(57)【要約】  動物対象における腎機能を決定するための方法であって、患者のサンプル中のβ−アミノイソ酪酸（β−アミノイソブチレート）（ＢＡＩＢ）の濃度を測定すること、および、器質的損傷の結果としての腎疾患の存在、可能性もしくは進行、または腎疾患に関連する死亡率を決定することを含む方法。本方法はまた、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）と組み合わせてＢＡＩＢの濃度を測定すること、ならびに、サンプル中のＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの濃度に基づいて腎疾患を決定することも含む。抗ＢＡＩＢ抗体、ＢＡＩＢコンジュゲートならびに抗体およびコンジュゲートを使用するアッセイ法もまた開示する。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物が、腎疾患に罹患しているかどうかを決定するための方法であって、動物からの尿サンプルまたは血液サンプル中のβ−アミノイソ酪酸（ＢＡＩＢ）を測定すること、および、サンプル中のＢＡＩＢの濃度に基づいて腎疾患を決定することを含む方法。
【請求項２】
サンプル中のＢＡＩＢの濃度を、健康な動物からのサンプル中のＢＡＩＢにおける濃度に関係する参照濃度と比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
動物対象における腎疾患を診断する方法であって、
対象から尿または血液サンプルを得ること、
サンプル中のＢＡＩＢの濃度を測定すること、
ＢＡＩＢのレベルを、健康な対象におけるＢＡＩＢの参照濃度と比較すること、および
サンプル中のＢＡＩＢの値が参照濃度を超える腎障害を診断すること
を含む方法。
【請求項４】
腎疾患が、器質的損傷の結果である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
器質的損傷が、炎症、線維症、傷害またはがんによる浸潤の結果である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
腎疾患が、糸球体腎炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
損傷が、腎結石の結果である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
腎結石が、シュウ酸塩の結晶である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
参照濃度が、健康な動物におけるＢＡＩＢの濃度の９５パーセンタイル値を反映している、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１０】
動物が、ネコ類であり、参照濃度が、２．０μｇ／ｄＬのＢＡＩＢである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
動物が、イヌ類であり、参照濃度が、１．２μｇ／ｄＬのＢＡＩＢである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
動物対象が、腎疾患に罹患しているかどうかを決定するための方法であって、
対象から血液または尿サンプルを得ること、
サンプル中のＢＡＩＢの濃度および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を測定すること、ならびに
ＳＤＭＡの濃度［ＳＤＭＡ］に対するＢＡＩＢの濃度［ＢＡＩＢ］の比が０．１５より高い場合、または［ＢＡＩＢ］に対する［ＳＤＭＡ］の比が７未満である場合、腎疾患を決定すること
を含む方法。
【請求項１３】
動物対象における腎障害を診断する方法であって、
対象から血液または尿サンプルを得ること、
サンプル中のＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの１つまたは複数の濃度を測定すること、ならびに
ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡのレベルを、健康な対象におけるＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの参照濃度と比較すること、
サンプル中のＳＤＭＡの濃度がＳＤＭＡ参照濃度を超える場合、腎機能の喪失を診断すること、ならびに
サンプル中のＢＡＩＢの濃度がＢＡＩＢ参照濃度を超える場合、腎機能の喪失が器質的損傷の結果であると診断すること
を含む方法。
【請求項１４】
ＢＡＩＢの参照濃度およびＳＤＭＡの参照濃度のうちの少なくとも１つが、健康な動物からのサンプル中のＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの濃度の９５パーセンタイル値を反映している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
動物が、ネコ類であり、参照濃度が、２．０μｇ／ｄＬのＢＡＩＢである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
動物が、イヌ類であり、参照濃度が、１．２μｇ／ｄＬのＢＡＩＢである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＳＤＭＡに対する参照濃度が、１４μｇ／ｄＬである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
腎疾患に関連する死亡率を決定するための方法であって、
（ａ）患者からの血液サンプル中のＢＡＩＢを測定すること、および
（ｂ）患者が閾値よりも高い血中ＢＡＩＢ濃度を有する場合、患者が腎疾患に関連する死の高い可能性を有すると決定すること
を含む方法。
【請求項１９】
ＳＤＭＡを測定すること、および、患者が閾値よりも高い血中ＳＤＭＡ濃度を有する場合、患者が腎疾患に関連する死の高い可能性を有すると決定することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルを、抗ＢＡＩＢ抗体と接触させること、および、サンプル中の抗体とＢＡＩＢとの結合または結合の量を決定することをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
血液サンプルが、血清または血漿である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＢＡＩＢおよび検出可能な標識を含む、コンジュゲート。
【請求項２３】
ＢＡＩＢと、グルタルアルデヒドおよびポリリジンの１つとを含む、コンジュゲート。
【請求項２４】
ＢＡＩＢおよびキャリアタンパク質を含む、コンジュゲート。
【請求項２５】
キャリアタンパク質が、ＫＬＨおよびＢＳＡの１つである、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載のＢＡＩＢのコンジュゲートに対して生じた、抗ＢＡＩＢ抗体。
【請求項２７】
ＢＡＩＢに特異的な抗ＢＡＩＢ抗体。
【請求項２８】
サンプル中のＢＡＩＢの存在または量を決定する方法であって、請求項２６または２７に記載の抗体を、サンプルと接触させること、および、サンプル中の抗体とＢＡＩＢとの結合または結合の量を決定することを含む方法。
【請求項２９】
サンプルおよび抗体を、ＢＡＩＢおよび検出可能な標識を含むコンジュゲートと接触させることをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗体が、標識を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２６または２７に記載の抗体を含む、キット。
【請求項３２】
抗ＳＤＭＡ抗体をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年４月３０日に出願した米国仮特許出願第６２／１５５，１５８号の利益を主張するものであり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本開示は、一般に、腎機能の決定に関する。より詳細には、本開示は、腎疾患の進行を診断、予測および決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
腎機能を迅速かつ正確に測定できることは重要である。例えば、薬の投薬は、腎不全患者に適したものでなければならない。したがって、腎機能を正確に評価することは、臨床医学において必要なことである。しかし、腎不全の診断は、確実なマーカー、および／または利用可能な診断試験の不足によって妨げられる。臨床診療においては、腎機能を評価するために、通常、血清クレアチニンが使用される。しかし、血清クレアチニンの使用は、データが比較的大きく変動しうるので、不正確さを欠点として持つ。加えて、クレアチニンが増加するまでに、最大で腎機能の７５％が失われうることは公知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明者らは、当分野における、正確さが増した腎機能評価方法の必要性を認識している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本開示は、動物が、腎疾患に罹患しているかどうかを決定する方法であって、動物からの尿サンプルまたは血液サンプル中のβ−アミノイソ酪酸（ＢＡＩＢ）を測定すること、および、サンプル中のＢＡＩＢの濃度に基づいて腎疾患を決定することを含む方法に関する。該方法は、サンプル中のＢＡＩＢの濃度を、健康な動物からのサンプル中のＢＡＩＢの濃度に関する参照濃度と比較することをさらに含みうる。
【０００６】
別の態様において、本開示は、動物対象における腎疾患を診断する方法であって、対象から尿または血液サンプルを得ること、サンプル中のＢＡＩＢの濃度を測定すること、ＢＡＩＢのレベルを、健康な対象におけるＢＡＩＢの参照濃度と比較すること、ならびに、サンプル中のＢＡＩＢの値が参照濃度を超える腎障害を診断することを含む方法に関する。
【０００７】
本開示の種々の態様において、参照濃度は、健康な動物におけるＢＡＩＢの濃度の９５パーセンタイル値を反映することができる。また、腎疾患は、器質的損傷（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄａｍａｇｅ）の結果でありうる。例えば、器質的損傷は、炎症、線維症、傷害、腎結石（例えば、シュウ酸塩石）またはがんによる浸潤の結果でありうる。腎疾患は、糸球体腎炎である。
【０００８】
さらなる態様において、本開示は、動物対象が、腎疾患に罹患しているかどうかを決定するための方法に関する。該方法は、対象から血液または尿サンプルを得ること、サンプル中のＢＡＩＢの濃度および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を測定すること、ならびに、ＳＤＭＡの濃度［ＳＤＭＡ］に対するＢＡＩＢの濃度［ＢＡＩＢ］の比が０．１５より高い場合、または［ＢＡＩＢ］に対する［ＳＤＭＡ］の比が７未満である場合、腎疾患を決定することを含む。
【０００９】
さらに、本開示は、動物対象における腎障害を診断する方法に関する。該方法は、対象から血液または尿サンプルを得ること、サンプル中のＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの１つまたは複数の濃度を測定すること、ならびに、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡのレベルを、健康な対象におけるＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの参照濃度と比較することを含む。サンプル中のＳＤＭＡの濃度がＳＤＭＡ参照濃度を超える場合、腎疾患が診断される。また、サンプル中のＢＡＩＢの濃度がＢＡＩＢ参照濃度を超える場合、腎機能の喪失は、器質的損傷の結果であると診断される。
