(57)【要約】哺乳動物の悪性腫瘍を予防又は治療するための組成物及び方法を提供する。本発明は、Hsp47発現を減少させる活性のRNAi分子又はHsp47及びp21に対して活性なRNAi分子の組み合わせを含む組成物の治療有効量を哺乳動物に投与する。【選択図】図１
2018513104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNAi分子を封入したナノ粒子を含み、上記RNAi分子がHsp47を標的とするものである、悪性腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
上記組成物は、ヒト血清に1時間暴露した後、封入されたRNAi分子の活性の少なくとも80％を保持するものである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
悪性腫瘍を治療するための上記RNAi分子がsiRNA又はshRNAである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
各RNAi分子が二本鎖領域を含み、上記二本鎖領域がHsp47 mRNAの標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項1記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、悪性腫瘍を治療するための被験体に活性薬剤を分配する方法。
【請求項６】
RNAi分子を封入したナノ粒子を含み、上記RNAi分子の一部がHsp47を標的とするものであり、上記RNAi分子の一部がp21を標的とするものである、悪性腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項７】
上記組成物は、ヒト血清に1時間暴露した後、封入されたRNAi分子の活性の少なくとも80％を保持するものである、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
悪性腫瘍を治療するための上記RNAi分子がsiRNA又はshRNAである、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】
Hsp47の発現を減少させるのに活性なRNAi分子の一部について、各RNAi分子は二本鎖領域を有し、当該二本鎖領域がHsp47 mRNAの標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１０】
p21の発現を減少させるのに活性なRNAi分子の一部について、各RNAi分子は二本鎖領域を有し、当該二本鎖領域がp21 mRNAの標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項６記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、悪性腫瘍を治療するための被験体に活性薬剤を分配する方法。
【請求項１２】
上記悪性腫瘍が、肺、結腸又は膵臓、肝臓、心臓、骨、皮膚又は腸に位置する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
上記投与が、１２週間までの期間、1日当たり少なくとも1回、上記RNAi分子について0.01〜2mg/kgの用量である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
上記投与が、Hsp47 RNAi分子についての平均AUC（0-最終）が1〜1000μg*/分/mLであり、平均Cmaxが0.1〜50μg/mLである、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
Hsp47の発現を減少させるのに有効なRNAi分子を含む組成物の治療有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、それを必要とする哺乳動物における悪性腫瘍の1つ以上の症状を予防、治療又は改善する方法。
【請求項１６】
上記哺乳動物がヒトであり、上記Hsp47がヒトHsp47である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
上記悪性腫瘍がHsp47を過剰発現する、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
上記RNAi分子が、上記哺乳動物におけるHsp47の発現を減少させる、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
上記投与が、哺乳動物におけるHsp47の発現を、少なくとも5日間で少なくとも5％減少させる、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
上記投与が、上記哺乳動物の悪性腫瘍の体積を、少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％減少させる、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
上記方法は、悪性腫瘍の1つ以上の症状を軽減するか、又は上記悪性腫瘍の進行を遅延させるか又は終了させる、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
上記投与が、上記被験体における悪性腫瘍細胞の増殖を減少させる、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
上記投与が、上記被験体における悪性腫瘍細胞の少なくとも2％、又は少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも15％、又は少なくとも20％の増殖を低下させる、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
上記腫瘍細胞が、野生型Hsp47 RNA又はタンパク質を過剰発現する、請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
上記腫瘍が、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の腺管癌及び大腸癌からなる群から選択される肉腫である、請求項１５記載の方法。
【請求項２６】
上記悪性腫瘍が、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の腺管癌、大腸癌、乳癌及び線維肉腫の群から選択される肉腫である、請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
上記悪性腫瘍が、肺、肝臓、膵臓、結腸、腎臓、心臓、骨、皮膚、腸及び関節並びにこれらの組み合わせ群から選択される解剖学的領域に位置する、請求項１５記載の方法。
【請求項２８】
上記投与が1日当たり1〜12回行われる、請求項１５記載の方法。
【請求項２９】
上記投与が、1、2、3、4、5、6又は7日間の期間行われる、請求項１５記載の方法。
【請求項３０】
上記投与が、1、2、3、4、5、6、8、10又は12週間の期間行われる、請求項１５記載の方法。
【請求項３１】
上記投与が、１２週までの期間、1日当たりに少なくとも1回、上記RNAi分子について0.01〜2mg/kgの用量である、請求項１５記載の方法。
【請求項３２】
上記投与が、Hsp47 RNAi分子についての平均AUC（0-最終）が1〜1000μg*分/mLであり、平均Cmaxが0.1〜50μg/mLである、請求項１５記載の方法。
【請求項３３】
上記投与が、静脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経口、局所、注入又は吸入である、請求項１５記載の方法。
【請求項３４】
悪性腫瘍の1つ以上の症状を、それを必要とする哺乳動物において予防、治療又は改善する方法であって、RNAi分子を含む組成物の治療有効量を哺乳動物に投与する工程を含み、上記RNAi分子の一部はHsp47の発現を減少させるのに活性であり、RNAi分子の一部はp21の発現を減少させるのに活性である、方法。
【請求項３５】
上記哺乳動物がヒトであり、上記Hsp47がヒトHsp47である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
上記悪性腫瘍がHsp47を過剰発現する、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
上記RNAi分子が、上記哺乳動物におけるHsp47及びp21の発現を減少させる、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
上記投与が、哺乳動物におけるHsp47及びp21の発現を少なくとも5日間に少なくとも5％減少させる、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
上記投与が、上記哺乳動物の上記悪性腫瘍の体積を、少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％減少させる、請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
上記方法が、悪性腫瘍の1つ以上の症状を軽減するか、又は悪性腫瘍の進行を遅延させるか又は終了させる、請求項３４記載の方法。
【請求項４１】
上記投与が、上記被験体における悪性腫瘍細胞の増殖を減少させる、請求項３４記載の方法。
【請求項４２】
上記投与が、被験体における悪性腫瘍細胞の少なくとも2％、又は少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも15％、又は少なくとも20％の増殖を低下させる、請求項３４記載の方法。
【請求項４３】
上記腫瘍細胞が、野生型Hsp47 RNA又はタンパク質を過剰発現する、請求項３４記載の方法。
【請求項４４】
上記腫瘍が、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の腺管癌及び大腸癌からなる群から選択される肉腫である、請求項３４記載の方法。
【請求項４５】
上記悪性腫瘍が、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の腺管癌、大腸癌、乳癌及び線維肉腫の群から選択される肉腫である、請求項３４記載の方法。
【請求項４６】
上記悪性腫瘍が、肺、肝臓、膵臓、結腸、腎臓、心臓、骨、皮膚、腸及び関節並びにこれらの組み合わせの群から選択される解剖学的領域に位置する、請求項３４記載の方法。
【請求項４７】
上記投与が1日当たり1〜12回行われる、請求項３４記載の方法。
【請求項４８】
上記投与が、1、2、3、4、5、6又は7日間の期間行われる、請求項３４記載の方法。
【請求項４９】
上記投与が、1、2、3、4、5、6、8、10又は12週間の期間行われる、請求項３４記載の方法。
【請求項５０】
上記投与が、１２週間までの期間、1日当たり少なくとも1回、RNAi分子について0.01〜2mg/kgの用量である、請求項３４記載の方法。
【請求項５１】
上記投与が、Hsp47 RNAi分子についての平均AUC（0-最終）が1〜1000μg*分/mLであり、平均Cmaxが0.1〜50μg/mLである、請求項３４記載の方法。
【請求項５２】
上記投与が、静脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経口、局所、注入又は吸入である、請求項３４記載の方法。
【請求項５３】
それを必要とする哺乳動物の癌幹細胞の増殖速度又は増殖を低下させる方法であって、RNAi分子を含む組成物の治療有効量を哺乳動物に投与する工程を含み、上記RNAi分子の一部がHsp47の発現を減少させるのに活性であり、上記RNAi分子の一部はp21の発現を減少させるのに活性である、方法。
【請求項５４】
上記哺乳動物がヒトであり、上記Hsp47がヒトHsp47である、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
上記RNAi分子が、哺乳動物におけるHsp47及びp21の発現を減少させる、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
上記投与が、上記哺乳動物におけるHsp47及びp21の発現を少なくとも5日間に少なくとも5％減少させる、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
上記投与が、上記哺乳動物の上記悪性腫瘍の体積を、少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％減少させる、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
上記投与が、被験体の癌幹細胞の少なくとも2％、又は少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも15％、又は少なくとも20％の増殖を低下させる、請求項５３記載の方法。
【請求項５９】
上記癌細胞が、野生型Hsp47 RNA又はタンパク質を過剰発現する、請求項５３記載の方法。
【請求項６０】
上記癌細胞が、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の腺管癌及び大腸癌からなる群から選択される肉腫である、請求項５３記載の方法。
【請求項６１】
上記癌細胞が、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の腺管癌、大腸癌、乳癌及び線維肉腫の群から選択される肉腫である、請求項５３記載の方法。
【請求項６２】
上記癌細胞が、肺、肝臓、膵臓、結腸、腎臓、心臓、骨髄、皮膚、腸、眼、これらの任意の組合せの群から選択される解剖学的領域に位置する、請求項５３記載の方法。
【請求項６３】
上記投与が1日当たり1〜12回行われる、請求項５３記載の方法。
【請求項６４】
上記投与が、1、2、3、4、5、6又は7日間の期間行われる、請求項５３に記載の方法。
【請求項６５】
上記投与が、上記投与が、1、2、3、4、5、6、8、10又は12週間の期間行われる、請求項５３記載の方法。
【請求項６６】
上記投与が、１２週間までの期間、1日当たり少なくとも1回、RNAi分子について0.01〜2mg/kgの用量である、請求項５３記載の方法。
【請求項６７】
上記投与が、Hsp47 RNAi分子についての平均AUC（0-最終）が1〜1000μg*/分/mLであり、平均Cmaxが0.1〜50μg/mLである、請求項５３記載の方法。
【請求項６８】
上記投与が、静脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経口、局所、注入又は吸入である、請求項５３記載の方法。
【請求項６９】
Hsp47を標的とするRNAi分子を封入したリポソームナノ粒子を含む、被験体における悪性腫瘍の治療に使用するための組成物。
【請求項７０】
上記悪性腫瘍が肺、結腸又は膵臓に位置する、請求項６９記載の組成物。
【請求項７１】
上記悪性腫瘍が、肝臓、心臓、骨、皮膚又は腸に位置する、請求項６９記載の組成物。
【請求項７２】
上記組成物が、10〜1000nmのサイズを有するリポソームナノ粒子を含む、請求項６９記載の組成物。
【請求項７３】
上記組成物が、10〜150nmのサイズを有するリポソームナノ粒子を含む、請求項６９記載の組成物。
【請求項７４】
上記RNAi分子の一部がHsp47を標的とし、上記RNAi分子の一部がp21を標的とするように標的化される、請求項６９記載の組成物。
【請求項７５】
上記リポソームナノ粒子が、ヒト血清に1時間暴露した後に、上記封入されたRNAi分子の少なくとも80％を保持する、請求項７４記載の組成物。
【請求項７６】
請求項６９記載の組成物を被験体に投与することを含む、悪性腫瘍を治療するための被験体の臓器へ活性剤を分配する方法。
【請求項７７】
上記悪性腫瘍が、肺、結腸、腎臓、膵臓、肝臓、骨髄、皮膚、眼又は腸に位置する、請求項７６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を基礎とする分子からなる生物医薬品及び治療剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、悪性腫瘍に関する状態及び疾患の影響を予防、治療又は緩和するためのRNA干渉剤を送達するための方法及び組成物に関する。
