(57)【要約】  本明細書では、カルコンおよびスチルベンなどのフェニルプロパノイド誘導体、ならびにジヒドロカルコンおよびジヒドロスチルベンなどのジヒドロフェニルプロパノイド誘導体を、微生物中で生産するための方法および組成物が提供される。特に本開示は、フェニルプロパノイド誘導体化合物およびジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産するための、組換え微生物およびその使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え宿主細胞において、ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物と比較したフェニルプロパノイド誘導体化合物の生産を調節する方法であって、方法が：
（ａ）ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物と比較したフェニルプロパノイド誘導体化合物の生産を、（ｉ）二重結合レダクターゼ活性、または（ｉｉ）二重結合レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子の発現を、低減または排除することによって、増加させること；または
（ｂ）ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物と比較したフェニルプロパノイド誘導体化合物の生産を、（ｉ）二重結合レダクターゼ活性、または（ｉｉ）二重結合レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子の発現を、増加させることによって、低減すること；
を含み、ここでフェニルプロパノイド誘導体化合物がカルコンまたはスチルベンであり、ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物がジヒドロカルコンまたはジヒドロスチルベンである、
前記方法。
【請求項２】
二重結合レダクターゼポリペプチドが、
（ａ）エノイルレダクターゼポリペプチド；または
（ｂ）ポリプレノールレダクターゼポリペプチド、
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エノイルレダクターゼポリペプチドが、S. cerevisiaeのｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼＴＳＣ１３である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ポリプレノールレダクターゼポリペプチドが、S. cerevisiaeのＤＦＧ１０である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
フェニルプロパノイド誘導体化合物が、ナリンゲニン、レスベラトロール、ピノシルビン、ピノセンブリンカルコン、またはピノセンブリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物が、フロレチン、フロリジン、ジヒドロピノシルビン、３−Ｏ−メチルジヒドロピノシルビン、２−イソプレニル−３−Ｏ−メチルジヒドロピノシルビン、またはジヒドロレスベラトロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
二重結合レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子を含む、フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産可能な組換え酵母細胞であって、該遺伝子の発現、または該遺伝子によってコードされる二重結合レダクターゼポリペプチドの活性が、低減または排除される、前記組換え酵母細胞。
【請求項８】
二重結合レダクターゼポリペプチドが、
（ａ）エノイルレダクターゼポリペプチド；または
（ｂ）ポリプレノールレダクターゼポリペプチド、
である、請求項７に記載の組換え酵母細胞。
【請求項９】
エノイルレダクターゼポリペプチドが、S. cerevisiaeのｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼＴＳＣ１３である、請求項８に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１０】
ポリプレノールレダクターゼポリペプチドが、S. cerevisiaeのＤＦＧ１０である、請求項８に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１１】
二重結合レダクターゼポリペプチドの機能を部分的または完全に補足する酵素をコードする組換え遺伝子をさらに含む、請求項７に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１２】
二重結合レダクターゼポリペプチドの機能を部分的または完全に補足する酵素をコードする組換え遺伝子が、（ａ）配列番号９４〜９６のいずれか１つ、または（ｂ）配列番号９４〜９６のいずれか１つと少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１３】
二重結合レダクターゼポリペプチドの機能を部分的または完全に補足する酵素をコードする組換え遺伝子が、（ａ）配列番号６５〜６７のいずれか１つ、または（ｂ）配列番号６５〜６７のいずれか１つと少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項１１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１４】
ポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドをコードする組換え遺伝子をさらに含む、請求項７に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１５】
ポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドが、
（ａ）カルコンシンターゼポリペプチド；または
（ｂ）スチルベンシンターゼポリペプチド、
である、請求項１４に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１６】
（ｃ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｄ）シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｅ）４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｆ）シトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；または
（ｇ）カルコンイソメラーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子、
の１つ以上をさらに含む、請求項１４に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１７】
フェニルプロパノイド化合物が、ケイ皮酸またはクマル酸である、請求項７に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１８】
フェニルプロパノイド誘導体化合物が、カルコン化合物またはスチルベノイド化合物である、請求項７に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１９】
レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号７もしくは配列番号４３；または（ｂ）配列番号７と少なくとも７０％の同一性もしくは配列番号４３と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項７に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２０】
レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号２２；（ｂ）配列番号２６；（ｃ）配列番号２２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド；または（ｄ）配列番号２６と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項７に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２１】
カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号４；または（ｂ）配列番号４と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１５に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２２】
カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号１９；または（ｂ）配列番号１９と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２３】
スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号２３；または（ｂ）配列番号２３と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１５に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２４】
スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号２４；または（ｂ）配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２５】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号１；または（ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２６】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号１６；または（ｂ）配列番号１６と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２７】
シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号２、または（ｂ）配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２８】
シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号１７；または（ｂ）配列番号１７と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２９】
４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号３；または（ｂ）配列番号３と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３０】
４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号１８；または（ｂ）配列番号１８と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３１】
シトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号６；または（ｂ）配列番号６と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３２】
シトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号２１；または（ｂ）配列番号２１と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３３】
カルコンイソメラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号８０〜８６のいずれか１つ；または（ｂ）配列番号８０〜８６のいずれか１つと少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３４】
カルコンイソメラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号８７〜９３のいずれか１つ；または（ｂ）配列番号８７〜９３のいずれか１つと少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３５】
Saccharomyces cerevisiae細胞、Schizosaccharomyces pombe細胞、Yarrowia lipolytica細胞、Candida glabrata細胞、Ashbya gossypii細胞、Cyberlindnera jadinii細胞、Pichia pastoris細胞、Kluyveromyces lactis細胞、Hansenula polymorpha細胞、Candida boidinii細胞、Arxula adeninivorans細胞、Xanthophyllomyces dendrorhous細胞、またはCandida albicans細胞である、請求項７に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３６】
酵母菌（Saccharomycete）である、請求項３５に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３７】
Saccharomyces cerevisiae種からの細胞である、請求項３５に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３８】
カルコン化合物またはスチルベン化合物を生産する方法であって、請求項７〜３７のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、前記化合物が、組換え酵母細胞により合成される、前記方法。
【請求項３９】
カルコン化合物を生産する方法である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
スチルベン化合物を生産する方法である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
スチルベン化合物がレスベラトロールである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
式（ＩＩＩ）：
【化１】
2018520661.tif 000131
で表される化合物またはその薬学的に許容し得る塩を生産する方法であって、式中、
Ａは、結合またはＣ＝Ｏであり；
ｎは、０、１、２、３、または４の整数であり；
Ｒは、
【化２】
2018520661.tif 000132
が二重結合の場合は水素であり、または、ＲとＲ５は、ＡがＣ＝Ｏであり、かつ
【化３】
2018520661.tif 000133
が単結合の場合は、それらが結合している原子と一緒になって、６員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素、−ＯＲ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
前記方法は、請求項７〜４１のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、ここで式Ｉの化合物が、組換え酵母細胞によって合成される、
前記方法。
【請求項４３】
化合物を収集することをさらに含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
化合物を単離することをさらに含む、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
組換え宿主細胞であって、
（ａ）エノイルレダクターゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；および
（ｂ）ポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドをコードする組換え遺伝子、
を含む、前記組換え宿主細胞。
【請求項４６】
ポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドをコードする組換え遺伝子が、
（ｉ）カルコンシンターゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；または
（ｉｉ）スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子、
を含む、請求項４５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４７】
以下：
（ｃ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｄ）シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｅ）４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；または
（ｆ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子、
の１つ以上をさらに含む、請求項４５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４８】
エノイルレダクターゼポリペプチドが過剰発現される、請求項４５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４９】
少なくとも１つのフロリジンまたはフロリジン前駆体化合物を生産することができる、請求項４５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５０】
フロリジン前駆体化合物が、フロレチンである、請求項４９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５１】
エノイルレダクターゼポリペプチドが、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである、請求項４５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５２】
ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼが、S. cerevisiaeのＴＳＣ１３である、請求項５１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５３】
エノイルレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号７を含む、請求項４５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５４】
エノイルレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項４５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５５】
エノイルレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号２２；または（ｂ）配列番号２２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項４５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５６】
カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号４、２７、または６８〜７０の１つを含む、請求項４６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５７】
カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号４、２７または６８〜７０の１つと少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５８】
カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号１９、４９、もしくは７１〜７３の１つ；（ｂ）配列番号１９、４９、もしくは７１〜７３の１つと少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド；または（ｃ）配列番号１９もしくは７１〜７３の１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を、配列番号１９もしくは７１〜７３の１つにおけるアミノ酸９５〜１０５、１３２〜１４２、１９１〜２０１および２６６〜２７６にまたがる合わせた領域において有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項４６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５９】
スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号２３を含む、請求項４６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６０】
スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号２３と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６１】
スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号２４；または（ｂ）配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項４６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６２】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号１を含む、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６３】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６４】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号１６；または（ｂ）配列番号１６と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６５】
シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号２を含む、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６６】
シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６７】
シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号１７；または（ｂ）配列番号１７と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６８】
４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号３を含む、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６９】
４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号３と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７０】
４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号１８；または（ｂ）配列番号１８と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７１】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号５を含む、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７２】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号５と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７３】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチドをコードする遺伝子が、（ａ）配列番号２０；または（ｂ）配列番号２０と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする、請求項４７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７４】
組換え宿主細胞が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である、請求項４５〜７３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７５】
細菌細胞が、Escherichia細胞、Lactobacillus細胞、Lactococcus細胞、Cornebacterium細胞、Acetobacter細胞、Acinetobacter細胞、またはPseudomonas細胞を含む、請求項７４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７６】
酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae細胞、Schizosaccharomyces pombe細胞、Yarrowia lipolytica細胞、Candida glabrata細胞、Ashbya gossypii細胞、Cyberlindnera jadinii細胞、Pichia pastoris細胞、Kluyveromyces lactis細胞、Hansenula polymorpha細胞、Candida boidinii細胞、Arxula adeninivorans細胞、Xanthophyllomyces dendrorhous細胞、またはCandida albicans細胞を含む、請求項７４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７７】
酵母細胞が酵母菌である、請求項７６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７８】
酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae種からの細胞である、請求項７６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７９】
ジヒドロカルコン化合物またはジヒドロスチルベン化合物を生産する方法であって、請求項４５〜７８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、ここで前記化合物が、組換え宿主細胞によって合成される、前記方法。
【請求項８０】
ジヒドロカルコン化合物を生産する方法である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
ジヒドロカルコン化合物が、フロレチンまたはフロレチン誘導体である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
フロレチン誘導体がフロリジンである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ジヒドロスチルベン化合物を生産する方法である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
式（ＩＩＩ）：
【化４】
2018520661.tif 000134
で表される化合物またはその薬学的に許容し得る塩を生産する方法であって、式中、
Ａは、結合またはＣ＝Ｏであり；
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素または−ＯＲ１１であり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１または−Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、およびアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
前記方法は、請求項４５〜７８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、ここで式ＩＩＩの化合物が、組換え宿主細胞によって合成される、
前記方法。
【請求項８５】
化合物を培地から収集することをさらに含む、請求項７９〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
化合物を培地から単離することをさらに含む、請求項７９〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年６月５日に出願された米国仮出願第62/171,742号、２０１６年５月３日に出願された米国仮出願第62/331,023号、および２０１６年５月１７日に出願された米国仮出願第62/337,576号の利益を主張する；これら各々の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
背景
発明の分野
本明細書に提供されるのは、宿主生物における化合物の生合成生産のための方法および組成物である。特に本開示は、カルコンおよびスチルベンなどのフェニルプロパノイド誘導体化合物、ならびにジヒドロカルコンおよびジヒドロスチルベンなどのジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物の、生合成生産に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
フェニルプロパノイドは、植物においてフェノール性アミノ酸前駆体から生合成的に生産されるフェノール化合物の多様なファミリーである。フェニルプロパノイドおよびその誘導体は、例えば食品および健康産業において望ましい用途を有する。
【０００４】
例示的なフェニルプロパノイド誘導体は、下流のフェニルプロパノイド誘導体の生産における中間体でもある化合物、ナリンゲニンである。ナリンゲニンは、次の化学構造を有する：
【化１】
2018520661.tif 000002
【０００５】
ナリンゲニンは植物中で天然に生産され、またフラボノイド生合成経路の成分で遺伝子操作された細胞においても、生合成的に生産される（例えばKoopman et al., (2012) Microbial Cell Factories 2012, 11:155を参照）。例えば、クマロイル−ＣｏＡを生産するように操作された細胞は、クマロイル−ＣｏＡをナリンゲニンに変換するタンパク質を発現する組換え遺伝子でさらに操作される。
