、これらの化学物質の組み合わせは、最終製品の病害防除の最終効力およびスペクトルにとって重要であることを示唆している。
【表２０】
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【０１６４】
実施例１９．パエニセリン、パエニプロリキシン、および他のフサリシジンの抗菌生理活性プロファイル
インビトロ抗菌９６ウェルプレートアッセイは、細菌増殖の指標として吸光度を使用する。このアッセイは、未処理のウェルの吸光度を試料ウェルと比較することによって、細菌増殖を阻害する試料の効力を測定する。細菌の増殖を阻害する最終希釈／濃度をＭＩＣ（最小発育阻害濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））と呼び、この値を用いて異なる試料の効力を比較することができる。アッセイは、キサントモナス・カンペストリス（ＸＡＮＴＡＶ）、シュードモナス・シリンゲ（ＰＳＤＭＴＭ）、およびエルウィニア・カロトボーラ（ＥＲＷＩＣＡ）の３種の農業関連細菌性病害を用いて評価した。
【０１６５】
表１９に概要を示した試料を抗菌アッセイに適用して、各細菌病原体によるＭＩＣ８０値を測定した。アッセイの結果を表２１に示す。試料１〜５は、農業関連の細菌性病害に対して活性であることが判明した。興味深いことに、ある種の化合物は特定の病害に対してさまざまな活性を有すると思われる。例えば、パエニセリンは、フサリシジンＡの弱点であるＰＳＤＭＴＭを防除することができるという点で、フサリシジンＡを補完する。一方、フサリシジンＡは、パエニセリンで観察されるＥＲＷＩＣＡの防除における弱点を補う。真菌アッセイと同様に、このことは、すべてがそれ自体で有効である一方、これらの化学物質の組み合わせは、最終製品の最終的な効力および病害防除のスペクトルにとって重要であることを示唆している。
【表２１】
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【０１６６】
実施例２０．Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ抗生物質のディスク拡散アッセイによる相乗効果の示唆
フサリシジン様化合物のさまざまなクラス間の相乗作用の初期評価を得るために、植物病原体ＣＯＬＬＬＡを用いてバイオアッセイを実施した。バイオアッセイは、寒天上の古典的なＫｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ抗生物質ディスク拡散アッセイであった（Ｂａｕｅｒ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，１９６６  Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３６：４９３−４９６）。簡潔には、ＣＯＬＬＬＡ胞子の芝生を接種したペトリ皿上に、同様の量の種々の試料を負荷したブランク無菌ディスクを置いた。このペトリ皿をインキュベートし、各ディスクの周りに示された阻害ゾーンの直径の大きさとして活性を記録した。結果を図１１に示す。
【０１６７】
この予備アッセイの結果は、特定のパエニセリンおよびパエニプロリキシンを一緒に施用すると、相乗効果が生じることを示唆している。別々に施用されたパエニセリン  Ａ１およびＢ１（「８６８」）またはパエニプロリキシン  Ａ２およびＢ２（「９３８」）は、このアッセイにおいて比較的小さな阻害ゾーンを示す。しかし、それらの組み合わせ（「８６８／９３８」）は、８６８、９３８またはフサリシジンＡおよびＢ（「ＡＢ」）の適用で得られた結果を超える阻害の最大かつ最も明確なゾーンを示す。ＡＢ、８６８、および９３８の試料について、約０．１ｍｇの全材料を各無菌ディスクに適用した。８６８および９３８の両方の試料を含むディスクは、８６８／９３８ディスク上の材料の総量が約０．１ｍｇであるように、各試料を約０．０５ｍｇ含有した。
【０１６８】
このアッセイの限界は、フサリシジン化合物を真菌の増殖を阻害するために寒天に拡散しなければならないという要件である。相乗効果のこの初期の指標を、液体培地中のインビトロ抗真菌アッセイを利用してさらに評価した。
【０１６９】
実施例２１．フサリシジンの組み合わせの相乗作用を実証するためのインビトロ抗真菌アッセイ
実施例１７に概説したフサリシジンの組合せに加えて、液体培地中のインビトロ抗真菌アッセイを実施して、図１２に示すフサリシジンおよび／またはフサリシジン様化合物の組み合わせの適用から生じる提案された相乗効果を実証する。図１２に示すグループの各々を、最初に構造特性を評価するために個別に評価し、次に相乗効果に対処するために組み合わせて評価する。二成分混合物と三元混合物の両方を評価する。
【０１７０】
個々の化合物は殺真菌活性に関して弱点を示すかもしれないが、組み合わせは活性の単純な添加を上回る活性を有するであろう。
【０１７１】
殺真菌剤の相乗効果は、活性化合物の組み合わせの殺真菌活性が、個別に適用された場合の活性化合物の活性の合計を超える場合、常に存在する。
【０１７２】
２つまたは３つの活性化合物の所与の組合せについての予想される活性は、以下のように計算することができる（Ｃｏｌｂｙ，Ｓ．Ｒ．，“Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，Ｗｅｅｄｓ  １９６７，１５，２０−２２）。
