(57)【要約】ＡｐｏＬ１を発現する非ヒトトランスジェニック動物およびその生成方法が提供される。ＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させることができる薬剤を同定する方法も提供される。さらに、ＡｐｏＬ１のヒト変異体に結合する単離抗体が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡｐｏＬ１を発現する、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記非ヒトトランスジェニック動物は、ｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（配列番号０１）、ｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体（配列番号０２）、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）、ｉｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ１変異体、ｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、ｖｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、またはｖｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体、およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現する、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記動物が齧歯動物である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記齧歯動物がマウスである、請求項３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記非ヒトトランスジェニック動物が腎症を有する、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記腎症はＨＩＶ関連腎症である、請求項５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
前記腎症はドキソルビシン誘発性腎症である、請求項５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞または組織。
【請求項９】
薬剤がヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させることができるかどうかを決定する方法であって：
ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を測定すること；
ｂ）前記非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与すること；および
ｃ）前記非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を測定することを含み；
ここで、前記非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトＡｐｏＬ１の血清濃度の低下は、該薬剤がヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させることができることを示す、方法。
【請求項１０】
腎症の進行を減少させることができる薬剤を同定する方法であって：
ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物における腎症を誘発すること；
ｂ）前記非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与すること；及び
ｃ）非ヒトトランスジェニック動物の腎臓の病理学的表現型に基づき腎症の進行を評価することを含み；
該薬剤を投与されていない非ヒトトランスジェニック動物と比較して進行性が低い腎症は、該薬剤が腎症の進行を減少させることができることを同定する、方法。
【請求項１１】
前記腎症はドキソルビシンの投与によって誘導される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腎症が、ヒト免疫不全ウイルスの一部を含む導入遺伝子を前記非ヒトトランスジェニック動物において発現させることによって誘発される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤は、ｉ）ＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体（配列番号０１）、ｉｉ）ＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のヒトＧ１変異体（配列番号０２）、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）、またはｉｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のヒトＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体に結合する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤は、抗体である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒトＡｐｏＬ１を発現する非ヒトトランスジェニック動物において腎症を誘発することを含む、腎症の動物モデルを生成する方法。
【請求項１６】
非ヒト動物が、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
腎症が、ヒト免疫不全ウイルスの一部を含む導入遺伝子を前記非ヒト動物において発現させることによって誘発される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記腎症はドキソルビシンの投与によって誘導される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ドキソルビシンは、１５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ドキソルビシンは、２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ドキソルビシンは、２４ｍｇ／ｋｇ〜２６ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ドキソルビシンは、２５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される、請求項１８に記載の方法。  
【請求項２３】
ドキソルビシンは単回投与で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ドキソルビシンは尾静脈内に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
脱水を防ぐために非ヒト動物を皮下の液体で毎日処置する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
ＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体（配列番号０１）及びＡｐｏＬ１のヒトＧ１変異体（配列番号０２）ならびにＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）の一方または両方に結合する、単離抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２６に記載の前記抗体。
【請求項２８】
前記抗体がヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２９】
前記抗体が完全長のＩｇＧ１抗体である、請求項２６に記載の抗体。
【請求項３０】
前記抗体がＡｐｏＬ１変異体の多量体化を阻止することができる、請求項２６に記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体がヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させることができる、請求項２６に記載の抗体。
【請求項３２】
前記抗体が腎症の進行を減少させることができる、請求項２６に記載の抗体。
【請求項３３】
前記腎症がＡｐｏＬ１媒介性腎症である、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
前記ＡｐｏＬ１媒介性腎症が、ＨＩＶ関連腎症、巣状分節性糸球体硬化症関連腎症、鎌状赤血球腎症、移植後の同種移植片喪失に関連する腎症、およびループス腎炎関連腎症からなる群から選択される、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３５】
前記ＡｐｏＬ１媒介性腎症が高血圧関連腎症である、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３６】
前記ＡｐｏＬ１媒介性腎症が糖尿病性腎症である、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３７】
請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離核酸。
【請求項３８】
請求項３７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項３９】
抗体が産生されるように、請求項３８に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体の産生方法。
【請求項４０】
請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤。
【請求項４１】
薬として使用するための、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４２】
薬の製造における、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項４３】
請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の抗体を個体に投与することにより、腎症を有する個体を治療するための方法。
【請求項４４】
対象における腎症の進行を減少させる方法であって、有効量の請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の抗体を対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０７７，７７４号に対する優先権の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１５年１１月１０日に作成された該アスキーコピーは、「Ｐ３２４０７ＷＯ＿ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名前で５２，８７４バイトサイズである。
【０００３】
本発明は、腎症の非ヒトトランスジェニック動物モデルおよび治療剤を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
アポリポタンパク質Ｌ１（ＡｐｏＬ１）は、シグナルペプチドを含む、アポリポタンパク質Ａ１を有する６遺伝子ファミリーの唯一のメンバーであり、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子の特に高密度亜種（ＨＤＬ３）に分泌される（Ｄｕｃｈａｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ＡｐｏＬ１は、アフリカのトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｂｒｕｃｅｉ）に対するヒトの先天性免疫応答の主要な成分であり、アフリカの睡眠病を引き起こす。トリパノソーマの亜種、Ｔ．ｂ．ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅは、野生型ＡｐｏＬ１（Ｇ０とも呼ばれる）に耐性である。しかしながら、アフリカの染色体では共通であるがヨーロッパの染色体には存在しないＡｐｏＬ１の２つの異なる対立遺伝子（Ｇ１およびＧ２と呼ばれる）は、Ｔ．ｂ．  Ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅによる感染から保護する（米国特許第７，５８５，５１１号、同第２０１２／０１２８６８２号を参照されたい）。Ｇ１およびＧ２対立遺伝子はまた、腎症の発症の危険性を増加させ、変異体は、例えば、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、高血圧関連腎症（ＨＴＮ）およびＨＩＶ関連腎症（ＨＩＶＡＮ）に関連する（米国特許第２０１２／０１９５９０２号、同第２０１２／０００３６４４号を参照されたい）。アフリカ系アメリカ人では、ＦＳＧＳは早期に発生し、白人と比較して末期腎疾患（ＥＳＲＤ）へ４〜５倍速く進行する（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；  Ｋｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｐａｒｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＡｐｏＬ１変異体は、糖尿病の状態に関わらず、「高血圧起因の」ＥＳＲＤの７倍高い確率（Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｐａｒｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、特発性ＦＳＧＳの１７倍高い確率（Ｋｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、およびＨＩＶ関連腎症の２９倍高い確率（Ｋｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）と関連する。遺伝的関連は、これまでに共通の疾患について報告された中で最も強力なものの１つであり、アフリカ系アメリカ人における白人に対するより高い腎症率についての説明を提供する。これらの疾患は多くの苦しみの原因となり、米国では何十億ドルもの支出に繋がる。フィルタバリア機能を保護し、腎症を予防するための標的療法は現在利用できない。
【０００５】
したがって、かかる疾患の治療のための治療剤を有することが非常に有利であり、望ましいであろう。さらに、薬剤を潜在的な治療薬として同定する方法での使用に適した腎症の動物モデルは有益であろう。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＡｐｏＬ１を発現する非ヒトトランスジェニック動物およびその生成方法を提供する。ＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させることができる薬剤を同定する方法も提供される。さらに、ＡｐｏＬ１のヒト変異体に結合する単離抗体が提供される。
【０００７】
一態様において、本発明はヒトＡｐｏＬ１を発現する非ヒトトランスジェニック動物を提供する。いくつかの実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、ｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（配列番号０１）、ｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体（配列番号０２）、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）、ｉｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ１変異体、ｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、ｖｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、またはｖｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体、およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現する。いくつかの実施形態において、動物は、齧歯動物である。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。幾つかの実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、腎症を有する。いくつかの実施形態において、腎症はＨＩＶ関連腎症である。いくつかの実施形態において、腎症はドキソルビシン誘発性腎症である。
【０００８】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞または組織を提供する。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は薬剤がヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させることができるかどうかを判定する方法を提供し、該方法は、非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を測定する、非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与する、および非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を測定する工程を含み、ここで非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトＡｐｏＬ１の血清濃度の低下は、該薬剤がヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させることができることを示す。いくつかの実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトＡｐｏＬ１を発現する非ヒトトランスジェニック動物である。いくつかの実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、ｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（配列番号０１）、ｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体（配列番号０２）、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）、ｉｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ１変異体、ｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、ｖｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、またはｖｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体、およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現する。いくつかの実施形態において、動物は、齧歯動物である。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。幾つかの実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、腎症を有する。いくつかの実施形態において、腎症はＨＩＶ関連腎症である。いくつかの実施形態において、腎症はドキソルビシン誘発性腎症である。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は腎症の進行を減少させることができる薬剤を同定する方法を提供し、該方法は非ヒトトランスジェニック動物において腎症を誘発する、非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与する、および非ヒトトランスジェニック動物の腎臓の病理学的表現型に基づき腎症の進行を評価する工程を含み（実施例に記載の通り）、ここで該薬剤と共投与されていない非ヒトトランスジェニック動物と比較して進行性が低い腎症は、該薬剤が腎症の進行を減少させることができることを同定する。いくつかの実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトＡｐｏＬ１を発現する非ヒトトランスジェニック動物である。いくつかの実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、ｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（配列番号０１）、ｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体（配列番号０２）、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）、ｉｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ１変異体、ｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、ｖｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、またはｖｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体、およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現する。いくつかの実施形態において、動物は、齧歯動物である。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。いくつかの実施形態において、腎症はドキソルビシンの投与によって誘発される。いくつかの実施形態において、腎症が、ヒト免疫不全ウイルスの一部を含む導入遺伝子を非ヒトトランスジェニック動物において発現させることによって誘発される。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｉ）ＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体（配列番号０１）、ｉｉ）ＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のヒトＧ１変異体（配列番号０２）、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）、またはｉｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のヒトＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体である。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明はヒトＡｐｏＬ１を発現する非ヒトトランスジェニック動物において腎症を誘発することを含む、腎症の動物モデルを生成する方法が提供する。いくつかの実施形態において、腎症が、ヒト免疫不全ウイルスの一部を含む導入遺伝子を非ヒト動物において発現させることによって誘発される。いくつかの実施形態において、腎症はドキソルビシンの投与によって誘発される。いくつかの実施形態において、ドキソルビシンは、１５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。いくつかの実施形態において、ドキソルビシンは、２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。いくつかの実施形態において、ドキソルビシンは、２４ｍｇ／ｋｇ〜２６ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。いくつかの特定の実施形態において、ドキソルビシンは、２５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。いくつかの実施形態において、ドキソルビシンは単回投与で投与される。いくつかの実施形態において、ドキソルビシンは尾静脈内に投与される。いくつかの実施形態において、脱水を防ぐために非ヒト動物を皮下の液体で毎日処置する。いくつかの実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、ｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（配列番号０１）、ｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体（配列番号０２）、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）、ｉｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ１変異体、ｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、ｖｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、またはｖｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体、およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現する。いくつかの実施形態において、動物は、齧歯動物である。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。
【００１２】
別の態様において、本発明はＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体（配列番号０１）およびＡｐｏＬ１のヒトＧ１変異体（配列番号０２）ならびにＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）の一方または両方に結合する、単離抗体を提供する。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、完全長のＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はＡｐｏＬ１変異体の多量体化を阻止することができる。いくつかの実施形態において、抗体はヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させることができる。いくつかのある特定の実施形態において、抗体は腎症の進行を減少させることができる。いくつかの実施形態において、腎症はＡｐｏＬ１媒介性腎症である。いくつかの実施形態において、ＡｐｏＬ１媒介性腎症が、ＨＩＶ関連腎症、巣状分節性糸球体硬化症関連腎症、鎌状赤血球腎症、移植後の同種移植片喪失に関連する腎症、およびループス腎炎関連腎症からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＡｐｏＬ１媒介性腎症は高血圧関連腎症である。いくつかの実施形態において、ＡｐｏＬ１媒介性腎症は糖尿病性腎症である。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の抗体をコードする単離核酸を提供する。さらに別の態様において、本発明は上述のような核酸を含む宿主細胞を提供する。さらに別の態様において、本発明は前記抗体が産生されるように、上述の宿主細胞を培養することを含む、抗体の産生方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は本明細書に説明される抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤を提供する。さらに別の態様において、本発明は、薬として使用するための、本明細書に記載の抗体を提供する。さらに別の態様において、本発明は、薬の製造における本発明に記載の抗体の使用を提供する。さらに別の態様において、本発明は記載の抗体を個体に投与することにより腎症を有する個体を治療する方法が提供する。さらに、一態様において、本発明は対象における腎症の進行を減少させる方法であって、有効量の本明細書に記載の抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（図１Ａ）、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体（図１Ｂ）及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図１Ｃ）のためのトランスジーンの概略図を示す。
