(57)【要約】  本発明は、癌治療薬、特に癌細胞への細胞療法標的の導入により、癌細胞をエフェクター細胞に対してより感受性にするシステムに関する。
2018536434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質として、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び治療薬に対する抗体又は抗体断片をコードする組換えベクター。
【請求項２】
前記治療薬が、サイトカイン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、Ｔ細胞エンゲージャ及びＮＫ細胞エンゲージャからなる群から選択される、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記治療薬が、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソテリン、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン−３、５Ｔ４、８Ｈ９、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児性ＡｃｈＲ、葉酸受容体ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬｌ  ｌＲａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、ルイス−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、並びにＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
前記サイトカインが、前記ベクターを含む腫瘍細胞によって分泌され得る、請求項２に記載のベクター。
【請求項５】
ウイルスベクターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
癌細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
前記治療薬が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
前記治療薬がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
前記治療薬がＡＤＣ抗体、ＡＤＣＣ抗体、及び／又は放射線治療用抗体の抗原である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
前記治療薬が、ＴＬＲアゴニスト、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ及び他の刺激因子からなる群から選択される免疫刺激性サイトカイン又は分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
前記治療薬が、免疫調節性又は抗腫瘍性を有するペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
前記ＴＡＡ又はＴＳＡ及び治療薬が融合タンパク質として発現される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ＴＡＡ又はＴＳＡが、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソテリン、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン−３、５Ｔ４、８Ｈ９、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児性ＡｃｈＲ、葉酸受容体ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬｌ  ｌＲａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、ルイス−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、並びにＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１４】
融合タンパク質として、腫瘍発現サイトカイン受容体に対するサイトカイン及び治療薬をコードする組換えベクター。
【請求項１５】
前記サイトカイン受容体がＩ型受容体又はＩＩ型受容体である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え腫瘍細胞。
【請求項１７】
１つ又は複数の融合タンパク質を発現する、請求項１６に記載の腫瘍細胞。
【請求項１８】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び治療薬に対する抗体又は抗体断片を含む融合タンパク質を発現することができる組換え腫瘍細胞を生成する方法であって、（ａ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載のベクターを腫瘍細胞に導入するステップ；及び（ｂ）前記ベクターが前記腫瘍細胞中に形質導入されるように前記腫瘍細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項１９】
前記ベクター及び／又はその成分が前記腫瘍細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＡＡ又はＴＳＡが、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソテリン、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン−３、５Ｔ４、８Ｈ９、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児性ＡｃｈＲ、葉酸受容体ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬｌ  ｌＲａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、ルイス−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、並びにＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＡＡ又はＴＳＡがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＴＡＡ又はＴＳＡがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療薬がＡＤＣ抗体、ＡＤＣＣ抗体、及び／又は放射線治療用抗体の抗原である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療薬が、ＴＬＲアゴニスト、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ及び他の刺激因子からなる群から選択される免疫刺激性サイトカイン又は分子である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記治療薬が、免疫調節性又は抗腫瘍性を有するペプチドである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
癌の治療を、それを必要とする個体において行う方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のベクターを含む組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２７】
融合タンパク質が発現される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌細胞が、前記癌細胞に対する免疫応答を高める治療薬を発現する、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌細胞が、ＣＡＲによって認識され得る１つ又は複数のタンパク質又はペプチド抗原を発現する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌細胞が、ＴＣＲによって認識され得る１つ又は複数のタンパク質又はペプチド抗原を発現する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌細胞が、個体の免疫細胞によって認識され得る治療薬を含む１つ又は複数の融合タンパク質を発現する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項３２】
個体へのＣＡＲ  Ｔ細胞の投与をさらに含む、請求項１７又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月３０日に提出された米国仮特許出願第６２／２４９，１８３号明細書（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
固形腫瘍に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の近年の事例は、臨床的（又は全臨床でも）失敗であった。本明細書に記載される本発明は、固形腫瘍及び他の癌適応症に対する解決法を提示する。
【０００３】
癌患者に導入され、腫瘍微小環境中に流入する細胞治療薬は、多くの障壁に直面し、その効果が制限される。こうした障壁として、限定されないが、細胞アネルギー、内因性細胞死、最適下限の細胞交通、限定的な増殖、限定的なエフェクター機能、乏しい「テイク（ｔａｋｅ）」（生存、持続及び分化）、腫瘍からの活発な排除、腫瘍微小環境における持続的な免疫抑制、並びに腫瘍誘導性細胞死が挙げられる。これらの制限を解決しようとするこれまでのほぼ全ての試みは、インビトロ及びインビボの両方で細胞治療薬の非生理学的な操作を必要とする。そのため、細胞治療薬の効果は、概して、内因的及び外因的要因の両方によって妨害される。
【０００４】
固形腫瘍のターゲティングは、さらに克服すべき一連の課題、例えば、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性に対して全体的に低い感受性、腫瘍型同士で異なる免疫抑制メカニズムを有する微小環境、並びに好都合な発現プロフィールを有する標的抗原の不足などを呈している。加えて、固体腫瘍は、非透過性細胞外マトリックス、低酸素、及び酸性ｐＨを展開することから、細胞治療薬の攻撃に対して非常に強化されている。膨大な数の標的が研究されてきたにもかかわらず、少数のみが腫瘍特異的（例えば、発現が腫瘍細胞に限定される）であり、従って、このような知見は、腫瘍を排除又は低減するための有効な解決法を見出すことが困難であり、その必要があることを示している。腫瘍をターゲティングする上でのなおも別の問題は、異なる抗原及び異なるレベルの抗原を発現する腫瘍細胞の不均一性である。本明細書に記載される本発明は、これらの問題に取り組み、さらなる利益も提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、少なくとも部分的に、癌細胞（例えば、固形腫瘍細胞などの腫瘍細胞）への細胞療法標的の導入に基づくものであり、それにより、癌細胞がエフェクター細胞に対してより感受性になり、エフェクター細胞が癌細胞を排除及び／又は低減することができるようにする。本明細書にさらに詳述するように、癌細胞（例えば、腫瘍）を融合タンパク質と一緒に形質導入することができる。こうした融合タンパク質は、標的成分に融合した結合成分から構成される。例えば、融合タンパク質は、細胞治療薬、例えば、ＣＤ１９、サイトカイン標的融合物；二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）の標的に融合した、１つ又は複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）と結合する抗体若しくは抗体断片であってよい。これらの融合タンパク質又は変異体（若しくは突然変異体）は、腫瘍細胞により分泌され、及び／又は腫瘍微小環境を透過することができる。
【０００６】
従って、一態様では、本発明は、融合タンパク質として、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び治療薬に対する抗体又は抗体断片をコードする組換えベクターを提供する。別の実施形態では、治療薬は、サイトカイン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、Ｔ細胞エンゲージャ及びＮＫ細胞エンゲージャからなる群から選択される。別の実施形態では、治療薬は、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソテリン、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）−３、５Ｔ４、８Ｈ９、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児性ＡｃｈＲ、葉酸受容体ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬｌ  ｌＲａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ（Ｌａｍｂｄａ）、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、並びにＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される。
【０００７】
