(57)【要約】  本発明は、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＧＩＴＲリガンドまたはＯＸ４０融合タンパク質（ＦＰ））と組み合わせたドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌ、および対象において抗腫瘍活性を増強するためにその組合せを使用する方法を特徴とする。【選択図】図１
2018500384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における抗腫瘍活性を増加させる方法であって、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連遺伝子（ＧＩＴＲ）リガンドおよびＯＸ４０融合タンパク質からなる群から選択される免疫調節薬とを対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
対象における抗腫瘍免疫反応を増加させる方法であって、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲリガンドおよびＯＸ４０融合タンパク質からなる群から選択される免疫調節薬とを対象に投与することを含む方法。
【請求項３】
対象における腫瘍を治療する方法であって、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲリガンドおよびＯＸ４０融合タンパク質からなる群から選択される免疫調節薬とを対象に投与することを含む方法。
【請求項４】
ドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態はＤｏｘｉｌ（登録商標）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９またはＭＰＤＬ３２８０Ａである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６である、請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抗ＰＤ−１抗体は、ＬＯＰＤ  １８、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４およびピジリズマブである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
抗ＰＤ−１抗体はＬＯＰＤ  １８である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗ＣＴＬＡ−４抗体はトレメリムマブまたはイピリムマブである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
抗ＣＴＬＡ−４抗体はトレメリムマブである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
免疫調節薬は、ＧＩＴＲリガンドまたはＧＩＴＲリガンド融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
免疫調節薬はＯＸ４０融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍は結腸癌または肉腫である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ドキソルビシン、ドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲリガンドおよびＯＸ４０融合タンパク質のいずれか１つの単独での投与と比較して全生存率における増加を生じさせる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍特異的免疫反応を誘導する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌは、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
抗ＰＤ−１抗体は、ＬＯＰＤ  １８、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４またはピジリズマブである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９またはＭＰＤＬ３２８０Ａである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌは、抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせて投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
抗ＣＴＬＡ−４抗体はトレメリムマブまたはイピリムマブである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌは、ＧＩＴＲリガンドまたはＧＩＴＲリガンド融合タンパク質と組み合わせて投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌは、ＯＸ４０融合タンパク質と組み合わせて投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ドキソルビシン、ドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲリガンドまたはＯＸ４０融合タンパク質の投与は静脈内注射による、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態と免疫調節薬とは同時に投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態は、免疫調節薬の前に投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
免疫調節薬は、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態の前に投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
対象はヒト患者である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
抗腫瘍活性を増加させるためのキットであって、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲリガンドおよびＯＸ４０アゴニストからなる群から選択される免疫調節薬とを含むキット。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法においてキットを使用するための取扱説明書をさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
有効量のドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態と、有効量の、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲリガンドおよびＯＸ４０アゴニストからなる群から選択される免疫調節薬とを含む医薬製剤。
【請求項３２】
抗ＣＴＬＡ−４抗体はトレメリムマブまたはイピリムマブである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
抗ＰＤ−１抗体は、ＬＯＰＤ  １８、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４またはピジリズマブである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９またはＭＰＤＬ３２８０Ａである、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１５年１０月２６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＩＭＴＣ−２００ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは２４，８２９バイトである。
【背景技術】
【０００２】
癌は、世界的規模の主要な健康上の負担であり続けている。癌の治療における進歩にもかかわらず、特に現行の療法に抵抗性である進行性疾患または癌を有する患者にとって、より効果的で毒性の低い療法に対する医療上のニーズは依然として満たされないままである。
【０００３】
腫瘍制御において免疫系、特にＴ細胞媒介性細胞傷害性が果たす役割は、明確に認識されている。Ｔ細胞が、疾患の早期および後期のいずれでも癌患者における腫瘍の増殖および生存を制御するという証拠が増大している。しかし、腫瘍特異的Ｔ細胞反応は、癌患者において増加および維持するのが困難である。
【０００４】
顕著な注目を集めている２つのＴ細胞経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２）およびプログラム細胞死１（Ｂ７Ｈ−１またはＣＤ２７４としても公知であるＰＤ−Ｌ１）を通してシグナル伝達する。
【０００５】
ＣＴＬＡ−４は、活性化Ｔ細胞上で発現し、ＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化後のチェック時におけるＴ細胞反応を維持するための共阻害因子として機能する。ＣＴＬＡ−４は、ＴＣＲ関与後の未感作および記憶Ｔ細胞の早期活性化の振幅を調節し、かつ抗腫瘍免疫および自己免疫の両方に影響を及ぼす中心阻害経路の一部になると考えられる。ＣＴＬＡ−４はＴ細胞上で排他的に発現し、そのリガンドであるＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）の発現は、主として抗原提示細胞、Ｔ細胞および他の免疫媒介細胞に限定される。ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路を遮断する拮抗性抗ＣＴＬＡ−４抗体は、Ｔ細胞活性化を増強すると報告されている。１つのそのような抗体イピリムマブは、転移性黒色腫の治療のためにＦＤＡによって２０１１年に承認された。別の抗ＣＴＬＡ−４抗体であるトレメリムマブは、進行性黒色腫の治療について第ＩＩＩ相臨床試験において試験されたが、その当時の標準治療（テモゾロミドまたはダカルバジン）と比較して患者の全生存期間を有意には増加させなかった。
【０００６】
ＰＤ−Ｌ１もＴ細胞活性化の制御に関係している受容体およびリガンドの複合系の一部である。正常組織中では、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞、骨髄由来肥満細胞および様々な非造血細胞上で発現する。その正常機能は、その２つの受容体：プログラム細胞死１（ＰＤ−１またはＣＤ２７９としても公知）およびＣＤ８０（Ｂ７−１またはＢ７．１としても公知）との相互作用を通してＴ細胞活性化と耐性との間の平衡を調節することである。ＰＤ−Ｌ１は、さらに腫瘍によっても発現し、腫瘍が宿主免疫系による検知および排除を回避するのに役立つように複数部位で作用する。ＰＤ−Ｌ１は、広範囲の癌において高頻度で発現する。一部の癌では、ＰＤ−Ｌ１の発現には、生存率の低下および不都合な予後が結び付いている。ＰＤ−Ｌ１とその受容体との間の相互作用を遮断する抗体は、ＰＤ−Ｌ１依存性免疫抑制効果を緩和してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強することができる。ＭＥＤＩ４７３６は、ＰＤ−１およびＣＤ８０受容体の両方へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断することができるヒトＰＤ−Ｌ１に対して向けられたヒトモノクローナル抗体である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
癌および他の疾患に対処するための戦略の開発において、過去１０年間にわたり顕著な進歩が遂げられてきたにもかかわらず、進行性、難治性および転移性疾患を有する患者の臨床選択肢は限定されている。化学療法、照射療法および高用量化学療法は、用量規制が行われるようになってきた。特に現行の治療薬に抵抗性の進行性疾患または癌を有する患者のために、より優れた治療効果、より長い臨床的有益性および改善された安全性プロファイルを有する新規な低毒性の方法および治療薬に対する満たされていない多大なニーズが依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以下に記載するように、本発明は、免疫調節薬（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＧＩＴＲリガンドまたはＯＸ４０融合タンパク質（ＦＰ））と組み合わせたドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌ、および対象において抗腫瘍活性を増強するためにその組合せを使用する方法を特徴とする。
【０００９】
１つの態様では、本発明は、対象における抗腫瘍活性を増加させる方法であって、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連遺伝子（ＧＩＴＲ）リガンドおよびＯＸ４０融合タンパク質のうちの１つ以上である免疫調節薬とを対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、対象における抗腫瘍免疫反応を増加させる方法であって、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連遺伝子（ＧＩＴＲ）リガンドおよびＯＸ４０融合タンパク質のうちの１つ以上である免疫調節薬とを対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、対象における腫瘍を治療する方法であって、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連遺伝子（ＧＩＴＲ）リガンドおよびＯＸ４０融合タンパク質のうちの１つ以上である免疫調節薬とを対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
１つの態様では、本発明は、抗腫瘍活性を増加させるためのキットであって、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲリガンドおよびＯＸ４０アゴニストのうちの１つ以上である免疫調節薬とを含有するキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、本発明の方法に従ってキットを使用するための取扱説明書を含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、有効量のドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）と、有効量の、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲリガンドおよびＯＸ４０アゴニストのうちの１つ以上である免疫調節薬とを含有する医薬製剤を提供する。
【００１４】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、ドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態はＤｏｘｉｌ（登録商標）である。
【００１５】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９またはＭＰＤＬ３２８０Ａである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６である。
【００１６】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＬＯＰＤ  １８、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４およびピジリズマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＬＯＰＤ  １８である。
