(57)【要約】  対象における肝転移の治療のための組成物及び方法を本明細書に開示する。該方法は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）のような腫瘍抗原に対して高度に特異的なキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）の肝動脈注入（ＨＡＩ）を含む。ＨＡＩ法は、正常細胞への曝露を最小にしながら、転移細胞への改変細胞の曝露を最大にするように最適化される。該方法は、第２の治療剤、例えばＩＬ−２の共投与を含む。
2018513216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の肝転移を治療する方法であって、
キメラ抗原受容体タンパク質を発現するキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む組成物を前記対象の肝動脈に注入することを含み、前記キメラ抗原受容体タンパク質は、肝臓中の転移性細胞上に発現する抗原に結合する、方法。
【請求項２】
前記注入ステップの前に、肝動脈及び近くの血管をマッピングするために血管造影を実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肝臓中に流れ込まない血管を閉塞させることをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記注入ステップ中に血管造影を実施することをさらに含み、前記血管造影は、前記注入ステップ中に肝内血行動態健常性（ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を監視する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記キメラ抗原受容体タンパク質が、前記転移性細胞の表面上に発現されるがん胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記キメラ抗原受容体タンパク質が配列番号１を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象の肝動脈内に第２の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の治療剤がＩＬ−２である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の治療剤の前記投与が、前記免疫応答性細胞を含む前記組成物の前記注入の前、前記注入の間、または前記注入の後に実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む前記組成物が、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、前記対象の肝動脈に注入される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む前記組成物の前記対象の肝動脈への前記注入が、１０８〜１０１０個のＣＡＲ−Ｔ細胞を肝動脈に注入することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記注入前記組成物が、前記注入前の血清中のＣＥＡのレベルと比較して、血清ＣＥＡの４０％〜５０％の減少をもたらす、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
対象における肝転移を治療する方法であって、
前記対象の肝動脈に、キメラ抗原受容体タンパク質（ＣＡＲ）を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物を注入することを含み、前記ＣＡＲタンパク質はＣＥＡに結合する、方法。
【請求項１４】
前記キメラ抗原受容体タンパク質が配列番号１を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＥＡに結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ
ドメイン、ＣＤ２８細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞質ドメイン、及びＣＤ３ゼータ細胞質ドメインを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記注入が、１０８〜１０１０個のＣＡＲ−Ｔ細胞を肝動脈に注入することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象に第２の治療剤を含む組成物を投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の治療剤がＩＬ−２またはイットリウム−９０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
肝転移と診断された対象の血清中のＣＥＡを減少させる方法であって、前記方法は前記対象の肝動脈に、キメラ抗原受容体タンパク質を発現するキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む組成物を注入することを含み、前記キメラ抗原受容体タンパク質は肝臓中の転移性細胞上に発現する抗原に結合する、方法。
【請求項２０】
前記キメラ抗原受容体タンパク質がＣＥＡに結合する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月１５日に出願された米国仮出願第６２／１４７，７９３号の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約Ｋ０８ＣＡ１６０６６２に基づく政府の支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表への参照
配列表は、２０１６年４月１４日に作成され、「０９６２０１０１２１ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」（１４，０３４バイト）という名前のテキストファイルの形式で、ＥＦＳ経由で電子的に提出されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
技術分野
本明細書に記載の主題は、腫瘍特異的抗原に結合するとともに改変されたＴ細胞の活性を活性化する受容体タンパク質を発現する遺伝子改変またはキメラ抗原受容体Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ）の肝動脈注入を介して肝臓関連がん及び転移を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
肝転移（ＬＭ）は、体の別の部分から肝臓に転移したがん性腫瘍である。肝転移の大部分は、結腸または直腸がんから発生し、結腸直腸がんを有する人々の約６０〜７０％が最終的に肝腫瘍を発症する。肝転移は、胃腸腺がん患者の罹患率及び死亡率の重要な原因である。肝切除は、切除可能な肝転移を有する患者の標準治療と考えられているが、多くの患者は、肝転移の切除の対象にはならない。化学療法は、肝転移にとって治癒的ではなく、多くの未だに満たされていない臨床的必要性を作り出している。
【０００６】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）研究は、ＬＭに対する宿主Ｔ細胞応答が、患者生存と有意に相互に関係があることを明らかにした（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ＬＭへの効果的な免疫応答を奏する者は、生存期間が延長する傾向にあるが、大部分の患者は、内因性免疫不全の状況でその疾患に罹る。肝内環境の免疫抑制性（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）は、ＬＭの発症を促進し、侵攻性疾患の生態に関与し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｔｚら，２０１３，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ，２０：９４６−９５５
【非特許文献２】Ｋａｔｚら，２０１０，ＨＰＢ（Ｏｘｆｏｒｄ），１２：６７４−６８３
【非特許文献３】Ｋａｔｚら，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ，１６：２５２４−２５３０
【非特許文献４】Ｗａｇｎｅｒら，２００８，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ，１５：２３１０−２３１７
【非特許文献５】Ｔｕｒｃｏｔｔｅら，Ｃａｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２：５３０−５３７
【非特許文献６】Ｃａｎｔｏｒら，１９６７，Ｎａｔｕｒｅ，２１５：７４４−７４５
【非特許文献７】Ｋａｔｚら，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌ，４２：２９３−３００
【非特許文献８】Ｋａｔｚら，２００４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７３：２３０−２３５
【非特許文献９】Ｋａｔｚら，２０１１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８７：１１５０−１１５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、肝転移の存在に対して、宿主を楽にしまたは免疫学的応答を提供することができる治療戦略が必要である。強力な肝臓ＴＩＬ応答の有益な効果及び肝臓内空間の固有の抑制的性質を考慮すると、ＬＭの治療のための高度に特異的な免疫応答性細胞の送達は、理にかなったアプローチである。肝外毒性を制限し且つ肝転移の治療のための有効性を最適化することができる抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔの肝動脈注入（ＨＡＩ）のための組成物及び方法が本明細書に記載される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
下記で説明される以下の態様及び実施形態は、例示的且つ実例的であることを意味し、範囲を限定するものではない。
一態様では、キメラ抗原Ｔ細胞受容体タンパク質（ＣＡＲ）を発現する免疫応答性細胞を含む組成物を対象の肝動脈に注入することを含む、肝転移を有すると診断された対象における肝転移を治療する方法であって、このキメラＴ細胞受容体タンパク質は、肝臓中の転移性細胞上に発現される抗原に結合する、方法が提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞及び単球系統の細胞からなる群より選択される。特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、Ｔ細胞である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、対象に対して自己由来である。別の実施形態では、免疫応答性細胞は、対象に対して自己由来ではない。
いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞はＴ細胞であり、この方法は、対象の血清から細胞を採取することを含む。他の実施形態では、最低１０８、１０９または１０１０個の細胞が、対象の血清から採取される。さらに他の実施形態では、この方法は、採取した細胞から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し活性化して、自己Ｔ細胞の集団を生成することをさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＡＲタンパク質を発現する免疫応答性細胞の集団を生成するためＣＡＲ配列をコードする核酸配列を含む核酸ベクターで免疫応答性細胞をトランスフェクトすることを含む。他の実施形態では、この方法は、ＣＡＲタンパク質を発現する免疫応答性細胞の集団を選択して増殖させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、免疫応答性細胞は、自己Ｔ細胞の集団である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＡＲタンパク質を発現する免疫応答性細胞の用量を、約１〜８週間、２〜８週間、２〜６週間、２〜４週間、１〜４週間、１〜３週間、１〜２週間、または３〜６週間、または４〜６週間の範囲の治療期間にわたって患者に注入することを含む。他の実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞を注入することは、毎週、２週間、３週間または４週間の治療期間にわたって、この細胞を注入することを含む。好ましい実施形態において、ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞の注入は、３週
