(57)【要約】  開示されるのは、生物学的試料中の一又は複数の酵素を不活性化するための組成物及び方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１から約３の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤を含み；過酸化物が組成物の総重量の約０．２５％から約５％の範囲の量で存在し、防腐剤が組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する、酵素不活性化組成物。
【請求項２】
過酸化物が過酸化水素であり、防腐剤がアジ化ナトリウムである、請求項１に記載の酵素不活性化組成物。
【請求項３】
ポリカルボン酸がシトレートである、請求項２に記載の酵素不活性化組成物。
【請求項４】
溶出軽減剤をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素不活性化組成物。
【請求項５】
溶出軽減剤が塩化ナトリウムである、請求項４に記載の酵素不活性化組成物。
【請求項６】
約１．５のｐＨを有し、過酸化物が組成物の総重量の約１％の量で存在し、防腐剤が組成物の総重量の約０．０８％の量で存在する、請求項３に記載の酵素不活性化組成物。
【請求項７】
約１．５のｐＨを有し、過酸化物が組成物の総重量の約０．５％の量で存在し、防腐剤が組成物の総重量の約０．０８％の量で存在する、請求項３に記載の酵素不活性化組成物。
【請求項８】
約２．０のｐＨを有し、過酸化物が組成物の総重量の約１％の量で存在し、防腐剤が組成物の総重量の約０．０８％の量で存在する、請求項３に記載の酵素不活性化組成物。
【請求項９】
０．５Ｍの塩化ナトリウムをさらに含む、請求項６に記載の酵素不活性化組成物。
【請求項１０】
０．７５Ｍの塩化ナトリウムをさらに含む、請求項６に記載の酵素不活性化組成物。
【請求項１１】
１Ｍの塩化ナトリウムをさらに含む、請求項６に記載の酵素不活性化組成物。
【請求項１２】
約１から約３の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤から本質的になり；過酸化物が組成物の総重量の約０．２５％から約１．５％の範囲の量で存在し、防腐剤が組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する、酵素不活性化組成物。
【請求項１３】
約１から約３の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤からなり；過酸化物が組成物の総重量の約０．２５％から約１．５％の範囲の量で存在し、防腐剤が組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する、酵素不活性化組成物。
【請求項１４】
生物学的試料中の一又は複数の酵素を不活性化する方法であって、ポリカルボン酸、過酸化物、及び防腐剤を含む約５０μＬから約２００μＬの酵素不活性化組成物を、一又は複数の試薬酵素又は内因性酵素を含む生物学的試料に適用することを含み、組成物又は生物学的試料の少なくとも一つが、約４分から約１６分の範囲の期間にわたり約２５℃から約５０℃の範囲の温度に維持される、方法。
【請求項１５】
生物学的試料に溶出軽減剤を付加する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
一又は複数の試薬酵素又は内因性酵素が、試薬ペルオキシダーゼ、内因性ペルオキシダーゼ、及びアルカリホスファターゼからなる群より選択される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的試料中の一又は複数の酵素を不活性化する方法であって、請求項６、７、及び８のいずれか一項に記載の酵素不活性化組成物約５０μＬから約２００μＬを、一又は複数の試薬酵素又は内因性酵素を含む生物学的試料に適用することを含み、酵素不活性化組成物又は生物学的試料の少なくとも一つが、少なくとも約４分間にわたり約３７℃から約４１℃の温度に維持される、方法。
【請求項１８】
生物学的試料中の一又は複数の酵素を不活性化する方法であって、請求項９、１０、及び１１のいずれか一項に記載の酵素不活性化組成物約５０μＬから約２００μＬを、一又は複数の試薬又は内因性酵素を含む生物学的試料に適用することを含み、酵素不活性化組成物又は生物学的試料の少なくとも一つが、少なくとも約４分間にわたり約３７℃から約４１℃の温度に維持される、方法。
【請求項１９】
約１から約３の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤を含む第１の成分であって、過酸化物が組成物の総重量の約０．２５％から約５％の範囲の量で存在し、防腐剤が組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する、第１の成分；並びに溶出軽減剤を含む第２の成分を含むキット。
【請求項２０】
生物学的試料中の標的を検出する方法であって：
ａ）生物学的試料を、第１の酵素を有する第１の発色性検出試薬と接触させること；
ｂ）第１の発色性検出試薬から第１のシグナルを検出すること；及び
ｃ）第１の酵素を、約１から約３の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；及び過酸化物又は防腐剤の少なくとも一つを含む第１の酵素不活性化組成物を適用することにより不活性化すること
を含み、過酸化物が、組成物の総重量の約０．２５％から約５％の範囲の量で存在し、防腐剤が、組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在し、第１の酵素不活性化組成物又は生物学的試料の少なくとも一つが、約４分から約１６分の範囲の期間にわたり約２５℃から約５０℃の範囲の温度に維持される、方法。
【請求項２１】
ａ）生物学的試料を、第２の酵素を有する第２の発色性検出試薬と接触させること；
ｂ）第２の発色性検出試薬から第２のシグナルを検出すること；及び
ｃ）第２の酵素を、約１から約３の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；及び過酸化物又は防腐剤の少なくとも一つを含む第２の酵素不活性化組成物を適用することにより不活性化すること
をさらに含み、過酸化物が、組成物の総重量の約０．２５％から約５％の範囲の量で存在し、防腐剤が、組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在し、第２の酵素不活性化組成物又は生物学的試料の少なくとも一つが、約４分から約１６分の範囲の期間にわたり約２５℃から約５０℃の範囲の温度に維持される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１の酵素不活性化組成物又は第２の酵素不活性化組成物の少なくとも一つが、シトレート、過酸化水素、及びアジ化ナトリウムを含み、且つ約１．５のｐＨを有し、過酸化水素が、組成物の総重量の約１％の量で存在し、アジ化ナトリウムが、組成物の総重量の約０．０８％の量で存在する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
