(57)【要約】  本発明は、遺伝子構築物およびそのような構築物を含む組換えベクターを提供する。該構築物およびベクターは、緑内障および聴覚消失をはじめとする一定範囲の障害を処置するための、または神経再生および／もしくは生存を促進するための遺伝子療法に用いられ得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）をコードする第一のコード配列と、前記ＴｒｋＢ受容体のアゴニストをコードする第二のコード配列とに動作可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子構築物。
【請求項２】
前記遺伝子構築物が、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＨＰＥ）をコードするヌクレオチド配列を含み、場合により前記ＷＨＰＥが、実質的に配列番号５７もしくは５８に表される核酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３】
前記遺伝子構築物が、ポリＡテールをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により前記ポリＡテールが、実質的に配列番号５９に表される核酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１または請求項１のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項４】
前記プロモーターが、ヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ Ｉ）プロモーターであり、場合により前記プロモーターが、実質的に配列番号１に表されるヌクレオチド酸（nucleotide acid）配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーターであり、場合により前記プロモーターが、実質的に配列番号２、３もしくは４８に表されるヌクレオチド酸（nucleotide acid）配列、またはそれらの断片もしくは変異体を含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
前記遺伝子構築物が、前記第一のコード配列と前記第二のコード配列との間に配置されたスペーサー配列を含み、前記スペーサー配列が、消化され、それにより前記ＴｒｋＢ受容体および前記アゴニストを別個の分子として生成するように構成されたペプチドスペーサーをコードする、請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項７】
前記スペーサー配列が、ウイルスペプチドスペーサー配列、より好ましくはウイルス２Ａペプチドスペーサー配列を含み、それをコードする、請求項６に記載の遺伝子構築物。
【請求項８】
前記ペプチドスペーサー配列が、実質的に配列番号４に表されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項６または７のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項９】
前記スペーサー配列が、実質的に配列番号５に表されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１０】
前記ペプチドスペーサー配列が、実質的に配列番号６に表されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項９に記載の遺伝子構築物。
【請求項１１】
前記スペーサー配列が、実質的に配列番号７に表されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１２】
前記ペプチドスペーサー配列が、実質的に配列番号８に表されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１１に記載の遺伝子構築物。
【請求項１３】
前記第一のコード配列が、ＴｒｋＢのヒトカノニカルアイソフォームをコードするヌクレオチド配列を含み、場合によりＴｒｋＢの前記カノニカルアイソフォームが、実質的に配列番号９に表されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項１４】
前記第一のコード配列が、実質的に配列番号１０に表されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１３に記載の遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記第一のコード配列が、ＴｒｋＢのアイソフォーム４をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項１７】
ＴｒｋＢの前記アイソフォーム４が、実質的に配列番号１１に表されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１６に記載の遺伝子構築物。
【請求項１８】
前記第一のコード配列が、実質的に配列番号１２に表されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１６または１７のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項１９】
前記第一のコード配列が、ＴｒｋＢ受容体の突然変異体形態をコードするヌクレオチド配列を含み、配列番号９の５１６位、７０１位、７０５位、７０６位および／または８１６位の１つまたは複数のチロシン残基が、修飾または突然変異されている、請求項１〜１８のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項２０】
配列番号９の５１６位、７０１位、７０５位、７０６位および／または８１６位の少なくとも２つ、３つまたは４つのチロシン残基が、修飾されている、請求項１９に記載の遺伝子構築物。
【請求項２１】
配列番号９の５１６位、７０１位、７０５位、７０６位および／または８１６位の５つのチロシン残基全てが、修飾されている、請求項２０に記載の遺伝子構築物。
【請求項２２】
前記チロシン残基または各チロシン残基が、グルタミン酸に修飾されている、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項２３】
前記ＴｒｋＢ受容体の修飾形態が、実質的に配列番号１３に表されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項２４】
前記第一のコード配列が、実質的に配列番号１４に表されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２３に記載の遺伝子構築物。
【請求項２５】
前記第二のコード配列が、栄養因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーである、前記ＴｒｋＢ受容体のアゴニストをコードし、場合により前記アゴニストが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；神経成長因子（ＮＧＦ）；ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）；ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）；およびニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）；またはそれらの断片からなるアゴニストの群から選択される、請求項１〜２４のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項２６】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号４９もしくは５５に表されるアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくは変異体を含むニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）をコードし、そして／あるいは前記第二のコード配列が、実質的に配列番号５０もしくは５６に表されるヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくは変異体を含む、請求項２５に記載の遺伝子構築物。
【請求項２７】
前記ＴｒｋＢ受容体の前記アゴニストが、プレプロ脳由来神経栄養因子（プレプロＢＤＮＦ）、プロＢＤＮＦまたは成熟型ＢＤＮＦ（ｍＢＤＮＦ）である、請求項１〜２６のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項２８】
前記プロＢＤＮＦが、カノニカルなプロＢＤＮＦであり、場合により前記カノニカルなプロＢＤＮＦが、実質的に配列番号１５に表されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含むか、あるいは前記第二のコード配列が、実質的に配列番号１６に表されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２４に記載の遺伝子構築物。
【請求項２９】
前記プロＢＤＮＦが、プロＢＤＮＦのアイソフォーム２であり、場合により前記プロＢＤＮＦのアイソフォーム２が、本明細書で配列番号１７として参照されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２７に記載の遺伝子構築物。
【請求項３０】
前記第二のコード配列が、成熟型ＢＤＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載の遺伝子構築物。
【請求項３１】
前記成熟型ＢＤＮＦが、実質的に配列番号１８に表されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項３０に記載の遺伝子構築物。
【請求項３２】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号１９に表されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項３１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３３】
前記第二のコード配列が、前記ＴｒｋＢ受容体の前記アゴニストのためのシグナルペプチド、最も好ましくはＢＤＮＦのためのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３２のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項３４】
前記ヌクレオチド配列が、ＢＤＮＦのためのカノニカルなシグナルペプチドをコードする、請求項３３に記載の遺伝子構築物。
【請求項３５】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号２０に表されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含むシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の遺伝子構築物。
【請求項３６】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号２１に表されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項３６に記載の遺伝子構築物。
【請求項３７】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号２３、２５、２７もしくは２９のいずれか１つに表されるシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、または前記シグナルペプチドが、実質的に配列番号２２、２４、２６もしくは２８のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３６のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項３８】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１もしくは１０３のいずれか１つに表されるシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、または前記シグナルペプチドが、実質的に配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００もしくは１０２のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３７のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項３９】
実質的に配列番号１０７もしくは１０８に表されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１〜３８のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか１項に記載の遺伝子構築物を含む組換えベクター。
【請求項４１】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項４０に記載の組換えベクター。
【請求項４２】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０またはＡＡＶ−１１である、請求項４１に記載の組換えベクター。
【請求項４３】
前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ血清型−２である、請求項４２に記載の組換えベクター。
【請求項４４】
薬剤としての使用または治療における使用のための、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の遺伝子構築物、または請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項４５】
視神経障害もしくは蝸牛障害を処置、予防もしくは改良することにおける使用のため、または神経再生および／もしくは生存を促進するための、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の遺伝子構築物、または請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項４６】
処置される前記視神経障害が、頭部もしくは顔面への外傷、または血管損傷など、ＲＧＣの損失をもたらす任意の病理生理学的状態、例えば視神経からの入力情報を受け取る目の構造または脳の領域への血液供給の部分的または完全な喪失であるか、あるいは形質転換されていない、または形質転換されている幹細胞を患者の目または視力に関連する領域に導入することによりＲＧＣの置換を支援するのに用いられる、請求項４５に記載の使用のための構築物またはベクター。
【請求項４７】
処置される前記視神経障害が、緑内障である、請求項４６に記載の使用のための構築物またはベクター。
【請求項４８】
処置される前記蝸牛障害が、難聴または聴覚消失である、請求項４５に記載の使用のための構築物またはベクター。
【請求項４９】
請求項１〜３９のいずれか１項に記載の遺伝子構築物、または請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の組換えベクターと、医薬的に許容し得るビヒクルとを含む医薬組成物。
【請求項５０】
請求項１〜３９のいずれか１項に記載の遺伝子構築物、または請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の組換えベクターを、医薬的に許容し得るビヒクルと接触させることを含む、請求項４９に記載の医薬組成物を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子構築物およびそのような構築物を含む組換えベクター、ならびに緑内障および聴覚消失をはじめとする一定範囲の障害を処置するための、または神経再生および／もしくは生存を促進するための遺伝子療法における該構築物およびベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は、進行性の視神経変性、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅および軸索損失を特徴とし、視神経乳頭の陥凹および視力喪失をもたらす、目の障害群を定義するために用いられる用語である。緑内障は、世界中の盲目の主因であり［１］、緑内障の発症率は、年齢と共に劇的に増加する。４０歳以上の英国のおよそ５０万人および北アメリカの２２０万人より多くが、緑内障を有する。その上、米国では、１時間に数名が、この視力を脅かす疾患によって盲目になっている［２］。高齢者人口が急速に増加し続けているため、緑内障は差し迫った社会的および医学的問題になった。眼内圧（ＩＯＰ）の上昇は、年齢を除く、緑内障の最も重要な危険因子であり［３］、現在公認の処置は全て、ＩＯＰ低下により作用する［４〜５］。
【０００３】
緑内障は、視野測定により、そして「カッピング」を検出する視神経の眼底検査により、視力喪失前に診断され得る。現行の緑内障管理は、局所適用される薬物を利用してさらなる視神経傷害を予防するために、ＩＯＰを１０〜２１ｍｍＨｇの間の正常レベルまで低下させることに基づく［６］。正常な成人の平均ＩＯＰは、１５〜１６ｍｍＨｇである。現在、ＩＯＰを低下させるのに用いられる薬剤には５つの主要な分類：β−アドレナリン作動性アンタゴニスト、アドレナリン作動性アゴニスト、副交感神経刺激薬、プロスタグランジン様類似体、および炭酸脱水酵素阻害剤、が存在する［７］。これらの薬物は、正しく用いられればＩＯＰを低下させるのに比較的効果があるが、一部の患者では重度の副作用を引き起こし、それにより患者の生活の質に悪影響を及ぼす可能性がある。加えて、ＩＯＰを低下させる点眼薬処置へのアドヒアランスは、特に多剤の使用を必要とする高齢患者では、不十分になることが多い。ＩＯＰ低下処置を処方された患者の５０％未満が、実際にそれを指示通り規則的に使用しており、根底にある病気のコントロールに明確な影響を及ぼしていると推定されている。ＩＯＰのさらなる低下が必要とされる場合、または薬剤でＩＯＰの十分な低下ができない場合、レーザー線維柱帯形成術が利用される場合があるが、この処置は、多くの患者で適切なＩＯＰ低下を実現できない。ＩＯＰが、依然として適切にコントロールされない場合、緑内障の切開術が必要となる場合がある。しかしＩＯＰ低下処置は、多くの患者で増悪を予防することができず、緑内障は、今も世界中で不可逆的失明の主因である。緑内障性ＲＧＣの神経保護および視神経を形成する該ＲＧＣの軸索投射は、それゆえ従来のＩＯＰ低下処置への補助として使用される貴重な治療パラダイムであり、従来の治療に反して増悪した患者では特に重要である［８］。
