(57)【要約】本発明は、一又は複数のプロピオン酸菌細菌株から生産されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むプレバイオティクス組成物であって、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株の選択的増殖培地として作用し、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株の逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生産される形態と実質的に同じである、組成物に関する。本発明はまた、ＧＯＳ生産方法およびＧＯＳ含有関連組成物に関し、そして、個人の大腸でのプロピオネートレベルを上昇させて、プロピオネート分泌細菌の増殖を促進して食欲を制御するのに特に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一又は複数のプロピオン酸菌細菌株から生産されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むプレバイオティクス組成物であって、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株の選択的増殖培地として作用し、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株の逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生産される形態と実質的に同じである、組成物。
【請求項２】
前記ＧＯＳが、以下の細菌株：プロピオニバクテリウム・イエンセニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）；プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）；プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）；またはそれらの亜種もしくは変異株のうちの１つまたは複数から生産され、および／または、それらに選択的である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＧＯＳが選択されたプロピオン酸菌細菌属または株から生産され、前記ＧＯＳが前記選択されたプロピオン酸菌細菌属または株用の選択的増殖培地として作用する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物がカプセル化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、体内の胃腸管環境の少なくとも一部を通過し、その機能性を保持するのを可能にする賦形剤または担体化合物をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が液体もしくは粉末の形態であり、および／または、固形もしくは液状食品と混合可能である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
薬剤として使用するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記薬剤が肥満の治療および／または管理用である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
食品サプリメントとして使用するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
個人の食欲の制御および／または調節に使用するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
体重管理に使用するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
個人の下部消化管におけるプロピオネートレベルを増加させる方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物を投与して、プロピオネート分泌細菌の増殖を促進する工程を含む、方法。
【請求項１３】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の生産方法であって、一又は複数のプロピオン酸菌株を、５０％までのラクトースを含む増殖培地中、５５℃までの温度で２４時間までの間、嫌気的条件下で増殖させる工程と、前記プロピオン酸菌細胞からＧＯＳを回収する工程とを含む、方法。
【請求項１４】
前記一又は複数のプロピオン酸菌株を、４０％までのラクトースを含む増殖培地中、５０℃までの温度で、２４時間までの間増殖させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＯＳを、溶菌によって前記プロピオン酸菌細胞から回収する、請求項１３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロピオン酸菌株が、以下：プロピオニバクテリウム・イエンセニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）；プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）；プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）；またはそれらの亜種もしくは変異株のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載される組成物に使用するためのＧＯＳを生産するのに使用される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
