(57)【要約】  本発明は、ナノテクノロジーおよびがん治療の分野に関する。特に、本開示は、脂質コンジュゲート型白金化合物を高純度および良好な収率で調製するための改善された方法に関する。本開示はまた、脂質コンジュゲート型白金化合物を高い薬物負荷効率で有する化学療法における使用のためのナノ粒子、および前記ナノ粒子を作製するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質コンジュゲート型白金化合物を調製する方法であって、
脂質の水溶性の塩を水溶性白金化合物と実質的に水性の溶液中で反応させ、前記脂質コンジュゲート型白金化合物を析出物として得る工程を有し、
前記方法は、前記脂質コンジュゲート型白金化合物の>５０％の収率を提供し、
前記方法は、前記脂質コンジュゲート型白金化合物の>７０％の純度を提供する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに、反応混合物を濾過または遠心分離して前記析出物を前記実質的に水性の溶液から分離する工程と、選択的に前記析出物を水で洗浄する工程と、を有する方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、さらに、ＨＰＬＣを用いて前記脂質コンジュゲート型白金化合物を精製する工程を有する方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法において、前記脂質コンジュゲート型白金化合物の純度は、ＮＨ２、Ｃ１８、またはＰｈｅｎｙｌカラムでの分析用ＨＰＬＣを用いて測定される方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、前記ＨＰＬＣ精製は、分取逆相カラムを使用する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記カラムは、ＮＨ２固定相、Ｐｈｅｎｙｌ固定相、またはＣ１８固定相を有する方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法において、前記カラムは、ＮＨ２またはＰｈｅｎｙｌ固定相を有し、かつ、前記脂質コンジュゲート型白金化合物は勾配法を用いて溶出される方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記勾配法は水とメタノールの混合物を有する移動相を用いて溶出する工程を有し、前記溶出はより高いパーセンテージの水を有する混合物で開始し、より高いパーセンテージのメタノールを有する混合物に経時的に線形的に進行する方法。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれかに記載の方法において、前記カラムは、Ｃ１８を有し、かつ、前記脂質コンジュゲート型白金化合物は定組成法を用いて溶出される方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記定組成法は、９８％のメタノールと２％の水を有する移動相を用いて溶出する工程を有する方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法において、前記ＨＰＬＣ精製工程は、前記脂質コンジュゲート型白金化合物の>９９．５％の純度を提供する方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法において、前記方法は、前記脂質コンジュゲート型白金化合物の>７０％の収率を提供する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法において、前記実質的に水性の溶液は、少なくとも９０％の水を有する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法において、前記実質的に水性の溶液は、少なくとも９５％の水を有する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法において、前記実質的に水性の溶液は、少なくとも９８％の水を有する方法。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法において、前記実質的に水性の溶液は、少なくとも９９％の水を有する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法において、前記実質的に水性の溶液は、１００％の水を有する方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法において、前記反応は室温で行われる方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法において、前記反応は約１気圧で行われる方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法において、前記脂質の水溶性の塩は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、およびそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法において、前記脂質の水溶性の塩は、脂肪、ワックス、ステロール、ステロイド、胆汁酸、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質、アミノ脂質、クロモ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質、ポリケチド、脂肪酸、およびそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される脂質を有する方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、前記脂質はコレステロールまたはその誘導体である方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法において、前記脂質はα−トコフェロールである方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法において、前記脂質の水溶性の塩は、さらに、前記脂質に共有結合されたリンカーを有する方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法において、前記脂質に共有結合されたリンカーは、式Ｉ：
【化１】
2018520206.tif 000068
で表されるものであり、
式中：
ＸはＮＨであり、
Ｘ１は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、ＮＨ２、およびＯＨから成る群から選択され、
Ｘ２は（ＣＨ２）ｎまたはＣＯであり、
Ｘ３は、（ＣＨ２）ｎ、ＣＨ２−ＮＨ、およびＣ４Ｈ８から成る群から選択され、
Ｘ４はＣＯまたは−ＣＨ−ＣＨ３であり、
かつ、ｎ＝０〜２である
方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法において、前記脂質に共有結合されたリンカーは、式ＩＩ：
【化２】
2018520206.tif 000069
で表されるものであり、
式中、
ＸはＮＨまたはＮ−ＣＨ２ＣＯＯ−であり、
Ｘ１は、−（ＣＨ２）ｎＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎＯＨ、および（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨから成る群から選択され、かつ、ｎ＝０〜２である
方法。
【請求項２７】
請求項２４に記載の方法において、前記脂質に共有結合されたリンカーは、式ＩＩＩ：
【化３】
2018520206.tif 000070
で表されるものであり、
式中、
Ｘは、Ｓ＋、Ｃ、Ｓ＋＝Ｏ、Ｎ＋Ｈ、およびＰ＝Ｏから成る群から選択され、
Ｘ１は、−ＣＨ、−ＣＨ２、および−ＣＨ２Ｏから成る群から選択され、
Ｘ２はＣ＝Ｏであり、
Ｘ３はＣＨ、ＣＨ２またはＯであり、
Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６は−ＣＨ２ＯまたはＯである
方法。
【請求項２８】
請求項２４に記載の方法において、前記脂質に共有結合されたリンカーは、式ＩＶ：
【化４】
2018520206.tif 000071
で表されるものであり、
式中、
ＸはＣＨ２ＯＨであり、
Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり、ｎ＝０〜２であり、かつ
Ｘ２はＣ＝Ｏである
方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法において、前記脂質の水溶性の塩は、脂質をＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＲｂＯＨ、ＣｓＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｓｒ（ＯＨ）２、Ｂａ（ＯＨ）２またはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの酸、およびそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される塩基と反応させることによって提供される方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法において、前記水溶性白金化合物は、式Ｖ：
【化５】
2018520206.tif 000072
で表されるものであり、
式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は独立して、ハライド、アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、Ｈ２Ｏ、アルコキシ、チオール、チオアルキル、Ｏ−アシル、およびそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、Ｘ１およびＸ２は単座配位または二座配位の配位子である方法。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載の方法において、Ｘ１およびＸ２はアミノである方法。
【請求項３３】
請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法において、Ｘ１およびＸ２はジアミノシクロヘキシル（ＤＡＣＨ）である方法。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法において、Ｘ３およびＸ４は各々、Ｈ２Ｏである方法。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法において、前記水溶性白金化合物は、式Ｖの白金化合物を、ＡｇＮＯ３およびＨ２Ｏと反応させることによって提供され、Ｘ１およびＸ２は二座配位のアミノ配位子を有し、Ｘ３およびＸ４は各々、ハライドを有する方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法において、Ｘ１およびＸ２はＤＡＣＨであり、Ｘ３およびＸ４は各々、Ｃｌである方法。
【請求項３７】
ナノ粒子を調製する方法であって、
ナノ粒子を得るために、白金部分と前記白金部分に連接された脂質とを有する白金化合物を、溶媒の存在下でコリピドと混合する工程を有する方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法において、前記白金化合物は、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法に従って調製される方法。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載の方法において、前記溶媒は、クロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、エタノール、およびそれらのいずれかの組合せを有する群から選択される方法。
【請求項４０】
請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法において、前記コリピドは、ダイズホスファチジルコリン（完全水添型）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、およびそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される方法。
【請求項４１】
請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法であって、さらに、乾燥工程と、インキュベーション工程と、安定剤の選択的な添加の工程と、を有する方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法において、前記安定剤は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２、ＰＥＧ、無機塩、糖質、およびそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法において、前記無機塩は、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、およびそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法において、前記糖質は、グルコース、デキストロース、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラクトース、およびそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される方法。
【請求項４５】
請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の方法において、前記コリピドは、ダイズホスファチジルコリン（水添型）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］を有する方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法において、前記白金化合物と前記コリピドのｍｏｌ％比は３０：５５：４〜３８：５７：５である方法。
【請求項４７】
請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の方法において、前記コリピドは、ダイズホスファチジルコリン（水添型）、コレステロール、および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］を有する方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法において、前記白金化合物と前記コリピドのｍｏｌ％比は２０：６０：３：１〜約３５：７０：１５：５である方法。
【請求項４９】
白金化合物とＤＯＰＥとを有する組成物。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法において、前記白金化合物とＤＯＰＥのｍｏｌ％比は約２０：３０〜約３０：５０である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年５月１９日の日付で出願されたインド特許出願第１４１８／ＤＥＬ／２０１５号の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ａ）〜１１９（ｄ）の１またはそれ以上に基づく恩典を主張する。両出願の内容は、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ナノテクノロジーおよびがん治療の分野に関する。特に、本開示は、脂質コンジュゲート型白金化合物の合成に関し、さらに、脂質コンジュゲート型白金化合物を高純度および良好な収率で調製するための方法に関する。本開示はまた、脂質コンジュゲート型白金化合物を高い薬物負荷効率で有する化学療法における使用のためのナノ粒子、および前記ナノ粒子を作製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
白金ベース化学療法剤は、ファーストライン治療として、すべてのがんの７０％超において使用されている。シスプラチンは、シス−［Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ（ＯＨ２）］＋およびシス−［Ｐｔ（ＮＨ３）２（ＯＨ２）］２＋を急速に形成し、腎毒性をもたらす。さらに、カルボプラチンおよびオキサリプラチンでは、どちらも、アクア化が有意に遅く、効力が低下する。ここしばらくで、相当な進歩がみられており、Ｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ，２００８，１０５，１７３５６）により、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧナノ粒子内への封入のために充分に疎水性である白金（ＩＶ）錯体（ｃ，ｔ，ｃ−［Ｐｔ（ＮＨ３）２（Ｏ２ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）２Ｃｌ２］が作製された。しかしながら、この場合、プロドラッグは、細胞内プロセッシングによってシスプラチンになるものでなければならない。さらに、ポリマーとの白金のコンジュゲーションに基づいた択一的なストラテジー（例えば、ポリアミドアミンデンドリマー−白金錯体）では、遊離のシスプラチンよりも２００〜５５０倍の細胞毒性の低下がもたらされた。これは、ポリマーと白金間で形成される強力な結合の結果であった（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２００９，９８，２２９９）。別の例は、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー結合型白金のＡＰ５２８０であり、これはカルボプラチンよりも効力が低い。ここで、白金は、テトラペプチドスペーサーのＣＯＯＨ末端グリシンにカップリングさせたアミノマロン酸キレート剤によって保持されている（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．，２００４，１０，３３８６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎ．，２００４，４０，２９１）。さらに、ＷＯ２０１０／０９１１９２Ａ２（Ｓｅｎｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．）には、コポリマー骨格、前記骨格と共有結合している複数の側鎖、および前記骨格と解離可能に結合している複数の白金化合物を含む生体適合性コンジュゲート型ポリマーナノ粒子が開示されている。