【０００６】
他の例示的なフェニルプロパノイド誘導体は、スチルベンレスベラトロールであり、これは、他の下流のフェニルプロパノイド誘導体の生産における中間体でもある。レスベラトロールは、次の化学構造を有する：
【化２】
2018520661.tif 000003
【０００７】
レスベラトロールはまた、クマロイル−ＣｏＡ前駆体分子を用いても生産される。ジヒドロフェニルプロパノイドは、フェニルプロパノイドプロペンの尾部（tail）の二重結合が還元された、フェニルプロパノイド誘導体である。ジヒドロクマロイル−ＣｏＡまたはジヒドロシンナモイル−ＣｏＡなどのジヒドロフェニルフェニルプロパノイドは、例えばジヒドロカルコンのメンバーおよびジヒドロスチルベノイドのメンバーなどの種々の望ましい化合物の生産において、重要な生合成中間体を提供する。
【０００８】
ジヒドロスチルベノイドの例は、ジヒドロレスベラトロールおよびジヒドロピノシルビンであり、これらはそれぞれ、ジヒドロクマロイル−ＣｏＡまたはジヒドロシンナモイル−ＣｏＡの、スチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）が触媒する変換により生産され、次の化学構造によって表される：
【化３】
2018520661.tif 000004
【０００９】
アモルフルチンは、潜在的な健康上の利益を有する、ジヒドロフェニルプロパノイド由来のジヒドロスチルベノイド植物化合物の別のクラスである。例えば、Sauer, Chembiochem 2014、15(9):1231-8を参照。アモルフルチンの例はアモルフルチン２であり、これは次の化学構造によって表される：
【化４】
2018520661.tif 000005
【００１０】
ジヒドロカルコノイド化合物の例は、フロリジンである。フロリジンは自然界において、ナシ、リンゴ、チェリー、および他の果樹を含むいくつかの植物中に存在する。フロリジンは、腸および肝臓からのグルコース再吸収に関与する、ナトリウム／グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）およびナトリウム／グルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）を阻害することが示されている。したがってフロリジンは、２型糖尿病に関連する高血糖症の予防などの、血糖値を制御するための潜在的用途、ならびにヒトの健康を改善するための他の潜在的用途を有する。フロリジンは、次の化学構造によって表される：
【化５】
2018520661.tif 000006
【００１１】
ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の別の例は、フロリジンの生合成前駆体であり、これはフロレチンと呼ばれる（フロリジンはフロレチンの２’−グルコシドである）。フロレチンはフロリジンと同一の特性のいくつかを共有し、これは例えば、ＳＧＬＴ１およびＳＧＬＴ２の能動輸送を阻害する能力を含む。さらにフロレチンは、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）を阻害することが見出されている。フロレチンは、次の化学構造によって表される：
【化６】
2018520661.tif 000007
【００１２】
ジヒドロカルコン（例えば、フロレチンおよびフロリジン）およびジヒドロスチルベンの両方の生合成経路の１つのステップは、フェニルプロパノイド（例えば、ｐ−クマロイル−ＣｏＡ）からジヒドロフェニルプロパノイド（例えば、ｐ−ジヒドロクマロイル−ＣｏＡ）への変換である。ｐ−クマロイル−ＣｏＡ生合成のために操作された組換え宿主は、当分野で知られている（例えば、米国特許第8,343,739号参照）。しかしながら、フェニルプロパノイドのジヒドロフェニルプロパノイドへの組換え変換が、依然として必要とされている。
【００１３】
さらに、ナリンゲニン、レスベラトロール、および他のフェニルプロパノイド誘導体を生産する現在の方法は、基質としてのクマロイル−ＣｏＡなどのフェニルプロパノイドと競合する経路によって制限される。例えば、ナリンゲニンを生産するように操作された特定の細胞は、未知の機序によってフロレチン酸も生産することが知られている（例えば、Koopman et al., (2012) Microbial Cell Factories 2012, 11:155参照）。フロレチン酸はジヒドロ−フェニルプロパノイドであり、ジヒドロフェニルプロパノイド生産の生合成経路の１つのステップは、フェニルプロパノイド（例えば、ｐ−クマロイル−ＣｏＡ）からジヒドロフェニルプロパノイド（例えば、ｐ−ジヒドロクマロイル−ＣｏＡ）への変換である。しかしながら、ジヒドロフェニルプロパノイドの生産（および、例えばナリンゲニン生産の減少など）の原因となる酵素は不明である。したがって、組換え宿主細胞における、ナリンゲニンなどのフェニルプロパノイド誘導体の最適化された生産の必要性が、当分野に存在する。
【発明の概要】
【００１４】
概要
本明細書に開示される方法および組成物は、特定の利点または機能に限定されない。
【００１５】
一側面において、本開示は、組換え宿主細胞において、ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物と比較したフェニルプロパノイド誘導体化合物の生産を調節する方法を提供し、この方法は以下を含み：（ａ）ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物と比較したフェニルプロパノイド誘導体化合物の生産を、（ｉ）二重結合レダクターゼ活性、または（ｉｉ）二重結合レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子の発現を、低減または排除することによって、増加させること；または、（ｂ）ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物と比較したフェニルプロパノイド誘導体化合物の生産を、（ｉ）二重結合レダクターゼ活性、または（ｉｉ）二重結合レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子の発現を、増加させることによって、低減すること；ここでフェニルプロパノイド誘導体化合物はカルコンまたはスチルベンであり、ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物はジヒドロカルコンまたはジヒドロスチルベンである。いくつかの態様において、二重結合レダクターゼポリペプチドは、（ａ）エノイルレダクターゼポリペプチド；または（ｂ）ポリプレノールレダクターゼポリペプチドである。いくつかの態様において、エノイルレダクターゼポリペプチドは、S. cerevisiaeのｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼＴＳＣ１３である。いくつかの態様において、ポリプレノールレダクターゼポリペプチドは、S. cerevisiaeのＤＦＧ１０である。いくつかの態様において、フェニルプロパノイド誘導体化合物は、ナリンゲニン、レスベラトロール、ピノシルビン、ピノセンブリンカルコン、またはピノセンブリンである。いくつかの態様において、ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物は、フロレチン、フロリジン、ジヒドロピノシルビン、３−Ｏ−メチルジヒドロピノシルビン、２−イソプレニル−３−Ｏ−メチルジヒドロピノシルビン、またはジヒドロレスベラトロールである。いくつかの態様において、レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号７または配列番号４３を含む。いくつかの態様において、レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号７と少なくとも７０％の同一性、または配列番号４３と少なくとも８０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号２２；（ｂ）配列番号２６；（ｃ）配列番号２２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド；または（ｄ）配列番号２６と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００１６】
別の側面において、本開示は、二重結合レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子を含む、組換え酵母細胞を提供し、ここで、遺伝子の発現またはそれによってコードされる二重結合レダクターゼポリペプチドの活性が、低減または排除される。いくつかの態様において、二重結合レダクターゼポリペプチドは、（ａ）エノイルレダクターゼポリペプチド；または（ｂ）ポリプレノールレダクターゼポリペプチドである。いくつかの態様において、エノイルレダクターゼポリペプチドは、S. cerevisiaeのｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼＴＳＣ１３である。いくつかの態様において、ポリプレノールレダクターゼポリペプチドは、S. cerevisiaeのＤＦＧ１０である。いくつかの態様において、レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号７または配列番号４３を含む。いくつかの態様において、レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号７と少なくとも７０％の同一性、または配列番号４３と少なくとも８０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号２２；（ｂ）配列番号２６；（ｃ）配列番号２２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド；または（ｄ）配列番号２６と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００１７】
本明細書に開示される組換え酵母細胞のいくつかの態様において、組換え酵母細胞は、二重結合レダクターゼポリペプチドの機能を部分的または完全に補足する酵素をコードする組換え遺伝子をさらに含む。いくつかの態様において、二重結合レダクターゼポリペプチドの機能を部分的または完全に補足する酵素をコードする組換え遺伝子は、（ａ）配列番号９４〜９６のいずれか１つ、または（ｂ）配列番号９４〜９６のいずれか１つと少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む。いくつかの態様において、二重結合レダクターゼポリペプチドの機能を部分的または完全に補足する酵素をコードする組換え遺伝子は、（ａ）配列番号６５〜６７のいずれか１つ、または（ｂ）配列番号６５〜６７のいずれか１つと少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００１８】
本明細書に開示される組換え酵母細胞のいくつかの態様において、組換え酵母細胞は、ポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドをコードする組換え遺伝子をさらに含む。いくつかの態様において、ポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドは、（ａ）カルコンシンターゼポリペプチド；または（ｂ）スチルベンシンターゼポリペプチドである。いくつかの態様において、カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号４を含む。いくつかの態様において、カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号４と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号１９；または（ｂ）配列番号１９と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号２３を含む。いくつかの態様において、スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号２３と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号２４；または（ｂ）配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００１９】
本明細書に開示される組換え酵母細胞のいくつかの態様において、組換え酵母細胞はさらに、（ｃ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；（ｄ）シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；（ｅ）４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；（ｆ）シトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；または（ｇ）カルコンイソメラーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子、の１つ以上を含む。
【００２０】
いくつかの態様において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号１を含む。いくつかの態様において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号１６；または（ｂ）配列番号１６と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００２１】
いくつかの態様において、シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号２を含む。いくつかの態様において、シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号１７；または（ｂ）配列番号１７と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００２２】
いくつかの態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号３を含む。いくつかの態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号３と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号１８；または（ｂ）配列番号１８と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００２３】
いくつかの態様において、シトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号６を含む。いくつかの態様において、シトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号６と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、シトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号２１；または（ｂ）配列番号２１と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００２４】
いくつかの態様において、カルコンイソメラーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号８０〜８６のいずれか１つを含む。いくつかの態様において、カルコンイソメラーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号８０〜８６のいずれか１つと少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、カルコンイソメラーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号８７〜９３のいずれか１つ；または（ｂ）配列番号８７〜９３のいずれか１つと少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００２５】
本明細書に開示される組換え酵母細胞のいくつかの態様において、組換え酵母細胞は、フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産することができる。いくつかの態様において、フェニルプロパノイドは、ケイ皮酸またはクマル酸である。いくつかの態様において、フェニルプロパノイド誘導体化合物は、カルコン化合物またはスチルベノイド化合物である。
【００２６】
いくつかの態様において、組換え酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae細胞、Schizosaccharomyces pombe細胞、Yarrowia lipolytica細胞、Candida glabrata細胞、Ashbya gossypii細胞、Cyberlindnera jadinii細胞、Pichia pastoris細胞、Kluyveromyces lactis細胞、Hansenula polymorpha細胞、Candida boidinii細胞、Arxula adeninivorans細胞、Xanthophyllomyces dendrorhous細胞、またはCandida albicans細胞である。いくつかの態様において、組換え酵母細胞は、酵母菌（Saccharomycete）である。いくつかの態様において、組換え酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae種からの細胞である。
【００２７】
別の側面において、本開示は、フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産する方法を提供し、該方法は、本明細書に開示されるような組換え酵母細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、ここでフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物は、組換え酵母細胞によって合成される。いくつかの態様において、フェニルプロパノイド化合物は、ケイ皮酸またはクマル酸である。いくつかの態様において、フェニルプロパノイド誘導体化合物は、カルコン化合物またはスチルベン化合物である。いくつかの態様において、カルコン化合物はレスベラトロールを含む。
【００２８】
別の側面において、本開示は、式（ＩＩＩ）：
【化７】
2018520661.tif 000008
で表される化合物またはその薬学的に許容し得る塩を生産する方法を提供し、式中、
Ａは、結合またはＣ＝Ｏであり；
ｎは、０、１、２、３、または４の整数であり；
Ｒは、
【化８】
2018520661.tif 000009
が二重結合の場合は水素であり、または、ＲとＲ５は、ＡがＣ＝Ｏであり、かつ
【化９】
2018520661.tif 000010
が単結合の場合は、それらが結合している原子と一緒になって、６員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素、−ＯＲ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
前記方法は、本開示の組換え酵母細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、ここで式Ｉの化合物は組換え酵母細胞によって合成される。いくつかの態様において、方法は、化合物を収集することをさらに含む。いくつかの態様において、方法は、化合物を単離することをさらに含む。
【００２９】
別の側面において、本開示は、（ａ）エノイルレダクターゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；および（ｂ）ポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドをコードする組換え遺伝子、を含む、組換え宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、エノイルレダクターゼポリペプチドは、過剰発現される。いくつかの態様において、エノイルレダクターゼポリペプチドは、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである。いくつかの態様において、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、S.cerevisiaeのＴＳＣ１３である。いくつかの態様において、エノイルレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号７を含む。いくつかの態様において、エノイルレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも７０％の同一性を有する。いくつかの態様において、エノイルレダクターゼポリペプチドは、（ａ）配列番号２２；または（ｂ）配列番号２２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００３０】
いくつかの態様において、ポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、（ｉ）カルコンシンターゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；または（ｉｉ）スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子、を含む。いくつかの態様において、カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号４、２７または６８〜７０の１つを含む。いくつかの態様において、カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号４、２７または６８〜７０の１つと少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号１９、４９、もしくは７１〜７３の１つ；（ｂ）配列番号１９、４９、もしくは７１〜７３の１つと少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド；または（ｃ）配列番号１９もしくは７１〜７３の１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を、配列番号１９もしくは７１〜７３の１つにおけるアミノ酸９５〜１０５、１３２〜１４２、１９１〜２０１および２６６〜２７６にまたがる合わせた領域において有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号２３を含む。いくつかの態様において、スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号２３と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、スチルベンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号２４；または（ｂ）配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００３１】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞はさらに、（ｃ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；（ｄ）シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；（ｅ）４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子；（ｆ）シトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；または（ｇ）ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子、の１つ以上を含む。いくつかの態様において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号１を含む。いくつかの態様において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号１６；または（ｂ）配列番号１６と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号２を含む。いくつかの態様において、シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号１７；または（ｂ）配列番号１７と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号３を含む。いくつかの態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号３と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号１８；または（ｂ）配列番号１８と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号５を含む。いくつかの態様において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号５と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチドをコードする遺伝子は、（ａ）配列番号２０；または（ｂ）配列番号２０と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【００３２】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である。いくつかの態様において、細菌細胞は、Escherichia細胞、Lactobacillus細胞、Lactococcus細胞、Cornebacterium細胞、Acetobacter細胞、Acinetobacter細胞、またはPseudomonas細胞を含む。いくつかの態様において、酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae細胞、Schizosaccharomyces pombe細胞、Yarrowia lipolytica細胞、Candida glabrata細胞、Ashbya gossypii細胞、Cyberlindnera jadinii細胞、Pichia pastoris細胞、Kluyveromyces lactis細胞、Hansenula polymorpha細胞、Candida boidinii細胞、Arxula adeninivorans細胞、Xanthophyllomyces dendrorhous細胞、またはCandida albicans細胞である。いくつかの態様において、酵母細胞は、酵母菌である。いくつかの態様において、酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae種からの細胞である。
【００３３】
別の側面において、本開示は、ジヒドロカルコン化合物またはジヒドロスチルベン化合物などのジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産する方法を提供し、方法は、本明細書に開示されるような組換え宿主細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、ここで前記化合物は、組換え宿主細胞によって合成される。いくつかの態様において、方法は、ジヒドロカルコン化合物を生産する方法である。いくつかの態様において、ジヒドロカルコン化合物は、フロレチンまたはフロレチン誘導体である。いくつかの態様において、フロレチン誘導体は、フロリジンである。いくつかの態様において、方法は、ジヒドロスチルベノイド化合物を生産する方法である。
【００３４】
別の側面において、本開示は、式（ＩＩＩ）：
【化１０】
2018520661.tif 000011
で表される化合物またはその薬学的に許容し得る塩を生産する方法を提供し、式中、
Ａは、結合またはＣ＝Ｏであり；
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素または−ＯＲ１１であり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１または−Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、およびアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
前記方法は、本明細書に開示されるような組換え宿主細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、ここで式ＩＩＩの化合物は、組換え宿主細胞によって合成される。いくつかの態様において、方法は、化合物を培地から収集することをさらに含む。いくつかの態様において、方法は、化合物を培地から単離することをさらに含む。
【００３５】
これらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲と共に以下の詳細な説明から、より完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
以下の詳細な説明は、下の図面と併せて読むと最もよく理解することができる。
【００３７】
【図１】図１は、フェニルプロパノイド由来のカルコンおよびスチルベンの生合成を、ジヒドロフェニルプロパノイド由来のジヒドロカルコンおよびジヒドロスチルベンの生合成と対照させた図である。二重結合レダクターゼ（ＤＢＲ）の作用は、これらの生合成の枝を分離する。
【００３８】
【図２】図２は、ＤＢＲ酵素の作用によって分離された、ｐ−クマル酸から種々のフェニルプロパノイド誘導体およびジヒドロフェニルプロパノイド誘導体に分岐する、フェニルプロパノイド経路を示す図である。（ケイ皮酸（ｐ−クマル酸の代わりに）からの対応する経路を、図３に示す）。２つのＰＫＳＩＩＩ型酵素の作用が、各側に示されている：カルコシンターゼ（ＣＨＳ）およびスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）。他の酵素略号は以下である：フェニルアラニンリアーゼ（ＰＡＬまたはＴＡＬ）；レダクターゼ（ＣＰＲ）の活性を必要とするシンナマート−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）；４−クマロイル−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）；カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）；およびフロリジングルコシルトランスフェラーゼ（Ｐ２’ＵＧＴ）。
【００３９】
【図３】図３は、ケイ皮酸（図２に示したｐ−クマル酸の代わりに）から分岐する、フェニルプロパノイド／ジヒドロフェニルプロパノイド経路を示す図である。図２と同様に２つの分枝が各側に表示され、これらはＣＨＳとＳＴＳで表される。他の酵素略号は以下である：Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）およびプレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）。
