(57)【要約】  【解決手段】  二鎖インスリンアナログは、位置Ｂ１０におけるアスパラギン酸、位置Ｂ２４におけるペンタ−フルオロ−フェニルアラニン、任意で位置Ａ８におけるヒスチジンまたはグルタミン酸、任意で位置Ａ１３及び／またはＡ１４及び／またはＢ２８及び／またはＢ２９における追加の置換または改変を含有する。そのアナログは、ヒトインスリンなどの哺乳類インスリンのアナログであってもよく、任意で、（ｉ）Ｂ鎖からの１、２、または３残基のＮ末端欠失、（ｉｉ）少なくとも１つの酸性残基を含有する、Ｂ鎖のモノペプチドまたはジペプチドＣ末端伸長、及び（ｉｉｉ）当技術分野においてインスリンの安定性を増強することが知られている他の改変を含みうる。インスリンアナログ単量体あたりの亜鉛イオン０．００〜０．１０のモル比での亜鉛イオンの非存在下または存在下で、少なくとも範囲７．０−８．０にあるｐＨ値において可溶溶液の、Ｕ−１００〜Ｕ−１０００の連続的強度にある、上記のアナログの製剤。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンアナログであって、野生型ヒトインスリンと比較した位置Ｂ１０におけるＡｓｐ置換と、野生型ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２４におけるペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ置換とを含有するＢ鎖ポリペプチドを有する、インスリンアナログ。
【請求項２】
請求項１記載のインスリンアナログであって、オルニチン及びＧｌｕから選択される、野生型ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２９における置換を追加で有する、インスリンアナログ。
【請求項３】
請求項２記載のインスリンアナログにおいて、前記野生型ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２９における置換はオルニチンである、インスリンアナログ。
【請求項４】
請求項１記載のインスリンアナログであって、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、及びＡｌａからなる群から選択される、ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２８における置換を追加で有する、インスリンアナログ。
【請求項５】
請求項４記載のインスリンアナログにおいて、前記ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２８における置換はＬｙｓであり、かつ、ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２９におけるＰｒｏ置換を追加で有する、インスリンアナログ。
【請求項６】
請求項１記載のインスリンアナログであって、１〜３アミノ酸のＢ鎖ポリペプチドＮ末端欠失を追加で有する、インスリンアナログ。
【請求項７】
請求項１〜６記載のインスリンアナログであって、野生型ヒトインスリンと比較した、
Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ以外の任意のアミノ酸から選択される位置Ａ８における置換と、
ＴｒｐまたはＴｙｒから選択される位置Ａ１３における置換と、
位置１４におけるＴｙｒ置換と、
Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、及びＧｌｙからなる群から選択される位置Ａ２１における置換と
からなる群から選択される、１つまたはそれ以上の置換を含有するＡ鎖ポリペプチドを追加で有する、インスリンアナログ。
【請求項８】
患者の血糖レベルを低下させるための医薬製剤であって、前記医薬製剤は、野生型ヒトインスリンと比較した位置Ｂ１０におけるＡｓｐ置換と、野生型ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２４におけるペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ置換とを有するＢ鎖ポリペプチドを含有するインスリンアナログを有する、医薬製剤。
【請求項９】
請求項８記載の医薬製剤において、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、オルニチン及びＧｌｕから選択される、野生型ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２９における置換を追加で有する、医薬製剤。
【請求項１０】
請求項９記載の医薬製剤において、前記野生型ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２９における置換は、オルニチンである、医薬製剤。
【請求項１１】
請求項８記載の医薬製剤において、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、及びＡｌａからなる群から選択される、ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２８における置換を追加で有する、医薬製剤。
【請求項１２】
請求項９記載の医薬製剤において、前記ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２８における置換はＬｙｓであり、かつ、ヒトインスリンと比較した位置Ｂ２９におけるＰｒｏ置換を追加で有する、医薬製剤。
【請求項１３】
請求項８記載の医薬製剤において、前記Ｂ鎖ポリペプチドは、１〜３アミノ酸のＢ鎖ポリペプチドＮ末端欠失を追加で有する、医薬製剤。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の医薬製剤であって、野生型ヒトインスリンと比較した、
Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ以外の任意のアミノ酸から選択される位置Ａ８における置換と、
ＴｒｐまたはＴｙｒから選択される位置Ａ１３における置換と、
位置１４におけるＴｙｒ置換と、
Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、及びＧｌｙからなる群から選択される位置Ａ２１における置換と
からなる群から選択される、１つまたはそれ以上の置換を含有するＡ鎖ポリペプチドを追加で有する、医薬製剤。
【請求項１５】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の医薬製剤であって、野生型ヒトインスリンと比較した、
Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ以外の任意のアミノ酸から選択される位置Ａ８における置換と、
ＴｒｐまたはＴｙｒから選択される位置Ａ１３における置換と、
位置１４におけるＴｙｒ置換と、
Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、及びＧｌｙからなる群から選択される位置Ａ２１における置換と
からなる群から選択される、１つまたはそれ以上の置換を含有するＡ鎖ポリペプチドを追加で有し、
前記製剤はインスリンアナログ単量体あたり亜鉛イオン０．００〜０．１０のモル比で亜鉛イオンを含有し、
前記製剤のｐＨはｐＨ７．０〜ｐＨ８．０である、医薬製剤。
【請求項１６】
請求項１５記載の医薬製剤において、前記インスリンアナログ製剤は少なくともＵ−１００の強度で製剤化される、医薬製剤。
【請求項１７】
請求項１６記載の医薬製剤において、前記インスリンアナログ製剤は少なくともＵ−５００の強度で製剤化される、医薬製剤。
【請求項１８】
請求項１７記載の医薬製剤において、前記インスリンアナログ製剤はＵ−５００〜Ｕ-１０００の強度で製剤化される、医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府により助成される研究または開発に関する記述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより助成金第ＤＫ０４０９４９号、及び第ＤＫ０７４１７６号のもと授与された、共同契約下の政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、より高い熱力学的安定性、より低い分裂促進性、及び亜鉛イオンの非存在下で高いタンパク質濃度（１−５ｍＭ）における速効型製剤の容易性などの、強化された薬学的特性を呈するポリペプチドホルモンアナログに関する。より具体的には、本発明は、（野生型インスリンによるシグナリングと比較して）改変されたまたは選択的な受容体後シグナリング特性を与えるインスリンアナログに関する。本発明のインスリンアナログは、従って、アナログが、（ｉ）強化された熱力学的安定性、（ｉｉ）０．６ｍＭより大きいタンパク質濃度におけるより低い自己会合、及び（ｉｉｉ）血液グルコース濃度に同様の低下を呈するためには哺乳類における皮下または静脈内注射の際にはより多数のタンパク質分子が必要とされるかもしれないが、ヒトインスリン分子の生物学的効能の少なくとも一部を引き起こすような、アミノ酸置換の新規の組合せを含有する２つのポリペプチド鎖からなる。
【０００３】
治療薬及びワクチンを含む非標準的タンパク質の工学的操作は、幅広い医学的及び社会的利益を有しうる。人間、他の哺乳類、脊椎生物、無脊椎生物、または真核細胞全般のゲノム中にコードされるような天然起源のタンパク質は、細胞のコンテキスト内では最適に機能するように進化してきたかもしれないが、治療用適用には最適ではないかもしれない。そのようなタンパク質のアナログは、改良された、生物物理学的、生化学的、または生物学的特性を呈しうる。タンパク質アナログの利点は、増強された「オンターゲット」活性（血液グルコース濃度の低下をもたらす代謝の代謝調節など）を、がん細胞の成長の促進または脂質の生合成上昇などの、意図せずかつ好ましくない副作用の低下とともに達成することであろう。そのようなタンパク質工学的操作の別の一利点は、より高い強度の製剤を実現させるためのタンパク質濃度における迅速な作用開始の維持であろう。さらに別の社会的利点の例は、室温またはそれより高い温度における分解に対する増強された耐性が、輸送、流通、及び使用を容易にすることであろう。治療用タンパク質の例は、インスリンにより提供される。野生型ヒトインスリン、及び他の哺乳類のゲノム中にコードされるインスリン分子は、ＲＮＡスプライシングの代替的様式により、または翻訳後糖鎖付加の代替的パターンにより生じる受容体アイソフォームによらず、複数の臓器及び様々な種類の細胞において、インスリン受容体に結合する。野生型インスリンはまた、相同の１型インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）にも、より低いが顕著な親和性で結合する。
【０００４】