【０００４】
脂質ベースのオキサリプラチン、シスプラチン、およびカルボプラチン分子フレームワークは、ナノ粒子を形成し、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果をもたらすその能力のため、抗がん薬開発のための研究の魅力的な分野となっている。しかしながら、脂質コンジュゲート型白金薬物に関する報告は極めて稀である。これは、低収率の合成方法およびこのような化合物の精製の困難さに関連する問題のためである。脂質と白金とのカップリング（錯化）反応において良好な収率を得ることは、脂質ベース配位子と白金前駆体の溶解度の差が大きいため、依然として難題である。脂質含有配位子は有機溶媒に溶けやすいが、白金前駆体は水に溶けやすい。反応体の溶解度を改善するため、報告されたほとんどの錯化反応では、特に、前記脂質が水不溶性である場合、有機溶媒と水性溶媒の混合物が使用されている（例えば、コレステロール、表１，参考文献１参照）。それでもなお、この溶解度の問題により不完全な反応がもたらされる。したがって、未反応の出発物質からの所望の白金錯体の精製が困難となる。また、このような反応は、例えば、手順が複雑で多工程（表１，参考文献３参照）、反応温度が高い（表１，参考文献２、３参照）、および処理手順が複雑（表１，参考文献２参照）などという欠点を有する
【表１】
2018520206.tif 000002
【０００５】
米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ&Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）の要件を満たす製剤品を得るためのＰｔベース化合物のさらなる精製は、複雑で難儀なプロセスであることが知られている。最終の脂質コンジュゲート型白金医薬品有効成分（ａｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ：ＡＰＩ）の精製は、大きなサイズと両親媒性の性質のため晶析が困難であることから問題となっている。Ｐｔ（ＩＶ）−ペプチドコンジュゲートは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）によって精製されている；しかしながら、ＨＰＬＣ分析法による最終純度は、報告されていない（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１９，３９−４９（２００８））。いくつかの他の場合では、Ｐｔ（ＩＶ）錯体はカラムで分解され、精製することができなかったと報告されている（<ｈｔｔｐ：／／ｄｓｐａｃｅ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｈａｎｄｌｅ／１７２１．１／３６２７９＃ｆｉｌｅｓ−ａｒｅａ>のＳａｏｕｍａ，Ｃ．Ｔ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｂａｓｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．１-７８（２００５）。同様に、Ｐｔ（ＩＩ）錯体の精製について報告された別の方法でも、ＨＰＬＣによる最終純度は示されていない（Ｔｒｏｍｐ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１４、４２７３−６（２００４））。Ｐｔ（ＩＩ）化合物、特に、含窒素配位子を含有しているものの精製に伴う問題が報告されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１５３，１２３−１２７（１９８８））。この場合、精製後の生成物は生物学的活性が低かった。
【０００６】
本発明は、先行技術の欠点を解決し、相応に良好な純度の粗製脂質コンジュゲート型白金化合物（医薬品有効成分（ＡＰＩｓ））を高収率で得るための改善された合成手順を提供することを目的とするものである。また、本発明の一部の特定の態様により、脂質コンジュゲート型白金化合物の精製のためのロバストな分取ＨＰＬＣ法を提供する。本発明の一部の特定の態様により、がん化学療法において安定で効力があり、より安全なナノ白金酸塩を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示により、脂質コンジュゲート型白金化合物の調製のための合成ストラテジーを提供する。本発明の一態様により、脂質コンジュゲート型白金化合物の調製方法であって：脂質の水溶性の塩を水溶性白金化合物と実質的に水性の溶液中で反応させ、脂質コンジュゲート型白金化合物を析出物として得ることを有する方法を提供する。別の態様により、前記脂質コンジュゲート型白金化合物をＨＰＬＣを用いてさらに精製するための方法を提供する。別の態様により、本開示の脂質コンジュゲート型白金化合物を有するナノ粒子の調製方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明がより容易に理解され、実用化され得るように、次に、添付の図面を参照しながら実例を示す例示的な実施形態に言及する。これらの図は、以下の詳細説明とともに本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、本開示による諸実施形態をさらに図面で示し、種々の原理および利点を説明する機能を果たす。
【図１】図１は、水／アセトン洗浄前のＣ１８カラムでの化合物２６のＨＰＬＣプロフィール（保持時間：１０．９３分）を示す。化合物の純度は８２％である。移動相：１００％メタノール．検出：２１０ｎｍ，ＵＶ．
【図２】図２は、水／アセトン洗浄後のＣ１８カラムでの化合物２６のＨＰＬＣプロフィール（保持時間：１１．２分）を示す。化合物の純度は９０％である。移動相：１００％メタノール．検出：２１０ｎｍ，ＵＶ．
【図３】図３は、ＨＰＬＣ精製後の化合物２５の一例の分析プロフィールを示す。純度は>９９．５％である。純度は、ブランクのスペクトル（図示せず）をオーバーレイした後に計算したものである。
【図４】図４は、ＨＰＬＣ精製後の化合物２７の一例の分析プロフィールを示す。純度は９９．５％である。純度は、ブランクのスペクトル（図示せず）をオーバーレイした後に計算したものである。
【図５】図５は、ＨＰＬＣ精製後の化合物２８の一例の分析プロフィールを示す。純度は９９％である。純度は、ブランクのスペクトル（図示せず）をオーバーレイした後に計算したものである。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＨＰＬＣ精製後の化合物２５の一例の分析プロフィールを示す。純度は、Ｃ１８カラムでは９８．５％である（図６Ａ）が、アミノカラムでは約１００％であり（図６Ｂ）、Ｃ１８カラムでは化合物が分解することがわかる。この結果により、純度に対する分析方法の選択の重要性が強調される。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＨＰＬＣ精製後の化合物２７の一例の分析プロフィールを示す。純度は、Ｃ１８カラムでは５９％である（図７Ａ）が、アミノカラムでは９８％であり（図７Ｂ）、Ｃ１８カラムでは化合物が分解することがわかる。この結果により、純度のための分析方法の選択の重要性が強調される。
【図８】図８は、化合物２５の超分子製剤のＤＬＳヒストグラムを示す。
【図９】図９は、本発明による脂質コンジュゲート型白金化合物を有するナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＴＥＭ）画像を示す。ナノ粒子を、各画像におけるスケールバーからわかるとおり種々の倍率で示す。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態による脂質コンジュゲート型白金化合物を有するナノ粒子のクライオ透過型電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ−ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）画像を示す。
【図１１】図１１は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を有する化合物２５の超分子製剤のＤＬＳヒストグラムを示す。
【図１２】図１２は、Ａ５４９およびＤＵ１４５細胞株において、化合物２５のＤＯＰＥ含有製剤（ＩＯ−１２５）がＤＯＰＥなしの製剤よりも良好な有効性を有することを示す。
【図１３】図１３は、ＨＣｌ塩の形成前の中間体Ｉｍ−０６のＨＰＬＣプロフィールを示す。図示のように、ＨＣｌ塩の形成前のＩｍ−０６の純度は９１％であった。
【図１４】図１４は、ＨＣｌ塩の形成および脱塩後の中間体Ｉｍ−０６のＨＰＬＣプロフィールを示す。図示のように、ＨＣｌ塩の形成および脱塩後のＩｍ−０６の純度は９６．７％に改善された。
【図１５】図１５は、晶析後および２回のスラリー化後の化合物２５のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図１６】図１６は、粗製ＣＯＭＰ  ２５の成功裡の晶析スクリーニングで回収された固形物のＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを示す。
【図１７】図１７は、温度サイクル後の固形物におけるＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを示す。
【図１８】図１８は、種晶添加メタノール：ジクロロメタン（ｄｉｃｈｏｌｏｒｍｅｔｈａｎｅ）（１０：９０％ｖ／ｖ）で得られた結晶性物質のＰＬＭ顕微鏡写真を示す。
【図１９】図１９は、濃度約１５０ｍｇ／ｍｌでの温度サイクル後の固形物のＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを示す。
【図２０】図２０は、ヘプタンを貧溶媒として使用した温度サイクル後の固形物のＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを示す。
【図２１】図２１は、ヘプタンを貧溶媒として使用した温度サイクル後の固形物のＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを示す。
【図２２】図２２は、冷却晶析した固形物のＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを示す。
【図２３】図２３は、乾燥させた固形物のＰＬＭ顕微鏡写真を示す。
【図２４】図２４は、冷却晶析２のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２５】図２５は、乾燥させた固形物のＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを示す。
【図２６】図２６は、乾燥させた固形物のＰＬＭ顕微鏡写真を示す。
【図２７】図２７は、メタノール：ジクロロメタン（２０：８０％ｖ／ｖ）を使用して単離した固形物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２８】図２８は、乾燥させた固形物のＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを示す。
【図２９】図２９は、乾燥させた固形物のＰＬＭ顕微鏡写真を示す。
【図３０】図３０は、メタノール：ジクロロメタン（２０：８０％ｖ／ｖ）を使用し、ヘプタンを貧溶媒として用いて単離した固形物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明により、白金化合物の脂質官能性付与のための単純でコスト効率のよい手順のための方法であって、相応に純粋な脂質コンジュゲート型白金化合物が反応混合物自体から良好な収率で形成される方法を提供する。形成されたら、該脂質コンジュゲート型白金化合物が即座に析出し、熱力学的に反応が錯化の方向に推進され、したがって高収率がもたらされる。本開示の方法の一部の特定の例示的な実施形態の他の利点としては、反応が室温および１気圧で数時間以内に完了し得るような穏やかな反応条件が挙げられる。一部の特定の例示的な実施形態では、水が唯一の溶媒として使用される。一部の特定の例示的な実施形態では、該脂質コンジュゲート型白金化合物を反応混合物から析出させ、粗製生成物を≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、もしくは≧９０％収率で、または７０％〜９０％の範囲の収率で得る。一部の特定の例示的な実施形態では、該脂質コンジュゲート型白金化合物は、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、または≧９０％の粗製物純度を有する。一部の特定の例示的な実施形態では、該粗製生成物は続いて、半分取または分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）の要件を満たす>９９．５％純度まで精製する。
【００１０】
本発明の一部の特定の例示的な実施形態により：脂質の水溶性の塩を水溶性白金化合物と実質的に水性の溶液中で反応させ、脂質コンジュゲート型白金化合物を析出物として得ることを有する、脂質コンジュゲート型白金化合物の調製方法を提供する。一部の特定の例示的な実施形態は、さらに、反応混合物を濾過または遠心分離して前記析出物を前記実質的に水性の溶液から分離する工程と、任意選択で前記析出物を水で洗浄する工程とを有する。理論に拘束されないが、本開示の方法により、生成物は水溶液に不溶性であるため析出するが反応体は溶液中に残存し、したがって、反応混合物を単に濾過または遠心分離することによって生成物の容易な精製が可能になる生成物が提供される。
【００１１】
一部の特定の例示的な実施形態は、さらに、前記脂質コンジュゲート型白金化合物をＨＰＬＣを用いて精製する工程を有する。ＨＰＬＣを使用し、脂質コンジュゲート型白金化合物の純度を、ＦＤＡガイドラインに従う>９９．５％までさらに改善する。ＨＰＬＣ法を、まず分析用カラムで最適化し、次いで、分取カラムでのより大きな規模に移行し、グラム量の≧９９．５％の純粋な脂質コンジュゲート型白金化合物を得た。本明細書に開示したＨＰＬＣ法（以下の実施例を参照）は非常にロバストであり、該脂質コンジュゲート型白金化合物の出発純度に無関係である。２０〜９０％の出発純度を有する化合物は、本開示の方法を用いて成功裡に精製されている。また、ＨＰＬＣ精製プロセスにより、高収率（例えば、種々の脂質官能性付与白金化合物で≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、または≧９０％収率）ももたらされる。脂質コンジュゲート型白金化合物は再結晶によって精製するのが困難であるが、本明細書に開示したＨＰＬＣ精製法により、この困難が好都合に克服される。
【００１２】
一部の特定の例示的な実施形態では、該ＨＰＬＣ精製法は分取逆相カラムを使用するものである。一部の特定の例示的な実施形態では、前記カラムはＮＨ２固定相、Ｐｈｅｎｙｌ固定相またはＣ１８固定相を有する。一部の特定の例示的な実施形態では、前記カラムは固定相としてＮＨ２またはＰｈｅｎｙｌを有し、前記脂質コンジュゲート型白金化合物は勾配法を用いて溶出される。一部の特定の例示的な実施形態では、前記勾配法は、水とメタノールの混合物を有する移動相を用いて溶出させることを有し、ここで、溶出は、より高いパーセンテージの水を有する該混合物で開始し、より高いパーセンテージのメタノールを有する該混合物に経時的に線形的に進行させる。一部の特定の例示的な実施形態では、前記カラムは固定相としてＣ１８を有し、前記脂質コンジュゲート型白金化合物は定組成法を用いて溶出される。一部の特定の例示的な実施形態では、前記定組成法は、９８％のメタノールと２％の水を有する移動相を用いて溶出させることを有する。
【００１３】
用語「実質的に水性の溶液」は、ほとんどが水、例えば、少なくとも９０％の水、少なくとも９５％の水、少なくとも９８％の水、少なくとも９９％の水、および１００％の水を有する溶液と定義する。少なくとも９９％の水には、９９％またはそれより多く１００％までの任意の量の水、例えば、９９．３％の水、９９．５％の水、９９．８％の水、９９．９％の水、および１００％の水が包含され得る。
【００１４】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質の水溶性の塩と前記水溶性白金化合物を室温で反応させる。用語「室温」は、外部加熱要素または外部冷却要素を反応に適用しないという慣用的な意味で用いている。室温には、例えば、１０℃〜４０℃、２０℃〜３０℃、２２℃〜２８℃の範囲の温度、および約２５℃が包含され得る。一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質の水溶性の塩と前記水溶性白金化合物を１気圧で反応させる。１気圧には、例えば、７９０〜６５０ｍｍＨｇ、７８０〜６９０ｍｍＨｇ、７７０〜７３０ｍｍＨｇの圧力範囲内の値、および約７６０ｍｍＨｇが包含され得る。
【００１５】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質の水溶性の塩は：リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩、およびその任意の組合せから成る群から選択される。一部の実施形態では、前記脂質の水溶性の塩は、脂質を：ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＲｂＯＨ、ＣｓＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｓｒ（ＯＨ）２、Ｂａ（ＯＨ）２、およびその任意の組合せから成る群から選択される塩基と反応させることにより得られ得る。