【０００２】
この出願は、100,000バイトのサイズであるND5123767WO_SL.txtと名付けられた2015年12月20日に作成されたASCIIファイルとして電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
悪性腫瘍の増殖は、細胞外マトリックス（ECM）に関連する。分子シャペロン「熱ショック」タンパク質Hsp47は、ECM遺伝子転写ネットワークの調節に関与している。
【０００４】
Hsp47発現が乳癌及び他の癌において活性化されることがある。Hsp47を減少させることは、乳癌細胞の増殖を減少させ、腫瘍増殖を制限することができる。
【０００５】
Hsp47の発現増加は、乳癌患者の生存不良の原因となる可能性がある。Hsp47発現は、一部ではあるがECMタンパク質を増加させることによって、癌の進行を促進することがある。例えば、Cancer Res、2015、75（8）、1580-91を参照。
【０００６】
Hsp47は、膵臓癌において高度に発現する場合がある。Hsp-47を口腔癌検出にとって有用な特異的マーカーとすることができる。
【０００７】
Hsp47又はその相同遺伝子配列は、例えば、GenBankアクセッション番号AB010273（ヒト）、X60676（マウス）又はM69246（ラット、gp46）として開示されている。
【０００８】
Hsp47の抑制剤については、線維症を抑制するものとして開示されている。例えば、US 8,173,170 B2及びUS 8,710,209 B2を参照されたい。しかし、悪性腫瘍の発症、進行、及び増殖におけるHsp47の阻害効果に関する情報は限られている。
【０００９】
p21は、CDKN1A遺伝子によってコードされ、CIP/KIPファミリーに属する細胞周期調節タンパク質である。このタンパク質は、サイクリン-CDK複合体の効果を当該複合体へ結合することにより阻害することで、G1期及びG2/M期における細胞周期の進行を阻害する機能を有する。具体的には、p21遺伝子は腫瘍抑制遺伝子の1つであるp53によって活性化される。DNA損傷等によるp53の活性化により、p53がp21を活性化し、細胞周期がG1期及びG2/M期に停止することが報告されている。
【００１０】
p21は、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌及び扁平上皮癌を含む様々なヒト癌において過剰発現されており、多くの場合、p21のアップレギュレートは腫瘍等級、侵襲性及び攻撃性に対して正に相関する。例えば、Changら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2000、Vol. 97、8号、4291〜96頁参照。また、p21のアップレギュレーションは、脳、前立腺、卵巣、乳癌及び食道細胞癌を含む多くの形態の癌において、腫瘍原性及び予後不良と関連することが報告されている。例えば、Wintersら、Breast Cancer Research、2003、Vol. 5、No.6、pp. R242-R249参照。また、疾患は、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、アミロイドーシス及び関節炎を含む加齢性疾患であっても良い。例えば、Changら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2000、Vol. 97、8号、4291〜96頁参照。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
Hsp47及びp21の発現の阻害のためのsiRNA配列、化合物及び構造のような、悪性腫瘍を有する患者のための治療を開発するための方法及び組成物が緊急に必要とされている。
【００１２】
悪性腫瘍を予防又は治療するための方法及び組成物が必要とされている。悪性腫瘍を予防、治療又は低減するためのHsp47、p21及び他の構造を標的とするRNAi分子並びに組成物が引き続き必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、Hsp47のsiRNAインヒビターによる処置及びp21のインヒビターと組み合わせたHsp47のインヒビターによる処置によって、悪性腫瘍の大きさをin vivoで低下させることができる驚くべき発見に関する。
【００１４】
本発明は、悪性腫瘍の状態及び疾患を予防、治療、又は改善するための様々な器官への送達に使用するための核酸に基づく治療化合物を組み込む方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、悪性腫瘍に関連する様々な標的の遺伝子サイレンシングのためのRNA干渉分子（RNAi分子）の組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、治療用分子を送達用するための組成物、及びその使用方法を提供することができる。本発明の種々のRNA系及び薬剤組成物は、悪性腫瘍を予防又は治療するための方法において使用することができる。
【００１６】
本発明は、悪性腫瘍に対する核酸に基づく治療化合物のための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Hsp47ならびにHsp47及びp21の発現をサイレンシングすることができるRNAi分子、構造及び組成物を提供する。本開示の構造及び組成物は、悪性腫瘍の予防、治療又はサイズ縮小に使用することができる。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明は、Hsp47を抑制するためのsiRNA又はshRNAなどのRNAi分子である二本鎖核酸分子を提供する。本発明の実施形態は、p21を抑制するためのRNAi分子を提供することもできる。
【００１８】
特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、アンチセンス核酸分子、低分子干渉RNA（siRNA）又は二本鎖RNA（dsRNA）とすることができる。
【００１９】
本発明のRNAi分子は、遺伝子サイレンシングに対して活性であり、例えば、遺伝子サイレンシングに活性であるdsRNA、siRNA、マイクロRNA、又は遺伝子サイレンシングに活性なshRNA、並びにDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）及び反復関連siRNA（rasiRNA）を含んでいる。
【００２０】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、悪性腫瘍におけるHsp47及び/又はp21の転写又は翻訳を減少させることができる。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、Hsp47の発現を低下させる方法、又は悪性腫瘍細胞におけるHsp47及びp21の発現を減少させる方法であって、細胞がヒト細胞、新生物細胞、インビボでの細胞又はインビトロでの細胞である。
【００２２】
本発明の実施形態はまた、新生物がん細胞が異常なHsp47発現レベルを示す、新生物を有する被験体を治療する方法を提供することができる。方法は、阻害性核酸分子の有効量を被験体に対して投与する工程を含み、それによって新生物を治療する。ここで、阻害性核酸分子がHsp47発現を低下させるものであり、又はRNAi分子の組み合わせがHsp47及びp21の発現を低下させるものである。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療前又は治療なしにおける新生物のサイズと比較して新生物のサイズを減少させることができる。
【００２３】
種々の実施形態において、阻害性核酸分子は、リポソーム、ポリマー、マイクロスフェア、ナノ粒子、遺伝子治療ベクター、又は裸のDNAベクター中に送達することができる。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、例えばヒト患者といった、新生物がん細胞がHsp47を発現している新生物を有する被検体を治療する方法を特徴とする。特定の実施形態では、本方法は、阻害性核酸分子の有効量を被験体に投与する工程を含むことができる。ここで、阻害性核酸分子は、Hsp47ポリペプチドの発現を阻害する若しくはHsp47ポリペプチド及びp21ポリペプチドの両方の発現を阻害するアンチセンス核酸分子又はRNAi分子又はそれらの組み合わせである。
【００２５】
特定の実施形態では、新生物の細胞はHsp47を過剰発現する。
【００２６】
特定の実施形態において、新生物は、悪性腫瘍又は肺癌又は膵臓癌であり得る。
【００２７】
本発明の実施形態は、悪性腫瘍を治療するための医薬組成物を提供することができ、該組成物は、Hsp47を標的とするRNAi分子をカプセル化する（封入する）ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、悪性腫瘍を治療するため被験体に活性薬剤を分配する方法であって、被験体に上記医薬組成物を投与することを含む方法である。
【００２８】
さらなる実施形態では、本発明は、悪性腫瘍を治療するための医薬組成物を含んでおり、当該組成物がRNAi分子をカプセル化するナノ粒子を含んでおり、RNAi分子の一部がHsp47を標的とし、RNAi分子の一部がp21を標的としている。
【００２９】
本発明はさらに、悪性腫瘍の1つ以上の症状を、それを必要とする哺乳動物において予防、治療又は改善する方法を企図し、該方法は、Hsp47の発現を減少させる活性のRNAi分子を含む組成物の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含んでいる。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、悪性腫瘍の1つ以上の症状を、それを必要とする哺乳動物において予防、治療又は改善する方法であって、該方法は、RNAi分子を含む組成物の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含んでいる。ここで、RNAi分子の一部はHsp47の発現を減少させるのに活性であり、RNAi分子の一部はp21の発現を減少させるのに活性である。
【００３１】
ある態様では、本発明は、それを必要とする哺乳動物において癌幹細胞の増殖速度又は増殖を低下させる方法を含み、当該方法は、RNAi分子を含む組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含んでいる。ここで、RNAi分子の一部はHsp47の発現を減少させるのに活性であり、RNAi分子の一部はp21の発現を減少させるのに活性である。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態は、被験体における悪性腫瘍を治療するため活性剤を分布させるのに使用する組成物であって、組成物がリポソームナノ粒子を含む組成物を提供することができる。この組成物は、悪性腫瘍を治療するために、活性薬剤を被験体の器官に分配する方法に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図1は、単一の標的としてHsp47を用い、腫瘍増殖阻害を試験するために実施された膵臓癌モデルのインビボ研究の結果を示す。図1に示すように、Hsp47 siRNA（2M）を含有する製剤で処置した群では、腫瘍は増殖しているとしても研究の過程でゆっくりと増殖した。体重減少は検査されなかった。対照的に、ビヒクル対照群の腫瘍はわずか22日間で倍増した。結論として、Hsp47 siRNAは、0.75mpkの用量で腫瘍増殖を完全に抑制することが観察され、Hsp47 siRNAを含有する製剤は強力な抗癌治療剤であることが示された。
【図２】図2は、ヒト癌細胞株におけるHsp47、コラーゲンI及びコラーゲンIVの遺伝子発現を示す。
【図３】図3は、Hsp47を標的とするsiRNAによるSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法に用いた未処理サンプルを示す。
【図４】図4は、図3は、Hsp47を標的とするsiRNAによるSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの陰性siRNAの効果を示す。
【図５】図5は、Hsp47を標的とするsiRNAによるSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの陰性siRNAの効果を示す。
【図６】図6は、Hsp47を標的とするsiRNAによるSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの陰性siRNAの効果を示す。
【図７】図7は、Hsp47を標的とするsiRNAによるSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの活性siRNAの効果を示す。
【図８】図8は、Hsp47を標的とするsiRNAによるSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの活性siRNAの効果を示す。
【図９】図9は、Hsp47を標的とするsiRNAによるSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの活性siRNAの効果を示す。
【図１０】図10は、Hsp47を標的とするsiRNAによるSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法における増殖アッセイの結果を示す。縦軸は細胞数×104である。黒丸は未処理試料である。Xマーカーは陰性siRNAである。三角マーカーは、Hsp47を標的とした活性siRNAで処理した試料を表す。
【図１１】図11は、Hsp47を標的とするsiRNAによるSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法における色素排除アッセイの結果を示す。縦軸は死んだ細胞のパーセンテージである。白丸は、Hsp47を標的とする活性siRNAで処理したサンプルである。Xマーカーは陰性siRNAである。黒丸マーカーは未処理サンプルを表す。
【図１２】図12は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法における未処理サンプルを示す。
【図１３】図13は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの陰性siRNAの効果を示す。
【図１４】図14は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの活性siRNAの効果を示す。
【図１５】図15は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法における増殖アッセイの結果を示す。縦軸は細胞数×104である。黒丸は未処理試料である。上昇曲線の白丸マーカーは陰性siRNAである。フラット曲線の白丸印は、Hsp47を標的とする活性siRNAで処理したサンプルを示す。
【図１６】図16は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法における色素排除アッセイの結果を示す。縦軸は死んだ細胞のパーセンテージである。上昇曲線の白丸は、Hsp47を標的とした活性siRNAで処理したサンプルである。フラット曲線の白丸マーカーは陰性のsiRNAである。黒丸マーカーは、未処理サンプルを表す。
【図１７】図17は、Hsp47を標的とするsiRNAによるA549肺癌細胞の増殖抑制方法における未処理サンプルを示す。
【図１８】図18は、Hsp47を標的とするsiRNAによるA549肺癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの陰性siRNAの効果を示す。
【図１９】図19は、Hsp47を標的とするsiRNAによるA549肺癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの陰性siRNAの効果を示す。
【図２０】図20は、Hsp47を標的とするsiRNAによるA549肺癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの陰性siRNAの効果を示す。