【０００４】
緑内障性視神経症は、特有の病理生理学的変化と、それに続くＲＧＣおよびその軸索の死滅から生じると考えられる。ＲＧＣ死滅のプロセスは、二相性、即ち傷害開始を担う一次的損傷と、その後の、変性した細胞を取り囲む不適切な環境に起因し得るより緩やかな二次的変性であると思われる［９］。
【０００５】
緑内障の実験動物モデルおよびヒトの緑内障におけるＲＧＣ死滅のメカニズムは、アポトーシスを含むことが示されている［１０］。アポトーシスを惹起する分子メカニズムは、同定されていないが、神経栄養因子の欠乏、虚血、グルタミン酸塩の慢性的増加および無秩序な一酸化窒素代謝が、可能性のあるメカニズムであると疑われている［１１］。
【０００６】
神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、およびニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）と共に脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、栄養因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーである［１２〜１３］。ニューロトロフィンは、ＲＧＣをはじめとする、末梢および中枢神経系の両方での広範囲の神経細胞の発達、生存および機能において肝要な役割を担う。ニューロトロフィンは、２つの細胞表面受容体：低親和性のｐ７５NTR受容体および高親和性のチロシン受容体キナーゼ（Ｔｒｋ）ファミリーと相互作用する［１２〜１３］。神経成長因子（ＮＧＦ）は、主にＴｒｋＡに結合し、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）は、トロポミオシン（tropmyosin）受容体キナーゼ−Ｂ（ＴｒｋＢ）に結合し、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）は、ＴｒｋＣに（そしてより少ない度合いでＴｒｋＡに）結合する［１２〜１３］。
【０００７】
ニューロトロフィンのうち、ＢＤＮＦは、損傷されたＲＧＣにとって最も強力な生存因子である［１４〜２１］。ＢＤＮＦは、脳で産生されて、視神経を通した逆行性軸索輸送により網膜に輸送され、そこでＲＧＣを支援し、それらの生存を維持するタンパク質分子である［１５〜２１］。Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩などのグルタミン酸受容体アゴニストでの興奮毒性損傷時など特定の条件では、ＢＤＮＦも、比較的低レベルではあるがＲＧＣ内で産生され得る［２２〜２３］。ＢＤＮＦは通常、短いシグナルペプチド配列を含むプレプロポリペプチド（即ち、プレプロＢＤＮＦ）として産生され、細胞外空間への放出のために小胞への該ポリペプチド全体の運搬を促進する。シグナルペプチドの開裂および除去は、プレプロＢＤＮＦをプロＢＤＮＦに変換する。Ｎ−末端プロＢＤＮＦ配列はその後、細胞内で開裂されるか、または細胞外で成熟型ＢＤＮＦ（ｍＢＤＮＦ）を生み出す［２４］。プロＢＤＮＦおよびｍＢＤＮＦは両者とも、生物活性を有し、プロＢＤＮＦは優先的にｐ７５NTR受容体を活性化し、より短いｍＢＤＮＦは、ＴｒｋＢ受容体を活性化する［２５〜２７］。網膜におけるｐ７５NTRおよびＴｒｋＢ受容体の活性化は、ＲＧＣの生存に対して反対の影響を示し、前者は、直接的なＲＧＣ細胞体−ｐ７５NTR活性化（RGC-cell-body-p75NTR-activation）［２５〜２８］を通して、または間接的にミュラー細胞でのｐ７５NTR活性化を介して、アポトーシスを担い、それにより腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の放出を刺激して、ＲＧＣ損失をさらに促進する［２９］。
【０００８】
緑内障の動物モデルで、神経挫滅またはＩＯＰ上昇の後、神経栄養性ｍＢＤＮＦ／ＴｒｋＢシグナル伝達からプロＢＤＮＦ／ｐ７５NTR経路に向かうシフトが存在することが実証されている。網膜におけるｍＢＤＮＦおよびＴｒｋＢ受容体のレベル低下が、プロＢＤＮＦ［２８］およびｐ７５NTR受容体［３２］の相対レベルにおける相反する上昇と共に実証されている［２７、３０〜３１］。実験的にＩＯＰを上昇させたラットへの組換えタンパク質の眼内注射によるｍＢＤＮＦの補充は、未処置の目に比較してＲＧＣ生存を増大させ、それによりこのニューロトロフィンの重要な神経保護的役割が確認された［１９〜２１］。
【０００９】
ｍＢＤＮＦは、眼の中で急速に変性するため、緑内障の目においてｍＢＤＮＦレベルを維持するためには、ｍＢＤＮＦの定期的注射が必要となろう。ｍＢＤＮＦの規則的な眼内注射の必要性を克服するために、網膜への、ＢＤＮＦをコードするトランスジーンの組換えアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター送達を利用して、緑内障動物モデルにおけるＲＧＣ死滅を遅延または予防するための、一定して高いＢＤＮＦを提供する試みが行われた［１８、３３〜３４］。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖ＤＮＡゲノムからなる。それらは、低い毒性を示し、複数の臨床試験で遺伝子療法でのウイルスベクターとして用いることに成功した。組換えｍＢＤＮＦ単独の硝子体内注射、または遺伝子療法を介した局所ＢＤＮＦ産生の増加は、ＩＯＰ上昇または他の視神経傷害後に短期間にわたりＲＧＣ損失を予防するのに効果的であることが示されたが、ＢＤＮＦの有益効果は、一過性であることが示された［１８］。しかし内因性ＢＤＮＦ遺伝子配列を組み込んだ遺伝子療法もまた、プロＢＤＮＦと、予定されたｍＢＤＮＦを産生および放出することが可能である。
【００１０】
アゴニスト性を有する抗体を利用して、ＲＧＣ内の受容体の発現増加により、または残留する細胞外ＴｒｋＢ受容体の一定した刺激により、ＴｒｋＢシグナル伝達の損失を減弱または予防することを目標とした遺伝子療法でも、ＲＧＣ損失予防の成功が実証された［３５〜３６］。しかし、ｍＢＤＮＦ／ＴｒｋＢ経路を通した栄養性シグナル伝達の減少は、ｍＢＤＮＦ活性化ＴｒｋＢ受容体の内在化、および細胞表面にあるこれらの受容体の、細胞内シグナル伝達が不可能なＴｒｋＢアイソフォームでの置き換えによりさらに複雑になる［３７〜３８］。その上、ｍＢＤＮＦの存在下でＴｒｋＢ受容体二量体の自己リン酸化後のＴｒｋＢ受容体の活性解除を担う生化学系は、ＩＯＰ上昇を受けた網膜で上方制御される［３９］。
【００１１】
さらに緑内障に加えて、ＢＤＮＦ／ＴｒｋＢ軸は、損傷すると有毛細胞を損失して聴覚消失し得［４０〜４２］、神経再生を損失し得る［４３〜４４］内耳の、具体的には蝸牛構造の構成要素の神経保護にも関連づけられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それゆえ、緑内障および聴覚消失の処置のため、そして神経再生または生存の促進のための改善された遺伝子療法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、単一プロモーターの制御下でチロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）およびＴｒｋＢ受容体アゴニストをコードする新規な遺伝子構築物を構築した。該構築物のプロモーターは、該アゴニストおよび該受容体が確実に網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、蝸牛または神経細胞のみで発現され、これらの細胞の生存を促進するように用いることができる。
【００１４】
したがって本発明の第一の態様によれば、チロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）をコードする第一のコード配列と、該ＴｒｋＢ受容体のアゴニストをコードする第二のコード配列とに動作可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子構築物が提供される。
【００１５】
本発明者らは、１つの遺伝子構築物内でＴｒｋＢ受容体およびそのアゴニストの両方をコードする遺伝子を組み合わせることが可能であることを、実施例で実証した。これは、大きなサイズであれば特に困難であり、生理学的に有用な濃度でそれらを共発現し得ると予測することはできなかった。有利には本発明の構築物は、先行技術で記載された通り、組換えタンパク質を注射する必要がない。さらに、先行技術では、タンパク質の定期的注射を実施する必要があるが、本発明の構築物は、単回の遺伝子療法用注射のみが必要となる。
【００１６】
好ましくは、使用の際に、ＴｒｋＢ受容体は、アゴニストにより活性化され、それにより網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、神経細胞または蝸牛細胞の生存を促進する。それゆえ有利には本発明の構築物は、これらの細胞におけるＴｒｋＢシグナル伝達を維持または増進するために、ＲＧＣ、神経細胞または蝸牛細胞を標的とするように用いることができる。したがって該構築物を用いて、緑内障および聴覚消失の病理生理学的ストレッサーからの防御を最大にすること、ならびに神経再生および／または生存を促進することができる。さらに該構築物を用いて、１種または複数のプロモーターの制御下でＴｒｋＢ受容体および該受容体のアゴニストの発現により、緑内障または聴覚消失の長期処置を提供することができる。結論として、該構築物は、併用したとしても一過性の治療効果を提供する、複数の代替的処置を利用する必要性を克服した。さらに本発明の構築物は、ＴｒｋＢ受容体および該受容体のアゴニストの両方の局在的増加により、ＴｒｋＢ受容体アゴニストへのＲＧＣまたは蝸牛細胞感受性を有意に増大するのに用いられ得るため、有利である。
【００１７】
好ましくは本発明の遺伝子構築物は、発現カセットを含み、その一実施形態が図１に示される。図１で認められる通り、該構築物は、該プロモーターと、ＴｒｋＢをコードする第一のヌクレオチド配列と、成熟型脳由来神経栄養素（ｍＢＤＮＦ）をコードしてＴｒｋＢ受容体の好ましいアゴニストとして働く第二のヌクレオチド配列と、を含む。しかし、本明細書で議論される通り、他のアゴニストが用いられ得ることは認識されよう。同じく図１に示される通り、該発現カセットはまた、２Ａスペーサー配列と、肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＨＰＥ）をコードする配列と、ポリＡテールをコードする配列と、左および右側の逆位末端配列（ＩＴＲｓ）と、を含む。
【００１８】
つまり好ましくは該遺伝子構築物は、第一のコード配列と第二のコード配列の間に配置されたスペーサー配列を含み、該スペーサー配列は、消化または切断され、それにより該ＴｒｋＢ受容体および該アゴニストを別個の分子として生成するように構成されたペプチドスペーサーをコードする。図１に示された実施形態において、ＴｒｋＢ受容体のコード配列が、受容体アゴニスト（ＢＤＮＦ）のコード配列の５’側に配置され、それらの間にスペーサー配列を有する。しかし別の実施形態において、該受容体アゴニストのコード配列が、該受容体のコード配列の５’側に配置され、それらの間にスペーサー配列を有し得る。
【００１９】
好ましくは、該遺伝子構築物は、２つのトランスジーン、即ちＴｒｋＢ受容体およびそのアゴニスト、好ましくはＢＤＮＦの発現を増大するウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＨＰＥ）をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは該ＷＨＰＥコード配列は、該トランスジーンコード配列の３’側に配置される。
【００２０】
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＨＰＥ）の一実施形態は、ガンマ−アルファ−ベータエレメントを含み５９２ｂｐ長であり、本明細書では以下の配列番号５７として参照される：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG
［配列番号５７］
【００２１】
好ましくは該ＷＨＰＥは、実質的に配列番号５７に表される核酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００２２】
しかし好ましい実施形態において、ベータエレメントの欠失により２４７ｂｐ長になった、本明細書では以下の配列番号５８として参照されるトランケート型ＷＨＰＥが用いられる：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGT
［配列番号５８］
【００２３】
有利には、該構築物内で用いられる該トランケート型ＷＨＰＥ配列は、トランスジーン発現に負の影響を及ぼさずに全体として約３００ｂｐを保持した。好ましくは該ＷＨＰＥは、実質的に配列番号５８に表される核酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００２４】
好ましくは該遺伝子構築物は、ポリＡテールをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは該ポリＡテールのコード配列は、該トランスジーンコード配列の３’側、好ましくは該ＷＨＰＥコード配列の３’側に配置される。
【００２５】
好ましくは該ポリＡテールは、シミアンウイルス４０ポリＡの２２４ｂｐ配列を含む。該ポリＡテールの一実施形態は、本明細書では以下の配列番号５９として参照される：
AGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTA
［配列番号５９］
【００２６】
好ましくは該ポリＡテールは、実質的に配列番号５９に表される核酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００２７】
好ましくは該遺伝子構築物は、左および／または右の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。好ましくは各ＩＴＲは、該構築物の５’および／または３’末端に配置される。
【００２８】
第一の態様の該遺伝子構築物内のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを誘導し、第一および第二のコード配列に結合してそれらを転写することが可能な任意のヌクレオチド配列であり得る。１つの好ましい実施形態において、該プロモーターは、ヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ Ｉ）プロモーターである。該ヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ Ｉ）プロモーターをコードする４６９ヌクレオチド配列の一実施形態は、本明細書では以下の配列番号１として参照される：
CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG 
［配列番号１］
【００２９】
それゆえ、好ましくは該プロモーターは、実質的に配列番号１に表されるヌクレオチド酸（nucleotide acid）配列、またはその断片もしくは変異体を含み得る。
【００３０】
別の実施形態において、該プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。該ＣＡＧプロモーターは、好ましくはサイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメントと、ニワトリベータアクチン遺伝子の第一のエキソンおよび第一のイントロンと、ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターと、を含み、それによりＲＧＣおよび蝸牛細胞のみでの組織特異性発現を容易にする。ＣＡＧプロモーターをコードする１７３３ヌクレオチド配列の一実施形態は、本明細書では以下の配列番号２として参照される：
CTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTG 
［配列番号２］
【００３１】
別の好ましい実施形態において、該プロモーターは、本明細書では以下の配列番号３として参照されるプロモーターの６６４のヌクレオチド形態など、ＣＡＧプロモーターのトランケート型の形態である：
CTAGATCTGAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
［配列番号３］
【００３２】
さらに別の好ましい実施形態において、該プロモーターは、本明細書では以下の配列番号４８として参照されるプロモーターの５８４のヌクレオチド形態など、ＣＡＧプロモーターのトランケート型の形態である：
GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
［配列番号４８］
【００３３】
それゆえ好ましくは該プロモーターは、実質的に配列番号２、３もしくは４８に表されるヌクレオチド酸（nucleotide acid）配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００３４】
科学文献で示される多くのバイシストロン性遺伝子構築物は、（ｉ）２つの遺伝子の発現を別個に駆動する二重プロモーターを組み込むか、または（ｉｉ）脳心筋炎ウイルス（encepahlomyocarditis virus）（ＥＭＣＶ）の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、組換えウイルスベクター内の単一プロモーターから転写された２つの遺伝子を連結させている［４５〜４６］。しかし、ＩＲＥＳ依存性翻訳の効率は、異なる細胞および組織において変動する場合があり、ＩＲＥＳ依存性の第二の遺伝子発現は、バイシストロン性ベクター内のキャップ依存性の第一の遺伝子発現よりも有意に低くなり得る［４７］。その上、ｒＡＡＶベクターのサイズ制限（一般には５ｋｂ未満）により、二重プロモーターまたはＩＲＥＳリンカーを用いてＴｒｋＢ受容体などの大きな遺伝子構築物をＢＤＮＦと共に組み込むことが防止される。
【００３５】
したがって好ましい実施形態において、該遺伝子構築物は、第一のコード配列と第二のコード配列の間に配置されたスペーサー配列を含み、該スペーサー配列は、消化され、それにより該ＴｒｋＢ受容体および該アゴニストを別個の分子として生成するように構成されたペプチドスペーサーをコードする。好ましくは該スペーサー配列は、ウイルスペプチドスペーサー配列、より好ましくはウイルス２Ａペプチドスペーサー配列を含み、それをコードする［４７］。好ましくは該２Ａペプチド配列は、第一のコード配列を第二のコード配列に結合させる。これにより、該構築物が様々なベクター内での発現で生じるサイズ制限を克服することができ、単一プロモーターの制御下で単一タンパク質として存在する第一の態様の構築物によりコードされたペプチドの全ての発現を可能にする。
【００３６】