組成物が塩化ナトリウムをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
実質的に不活性化される又は完全に不活性化される一又は複数の酵素を含み、シトレート、過酸化水素、及びアジ化ナトリウムを含む酵素不活性化組成物を適用することにより調製される生物学的試料であって、前記組成物が約１．５のｐＨを有し、過酸化水素が組成物の総重量の約１％の量で存在し、アジ化ナトリウムが組成物の総重量の約０．０８％の量で存在し、組成物が少なくとも約４分間にわたり約２５℃から約４１℃の温度で生物学的試料と接触したままにされる、生物学的試料。
【請求項２５】
組成物が塩化ナトリウムをさらに含む、請求項２４に記載の生物学的試料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月１０日出願の米国特許仮出願第６２／１５９２９７号の出願日の利益を主張し、前記出願の開示内容を参照により本明細書に包含する。
【０００２】
産業上の利用可能性
本開示内容は、診断の分野に産業上の利用性を有している。
【背景技術】
【０００３】
免疫組織化学（ＩＨＣ）は、蛍光性色素、酵素、又はコロイド金といったマーカーにより可視化される抗原−抗体相互作用を通した特異的試薬としての標識化抗体の使用による、組織切片中の局在化抗原又はタンパク質の検出である。この検出技術は、組織試料内のどこに所与のタンパク質が位置するかを正確に示すことができるという利点を有する。この技術は、組織自体を検査するための有効な方法でもある。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、即ちＩＳＨは、核酸を検出、局在化、及び定量化する方法を指す。ＩＨＣ及びＩＳＨは共に、様々な生物学的試料、例えば組織（例えば、新鮮凍結、ホルマリン固定パラフィン包埋）及び細胞学的試料に対して実施することができる。標的を認識すると、標的が核酸であるか抗原であるかを問わず、認識事象は様々な標識（例えば、発色性、蛍光性、発光性、放射測定式）の使用により検出することができる。組織のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）には、レポーター分子が結合する核酸の相補鎖を適用することにより核酸を検出することが含まれる。レポーター分子の可視化は、観察者が、異種細胞集団、例えば組織学的、細胞学的、又は環境的試料中において、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を局在化することを可能にする。現在利用可能なＩＳＨ技術には、シルバーｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、クロモジェニックｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）及び蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が含まれる。
【０００４】
発色基質は、発色性検出が単純で費用効果的検出方法を提供するＩＨＣ及びＩＳＨの両方に使用される。伝統的に、発色基質は、適切な酵素により活性化されると沈殿する。即ち、伝統的な発色基質は、酵素と接触すると、可溶型試薬から非可溶性の有色沈殿物へと変換される。二つのこのような酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とアルカリホスファターゼ（ＡＰ）である。
【０００５】
多重ＩＨＣ及びＩＳＨアッセイが、単一の組織スライド上での複数のアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ検出工程を用いて、例えば多組織抗原を検出するために開発されている。酵素不活性化は、その後の酵素検出工程における不適切なシグナル生成を軽減するために重要である。酵素を少なくとも部分的に不活性化する方法は存在するが、これら方法は、内因性の酵素活性及び試薬の酵素活性の両方を完全に阻害することはできず、酵素再活性化の影響を受け易い（例えば過酸化水素は可逆的ＨＲＰ酵素阻害剤であるが、過酸化水素の除去は酵素活性を回復させる）。
【０００６】
酵素の不活性化は大量の時間を要することが多く、これは多重化アッセイに適用される場合倍増しうる。例えば、ペルオキシダーゼ不活性化工程は、１の検出サイクルにつき約一時間を要しうる。より高次の多重アッセイ（例えば四つ以上の色素原検出工程を用いるもの）では、このような酵素殺傷工程により、アッセイ期間が大幅に延びるであろう。より短時間の酵素不活性化工程が利用可能であるが、それらは往々にして厳しい条件（例えば５０℃を上回る熱）を要し、それは組織抗原の検出シグナルの強度、組織の形態、色素原の安定性、及び対比染色の外観に影響しうる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様は、約１から約３の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤又は添加剤の少なくとも一つを含む酵素不活性化組成物である。いくつかの実施態様では、ポリカルボン酸はシトレートである。いくつかの実施態様では、可逆的酵素阻害剤（例えばＮａＮ３）としても機能する防腐剤が選択される。いくつかの実施態様では、過酸化物は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）であり、防腐剤はアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）である。いくつかの実施態様では、過酸化物は組成物の総重量の約０．２５％から約５％の範囲の量で存在し；防腐剤は組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は溶出軽減剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、溶出軽減剤は塩化ナトリウムである。いくつかの実施態様では、溶出軽減剤は塩化ナトリウムである。いくつかの実施態様では、組成物は、生物学的試料と接触している一定容積の流体を既に含有する生物学的試料に適用され、前記試料（例えば「パドル（ｐｕｄｄｌｅ）」）と接触している流体の総容積のｐＨは、酵素不活性化組成物の付加後、約１から約３の範囲である。
【０００８】
いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、及びＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）を含む。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約０．５％）、及びＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）を含む。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、約２．０のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、及びＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）を含む。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）、及び塩化ナトリウム（約０．５Ｍ）を含む。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）、及び塩化ナトリウム（約０．７５Ｍ）を含む。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）、及び塩化ナトリウム（約１Ｍ）を含む。
【０００９】
本発明の別の態様は、生物学的試料中の一又は複数の酵素を不活性化する方法であり、この方法は、酵素不活性化組成物を、一又は複数の試薬酵素又は内因性酵素を含む生物学的試料に適用する工程を含み、酵素不活性化組成物又は生物学的試料の少なくとも一つが、約４分から約１６分の範囲の期間にわたり約２５℃から約５０℃の範囲の温度に維持される。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、酸、過酸化物、及び防腐剤を含む。いくつかの実施態様では、組成物のｐＨ及び／又は温度及び／又は組成物が試料と接触している時間は、酵素不活性化を実行するために変化させる。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１から約３の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤を含み；過酸化物は組成物の総重量の約０．２５％から約５％の範囲の量で存在し、防腐剤は組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１から約３の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤を含み；過酸化物は組成物の総重量の約０．２５％から約１．５％の範囲の量で存在し、防腐剤は組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物の成分は、試料に対して同時に適用される。他の実施態様では、成分は、試料に対して連続して適用され、その順序は問われない。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、溶出軽減剤（例えばＮａＣｌ）をさらに含む。いくつかの実施態様では、生物学的試料（「パドル」）と接触している総流体容積の最終ｐＨは、約１．５から約３．０の範囲である。他の実施態様では、生物学的試料と接触している総流体容積の最終ｐＨは、約１．５から約２の範囲である。いくつかの実施態様では、生物学的試料は発色基質で染色され、発色基質の検出可能な強度及び色相（例えば上流プロセスの間に適用される一又は複数の検出キットからの）は、病理学的レビュー又は有資格読者のレビューにより、酵素不活性化組成物の適用後に実質的に低下しないと決定された。いくつかの実施態様では、一又は複数の酵素は、実質的に不活性化されるか又は完全に不活性化され、これら用語は本明細書において定義される。
【００１０】
いくつかの実施態様では、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、及びＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）を含む酵素不活性化組成物が、内因性ペルオキシダーゼ、試薬ペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼの少なくとも一つを含む生物学的試料に適用され、この酵素不活性化組成物は、少なくとも約４分間生物学的試料と連通状態に維持され、組成物、生物学的試料、又は他の導入成分の少なくとも一つは、約３７℃から約４１℃の範囲の温度に加熱される。
【００１１】
いくつかの実施態様では、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約０．５％）、及びＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）を含む酵素不活性化組成物が、内因性ペルオキシダーゼ、試薬ペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼの少なくとも一つを含む生物学的試料に適用され、この酵素不活性化組成物は、少なくとも約４分間生物学的試料と連通状態に維持され、組成物、生物学的試料、又は他の導入成分の少なくとも一つは、約３７℃から約４１℃の間の温度に加熱される。
【００１２】
いくつかの実施態様では、約２のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、及びＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）を含む酵素不活性化組成物が、内因性ペルオキシダーゼ、試薬ペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼの少なくとも一つを含む生物学的試料に適用され、この酵素不活性化組成物は、少なくとも約４分間生物学的試料と連通状態に維持され、組成物、生物学的試料、又は他の導入成分の少なくとも一つは、約３７℃から約４１℃の間の温度に加熱される。
【００１３】
いくつかの実施態様では、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）、及び０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む酵素不活性化組成物が、内因性ペルオキシダーゼ、試薬ペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼの少なくとも一つを含む生物学的試料に適用され、この酵素不活性化組成物は、少なくとも約４分間生物学的試料と連通状態に維持され、組成物、生物学的試料、又は他の導入成分の少なくとも一つは、少なくとも約３７℃の温度に加熱される。
【００１４】
いくつかの実施態様では、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）、及び０．７５Ｍの塩化ナトリウムを含む酵素不活性化組成物が、内因性ペルオキシダーゼ、試薬ペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼの少なくとも一つを含む生物学的試料に適用され、この酵素不活性化組成物は、少なくとも約４分間生物学的試料と連通状態に維持され、組成物、生物学的試料、又は他の導入成分の少なくとも一つは、少なくとも約３７℃の温度に加熱される。
