(57)【要約】本発明は、膠芽腫の治療、特に静脈内投与または随腔内投与による膠芽腫の治療のための、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６から選択されるＮｏｇｏの細胞外ドメインの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膠芽腫の治療方法において使用するためのＮｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６から選択されるＮｏｇｏの細胞外ドメイン。
【請求項２】
前記細胞外ドメインが、配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３または配列番号００４のいずれか１つに対して、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％または≧９８％の配列同一性を有する、請求項１に記載の膠芽腫の治療方法において使用するためのＮｏｇｏの細胞外ドメイン。
【請求項３】
膠芽腫の治療方法において使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物がＮｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６から選択されるＮｏｇｏの細胞外ドメインを含むポリペプチドを含む、膠芽腫の治療方法において使用するための医薬組成物。
【請求項４】
前記細胞外ドメインが、配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３または配列番号００４のいずれか１つに対して、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％または≧９８％の配列同一性を有する、請求項３に記載の膠芽腫の治療方法において使用するための医薬組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０またはそれと機能的に同等のものを有する、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、Ｎｏｇｏ−６６またはそれと機能的に同等のものを有する、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
静脈内または、随腔内投与による膠芽腫の治療方法において使用するための、請求項３から６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
膠芽腫を有する患者を治療する方法であって、前記方法が、Ｎｏｇｏの細胞外ドメインの効果的な量を前記患者へ提供することを含み、ここで、前記細胞外ドメインが、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６から選択され、ここで特に、前記細胞外ドメインが、配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３または配列番号００４のいずれか１つに対して、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％または≧９８％の配列同一性を有する、膠芽腫を有する患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
脳腫瘍および特に膠芽腫は、制御不能な増殖によって特徴づけられる致命的な癌であり、（膠芽腫については）平均１５ヶ月以内に死に至る。脳腫瘍の増殖の特徴の１つは、血管新生、つまり新しい血管の増殖である。原理的には、脳腫瘍／膠芽腫における過剰な血管新生を阻害することによって脳腫瘍の増殖を阻害／遅延することができる。しかし、脳腫瘍／膠芽腫の増殖を遅延させるための現在のいずれの戦略も、患者生存の所望の改善をもたらしていない。
【０００２】
成人の中枢神経系（ＣＮＳ）において、Ｎｏｇｏ−Ａは、乏突起膠細胞によって主に合成されるミエリン関連タンパク質である。Ｎｏｇｏ−ＡはＣＮＳにおける軸索再生の主要阻害分子として同定された。
【０００３】
Ｎｏｇｏ−Ａは２つのドメインを介してその阻害効果を発揮する：３つの主要なアイソフォーム（Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−ＢおよびＮｏｇｏ−Ｃ）全てに存在するＮｏｇｏ−６６（ヒト  ａａ１０５５−１１２０）および、Ｎｏｇｏ−Ａ特有のＮｏｇｏ−Ａデルタ２０（ヒト  ａａ５６７−７４８）である。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０は、マウスの脳の発達中に血管新生の制御に関与するが、Ｎｏｇｏ−６６は関与しないこともまた当該技術分野では公知である（バルキリーら著、ＰＮＡＳ  ２０１３；１１０、Ｅ１９４３−５２）。
【０００４】
Ｎｏｇｏ−６６は、Ｎｏｇｏ−６６受容体（ＮｇＲ１）、アダプター要素Ｌｉｎｇｏ１、エフェクター部分ｐ７５／Ｔｒｏｙおよび共受容体ＰｉｒＢで構成される多量体の受容体複合体によってシグナル伝達を行う。Ｎｏｇｏ−Ａ／Ｎｏｇｏ−６６によるＮｇＲ−ｐ７５／Ｔｒｏｙ−Ｌｉｎｇｏ１の刺激は、細胞内ＧＴＰａｓｅであるＲｈｏＡの活性化を誘導する。ＲｈｏＡは、アクチンの脱重合を引き起こし、それにより神経突起の退縮を引き起こす、Ｎｏｇｏ−Ａの重要なメディエーターと考えられている。Ｎｏｇｏ−Ａ特異的阻害ドメインであるＮｏｇｏ−Ａデルタ２０についての受容体は、スフィンゴ脂質受容体スフィンゴシン−１リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体２（Ｓ１ＰＲ２）として最近同定されたばかりである。
【０００５】
Ｎｏｇｏ−Ａは、出生後ＣＮＳ血管新生の重要な負の制御因子である。Ｎｏｇｏ−ＡはＣＮＳ内皮先端細胞の糸状仮足の近傍のニューロンにおいて発現し、これは神経血管細胞機構を示唆する。Ｎｏｇｏ−Ａの遺伝子欠損または抗体を介した中和は、ＣＮＳ組織血管密度の増加およびＣＮＳ内皮先端細胞数の増加を誘導する。病理学的状態においては、Ｎｏｇｏ−Ａが血管新生へ及ぼす影響についてほとんど知られていない。
【０００６】
外科手術による治療、それに続く放射線療法および、一般的にはテモゾロミドを用いる化学療法による多様式の治療にもかかわらず、膠芽腫患者の生存期間の中央値はわずか約１年である。脳腫瘍の治療における治療の成功の欠如と、血管新生の負の制御経路としてのＮｏｇｏ−Ａシグナルについての重要な役割とを考慮すれば、脳腫瘍血管新生におけるＮｏｇｏ−Ａおよびその受容体の機能的な調節は大きな可能性を秘めている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】バルキリーら著、ＰＮＡＳ  ２０１３；１１０、Ｅ１９４３−５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、Ｎｏｇｏ−Ａおよびその受容体が相互作用して、ヒト膠芽腫由来の内皮細胞の伸展と遊走を負に制御するという、驚くべき、予期しない知見に基づいている。
【０００９】
