(57)【要約】【課題】拡張可能な連結組織製造のみならず、腱、靭帯、及び骨を含むコラーゲン組織の組織改造及び修復のための方法及び装置が提供される。【解決手段】コラーゲン線維は、コラーゲンモノマーに関する引張ひずみ誘起の流動結晶化によって集合される。引張ひずみはまた、長範囲で途切れのない線維を提供するため、既に形成された短コラーゲン原線維の融合を駆動する。制御された組織改造及び創傷治癒のためのウェラブル装置は、組織改造溶液を組織修復サイトに供給する。組織改造サイトへのひずみの適切な適用と共に、改造溶液は、治癒を加速し、損傷を防ぎ、瘢痕形成を減少する。【選択図】図１０
2018500395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象においてコラーゲン組織の改造を促進する方法であって、当該方法は、以下のステップを含む：
（ａ）対象の組織改造サイトに組織改造溶液を投与すること；
（ｂ）組織改造サイトでのひずみ又はひずみ速度を誘起し、それにより、コラーゲンの組み込み、コラーゲン原線維の集合、コラーゲン原線維の融合、及び／又はコラーゲン原線維の分解が、組織改造サイトで刺激されること。
【請求項２】
組織改造溶液は、コラーゲンモノマー及び／又はオリゴマーの混合物を備え、前から存在するコラーゲン原線維を欠いている、請求項１の方法。
【請求項３】
組織改造溶液は、コラーゲンモノマー、ダイマー、トリマー、凝集体、及び／又は原線維を備える、請求項１の方法。
【請求項４】
組織改造溶液は、細胞外基質酵素、架橋剤、免疫抑制剤、ｐＨ変性剤、イオン強度変性剤、浸透圧上昇剤、可塑剤、線維芽細胞、間充織幹細胞、細胞移動促進剤、コラーゲン原線維片、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリノゲン、トロンビン、トロンボスポンジン、絹、及び成長因子からなる群から選択される一以上の成分を更に備える、請求項１の方法。
【請求項５】
組織改造溶液は、コラーゲンの集合を遅らせる又はコラーゲンの溶解限度を増やす一以上の因子を更に備える、請求項４の方法。
【請求項６】
コラーゲンの集合を遅らせる一以上の因子は、グルコース、熱ショックタンパク質、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、及びアニオン性ポリマーからなる群から選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
組織改造溶液は、トランスグルタミナーゼ、リシルオキシダーゼ、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びリボフラビンから選択される架橋剤を備える、請求項６の方法。
【請求項８】
組織改造溶液は、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）、カテプシン、細菌性コラゲナーゼ、並びにコンドロイチナーゼ又はヒアルロニダーゼのようなグリコサミノグリカン分解酵素から選択される細胞外基質酵素を備える、請求項４の方法。
【請求項９】
組織改造溶液は、免疫抑制剤を備え、免疫抑制剤は、抗炎症剤である、請求項４の方法。
【請求項１０】
組織改造溶液は、一回以上の注射、又は連続的若しくは間欠的な注入により投与される、請求項１の方法。
【請求項１１】
ひずみ速度は、循環的又は間欠的に誘起され、組織改造サイトで引張又は圧縮のいずれか一方を提供する、請求項１の方法。
【請求項１２】
改造サイトでのひずみ速度は、約０．００１ｓｅｃ−１から約１０ｓｅｃ−１である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
コラーゲン原線維の集合は、流動誘起結晶化により刺激される、請求項１１の方法。
【請求項１４】
静的ひずみが、循環的又は間欠的のいずれか一方で誘起及び保持される、請求項１の方法。
【請求項１５】
改造サイトでの静的ひずみが、０から約２であり、コラーゲン原線維の集合が、前から存在するコラーゲン原線維内にコラーゲンモノマー及び／又はオリゴマーを組み込むことによって刺激される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
改造サイトで誘起された静的ひずみは、０から約２であり、コラーゲン原線維の分離又は劣化が、一以上の温度又はマトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）、カテプシン、及び細菌性コラゲナーゼから選択される酵素によって刺激される、請求項１４の方法。
【請求項１７】
引張若しくは圧縮ひずみ、又は引張ひずみ速度は、物理的な治療、マッサージ、ストレッチ、運動プログラム、電気的筋肉刺激、又は連続的受動運動装置によって改造サイトで誘起される、請求項１の方法。
【請求項１８】
投与される組織改造溶液の組成又は量及び組織改造溶液を投与するタイミングを決めるプログラムに従って、組織改造溶液を投与することが実行される、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記プログラムは、コラーゲンモノマー、コラーゲンオリゴマー、細胞外基質酵素、架橋剤、免疫抑制剤、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリノゲン、トロンビン、トロンボスポンジン、絹、成長因子、グルコース、熱ショックタンパク質、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、及びアニオン性ポリマーからなる群から選択される組織改造溶液の一以上の成分の存在又は欠如、及び仮に存在する場合その濃度を決める、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記投与するステップは、注入ポンプと、改造溶液を含む貯留容器と、組織改造サイトに差し込まれるカテーテルと、前記プログラムに従う投与を実行するようプラグラムされた制御モジュールとを備えるウェラブル装置の使用を備える、請求項１８の方法。
【請求項２１】
コラーゲンは、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、プロコラーゲン、又はそれらの混合物である、請求項２の方法。
【請求項２２】
コラーゲンは、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、又はタイプＸＩである、請求項２の方法。
【請求項２３】
対象が、魚類、両性動物、爬虫類、鳥類、哺乳類である、請求項１の方法。
【請求項２４】
対象が哺乳類であり、哺乳類はヒトである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
以下のステップを更に備える請求項１の方法：
（ａ０）ステップ（ａ）に先立って、対象内への内鞘を差し込むステップを備え、前記鞘は、組織改造サイトを包む。
【請求項２６】
鞘は、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、フィブロネクチン、線維素、エラスチン、絹、架橋剤、生分解性高分子からなる群から選択される一以上の成分を備える、請求項２５の方法。
【請求項２７】
組織改造溶液は、組織改造サイトに到達するよう鞘を介して投与される、請求項２５の方法。
【請求項２８】
鞘は、腱の剛性を再現する、請求項２５の方法。
【請求項２９】
鞘は、腱、靭帯、若しくは骨の途切れ又は裂け目の両端を取り囲むか、又は腱、靭帯、骨の損傷サイトを取り囲むよう、腱、靭帯、若しくは骨との接続を形成する、請求項２５の方法。
【請求項３０】
以下のステップを更に備える、請求項１の方法：
（ｃ）組織改造サイトから得られる細胞外流体の試料における一以上のパラメータを測定し、
（ｄ）前記一以上のパラメータに基づく改造溶液の投与又は組成を調整する。
【請求項３１】
前記測定するステップは、前記細胞外流体試料の成分濃度を測る一以上のセンサーの使用を備える、請求項３１の方法。
【請求項３２】
前記投与又は組成を調整するステップは、コラーゲン成長モードの支援からコラーゲン改造モードの支援、又はコラーゲン改造モードの支援からコラーゲン成長モードの支援に、組織改造溶液の組成及び／又は投与を切り替えることを備える、特徴３０の方法。
【請求項３３】
コラーゲン原線維の数、直径、長さ、密度、及び／又は列が増やされる、請求項１の方法。
【請求項３４】
組織改造サイトで、存在するコラーゲン原線維の再配列が達成される、請求項１の方法。
【請求項３５】
組織改造サイトでコラーゲン原線維の数又は密度の増加が達成される、請求項１の方法。
【請求項３６】
腱若しくは靭帯の張り、捻挫、裂け目、又は裂傷の修復が達成される、請求項１の方法。
【請求項３７】
靭帯は、前十字靭帯（ＡＣＬ）、内側十字靭帯（ＭＣＬ）、後十字靭帯（ＰＣＬ）、側十字靭帯（ＬＣＬ）、内側側副靱帯である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
腱は、アキレス腱、手の伸筋腱、手の屈筋腱、回旋筋腱板、肘の腱である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
折れた又は砕けた骨の治癒が達成される、請求項１の方法。
【請求項４０】
組織改造溶液は、カルシウム、カルシウム供与体；リン酸塩、リン酸塩供与体；オステオポンチン、オステオネクチン、オステオカルシン、ホスホホリン、骨シアロタンパク質のような骨結合の非コラーゲン性タンパク質；骨形成タンパク質；及びポリアスパラギン酸のような合成添加分子から成る群から選択される一以上の成分を備える、請求項３９の方法。
【請求項４１】
引き裂かれた若しくは切断された腱若しくは靭帯、又は砕かれた骨の外科的修復に続いて適用される、請求項１の方法。
【請求項４２】
整形外科、関節形成、歯科矯正外科、血管手術、美容整形外科、又は皮膚手術に関して適用される、請求項１の方法。
【請求項４３】
慢性腰痛、脱出した又はヘルニア状態の脊椎板、スポーツでの怪我、骨関節炎、関節リウマチ、骨粗しょう症、円すい角膜、緑内障、又は軟骨の病気の治療に適用される、請求項１の方法。
【請求項４４】
組織改造サイトは、創傷部分である、請求項１の方法。
【請求項４５】
傷を残さない創傷の治癒を促進する、又は創傷の治癒中に瘢痕を減少する、請求項４３の方法。
【請求項４６】
自然治癒プロセスが加速される、請求項１の方法。
【請求項４７】
請求項４８の装置の使用を行なう、請求項１の方法。
【請求項４８】
必要とする対象において、組織の改造を促進する装置であって、前記装置は以下を備える：
（ｉ）組織改造溶液の貯留容器及び貯留容器から組織改造溶液を移送するための注入ポンプを備えるディスペンスモジュール；
（ｉｉ）組織改造溶液を注入ポンプから対象人体の組織改造サイトへ移送するための供給カテーテル；
（ｉｉｉ）前記ポンプと任意に組織改造溶液の組成を制御するためのプログラム可能な制御モジュールであって、ここで、前記制御モジュールは、組織改造溶液の組織改造サイトへの供給及び／又は組成を調整することによって組織改造を制御するようプログラムされて、その結果、組織改造サイトでのコラーゲン原線維の集合、融合、分解、及び／又は再編成を促進する。
【請求項４９】
ディスペンスモジュールは、
一以上の追加的試薬溶液のための一以上の追加的貯留容器と、
組織改造サイトへの移送前に、組織改造溶液を有する一以上の追加的試薬溶液を混合するための混合システムと、
を更に含む、請求項４８の装置。
【請求項５０】
混合システムは、マイクロ流体チップである、請求項４９の装置。
【請求項５１】
プログラム可能な制御モジュールは、組織改造溶液を伴う前記一以上の試薬溶液の混合を制御する、請求項４９の装置。
【請求項５２】
プログラム可能な制御モジュールは、組織改造溶液及び／若しくは一以上の試薬溶液のｐＨ、イオン強度、並びに／又は温度を制御する、請求項４９の装置。
【請求項５３】
（ｉｖ）組織改造サイトから分析装置へ細胞外流体を送り返すためのリターンカテーテルを更に含む、請求項４８の装置。
【請求項５４】
リターンカテーテルは、細胞及び集合した線維を除くためのフィルターを備える、請求項５３の装置。
【請求項５５】
（ｖ）組織改造サイトにおける細胞外基質流体の一以上の成分の濃度を検出するセンサーを更に含み、前記センサーは、一以上の成分に関する出力を制御モジュールに供給する、請求項５３の装置。
【請求項５６】
前記センサーは、マイクロ熱量計である、請求項５５の装置。
【請求項５７】
前記センサーは、コラーゲンの濃度を検出する、請求項５５の装置。
【請求項５８】
前記センサーは、二以上の異なるコラーゲン種の濃度を検出する、請求項５７の装置。
【請求項５９】
細胞外基質流体の二以上の異なる成分の濃度を検出する二以上のセンサーを備える、請求項５５の装置。
【請求項６０】
ディスペンスモジュールは、供給カテーテルを介して組織改造サイトに移送するための組織改造溶液を有する、及び／又は一以上の追加的試薬を有する、戻された細胞外流体を混合するための混合システムを更に備える、請求項５５の装置。
【請求項６１】
組織改造サイトに送り返される前に、戻される細胞外流体を調整するための微小透析モジュールを更に備える、請求項６０の装置。
【請求項６２】
ディスペンスモジュール又は前記ディスペンスモジュールに接続される他のモジュールに保管された組織改造溶液及び任意の一以上の追加的試薬溶液の温度を制御する温度制御機構を更に備える、請求項４８の装置。
【請求項６３】
対象への投与に先立ち、試薬を長期間保管するために冷却すること、及び溶液を体温まで加温することの双方を提供する、請求項６２の装置。
【請求項６４】
ウェラブル装置として構成される、請求項４８の装置。
【請求項６５】
一以上のバルブを更に備える、請求項４８の装置。
【請求項６６】
制御モジュールは、ディスペンスモジュールから離れている、請求項４８の装置。
【請求項６７】
制御モジュールは、ディスペンスモジュールと信号を送受信する携帯電話、コンピュータ、又は他のワイヤレス装置である、請求項６６の装置。
【請求項６８】