【００１６】
一部の実施形態では、前記脂質の水溶性の塩は酸塩であり得る。酸塩を作製するための酸は無機酸または有機酸であり得る。前記脂質の前記水溶性の塩を作製するための例示的な有機酸は、これに限定されるものではないが、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、酢酸、アントラニル酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸，１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、３−フェニルプロピオン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］オクト−２−エン−ｌ−カルボン酸、４，４'−メチレン（ｍｅｆｈｙｌｅｎｅ）ビス（３−ヒドロキシ−２−エン−ｌ−カルボン酸）、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、ナフタレンスルホン酸、ｏ−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、シュウ酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、ターシャリーブチル酢酸、トリフルオロ酢酸、トリメチル酢酸などを含む。前記脂質の前記水溶性の塩を作製するための例示的な有機酸は、これに限定されるものではないが、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸などを含む。
【００１７】
本明細書に開示した種々の態様の一部の実施形態において、前記白金部分は白金（ＩＩ）化合物または白金（ＩＶ）化合物である。一部の実施形態では、該白金（ＩＩ）化合物は、ＤＡＣＨ−白金、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、パラプラチン、サルトラプラチン（ｓａｒｔｒａｐｌａｔｉｎ）、およびその種々の組合せで構成される群から選択される。一部の実施形態では、該白金含有化合物はＰｔ（ＩＩ）化合物、Ｐｔ（ＩＶ）化合物またはハライド含有白金化合物である。好ましい一実施形態では、該白金化合物はオキサリプラチンである。
【００１８】
用語「脂質」は、慣用的な意味で用いており、約２個の炭素原子という短鎖から約２８個の炭素原子という長鎖におよぶさまざまな鎖長の化合物を包含している。さらに、該化合物は飽和型であっても不飽和であってもよく、直鎖または分枝鎖の形態であっても非縮合環構造または縮合環構造の形態であってもよい。例示的な脂質は、これに限定されるものではないが、脂肪、ワックス、ステロール、ステロイド、胆汁酸、脂溶性ビタミン（例えば、Ａ、Ｄ、Ｅ、およびＫ）、モノグリセリド、ジグリセリド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質、アミノ脂質、クロモ脂質（ｃｈｒｏｍｏｌｉｐｉｄ）（リポクロム）、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、ポリケチド、ならびに脂肪酸を含む。
【００１９】
これに限定されるものではないが、前記脂質は、ステロール脂質、脂肪酸、脂肪族アルコール、グリセロ脂質（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド）、リン脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質、ポリケチド、ならびにその任意の組合せから成る群から選択され得る。前記脂質は多価不飽和の脂肪酸またはアルコールであり得る。用語「多価不飽和の脂肪酸」または「多価不飽和の脂肪族アルコール」は、本明細書で用いる場合、その炭化水素鎖内に２またはそれ以上の炭素−炭素二重結合を有する脂肪酸またはアルコールを意味する。また、前記脂質は高度不飽和の脂肪酸またはアルコールであってもよい。用語「高度多価不飽和の脂肪酸」または「高度多価不飽和の脂肪族アルコール」は、本明細書で用いる場合、少なくとも１８個の炭素原子および少なくとも３つの二重結合を有する脂肪酸またはアルコールを意味する。前記脂質はオメガ−３脂肪酸であってもよい。用語「オメガ−３脂肪酸」は、本明細書で用いる場合、第１の二重結合が酸基と反対の末端から３番目の炭素−炭素結合に存在している多価不飽和の脂肪酸を意味する。
【００２０】
一部の実施形態では、前記脂質は、ジカプリル酸／ジカプリン酸１，３−プロパンジオール；１０−ウンデセン酸；１−ドトリアコンタノール；１−ヘプタコサノール；１−ノナコサノール；２−エチルヘキサノール；アンドロスタン；アラキジン酸；アラキドン酸；アラキジルアルコール；ベヘン酸；ベヘニルアルコール；Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ  Ｃ１０；カプリン酸；カプリンアルコール；カプリルアルコール；カプリル酸；飽和脂肪族アルコールＣ１２〜Ｃ１８のカプリル酸／カプリン酸とのエステル；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド；セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン，ＳＰＨ）；セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン，Ｃｅｒ−ＰＥ）；セラミドホスホリルグリセロール；セロプラスチン酸；セロチン酸；セロチン酸；セリルアルコール；セテアリルアルコール；セテス−１０；セチルアルコール；コラン；コレスタン；コレステロール；シス−１１−エイコセン酸；シス−１１−オクタデセン酸；シス−１３−ドコセン酸；クルイチル（ｃｌｕｙｔｙｌ）アルコール；コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）；ジホモ−γ−リノレン；ドコサヘキサエン酸；卵レシチン；エイコサペンタエン酸；エイコセン酸；エライジン酸；エライドリノレニルアルコール；エライドリノレイルアルコール；エライジルアルコール；エルカ酸；エルシルアルコール；エストラン；エチレングリコールジステアレート（ＥＧＤＳ）；ゲジン（Ｇｅｄｄｉｃ）酸；ゲジル（ｇｅｄｄｙｌ）アルコール；グリセロールジステアレート（Ｉ型）ＥＰ（Ｐｒｅｃｉｒｏｌ  ＡＴＯ  ５）；トリカプリル／カプリン酸グリセロール；トリカプリル／カプリン酸グリセロール（ＣＡＰＴＥＸ（登録商標）３５５  ＥＰ／ＮＦ）；グリセリルモノカプリレート（Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ  Ｃ８  ＥＰ）；グリセリルトリアセテート；グリセリルトリカプリレート；グリセリルトリカプリレート／カプレート／ラウレート；グリセリルトリカプリレート／トリカプレート；グリセリルトリパルミテート（トリパルミチン）；ヘナトリアコンチル（Ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ）酸；ヘンエイコシルアルコール；ヘンエイコシル酸；ヘプタコシル酸；ヘプタデカン酸；ヘプタデシルアルコール；ヘキサトリアコンチル酸；イソステアリン酸；イソステアリルアルコール；ラクセロ（Ｌａｃｃｅｒｏｉｃ）酸；ラウリン酸；ラウリルアルコール；リグノセリン酸；リグノセリルアルコール；リノエライジン酸；リノール酸；リノレニルアルコール；リノレイルアルコール；マルガリン酸；ミード；メリシン酸；メリシルアルコール；モンタン酸；モンタニルアルコール；ミリシルアルコール；ミリスチン酸；ミリストレイン酸；ミリスチルアルコール；ネオデカン酸；ネオヘプタン酸；ネオノナン酸；ネルボン（Ｎｅｒｖｏｎｉｃ）；ノナコシル酸；ノナデシルアルコール；ノナデシル酸；ノナデシル酸；オレイン酸；オレイルアルコール；パルミチン酸；パルミトレイン酸；パルミトレイルアルコール；ペラルゴン酸；ペラルゴンアルコール；ペンタコシル酸；ペンタデシルアルコール；ペンタデシル酸；ホスファチジン酸（ホスファチデート，ＰＡ）；ホスファチジルコリン（レシチン，ＰＣ）；ホスファチジルエタノールアミン（ケファリン，ＰＥ）；ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）；ホスファチジルイノシトールビスリン酸（ＰＩＰ２）；ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）；ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）；ホスファチジルセリン（ＰＳ）；ポリグリセリル−６−ジステアレート；プレグナン；プロピレングリコールジカプレート；プロピレングリコールジカプリロカプレート；プロピレングリコールジカプリロカプレート；プシル（Ｐｓｙｌｌｉｃ）酸；リシノール（ｒｅｃｉｎｏｌｅａｉｃ）酸；リシノレイル（ｒｅｃｉｎｏｌｅｙｌ）アルコール；サピエン酸；ダイズレシチン；ステアリン酸；ステアリドン；ステアリルアルコール；トリコシル酸；トリデシルアルコール；トリデシル酸；トリオレイン；ウンデシルアルコール；ウンデシレン酸；ウンデシル酸；バクセン酸；α−リノレン酸；γ−リノレン酸；１０−ウンデセン酸、アダパレン、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、酪酸、カプリン酸、カプリル酸、セロチン酸、シス−１１−エイコセン酸、シス−１１−オクタデセン酸、シス−１３−ドコセン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、エライジン酸、エルカ酸、ヘンエイコシル酸、ヘプタコシル酸、ヘプタデカン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、リグノセリン酸、リノエライジン酸、リノール酸、モンタン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、ネオデカン酸、ネオヘプタン酸、ネオノナン酸、ノナデシル酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ペラルゴン酸、ペンタコシル酸、ペンタデシル酸、リシノール酸（例えば、リシノール酸亜鉛）、サピエン酸、ステアリン酸、トリコシル酸、トリデシル酸、ウンデシレン酸、ウンデシル酸、バクセン酸、吉草酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸の脂肪酸塩；およびその任意の組合せから成る群から選択され得る。
【００２１】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質はコレステロールまたはその誘導体である。一部の実施形態では、前記脂質はα−トコフェロールである。
【００２２】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質の水溶性の塩はさらに、前記脂質に共有結合されたリンカーを有する。本明細書で用いる場合、用語「リンカー」は、化合物内の２つの部分を連接することができる有機部分を意味する。リンカーには、典型的には、原子（酸素もしくはイオウなど）との直接結合、単位、例えば、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨまたは原子鎖、例えば、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロ（ｈｅｒｅｒｏ）シクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールが包含され、ここで、１またはそれ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＳＯ２ＮＨ、切断性連結基、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換の複素環式部が介在しているか、またはこれらで終結していてもよく；ここで、Ｒ１は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。
【００２３】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質に共有結合された前記リンカーは、式Ｉ：
【化１】
2018520206.tif 000003
で表されるものであり、
式中：
ＸはＮＨであり；
Ｘ１は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、ＮＨ２、およびＯＨから成る群から選択され；
Ｘ２は（ＣＨ２）ｎまたはＣＯであり；
Ｘ３は、（ＣＨ２）ｎ、ＣＨ２−ＮＨ、およびＣ４Ｈ８から成る群から選択され；
Ｘ４はＣＯまたは−ＣＨ−ＣＨ３であり；
ここで、ｎ＝０〜２である。
【００２４】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質に共有結合された前記リンカーは、式ＩＩ：
【化２】
2018520206.tif 000004
で表されるものであり、
式中、
ＸはＮＨまたはＮ−ＣＨ２ＣＯＯ−であり；
Ｘ１は、−（ＣＨ２）ｎＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎＯＨ、および（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨから成る群から選択され；ここで、ｎ＝０〜２である。
【００２５】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質に共有結合された前記リンカーは、式ＩＩＩ：
【化３】
2018520206.tif 000005
で表されるものであり、
式中、
Ｘは、Ｓ＋、Ｃ、Ｓ＋＝Ｏ、Ｎ＋Ｈ、およびＰ＝Ｏから成る群から選択され；
Ｘ１は、−ＣＨ、−ＣＨ２、および−ＣＨ２Ｏから成る群から選択され；
Ｘ２はＣ＝Ｏであり；
Ｘ３はＣＨ、ＣＨ２、またはＯであり；
Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６は−ＣＨ２ＯまたはＯである。
【００２６】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質に共有結合された前記リンカーは、式ＩＶ：
【化４】
2018520206.tif 000006
で表されるものであり、
式中、
ＸはＣＨ２ＯＨであり；
Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり、ここで、ｎ＝０〜２であり；
Ｘ２はＣ＝Ｏである。
【００２７】
一部の実施形態では、前記リンカーは分枝リンカーである。該分枝リンカーの分岐点は少なくとも三価であり得るが、四価、五価、もしくは六価の原子、またはかかる複数価を提示する基であってもよい。一部の実施形態では、該分岐点は−Ｎ、−Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｏ−Ｃ、−Ｓ−Ｃ、−ＳＳ−Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−Ｃ、または−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃであり；ここで、Ｑは独立して、各存在の場合で、Ｈまたは任意選択で置換されているアルキルである。一部の実施形態では、該分岐点はグリセロールまたはその誘導体である。
【００２８】
切断性連結基は、細胞外では充分に安定であるが、標的細胞内に進入すると切断されて、前記リンカーが一体に保持している２つの部分を放出するものである。好ましい一実施形態では、該切断性連結基は、標的細胞内または第１の基準状態下（これは、例えば、細胞内条件を模倣するか、もしくは表すように選択され得る）において、被験体の血中もしくは血清中または第２の基準状態下（これは、例えば、血中もしくは血清中においてみられる条件を模倣するか、もしくは表すように選択され得る）よりも少なくとも１０倍もしくはそれ以上またはより好ましくは少なくとも１００倍速く切断される。
【００２９】
切断性連結基は、切断因子、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在に対して感受性である。一般的に、切断因子は、細胞内部において血清中または血中よりも多く見られるか、または高レベルもしくは高活性でみられる。かかる分解性因子の例としては：特定の基質に対して選択された、もしくは基質特異性を有しない酸化還元因子、例えば、酸化酵素もしくは還元酵素、または細胞内に存在し、還元によって酸化還元型切断性連結基を分解させ得る還元剤、例えばメルカプタンなど；エステラーゼ；アミダーゼ；エンドソームまたは酸性環境をもたらし得る因子、例えば、５またはそれ以下のｐＨをもたらすもの；一般酸として作用することにより酸型切断性連結基を加水分解もしくは分解させ得る酵素、ペプチダーゼ（これは基質特異的であり得る）、およびプロテアーゼ、ならびにホスファターゼが挙げられる。
【００３０】
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断性連結基を含むものであり得る。リンカーに組み込まれる切断性連結基の型は、標的化対象の細胞に依存し得る。例えば、肝臓標的化配位子はカチオン性脂質に、エステル基を含むリンカーを介して連結され得る。肝臓細胞はエステラーゼ含有量が高く、したがって、前記リンカーは、肝臓細胞内においてエステラーゼ高含有でない細胞型より効率的に切断される。エステラーゼ含有量が高い他の細胞型としては肺、腎皮質および精巣の細胞が挙げられる。ペプチド結合を含むリンカーは、ペプチダーゼ含有量が高い細胞型、例えば、肝臓細胞および滑膜細胞を標的化する場合に使用され得る。
【００３１】