別の実施形態では、サイトカインは、前記ベクターを含む腫瘍細胞によって分泌され得る。別の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは、癌細胞のゲノムに組み込まれる。別の実施形態では、治療薬は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原である。別の実施形態では、治療薬は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原である。別の実施形態では、治療薬は、ＡＤＣ抗体、ＡＤＣＣ抗体、及び／又は放射線治療用抗体の抗原である。別の実施形態では、治療薬は、ＴＬＲアゴニスト、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ及び他の刺激因子からなる群から選択される免疫刺激性サイトカイン又は分子である。別の実施形態では、治療薬は、免疫調節性又は抗腫瘍性を有するペプチドである。別の実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡ及び治療薬は、融合タンパク質として発現される。別の実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソテリン、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン−３、５Ｔ４、８Ｈ９、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児性ＡｃｈＲ、葉酸受容体ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬｌ  ｌＲａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、ルイス−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、並びにＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される。
【０００８】
別の態様では、本発明は、融合タンパク質として、腫瘍発現サイトカイン受容体に対するサイトカイン及び治療薬をコードする組換えベクターを提供する。一部の実施形態では、サイトカイン受容体は、Ｉ型受容体又はＩＩ型受容体である。
【０００９】
別の態様では、本発明は、前述及び本明細書に記載のベクターを含む組換え腫瘍細胞を提供する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、１つ又は複数の融合タンパク質を発現する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び治療薬に対する抗体又は抗体断片を含む融合タンパク質を発現することができる組換え腫瘍細胞を生成する方法を提供し、前記方法は、（ａ）前述及び本明細書に記載のベクターを腫瘍細胞に導入するステップ；及び（ｂ）ベクターが腫瘍細胞中に形質導入されるように腫瘍細胞を培養するステップを含む。一部の実施形態では、ベクター及び／又はその成分が腫瘍細胞のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソテリン、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン−３、５Ｔ４、８Ｈ９、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児性ＡｃｈＲ、葉酸受容体ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬｌ  ｌＲａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、ルイス−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、並びにＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原である。一部の実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原である。一部の実施形態では、治療薬は、ＡＤＣ抗体、ＡＤＣＣ抗体、及び／又は放射線治療用抗体の抗原である。一部の実施形態では、治療薬は、ＴＬＲアゴニスト、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ及び他の刺激因子からなる群から選択される免疫刺激性サイトカイン又は分子である。一部の実施形態では、治療薬は、免疫調節性又は抗腫瘍性を有するペプチドである。
【００１１】
別の態様では、本発明は、癌の治療を、それを必要とする個体において行う方法を提供し、これは、前述及び本明細書に記載のベクターを含む組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質が発現される。別の実施形態では、癌細胞は、癌細胞に対する免疫応答を高める治療薬を発現する。一部の実施形態では、癌細胞は、ＣＡＲによって認識され得る１つ又は複数のタンパク質又はペプチド抗原を発現する。一部の実施形態では、癌細胞は、ＴＣＲによって認識され得る１つ又は複数のタンパク質又はペプチド抗原を発現する。一部の実施形態では、癌細胞は、個体の免疫細胞よって認識され得る治療薬を含む１つ又は複数の融合タンパク質を発現する。一部の実施形態では、本方法は、個体へのＣＡＲ  Ｔ細胞の投与をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、固形腫瘍細胞への細胞療法標的の導入方法の非限定的例を示す概略図である。ステップ１は、形質導入構築物（例えば、ウイルス形質導入、ＲＮＡ形質導入、及び遺伝子形質導入を介した腫瘍選択性形質導入）、並びに／又はインビボ形質導入及び組込みに対応する。ステップ２は、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ抗原と融合した腫瘍抗原に対する抗体断片、例えば、ＣＤ１９又はその断片と融合したｓｃＦｖ抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））の発現に対応する。ステップ３は、抗原、例えば、ＣＤ１９と融合した抗体断片に対応し、これは、腫瘍細胞に結合して抗原を提示し、全ての隣接腫瘍細胞が、ＣＡＲ  Ｔ細胞によって認識される抗原であるタンパク質、ペプチド、又は他の物質、例えば、ＣＤ１９と融合した抗体断片で被覆される。ステップ４は、ＣＡＲ抗原を認識するＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞）のインビボでの注入に対応する。応答は、ＣＤ１９で被覆された腫瘍細胞に対して細胞傷害性となる。
【００１３】
【図２−１】図２Ａ−２Ｃは、ＡＡＶ形質導入細胞からの融合タンパク質の発現を示す。
【図２−２】同上
【図２−３】同上
【００１４】
【図３】図３Ａ−３Ｂは、発現された融合タンパク質によるＣＡＲ１９  Ｔ細胞でのＩＦＮγの誘導を測定するＩＦＮγＥＬＩＳＡの結果の概要を示す。
【００１５】
【図４】図４Ａ−４Ｃは、ＡＡＶ発現上清及びＢＴ４７４細胞とＣＡＲ１９  Ｔ細胞のインキュベーション時の細胞傷害性の誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、固形腫瘍細胞への細胞療法標的の導入に少なくとも部分的に基づく。腫瘍細胞を融合タンパク質と一緒に形質導入して、腫瘍細胞によって融合タンパク質が分泌され、腫瘍微小環境に放出されて腫瘍を殺傷することができる。
【００１７】
１．定義
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、特定の標的抗原に対する特異的な結合を付与する上で十分な規定免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当技術分野で公知のように、天然に産生されるインタクトな抗体は、互いに結合して、一般に「Ｙ字型」構造と呼ばれるものを形成する、２つの同じ重鎖ポリペプチド（各々約５０ｋＤ）と２つの同じ軽鎖ポリペプチド（各々約２５ｋＤ）からなるおよそ１５０ｋＤの四量体物質である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各々約１１０アミノ酸長）−アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）、続いて３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙ字の幹の下端に位置する）からなる。「スイッチ」として知られる短い領域は、重鎖可変及び定常領域をつなげる。「ヒンジ」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを抗体の残り部分とつなげる。このヒンジ領域中の２つのジスルフィド結合は、２つの重鎖ポリペプチドをインタクトな抗体中のもう１つのポリペプチドとつなげる。各軽鎖は、互いに他の「スイッチ」により隔てられた２つのドメイン、すなわち、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメインと、それに続くカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインからなる。インタクトな抗体四量体は、２つの重鎖−軽鎖二量体から構成され、重鎖及び軽鎖は、単一のジスルフィド結合によって互いに結合され；他の２つのジスルフィド結合が重鎖ヒンジ領域を互いに結合することにより、二量体が互いに結合して四量体が形成される。天然に産生される抗体も典型的にはＣＨ２ドメインでグリコシル化される。天然抗体中の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレル中に互いに接触して充填される２つのβシート（例えば、３、４、若しくは５本鎖シート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「補体決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）として知られる３つの超可変ループと、４つの幾分不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）とを含む。天然抗体が折り畳まれると、ＦＲ領域は、ドメインの構造フレームワークを付与するβシートを形成すると共に、重鎖及び軽鎖の両方からのＣＤＲループ領域が３次元空間内で一緒になって、Ｙ字構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に、さらには例えば細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞をはじめとするエフェクター細胞上の受容体にも結合する。当技術分野で公知のように、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性及び／又は他の結合属性は、グリコシル化又は他の修飾を介して調節することができる。一部の実施形態では、本開示に従って生成及び／又は使用される抗体は、修飾又は操作されたそのようなグリコシル化を有するＦｃドメインなどのグリコシル化Ｆｃドメインを含む。本開示の目的のために、いくつかの実施形態では、天然抗体に見出されるように十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが天然に生成される（例えば、抗原に反応する生物によって産生される）か、又は組換え操作、化学的合成、又は他の人工系若しくは方法によって生成されるかにかかわらず、「抗体」と呼ぶことができ、且つ／又は「抗体」として使用することができる。一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナルであり；一部の実施形態では、抗体は、モノクローナルである。一部の実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、又はヒト抗体に特有の定常領域配列を有する。一部の実施形態では、抗体配列要素は、当技術分野で公知のように、完全にヒト由来であるか、又はヒト化、霊長類化、キメラなどである。さらに、本明細書で使用される用語「抗体」は、適切な実施形態（別の解釈が記載されているか、又は文脈から明らかでない限り）では、別の形態で抗体構造及び機能的特徴を使用することを目的とする、当技術分野で公知の又は開発された構築物若しくはフォーマットのいずれも指し得る。例えば、一部の実施形態では、本開示に従って使用される抗体は、限定されないが、以下：インタクトなＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、二重若しくは多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、単鎖Ｆｖ、ポリペプチド−Ｆｃ融合物、Ｆａｂ、カメロイド（ｃａｍｅｌｏｉｄ）抗体、マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）、単鎖若しくはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質若しくはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、及びＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるフォーマットである。一部の実施形態では、抗体は、天然に生成されていれば有する共有結合修飾（例えば、グリカンの結合）が欠如していてもよい。一部の実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカン、ペイロード（例えば、検出可能な部分、治療薬部分、触媒部分など）、又は別のペンダント基（例えば、ポリエチレングリコールなど））の結合）を含んでもよい。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域など、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；トリアボディ；テトラボディ；直鎖抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。例えば、抗体断片は、単離された断片、「Ｆｖ」断片（重鎖及び軽鎖の可変領域からなる）、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって結合された組換え単鎖ポリペプチド分子（「ＳｃＦｖタンパク質」）、並びに超可変領域を模倣するアミノ酸残基から構成される最小認識単位が挙げられる。多くの実施形態では、抗体断片は、親抗体の十分な配列を含有し、その場合、これは、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合する断片であり；一部の実施形態では、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、及び／又は抗原に対する結合について親抗体と競合する。抗体の抗原結合断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域が挙げられる。抗体の抗原結合断片は、任意の手段で生成してよい。例えば、抗体の抗原結合断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的若しくは化学的に生成してもよく、及び／又は部分的抗体配列をコードする遺伝子から組換えにより生成してもよい。代わりに又は加えて、抗体の抗原結合断片は、完全又は部分的に合成により生成してもよい。抗体の抗原結合断片は、任意選択で単鎖抗体断片を含んでもよい。代わりに又は加えて、抗体の抗原結合断片は、例えば、ジスルフィド結合により互いに結合された複数の鎖を含んでもよい。抗体の抗原結合断片は、任意選択で多分子複合体を含んでもよい。機能的抗体断片は、一般的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より一般的には、少なくとも約２００アミノ酸を含む。