インスリンは、脊椎動物においてはプロインスリンと呼ばれる単鎖前駆体の生合成産物である、二鎖タンパク質分子である。ヒトプロインスリンの配列及び構造は、それぞれ図１Ａ及び１Ｂ中に図解され、ヒトインスリンの配列は図１Ｃ中に示される。インスリンの２つのポリペプチド鎖は、それぞれＡ及びＢと呼ばれる。一方または他方の鎖における特定の残基は、以下では、標準的な３文字コード（例えば、アラニンに対してはＡｌａ、アスパラギン酸に対してはＡｓｐ）、それに続く鎖（ＡまたはＢ）及びその鎖中の残基番号を指定する上付き文字により示される。例えば、Ｂ鎖の位置１０におけるヒスチジンはＨｉｓＢ１０、Ｂ鎖の位置１２におけるバリンはＶａｌＢ１２、またＡ鎖の位置８におけるトレオニンはＴｈｒＡ８と示される。「インスリンアナログ」は、異なる種類のアミノ酸による１つもしくはそれより多いアミノ酸残基の置換により、または異なる原子もしくは原子の組合せによるそのような残基の側鎖もしくは主鎖中の１つもしくはそれより多い原子の改変により野生型インスリンに関連する、分子のクラスを指す。当技術分野において既知のインスリンアナログの例はインスリンｌｉｓｐｒｏであり、インスリンｌｉｓｐｒｏにおいては、ＰｒｏＢ２８がＬｙｓにより置換され、ＬｙｓＢ２９がＰｒｏにより置換されている。インスリンｌｉｓｐｒｏ（ＫＰ−インスリンとも呼ばれる）は、製品Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）の有効成分である。
【０００５】
当技術分野においては、皮下デポからのインスリンアナログの吸収速度を増強するために、インスリンのＢ鎖が１または数箇所の位置において標準的なアミノ酸置換により改変されうることが知られている。さらなる医学的利点の例は、Ｕ−２００〜Ｕ−１０００の範囲、つまり、従来型のＵ−１００インスリン製品よりも二倍から十倍の間（この呼称法においては「Ｕ−Ｘ」はｍｌの溶液または懸濁液あたりＸ内部単位を指す）にある強度の製剤において迅速な作用開始が保持されるような、可溶性インスリンアナログ製剤の薬物動態学的特性の最適化であろう。より高い強度のインスリン製剤は、顕著なインスリン抵抗性を呈する患者にとって格別な利益となることを約束し、また、リザーバー寿命を延長する、あるいは新世代のポンプ技術においてリザーバーの小型化を可能にするように、内部または外部インスリンポンプにおいて価値があるものともなりうる。既存のインスリン製品は、一般に、>Ｕ−２００（２００国際単位／ｍｌ）の製剤強度を達成するようにインスリンまたはインスリンアナログの濃度を上昇させると、延長化された薬物動態学的及び薬力学的特性を呈する。そのような延長化は、皮下注射に際する血糖症のプランディアルな管理に対するそのような製品の効能を損ない、またポンプベースの連続的な皮下注入の効能及び安全性を損なう。これらの欠点を鑑みて、速効型インスリンアナログ製剤の治療上及び社会的利益は、Ｕ−２００〜Ｕ−１０００の強度における迅速な作用を維持するインスリンアナログの工学的操作により、増強されるであろう。もし新規の可溶性インスリンアナログが、野生型ヒトインスリンと比較して１型ＩＧＦ受容体に対してより弱い親和性を呈するならば、追加の利益が生じるであろう。もし濃縮されたインスリンアナログ製剤が、ヒトがん細胞株のインスリン刺激性増殖を監視するために開発されたアッセイにおいて、より低い分裂促進性を呈するならば、さらなる追加の治療的及び社会的利益が生じるであろう。
【０００６】
インスリンの投与は、糖尿病のための治療法として長く確立されてきた。糖尿病を有する患者における従来型インスリン補充療法の主な目標は、ヒト健常者特有の正常範囲より上または下への変動を防止するための、血液グルコース濃度の厳格な管理である。正常範囲より下への変動は、即座に現れるアドレナリン様または神経低糖症の症状と関連付けられ、それは重い発作では痙攣、昏睡状態、及び死に至らしめる。正常範囲より上への変動は、網膜症、失明、及び腎不全を含む微小血管疾患の長期的危険性の上昇と関連付けられる。血糖管理の重要性は当技術分野においては周知であるものの、二型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の病態生理学は、インスリンが血糖管理において非効果的となりそれでもなお分裂促進性と過剰な脂質合成とを駆動し続ける、選択的インスリン抵抗性（ＳＩＲ）によっても特徴づけられる。肝臓及び筋肉中における脂質の蓄積は、グルコース制御のバランスを崩し、インスリン抵抗性を上昇させ、Ｔ２ＤＭの進行及びその合併症を加速させる。我々の知る限りでは、現在、そのような撹乱された細胞及び臓器特異的シグナリングをリバランスする（認可された、または臨床試験中の）インスリン製品は存在しない。我々は従って、そのような製品は、Ｔ２ＤＭにおける新しい治療パラダイムを生み、顕著な長期的健康利益、及び総計医療費の低下をもたらすであろうと予期する。
【０００７】
インスリンは、脊椎動物での代謝における中心的な役割を果たす小球状タンパク質である。インスリンは、２１残基を含有するＡ鎖、及び３０残基を含有するＢ鎖の２鎖を含有する。そのホルモンは、膵β細胞中にＺｎ２＋安定化六量体として貯蔵されているが、血流中ではＺｎ２＋なし単量体として機能する。インスリンは、単鎖前駆体であるプロインスリンの産物であり、プロインスリンにおいては、連結領域（３５残基）がＢ鎖のＣ末端残基（残基Ｂ３０）をＡ鎖のＮ末端残基へと連結させる。様々な証拠が、プロインスリンはインスリン様コアと無秩序な連結ペプチドとからなることを示す。３つの特定のジスルフィド架橋（Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７、及びＡ２０−Ｂ１９）の形成は、粗面小胞体（ＥＲ）におけるプロインスリンの酸化的折り畳みと共役すると。プロインスリンは、膵臓ベータ細胞内のグルコース制御性分泌顆粒における亜鉛インスリン六量体としての貯蔵への途中で、トランスゴルジ網中でインスリンに変換される。インスリンの典型的な結晶構造（亜鉛六量体から抽出された１つのプロトマー）が図２中に示される。
【０００８】
本発明は、改変されたまたは選択的な受容体後シグナリング特性を呈する、Ｕ−１００〜Ｕ−１０００の範囲の強度で中性ｐＨにある可溶性製剤である、速効型インスリンアナログを工学操作する医学的及び社会的需要により動機付けられた。そのような製品に対する障壁は、どのようにインスリン受容体の結合が細胞膜をまたぐシグナル伝達をもたらし受容体の細胞質部分の自己リン酸化につながるかの、有力なパラダイムにより、長い間提唱されてきた。そのような自己リン酸化は、次いで、（ｉ）形質膜の細胞内区画からのＧＬＵＴ４グルコーストランスポーターの移行、（ｉｉ）がん細胞の成長及び増殖を促進する遺伝子の転写活性化、（ｉｉｉ）細胞内におけるグリコーゲンとしてのグルコース分子の貯蔵、及び（ｉｖ）脂質の細胞内生合成を介するインスリン分子の代謝変換を引き起こす経路などの、様々な受容体後シグナリング経路を活性化する。
【０００９】
インスリン分子が、一つの受容体後シグナリング経路が選択的に増強または減弱化されうるように改変されうるか、またはどのように改変されうるかは、一般的に知られていない。未変化のインスリン受容体の構造は今日まで決定されていないため、細胞の外側（受容体の「エクトドメイン」）へのインスリンの結合が、どのように細胞の内部へ（つまり受容体の細胞質ドメインへ）のシグナルの伝播につながるかは知られていない。アポエクトドメインの結晶構造は、当技術分野においては、低解像度では反転Ｖ二量体集合体（図３）として知られているが、インスリン分子が結合した結晶は得られなかった。ドメイン最小化された「マイクロ受容体」に結合したインスリンの結晶構造も、低解像度で決定されているが（図４）、この構造は、膜をまたぐシグナリング及び受容体後経路へのシグナルの伝達に必要とされる、受容体のベータサブユニットを欠如する。従って、当技術分野においては、インスリン分子の改変が、様々な受容体後シグナリングのアウトプットの相対的強度に影響を与えうるか、またはどのように影響を与えうるかは知られていない。
【００１０】
受容体後シグナリングのバランスの好ましくない変化を呈することが当技術分野において知られているインスリンアナログは、ＡｓｐＢ１０インスリンによって提供される。このアナログの設計及び調製への当初の動機は、インスリン自己集合における構造的役割に基づいた。天然型の六量体集合体においては、野生型残基（ＨｉｓＢ１０）は、六量体の中心軸において２つのアキシャル亜鉛イオンを配位させるように機能する。ＨｉｓＢ１０のＡｓｐによる置換は、このアキシャルモードでの亜鉛イオンの結合を損なわせ、古典的六量体の三量体関連表面による高次自己集合を阻止する。ＡｓｐＢ１０は、一般に、好ましいＣ−Ｃａｐ残基として及び（ｉ、ｉ＋４）塩橋の潜在的形成による静電メカニズムにより、亜鉛フリー単量体または二量体における中心Ｂ鎖αヘリックスの部分的安定性を増強させることが予期されうる。タンパク質安定性の理論的基板によらず、ＨｉｓＢ１０のＡｓｐによる置換は、化学的変性実験により調査されるように、亜鉛フリー単量体の熱力学的安定性を実際に増大させることが観察された。ＡｓｐＢ１０はまた、インスリン受容体に対するインスリンの親和性も増強させ、またそれに並行して単離脂肪細胞における脂質生成を刺激する能力を増強させる。
【００１１】
ＨｉｓＢ１０のＡｓｐによる置換により与えられる上の好ましい構造的及び生物物理学的特性にもよらず、その臨床的使用は、野生型インスリンと比べＡｓｐＢ１０インスリンによるＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの慢性的処理における乳腺腫瘍の過剰発生の発見と関連して、（ヒト乳がんから派生する細胞株を含む）新生細胞株の細胞培養アッセイにおける分裂促進性上昇により妨げされた。本発明は、ＡｓｐＢ１０により与えられる好ましい特性（安定性増強、及び二量体化ステージより後の自己集合不全など）は保持される一方で、細胞培養アッセイにおける分裂促進性の好ましくない増加は軽減され、あるいは野生型インスリン自身のそれよりも低い分裂促進性のレベルを実現するように確保されさえするような、インスリン分子における非標準型アミノ酸置換の組合せ（ペンタ−フルオロ−ＰｈｅＢ２４）を提供する。さらに驚くべきこととして、ＡｓｐＢ１０のペンタ−フルオロ−ＰｈｅＢ２４との組合せは、筋肉における受容体後シグナリング経路のバランスを、グリコーゲンの形成が脂質の形成と比べ増強されるように、好ましく改変する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の驚くべき一態様は、これらの補足的目標が、Ｂ鎖のＣ末端βストランドにおけるアミノ酸置換（ＰｈｅＢ２４→ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ）を伴う酸性ＡｓｐＢ１０置換の共導入により達成されうることである。この改変ＰｈｅＢ２４→ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅは、それのみでは、インスリンの生物学的活性を顕著に損なわせる。この改変の組合せは、（ｉ）別の無関係の目的、つまり自己集合能力のあるプランディアルインスリンアナログの設計ために、Ｂ鎖のＮ末端部分における塩基性置換（ＡｓｎＢ３→Ｌｙｓ）と以前に組み合わせられた、Ｂ鎖のＣ末端部分におけるアミノ酸置換（ＬｙｓＢ２９→Ｇｌｕ）、または（ｉｉ）二量体化の強度を低下させ、あるいは通常は野生型インスリン中の位置Ｂ２９におけるＬｙｓの存在と関連付けられるトリプシン部位を除去することを目的とする、位置Ｂ２８及び／またはＢ２９における他の置換と、さらに組み合わせられうる。本発明のインスリンアナログは従って、上記のＢ１０及びＢ２４改変をコアの設計要素として含有する。これは、この組合せが、ＡｓｐＢ１０の有利な生物物理学的特性を維持しまたは増強させつつ、新規のシグナリング特性を与え、かつその不利な特性を軽減または回避するという、我々の驚くべき観察に基づく。本発明のインスリンアナログは、また、位置Ａ８における非β分岐置換、残基Ｂ３１を含むようなＢ鎖のＣ末端伸長（Ｂ鎖残基３１、または残基Ｂ３１−Ｂ３２（Ｂ鎖の残基３２）も含有しうる。上記のアナログの組合せは、任意で、Ｎ末端Ｂ鎖残基Ｂ１、Ｂ１−Ｂ２、またはＢ１−３の欠失によりさらに改変されうる。