本発明の課題は、安全で効果的な膠芽腫の治療を提供することである。この課題は独立請求項の保護対象によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、膠芽腫のマウスモデルにおけるＳ１ＰＲ２の発現を示す。血管を可視化するためにＦＩＴＣレクチン（緑色）で灌流し、Ｓ１ＰＲ２（赤色）について染色し、および一般的な核マーカー  ＤＡＰＩ（青色）で染色した、膠芽腫保有マウス（注射後１５日、１５Ｄ−ＰＩ）の脳の冠状切片（４０  μｍ）である。（ａ−ｃ）膠芽腫に隣接する正常な脳の血管（緑色、矢印）はＳ１ＰＲ２（赤色）を発現する。（ｄ−ｆ）脳腫瘍／膠芽腫／神経膠腫内では、血管上のＳ１ＰＲ２（緑色、矢印）はアップレギュレートされている。スケールバー：ａ−ｆは２０  μｍ。
【図２】図２は、ヒト膠芽腫組織におけるＮｏｇｏ−ＡおよびＳ１ＰＲ２の発現を示す。ヒト膠芽腫組織の切片（８０  μｍ）は、Ｓ１ＰＲ２（緑色）、血管内皮細胞マーカー  ＣＤ３１（赤色）について染色し、および一般的な核マーカー  ＤＡＰＩ（青色）で染色した。（ａ−ｃ）ヒト膠芽腫組織内の血管（赤色）はＳ１ＰＲ２（緑色）を発現する。囲んだ領域をｄ−ｆおよびｇ−ｉに拡大して示す。（ｄ−ｉ）Ｓ１ＰＲ２は、膠芽腫内の確立された血管上（赤色、矢印）（ｄ−ｆ）だけでなく、内皮先端細胞上（赤色、矢印）（ｇ−ｉ）に発現する。（ｊ−ｑ）ヒト膠芽腫および正常なヒトの脳の試料の組織マイクロアレイ（１０  μｍ）をＮｏｇｏ−Ａ（赤色）およびＳ１ＰＲ２（茶色）について染色した。Ｓ１ＰＲ２（茶色）は、正常なヒトの脳の内皮細胞上と同様にヒト膠芽腫組織の腫瘍内皮細胞上に発現する（矢印）。Ｎｏｇｏ−Ａ（赤色）は、ヒト膠芽腫において、実質的に存在しない（ｎ、ｏ）から強い発現（ｐ、ｑ）までの範囲で高い可変性の発現を示す。腫瘍内皮細胞上のＮｏｇｏ−Ａの発現はほとんど観測されなかった（ｎ−ｑ）。スケールバー：ａ、ｂ、ｃ、ｊ、ｌ、ｎ、ｐは１００  μｍ；ｋ、ｍ、ｏ、ｑは２０  μｍ；ｄ−ｉは１０  μｍ。
【図３】図３は、ヒト膠芽腫組織、および単離したヒト膠芽腫内皮細胞における、Ｎｏｇｏ−Ａの発現を示す。（ａ）Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６についての、受容体の異なるタンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロットである。Ｓ１Ｐ受容体（Ｓ１ＰＲ１、２、３、５）は、ヒト膠芽腫抽出物（膠芽腫  ＺＨ−３７９／４１３）において、および単離したヒト膠芽腫内皮細胞（膠芽腫  ＺＨ−３７９／４１３  ＭＶＥＣ）において、検出された。Ｎｏｇｏ−６６受容体のタンパク質メンバー、すなわちＮｇＲ１、Ｌｉｎｇｏ１、ＴＲＯＹ、ｐ７５およびＰｉｒＢは、ヒト膠芽腫抽出物（膠芽腫  ＺＨ−３７９／４１３）において、および単離したヒト膠芽腫内皮細胞（膠芽腫  ＺＨ−３７９／４１３  ＭＶＥＣ）において検出された。（ｂ）Ｓ１ＰＲ２、Ｓ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ５の発現もまた、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて正常な脳のＭＶＥＣおよび膠芽腫のＭＶＥＣ（ＧＢＭ  ＭＶＥＣ）において検出された。該発現は、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣにおいてより強力に発現するＳ１ＰＲ１を除いて、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣに匹敵するものであった。
【図４ａ−ｌ】図４は、Ｓ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤ＪＴＥ−０１３と同様に、Ｓ１ＰＲファミリー受容体の他の薬理学的阻害剤（ＶＰＣ  ２３０１９およびＦＴＹ７２０）を用いて、Ｎｏｇｏ−ＡおよびＳ１ＰＲ２が相互作用して、単離されたヒト膠芽腫内皮細胞の伸展ならびに糸状仮足および膜状仮足の伸長を阻害することを示している。（ａ−ｄ）図４ａ−ｄは、終濃度１  μＭのＮｏｇｏ−Ａデルタ２０により誘導された、単離されたヒト膠芽腫微小血管内皮細胞（ＧＢＭ  ＭＶＥＣｓ）の膜状仮足および糸状仮足の退縮を示す、３０分から１時間にわたるタイムコースである。（ｅ−ｈ）Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１で処理したＧＢＭ  ＭＶＥＣはわずかな形態変化だけ示した。（ｉ−ｌ）可溶性Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１  μＭ）で誘導したＧＢＭ  ＭＶＥＣの膜状仮足および糸状仮足の退縮は、ＧＢＭ  ＭＶＥＣをＳ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤ＪＴＥ−０１３（１０  μＭ）とプレインキュベーションすることによって相殺された。各条件の囲まれた領域は、該図の右側に拡大して示す。
【図４ｍ−ｎ】図４ｍにおいて、接着したＧＢＭ  ＭＶＥＣによって誘導されるナノピラー上での平均牽引力およびピラー変位は、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０を被覆したナノピラー上では減少したが、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１を被覆したナノピラー上では減少しなかった。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０の被覆は、〜１２ ｎＮの基礎となるナノピラー上の平均牽引力を誘導した。１０  μＭのＳ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤ＪＴＥ−０１３でＧＢＭ  ＭＶＥＣをプレインキュベーションすることにより、ナノピラー上へ被覆したＮｏｇｏ−Ａデルタ２０により誘導される平均牽引力は、〜４．１  ｎＮへ減少した。しかし、１０  μＭのＳ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ３の薬理学的阻害剤ＶＰＣ  ２３０１９で、またはＳ１ＰＲ１、３、４もしくは５の薬理学的阻害剤ＦＴＹ７２０で、ＧＢＭ  ＭＶＥＣをプレインキュベーションしても、ナノピラー上へ被覆したＮｏｇｏ−Ａデルタ２０により誘導される平均牽引力は減少しなかった。（ｎ）図４ｎは、ＧＢＭ  ＭＶＥＣの糸状仮足によってナノピラー上へ及ぼされるピーク牽引力を示す。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１  μＭ）で処理したＧＢＭ  ＭＶＥＣ糸状仮足は〜１０  ｎＮの基礎とするナノピラー上のピーク牽引力を誘導したが、一方、参照ペプチドＮｏｇｏ−Ａデルタ２１での処理では、わずか〜４  ｎＮだけピーク牽引力を誘導した。ＧＢＭ  ＭＶＥＣを１０  μＭのＳ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤ＪＴＥ−０１３でプレインキュベーションすることにより、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１  μＭ）で処理したナノピラー上のＧＢＭ  ＭＶＥＣ糸状仮足によって誘導された平均ピーク牽引力は〜４．５  ｎＮに減少し、ほぼＮｏｇｏ−Ａデルタ２１（１  μＭ）で処理したＧＢＭ  ＭＶＥＣ糸状仮足のレベル（〜４  ｎＮ）へと下がった。興味深いことに、１０  μＭのＳ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ３の薬理学的阻害剤ＶＰＣ  ２３０１９で、またはＳ１ＰＲ１、３、４もしくは５の薬理学的阻害剤ＦＴＹ７２０で、ＧＢＭ  ＭＶＥＣをプレインキュベーションすることにより、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１  μＭ）で処理したナノピラー上のＧＢＭ  ＭＶＥＣ糸状仮足によって誘導された平均ピーク牽引力は、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１と近いレベルへ減少した。