【００１９】
「抗原」は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、若しくは免疫適格細胞の活性化のいずれか、又はその両方に関与し得る。当業者であれば、ほぼ全てのタンパク質又はペプチドを含むあらゆる高分子が抗原の役割を果たし得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換え又はゲノムＤＮＡから得ることもできる。従って、当業者であれば、この用語が本明細書で使用されるとき、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分的ヌクレオチド配列を含む全てのＤＮＡが「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要がないことも理解するであろう。さらにまた、当業者であれば、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことも理解するであろう。抗原は、作製、合成することもでき、又は生体サンプルから取得することもできる。こうした生体サンプルとして、限定されないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞又は生体液を挙げることができる。
【００２０】
用語「オートロガス」は、後に個体に再び導入される同じ個体から得られたあらゆる物質を指す。
【００２１】
本明細書で使用される用語「細胞療法抗原」は、エフェクター細胞（例えば、遺伝子操作されたＣＡＲ  Ｔ細胞又は遺伝子操作されているか又は天然に存在するＴＣＲ）により認識され得る１つ又は複数の抗原（遺伝子操作されているか又は天然に存在する）を指すものとする。腫瘍に発現される抗体（すなわち「腫瘍結合抗原」又はＴＡＡ）は、１タイプの細胞療法抗原である。腫瘍に選択的に発現される抗原（すなわち「腫瘍選択的抗原」又はＴＳＡ）も１タイプの細胞療法抗原である。抗原は、治療介入、例えば、本明細書に記載のように、本発明の遺伝子材料を用いて腫瘍細胞をインビボで形質導入することによって腫瘍細胞上に発現させることができる。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「融合タンパク質」は一般に、各々が（１）天然に存在する、及び／又は（２）ポリペプチドの機能性ドメインを表すペプチド部分に対して高度のアミノ酸同一性を示す少なくとも２つのセグメントを含むポリペプチドを指す。典型的には、少なくとも２つのこうしたセグメントを含むポリペプチドは、２つのセグメントが（１）同じペプチド中に天然に含まれず、且つ／又は（２）事前に単一ポリペプチド中で互いに連結されておらず、且つ／又は（３）人の手によって互いに連結されていない部分である場合に融合タンパク質であると考えられる。
【００２３】
用語「プロモータ」は、遺伝子の発現を指令するＤＮＡ配列の領域を指す。プロモータは、典型的に、転写開始部位の開始から上流にあり、ポリヌクレオチド配列の転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写機構（例えば、他のタンパク質）の認識及び結合に関与する。
【００２４】
用語「固形腫瘍」は、通常、嚢胞又は液体領域を含まない異常な組織塊である。固形腫瘍は、良性又は悪性のいずれであってもよい。様々なタイプの固形腫瘍が、それらを形成する細胞型の名を取って命名されている（例えば、肉腫、癌腫、及びリンパ腫など）。肉腫及び癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑液膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウイルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、ＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹グリオーマ及び混合型神経膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても知られる）、星細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移が挙げられる。
【００２５】
「個体」又は「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、又はヒトであってよい。哺乳動物としては、限定されないが、家畜、競技動物、ペット、霊長類、マウス及びラットが挙げられる。一形態では、対象はヒトである。「個体」又は「対象」は、「患者」（例えば、医師の医療を受けている者）であってもよいが、場合により個体又は対象は患者ではない。
【００２６】
「偽ウイルス」、又は「パピローマ（ｐａｐｉｌｌｏｍａ）偽ウイルス」、又は「パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）遺伝子移入ベクター」は、ウイルスの核酸（例えば、ＤＮＡ）を含むか又は含まない異種核酸（例えば、ＤＮＡ）を感染粒子にアセンブリング及びパッケージングする１つ又は複数のパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）カプシドタンパク質を指す。パピローマ（ｐａｐｉｌｌｏｍａ）偽ウイルスを生成するのに用いられる方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，５９９，７３９号明細書、同第７，２０５，１２６号明細書、及び同第６，４１６，９４５号明細書；並びにＢｕｃｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｐｏｎ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６．１．１−２６．１．１９，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００７に記載されており、これらの文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
用語「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は、Ｔリンパ球の表面に見出されるヘテロ二量体受容体を指す。ＴＣＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、又は他の有核細胞の表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の抗原ペプチドの認識を担う抗原特異的分子である。これらは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、典型的には、２つの鎖；アルファ（α）及びベータ（β）からなるが、ＴＣＲの小さいサブセットは、可変ガンマ（γ）及びデルタ（δ）鎖により形成される。鎖はＴ細胞の表面上で対合して、ヘテロ二量体受容体を形成する。
【００２８】
用語「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」は、外性核酸を宿主細胞に移入又は導入するプロセスとして定義される。「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」細胞は、外性核酸でトランスフェクトされた、形質転換された、又は形質導入された細胞である。細胞は、対象の一次細胞及びその子孫を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、癌細胞、例えば、固形腫瘍細胞などの腫瘍細胞である。
【００２９】
用語「向性」は、受容体に向かうウイルスベクターの運動又はターゲティングを指す。
【００３０】
用語「ベクター」は、単離された核酸を含み、細胞の内部に単離された核酸を送達するために使用することができる組成物を指す。多数のベクターが当技術分野で知られており、限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物、プラスミド、及びウイルスと結合したポリヌクレオチドが挙げられる。従って、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。この用語は、細胞への核酸の移入を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなども包含すると解釈すべきである。ウイルスベクターの例として、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス及びファージベクター（ＡＡＶＰ）、レトロウイルスベクター、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）偽ウイルスベクターなどが挙げられる。
【００３１】
ＩＩ．組成物
本発明は、癌細胞（例えば、腫瘍細胞）中への融合タンパク質の導入のために使用することができ、個体の免疫系及び／又は別の治療薬のいずれかによる破壊に対して癌細胞をより感受性にする組成物を提供する。組成物は、限定されないが、本明細書に記載されるベクター及び様々な構築物、そうしたベクター及び／又は構築物を含有する宿主細胞（腫瘍細胞を含む）、これらのベクター及び／又は構築物を発現するか又は発現することができる宿主細胞、ベクター、構築物、指示書、及び／又は試薬などを含有するキットを含むことができる。
【００３２】
癌細胞（例えば、腫瘍）は、融合タンパク質で形質導入することができる。融合タンパク質が発現（及び／又は分泌）されると、これらのタンパク質は、腫瘍微小環境に透過することもできる。本発明により考慮される融合タンパク質の非限定的な例として、以下：抗体又は抗体断片が１つ又は複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に結合するような抗体融合物、サイトカイン標的融合物、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢＩＴＥＳ）又はＣＤ１９変異体が挙げられる。
【００３３】
ベクター設計
目的とする所望の遺伝子をコードする核酸配列をいくつかのタイプのベクターにクローン化することができる。例えば、核酸をプラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドにクローン化することができる。他のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、シーケンシング用ベクター、及びウイルスベクターを含み得る。別の事例では、ベクターは、スプマウイルス（ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）から作製されるレトロウイルスベクターの１タイプである、泡沫状ウイルス（ＦＶ）ベクターであってもよい。ウイルスベクター設計及び技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２００１）、並びに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されているように当技術分野で公知である。
【００３４】
形質導入方法
細胞に目的の遺伝子を発現させることを目的とする、細胞の遺伝子修飾のための細胞への核酸の移入は、形質導入（例えば、ウイルス形質導入）によって広く実施されている。目的とする所望の遺伝子又はその部分（例えば、腫瘍関連抗原）をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組換え方法を用いて取得することができる。例示的な方法として、遺伝子を発現する細胞からライブラリをスクリーニングすること、ベクターから遺伝子を誘導すること、又は細胞及び組織から直接単離することなどがある。これらの方法は、標準的な技術を用いて実施される。別の実施形態では、目的の遺伝子は、クローン化されるのではなく、合成によって生成される。遺伝子送達方法は、例えば、米国特許第５，３９９，３４６号明細書など、当技術分野で公知である。
【００３５】
ウイルス形質導入
ウイルスは、特定の細胞型への核酸送達に非常に効率的であるが、往々にして感染した宿主免疫系による検出を回避する。これらの特徴により、特定のウイルスは、癌細胞、例えば、固形腫瘍細胞中への細胞療法標的の導入のためのビヒクルとして有力な候補となる。いくつかのウイルスベース系が哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。ウイルスベクターの例として、限定されないが、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペス１ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  １  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、腫瘍ウイルス（ｏｎｃｏｖｉｒｕｓ）（例えば、マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ））などが挙げられる。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能性の複製起点、プロモータ配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、並びに１つ又は複数の選択マーカを含有する（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット；同第０１／２９０５８号パンフレット；及び米国特許第６，３２６，１９３号明細書）。
【００３６】