【００１５】
いくつかの実施態様では、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）、及び１Ｍの塩化ナトリウムを含む酵素不活性化組成物が、内因性ペルオキシダーゼ、試薬ペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼの少なくとも一つを含む生物学的試料に適用され、この酵素不活性化組成物は、少なくとも約４分間生物学的試料と連通状態に維持され、組成物、生物学的試料、又は他の導入成分の少なくとも一つは、少なくとも約３７℃の温度に加熱される。
【００１６】
本発明の別の態様は、生物学的試料中の複数の標的を検出する方法であり、この方法は：（ａ）生物学的試料を、第１の酵素を有する第１の発色性検出試薬と接触させること；（ｂ）第１の発色性検出試薬から第１のシグナルを検出すること；及び（ｃ）第１の酵素を、約１から約５の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤を含む第１の酵素不活性化組成物を適用することにより不活性化すること；を含み、過酸化物は、組成物の総重量の約０．２５％から約１．５％の範囲の量で存在し、防腐剤は、組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在し、第１の酵素不活性化組成物又は生物学的試料の少なくとも一つは、約４分から約１６分の範囲の期間にわたり約２５℃から約５０℃の範囲の温度に維持される。いくつかの実施態様では、方法はさらに、（ｄ）生物学的試料を、第２の酵素を有する第２の発色性検出試薬と接触させる工程；（ｅ）第２の発色性検出試薬から第２のシグナルを検出する工程；及び（ｆ）第２の酵素を、約１から約５の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤を含む第２の酵素不活性化組成物を適用することにより不活性化する工程をさらに含み；過酸化物は、組成物の総重量の約０．２５％から約１．５％の範囲の量で存在し、防腐剤は、組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在し、第２の酵素不活性化組成物又は生物学的試料の少なくとも一つは、約４分から約１６分の範囲の期間にわたり約２５℃から約５０℃の範囲の温度に維持される。いくつかの実施態様では、追加的な発色性検出試薬、例えば第３、第４、及び第５（及び第ｎ）の発色性検出試薬を検出するために工程が繰り返される。いくつかの実施態様では、一又は複数の酵素が実質的に不活性化されるか又は完全に不活性化される。いくつかの実施態様では、発色基質の検出可能な強度及び色相が、酵素不活性化組成物の付加後に実質的に低下しないことが病理学的レビュー又は有資格読者のレビューにより決定されるように、生物学的試料は一又は複数の発色基質で染色される。いくつかの実施態様では、生物学的試料は、実質的に又は完全に内因性ペルオキシダーゼ活性を不活性化するために酵素不活性化組成物で前処理される。
【００１７】
本発明の他の態様は、少なくとも第２の標的の検出のための生物学的試料を調製する方法であり、この方法は、内因性ペルオキシダーゼ、試薬ペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼの少なくとも一つを含む生物学的試料を、約１から約５の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤を含む第１の酵素不活性化組成物と接触させることであって；過酸化物が組成物の総重量の約０．２５％から約１．５％の範囲の量で存在し、防腐剤が組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する、接触させること；並びに続いて少なくとも第２の標的を検出するための成分を導入することを含む。いくつかの実施態様では、試料及び／又は酵素不活性化組成物の少なくとも一つは、約４分から約１６分の範囲の期間にわたり約２５℃から約５０℃の範囲の温度に維持される。他の実施態様では、試料及び／又は酵素不活性化組成物の少なくとも一つは、約４分から約１６分の範囲の期間にわたり約３７℃から約５０℃の範囲の温度に維持される。
【００１８】
本発明の別の態様は、実質的に不活性化されているか又は完全に不活性化されている一又は複数の酵素を含む生物学的試料であり、この生物学的試料は、酵素不活性化組成物を、約４分から約８分間にわたり約２５℃から約４１℃の範囲の温度で適用することにより調製され、この酵素不活性化組成物は、（ｉ）約１．５のｐＨを有するシトレートと、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）と、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）；（ｉｉ）約１．５のｐＨを有するシトレートと、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約０．５％）と、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）；（ｉｉｉ）約２．０のｐＨを有するシトレートと、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）と、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）；（ｉｖ）約１．５のｐＨを有するシトレートと、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）と、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）と、塩化ナトリウム（約０．５Ｍ）；（ｖ）約１．５のｐＨを有するシトレートと、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）と、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）と、塩化ナトリウム（約０．７５Ｍ）；（ｖｉ）約１．５のｐＨを有するシトレートと、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）と、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）と、塩化ナトリウム（約１Ｍ）を含む組成物からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、生物学的試料は、上流のプロセスにおいて発色性検出試薬で処理され、発色性検出試薬は酵素（例えばペルオキシダーゼ及び／又はアルカリホスファターゼ）を含む。
【００１９】
