(57)【要約】  本明細書において、活性化された内在性ＲＴＰ１遺伝子を含む、改善された匂い物質受容体機能を有する細胞株であって、該細胞株はさらにＲＴＰ１タンパク質を発現する細胞株が提供される。さらに本明細書において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来の技術を用いて真核細胞において内在性ＲＴＰ１遺伝子を特異的に活性化させるための方法が提供される。さらに本明細書において、前記細胞株における香料または芳香のモジュレーターのような所望の効果を有する化合物を同定するための方法が提供される。
2018520665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に活性化された内在性ＲＴＰ１遺伝子を含む細胞であって、さらにＲＴＰ１タンパク質を発現する、細胞。
【請求項２】
非嗅覚系細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株に由来する、請求項２記載の細胞。
【請求項４】
匂い物質受容体をコードする核酸をさらに含む、請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項５】
前記匂い物質受容体は、インドール匂い物質受容体、スカトール匂い物質受容体およびムスク匂い物質受容体からなる群から選択される、請求項４記載の細胞。
【請求項６】
内在性ＲＴＰ１遺伝子座の上流にプロモーターを含み、ここで、前記ＲＴＰ１遺伝子は、前記細胞内で発現される、請求項１から５までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項７】
前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである、請求項６記載の細胞。
【請求項８】
Ｃａｓタンパク質を含む、請求項１から７までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項９】
転写活性化ドメインに融合されたｄＣａｓタンパク質を含む、請求項１から５までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項１０】
真核細胞において内在性ＲＴＰ１遺伝子を活性化させるための方法であって、
ａ．  前記ＲＴＰ１遺伝子の上流のゲノム標的部位に相補的なガイドＲＮＡを導入すること、および
ｂ．  前記ガイドＲＮＡとの複合体を作製して、ガイドＲＮＡ−Ｃａｓタンパク質複合体を形成するために、Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質を導入すること
を含む方法。
【請求項１１】
プロモーターを含むドナーＤＮＡを、内在性ＲＴＰ１遺伝子座の上流のゲノム標的部位に導入することをさらに含み、ここで、前記プロモーターは、前記ＲＴＰ１遺伝子の発現を駆動する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記複合体は、転写活性化ドメインに融合されたｄＣａｓ９タンパク質をさらに含み、ここで、前記活性化ドメインは、前記ＲＴＰ１遺伝子の発現を駆動する、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９ニッカーゼである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記ガイドＲＮＡ−Ｃａｓタンパク質複合体によって、前記ガイドＲＮＡ配列に隣接する前記標的核酸配列を切断することをさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
匂い物質受容体をコードする核酸を前記細胞内に導入することをさらに含む、請求項１０から１７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
非嗅覚系細胞において嗅覚受容体の活性を活性化、模倣、遮断、阻害、調節および／もしくは増強する化合物または化合物の混合物を同定するための方法であって、前記細胞は、活性化された内在性ＲＴＰ１遺伝子を含み、前記方法は、
ａ．  前記受容体またはそのキメラもしくは断片を、前記受容体を活性化、模倣、遮断、阻害、調節および／もしくは増強する化合物または化合物の混合物と接触させること、ならびに
ｂ．  前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすか否かを判断すること
をさらに含む方法。
【請求項２０】
前記嗅覚受容体は、ムスク受容体および悪臭受容体からなる群からのものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記悪臭受容体は、スカトール受容体またはインドール受容体から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記ムスク受容体は、多環状ムスク受容体およびニトロムスク受容体から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
請求項１９から２２までのいずれか１項記載の方法によって得られた非嗅覚系細胞内の嗅覚受容体の活性を活性化、模倣、遮断、阻害、調節および／もしくは増強する化合物または化合物の混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術分野は、匂い物質および芳香の受容体、ならびに匂い物質および／もしくは芳香化合物またはそれらのモジュレーターの同定に使用することができるアッセイを対象とする。このアッセイはより具体的には、改善された匂い物質受容体活性を示す操作された細胞株を対象とする。
【０００２】
背景技術
匂いは、揮発性のフレーバーおよびフレグランス化合物と、嗅覚上皮組織の嗅覚受容体ニューロンの膜上に存在する匂い物質受容体（ＯＲ）タンパク質との間の相互作用を介して、末梢嗅覚系（すなわち鼻）において最初にコードされる。そのような相互作用は、匂いに特異的な組み合わせの様式で生じ、いずれかの単一のＯＲが複数の匂い物質によって活性化されることができ、また反対に大半の匂い物質がいくつかの異なるＯＲを活性化させることもできる。所与の匂い物質／芳香化合物または混合物について、これらの受容体相互作用は、脳内で神経生理学的シグナルを生成し、最終的に意識的な匂い知覚を生じさせる。ヒトゲノムにおけるおよそ４００個のＯＲ遺伝子は、数千またはそれを上回る匂い物質刺激によって活性化されることができ、我々が広範な嗅覚を知覚しうるのは、匂い物質と受容体との間の組み合わせの相互作用の固有の複雑さゆえである。これらの相互作用を解明することは、これらに限定されるわけではないが、例えば、不快な匂いの知覚を遮断する悪臭中和剤、非生分解性または有毒な化合物と置き換わる新たなフレーバーおよびフレグランス成分、ならびに天然源からの化合物の入手が困難であることへの我々の依存を制限することになる匂い増強体といった有益な生成物の発見につながる可能性がある。