プロピオン酸菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細菌株（複数可）の増殖に選択的なプレバイオティクス組成物であって、限定はされないが、消化管内でプロピオネートの生産を促進して個人の食欲を制御するのに使用するためのものに関する。
【背景技術】
【０００２】
プレバイオティクスとは、食品成分であって有益な固有の消化管内微生物相（例、乳酸菌またはビフィズス菌）のレベルおよび／または活性を選択的に向上させることができるものであり、プレバイオティクスは食品部門での応用がますます増加していることが見られている。プレバイオティクスは、消化されることがない食品成分であって、健康増進に役立つ大腸の細菌によって選択的に代謝されるものである。してみると、その利用は固有の消化管微生物環境内の有益な変化を促進し、プレバイオティクスは従ってプロバイオティクスの生存可能性を補助することができる。プレバイオティクスは、消化管内で選択的に代謝されることのないほとんどの食品繊維（ペクチン、セルロース類、キシランの様なもの）とは異なっている。プレバイオティクスとしての分類評価基準は、プレバイオティクスが胃の酸性度、哺乳類酵素による加水分解、および上部胃腸管での吸収に抵抗することが必要であり、腸内細菌叢によって発酵され、そして、健全性と健康に関わる腸内細菌の増殖および／または活性を選択的に刺激することである。
【０００３】
プロピオネートの大腸でのレベルを増加させることは個人の食欲を制御することに役立つと考えられている。しかしながら、大腸に直接プロピオネートを投与することは、破壊的消化環境と上部胃腸管の吸収能のために難しい。
【０００４】
フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ；イヌリンおよびオリゴフルクトース）とガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、プレバイオティクス分類評価基準を満たすことが、複数のヒト治療手段試験で繰り返し実証されている。現在利用可能なフラクトオリゴ糖とガラクトオリゴ糖は、ビフィズス菌と乳酸菌（そのどちらもプロピオネートを生産することはできない）の増殖および／または活性を標的としている。現状では、プロピオン酸菌に対する選択的プレバイオティクスは知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、プロピオネート生産細菌の特異的増殖を可能にするプレバイオティクス組成物を提供することである。そのプレバイオティクスがプロピオン酸菌の有用種や株を標的とする場合も望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の態様で提供されるのは、一又は複数のプロピオン酸菌細菌株から生産されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むプレバイオティクス組成物であって、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株の選択的増殖培地として作用し、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株からの逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生産される形態と実質的に同じである、組成物である。
【０００７】
好ましくは、前記ＧＯＳは、以下の細菌株：プロピオニバクテリウム・イエンセニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）；プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）；プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）；またはそれらの亜種もしくは変異株のうちの１つまたは複数によって生産され、および／または、それらに対して選択的である。
【０００８】
ＧＯＳは選択されたプロピオン酸菌の細菌属または株から生産可能であり、そのＧＯＳは前記選択されたプロピオン酸菌の細菌属または株用の選択的増殖培地として作用することができる。
【０００９】
本プレバイオティクス組成物は好ましくは、消化管内のプロピオン酸菌の割合と活性のポジティブなおよび段階的な変化を誘発するのに有効な量で前記組成物中に存在する。微生物相の変化が迅速に必要な場合または現状で存在していない新規細菌株を消化管に種付けするのを補助するために前記組成物が使用されている場合は、量を多くして使用してもよい。
【００１０】
本プレバイオティクス組成物はカプセル化可能である。数あるカプセル化手法が当業者には明白であり、そのうち採用されるものの一つを、消化管を移行する間に必要なプレバイオティクス増殖培地の安定性に適合させる。
【００１１】
プレバイオティクス組成物は、体内の胃腸管環境の少なくとも一部を通過するのを可能にする賦形剤または担体化合物をさらに含んでいてもよく、そして、下部消化管内に効率的に送達および放出可能となる。本プレバイオティクスは濃縮および／または凍結乾燥可能である。本組成物は種々の形態、例えば、（飲むことが可能な）液体形態および／または固形もしくは液体食品と混合可能な粉末形態でのものであってもよい。
【００１２】
本プレバイオティクス組成物は、一又は複数の活性成分（例、ビタミン、ミネラル、植物性化学物質、酸化防止剤、プロバイオティクス細菌株、およびそれらの組み合わせ）と組み合わされてもよい。
【００１３】