【００１７】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体はトレメリムマブまたはイピリムマブである。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体はトレメリムマブである。
【００１８】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、免疫調節薬はＧＩＴＲリガンドまたはＧＩＴＲリガンド融合タンパク質である。
【００１９】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、免疫調節薬はＯＸ４０融合タンパク質である。
【００２０】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、腫瘍は結腸癌または肉腫である。
【００２１】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、本方法は、ドキソルビシン、ドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲリガンドおよびＯＸ４０融合タンパク質のいずれか１つの単独での投与と比較して全生存における増加を生じさせる。様々な実施形態では、本方法は腫瘍特異的免疫反応を誘導する。
【００２２】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）は、ＬＯＰＤ  １８、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４およびピジリズマブのうちのいずれか１つ以上を含む抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて投与される。
【００２３】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）は、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９およびＭＰＤＬ３２８０Ａのうちのいずれか１つ以上を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて投与される。
【００２４】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）は、トレメリムマブおよびイピリムマブのうちのいずれか１つ以上を含む抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせて投与される。
【００２５】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）は、ＧＩＴＲリガンドまたはＧＩＴＲリガンド融合タンパク質と組み合わせて投与される。
【００２６】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）は、ＯＸ４０融合タンパク質と組み合わせて投与される。
【００２７】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、本方法は、ドキソルビシン、ドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）または免疫調節薬（例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲリガンドまたはＯＸ４０融合タンパク質）の投与は静脈内注射による。
【００２８】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）と免疫調節薬とは同時に投与される。
【００２９】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、ドキソルビシンまたはドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）は、免疫調節薬の投与前に投与される。
【００３０】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、免疫調節薬は、ドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態（例えば、Ｄｏｘｉｌ）の投与前に投与される。
【００３１】
本明細書に記述したいずれかの態様の様々な実施形態では、対象はヒト患者である。
【００３２】
本発明の他の特徴および長所は、詳細な説明および請求項から明白であろう。
【００３３】
用語の定義
他に特に規定しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。下記の参考文献は、本発明で使用する多数の用語の一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用するように、以下の用語は、他に特に規定しない限り、下記においてそれらに属する意味を有する。
【００３４】
「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞の増殖または生存を低下または安定化させる任意の生物活性を意味する。１つの実施形態では、抗腫瘍活性は、抗腫瘍免疫反応である。
【００３５】
「免疫調節薬」は、免疫反応（例えば、抗腫瘍免疫反応）を増強する薬剤を意味する。本発明の典型的な免疫調節薬には、抗体、例えば抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびそれらのフラグメントと、タンパク質、例えばＧＩＴＲリガンドもしくはＯＸ４０融合タンパク質、またはそれらのフラグメントとが含まれる。１つの実施形態では、免疫調節薬は、免疫チェックポイント阻害剤である。
【００３６】
「ＰＤ−１ポリペプチド］は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５００９と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＰＤ−Ｌ１および／または、ＰＤ−Ｌ２結合活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。ＮＰ＿００５００９の配列を下記に提供する。
【化１】
2018500384.tif 000003
【００３７】
「ＰＤ−１核酸分子」は、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。典型的なＰＤ−１核酸分子配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５０１８で提供される。
【００３８】
「抗ＰＤ−１抗体」は、選択的にＰＤ−１ポリペプチドに結合する抗体を意味する。ＬＯＰＤ  １８０は、典型的なＰＤ−１抗体である。
【００３９】
ＬＯＰＤ１８０重鎖可変領域ポリペプチド配列
【化２】
2018500384.tif 000004
【００４０】
ＬＯＰＤ１８０重鎖可変領域核酸配列
【化３】
2018500384.tif 000005
【００４１】
ＬＯＰＤ１８０軽鎖可変領域ポリペプチド配列
【化４】
2018500384.tif 000006
【００４２】
ＬＯＰＤ１８０軽鎖可変領域核酸配列
【化５】
2018500384.tif 000007
【００４３】
他の典型的な抗ＰＤ−１抗体には、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０、Ｏｐｄｉｖｏ；ＢＭＳ；承認済み）、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａｔ（登録商標）、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５；Ｍｅｒｃｋ；承認済み）、ＡＭＰ−２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ／ＧＳＫ）およびピジリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｔｅｖａ／Ｃｕｒｅｔｅｃｈ）が含まれる。
【００４４】
「ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２５４６３５と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＰＤ−１およびＣＤ８０結合活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。
【００４５】
「ＰＤ−Ｌ１核酸分子」は、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。典型的なＰＤ−Ｌ１核酸分子配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２６７７０６で提供される。
【００４６】
「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」は、選択的にＰＤ−Ｌ１ポリペプチドに結合する抗体を意味する。典型的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３００３４５５９号明細書／米国特許第８７７９１０８号明細書および米国特許出願公開第２０１４０３５６３５３号明細書に記載されている。ＭＥＤＩ４７３６は、典型的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）が含まれる。
【００４７】
ＭＥＤＩ４７３６  ＶＬ
【化６】
2018500384.tif 000008
【００４８】
ＭＥＤＩ４７３６  ＶＨ
【化７】
2018500384.tif 000009
【００４９】
ＭＥＤＩ４７３６  ＶＨ  ＣＤＲ１
ＲＹＷＭＳ（配列番号８）
【００５０】
ＭＥＤＩ４７３６  ＶＨ  ＣＤＲ２
ＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号９）
【００５１】
ＭＥＤＩ４７３６  ＶＬ  ＣＤＲ１
ＲＡＳＱＲＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号１０）
【００５２】
ＭＥＤＩ４７３６  ＶＬ  ＣＤＲ２
ＤＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１）
【００５３】
ＭＥＤＩ４７３６  ＶＬ  ＣＤＲ３
ＱＱＹＧＳＬＰＷＴ（配列番号１２）
【００５４】
「ＣＴＬＡ−４ポリペプチド」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ０７４７３．１またはＴ細胞阻害活性を有するそのフラグメントと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味する。ＡＡＬ０７４７３．１の配列を下記に提供する。
【化８】
2018500384.tif 000010
【００５５】
「ＣＴＬＡ−４核酸分子」は、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。典型的なＣＴＬＡ−４ポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ０７４７３で提供される。
【００５６】
「抗ＣＴＬＡ−４抗体」は、選択的にＣＴＬＡ−４ポリペプチドに結合する抗体を意味する。典型的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、米国特許第６，６８２，７３６号明細書；同第７，１０９，００３号明細書；同第７，１２３，２８１号明細書；同第７，４１１，０５７号明細書；同第７，８２４，６７９号明細書；同第８，１４３，３７９号明細書；同第７，８０７，７９７号明細書；および同第８，４９１，８９５号明細書（その中で、トレメリムマブは１１．２．１に記載されている）で記載されており、上記特許は参照により本明細書に組み込まれる。トレメリムマブは、典型的な抗ＣＴＬＡ−４抗体である。トレメリムマブ配列を下記に提供する。
【００５７】
トレメリムマブ、米国特許第６，６８２，７３６号明細書
トレメリムマブＶＬ
【化９】
2018500384.tif 000011
【００５８】
トレメリムマブＶＨ
【化１０】
2018500384.tif 000012
【００５９】
トレメリムマブＶＨ  ＣＤＲ１
ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号１６）
【００６０】
トレメリムマブＶＨ  ＣＤＲ２
ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶ（配列番号１７）
【００６１】
トレメリムマブＶＨ  ＣＤＲ３
ＤＰＲＧＡＴＬＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１８）
【００６２】
トレメリムマブＶＬ  ＣＤＲ１
ＲＡＳＱＳＩＮＳＹＬＤ（配列番号１９）
【００６３】
トレメリムマブＶＬ  ＣＤＲ２
ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２０）
【００６４】
トレメリムマブＶＬ  ＣＤＲ３
ＱＱＹＹＳＴＰＦＴ（配列番号２１）
【００６５】
本開示で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントもしくは誘導体を意味しており、それがｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれで生成されるかとは無関係に、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドを含む。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体およびグラフト化抗体が含まれるがそれらに限定されない。本開示のために、「無傷抗体」におけるように用語「無傷」によって他の点で修飾されない限り、用語「抗体」にはさらに抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなどの抗体フラグメントおよび詳細には、抗原結合機能、すなわち、例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合する能力を維持する他の抗体フラグメントが含まれる。典型的には、そのようなフラグメントは、抗原結合ドメインを含むであろう。
【００６６】
用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合フラグメント」および「結合フラグメント」は、抗体と抗原との間の特異的結合の原因となるアミノ酸を含む抗体分子の一部を意味する。抗原が大きい場合、抗原結合ドメインは抗原の一部のみに結合できる可能性がある。抗原結合ドメインとの特異的相互作用の原因となる抗原分子の一部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」を意味する。抗原結合ドメインは、典型的には抗体軽鎖可変領域（ＶL）および抗体重鎖可変領域（ＶH）を含むが、必ずしも両方を含んではいない。例えば、いわゆるＦｄ抗体フラグメントはＶHドメインのみからなるが、依然として無傷抗体の一部の抗原結合機能を維持する。
【００６７】
抗体の結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷抗体の酵素的開裂もしくは化学的開裂によって生成される。結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体が含まれる。「二重特異性」または「二官能性」抗体以外の抗体は、その各々が同一である結合部位を有すると理解されている。酵素であるパパインによる抗体の消化は、「Ｆａｂ」フラグメントとしても公知である２つの同一抗原結合フラグメントおよび抗原結合活性を有していないが、結晶化する能力を有する「Ｆｃ」フラグメントを生じさせる。酵素であるペプシンによる抗体の消化は、その抗体分子の２つの腕が結合したままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じさせる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは抗原を架橋結合させる能力を有する。本明細書で使用する場合の「Ｆｖ」は、抗原認識部位および抗原結合部位の両方を維持する抗体の最小フラグメントを意味する。本明細書で使用する場合の「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨＩドメインを含む抗体のフラグメントを意味する。