本発明の別の態様は、約１から約５の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；過酸化物；及び防腐剤を含む第１の成分であって、過酸化物は組成物の総重量の約０．２５％から約１．５％の範囲の量で存在し、防腐剤は組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する、第１の成分；並びに溶出軽減剤を含む第２の成分を含むキットである。いくつかの実施態様では、溶出軽減剤は塩（例えばＮａＣｌ）である。
【００２０】
酵素不活性化組成物、並びにそのような組成物を生物学的試料に適用する方法であって、試料中の試薬及び／又は内因性酵素を少なくとも実質的に不活性化し、且つ組織抗原検出シグナルの強度、組織形態、色素原の安定性、及び対比染色の外観に実質的に影響を与えることなくそれを適切な時間量で行うことを可能にする方法に対する需要が依然として存在する。
【００２１】
本発明者らは、ここに開示される酵素不活性化組成物、並びにそのような組成物を生物学的試料に適用する方法であって、内部に存在する任意の試薬及び／又は内因性酵素を実質的に不活性化又は完全に不活性化する方法を開発した。（「実質的に不活性化又は完全に不活性化」という表現は本明細書において定義される。）実際、本発明者らは、本組成物及び方法により、酵素不活性化が、先行技術による方法と比較して、厳しくない条件下で生じること、即ち本発明の組成物を適用する方法が、長時間にわたる５０℃を上回る温度の適用を要しないことを示した。再び先行技術による酵素不活性化方法と比較して、ここに開示される本組成物及び方法は、相対的に優れており、検出キットの完全な溶出なしで短時間（例えば４から８分）での不可逆的酵素不活性化を可能にし、これは多重化アッセイの観点から特に重要である。さらに、本発明者らは、本組成物及び方法が、本明細書に記載される実施例において実証されるように、組織抗原検出シグナルの強度、組織形態、色素原の安定性、及び対比染色の外観に実質的に悪影響を与えることなく酵素不活性化を可能にすることを示した。実際、本明細書において提供される本組成物及び方法は、下流の処理工程に悪影響を与えないことが示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本特許又は出願ファイルは、カラー図面を少なくとも一点含む。カラー図面を伴う本特許又は特許出願文献のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁に提供される。
【００２３】
【図１】図１Ａから図１ＨＨは、生物学的試料への適用後のペルオキシダーゼ不活性化に対する異なる酵素不活性化組成物と方法の効果を示す一連の画像である。
【図２】図２Ａから図２Ｓは、生物学的試料への適用後のアルカリホスファターゼ不活性化に対する異なる酵素不活性化組成物と方法の効果を示す一連の画像である。
【図３】図３Ａから図３Ｖは、異なる酵素不活性化組成物及び方法を生物学的試料に適用した後の酵素不活性化と検出キットの溶出の対比を示す一連の画像である。
【図４】図４Ａから図４ＨＨは、生物学的試料への適用後のＤＡＢ色素原の強度又は色相に対する異なる酵素不活性化組成物及び方法の影響を示す一連の画像である。
【図５】図５Ａから図５ＨＨは、生物学的試料への適用後の組織抗原検出シグナルの強度（ＢＬＣ２）に対する異なる酵素不活性化組成物と方法の影響を示す一連の画像である。
【図６】図５Ａから図６ＨＨは、生物学的試料への適用後の組織抗原検出シグナルの強度（ＣＤ８）に対する異なる酵素不活性化組成物と方法の影響を示す一連の画像である。
【図７】図５Ａから図７ＨＨは、生物学的試料への適用後の組織抗原検出シグナルの強度（ＨＥＲ２）に対する異なる酵素不活性化組成物と方法の影響を示す一連の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書で使用される単数形は、別途指示がない限り複数の指示物を含む。同様に、「又は」という単語は、別途指示がない限り「及び」を含むことが意図される。用語「含む」は、すべてを含むと定義され、例えば「Ａ又はＢを含む」とは、Ａ、Ｂ、又はＡとＢを含むことを意味する。
【００２５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」などは互換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」などは互換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、これら用語の各々は、一般的な米国特許法の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の定義と一致するように定義され、したがって「少なくとも以下を」を意味する開いた意味の用語であり、さらには追加の特徴、制限、態様などを排除しない。したがって、例えば、構成要素ａ、ｂ、及びｃを有するデバイス」は、このデバイスが少なくとも構成要素ａ、ｂ及びｃを含むことを意味する。同様に表現：「工程ａ、ｂ、及びｃを含む方法」は、この方法が少なくとも工程ａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。さらに、工程及びプロセスは本明細書において特定の順序で概説されるが、当業者であれば工程及びプロセスの順序付けは変更可能であることを理解するであろう。
【００２６】
「抗体」（時に「Ａｂ」と略す）は、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子を指し、これには例として、限定されないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、これらの組み合わせ、並びに任意の脊椎動物，（例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ及びマウスのような哺乳動物）において免疫応答の間に生成される類似の分子と、対象の分子（又は対象の高度に類似の分子の群）に特異的に結合し、他の分子への結合が実質的に排除される抗体断片が含まれる。「抗体」はさらに、抗原のエピトープを特異的に認識してそれに結合する、少なくとも一の軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを指す。抗体は重鎖及び軽鎖から構成されてよく、その各々は、可変重（ＶＨ）領域及び可変軽（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域を有する。ＶＨ領域及びＶＬ領域は組み合わさって、抗体により認識される抗原の結合に関与する。抗体という用語には、当技術分野において周知の、インタクトな免疫グロブリン及び変異体とそれらの部分も含まれる。
【００２７】
「抗原」は、抗体分子又はＴ細胞受容体などの特異的体液性又は細胞性免疫の産物によって特異的に結合されうる化合物、組成物又は物質を指す。抗原は、例えばハプテン、単純中間代謝産物、糖（例えばオリゴ糖）、脂質、及びホルモン、並びに複雑な炭水化物（例えば多糖類）、リン脂質、核酸及びタンパク質などの高分子を含む任意の種類の分子でありうる。
【００２８】