【図５】図５は、Ｓ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤ＪＴＥ−０１３、Ｓ１ＰＲファミリー受容体の他の薬理学的阻害剤（ＶＰＣ  ２３０１９およびＦＴＹ７２０）と同様に、Ｎｏｇｏ−６６受容体複合体の活性を阻害するＮｏｇｏ−６６の競合的アンタゴニストＮＥＰ１−４０を用いて、Ｎｏｇｏ−ＡおよびＳ１ＰＲ２と同様にＮｏｇｏ−６６およびＮｏｇｏ−６６受容体複合体が相互作用して、単離したヒト膠芽腫内皮細胞の遊走を阻害することを示す。（ａ、ｂ）ヒトＧＢＭ  ＭＶＥＣはＶＥＧＦ−Ａおよびフィブロネクチンの組み合わせ（ＶＥＧＦ＋ＦＮ）の刺激において、誘導された遊走を示す（（ａ）のスキームおよび（ｂ）のデータ）。（ｃ）ヒトＧＢＭ  ＭＶＥＣのＶＥＧＦ＋ＦＮ誘導による遊走は、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０の添加によって量依存的に阻害される。（ｄ）１０  μＭのＳ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤ＪＴＥ−０１３でＧＢＭ  ＭＶＥＣをプレインキュベーションすることにより、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０の暴露にもかかわらず、遊走能は有意に増加する。Ｓ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ３の薬理学的阻害剤ＶＰＣ  ２３０１９はそれ単独では効果を示さないが、ＪＴＥ−０１３とのプレインキュベーションと組み合わせると、ＧＢＭ  ＭＶＥＣ遊走におけるＮｏｇｏ−Ａデルタ２０の阻害効果を強く減少させる。（ｅ）ヒトＧＢＭ  ＭＶＥＣのＶＥＧＦ＋ＦＮ誘導による遊走は、Ｎｏｇｏ−６６の添加によって量依存的に阻害される。Ｎｏｇｏ−６６の競合的アンタゴニストであるＮＥＰ１−４０とプレインキュベーションすることにより、被覆したＮｏｇｏ−６６への暴露におけるＧＢＭ  ＭＶＥＣの遊走能は有意に増加する。
【図６ａ】図６は、Ｎｏｇｏ−Ａが、（例えば、ベバシズマブ／アバスチンによって標的とされる、高い臨床関連性を有する）ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ経路と相互作用することを示す。（ａ）ＨＵＶＥＣは、ＶＥＧＦ−Ａで５分間、１５分間、３０分間処理し、およびＮｏｇｏ−Ａデルタ２０またはＮｏｇｏ−Ａデルタ２１で処理した。ＶＥＧＦＲ２のＴｙｒ１１７５のリン酸化および全ＶＥＧＦＲ２は免疫蛍光染色で可視化した。ＶＥＧＦＲ２のリン酸化は、１５分後にピークに達し、そしてＮｏｇｏ−Ａデルタ２１処理の条件と比較して、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０処理の条件においては、かなり低かった。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１処理の条件においては、３０分後にもリン酸化ＶＥＧＦＲ２は残存したが、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０処理の条件においては、リン酸化ＶＥＧＦＲ２は検出されなかった。
【図６ｂ】図６ｂにおいて、ＨＵＶＥＣはＶＥＧＦ−Ａ有りまたは無しの条件で１５分間処理し、およびＮｏｇｏ−Ａデルタ２０またはＮｏｇｏ−Ａデルタ２１で処理した。ＶＥＧＦＲ２のＴｙｒ１１７５のリン酸化および全ＶＥＧＦＲ２はウエスタンブロットで可視化した。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０またはＮｏｇｏ−Ａデルタ２１単独での処理は、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化を誘導しなかった。ＶＥＧＦ−Ａの添加により、ＶＥＧＦＲ２のＴｙｒ１１７５のリン酸化は強く誘導された。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０の添加により、リン酸化ＶＥＧＦＲ２タンパク質量だけでなくＶＥＧＦＲ２のタンパク質総量も減少した。スケールバー：２０  μｍ。
【図７】図７は、サツら著、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１３；２１、５３７３−５３８２に記載されているとおり、Ｓ１ＰＲ２アゴニストであるＸＡＸ−１６２（左側）およびＣＹＭ−５５２０（右側）の化学構造を示す。
【図８ａ−ｌ】図８は、膠芽腫のマウスモデルへのＮｏｇｏ−Ａデルタ２０の注入が、増殖する血管および増殖する内皮先端細胞（増殖する血管の最前部に特化した細胞型）を阻害することを示す。浸透圧ミニポンプを用いて、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０およびスクランブルＮｏｇｏ−Ａデルタ２０（Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０の不活性形態）を膠芽腫保有マウスへ注入した。膠芽腫保有マウス（注入後２０日、２０Ｄ−ＰＩ）の脳の冠状切片（４０  μｍ）を、ＦＩＴＣレクチン（緑色）で灌流して、灌流した血管を可視化し、および内皮先端細胞を含む血管を可視化するためにエンドムシン（ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ）について染色し（赤色）、および一般的な核マーカー  ＤＡＰＩ（青色）で染色した。囲まれた領域は、ｄ−ｆおよびｇ−ｉに拡大して示す。（ａ−ｆ）エンドムシン＋内皮先端細胞（赤色、矢印）およびＦＩＴＣレクチン＋確立した血管（緑色）（ｄ−ｆ）は、膠芽腫内に示されている。エンドムシンは、（正常な脳の周囲のエンドムシン−血管：緑色と比較して）膠芽腫内の血管（赤色）に特異的であるようである。（ｄ、ｆ、ｇ、ｉ）膠芽腫内の糸状仮足突起を有するエンドムシン＋内皮先端細胞（赤色、矢印）（ｇ）の精密な可視化に注目すべきである。
【図８ｊ】図８ｊにおいて、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０の注入は、膠芽腫内の平均内皮先端細胞数を減少させ、マウス膠芽腫血管へのその阻害効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