ディスペンスモジュールの一以上の貯留容器に、前記組織改造溶液、及び任意に一以上の追加的試薬を備える、請求項４８の装置。
【請求項６９】
組織改造サイト又はその近くとは異なる場所で組織改造溶液を投与するための一以上の追加的カテーテルを更に備える、請求項４８の装置。
【請求項７０】
供給カテーテルは、組織改造サイト又はその近くで注射により当該溶液を投与するための針を備える、請求項４８の装置。
【請求項７１】
組織改造流体の、ディスペンスモジュールとの双方向の流れが提供される、請求項４８の装置。
【請求項７２】
双方向の流れは、供給カテーテルを介する逆戻し可能な流れにより提供される、請求項７１の装置。
【請求項７３】
双方向の流れは、供給カテーテルとリターンカテーテルの組み合された動作により提供される、請求項７１の装置。
【請求項７４】
組織改造サイトから集められた細胞外流体は、分析のための流体チャンバーで収集される、請求項７１の装置。
【請求項７５】
組織改造サイトを取り囲む領域で対象の一以上の筋に電気的刺激を提供する筋刺激装置を更に含む、請求項４８の装置。
【請求項７６】
組織改造サイトを取り囲む領域で引張ひずみを提供する受動運動装置を更に含む、請求項４８の装置。
【請求項７７】
請求項４８の装置、当該装置と共に使用されるための組織改造溶液及び任意の一以上の試薬溶液を備える、キット。
【請求項７８】
請求項４８の装置、当該装置と共に使用されるための一以上の鞘を備える、キット。
【請求項７９】
一以上のコラーゲン原線維を体外で生成する方法であって、前記方法は、下記のステップを含む：
（ａ）初期状態でコラーゲン原線維を欠いているコラーゲン溶液を供給すること；
（ｂ）前記溶液にひずみを印加すること、これにより、前記溶液からのコラーゲンが、一以上のコラーゲン原線維に集合する。
【請求項８０】
コラーゲン溶液のｐＨ、イオン強度、温度、及び／又はコラーゲン濃度は、基本的に一定を維持される、請求項７９の方法。
【請求項８１】
ｐＨ、イオン強度、温度、及び／又はコラーゲン濃度は、当初、コラーゲン原線維の形成を防ぐために十分低く、ひずみ誘起の前、最中、又は後に高められる、請求項７９の方法。
【請求項８２】
引張ひずみは、コラーゲン溶液の表面を引く、又はコラーゲン溶液内のコラーゲン原線維を引き寄せることを用いた、コラーゲン溶液内の流れ又はせん断の定立によって達成される、請求項７９の方法。
【請求項８３】
引出プローブが、引張ひずみを誘起するために使用される、請求項７９の方法。
【請求項８４】
必要とする対象において損傷又は組織ダメージの防止を目的とする方法であって、前記方法は、以下のステップを含む：
（ａ）対象の組織改造サイトに組織改造溶液を投与し、ここで、組織改造サイトは、将来の損傷又は組織ダメージへの対象となり得ることを疑われるものである；
（ｂ）組織改造サイトでひずみ又は引張ひずみ速度を誘起し、これにより、コラーゲンの組み込み、コラーゲン原線維の集合、コラーゲン原線維の融合、及び／又はコラーゲン原線維の分解が、組織改造サイトで刺激される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン組織治療装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（アメリカ合衆国連邦政府の助成による研究または開発に関する陳述）
本発明は、アメリカ合衆国国立衛生研究所の許可番号ＮＥＩＥＹ０１５５００号からの資金援助を伴い開発された。アメリカ合衆国政府は、本発明において一定の権利を保有する。
【０００３】
細胞外基質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）組織は、低細胞集団、低血管分布、及び年齢に関連して低下する代謝活動のため、当然ながらゆっくりと治癒する。ＥＣＭ損傷の基本的生物学的反応は、分子組織を減らし、力学的性質を弱め、そしてしばしば可動性の低下をもたらすような、瘢痕組織の形成である。その損傷が、瘢痕組織では埋められないほど大きな隔たりによって組織を分離するとき、極近接状態で組織の断裂片を保持するための縫合を利用する外科技術が、実行される。しかしながら、実際の治療は、未だ、細胞による分子生産にもっぱら依存している。更に、多くのＥＣＭ損傷において、細胞は、損傷領域を立ち退き、アポトーシス（細胞自然死）を被り、更に、治療を行なう組織の能力を弱める。治癒プロセスの律速（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）ステップは、治療の促進に要求される、細胞にとってのＥＣＭ分子の分泌に掛かる時間の量である。その上、変更された力学的状態及び免疫系による炎症反応は、タンパク質の選択と、それらの対応濃度に関して間違う。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、損傷された生体組織、特に細胞外基質（ＥＣＭ）のようなコラーゲン組織の治療に関する。装置、システム、及び方法は、治療（修復）が起こるスピードを加速し、損傷組織の回復の程度や質を改善するよう提供される。
【０００５】
ここに記載される提案は、治療を受ける又は内因性生体反応で認識される負担や信頼を和らげる生体分子の外因性混合物及び／若しくはそれらの前駆体を供給することによって作り直す組織の分子環境を制御する。その混合物の成分は、外傷治癒及び／又は組織の成長中に存在する成分に類似する。抗炎症性分子又は分子抑制免疫のような追加の成分が、含まれ得る。その分子混合物は、治療プロセスに貢献しこれを加速する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、必要とする対象において、コラーゲン組織の改造を促進する方法である。その方法は、以下のステップを含む：（ａ）対象の組織改造サイト（ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｉｔｅ）に組織改造溶液（ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を投与する；（ｂ）組織改造サイトでのひずみ（ｓｔｒａｉｎ）又はひずみ速度を誘起し、それにより、コラーゲンの組み込み（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コラーゲン原線維の集合（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｌｉｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）、又はコラーゲン原線維の分解（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｌｉｌ  ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）が、組織改造サイトで刺激される。幾つかの実施形態において、前記方法は、ステップ（ａ）に先立って、（ａ０）対象内への内鞘を差し込むステップを含む。ここで、前記鞘は、組織改造サイトを包む。幾つかの実施形態において、前記方法は、（ｃ）組織改造サイトから得られる細胞外流体の試料における一以上のパラメータを測定し、（ｄ）前記一以上のパラメータに基づく改造溶液の投与又は組成を調整する、ステップを更に含む。
【０００７】
本発明の他の態様は、必要とする対象において、組織の改造を促進する装置である。前記装置は、（ｉ）組織改造溶液の貯留容器及び貯留容器から組織改造溶液を移送するための注入ポンプを備えるディスペンスモジュール、（ｉｉ）組織改造溶液を注入ポンプから対象人体の組織改造サイトへ移送するための供給カテーテル、（ｉｉｉ）前記ポンプと任意に組織改造溶液の組成を制御するためのプログラム可能な制御モジュールであって、ここで、前記制御モジュールは、組織改造溶液の組織改造サイトへの供給及び／又は組成を調整することによって組織改造を制御するようプログラムされて、その結果、組織改造サイトでのコラーゲン原線維の集合、分解、及び／又は再編成を促進する。幾つかの実施形態において、ディスペンスモジュールは、一以上の追加的試薬溶液のための一以上の追加的貯留容器と、組織改造サイトへの移送前に、組織改造溶液を有する一以上の追加的試薬溶液を混合するための混合システムとを更に含む。幾つかの実施形態において、前記装置は、（ｉｖ）組織改造サイトからまた分析装置へ細胞外流体の移送のためのリターンカテーテルを更に含む。幾つかの実施形態において、ディスペンスモジュールは、組織改造溶液及び／又は供給カテーテルを介して組織改造サイトに移送するための一以上の追加的試薬を伴う戻された細胞外流体を混合するための混合システムを更に含む。前記装置の幾つかの実施形態は、（ｖ）組織改造サイトにおける細胞外基質流体の一以上の成分の濃度を検出するセンサーを含み、前記センサーは、一以上の成分に関する出力を制御モジュールに供給する。前記装置の幾つかの実施形態は、組織改造サイトを囲む領域に係る一以上の対象筋肉の電気的刺激を供給する筋刺激モジュールを含む。前記装置の幾つかの実施形態は、組織改造サイトで引張ひずみ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒａｉｎ）を誘起する受動運動装置を含む。
【０００８】
本発明の更に他の態様は、上記装置、組織改造溶液、及び任意に前記装置と共に使用する一以上の試薬溶液を含むキットである。
【０００９】
本発明の更に他の態様は、一以上のコラーゲン原線維を体外で生成する方法に関する。前記方法は、以下のステップを含む：（ａ）初期状態でコラーゲン原線維を欠いているコラーゲン溶液を供給する、及び（ｂ）前記溶液に機械的応力を印加する、これにより、前記溶液からのコラーゲンが、一以上のコラーゲン原線維に集合させる。
【００１０】
本発明の更に他の態様は、人工組織足場（ａｒｔｉｆｉｃａｉｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）を生成する方法である。前記方法は、コラーゲンモノマー溶液が型にある際、上記した一以上のコラーゲン原線維を生成する前記体外方法を実行するステップを含み、ここで、型の形状は、前記組織足場の形状を提供する。
【００１１】
本発明の更に他の態様は、必要とする対象において損傷又は組織ダメージの防止を目的とする方法である。前記方法は、以下のステップを含む：（ａ）対象の組織改造サイトに組織改造溶液を投与し、ここで、組織改造サイトは、将来の損傷又は組織ダメージを疑われるものであり、及び（ｂ）組織改造サイトへのひずみ又はひずみ速度を誘起し、これにより、コラーゲン原線維の集合又は分解が、組織改造サイトで刺激される。
【００１２】
本発明の他の態様は、単量体のコラーゲン、オリゴマーのコラーゲン、並びに細胞外基質酵素、架橋剤、免疫抑制剤、ｐＨ変性剤（ｐＨ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、イオン強度変性剤、浸透圧上昇剤（ｏｓｍｉｃａｎｔｓ）、可塑剤、線維芽細胞、間充織幹細胞、細胞移動促進剤、コラーゲン原線維片、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリノゲン、トロンビン、トロンボスポンジン、絹、及び成長因子からなる群から選択される一以上の成分を含む組織改造溶液である。組織改造溶液はまた、グルコース、熱ショックタンパク質、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、及びアニオン性ポリマーのようなコラーゲンの集合を遅らせる又はコラーゲンの溶解限度を増やす一以上の因子、トランスグルタミナーゼ、及びリシルオキシダーゼのような架橋剤、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）、カテプシン、及び細菌性コラゲナーゼのような細胞外基質酵素、並びに免疫抑制剤のような抗炎症剤を含む。
【００１３】
本発明は、下記の特徴リストにより更に要約される。
【００１４】
１．必要とする対象においてコラーゲン組織の改造を促進する方法であって、その方法は、以下のステップを含む：（ａ）対象の組織改造サイトに組織改造溶液を投与すること；（ｂ）組織改造サイトでのひずみ又はひずみ速度を誘起し、それにより、コラーゲンの組み込み、コラーゲン原線維の集合、及び／又はコラーゲン原線維の分解が、組織改造サイトで刺激されること。
【００１５】
２．組織改造溶液は、コラーゲンモノマー及び／又はオリゴマーの混合物を備え、前から存在するコラーゲン原線維を欠いている、特徴１の方法。
【００１６】
３．組織改造溶液は、コラーゲンモノマー、ダイマー、トリマー、凝集体、及び／又は原線維を備える、特徴１又は２の方法。
【００１７】
４．組織改造溶液は、細胞外基質酵素、架橋剤、免疫抑制剤、ｐＨ変性剤、イオン強度変性剤、浸透圧上昇剤（ｏｓｍｉｃａｎｔｓ）、可塑剤、線維芽細胞、間充織幹細胞、細胞移動促進剤、コラーゲン原線維片、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリノゲン、トロンビン、トロンボスポンジン、絹、及び成長因子からなる群から選択される一以上の成分を更に備える、先行する特徴のいずれかの方法。
【００１８】
５．組織改造溶液は、コラーゲンの集合を遅らせる又はコラーゲンの溶解限度を増やす一以上の因子を更に備える、特徴４の方法。
【００１９】
６．コラーゲンの集合を遅らせる一以上の因子は、グルコース、熱ショックタンパク質、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、及びアニオン性ポリマーから選択される、特徴５の方法。
【００２０】
７．組織改造溶液は、トランスグルタミナーゼ及びリシルオキシダーゼ、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びリボフラビンから選択される架橋剤を備える、特徴６の方法。
【００２１】