「生物学的試料」は、限定しないが、特に細菌、酵母、原生動物、及びアメーバといった単細胞生物、多細胞生物（例えば植物又は動物、健常な若しくは見かけ上健常なヒト対象、又はがんなどの診断若しくは調査対象の病態又は疾患に罹患しているヒト患者を含む）を含む任意の生存生物から取得、排泄又は分泌された任意の固体又は流体試料とすることができる。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、眼房水又は硝子体液、又はいずれかの体分泌から得られた生体液、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍又は感染若しくは炎症の他のいずれかの部位から得られた流体）、又は関節（例えば、正常な関節又は疾患に罹患した関節）から得られた流体とすることができる。生物学的試料は、いずれかの器官又は組織（生検又は剖検標本、例えば腫瘍生検を含む）から得られた試料とすることもできる、又は細胞（初代細胞であるか培養細胞であるかを問わず）又はいずれかの細胞、組織又は器官により調整された培地を含むことができる。いくつかの実施例では、生物学的試料は核抽出物である。特定の実施例では、試料は、品質管理試料、例えば開示される細胞ペレットの切片試料の一つである。他の実施例では、試料は試験試料である。例えば、試験試料は、対象から取得された生物学的試料から調製された細胞、組織又は細胞ペレット切片である。一実施例では、対象は、危険に曝されている、又は罹患している対象である。試料は、当業者により、当技術分野で既知の任意の方法を用いて調製することができる。試料は、常套的なスクリーニングのために被験体から、又は遺伝的異常、感染若しくは新生物などの障害を有することが疑われる対象から得ることができる。本開示の方法の記載されている実施態様は、「正常」試料と呼ばれる、遺伝的異常、疾患、障害などを有さない試料にも適用することができる。試料には、一又は複数の検出プローブが特異的に結合することのできる複数の標的が含まれうる。
【００２９】
ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、ホスフェート基有機エステルを、ホスフェート−酸素結合を分断して一時的に中間体酵素−基質結合を形成することにより、除去（加水分解により）及び運搬する酵素である。例えば、ＡＰはナフトールホスフェートエステル（基質）をフェノール化合物とホスフェートに加水分解する。フェノールは無色のジアゾニウム塩（色素原）に結合して不溶性の有色アゾ色素を生成する。
【００３０】
「発色団」は、その色を担う分子又は分子の一部を指す。色は、分子が特定の波長の可視光を吸収して他の色を透過又は反射するときに生じる。可視スペクトルの範囲内に含まれる二つの異なる分子軌道間にエネルギー差を有する分子は、可視光を吸収することができ、したがって発色団として特徴付けられるのにふさわしい。発色団に入射する可視光は吸収され、それにより基底状態の分子軌道から励起状態の分子軌道へと電子を励起する。
【００３１】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、標識された分子にコンジュゲートすることのできる酵素である。この酵素は、適切な基質と共にインキュベートされると、標識された分子の有色の、蛍光定量的な、又は発光性の誘導体を生成し、その検出及び定量化を可能にする。ＨＲＰは、電子供与体の存在下において、まず酵素基質複合体を形成するように作用し、次いでその後電子供与体を酸化するように作用する。例えば、ＨＲＰは、３，３′−ジアミノベンジジントラハイドロクロライド（ＤＡＢ）に作用して検出可能な色を生成する。ＨＲＰは、標識されたチラミドコンジュゲート、又はチラミド様反応性コンジュゲート（即ちフェルラ酸、クマル酸、コーヒー酸、シンナメート、ドーパミンなど）にも作用し、有色又は蛍光性又は無色の、チラミドシグナル増殖（ＴＳＡ）について検出可能な部分を堆積させることができる。
【００３２】
「多重」、「多重化（される）」、「多重の」は、試料中の複数の標的を同時に、実質的に同時に、又は連続的に検出することを指す。多重化は、複数の別個の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）及びポリペプチド（例えば、タンパク質）を、個別に及びあらゆる組み合わせで、同定及び／又は定量化することを含む。
【００３３】
本明細書に開示されるのは、下流の処理に先立ち生物学的試料中の少なくとも一つの酵素を不活性化するための酵素不活性化組成物と方法である。複数の発色性試薬が順に検出される多重アッセイの観点から、連続的発色検出工程の間にあらゆる試薬酵素又は内因性酵素を不活性化することが望ましい。これにより、任意の一発色検出工程に存在する酵素が、後の発色検出工程における酵素と干渉することはないであろう。これは、ひいては多重アッセイで使用される異なる色素原の視覚化及び検出を改善すると考えられる。
【００３４】
例として、多重アッセイは、一連の発色性試薬検出工程を含む。各発色性試薬検出工程は、例えば酵素及び酵素の発色基質を含む発色性検出試薬を供給することを含む。いずれかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、酵素が発色基質に作用して、有色の検出可能シグナルを生じさせる（即ち酵素基質反応が無色の色素原又は発色基質を、検出に適した有色の最終生成物に変換する）と考えられる。いくつかの実施態様では、発色性検出試薬は検出キットの一部であり、このキットには、例えば、検出プローブ（例えば抗体）、標識化コンジュゲート（標識化コンジュゲートは酵素を含む）、潜在的反応性部分、及び／又は発色部分の一又は複数が含まれる。
【００３５】
やはり一例として、多重アッセイは、第１の発色性検出試薬（例えばジアミノベンジジン）の検出、及び続いて続く第１の発色性検出試薬中に存在する第１の酵素（例えばＨＲＰ）の不活性化を要する。第１の発色性検出試薬は、まず試料に適用され、その中に含まれる第１の発色基質の検出に先立って反応させるために時間を経過させる。色素原の検出後、次いで第１の酵素不活性化組成物を適用し、第１の発色性検出キット中の第１の酵素に作用させて同酵素を不活性化させる。その後、第２の発色性検出試薬を試料に供給し（例えば４−クロロ−２−メチルベンゼンジアゾニウム塩）、続いて第２の発色性検出試薬中の第２の発色基質を検出する。次いで第２の発色性検出試薬中の第２の酵素（例えばＡＰ）を、第１の酵素不活性化組成物と同じでも異なってもよい第２の酵素不活性化組成物の適用により不活性化する。発色性検出試薬の適用工程、発色基質シグナルの検出工程、及び酵素不活性化工程は、用いるアッセイ及び検出対象標的により、必要に応じて繰り返すことができる。
【００３６】
いくつかの実施態様では、本発明の酵素不活性化組成物は、一又は複数の試薬酵素又は内因性酵素を含む生物学的試料に適用される。酵素の例には、限定されないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、Ｂ−グルクロニダーゼ又はＢ−ラクタマーゼが含まれる。
【００３７】