用語と定義
本明細書のＧｅｎｅ  ＩＤ番号は米国国立生物工学情報センターの遺伝子データベースの登録を参照している。
【００１２】
本発明で意味する膠芽腫の増殖とは、脳腫瘍の制御不能な増殖、過剰増殖を意味し、それは最終的に、運動麻痺、言語障害、視覚障害、人格変化などを含む様々な神経学的症状、神経系の損傷を引き起こし、そしてほとんどの患者を１５ヶ月以内に死亡させる。
【００１３】
本発明の第１の側面によれば、膠芽腫の治療方法で使用するための、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（配列番号００１および配列番号００２によって定義される）およびＮｏｇｏ−６６（配列番号００３および配列番号００４によって定義される）から選択されるＮｏｇｏの細胞外ドメインもしくは機能的に同等なそれらのホモログを含む単離されたポリペプチド、または基本的に前記細胞外ドメインもしくは機能的に同等なそれらのホモログで構成される単離されたポリペプチドを提供する。
【００１４】
一実施態様においては、Ｎｏｇｏの細胞外ドメインは、配列番号００１、００２、００３または００４のいずれか１つと機能的に同等であり、および配列番号００１、００２、００３または００４のいずれか１つに対して、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％または≧９８％、または１００％の配列同一性を有する。
【００１５】
理論によって縛られるのを望まないが、本発明者らは、Ｎｏｇｏの細胞外ドメインとそれらのそれぞれの受容体との相互作用は血管新生に関与する経路を誘発すると仮説を立てている。それゆえに、Ｎｏｇｏの細胞外ドメインとは異なる化合物であるが、Ｎｏｇｏ−Ａと構造上（または受容体効果が）類似している化合物は、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０および／またはＮｏｇｏ−６６と同様の受容体に相互作用する可能性がある。そのような化合物の受容体への結合は、Ｎｏｇｏ−Ａ細胞外ドメインと類似する受容体の下流シグナル伝達経路を活性化する。
【００１６】
本発明の第２の側面によれば、膠芽腫の治療方法において使用されるための医薬組成物が提供される。該医薬組成物は、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６から選択されるＮｏｇｏ細胞外ドメインを含むポリペプチド、または、基本的に前記細胞外ドメインで構成されるポリペプチドを含む。
【００１７】
一実施態様では、該細胞外ドメインは、配列番号００１、００２、００３または００４のいずれか１つと機能的に等しく、および配列番号００１、００２、００３または００４に対して、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％または≧９８％の配列同一性を有する。一実施態様では、細胞外ドメインは、配列番号００１または００２に対して前記の配列同一性を有し、およびＮｏｇｏデルタ２０のＳ１ＰＲ２受容体との相互作用に関して、Ｎｏｇｏデルタ２０と機能的に同等である。一実施態様では、該細胞外ドメインは、配列番号００３または００４に対して前記の配列同一性を有し、およびＮｏｇｏ−６６のその同族受容体との相互作用に関して、Ｎｏｇｏ−６６と機能的に同等である。
【００１８】
一実施態様では、該医薬組成物は、静脈内または随腔内または脳室内投与によって適用される。
【００１９】
本発明の第３の側面によれば、本発明は膠芽腫を有する患者の治療方法を提供する。該方法は、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６から選択させるＮｏｇｏの細胞外ドメインの有効量を患者へ提供することを含み、ここで特に該細胞外ドメインは、配列番号００１、００２、００３または００４のいずれか１つと機能的に同等であり、および配列番号００１、００２、００３または００４のいずれか１つに対して、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％または≧９８％、または１００％の配列同一性を有する。
【００２０】
本発明の別の側面によれば、１０−８  ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数を有する、Ｓ１ＰＲ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１９０１）、Ｓ１ＰＲ２（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９２９４）、Ｓ１ＰＲ３（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１９０３）およびＳ１ＰＲ５（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５３６３７）を含むＳ１ＰＲ受容体グループのメンバーへ結合可能なアゴニストが、膠芽腫増殖の治療／阻害のために提供される。一実施態様においては、該アゴニストはＳ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ１へ結合する。一実施態様においては、該アゴニストはＳ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ３へ結合する。一実施態様においては、該アゴニストはＳ１ＰＲ２およびＳ１ＰＲ５へ結合する。一実施態様においては、該アゴニストはＳ１ＰＲ２へ結合する。
【００２１】
そのようなアゴニストは、Ｓ１ＰＲ受容体を活性化する低分子であってもよく、例えば、Ｓ１ＰＲ２に対して高選択性であり、他のＳ１Ｐ受容体を活性化しない、低分子ＸＡＸ−１６２およびＣＹＭ−５５２０（図７）である（サツら著、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１３；２１、５３７３−５３８２）。
【００２２】
一実施態様では、該Ｓ１ＰＲ受容体アゴニストは、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０であり、膠芽腫、特に多形性膠芽腫の治療方法において使用するために提供される。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０はＳ１ＰＲ２に対するペプチド活性化因子であるが、他のＳ１Ｐ受容体へも結合する。
【００２３】
本発明の別の側面によれば、１０−８  ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数を有する、ＮｇＲ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６５０７８）、Ｌｉｎｇｏ１  （Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８４８９４）、ｐ７５  （Ｇｅｎｅ  ＩＤ：７１３３）、ＴＲＯＹ  （Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５５５０４）および  ＰｉｒＢ  （Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１０２５）を含むＮｏｇｏ−６６受容体複合体へ結合可能なアゴニスト（例えばＮｏｇｏ−６６）が膠芽腫増殖の治療のために提供される。