【００１３】
インスリンアナログが、自己集合不全、従って皮下集合に伴う速効性を呈し、それでもなお、実用的なインスリン製品として安全かつ効果的な製剤を可能にするよう、化学的及び物理的分解に関し十分な安定性を維持するように同時に設計されうることは、本発明の第二の驚くべき一態様である。そのような安定性は、ＡｓｐＢ１０とペンタ−フルオロ−ＰｈｅＢ２４とにより与えられる組合せ特性の結果でもある。上記のものに分裂促進性の低下が伴うことは、さらなる驚きである。我々は、本発明の産物が、肥満、２型糖尿病、及び顕著なインスリン抵抗性を有する西洋社会における患者に、不均衡に利益を与えることを想像する。そのような臨床的特徴は、アフリカ系アメリカ人、ヒスパニック系アメリカ人、及びアメリカ先住部族を含む十分に代表されないマイノリティーにますます負荷を課す。ナノモルのタンパク質あたりの生物学的活性の増強ゆえ、本発明の産物は、インスリンポンプのリザーバー寿命を延長すること、及びそのようなポンプの小型化を可能にすることにおいてもまた、有用となるだろう。
【００１４】
さらに、皮下注射に際して速効型の薬物動態学的及び薬力学的特性を提供するインスリンアナログを提供することも、本発明の一態様である。本発明のアナログは、位置Ｂ１０においてアスパラギン酸（ＡｓｐＢ１０）、位置Ｂ２４においてペンタ−フルオロ−ＰｈｅＢ２４（５ＦーＰｈｅＢ２４）、また一実施形態においては、Ｂ２９においてグルタミン酸またはオルニチン（ＧｌｕＢ２９またはＯｒｎＢ２９）をも含有する。そのようなアナログは任意で、位置Ａ８において非β分岐アミノ酸置換、最大で二残基（Ｂ３１及びＢ３２）及び二残基（Ｂ３１及びＢ３２）を含むＢ鎖のＣ末端伸長、並びに／または最大で３残基（Ｂ１−Ｂ３）及び３残基（Ｂ１−Ｂ３）を含むＢ鎖のＮ末端欠失を含有しうる。残基Ｂ２８は、Ｐｒｏ（野生型インスリンと同様）、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、またはＡｌａでありうる。位置Ａ１３は、任意でＬｅｕ、Tｒｐ、またはＴｙｒであってもよく、位置Ａ１４は任意でＴｙｒまたはＧｌｕでありうる。残基Ｂ３０は、任意で存在しなくてもよい。本発明のインスリンアナログは、当技術分野において速効作用を与えることが知られている位置Ｂ２８など、ＡまたはＢドメイン中の他の部位において標準型または非標準型アミノ酸置換を任意で含有してもよく、またＢ鎖の一または二残基伸長（残基Ｂ３１及びＢ３２）を任意で含有してもよい。アナログが、野生型インスリンのそれと比較して同等またはより大きい熱力学的安定性、及び野生型インスリンのそれと比較して同等または低い、ヒト乳がん細胞株の組織培養アッセイにおける分裂促進性を呈することは、本発明の追加の一態様である。
【００１５】
上記の特徴の組合せは、位置Ｂ１０における酸性アミノ酸置換と、位置Ｂ２４におけるペンタ−フルオロ−フェニルアラニンとの新規組合せにより与えられる。理論に拘束されることは望まないが、我々は、ペンタ−フルオロ−ＰｈｅＢ２４の芳香環の逆転した四重極静電モーメントが、ホルモン受容体界面においてドッキングされると（図４）、ＡｓｐＢ１０の、滞留時間を延長させ、また３つの相同ホルモン受容体複合体（ＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂ、及びＩＧＦ−１Ｒ）の親和性を増強する効果を軽減させると想像する。我々は、遊離ホルモンにおいては、ＰｈｅＢ２４のペンタ−フルオロ−Ｐｈｅによる置換が、当技術分野において知られるＡｓｐＢ１０の安定化効果を維持しかつ増強させることをさらに想像する。理論に拘束されることは望まないが、我々は、ペンタ−フルオロ−ＰｈｅＢ２４置換により引き起こされる天然型のＬｅｕＢ１５−ＰｈｅＢ２４相互作用に対するあらゆる構造的撹乱が、インスリン分子中の間隙内の改変芳香環のより大きい疎水性によりバランスがとられることを描写する（図５）。理論に拘束されることは望まないが、我々は、位置Ａ８、Ａ１４、及び／またはＢ２９における任意の酸置換の非相加的効果は、そのようなアナログとインスリン受容体との複合体により、あるいはそのようなアナログの１型ＩＧＦ受容体との複合体により、分裂促進性シグナリングを低下させることをさらに想像する。
【００１６】
一般的に、本発明は、位置Ｂ１０におけるアスパラギン酸、位置Ｂ２４におけるペンタ−フルオロ−フェニルアラニン、並びに、任意で、Ａ８、Ａ１３、Ａ１４、Ｂ２８、Ｂ２９の３つの位置のうち１つまたはそれ以上の位置における他のアミノ酸置換、並びに、任意で、Ｂ鎖のＣ末端伸長（Ｂ３１もしくはＢ３１−Ｂ３２を含み、追加の残基の少なくとも１つは酸性である）またはＢ鎖のＮ末端欠失（Ｂ３まで、及びＢ３を含む）を含有するインスリンアナログを提供する。本発明は従って、改変構成要素のいかなる１つによっても与えられない長く求められてきた臨床的利点を組み合わさって提供する、改変の組合せを含有する、新規クラスのインスリンアナログに関する。本発明のアナログの一バージョンにおいては、残基Ｂ２８及びＢ２９は、当技術分野において既知の速効型インスリンアナログ（インスリンｌｉｓｐｒｏ、ＫＰ−インスリンとも呼ばれる）においてと同様に、ＬｙｓＢ２８及びＰｒｏＢ２９である。他のバージョンにおいては、残基Ｂ２８は、（野生型インスリンにおいてと同様に）プロリンであり、一方で、残基Ｂ２９はオルニチン（Ｏｒｎ）またはグルタミン酸である。本発明のさらに別の一バージョンにおいては、Ｂ３０は存在しない。さらに別のバージョンにおいては、本発明のアナログは、位置Ａ１４においてグルタミン酸、及び／または位置Ａ２１においてグリシン、アラニン、またはアスパラギン酸を含有しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、Ａ及びＢ鎖、並びに、隣接する二塩基性切断部位（黒円）及びＣペプチド（白円）と共に示される連結領域を含む、ヒトプロインスリンの配列の概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、インスリン様部分及び無秩序な連結ペプチド（破線）からなる、プロインスリンの構造モデルである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｂ鎖中の残基Ｂ２７及びＢ３０の位置を示す、ヒトインスリンの配列の概略図である。
【図２】図２は、インスリンの構造を描写する。（Ａ）フェノール安定化Ｒ６亜鉛六量体。アキシャル亜鉛イオン（オーバーレイ）は、ヒスチジン側鎖により配位される重複する黒球として示される。（Ｂ）インスリン単量体の構造。ジスルフィド架橋は玉及び棒として描写される。
【図３】図３は、インスリン受容体（ＩＲ）エクトドメイン二量体の構造を描写する。一方のサブユニットはリボン描写で、また他方は空間充てん表面として表現される。細胞膜の位置は、下部に略図的に示される。配位は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋエントリー３ＬＯＨから得られた。
【図４】図４は、インスリンがその受容体のエクトドメインにどのように結合するかを描写する。「マイクロ受容体」構造は、インスリン、αＣＴペプチド、及びエクトドメインαサブユニットフラグメントＬ１−ＣＲを含有する三成分複合体を示す（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋエントリー３Ｗ１１）。ポリペプチド鎖及びドメインは、標識の通りに色分けされている。ジスルフィド架橋は示されていない。
【図５】図５は、タンパク質間隙にどのようにＰｈｅＢ２４が充てんするかを描写する。境界及び縁が部分的に陽性及び陰性の静電タンパク質表面（赤及び青）を呈する、疎水性コア中の間隙内の、ＰｈｅＢ２４部位の芳香環側鎖（淡青色棒）。
【図６】図６は、インスリンアナログの分裂促進性を測定するアッセイを提供し、ヒストグラムはソフトアガー中のＭＣＦ−７細胞コロニー形成表わす。データは、基礎値との比較での、各条件下における、>１００ｎｍのコロニーの相対数を示す。略語：ＨＩは野生型ヒトインスリン、５Ｆ−ＰＯＴは５Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＯｒｎＢ２９−インスリン、５Ｆ−ＤＫＰは５Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＡｓｐＢ１０−ＫＰ−インスリン（Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１）、ＨＰＩは野生型ヒトプロインスリン、Ａ３Ｌｅｕは置換ＶａｌＡ３→Ｌｅｕ（「インスリンＷａｋａｙｍａ」）を含有する不活性インスリンアナログ。
【図７】図７は、ＳＴＺ  Ｌｅｗｉｓラットにおけるグルコース低下活性を測定するアッセイを提供する。（Ａ及びＢ）時刻＝０における６匹のラットでの１１．５ｎモル／ｋｇ  ＳＱ注射の後の平均ＢＧの経時変化。（四角）ＫＰ−インスリン、（ひし形）ＡｓｐＢ１０−ＫＰ−インスリン、（円）５Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン、及び（三角）５Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＡｓｐＢ１０−ＫＰ−インスリン（Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１）。（Ｃ及びＤ）ＳＱ注射後の最初の６０分において観察された、ＢＧ濃度の低下に関する、Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１（円）及びＫＰ−インスリン（四角）についての用量反応曲線。
【図８】図８は、高インスリン血症−正常血糖クランプ（ＨＩＥＣ）実験に関するデータ提供する。ｍｇ／ｍｌの単位（通常のｍｇ／ｄｌの代わりに）で与えられる血液グルコース（ＢＧ）濃度の経時変化。データは、クランプ技術を確証する（アームあたりＮ＝４匹のラット）。