レンチウイルス及びレトロウイルス形質導入は、ポリブレン（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  ｓｃ−１３４２２０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＴＲ−１００３−Ｇ；Ｓｉｇｍａ  １０７６８９）、レトロウイルス形質導入の効率を高めるために使用されるカチオン性ポリマー（別名：臭化ヘキサメトリン）の添加によって増強することができる。
【００３７】
例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）は、遺伝子送達系のプラットホームを提供する。レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスファミリーに属する包膜ウイルスである。宿主細胞に入ると、ウイルスは、ウイルス逆転写酵素を用いて、そのＲＮＡをＤＮＡに転写することによって複製する。レトロウイルスＤＮＡは、宿主ゲノムの一部として複製し、プロウイルスと呼ばれる。当技術分野で公知の技術を用いて、選択した遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離してから、インビボ又はエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達することができる。いくつかのレトロウイルス系が当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，９９４，１３６号明細書、同第６，１６５，７８２号明細書、及び同第６，４２８，９５３号明細書を参照されたい。
【００３８】
レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）としては、アルファレトロウイルス属（Ａｌｐｈａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）（例えば、トリ白血病ウイルス（ａｖｉａｎ  ｌｅｕｋｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ））、ベータレトロウイルス属（Ｂｅｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）；（例えば、マウス乳癌ウイルス（ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ））、デルタレトロウイルス属（Ｄｅｌｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）（例えば、ウシ白血病ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）及びヒトＴリンパ球向性ウイルス（ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、イプシロンレトロウイルス属（Ｅｐｓｉｌｏｎｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）（例えば、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（Ｗａｌｌｅｙｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ））、並びにレンチウイルス属（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）が挙げられる。
【００３９】
別の実施形態では、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）は、長いインキュベーション期間を特徴とする、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス属であるレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）である。レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）は、非分裂細胞に感染することができる点で、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）の中でも独特であり；有意な量の遺伝子情報を宿主細胞のＤＮＡに送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。レンチウイルスベクターは、非増殖細胞に形質導入することができ、低い免疫原性を示すことができるという利点を他のウイルスベクターに対して有する。一部の事例では、レンチウイルスとして、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）（Ｓ１Ｖ）、ネコ免疫不全ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血（ｅｑｕｉｎｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｅｍｉａ）（ＥＩＡ）、及びビスナウイルス（ｖｉｓｎａ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）由来のベクターは、有意なレベルのインビボ遺伝子移入を達成する手段を提供する。
【００４０】
様々な実施形態では、ベクターは、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ベクターである。アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）は、二本鎖ＤＮＡを含むウイルスの大きいファミリーである。これらのウイルスは、宿主の細胞機構を用いて、ウイルスのＲＮＡ  ＤＮＡ及びタンパク質を合成しながら、宿主細胞のＤＮＡを複製する。アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）は、当技術分野において、複製及び非複製細胞の両方に作用して、大きいトランスジーンを収容し、宿主細胞ゲノムに組み込むことなくタンパク質をコードすることが知られている。
【００４１】
一部の実施形態では、ＡＡＶＰベクターを使用する。ＡＡＶＰベクターは、原核−真核ベクターのハイブリッドであり、これは、組換えアデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）及びファージの遺伝子シスエレメントのキメラである。ＡＡＶＰは、両ファージの選択エレメントとＡＡＶベクター系を組み合わせて、哺乳動物の感染と宿主染色体への組込みとを同時に実施しながら、パッケージング限界なしに細菌中で生成するのが簡単なベクターをもたらす。多くの適切なエレメントを含有するベクターが市販されており、必要な配列を含むように標準的な方法でさらに修飾することができる。中でも、ＡＡＶＰは、ヘルパーウイルス又はトランス作用因子を必要としない。さらに、ＡＡＶカプシド形成がないため、哺乳動物についてのＡＡＶのネイティブ向性は排除される。他の方法及び詳細は、米国特許第８，４７０，５２８号明細書及びＨａｊｉｔｏｕ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２５：３５８−３９８に記載されており、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
別の態様では、ヒトパピローマ（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ）（ＨＰＶ）偽ウイルスを使用する。近年の研究では、ＤＮＡプラスミドをパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）Ｌ１及びＬ２カプシドタンパク質中にパッケージングして、ＤＮＡを効率的に送達することができる偽ビリオン（ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）を生成できることが明らかにされている。包膜により、ＤＮＡは核から保護されるため、高い安定性で標的送達を達成する。ウイルスベクターの使用に関連する安全性についての懸念の多くは、天然ＨＰＶウイルスゲノムと構造が異なるため、ＨＰＶ偽ウイルスによって軽減される。他の方法及び例は、Ｈｕｎｇ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，７：７（ｅ４０９８３）；２０１２、米国特許第８，３９４，４１１号明細書、及びＫｉｎｅｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｔ  Ｊ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１５に記載されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
一部の態様では、腫瘍溶解性ウイルスを使用する。腫瘍溶解性ウイルス療法は、癌細胞中でウイルスを選択的に複製した後、正常細胞に影響を与えることなく腫瘍内に広がる。或いは、腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞に損傷を引き起こすことなく選択的に細胞に感染し、それらを殺傷する。腫瘍溶解性ウイルスはまた、感染した腫瘍細胞と同様に、それ自体で免疫応答を誘導する点でも有効である。典型的に、腫瘍溶解性ウイルスは、次の２つのクラスに属する；（Ｉ）天然に癌細胞で優先的に複製し、且つヒトにおいて非病原性であるウイルス。例示的なクラス（Ｉ）腫瘍溶解性ウイルスとしては、自律的パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、粘液腫ウイルス（ｍｙｘｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ニューキャッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＮＤＶ；パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ））、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、及びセネカ・バレー・ウイルス（Ｓｅｎｅｃａ  ｖａｌｌｅｙ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。第２のクラス（ＩＩ）は、ワクチンベクターとしての使用のために遺伝子操作されたウイルスを含み、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）（パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ））、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）（ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ））、及びワクシニアウイルス（ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ））が挙げられる。さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞ではなく、正常細胞での複製に必要な遺伝子において突然変異／欠失で遺伝子操作されたものも含み、そうしたものとして、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、及び水胞性口炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。腫瘍溶解性ウイルスは、複数の経路をターゲティングし、腫瘍選択的方法で複製することができることから、その遺伝的抵抗性の可能性が低いために、ウイルス形質導入方法として使用することができる。腫瘍中のウイルス用量は、インサイチューウイルス増幅のために時間の経過と共に増加する（時間と共に減少する小分子療法と比較して）ことができ、安全性の特徴を組み入れることができる（すなわち薬物及び免疫感受性）。
【００４４】
組込み
本発明の一部の態様では、細胞療法標的又は腫瘍関連抗原をコードする核酸配列が腫瘍細胞の遺伝子構造の一部として組み込まれる。特定の理論に拘束されるわけではないが、腫瘍細胞が複製すると、子孫腫瘍細胞が細胞療法標的を発現し、従ってエフェクター細胞及び他の治療薬（併用療法薬を含む）に感受性となることから、細胞療法標的をコードする核酸配列の組込みは有用となり得る。その結果、転移性疾患などのいくつかの適応症では、急速な腫瘍細胞増殖の状態が本発明の治療薬を増殖させる上で有用となる。
【００４５】
一実施形態では、組込みは、腫瘍細胞に天然に組み込まれるウイルスを用いて達成することができる。組込みは、それが腫瘍細胞のＤＮＡに組み込まれたウイルスゲノムであることから、レトロウイルスの複製において重要なステップである。組込みは、ウイルス複製周期の一部ではなく、ときおり起こり得る。ウイルスは、宿主ゲノム中に組み込まれるが、その新たなＤＮＡコピーを直接生成しない。或いは、ウイルスは、宿主ゲノムと一緒に受動的に複製されて元の細胞の子孫に継代される。ウイルスＤＮＡの組込みにより、宿主染色体ＤＮＡ中へのウイルスゲノムの永続的な挿入が達成され、これは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）の場合、プロウイルスと呼ばれる。
【００４６】
別の実施形態では、組込みは、市販のキットによって達成することができ、そうしたキットとして、ヒト染色体１９上のアデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）組込み部位１（ＡＡＶＳ１）中に目的の遺伝子を組み込むように設計されたＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔがある。
【００４７】
ＴＡＡの発現以外に、癌細胞（例えば、固形腫瘍細胞）を操作して、癌細胞も、エフェクター細胞が認識する抗原に結合された抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）の１つ又は複数の融合タンパク質を発現するようにすることができる。抗体又は抗体断片は、腫瘍細胞を認識し、エフェクター細胞が認識すべき抗原に結合し、これを提示する。非限定的な一例では、腫瘍細胞に結合する抗腫瘍ＴＡＡｓｃＦｖ、及びヒトＣＤ１９タンパク質の一部又は全部を含む融合タンパク質で固形腫瘍細胞を形質導入することができる。ｓｃＦｖ部分は、腫瘍細胞に結合し、ＣＤ１９は、エフェクター細胞に提示されて、エフェクター細胞が腫瘍細胞をターゲティングし、腫瘍細胞を破壊する。エフェクター細胞は、天然に存在するものでも又は遺伝子操作されたものでもよい。
【００４８】
固形腫瘍ターゲティングのための発現遺伝子アプローチ
