(57)【要約】【課題】神経線維腫症２型に関連する腫瘍の治療のためのユビキチン−プロテアソーム系阻害剤の使用に関する。【解決手段】本発明は、神経線維腫症２型欠損腫瘍の成長または関連する症状を阻害するか、または遅延させる治療有効量のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を対象に投与することにより、対象において、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子から生じる腫瘍または症状を治療、予防、または改善する方法を開示する。本発明はまた、神経線維腫症２型および中皮腫の患者を診断およびスクリーニングする方法を含む。【選択図】図１
2018500299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、神経線維腫症２型遺伝子変異に起因して生じる腫瘍または症状を治療、予防、または改善する方法であって、治療有効量の少なくとも１種のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
悪性または非悪性腫瘍を有する患者を治療する方法であって、前記腫瘍細胞が神経線維腫症２型遺伝子において１つまたは複数の変異を有し、前記方法が、治療有効量のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項３】
前記腫瘍が神経線維腫症２型／マーリン欠損腫瘍である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
神経線維腫症２型欠損腫瘍が前庭シュワン細胞腫である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
神経線維腫症２型欠損腫瘍が片側性シュワン細胞腫である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
神経線維腫症２型欠損腫瘍が両側性前庭シュワン細胞腫である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
神経線維腫症２型欠損腫瘍が脊髄シュワン細胞腫である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
神経線維腫症２型欠損腫瘍が散発性シュワン細胞腫である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
神経線維腫症２型欠損腫瘍が末梢神経シュワン細胞腫である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
１つまたは複数の神経線維腫症２型欠損腫瘍が、髄膜腫、中皮腫、上衣腫、神経膠腫、または星状細胞腫の腫瘍である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
神経線維腫症２型依存性腫瘍を有する患者を診断および治療する方法であって、ａ）欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子に起因して、腫瘍細胞で神経線維腫症２型／マーリンの活性が損なわれているかどうかを決定すること；およびｂ）神経線維腫症２型欠損患者を同定すること；ｃ）そのような患者の治療用の医薬品として、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項１２】
神経線維腫症２型遺伝子変異の診断用の生体試料を得ることによって患者を診断する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子を有すると決定された対象において、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子から生じる腫瘍または症状を治療、予防、または改善するためのプロテアソーム阻害剤の使用であって、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を薬学的に許容できる賦形剤と共に含む治療有効量の医薬製剤を前記対象に投与することを含む使用。
【請求項１４】
ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤の投与が治療上有益であると推定される、中皮腫の疑いがある患者を診断および治療する方法であって、ａ）患者が中皮腫を患っているかどうかを診断すること；およびｂ）工程ａ）において、中皮腫が、変異神経線維腫症２型遺伝子に起因してマーリンタンパク質の機能活性が存在しない細胞に関連していると見出された場合、患者を神経線維腫症２型依存性中皮腫患者として同定すること；ｃ）治療活性量のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項１５】
ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤の投与が治療上有益であると推定される、中皮腫の疑いがある患者を診断および治療する方法であって、ａ）患者が中皮腫を患っているかどうかを診断すること；ｂ）工程ａ）において、中皮腫が、変異ＢＡＰ１遺伝子に起因してマーリンタンパク質の機能活性が存在しない細胞に関連していると見出された場合、患者をＢＡＰ１遺伝子依存性中皮腫患者として同定すること；ｃ）治療活性量のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項１６】
ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤が、ボルテゾミブ、ＰＩ−０８３、ＭＬＮ  ９７０８、ＭＬＮ  ４９２４、ＭＬＮ  ５１９、カルフィルゾミブ、ＯＮＸ  ０９１２、ＣＥＰ−１８７７、ＮＰＩ−００５２、ＢＵ−３２（NSC D750499-S）、ＰＲ−１７１、ＩＰＳＩ−００１、ならびに、緑茶ポリフェノール（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（EGCG）、大豆イソフラボンゲニステイン、および香辛料ウコン化合物クルクミンのような、プロテアソーム阻害効果を有する天然物からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
プロテアソーム阻害剤がカルフィルゾミブである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
プロテアソーム阻害剤がボルテゾミブである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ボルテゾミブが、式［（１Ｒ）−３−メチル−１−（｛（２Ｓ）−３−フェニル−２−［（ピラジン−２−イルカルボニル）アミノ］プロパノイル｝アミノ）ブチル］ボロン酸、またはその薬学的に許容できる塩、誘導体、多形体、ラセミ体、もしくは立体異性体、結合体、もしくは複合体である薬学的に活性な化合物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞の成長または数を阻害するか、または減少させる方法であって、前記神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞または神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞を、ボルテゾミブ化合物またはその誘導体、塩、多形体、もしくは異性体、結合体、もしくは複合体と接触させることを含む方法。
【請求項２１】
対象において、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子から生じる腫瘍または症状を治療、予防、または改善する方法であって、１種または複数の神経線維腫症２型欠損腫瘍の成長または関連する症状を阻害するか、または遅延させる治療有効量のボルテゾミブを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２２】
欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子から生じる腫瘍または症状を治療、予防、または改善するためのボルテゾミブの使用。
【請求項２３】
マーリン／神経線維腫症２型タンパク質の欠損から生じる腫瘍または症状を有する患者において、マーリンタンパク質の効果を模倣するためのボルテゾミブの使用。
【請求項２４】
ボルテゾミブを約０．５〜１００ｍｇ／ｍ２から約０．５〜１．３ｍｇ／ｍ２までの範囲の用量で投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
ボルテゾミブを１日あたり約０．０１〜５０ｍｇの用量範囲で患者に投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
ボルテゾミブを１日あたり約１〜１０ｍｇの用量で患者に投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
ボルテゾミブを、非経口経路、腫瘍内経路、経口経路、静脈内経路、経皮経路、皮下経路、および筋肉内経路からなる群から選択される送達経路で投与する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ボルテゾミブを局所的に、または腫瘍内注射により患者に投与する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ボルテゾミブを皮下送達経路により患者に投与する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
プロテアソーム阻害剤がカルフィルゾミブである、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
患者が腫瘍に対する１種または複数のさらなる治療も受ける、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
１種または複数のさらなる治療が、従来の化学療法剤（アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物アルカロイドおよびテルペノイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ならびに抗悪性腫瘍薬など）、放射線療法剤、抗体系治療剤（ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブなど）、ならびにステロイドからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
さらなる治療剤をユビキチン−プロテアソーム系阻害剤と共に使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３４】
さらなる治療剤がステロイドである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステロイドが、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、およびデキサメタゾンからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
さらなる治療剤をユビキチン−プロテアソーム系阻害剤と共に使用する、請求項１１に記載の診断および治療する方法。
【請求項３７】
欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子に起因して生じる腫瘍の治療用の、デキサメタゾンとボルテゾミブとの固定用量の組合せ。
【請求項３８】
欠陥がある神経線維腫症１型遺伝子に起因して生じる腫瘍の治療用の、デキサメタゾンとボルテゾミブとの固定用量の組合せ。