８．組織改造溶液は、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）、カテプシン、細菌性コラゲナーゼ、並びにコンドロイチナーゼ又はヒアルロニダーゼのようなグリコサミノグリカン分解酵素（ｇａｇａｓｅｓ）から選択される細胞外基質酵素を備える、特徴４の方法。
【００２２】
９．組織改造溶液は、免疫抑制剤を備え、免疫抑制剤は、抗炎症剤である、特徴４の方法。
【００２３】
１０．組織改造溶液は、一回以上の注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、又は連続的若しくは間欠的な注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）により施される、先行する特徴のいずれかの方法。
【００２４】
１１．ひずみ速度は、循環的又は間欠的に誘起され、組織改造サイトで引張又は圧縮のいずれか一方を提供する、先行する特徴のいずれかの方法。
【００２５】
１２．改造サイトでのひずみ速度は、約０．００１ｓｅｃ−１（毎秒）から約１０ｓｅｃ−１である、特徴１１の方法。
【００２６】
１３．コラーゲン原線維の集合は、流動誘起結晶化（ｆｌｏｗ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）により刺激される、特徴１１の方法。
【００２７】
１４．静的ひずみが、循環的又は間欠的のいずれか一方で誘起、保持される、先行する特徴のいずれかの方法。
【００２８】
１５．改造サイトでの静的ひずみが、０から約２であり、コラーゲン原線維の集合が、前から存在するコラーゲン原線維内にコラーゲンモノマー及び／又はオリゴマーを組み込むことによって刺激される、特徴１４の方法。
【００２９】
１６．改造サイトで誘起された静的ひずみは、０から約２であり、コラーゲン原線維の分離又は劣化が、一以上の温度又はマトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）、カテプシン、及び細菌性コラゲナーゼから選択される酵素によって刺激される、特徴１４の方法。
【００３０】
１７．引張若しくは圧縮ひずみ、又は引張ひずみ速度は、物理的な治療、マッサージ、ストレッチ、運動プログラム、電気的筋肉刺激、又は連続的受動運動装置によって改造サイトで誘起される、先行する特徴のいずれかの方法。
【００３１】
１８．投与される組織改造溶液の組成又は量及び組織改造溶液を投与するタイミングを決めるプログラムに従って、組織改造溶液を投与することが実行される、先行する特徴のいずれかの方法。
【００３２】
１９．前記プログラムは、コラーゲンモノマー、コラーゲンオリゴマー、細胞外基質酵素、架橋剤、免疫抑制剤、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリノゲン、トロンビン、トロンボスポンジン、絹、成長因子、グルコース、熱ショックタンパク質、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、及びアニオン性ポリマーからなる群から選択される組織改造溶液の一以上の成分の存在又は欠如及び濃度（もし存在すれば）を決める、特徴１８の方法。
【００３３】
２０．前記投与するステップは、注入ポンプと、改造溶液を含む貯留容器と、組織改造サイトに差し込まれるカテーテルと、前記プログラムに従う投与を実行するようプラグラムされた制御モジュールとを備えるウェラブル装置の使用を備える、特徴１８の方法。
【００３４】
２１．コラーゲンは、アテロコラーゲン（ａｔｅｌｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）、テロコラーゲン（ｔｅｌｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）、プロコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）、又はそれらの混合物である、特徴２の方法。
【００３５】
２２．コラーゲンは、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、又はタイプＸＩである、特徴２の方法。
【００３６】
２３．対象が、魚類、両性動物、爬虫類、鳥類、哺乳類である、先行する特徴のいずれかの方法。
【００３７】
２４．対象が哺乳類であり、哺乳類はヒトである、特徴２３の方法。
【００３８】
２５．更に、（ａ０）ステップ（ａ）に先立って、対象内への内鞘を差し込むステップを備え、前記鞘は、組織改造サイトを包む、先行する特徴のいずれかの方法。
【００３９】
２６．鞘は、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、フィブロネクチン、線維素、エラスチン、絹、架橋剤、生分解性高分子からなる群から選択される一以上の成分を備える、特徴２５の方法。
【００４０】
２７．組織改造溶液は、組織改造サイトに到達するよう鞘を介して投与される、特徴２５の方法。
【００４１】
２８．鞘は、腱の剛性を再現する、特徴２５の方法。
【００４２】
２９．鞘は、腱、靭帯、若しくは骨の途切れ又は裂け目の両端を取り囲むか、又は腱、靭帯、骨の損傷サイトを取り囲む、腱、靭帯、骨との接続を形成する、特徴２５の方法。
【００４３】
３０．更に、
（ｃ）組織改造サイトから得られる細胞外流体の試料における一以上のパラメータを測定し、
（ｄ）前記一以上のパラメータに基づく改造溶液の投与又は組成を調整する、ステップを備える、先行する特徴のいずれかの方法。
【００４４】
３１．前記測定するステップは、前記細胞外流体試料の成分濃度を測る一以上のセンサーの使用を備える、特徴３０の方法。
【００４５】
３２．前記投与又は組成を調整するステップは、コラーゲン成長モードの支援からコラーゲン改造モードの支援、又はコラーゲン改造モードの支援からコラーゲン成長モードの支援に組織改造溶液の組成及び／又は投与を切り替えることを備える、特徴３０の方法。
【００４６】
３３．コラーゲン原線維の数、直径、長さ、密度、及び／又は列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）が増加する、先行する特徴のいずれかの方法。
【００４７】
３４．組織改造サイトで、存在するコラーゲン原線維の再配列（ｒｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ）が達成される、特徴３４の方法。
【００４８】
３５．組織改造サイトでコラーゲン原線維の数又は密度の増加が達成される、特徴３５の方法。
【００４９】
３６．腱又は靭帯の張り（ｓｔｒａｉｎ）、捻挫、裂け目、又は裂傷の修復が達成される、先行する特徴のいずれかの方法。
【００５０】
３７．靭帯は、前十字靭帯（ＡＣＬ）、内側十字靭帯（ｍｅｄｉａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ：ＭＣＬ）、後十字靭帯（ＰＣＬ）、側十字靭帯（ｌａｔｅｒａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ：ＬＣＬ）、内側側副靱帯である、特徴３６の方法。
【００５１】
３８．腱は、アキレス腱、手の伸筋腱、手の屈筋腱、回旋筋腱板、肘の腱である、特徴３６の方法。
【００５２】
３９．折れた又は砕けた骨の治癒が達成される、先行する特徴のいずれかの方法。
【００５３】
４０．組織改造溶液は、カルシウム、カルシウム供与体；リン酸塩、リン酸塩供与体；オステオポンチン、オステオネクチン、オステオカルシン、ホスホホリン、骨シアロタンパク質のような骨関連の非コラーゲン性タンパク質；骨形成タンパク質；及びポリアスパラギン酸のような合成添加分子（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）から成る群から選択される一以上の成分を備える、特徴３９の方法。
【００５４】
４１．引き裂かれた若しくは切断された腱若しくは靭帯、又は砕かれた骨の外科的修復に続いて適用される、先行する特徴のいずれかの方法。
【００５５】
４２．整形外科、関節形成、歯科矯正外科、血管手術、美容整形外科、又は皮膚手術に関して適用される、先行する特徴のいずれかの方法。
【００５６】
４３．慢性腰痛、脱出した又はヘルニア状態の脊椎板、スポーツでの怪我、骨関節炎、関節リウマチ、骨粗しょう症、円すい角膜、緑内障、又は軟骨の病気の治療に適用される、先行する特徴のいずれかの方法。
【００５７】
４４．組織改造サイトは、外傷部分である、先行する特徴のいずれかの方法。
【００５８】
４５．傷を残さない外傷の治癒を促進する、又は外傷の治癒中に瘢痕を減少する、特徴４３の方法。
【００５９】
４６．自然治癒プロセスが加速される、先行する特徴のいずれかの方法。
【００６０】
４７．特徴４８の装置の使用を行なう先行する特徴のいずれかの方法。
【００６１】
４８．必要とする対象において、組織の改造を促進する装置であって、前記装置は以下を備える。
（ｉ）組織改造溶液の貯留容器及び貯留容器から組織改造溶液を移送するための注入ポンプを備えるディスペンスモジュール、
（ｉｉ）組織改造溶液を注入ポンプから対象人体の組織改造サイトへ移送するための供給カテーテル、
（ｉｉｉ）前記ポンプと任意に組織改造溶液の組成を制御するためのプログラム可能な制御モジュールであって、ここで、前記制御モジュールは、組織改造溶液の組織改造サイトへの供給及び／又は組成を調整することによって組織改造を制御するようプログラムされて、その結果、組織改造サイトでのコラーゲン原線維の集合、融合、分解、及び／又は再編成を促進する。
【００６２】
４９．ディスペンスモジュールは、
一以上の追加的試薬溶液のための一以上の追加的貯留容器と、
組織改造サイトへの移送前に、組織改造溶液を有する一以上の追加的試薬溶液を混合するための混合システムと、
を更に含む、特徴４８の装置。
【００６３】
５０．混合システムは、マイクロ流体チップである、特徴４９の装置。
【００６４】
５１．プログラム可能な制御モジュールは、組織改造溶液を伴う前記一以上の試薬溶液の混合を制御する、特徴４９又は５０の装置。
【００６５】
５２．プログラム可能な制御モジュールは、組織改造溶液及び／又は一以上の試薬溶液のｐＨ、イオン強度、及び／又は温度を制御する、特徴４９から５１のいずれかの装置。
【００６６】
５３．（ｉｖ）組織改造サイトからまた分析装置へ細胞外流体を送り返すためのリターンカテーテルを更に含む、特徴４８から５２のいずれかの装置。
【００６７】
５４．リターンカテーテルは、細胞及び集合した線維を除くためのフィルターを備える、特徴５３の装置。
【００６８】
５５．（ｖ）組織改造サイトにおける細胞外基質流体の一以上の成分の濃度を検出するセンサーを更に含み、前記センサーは、一以上の成分に関する出力を制御モジュールに供給する、特徴５３又は５４の装置。
【００６９】
５６．前記センサーは、マイクロ熱量計である、特徴５５の装置。
【００７０】
５７．前記センサーは、コラーゲンの濃度を検出する、特徴５５又は５６の装置。
【００７１】
５８．前記センサーは、二以上の異なるコラーゲン種の濃度を検出する、特徴５５から５７のいずれかの装置。
【００７２】
５９．細胞外基質流体の二以上の異なる成分の濃度を検出する二以上のセンサーを備える、特徴５５から５８のいずれかの装置。
【００７３】
６０．ディスペンスモジュールは、供給カテーテルを介して組織改造サイトに移送するための組織改造溶液を有する、及び／又は一以上の追加的試薬を有する、戻された細胞外流体を混合するための混合システムを更に備える、特徴５５から５９のいずれかの装置。
【００７４】
６１．組織改造サイトに送り返される前に、戻される細胞外流体を調整するための微小透析モジュールを更に備える、特徴６０の装置。
【００７５】
６２．ディスペンスモジュール又は前記ディスペンスモジュールに接続される他のモジュールに保管された組織改造溶液及び任意の一以上の追加的試薬溶液の温度を制御する温度制御機構を更に備える、特徴４８から６１のいずれかの装置。
【００７６】
６３．対象への投与に先立ち、試薬を長期間保存するために冷却すること、及び溶液を体温まで加温することの双方を提供する、特徴６２の装置。
【００７７】
６４．ウェラブル装置として構成される、特徴４８から６３のいずれかの装置。
【００７８】
６５．一以上のバルブを更に備える、特徴４８から６４のいずれかの装置。
【００７９】
６６．制御モジュールは、ディスペンスモジュールから離れている、特徴４８から６５のいずれかの装置。
【００８０】
６７．制御モジュールは、ディスペンスモジュールと信号を送受信する携帯電話、コンピュータ、又は他のワイヤレス装置である、特徴６６の装置。
【００８１】
６８．ディスペンスモジュールの一以上の貯留容器に、前記組織改造溶液、及び任意に一以上の追加的試薬を備える、特徴４８から６７の装置。
【００８２】
６９．組織改造サイト又はその近くとは異なる場所で組織改造溶液を投与するための一以上の追加的カテーテルを更に備える、特徴４８から６８のいずれかの装置。
【００８３】
７０．供給カテーテルは、組織改造サイト又はその近くで注射により前記溶液を投与するための針を備える、特徴４８から６９のいずれかの装置。
【００８４】
７１．組織改造流体の、ディスペンスモジュールとの双方向の流れが提供される、特徴４８から７０のいずれかの装置。
【００８５】
７２．双方向の流れは、供給カテーテルを介する逆戻し可能な流れにより提供される、特徴７１の装置。
【００８６】
７３．双方向の流れは、供給カテーテルとリターンカテーテルの組み合された動作により提供される、特徴７１の装置。
【００８７】
７４．組織改造サイトから集められた細胞外流体は、分析のための流体チャンバーで収集される、特徴７１から７３の装置。
【００８８】
７５．組織改造サイトを取り囲む領域で対象の一以上の筋に電気的刺激を提供する筋刺激装置を更に含む、特徴４８から７４のいずれかの装置。
【００８９】
７６．組織改造サイトを取り囲む領域で引張ひずみを提供する受動運動装置を更に含む、特徴４８から７４のいずれかの装置。
【００９０】
７７．特徴４８から７６のいずれかの装置、前記装置と共に使用されるための組織改造溶液及び任意の一以上の試薬溶液を備える、キット。
【００９１】