【００２４】
一実施態様において、Ｎｏｇｏ−６６（配列番号００３および００４）は膠芽腫、特に多形性膠芽腫の治療方法において使用するために提供される。
【００２５】
本発明は、以下の実施例および図面によってさらに説明され、それらからさらなる実施形態および利点を引き出すことができる。 これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２６】
本発明の背後にある概念と証拠
Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０は、マウスの脳の発達中の血管新生の制御に関与するが、Ｎｏｇｏ−６６は関与しないことは、当該技術分野において周知であるが（バルキリーら著、ＰＮＡＳ  ２０１３；１１０、Ｅ１９４３−５２）、それとは対照的に、開示したデータは、ヒト膠芽腫由来の内皮細胞は、Ｎｏｇｏ−６６と同様にＮｏｇｏ−Ａデルタ２０により誘導した膜状仮足および糸状仮足の退縮（図４）ならびに遊走の阻害（図５）に応答することを示している。これらのデータは、膠芽腫血管新生および増殖においてのＮｏｇｏ−Ａの重要な役割を強調している。しかし、Ｎｏｇｏ−Ａは、ＷＨＯ等級Ｉ〜ＩＩＩの星状細胞腫と同様に他の脳腫瘍（例えば髄膜腫、血管外皮細胞腫など）にも影響を及ぼす可能性がある。
【００２７】
本発明は、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６という、Ｎｏｇｏ−Ａの２つの阻害ドメインが、ヒト膠芽腫の血管増殖を阻害することができるという上記記載の所見に基づく。理論によって縛られるのを望まないが、本発明者らは、この効果は、これらの受容体、Ｓ１ＰＲ（Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０について）およびＮｏｇｏ−６６受容体複合体（Ｎｏｇｏ−６６について）各々との相互作用によって達成されると仮定する。Ｓ１ＰＲは、広範囲の生物学的機能を仲介する、５つのＧタンパク質共役受容体Ｓ１ＰＲ１、Ｓ１ＰＲ２、Ｓ１ＰＲ３、Ｓ１ＰＲ４およびＳ１ＰＲ５の群を有する。
【００２８】
配列リスト
配列番号００１  ＞ラット  Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１８２ａａ；ａａ５４４−７２５）
ＴＧＴＫＩＡＹＥＴＫＶＤＬＶＱＴＳＥＡＩＱＥＳＬＹＰＴＡＱＬＣＰＳＦＥＥＡＥＡＴＰＳＰＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮＳＬＬＰＳＡＧＡＳＶＶＱＰＳＶＳＰＬＥＡＰＰＰＬＳＹＤＳＩＫＬＥＰＥＮＰＰＰＹＥＥＡＭＮＶＡＬＫＡＬＧＴＫＥＧＩＫＥＰＥＳＦＮＡＡＶＱＥＴＥＡＰＹＩＳＩＡＣＤＬＩＫＥＴＫＬＳＴＥＰＳＰＤＦＳＮＹＳＥＩＡＫＦＥＫＳＶＰＥＨＡＥＬＶＥＤＳＳＰＥＳＥＰＶＤＬＦ
配列番号００２  ＞ヒト  Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１８２ａａ；ａａ５６７−７４８）
ＴＧＴＫＩＡＹＥＴＫＭＤＬＶＱＴＳＥＶＭＱＥＳＬＹＰＡＡＱＬＣＰＳＦＥＥＳＥＡＴＰＳＰＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮＳＡＶＰＳＡＧＡＳＶＩＱＰＳＳＳＰＬＥＡＳＳＶＮＹＥＳＩＫＨＥＰＥＮＰＰＰＹＥＥＡＭＳＶＳＬＫＫＶＳＧＩＫＥＥＩＫＥＰＥＮＩＮＡＡＬＱＥＴＥＡＰＹＩＳＩＡＣＤＬＩＫＥＴＫＬＳＡＥＰＡＰＤＦＳＤＹＳＥＭＡＫＶＥＱＰＶＰＤＨＳＥＬＶＥＤＳＳＰＤＳＥＰＶＤＬＦ
配列番号００３  ＞ラット  Ｎｏｇｏ−６６（６６ａａ；ａａ１０２６−１０９１）
ＲＩＹＫＧＶＩＱＡＩＱＫＳＤＥＧＨＰＦＲＡＹＬＥＳＥＶＡＩＳＥＥＬＶＱＫＹＳＮＳＡＬＧＨＶＮＣＴＩＫＥＬＲＲＬＦＬＶＤＤＬＶＤＳＬＫ
配列番号００４  ＞ヒト  Ｎｏｇｏ−６６（６６ａａ；ａａ１０５５−１１２０）
ＲＩＹＫＧＶＩＱＡＩＱＫＳＤＥＧＨＰＦＲＡＹＬＥＳＥＶＡＩＳＥＥＬＶＱＫＹＳＮＳＡＬＧＨＶＮＣＴＩＫＥＬＲＲＬＦＬＶＤＤＬＶＤＳＬＫ
【００２９】
実施例１：膠芽腫マウスモデルにおける血管上のＳ１ＰＲ２の発現
方法：
成体Ｃ５７ＢＬ／６動物（生後２ヶ月）へのＧＬ２６１神経膠腫細胞の移植を、以前の記載（アルウォーンら著、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６；１１８、１７２８−１７３５；バイオラズら著、  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；３９、１３２３−１３３３ｊ）の方法で実施した。簡単に説明すると、総数２×１０４  細胞数のＧＬ２６１細胞を、ハミルトンシリンジを用いて、３ｍｍの深さのブレグマへ、側面１ｍｍおよび背面２ｍｍの位置の配置したボアホールを通じて、播種した。腫瘍保有マウスは体重測定および脳内腫瘍に関する神経症状の評価によって毎日チェックを行った。注入後７日（７Ｄ−ＰＩ）、１５日（１５Ｄ−ＰＩ）および終了時（３週間）に、動物に免疫蛍光のための処理をした。ようするに、マウスをイソフルランで麻酔し、１５０  μｇのＦＩＴＣレクチン（ベクター  ラボラトリーズ）を溶解した０．９％ＮａＣｌ含有水溶液を静脈注射で注入した。ＦＩＴＣレクチンはマウスを４％ＰＦＡで心臓内灌流する前に、５分間循環させた。続いて、脳を解剖し、４℃で一晩、４％ＰＦＡで固定した。固定した組織を、３０％スクロース含有０．１Ｍ  ＰＢＳで３〜４日間凍結保護し、それからＯ．Ｃ．Ｔ．ティシュー・テック（サクラ）で包埋した。厚さ４０  μｍの腫瘍を有する脳の凍結切片を作製した。免疫組織化学は記述（バルキリーら著、ＰＮＡＳ  ２０１３；１１０、Ｅ１９４３−５２）のとおりに実施した。
【００３０】
結果：
図１に、膠芽腫マウスモデルにおけるＳ１ＰＲ２の発現を示す。膠芽腫に隣接する正常な脳の血管（図１ａ−ｃ；緑色、矢印）はＳ１ＰＲ２を発現した（図１ａ−ｃ；赤色）。腫瘍／膠芽腫／神経膠腫内では、血管上のＳ１ＰＲ２はアップレギュレートされている（図１ｄ−ｆ；緑色、矢印）。
【００３１】
実施例２：ヒト膠芽腫において血管はＳ１ＰＲ２を発現する
方法：
チューリッヒ大学病院の神経外科で手術された患者から得た腫瘍は、４℃で一晩、４％ＰＦＡで固定した。固定した組織を、３０％スクロース含有０．１Ｍ  ＰＢＳ中で３〜４日間凍結保護し、それからＯ．Ｃ．Ｔ．ティシュー・テック（サクラ）で包埋した。厚さ８０  μｍの腫瘍組織の凍結切片を作製した。免疫組織化学は記述（バルキリー著、ＰＮＡＳ  ２０１３；１１０、Ｅ１９４３−５２）のとおりに実施した。
【００３２】
結果：
図２に、ヒト膠芽腫組織におけるＮｏｇｏ−ＡおよびＳ１ＰＲ２の発現を実証する。ヒト膠芽腫組織内の血管（図２ａ−ｃ；赤色）はＳ１ＰＲ２を発現している（図２ａ−ｃ；緑色）Ｓ１ＰＲ２は確立された血管上（図２ｄ−ｉ；赤色）（ｄ−ｆ）と同様に、内皮先端細胞上（図２ｄ−ｆ；赤色、矢印）および膠芽腫内（図２ｇ−ｉ）でも発現している。
【００３３】