【請求項３９】
神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞の成長または数を阻害するか、または減少させる方法であって、前記神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞または神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞を、治療有効量のボルテゾミブ化合物、またはその誘導体、塩、多形体、結合体、複合体、もしくは異性体、およびデキサメタゾンを含む製剤と接触させることを含む方法。
【請求項４０】
対象において、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子から生じる腫瘍または症状を治療、予防、または改善する方法であって、１種または複数の神経線維腫症２型欠損腫瘍の成長または関連する症状を阻害するか、または遅延させる、ボルテゾミブおよびデキサメタゾンを含む治療有効量の製剤を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４１】
神経線維腫症２型依存腫瘍を有する患者を診断および治療する方法であって、ａ）欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子に起因して腫瘍細胞で神経線維腫症２型／マーリンの活性が損なわれているかどうかを決定すること；およびｂ）神経線維腫症２型欠損患者を同定すること；ｃ）ボルテゾミブを皮下投与すること；およびｄ）治療有効量のデキサメタゾンを経口投与することを含む方法。
【請求項４２】
ボルテゾミブを単独で、またはステロイドと組み合わせて皮下送達するために好ましくはプレフィルドシリンジを使用する、請求項１〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
神経線維腫症２型／マーリンの活性が損なわれていると決定された対象においてシュワン細胞腫腫瘍サイズを減少させる方法であって、ボルテゾミブ単独の製剤、またはステロイドと組み合わせたボルテゾミブの製剤を含有する、プレフィルドシリンジに含まれる組成物を、対象に皮下投与することを含む方法。
【請求項４４】
シュワン細胞腫が、前庭シュワン細胞腫、片側性シュワン細胞腫、両側性前庭シュワン細胞腫、脊髄シュワン細胞腫、散発性シュワン細胞腫、および末梢神経シュワン細胞腫からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
シュワン細胞腫腫瘍サイズを減少させることが、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
アポトーシスを誘導することが、腫瘍細胞においてカスパーゼ３／７活性を増加させることを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
神経線維腫症２型／マーリンの活性が損なわれた腫瘍においてＬＡＴＳ活性を向上させる方法であって、腫瘍を有すると決定された対象にボルテゾミブを投与することを含む方法。
【請求項４８】
腫瘍がシュワン細胞腫由来である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
シュワン細胞腫が、前庭シュワン細胞腫、片側性シュワン細胞腫、両側性前庭シュワン細胞腫、脊髄シュワン細胞腫、散発性シュワン細胞腫、および末梢神経シュワン細胞腫からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ボルテゾミブ単独の製剤、またはステロイドと組み合わせたボルテゾミブの製剤を含有するプレフィルドシリンジを使用して、腫瘍を有する対象にボルテゾミブを皮下投与する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
神経線維腫症２型／マーリンの活性が損なわれた未治療細胞における活性と比較して、ＬＡＴＳ活性を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、または少なくとも１５０％増加させるのに充分な量でボルテゾミブを投与する、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、がんを治療する新規療法および方法に関する。より詳細には、本発明は、神経線維腫症２型遺伝子において変異を有する細胞に関連する腫瘍を、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を使用して治療する方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
[0002]  本出願は、あらゆる目的で、２０１４年１１月２５日に出願した米国仮特許出願第６２／０８４，２７６号、および２０１５年３月２日に出願した同６２／１２６，７４９号を全体として組み入れる。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  神経線維腫症は、骨、軟部組織、皮膚、および神経系に影響を及ぼす遺伝性障害である。神経線維腫症は、神経線維腫症１型と神経線維腫症２型に分類される。神経線維腫症２型は、２２番染色体の神経線維腫症２型遺伝子における変異によって生じる。神経線維腫症２型欠損腫瘍は、成長の遅い腫瘍であるという点で独特である。神経線維腫症２型遺伝子は、腫瘍抑制機能を有するマーリンタンパク質をコードする。
【０００４】
[0004]  いくつかの経路が神経線維腫症２型に関連する腫瘍の治療の標的とされている。ＵＳ７５１４２０７特許では、ｐ２１活性化キナーゼ（PAK）の阻害、またはマーリンのリン酸化の阻害が、神経線維腫症２型の治療における助けとなることが開示されている。ｐ２１活性化キナーゼは、細胞骨格リモデリングおよび細胞運動の周知の調節因子であるが、最近、細胞増殖を促進することも示されている。
【０００５】
[0005]  またＷＯ２００７１４３６２９（「ＷＯ’６２９」）では、ＡＫＴ／プロテインキナーゼＢの阻害が神経線維腫症２型の治療に有用であることが開示されている。ＷＯ’６２９は、神経線維腫症２型から生じる腫瘍を、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナリングまたはその経路のタンパク質を阻害する化合物を使用して治療する方法に関する。ＰＡＫ阻害剤およびＡＫＴ／プロテインキナーゼＢ阻害剤は、マーリン不活性化による神経線維腫症２型を治療する。したがって、マーリンが関与する場合にのみ有利である。しかしながら、これらの経路は他の原因が関与する場合に有効ではない可能性がある。
【０００６】
[0006]  米国公開特許出願ＵＳ２０１４０１２８４３４では、チロシンキナーゼ／接着斑キナーゼ（FAK）経路を阻害することによる神経線維腫症２型の治療が開示されている。チロシンキナーゼ阻害剤は、腫瘍成長および細胞増殖の原因となるＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）の活性を阻害する。しかしながら、他の経路が疾患の予後に関与する場合には効果がない。
【０００７】
[0007]  Ｋａｒａｊａｎｎｉｓ  ＭＡら、Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１４  Ｊａｎ，  １６（２）：２９２−７においては、Ｍ−ＴＯＲＣ１（哺乳類のラパマイシン標的複合体1）が開示されている。Ｋａｒａｊａｎｎｉｓ  ＭＡらでは、神経線維腫症２型を治療するためのエベロリムス（mTOR阻害剤）の第ＩＩ相研究が開示されている。ｍＴＯＲＣ１（哺乳類のラパマイシン標的複合体1）は、腫瘍イニシエーションを阻害し、アポトーシスを増加させる。しかしながら、これはｍＴＯＲＣ１経路のみに特異的である。
【０００８】
[0008]  ＵＳ２０１２０１５７４０１では、血管内皮増殖因子（VEGF）およびその阻害剤が開示されている。その阻害剤は血管内皮増殖因子の病理学的産生を阻害して、神経線維腫症２型を治療する。ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）阻害剤は、腫瘍細胞における血管新生を阻害するのに効果的である。
【０００９】
[0009]  Ｒａｓタンパク質の阻害は、Ａ．Ｍ．  Ｔｓｉｍｂｅｒｉｄｏｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ２００８  Ａ．Ｍ．において開示されている。腫瘍抑制タンパク質マーリン（NF2）は、ＲａｓおよびＲａｃの活性化を妨害する。細胞の成長および増殖を妨げるのに使用されるサリラシブなどのＲａｓタンパク質阻害剤は、Ｒａｓ活性化を妨げる。
【００１０】
[0010]  Ｓ  Ａｍｍｏｕｎら、ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１１  Ｊｕｌ，  １３（７）：７５９−６６では、ＰＤＧＦＲ（血小板由来増殖因子受容体）の阻害による神経線維腫症２型治療の、他とは異なる経路が開示されている。ここでは、神経線維腫症２型に対する薬剤の候補として単独のニロチニブ、またはセルメチニブと組み合わせたニロチニブが開示されている。血小板由来増殖因子受容体−β（PDGFR-β）を阻害すると、細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK1/2）およびＡＫＴ／プロテインキナーゼＢが阻害されることになり、神経鞘腫症が妨げられる。しかしながらＰＤＧＦＲ阻害剤はまた非常に特異的であり、腫瘍を完全に根絶することに有効ではない可能性がある。
【００１１】
[0011]  ＷＯ２００７１４３６３０では、ＨＳＰ９０（熱ショックタンパク質）阻害化合物を用いた、神経線維腫症２型欠損、または神経線維腫症２型欠損細胞を治療するためのＨＳＰ９０の阻害が開示されている。ＨＳＰ９０、および／またはＨＳＰ７０の上方制御は、ＮＦ２欠損腫瘍細胞の増殖および生存に重要である。ＨＳＰ９０阻害剤は、プロテアソームが媒介する、増殖に関与するキナーゼなどの調節タンパク質および転写因子の分解を誘導するが、増殖に関与する多くの重複する因子がある。ゆえに、これは神経線維腫症２型の治療に対する有効な経路ではない可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
[0012]  上記で考察した全ての経路には限界があり、治療的な療法または薬剤は現在までのところ承認されていない。疾病管理は、ほぼ完全に、腫瘍の外科的除去に頼っている。ゆえに、神経線維腫症２型および関連状態を治療する有効な方法を開発する必要がある。本発明は、当技術分野におけるこれらの不足点および他の不足点を克服することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
[0013]  本発明の第１の目的は、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子を有する細胞に関連する腫瘍を、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を使用して治療する方法を提供することである。
【００１４】
[0014]  本発明のさらなる態様は、神経線維腫症２型変化依存性腫瘍を有する患者を診断する方法であって、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子に起因して腫瘍細胞で神経線維腫症２型／マーリンタンパク質の活性が損なわれているかどうかを決定すること；および、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を使用する治療のための欠損患者を選択することを含む方法を提供することである。