【０００３】
ＯＲコードを確実に解読するには、これに限定されるものではないが、例えば、細胞表面上にＯＲを機能的に発現させうる新規の方法が必要である。ＯＲ活性の網羅的な特徴付けのための揮発性のフレーバーおよびフレグランス化合物のライブラリーを用いたハイスループットスクリーニングに適した非嗅覚系細胞（これに限定されるものではないが例えば、異種細胞株）においてＯＲを機能的に発現させる方法が、さらに必要とされている。これによって、非常に望ましい悪臭中和剤、匂いモジュレーターおよび新規のフレーバーまたはフレグランス化合物の発見を著しく促進させることができよう。
【０００４】
嗅覚ニューロンに由来する特定のタンパク質は、非嗅覚系細胞株における匂い物質受容体の、細胞表面での局在を改善することができる。これらのタンパク質は、小胞体から細胞のゴルジ体および原形質膜への匂い物質受容体の輸送を助けることによって機能する。受容体輸送タンパク質１（ＲＴＰ１）、受容体輸送タンパク質２（ＲＴＰ２）および受容体発現促進タンパク質１（ＲＥＥＰ１）は、匂い物質受容体の原形質膜での局在を改善し、したがって非嗅覚系細胞において機能することが報告されている。ＲＴＰ１は、最も効果的な匂い物質受容体シャペロンであることが報告されている。このタンパク質は、部分的に、小胞体中の匂い物質受容体との相互作用によって作用することが示されている。したがって、匂い物質と匂い物質受容体との間の組み合わせの相互作用を網羅的に解明するには、ハイスループットスクリーニングに適しておりかつＲＴＰ１遺伝子を含む非嗅覚系細胞株が非常に望ましい。
【０００５】
内在性ＲＴＰ１遺伝子座から遺伝子を安定的に発現させることにより、ＲＴＰ１タンパク質（ＲＴＰ１Ｓを含むがこれに限定されない）を一貫して生成する細胞株がさらに望ましい。しかし、内在性ＲＴＰ１遺伝子を安定に発現する細胞株を開発するための現在の技術は、通常であれば遺伝子を発現しない培養細胞にＤＮＡを挿入するための非効率的でかつ煩雑な分子生物学的アプローチを含む。したがって、安定した細胞株を開発するためのこのようなアプローチを回避し、かつ組換え方法を使用しなくても内在性ＲＴＰ１の一貫した発現を可能にする技術を用いることが望ましい。
【０００６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、挿入および欠失のような正確なゲノム改変を生成するために使用される高効率のゲノム編集ツールである。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の特定の使用によって、通常であれば細胞株においてサイレントでありうる遺伝子の発現が可能となる。遺伝子の上流に転写プロモーターを組み込むことによって、細胞株は、通常であれば不活性である内在性遺伝子を発現することができる。
【０００７】
発明の概要
細胞であって、前記細胞内に活性化された内在性ＲＴＰ１遺伝子を含み、前記細胞はさらに、ＲＴＰ１タンパク質を発現する細胞。
【０００８】
本明細書において、活性化された内在性ＲＴＰ１遺伝子を含む、改善された匂い物質受容体機能を有する非嗅覚系細胞株が提供される。
【０００９】
本明細書において、細胞内に活性化された内在性ＲＴＰ１遺伝子を含む非嗅覚系細胞株であって、さらに、ＲＴＰ１タンパク質を発現する非嗅覚系細胞株が提供される。
【００１０】
さらに本明細書において、真核細胞において内在性ＲＴＰ１遺伝子を活性化させるための方法であって、
ａ．  前記ＲＴＰ１遺伝子の上流のゲノム標的部位に相補的なガイドＲＮＡを導入すること、
ｂ．  前記ガイドＲＮＡとの複合体を作製するためにＣａｓヌクレアーゼタンパク質を導入すること、および
ｃ．  前記ＲＴＰ１遺伝子のための遺伝子活性化エレメントを特異的に送達するために前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９ゲノムターゲティング複合体を使用すること
を含む方法が提供される。
【００１１】
さらに本明細書において、非嗅覚系細胞において嗅覚受容体の活性を活性化、模倣、遮断、阻害、調節および／または増強する化合物を同定するための方法であって、前記細胞は、活性化された内在性ＲＴＰ１遺伝子を含み、前記方法は、
ａ．  前記受容体またはそのキメラもしくは断片を、前記受容体を活性化、模倣、遮断、阻害、調節および／または増強する化合物と接触させること、ならびに
ｂ．  前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすか否かを判断すること
をさらに含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１に、内在性ＲＴＰ１遺伝子座およびゲノム編集に使用される特定の標的部位の概略図を示す。
【図２】図２に、ＣＭＶプロモーター挿入プロセスの概略図を示す。
【図３】図３に、野生型および組換え型の対立遺伝子および対応する遺伝子型決定領域の概略図を示す。
【図４】図４に、操作された細胞株におけるＣＭＶプロモーターの組み込みの特性解析を示す。
【図５】図５に、操作された細胞株におけるＲＴＰ１ｍＲＮＡ発現の特性解析を示す。
【図６】図６に、操作された細胞株におけるＲＴＰ１タンパク質発現の特性解析を示す。
【図７】図７に、増加する濃度のインドールの存在下でのマウス受容体Ｏｌｆｒ７４１の用量反応曲線を示す。
【図８】図８に、増加する濃度のインドールの存在下でのマウス受容体Ｏｌｆｒ７４２の用量反応曲線を示す。
【図９】図９に、増加する濃度のブルカノリドの存在下でのマウス受容体Ｏｌｆｒ９６の用量反応曲線を示す。
【図１０】図１０に、増加する濃度のブルカノリドの存在下でのヒト受容体ＯＲ１１Ａ１の用量反応曲線を示す。
【図１１】図１１に、増加する濃度のインドールの存在下でのマウス受容体Ｏｌｆｒ７４０の用量反応曲線を示す。