腫瘍細胞に生産的に導入される遺伝子は、有効性に対する重大な障壁に取り組むか又はこれを回避することにより、改善された細胞療法活性を提供する。これらの遺伝子は、抗腫瘍応答を「伝播する」ことによって治療有効性を改善し、局所環境内のサイトカイン支持を最適化し、局所免疫抑制を逆転させ、細胞エフェクター機能を改善し、腫瘍への細胞アクセスを促進する。任意の遺伝子を本明細書に記載の発現構築物に含有させることができ、本開示は、いずれの具体的な遺伝子にも限定されない。細胞療法標的として含有させることができる例示的で非限定的な遺伝子型として、例えば、別の細胞療法薬の標的、ポリペプチド抗原、抗体、サイトカイン、腫瘍微小環境をターゲティングする因子、及び細胞成長／増殖を支持する因子が挙げられる。
【００４９】
発現された遺伝子は、その関連エレメントを含むプロモータ、及び遺伝子配列を含む。発現された遺伝子は、３つの不可欠な特徴：１）腫瘍細胞における発現のための最適プロモータ、２）最適な発現遺伝子配列、及び３）規定動態を有する最適化発現パターンを含む。
多様な発現パターンを駆動するプロモータの組を作製する。例として、数日で測定される高速且つ持続的な発現、又は高速であるが、可逆的な発現、又は遅延させた発現が挙げられる。また、発現のレベルは、調節及びプロモータエレメントの選択的使用によって修飾することができる。こうした方法は、例えば、Ｅ．Ｄ．Ｐａｐａｄａｋｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４：８９−１１３（参照により本明細書に組み込まれる）において十分に理解されている。
【００５０】
ＩＩＩ．癌を治療する方法
本発明は、癌細胞（例えば、腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞）が、ＴＡＡ又はＴＳＡ及び治療薬を含む融合タンパク質を分泌する系を操作することにより、癌を治療する組成物又は方法を提供する。癌を有するか又は癌を有することが疑われる個体に、その癌細胞のインビボ形質導入を可能にする組成物を投与することができる。投与は、限定されないが、静脈内、全身、筋肉内、腹腔内、又は腫瘍内注射をはじめとする任意の手段で行うことができる。
【００５１】
別の治療薬の標的
一部の実施形態では、融合タンパク質の形質導入及び分泌の後に局所腫瘍細胞に発現された細胞治療薬抗原は、エフェクター細胞により認識され、これは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含むことができる。一実施形態では、ＴＡＡ発現は、腫瘍細胞集団のみに限定し、全ての腫瘍細胞に発現させ、腫瘍細胞表面上に発現させることができる。他の抗原は、腫瘍細胞に過剰発現されるが、正常細胞には低レベルで存在し、従って腫瘍選択的抗原（ＴＳＡ）である。さらに、一部の腫瘍抗原は、「パッセンジャー突然変異」として発生し、すなわち、ＤＮＡ修復に対する制御欠陥を有するために、多様なタンパク質中に突然変異を蓄積する腫瘍細胞によって発現される非必須抗原である。いくつかの腫瘍抗原は、免疫応答；特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞により産生されるタンパク質である。細胞療法標的によりターゲティングされ得る腫瘍特異的分子は、当技術分野で公知の腫瘍関連抗原を含み、例えば、以下：神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソテリンを挙げることができる。腫瘍ゲノム及びエキソームの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、及び腫瘍プロテオームの高感度質量分析（タンパク質シーケンシング）分析をはじめとする技術の適用は、本発明で使用される新たなＴＡＡ及びＴＳＡ抗原を同定し続けている。
【００５２】
ＮＧＳは、同時に多数のシーケンシングを実施するハイスループットシーケンシングの方法であり、その工程中、単一のサンプルからのＤＮＡの数百万の断片がユニゾンでシーケンシングされる。ＮＧＳは、ハイスループットシーケンシングを促進し、これにより全ゲノムを１日足らずで配列決定することができる。ＮＧＳプラットホームの作製により、シーケンシングがより多くの研究室にアクセス可能となり、核酸シーケンシングを用いて実施される研究及び臨床診断の量が急速に増加し、このようにしてゲノミクス及び分子生物学に急激な変化がもたらされた。いくつかのＮＧＳ技術は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、Ｒｏｃｈｅ  ４５４シーケンシング、Ｉｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔ：プロトン／ＰＧＭシーケンシング、及びＳＯＬｉＤシーケンシングを含む。
【００５３】
腫瘍特異的抗原を同定する別の方法は、直接タンパク質シーケンシングである。タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ））をはじめとする多次元ＭＳ技術（ＭＳｎ）を用いた酵素消化物のタンパク質シーケンシングも、抗原を同定するのに使用することができる。こうしたプロテオームアプローチは、高速であり、高度に自動化された解析を可能にする（例えば、Ｋ．Ｇｅｖａｅｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１１４５−１１５４（２０００、これは参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。さらに、未知のタンパク質の新たなシーケンシングのためのハイスループット方法を用いて患者の腫瘍のプロテオームを解析することにより、発現された抗原を同定することもできる。例えば、メタショットガンタンパク質シーケンシングを用いて、発現された抗原を同定することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｕｔｈａｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １１（１０）：１０８４−９６を参照）。
【００５４】
使用することができる腫瘍抗原の非限定的例として、以下：ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン−３、５Ｔ４、８Ｈ９、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児性ＡｃｈＲ、葉酸受容体ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬｌ  ｌＲａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、ルイス−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、及びＶＥＧＦ受容体が挙げられる。使用することができる他の例示的な抗原は、フィブロネクチンの癌胎児変異体、テナシン、又は腫瘍の壊死領域などの腫瘍の細胞外マトリックス内に存在する抗原である。
【００５５】
使用することができる別の腫瘍選択的分子は、腫瘍細胞に発現又は過剰発現される任意の膜タンパク質又はバイオマーカを含み、そうしたものとして、限定されないが、以下：インテグリン（インテグリンανβ３、α５β１）、ＥＧＦ受容体ファミリー（例えば、ＥＧＦＲ２、Ｅｒｂｂ２／ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｅｒｂｂ３、Ｅｒｂｂ４）、プロテオグリカン（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカン）、ジシアロガングリオシド（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３）、Ｂ７−Ｈ３（別名：ＣＤ２７６）、癌抗原１２５（ＣＡ−１２５）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、血管内皮増殖因子受容体１及び２（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２）、ＣＤ５２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、腫瘍関連糖タンパク質（例えば、ＴＡＧ−７２）、白血球分化抗原（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１９（ＣＤ１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ７４、ＣＤ１５２、ムチン１（ＭＵＣ１）、腫瘍壊死因子受容体（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、インスリン様増殖因子受容体、葉酸受容体ａ、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、Ｃ−Ｃケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ４）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、レセプタードリジンナンタイス（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ  ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ  ｎａｎｔａｉｓ）（ＲＯＮ）受容体、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、及び他の腫瘍特異的受容体又は抗原が挙げられる。
【００５６】
本明細書に引用するＴＡＡ及びＴＳＡ標的の非限定的例によって例示されるように、当業者が、本明細書に記載の形質導入及び発現された治療薬を向かわせることができる極めて多様な抗原がある。例えば、治療薬は、ＣＡＲ  Ｔ細胞によって認識され得る標的抗原（例えば、ＣＤ１９）に融合したｓｃＦｖ抗原結合ドメイン（例えば、抗ＭＵＣ１６、抗ＣＥＡ、抗ＰＳＭＡ）を含有する分泌された融合タンパク質を含み得る。この実施形態では、分泌された融合タンパク質は、２つの機能性ドメイン、すなわち、標的腫瘍細胞表面に結合するｓｃＦｖ及びＣＡＲ  Ｔ細胞の標的として提示されるＣＤ１９タンパク質ドメインを有する（図１）。多くの多様な抗原の１つをターゲティングするためにｓｃＦｖを選択することができること、及び細胞治療薬（また、本発明の「エフェクター細胞」）によって認識されるべきタンパク質ドメインも多様であり、例えば、特定のＣＡＲ  Ｔ細胞、又はＴＣＲ  Ｔ細胞、又は特性決定されたＴＩＬ若しくはＮＫ細胞によって認識され得ることは直ちに理解されるであろう。さらに、最新の抗体操作により、最新の抗体操作は、二重特異性認識の使用を治療薬のｓｃＦｖ部分の中に組み入れることを可能にし、その結果、二重特異性ｓｃＦｖの両アームが結合することができて初めて、腫瘍細胞への有効な結合が達成されることが認識されるであろう。入手可能な二重特異性技術の種類は多様であり、分子生物学及びタンパク質化学ツール並びに有効な二重特異性抗体の操作に必要な原理は、よく知られており、例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ＭＡｂｓ  ２０１２；４（２）１８２−９７（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００５７】
さらに、例えば、個別のエレメントについてのフレーム内又は独立のＩＲＥＳ開始部位を用いて、単一のＣＡＲ発現構築物に複数の遺伝子をコードすることができる。或いは、誘導性方法が記載されており、この方法では、小分子の適用により、１つ又は複数のＣＡＲエレメントの発現を誘導又は遮断することができる。非常に多様なこうした方法が開示されており、例えば、阻害性ＣＡＲ、共刺激性ＣＡＲ、「ｃｉｄｅＣＡＲ」、オンスイッチ（ｏｎ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ）などがあり、それらを使用してＣＡＲ  Ｔ細胞の活性をさらに修飾又は改変することができる（Ｂａａｓ，Ｔ．ＳｃｉＢＸ７（２５）；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｃｉｂｘ．２０１４．７２５を参照）。
【００５８】
抗体−薬物複合体標的
別の実施形態では、形質導入された細胞は、公知の抗体−薬物複合体によりターゲティングされる融合タンパク質を分泌し、例えば、こうしたものとして、例えば、ブレンツキシマブベドチン（アドセトリス（ＡＤＣＥＴＲＩＳ）、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；トラスツズマブ・エムタンシン（Ｒｏｃｈｅ）；ゲムツズマブ・オゾガマイシン（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＭＣ−５４４；ＳＡＲ３４１９；ＣＤＸ−０１１；ＰＳＭＡ−ＡＤＣ；ＢＴ−０６２；ＣＤ３０、ＨＥＲ２、及びＩＭＧＮ９０１が挙げられる（例えば、Ｓａｓｓｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０４５：１−２７（２０１３）；Ｂｏｕｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２４：５３５７−５３６３（２０１４）を参照）。別の実施形態では、形質導入された細胞は、抗体依存的細胞傷害性機能を有する抗体によってターゲティングすることができる融合タンパク質、例えば、リツキシマブ、オクレリズマブ、イピリムマブ、シツキシマブ、アービタックス及びその他多数によって認識されるものを分泌する。従って、一部の実施形態では、こうした既知の抗体薬物複合体の１つ又は複数に結合する融合タンパク質の一部としてポリペプチド抗原をコードする核酸を、本明細書に記載の細胞療法標的として含有させることができる。
【００５９】
サイトカイン融合タンパク質