【００１０】
さらに、本開示は、腎疾患に関連する死亡率を決定するための方法に関する。該方法は、患者からの血液サンプル中のＢＡＩＢを測定すること、および、患者が閾値よりも高い血中ＢＡＩＢ濃度を有する場合、患者が腎疾患に関連する死の高い可能性を有すると決定することを含む。該方法はまた、ＳＤＭＡを測定すること、および、患者が閾値よりも高い血中ＳＤＭＡ濃度を有する場合、患者が腎疾患に関連する死の高い可能性を有すると決定することも含む。
【００１１】
さらにまた、本開示は、ＢＡＩＢおよび検出可能な標識を含むＳＤＭＡコンジュゲート、ＢＡＩＢと、グルタルアルデヒドおよびポリリジンの１つとを含むコンジュゲート、ならびに、ＢＡＩＢおよびキャリアタンパク質を含むコンジュゲートに関する。
【００１２】
別の態様において、本開示は、ＢＡＩＢに特異的な抗ＢＡＩＢ抗体に関する。該抗体は、サンプル中のＢＡＩＢの存在または量を決定する方法に関する本開示の様々な態様において、使用されうる。例えば、該方法は、抗ＢＡＩＢ抗体をサンプルと接触させること、および、サンプル中の抗体とＢＡＩＢとの結合または結合の量を決定することを含む。該方法はまた、サンプルおよび抗体を、ＢＡＩＢおよび検出可能な標識を含むコンジュゲートと接触させることも含みうる。いくつかの実施形態において、抗体は、標識を含む。
【００１３】
別の態様において、本開示は、抗ＢＡＩＢ抗体を含むキットに関する。該キットは、抗ＳＤＭＡ抗体をさらに含みうる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
その種々の態様において、本開示は、腎疾患および腎疾患に関連する死亡率の決定、診断、進行、および予後に関する。本開示は、動物において、腎機能、および腎障害の存在、可能性または進行を決定するための方法を含む。
【００１５】
種々の態様において、本開示は、腎疾患の存在、可能性または進行、および、腎疾患に関連する死亡率を決定する、β−アミノイソブチレートとしても知られるβ−アミノイソ酪酸（ＢＡＩＢ）の使用に関する。ＢＡＩＢは、ネフロンの減少をもたらす腎臓の器質的損傷のマーカーであり、したがって、腎がん(kidney cancer)、腎癌(renal carcinoma)、転移性腎癌、腎臓の新生物浸潤、腎臓の炎症、低形質細胞性間質性腎炎(interstitial hypoplasmocytic nephritis)、糸球体炎症および腎線維症のマーカーである。
【００１６】
加えて、動物、特に、ネコおよびイヌからの血液サンプル中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）およびクレアチニンは、予後の精度を改善するために、ＢＡＩＢと併せて使用される。したがって、本開示は、動物対象からの血液サンプル中のＢＡＩＢの濃度を測定するための；動物対象からの血液サンプル中のＳＤＭＡおよび／またはクレアチニンの濃度を測定するための；ならびに、ＢＡＩＢの濃度のみに基づいて、またはＳＤＭＡおよび／もしくはクレアチニンと組み合わせて、腎疾患の存在、可能性または進行を決定するための、方法を含む。
【００１７】
ＳＤＭＡは、内因性一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）阻害物質である非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の構造異性体である。ＡＤＭＡもＳＤＭＡも、Ｌ−アルギニン残基の核内メチル化から生じ、タンパク質分解後、細胞質中に放出される。ＳＤＭＡは、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）およびＰＲＭＴ７によって産生される。メチルアルギニン、例えば、ＳＤＭＡ、ＡＤＭＡ、およびモノメチルアルギニンを有するタンパク質は、ＲＮＡプロセッシング、タンパク質シャトリング、およびシグナル伝達に関与する（ＢｅｄｆｏｒｄおよびＲｉｃｈａｒｄ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００５年、１８（３）：２６３〜７２）。そのようなメチル化タンパク質の分解から生じた遊離型ＳＤＭＡは、主に、腎排泄によって排出されるのに対して、ＡＤＭＡは、大部分は代謝される。ＡＤＭＡは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）のリスク因子、例えば、高血圧、高コレステロール血症、高ホモシステイン血症、インスリン抵抗性、年齢、および平均動脈圧と強く相関する。ＳＤＭＡは、腎機能のパラメーター、例えば、糸球体濾過量（ＧＦＲ）、イヌリンクリアランス、およびクレアチニンクリアランスと相関する。
【００１８】
ＢＡＩＢは、（例えば、ＳＤＭＡによって示されるような）腎機能が、正常な参照範囲内である場合でも、腎臓の損傷または病変のマーカーでありうる。
【００１９】
本開示のさらなる態様を記載する前に、多くの用語を以下に定義する。
【００２０】
ＢＡＩＢは、β−アミノイソ酪酸（β−アミノイソブチレート）である。ＢＡＩＢの構造は、
【００２１】
【化１】
2018515761.tif 000002
である。
【００２２】
ＢＳＡは、ウシ血清アルブミンである。
【００２３】
腎疾患は、器質的損傷を伴ってまたは伴わずに、ネフロン機能（濾過効率）の喪失を含む。器質的損傷は、病変、炎症、線維症、傷害、浸潤および他の原因によって起こりうる。がんは器質的損傷の原因でありうるが、がん自身は、一般に、腎疾患として識別されない。したがって、いくつかの実施形態において、腎疾患に、腎がんは含まれない。
【００２４】
腎結石は、腎臓または泌尿器の解剖学的構造の任意の部分における石を指し、腎石（nephrolith）、尿細管または尿管内の腎石、および膀胱の石を含む。腎結石は、しばしば器質的損傷および腎疾患につながる。
【００２５】
ＣＭＩＡは、化学発光磁気免疫アッセイである。
【００２６】
ＤＩＰＥＡは、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。
【００２７】
ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドである。
【００２８】
ＥＩＡは、酵素免疫アッセイである。
【００２９】
ＥＬＩＳＡは、酵素結合免疫吸着アッセイである。
【００３０】
ＥＳＩ−ＭＳは、エレクトロスプレーイオン化質量分析である。
【００３１】
ＦＰＩＡは、蛍光偏光免疫アッセイである。
【００３２】
ＧＦＲは、糸球体濾過量である。
【００３３】
ＨＡＴＵは、（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウランヘキサフルオロホスフェートメタナミニウム(methanamininium)である。
【００３４】
ＫＬＨは、キーホールリンペットヘモシアニンである。
【００３５】
ＭＥＩＡは、微粒子酵素免疫アッセイである。
【００３６】
ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水である。
【００３７】
ＲＩＡは、放射免疫アッセイである。
【００３８】
ＳＤＭＡは、対称性ジメチルアルギニンである。ＳＤＭＡの構造は、
【００３９】
【化２】
2018515761.tif 000003
である。
【００４０】
遊離型ＳＤＭＡは、ポリペプチド鎖の一部ではないＳＤＭＡを指す。ＳＤＭＡの１つまたは複数のアミノ酸残基が、ポリペプチドに存在しうる。
【００４１】
ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸である。
【００４２】
用語「類似体」は、本明細書で使用する場合、概して、１つまたは複数の個々の原子が異なる原子（複数可）または異なる官能基（複数可）で置きかえられた化合物を指す。例えば、類似体は、受容体に対する分析物と競合できる、分析物の改変形態であってもよく、改変は、分析物が別の部分、例えば、標識または固体担体に結合する手段を与える。分析物類似体は、分析物と同じように抗体に結合することができる。
【００４３】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、概して、抗原への曝露に反応して、Ｂリンパ球細胞により産生される糖タンパク質を指し、その抗原に特異的に結合する。用語「抗体」を、最も広い意味で使用し、詳細には、それは、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、複数特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを包含する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「抗ＢＡＩＢ」、「抗ＢＡＩＢ抗体部分」、もしくは「抗ＢＡＩＢ抗体フラグメント」および／または「抗ＢＡＩＢ抗体変異体」などは、ＢＡＩＢと特異的に結合する、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分、例えば、限定されないが、重鎖もしくは軽鎖定常領域の１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、フレームワーク領域、またはその任意の一部分を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「抗ＳＤＭＡ」、「抗ＳＤＭＡ抗体部分」、もしくは「抗ＳＤＭＡ抗体フラグメント」および／または「抗ＳＤＭＡ抗体変異体」などは、ＳＤＭＡと特異的に結合する、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分、例えば、限定されないが、重鎖もしくは軽鎖定常領域の１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、フレームワーク領域、またはその任意の一部分を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。
【００４６】
用語「抗体フラグメント」は、本明細書で使用する場合、完全長の抗体の一部分、概して、その抗原結合または可変領域を指す。詳細には、例えば、抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントからの複数特異性抗体を挙げることができる。
【００４７】
用語「抗原」は、本明細書で使用する場合、概して、抗原に特異的な抗体と適切な条件下で反応することができる物質を指す。
【００４８】
用語「分析物」は、本明細書で使用する場合、概して、検出および／または測定されるサンプル中の物質または物質のセットを指す。
【００４９】
用語「動物」は、本明細書で使用する場合、概して、任意の動物、例えば、ヒト、またはヒト以外の動物、例えば、ネコ、イヌ、またはウマを指す。
【００５０】
用語「サンプル」は、本明細書で使用する場合、一般に、尿、または、それらに限定されないが、全血、血漿、および血清を含む任意の血液由来の流体サンプルを指す。本開示の方法で使用する血清を用意するために、１つまたは複数の血清サンプルは、動物対象から得られる。血清サンプルを、例えば、血液サンプルとして動物対象から得ることができ、次いで、分離して血清を用意することができる。ある種の実施形態において、血清は、血液から分離することなく測定することができる。当業者が理解する通り、単一で得られたサンプルを、多数の濃度を測定するために分ける、または使用することができる。あるいは、複数のサンプルを動物対象から得ることができ、（少なくとも）１つのサンプルは、目的の各分析物または多数の分析物について、連続的に、並行に、または同時に測定する。ある種のそのような場合において、サンプルは、ほぼ同時（例えば、互いに６０分以内、３０分以内、または１０分以内）に動物から得られる。
【００５１】