【００４０】
【図４】図４は、ＵＰＬＣ−ＭＳピーク積分に基づく、株Ｓｃ１．０、Ｓｃ１．１およびＳｃ１．２における、ジヒドロ−クマロイル−ＣｏＡ誘導体フロレチン（ｍ／ｚ＝２７４．３Ｄａ）およびｐ−クマロイル−ＣｏＡ誘導体ナリンゲニン（ｍ／ｚ＝２７２．３）の生産を示す図である。フェニルプロパノイドナリンゲニンの生産は、Ｔｓｃ１３活性または発現が低い場合に、増加する。
【００４１】
【図５】図５は、株Ｓｃ１．０、Ｓｃ１．１およびＳｃ１．３における、フロレチン（ｍ／ｚ＝２７４．３Ｄａ）およびフロリジン（ｍ／ｚ＝４３６．４Ｄａ）の生産を示す図である（ＬＣ−ＭＳピーク積分に基づく）。
【００４２】
【図６】図６は、１１種の異なるカルコンシンターゼを有する酵母株における、フロレチン（ｍ／ｚ＝２７４．３Ｄａ）およびフロリジン（ｍ／ｚ＝４３６．４Ｄａ）の生産を示す図である（ＬＣ−ＭＳピーク積分に基づく）。
【００４３】
【図７】図７は、様々な異なるエノイルレダクターゼを過剰発現する酵母株における、フロレチン（ｍ／ｚ＝２７４．３Ｄａ）およびナリンゲニン（ｍ／ｚ＝２７２．３Ｄａ）の生産（ＬＣ−ＭＳピーク積分に基づく）を、各株についてのフロレチン対ナリンゲニン生産の比率と共に示す図である。
【００４４】
【図８】図８は、コアスチルベン経路との組み合わせでＴＳＣ１３を過剰発現する酵母株における、レスベラトロール（ｍ／ｚ＝２２８．２Ｄａ）およびジヒドロレスベラトロール（ｍ／ｚ＝２３０．２Ｄａ）の生産を示す図である（ＬＣ−ＭＳピーク積分に基づく）。
【００４５】
【図９】図９は、天然の酵素およびＣＨＳ２ Ｈｖの３つの突然変異体を過剰発現する酵母株における、フロレチン（ｍ／ｚ＝２７４．３Ｄａ）およびナリンゲニン（ｍ／ｚ＝２７２．３Ｄａ）の生産（ＬＣ−ＭＳピーク積分に基づく）を、各株についてのフロレチン対ナリンゲニン生産の比率と共に示す図である。
【００４６】
【図１０】図１０は、S. cerevisiaeのＰＩＮ株およびＰＩＮＤＨＣ株における、ピノセンブリンジヒドロカルコン（ｍ／ｚ＝２５８．３Ｄａ）およびピノセンブリン（ｍ／ｚ＝２５６．３Ｄａ）（ＬＣ−ＭＳピーク積分に基づく）の生産を示す図である。
【００４７】
【図１１】図１１は、様々な酵母レダクターゼノックアウト株によって生産された、レスベラトロール対フロレチン酸の比を示す図である。
【００４８】
【図１２】図１２は、追加の酵母レダクターゼノックアウト株によって生産された、レスベラトロール対フロレチン酸の比を示す図である。
【００４９】
【図１３】図１３は、ＳＣ培地中での４日間の増殖後に、異なるノックアウト株によって消費されたクマル酸および生産されたフロレチン酸のレベルを示す図である。
【００５０】
【図１４】図１４は、セントロメアプラスミドＰＳＢ３３（対照株Ｓｃ１０．３）上の、ＴＳＣ１３（ｐＲＯＰ４９２）（株Ｓｃ１０．４中）およびＤＦＧ１０（ｐＲＯＰ４９３）（株Ｓｃ１０．５中）を過剰発現するベース株Ｓｃ１０．１における（図１４Ａ）、ならびに、ＰＳＢ３４（対照株Ｓｃ１０．６）上のＴＳＣ１３（ｐＲＯＰ４９４）（株Ｓｃ１０．７中）およびＤＦＧ１０（ｐＲＯＰ４９５）（株Ｓｃ１０．８中）を過剰発現するベース株Ｓｃ１０．２における（図１４Ｂ）、フェニルプロパノイド経路のプロファイルを示す図である。
【００５１】
【図１５】図１５は、以下を有するS. cerevisiae株におけるクロマトグラムを示す図である：（Ａ）ＰＡＬのみ：これはケイ皮酸の生産をもたらす、（Ｂ）ＰＡＬとＣ４ＨＬ５ＡＴＲ２、これはクマル酸の生産をもたらす、（Ｃ）ＰＡＬとＣ４ＨＬ５ＡＴＲ２と４Ｃ１、これはフロレチン酸（ジヒドロクマル酸）の生産をもたらす、および（Ｄ）ＰＡＬと４ＡＬ：これはジヒドロケイ皮酸の生産をもたらす。
【００５２】
【図１６】図１６は、異なるＴｓｃ１３オルソログを有するS. cerevisiae株における、フェニルプロパノイド経路中間体の生産を示す図である。生産試験は、合成流加培地で行った。Ｔ１：ＡｔＥＣＲを発現する株、Ｔ２：Ｇｈ２ＥＣＲを発現する株、Ｔ３：ＭｄＥＣＲを発現する株、Ｃ：バックグラウンド株対照。
【００５３】
【図１７】図１７は、７２時間増殖させた酵母細胞の形態を示す。バックグラウンド対照株を左側に示し、ＭｄＥＣＲを発現する株を右側に示す。倍率４００倍。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
詳細な説明
本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的のために参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
【００５５】
多くのフェニルプロパノイド誘導体およびジヒドロフェニルプロパノイド誘導体は、とりわけ医薬化合物として有用であるため、それらの生産のための効率的な方法が必要とされている。例えば、ジヒドロカルコンであるフロリジンおよびフロレチンは、血糖値をコントロールするため、およびヒトの健康を改善するための他の潜在的用途に有用である。カルコンであるナリンゲニンおよびスチルベンであるレスベラトロールは、血糖値をコントロールするため、およびヒトの健康を改善するための他の潜在的用途に有用である。
【００５６】
したがって、本明細書で提供されるのは、カルコンおよびスチルベンを含むフェニルプロパノイド誘導体、ならびにジヒドロカルコンおよびジヒドロスチルベンを含むジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の生合成に有用な、材料および方法である。いくつかの態様において、本開示は、ナリンゲニンおよび他のカルコンの生合成のための、組換え宿主および方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、レスベラトロールおよび他のスチルベンの生合成のための、組換え宿主および方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、フロリジンおよびフロリジン前駆体の生合成のための、組換え宿主および方法を提供する。
【００５７】
開示された方法および組成物を詳細に記載する前に、多くの用語を定義する。本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に別の規定をしない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「核酸」への参照は１以上の核酸を意味する。
【００５８】
「好ましくは」、「一般的に」および「典型的に」などの用語は、請求項に記載の発明の範囲を限定するために、または、請求項に記載の発明の構造もしくは機能に対して所定の特徴が重大、必須、またはさらに重要であることを意味するためには、ここでは用いられないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の態様において用いられ得るか、または用いられ得ない、代替的または追加の特徴を強調することを意図するにすぎない。
【００５９】
本発明を記載し、定義する目的のために、用語「実質的に」は、任意の定量的な比較、値、測定、または他の表現に寄与し得る不確実性の固有の程度を表わすために、ここで用いられることに留意されたい。用語「実質的に」はまた、問題の主題の基本的な機能における変化をもたらすことなく、定量的な表示が記載された参照から変わり得る程度を表わすために、ここで用いられる。
【００６０】
当業者によく知られている方法を使用して、本明細書に開示された遺伝子発現コンストラクトおよび組換え細胞を構築することができる。これらの方法は、in vitroの組換えＤＮＡ技術、合成技術、in vivoの組換え技術、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を含む。例えば、Maniatis et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, New York；Ausubel et al., 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York、およびPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA)に記載された技術を参照。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、互換的に使用することができて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その誘導体、またはその組み合わせを含む核酸を指す。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「微生物」、「微生物宿主」、「微生物宿主細胞」、「組換え宿主」、「宿主細胞」、および「組換え宿主細胞」は、互換的に使用することができる。本明細書で使用する場合、用語「組換え宿主」は、そのゲノムが少なくとも１つのＤＮＡ配列によって増大された宿主を指すことが意図される。かかるＤＮＡ配列は、天然に存在しない遺伝子またはＤＮＡ配列、通常ＲＮＡに転写されないか、または細胞中で天然にタンパク質に翻訳され（「発現され」）ない、遺伝子またはＤＮＡ配列、および宿主に導入することが望まれる他の遺伝子またはＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない。典型的には、ここで記載される組換え宿主のゲノムは、１以上の組換え遺伝子の安定的な導入を通じて増大されることが理解されるであろう。一般に、導入されたＤＮＡは、ＤＮＡの受け手である宿主において元々存在していないが、所与の宿主からＤＮＡセグメントを単離すること、およびその後そのＤＮＡの１以上の追加のコピーを同じ宿主に導入すること、例えば、遺伝子の産物の生産を増強するか、または遺伝子の発現パターンを変更することは、この開示の範囲内である。いくつかの例において、導入されたＤＮＡは、例えば相同組換えまたは部位特異的な変異誘発によって、内因性遺伝子またはＤＮＡ配列を改変するか、または置き換えさえもするであろう。好適な組換え宿主は、微生物を含む。
【００６３】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、本明細書に開示されるＤＮＡ配列の少なくとも１つ、または本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードする任意のＤＮＡ配列、または本明細書に開示されるコード配列の相補体にハイブリダイズする任意のＤＮＡ配列から構成される、ポリヌクレオチド単位を指す。好ましくは、この用語は、コード領域および非コード領域、および好ましくは正常な遺伝子発現に必要なすべての配列を含み、これにはプロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列などが含まれる。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「組換え遺伝子」は、同一もしくは同様な遺伝子またはＤＮＡ配列が、すでにかかる宿主において存在し得るか否かに拘らず、受け手の宿主中へ導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を指す。この文脈における「導入された」または「増大された」は、人為的に導入または増大されたことを意味することが、当該技術分野において知られる。したがって、組換え遺伝子は、別の種からのＤＮＡ配列であり得るか、または、同一の種を起源とするかもしくは同一の種において存在するが、組換え方法によって宿主中へ取り込まれて組換え宿主を形成するＤＮＡ配列であり得る。宿主中へ導入された組換え遺伝子は、形質転換された宿主において通常存在するＤＮＡ配列と同一であり得、１以上の追加のコピーのＤＮＡを提供するために導入され、それによって、そのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変された発現を可能にすることが理解されるであろう。組換え遺伝子は、ｃＤＮＡによって特にコードされる。
【００６５】
本明細書に記載のポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するのに適した１つ以上の調節領域にセンス配向で作動可能に連結された、そのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物は、多シストロン性ｍＲＮＡから複数の遺伝子産物を発現することができるため、必要に応じて、複数のポリペプチドを、それらの微生物の単一調節領域の制御下で任意に発現させる。コード配列と調節領域が作動可能に連結されているとは、調節領域が配列の転写または翻訳を調節するのに有効であるように、調節領域とコード配列が位置されている場合である。典型的には、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、単シストロン性遺伝子の調節領域の下流の１〜約５０ヌクレオチドの間に位置される。多くの場合、本明細書に記載のポリペプチドのコード配列は、組換え微生物以外の種において同定され、すなわち異種核酸である。したがってコード配列は、植物または動物からの、他の原核または真核微生物由来であり得る。しかしながらいくつかの場合には、コード配列は、微生物に固有の配列であって、その生物に再導入されているものである。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「操作された生合成経路」とは、本明細書に記載されているように組換え宿主中に生じ、天然では宿主内に生じない、生合成経路を指す。いくつかの態様において、操作された生合成経路は、宿主によって天然に生産される酵素を含み、ここである態様においては、これらの酵素をコードする遺伝子の発現の程度および量は、組換え宿主において変更され；いくつかの態様において、これらの酵素は、組換え宿主において過剰発現される。
【００６７】
本明細書で使用する場合、用語「内因性」遺伝子とは、特定の生物、組織、または細胞に由来するか、またはこれらの内部で生産もしくは合成される遺伝子を指す。
【００６８】
本明細書で使用する場合、用語「異種配列」および「異種コード配列」は、組換え宿主以外の種に由来する配列を記載するために用いられる。いくつかの態様において、組換え宿主はS. cerevisiae細胞であり、異種配列はS. cerevisiae以外の生物に由来する。異種コード配列は、例えば、異種配列を発現する組換え宿主とは異なる原核微生物、真核微生物、植物、動物、昆虫、または真菌からのものであることができる。いくつかの態様において、コード配列は、宿主に固有の配列である。
【００６９】
「調節領域」は、転写または翻訳産物の転写または翻訳開始および速度、ならびに安定性および／または可動性(mobility)に影響するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。調節領域は、限定することなく、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、停止配列、ポリアデニル化配列、イントロン、およびその組み合わせを含む。調節領域は典型的には、少なくともコア（基礎的）プロモーターを含む。調節領域はまた、少なくとも１つの制御要素、例えばエンハンサー配列、上流要素または上流活性化領域（ＵＡＲ）などを含み得る。調節領域は、調節領域が配列の転写または翻訳の調節に有効であるように、調節領域とコード配列を位置させることによって、コード配列に作動可能に連結される。例えば、コード配列とプロモーター配列を作動可能に連結するために、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの下流の１〜約５０ヌクレオチドの間に位置される。しかしながら、調節領域はさらに遠くに、例えば翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドもの上流、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流にも、位置させることができる。
【００７０】
含まれる調節領域の選択は、いくつかの因子、例えば、限定はされないが、効率性、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および所定の培養段階の間の優先的な発現を含む因子に依存する。調節領域をコード配列に対して適切に選択して位置させることにより、コード配列の発現を調節することは、当業者に日常的な事項である。１よりも多い調節領域、例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、および誘導性要素が存在し得ることが理解されるであろう。１以上の遺伝子は、化合物生産の個別の側面に有用な「モジュール」での組換え核酸コンストラクトにおいて、組み合わされ得る。モジュール、特に多シストロン性モジュールにおいて複数の遺伝子を組み合わせることは、様々な種におけるモジュールの使用を促進する。化合物生産に有用な遺伝子に加えて、組換えコンストラクトは、典型的には、複製起点および、適切な種におけるコンストラクトの維持のための１つ以上の選択可能なマーカーも含む。
【００７１】
遺伝コードの縮重のために、多数の核酸が特定のポリペプチドをコードし得ることが理解されるであろう；すなわち、多くのアミノ酸について、そのアミノ酸のコドンとして機能する１つより多くのヌクレオチドトリプレットが存在する。したがって、所与のポリペプチドのコード配列中のコドンは、その微生物のための適切なコドンバイアス表を用いて、特定の微生物における最適な発現が得られるように改変することができる。核酸はまた、特定の微生物にとって好ましいＧＣ含有量に最適化され、および／または反復配列の数を減少させることができる。単離された核酸として、これら改変された配列は精製された分子として存在することができ、組換え核酸コンストラクトのためのモジュール構築に使用するベクターまたはウイルスに、組み込むことができる。さらに、異種核酸は、関連する微生物での増加した、または最適な発現のために、改変することができる。したがって、本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの態様において、異種核酸は、関連する微生物での発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化は、当技術分野で知られている常法により行うことができる（例えば、Welch, M., et al。(2011), Methods in Enzymology 498:43-66を参照）。
【００７２】
フェニルプロパノイド誘導体およびジヒドロフェニルプロパノイド誘導体
本明細書で使用する場合、用語「カルコン」および「カルコノイド」は互換的であり、式（Ｉ）の化合物の誘導体を指す：
【化１１】
2018520661.tif 000012
ここで式（Ｉ）は、１つ以上の適切な位置で置換されていてもよい。例示的な置換基としては、限定はされないが、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、チオール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、アミド、およびグリコシルが挙げられる。
【００７３】
本明細書で使用する場合、用語「スチルベン」および「スチルベノイド」は互換的であり、式（ＩＩ）の化合物に基づく化合物を指す：
【化１２】
2018520661.tif 000013
ここで式（ＩＩ）は、１つ以上の適切な位置で置換されていてもよい。例示的な置換基としては、限定はされないが、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、チオール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、アミド、およびグリコシルが挙げられる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「ジヒドロカルコン」および「ジヒドロカルコノイド」は互換的であり、式（Ｉ）の化合物の誘導体を指す：
【化１３】
2018520661.tif 000014
ここで式（Ｉ）は、１つ以上の適切な位置で置換されていてもよい。例示的な置換基としては、限定はされないが、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、チオール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、アミド、およびグリコシルが挙げられる。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「ジヒドロスチルベン」および「ジヒドロスチルベノド」は互換的であり、式（ＩＩ）の化合物に基づく化合物を指す：
【化１４】
2018520661.tif 000015
ここで式（ＩＩ）は、１つ以上の適切な位置で置換されていてもよい。例示的な置換基としては、限定はされないが、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、チオール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、アミド、およびグリコシルが挙げられる。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「フェニルプロパノイド」は、３−フェニルプロパ−２−エノエート主鎖に基づく化合物を指す。かかる化合物の例としては、限定はされないが、ケイ皮酸、クマル酸、カフェー酸、フェルラ酸、５−ヒドロキシフェルラ酸、シナピン酸、シンナモイル−ＣｏＡ、ｐ−クマロイル−ＣｏＡなどが挙げられる。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「フェニルプロパノイド誘導体」および「フェニルプロパノイド誘導体化合物」は互換的であり、フェニルプロパノイドから誘導されるか、合成されるか、または生合成される任意の化合物を指す；すなわち、フェニルプロパノイド誘導体には、フェニルプロパノイド化合物が前駆体または中間体である任意の化合物が含まれる。フェニルプロパノイド誘導体の例としては、限定はされないが、スチルベン化合物およびカルコン化合物が挙げられる。フェニルプロパノイド誘導体の具体例には、限定はされないが、ナリンゲニン、レスベラトロール、ピノシルビン、ピノセンブリンカルコン、およびピノセンブリンが含まれる。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語「ジヒドロフェニルプロパノイド」は、フェニルプロパノエート骨格に基づく化合物を指す。かかる化合物の例としては、限定はされないが、ジヒドロケイ皮酸、フロレチン酸、３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸、ヒドロフェルラ酸、ジヒドロクマロイル−ＣｏＡ、ジヒドロシンナモイル−ＣｏＡなどが挙げられる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体」および「ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物」は互換的であり、ジヒドロフェニルプロパノイドから誘導されるか、合成されるか、または生合成される任意の化合物を指す；すなわち、ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体には、ジヒドロフェニルプロパノイド化合物が前駆体または中間体である、任意の化合物が含まれる。ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の例としては、限定はされないが、ジヒドロスチルベノイド化合物およびジヒドロカルコン化合物が挙げられる。ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の具体例としては、限定はされないが、フロレチン、フロリジン、ジヒドロピノシルビン、３−Ｏ−メチルジヒドロピノシルビン、２−イソプレニル−３−Ｏ−メチルジヒドロピノシルビン（アモルフルチン２；ＩＵＰＡＣ：３−メトキシ−２−（３−メチルブタ−２−エン−１−イル）−５−フェネチルフェノール）、およびジヒドロレスベラトロールが挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用する場合、用語「フェニルプロパノイド経路」、「フェニルプロパノイド誘導体経路」、「フェニルプロパノイド誘導体合成経路」、および「フェニルプロパノイド誘導体生合成経路」は互換的であり、フェニルプロパノイドが前駆体または中間体であって、フェニルプロパノイド誘導体化合物が産物である、任意の生合成経路を指す。カルコンおよびスチルベンなどのフェニルプロパノイド誘導体は、フェニルプロパノイド誘導体生合成経路に従って生合成される。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「ジヒドロフェニルプロパノイド経路」「ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体経路」「ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体合成経路」、および「ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成経路」は互換的であり、フェニルプロパノイドまたはジヒドロフェニルプロパノイドが前駆体または中間体であって、ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物が産物である、任意の生合成経路を指す。ジヒドロカルコン及びジヒドロスチルベンなどのジヒドロフェニルプロパノイド誘導体は、ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成経路に従って生合成される。
【００８２】
本明細書で使用する場合、用語「アルキル」は、特に指定しない限り、１〜２０個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖の炭化水素を意味する。用語「Ｃｍ〜Ｃｎアルキル」は、ｍ〜ｎ個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。例えば、「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である。アルキルの代表例としては、限定はされないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニルおよびｎ−デシルが挙げられる。
【００８３】
本明細書で使用する用語「アルケニル」は、特に指定しない限り、２〜２０個の炭素原子を含有し、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する、直鎖または分枝鎖の炭化水素を意味する。用語「Ｃｍ〜Ｃｎアルケニル」は、ｍ〜ｎ個の炭素原子を有するアルケニル基を意味する。例えば、「Ｃ２〜Ｃ６アルケニル」は、２〜６個の炭素原子を有するアルケニル基である。アルケニルの代表例としては、限定はされないが、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニル、３−デセニル、および３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル、および２−プロピル−２−ヘプテニルが挙げられる。
【００８４】
本明細書で使用する用語「アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子部分に結合した、本明細書で定義のアルキル基を意味する。アルコキシの代表例としては、限定はされないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシおよびヘキシルオキシが挙げられる。
【００８５】
本明細書で使用する用語「シアノ」および「ニトリル」は、−ＣＮ基を意味する。
【００８６】
本明細書で使用する用語「ハロゲン」は、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは−Ｆを意味する。
【００８７】
「ハロアルキル」という用語は、１個以上のハロゲン原子で置換されたアルキル基を意味する。
【００８８】
本明細書で使用する用語「ヘテロシクリル」は、単環式複素環または二環式複素環を意味する。単環式複素環は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する、３、４、５、６または７員環であって、ここで環は、飽和または不飽和であるが芳香族ではない。３員環または４員環は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子を含む。５員環は、０または１個の二重結合および、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含むことができる。６員環または７員環は、０、１または２個の二重結合および、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含む。二環式複素環は、フェニル、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、単環式複素環、または単環式ヘテロアリールのいずれかに融合した、単環式複素環である。二環式複素環は、どちらかの環式部分を介して（例えばヘテロシクリルを介して、またはフェニルを介してのいずれか）、結合してよい。複素環の代表例としては、限定はされないが、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル、トリチアニル、２，３−ジヒドロベンゾフラン−２−イル、およびインドリニルが挙げられる。
【００８９】
用語「ヒドロキシアルキル」は、１つ以上の−ＯＨ基で置換されたアルキル基を指す。
【００９０】
本明細書で使用する用語「グリコシル」は、単糖または二糖の環状形態からヘミアセタールヒドロキシル基を除去することによって得られる、一価のラジカルを意味する。単糖または単糖単位は、糖を含有する任意の５〜９炭素原子であって、以下からなるものから選択することができる：アルドース（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース等）、ケトース（例えば、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ソルボース、Ｄ−タガトース等）、デオキシ糖（例えば、Ｌ−ラムノース、Ｌ−フコース等）、デオキシアミノ糖（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン等）、ウロン酸、ケトアルドン酸（例えば、シアル酸）など。
【００９１】
本明細書で使用する「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２基を意味する。
【００９２】
本明細書で使用する語句「１つ以上の」置換基とは、利用可能な結合部位の数に基づき、１から最大数可能数の置換基に等しい数の置換基であって、上記の安定性および化学的実現可能性の条件を満たすものを指す。特に断りのない限り、任意に置換されていてもよい基は、基の置換可能な位置それぞれに置換基を有していてもよく、置換基は同一であっても異なっていてもよい。本明細書で使用する場合、用語「独立して選択される」とは、単一の化合物における所与の変数の複数の事例について、同じまたは異なる値が選択され得ることを意味する。
【００９３】