【図１２】図１２に、増加する濃度のカルボン−（−）の存在下でのヒト受容体ＯＲ１Ａ１の用量反応曲線を示す。
【００１３】
詳細な説明
本明細書中の説明および付属の特許請求の範囲に関して、「または」の使用は、他に記載がない限り「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は互換的であり、限定することを意図するものではない。
【００１４】
さらに、様々な実施形態の記載において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が用いられる場合に、いくつかの特定の例においては、ある実施形態を、「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という言語を用いて代替的に記載しうることを当業者であれば理解するであろうということが理解されるべきである。
【００１５】
一実施形態において、匂い物質受容体をコードする核酸を含む細胞が提供される。
【００１６】
さらなる一実施形態において、Ｏｌｆｒ７４１、Ｏｌｆｒ７４２、Ｏｌｆｒ９６、Ｏｌｆｒ７４０、ＯＲ１Ａ１およびＯＲ１１Ａ１からなる群から選択される匂い物質受容体をコードする核酸を含む細胞が提供される。
【００１７】
なおさらなる一実施形態において、内在性ＲＴＰ１遺伝子座の上流に構成的プロモーターを含む細胞であって、それにより該プロモーターが該内在性ＲＴＰ１遺伝子の発現を駆動する細胞が本明細書において提供される。
【００１８】
マウスの嗅覚ニューロンにおいて、ＲＴＰ１転写物は、２つの択一的な翻訳開始部位を含み、これらは、長いバージョン（ＲＴＰ１Ｌ）および短いバージョン（ＲＴＰ１Ｓ）の２つの異なる形態のＲＴＰ１タンパク質をもたらしうる。しかし、マウスの嗅覚ニューロンで主に発現されるのは、ＲＴＰ１Ｓタンパク質である。また、ＲＴＰ１Ｓコード配列がＲＴＰ１Ｌ内に含まれていても、完全なＲＴＰ１コード配列を異種発現する非嗅覚系細胞（これに限定されるものではないが例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）は、主にＲＴＰ１Ｌを発現する。しかし、ＲＴＰ１Ｓは、細胞表面でのＯＲ発現に関してＲＴＰ１Ｌよりも非常に優れていることが知られているため、非嗅覚系細胞における匂い物質受容体のスクリーニングにはＲＴＰ１Ｓが好ましい。我々は驚くべきことに、完全なＲＴＰ１遺伝子の内在的な活性化が、ＲＴＰ１Ｓの発現を優先的にもたらすことを見出した。
【００１９】
さらなる一実施形態において、ＲＴＰ１遺伝子の短いバージョンであるＲＴＰ１Ｓの発現を駆動する構成的プロモーターを内在性ＲＴＰ１遺伝子座の上流に含む細胞が本明細書において提供される。
【００２０】
本明細書において、ＲＴＰ１タンパク質の短いバージョンであるＲＴＰ１Ｓをさらに発現する、細胞内に活性化された内在性ＲＴＰ１遺伝子を含む非嗅覚系細胞株が提供される。
【００２１】
なおさらなる一実施形態において、構成的プロモーターは、ＣＭＶ、ＰＧＫ、ＥＦ１ａおよびＳＶ４０からなる群から選択される。
【００２２】
一実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルスに由来するＣＭＶである。
【００２３】
一実施形態において、本明細書において提供される細胞は、内在性ＲＴＰ１遺伝子座の上流に誘導性プロモーターを含み、それによって、対応するオペレーターが存在する場合に、該プロモーターは、ＲＴＰ１遺伝子の発現を駆動する。
【００２４】
さらなる一実施形態において、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン（またはその類似体であるドキシサイクリン）の投与によって誘導可能なテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーターである。
【００２５】
一実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
【００２６】
さらなる一実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９、ｄＣＡｓ９（失活したＣａｓ９）およびＣａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される。
【００２７】
一実施形態において、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列は、従来技術による規則（Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  （２０１４））および効率的なゲノムターゲティングのための公開されているガイドＲＮＡ設計ツール（例えばｗｗｗｓ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ／ｅｘｔｅｒｎａｌ／ｔｏｏｌｓ／ｇＲＮＡＳｒｃ．ｊｓｐ）に基づいて設計されうる。Ｃａｓ９により生成された特定の二本鎖ＤＮＡ切断部の両側に８００ｂｐの長さで存在するホモロジーアームを使用することができる。内在性ＲＴＰ１開始部位の前に望ましくない翻訳開始部位が存在することを避けるためには、ＣＭＶプロモーターの組み込み部位を慎重に検討することが有用である。
【００２８】
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９操作に使用される元の細胞株は、哺乳動物由来のものであり、かつＲＴＰ１遺伝子座を有するものであることが望ましい。そうした細胞株としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＯＰ６、ＨｅＬａ−Ｓ３、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＰＣ−３、Ｃａｌｕ１、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａＢ、ＨｅＬａＴ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ  Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＳ−７、ＨＬ−６０、ＬＮＣａｐ、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＣＫＩＩ、ＳｋＢｒ３、ベロ細胞、不死化嗅覚細胞、不死化味覚細胞およびそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞株は、当業者に知られている様々な供給源より入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナサス）参照）。