【図１Ｂ】ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（図１Ａ）、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体（図１Ｂ）及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図１Ｃ）のためのトランスジーンの概略図を示す。
【図１Ｃ】ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（図１Ａ）、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体（図１Ｂ）及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図１Ｃ）のためのトランスジーンの概略図を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｈは、トランスジェニックマウスの血清学的ＡｐｏＬ１の検出を密度勾配遠心分離法を用いて主要リポタンパク質分類のＨＤＬ３及びＶＨＤＬフラクション中で検出できることを示す。略語：ＶＬＤＬは超低密度リポタンパク質であり、ＩＦは中間フラクションであり、ＨＤＬは高密度リポタンパク質であり、ＶＨＤＬは超高密度リポタンパク質である。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｈは、トランスジェニックマウスの血清学的ＡｐｏＬ１の検出を密度勾配遠心分離法を用いて主要リポタンパク質分類のＨＤＬ３及びＶＨＤＬフラクション中で検出できることを示す。略語：ＶＬＤＬは超低密度リポタンパク質であり、ＩＦは中間フラクションであり、ＨＤＬは高密度リポタンパク質であり、ＶＨＤＬは超高密度リポタンパク質である。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｈは、トランスジェニックマウスの血清学的ＡｐｏＬ１の検出を密度勾配遠心分離法を用いて主要リポタンパク質分類のＨＤＬ３及びＶＨＤＬフラクション中で検出できることを示す。略語：ＶＬＤＬは超低密度リポタンパク質であり、ＩＦは中間フラクションであり、ＨＤＬは高密度リポタンパク質であり、ＶＨＤＬは超高密度リポタンパク質である。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｈは、トランスジェニックマウスの血清学的ＡｐｏＬ１の検出を密度勾配遠心分離法を用いて主要リポタンパク質分類のＨＤＬ３及びＶＨＤＬフラクション中で検出できることを示す。略語：ＶＬＤＬは超低密度リポタンパク質であり、ＩＦは中間フラクションであり、ＨＤＬは高密度リポタンパク質であり、ＶＨＤＬは超高密度リポタンパク質である。
【図２Ｅ】図２Ａ〜Ｈは、トランスジェニックマウスの血清学的ＡｐｏＬ１の検出を密度勾配遠心分離法を用いて主要リポタンパク質分類のＨＤＬ３及びＶＨＤＬフラクション中で検出できることを示す。略語：ＶＬＤＬは超低密度リポタンパク質であり、ＩＦは中間フラクションであり、ＨＤＬは高密度リポタンパク質であり、ＶＨＤＬは超高密度リポタンパク質である。
【図２Ｆ】図２Ａ〜Ｈは、トランスジェニックマウスの血清学的ＡｐｏＬ１の検出を密度勾配遠心分離法を用いて主要リポタンパク質分類のＨＤＬ３及びＶＨＤＬフラクション中で検出できることを示す。略語：ＶＬＤＬは超低密度リポタンパク質であり、ＩＦは中間フラクションであり、ＨＤＬは高密度リポタンパク質であり、ＶＨＤＬは超高密度リポタンパク質である。
【図２Ｇ】図２Ａ〜Ｈは、トランスジェニックマウスの血清学的ＡｐｏＬ１の検出を密度勾配遠心分離法を用いて主要リポタンパク質分類のＨＤＬ３及びＶＨＤＬフラクション中で検出できることを示す。略語：ＶＬＤＬは超低密度リポタンパク質であり、ＩＦは中間フラクションであり、ＨＤＬは高密度リポタンパク質であり、ＶＨＤＬは超高密度リポタンパク質である。
【図２Ｈ】図２Ａ〜Ｈは、トランスジェニックマウスの血清学的ＡｐｏＬ１の検出を密度勾配遠心分離法を用いて主要リポタンパク質分類のＨＤＬ３及びＶＨＤＬフラクション中で検出できることを示す。略語：ＶＬＤＬは超低密度リポタンパク質であり、ＩＦは中間フラクションであり、ＨＤＬは高密度リポタンパク質であり、ＶＨＤＬは超高密度リポタンパク質である。
【図３Ａ】基準曲線に対するＡｐｏＬ１（ｗｔ）のＧ０変異体（図３Ａ）かＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図３Ｂ）のどちらかの血清を用いてＥＬＩＳＡにより決定したトランスジェニックマウス及びヒトドナーの血清学的ＡｐｏＬ１濃度を示す。
【図３Ｂ】基準曲線に対するＡｐｏＬ１（ｗｔ）のＧ０変異体（図３Ａ）かＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図３Ｂ）のどちらかの血清を用いてＥＬＩＳＡにより決定したトランスジェニックマウス及びヒトドナーの血清学的ＡｐｏＬ１濃度を示す。
【図４Ａ−１】定量ＰＣＲにより決定した腎臓、肝臓、及び肺内のＡｐｏＬ１の発現を示す（図４Ａ−１、図４Ａ−２）。ＰＢＳかん流マウスの肝臓及び肺のホモジネート上で、ＡｐｏＬ１に対するポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法を実施した（図４Ｂ）。ＣＨＯ−１Ｋ細胞内のＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ２またはコントロール一過性トランスフェクションのライセートを用いたウサギポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法を実施した（図４Ｃ）。
【図４Ａ−２】定量ＰＣＲにより決定した腎臓、肝臓、及び肺内のＡｐｏＬ１の発現を示す（図４Ａ−１、図４Ａ−２）。ＰＢＳかん流マウスの肝臓及び肺のホモジネート上で、ＡｐｏＬ１に対するポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法を実施した（図４Ｂ）。ＣＨＯ−１Ｋ細胞内のＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ２またはコントロール一過性トランスフェクションのライセートを用いたウサギポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法を実施した（図４Ｃ）。
【図４Ｂ】定量ＰＣＲにより決定した腎臓、肝臓、及び肺内のＡｐｏＬ１の発現を示す（図４Ａ−１、図４Ａ−２）。ＰＢＳかん流マウスの肝臓及び肺のホモジネート上で、ＡｐｏＬ１に対するポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法を実施した（図４Ｂ）。ＣＨＯ−１Ｋ細胞内のＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ２またはコントロール一過性トランスフェクションのライセートを用いたウサギポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法を実施した（図４Ｃ）。
【図４Ｃ】定量ＰＣＲにより決定した腎臓、肝臓、及び肺内のＡｐｏＬ１の発現を示す（図４Ａ−１、図４Ａ−２）。ＰＢＳかん流マウスの肝臓及び肺のホモジネート上で、ＡｐｏＬ１に対するポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法を実施した（図４Ｂ）。ＣＨＯ−１Ｋ細胞内のＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ２またはコントロール一過性トランスフェクションのライセートを用いたウサギポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法を実施した（図４Ｃ）。
【図５】未治療トランスジェニックネガティブマウス及びＡｐｏＬ１（ｗｔ）のＧ０変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するマウス内の尿タンパク値を示す。
【図６】それぞれ、５〜７日目及び９〜１１日目までの尿タンパクに対する種々のドキソルビシン投与の効果を示す（遺伝子型当たりｎ＝３〜５、平均は±ＳＥＭである）。
【図７Ａ】ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇまでで７日目までの短い暴露の効果を示す（図７Ａ、ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇで治療した遺伝子型当たりｎ＝３〜６であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。ドキソルビシンで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｂ）、ＰＢＳで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｃ）、ＡｐｏＬ１（ｗｔ）のＧ０変異体（図７Ｄ、図７Ｅ）またはＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図７Ｆ、図７Ｇ）を発現するトランスジェニックマウスのＨ＆Ｅ染色腎組織。
【図７Ｂ】ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇまでで７日目までの短い暴露の効果を示す（図７Ａ、ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇで治療した遺伝子型当たりｎ＝３〜６であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。ドキソルビシンで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｂ）、ＰＢＳで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｃ）、ＡｐｏＬ１（ｗｔ）のＧ０変異体（図７Ｄ、図７Ｅ）またはＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図７Ｆ、図７Ｇ）を発現するトランスジェニックマウスのＨ＆Ｅ染色腎組織。
【図７Ｃ】ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇまでで７日目までの短い暴露の効果を示す（図７Ａ、ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇで治療した遺伝子型当たりｎ＝３〜６であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。ドキソルビシンで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｂ）、ＰＢＳで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｃ）、ＡｐｏＬ１（ｗｔ）のＧ０変異体（図７Ｄ、図７Ｅ）またはＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図７Ｆ、図７Ｇ）を発現するトランスジェニックマウスのＨ＆Ｅ染色腎組織。
【図７Ｄ】ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇまでで７日目までの短い暴露の効果を示す（図７Ａ、ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇで治療した遺伝子型当たりｎ＝３〜６であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。ドキソルビシンで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｂ）、ＰＢＳで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｃ）、ＡｐｏＬ１（ｗｔ）のＧ０変異体（図７Ｄ、図７Ｅ）またはＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図７Ｆ、図７Ｇ）を発現するトランスジェニックマウスのＨ＆Ｅ染色腎組織。
【図７Ｅ】ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇまでで７日目までの短い暴露の効果を示す（図７Ａ、ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇで治療した遺伝子型当たりｎ＝３〜６であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。ドキソルビシンで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｂ）、ＰＢＳで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｃ）、ＡｐｏＬ１（ｗｔ）のＧ０変異体（図７Ｄ、図７Ｅ）またはＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図７Ｆ、図７Ｇ）を発現するトランスジェニックマウスのＨ＆Ｅ染色腎組織。
【図７Ｆ】ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇまでで７日目までの短い暴露の効果を示す（図７Ａ、ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇで治療した遺伝子型当たりｎ＝３〜６であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。ドキソルビシンで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｂ）、ＰＢＳで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｃ）、ＡｐｏＬ１（ｗｔ）のＧ０変異体（図７Ｄ、図７Ｅ）またはＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図７Ｆ、図７Ｇ）を発現するトランスジェニックマウスのＨ＆Ｅ染色腎組織。
【図７Ｇ】ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇまでで７日目までの短い暴露の効果を示す（図７Ａ、ドキソルビシン２５ｍｇ／ｋｇで治療した遺伝子型当たりｎ＝３〜６であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。ドキソルビシンで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｂ）、ＰＢＳで治療したトランスジェニックネガティブ動物（図７Ｃ）、ＡｐｏＬ１（ｗｔ）のＧ０変異体（図７Ｄ、図７Ｅ）またはＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図７Ｆ、図７Ｇ）を発現するトランスジェニックマウスのＨ＆Ｅ染色腎組織。
【図８】２１日後のＡｐｏＬ１  Ｇ２変異体を発現するドキソルビシンで治療したトランスジェニックマウスの体重減少を示す（遺伝子型当たりｎ＝５、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。
【図９】ドキソルビシンで治療したＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するマウスのタンパク尿を示す。アルブミン濃度をクレアチニン値に正規化し（ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））２５ｍｇ／ｋｇで治療した遺伝子型当たりｎ＝３〜５であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。
【図１０Ａ】ＰＢＳ治療マウスの有足細胞（図１０Ａ）、ドキソルビシン治療トランスジェニックネガティブマウス（図１０Ｂ）、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するマウス（図１０Ｃ）及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するマウス（図１０Ｄ）の５０００倍透過型電子顕微鏡画像を示す。複数の足突起（ＦＰ）及び介在性スリット隔膜（矢印）をさらに図示する。
【図１０Ｂ】ＰＢＳ治療マウスの有足細胞（図１０Ａ）、ドキソルビシン治療トランスジェニックネガティブマウス（図１０Ｂ）、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するマウス（図１０Ｃ）及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するマウス（図１０Ｄ）の５０００倍透過型電子顕微鏡画像を示す。複数の足突起（ＦＰ）及び介在性スリット隔膜（矢印）をさらに図示する。
【図１０Ｃ】ＰＢＳ治療マウスの有足細胞（図１０Ａ）、ドキソルビシン治療トランスジェニックネガティブマウス（図１０Ｂ）、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するマウス（図１０Ｃ）及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するマウス（図１０Ｄ）の５０００倍透過型電子顕微鏡画像を示す。複数の足突起（ＦＰ）及び介在性スリット隔膜（矢印）をさらに図示する。
【図１０Ｄ】ＰＢＳ治療マウスの有足細胞（図１０Ａ）、ドキソルビシン治療トランスジェニックネガティブマウス（図１０Ｂ）、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するマウス（図１０Ｃ）及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するマウス（図１０Ｄ）の５０００倍透過型電子顕微鏡画像を示す。複数の足突起（ＦＰ）及び介在性スリット隔膜（矢印）をさらに図示する。
【図１１Ａ−Ｅ】図１１Ａ〜Ｔは、それぞれ、ドキソルビシンまたはＰＢＳで治療したトランスジェニック動物内の異なる倍率（５倍、２０倍）と異なる染色（Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳ、マッソントリクローム染色）における腎障害の進行を示す。
【図１１Ｆ−Ｉ】図１１Ａ〜Ｔは、それぞれ、ドキソルビシンまたはＰＢＳで治療したトランスジェニック動物内の異なる倍率（５倍、２０倍）と異なる染色（Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳ、マッソントリクローム染色）における腎障害の進行を示す。
【図１１Ｊ−Ｍ】図１１Ａ〜Ｔは、それぞれ、ドキソルビシンまたはＰＢＳで治療したトランスジェニック動物内の異なる倍率（５倍、２０倍）と異なる染色（Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳ、マッソントリクローム染色）における腎障害の進行を示す。
【図１１Ｎ−Ｑ】図１１Ａ〜Ｔは、それぞれ、ドキソルビシンまたはＰＢＳで治療したトランスジェニック動物内の異なる倍率（５倍、２０倍）と異なる染色（Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳ、マッソントリクローム染色）における腎障害の進行を示す。
【図１１Ｒ−Ｔ】図１１Ａ〜Ｔは、それぞれ、ドキソルビシンまたはＰＢＳで治療したトランスジェニック動物内の異なる倍率（５倍、２０倍）と異なる染色（Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳ、マッソントリクローム染色）における腎障害の進行を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｃは、腎症のドキソルビシン誘導モデルにおける腎疾患進行に対するトランスジェニック動物内で発現されたＡｐｏＬ１のＧ０変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体の効果を示す（遺伝子型当たりｎ＝９〜１０であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｃは、腎症のドキソルビシン誘導モデルにおける腎疾患進行に対するトランスジェニック動物内で発現されたＡｐｏＬ１のＧ０変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体の効果を示す（遺伝子型当たりｎ＝９〜１０であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｃは、腎症のドキソルビシン誘導モデルにおける腎疾患進行に対するトランスジェニック動物内で発現されたＡｐｏＬ１のＧ０変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体の効果を示す（遺伝子型当たりｎ＝９〜１０であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表す）。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｄは、腎症のドキソルビシン誘導モデルにおける腎疾患進行に対する非トランスジェニック動物内のアデノウイルス送達により発現されたＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体の効果を示す。効果をコントロール（ハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ）を発現するマウス）に対して相対的に示す；（遺伝子型当たりｎ＝６〜８であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表し、どくろのシンボルは試験終了前に死んだ動物を示す）。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｄは、腎症のドキソルビシン誘導モデルにおける腎疾患進行に対する非トランスジェニック動物内のアデノウイルス送達により発現されたＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体の効果を示す。効果をコントロール（ハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ）を発現するマウス）に対して相対的に示す；（遺伝子型当たりｎ＝６〜８であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表し、どくろのシンボルは試験終了前に死んだ動物を示す）。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｄは、腎症のドキソルビシン誘導モデルにおける腎疾患進行に対する非トランスジェニック動物内のアデノウイルス送達により発現されたＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体の効果を示す。効果をコントロール（ハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ）を発現するマウス）に対して相対的に示す；（遺伝子型当たりｎ＝６〜８であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表し、どくろのシンボルは試験終了前に死んだ動物を示す）。
【図１３Ｄ−１】図１３Ａ〜Ｄは、腎症のドキソルビシン誘導モデルにおける腎疾患進行に対する非トランスジェニック動物内のアデノウイルス送達により発現されたＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体の効果を示す。効果をコントロール（ハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ）を発現するマウス）に対して相対的に示す；（遺伝子型当たりｎ＝６〜８であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表し、どくろのシンボルは試験終了前に死んだ動物を示す）。
【図１３Ｄ−２】図１３Ａ〜Ｄは、腎症のドキソルビシン誘導モデルにおける腎疾患進行に対する非トランスジェニック動物内のアデノウイルス送達により発現されたＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体の効果を示す。効果をコントロール（ハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ）を発現するマウス）に対して相対的に示す；（遺伝子型当たりｎ＝６〜８であり、平均は±ＳＥＭであり、Ｐ値は等分散両側ｔ検定を表し、どくろのシンボルは試験終了前に死んだ動物を示す）。
【図１４】ＡＰＯＬ１コンストラクトの略図を示す。ＰＦＤ：ポア形成ドメイン、ＭＡＤ：膜アドレスドメイン、ＳＲＡ−ＩＤ：血清耐性関連タンパク質相互作用ドメイン、ＧＰＩ：グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー、ｇＤ：単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄアンカー。
【図１５】ＡＰＯＬ１のＧ０変異体（黒）、ＡＰＯＬ１のＧ１変異体（グレイ）またはＡＰＯＬ１のＧ２変異体（斜線）を発現するＣＨＯ細胞に対するＦＡＣＳにより分析した抗ＡｐｏＬ１抗体の交差反応性を示す。抗体を濃度１μｇ／ｍｌで使用した。ポジティブコントロールとして、アポリポタンパク質Ｌファミリーの１つのメンバーより非特異的に結合する市販のポリクローナル抗体を使用した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｙ軸にプロットする。
【図１６】トリパノソーマに対抗する活性のインビトロ遮断の結果を示す。マウス内で生成したモノクローナル抗ＡＰＯＬ１抗体を１％正常ヒト血清（ＮＨＳ）の存在下Ｔｒｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｂｒｕｃｅｉに２０時間添加した。生存するトリパノソーマ数をレサズリン系染料（アラマーブルー ）の存在による蛍光作用によって測定した。遮断作用を非抗体コントロールに対して正規化し、生存するトリパノソーマ％をプロットする。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
別途定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有するものとする。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９４），及びＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）は、当業者に、本出願で使用される多くの用語の一般的な説明を提供する。
【００１６】
１．定義
この明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。以下に述べる定義が、参照により本明細書に組み込まれるあらゆる文書と矛盾する場合には、以下に述べる定義が制御されるものとする。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別様に明確に示されない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質」または「抗体」への言及はそれぞれ、複数のタンパク質または抗体を含み；「細胞への言及」は、細胞の純粋性などを含む。
【００１８】
「ＡｐｏＬ１」または「ヒトＡｐｏＬ１」という用語は、シグナルペプチドを含む６遺伝子ファミリーの唯一のメンバーであるヒトアポリポタンパク質Ｌ１、ポリペプチドを指す。集団には３つの異なる変異体、すなわちＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体が存在する。ＡｐｏＬ１のＧ０変異体は、配列番号０１のアミノ酸配列を有する野生型ヒトＡｐｏＬ１タンパク質（本明細書では「ｗｔ」とも呼ばれる）を指す。ＡｐｏＬ１のＧ１変異体は、配列番号０２のアミノ酸配列を有する２つのアミノ酸置換（Ｓ３４２ＧおよびＩ３８４Ｍ）を有するヒトＡｐｏＬ１タンパク質の変異体を指す。ＡｐｏＬ１のＧ２変異体は、配列番号０３のアミノ酸配列を有する２つのアミノ酸欠失（Ｎ３８８およびＹ３８９）を有するヒトＡｐｏＬ１タンパク質の変異体を指す。
【００１９】
本明細書における「検出する」という用語は、標的分子の定性的および／または定量的測定の両方を含む最も広い意味で使用され、すなわち、検出することは、試料中の標的分子の単なる存在を同定すること、ならびに試料中の標的分子のレベルを決定することを含む。
【００２０】
本明細書で使用される「ドキソルビシン」という用語は、ＣＡＳ番号２３２１４−９２−８を有する化合物を指す。ドキソルビシンは、本明細書でアドリアマイシン（登録商標）またはＡＤＲとも呼ばれる。
【００２１】