したがってＴｒｋＢ、該２Ａペプチドおよび該アゴニスト（好ましくはＢＤＮＦ）の配列を含む単一タンパク質の翻訳に続いて、開裂が、末端グリシン−プロリンリンクのウイルス２Ａペプチド配列内で起こり、それにより２つのタンパク質、即ちＴｒｋＢおよび該アゴニスト（即ち、ｍＢＤＮＦ）を遊離させる。ウイルス２Ａペプチドの残りの短いＮ−末端アミノ酸配列がＴｒｋＢ受容体の細胞内部分に付着したままで、それにより免疫原性リスクが排除されて成熟型受容体の細胞内シグナル伝達能力を妨害しないように、該遺伝子構築物が設計される。Ｃ−末端ウイルス２Ａ配列からの残留するプロリンアミノ酸は、Ｎ−末端ＢＤＮＦシグナルペプチドに付着されたままであり、成熟型タンパク質からのシグナル配列の開裂後に最終的にｍＢＤＮＦタンパク質から除去される。
【００３７】
本発明者らは、スペーサー配列の２つの実施形態を作製した。本明細書に記載された両方の実施形態に共通するペプチドスペーサー配列の１つの重要区分は、Ｃ−末端である。したがって好ましくは、該ペプチドスペーサー配列は、本明細書では以下の配列番号４として参照されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
QAGDVEENPGP
［配列番号４］
【００３８】
好ましくは該ペプチドスペーサー配列の消化または切断部位は、配列番号４の末端グリシンと最後のプロリンの間に配置される。
【００３９】
第一の好ましい実施形態において、該スペーサー配列は、本明細書では以下の配列番号５として参照されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
［配列番号５］
【００４０】
この第一の実施形態において、該ペプチドスペーサー配列は、本明細書では以下の配列番号６として参照されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
GSGATNFSLLQAGDVEENPGP
［配列番号６］
【００４１】
第二の好ましい実施形態において、該スペーサー配列は、本明細書では以下の配列番号７として参照されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
AGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
［配列番号７］
【００４２】
この第二の実施形態において、該ペプチドスペーサー配列は、本明細書では以下の配列番号８として参照されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
SGATNFSLLKQAGDVEENPGP
［配列番号８］
【００４３】
本発明者らは、ＴｒｋＢ受容体の配列を注意深く考慮し、第一の態様の遺伝子構築物内の第一のコード配列によってコードされた受容体の複数の好ましい実施形態を作製した。
【００４４】
１つの好ましい実施形態において、該第一のコード配列は、ＴｒｋＢのヒトカノニカルアイソフォームをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくはＴｒｋＢの該カノニカルアイソフォームは、本明細書では以下に表される配列番号９として参照されるアミノ酸配列（８２２残基）、またはその断片もしくは変異体を含む：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
［配列番号９］
【００４５】
好ましくはこの実施形態において、第一のコード配列は、本明細書では以下に表される配列番号１０として参照されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC
［配列番号１０］
【００４６】
別の好ましい実施形態において、該第一のコード配列は、ＴｒｋＢのアイソフォーム４をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくはＴｒｋＢのアイソフォーム４は、本明細書では以下に表される配列番号１１として参照されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKDFSWFGFGKVKSRQGVGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
［配列番号１１］
【００４７】
好ましくは、第一のコード配列のこの実施形態は、本明細書では以下に表される配列番号１２として参照されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGATTTCTCATGGTTTGGATTTGGGAAAGTAAAATCAAGACAAGGTGTTGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC
［配列番号１２］
【００４８】
本発明者らは、ＴｒｋＢ受容体の配列を研究することに相当な発明努力を注ぎ、ＴｒｋＢが通常はＢＤＮＦ二量体の存在下での二量体化および自己リン酸化の後にリン酸化される５つのチロシン残基（配列番号９の５１６位、７０１位、７０５位、７０６位および８１６位）を含むことを理解した。これらの５つのチロシン残基のリン酸化にまつわる問題は、該受容体がＳｈｐ−２ホスファターゼなどのホスファターゼによって即座に活性解除され得る、ということである。したがって、インビボでの受容体のリン酸化と、結果的な活性解除を予防するために、好ましくはこれらの重要なチロシンの１つまたは複数は、生じるホスホチロシンを模倣し、ＢＤＮＦの存在下で活性のままでＳｈｐ−２ホスファターゼなどのホスファターゼ（phosphatise）によって活性解除され得ない受容体を生成するように、突然変異される（より好ましくはグルタミン酸に）。ＴｒｋＢのそのような突然変異形態は、より長期間、または該受容体が内在化されるまで活性のままとなるＴｒｋＢ受容体活性を生成することを目指している。
【００４９】
以下に提供されるＤＮＡおよびアミノ酸配列は、５つのグルタミン酸（Ｅ）残基に突然変異されているこれらの５つのチロシン（Ｙ）残基の位置を示している。これらの残基の１、２、３、４または５個が本発明の実施形態でグルタミン酸に突然変異され得ることは、認識されよう。これらの突然変異の様々な組み合わせ、例えば５１６位および７０１位のみ、または７０５位、７０６位および８１６位のみなども、想定される。
【００５０】
したがって別の好ましい実施形態において、第一のコード配列は、配列番号９の５１６位、７０１位、７０５位、７０６位および／または８１６位の１つまたは複数のチロシン残基が修飾または突然変異された、ＴｒｋＢ受容体の突然変異形態をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは配列番号９の５１６位、７０１位、７０５位、７０６位および／または８１６位の少なくとも２つ、３つまたは４つのチロシン残基は、修飾されている。最も好ましくは配列番号９の５１６位、７０１位、７０５位、７０６位および／または８１６位の５つのチロシン残基全てが、修飾されている。
【００５１】
好ましくは該チロシン残基または各チロシン残基は、異なるアミノ酸残基に、より好ましくはグルタミン酸に修飾されている。したがって好ましくはＴｒｋＢ受容体の突然変異形態は、Ｙ５１６Ｅ、Ｙ７０１Ｅ、Ｙ７０５Ｅ、Ｙ７０６Ｅおよび／またはＹ８１６Ｅを含む。
【００５２】
好ましくはＴｒｋＢ受容体の修飾形態は、本明細書では以下に表される配列番号１３として参照されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQEFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVESTDEERVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVELDILG
［配列番号１３］
【００５３】
好ましくはこの実施形態において、第一のコード配列は、本明細書では以下に表される配列番号１４として参照されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGGAATTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGGAAAGCACTGACGAAGAAAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCGAACTGGACATTCTAGGC
［配列番号１４］
【００５４】
第二のコード配列が、好ましくは栄養因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーである、ＴｒｋＢ受容体のアゴニストをコードすることは、認識されよう。それゆえＴｒｋＢ受容体の好ましいアゴニストは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；神経成長因子（ＮＧＦ）；ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）；ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）；およびニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）；またはそれらの断片からなるアゴニストの群から選択され得る。
【００５５】
これらのアゴニストそれぞれのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当業者に公知であろう。しかし例として、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）の一実施形態のアミノ酸配列は、実質的には以下の配列番号４９に表される：
MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIESQPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRRGVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA
［配列番号４９］
【００５６】
ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）のこの実施形態の核酸コード配列は、実質的に以下の配列番号５０に表される：
ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGTCCCAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGCAGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGTGGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC
［配列番号５０］
【００５７】
ＮＴ−４配列のためのシグナルペプチドのアミノ酸配列は、実質的に以下の配列番号５１に表される：
MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIES
［配列番号５１］
【００５８】
このシグナルペプチドの核酸配列は、実質的に以下の配列番号５２に表される：
ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGTCC
［配列番号５２］
【００５９】
このＮＴ−４配列のためのプロペプチドのアミノ酸配列は、実質的に以下の配列番号５３に表される：
QPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRR
［配列番号５３］
【００６０】
このプロペプチドの核酸配列は、実質的に以下の配列番号５４に表される：
CAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGCAGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGT
［配列番号５４］
【００６１】
このＮＴ−４配列のための成熟型タンパク質配列のアミノ酸配列は、実質的に以下の配列番号５５に表される：
GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA
［配列番号５５］
【００６２】
この成熟型ＮＴ−４タンパク質の核酸コード配列は、実質的に以下の配列番号５６に表される：
GGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC
［配列番号５６］
【００６３】
したがって１つの好ましい実施形態において、第二のコード配列は、実質的に配列番号４９もしくは５５に表されるアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくは変異体を含み得るニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）をコードする。したがって第二のコード配列は、実質的に配列番号５０もしくは５６に表されるヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくは変異体を含み得る。
【００６４】
しかしＴｒｋＢ受容体の最も好ましいアゴニストとしては、プレプロ脳由来神経栄養因子（プレプロＢＤＮＦ）、プロＢＤＮＦまたは成熟型ＢＤＮＦ（ｍＢＤＮＦ）が挙げられる。ＢＤＮＦは最初、小胞体上で見出されるリボソームにより、前駆体タンパク質のプレプロＢＤＮＦとして合成される。ヒトプレプロＢＤＮＦ遺伝子（ＥＮＳＧ０００００１７６６９７）によってコードされた少なくとも１７の公知スプライスバリアントが存在する。プレプロＢＤＮＦは、粗面小胞体内に進入すると、プレプロＢＤＮＦが、シグナルペプチド（即ち、「プレ」配列）の開裂によってプロＢＤＮＦに変換される。プロＢＤＮＦは、プロＢＤＮＦ上に存在するさらなるＮ−末端ペプチド配列の開裂によってｍＢＤＮＦに変換される。その後、プロＢＤＮＦおよびｍＢＤＮＦの両方が、細胞外空間に分泌され、そこでＲＧＣおよび蝸牛細胞をはじめとする様々な細胞上の受容体に結合し、それらを活性化する。
【００６５】
プロＢＤＮＦは、活性化されるとＲＧＣおよび蝸牛細胞のアポトーシスを誘導する受容体ｐ７５NTRに優先的に結合し、それを活性化する。したがって１つの好ましい実施形態において、プロＢＤＮＦは、ｐ７５NTR受容体のアゴニストである。一実施形態において、該プロＢＤＮＦは、カノニカルなプロＢＤＮＦである。好ましくはカノニカルなプロＢＤＮＦは、本明細書では以下に表される配列番号１５として参照されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
［配列番号１５］
【００６６】
好ましくはこの実施形態において、第二のコード配列は、本明細書では以下に表される配列番号１６として参照されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
GCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
［配列番号１６］
【００６７】
別の実施形態において、該プロＢＤＮＦは、好ましくはバリンからメチオニンへの突然変異（下線のアミノ酸）を含む、プロＢＤＮＦのアイソフォーム２である。好ましくはプロＢＤＮＦのアイソフォーム２は、本明細書では以下に表される配列番号１７として参照されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHMIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
［配列番号１７］
【００６８】
しかし一実施形態において、該アゴニストは、プロＢＤＮＦまたはその断片もしくは変異体ではなく、代わりに第二のコード配列は、好ましくは成熟型ＢＤＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む。成熟型ＢＤＮＦ（ｍＢＤＮＦ）は、活性化されるとＲＧＣおよび／または蝸牛細胞の生存を促進するＴｒｋＢに優先的に結合し、それを活性化する。したがって成熟型ＢＤＮＦは、ＴｒｋＢの最も好ましいアゴニストである。第一の態様による構築物は、他の公知遺伝子構築物とは異なり、ミスフォールディングされていない成熟型ＢＤＮＦタンパク質を生成することが可能であるため、有利である。
【００６９】
したがって１つの好ましい実施形態において、第二のコード配列は、成熟型ＢＤＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む。ｍＢＤＮＦは、該遺伝子によってコードされた１７のアイソフォーム全てに共通する。７つのタンパク質の異なる配列が存在し、そのうち５つは、カノニカル形態に伸長されたシグナル配列を有し、１つは、カノニカルなシグナル配列を有するが、バリンからメチオニンへの突然変異を有する（アイソフォーム２、４、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１６に共通する）。バリンからメチオニンへの突然変異は、細胞からのＢＤＮＦ放出を減少させると考えられる。
【００７０】
好ましくは成熟型ＢＤＮＦは、本明細書では以下に表される配列番号１８として参照されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
［配列番号１８］
【００７１】
好ましくは第二のコード配列のこの実施形態は、本明細書では以下に表される配列番号１９として参照されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
［配列番号１９］
【００７２】
さらに別の好ましい実施形態において、該アゴニストは、Ｎ−末端にコンジュゲートされたシグナルペプチドを有するｍＢＤＮＦである。以下に議論される通り、該シグナルペプチドは、プレプロＢＤＮＦのカノニカルなシグナルペプチド、またはＩＬ−２のシグナルペプチド、または本発明者らによって作出された新規なシグナル配列であり得る。
【００７３】
好ましくは第二のコード配列は、ＴｒｋＢ受容体のアゴニストのためのシグナルペプチド、最も好ましくはＢＤＮＦのためのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの好ましい実施形態において、該ヌクレオチド配列は、ＢＤＮＦのためのカノニカルなシグナルペプチドをコードする。好ましくは第二のコード配列のこの実施形態は、本明細書では以下に表される配列番号２０として参照されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含むシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む：
MTILFLTMVISYFGCMKA
［配列番号２０］
【００７４】
好ましくは第二のコード配列のこの実施形態は、本明細書では以下に表される配列番号２１として参照されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
［配列番号２１］
【００７５】
本発明者らは、一連の伸長したシグナルペプチドを作出した。好ましい実施形態において、ＢＤＮＦのためのアイソフォームシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、アイソフォーム２、３、６、５および４からなる群から選択される。これらの伸長されたシグナルペプチドそれぞれの核酸およびアミノ酸配列は、以下の通り表される。