【００２９】
したがっていくつかの実施形態において、安定な細胞株は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＯＰ６、ＨｅＬａ−Ｓ３、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＰＣ−３、Ｃａｌｕ１、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａＢ、ＨｅＬａＴ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１，１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ  Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＳ−７、ＨＬ−６０、ＬＮＣａｐ、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＣＫＩＩ、ＳｋＢｒ３、ベロ細胞、不死化嗅覚細胞、不死化味覚細胞およびそれらのトランスジェニック変種からなる群から選択される。
【００３０】
さらなる一実施形態において、ガイドＲＮＡ配列とＣａｓ９タンパク質との複合体によって、細胞に送達される該複合体に隣接する標的核酸配列を切断することができ、その際、前記方法は、ＣＭＶプロモーターを含むドナーＤＮＡを細胞に導入することをさらに含む。
【００３１】
一実施形態において、ガイドＲＮＡ配列とＣａｓ９タンパク質との複合体によって、該ガイドＲＮＡ配列とＣａｓ９タンパク質との複合体に隣接する標的核酸配列を切断することができ、前記方法は、切断部位での細胞の相同組換え修復機構を通じてＣＭＶプロモーターを含むドナーＤＮＡを導入することをさらに含む。
【００３２】
さらなる一実施形態において、細胞株は、内在性ＲＴＰ１遺伝子をＣＭＶプロモーター下で安定に発現するように改変される。
【００３３】
さらなる一実施形態において、ドナーＤＮＡはまた、抗生物質選択カセット（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子を含む）を含みうる。ＤＮＡ送達後に抗生物質含有培地内での細胞の培養は、適切なＤＮＡの組み込みを受けなかった細胞が排除されるため、有益であってよく、このようにして、耐性マーカー、したがってドナーＤＮＡ（例えば構成的プロモーターＣＭＶ）の望ましい組み込みを獲得した組換えクローン細胞集団を、効率的に選択することができる。そのような抗生物質耐性遺伝子はその後、フリッパーゼ酵素によって特異的に認識される隣接する「ｆｒｔ」部位を用いた該遺伝子の操作によって除去されうる。次いで、この酵素を細胞に送達することによってこのカセットが除去される。
【００３４】
一実施形態において、複合体は、ゲノム内の特定の位置を標的とし、ＤＮＡを切断する必要なくＲＴＰ１のような下流の内在性遺伝子を活性化させる転写因子をさらにリクルートすることによって機能する。これは、Ｃａｓ９タンパク質を転写活性化ドメインに融合させて複合体を形成することによって行われ、その際この複合体は、標的核酸配列を切断することができない。この方法によって、ガイドＲＮＡの指示によるＣａｓ９融合転写活性化ドメインのＤＮＡターゲティングが（すなわちＲＴＰ１遺伝子の上流で）提供される。プロモーターの組み込みを可能にするためにＤＮＡを切断する代わりに、これは、ゲノムを操作または改変する必要なく遺伝子を活性化させる転写因子を一時的に結合させてリクルートし、すなわちｄという。このことは、例えばＶＰ６４、ＶＰＲおよびＳＡＭなどの特定の転写因子のリクルートエレメントに融合されるｄＣａｓ９と呼ばれる非活性化バージョンのＣａｓ９の使用によって行われることができ、また改変されたガイドＲＮＡ（例えば短縮型ガイドＲＮＡ）の使用によって行われることもできる。この融合タンパク質は、核酸を切断しない。
【００３５】
一実施形態において、本明細書において、嗅覚受容体をコードする核酸を細胞に導入することを含む方法が提供される。
【００３６】
さらなる一実施形態において、本明細書において、非嗅覚系細胞において嗅覚受容体の活性を活性化、模倣、遮断、阻害、調節および／または増強する化合物を同定するための方法であって、前記細胞は、活性化された内在性ＲＴＰ１遺伝子を含み、前記方法は、
ａ．  前記受容体またはそのキメラもしくは断片を、前記受容体を活性化、模倣、遮断、阻害、調節および／または増強する化合物と接触させること、ならびに
ｂ．  前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすか否かを判断すること
をさらに含む方法が提供される。
【００３７】
一実施形態において、嗅覚受容体は、ムスク受容体および悪臭受容体からなる群からのものである。
【００３８】
特定の一実施形態において、悪臭受容体は、スカトール受容体またはインドール受容体から選択される。
【００３９】
特定の一実施形態において、ムスク受容体は、多環状ムスク受容体およびニトロムスク受容体から選択される。
【００４０】
一実施形態において、匂い物質受容体をコードする核酸は、Ｇｏｌｆタンパク質が実質的に存在しない状態で導入される。
【００４１】
一実施形態において、以下のステップが実行される。
【００４２】
１．  （１）内在性ＲＴＰ１ゲノム座の近傍に位置する所望のゲノムＤＮＡ組み込み部位に特異的な「ガイドＲＮＡ」をコードするＤＮＡ、および
（２）構成的に活性な転写プロモーターを含む、前記ゲノム座に組み込むべき「ドナーＤＮＡ」
を設計することを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて細胞株ゲノムを編集するステップ、
２．  ステップ１で操作されたＤＮＡを、哺乳動物の細胞株に導入するステップ、
３．  前記ドナーＤＮＡが前記所望のゲノム座に組み込まれており、かつ前記内在性ＲＴＰ１遺伝子の活性化によりＲＴＰ１  ｍＲＮＡを生成する細胞株を選択するステップ、
４．  前記選択された細胞株に、匂い物質受容体ＤＮＡ配列を導入するステップ、