【０１７３】
Ｘは、活性化合物Ａをｍ  ｐｐｍ（またはｇ／ｈａ）の施用量で施用した場合の効力であり、
Ｙは、活性化合物Ｂを施用量ｎ  ｐｐｍ（またはｇ／ｈａ）で施用した場合の効力であり、
Ｚは、活性化合物Ｂを施用量ｒ  ｐｐｍ（またはｇ／ｈａ）で施用した場合の効力であり、
Ｅ１は、活性化合物ＡおよびＢを施用量ｍおよびｎ  ｐｐｍ（またはｇ／ｈａ）で施用した場合の抗力であり、
Ｅ２は、活性化合物Ａ、ＢおよびＣをそれぞれ施用量ｍ、ｎおよびｒ  ｐｐｍ（またはｇ／ｈａ）で施用した場合の効力であり、
この場合、二成分混合物に関しては：
【数１】
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【０１７４】
であり、および三成分混合物に関しては：
【数２】
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【０１７５】
である。
【０１７６】
効力の程度は％で表される。０％は対照の効力に相当する効力を意味し、１００％の効力は病害が観察されないことを意味する。
【０１７７】
実際の殺真菌活性が計算値を超える場合、組み合わせの活性は超相加的であり、すなわち相乗効果が存在する。この場合、実際に観察された効力は、上記の式から計算された予想効力（Ｅ）の値よりも大きくなければならない。
【０１７８】
相乗効果を実証するためのさらなる方法は、Ｔａｍｍｅｓの方法である（“Ｉｓｏｂｏｌｅｓ，Ａ  Ｇｒａｐｈｉｃ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ”ｉｎ  Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．，１９６４，７０，７３−８０参照）。
【０１７９】
実施例２２．パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の変異株の選択
標準的な実験室条件下では、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株は、固体寒天培地上で複数のコロニー形態を産生する。いくつかの形態学的に異なるコロニーを同定し、−８０℃でグリセロールストックとして保存した。液体培地培養物は、異なるコロニー表現型に由来するストックを用いて接種し、液体培地中で数ラウンド増殖させた後、固体寒天培地上に再接種した。ここから、試験された条件下で安定なコロニー表現型を有し、耐熱胞子およびフサリシジン化学物質を依然として産生することができる、１つの単離株を同定した。安定なコロニー形態を有する単離株は、さらなる株の改良のために望ましい（実施例２３参照）。この単離株は、２０１５年９月１日にＮＲＲＬに寄託され、受託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９が割り当てられている。
【０１８０】
実施例２３．改善されたパエニバチルス種突然変異体を生成するランダム突然変異誘発
化学的突然変異誘発
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株の遺伝的に多様な単離株のプールを作製するために、菌株の液体培養培養物を遠心分離によりペレット化し、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトログアニジン（ＮＴＧ）を含有する緩衝液中に最終濃度４００μｇ／ｍＬで再懸濁した。参照として、ＮＴＧを含まない第２の試料を調製した。試料を３０℃および２２０ｒｐｍにおいて１時間インキュベートした。１時間後、試料を遠心分離によってペレット化し、ＮＴＧを含有しない緩衝液で洗浄し、最後に同じ容量の新鮮な緩衝液に再懸濁した。希釈されていない培養物のアリコートをグリセロールストックとして−８０℃で凍結させた。試料を希釈して、寒天プレート上にプレーティングしてコロニー形成単位を決定し、ゲノムあたりの突然変異度の基準として死滅率を決定した。第１ラウンドのスクリーニングから選択された改良された単離株を、上記のように１または複数回のＮＴＧ処理に付し、フサリシジン産生のさらなる改善についてスクリーニングした。フサリシジン産生は、フサリシジンＡ（ＬｉＦ０４ａまたは「ＦｕｓＡ」としても知られている）；ＬｉＦ０８ａ；パエニセリン  Ａ１およびＢ１（「Ｍ８６８」または「８６８」としても知られている）；パエニプロリキシン  Ａ２およびＢ２（「Ｍ９３８」または「９３８」としても知られている）を含むいくつかの化合物の相対量によって決定した。
【０１８１】
高スループットスクリーニングと分離特性