ビタミンには、脂肪に可溶なビタミン（例、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミン、ならびにそれらの組み合わせ）が含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、ビタミンには、水溶性ビタミン（例、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＢ（チアミンもしくはＢ１、リボフラビンもしくはＢ２５、ナイアシンもしくはＢ３、ピリドキシンもしくはＢ６、葉酸もしくはＢ９、シアノコバラミンもしくはＢ１２、パントテン酸、ビオチン）、およびそれらの組み合わせ）が含まれる場合がある。
【００１４】
ミネラルには、限定はされないが、ナトリウム、マグネシウム、クロム、ヨウ素、鉄、マンガン、カルシウム、銅、フッ化物、カリウム、リン、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組み合わせが含まれる場合がある。
【００１５】
酸化防止剤には、限定はされないが、アスコルビン酸、クエン酸、ローズマリー油、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リン酸ビタミンＥ、トコフェロール、ジ−α−トコフェリルリン酸エステル、トコトリエノール、α−リポ酸、ジヒドロリポ酸、キサントフィル、β−クリプトキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、β−カロテン、カロテン、カロテノイド混合物、ポリフェノール、フラボノイド、およびそれらの組み合わせが含まれる場合がある。
【００１６】
植物性化学物質には、限定はされないが、カロテノイド、クロロフィル、クロロフィリン、繊維、フラバノイド、アントシアニン、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、フラバノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、テアフラビン、テアルビジン、プロアントシアニン、フラボノール、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチン、フラボノン、ヘスペリジン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、タンゲレチン、フラボン、アピゲニン、ルテオリン、リグナン、植物エストロゲン、レスベラトロール、イソフラボン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、大豆イソフラボン、およびそれらの組み合わせが含まれる場合がある。
【００１７】
プロバイオティクス株を、本組成物中に取り込ませてもよい。そのプロバイオティクス株がプロピオン酸菌細菌株を含むことが好ましい。プロバイオティクス株（複数可）が、ＧＯＳを初期に生産するのに使用されるプロピオン酸菌細菌株（複数可）を含むことが最も好ましい。
【００１８】
本発明のさらなる態様で提供されるのは、食欲の制御および／または調節で使用するためのプレバイオティクス組成物である。代替的または追加的に、本組成物は肥満の管理もしくは治療および／または体重管理に使用するためのものであってもよい。一又は複数のプロピオン酸菌細菌株から生産されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）であって、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株の選択的増殖培地として作用し、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株からの逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生産される形態と実質的に同じであるものを含む組成物は、薬剤もしくは医薬品および／または食品サプリメントとして使用するためのものである場合がある。
【００１９】
本発明のさらなる態様で提供されるのは、肥満の治療に使用するためのプレバイオティクス組成物であって、一又は複数のプロピオン酸菌細菌株から生産されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含み、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株の選択的増殖培地として作用し、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株についての逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生産される形態と実質的に同じである、組成物である。
【００２０】
本発明の別のさらなる態様で提供されるのは、肥満の治療または管理に使用するための薬剤の製造におけるプレバイオティクス組成物の使用であって、前記組成物が微生物によって生産されるオリゴ糖を含み、前記組成物が一又は複数のプロピオン酸菌細菌株から生産されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含み、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株の選択的増殖培地として作用し、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌についての逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生産される形態と実質的に同じである、前記組成物の使用である。
【００２１】
医薬品または薬剤に代替的（または追加的）に、本組成物は食品サプリメント、栄養補助食品、または機能性食品として使用可能である。本発明の別のさらなる態様は、食品サプリメント、栄養補助食品、または機能性食品として使用するためのプレバイオティクス組成物であって、前記組成物が一又は複数のプロピオン酸菌細菌株から生産されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含み、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株の選択的増殖培地として作用し、前記ＧＯＳがプロピオン酸菌細菌株についての逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生産される形態と実質的に同じである、組成物である。