【００６８】
用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を意味する。本発明の抗体は、限定することなく、完全自然抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖Ｖ領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチドおよび非従来型抗体を含む。
【００６９】
本開示では、「含む」、「含んでいる」、「含有する」および「有する」などは、米国特許法においてそれらに属すると見なされている意味を有することができ、「包含する」、「包含している」などを意味することができる。「から本質的になっている」または「から本質的になる」などは制約されず、言及されていることの基本的または新規な特徴が、言及されていることを超える存在によって変化させられない限り、言及されていることを超える存在が許容されるが、先行技術の実施形態は除外される。
【００７０】
本明細書で使用する用語「決定する」、「評価する」、「アッセイする」、「測定する」および「検出する」は、定量的および定性的決定の両方を意味しており、したがって、用語「決定する」は、「アッセイする」、「測定する」などと互換的に使用される。定量的決定が予定される場合、非分析物の「量を決定する」という語句が使用されることが企図されている。定性的および／または定量的決定が予定される場合、非分析物の「レベルを決定する」または分析物を「検出する」という語句が使用されることが企図されている。
【００７１】
「ドキソルビシン」は、商標名Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎを付して販売されている、下記の構造式：
【化１１】
2018500384.tif 000013
（ＣＡＳ  ２３２１４−９２−８）を有する小さい化合物を意味する。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）は、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＬＰから入手できる、ドキソルビシンのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態に対する商標名である。
【００７２】
「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連遺伝子（ＧＩＴＲ）ポリペプチド」は、ＮＰ＿６８３６９９と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはＴ細胞調節活性を有するそのフラグメントを意味する。１つの実施形態では、ＧＩＴＲはＴ細胞生存を調節する。
【化１２】
2018500384.tif 000014
ＧＩＴＲはさらに、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１８とも称されている。
【００７３】
「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連遺伝子（ＧＩＴＲ）リガンド」は、ＧＩＴＲに特異的に結合し、ＮＰ＿００５０８３と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはそのフラグメントを意味する。典型的なヒトＧＩＴＲリガンドであるＮＰ＿００５０８３の配列を下記に提供する：
【化１３】
2018500384.tif 000015
１つの実施形態では、ＧＩＴＲリガンドは、ＧＩＴＲアゴニストまたはＧＩＴＲリガンド融合タンパク質である。ＧＩＴＲアゴニストはＧＩＴＲに結合し、腫瘍退行を誘導する。ＧＩＴＲリガンドについては、例えば、Ｃｌｏｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ３，２０１４  １４０１００２によって記載されている。
【００７４】
「ＯＸ４０融合タンパク質」は、ＯＸ４０受容体に特異的に結合し、免疫反応を増加させるタンパク質を意味する。１つの実施形態では、ＯＸ４０融合タンパク質のＯＸ−４０受容体への結合は、Ｔ細胞認識を高めることによって腫瘍抗原特異的免疫反応を増強する。典型的なＯＸ４０融合タンパク質は、「Ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ＯＸ４０  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」という名称の米国特許第７，９５９，９２５号明細書に記載されている。例えば、米国特許第７，９５９，９２５号明細書、配列番号８：
【化１４】
2018500384.tif 000016
を参照されたい。他のＯＸ４０融合タンパク質は、例えば米国特許第６，３１２，７００号明細書に記載されている。１つの実施形態では、ＯＸ４０融合タンパク質は、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を増強する。
【００７５】
「参照」は、比較の標準を意味する。
【００７６】
「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジもしくはネコなどを含むがそれらに限定されない哺乳動物を意味する。
【００７７】
本明細書に提供された範囲は、範囲内の全数値についての省略表現であると理解されている。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０からなる群からの任意の数、数の組合せまたは部分範囲を含むと理解されている。
【００７８】
本明細書で使用する用語「治療する」、「治療している」、「治療」などは、疾患および／またはそれに関連する症状を減少または緩和することを意味する。排除されはしないが、疾患または状態を治療することは、その疾患、それに関連する状態または症状が完全に排除されることを必要としないことは理解されるであろう。
【００７９】
詳細に規定しない限り、または文脈から明白ではない限り、本明細書で使用する用語「または」は包括的であると理解されている。詳細に規定しない限り、または文脈から明白ではない限り、本明細書で使用する用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は単数または複数であると理解されている。
【００８０】
詳細に規定しない限り、または文脈から明白ではない限り、本明細書で使用する用語「約」は、当技術分野における通常の容認範囲内、例えば平均値の２標準偏差内であると理解されている。「約」は、標準値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％内であると理解することができる。文脈から他のことが明白ではない限り、本明細書に提供された全数値は、用語「約」によって修飾される。
【００８１】
本明細書の変量のいずれかの定義における化学基のリストの列挙は、任意の単一基または列挙した基の組合せとしてのその変量の定義を含んでいる。本明細書での変量または態様についての実施形態の列挙は、任意の単一実施形態としての、または任意の他の実施形態またはそれらの部分と組み合わせた実施形態を含んでいる。
【００８２】
本明細書に提供した任意の組成物または方法は、本明細書に提供した他の組成物のいずれかおよび方法の１つ以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１Ａ−１Ｊは、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいてドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌのα−ＰＤ−１およびα−ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせた相乗作用を示すグラフである。図１Ａは、未治療マウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図１Ｂは、アイソタイプコントロール（ラットＩｇＧ２ａ＋マウスＩｇＧ２ｂ（５／０．５ｍｇ／ｋｇ））が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図１Ｃは、ドキソルビシン（４ｍｇ／ｋｇ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図１Ｄは、Ｄｏｘｉｌ（１ｍｇ／ｋｇ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図１Ｅは、α−ＰＤ−１（５ｍｇ／ｋｇ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図１Ｆは、α−ＣＴＬＡ−４（０．５ｍｇ／ｋｇ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図１Ｇは、ドキソルビシン＋α−ＰＤ−１（４／５ｍｇ／ｋｇ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図１Ｈは、Ｄｏｘｉｌ＋α−ＰＤ−１（１／５ｍｇ／ｋｇ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図１Ｉは、ドキソルビシン＋α−ＣＴＬＡ−４（４／０．５ｍｇ／ｋｇ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフであり、図１Ｊは、Ｄｏｘｉｌ＋α−ＣＴＬＡ−４（１／０．５ｍｇ／ｋｇ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。*、ｐ＜０．００５（Ｂｌｉｓｓ独立試験）。ＣＴ２６細胞はＢａｌｂ／Ｃマウスに移植された。細胞移植の４日後、マウスは体重によって無作為割り付けされ、Ｄｏｘｉｌは第４、１１および１７日に；ドキソルビシンは第４、８および１２日に；および抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４は第１０、１４、１７および２１日に投与された。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、Ｄｏｘｉｌもしくはドキソルビシン単独またはα−ＰＤ−１およびα−ＣＴＬＡ−４と組み合わせて治療されたマウスの生存率を示す。図１Ａ〜１Ｊにおける試験からのマウスの生存率を示した。図２Ａは、α−ＰＤ−１がＤｏｘｉｌまたはドキソルビシンと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。図２Ｂは、α−ＣＴＬＡ−４単独またはＤｏｘｉｌもしくはドキソルビシンと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。α−ＰＤ−１またはα−ＣＴＬＡ−４抗体とＤｏｘｉｌ（１ｍｇ／ｋｇ）またはドキソルビシン（４ｍｇ／ｋｇ）とを組み合わせて治療されたマウスは、α−ＰＤ−１またはα−ＣＴＬＡ−４のいずれか単独で治療されたマウスより長期間生存した。α−ＰＤ−１＋ドキソルビシン（*）およびα−ＣＴＬＡ−４＋ドキソルビシン（#）群は、ドキソルビシン群（ｐ＝０．００５およびｐ＝０．００１２、それぞれログランク検定による）と比較して統計的有意に相違した。
【図３】図３Ａ−３Ｄは、Ｄｏｘｉｌ単独または抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくは抗ＰＤ−１抗体との組合せにより完全反応を達成したマウスが腫瘍再投与に抵抗したことを示す。図３Ａは、未治療Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝１０）における腫瘍容積を描出するグラフである。図３Ｂは、Ｄｏｘｉｌ治療により完全反応を達成し、ＣＴ２６細胞が再投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図３Ｃは、α−ＣＴＬＡ−４＋Ｄｏｘｉｌ治療（ｎ＝１０）により完全反応を達成し、ＣＴ２６細胞により再投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図３Ｄは、α−ＰＤ−１＋Ｄｏｘｉｌ治療（ｎ＝９）により完全反応を達成し、ＣＴ２６細胞が再投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。数値は、群中のマウスの総数のうちで腫瘍を拒絶したマウスの数を示している。
【図４−１】図４Ａ−４Ｅは、Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでのＤｏｘｉｌ活性のために必要であることを示す。図４Ａは、指示したようにＤｏｘｉｌ（５ｍｇ／ｋｇ）またはドキソルビシン（５ｍｇ／ｋｇ）が投与されたＣＴ２６腫瘍担持無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍容積を示すグラフである。図４Ｂは、指示したようにＤｏｘｉｌ（５ｍｇ／ｋｇ）またはドキソルビシン（５ｍｇ／ｋｇ）が投与されたＣＴ２６腫瘍担持Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍容積を示すグラフである。図４Ｃは、指示したようにゲムシタビン（７５ｍｇ／ｋｇ）が投与されたＣＴ２６腫瘍担持無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍容積を示すグラフである。図４Ｄは、指示したようにゲムシタビン（７５ｍｇ／ｋｇ）が投与されたＣＴ２６腫瘍担持Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍容積を示すグラフである。図４Ｅは、指示したようにオキシプラチン（８ｍｇ／ｋｇ）が投与されたＣＴ２６腫瘍担持無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍容積を示すグラフである。図４Ｆは、指示したようにオキシプラチン（８ｍｇ／ｋｇ）が投与されたＣＴ２６腫瘍担持Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍容積を示すグラフである。矢印は用量投与を示す。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−２の続きである。
【図５】図５Ａ−５Ｌは、樹立ＣＴ２６腫瘍モデルにおける複数の免疫療法を組み合わせたＤｏｘｉｌの相乗性抗腫瘍反応を示す。図５Ａは、未治療マウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｂは、Ｄｏｘｉｌが投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｃは、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質（ＦＰ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｄは、α−ＰＤ−１が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｅは、α−ＰＤ−Ｌ１が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｆは、α−ＣＴＬＡ−４が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｇは、ＧＩＴＲリガンド融合タンパク質（ＧＩＴＲＬ  ＦＰ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｈは、Ｄｏｘｉｌ＋ＯＸ４０Ｌ  ＦＰが投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｉは、Ｄｏｘｉｌ＋α−ＰＤ−１が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｊは、Ｄｏｘｉｌ＋α−ＰＤ−Ｌ１が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｋは、Ｄｏｘｉｌ＋α−ＣＴＬＡ−４が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図５Ｌは、Ｄｏｘｉｌ＋ＧＩＴＲＬ  ＦＰが投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。樹立（約２００〜３００ｍｍ３）ＣＴ２６腫瘍を担持するＢａｌｂ／Ｃマウスを腫瘍容積によって無作為割り付けし、最大有効用量のＤｏｘｉｌ（５ｍｇ／ｋｇ、第１１および１９日）；ＯＸ４０Ｌ  ＦＰ（２．５ｍｇ／ｋｇ、第１４および１９日）；α−ＰＤ−１（２０ｍｇ／ｋｇ、第１１、１４、１９および２２日）；α−ＰＤ−Ｌ１（３０ｍｇ／ｋｇ；第１１、１４、１９および２２日）；α−ＣＴＬＡ−４（２０ｍｇ／ｋｇ、第１４、１９、２２および２６日）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ（５ｍｇ／ｋｇ、第１４、１９、２２、２６、２９および３２日）を用いて治療した。ＣＲ数は、１２匹中の完全反応を達成したマウスの数を示している。#、ｐ＝０．０５６；*、ｐ＜０．００８、Ｂｌｉｓｓ独立試験。