７８．特徴４８から７７のいずれかの装置、前記装置と共に使用されるための一以上の鞘を備える、キット。
【００９２】
７９．一以上のコラーゲン原線維を体外で生成する方法であって、前記方法は、下記のステップを含む：
（ａ）初期状態でコラーゲン原線維を欠いているコラーゲン溶液を供給すること、
（ｂ）前記溶液にひずみを印加すること、これにより、前記溶液からのコラーゲンが、一以上のコラーゲン原線維に集合する。
【００９３】
８０．コラーゲン溶液のｐＨ、イオン強度、温度、及び／又はコラーゲン濃度は、基本的に一定を維持される、特徴７９の方法。
【００９４】
８１．ｐＨ、イオン強度、温度、及び／又はコラーゲン濃度は、当初、コラーゲン原線維の形成を防ぐために十分低く、ひずみ誘起の前、最中、又は後に高められる、特徴７９の方法。
【００９５】
８２．コラーゲン溶液は、コラーゲンモノマーとオリゴマーの混合物を備える、特徴７９から８１のいずれかの方法。
【００９６】
８３．コラーゲン溶液は、コラーゲン凝集体及び／又は線維素を更に備える、特徴８２の方法。
【００９７】
８４．コラーゲン溶液は、約０．００１ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬの範囲内の全コラーゲン濃度を備える、特徴７９から８３のいずれかの方法。
【００９８】
８５．コラーゲンは、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、プロコラーゲン、又はそれらの混合物である、特徴７９から８４の方法。
【００９９】
８６．コラーゲンは、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、又はタイプＸＩである、特徴７９から８５の方法。
【０１００】
８７．コラーゲン溶液は、細胞外基質酵素、架橋剤、ｐＨ変性剤、イオン強度変性剤、浸透圧上昇剤、可塑剤、線維芽細胞、間充織幹細胞、細胞移動促進剤、コラーゲン原線維片、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリノゲン、トロンビン、トロンボスポンジン、絹、及び成長因子からなる群から選択される一以上の成分を更に備える、特徴７９から８６のいずれかの方法。
【０１０１】
８８．コラーゲン溶液は、トランスグルタミナーゼ、リシルオキシダーゼ、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びリボフラビンから選択される架橋剤を備える、特徴８７の方法。
【０１０２】
８９．引張ひずみは、循環的又は間欠的に、一定の割合、増加又は減少する割合でコラーゲン溶液に誘起される、特徴７９から８８のいずれかの方法。
【０１０３】
９０．引張ひずみ速度は、約０．００１ｓｅｃ−１から約１０ｓｅｃ−１である、特徴８９の方法。
【０１０４】
９１．コラーゲン原線維の集合は、流動誘起結晶化によって刺激される、特徴８９又は９０の方法。
【０１０５】
９２．ひずみは、静的状態に保たれる、特徴７９の方法。
【０１０６】
９３．ひずみは、０から約２である、特徴９２の方法。
【０１０７】
９４．コラーゲン原線維は、前から存在するコラーゲンモノマー及び／又はオリゴマーの組み込みによって刺激される、特徴９２又は９３の方法。
【０１０８】
９５．引張ひずみは、コラーゲン溶液の表面を引く、又はコラーゲン溶液内のコラーゲン原線維を引き寄せることを用いた、コラーゲン溶液内の流れ又はせん断の定立（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ）によって達成される、特徴７９から９４のいずれかの方法。
【０１０９】
９６．引出プローブ（ｄｒａｗ  ｐｒｏｂｅ）が、引張ひずみを誘起するために使用される、特徴９５の方法。
【０１１０】
９７．人工組織足場を生成する方法であって、前記方法は、コラーゲンモノマー溶液が型にある際、特徴７９から９６のいずれかの方法を実行するステップを備える。ここで、型の形状は、前記組織足場の形状を提供する。
【０１１１】
９８．必要とする対象において損傷又は組織ダメージの防止を目的とする方法であって、前記方法は、以下のステップを含む：
（ａ）対象の組織改造サイトに組織改造溶液を投与し、ここで、組織改造サイトは、将来の損傷又は組織ダメージへの対象となり得ることを疑われるものである；
（ｂ）組織改造サイトでひずみ又は引張ひずみ速度を誘起し、これにより、コラーゲンの組み込み、コラーゲン原線維の集合、コラーゲン原線維の融合、及び／又はコラーゲン原線維の分解が、組織改造サイトで刺激される。
【０１１２】
９９．組織改造溶液は、コラーゲンモノマー及び／又はオリゴマーの混合体を備え、コラーゲン原線維を欠いている、特徴９８の方法。
【０１１３】
１００．組織改造溶液は、コラーゲンモノマー、ダイマー、トリマー、凝集体、及び／又は原線維を備える、特徴９８の方法。
【０１１４】
１０１．組織改造溶液は、細胞外基質酵素、架橋剤、免疫抑制剤、ｐＨ変性剤、イオン強度変性剤、浸透圧上昇剤、可塑剤、線維芽細胞、間充織幹細胞、細胞移動促進剤、コラーゲン原線維片、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリノゲン、トロンビン、トロンボスポンジン、絹、及び成長因子からなる群から選択される一以上の成分を更に備える、特徴９８から１００のいずれかの方法。
【０１１５】
１０２．コラーゲンの集合を遅らせる一以上の因子は、グルコース、熱ショックタンパク質、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、及びアニオン性ポリマーからなる群から選択される、特徴１０１の方法。
【０１１６】
１０３．組織改造溶液は、トランスグルタミナーゼ、リシルオキシダーゼ、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びリボフラビンから選択される架橋剤を備える、特徴１０１又は１０２の方法。
【０１１７】
１０４．組織改造溶液は、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）、カテプシン、細菌性コラゲナーゼ、及びコンドロイチナーゼ又はヒアルロニダーゼのようなグリコサミノグリカン分解酵素から選択される細胞外基質酵素を備える、特徴１０１から１０３のいずれかの方法。
【０１１８】
１０５．組織改造溶液は、免疫抑制剤を備え、免疫抑制剤は、抗炎症剤である、特徴１０１から１０４のいずれかの方法。
【０１１９】
１０６．組織改造溶液は、コラーゲンの集合を遅らせる又はコラーゲンの溶解限度を増やす一以上の因子を更に備える、特徴９８から１０５のいずれかの方法。
【０１２０】
１０７．コラーゲンは、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、プロコラーゲン、又はそれらの混合物である、特徴９８から１０６のいずれかの方法。
【０１２１】
１０８．コラーゲンは、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、又はタイプＸＩである、特徴９８から１０７のいずれかの方法。
【０１２２】
１０９．ひずみ速度は、改造サイトで循環的、間欠的、拡大的、又は圧縮的なものであり、前記速度は、約０．００１ｓｅｃ−１から約１０ｓｅｃ−１である、特徴９８から１０８のいずれかの方法。
【０１２３】
１１０．ひずみは、静的状態に保たれ、０から約２である、特徴９８から１０９のいずれかの方法。
【０１２４】
１１１．拡大的又は圧縮的ひずみは、物理的な治療、マッサージ、ストレッチ、運動プログラム、電気的筋肉刺激、又は連続的受動運動装置によって達成される、特徴９８から１１０のいずれかの方法。
【０１２５】
１１２．組織改造溶液は、一回以上の注射によって投与される、特徴９８から１１１のいずれかの方法。
【０１２６】
１１３．組織改造溶液の投与は、投与される組織改造溶液の組成又は量及び組織改造溶液を投与するタイミングを決めるプログラムに従って実行される、特徴９８から１１２のいずれかの方法。
【０１２７】
１１４．前記プログラムは、コラーゲンモノマー、コラーゲンオリゴマー、細胞外基質酵素、架橋剤、免疫抑制剤、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリノゲン、トロンビン、トロンボスポンジン、絹、成長因子、グルコース、熱ショックタンパク質、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、及びアニオン性ポリマーからなる群から選択される組織改造溶液の一以上の成分の存在又は欠如及び濃度（もし存在すれば）を決める、特徴１１３の方法。
【０１２８】
１１５．前記投与するステップは、注入ポンプと、改造溶液を含む貯留容器と、組織改造サイトに差し込まれるカテーテルと、前記プログラムに従って処理を実行するようプラグラムされた制御モジュールとを備えるウェラブル装置の使用を備える、特徴１１３又は１１４の方法。
【０１２９】
１１６．組織改造サイトでの瘢痕の形成が防がれる、特徴９８から１１５のいずれかの方法。
【０１３０】
１１７．外科的治療を用いた接続を実行される、特徴９８から１１６のいずれかの方法。
【０１３１】
１１８．対象における腫瘍を治療する方法であって、前記方法は、以下のステップを備える：
（ａ）対象における組織改造サイトへ組織改造溶液を投与する。ここで、組織改造サイトは、前記腫瘍を備える；
（ｂ）組織改造サイトのコラーゲンに誘起されるひずみの量を制御する。これにより、腫瘍内でコラーゲン原線維の集合が起こる。
【０１３２】
１１９．改造溶液は、細胞外基質に作用する一以上の酵素を備える、特徴１１８の方法。
【０１３３】
１２０．一以上の酵素は、プロテアーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、マトリクス・メタロプロテイナーゼ、及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される、特徴１１８の方法。
【０１３４】
１２１．腫瘍は検査（ｍｏｎｉｔｏｒ）され、改造溶液の成分及び／又は投与が、腫瘍の更なる解消に有利に働くよう調整される、特徴１１８から１２０のいずれかの方法。
【０１３５】
１２２．単量体のコラーゲン、オリゴマーのコラーゲン、並びに細胞外基質酵素、架橋剤、免疫抑制剤、ｐＨ変性剤、イオン強度変性剤、浸透圧上昇剤、可塑剤、線維芽細胞、間充織幹細胞、細胞移動促進剤、コラーゲン原線維片、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリノゲン、トロンビン、トロンボスポンジン、絹、及び成長因子からなる群から選択される一以上の成分を備える組織改造溶液。
【０１３６】
１２３．コラーゲンは、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、又はタイプＸＩである、特徴１２２の組織改造溶液。
【０１３７】
１２４．コラーゲンモノマー及び／又はオリゴマーの混合物を備え、前から存在するコラーゲン原線維を欠いている、特徴１２２又は１２３の組織改造溶液。
【０１３８】
１２５．コラーゲンモノマー、ダイマー、トリマー、凝集体、及び／又は原線維を備える、特徴１２２又は１２３の組織改造溶液。
【０１３９】
１２６．コラーゲンの集合を遅らせる又はコラーゲンの溶解限度を増やす一以上の因子を更に備える、特徴１２２から１２５のいずれかの組織改造溶液。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、コラーゲン組織の改造に役立つ方法の概略図を示す。
【図２】図２は、組織の改造に役立つ装置の概略図である。
【図３】図３は、引張ひずみによってコラーゲン溶液からコラーゲン原線維を引き込む（引き出す）ための装置の概略図である。
【図４】図４Ａから４Ｉは、コラーゲン原線維の引出実験の結果を示す。図４Ａ：コラーゲン溶液の液滴から引き出された線維が、生成された線維の高アスペクト比を明示する。図４Ｂ：乾燥窒素ガスが、液滴の表面からの蒸発を促進するよう液滴の上方に通される。図４Ｃ：１２０秒後、コラーゲン分子より早く液滴を抜け出る水分子が、バルクに拡散する結果として、濃縮された単量体の表面が生成される（ペクレ数（Ｐｅ）が２．１５と見積もられた）。現段階でコラーゲン原線維は、液滴から引き出された。図４Ｄ：ガラス針が、液滴表面を突き刺すよう使用され、それから１５０秒まで外部に引き出される。液滴のメニスカスが針から流れ出すにつれて、コラーゲン原線維が残った。図４Ｅ：線維形成プロセスは、液滴から針を引き離すことでもたらされる引張ひずみの印加によって引き起こされた。上方の画像は、線維に引き込まれた整列原線維を示す。下方の画像は、白枠部分の拡大を示す。ここで、原線維は、機械的刺激に応答し始めるだけであることが明確に確認できる。白矢印は、拡大速度が、最初の原線維の形成に求められる臨界値に到達する場所を示す。図４Ｆ〜Ｉ：連続する画像は、コラーゲン線維の修復を示す。コラーゲン線維部分の終端が、白い矢によって識別される。線維部分の終端は、液滴内へ置かれ、引き抜かれ、修復サイトと新しい線維形成の連続を開始する。
【図５】図５Ａから５Ｆは、引張ひずみ下のコラーゲン溶液からコラーゲン線維を引き出すプロセスの動的画像（ｍｏｖｉｅ）に係る光学顕微鏡検査（微分干渉コントラスト法、ＤＩＣ）の画像を示す。フレームの時間は、図５Ａから５Ｆの各々に関して、２．５２秒、４．４８秒、６．４４秒、７．７０秒、９．２４秒、及び１０．７８秒であった。