一部の実施形態では、切断性連結基は、細胞内（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）において、血中もしくは血清中（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比べて少なくとも１．２５、１．５、１．７５、２、３、４、５、１０、２５、５０または１００倍速く切断される。一部の実施形態では、該切断性連結基は、血中（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件）において、細胞内（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比べて９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％，２０％、１０％、５％または１％少なく切断される。
【００３２】
例示的な切断性連結基は、これに限定されるものではないが、酸化還元型切断性連結基（例えば、−Ｓ−Ｓ−および−Ｃ（Ｒ）２−Ｓ−Ｓ−、ここで、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、少なくとも１つのＲはＣ１〜Ｃ６アルキル、例えば、ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３である）；ホスフェートベースの切断性連結基（例えば、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（  Ｒ）−Ｓ−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、および−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−であり、ここで、Ｒは、任意選択で置換されている線形または分枝のＣ１〜Ｃ１０アルキル）；酸型切断性（ｃｅｌａｖａｂｌｅ）連結基（例えば、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステル、−Ｃ＝ＮＮ−および−ＯＣ（Ｏ）−）；エステルベースの切断性連結基（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）；ペプチドベースの切断性連結基、（例えば、細胞内でペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される連結基、例えば、−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−、ここで、ＲＡおよびＲＢは、隣接した２つのアミノ酸のＲ基である）を含む。ペプチドベースの切断性連結基は、２またはそれ以上のアミノ酸を有するものである。一部の実施形態では、ペプチドベースの切断結合は、細胞内にみられるペプチダーゼまたはプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を有するものである。
【００３３】
一部の実施形態では、酸型切断性連結基は、約６．５またはそれ以下（例えば、約６．５、６．０、５．５、５．０もしくはそれ以下）のｐＨの酸性環境において、または一般酸として作用し得る薬剤、例えば酵素によって切断可能なものである。
本発明によるリンカーは、２またはそれ以上の炭素分子を有する部分などを含むもの、例えば、エチレンジアミン、エチレングリコール、グリシン、β−アラニン、および分子量が約４４〜約２００ｋＤのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。さらに、本開示により、前記白金部分および／または前記脂質は、前記リンカー分子との連結のための官能基を有するように修飾してもよいことは理解されよう。
【００３４】
本明細書に開示した種々の態様の一部の実施形態において、前記リンカーは−Ｘ−ＣＨ２−Ｘ２−Ｘ１−であり、ここで、ＸはＮＨであり；Ｘ１はＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｏ（ＣＨ２）−Ｏ、ＮＨ、またはＯであり；Ｘ２は（ＣＨ２）ｎまたはＣ（Ｏ）であり；ｎは０、１、２、３、４、または５である。
【００３５】
他の一部の実施形態では、前記リンカーは−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｍＯ−、−（ＣＨ２）ｎＯ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＯ−、または−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｏ−であり；ｎおよびｍは独立して、０、１、２、３、４、または５である。
【００３６】
さらに他の一部の実施形態では、前記リンカーは−Ｘ３−Ｘ４Ｘ５−Ｘ６−であり、ここで、Ｘ３はＣＨ、ＣＨ２、またはＯであり；Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６は独立して、同じであるか、または異なっており、−ＣＨ２Ｏ−またはＯである。
【００３７】
また他の一部の実施形態では、前記リンカーは−ＣＨ２Ｏ−である。
【００３８】
一部の実施形態では、前記リンカーは、結合、−Ｏ−、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ２−、＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、およびその任意の組合せから成る群から選択される。
【００３９】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質の水溶性の塩は、脂質または脂質に共有結合させたリンカーを：ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＲｂＯＨ、ＣｓＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｓｒ（ＯＨ）２、Ｂａ（ＯＨ）２、およびその任意の組合せから成る群から選択される塩基と反応させることにより得られ得る。一部の実施形態では、脂質または脂質に共有結合させたリンカーをＬｉＯＨと反応させて前記脂質の前記水溶性の塩を得る。
【００４０】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記水溶性白金化合物は、式Ｖ：
【表５】
2018520206.tif 000007
で表されるものであり、
式中、
【００４１】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は独立して、ハライド、アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、Ｈ２Ｏ、アルコキシ、チオール、チオアルキル、Ｏ−アシル、およびその任意の組合せから成る群から選択される。
【００４２】
Ｘ１およびＸ２は単座配位または二座配位の配位子であり得る。一部の実施形態では、Ｘ１およびＸ２はアミノ、例えば、ＮＨ３またはジアミノシクロヘキシル（ＤＡＣＨ）である。一部の実施形態では、Ｘ３およびＸ４は各々、Ｈ２Ｏである。一部の特定の例示的な実施形態では、前記水溶性白金化合物は、式中においてＸ１およびＸ２は二座配位のアミノ配位子を構成しており、Ｘ３およびＸ４は各々、ハライドを有する式Ｖの白金化合物をＡｇＮＯ３およびＨ２Ｏと反応させることにより得られるものである。この工程の一部の実施形態では、Ｘ１およびＸ２はＤＡＣＨであり、Ｘ３およびＸ４は各々、Ｃｌである。
【００４３】
本開示の本発明の方法は、種々の脂質コンジュゲート型白金化合物を合成するために使用され得る。一部の特定の例示的な実施形態では、前記脂質コンジュゲート型白金化合物は、式Ｖ：
【表６】
2018520206.tif 000008
で表されるものであり、
式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は独立して、ハライド、アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、チオール、チオアルキル、Ｏ−アシル、およびその任意の組合せから成る群から選択される。
【００４４】
一部の実施形態では、本明細書に開示している脂質コンジュゲート型白金化合物は、式（ＶＩ）：
【表７】
2018520206.tif 000009
で表されるものであり、
式中、
ＸはＮＨであり；
Ｘ１は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、ＮＨ２、およびＯＨを有する群から選択され；
Ｘ２は（ＣＨ２）ｎまたはＣＯであり；
Ｘ３は、（ＣＨ２）ｎ、ＣＨ２−ＮＨ、およびＣ４Ｈ８を有する群から選択され；
Ｘ４はＣＯまたは−ＣＨ−ＣＨ３であり；
Ｚは、式中において白金が式ＶＩの環の一部を形成している式Ｖによる白金化合物であり；
ｎは０、１、または２である。
【００４５】
他の一部の実施形態では、本明細書に開示している脂質コンジュゲート型白金化合物は、式（ＶＩＩ）：
【表８】
2018520206.tif 000010
で表されるものであり、
式中、
ＸはＮＨまたはＮ−ＣＨ２ＣＯＯ−であり；
Ｘ１は、−（ＣＨ２）ｎＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｎＯＨ、（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎＯＨ、および（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨを有する群から選択され；
Ｚは、式中において白金が式ＶＩＩの環の一部を形成している式Ｖによる白金化合物であり；
ｎは０、１、または２である。
【００４６】
一部の実施形態では、本明細書に開示している脂質コンジュゲート型白金化合物は、式（ＶＩＩＩ）：
【表９】
2018520206.tif 000011
で表されるものであり、
式中、
Ｘは、Ｓ＋、Ｃ、Ｓ＋＝Ｏ、Ｎ＋Ｈ、およびＰ＝Ｏを有する群から選択され；
Ｘ１は、−ＣＨ、−ＣＨ２、および−ＣＨ２Ｏを有する群から選択され；
Ｘ２はＣ＝Ｏであり；
Ｘ３は、ＣＨ、ＣＨ２、またはＯから選択され；
Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６は、−ＣＨ２ＯまたはＯから選択され
Ｚは、式中において白金が式ＶＩＩＩの環の一部を形成している式Ｖによる白金化合物である。
【００４７】
一部の実施形態では、本明細書に開示している脂質コンジュゲート型白金化合物は、式（ＩＸ）：
【表１０】
2018520206.tif 000012
で表されるものであり、
式中、
ＸはＣＨ２ＯＨであり；
Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり；
Ｘ２はＣ＝Ｏであり；
Ｚは、式中において白金が式ＩＸの環の一部を形成している式Ｖによる白金化合物であり；
ｎは０、１、または２である。
【００４８】
式（ＶＩ）の例示的な化合物は、これに限定されるものではないが、以下の化合物を含む：式（ＶＩ）の化合物はすべて、図示していない硝酸（ＮＯ３−）対イオンを含んでいる。
【表１１】
2018520206.tif 000013
【表１２】
2018520206.tif 000014
【表１３】
2018520206.tif 000015
【表１４】
2018520206.tif 000016
【表１５】
2018520206.tif 000017
【表１６】
2018520206.tif 000018
【表１７】
2018520206.tif 000019
【００４９】
式（ＶＩＩ）の例示的な化合物は、これに限定されるものではないが、以下の化合物を含む：
【表１８】
2018520206.tif 000020
【表１９】
2018520206.tif 000021
【表２０】
2018520206.tif 000022
【表２１】
2018520206.tif 000023
【００５０】
式（ＶＩＩＩ）の例示的な化合物は、これに限定されるものではないが、以下の化合物を含む：
【表２２】
2018520206.tif 000024
【表２３】
2018520206.tif 000025
【表２４】
2018520206.tif 000026
【００５１】
式（ＩＸ）の例示的な化合物は、これに限定されるものではないが、以下の化合物を含む：
【表２５】
2018520206.tif 000027
【００５２】
また、本開示により、以下の化合物も提供する：
【表２６】
2018520206.tif 000028
【００５３】
本明細書に開示した種々の態様の一部の実施形態において、式（Ｖ）の白金化合物は、化合物４３〜６５および７３〜８５ならびに化合物９５を有する群から選択される。好ましい一実施形態では、Ｐｔ化合物はＤＡＣＨ−Ｐｔである。
【表２７】
2018520206.tif 000029
【表２８】
2018520206.tif 000030
【表２９】
2018520206.tif 000031
【表３０】
2018520206.tif 000032
【００５４】
上記の化合物において、特に規定していない限り、Ｒ１は−リンカー−脂質であり、ｎは１である。
【００５５】
本発明の一部の例示的な実施形態により、本開示の脂質コンジュゲート型白金化合物を有するナノ粒子、および前記ナノ粒子を作製するための方法を提供する。本開示の方法により、高い封入効率、高い薬物負荷、一様なサイズ、および良好な安定性が好都合にもたらされる。一部の特定の例示的な実施形態では、化学療法における使用のための、薬物負荷効率が高い化合物２５製剤の安定な凍結乾燥ペグ化両親媒性自己組織化超分子を作製するための方法を開示する。本発明の特徴を明確にするため、その実施の一例を、医薬品有効成分と医薬品非有効成分の種々のｍｏｌ％で以下に本実施例において記載している。本実施例では、化合物２５を有する製剤を説明しているが、本開示において説明した任意の脂質コンジュゲート型白金化合物で置き換えて本発明のナノ粒子が作製され得ることは理解されよう。
【００５６】
一部の特定の例示的な実施形態では：ナノ粒子を調製するための方法であって、白金部分と前記白金部分に連接された脂質とを有する白金化合物をコリピド（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）と溶媒の存在下で混合し、ナノ粒子を得ることを有する方法を開示する。一部の特定の例示的な実施形態では、前記白金化合物は、本明細書に開示した方法に従って調製される。一部の特定の例示的な実施形態では、前記溶媒は、クロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、エタノール、およびその任意の組合せを有する群から選択される。一部の特定の例示的な実施形態では、前記コリピドは、ダイズホスファチジルコリン（完全水添型）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｌｏｎａｍｉｎｅ）−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイル（ｄｉｐａｌｍｉｐｏｙｌ）ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、およびその任意の組合せから成る群から選択される。一部の特定の例示的な実施形態では、該ナノ粒子の調製方法はさらに、乾燥工程と、インキュベーション工程と、任意選択の安定剤添加工程とを有する。一部の特定の例示的な実施形態では、前記安定剤は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２、ＰＥＧ、無機塩、糖質、およびその任意の組合せから成る群から選択される。一部の特定の例示的な実施形態では、前記無機塩は、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、およびその任意の組合せから成る群から選択される。一部の特定の例示的な実施形態では、前記糖質は、グルコース、デキストロース、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラクトース、およびその任意の組合せから成る群から選択される。一部の特定の例示的な実施形態では、前記コリピドは、ダイズホスファチジルコリン（水添型）（ＨＳＰＣ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を有する。一部の特定の例示的な実施形態では、前記白金化合物（Ｐｔ）と前記コリピド（Ｐｔ：ＨＳＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）のｍｏｌ％比は約３０〜３２：５５〜６０：４〜５、または約３０：５５：４〜約３２：６０：５である。一部の特定の例示的な実施形態では、前記白金化合物（Ｐｔ）と前記コリピド（Ｐｔ：ＨＳＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）のｍｏｌ％比は約４〜５：３０〜３２：５５〜６０、または約４：３０：５５〜約５：３２：６０である。一部の特定の例示的な実施形態では、前記コリピドは、ダイズホスファチジルコリン（水添型）（ＨＳＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を有する。一部の特定の例示的な実施形態では、前記白金化合物（Ｐｔ）と前記コリピド（Ｐｔ：ＨＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）のｍｏｌ％比は約２０〜３５：６０〜７０：３〜１５：１〜５、または約２０：６０：３：１〜約３５：７０：１５：５である。一部の特定の例示的な実施形態では、前記白金化合物（Ｐｔ）と前記コリピド（Ｐｔ：ＨＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）のｍｏｌ％比は約１〜５：２０〜３５：６０〜７０：３〜１５、または約１：２０：６０：３：１〜約５：３５：７０：１５である。一部の実施形態では、ＨＳＰＣ：ＣＨＯＬ：Ｐｔ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のｍｏｌ％比は５５：３：３８：４ｍｏｌ％である。
【００５７】