本明細書で使用される「腎症」という用語は、血液および尿中の溶質濃度を適切に調節する能力を崩壊させる腎臓の損傷が生じる生理学的状態を指す。これは、血清クレアチニン濃度、尿タンパク質濃度、尿タンパク質対クレアチニン比、またはフタル酸エステルなどのトレーサー化合物の使用を介すことを含む、多くの一般的な方法によって評価することができる。腎症は、明らかに異なる臨床状態に分類されることが多く、例えば、巣状糸球体硬化症関連腎症、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球症、移植後の同種移植片喪失、高血圧、ループス腎炎、糖尿病、および非糖尿病慢性腎臓疾患が挙げられる。腎症は、糸球体の大きさ、小葉または癒着、タフト線維症、ボーマン嚢線維症、拡張、毛細血管の狭窄、基底膜の肥厚、ボーマン隙のタンパク質、細胞性の増加（メサンギウムまたは内皮）、白血球による浸潤、毛細血管血栓、尿細管萎縮症、壊死、液胞および硝子液滴の変化、基底膜肥厚、拡張、内腔の炎症性細胞およびキャスト、間質性線維症、浮腫、急性および慢性の白血球浸潤、細動脈線維症、血栓症、硝子体の変化および狭窄の１つ以上から選択される病理学的変化を特徴とする組織学的に分類することもできる。
【００２２】
本明細書で使用される「ＡｐｏＬ１媒介性腎症」とい用語は上で定義した腎症を指し、ここで腎症の進行は、１つ以上のＡｐｏ  Ｌ１のＧ０変異体、Ａｐｏ  Ｌ１のＧ１変異体およびＡｐｏ  Ｌ１のＧ２変異体により増加する。
【００２３】
「標識」または「検出可能な標識」という用語は、検出または定量すべき物質、例えば抗体に結合可能な任意の化学基または部分を指す。典型的には、標識は、物質の高感度検出または定量化に適した検出可能な標識である。検出可能な標識の例には、蛍光標識、リン光標識、化学発光標識、生物発光標識および電気化学発光標識、放射性標識、酵素、粒子、磁性物質、電気活性種などの発光標識が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、検出可能な標識は、特異的結合反応に関与することによって、その存在をシグナルすることができる。かかる標識の例には、ハプテン、抗体、ビオチン、ストレプトアビジン、ｈｉｓタグ、ニトリロ三酢酸、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、グルタチオンなどが含まれる。
【００２４】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために同義に使用される。ポリマーは、直鎖であっても分枝鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。本用語は、天然または介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する：例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成成分との接合のようなほかの任意の操作または修飾）が挙げられる。この定義には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つまたは複数の類似体、ならびに当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、特に抗体を包含する。
【００２５】
「精製された」ポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）は、その自然環境に存在するよりも純粋な形で存在するように、及び／または実験室条件下で最初に合成および／または増幅された場合に、ポリペプチドが純度において増加したことを意味する。純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度を意味するものではない。
【００２６】
目的の抗原「と結合する」抗体は、抗体が治療剤またはアッセイ試薬、例えば捕捉抗体または検出抗体として有用であるように十分な親和性で抗原に結合する抗体である。典型的には、そのような抗体は他の抗原と有意に交差反応しない。「Ｘに結合する抗体」および「抗Ｘ抗体」は、同じ意味を有するものとする（ここで、Ｘは目的の抗原の名前、例えば、タンパク質である）。結果として、「ＡｐｏＬ１に結合する抗体」という用語は、本明細書では「抗ＡｐｏＬ１抗体」と互換的に用いることができる。
【００２７】
ポリペプチドの標的分子への結合に関して、特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたはエピトープに対する「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的」という用語は、非特異的相互作用と測定可能な差異を有する結合を意味する。特異的結合は、例えば、標的分子の結合を、結合活性を有さない類似の構造の分子である対照分子の結合と比較して判定することにより測定することができる。  
【００２８】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の、総計の非共有性相互作用の強度を指す。別途指定されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する、本来の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。
【００２９】
「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むが、これらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
【００３０】
抗体は、免疫グロブリンフォールドに基づき、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子である。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合して機能的抗体を形成する２つの「重」鎖および２つの「軽」鎖を有する。各重鎖および軽鎖自体は、「定常」（Ｃ）および「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域は抗体の抗原結合特異性を決定し、Ｃ領域は構造的支持を提供し、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において機能する。抗体または抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性は、特定の抗原に特異的に結合する抗体の能力である。  
【００３１】
抗体の抗原結合特異性は、可変領域またはＶ領域の構造的特徴によって決定される。「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が抗体によって配列が大幅に異なり、それらが、それぞれの特定の抗体の特定の抗原に対する結合及び特異性に用いられるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布しているわけではない。それは、軽鎖及び重鎖のいずれの可変ドメインにおいても、超可変領域と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのうちのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれが、主としてβシート構造を取る４つのＦＲを含み、これが３つの超可変領域によって結合され、それによってβシート構造を結合するループ、またいくつかの場合にはその一部を形成するループが形成される。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって、他方の鎖の超可変領域と近接して保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、その抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与など、様々なエフェクター機能を呈する。  
【００３２】
本明細書に使用されるとき、「超可変領域」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬでは残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７（Ｌ３）、ならびにＶＨでは３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．  （１９９１））、ならびに／または「超可変ループ」からの残基（例えば、ＶＬでは残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）ならびにＶＨでは２６〜３２（Ｈ１）、５２Ａ〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）、（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含んでもよい。  
【００３３】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３４】
「抗体断片」は、正常な抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；片腕抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディー、単鎖抗体分子；抗体断片から形成される多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ、またはタンデム）（ｄｉ，ｔｒｉ）−ｓｃＦｖが含まれるが、これらに限定されない）；およびＢｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒｓ（ＢｉＴＥｓ）が含まれる。
【００３５】
抗体のパパイン分解により、「Ｆａｂ」と呼ばれるそれぞれが単一の抗原結合部位を有する２つの同一な抗原結合断片と、残りの「Ｆｃ」断片とが得られ、その名前は容易に結晶化する能力を反映している。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原に架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００３６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む、最小の抗体断片である。この領域は、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインが緊密な非共有結合で結合した二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を定めるのは、この構成においてである。集合的に、６つの超可変領域が、抗原結合の特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）ですら、全結合部位よりは親和性は低いとはいえ、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。  
【００３７】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加が、Ｆａｂ断片と異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として、産生されたものである。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００３８】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」には、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型のうちの１つを割り当てることができる。
【００３９】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なる種類に割り当てることができる。５つの主要な正常抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちの数個は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分割され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれている。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は、周知である。
【００４０】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖で存在している。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、更に、ＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含んでおり、このリンカーにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を成すことが可能となっている。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００４１】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、その断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結びつく重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上で２つのドメイン間の対を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対にされ、２つの抗原結合部位を創出する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）でより完全に説明される。
【００４２】
「多重特異性抗体」という用語は最も広義に用いられ、特にポリエピトープ性特異性を有する抗体を包含する。このような多重特異性抗体は、限定するものではないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体であって、ＶＨＶＬユニットはポリエピトープ性特異性を有する抗体、二以上のＶＬ及びＶＨドメインを有し各ＶＨＶＬユニットは異なるエピトープに結合する抗体、２つ以上の単可変ドメインを有し各単可変ドメインは異なるエピトープに結合する抗体、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディおよびトリアボディ等の抗体断片、及び共有結合又は非共有結合された抗体断片を含む。「多重エピトープ特異性」は、同じ又は異なる抗原（複数可）における２以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」は、１つのエピトープにのみ結合する能力を指す。一実施形態によると、多重特異性抗体は、５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合するＩｇＧ抗体である。
【００４３】
「単ドメイン抗体」（ｓｄＡｂｓ）又は「単可変ドメイン」（ＳＶＤ）抗体」なる発現は一般に、単可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）が抗原結合を与えることが可能な抗体を指す。換言すると、単可変ドメインは、標的抗原を認識するために、別の可変ドメインを相互作用する必要がない。単ドメイン抗体の例は、ラクダ科（ラマ及びラクダ）及び軟骨魚類（例えば、テンジクザメ）から得られたもの、及びヒト及びマウス抗体から組換え法により得られたものを含む（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４−５４６；Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）３０：４３−５６；Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ（２００１）２６：２３０−２３５；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）：２１：４８４−４９０；ＷＯ２００５／０３５５７２；ＷＯ０３／０３５６９４；Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ（１９９４）３３９：２８５−２９０；ＷＯ００／２９００４；ＷＯ０２／０５１８７０）。
【００４４】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、例えば、モノクローナル抗体の産生中に発生する、可能性のある変異体抗体は例外であり、かかる変異体は一般に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体が有利であるのは、他の免疫グロブリンによって汚染されないという点である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、いずれの特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるものではない。例えば、本明細書で提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）が初めて述べたハイブリドーマ法によって作製してもよく、または組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製してもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することができる。
【００４５】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種であり、一方で鎖（複数可）の残りが別の種に由来するかまたは別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である、「キメラ」抗体、ならびにそのような抗体の断片が含まれるが、これは、それらが所望される生物学的活性を呈する限りにおいてである（米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）。目的のキメラ抗体は、本明細書において、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル、またはカニクイザルなどの旧世界サル）由来の可変ドメイン抗原結合配列、およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００４６】
本明細書の目的のために、「インタクトな抗体」は、重鎖および軽鎖可変ドメインならびにＦｃ領域を含むものである。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒトの天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、インタクト抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００４７】
「天然抗体」は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一な軽鎖（Ｌ）と２つの同一な重鎖（Ｈ）から構成される。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に結合されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽鎖は、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端（ＶＬ）に可変ドメインを有し、その他端に定常ドメインを有し、この軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間に界面を形成すると考えられている。
【００４８】
「裸の抗体」は、異種分子、例えば、検出部分または標識に複合されていない抗体（本明細書中で定義される）を指す。
【００４９】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞には、初代形質転換細胞および継代の数に関わらずそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、核酸含量において親細胞と完全に同一でない場合があるが、突然変異を含有し得る。元々形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体子孫が、本明細書に含まれる。
【００５０】
「単離」核酸は、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸には、核酸分子を通常含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、その核酸分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に、存在する。
【００５１】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体を抗原に結合することに関与する、抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は一般に、同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい。）抗原結合特異性を付与するためには、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分であり得る。さらに、抗原に結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを使用して、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、特定の抗原に結合する抗体を単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【００５２】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を増殖することが可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある特定のベクターは、作動的に連結された核酸の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【００５３】
本明細書における「約」の値またはパラメータは、その値またはパラメータ自体に関する変形形態を含む（そして説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。
【００５４】
ＩＩ．動物モデル、組成物および方法Ａ．腎症の動物モデル
本明細書において、腎症の動物モデルが提供される。ＡｐｏＬ１はヒト、アフリカミドリザルおよびゴリラにのみ存在するので、我々はトランスジェニック動物に基づいて動物モデルを確立した。世代に応じて、非ヒト動物はＧ０、Ｇ１またはＧ２のいずれかを発現するのみである。しかしながら、動物を交雑することにより、３つの変異体の組み合わせを発現するトランスジェニック動物を生成することが可能である。したがって、一態様において、ヒトＡｐｏＬ１を発現する非ヒトトランスジェニック動物が本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、ｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（配列番号０１）、ｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体（配列番号０２）、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）、ｉｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ１変異体、ｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、ｖｉ）ＡｐｏＬ１のＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体、またはｖｉｉ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体、およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現する。ある特定の実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、齧歯動物である。ある特定の実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシおよびヤギからなる群より選択される。ある特定の実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、マウスである。腎症のモデルを提供するために、動物はＡｐｏＬ１を発現し、腎症は非ヒトトランスジェニック動物において誘発される。したがって、ある特定の実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、腎症を有する。非ヒトトランスジェニック動物において腎症を誘発する様々な方法がある。１つの可能性は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の一部を含有する導入遺伝子をＡｐｏＬ１に加えて非ヒトトランスジェニック動物で発現させることである。ＨＩＶ導入遺伝子を発現させることにより、急性腎症が発症する。したがって、ある特定の実施形態において、腎症はＨＩＶ関連腎症である。非ヒトトランスジェニック動物において腎症を誘発する別の可能性は、化学的曝露による。ドキソルビシンは、化学療法で薬物としてヒトにおいて通常使用される。しかしながら、この物質は動物において腎症を誘発することも知られている。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書に記載の腎症はドキソルビシン誘発性腎症である。
【００５５】
別の態様において、本明細書は、上記の非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞または組織に関する。
【００５６】
本明細書に示すように、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体を含む循環ＡｐｏＬ１は、腎症の進行を媒介することができる。したがって、ＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させる１つの可能性は、循環するＡｐｏＬ１を除去することである。抗体をＡｐｏＬ１に結合させることにより、ＡｐｏＬ１のクリアランスを増加させることができ、ＡｐｏＬ１の血清濃度が低下し、ＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行に対する減弱効果がもたらされる。したがって、一態様において、薬剤がヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させることができるかどうかを判定する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を測定する、非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与する、および非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を測定する工程を含み、ここで非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトＡｐｏＬ１の血清濃度の低下は、該薬剤がヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させることができることを示す。
【００５７】
あるいは、抗体などの薬剤のＡｐｏＬ１への結合は、ＡｐｏＬ１の不活性化を導くことができ、すなわち、抗体−ＡｐｏＬ１−複合体は、ＡｐｏＬ１単独と比較して同じ生理学的効果を有することができず、それにより、ＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行に対する効果が減弱する。さらに別の可能性は、結合した抗体がＡｐｏＬ１の多量体化を防止し、ＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行に対する減弱効果をもたらすことが可能なことである。
【００５８】