【００７６】
アイソフォーム２
MFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
［配列番号２２］
ATGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
［配列番号２３］
【００７７】
アイソフォーム３および６
MQSREEEWFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
［配列番号２４］
ATGCAGAGCCGGGAAGAGGAATGGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTT ACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
［配列番号２５］
【００７８】
アイソフォーム５
MLCAISLCARVRKLRSAGRCGKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
［配列番号２６］
ATGCTCTGTGCGATTTCATTGTGTGCTCGCGTTCGCAAGCTCCGTAGTGCAGGAAGGTGCGGGAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
［配列番号２７］
【００７９】
アイソフォーム４
MCGATSFLHECTRLILVTTQNAEFLQKGLQVHTCFGVYPHASVWHDCASQKKGCAVYLHVSVEFNKLIPENGFIKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
［配列番号２８］
ATGTGTGGAGCCACCAGTTTTCTCCATGAGTGCACAAGGTTAATCCTTGTTACTACTCAGAATGCTGAGTTTCTACAGAAAGGGTTGCAGGTCCACACATGTTTTGGCGTCTACCCACACGCTTCTGTATGGCATGACTGTGCATCCCAGAAGAAGGGCTGTGCTGTGTACCTCCACGTTTCAGTGGAATTTAACAAACTGATCCCTGAAAATGGTTTCATAAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
［配列番号２９］
【００８０】
したがって好ましい実施形態において、第二のコード配列は、本明細書では配列番号２３、２５、２７または２９のいずれか１つとして参照されるシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは該シグナルペプチドは、本明細書では配列番号２２、２４、２６または２８のいずれか１つとして参照されるアミノ酸配列を含む。
【００８１】
本発明者らはまた、アゴニスト、好ましくはＢＤＮＦのための新規なシグナルペプチドの様々な実施形態を作出した。これらのシグナルペプチドは、Ｎ−末端区分（付加されたリシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）残基を有する）および先行する疎水性領域（ロイシン（Ｌ）残基の付加を有する）の塩基性レベルを上昇させて、野生型カノニカルシグナル配列で観察されたレベルに比較してＢＤＮＦの分泌を増加させる。
【００８２】
ａ）ＱＴＡ００３Ｐ（ＩＬ−２シグナル）
MYRMQLLSCIALSLALVTNS
［配列番号３０］
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT
［配列番号３１］
【００８３】
ｂ）ＱＴＡ００４Ｐ
MKRRVMIILFLTMVISYFGCMK
［配列番号３２］
ATGAAAAGAAGAGTGATGATCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGAGCG
［配列番号３３］
【００８４】
ｃ）ＱＴＡ００９Ｐ（修飾されたＩＬ−２）
MRRMQLLLLIALSLALVTNS
［配列番号３４］
ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT
［配列番号３５］
【００８５】
ｄ）ＱＴＡ０１０Ｐ
MRRMQLLLLTMVISYFGCMKA
［配列番号３６］
ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
［配列番号３７］
【００８６】
ｅ）ＱＴＡ００１２Ｐ
MRILLLTMVISYFGCMKA
［配列番号３８］
ATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
［配列番号３９］
【００８７】
ｆ）ＱＴＡ００１３Ｐ
MRRILFLTMVISYFGCMKA
［配列番号４０］
ATGAGAAGAATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
［配列番号４１］
【００８８】
ｇ）ＱＴＡ００１４Ｐ
MRRFLFLLVISYFGCMKA
［配列番号４２］
ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
［配列番号４３］
【００８９】
ｉ）ＱＴＡ００１５Ｐ
MRRFLFLLYFGCMKA
［配列番号４４］
ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTTACTTCGGTTGCATGAAGGCG
［配列番号４５］
【００９０】
図６は、該アゴニスト、好ましくはＢＤＮＦの分泌を増幅する本発明の構築物において用いられるシグナルペプチドのさらに好ましい実施形態のためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。該シグナルペプチドの第二の残基は、好ましくはリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）などの１つまたは複数の塩基性残基によって置き換えられている、トレオニン（Ｔ）である。イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）およびロイシン（Ｌ）をはじめとするシグナルペプチド内の残基の次の延伸は、好ましくは１つまたは複数の疎水性残基によって置き換えられている。
【００９１】
したがって好ましい実施形態において、第二のコード配列は、本明細書で配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１または１０３のいずれか１つとして参照されるシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは該シグナルペプチドは、本明細書で配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００または１０２のいずれか１つとして参照されるアミノ酸配列を含む。
【００９２】
したがって、本発明者らが、作製された適度なフォールディングのある成熟型ＢＤＮＦの結果と、ＢＤＮＦ生成を有意に増幅してこれまで内在性配列で実現された上記物質を遊離する、完全に新規なシグナルペプチドの導入との組み合わせにより、過去に実現されなかったプロ配列の除去によりＢＤＮＦ遺伝子配列を修飾したことは、認識されよう。
【００９３】
好ましくは該遺伝子構築物は、左および／または右の逆位末端配列（ＩＴＲｓ）を含む。好ましくは各ＩＴＲは、該構築物の５’および／または３’末端に配置される。ＩＴＲは、ウイルス（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルス）血清型に特異的であり得、二次構造においてヘアピンループを形成する限りはいずれの配列でもあり得る。
【００９４】
ＩＴＲの一実施形態（市販のＡＡＶプラスミドからの左ＩＴＲ）のＤＮＡ配列は、本明細書では以下の配列番号４６として表される：
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
［配列番号４６］
【００９５】
ＩＴＲの別の実施形態（市販のＡＡＶプラスミドからの右ＩＴＲ）のＤＮＡ配列は、本明細書では以下の配列番号４７として表される：
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
［配列番号４７］
【００９６】
前述のことから、当業者は、第一の態様の構築物の実施形態のヌクレオチド配列およびコードされたトランスジーンのアミノ酸配列を認識するであろう。しかし疑念を避けるために、プラスミドＱＴＡ０２０Ｐ（およびベクターＱＴＡ０２０Ｖ）内に含まれるネズミＴｒｋＢ受容体−ウイルス２Ａペプチド−ｍＢＤＮＦのためのコドン最適化２９４０ｂｐ配列のコード配列 は、本明細書では以下の配列番号１０７として参照される： ATGAGCCCATGGCTGAAGTGGCACGGACCAGCAATGGCAAGACTGTGGGGCCTGTGCCTGCTGGTGCTGGGCTTCTGGAGAGCCAGCCTGGCCTGTCCAACCTCCTGCAAGTGTAGCTCCGCCAGGATCTGGTGCACAGAGCCTTCTCCAGGCATCGTGGCCTTTCCCCGCCTGGAGCCTAACAGCGTGGATCCCGAGAATATCACCGAGATCCTGATCGCCAACCAGAAGCGGCTGGAGATCATCAATGAGGACGATGTGGAGGCCTACGTGGGCCTGAGAAACCTGACAATCGTGGACTCCGGCCTGAAGTTCGTGGCCTATAAGGCCTTTCTGAAGAACTCTAATCTGAGGCACATCAACTTCACCCGCAATAAGCTGACATCTCTGAGCCGGAGACACTTTCGGCACCTGGATCTGTCCGACCTGATCCTGACCGGCAATCCATTCACATGCTCTTGTGACATCATGTGGCTGAAGACCCTGCAGGAGACAAAGTCTAGCCCCGATACCCAGGACCTGTACTGTCTGAACGAGTCCTCTAAGAATATGCCTCTGGCCAACCTGCAGATCCCTAATTGTGGACTGCCAAGCGCCCGGCTGGCCGCACCTAACCTGACAGTGGAGGAGGGCAAGTCCGTGACACTGTCCTGTTCTGTGGGCGGCGATCCCCTGCCTACCCTGTATTGGGACGTGGGCAACCTGGTGTCTAAGCACATGAATGAGACCTCCCACACACAGGGCTCTCTGAGAATCACAAATATCAGCTCCGACGATAGCGGCAAGCAGATCTCTTGCGTGGCAGAGAACCTGGTGGGAGAGGATCAGGACAGCGTGAATCTGACCGTGCACTTCGCCCCCACCATCACATTTCTGGAGTCTCCTACCAGCGATCACCACTGGTGCATCCCCTTCACAGTGCGGGGAAACCCAAAGCCCGCCCTGCAGTGGTTTTACAACGGCGCCATCCTGAATGAGTCCAAGTATATCTGTACCAAGATCCACGTGACCAACCACACAGAGTACCACGGCTGCCTGCAGCTGGATAATCCCACCCACATGAACAATGGCGACTACACACTGATGGCCAAGAACGAGTATGGCAAGGACGAGAGGCAGATCAGCGCCCACTTCATGGGCCGCCCTGGAGTGGATTATGAGACCAACCCTAATTACCCAGAGGTGCTGTATGAGGACTGGACCACACCTACCGATATCGGCGACACCACAAACAAGTCTAATGAGATCCCAAGCACAGATGTGGCCGACCAGTCTAACAGGGAGCACCTGAGCGTGTACGCAGTGGTGGTCATCGCCTCCGTGGTGGGCTTCTGCCTGCTGGTCATGCTGCTGCTGCTGAAGCTGGCCCGCCACTCTAAGTTTGGCATGAAGGGCCCAGCCTCCGTGATCTCTAATGACGATGACAGCGCCAGCCCCCTGCACCACATCAGCAACGGCTCCAATACCCCTTCTAGCTCCGAGGGCGGCCCAGATGCCGTGATCATCGGCATGACAAAGATCCCCGTGATCGAGAACCCTCAGTACTTCGGCATCACCAATTCCCAGCTGAAGCCTGACACATTTGTGCAGCACATCAAGCGGCACAACATCGTGCTGAAGAGGGAACTGGGAGAGGGAGCCTTCGGCAAGGTGTTTCTGGCCGAGTGCTATAACCTGTGCCCAGAGCAGGATAAGATCCTGGTGGCCGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGCGACAACGCCCGGAAGGACTTCCACAGAGAGGCCGAGCTGCTGACAAATCTGCAGCACGAGCACATCGTGAAGTTTTACGGCGTGTGCGTGGAGGGCGACCCTCTGATCATGGTGTTCGAGTATATGAAGCACGGCGATCTGAACAAGTTTCTGAGAGCACACGGACCAGATGCCGTGCTGATGGCAGAGGGAAATCCCCCTACCGAGCTGACACAGTCTCAGATGCTGCACATTGCACAGCAGATTGCAGCAGGAATGGTGTACCTGGCCAGCCAGCACTTCGTGCACAGGGATCTGGCAACCAGAAACTGCCTGGTGGGAGAGAATCTGCTGGTGAAGATCGGCGACTTTGGCATGTCCCGGGACGTGTACTCTACCGACTACTATAGAGTGGGCGGCCACACAATGCTGCCCATCAGGTGGATGCCACCCGAGAGCATCATGTATCGCAAGTTCACCACAGAGTCTGACGTGTGGAGCCTGGGCGTGGTGCTGTGGGAGATCTTTACCTACGGCAAGCAGCCTTGGTATCAGCTGTCCAACAATGAAGTGATCGAGTGTATTACACAGGGACGCGTGCTGCAGAGGCCACGCACATGCCCCCAGGAGGTGTACGAGCTGATGCTGGGCTGTTGGCAGCGGGAGCCACACACCAGAAAGAACATCAAGAGCATCCACACACTGCTGCAGAATCTGGCCAAGGCCTCCCCCGTGTATCTGGACATCCTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG 
［配列番号１０７］
【００９７】
プラスミドＱＴＡ０２９Ｐ（およびベクターＱＴＡ０２９Ｖ）内に含まれるヒトＴｒｋＢ受容体−ウイルス２Ａペプチド−ｍＢＤＮＦのためのコドン最適化２９４３ｂｐ配列のコード配列 は、本明細書では以下の配列番号１０８として参照される：
ATGTCATCTTGGATCCGCTGGCACGGGCCAGCGATGGCCCGATTGTGGGGCTTCTGCTGGCTTGTTGTAGGCTTCTGGCGCGCGGCGTTCGCGTGTCCGACCTCTTGCAAATGCTCAGCAAGCCGAATTTGGTGCTCAGACCCTAGTCCAGGAATTGTTGCATTCCCCCGACTGGAACCAAACTCCGTCGACCCGGAGAATATAACTGAGATATTTATTGCAAATCAAAAACGCCTTGAAATCATTAACGAGGATGACGTGGAGGCCTACGTTGGTTTGAGAAATCTTACTATTGTCGACTCCGGACTTAAATTTGTAGCTCATAAAGCCTTCCTGAAGAACTCTAATCTGCAGCACATTAATTTCACGAGAAATAAGCTGACCAGCTTGTCCCGGAAGCATTTCCGCCATCTCGACCTGAGCGAGCTCATACTGGTCGGAAACCCATTTACGTGCTCCTGTGACATCATGTGGATCAAAACTCTGCAAGAGGCGAAAAGTAGTCCGGATACCCAAGACCTTTACTGTCTTAATGAAAGCTCAAAAAATATCCCGCTGGCCAACCTGCAGATACCGAACTGCGGACTTCCTAGTGCGAATTTGGCTGCCCCAAATCTTACCGTCGAAGAAGGCAAATCAATCACGCTTTCTTGTTCTGTAGCTGGAGATCCAGTGCCTAATATGTATTGGGACGTGGGTAACCTCGTCTCAAAACATATGAACGAAACGAGCCACACCCAGGGCTCTTTGCGGATAACAAACATCTCCTCTGATGATTCTGGAAAGCAAATCAGTTGCGTAGCTGAAAATCTGGTTGGCGAAGATCAAGATTCAGTCAATCTGACAGTCCATTTCGCCCCAACGATCACCTTTCTGGAGAGCCCAACTAGCGATCACCACTGGTGTATTCCGTTTACGGTAAAAGGAAATCCAAAACCTGCACTCCAATGGTTTTATAATGGAGCCATCTTGAATGAAAGCAAATATATCTGTACTAAAATCCATGTGACGAATCACACCGAGTATCACGGGTGTCTTCAATTGGATAATCCAACCCATATGAATAATGGTGATTATACTTTGATAGCGAAGAACGAATACGGCAAAGACGAAAAGCAAATATCCGCACATTTCATGGGTTGGCCTGGCATCGACGACGGTGCGAACCCGAACTACCCAGATGTTATTTACGAGGATTATGGGACTGCGGCAAACGACATTGGCGACACCACAAACCGAAGCAACGAGATACCAAGTACTGACGTCACTGACAAAACGGGTCGAGAGCATTTGTCTGTTTACGCCGTTGTTGTTATCGCCTCAGTTGTCGGATTTTGCCTGTTGGTCATGCTTTTCCTCCTGAAGCTCGCGCGACATTCCAAGTTTGGCATGAAGGGG CCAGCAAGTGTTATATCCAATGATGATGATAGCGCTTCTCCATTGCACCACATAAGTAACGGCTCAAACACGCCGTCATCTAGTGAAGGTGGACCAGACGCGGTCATTATAGGGATGACTAAAATTCCCGTAATCGAAAACCCTCAGTACTTCGGCATAACCAACAGTCAGCTTAAACCCGATACTTTCGTGCAGCACATCAAAAGGCACAACATAGTCCTCAAGCGCGAACTCGGGGAGGGAGCCTTCGGAAAGGTCTTTCTTGCTGAGTGCTATAATTTGTGTCCTGAGCAGGATAAAATTCTTGTGGCTGTAAAAACTCTCAAAGATGCTTCCGACAACGCACGGAAGGATTTTCATCGGGAGGCCGAACTGTTGACGAATTTGCAGCACGAGCATATAGTAAAGTTCTACGGGGTATGTGTTGAGGGGGACCCGTTGATTATGGTCTTCGAGTATATGAAGCACGGGGACCTGAACAAATTTTTGCGCGCCCATGGGCCTGATGCCGTCCTTATGGCAGAAGGGAACCCTCCAACAGAACTCACCCAGAGTCAGATGTTGCACATAGCGCAACAGATCGCGGCCGGCATGGTTTACCTGGCCAGTCAACACTTCGTGCATAGAGATCTTGCCACTCGCAACTGTTTGGTCGGGGAGAACCTTCTGGTTAAGATTGGTGACTTTGGTATGTCACGAGATGTGTATTCCACTGACTATTACAGAGTTGGGGGTCATACAATGCTTCCTATTCGGTGGATGCCCCCCGAATCCATCATGTACAGAAAGTTCACGACAGAGAGTGATGTT TGG AGT CTCGGCGTGGTGCTCTGGGAAATTTTCACATACGGAAAGCAGCCGTGGTATCAACTTAGCAACAATGAGGTGATAGAGTGTATTACACAGGGTCGGGTGTTGCAGCGCCCTCGAACGTGCCCACAAGAAGTATATGAACTTATGCTCGGGTGCTGGCAAAGAGAACCACATATGAGAAAAAATATCAAGGGGATACATACATTGCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCACCCGTCTACCTCGATATACTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