一部の特定の例示的な実施形態では、前記コリピドはＤＯＰＥである。前記白金化合物（Ｐｔ）と該ＤＯＰＥ脂質のｍｏｌ％は２０〜３５：３０〜５０の範囲であり得る。一部の特定の実施形態では、前記白金化合物（Ｐｔ）と該ＤＯＰＥ脂質のｍｏｌ％は２２．５〜２７．５：３５〜５０の範囲であり得る。諸実施形態では、前記白金化合物（Ｐｔ）と該ＤＯＰＥ脂質のｍｏｌ％は約４０：２５である。一部の特定の例示的な実施形態では、前記コリピドは、ＤＯＰＥ、ダイズホスファチジルコリン（水添型）（ＨＳＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を有する。一部の実施形態では、前記コリピドはＤＯＰＥとＨＳＰＣであり、ＤＯＰＥとＨＳＰＣのｍｏｌ％比は約３０〜５０：２５〜３５または約３０：２５〜約５０：３５である。一部の実施形態では、前記コリピドはＤＯＰＥとコレステロールであり、ＤＯＰＥ対コレステロールのｍｏｌ％比は約３０〜５０：１〜５または約３０：１〜約５０：５である。一部の実施形態では、前記コリピドはＤＯＰＥとＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００であり、ＤＯＰＥ対ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のｍｏｌ％比は約３０〜５０：１〜１０  約３０：１〜５０：４である。一部の特定の例示的な実施形態では、前記白金化合物（Ｐｔ）と前記コリピド（Ｐｔ：ＤＯＰＥ：ＨＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）のｍｏｌ％比は約２０〜４０：３０〜５０：２５〜３５：３〜１５：１〜５である。一実施形態では、Ｐｔ：ＤＯＰＥ：ＨＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のｍｏｌ％比は約２５：４０：２８：３：４である。
【００５８】
一部の特定の例示的な実施形態は、一連の白金ベースナノ粒子の合成に関するものであり、ここで、前記ジアミノ（ｄｉａｍｍｉｎｏ）シクロヘキシル−Ｐｔ（ＤＡＣＨ−Ｐｔ）は、カルボン酸によるモノカルボキシル化共有結合およびアミド酸素との配位結合を有するものである。ジカルボニル分子（ジカルボン酸）、例えば、コハク酸、マロン酸、およびシュウ酸が使用され、これらは、それぞれ、最終的に白金（ＩＩ）と７、６、および５員環を形成する。該白金環とコレステロール間のリンカーにより、カルバメート結合（化合物１、２、３）、エーテル結合（化合物６、４、５）など、またはその任意の組合せを有する群から選択される結合の形成が補助される。したがって、本開示の実施形態の一部のものは、一般骨格：脂質−リンカー−ジカルボニルで表される化合物に関する。このような分子を使用し、白金化合物、例えば、ＤＡＣＨ−Ｐｔ、オキサリプラチン、シスプラチン、白金含有カルベン、または他の白金酸塩および白金化合物を共有結合および／または配位結合によって錯体化する。
【００５９】
本開示の一実施形態では、白金ベース化合物のいくつかの異形型、例えば、ラセミ化合物、ジアステレオマーなどもまた提供する（例えば、化合物１〜６）。
【００６０】
本開示の一実施形態では、２つのカルボニル基を有する任意の分子が使用され得る。一実施形態では、該ジカルボニル分子はジカルボン酸、例えば、コハク酸、マロン酸、またはシュウ酸などである。
【００６１】
また、本開示により、１またはそれ以上の本明細書に記載の白金ベース化合物を有する粒子を提供する。一般的に、本明細書に開示した粒子は、任意の形状または形態のもの、例えば、球形、棒状、楕円形、柱状、カプセル、または円板状であり得；このような粒子は網目または凝集体の一部であってもよい。
【００６２】
一部の実施形態では、該粒子はマイクロ粒子またはナノ粒子である。本明細書で用いる場合、用語「マイクロ粒子」は約１μｍ〜約１０００μｍの粒径を有する粒子をいう。本明細書で用いる場合、用語「ナノ粒子」は約０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍの粒径を有する粒子をいう。一般的に、該粒子は、ｎｍからミリメートルまでの任意のサイズを有するものである。一部の実施形態では、該粒子は約５ｎｍ〜約５０００ｎｍの範囲の平均直径を有するものであり得る。一部の実施形態では、該粒子は約５０ｎｍ〜約２５００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約１５０ｎｍ〜約１７００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約１５００ｎｍ、または約２６０ｎｍの平均直径を有するものである。一部の実施形態では、該粒子は約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍまたは約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍの平均直径を有するものである。一部の実施形態では、該粒子は約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約７００ｎｍ、または約３００ｎｍ〜約７００ｎｍの平均直径を有するものである。
【００６３】
一部の実施形態では、該粒子は約５０〜約１０００ｎｍの平均サイズを有するものである。さらなる一実施形態では、本発明のナノ粒子は約５０〜約５００ｎｍの範囲である。別の実施形態では、本発明のナノ粒子は約５０〜約２００ｎｍの範囲である。一実施形態では、該粒子は約５０〜約１００ｎｍのサイズを有するものである。
【００６４】
当業者には、粒子は通常、記載の「サイズ」前後で粒径の分布を示すことが理解されよう。特に記載のない限り、用語「粒径」は、本明細書で用いる場合、粒子のサイズ分布様式、すなわち、サイズ分布において最も高頻度に存在している値をいう。粒径を測定するための方法は当業者にわかり、例えば、動的光散乱（例えば、光子相関分光法、レーザー回折、小角度レーザー光散乱（ＬＡＬＬＳ）、および中角度（ｍｅｄｉｕｍ−ａｎｇｌｅ）レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ））、光遮蔽法（例えば、コールター分析方法）、または他の手法（例えば、レオロジー、および光学顕微鏡検査もしくは電子顕微鏡検査）によるものである。
【００６５】
一部の実施形態では、該粒子は実質的に球形であり得る。「実質的に球形」によって意図しているのは、該粒子の断面の直交する軸の最長の長さ対最短の長さの比が約１．５以下であるということである。実質的に球形であることは対称中心線を要するものではない。さらに、該粒子は、該粒子の全体サイズと比べたとき小規模の表面テクスチャリング、例えば、線または凹部または凸部を有していてもよいがなお実質的に球形であり得るものである。一部の実施形態では、該粒子の最長軸と最短軸の長さの比は約１．５以下、約１．４５以下、約１．４以下、約１．３５以下、約１．３０以下、約１．２５以下、約１．２０以下、約１．１５以下、約１．１以下である。理論に拘束されることを望まないが、実質的に球形である粒子同士の表面接触は最小限であり、これにより、保存時の粒子の望ましくない凝塊形成が最小限になる。多くの結晶または薄片は平坦面を有し、これは大きな接触表面積を許容し得、このとき、凝塊形成がイオン的または非イオン的相互作用によって起こり得る。球体によって許容される接触はずっと小さい面積におけるものである。
【００６６】
一部の実施形態では、該粒子は実質的に同じ粒径を有するものである。比較的大きな粒子と小さな粒子の両方が存在する広いサイズ分布を有する粒子では、小粒子が大粒子間の隙間に入り込むことが可能になり、それにより、新な接触表面が作り出される。広いサイズ分布では、凝塊結合する多くの接触機会が作り出されることにより大球体がもたらされ得る。本明細書に記載の粒子は狭いサイズ分布のものであり、それにより凝塊接触の機会が最小限となる。「狭いサイズ分布」によって意図しているのは、球形小粒子の９０位パーセンタイルの体積基準直径対１０位パーセンタイルの体積基準直径が５以下の比を有する粒径分布である。一部の実施形態では、球形小粒子の９０位パーセンタイルの体積基準直径対１０位パーセンタイルの体積基準直径は４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１．４５以下、１．４０以下、１．３５以下、１．３以下、１．２５以下、１．２０以下、１．１５以下、または１．１以下である。
【００６７】
また、幾何標準偏差（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ：ＧＳＤ）を用いて狭いサイズ分布を示してもよい。ＧＳＤの計算は、累積で１５．９％および８４．１％のパーセンテージ未満の有効カットオフ直径（ＥＣＤ）を求めることを伴った。ＧＳＤは、１５．９％未満のＥＣＤに対する８４．１７％未満のＥＣＤの比の平方根に等しい。ＧＳＤは、ＧＳＤ<２．５である場合、狭いサイズ分布を有する。一部の実施形態では、ＧＳＤは２未満、１．７５未満、または１．５未満である。一実施形態では、ＧＳＤは１．８未満である。
【００６８】
本明細書に開示した白金化合物に加えて、該粒子はコリピドおよび／安定剤を有するものであり得る。さらなる脂質は、さまざまな目的で、例えば、脂質の酸化を抑制するため、二層構造を安定化させるため、形成時の凝集を低減させるため、または粒子表面上に配位子を結合させるために該粒子に含められ得る。いくつかの任意のさらなる脂質および／または他の成分、例えば、両親媒性、中性、カチオン性、アニオン性の脂質、およびプログラマブル融合脂質を存在させてもよい。かかる脂質および／または成分は単独で使用しても組み合わせて使用してもよい。１またはそれ以上の粒子成分は、配位子、例えば標的化配位子を有するものであり得る。
【００６９】
一部の実施形態では、該粒子はさらにリン脂質を有する。これに限定されるものではないが、該リン脂質は、天然起源のもの、例えば、卵黄もしくはダイズのリン脂質、または合成もしくは半合成起源のものであり得る。該リン脂質は、ホスファチジルコリン、６〜２２個の炭素原子を有する規定のアシル基を有するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、またはホスファチジルグリセロールの純粋な画分または混合物を有するように部分精製または分画され得る。好適なリン脂質は、これに限定されるものではないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、レシチン、β，γ−ジパルミトイル−α−レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、Ｎ−（２，３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））−プロプ−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ケファリン、カルジオリピン、セレブロシド、リン酸ジセチル、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン、ジ−ステアロイル−ホスファチジルコリン、ステアロイル−パルミトイル−ホスファチジルコリン、ジ−パルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ミリストイル−ホスファチジルセリン、ジ−オレイル−ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセム−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、およびその任意の組合せを含む。また、リン無含有脂質も使用され得る。このようなものは、例えば、ステアリルアミン、ドデシル（ｄｏｃｅｃｙｌ）アミン、アセチルパルミテート、脂肪酸アミドなどを含む。他の無リン化合物、例えば、スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸もまた使用され得る。
【００７０】
一部の実施形態では、該粒子中のリン脂質は、１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジエルコイル（ｄｉｅｒｕｃｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ナトリウム塩）；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン；１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ナトリウム塩）；１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ナトリウム塩）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ナトリウム塩）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（アンモニウム塩）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ナトリウム塩）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ナトリウム塩）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ナトリウム塩）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（アンモニウム塩）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ナトリウム／アンモニウム塩）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ナトリウム塩）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ナトリウム塩）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ナトリウム塩）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ナトリウム塩）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ナトリウム塩）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ナトリウム塩）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（アンモニウム塩）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ナトリウム塩）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ナトリウム塩）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ナトリウム塩）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（アンモニウム塩）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ナトリウム塩）；Ｅｇｇ−ＰＣ；水添卵ＰＣ；水添ダイズＰＣ；１−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ３−ホスホコリン；１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）；１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；および１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンから成る群から選択される。一部の実施形態では、該リン脂質はＳＰＯＣ、卵ＰＣ、または水添ダイズＰＣ（ＨＳＰＣ）である。一例では、前記組成物中の該リン脂質はＨＳＰＣである。一部の実施形態では、前記脂質はＤＯＰＥである。
【００７１】
一部の実施形態では、該粒子はさらにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有する。ＰＥＧは、該粒子中に単独で含めてもよく、該粒子中に存在させる成分とコンジュゲートさせてもよい。例えば、該ＰＥＧは、該粒子の該白金ベース化合物またはコリピド／安定剤成分とコンジュゲートさせ得る。一部の実施形態では、該ＰＥＧは、該粒子のコリピド成分とコンジュゲートさせる。これに限定されるものではないが、該ＰＥＧは任意のコリピドとコンジュゲートさせ得る。例えば、ＰＥＧコンジュゲート型コリピドは、ＰＥＧコンジュゲート型のジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロール、ＰＥＧ−コンジュゲート型ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸にコンジュゲートさせたＰＥＧ、ＰＥＧコンジュゲート型セラミド（米国特許第５，８８５，６１３号明細書参照）、ＰＥＧコンジュゲート型ジアルキルアミン、ＰＥＧコンジュゲート型１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミン、および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセム−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）にコンジュゲートさせたＰＥＧ、ならびにその任意の組合せから成る群から選択され得る。一部の実施形態では、該ＰＥＧコンジュゲート型脂質は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセム−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）である。
【００７２】