用語「交差反応性」は、本明細書で使用する場合、概して、抗体の個々の抗原結合部位の、２つ以上の抗原決定基と反応する能力、または抗体分子の集団の、２つ以上の抗原と反応する能力を指す。一般に、交差反応は、（ｉ）交差反応性抗原が、免疫抗原と共通のエピトープを有すること、または（ｉｉ）交差反応性抗原が、免疫抗原上のエピトープと構造的に類似するエピトープを有することを理由にして起こる（複数特異性）。
【００５２】
用語「免疫アッセイ」は、本明細書で使用する場合、概して、測定可能な反応を生じさせる抗体抗原複合体を用いる検定を指す。「抗体抗原複合体」を、用語「免疫複合体」と互換的に使用することができる。一般に、免疫アッセイとしては、非競合型免疫アッセイ、競合型免疫アッセイ、均一系免疫アッセイ、および不均一系免疫アッセイが挙げられる。「競合型免疫アッセイ」において、試験サンプル中の標識されていない分析物（または抗原）は、免疫アッセイにおいて、標識されている抗原と競合する能力によって測定される。標識されていない抗原は、標識されている抗原の結合能力を妨げる。なぜなら、抗体の結合部位がすでにふさがれているからである。「競合型免疫アッセイ」において、試験サンプルに存在する抗原の量は、標識から生じるシグナルの量と逆の関係にある。結合した抗体抗原複合体の分離を必要とする免疫アッセイは、一般に、「不均一系免疫アッセイ」と呼ばれ、抗体抗原複合体の分離を必要としない免疫アッセイは、一般に、「均一系免疫アッセイ」と呼ばれる。当業者は、様々な免疫アッセイの形態を容易に理解するであろう。
【００５３】
「接触」は、本明細書で使用する場合、最も広い態様において、本明細書で別段の定めがない限り、任意の順で試薬を組み合わせることを指すために使用される。
【００５４】
用語「免疫複合体」は、本明細書で使用する場合、概して、補体結合を伴ってまたは伴わずに抗原と抗体分子との結合により形成される複合体を指す。抗体または抗原のどちらか一方が標識された場合、抗原と抗体との結合の結果として、標識は、免疫複合体と関連する。したがって、抗体が標識された場合、結合の結果として、標識は、抗原と関連するようになる。同様に、抗原が標識された場合（例えば、標識を有する分析物類似体）、抗原と抗体との結合の結果として、標識は、抗体と関連するようになる。
【００５５】
用語「標識」は、本明細書で使用する場合、（例えば、共有結合もしくは非共有結合で、単独で、または被包化されて）本開示の抗体、ＢＡＩＢ類似体、ＳＤＭＡ類似体または抗原と直接または間接的にコンジュゲートさせることができる、検出可能な化合物、組成物、または固体担体を指す。標識は、それ自体で検出可能（例えば、ラジオアイソトープ標識、化学発光色素、電気化学的標識、金属キレート、ラテックス粒子、または蛍光標識）であってもよいし、酵素標識の場合において、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒してもよい（例えば、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）。本開示で用いる標識は、それらに限定されないが、アルカリホスファターゼ；グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、例えば、イソルミノール、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）例えば、フルオロセインおよびローダミン化合物；リボザイム；ならびに色素でありうる。標識はまた、それ自体が検出可能であってもよい特異的結合分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン(digioxigenin)、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｅｎａｔｅ）、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）であってもよい。標識は、別の分子または固体担体に結合してもよく、標識された分子の検出を可能にする特性で選択される。標識の利用は、電磁放射または直接可視化の検出などの手段によって検出することができ、場合により、測定することができるシグナルをもたらす。
【００５６】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用する場合、概して、実質的に均一な抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体が同一である）から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位に対するものである。異なるエピトープに対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物に対して、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の特徴を指すだけであり、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。詳細には、例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組換えＤＮＡ法によって作製されてもよいし、公知の技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００５７】
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、概して、ペプチド結合でつながったアミノ酸配列を有する分子を指す。この用語は、タンパク質、融合タンパク質、オリゴペプチド、環状ペプチド、およびポリペプチド誘導体を含む。抗体および抗体の誘導体を、別の段落ですでに述べたが、抗体および抗体の誘導体を、本開示の目的のために、ポリペプチドおよびポリペプチド誘導体のサブクラスとして取り扱う。
【００５８】
用語「固体担体」は、本明細書で使用する場合、本開示の抗体またはＳＤＭＡ類似体が付着できる非水性マトリクスを指す。固体担体の例としては、ガラス（例えば、多孔質ガラス）、合成および天然ポリマー、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーン、磁気粒子、ラテックス粒子、クロマトストリップ、マイクロタイターポリスチレンプレート、または結合されていない材料から洗浄もしくは分離される抗原および／または抗体と結合することができる任意の他の物質で部分的または全体的に形成される担体が挙げられる。ある種の実施形態において、適用に応じて、固体担体は、アッセイプレートのウェルである場合もあるし、精製カラム（例えば、親和クロマトグラフィーカラム）である場合もある。
【００５９】
「受容体」は、分子の特定の空間的および極性組織、例えば、エピトープまたは決定部位を認識できる任意の化合物または組成物を指す。受容体の例としては、抗体、Ｆａｂフラグメントなどが挙げられる。
【００６０】
「結合特異性」または「特異的結合」は、例えば、ポリペプチドと、ポリペプチドに特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ’、もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント）などの第１の分子の第２の分子への実質的な認識を指す。例えば、「特異性」は、本明細書で使用する場合、概して、個々の抗体結合部位の、たった１つの抗原決定基と反応する能力、または抗体分子の集団の、たった１つの抗原と反応する能力を指す。一般に、抗原−抗体反応においては、高度な特異性が存在する。抗体は、（ｉ）抗原の一次構造、（ｉｉ）抗原の異性形態、ならびに（ｉｉｉ）抗原の二次および三次構造における違いを区別することができる。高い特異性を示す抗体−抗原反応は、低い交差反応性を示す。
【００６１】
「実質的な結合」または「実質的に結合する」は、特定のアッセイ条件下でのアッセイ混合物における分子間の特異的結合または認識の程度を指す。最も広い態様において、実質的な結合は、第１の分子が第２の分子を結合するまたは第２の分子を認識する能力の欠如と、第１の分子が第３の分子と結合するまたは第３の分子を認識する能力との差に関連し、当該差は、分子の相対濃度、ならびにインキュベーションの時間および温度を含む特定のセットのアッセイ条件下で、特異的な結合を区別する意味あるアッセイの実施を可能にするのに十分である。別の態様においては、交差反応という意味において、１つの分子は、別の分子と結合するまたは別の分子を認識する能力が実質的に欠如し、ここでは、特定のセットのアッセイ条件下で、第１の分子が第２の分子について、第３の分子に対して示す反応性の２５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満の反応性を示す。特異的な結合は、広く知られている多くの方法、例えば、免疫組織化学アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、またはウェスタン・ブロットアッセイを使用して試験することができる。
【００６２】
用語「塩」は、本明細書で使用する場合、酸と化合物の塩基性官能基との間に形成される塩を意味する。塩の例としては、それらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカル酸塩、サッカラート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））が挙げられる。用語「塩」はまた、酸性官能基、例えば、カルボン酸官能基を有する化合物と、無機または有機塩基との間に形成される塩も指す。適切な塩基としては、それらに限定されないが、アルカリ金属、例えば、ナトリウム、カリウムおよびリチウムの水酸化物；アルカリ土類金属、例えば、カルシウムおよびマグネシウムの水酸化物；他の金属、例えば、アルミニウムおよび亜鉛の水酸化物；アンモニア、および有機アミン、例えば、非置換またはヒドロキシ置換モノ−、ジ−、またはトリアルキルアミン；ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ−メチル、Ｎ−エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン、モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキルアミン）、例えば、モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ低級アルキル）−アミン、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、またはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；ならびにアミノ酸、例えば、アルギニン、リシンなどが挙げられる。
【００６３】
本開示を続ける場合、一態様において、本開示は、動物が、腎障害、例えば、腎疾患に罹患しているかどうかを決定するための方法に関する。該方法は、動物からの尿または血液サンプル中のＢＡＩＢを測定すること、および、サンプル中のＢＡＩＢの濃度に基づいて、器質的損傷の結果である腎疾患を決定することを含む。例えば、該方法は、サンプル中のＢＡＩＢの濃度を、健康な動物の集団からのサンプル中のＢＡＩＢにおける濃度に関係する参照濃度と比較することを含む。動物の血液サンプル中のＢＡＩＢ濃度の参照範囲または正常な範囲は、明白に健康な（非疾患の）対象からのサンプルを使用して設定することができる。一態様において、参照上限は、健康なネコ対象の集団の９５パーセンタイル値を表す。参照限界を超える血液または尿のＢＡＩＢ濃度［ＢＡＩＤ］を有する対象は、腎障害、例えば、腎臓の器質的損傷に罹患しているとしてみなされうる。加えて、こうした患者はまた、腎疾患に関連する早期死亡の高い可能性を有することも特徴とする。ネコ対象の場合、９５パーセンタイル値の参照限界は、ネコの集団に対して約２．０μｇ／ｄＬのＢＡＩＢであってもよい。９５パーセンタイル値の範囲は、例えば、約１．５〜２．５μｇ／ｄＬを含み、特に、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４および２．５μｇ／ｄＬを含むことができる。イヌの場合、９５パーセンタイル値は、約１．０〜２．０であり、特に、約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９および２．０μｇ／ｄＬである。