間の毎週１回ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を注入することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を発現する免疫応答性細胞及びＣＥＡに結合するＣＡＲは、自己Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を発現する免疫応答性細胞及びＣＥＡに結合するＣＡＲは、非自己Ｔ細胞である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、患者に注入される免疫応答性細胞の用量は、約１０７〜１０１０または１０８〜１０９個のＣＡＲ−Ｔ細胞である。他の実施形態では、患者に注入される免疫応答性細胞の用量は、約１０７、１０８、１０９または１０１０個の免疫応答性細胞である。好ましい実施形態では、免疫応答性細胞はＴ細胞であり、ＣＡＲはＣＥＡに結合する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、この方法は、免疫応答性細胞及び薬学的に適合する溶液を含む組成物を注入することを含み、組成物の総体積は、約２５ｍｌ〜１２５ｍｌ、５０ｍｌ〜７５ｍｌ、７５ｍｌ〜１００ｍｌ、または５０ｍｌ〜１００ｍｌである。好ましい実施形態では、免疫応答性細胞はＴ細胞であり、ＣＡＲはＣＥＡに結合する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、組成物は、外科技術によって肝動脈に投与される。他の実施形態では、組成物は、経皮技術によって肝動脈に投与される。さらに他の実施形態において、経皮技術による投与は、胃十二指腸動脈及び／または胃動脈の塞栓術に先行する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、この方法は、注入プロセス中の肝内血行動態健常性（ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を確認するために血管造影法を使用するステップをさらに含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本方法は、免疫応答性細胞を含む組成物及び薬学的に適合性のある溶液を経皮的カテーテルを介して注入すること、及び異常な解剖学的考察を熟考して肝動脈投薬量を分割するため肝臓容積計算を行うことを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本方法は、対象の肝動脈に第２の治療剤を注入することをさらに含む。他の実施形態では、第２の治療剤は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）である。他の実施形態において、第２の治療剤は、ＩＬ−２を投与されていない患者における免疫応答性細胞の抑制と比較して、対象における免疫応答性細胞の抑制を阻害する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、この方法は、対象へのＩＬ−２の投与前のＣＥＡレベルと比較して、血清中ＣＥＡが１５〜５０％、２０〜５０％、３０〜５０％、４０〜５０％、または１９〜４８％低下する。別の実施形態において、血清ＣＥＡの低下は、注入後１、２、３、４または５日で起こる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ＣＡＲ−Ｔ治療期間の間、約２５，０００〜１５０，０００ＩＵ／ｋｇ／日、２５，０００〜７５，０００ＩＵ／ｋｇ／日、５０，０００〜１００，０００ＩＵ／ｋｇ／日の範囲の連続全身投与で投与される。他の実施形態では、ＩＬ−２は、約２５，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、８５，０００または１００，０００ＩＵ／ｋｇ／日の連続的な全身投与量で投与される。好ましい実施形態において、ＩＬ−２は、約５０，０００ＩＵ／ｋｇ／日の連続的な全身投与量で投与される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤を注入することは、キメラＴ細胞受容体タンパ
ク質を発現する免疫応答性細胞の注入前、注入中または注入後に実施される。
いくつかの実施形態では、この方法は、対象に対象の肝動脈に放射線療法を投与することをさらに含む。他の実施形態において、放射線療法は、イットリウム−９０（９０Ｙ）を含有する複数のマイクロスフェアの投与を含む。さらに他の実施形態では、放射線投与療法は、約１〜４ギガベクレル（ＧＢｑ）、１〜３ＧＢｑ、２〜４ＧＢｑ、３〜４ＧＢｑ、または２〜３ＧＢｑの放射能を投与することを含む。さらに他の実施形態では、放射線投与療法は、約１ＧＢｑ、１．５ＧＢｑ、２ＧＢｑ、２．５ＧＢｑ、３ＧＢｑ、３．５ＧＢｑ、または４ＧＢｑの放射能を投与することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、放射線療法の投与は、ＣＡＲ−Ｔ注入の最後の約１週間後、２週間後、または３週間後に放射線療法を施すことを含む。
いくつかの実施形態において、対象は、肝臓に局在する転移性疾患と診断される。他の実施形態では、転移性疾患は、がんである。さらに他の実施形態では、がんは、乳房、結腸、直腸、食道、肺、膵臓及び／または胃の原発腫瘍から転移した。さらに他の実施形態において、対象は、切除不能な転移性肝腫瘍と診断される。さらに他の実施形態において、対象は、原発性結腸直腸がんからの切除不能な転移性肝腫瘍と診断される。いくつかの実施形態において、対象は、肝細胞がんと診断される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、対象は、肝転移と診断され、肝転移の悪性細胞は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質を発現することが実証されている。
いくつかの実施形態では、この方法は、対象の肝臓における腫瘍負荷を減少させる。他の実施形態において、腫瘍負荷の減少は、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または生検を用いて測定される。さらに他の実施形態では、治療期間の１〜８週間後、または約１、２、３、４、５、６、７または８週間後に腫瘍負荷を測定する。さらに他の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の用量を注入する前に、腫瘍負荷に関して減少を測定する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、処置期間後の１〜８週間、または約１、２、３、４、５、６、７または８週間後に測定された腫瘍負荷は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の初回投与前の腫瘍負荷の５０％〜９０％以下である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、肝転移と診断された対象における腫瘍負荷を減少させる方法が提供され、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞を対象に投与することを含む。他の実施形態において、腫瘍負荷は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を対象に投与する前の腫瘍負荷の約１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満または９０％未満の量まで減少する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、肝転移と診断された患者の血清中のＣＥＡの量を減少させる方法が提供され、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞を対象に投与することを含む。他の実施形態において、ＣＥＡの量は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与する前の対象におけるＣＥＡの量の約１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満または９０％未満の量に減少する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、キメラＴ細胞受容体タンパク質は、肝臓中の転移細胞の表面上に発現される腫瘍抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、キメラＴ細胞受容体タンパク質は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に特異的に結合する細胞外ドメインを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、キメラＴ細胞受容体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＣＥＡ結合ＩｇＧ免疫グロブリンドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ２８細胞
外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞質ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞質ドメインを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＣＥＡ結合ＩｇＧ免疫グロブリンドメインは、配列番号１を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ８ヒンジ領域は、１２アミノ酸長であり、且つ配列番号２の残基１６９〜１８０の配列と少なくとも７５％、８３％、９１％、または１００％同一である配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２８細胞外ドメインは、４０アミノ酸長であり、且つ配列番号４の残基１１３〜１５２の配列と少なくとも９２％、９５％、９７％、または１００％同一である配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、２７アミノ酸長であり、且つ配列番号４の残基１５３〜１７９の配列と少なくとも８８％、９２％、９６％、または１００％同一である配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、４１アミノ酸長であり、且つ配列番号４の残基１８０〜２２０の配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、または１００％同一である配列を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ゼータ細胞質ドメインは、１１３アミノ酸長であり、且つ配列番号３の残基５２〜１６４の配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、キメラＴ細胞受容体タンパク質は、Ｔ細胞受容体タンパク質のＮ末端にシグナル配列をさらに含む。他の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号６と少なくとも８４％、８９％、９４％または１００％同一である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＩＴＭ（登録商標）転移に関する肝臓免疫療法（ＨＥＰＡＴＩＣ  ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ  ＦＯＲ  ＭＥＴＡＳＴＡＳＥＳ）である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】改変免疫応答性細胞の注入前の患者におけるＣＤ３＋及びＣＡＲ＋細胞の平均パーセンテージを示す図。
【図２】患者においてＣＥＡ＋標的細胞を殺傷する製品を試験するためのアッセイの結果を示す図。
【図３】本明細書に記載の改変免疫応答性細胞の治療効果を試験するための第１相臨床試験プロトコルを示す図。
【図４】本明細書に記載の方法に従って治療された患者の血清ＣＥＡレベルを示す図。
【図５Ａ】本明細書に記載の方法に従って治療した患者におけるＬＭ線維化を示す図。
【図５Ｂ】本明細書に記載の方法に従って治療した患者におけるＬＭ壊死を示す図。
【図６】本明細書に記載の方法に従って治療された患者のＩＦＮγレベルを示す図。
【図７】本明細書に記載の方法に従って治療された患者におけるピーク及び平均ＩＦＮγレベルを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、様々な態様をより詳細に説明する。しかしながら、そのような態様は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底してかつ完全であり、その範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。
【００４０】
Ｉ．定義
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリマー」への言及は、単一のポリマーならびに２つ以上の同一または異なるポリマーを含み、「賦形剤」とは、単一の賦形剤ならびに２つ以上の同じまたは異なる賦形剤、等が含まれる。
【００４１】
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの介在値と、その記載された範囲内の他の記載された値または介在値は、本開示内に包含されることが意図される。例えば、１ｍＬ〜８ｍＬの範囲が記載されている場合、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、及び７ｍＬがまた、ならびに１ｍＬ以上の値の範囲及び８ｍＬ以下の値の範囲であることが、明示的に開示されていることが意図される。
【００４２】
用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書中では互換的に使用され、インビトロまたはインサイチュで、本明細書に記載の方法に従う任意の動物またはその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、対象または個体は、ヒトである。
【００４３】
本明細書で使用する「治療の」という用語は、治療及び／または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。
本明細書において用語が使用されるときに疾患を「治療する」とは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を低下させることを意味する。本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクション、形質転換または形質導入された細胞である。細胞は、原対象細胞及びその子孫を含む。
【００４４】
本明細書で使用されるように、用量または量に適用される「治療的に有効な」という用語は、本開示のキメラ受容体を含み、及びさらにそれを必要とする対象への投与の際に所望の活性をもたらすのに十分な薬剤耐性ポリペプチドを含む、化合物または薬学的組成物（例えば、Ｔリンパ球及び／またはＮＫ細胞などの免疫細胞を含む組成物）の分量を指す。本開示の文脈内では、用語「治療的に有効な」とは、本開示の方法によって治療される、障害の少なくとも１つの症状の、発現の遅延、進行の阻止、緩和または軽減に十分な化合物または薬学的組成物の分量を指す。有効成分の組み合わせを投与する場合、その有効量の組み合わせは、個々に投与した場合に有効であったであろう各成分の量を含んでも含まなくてもよいことに留意されたい。
【００４５】
本明細書で使用される表現「腫瘍量」または「腫瘍負荷」は、対象の体におけるがん細胞の数、腫瘍のサイズ、またはがんの量を指す。
本明細書で使用される「キメラ受容体」という用語は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞質共刺激シグナル伝達ドメインを、単一のタンパク質上で天然には一緒に見出されない組み合わせで含む細胞表面受容体として定義される。これは、特に、細胞外ドメイン及び細胞質ドメインが単一の受容体タンパク質上に天然には一緒に見出されない受容体を含む。本開示のキメラ受容体は、主にＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞との使用を意図している。本明細書に記載のキメラ受容体は、本明細書においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラリガンド受容体、またはキメラＴ細胞