一部の実施形態では、腫瘍又は腫瘍微小環境をサイトカイン融合タンパク質、例えば、サイトカイン（例えば、抗腫瘍サイトカイン）と、本明細書に記載の１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的との融合タンパク質で形質導入する。例示的なサイトカインは、腫瘍に結合し、サイトカインを含む腫瘍を提示する。例えば、いくつかの考慮される標的として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、及びＢＣＭＡが挙げられる。こうした細胞療法は、腫瘍表面に１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的と刺激性サイトカインとの両方を供給することができる。例えば、発現及び／又は分泌された構築物は、サイトカイン−ＣＤ１９融合タンパク質、又はサイトカインとＣＤ１９断片、例えば、ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞が結合するＣＤ１９断片との融合物をコードすることができる。一部の実施形態では、ＣＤ１９断片は、ＣＤ１９ＩｇＣドメインである。特定の理論に拘束されることは望まないが、こうした融合タンパク質をコードする単一発現構築物は、有利には、最小（例えば、単一）トランスジーンを用いて細胞治療薬を遺伝子改変することができる。サイトカイン融合タンパク質を使用するもう１つの利点は、サイトカイン機能効果以外に、受容体に対するそれらの堅固な結合を使用することである。
【００６０】
一部の実施形態では、サイトカイン融合タンパク質の一部として分泌される１つ又は複数のサイトカインは、高い親和性（例えば、約１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１又はそれを下回るＫＤ）で細胞に結合し、且つ／又は低い内在化率（例えば、１日につき１細胞当たり約１０、１０２、１０３、１０４又は１０５個のサイトカイン分子）を有する。様々なサイトカインの結合親和性及び内在化率は、当技術分野で公知であり、及び／又は公知の方法を用いて測定することができる。
【００６１】
免疫応答促進（Ｐｒｏ−ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）剤
一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え腫瘍は、本明細書に記載の融合タンパク質と同様に、１つ又は複数の免疫応答促進剤、例えば、癌療法に使用される１つ又は複数のサイトカインをコードする。含有させることができる非限定的、例示的なサイトカインとして、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−３６、ＴＮＦ、ＬＴα、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＬＲアゴニスト、及び免疫チェックポイント抗体断片が挙げられる。
【００６２】
サイトカイン療法に関連する周知の問題として、例えば、高用量要件、毒性、及び限定的な有効性が挙げられる。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現構築物を用いて、（例えば、サイトカイン療法に関連する１つ又は複数の危険性を軽減又は排除するために）特定の部位に及び／又は特定の用量で１つ又は複数のサイトカインを送達する。
【００６３】
一部の実施形態では、腫瘍の表面又は近傍でのサイトカイン（例えば、免疫刺激性サイトカイン）の発現により、腫瘍に対する免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、発現されたサイトカイン融合タンパク質は、１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、１つ又は複数の別のＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的となり得る。一部の実施形態では、腫瘍の表面近傍でのサイトカイン融合タンパク質の分泌により、腫瘍に対する免疫応答を誘導し、これはまた、１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、１つ又は複数の別のＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的としても使用される。一例は、ＣＤ１９反応性を有するＣＡＲ  Ｔ細胞によって認識されるＣＤ１９タンパク質ドメインに融合したインターフェロンαサイトカインである。ＩＦＮα分子は、腫瘍細胞上又はその近傍のインターフェロン受容体と高い親和性で結合するため、ＣＤ１９を指向する細胞治療薬活性を支持する。別の例では、インターフェロンαサイトカインを、同じ腫瘍細胞型上のＴＡＡ又はＴＳＡを認識するｓｃＦｖと融合させることより、その細胞及び周囲細胞と再度結合させて、ＩＦＮα駆動の免疫応答を誘導又は支持する。
【００６４】
例えば、ＩＬ−２１の放出を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大及び／若しくはエフェクター分化を誘導する、且つ／又はＮＫ細胞活性化及び細胞傷害活性を支持することができる。例示的な一方法では、発現構築物は、ＩＬ−２１をコードする。腫瘍細胞上のｓｃＦｖ指向性抗原と結合すると、本明細書に記載の細胞治療薬は、ＩＬ−２１の持続的な放出を呈示する。例示的な細胞治療薬として、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、及びオートロガスＮＫ細胞が挙げられる。
【００６５】
別の例示的な方法では、ＩＬ−１５融合タンパク質の誘導放出を用いて、ＮＫ細胞拡大を支持し、及び／又はＮＫ細胞を動員して、抗腫瘍応答を伝播すると共に、細胞治療薬の生存及び拡大を支持することができる。例示的な細胞治療薬として、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、及びオートロガスＮＫ細胞が挙げられる。この例では、標的腫瘍細胞型上のＴＡＡ又はＴＳＡを認識するｓｃＦｖは、局所環境内のＩＬ−１５に結合し、これを提示する。提案されるサイトカイン例の全てに関連する別の例示では、分泌された融合タンパク質は、三価であり、標的腫瘍細胞型上のＴＡＡ又はＴＳＡを認識するｓｃＦＶ、抗原結合にエンゲージしない重鎖若しくは軽鎖可変領域内のβループ又はβ鎖にコードされないサイトカインを有し、細胞治療薬が結合するための標的抗原を発現する。ｓｃＦｖの重鎖及び軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲの利用は、いずれの残基が抗原エンゲージメントに関与するか、並びにいずれの残基が関与せずに溶媒に曝露されている、すなわち、サイトカインなどのコードされた配列の発現に有用であるかを示すデータベースの使用と同様に、ＣＤＲの配列から容易に決定される。
【００６６】
細胞動員部分
いくつかの例では、組換え腫瘍細胞は、融合タンパク質の一部として、ｓｃＦｖ又はＴＣＲを発現することができ、これらを細胞動員部分（例えば、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ１６）に融合させることができる。別の実施形態では、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ（登録商標））技術を利用して、身体の内在性Ｔ細胞にエンゲージすることを促進すると共に、１つ又は複数のＴＡＡを発現するように操作された標的癌細胞をターゲティングする。ＢｉＴＥ（登録商標）技術の抗体構築物は、ＴＡＡ又は腫瘍結合表面抗原に対する、及びＴ細胞受容体結合分子に対するモノクローナル抗体の最小結合ドメインを一本鎖ポリペプチド鎖と遺伝子的に連結することによって構築される。一方の抗体は、標的腫瘍細胞上の選択された表面抗原に特異的であり、他方の抗体は、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体複合体と結合した部分（例えば、ＣＤ３）に特異的である。ＢｉＴＥ（登録商標）技術は、ポリクローナル細胞傷害性Ｔ細胞と標的悪性腫瘍細胞とに結合する。
【００６７】
ポリペプチド抗原
一部の実施形態では、１つ又は複数の別の細胞治療薬の標的は、ポリペプチド抗原であるか、又はこれを含む。別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）が、こうしたポリペプチド抗原を認識して結合するようにこれを操作することができれば、発現構築物によって発現されるポリペプチド抗原は、特定のポリペプチド又はその部分に限定されない。一部の実施形態では、ポリペプチド標的は、腫瘍関連抗原ではないポリペプチドである。一部の実施形態では、標的は、腫瘍抗原、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、グリコリピド（Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、又はＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲである。
【００６８】
抗体融合タンパク質
一部の実施形態では、腫瘍又は腫瘍微小環境を、抗体（又はその抗体結合断片、例えば、分泌されたｓｃＦｖ又は他の抗体フォーマット）と、１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的とを含む融合タンパク質で形質導入する。抗体（又は断片）は、例えば、腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載の腫瘍抗原）に結合するように選択することができ、その融合パートナーは、１つ又は複数の別の細胞治療薬の標的を含んでもよい。こうした抗体（又はその抗体結合断片）は、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含み、例えば、ｓｃＦｖ及び完全長ｍＡｂ、ＶＨＨドメイン、ディアボディ、ナノボディなどが挙げられる。一例では、構築物は、ｍＡｂ（例えば、抗腫瘍関連抗原ｍＡｂ又は抗原結合断片）及びＣＤ１９又はその断片（例えば、ＣＤ１９Ｉｇドメイン）からなる分泌された融合タンパク質をコードする。
【００６９】
一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、いくつかの細胞型に発現される抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、腫瘍選択的抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、腫瘍選択的ではあるが、特異的ではない抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、血液系腫瘍に関連する腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、固形腫瘍に関連する腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、以下：ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、及びＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲの１つ又は複数に結合する。
【００７０】
腫瘍細胞上に配置される標的は、ＣＤ１９であってよい。他のＢ細胞標的を使用することができ、限定されないが、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＢＣＭＡが挙げられる。これらのＢ細胞標的は、リストに挙げる他の標的と一緒に、ＣＡＲ  Ｔ細胞標的のような特定の利点を有する。さらに、標的は、ＣＤ３０、Ｈｅｒ２、ＡＤＣ又は放射線療法の標的（例えば、放射性同位体を担持するモノクローナル抗体）を含み得る。
【００７１】
局所（例えば、腫瘍微小環境）因子を阻害するペプチド
一部の実施形態では、局所因子を阻害するペプチド（例えば、ポリペプチド及びその断片）を腫瘍細胞により融合タンパク質として発現させることができる。これらのペプチドをコードする核酸を本明細書に記載のように、及び／又は当業者には周知の任意の方法で操作することにより、ペプチドを発現させることができる。非限定的な例として、ＴＧＦβ、アデノシン受容体２、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ））が挙げられる。
【００７２】
誘導性ＣＤ１９変異体タンパク質及びＣＤ１９変異体融合タンパク質のスカフォールドとしてのＣＤ１９
ＣＤ１９は、Ｉｇスーパーファミリーに属する９５ｋｄ膜貫通タンパク質であり、２つの細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインを含む（例えば、Ｔｅｄｄｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍ．５：５７２−５７７（２００９）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２０１２  Ｎｏｖ  ２９；１（１）：３６．ｄｏｉ：１０．１１８６／２１６２−３６１９−１−３６．）を参照）。一部の実施形態では、Ｃ２型Ｉｇドメインの一方若しくは両方を突然変異誘発のスカフォールドとして使用し、ＣＤ１９変異体（例えば、一方若しくは両方のＣ２型Ｉｇドメイン内に１つ若しくは複数の突然変異を含むＣＤ１９若しくはその一部分）を、本明細書に記載の標的抗原への結合についてスクリーニング及び選択することができる。
【００７３】
ヒトＣＤ１９のヌクレオチド配列は公知である（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｍ８４３７１．１を参照）。特定の抗原に結合するＣＤ１９変異体をコードする変異体核酸配列を取得するために、当技術分野で公知のいくつかの方法を使用することができる。一部の実施形態では、特定の抗原に結合するＣＤ１９変異体をコードする核酸の同定及び／又は単離を可能にするスクリーニング法を使用する。例示的な方法としては、いわゆるバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）ステップがあり、これは、ファージディスプレイ（Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，４３６３−４３６６）、リボソームディスプレイ（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１，１１９−１３５）、ＤＮＡディスプレイ（Ｃｕｌｌ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９，１８６５−１８６９）、ＲＮＡペプチドディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，１２２９７−１２３０２）、共有結合ディスプレイ（国際公開第９８／３７１８６号パンフレット）、細菌表面ディスプレイ（Ｆｕｃｈｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，１３６９−１３７２）、酵母表面ディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．，１９９７．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５，５５３−５５７）及び真核ウイルスディスプレイ（Ｇｒａｂｈｅｒｒ，Ｒ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｗ．，２００１．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ．Ｓｃｒｅｅｎ．４，１８５−１９２）などの技術から知られている。ＦＡＣＳ及び磁気ビーズ選別も、標識抗原を用いた富化（パニング）用途に適用可能である。また、バイオパニングステップの後に又は単独で、ＥＬＩＳＡ（Ｄｒｅｈｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３９，１９７−２０５）及びＥＬＩＳＰＯＴ（Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．１９８３．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６５，１０９−２１）などの免疫検出アッセイを用いることもできる。