【００６４】
本開示の別の態様は、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの組合せを使用して、腎障害を決定することを含む。この態様において、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの両参照範囲は、公知であり、または健康な対象の集団から得ることができる。参照値より高いＢＡＩＢ濃度およびＳＤＭＡ濃度の値は、腎障害を示しうる。ＳＤＭＡに対する健康な対象の９５パーセンタイル値を表す適切な参照上限は、例えば、１４μｇ／ｄＬであってもよい。ＷＯ２０１５／０３５１１５を参照されたい。腎障害の予後はまた、対象からの血液サンプル中のＢＡＩＢの濃度とＳＤＭＡの濃度との比を計算することでも達成されうる。［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比が０．１５超である、または［ＳＭＤＡＳＤＭＡ］／［ＢＡＩＢ］比が７未満であることは、腎障害を示し、死亡の兆候となる。正常なＳＤＭＡ濃度の存在下でのＢＡＩＢ濃度の上昇は、正常な腎機能であっても器質的損傷を示す可能性がある。上昇したＳＤＭＡ濃度の存在下でのＢＡＩＢ濃度の減少は、器質的損傷の不在下でのネフロン機能の喪失を示す可能性がある。
【００６５】
他の態様において、本開示は、腎結石を診断する方法に関する。該方法は、対象からのサンプル中のＢＡＩＢの濃度を測定すること、および、対象が、参照限界より高いＢＡＩＢ濃度を有するかを決定することを含む。参照限界より高いＢＡＩＢレベルの上昇は、器質的損傷を示すが、これは腎結石によって起こりうる。超音波、ＣＴスキャンまたはＸ線による腎臓のさらなる分析は、腎結石の他の症状がなくても確証的でありうる。
【００６６】
別の態様において、本開示は、腎疾患を決定する方法に関し、ここで、該方法は、対象からの２つ以上のサンプルにおけるＢＡＩＢの濃度を決定することを含み、ここで、該サンプルは、数分、数時間、数日、週、数か月または数年にわたり、対象から得られる。腎疾患の診断または進行は、サンプル中のＢＡＩＢの濃度に基づいて決定することができる。サンプル中のＢＡＩＢの濃度が一連のサンプルにわたって上昇している場合、腎疾患、例えば、腎臓の器質的損傷が悪化していることを決定することができる。死亡率または早期死亡はまた、一連のサンプル中のＢＡＩＢの濃度の上昇に基づいて、予測されうる。
【００６７】
本開示はまた、本明細書に記載された計算もしくは比の決定を行う、または、腎疾患もしくは腎機能障害を診断するためのコンピューティング装置にも関する。該コンピューティング装置は、疾患の状態を決定するために使用することができる方程式から値を実行時に算出するソフトウェア命令のための記憶装置を含む。
【００６８】
ある種の実施形態において、遊離型ＳＤＭＡの濃度は、参照によりそれら全体がそれぞれ本明細書に組み込まれる、米国特許第８，４８１，６９０号、ＷＯ２０１５／０３５１５５、２０１５年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１１８，８３２号に記載されている、免疫学的な方法、装置およびキットを使用して決定される。該方法は、１種または複数のＳＤＭＡ類似体を含む対照、校正物質、または標準物質を含むことができる。特に、該方法は、それに限定されないが、マイクロプレートおよびラテラルフロー装置を使用することを含めて、当業者に周知の免疫アッセイ技術を使用することで達成することができる。ＳＤＭＡを検出するためにサンプルが得られる動物対象としては、ヒトおよびヒト以外の動物（例えば、ペット、家畜など）対象が挙げられる。
【００６９】
サンプルは、ＥＭＩＴ（登録商標）（酵素増幅免疫アッセイ技術）均一免疫アッセイシステムに基づいて、改変されたアッセイを使用して分析されうる。従来のＥＭＩＴ（登録商標）アッセイにおいて、分析物を含有するサンプルは、抗分析物抗体、分析物と酵素とのコンジュゲート、および、酵素と接触した場合にシグナルを発生する基質と接触する。抗体とコンジュゲートの結合は、酵素活性を阻害し、または減少させる。分析物がサンプル中に存在する場合、サンプルの分析物は、抗体と結合するために、コンジュゲートさせた分析物と競合し、その結果、酵素／基質からのシグナルはより多く発生する。分析物が存在しない場合、抗体とコンジュゲートとの間でさらに結合が起こり、シグナル発生を制限または妨げる可能性がある。したがって、分析物がより多く存在する場合、シグナルはより多く発生する。動力学アッセイは、サンプル中の分析物の存在または量を指標として、シグナル発生速度を使用することができる。
【００７０】
一態様において、シグナルは、当業者には周知のように、酵素／基質システムに特異的な波長での吸光度として測定される。例えば、Ｇ６ＰＤＨ／ＮＡＤの酵素／基質システムについて３４０ｎｍで吸光度を測定することで、Ｇ６ＰＤＨの存在下での、ＮＡＤからＮＡＤＨへの変換の相対量の値が得られ、これを使用して酵素による基質の変換を反映した反応速度を得ることができる。
【００７１】
反応速度は、酵素媒介反応の間に、複数の時点でシグナル（例えば、吸光度）を測定することによって決定することができる。シグナル測定の時間および間隔の決定は、試薬の濃度およびアッセイの温度を考慮する当該技術の範囲内である。例えば、速度は、サンプル（または校正物質）と全試薬とを室温で組み合わせた後、最初の約２〜１０分間で吸光度を測定することによって決定され、さらに１〜１５分間に、５〜６０秒ごとに測定することができる。反応速度は、吸光度の経時的変化として表されることができる。例えば、吸光度は、サンプル（または校正物質）と全試薬とを組み合わせた後、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０分から開始して測定することができる。吸光度は、通常、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５分間に、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０秒の間隔で測定する。これらの時間はそれぞれ、反応条件、分析物および試薬に応じて、延長または短縮することができる。
【００７２】
本開示の一実施形態によれば、分析物は、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡであり、酵素コンジュゲートシステムは、Ｇ６ＰＤＨ／ＮＡＤである。参照によりそれら全体がそれぞれ本明細書に組み込まれる、２０１５年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１１８，８３２号および２０１６年２月１９日に出願された米国特許出願第１５／０４８，２０９号を参照されたい。本実施形態において、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡの類似体は、動物、例えば、ヒト、ネコおよびイヌからの血清または血漿サンプル中のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡの存在または量を決定するために、Ｇ６ＰＤＨにコンジュゲートされ、アッセイにおいてコンジュゲートとして使用される。本実施形態の一態様において、校正物質は、公知の量のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡと校正物質マトリクス（例えば、処理血清）とを組み合わせることによって調製される。
【００７３】
また、固相アッセイ形式は、よく使用される結合アッセイ技術である。分析物の存在（例えば、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ）が、コンジュゲートおよび／または固定化された相補性結合メンバーへの分析物の結合によって示される、いくつものアッセイ装置および手順が存在する。１つの特定の態様において、固定化された結合メンバー（例えば、抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体）は、アッセイの間に、固相、例えば反応ウェル、ディップスティック、試験紙、フロースルーパッド、紙、ファイバーマトリクス、または他の適切な固相材料に結合する、または結合するようになる。サンプル中のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡと固定化抗体との結合反応は、標識にコンジュゲートしたＢＡＩＢまたはＳＤＭＡを含むある量のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体をサンプルに添加することによって決定される。サンプルとＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体との混合物を固相に接触させた後、混合物および固相をインキュベートして、固定化抗体とＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ、およびＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体の間で結合させる。インキュベーション後、結合していない反応物は、固相から除去される。類似体への抗体の結合によって抗体と結び付いた標識の量が測定される。抗体に結び付いた標識の量は、サンプル中のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡの量に反比例する。ある種の実施形態において、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡは、上記の本開示によれば、別々に標識され、同時に測定される。他の実施形態において、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡは、単独で、連続的に、または、並行に測定される。
【００７４】
ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡに対する１つまたは複数の抗体の、装置または固体担体への固定化は、抗体が、サンプル、希釈および／または洗浄手順によって流されないように行われる。１つまたは複数の抗体は、物理的吸着によって（すなわち、化学リンカーの使用なしで）、または化学的結合によって（すなわち、化学リンカーを使用して）、表面に付着させることができる。化学的結合は、表面での抗体のより強い付着をもたらすことができ、表面結合分子の所定の配向および形態を与えることができる。
【００７５】
別の実施形態において、特定種において生じたＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ抗体は、固体担体に結合する抗種抗体との相互作用によって、固体担体に結合する。１つの特定の態様において、抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体は、ウサギにおいて生じさせ、担体は、ウサギにおいて生じた抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体を認識する、抗ウサギ抗体に結合している。この態様において、抗体は、その種から得られた抗血清の形態であってもよい。抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体は、サンプルを固相に添加する前に、抗種抗体を有する固相に付すこともできるし、抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体は、サンプルを固相に添加する前に、サンプルと混合させることもできる。どちらの場合でも、抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体は、固相上の抗種抗体への結合によって、固相に結合するようになる。