したがって、非ヒトトランスジェニック動物の腎臓の病理学的表現型に基づきＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行に対する薬剤の効果を評価することにより、ＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させることができる薬剤を同定することは有益であろう。したがって、別の態様において、ＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させることができる薬剤を同定する方法が提供され、該方法は本明細書中に開示されるような非ヒトトランスジェニック動物においてＡｐｏＬ１媒介性腎症を誘発する、非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与する、および非ヒトトランスジェニック動物の腎臓の病理学的表現型に基づきＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を評価する工程を含み、ここで該薬剤と共投与されていない非ヒトトランスジェニック動物と比較して進行性が低いＡｐｏＬ１媒介性腎症は、該薬剤がＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させることができることを同定する。既に言及したように、非ヒトトランスジェニック動物において腎症を確立する様々な方法がある。一実施形態において、腎症はドキソルビシンの投与によって誘発される。別の実施形態において、腎症が、ヒト免疫不全ウイルスの一部を含む導入遺伝子を非ヒトトランスジェニック動物において発現させることによって誘発される。ＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させる薬剤の能力は、ヒトＡｐｏＬ１の１つ以上の変異体へのその結合に基づいてもよい。ある特定の実施形態において、薬剤は、ｉ）ＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体（配列番号０１）、ｉｉ）ＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のヒトＧ１変異体（配列番号０２）、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）、またはｉｖ）ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のヒトＧ１変異体およびＡｐｏＬ１のＧ２変異体に結合する。ある特定の実施形態において、薬剤は、抗体である。ある特定の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。ある特定の実施形態において、抗体は、完全長のＩｇＧ１抗体である。
【００５９】
本明細書において、さらに、腎症の動物モデルを生成するための方法が提供される。したがって、一態様において、ヒトＡｐｏＬ１を発現する非ヒトトランスジェニック動物において腎症を誘発することを含む、腎症の動物モデルを生成する方法が提供される。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は、上記の非ヒトトランスジェニック動物である。ある特定の実施形態において、腎症が、ヒト免疫不全ウイルスの一部を含む導入遺伝子を非ヒト動物において発現させることによって誘発される。ある特定の実施形態において、腎症はドキソルビシンの投与によって誘発される。ある特定の実施形態において、ドキソルビシンは、１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。ある特定の実施形態において、ドキソルビシンは、１５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。ある特定の実施形態において、ドキソルビシンは、２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。ある特定の実施形態において、ドキソルビシンは、２４ｍｇ／ｋｇ〜２６ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。ある特定の実施形態において、ドキソルビシンは、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。ある特定の実施形態において、ドキソルビシンは、２５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。測定ｍｇ／ｋｇは、動物の体重１ｋｇあたりｍｇで表した投与ドキソルビシンの質量を指す。ある特定の実施形態において、ドキソルビシンは複数回投与で投与される。ある特定の実施形態において、ドキソルビシンは単回投与で投与される。ある特定の実施形態において、ドキソルビシンは静脈内投与される。ある特定の実施形態において、ドキソルビシンは尾静脈内に投与される。
【００６０】
ドキソルビシンによる動物の処置は、脱水症状に繋がる。ある特定の実施形態において、脱水を防ぐために非ヒト動物を皮下の液体で毎日処置する。ある特定の実施形態において、皮下液体は０．５〜５ｍｌの容量で投与される。ある特定の実施形態において、皮下液体は１〜４ｍｌの容量で投与される。ある特定の実施形態において、皮下液体は１．５〜３ｍｌの容量で投与される。ある特定の実施形態において、皮下液体は２ｍｌの容量で投与される。ある特定の実施形態において、皮下液体は乳酸リンゲル液である。
【００６１】
Ｂ．例となる抗ＡｐｏＬ１抗体
ＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させるために、ＡｐｏＬ１に結合する抗体が生成される。したがって、一態様において、本発明はＡｐｏＬ１のヒトＧ０変異体（配列番号０１）およびＡｐｏＬ１のヒトＧ１変異体（配列番号０２）ならびにＡｐｏＬ１のＧ２変異体（配列番号０３）の一方または両方に結合する、単離抗体が提供される。ある特定の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。ある特定の実施形態において、抗体は、完全長のＩｇＧ１抗体である。ある特定の実施形態において、抗体はＡｐｏＬ１変異体の多量体化を阻止することができる。ある特定の実施形態において、抗体はヒトＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させることができる。ある特定の実施形態において、抗体は腎症の進行を減少させることができる。ある特定の実施形態において、腎症はＡｐｏＬ１媒介性腎症である。ある特定の実施形態において、ＡｐｏＬ１媒介性腎症が、ＨＩＶ関連腎症、巣状糸球体硬化症関連腎症、鎌状赤血球腎症、移植後の同種移植片喪失に関連する腎症、およびループス腎炎関連腎症からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＡｐｏＬ１媒介性腎症は高血圧関連腎症である。いくつかの実施形態において、ＡｐｏＬ１媒介性腎症は糖尿病性腎症である。
【００６２】
さらに、一態様において、本明細書に記載の抗体をコードする単離核酸が提供される。別の態様において、上述のような核酸を含む宿主細胞が提供される。別の態様において、前記抗体が産生されるように、上述の宿主細胞を培養することを含む、抗体の産生方法が提供される。さらに、一態様において、本明細書に説明される抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤を提供される。さらに、一態様において、薬として使用するための、本発明に記載の抗体が提供される。さらに、一態様において、薬の製造における、本発明に記載の抗体の使用が提供される。さらに、一態様において、本明細書に記載の抗体を個体に投与することにより腎症を有する個体を治療する方法が提供される。さらに、一態様において、対象における腎症の進行を減少させる方法であって、有効量の本明細書に記載の抗体を対象に投与することを含む方法が提供される。
【００６３】
本発明のさらなる態様において、上の実施形態のいずれかによる抗ＡｐｏＬ１抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一実施形態において、抗ＡｐｏＬ１抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態において、本抗体は、完全長の抗体、例えば、本明細書に定義される正常なＩｇＧ１抗体または他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【００６４】
さらなる態様において、上の実施形態のいずれかによる抗ＡｐｏＬ１抗体は、下の第１〜７節に記載される特長のうちのいずれをも、単独でまたは組み合わせて、組み込んでもよい。
【００６５】
１．抗体親和性
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の、解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００６６】
一実施形態において、Ｋｄは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施形態において、ＲＩＡは目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて行われる。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、標識化されていない抗原の滴定シリーズの存在下で、（１２５Ｉ）標識化抗原の最小濃度でＦａｂを平衡化することにより測定され、次いで、抗Ｆａｂ抗体コート板と結合した抗原を捕捉する（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイのための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍＬの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンにより、室温（およそ２３℃）で２〜５時間ブロッキングする。非吸着性の板（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）において、１００ｐＭまたは２６ｐＭ［１２５Ｉ］抗原は、目的のＦａｂの連続希釈液と混合される（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における、抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一致）。目的のＦａｂを次いで一晩インキュベートするが、インキュベーションは、平衡に到達することを確実にするために、より長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を、室温での（例えば、１時間）インキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いでこの溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したとき、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）γ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）により１０分間計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選定する。    
【００６７】
別の実施形態によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラスモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用したアッセイを使用して、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて行われる。一実施形態において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）により、供給業者の指示に従って活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）まで希釈した後、５μＬ／分の流速で注射して、カップリングされたタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成する。抗原の注射後、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応の基をブロッキングする。動態測定については、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、２５℃で、およそ２５μＬ／分の流速で注射する。会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合及び解離のセンサーグラムを同時に適合させることにより、単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して計算される。平衡状態解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。オン速度が、上の表面プラスモン共鳴アッセイによって、１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オン速度は、撹拌されたキュベットを備えるストップトフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００−シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計において測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭ抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する、蛍光消光技法を使用することによって、決定することができる。
【００６８】
２．抗体断片
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片、ならびに下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４  （２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、また、ＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【００６９】
ダイアボディは、二価性または二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【００７０】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６  Ｂ１号を参照されたい）。
【００７１】
抗体断片は、本明細書に記載される、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、ならびに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない、種々の技法によって作製することができる。
【００７２】
３．キメラおよびヒト化抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載される。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる実施例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のそれから変更された、「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体には、それらの抗原結合断片が含まれる。
【００７３】
特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的に、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはそれらの部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはそれらの部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。任意にヒト化抗体はまた、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元するまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【００７４】
ヒト化抗体およびそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に総説され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ）グラフティングを記述）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記述）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記述」）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）にさらに記載されている。    
【００７５】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３））を参照されたい、軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、およびＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８））、およびスクリーニングＦＲライブラリー由来のフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６））が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
４．ヒト抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【００７７】
ヒト抗体は、免疫原を、抗原投与に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を含むインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に投与することによって、調製されてもよい。かかる動物は典型的に、内因性免役グロブリン遺伝子座を置き換える、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体中に無作為に組み込まれる、ヒト免役グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含有する。かかるトランスジェニックマウスにおいて、内因性免役グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号、ならびにＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照されたい。かかる動物によって生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾されてもよい。
【００７８】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１））を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体もまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載される。さらなる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記述）およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記述）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２０（３）：９２７−９３７  （２００５）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載される。
【００７９】
ヒト抗体はまた、Ｆｖクローン可変ドメイン配列をヒト由来ファージディスプレイライブラリから単離することによって、生成されてもよい。かかる可変ドメイン配列は次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合わされてもよい。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技法が、下に記載される。
【００８０】
５．ライブラリ由来抗体
本発明の抗体は、コンビナトリアルライブラリを、所望の活性（単数または複数）を有する抗体についてスクリーニングすることによって、単離されてもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、かかるライブラリを、所望の結合特性を保有する抗体についてスクリーニングするための、多様な方法が当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に総説され、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）にさらに記載されている。
【００８１】
ある特定のファージディスプレイ法において、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリ中で無作為に組み換えられ、それを次いで、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載の通り、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的に、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片としてまたはＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫された源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ，  １２：７２５−７３４  （１９９３）によって記載されるように、ナイーブレパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）、いかなる免疫化も伴わずに、広範な非自己抗原およびまた自己抗原に対する抗体の単一の源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、再配列されていないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配列を遂行することによって、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、および同第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【００８２】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【００８３】
６．多重特異性抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。特定の実施形態において、結合特異性のうちの一方は、ＡｐｏＬ１に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、結合特異性のうちの一方は、ＡｐｏＬ１に対するものであり、第２の結合特異性は、ＡｐｏＬ１含有ＨＤＬ粒子のエンドサイトーシスを誘発する。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ＡｐｏＬ１の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。  
【００８４】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）を参照されたい）、国際公開第９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１））、ならびに「ノブインホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ−へテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体もしくは断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、二重特異性抗体を産生するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、および、例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるように、三重特異性抗体を調製することによって作製することができる。
【００８５】
「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、米国公開特許第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照されたい）。
【００８６】
本明細書における抗体または断片にはまた、ＡｐｏＬ１及び別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む、「二重作用（Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」が含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照されたい）。
【００８７】
７．抗体変異体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましいことがある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切な修飾を、抗体をコードするヌクレオチド配列中に導入することによって、またはペプチド合成によって、調製されてもよい。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、および／またはそこへ残基の挿入、および／またはその内の残基の置換が含まれる。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを作製して、最終構築物に到達することができるが、但し、その最終構築物が、所望の特性、例えば、抗原結合性を保有することを条件とする。    
【００８８】
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型突然変異生成に対する目的の部位には、ＨＶＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換は、表１において、「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表１において、「例となる置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して下にさらに記載される。アミノ酸置換が目的の抗体中に導入され、産物が、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについて、スクリーニングされてもよい。
【００８９】
【表１】
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【００９０】
アミノ酸は、次の一般的な側鎖特性に従って分類されてもよい：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００９１】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。
【００９２】
置換型変異体の１つの種類は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１個以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される、結果として生じる変異体（複数可）は、親抗体と比べて、ある特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、低減された免疫原性）を有することになり、および／または親抗体の、実質的に保持されたある特定の生物学的特性を有することになる。例となる置換型変異体は、例えば、本明細書に記載されるもの等のファージディスプレイベースの親和性成熟技法を使用して、好都合に生成され得る、親和性成熟抗体である。簡潔に述べると、１個以上のＨＶＲ残基が突然変異させられ、変異体抗体がファージ上で提示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【００９３】