「任意の」または「任意に」とは、続いて記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいこと、および、前記記載は、前記事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。当業者は、１つ以上の任意の置換基を含有すると記載された任意の分子に関しては、立体的に実用的な化合物および／または合成的に実現可能な化合物のみが含まれることが意味されることを、理解するであろう。「任意に置換されていてもよい」とは、別段の記載がない限り、用語中の続くすべての修飾語（modifier）を指す。
【００９４】
本明細書で使用する用語「置換された」とは、指定された部分の水素ラジカルが特定の置換基のラジカルで置き換えられていることを意味するが、但し、置換によって安定なまたは化学的に実現可能な化合物が得られる場合に限る。
【００９５】
フェニルプロパノイド誘導体化合物の生合成
一側面において、本開示は、フェニルプロパノイド誘導体生合成経路における遺伝子の発現またはポリペプチドの活性を、低減または排除するように操作された、組換え宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、組換え宿主は、フェニルプロパノイドのエノイル二重結合をジヒドロフェニルプロパノイドに還元する能力が低下または排除され、それにより、ジヒドロフェニルプロパノイドおよびジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の生産が低減または排除されて、フェニルプロパノイドおよびフェニルプロパノイド誘導体に有利となる。例えば、いくつかの態様において、組換え宿主は、ｐ−クマロイル−ＣｏＡの二重結合をジヒドロクマロイル−ＣｏＡに還元するか、またはシンナモイル−ＣｏＡの二重結合をジヒドロシンナモイル−ＣｏＡに還元する能力が、低減または排除される。いくつかの態様において、エノイル二重結合の還元は、エノイルレダクターゼによって行われる。いくつかの態様において、エノイル二重結合の還元は、ポリプレノールレダクターゼによって行われる。これらのレダクターゼは集合的に、二重結合還元酵素（ＤＢＲ）とも呼ばれる。したがってＤＢＲは、とりわけ、エノイルレダクターゼおよびポリプレノールレダクターゼを含むレダクターゼのクラスである。
【００９６】
いくつかの態様において、エノイルレダクターゼは、Saccharomyces cerevisiaeのｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＴＳＣ１３）、またはその機能的ホモログを含む。いくつかの態様において、エノイルレダクターゼは、配列番号７として本明細書に開示される配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、エノイルレダクターゼは、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、エノイルレダクターゼは、配列番号２２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドである。
【００９７】
いくつかの態様において、ポリプレノールレダクターゼは、Saccharomyces cerevisiaeのポリプレノールレダクターゼＤＦＧ１０、またはその機能的ホモログを含む。いくつかの態様において、ポリプレノールレダクターゼは、配列番号４３として本明細書に開示される配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、ポリプレノールレダクターゼは、配列番号４３と少なくとも８０％の同一性を有する遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、ポリプレノールレダクターゼは、配列番号２６と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチドである。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「低減した発現」とは、遺伝子またはタンパク質の天然の発現より低いレベルでの、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。例えば、いくつかの態様において、レダクターゼの活性は、レダクターゼをコードする遺伝子の、タンパク質産物または発現の量を減少させることによって、低減される。
【００９９】
遺伝子の発現の低減または排除（すなわち、破壊（disruption））は、任意の知られている方法によって達成することができ、これには、ＤＮＡ配列の挿入、ミスセンス突然変異、フレームシフト突然変異、欠失、置換、もしくは置き換え、またはそれらの任意の組み合わせを含む。挿入は、任意の起源であってよい遺伝子全体の挿入を含む。遺伝子発現の低減または排除は、例えば、遺伝子のプロモーター、エンハンサーまたはスプライス部位を変更または置き換えることを含み、正常な遺伝子産物の部分的または完全な生産の阻害をもたらすことができる。いくつかの態様において、遺伝子発現の低減または排除は、細胞または生物において発現されるタンパク質産物の総レベルを変化させることを含む。他の態様において、遺伝子の破壊は、細胞または生物中の遺伝子のタンパク質産物の活性を、低減または排除することを含む。本開示のいくつかの態様において、破壊は、遺伝子の有意な発現がない、無破壊（null disruption）である。いくつかの態様において、宿主細胞または生物における遺伝子の破壊は、両方の染色体で起こり、この場合、ホモ接合性破壊である。他の態様において、宿主細胞または生物における遺伝子の破壊は、ただ１つの染色体上で起こり、他の染色体コピーは無傷のままであり、この場合、これはヘテロ接合性遺伝子破壊である。さらに他の態様において、宿主細胞または生物中の遺伝子の各コピーは、異なって破壊される。
【０１００】
遺伝子発現の減少または排除はまた、遺伝子ノックアウトまたはノックダウンを含んでよい。「遺伝子ノックアウト」とは、１つ以上の遺伝子の発現が排除された細胞または生物をいう。「遺伝子ノックダウン」とは、１つ以上の遺伝子のレベルが低下するが完全には排除されない、細胞または生物をいう。
【０１０１】
いくつかの態様において、遺伝子の発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などの技術によって、すなわち、ＲＮＡ分子を使用して典型的には特異的ｍＲＮＡ分子の破壊を引き起こすことにより、遺伝子発現を阻害するプロセスによって、低減または排除される。ＲＮＡｉは、同時抑制、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、およびクエリング（quelling）としても知られている。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「低減した活性」とは、例えば酵素などのポリペプチドの活性であって、ポリペプチドの天然の活性レベルより低いレベルのものを指す。ポリペプチドの活性を低下させる任意の手段を、開示された態様において用いることができる。例えば、二重結合レダクターゼの配列または構造を変更して、酵素の元の基質に対する活性を低減することができる。別の例において、二重結合レダクターゼポリペプチドの活性は、宿主細胞を二重結合レダクターゼポリペプチドの阻害剤の存在下で増殖させることにより、または二重結合レダクターゼポリペプチドの阻害剤の同時発現または同時生産によって、低減することができる。
【０１０３】
いくつかの態様において、本明細書に開示された組換え酵母細胞はさらに、二重結合レダクターゼポリペプチドの機能を部分的または完全に補足する酵素をコードする組換え遺伝子を含む。本明細書で使用する場合、語句「機能を補足する」とは、それが「補足する」酵素の天然の機能のいくつかまたは全てを行う酵素を指す。例えば、ＤＢＲポリペプチドの発現もしくは活性の低減または排除は、いくつかの態様において、宿主細胞の致死性または不十分な増殖をもたらす。得られる致死性または不十分な増殖を改善するために、増殖に必要な低減／排除されたＤＢＲの活性を行うが、フェニルプロパノイドのジヒドロフェニルプロパノイドへの変換は触媒しない（例えば、基質としてクマル酸またはケイ皮酸を取らない）、相補的酵素を導入することができる（例えば組換えにより）。ＤＢＲの機能を部分的または完全に補足する酵素の例には、限定することなく、他のエノイルレダクターゼおよびポリプレノールレダクターゼが含まれる。
【０１０４】
いくつかの態様において、二重結合レダクターゼポリペプチドの機能を部分的または完全に補足する酵素をコードする組換え遺伝子は、（ａ）配列番号９４〜９６のいずれか１つ、または（ｂ）配列番号９４〜９６のいずれか１つと少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む。いくつかの態様において、二重結合レダクターゼポリペプチドの機能を部分的または完全に補足する酵素をコードする組換え遺伝子は、（ａ）配列番号６５〜６７のいずれか１つ、または（ｂ）配列番号６５〜６７のいずれか１つと少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドをコードする。
【０１０５】
本明細書に開示される組換え酵母細胞のいくつかの態様において、組換え酵母細胞はさらに、ポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。いくつかの態様において
【０１０６】
いくつかの態様において、本開示の組換え酵母細胞は、組換えポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドを過剰発現するように、さらに操作される。いくつかの態様において、組換えポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドは、（ｉ）組換えカルコンシンターゼポリペプチド；または（ｉｉ）組換えスチルベンシンターゼポリペプチド、を含む。
【０１０７】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞はさらに、フェニルプロパノイド誘導体生合成経路の１つ以上のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、カルコン、スチルベンまたは他のフェニルプロパノイド誘導体の生合成における中間体の形成を触媒する、組換え遺伝子が提供される。中間体は、とりわけ、ケイ皮酸、シンナモイル−ＣｏＡ、ｐ−クマル酸、ｐ−クマロイルＣｏＡ、ナリンゲニンおよびレスベラトロールを含む。
【０１０８】
いくつかの態様において、組換え細胞は、ケイ皮酸の形成を触媒するフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする、内因性遺伝子または組換え遺伝子をさらに含む。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、Arabidopsis thalianaのＰＡＬ２遺伝子と相同性を有するポリペプチドを発現する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、配列番号１として本明細書に開示される配列を含む組換え遺伝子を発現する。他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する組換え遺伝子を発現する。さらに他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号１６と少なくとも７０％の同一性を有する組換えポリペプチドを発現する。
【０１０９】
ある態様において、組換え宿主細胞は、ｐ−クマル酸の形成を触媒する１つ以上の組換えポリペプチドを発現するように、操作される。したがって、いくつかの態様において、組換え細胞はさらに、シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、配列番号２を含むシンナマート４−ヒドロキシラーゼ遺伝子を発現する。さらなる態様において、シンナマート４−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有する。また提供されるのは、配列番号１７と少なくとも７０％の同一性を有するシンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む、組換え宿主細胞である。
【０１１０】
いくつかの態様において、宿主細胞は、ｐ−クマロイル−ＣｏＡまたはシンナモイル−ＣｏＡの形成を触媒する組換えポリペプチドを発現するように、操作される。したがって、いくつかの態様において、組換え細胞はさらに、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする遺伝子を含む。特定の態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ遺伝子は、配列番号３を含む。特定の態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも６５％の同一性を有する。さらに他の態様において、組換え遺伝子は、配列番号１８と少なくとも６５％の同一性を有する４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする。
【０１１１】
いくつかの態様において、本開示は、ケイ皮酸およびクマル酸などのフェニルプロパノイドの形成を触媒する、および／またはカルコンおよびスチルベノイドなどのフェニルプロパノイド誘導体の形成を触媒する組換えポリペプチドを発現するように操作された、組換え宿主細胞を提供する。
【０１１２】
ある態様において、組換え宿主細胞は、ナルゲニン前駆体化合物などのカルコンの、クマロイル−ＣｏＡまたはシンナモイル−ＣｏＡからの形成を触媒する組換えポリペプチドを発現するように、操作される。したがって、いくつかの態様において、組換え細胞はさらに、１つ以上のカルコンシンターゼ遺伝子を含む。ある態様において、組換え宿主細胞は、Hordeum vulgareカルコンシンターゼ２と相同性を有する異種遺伝子を発現する。他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号４の配列を含む組換え遺伝子を発現する。さらに他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号４と少なくとも６５％の同一性を有する組換え遺伝子を発現する。さらに他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号１９と少なくとも６５％の同一性を有する組換えポリペプチドを発現する。
【０１１３】
いくつかの態様において、本開示は、ｐ−クマロイル−ＣｏＡまたはシンナモイル−ＣｏＡからのスチルベノイドの形成を触媒する組換えポリペプチドを発現するように操作された組換え宿主細胞を、提供する。したがって、いくつかの態様において、組換え宿主細胞はさらに、１つ以上のスチルベンシンターゼ遺伝子を含む。
【０１１４】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、Pinus densifloraスチルベンシンターゼ遺伝子と相同性を有する異種遺伝子を発現する。他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号２３の配列を含む組換え遺伝子を発現する。さらに他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号２３と少なくとも７０％の同一性を有する組換え遺伝子を発現する。さらに他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を有する組換えポリペプチドを発現する。
【０１１５】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、組換えシトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする組換え遺伝子をさらに含み、組換えシトクロムｐ４５０遺伝子は、配列番号６によりコードされる。態様において、組換えシトクロムｐ４５０遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも６５％の同一性を有する。さらに他の態様において、組換え遺伝子は、配列番号２１と少なくとも６５％の同一性を有するシトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする。
【０１１６】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、組換えカルコンイソメラーゼポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含み、組換えカルコンイソメラーゼは、配列番号８０〜８６のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの態様において、組換えカルコンイソメラーゼ遺伝子は、配列番号８０〜８６のいずれか１つに対して少なくとも６０％の同一性を有する。他の態様において、カルコンイソメラーゼポリペプチドは、配列番号８７〜９３のいずれか１つに対して少なくとも６５％の同一性を有する。
【０１１７】
別の側面において、本開示は、ケイ皮酸およびクマル酸などのフェニルプロパノイドを生産する、および／またはカルコンまたはスチルベンなどのフェニルプロパノイド誘導体を生産する方法を提供し、該方法は、本明細書に開示されるような組換え酵母細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、ここで前記化合物は、組換え酵母細胞によって合成される。
【０１１８】
いくつかの態様において、本開示の方法は、カルコン化合物を生産するために使用される。いくつかの態様において、カルコン化合物は、ナリンゲニンまたはナリンゲニン誘導体である。ナリンゲニンに加えて、本明細書に開示されるいくつかの態様は、他のカルコン、例えばイソリキリチゲニン（リキリチゲニンカルコン）、ブテイン（ブチンカルコン）、ピノセンブリンカルコン、エリオジクチオールカルコンおよびホモエリオジクチオールカルコンなどを生産するのに、有用である。
【０１１９】
いくつかの態様において、本開示の方法は、スチルベノイド化合物を生産するために使用される。いくつかの態様において、スチルベン化合物はレスベラトロールである。レスベラトロールに加えて、本開示のいくつかの態様は、他のスチルベノイド、例えばピセアタンノール、ジヒドロレスベラトロール、レスベラトロール３−Ｏ−グルコシド（ピセイド、ポリダチン）、イプシロン−ビニフェリン、デルタ−ビニフェリンおよびパリドールを生産するのに有用である。
【０１２０】
いくつかの態様において、カルコンまたはスチルベン化合物を生産する方法は、前記化合物を収集することをさらに含む。本明細書で使用する場合、用語「収集すること」は、化合物を収集するための任意の手段を指し、これは、化合物を単離することを含んでも含まなくてもよい。いくつかの態様において、カルコンまたはスチルベン化合物を生産する方法は、前記化合物を単離することをさらに含む。
【０１２１】
別の側面において、本開示は、式（ＩＩＩ）：
【化１５】
2018520661.tif 000016
で表される化合物またはその薬学的に許容し得る塩を生産する方法を提供し、式中、
Ａは、結合またはＣ＝Ｏであり；
ｎは、０、１、２、３、または４の整数であり；
Ｒは、
【化１６】
2018520661.tif 000017
が二重結合の場合は水素であり、または、ＲとＲ５は、ＡがＣ＝Ｏであり、かつ
【化１７】
2018520661.tif 000018
が単結合の場合は、それらが結合している原子と一緒になって、６員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素、−ＯＲ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
前記方法は、本明細書に開示されるような組換え宿主細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、ここで式（ＩＩＩ）の化合物は、組換え宿主細胞によって合成される。
【０１２２】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４が独立して水素である化合物ではない。
【０１２３】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＶ）：
【化１８】
2018520661.tif 000019
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩であり、式中、
Ａは、結合またはＣ＝Ｏであり；
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素、−ＯＲ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１２４】
いくつかの態様において、式（ＩＶ）の化合物は、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４が独立して水素である化合物ではない。
【０１２５】
いくつかの態様において、式（ＩＶ）の化合物は、Ａが結合である、スチルベノイド化合物である。例えば、本発明の方法によって生産されるスチルベノイドは、式（ＩＶ−Ａ）：
【化１９】
2018520661.tif 000020
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩を含み、式中、
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素、−ＯＲ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１２６】
いくつかの態様において、式（ＩＶ−Ａ）の化合物は、式中が以下である化合物である：
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素、−ＯＲ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１２７】
いくつかの態様において、式（ＩＶ−Ａ）の化合物は、式中が以下である化合物である：
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、−ＯＲ１１であり；
Ｒ２は、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；ここでＲ１１は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＲ１１またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０であり、ここでＲ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルまたは−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０であり、ここでアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１２８】
いくつかの態様において、式（ＩＶ−Ａ）の化合物は、ｎが０の化合物である。別の態様において、式（ＩＶ−Ａ）の化合物は、Ｒ１が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が水素またはメチルである化合物である。いくつかの態様は、Ｒ１が水素である、式（ＩＶ−Ａ）の化合物を提供する。
【０１２９】
いくつかの態様は、Ｒ２が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、式（ＩＶ−Ａ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ１１は、水素またはメチルである。他の態様は、Ｒ２が水素である、式（ＩＶ−Ａ）の化合物を提供する。
【０１３０】
いくつかの態様は、Ｒ４が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、式（ＩＶ−Ａ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ１１は、水素またはメチルである。他の態様は、Ｒ４が、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ１２アルケニルである、式（ＩＶ−Ａ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ４は、ヒドロキシで任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ１２アルケニルである。いくつかの態様において、Ｒ４は、ヒドロキシで任意に置換されていてもよい３−メチルブタ−２−エン−１−イルである。いくつかの態様において、Ｒ４は、３−メチルブタ−２−エン−１−イルである。
【０１３１】
いくつかの態様は、Ｒ５が水素である、式（ＩＶ−Ａ）の化合物を提供する。
【０１３２】
いくつかの態様は、Ｒ６が水素または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０である、式（ＩＶ−Ａ）の化合物を提供する。一態様において、Ｒ６は、水素または−Ｃ（Ｏ）ＯＨである。
【０１３３】
式（ＩＶ−Ａ）の化合物の代表的な例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：レスベラトロール、アストリンジン、プテロスチルベン、ピノシルビン、ピセアタンノール、ピセイド、
【化２０】
2018520661.tif 000021
【化２１】
2018520661.tif 000022
【０１３４】
いくつかの態様において、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ−Ｂ）：
【化２２】
2018520661.tif 000023
で表されるカルコン化合物、またはその薬学的に許容し得る塩であり、式中、
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素、−ＯＲ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２あり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２あり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１３５】
いくつかの態様において、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物は、式中が以下である化合物である：
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素、−ＯＲ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２あり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２あり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１３６】
いくつかの態様において、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物は、式中が以下である化合物である：
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；ここでＲ１１は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＲ１１またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０であり、ここでアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１３７】
いくつかの態様において、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物は、ｎが０の化合物である。別の態様において、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物は、Ｒ１が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が水素またはメチルである化合物である。いくつかの態様は、Ｒ１が水素である、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物を提供する。
【０１３８】
いくつかの態様は、Ｒ２が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ１１は、水素またはメチルである。他の態様は、Ｒ２が水素である、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物を提供する。
【０１３９】
いくつかの態様は、Ｒ４が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ１１は、水素またはメチルである。他の態様は、Ｒ４が、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ１２アルケニルである、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ４は、ヒドロキシで任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ１２アルケニルである。いくつかの態様において、Ｒ４は、ヒドロキシで任意に置換されていてもよい３−メチルブタ−２−エン−１−イルである。いくつかの態様において、Ｒ４は、３−メチルブタ−２−エン−１−イルである。
【０１４０】
いくつかの態様は、Ｒ５が水素である、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物を提供する。
【０１４１】
いくつかの態様は、Ｒ６が水素または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０である、式（ＩＶ−Ｂ）の化合物を提供する。一態様において、Ｒ６は、水素または−Ｃ（Ｏ）ＯＨである。
【０１４２】
式（ＩＶ−Ｂ）の化合物の代表的な例としては、限定はされないが、ピノセンブリンカルコンおよびナリンゲニンカルコンが挙げられる。
【０１４３】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（Ｖ）：
【化２３】
2018520661.tif 000024
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩であり、式中、
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１４４】
いくつかの態様において、式（Ｖ）の化合物は、式中が以下である化合物である：
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１４５】
いくつかの態様において、式（Ｖ）の化合物は、式中が以下である化合物である：
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；ここでＲ１１は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＲ１１またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；および
Ｒ６は、水素、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０であり、ここでアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１４６】