ヒト膠芽腫および正常なヒトの脳の試料（図２ｊ−ｑ）の組織マイクロアレイ（１０  μｍ）は、Ｎｏｇｏ−Ａ（赤色）およびＳ１ＰＲ２（茶色）について染色した。Ｓ１ＰＲ２（茶色）は正常なヒトの脳の内皮先端細胞上と同様に、ヒト膠芽腫組織の腫瘍内皮細胞上でも発現している（矢印）。Ｎｏｇｏ−Ａ（赤色）は、ヒト膠芽腫において、実質的に存在しない（ｎ、ｏ）から強い発現（ｐ、ｑ）までの範囲で高い可変性の発現を示す。腫瘍内皮細胞上ではＮｏｇｏ−Ａの発現はほとんど観測されなかった（ｎ−ｑ）。
【００３４】
実施例３：ヒト膠芽腫およびヒト膠芽腫内皮細胞においてＮｏｇｏ−Ａ受容体は発現する
方法：
以前の記載（バルキリーら著、ＰＮＡＳ  ２０１３；１１０、Ｅ１９４３−５２）のとおりにウエスタンブロットおよび定量ＰＣＲを行った。
【００３５】
結果：
ウエスタンブロットはＮｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６に対する受容体の異なるタンパク質に対する抗体を用いる。Ｓ１Ｐ受容体（Ｓ１ＰＲ１、２、３、５）は、ヒト膠芽腫抽出物（膠芽腫  ＺＨ−３７９／４１３）において、および単離したヒト膠芽腫内皮細胞（膠芽腫  ＺＨ−３７９／４１３  ＭＶＥＣ）において、検出された（図３ａ）。Ｎｏｇｏ−６６受容体複合体のタンパク質メンバー、すなわちＮｇＲ１、Ｌｉｎｇｏ１、ＴＲＯＹ、ｐ７５およびＰｉｒＢはヒト膠芽腫抽出物（膠芽腫  ＺＨ−３７９／４１３）において、および単離したヒト膠芽腫内皮細胞（膠芽腫  ＺＨ−３７９／４１３  ＭＶＥＣ）において、検出された。
【００３６】
Ｓ１ＰＲ２、Ｓ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ５の発現もまた、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、正常な脳ＭＶＥＣおよび膠芽腫ＭＶＥＣ（ＧＢＭ  ＭＶＥＣ）において検出された（図３ｂ）。該発現は、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣにおいてより強く発現するＳ１ＰＲ１を除いて、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣに匹敵するものであった。
【００３７】
実施例４：Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０はＳ１ＰＲ２と相互作用して膜状仮足および糸状仮足の退縮を仲介する
方法：
時間経過および力の発生の実験のために、Ｖｙｂｒａｎｔ／Ｄｉｌ  （インビトロジェン、１：２００）ラベル化ＧＢＭ  ＭＶＥＣ（１０４  細胞／ｍｌ）をナノピラー構造体上に添加した。撮像工程は、ＧＢＭ  ＭＶＥＣをナノピラーに播種後１時間から開始した。ナノピラー表面上のＧＢＭ  ＭＶＥＣが及ぼす牽引力を算出するために、６３ｘ、ＮＡ１．４油浸対物レンズを備えるＬｅｉｃａ共焦点顕微鏡ＳＰ５を用いて、ナノピラー先端の歪みを、共焦点顕微鏡で画像化した。
【００３８】
画像取得中、ＧＢＭ  ＭＶＥＣは３７℃および１０％ＣＯ２で維持された。ナノピラーアレイおよびＤｉラベル化細胞の画像を得るために、以下のレーザー波長を使用した：４８８  ｎｍ（ナノピラー構造）および５４６  ｎｍ（Ｄｉｌ）。
【００３９】
内皮細胞（ＧＢＭ  ＭＶＥＣ）とナノピラーとの間の接着において、被覆されたＮｏｇｏ−Ａタンパク質の効果を定量的に評価するために、ナノピラーをＮｏｇｏ−Ａデルタ２０、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１またはフィブロネクチン（ブランク条件）で被覆した。
【００４０】
基板上の内皮細胞（ＧＢＭ  ＭＶＥＣ）により適用された合計の力を算出するために、単一細胞あたり８００から５０００のナノピラーの平均変位を使用した。単一ＧＢＭ  ＭＶＥＣは、フレームあたり３０秒の走査比で、合計２０分間撮像した。各条件について少なくとも３つの個々のＧＢＭ  ＭＶＥＣを分析した。
【００４１】
Ｎｏｇｏ−Ａ受容体の役割を評価するために、内皮細胞を、播種する前に３０分間、Ｓ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤（ＪＴＥ−０１３、１０  μＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｓ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ３の薬理学的阻害剤（ＶＰＣ  ２３０１９、１０  μＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、またはＳ１ＰＲ１、３、４および５の薬理学的阻害剤（ＦＴＹ７２０、１０  μＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でプレインキュベートした。
【００４２】
ＧＢＭ  ＭＶＥＣの退縮における可溶性Ｎｏｇｏ−Ａタンパク質の重大な効果を定量的に評価するために、２５  μｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチンで被覆したナノピラー上のＤｉｌラベル化内皮細胞を、細胞播種後３０分に、１  μＭの可溶性Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−Ａデルタ２１で処理した。次いで単一のＧＢＭ  ＭＶＥＣを、フレームあたり走査比３０秒で、合計１．５時間撮像した。ナノピラー変位は、ＧＢＭ  ＭＶＥＣがナノピラー表面上で力を適用したときにシーケンス画像として記録した。各条件について、少なくとも３つの個々のＧＢＭ  ＭＶＥＣを分析した。Ｎｏｇｏ−Ａ受容体の役割を評価するために、内皮細胞を３０分間培養後、さらに３０分、Ｓ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤（ＪＴＥ−０１３、１０  μＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｓ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ３の薬理学的阻害剤（ＶＰＣ  ２３０１９、１０  μＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、またはＳ１ＰＲ１、３、４および５の薬理学的阻害剤（ＦＴＹ７２０、１０  μＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で細胞をインキュベートした。次いで、可溶性Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１  μＭ）またはＮｏｇｏ−Ａデルタ２１（１  μＭ）を添加し、そして膜状仮足および糸状仮足を１時間撮像した。（被覆されたＮｏｇｏ−Ａタンパク質を用いる実験について）全内皮細胞により、または（可溶性Ｎｏｇｏ−Ａタンパク質を用いる実験について）単一の内皮細胞糸状仮足により、誘導されたナノピラー先端の歪み（ｘ）を、プログラムＤｉａｔｒａｃｋ（Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ、Ｓｅｍａｓｏｐｈｔ）を用いて測定した。最後に、式Ｆ＝ｋ×ｘを用いて対応する牽引力を算出し、前記式においてｋはナノピラーのバネ定数、７８．７６  ｎＮ／μｍを表す。