５．  受容体またはキメラまたは断片を化合物と接触させ、該化合物が匂い物質受容体の活性に影響を及ぼすか否かのアッセイを行うステップ。
【００４３】
本明細書において提供される方法によって、細胞株を使用して、例えば化粧品用途および工業用途の匂い増強体および匂い遮断体（例えば、香料、香料増強体、フレーバー増強体、家庭用脱臭体および身体脱臭体）のような成分を見出すことが可能となる。新規な成分は、より好ましい香気性、毒性および生物分解性のプロフィールを提供することができ、かつ／またはより大きな効力を示すことができる。
【００４４】
したがって、本明細書に開示された方法のいずれか１つによって得られた非嗅覚系細胞において嗅覚受容体の活性を活性化、模倣、遮断、阻害、調節および／もしくは増強する化合物または化合物の混合物。
【００４５】
一実施形態において、通常のＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてはサイレント（不活性）であるＲＴＰ１遺伝子を特異的かつ構成的に活性化させるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、異種発現系における匂い物質受容体の増強された機能的発現が提供される。
【００４６】
定義
特に指定しない限り、以下の用語は、それらに与えられた意味を有する。
【００４７】
「内在性遺伝子」は、生物、組織または細胞内に由来する遺伝子を指す。
【００４８】
「機能的効果」という用語には、間接的または直接的に受容体の影響下にある任意のパラメーター、例えば機能的、物理的および化学的効果の判断が含まれる。これには、これらに限定されるものではないが例えば、リガンド結合、イオンフラックス、膜電位、電流、転写、Ｇタンパク質結合、ＧＰＣＲリン酸化または脱リン酸化、シグナル伝達受容体−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度（例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ  ＩＰ３または細胞内Ｃａ２＋）のインビトロ、インビボおよびエキソビボでの変化が含まれ、さらに、他の生理学的効果、例えば神経伝達物質またはホルモン放出の増加または減少も含まれる。
【００４９】
アッセイの文脈における「化合物が活性に影響を及ぼすか否かを判断する」という句は、間接的または直接的にＯＲファミリーメンバーの影響下にあるパラメーター、例えば機能的、物理的および化学的な効果を増加または減少させる化合物についてのアッセイを指す。そのような機能的効果は、当業者に知られているいずれの手段によって測定することもでき、これらに限定されるものではないが、例えば、分光学的特性（例えば蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的特性（例えば形状）、クロマトグラフ特性または溶解特性の変化、パッチクランプ、電位感受性色素、全細胞電流、放射性同位体流出、誘導マーカー、卵母細胞ＯＲ遺伝子発現；組織培養細胞ＯＲ発現；ＯＲ遺伝子の転写活性化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化；イオンフラックスアッセイ；細胞内セカンドメッセンジャー、例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰおよびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の変化；細胞内カルシウムレベルの変化；神経伝達物質放出などによって測定することができる。
【００５０】
「発現ベクター」という用語は、本発明の核酸配列を、インビトロまたはインビボで、原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物の細胞を含むいずれかの細胞において構成的または誘導的に発現させる目的での、いずれの組換え発現系をも指す。この用語には、線状または環状の発現系が含まれる。この用語には、エピソームのままであるかまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれた発現系が含まれる。この発現系は、自己複製能力を有することも有しないこともでき、すなわち、細胞内で一過性の発現のみを駆動することもできる。この用語には、組換え核酸の転写に必要な最低限の要素のみを含む組換え発現カセットが含まれる。
【００５１】
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、かつ発現ベクターの複製または発現を支援する細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌または真核細胞、例えば酵母、昆虫、両生類または哺乳動物の細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３など、例えば培養細胞、外植片および生体内細胞であることができる。
【００５２】
ＯＲ遺伝子またはタンパク質の「インヒビター」、「アクチベーター」、「カウンタラクタント」および「モジュレーター」は、嗅覚伝達についてインビボ、インビトロおよびインビボアッセイを用いて特定される阻害分子、活性化分子または調節分子を指すために互換的に用いられ、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、エンハンサー、並びにそれらのホモログおよび模倣物である。インヒビターとは、例えば、結合することによって刺激を部分的または完全に遮断し、活性化を減少、妨害、遅延させ、嗅覚伝達を不活化、脱感作または下方調節する化合物であり、例えばアンタゴニストである。アクチベーターとは、例えば、結合することによって活性化を刺激、増加、開放活性化、促進、増強させ、嗅覚伝達を感作または上方調節する化合物であり、例えばアゴニストである。モジュレーターには、例えば受容体と以下のものとの相互作用を変更する化合物が含まれる：アクチベーターまたはインヒビターに結合する細胞外タンパク質（例えば、匂い物質結合タンパク質および疎水性キャリアファミリーの他のメンバー）；Ｇタンパク質；キナーゼ（例えば、受容体の不活性化および脱感作に関与するロドプシンキナーゼおよびβアドレナリン受容体キナーゼのホモログ）；およびアレスチン（これもまた、受容体を不活性化および脱感作する）。モジュレーターには、ＯＲファミリーメンバーの遺伝的に改変されたバージョン、例えば活性が改変されたバージョンならびに天然由来および合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低化学分子などが含まれうる。インヒビターおよびアクチベーターについてのそのようなアッセイには、例えば、細胞または細胞膜におけるＯＲファミリーメンバーの発現、フレーバーもしくはフレグランス分子、例えばムスクもしくは悪臭の存在または不在下での推定モジュレーター化合物の適用、および次いで上記のような嗅覚伝達に対する機能的効果の判断が含まれる。潜在的なアクチベーター、インヒビターまたはモジュレーターを用いて処理されたＯＲファミリーメンバーを含むサンプルまたはアッセイを、このインヒビター、アクチベーターまたはモジュレーターを含まない対照サンプルと比較することによって、調節の程度が調べられる。