いくつかの態様において、式（Ｖ）の化合物は、ｎが０の化合物である。別の態様において、式（Ｖ）の化合物は、Ｒ１が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が水素またはメチルである、化合物である。いくつかの態様は、Ｒ１が水素である、式（Ｖ）の化合物を提供する。
【０１４７】
いくつかの態様は、Ｒ２が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、式（Ｖ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ１１は、水素またはメチルである。他の態様は、Ｒ２が水素である、式（Ｖ）の化合物を提供する。
【０１４８】
いくつかの態様は、Ｒ４が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、式（Ｖ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ１１は、水素またはメチルである。他の態様は、Ｒ４が、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ１２アルケニルである、式（Ｖ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ４は、ヒドロキシで任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ１２アルケニルである。いくつかの態様において、Ｒ４は、ヒドロキシで任意に置換されていてもよい、３−メチルブタ−２−エン−１−イルである。いくつかの態様において、Ｒ４は、３−メチルブタ−２−エン−１−イルである。
【０１４９】
いくつかの態様は、Ｒ６が水素または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０である、式（Ｖ）の化合物を提供する。一態様において、Ｒ６は、水素または−Ｃ（Ｏ）ＯＨである。
【０１５０】
式（Ｖ）の化合物の代表的な例としては、限定はされないが、ピノセンブリン、ヘスペレチン、エリオジクチオール、ホモエリオジクチオール、およびナリンゲニンが挙げられる。
【０１５１】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶ−Ａ）、（ＩＶ−Ｂ）、または（Ｖ）のいずれか１つの化合物を生産する方法は、前記化合物を収集することをさらに含む。いくつかの態様において、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶ−Ａ）、（ＩＶ−Ｂ）、または（Ｖ）のいずれか１つの化合物を生産する方法は、前記化合物を単離することをさらに含む。
【０１５２】
ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体化合物の生合成
別の側面において、本開示は、フェニルプロパノイド誘導体生合成経路における１つ以上の異種組換え遺伝子で操作された、組換え宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、組換え宿主は、フェニルプロパノイドのエノイル二重結合の還元を行うことができ、エノイルレダクターゼ（ＥＮＲ）などの二重結合レダクターゼ（ＤＢＲ）の組換え発現により、ジヒドロフェニルプロパノイドを生産する。例えば、いくつかの態様において、組換え宿主は、ｐ−クマロイル−ＣｏＡの二重結合をジヒドロクマロイル−ＣｏＡに還元すること、またはシンナモイル−ＣｏＡの二重結合をジヒドロシンナモイル−ＣｏＡに還元することができる。
【０１５３】
いくつかの態様において、エノイルレダクターゼが過剰発現される。本明細書で使用する場合、用語「過剰発現」は、遺伝子またはタンパク質の天然の発現より高いレベルでの、該遺伝子またはタンパク質の発現を指す。
【０１５４】
いくつかの態様において、エノイルレダクターゼは、Saccharomyces cerevisiaeのｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＴＳＣ１３）、またはその機能的ホモログを含む。いくつかの態様において、組換えエノイルレダクターゼは、配列番号７として本明細書に開示される配列を含む遺伝子によりコードされる。いくつかの態様において、組換えエノイルレダクターゼは、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する遺伝子によりコードされる。いくつかの態様において、組換えエノイルレダクターゼは、（ａ）配列番号２２のポリペプチドを含むか、または（ｂ）配列番号２２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１５５】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、組換えエノイルレダクターゼと共に、組換えポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドを同時発現する。いくつかの態様において、組換えポリケチドシンターゼＩＩＩ型ポリペプチドは、（ｉ）組換えカルコンシンターゼポリペプチド；または（ｉｉ）組換えスチルベンシンターゼポリペプチド、を含む。
【０１５６】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞はさらに、ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成経路の１つ以上のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ジヒドロカルコンまたはジヒドロスチルベン生合成における中間体の形成を触媒する組換え遺伝子が提供される。中間体は、とりわけ、ケイ皮酸、シンナモイル−ＣｏＡ、ジヒドロシンナモイル−ＣｏＡ、ｐ−クマル酸、ｐ−クマロイルＣｏＡ、ｐ−ジヒドロクマロイルＣｏＡ、およびフロレチンを含む。
【０１５７】
いくつかの態様において、組換え細胞はさらに、ケイ皮酸の形成を触媒するフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする、内因性または組換え遺伝子を含む。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、Arabidopsis thalianaのＰＡＬ２遺伝子と相同性を有するポリペプチドを発現する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、配列番号１として本明細書に開示される配列を含む組換え遺伝子を発現する。他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する組換え遺伝子を発現する。さらに他の態様において、組換え宿主細胞は、（ａ）配列番号１６を含む組換えポリペプチド、または（ｂ）配列番号１６と少なくとも７０％の同一性を有する組換えポリペプチドを、発現する。
【０１５８】
ある態様において、組換え宿主細胞は、ｐ−クマル酸の形成を触媒する１つ以上の組換えポリペプチドを発現するように操作される。したがって、いくつかの態様は、シンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子を発現する宿主細胞を含む。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、配列番号２を含むシンナマート４−ヒドロキシラーゼ遺伝子を発現する。さらなる態様において、シンナマート４−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有する。さらに提供されるのは、組換え宿主細胞であって、（ａ）配列番号１７を含むシンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチド；または（ｂ）配列番号１７と少なくとも７０％の同一性を有するシンナマート４−ヒドロキシラーゼポリペプチド、をコードする組換え遺伝子を含む、前記組換え宿主細胞である。
【０１５９】
いくつかの態様において、宿主細胞は、ｐ−クマロイル−ＣｏＡまたはシンナモイル−ＣｏＡの形成を触媒する組換えポリペプチドを発現するように操作される。したがって、ある態様において、宿主細胞は、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子を発現する。特定の態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ遺伝子は、配列番号３を含む。特定の態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも６５％の同一性を有する。他の態様において、組換え遺伝子は、（ａ）配列番号１８を含む４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチド、または（ｂ）配列番号１８と少なくとも６５％の同一性を有する４−クマラート−ＣｏＡリガーゼポリペプチドを、コードする。
【０１６０】
いくつかの態様において、本開示は、ジヒドロカルコンおよびジヒドロスチルベノイドなどのジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の形成を触媒する組換えポリペプチドを発現するように操作された、組換え宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、宿主細胞は、例えばジヒドロクマロイル−ＣｏＡまたはジヒドロシンナモイル−ＣｏＡからの、フロリジン化合物および／またはフロリジン前駆体化合物の形成を触媒する組換えポリペプチドを発現するように操作される。ある態様において、組換え宿主細胞は、ｐ−ジヒドロクマロイル−ＣｏＡまたはジヒドロシンナモイル−ＣｏＡからの、フロレチンを含むフロリジン前駆体化合物の形成を触媒する組換えポリペプチドを発現するように、操作される。
【０１６１】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、１つ以上のカルコンシンターゼ遺伝子を含む。ある態様において、組換え宿主細胞は、Hordeum vulgareカルコンシンターゼ２（ＨｖＣＨＳ２）またはそのホモログもしくは機能的類似体をコードする異種遺伝子を発現する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、配列番号４または６８〜７０の１つを含む組換え遺伝子を発現する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、配列番号４または６８〜７０の１つと少なくとも６５％の同一性を有する組換え遺伝子を発現する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、（ａ）（ａ）配列番号１９もしくは７１〜７３の１つ；ｂ）配列番号１９もしくは７１〜７３の１つと少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチド；または（ｃ）配列番号１９もしくは７１〜７３の１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を、配列番号１９もしくは７１〜７３におけるアミノ酸９５〜１０５、１３２〜１４２、１９１〜２０１および２６６〜２７６にまたがる合わせた領域において有するポリペプチド、を含む組換えポリペプチドを、発現する。
【０１６２】
いくつかの態様において、本開示の組換え宿主細胞は、Hordeum vulgareのカルコンシンターゼ２（ＣＨＳ２）をコードする核酸配列を含み、該核酸配列は、Ｇ５９５Ａ、Ａ７９９Ｔ、およびＡ８０１Ｔからなる群から選択される１つ以上の核酸置換を含む。いくつかの態様において、本開示の組換え宿主細胞は、Ａ１９９ＴおよびＩ２６７Ｆからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むHordeum vulgareのカルコンシンターゼ２（ＣＨＳ２）をコードする核酸配列を含む。
【０１６３】
ある態様において、組換え宿主細胞は、Hypericum androsaemumカルコンシンターゼ（ＨａＣＨＳ）またはそのホモログもしくは機能的類似体をコードする異種遺伝子を発現する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、配列番号２７を含む組換え遺伝子、または配列番号２７と少なくとも６５％の配列同一性を有する組換え遺伝子を、発現する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、配列番号４９を含む組換えポリペプチドまたは配列番号４９と少なくとも６５％の配列同一性を有する組換えポリペプチドを、発現する。
【０１６４】
いくつかの態様において、本開示は、フロリジンのフロレチンからの形成を触媒する組換えポリペプチドを発現するように操作された組換え宿主細胞を提供する。ある態様において、組換え宿主は、Malus domesticaのＰ２’ＵＧＴ遺伝子と相同性を有する異種ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）で操作される。他の態様において、本明細書に開示された組換え宿主は、配列番号５を含む異種遺伝子を含む。さらに他の態様において、組換え宿主は、配列番号５と少なくとも６５％の同一性を有する異種遺伝子を含む。さらに他の態様において、組換え宿主は、（ａ）配列番号２０を含むＵＧＴポリペプチド、または（ｂ）配列番号２０と少なくとも７０％の同一性を有するＵＧＴポリペプチドを、発現する。
【０１６５】
いくつかの態様において、本開示は、ジヒドロスチルベノイドの、ｐ−ジヒドロクマロイル−ＣｏＡまたはジヒドロシンナモイル−ＣｏＡからの形成を触媒する組換えポリペプチドを発現するように操作された、組換え宿主細胞を提供する。したがって、いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、１つ以上のスチルベンシンターゼ遺伝子を含む。
【０１６６】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、Pinus densifloraスチルベンシンターゼ遺伝子と相同性を有する異種遺伝子を発現する。他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号２３の配列を含む組換え遺伝子を発現する。さらに他の態様において、組換え宿主細胞は、配列番号２３と少なくとも７０％の同一性を有する組換え遺伝子を発現する。さらに他の態様において、組換え宿主細胞は、（ａ）配列番号２４を含む組換えポリペプチド、または（ｂ）配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を有する組換えポリペプチドを、発現する。
【０１６７】
いくつかの態様において、本開示は、組換えシトクロムｐ４５０ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を発現する組換え宿主細胞を提供し、ここで組換えシトクロムｐ４５０遺伝子は、配列番号６によってコードされる。態様において、組換えシトクロムｐ４５０遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも６５％の同一性を有する。さらに他の態様において、組換え遺伝子は、（ａ）配列番号２１を含むシトクロムｐ４５０ポリペプチド、または（ｂ）配列番号２１と少なくとも６５％の同一性を有するシトクロムｐ４５０ポリペプチドを、コードする。
【０１６８】
別の側面において、本開示は、ジヒドロカルコンまたはジヒドロスチルベン化合物を生産する方法を提供し、この方法は、本明細書に開示されるような組換え宿主細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、前記化合物は、組換え宿主細胞によって合成される。
【０１６９】
いくつかの態様において、本開示の方法は、ジヒドロカルコン化合物を生産するために使用される。いくつかの態様において、ジヒドロカルコン化合物は、フロレチンまたはフロレチン誘導体である。いくつかの態様において、フロレチン誘導体はフロリジンである。
【０１７０】
フロリジンに加えて、本明細書に開示されるいくつかの態様は、他のジヒドロカルコン、例えばネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＣ）の生産に有用である。
【０１７１】
いくつかの態様において、本開示の方法は、ジヒドロスチルベノイド化合物を生産するために使用される。
【０１７２】
いくつかの態様において、ジヒドロカルコンまたはジヒドロスチルベン化合物を生産する方法は、前記化合物を収集することをさらに含む。本明細書で使用する場合、用語「収集すること」は、化合物を収集する任意の手段を指し、これは化合物を単離することを含んでいてもいなくてもよい。いくつかの態様において、ジヒドロカルコンまたはジヒドロスチルベン化合物を生産する方法は、前記化合物を単離することをさらに含む。
【０１７３】
別の側面において、本開示は、式（ＩＩＩ）：
【化２４】
2018520661.tif 000025
で表される化合物またはその薬学的に許容し得る塩を生産する方法を提供し、式中、
Ａは、結合またはＣ＝Ｏであり；
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素または−ＯＲ１１であり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１または−Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、およびアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
前記方法は、本明細書に開示されるような組換え宿主細胞を、培地中、組換え遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、ここで式（ＩＩＩ）の化合物は、組換え宿主細胞によって合成される。
【０１７４】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４が独立して水素である化合物ではない。
【０１７５】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ）の化合物は、Ａが結合である、ジヒドロスチルベノイド化合物である。例えば、本発明の方法により生産されたジヒドロスチルベノイドとしては、式（ＩＩＩ−Ａ）：
【化２５】
2018520661.tif 000026
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩を含み、式中、
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素または−ＯＲ１１であり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１または−Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、およびアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１７６】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物は、式中が以下である化合物である：
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素または−ＯＲ１１であり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１または−Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、およびアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１７７】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物は、式中が以下である化合物である：
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、−ＯＲ１１であり；
Ｒ２は、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；ここでＲ１１は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＲ１１またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素であり；および
Ｒ６は、水素またはＣ２〜Ｃ６アルケニルであり、ここでアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１７８】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物は、ｎが０の化合物である。別の態様において、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物は、Ｒ１が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が水素またはメチルである化合物である。いくつかの態様は、Ｒ１が水素である、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物を提供する。
【０１７９】
いくつかの態様は、Ｒ２が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ１１は、水素またはメチルである。他の態様は、Ｒ２が水素である、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物を提供する。
【０１８０】
いくつかの態様は、Ｒ４が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ１１は、水素またはメチルである。他の態様は、Ｒ４が、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ１２アルケニルである、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ４は、ヒドロキシで任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ１２アルケニルである。いくつかの態様において、Ｒ４は、ヒドロキシで任意に置換されていてもよい３−メチルブタ−２−エン−１−イルである。いくつかの態様において、Ｒ４は、３−メチルブタ−２−エン−１−イルである。
【０１８１】
いくつかの態様は、Ｒ５が水素である、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物を提供する。
【０１８２】
いくつかの態様は、Ｒ６が水素である、式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物を提供する。
【０１８３】
式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物の代表的な例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：ジヒドロレスベラトロール、ジヒドロピノシルビン、アモルフルチン２、
【化２６】
2018520661.tif 000027
【０１８４】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩ−Ｂ）：
【化２７】
2018520661.tif 000028
で表されるジヒドロカルコン化合物、またはその薬学的に許容し得る塩であり、式中、
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
ここで各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはグリコシルであり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素または−ＯＲ１１であり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１または−Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、およびアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１８５】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物は、式中が以下である化合物である：
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素または−ＯＲ１１であり；および
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−ＯＲ１１または−Ｎ（Ｒ１０）２であり、ここで各Ｒ１０は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、およびアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１８６】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物は、式中が以下である化合物である：
ｎは、０、１、２、３または４の整数であり；
Ｒ１は、水素または−ＯＲ１１であり；
Ｒ２は、水素、−ＯＲ１１、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；ここでＲ１１は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
または、Ｒ２とＲ６は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
または、Ｒ２とＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３は独立して、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１２、−Ｎ（Ｒ１２）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）２から選択され、ここで各Ｒ１２は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＲ１１またはＣ２〜Ｃ１２アルケニルであり、ここでアルケニルは、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよく；
または、Ｒ４とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ７基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ５は、水素であり；および
Ｒ６は、水素またはＣ２〜Ｃ６アルケニルであり、ここでアルケニルは、１つ以上のＲ８で任意に置換されていてもよく；または、Ｒ６とＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＲ８基で任意に置換されていてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成し；
Ｒ７およびＲ８のそれぞれは独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、−ＯＲ１３、−ＳＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）２、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３であり、ここで各Ｒ１３は独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１８７】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物は、ｎが０の化合物である。別の態様において、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物は、Ｒ１が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が水素またはメチルである化合物である。いくつかの態様は、Ｒ１が水素である、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物を提供する。
【０１８８】
いくつかの態様は、Ｒ２が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ１１は、水素またはメチルである。他の態様は、Ｒ２が水素である、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物を提供する。
【０１８９】
いくつかの態様は、Ｒ４が−ＯＲ１１であり、Ｒ１１が独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ１１は、水素またはメチルである。他の態様は、Ｒ４が、１つ以上のＲ７で任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ１２アルケニルである、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物を提供する。いくつかの態様において、Ｒ４は、ヒドロキシで任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ１２アルケニルである。いくつかの態様において、Ｒ４は、ヒドロキシで任意に置換されていてもよい３−メチルブタ−２−エン−１−イルである。いくつかの態様において、Ｒ４は、３−メチルブタ−２−エン−１−イルである。
【０１９０】
いくつかの態様は、Ｒ５が水素である、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物を提供する。
【０１９１】
いくつかの態様は、Ｒ６が水素である、式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物を提供する。
【０１９２】
式（ＩＩＩ−Ｂ）の化合物の代表例としては、限定はされないが、フロレチン、フロリジン、およびピノセンブリンジヒドロカルコンが挙げられる。
【０１９３】
いくつかの態様において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ−Ａ）、または（ＩＩＩ−Ｂ）のいずれか１つの化合物を生産する方法は、前記化合物を収集する方法をさらに含む。いくつかの態様において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ−Ａ）、または（ＩＩＩ−Ｂ）のいずれか１つの化合物を生産する方法は、前記化合物を単離する方法をさらに含む。
【０１９４】
機能的ホモログ