【図６】図６Ａ−６Ｅは、ＣＴ２６樹立腫瘍試験におけるマウスの生存率を示す。図５Ａ〜５ＬにおけるＣＴ２６樹立腫瘍試験からのマウスの生存率が示されている。図６Ａは、ＯＸ４０  ＦＰ単独またはＤｏｘｉｌと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。図６Ｂは、α−ＰＤ−１単独またはＤｏｘｉｌと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。図６Ｃは、α−ＰＤ−Ｌ１単独またはＤｏｘｉｌと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。図６Ｄは、α−ＣＴＬＡ−４単独またはＤｏｘｉｌと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。図６Ｅは、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ単独またはＤｏｘｉｌと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。*ｐ＜０．００６２５およびログランク検定により単剤療法と比較して統計的有意。#、ｐ＜０．００６２５およびログランク検定によりＤｏｘｉｌ治療と比較して統計的有意。
【図７】図７Ａ−７Ｌは、ＭＣＡ２０５同系モデルにおいてα−ＰＤ−１、α−ＰＤ−Ｌ１およびα−ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせたＤｏｘｉｌの相乗性抗腫瘍反応を示すグラフである。図７Ａは、未治療マウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｂは、Ｄｏｘｉｌが投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｃは、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質（ＦＰ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｄは、α−ＰＤ−１が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｅは、α−ＰＤ−Ｌ１が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｆは、α−ＣＴＬＡ−４が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｇは、ＧＩＴＲリガンド融合タンパク質（ＧＩＴＲＬ  ＦＰ）が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｈは、Ｄｏｘｉｌ＋ＯＸ４０Ｌ  ＦＰが投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｉは、Ｄｏｘｉｌ＋α−ＰＤ−１が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｊは、Ｄｏｘｉｌ＋α−ＰＤ−Ｌ１が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｋは、Ｄｏｘｉｌ＋α−ＣＴＬＡ−４が投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。図７Ｌは、Ｄｏｘｉｌ＋ＧＩＴＲＬ  ＦＰが投与されたマウスにおける腫瘍容積を描出するグラフである。樹立（約１００〜１５０ｍｍ3）ＭＣＡ２０５腫瘍を担持するＣ５７／Ｂｌ６マウスを腫瘍容積によって無作為割り付けし、最大有効用量のＤｏｘｉｌ（５ｍｇ／ｋｇ、第１０、１７および２４日）；ＯＸ４０Ｌ  ＦＰ（２０ｍｇ／ｋｇ、第１０および１４日）；α−ＰＤ−１（１０ｍｇ／ｋｇ、第１０、１４、１７および２１日）；α−ＰＤ−Ｌ１（２０ｍｇ／ｋｇ；第１０、１４、１７および２１日）；α−ＣＴＬＡ−４（１０ｍｇ／ｋｇ、第１０、１４、１７および２１日）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ（５ｍｇ／ｋｇ、第１０、１４、１７、２１、２４および２８日）を用いて治療した。ＣＲ数は、１２匹中の完全反応を達成したマウスの数を示している。*ｐ＜０．００８、Ｂｌｉｓｓ独立試験。
【図８】図８Ａ−８Ｅは、ＭＣＡ２０５樹立腫瘍試験におけるマウスの生存率を示す。図７Ａ〜７ＬにおけるＭＣＡ２０５樹立腫瘍試験からのマウスの生存率が示されている。図８Ａは、ＯＸ４０  ＦＰ単独またはＤｏｘｉｌと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。図８Ｂは、α−ＰＤ−１単独またはＤｏｘｉｌと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。図８Ｃは、α−ＰＤ−Ｌ１単独またはＤｏｘｉｌと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。図８Ｄは、α−ＣＴＬＡ−４単独またはＤｏｘｉｌと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。図８Ｅは、ＧＩＴＲＬ単独またはＤｏｘｉｌと組み合わせて投与されたマウスの群および関連コントロール群の生存率を示すグラフである。
【図９】図９Ａ−９Ｉは、Ｄｏｘｉｌがｉｎ  ｖｉｖｏの免疫調節機能を有することを示す。ＭＣＡ２０５腫瘍担持Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに、α−ＰＤ−Ｌ１、Ｄｏｘｉｌまたは本明細書に記載した組合せが投与された。図９Ａは、血液中のＣＤ８+Ｔ細胞の比率を描出するグラフである。図９Ｂは、腫瘍中のＣＤ８+Ｔ細胞の比率を描出するグラフである。図９Ｃは、腫瘍中のＣＤ４+／ＦｏｘＰ３+細胞の比率を描出するグラフである。図９Ｄは、血液中のＣＤ４５+ＣＤ１１ｃ+ＭＨＣＩＩhi細胞内のＣＤ８０の発現を描出するグラフである。図９Ｅは、腫瘍中のＣＤ４５+ＣＤ１１ｃ+ＭＨＣＩＩhi細胞内のＣＤ８０の発現を描出するグラフである。図９Ｆは、Ｄｏｘｉｌ治療動物における血液中でＣＤ４５+ＣＤ１１ｃ+ＭＨＣＩＩhi細胞の比率が増加し、さらにα−ＰＤ−Ｌ１の添加によってさらに増大されたことを示すグラフである。図９Ｇは、腫瘍単離ＣＤ４５+ＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６Ｃ+細胞内のＣＤ８０の発現を描出するグラフである。図９Ｈは、腫瘍単離ＣＤ４５+ＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６Ｇ+細胞内のＣＤ８０の発現を描出するグラフである。図９Ｉは、ＤｏｘｉｌおよびＤｏｘｉｌ＋α−ＰＤ−Ｌ１治療動物における腫瘍中でＣＤ４５+ＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６Ｃ+細胞の比率が増加したことを示すグラフである。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１（対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
以下に記載するように、本発明は、免疫調節薬（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＧＩＴＲＬまたはＯＸ４０融合タンパク質（ＦＰ））と組み合わせたドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌを特徴とする。
【００８５】
ドキソルビシンは、肉腫、肺癌、乳癌および他の癌を有する患者のために広汎に使用される化学療法薬である。以前には、ドキソルビシンは、ＤＮＡ挿入剤およびトポイソメラーゼの阻害剤として明確に特徴付けられている。報告されているドキソルビシンの他の作用機序は、ＤＮＡ架橋結合、ＤＮＡ鎖分離の妨害、フリーラジカル形成、ヘリカーゼ活性および直接膜効果である。そのため、ドキソルビシンは、腫瘍細胞への直接細胞殺滅効果を備える細胞傷害性薬であると見なされてきた。より近年には、ドキソルビシンは、免疫原性細胞死の誘導因子であると確定されており、ＩＦＮγ産生を増加させ、マウスモデルにおいて樹状細胞およびＴ細胞腫瘍浸潤を誘導することが証明されている。
【００８６】
本明細書に記載するように、ドキソルビシンおよびＤｏｘｉｌはいずれも２種の同系マウスモデルにおいて数種のＴ細胞標的化免疫療法と相乗作用した。重要なことに、組合せ活性は、マウスモデルにおいて高い治癒率をもたらす長期持続性であり、免疫学的記憶を生成した。さらに、これらの結果は、Ｄｏｘｉｌが全身性投与後には腫瘍内の受容細胞および未成熟骨髄細胞に直接的効果をもたらすことを初めて明らかにしている。
【００８７】
ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１
Ｔ細胞が、疾患の早期および後期のいずれでも癌患者において腫瘍の増殖および生存を制御するという証拠が増大している。しかし、腫瘍特異的Ｔ細胞反応は、癌患者において増加および維持するのが困難である。
【００８８】
顕著な注目を集めている２つのＴ細胞調節経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２）およびプログラム細胞死１（Ｂ７Ｈ−１またはＣＤ２７４としても公知であるＰＤ−Ｌ１）を通してシグナル伝達する。
【００８９】
ＣＴＬＡ−４は、活性化Ｔ細胞上で発現し、ＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化後のチェック時におけるＴ細胞反応を維持するための共阻害因子として機能する。ＣＴＬＡ−４は、ＴＣＲ関与後の未感作および記憶Ｔ細胞の早期活性化の振幅を調節し、かつ抗腫瘍免疫および自己免疫の両方に影響を及ぼす中心阻害経路の一部になると考えられる。ＣＴＬＡ−４はＴ細胞上で発現し、そのリガンドであるＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）の発現は、主として抗原提示細胞、Ｔ細胞および他の免疫媒介細胞に限定される。ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路を遮断する拮抗性抗ＣＴＬＡ−４抗体は、Ｔ細胞活性化を増強すると報告されている。１つのそのような抗体イピリムマブは、転移性黒色腫の治療のためにＦＤＡによって２０１１年に承認された。別の抗ＣＴＬＡ−４抗体であるトレメリムマブは、進行性黒色腫の治療について第ＩＩＩ相臨床試験において試験されたが、その当時の標準治療（テモゾロミドまたはダカルバジン）と比較して患者の全生存率を有意には増加させなかった。
【００９０】
ＰＤ−Ｌ１もＴ細胞活性化を制御することに関係している受容体およびリガンドの複合系の一部である。正常組織中では、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞、骨髄由来肥満細胞および様々な非造血細胞上で発現する。その正常機能は、その２つの受容体：プログラム細胞死１（ＰＤ−１またはＣＤ２７９としても公知）およびＣＤ８０（Ｂ７−１またはＢ７．１としても公知）との相互作用を通してＴ細胞活性化と耐性との間の平衡を調節することである。ＰＤ−Ｌ１は、さらに腫瘍によっても発現し、腫瘍が宿主免疫系による検知および排除を回避するのに役立つように複数部位で作用する。ＰＤ−Ｌ１は、広範囲の癌において高頻度で発現する。一部の癌では、ＰＤ−Ｌ１の発現には、生存率の低下および不都合な予後が結び付いている。ＰＤ−Ｌ１とその受容体（例えば、ＰＤ−１）との間の相互作用を遮断する抗体は、ＰＤ−Ｌ１依存性免疫抑制効果を緩和してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強することができる。
【００９１】
ＰＤ−１は、活性化誘導性アポトーシスを経験しているＴ細胞系内で最初に同定された５０〜５５ｋＤａのＩ型膜貫通受容体である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージ上で発現する。ＰＤ−１に対するリガンドは、Ｂ７ファミリーメンバーであるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）である。
【００９２】
ＰＤ−１は、この細胞外領域内に単一Ｉｇ  Ｖ様ドメインを含有する免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤ−１細胞質ドメインは２種のチロシンを含有しており、膜に最も近位のチロシン（マウスＰＤ−１内のＶＡＹＥＥＬ（配列番号２５））はＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンをベースとする阻害性モチーフ）内に位置する。ＰＤ−１上のＩＴＩＭの存在は、この分子が細胞質ホスファターゼの動員により抗原受容体シグナル伝達を減衰させるように機能することを示唆している。ヒトおよびマウスＰＤ−１タンパク質は、４つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位の保存を伴う約６０％のアミノ酸同一性およびＩｇ−Ｖドメインを規定する残基を共有する。細胞質領域内のＩＴＩＭおよびカルボキシ末端チロシン（ヒトおよびマウスにおけるＴＥＹＡＴＩ（配列番号２６））を取り囲んでいるＩＴＩＭ様モチーフは、さらにヒトおよびマウスオルトログ間でも保存されている。
【００９３】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球上で発現する。実験データは、中心および末梢免疫反応のダウンレギュレーションにおいてＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用を意味している。詳細には、野生型Ｔ細胞における増殖はＰＤ−Ｌ１の存在下では阻害されるが、ＰＤ−１欠損Ｔ細胞内では阻害されない。さらに、ＰＤ−１欠損マウスは、自己免疫表現型を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＤ−１欠損は、慢性進行性ループス様糸球体腎炎および関節炎を生じさせる。Ｂａｌｂ／ｃマウスでは、ＰＤ−１欠損は、心組織特異的自己反応性抗体の存在に起因する重度心筋症をもたらす。
【００９４】
抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体