【図９】図９は、１４Ｃ−トレーサー２−デオキシグルコースの筋肉取込みのアッセイを提供する。媒体コントロール、「インスリン」（インスリンｌｉｓｐｒｏ）、及び「アナログ」（Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１）。
【図１０】図１０は、グリコーゲンへの３Ｈ標識グルコースの筋肉特異的組み込みのアッセイを提供する。「インスリン」（インスリンｌｉｓｐｒｏ）、及び「アナログ」（Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、選改変されたまたは択的な受容体後インスリンシグナリング特性、幅広いタンパク質濃度及び製剤強度下（一般的にＵ−１００〜Ｕ−５００、また任意で最大Ｕ−１０００）での速効作用、野生型ヒトインスリンのそれよりも小さいＩＧＦ−１Ｒに対する親和性、並びに、亜鉛イオン非存在下での野生型ヒトインスリンのベースライン安定性と比較して野生型ヒトインスリンのそれよりも大きい亜鉛イオンの非存在下での熱力学的安定性を提供する、インスリンアナログを対象とする。
【００１９】
本アナログが、野生型ヒトインスリンの分裂促進性と比べて低いまたは等しい、ソフトアガーにおけるヒト乳がん細胞増殖の細胞ベースのアッセイにおける分裂促進性を呈することは、本発明の一態様である。本アナログが、筋肉細胞内のグルコース由来の炭素原子からグリコーゲンへ流れを、そのような炭素原子から脂質への流れと比較して、好んで指揮することは、本発明のさらに別の態様である。これらの態様は、受容体後シグナリングにおける「バイアス」を提供し、これにより好ましいシグナリングの結果が維持されまたは増強され、好ましくないシグナリングの結果は抑制される。
【００２０】
皮下デポからの迅速な吸収動態が、中性ｐＨの亜鉛フリー溶液中で（正式な単量体濃度との関連で計算される）タンパク質濃度０．６−６．０ｍＭにおいて、単量体または二量体であるがより高次の自己集合状態ではないインスリンアナログによりもたらされることは、本発明の一態様である。従来型のプランディアル製品は、当技術分野において知られるように、潜在的な六量体−六量体相互作用により伸長された亜鉛安定化または亜鉛イオン独立性六量体を含む、自己集合状態間の可能な共役する均衡の連続体を意味する。この戦略の分子的実行は、（ｉ）野生型ヒトインスリンと比較して、亜鉛フリー単量体及び二量体として同じだけまたはより安定であり、かつ（ｉｉ）分子あたりまたはナノモルあたりベースで、（血液グルコース濃度のホルモン調節性低下により評価される）野生型ヒトインスリンの生物学的効能の少なくとも一部を保持する、新規クラスのインスリンアナログを提供する。血糖管理に関連して保持される効能がより低い分裂促進性と関連付けられることは、本発明の一態様である。分裂促進性は、がんリスク及びがん成長の観点から望ましくない、個別のシグナリング経路の生物学的結果である。
【００２１】
インスリンアナログは、アスパラギン酸が位置Ｂ１０にて保持され、アラニンが位置Ｂ１２に存在し、グルタミン酸が位置Ｂ２９に存在し、かつＡ８、Ａ１４、Ａ２１、及びＢ２８により提供される１つまたはそれ以上の箇所で１つまたはそれ以上の酸性アミノ酸置換が任意で存在する限り、非限定的な例としてブタ、ウシ、ウマ、及びイヌインスリンなどの動物インスリンに由来するＡ及びＢ鎖配列で作製されうることもまた、想像される。ヒトインスリンまたは動物インスリンから由来するそのような変異型Ｂ鎖は、任意で、ＴｈｒＢ３０（ｄｅｓ−Ｂ３０）を欠き、あるいはＣ末端ジペプチド伸長（それぞれＢ３１及びＢ３２と呼ばれる残基位置）であってこれらのＣ末端伸長残基のうち少なくとも１つが酸性アミノ酸である伸長を含有しうる。さらにまたはあるいは、本発明のインスリンアナログは、残基Ｂ１、Ｂ１−Ｂ２、またはＢ１−Ｂ３の欠失を含有してもよく、あるいは、位置Ｂ２８においてプロリンを欠く変異型Ｂ鎖と組合せられてもよい（例えば、位置Ｂ２９におけるグルタミン酸との組合せでの、ＬｙｓＢ２８、ＡｌａＢ２８、またはＧｌｎＢ２８）。位置Ａ１３は任意でＴｒｐまたはＴｙｒにより置換されてもよく、位置１４チロシンは任意でグルタミン酸で置換されてもよく、また位置Ａ２１においてはアスパラギンは任意でアラニン、グリシン、またはアスパラギン酸により置換されてもよい。
【００２２】
本発明のインスリンアナログが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｃｉａｅ、または他の酵母発現種もしくは株における酵母生合成において前駆体ポリペプチドのＬｙｓ対象タンパク質分解から得られうることは、さらに想像される。そのような株は、工学操作されたｔＲＮＡ合成酵素及び直交性ナンセンス抑制により、位置Ｂ２４においてペンタ−フルオロ−フェニルアラニンを挿入するように工学操作されうる。任意で、アナログは、ＴｙｒＢ１６及び／またはＴｙｒＢ２６の芳香環内にヨード置換（３−モノ−ヨード−Ｔｙｒまたは［３、５］−ジ−ヨード−Ｔｙｒ）を含有してもよく、熱力学的安定性及び受容体結合能を増強することが意図される。Ｃドメイン中のＴｈｒＢ２７、ＴｈｒＢ３０、または１つもしくはそれより多いセリン残基が、単独もしくは組合せで、単糖付加により改変されうることもまた想像され、例は、Ｏ結合型Ｎ−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＧａｌＮＡｃ−Ｏβ−ＳｅｒまたはＧａｌＮＡｃ−Ｏβ−Ｔｈｒと呼ばれる）、Ｏ結合型α−Ｄ−マンノピラノシド（マンノース−Ｏβ−Ｓｅｒまたはマンノース−Ｏβ−Ｔｈｒ）、及び／またはα−Ｄ−グルコピラノシド（グルコース−Ｏβ−Ｓｅｒまたはグルコース−Ｏβ−Ｔｈｒ）により提供される。
【００２３】
さらに、ヒト及び動物インスリン間の類似性、並びに糖尿病を有するヒト患者における動物インスリンの過去の使用の観点から、インスリンの配列中の他の小さな改変、とくに「保存的」と見なされる置換が導入されうることもまた想像される。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸群内でのアミノ酸の追加の置換も、本発明から逸脱することなくなされうる。これらは、中性疎水性アミノ酸である、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、及びメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）を含む。同様に、天然型極性アミノ酸は、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｕまたはＱ）、及びアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）の群内で互いに置換されうる。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）及びグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。塩基性アミノ酸置換（リシン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、及びヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）を含む）の導入は、このクラスのアナログの増強された総計負電荷を維持するためには好ましくない。別に記されまたは文脈から明らかでない限り、本明細書に記されるアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であるとみなされるべきである。標準的アミノ酸は、同じ化学的クラスに属する非標準的アミノ酸により置換されてもまたよい。
【００２４】
ヒトプロインスリンのアミノ酸配列が、比較目的で配列ＩＤ番号１として提供される。
配列ＩＤ番号１（ヒトプロインスリン）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
【００２５】
ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号２として提供される。
配列ＩＤ番号２（ヒトＡ鎖、残基位置Ａ１−Ａ２１）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
【００２６】
ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号３として提供される。
配列ＩＤ番号３（ヒトＢ鎖；残基位置Ｂ１−Ｂ３０）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
【００２７】
本発明の改変インスリンのアミノ酸配列は、一般形式で配列ＩＤ番号４及び５に与えられ、ここで、６つのシステイン残基は、野生型ヒトインスリンにおいてと同様に３つのジスルフィド橋を提供するようにペアリングさせられる。
配列ＩＤ番号４
Ａ鎖
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１３−Ｘａａ２−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘａａ３
配列中、Ｘａａ１（位置Ａ８）は、Ｔｈｒ（野生型インスリンにおいてと同様）、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、またはあらゆる他の非β分岐アミノ酸でありうる。つまり、Ｘａａ１は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅ以外のあらゆるアミノ酸でありうる。Ｘａａ２（位置Ａ１４）は、Ｔｙｒ（野生型インスリンと同様）または（Ｇｌｕ）でありうる。Ｘａａ３（位置Ａ２１）は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、またはＧｌｙでありうる。Ｘａａ１３（位置Ａ１３）がＬｅｕ（野生型インスリンと同様）でありうる、またはＴｒｐまたはＴyｒにより置換されうることは、さらに想像される。
配列ＩＤ番号５
Ｂ鎖
Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１２−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｘａａ７−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ８−  Ｘａａ９−Ｔｈｒ−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１
Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６は、野生型ヒトインスリンにおいてと同様にＰｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ、またはＮ末端欠失型変異体Ｖａｌ−Ａｓｎ（ｄｅｓ−Ｂ１）、Ａｓｎ（ｄｅｓ−Ｂ１、Ｂ２）、または省略（ｄｅｓ−Ｂ１−Ｂ３）でありうる。Ｘａａ７は、芳香環中の５つの水素原子が同時にフッ素（Ｆ）により置換されている、フェニルアラニンの誘導体であるペンターフルオロ−フェニルアラニンである。Ｘａａ８（位置Ｂ２８）は、Ｐｒｏ（野生型と同様）、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎでありうる。Ｘａａ９（位置Ｂ２９）は、Ｌｙｓ（野生型ヒトインスリンと同様）、Ｐｒｏ（インスリンｌｉｓｐｒｏと同様）、Ｇｌｕ（インスリングルリジンと同様）、オルニチン（Ｏｒｎ、非標準型アミノ酸）、Ａｌａ、またはＧｌｎでありうる。また任意で、Ｘａａ１０−Ｘａａ１１は、少なくとも１つのアミノ酸が酸性側鎖を含有するように、Ｂ鎖のＣ末端モノペプチドまたはジペプチド伸長を提供する。Ｘａａ１２（位置Ｂ１０）がＡｓｐ（野生型ヒトインスリンと同様）の代わりにＧｌｕでありうることは、さらに想像される。
【００２８】
本発明のインスリンアナログのアミノ酸配列は、部分的に、配列ＩＤ番号４及び５の例において、完全なＢ鎖を含有するかＮ末端がトランケートされたＢ鎖を含有するかのいずれかとして与えられる。簡潔性のため、野生型ヒトインスリンとの比較での特定の改変のみが提供される（つまり、特異的な配列の例は、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ１０、及びＸａａ１１を特色とする）。これらの実施形態のそれぞれにおいて、残基位置Ｂ１０はＡｓｐであり、残基Ｘａａ７（位置Ｂ２４）はペンタ−フルオロ−ＰｈｅＢ２４（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４）である。
・ＡｓｐＢ１０  およびＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＢ２９−−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、および  ＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、ＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、ＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＧｌｕＡ８、、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０、およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン。
【００２９】
配列ＩＤ番号４及び５のアナログなどの本発明のインスリンアナログは、以下の例に示されるように、任意でＢ鎖のＮ末端欠失（ｄｅｓ−Ｂ１、ｄｅｓ−Ｂ１、Ｂ２、またはｄｅｓ−Ｂ１−Ｂ３）を含有しうる。これらのＮ末端残基は、受容体結合には必要でないが、生合成単鎖前駆体におけるその存在は、小胞体における天然型ジスルフィドペアリングの効率を、従って生成収量を増強させると考えられている。その例は、以下を含む。
・ＡｓｐＢ１０  およびＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、およびＧｌｕＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、ＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、およびＰｒｏＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョン、
・ＡｓｐＢ１０  およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンの、
・ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＨｉｓＡ８、ＡｓｐＢ１０、ＡｓｐＢ２８、およびＯｒｎＢ２９−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体、
・ＡｓｐＢ１０、およびＡｓｐＢ２８−インスリン（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４に加え）のＧｌｕＢ３１、ＧｌｕＢ３２伸長バージョンのｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）誘導体。
【００３０】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓでの使用パターンに対し最適化したコドンで単鎖インスリンアナログをコードする。これらの単鎖インスリンアナログは、上記の二鎖インスリンアナログの生成のための生合成中間体を提供する。各場合において、最後のコドン（ＡＡＴ）は終始コドンを表わす。
【００３１】
ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う置換ＡｓｐＢ１０及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖が、配列ＩＤ番号６に与えられる。
配列ＩＤ番号６
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
【００３２】
ＣドメインのＡｌａ−Ｌｙｓを伴う置換ＡｓｐＢ１０及びＡｌａＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖が、配列ＩＤ番号７に与えられる。
配列ＩＤ番号７
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
【００３３】
ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＡ８、及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖が、配列ＩＤ番号８に与えられる。
配列ＩＤ番号８
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
【００３４】
コドン位置Ｂ２４（ＴＡＧ）においてナンセンス抑制により非標準型アミノ酸が挿入されうるような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖が、配列ＩＤ番号９に与えられる。
配列ＩＤ番号９
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
【００３５】
コドン位置Ｂ２４（ＴＡＧ）においてナンセンス抑制により非標準型アミノ酸が挿入されうるような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖が、配列ＩＤ番号１０に与えられる。
配列ＩＤ番号１０
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
【００３６】
配列ＩＤ番号１１−１５において提供される合成遺伝子の群は、上で特定されるアミノ酸配列に従い位置Ａ１３及びＡ１４において任意のアミノ酸置換を任意でコードする、ＤＮＡ配列のセットを提供する。当技術分野においては、酵母の核遺伝子において、ロイシンはＤＮＡコドンＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、及びＣＴＧによりコードされること、チロシンはＤＮＡコドンＴＡＴ及びＴＡＣによりコードされること、トリプトファンはＤＮＡコドンＴＧＧによりコードされること、並びにグルタミン酸はＤＮＡコドンＧＡＡ及びＧＡＧによりコードされることが知られている。
【００３７】
配列ＩＤ番号１１は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、また位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号１１
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００３８】
配列ＩＤ番号１２は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードし、また位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、ＣドメインのＡｌａ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＡｌａＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号１２
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ  
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００３９】
配列ＩＤ番号１３は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、また位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＡ８、及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号１３
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００４０】
配列ＩＤ番号１４は、コドン位置Ｂ２４（ＴＡＧ）においてナンセンス抑制により非標準型アミノ酸が挿入されうるような、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、また位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号１４
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００４１】
配列ＩＤ番号１５は、コドン位置Ｂ２４（ＴＡＧ）においてナンセンス抑制により非標準型アミノ酸が挿入されうるような、位置Ａ１３（ＸＸＸ１）におけるコドンがロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、また位置Ａ１４（ＸＸＸ２）におけるコドンがチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号１５
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００４２】