上記のポリペプチドの機能的ホモログは、本明細書で提供される組換え宿主においてジヒドロフェニルプロパノイド誘導体を生産することにおける使用にもまた好適である。機能的ホモログは、参照ポリペプチドに対して配列類似性を有し、参照ポリペプチドの１以上の生化学的または生理学的機能を実施するポリペプチドである。機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドであり得、配列類似性は、収束的または発散的な進化的事象が原因であり得る。よって、機能的ホモログは、文献においてホモログ、またはオルソログ、またはパラログと称されることもある。野生型コード配列の突然変異体によってコードされたポリペプチドなどの天然に生じる機能的ホモログのバリアントは、それら自体が機能的ホモログであり得る。機能的ホモログはまた、ポリペプチドのコード配列の部位特異的な変異誘発を介するか、または種々の天然に生じるポリペプチドのコード配列からのドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）によって、作製され得る。本明細書に記載の機能的ポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は、知られたものであり、とりわけ、定向進化技術、部位特異的な変異誘発技術、およびランダム変異誘発技術を含み、ポリペプチドの特定の活性を増加させること、基質特異性を変更すること、発現レベルを変更すること、細胞内位置を変更すること、または所望の様式においてポリペプチド−ポリペプチド相互作用を改変することに、有用であり得る。かかる改変されたポリペプチドは、機能的ホモログであると考えられる。用語「機能的ホモログ」は、時として機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
【０１９５】
機能的ホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチドの配列アラインメントの分析によって同定され得る。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチドの配列のデータベースにおけるクエリ（query）を実行することは、フェニルプロパノイドまたはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成経路ポリペプチドのホモログを同定し得る。配列分析は、参照配列としてＴＳＣ１３、ＣＨＳ２、またはＰ２’ＵＧＴアミノ酸配列を使用する、非重複データベースのＢＬＡＳＴ、相互ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析を含むことができる。アミノ酸配列は、いくつかの例において、ヌクレオチド配列から推測される。４０％より大きな配列同一性を有する、データベースにおけるこれらのポリペプチドは、フェニルプロパノイドまたはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成経路ポリペプチドとしての適合性のさらなる評価のための候補である。アミノ酸配列の類似性は、１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換または１つの極性残基の別の極性残基への置換などの、保存的アミノ酸置換を可能にする。所望される場合、かかる候補の手動検査を実施して、さらなる評価のための候補の数を狭めることができる。手動検査は、フェニルプロパノイドまたはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成経路ポリペプチドに存在するドメイン、例えば保存された機能的ドメインを有すると思われるこれらの候補を選択することによって、行うことができる。
【０１９６】
保存領域は、領域を、繰り返し配列であるフェニルプロパノイドまたはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成経路ポリペプチドの一次アミノ酸配列内に位置させることによって同定され得、いくつかの二次構造（例えば、ヘリックスおよびベータシート）を形成し、正もしくは負に荷電したドメインを確立し、またはタンパク質モチーフもしくはドメインを表わす。例えば、様々なタンパク質モチーフおよびドメインについてのコンセンサス配列を記載するワールドワイドウェブ上のPfamウェブサイト（sanger.ac.uk/Software/Pfam/ and pfam.janelia.org/）を参照。Pfamデータベースに含まれた情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997)；およびBateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999)に記載されている。保存領域はまた、密接に関係する種からの同一または関連するポリペプチドの配列をアラインメントすることによっても、決定され得る。密接に関係する種は、好ましくは同一ファミリーからのものである。いくつかの態様において、２つの異なる種からの配列のアラインメントは、かかるホモログを同定するのに適切である。
【０１９７】
典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドは、保存領域を同定するのに有用である。関連するポリペプチドの保存領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。いくつかの態様において、保存領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
【０１９８】
例えば、組換え宿主においてフロリジンを生産するのに適したポリペプチドとしては、ＴＳＣ１３、ＣＨＳ２、およびＰ２’ＵＧＴの機能的ホモログが含まれる。別の例では、組換え宿主においてナリンゲニンを生産するのに適したホモログとしては、カルコンシンターゼおよび／またはカルコンイソメラーゼ遺伝子の組換えホモログが含まれる。
【０１９９】
例えばカルコンシンターゼ、カルコンイソメラーゼ、スチルベンシンターゼ、ＴＳＣ１３、ＣＨＳ２、またはＰ２’ＵＧＴなどの基質特異性を改変する方法は、当業者に知られており、限定されるものではないが、部位特異的／合理的な変異誘発アプローチ、ランダム定向進化アプローチ、およびランダム変異誘発／飽和技術を酵素の活性部位近傍で実行する組み合わせ、を含む。例えば、Osmani et al., 2009, Phytochemistry 70: 325-347を参照。
【０２００】
候補配列は、典型的には参照配列の長さの８０％〜２００％、例えば、参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００％の長さを有する。機能的ホモログポリペプチドは、典型的には参照配列の長さの９５％〜１０５％、例えば、参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０％、またはその間の任意の範囲である長さを有する。参照核酸またはポリペプチドに対する、任意の候補核酸またはポリペプチドの同一性％は、以下のとおり決定され得る。参照配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列またはアミノ酸配列）を、コンピュータープログラムClustalW（バージョン１．８３、デフォルトパラメータ）を使用して１以上の候補配列にアラインメントさせる；これは、核酸またはポリペプチド配列のアラインメントを、それらの全長にわたって実施することを可能にする（グローバルアラインメント）。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(13):3497-500。
【０２０１】
ClustalWは、参照と１以上の候補配列との間のベストマッチを計算し、それらをアラインメントし、これにより、同一性、類似性および相違を決定することができる。配列アラインメントを最大化するために、１以上の残基のギャップを、参照配列、候補配列、または両方の中へ挿入することができる。核酸配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、以下のデフォルトパラメータが使用される：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；点数化方法：％ａｇｅ；上対角線(top diagonal)の数：４；およびギャップペナルティ：５。核酸配列の複数アラインメントのために、以下のパラメータが使用される：ギャップオープニングペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：５．０；および重み変化(transition)：有。タンパク質配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、以下のパラメータが使用される：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；点数化方法：％ａｇｅ；上対角線の数：５；ギャップペナルティ：３。タンパク質配列の複数アラインメントのために、以下のパラメータが使用される：重みマトリクス：blosum；ギャップオープニングペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；残基特異的なギャップペナルティ：オン。ClustalWのアウトプットは、配列間の関係性を反映する配列アラインメントである。ClustalWは、例えば、ワールドワイドウェブ上のBaylor Colege of Medicine Search Launcherサイト（searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html）およびワールドワイドウェブ上のEuropean Bioinformatics Instituteサイト（ebi.ac.uk/clustalw）で実行することができる。
【０２０２】
参照配列に対する候補核酸またはアミノ酸配列のパーセント同一性を決定するために、ClustalWを使用して配列をアラインメントさせ、アラインメントにおける同一一致の数を参照配列の長さで割り、結果を１００倍する。パーセント同一値は、最も近い１０分の１に丸め得ることに留意する。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、７８．１４は７８．１に切り捨てられ、一方７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８、１９は７８．２に切り上げられる。
【０２０３】
フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド生合成に関与する酵素などの機能的ホモログ、例えば、ＴＳＣ１３、ＣＨＳ２、およびＰ２’ＵＧＴは、酵素によって行われる酵素活性に関与しない追加のアミノ酸を含み得ることが、理解されるであろう。
【０２０４】
組換え核酸
本明細書に記載のポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するために好適な１以上の調節領域にセンス配向で作動可能に連結されたそのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物は、多シストロン性ｍＲＮＡからの複数の遺伝子産物を発現することができるため、複数のポリペプチドが、所望の場合はそれらの微生物の単一の調節領域の制御下で発現され得る。コード配列と調節領域は、調節領域が配列の転写または翻訳を調節するために有効であるように調節領域とコード配列が位置される場合に、作動可能に連結されていると考えられる。典型的には、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、単シストロン性遺伝子の調節領域の下流の１〜約５０ヌクレオチドの間に位置する。
【０２０５】
多くの場合において、本明細書に記載のポリペプチドについてのコード配列は、組換え宿主以外の種において同定され、すなわち異種核酸である。したがって組換え宿主が微生物である場合、コード配列は、他の原核または真核微生物、植物または動物からのものであり得る。しかしながらいくつかの場合において、コード配列は、宿主に固有の配列であって、その生物に再導入されているものである。固有の配列（native sequence）は、外因性核酸に連結された非天然配列（例えば、組換え核酸コンストラクトにおいて固有の配列に隣接する非固有の調節配列など）の存在によって、天然に生じる配列としばしば区別され得る。さらに、安定的に形質転換された外因性核酸は典型的には、固有の配列が見出される位置以外の位置で統合される。「調節領域」は、転写または翻訳産物の転写または翻訳開始および速度、ならびに安定性および／または可動性（mobility）に影響するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。調節領域は、限定することなく、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、停止配列、ポリアデニル化配列、イントロン、およびその組み合わせを含む。調節領域は典型的には、少なくともコア（基礎的）プロモーターを含む。調節領域はまた、少なくとも１つの制御要素、例えばエンハンサー配列、上流要素または上流活性化領域（ＵＡＲ）などを含み得る。調節領域は、調節領域が配列の転写または翻訳の調節に有効であるように、調節領域とコード配列を位置させることによって、コード配列に作動可能に連結される。例えば、コード配列とプロモーター配列を作動可能に連結するために、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの下流の１〜約５０ヌクレオチドの間に位置される。しかしながら調節領域は、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドもの上流、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に、位置させることができる。
【０２０６】
含まれる調節領域の選択は、いくつかの因子、例えば、限定はされないが、効率性、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および所定の培養段階の間の優先的な発現を含む因子に依存する。調節領域をコード配列に対して適切に選択して位置させることにより、コード配列の発現を調節することは、当業者に日常的な事項である。１よりも多い調節領域、例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、および誘導性要素が存在し得ることが理解されるであろう。
【０２０７】
組換え宿主
組換え宿主は、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生産のためのポリペプチドを発現するために使用することができ、これは哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および藻類細胞を含む。多数の原核生物および真核生物もまた、例えばグラム陰性細菌、酵母および真菌などの、本明細書に記載の組換え微生物の構築に使用するのに適している。フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生産株として使用するために選択された種および株をまず分析して、どの生産遺伝子がその株に対して内因性であり、どの遺伝子が存在しないかを決定する。内因性対応物が株に存在しない遺伝子は、１つ以上の組換えコンストラクトに有利に集められ、これは次に、欠損した機能（単数または複数）を供給するために、その株に形質転換される。
【０２０８】
本明細書で提供される、構築され遺伝子操作された微生物は、従来の発酵プロセス、とりわけ、ケモスタット、バッチ、流加培養、連続灌流発酵、および連続灌流細胞培養を用いて、培養することができる。
【０２０９】
本発明の方法における使用の炭素源は、組換え宿主細胞によって代謝されることができて、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の増殖および／または生産を促進する、任意の分子を含む。適切な炭素源の例には、限定はされないが、スクロース（例えば、糖蜜に見られるような）、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオースまたは他のグルコース含有ポリマーが含まれる。酵母を宿主として用いる態様では、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロールおよびグルコースなどの炭素源が適している。炭素源は、培養期間を通して宿主生物に提供することができ、あるいは、生物は、別のエネルギー源、例えばタンパク質の存在下で一定期間増殖させ、次いで、炭素源を流加バッチ段階の間にのみ提供することができる。
【０２１０】
例示的な原核種および真核種は、以下にさらに詳細に記載される。しかしながら、他の種も好適であり得ることが理解されるであろう。例えば、好適な種は、Agricus、Aspergillus、Bacillus、Candida、Corynebacterium、Eremothecium、Escherichia、Fusarium／Gibberella、Kluyveromyces、Laetiporus、Lentinus、Phaffia、Phanerochaete、Pichia、Physcomitrella、Rhodotorula、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Sphaceloma、XanthophyllomycesまたはYarrowiaなどの属のものであり得る。かかる属からの例示的な種としては、Lentinus tigrinus、Laetiporus sulphureus、Phanerochaete chrysosporium、Pichia pastoris、Cyberlindnera jadinii、Physcomitrella patens、Rhodotorula glutinis 32、Rhodotorula mucilaginosa、Phaffia rhodozyma UBV-AX、Xanthophyllomyces dendrorhous、Fusarium fujikuroi／Gibberella fujikuroi、Candida utilis、Candida glabrata、Candida albicans、およびYarrowia lipolyticaを含む。
【０２１１】
いくつかの態様において、微生物は、原核生物、例えばEscherichia coli、Rhodobacter sphaeroides、Rhodobacter capsulatus、またはRhodotorula toruloidesなどであることができる。
【０２１２】
いくつかの態様において、微生物は、子嚢菌、例えばGibberella fujikuroi、Kluyveromyces lactis、Schizosaccharomyces pombe、Aspergillus niger、Yarrowia lipolytica、Ashbya gossypii、またはSaccharomyces cerevisiaeなどであることができる。
【０２１３】
いくつかの態様において、微生物は、藻類細胞、例えばBlakeslea trispora、Dunaliella salina、Haematococcus pluvialis、Chlorella種、Undaria pinnatifida、Sargassum、Laminaria japonica、Scenedesmus almeriensis種などであることができる。
【０２１４】
いくつかの態様において、微生物は、シアノバクテリア細胞、例えばBlakeslea trispora、Dunaliella salina、Haematococcus pluvialis、Chlorella種、Undaria pinnatifida、Sargassum、Laminaria japonica、Scenedesmus almeriensisなどであることができる。
【０２１５】
Saccharomyces種
Saccharomycesは、合成生物学において広く使用される土台(chassis)の生物であり、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。例えば、S. cerevisiaeについて利用可能な、突然変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよび他の情報のライブラリが存在し、様々なモジュールの合理的な設計を可能にして、産物収量を増強する。組換え微生物を作製するための方法は既知である。
【０２１６】
Aspergillus種
A. oryzae、A. nigerおよびA. sojaeなどのAspergillus種は、食品生産において広く使用される微生物であり、組換え微生物プラットフォームとしても使用することができる。ヌクレオチド配列は、A. nidulans、A. fumigatus、A. oryzae、A. clavatus、A. flavus、A. nigerおよびA. terreusのゲノムについて利用可能であり、内因性経路の合理的な設計および改変を可能にして、フラックスを増強し、産物収量を増加させる。Aspergillusについて代謝モデルが開発されている。一般にA. nigerは、クエン酸およびグルコン酸などの多数の食品成分の工業生産のために培養され、したがってA. nigerなどの種は、フェニルプロパノイド誘導体またはジフェニルプロパノイド誘導体を生産するために一般に好適である。
【０２１７】
Escherichia coli
Escherichia coli（合成生物学において広く使用される別のプラットフォーム生物）も、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。Saccharomycesと同様に、E. coliについて利用可能な、突然変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよび他の情報のライブラリが存在し、様々なモジュールの合理的な設計を可能にして、産物収量を増強する。Saccharomycesについての上記のものと同様な方法を使用して、組換えE. coli微生物を作製することができる。
【０２１８】
Agaricus、Gibberella、およびPhanerochaete種
Agaricus、Gibberella、およびPhanerochaete種は、培養で大量のイソプレノイドを生産することが知られているため、有用であり得る。このように、大量のフェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体を生産するための前駆体は、内因性遺伝子によって既に生産されている。
【０２１９】
Arxula adeninivorans（Blastobotrys adeninivorans）
Arxula adeninivoransは、独特な生化学的特性を有する二形性酵母である（パン酵母などの出芽酵母として、４２℃の温度まで増殖し、この閾値を超えると糸状の形態で増殖する）。これは広範囲の基質において成長し得、硝酸塩を同化し得る。これは天然プラスチックを生産し得る株の生成、または環境試料におけるエストロゲンのバイオセンサーの開発に、成功して適用されている。
【０２２０】
Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolyticaは、二形性酵母（Arxula adeninivoransを参照）であり、半子嚢菌類ファミリーに属する。Yarrowia lipolyticaの全ゲノムは、知られている。Yarrowia種は好気性菌であり、非病原性であると考えられる。Yarrowiaは疎水性基質（例えば、アルカン、脂肪酸、油）を使用することに効率的であり、糖で増殖し得る。これは産業用途に高いポテンシャルを有し、油性微生物である。Yarrowia lipolyticaは、その乾燥細胞重量のおよそ４０％まで脂質含有量を蓄積し得、脂質蓄積および再移動のためのモデル生物である。例えば、Nicaud, 2012, Yeast 29(10):409-18；Beopoulos et al., 2009, Biochimie 91(6):692-6；Bankar et al., 2009, Appl Microbiol Biotechnol. 84(5):847-65を参照。
【０２２１】
Rhodotorula種
Rhodotorulaは、単細胞の着色酵母である。油性の赤色酵母であるRhodotorula glutinisは、粗製グリセロールから脂質およびカロテノイドを生産することが示されている（Saenge et al., 2011, Process Biochemistry 46(1):210-8）。Rhodotorula toruloides株は、改善されたバイオマスおよび脂質の生産性のための、効率的なフェドバッチ発酵システムであることが示されている（Li et al., 2007, Enzyme and Microbial Technology 41:312-7）。
【０２２２】
Rhodosporidium toruloides
Rhodosporidium toruloidesは油性酵母であり、脂質生産経路の操作に有用である（例えば、Zhu et al., 2013, Nature Commun. 3:1112; Ageitos et al., 2011, Applied Microbiology and Biotechnology 90(4):1219-27を参照）。
【０２２３】
Candida boidinii
Candida boidiniiは、（メタノールで成長し得る）メチロトローフ酵母である。Hansenula polymorphaおよびPichia pastorisなどの他のメチロトローフ種と同様に、これは、異種タンパク質を生産するための優れたプラットフォームを提供する。数グラム範囲の分泌された外来タンパク質の収量が報告されている。計算方法であるＩＰＲＯは最近、Candida boidiniiのキシロースレダクターゼの補因子の特異性をＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへと実験的に転換する変異を予測した。
【０２２４】
Hansenula polymorpha（Pichia angusta）
Hansenula polymorphaは、別のメチロトローフ酵母である（Candida boidiniiを参照）。これは広範囲の他の基質でさらに成長し得る；これは熱耐性であり、硝酸塩を同化し得る（Kluyveromyces lactisも参照）。これは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリン、およびＣ型肝炎の処置のためのインターフェロンアルファ−２ａを生産することに、さらに技術的酵素の範囲にまでに適用されている。
【０２２５】
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces lactisは、通常ケフィアの生産に適用される酵母である。これはいくつかの糖で成長し得、最も重要なことに、乳および乳清に存在するラクトースで成長し得る。これは、チーズ生産のためのキモシン（仔牛の胃において通常に存在する酵素）を生産するために、とりわけ成功して適用されている。生産は、４０，０００Ｌ規模の発酵槽で行われる。
【０２２６】
Pichia pastoris
Pichia pastorisはメチロトローフ酵母である（Candida boidiniiおよびHansenula polymorphaを参照）。これは、外来タンパク質を生産するための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム要素はキットとして利用可能であり、タンパク質を生産するために学界において世界的に使用されている。複合体ヒトＮ−グリカン（酵母グリカンは、ヒトにおいて見出されたものに類似しているが、同一ではない）を生産し得る株に、操作がなされてきた。
【０２２７】
Physcomitrella種
Physcomitrella mossesは、懸濁培養で成長する場合、酵母または他の真菌培養と同様な特性を有する。この属は、他の種類の細胞で生産することが困難となり得る、植物の二次代謝産物を生産するための、重要な種類の細胞となっている。
【０２２８】
フェニルプロパノイド誘導体およびジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の生産方法
本明細書に記載の組換え宿主は、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体を生産する方法において使用することができる。
【０２２９】
例えばこの方法は、組換え宿主を、培地中、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成遺伝子が発現される条件下で、増殖させることを含むことができる。組換え宿主は、流加バッチまたは連続プロセスで増殖させることができる。典型的には組換え宿主は、発酵槽中、規定の温度（単数または複数）で所望の期間、増殖される。この方法で使用される特定の宿主に依存して、他の組換え遺伝子も存在し発現することができる。基質および中間体のレベルは、試料を、公開された方法に従って分析用に培地から抽出することにより、決定することができる。
【０２３０】
組換え宿主を培地中で所望の期間増殖させた後、フェニルプロパノイド誘導体（例えば、ナリンゲニン、レスベラトロール、ピノシルビン、ピノセンブリンカルコン、およびピノセンブリン）またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体（例えば、フロリジンまたはフロリジン前駆体）は次に、当分野で知られている様々な技術を用いて、培養物から回収される。いくつかの態様において、透過性付与剤を添加して、供給原料が宿主に入るのを助け、宿主からの産物の放出を助けることができる。例えば、培養された微生物の粗溶解物を遠心分離して、上清を得ることができる。次いで、得られた上清をクロマトグラフィーカラム、例えばＣ−１８カラムに適用し、水で洗浄して親水性化合物を除去した後、目的の化合物（単数または複数）をメタノールなどの溶媒で溶出する。その後、化合物（単数または複数）をさらに、分取ＨＰＬＣにより当技術分野で知られている方法に従って、精製することができる。
【０２３１】
本明細書で考察される様々な遺伝子は、１種の宿主ではなく、２種以上の組換え宿主中に存在し得ることが理解されるであろう。複数の組換え宿主を使用する場合、それらを混合培養物中で増殖させて、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体を生産することができる。
【０２３２】
代替的に、２種以上の宿主をそれぞれ別々の培地で増殖させることができ、第１の培地の産物、例えばナリンゲニン、レスベラトロールまたはフロリジン前駆体を第２の培地に導入して、次の中間体へ変換するか、または、例えばナリンゲニン、レスベラトロール、またはフロリジンなどの最終生成物にそれぞれ変換することができる。次いで、第２または最終宿主によって生産された産物が回収される。いくつかの態様において、組換え宿主を、培地以外の栄養源を使用し発酵槽以外のシステムを利用して増殖させることも、理解されよう。
【０２３３】
いくつかの態様において、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体は、組換え宿主におけるフェニルプロパノイド誘導体生合成経路またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成経路に関与する１つ以上の酵素の発現を介して、in vivoで生産される。例えば、ナリンゲニン生産またはレスベラトロール生産組換え宿主であって、Saccharomyces cerevisiaeのｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子が過少発現または発現されず、かつ１つ以上の、Arabidopsis thalianaフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子、Ammi majusシンナマート４−ヒドロキシラーゼ（ＣＨ４）ポリペプチドをコードする遺伝子、Arabidopsis thaliana４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、Hordeum vulgareカルコンシンターゼ２（ＣＨＳ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ１）ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する、前記組換え宿主を使用して、カルコン化合物、例えば、ナリンゲニンを、in vivoで生産することができる。