【００５３】
「Ｎ末端ドメイン」領域は、Ｎ末端で始まり、最初の膜貫通領域の始点に近い領域まで延びる。７つの「膜貫通領域」を含む「膜貫通ドメイン」とは、原形質膜内に存在するＯＲポリペプチドのドメインを指し、これには、対応する細胞質（細胞内）および細胞外のループも含まれうる。７つの膜貫通領域ならびに細胞外および細胞質のループは、Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５７：１０５−３２  （１９８２）またはＳｔｒｙｅｒにおいて記載されているような標準的な方法を用いて特定することができる。膜貫通ドメインの一般的な二次および三次構造、特に嗅覚受容体のようなＧタンパク質共役受容体の７つの膜貫通ドメインは、当技術分野で知られている。したがって、一次構造配列は、以下に詳細に説明するように、既知の膜貫通ドメイン配列に基づいて設計または予測されることができる。これらの膜貫通ドメインは、可溶性相および固相の双方でインビトロでのリガンド結合アッセイに有用である。
【００５４】
「核酸」または「核酸配列」という用語は、１本鎖または２本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを指す。この用語には、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸、すなわちオリゴヌクレオチドが包含される。またこの用語には、合成骨格を有する核酸様構造体も包含される。別段の記載がない限り、特定の核酸配列には、明示された配列以外に、その保存的に改変された変異体（例えば縮重コドン置換体）および相補的配列も暗に包含される。具体的には、縮重コドン置換体は、例えば１つもしくは複数の選択されたコドンの第３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列の生成により達成されることができる。
【００５５】
匂い物質受容体、すなわち「ＯＲ」とは、嗅覚細胞において発現されるＧタンパク質共役受容体のファミリーの１つまたは複数のメンバーを指す。嗅覚受容体細胞は、形態に基づいて、または嗅覚細胞において特異的に発現されるタンパク質の発現によっても同定されることができる。ＯＲファミリーメンバーは、嗅覚伝達のための受容体として作用する能力を有しうる。
【００５６】
匂い物質受容体、すなわち「ＯＲ」の核酸は、「Ｇタンパク質共役受容体活性」を有する７つの膜貫通領域を有するＧＰＣＲのファミリーをコードし、例えば、それらは細胞外刺激に応答してＧタンパク質に結合し、かつセカンドメッセンジャー、例えばＩＰ３、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰおよびＣａ２＋の生成を、酵素、例えばホスホリパーゼＣおよびアデニル酸シクラーゼの刺激を介して促進することができる。
【００５７】
「ＯＲ」のポリペプチドは、約１ｋｂの長さの単一エクソンによりコードされる７回膜貫通型ドメインを有するＧタンパク質共役型受容体スーパーファミリーに属し、特徴的な嗅覚受容体特異的アミノ酸モチーフを示すと考えられる。予測されるこれら７つのドメインは、「膜貫通型」または「ＴＭ」ドメインＴＭ  Ｉ〜ＴＭ  ＶＩＩと呼ばれ、これらは、予測される３つの「細胞内ループ」すなわち「ＩＣ」ドメインＩＣ  Ｉ〜ＩＣ  ＩＩＩおよび予測される３つの「細胞外ループ」すなわち「ＥＣ」ドメインＥＣ  Ｉ〜ＥＣ  ＩＩＩにより連結される。これらのモチーフは、これらに限定されるものではないが、ＴＭ  ＩＩＩおよびＩＣ  ＩＩに重なるＭＡＹＤＲＹＶＡＩＣモチーフ、ＩＣ  ＩＩＩおよびＴＭ  ＶＩに重なるＦＳＴＣＳＳＨモチーフ、ＴＭ  ＶＩＩにおけるＰＭＬＮＰＦＩＹモチーフ、ならびにＥＣ  ＩＩにおける３つの保存されたＣ残基、ならびにＴＭ  Ｉにおける高度に保存されたＧＮ残基の存在と定義される［Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  （２００２），  Ｔｈｅ  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：  ５（２）：１２４−３３；  Ｍａｌｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｆａｍｉｌｙ：  ＰＮＡＳ：  １０１（８）：２５８４−９］。
【００５８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換的に用いられる。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「異種」という用語は、核酸の部分に関して使用する場合には、当該核酸が、自然では互いに同一の関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は典型的には組換えにより生成され、新たな機能的核酸を生成するために配置された無関係の遺伝子に由来する２つ以上の配列を有し、例えばある供給源からのプロモーターおよび他の供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質とは、当該タンパク質が自然では互いに同一の関係では見出されない２つ以上の配列を含むこと（例えば、融合タンパク質）を示す。
【００５９】