受容体と呼ぶこともできる。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、キメラＴ細胞受容体に関して「特異的に結合する」という表現は、キメラＴ細胞受容体が構造的に異なるタンパク質（類）に対してより高い親和性でその標的タンパク質に結合することを意味する。
【００４７】
ＩＩ．ＣＡＲ−Ｔ細胞の肝動脈注入
研究は、頑強なＴ細胞応答を有する肝転移（ＬＭ）患者が有意に改善された結果を有することを実証したが、ほとんどのＬＭ患者は、有効な肝内抗腫瘍免疫を達成できない（Ｋａｔｚら，２００３，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃ，２０：９４６−９５５）。特異的な腫瘍抗原を標的とするように設計された高度に特異的な免疫療法産物であるキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）は、特に切除不能な腫瘍と診断された患者において、必要な抗腫瘍免疫を提供することを約束している。抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与は、白血病の早期臨床試験において有望な結果を示しているが、胃腸がん患者の主要な死因であるＣＥＡ発現腺がんＬＭに対するＣＡＲ−Ｔ技術の成功した適応は未だに達成されていない。したがって、ＣＡＲ−Ｔ技術がＬＭの治療のための実行可能な選択肢であることを示すために、本明細書に記載のように、第Ｉ相臨床試験を設計し、実施した。さらに、臨床研究は、ＬＭに対するＣＡＲ−Ｔ治療の有効性を制限しうる全身注入によるＣＡＲ−Ｔの非効率的な肝内送達に対処している。以下に記載する内容は、ＣＡＲ−Ｔ肝動脈注入（ＨＡＩ）を試験して、ＣＡＲ−ＴのＬＭへの直接的な領域的送達が、ＬＭの治療において安全かつ有効であることを示す研究である。要約すれば、データは、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩが良好に耐容され、腫瘍細胞の死滅の証拠と関連していることを実証し、ＣＡＲ−ＴのＬＭへの肝動脈注入（ＨＡＩ）がそれを必要とする患者におけるＬＭを実際に効果的に治療できることを示している。
【００４８】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞
非常に特異的な腫瘍認識及び死滅を可能にするためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作されたＴ細胞は、有望な臨床結果を受けて、かなり注目を集めている（Ｇｒｕｐｐら，２０１３，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，３６８：１５０９−１５１８；Ｐｏｒｔｅｒら，２０１１，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，３６５：７２５−７３３；Ｓａｄｅｌａｉｎら，２００９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１：２１５−２２３）。ＣＡＲ遺伝子を有するＴ細胞を再プログラミングすることは、腫瘍細胞とドッキングし、そしてそれを溶解するためのＭＨＣ非依存性機構を提供する。そのような改変Ｔ細胞は、「デザイナーＴ細胞」、「Ｔ体」、または「ＣＡＲ−Ｔ細胞」とも呼ばれている（Ｍａら，２００２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ．３１９−３４５；Ｐａｒｋら，２０１１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２９：５５０−５５７；Ｍａら，２０１４，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，７４：２８６−２９６）。がん胎児性抗原（ＣＥＡ）は、高レベルのＣＥＡ発現及び血清中のＣＥＡを測定する能力を考慮すると腺がんＬＭのＣＡＲ−Ｔ治療のための魅力的な標的である（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら，２００７，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，７：２；Ｍｉｄｉｒｉら，１９８５，Ｃａｎｃｅｒ，５５：２６２４−２６２９）。抗原認識に際して、抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔが増殖し、サイトカインを生成し、標的細胞を殺傷する（Ｅｍｔａｇｅら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ，１４：８１１２−８１２２）。
【００４９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質及びこれらのタンパク質を発現する免疫細胞（例えば、免疫応答性またはＴ細胞）の生成は、当技術分野で周知であり、リガンドまたは抗体またはそのフラグメントの標的機能及び特異性を、免疫細胞の抗腫瘍活性と組み合わせる。例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎら，２０１３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、３：３８８−３９８を参照されたい。キメラ抗原受容体タンパク質は、一般にＮ末端からＣ
末端の方向に、罹患した標的細胞（例えば、腹腔に存在するがん細胞または悪性細胞）の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する標的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び免疫調節シグナル伝達ドメインを含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、ＣＡＲタンパク質の標的結合ドメインは、ＣＥＡタンパク質に結合する。このＣＥＡ結合タンパク質は、ヒト化モノクローナル抗体から生成された（米国特許第６，６７６，９２４号；Ａｋａｍａｔｓｕら，１９９８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４：２８２５−２８３２；Ｎｏｌａｎら，１９９９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５：３９２８−３９４１）。抗ＣＥＡ  ＣＡＲ構築物を作製する際に、ｓｃＦＶ構築物を、当技術分野の常用の方法を使用して重鎖及び軽鎖可変ドメインから作製し、次にｓｃＦＶフラグメント（本明細書において配列番号１として開示される）を他の受容体ドメインに融合させて、現在記載されている治療方法で使用するためのＣＡＲを作製した。
【００５１】
ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインのそれぞれについての好ましい実施形態を、以下の表１に提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ構築物は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＣＥＡ結合ドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ３ゼータ鎖膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ゼータ鎖細胞質ドメインを含む。好ましい実施形態では、ＣＡＲ構築物は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＣＥＡ結合ドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ２８細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータ鎖細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、構築物は、標的結合ドメインのＮ末端に融合されたシグナルペプチドをさらに含む。シグナルペプチドは、インビボで切断されたため、投与された免疫応答性細胞上に発現されるＣＡＲタンパク質中に存在しないことが理解される。
【００５２】
【表１】
2018513216.tif 000003
いくつかの実施形態では、キメラ受容体タンパク質の標的結合ドメインは、免疫グロブリンが疾患細胞の表面上のタンパク質に結合する免疫グロブリンの抗原結合部分を含む。抗原結合ドメインは、受容体に対するリガンドまたは免疫グロブリンタンパク質、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びそのフラグメントなどを含むがこれらに限定されない、細胞表面抗原に結合する任意のドメインであり得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＡＲ構築物の一部である場合に抗原に特異的に結合することができる抗体の可変ドメインから構築される。場合によっては、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが最終的に使用される同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトでの使用のためには、ＣＡＲの抗原結合ドメインがヒトまたはヒト化抗体のフラグメントを含むことが有益であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメイン部分は、ヒトまたはヒト化抗体の腫瘍抗原結合フラグメントを含む。これらの実施形態の各々において、抗体の抗原結合ドメイン、例えば一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）またはＦａｂフラグメントは、または、Ｔ細胞受容体の膜貫通ドメイン及びシグナル伝達細胞内ドメイン（エンドドメイン）に融合される。しばしば、スペーサーまたはヒンジが、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に導入されて、抗原認識及び抗原結合を容易にするために抗原結合ドメインが異なる方向に配向することを可能にする柔軟性を提供する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原Ｔ細胞受容体の抗原結合部分は、ＣＥＡ抗原を標的とし、細胞表面上に発現されるＣＥＡに結合することが示されている抗体のＣＥＡ結合ドメインを含む。キメラ受容体構築物は、当業者に既知の方法及び組成物に従って作製することができる。例えば、以下の実施例において使用されるＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物は、ヒト化ＭＮ１４抗体の可変ドメインの部分を含む（米国特許第５，８７４，５４０号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｎｏｌａｎらの方法に従って、ＣＥＡ抗体のＣＥＡ−結合ドメインを含むように、ＦａｂまたはｓｃＦｖ構築物をＣＥＡ抗体から作製することができる（１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ，５：３９２８−３９４１）。いくつかの実施形態において、ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物は、以下に示す配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む：
【００５４】
【化１】
2018513216.tif 000004
いくつかの実施形態では、ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物は、ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物のインビボ発現後に構築物から切断される配列番号１のＮ末端にシグナルペプチドをさらに含む。シグナル配列は、当業者に周知であり、翻訳されたタンパク質を細胞表面に向けるように機能する。シグナル配列は、ＣＡＲタンパク質の細胞表面への移行中の、小胞体からの移動後に切断される。他の実施形態では、シグナルペプチドは、配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号６）を有する。さらに他の実施形態では、１、２、３、４、５または６個のアミノ酸を含むリンカー配列が、シグナルペプチドとＣＥＡ結合ドメインとの間に存在する。
【００５５】
次いで、ＦａｂまたはｓｃＦｖドメインは、ＣＤ８ヒンジドメイン（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１７３２；配列番号２参照）由来のようなヒンジドメインへのペプチド結合を介して、そのＣ末端で融合され得る。好ましい実施形態で
は、ヒンジドメインは、１２アミノ酸長であり、配列番号２の残基１６９〜１８０の配列と少なくとも８３％、９１％または１００％同一である配列を含む。他の実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号２の残基１１１〜１９０に存在する１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０または１０〜５０残基の連続配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
【００５６】
次いで、ヒンジドメインをそのＣ末端で膜貫通ドメインに融合させることができる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２０９６３；配列番号３）に由来する配列を含む。この実施形態では、膜貫通ドメインは、２０〜３０アミノ酸長または２０、２１、２２、２３アミノ酸長であり、かつ配列番号３の残基３１〜５１に存在する１５〜２５または２０〜３０残基の隣接配列と少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％同一である、配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータ鎖由来の膜貫通ドメインは、配列番号３の３１〜５１位のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ１０７４７；配列番号４）由来である。膜貫通ドメインは、２７アミノ酸長であり、且つ配列番号４の残基１５３〜１７９の配列と少なくとも８８％、９２％または１００％同一である配列を含むことができる。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４の残基１５０〜１９０の配列中に存在する２０〜３０、２０〜４０、または２０〜５０残基の隣接配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。上記のようにＣＡＲ膜貫通ドメインがＣＤ２８膜貫通ドメインである場合、ＣＡＲはさらにＣＤ２８細胞外ドメインを含むことができ、この細胞外ドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインとＣＤ２８膜貫通ドメインとの間に位置する。ＣＤ２８細胞外ドメインは、３５〜４５アミノ酸長、または約３８、３９、４０、４１、または４２アミノ酸長であり、且つ配列番号４の残基１１０〜１６０の配列中に存在する３５〜４５残基の隣接配列と少なくとも９２％、９５％、９７％または１００％同一である。