ＮＴＧ処理した試料を希釈し、寒天プレート上にプレーティングして単一のコロニーを得た。単一コロニーを、種培地を含む９６ウェルディープウェルブロックに接種し、３０℃において２日間振盪しながらインキュベートした。ここから、大豆ベースの生産培地を含む新しい９６ウェルディープウェルブロックに接種し、３０℃において５日間振盪しながらインキュベートした。５日後、個々のウェル中の各試料からグリセロールストックを調製し、−８０℃で保存し、試料を上記で特定した４種のフサリシジンバイオマーカーの化学分析に供した。この一次スクリーニングにおいて、個々の単離株は、それらの「総フサリシジン値」（すなわち、野生型の値の平均に対する４つの分析されたフサリジジンバイオマーカーの合計）が野生型値の平均よりも野生型値の標準偏差の３倍高かった場合にヒットとみなした。この基準に基づいて選択された各単離株の８つの複製物を上記のように増殖させて分析した。確認されたフサリシジン過剰産生体を次に２５０ｍＬの振盪フラスコ中で５０ｍＬ容量にスケールアップし、胞子形成、フサリシジン産生および生物活性について特徴付けた。優先単離株をバイオリアクターにさらにスケールアップし、胞子形成、粘性、フサリシジン産生、および生物活性について特徴付けた。ＮＴＧ処理およびスクリーニングの第２ラウンドからいくつかの突然変異株が得られ、優れたフサリシジンバイオマーカー産生および生物活性を有することが判明した。
【０１８２】
実施例２４．パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の抗生物質感受性の特徴付け
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株を、典型的な濃度の抗生物質を補充した固形ｓＬＢ寒天培地およびｓＬＢ寒天培地に接種した。寒天プレートを３０℃においてインキュベートし、増殖を２４時間後、４８時間後および７２時間後に評価した。それぞれの被験抗生物質に対するパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の感受性を表２２に示す。
【表２２】
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【０１８３】
実施例２５．パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株におけるｓｐｏ０Ａの特徴付け
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株のゲノムを配列決定した。２つのゲノム配列の比較により、２つの菌株におけるｓｐｏ０Ａ遺伝子の特徴的な相違を同定した。図１５の配列アラインメントに示されるように、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株は、ｓｐｏ０Ａ遺伝子の３’末端に向かって１ヌクレオチド異なる。単一ヌクレオチドの相違を同定して、図１５の配列の下に赤い矢印で示した。ｓｐｏ０Ａ遺伝子の第１のヌクレオチドに対するヌクレオチド番号は、配列の上に示される。
【０１８４】
内生胞形成細菌由来のＳｐｏ０Ａオルソログのアライメントは、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株コード配列におけるヌクレオチド変化が、保存領域において単一のアミノ酸置換をもたらすことを示した。（図１６参照）。パエニバチルス・テラエ由来のＳｐｏ０Ａアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０４４６４７６４４．１）、パエニバチルス・ポリミキサＳＱＲ−２１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＨＭ６６６３０．１）、バチルス・ズブチリス亜種ズブチリス株１６８（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿３９０３０２．１）、バチルス・セレウスＥ３３Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪＩ２６９２４．１）、およびクロストリジウム・パステリアヌムＤＳＭ  ５２５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ１８８８３．１）を、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株由来のＳｐｏ０Ａアミノ酸配列とアライメントさせた。図１６中の矢印は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ株Ｂ−６７１２９株由来のＳｐｏ０Ａにおける単一のアミノ酸置換を示す。
【０１８５】
実施例２６．フサリシジン、パエニセリン、パエニプロリキシンとの構造活性関係研究
実施例１６に記載のインビトロアッセイを用いて、いくつかの精製されたフサリシジン、パエニセリンおよびパエニプロリキシンの構造活性関係を調べた。第１の実験において、最も一般的なフサリシジンの対を比較した。これらのフサリシジンの変異は、アスパラギンまたはグルタミンのいずれかを有する環／鎖のアミノ酸位置（５）で生じる。この研究において、植物病原体アルテルナリア・ソラニ（ＡＬＴＥＳＯ）に対してフサリシジンＡをフサリシジンＢと比較し、ＬｉＦ０８ａをＬｉＦ０８ｂと比較した。どちらの場合においても、アスパラギン類似体は、その対応物のグルタミンより２倍以上強力であった（図１７参照）。
【０１８６】