【図２１】図21は、Hsp47を標的とするsiRNAによるA549肺癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの活性siRNAの効果を示す。
【図２２】図22は、Hsp47を標的とするsiRNAによるA549肺癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの活性siRNAの効果を示す。
【図２３】図23は、Hsp47を標的とするsiRNAによるSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの活性siRNAの効果を示す。
【図２４】図24は、Hsp47を標的とするsiRNAによるA549肺癌細胞の増殖抑制方法における増殖アッセイの結果を示す。縦軸は細胞数×104である。黒丸は未処理試料である。白丸のマーカーは陰性のsiRNAである。三角マーカーは、Hsp47を標的とした活性siRNAで処理した試料を表す。
【図２５】図25は、Hsp47を標的とするsiRNAによるA549肺癌細胞の増殖抑制方法における色素排除アッセイの結果を示す。縦軸は死んだ細胞のパーセンテージである。白丸は、Hsp47を標的とする活性siRNAで処理したサンプルである。Xマーカーは陰性siRNAである。黒丸マーカーは、未処理サンプルを表す。
【図２６】図26は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法における未処理サンプルを示す。
【図２７】図27は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの陰性siRNAの効果を示す。
【図２８】図28は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの陰性siRNAの効果を示す。
【図２９】図29は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの陰性siRNAの効果を示す。
【図３０】図30は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの活性siRNAの効果を示す。
【図３１】図31は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの活性siRNAの効果を示す。
【図３２】図32は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの活性siRNAの効果を示す。
【図３３】図33は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法における増殖アッセイの結果を示す。縦軸は細胞数×104である。黒丸は未処理試料である。白丸のマーカーは陰性のsiRNAであり。Xマーカーは、Hsp47を標的とする活性siRNAで処理した試料を表す。
【図３４】図34は、Hsp47を標的とするsiRNAによるHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法における色素排除アッセイの結果を示す。縦軸は死んだ細胞のパーセンテージである。白丸は、Hsp47を標的とする活性siRNAで処理したサンプルである。Xマーカーは陰性siRNAである。白四角のマーカーは、未処理サンプルを表す。
【図３５】図35は、活性Hsp47 siRNAでトランスフェクトした大腸癌細胞SW480におけるアネキシンV及びPIの検出方法において、siRNAのトランスフェクション後2日目の結果を示す。
【図３６】図36は、活性Hsp47 siRNAでトランスフェクトした結腸癌細胞HCT116におけるアネキシンV及びPIの検出方法において、siRNAのトランスフェクション後2日目の結果を示す。
【図３７】図37は、活性Hsp47 siRNAでトランスフェクトしたSW480結腸癌細胞におけるプロカスパーゼ-3及びHsp47タンパク質の発現を検出する方法の結果を示す。
【図３８】図38は、活性Hsp47 siRNAでトランスフェクトされたHepG2肝癌細胞におけるプロカスパーゼ-3及びHsp47タンパク質の発現を検出する方法の結果を示す。
【図３９】図39は、活性Hsp47 siRNAでトランスフェクトされたA549肺癌細胞におけるプロカスパーゼ-3及びHsp47タンパク質の発現を検出する方法の結果を示す。
【図４０】図40は、Hsp47 siRNA及びp21 siRNAでトランスフェクトした大腸癌細胞SW480におけるカスパーゼ-3/7活性の検出方法の結果を示す。これらのデータは、大腸癌細胞におけるHsp47 siRNA及びp21 siRNAを組合せて使用することで、予想外に有利なカスパーゼレベルの増加をもたらし、細胞が驚くほどアポトーシスを増加させることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、被験体における新生物の治療のためのHsp47核酸分子又はポリペプチドの発現を減少させる治療組成物の利用方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、被験体における新生物の治療のため、Hsp47核酸分子又はポリペプチド及びp21核酸分子又はポリペプチドの発現を減少させる治療組成物の利用方法を提供する。
【００３５】
さらなる態様において、本発明の実施形態は、癌幹細胞の増殖速度又は増殖を低下させるための方法及び組成物を提供することができる。本発明は、Hsp47のsiRNAインヒビターによる処置及びp21のインヒビターと組み合わせたHsp47のインヒビターによる処置によって、癌幹細胞の成長又は増殖をインビボで阻害できるという驚くべき効果に関する。
【００３６】
本発明の治療用組成物は、阻害性核酸分子（siRNA、shRNA及びアンチセンスRNAなどのRNAi分子を含む）を含むことができる。
【００３７】
本発明は、Hsp47をコードするDNAを抑制するRNAi分子、リボザイム、アンチセンス核酸、DNA/RNAキメラポリヌクレオチド及びそれらを発現するためのベクター、並びにHsp47のドミナントネガティブ変異体を包含する。
【００３８】
一般に、被験体が新生物、例えば肺癌又は膵臓癌を有すると診断された後、Hsp47の抑制を含む治療方法が選択されるか、又はHsp47及びp21の抑制が選択される。
【００３９】
ここで、Hsp47を抑制する薬剤としては、Hsp47の産生及び/又は活性を抑制する薬剤、及びHsp47の分解及び/又は不活性化を促進する薬剤が挙げられる。Hsp47産生を抑制する薬剤としては、RNAi分子、リボザイム、アンチセンス核酸、Hsp47をコードするDNAのDNA/RNAキメラポリヌクレオチド、又はこれらを発現するベクターが挙げられる。
【００４０】
ここで、p21を抑制する薬剤としては、p21の産生及び/又は活性を抑制する薬剤、p21の分解及び/又は不活性化を促進する薬剤などが挙げられる。p21産生を抑制する薬剤としては、RNAi分子、リボザイム、アンチセンス核酸、p21をコードするDNAのDNA/RNAキメラポリヌクレオチド、又はそれらを発現するベクターが挙げられる。
【００４１】
RNAi分子
当業者は、報告された配列が経時的に変化することがあり、それに応じて本明細書中の核酸分子に必要な変化を組み込むことができることを理解するであろう。
【００４２】
本発明の実施形態は、小さな核酸分子を用いたHsp47発現の遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。本発明のさらなる実施形態は、小さな核酸分子を用いたHsp47発現及びp21発現の遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。
【００４３】
本発明のRNAi分子は、遺伝子サイレンシングに対して活性であり、例えば、遺伝子サイレンシングに活性であるdsRNA、siRNA、マイクロRNA、又は遺伝子サイレンシングに活性なshRNA、並びにDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）及び反復関連siRNA（rasiRNA）を含んでいる。そのような分子は、RNA干渉を媒介することができる。
【００４４】
本明細書に開示される組成物及び方法はまた、被験体における様々な種類の悪性腫瘍の治療において使用することができる。
【００４５】
本発明の核酸分子及び方法は、Hsp47をコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートするため並びにHsp47及びp21をコードする遺伝子の発現を同時にダウンレギュレートするためにプールされるか又は組み合わせて使用される。
【００４６】
本発明の組成物及び方法は、Hsp47タンパク質及び/又は当該タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節又は制御することができ、又はHsp47タンパク質及び/又は当該タンパク質をコードする遺伝子の発現をp21タンパク質及び/又は当該タンパク質をコードする遺伝子の発現を組み合わせて調節又は制御することができ、並びに、悪性腫瘍等の疾患並びにHsp47に関連する状態又は疾病の維持及び/又は発症に関与するタンパク質及び/又はそれらタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節又は制御する核酸分子を含むことができる。
【００４７】
本発明の組成物及び方法は、Hsp47及びp21の例示的な配列を参照して記載される。当業者は、本発明の様々な態様及び実施形態が、関連するHsp47又はp21遺伝子、配列、又はホモログ遺伝子及び転写変異体といった変異体、並びにHsp47若しくはp21遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）を含む多型を対象とすることを理解するであろう。
【００４８】
本発明のRNAi分子は、Hsp47又はp21を標的とすることができ、及び、例えば相補的配列を用いて、又は非標準塩基対、例えばミスマッチ及び/又はウォブル塩基対を組み込むことによって更なる標的配列を提供できる任意の相同配列を標的とすることができる。
【００４９】
ミスマッチが同定される場合、非標準的な塩基対、例えば、ミスマッチ及び/又はウォブル塩基を用いて、2つ以上の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。
【００５０】
例えば、UU及びCC塩基対などの非標準塩基対を使用して、配列相同性を有する異なる標的のための配列を標的にできる核酸分子を生成できる。したがって、RNAi分子は、相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列を標的とすることができ、単一のRNAi分子を用いて2つ以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
【００５１】
ある意味において、本発明の組成物及び方法は、Hsp47 mRNAの任意の部分に対して活性であるRNAi分子を含む。RNAi分子は、Hsp47配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含むことができる。
【００５２】
さらなる態様において、本発明の組成物及び方法は、p21 mRNAの任意の部分に対して活性であるRNAi分子を含む。RNAi分子は、p21配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含むことができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本開示のRNAi分子は、Hsp47 RNAに対して活性を有することができ、ここでRNAi分子は、変異型Hsp47コード配列、例えば、当該分野で公知の悪性腫瘍に関連する変異型Hsp47遺伝子を有するRNAに相補的な配列を含む。
【００５４】
さらなる実施形態では、本発明のRNAi分子は、Hsp47又はp21遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、RNAi分子は、siRNA（低分子干渉RNA）、miRNA（マイクロRNA）、shRNA（ショートヘアピンRNA）、ddRNA（DNA指向性RNA）、piRNA（Piwi相互作用RNA）、又はrasiRNA（反復関連siRNA）及びその改変形態といった二重RNAを含み、RNA干渉を引き起こす如何なる分子も意味する。これらのRNAi分子は、市販されているか、又は既知の配列情報などに基づいて設計及び調製することができる。アンチセンス核酸には、RNA、DNA、PNA、又はその複合体が含まれる。本明細書中で使用される場合、DNA/RNAキメラポリヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を阻害するDNA及びRNAからなる二本鎖ポリヌクレオチドを含む。
【００５６】
一実施形態では、本発明の薬剤は治療剤としてsiRNAを含む。siRNA分子は、約10〜50又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有することができる。siRNA分子は、約15〜45ヌクレオチドの長さを有することができる。siRNA分子は、約19〜40ヌクレオチドの長さを有することができる。siRNA分子は、19〜23ヌクレオチドの長さを有することができる。本発明のsiRNA分子は、標的mRNAに対するRNAiを媒介することができる。Ambion、Inc.（Austin、TX）及びMIT（Cambridge、MA）のWhitehead Institute of Biomedical Researchのような商業的に入手可能な設計ツール及びキットにより、siRNAの設計及び生産が可能である。
【００５７】
悪性腫瘍を治療するための方法
本発明の実施形態は、Hsp47及び/又はHsp47タンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するため、ならびにp21及び/又はp21タンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するために使用できるRNAi分子を提供することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明のRNAi分子は、悪性腫瘍などの疾患又は状態に関連し得るHsp47ハプロタイプ多型から生じるHsp47及び/又はHsp47タンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するために使用することができる。
【００５９】
Hsp47タンパク質又はmRNAレベル、及び/又はp21タンパク質又はmRNAレベルのモニタリングを使用して、遺伝子サイレンシングを特徴づけることができ、本発明の化合物及び組成物の有効性を決定することができる。
【００６０】
本開示のRNAi分子は、1つ以上の遺伝子の発現を調節するために、単独で又は他のsiRNAと組み合わせて使用することができる。
【００６１】
本開示のRNAi分子は、Hsp47に関連する疾患（悪性腫瘍を含む）の予防又は治療、又は症状もしくは症状の改善のために、単独で又は組み合わせて、又は他の既知の薬物と組み合わせて使用することができる。
【００６２】
本発明のRNAi分子は、配列特異的様式でHsp47又はp21の発現を調節又は阻害するために使用することができる。
【００６３】
本開示のRNAi分子は、一連の連続したヌクレオチドがHsp47 mRNA又はp21 mRNAに少なくとも部分的に相補的であるガイド鎖を含むことができる。
【００６４】
特定の態様において、悪性腫瘍は、本発明のRNAi分子を用いたRNA干渉によって治療することができる。
【００６５】
悪性腫瘍の治療は、適切な細胞ベースのモデル、ならびにエクスビボ又はインビボの動物モデルにおいて特徴づけることができる。
【００６６】
悪性腫瘍の治療は、冒された組織の細胞におけるHsp47 mRNAのレベル又はHsp47タンパク質のレベルを決定することによって、及び/又は冒された組織の細胞におけるp21 mRNAのレベル又はp21タンパク質のレベルを決定することによって特徴づけることができる。
【００６７】
悪性腫瘍の治療は、冒された臓器又は組織の非侵襲的な医学的走査によって特徴づけることができる。
【００６８】
本発明の実施形態は、それを必要とする被験体におけるHSP47に関連する疾患又は状態の症状を予防、治療、又は改善するための方法を含むことができる。
【００６９】