抗ＰＤ−１抗体およびそれらの抗原結合フラグメントについて記載されている（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，４８８，８０２号明細書を参照されたい）。ＬＯＰＤ１８０は、典型的なＰＤ−１抗体である。ＰＤ−Ｌ１活性（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＤ８０に結合する）に特異的に結合して阻害する抗体は、抗腫瘍免疫反応を増強するために有用である。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、当技術分野において公知であり、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる下記の米国特許文献：国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに対応する米国特許出願公開第２００９００５５９４４号明細書（ＢＭＳ／Ｍｅｄａｒｅｘ）；国際公開第０１／１４５５６号パンフレットに対応する米国特許出願公開第２００６／０１５３８４１号明細書（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ）；米国特許出願公開第２０１１／０２７１３５８号明細書（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ）；国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットに対応する米国特許第８，２１７，１４９号明細書として発行された米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６号明細書（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；米国特許出願公開第２０１２／００３９９０６号明細書（ＩＮＳＥＲＭ）；国際公開第２０１２／１４５４９３号パンフレットに対応する米国特許出願公開第２０１４００４４７３８号明細書（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）；米国特許出願公開第２０１００２８５０３９号明細書（Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；および米国特許第８，７７９，１０８号明細書（ＭＥＤＩ４７３６）に記載されている。
【００９５】
ＭＥＤＩ４７３６は、ＰＤ−Ｌ１に対して選択的であり、ＰＤ−１およびＣＤ８０受容体へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する典型的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ＭＥＤＩ４７３６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＴ細胞活性化のＰＤ−Ｌ１媒介性抑制を緩和することができ、Ｔ細胞依存性機序を介して異種移植片モデルにおける腫瘍増殖を阻害する。
【００９６】
本明細書に提供した方法で使用するためのＭＥＤＩ４７３６（またはそのフラグメント）に関する情報は、その開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７９，１０８号明細書に見いだすことができる。ＭＥＤＩ４７３６のフラグメント結晶可能（Ｆｃ）ドメインは、補体成分Ｃ１ｑおよび抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する役割を果たすＦｃγ受容体への結合を低下させるＩｇＧ１重鎖の定常ドメイン内に三重突然変異を含有する。
【００９７】
本明細書に提供した方法で使用するためのＭＥＤＩ４７３６およびその抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖または重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、本明細書に提供した方法で使用するためのＭＥＤＩ４７３６またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。特定の態様では、本明細書に提供した方法で使用するためのＭＥＤＩ４７３６またはそのフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域は上記に示したＫａｂａｔ定義のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域は上記に示したＫａｂａｔ定義のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。当業者であれば、当業者に公知のＣｈｏｔｈｉａ定義、Ａｂｍ定義または他のＣＤＲ定義を容易に同定することができるであろう。特定の態様では、本明細書に提供した方法で使用するためのＭＥＤＩ４７３６またはそのフラグメントは、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７９，１０８号明細書に開示された２．１４Ｈ９ＯＰＴ抗体の可変重鎖および可変軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００９８】
抗ＣＴＬＡ−４抗体
ＣＴＬＡ−４に特異的に結合してＣＴＬＡ−４活性を特異的に阻害する抗体は、抗腫瘍免疫反応を増強するために有用である。本明細書に提供した方法で使用するためのトレメリムマブ（またはその抗原結合フラグメント）に関する情報は、その開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８２，７３６号明細書（その中では１１．２．１と記載されている）に見いだすことができる。トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６、ＣＰ−６７５、ＣＰ−６７５２０６およびチシリムマブとしても公知）は、ＣＴＬＡ−４に対して高度に選択性であり、ＣＴＬＡ−４のＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）に対する結合を遮断するヒトＩｇＧ2モノクローナル抗体である。トレメリムマブは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫活性化を生じさせることが証明され、トレメリムマブにより治療された一部の患者が腫瘍退行を示していた。
【００９９】
本明細書に提供した方法で使用するためのトレメリムマブおよびその抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖または重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、本明細書に提供した方法で使用するためのトレメリムマブまたはその抗原結合フラグメントは、本明細書の上記で示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および本明細書の上記で示した重鎖可変領域を含む。特定の態様では、本明細書に提供した方法で使用するためのトレメリムマブまたはそのフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域は上記に示したＫａｂａｔ定義のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域は上記に示したＫａｂａｔ定義のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。当業者であれば、当業者に公知のＣｈｏｔｈｉａ定義、Ａｂｍ定義または他のＣＤＲ定義を容易に同定することができるであろう。特定の態様では、本明細書に提供した方法で使用するためのトレメリムマブまたはそのフラグメントは、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８２，７３６号明細書に開示された１１．２．１抗体の可変重鎖および可変軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１００】
他の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、米国特許出願公開第２００７０２４３１８４号明細書に記載されている。１つの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＭＤＸ−０１０；ＢＭＳ−７３４０１６とも称されるイピリムマブである。
【０１０１】
抗体
ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に選択的に結合し、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の結合または活性化を阻害する抗体は、本発明の方法において有用である。
【０１０２】
一般に、抗体は、例えば従来のハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９９）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）または抗体、ライブラリーを用いて実施されるファージ提示法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７）を使用して作成できる。他の抗体生成技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい。本発明は、いずれかの特定の入手源、起源種、製造方法に限定されない。
【０１０３】
免疫グロブリンとしても公知である無傷抗体は、典型的にはそれぞれおよそ２５ｋＤａの２本の軽（Ｌ）鎖と、それぞれおよそ５０ｋＤａの２本の重（Ｈ）鎖とから構成される四量体グリコシル化タンパク質である。λ鎖およびκ鎖と指定される２つのタイプの軽鎖は、抗体内で見いだされる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは５つの主要なクラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＭに指定することができ、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類することができる。
【０１０４】
様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は、当技術分野において周知である。抗体構造の総説については、上記のＨａｒｌｏｗらを参照されたい。簡単には、各軽鎖は、１つのＮ末端可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）から構成される。各重鎖は、１つのＮ末端可変ドメイン（ＶＨ）、３または４つの定常ドメイン（ＣＨ）および１つのヒンジ領域から構成される。ＶＨに最も近位のＣＨドメインは、ＣＨ１と指名されている。ＶＨおよびＶＬドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変配列の３つの領域にとっての足場を形成するフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）と呼ばれる相当に保存された配列の４つの領域からなる。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用の役割を果たす大多数の残基を含有する。３つのＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。重鎖上のＣＤＲ構成成分はＨ１、Ｈ２およびＨ３と呼ばれるが、他方では、軽鎖上のＣＤＲ構成成分はそれに合わせてＬ１、Ｌ２およびＬ３と呼ばれる。ＣＤＲ３および特にＨ３は、抗原結合ドメイン内の分子多様性の最大の起源である。例えば、Ｈ３は、２個のアミノ酸残基のように短い場合があるか、または２６超の場合がある。
【０１０５】
Ｆａｂフラグメント（抗原結合フラグメント）は、定常領域間のジスルフィド結合によって共有的に結合されたＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬドメインからなる。Ｆｖ内の非共有結合ＶＨおよびＶＬドメインが宿主細胞内で共発現した場合に解離する傾向を克服するために、いわゆる一本鎖（ｓｃ）Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を構築することができる。ｓｃＦｖ内では、柔軟性および適正に長いポリペプチドはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に、またはＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端へ結合させる。最も一般には、１５残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチド（配列番号２７）は、リンカーとして使用されるが、他のリンカーも当技術分野において公知である。
【０１０６】
抗体多様性は、可変領域および様々な体性事象の組合せアセンブリをコードする複数の生殖系遺伝子の結果である。体性事象には、完全ＶＨ領域を作成するための多様性（Ｄ）を備える可変遺伝子区分と接合（Ｊ）遺伝子区分との組合せ、ならびに完全ＶＬ領域を作成するための可変遺伝子および接合遺伝子区分の組合せが含まれる。組合せ方法自体は不正確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部でのアミノ酸の消失または付加を生じさせる。これらの多様性の機序は、抗原曝露前に発達中のＢ細胞内で発生する。抗原刺激後、Ｂ細胞内で発現した抗体遺伝子は体性突然変異を受ける。
【０１０７】
生殖系遺伝子区分の推定数、これらの区分の無作為組合せおよび無作為ＶＨ−ＶＬ対合に基づくと１．６×１０7種までの抗体を作成することができた（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）。抗体多様性（例えば、体性突然変異）の原因となる他の方法を考慮に入れると、１×１０10より多い種の異なる抗体を潜在的に生成することができたと考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９５）。抗体多様性には多数のプロセスが関係しているため、独立して生成された抗体がＣＤＲ内で同一またはさらには実質的に類似したアミノ酸配列を有する可能性は極めて低い。
【０１０８】
本明細書には、典型的な抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＰＤ−１  ＣＤＲの配列が提供される。ＣＤＲを運ぶための構造は、一般にはＣＤＲが天然型ＶＨおよびＶＬのＣＤＲに対応する場所に位置している抗体重鎖もしくは軽鎖またはその一部分であろう。免疫グロブリン可変ドメインの構造および場所は、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１に記載されたように決定することができる。
【０１０９】
本発明の抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＰＤ−１）は、任意選択的に抗体定常領域またはそれらの部分を含むことができる。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ末端でヒトＣκまたはＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに付着している場合がある。同様に、ＶＨドメインに基づく特異的抗原結合ドメインは任意の抗体アイソトープ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ４を含むがそれらに限定されないアイソトープサブクラスのいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部に付着している場合がある。
【０１１０】
当業者であれば、本発明の抗体は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１と若干相違するタンパク質を検出、測定および阻害するために使用できることを認識するであろう。抗体は、標的タンパク質が本明細書に記載した隣接アミノ酸の少なくとも１００、８０、６０、４０または２０の任意の配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上同一である配列を含む限り、結合の特異性を維持すると見込まれている。同一性率は、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，ｔｈｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｏｆ  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３に記載されたＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）またはＭｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７のアルゴリズムなどの標準整列アルゴリズムによって決定される。
【０１１１】