以下に提供される配列ＩＤ番号１６〜３０の合成配列の以下の群は、配列ＩＤ番号１１−１５において定義される配列特性に加え、以下の３つのコドン位置Ｂ１、Ｂ２、またはＢ３のうち１箇所においてリシン残基を任意でコードする、ＤＮＡ配列のセットを提供する。生合成単鎖インスリン前駆体におけるそのようなリシン置換は、Ｂ鎖が、上で特定されたアミノ酸配列に従いＮ末端欠失ｄｅｓ−Ｂ１、ｄｅｓ−Ｂ１、Ｂ２、またはｄｅｓ−Ｂ１−Ｂ３を含有する、本発明のインスリンアナログの生産を可能にするであろう。これらのＮ末端トランケーションは、それぞれ、生合成単鎖インスリン前駆体中の位置Ｂ１、Ｂ２、またはＢ３におけるリシンの置換により指揮される。当技術分野において、酵母の核遺伝子においては、リシンはＤＮＡコドンＡＡＡ及びＡＡＧ（またはＡＡＲ）によりコードされることが知られている。上記の通り、当技術分野においては、酵母の核遺伝子において、ロイシンはＤＮＡコドンＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、及びＣＴＧによりコードされること、チロシンはＤＮＡコドンＴＡＴ及びＴＡＣによりコードされること、トリプトファンはＤＮＡコドンＴＧＧによりコードされること、並びにグルタミン酸はＤＮＡコドンＧＡＡ及びＧＡＧ（ＧＡＲ）によりコードされることもまた知られている。
【００４３】
配列ＩＤ番号１６は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、また位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の最初のコドン（ＡＡＲ）がリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号１６
ＡＡＲＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００４４】
配列ＩＤ番号１７は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の最初のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＡｌａ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＡｌａＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号１７
ＡＡＲＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＡＲＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ  
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００４５】
配列ＩＤ番号１８は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の最初のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＡ８、及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号１８
ＡＡＲＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００４６】
配列ＩＤ番号１９は、コドン位置Ｂ２４（ＴＡＧ）においてナンセンス抑制により非標準型アミノ酸が挿入されうるような、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の最初のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号１９
【００４７】
ＡＡＲＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
以下の配列は、コドン位置Ｂ２４（ＴＡＧ）においてナンセンス抑制により非標準型アミノ酸が挿入されうるような、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の最初のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号２０
ＡＡＲＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００４８】
以下の配列は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の二番目のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号２１
ＴＴＣＡＡＲＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００４９】
以下の配列は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の二番目のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＡｌａ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＡｌａＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号２２
ＴＴＣＡＡＲＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ  
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００５０】
以下の配列は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の二番目のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＡ８、及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号２３
ＴＴＣＡＡＲＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００５１】
以下の配列は、コドン位置Ｂ２４（ＴＡＧ）においてナンセンス抑制により非標準型アミノ酸が挿入されうるような、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の二番目のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号２４
ＴＴＣＡＡＲＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００５２】
以下の配列は、コドン位置Ｂ２４（ＴＡＧ）においてナンセンス抑制により非標準型アミノ酸が挿入されうるような、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の二番目のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号２５
ＴＴＣＡＡＲＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００５３】
以下の配列は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の３番目のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号２６
ＴＴＣＧＴＣＡＡＲＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００５４】
以下の配列は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の３番目のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＡｌａ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＡｌａＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号２７
ＴＴＣＧＴＣＡＡＲＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００５５】
以下の配列は、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の３番目のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０、ＧｌｕＡ８、及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号２８
ＴＴＣＧＴＣＡＡＲＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００５６】
以下の配列は、コドン位置Ｂ２４（ＴＡＧ）においてナンセンス抑制により非標準型アミノ酸が挿入されうるような、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の３番目のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＡｓｐＢ１０及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号２９
ＴＴＣＧＴＣＡＡＲＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００５７】
以下の配列は、コドン位置Ｂ２４（ＴＡＧ）においてナンセンス抑制により非標準型アミノ酸が挿入されうるような、位置Ａ１３におけるコドン（ＸＸＸ１）がロイシン、チロシン、またはトリプトファンをコードするような、位置Ａ１４におけるコドン（ＸＸＸ２）がチロシンまたはグルタミン酸をコードするような、またＢ鎖配列の３番目のコドンがリシンをコードするような、ＣドメインのＴｒｐ−Ｌｙｓを伴う、置換ＧｌｕＡ８、ＡｓｐＢ１０、及びＧｌｕＢ３０を有する、５３残基の単鎖インスリンアナログをコードする遺伝子のセンス鎖を提供する。
配列ＩＤ番号３０
ＴＴＣＧＴＣＡＡＲＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡ−ＸＸＸ１−ＸＸＸ２−ＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸ１はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣまたはＴＧＧである。
ＸＸＸ２はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。
【００５８】
本発明の２つの単鎖インスリンアナログは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける前駆体ポリペプチドの生合成により調製された。このシステムは、切断Ｎ末端伸長ペプチドを伴う天然型ジスルフィド橋を含有する折り畳まれたタンパク質を分泌する。この前駆体タンパク質のトリプシン切断は、残基ＰｈｅＢ１で始まりＡｒｇＢ２２で終わるトランケートされたＢ鎖と完全なＡ鎖とを含有する、二鎖インスリンフラグメントを生じる。その前駆体ポリペプチドは、配列が配列ＩＤ番号４及び５の一般的開示内である合成遺伝子によりコードされる。配列ＩＤ番号４及び５は、それぞれの場合において、置換ＡｓｐＢ１０を含有し、また任意で、追加の置換ＧｌｕＡ８、ＴｒｐＡ１３、ＴｙｒＡ１３、及び／またはＧｌｕＡ１４を含有しうる。単鎖インスリン前駆体は、非標準型アミノ酸置換が工学操作された直交性ｔＲＮＡ合成酵素により挿入されうるような、位置Ｂ２４におけるナンセンスコドンを含有することもまた想像される。そのような前駆体は、トリプシンによって処理されず、代わりにリシン特異的エンドペプチダーゼによりスプリットされるであろう。