【００７６】
別の実施形態において、１つまたは複数の標識された抗体は、混合物を固体担体に付す前に、試験サンプルと混合させることができる。この場合において、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体は、サンプル、希釈および／または洗浄手順によって流されないように固体担体に付着させることができる。サンプル中の標識された抗体は、サンプル中のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡに結合し、したがって、固体担体でのＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体と結合させるために利用することができない。混合物を固体担体に付し、適切にインキュベートした後、混合物は、固体担体から洗浄される。サンプルのＢＡＩＢまたはＳＤＭＡに結合していなかった抗体は、固体担体上のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体に結合することになる。サンプル中のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡの存在または量は、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体に結合した抗体の量に反比例する。抗体上の標識に関連するシグナルは、適切な方法によって測定することができる。
【００７７】
抗体抗原複合体の検出は、当業者に周知の様々な手法、例えば、比濁法、酵素標識化、放射性標識、発光、または蛍光によって実現することができる。免疫アッセイ法は、当業者に公知であり、それらに限定されないが、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）、微粒子酵素免疫アッセイ（ＭＥＩＡ）、酵素増幅免疫アッセイ技術（ＥＭＩＴ）アッセイ、免疫濁度または凝集アッセイ、ラテラルフロー装置を含むコロイド金ベースの免疫アッセイ、および化学発光磁気免疫アッセイ（ＣＭＩＡ）を含むと理解されている。ＲＩＡにおいて、抗体または抗原は、放射能で標識され、競合または非競合形式で使用される。ＥＩＡにおいて、抗体または抗原は、基質を、測定されるシグナル、例えば、色の変化、を生じる産物に変える酵素で標識される。ＦＰＩＡにおいて、抗原は、蛍光標識で標識され、試料からの標識されていない抗原と競合する。測定される分析物の量は、測定されるシグナルの量に反比例する。ＭＥＩＡにおいて、固相の微粒子は、目的の抗原に対する抗体で被覆され、分析物を捕捉するために使用される。検出のための抗体は、ＥＩＡ法のように、酵素で標識される。測定される分析物の濃度は、測定されるシグナルの量に比例する。ＣＭＩＡにおいて、化学発光標識が、抗体または抗原へコンジュゲートされ、その基質と合わさった時に光を発生する。ＣＭＩＡは、競合または非競合形式に設定することができ、それぞれ、存在する分析物の量に反比例または正比例する結果をもたらす。
【００７８】
特異的結合アッセイにおける、試薬に浸漬した試験紙の使用も周知である。そのような手法において、試験サンプルは、試験紙の一部分に付され、試験紙材料を移動、または運ばれる（wick）。したがって、検出または測定される分析物は、試験サンプル自体でありうるまたは別個に添加される溶出液を利用して、材料中をまたは材料に沿って通過する。分析物は、分析物の相補性結合メンバーが固定化されている、試験紙上の捕捉部分または検出部分へと移動する。分析物が検出部分で結合する程度は、試験紙に組み込むこともできるまたは別個に付すことができるコンジュゲートを利用して決定することができる。一実施形態において、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡに特異的な抗体は、離れた所で固体担体に固定化される。サンプルの添加後、固体担体でのＢＡＩＢ−またはＳＤＭＡ−抗体複合体の検出は、当分野で公知の任意の手段によるものでありうる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７２６，０１０号は、ラテラルフロー装置の一例、ＳＮＡＰ（登録商標）免疫アッセイ装置（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を記載している。
【００７９】
他の検出技術は、磁気粒子またはマイクロビーズ、例えば、超常磁性酸化鉄に浸漬したポリマービーズを用いる。これらのビーズは、例えば、分析物の特異的な結合相手に結び付く。ビーズは、試験されるサンプル中の標的の分析物と結合し、次いで、通常、磁気によって溶液から単離または分離される。一度単離が行われたら、直接的に、光学的に、またはカメラによって、特定の画像かまたは標識を観察することを含む、他の試験を行うことができる。
【００８０】
さらなる実施形態において、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体、特に、チオール含有、ヒドロキシル含有、アミノ含有、およびカルボキシレート含有ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体は、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡを他の分子（コンジュゲートする標的）、例えば、活性タンパク質と連結させることができ、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡコンジュゲートを形成する。本明細書に記述するＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体は、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡを、コンジュゲートする標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、検出可能な標識、固体担体などに連結させることができ、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡコンジュゲートをもたらす。本明細書に記述するＢＡＩＢまたはＳＤＭＡコンジュゲートを使用して、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡに特異的な免疫アッセイで使用する抗体を作ることができる。ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体は、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡに特異的な免疫アッセイで使用する標識とコンジュゲートさせることもできる。
【００８１】
一実施形態において、ＢＡＩＢは、キャリアタンパク質とコンジュゲートされ、「ハプテン−キャリア」免疫原を形成し、それを、ＢＡＩＢを含むエピトープへの免疫反応を刺激するために使用することができる。免疫原タンパク質の例としては、それらに限定されないが、ＢＳＡ、ＫＬＨ、およびオボアルブミンが挙げられる。ハプテンを免疫原タンパク質とコンジュゲートするためのプロトコルは、当分野で公知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８）７８〜８７頁を参照されたい）。
【００８２】
適切なＳＤＭＡ類似体は、例えば、参照によりそれら全体が組み込まれる米国特許第８，４８１，６９０号およびＷＯ２０１５／０３５１５５に記載される。
【００８３】
ＢＡＩＢ類似体は、例えば、ＢＡＩＢ−チオール（アミノ末端およびカルボキシ末端）ならびにＢＡＩＢ−ＦＭＯＣ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）を含み、ここに示す：
【００８４】
【化３】
2018515761.tif 000004
【００８５】
これらの類似体を使用して、例えば、以下：グルタルアルデヒド−ＢＡＩＢコンジュゲート、ポリリジン−ＢＡＩＢコンジュゲート、ＢＡＩＢ（アミン末端）−ＢＳＡコンジュゲート、ＢＡＩＢ（カルボキシ末端）−ＢＳＡコンジュゲート、ＢＡＩＢ（アミン末端）−ＫＬＨコンジュゲート、ＢＡＩＢ（カルボキシ末端）−ＫＬＨコンジュゲート、ＢＡＩＢ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートおよび粒子にコンジュゲートさせたＢＡＩＢを含む、ＢＡＩＢのコンジュゲートを調製することができる。これらのコンジュゲートのいくつかの構造を、ここに示す。
【００８６】
【化４−１】
2018515761.tif 000005
【００８７】
【化４−２】
2018515761.tif 000006
【００８８】
代替的実施形態において、ＢＡＩＢおよび／またはＳＤＭＡ類似体は、検出可能な標識に連結される。標識は、それ自体で検出可能（例えば、ラジオアイソトープ標識、化学発光色素、電気化学的標識、金属キレート、ラテックス粒子、または蛍光標識）であってもよいし、酵素標識の場合において、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒してもよい（例えば、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）。標識は、それ自体が検出可能であってもよい特異的結合分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸（phenylarsenate）、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）であってもよい。ＳＤＭＡおよび／またはＢＡＩＢは、当業者に周知の方法を使用して、検出可能な標識に連結させることができる。
【００８９】
ＳＤＭＡおよびＢＡＩＢならびにＫＬＨまたはＢＳＡの類似体のコンジュゲートは、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡと実質的に結合する抗体（すなわち、抗ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡ抗体）を生じる免疫原として使用されうる。本開示の方法、装置、およびキットに有用な抗ＳＤＭＡ抗体および抗ＢＡＩＢ抗体は、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡに高い親和性で結合することを特徴とする。したがって、本明細書に記述するのは、単離された、遺伝子組換えの、合成の、および／またはインビボで生成された抗ＢＡＩＢ抗体および抗ＳＤＭＡ抗体、ならびに、そのような抗体を作製および使用する方法であり、診断用および治療用の組成物、方法および装置を含む。本明細書に記述する抗体は、例えば、患者のサンプル中のＳＤＭＡおよびＢＡＩＢを決定するためのアッセイの試薬として有用である。一実施形態において、もたらされた抗体は、ＢＡＩＢおよび遊離型ＳＤＭＡ（すなわち、ポリペプチド鎖の一部ではないＳＤＭＡ）を検出することができる。
【００９０】