一部の実施形態では、該粒子はさらに界面活性剤を有する。界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソームなどの製剤において広範な用途がみられる。多くの異なる型の界面活性剤（天然および合成のどちらも）の特性を分類およびランキングする最も一般的な様式は、親水／親油バランス（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ｂａｌａｎｃｅ）（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部」としても知られる）の性質は、製剤に使用される種々の界面活性剤をカテゴリー分類するための最も有用な手段をもたらす（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【００７３】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、これは非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品において広範な用途がみられ、広範囲のｐＨ値で使用可能である。一般に、そのＨＬＢ値は、その構造にもよるが２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤は、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルを含む。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的な構成員である。
【００７４】
界面活性剤分子が、水中に溶解または分散させたときに負電荷を担持している場合、この界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤は、カルボン酸塩、例えば石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えばアルキル硫酸塩およびエトキシル化アルキル硫酸塩、スルホン酸塩、例えばアルキルベンゼンスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウリン塩、ならびにスルホコハク酸塩、ならびにリン酸塩を含む。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員はアルキル硫酸塩および石鹸である。
【００７５】
界面活性剤分子が、水中に溶解または分散させたときに正電荷を担持している場合、この界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤は、第４級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンを含む。第４級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用されている構成員である。
【００７６】
界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれかを担持する能力を有するものである場合、この界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドを含む。
【００７７】
薬物製剤品、製剤およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は概説されている（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５のＲｉｅｇｅｒ）。
【００７８】
一部の実施形態では、該粒子は、さらにカチオン性脂質を有するものであり得る。例示的なカチオン性脂質は、これに限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃ１）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃ１）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、もしくは３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）もしくはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１'−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ  Ｇｉ）、またはその混合物を含む。
【００７９】
一部の実施形態では、該粒子はさらに非カチオン性脂質を有する。非カチオン性脂質はアニオン性脂質または中性脂質であり得、これに限定されるものではないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物を含む。
【００８０】
また、粒子の凝集を抑止するコンジュゲート型脂質を本明細書に開示した粒子に含めてもよい。かかる脂質は、これに限定されるものではないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質（これに限定されるものではないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはその混合物を含む）を含む。該ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であり得る。粒子の凝集を抑制するコンジュゲート型脂質は、該粒子中に存在している全脂質の０．０１ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％または約２ｍｏｌ％であり得る。
【００８１】
一部の実施形態では、該粒子はリポソーム、小胞、またはエマルジョンの形態である。本明細書で用いる場合、用語「リポソーム」は、脂質層に封入された任意のコンパートメントを包含している。リポソームは１またはそれ以上の脂質膜を有するものであり得る。リポソームは膜の型およびサイズによって特徴づけられ得る。小型単層小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶｓ）は、単一の膜を有し、典型的には直径が０．０２〜０．０５μｍの範囲であり；大型単層小胞（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ：ＬＵＶＳ）は典型的には０．０５μｍより大きい。オリゴラメラ大型小胞およびマルチラメラ小胞は多数の、通常、同心の膜層を有し、典型的には０．１μｍより大きい。いくつかの非同心膜を有する、すなわち、大きな小胞内に含有されたいくつかの小さな小胞を有するリポソームは多胞体小胞と称される。
【００８２】
リポソームを形成するために、前記脂質分子は、細長い無極性（疎水性）部分と極性（親水性）部分を有する。該分子の疎水性部分と親水性部分は好ましくは、細長い分子構造の両端に位置する。かかる脂質は、水中に分散されると、ラメラと称される二層膜を自然に形成する。ラメラは脂質分子の２つの単層シートで構成され、その無極性（疎水性）表面は互いに対向し、その極性（親水性）表面は水性媒体と対向する。前記脂質によって形成された膜は水相部分を、細胞内容物を封入している細胞膜と同様の様式で封入している。したがって、リポソームの二層は、細胞膜と類似性を有するが細胞膜に存在するタンパク質成分はない。
【００８３】
リポソーム組成物は、当該技術分野で知られたさまざまな方法によって調製され得る。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，８９７，３５５号明細書および同第５，１７１，６７８号明細書；公開ＰＣＴ出願ＷＯ９６／１４０５７およびＷＯ９６／３７１９４；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（１９８７）８：７４１３−７４１７，Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９６５）２３：２３８，Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７９）５５７：９，Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７８）７５：４１９４，Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８４）７７５：１６９，Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８３）７２８：３３９，およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９８４）１１５：７５７（これらの内容はすべて、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００８４】
リポソームは、選択したサイズ範囲内で実質的に均一なサイズを有するように調製され得る。有効なサイジング方法の一例は、リポソームの水性懸濁液を、選択した一様な孔径を有する一連のポリカーボネート膜に通して押出すことを伴うものである；該膜の孔径は、この膜に通す押出しによって作製されるリポソームの最大サイズにほぼ対応するものである。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号明細書（この内容は、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００８５】
理論に拘束されることを望まないが、本明細書に開示したナノ粒子は、がん細胞内においてシスプラチンおよびオキサリプラチンと比べて高い白金取込みを有する。一部の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｍｅｎｔｓ）では、本明細書に開示したナノ粒子は、がん細胞内において等価投薬量のシスプラチンまたはオキサリプラチンと比べて約２５％、約５０％、約７５％、約１倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、またはそれより高い白金取込みを有する。
【００８６】
また、本明細書に開示したナノ粒子は、等価量で投与したとき、シスプラチンおよびオキサリプラチンと比べて高い組織（例えば、これに限定されるものではないが、腫瘍）内白金蓄積を有する。例えば、本明細書に開示したナノ粒子は、等価量で投与したとき、シスプラチンまたはオキサリプラチンと比べて約２５％、約５０％、約７５％、約１倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、またはそれより高い組織内白金蓄積を有する。
【００８７】
定義
便宜上、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において本明細書で用いている一部の特定の用語をここに集める。特に記載のない限り、または文脈により黙示的でない限り、以下の用語および語句は、以下に示す意味を含む。そうでないことを明示していない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、該用語または語句が関連技術分野において獲得した意味を排除しない。本定義は、具体的な実施形態の説明を補助するために示したものであり、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため請求項に記載の発明を限定することを意図するものではない。さらに、文脈から必要とされない限り、単数形の用語は複数形を包含しているものとし、複数形の用語は単数形を包含しているものとする。
【００８８】
特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が関する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。任意の既知の方法、デバイス、および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、本件に関する方法、デバイス、および材料を本明細書において説明する。
【００８９】
本明細書で用いる場合、用語"ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を有する）"または"ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（〜を有する）"は、本発明に必須である組成物、方法、およびそのそれぞれの成分（１または複数）に関して用いているが、包含的表現であり、明記されていない要素（必須であれ、そうでなかれ）を含む。
【００９０】
本明細書で用いる場合、用語"ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的に〜からなる）"は、所与の実施形態に必要とされる要素をいう。この用語は、本発明の該実施形態の基本的で新規な、または機能的な特徴（１または複数）に実質的に影響しない要素の存在を許容する。
【００９１】
単数形の用語"ａ"、"ａｎ"および"ｔｈｅ"は、本文中にそうでないことが明示されていない限り、複数の指示対象物を含む。同様に、語"ｏｒ（または／もしくは）"は、本文中にそうでないことが明示されていない限り、"ａｎｄ（および／ならびに）"  を含むことを意図する。
【００９２】
本実施例以外またはそうでないことを示している箇所以外、本明細書で用いている成分または反応条件の量を示す数値はすべて、すべての場合において用語「約」で修飾されていると理解されたい。用語「約」は、パーセンテージに関して用いている場合、記載された値の±１％を意味し得る。例えば、約１００は９９〜１０１を意味する。
【００９３】
本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料を以下に説明する。用語"ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（〜を有する）"は、"ｉｎｃｌｕｄｅｓ（〜を含む）"を意味する。略語"ｅ．ｇ．（例えば）"は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａ（例えば）に由来し、本明細書において非限定的な例を示すために用いている。したがって、略語"ｅ．ｇ．"は、用語"ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ（例えば）"と同義である。
【００９４】
用語「置換されている」は、前に用語「任意選択で」があろうがなかろうが、所与の構造内の水素原子団が明記された置換基の原子団で置き換えられていることをいう。任意の所与の構造内の１より多くの位置が、明記された群から選択される１より多くの置換基で置換され得る場合、該置換基は同じであるか、または位置ごとに異なるかのいずれかであり得る。本明細書で用いる場合、用語「置換されている」は、有機化合物の考えられ得るすべての置換基を含むことを想定している。広い態様において、許容置換基は、有機化合物の非環式および環式、分枝および非分枝、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族の置換基を含む。窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／または該ヘテロ原子の結合価を満足する本明細書に記載の有機化合物の任意の許容置換基を有していてもよい。
【００９５】
本開示の諸実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示した厳密な形態に限定することを意図するものではない。本開示の具体的な実施形態および実施例を例示の目的で本明細書において説明したが、関連技術分野の当業者には認識されるように、本開示の範囲内において種々の等価な修正例が考えられ得る。例えば、方法工程または機能は所与の順番で示したが、択一的な実施形態では、異なる順番で機能を発揮させてもよく、機能を実質的に並行して発揮させてもよい。本明細書に示した本開示の教示を、適宜、他の手順または方法に適用してもよい。本明細書に記載の種々の実施形態を合わせてさらなる実施形態を得てもよい。本開示の諸態様を、必要であれば、上記の参考文献および用途の組成物、機能および概念が使用されるように修正し、本開示のまたさらなる実施形態を得てもよい。本開示内容に対するこれらおよび他の変更は、本詳細説明に鑑みて行われ得る。かかる修正例はすべて、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることを意図する。
【００９６】
本開示の任意の実施形態の具体的要素を合わせてもよく、他の実施形態の要素で置き換えてもよい。さらに、本開示の一部の特定の実施形態と関連している利点を該実施形態との関連において説明したが、他の実施形態も同様にかかる利点を示す場合もあり得、本開示の範囲に含まれるために、必ずしもすべての実施形態がかかる利点を示すものである必要はない。
【００９７】
実施例
以下の実施例により、本発明の一部の実施形態および態様の実例を示す。関連技術分野の当業者には、種々の修正、追加、置換えなどが、本発明の趣旨または範囲を改変することなく行われ得、かかる修正および変形は、以下の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲に包含されることが明らかであろう。以下の実施例は、本発明をなんら限定するものではない。
実施例１：例示的な合成手順の略図
【化３１】
2018520206.tif 000033
【００９８】
同様の手順を化合物２５〜２８および他の脂質コンジュゲート型白金化合物の合成に使用した。この例示的な手順は、該化合物のすべてで良好に機能した。追加の洗浄工程の導入により化合物２６の純度の９３％までの増大が補助された（表２）。
【表２】
2018520206.tif 000034
【００９９】
図１は、水とアセトンでの洗浄前の化合物２６のＨＰＬＣプロフィールを示し、図２は、水とアセトンでの洗浄後の化合物２６のＨＰＬＣプロフィールを示す。これは、洗浄することによって得られる最大純度である。
【０１００】
上記の例示的な化合物を合成するための詳細な方法は、ＷＯ／２０１４／２０１３７６として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４２３３９号に記載されており、これは、この参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
実施例２：化合物２５の中間体６までの改善された合成経路
化合物２５の多工程合成はＷＯ／２０１４／２０１３７６において知得され得る。配位子の合成のための工程数の削減により化合物２５（ＡＰＩ）の収率の増大が補助され得よう。この参考文献に記載の手順は中間体６に達するのに６工程を伴うものであるが、本明細書に開示する手順は同じ中間体に達するのに２工程である。中間体６の全収率は、参考文献に記載の手順（スキーム１）では１３％である。新しい本経路（スキーム５）では中間体６の収率の有意な増大が観察された（５０％）。