【図６】図６Ａから６Ｆは、引き出されたコラーゲン線維の画像を示す。アテロコラーゲン（図６Ａ）及びテロコラーゲン（図６Ｂ）の溶液から引き出された線維の中央部が、リン酸緩衝液の下、観察された。図６Ｃ：テロコラーゲンの予備重合された液滴からの繊維の引き出し（蒸発の防止とｐＨ及びイオン強度を維持するため、シリコーンオイル下に保持される。）。予備集合されたコラーゲン原線維は、ガラス極微針に付着し、集合されたネットワークから線維が引き出されることを許容する。矢印は、線維が引き出される場所を示す。図６Ｄ：予備形成されたコラーゲンネットワークから引き出された線維の中央部が、分裂し、もつれたネットワークを引き出すことに由来する不十分な空間詰込（ｐｏｏｒ  ｓｐａｔｉａｌ  ｐａｃｋｉｎｇ）を明確に示す。線維の形態は、図６Ａ又は図６Ｂで観察されたものとはかなり異なり、引張ひずみを介した重合化の引き金が、既に形成されたネットワークからの線維を引き出すことに比べて独自の異なるプロセスであることが示唆された。この観察は、既に重合されたネットワークの細胞操作ですら、更なる改良なしに高配列のフィブリル構造（ｆｉｂｌｉｌｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をもたらさないことを示唆する。線維が引き出されるときの（１５０秒）アテロコラーゲン（図６Ｅ）及びテロコラーゲン（図６Ｆ）液滴表面の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像（急速冷凍により保存し、プラチナを使った環状影（ｒｏｔａｒｙ  ｓｈａｄｏｗｉｎｇ）による深いエッチング（ｄｅｅｐ−ｅｔｃｈｉｎｇ）に従って置き換えられる。）。通常、コラーゲン液滴の表面は、未だ大きな階層構造へ組み立てられていない高濃度モノマーで濃縮された。
【図７】図７Ａから７Ｆは、引き出されたコラーゲン線維の自発的に形成された階層構造の走査型電子顕微鏡の画像である。図７Ａから７Ｃは、漸進的な倍率の増加における引き出されたコラーゲン線維の構造を描く。図７Ｄから７Ｆは、２％のデコリンを含む溶液から引き出されたテロ線維を同様に描く。双方の線維は、自然の腱を連想させる素晴らしい階層形態を見せる。しかしながら、デコリンの追加効果（小ロイシンリッチなプロテオグリカンはＥＣＭで発見され、コラーゲン線維形態に影響を与えることで知られる。）は、個々のコラーゲン原線維と同等にあることが明らかである（図７Ｃ−デコリンなし  ｖｓ．  図７Ｆ−デコリンを持つ）。生体内で見られるのと同様に、デコリンは、体外の原線維間の横のつながりの数を減らすように見える。
【図８】図８Ａから８Ｆは、典型的な殻部（ｓｈｅｌｌ）、移行部（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）、及び芯部（ｃｏｒｅ）の構造を示す、引き出されたアテロ線維薄片のＴＥＭ画像を示す。図８Ａ：線維の縦断面は、高度に組織化された原線維の周辺殻部と、まとまりの悪い線維の芯部を描く。図８Ｂ：印加されたひずみの方向における、殻部での線維の印象的な配列が、自然の腱の形態に高く類似する。図８Ｃ：（図８Ｂの画像で輪郭を描かれた）長方形領域の高倍率は、離散的、均一な直径、一貫性のある空間、及び引張ひずみが最も高くなる殻部での原線維の一連的特性を示す。図８Ｄ：高密度で連続する線維から、乱雑に配列され、希薄で、より短い原線維への移行は、時々急である（典型的には、線維のより薄い領域で）。図８Ｅ：より大きな直径（２０マイクロメーター以上）を持つ線維の断面において、移行領域は存在し、引張ひずみの一般的な方向に配向された短く波状の線維を備える。図８Ｆ：原線維の芯部は、低空間密度を持ち離散的で等方的な原線維を備える。
【図９】図９Ａから９Ｈは、液滴表面の深さに沿ったコラーゲン濃度勾配と、ＴＥＭ画像に見られる多面的線維形態の主な原因となる線維引き出し中の引張ひずみ領域の変化の様子を示す。図９Ａ、９Ｂ：溶液中の蛍光ビーズを用いた、テロ線維の引き出し中の画像。赤く強調された蛍光ビーズは、流れない（ｓｔａｇｎａｎｔ）状態を保った一方で、青く強調されたビーズは、双曲線形状に沿って加速し、線維に入った。全ての映像は、ネック領域（ｎｅｃｋｉｎｇ  ｚｏｎｅ）の基点での再循環領域を識別し、等方性の線維芯の形態を説明する。図９Ｃ：この図は、蛍光粒子速度プロファイルと液滴全体に渡る濃度測定に基づき、ネック領域でのレオロジー的な流れを特徴付ける。最も高い引張ひずみ（〜１ｓｅｃ−１）が、液滴表面上で達成され、図９Ｄに示される対応構造（Ｉ）は、高度に配列されたＦＩＣテロコラーゲン原線維を備える。表面の直下で、コラーゲン濃度は低下し、その流れは、角があり、中断された小線維形態（ＩＩ）を産み出すせん断要素を持った。移行領域において、流れの回転要素が増加し、更に減少したコラーゲン濃度が、図９Ｅに示される渦巻形態（ＩＩＩ）を生成した。ネック領域の芯部において、その濃度は、バルク濃度４．５ｍｇ／ｍｌとおおよそ同じであり、図９Ｆに見られる最終線維形態（ＩＶ）（ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｉｂｅｒ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）は、等方性の基質であった。その濃度／速度勾配は、表面下の純粋な伸長流を中断させるが、引張ひずみへの好ましい分子応答は、線維殻部で明白であった。原線維内の当該分子の位置はまた、ＴＥＭを用いて調査された。図９Ｇ：天然縞状パターン内の原線維が、広く行き渡った。図９Ｈ：図９Ｇの括弧領域が、縞周期性を測定するためにパワースペクトル解析を用いて分析され、主要な周波数が、６５．５ｎｍの縞周期性に関連付けられた。
【図１０】図１０は、どのように細胞が体内での組織生成の最初の段階を開始すると考えられるかを示す概念図（概略図）である。図は、互いに近接する二つの細胞の糸状仮足を見せる。それらの細胞は、隣接する溶解性コラーゲン濃度を単離し高めるためにヒアルロン酸を分泌した。細胞が、（例えば、非筋肉性ミオシンＩＩを介した）収縮力Ｆを印加する際、二つの糸状仮足は後退し、局所的な伸長の流れを誘起する。引張ひずみは、ＦＩＣを引き起こし、引張ひずみが閾値下に落ちるまで、双方が、分子を一直線状にし、原線維の連続形成をもたらす。各糸状仮足は、陥入（ｉｎｖａｇｉｎａｔｉｏｎ）が起こり得ると指摘されるような、引き伸ばし力抵抗（ｓｔａｌｌｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）に会うか、またはアクチンフィラメントの完全な収縮が起こるまで、後退する。糸状仮足のどちらか一方側の流体は、収縮中に、コラーゲンを予備的に並べ（ｐｒｅ−ａｌｉｇｎ）引張ひずみ領域で形成される原線維と共に原線維を形成する役割を果たす、せん断誘起のひずみを経験する。
【発明を実施するための形態】
【０１４１】
体外でのコラーゲンの集合に影響を与える多くの要因が知られている一方で、これまで、コラーゲン原線維の組織化が、体内でどのように作られ維持されるのか、及びこの知見の不足は、断裂された靭帯及び腱並びに骨折のような重い怪我にとっての自然治癒プロセス向上の妨害効果を持つことは知られていない。さて、本発明によれば、コラーゲン線維は、機械的ひずみのみを用いてコラーゲン単量体から集合され、得られた線維は、引張又は圧縮ひずみに抗する安定化を提供するよう自発的に配列する。このコラーゲン集合プロセスは、重合反応で直面する同様の機構に類似する流動誘起結晶化によって機能すると考えられる。
【０１４２】
コラーゲンのひずみ誘起の集合は、結果として生じる再組織化を伴う体内のコラーゲン原線維形成を引き起こし操るため、及び細胞外基質組織とその中のコラーゲン含有構造を改造するための新規方法の基礎として働く。その方法は、いずれのタイプのコラーゲン組織を改造するために使用される。本発明の適用に適するコラーゲン組織は、動物の体内に備わるいずれの骨、軟骨、腱、又は靭帯を含む。同様に、本発明の適用に適するコラーゲン組織は、痩せた、心臓性の、及び平坦な筋肉のようなコラーゲン組織に付着又は囲まれる組織又は器官、並びに原線維状又は他の形態のコラーゲンを含む細胞外基質の重要な機能を備えた組織又は器官を含む。ここで使用されるように、コラーゲンは、三重螺旋構造を有するタンパク質、及び繰り返されるｇｌｙ（グリシン）−Ｘ−Ｙモチーフ（ここで、Ｘは、頻繁にプロリン、Ｙは、頻繁にヒドロキシプロリン）によって特徴付けられるアミノ酸配列に言及する。本発明で用いられるコラーゲンは、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチド（ここで、‘プロコラーゲン’と呼ばれる）の全て又は一部だけでなく、Ｃ末端及び／又はＮ末端テロペプチド（ここで、‘テロコラーゲン’と呼ばれる）の全て又は一部を有する。テロペプチドの欠乏するコラーゲン（ここで、‘アテロコラーゲン’と呼ばれる）だけでなく、プロペプチドの欠乏するコラーゲン（ここで、‘コラーゲン’と呼ばれる）もまた使用される。タイプＩＶを含む他のタイプのコラーゲンも使用できるが、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＶ、又はタイプＸＩコラーゲンのような原線維形態のコラーゲンが好ましい。
【０１４３】
本発明の方法は、コラーゲン組織での組織の改造を提供する。そのような改造は、腱や靭帯のような、ぎっしりと詰まった高密度コラーゲン線維を含む裂傷や裂け目構造の修復を含む。本発明による改造は、個々のコラーゲン原線維又は線維の修復、強化、引張、及び／又は再編成を含み、コラーゲン原線維又は線維の部分的若しくは完全な分解又は劣化をも含む。好ましくは、本発明による組織の改造は、成長に起因する天然組織の再作成若しくは修復を再現する又は試みるが、将来の怪我や損傷を防ぐために自然の状態を超えて、靭帯又は腱のような体を強化する様々な構造をも含み得る。そのような組織の改造が引き起こされるサイトは、ここで‘組織改造サイト’と呼ばれ、損傷部に隣接する組織の幾つかを囲み得る。
【０１４４】
本発明は、必要とする対象において、コラーゲン組織改造を促進する方法を提供する。その方法は、以下のステップを含む：（ａ）対象の組織改造サイトに組織改造溶液を投与する；（ｂ）組織改造サイトでのひずみ又はひずみ速度を誘起し、それにより、コラーゲンの組み込み、コラーゲン原線維の集合、又はコラーゲン原線維の分解が、組織改造サイトで刺激される。その方法の描写は、図１で提供される。組織改造サイトでの機械的ひずみの誘導は、組織内のコラーゲン線維の成長を刺激する、及び／又は改造することのもとであるが、改造サイトは、十分なコラーゲンモノマー並びに他の必要とされる必須構造タンパク質及び急速な成長、治癒、特に創傷修復を支持する酵素を生成するための線維芽細胞のような十分なＥＣＭ細胞を典型的に欠いている。そのため、そのような溶解成分の相対的欠乏は、組織改造溶液の改造サイトへの投与によって克服され得る。
【０１４５】
ここで使用されるように、‘組織改造溶液’は、溶解性の‘予備小線維（ｐｒｅ−ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）’コラーゲン分子を含む溶液に言及し、任意に、集合、組み込み、融合及び／又は分解、並びにコラーゲン原線維の劣化を促進する又は調整する一以上の他の物質を含む。コラーゲン分子の上記名付けられた種のいずれも、前記改造溶液に含まれる。しかしながら、単量体形態におけるコラーゲン分子（コラーゲンモノマー）は、溶液の主成分として強く望ましい。コラーゲンの他の予備小線維形態は、二量体のコラーゲン若しくはオリゴマーのコラーゲン（二以上のコラーゲン分子の複合体に結合する溶解性コラーゲン）のようなものとして、又はコラーゲン原線維若しくは線維の一片（ｅｖｅｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）でさえも含まれ得るものであり、それにより、予備小線維形態は、酵素若しくは動物組織から単離されるコラーゲンの化学的処理によって容易に入手可能となる。改造溶液で使用されるコラーゲン分子又は小線維片は、溶液において同種が用いられることが好ましいが、他種であってもよい。例えば、牛由来のコラーゲンは、低い免疫原性のため、人間を治療するために使用される。組織改造溶液は、単一の溶液として提供され得るか、又は投与のすぐ前に二以上の試薬溶液から混合され得る。好ましくは、組織改造溶液は、約０．００１ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬから約３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約１５ｍｇ／ｍＬの範囲の総コラーゲン濃度を備える。
【０１４６】
コラーゲン改造溶液への任意の添加剤は、追加の構造、又はコラーゲンと相互作用する若しくはコラーゲンの集合、分解、若しくは組織化プロセスの調整を支援する付属タンパク質、酵素、小分子、及びイオン種を含む。例えば、改造溶液は、一以上の細胞外基質酵素、架橋剤、免疫抑制剤、ｐＨ変性剤、イオン強度変性剤、浸透圧上昇剤、可塑剤、線維芽細胞、間充織幹細胞、細胞移動促進剤、コラーゲン原線維片、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリノゲン、トロンビン、トロンボスポンジン、絹、及び成長因子を含む。
【０１４７】
細胞外基質酵素は、コラーゲン若しくは非コラーゲン原線維、又はプロテオグリカン、グリコサミノグリカンのようなＥＣＭ高分子（巨大分子）を分解又は重合するよう追加される。例えば、ＥＣＭ酵素は、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）、カテプシン、細菌性コラゲナーゼ、又は他のコラゲナーゼ、及びコンドロイチナーゼ又はヒアルロニダーゼのようなグリコサミノグリカン分解酵素であってもよい。
【０１４８】
架橋剤は、原線維における隣り合うコラーゲン分子間の共有結合性側部架橋（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｌａｔｅｒａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｂｒｉｄｇｅｓ）を形成する酵素又は化学試薬を含み、その結果、原線維を強化し安定化させる。適切な架橋剤は、例えば、トランスグルタミナーゼ若しくはリシルオキシダーゼのような酵素、又はグルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、若しくはリボフラビンのような化学的架橋剤を含む。
【０１４９】