変化（例えば、置換）をＨＶＲにおいて行って、例えば、抗体親和性を改善してもよい。そのような変化は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされた残基で（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、及び／または抗原と接触する残基で行うことができ、得られた変異体ＶＨまたはＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、そこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  （２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態において、多様性が、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性突然変異生成）のうちのいずれかによって、成熟のために選定された可変遺伝子中に導入される。二次ライブラリが次いで作り出される。ライブラリは次いで、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定するために、スクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、数個のＨＶＲ残基（例えば、１回に４〜６個の残基）が無作為化される、ＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異生成またはモデリングを使用して、具体的に特定されてもよい。特にＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的とされる。
【００９４】
ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる変化が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変化（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいて行われてもよい。かかる変化は、例えば、ＨＶＲの抗原接触残基の外側であり得る。上に提供される変異体ＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施形態において、各ＨＶＲは、変化させられないか、またはわずか１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含有するにすぎないかのいずれかである。    
【００９５】
突然変異生成のための標的とされ得る、抗体の残基または領域の特定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって記載される、「アラニンスキャニング変異生成」と呼ばれるものである。この方法において、標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ等の荷電残基）のうちのある残基または基が特定され、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体の抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の場所に導入されてもよい。代替的に、または追加的に、抗体と抗原との間の接触点を識別するための抗原−抗体複合体の結晶構造。かかる接触残基および隣接する残基は、置換の候補として標的とされるか、または排除されてもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定してもよい。
【００９６】
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの範囲の長さである、アミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一のまたは多数のアミノ酸残基の配列内（ｉｎｔｒａｓｅｑｕｅｎｃｅ）挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入型変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端もしくはＣ末端への融合が含まれる。
【００９７】
ｂ）グリコシル化変異体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変化させられる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、または除去されるように、アミノ酸配列を変化させることによって、好都合に遂行されてもよい。
【００９８】
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合した炭水化物が変化してもよい。哺乳類細胞によって産生される天然抗体は、典型的に、一般にＮ−結合によって、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される、分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖類には、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖類構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、ある特定の向上した特性を有する抗体変異体を作り出すために行われても良い。
【００９９】
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的にまたは間接的に）結合されるフコースを欠いた炭水化物構造を有する、抗体変異体が提供される。例えば、かかる抗体におけるフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であってもよい。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定するとき、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖鎖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、および高マンノース構造）の合計と比べた、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における小規模な配列変異に起因して、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４位〜３００位の間にも位置する。かかるフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８  Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、および国際公開第２００４／０５６３１２  Ａ１号、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、特に実施例１１）、およびノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、および国際公開第２００３／０８５１０７号）が含まれる。
【０１００】
二分されたオリゴ糖類を有する、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖類がＧｌｃＮＡｃによって二分される、抗体変異体がさらに提供される。かかる抗体変異体は、低減されたフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）、および米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖類において少なくとも１個のガラクトース残基を有する、抗体変異体もまた提供される。かかる抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、およびＷＯ１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１０１】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによってＦｃ領域変異体を生成してもよい。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含んでもよい。
【０１０２】
ある特定の実施形態において、本発明は、いくつかのエフェクター機能を保有するが、全てのエフェクター機能は保有せず、それにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、なおもある特定のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣ等）が不必要または有害である場合の適用に対する望ましい候補となる、抗体変異体を企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害性アッセイを実行して、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃＲ結合を欠いている（よって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページ、表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。代替的に、非放射アッセイ法が用いられてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６  （１９９８）に開示されるもの等の動物モデルにおいて、評価されてもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイをまた行って、抗体がＣ１ｑに結合不可能であり、よってＣＤＣ活性を欠いていることを確認してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を査定するために、ＣＤＣアッセイを行っても良い（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２���３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の判定も、当該技術分野で既知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。
【０１０３】
エフェクター機能が減少した抗体には、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ突然変異体には、アラニンへの残基２６５および２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７、および３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる。
【０１０４】
ＦｃＲへの改善されたまたは減少した結合を有する、ある特定の抗体変異体が記載される。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。）
【０１０５】
ある特定の実施形態において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位（残基のＥＵ付番）における置換を有する、Ｆｃ領域を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、Ｆｃ領域に、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に変化（すなわち、改善または減少のいずれか）をもたらす、変化がなされる。
【０１０７】
増加した半減期を持ち、胎児への母体ＩｇＧの移動を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合性を向上させる１つ以上の置換を中に有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を有するものが含まれる。
【０１０８】
また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、および国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
【０１０９】
ｄ）システイン操作された抗体変異体
ある特定の実施形態において、抗体の１個以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「チオＭａｂ」を作り出すことが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換残基は、抗体の利用しやすい部位において生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基はそれによって、抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、抗体を、薬物部分またはリンカー−薬物部分等の他の部分に複合して、本明細書にさらに記載される、免疫複合体を作り出してもよい。ある特定の実施形態において、次の残基のうちの任意の１個以上が、システインで置換されてもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ付番）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）、および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
【０１１０】
ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐していても非分岐であってもよい。抗体に結合したポリマーの数は、様々であってもよく、１つを超えるポリマーが結合される場合、それらは、同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、改善対象の抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で療法において使用されるかどうか等を含むが、これらに限定されない考慮に基づいて、決定することができる。
【０１１１】
別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る、抗体および非タンパク質性部分の複合体が提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであってもよく、一般の細胞を害さないが、非タンパク質性部分を、抗体−非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅させられる温度まで加熱する波長が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
Ａ．組み換え法および組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるように、組換え方法および組成物を用いて産生することができる。一実施形態において、本明細書に記載される抗ＡｐｏＬ１抗体をコードする単離核酸が提供される。かかる核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードし得る。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのかかる実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらで形質転換されている）。一実施形態において、宿主細胞は、真核性、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗ＡｐｏＬ１抗体を作製する方法が提供され、本方法は、該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意で、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む。
【０１１３】
抗ＡｐｏＬ１抗体の組み換え産生のために、例えば、上述のものなどの、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。かかる核酸は、慣例の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能である、オリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。
【０１１４】
抗体コードベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌において産生されてもよい。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、および第５，８４０，５２３号を参照されたい。（また、大腸菌における抗体断片の発現を説明している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい。）発現後、抗体は、可溶性画分において細菌細胞ペーストから単離されてもよく、またさらに精製することができる。
【０１１５】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物は、抗体コードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、それには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌および酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）およびＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。
【０１１６】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、使用され得る、多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０１１７】
植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる。米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号を参照されたい（遺伝子組換え植物内で抗体を作製するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載する）。
【０１１８】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合される哺乳類細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３もしくは２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ  ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＹ０、ＮＳ０、およびＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適したある種の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【０１１９】
Ｃ．アッセイ
本明細書に提供される抗ＡｐｏＬ１抗体は、それらの物理／化学特性及び／または生物活性について、当該技術分野で既知の種々のアッセイによって、同定され、スクリーニングされ、または特徴付けられてもよい。
【０１２０】
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等の公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。別の態様において、競合アッセイを使用して、ＡｐｏＬ１への結合について本明細書に記載される抗体と競合する抗体を同定してもよい。ある特定の実施形態において、かかる競合抗体は、本明細書に記載される抗体によって結合される、同じエピトープ（例えば、直線状または立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ  ＭａｐｐｉｎｇＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。
【０１２１】
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＡｐｏＬ１は、ＡｐｏＬ１に結合する第１の標識抗体（例えば、本明細書に記載される抗体）、及びＡｐｏＬ１への結合について第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化されたＡｐｏＬ１が、第１の標識抗体を含むが、第２の未標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。ＡｐｏＬ１に第１の抗体が結合することを許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な非結合抗体が除去され、固定化されたＡｐｏＬ１に関連する標識の量が測定される。固定化されたＡｐｏＬ１に関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低減される場合、それは、第２の抗体がＡｐｏＬ１への結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
【０１２２】
２．活性アッセイ
一態様において、生物学的活性を有するその抗ＡｐｏＬ１抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、ＡｐｏＬ１への結合、それによりＡｐｏＬ１の血清濃度を減少させること、及び／またはＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させることを含み得る。インビボ及び／またはインビトロでそのような生物活性を有する抗体もまた提供される。
【０１２３】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、かかる生物活性に関して試験される。ある特定の実施形態において、ＡｐｏＬ１のトリパノソーム活性を低下させる抗体のスクリーニングが行われる。ある特定の実施形態において、有足細胞毒性のインビトロモデルにおいてＡｐｏＬ１の毒性を低下させる抗体のスクリーニングが行われる。ある特定の実施形態において、アッセイは、実施例に記載されるように使用される。  
【０１２４】
Ｄ．医薬製剤
本明細書に記載されるＡｐｏＬ１抗体または免疫複合体の医薬製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有するかかる抗体または免疫複合体を、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投薬量および濃度で、受容者に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム等；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免役グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート薬剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、例えば、介在性（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）が更に含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わされる。
【０１２５】
例となる凍結乾燥抗体は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載される。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号および国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１２６】
本明細書における製剤はまた、治療されている特定の適応症に対する必要に応じて、１つを超える活性成分、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有する成分を含有してもよい。例えば、ケアの基準をさらに提供することが望ましい場合がある。このような活性成分は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０１２７】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製される、マイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルション中の、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中に、封入されてもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される。
【０１２８】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、そのマトリクスは、造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。
【０１２９】
インビボ投与のために使用されるべき製剤は、一般に滅菌されている。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過によって、容易に遂行され得る。
【０１３０】
Ｅ．治療方法および組成物
本明細書に提供される抗ＡｐｏＬ１抗体のいずれも、治療方法において使用され得る。
【０１３１】
一態様において、薬として使用するための抗ＡｐｏＬ１抗体が提供される。さらなる態様において、腎症の治療に使用するための抗ＡｐｏＬ１抗体が提供される。ある特定の実施形態において、治療方法において使用するための抗ＡｐｏＬ１抗体が提供される。ある特定の実施形態において、本発明は、個体に、有効量の抗ＡｐｏＬ１抗体を投与することを含む、腎症を有する個体を治療する方法において使用するための抗ＡｐｏＬ１抗体を提供する。１つのかかる実施形態において、本方法は、個体に、例えば、下に記載される、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、本発明はＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させる及び／またはＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させるのに使用するための抗ＡｐｏＬ１抗体を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、ＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させるおよび／またはＡｐｏＬ１介在性腎症の進行を減少させるために有効量の抗ＡｐｏＬ１抗体を個体に投与することを含む、個体におけるＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させる方法および／またはＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させる方法における使用のための抗ＡｐｏＬ１抗体を提供する。上の実施形態のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
【０１３２】
さらなる態様において、本発明は、薬の製造または調製における、抗ＡｐｏＬ１抗体の使用を提供する。一実施形態において、薬は、腎症を治療するためのものである。さらなる実施形態において、薬は、腎症を治療する方法において使用するためのものであり、本方法は、腎症を有する個体に、有効量の薬を投与することを含む。１つのかかる実施形態において、本方法は、個体に、例えば、下に記載される、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、薬はＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させるため及び／またはＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させるためのものである。さらなる実施形態において、薬は、ＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させるおよび／またはＡｐｏＬ１介在性腎症の進行を減少させるために有効量の薬を個体に投与することを含む、個体におけるＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させる方法および／またはＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させる方法における使用のためである。上の実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
【０１３３】
さらなる態様において、本発明は、腎症を治療するための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、かかる腎症を有する個体に、有効量の抗ＡｐｏＬ１抗体を投与することを含む。１つのかかる実施形態において、本方法は、個体に、下に記載されるような、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。上の実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。  