【００２２】
本発明の第一の態様と関連するプレバイオティクス組成物の特徴が、医薬品、薬剤、食品サプリメント、栄養補助食品、または機能性食品として使用するための本組成物に応用可能および相互に代替可能でもあることは、当業者には明白である。
【００２３】
さらにまた、本組成物は、既存食品（例、ヨーグルト）中に、または、食物と容易にブレンド可能もしくは液体飲料にすることができる粉末として、組み込まれてもよい。
【００２４】
本発明のさらなる態様で提供されるのは、本明細書中に上記した組成物を投与して、プロピオネート分泌細菌の増殖を促進することによって、個人の下部消化管内のプロピオネートレベルを増加させる方法である。
【００２５】
本発明の別の態様で提供されるのは、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の生産方法であって、一又は複数のプロピオン酸菌株を、５０％までのラクトースを含む増殖培地中、５５℃までの温度で２４時間までの間、嫌気的条件下で増殖させる工程と、前記プロピオン酸菌細胞からＧＯＳを回収する工程とを含む、方法である。
【００２６】
好ましくは、前記一又は複数のプロピオン酸菌株を、４０％までのラクトースを含む増殖培地中、５０℃までの温度で、２４時間までの間増殖させる。前記一又は複数のプロピオン酸菌株を、約２０〜約４０％の範囲のラクトースを含む増殖培地中、約３５〜約５０℃の範囲の温度で、約１０〜約１４時間増殖させてもよい。
【００２７】
ＧＯＳは、種々の方法によって回収可能であるが、溶菌して細胞から回収することが好ましい。そのような溶菌は、一又は複数の凍結融解工程が関与する場合がある。
【００２８】
本プロピオン酸菌株は、以下：プロピオニバクテリウム・イエンセニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）；プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）；プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）；またはそれらの亜種もしくは変異株のうちの１つまたは複数から選択可能である。
【００２９】
好ましくは、選択されたプロピオン酸菌株（複数可）内でＧＯＳを生産する方法を最適化する。
【００３０】
本明細書中で上記した方法を使用して、本発明の組成物の態様で使用するためにＧＯＳを生産することができる。
【００３１】
本発明の実施形態を、例示のためだけに今から以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、各種温度と時点で計算した、プロピオニバクテリウム・イエンセニーの最も量の多いＧＯＳ種間の比率を示すグラフである。
【図２】図２は、選択された２種類のプロピオン酸菌株の３０℃と５０℃でのＧＯＳ形成率２つを示すグラフである。
【図３】図３は、選択された細胞株の３０℃と５０℃での理論ＧＯＳ形成率に対する実際のＧＯＳ形成率の比率を示すグラフである。
【図４】図４は、選択された株における初期スクリーニング実験と後期ＧＯＳ合成実験でのβーガラクトシダーゼ活性の差の解析を示すグラフである。
【図５】図５は、選択された株のβーガラクトシダーゼ発現の依存関係を（対数増殖期／定常期の比率によって）解析したものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
機構的には、グリコシダーゼは全て、水をその好適なアクセプター分子として使用する転移酵素である。適切な条件下（例、基質である炭水化物の濃度が高いもの）では、しかしながら、これらの酵素は、その基質（グリコシルドナーとして作用するもの）由来の単糖部分を、他の基質または非基質炭水化物（グリコシルアクセプターとして作用するもの）へと転移することができる。典型的には、これらの反応産物は、量は異なるが全ての可能なグリコシド結合を含む複合混合物である。その反応は動力学的に制御されているので、合成される結合のプロフィールは、生産酵素によってこれらの結合が加水分解される速度定数として特定されることになる。従って、オリゴ糖は、胃腸生態系に存在する他の生物よりもそのオリゴ糖を生産する生物によってより容易に代謝可能となる。このアプローチが研究室の試験では有望であることが示されている。
【００３４】
多くの酵素合成反応では、しかしながら、ラクトースに加えて、アクセプターとして作用する他の炭水化物を含ませることが可能である。このように、新規構造を含む新規混合物が構築可能となっている。
【００３５】
本実験の基礎となるのは、プロピオン酸菌株内でβーガラクトシダーゼを逆方向に利用して新規ＧＯＳを生産することであった。通常、βーガラクトシダーゼはラクトースを加水分解する。しかしながら、基質濃度と温度に関して反応条件を変化させることによって、この酵素は逆方向に作用して、ラクトースのオリゴ糖バージョン（ＧＯＳ）を生成する。
【実施例】
【００３６】
実験例
実験を二つの相で実施した。第一相では、７７株について、ｏｒｔｈｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）の分解に基づくβ−ガラクトシダーゼ加水分解活性の検出を行ってスクリーニングした。増殖条件は、総合的増殖性を向上させるように調整した。総β−ガラクトシダーゼ活性を評価して、最も高い活性を示す株を、その後、第二相へと進めた。第二相中では、実行可能性試験を実施して、選択した株について、実際のＧＯＳ合成能をスクリーニングした。
【００３７】