【００７４】
従って、一部の実施形態では、本明細書に記載される誘導性構築物は、単独で、又は本明細書に記載の融合タンパク質の一部としてＣＤ１９変異体（若しくは断片）をコードする。例えば、本明細書に記載される誘導性構築物は、腫瘍因子に結合するように選択され、発現すると、腫瘍抗原に結合することができ、しかも、それ自体が別の細胞治療薬（例えば、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的となり得るＣＤ１９変異体（又は断片）をコードすることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される誘導性構築物は、主要抗原に結合するように選択されたＣ２型Ｉｇドメイン変異体を含むＣＤ１９変異体をコードする。ＣＤ１９変異体が発現すると、Ｃ２型Ｉｇドメインは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原に結合する。続いて、ＣＤ１９を認識するＣＡＲ−Ｔ細胞による治療（例えば、対象への投与）により、ＣＤ１９変異体が結合した腫瘍細胞を殺傷する。一部の実施形態では、本明細書に記載される誘導性構築物は、各々が腫瘍抗原（例えば、腫瘍抗原の異なるエピトープ）に結合するように選択された両方のＣ２型Ｉｇドメインの変異体を含むＣＤ１９変異体をコードする。ＣＤ１９変異体が発現すると、Ｃ２型Ｉｇドメインは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原に結合する。これに続いて、ＣＤ１９を認識するＣＡＲ−Ｔ細胞による治療（例えば、対象への投与）により、ＣＤ１９変異体が結合した腫瘍細胞を殺傷する。
【００７５】
一部の実施形態では、標的抗原に結合させるために選択されたＣＤ１９変異体を融合タンパク質に含有させる。例えば、標的抗原に結合するように選択されたＣ２型Ｉｇドメイン変異体を含むＣＤ１９変異体を、やはり腫瘍抗原（例えば、腫瘍抗原上の異なるエピトープ）に結合する抗体若しくはその断片と融合することができる。例示的な融合タンパク質として、例えば、ＣＤ１９変異体／ｓｃＦｖ融合タンパク質及びＣＤ１９変異体／ＶＨＨ融合タンパク質が挙げられる。本明細書に記載される誘導性構築物は、こうしたＣＤ１９変異体／抗体融合タンパク質をコードすることができ、発現すると、融合タンパク質のＣＤ１９変異体及び抗体は、腫瘍細胞上の腫瘍抗原に結合する。これに続いて、ＣＤ１９を認識するＣＡＲ−Ｔ細胞による治療（例えば、対象への投与）により、ＣＤ１９変異体／抗体融合タンパク質が結合した腫瘍細胞を殺傷する。一部の実施形態では、本明細書に記載のように、誘導性発現に関して有用なＣＤ１９スカフォールド遺伝子は、可溶性の精製済融合タンパク質のインビトロでの生成のために修飾する場合も有用となる。ＣＤ１９変異体（又は断片）をスカフォールドとして含む融合タンパク質の追加的で非限定的な例として、例えば、ＣＤ１９変異体／サイトカイン融合タンパク質及びＣＤ１９変異体／ＴＬＲアゴニスト融合タンパク質が挙げられる。
【００７６】
ＣＤ１９（又は断片）をスカフォールドとして含む融合タンパク質の追加的で非限定的な例として、例えば、ＣＤ１９−サイトカイン融合タンパク質、ＣＤ１９−ＴＬＲアゴニスト融合タンパク質が挙げられる。免疫グロブリン様ドメインを含有する他のＢ細胞制限細胞表面マーカとして、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂが挙げられる。これらのＩｇドメインを突然変異誘発させて、ＴＡＡ及びＴＳＡに結合する変異体を作製することができる。
【００７７】
ポリペプチド抗原及び抗体
以下の表１に、既知の入手可能な抗体剤によってターゲティングされるいくつかのヒトポリペプチド抗原の非包括的リストを示し、抗体剤が有用であると想定されているいくつかの癌適応症を記載する。
【表１−１】
2018536434.tif 000003
【表１−２】
2018536434.tif 000004
【００７８】
従って、ポリペプチド抗原をコードする発現構築物をターゲティングする細胞治療薬をこれらの（又は他の）既知抗体の１つ又は複数と組み合わせて使用することができる。
【００７９】
以下の実施例を例示の目的で提供するが、本発明を限定することは何ら意図されない。
【実施例】
【００８０】
実施例１．細胞治療薬の細胞が抗原（例えば、腫瘍細胞又はその局所環境）と遭遇した後、抗原活性化制御プロモータは、サイトカイン放出を促進する
癌治療薬のためのサイトカイン支持には長い歴史がある（例えば、ＴＮＦ、ＬＴａ、ＩＦＮａ及びＩＬ−２の全身使用など）。全身性サイトカイン療法に固有の問題として、高用量要件、わずかな有効性、及び毒性（ＴＮＦ及びＬＴａの場合には致死的）が挙げられる。こうした毒性により、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５の使用が限定されている。
【００８１】
例えば、全身性組換えＩＬ−１２は、腎臓及び全身性毒性をはじめとする様々な重篤な有害作用を誘導した。高い用量レベルは、一時的な免疫抑制につながったが、これは、有効な免疫療法には不都合となり得る。（参照により本明細書に組み込まれるＬｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９７；９０：２５４１−８及びＣｏｌｏｍｂｏ，ＭＰ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｙｔｏｋｉｎｅＧｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ２００２；１３：１５５−６８を参照されたい。サイトカインが十分な濃度で腫瘍部位に到達しなかったことから、全身性ＩＬ−１２試験の大部分は、有毒な有害事象及び限定的な有効性を伴った（参照により本明細書に組み込まれるＳ  Ｔｕｇｕｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２２：２３７−２４６。
【００８２】
組換えＩＬ−１５は、ＮＫ及びＣＤ８細胞媒介性毒性を誘導する。ｒＩＬ−１５を受けた患者に観察された用量制限毒性は、グレード３低血圧、血小板減少症、及びＡＬＴ及びＡＳＴの上昇を含み、これにより、最小臨床的有効性の最適下限最大耐量をもたらした。（参照により本明細書に組み込まれるＣｏｎｌｏｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｊａｎ  １，２０１５：７４−８２を参照）。
【００８３】
これらの並びに類似の試験は、サイトカインの非制御投与及び全身分布に関連する用量制限毒性及び最小有効性を示す。従って、癌を有するか又は癌（例えば、腫瘍）を有することが疑われる個体に、サイトカインと標的との融合タンパク質であるように、腫瘍細胞の直接形質導入を可能にする組成物を投与する。投与は、静脈内又は腫瘍内で行うことができる。
【００８４】
実施例２．形質導入腫瘍細胞からのサイトカインの放出
ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＡＲ  ＮＫ細胞、ＴＣＲ  Ｔ細胞、ＴＩＬ、同種異系ＮＫ細胞、及びオートロガスＮＫ細胞を、ＴＡＡを含むサイトカイン融合タンパク質としてＩＬ−２１の徐放を達成するように操作する。ＣＤ８＋Ｔ細胞において拡大及びエフェクター分化を誘導してＮＫ細胞活性化及び細胞傷害活性を支持する。
【００８５】
活性化シグナルのエンゲージメントにより、ＴＮＦプロモータの制御下でＩＬ−１５が急速に分泌され、これは、ＮＫ細胞拡大（例えば、ＣＡＲ  ＮＫ細胞、同種異系ＮＫ細胞、及びオートロガスＮＫ細胞）を支持するか、又は抗腫瘍応答においてＮＫ細胞伝播（例えば、ＣＡＲ  Ｔ、ＴＣＲ、ＴＩＬ）を動員する。或いは、発現されたサイトカイン及びプロモータの様々な組合せを使用して、融合タンパク質として好適な様式（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−３６ｇ、ＩＦＮｇ）に発現させる。
【００８６】
ＩＬ−１２に融合した抗ＴＡＡｓｃＦｖ抗体の持続的な産生は、免疫細胞を動員して、ＣＡＲ  Ｔ細胞又は他の細胞治療薬とのエンゲージメントによってトリガーされた抗腫瘍免疫応答を支持及び拡大する。
【００８７】
実施例３．ターゲティング法は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体（又はその断片）を利用するか、又は分泌されたヘテロ二量体ＴＣＲα／β又はγ／δ鎖を抗体薬物複合体標的と融合させる。
標的は、毒素に結合した抗体であるＡＤＣによって認識されるポリペプチド配列、１つ又は複数のタンパク質ドメインである。ＡＤＣ標的は、中でも、ＨＥＲ２受容体、ＣＤ３０細胞表面タンパク質、葉酸受容体α、及びＣＤ１９である。
【００８８】
ターゲティング法は、ｓｃＦｖ抗体又はその断片を利用し、抗体薬物複合体標的と融合させる。或いは、分泌されたヘテロ二量体ＴＣＲα／β又はγ／δ鎖ターゲティング法を使用する。抗体薬物複合体標的の例として、ＣＤ３０、ＨＥＲ２、又はＡＤＣＣ抗体標的が挙げられる。
【００８９】
実施例４．ターゲティング法は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体（又はその断片）を利用するか、又は分泌されたヘテロ二量体ＴＣＲα／β又はγ／δ鎖を免疫応答促進剤と融合させる。
「免疫応答促進剤」は、免疫応答細胞集団を含む刺激細胞によって免疫応答を刺激することができるあらゆる物質である。免疫応答を直接刺激する物質として、サイトカイン、「危険シグナル」（ＤＡＭＰ、ＰＡＭＰ、ＴＬＲアゴニストなど）、アゴニスト抗体又はリガンド（例えば、抗４−１ＢＢ、ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７−１、及びその他多数）、免疫抑制シグナルの阻害剤（ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ−３、ＴＩＭ−３、ＩＤＯ１、アデノシン受容体、ＴＧＦβのアンタゴニスト、及びその他多数）が挙げられる。
【００９０】
ターゲティング法は、ｓｃＦｖ抗体（又はその断片）を利用するか、或いはターゲティング法は、分泌されたヘテロ二量体ＴＣＲα／β又はγ／δ鎖ターゲティング法である。いずれのターゲティング法でも、免疫応答促進剤として、ＩＬ−２、ＩＦＮα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、任意のＴＬＲアゴニスト及び任意の免疫チェックポイント抗体（又はその断片）が挙げられる。
【００９１】
実施例５．ターゲティング法は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体（又はその断片）を利用するか、又は分泌されたヘテロ二量体ＴＣＲα／β又はγ／δ鎖を細胞動員部分と融合させる。
免疫エフェクター細胞の動員のための別の方法は、リンカーにより連結された２つのｓｃＦｖから構成される二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（例えば、ＢｉＴＥ）の作製である。一方のアームは、抗ＴＡＡｓｃＦｖであり、２つ目のｓｃＦｖは、ＴＣＲ複合体のＣＤ３εサブユニットに結合するため、Ｔ細胞活性化をトリガーする。重要なことに、ＢｉＴＥ及び関連分子（ＤＡＲＴ、ダイアボディ、ｆＣａｂなど）は、非常に低いエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）細胞比のＴ細胞により、腫瘍細胞溶解のラウンドを繰り返し誘発する。細胞傷害性は、膜穿孔及びそれに続くグランザイム及びアポトーシスの誘導によって媒介され、これは、まさに抗腫瘍環境に誘発することが意図された殺傷のタイプである。通常、抗ＴＡＡｓｃＦｖ腫瘍関連抗原の親和性は、ＣＤ３に対するものよりもはるかに高く、これは標的腫瘍に対する特異性を強化する。多くのＢｉＴＥが作製されており、そのようなものとして、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、エフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）、ＣＤ３３、及び黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）をターゲティングするＢｉＴＥが挙げられる。臨床試験中の他のＢｉＴＥは、ＥｐＣＡＭ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、又はＣＤ３結合モジュールと組み合わせたＣＥＡ結合分子から構成される。
【００９２】
いくつかの例では、ターゲティング法は、ｓｃＦｖ抗体（又はその断片）を利用するか、或いはターゲティング法は、分泌されたヘテロ二量体ＴＣＲα／β又はγ／δ鎖を含む。いずれのターゲティング法でも細胞動員部分を抗ＣＤ１６と融合させる。別の例では、細胞動員部分を抗ＣＤ３部分と融合させ、本明細書に記載のＢｉＴＥ（登録商標）技術を利用する。
【００９３】
実施例６．ＳｃＦｖがＴＡＡ  Ｈｅｒ２に結合して、腫瘍がＣＤ１９指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞によって殺傷される、ＳｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質を含むＨＰＶ偽ウイルスを用いたインビボでの腫瘍のトランスフェクション