発色検出アッセイに有用な酵素基質及び酵素基質系の特定の例には、限定されないが、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ナフトールホスフェート、ナフトールホスフェート／Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（例えば、４−クロロ−２−メチルベンゼンジアゾニウム塩及びこのバリエーション、例えばＦａｓｔ  Ｒｅｄ  ＫＬ／ナフトールＡＳ−ＴＲ、ナフトールホスフェート／フクシン、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＢＢ（４−（ベンゾイルアミノ）−２，５−ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート）／ナフトールホスフェート（例えばナフトールＡＳ−ＴＲホスフェート（Ｎ−４−クロロ−２−メチルフェニル）−３−（ホスホノオキシ）ナフタレン−２−カルボキサミド）、ブロモクロロインドイル  ホスフェート（ＢＣＩＰ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、ＢＣＩＰ／ＩＮＴ（ｐ−ヨードニトロテトラゾリウム）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２′−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリン  スルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ミュー−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、及び３−アミノ−９−エチル  カルバゾール（ＡＥＣ）が含まれる。酵素がアルカリホスファターゼであるいくつかの好ましい実施態様では、発色基質系は、ナフトールホスフェート／Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（及びそのンバリエーション、例えばＦａｓｔ  Ｒｅｄ  ＫＬ／ナフトールＡＳ−ＴＲ）、ナフトールホスフェート／フクシン、ナフトールホスフェート／Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＢＢ（４−（ベンゾイルアミノ）−２，５−ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート）、５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリル  ホスフェート（ＢＣＩＰ）／ナフトールホスフェート、ＢＣＩＰ／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、及びＢＣＩＰ／ｐ−ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）；キノンメチド及びこれらの中間体からなる群より選択され；ＨＲＰは、３，３′−ジアミノベンジジントラハイドロクロライド（ＤＡＢ）に作用して検出可能な色を生じさせ；ＨＲＰは、標識されたチラミドコンジュゲート、又はチラミド様反応性コンジュゲート（即ちフェルラ酸、クマル酸、コーヒー酸、シンナメート、ドーパミンなど）にも作用して、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）のための有色又は蛍光性又は無色の検出可能な部分を堆積させる。
【００３８】
いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、試薬ペルオキシダーゼ、一又は複数の内因性ペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼのうちの少なくとも一つを有する生物学的試料に適用される。他の実施態様では、酵素不活性化組成物は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、又は一又は複数の内因性ペルオキシダーゼのうちの少なくとも一つを有する生物学的試料に適用される。いくつかの実施態様では、試料はＨＲＰ及びＡＰの両方を含む。
【００３９】
一般に、酵素不活性化組成物は、その中に含まれる試薬酵素又は内因性酵素を実質的に不活性化する又は完全に不活性化する（まとめて「不活性化する」又は「不活性化される」という）ために十分な温度で且つ十分な時間にわたり生物学的試料と接触させる。「実質的に不活性化する」又は「実質的に不活性化される」とは、一又は複数の試薬酵素又は内因性酵素の活性がその正常な活性の約９０％未満に低下したことを意味する。他の実施態様では、一又は複数の試薬酵素又は内因性酵素の活性は、その正常な活性の約９５％未満に実質的に不活性化される。本明細書において使用される用語「完全に不活性化する」又は「完全に不活性化される」は、一又は複数の試薬酵素又は内因性酵素の活性が、その正常な活性の１％未満であるか、又は機器により検出できないレベルまで低下したことを意味する。いくつかの実施態様では、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ又は  一又は複数の内因性ペルオキシダーゼ）又はアルカリホスファターゼの少なくとも一つは、実質的に不活性化される。他の実施態様では、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ又は一又は複数の内因性ペルオキシダーゼ）又はアルカリホスファターゼの少なくとも一つは、完全に不活性化される。
【００４０】
当業者であれば、組成物を生物学的試料に適用して試薬又はその中の内因性酵素を不活性化するための適切な酵素不活性化組成物及び／又は方法を設計するときに複数の変数が考慮されることを理解するであろう。これら変数には、例えば、（ｉ）組成物を生物学的試料と接触させる時間の量（例えば約４分から約８分）；（ｉｉ）組成物を生物学的試料と接触させる間に組成物又は生物学的試料が維持される温度（例えば約３７℃から約５０℃）；（ｉｉｉ）組成物のｐＨ（例えば約１．５から約２．５）；（ｉｖ）組成物中の個々の成分の量及び／又は濃度；並びに（ｖ）追加の成分の必要性（例えば溶出軽減剤又はキレート化剤）が含まれる。いうまでもなく、これら変数は、不活性化される酵素及び／又は他の検出キット成分にも依存する。
【００４１】
例えば、当業者であれば理解するように、酵素不活性化組成物又は酵素不活性化組成物を含有する生物学的試料の温度を上昇させると、酵素不活性化に必要な時間が短縮される（例えば約８分から約４分へ）。逆に、不活性化のための時間を延長すると、高温使用（例えば約３７℃から約４１℃へ）の必要性が低下する  。同様に、当業者であれば、酵素不活性化組成物の成分のいずの量も、時間及び／又は温度の変数、並びに補助成分（例えば溶出軽減剤、キレート化剤など）の必要性に影響しうることを理解するであろう。例として、生物学的試料に接触させる酵素不活性化組成物のｐＨ（例えば約２．０から約１．５）は、酵素の一又は複数を不活性化するために必要な時間又は温度の変数を低減しうる（例えば約８分から約４分へ）。