【０１３４】
さらなる態様において、本発明は個体におけるＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させる及び／またはＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させる方法を提供する。一実施形態において、方法は、個体に有効量の抗ＡｐｏＬ１抗体を投与しＡｐｏＬ１の血清濃度を低下させ、及び／またはＡｐｏＬ１媒介性腎症の進行を減少させることを含む。一実施形態において、「個体」は、ヒトである。
【０１３５】
さらなる態様において、本発明は、例えば、上記治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗ＡｐｏＬ１抗体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施形態において、医薬製剤は、本明細書に提供される抗ＡｐｏＬ１抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む。別の実施形態において、医薬製剤は、本明細書に提供される抗ＡｐｏＬ１抗体のいずれかと、例えば、以下に記載される少なくとも１つの追加の治療剤と、を含む。
【０１３６】
本発明の抗体は、治療法において、単独で、または他の薬剤と組み合わせてのいずれかで使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。
【０１３７】
上述のかかる併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別個の製剤中に含まれる）、および別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤（複数可）の投与の前、それと同時、及び／またはその後に生じ得る。一実施形態において、抗ＡｐｏＬ１抗体の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに約１か月以内、または約１週間、２週間、若しくは３週間以内、または約１日、２日、３日、４日、５日、若しくは６日以内に発生する。
【０１３８】
本発明の抗体（および任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内および鼻腔内を含む任意の適切な手段によって、および必要に応じて局所治療のために病巣内投与によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、任意の好適な経路による、例えば、投与が短時間であるか慢性的であるかに部分的に応じて、静脈内または皮下注射等の、注射によるものであり得る。単回または種々の時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない、種々の投薬スケジュールが本明細書で企図される。
【０１３９】
本発明の抗体は、良好な医療行為と一致した様式で、製剤化され、投薬され、投与されるであろう。この文脈における考慮の要因には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、および医療従事者に既知の他の要因が含まれる。抗体は、必要ではないが、任意で、問題の障害を予防または治療するために現在使用される１つ以上の薬剤と共に製剤化される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、および上に考察された他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投薬量で、本明細書に記載される投与経路により、または本明細書に記載される投薬量の約１〜９９％、または適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投薬量で、任意の経路によって、使用される。
【０１４０】
疾患の予防または治療のために、本発明の抗体の適切な投薬量（単独でまたは１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用されるとき）は、治療対象の疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療法、患者の病歴および抗体への反応、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。抗体は、患者に、１回で、または一連の治療にわたって、好適に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によってであれ、連続注入によってであれ、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者への投与のための初回の候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。病態に応じて数日間またはより長い日数にわたる反復投与について、治療は、一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内となる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（若しくはこれらの任意の組み合わせ）の１回以上の用量が患者に投与され得る。かかる用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間毎に（例えば、患者が抗体の約２〜約２０回、または例えば、約６回用量を受容するように）投与されてもよい。初回よりも高い負荷用量、続いて１回以上のより低い用量が投与されてもよい。この治療法の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易に監視される。
【０１４１】
上記製剤または治療方法のうちのいずれも、抗ＡｐｏＬ１抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫複合体を使用して行われ得ることが理解される。
【０１４２】
Ｆ．製品
本発明の別の態様において、上述の障害の治療、予防、及び／または診断に有用な物質を含有する製品が提供される。製品は、容器、および容器上のまたは容器と関連したラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静脈注射用溶液バッグなどが挙げられる。容器は、組成物を、それ自体で、または病態を治療する、予防する、及び／もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保有し、また滅菌アクセスポートを有し得る（例えば容器は、静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性な薬剤は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選定した病態を治療するために使用されることを表示する。さらに、製品は、（ａ）組成物がその中に含有された第１の容器を含み、この組成物は本発明の抗体を含み、及び（ｂ）組成物がその中に含有された第２の容器を含み、この組成物はさらなる細胞傷害性薬剤または治療剤を含んでもよい。本発明のこの実施形態の製品は、組成物が特定の病態を治療するために使用され得ることを表示する、添付文書をさらに含んでもよい。代替または追加として、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液といった、薬学的に許容される緩衝液を含む第２（または第３）の容器を更に含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザの立場から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０１４３】
上記の製品のうちのいずれも、抗ＡｐｏＬ１抗体の代わりに、またはそれに加えて本発明の免疫複合体を含んで良いことが理解される。
【実施例】
【０１４４】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供される一般的説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０１４５】
倫理
全動物をジェネンテック社実験動物飼育使用委員会により認可されたプロトコールに従って取り扱った。カリフォルニア州法及び動物ケア倫理基準に従ってジェネンテック社隔離施設においてマウスコロニーを飼育した。
【０１４６】
実施例１：ＡＰＯＬ１トランスジェニックマウスの生成及び遺伝子型
腎疾患進行におけるアポリポタンパク質Ｌ１（ＡｐｏＬ１）の役割を確認するため、発明者らは、ヒトＡｐｏＬ１遺伝子を含むバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）の４４ｋｂ部分を使用して、３系統のＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ならびにトリパノソーマ感染症耐性を提供し、アフリカ人口における腎疾患リスクを増大する２種の共通配列変異体（Ｇ１、Ｇ２）を発現するトランスジェニックマウスを生成した（Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｋｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１４７】
トランスジーンの生成
ヒトＡＰＯＬ１遺伝子（ＲＰ１１−８２６Ｐ１３）を含むＢＡＣ（バクテリア人工染色体）を確立されたリコンビニアリング法及びＷａｒｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００５，ｖ３３，ｅ３６に殆ど記載されているｇａｌｋポジティブと対抗選択を用いて修飾した。ＳＷ１０２  Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換後及び各修飾工程後に、ＢＡＣ  ＤＮＡをＳｐｅＩ切断ＢＡＣミニプレップＤＮＡを用いてフィンガープリント法により特徴付けた。ポジティブとネガティブ選択の両方のためのデュアルステップカセットをブルーヘロンバイオテック／オリジーン社にて合成した。各カセットは修飾のいずれかの側に約２００ｂｐのホモロジーを有する。ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ部位を用いてｇａｌＫ選択の挿入を可能にするように設計して、ＢＡＣ修飾及びＢｆｕＡＩ  ＩＩｓ型制限酵素を用いた続く継ぎ目のないｇａｌＫ除去のためのポジティブ選択カセットを生成し、次いでセルフライゲーションしてＢＡＣ修飾のための対抗選択カセットを生成した。ターゲティングカセットをＮｏｔＩ切断によりｐＵＣベクターバックボーンから遊離した。この試験で使用した２つのカセットの配列を表２に示す（Ａｓｃｌ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩ、及びＢｆＵＡＩの認識配列（ＩＩｓ型酵素の上鎖または下鎖）に下線を引いている；Ｇ１カセットでは、２つのＧ１変異（Ｓ３４２Ｇ及びＩ３８４Ｍ）をコードするＤＮＡ変化を太字にしている）。
【０１４８】
Ｇ２変異はアミノ酸Ｎ３８８及びＹ３８９（塩基対ＡＡＴＴＡＴ）の欠失である。Ｇ１変異は２つの置換、Ｓ３４２Ｇ及びＩ３８４Ｍ（それぞれ、ＡＧＣからＧＧＣへ、及びＡＴＴからＡＴＧへ）から成る。ＢＡＣからｇａｌＫカセット除去後、ＡＰＯＬ１  ＢＡＣの修飾ゲノム領域を、リコンビニアリング法を用いてｐＢＲ３２２中にリトリーブ（サブクローニング）して４４ｋｂトランスジーンを生成した。加えて、コントロールトランスジーン（ｗｔ）を未修飾ＡＰＯＬ１  ＢＡＣからリトリーブして生成した。トランスジーンをＮｏｔＩ切断により線状化し、精製し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス株の接合体中にマイクロインジェクトして、確立された方法を用いてトランスジェニックマウスを生成した。それぞれ、ＡｐｏＬ１  ｗｔ、Ｇ１及びＧ２のトランスジーンの概略図を図１Ａ〜Ｃに示す。マウスをＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドで飼育した。
【０１４９】
【表２】
2018500882.tif 000003
2018500882.tif 000004
【０１５０】
マウスの遺伝子型解析
標準的ＰＣＲまたはタクマン（Ｔａｑｍａｎ）解析によりＡｐｏＬ１トランスジェニックマウスの遺伝子型解析を行った。ＡｐｏＬ１のＧ０変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体の遺伝子型解析は、標準ＰＣＲ及びＡｐｏＬ１（フォワード５’−ＴＴＴＣＴＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＴＡＧ−３’（配列番号０８）及びリバース５’−ＡＴＡＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴ−３’（配列番号０９））に対するプライマーならびにＴａｃｉ（フォワード５’−ＴＧＧＧＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１０）及びリバース５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＧＣＧＣＡＧＧＡＣ−３’（配列番号１１）に対するインターナルコントロールを使用する。反応条件は９４℃、４分、次いで９４℃、６０秒（変性）、５５℃、３０秒（アニーリング）及び７２℃、１分（伸長）で３０サイクルである。Ｔｙｐｅ−ｉｔ  Ｆａｓｔ  ＳＮＰ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（キアゲン社、ＰＮ２０６０４２）、各プライマー０．５μＭ及びプローブ（アプライドバイオシステムズ社）０．１５μＭを用いてＡｐｏＬ１のＧ１変異体のため、タグマン（ｔａｇｍａｎ）アッセイを使用する。ＡｐｏＬ１は、フォワードプライマー５’−ＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号：１２）、リバースプライマー５’−ＴＧＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号：１３））、及びプローブ５’−６ＦＡＭ− ＡＧＣＴＡＡＡＣＡＴＧＣＴＣＡＡＣ−ＮＦＱ−ＭＧＢ−３’（配列番号１４）を使用する。Ａｐｏに対するポジティブコントロールは、フォワ−ドプライマ−５’−ＣＡＣＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＡＴＴ−３’（配列番号１５）、リバースプライマー５’ＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＧ−３’（配列番号１６）、及びプローブ５’−ＶＩＣ−ＣＣＡＡＴＧＧＴＣＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＣＡＡ−３’（配列番号１７）を使用する。反応条件は９４℃、４分、次いで９４℃、６０秒（変性）、５５℃、３０秒（アニーリング）及び７２℃、１分（伸長）で３５サイクルである。ＦＡＭ及びＶＩＣプローブを用いたエンドポイントＰＣＲをＡＢ７９００（アプライドバイオシステムズ社）で読み、クラスタープロットから アレルを識別する。
【０１５１】
実施例２：トランスジェニックマウス及びヒトの血清学的ＡｐｏＬ１の分析
血清の主要リポタンパク質分類を分別する密度勾配遠心分離法
１．００６、１．０１９、１．０６３及び１．２４ｇ／ｍｌの密度を有するＫＢｒ／ＮａＣｌ溶液をＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に従って製造した。全塩溶液はＮａＮ３０．１％及びＥＤＴＡ０．０４％を含有した。Ｄｅｎｓｉｔｏ  ３０ＰＸ密度計（メトラー・トレド社）を用いて２５℃で密度を確認した。１．２１ｇ／ｍｌの密度を有する希釈血清溶液を、血清０．２８４ｍｌ及びＨ２Ｏ  ２．５５６ｍｌにＫＢｒ  ０．９２３ｇを添加して最終体積３ｍｌにすることにより製造した。密度勾配管を蠕動ポンプを用いてＣｈａｐｍａｎ  ＭＪらに従って調製し充填した（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１Ｔｉローター、４０，０００ｒｐｍ、＞４８時間、１５℃で遠心分離を行った。蠕動ポンプを用いて１ｍｌ体積中にフラクションを集めてから、一夜４℃でトリス緩衝液（ＥＤＴＡ  ０．０４％、トリス５ｍＭ及びＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ  ７．４）に対して透析した。ウエスタンブロット法については、ＡｐｏＬ１（プロテインテック社、１１４８６−２−ＡＰ）、ＡｐｏＡ１（ロックランド社、６００−１０１−１９６）、及びＩｇＧ（ＧＥ社、ＮＡ９３１Ｖ）に対して特異的な抗体を用いた４〜２０％トリス−グリシンゲルプローブ上にロードした。ＥＣＬプライム（ＧＥヘルスケア社）を用いて免疫反応性を検出した。
【０１５２】
ＡｐｏＬ１  ＥＬＩＳＡ
ＡｐｏＬ１サンドイッチＥＬＩＳＡを次のように展開した：抗ＡｐｏＬ１ポリクローナル抗体（プロテインテック社、１１４８６−２−ＡＰ）０．５μｇ／ｍｌを炭酸／重炭酸緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３  １．５９ｇ、ＮａＨＣＯ３  ２．９３ｇ、水適量で１Ｌに調製）中、一夜４℃でマキシソープ（登録商標）プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、４６４７１８）上に塗布した。ツイーン２０を０．０５％含有するトリス緩衝生理食塩水中、塗布プレートを５％牛乳で遮断した。アッセイ標準曲線を作成するため、ＯＤ２８０においてその濃度を測定した精製ＡｐｏＬ１タンパク質を、マジック緩衝液（ＢＳＡ  ０．５％、ツイーン２０  ０．０５％、ＥＤＴＡ  ５ｍＭ、ｐＨ８、ＣＨＡＰＳ  ０．２５％、ＢｇＧ  ０．２％、ＰＢＳ中のプロクリン  １５ｐｐｍ）で希釈し、１０％マウス血清（インビトロジェン社、１０４１０）を添加した。その後、４×段階希釈法を行って、１０μｇ／ｍｌ〜０．１５３ｎｇ／ｍｌの範囲の標準曲線を得た。実験血清試料をマジック緩衝液中１：１０に希釈した。その後、プレ塗布及びプレ遮断したプレートを、標準曲線か実験試料のいずれか、ヒトＡＰＯＬ１アイソフォーム１（ジェネンテック社において生成及び精製）のアミノ酸６１〜３９８含有組換え融合タンパク質を用いてウサギ内で生じたＡｐｏＬ１のＧ０変異体に対するビオチン化抗体０．５μｇ／ｍｌ、及び１：１０，０００の過酸化物結合ストレプトアビジン（ＧＥ社、ＲＰＮ４４０１Ｖ）と一緒にインキュベートした。ツイーン２０  ０．０５％含有リン酸緩衝生理食塩水を用いて４０５（商標）マイクロプレートウォッシャー（バイオテック社）で各インキュベーション工程間に、プレートを洗浄した。比色分析ＢｉｏＦＸ（登録商標）ＴＭＢ基質（サーモディクス社、ＴＭＢＳ１０００−０１）を用いて検出し、１Ｍリン酸で停止して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０分光計（モレキュラーデバイス社）で読み取った。
【０１５３】
分別試験及びＥＬＩＳＡにおけるトランスジェニックマウス及びヒトの血清学的ＡｐｏＬ１の比較
トランスジェニックマウスの血清学的ＡｐｏＬ１がヒトＡｐｏＬ１と同様にＨＤＬ粒子と会合するか確認するために、ヒト血清（図２Ａ）から主要リポタンパク質分類を分別し、上記密度勾配遠心分離法を用いてトランスジェニック血清（図２Ｅ）と比較した。本発明者らは、ＡｐｏＡ１がヒト血清（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）から期待された通り正確に分別して、この方法が上手くいくことを示していることを見出した。バンドＩＶ及びＩＦ−ｃ（フラクション７、８及び９）中、ＨＤＬ３として主に存在し；少量はバンドＩＩＩ（フラクション６）中、ＨＤＬ２として存在し；有意量はＶＨＤＬ（フラクション９及び１０）としてＩＦ−ｄ中に見られ；ＡｐｏＡ１はＩｇＧ（フラクション１１及び１２）などの遊離タンパク質と一緒にペレット状である（図２Ｃ、Ｄ）。ヒト血清中のＡｐｏＬ１はＡｐｏＡ１が存在するフラクションのサブセット中に存在する。少量はバンドＩＶ及びＩＦ−ｃ（フラクション８及び９）中ＨＤＬ３として存在するが、大部分はＩＦ−ｄ及びバンドＶ（フラクション９及び１０）中ＶＨＤＬとして、ならびにバンドＶ及びペレット（フラクション１１、１２）中遊離タンパク質として存在する（図２Ｂ、Ｄ）。ヒトアポリポタンパク質と一致して、トランスジェニックマウスの血清のＡｐｏＡ１はバンドＩＩＩ及びＩＶ（フラクション６、７、８及び９）中ＨＤＬ２及びＨＤＬ３として存在するが、比較的少量のものはＩＦ−ｄ（フラクション１０）中ＶＨＤＬとして、及びＩｇＧ（フラクション１２）などの非結合性タンパク質と一緒に存在する（図２Ｇ、Ｈ）。トランスジェニックマウスのＡｐｏＬ１はバンドＩＶ（フラクション８及び９）及びＶＨＤＬ（ＩＦ−ｄ、フラクション１０）中ＨＤＬ３として主に存在するが、比較的少量のものは同様にＡｐｏＬ１のＧ０変異体とＡｐｏＬ１のＧ２変異体の両方に脂質付加していないタンパク質（フラクション１１）と一緒にバンドＶ中に存在する（図２Ｆ）。トランスジェニック系統の両方からのＡｐｏＬ１及びＡｐｏＡ１は同様に分別する。
【０１５４】
本発明者らのトランスジェニックマウス系統がヒトと同様にＡｐｏＬ１の濃縮物を発現するかどうかを決定するために、トランスジェニックマウス内の循環ＡｐｏＬ１値を定量化して、上記のように社内で開発した特定のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてヒト血清学的ＡｐｏＬ１と比較した。本発明者らは、アフリカ系アメリカ人ドナーのヒト血清をＡｐｏＬ１のＧ０変異体またはＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するマウス及びトランスジェニックネガティブ同腹仔コントロールと比較した。他者が循環ＡｐｏＬ１濃度が３８６〜１５，７４３ｎｇ／ｍｌの範囲であることを報告している（Ｄｕｃｈａｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）が、本発明者らはＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現する動物の血清中のＡｐｏＬ１が５３〜７０ｎｇ／ｍｌ（±１０）であり、Ｇ２変異体を発現する動物中の濃度は９３〜１１７（±１４）であり、ヒト血清中のＡｐｏＬ１は９９〜１２５（±３２）であることを見出している。各血清の範囲は図３に示しており、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（図３Ａ）かＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図３Ｂ）のいずれかと標準曲線の使用を反映している。結論として、本発明者らは、分別試験及びＥＬＩＳＡにおいて、トランスジェニックマウス内の血清学的ＡｐｏＬ１がヒトＡｐｏＬ１と同様に挙動することを見出した。
【０１５５】
実施例３：トランスジェニックマウスにおけるＡｐｏＬ１の発現
定量的ＰＣＲ
成体マウス（ＲＮｅａｓｙキット、キアゲン社）の臓器から全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ処理（キアゲン社）を含めた。ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、アプライドバイオシステムズ社から購入したプライマー／プローブセットを用いてＡｐｏＬ１及びｍＧａｐｄＨについて定量ＰＣＲを行った。
【０１５６】
ウエスタンブロット法
ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ社）及びｃＤＮＡを用いて製造者説明書に従ってＣＨＯ．Ｋ１細胞をＡｐｏＬ１（ＤＮＡ３７００８１、ＮＭ_００３６６１）及びＡｐｏＬ２（ＤＮＡ３６９８４３、ＮＭ_１４５６３７）（オリジーン社）に一過性トランスフェクトを行った。細胞を迅速にＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液プラスプロテアーゼインヒビターカクテル中に直ちに溶解した。分散組織ライセートについては、キシラジン（１ｍｇ／ｍｌ）とケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）とのカクテルを体重２０〜３０ｇ当たり０．１〜０．２ｍｌ腹腔内投与して麻酔し、心臓を通してリン酸緩衝生理食塩水４０ｍｌをかん流した。肝臓及び肺を取り出し、１ｍｍ３片に細かく刻み、ＨＢＳＳ中にホモジナイズし、ペレット化してＲＩＰＡ緩衝液プラスプロテアーゼインヒビターカクテル中に溶解した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬（ピアス社）を用いて、タンパク質濃度を決定した。有足細胞または組織ホモジネート３０μｇ、過剰発現ライセート１５μｇ、及びＡｐｏＬ１トランスジェニックマウス血清またはヒト血清０．１μｌを、各レーンにロードし、４〜２０％トリス−グリシンまたは４〜１２％ビス−トリスドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動法により分離した。タンパク質をニトロセルロース膜（インビトロジェン社）に移動した。ブロットを、ＰＢＳ中の５％牛乳中、０．０５％ツイーン２０で停止してから、ＡｐｏＬ１抗体（シグマアルドリッチ社、ＨＰＡ０１８８８５、１：５００、またはプロテインテック社、１１４８６−２ＡＰ、１μｇ／ｍｌ）でプローブした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体で一次抗体を化学発光検出し、次いでＥＣＬ−ｐｒｉｍｅ試薬（ＧＥ社）で可視化することによりシグナルを検出した。
【０１５７】
有足細胞培養及び分化
条件的不死化ヒトＳＶ４０ｔｓＡ５８Ｔ／ｈＴＥＲＴ有足細胞セルラインをブリストル大学（英国、ブリストル）から得た。未分化有足細胞を、１０％ＦＢＳ（シグマ社）及びインスリン−トランスフェリン−セレニウム（インビトロジェン社）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中、増殖のために３３℃で保持した。Ｓａｌｅｅｍ  ｅｔ  ａｌ（Ｓａｌｅｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）に記載されている通り、要するに、未分化有足細胞を４０〜６０％コンフルエントで３７℃まで温度スイッチし、さらに１４日間それを維持し、週に３回培地を変えることにより、有足細胞の分化を行った。
【０１５８】
定量ＰＣＲ及びウエスタンブロット解析を用いたＡｐｏＬ１発現の決定
ＡｐｏＬ１を発現するトランスジェニックマウスがヒトと同様なパターンの遺伝子発現を有するのか否かを決定するために、本発明者らは、ＡｐｏＬ１を高発現すると報告されているいくつかの臓器、すなわち、腎臓、肺及び肝臓に対して上記のように定量ＰＣＲを行った（Ｇｅｎｅｃａｒｄｓ，ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）。本発明者らのデータは、トランスジェニックマウス内の発現がヒト発現パターンと一致することを示している。全腎臓内で比較的少ない発現であるが、肝臓内で最大の発現（腎臓の８８倍）及び肺（腎臓の１０倍）である（図４Ａ−１、Ａ−２）。循環ＡｐｏＬ１を除去するためＰＢＳでかん流したマウスからの肺及び肝臓ライセートのウエスタン解析（上記の通り）は、発現されたタンパク質が遺伝子発現データと相関があることを示している。ヒトＡＰＯＬ１アイソフォーム１のＮ末端２３８アミノ酸含有組換え融合タンパク質を用いてウサギに免疫して得たポリクローナル抗体（プロテインテック社、１１４８６−２ＡＰ）を用いてＡｐｏＬ１を検出した（図４Ｂ）。ウサギポリクローナル抗体（シグマ社、ＨＰＡ０１８８８５）を用いて、未分化または分化ヒト培養有足細胞中、及びＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するトランスジェニックマウスの血清中でＡｐｏＬ１を検出した。ＣＨＯ−１Ｋ細胞内のＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ２、またはコントロール一過性トランスフェクションのライセートは、ＡｐｏＬ１及びＡｐｏＬ２の両方がシグマ抗体で検出されることを示している（図４Ｃ）。
【０１５９】
実施例４：
薬剤性腎症
２０〜２５ｇの体重で８〜１２週齢の雄マウスを得た。ドキソルビシン（温ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌに再懸濁；シグマ社Ｄ１５１５）を各非麻酔マウスの尾静脈から１回注射した。同齢雄マウスに同体積のリン酸緩衝生理食塩水を注射した。全コントロール及び実験マウスを個別に収容し、毎日２ｍｌの乳酸加リンゲル液（バクスター社）を水分補給させた。各動物の自然に排泄された尿から週毎にタンパク尿を評価した。標準品としてマウスアルブミン（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により尿中アルブミンを測定し、比色アッセイ（エンゾライフサイエンス社）により測定したクレアチニンに対して正規化した。２１日目で、動物の体重を量り、安楽死させて組織診断のために腎臓を得た。