Ｈｅｒ２を発現する乳癌の異種移植マウスモデルの腫瘍細胞を形質導入するために、ＳｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質を含むＨＰＶ偽ウイルスをＩＶ注射する。形質導入された腫瘍は、ＳｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質を分泌し、その結果、ＳｃＦｖとＨｅｒ２との結合を介してＳｃＦｖ−Ｃｄ１９融合タンパク質による腫瘍細胞の被覆が起こる。ＣＤ１９指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞の添加により、ＣＤ１９で被覆された腫瘍細胞を殺傷する。ＣＤ１９指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標準的な方法によって作製される。
【００９４】
実施例７．ＳｃＦｖがＴＡＡ  Ｈｅｒ２に結合して、腫瘍がＣＤ１９指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞によって殺傷される、ＳｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質を含むＡＡＶ−ファージキメラウイルスを用いたインビボでの腫瘍のトランスフェクション
Ｈｅｒ２を発現する乳癌の異種移植マウスモデルの腫瘍細胞を形質導入するために、キメラＡＡＶ／ファージウイルスをＩＶ注射する。形質導入された腫瘍は、ＳｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質を分泌し、その結果、ＳｃＦｖとＨｅｒ２との結合を介してＳｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質による腫瘍細胞の被覆が起こる。ＣＤ１９指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞の添加により、ＣＤ１９で被覆された腫瘍細胞を殺傷する。ＣＤ１９指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞の作製は十分に確立されている。
【００９５】
実施例８．ＳｃＦｖがＴＡＡ  Ｈｅｒ２に結合して、ＣＤ３０を標的とするＡＤＣによって腫瘍が殺傷される、ＳｃＦｖ−ＣＤ３０融合タンパク質を含むＨＰＶ偽ウイルスを用いたインビボでの腫瘍のトランスフェクション
Ｈｅｒ２を発現する乳癌の異種移植マウスモデルの腫瘍細胞を形質導入するために、ＳｃＦｖ−ＣＤ３０融合タンパク質を含むＨＰＶ偽ウイルスをＩＶ注射する。形質導入された腫瘍は、ＳｃＦｖ−ＣＤ３０融合タンパク質を分泌し、その結果、ＳｃＦｖとＨｅｒ２との結合を介してＳｃＦｖ−ＣＤ３０融合タンパク質による腫瘍細胞の被覆が起こる。ＣＤ３０指向性抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の添加により、ＣＤ３０で被覆された腫瘍細胞を殺傷する。アドセトリスは、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから市販されているＡＤＣである。
【００９６】
実施例９．融合タンパク質をコードするＡＡＶウイルス粒子による細胞の形質導入により、ＣＡＲ１９Ｔ細胞ターゲティング及び活性化を指令することができる機能性融合タンパク質の分泌が起こる。
本実施例は、融合タンパク質をコードするＡＡＶウイルス粒子で形質導入された細胞からの融合タンパク質の発現を示す。さらに、本実施例は、発現された融合タンパク質が、抗ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３に結合されて、抗Ｈｉｓ抗体とＣ末端Ｈｉｓタグとの結合により検出することができることを立証する。発現されると、融合タンパク質は、ＣＤ１９陰性である細胞の存在下でＣＡＲ１９Ｔ細胞を活性化することができる。
以下の表に、本実施例で試験した様々な構築物を列記する。
【表２】
2018536434.tif 000005
【００９７】
方法
１２ウェルプレートにＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中約４×１０ｅ５細胞／ウェルでＡ４３１又は２９３Ｔ細胞のいずれかを接種した。翌日、１ウェルをカウントして、ウイルス感染について正確なカウントを得た。細胞は、１×１０６又は５×１０６の感染多重度で感染した。ＡＡＶ２ウイルス粒子をＶｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）により作製した。ウイルス粒子は、ＣＤ１９Ｄ１＋Ｄ２−ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ配列を含有する挿入片をｐＡＶ−ＦＨにクローン化したプラスミドから作製した。ウイルス粒子ＡＡＶ−１（ＣＤ１９Ｄ１＋Ｄ２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）、配列番号１）、ＡＡＶ−３（ＣＤ１９Ｄ１＋Ｄ２−ＭＯＣ３１ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）、配列番号３）、ＡＡＶ−５（ＣＤ１９Ｄ１＋Ｄ２−ＬＹ２８７５３５８ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）、配列番号５）及びＡＡＶ−７（ＣＤ１９Ｄ１＋Ｄ２−パニツムマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）、配列番号７）は、それぞれ８．３９×１０１３、１．５１×１０１４、３．０３×１０１４及び２．１３×１０１４ＧＣ／ｍｌの力価を有した。０．６ｍｌ／ウェルＤＭＥＭ＋２％  ＦＢＳ中で感染を実施し、その際、培地中にウイルスを直接添加した。１０４（「１０４」又は「１０ｅ４」としても知られる）〜５×１０６（「５ｘ１０６」又は「５×１０ｅ６」としても知られる）の様々な濃度のウイルスを使用した。翌日、培地をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに交換し、インキュベーションを３又は６日間続けた。
【００９８】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを用いて上清中の発現分析を調べたが、その際、捕捉のために抗ＣＤ１９ＦＭＣ６３を、検出のために抗Ｈｉｓを用いた。手短には、９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃１５０４１）を０．１Ｍ炭酸塩、ｐＨ９．５中の１．０μｇ／ｍｌの試薬で一晩４℃において被覆した。次に、プレートをＴＢＳ（２００μｌ／ウェル）中の０．３％脱脂粉乳（ＮＦＤ）で１時間ＲＴにおいて遮断した。続いて、プレートを洗浄バッファー（１×ＴＢＳＴ：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。１ウェル当たり１００μｌの非希釈細胞培養物上清又は段階的３×希釈物を含む１．０μｇ／ｍｌの精製済タンパク質から滴定を実施し、ＲＴで１時間インキュベートした。希釈バッファーは、１×ＴＢＳ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）中の１％ＢＳＡであり、続いて洗浄バッファーで３回洗浄する。１μｇ／ｍｌ濃度のビオチン化試薬などの二次試薬をＲＴで１時間（必要に応じて）添加した。ＨＲＰ−共役試薬を１：２０００で添加し、１ウェル当たり１００μｌ塗布して、ＲＴの暗所において１時間インキュベートした。１ウェル当たり１００μｌの１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｒｏｄ♯３４０２８）を添加した。発色が起こったとき、プレートを４０５ｎｍで読み取った。
【００９９】
ＸＴＴ細胞増殖アッセイ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃３０−１０１１Ｋ）
ＸＴＴ試薬のアリコート及び活性化試薬を使用前に３７℃で急速解凍した。次に、０．１ｍｌの活性化試薬を５．０ｍｌのＸＴＴ試薬に添加した。続いて、５０μｌの活性化−ＸＴＴ溶液を各ウェルに添加した。プレートを細胞培養インキュベータ内に２〜４時間配置し、発色についてモニターした。プレートの吸光度を波長４５０ｎｍで読み取った。細胞死％（別名：細胞傷害性）を以下のように計算した。
殺傷％＝［１−ＯＤ（実験ウェル−対応するＴ細胞数）／ＯＤ（Ｔ細胞−培地を含まない腫瘍細胞）］×１００
【０１００】
ＥＬＩＳＡによるインターフェロンγ濃度アッセイ
９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、製品＃１５０４１）を０．１Ｍ炭酸塩バッファー、ｐＨ９．５中の１．０μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩＦＮγ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｃａｔ♯５５１２２１）で一晩４℃において被覆した。次に、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中の０．３％脱脂粉乳溶液２００μｌ／ウェルを用いて、プレートを１時間室温で遮断した。プレートを洗浄バッファー（１×ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。２４時間又は４８時間培養プレート（前述参照）からの１００μｌの培養物上清をＥＬＩＳＡプレートに添加した。組換えヒトＩＦＮγ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ♯ＲＩＦＮＧ１００）の滴定も、３００ｎｇ／ｍｌから段階的３×希釈により２ｐｇ／ｍｌまで同じプレート中で実施して標準曲線を作成した。次に、プレートを室温で１時間インキュベートした。希釈バッファーは、１％ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）であった。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。ビオチン化マウス抗ヒトＩＦＮγ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｃａｔ♯５５４５５０）を１μｇ／ｍｌ濃度で添加してから、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをさらに洗浄バッファーで３回洗浄した。ＨＲＰ共役ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ♯２１１３０）を原液から１：２０００希釈で、１ウェル当たり１００μｌ添加した。次に、プレートを室温の暗所において１時間インキュベートした。プレートをさらに洗浄バッファーで３回洗浄した。１ウェル当たり１００μｌの１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ発色溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ♯３４０２８）を各ウェルに添加した。発色が十分に起こったとき、プレートを波長４０５ｎｍで読み取った。
【０１０１】
結果
図２Ａ〜２Ｃは、形質導入細胞からの融合タンパク質の発現を示す。図２Ａは、融合タンパク質をコードするＡＡＶウイルス粒子によるＡ４３１又は２９３Ｔ細胞の形質導入後、融合タンパク質ＣＤ１９Ｄ１＋２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（ＡＡＶ＃１）の検出が発現されることを示す。発現された融合タンパク質は、抗ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３に結合されて、抗Ｈｉｓ抗体とＣ末端Ｈｉｓタグとの結合により検出することができる。図２Ｂは、表示の融合タンパク質コードするＡＡＶウイルス粒子による２９３Ｔ細胞の形質導入から得られた融合タンパク質ＡＡＶ−３（ＣＤ１９Ｄ１＋Ｄ２−ＭＯＣ３１ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）、配列番号３）、ＡＡＶ−５（ＣＤ１９Ｄ１＋Ｄ２−ＬＹ２８７５３５８ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）、配列番号５）、及びＡＡＶ−７（ＣＤ１９Ｄ１＋Ｄ２−パニツムマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）、配列番号７）の発現の検出を示す。図２Ｃは、融合タンパク質コードするＡＡＶウイルス粒子によるＡ４３１細胞の形質導入から得られた融合タンパク質ＡＡＶ−３（ＣＤ１９Ｄ１＋Ｄ２−ＭＯＣ３１ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）の発現の検出を示す。
【０１０２】
図３Ａ及び３Ｂは、ＡＡＶ−１発現上清及びＢＴ４７４細胞とＣＡＲ１９Ｔ細胞（Ｐｒｏｍａｂ）のインキュベーション時のＩＦＮγの誘導を測定するＩＦＮγＥＬＩＳＡの結果の概要を示す。図３Ａは、１０：１エフェクター：標的比で２４時間後のＩＦＮγＥＬＩＳＡの結果を示す。図３Ｂは、１０：１エフェクター：標的比で４８時間後のＩＦＮγＥＬＩＳＡの結果を示す。
【０１０３】
図４Ａ〜４Ｃは、ＡＡＶ−１発現上清及びＢＴ４７４細胞とＣＡＲ１９Ｔ細胞（Ｐｒｏｍａｂ）とのインキュベーション時の細胞傷害性の誘導を示す。図４Ａは、２：１エフェクター：標的比で２４時間後のＸＴＴ−細胞傷害性結果の概要を示す。図４Ｂは、２：１エフェクター：標的比で４８時間後のＸＴＴ−細胞傷害性結果の概要を示す。図４Ｃは、１０：１エフェクター：標的比で４８時間後のＸＴＴ−細胞傷害性結果の概要を示す。これらの結果は、細胞（例えば、腫瘍細胞）のＡＡＶ形質導入により、ＣＡＲ１９Ｔ細胞活性化及び細胞傷害性を指令することができる機能性融合タンパク質の発現をもたらすことができることを立証するものである。
【０１０４】
均等物
当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識するか、又はルーティンに過ぎない実験を使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、以上の説明に限定することが意図されるのではなく、以下の特許請求の範囲に記載される。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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