【００４３】
結果：
タイムコースは、３０分から１時間にわたる、終濃度１  μＭのＮｏｇｏ−Ａデルタ２０によって誘導された単離したヒト膠芽腫微小血管内皮細胞（ＧＢＭ  ＭＶＥＣ）の膜状仮足および糸状仮足の退縮のを示す（図４ａ−ｄ）。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１で処理したＧＢＭ  ＭＶＥＣはわずかな形態変化しか示さなかった（図４ｅ−ｈ）。可溶性Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１  μＭ）で誘導したＧＢＭ  ＭＶＥＣの膜状仮足および糸状仮足の退縮は、ＧＢＭ  ＭＶＥＣをＳ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤ＪＴＥ−０１３（１０  μＭ）でプレインキュベーションすることによって相殺された（図４ｉ−ｌ）。
【００４４】
接着したナノピラー上のＧＢＭ  ＭＶＥＣによって誘導される平均牽引力およびピラー変位は、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０被覆ナノピラー上では減少し、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１被覆ナノピラー上では減少しなかった（図４ｍ）。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０の被覆は、基礎となるナノピラーの〜１２  ｎＮの平均牽引力を誘導した。ＧＢＭ  ＭＶＥＣを、１０  μＭのＳ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤ＪＴＥ−０１３でプレインキュベーションすることにより、ナノピラー上へ被覆したＮｏｇｏ−Ａデルタ２０により誘導される平均牽引力は〜４．１  ｎＮへ減少した。しかし、ＧＢＭ  ＭＶＥＣを、１０  μＭのＳ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ３の薬理学的阻害剤ＶＰＣ  ２９０１３、またはＳ１ＰＲ１、３、４もしくは５の薬理学的阻害剤ＦＴＹ７２０でプレインキュベーションしても、ナノピラー上へ被覆したＮｏｇｏ−Ａデルタ２０により誘導される平均牽引力は減少しなかった。
【００４５】
ピーク牽引力はナノピラー上のＧＢＭ  ＭＶＥＣ糸状仮足によって及ぼされる。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１  μＭ）で処理したＧＢＭ  ＭＶＥＣ糸状仮足は基礎となるナノピラーの〜１０  ｎＮのピーク牽引力を誘導し、一方で参照ペプチドＮｏｇｏ−Ａデルタ２１は、わずか〜４  ｎＮだけピーク牽引力を誘導した（図４ｎ）。ＧＢＭ  ＭＶＥＣを、１０  μＭのＳ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤ＪＴＥ−０１３でプレインキュベーションすることにより、ナノピラー上のＮｏｇｏ−Ａデルタ２０で処理したＧＢＭ  ＭＶＥＣ糸状仮足により誘導される平均ピーク牽引力は、〜４．５  ｎＮへ減少し、それはＮｏｇｏ−Ａデルタ２１（１  μＭ）で処理したＧＢＭ  ＭＶＥＣ糸状仮足のレベル（〜４  ｎＮ）までほぼ下がっている。興味深いことに、ＧＢＭ  ＭＶＥＣを、１０  μＭのＳ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ３の薬理学的阻害剤ＶＰＣ  ２９０１３、またはＳ１ＰＲ１、３、４もしくは５の薬理学的阻害剤ＦＴＹ７２０とプレインキュベーションすることにより、ナノピラー上のＮｏｇｏ−Ａデルタ２０で処理したＧＢＭ  ＭＶＥＣ糸状仮足により誘導される平均ピーク牽引力は、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１に近いレベルまで減少した。
【００４６】
実施例５：Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６はそれぞれＳ１ＰＲ２およびＮｇＲ１を介してＧＢＭ  ＭＶＥＣの遊走を阻害する
方法：
遊走アッセイのために、２４ウェルプレートインサート（ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））の底面を１０  μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（リコンビナント  ヒトフィブロネクチン、Ｂｉｏｐｕｒ  ＡＧ）ならびに異なる濃度のＮｏｇｏ−Ａデルタ２１、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０およびＮｏｇｏ−６６（Ｒ＆Ｄシステムズ）を含むＰＢＳ  ０．５ｍＬで被覆し、そして３７℃で１時間インキュベートした。内皮細胞（ＧＢＭ  ＭＶＥＣｓ）は、ａｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡラボラトリーズ）で解離する４時間前に、遊走培地（ＤＭＥＭ＋０．２５％ＢＳＡ）中で飢餓状態にした。細胞を遊走培地に再懸濁し（１  Ｍｉｏ／ｍｌ）、カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、４  μｇ／ｍｌ）でラベル化し、続いてＨＢＳＳで洗浄し、遊走培地に再懸濁した（１２５，０００細胞／ｍｌ）。被覆したインサートを洗浄し、そしてヒトＶＥＧＦ−Ａ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．、１０  ｎｇ／ｍｌ）を含む、または含まない遊走培地を添加することによって、底部チャンバ−を調製した。そして該インサートを空の２４ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））へセットし、カルセインＡＭラベル化内皮細胞（インサートあたり５０，０００細胞）を添加した。
【００４７】
充填したインサートを準備したクラスタープレートへ移し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。１．２  ｍＬの遊走培地中で、異なる細胞数（ウェルあたり５０，０００／２５，０００／１２，５００／６，２５０／３，１２５／１，５６３／７８２細胞）の細胞を３連で添加することで、細胞滴定プレートを調製し、平行してインキュベートした。４時間後に細胞蛍光測定機（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｐｒｏ  ２００）によって、蛍光を測定し、そして遊走した細胞の数を滴定曲線に基づいて算出した。
【００４８】