免疫抑制剤は、創傷治癒又は組織改造の抑制効果を持ち得、改造プロセスに重要であるＥＣＭ細胞の退出をもたらす、炎症のような免疫系機能を修正するよう加えられる。適切な免疫抑制剤は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、コルチゾン及びその誘導体のようなホルモン剤、並びに様々なサイトカインのような様々な抗炎症剤を含む。
【０１５０】
組織改造サイトの化学的環境の変性剤は、コラーゲンの集合若しくは分解に好ましい又は嫌う、ｐＨ、イオン強度、及びオスモル濃度のような条件を促進するために重要である。ｐＨ変性剤は、従来から良く知られる酸、塩基、及びｐＨ緩衝剤、並びに毒性のない種を含む。イオン強度変性剤は、細胞外スペースに行き渡り、細胞崩壊を引き起こさない程度に用いられる、ナトリウム、カリウム、塩化物イオンのようなイオン種を好ましく提供する塩を含む。浸透圧上昇剤は、浸透圧を生成又は増やし、水又は溶液の流れを引き起こす高分子又は巨大分子である。適切な浸透圧上昇剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロテオグリカン、又はヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸のようなグリコサミノグリカンを含む。それらは、例えば、０．１から５０重量％の範囲の濃度で使用される。
【０１５１】
ここで使用されるように、‘可塑剤’は、例えば、コラーゲンの溶解性を保持し、改造サイトに達する前にあまりに大きい構造の形成を防ぐような、コラーゲンの集合を遅らせる物質である。改造溶液のコラーゲン濃度が増加するにつれて、全体的にもつれたネットワーク形成までの時間が減少する。可塑剤の追加は、相互作用を制限し、改造サイトに向けてコラーゲン分子（又はコラーゲン分子の小凝集体）に付き添う（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇ）ことによって、原線維の集合を遅らせる。コラーゲンの集合、又は溶液内の他の成分若しくは分子成分を持つ改造溶液内のいずれの成分の他のモノマー、オリゴマー、凝集体へのコラーゲンモノマーの結合；集合；変性；又は酵素反応のような関連反応に求められる分子相互作用を制限するいずれの分子が、改造サイトの体内環境において存在する。適切な可塑剤の例は、グルコース、熱ショックタンパク質、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、及びアニオン性ポリマーを含む。
【０１５２】
組織改造溶液の追加の可能な成分は、線維芽細胞、軟骨細胞、又は骨芽細胞といったＥＣＭ細胞のような細胞、及び間充織幹細胞又は他の幹細胞を含む。同様の役割は、炎症プロセスに関連するサイトカインのような細胞移動促進剤を追加することにより奏され、これにより、内因性ＥＣＭ細胞（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＥＣＭ  ｃｅｌｌｓ）を組織改造サイトに回復する。成長因子（例えば、内皮細胞由来の成長因子又は線維芽細胞成長因子）のような細胞分化の促進剤もまた、組織改造サイトでのＥＣＭの成長及び発展を促進するよう含まれる。
【０１５３】
自然に生じるＥＣＭ分子もまた、組織改造溶液に含有することに適する。そのような分子は、ＥＣＭの再成長とそれに関する構造化を促進するため、コラーゲン線維の加速された集合と結合する。適切なＥＣＭ分子は、ヒアルロン酸、糖タンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、線維素、及びフィブリノゲンのようなプロテオグリカン、グリコサミノグリカンを含む。
【０１５４】
本方法の幾つかの実施形態において、追加的ステップが、対象に内鞘を差し込むことを含む。ここで、前記鞘は、組織改造サイトを包囲する。鞘は、組織改造溶液の分子が、改造サイト近くで高濃度を維持し、改造に適する局所環境又は境遇を生成することを許容する。鞘は、浸透性又は選択的浸透性であって、好ましくは、生分解性高分子若しくはタンパク質、又はコラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、フィブロネクチン、線維素、エラスチン、又は絹のような他の生物高分子により作られた薄膜又は袋（ｓａｃｋ）であってもよい。鞘は、一以上の架橋剤を含み、そのタンパク質成分は、差し込みに先立ち架橋される。
【０１５５】
幾つかの実施形態において、本方法は、組織改造サイトから得られる細胞外流体の試料における一以上のパラメータを測定すること；前記一以上のパラメータに基づく改造溶液の投与又は組成を調整すること、を更に含む。そのような測定は、コラーゲンモノマー若しくは他のタンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、又は酵素のような関心の分子を検出する一以上のバイオセンサー又は化学センサーの使用によって提供される。ｐＨ、イオン強度、浸透圧若しくは膠質浸透圧の測定が実行される。マイクロ熱量計もまた、改造サイトでのタンパク質又は巨大分子の全濃度の量を提供するよう実行され得る。そのような測定に応じて、好ましい改造結果に達するため、組織改造溶液の投与の組成若しくは割合又は頻度における調整がなされる。
【０１５６】
組織改造溶液は、従来知られたいずれの方法によって、組織改造サイトへ投与される。溶液は、一回（単一）の注射において、一期間に渡り間欠的又は連続的に投与され得る。組織改造サイトへの直接的な注射（注入）によって手動的に、又は注入ポンプ若しくは他のポンプ、若しくは自動的装置の助けを用いて、投与される。
【０１５７】
ひずみは、様々な方法で組織改造サイトに導入される。好ましい方法は、物理的な治療、マッサージ、ストレッチ、（例えば、経皮的末梢神経電気刺激（ＴＥＮＳ）装置の使用を介した）電気的筋肉刺激、一以上の特定の関節（ｊｏｉｎｔ）若しくは筋肉の目標とされた動作（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｏｔｉｏｎ）又は治療領域への適切なひずみを提供することを目的とする運動プログラムの使用を含む。生物力学は、求められるひずみの度合いをサイトに提供する適切な指令（プロトコル）決定するために利用される。ひずみは、静的又は動的に印加される。静的ひずみの値は、循環的又は間欠的に変化し得るが、静的ひずみは、改造サイトを変形させ、幾つかの期間の時間中、定常変形を維持する。ひずみ速度は、一の時間期間、改造サイトの連続的な引張又は圧縮により印加され、ひずみ速度は、循環の、間欠の、増加する、又は減少する方法で印加される。連続的受動運動（ＣＰＭ）装置はまた、組織改造サイトでひずみを誘起するために利用される。コラーゲンの集合又は分解を刺激するために効果的なひずみ速度は、例えば、約０．００１ｓｅｃ−１から約１０ｓｅｃ−１、約０．０１ｓｅｃ−１から約１０ｓｅｃ−１、約０．１ｓｅｃ−１から約１０ｓｅｃ−１、約０．０１ｓｅｃ−１から約５ｓｅｃ−１、約０．１ｓｅｃ−１から約５ｓｅｃ−１、約１ｓｅｃ−１から約５ｓｅｃ−１、約０．１ｓｅｃ−１から約２ｓｅｃ−１、約２ｓｅｃ−１から約５ｓｅｃ−１、のように変化し得る。
【０１５８】
本方法の結果は、ほとんどの場合、誘起されたひずみと結合した改造溶液の使用を介し、また仕事やスポーツ活動を含む日々の活動又は緊張の多い活動の間に誘起されるひずみに対して組織を安定化させる方向に新しいコラーゲン原線維及び前から存在するコラーゲン原線維を配列するよう適切に誘起されたひずみの使用を介して組織改造組織でコラーゲン原線維形成を刺激した。そのため、本方法は、増加されたコラーゲン原線維の数、若しくはより大きな原線維、又は適切な方向、若しくは組織を安定化させ且つ改造サイトに機能を回復する方向の組み合せに、よりよく配列され組織化された原線維をもたらす。これは、新たなコラーゲン原線維の集合によるだけでなく、前から存在するコラーゲン原線維に対して、供給された（例えば、外因的な）コラーゲンモノマー、オリゴマー、又は凝集体の組み込みによっても達成される。
【０１５９】
本発明の方法は、端と端とを接続したコラーゲン原線維（新規若しくは前から存在する、又は新規及び前から存在するものの混合の）の融合を更に促進し、より長い原線維をもたらす。例えば、原線維は、誘起された引張ひずみ速度を介して修復サイトの間隙に生成されるが、連続組織を再確立するため、それらの原線維の端は、損傷組織内の内生原線維のいずれかの端と融合しなければならない。原線維の融合は、原線維の端同士が近接するとき、端と端とを融合する状態で、自発的に生じることが知られているプロセスである。そのため、新たに形成された原線維は、連続性を回復させるために修復される既存の組織に融合する。
【０１６０】
本方法の他の結果は、創傷治癒プロセス若しくは組織改造プロセスにおける瘢痕形成を避ける又は最小化する。瘢痕組織は、損傷サイトに存在する構造及び分子に関する不十分な制御のため形成する。その損傷は、炎症及び異質（外来）細胞（近隣細胞及び免疫細胞）による物質の生成だけでなく、不十分な構造をもたらす。損傷に従い機械的に取り外された組織は、更なる劣化に対して弱い。その結果は、壊された瘢痕組織であり、それから強度のために架橋され、劣る構造をより長持ちさせる。本発明の方法を使用することで、瘢痕形成は、改造溶液の適切な成分の使用を介し、ある程度炎症を少なくし及び免疫系を抑制することによって防がれ又は減少される。それから瘢痕は、十分速く修復することにより防がれ、典型的に壊された体内生産組織は、そのプロセスにおいてほとんど影響を与えない。任意に、細胞がサイトであまりに速くコラーゲン原線維に架橋することは、ベータアミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ）の添加によって抑制される。それから、改造は、ひずみを制御することにより、また壊された物質を除去するよう改造溶液に適当な酵素を加えることにより、開始される。
【０１６１】
本発明の方法を実行する装置は、図２に描写される。好ましくは、本装置は、着用可能な（例えば、皮膚に結び付けられる又は衣服の上に身に着けられる）ように構成されるが、一期間中静止される患者用などのような幾つかの状況において、体から分離可能である。装置１０は、ディスペンスモジュール２０、制御モジュール３０、一以上の化学的貯留容器６０（例えば、組織改造溶液のための少なくとも一つの貯留容器）、組織改造サイトに一種以上の溶液を供給するための供給カテーテル７０、及びポンプ１００を含む。混合システム４０、検出モジュール５０、リターンカテーテル８０、及び鞘９０を含む残りの構成要素は、全て任意である。
【０１６２】
ディスペンスモジュールは、一以上の溶液若しくは試薬貯留容器と、溶液及び／若しくは試薬を組織改造サイトへ供給するために必要な装置又はモジュールを含む。一の貯留容器は、組織改造溶液を含む。他の貯留容器に含まれる追加的試薬は、治療に求められるような成分を改めるために改造溶液と結び付けられる。貯留容器又は全体のディスペンスモジュールは、溶液／試薬の活動の保持を求められるよう、任意に冷却及び／又は加熱される。注入ポンプは、組織改造サイトに改造溶液を供給する責任を負い、試薬、改造溶液、及び返送された患者の流体（体液）を任意の混合システムへ任意に供給する責任を負う。ポンプの出力は、注入ポンプから対象人体の組織改造サイトへ組織改造溶液を移送するために供給カテーテルに接続される。制御モジュールは、ポンプ並びに任意の混合システム及び温度制御システムを制御する責任を負う。好ましくは、制御モジュールは、適切な割合及び／又は間隔で組織改造溶液の投与を提供し、組織改造サイトでコラーゲン原線維の集合、分解、線維端の融合、及び／又は原線維の再配列を促進するよう、組織改造溶液の組成を管理するようプログラムされる。任意のリターンカテーテルは、細胞外流体を組織改造サイトから分析用装置に戻すよう移送するために使用される。ディスペンスモジュールは、細胞外流体が、組織改造サイトに戻されるよう移送される前、又は改造サイトへの供給のために組織改造溶液に混合される前に、戻された細胞外流体を調整するための微小透析サブモジュールを含み得る。任意の検出モジュールは、組織改造サイトでの一以上の細胞外基質流体又は再循環される組織改造溶液の成分濃度を決めるために使用される。幾つかの実施形態において、その装置は、組織改造サイトでの自動ひずみ誘起装置を含むか、又は取り付けられ、及び制御モジュールを介してこれを制御する。そのようなひずみ誘起装置は、例えば、筋刺激ユニット又は受動運動装置であってもよい。
【実施例】
【０１６３】
［実施例１］外的ひずみの誘起による体外でのコラーゲン線維の集合
（コラーゲンの準備）
二つのウシ属の皮膚に関するコラーゲン源が、配列されたコラーゲン原線維の生成に使用された。ペプシン抽出コラーゲン（５０１０−Ｄ,  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ）及び酢酸抽出コラーゲン（５０２６−Ｄ,  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ）が、０．０１Ｍ塩酸に懸濁された６ｍｇ／ｍｌの出発濃度で使用された。ペプシン抽出コラーゲンは、コラーゲン、１０倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＢＰ３９９−１,  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１Ｍ水酸化ナトリウム（１２４１９−００１０,  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各々の割合８：１：１を用いて中和された。これは、ｐＨ７．３をもたらした。デコリン（Ｄ８４２８−．５ＭＧ，  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた実験として、コラーゲンに対する２％デコリンが使用された。０．５ｍｇ凍結乾燥デコリンは、最初、１ｍｌ純水（脱イオン水）を伴い再構成された。酢酸抽出コラーゲンと共に働く間のいずれの自発的な重合を防ぐため、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを１１５％に増加するよう、中性化速度は変化された。その結果として、これは、ｐＨ７．７をもたらした。しかしながら、実験期間の二度の微分干渉顕微鏡法を用いても、原線維は検出されなかった。