【化３２】
2018520206.tif 000035
【化３３】
2018520206.tif 000036
【化３４】
2018520206.tif 000037
【０１０２】
経路１Ｂ（スキーム３Ｂ）の実験の詳細：２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（５．０ｇ，２５ｍｍｏｌ）を分割して、ブロモ酢酸エチル（８．６ｍｌ，７５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１７．５ｍｌ，１００ｍｍｏｌ）および３０ｍｌの乾燥アセトニトリルの混合物に０℃で添加した。混合物を室温で２０時間撹拌し、次いで濾過し、回転式エバポレータで濃縮した。カラムクロマトグラフィーを行い（酢酸エチル：ヘキサン＝１：３で溶出）、５．６ｇ（７７％）のターシャリーブロモジエステルアミンを得た。
【０１０３】
コレステロール（１．０ｇ，２．５９ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（新鮮蒸留済）（１５ｍｌ）溶液（２５℃）を室温にてＮ２雰囲気下で１０分間撹拌した。次に、ＡｇＯＴｆ（１．０ｇ，３．８８ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌を１０分間継続した。次いで、ターシャリーブロモジエステルアミン（１．１４ｇ，３．８８ｍｍｏｌ）の５ｍｌのＤＣＭ中の溶液を反応混合物に滴下した。室温で２０時間の撹拌後、混合物をＥｔ３Ｎで中和し、クロロホルムで希釈し、濾過した。これを濃縮し、カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）によって精製した。収量＝１．０ｇ（６４％）。
【化３５】
2018520206.tif 000038
【化３６】
2018520206.tif 000039
【化３７】
2018520206.tif 000040
【０１０４】
実験手順：コレステロール（１０ｇ，２５．８６ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの乾燥ＤＭＦ／ＴＨＦ（１：１）に溶解させ、６０％水素化ナトリウム（ｗ／ｗ）の鉱油（６．２ｇ，１５５．１７ｍｍｏｌ）溶液を添加した後、１０分間撹拌した。２−ブロモ−１，１−ジメトキシエタン（９．２ｍｌ，７８ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を７０℃にて還流下で１８時間撹拌した。反応混合物を冷却し、水の添加によってクエンチした。有機層を酢酸エチルで抽出し、水で数回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、反応生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって（３％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンにて）精製した。収量＝８．８ｇ（７２％）。
【化３８】
2018520206.tif 000041
【０１０５】
実験手順：ＴＦＡ（２ｍｌ）を、化合物１（０．３５０ｇ，０．７３７ｍｍｏｌ）の２ｍｌのＤＣＭ中の溶液に添加し、混合物を室温で３時間撹拌した。混合物を１Ｎ  ＮａＯＨで中和し、ＤＣＭで２回抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、これを直接、次の工程で使用した。
【化３９】
2018520206.tif 000042
【０１０６】
実験手順：化合物２を、イミノ二酢酸ジエチル（０．１６１ｍｌ，０．９ｍｍｏｌ）を含有している３．２ｍｌのＭｅＯＨ：ＤＣＭ（１：１）に溶解させ、ＡｃＯＨ（０．２１４ｍｌ，３．７４ｍｍｏｌ）およびＮａＢＨ３ＣＮ（０．０９３ｇ，１．４８ｍｍｏｌ）を連続的に添加した。混合物を室温で１８時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈し、ＮａＨＣＯ３と水で２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン系を使用）によって精製した。収率＝７２％．
【化４０】
2018520206.tif 000043
【化４１】
2018520206.tif 000044
【０１０７】
実施例３：ＨＰＬＣ精製および分析
本開示の脂質コンジュゲート型白金化合物は、続いて、分取逆相ＨＰＬＣによって精製され得る。該化合物は、Ｃ１８固定相、ＮＨ２固定相またはＰｈｅｎｙｌ固定相を有するカラムで精製され得る。該化合物の一部のものは、Ｃ１８、Ｃ８、ＣｙａｎｏおよびＰＦＰ固定相において不安定であり、純度の推定に誤りが生じることがわかった。したがって、純度の推定は、該化合物が安定であることがわかっているＮＨ２カラムまたはＰｈｅｎｙｌカラムのいずれかで行う。
【０１０８】
Ｃ１８カラムでの精製は、９８％のメタノールと２％の水を有する移動相を用いた定組成法を伴う。２１０ｎｍにおけるＵＶ吸光度をモニタリングする。化合物ピークを収集し、プールし、溶媒をエバポレーションと凍結乾燥によって除去すると、>９９．５％の純粋な化合物が粉末形態で得られる。
【０１０９】
ＮＨ２またはＰｈｅｎｙｌカラムでの精製は、より高いパーセンテージの水で開始し、より高いパーセンテージのメタノールまで経時的に線形的に進行させる勾配法を伴う。２１０ｎｍにおけるＵＶ吸光度をモニタリングする。化合物ピークを収集し、プールし、溶媒をエバポレーションと凍結乾燥によって除去すると、>９９．５％の純粋な化合物が粉末形態で得られる。
【０１１０】
純度の推定のための分析方法はＮＨ２またはＰｈｅｎｙｌ固定相を用いて行う。化合物をメタノール（>１ｍｇ／ｍＬ）に溶解させる。分析は、水／メタノール勾配およびＵＶ／ＰＤＡ検出器を２１０ｎｍで用いて行う。純度は、全ピーク面積から化合物のピーク面積のパーセンテージを計算することにより測定される。ゴーストピークを考慮するため、分析は、純粋なメタノールのインジェクションのクロマトグラムをオーバーレイした後に行う。
【０１１１】
図３は、ＨＰＬＣ精製後の化合物２５の分析プロフィールを示す。図６Ａおよび６Ｂは、Ｃ１８カラムとＮＨ２カラムでの化合物２５のＨＰＬＣプロフィールの比較を示す。図４は、ＨＰＬＣ精製後の化合物２７の分析プロフィールを示す。図７Ａおよび７Ｂは、Ｃ１８カラムとＮＨ２カラムでの化合物２７のＨＰＬＣプロフィールの比較を示す。図５は、ＨＰＬＣ精製後の化合物２８の分析プロフィールを示す。
【０１１２】
実施例４：化合物２５を有するナノ粒子の作製方法
ダイズホスファチジルコリン（完全水添型，ＨＳＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、化合物２５および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）（５５：３：３８：４のｍｏｌ％比にした）をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１：１，ｖ／ｖ）混合物に溶解させた。すべての脂質溶液を丸底フラスコ内で均一に混合し、有機溶媒を回転式エバポレータによって蒸発させ、脂質膜を高真空下に４〜５時間維持した。次いで、この薄膜を、４０ｍＬの５％ラクトース溶液をこれに添加することにより水和させ、回転式水浴中で６５℃にて１．０時間回転させた。次に、水和した超分子を、逐次、フィルター支持体で支持した４００ｎｍ、２００ｎｍおよび１００ｎｍの孔径の膜（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）フィルター）に１０回通し、６５℃の循環式水浴と接続したＬＩＰＥＸ（商標）押出機（１００ｍＬ容）を用いて押出した。原子吸光分析装置（Ａｔｏｍｉｃ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＡＡＳ）でのＰｔの測定は、この製剤の最終Ｐｔ当量が２．３３ｍｇ／ｍＬであり、化合物２５の封入効率％が３２．７ｍｏｌ％であることを示す。
【０１１３】
前述の超分子製剤を、１６〜２０時間にわたって凍結乾燥させた（５％ラクトース溶液を抗凍結剤として使用した）。その後に形成された白色固形物粉末を、必要容量の滅菌注射用水を添加することにより再構成した。再構成したこの超分子製剤のＤＬＳ試験は、凍結乾燥前に有していたものと同様のサイズ、ＰＤＩ、表面電位の超分子を示す。
【０１１４】
実施例５：化合物２５を有する蛍光ナノ粒子の作製方法
ＨＳＰＣ、ＣＨＯＬ、化合物２５、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＬｉｓｓ  Ｒｈｏｄ  ＰＥ（蛍光色素）（６１．０２：３．５５：３１．３２：３．５５：０．５６のｍｏｌ％比にした）をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１：１，ｖ／ｖ）混合物に溶解させた。すべての脂質溶液を丸底フラスコ（アルミホイルで覆う）内で均一に混合し、有機溶媒を回転式エバポレータによって蒸発させた。次いで、この薄膜を、２．５ｍＬの５％ラクトース溶液をこれに添加することにより水和させ、回転式水浴中で６５℃にて１．０時間回転させた。次に、水和した超分子を、逐次、フィルター支持体で支持した４００ｎｍ、２００ｎｍおよび１００ｎｍの孔径の膜（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）フィルター）に１０回通し、６５℃の循環式水浴と接続したＬＩＰＥＸ（商標）押出機（１０ｍＬ容）を用いて押出した。原子吸光分析装置（ＡＡＳ）でのＰｔの測定は、この製剤の最終Ｐｔ当量が１．２ｍｇ／ｍＬであり、化合物２５の封入効率％が２５ｍｏｌ％であることを示す。
【０１１５】
前述の超分子製剤を、１６〜２０時間にわたって凍結乾燥させた（５％ラクトース溶液を抗凍結剤として使用した）。その後に形成された白色固形物粉末を、必要容量の滅菌注射用水を添加することにより再構成した。再構成したこの超分子製剤のＤＬＳ試験は、凍結乾燥前に有していたものと同様のサイズ、ＰＤＩ、表面電位の超分子を示す。
【０１１６】
実施例６：化合物２５を有するナノ粒子の作製方法
ＨＳＰＣ、ＣＨＯＬ、化合物２５およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（６５．５７：１０．９３：２１．８６：１．６４のｍｏｌ％比にした）をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１：１，ｖ／ｖ）混合物に溶解させた。すべての脂質溶液を丸底フラスコ内で均一に混合し、有機溶媒を回転式エバポレータによって蒸発させた。次いで、この薄膜を、４ｍＬの５％スクロース溶液をこれに添加することにより水和させ、回転式水浴中で６５℃にて１．０時間回転させた。次に、水和した超分子を、逐次、フィルター支持体で支持した４００ｎｍ、２００ｎｍおよび８０ｎｍの孔径の膜（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）フィルター）に６５℃にて１１回通し、ホットプレート上に置いたＡｖａｎｔｉ押出機（１ｍＬ）を用いて押出した。超分子の製剤化後、押出し、これを、５％スクロース溶液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０）脱塩カラムに通し、種々の画分を収集した。超分子含有画分をまとめてプールし、遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ，３０ｋＤ）を３０００ｇで用いて最終容量３ｍＬまで１５分間濃縮した。原子吸光分析装置（ＡＡＳ）でのＰｔの測定は、この製剤の最終Ｐｔ当量が０．４３ｍｇ／ｍＬであり、化合物２５の封入効率％が１２．８ｍｏｌ％であることを示す。
【０１１７】
前述の超分子製剤を１６〜２０時間にわたって凍結乾燥させた（５％スクロース溶液を抗凍結剤として使用した）。その後に形成された白色固形物粉末を、必要容量の滅菌注射用水を添加することにより再構成した。再構成したこの超分子製剤のＤＬＳ試験は、凍結乾燥前に有していたものと同様のサイズ、ＰＤＩ、表面電位の超分子を示す。
【０１１８】
実施例７：化合物２５を有するナノ粒子の作製方法
ガラスバイアル内のＨＳＰＣ、ＣＨＯＬ、化合物２５、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（６２．５４：３．２４：３２．４５：１．７７のｍｏｌ％比にした）をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１：１，ｖ／ｖ）混合物に溶解させた。４ｍＬの５％ラクトース溶液を洋ナシ型丸底フラスコ内に入れ、これに有機相をゆっくり添加した。混合物を穏やかに１分間ボルテックスした。有機溶媒をＮ２フラッシングにより回転式エバポレータによって６５℃で１時間除去すると粘性懸濁液が得られた。これを、プローブ超音波装置を用いて５サイクル超音波処理した。次に、水和した超分子を、逐次、フィルター支持体で支持した４００ｎｍ、２００ｎｍおよび８０ｎｍの孔径の膜（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）フィルター）に６５℃にて９回通し、ホットプレート上に置いたＡｖａｎｔｉ押出機（１ｍＬ容）を用いて押出した。原子吸光分析装置（ＡＡＳ）でのＰｔの測定は、この製剤の最終Ｐｔ当量が１．５６ｍｇ／ｍＬであり、化合物２５の封入効率％が１９ｍｏｌ％であることを示す。
【０１１９】
前述の超分子製剤を、１６〜２０時間にわたって凍結乾燥させた（５％ラクトース溶液を抗凍結剤として使用した）。その後に形成された白色固形物粉末を、必要容量の滅菌注射用水を添加することにより再構成した。再構成したこの超分子製剤のＤＬＳ試験は、凍結乾燥前に有していたものと同様のサイズ、ＰＤＩ、表面電位の超分子を示す。
【０１２０】
実施例８：化合物２５の超分子製剤の特性評価
動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＤＬＳ）による超分子製剤の特性評価：実施例７で作製した製剤の累積粒径を動的光散乱法により、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いて測定した。５０μＬの製剤を１ｍＬまで脱イオン水を用いて希釈し、９０度の散乱角で２５℃にて測定を行い、平均粒径分布を得た。例示的な製剤のＤＬＳヒストグラムを図８に示す。図８からわかるように、平均粒径は約４０ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲であった。本発明の一実施形態による脂質コンジュゲート型白金化合物を有するナノ粒子の透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＴＥＭ）画像を図９に示す。ナノ粒子を、各画像におけるスケールバーからわかるとおり種々の倍率で示す。また、ゼータ電位も同じ機器Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳ９０を用いて測定した。ゼータ電位の測定結果を表３にまとめる。
【表３】
2018520206.tif 000045
【０１２１】
原子吸光分析（Ａｔｏｍｉｃ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＡＡＳ）：製剤のＰｔ当量を、原子吸光分析装置（ＡＡＳ）での測定を使用することにより定量した。ＡＡＳの結果を表４にまとめる。
【表４】
2018520206.tif 000046
【０１２２】
例示的な超分子製剤の安定性を測定し、表５に報告する。
【０１２３】
化合物２５（ＩＯ−１２５，ｐｒｅｐ−４７）の安定性の分析：：
安定条件：ＩＣＨ  Ｑ１  Ａ（Ｒ２）Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
促進試験：（６ヶ月）
【表５】
2018520206.tif 000047
【０１２４】
実施例９：化合物２５および脂質成分としてＤＯＰＥを有するｐＨ感受性ナノ粒子の作製方法
【０１２５】
ＤＯＰＥはｐＨ感受性超分子製剤を形成することが知られている（Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７，５９，４６９）。理論に拘束されることを望まないが、以下の要素：１）プロトン化性酸基；２）低い転移温度；および３）アルキル鎖内の二重結合の存在がＤＯＰＥのｐＨ感受性を担っている。
手順：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、水添ダイズＰＣ（ＨＳＰＣ）、コレステロール、化合物２５および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）（４０：２８：３：２５：４のｍｏｌ％（全リン脂質濃度は１９．７ｍＭであった）比にした）をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１：１，ｖ／ｖ）混合物に溶解させた。表６に、この実施例で作製した種々の製剤の脂質の組成をまとめる。
【表６】
2018520206.tif 000048
【０１２６】
すべての脂質溶液を丸底フラスコ内で均一に混合し、有機溶媒を回転式エバポレータによって蒸発させ、脂質膜を高真空下で４〜５時間維持した（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２；２３７：９７３−９８４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２：７  ５２５９−５２６９&Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１；２１（１）：６０−６９）。次いで、この薄膜を、５％ラクトース溶液をこれに添加することにより水和させ、回転式水浴中で６５℃にて１．０時間回転させた。次に、水和した超分子製剤を逐次、フィルター支持体で支持した４００ｎｍ、２００ｎｍおよび１００ｎｍの孔径の膜（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）フィルター）に１０回通し、６５℃の循環式水浴と接続したＬＩＰＥＸ（商標）押出機（１０ｍＬ容）を用いて押出した。原子吸光分析装置（ＡＡＳ）でのＰｔの測定は、この製剤の最終Ｐｔ当量が１．１３ｍｇ／ｍＬであることを示す。