【０１６０】
免疫組織化学解析
全ての組織学的解析のため、マウスを、結果をもたらすＣＯ２吸入により殺処分し、腎臓を直ちに解剖して取り出し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドに浸漬することにより固定し、矢状に切断してパラフィン切片処理した。３μｍの切片に対して標準プロトコールに従って退行性ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。
【０１６１】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
組織を、１／２強度のカルノフスキー固定液（２％パラホルムアルデヒド及び０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒド、ｐＨ  ７．２）中で固定し、同緩衝液で洗浄し、１％四酸化オスミウム水溶液中で１時間、後固定した。それから、試料を一連のエタノール、次いで、酸化プロピレンにより脱水し、Ｅｐｏｎａｔｅ  １２（テッドペラ社）中に包埋した。ミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｅ；ライヘルト社）で薄切片を切り出し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色し、顕微鏡（ＣＭ１２；フィリップス社）で検査した。レトラクタブルデジタルカメラ（マルチスキャン；ガタン社）を用いて画像をキャプチャーした。
【０１６２】
ＡｐｏＬ１は、マウスモデルの腎疾患の進行を促進する。
ＡｐｏＬ１発現単独で末期腎疾患（ＥＳＲＤ）に対して進行を誘導しない。２５週齢まで、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体またはＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するトランスジェニックマウスで尿タンパク値は正常であり、クレアチニンに対するアルブミンの比は５の値より低くなる（アルブミン濃度をクレアチニン値に対して正規化する；遺伝子型当たりｎ＝３〜９及び平均は±ＳＥＭ；図５）。ドキソルビシン誘導腎症は有足細胞傷害、次いで、糸球体硬化症、尿細管間質炎及び線維症により特徴付けられる慢性腎疾患の確立したげっ歯類モデルである（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，２０１１）。したがって、本発明者らは、本発明者らの上記トランスジェニックモデルにおいて薬剤的に腎症を誘導した。一連の先行実験では、本発明者らは、８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに１回の尾静脈注射によりドキソルビシンを投与した。体重当たり１２、または１５ｍｇ／ｋｇの投与では、尿タンパク（クレアチニンに対するアルブミンの比は５以上１５以下の範囲である）に対する効果はなく（図６）、腎臓の組織学的検査はドキソルビシン治療マウス及びＰＢＳで治療した同腹仔コントロールで識別不能である（データ示さず）。２０ｍｇ／ｋｇの中位の投与は１１日目までタンパク尿を引き起こすが、ＡｐｏＬ１の存在は効果がない（図６）。
【０１６３】
２５ｍｇ／ｋｇドキソルビシンの単回注射後、ドキソルビシンで治療した全てのマウスにおいて２日目まで尿タンパクは急激に上昇したが、遺伝子型間に有意差はなかった（図７Ａ）。Ｈ＆Ｅ染色腎組織はいろいろな腎症の表現型を示している。ドキソルビシン（図７Ｂ）またはＰＢＳ（図７Ｃ）で治療したトランスジェニックネガティブ動物は識別不可能であり、腎症を示さない。しかしながら、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（図７Ｄ）またはＡｐｏＬ１のＧ２変異体（図７Ｆ、Ｇ）を発現するトランスジェニックマウスは、尿細管拡張症、尿細管壊死、タンパク性円柱形成（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  ｃａｓｔｓ）及び尿細管細胞萎縮症を示す。しかしながら、全てのトランスジェニックポジティブマウスが腎症を示すわけではなく（図７Ｅ）、観察された糸球体に対する明白な損傷もない。これらの試験では、本発明者らは、有意な体重減少及び治療群、特に、ＡｐｏＬ１発現に対してポジティブであるものにおける死亡率を観察した。
【０１６４】
水分補給と血流の減少は腎臓のより急速な増悪と早期死亡率をもたらし得るので、本発明者らは、毎日、付加的に皮下液体を投与しながらドキソルビシンのより高用量を繰り返した。これは、全てのマウスが２１日目の試験終了まで生存することを可能とした。試験終了時、ドキソルビシンで治療したマウスはＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１トランスジェニックマウス（１０％）またはトランスジェニックネガティブ動物（１１％）と比較して、１７％の有意な体重減少である（図８）。Ｇ２変異体を発現するトランスジェニックマウスにおいて、尿中アルブミンも１１日目で有意に上昇し、クレアチニンに対するアルブミンの平均比は６６０９であり、トランスジェニックネガティブマウスより５．２倍高い（ｐ＝０．００２）。これらのマウスにおいて、タンパク尿は１８日目で高いままであり、クレアチニンに対するアルブミンの平均比は６１４６であり、治療トランスジェニックネガティブマウスより３．９倍高い（ｐ＝０．０２）。ＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するドキソルビシン治療トランスジェニックマウスにおいて、尿中アルブミンは有意に高くないが、値はドキソルビシン治療トランスジェニックネガティブ動物とＧ２変異体を発現するマウスとの中間である（ＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するトランスジェニックにおけるクレアチニンに対するアルブミンの平均比は１１日目で２７６８であり、１８日目で２８８０である）。ＰＢＳ治療コントロールは正常なままである（図９）。さらに、ＴＥＭ分析は、ＰＢＳ治療マウスにおける規則的間隔の足突起中への有足細胞の同化作用を示しているが、ドキソルビシンで治療した動物は有足細胞足突起の展退を示し、これはタンパク尿の糸球体疾患の不変の特徴である（図１０）。上記の通り、ＴＥＭ分析を行った。
【０１６５】
尿中アルブミン値上昇がドキソルビシン治療腎臓内の組織病理と相関するか否かを評価するため、ドキソルビシン治療後２１日目にマウスを取り出し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）、 過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）及びマッソン三色染色で染色した。定性的に、Ｈ＆Ｅはタンパク質及び核を染色し、ＰＡＳは基底膜を染色するが、三色染色は間質性線維症及び基底膜の両方を染色する。全ドキソルビシン治療動物がいくつかの病変を示すが、遺伝子型間の差は、重症度及び病変分布の差であるが、病変自体ではなく、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するドキソルビシン治療トランスジェニックマウスはトランスジェニックネガティブ及びＡｐｏＬ１  Ｇ２トランスジェニックマウスへの中間的病理表現型を示す。Ｈ＆Ｅ染色腎臓の低倍率画像は、ドキソルビシンの単回投与を０日目で静脈内に送達し、２１日目で取り出し、脱水予防のため皮下液体を毎日投与するプロトコールにおいて、非トランスジェニックマウス（図１１Ｂ）の最軽度な損傷、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するトランスジェニックマウスの中度な損傷（図１１Ｃ）、及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するトランスジェニックマウスの最重度な損傷（図１１Ｄ）を有するＰＢＳ治療マウス（図１１Ａ）と比較して損傷の段階的進行を示す（図１１Ｅ）。Ｈ＆Ｅ（図１１Ｆ〜Ｊ）、 過ヨウ素酸シッフ染色（図１１Ｋ〜Ｏ）、及びマッソン三色染色（図１１Ｐ〜Ｓ）で染色したドキソルビシン治療腎臓のより高倍率は、正常な糸球体（図１１Ｆ、Ｋ、Ｐ）と比較して、ドキソルビシン治療動物がＦＳＧＳと存在することを示す（図１１Ｇ〜Ｊ、Ｌ〜Ｏ、Ｑ〜Ｓ）。ボーマン隙は拡張し、タンパク性液体で満たされており（図１１Ｈ、星）；主にリンパ球から成る軽度尿細管間質性浸潤物があり（図１１Ｉ、白色アスタリスク（ａｓｔｅｒｉｘ））；拡張した近位尿細管内にタンパク質が蓄積しており（図１１Ｏ、十字）；近位上皮細胞の細胞質内に硝子（タンパク質）滴の蓄積がある（図１１Ｏ、黒矢印）。病理学スコアは、トランスジェニックネガティブコントロールまたはＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するマウス（ｐ＝０．０３）と比較して、ＡｐｏＬ１  Ｇ２を発現するドキソルビシン治療マウス（ｐ＝０．０００３４）において有意により大きな損傷があることを示す（図１１Ｔ）。
【０１６６】
全ドキソルビシン治療マウスにおいて、タンパク性液体が存在し、ボーマン隙は拡張している。巣状分節性糸球体硬化症があり、これが、全腎臓内の糸球体係蹄に可変的に影響を及ぼす。近位尿細管は拡張し、タンパク性液体で満たされており、タンパク円柱及び近位上皮細胞の細胞質は球状タンパク質で満たされている。腎臓全体を通して多発的に、主にリンパ球から成る軽度尿細管間質性浸潤物がある。以下の類別システムを適用して、ＡｐｏＬ１介在腎症の進行を評価するために腎臓の病理学的表現型を決定した。腎臓の４つの主要な構造をスケール０〜４で類別した。０は正常を示し、４は重度な変化を示す。少なくとも１０例の糸球体を各動物について検査した。類別全体は全変化の総合印象に基づき、大部分で影響された適切な構造の割合を考慮する。以下のように各成分について変化を類別した：
【０１６７】
１．糸球体の大きさ、分葉、癒着、房の線維症、ボーマン嚢の線維症、拡張、毛細管狭窄、基底膜肥厚、ボーマン隙内のタンパク質、細胞性増大（糸球体間質または内皮）、白血球による浸潤、毛細管血栓
２．尿細管萎縮症、壊死、液胞及び硝子滴変化、基底膜肥厚、拡張、管腔内の炎症細胞及び円柱
３．間質線維症、浮腫、急性及び慢性白血球浸潤
４．細動脈線維症、血栓症、硝子変化と狭窄
【０１６８】
動物のより大きなコホートで個別の試験を行った。ドキソルビシンの単回投与を０日目で静脈内（ＩＶ）に送達し、２８日目で取り出し、皮下液体を脱水予防のために毎日投与した（図１２Ａ）。クレアチニン値に対して正規化した尿中アルブミンは、トランスジェニックネガティブコントロールと比較して（ｐ＝０．０５、図１２Ｂ）、ＡｐｏＬ１  Ｇ２において上昇した。尿中アルブミン値上昇及びＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するマウスの疾患進行と相関した病理組織診断はトランスジェニックネガティブコントロールと比較して、ＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するマウスに対して中間であった。病理学的スコアは、トランスジェニックネガティブコントロールと比較して、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（ｐ＝０．００３）かＡｐｏＬ１のＧ２変異体（ｐ＝０．０００５）のいずれかを発現するドキソルビシン治療マウスにおいて有意により大きな損傷があったことを示した（図１２Ｃ）。前の試験と一致して、トランスジェニックネガティブマウス（ｐ＝０．０５）より２倍高い、５９６４のクレアチニンに対するアルブミンの平均比を有するＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するトランスジェニックマウスにおいて１８日目に尿中アルブミンは有意に上昇した。尿中タンパク尿の上昇は、非トランスジェニック動物と比較して、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体を発現するマウスにおいて有意でなかったが、２８日の試験の終了時の病理学的スコアは、トランスジェニックネガティブとＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するトランスジェニックマウスに対して中間であるトランスジェニックネガティブと比較して、有意な疾患進行を示した。
【０１６９】
実施例５：ＡｐｏＬ１アデノウイルス送達
ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体をアデノウイルスを用いて発現した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＢｉｏＬａｂｓ社により、ＡｐｏＬ１変異体をアデノウイルスベクター中にクローンし、製造し、タイター（ｔｉｔｅｒｄ）した。滅菌ＰＢＳ中１００μｌにした１×１０８Ｐｆｕと一緒に各マウスの（−）２日目及び１４日目に尾静脈注射によりアデノウイルス送達を行った。ドキソルビシン誘導腎症を０日目に上記のように行った（実施例４参照）。脱水予防のために皮下液体を投与し、１１日目及び１８日目に尿を集め、２８日目に取り出した（図１３Ａ）。クレアチニン値に対して正規化した尿中アルブミンは、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（ｐ＝０．０５）及びＧ１変異体（ｐ＝０．０３）において有意に上昇し、トランスジェニックネガティブコントロールと比較した（図１３Ｂ）。尿中アルブミン値上昇及び病理学的スコアと相関がある病理組織診断は、トランスジェニックネガティブコントロールと比較して、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体（ｐ＝０．００４）、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体（ｐ＝０．００００８５）、及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体（ｐ＝０．０３）において観察される有意に大きな損傷を明らかにした（図１３Ｃ）。アデノウイルスコンストラクトを注射されたマウスの大部分においてＡｐｏＬ１値は高かった。第一回目の注射後にＡｐｏＬ１を発現する動物のみ、尿分析及び病理学的スコアに含めた（図１３Ｄ）。コントロールとしてハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ）を発現するマウスと比較してＡｐｏＬ１変異体の効果を示した。ＨＰＲはヒト特異的な血清分泌タンパク質であり、通常、マウスでは発現されない。結論として、肝臓にＡｐｏＬ１を送達したＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体のアデノウイルス発現は、血清のＡｐｏＬ１発現が腎疾患の進行を促進することを確認した。
【０１７０】
実施例６：ＡｐｏＬ１を認識する抗体の製造
これに限定されないが、組換えＡｐｏＬ１タンパク質（Ｇ０、Ｇ１及びＧ２）をマウスまたはハムスターに注射することを含むいずれかの標準的ハイブリドーマの方法により、Ｇ０、Ｇ１及びＧ２に対するモノクローナル抗体を作成する。加えて、マウスに対して、適切な送達ベクター（ｐＣＡＧＧＳ）中ＡｐｏＬ１またはそのＧ１及びＧ２をコードするＤＮＡ配列の水力学的送達を行う。
【０１７１】
抗体スクリーニングを下記のように行う。標準ＥＬＩＳＡを、ポジティブハイブリドーマを選択するために原抗原に対して使用する。したがって、ＡｐｏＬ１  Ｇ０、Ｇ１またはＧ２（Ｎ末端ｈｉｓまたはＦＬＡＧエピトープタグを有するアミノ酸Ｄ６１−Ｌ３９８）をコートしたＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートを遮断し、ハイブリドーマ上澄みと結合し、ＨＲＰ結合抗マウスで検出する。それから、このロイシンジッパー領域は他のまだ確認されていないタンパク質との結合も介在して腎機能不全を介在するので、ＳＲＡ（血清耐性関連タンパク質）遮断ＥＬＩＳＡを行い、ＡｐｏＬ１のＳＲＡ相互作用ドメインがＳＲＡと結合するのを抑制する抗体を確認する。遮断ＥＬＩＳＡのため、ＡｐｏＬ１−ＦＬＡＧコートプレートを遮断し、抗体上澄みとプレ結合したＳＲＡ−ｈｉｓとインキュベートする。ＳＲＡ−ｈｉｓ（すなわち、非ＳＲＡ−ＩＤ遮断抗体）の存在下、抗体結合をＨＲＰ結合抗ｈｉｓタグ抗体及びＴＭＢ基質を用いて検出する。
【０１７２】
その後、ヒト血清のＡｐｏＡ１−ＡｐｏＬ１サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、血清中のＨＤＬ粒子内のＡｐｏＬ１を認識可能な抗体を同定する。この目的のため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートをポリクローナルヤギ抗ＡｐｏＬ１抗体でコートし、遮断し、界面活性剤フリー緩衝液（ＨＤＬ粒子完全性を維持するため）中ヒト血清とインキュベートしてＨＤＬ粒子を捕捉する。それから、抗ＡｐｏＬ１モノクローナルをインキュベートし、いずれもの結合した抗体をＨＲＰ抗マウスで検出する。必要ならば、ヒトＡｐｏＬ１  Ｇ１及び／またはＧ２血清に対して、ポジティブ抗体をさらに試験できる。
【０１７３】
次に、標準クロスブロッキングＥＬＩＳＡによるエピトープビニングを行う。この目的のため、いずれもの標準的方法を使用でき、例えば、一次抗体を組換えＡｐｏＬ１と結合し、次いで、ビオチン化二次抗体とインキュベートし、ストレプトアビジンＨＲＰを用いて検出してどの抗体が同じＡｐｏＬ１エピトープのために競合するのかを決定する。
【０１７４】
エピトープマッピングのため、Ｃ末端人工グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによりその表面上に誘導可能なＡｐｏＬ１またはそのフラグメントを安定に発現するＣＨＯ細胞をハイブリドーマ上澄みとインキュベートし、次いで、Ａｌｅｘａ６４７抗マウスによりそれらがどのドメインと結合するかを同定する。ＡｐｏＬ１（そのシグナル及び細胞表面にアンカーするＣ末端グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを含むＮ末端単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）エピトープタグを有する）レンチウイルスを使用して、毒性の問題を克服するためにドキシサイクリン誘導可能な方法で、ＡｐｏＬ１  Ｇ０、Ｇ１またはＧ２全長またはドメインフラグメントを安定に発現するＣＨＯ細胞を製造する。以下のコンストラクトを使用する：全長＝Ｄ６１０〜Ｌ３９８；ポア形成ドメイン＋メンブレンアドレッシングドメイン＝ａａＤ６１〜Ｅ３０８；メンブレンアドレッシングドメイン＋ＳＲＡ相互作用ドメイン＝Ｇ２３１〜Ｌ３９８；ＳＲＡ−ＩＤのみ＝Ｒ３０５〜Ｌ３９８。
【０１７５】
ＡｐｏＬ１活性のための細胞ベースアッセイとしては以下のものが挙げられる：
ａ）カルバコールで刺激された安定２９３細胞を発現するドキシサイクリン誘導性ＴＲＰＣ６を用いたメンブレンポテンシャルアッセイ。ＡｐｏＬ１のいずれもの効果（ポドシンの発現があってもなくても）を抗ＡｐｏＬ１抗体の存在下で評価し、ＴＲＰＣ６シグナル伝達に対するＡｐｏＬ１の効果を阻害するいずれかを同定する。
ｂ）ヒト不死化有足細胞のアクチン細胞骨格（アレクサファロイジン染色）に対する組換えＡｐｏＬ１の効果を抗ＡｐｏＬ１抗体の存在下で評価し、いずれがＡｐｏＬ１の効果を阻害するかを決定する。
ｃ）アデノウイルス発現されたＡｐｏＬ１（特にＧ１変異体）は飲細胞作用染料（ルシファーイエローＣＨ）及び酸トレーサー、リソトラッカーレッドを用いて評価したとき、ヒト不死化有足細胞のリソソーム完全性を破壊する。感染した有足細胞の理想的な条件培地を抗ＡｐｏＬ１抗体とプレインキュベートを可能とするために使用して、リソソームに対する効果を阻害するいずれかを同定する。
【０１７６】
様々なドメインに対する可能性のある候補をインビボ有効性モデル、すなわち、ＡｐｏＬ１（Ｇ０、Ｇ１及びＧ２）トランスジェニックマウスのＡｐｏＬ１促進ドキソルビシン誘導タンパク尿を抑制する能力について試験する。様々なエピトープからの候補抗体、好ましくは、ＳＲＡ結合を遮断するもの、または細胞ベースアッセイの１つをインビボで試験する。タンパク尿（尿中のアルブミン：クレアチニン比の増加）により評価するとき、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体、ＡｐｏＬ１のＧ１変異体及びＡｐｏＬ１のＧ２変異体を発現するトランスジェニックマウスにドキソルビシンを投与して上記のように腎症を誘導する。本明細書で示すように、ＡｐｏＬ１のＧ０変異体は非トランスジェニックマウスと比較してタンパク尿を増加させ、ＡｐｏＬ１のＧ２変異体はさらに大きな効果を有する。ＡｐｏＬ１介在性タンパク尿増大を回復させるＡｐｏＬ１に対する抗体能力をモニターする。
【０１７７】
インビボ活性に対するＰＤマーカーは血清ＡｐｏＬ１値のモニターも含み、ＡｐｏＬ１含有ＨＤＬ粒子が欠乏するかどうかを決定する。従したがって、本明細書に記載のＡｐｏＬ１トランスジェニックマウスモデルを用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによりＡｐｏＬ１値の評価のために抗体投与後の適切な間隔で血液を採取してＡｐｏＬ１が循環から欠乏していないかどうかを決定する。ウサギポリクローナルＡｐｏＬ１をプレート上にコートし、遮断し、界面活性剤の存在下マウス血清とインキュベートして、非競争的エピトープに対するビオチン化ウサギポリクローナルＡｐｏＬ１で検出する。結合をストレプトアビジンＨＲＰで検出し、組換えＡｐｏＬ１標準品と比較して相対血清値を決定する。
【０１７８】
上述の発明は、明確な理解のための例示説明及び例としてある程度詳細に記載されたが、これらの説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
【０１７９】
実施例７：ＡｐｏＬ１抗体の生成及び特徴付け
Ｒｉｂｉアジュバントはシグマ社（カタログ＃Ｓ６３２２）、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ／ＩＦＡ）はベクトンディッキンソン社（ＢＤ、カタログ＃２３１１４１／２６３９１０）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）カクテルで使用したアジュバントはインビボゲン社のＣｐＧ（カタログ＃ｔｌｒｌ−１８２６−１）、インビボゲン社のＲ８４８（カタログ＃ｔｌｒｌ−ｒ８４８）、インビボゲン社のＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（カタログ＃ｖａｃ−ｐｉｃ）及びシグマ社のモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）（カタログ＃Ｌ６８９５）、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ培地Ｂ（カタログ＃０３８０２）、培地Ｃ（カタログ＃０３８０３）、培地Ｄ（カタログ＃０３８０４）及び培地Ｅ（カタログ＃０３８０５）はステムセルテクノロジーズ社から入手した。電気融合用に使用した細胞融合用培地Ｃ（カタログ＃ＬＣＭ−Ｃ）はサイト・パルス・サイエンシズ社から入手した。ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体はシグマ社（カタログ＃Ａ２５５４）から入手した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）伝導率一成分ＨＲＰマイクロウェル基質（カタログ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）及びＴＭＢ停止試薬（カタログ＃ＢＳＴＰ−１０００−０１）はバイオＦｘラボラトリーズ社から入手した。
【０１８０】
インビボ免疫
水力学的尾静脈注射（ＨＴＶ）免疫のため、１μｇ  ＧＭ−ＣＳＦと混合したＡｐｏＬ１  Ｇ１またはＧ２  ＤＮＡコンストラクト（配列を下表３に示す）の５０μｇ／マウスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中全体積２．０ｍｌで尾静脈注射によりＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。全部で６回の注射を２週間毎に注射した。
【０１８１】
タンパク質免疫のため、ＢＡＬＢ／ｃマウスをアジュバントに依存して、組換えヒトＡｐｏＬ１  Ｇ０（アミノ酸Ｄ６１〜Ｌ３９８）をマウス当たり１０かまたは５０μｇ／注射のいずれかでＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。Ｒｉｂｉアジュバント（シグマ社）及びＴＬＲカクテルアジュバント（１０μｇのＣｐＧ＋１０μｇのポリＩ：Ｃ＋２０μｇのＲ８４８＋５０μｇのＭＰＬ）のため、全１６回の注射のため、３〜４日の間隔で、１００μｌのアジュバント／マウス中の抗原１０μｇ全部を腹腔内（ＩＰ）か、皮下（ＳＣ）か、あるいは尾の底（ＢＯＴ）かいずれかに注射した。ＣＦＡ／ＩＦＡアジュバントのため、１００μｌのアジュバント／マウス中のアジュバント５０μｇを全７回の追加免疫のため、２週間毎に腹腔内（ＩＰ）注射した。最終プレ赤血球ゴースト融合後３日目、マウス脾臓のリンパ球及びリンパ節を採取した。
【０１８２】
融合及びＥＬＩＳＡスクリーニング
単離したマウスリンパ球を、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  ＣＥＥＦ−５０装置（サイトパルスサイエンス社）を用いてＰＵ−１骨髄腫細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）と融合した。Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ培地Ｃで２回洗浄後、単離したリンパ球及びＰＵ−１細胞を１：１の比で混合し、それから、Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ培地Ｃで１０百万細胞／ｍｌに再懸濁した。電気融合を製造者の指示に従って用いて行った。融合細胞を７％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、一夜、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ培地Ｃ中で培養した。翌日、融合細胞を遠心分離してから、１０ｍｌのＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ培地Ｃ中に再懸濁し、それから、９０ｍｌのメチルセルロースベースＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ培地Ｄと優しく混合した。細胞をＯｍｎｉディッシュ（カタログ＃１００２６、ヌンク社）中に蒔き、７％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で生育させた。インキュベート６〜７日後、１つのハイブリドーマクローンをＣｌｏｎｅＰｉｘ  ＦＬ（ジェネティクス社、英国）により取り出し、２００μｌ／ウェルのＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ培地Ｅを含む９６ウェル細胞培養プレート（＃３５３０７５、ベクトンディッキンソン社）中に移動した。培養６〜７日後、ハイブリドーマ上澄みをＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＡｐｏＬ１  Ｇ０に対する全ＥＬＩＳＡポジティブクローンの上澄みもフローサイトメトリーアッセイのために集めた。
【０１８３】
ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った。９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（グライナー社、ドイツ）を４℃、一夜、最終体積１００μｌ／ウェルで０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中１μｇ／ｍｌでＡｐｏＬ１  Ｇ０、Ｇ１またはＧ２でコートした。洗浄用緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％ツイーン２０、シグマ社）で３回洗浄後、ＢＳＡ含有ＥＬＩＳＡアッセイ希釈液２００μｌでプレートを遮断した。培養した上澄みまたは希釈精製ｍＡｂｓの１００μｌを添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、１時間、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃとインキュベートした。３回洗浄後、結合したＨＲＰを、５分間、最終体積１００μｌ／ウェルでＴＭＢ基質（バイオＦＸラボラトリーズ社、米国メリーランド州）の添加により検出した。１００μｌ／ウェルの停止試薬（バイオＦＸラボラトリーズ社、米国メリーランド州）の添加により反応を停止した。ＯＤ６３０をＳｕｎｒｉｓｅ  Ｔｅｃａｎプレートリーダーで検出した。