７７のプロピオン酸菌株のスクリーニングは、ＯＮＰＧの分解に基づくβ−ガラクトシダーゼ加水分解活性の検出を行って実施した。総β−ガラクトシダーゼ活性を、ミラーユニット（Ｍｉｌｌｅｒ  ｕｎｉｔ）で評価した。
【００３８】
プロピオン酸菌におけるβ−ガラクトシダーゼ活性
様々なプロピオン酸菌株（異なる種および亜種を含むもの）を、−８０℃のストックから、標準的９６ウェルプレート中の２００μｌの１％グルコース添加ＬＢ培地で３０℃、７２時間前培養した。培養物を１００倍再稀釈して１６００μｌの１％グルコース添加ＬＢにして、ディープウエルプレートに入れた。増殖は、９６時間３７℃の嫌気的条件で行い、その培養物を１０倍希釈後、ＯＤ６００を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性を評価するために、細胞をまず４℃、５０００×ｇで遠心分離した。その後、得られたペレットを、８００μｌの０．０５ＭのＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ＝７．０）中で、０．５グラムのシリカビーズ（０．１ｍｍ）を使用して溶解した。標準的プロトコルを使用して、その上清を用いて３０℃でのβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【００３９】
下の表１は、上記プロトコルを使用してスクリーニングしたプロピオン酸菌株の結果を示す。
【００４０】
【表１−１】
2018515576.tif 000003
【００４１】
【表１−２】
2018515576.tif 000004
【００４２】
【表１−３】
2018515576.tif 000005
【００４３】
【表１−４】
2018515576.tif 000006
【００４４】
【表１−５】
2018515576.tif 000007
【００４５】
最も高いβ−ガラクトシダーゼを発現する株をその後、本試験の次の相に含めた。
【００４６】
選択された株のＧＯＳ生産の解析
以下の増殖法を使用した。
プロピオン酸菌株を、−８０℃ストックから、１００ｍｌの１％グルコース添加ＬＢ培地中で３０℃、７２時間前培養した。培養物を、１％グルコース添加ＬＢ培地で満たした１リットルボトル中で、５０、２００、１０００、および４０００倍希釈した。増殖は、３０℃で、回収目的時に対数増殖期培養および定常期培養を確保するよう計算された設定時間実行した。
【００４７】
選択された株のβ−ガラクトシダーゼ活性の解析
β−ガラクトシダーゼ活性を解析するために、細胞を１５分間、４℃、５０００×ｇで遠心分離した。ペレットを、リン酸緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を使用して、元の容量の１％となるように再溶解した。その後、各細胞不含有抽出物の１２５０μｌのアリコート８つを、ディープウエルプレートへと移した。
【００４８】
ペレットはその後、８００μｌの０．０５ＭのＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ＝７．０）中で、０．５グラムのシリカビーズ（０．１ｍｍ）を使用して溶解した。細胞破壊装置中で、３０秒間のバーストを４回繰り返した。同じ細胞不含有抽出物の溶解済みペレットをその後再び合わせて、一つの１５ｍｌのＧｒｅｉｎｅｒチューブに入れた。培養物は、９６ウェルプレート遠心分離機を使用して、指定時間後に５０００×ｇで１０分間遠心分離した。２０μｌの細胞溶解物上清を、１８０μｌのリン酸緩衝液Ａ（８．９グラム／ｌのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、６．９グラム／ｌのＮａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中へと溶解した。
【００４９】
さらに、細胞溶解物リン酸緩衝液混合液の１０、１００、および１００倍希釈物を調製し、開始濃度が１ｍＭとなるようにＯＮＰＧ保存溶液（リン酸緩衝液中２０ｍＭ）を加えた。ＳｗｉｆｔＩＩアプリケーションソフトウェアを使用するＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２０００  ＵＶ／可視光分光光度計を用いて、４２０ｎｍでの吸光度を経時的に観測し、上記した希釈物を使用して、そのミラーユニットを計算した。
【００５０】
ＧＯＳ合成法
リン酸緩衝液Ｂを使用して総容量１０ｍｌへとなるように希釈して、活性を２ｍＭ／分へと標準化した。１３．５ｍｌのリン酸緩衝液Ｂを含む１５ｍｌのＧｒｅｉｎｅｒチューブを、３０℃、５０℃、および６０℃へと前もって温めた。１．５ｍｌの細胞不含有抽出物（２ｍＭ／分のβ−ガラクトシダーゼ活性）を前もって温めていたＧｒｅｉｎｅｒチューブに加えることによって、反応を開始させた。反応を、３０秒間隔で進めた。０、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、および１４４０分間隔で、１ｍｌのサンプルをその後、エッペンドルフチューブへと移した。ＧＯＳ形成反応をその後１００℃で５分間インキュベーションすることによって停止させて、そのサンプルをすぐに−８０℃で保存した。
【００５１】
見られたβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいて、ＧＯＳ形成率の実際の活性が推定可能である。各種に関する換算係数を計算した。
【００５２】
下の表２は３０℃での推定ＧＯＳ形成率を示す。
【００５３】
【表２】
2018515576.tif 000008
【００５４】
下の表３は５０℃での推定ＧＯＳ形成率を示す。
【００５５】
【表３】
2018515576.tif 000009
【００５６】
ＧＯＳ解析法