【０１２７】
前述の超分子製剤を１２〜１５時間にわたって凍結乾燥させた（５％ラクトース溶液を抗凍結剤として使用した）。その後に形成された白色固形物粉末を、必要容量のｍｉｌｌｉＱ水を添加することにより再構成し、ＤＬＳを測定した。ＤＬＳヒストグラムは図１１において確認でき、データを表７にまとめる。
【表７】
2018520206.tif 000049
【０１２８】
ＤＯＰＥ含有製剤の有効性を調べた。図１２に示し、表８にまとめたように、ＤＯＰＥ含有製剤は、Ａ５４９およびＤＵ１４５細胞株において、ＤＯＰＥがない同様の製剤よりも相対的に良好な有効性を示した。
【表８】
2018520206.tif 000050
【０１２９】
実施例１０：中間体６（Ｉｍ−０６）の改善された合成
実施例２に示した合成スキーム３を用いて合成した中間体６（Ｉｍ−０６）の純度は８８〜９２％の間でさまざまであった。純度を要求仕様の９５％まで改善することが所望された。これは、スキーム８に示すように、中間体Ｉｍ−０６の酸塩を形成した後、脱塩を行うことによって達成された。
【化４２】
2018520206.tif 000051
【０１３０】
工程１：１０ｇ規模でのＨＣｌまたはＨＮＯ３塩の形成：Ｉｍ−０６（１０．０ｇ，図１３からわかるとおり９１％純度）（ＥｔＯＡｃ（９０ｍＬ）中）に室温で、５Ｎ  ＨＣｌまたはＨＮＯ３／ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）を添加した。混合物を加熱し、３０分間撹拌した。白色析出物を濾過した。ケークを冷ＥｔＯＡｃで洗浄し、乾燥させ、Ｉｍ−０６−ＨＣｌまたはＨＮＯ３塩（８ｇ，８０％収率，ＨＰＬＣ  ９６．０％）を白色固形物として得た。
【０１３１】
再結晶：Ｉｍ−０６−ＨＣｌまたはＨＮＯ３塩（８ｇ）とＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ（５０ｍｌ／８ｍｌ）の混合物を８０℃までアジテーション下で（可溶化するまで）加熱した。この溶液を室温まで２時間、アジテーションなしで冷却した。析出物を濾過によって収集し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、Ｉｍ−０６−ＨＣｌまたはＨＮＯ３（結晶性）（５〜６ｇ，ＨＰＬＣ  ９７％）を白色固形物として得た。
【０１３２】
工程２：Ｉｍ−０６．ＨＣｌまたはＩｍ−０６．ＨＮＯ３の遊離塩の形成：Ｉｍ−０６．ＨＣｌまたはＩｍ−０６．ＨＮＯ３（１００ｍｇ）とＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）の混合物に、ＮａＨＣＯ３（２ｍＬ，飽和水溶液）を添加した。混合物を１０分間撹拌し、次いで分離した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、Ｉｍ−０６（７０〜８０ｍｇ，８０〜９０％収率，ＨＣｌ塩から回収されたＩｍ−０６の２１０ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度は９６．７％である，図１４）を無色の油状物として得た。
【０１３３】
好ましい実施形態を本明細書において詳細に示し、説明したが、関連技術分野の当業者には、種々の修正、追加、置換えなどが本発明の趣旨を逸脱することなく行われ得、したがって、このようなものは、以下の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲に含まれるとみなされることが明らかであろう。さらに、既に示されたものでない範囲で、当業者には、本明細書に記載し、図示した種々の実施形態の任意の１つは、本明細書に開示したその他の任意の実施形態に示された特色が組み込まれるようにさらに修正できることが理解されよう。
【０１３４】
実施例１１：Ｉｍ−０７の改善された合成
Ｉｍ−０７の合成は、先に記載の手順に処理に関するいくらかの軽微な修正を行って実施した。スキーム９に示したように、ＬｉＯＨを、完全な変換が行われるまで添加する（約２．１当量が必要とされる）。処理は、ジクロロメタンでの抽出なしで行い、透明な生成物が得られた。
【化４３】
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【０１３５】
実施例１２：化合物２５の合成
この試験の目的は、毒性試験に適しており、カラムクロマトグラフィーなしで９７％に近い純度を有する化合物２５（ＣＯＭＰ  ２５）を作製することであった。この理由のため、晶析に加えて、単離を容易にすることを目的としたいくつかの取り組みを行った。最初の試行では、該手順に従ってＩｍ−０７とＩｍ−０８の２つの溶液を一緒に混合すると析出物が即座に形成された。（スキーム１０）
【化４４】
2018520206.tif 000053
【０１３６】
しかしながら、フィルター上に固形物が残存しなかったため、濾過は効率的でなかった。この理由のため、最後の試行では水を除去し、残渣を得た。次いで、単離された生成物をＤＣＭ／メタノール中で晶析し、水／アセトンの混合物中でスラリー化した。粗製物は、晶析前、多量のＮＯ３（約１１％）を含有していた。これは、生成物を洗浄せずに単離し、反応中の水分量が除去に充分でなかったことによって容易に説明された。２回のスラリー化を行い、ナイトレートが低減された。最終ＡＰＩの純度は約９７％であった。表９は、粗製化合物２５の漸進的精製工程を示す。
【表９】
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【０１３７】
反応は最大２０ｇのＩｍ−０６で行い、９７％の化合物２５が５７％収率で得られた。反応手順はＫＧ規模で楽に実施することができる。晶析後および２回のスラリー化後の化合物２５のＨＰＬＣクロマトグラムを図１５に示し、図１５のピーク結果を表１０に示す。
【表１０】
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【０１３８】
実施例１３．化合物２５の晶析
化合物２５の純度を改善するため、化合物２５（ＣＯＭＰ  ２５）の晶析をもたらし、明白な純度向上が得られる条件の組を特定した。この作業プログラム中、いくつかの非晶質固形物がさまざまな溶媒系で観察された。ＰＸＲＤおよびＰＬＭ分析は、一部の晶析試験中に得られた固形物が結晶性の性質であったことを示す。
【０１３９】
粗製試料（例えば、実施例１２，純度９４％）の分析のための逐次工程は以下のとおりである：
１）粗製化合物２５に対する選択溶媒での晶析スクリーニング（２０ｍｇでの試行）
２）粗製ＣＯＭＰ  ２５の種晶添加冷却晶析（２０ｍｇでの試行）
３）粗製ＣＯＭＰ  ２５の冷却晶析（２０ｍｇでの試行）
４）粗製ＣＯＭＰ  ２５の貧溶媒／冷却晶析（２０ｍｇおよび５０ｍｇでの試行）
５）粗製ＣＯＭＰ  ２５の冷却晶析（２００〜２５０ｍｇ規模）
６）粗製ＣＯＭＰ  ２５の種晶添加冷却晶析（２５０ｍｇでの試行）
７）粗製ＣＯＭＰ  ２５の種晶添加貧溶媒冷却晶析（１４０〜１５０ｍｇでの試行）
【０１４０】
最初に、一連の溶媒および溶媒混合物をスクリーニングし、晶析手順に好適な溶媒を選択した。表１１に示したように、メタノール／エタノールおよびクロロホルム／ジクロロメタンなどのアルコール混合物が晶析手順に好適な溶媒混合物である。
【表１１】
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【０１４１】
粗製化合物２５に対する選択溶媒での晶析スクリーニング：粗製化合物２５に対する晶析スクリーニング（ＣＯＭＰ  ２５）を、メタノール：ジクロロメタン溶媒混合物およびエタノール：ジクロロメタン溶媒混合物を用いて行った。温度サイクル後に各実験で単離された物質をＸＲＰＤによって解析し、結果を表１２にまとめる。結晶性ＣＯＭＰ  ２５は、メタノール：ジクロロメタンの（２０：８０％  ｖ／ｖ）溶媒系および（１０：９０％  ｖ／ｖ）溶媒系を使用すると得られた。他のメタノール：ジクロロメタン溶媒混合物およびエタノール：ジクロロメタン溶媒混合物ではすべて、非晶質物質が生成した。粗製ＣＯＭＰ  ２５の成功裡の晶析スクリーニングで回収された固形物のＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを図１６に示す。
【表１２】
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【０１４２】
粗製ＣＯＭＰ  ２５の種晶添加冷却晶析
一般手順：およそ２０ｍｇの粗製ＣＯＭＰ  ２５を２ｍｌ容ガラスバイアル内に量り入れ、１００ＮＬのそれぞれの溶媒系を実験系に約２５℃で添加した。溶媒はすべて、使用前に、予備乾燥させた３Ａモレキュラーシーブス上で乾燥させた（適切な場合）。少量の結晶性ＣＯＭＰ  ２５を種晶として実験系に添加した。実験系を４０℃まで加熱した。実験系を５℃まで約０．１１℃／分で冷却した。実験系を５℃で３時間撹拌し、温度サイクルを、５℃〜４０℃の間で０．２℃／分にて一晩（約１８時間）行った。固形物質が観察された実験系は、その固形物を遠心分離機を用いて周囲温度（約２２℃）で単離し、ＸＲＰＤによって解析した。表１３に粗製ＣＯＭＰ  ２５の種晶添加冷却晶析に使用した溶媒系をまとめる。
【表１３】
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【０１４３】
再生性（ｒｅｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）結晶性形態を回復させる唯一の実験条件はメタノール：ジクロロメタン（１０：９０％ｖ／ｖ）であった。メタノール：ジクロロメタン（２０：９０％ｖ／ｖ）では少し結晶性の物質に回復した。すべてのエタノール：ジクロロメタン混合物およびメタノール：ジクロロメタン（３０：７０％ｖ／ｖ）では、非晶質物質に回復した。図１７は、温度サイクル後の固形物におけるＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを示し、図１８は、種晶添加メタノール：ジクロロメタン（１０：９０％ｖ／ｖ）で得られた結晶性物質のＰＬＭ顕微鏡写真を示す。
粗製ＣＯＭＰ  ２５の冷却晶析（２０ｍｇでの試行）
【０１４４】
一般手順：粗製ＣＯＭＰ  ２５を２ｍＬ容の試料バイアル内に量り入れ、溶媒の既知アリコートを約２５℃で添加した。２５℃で撹拌した。２５℃から５℃まで約０．１１℃／分で冷却した。５℃で３時間撹拌した。温度サイクルを、５℃〜４０℃の間で約０．２℃／分にて行った。固形物質が観察された実験系は、その固形物を２５℃で遠心分離機を用いて単離し、ＸＲＰＤによって解析した。表１４に冷却晶析に使用した条件をまとめ、表１５にダブルスケールでの冷却晶析の条件をまとめる。表１６および１７に冷却晶析試験の結果および観察結果をまとめる。約１５０ｍｇ／ｍｌの濃度の例示的な温度サイクル後の固形物のＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを図１９に示す。
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【０１４５】
粗製ＣＯＭＰ  ２５の貧溶媒／冷却晶析
一般手順：およそ５０ｍｇのＣＯＭＰ  ２５粗製物を２ｍＬ容の試料バイアル内に量り入れ、適切な容量のそれぞれの溶媒を約２５℃で添加した。それぞれの貧溶媒を、適切なバイアルに２５ＮＬアリコートにて約２５℃で添加した。実験系を２５℃から５℃まで約０．１１℃／分で冷却した。５℃で３時間撹拌した。実験系に温度サイクルを、５℃〜４０℃の間で約０．２℃／分にて一晩（約１８時間）行った。実験系で希薄なスラリーまたは透明な溶液が観察された場合、さらに貧溶媒を、この実験系に約２５℃で添加した。実験系を２５℃から５℃まで約０．１１℃／分で冷却した。５℃で３時間撹拌した。実験系に温度サイクルを一晩、５℃〜４０℃の間で約０．２℃／分にて一晩（約１８時間）行った。固形物質が観察された実験系は、その固形物を周囲温度（約２２℃）で遠心分離機を用いて単離し、ＸＲＰＤによって解析した。単離した試料を、次いで、真空下で周囲温度にて一晩乾燥させた。２−メチルＴＨＦを貧溶媒として使用すると、メタノール：ジクロロメタン溶媒混合物およびエタノール：ジクロロメタン（３０：７０％  ｖ／ｖ）溶媒系を用いた晶析によりゲル様物質の形成がもたらされた。ヘプタンを貧溶媒として使用すると、ほとんどの溶媒系の使用で結晶性物質が観察された。表１８および１９に示したように、アセトニトリルを貧溶媒として使用すると、ほとんどの溶媒系の使用で部分的に結晶性の物質が観察された。温度サイクル後（使用した貧溶媒はヘプタン）の固形物のＸＲＰＤ  ２θディフラクトグラムを図２０および２１に示す。
【表１８】
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【表１９】
2018520206.tif 000064
【０１４６】
粗製ＣＯＭＰ  ２５の冷却晶析（２００〜２５０ｍｇ規模）
一般手順：それぞれの質量のＣＯＭＰ  ２５粗製物を２０ｍＬ容の試料バイアル内に量り入れ、適切な容量のそれぞれの溶媒系を約２５℃で添加し、試料を溶解させた。実験系を５℃まで約０．１℃／分で冷却した。５℃で２時間撹拌した。温度サイクルを５℃〜４０℃の間で行った。４０℃まで２時間にわたって加熱した（約０．３℃／分）。４０℃で２時間撹拌した。５℃まで２時間にわたって冷却した（約０．３℃／分）。５℃で２時間撹拌した。試料を周囲温度（約２２℃）で、ブフナー漏斗（真空下，Ｗｈａｔｍａｎｎ濾紙Ｎｏ．１を使用）で濾過することにより単離し、次いで、周囲温度で一晩（およそ１８時間）真空乾燥させた。次いで、固形物質をＸＲＰＤとＰＬＭによって解析した。結果を表２０にまとめ、図２２および２３に示す。例示的な冷却晶析２のＨＰＬＣクロマトグラムを図２４に示す。
【表２０】
2018520206.tif 000065
【０１４７】
粗製ＣＯＭＰ  ２５の種晶添加冷却晶析（２５０ｍｇ規模）
一般手順：それぞれの質量の粗製ＣＯＭＰ  ２５を２０ｍＬ容の試料バイアル内に量り入れ、適切な容量のそれぞれの溶媒系を約２５℃で添加し、試料を溶解させた。結晶性ＣＯＭＰ  ２５を実験系に種晶として添加した。実験系を５℃まで約０．１℃／分で冷却した。５℃で２時間撹拌した。温度サイクルを５℃〜４０℃の間で行った。４０℃まで２時間にわたって加熱した（約０．３℃／分）。４０℃で２時間撹拌した。５℃まで２時間にわたって冷却した（約０．３℃／分）。５℃で２時間撹拌した。試料を周囲温度（約２２℃）で、ブフナー漏斗（真空下，Ｗｈａｔｍａｎｎ濾紙Ｎｏ．１を使用）で濾過することにより単離し、次いで、周囲温度にて一晩（約１８時間）真空乾燥させた。次いで、固形物質をＸＲＰＤとＰＬＭによって解析した。結果を表２１にまとめ、図２５および２６に示す。
【０１４８】
溶媒混合物メタノール：ジクロロメタン（１０：９０％ｖ／ｖ）．濃度１６０ｍｇ／ｍｌ．回復した物質は結晶性であり、９６．６５％（ＨＰＬＣによる）の純度を有していた。この実験の計算値収率は３６％であった。溶媒混合物メタノール：ジクロロメタン（２０：８０％ｖ／ｖ）．濃度１９０ｍｇ／ｍｌ．戻った物質は結晶性であり、９６．２１％（ＨＰＬＣによる）の純度を有していた（図２７）。この実験の計算値収率は４１％であった。
【表２１】
2018520206.tif 000066
【０１４９】
種晶添加貧溶媒冷却晶析
一般手順：およそ２５０ｍｇの粗製ＣＯＭＰ  ２５を２０ｍＬ容の試料バイアル内に量り入れ、適切な容量のそれぞれの溶媒系を約２５°で添加し、ＩＯ−１２５を溶解させた。ヘプタンを貧溶媒として２５０ＮＬアリコートで添加した。合計１ｍｌのヘプタンを各実験に添加した。実験系に、結晶性ＣＯＭＰ  ２５を用いて種晶添加した。実験系を２５℃で約１時間撹拌し、次いで、５℃まで約０．１℃／分で冷却した。５℃で２時間撹拌した。温度サイクルを５℃〜４０℃の間で行った。４０℃まで２時間にわたって加熱した（約０．３℃／分）。４０℃で２時間撹拌した。５℃まで２時間にわたって冷却した（約０．３℃／分）。５℃で２時間撹拌した。実験系を周囲温度（約２２℃）で、ブフナー漏斗（真空下，Ｗｈａｔｍａｎｎ濾紙ｎｏ  １を使用）で濾過することにより単離し、次いで、周囲温度にて一晩（約１８時間）真空乾燥させた。次いで、固形物質をＸＲＰＤ（図２８）とＰＬＭ（図２９）によって解析した。３つのすべての手法の組合せを使用し、溶媒系から生成される物質になんらかの差がみられるかどうかを調べ、また、最良の晶析条件がみつかったかどうかを調べた。収率の計算を行い、表２２にまとめる。メタノール：ジクロロメタン（２０：８０％ｖ／ｖ）を使用し、ヘプタンを貧溶媒として用いて単離された固形物のＨＰＬＣクロマトグラムを図３０に示す。
【表２２】
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【０１５０】
本出願の至る箇所において挙げた特許および他の刊行物；例えば、参考文献、発行済特許、公開特許出願および同時係属中の特許出願；はすべて、この参照により、例えば、かかる刊行物に記載された、本明細書に記載の技術に関連して使用されるかもしれない方法論を説明および開示する目的のために本明細書に明示的に組み込まれる。このような刊行物は、その開示が本出願の出願日より前であることを示すものにすぎない。これに関して、いずれのものも、先願発明という理由で、または任意の他の理由で、本発明者らがかかる開示が時間的に先行していると主張できないという是認と解釈されるべきでない。日付に関する記載またはこれらの文献の内容に関する表示はすべて、出願人らが入手可能な情報に基づいたものであり、これらの文献の日付または内容の正確さに関する是認をなんら構成するものではない。
【０１５１】
本発明は、本明細書に記載した具体的な方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、そのため種々であり得ることは理解されよう。本明細書で用いている専門用語は、具体的な実施形態を説明する目的のためのものにすぎず、特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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