【０２３４】
別の例として、フロリジン生産組換え宿主であって、以下の１つ以上の遺伝子：Saccharomyces cerevisiaeのｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＴＳＣ１３）ポリペプチドをコードする遺伝子、Arabidopsis thalianaフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、Ammi majusシンナマート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）ポリペプチドをコードする遺伝子、Arabidopsis thaliana４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、Hordeum vulgareカルコンシンターゼ２（ＣＨＳ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ１）ポリペプチドをコードする遺伝子をコードする遺伝子、および／またはMalus domesticaＰ２’ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子、を発現する、前記組換え宿主を使用して、フロリジンをin vivoで生産することができる。
【０２３５】
【０２３６】
また、別の例として、スチルベイド（レスベラトロールなど）生産組換え宿主であって、Saccharomyces cerevisiaeのｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子が過少発現または発現されず、かつ１つ以上の、Arabidopsis thalianaフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子、Ammi majusシンナマート４−ヒドロキシラーゼ（ＣＨ４）ポリペプチドをコードする遺伝子、Arabidopsis thaliana４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、および／またはスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する、前記組換え宿主を使用して、スチルベノイド化合物、例えばレスベラトロールを、in vivoで生産することができる。
【０２３７】
別の例として、ジヒドロスチルベン（例えば、ジヒドロレスベラトロール）生産組換え宿主であって、以下の１つ以上の遺伝子：Saccharomyces cerevisiaeのｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＴＳＣ１３）ポリペプチドをコードする遺伝子、Arabidopsis thalianaフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、Ammi majusシンナマート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）ポリペプチドをコードする遺伝子、Arabidopsis thaliana４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、および／またはスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する、前記組換え宿主を使用して、ジヒドロスチルベノイド化合物をin vivoで生産することができる。
【０２３８】
いくつかの態様において、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体は、所望の化合物の前駆体を、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成経路に関与する１つ以上の酵素とin vitroで接触させることによって、生産される。例えば、ｐ−クマロイル−ＣｏＡをカルコンシンターゼポリペプチドと接触させると、ナリンゲニンまたはナリンゲニン誘導体化合物のin vitroでの生産をもたらすことができる。いくつかの態様において、ナリンゲニン前駆体は、上流のナリンゲニン前駆体とナリンゲニン経路に関与する１つ以上の酵素とのin vitroでの接触によって、生産される。別の例として、β−クマロイル−ＣｏＡをカルコンシンターゼ酵素と、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ酵素の不在下で接触させると、ナリンゲニンのin vitroでの生産をもたらすことができる。別の例として、フロレチンのＰ２’ＵＧＴポリペプチドとの接触は、フロリジン化合物のin vitroでの生産をもたらすことができる。いくつかの態様において、フロリジン前駆体は、上流のフロリジン前駆体と、フロリジン経路に関与する１つ以上の酵素とのin vitroでの接触によって、生産される。別の例として、ｐ−クマロイルＣｏＡをｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ酵素と接触させると、ｐ−ジヒドロクマロイルＣｏＡのin vitroでの生産をもたらすことができる。
【０２３９】
いくつかの態様において、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体は、生物変換によって生産される。生物変換が起こるために、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体生合成経路に関与する１つ以上の酵素を発現する宿主細胞は、細胞内にフェニルプロパノイド誘導体前駆体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体前駆体を取り込み、改変する；in vivoでの改変に続いて、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体は細胞内に残り、および／または培地中に排出される。例えば、カルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主細胞は、クマロイルＣｏＡを取り込み、これを細胞内でナリンゲニンに変換することができる；in vivoでの変換に続いて、ナリンゲニン化合物が培地中に排出される。別の例として、ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主細胞は、フロレチンを取り込み、細胞内でフロレチンをグリコシル化することができる；in vivoでのグリコシル化に続いて、フロリジン化合物が培地中に排出される。
【０２４０】
いくつかの態様において、本明細書に開示されるフェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体は、均質性（例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％または９８％の純度）まで、単離および精製される。他の態様において、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体は、組換え宿主またはin vitro生産方法からの抽出物として、単離される。この点において、フェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体は、単離されてもよいが、必ずしも均質に精製される必要はない。望ましくは、生産されたフェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約２０，０００ｍｇ／Ｌ以上であり得る。例えば、約１〜約１００ｍｇ／Ｌ、約３０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約５０〜約２００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、約２５０〜約５，０００ｍｇ／Ｌ、約１，０００〜約１５，０００ｍｇ／Ｌ、または約２，０００〜約１０，０００ｍｇ／Ｌのフェニルプロパノイド誘導体またはジヒドロフェニルプロパノイド誘導体を、生産することができる。一般に、より長い培養時間は、より多くの量の生成物をもたらすであろう。したがって組換え微生物は、１日〜７日間、１日〜５日間、３日間〜５日間、約３日間、約４日間、または約５日間、培養することができる。
【実施例】
【０２４１】
以下の実施例は、本明細書に開示された特定の態様およびその様々な使用を例示するものである。それらは説明目的のみのために記載されたものであり、限定として解釈されるべきではない。
【０２４２】
例１：酵母におけるフロレチンの生産
材料および方法：
例１および２で使用したS.cerevisiae株を表１に列挙する：
表１：例１および２で使用した株。３種の異なるプラスミド（ｐＰＨＬＯ、ｐＰＨＬＯＮ、ｐＰＨＬＯＺ）を、バックグラウンド株Ｓｃ１．０においてin vivo相同組換えにより構築し、株Ｓｃ１．１、Ｓｃ１．２およびＳｃ１．３を作製した。
【表１】
2018520661.tif 000029
【０２４３】
例１および２で使用した遺伝子を表２に列挙する：
表２：例１および２で使用した遺伝子
【表２】
2018520661.tif 000030
【０２４４】
化学参照化合物は、Sigma-Aldrich, Switzerlandから（ナリンゲニン、フロリジン）またはExtrasynthese, Franceから（フロレチン）購入した。
【０２４５】
遺伝子クローニング：
酵母での発現のために最適化された合成遺伝子は、DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA, USAまたはGeneArt AG, Regensburg, Germany（配列番号１、２、４および５）により製造された。合成の間、ＰＡＬ２ Ａｔを除く全ての遺伝子には、５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限認識部位およびKozak配列を含むＤＮＡ配列ＡＡＧＣＴＴＡＡＡが、および３’末端に、ＳａｃＩＩ認識部位を含むＤＮＡ配列ＣＣＧＣＧＧが提供された。ＰＣＲにより、ＰＡＬ２ Ａｔには、５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限認識部位およびKozak配列を含むＤＮＡ配列ＡＡＧＣＴＴＡＡＡが、３’末端に、ＳａｃＩＩ認識部位を含むＤＮＡ配列ＣＣＧＣＧＧが提供された。A. thaliana遺伝子４ＣＬ２（配列番号３）を、ＰＣＲにより、第１鎖ｃＤＮＡから増幅した。４ＣＬ２配列は、１つの内部ＨｉｎｄＩＩＩ、および１つの内部ＳａｃＩＩ部位を有し、したがって、In-Fusion HD Cloning Plusキット（Clontech Inc.）を用い、製造業者の指示に従ってＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩにクローニングした。S.cerevisiae遺伝子は、バックグラウンド株Ｓｃ１．０のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲにより増幅した（配列番号６および７）。ＰＣＲの間、これら２つの遺伝子には、５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限認識部位およびKozak配列を含むＤＮＡ配列ＡＡＧＣＴＴＡＡＡが、および３’末端に、ＳａｃＩＩ認識部位を含むＤＮＡ配列ＣＣＧＣＧＧが提供された。配列番号６の内部ＳａｃＩＩ部位を、サイレント点突然変異（Ｃ５１９Ｔ）で部位特異的突然変異誘発により除去した。すべての遺伝子を、天然の酵母プロモーターおよびターミネーターに由来する酵母発現カセットを含有するｐＵＣ１８に基づくベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩにクローニングした。Shao et al. (Nucl. Acids Res. 2009, 37(2):e16)により記載されたプロモーターおよびターミネーターは、酵母ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって調製した。各発現カセットは、両側に６０ｂｐの相同組換えタグ（ＨＲＴ）配列が隣接し、これらのＨＲＴを含むカセットは、次にＡｓｃＩ認識部位に隣接していた。ＨＲＴは、第１の発現カセット断片の３’末端タグが、第２の発現カセット断片の５’末端タグと等しくなるように、などとして設計された。３つのヘルパー断片（配列番号１１〜１４）を使用して、相同組換えにより、酵母において多発現プラスミドを構築した。１つのヘルパー断片は、酵母栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３）および細菌ｐＳＣ１０１複製起点（配列番号１１）を含んでいた。第２のヘルパー断片は、酵母での複製のためのＡＲＳ４／ＣＥＮ６配列および細菌クロラムフェニコール耐性マーカー（配列番号１２）を含んでいた。両方の断片は、隣接するＨＲＴを有していた。第３の断片は、短い６００ｂｐのスペーサー配列によって分離されたＨＲＴのみで設計された。このヘルパー断片は、遺伝子発現カセットの数に応じて異なるＨＲＴを含んでおり、得られた多発現プラスミドは、（６遺伝子について配列番号１３を（例えば、ｐＰＨＬＯおよびｐＰＨＬＯＮ）；および７遺伝子について配列番号１４を（例えば、ｐＰＨＬＯＺ））含む。すべてのヘルパー断片は、E. coliでの増幅のために、ｐＵＣ１８ベースの骨格にクローニングされていた。すべての断片を、それらをそこから切除できるＡｓｃＩ部位にクローニングし���。
【０２４６】
３つのプラスミドｐＰＨＬＯ、ｐＰＨＬＯＮおよびｐＰＨＬＯＺ（配列番号８〜１０）を調製するために、３つのヘルパープラスミドからのプラスミドＤＮＡを、発現カセットを含有する各プラスミドからのプラスミドＤＮＡと混合した。表３に列挙した異なる遺伝子のセットを含む、３つの異なる混合物を調製した。プラスミドＤＮＡの混合物をＡｓｃＩで消化した。これにより、プラスミド骨格からすべての断片が放出され、末端にＨＲＴを有する断片が生成される；これら断片は次の断片のＨＲＴと順次重複している。酵母菌株Ｓｃ１．０を、消化した混合物のそれぞれで形質転換し、プラスミドｐＰＨＬＯ、ｐＰＨＬＯＮおよびｐＰＨＬＯＺを、Shao et a. 2009に記載された相同組換えにより、in vivoで構築した。
表３：例１および２で使用した多発現プラスミド
【表３】
2018520661.tif 000031
【０２４７】
ｐＰＨＬＯは、フェニルアラニンをフロレチンに変換するための全生合成経路を含んでおり、ＰＡＬ２ Ａｔ、Ｃ４Ｈ Ａｍ、ＣＰＲ１ Ｓｃ、４ＣＬ２ Ａｔ、ＴＳＣ１３ ＳｃおよびＣＨＳ２ Ｈｖを含む。ｐＰＨＬＯＮはｐＰＨＬＯと等価であるが、ただしＴＳＣ１３ Ｓｃが非発現スタッファー配列（配列番号１５）によって置き換えられており、ｐＰＨＬＯＺはｐＰＨＬＯと等価であるが、ただしＰ２’ＵＧＴ Ｍｄを有する追加の発現カセットを含んでいる。
【０２４８】
増殖条件：
操作された酵母株を、２．５ｍＬの標準ＳＣ−全ブロス（Ｓｃ１．０）またはＳＣ−Ｕｒａ、すなわちウラシルなしで（Ｓｃ１．１、Ｓｃ１．２およびＳｃ１．３）、および２％グルコース（ForMedium, Hunstanton, UK）を用いて、深型２４ウェルプレート（Kuhner AG, Switzerland）中で培養した。培養物を５ｃｍの振幅、３００ＲＰＭで一定に振とうしながら、３０℃で７２時間増殖させた。これらは、同じ条件で０．４ｍＬの培地中２４時間、ＯＤ ０．１まで増殖させた前培養物から、接種した。
【０２４９】
分析手順：
試料調製：酵母培養物を、等容量の１００％メタノールで希釈した。１５００ＲＰＭでの３０秒間のボルテックスにより激しく混合した後、細胞を４０００×ｇで５分間スピンダウンした。ペレットと上清を分離した。さらなる精製なしに、５μＬの上清をSingle Quadrupole Detector（ＳＱＤ）質量分析計（Waters、Milford、MA）に連結したＵＰＬＣ装置（Waters Acquity（商標）Ultra Performance Liquid chromatography、Waters, Milford, Mass., USA）に注入した。
【０２５０】
静止相：使用したカラムは、Waters AcquityＵＰＬＣ（登録商標）Bridged EthylHybrid(BEH)C18 １．７μｍ、２．１×１００ｍｍであった。液体クロマトグラフィー法：移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸。移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸。
【０２５１】
運転条件：
【表４】
2018520661.tif 000032
ＰＤＡパラメータ：λ範囲：２１０ｎｍ〜４００ｎｍ。
分解能：１．２ｎｍ。
サンプリングレート：２０ポイント／秒。
ＳＱＤパラメータ：ソース：正モードでのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ＋）。
キャピラリー：３．５ｋＶ。コーン：３０Ｖ。エクストラクタ：３Ｖ。
ソース温度：１５０℃。
脱溶媒和温度：３５０℃。ガス流は、コーンについては５０Ｌ／時、脱溶媒和については４５０Ｌ／時に設定した。
ＭＳモード：ＳＩＲ（選択イオン記録）モード。記録すべきイオン質量は、目的の化合物を検出するように選択した（結果参照）。
カラムを３５℃の一定温度に維持した。
【０２５２】
結果：
エタノール希釈後の、Ｓｃ１．０、Ｓｃ１．１およびＳｃ１．２培養物の上清をＵＰＬＣ−ＭＳで分析し、フロレチンの予想質量（ｍ／ｚ＝２７４．３Ｄａ）およびナリンゲニンの予想質量の質量（ｍ／ｚ＝２７２．３Ｄａ）のイオンクロマトグラムを記録した。ピーク下の領域を積分し、フロレチンおよびナリンゲニンの生産を、標準曲線に基づいて計算した。Ｓｃ１．１およびＳｃ１．２によって生産されたフロレチンおよびナリンゲニンの量を比較したところ（図４）、Ｓｃ１．１におけるコアフラボノイド経路と組み合わせたＴＳＣ１３の過剰発現は、フロレチン生産を１．９倍増加させたが、ナリンゲニン生産は１１．８倍低減することが示された。いずれの遺伝子も過剰発現していないバックグラウンド株Ｓｃ１．０は、フロレチンまたはナリンゲニンのいずれも生産しなかった。
【０２５３】
当分野において、フェニルプロパノイドをジヒドロフェニルプロパノイドに変換するために提案された植物酵素が記載されている。Dare et al. (Plant Physiol Biochem. 2013, 72:54-61)は、変換に関与する２つのタンパク質、ＥＮＲＬ３およびＥＮＲＬ５を提案した。タンパク質配列の分析は、これらの酵素を、ＶＬＣＦＡ合成に通常に関与するエノイルレダクターゼの群に配置する。Ibdah et al. (Phytochemistry. 2014, 107:24-31)は、変換に関与する別の酵素ＭｄＨＣＤＢＲを記載した。ＭｄＨＣＤＢＲタンパク質配列は、これが、小さなアルデヒドを通常還元する二重結合レダクターゼの群に属することを示す。
【０２５４】
３つのレダクターゼＥＮＲＬ３、ＥＮＲＬ５、およびＭｄＨＣＤＢＲの合成酵母コドン最適化遺伝子バージョンを、酵母において、フロレチンへの残りの経路の酵素と共に発現させた。培養物の化学分析の後、フロレチン生産の増加は観察されなかった（データは示さず）。しかしながら、驚くべきことにかつ予想外に、異種レダクターゼを発現しない株において、少量のフロレチンの生産が観察された。このことは、酵母の天然のレダクターゼを試験して、これらのいずれかが関与しているかどうか調査することを促した。いくつかの天然のレダクターゼのうち、ＴＳＣ１３はレダクターゼ活性を有すると同定された。図４に示すように、ＴＳＣ１３の過剰発現は、この酵素の活性が、残りの異種経路と共に、フロレチンの効率的な生産にとって重要であることを確認した。
【０２５５】
Saccharomyces cerevisiaeのＴＳＣ１３は従来、パルミテートから２６炭素の超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）を生成する脂肪酸合成中にエノイル還元に関与することしか知られていなかったため、ｐ−クマロイル−ＣｏＡは、ＴＳＣ１３に対して非常に期待の薄い基質である。したがって、フロリジンおよびフロレチンなどのジヒドロカルコンの前駆体およびジヒドロスチルベノイドを生産するための、ＴＳＣ１３の過剰発現の使用は、驚くべきかつ予期されぬものであった。
【０２５６】
例２：酵母でのフロリジンの生産
材料および方法：
例２の材料および方法は、例１に記載したものと同じである。
【０２５７】
結果：
エタノール希釈後の、Ｓｃ１．０、Ｓｃ１．１およびＳｃ１．３培養物の上清をＬＣ−ＭＳで分析し、フロレチンの予想質量（ｍ／ｚ＝２７４．３Ｄａ）およびフロリジンの予想質量（ｍ／ｚ＝４３６．４Ｄａ）のイオンクロマトグラムを抽出した。ピーク下の領域を積分し、フロレチンおよびフロリジンの生産を、標準曲線に基づいて計算した。Ｓｃ１．３におけるＰ２’ＵＧＴ Ｍｄの追加の過剰発現は、０．４ｍｇ／Ｌのフロリジンの生産をもたらした（図５）。いずれの遺伝子も過剰発現していないバックグラウンド株Ｓｃ１．０は、フロレチンまたはフロリジンのいずれも生産しなかった。
【０２５８】
例３：種々のカルコンシンターゼを有する酵母でのフロレチンの生産
材料および方法：
例３の材料および方法は、異なる親株および異なるＣＨＳ配列を使用したことを除いて、例１に記載したものと同じである。
【０２５９】
例３で使用したS. cerevisiae株を、表４に列挙する：
表４：例３で使用した株。１２種の異なるプラスミド（ｐＰＨＣＨＳ１〜１２）を、バックグラウンド株Ｓｃ３．０でのin vivo相同組換えにより構築して、株Ｓｃ３．１〜Ｓｃ３．１２を作製した。
【表５】
2018520661.tif 000033
【０２６０】
例３で使用した追加の遺伝子を、表５に列挙する：
表５：例３で使用した追加の遺伝子
【表６】
2018520661.tif 000034
【０２６１】
遺伝子クローニング：
酵母での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子は、DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA, USAまたはGeneArt AG, Regensburg, Germanyにより製造された（配列番号４および２７〜３２）。合成の間、全ての遺伝子には、５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限認識部位およびKozak配列を含むＤＮＡ配列ＡＡＧＣＴＴＡＡＡが、および３’末端に、ＳａｃＩＩ認識部位を含むＤＮＡ配列ＣＣＧＣＧＧが提供された。M. domestica遺伝子ＣＨＳａ、ｂ、ｃ、ｄ（配列番号３３〜３６）を、第１鎖ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。それらは、In-Fusion HD Cloning Plusキット（Clontech Inc.）を用いて、製造業者の指示に従ってＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩにクローニングした。すべての遺伝子を、ｐＵＣ１８に基づくＨＲＴベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩにクローニングした。
【０２６２】
１２種のプラスミド、ｐＰＨＣＨＳ１〜１２を調製するために、３種のヘルパープラスミドからのプラスミドＤＮＡを、発現カセットを含有する各プラスミドからのプラスミドＤＮＡと混合した。表６に列挙した異なる遺伝子セットを含む１２種の異なる混合物を調製した。プラスミドＤＮＡの混合物をＡｓｃＩで消化した。これにより、プラスミド骨格からすべての断片が放出され、末端にＨＲＴを有する断片が生成された；これらの断片は、次の断片のＨＲＴと順次重複している。バックグラウンド酵母株Ｓｃ３．０を、各消化混合物で形質転換し、プラスミドｐＰＨＣＨＳ１〜１２を、Shao et al. 2009が記載した相同組換えにより、in vivoで構築した。
表６：例３で使用した多発現プラスミド
【表７】
2018520661.tif 000035
【０２６３】
結果：
エタノール希釈後のＳｃ３．１〜Ｓｃ３．１２培養物の上清を、ＬＣ−ＭＳで分析し、フロレチンの予想質量（ｍ／ｚ＝２７４．３Ｄａ）およびナリンゲニンの予想質量（ｍ／ｚ＝２７２．３Ｄａ）のイオンクロマトグラムを記録した。ピーク下の領域を積分し、フロレチンおよびナリンゲニンの生産を標準曲線に基づいて計算した（図６）。試験した１１例のＣＨＳのうち、１０例についてフロレチンの生産が観察された。２６．２ｍｇ／ｌの最も高いフロレチン力価が、ＣＨＳ Ｈａ（Ｓｃ３．１株）で観察された。
【０２６４】
例４：酵母でのジヒドロレスベラトロールの生産
材料および方法：
例４の材料および方法は、異なる親株および追加の２つの３型ポリケチドシンターゼ配列を使用したこと以外は、例１に記載したものと同じであった。
【０２６５】
例４で使用したS.cerevisiae株を、表７に列挙する：
表７：例４で使用した株。４種の異なるプラスミド（ｐＤＨＲ１、ｐＤＨＲ２、ｐＤＨＲＮ１およびｐＤＨＲＮ２）を、バックグラウンド株Ｓｃ４．０でのin vivo相同組換えによって構築して、株Ｓｃ４．１〜Ｓｃ４．４を作製した。
【表８】
2018520661.tif 000036
【０２６６】
例４で使用した追加の遺伝子を、表８に列挙する：
表８：例４で使用した追加の遺伝子
【表９】
2018520661.tif 000037
【０２６７】
遺伝子クローニング：
合成遺伝子を、酵母での発現のためにコドン最適化した（配列番号３７〜３８）。合成の間、遺伝子には、５’末端に、Kozak配列を含むＤＮＡ配列ＡＡＡが提供された。この遺伝子は、１つおよび２つの内部ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含み、したがって、In-Fusion HD Cloning Plusキット（Clontech Inc.）を用いて、製造業者の指示に従ってＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩにクローニングした。４つのプラスミド、ｐＤＨＲ１、ｐＤＨＲ２、ｐＤＨＲＮ１、およびｐＤＨＲＮ２を調製するために、３つのヘルパープラスミドからのプラスミドＤＮＡを、発現カセットを含有する各プラスミドからのプラスミドＤＮＡと混合した。表９に列挙された異なる遺伝子セットを含む４つの異なる混合物を調製した。プラスミドＤＮＡの混合物を、ＡｓｃＩで消化した。これにより、プラスミド骨格からすべての断片が放出され、末端にＨＲＴを有する断片が生成された；これらの断片は、次の断片のＨＲＴと順次重複している。バックグラウンド酵母株Ｓｃ４．０を、各消化混合物で形質転換し、プラスミドｐＤＨＲ１、ｐＤＨＲ２、ｐＤＨＲＮ１およびｐＤＨＲＮ２を、Shao et al. 2009が記載した相同組換えによりin vivoで構築した。
表９：例４で使用した多発現プラスミド
【表１０】
2018520661.tif 000038
【０２６８】
結果：
エタノール希釈後のＳｃ４．１〜Ｓｃ４．４培養物の上清を、ＬＣ−ＭＳで分析し、ジヒドロレスベラトロール（ｍ／ｚ＝２３０．２Ｄａ）およびレスベラトロール（ｍ／ｚ＝２２８．２Ｄａ）の予想質量のイオンクロマトグラムを記録した。ピーク下の領域を積分した。図８に示すように、株Ｓｃ４．１〜Ｓｃ４．４によって生産されたジヒドロレスベラトロールおよびレスベラトロールの量を比較したところ、ＴＳＣ１３の過剰発現をコアスチルベン経路と組み合わせると（Ｓｃ４．１およびＳｃ４．２を、Ｓｃ４．３およびＳｃ４．４と組み合わせる）、ジヒドロレスベラトロールの生産は増加したが、レスベラトロールの生産は減少したことを示す。
【０２６９】
例５：フロレチン生産のための二重結合レダクターゼの比較
材料および方法：
例５の材料および方法は、異なる親株および種々の二重結合レダクターゼ配列を使用したことを除いて、例１に記載したものと同じである。
【０２７０】
例５のS.cerevisiae株を表１０に列挙する：
表１０：１２種の異なるプラスミド（ｐＰＨＤＲ１〜１２）を、バックグラウンド株Ｓｃ５．０でのin vivo相同組換えにより構築して、株Ｓｃ５．１〜Ｓｃ５．１２を作製した。
【表１１】
2018520661.tif 000039
【０２７１】
例５のための追加の遺伝子を表１１に列挙する：
表１１：例５のための追加の遺伝子
【表１２】
2018520661.tif 000040
【０２７２】
遺伝子クローニング：
酵母での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子は、GeneArt AG, Regensburg, Germanyによって製造された（配列番号：３９〜４８）。合成の間、遺伝子には、５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限認識部位およびKozak配列を含むＤＮＡ配列ＡＡＧＣＴＴＡＡＡ、および３’末端に、ＳａｃＩＩ認識部位を含むＤＮＡ配列ＣＣＧＣＧＧが提供された。これらの遺伝子を、ｐＵＣ１８に基づくＨＲＴベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩにクローニングした。
【０２７３】
１２種のプラスミド、ｐＰＨＤＲ１〜１２を調製するために、３種のヘルパープラスミドからのプラスミドＤＮＡを、発現カセットを含有する各プラスミドからのプラスミドＤＮＡと混合した。表１２に列挙した異なる遺伝子セットを含む、１２種の異なる混合物を調製した。プラスミドＤＮＡの混合物を、ＡｓｃＩで消化した。これにより、プラスミド骨格からすべての断片が放出され、末端にＨＲＴを有する断片が生成された；これらの断片は、次の断片のＨＲＴと順次重複している。バックグラウンド酵母株Ｓｃ５．０を、各消化混合物で形質転換し、プラスミドｐＰＨＤＲ１〜１２をShao et al. 2009が記載した相同組換えによってin vivoで構築した。
表１２：例５で使用した多発現プラスミド
【表１３】
2018520661.tif 000041
【０２７４】
結果：
エタノール希釈後のＳｃ５．１〜Ｓｃ５．１２培養物の上清を、ＬＣ−ＭＳで分析し、フロレチンの予想質量（ｍ／ｚ＝２７４．３Ｄａ）およびナリンゲニンの予想質量（ｍ／ｚ＝２７２．３Ｄａ）のイオンクロマトグラムを記録した。ピーク下の領域を積分し、フロレチンおよびナリンゲニンの生産を、標準曲線に基づいて計算した（図７）。過剰発現された１１のＥＮＲのうち、対照株（Ｓｃ５．１２）と比較したフレレンチン対ナリンゲニンの比の増加は、ＴＳＣ１３ Ｓｃ（株Ｓｃ５．６）およびＴＳＣ１３ Ｋ１（Ｓｃ５．１１株）でのみ観察され、後者はS.cerevisiaeと密接に関連する真菌K.lactisからのＴＳＣ１３ホモログである。最高のフロレチン力価３８．６ｍｇ／ｌが、ＴＳＣ１３ Ｓｃ（Ｓｃ５．６株）で観察された。
【０２７５】
例６：特異性および活性が増加したＣＨＳ−２ Ｈｖの突然変異体