［配列番号１０８］
【００９８】
こうして最も好ましい実施形態において、該構築物は、実質的に配列番号１０７もしくは１０８に表されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００９９】
本発明者らは、本発明の構築物を含む一連の組換え発現ベクターを作出した。
【０１００】
したがって第二の態様によれば、第一の態様による遺伝子構築物を含む組換えベクターが提供される。
【０１０１】
該組換えベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであり得る。該ｒＡＡＶは、天然由来のベクター、またはハイブリッドＡＡＶ血清型を有するベクターであり得る。該ｒＡＡＶは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、およびＡＡＶ−１１であり得る。好ましくは該ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ血清型−２である。
【０１０２】
有利には組換えＡＡＶ２は、宿主生物体において最小限の免疫反応を誘発し、ベクター投与後少なくとも１年間、網膜内で持続され得る長期トランスジーン発現を媒介する。
【０１０３】
本明細書で用いられる用語「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、少なくとも１種の末端反復配列を含む組換えＡＡＶ由来の核酸を意味する。
【０１０４】
該ベクターの好ましい実施形態を、図２〜５に示す。
【０１０５】
本明細書に記載された構築物および発現ベクターを用いて、視神経障害および蝸牛障害を処置すること、より一般的には神経再生および生存を促進することができる。
【０１０６】
こうして第三の態様によれば、薬剤としての使用または治療における使用のための、第一様態様による遺伝子構築物、または第二の態様による組換えベクターが提供される。
【０１０７】
第四の態様によれば、視神経障害もしくは蝸牛障害を処置、予防もしくは改良することにおける使用のため、または神経再生および／もしくは生存を促進するための、第一様態様による遺伝子構築物、または第二の態様による組換えベクターが提供される。
【０１０８】
第五の態様によれば、対象における視神経障害もしくは蝸牛障害を処置、予防もしくは改良する方法、または対象における神経再生および／もしくは生存を促進する方法であって、第一様態様による遺伝子構築物、または第二の態様による組換えベクターの治療有効量を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。
【０１０９】
好ましくは本発明による遺伝子構築物または組換えベクターは、遺伝子療法技術において用いられる。該構築物またはベクターによりコードされるアゴニストは、同じく該構築物／ベクターによりコードされるＴｒｋＢを活性化し、それにより網膜神経節細胞（ＲＧＣ）または蝸牛細胞の生存を促進する。
【０１１０】
一実施形態において、処置される視神経障害は、緑内障、または頭部もしくは顔面への外傷、または血管損傷など、ＲＧＣの損失をもたらし得る他の病理生理学的状態、例えば視神経からの入力情報を受け取る目の構造または脳の領域への血液供給の部分的または完全な喪失であり得る。加えて該構築物を用いて、形質転換されていない、または形質転換された幹細胞を患者の目または視力に関連する領域に導入することによりＲＧＣの置換を支援することもできる。
【０１１１】
一実施形態において、処置される蝸牛障害は、難聴または聴覚消失であり得る。本発明の構築物およびベクターは、ＴｒｋＢ受容体および該受容体のアゴニストの両方の局所的増加により、ＴｒｋＢ受容体アゴニストへの蝸牛細胞感受性を有意に増大する。該蝸牛細胞は、軸索を介して耳から脳幹まで聴覚シグナルを送信する有毛細胞または神経細胞のらせん神経節細胞であり得る。該有毛細胞は、内耳有毛細胞または外耳有毛細胞であり得る［４２、４３、４４］。
【０１１２】
別の実施形態において、該構築物およびベクターを用いて、神経再生および／または生存を促進することができる。
【０１１３】
第一様態様による遺伝子構築物、または第二の態様による組換えベクターが、視神経障害もしくは蝸牛障害を処置、改良もしくは予防するため、または神経再生および／もしくは生存を促進するために、薬剤の中で使用され得、単独療法（即ち、本発明の第一様態様による遺伝子構築物、または第二の態様による組換えベクターの使用）として用いられ得ることは、認識されよう。あるいは本発明による遺伝子構築物または組換えベクターは、視神経障害もしくは蝸牛障害を処置、改良もしくは予防するため、または神経再生および／もしくは生存を促進するために、公知治療への補助として、または該公知治療と併用で用いられ得る。
【０１１４】
本発明による遺伝子構築物または組換えベクターは、特に用いられる手法に応じて、複数の異なる形態を有する組成物中で併用され得る。したがって例えば該組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮貼付剤、リポソーム懸濁液の形態、または処置の必要があるヒトもしくは動物に投与され得る任意の他の適切な形態であり得る。本発明による薬剤のビヒクルが与えられる対象により十分忍容されるものであるべきことは、認識されよう。
【０１１５】
本発明による遺伝子構築物または組換えベクターはまた、徐放性または遅延放出性デバイスの中に組み込まれ得る。そのようなデバイスは、例えば皮膚表面または皮膚の下に挿入され得、該薬剤は、数週間または数ヶ月かけて放出され得る。該デバイスは、処置部位に少なくとも隣接して位置し得る。そのようなデバイスは、該遺伝子構築物または該組換えベクターでの長期処置が必要となり、通常は頻回投与（例えば、少なくとも１日１回の注射）が必要となる場合に、特に有利であり得る。
【０１１６】
好ましい実施形態において、本発明による薬剤は、血流、神経への注射、または処置を必要とする部位への直接の注射により、対象に投与され得る。例えば該薬剤は、網膜または耳に少なくとも隣接して注射され得る。注射は、静脈内（ボーラスまたは輸液）、または皮下（ボーラスまたは輸液）、または皮内（ボーラスまたは輸液）であり得る。
【０１１７】
必要とされる遺伝子構築物または組換えベクターの量が、生物活性および生物学的利用度によって決定され、該生物活性および生物学的利用度もまた、投与様式、該遺伝子構築物または該組換えベクターの生理化学的特性、および単独療法または併用療法のいずれとして用いられるか、に依存することは認識されよう。投与回数は、処置される対象の体内での環状ポリペプチドの半減期によっても影響を受けよう。投与されるべき最適な投薬量は、当業者に決定され得、使用される個々の遺伝子構築物または組換えベクター、医薬組成物の強度、投与様式、および視神経障害または蝸牛障害の進行度により変動するであろう。対象の年齢、体重、性別、食事および投与時間をはじめとする、処置される個々の対象に依存するさらなる因子が、投薬量を調整する要件となろう。
【０１１８】
一般に、０．００１μｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間、または０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重の間の本発明による環状ポリペプチドの日用量が、用いられる遺伝子構築物または組換えベクターに応じて、視神経障害または蝸牛障害を処置、改良または予防するために用いられ得る。
【０１１９】
該遺伝子構築物または該組換えベクターは、視神経または蝸牛障害の発症前、発症時、または発症後に投与され得る。日用量が、単回投与（例えば、１日１回の注射または鼻腔スプレーの吸入）として与えられ得る。あるいは該遺伝子構築物または該組換えベクターは、１日に２回以上投与される必要があり得る。例として、該遺伝子構築物または該組換えベクターは、０．０７μｇ〜７００ｍｇ（即ち、体重７０ｋｇを仮定して）の間の日用量を２回として（または処置される視神経または蝸牛障害の重症度に応じてそれよりも多く）投与され得る。処置を受ける患者は、起床時に初回用量を、その後、午後に第二の用量を（２回投与レジメンであれば）、またはその後３もしくは４時間間隔で受け得る。あるいは徐放性デバイスを用いて、本発明による遺伝子構築物または組換えベクターの最適用量を患者に提供することができ、反復投与の必要がない。
【０１２０】
医薬業界によって従来から用いられているような公知の手順（例えば、インビボ実験法、臨床試験など）を用いて、本発明の遺伝子構築物または組換えベクターの専用の配合剤、および精密な治療レジメン（薬剤の日用量および投与回数など）を形成させ得る。本発明者らは、それらが初めて、ＴｒｋＢ受容体およびＴｒｋＢ受容体アゴニストのコード配列に動作可能に連結されたプロモーターをコードする遺伝子構築物を示唆すると考えている。
【０１２１】
第六の態様によれば、第一の態様による遺伝子構築物または第二の態様による組換えベクターと、医薬的に許容し得るビヒクルと、を含む医薬組成物が提供される。
【０１２２】
第七の態様によれば、第一の態様による遺伝子構築物、または第二の態様による組換えベクターを、医薬的に許容し得るビヒクルと接触させることを含む、第六の態様による医薬組成物を調製する方法が提供される。
【０１２３】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または飼育動物であり得る。このため本発明による組成物および薬剤を用いて、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えば、ウマ）、ペットを処置することができ、または他の獣医学的適用において用いることができる。しかし最も好ましくは、該対象は、ヒトである。
【０１２４】
該遺伝子構築物、該組換えベクターまたは該医薬組成物の「治療有効量」は、対象に投与された時に、緑内障、聴覚消失を処置すること、または神経再生および／もしくは生存を促進するなどの所望の効果を生じること、が求められる前述のものの量である任意の量である。
【０１２５】
例えば、用いられる該遺伝子構築物、該組換えベクターまたは該医薬組成物の治療有効量は、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇであり得る。該遺伝子構築物、該組換えベクターまたは該医薬組成物の量が、約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、最も好ましくは約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの量であることが、好ましい。
【０１２６】
本明細書で参照される「医薬的に許容し得るビヒクル」は、医薬組成物を配合する上で有用であることが当業者に知られる任意の公知化合物または公知化合物の組み合わせである。
【０１２７】
一実施形態において、該医薬的に許容し得るビヒクルは、固体であり、該組成物は、粉末または錠剤の形態であり得る。固体の医薬的に許容し得るビヒクルとしては、香味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、染色剤、充填剤、滑剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味剤、防腐剤、染色剤、コーティング剤、または錠剤崩壊剤としても作用し得る１種または複数の物質を挙げることができる。該ビヒクルはまた、カプセル化材料であり得る。粉末では、ビヒクルは、本発明による微細活性剤と混和された微細固体である。錠剤では、該活性剤（例えば、本発明による遺伝子構築物または組換えベクター）は、必要な圧縮特性を有するビヒクルと適切な割合で混合されて、所望の形状およびサイズで圧縮され得る。該粉末および錠剤は、好ましくは９９％までの活性剤を含有する。適切な固体ビヒクルとしては、例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態において、該医薬ビヒクルは、ゲルであり得、該組成物は、クリームなどの形態であり得る。
【０１２８】
しかし該医薬ビヒクルは、液体であり得、該医薬組成物は、溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシルおよび圧縮された組成物を調製する際に用いられる。本発明による遺伝子構築物または組換えベクターは、水、有機溶媒、両方の混合物、または医薬的に許容し得る油もしくは脂肪などの医薬的に許容し得る液体ビヒクルに溶解または懸濁され得る。該液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、色素、粘度調整剤、安定化剤または浸透圧調節剤などの他の適切な医薬添加剤を含有し得る。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例としては、水（上記添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を一部含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールなど）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分別蒸留ココナッツオイルおよび落花生油）が挙げられる。非経口投与では、該ビヒクルはまた、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであり得る。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌液体形態の組成物において有用である。圧縮された組成物のための液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の医薬的に許容し得る噴射剤であり得る。
【０１２９】
滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内注射、そして特に皮下注射によって使用され得る。該遺伝子構築物または組換えベクターは、滅菌水、生理食塩水、または他の適当な滅菌注射可能媒体を用いて投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。
【０１３０】
本発明の遺伝子構築物、組換えベクターおよび医薬組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アラビアゴム、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（エチレンオキシドと共重合されたソルビトールおよびその無水物のオレイン酸エステル）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明による遺伝子構築物、組換えベクターまたは医薬組成物はまた、液体または固体組成物形態のいずれかで経口投与され得る。経口投与に適した組成物としては、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤および粉末などの固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシルおよび懸濁液などの液体形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液が挙げられる。
【０１３１】
本発明が、変異体または断片をはじめとする、本明細書で参照される配列のいずれかのアミノ酸または核酸配列を実質的に含む任意の核酸もしくはペプチド、またはそれらの変異体、誘導体もしくは類似体に及ぶことは、認識されよう。用語「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「変異体」および「断片」は、本明細書で参照される配列の任意の１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する、例えば配列番号１〜１０８として同定された配列などと４０％の同一性を有する配列であり得る。
【０１３２】
参照される配列のいずれかと６５％を超える、より好ましくは７０％を超える、より好ましくは７５％を超える、より好ましくは８０％を超える配列同一性である配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた、想定される。好ましくは該アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書で参照される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは本明細書で参照される配列のいずれかと少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９２％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９７％の同一性、より好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１３３】
熟練の技術者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性％を計算する方法を認識しているであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の間の同一性％を計算するためには、２つの配列のアラインメントを最初に調整して、その後、配列同一性値の計算を行わなければならない。２つの配列のための同一性％は、（ｉ）配列をアラインメントするために用いられる方法、例えばClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman（異なるプログラムで実行）、または３Ｄ比較からの構造アラインメント；および（ii）アラインメント法によって用いられるパラメータ、例えば局所アラインメント対全体的アラインメント、用いられるペア−スコア・マトリックス（例えば、BLOSUM62、PAM250、Gonnetなど）およびギャップ・ペナルティ、例えば機能的形態および定数、に応じて異なる値をとり得る。