「プロモーター」とは、核酸の転写を指示する核酸配列のアレイと定義される。本明細書で使用する場合、プロモーターには、転写の開始部位付近の必要な核酸配列が含まれ、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合にはＴＡＴＡエレメントが含まれる。プロモーターには、必要に応じて、転写の開始部位から数千塩基対ほどの場所に位置しうる遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含まれる。「構成的」プロモーターとは、大半の環境および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、環境または発生の調節下で活性であるプロモーターである。
【００６０】
本明細書で使用する場合に、「組換え」とは、合成されたかもしくはさもなくばインビトロで操作されたポリヌクレオチド（例えば「組換えポリヌクレオチド」）、細胞もしくは他の生物学的系における遺伝子生成物の生成に組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を指す。「組換え手段」には、本発明のトランスロケーションドメインおよび本発明のプライマーを用いて増幅された核酸配列を含む融合タンパク質を発現させる、例えば誘導的または構成的に発現させるための発現カセットまたは発現ベクターへの、異なる供給源からの様々なコード領域またはドメインまたはプロモーター配列を有する核酸のライゲーションも含まれる。
【００６１】
本明細書において同定および／または使用される核酸およびアミノ酸配列を以下に列挙する。
【００６２】
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【００６３】
実施例
以下の実施例は単なる例示であり、特許請求の範囲の限定も本明細書に記載の実施形態の限定も意図するものではない。
【００６４】
例１
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において内在性ＲＴＰ１遺伝子の構成的活性化を誘導するための、ゲノム編集戦略
異種発現系における匂い物質受容体の増強された機能的発現を生じさせるための戦略について説明する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と呼ばれる新たに利用可能となったゲノム編集の技術を利用して、通常のＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてはサイレント（不活性）である内在性ＲＴＰ１遺伝子を、そのコード配列の上流への構成的プロモーター（ＣＭＶ）の導入によって特異的かつ構成的に活性化させる。図１）ＲＴＰ１遺伝子は、３番染色体上に位置しており、その開始部位の周囲のＤＮＡ配列を示す。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的に相同な２０の塩基対（ｂｐ）のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって指示される。細胞への送達時に（ＧｅｎｅＡｒｔ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＣＤ４  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ、製品番号Ａ２１１７５）、ガイドＲＮＡ分子およびＣａｓ９タンパク質は、コード配列の上流での所望の二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を誘導する活性複合体を形成する。ボックスは、３番染色体上のＲＴＰ１遺伝子を示す（充填されたボックス、コード配列（ＣＤＳ）；開放したボックス、エクソン内の非翻訳領域（ＵＴＲ））。ＲＴＰ１遺伝子の上流の推定プロモーター領域は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において不活性である。それぞれ開始コドン（ＡＴＧ）からの、位置−１５０と−１３１との間のガイドＲＮＡ標的配列（配列番号１）と、−１５３から−１５１までのＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）とを示す。図１）三角形により示される、ＰＡＭモチーフから３ｂｐ離れたＣａｓ９ヌクレアーゼのためのＤＳＢ部位によって、ドナーＤＮＡ（配列番号２）の挿入が可能となる。図２）ＣＭＶプロモーター挿入プロセスの概略図を示す。上部の構成は、改変前のＲＴＰ１遺伝子座を示し、底部の概略図は、相同組換え修復（ＨＤＲ）によりドナーＤＮＡをＤＳＢ部位へと導いた後のＲＴＰ１座を示す。ドナーＤＮＡは、５’ホモロジーアーム、ＦＲＴ（フリッパーゼ認識標的）に隣接するピューロマイシン選択カセット、ＣＭＶプロモーターおよび３’ホモロジーアームから構成される。その後、真核細胞に固有の細胞ＨＤＲ機構によって、ＲＴＰ１遺伝子の上流へのＣＭＶプロモーターの組み込みを得る。ピューロマイシン耐性選択カセット（Ｐｕｒｏｒ）およびＣＭＶ  ＤＮＡに隣接する所望のエントリポイントのいずれかの側の配列に相同な２つのＤＮＡ配列を含むドナープラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時にトランスフェクトする。ＨＤＲの結果、ＲＴＰ１コード配列の上流にＰｕｒｏｒおよびＣＭＶが導入される。その後、ピューロマイシン選択カセットを、フリッパーゼ酵素の使用により除去することができる。
【００６５】
例２
ＲＴＰ１遺伝子を内在的に発現する改変された細胞株の選択
細胞株およびその完全性の改変の特性解析には、いくつかの制御ステップが役立つ。図３）に、野生型および組換え型の対立遺伝子の概略図を示す。灰色の線はそれぞれ、ＤＮＡ遺伝子型決定に関するおよびＲＮＡ発現制御に関するＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲの実験結果の相対的なアンプリコンの位置を示す（正確な縮尺ではない）。図４）ピューロマイシン耐性細胞株からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行って、組換えされていない野生型（ＷＴ）細胞株と改変型細胞株（Ｍｏｄ．）との判別を行う。ＰＣＲ  １では、野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のみにおいて２．０ｋｂのバンドが増幅され、改変型細胞株においては増幅されない。この改変型株は、ＰＣＲ  １により４．０ｋｂのバンドを得るはずであったが、恐らくは長さおよびゲノム構造の複雑さゆえ、そうはならなかった。