抗体を作製するための方法は、１つまたは複数のＢＡＩＢおよびＳＤＭＡコンジュゲートを免疫原として使用して、免疫反応を刺激することを含むことができる。該方法は、適切な免疫化プロトコルを使用して、１つまたは複数のＢＡＩＢおよびＳＤＭＡコンジュゲートを動物に投与すること、および、動物の体液（複数可）から適切な抗体を分離することを含む。あるいは、コンジュゲートをファージディスプレイ法で使用して、それらの表面に適切な抗体を示すファージを選択することができ、その後、少なくとも適切な抗体の様々なドメイン領域をコードする核酸配列の分離が続く。ファージディスプレイ法は、当業者に周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ，１７８、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ｐｈｉｌｉｐｐａ  Ｍ．；Ａｉｔｋｅｎ，Ｒｏｂｅｒｔ（Ｅｄｓ．）２００２を参照されたい）。モノクローナル抗体は、当分野で一般に知られた方法によって、調製することができる。
【００９１】
本明細書に記述するＢＡＩＢおよびＳＤＭＡ類似体は、受容体結合アッセイ、例えば、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの免疫アッセイで使用する検出可能なコンジュゲートを与えるために、標識に連結させることができる。同様に、抗ＢＡＩＢおよび抗ＳＤＭＡ抗体も、受容体結合アッセイ、例えば、免疫アッセイで使用する検出可能な抗ＳＤＭＡ抗体および抗ＢＡＩＢ抗体を与えるために、標識に連結させることができる。類似体および抗体は、当業者に周知の方法を使用して、標識に連結させることができる。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２９５、Ｒ．Ｂｕｒｎｓ編（２００５））。検出可能なコンジュゲートまたは検出可能な抗ＳＤＭＡ抗体は、試験サンプル中のＢＡＩＢおよび／またはＳＤＭＡの存在または量に関係するシグナルを出すために、様々な均一系および／または競合型アッセイ形式で使用することができる。
【００９２】
特定の実施形態において、免疫アッセイ法は、抗ＢＡＩＢおよび抗ＳＤＭＡ抗体の検出のための競合型免疫アッセイである。競合型免疫アッセイは、以下の例示的な方法で行うことができる。動物の体液からの、サンプルは、固体担体とコンジュゲートしたＢＡＩＢ類似体またはＳＤＭＡ類似体、および検出可能な標識とコンジュゲートした抗ＢＡＩＢおよび抗ＳＤＭＡ抗体と接触させる。サンプルに存在する、目的の抗体は、固体担体とコンジュゲートした類似体との結合のために、検出可能な標識とコンジュゲートした抗ＢＡＩＢおよび抗ＳＤＭＡ抗体と競合する。固体担体と結び付いた標識の量は、結合していない抗体および固体担体を分離した後に決定することができる。代替的実施形態において、競合型免疫アッセイは、以下の例示的な方法で行われる。動物の体液からの、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡを含有するサンプルは、検出可能な標識に連結したＢＡＩＢ類似体またはＳＤＭＡ類似体、次いで、固体担体とコンジュゲートした抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体と接触させる。サンプル中のＳＤＭＡまたはＢＡＩＢは、標識された抗体に連結したＢＡＩＢまたはＳＤＭＡコンジュゲートと結合するために、固体担体上のＳＤＭＡまたはＢＡＩＢと競合する。どちらの場合でも、得られたシグナルは、サンプルに存在するＢＡＩＢまたはＳＤＭＡの量と逆関係である。
【００９３】
血清中のクレアチニンの濃度は、当業者によって知られているように、様々な方法で測定することができる。例えば、Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｄｘ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＡｎａｌｙｚｅｒまたはＶｅｔＴｅｓｔ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒは、クレアチニンの試験に適合したドライスライド、例えば、ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されているものと共に使用することができる。他の分析装置およびスライド、例えば、Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手可能なＶＩＴＲＯＳ（登録商標）９５０分析装置およびＶＩＴＲＯＳ（登録商標）ＣＲＥＡスライド、ならびにＲｏｃｈｅ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＣＯＢＡＳ（登録商標）分析装置および関連したキットも使用することができる。酵素湿式アッセイ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｗｅｔ  ａｓｓａｙ）も使用することができる。例えば、当業者は、Ｉｎｔｅｇｒａ  ８００分析装置で酵素湿式化学法を使用することができる。１つの特定のアッセイは、５５２ｎｍでの検出、および６５９ｎｍでの吸光度ブランキングを伴う、クレアチニナーゼ／クレアチナーゼ／サルコシンオキシダーゼ系に基づく。当業者は、比色法、例えば、ピクリン酸に基づくもの、例えば、Ｊａｆｆｅアッセイも使用することができる。当業者に公知の他の方法、例えば、参照によりそれぞれが本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００５／０２６６５７４号および米国特許第４，８１８、７０３号に記載されているものも、クレアチニン濃度を測定するために使用することができる。ある種の実施形態において、クレアチニン濃度の測定は、アイソトープ希釈質量分析を使用して行われる。
【００９４】
以下のものは、例示の目的で示すにすぎず、上記の広義の用語で説明している本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本開示で引用したすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９５】
実施例１：ＢＡＩＢ血清レベルの液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）アッセイ
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）アッセイは、ＢＡＩＢ血清レベルを測定するために最適化された。
【００９６】
イヌの処理血清は、以下の通り調製した：未処置の市販のイヌの血清（５００ｍＬ）は、２フィートのＳＮＡＫＥＳＫＩＮ（商標）透析チューブ（３．５Ｋ  ＭＷＣＯ、３５ｍｍ  Ｄｒｙ  Ｉ．Ｄ．）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に充填し、４℃で少なくとも６時間、２０ｇの炭素粉末を有するＰＢＳ緩衝液（２０Ｌ）に対して透析した。プロセスは、緩衝液と炭素を交換しながら、３回繰り返した。血清中のＢＡＩＢ濃度は、透析前後に、ＬＣ−ＭＳによって測定された。透析前の血清において、ＢＡＩＢ濃度は、２〜３μｇ／ｄＬであった。透析後、ＢＡＩＢ濃度は、検出限界を下回った。イヌのチャコール処理血清を、使用するために−８０℃で保管した。
【００９７】
ＬＣ−ＭＳ標準曲線を、以下の手順に従って作成した。
【００９８】
水中に５０μｇ／ｄＬのＤ３−ＢＡＩＢ（３つの重水素原子で標識されたＢＡＩＢ）（ＣＤＮ  ＩＳＯＴＯＰＥＳ型番Ｄ−７２２９）を溶解することによって内部標準を調製した。
【００９９】
アッセイ標準を、水中の１ｍｇ／ｍＬのＢＡＩＢの溶液を最初に調製することによって調製した。８μＬのこの溶液を、７９９２μＬのイヌの処理血清に移し、逐次的に処理血清（上記で調製）に希釈して表１の希釈系列を生成した。
【０１００】
【表１】
2018515761.tif 000007
【０１０１】
サンプルを、以下に従ってＬＣ−ＭＳについて調製した：
１．５０μＬの試験サンプルまたは参照標準を、バイアルに移した。
２．５０μＬの内部標準溶液を、バイアルに添加し、溶液を、完全に混合した。
３．３００μＬの純粋なアセトニトリルを、バイアルに添加し、溶液を、完全に混合した。
４．バイアルを、２０分間、３０００ｘｇで遠心分離し、上澄みを、デカント、濾過し（０．２μｍ）、下記の条件下でＬＣ−ＭＳにかけた。
【０１０２】
ＬＣ−ＭＳを、以下の条件下で行った：
移動相Ａ：水、０．１％ギ酸、０．５ｍＭペルフルオロヘプタン酸（Ｓｉｇｍａ  ３４２０４１−５Ｇ）
移動相Ｂ：アセトニトリル、０．１％ギ酸
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＣＳＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、２．１×３０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ  １８６００５２９５）
スキャンタイプ：ＭＲＭ
スキャンモード：正極性
イオン源：ターボスプレー
【０１０３】
2018515761.tif 000008
【０１０４】
2018515761.tif 000009
【０１０５】
時間０分で、０％Ｂで開始する。１分で５％Ｂになる勾配に強める。１．２分間で１００％Ｂになる勾配に強める（２．２０分マーク）。０．３分間、１００％Ｂを保ち（２．５分マーク）、その後、初期状態に戻す（０％Ｂ）。
【０１０６】
実施例２：健康なおよび疾患を有するネコにおけるＢＡＩＢの測定
正常なネコ対象におけるＢＡＩＢ参照レベルを、両方の性で様々な種の５８匹のネコにおいて決定した。血清サンプルを集め、上記の通りＬＣ−ＭＳにかけ、個別の試験サンプルを標準（上記で測定）と比較してＢＡＩＢレベルを決定した。この集団における９５パーセンタイル値に基づく参照上限は、２．０μｇ／ｄＬであった。
【０１０７】
腎疾患に罹患しているネコの血清中ＢＡＩＢ濃度［ＢＡＩＢ］をまた、ＬＣ−ＭＳによって１０匹のネコにおいても測定した。加えて、ＳＤＭＡ濃度［ＳＤＭＡ］を、ＬＣ−ＭＳによって測定した。
【０１０８】
ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡのレベルを、表２に示す。
【０１０９】
【表２−１】
2018515761.tif 000010
【表２−２】
2018515761.tif 000011
【表２−３】
2018515761.tif 000012
【０１１０】
ネコのＳＤＭＡの濃度［ＳＤＭＡ］の参照上限は、１４μｇ／ｄＬで、これは健康な対象におけるＳＤＭＡの濃度の９５パーセンタイル値を表す。ＷＯ２０１５／０３５１１５を参照されたい。
【０１１１】
上昇したＢＡＩＢレベルは、腎臓の器質的損傷の重症度のマーカーであり、死亡の兆候である。約７未満の［ＳＤＭＡ］／［ＢＡＩＢ］比は、腎疾患における機能的損傷ならびに器質的損傷を示す。約０．１５より高い［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比はまた、腎疾患における器質的損傷による機能喪失も示す。高い［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比は、早期死亡の高い可能性を反映し、低い［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比は、早期死亡の低い可能性を反映する。ネコの［ＳＤＭＡ］／［ＢＡＩＢ］比の参照限界は、７である。ネコの［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比の参照限界は、０．１５である。
【０１１２】
実施例３：腎結石を有するネコのＢＡＩＢ
ＢＡＩＢの血清レベルは、腎結石に罹患しているネコ対象において、様々な時間で決定される。上昇した血清中ＢＡＩＢ濃度は、表３に示される通り、腎結石を示した。
【０１１３】
【表３−１】
2018515761.tif 000013
【表３−２】
2018515761.tif 000014
【表３−３】
2018515761.tif 000015