トランズウェルインサートの底部へ被覆したＮｏｇｏ−Ａデルタ２０／Ｎｏｇｏ−６６およびその受容体の共シグナル伝達が、どのように細胞の遊走へ影響を与えるかを調べるために、カルセインＡＭラベル化ＧＢＭ  ＭＶＥＣは、カルセインＡＭラベル化中に、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０受容体Ｓ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤（ＪＴＥ−０１３、１  μＭ、１０  μＭ）と、Ｓ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ３の薬理学的阻害剤（ＶＰＣ  ２３０１９、１０  μＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、ならびにＮｏｇｏ−６６受容体ＮｇＲ１（ＮＥＰ１−４０、４．６  μｇ／ｍｌ）と１時間インキュベートした。洗浄後、トランズウェルインサートのチャンバ−上に細胞を添加する前に、細胞培地に再度それらの薬理学的阻害剤を供給した。
【００４９】
結果：
ヒトＧＢＭ  ＭＶＥＣは、ＶＥＧＦ−Ａおよびフィブロネクチンの組み合わせ（ＶＥＧＦ＋ＦＮ）を用いた刺激において、誘導される遊走を示す（図５ａ中の模式図および図５ｂ中のデータ）。ヒトＧＢＭ  ＭＶＥＣのＶＥＧＦ＋ＦＮが誘導する遊走は、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０の添加によって、量依存的に阻害された（図５ｃ）。ＧＢＭ  ＭＶＥＣを、１０  μＭのＳ１ＰＲ２の薬理学的阻害剤ＪＴＥ−０１３でプレインキュベーションすることにより、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０の暴露にもかかわらず、遊走能は有意に増加する（図５ｄ）。Ｓ１ＰＲ１およびＳ１ＰＲ３の薬理学的阻害剤ＶＰＣ  ２３０１９は、それ単独では効果がないにもかかわらず、ＪＴＥ−０１３とのプレインキュベーションを組み合わせることで、ＧＢＭ  ＭＶＥＣ遊走におけるＮｏｇｏ−Ａデルタ２０の阻害剤効果を強く減少させる。ヒトＧＢＭ  ＭＶＥＣのＶＥＧＦ＋ＦＮ誘導による遊走は、Ｎｏｇｏ−６６の添加によって、量依存的に阻害される（図５ｅ）。Ｎｏｇｏ−６６の競合的アンタゴニストであるＮＥＰ１−４０とプレインキュベーションすることにより、被覆したＮｏｇｏ−６６への暴露におけるＧＢＭ  ＭＶＥＣの遊走能は有意に増加する。
【００５０】
実施例６：Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０はＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２経路と相互作用して、シグナル伝達のアウトプットを調節する
方法：
異なる処理条件について、８ウェルディッシュ（ＬａｂＴｅｋ  チャンバースライド、免疫蛍光）または６ウェルディッシュ（ウエスタンブロット）にＨＵＶＥＣを播種し、細胞がコンフルエントになるまで２〜３日間静置した。ＥＢＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ、スイス）中で４時間細胞を飢餓状態にした後、細胞を、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１  μＭ）、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０（１  μＭ）およびＶＥＧＦ−Ａ（１００  ｎｇ／μｌ）、  Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１（１  μＭ）、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１（１  μＭ）およびＶＥＧＦ（１００  ｎｇ／μｌ）、またはＶＥＧＦ−Ａ単独（１００  ｎｇ／μｌ）で、それぞれＥＢＭ−２培地中で処理した。該細胞を、室温で１５分間、４％ホルムアルデヒドで固定化するか、またはＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。固定後、抗リン酸化ＶＥＧＦＲ２抗体（ｐＴｙｒ１１７５、＃２４７８、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｆ−アクチン（ファロイジン  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標））およびＤＡＰＩでＨＵＶＥＣを染色した。ウエスタンブロットにおいてもＶＥＧＦＲ２およびリン酸化ＶＥＧＦＲ２を検出するために同一の抗体を用いた。
【００５１】
結果：
ＨＵＶＥＣを５分間、１５分間または３０分間ＶＥＧＦ−Ａで、およびＮｏｇｏ−Ａデルタ２０またはＮｏｇｏ−Ａデルタ２１で処理した（図６ａ）。ＶＥＧＦＲ２のＴｙｒ１１７５のリン酸化および全ＶＥＧＦＲ２を免疫蛍光染色で可視化した。ＶＥＧＦＲ２リン酸化は、１５分後にピークに達し、そしてＮｏｇｏ−Ａデルタ２１処理の条件と比較してＮｏｇｏ−Ａデルタ２０処理の条件のおいては、かなり低かった。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２１処理の条件においては３０分後、リン酸化ＶＥＧＦＲ２が残存するのに対して、Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０処理の条件においては、リン酸化ＶＥＧＦＲ２は検出されなかった。
【００５２】
ＨＵＶＥＣを１５分間、ＶＥＧＦ−Ａで、またはＶＥＧＦ−Ａなしで、およびＮｏｇｏ−Ａデルタ２０またはＮｏｇｏ−Ａデルタ２１で処理した（図６ｂ）。ＶＥＧＦＲ２のＴｙｒ１１７５のリン酸化および全ＶＥＧＦＲ２をウエスタンブロットで可視化した。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０またはＮｏｇｏ−Ａデルタ２１単独での処理は、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化を誘導しなかった。ＶＥＧＦ−Ａの添加は、ＶＥＧＦＲ２のＴｙｒ１１７５のリン酸化を強く誘導した。Ｎｏｇｏ−Ａデルタ２０の添加は、リン酸化ＶＥＧＦＲ２タンパク質だけでなくＶＥＧＦＲ２タンパク質総量も減少させた。
【図１】
2018505161.tif 000002
【図２】
2018505161.tif 000003
【図３】
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【図４ａ−ｌ】
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【図４ｍ−ｎ】
2018505161.tif 000006
【図５】
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【図６ａ】
2018505161.tif 000008
【図６ｂ】
2018505161.tif 000009
【図７】
2018505161.tif 000010
【図８ａ−ｌ】
2018505161.tif 000011
【図８ｊ】
2018505161.tif 000012
【配列表】
2018505161000001.app
【国際調査報告】
2018505161.tif 000013
2018505161.tif 000014
2018505161.tif 000015