【００５７】
ＣＤ３ゼータ鎖細胞質ドメインは、ＣＡＲ構築物のＣ末端に存在し且つ、配列番号３の残基４０〜１６４の配列中に存在する１００〜１２０個のアミノ酸の隣接配列と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む。好ましい実施形態では、ゼータ鎖ドメインは、配列番号３の残基５２〜１６４と少なくとも９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
【００５８】
好ましい実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインのＣ末端及びＣＤ３ゼータ鎖の細胞質ドメインのＮ末端のＣＤ２８シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、配列番号４の残基１７５〜２２０の配列中に存在する３５〜４５アミノ酸の連続配列と少なくとも９２％、９５％または１００％同一である配列を含む。好ましい実施形態では、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、配列番号４の残基１８０〜２２０と少なくとも９２％、９５％または１００％同一である配列を含む。
【００５９】
好ましい実施形態では、ＣＡＲポリペプチド配列は、Ｎ末端からＣ末端方向に、配列番号１を含むＣＥＡ結合ドメイン、上記のようなＣＤ８ヒンジドメイン、上記のようなＣＤ２８細胞外ドメイン、上記のようなＣＤ２８膜貫通ドメイン、上記のようなＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、及び上記のようなＣＤ３ゼータ細胞質ドメインを含む。一実施形態では、このＣＡＲ配列は、Ｎ末端からＣ末端ドメインにおいて以下の各セグメントを含む、配列番号１（ＣＥＡ結合ドメイン）、配列番号２の残基１６９〜１８０（ＣＤ８ヒンジ）、配列番号４の残基１１３〜１５２（ＣＤ２８細胞外ドメイン）、配列番号４の残基１５３〜１７９（ＣＤ２８細胞外ドメイン）、配列番号４の残基１８０〜２２０（ＣＤ２８細胞質ドメイン）、及び配列番号３の残基５２〜１６４（ＣＤ３ゼータ鎖の細胞質ドメイン
）（あるいは、本明細書では「抗ＣＥＡ  ｓｃｆｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８／ＣＤ３ζ」と称される）。常用の方法を用いたＣＡＲ構築物の構築は、所望の融合構築物を生成するために種々のドメインの消化及び連結を可能にする制限エンドヌクレアーゼ部位の導入を伴う全長遺伝子配列のＰＣＲ増幅の使用を含むことができるが、それはキメラ構築物の各ドメインの間に１つ以上のアミノ酸をコードしていてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲ配列は、結合及びＣＤ８ヒンジドメイン間、ヒンジ及びＣＤ２８細胞外ドメイン間、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメイン間、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメイン間、膜貫通ドメイン及びゼータ細胞質ドメイン間、ならびに／またはＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びゼータ細胞質ドメイン間の、１、２または３個のアミノ酸のリンカー配列を含む。
【００６０】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の調製
増殖及び遺伝子改変の前に、肝転移の治療を必要とする対象からＴ細胞源が得られる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から得ることができる。本開示の特定の態様では、当技術分野で利用可能な様々なＴ細胞株を使用することができる。Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離のような、当業者に既知の様々な技術を使用して、対象から採取した血液の単位から得ることができる。好ましい実施形態において、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球が含まれるリンパ球、赤血球、及び血小板を含有する。アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、その後の処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができる。当業者であれば容易に理解されるように、洗浄工程は、製造者の指示に従い半自動フロースルー遠心分離機を用いるなど、当業者に既知の方法によって達成することができる。洗浄後、細胞は、種々の生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ非含有、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、または緩衝液を含むまたは含まない他の生理食塩水などに再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁することができる。
【００６１】
ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択技術によって単離及び／または濃縮することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８接合ビーズとの、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間のインキュベーションによって単離する。当業者であれば、本開示の文脈において複数回の選択を用いることもできることを認識するであろう。特定の態様では、選択手順を実行し、活性化及び増殖プロセスにおいて選択されていない細胞を使用することが望ましい場合がある。選択されていない細胞は、さらなるラウンドの選択を受けることもできる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、及びパーフォリン、または他の適切な分子、例えば他のサイトカインのうちの１つ以上を発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞発現をスクリーニングする方法は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載されている方法によって決定することができる。Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第７，２３２，５６６号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されているような方法を使用して活性化及び拡張され得る。
【００６３】
肝臓転移と診断された対象の治療に使用するＣＡＲ−Ｔ細胞の調製のために、患者は白血球搬出法を受け、約６×１０９個のＴ細胞の理想的な標的で、最低限４×１０９個のＴ細胞を採取する。白血球搬出産物中のＴ細胞数の最初の評価は、２時間後に実施され、そ
の後、必要に応じて繰り返される。細胞を精製して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、あるいは本明細書ではリンパ球リッチ（ＰＢＬ）と呼ぶ、を回収する。リンパ球は、５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２への曝露によって活性化される（Ｗａｌｋｅｒら，１９９３，４：６５９−６８０）。活性化細胞に、１０μｇ／ｍＬプロタミンを用いて、上記のように組換えキメラＣＡＲを含むレトロウイルスの高力価上清で形質導入する（Ｃｏｒｎｅｔｔａら、１９８９，２３：１８７−１９４）。翌日、この手順を繰り返して形質導入細胞の画分を増加させる。形質導入の２日後に、少量の細胞を導入遺伝子の発現のためのフローサイトメトリーによって分析する。形質導入された細胞の割合が１０％未満である場合、細胞はさらに２回の形質導入を受け、形質導入された細胞のパーセンテージについてフローサイトメトリーによって再度分析され得る。適切な数のＴ細胞が形質導入された（例えば、＞１０％）場合、活性化条件（上記）下で、細胞は例えば１．２〜１．５×１０６／ｍＬで培養される。活性化された細胞の残りの部分は、形質導入の結果が分かるまで維持され、必要に応じて第２の試みに使用される。形質導入したＴ細胞を培養中で増殖させ、増殖／形質導入パラメーター（倍加時間、全細胞数、形質導入％、Ｔ細胞活性化指標）を監視する。細胞を凍結保存する前に、１０％ＤＭＳＯ、２０％ヒト血清及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加する。細胞を採取する時期の決定は、採取後の培養で十分な細胞が将来の注入のために増殖するよう、十分な総細胞の存在に基づいている。通常は、Ｔ細胞活性化から用量の採取までの間隔は、２〜３週間の範囲である。増殖の間、キメラ受容体を発現するＴ細胞の存在を記録するためにフローサイトメトリーを実施する。他の試験には、ＣＥＡ＋及びＣＥＡ標的に対する生存性、繁殖不能性（ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）、及び標準的な細胞傷害性アッセイが含まれる。用量を構成するのに十分な形質導入効率及び細胞数を達成するために、患者Ｔ細胞で３回まで試みが為される。いくつかの実施形態では、種々の形質導入から増殖した細胞をプールして用量を達成する。
【００６４】
治療用ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ構築物をコードする発現ベクターでリンパ球の集団をトランスフェクトすることによってＣＡＲ核酸構築物を発現するように操作することができる。選択されたＣＡＲ構築物を発現するリンパ球の形質導入された集団を調製するための適切な手段は、当業者に周知であり、そしてレトロウイルス、ＭＦＧベクター、アデノウイルスベースのベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクター、レトロウイルスベクター、レトロウイルス−アデノウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のベクターを含むがこれらに限定されない。以下の実施例１は、患者に投与されるＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するために使用される方法を記載する。
【００６５】
好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、所望のＣＡＲ構築物を保有するレトロウイルスでトランスフェクトされる。ＭＦＧレトロウイルス及びトランスフェクト真核細胞におけるその使用は、当業者に周知である。ＣＡＲ−Ｔ細胞の生成のために、ＣＥＡ  ＣＡＲをコードする発現カセットを、ＭＦＧレトロウイルスベクター骨格のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位の間に挿入することができる。挿入された配列の開始コドンは、ウイルスｅｎｖ開始コドンの位置に正確に位置する。ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲが、骨髄増殖性ウイルス由来の相同配列で置換されており、及び５’プライマー結合部位が、正の鎖プライマーとしてｔＲＮＡｐｒｏではなくｔＲＮＡｇｌｕを利用する変異体由来の相同配列で置換されている、ＭＰＳＶ／ＰＢＳＱと呼ばれるＭＦＧベクターを使用できる。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、選択マーカー遺伝子を含まない。トランスフェクトされた細胞からのレトロウイルスベクター上清は、ＰＧ１３パッケージング細胞株を用いて産生され得る。ＰＧ１３細胞株は、マウス３Ｔ３細胞にテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ヘルパーパッケージングシステムを安定して導入することによって産生された。ベクタープロデューサ細胞（ＶＰＣ）株は、２段階プロセスによって作成される。最初に、ＣＡＲ−ＭＦＧベクターをＧＰ＋Ｅ８６エコトロピックパッケージング細胞株にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞からの一時的なウイルス上清を回収し、ＰＧ１３細胞
を感染させるために使用する。感染後、ＰＧ１３細胞をフローサイトメトリーによりＣＡＲ導入遺伝子の発現についてアッセイする。次いで、細胞を、ＦＡＣＳによるＣＡＲ導入遺伝子の安定発現のために選別して、マスター作業細胞バンクを確立し、安全性、無菌性、同一性及び複製コンピテントレトロウイルス（ＲＣＲ）の不在について試験する。形質導入した細胞を凍結して、患者の用量を構成する量にする。いくつかの実施形態では、適切な量のＣＡＲ−Ｔ細胞を、約５０〜１００ｍＬ、７５〜１００ｍＬ、７５〜１２５ｍＬ、または約５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、または１３５ｍＬの等張性及び薬学的に許容される溶液を含む１つのバッグ内の液体窒素気相中に保存する。いくつかの実施形態では、溶液は、約１５〜２５％、１５％、２０％または２５％のアルブミンを含有する。他の実施形態では、溶液は、約５〜１５％、５％、１０％または１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。好ましい実施形態では、溶液容量は、約１００ｍＬであり、適切な数の細胞、約２０％のアルブミン及び約１０％のＤＭＳＯを含有する。いくつかの実施形態では、投与前に細胞生存率を維持するために、約４００，０００〜５００，０００ＩＵまたは約４５０，０００ＩＵのＩＬ−２を凍結前にバッグに添加する。溶液を投与前に解凍する。
【００６６】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の肝動脈注入（ＨＡＩ）