配列相同性分析に加えて、エピトープマッピング（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照されたい）と、二次および三次構造分析とを実施すると、開示された抗体および抗原とそれらとの錯体とによって推定される特異的３Ｄ構造を同定することができる。そのような方法には、Ｘ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｏｍ（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，１１：７−１３）および本出願に開示した抗体の仮想表現のコンピューターモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）が含まれるがそれらに限定されない。
【０１１２】
誘導体
本発明の抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＰＤ−１）は、それらの標的に特異的に結合する能力を維持しているこれらの配列の変異体を含むことができる。そのような変異体は、当技術分野において周知である技術を使用する当業者により、これらの抗体の配列から導出されることができる。例えば、アミノ酸置換、欠失または付加は、ＦＲ内および／またはＣＤＲ内で作成することができる。ＦＲ内の変化は、通常、抗体の安定性および免疫原性を改善するために設計されるが、ＣＤＲ内の変化は、典型的には抗体のその標的に対する親和性を高めるために設計される。ＦＲの変異体は、天然型免疫グロブリンアロタイプをさらに含んでいる。そのような親和性を高める変化は、ＣＤＲを変化させることおよび抗体のその標的に対する親和性を試験することを含むルーチン技術によって経験的に決定することができる。例えば、保存的アミノ酸置換は、本明細書に開示したＣＤＲのいずれか１つで作成できる。様々な変化は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，１９９５に記載された方法に従って作成できる。これらには、配列内で機能的に均等なアミノ酸残基をコードし、したがって「サイレント」変化をコードする様々なコドンの置換によって変化させられるヌクレオチド配列が含まれるがそれらに限定されない。例えば、非極性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラミン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性天然アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【０１１３】
本発明の抗体の誘導体およびアナログは、組換え法および合成法（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，およびＢｏｄａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む、当技術分野において周知である様々な技術によって作成できる。
【０１１４】
１つの実施形態では、本発明のＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを作成するための方法は、本明細書に開示したＶＨドメインのアミノ酸配列内に１つ以上のアミノ酸を付加する、欠失させる、置換する、または挿入する工程、任意選択的にこのように提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと結合する工程、およびＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの１つ以上の組合せを抗原への特異的結合について試験する工程を含む。本明細書に開示したＶＬドメインの１つ以上の配列変異体が１つ以上のＶＨドメインと結合される類似の方法を使用できる。
【０１１５】
類似のシャッフリングまたはコンビナトリアル技術もβ−ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術について記載しているが、そのアプローチが抗体生成のために使用できることを観察しているＳｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３８９−３９１）によっても開示されている。
【０１１６】
別の実施形態では、１つ以上の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム突然変異導入法を使用して本明細書に開示した配列に由来する１つ以上の配列を有する新規なＶＨまたはＶＬ領域を生成することができる。１つのそのような技術であるエラープローンＰＣＲは、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：３５７６−３５８０）によって記載されている。
【０１１７】
使用できる別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲに突然変異誘発を方向付けることである。そのような技術は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）９１：３８０９−３８１３）およびＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６３：５５１−５６７）によって開示されている。
【０１１８】
同様に、１つ以上または３つ全てのＣＤＲは、ある範囲のＶＨまたはＶＬドメインに移植することができ、これらはその後にＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対して特異的な抗原結合フラグメントについてスクリーニングされる。
【０１１９】
免疫グロブリン可変ドメインの一部分は本明細書に実質的に記載した少なくとも１つのＣＤＲ、および任意選択的に本明細書に規定したｓｃＦｖフラグメント由来の介在フレームワーク領域を含むであろう。その部分はＦＲ１およびＦＲ４のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含むことができ、その５０％はＦＲ１のＣ末端５０％およびＦＲ４のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端にある追加の残基は、通常、天然型可変ドメイン領域と結び付いていない残基であってよい。例えば、組換えＤＮＡ技術による抗体の構築は、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されたリンカーによってコードされるＮ末端またはＣ末端残基の導入を生じさせる可能性がある。他の操作工程には、免疫グロブリン重鎖定常領域、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの生成における）または下記でより詳細に考察するタンパク性標識を含む別のタンパク質配列に可変ドメインを結合するためのリンカーの導入が含まれる。
【０１２０】
当業者であれば、本発明の抗体がＶＬまたはＶＨドメインいずれかからの単一ＣＤＲのみを含有する抗原結合フラグメントを含む可能性があることを認識するであろう。一本鎖特異的結合ドメインのいずれか１つは、例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１のうちの２つに結合することができる２ドメイン特異的抗原結合フラグメントを形成することのできる相補的ドメインについてスクリーニングするために使用できる。
【０１２１】
本明細書に記載した本発明の抗体（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＰＤ１）は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（アルブミン、別の抗体など）に結合させることができる。例えば、抗体は、化学的架橋結合によって、または組換え法によって結合させることができる。抗体は、さらに様々な非タンパク性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンのうちの１つに、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書；または同第４，１７９，３３７号明細書に規定した方法で結合させることができる。抗体は、例えば、それらの循環中半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合によって化学的に修飾することができる。典型的なポリマーおよびそれらに付着させるための方法は、さらに米国特許第４，７６６，１０６号明細書；同第４，１７９，３３７号明細書；同第４，４９５，２８５号明細書および同第４，６０９，５４６号明細書に示されている。
【０１２２】
本明細書に開示した抗体は、自然パターンと異なるグリコシル化パターンを有するようにさらに変化させることができる。例えば、１つ以上の炭水化物成分を欠失させることができ、および／または１つ以上のグリコシル化部位を最初の抗体に付加することができる。本明細書に開示した抗体へのグリコシル化部位の付加は、当技術分野において公知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含有するためにアミノ酸配列を変化させることによって遂行することができる。抗体上の炭水化物成分の数を増加させる別の手段は、抗体のアミノ酸残基へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。そのような方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレットおよびＡｐｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９−３０６に記載されている。抗体からの任意の炭水化物成分の除去は、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１ならびにＴｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０によって記載されたように化学的または酵素的に実施することができる。抗体は、検出可能または機能的標識を用いてタグ付けすることもできる。検出可能な標識には、従来型化学を使用してさらに抗体に付着させることもできる放射性標識、例えば１３１Ｉまたは９９Ｔｃが含まれる。検出可能な標識には、酵素標識、例えばホースラディッスペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼがさらに含まれる。検出可能な標識には、化学的成分、例えば、特異的同族検出可能成分、例えば、標識アビジンへの結合を介して検出できるビオチンがさらに含まれる。
【０１２３】
ＣＤＲ配列が本明細書に規定したＣＤＲ配列とごくわずかにのみ相違する抗体は、本発明の範囲内に含まれる。典型的には、アミノ酸は、類似の電荷、疎水性または立体化学的特徴を有する関連アミノ酸によって置換される。そのような置換は、当業者の技術の範囲内に含まれるであろう。ＣＤＲとは相違して、ＦＲには抗体の結合特性に有害な影響を及ぼすことなくより実質的な変化を加えることができる。ＦＲへの変化には、非ヒト由来をヒト化すること、または抗原接触もしくは結合部位を安定化するために重要である所定のフレームワーク残基を操作すること、例えば定常領域のクラスまたはサブクラスを変化させること、例えば米国特許第５，６２４，８２１号明細書および同第５，６４８，２６０号明細書ならびにＬｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−３２４に記載されているようにＦｃ受容体結合などのエフェクター機能を変化させる可能性がある特異的アミノ酸残基を変化させることまたはそれに定常領域が由来する種を変化させることが含まれるがそれらに限定されない。
【０１２４】
当業者であれば、上記に記載した修飾は全く排他的ではないこと、および多数の他の修飾が本開示の教示に照らせば当業者には明白であろうことを理解するであろう。
【０１２５】
併用療法
本発明の組合せ、例えばドキソルビシンもしくはＤｏｘｉｌとＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）もしくはＯＸ４０融合タンパク質、またはドキソルビシンもしくはＤｏｘｉｌと抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくは本明細書に提供したそれらの抗原結合フラグメントのうちのいずれか１つとを使用した充実性腫瘍を有する患者の治療は、付加効果または相乗効果を生じさせることができる。本明細書で使用する用語「相乗作用性」は、単剤療法の付加効果よりはるかに有効である療法の組合せ（例えば、ドキソルビシンもしくはＤｏｘｉｌとＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）もしくはＯＸ４０融合タンパク質、またはドキソルビシンもしくはＤｏｘｉｌと抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくは本明細書に提供したそれらの抗原結合フラグメントのうちのいずれか１つとの組合せ）に関する。
【０１２６】
所定の実施形態では、相乗作用は、Ｂｌｉｓｓ独立試験モデルを使用する統計的分析によって決定される（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ２０１４；１９（５）：８１７−２１）。このモデルについて下記に記載する。薬剤Ａ単独に起因する全腫瘍退行率がｒaであり、薬物Ｂ単独に起因する退行率がｒbである場合、組み合わせた場合の薬剤Ａおよび薬剤Ｂに起因する予想全腫瘍退行率は、これら２種の薬剤がＢｌｉｓｓ独立であることを前提とすると、ｒBliss＝ｒa＋ｒb−ｒaｒbである。観察された全腫瘍退行率ｒabと予測退行率との差は、相乗作用指数：
ｌ＝ｒab−ｒBliss
であると規定される。
【０１２７】
したがって、相乗指数の変動は、
ｖａｒ（ｌ）＝ｖａｒ（ｒab）＋ｖａｒ（ｒBliss）
と記述することができる。
【０１２８】
さらに、
【数１】
2018500384.tif 000017
（式中、ｎab、ｎaおよびｎbは、組合せ実験および２種の単剤療法実験の各サンプルサイズである）である。これら２種の薬剤は、
【数２】
2018500384.tif 000018
（式中、Ｚ0.95が標準正規分布の９５％パーセンタイルである）である場合に相乗作用性であると言われる。
【０１２９】
療法の組合せ（例えば、ドキソルビシンもしくはＤｏｘｉｌとＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）もしくはＯＸ４０融合タンパク質、またはドキソルビシンもしくはＤｏｘｉｌと抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはそれらの抗原結合フラグメントのうちのいずれか１つとの組合せ）の相乗効果は、充実性腫瘍を有する患者への低用量の１種以上の治療薬および／または前記治療薬の低頻度投与の使用を許容する。低用量の治療薬を利用し、および／または前記療法を低頻度で投与する能力は、充実性腫瘍の治療における前記療法の有効性を低下させることなく、対象への前記療法の投与に関連する毒性を減少させる。さらに、相乗効果は、充実性腫瘍の管理、治療または緩和における治療薬の改良された有効性を生じさせることができる。治療薬の組合せの相乗効果は、いずれかの単剤療法の使用に関連する有害または望ましくない副作用を回避または減少させることができる。
【０１３０】
併用療法では、ドキソルビシンもしくはＤｏｘｉｌとＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）もしくはＯＸ４０融合タンパク質、またはドキソルビシンもしくはＤｏｘｉｌと抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはそれらの抗原結合フラグメントのうちのいずれか１つとの組合せは、任意選択的に同一医薬組成物中に含めることができるか、または別個の医薬組成物中に含めることができる。後者の場合、ドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌを含む医薬組成物は、ＧＩＴＲリガンド、ＯＸ４０融合タンパク質、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与するために好適である。所定の場合、別個の組成物中のドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌは、ＧＩＴＲリガンド、ＯＸ４０融合タンパク質、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはそれらの抗原結合フラグメントと重複する時点で投与される。ＭＥＤＩ４７３６またはその抗原結合フラグメントとトレメリムマブまたはその抗原結合フラグメントとは、患者への利点を依然として提供しながら１回のみまたは不定期で投与することができる。別の態様では、患者に追加の後続用量が投与される。後続用量は、患者の年齢、体重、臨床評価、腫瘍組織量および／または主治医の判断を含む他の因子に依存して様々な時間間隔で投与することができる。