ジヒドロカルコンの最高収率を達成するために、生合成経路の各ステップの酵素反応は、好ましい反応の基質について高い活性および高い特異性の両方を有すべきである。例えば、３単位のマロニル−ＣｏＡを有するジヒドロ−フェニルプロパノイド−ＣｏＡの伸長において、縮合酵素であるカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）が、ジヒドロ−フェニルプロパノイド−ＣｏＡに対してフェニルプロパノイド−ＣｏＡに対するよりも高い活性および特異性を有する場合、目的生成物の収率が改善される。より高い活性は、組換え宿主中の関連する遺伝子のコピー数を増加させることにより、ある程度達成することができる。しかしながら、より高い特異性は操作がより困難であり、特異性が低いと前駆体の損失がもたらされ、したがって炭素源が望ましくない生成物に入り、および所望の生成物の精製プロセスおよび下流プロセスを複雑にし得る、副産物形成がもたらされる。例３に記載したように、多数のＣＨＳ酵素を、ジヒドロ−フェニルプロパノイド−ＣｏＡ基質での活性について試験し、ＨａＣＨＳが最も高い活性を示した。しかしこの酵素は、非還元フェニルプロパノイド−ＣｏＡに対しても活性を示し、ナリンゲニンの形成を導く（ＨａＣＨＳを有する、図６の株Ｓｃ３．１を参照）。驚くべきことに、ＨｖＣＨＳ２（図６の株Ｓｃ３．５参照）は、還元された基質に対してより高い優先度を有し、ナリンゲニンをほとんど生産しない。
【０２７６】
ＣＨＳ酵素の通常の基質は、ＣｏＡ−活性化された非−またはモノヒドロキシル化フェニル−プロパノイドケイ皮酸およびｐ−クマル酸である。しかし、Hordeum vulgareからのＨｖＣＨＳ２（配列番号１９；GenBankアクセッション番号ＣＡＡ７０４３５；Christensen et al., 1998, Plant Mol Biol. 37(5):849-57も参照）を含むいくつかの酵素は、ＣｏＡ活性化カフェー酸およびフェルラ酸などの、さらにヒドロキシル化および／またはメチル化された基質を好むことが示されている。この酵素は、ＵＶ光または病原体の攻撃によって誘導される。この酵素のタンパク質配列は、他のＣＨＳ酵素と８０％未満のアミノ酸同一性を有するが、ただし触媒部位は保存されている（Austin & Noel, 2003, Nat. Prod. Rep. 20(1):79-110）。構造が解明されているMedicago sativaからのＭｓＣＨＳに対する、タンパク質配列およびアラインメントの検査（Ferrer et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6:775-784）は、ＨｖＣＨＳ２が、高度に保存された配列の領域を含むこと、しかし明確な違いのある領域も含むことを示す。後者の領域のいくつかは、機能的多様性にとって重要であると予測された領域と重複する；例えばその領域は、アミノ酸９５〜１０５、１３２〜１４２、１９１〜２０１、および２６６〜２７６を含む。
【０２７７】
本例は、これらの領域においてアミノ酸を選択的に交換することにより、基質特異性および活性を変更できることを実証する。驚くべきことに、これは、改善された活性ならびにｐ−クマロイル−ＣｏＡと比較した選択性の増加が証明されている、非天然基質ジヒドロ−クマロイル−ＣｏＡの場合にも当てはまる。この酵素の天然の基質はカフェオイル−ＣｏＡおよびフェルロイル−ＣｏＡであることに留意すると、これは非常に予想外である。これらの結果が予想外であることは、酵素ＨｖＣＨＳ２が、ジヒドロカルコンが報告されていない植物Hordeum vulgareに由来するという事実によって、さらに強調される。
【０２７８】
材料および方法：
例６の材料および方法は、異なる親株および異なるＣＨＳ配列を使用したこと以外は、例１に記載したものと同じである。
【０２７９】
例６のS.cerevisiae株を表１３に列挙する：
表１３：例６で使用した株。４つの異なるプラスミド（ｐＣＨＳＭ１〜４）を、バックグラウンド株Ｓｃ６．０でのin vivo相同組換えにより構築し、株Ｓｃ６．１〜Ｓｃ６．４を作製した。
【表１４】
2018520661.tif 000042
【０２８０】
例６の追加の遺伝子を表１４に列挙する：
表１４：例６の追加の遺伝子
【表１５】
2018520661.tif 000043
【０２８１】
遺伝子クローニング：
酵素の基質結合ポケット（Ａ１９９Ｔ）および環化ポケット（Ｉ２６７Ｆ）（Ferrer et al. 2009に記載）における突然変異を含有する、ＣＨＳ２ Ｈｖの３つのバリアント（配列番号６８〜７０）を、重複伸長ＰＣＲにより、Heckman et al., 2007, Nat. Protoc. 2:924-932の記載のようにして、プライマーＥＶＰＲ１３４９２〜１３４９７を使用して調製した（表１５）。
【０２８２】
４つのプラスミド、ｐＣＨＳＭ１〜４を調製するために、３つのヘルパープラスミドからのプラスミドＤＮＡを、発現カセットを含有する各プラスミドからのプラスミドＤＮＡと混合した。表１６に列挙した異なる遺伝子セットを含む、４つの異なる混合物を調製した。プラスミドＤＮＡの混合物を、ＡｓｃＩで消化した。これにより、プラスミド骨格からすべての断片が放出され、末端にＨＲＴを有する断片が生成された；これらの断片は、次の断片のＨＲＴと順次重複している。バックグラウンド酵母株Ｓｃ６．０を各消化混合物で形質転換し、プラスミドｐＣＨＳＭ１〜４を、Shao et al. 2009が記載した相同組換えにより、in vivoで構築した。
表１５：例６で使用したプライマー
【表１６】
2018520661.tif 000044
表１６：例６で使用した多発現プライマー
【表１７】
2018520661.tif 000045
【０２８３】
結果：
メタノール希釈後のＳｃ６．１〜Ｓｃ６．４培養物の上清を、ＬＣ−ＭＳで分析し、フロレチンの予想質量（ｍ／ｚ＝２７４．３Ｄａ）およびナリンゲニンの予想質量（ｍ／ｚ＝２７２．３Ｄａ）のイオンクロマトグラムを記録した。ピーク下の領域を積分し、フロレチンおよびナリンゲニンの生産を、標準曲線に基づいて計算した（図９）。試験した４つのＣＨＳのうち、フロレチンの生産は全てについて観察された。最高のフロレチン力価は、ＣＨＳ２ Ｈｖ（Ａ１９９Ｔ／Ｉ２６７Ｆ）（配列番号７３）（株Ｓｃ６．４）で観察され、これは親酵素ＣＨＳ２ Ｈｖよりも高い特異性を示した。フロレチン対ナリンゲニンの比として計算された、さらに高い特異性は、ＣＨＳ２ Ｈｖ（Ｉ２６７Ｆ）（株Ｓｃ６．３）（配列番号７２）によって示された。
【０２８４】
例７：ピノセンブリンジヒドロカルコンの生産
ジヒドロ−シンナモイル−ＣｏＡが、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）によって、ピノセンブリンジヒドロカルコンを生産する基質として使用されているという、以前の報告はない。本例は、Hypericum androsaemumからのＣＨＳ（ＨａＣＨＳ）（およびおそらくは、拡張して多くの他のＣＨＳ酵素）が、ジヒドロシンナモイル−ＣｏＡを基質として使用できることを実証する結果を示す。酵母でＴＳＣ１３を過剰発現させることにより、ジヒドロ−シンナモイル−ＣｏＡが生産され、これが次にＣＨＳによって使用され得る。
【０２８５】
材料および方法：
例７の材料および方法は、異なる親株および異なるＣＨＳ配列を使用したことを除いて、例１に記載したものと同じである。また、非ヒドロキシル化前駆体のシンナモイル−ＣｏＡをｐ−クマロイル−ＣｏＡの代わりに作製するために、この例では、Ｃ４Ｈ ＡｍおよびＣＰＲ１ Ｓｃを使用しなかった。
【０２８６】
例７で使用したS.cerevisiae株を表１７に列挙する：
表１７：例７で使用した株。２つの異なるプラスミド（ｐＰＩＮ１〜２）を、バックグラウンド株Ｓｃ７．０でのin vivo相同組換えにより構築して、株ＰＩＮおよびＰＩＮＤＨＣを作製した。
【表１８】
2018520661.tif 000046
【０２８７】
遺伝子クローニング：
２つのプラスミド、ｐＰＩＮ１およびｐＰＩＮ２を調製するために、３つのヘルパープラスミドからのプラスミドＤＮＡを、発現カセットを含有する各プラスミドからのプラスミドＤＮＡと混合した。表１８に列挙した異なる遺伝子セットを含む２つの異なる混合物を調製した。プラスミドＤＮＡの混合物を、ＡｓｃＩで消化した。これにより、プラスミド骨格からすべての断片が放出され、末端にＨＲＴを有する断片が生成された；これらの断片は、次の断片のＨＲＴと順次重複している。バックグラウンド酵母株Ｓｃ７．０を、消化した混合物の各々で形質転換し、プラスミドｐＰＩＮ１およびｐＰＩＮ２を、Shao et a. 2009が記載したin vivo相同組換えにより構築した。
【表１９】
2018520661.tif 000047
【０２８８】
結果：
メタノール希釈後のＰＩＮおよびＰＩＮＤＨＣ培養物の上清を、ＬＣ−ＭＳで分析し、ピノセンブリンジヒドロカルコンの予想質量（ｍ／ｚ＝２５８．３Ｄａ）およびピノセンブリンの予想質量（ｍ／ｚ＝２５６．３Ｄａ）のイオンクロマトグラムを記録した。ピーク下の領域を積分し、ピノセンブリンジヒドロカルコンおよびピノセンブリンの生産を、標準曲線に基づいて計算した（図１０）。ＴＳＣ１３ Ｓｃの過剰発現は、ジヒドロカルコン生産をフラバノン生産より明らかに増加させ、この酵素がジヒドロシンナモイル−ＣｏＡも基質として受容することを示した。
【０２８９】
例８：ジヒドロ−フェニルプロパノイド誘導体生産と比較して、増加したフェニルプロパノイド誘導体生産を有する欠失株の同定
酵母レダクターゼノックアウト株（すなわち、レダクターゼ遺伝子の一方または両方のコピーが除去された酵母株）を、レスベラトロールおよびフロレチン酸の作製におけるそれらの活性について分析した。ノックアウト株は、酵母ノックアウトライブラリー（Stanford University, California）から得た。実験の第１ラウンドで使用したノックアウトを表１９に示す。実験の第２ラウンドで使用したノックアウトを表２０に示す。
表１９．ラウンド１のレダクターゼノックアウト株
【表２０】
2018520661.tif 000048
表２０．ラウンド２のレダクターゼノックアウト株
【表２１】
2018520661.tif 000049
【０２９０】
実験の両方のラウンドにおいて、欠失突然変異体および対応する野生型株を、当分野で知られている方法に従い、Ｒｈｏ００１１プラスミド（ＴＥＦ−Ａｔ４ＣＬ２＋ＴＤＨ３−ＶｖＶＳＴ１を有するｐＥＳＣ−ＨＩＳ）で形質転換した（例えばGietz & Schiestl, Nat. Protoc. 2007, 2(1):31-34を参照）。可能な場合には、レダクターゼノックアウト株をホモ接合性二倍体として試験した（例えば、ｄｆｇ１０／ｄｆｇ１０）。しかし、ホモ接合性の致死性の場合、レダクターゼはヘテロ接合体のバックグラウンドで分析した。例えば、ＴＳＣ１３のホモ接合型欠失は致死性をもたらし、したがって、ｔｓｃ１３突然変異体はヘテロ接合性二倍体（すなわち、ＴＳＣ１３／ｔｓｃ１３）として試験した。
【０２９１】
各株について、４つの形質転換体それぞれをヒスチジンを欠く１ｍＬ合成培地（ＳＣ−Ｈｉｓ）に接種し、３０℃、４００ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日、５０μＬの各培養物を０．５ｍＬの新鮮な培地に移し、９６％エタノールに溶解した１００ｍｇ／ｍＬのｐ−クマル酸５０μＬを添加した。培養物をさらに７２時間インキュベートし、存在する細胞の数によって生産値を補正するために、ＯＤ６００を測定した。１００μＬの各培養物を１００μＬの９６％エタノールに添加し（ポリフェノール溶解性を促進するため）、混合し、遠心分離し、上清を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で化合物を測定するために使用した。
【０２９２】
レスベラトロールおよびフロレチン酸のレベルは、ＨＰＬＣにより、野生型対照株および欠失株について決定した。データは、これらの株で生産されたレスベラトロールとフロレチン酸の比率として分析した。これらのデータを、図１１（ラウンド１）および図１２（ラウンド２）に示す。
【０２９３】
レスベラトロール／フロレチン酸比が有意に高い、図５および図６（ＴＳＣ１３／ｔｓｃ１３ノックアウトおよびｄｆｇ１０／ｄｆｇ１０ノックアウト）に示される２つの事例は、クマル酸が、ジヒドロククマラートに変換されるよりもむしろ蓄積された株を示す。結果としてのレスベラトロール生産の増加およびそれに伴うフロレチン酸レベルの低下は、ＴＳＣ１３およびＤＦＧ１０がｐ−クマロイル−ＣｏＡの二重結合を還元できること、ならびに、ＴＳＣ１３および／またはＤＦＧ１０の活性を低下または排除することで、スチルベン、カルコン、またはフラボノイドに対するそれらのジヒドロ対応物の比を増加させること、を実証する。
【０２９４】
例９：ジヒドロ−フェニルプロパノイド誘導体生産と比較して、増加したフェニルプロパノイド誘導体生産を有する欠失株のさらなる同定
例８に記載の実験を、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）およびカルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）をレスベラトロールシンターゼの代わりに用いた第３ラウンドにより、持続した。実験の第３ラウンドで用いたノックアウトを表２１に示す。
表２１．ラウンド３ノックアウト株
【表２２】
2018520661.tif 000050
【０２９５】
内因性レダクターゼの同定のために、一部分のナリンゲニン生産経路をコードするプラスミド（Ａｔ４Ｃｌ、ＭｓＣＨＩおよびＨａＣＨＳ）を、Shao et al. 2008に記載された形質転換関連相同組換え法によって、第３ラウンドのノックアウト株にin vivoで構築した。このプラスミドの断片は、表２２に示すＡｓｃＩ消化プラスミド混合物から得た。
表２２．一部分のナリンゲニン生産経路をコードするプラスミドを作製するために用いた、ＡｓｃＩ消化プラスミド混合物。右側の列は、各ノックアウト株の形質転換に使用した各プラスミドの濃度（等モル比）を示す。
【表２３】
2018520661.tif 000051
【０２９６】
形質転換株（それぞれ６つの複製物）を、ウラシルを欠く合成培地（ＳＣ−Ｕｒａ）に接種し、深型９６ウェルプレート中、３０℃、４００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。翌日、５０μＬを、９６％エタノール中の１００ｍｇ／ｍＬのｐ−クマル酸５μＬを含有する、０．５ｍＬの新鮮なＳＣ培地（ウラシル含有）に移した。次いで形質転換体を、深型９６ウェルプレート中、３０℃、４００ｒｐｍで９６時間インキュベートした。１００μＬの各培養物を、１００μＬの９６％エタノール（ポリフェノール溶解性を促進するため）に添加し、混合し、遠心分離し、上清を用いて、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により化合物を測定した。
【０２９７】
２６種のＣｏＡ依存性二重結合レダクターゼノックアウトのうちの２つ、ＴＳＣ１３／Ｔｓｃ１３およびｄｆｇ１０／ｄｆｇ１０は、試験した他の株と比較してクマル酸の消費が少なかったため、結果としてより少量のフロレチン酸を生産した（図１３）。
【０２９８】
例１０：ＴＳＣ１３およびＤＦＧ１０の過剰発現
ＴＳＣ１３およびＤＦＧ１０を過剰発現させて、試験した。この例に用いた酵母株を表２３に示す。
表２３．例１０で使用したS. cerevisiae株
【表２４】
2018520661.tif 000052
【０２９９】
レダクターゼＴＳＣ１３およびＤＦＧ１０を、株Ｓｃ１０．１中のセントロメアプラスミドｐ４１６ｇｐｄ（ＰＳＢ３３）（ＴＳＣ１３を有するプラスミドｐＲＯＰ ４９２およびＤＦＧ１０を有するｐＲＯＰ ４９３）、およびＳｃ１０．２株（クマル酸を蓄積する株）中の多コピープラスミドｐ４２６ｇｐｄ（ＰＳＢ３４）（ＴＳＣ１３を有するプラスミドｐＲＯＰ ４９４および有するＤＦＧ１０を有するプラスミドｐＲＯＰ ４９５）で、過剰発現させた。これらの追加株を表２４に示す。
表２４．例１０で生産された追加のS.cerevisiae株
【表２５】
2018520661.tif 000053
【０３００】
試験した各株について、６つのコロニーを、ウラシルを欠く０．５ｍＬの合成培地（ＳＣ−Ｕｒａ）に接種し、深型９６ウェルプレート中、３０℃、４００ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日、５０μＬの各培養物を、０．５ｍＬの新鮮なＳＣ培地（ウラシルなし）に移した。次いで形質転換体を、深型９６ウェルプレート中、３０℃、４００ｒｐｍで７２時間インキュベートした。サンプリングを７２時間の増殖後に行い、ＯＤ６００測定（EnVision 2104プレートリーダーで作成）を開始した。１００μＬの各培養物を１００μＬの９６％エタノールと混合し、１５００ｒｐｍで３０秒間旋回混合し、４０００×ｇで１０分間遠心分離した。次いで、上清を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
【０３０１】
ＴＳＣ１３の、株Ｓｃ１０．４におけるセントロメアプラスミドｐＲＯＰ４９２上での、および株Ｓｃ１０．７におけるマルチコピープラスミドｐＲＯＰ４９４上での過剰発現は、株Ｓｃ１０．３およびＳｃ１０．６と比較した場合に、ナリンゲニンのレベルの有意な低下、ならびにフロレチン酸およびその誘導体フロレチンのレベルのわずかな増加をもたらした（図１４）。
【０３０２】
クマル酸を蓄積する株Ｓｃ１０．２を、レダクターゼの基質のレベルを上げるための株Ｓｃ１０．６〜Ｓｃ１０．８のベース株として用いて、ＤＦＧ１０の過剰発現による影響を観察する可能性を高めた。それにもかかわらず、ＤＦＧ１０が過剰発現された株（Ｓｃ１０．５株のセントロメアｐＲＯＰ４９３プラスミド、およびＳｃ１０．８株の多コピープラスミドｐＲＯＰ４９５）はいずれも、対照株Ｓｃ４．３およびＳｃ１０．６と比較した場合、フェニルプロパノイド経路の変化を示さなかった（図１４）。
【０３０３】
ＤＦＧ１０の過剰発現ではなく、ＴＳＣ１３の過剰発現に応答した、フロレチン酸の増加したレベルに基づき、これらの結果は、Ｔｓｃ１３が、酵母においてクマル酸をフロレチン酸に還元する一次酵素であり、一方Ｄｆｇ１０の役割が二次的であることを示唆する。
【０３０４】
例１１：S.cerevisiaeにおける内因性レダクターゼのフェニルプロパノイド基質の同定。
どの基質が内因性S.cerevisiaeレダクターゼによって受け入れられるかを決定するために、A.thalianaのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＡｔＰＡＬ２）、シンナマート−４−ヒドロキシラーゼ（ＡｔＣ４Ｈ）、および４−クマロイル−ＣｏＡリガーゼ（Ａｔ４ＣＬ）の様々な組合せを発現する株を生成した。株を表２５に示す。
表２５．例１１について生産された株
【表２６】
2018520661.tif 000054
【０３０５】
各株について、６つのコロニーを、ウラシルを欠く０．５ｍＬの合成培地（ＳＣ−Ｕｒａ）に接種し、深型９６ウェルプレート中、３０℃、４００ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日、５０μＬの各培養物を０．５ｍＬの新鮮なＳＣ培地（ウラシルなし）に移した。次いで形質転換体を、深型９６ウェルプレート中、３０℃、４００ｒｐｍで７２時間インキュベートした。サンプリングを７２時間の増殖後に行い、ＯＤ６００測定（EnVision 2104プレートリーダーで作成）を開始した。１００μＬの各培養物を１００μＬの９６％エタノールと混合し、１５００ｒｐｍで３０秒間旋回混合し、４０００×ｇで１０分間遠心分離した。次いで、上清を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。
【０３０６】
試験した株のうち、フロレチン酸は、ＡｔＰＡＬ、ＡｔＣ４Ｈ、およびＡｔ４Ｃｌを発現するＳｃ１１．３株においてのみ形成され（図１５Ｃ）、これは、クマロイル−ＣｏＡが、酵母の内因性レダクターゼの基質として作用することを実証する。ＰＡＬおよび４Ｃ１を同時発現する株（Ｓｃ１１．４）では、ケイ皮酸が蓄積されるＰＡＬのみを有する株（Ｓｃ１１．１）（図１５Ａ）とは対照的に、ジヒドロキシケイ皮酸がケイ皮酸と共に形成された（図１５Ｄ）。これらの結果は、シンナモイル−ＣｏＡが、内因性レダクターゼの基質としても作用することを示す。
【０３０７】
例１２：ＴＳＣ１３を代替遺伝子で置換する
ＴＳＣ１３の天然のＯＲＦを、Ｓｃ１０．１株において以下のＴＳＣ１３オルソログで、Fairhead et al.が記載した方法に従いスプリットＵＲＡ３カセットを用いて、置き換えた：Arabidospis thaliana（ＡｔＥＣＲ）（配列番号９５）、Gossypium hirsutum（ＧｈＥＣＲ２）（配列番号９５）、およびMalus domestica（ＭｄＥＣＲ）（配列番号９６）（Fairhead et al., 1996, Yeast 12:1439-1457）。ＯＲＦの置換は、酵母を、組換え時に再生され選択に使用されるＵＲＡ３マーカーの一部をそれぞれ担持する一対の組換えＤＮＡ断片で同時形質転換することにより、得られた。マーカーはその後除去され、ＯＲＦのクリーンな完全置換が得られた。導入されたホモログは、天然のＴＳＣ１３プロモーターの下に置かれた。正しい挿入物を、ＰＣＲによって確かめ、ＰＣＲ断片の配列決定により確認した。それぞれＰＣＲで確認された形質転換体のうちの２つをさらなる実験に付したが、ただし、コロニーが１つしか得られなかったＧｈＥＣＲ２形質転換体は除外した。
【０３０８】
ＴＳＣ１３ホモログを有する株におけるフェニルプロパノイド誘導体の生産を試験するために、細胞を、合成流加（ＳＣ）培地（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ）中で７２時間培養した。株の増殖は、株をＳＣ培地中で７２時間培養した後に、ＯＤ６００を読み取ることによって測定した。
【０３０９】
野生型ＴＳＣ１３のＯＲＦを、Arabidospis thaliana（ＡｔＥＣＲ）、Gossypium hirsutum（ＧｈＥＣＲ２）、およびMalus domestica（ＭｄＥＣＲ）からのオルソログで置換すると、株の生存がもたらされた；ＴＳＣ１３のノックアウトは通常致死的であるため、これらの株の生存は、これらのオルソログがＴｓｃ１３の喪失を補えることを実証する。
【０３１０】
ナリンゲニン生産株（Ｓｃ１０．１）で発現された場合、植物オルソログのいずれも、いかなるフロレチン酸生産も生じなかった。これは、ＣｏＡ活性化フェニルプロパノイドに対するＳｃＴｓｃ１３の活性が、試験したオルソログにおいて保存されていないこの酵素の特異的特徴であることを示唆している。
試験した全ての株のうち、ＭｄＥＣＲオルソログを有する株は、最もクマル酸およびナリンゲニンを生産した（図１６）。ＡｔＥＣＲオルソログを有する株は、増殖が少なかった（増殖７２時間後に６２％の減少）（図１７）。ＧｈＥＣＲ２およびＭｄＥＣＲを発現する株の増殖も低下したが、ＡｔＥＣＲ発現株より低い程度であった（それぞれ約５０および３０％）。
【０３１１】
本発明を詳細に、その特定の態様を参照して説明したが、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲から逸脱することなく、変更および変形が可能であることは明らかであろう。より具体的には、本発明のいくつかの側面が本明細書において特に有利であると特定されるが、本発明は必ずしも、本発明のこれらの特定の態様に限定されないことが企図される。
【０３１２】
配列
【表２７−１】
2018520661.tif 000055
【０３１３】
【表２７−２】
2018520661.tif 000056
【０３１４】
【表２７−３】
2018520661.tif 000057
【０３１５】
【表２７−４】
2018520661.tif 000058
【０３１６】
【表２７−５】
2018520661.tif 000059
【０３１７】
【表２８−１】
2018520661.tif 000060
【０３１８】
【表２８−２】
2018520661.tif 000061
【０３１９】
【表２８−３】
2018520661.tif 000062
【０３２０】
【表２８−４】
2018520661.tif 000063
【０３２１】
【表２８−５】
2018520661.tif 000064
【０３２２】
【表２８−６】
2018520661.tif 000065
【０３２３】
【表２８−７】
2018520661.tif 000066
【０３２４】
【表２８−８】
2018520661.tif 000067
【０３２５】
【表２８−９】
2018520661.tif 000068
【０３２６】
【表２８−１０】
2018520661.tif 000069
【０３２７】
【表２８−１１】
2018520661.tif 000070
【０３２８】
【表２８−１２】
2018520661.tif 000071
【０３２９】
【表２８−１３】
2018520661.tif 000072
【０３３０】
【表２８−１４】
2018520661.tif 000073
【０３３１】
【表２８−１５】
2018520661.tif 000074
【０３３２】
【表２８−１６】
2018520661.tif 000075
【０３３３】
【表２８−１７】
2018520661.tif 000076
【０３３４】
【表２８−１８】
2018520661.tif 000077
【０３３５】
【表２８−１９】
2018520661.tif 000078
【０３３６】
【表２８−２０】
2018520661.tif 000079
【０３３７】
【表２８−２１】
2018520661.tif 000080
【０３３８】
【表２８−２２】
2018520661.tif 000081
【０３３９】
【表２８−２３】
2018520661.tif 000082
【０３４０】
【表２８−２４】
2018520661.tif 000083
【０３４１】
【表２８−２５】
2018520661.tif 000084
【０３４２】
【表２８−２６】
2018520661.tif 000085
【０３４３】
【表２８−２７】
2018520661.tif 000086
【０３４４】
【表２８−２８】
2018520661.tif 000087
【０３４５】
【表２８−２９】
2018520661.tif 000088
【０３４６】
【表２８−３０】
2018520661.tif 000089
【０３４７】
【表２８−３１】
2018520661.tif 000090
【０３４８】
【表２８−３２】
2018520661.tif 000091
【０３４９】
【表２８−３３】
2018520661.tif 000092
【０３５０】
【表２８−３４】
2018520661.tif 000093
【０３５１】
【表２８−３５】
2018520661.tif 000094
【０３５２】
【表２８−３６】
2018520661.tif 000095
【０３５３】
【表２８−３７】
2018520661.tif 000096
【０３５４】
【表２８−３８】
2018520661.tif 000097
【０３５５】
【表２８−３９】
2018520661.tif 000098
【０３５６】
【表２８−４０】
2018520661.tif 000099
【０３５７】
【表２８−４１】
2018520661.tif 000100
【０３５８】
【表２８−４２】
2018520661.tif 000101
【０３５９】
【表２８−４３】
2018520661.tif 000102
【０３６０】
【表２８−４４】
2018520661.tif 000103
【０３６１】
【表２８−４５】
2018520661.tif 000104
【０３６２】
【表２８−４６】
2018520661.tif 000105
【０３６３】
【表２８−４７】
2018520661.tif 000106
【０３６４】
【表２８−４８】
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【０３６５】
【表２８−４９】
2018520661.tif 000108
【０３６６】
【表２８−５０】
2018520661.tif 000109
【０３６７】
【表２８−５１】
2018520661.tif 000110
【０３６８】
【表２８−５２】
2018520661.tif 000111
【０３６９】
【表２８−５３】
2018520661.tif 000112
【０３７０】
【表２８−５４】
2018520661.tif 000113
【０３７１】
【表２８−５５】
2018520661.tif 000114
【０３７２】
【表２８−５６】
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【０３７３】
【表２８−５７】
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【０３７４】
【表２８−５８】
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【０３７５】
【表２８−５９】
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【０３７６】
【表２８−６０】
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【０３７７】
【表２８−６１】
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【０３７８】
【表２８−６２】
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【０３７９】
【表２８−６３】
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【０３８０】
【表２８−６４】
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【０３８１】
【表２８−６５】
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【０３８２】
【表２８−６６】
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【０３８３】
【表２８−６７】
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【０３８４】
【表２８−６８】
2018520661.tif 000127
【０３８５】
【表２８−６９】
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【０３８６】
【表２８−７０】
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【０３８７】
【表２８−７１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−１】
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【図１５Ａ−２】
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【図１５Ｂ−１】
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【図１５Ｂ−２】
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【図１５Ｃ−１】
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【図１５Ｃ−２】
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【図１５Ｄ−１】
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【図１５Ｄ−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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