【００１５】
[0015]  本発明の別の態様は、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を用いて中皮腫患者を診断および治療する方法であって、中皮腫を患う患者を診断し、その後、中皮腫が、変異した神経線維腫症２型遺伝子を有する細胞に関連しているかどうかを見出すこと、患者を神経線維腫症２型依存性中皮腫患者として同定すること、および、治療活性量のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を患者に投与することを含む方法を提供することである。
【００１６】
[0016]  本発明の別の一態様は、変異ＢＡＰ１遺伝子に起因してマーリンタンパク質の機能活性が存在しない細胞に関連する中皮腫を患う患者を診断する方法であって、その患者をＢＡＰ１遺伝子依存性中皮腫患者として同定し、治療活性量のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を用いて治療する方法を提供する。
【００１７】
[0017]  好ましい態様においては、本発明は、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子から生じる腫瘍または症状を治療、予防、または改善するための、プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブの使用を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】[0018]インキュベーション時間６時間における、参照化合物としてカルフィルゾミブを使用した、濃度１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭでのボルテゾミブの２０Ｓプロテアソームアッセイを示す図である。
【図２】[0019]インキュベーション時間１２時間における、参照化合物としてカルフィルゾミブを使用した、濃度１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭでのボルテゾミブの２０Ｓプロテアソームアッセイを示す図である。
【図３】[0020]インキュベーション時間１８時間における、参照化合物としてカルフィルゾミブを使用した、濃度１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭでのボルテゾミブの２０Ｓプロテアソームアッセイを示す図である。
【図４】[0021]インキュベーション時間２４時間における、参照化合物としてカルフィルゾミブを使用した、濃度１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭでのボルテゾミブの２０Ｓプロテアソームアッセイを示す図である。
【図５】[0022]インキュベーション時間間隔１８時間での、ＮＦ２ノックアウト／野生型一倍体細胞株における濃度１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭのボルテゾミブによるプロテアソーム活性の阻害割合（%）を示す図である。
【図６】[0023]ＮＦ２ノックアウト細胞株における、濃度０．１ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭのボルテゾミブでのカスパーゼ３／７活性を示す図である。スタウロスポリン（１および１０μＭ）を参照化合物として使用した。観察した時間間隔は１８時間であった。
【図７】[0024]野生型一倍体細胞株における、濃度０．１ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭのボルテゾミブでのカスパーゼ３／７活性を示す図である。スタウロスポリン（１および１０μＭ）を参照化合物として使用した。観察した時間間隔は１８時間であった。
【図８】[0025]ＮＦ２ノックアウト細胞株（KO）において濃度３ｎＭ、１０ｎＭ、および３０ｎＭで試験したボルテゾミブでのウエスタンブロット分析を示す図である。ＬＡＴＳ１レベルについて野生型一倍体細胞株（WT）も示す。ＵＴ：未処理。
【図９】[0026]インキュベーション１８時間での、未処理（UN）ＮＦ２ノックアウト対照および未処理野生型対照と共に示した、ＮＦ２ノックアウト（KO）細胞株において濃度３ｎＭ、１０ｎＭ、および３０ｎＭ（各濃度に対して３レーン）で試験したボルテゾミブでのウエスタンブロット分析のブロットを示す図である。標準対照としてのＧＡＰＤＨ（内因性対照）も示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
[0027]  本明細書には、本発明としてみなされるものを詳細に示して明確に特許請求する特許請求の範囲が添付されているが、本発明は、以下の本発明の詳細な説明、および含まれている実施例の考察を読むことによってより容易に理解され得ると考える。
【００２０】
[0028]  本発明は概して、患者において、神経線維腫症２型遺伝子変異を有する細胞に関連する腫瘍の成長を阻害するか、または減少させる方法であって、治療有効量の少なくとも１種のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を投与することを含む方法に関する。腫瘍は、神経線維腫症２型遺伝子において１つまたは複数の変異を有する良性腫瘍または悪性腫瘍であってよい。
【００２１】
[0029]  神経線維腫症２型は常染色体優性の遺伝形質であり、両性別に等しく影響を及ぼし、それを患う親の子供の各々は、５０パーセントの確率でその遺伝子を受け継ぐ。神経線維腫症２型は、神経線維腫症２型遺伝子の変異または欠失から生じ、２２番染色体で伝えられる。神経線維腫症２型遺伝子は、マーリンと呼ばれる５９５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする腫瘍抑制遺伝子である。マーリンは、タンパク質のエズリン、ラディキシン、およびモエシン（ERM）ファミリーに属する。マーリンタンパク質は、シュワノミンまたはニューロフィブロミン２とも呼ばれる。
【００２２】
[0030]  神経線維腫症２型は、神経系における腫瘍の成長によって特徴づけられる。神経線維腫症２型に関連する極めてよくある腫瘍は、前庭シュワン細胞腫すなわち聴神経腫瘍、シュワノミン、他の頭蓋、脊髄および皮膚神経のシュワン細胞腫、ならびに、頭蓋および脊髄髄膜腫と呼ばれるものである。
【００２３】
[0031]  ほとんどの場合、腫瘍は、内耳から脳へ延びる神経（聴神経）に沿って成長する。他の神経で生じる腫瘍も、この状態と共によく見出される。
【００２４】
[0032]  神経線維腫症２型の徴候および症状は、通常、青年期またはヒトの２０代前半で発生するが、あらゆる年齢で始まり得る。前庭シュワン細胞腫の極めて頻発する初期症状は、難聴、耳鳴（ringing in the ears (tinnitus)）、および、バランスでの問題である。大抵の場合、これらの腫瘍は３０歳までに両耳で生じる。腫瘍が神経系の他の場所で発達した場合、徴候および症状はその場所に応じて様々である。腫瘍成長の合併症には、視力の変化、腕または脚でのしびれまたは脱力、および脳における体液増加が含まれ得る。視神経における腫瘍は失明を引き起こす可能性があり、胃腸管における腫瘍は出血または閉塞を生じさせることがある。
【００２５】
[0033]  神経線維腫症２型の喪失が生じる機構は、いまださらなる研究の主題である。しかしながら、研究者らは遺伝学的アプローチおよび生化学的アプローチの両方に着目している。
【００２６】
[0034]  神経線維腫症２型遺伝子は、マーリンと呼ばれ、またシュワノミンとしても知られるタンパク質の産生についての指示を与える。このタンパク質は、神経系において、特に神経を取り囲んで絶縁する特殊化細胞（シュワン細胞）において生成される。マーリンは、細胞形状、細胞移動、および細胞間情報交換の制御において役割を果たすと考えられている。これらの仕事を行うため、マーリンは、細胞を支える内部フレームワーク（細胞骨格）と関連する。
【００２７】
[0035]  マーリンの極めて重要な機能の１つは、腫瘍抑制因子として機能することである。腫瘍抑制因子タンパク質は、細胞があまりに速く、または制御されていない方法で成長および分裂することを妨げる。マーリンは、核に転位置することによってこれを行い、ＣＲＬ４ＤＣＡＦ１の阻害によって腫瘍形成を抑制する。ＣＲＬ４ＤＣＡＦ１は、Ｅ３リガーゼのカリンｒｉｎｇファミリーに属するタンパク質複合体である。Ｅ３リガーゼは、ユビキチン分解経路の不可欠部分であり、分解される標的タンパク質のリシンにユビキチンがイソペプチド結合によって結合することを触媒する。ＣＲＬ４ＤＣＡＦ１を阻害すると、下流シグナリングに関与するタンパク質（LATS1/2キナーゼおよびYAP/TAZ）のプロテアソーム分解が阻害されることになり、それによりＨｉｐｐｏシグナリング経路が活性化する。Ｈｉｐｐｏシグナリング経路は、細胞生存能、増殖、および細胞死を制御する、細胞の顕著な抗有糸分裂シグナリング機構である。神経線維腫症２型／マーリンの機能障害が起こると、ＣＲＬ４ＤＣＡＦ１を阻害することができなくなり、それによりｈｉｐｐｏシグナリングを活性化するイベントの連鎖が調節解除され、最終的に、神経線維腫症２型に関連するシュワン細胞腫および髄膜腫、神経線維腫症５型、神経鞘腫症、良性髄膜腫、ならびに中皮がん（中皮腫）が発症することになる。神経線維腫症２型依存性腫瘍形成は、変異マーリンが核に入ることができず、ＣＲＬ４ＤＣＡＦ１依存性遺伝子発現を抑制することができない場合に生じる。
【００２８】
[0036]  ユビキチン−プロテアソーム経路は、細胞内タンパク質のタンパク質分解を制御するための中枢経路である。タンパク質は最初に、ポリユビキチン鎖が結合することによりタンパク質分解の標的とされ、次にプロテアソームによって小さなペプチドへと急速に分解され、続いてユビキチンが放出されて再利用される。この協調的なタンパク質分解経路は、ユビキチン結合系と２６Ｓプロテアソームの相乗活性に依存的である。２６Ｓプロテアソームは、真核生物の核および細胞質に存在する、約１５００〜２０００ｋＤａの大きな多サブユニット複合体である。２０Ｓプロテアソームと呼ばれるこの複合体の触媒コアは、アルファおよびベータサブユニットを含有する、４つの七量体環からなる円筒型構造体である。プロテアソームはスレオニンプロテアーゼであり、β−サブユニットのＮ末端スレオニンが、標的タンパク質のペプチド結合のカルボニル基を攻撃する求核基を与えている。少なくとも３つの異なるタンパク質分解活性：キモトリプシン活性、トリプシン活性、およびペプチジルグルタミル活性がプロテアソームに伴っている。ポリユビキチン化した基質を認識して結合する能力は、２０Ｓプロテアソームの各末端に結合している１９Ｓ（PA700）サブユニットによって与えられている。これらの付属サブユニットは基質をほどき、それらを２０Ｓ触媒複合体に供給する一方、結合したユビキチン分子を除去する。
【００２９】
[0037]  実施形態の１つにおいては、本発明は、神経線維腫症２型シュワン細胞腫および髄膜腫を治療する新規アプローチを開示する。本発明者らは、ユビキチン−プロテアソーム経路を破壊することが、腫瘍抑制因子神経線維腫症２型／マーリンの下流の分子イベントに直接的な影響を及ぼすことを証明した。神経線維腫症２型／マーリンの欠損の主な影響はプロテアソーム分解の調節不全であり、ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤は２６Ｓプロテアソームを阻害して、腫瘍抑制と、抗有糸分裂経路（例えばhippoシグナリング）の活性化とに関与するタンパク質の分解を防ぐことによって、神経線維腫症２型／マーリン欠損の影響を無効にすることができる可能性がある。
【００３０】