特定の実施形態では、Hsp47 siRNAとp21 siRNAとの組み合わせは、予想外に有利な癌細胞死の増加をもたらすことができる。さらなる実施形態では、Hsp47 siRNAとp21 siRNAとの組み合わせは、予期せず有利な癌細胞増殖の減少をもたらすことができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、被験体における悪性腫瘍の症状を予防、治療又は改善するための方法は、本発明のRNAi分子を被験体に投与することでHSP47遺伝子及び/又はp21遺伝子の発現を当該被験体又は生物において調節することを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞又は生物を本発明のRNAi分子と接触させることによって、細胞又は生物におけるHsp47遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を企図する。特定の実施形態では、本発明はさらに、細胞又は生物を本発明の2つ以上のRNAi分子と接触させることにより、細胞又は生物中のHsp47遺伝子及びp21遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を企図する。
【００７２】
阻害性核酸分子は、遺伝子発現を減少させるために一本鎖又は二本鎖核酸分子として採用されるヌクレオチドオリゴマーであっても良い。1つのアプローチでは、当該阻害性核酸分子は、RNA干渉（RNAi）媒介性の遺伝子発現ノックダウンに使用される二本鎖RNAである。一実施形態では、二本鎖RNA（dsRNA）分子が作製され、これは本発明のヌクレオチドオリゴマーにおける8〜25（例えば8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25）の連続したヌクレオチドを含むことができる。dsRNAは、二重鎖を有するRNAの2つの相補鎖又は自己二重鎖を有する単一のRNA鎖（小さなヘアピン（sh）RNA）とすることができる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、dsRNAは、約21又は22塩基対であるが、より短くても長くてもよく、約29ヌクレオチドまでであってもよい。二本鎖RNAは、標準的な技術、例えば化学合成又はインビトロ転写を用いて作製することができる。キットは、例えばAmbion（Austin、Tex.）及びEpicentre（Madison、Wis.）から入手可能である。
【００７４】
哺乳動物細胞においてdsRNAを発現させるための方法は、Brummelkamp et al. Science 296：550-553, 2002; Paddison et al. Genes＆Devel. 16：948-958, 2002; Paulら Nature Biotechnol. 20: 505-508, 2002; Suiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5515-5520, 2002; Yuら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99：6047-6052, 2002; Miyagishiら、Nature Biotechnol. 20: 497-500, 2002;及びLeeら、Nature Biotechnol. 20: 500-505 2002を参照されたい。これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
Hsp47遺伝子に「対応する」阻害性核酸分子は、少なくとも二本鎖遺伝子の断片を含み、二本鎖阻害性核酸分子の各鎖が標的Hsp47遺伝子の相補鎖に結合できる。阻害性核酸分子は、参照となるHsp47配列と完全に対応する必要はない。
【００７６】
一実施形態において、siRNAは、標的核酸と少なくとも約85％、90％、95％、96％、97％、98％又はさらには99％の配列同一性を有する。例えば、1〜2塩基対のミスマッチを有する19塩基対の二重鎖は、本発明の方法において有用であると考えられる。他の実施形態においては、阻害性核酸分子のヌクレオチド配列は、1, 2, 3, 4, 5又はそれ以上のミスマッチを示す。
【００７７】
本発明によって提供される阻害性核酸分子は、siRNAに限定されず、Hsp47又はp21核酸分子又はポリペプチドの発現を減少させるのに十分な任意の核酸分子を含む。本明細書で提供されるDNA配列は、例えば、コードされたタンパク質の発現を減少させるための治療用アンチセンス核酸分子の発見及び開発において使用することができる。本発明はさらに、触媒性RNA分子又はリボザイムを提供する。そのような触媒RNA分子は、インビボで標的核酸分子の発現を阻害するために使用することができる。アンチセンスRNA内にリボザイム配列を含めることにより、RNA切断活性が分子上に付与され、それによって構築物の活性が向上する。標的RNA特異的リボザイムの設計及び使用は、Haseloffら、Nature 334：585-591, 1988及び米国特許出願公開第2003/0003469 A1に記載されている。これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
本発明の様々な実施形態において、触媒核酸分子は、ハンマーヘッド又はヘアピンモチーフに形成される。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Rossiら、Aids Research and Human Retroviruses、8：183, 1992に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Hampelら、Biochemistry、28：4929,1989及びHampel et al. Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990に記載されている。当業者であれば、酵素的核酸分子に必要とされるのは、標的遺伝子RNA領域の1つ以上に相補的な特異的基質結合部位であることを認識し、分子にRNA切断活性を付与するその基質結合部位内又はその周囲のヌクレオチド配列を有することを認識する。
【００７９】
標的の抑制は、抑制剤が利用されていない細胞と比較して、細胞中の対応するタンパク質の発現又は活性が抑制されることによって決定され得る。タンパク質の発現は、任意の公知の技術によって評価することができる。これらの例示としては、抗体を利用した方法、EIA、ELISA、IRA、IRMA、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法、当該タンパク質又はその固有の断片をコードする核酸又は転写産物（mRNA）又は当該核酸のスプライシング産物と特異的にハイブリダイズする核酸を利用するハイブリダイゼーション方法、ノーザンブロット法、サザンブロット法及び様々なPCR法を挙げることができる。
【００８０】
タンパク質の活性は、例えばRaf-1（特にリン酸化Raf-1）又はEGFR（特にリン酸化EGFR）のようなタンパク質への結合を含むタンパク質の既知の活性を分析することによって評価することができる。これには、例えば、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（SPR）法等を挙げることができる。
【００８１】
一態様では、本発明は、上記態様のいずれかの阻害性核酸分子をコードするベクターを特徴とする。特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞における発現に適したプロモーターを含む。
【００８２】
本発明の組成物中に処方される活性RNA干渉誘導成分の量は、投与の利益を上回る副作用を引き起こさない量とすることができる。このような量は、培養細胞を用いたインビトロ試験、マウス、ラット、イヌ、ブタ等のモデル動物又は哺乳動物での試験により測定することができ、これらの試験方法は当業者には明らかである。
【００８３】
配合される活性成分の量は、薬剤又は組成物が投与される様式に依存して変更すれば良い。例えば、組成物の複数の単位が1回の投与に使用される場合、組成物の1単位中に処方される活性成分の量は、1回の投与に必要な有効成分の量を前記複数単位で割ることによって決定することができる。
【００８４】
本発明はまた、Hsp47又はp21を抑制する薬剤又は組成物の製造方法、並びにHsp47を抑制する又はHsp47及びp21を抑制して悪性腫瘍を縮小又は収縮させる組成物の使用に関する。
【００８５】
RNA干渉
RNA干渉（RNAi）は、短い干渉RNA（siRNA）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを意味する。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Fireら、Nature、1998、Vol. 391、806811頁; Sharp、Genes＆Development、1999、Vol. 13、pp. 139-141参照。
【００８６】
細胞内のRNAi応答は、二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発することができるが、メカニズムはまだ完全には理解されていない。細胞内の特定のdsRNAは、ダイサー酵素、リボヌクレアーゼIII酵素の作用を受けることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Hammondら、Nature、2000、Vol. 404、pp.293-296参照。ダイサーは、dsRNAをsiRNAであるdsRNAのより短い断片に加工することができる。
【００８７】
一般に、siRNAは、約21〜約23ヌクレオチドの長さとすることができ、約19ヌクレオチド長の塩基対二重鎖領域を含むことができる。
【００８８】
RNAiは、RNA誘発サイレンシング複合体（RISC）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体に関与する。siRNAは、RISC複合体に入るアンチセンス又はガイド鎖であって、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNA標的の切断を媒介するアンチセンス又はガイド鎖を有する。siRNAの他方の鎖はパッセンジャー鎖である。標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（例えば、Elbashirら、Genes＆Development、2001、Vol. 15、188〜200頁参照）。
【００８９】
本明細書で使用する「センス鎖」という用語は、siRNA分子の対応するアンチセンス鎖の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のセンス鎖は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
【００９０】
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」という用語は、標的核酸配列の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のアンチセンス鎖は、siRNA分子の対応するセンス鎖の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含むことができる。
【００９１】
RNAi分子は、配列特異的様式でRNA干渉を媒介することによって遺伝子発現をダウンレギュレート又はノックダウンすることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Elbashirら、Nature、2001、Vol. 411、494〜498頁; Kreutzerら、WO2000/044895; Zernicka-Goetzら、WO2001/36646; Fireら、WO1999/032619; Plaetinckら、WO2000/01846; Melloら、WO2001/029058参照。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、遺伝子発現に関して「阻害する」、「ダウンレギュレートする」又は「縮小する」という用語は、遺伝子の発現又は1つ以上のタンパク質をコードするmRNA分子のレベル、若しくは1つ又は複数のコードされたタンパク質の活性が、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも低下することを意味している。例えば、発現のレベル、mRNAのレベル又はコードされたタンパク質活性のレベルが、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも、少なくとも1％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも50％、又は少なくとも90％、又はそれ以上で低下すれば良い。
【００９３】
RNAi分子はまた、ウイルス遺伝子発現をノックダウンするために使用することができ、よってウイルス複製に影響を及ぼす。
【００９４】
RNAi分子は、別個のポリヌクレオチド鎖：センス鎖又はパッセンジャー鎖と、アンチセンス鎖又はガイド鎖とから作製することができる。ガイド鎖とパッセンジャー鎖とは、少なくとも部分的に相補的である。ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、約15〜約49塩基対を有する二重鎖領域を形成することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、siRNAの二重鎖領域は、17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,又は49個の塩基対を含むことができる。
【００９６】
特定の実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であり、RISCに対して活性な二重鎖領域の長さを有することができる。
【００９７】
さらなる実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であるRNAi分子に変換されるダイサー基質として活性とすることができる。
【００９８】
いくつかの態様では、RNAi分子は、長い分子の対向する末端に相補的なガイドとパッセンジャー配列部分とを有することができ、その結果、分子は相補配列部分において二重鎖領域を形成することができ、各鎖はヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのいずれかによって当該二重鎖領域の一端で結合する。例えば、ヘアピン配列ステム及びループ配列である。各鎖とリンカー相互作用は、共有結合又は非共有相互作用とすることができる。
【００９９】
本開示のRNAi分子は、核酸のセンス領域を核酸のアンチセンス領域に結合するヌクレオチド、非ヌクレオチド又はヌクレオチド/非ヌクレオチド混合リンカーを含んでいてもよい。ヌクレオチドリンカーは、長さが2ヌクレオチド以上、例えば約3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10ヌクレオチドのリンカーとすることができる。ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーとしても良い。本明細書で使用する「アプタマー」又は「核酸アプタマー」は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、ここで核酸分子はその天然の状況において標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子に結合する核酸分子であってもよく、ここで標的分子は核酸に天然に結合しなくてよい。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合し、それにより天然に存在するリガンドとタンパク質との相互作用を防止するために使用することができる。例えば、Goldら、Annu Rev Biochem、1995、Vol. 64、763-797頁; Brodyら、J.Biotechnol., 2000、Vol. 74、5〜13頁; Hermannら、Science、2000、Vol. 287、pp. 820-825参照。
【０１００】