【０１３１】
本明細書に提供した方法は、腫瘍増殖を減少または遅延させることができる。一部の態様では、この減少または遅延は、統計的有意な可能性がある。腫瘍増殖における減少は、予測腫瘍増殖、大きい患者集団に基づく予測腫瘍増殖またはコントロール集団の腫瘍増殖に対するベースライン時の患者の腫瘍の増殖の比較によって測定できる。他の実施形態では、本発明の方法は、生存率を増加させる。
【０１３２】
キット
本発明は、抗腫瘍活性を増強するためのキットを提供する。１つの実施形態では、キットは、単位剤形中の有効量のドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌと抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＧＩＴＲリガンド、ＯＸ４０融合タンパク質のうちの１つ以上とを含有する治療用組成物を含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、キットは、治療用組成物を含有する無菌容器を含む。そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパックまたは当技術分野において公知の他の好適な容器形であってよい。そのような容器は、プラスチック、グラス、ラミネート紙、金属箔または医薬品を保持するために好適な他の材料から製造することができる。
【０１３４】
必要に応じて、キットは、本発明の治療用組合せを投与するための説明書をさらに含む。特定の実施形態では、取扱説明書には、下記：治療薬の説明；抗腫瘍活性を増強するための投与スケジュールおよび投与；安全上の注意；警告；適応；禁忌；過量投与に関する情報；有害反応；動物薬理学；臨床試験および／または参考文献のうちの少なくとも１つが含まれる。取扱説明書は、（存在する場合）容器上に直接的に、または容器に貼り付けられたラベルとして、または容器内もしくは容器とともに提供される別個のシート、パンフレット、カードもしくはホルダーとして印刷されてよい。
【０１３５】
本発明の実施は、他に特に指示しない限り、当業者の知識範囲内に明確に含まれる分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来型技術を使用する。そのような技術は、文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ ADDIN ENRfu （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” ADDIN ENRfu （Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ” ADDIN ENRfu （Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” ADDIN ENRfu   “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” ADDIN ENRfu （Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ” ADDIN ENRfu （Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ” ADDIN ENRfu （Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”， ADDIN ENRfu （Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” ADDIN ENRfu （Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）で十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に適用することができ、したがって、本発明を製造および実施する際に考慮に入れることができる。下記のセクションでは、特定の実施形態のために特に有用な技術について考察する。
【０１３６】
下記の実施例は、当業者に本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法の作製方法および使用方法についての完全な開示および説明を提供できるように提示するものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【０１３７】
実施例１．チェックポイント阻害剤と組み合わせたＤｏｘｉｌまたはドキソルビシンによる治療は相乗性抗腫瘍活性を有した。
ドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌがＩＭＴ−Ｃ（癌に対する免疫媒介性療法）薬の抗腫瘍効果を強化できるという仮説を試験するために、ＣＴ２６腫瘍担持Ｂａｌｂ／Ｃマウスを様々な用量のこれらの薬剤単独ならびに抗マウスＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせて用いて治療した。これらのマウスは予防的方法で治療され、いずれかの測定可能な腫瘍に先行して治療を受けた。これは予防的試験であったため、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体の用量は、この設定におけるより高用量がより強度の抗腫瘍反応を生じさせることが公知であったために減量させた。
【０１３８】
数種の試験においてＣＴ２６モデルを使用した。ＣＴ２６細胞は、マウス結腸癌細胞である。ＣＴ２６細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩを用いて増殖させた。受領後、細胞系はＳＴＲベースのＤＮＡプロファイリングおよび多重ＰＣＲ（ＩＤＥＸＸ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ）を使用して再認証された。細胞は単層培養中で増殖させ、トリプシン処理によって収穫し、６〜８週齢の雌性Ｂａｌｂ／Ｃ（ＣＴ２６）、Ｃ５７／Ｂｌ６（ＭＣＡ２０５）または４〜６週齢の無胸腺雌性ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の右側腹部に皮下移植した。ＣＴ２６腫瘍モデルについて、５×１０5個の細胞は２６ゲージ針を使用して右側腹部に移植した。抗体は、抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）、抗ＰＤ−Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２）、抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９）およびマウスＩｇＧ２ｂコントロール（ＭＰＣ−１１）から入手した。マウスＯＸ４０融合タンパク質（ＯＸ４０  ＦＰ）およびラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体は、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によって生成された。全抗体およびＯＸ４０  ＦＰは、腹腔内注射によって投与した。Ｄｏｘｉｌ（Ｂｌｕｅｄｏｏｒ  Ｐｈａｒｍａ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびドキソルビシン（Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）は、静脈内投与を介して投与した。一部の試験では、アイソタイプコントロールをマウスにラットＩｇＧ２ａおよびマウスＩｇＧ２ｂのカクテルとして投与した。治療開始時、マウスは腫瘍容積（樹立腫瘍試験）または体重（予防的試験）のいずれかによって無作為割り付けした。１群当たりの動物数は、ｎＱｕｅｒｙソフトウエアを使用するサンプルサイズ計算に基づいて決定すると１群当たり１０〜１２匹の範囲に及んだ。腫瘍および体重測定値はいずれも週２回収集し、腫瘍容積は方程式（Ｌ×Ｗ2）／２（式中、ＬおよびＷは、それぞれ長さおよび幅の寸法を表す）を使用して計算した。エラーバーは、平均値の標準誤差として計算した。マウスの一般的健康状態は毎日監視し、全実験は実験動物の人道的治療および使用に関するＡＡＡＬＡＣおよびＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＩＡＣＵＣガイドラインに従って実施した。カプラン・マイヤー統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用するログランク検定を使用して実施した。ログランク（マンテル・コックス）検定を使用して生存率曲線（Ｐｒｉｓｍ  ６．０３）を比較した。ボンフェローニ法は、多重比較のために０．０５のαレベルを調整するために使用した。報告したｐ値は、両側ｐ値である。
【０１３９】
ドキソルビシンと比較して、Ｄｏｘｉｌは、４ｍｇ／ｋｇの用量でより強力な抗腫瘍活性を有していた（表１）。実際に、ＤｏｘｉｌによりそのＭＴＤ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療された全マウスは、完全反応（ＣＲ）を有した。Ｄｏｘｉｌの１ｍｇ／ｋｇでの低下した用量は、４ｍｇ／ｋｇでのドキソルビシンとほぼ等価の抗腫瘍活性を有していた（図１Ｃおよび１Ｄ）。抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４治療は単剤としての中等度から低抗腫瘍活性を有していたが（図１Ｅおよび１Ｆ）、いずれの抗体もドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌと組み合わせた場合に相乗性抗腫瘍効果を示した（図１Ｇ〜１Ｊ）。抗ＰＤ−１をドキソルビシン（４ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせた場合、完全反応者の数は動物２匹から８匹に増加した（図１Ｇ）。同様に、抗ＣＴＬＡ−４との組合せは反応者の数を動物２匹から９匹に増加させた（図１Ｉ）。抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４を１ｍｇ／ｋｇのＤｏｘｉｌと組み合わせた場合に類似の結果が得られた（図１Ｈおよび１Ｊ）。全試験について１群当たりの完全反応者の数を表１に示した。
【０１４０】
表１．ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４  ｍＡｂｓと組み合わせたドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌは多数の治癒を生じさせた。図１Ａ〜１Ｊに示した実験からの全群からの完全反応（ＣＲ）数を示した。Ｄｏｘｉｌは、ドキソルビシンより高活性であった。ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４と組み合わせたドキソルビシンまたはＤｏｘｉｌは強力な抗腫瘍反応を生じさせた。
【０１４１】
【表１】
2018500384.tif 000019
【０１４２】
これらのデータは、ドキソルビシンおよびＤｏｘｉｌがいずれも抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体と相乗作用性であることを証明しており、この特徴は、リポソームドキソルビシンの利用がＩＭＴ−Ｃとの遊離薬剤と類似の相乗作用活性を有したため、ドキソルビシン自体に特有であることを指示している。
【０１４３】
試験完了時、抗ＰＤ−１抗体とドキソルビシン（４ｍｇ／ｋｇ）の組合せで治療されたマウスは単剤療法と比較して増加した生存率を示した（図２Ａ、ｐ＝０．００５）。同様に、抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせたドキソルビシン（４ｍｇ／ｋｇ）またはＤｏｘｉｌ（１ｍｇ／ｋｇ）は、いずれかの単剤単独と比較して改善された生存率を示した（図２Ｂ、ｐ＝０．０１２）。統計的有意ではないが、Ｄｏｘｉｌ（１ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＣＴＬＡ−４抗体または抗ＰＤ−１抗体のいずれかを用いて治療されたマウスも本試験において単剤療法で治療されたマウスより長い生存期間を有する傾向を示した。
【０１４４】
実施例２．Ｄｏｘｉｌ単独またはチェックポイント阻害剤と組み合わせたＤｏｘｉｌによる治療は腫瘍特異的免疫学的記憶を有した。
Ｄｏｘｉｌ治療単独または抗ＰＤ−１もしくは抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせたＤｏｘｉｌ治療により完全反応を得たマウスが免疫学的記憶を提示したかどうかを決定するために、これらの動物に初期治療の７０日後にＣＴ２６生細胞を再投与した。ＣＴ２６細胞は未感作未治療マウス全１０匹において増殖したが（図３Ａ）、Ｄｏｘｉｌにより完全反応を達成したマウスは、腫瘍を拒絶したマウス１０匹中９匹において広汎な腫瘍拒絶を示した（図３Ｂ）。Ｄｏｘｉｌ＋抗ＣＴＬＡ−４により治療されたマウス１０匹中８匹およびＤｏｘｉｌ＋抗ＰＤ−１により治療されたマウス９匹中９匹は腫瘍を拒絶した（図３Ｃおよび３Ｄ）。これらの結果は、単剤としてのＤｏｘｉｌおよびチェックポイント阻害剤と組み合わせたＤｏｘｉｌによる治療が腫瘍特異的免疫学的記憶を生じさせたことを証明している。
【０１４５】
実施例３．Ｄｏｘｉｌの抗腫瘍活性を免疫適格対象および関連Ｔ細胞において観察した。
Ｄｏｘｉｌおよびドキソルビシンはいずれも予防的ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて活性であったが、これらの薬剤が樹立ＣＴ２６腫瘍を制御することに有効であるかどうか、およびこれらの薬剤の活性が機能的免疫系の存在下において異なるかどうかも興味深かった。ＣＴ２６細胞をＴ細胞欠損性無胸腺ヌードマウスおよび免疫適格Ｂａｌｂ／Ｃマウスの両方に移植し、腫瘍がおよそ２００ｍｍ3に達した時点でこれらの薬剤を最大許容用量で用いて治療した。
【０１４６】
この実験では、ドキソルビシンは、免疫無防備マウスまたは免疫適格マウスのいずれにおいても抗腫瘍活性を引き出さなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。これとは対照的に、Ｄｏｘｉｌ治療は樹立ＣＴ２６腫瘍を担持する免疫適格マウスにおいて強固な抗腫瘍活性を示したが（図４Ｂ）、これは免疫欠損マウスにおけるはるかに低い活性（図４Ａ）は機能的免疫系の存在下で増加し、Ｔ細胞の存在に依存する可能性が高いことを証明している。
【０１４７】
他の化学療法薬が類似の結果を達成できたかどうかを評価するために、免疫欠損性および免疫適格ＣＴ２６腫瘍担持マウスにオキサリプラチンまたはゲムシタビンのいずれかを投与した。オキサリプラチンは、以前の報告書と一致して、免疫欠損マウスと比較して（図４Ｅ）免疫適格マウスにおける増加した抗腫瘍活性を示した（図４Ｆ）（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ２０１４；１９（５）：８１７−２）。対照的に、ゲムシタビンは、免疫欠損マウスおよび免疫適格マウスのいずれにおいても有意な抗腫瘍活性を有していた（図４Ｃおよび４Ｄ）。これらの結果は、所定の化学療法が免疫学的細胞死の効率的な誘導因子であることを示唆した以前の試験（Ｏｂｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００７；１３（１）：５４−６１）と一致しており、さらにこの特徴がｉｎ  ｖｉｖｏではゲムシタビンによって保持されないことを初めて明らかにしている。
【０１４８】
実施例４．Ｄｏｘｉｌは、様々な免疫調節薬と組み合わせた場合に抗腫瘍活性の増進剤である。