【０１６４】
（線維引出機構）
図３に示されるコラーゲン線維の引出機構（ｄｒａｗｉｎｇ  ｓｅｔｕｐ）は、生の映像と視覚的フィードバックのため、ニコン社ＴＥ−２０００Ｅ顕微鏡に設置された。あつらえの窒素拡散チャンバーは、還流を介して、湿度制御を提供し蒸発率を高めるよう、設計された。デジタル式圧力制御装置（ＰＣＤＡＳ−１ＰＳＩＧ−Ｄ／５Ｐ，５ＩＮ，Ａｌｉｃａｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により０．０２２ｐｓｉに調整された窒素タンクは、乾燥窒素ガスの定常流を提供する六つのノズルに分岐されるチャンバーの基本注入口を供給する。中和されたコラーゲン溶液の１２５μｌ液滴は、４０ｍｍガラス製カバースリップの上端に存在する８ｍｍガラス製カバースリップの上端に置かれた。８ｍｍカバースリップは、液滴の境界を固定するために必要であり、繰り返し可能な初期形状及び蒸発外形（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）を再生することをもたらした。４０ｍｍカバースリップは、倒立顕微鏡への光学的アクセスを提供するよう使用された。キャピラリーホルダーに保持され、電子式極微操作装置（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ）（ＴｒａｎｓｆｅｒＭａｎ  ＮＫ  ２，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により移動されるガラス極微針は、コラーゲン線維を引き出すためのプローブとして使用された。チャンバー蓋は、チャンバーを室内の局所的な湿気から隔絶させるよう顕微鏡の集光レンズ上に装着された。
【０１６５】
（線維引出手順）
中和されたコラーゲン溶液の作製に先立ち、チャンバー内の湿気レベルを５％未満に釣り合わせるよう、窒素ガスの流れに関して５分が充てられた。それから、コラーゲン溶液は、水酸化ナトリウム及びＰＢＳ成分を最初に合成し、最後にコラーゲン成分を添加することで作製される。これは、初期のｐＨショックを減少させ、いずれの瞬間的な降下（ｉｎｓｔａｎｔａｎｅｏｕｓ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を防いだ。それから、その溶液は、均質な中和溶液を得るため、１５回以下、（気泡の導入を注意深く避けながら）ピペットに吸入及び排出された。次に、１２５μｌが、８ｍｍガラス製カバースリップ上にピペットで取り出され、再び、いずれの気泡の追加を防いだ。極微針は、液滴先端の表面下方に５００μｍ差し込まれ、それから、その系は、１２０秒間触れられなかった。割り当てられた時間後、ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ  ｖ４．１３で予め記述されたプログラムは、以下のように極微針を上昇させた。
【０１６６】
【表１】
2018500395.tif 000003
【０１６７】
初期待機ステップは、（１０ｍｍ未満の）相当の長さの線維を引っ張ることを求められ、より緩やかな出発速さが、メニスカスの除去に抵抗可能な付着物の形成を始めるよう設計される。９０μｍ／ｓｅｃ速さは、線維の破壊なしに、２４０μｍ／ｓｅｃまでの滑らかな移行に役立つ。２４０μｍ／ｓｅｃ速さは、蒸発表面濃縮に最もよく組み合わされ、その結果、線維の長さに渡って、可視的な薄い部分又は厚い部分がほとんどない。濃縮コラーゲンの源もまた、液滴から同等に減らされるよう、最後のステップは、その速さを減らすために含まれる。線維の引っ張りが完了した時点で、後の分析用に保管される前、線維は、乾燥のため１分与えられる。
【０１６８】
（引張ひずみ速度の計算）
引張ひずみ速度は、線維引出プロセス中の１．９μｍ微粒子（Ｇ０２００，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に係る蛍光動作を７フレーム毎秒で記録することによって計算される。各映像フレームの位置及びタイムスタンプは、流線に沿った速度と推定される、液滴のネック領域を進む個々のビーズ（ｂｅａｄ）に関する二次元の速度強度を計算するために使用される。それから、引張ひずみ速度は、各フレーム間でビーズが動いた距離によって乗算された二次元速度強度の変化として測定される。ネック領域に沿った流線は曲線軌道であるが、増分分析（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、その距離が最小誤差を持つ直線として近似されることを許容する。そのひずみ速度は、０．３９±０．１８ｓ−１（毎秒）として計算された。
【０１６９】
（接触凍結及び急速凍結ディープエッチング試料作製）
アテロ及びテロコラーゲン液滴の双方とも、線維引出手順にさらされ、実際に線維を引き出す直前に保たれた。その保持プロセスは、液滴及びカバースリップをリニアモータ（スタータ  ＃０１５０−１２５４及びスライダー  ＃０１５０−１５２４，ＬｉｎＭｏｔ）に備え付けることを含み、液体窒素で冷却された銅ミラーへの急速アプローチが続いた。あつらえの接触７０凍結器は、過度な熱伝導を最小化するため、２．５ｍ／ｓでミラーの５ｍｍ上方に試料を移動させ、機械的歪みを最小化するため、２ｃｍ／ｓｅｃでの最終アプローチが続いた。凍結された液滴は、急速凍結ディープエッチング（ＱＦＤＥ）装置に移動される液体窒素ユニットに保存された。
【０１７０】
ＱＦＤＥ装置は、修正されたＣｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ凍結割断システム（ＣＦＥ−４０，Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）であった。液滴は、液滴の表面からガラス化された氷を除去するため、−１００°Ｃ及び１０−６ｔｏｒｒで１時間、ＱＦＤＥの内側でエッチングされた。次に、プラチナ（〜４ｎｍ厚さ）及びカーボン（〜１０ｎｍ厚さ）層を堆積する際、ＱＦＤＥ温度は、粒径を最小化するため（１．５−２．５ｎｍ）、−１３０°Ｃまで減少された。それから、プラチナ／カーボンの複製は、２５％漂白剤（ｂｌｅａｃｈ）での消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を介してコラーゲン液滴から分離された。一時間の漂白の後、その複製は、１時間純水に移動された。最後に、その複製は、６００メッシュ銅グリッドに取り出され、ＪＥＯＬ  ＪＥＭ  １０１０  透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，Ｊａｐａｎ）を用いて撮像された。
【０１７１】
（透過型電子顕微鏡法のためのアテロ線維作製）
アテロ線維は、仮にいずれの視覚的変化が線維の構造に生じたことを観察するため、顕微鏡の公称ひずみ下（図８Ａから８Ｆ）で、リン酸緩衝生理食塩水内で３７°Ｃ、４８時間培養することにより、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）のために作製された。ひずみの適用は、長期間の撮像の間、狭い焦点面内に線維を維持するために使用された。培養の間、視覚的変化は観察されず、線維は、室温で１時間、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝材に２．５％グルタルアルデヒド及び２．５％グルタルアルデヒドのレシピで固定され（ｆｉｘ）、三度の洗浄、１時間の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝材内の１％四酸化オスミウムを用いた後固着（ｐｏｓｔ−ｆｉｘａｔｉｏｎ）、三度の洗浄、及び段階的な一連のエタノール交換（ｅｔｈａｎｏｌ  ｅｘｃｈａｎｇｅｓ）が続いた。線維は、樹脂に埋め込まれ、それから、ダイヤモンドナイフを用いてミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｅ，  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ）上で長手方向（縦）に薄片にされた。おおよそ９０ｎｍ程度（〜９０ｎｍ）の薄片は、ＴＥＭグリッドに置かれ、５％酢酸ウラニル及び５％レイノルズクエン酸鉛を用いて染色された。その薄片は、ＴＥＭで観察され、像は、ＣＣＤカメラシステム（ＡＭＴ  ＸＲ−４１Ｂ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎｃ．）でデジタル式に撮影られた。
【０１７２】
（走査電子顕微鏡法のためのテロ線維の作製）
テロ線維は、無負荷未結合方法（ｕｎｌｏａｄｅｄ，  ｕｎａｔｔａｃｈｅｄ  ｍａｎｎｅｒ）で、リン酸緩衝生理食塩水内で３７°Ｃ、４８時間培養することにより、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）のために作製された。これは、試料の並行処理を可能にさせるが、線維の重大な分離をもたらした。無負荷の培養が、アテロ線維に対して繰り返されたとき、線維は、同等に分離され、（ひずみを介した）固定化は、生理的温度での非架橋線維の粘り強さ（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）にとって極めて重要であることが認識された。並行処理アプローチを維持するため、ポリエチレングリコール（分子量＝２０ｋＤａ（キロダルトン））が、生理的濃度３５での浸透圧安定効果３４（図３Ａ−Ｃ）のために、ひずみ安定化の代用として使用された。テロ線維はまた、操作のとき、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の代わりにひずみを用いて顕微鏡上で処理されたが、いずれの観測可能な変化は、線維形態において認識されなかった。
【０１７３】
第二のテロ線維の組は、線維引張溶液内に２％デコリンを含み、それから、１．６３％ＰＥＧ及び２％デコリンを含むリン酸緩衝生理食塩水内で３７°Ｃ、４８時間無負荷線維を培養することによってＳＥＭのために作製された（図７Ｄ−７Ｆ）。培養期間の後、線維の組の双方は、室温で１時間、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝材内の２．５％グルタルアルデヒド及び２．５％パラホルムアルデヒドのレシピを用いて固定され、三度の洗浄及び段階的な一連のエタノール交換が続いた。その線維は、カーボン−プラチナコーティングを用い、スパッタコートされ、調査のためＳＥＭ撮像（Ｓ−４８００,  Ｈｉｔａｃｈｉ,  Ｊａｐａｎ）された。
【０１７４】
（透過型電子顕微鏡法のためのテロ線維の作製）
テロ線維は、溶液中の２％デコリンと共に引き出され、１．６３％ＰＥＧ及び２％デコリンを有するリン酸緩衝生理食塩水内で３７°Ｃ、４８時間、無負荷の形態で培養されることにより、ＴＥＭのために作製された（図９Ａ−９Ｈ）。アテロ線維のＴＥＭのために使用された固定化、薄片化、及び撮像手順は、テロ線維に関して繰り返された。
【０１７５】
（線維の分離）
ひずみのない場合における３７°Ｃでの線維の培養は、線維の漸進的な分離をもたらした。テロ線維は、二つの時点（１時間及び４８時間）でのＴＥＭ画像により評価された。１時間後、多くの末梢原線維は、線維から離れ始めた。４８時間後、全ての殻部は、ほぼ完全に分離し、移行領域は、原線維帯の間の隙間を増加させた。観察された変化は、培養期間に、公称ひずみを用いて保持された原線維（図８Ａ−８Ｆ）又は高張液内で保持された原線維（図９Ａ−９Ｈ）と全く対照的であった。ひずみ及び浸透圧は、共有結合架橋のない場合において、コラーゲン線維の残留（持続）に求められる分子間の安定性を与えるものと考えられる。
【０１７６】
（原線維の単離）
テロ線維からの単一の原線維は、ガラス製の微小組織グラインダ（８８５４７０−００００，Ｋｉｍｂｌｅ  Ｃｈａｓｅ）を用いた機械的な破壊（ｄｉｓｒｕｐｔ）によってＴＥＭ撮像のために単離された。１０ｍｍの中央片は、１００μｌリン酸緩衝材（液）と共にガラス製バイアル内に懸濁された。ガラスプローブは、溶液が不透明に変化し、線維断片が目視できなくなるまで、線維を破壊するために使用された。２０μｌの分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）は、１．５％酢酸ウラニルを用いた続く着色及び撮像のため、フォルムバール被覆のＴＥＭグリッド（０１７０１−Ｆ，  Ｔｅｄｐｅｌｌａ）に移された。そのグリッドは、付着する原線維に対してより親水性の表面を提供するため、１％アルシアンブルーを用いて予め処理された。
【０１７７】
（原線維の周期性分析）
原線維の縞周期（ｂａｎｄｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄｉｃｉｔｙ）は、各原線維のＴＥＭ画像のパワースペクトルから見積もられた。好ましい画像は、結合原線維の少なくとも５００ｎｍが、明確に確認されるものであった。一の原線維の長軸が、水平で且つ画像内の結合原線維の最長の直状領域に切り取られるため、最初に、各グレースケール画像が、正しい位置に置かれた。次に、切り取られた画像の各列内のグレースケールピクセル値が平均化され、一次元空間信号が、離散的フーリエ変換を用いて周波数領域に変換された。それから、周波数領域の平方複素係数が、パワースペクトル密度プロットを得るため計算された。このプロットにおいて、６０−８０ｎｍ間に落ちる最長ピークが、縞周期として評価された。全ての画像分析及び処理は、ＭＡＴＬＡＢ（Ｒ２０１４ａ，  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）で実行された。
【０１７８】
（結果）