【０１３４】
アラインメントを行ったら、２つの配列間の同一性％を計算するのに多くの異なる方法が存在する。例えば、（ｉ）最短配列の長さ；（ｉｉ）アラインメントの長さ；（ｉｉｉ）配列の平均長；（ｉｖ）非ギャップ位置の数；または（ｉｖ）オーバーハングを除く同等の位置の数、により同一性の数を分別し得る。さらに同一性％が長さに強く依存することも、認識されよう。それゆえ、配列対が短いほど、偶然に起こると予測される配列同一性が高くなり得る。
【０１３５】
こうして、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントが複雑なプロセスであることは、認識されよう。評判の良い多重アラインメントプログラムClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)は、本発明によるタンパク質またはＤＮＡの多重アラインメントを作成するための好ましい方法である。ClustalWの適切なパラメータは、以下の通りであり得る：ＤＮＡアラインメントの場合、ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、マトリックス＝同一性。タンパク質のアラインメントの場合、ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、マトリックス＝Gonnet。ＤＮＡおよびタンパク質のアラインメントの場合、ＥＮＤＧＡＰ＝−１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者は、最適な配列アラインメントのためにこれらおよび他のパラメータを変動させる必要があり得ることを、認知しているであろう。
【０１３６】
好ましくは２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の間の同一性％の計算は、その後、（Ｎ／Ｔ）×１００（式中、Ｎは、配列が同一残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを含まない場合と比較された位置の総数である）などのアラインメントから計算され得る。こうして、２つの配列間の同一性％を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば先に表された通り、パラメータの適切なセットを用いてClustalWプログラムを利用した配列アラインメントを調整すること；ならびに（ｉｉ）ＮおよびＴの値を、以下の式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）×１００に挿入すること、を含む。
【０１３７】
類似の配列を同定するための別の方法は、当業者に公知であろう。例えば実質的に類似のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でＤＮＡ配列またはそれらの相補体にハイブリダイズする配列によってコードされよう。ストリンジェントな条件とは、本発明者らによれば、ヌクレオチドがおよそ４５℃で３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、フィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、その後、およそ２０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは実質的に類似のポリペプチドは、例えば配列番号３および５で示された配列と、少なくとも１、しかし５、１０、２０、５０または１００未満のアミノ酸が異なり得る。
【０１３８】
遺伝子コードの縮退により、本明細書に記載された任意の核酸配列がコードされたタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼさずに変動または変更され、それによりその機能的変異体を提供し得ることは、明白である。適切なヌクレオチド変異体は、配列内で同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により改変され、こうしてサイレントチェンジを生じる配列を有するものである。他の適切な変異体は、相同的なヌクレオチド配列を有するが、置換したアミノ酸と類似の生物物理的特性の側鎖による、アミノ酸をコードする異なるコドンの置換により改変されて、保存的変更を生じる配列の全てまたは一部を含むものである。例えば小さな非極性疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが挙げられる。大きな非極性疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸としては、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）アミノ酸としては、アルパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。それゆえ、アミノ酸が類似の生物物理的特性を有するアミノ酸で置き換えられ得ることは認識されると思われ、当業者はこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【０１３９】
別の態様によれば、チロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）を活性化するために、ＴｒｋＢをコードする第一のコード配列と、ＴｒｋＢ受容体のアゴニストをコードする第二のコード配列とに動作可能に連結されたプロモーターを含み、それにより網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、神経細胞または蝸牛細胞の生存を促進する、遺伝子構築物が提供される。
【０１４０】
本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に記載された特色の全て、および／またはそのように開示された任意の方法もしくは工程のステップの全ては、そのような特色および／またはステップの少なくとも一部が互いに排他的となる組み合わせ以外の任意の組合せで、上記態様のいずれかと組み合わせられ得る。
【０１４１】
本発明のより良好な理解のために、そしてその実施形態がどのようにして実行され得るかを示すために、ここに添付の図面を例として参照する。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】本発明による遺伝子構築物の一実施形態の略図である。
【図２】カノニカルなシグナル配列（青色）＋プロＢＤＮＦ（赤色）およびｍＢＤＮＦ（黒色）を含有する「プラスミドＱＴＡ００１ＰＡ」として知られる本発明による組換えベクターの第一の実施形態の略図である。それはまた、−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−配列（シアンおよび紫色）を含む。
【図３】プロＢＤＮＦを含まず（しかしｍＢＤＮＦのみを生成し）プラスミドＱＴＡ００１ＰＡと同じシグナル配列（青色）を含む「プラスミドＱＴＡ００２Ｐ」として知られる本発明による組換えベクターの第二の実施形態の略図である。それはまた、−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−配列（シアンおよび紫色）を含む。
【図４】プロＢＤＮＦを含まず（しかしｍＢＤＮＦのみを生成し）ＩＬ−２シグナル配列（青色）を含む「プラスミドＱＴＡ００３Ｐ」として知られる本発明による組換えベクターの第三の実施形態の略図である。それはまた、−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−配列（シアンおよび紫色）を含む。
【図５】プロＢＤＮＦを含まず（しかしｍＢＤＮＦのみを生成し）新規なシグナル配列（青色）を含む「プラスミドＱＴＡ００４Ｐ」として知られる本発明による組換えベクターの第四の実施形態の略図である。それはまた、−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−配列（シアンおよび紫色）を含む。
【図６】本発明の構築物内で用いられるシグナルペプチドの異なる実施形態のためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。第二の残基は、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）などの１つまたは複数の塩基性残基によって置き換えられ得るトレオニン（ｔ）である。イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）およびロイシン（Ｌ）をはじめとする残基の次の延伸は、１つまたは複数の疎水性残基によって置き換えられ得る。
【図７】異なるシグナルペプチド配列を有し、伸長されたプロＢＤＮＦ成分のコード配列を有さない、ｍＢＤＮＦをコードする遺伝子を含むプラスミド（４μｇＤＮＡ／ウェル）の形質導入後２４時間目の特異的ＥＬＩＳＡを用いたＨＥＫ２９３細胞からのＢＤＮＦの放出を示す（データは、ｎ＝４での平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される）。
【図８】プラスミド形質導入の２４時間後のＨＥＫ２９３細胞溶解物中のＢＤＮＦ免疫反応性材料の細胞内濃度（任意の単位）のウェスタンブロットの結果を示す（データは、ｎ＝４での平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される）。
【図９】細胞をＱＴＡ００１ＰＡで形質導入した場合の２つの分子量バンド（３２ｋＤａおよび１４ｋＤａ）を示す細胞溶解物のウェスタンブロットにおけるＢＤＮＦ免疫反応性を、ＱＴＡ００２Ｐ、ＱＴＡ００３ＰおよびＱＴＡ００４Ｐでの単一の１４ｋＤａバンドのみに対比させて示す。
【図１０】選択的プロＢＤＮＦ  ＥＬＩＳＡを用いたプラスミド形質導入の２４時間後に特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定されたＨＥＫ２９３インキュベーション培地中のプロＢＤＮＦ濃度を示す（データは、ｎ＝４での平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される）。
【図１１】プラスミドＱＴＡ００２Ｐ（内在性カノニカルシグナルペプチド配列）およびＱＴＡ００９Ｐ〜ＱＴＡ０１３ＰによるＨＥＫ２９３細胞溶解物中のＢＤＮＦ発現を示す。データは、平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される。**  ＱＴＡ００２Ｐとの比較でＰ＜０．０１。
【図１２】プラスミドＱＴＡ００２Ｐ（内在性カノニカルシグナルペプチド配列）およびＱＴＡ００９Ｐ〜ＱＴＡ０１３ＰによるＨＥＫ２９３細胞インキュベーション培地中のＢＤＮＦ発現を示す。データは、平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される。**  ＱＴＡ００２Ｐとの比較でＰ＜０．０１。
【図１３】ＨＥＫ２９３細胞をプラスミドＱＴＡ０１５Ｐ（ＩＲＥＳスペーサーによって分離されたＢＤＮＦおよびｅＧＦＰを発現する）、ＱＴＡ０２１Ｐ（機能的ウイルス２Ａペプチド配列によって分離されたＢＤＮＦと、それに続くｅＧＦＰを発現する）、ＱＴＡ０２２Ｐ（非機能的ウイルス２Ａペプチド配列によって分離された、ＢＤＮＦと、それに続くｅＧＦＰを発現する）、およびＱＴＡ０２３Ｐ（機能的ウイルス２Ａペプチド配列によって分離された、ｅＧＦＰと、それに続くＢＤＮＦのコードを発現する）で形質導入された後２４時間目の該ＨＥＫ２９３細胞からのウェスタンブロットを示す。データは、ＢＤＮＦ免疫反応性（Ａ）、ｅＧＦＰ免疫反応性（Ｂ）およびＨＥＫ２９３細胞からインキュベーション培地に放出されたＢＤＮＦの量（Ｃ）として示される。データは、バンドの密度の平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される。
【図１４】図１４Ａは、ＱＴＡ０２０Ｖベクターでのトランスフェクションの４８時間後のＨＥＫ２９３細胞ホモジネートのウェスタンブロットを示し、ウイルス２Ａペプチド配列により分離されたＴｒｋＢ受容体およびＢＤＮＦを含む大きな前駆体コード領域の効率的なプロセシングを示す。図１４Ｂおよび１４Ｃは、ウイルス２Ａペプチド開裂後に生成されたトランスジーンタンパク質が、プロセシング（放出前に、ＴｒｋＢ受容体が細胞表面へ、そしてＢＤＮＦが貯蔵小胞へ）後のＨＥＫ２９３細胞内の正しい細胞内コンパートメントに輸送されたことを示す。
【図１５】図１５Ａは、ｒＡＡＶ２ベクターであるＱＴＡ０２０Ｖのためのマウス網膜ホモジネート中のＴｒｋＢ受容体発現を示し、図１５Ｂは、ＢＤＮＦ発現を示す。データは、マウス網膜ホモジネートのウェスタンブロットの密度の平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される。**  ナイーブ（未注射の動物）と比較してＰ＜０．０１。
【図１６】ウイルス２Ａペプチド配列によって分離されたＴｒｋＢ受容体およびＢＤＮＦのコードを含むｒＡＡＶ２ベクターであるＱＴＡ０２０Ｖの注射後の免疫細胞化学的測定により示された、マウス網膜神経節細胞層におけるＴｒｋＢ（Ａ）およびＢＤＮＦ（Ｂ）トランスジーンの発現を示す。
【図１７】ｒＡＡＶ２−ＣＡＧ−ｅＧＦＰベクターで処置された対照動物と対比されたマウスにおける視神経挫滅（ＯＮＣ）に続く網膜神経節細胞（ＲＧＣ）生存を示す。データは、網膜フラットマウント内のＢｒｎ３Ａ陽性細胞によりカウントされた、動物あたりの網膜全体の網膜神経節細胞の平均数が平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される。***  対照との比較でｐ＜０．００１、*  Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【０１４３】
実施例
方法と材料
分子クローニングおよびプラスミド構築物
ＤＮＡ配列のコドン最適化を、オンラインツール（http://www.idtdna.com/CodonOpt）を用いて実施し、ＤＮＡブロックを、Integrated DNA technologies, Inc.（IDT; 9180 N. McCormick Boulevard, Skokie, IL 60076-2920, USA）またはGenScript（860 Centennial Ave, Piscataway, NJ 08854, USA）によって合成した。マスタープラスミドＱＴＡ００１ＰＡと、次のプラスミドを作製するためのクローニングは、標準の分子生物学およびクローニング技術を利用して実施した。
【０１４４】
プラスミドの拡大および精製
ＤＮＡプラスミドを、SURE競合細胞(Agilent Technologies; cat.#200238)中で一晩、拡大し、Maxi-Prep精製後に２．２９μｇ／μｌのプラスミドを提供した。残りのプラスミドは、５００μｇスケールおよび最小限の内毒素が存在する形質導入品質に拡大した。
【０１４５】
ＨＥＫ２９３培養およびプラスミドＤＮＡでの細胞形質導入
ＨＥＫ２９３細胞（４００，０００個）を、ポリ−Ｌ−リシン（１０μｇ／ｍＬ、Sigma-Aldrich; cat.#P1274）コーティング６ウェルプレートにおいて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリンおよび１％ストレプトマイシン（１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を含有するダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）１．５ｍＬ中で８０％コンフルエントになるまで培養した。その後、培地をＤＭＥＭ（添加剤不含）２ｍＬと交換した。２〜３時間後に、プラスミドＤＮＡ  ４μｇ＋リポフェクタミン１０μＬ(４μＬ／ｍＬ；Thermo Fisher Scientific; cat.#12566014)を含有するトランスフェクション培地のさらなる０．５ｍｌを各ウェルに添加して、トランスフェクション期間全体および上清採取のために全容量２．５ｍｌを得た。
【０１４６】
ＥＬＩＳＡによるＢＤＮＦ測定
ＨＥＫ２９３細胞から分泌されたＢＤＮＦの量を、トランスフェクションの２４時間後に細胞培地中で測定した。培地を遠心分離して、細胞破片を除去し、市販のヒトＢＤＮＦ  ＥＬＩＳＡキット（Sigma-Aldrich、製品# RAB0026）を用いて測定した。試料を新たに作製されたＢＤＮＦ標準と比較することにより、ＢＤＮＦ濃度を決定した。
【０１４７】
ＢＤＮＦおよびＴｒｋＢ受容体のウェスタンブロット
ＤＭＥＭインキュベーション培地を除去し、低温リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、新たに調製された溶解緩衝液３５０μＬをウェルに添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞内のＢＤＮＦおよびＴｒｋＢ免疫反応性の量を測定した(Lysis-M試薬１０ｍｌ＋cOmplete Miniプロテアーゼインヒビターカクテル、Roche; cat.#04719964001  １錠＋Haltホスファターゼインヒビターカクテル(１００倍)、Thermo Scientific; cat.#78428  １００μｌ)。細胞のホモジナイズ後に、タンパク質懸濁液を、BCAアッセイ（Pierce BCA タンパク質アッセイキット、Thermo Scientific; cat.#23227）を用いて定量した。１レーンにＨＥＫ２９３細胞溶解物タンパク質６μｇ〜１５μｇの間を、Bis-Trisゲル（１２％NuPAGE Novex; cat.#NP0342BOX、Thermo Scientific)でランダウン（run down）して、一晩インキュベートされた、一次ウサギポリクローナル抗ＢＤＮＦ抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc; 製品# sc-546;１：５００希釈)、ウサギポリクローナル抗ＴｒｋＢ抗体(Abcam; cat.#ab33655、１：２０００希釈で使用）またはｅＧＦＰ抗体(Abcam 製品#ab-290、１：５００で使用）を用いたウェスタンブロットにより検査した。一次抗体を、ＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ抗体(Vector Laboratories; cat.#PI-1000、１：８０００）、ならびにECL Prime(Amersham, GE Healthcare, UK)およびAllianceウェスタンブロット画像システム（UVItec Ltd, Cambridge, UK)を用いたシグナル検出で視覚化した。マウス網膜のウェスタンブロットでは、ベクター処置された動物の目を、新たに調製された溶解緩衝液(Lysis-M試薬１０ｍｌ＋cOmplete Miniプロテアーゼインヒビターカクテル、Roche; 製品#04719964001  １錠＋Halt ホスファターゼインヒビターカクテル(１００倍)、Thermo Scientific;#78428  １００μｌ)５００μＬ中でホモジナイズした。組織を１分間破壊し(Qiagen, TissueRuptor 製品#9001273)、その後、さらに１５分間、氷上で保持した。その後、タンパク質を上記の通りウェスタンブロットにより分析した。