【０１８４】
ｍＡｂｓ精製及びアイソタイプ判定
ハイブリドーマ上澄みをＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、それから、細菌ろ過（ポア径０．２μｍ、ナルゲヌンクインターナショナル社、米国ニューヨーク州）し、ＰＢＳ中、４℃で貯蔵した。精製ｍＡｂｓのＡＰＯＬ１との結合をさらなる機能分析試験前にＥＬＩＳＡにより確認した。
【０１８５】
精製ｍＡｂｓのアイソタイプをマウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定キット（ロシュダイアグノスティックス社）により決定した。
【０１８６】
セルライン及びコンストラクト
全長ＡＰＯＬ１タンパク質を４つのドメイン（図１４）：シグナル配列、１〜２７アミノ酸（ａａ）、ポア形成ドメイン（ＰＦＤ）、６０〜２３５ａａ、メンブレンアドレッシングドメイン（ＭＡＤ）、２４０〜３０３ａａ、及びＳＲＡ相互作用ドメイン（ＳＲＡ−ＩＤ）、３３９〜３９８ａａ（図１４Ａ）に分けることができる。ＡＰＯＬ１過剰発現はしばしば有害であるので、安定なドキシサイクリン誘導ＡＰＯＬ１発現ＣＨＯ細胞をウイルス感染により生成した。生理的に分泌されるＡＰＯＬ１を模倣するため、全長のＡＰＯＬ１（ＷＴ）のＧ０変異体かＡＰＯＬ１のＧ１変異体かＡＰＯＬ１のＧ２変異体かのいずれかを発現及び分泌するＣＨＯ細胞を生成した。
【０１８７】
これらの細胞がＡＰＯＬ１分泌するはずであるフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による抗体結合の評価に有用であるかどうかは不確かであるので、ＧＰＩアンカーＡＰＯＬ１発現細胞も生成し（図１４Ｂ）、おそらくナイーブＡＰＯＬ１と異なる立体配置であるが、タンパク質の細胞表面の発現を保証した。加えて、ＧＰＩアンカーコンストラクトはｇＤ（ＨＳＶ糖タンパク質Ｄ）エピトープタグ（及びＨＳＶシグナル配列）で置換したＡＰＯＬ１の第一６０ａａ（他のＡｐｏＬファミリーメンバーに存在せず、ＡｐｏＬ１活性にとって必須でない）を有し、発現を確認して抗体結合の正規化を可能とした。さらに、ＦＡＣＳによる３つのＡＰＯＬ１ドメイン（ＰＦＤ、ＭＡＤまたはＳＲＡ−ＩＤ）に抗体をマッピングするため、Ｎ末端にｇＤを有しＧＰＩアンカーにより細胞表面に結合したＡＰＯＬ１ドメインの１つのみまたは２つを発現するＣＨＯ細胞も生成した（図１４Ｃ〜Ｅ）。
【０１８８】
セルラインを以下のように生成した。ＡＰＯＬ１のＧ０変異体用ＡＰＯＬ１コンストラクト（ＷＴ、アイソフォームａ、ＮＭ＿００３６６１．３）、ＡＰＯＬ１のＧ１変異体（Ｓ３４２Ｇ、Ｉ３８４Ｍ）及びＡＰＯＬ１のＧ２変異体（ΔＮ３８８、Ｙ３８９）を部位直接突然変異誘発により生成し（全長及び切断型）、ｐＥＮＴＲ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯクローニングキット（Ｋ２４００−２０）を用いてＧａｔｅｗａｙ  ｅｎｔｒｙ  ベクター中にサブクローニングした。非ＧＰＩアンカーならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄアンカー（ｇＤ）タグ及びＧＰＩアンカーコンストラクトを生成し、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲＩＩ組換えを用いて、ドキシサイクリン誘導レンチウイルス発現プラスミドｐＩｎｄｕｃｅｒ２０中にサブクローニングした。コンストラクトをＤＮＡシークエンシングにより検証し、ｐＩｎｄｕｃｅｒシステムを用いて全長または切断型ＡｐｏＬ１をコードするレンチウイルスを生成するために使用した。安定な誘導性ＡｐｏＬ１発現ＣＨＯ細胞を生成するため、レンチウイルスをＣＨＯ細胞上に播種し、７２時間培養してから、Ｇ４１８を用いて選択した。培養培地中のウイルス性Ｐ２４タンパク質を検出できなくなるまでＥＬＩＳＡにより定期的に測定した。ＡｐｏＬ１の発現を実験分析前、４８時間ドキシサイクリン５μｇ／ｍｌで誘導した。
【０１８９】
フローサイトメトリー
１９のモノクローナル抗ＡＰＯＬ１抗体を、全長のＡＰＯＬ１（ＷＴ）のＧ０変異体、ＡＰＯＬ１のＧ１変異体またはＡＰＯＬ１のＧ２変異体との結合についてＦＡＣＳにより分析して交差反応性を推定した。全抗体は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）により示されるとき、ＡＰＯＬ１のＧ０変異体ならびにＡＰＯＬ１のＧ１変異体及びＡＰＯＬ１のＧ２変異体の両方と結合した（図１５）。
【０１９０】
抗体の各々の結合ドメインをマッピングするため、ＡＰＯＬ１のＧ０変異体の切断型を発現する細胞に対してＦＡＣＳ分析を行った。生成した１９の抗ＡＰＯＬ１抗体のうち、１２はＰＦＤ特異的、１つはＭＡＤ特異的、５つはＳＲＡ−ＩＤ特異的、１つは立体配置に敏感な結合体と見なされた、すなわち、非線形エピトープと結合する。
【０１９１】
本明細書中下記のようにフローサイトメトリー分析を行った。ドキシサイクリン５μｇ／ｍｌで４８時間誘導したＡｐｏＬ１−ＣＨＯ細胞をＰＢＳ中５ｍＭのＥＤＴＡで採取し、ＣＨＯ培地で洗浄し（Ｇ６−ＳＲ遠心分離機で１０分間１２００ｒｐｍにて回転）、ＰＢＳ中で再度洗浄した。試料当たり約０．５×１０５細胞を氷上で６０分間ＰＢＳ中、抗体１μｇ／ｍｌとインキュベートした。それから、細胞を上記遠心分離により集め、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋３％ウシ胎仔血清）で３回洗浄し、それから、再懸濁し、氷上で６０分間、ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合ヤギ抗マウス／抗ウサギ（Ｈ＋Ｌ）ＩｇＧとインキュベートした。それから、細胞を上記のように洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含むＰＢＳ中に再懸濁し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）フローサイトメータ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各試料について測定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ８．４．５）を用いて、データを解析した。それから、二次抗体単独のバックグラウンドシグナルを差引いた後、ＭＦＩをＭＳエクセルにエクスポートしてプロットした。
【０１９２】
トリパノソーマアッセイ
腎疾患のＡｐｏＬ１介在進行の機序が、ＡＰＯＬ１がトリパノソーマを溶解する能力と関連し得るという仮定に基づいてトリパノソーマベース機能分析を行った。Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｂｒｕｃｅｉはＡＰＯＬ１により溶解するトリパノソーマのヒト血清感受性種である。したがって、本明細書に記載のモノクローナル抗ＡＰＯＬ１抗体を正常ヒト血清（ＮＨＳ）のＡＰＯＬ１介在溶解を遮断するその能力についてスクリーニングした。１％ＮＨＳの存在下、細胞生存率につい遮断活性を測定した。抗ＡｐｏＬ１抗体は１μｇ／ｍｌの濃度におけるこのアッセイにおいて２８％〜４９％の範囲の遮断活性を有する（図１６）。
【０１９３】
下記のようにトリパノソーマアッセイを行った。Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｂｒｕｃｅｉ（Ｌｉｓｔｅｒ４２７  ＶＳＧ２２１）をＡＴＣＣから適切な認可の下得て、少なくとも週に３回継代して修飾ＨＭＩ−９培地（ＡＴＣＣ＃ＰＲＡ−３８３）中で生育した。トリパノソーマは決して全コンフルエントまで生育できず、ずんぐり型（ｓｔｕｍｐｙ  ｆｏｒｍ）よりむしろ増殖性のままであることを保証した。遮断アッセイのため、約０．５×１０５のＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｂｒｕｃｅｉを、３７℃、２０時間、９６ウェル透明プレート中、１．０μｇ／ｍｌの抗ＡｐｏＬ１抗体の存在または非存在下、１％正常ヒト血清（ＮＨＳ）とインキュベートした。その後、１０μｌのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（インビトロジェン社、カタログ＃ＤＡＬ１０２５）を添加し、４〜６時間後、細胞生存率を５３０励起／５９０発光において蛍光計で読み取った。ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏを用いてデータを解析した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）値をグラフプロットのためにＭＳエクセルにエクスポートした。
【０１９４】
【表３】
2018500882.tif 000005
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2018500882.tif 000021
【０１９５】
参考文献
Ｃｈａｐｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓ．，Ｌａｇｒａｎｇｅ，Ｄ．，Ｌａｐｌａｕｄ，Ｐ．Ｍ．，１９８１．Ａ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ．Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ２２，３３９−３５８．
Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｗ．Ｓ．，Ｓｉｌｖａ，Ｒ．Ａ．，Ｃｈａｎｔｅｐｉｅ，Ｓ．，Ｌａｇｏｒ，Ｗ．Ｒ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｋｏｎｔｕｓｈ，Ａ．，２００９．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＨＤＬ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２９，８７０−８７６．
Ｄｕｃｈａｔｅａｕ，Ｐ．Ｎ．，Ｍｏｖｓｅｓｙａｎ，Ｉ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｓ．，Ｓａｋａｉ，Ｎ．，Ｈｉｒａｎｏ，Ｋ．，Ｓｃｈｏｅｎｈａｕｓ，Ｓ．Ａ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−Ｋｅａｒｎｓ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｊａｆｆｅ，Ｒ．Ｂ．，Ｒｅｄｂｅｒｇ，Ｒ．Ｆ．，Ｉｓｈｉｄａ，Ｂ．Ｙ．，Ｍａｔｓｕｚａｗａ，Ｙ．，Ｋａｎｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｍａｌｌｏｙ，Ｍ．Ｊ．，２０００．Ｐｌａｓｍａ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ，ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ，ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４１，１２３１−１２３６．
Ｄｕｃｈａｔｅａｕ，Ｐ．Ｎ．，Ｐｕｌｌｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｒ．，Ｏｒｅｌｌａｎａ，Ｒ．Ｅ．，Ｋｕｎｉｔａｋｅ，Ｓ．Ｔ．，Ｎａｙａ−Ｖｉｇｎｅ，Ｊ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｍａｌｌｏｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｋａｎｅ，Ｊ．Ｐ．，１９９７．Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ，  ａ  ｎｅｗ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２，２５５７６−２５５８２．
Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｂ．Ｉ．，Ｋｏｐｐ，Ｊ．Ｂ．，Ｌａｎｇｅｆｅｌｄ，Ｃ．Ｄ．，Ｇｅｎｏｖｅｓｅ，Ｇ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｂｏｗｄｅｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｐｏｌｌａｋ，Ｍ．Ｒ．，２０１０．Ｔｈｅ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１  （ＡＰＯＬ１）ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｎｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２１，１４２２−１４２６．
Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｂ．Ｉ．，Ｌａｎｇｅｆｅｌｄ，Ｃ．Ｄ．，Ｌｕ，Ｌ．，Ｄｉｖｅｒｓ，Ｊ．，Ｃｏｍｅａｕ，Ｍ．Ｅ．，Ｋｏｐｐ，Ｊ．Ｂ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｐａｌｍｅｒ，Ｎ．Ｄ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｏｓｔｒｏｍ，Ｍ．Ａ．，Ｃｏｏｋｅ，Ｊ．Ｎ．，ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ，Ｃ．Ｗ．，Ｂｏｗｄｅｎ，Ｄ．Ｗ．，２０１１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＭＹＨ９  ａｎｄ  ＡＰＯＬ１  ｒｉｓｋ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｎ  ＦＲＭＤ３  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  ＥＳＲＤ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ７，ｅ１００２１５０．
Ｈｓｕ，Ｃ．Ｙ．，Ｌｉｎ，Ｆ．，Ｖｉｔｔｉｎｇｈｏｆｆ，Ｅ．，Ｓｈｌｉｐａｋ，Ｍ．Ｇ．，２００３．Ｒａｃｉａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｏ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １４，２９０２−２９０７．
Ｋａｏ，Ｗ．Ｈ．，Ｋｌａｇ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｅｏｎｉ，Ｌ．Ａ．，Ｒｅｉｃｈ，Ｄ．，Ｂｅｒｔｈｉｅｒ−Ｓｃｈａａｄ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｃｏｒｅｓｈ，Ｊ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．，Ｔａｎｄｏｎ，Ａ．，Ｐｏｗｅ，Ｎ．Ｒ．，Ｆｉｎｋ，Ｎ．Ｅ．，Ｓａｄｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｗｅｉｒ，Ｍ．Ｒ．，Ａｂｂｏｕｄ，Ｈ．Ｅ．，Ａｄｌｅｒ，Ｓ．Ｇ．，Ｄｉｖｅｒｓ，Ｊ．，Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｂ．Ｉ．，Ｋｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｋｎｏｗｌｅｒ，Ｗ．Ｃ．，Ｋｏｈｎ，Ｏ．Ｆ．，Ｋｒａｍｐ，Ｋ．，Ｌｅｅｈｅｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｎｉｃｈｏｌａｓ，Ｓ．Ｂ．，Ｐａｈｌ，Ｍ．Ｖ．，Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｅｄｏｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｈｏｒｎｌｅｙ−Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｗ．，Ｐａｒｅｋｈ，Ｒ．Ｓ．，２００８．ＭＹＨ９  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４０，１１８５−１１９２．
Ｋｏｐｐ，Ｊ．Ｂ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．，Ｓａｍｐａｔｈ，Ｋ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｇｅｎｏｖｅｓｅ，Ｇ．，Ａｎ，Ｐ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｄ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ｗ．，Ｄａｒｔ，Ｒ．，Ｋｏｒｂｅｔ，Ｓ．，Ｍｏｋｒｚｙｃｋｉ，Ｍ．Ｈ．，Ｋｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｌｉｍｏｕ，Ｓ．，Ａｈｕｊａ，Ｔ．Ｓ．，Ｂｅｒｎｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｆｒｙｃ，Ｊ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｅ．Ｅ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｔｒａｃｈｔｍａｎ，Ｈ．，Ｍｉｃｈｅｌ，Ｄ．Ｍ．，Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．，Ｖｌａｈｏｖ，Ｄ．，Ｐｏｌｌａｋ，Ｍ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｃ．Ａ．，２０１１．ＡＰＯＬ１  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｆｏｃａｌ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ＨＩＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２２，  ２１２９−２１３７．
Ｋｏｐｐ，Ｊ．Ｂ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｒ．Ｃ．，Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｂ．Ｉ．，Ｂｏｗｄｅｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｏｌｅｋｓｙｋ，Ｔ．，ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｋａｊｉｙａｍａ，Ｈ．，Ａｈｕｊａ，Ｔ．Ｓ．，Ｂｅｒｎｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ｗ．，Ｃｈｏ，Ｍ．Ｅ．，Ｄａｒｔ，Ｒ．Ａ．，Ｋｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｋｏｒｂｅｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｍｉｃｈｅｌ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｏｋｒｚｙｃｋｉ，Ｍ．Ｈ．，Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｅ．，Ｔｒａｃｈｔｍａｎ，Ｈ．，Ｖｌａｈｏｖ，Ｄ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｃ．Ａ．，２００８．ＭＹＨ９  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ−ｅｆｆｅｃｔ  ｒｉｓｋ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｆｏｃａｌ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４０，１１７５−１１８４．
Ｌｅｅ，Ｖ．Ｗ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｄ．Ｃ．，２０１１．Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ：ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｆｏｃａｌ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  （Ｃａｒｌｔｏｎ）１６，３０−３８．
Ｍａｄｈａｖａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｏ’Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．Ｆ．，Ｋｏｎｉｅｃｚｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｇａｎｅｓａｎ，Ｓ．，Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ，Ｌ．Ａ．，Ｓｅｄｏｒ，Ｊ．Ｒ．，２０１１．ＡＰＯＬ１  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｋｉｄｎｅｙ  ａｎｄ  ｎｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２２，  ２１１９−２１２８．
ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ａ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｉ．Ｓ．，ＭｃＫｉｂｂｅｎ，Ｂ．，ＭｃＥｎｅｎｙ，Ｊ．，２００７．Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎｓ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｕｐｌｉｃｉｔｏｕｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４８，８６−９５．
Ｐａｇｅ，Ｎ．Ｍ．，Ｏｌａｎｏ−Ｍａｒｔｉｎ，Ｅ．，Ｌａｎａｗａｙ，Ｃ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．，Ｍｉｎｉｈａｎｅ，Ａ．Ｍ．，２００６．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｌｉｐｉｄ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｍｉｄｄｌｅ  ａｇｅ  ｍａｌｅｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｎｕｔｒ  １，１３３−１３５．
Ｐａｒｓａ，Ａ．，Ｋａｏ，Ｗ．Ｈ．，Ｘｉｅ，Ｄ．，Ａｓｔｏｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｈｓｕ，Ｃ．Ｙ．，Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｈ．Ｉ．，Ｐａｒｅｋｈ，Ｒ．Ｓ．，Ｋｕｓｅｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｈ．，ｉｎｋ，  Ｊ．Ｃ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｈ．，Ｃｈｏｉ，Ｍ．Ｊ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｒ．，Ｌａｓｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｂ．Ｉ．，Ｏｊｏ，Ａ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｒａｊ，Ｄ．Ｓ．，Ｋｏｐｐ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｅ，Ｊ．，Ｊｅｎｓｖｏｌｄ，Ｎ．Ｇ．，Ｔａｏ，Ｋ．，Ｌｉｐｋｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ａｐｐｅｌ，Ｌ．Ｊ．，２０１３．ＡＰＯＬ１  ｒｉｓｋｖａｒｉａｎｔｓ，ｒａｃｅ，ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９，２１８３−２１９６．
Ｓａｌｅｅｍ，Ｍ．Ａ．，Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｒｅｉｓｅｒ，Ｊ．，Ｃｏｗａｒｄ，Ｒ．Ｊ．，Ｉｎｗａｒｄ，Ｃ．Ｄ．，Ｆａｒｒｅｎ，Ｔ．，Ｘｉｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｎｉ，Ｌ．，Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｍｕｎｄｅｌ，Ｐ．，２００２．Ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｄｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ  ｎｅｐｈｒｉｎ  ａｎｄ  ｐｏｄｏｃｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １３，６３０−６３８．
【図１Ａ】
2018500882.tif 000022
【図１Ｂ】
2018500882.tif 000023
【図１Ｃ】
2018500882.tif 000024
【図２Ａ】
2018500882.tif 000025
【図２Ｂ】
2018500882.tif 000026
【図２Ｃ】
2018500882.tif 000027
【図２Ｄ】
2018500882.tif 000028
【図２Ｅ】
2018500882.tif 000029
【図２Ｆ】
2018500882.tif 000030
【図２Ｇ】
2018500882.tif 000031
【図２Ｈ】
2018500882.tif 000032
【図３Ａ】
2018500882.tif 000033
【図３Ｂ】
2018500882.tif 000034
【図４Ａ−１】
2018500882.tif 000035
【図４Ａ−２】
2018500882.tif 000036
【図４Ｂ】
2018500882.tif 000037
【図４Ｃ】
2018500882.tif 000038
【図５】
2018500882.tif 000039
【図６】
2018500882.tif 000040
【図７Ａ】
2018500882.tif 000041
【図７Ｂ】
2018500882.tif 000042
【図７Ｃ】
2018500882.tif 000043
【図７Ｄ】
2018500882.tif 000044
【図７Ｅ】
2018500882.tif 000045
【図７Ｆ】
2018500882.tif 000046
【図７Ｇ】
2018500882.tif 000047
【図８】
2018500882.tif 000048
【図９】
2018500882.tif 000049
【図１０Ａ】
2018500882.tif 000050
【図１０Ｂ】
2018500882.tif 000051
【図１０Ｃ】
2018500882.tif 000052
【図１０Ｄ】
2018500882.tif 000053
【図１１Ａ−Ｅ】
2018500882.tif 000054
【図１１Ｆ−Ｉ】
2018500882.tif 000055
【図１１Ｊ−Ｍ】
2018500882.tif 000056
【図１１Ｎ−Ｑ】
2018500882.tif 000057
【図１１Ｒ−Ｔ】
2018500882.tif 000058
【図１２Ａ】
2018500882.tif 000059
【図１２Ｂ】
2018500882.tif 000060
【図１２Ｃ】
2018500882.tif 000061
【図１３Ａ】
2018500882.tif 000062
【図１３Ｂ】
2018500882.tif 000063
【図１３Ｃ】
2018500882.tif 000064
【図１３Ｄ−１】
2018500882.tif 000065
【図１３Ｄ−２】
2018500882.tif 000066
【図１４】
2018500882.tif 000067
【図１５】
2018500882.tif 000068
【図１６】
2018500882.tif 000069
【配列表】
2018500882000001.app
【国際調査報告】
2018500882.tif 000070
2018500882.tif 000071
2018500882.tif 000072
2018500882.tif 000073
2018500882.tif 000074