【表３−４】
2018515761.tif 000016
【表３−５】
2018515761.tif 000017
【０１１４】
実施例４：糸球体腎炎に罹患しているネコ対象のＢＡＩＢレベル
４匹のネコ患者および１匹のイヌ患者は、腎疾患の結果として死亡した。患者の死後、剖検により、糸球体腎炎の診断となった。ＳＤＭＡ、ＢＡＩＢおよびＣＲＥは、患者の死亡の前に集めた貯蔵したサンプルにおいて、遡及的に（上記した通り）測定された。ＢＡＩＢは、表４で示される通り、これらの患者で上昇した。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
実施例５：腎障害を有するイヌにおけるＢＡＩＢレベル
正常なイヌ対象におけるＢＡＩＢ参照レベルは、両方の性で様々な種の１３６匹のイヌにおいて決定した。血清サンプルを集め、上記の通りＬＣ−ＭＳで分析した。この集団における９５パーセンタイル値に基づく参照上限は、１．２４μｇ／ｄＬであった。
【０１１７】
血清中ＳＤＭＡ濃度と血清中ＣＲＥ濃度との間の不調和（すなわち、［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］の高い比および正常値より高い血清ＳＤＭＡ）の存在は、時期尚早の死亡のリスクを示すことは公知である。ＷＯ２０１５／０３５１５５を参照されたい。したがって、血清ＢＡＩＢ、ＣＲＥおよびＳＤＭＡを、ＳＤＭＡおよびＣＲＥの様々レベルで、１３匹のイヌにおいて測定した。比［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］を計算した。これらのデータを、表５に表す。
【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
それに続いて、イヌのコホートをモニタリングした。［ＳＤＭＡ］：［ＣＲＥ］不調和を示すイヌにおいて、ＢＡＩＢは、正常なカットオフ値より高く上昇した。［ＳＤＭＡ］：［ＣＲＥ］不調和を示すイヌにおいて、［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比は、不調和を示さないイヌに対して上昇した。追跡すると、［ＳＤＭＡ］：［ＣＲＥ］不調和を示すイヌは、死亡と報告された。１．５より高い［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］の比を、腎機能障害および時期尚早の死亡のリスクを示すとして決定した。上昇した血清中ＢＡＩＢ濃度は、腎機能障害および時期尚早の死亡のリスクを示す。
【０１２０】
実施例６：がん患者におけるＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの測定
ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡを、診療所にいる、様々ながんを有する７匹のイヌおよび６匹のネコの患者の血清で測定した。
【０１２１】
７匹のイヌのがん患者のうち、１匹のみ（Ｃ６）が、正常な参照範囲の上限（３．６ｐｇ／ｍＬ）より高いＢＡＩＢレベルを有した。イヌのがん患者Ｃ６は、転移性腎癌を有すると見出された、すなわち、Ｃ６は、がんが腎臓に広がっていた群の中で、唯一のイヌだった。
【０１２２】
６匹のネコのがん患者のうち、腎臓の病理組織学的な陽性所見（転移性腎癌、リンパ形質細胞性間質性腎炎、炎症、線維症）を有する３匹の患者は、参照範囲（２．０μｇ／ｄｌ）より高いＢＡＩＢの上昇したレベルを有していた（Ｆ３、Ｆ４およびＦ５）。正常な腎臓の病理組織像を有する３匹の患者は、正常な参照内のＢＡＩＢレベルを有していた。
【０１２３】
【表６】
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【０１２４】
実施例７：ＢＡＩＢ−Ｇ６ＰＨＤコンジュゲートの調製
ＢＡＩＢとＧ６ＰＤＨとのコンジュゲートを、ＮＡＤおよびＧ６Ｐの存在下で、ＢＡＩＢ類似体ＳＤＭＡ−ＳＨをＳＩＡ活性化Ｇ６ＰＤＨとコンジュゲートすることで調製した。
【０１２５】
【化５】
2018515761.tif 000021
【０１２６】
ＳＩＡによる酵素予備活性化：１つのバイアルのグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）（１２ｍｇ）を、３ｍＬのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解し、１時間回転して、酵素を完全に溶解したことを確実にした。酵素溶液を、必要とされるまで氷上で保持した。追加の４．５ｍＬのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を、酵素溶液に添加し、ボルテックスでよく混合し（５秒間）、１０分間氷上で溶液を保持した。１００ｍｇのＧ６Ｐを、１ｍＬの脱イオン水に溶解し、１０分間氷上に置いた。２００ｍｇのＮＡＤＨを、１ｍＬの脱イオン水に溶解し、１０分間氷上で保持した。０．６８ｍＬのＧ６Ｐ溶液および０．３４ｍＬのＮＡＤＨ溶液を、酵素溶液に添加し、ボルテックスでよく混合し（５秒間）、１０分間氷上で溶液を保持した。１つのバイアルのＳＩＡ（５０ｍｇ）を、０．５ｍＬのＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。０．１４ｍＬのＳＩＡ溶液を、酵素溶液に添加し、ボルテックスでよく混合し（５秒間）、アルミホイルで覆い、室温で２時間回転した。溶液を、Ｇ２  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットに移し、４℃の暗室で５時間、ＰＢＳ緩衝液（４Ｌ）に対して透析した。緩衝液を、新しいＰＢＳ（４Ｌ）に交換し、溶液を４℃の暗室で一晩かけて透析した。透析緩衝液を、ＭＥＳ（４Ｌ、２５ｍＭ、ｐＨ８．０）に交換し、溶液を４℃で３時間透析した。１２．５ｍＬの酵素溶液を、透析カセットから除去し、０．３２ｍＬのＭＥＳ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）および０．３２ｍＬのＥＤＴＡ（０．２Ｍ、ｐＨ８．０）を添加して、溶液の最終濃度を５０ｍＭのＭＥＳおよび５ｍＭのＥＤＴＡとした。必要ならば、酵素溶液が１２．５ｍＬ未満である場合、ＭＥＳおよびＥＤＴＡの体積を、適宜に調整してもよい。溶液を、５分間アルゴンで脱気した。
【０１２７】
ＢＡＩＢ−ＳＨ類似体（カルボキシ末端）を、実施例１２に記載の通り調製し、以下の通り活性化した酵素にカップリングした：ＢＡＩＢ−ＳＨ（４００ｅｑ、０．０９６ｍｍｏｌ、１５．６ｍｇ）を、水（０．１５６ｍｌ）に溶解し、ＳＩＡ活性Ｇ６ＰＤＨ酵素溶液に添加した。反応物を４℃で３６時間攪拌した。ＢＡＩＢ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートを、４℃で６時間、緩衝液を３回交換しながら、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して透析することによって形成し、精製した。
【０１２８】
実施例８：グルタルアルデヒド−ＢＡＩＢコンジュゲートの調製
グルタルアルデヒド−ＢＡＩＢコンジュゲートを、２０ｍＭのＰＢＳおよび０．１５ＭのＮａＣｌ（５ｍＬ、総計１０ｍｇ）中の２ｍｇ／ｍＬのＢＡＩＢと、２５μＬ（６．２５ｍｇ）の追加のグルタルアルデヒド（水中で２５％）とで調製した。室温で１時間反応後、ＮａＢＨ４（４ｅｑのＢＡＩＢ、０．７７６ｍｍｏｌ、４８ｍｇ）を添加し、反応混合物を４℃で１８時間攪拌した。
【０１２９】
【化６】
2018515761.tif 000022
【０１３０】
実施例９：ポリリジン−ＢＡＩＢコンジュゲートの調製
ポリリジン−ＢＡＩＢコンジュゲートを、以下の反応スキームに従って、水中の０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。
【０１３１】
【化７】
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【０１３２】
Ｆｍｏｃ−ＢＡＩＢ（５ｍｇ）を、水（５ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ（２ｍｇ）およびスルホ−ＮＨＳ（３ｍｇ）を添加した。溶液を、室温で１５分間攪拌し、次いで、ポリリジン溶液（２０ｍｌ、０．１％）を添加し、次いで、混合物を室温で３時間攪拌した。溶液を、ピペリジンに添加して最終濃度を２０％とし、室温で少なくとも１時間インキュベートした。反応溶液を、次いで、４℃で、１０Ｋ  ＭＷＣＯ透析カセット（３０ｍｌ）でＰＢＳ（４Ｌ）に対して透析し、緩衝液を２回交換した。
【０１３３】
実施例１０：粒子−ＢＡＩＢコンジュゲートの調製
５％固体における０．４ｍＬの粒子を、２．８ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液中の、５ｍｇ／ｍＬ濃度の０．８ｍＬのＢＡＩＢと混合し、４℃で２日間回転させて混合した。
【０１３４】
実施例１１：ＢＡＩＢ−チオール（アミン末端）およびＢＳＡでコンジュゲートさせたＢＡＩＢの合成
例示的な免疫原であるＢＡＩＢ（アミン末端）−ＢＳＡコンジュゲートを、下記の手順に従って調製した。
【０１３５】
まず、ＢＡＩＢ−ＳＨ類似体（アミノ末端）を、下記の反応スキームおよび下記の方法により調製した。
【０１３６】
【化８】
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１．２２ｍｇ（０．２１６ｍｍｏｌ）のＢＡＩＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２１７７９４）を、ＰＢＳ（４ｍＬ）に溶解した。
２．５０ｍｇ（０．２１６ｍｍｏｌ）のＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオ酢酸  −  Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号ＰＤ１９９３７７）を、ＤＭＳＯ（０．４ｍＬ）に溶解し、ＢＡＩＢ溶液に添加した。
３．反応は、２０℃で３０分間、反転させた。
４．反応を、次いで、脱アセチル化溶液（ＰＢＳ中の０．９ｍＬ、０．５Ｍのヒドロキシルアミン、２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）で処理した。
５．反応は、４℃で４時間、反転させ、ＢＡＩＢ−ＳＨ（アミノ末端）を得た。
【０１３７】
ＢＡＩＢ−ＳＨを、以下の通りＢＳＡにカップリングした：
１．１ｍＬの反応溶液を、１つのバイアルのマレイミド活性化ＢＳＡ（５ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号０５４Ｍ４８０１Ｖ）に添加し、反応は、２℃で１８時間、反転させた。
３．コンジュゲートを１０ＭＷカットオフ、３ｍＬ透析カセット内に設置し、４℃で４８時間、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して透析した。
４．カップリング効率を、当業者には公知の方法に従って、上記ステップ６から過剰なチオール溶液を使用して、エルマン試験によって決定した：１０μＬのサンプル＋２０μＬのエルマン試薬＋７０μＬのＤＴＮＢ緩衝液を、次いで、４１２ｎｍで読み取った。
【０１３８】
実施例１２：ＢＡＩＢ−チオール（カルボキシ末端）とＢＳＡコンジュゲートされたＢＡＩＢとの合成
例示的な免疫原であるＢＡＩＢ（カルボキシ末端）−ＢＳＡコンジュゲートを、以下の手順に従って調製した。
【０１３９】
ＢＡＩＢ樹脂の調製：
ＢＡＩＢ−ＳＨ樹脂を、以下の一般的な反応スキームに従って、および下記のように調製した。
【０１４０】
【化９】