非ヌクレオチドリンカーの例は、無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素又は他の高分子化合物、例えば2〜100個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールなどの高分子化合物を挙げることができる。いくつかの例は、Seelaら、Nucleic Acids Research、1987、Vol. 15、3113〜3129頁; Cloadら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、6324-6326頁; Jaeschkeら、Tetrahedron Lett.,1993、Vol. 34、301頁; Arnoldら、WO1989/002439; Usmanら、WO1995/006731; Dudyczら、WO1995/011910; 及びFerentzら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、pp. 4000-4002に記載されている。
【０１０１】
RNAi分子は、二重鎖領域から1つ以上のオーバーハングを有することができる。オーバーハングは、塩基対形成されていない一本鎖領域であり、長さが1〜8ヌクレオチド又はそれ以上としても良い。オーバーハングは、鎖の3'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する3'末端オーバーハングとしても良い。オーバーハングは、鎖の5'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する5'末端オーバーハングとしても良い。
【０１０２】
RNAi分子のオーバーハングは、同じ長さを有していても良いし、異なる長さとしても良い。
【０１０３】
RNAi分子は、二重鎖領域がオーバーハングなしで終わり、鎖が二重鎖領域の末端まで塩基対合する、一つ以上の平滑末端を有するものとすることができる。
【０１０４】
本開示のRNAi分子は、1つ以上の平滑末端を有することができ、又は1つ以上のオーバーハングを有することができ、若しくは平滑末端とオーバーハングとの組み合わせを有することができる。
【０１０５】
RNAi分子の鎖の5'末端は、平滑末端にあってもよく又はオーバーハングにあってもよい。RNAi分子の鎖の3'末端は、平滑末端にあってもよく又はオーバーハングにあってもよい。
【０１０６】
RNAi分子の鎖の5'末端は平滑末端にあり、3'末端はオーバーハングにあってもよい。RNAi分子鎖の3'末端は平滑末端にあり、5'末端はオーバーハングにあってもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、RNAi分子の両端は平滑末端である。
【０１０８】
さらなる実施形態において、RNAi分子の両端はオーバーハングを有する。
【０１０９】
5'-及び3'-末端のオーバーハングは、異なる長さであってもよい。
【０１１０】
特定の実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の5'末端及びセンス鎖の3'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
【０１１１】
さらなる実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の3'末端及びセンス鎖の5'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
【０１１２】
RNAi分子は、二重鎖領域における塩基対合においてミスマッチを有していてもよい。
【０１１３】
RNAi分子のオーバーハングにおける任意のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドとすることができる。
【０１１４】
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは5'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他方の鎖の3'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。
【０１１５】
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは3'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他の鎖の5'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、RNAi分子のオーバーハングヌクレオチドの1つ以上又は全てを2'-デオキシリボヌクレオチドとしてもよい。
【０１１７】
ダイサー基質RNAi分子
いくつかの態様において、RNAi分子は、RISC活性RNAi分子を生成するようにプロセシングされるダイサー基質として適した長さにすることができる。例えば、Rossiら、US2005/0244858参照。
【０１１８】
ダイサー基質dsRNAは、活性RNAi分子を生成するためにダイサーによって処理されるのに十分な長さとすることができ、さらに以下の特性の1つ以上を含んでいてもよい：（i）ダイサー基質dsRNAは、例えば、アンチセンス鎖上に3'オーバーハングを有するような非対称とすることができ、（ii）ダイサー基質dsRNAはダイサー結合の配向を指示し、dsRNAを処理して活性なRNAi分子とするためにセンス鎖上に改変された3'末端を有していてもよい。
【０１１９】
p21のRNAi分子
p21 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表1に示す。
【０１２０】
【表１】
2018513104.tif 000003
【０１２１】
表1の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを指す。小文字a、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びチミジンを意味する。mUは2'-メトキシ-Uである。
【０１２２】
p21 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表2に示す。
【０１２３】
【表２】
2018513104.tif 000004
【０１２４】
表2の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを指す。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、RNAi分子は、siRNA（低分子干渉RNA）、miRNA（マイクロRNA）、shRNA（ショートヘアピンRNA）、ddRNA（DNA指向性RNA）、piRNA（Piwi相互作用RNA）、又はrasiRNA（反復関連siRNA）及びその改変形態といった二重RNAを含み、RNA干渉を引き起こす如何なる分子も意味する。これらのRNAi分子は、市販されているか、又は既知の配列情報などに基づいて設計及び調製することができる。アンチセンス核酸には、RNA、DNA、PNA、又はその複合体が含まれる。本明細書中で使用される場合、DNA/RNAキメラポリヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を阻害するDNA及びRNAからなる二本鎖ポリヌクレオチドを含む。
【０１２６】
一実施形態では、本発明の薬剤は治療剤としてsiRNAを含む。siRNA分子は、約10〜50又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有することができる。siRNA分子は、約15〜45ヌクレオチドの長さを有することができる。siRNA分子は、約19〜40ヌクレオチドの長さを有することができる。siRNA分子は、19〜23ヌクレオチドの長さを有することができる。本発明のsiRNA分子は、標的mRNAに対するRNAiを媒介することができる。Ambion、Inc.（Austin、TX）及びMIT（Cambridge、MA）のWhitehead Institute of Biomedical Researchのような商業的に入手可能な設計ツール及びキットにより、siRNAの設計及び生産が可能である。
【０１２７】
p21はヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報は、NM_000389.4、NM_078467.2、NM_001291549.1、NM_001220778.1、NM_001220777.1（NP_001207707.1、NP_001278478 NP_001207706.1、NP_510867.1、NP_000380.1）で見つけられる。
【０１２８】
p21 mRNAの核酸配列は、例えば、2175ヌクレオチドの長さであるGenBankアクセッション番号NM_000389.4（CDKN1A）に開示されている。
【０１２９】
Hsp47を標的とするRNAi分子
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞内輸送及び成熟のためのコラーゲン特異的分子シャペロンである熱ショックタンパク質47（Hsp47）の発現を調節するための一連のRNAi分子及び組成物を提供することができる。
【０１３０】
Hsp47のsiRNAのいくつかの例は、米国特許第8,710,209号に記載されており、これは、参照によりその全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
Hsp47又はその相同遺伝子配列は、例えば、GenBankアクセッション番号AB010273（ヒト）、X60676（マウス）又はM69246（ラット、gp46）として開示されている。
【０１３２】
Hsp47を抑制する薬剤は、線維症を阻害するためのもとして開示されている。例えば、米国特許第8,173,170 B2号参照。これは、その全体が参照により全ての目的のために本明細書に組み込まれる。しかし、悪性腫瘍の発症、進行、及び増殖におけるHsp47の阻害効果に関する情報は限られている。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本発明のsiRNA分子の各鎖は、15〜60ヌクレオチド長、又は15〜40ヌクレオチド長、又は19〜25ヌクレオチド長とすることができる。
【０１３４】
特定の実施形態では、本発明は、Hsp47を標的とするRNAi分子である悪性腫瘍を治療するためのRNAi分子を含有する医薬組成物を提供する。
【０１３５】
Hsp47 mRNAを標的とする本開示のRNAi分子の例を表3に示す。
【０１３６】
【表３】
2018513104.tif 000005
【０１３７】
表3の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを指す。小文字のdは「デオキシ」を表す。
【０１３８】
Hsp47 mRNAを標的とする本開示のRNAi分子のさらなる例を表4に示す。
【０１３９】
【表４】
2018513104.tif 000006
【０１４０】
表4の要点：記号：rXはリボヌクレオチドを表し、mXは2'-O-メチルリボヌクレオチドを表し、25rXは2’-5’結合を有するリボヌクレオチドを表し、C3は1,3-プロパンジオールスペーサーを表し、idABは逆位1,2-ジデオキシ-D-リボースを表し、Pは、3’末端のリン酸基を表す。
【０１４１】
RNAi分子の使用方法
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、分子の直接的な適用によって、又は担体若しくは希釈剤と組み合わせた分子を用いて、細胞又は組織に送達することができる。
【０１４２】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、担体又は希釈剤若しくは、ウイルス配列、ウイルス物質又は脂質若しくはリポソーム製剤などの細胞への侵入を補助又は促進するように機能する他の送達ビヒクルを用いた分子の直接的な適用によって、細胞、組織、器官又は被験体に送達又は投与することができる。
【０１４３】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、カチオン性脂質と複合体を形成するか、リポソーム内にパッケージするか、或いは標的細胞又は組織に送達することができる。核酸又は核酸複合体は、直接皮膚適用、経皮適用又は注射によって生体外又は生体内の関連する組織に局所投与することができる。
【０１４４】
送達系は、例えば、水性及び非水性ゲル、クリーム、エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性及び非水性溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベース及び粉末を含んでいても良く、そして可溶化剤及び浸透増強剤等の添加物を含んでいても良い。
【０１４５】
本発明の阻害性核酸分子又は組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤の単位剤形で投与することができる。従来の製薬実務を用いて、過度の細胞増殖によって引き起こされる疾患に罹患している患者に化合物を投与するための適切な製剤又は組成物を提供することができる。患者は症状が現れる前に投与を開始することができる。例えば、非経口、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼科、脳室内、肝内、嚢内、髄腔内、膀胱内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐薬、又は経口投与が含まれる。例えば、治療用製剤は、液体溶液又は懸濁液の形態とすることができる。経口投与の場合、製剤は、錠剤又はカプセル剤の形態とすることができる。鼻腔内製剤としては、粉末、点鼻薬又はエアロゾルの形態とすることができる。
【０１４６】
本開示の組成物及び方法は、核酸分子の発現を可能にするように、少なくとも1つの本発明のRNAi分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
【０１４７】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、DNA又はRNAベクターに挿入された転写単位から発現させることができる。組換えベクターは、DNAプラスミド又はウイルスベクターとすることができる。核酸分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。
【０１４８】
例えば、ベクターは、二重鎖のRNAi分子の両方の鎖をコードする配列、又は自己相補的であってRNAi分子を形成する単一の核酸分子を含んでいても良い。発現ベクターは、2つ以上の核酸分子をコードする核酸配列を含んでいても良い。
【０１４９】
核酸分子は、真核生物のプロモーターから細胞内で発現することができる。当業者は、任意の核酸が、適切なDNA/RNAベクターから真核細胞において発現できることを理解している。
【０１５０】
いくつかの態様では、発現コンストラクトを細胞に導入するためにウイルスコンストラクトを使用することができ、これは当該発現コンストラクトによりコードされるdsRNA構築物の転写のためである。
【０１５１】
脂質製剤は、静脈内、筋肉内又は腹腔内注射によって、若しくは経口的に又は吸入によって、若しくは当該分野で公知の他の方法によって動物に投与することができる。
【０１５２】
オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は公知であり、使用することができる。
【０１５３】
上記方法の一実施形態では、阻害性核酸分子は、約5〜500mg/m2/日、例えば、5、25、50、100、125、150、175、200、225、250、275又は300mg/m2/日である。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本発明の阻害性核酸分子は、約1〜100mg/kg、例えば、1, 5, 10, 20, 25, 50, 75又は100mg/kgの投薬量で全身投与される。
【０１５５】
さらなる実施形態において、投薬量は、約25〜500mg/m2/日の範囲とすることができる。
【０１５６】