改変型細胞株についての遺伝子型決定の結果では、ＣＭＶプロモーターのホモ接合型の組み込みを示す２．０ｋｂのバンドの生成に失敗した。示されているように、ドナーＤＮＡの適切な組み込みを、ＰＣＲ  ２およびＰＣＲ  ３を用いてさらに試験した。図５）ｍＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成の後にＲＴ−ＰＣＲ実験を行うことにより、ＲＴＰ１  ｍＲＮＡが、改変型細胞株においては特異的に発現されるが、元のＨＥＫ２９３Ｔ細胞においては発現されないことが実証される。これによって、標的とされたゲノム座に組み込まれたＣＭＶプロモーターが、ＲＴＰ１遺伝子の発現を適切に駆動することが確認される。ＲＴ−ＰＣＲバンドの特異性を、増幅されたバンドの直接的な配列決定によって確認した。逆転写酵素陰性（ＲＴ−）およびＧＡＰＤＨ  ＰＣＲ条件はそれぞれ、汚染物であるゲノムＤＮＡが存在していないことおよびいずれのサンプル中にもｃＤＮＡが存在することを示す。
【００６６】
例３
ＲＴＰ１タンパク質発現の特性解析
選択された改変型細胞株におけるＲＴＰ１タンパク質発現を、ＲＴＰ１特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析によって調べた。長いタンパク質形態（ＲＴＰ１Ｌ）および短いタンパク質形態（ＲＴＰ１Ｓ）は、内在性ＲＴＰ１遺伝子に由来することができる。本明細書に記載のゲノム改変戦略は、内在性コード配列のいかなる改変をも避けるために、ＲＴＰ１Ｌ開始コドンの上流にＣＭＶプロモーターを導入することを含んでおり、したがってＲＴＰ１Ｌが発現されることが予想された。しかし結果は、改変型細胞株が、ＲＴＰ１Ｓの発現に大きく偏っていたことを示している。このことは、内在性ＲＴＰ１遺伝子が、さらなるゲノム編集を行うことなく短いバージョンを優先的に表現することを示唆している。この短いバージョンは、匂い物質受容体の細胞表面発現をより良好に促進することが知られているため、好ましいバージョンである。図６）に、ＲＴＰ１タンパク質のウェスタンブロットを示す。矢印は、ＲＴＰ１Ｓの予想タンパク質サイズが２５ｋＤａであり、ＲＴＰ１Ｌの予想タンパク質サイズが２８ｋＤａであり、対照タンパク質β−アクチンの予想タンパク質サイズが４２ｋＤａであることを示す。野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＷＴ）にはＲＴＰ１タンパク質が存在せず、改変型細胞株（Ｍｏｄ．）にはＲＴＰ１Ｓが存在することが示されている。驚くべきことに、ＲＴＰ１Ｌに比べてＲＴＰ１Ｓについて、はるかに強いバンドを認めることができる。膜タンパク質の抽出物を、Ｍｅｍ−Ｐｅｒ  Ｐｌｕｓ膜タンパク質抽出キット（Ｐｉｅｒｃｅ、製品番号８９８４２）により調製した。サイズマーカーとして、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ  Ｄｕｏ  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄを使用した（ＬｉＣｏｒ、製品番号９２８６００００）。以下の一次抗体を用いて標識を行った：ウサギ抗ＲＴＰ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号ＰＡ５−２４０２８）およびマウス抗β−アクチン（Ｐｉｅｒｃｅ、製品番号ＰＩＭＡ５１５７３９）。以下の二次抗体を用いて検出を行った：ヤギ抗ウサギ（ＬｉＣｏｒ、製品番号９２５−３２２１１）およびヤギ抗マウス（ＬｉＣｏｒ、製品番号９２５−６８０７０）。Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ（ＬｉＣｏｒ）でイメージングを行った。
【００６７】
例４
改変型細胞株における複数の匂い物質受容体の機能的特性解析
改変型細胞株における匂い物質受容体の活性の機能的な増強のレベルを評価するために、機能的用量反応実験を行った。匂い物質受容体を、それらのＮ末端で、短いポリペプチド配列またはタグ［例えばＦｌａｇ（配列番号１５）、Ｒｈｏ（配列番号１７；ウシロドプシン受容体の最初の２０個のアミノ酸）またはＬｕｃｙ（配列番号１９）］で修飾し、ＷＴ型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または改変型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過的に発現させ、匂い物質化合物で刺激して、各受容体の活性を判断した。図７および８）細胞ベースの匂い物質結合アッセイを用いて、インドールに対するＯｌｆｒ７４１（配列番号４）およびＯｌｆｒ７４２（配列番号６）の活性を、操作されたＲＴＰ１細胞株において試験し、ＲＴＰ１タンパク質を発現しないＨＥＫ２９３Ｔと比較した。匂い物質受容体を、双方の細胞株にトランスフェクトし、増加する濃度のインドールに曝露した。ＨＴＲＦベースのキット（ＣｉｓＢｉｏ、ｃＡＭＰ  ｄｙｎａｍｉｃ  ２  ｋｉｔ、製品番号６２ＡＭ４ＰＥＪ）を用いてサイトゾル内のｃＡＭＰの増加のレベルを測定することにより、匂い物質により誘発される活性を検出した。図９および１０）同一の細胞ベースの匂い物質結合アッセイを用いて、ブルカノリドに対するＯｌｆｒ９６（配列番号８）およびＯＲ１１Ａ１（配列番号１０）の活性を、操作されたＲＴＰ１発現細胞株において試験し、ＲＴＰ１タンパク質を発現しないＨＥＫ２９３Ｔと比較した。インドールに対するＯｌｆｒ７４０（配列番号１２）の活性についても、双方の細胞バックグラウンドにおいて試験した。受容体活性の用量依存的増加は、改変型ＲＴＰ１細胞株においてはすべてのＯＲについて記録されるが、ＲＴＰ１を発現しない未改変型の対照細胞株においては記録されない。さらに、カルボン−（−）に対するＯＲ１Ａ１（配列番号１４）の活性についても、双方の細胞バックグラウンドにおいて試験した。通常のＨＥＫ２９３ＴにおいてＯＲ１Ａ１が発現されうるにもかかわらず、ＲＴＰ１を発現しない未改変型の対照細胞株と比較して、改変型ＲＴＰ１細胞株において、受容体活性のより強力な用量依存的増加が記録される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018520665.tif 000023
2018520665.tif 000024
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