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１．１５０ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）のＢＡＩＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２１７７９４）、４００ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｃｌ（Ｆｌｕｋａ  ＢＣＢＨ６１５３Ｖ）、０．４１ｍＬ（０．４７ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号７７９９６ＪＪ）、および１８ｍＬのＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２３１８５）を含む混合物を、２０℃で３時間、反転させた。
２．以下を、上記の混合物に添加した：１．２ｇ（０．０９３ｍｍｏｌ）の４−メトキシ−トリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓ６０１３８８７  ３４８）および５３０ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓ８４４６５１３  ３０９）。得られた溶液を、２０℃でさらに１８時間、反転させた。
３．ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを、次いで、添加し、１５分間反転させた（３×１８ｍＬ）。
３．インキュベーション後、樹脂を、ＤＭＦ（４×１８ｍＬ）、次いで、ＭｅＯＨ（４×１８ｍＬ）で洗浄し、乾燥して０．９５ｇのＢＡＩＢ−ＳＨ樹脂を得た。
【０１４１】
ＢＡＩＢ（カルボキシ末端）−ＢＳＡコンジュゲートの合成
１．２００ｍｇのＢＡＩＢ−ＳＨ樹脂を、４ｍＬのＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号９１７０７）に添加した。
２．ＢＡＩＢ−ＴＦＡ混合物を、２０℃で１時間、反転させた。
３．反応物を、乾燥して、２０ｍｇのＢＡＩＢ−チオール類似体を得た。
４．ステップ３からのチオールを、ＰＢＳ（４ｍＬ）に溶解した。
６．チオール溶液を、４つのバイアルのマレイミド活性化ＢＳＡ（２０ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号０５４Ｍ４８０１Ｖ）に添加し、反応は、４℃で１８時間、反転させた。過剰な溶液を、エルマン試験のために保存した：１０μＬのサンプル＋２０μＬのエルマン試薬＋７０μＬのＤＴＮＢ緩衝液を、次いで、４１２ｎｍで読み取った。
７．コンジュゲートを１０ＭＷカットオフ、３ｍＬ透析カセット内に設置し、４℃で４８時間、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して透析した。
８．カップリング効率を、当業者には公知の方法に従って、上記ステップ５から過剰なチオール溶液を使用して、エルマン試験によって決定した：１０μＬのサンプル＋２０μＬのエルマン試薬＋７０μＬのＤＴＮＢ緩衝液を、次いで、４１２ｎｍで読み取った。
【０１４２】
実施例１３：ＫＬＨコンジュゲートされたＢＡＩＢの合成
例示的な免疫原であるＢＡＩＢ（カルボキシ末端）−ＫＬＨコンジュゲートを、以下の手順に従って調製した：
１．１００ｍｇのＢＡＩＢ−ＳＨ樹脂（上記、実施例１１を参照されたい）を、２ｍＬのＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＳＨＢＤ１５３７Ｖ）に添加した。
２．ＢＡＩＢ−ＴＦＡ混合物を、２０℃で１時間、反転させ、樹脂を、濾別し、０．５ｍＬのアセトニトリルで洗浄した。
３．反応を、乾燥して、１５ｍｇのＢＡＩＢ−ＳＨを、澄んだ油として得た。
４．ステップ３からの油を、ＰＢＳ（３ｍＬ）に溶解して、ＢＡＩＢチオール溶液を形成した。
５．２ｍＬのチオール溶液を、１０ｍｇのマレイミド活性化ＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号０７２Ｍ４７９６）に添加し、反応は、４℃で１８時間、反転させた。
６．コンジュゲートを１０ＭＷカットオフ、３ｍＬ透析カセット内に設置し、４℃で４８時間、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して透析した。
７．カップリング効率を、当業者には公知の方法に従って、上記ステップ５から過剰なチオール溶液を使用して、エルマン試験によって決定した：１０μＬのサンプル＋２０μＬのエルマン試薬＋７０μＬのＤＴＮＢ緩衝液を、次いで、４１２ｎｍで読み取った。
【０１４３】
実施例１４：抗ＢＡＩＢポリクローナル抗体を作製する方法
抗ＢＡＩＢポリクローナル抗体を作製する免疫プロトコルを、当業者には周知の、以下のプロトコルに従って実施してもよい。ウサギを、例えば、上記の実施例８〜１２からの免疫原の１つ、または別のＢＡＩＢ特異的抗原で免疫する。それぞれの場合、例示的な免疫を、１ｍＬの完全フロイントアジュバントと混合された、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．５ｍｇの免疫原を注射することによって実施する。各動物の剃毛された背部に、２０〜３０回の皮内注射を行ってもよい。各動物の後ろ足に、等量の不完全フロイントアジュバントと混合された１ｍＬのＰＢＳ中の０．２５ｍｇの免疫原で追加免疫してもよい。追加免疫注射を、最初の注射後に各月に与えてもよい。各追加免疫の７〜１０日後に、各ウサギから試験採血の血液５ｍＬを採取することができる。採血産物４０ｍＬを、３回目の追加免疫注射後、抗血清力価が約１：２０００より大きかった時、各ウサギから採取することができる。抗血清力価は、アッセイについての校正曲線の傾きが最も大きい、抗血清の希釈度である。
【０１４４】
実施例１５：抗ＢＡＩＢモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体を生成する方法は、当該分野の技術内である。実施形態において、抗体は、グルタルアルデヒド−ＢＡＩＢコンジュゲート、ポリリジン−ＢＡＩＢコンジュゲート、ＢＡＩＢ（アミン末端）−ＢＳＡコンジュゲート、ＢＡＩＢ（カルボキシ末端）−ＢＳＡコンジュゲート、ＢＡＩＢ（アミン末端）−ＫＬＨコンジュゲート、または、ＢＡＩＢ（カルボキシ末端）−ＫＬＨコンジュゲートに対して生じたモノクローナル抗体である。抗体は、当業者に周知の方法を使用することによって、精製し、特徴付けられうる。
【０１４５】
実施例１６：抗ウサギＢＡＩＢ抗血清の調製
抗ＢＡＩＢ抗体特異性を、ＢＡＩＢ（アミン末端）−ＫＬＨコンジュゲートとＢＡＩＢ（カルボキシ末端）−ＫＬＨコンジュゲートとの混合物に対して生じたウサギ抗ＢＡＩＢ血清を使用する結合アッセイにより示した。ＢＡＩＢを量り、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で溶解して１．０ｍｇ／ｍｌとし、さらに希釈して５０μｇ／ｍｌとした。タンパク質Ａ（ｒＰＡ）スラリーを、ウサギ抗ＢＡＩＢ抗血清によってインキュベートして、ＩｇＧを捕捉した。陰性対照において、タンパク質Ａ（ｒＰＡ）スラリーを、ＰＢＳによってインキュベートした。インキュベーション後、６００μＬのｒＰＡスラリーを、マイクロスピンカラムに添加し、回転して液体を除去した。３００μＬの５０μｇ／ｍＬのＢＡＩＢを、カラムに添加し、２５℃で１００分間インキュベートした。カラムを、次いで、回転し、フロースルーを集めた。フロースルーを、次いで、以下の通り、ＬＣ−ＭＳによる分析で調製した。５０μＬのフロースルーの各サンプルを、９６ウェルのプレートにおいて、５０μＬのＢＡＩＢ内部標準と混合し、次いで、２０分間、３，０００ｘｇで遠心分離した。３００μＬのアセトニトリルを、次いで、プレート内の各サンプルに添加し、プレートを、次いで、２０分間超音波処理した。プレートを、次いで、２０分間、３，０００ｘｇで遠心分離した。３００μＬの上澄みを、次いで、９６ウェルのプレートフィルター（０．４５ｕｍ）に充填することによって濾過し、２０分間、３，０００ｘｇで遠心分離した。濾過後、プレートを、次いで、４時間、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥した。乾燥後、５０μＬの２０％アセトニトリル溶液を、各サンプルに添加した。サンプルを、次いで、ＬＣ−ＭＳにかけた。下記の表７に示す通り、抗ＢＡＩＢ：ｒＰｒｏｔＡカラムは、対照のｒＰｒｏｔＡカラムより６．６％多くＢＡＩＢと結合した。
【０１４６】
【表７】
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【０１４７】
先に示した実施例は、例示的なものにすぎず、本発明のすべての可能な実施形態、応用、または変更形態の網羅的な列挙であることを意味するものではない。したがって、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、上記の本発明の方法および系の種々の変更形態または変形物が、当業者に明らかである。本発明を、特定の実施形態と絡めて説明してきたが、特許請求している本発明を、そのような特定の実施形態に過度に限定すべきではないと理解すべきである。実際、本発明を実施するための上記の形態の種々の変更形態が、当業者に明らかである。
【０１４８】
本発明を、本明細書に記述した特定の方法、プロトコル、および試薬などに限定しないと理解されたい。なぜなら、それらは、当業者が認識するように変わりうるからである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を記述するために使用するものにすぎず、本発明の範囲を限定していることを意図するものではないとも理解されたい。また、本明細書で使用する場合、および添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の言及を含むことにも留意されたい。したがって、例えば、「１つのリンカー（ａ  ｌｉｎｋｅｒ）」への言及は、１つまたは複数のリンカー、および当業者に公知の等価物への言及である。
【０１４９】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者に共通に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施形態および種々の特徴、ならびにそれらの有利な詳細を、非限定的な実施形態の参照によってより十分に説明され、および／または添付図面で図示し、その後の説明で詳述する。図面に示した特徴は、必ずしも正寸ではなく、本明細書で明記されていなくても、当業者が認識するように、一実施形態の特徴を他の実施形態によって用いることができることに留意すべきである。
【０１５０】
本明細書に記述する任意の数値は、その低い値と高い値とが少なくとも２単位離れていれば、その低い値からその高い値まで１単位ずつ増えるすべての値を含む。一例として、ある成分の濃度、またはプロセスの変数の値、例えば、大きさ、角度、圧力、時間などが、例えば、１〜９０、詳細には２０〜８０、より詳細には３０〜７０と記載されていれば、１５〜８５、２２〜６８、４３〜５１、３０〜３２などの値を本明細書に明白に列挙していることを意図するものである。１未満の値の場合、１単位は、適宜０．０００１、０．００１、０．０１または０．１であると考える。これらは、特に意図しているものの単なる一例にすぎず、列挙している最小の値から最高の値までの間の数値のすべての可能な組合せを、同じように本出願に明記しているものと考えるべきである。
【０１５１】
特定の方法、装置、材料を記述するが、本明細書に記述するものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができる。先に引用したすべての参考文献および刊行物の開示は、あたかも、それらそれぞれが、参照によって個々に組み込まれるように、参照によってそれら全体が本明細書に明らかに組み込まれる。
【国際調査報告】
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