[0038]  さらに別の実施形態においては、本発明は、神経線維腫症２型、ならびに、神経線維腫症２型／マーリンの欠損／機能障害に関する他の状態、例えば中皮腫、神経鞘腫症、良性髄膜腫および神経線維腫症５型を治療するための、プロテアソーム阻害剤、例えば限定されないがボルテゾミブなどの使用を開示する。
【００３１】
[0039]  特定の態様においては、神経線維腫症２型／マーリンの活性が損なわれた腫瘍においてＬＡＴＳ活性を向上させる方法であって、腫瘍を有すると決定された対象にボルテゾミブを投与することを含む方法を本明細書において開示する。特に、腫瘍はシュワン細胞腫由来である。例えばシュワン細胞腫は、前庭シュワン細胞腫、片側性シュワン細胞腫、両側性前庭シュワン細胞腫、脊髄シュワン細胞腫、散発性シュワン細胞腫、および末梢神経シュワン細胞腫であってよい。ボルテゾミブは、ボルテゾミブ単独の製剤、またはステロイドと組み合わせたボルテゾミブの製剤を含有するプレフィルドシリンジを使用して、腫瘍を有する対象に皮下投与することが好ましい。特定の態様においては、ボルテゾミブは、神経線維腫症２型／マーリンの活性が損なわれた未治療細胞における活性と比較して、ＬＡＴＳ活性を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、または少なくとも１５０％増加させるのに充分な量で投与する。理論に拘泥するものではないが、ＬＡＴＳ活性の増加により腫瘍細胞死滅がもたらされると考えられる。
【００３２】
[0040]  さらに、本発明者は、神経線維腫症２型欠損中皮腫の腫瘍においてユビキチン−プロテアソーム経路の活性が高いことを知ることになる。
【００３３】
[0041]  別の実施形態においては、本発明は、ユビキチン−プロテアソーム経路と中皮腫の間の連鎖を開示する。中皮腫は、身体の多くの内臓を覆う保護内層である中皮細胞から発生する珍しい型のがんである。現在利用可能な中皮腫の療法では、予後での効果が限られている。初期疾患の外科手術を含めた積極的な多様式療法を用いても、診断時からの全生存期間の中央値は非常に短い。
【００３４】
[0042]  神経線維腫症２型腫瘍抑制因子遺伝子の変異は、遺伝性障害の神経線維腫症２型を引き起こし、神経線維腫症２型疾患の特徴ではない悪性中皮腫においてもよく見られる。中皮腫の免疫組織学的解析により、神経線維腫症２型タンパク質の発現の減少が確かめられ、比較ゲノムハイブリダイゼーションにより、１４番、１５番、および２２番染色体の喪失、および７番染色体の増加が明らかとなった。中皮腫の腫瘍におけるＮＦ２／マーリンタンパク質の喪失は、腫瘍増殖を加速する可能性がある。
【００３５】
[0043]  ボルテゾミブは、式［（１Ｒ）−３−メチル−１−（｛（２Ｓ）−３−フェニル−２−［（ピラジン−２−イルカルボニル）アミノ］プロパノイル｝アミノ）ブチル］ボロン酸の薬学的に活性な化合物、またはその薬学的に許容できる塩、誘導体、多形体、ラセミ体、結合体、複合体、または立体異性体である。ボルテゾミブは、（Ｎ−（２−ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸とも呼ばれる。ボルテゾミブのホウ素原子がプロテアソームの触媒部位に結合することにより、最終的にプロテアソームが阻害されてアポトーシス促進性因子の分解が減少することになり、続いてアポトーシス促進性因子が、治療した細胞におけるアポトーシスを引き起こす。構造的には、ボルテゾミブは、Ｌ−ロイシン部分およびＬ−フェニルアラニン部分を含むホウ素化ジペプチド化合物である。したがってボルテゾミブは２個のキラル炭素を含み、その分子は強固な空間配向を有し、よって単一のジアステレオマーである。ボルテゾミブは酸付加塩を形成してもよい。固体状態では、ボルテゾミブは三量体ボロキシン形態で存在する。ボルテゾミブの様々な結晶多形体が文献に記載されている。例えば、ＷＯ２００８０７５３７６Ａ１では、ボルテゾミブの形態Ｉの多形体とその調製方法が開示されており、ＷＯ２０１４０９７３０６Ａ１では、ボルテゾミブの形態Ｎの多形体が開示されており、ＣＮ１０４９５８７６９Ａでは、酸化デキストラン−ボルテゾミブ−アドリアマイシン結合体医薬およびその調製方法が記載されている。
【００３６】
[0044]  ブロックコポリマーを含有するボロン酸化合物調合物、その製造方法、および含有薬物は、ＷＯ２０１５００２０７８  Ａ１２０１５０１０８に開示されている。他の態様においては、ボルテゾミブをＤ−グルコン酸と組み合わせて、製剤をより安定なものとする。
【００３７】
[0045]  さらに別の実施形態においては、本発明のプロテアソーム阻害剤は、神経線維腫症２型を治療するようにｍＴＯＲＣ１経路を介しても作用する。神経線維腫症２型／マーリンは、哺乳類のラパマイシン標的（mTOR複合体1）を負に調節する。ｍＴＯＲＣ１シグナリング活性化の調節解除は、神経線維腫症２型関連腫瘍の異常成長および増殖の原因となる。
【００３８】
[0046]  本発明のさらに別の実施形態は、プロテアソーム阻害剤によって、神経線維腫症１型遺伝子産物のニューロフィブロミンを阻害することを想定する。ニューロフィブロミンは、Ｒａｓ機能を抑制する腫瘍抑制因子タンパク質である。ニューロフィブロミンはプロテアソームによって動力学的に調節され、ニューロフィブロミンの分解および再発現は適切なＲａｓ−ＧＴＰレベルを維持するのに必須である。神経線維腫症１型／ニューロフィブロミンは、変異、および過剰なプロテアソーム媒介破壊の両方により、がんにおいて活性化されている可能性がある。ボルテゾミブのようなプロテアソーム阻害剤は、ニューロフィブロミンの調節に有用である。
【００３９】
[0047]  さらに別の実施形態においては、本発明は、相乗効果のためにプロテアソーム阻害剤をステロイド薬物、好ましくはデキサメタゾンと任意選択により組み合わせることを開示する。
【００４０】
薬物製剤
[0048]  一般的に、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤は公知技術に従って投与用に製剤化する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第9版、1995）を参照のこと。
【００４１】
[0049]  ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤は、使用する阻害剤の有効性／毒性、および阻害剤を使用する適応症を含めたいくつかの因子に応じて、様々な濃度で製剤してもよいことを当業者はさらに理解するであろう。製剤は、細胞死（例えば、アポトーシスによる細胞死）を誘導するのに充分な生体内濃度を標的腫瘍細胞で、または標的腫瘍細胞近傍でもたらすのに充分な量の阻害剤を含有するべきである。所望の効果をもたらすのに必要な濃度または量は、その阻害剤の効力に依存するものであり、当業者に公知の方法によって確立することもできるし、既に入手可能な情報であることもある。同じことが、個々の阻害剤の１日の用量および投与レジメンについても当てはまる。
【００４２】
[0050]  本発明のプロテアソーム阻害剤化合物は、経口、体内、肺内、直腸内、経鼻、経膣、経舌、経皮、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、皮内、および皮下経路を含めた、従来技術において公知の任意の手段によって送達することができる。
【００４３】
[0051]  より好ましい経路は、錠剤、カプセルもしくは溶液などの経口経路、または局所、経皮もしくは腫瘍内注射による経路である。皮下送達経路は、神経線維腫症２型および関連腫瘍の治療に関し、プロテアソーム阻害剤単独、またはステロイド薬物と組み合わせたプロテアソーム阻害剤の最も好ましい送達経路である。
【００４４】
[0052]  さらに別の実施形態においては、本発明は、ボルテゾミブを皮下投与し、同時にデキサメタゾンを経口投与することを提供する。皮下送達は、皮下組織において（皮膚の下で）、一般に短時間注射（数秒または数分）として行う。しかしながら痛みがあるので注射量は制限される必要があり（１〜６ｍｌ）、濃縮製剤の使用、および場合により別の２部位での投与が必要となる。
【００４５】
[0053]  組成物中に存在するプロテアソーム阻害剤化合物の量は、概して組成物の約０．０１〜約３０％ｗ／ｗの範囲とするべきであり、好ましくは組成物の１〜２０％ｗ／ｗの量である。プロテアソーム阻害剤化合物はボルテゾミブであることが好ましい。
【００４６】
[0054]  別の実施形態においては、本発明は、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせて含む医薬製剤を提供する。さらに一実施形態においては、本発明は局所適用する医薬組成物を提供する。局所用医薬組成物は、神経線維腫症２型欠損腫瘍の近傍の皮膚に適用することができる。局所用製剤は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油とすることができる。局所用製剤を製剤化するのに一般に使用される担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮向上剤、およびそれらの２つ以上の組合せなどである。
【００４７】
[0055]  さらなる実施形態においては、本発明は、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤組成物が、長時間患者の上皮に密接したままであるように適合された経皮パッチであることを開示する。当該組成物は、神経線維腫症２型欠損腫瘍の近傍、またはその部位に適用する。経皮製剤はイオン導入によって送達され、任意選択により活性化合物の緩衝水溶液の形態を局所的にとる。好適な製剤は、クエン酸バッファーもしくはビス／トリスバッファー（ｐＨ６）、またはエタノール／水を含み、０．１〜０．２Ｍの活性成分を含有する。
【００４８】
[0056]  本発明は、ユビキチン−プロテアソーム経路阻害剤およびその塩のリポソーム製剤を用いた治療方法も開示する。リポソーム懸濁液を形成させる技術は当技術分野において周知である。阻害剤が非水溶性である場合、当該塩は、リポソーム構造を形成する疎水性脂質二重層内に実質的に取り込まれていてもよい。作製するリポソームは、標準的な超音波技術および均質化技術を使用するなどしてサイズを小さくしてもよい。当然、本明細書において開示するユビキチン−プロテアソーム経路阻害剤またはその塩、結合体もしくは複合体を含有するリポソーム製剤は、凍結乾燥して凍結乾燥物を形成させてもよく、凍結乾燥物は水などの薬学的に許容できる担体を用いて復元して、リポソーム懸濁液を再生してもよい。好ましいボルテゾミブのリポソーム製剤は、ボルテゾミブおよびポリオールを含み、水素イオン勾配、ポリエチレングリコールを含む疎水性部分（脂質）誘導物をさらに含み、ボルテゾミブはリポソームに取り込まれている。
【００４９】
[0057]  ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤はまた、鼻腔内に、または吸入によって投与してもよく、乾燥粉末吸入器の形態、または、好適な噴霧剤もしくは好適なガスを使用した加圧容器、ポンプ、スプレーもしくはネブライザーからのエアロゾルスプレー投与の形態で好都合に送達してもよい。
【００５０】
[0058]  非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、活性化合物の滅菌水性および非水性注射液を含み、調合物は対象とするレシピエントの血液と等張性であることが好ましい。これらの調合物は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および製剤を対象とするレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有してもよい。水性および非水性滅菌懸濁液は、懸濁剤および粘稠剤を含んでもよい。好ましい非経口製剤の１つは、モル比１：３で、ボルテゾミブ化合物またはその誘導体、塩、多形体、もしくは異性体、結合体、もしくは複合体をトロメタミンと共に含み、ｐＨは３〜６．５の範囲に調節し、組成物は凍結乾燥形態である。ｐＨは４〜５の範囲に調節することがより好ましい。