別の実験において、環式対非環式形態のフサリシジンを比較した。フサリシジンの非環式形態が最終化合物の前駆体または分解生成物であるかどうかは不明であるが、それらはパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の発酵ブロス中に偏在しており、この発酵ブロス由来の精製フサリシジンに共通の混入物質である。フサリシジンＡの抗真菌活性を、植物病原体ＡＬＴＥＳＯを用いたインビトロアッセイにおいて、ＬｉＦ０４ｃおよびＬｉＦ０４ｄ（フサリシジンＡおよびＢの非環式類似体）の混合物と比較した。エステル結合におけるペプチド開環の重要な影響がある。非環式類似体は、試験した最高濃度で不活性であった（図１７参照）。これは構造的情報に関して重要であり、そうでなければ精製されたフサリシジン中で典型的に混入物質を構成するこれらの化合物が、抗真菌活性に寄与しない可能性が高いことを実証する。
【０１８７】
環／鎖のアミノ酸位置（２）および（３）におけるアミノ酸置換もまた調査した。類似体フサリシジンＡ、ＬｉＦ０５ａ、ＬｉＦ０６ａ、およびＬｉＦ０８ａは、それらの位置にバリンまたはイソロイシンのいずれかの組み合わせを有することで異なる。これらを、植物病原体ＡＬＴＥＳＯを用いたインビトロアッセイで試験した。２つの最も強力な類似体は、フサリシジンＡ（バリン／バリン）およびＬｉＦ０８ａ（イソロイシン／イソロイシン）であった。バリン／イソロイシンの混合物を含む他の２つの類似体は、１／３未満の効力を有していた（図１７参照）。
【０１８８】
新規パエニセリンとの抗真菌活性の違いも調査した。この場合もまたＡＬＴＥＳＯに対して試験し、環／鎖のアミノ酸位置（１）および（４）の違いを評価した。古典的なフサリシジンは、これらの位置がスレオニンに限定され、一方、パエニセリンはスレオニンとセリンの間で交替することができる。パエニセリンは、このアッセイにおいてフサリシジンＡと同様の抗真菌活性を示した（図１７参照）。
【０１８９】
真菌病原体ＡＬＴＥＳＯおよびコレトトリカム・ラゲナリウム（ＣＯＬＬＬＡ）に対するインビトロアッセイを用いて、パエニプロリキシン（すなわち、異なる側鎖長を有する類似体）の抗真菌活性も調査した。古典的なフサリシジンは、１５−グアニジノ−３−ヒドロキシペンタデカン酸側鎖を含む。パエニプロリキシンは、鎖中に４つの追加のメチレン基のうちの２つを有することが示されている。側鎖長は生物活性に顕著な効果を示し、異なる真菌病原体には差異を示した。ＡＬＴＥＳＯに対して、長さの変化がないＧＨＰＤが最も強力であり、メチレン基が追加されるたびに低下していった。ＣＯＬＬＬＡに対して、最も強力な長さはＧＨＰＤ＋２ＣＨ２であった（図１７参照）。
【０１９０】
実施例２７．フサリシジンＡとパエニセリン  Ａ１またはパエニプロリキシン  Ｃ１との混合物による相乗的抗真菌活性
レザズリンベースの細胞生存性試薬ＰＲＥＳＴＯＢＬＵＥ（登録商標）（実施例１８参照）を用いたインビトロ抗真菌９６ウェルプレートアッセイを用いて、フサリシジン、パエニセリン、およびパエニプロリキシンの単独または双方向の組み合わせにおける抗真菌活性を評価した。抗真菌活性は、以下の式を用いて未処理対照値との関連で計算した：
効力＝（１００−未処理対照に対する相対的増殖）
１００％効力は、未処理対照と比較して真菌増殖がないことを示し、０％効力は、未処理対照と比較して真菌増殖の阻害がないことを示す。
【０１９１】
表２３および２４は、本発明による活性化合物の組合せの観察された活性が、計算された活性よりも大きい、すなわち相乗効果が存在したことを明確に示している。
【表２３】
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【表２４】
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【０１９２】
他に定義されない限り、本明細書におけるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。引用されたすべての刊行物、特許および特許公報は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９３】
開示された発明は、記載された特定の方法論、プロトコルおよび材料に限定されず、変更可能であると理解される。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解される。
【０１９４】
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、日常的な実験のみを用いて認識または確認することができると思われる。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
2018517396.tif 000049
【図２】
2018517396.tif 000050
【図３】
2018517396.tif 000051
【図４Ａ】
2018517396.tif 000052
【図４Ｂ】
2018517396.tif 000053
【図４Ｃ】
2018517396.tif 000054
【図５Ａ】
2018517396.tif 000055
【図５Ｂ】
2018517396.tif 000056
【図５Ｃ】
2018517396.tif 000057
【図６Ａ】
2018517396.tif 000058
【図６Ｂ】
2018517396.tif 000059
【図７Ａ】
2018517396.tif 000060
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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