本明細書に開示される研究及び結果は、肝動脈注入によるＣＡＲ発現免疫応答性細胞の投与が、肝臓に転移したがんを治療する際の治療効果を提供し得ることを示す。本明細書に記載されるように改変されて、肝臓転移、具体的にはＣＥＡを発現する転移性細胞を標的とする細胞の投与は、例えば小分子化学療法剤の注入と比較してかなり複雑なプロセスである。結腸にあるような正常細胞は、ＣＥＡを発現する。健常細胞の破壊を最小化または防止するために、改変ＣＡＲ−Ｔ細胞による正常細胞の接触を最小化または排除することが重要である。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、様々なサイトカインを分泌することができる免疫細胞であり、有害な副作用に寄与する。以下に、この問題に取り組む方法、具体的には、改変された免疫応答性細胞の健常細胞への曝露を最小限に抑え、改変された細胞の罹患細胞との接触を最適化するための手段を記載する。
【００６７】
好ましい実施形態において、ＣＡＲ発現免疫応答性細胞は、操作された細胞で治療される対象から得られたＴ細胞を使用して生成された抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞である。肝転移と診断された患者を治療するためのＣＡＲ−Ｔ細胞のＨＡＩは、改変細胞が、転移性細胞が存在する肝臓に効率的に指向される場合に、最も効果的であろう。ＣＡＲ−ＴのＨＡＩもまた、ＣＥＡを発現する肝外組織への免疫介在損傷を最小限にするために選択された。ＣＡＲ−Ｔ療法の恩恵を受ける可能性が最も高い患者は、結腸直腸がん肝転移などの肝転移と診断された患者である。しかし、本明細書に開示される治療方法は、肝臓腫瘍細胞または肝臓転移細胞が操作され、投与されたＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される１つ以上のタンパク質を発現する患者の治療に有効であり得ることが理解される。そのような腫瘍抗原には、炭水化物抗原（ＣＡ）１９−９、炭水化物抗原（ＣＡ）１２５、及びチミジンキナーゼが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の表面上に発現されるキメラ受容体は、周知のがん抗原がん胎児性抗原を認識してこれに結合する。がん胎児性抗原（ＣＥＡ）は、結腸直腸がん、胃がん、膵臓がん、肺がん、乳がん及び甲状腺髄様がん細胞を含むが、これらに限定されない多くの悪性細胞型によって発現されるがん胎児性細胞表面糖タンパク質である。肝臓のような別の器官に転移するこのような悪性細胞は、ＣＥＡの発現を含むそれらの表現型を維持し、したがって、抗ＣＥＡ免疫療法の標的である。ＣＥＡは、構造及び配列においてよく知られており、よく特徴付けられている複数のアイソフォームを有する（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１７１７４２、ＮＰ＿００１１７１７４４、ＮＰ＿００１０２００８３、及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１３６８８）。本方法は、当技術分野で既知のようにＣＥＡタンパク質を特異的に認識するキメラ受容体タンパク質を発現するように操作された免疫応答性細胞の使用を用いる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体
タンパク質は、配列番号５に対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＣＥＡタンパク質に特異的に結合する。
【００６８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された患者は、肝臓がんと診断されている。いくつかの実施形態では、患者は、検出不能なＣＥＡ陽性肝転移または検出可能な血清ＣＥＡレベルを有する。他の実施形態において、患者は、従来の全身療法または化学療法の１つ以上の系統は不成功であった。肝臓ＭＲＩ及びＰＥＴ検査は、がんまたは転移の位置及び程度を決定するためにＣＡＲ−Ｔ治療の前に実施される。
【００６９】
改変された細胞を肝動脈に直接注入することで改変された細胞の大部分が肝臓に導かれるが、多くの細胞は４０〜４５％の人々で観察される肝動脈解剖学的変化のために迂回される。肝臓全体に供給するために固有肝動脈が右肝動脈及び左肝動脈に分岐することは、集団の約８０〜８５％に見られる。残りの集団において、例えば、肝動脈は、右肝動脈または左肝動脈のみに分岐していてもよく（肝臓の右または左葉にそれぞれ栄養を与える）、または固有肝動脈は、いくつかの血流を肝臓以外の器官に分流させる異常血管に置換され得る。したがって、ＨＡＩを実施する前に肝臓の左右の葉に繋がる血管をマッピングし、必要に応じて肝臓に通じない血管を閉塞することが重要である。いくつかの実施形態では、注入の前に、患者は、例えば共通の大腿動脈アプローチを介してマッピング血管造影を受ける。
【００７０】
体内の血管をマッピングする方法は、当業者に周知である。治療の前にこのようなマッピングが終了すると、開業医は、どの血管が閉塞されるかを決定する。閉塞は、例えば開業医が標的外の動脈または血管を遮断し、それによって肝臓への改変細胞の送達を最適化することを可能にするマイクロコイル塞栓術の使用によって達成される。マイクロコイル塞栓術は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む薬学的組成物の最適注入を容易にするためにＣＡＲ−Ｔ細胞の最初の用量を投与する前に、必要に応じて行うことができる。
【００７１】
記載された方法は、肝動脈に直接配置されたカテーテルを介して治療用ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与することを含む。例えば、治療用ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む薬学的組成物は、１ｍＬ／秒未満、２ｍＬ／秒未満の速度で、または約１〜２ｍＬ／秒、１〜３ｍＬ／秒、１〜５ｍＬ／秒、１ｍＬ／秒、２ｍＬ／秒、もしくは３ｍＬ／秒の速度で、シリンジを介して肝動脈に手で注入される。あるいは、細胞は、手注射について記載したのと同じ速度で、当技術分野で容易に知られているように、注入ポンプを用いて注入される。治療用ＣＡＲ−Ｔ細胞の用量（例えば、約１０８、１０９または１０１０個の細胞）を含む薬学的組成物は、約２５〜１００ｍＬ、２５〜７５ｍＬ、４０〜６０ｍＬ、５０〜７５ｍＬまたは５０〜１００ｍＬの全容量を有するか、または約２５ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７５ｍＬまたは１００ｍＬの全容量を有する。本明細書で開示される方法は、患者に投与される改変された細胞の用量が左右肝動脈に向けられることを確実にするために肝臓体積計算を実施し、それにより肝臓全体に治療上有効な用量を提供することをさらに含み得る。肝臓体積計算は、当業者に既知の標準的な方法に従って行われ、シンチグラフィー、超音波、単一光子放出コンピュータ断層撮影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）及び磁気共鳴画像法が含まれるが、これらに限定されない。患者の体積計算が完了すると、改変された細胞の用量または数は、右葉及び左葉に送達される改変された細胞の数が右葉及び左葉の体積それぞれに比例するように、右及び左の肝動脈に注入するため分割される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、全体積の５０％を患者に注入し、ＣＡＲ−Ｔ溶液を攪拌して完全な細胞懸濁を確実にし、次いで全体積の最後の５０％を患者に注入する。注入は、１８ゲージの針を用いて行うことができる。
【００７３】
ＩＬ−２の同時投与
患者は、ＣＡＲ−Ｔ治療期間の間、例えば毎週または２週間ごとにＣＡＲ−Ｔ注入を受ける。ＣＡＲ−Ｔ治療期間は、２、３、４、５、６  ７、８、９、または１０週間であってもよく、あるいは２〜１０、４〜９、２〜８、２〜６、２〜４、３〜６、４〜８または４〜６週間続いてもよい。ＣＡＲ−Ｔ治療期間の開始（０日目）は、治療される患者（あるいは代わりに、治療されるべき患者ではない対象）から血液細胞が採取される日である。ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入を受ける患者にはまた、ＩＬ−２も投与されうる。ＩＬ−２は、注入後のＣＡＲ−Ｔ細胞の生存を促進するが、発熱、吐き気、嘔吐、及び／または頻脈などの有害な副作用を引き起こさないかまたは増強しないＩＬ−２の用量を使用することが好ましい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ＣＡＲ−Ｔ治療期間の全期間にわたって連続して投与される。このような連続注入は、ポンプ貯蔵器を使用して実施することができ、患者を歩行可能にする中心静脈カテーテルまたは他の方法によって投与することができる。ＩＬ−２注入は、ＣＡＲ−Ｔ注入の開始の１、２または３時間前に開始することができ、または最初のＣＡＲ−Ｔ注入開始時または注入最中に、または、最初のＣＡＲ−Ｔ注入の完了後、約１、２または３時間以内に投与することができる。
【００７４】
ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの第Ｉ相試験
肝転移（ＬＭ）を有する８人の患者が最初に登録され、本明細書に記載の抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療される第１相臨床試験を実施した。６人の患者がプロトコルを完了した。患者をコホート１とコホート２に分けた。０日目にすべての患者から細胞を採取し、抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するために使用した（抗ＣＥＡ  ｓｃｆｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８／ＣＤ３ζＣＡＲ−Ｔ細胞）。１４日目、２８日目、４２日目に、コホート１の各患者は、１４日目に１０８個の細胞、２８日目に１０９個の細胞、４２日目に１０１０個の細胞の注入を受けた。コホート２については、１４日目、２８日目、４２日目に、各患者は１０１０個の細胞の注入を受けた。コホート２の患者はまた、１４日目に開始し、５５日目または５６日目に終了するＩＬ−２の７５，０００ＩＵ／ｋｇ／日の用量の連続注入を受けた。約５６日目に、コホート１及び２における患者のＭＲＩ及びＰＥＴ分析を５６日目に行った。プロトコルを完了した６人の患者からのデータは、抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−ＴのＨＡＩが全身性ＩＬ−２注入の有無に十分耐容性であることを示した。ＩＦＮγのスパイクは、系ＩＬ−２の有無にかかわらず、すべての患者において２４時間から４８時間後に発生することが確認された（図６参照）。放射線学的な部分的または完全な反応はなかったが、６人の患者のうち１人は安定した疾患を有し、少なくとも２４ヶ月の追跡期間にわたって生存していた。
【００７５】
本明細書に記載された研究は、全身性ＩＬ−２補助の有無にかかわらず、１０１０個の細胞の最大計画用量に達する抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの安全性を確立した。したがって、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの安全性及び有効性を伴って、この知見は、ＬＭの治療のためのＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの使用を支持する。研究対象における限定されたＣＡＲ−Ｔの全身暴露は、おそらく、有利な有害事象プロファイルの主要因である。全身性ＩＬ−２補助は、より重篤ではあるが管理可能な有害事象を代償とする、血清ＩＦＮγレベルの上昇及びＣＥＡ応答の改善と関連していた。実施例４に示されるように、ＨＡＩは、正常肝臓及び末梢血と比較して、患者６人のうち５人において肝転移内でＣＡＲ−Ｔの優先的蓄積をもたらした。６人の患者のうち４人でＣＡＲ−Ｔは、末梢血で検出されず、患者７と８では一時的にしか観察されなかった。重要なことに、増大したＬＭ壊死及び線維化の組織学的証拠は、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩ後の大多数の対象において見られた（図５参照）。これらのデータはすべて、ＣＥＡ＋腫瘍沈着物（ｔｕｍｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｓ）へのＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の効果的な送達は、腫瘍死滅及び血清サイトカインサージの組織学的証拠とよく相関し、肝動脈注入による肝転移の治療のためのＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、抗ＣＥＡ
ｓｃｆｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８／ＣＤ３ζＣＡＲ−Ｔ細胞）の治療効果を支持することを示した。
【００７６】
ＨＡＩは、正常な肝臓及び末梢血と比較して、ＨＩＴＭ患者６人のうち５人においてＬＭ中にＣＡＲ−Ｔを優先的に蓄積した。ＣＡＲ−Ｔは、患者６人のうち４人で末梢血中に検出されず、患者７及び８では一時的にしか観察されなかった。肝機能検査値の中程度の上昇（例えば、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベルの一時的な上昇）は、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩに関連する可能性があるが、臨床的に有意な結果をもたらさなかった。抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔを発現するＴ細胞の全身注入は、用量規制毒性をもたらすことが以前に報告された（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら，２０１１，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１９：６２０−６２６）。特にＩＬ−２補助を伴って全身的に注入された場合、抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔを用いた本研究においても同様の毒性が見られた（図示せず）。７５，０００ＩＵ／ｋｇ／日のＩＬ−２の連続的な移動式の注入用量は、他のプロトコルに示されているものより数倍低い（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，１９９９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，１７：９６８−９７５）。この研究でＩＬ−２の１日の投与量は低いにもかかわらず、２人の患者がＩＬ−２の投与量削減を必要とする等級３の事象を経験した。重篤な発熱及び大腸炎を含むこれらの有害事象は、ＩＬ−２の用量減少の際に症状が速やかに解消されたことに基づきＩＬ−２に起因する可能性がある。１人の対象において、ＩＬ−２は、発熱及び大腸炎を媒介する少量の全身循環性抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔを活性化する可能性がある。全体的に、ＩＬ−２注入投与は十分に許容され、有害事象は用量減少によって容易に管理された。