アンペロメトリック電気化学検出法（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いた高速陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、ＧＯＳ解析を実施した。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析はＰＡＤ付きＤＸ−５００ＢＩＯ−ＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ社）上で実行した。ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラム（サイズ２５０ｍｍ＊４ｍｍ；２２℃での流速１ｍＬ／分）で、ガラクトオリゴ糖を分離した。ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１ガードカラム（サイズ５０＊４ｍｍ  ｉ．ｄ．）（Ｄｉｏｎｅｘ社）を、カラム保護のために使用した。解析に使用する溶離液は、（Ａ）５００ｍＭ  ＮａＯＡｃ＋１００ｍＭ  ＮａＯＨ；（Ｂ）１００ｍＭ  ＮａＯＨ；および（Ｃ）ミリＱ水であった。
【００５７】
溶離液ＡとＢを混ぜて、以下の勾配を形成させた：０〜５分は１００％のＢ、その後、７３分かけて０〜２６％のＡを形成させた。各実施後、カラムを６分間１００％のＡで洗浄し、そして、１００％のＢで１０分間再平衡化した。ピークの同定は、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００９，５７，８４８８−８４９５に記載されるＨＰＬＣクロマトグラムのピーク分布との比較に基づいて行った。ラクトースを、溶出時間標準化の基準物質として使用した。
【００５８】
結果
形成量の多いＧＯＳ種間の比率を決定するために、プロピオニバクテリウム・イエンセニーで最も量の多いＧＯＳ種を定量した。そして、それらの２種間の比率を各種温度と時点で計算した。下の表４に示され、図１で記載されるように、その種間の比率は温度依存性が強く、時間依存性は小さいことが分かった。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
標準的熱力学に基づくと、５０℃でのβ−ガラクトシダーゼ反応は、３０℃でのものよりも４〜８倍高い率で起こると推定された。ＧＯＳ形成率が直線的であると期待されるステージでのテストサンプルに関して、そのＧＯＳ形成率をグラフにした。下の表５に示され、図２で記載されるように、どのプロピオン酸菌株においても、活性の有意な増加は検出されなかった。
【００６１】
【表５】
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【００６２】
本試験の第二相でのミラーユニットで測定されたβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいて、理論ＧＯＳ形成率を計算した。下の表６は、理論ＧＯＳ形成率に対する実際のＧＯＳ形成率の比を示し、図３は３０℃と５０℃の両方に関してグラフにしたものを示す。驚くべき且つ有利なことに、ＧＯＳ形成率は、理論ＧＯＳ形成率よりもいつも高いことが分かった。
【００６３】
【表６】
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【００６４】
実験の第一相で分析されたβ−ガラクトシダーゼ活性は一般的に、その後の相で測定された活性よりも高いように見えた。方法論に一貫した誤りがあるかどうかを確認するために、第一相と第二相での活性の比率を計算し（下の表７で示される）、そして、図４で示すグラフを描いた。図４は、ほとんどのサンプルに関して、５倍の差が検出されることを示す。いくつかのサンプルは、さらに大きな差を示し、これらの差は細胞の増殖期の違いに主としてよるものであることが予想される。
【００６５】
【表７】
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【００６６】
β−ガラクトシダーゼの発現がその生物の増殖期に依存していたかどうかを評価するために、その活性（ミラーユニットで測定したもの）を、全ての株に関してグラフ化した。表８と図５は、それぞれそのデータとグラフを示す。ほとんどの株に関して、対数増殖期：定常期での比率≧１であることが分かり、β−ガラクトシダーゼ活性は、定常期よりも対数増殖期の方が高いことを示している。これらの差は限定的であり、定常期でのバイオマス生産量がより高いことが、β−ガラクトシダーゼ活性が低いことを相殺している可能性がある。
【００６７】
【表８】
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【００６８】
結論
全てのプロピオン酸菌株はＧＯＳを生産し、その細胞不含有抽出物のＧＯＳ形成率は、３０℃と５０℃でほぼ同じであった。全てのサンプルは、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の酵素によって生産されるＧＯＳとは異なるＧＯＳプロフィールを示す。具体的には、株３６４（プロピオニバクテリウム・イエンセニー）は、有意に高いＧＯＳ生産量を示した。一般的に、ＧＯＳ合成の後相では、スクリーニング第一相に比べて、β−ガラクトシダーゼ活性は５倍低かった。
【００６９】
これらの実験が示したのは、プロピオン酸菌株がＧＯＳを生産可能なことであり、そのＧＯＳは選択されたプロピオン酸菌プロバイオティクス細菌株のための選択的増殖培地として潜在的に使用可能であり、その結果、下部消化管内での増殖を促進して、食欲の調節に役立つことである。
【００７０】
前記実施形態は、特許請求の範囲によって可能とされる保護範囲を限定する意図はなく、むしろ本発明が如何に実施可能かを示す例として記載されることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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