製剤を製造するための当該分野で公知の方法は、例えば、"Remington：The Science and Practice of Pharmacy" Ed. A. R. Gennaro、Lippincourt Williams ＆ Wilkins、Philadelphia、Pa., 2000で見つけることができる。
【０１５７】
非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油又は水素化ナフタレンを含むことができる。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して、化合物の放出を制御することができる。阻害性核酸分子のための他の潜在的に有用な非経口送達システムには、エチレン-酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム及びリポソームが含まれる。吸入のための製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含むことができ、又は例えばポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸塩及びデオキシコール酸塩を含む水溶液であってもよく、又は点鼻薬の形態で投与する油性溶液であってもよい。
【０１５８】
処方物は、新生物の疾患又は状態の治療を提供するために、治療上有効な量（例えば、病的状態を予防、排除又は軽減する量）でヒト患者に投与することができる。本発明のヌクレオチドオリゴマーの好ましい投与量は、障害のタイプ及び程度、特定の患者の全体的な健康状態、化合物賦形剤の製剤及びその投与経路などの変数に依存することができる。
【０１５９】
本発明の医薬組成物は、Hsp47関連疾患の治療に有効となりうる。疾患としては、異常な細胞増殖による疾患や、Hsp47の過剰発現を伴う疾患などが挙げられる。
【０１６０】
悪性腫瘍を減少させるための上記の方法の全ては、インビトロ方法又はインビボ方法のいずれであっても良い。投薬量は、当技術分野で知られているように、培養細胞等を用いたin vitro試験によって決定され得る。有効量は、腫瘍サイズを少なくとも10％、少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％、又は少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なくとも90％、最大100％まで縮小する量としても良い。有効量は、癌細胞増殖をコントロールと比較して少なくとも10％、少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％、又は少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なくとも90％、最大100％まで減少する量としても良い。
【０１６１】
異常細胞増殖による疾患としては、悪性腫瘍、過形成、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、赤血球増加症、真性赤血球増加症、白血球増加症、過形成性瘢痕、扁平苔癬及び白子症が挙げられる。
【０１６２】
Hsp47過剰発現に起因する疾患の例には、悪性腫瘍が含まれる。
【０１６３】
癌の例には、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫及び骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頸部癌腫、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病及び悪性リンパ腫などの癌腫を挙げることができる。
【０１６４】
癌は、上皮悪性腫瘍及び非上皮悪性腫瘍を含む。癌は、身体のあらゆる部位、例えば、脳、頭頸部、胸部、四肢、肺、心臓、胸腺、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸、盲腸、虫垂、直腸）、肝臓、膵臓、胆嚢、腎臓、膀胱、膀胱、前立腺、精巣、子宮、卵巣、皮膚、線条筋、平滑筋、滑膜、軟骨、骨、甲状腺、副腎、腹膜、腸間膜、骨髄、血液、血管系、リンパ節などのリンパ系、リンパ液などに存在することができる。
【０１６５】
別の実施形態では、癌は、ホルモン依存性増殖因子又は増殖因子非依存性増殖を示す癌細胞を含む。さらなる実施形態において、癌は、Hsp47過剰発現を示す癌細胞を含む。
【０１６６】
ナノ粒子
本発明の実施形態は、リポソームナノ粒子組成物を提供することができる。本発明のイオン化可能な分子を使用して、脂質様分子の二重層を有することができるリポソーム組成物を形成することができる。
【０１６７】
ナノ粒子組成物は、リポソーム構造、二重層構造、ミセル、層状構造又はそれらの混合構造の中に、本発明のイオン化可能な分子の1つ以上を有することができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、組成物は、1つ以上の液体ビヒクル成分を含むことができる。本発明の活性薬剤の送達に適した液体ビヒクルは、薬学的に許容される液体ビヒクルとすることができる。液体ビヒクルは、有機溶媒又は水と有機溶媒との組み合わせを含むことができる。
【０１６９】
本発明の実施形態は、10〜1000nmのサイズを有する脂質ナノ粒子を提供することができる。いくつかの実施形態において、リポソームナノ粒子は、10〜150nmのサイズを有することができる。
【０１７０】
特定の実施形態では、本発明のリポソームナノ粒子は、RNAi分子をカプセル化し、ヒト血清に1時間暴露した後にカプセル化されたRNAi分子の少なくとも80％を保持することができる。
【０１７１】
医薬組成物
本発明はさらに、本発明の組成物を被験体に投与することによって、悪性腫瘍を処置するための被験体の器官に活性剤を分配する方法を企図する。治療できる臓器には、肺、肝臓、膵臓、結腸、心臓、骨、皮膚、腸及び関節が含まれる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の組成物を被験体に投与することによって肺悪性腫瘍疾患を治療するための方法を提供する。
【０１７３】
さらなる態様において、本発明はある範囲の医薬製剤を提供する。
【０１７４】
本明細書の医薬製剤は、薬学的に許容される担体又は希釈剤とともに、本発明の薬物担体又は脂質を含むことができる。一般に、本書における活性薬剤は、siRNA、悪性腫瘍のための任意の活性薬剤、並びに任意の小分子薬剤を含んでいる。
【０１７５】
薬物担体は、組成物を標的化して星状細胞に到達させることができる。薬物担体は、その内部に薬剤を含有していても良いし、薬物含有物資の外側に付着していても良いし、薬物と混合させていても良い。ただしレチノイド誘導体及び/又はビタミンA類似体が薬物担体に含まれており、少なくとも部分的に製剤の外部に露出している。組成物又は調製物は、例えば、腸溶コーティング又は経時的に崩壊する物質などの適切な物質で覆われてもよく、又は適切な薬物放出系に組み込まれてもよい。
【０１７６】
本発明の医薬製剤は、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、防腐剤、安定剤、染料、及び懸濁剤の各々の1つ以上を含有することができる。
【０１７７】
本発明の化合物及び組成物を処方及び投与するための方法と同様に、いくつかの薬学的担体、希釈剤及び成分は、Remington's Pharmaceutical Sciences、18th Ed., Mack Publishing Co.、Easton、Penn.（1990）に記載されている。
【０１７８】
防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸及びp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。
【０１７９】
界面活性剤の例には、アルコール、エステル、硫酸化脂肪族アルコールが含まれる。
【０１８０】
賦形剤の例には、スクロース、グルコース、ラクトース、デンプン、結晶セルロース、マンニトール、軽質無水ケイ酸塩、アルミン酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム及びカルボキシメチルセルロースカルシウムが含まれる。
【０１８１】
懸濁剤の例には、ヤシ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆、酢酸フタル酸セルロース、酢酸メチル-メタクリル酸コポリマー及びフタル酸エステルが含まれる。
【０１８２】
遺伝子サイレンシングについて活性な1つ以上の分子を送達する本発明の治療用製剤は、それを必要とする哺乳動物に投与することができる。リポソームにカプセル化することができる製剤及び活性剤の治療有効量を、悪性腫瘍を予防又は治療するために哺乳動物に投与することができる。
【０１８３】
投与経路は、局所的又は全身的とすることができる。
【０１８４】
本発明の治療上有効な製剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下及び経口を含む様々な経路によって投与することができる。
【０１８５】
投与経路には、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、髄腔内注射、ならびに髄腔内、直接的脳室内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射を含む非経口送達が含まれる。
【０１８６】
処方物は、所定の速度での長期及び/又は時限のパルス投与のために、デポー注射、浸透圧ポンプなどを含む持続放出又は制御放出投与形態で投与することもできる。
【０１８７】
本発明の組成物は、経口経路及び非経口経路の両方を含む様々な経路によって投与することができ、その例としては、特に限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、肺内、気道内、気管内、気管支内、鼻内、直腸内、動脈内、門脈内、心室内、髄内、内リンパ節、リンパ管内、脳内、髄腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻腔内、腹腔内及び子宮内経路が挙げられる。そして、各投与経路に適した剤形に製剤化することができる。そのような剤形及び製剤方法は、任意の既知の剤形及び方法から適宜選択することができる。例えば、Hyojun Yakuzaigaku、Standard Pharmaceutics、Ed. Yoshiteru Watanabeら、南光堂、2003参照。
【０１８８】
経口投与に適した剤形の例には、特に限定されないが、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、液体、懸濁液、乳液、ゲル及びシロップが挙げられる。注射を含む非経口投与に適した剤形の例には、注射可能な溶液、注射可能な懸濁液、注射可能なエマルジョン及びすぐに使用できる注射剤が挙げられる。非経口投与のための製剤は、水性又は非水性の等張滅菌溶液又は懸濁液などの形態であってもよい。
【０１８９】
例えば、ボーラス注射又は連続点滴などによる非経口投与のための医薬製剤には、水溶性形態の活性製剤の水溶液が含まれる。活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。場合により、懸濁液はまた、化合物の溶解度を高めて高濃度の溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は剤を含有してもよい。
【０１９０】
注射のための処方物は、単位剤形、例えば、アンプル又は複数回投与の容器中で、防腐剤を添加して提供することができる。製剤は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンのような形態をとり、懸濁剤、安定化剤及び/又は分散剤のような処方剤を含んでいてもよい。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で構成するための粉末形態であってもよい。
【０１９１】
前述の製剤に加えて、製剤は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用性製剤は、筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、製剤は、適切なポリマー又は疎水性物質、例えば許容される油中のエマルジョン、又はイオン交換樹脂、又は難溶性誘導体、例えば難溶性塩として処方されてもよい。
【０１９２】
本発明の組成物及び処方物はまた、局所送達のために処方することができ、局所送達ビヒクルの適用のための任意の適切なプロセスを用いて被験体の皮膚に適用することができる。例えば、製剤は、手動で、アプリケータを用いて、又は両方を含むプロセスによって適用することができる。施用後、処方物は、例えば擦ることによって被験体の皮膚内にに作用することができる。アプリケーションは、1日に複数回又は1日に1回実行することができる。例えば、製剤は、1日1回、1日2回、又は1日複数回、被験体の皮膚に適用してもよく、2日に1回、3日に1回、又は毎週約1回、2週間に1回 、又は数週間に1回適用してもよい。
【０１９３】
本明細書に記載の製剤又は医薬組成物は、任意の適切な手段によって対象に投与することができる。投与方法の例としては、とりわけ、（a）輸液ポンプ送達を含む注射を介した、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、腔内、嚢内、髄腔内、胸骨内などの投与; （b）活性化合物を生きた組織と接触させるための当業者によって適切であると考えられる、例えばデポー移植による、腎臓又は心臓領域内への直接注射などによる局所投与;を挙げることができる。
【０１９４】
医薬組成物の正確な製剤、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。例えば、Goodman ＆ GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics、12th Ed.、Sec. 1, 2011参照。典型的には、患者に投与される組成物の用量範囲は、患者の体重1kg当たり約0.5〜約1000mgとすることができる。投与量は、患者が必要とするように、1又は複数の日の経過中に与えられた1つ又は一連の2つ以上であってもよい。化合物のヒト投薬量が少なくともいくつかの条件のために確立されている場合、投薬量はほぼ同じか又は確立されたヒト投薬量の約0.1％〜約500％、より好ましくは約25％〜約250％とすることができる。新たに発見された医薬組成物の場合のように、ヒト投薬量が確立されていない場合、適切なヒト投薬量は、毒性研究及び動物における有効性試験によって認定されたED50又はID50値、又はインビトロ又はインビボ研究に由来する他の適切な値から推測することができる。
【０１９５】
悪性腫瘍を予防又は治療するための方法
本発明は、さらに、悪性腫瘍の活性又は増殖を制御するための方法であって、有効量の組成物をそれを必要とする被験体に投与する工程を含む方法に関する。ここでいう有効量とは、悪性腫瘍を治療する方法において、その症状を緩和するか、進行を遅延させるか停止させることであり、好ましくは、悪性腫瘍の発症又は再発を予防又は治癒する量である。好ましくは、投与の利益を上回る有害作用を引き起こさない量でもある。このような量は、培養細胞を用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌ、ブタ等のモデル動物や哺乳動物での試験により適宜決定すればよく、そのような試験方法は、当業者には明らかである。さらに、本発明の方法において使用される担体中の活性剤の用量及び活性剤の用量は、当業者に公知であるか、又は上記の試験によって適宜決定することができる。
【０１９６】
投与頻度は、使用される組成物の特性及び上記の被験体の状態に依存し、1日に複数回（すなわち、1日あたり2、3、4、5又はそれ以上）とすることができ、1日に1回、数日ごと（すなわち、2、3、4、5、6又は7日ごとなど）、週に数回（たとえば、１週に2、3、4回など）、隔週又は数週間ごと（つまり、2、3、4週ごとなど）に設定することができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本発明はまた、上記担体を利用することによって、悪性腫瘍細胞に薬物を送達する方法に関する。この方法は、送達されるべき物質を担持する担体を生体内又は培地、例えば肺の細胞外マトリックス産生細胞を含む培地に投与又は添加する工程を含む。これらの工程は、本発明に記載された任意の既知の方法又は方法に従って、適切に達成することができる。また、上記の方法は、インビトロで行う態様と、体内の肺の悪性腫瘍細胞を標的とする態様とを含む。