Ｄｏｘｉｌと抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体との組合せはＣＴ２６モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を示したが（図１Ａ〜１Ｊ）、実験の限界は、それが予防的試験であり、低用量の抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体が使用されたことにあった。Ｄｏｘｉｌが樹立腫瘍状況においてＩＭＴ−Ｃと相乗作用性のままであるかどうかを決定するために、ＣＴ２６腫瘍担持マウスをＤｏｘｉｌ単独およびＣＴＬＡ−４（抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９）、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）、抗ＰＤ−１（ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）、ＰＤ−Ｌ１（抗ＰＤ−Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２），Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）、ＯＸ４０（マウスＯＸ４０融合タンパク質、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）およびＧＩＴＲ（マウスＧＩＴＲＬリガンド融合タンパク質、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を標的とするＩＭＴ−Ｃ薬との組合せで、全て腫瘍がおよそ２００〜３００ｍｍ3であった場合に最大有効用量で治療した（図５Ａ〜５Ｌ）。以前の試験は、より高用量のこれらの抗マウスＩＭＴＣ薬が、これらの樹立腫瘍容積でより大きい抗腫瘍有効性を生じさせないことを証明した。
【０１４９】
Ｄｏｘｉｌ治療は、一時的な腫瘍増殖の制御を生じさせたが、これには急速な腫瘍の再増殖が続き、完全反応を示したのは１例のみであった（図５Ｂ）。ＯＸ４０  ＦＰ、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４抗体による治療は、低度から中等度の活性を示し（図５Ｃ〜５Ｆ）、各群における完全反応者は少数であった。ＤｏｘｉｌとＯＸ４０  ＦＰとの組合せは単剤療法と比較して腫瘍進行までの時間および統計的有意な相乗作用に向かう傾向を増加させた（図５Ｇ）。ＧＩＴＲリガンド単独は、より堅固な反応を生じさせ、１２例中６例が完全反応者であった（図５Ｇ）。ＤｏｘｉｌとＯＸ４０  ＦＰとの組合せは、いずれかの単剤と比較して穏当な活性の増加を生じさせた（図５Ｈ）。
【０１５０】
驚くべきことに、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせたＤｏｘｉｌは、完全応答者数の相乗性増加を生じさせ、それぞれ１１／１２、９／１２および８／１２の治癒が生じた（図５Ｈ〜５Ｊ）。顕著なことに、ＤｏｘｉｌとＧＩＴＲＬ  ＦＰとの組合せは全マウスを治癒させ、１２／１２が完全応答者であった（図５Ｌ）。これらの実験は、Ｄｏｘｉｌとチェックポイント阻害剤との組合せが、樹立腫瘍状況においてさえ抗腫瘍反応において劇的な増加を生成することを証明した。これは、Ｄｏｘｉｌ＋ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４抗体の組合せで治療された全マウスがいずれかの単剤単独より長期間生存することを証明したカプラン・マイヤー生存分析プロットにおいても反映された（図６Ａ〜６Ｅ）。
【０１５１】
実施例５．Ｄｏｘｉｌは、複数の免疫調節薬と組み合わせた場合に抗腫瘍活性の増進剤である。
ＣＴ２６は免疫療法に対して高感受性であるため、Ｄｏｘｉｌが低感受性モデルＭＣＡ２０５において免疫療法の活性を増強できるかどうかを決定した。Ｄｏｘｉｌ、抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）；抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）；抗ＰＤ−Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）；ＯＸ４０  ＦＰ（マウスＯＸ４０融合タンパク質（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ（マウスＧＩＴＲリガンド融合タンパク質、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）は、腫瘍容積が１００〜１５０ｍｍ3の時点で開始して樹立ＭＣＡ２０５腫瘍にそれらの最大有効用量で投与した（図７Ａ〜７Ｌ）。
【０１５２】
ＭＣＡ２０５細胞は、Ａｇｏｎｏｘ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）から入手し、１０％ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩを用いて増殖させた。受領後、細胞系はＳＴＲベースのＤＮＡプロファイリングおよび多重ＰＣＲ（ＩＤＥＸＸ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ）を使用して再認証した。ＭＣＡ２０５は、線維肉腫細胞である。ＭＣＡ２０５腫瘍モデルについて、２．５×１０5個の細胞を移植した。全抗体およびＯＸ４０  ＦＰは、腹腔内注射によって投与した。Ｄｏｘｉｌ（Ｂｌｕｅｄｏｏｒ  Ｐｈａｒｍａ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびドキソルビシン（Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）は、静脈内投与を介して投与した。一部の試験では、アイソタイプコントロールをマウスにラットＩｇＧ２ａおよびマウスＩｇＧ２ｂのカクテルとして投与した。治療開始時、マウスは腫瘍容積（樹立腫瘍試験）または体重（予防的試験）のいずれかによって無作為割り付けした。１群当たりの動物数は、ｎＱｕｅｒｙソフトウエアを使用するサンプルサイズ計算に基づいて決定して１群当たり１０〜１２匹の範囲に及んだ。腫瘍および体重測定値はいずれも週２回収集し、腫瘍容積は方程式（Ｌ×Ｗ2）／２（式中、ＬおよびＷは、それぞれ長さおよび幅の寸法を表す）を使用して計算した。エラーバーは、平均値の標準誤差として計算した。マウスの一般的健康状態は毎日監視し、全実験は実験動物の人道的治療および使用に関するＡＡＡＬＡＣおよびＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＩＡＣＵＣガイドラインに従って実施した。カプラン・マイヤー統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用するログランク検定を使用して実施した。ログランク（マンテル・コックス）検定を使用して生存率曲線（Ｐｒｉｓｍ  ６．０３）を比較した。ボンフェローニ法は、多重比較のために０．０５のαレベルを調整するために使用した。報告したｐ値は、両側ｐ値である。
【０１５３】
このモデルでは、Ｄｏｘｉｌは一時的に腫瘍増殖を制御したが、腫瘍の大多数は再増殖した（図７Ｂ）。１匹のマウスはＤｏｘｉｌ群において完全反応を達成した。このモデルではＯＸ４０  ＦＰ、ＰＤ−１、ＧＩＴＲＬ  ＦＰおよびＰＤ−Ｌ１抗体は最小活性であり、一部は腫瘍進行を遅延させたが、完全反応を達成したのはＯＸ４０  ＦＰ群の１匹のみであった（図７Ｃ〜７Ｇ）。抗ＣＴＬＡ−４抗体による治療は中等度の反応を生成し、８／１２匹のマウスが完全反応を達成した。組合せ治療について、ＤｏｘｉｌとＯＸ４０  ＦＰアゴニストとの組合せはＤｏｘｉｌ単独よりも腫瘍増殖を遅延させず、さらに完全反応における有意な増加を提供しなかった（図７Ｈ）。
【０１５４】
これとは対照的に、チェックポイント阻害剤であるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４に対する抗体と組み合わせたＤｏｘｉｌは、それぞれ９／１２匹、１２／１２匹および１２／１２匹のマウスが完全反応を達成したという衝撃的な反応を生成した（図７Ｉ〜７Ｋ）。これらの結果は、Ｄｏｘｉｌが、単剤としての免疫療法に感受性ではないモデルにおける免疫療法の抗腫瘍効果を増強することを示している。増加した生存率は、本試験においてＤｏｘｉｌ治療と比較して、Ｄｏｘｉｌ＋抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４抗体により治療されたマウスにおいて観察された（図８Ａ〜８Ｅ）。
【０１５５】
実施例６  Ｄｏｘｉｌは、腫瘍Ｔｒｅｇを減少させ、細胞傷害性Ｔ細胞容積増大を誘導し、腫瘍内の成熟ＤＣを活性化した。
Ｄｏｘｉｌがｉｎ  ｖｉｖｏの免疫細胞集団に及ぼす何らかの効果を誘導するために機構研究を実施した。ＭＣＡ２０５腫瘍担持マウスをＤｏｘｉｌ、α−ＰＤ−Ｌ１抗体または組合せにより治療し、腫瘍および血液を採取した。ＭＣＡ２０５細胞（２．５×１０5）を６〜８週齢の雌性Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの右側腹部に移植した。腫瘍が平均約２５０ｍｍ3に達した時点でマウスを６匹ずつの群に無作為割り付けし、Ｄｏｘｉｌ（５ｍｇ／ｋｇ）；ＯＸ４０  ＦＰ（２０ｍｇ／ｋｇ）；α−ＰＤ−Ｌ１（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＤｏｘｉｌとＯＸ４０  ＦＰまたはα−ＰＤ−Ｌ１（第０日）との組合せを投与した。ＯＸ４０  ＦＰおよびα−ＰＤ−Ｌ１の第２回投与は第３日に行い、Ｄｏｘｉｌは第７日に再投与した。第８日に全マウスを安楽死させ、マウスから組織を収集した。赤血球はＡＣＫ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて溶解させた。腫瘍を２ｍｍ3片に切片作製し、２０分間かけて３７℃で２００単位／ｍＬの３型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）および０．２５ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて消化した。９６ウエルプレート内の１ウエル当たり１００万〜２００万個の細胞を装填し、Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて染色し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％のＦＢＳおよび２ｍｍのＥＤＴＡ）中のＣＤ１１ｂ（ＢＤ  Ｃｌｏｎｅ  Ｍ１／７０）、ＣＤ１１ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃｌｏｎｅ  ｎ４１８）、ＣＤ８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃｌｏｎｅ  １６−１０Ａ１）、Ｌｙ６Ｇ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃｌｏｎｅ  １Ａ８）、Ｌｙ６Ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＨＫ１．４）、ＣＤ４５（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｅ  ３０−Ｆ１１）、ＭＨＣ−ＩＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃｌｏｎｅ  Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃｌｏｎｅ  ＲＭ４−５）、ＣＤ８（ＢＤ  Ｃｌｏｎｅ  ＲＰＡ−Ｔ８）およびＦＯＸＰ３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｅ  ＦＪＫ−１６Ｓ）に対する抗体で染色した。ＦＯＸＰ３検出のために、ＦＯＸＰ３転写キットを使用した（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。細胞を４℃で２０分間染色し、洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドを用いて固定した。サンプルデータはＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で獲得した。データはＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析した。
【０１５６】
ＭＣＡ２０５腫瘍担持マウスをＤｏｘｉｌ、α−ＰＤ−Ｌ１抗体または組合せにより治療した場合、Ｄｏｘｉｌは血中のＣＤ８＋Ｔ細胞の含有率を増加させ、ＤｏｘｉｌおよびＰ  α−Ｄ−Ｌ１の組合せは腫瘍中のＣＤ８+Ｔ細胞の含有率の有意な増加を生じさせた（図９Ａおよび９Ｂ）。細胞傷害性Ｔ細胞に加えて、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇの量における有意な減少はＤｏｘｉｌ治療の結果として観察され、これはＤｏｘｉｌおよび抗ＰＤ−Ｌ１の組合せによりさらに増強されると思われた（図９Ｃ）。
【０１５７】
Ｔ細胞変化の原因を試験するために、血液中および腫瘍中の骨髄区画の表現型を調査した。血液中および腫瘍中のいずれにおいても、ＤｏｘｉｌおよびＤｏｘｉｌ＋抗ＰＤ−Ｌ１は成熟樹状細胞を表すＣＤ４５+ＣＤ１１ｃ+ＭＨＣＩＩhi細胞上の共刺激性分子ＣＤ８０の発現を誘導したが、抗ＰＤ−Ｌ１単独は誘導しなかった（図９Ｄおよび９Ｅ）。ＣＤ８０の発現レベルは、Ｄｏｘｉｌ単独と比較して組合せ群においてより高い傾向を示した。同時に、Ｄｏｘｉｌ治療はさらに血液中のＣＤ４５+ＣＤ１１ｃ+ＭＨＣＩＩhi細胞の含有率を増加させ、この含有率はさらに抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わせた場合に有意に増加した（図９Ｆ）。これは、Ｄｏｘｉｌが成熟樹状細胞上のＣＤ８０のレベルを増加させなかっただけではなく、これらの細胞の容積増大も誘導したことを証明している。興味深いことに、ＣＤ８０のＤｏｘｉｌ誘導性アップレギュレーションの効果は、腫瘍中のＣＤ４５+ＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６ｃ+単細胞ＭＤＳＣおよびＣＤ４５+ＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６Ｇ+顆粒細胞ＭＤＳＣ上でも観察された（図９Ｇおよび９Ｈ）。ＤｏｘｉｌおよびＤｏｘｉｌ＋抗ＰＤ−Ｌ１も腫瘍中のＣＤ４５+ＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６ｃ+細胞の含有率を増加させた（図９Ｉ）。これらをまとめると、これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏではＤｏｘｉｌが腫瘍Ｔｒｅｇを減少させ、細胞傷害性Ｔ細胞容積増大を誘導し、腫瘍内の成熟ＤＣを活性化することを証明した。これらの所見は一貫しており、Ｄｏｘｉｌが抗ＰＤ−Ｌ１および同様に本試験において観察されたチェックポイント阻害の潜在的な他の媒介因子と組み合わせた場合に有した顕著な抗腫瘍効果についての説明を提供する。
【０１５８】
他の実施形態
上記の説明から、本明細書に記載した本発明を様々な使用および条件に採用するために、それに対する変更形態および修飾形態をなし得ることは明白であろう。そのような実施形態も添付の特許請求項の範囲内に含まれる。
【０１５９】
本明細書の変量のいずれかの定義における要素のリストの列挙は、いずれかの単一要素または列挙した要素の組合せ（もしくは部分組合せ）としてのその変量の定義を含んでいる。本明細書での１つの実施形態の列挙は、任意の単一実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはそれらの部分と組み合わせた実施形態を含んでいる。
【０１６０】
本明細書において言及した全特許および刊行物は、各独立特許および刊行物が明確におよび個別に参照により組み込まれていると指示されたのと同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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