【００７７】
本開示の一態様では、各患者のＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の用量レベルは、ＨＡＩを介して１週間に１回投与される１０１０個の細胞である。細胞の週１回の注入の治療有効性は、本明細書に開示される第１相試験からの血清肝化学及びサイトカインデータによって裏付けられる。２週間ごとに注入を行った第１相試験では、ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの後に、血清アルカリ性ホスファターゼ、ビリルビン、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルにおいて、一時的であるが臨床的に有意ではない上昇を示した（実施例７参照）。ほぼすべての場合において、レベルは３〜４日以内に正常化した。同様に、患者は、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩに続く血清ＩＦＮγ及びＩＬ−６レベルの急激な上昇を示し、これはベースラインレベルまたはほぼベースラインレベルに１週間以内に戻った。これらのデータは、１週間の間隔が、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩに対する急性炎症反応の消散を可能にするとともにＣＡＲ−Ｔの安全な再現を可能にするために十分であることを示唆している。ＣＡＲ−Ｔ間隔を２週間から１週間に変更することで、患者のＩＬ−２曝露も最小限に抑えられ、臨床的に示されている患者の全身療法へのより迅速な回復が可能になる。好ましい実施形態において、ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞注入を１週間に１回投与されている患者は、５０，０００ＩＵ／ｋｇ／日の用量でＩＬ−２の連続的全身注入を受ける。いくつかの実施形態では、切除不能な肝転移と診断された患者に、ＣＡＲ−Ｔ注入治療期間中、最終的なＣＡＲ−Ｔ注入の１４日後を含めて２８日間、連続静脈内注入によって、ＩＬ−２の５０，０００ＩＵ／ｋｇ／日の用量を投与する。
【００７８】
肝転移のＣＡＲ−Ｔ治療の治療有効性は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、または超音波などの常用の画像処理技術によって決定することができる。そのような画像処理手順は、治療前、治療中及び治療後の肝臓における腫瘍負荷または腫瘍の広がりを測定することができる。ＣＡＲ−Ｔ細胞のＨＡＩのための治療的に有効な投薬レジメンは、細胞の最初の注入の前の腫瘍負荷と比較して、約１０％〜１００％、１０％〜８０％、１０％〜６０％、１０％〜４０％、２０％〜４０％、２０％〜６０％、２０％〜８０％腫瘍負荷を軽減することができる。
【００７９】
選択的内照射療法（ＳＩＲＴ）を併用するＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩ
選択的内照射療法（ＳＩＲＴ）は、切除不能ながんと診断された患者に一般に使用される放射線療法の一形態である。ＳＩＲＴは、その標的臓器、組織または腫瘍の損傷または死をもたらす治療用線量の電離放射線をその標的に効果的に送達するために、器官、組織
または腫瘍のような標的に放射性マイクロスフェアとして投与される。
【００８０】
治療的適用のための放射性マイクロスフェアは、通常、電離放射線を放出する放射性核種材料のための担体として作用することができるマトリックス材料を含む。特に、治療効果を有するがん患者の血流に注入するために、多くのベータ線を放射する放射性核種例えば、リン−３２、ホルミウム−１６６またはイットリウム−９０を、マトリックスマイクロスフェア例えばポリマー樹脂またはガラス微小球に付着させることができることが以前に示されている。
【００８１】
放射性マイクロスフェアは、一般に、標的組織または腫瘍の動脈血供給を介して送達される。この目的のために、標的組織または腫瘍に送る血管枝にカテーテルを誘導して、マイクロスフェアを循環中に注入する。放射性マイクロスフェアは、肝臓動脈、門脈、またはこれらの血管のいずれかの枝内への放射性マイクロスフェアの注入によって、肝臓全体、肝臓の一部の動脈血供給部、または治療すべき腫瘍を含む肝臓の部分の動脈血供給部に、導入することができる。放射性マイクロスフェアは、標的組織または腫瘍の毛細血管床に捕捉され、標的組織または腫瘍への線量の選択的送達をもたらす。
【００８２】
肝臓がんのＳＩＲＴ治療に利用可能な市販の２つの製品は、ＴｈｅｒａＳｐｈｅｒｅ（登録商標）（ＭＤＳ  Ｎｏｒｄｉｏｎ、Ｉｎｃ．）、及びＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）（ＳＩＲＴｅＸ（登録商標）Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｔｄ．）が含まれる。両製品は、イットリウム−９０標識マイクロスフェアであり、ＴｈｅｒａＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）は、直径２５±１０μｍを有するガラスマイクロスフェアであり及びＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）は、直径３２±２．５μｍを有する樹脂ベースのマイクロスフェアである。
【００８３】
本明細書に開示される第１相試験の有望な結果及びＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの治療効果にもかかわらず、可能であればいつでも治療効果及び利便性を最適化することが常に最良である。組み合わせ戦略は、しばしば難病と診断された患者の利益を最大化することができる。放射線療法は、エフェクターＴ細胞の抗原放出及び補充によって免疫原性腫瘍細胞死を誘導する。放射線療法単独では、効果的な抗腫瘍免疫を生成することはめったにない。しかしながら、標的化免疫療法剤と組み合わせた場合、放射線療法は、治療上有効な抗腫瘍免疫応答に有意に寄与する。「ＨＩＴＭ−ＳＩＲ」試験は、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩに続くＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）を用いて、腫瘍の死滅における安全性及び増加可能性を試験するように設計されている。ＨＩＴＭ−ＳＩＲは、証明された安全性を備えた確立された原則及びアプローチの新規な繰り返しである。本新規な試験は、ＬＭの管理のためのパラダイム変更データを生成する可能性を有している。
【００８４】
一態様では、肝転移と診断された対象を治療する方法であって、全身性ＩＬ−２投与を伴いまたは伴わずに、対象を上記のＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩで治療し、続いてＳＩＲＴの投与が行われる、方法が提供される。患者は、腫瘍の体積に基づいて、２ＧＢｑ、２．５ＧＢｑ、または３ＧＢｑの９０Ｙ活性のいずれかと同等のＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓを投与される。いくつかの実施形態では、全肝臓体積の２５％未満、約２５％〜５０％または５０％超の腫瘍容積を有する患者には、２ＧＢｑ、２．５ＧＢｑ、または３ＧＢｑの９０Ｙ活性に相当するＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓがそれぞれ与えられる。最後のＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩ注入の約１週間後、２週間後、または３週間後に、ＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓの用量を患者に投与する。好ましい実施形態では、ＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓの用量は、最終ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩ注入の約１週間後に投与される。
【００８５】
免疫抑制剤
キメラ抗原受容体Ｔ細胞注入の治療有効性は、免疫抑制、例えば腫瘍死滅細胞の抑制ま
たは抗腫瘍サイトカインの発現の減少をもたらす因子によって影響される可能性がある。がんの存在下での腹腔内空間の免疫環境の影響を考慮し、それに応じてキメラ受容体Ｔ細胞治療を受ける患者を治療することが重要である。
【００８６】
腫瘍微小環境内の免疫抑制調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の蓄積は、有効な抗腫瘍免疫療法の開発の潜在的な主要な障害となる（Ｗｅｉｓｓら，２０１４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９２：５８２１−５８２９）。ＭＤＳＣの排除は、担がんマウス及びがん患者における免疫応答を有意に改善することが示されている（Ｏｓｔｒｏｎｇ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，２００９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８２：４４９９−４５０６）；Ｔａｌｍａｄｇｅ，２００７，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｒｅｓ，１３：５２４３−５２４８）。キメラ受容体Ｔ細胞療法を受けている患者において、例えば、Ｔｒｅｇ及びＭＤＳＣによる、免疫抑制を阻害するための方法であって、この患者に、免疫抑制細胞の機能を阻害する薬剤も投与される方法もまた本明細書で提供される。ＭＤＳＣ及びＴｒｅｇの両方は、内因性Ｔ細胞及びＣＡＲ−Ｔ抗腫瘍応答の阻害剤として十分に記載されている（Ｋｈａｌｅｄら，２０１３，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，９１：４９３−５０２；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒら，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ，  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１８４５：１８２−２０１）。ＩＰ  ＭＤＳＣはまた、以前にＣＡＲ−Ｔ抑制の重要なメディエーターであることが実証されている高レベルのＰＤ−Ｌ１（プログラムされたデス−１受容体リガンド）を発現した（Ｂｕｒｇａら，２０１５，６４：８１７−８２９）。したがって、本開示の１つの態様において、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩを受ける患者には、ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇのようなサプレッサーＴ細胞の活性を抑制する免疫抑制剤も投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、Ｇｒ１（顆粒球性骨髄性マーカータンパク質）またはＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体に結合するＭＤＳＣ枯渇抗体である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、ＩＬ−１０、ＰＤ−１（プログラムされたデス−１受容体）に結合する抗体であり、ＰＤ−Ｌ１（プログラム死−１受容体リガンド１）、ＰＤ−Ｌ２（プログラム死−１受容体リガンド２）、ＳＴＡＴ３（転写３のシグナルトランスデューサー及びアクチベーター）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質）、ＴＧＦ−β、またはＣＴＬＡ４と結合する抗体である。他の実施形態において、免疫抑制剤は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入前に対象に投与される。さらに他の実施形態において、免疫抑制剤は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入後に対象に投与される。免疫抑制剤は、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの後、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごとまたは１週間に１回（７日ごと）に複数回投与することができる。免疫抑制剤は、前記注入と同じ日に投与することができ、または最初のＣＡＲ−Ｔ肝動脈注入の１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前またはそれ以上前に投与することができる。２つ以上の免疫抑制剤を患者に投与することができ、例えば、対象は、ＣＤ２５に結合する抗体及びＧＲ１に結合する抗体を共投与または逐次投与することができる。
【００８８】
関連技術の前述の例及びこれに関連する限定は、例示的であり排他的なものではないことが意図される。関連技術の他の限定は、明細書の読解及び図面の検討に際して当業者には明らかになるであろう。
【００８９】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は本質的に例示的なものであり、限定することを意図するものではない。
実施例１
ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞の生産
以下により詳細に記載するように、６人の患者（本明細書では患者番号１、４、５、６、７及び８と呼ぶ）を、その表面にＣＥＡ抗原を発現する転移性細胞を特異的に標的とす
るＣＡＲ−Ｔ細胞の肝臓注入で治療した。抗ＣＥＡ  ｓｃｆｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８／ＣＤ３ζ（タンデム）キメラ抗原受容体を、先に記載したようにＭＦＧレトロウイルス骨格にクローニングした（ＦＤＡ  ＢＢ  ＩＮＤ  １０７９１）（Ｅｍｔａｇｅら，Ｃｌｉｎ
Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ，１４：８１１２−８１２２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に述べると、タンデム分子は、ＣＥＡに特異的に結合するモノクローナル抗体のｈＭＮ１４  ｓＦｖ（配列番号１）、ＣＤ８ヒンジセグメント、ＣＤ２８細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、ならびにζ細胞質ドメインを含む。得られたキメラ構築物をレトロウイルスベクターにクローニングし、制限消化及び配列決定によって確認した。臨床レトロウイルスベクター上清をＰＧ１３細胞を用いて産生させて、先に記載したようにテナガザル白血病ウイルスシュードタイプウイルス粒子を生成した（Ｂｅａｕｄｏｉｎら，２００８，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４８：２５３−２５９）。すべての臨床バッチは、インディアナ大学のベクター生産施設（Ｉｎｄｉａｎａ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）（インディアナ州、インディアナポリス）で調製し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００９０】
ロードアイランドの血液センターの要員は、ロジャーウィリアムスメディカルセンター（Ｒｏｇｅｒ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＲＷＭＣ）、ロードアイランド州、プロビデンス）で白血球搬出法を行った。処理、製造、増殖、用量採取、ラベリング、貯蔵及び分配のための標準操作手順（ＳＯＰ）を備えた、ＲＷＭＣ細胞免疫療法及び遺伝子治療（ＣＩＴＧＴ）グッドマニュファクチャリングプラクティス（ＧＭＰ）施設（ＲＷＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ＣＩＴＧＴ）Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔを調製した。簡単に述べると、患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ、モンタナ州、セントルイス）を用いて白血球搬出産物から単離した。次いで、５％滅菌ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、バージニア州、ウィンチェスター）、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３、Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ペンシルベニア州、ホーシャム）及び３０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ、カリフォルニア州、サンディエゴ）を補充したＡＩＭ  Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州、グランドアイランド）を含む組織培養フラスコ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、ニュージャージー州、フランクリンレイクス）で４８〜７２時間ＰＢＭＣを活性化した。
【００９１】
スピノキュレーション法（Ｑｕｉｎｔａｓ−Ｃａｒｄａｍａら，２００７，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１８：１２５３−１２６０）を用いて、患者から得た７．２〜１４．４×１０８個のＴ細胞を、５％ヒトＡＢ血清、３０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、及び硫酸プロタミン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含むＡＩＭ  Ｖ培地中で、レトロネクチン（タカラバイオ社、日本）でコーティングした６ウェルプレートにおいて、室温で１時間、低速遠心分離で形質導入した。この形質導入工程は、２４時間にわたって合計３回実施した。形質導入後、細胞を培地で洗浄し、３７℃で４８〜７２時間インキュベートした。ＣＡＲ−Ｔを、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ組織培養バッグ（Ｂａｘｔｅｒ、イリノイ州ディアフィールド）でさらに１０〜１４日間増殖させた。ＣＡＲ−Ｔ増殖曲線及び細胞生存率を定期的に調べ、必要に応じて細胞増殖培地を交換した。ＣＡＲ−Ｔを、ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、メリーランド州、フレデリック）、ＣＤ４（ＳＫ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）、ＣＤ８（３Ｂ５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＣＡＲ発現（ＷＩ２抗体，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ、ニュージャージー州、ノリスプレインズ）に特異的な蛍光標識抗体でのフローサイトメトリーによって試験した。ＷＩ２抗体は、ＡＰＣコンジュゲート（ＷＩ２−ＡＰＣ；分子プローブ）として調製した。フローサイトメトリーは、ＣｙＡｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州ブレア）またはＬＳＲ−ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）装置で行った。患者の産物のインビトロ活性は、生物発光細胞毒性アッセイに
よって測定した。ルシフェラーゼ発現ＣＥＡ＋腫瘍細胞を９６ウェル丸底プレート中で様々な比率で抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔと混合し、各ウェルからの生物発光の消失を測定した（Ｋａｒｉｍｉら，２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，９：ｅ８９３５７）。形質導入Ｔ細胞を培養し、ＩＬ−２（５００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で増殖させ、ＣＡＲ発現レベルを形質導入の４８時間後に調べた。
【００９２】
ＣＡＲ−Ｔ細胞を評価するために、各患者由来の白血球搬出産物を、抗ＣＥＡ  ＣＡＲ構築物での形質導入の前及び後にフローサイトメトリーによって分析した。患者１、４、５、６、７及び８について、白血球搬出後のＣＤ３＋細胞の平均パーセンテージは、活性化及び形質導入後に５５％（範囲１２．０〜８２．０）であり、９１％（範囲７２〜９７）に増加した（図１）。平均ＣＤ４：ＣＤ８比は、白血球搬出試料で２．４（範囲、１．４〜４．７）であり、最終産物（図示せず）で０．８（０．２〜２．２）であった。形質導入効率（ＣＡＲ＋）は、１０％〜６４％の範囲であり、平均は４５％であった（図１）。無視できるＦｏｘＰ３染色が、注入前にＣＡＲ＋Ｔ細胞の間で検出された（図示せず）。最終産物中の細胞は、注入前に８５％生存可能であった（範囲、７１〜９５）。ＣＥＡ＋標的細胞の患者産物死滅を試験するために、インビトロ細胞傷害性アッセイを実施した。抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＥＡ＋ＭＣ３８結腸直腸がん標的細胞と共に培養した。標的細胞死滅は、ルシフェリン添加後の生物発光の消失によって定量した。特異的溶解は、残留光子数に基づいて計算した。これらのアッセイは、患者産物がＣＥＡ＋標的細胞を特異的に溶解したことを確認した（図２）。
【００９３】
ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ）、２０％ヒトウシアルブミン（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、１０％ＤＭＳＯ（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ、イリノイ州、レイクフォレスト）及びＩＬ−２を含む凍結培地中でＦｅｎｗａｌ細胞ハーベスターシステム（Ｂａｘｔｅｒ、イリノイ州、ディアフィールド）を用いて臨床用量を調製した。細菌培養及び真菌培養をそれぞれ１４日間及び２８日間監視した。細菌エンドトキシンのアッセイは、ＬＡＬエンドトキシンアッセイキット（Ｌｏｎｚａ、メリーランド州、ウォーカーズビル）を用いて行った。臨床用量を液体窒素中に貯蔵しそして注入の直前に解凍した。
【００９４】
実施例２
臨床研究デザイン
第Ｉ相臨床試験（ＮＣＴ０１３７３０４７、ＲＷＨ  １１−３３５−９９）を実施した。この研究は、従来の全身療法の平均２．５（範囲２〜４）ラインで進行した切除不能ＣＥＡ＋腺がんＬＭを有する８人の患者を登録した（表２）。
【００９５】
【表２】
2018513216.tif 000005
６人の患者がプロトコルを完了し（図３）、治療前の無関係な感染のために１人の患者が中止し、肝臓外の疾患の進行により別の患者が３回目のＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの前に中止した。プロトコルを完了した患者のうち、４人が男性で、２人が女性であった。５人の患者はＩＶ期の結腸直腸がんを有し、１人の患者は膵胆管膨大部がん（ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ａｍｐｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を有していた。平均年齢は５７歳（５１〜６６歳）であった。患者は、最大のＬＭの平均サイズが８．４ｃｍ（範囲、１．７〜１４．４）であり、５人の患者が１０を超えるＬＭを有する、相当な疾病負荷を示した。登録時の平均ＣＥＡレベルは８０７ｎｇ／ｍｌ（範囲、２〜３２６５）であった。８人の患者のうち５人に同時性結腸直腸のＬＭがあり、異時性のＬＭ患者の平均無病期間は２７．３カ月（範囲、９〜３７）であった。さらなる分析には、試験を完了した６人の患者のみが含まれる。
【００９６】
この研究では、３人の患者の２つのコホートを、全身性ＩＬ−２補助を伴わないか、または全身性ＩＬ−２補助を用いて抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩで処置した（図３）。コホート１（患者１、４及び５）は、ＩＬ−２なしで、患者内用量増加様式（１０８、１０９、及び１０１０個の細胞）でＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩで処置した。具体的には、Ｔ細胞を０日目に各患者から収集し、最初の注入を１４日目に行い、その間に１０８個の細胞を注入し、２回目の注入を２８日目に行い、その間に１０９個の細胞を注入し、３回目の注入を４４日目に行い、その間に１０１０個の細胞を注入した。コホート２（患者６、７及び８）は、１４日目の最初の注入時に始まる６週間外来輸液ポンプを介して７５，０００Ｕ／ｋｇ／日の連続的な全身ＩＬ−２注入に加えて、１４日目、２８日目及び４４日目に１０
１０のＣＡＲ−Ｔの３回ＨＡＩを受けた。
【００９７】
対象となる患者は、測定可能な、切除不能のＣＥＡ陽性ＬＭまたは検出可能な血清ＣＥＡレベルを有し、従来の全身療法の１つ以上の系統が不成功であった。肺または腹部における最小限の肝外病変は認められた。ベースライン、注入日、及び注入後１、２、４及び７日目に臨床評価を行った。肝臓ＭＲＩ及びＰＥＴ検査による計画された画像診断評価は、最初の注入の１ヶ月以内に、次いで３番目のＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの１ヶ月以内に予定された。研究放射線科医（ＢＳ）は、修正ＲＥＣＩＳＴ（ｍＲＥＣＩＳＴ）及び免疫関連応答基準（Ｗｏｌｃｈｏｋら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１５：７４１２−７４２０）に従って応答を等級分けした。盲検の病理学者は、治療前及び第２回投与の２週間後に行った経皮的生検からのスライド上の腫瘍壊死及び線維化を評価した。プロトコルごとに安全性評価を実施した。有害事象の重症度は、バージョン３．０の有害事象の国立がん研究所共通用語基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ
Ｅｖｅｎｔｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０）を用いて等級付けした。
【００９８】
実施例３
ＣＡＲ−Ｔ細胞肝動脈注入
ベースライン時に、右大腿動脈アプローチを介してマッピング血管造影を行った。他の潜在的な肝外灌流源に加えて、胃十二指腸及び右胃動脈は、マイクロコイルで塞栓形成された。ＣＡＲ−Ｔ注入については、同じ動脈アクセス手順を実施し、６０ｃｃシリンジを介して２ｃｃ／秒未満の速度で、１００ｃｃの総容量で細胞を手で注入した。最初の５０ｃｃ後及びＣＡＲ−Ｔ注入の完了時に、較正されたコントラスト速度を有する血管造影を実施して、保存された動脈流を確認した。可能であれば、適切な肝動脈に注入液を送達した。右または左の肝動脈のいずれかが固有肝動脈から生じなかった異常な肝動脈解剖所見の場合、葉の体積計算に基づいて用量を分割した。そのような場合、両方の葉への比例したＣＡＲ−Ｔ送達を確実にするために、分割用量を左右の肝動脈に別々に送達した。
【００９９】
以下の実施例において使用された抗ＣＥＡ  ｓｃｆｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８／ＣＤ３ζ（タンデム）キメラ抗原受容体を、以前に記載されたようにＭＦＧレトロウイルス骨格中にクローン化した（ＦＤＡ  ＢＢ  ＩＮＤ  １０７９１）（Ｎｏｌａｎ，ら，１９９９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５：３９２８−３９４；Ｅｍｔａｇｅら，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１４：８１１２−８１２２；前記実施例１を参照されたい）。簡単に述べると、タンデム分子は、ＭＦＧレトロウイルス骨格中のｈＭＮ１４  ｓＦｖ−ＣＤ８ヒンジセグメントをコードするフラグメントをハイブリッドＣＤ２８／ＣＤ３ζ分子と分子的に融合することによって生成された。構築物を制限消化及び配列決定によって確認した。臨床的レトロウイルスベクター上清を、ＰＧ１３細胞を用いて産生し、先に記載したように、テナガザル白血病ウイルスシュードタイプウイルス粒子を生成させた（Ｂｅａｕｄｏｉｎら，２００８，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４８：２５３−２５９）。すべての臨床バッチは、インディアナ大学のベクター生産施設（インディアナ州インディアナポリス）で調製し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１００】