【００５１】
[0059]  ボルテゾミブは、マンニトールとの滅菌凍結乾燥混合物として製剤化することもできる。好ましい注射用凍結乾燥組成物は、窒素パージに付した注射用蒸留水を含み、ボルテゾミブはｔｅｒｔ−ブタノールに溶かし、凍結乾燥製剤の含水率は３．５〜６．５％である。別の一実施形態は、比２：１のボルテゾミブおよび酒石酸、ならびに薬学的に許容できる担体を含む注射用液体製剤を開示する。
【００５２】
[0060]  別の実施形態においては、本発明は、非水性溶媒のプロピレングリコール、ボルテゾミブ、およびｐＨ３〜４の緩衝剤を含む液体製剤を開示する。実施形態の１つにおいては、本発明は、ホウ酸、ボルテゾミブ、およびグリシンを含む固体製剤を開示する。別の一態様においては、本発明は、ボルテゾミブおよびホウ酸のみを含む組成物を提供する。その組成物は固体であり、ホウ酸：ボルテゾミブの質量比は、１：１〜１０：１である。特定の態様においては、ボルテゾミブは、ｐＨ範囲２〜６．５にて、水中３．３〜３．８ｍｇ／ｍｌで、単量体ボロン酸形態で提供する。
【００５３】
[0061]  ナノ材料またはナノ薬剤担体としてのボルテゾミブ持続放出製剤は、炭素量子ドット、キトサンナノ粒子、およびボルテゾミブを含む。
【００５４】
[0062]  実施形態の１つにおいては、本発明は、神経線維腫症２型欠損腫瘍の部位に直接適用するための組成物も開示する。例えばプロテアソーム阻害剤は局部治療によって適用することができ、局部治療は、腫瘍部位での局所治療と、病巣内治療または皮内治療との両方を包含する。したがって阻害剤は、神経線維腫症２型欠損腫瘍に注射するか、神経線維腫症２型腫瘍に局所適用するか、神経線維腫症２型腫瘍の近傍に局所適用することができる。本発明の一実施形態においては、阻害剤は当技術分野で公知の方法によって病巣内に適用する。あるいは、プロテアソーム阻害剤の医薬組成物は、植込錠の形態をとることができる。そのような組成物は、阻害剤をゆっくり放出させるために、腫瘍部位に、または腫瘍近傍に、外科的に植え込むことができる。
【００５５】
[0063]  別の好ましい実施形態においては、本発明は、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、および静脈内バッグ含めた容器を開示する。好ましい複数回利用容器は、２回以上の別個の使用、より典型的には５回以上、最も典型的には１０回以上の別個の使用（各使用では、同じ量の製剤を患者に投与することが必要とされてもされなくてもよい）を可能にするのに好適な量で、ボルテゾミブを単独で、または、ステロイドなどのさらなる薬剤と組み合わせて含有することになる。
【００５６】
[0064]  さらに別の実施形態においては、本発明は、ボルテゾミブ製剤を単独で、または別の薬物と組み合わせて含む、ディスクシャント（disc shunt）植込み用、およびペリシャント（peri-shunt）注入用のデバイスを提供する。
【００５７】
[0065]  別の実施形態においては、本発明は、神経線維腫症２型、中皮腫、神経鞘腫症、良性髄膜腫、および／または神経線維腫症５型の患者を神経線維腫症２型／マーリン遺伝子における変異についてスクリーニングするための、遺伝子検査に基づいたコンパニオン診断キットを開示する。
神経鞘腫症および中皮腫の全ての症例が神経線維腫症２型／マーリン変異に関連するわけではないことが知られている。ユビキチン−プロテアソーム経路の活性は、中皮腫患者のうちの３０％〜４０％で高いことが見出されている。しかしながら、中皮腫の残りの６０％の症例の原因は異なることが見出されている。ゆえに、本発明のユビキチン−プロテアソーム経路阻害剤は、中皮腫の症例のうち６０％において有効ではない可能性がある。ゆえに、まず神経線維腫症２型／マーリン遺伝子変異に関連する中皮腫を有する患者を分離することが必要である。本発明は、中皮腫の患者を神経線維腫症２型／マーリン遺伝子変異についてスクリーニングするための、遺伝的解析または免疫組織化学に基づいたコンパニオン診断キットを開示する。別の一実施形態においては、本発明は、治療有効量のユビキチン−プロテアソーム経路阻害剤をこのような患者に投与することを開示する。
【００５８】
[0066]  さらに別の実施形態においては、本発明は、欠失／重複解析、選択エクソンの配列解析、全コード領域の配列解析、連鎖解析、全コード領域の変異スキャニング、欠失／重複解析を含んでもよい遺伝子検査の方法を開示する。神経線維腫症２型／マーリンまたは遺伝子全体の複数のエクソンを除去する、より小さな欠失は、ＦＩＳＨ（蛍光インサイツハイブリダイゼーション法）解析によって同定することもできる。
【００５９】
[0067]  さらに別の実施形態においては、本発明は、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤の投与が治療上有益であると推定される、中皮腫の疑いがある患者を同定および治療する方法であって、まず患者が中皮腫を患っているかどうかを診断すること、そうである場合には、変異ＢＡＰ１遺伝子に起因してマーリンタンパク質の機能活性が存在しない細胞と、診断された中皮腫の関連性を確認すること、患者をＢＡＰ１遺伝子依存性中皮腫患者として同定すること、および、治療活性量のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を投与することを含む方法を開示する。ＢＡＰ１（BRCA1関連タンパク質1）関連タンパク質１（ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ）は、７２９個のアミノ酸からなる核ユビキチンヒドラーゼである。この遺伝子は、タンパク質からのユビキチンの除去に関与する脱ユビキチン化酵素のユビキチンＣ末端ヒドラーゼサブファミリーに属する。ＢＡＰ１は、アポトーシスとネクローシスの両方との類似性を有するプロセスによって細胞死を誘導することが示されている。さらにＢＡＰ１は、適切なヒストン修飾酵素を転写因子、特にＥ２Ｆファミリーの転写因子のサブセットに連結することによって転写の活性化および抑制を行うと考えられているクロマチン関連タンパク質である宿主細胞因子−１（HCF-1），２５を脱ユビキチン化することによって、細胞増殖を調節する。ＢＡＰ１はユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（デユビキチナーゼ、DUB）をコードし、したがってＥ３ユビキチンリガーゼによって形成されるユビキチン結合を正反対のものにすることができる。
【００６０】
[0068]  一実施形態においては、本発明は、神経線維腫症２型遺伝子変異に関連する腫瘍細胞を死滅させる方法であって、ある量のプロテアソーム阻害剤を投与することを含む方法を提供する。プロテアソーム阻害剤の非限定的な例はボルテゾミブである。
【００６１】
[0069]  別の実施形態においては、本発明は、神経線維腫症２型に関連する腫瘍が前庭シュワン細胞腫、聴神経腫瘍、片側性シュワン細胞腫、両側性前庭シュワン細胞腫、脊髄シュワン細胞腫、散発性シュワン細胞腫、末梢神経シュワン細胞腫、髄膜腫、中皮腫、上衣腫、神経膠腫、および星状細胞腫であることを開示する。特定の実施形態においては、ＮＦ−２欠損腫瘍細胞は髄膜腫ではない。
【００６２】
[0070]  別の一実施形態においては、本発明は、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤が、プロテアソームに直接作用してその機能を阻害するプロテアソーム阻害剤であることを開示する。例えばプロテアソーム阻害剤は、ヒトプロテアソームのタンパク質分解能力を（少なくとも部分的に）阻害してもよい。ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤はまた、ユビキチン阻害剤としてもよく、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤としては、ユビキチンリガーゼ阻害剤、ユビキチン特異的ペプチダーゼ８（USP8）阻害剤、ユビキチン様修飾因子活性化酵素３（UBA3）阻害剤、ユビキチン特異的プロテアーゼ７（USP7）阻害剤が含まれる。
【００６３】
[0071]  別の一実施形態においては、本発明は、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤が、開発中の分子または任意の抗体とすることができるプロテアソーム阻害剤であり、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ＣＥＰ２８３３１、プロテアソーム阻害剤ＯＮＸ−０９１４、ＶＬ０１、Ｅ１８７７０、イキサゾミブクエン酸エステル（MLN9708）、ＮＰＩ−００５２（サリノスポラミドA）、ＨＣＶプロテアソーム阻害剤、ＨＩＶプロテアソーム阻害剤、ＫＲＸ−０４０（ペリフォシン）、ＭＬＮ−２７３、ＭＬＮ−５１９（以前はLDP-519として知られていた）、テトラアクリジン、ＭＬＮ４９２４（NEDD8阻害剤）、ＨＢＸ１９８１８、ＨＢＸ４１１０８（USP7、プロテアーゼ7阻害剤）、ユビキチンリガーゼ、ＵＳＰ８阻害剤（システインプロテアーゼ）、ＣＣ１２５０７、ＨＢＸ９９２００、およびＰ５０９１からなる群から選択されるプロテアソーム阻害剤であることを開示する。
【００６４】
[0072]  より詳細には、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤は、ボルテゾミブ（PS-341,MG-341,Velcade（登録商標））、Ｐ１−０８３、ＭＬＮ  ９７０８、ＭＬＮ  ４９２４、ＭＬＮ  ５１９、カルフィルゾミブ、ＯＮＸ  ０９１２、ＣＥＰ−１８７７、ＮＰＩ−００４７、ＮＰＩ−００５２、ＢＵ−３２（NSC D750499-S）、ＰＲ−１７１、ＩＰＳＩ−００１、ならびに、緑茶ポリフェノール（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（EGCG）、大豆イソフラボンゲニステイン、および香辛料ウコン化合物クルクミンなどの、プロテアソーム阻害効果を有する天然物からなる群から選択されるプロテアソーム阻害剤である。プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブであることが最も好ましい。
【００６５】
[0073]  本発明は、ＣＵＬ４Ａの活性を妨げる物質、例えば１，３−ベンゾオキサチオール−２−オン化合物、ピリジンチオン化合物、または２，６−ジアミノ−４−チオピラン３，５−ジカルボニトリルなどを使用して、神経線維腫症２型を治療する方法も提供する。ＣＵＬ４Ａユビキチンリガーゼ（当技術分野において、カリンRingリガーゼ4（CRL4）およびカリン-4Aとも呼ばれる）をコードする遺伝子は、神経線維腫症２型／マーリン遺伝子変異がカリンＲｉｎｇリガーゼ４の過剰発現の理由となっている様々ながん型、例えば乳がんまたは原発性悪性胸膜中皮腫などにおいて、高頻度で増幅または過剰発現されている。
【００６６】
[0074]  さらに別の実施形態においては、本発明は、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を、通常、１投与あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｍ２、例えば１投与あたり０．５〜１．３ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与し、この投与を一定間隔（例えば、毎日、週２回、毎週、隔週、毎月など）で繰り返してもよいことを開示する。ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤はボルテゾミブであり、これを１日あたり０．１ｍｇから、１日あたり５０ｍｇまでの用量範囲で患者に投与することが好ましい。１日あたり１ｍｇから、１日あたり１０ｍｇまでの用量がより好ましい。ボルテゾミブは、約１．３ｍｇ／ｍ２の用量で、３〜５秒間の静脈内大量瞬時投与により、２１日サイクルのうちの２週間以上で週２回（１、４、８および１１日目）を８サイクル以下の間、患者に与えることが最も好ましい。