【０１９８】
本発明の治療有効配合物は、活性薬剤の広い生体内分布を提供し得る全身性送達によって投与することができる。
【０１９９】
本発明の実施形態は、本発明の治療用分子及び薬学的に許容される担体を含む治療用製剤を提供することができる。
【０２００】
本発明の製剤の有効用量は、1日1回から12回、又は1週間に1回で投与することができる。投与期間は、1、2、3、4、5、6又は7日とすることができ、又は1、2、3、4、5、6、8、10又は12週間とすることができる。
【実施例】
【０２０１】
実施例１：HSP47を単一の標的として用い、腫瘍増殖阻害を試験するためのインビボ研究を行った。PANC-1由来の膵臓癌モデルを選択した。これは、表5に示すように、そのコラーゲンタンパク質の豊富化のためである。
【０２０２】
【表５】
2018513104.tif 000007
【０２０３】
研究方法：
PANC-1細胞を、雌無胸腺ヌードマウスの右腹部に皮下に接種した。
腫瘍の大きさは、式：腫瘍体積=長さ×幅2/2を用いて測定及び計算した。確立された腫瘍が約200mm3に達したとき、マウスを無作為化し、被験物質注射のために割り当てた。
HSP47-siRNA（2M）を含有する製剤を動物に静脈内に0.75mg/kg、q1wで計4回投与した。
動物の体重及び腫瘍体積を週2回モニタリングした。
【０２０４】
結果及び結論：このPANC-1モデルにおいて腫瘍はゆっくりと増殖し、倍加時間はビヒクル群では22日であった。体重減少は検査されなかった。化合物81に基づいており、HSP47-siRNA（2M）を含有する製剤は、0.75mpkの用量で腫瘍増殖を完全に抑制することが観察された。全体的に、Hsp47の抑制は腫瘍増殖を阻害し、この製剤が強力な抗癌治療剤であることを示した。
【０２０５】
結果及び結論：図1は、単一の標的としてHsp47を用いて腫瘍増殖阻害を試験するために実施された膵臓癌モデルのインビボ研究の結果を示す。図1に示すように、Hsp47 siRNA（2M）を含有する製剤で処置した群では、腫瘍体積は、増加したとしても試験の期間中にゆっくりと増加した。体重減少は検査されなかった。対照的に、ビヒクル対照群の腫瘍容積はわずか22日間で倍増した。結論として、Hsp47 siRNAは、0.75mpkの用量で腫瘍増殖を完全に抑制することが観察され、Hsp47 siRNAを含有する製剤は強力な抗癌治療剤であることが示された。
【０２０６】
実施例２：ヒト癌細胞株A549、MCF7、MDA-MB-231、HCT116、M7609、COLO230HSR、SW480、PANC-1、SW1990、MIA-PaCa、HepG2、HT1080及びHaLaにおける、Hsp47、コラーゲンI及びコラーゲンIVの遺伝子発現を図２に示した。発現は、SW480及びHepG2において顕著である。
【０２０７】
実施例３：Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480大腸癌細胞の増殖を抑制する方法の結果を図7〜11に示す。
【０２０８】
図3は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、未処理サンプルを示す。図4は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの陰性siRNAの効果を示す。図5は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの陰性siRNAの効果を示す。図6は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの陰性siRNAの効果を示す。図7は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの活性siRNAの効果を示す。図8は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの活性siRNAの効果を示す。図9は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの活性siRNAの効果を示す。
【０２０９】
図4と7、図5と8、図6と9の比較から、Hsp47を標的とする活性siRNAがSW480結腸癌細胞を抑制することが示された。
【０２１０】
図10は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法における増殖アッセイの結果を示す。縦軸は細胞数×104である。黒丸は未処理試料である。Xマーカーは陰性siRNAである。三角マーカーは、Hsp47を標的とした活性siRNAで処理した試料を表す。
【０２１１】
図11は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480大腸癌細胞の増殖抑制方法における色素排除アッセイの結果を示す。縦軸は死んだ細胞のパーセンテージである。白丸は、Hsp47を標的とする活性siRNAで処理したサンプルである。Xマーカーは陰性siRNAである。黒丸マーカーは、未処理サンプルを表す。
【０２１２】
実施例４：Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法の結果を図12〜16に示す。
【０２１３】
図12は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法において、未処理サンプルを示す。図13は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの陰性siRNAの効果を示す。図14は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの活性siRNAの効果を示す。図12。13及び14の比較から、Hsp47を標的とする活性siRNAがHCT116結腸癌細胞を抑制することが示された。
【０２１４】
図15は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法における増殖アッセイの結果を示す。縦軸は細胞数×104である。黒丸は未処理試料である。上昇曲線の白丸マーカーは陰性siRNAである。フラット曲線の白丸印は、Hsp47を標的とする活性siRNAで処理したサンプルを示す。
【０２１５】
図16は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHCT116結腸癌細胞の増殖抑制方法における色素排除アッセイの結果を示す。縦軸は死んだ細胞のパーセンテージである。上昇曲線の白丸は、Hsp47を標的とした活性siRNAで処理したサンプルである。平らな曲線の白丸マーカーは陰性のsiRNAである。黒丸マーカーは、未処理サンプルを表す。
【０２１６】
実施例５：Hsp47を標的とするsiRNAを用いたA549肺癌細胞の増殖抑制方法の結果を、図17〜25に示す。
【０２１７】
図17は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたA549肺癌細胞の増殖抑制方法における未処理サンプルを示す。図18は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたA549肺癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの陰性siRNAの効果を示す。図19は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたA549肺癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの陰性siRNAの効果を示す。図20は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたA549肺癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの陰性siRNAの効果を示す。図21は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたA549肺癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの活性siRNAの効果を示す。図22は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたA549肺癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの活性siRNAの効果を示す。図23は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたSW480結腸癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの活性siRNAの効果を示す。
【０２１８】
図18と21、図19と22及び図20と23との比較から、Hsp47を標的とする活性siRNAがA549肺癌細胞を抑制することが示された。
【０２１９】
図24は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたA549肺癌細胞の増殖抑制方法における増殖アッセイの結果を示す。縦軸は細胞数×104である。黒丸は未処理試料である。白丸のマーカーは陰性のsiRNAである。三角マーカーは、Hsp47を標的とした活性siRNAで処理した試料を表す。
【０２２０】
図25は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたA549肺癌細胞の増殖抑制方法における色素排除アッセイの結果を示す。縦軸は死んだ細胞のパーセンテージである。白丸は、Hsp47を標的とする活性siRNAで処理したサンプルである。Xマーカーは陰性siRNAである。黒丸マーカーは、未処理サンプルを表す。
【０２２１】
実施例６：Hsp47を標的とするsiRNAを用いたA549肺癌細胞の増殖抑制方法の結果を図26〜34に示す。
【０２２２】
図26は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、未処理サンプルを示す。図27は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの陰性siRNAの効果を示す。図28は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの陰性siRNAの効果を示す。図29は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの陰性siRNAの効果を示す。図30は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、10nMでの活性siRNAの効果を示す。図31は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、50nMでの活性siRNAの効果を示す。図32は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法において、100nMでの活性siRNAの効果を示す。
【０２２３】
図27及び30、図28及び31、及び図29及び32との比較から、Hsp47を標的とする活性siRNAがHepG2肝癌細胞を抑制することが示された。
【０２２４】
図33は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法における増殖アッセイの結果を示す。縦軸は細胞数×104である。黒丸は未処理試料である。白丸のマーカーは陰性のsiRNAである。Xマーカーは、Hsp47を標的とする活性siRNAで処理した試料を表す。
【０２２５】
図34は、Hsp47を標的とするsiRNAを用いたHepG2肝癌細胞の増殖抑制方法における色素排除アッセイの結果を示す。縦軸は死んだ細胞のパーセンテージである。白丸は、Hsp47を標的とする活性siRNAで処理したサンプルである。Xマーカーは陰性siRNAである。白四角のマーカーは、未処理サンプルを表す。
【０２２６】
実施例７：Hsp47 siRNAでトランスフェクトされた大腸癌細胞（SW480、HCT116）におけるアネキシンV及びPIの検出方法の結果を図35〜36に示す。
【０２２７】
図35は、活性Hsp47 siRNAでトランスフェクトした結腸癌細胞SW480中のアネキシンV及びPIを検出する方法のsiRNAのトランスフェクション後2日目における結果を示す。図36は、活性Hsp47 siRNAでトランスフェクトした結腸癌細胞HCT116のアネキシンV及びPIを検出する方法のsiRNAのトランスフェクション後2日目における結果を示す。
【０２２８】
実施例８：Hsp47 siRNAをトランスフェクトした癌細胞におけるプロカスパーゼ-3及びHsp47タンパク質の発現を検出する方法の結果を図37〜39に示す。
【０２２９】
図37は、活性Hsp47 siRNAでトランスフェクトしたSW480結腸癌細胞におけるプロカスパーゼ-3及びHsp47タンパク質の発現を検出する方法の結果を示す。図38は、活性型Hsp47 siRNAでトランスフェクトされたHepG2肝癌細胞におけるプロカスパーゼ-3及びHsp47タンパク質の発現を検出する方法の結果を示す。図39は、活性型Hsp47 siRNAでトランスフェクトされたA549肺癌細胞におけるプロカスパーゼ-3及びHsp47タンパク質の発現を検出する方法の結果を示す。
【０２３０】
実施例９：Hsp47 siRNA及びp21 siRNAでトランスフェクトした結腸癌細胞（SW480）におけるカスパーゼ-3/7活性を検出する方法の結果を図40に示す。これらのデータは、結腸癌細胞においてHsp47 siRNA及びp21 siRNAを組み合わせて使用することで、予想外に有利なカスパーゼレベルの増加をもたらしたことを示している。癌細胞におけるカスパーゼレベルの驚くべき増加は、細胞が驚くほどアポトーシスを増加させたことを示している。
【０２３１】
実施例１０：インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、siRNAノックダウン効果を測定した。Hsp47を標的とするRNAi分子を含有する本発明の製剤を用いて、Hsp47 mRNAの用量依存性ノックダウンが観察された。
【０２３２】
インビトロノックダウンのためのプロトコル：トランスフェクションの1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプレートに2×103細胞/ウェルでプレートし、5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュベーターで培養する。トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μlのOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に変更する。0.2μlのLipofectamine RNAiMax（Life Technologies Cat。＃13778-100）を4.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合する。1μlのsiRNAと4μlのOpti-MEM Iを混合し、LF2000溶液と混合し、ボルテックスせずに静かに混合する。室温で5分間待ち、混合物を室温で10分間インキュベートし、RNA-RNAiMax複合体を形成させる。さらに、10μlのRNA-RNAiMax複合体をウェルに添加し、プレートを手で静かに振盪する。細胞を5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃のインキュベーター中で2時間インキュベートする。2％FBSを含む培地を新鮮な-MEM I Reduced Serum Medium（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に交換する。トランスフェクションの24時間後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄する。室温で5〜30分間、50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液（Life Technologiesカタログ番号4391851C）で細胞を溶解する。停止液5μlを加え、室温で2分間インキュベートする。直ちにTAQMANを用いてRT-qPCRによりmRNAレベルを測定する。あるいは、サンプルを-80℃で凍結させ、後でアッセイすることもできる。