【０１４８】
免疫細胞化学的測定
ＨＥＫ２９３細胞（７０，０００個）を、４ウェルプレート内の１３ｍｍのポリ−Ｌ−リシンコーティングカバースリップに播種して、培地０．５ｍｌ中に１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭでインキュベートした。細胞が８０％コンフルエントまで発育したら、２〜３時間の間、培地をＤＭＥＭ  ０．４ｍｌ（添加剤不含）と交換し、その後、トランスフェクション培地（プラスミドＤＮＡ  ０．８μｇ＋リポフェクタミン２μｌ）のさらなる０．１ｍＬを添加して、最終容量を０．５ｍｌにした。カバースリップをＰＢＳで２回洗浄して、室温の１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。細胞をＰＢＳでさらに３回洗浄した後、５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＰＢＳ中の０．３％TritonX-100中、室温で６０分間インキュベートすることによりブロックして、浸透させた。その後、細胞を、ブロッキング溶液で希釈されたＢＤＮＦ用（Santa Cruz Biotechnology Inc; 製品# sc-546;１：３００希釈）またはＴｒｋＢ用（Abcam 製品# ab33655、１：５００希釈）の市販のウサギポリクローナル抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。alexa fluor 647 (Invitrogen, 製品# A21248、１：１０００)にコンジュゲート化された二次抗ウサギ抗体を用いて室温で２時間、染色を明らかにした。細胞核もまた、１μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ (Thermo Scientific, 製品# D1306 １：８０００)で対比染色した。細胞をさらに３回洗浄して、fluorSave（商標）試薬(Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, USA)を添加した後、撮像した。撮像は、３倍デジタルズームおよび０．５〜０．８シーケンシャルスキャンＺステップ間隔を利用し、２０倍対物レンズと、６３倍油浸対物レンズを備えたLeica DM6000落射蛍光顕微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)またはLeica SP5共焦点顕微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)を用いて実施した。
【０１４９】
対照またはベクター処置動物からの網膜構造の免疫細胞化学的測定では、注意深く切除された目を、４％パラホルムアルデヒド／０．１％ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で一晩固定して、３０％スクロース／０．１％ＰＢＳ中、４℃で脱水した（２４時間）。その後、最適切削温度化合物（ＯＣＴ）(Sakura Finetek, Zoeterwoude, Netherlands)を含有するシリコンモールドに目を包埋して、ドライアイスで凍結させた。網膜の背腹／上下軸を通る１３μｍ切片を、Bright OTF 5000クリオスタット(Bright Instruments, Huntingdon, UK)を用いてSuperfrost plusスライド(VWR 製品#631-0108)上に採取した。スライドをＰＢＳで３回洗浄して、ＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．３％TritonX-100を室温で６０分間、浸透させた。その後、スライドを、ＢＤＮＦ用（Santa Cruz Biotechnology Inc; 製品# sc-546;１：３００）またはＴｒｋＢ用（Abcam 製品# ab33655、１：５００）の市販のウサギポリクローナル抗体と共に４℃で一晩インキュベートして、ブロッキング溶液で希釈した。alexa fluor 647 (Invitrogen, 製品# A21248、１：１０００)にコンジュゲート化された二次抗ウサギ抗体を用いて室温で２時間、染色を明らかにした。網膜細胞核もまた、１μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ(Thermo Scientific, 製品# D1306  １：８０００)で対比染色した。細胞をさらに３回洗浄して、fluorSave（商標）試薬(Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, USA)を添加した後、撮像した。撮像は、３倍デジタルズームおよび０．５〜０．８シーケンシャルスキャンＺステップ間隔を利用し、２０倍対物レンズと、６３倍油浸対物レンズを備えたLeica DM6000落射蛍光顕微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)またはLeica SP5共焦点顕微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)を用いて実施した。
【０１５０】
硝子体内注射
マウスを、７〜１０日の馴化期間の後、様々な試験群に無作為化した。それらをその後、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔した。１％局所テトラカイン点眼薬を、試験１日目に投与しした。１％トロピカミド点眼薬を用いて、瞳孔拡張（Pupillary dilation）を実行した。手術用顕微鏡を利用して、強膜部分層のパイロットホール（partial-thickness scleral pilot hole）を３０ゲージの針で作製して、先端径３０μｍおよび先端長２．５ｍｍの微細金属製マイクロピペットによる下部の強膜、脈絡膜および網膜への透過を容易にした。マイクロピペットをその後、１０μｌガラスシリンジ（Hamilton Co., Reno, NV）に連結させた後、群に応じてベクター懸濁液２μｌをピペット内に引き上げた。硝子体内注射の間、レンズの透過または渦静脈の損傷を回避するように注意を払った。注射部位として、上側角膜輪部（supero-temporal limbus）の後部およそ３ｍｍを目標に定めた。注射は１分間かけて緩徐に行い、ベクター懸濁液を拡散させた。右目は触れないまま、内部対側対照とした。
【０１５１】
視神経挫滅（ＯＮＣ）
ベクター投与後３週間（２１日）目に、マウスをＯＮＣ処置に供するか、未処置とするか、または偽処置で挫滅させた。両眼手術用スコープの下、スプリングシザーで、結膜の、眼球に対して下位から開始して目の周囲に、一時的に小さな切開を作製した。これにより、眼球の後面を露出させて、視神経を視覚化させた。クロスアクションタイプの鉗子(Dumont #N7 cat.#RS-5027; Roboz)により、神経を圧迫するセルフクランピング作用からの圧力のみで、露出された視神経を眼球からおよそ１〜３ｍｍで１０秒間つかんだ。１０秒後に、視神経を解放し、鉗子を取り除いて、眼を回転させて適所に戻した。ＯＮＣの７日後に、動物を選別した。各群の両眼を、４％パラホルムアルデヒド／０．１％ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に一晩静置することにより固定した。その後、角膜からの後部眼構造の切除およびレンズの除去の後に、網膜フラットマウントを作製した。網膜フラットマウントを、４％パラホルムアルデヒド／０．１％ＰＢＳで３０分間、後固定して、ＰＢＳ中の０．５％Triton X-100で洗浄した。網膜を−８０℃で１０分間凍結し、核膜に浸透させて抗体の浸透性を改善した後、１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＰＢＳ中の２％Triton X-100の中、室温で６０分間ブロッキングした。ＲＧＣをＢｒｎ３Ａ(Santa Cruz, #sc-31984  １：２００)に対する抗体で対比染色して、２０倍対物レンズおよびLeica DM6000落射蛍光顕微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)を用いた蛍光顕微鏡測定により視覚化した。高解像度画像を、１．５倍デジタルズームおよび０．５〜０．８シーケンシャルスキャンＺステップ間隔を利用し、４０倍油浸対物レンズを備えたLeica SP5共焦点顕微鏡(Leica Microsystems)を用いて得た。ＲＧＣ細胞数を、核カウントのための画像ツール（image-based tool for counting nuclei）（ＩＴＣＮ）のプラグインを利用したImageJにより測定して、ＲＧＣ／ｍｍ2の密度として表した。
【０１５２】
構築物およびベクター
本発明者らは、緑内障もしくは蝸牛の病気などの視神経病に罹患した対象を処置するため、または神経再生および／もしくは生存を促進するために用いられ得る、図１に示された遺伝子構築物を作製した。該構築物は、ｍＢＤＮＦの同時生成および局所放出により、ＲＧＣの細胞表面上のＴｒｋＢ受容体の密度を維持または増大し、そしてＴｒｋＢ受容体経路を通したシグナル伝達を維持または増進するように設計された。
【０１５３】
該構築物は、ＴｒｋＢ受容体およびそのアゴニストである成熟型脳由来神経栄養因子をコードするトランスジーンを含む。これらのトランスジーンは、ヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ Ｉ）プロモーターまたはＣＡＧプロモーターのいずれかである単一プロモーターに動作可能に連結される。有利には、図１の構築物は、ｒＡＡＶ２ベクター内に入れられ得、コードするトランスジーンのサイズによって妨害されない。これは、第一のトランスジーンであるＴｒｋＢがウイルス２Ａペプチド配列に連結された後、ＢＤＮＦシグナルペプチドに、そしてその後、成熟型タンパク質に連結されるように該構築物が配向されているためである。ウイルス２Ａペプチドの短いＮ−末端アミノ酸配列は、ＴｒｋＢ受容体の細胞内部分に付着したままであり、Ｃ−末端ウイルス２Ａ配列からの残りのプロリンアミノ酸は、Ｎ−末端ＢＤＮＦシグナルペプチドに付着したままで、最終的には開裂後にｍＢＤＮＦタンパク質から除去されるため、この配向は免疫原性リスクも最小限に抑える。該ベクターは、対象に投与され得る、薬理学的に許容し得る緩衝溶液に入れられ得る。
【０１５４】
図２〜５は、発現ベクターの様々な実施形態を示す。図２は、カノニカルなシグナル配列（青色）（即ち、MTILFLTMVISYFGCMKA（配列番号２０]）＋プロＢＤＮＦ（赤色）およびｍＢＤＮＦ（黒色）を含有する「プラスミドＱＴＡ００１ＰＡ」として知られるベクターを示す。図３は、「プラスミドＱＴＡ００２Ｐ」として知られるベクターを示す。それは、プロＢＤＮＦをコードせず、ｍＢＤＮＦのみを生成し、ＱＴＡ００１ＰＡと同じシグナル配列（青色）をコードする。図４は、プロＢＤＮＦをコードせず、ｍＢＤＮＦのみを生成する「プラスミドＱＴＡ００３Ｐ」として知られるベクターを示す。それは、ｍＢＤＮＦのカノニカルなシグナル配列の代わりに、ＩＬ−２シグナル配列（青色）を含む。最後に、図５は、「プラスミドＱＴＡ００４Ｐ」として知られるベクターを示す。それは、プロＢＤＮＦをコードせず、代わりにｍＢＤＮＦのみを生成する。それは、新規なシグナル配列（青色）［配列番号３２］もコードする。
【０１５５】
本発明者らは、成熟型ＢＤＮＦ（ｍＢＤＮＦ）エレメントから出発して、緑内障遺伝子療法のコンセプトに関係する構築物およびベクターを生成および研究した。彼らは、プロＢＤＮＦコード領域を有さずＢＤＮＦ配列を含むプラスミド（ＱＴＡ００２Ｐ、図３参照）を用いたリポフェクタミン形質導入後の、ＨＥＫ２９３細胞からのｍＢＤＮＦの生成および放出を明確に実証した（図７参照）。該細胞から放出されたｍＢＤＮＦは、酵母および他の細胞系の製造アプローチを用いてｍＢＤＮＦの市販量を作製しようと試みた複数のグループによって報告された通り、予測された１４ｋＤａモノマーであり（ウェスタンブロットおよびＢＤＮＦのための市販の抗体を用いて測定）、タンパク質凝集体の証拠はない。それゆえｍＢＤＮＦは、ＴｒｋＢ受容体を活性化するために、タンパク質分子に非共有結合の二量体を形成させることが可能な形態で放出される。
【０１５６】
ＢＤＮＦ（ｍＢＤＮＦとより大きく伸長されたプロＢＤＮＦタンパク質とを識別せず）のためのＥＬＩＳＡを用いて、本発明者らは、内在性のカノニカルな１８アミノ酸シグナルペプチド配列（MTILFLTMVISYFGCMKA）をコードするＤＮＡ配列を新規なペプチド配列（ＱＴＡ００４Ｐ、図５参照）で置換し、ＢＤＮＦ遺伝子を含有するプラスミドによる細胞のリポフェクタミン形質導入後に、ＨＥＫ２９３インキュベーション培地に同等レベルのＢＤＮＦを放出することが可能であることも実証した（図７参照）。
【０１５７】
インターロイキン−２シグナルペプチド（QTA003P、図４参照）をコードする配列による内在性シグナルペプチドの置換は、培地からのＢＤＮＦ放出においてあまり効果的ではなかった。培地に放出されたＢＤＮＦのレベルは、現在のところおよそ１〜２ｎＭであり、このアゴニスト濃度は、特異的なＴｒｋＢ受容体を最大限に活性化させるのに十分である（およそ０．９ｎＭのＩＣ50）。ＢＤＮＦ放出のレベルは、プロＢＤＮＦとｍＢＤＮＦ配列の組み合わせを含み、１８アミノ酸のカノニカルシグナルペプチドも含むプラスミドＱＴＡ００１ＰＡ（図２参照）では、プラスミドＱＴＡ００２Ｐ（図３参照）およびＱＴＡ００４Ｐ（図５参照）に比較しておよそ３５倍高い（８７６±８７ｎｇ／ｍＬ  ＢＤＮＦ）。
【０１５８】
リポフェクタミンプラスミド形質導入の２４時間後に定量的ウェスタンブロットにより細胞内に残留するＢＤＮＦを測定し、ＱＴＡ００２ＰおよびＱＴＡ００４ＰよりもＱＴＡ００１ＰＡで低いＢＤＮＦ残留濃度が明らかとなった（図８参照）。
【０１５９】
その上、ＱＴＡ００１ＰＡにより形質導入された細胞溶解物中のＢＤＮＦを免疫反応のおよそ半量が、プロＢＤＮＦ（３２ｋＤａの分子量バンド）の形態であったが、プロＢＤＮＦのバンドは、ＱＴＡ００２Ｐ、ＱＴＡ００３ＰおよびＱＴＡ００４Ｐで形質導入された細胞の溶解物中に存在しなかったが（図９参照）、それはおそらく、これらのプラスミドがプロＢＤＮＦを伸長されたコード配列を含有しないためであろう。
【０１６０】
プロＢＤＮＦに特異的なＥＬＩＳＡを利用して、本発明者らは、ＱＴＡ００１ＰＡにより形質導入された細胞から放出されたＢＤＮＦ免疫反応性のおよそ７０ｎｇ／ｍＬ（２．２ｎＭまたは３．５％）がプロＢＤＮＦの形態であるが、大部分（９６．５％または８７６ｎｇ／ｍＬ／６３ｎＭ）がｍＢＤＮＦとして放出されることも、実証することができた（図１０参照）。伸長されたプロＢＤＮＦのコード配列を含まないＱＴＡ００２Ｐ、ＱＴＡ００３ＰまたはＱＴＡ００４Ｐにより形質導入された細胞から検出されたプロＢＤＮＦ免疫反応性はなかった。
【０１６１】
したがって、プラスミドの全てが１４ｋＤａ  ｍＢＤＮＦタンパク質を生成することが可能であるが、ＨＥＫ２９３細胞から放出されるｍＢＤＮＦの量がタンパク質貯蔵および分泌小胞へのパッケージングの効率に大きく依存することは明らかである。プラスミドＱＴＡ００１ＰＡ（図２参照）で生成されたプロＢＤＮＦとｍＢＤＮＦ配列の組み合わせを含む伸長形態のタンパク質はそれゆえ、細胞内に蓄積すると思われるより小さなｍＢＤＮＦよりもかなり効率的に、分泌小胞にパッケージングされて、インキュベーション培地に放出される。
【０１６２】
図１１を参照すると、プラスミドＱＴＡ００９Ｐ〜ＱＴＡ０１３Ｐに含まれる新規な配列による、プラスミドＱＴＡ００２Ｐに表される内在性のカノニカルなシグナルペプチド配列のコードの置換が、プラスミドでの形質導入の２４時後にＨＥＫ２９３細胞内のＢＤＮＦ濃度を上昇させることが示される。図１２により、新規な配列（プラスミドＱＴＡ００９Ｐ〜ＱＴＡ０１３Ｐ）による、プラスミドＱＴＡ００２Ｐに含まれる内在性のカノニカルなシグナルペプチドコード配列の置換が、プラスミドでの形質導入の２４時間後の測定で、ＨＥＫ２９３細胞からのＢＤＮＦの放出を増加させることが実証される（ＥＬＩＳＡによる測定）。
【０１６３】
図１３に示される通り、ウイルス２Ａペプチド配列の付加は、２つのトランスジーン：ｅＧＦＰおよびＢＤＮＦへの大きな前駆体タンパク質のコード配列の効率的なプロセシングをもたらす。ウェスタンブロットは、プラスミド：（ｉ）ＱＴＡ０１５Ｐ（ＩＲＥＳスペーサーによって分離されたＢＤＮＦおよびｅＧＦＰを発現する）、（ｉｉ）ＱＴＡ０２１Ｐ（機能的ウイルス２Ａペプチド配列によって分離されたＢＤＮＦと、それに続くｅＧＦＰを発現する）、（ｉｉｉ）ＱＴＡ０２２Ｐ（非機能的ウイルス２Ａペプチド配列によって分離された、ＢＤＮＦと、それに続くｅＧＦＰを発現する）、および（ｉｖ）ＱＴＡ０２３Ｐ（機能的ウイルス２Ａペプチド配列によって分離された、ｅＧＦＰと、それに続くＢＤＮＦのコードを発現する）、で形質導入された後２４時間目のＨＥＫ２９３細胞を示す。
【０１６４】
ＱＴＡ０２１Ｐ（ｍＢＤＮＦ−ウイルス２Ａペプチド−ｅＧＦＰのコドン最適化配列を含むプラスミド）のコード配列は、本明細書では以下の配列番号１０４として参照される：
ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCACGCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGTGGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATATTTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACTGGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGGATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATTTGCTCAAGTTGGCGGGGGATGTGGAAAGCAATCCCGGGCCAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACACAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCAGCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGAAAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGGAATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTAATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGAGCTTTACAAGTAA
［配列番号１０４］
【０１６５】
ＱＴＡ０２２Ｐ（ｍＢＤＮＦ−非機能性ウイルス２Ａペプチド−ｅＧＦＰのコドン最適化配列を含むプラスミド）のコード配列は、本明細書では以下の配列番号１０５として参照される：
ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCACGCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGTGGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATATTTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACTGGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGGATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCTGTCAAACAAACCCTCAATTTTGACTTGCTGAAGCTTGCTGGGGATGTCGAGTCCGCTGCCGCGGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACACAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCAGCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGAAAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGGAATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTAATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGAGCTTTACAAGTAA
［配列番号１０５］
【０１６６】
ＱＴＡ０２３Ｐ（ｅＧＦＰ−ウイルス２Ａペプチド−ｍＢＤＮＦのコドン最適化配列を含むプラスミド）のコード配列は、本明細書では以下の配列番号１０６として参照される：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAGGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCTCCCGTTAAACAAACTCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCTGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
［配列番号１０６］
【０１６７】
図１４Ａを参照すると、ＱＴＡ０２０Ｖベクターでのトランスフェクションの４８時間後のＨＥＫ２９３細胞ホモジネートのウェスタンブロットが示される。それは、ウイルス２Ａペプチド配列により分離されたＴｒｋＢ受容体およびＢＤＮＦを含む大きな前駆体コード領域の効率的プロセシングを示している。２つのＴｒｋＢおよびｍＢＤＮＦ免疫反応性トランスジーンは、予測された正しい分子量サイズ内である。ＴｒｋＢ受容体バンドを超える大きな前駆体タンパク質の染色が無いことに留意しなければならず、それは５つのリピートにおける前駆体タンパク質のほぼ全てまたは全てのプロセシングを示している。図１４Ｂおよび１４Ｃは、ウイルス２Ａペプチド開裂後に生成されたトランスジーンタンパク質が、プロセシング後のＨＥＫ２９３細胞において正しい細胞内コンパートメントに輸送されたことを示している（放出前に、ＴｒｋＢ受容体が細胞表面へ、そしてＢＤＮＦが貯蔵小胞へ）。
【０１６８】
図１５は、ＴｒｋＢ受容体およびＢＤＮＦの２つのコード領域を分離するウイルス２Ａペプチド配列の付加が、ｒＡＡＶ２ベクター：ＱＴＡ０２０Ｖの硝子体内注射後にマウス網膜内の２つのトランスジーンへの効率的プロセシングをもたらすことを示す。
【０１６９】
図１６は、ウイルス２Ａペプチド配列により分離されたＴｒｋＢ受容体およびＢＤＮＦのコードを含むｒＡＡＶ２ベクターであるＱＴＡ０２０Ｖの注射後の免疫細胞化学的測定により示されたマウス網膜神経節細胞層内のトランスジーンの発現を示す。標的網膜神経節細胞体が、抗Ｂｒｎ３Ａ抗体で赤色に染色され、細胞核は、ＤＡＰＩで青色に対比染色されて、網膜層を区別している。
【０１７０】
図１７を参照すると、硝子体内注射（２μｌの９ｘ１０12ベクター粒子／ｍｌ）による、ＱＴＡ０２０Ｖ（ウイルス２Ａペプチド配列により分離されたＴｒｋＢ受容体およびＢＤＮＦのコードを含む）の前処置が、ｒＡＡＶ２−ＣＡＧ−ｅＧＦＰベクターで処置された対照動物に対比して、マウスの視神経挫滅後の網膜神経節細胞の生存に有意な神経保護効果を付与することが示される。ＱＴＡ０２０Ｖベクターによる神経保護レベルはまた、ＢＤＮＦのみを発現するベクターにより提供されるレベルよりも大きかった。３群全ての動物を、視神経障害処置に供し、網膜神経節細胞の数を、損傷の７日後に測定した。網膜神経節細胞は、偽処置での挫滅を受けた動物に対比して、対照（黒色のバー）で７１％減少した（データは示さない。）
【０１７１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月22日(2017.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）をコードする第一のコード配列と、前記ＴｒｋＢ受容体のアゴニストをコードする第二のコード配列とに動作可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子構築物を含む組換えベクターであって、前記アゴニストが、成熟型ＢＤＮＦまたは成熟型ＮＴ−４であり、前記第二のコード配列が、前記ＴｒｋＢ受容体の前記アゴニストの分泌を増幅するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記遺伝子構築物が、前記第一のコード配列と前記第二のコード配列との間に配置されたスペーサー配列を含み、前記スペーサー配列が、消化され、それにより前記ＴｒｋＢ受容体および前記アゴニストを別個の分子として生成するように構成されたペプチドスペーサーをコードする、組換えベクター。
【請求項２】
前記遺伝子構築物が、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＨＰＥ）をコードするヌクレオチド配列を含み、場合により前記ＷＨＰＥが、実質的に配列番号５７もしくは５８に表される核酸配列、または配列番号５７もしくは５８と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
前記遺伝子構築物が、ポリＡテールをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により前記ポリＡテールが、実質的に配列番号５９に表される核酸配列、または配列番号５９と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項４】
前記プロモーターが、ヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ Ｉ）プロモーターであり、場合により前記プロモーターが、実質的に配列番号１に表されるヌクレオチド酸配列、または配列番号１と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項５】
前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーターであり、場合により前記プロモーターが、実質的に配列番号２、３もしくは４８に表されるヌクレオチド酸配列、または配列番号２、３もしくは４８と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項６】
前記スペーサー配列が、ウイルスペプチドスペーサー配列、より好ましくはウイルス２Ａペプチドスペーサー配列を含み、それをコードする、請求項１〜５のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項７】
前記ペプチドスペーサー配列が、実質的に配列番号４に表されるアミノ酸配列、または配列番号４と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項８】
前記スペーサー配列が、実質的に配列番号５に表されるヌクレオチド配列、または配列番号５と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項９】
前記スペーサー配列が、実質的に配列番号６に表されるアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
前記スペーサー配列が、実質的に配列番号７に表されるヌクレオチド配列、または配列番号７と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
前記ペプチドスペーサー配列が、実質的に配列番号８に表されるアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
前記第一のコード配列が、ＴｒｋＢのヒトカノニカルアイソフォームをコードするヌクレオチド配列を含み、ＴｒｋＢの前記カノニカルアイソフォームが、実質的に配列番号９に表されるアミノ酸配列、または配列番号９と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項１３】
前記第一のコード配列が、実質的に配列番号１０に表されるヌクレオチド配列、または配列番号１０と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項１４】
前記第一のコード配列が、ＴｒｋＢのアイソフォーム４をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項１５】
ＴｒｋＢの前記アイソフォーム４が、実質的に配列番号１１に表されるアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１４に記載の組換えベクター。
【請求項１６】
前記第一のコード配列が、実質的に配列番号１２に表されるヌクレオチド配列、または配列番号１２と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１４または１５のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項１７】
前記第一のコード配列が、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、配列番号９の５１６位、７０１位、７０５位、７０６位および／または８１６位の１つまたは複数のチロシン残基が、異なるアミノ酸残基に修飾されている、請求項１〜１６のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項１８】
配列番号９の５１６位、７０１位、７０５位、７０６位および／または８１６位の少なくとも２つ、３つまたは４つのチロシン残基が、異なるアミノ酸残基に修飾されている、請求項１７に記載の組換えベクター。
【請求項１９】
配列番号９の５１６位、７０１位、７０５位、７０６位および／または８１６位の５つのチロシン残基全てが、異なるアミノ酸残基に修飾されている、請求項１８に記載の組換えベクター。
【請求項２０】
前記チロシン残基または各チロシン残基が、グルタミン酸に修飾されている、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項２１】
前記ＴｒｋＢ受容体の前記修飾形態が、実質的に配列番号１３に表されるアミノ酸配列、または配列番号１３と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項２２】
第一のコード配列が、実質的に配列番号１４に表されるヌクレオチド配列、または配列番号１４と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項２１に記載の組換えベクター。
【請求項２３】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号４９もしくは５５に表されるアミノ酸配列、または配列番号４９もしくは５５と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含むニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）をコードし、そして／あるいは前記第二のコード配列が、実質的に配列番号５０もしくは５６に表されるヌクレオチド配列、または配列番号５０〜５６と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項２４】
前記第二のコード配列が、成熟型ＢＤＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項２５】
前記成熟型ＢＤＮＦが、実質的に配列番号１８に表されるアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項２４に記載の組換えベクター。
【請求項２６】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号１９に表されるヌクレオチド配列、または配列番号１９と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項２５に記載の組換えベクター。
【請求項２７】
前記第二のコード配列が、前記ＴｒｋＢ受容体の前記アゴニストのためのシグナルペプチド、最も好ましくはＢＤＮＦのためのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項２８】
前記ヌクレオチド配列が、ＢＤＮＦのための前記カノニカルなシグナルペプチドをコードし、前記第二のコード配列が、実質的に配列番号２０に表されるアミノ酸配列、または配列番号２０と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含むシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載の組換えベクター。
【請求項２９】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号２１に表されるヌクレオチド配列、または配列番号２１と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項２７に記載の組換えベクター。
【請求項３０】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号２３、２５、２７もしくは２９のいずれか１つに表されるシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、または前記シグナルペプチドが、実質的に配列番号２２、２４、２６もしくは２８のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２９のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項３１】
前記第二のコード配列が、実質的に配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１もしくは１０３のいずれか１つに表されるシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、または前記シグナルペプチドが、実質的に配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００もしくは１０２のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項３２】
前記構築物が、実質的に配列番号１０７もしくは１０８に表されるヌクレオチド配列、または配列番号１０７もしくは１０８と少なくとも６５％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜３１のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項３３】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項１〜３２のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項３４】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０またはＡＡＶ−１１である、請求項３３に記載の組換えベクター。
【請求項３５】
前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ血清型−２である、請求項３４に記載の組換えベクター。
【請求項３６】
薬剤としての使用または治療における使用のための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項３７】
視神経障害もしくは蝸牛障害を処置、予防もしくは改良することにおける使用のため、または神経再生および／もしくは生存を促進するための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項３８】
処置される前記視神経障害が、頭部もしくは顔面への外傷、または血管損傷など、ＲＧＣの損失をもたらす任意の病理生理学的状態、例えば視神経からの入力情報を受け取る目の構造または脳の領域への血液供給の部分的または完全な喪失であるか、あるいは形質転換されていない、または形質転換されている幹細胞を患者の目または視力に関連する領域に導入することによりＲＧＣの置換を支援するのに用いられる、請求項３７に記載の使用のためのベクター。
【請求項３９】
処置される前記視神経障害が、緑内障である、請求項３８に記載の使用のためのベクター。
【請求項４０】
処置される前記蝸牛障害が、難聴または聴覚消失である、請求項３７に記載の使用のためのベクター。
【請求項４１】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の組換えベクターと、医薬的に許容し得るビヒクルとを含む医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の組換えベクターを、医薬的に許容し得るビヒクルと接触させることを含む、請求項４１に記載の医薬組成物を調製する方法。
【国際調査報告】
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