組織化されたコラーゲン線維は、低レベル（ｌｏｗ−ｌｅｖｅｌ）引張ひずみ速度の方向に集合された。線維は、溶液中にコラーゲンモノマーを含む液滴の濃縮表面（ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ）から極微針を緩やかに引き出すことにより形成された（図４Ａ−４Ｄ及び図５Ａ−５Ｆ）。線維開始の場所を単離するため、極微針は、線維の引き出しの後、液滴表面の近くに誘導された。液滴への線維の接続位置は、移動性（流動性）の高い度合いを示し、線維の集合は、線維が液滴に接続する小さい‘ネック’領域に局在されたことを示唆した。線維内の原線維の集合の開始は、液滴に向けて短い距離だけ新たに形成される原線維が伝搬するネック領域に本当に制限され、原線維の開始の正確な場所を示すことを、図４Ｅは確認する。微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法による残りの液滴の徹底的な微視的検査は、観察可能なフィブリル構造を示さなかった。
【０１７９】
引き出された線維における原線維核生成の場所は、幾何学（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）及び流体力学（ｆｌｕｉｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）によって示される引張ひずみ場の存在する領域に限定される。引張ひずみは、流動誘起結晶化（ＦＩＣ）２４を介してポリマーの結晶化を促進することで知られる。ＦＩＣは、次の二つの機構で結晶化を促進する。すなわち、１）核生成サイトの数の増加、及び２）結晶化（反応）速度の加速２５。ＦＩＣは、引張流動で誘起された引き伸ばし及び集合系のエントロピーを低下させることで知られるポリマー鎖の配列の直接的な結果であり、結果として、ポリマーの結晶化が起こるために必要な自由エネルギーの変化を減少させる２６。そのため、コラーゲン原線維の集合は、ポリマーのＦＩＣに類似するように進むものと考えられる。
【０１８０】
引張ひずみ速度εは、線維を引き出す間、蛍光ビーズを追跡することによって測定された。観測されたεの最大値は、０．７ｓｅｃ−１であり、無限希釈溶液において単一のコラーゲンモノマーを引き伸ばすために必要２７な臨界引張ひずみ速度εｃ＝１／λ，約７０００ｓｅｃ−１（ここで、λは緩和時間）をはるかに下回る。しかしながら、液滴が２．５分間乾燥窒素にさらされるまで、原線維は、液滴から連続して引っ張られないため、液滴の表面コラーゲン濃度は、希薄状態からかけ離れていることが明白である。コラーゲン拡散スピードに対して表面蒸発スピードを平衡させるスケーリング分析は、液滴表面が、実験時間の経過中、約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で増加することを示唆した。時間に伴い増加する表面濃度及び深さに依存するその濃度を測定するため、光磁気マイクロ粘度測定が、乾燥窒素での蒸発期間に液滴に関して行われた（ＳＩ（サポーティングインフォーメーション）本文を参照）。データは、液滴表面（１４．３ｍｇ／ｍｌ）から、濃度が４．６ｍｇ／ｍｌ（バルク液滴濃度の代表）であった１００μｍ径方向内側の地点への急な濃度勾配の存在を確認した。表面濃度は、約２．５ｍｇ／ｍｌの重複濃度（ｏｖｅｒｌａｐ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｉｔｏｎ）を大きく上回るため、高いレベルの分子間結合が、緩和時間を劇的に増やし、分子整列（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）をもたらすために必要な引張ひずみ速度を数桁低減させたことが、予想される。
【０１８１】
原線維の修復は、同じように容易に実証された。仮に、原線維が、あまりに高い割合（あまりに速い速度で）で液滴から引き出されたら、それは、ネック領域で破砕し、残った短い線維断片が、ガラス針に付着した（図４Ｆ）。切断された線維は、単にそれを液滴に再び導入し、低速度で再び引き出しすることにより‘修復された’（図４Ｇ−４Ｉ）。線維の断片端が溶液を通じて引っ張られるにつれて、線維の集合が再び開始され、明らかな修復サイトが形成された。接合が形成された時点で、線維は、追加の欠陥なしに生成され続けた。データは、制御された張力の適用と併せて、モノマーの外因的供給を介した体内の修復コラーゲン原線維へのルートを支持する。
【０１８２】
微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法を用いて、引き出された線維に関する構造調査（図６Ａ、６Ｂ）は、原線維の配列、及びテロペプチド（アテロ）又は傷のないテロペプチド（テロ）を持つ酢酸抽出コラーゲンモノマーを欠いているいずれかのペプシン抽出コラーゲンモノマー（ｐｅｐｓｉｎ−ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｍｏｎｏｍａｅｒｓ）から引き出された原線維内の連続性に関して高い程度を示した。アテロコラーゲン３０に関する集合の緩やかな速度は、アテロ原線維で観察される、より洗練された（品質の優れた）組織的制御を可能にした。おそらく、これは、ひずみ場を用いて、より十分に配列するフィブリル構造に向けて成長するコラーゲン凝集体内の分子移動性の時間増加のためである。テロコラーゲンモノマーから生成されるコラーゲン原線維は、典型的に、線維の長軸からの僅かな角度オフセットを伴う原線維を所有し、それにより、引出プロセスにおいて、初期の構造‘設定’を行なう比較的急速な集合速度をもたらす可能性がある。コラーゲン源に関わらず、注目に値する内部線維異方性（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ）を持つ線維は、モノマーの液滴から引き出されることによって生成された。引き出しに先立つコラーゲンの予備（事前）集合に関する積極的制御として、線維は、観察可能な予備集合コラーゲンネットワーク（図６Ｃ）を含む液滴から引き寄せられた。予備集合された原線維の引き出しは、ネットワークの無誘導集合（図６Ｄ）によって生成される分裂を維持した。画像は、内部原線維もつれ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｆｉｂｒｉｌ  ｅｎｔａｎｇｌｅｍｅｎｔ）、枝分かれ、及びモノマー濃縮液滴表面から引き出された原線維で観察されない、最も危うい自由線維端を示した。光学顕微鏡を用いては検出できない小さいコラーゲン凝集体は、引き出しに先立ち、液滴上に形成可能であり、液滴表面は、急速凍結ディープエッチング（ＱＦＤＥ）電子顕微鏡法を使用する高解像度で観察された。コラーゲン液滴は、乾燥窒素への２．５分の暴露（線維が熟した液滴から引き出されることが可能な正確な時間）に続く、あつらえの接触凍結技術を用いて、急速凍結された。図６Ｅ、６Ｆは、再現された液滴表面の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像を示す。詰め込まれた単量体表面（ｐａｃｋｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｓｕｒｆａｃｅ）は、表面重合／凝集の証拠をほとんど持たないコラーゲン液滴上で発見された。
【０１８３】
引張ひずみにより生成される線維は、仮に拡張期間中に溶液内に無負荷で残された場合、構造的に不安定であった。これは、引張力学力が、線維の生成だけでなく、安定化信号を構成することを示唆する。引き出されたテロ線維を４８時間、３７°Ｃのリン酸緩衝液で培養することは、重要な分離を導いた。無負荷試料で観察された原線維の分離は、ＴＥＭで確認されたように、培養中、線維へのほんのわずかの張力（ｎｏｍｉｎａｌ  ｔｅｎｓｉｏｎ）の適用によって防止された。コラーゲンフィブリル構造の観察されたひずみ安定化は、熱的２２及び酵素的２３分解の双方に向けた、ひずみ誘起されたコラーゲン構造抵抗に一致する。それはまた、張力／ひずみが、集合された生体高分子３１の半減期を拡張する一般概念を支持する。分子間安定性は、コラーゲン原線維の水和３２，３３が減少することを高め、潜在的に引張ひずみ効果３４に相当する。そのため、ひずみ誘起安定性と浸透圧誘起安定性との相関は、１．６３％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で引き出された線維を培養することによって調査され、間質液のコロイド浸透圧に生理的に適合するよう選択された３５。その処理（手当）は、機械的張力の適用だけでなく分解から原線維を保護した。
【０１８４】
図７Ａ−７Ｆは、引張ひずみによって線維内に誘起された腱のような階層（ｈｉｅｒａｒｃｈｙ）の高指向配向性及び自発的発展を示す。しかしながら、伸長流の強い軸方向組織化効果（ａｘｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）に関わらず、側部線維結合（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）が、走査型電子顕微鏡法により収集された画像（図７Ｃ）内の単一線維間にしばしば見られた。より十分な体内状況を再生するため、及び側部線維結合（小ロイシンリッチなプロテオグリカンが欠乏する３６際、天然のコラーゲン構造で観察される問題）を制御する機構の提供のため、線維は、デコリン（２％）の生理的濃度を含む溶液から引き出された。デコリンの添加は、線維を引き出す能力に影響を与えず、原線維の離散性の向上が、直ちに観察された（図７Ｆ）。
【０１８５】
線維の縦断面のＴＥＭ画像は、アテロ線維（図８Ａ−８Ｆ）及びテロ線維（図９Ａ−９Ｈ）の双方に関して、中間移行域を持つ異質の殻と芯構造を示した。外側の５−１０μｍ厚さの‘殻部’は、アテロ及びテロ線維の双方において、途切れなく高配向された原線維を備える。その原線維は、アテロ線維において（図８Ｂ、８Ｃ）離散的で均一に間隔を空けられている一方で、テロ線維の殻部（図９Ｄ）において、より密に詰め込まれた。幾つかの領域は、殻構造から芯へ突然に切り替わるが（図８Ｄ）、典型的なアテロ原線維の移行領域は、より短く波状の（起伏のある）原線維を備える（図８Ｅ）。テロ線維に関する殻部と芯部の間の移行領域は、原線維の短い帯（ｓｈｏｒｔ  ｂａｎｄ）を発端に（図９Ｄ）、概して線維長軸に向けた角度でより広域であった。芯部移行に向けた殻部は、短く不完全に詰め込まれた原線維（図５Ｅ）の渦巻き形態へ漸進的に変化した。アテロ線維（図８Ｆ）及びテロ線維（図９Ｆ）双方の芯部は、等方的配向を持つ離散原線維を備える類似外観を有した。テロ線維に関する原線維の縞周期は、（図９Ｇの括弧間に示される）抽出された原線維の領域を単離し、パワースペクトル分析を実行することによって計算された。ＳＬＲＰ（ｓｍａｌｌ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ：小ロイシンリッチなプロテオグリカン）デコリンを含むコラーゲン溶液から引き出されたテロ線維に関する平均原線維周期は、６５．４±２．２ｎｍであり、図９Ｈに描写された。その周期は、哺乳類原線維のＤ周期縞（Ｄ−ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｂａｎｄｉｎｇ）に適合する。
【０１８６】
殻部から芯部への内部原線維の超微形態配置（配列）における移行は、液滴表面からバルクへのコラーゲンの濃度勾配を反映するように考えられる（サポーティング  インフォメーション参照）。しかしながら、移行領域における線維の渦巻き形態及び曲がり模様（ａｎｇｌｅｄ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）はまた、ネック領域での径方向位置に応じた引張ひずみ速度において、変化し得ることを示唆した（図９Ａ−９Ｃ）。引出プロセスの間、ネック領域で追跡する蛍光ビーズを介した詳細な流体力学的調査は、流れが伸長し（０．１−０．７ｓ−１の範囲）、表面近くで良く振る舞うことを示した。しかしながら、再循環の明確な（ｃｌａｅｒ）中央領域は、中央で存在し、場合によって、線維芯への分裂（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）に同調する。濃度勾配データ及び流体力学に基づき、それが、ネック領域を通じた高配向フィブリル構造の形成に移行するように、より濃縮された液滴表面が、ＦＩＣ（流動誘起結晶化）を経験する。流れ場中央での低下濃度は、再循環を経験し、分裂された線維芯部をもたらす。そのため、最終形態は、集合中に観察される流体力学と調和する。
【０１８７】
本出願は、２０１４年１２月１５日に提出され‘機械的に駆動される細胞外分子のアロステリック制御’と題する米国仮出願第６２／０９２１６２号、及び２０１４年９月２５日に提出され‘ウェラブル微小流体に関する腱修復装置’と題する米国仮出願第６２／２３２７９３号の優先権を主張する。双方の仮出願は、それら全体における参照によって、ここに組み込まれた。
【０１８８】
ここに使用されるように、‘本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）’は、クレームの基本部及び新規特徴に実質的に影響を与えない物又は方法の含有を許容する。特に組成物の構成要素の記述又は装置要素の記述における、ここでの用語‘備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）’のいずれの記述は、‘本質的に成る’又は‘成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）’に交換され得る。
【０１８９】
本発明は、幾つかの好ましい実施形態と共に記述されたが、当業者は、前述の明細書を参照した後、種々の変更、均等物への置換、及びここで説明された構成及び方法のその他の修正をもたらし得る。
【０１９０】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2018500395.tif 000012
【図１０】
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【国際調査報告】
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