【００６７】
[0075]  実施形態の１つにおいては、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤は様々な濃度で製剤化する。例えば医薬製剤は、１μＭ〜１ｍＭ、例えば１μＭ〜１００μＭ、５μＭ〜５０μＭ、１０μＭ〜５０μＭ、２０μＭ〜４０μＭ、または約３０μＭの濃度でプロテアソーム阻害剤を含んでもよい。
【００６８】
[0076]  さらに別の実施形態においては、本発明は、１ｍｇ／ｍ２〜２．６ｍｇ／ｍ２の範囲のボルテゾミブの用量を、腹部または大腿から皮下送達してもよいことを開示する。腕の裏を３番目の選択肢とみなすこともできる。神経線維腫症２型患者に対する好ましいスケジュールは週２回である。ボルテゾミブの皮下投与は、末梢性ニューロパシーの発生率を有意に下げる。皮下経路用と静脈内経路用の両方のボルテゾミブの希釈は同じであり、濃度１ｍｇ／ｍｌとなってもよい。
【００６９】
[0077]  さらに別の実施形態においては、本発明は、神経線維腫症２型治療用のデキサメタゾンおよびボルテゾミブを含む製剤を開示する。デキサメタゾンの好ましい用量は、単独で、またはボルテゾミブと組み合わせて、毎日５ｍｇ〜４０ｍｇの範囲である。好ましい経路は、経口、静脈内、および皮下送達である。
【００７０】
[0078]  好ましい実施形態においては、本発明は、悪性または非悪性腫瘍を有する患者を治療する方法であって、前記腫瘍細胞が神経線維腫症２型遺伝子において１つまたは複数の変異を有し、前記方法が、治療有効量のプロテアソーム阻害剤を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００７１】
[0079]  別の好ましい実施形態においては、本発明は、神経線維腫症２型依存性腫瘍患者を診断する方法を開示する。この方法は、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子に起因して腫瘍細胞で神経線維腫症２型／マーリンタンパク質の活性が損なわれているかどうかを決定すること、および、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を用いて治療することを含む。
【００７２】
[0080]  さらに別の好ましい実施形態においては、本発明は、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤の投与が治療上有益であると推定される中皮腫患者を同定する方法であって、ａ）中皮腫細胞が変異神経線維腫症２型遺伝子を有するかどうかを決定すること；およびｂ）工程（ａ）において、中皮腫が、変異神経線維腫症２型遺伝子に起因してマーリンタンパク質の機能活性が存在しない細胞に関連していると見出された場合、患者を神経線維腫症２型依存性中皮腫患者として同定して、治療有効量のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を用いて治療することを含む方法を開示する。ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤はプロテアソーム阻害剤であることが好ましい。
【００７３】
[0081]  さらなる好ましい実施形態においては、本発明は、対象において、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子から生じる腫瘍または症状を治療または予防する方法であって、神経線維腫症２型遺伝子変異の診断用の生体試料を患者から得ることによって前記患者を診断すること、および有効量のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を投与するために上記のような患者を選択することを含む方法を開示する。
【００７４】
[0082]  別の実施形態においては、神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞の成長または数を阻害するか、または減少させるための、ボルテゾミブまたはその誘導体もしくは塩、多形体もしくはその異性体の使用を本明細書において開示する。有利なことに、神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞の治療によりアポトーシスの刺激がもたらされ、腫瘍サイズが減少することになる。理論に拘泥するものではないが、このことは、マーリンＮＦ−２タンパク質の欠損によって生じる腫瘍を有する患者において、ボルテゾミブがあたかもマーリン／ＮＦ−２タンパク質の効果を模倣するようなものである。
【００７５】
[0083]  別の一実施形態においては、本発明は、神経線維腫症２型／マーリンの治療に別の医薬品、放射線療法および／または外科手術を使用／実行するさらなる治療と並行して、ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を使用することができることを提案する。
【００７６】
[0084]  さらなる治療は、従来の化学療法剤（アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物アルカロイドおよびテルペノイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ならびに抗悪性腫瘍薬など）、放射線療法剤、抗体系治療剤（ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブなど）、ならびにステロイドからなる群から選択される。
【００７７】
[0085]  ステロイドは体内で自然に生成されるホルモンである。ステロイドは疾患の治療に使用される。２種の異なる薬剤が相補的作用機構を有する場合、それらは異なる方法で機能するが、一緒に与えられた場合は、疾患を阻害することにおいてより効果的となり得る。
【００７８】
[0086]  さらに別の実施形態においては、本発明は、ステロイドをボルテゾミブと組み合わせて、神経線維腫症２型、前庭シュワン細胞腫、聴神経腫瘍、片側性シュワン細胞腫、両側性前庭シュワン細胞腫、脊髄シュワン細胞腫、散発性シュワン細胞腫、末梢神経シュワン細胞腫、髄膜腫、中皮腫、上衣腫、神経膠腫、および星状細胞腫の治療に対する応答において相乗的な改善を提供することを開示する。
【００７９】
[0087]  最も好ましい実施形態においては、本発明は、ヒトにおいて、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子から生じる腫瘍または症状を治療、予防、または改善するための、プロテアソーム阻害剤の使用を開示する。
【００８０】
[0088]  さらに別の実施形態においては、本発明は、欠陥がある神経線維腫症２型およびＢＡＰ１遺伝子が中皮腫の原因である中皮腫を患う患者を、プロテアソーム阻害剤を使用して診断および治療する方法を開示する。中皮腫または悪性胸膜中皮腫（MPM）の患者は、胸膜生検および診断マーカーによって診断する。中皮腫を診断するため、胸膜生検を胸腔鏡検査によって優先的に行って、肺から組織試料を得る。中皮腫の診断用マーカーは、カルレチニン、ポドプラニン、ＷＴ１、およびサイトケラチン５／６である。中皮腫患者のうち約３５〜４０％は、マーリンタンパク質をコードする神経線維腫症２型（NF2）遺伝子において不活性化変異を有する。また有意な割合の患者が、ＢＡＰ１（BRCA関連タンパク質1）遺伝子における変異を有する。これらの両方の集団は非オーバーラップであり、両方の遺伝子において変異を有する患者がいないことを意味する。中皮腫患者は、分子遺伝学的検査により、これらの遺伝子のいずれかにおける変異についてスクリーニングすることができる。分子遺伝学的検査は、変異スキャニング、および遺伝子重複／欠失検査によって行う。例えば変異スキャニングは、対照ＤＮＡと比較した、患者のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅によって行い、変化したＤＮＡセグメントを有するＤＮＡは、配列解析などのさらなる検査に付して、配列変化を同定してもよい。遺伝子重複／欠失検査は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ロングレンジポリメラーゼ連鎖反応、マルチプレックスライゲーション依存プローブ増幅（MLPA）、および検出用遺伝子／染色体セグメントを含む染色体マイクロアレイ（CMA）によって行う。分子遺伝学的検査は、ＮＦ２遺伝子における変異、またはＢＡＰ１遺伝子における変異について確認する。中皮腫患者は、２つの遺伝子のいずれか（NF2またはBAP1）において変異を有することが確認されたら、ボルテゾミブを用いて治療する。ボルテゾミブは、１．３ｍｇ／ｍ２の用量で、３〜５秒間の静脈内大量瞬時投与により、２１日サイクルのうちの２週間以上で週２回（１、４、８および１１日目）を８サイクル以下の間、患者に与える。患者は腫瘍増殖の減少、および腫瘍サイズの減少に関して、顕著な改善を示す。腫瘍増殖における５０％の遅延、腫瘍サイズにおける２５％の減少が示される。
【００８１】
[0089]  開示した実施形態は限定することを意図するものではなく、代替実施形態またはさらなる実施形態が実現されてもよい。
【００８２】
定義：
[0090]  「プロテアソーム阻害剤」は、プロテアソーム、すなわち、例えばｐ５３タンパク質などのタンパク質を分解する細胞複合体、の作用を阻止する化合物を指す。いくつかのクラスのプロテアソーム阻害剤が公知である。ペプチドボロン酸のクラスはボルテゾミブおよびペプチドボロン酸（CEP-18770）を含む。他のクラスのプロテアソーム阻害剤としては、ペプチドアルデヒド（例えば、MG132）、ペプチドビニルスルホン、ペプチドエポキシケトン（例えば、エポキソミシン、カルフィルゾミブ）、βラクトン阻害剤（例えば、ラクタシスチン、MLN 519、NPI-0052、サリノスポラミドA）、金属とジチオカルバミン酸錯体を形成する化合物（例えば、慢性アルコール依存症の治療にも使用される薬物であるジスルフラム）、および特定の抗酸化剤（例えば、エピガロカテキン−３−ガレート）カテキン−３−ガレート、およびサリノスポラミドＡが挙げられる。
【００８３】
[0091]  本明細書において使用する場合、互換で使用する「対象」または「患者」という用語は、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、またはヒトなどの霊長類などの哺乳類を含めた任意の動物を意味する。
【００８４】
[0092]  本明細書において使用する場合、約という用語は、示される値の＋１０％または−１０％を意味する。
【００８５】
[0093]  「ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤」により、本発明者らは、（好ましくはヒトの生体内において）ユビキチン−プロテアソーム系の機能を（少なくとも部分的に）阻害することができる、小さな化学的実在物またはポリペプチドなどの薬剤を意味する。このような阻害剤は、ユビキチン−プロテアソームタンパク質分解経路の任意の箇所で作用してもよく、例えばユビキチン化もしくは脱ユビキチン化を調節することによる分解のためのタンパク質の標識を（少なくとも部分的に）阻害することにより、分解するタンパク質を認識するか、もしくはそのタンパク質に結合するプロテアソームの能力を阻害することにより、および／またはプロテアソームのタンパク質を分解する能力を阻害することにより、作用してもよい。