【０２３３】
実施例１１：Hsp47 siRNAの腫瘍阻害効力。膵臓癌異種移植モデルは、Hsp47を標的とするsiRNAの0.75mg/kgの比較的低用量で使用する。組み合わされたsiRNAは、28日目に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示す。
【０２３４】
この実験において、A549及びPANC-1細胞株をATCCから得る。細胞懸濁液を、氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用する。各マウス（無胸腺ヌード雌マウス、6〜8週、チャールズリバー（Charles River））に、マウス1匹につき1接種量の25G針及びシリンジを用いて、2.5×106個のA549細胞又は2.5×106個のPANC-1細胞の接種物0.1mlを右脇腹に皮下接種する。接種のためにマウスに麻酔をかる。確立された腫瘍が約250〜350mm3（A549）又は150〜250mm3（PANC-1）に達する日に、動物に尾静脈を通してボーラス注射を施す。動物は、過剰のCO2によって犠牲にされ、腫瘍は、投与後の異なる時点で解剖される。腫瘍を最初に湿潤し、次いでGST-πノックダウンの測定、siRNAの生体内分布、及びバイオマーカー分析のために3つの部分に分けられる。試料を液体窒素中で急速冷凍し、生物分析のために処理する準備ができるまで-80℃で保存する。
【０２３５】
実施例１２：同所性A549肺癌マウスモデルにおけるリポソーム製剤に封入されたsiRNAの有効性評価。
【０２３６】
実験動物：5週齢〜6週齢の全部で60匹の雄性NCr nu/nuマウスを研究に使用する。実験動物は、AntiCancer Inc.で繁殖され、飼育される。実験期間中、HEPA濾過環境で維持される。ケージ、食物及び寝具はオートクレーブ処理する。動物飼料はHarlan Teklad（Madison、WI）から入手する。
【０２３７】
リポソーム製剤の調製：製剤を調製し、4℃で保存する。マウスに注射する10分前に、それらを室温に温める。
【０２３８】
A549ヒト肺癌同所性モデル（SOI）：外科的同所移植（SOI）の日に、このA549ヒト肺癌同所性モデルについて、ストック腫瘍を、A549腫瘍異種移植片を有する動物の皮下部位から採取し、RPMI-1640培地に入る。壊死組織を除去し、生存組織を1.5〜2mm3に切断する。動物をイソフルラン吸入で麻酔し、手術領域をヨウ素及びアルコールで滅菌する。約1.5cmの横断切開を、マウスの左胸壁に、一対の外科用ハサミを用いて行う。3番目と4番目の肋間に肋間切開を行い、左肺を露出させる。1つのA549腫瘍断片を8-0の外科的縫合糸（ナイロン）で肺の表面に移植する。胸壁は6-0の外科用縫合糸（シルク）で閉じられる。肺は、胸腔内の残りの空気を引き出すために、25G×1/2針の3ccシリンジを使用して胸腔内穿刺により再膨張させる。胸壁は6-0の外科用絹縫合糸で閉じられる。上記操作の全ての手順は、HEPA濾過層流フードの下で7倍の倍率顕微鏡（Olympus）を用いて行う。
【０２３９】
腫瘍移植の3日後、腫瘍を有するマウスを、群当たり10匹のマウスでランダムに群に分ける。マウスの各群についての処置は、腫瘍移植の3日後に開始される。
【０２４０】
エンドポイント：実験用マウスは処置開始後42日で屠殺される。原発腫瘍を切除し、その後の分析のために電子天秤で秤量する。
【０２４１】
ヒト肺癌A549に対する製剤の抗腫瘍効果は、各処置群とビヒクル対照群との間において、解剖検査時に測定された最終原発腫瘍重量を比較することで評価される。各群の平均腫瘍重量を測定する。
【０２４２】
化合物毒性の推定：処置群及び対照群におけるマウスの平均体重を実験期間全体にわたって正常範囲内に維持する。毒性の他の症状も、マウスに対する巨視的観測では検出されない。
【０２４３】
結論：実験の最後に得られた最終的な腫瘍重量を比較することにより、処置群においてHsp47 siRNAを含む製剤を2mg/kgで処置することで、対照と比較して、ヒト肺癌A549に関して、有意にそして驚くほど腫瘍成長及び腫瘍を減少させると結論づけられる。毒性は観察されない。
【０２４４】
実施例１３：ヌードマウスにおけるA549細胞増殖及び漿尿膜（CAM）における血管新生に対するHsp47を標的とする低分子干渉RNA（siRNA）の効果。3対のHsp47 siRNA-プラスミド及び非サイレンシング-プラスミドを構築し、それぞれLIPOFECTAMINE 2000を介してA549細胞にトランスフェクトした。Hsp47 siRNA-プラスミドの最も有効な対をELISA及びリアルタイムRT-PCRにより選択した。選択されたHsp47 siRNA-プラスミドでトランスフェクトしたA549細胞、非サイレンシング-プラスミドでトランスフェクトしたA549細胞、トランスフェクションなしのA549細胞をそれぞれヌードマウスに接種した。ニワトリ胚を無作為に4つの群に分け、CAMを異なる溶液で48時間処理した。陰性対照群として培養培地DMEM、陽性対照群として非トランスフェクトA549細胞培養上清、Hsp47 siRNA群としてHsp47 siRNA A549細胞培養上清、及び非サイレンシングsiRNA群として非サイレンシングsiRNA A549細胞培養上清を使用した。CAMは12日目に顕微鏡アッセイにより回収された。
【０２４５】
対照群と比較して、Hsp47 siRNA-プラスミドは、Hsp47 mRNAの減少を伴ってA549細胞によるHsp47分泌の減少を誘導した。非サイレンシングsiRNA群と比較して、マウス異種移植片の平均腫瘍体積はHsp47 siRNA群で減少し；異種移植片が50mm3までに成長する時間が遅れた。異種移植におけるGST-π含量が減少した。CAMアッセイでは、Hsp47含量は陰性群でゼロであり、Hsp47 siRNA群では、非サイレンシングsiRNA群又は陽性群と比較して20〜70％減少した。Hsp47 siRNA群又は非サイレンシングsiRNA群又は陽性群におけるCAMの血管分岐点は陰性群と比較して増加した。Hsp47 siRNA群におけるCAMの全血管長は陰性群に比べて増加し、非サイレンシングsiRNA群又は陽性群では増加した。陰性対照群と比較して、Hsp47 siRNA群にHsp47を添加した細胞培養上清を添加すると微小血管の増殖が増加し、非サイレンシングsiRNA群又は陽性群で有意な増殖血管が観察された。
【０２４６】
実施例１４：細胞培養。ヒトの非小細胞肺癌細胞株であるA549を、10％FBS（FBS、Invitrogen）を添加したF-12K培地（ATCC）中、37℃、5％CO2の加湿雰囲気下で培養した。対照又はHsp47 siRNAを安定に発現する細胞は、A549TR細胞に、製造者の指示（Sigma-Aldrich）に従って、それぞれのレンチウイルス形質導入粒子を形質導入することによって作製した。2.5μg/mLピューロマイシン（Invivogen）中、12日間で耐性クローンを選択し、クローニングシリンダーを用いて単離し、続いてピューロマイシン含有培地で増殖させ維持した。
【０２４７】
実施例１５：Hsp47標的siRNAは、インビボでの腫瘍体積の著しい退行をもたらす。
【０２４８】
脂質製剤を使用して、scidマウス中のヒトA549肺癌細胞の異種移植片にナノ粒子中のsiRNAをカプセル化して送達した。異種移植片は、正常細胞と比較してKRAS突然変異の存在又は異常な発現レベルを同定するために試験された。腫瘍が確立されると（>100mm3）、Hsp47標的siRNA又は対照（非特異的）siRNAのいずれかで2日ごとに2週間処置した。対照群を安楽死させなければならない場合、試験を中止した。
【０２４９】
結果：Hsp47標的siRNAで処置した場合、腫瘍の拡大を防ぎ、劇的な腫瘍体積の減少をもたらした。
【０２５０】
回収された腫瘍を切片化し、TUNEL染色によって視覚化した。Hsp47標的siRNAで処置された腫瘍は、有意により高いレベルのアポトーシスを示した。腫瘍からRNAを抽出し、リアルタイムPCRを行ってHsp47の特異的ノックダウンを調べた。
【０２５１】
結果：Hsp47標的siRNAで処置した場合、in vivoにおけるsp47の発現を劇的に減少させた。
【０２５２】
実施例１６：p21を標的とする本発明のsiRNAは、インビトロで遺伝子サイレンシングに活性であることが見出された。遺伝子ノックダウンのためのp21 siRNAの用量依存的活性は、約3ピコモル（pM）未満のIC50、及び1pM程度の低いIC50を示すことが判明した。
【０２５３】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で実施し、siRNAノックダウン効果を決定した。表6に示すように、p21 mRNAに対する用量依存的ノックダウンが表1のsiRNAで観察された。
【０２５４】
【表６】
2018513104.tif 000008
【０２５５】
表6に示すように、表1のp21 siRNAの活性は0.3〜10pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に適している。
【０２５６】
実施例１７：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有する本発明のp21 siRNAの構造は、予想外に且つ有利に遺伝子ノックダウン活性を増加させた。
【０２５７】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で実施し、構造1735’（配列番号57及び71）に基づくp21 siRNAのノックダウン効力を決定した。p21 mRNAの用量依存的ノックダウンは、表7に示すように、構造1735’に基づくp21 siRNAで観察された。
【０２５８】
【表７】
2018513104.tif 000009
【０２５９】
表7に示すように、デオキシヌクレオチドを含まないp21 siRNAと比較して、アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造1735’に基づくp21 siRNAの活性は、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有しないp21 siRNAと比較して、驚くほどかつ予想外に300倍まで増加した。 
【０２６０】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域にデオキシヌクレオチドを有する構造を有するp21 siRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有さないp21 siRNAと比較して驚くほど高い遺伝子ノックダウン活性を提供することを示している。
【０２６１】
アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有するp21 siRNAについて、表7に示される活性は、0.001から0.1pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
【０２６２】
本明細書に記載された実施形態は限定的ではなく、当業者は、本明細書に記載の修飾の特定の組み合わせを、改善されたRNAi活性を有する核酸分子を同定するための過度の実験なしに試験することができることを容易に理解することができる。
【０２６３】
本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物、特許及び文献は、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。
【０２６４】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、材料、及び試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。説明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示された説明に様々な置換及び変更を加えることができ、これらの実施形態はこの説明及び添付の特許請求の範囲内にあることは、当業者にとって極めて明らかである。
【０２６５】
単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。同様に、用語「a」（又は「an」）、「1つ以上」及び「少なくとも1つの」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」及び「有する」は、互換的に使用することができ、広範かつ制限なしに読まれるべきである。
【０２６６】
本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個々に参照する簡略方法として役立つことを意図しており、それぞれの個別値は個々に記載されているかのように組み入れられる。ここで、マーカッシュグループについては、当業者は、この説明が個々のメンバーならびにマーカッシュグループのメンバーのサブグループを含むことを認識するであろう。
【０２６７】
それ以上の詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。
【０２６８】
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同じ、等価の目的、又は同様の目的を果たす代替の特徴と置き換えることができる。
【図１】
2018513104.tif 000010
【図２】
2018513104.tif 000011
【図３】
2018513104.tif 000012
【図４】
2018513104.tif 000013
【図５】
2018513104.tif 000014
【図６】
2018513104.tif 000015
【図７】
2018513104.tif 000016
【図８】
2018513104.tif 000017
【図９】
2018513104.tif 000018
【図１０】
2018513104.tif 000019
【図１１】
2018513104.tif 000020
【図１２】
2018513104.tif 000021
【図１３】
2018513104.tif 000022
【図１４】
2018513104.tif 000023
【図１５】
2018513104.tif 000024
【図１６】
2018513104.tif 000025
【図１７】
2018513104.tif 000026
【図１８】
2018513104.tif 000027
【図１９】
2018513104.tif 000028
【図２０】
2018513104.tif 000029
【図２１】
2018513104.tif 000030
【図２２】
2018513104.tif 000031
【図２３】
2018513104.tif 000032
【図２４】
2018513104.tif 000033
【図２５】
2018513104.tif 000034
【図２６】
2018513104.tif 000035
【図２７】
2018513104.tif 000036
【図２８】
2018513104.tif 000037
【図２９】
2018513104.tif 000038
【図３０】
2018513104.tif 000039
【図３１】
2018513104.tif 000040
【図３２】
2018513104.tif 000041
【図３３】
2018513104.tif 000042
【図３４】
2018513104.tif 000043
【図３５】
2018513104.tif 000044
【図３６】
2018513104.tif 000045
【図３７】
2018513104.tif 000046
【図３８】
2018513104.tif 000047
【図３９】
2018513104.tif 000048
【図４０】
2018513104.tif 000049
【配列表】
2018513104000001.app
【国際調査報告】
2018513104.tif 000050
2018513104.tif 000051
2018513104.tif 000052
2018513104.tif 000053