【００５９】
我々は、ＤＮＡ配列の２つの関連するセットが、（ｉ）位置Ｂ２９におけるグルタミン酸が、最終位置Ｂ２９においてグルタミン酸を含有する合成Ｃ末端Ｂ鎖ペプチドを利用して、半合成によりインスリンアナログへと導入されるか、あるいは（ｉｉ）位置Ｂ２９におけるグルタミン酸が、標準的な遺伝子コードにより、単鎖生合成前駆体へと直接的に導入されうるかの何れかであるような、製造中間体をコードしうることを想像する。
【００６０】
我々は、ＤＮＡ配列の２つの関連するセットが、（ｉ）位置Ｂ２４におけるペンタ−フルオロ−Ｐｈｅが、最終位置Ｂ２４においてペンタ−フルオロ−Ｐｈｅを含有する合成Ｃ末端Ｂ鎖ペプチドを利用して、半合成によりインスリンアナログへと導入されるか、あるいは（ｉｉ）位置Ｂ２４におけるペンタ−フルオロ−Ｐｈｅが、位置Ｂ２４におけるナンセンスコドンと直交性の工学操作されたｔＲＮＡ合成酵素とを利用して、拡張された遺伝子コード技術により、単鎖生合成前駆体へと直接的に導入されうるかの何れかであるような、製造中間体をコードしうることをさらに想像する。
【００６１】
本発明の２つの単鎖インスリンアナログは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける前駆体ポリペプチドの生合成に続くトリプシン媒介性半合成により調製された。このシステムは、切断Ｎ末端伸長ペプチドを伴う天然型ジスルフィド橋を含有する折り畳まれたタンパク質を分泌する。一実施形態は、位置Ｂ２４におけるペンタ−フルオロ−Ｐｈｅに加え、置換ＡｓｐＢ１０、ＬｙｓＢ２８、及びＰｒｏＢ２９を含有する。第二の実施形態は、位置Ｂ２４におけるペンタ−フルオロ−Ｐｈｅに加え、置換ＡｓｐＢ１０、及びＯｒｎＢ２９を含有する（Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１）。この前駆体タンパク質のトリプシン切断は、ＰｈｅＢ１で始まりＡｒｇＢ２２で終わるトランケートされたＢ鎖（配列ＩＤ番号５のアミノ酸１−２２）と、完全なＡ鎖（配列ＩＤ番号４）とを含有する二鎖インスリンフラグメント生じる。Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１に対する前駆体ポリペプチドは、配列ＩＤ番号３１として一般化されるポリヌクレオチドによりコードされうる。
配列ＩＤ番号３１（ＡｓｐＢ１０、５Ｆ−ＰｈｅＢ２４、Ｌｉｓｐｒｏ）
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡＲＣＣＮＡＣＮＸＸＸＡＡＲＧＧＮＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
ＸＸＸはＴＧＧまたはＧＣＮである。
【００６２】
工学操作された直交性ｔＲＮＡ合成酵素により非標準型アミノ酸置換が挿入されうるような、位置Ｂ２４においてナンセンスコドンを有する単鎖インスリン前駆体もまた、想像される。そのような前駆体は、トリプシンによっては処理されず、代わりにリシン特異的エンドペプチダーゼによりスプリットさるであろう。
【００６３】
天然型様構造は保持される。Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１の遠ＵＶ  ＣＤスペクトルは、ＫＰ−インスリンまたはＫＰ−インスリンのＡｓｐＢ１０誘導体のそれに非常によく似ている。Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１の熱力学的安定性は、ＣＤ監視グアニジン変性により調べられた。その方法は、開示の通りである（Ｈｕａ、Ｑ．Ｘ．、ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３、１４７０３−１６（２００８））。結果は、このアナログが、野生型インスリン、ＫＰ−インスリン、またはＫＰ−インスリンのＡｓｐＢ１０誘導体のいずれよりも、化学的変性に対しより安定であることを示す（２５℃及びｐＨ７．４にてＣＤ検出グアニジン変性により調べられた）。アンフォールディングの自由エネルギー（ΔＧｕ）は、以下の通りであった。ＷＴインスリンは３．３ｋｃａｌ／モル、インスリンｌｉｓｐｒｏは２．８ｋｃａｌ／モル、またＳｉｇｓｅｌｉｎ−１は４．８ｋｃａｌ／モル。ＫＰ−インスリンの不安定性（ＷＴと比較してΔΔＧｕ  ０．５（±０．２）ｋｃａｌ／モル）によりＨｕｍａｌｏｇ（登録商標）の製剤に課される難題をふまえると、Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１の増強された安定性（ΔΔＧｕ  １．５（±０．２）ｋｃａｌ／モル）は、安定な製剤を予測する。
【００６４】
ソフトアガーにおけるＭＣＦ−７コロニー形成についてのアッセイ。ＡｓｐＢ１０置換は、当技術分野において、ＩＲに対するインスリンの親和性を二倍増強し、亜鉛媒介性六量体集合をブロックし、またホルモンの固有の安定性を好ましく増強することが知られている。実際、速効型インスリンの先駆者的候補としてのＡｓｐＢ１０インスリンの臨床開発は、１年間の治療の後のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける過剰な乳腺腫瘍の予期せぬ観察ゆえ、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋにより中止された。ヒト新生細胞株の細胞培養実験におけるＡｓｐＢ１０インスリンの分裂促進活性を開示する、かなりの文献がこれに続いて出された。本発明のアナログにおけるＡｓｐＢ１０（または別のセットの実施形態におけるＧｌｕＢ１０）の存在をふまえたこの懸念に取り組むため、分裂促進性のアッセイが以下のように実施された。
【００６５】
このバックグラウンドは、インスリンアナログのヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７の増殖を刺激する能力の比較実験を動機付けた。ＭＣＦ−７は、当技術分野において、３つの相同受容体（ＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂ、及びＩＧＦ−１Ｒ）を発現し、ゆえに相対分裂促進性ＩＧＦ>ＡｓｐＢ１０インスリン>野生型インスリンのインスリン応答性悪性腫瘍に対するモデルを提供することが知られている。我々の予備的なアッセイにおいて、ＭＣＦ−７細胞（０．７５ｍｌ中１．５ｘ１０３細胞、ＡＴＣＣカタログ＃ＨＴＢ−２２から入手）は、４２℃にて同じ体積のＢａｃｔｏアガーと混合された。この０．３％アガー懸濁液は、１２ウェルプレート中に０．６％アガーの１．５ｍｌベースの上に注がれ、１００ｎＭのタンパク質濃度におけるインスリンまたはインスリンアナログを有する（または有さない）基礎的な培養培地でオーバーレイされた。培地は週あたり３ｘ充てんされた。プレートはＣＯ２組織培養インキュベーター中で３週間にわたり３７℃にてインキュベートされ、３週間の時点でコロニーがクリスタルバイオレットで染色され、倒立顕微鏡下でカウントされた。ポジティブコントロールはＩＧＦ−Ｉにより（表示無し）、またネガティブコントロールはインスリンまたはインスリンアナログを欠く培地（図６中の「基礎値」）により提供された。刊行された研究に従い高濃度のＷＴインスリンがＭＣＦ−７細胞増殖を増強する一方、我々の結果は、Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１（図６において「５Ｆ−ＤＫＰ」と標識）が、ＡｓｐＢ１０を欠く関連するペンタ−フルオロ−ＰｈｅＢ２４アナログ（「５Ｆ−ＰＯＴ」）の分裂促進性とは区別が付かず、またとヒトプロインスリン（「ＨＰＩ」）及び不活性アナログＬｅｕＡ３の無視できるほど小さい活性と一致する、無視できるほど小さい分裂促進性を呈することを示す。
【００６６】
生物学的活性、及び薬力学が、ストレプトゾシンにより糖尿病を患わされている雄Ｌｅｗｉｓラット（約３００ｇ）で試験された（図７）。それぞれがコアである３つの置換（他の任意の設計要素の存在下または非存在下で、ＡｓｐＢ１０、ＡｌａＢ１２、及びＧｌｕＢ２９）を含有する４つの代表的なインスリンアナログの皮下注射のＰＤ効果が、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）及びインスリンｌｉｓｐｒｏのＡｓｐＢ１０誘導体（ＤＫＰインスリン）との比較で評価された。血液グルコース濃度の生じた全体的特性は、１単位のＳｉｇｓｅｌｉｎ−１が１単位のＫＰインスリンの３倍のタンパク質分子を要するように定義されるタンパク質用量（ナノモルで定義される）においてであるが、Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１のＰＤ特性が、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）のそれに類似することを示した。これらのアッセイにおいては、ラットは皮下（ＳＱ）注射された。血液は、クリッピングされた尾先から連続的な間隔で得られた。平均血液グルコース（ＢＧ）濃度、及び初期のＢＧからのパーセント変化が、それぞれプロットされた（図７Ａ及び７Ｂ）。実験は、ｍｇ（これは市販のインスリン製品間で異なる）あたりの効能（ＳＱ注射後初めの６０分におけるＢＧの低下として定義される）を決定するため、Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１及びｌｉｓｐｒｏの４つの異なる用量について繰り返された（絶対及びパーセント変化が図７Ｃ及び７Ｄ）。
【００６７】
これらのデータは、インスリンｌｉｓｐｒｏのペンタ−フルオロ−ＰｈｅＢ２４（５Ｆ−ＰｈｅＢ２４）誘導体が無視できるほど小さい生物学的活性を呈するのに対し（図７Ａ及び７Ｂにおけるひし形）、生物学的活性は、インスリンｌｉｓｐｒｏ（ＫＰインスリン、四角）に対する共改変ＨｉｓＢ１０→Ａｓｐ（円）によりレスキューされることを示す。ＡｓｐＢ１０は、比較的劇的にではないが、ＫＰインスリンの活性も増強する（ひし形）。ＫＰインスリンとの比較での５Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＡｓｐＢ１０−ＫＰインスリン（Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１）の用量反応実験は、現在のインスリン製品インスリンｄｅｔｅｍｉｒ（Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標）、Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）についてそうであるように、同等の治療効果を達成するには３倍のナノモルのＳｉｇｓｅｌｉｎ−１が必要だったことを示した。