【００８６】
[0094]  ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤は、薬学的に有効な用量で患者に投与することになる。本明細書において使用する場合、「治療有効量」または「有効量」または「治療上有効的」は、所与の状態および投与レジメンに治療上の効果をもたらす量を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与媒体と共同で所望の治療効果を生成するよう計算された活性材料の所定量である。さらに、活性、機能および宿主の応答における臨床的に有意な欠損を減少させること、最も好ましくは妨げるのに充分な量を意味することを意図する。あるいは治療有効量は、宿主の臨床的に有意な状態において改善を生じさせるのに充分な量である。当業者によって理解されるように、化合物の量はその特定の活性に応じて変化してもよい。好適な投与量は、必要とされる希釈剤と共同で所望の治療効果を生成するよう計算された、活性組成物の所定量を含有してもよい。本発明の組成物を製造する方法、および製造するための使用においては、治療有効量の活性成分を用意する。治療有効量は、当技術分野で周知のように、例えば年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患などの患者の特徴に基づいて、一般的な医療従事者が決定することができる。薬学的に有効な用量の投与は、個別の単位剤形、またはそれより少量の単位剤形複数での単回投与、および特定の間隔における細分された用量での複数回投与の両方によって行うことができる。あるいは用量は、長期間の連続的な輸液として与えることができる。
【実施例】
【００８７】
実施例１：
様々なエンドポイントについての、対照ＨＡＰ１細胞株と比較した、ＮＦ２ノックアウト細胞株１２９３−１におけるボルテゾミブの評価ためのインビトロ分析
[0095]  ボルテゾミブのインビトロ分析は、ＮＦ２ノックアウト細胞株１２９３−１において、対照ＨＡＰ１（一倍体）野生型細胞株（Horizon Genomics）と共に、様々なエンドポイントで行った。この細胞株ではＮＦ２遺伝子の第１エクソンが欠失しているので、この細胞株は全ＮＦ２欠損細胞のモデルとして働く。ボルテゾミブはＮａｔｃｏ  Ｐｈａｒｍａ  Ｌｉｍｉｔｅｄから入手し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などのアッセイ用の標準的な化学薬品はＳｉｇｍａから入手し、カルフィルゾミブはＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから入手し、カスパーゼ３／７阻害剤、スタウロスポリンはＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
【００８８】
１．１．ボルテゾミブを使用した、Ｎｆ２ノックアウト細胞株および対照ＨＡＰ１（一倍体）細胞株における細胞増殖／細胞毒性の評価
[0096]  ＮＦ２ノックアウト細胞株１２９３−１および一倍体（HAP1）細胞株を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）および抗生物質を追加したそれぞれの培地で、２〜３日毎に培地を交換しながら、８０％の集密度が得られるまで維持した。細胞の継代は、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用することにより行った。細胞をトリプシンで処理し、培地１００μＬ中の所望の細胞数に従って９６ウェル透明底プレートに播種し、終夜接着させた。化合物の希釈を行い、各濃度の１００μＬを適切なウェルに加えた。細胞を、３７℃／５％ＣＯ２にて、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの異なる試験濃度範囲（すなわち、０．１、０．３、１、３、１０、３０、６０、および１００ｎＭ）で、６、１２、１８および２４時間インキュベートした。ビヒクルすなわち陰性対照は、化合物で処理されていない細胞、または該当する場合は使用する溶媒系の適切な対照であった（細胞はTriton X-100で処理した）。細胞増殖は、「MTS法に基づくcell titer 96 aqueous One Cell Proliferation assay」（MTS細胞増殖アッセイキット（Abcam、カタログ番号ab197010））、またはＣｅｌｌＴｉｔｒｅ  Ｂｌｕｅの蛍光に基づく方法を用いて測定した。この測定では、測定された吸光度が細胞毒性に反比例した。検出は、Ｆｌｅｘ  Ｓｔａｔｉｏｎ３（Molecular Devices）装置を用いて７５０ｎｍで行った。
【００８９】
[0097]  以下の表では、ＮＦ２ノックアウト細胞株（表１）およびＨＡＰ１（一倍体）細胞株（表２）で行った細胞増殖アッセイの結果が示されている。
【００９０】
【表１】
2018500299.tif 000003
【００９１】
【表２】
2018500299.tif 000004
【００９２】
[0098]  結論：０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度のボルテゾミブは、ＮＦ２ノックアウト細胞株において、６時間および１２時間で有意な細胞毒性を全く示さないが（１０〜１５％）；より高い濃度（＞３０ｎＭ）のボルテゾミブでは、１８時間および２４時間でわずかな細胞毒性が観察された。野生型一倍体（HAP1）細胞株では、ボルテゾミブは６時間で有意な毒性を全く示さなかったが、より高い濃度（＞３０ｎＭ）では、１２、１８および２４時間で毒性が観察された。
【００９３】
１．２．ボルテゾミブを使用した、Ｎｆ２ノックアウト細胞株および対照ＨＡＰ１（一倍体）細胞株における２０Ｓプロテアソーム活性の評価
[0099]  ＮＦ２ノックアウト細胞株１２９３−１および一倍体（HAP1）細胞株を６ウェルプレートに播種した。次に細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中で洗浄し、非イオン性界面活性剤およびＡＴＰを含有するバッファー中で溶解させた。細胞可溶化物を、１５，０００ｇにて３０分間、４℃で遠心分離した。上清を収集し、分注し、アッセイまで−８０℃で保管した。２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様ペプチダーゼ活性は、ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４  ２０ｍＭおよびＥＤＴＡ０．５ｍＭを含有するアッセイバッファー中で、蛍光発生ペプチド基質であるスクシニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ（Boston Biochem: S-280）４０μＭを、組換え型ＰＡ２８α（Boston Biochem: E-381、またはR&D Systemsカタログ番号E-381-100）１２ｎＭと共に使用することによって測定した。２０Ｓプロテアソームはペプチド基質を切断して、遊離のフルオロフォアＡＭＣを放出させた。ＮＦ２ノックアウト細胞を、３７℃／５％ＣＯ２にて、１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲のボルテゾミブの６つの異なる試験濃度（すなわち、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭ）で、６、１２、１８および２４時間インキュベートした。対照は、ビヒクルすなわち陰性対照（化合物で処理されていないNF2細胞、または該当する場合は使用する溶媒系の適切な対照）であった。化合物カルフィルゾミブをアッセイの内部標準として使用した（カルフィルゾミブで処理したNF2細胞）。同様のアッセイを、１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲の異なるボルテゾミブ濃度（すなわち、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭ）で１８時間、野生型一倍体（HAP1）細胞でも行った。反応は、Ｆｌｅｘ  Ｓｔａｔｉｏｎ３（Molecular Devices）またはＥｎｖｉｓｉｏｎ（PerkinElmer）を用い（励起／発光：３５３／４４２ｎｍ）、３７℃で１時間、速度論的設定下で測定することによってモニターした。基質代謝回転は、標準ＡＭＣを使用して作成した検量線に従って見積もった。２０Ｓプロテアソームアッセイの結果は、図１、２、３、４および５に記載されている。
【００９４】
結論：ボルテゾミブは、ＮＦ２ノックアウト細胞株において、１ｎＭ〜３００ｎＭの濃度でプロテアソーム活性の用量依存的減少を示した。３ｎＭより上の濃度のボルテゾミブを用いると、プロテアソーム活性は、インキュベーション６時間後、１２時間後、１８時間後および２４時間後に有意に減少した。ボルテゾミブは、１８時間にて、野生型一倍体細胞株においても濃度依存的な方法でプロテアソーム活性の阻害を示した。インキュベーション１８時間後での、ボルテゾミブを用いたプロテアソーム活性の阻害％の比較（図５）により、野生型一倍体細胞と比較してＮＦ２ノックアウト細胞において阻害がより大きいことが示された。
【００９５】
１．３．ボルテゾミブを使用した、ＮＦ２ノックアウト細胞株および対照ＨＡＰ１（一倍体）細胞株におけるカスパーゼ３／７活性の評価
[0093]  培養したＮＦ２ノックアウト細胞株１２９３−１細胞および対照一倍体細胞（対照野生型細胞）を９６ウェルプレートに播種した。異なる濃度のボルテゾミブを５μｌ／ウェル加え、３７℃／５％ＣＯ２にて、０．１ｎＭ〜３００ｎＭの異なる試験濃度で１８時間インキュベートした。ビヒクルすなわち陰性対照は、化合物で処理されていない細胞、または該当する場合は使用する溶媒系の適切な対照であり、陽性対照は、スタウロスポリンで処理した細胞であった。細胞可溶化物上清におけるカスパーゼ３／７活性は、均質かつ高感度なルミネセンスアッセイを用いて見積もった。Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイキット（Promegaカタログ番号G8093）は、カスパーゼ３／７活性に対して選択的なテトラペプチド配列ＤＥＶＤを有する基質を含有する。カスパーゼ活性は基質を切断して遊離アミノルシフェリンを遊離させ、これがまたルシフェラーゼの基質として作用して、ルミネセンスシグナルを生成する。ルミネセンスシグナルは、カスパーゼ３／７活性に正比例する。ルミネセンスシグナルは、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（PerkinElmer）またはＥｎｖｉｓｉｏｎ（PerkinElmer）装置で測定する。各アッセイには、適切な陰性対照、および参照阻害剤としてのスタウロスポリンが含まれた。
【００９６】
[00100]  結果：ＮＦ２ノックアウト細胞株において、異なる濃度（３ｎＭより上）のボルテゾミブの存在下で、カスパーゼ活性（アポトーシス）の有意な増加が観察された。しかしながら対照一倍体細胞株においては、１８時間において、ＮＦ２ノックアウト細胞株と比較して、様々な濃度で（３ｎＭより上で）アポトーシス／カスパーゼ３／７活性化の増加は最小限のものである（図６および７）。カスパーゼ３／７アッセイでは、両方の細胞株において陽性参照対照として働いたスタウロスポリンが誘発したアポトーシスも観察された。アポトーシス／カスパーゼ活性化の増加が得られる濃度は、プロテアソームアッセイにおいてＮＦ２ノックアウト細胞でプロテアソーム阻害が観察される濃度と同様の濃度である。アポトーシス活性の増加は、ボルテゾミブ治療に起因するＮＦ２腫瘍縮小の可能性を意味する。