実施例４
注入後のＣＡＲ−Ｔ細胞の輸送
第１のＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの前及び最終ＨＡＩの時点でＬＭ及び正常肝臓をサンプリングするために、ＣＴ誘導経皮的生検を得た。ＬＭ生検、正常肝生検、及び末梢血試料中のＣＡＲ−Ｔ（ＣＡＲ＋／全リンパ球％）の割合をフローサイトメトリーによって決定した。例えば、患者７の試料は、正常肝臓リンパ球の１．８％がＣＡＲ−ＴのＨＡＩに続いてＣＡＲ＋であり、腫瘍内リンパ球の７．６％がＣＡＲ＋であることを実証した。注入後のＬＭ生検標本におけるＣＡＲ＋細胞はＣＤ３＋であることが確認された。末梢血、正常肝
臓及びＬＭのＣＡＲ−Ｔ集団データをすべての患者について決定した。ＣＡＲ−Ｔは、６人中５人の正常な肝臓に比べて、ＬＭにおいて、より豊富であった。患者５では、ＣＡＲ−Ｔは、最終ＣＡＲ−Ｔ注入の１２週間後にマイクロ波アブレーション処置中に得られた試料中に１．４％のＬＭリンパ球を含むことが見出された。４人の患者では、ＣＡＲ−Ｔは末梢血では検出されなかったが、最終注入時に患者７及び患者８に一時的に存在し、３日後に検出レベルを下回った。最終的な注入後２日目に採取した末梢血サンプルについて定量ＰＣＲを実施し、患者７のみがベースラインに対してＣＡＲ  ＤＮＡの測定可能な増加（１．１倍）を示した。抗ＣＡＲ抗体は、ＣＡＲ−Ｔ注入後の患者血清では検出されなかった。
【０１０１】
実施例５
治療活性
最後のフォローアップでは、治験を完了した重度な前治療した６人の患者のうち５人が、疾患の進行のために死亡した（表３）。
【０１０２】
【表３】
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ＭＲＩ及びＰＥＴスキャンは、ベースラインで６人の患者のうち５人で、３回目のＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの後２〜４週で実施した。患者８は母国に帰国して最終画像処理を取得せず、最終的に疾患の進行により死亡した。患者５を除くすべての患者は、ｍＲＥＣＩＳＴ及び基準によるＸ線検査で疾患の進行があると判定された。患者５は、ＭＲＩ及びＰＥＴによって安定した疾患を有することが判明した。患者７は新たな病変を発症し、いくつかの既存病変のサイズの増加を示したが、他の病変はサイズが減少した。ＭＲＩでサイズが減少した患者７の後部セクターの病変は、ＰＥＴでは見えなかった。ＭＲＩ上でサイズが減少したより内側の疾患は、患者７の注入後ＰＥＴにおいて低代謝性になることが認められた。
【０１０３】
ＣＡＲ−Ｔを注入した後の短いフォローアップの従来画像処理の利用が限られていることを考慮して、各患者の３つのＨＡＩのそれぞれに続く複数の時点での血清ＣＥＡレベルを測定した。コホート１の患者の中で、血清ＣＥＡの一過性の減少が、各ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの後の２人の患者において実証された（図４、患者１及び５）。ＣＥＡ動態は、血清ＣＡ１９−９レベルの変化（図示せず）と密接に関連していた。肝胆道亜型膨大部がん（ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ａｍｐｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を呈した患者４は、試験中のいずれの時点でもＣＥＡが低下しなかった唯一の患者であり、生存期間も最短であった。
【０１０４】
抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔと共に全身性ＩＬ−２を受けたコホート２の患者は、治療に対してより良好なＣＥＡ応答を示した。コホート２の３人の患者のそれぞれが、ＣＡＲ−Ｔ機能に影響を及ぼす可能性のあるＩＬ−２中断または用量低下を要したので、我々はベースライン時のＣＥＡレベルをＩＬ−２用量変更の直前の時点（図４の矢印で示す）と比較した。これらの時点を用いると、コホート２の３人の患者のすべてが血清ＣＥＡ濃度の減少を示した（図４及び表３）。患者７及び８は、ＩＬ−２の投与中断または減少の前に、血清ＣＥＡ濃度がそれぞれ４８％及び４３％減少した。試験を完了した６人の患者の平均全生存期間は、３０週であり、中央値は１５週（８〜７３ヵ月）であった。患者５は、最終ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの２４ヶ月後に病気状態で生存している。ＨＩＴＭ試験の終了後、患者５は安定した疾患を有すると判定され、残存切除不可能な腫瘍のマイクロ波アブレーションを行った。
【０１０５】
進行した転移性疾患を有する重度の前治療された患者の放射線応答を検出することは、困難であり、腫瘍内の炎症及び浮腫が標準ＲＥＣＩＳＴ基準の関連性を最小限にする可能性がある免疫療法ではなおさらである（Ｗｏｌｃｈｏｋら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ，１５：７４１２−７４２０）。そこで我々は、腫瘍内壊死及び線維化の程度を評価するために、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの前及び後にＬＭ生検を得た。ベースライン時及び第３のＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの時点で、超音波検査の誘導の下で、正常な肝臓及び肝転移のコア針（１６ゲージ）生検が得られた。正常な肝臓及び肝臓の転移について３つのコアが得られ、それぞれが細胞診によって確認された。それぞれの場合について、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で４〜５ｍｍ切片を染色し、追加の染色されていないスライドを抗ＣＥＡ抗体（ＴＦ  ３Ｈ８−１；Ｖｅｎｔａｎａ）で染色した。すべての免疫組織化学的染色はＯｕｒ  Ｌａｄｙ  ｏｆ  Ｆａｔｉｍａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ロードアイランド州、プロビデンス）でのベンタナメディカルシステム（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）で行った。すべてのスライドを盲検法でレビューし、壊死及び線維化について等級分けした。線維化は以下のように採点した：０％、等級０；５％〜１０％、等級１；１１％〜５０％、等級２；＞５０％、等級３。壊死は以下のようにスコア化した：０％、等級０；０％〜１０％、等級１；１１％〜５０％、等級２；＞５０％、等級３。フローサイトメトリーを、上記のようにＣＡＲ−Ｔ細胞及び末梢血についての新鮮な生検組織上で実施した。盲検の病理学者による検討の後、４人の患者は腫瘍内線維化の増加を有し、３人の患者はそれらのＬＭ内で壊死の増加を有するとスコア化された（図５）。各患者について、ベースライン及び注入後のスコアが図５の左から右に示されている。患者１、４、７及び８は線維化の増加を示し、一方患者４及び５は壊死の増加を示した。
【０１０６】
実施例６
ＩＬ−２投与による血清ＩＦＮγ濃度及びＣＥＡ応答の相関
血清ＩＦＮγレベルは、複数の時点でＥＬＩＳＡによって測定した。ＩＦＮγのスパイクは、全身のＩＬ−２を伴わず、または全身のＩＬ−２を伴い、２４時間〜４８時間後にすべての患者に起こることが認められた（図６；点線の垂直線はＣＡＲ−Ｔ注入時点を示し、第１のデータ点はＣＡＲ−Ｔ注入前のベースライン値を示す）。血清ＣＥＡ変化を各
患者のＩＦＮγのピーク変化と比較した（図７、上部）。ピークＩＦＮγレベルとＣＥＡ変化との間の逆相関は有意であった（Ｒ＝−０．９４、ｐ＝０．０２）。すべての患者のＨＡＩ  ＣＡＲ−Ｔ用量は、ＩＬ−２（６００，０００ＩＵ）の量を含んでいた。連続的な全身ＩＬ−２曝露及び最大のＣＡＲ−Ｔ用量を有する３人の患者（患者番号６，７及び８）は、最良のＣＥＡ応答及び最も高い平均ＩＦＮγレベルを有した（Ｐ＝０．０３、図７、下部）。
【０１０７】
実施例７
安全データ
試験を完了したすべての患者において、いずれかの原因に起因するいずれかの等級の有害事象（ＡＥ）が観察された（表４）。コホート１における用量は、１０１０個の細胞で計画された最大のＨＡＩ  ＣＡＲ−Ｔ注入レベルに達した。コホート１ではＣＡＲ−Ｔの用量の減少は必要ではなく、したがって、コホート２の全患者は、ＩＬ−２の補助を受けて１０１０レベルで３回の投与を受けた。等級４または５の有害事象はなかった。４人の患者で発熱性ＡＥが観察された。患者７は、４０℃（１０４°Ｆ）の温度ピークを有する等級３の発熱及び頻脈を経験した。彼女の全身ＩＬ−２注入の５０％の投与量を減少させた後、患者７で発熱と頻拍が消散した。注目すべきことに、患者７はまた、２０％のピーク及び絶対数３，７４０／ｍｌで末梢好酸球数の増加を経験した。ＩＬ−２注入とレフラー（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）症候群の他の特徴を伴う心筋血栓症との間の報告された関連性を考慮して（Ｊｕｎｇｈａｎｓら，２００１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４４：８５９−８６０）、我々は正常な心エコー図と心電図を得た。彼女の好酸球数は、特別な介入なしに正常限界に戻った。
【０１０８】
【表４】
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正常な肝実質及び胆管構造はＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩの後でよく保存されていた。正常な肝臓からの生検は、全身性ＩＬ−２が投与されたか否かにかかわらず、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩ後の炎症または線維化のレベルの増加を示さなかった。すべての患者はアルカリホスファターゼ（ａｌｋ  ｐｈｏｓ）、総ビリルビン、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベル（ＡＳＴ）の一時的な上昇を経験したが、患者１のみが等級３の上昇を経験し、値の大部分はベースラインレベルから大きく逸脱しなかった。門脈圧及び肝臓合成機能は、患者が血小板減少症または凝固異常症になることはないので、ＣＡＲ−Ｔ  ＨＡＩによって悪影響を受けなかった。
【０１０９】
実施例８
安全データ
患者にＨＡＩを介して１０１０個の抗ＣＥＡ  ｓｃｆｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８／ＣＤ３ζＣＡＲ−Ｔ細胞を投与する、フェーズＩ臨床試験を（上記の実施例に記載されているように）実施する。Ｔ細胞を０日目に各患者から単離し、トランスフェクトし、抗ＣＥＡ  ｓｃｆｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８／ＣＤ３ζ構築物を発現するように選択する。その後、各患者に１４日目、２１日目及び２８日目に１０１０個の細胞を投与する。４４日目（最終細胞注入後の２週間の中断後）に、ＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）含有用量を各患者に注入する。
【０１１０】
ＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）を投与する場合、患者は、正常な肝臓体積と比較
して腫瘍体積の大きさに応じて変化する所定量のＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）を受ける。総肝臓容積の２５％未満、２５％〜５０％または５０％より大きい腫瘍を有する患者には、２ギガベクレル（ＧＢｑ）、２．５ＧＢｑ、または３ＧＢｑの９０Ｙ活性に相当するＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）が与えられる。肺−肝臓の呼吸スキャン（ｌｕｎｇ−ｌｉｖｅｒ  ｂｒｅａｔｈｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｃａｎ）により、マイクロスフェアの１０％超が肝臓を通過して肺に留まることが示された患者に対して提供される。投与される９０Ｙ活性の量は、１％ごとに２％減少し、肺−肝臓のブレークスルー率は１０％より大きい。患者は、ＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）治療後の同日または翌日のいずれかに退院する。
【０１１１】
患者は、適切な臨床研究及び放射線学的研究によって、最終注入後１ヶ月で完全応答、部分応答、安定疾患または進行性疾患を有すると評価される。改変Ｔ細胞の循環レベルを、抗ＣＥＡ  ｓｃｆｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８／ＣＤ３ζ及びＣＤ４／ＣＤ８を検出するためのフローサイトメトリー及びＰＣＲによってモニターする。ＬＭ及び正常肝生検標本を用いてＣＡＲ−Ｔ腫瘍浸潤の程度を決定する。抗ＣＥＡ  ｓｃｆｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８／ＣＤ３ζＣＡＲ−Ｔの存在を定量するために、生検試料をフローサイトメトリー及び／または免疫組織化学によって分析する。試料を血清サイトカインレベル及び正常な肝臓Ｔ細胞集団の変化について描く。血清ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ６、ＩＬ１７及びＩＬ１０を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施する。好中球：リンパ球比は、ＣＢＣからの同じ時点で決定され、また、フローサイトメトリーによる肝臓及び末梢Ｔ細胞集団の詳細な評価として決定される。肝内及び末梢Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３、ＰＤ−１、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４及びＣＤ６９に特異的な抗体で染色される。
【０１１２】
いくつかの例示的な態様及び実施形態が上記で議論されてきたが、当業者は、それらの特定の変更、置換、追加及びサブコンビネーションを認識するであろう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲及び以降に導入される特許請求の範囲は、それらの真の趣旨及び範囲内にあるそのような変更、置換、追加及びサブコンビネーションのすべてを含むと解釈されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
2018513216.tif 000014
【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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