【００６８】
上記の細胞ベース及びラットベースの発見は、あわせて、Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１が、インスリン反応性及びＩＧＦ−Ｉ反応性のヒトがん細胞株における分裂促進性経路を刺激することなく、治療的低血糖反応をもたらすシグナリング現象を指揮しうるという証拠を提供する。
【００６９】
非糖尿病Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける選択的シグナリングの証拠。内因性β細胞インスリン分泌がオクトレオチド（ソマトスタチンアナログ）により抑制された非糖尿病性ラットの高インスリン血症−正常血糖クランプ（ＨＩＥＣ）実験において、Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１の薬力学（ＰＤ）が調査された。グループあたり４匹のラットが用いられた。これらのベースライン実験は、３倍用量のＳｉｇｓｅｌｉｎ−１注入（モル／分／ｋｇで）がインスリンｌｉｓｐｒｏと同等の治療強度を与えたことを確かめた。
【００７０】
トリチウム化グルコーストレーサー技術を使用して、選択的シグナリングの証拠が探られた。簡潔には、ＨＩＥＣ環境への３０分間の順応の後、［３Ｈ−３］−グルコース（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＮＥＮ）の刺激連続注入（２０．８μＣｉの大量注射、それから０．５２μＣｉ／分）が開始され、開示されるように実験の間じゅう維持された。トレーサー平衡の３０分後、グルコース及び血漿放射性のための血液試料が、ベースラインを確立するため１０分毎に３０分間採取された。ＢＧは、ＨＩＥＣの間、ＧＭ７  Ｍｉｃｒｏ−ｓｔａｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＮＡＬＯＸ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してリアルタイムで測定された。時刻ゼロにおいて、インスリンｌｉｓｐｒｏ（１．５ｍＵ／ｋｇ／分）またはＳｉｇｓｅｌｉｎ−１（３倍のｍｇ／ｍｌタンパク質）の刺激連続注入、及び２５％通常グルコース溶液（ＩＶＸ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）の可変注入が開始された。グルコース注入の速度は、血漿グルコース濃度を１３０−１４０ｍｇ／ｄｌにて留めるため、必要に応じて調節された。血液試料は、６０分間の高インスリン血症期の間、１０分毎に採取された。［３Ｈ−３］−グルコースからの血漿放射性は、Ｂａ（ＯＨ）２及びＺｎＳＯ４での脱タンパク質化、並びにトリチウム化水を除去するための蒸発の後、決定された。血漿インスリンレベルは、６０、９０、１２０、１５０、及び１８０分において測定された。類似のプロトコールにおいては、我々は、クランプの最後の４０分の間（図８における灰色領域）におけるインスリン刺激性グルコース取込みの組織特異的相対速度を測定するためのプローブとして、［１４Ｃ］−２−デオキシグルコース（１００μＬの生理食塩水中２０μＣｉの［１４Ｃ］−２−デオキシグルコース）を用いた。
【００７１】
受容体後シグナリングバイアスを評価するため、我々は、遅攣縮ヒラメ筋及び速攣縮長指伸筋（ＥＤＬ）の２つの筋肉に注目した。これらの筋肉におけるインスリン指揮性グルコース取込み速度は、［１４Ｃ］−２−デオキシグルコースで調べられるように、インスリンｌｉｓｐｒｏとＳｉｇｓｅｌｉｎ−１との間で類似しており、また媒体とも類似した。この結果は、これらの実験において使用されたインスリンの低い用量を踏まえると、予期されていた（図９）。
【００７２】
しかしながら、［３Ｈ−３］−グルコースのグリコーゲンへの取込みの相対速度は、Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１によるシグナリング後のヒラメ筋においては、ｌｉｓｐｒｏによるシグナリング後よりも（図１０左）、Ｓｉｇｓｅｌｉｎ−１処理動物と比較してＷＴインスリン処理動物のヒラメ筋におけるグルコース取込み速度が同じであるにもかかわらず、ずっと高かった。類似の傾向がＥＤＬにおいて見られたが、統計学的有意性は達成しなかった（Ｎ＝４ラット）。これらの発見は、注目すべきであり、グルコース由来の３Ｈ−Ｃの流れは、グリコーゲンに（酸化または脂質合成と比較して）好ましく向かうことを提唱する。筋肉におけるより比較的少ない脂肪は、インスリン抵抗性を軽減しうる。これは優れた臨床的な重要性を持つであろう。
【００７３】
糖尿病を有する患者を治療するための方法は、本明細書において開示される二鎖インスリンアナログを投与する工程を有する。その二鎖インスリンアナログが、酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）により調製され、または天然型フラグメントのライゲーションによる完全化学合成の対象となりうることは、本発明の別の一態様である。調製の合成経路は、Ｄアミノ酸置換、または炭化水素によるセリンまたはトレオニンのＯ結合性改変などの、非標準的改変の場合に好まれる。しかしながら、拡張された遺伝コード技術または四塩基コドン技術により、非標準型改変を含有する単鎖アナログのサブセットを製造することは容易であろう（検討用には、Ｈｏｈｓａｋａ、Ｔ．、&Ｓｉｓｉｄｏ、Ｍ．、２０１２を参照）。非標準型アミノ酸置換が二鎖インスリンアナログの化学的分解に対するまたは物理的分解に対する耐性を増強しうることは、本発明のさらに別の一態様である。我々は、本発明のアナログが、糖尿病または代謝性症候群の治療のための方法を提供することをさらに想像する。インスリンアナログの送達経路は、シリンジまたはペン装置の使用による皮下注射による。本発明のインスリンは、位置Ａ１３及び／またはＡ１４における置換などの他の改変もまた含有しうる。本発明のインスリンアナログは、残基Ｂ１−Ｂ３の欠失による短縮型Ｂ鎖、または位置Ｂ３１における酸性残基もしくは二残基伸長Ｂ３１−Ｂ３２における少なくとも１つの酸性残基を含有するＣ末端伸長Ｂ鎖もまた含有しうる。
【００７４】
医薬組成物は、そのようなアナログを有してもよく、また任意で亜鉛を含んでもよい。本発明のインスリンアナログは古典的亜鉛安定化六量体を形成しない（また実際に安定性のためにそのような集合を必要としない）ため、亜鉛イオンは、優勢なインスリン六量体を含有する製剤において一般的に用いられるよりも低い、様々な亜鉛イオン：タンパク質比で含められうる。そのような比は、インスリンアナログのモルあたり０．０１〜０．１０モルの亜鉛イオンの範囲にありうる。製剤のｐＨは、ｐＨ７．０〜８．０の範囲にある。緩衝液（一般にリン酸ナトリウムまたはＴｒｉｓ−塩化水素）は、存在しても存在しなくてもよい。そのような製剤においては、インスリンアナログの濃度は、一般に約０．６−５．０ｍＭの間であろう。バイアルまたはペンにおいては最大５ｍＭの濃度が使用されうる。より濃縮された製剤（Ｕ−２００またはそれより高い）は、顕著なインスリン抵抗性を有する患者において特に有益となりうる。賦形剤は、グリセロール、グリシン、アルギニン、Ｔｒｉｓ、他の緩衝液及び塩、並びにフェノール及びメタクレゾールなどの抗微生物保存剤を含みうる。後者の保存剤は、インスリン六量体の安定性を増強することが知られている。物理的安定性を強めるため、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性界面活性剤もまた、添加されうる。そのような医薬組成物は、患者に生理学的有効量の組成物を投与することにより、糖尿病または他の医学的状態を有する患者を治療するために使用されうる。
【００７５】
上の開示を踏まえれば、提供された二鎖インスリンアナログが、本明細書において上に示された目的を実施するだろうことが、もう明らかであるはずである。つまり、これらのインスリンアナログは、野生型インスリンに類似する生物学的活性（皮下または静脈内注射により哺乳類において血液グルコース濃度を低下するのに必要なタンパク質単量体のナノモルにより定義される）を、低い分裂促進性を伴って速効性が保持されるように、呈する。したがって、特許請求の範囲の発明の範囲内に明らかに入るあらゆるバリエーション、及びゆえに特定の成分要素の選択が、本明細書に開示かつ記述される発明の真髄から逸脱することなく決定されうることが理解されるべきである。
【００７６】
以下の文献は、本明細書において開示される試験及びアッセイ方法が、当業者により理解されうるだろうことを示すために引用される。
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Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｐｅｔｋｏｖａ，Ａ．，Ｈｕａｎｇ，Ｋ．，Ｘｕ，Ｂ．，Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，Ｙｅ，Ｉ．Ｊ．，Ｃｈｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｈｕ，Ｓ．Ｑ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎ．Ｂ．，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｊ．，Ｉｓｍａｉｌ−Ｂｅｉｇｉ，Ｆ．，Ｍａｃｋｉｎ，Ｒ．Ｂ．，Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ，Ｐ．Ｇ．，Ｔｙｃｋｏ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．Ａ．（２０１０）Ａｎ  Ａｃｈｉｌｌｅｓ'ｈｅｅｌ  ｉｎ  ａｎ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｐａｉｒ：ｉｎｓｕｌｉｎ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１０８０６−２１．
Ｙｕｖｉｅｎｃｏ，Ｃ．，Ｍｏｒｅ，Ｈ．Ｔ．，Ｈａｇｈｐａｎａｈ，Ｊ．Ｓ．，Ｔｕ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｍｏｎｔｃｌａｒｅ，Ｊ．Ｋ．（２０１２）Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １３：２２７３−８．
【図１Ａ】
2018505874.tif 000002
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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