【００９７】
１．４．ボルテゾミブとインキュベーションした後の、Ｎｆ２ノックアウト細胞株および対照ＨＡＰ１（一倍体）細胞株におけるＬＡＴＳ１タンパク質のウエスタンブロット分析
[00101]  ＮＦ２ノックアウト細胞株１２９３−１細胞および対照一倍体細胞株（対照野生型細胞）からの細胞を６ウェルプレートに播種する。細胞を、３７℃／５％ＣＯ２にて、ボルテゾミブの異なる試験濃度、すなわち、３、１０、および３０ｎＭで、１８時間インキュベートした。ＬＡＴＳ１タンパク質は、ウエスタンブロット（化学ルミネセンス）法によってアッセイした。この分析では、ＮＦ２細胞株の両方を使用する。ビヒクルすなわち陰性対照は、化合物で処理されていない細胞、または該当する場合は使用する溶媒系の適切な対照であった。細胞可溶化物をウエスタンブロットにより分析し、ＬＡＴＳ１は抗ｌａｔｓ１抗体（Abcam, ab70561）を使用して検出し；ＧＡＰＤＨタンパク質レベルは、抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用して、内在性対照としてアッセイした。この目的は、対照細胞株と比較した、ＮＦ２ノックアウト細胞株におけるＨｉｐｐｏシグナリング経路に関与するタンパク質（LATS1）の上方制御／下方制御を定量化することであった。別の目的は、ウエスタンブロット／Ｗｅｓシステムを用いたアッセイに従って、ＮＦ２ノックアウト細胞株におけるボルテゾミブ処理の効果を観察することである。
【００９８】
[00102]  結果：ボルテゾミブでの処理の１８時間後に、対照一倍体細胞株（対照野生型細胞）およびＮＦ２ノックアウト細胞株１２９３−１におけるＬＡＴＳ１タンパク質の相対レベルをアッセイした（図８および９）。対照一倍体細胞においては、ＮＦ２タンパク質によるユビキチン化プロセスの阻害の結果、ＬＡＴＳ１の発現が上昇している（これはYAP1のリン酸化を意味する）。対照一倍体細胞株と比較すると、ＮＦ２ノックアウト細胞においては、ＬＡＴＳ１の発現が非常に少ない（リン酸化YAP1が少ないことを意味する）。これは、機能的なＮＦ２タンパク質を欠く結果、ＬＡＴＳ１がユビキチン化されて分解されることに起因する。ＮＦ２ノックアウト細胞株を３、１０、および３０ｎＭのボルテゾミブで１８時間処理すると、ボルテゾミブで処理していない細胞と比較して、ボルテゾミブ濃度の増加に伴いＬＡＴＳ１のレベルの増加が示され（リン酸化YAP1の増加を意味する）、プロテアソーム媒介分解を阻害することによるＬＡＴＳ１のレスキューが実証された（図８および９）。よって、ＮＦ２ノックアウト細胞株をボルテゾミブで処理することにより、ＬＡＴＳ１タンパク質はプロテアソーム媒介分解からレスキューされ、その結果生じるＬＡＴＳ１の機能（YAPのリン酸化およびhippo経路の活性化）により、ＮＦ２ノックアウト細胞における増殖の阻害がもたらされる。同時に生じる、ＮＦ２ノックアウト細胞株におけるボルテゾミブ処理に起因して示されるアポトーシスの増加により、増殖を停止するためのボルテゾミブの使用の有用性、さらにはＮＦ２腫瘍のサイズを減少させる可能性が明らかに実証される。
【００９９】
[00103]  上の結果の全て、つまりＮＦ２ノックアウト細胞における、ボルテゾミブ処理によるプロテアソーム活性の減少、細胞毒性の増加、およびｈｉｐｐｏ経路のレスキューにより、シュワン細胞腫および髄膜腫を含めたＮＦ２腫瘍を治療することにおけるボルテゾミブの治療有用性が実証される。
【０１００】
実施例２：
ボルテゾミブおよびデキサメタゾンの製剤
[00104]  好適な量のプロピレングリコールを製造容器に入れ、次に必要量のアルコールを加える。次いで、その２種の成分を混合する。次に、前の工程で得られた溶液に、酸素含有量が７ｍｇ／ｌ未満、好ましくは３ｍｇ／ｌ未満になるまで窒素をパージする。前の工程で得られた溶液の約８０％にボルテゾミブおよびデキサメタゾンを加えて撹拌し、溶解する。次に、工程２で得られた溶液で体積を１００％にする。次に、得られた薬物溶液を、好適な滅菌等級フィルターでろ過し、バイアルに入れる。次に、バイアルの上部空間を窒素で覆って、上部空間の酸素含有量を１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満とする。最後に、バイアルに栓をして密閉する。
【０１０１】
[00105]  実施例３による製剤の安定性プロファイルを分析した。これを表８および９に示す。組成物中の薬物の量は、保管前後で測定した。表８および９において使用する「アッセイ」という用語は、ＨＰＬＣによる薬物の定量測定を指す。また、組成物の不純物プロファイルは、様々な温度および湿度条件における保管の前後に分析した。
【０１０２】
【表３】
2018500299.tif 000005
【０１０３】
実施例３：
ボルテゾミブを含有するプレフィルドシリンジ製剤
[0106]  非経口投与用のボルテゾミブのプレフィルドシリンジ用の組成物の実施例を以下に開示する。この実施例は説明することを意図するものであり、限定することを意図するものではない。
【０１０４】
【表４】
2018500299.tif 000006
【０１０５】
【表５】
2018500299.tif 000007
【０１０６】
【表６】
2018500299.tif 000008
【図１】
2018500299.tif 000009
【図２】
2018500299.tif 000010
【図３】
2018500299.tif 000011
【図４】
2018500299.tif 000012
【図５】
2018500299.tif 000013
【図６】
2018500299.tif 000014
【図７】
2018500299.tif 000015
【図８】
2018500299.tif 000016
【図９】
2018500299.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月25日(2017.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、神経線維腫症２型遺伝子変異に起因して生じる腫瘍または症状を治療、予防、または改善するための医薬組成物であって、治療有効量の少なくとも１種のユビキチン−プロテアソーム系阻害剤を含み、前記対象に投与される、医薬組成物。
【請求項２】
前記腫瘍が神経線維腫症２型／マーリン欠損腫瘍である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ユビキチン−プロテアソーム系阻害剤が、ボルテゾミブ、ＰＩ−０８３、ＭＬＮ  ９７０８、ＭＬＮ  ４９２４、ＭＬＮ  ５１９、カルフィルゾミブ、ＯＮＸ  ０９１２、ＣＥＰ−１８７７、ＮＰＩ−００５２、ＢＵ−３２（NSC D750499-S）、ＰＲ−１７１、ＩＰＳＩ−００１、ならびに、緑茶ポリフェノール（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（EGCG）、大豆イソフラボンゲニステイン、および香辛料ウコン化合物クルクミンのような、プロテアソーム阻害効果を有する天然物からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
プロテアソーム阻害剤がカルフィルゾミブである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
プロテアソーム阻害剤がボルテゾミブである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ボルテゾミブが、式［（１Ｒ）−３−メチル−１−（｛（２Ｓ）−３−フェニル−２−［（ピラジン−２−イルカルボニル）アミノ］プロパノイル｝アミノ）ブチル］ボロン酸、またはその薬学的に許容できる塩、誘導体、多形体、ラセミ体、もしくは立体異性体、結合体、もしくは複合体である薬学的に活性な化合物である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞の成長または数を阻害するか、または減少させるための医薬組成物であって、ボルテゾミブ化合物またはその誘導体、塩、多形体、もしくは異性体、結合体、もしくは複合体を含み、前記神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞または神経線維腫症２型欠損腫瘍細胞と接触させる、医薬組成物。
【請求項８】
対象において、欠陥がある神経線維腫症２型遺伝子から生じる腫瘍または症状を治療、予防、または改善するための医薬組成物であって、１種または複数の神経線維腫症２型欠損腫瘍の成長または関連する症状を阻害するか、または遅延させる治療有効量のボルテゾミブを含み、前記対象に投与される、医薬組成物。
【請求項９】
約０．５〜１００ｍｇ／ｍ2、好ましくは約０．５〜１．３ｍｇ／ｍ2の範囲の用量で投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
１日あたり約０．１〜５０ｍｇ、好ましくは１日あたり約１〜１０ｍｇの用量範囲で患者に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
非経口経路、腫瘍内経路、経口経路、静脈内経路、経皮経路、皮下経路、および筋肉内経路からなる群から選択される送達経路で、好ましくは皮下経路または腫瘍内経路で、より好ましくは皮下経路で投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
腫瘍に対する１種または複数のさらなる治療と組み合わせて前記患者に投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
１種または複数のさらなる治療が、従来の化学療法剤（アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物アルカロイドおよびテルペノイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ならびに抗悪性腫瘍薬など）、放射線療法剤、抗体系治療剤（ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブなど）、ならびにステロイドからなる群から選択され、好ましくは、ステロイドはデキサメタゾンである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
神経線維腫症２型／マーリンの活性が損なわれた腫瘍においてＬＡＴＳ活性を向上させるための医薬組成物であって、ボルテゾミブを含み、腫瘍を有すると決定された対象に投与される、医薬組成物。
【請求項１５】
腫瘍が、前庭シュワン細胞腫、片側性シュワン細胞腫、両側性前庭シュワン細胞腫、脊髄シュワン細胞腫、散発性シュワン細胞腫、および末梢神経シュワン細胞腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
神経線維腫症２型／マーリンの活性が損なわれた未治療細胞における活性と比較して、ＬＡＴＳ活性を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、または少なくとも１５０％増加させるのに充分な量で投与される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
神経線維腫症２型欠損腫瘍が、前庭シュワン細胞腫、片側性シュワン細胞腫、両側性前庭シュワン細胞腫、脊髄シュワン細胞腫、散発性シュワン細胞腫、末梢神経シュワン細胞腫、髄膜腫、中皮腫、上衣腫、神経膠腫、星状細胞腫及びこれらの組み合わせからからなる群から選択される、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2018500299.tif 000018
2018500299.tif 000019