【００４２】
組成物、又は組成物が生物学的試料と接触を続ける時間の量及び／又は温度が組織抗原検出シグナルの強度又は組織形態に悪影響を与えない及び／又は色素原及び／又は対比染色の強度及び／又は色相に影響しない限りにおいて、どのような酵素不活性化組成物を生物学的試料に適用してもよい。例えば、視覚的に検出可能なＤＡＢの強度又は色相の変位が、酵素不活性化組成物の適用後に起こる場合があるが、本明細書の組成物及び方法は、病理学の又は有資格読者のレビューにより、発色基質の検出可能な強度又は色相が酵素不活性化組成物の適用後に実質的に低減しないように決定されるよう、強度又は色相のどのような変化も軽減するように選択されなければならない。
【００４３】
概して、本発明は、約１から約３のｐＨを有する酸、防腐剤、及び過酸化物を含む酵素不活性化組成物を提供する。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、キレート化剤、バッファー、及び／又は溶出軽減剤の少なくとも一つをさらに含む。
【００４４】
いくつかの実施態様では、組成物のｐＨは約０．５から約３．５の範囲である。他の実施態様では、組成物のｐＨは、約１から約３の範囲である。また別の実施態様では、組成物のｐＨは約１．５である。さらに別の実施態様では、組成物のｐＨは約２．０である。さらに追加的な実施態様では、組成物のｐＨは約２．５である。いずれかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、低いｐＨほど酵素不活性化の改善を助ける、即ち組成物のｐＨと酵素活性の間に直接的相関が存在すると考えられる。
【００４５】
組成物の成分に関し、ｐＨが本発明において確立されたｐＨ基準を満たす限りにおいて、どのような酸も本発明と組み合わせて使用することができる。酸は無機酸でも有機酸でもよく、一塩基酸又は多塩基酸から選択することができる。いくつかの実施態様では、酸は、酢酸、安息香酸、クエン酸、塩酸、乳酸、硝酸、コハク酸、硫酸、亜硫酸、酒石酸、トリクロロアシック（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｉｃ）酸、低ｐＨのアミノ酸、例えばアラニン、又はその塩から選択される。
【００４６】
いくつかの実施態様では、酸はポリカルボン酸又はその塩である。他の実施態様では、ポリカルボン酸は約５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。適切なポリカルボン酸は、式ＣＯ（ＯＨ）-Ｒ１-Ｒ２（Ｃ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｒ３-Ｃ（Ｏ）ＯＨを有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は同じでも異なってもよく、置換又は未置換の脂肪族基又は芳香族基を有してもよく、Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３のいずれもが任意の数の追加的カルボン酸基を含有してよい。いくつかの実施態様では、ポリカルボン酸はシトレート又はイソシトレート又はその塩である。他の実施態様では、ポリカルボン酸は、酢酸ナトリウム、例えば１Ｍのシトレートである。
【００４７】
いくつかの実施態様では、酸は、カルシウム、鉄、マグネシウム及び亜鉛イオンを含む金属イオンをキレート化することができる。例えば、シトレートは、Ｃａ２＋補助因子を隔離することができる。他の実施態様では、キレート化剤は、キレート化ポリカルボン酸が存在しないとき、組成物に付加される。いくつかの実施態様では、任意選択的キレート剤は、組成物の総重量の約０．０５％から約２．５％の量で存在する。酸が酵素補助因子を直接キーレト化できないいくつかの実施態様では、必須の酵素補助因子を隔離するためにキレート化剤が付加される。これらキレート剤には、限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミンジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又は必須酵素補助因子を隔離するために適した他のキレート化剤が含まれる。いずれかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、伝統的に細胞内に見出される又は酵素と共に見出される金属イオンのキレート化は、酵素を不可逆的に不活性化又は変性させることを助け、それにより酵素の不活性化に寄与しうると考えられる。
【００４８】
無機過酸化物及び有機過酸化物を含め、本発明の酵素不活性化組成物にはどのような過酸化物を用いてもよい。いくつかの実施態様では、過酸化物は式Ｒａ-Ｏ-Ｏ-Ｒｂを有し、式中、Ｒａ及びＲｂは、同じでも異なってもよく、独立して水素、アルキル基、アリール基、酸基（Ｒ（Ｃ（Ｏ））［ＲはＲａ又はＲｂと同じか、アシル基とすることができる］から選択されうる。いくつかの実施態様では、過酸化物は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。一般に、過酸化物は、酵素不活性化組成物の総重量の約０．０２５％から約５％の範囲の量で存在する。
【００４９】
防腐剤は、典型的に生物学的試料と共に用いられるあらゆる防腐剤から選択することができる。いくつかの実施態様では、防腐剤はアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）である。一般に、防腐剤は、酵素不活性化組成物の総重量の約０．０２５％から約１．５％の範囲の量で存在する。いくつかの実施態様では、ＮａＮ３は、ペルオキシダーゼの可逆的阻害剤でもあると考えられるため防腐剤として使用され、さらに酵素の不活性化に寄与することができる（本明細書の実施例３、６、７、及び８参照）。
【００５０】
いくつかの実施態様では、溶出軽減剤は酵素不活性化組成物の内部に含まれる。いくつかの実施態様では、溶出軽減剤はアルカリ性塩化物塩である。溶出軽減剤は、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、溶出軽減剤は塩である。一般に、溶出軽減剤は、酵素不活性化組成物の総重量の約１％から約５％の範囲の量で存在する。いくつかの実施態様では、０．５ＭのＮａＣｌが溶出軽減剤として使用される。他の実施態様では、０．７５ＭのＮａＣｌが溶出軽減剤として使用される。また別の実施態様では、１ＭのＮａＣｌが溶出軽減剤として使用される。
【００５１】
本発明の組成物は、バッファー、可逆的酵素阻害剤、不可逆的酵素阻害剤などといった他の成分も含みうる。
【００５２】
本発明の一実施態様は、約１から約３．０の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸と；過酸化物及び防腐剤の少なくとも一つとを含む酵素不活性化組成物である。本発明の別の実施態様は、約１から約３．０の範囲のｐＨを有するシトレート、過酸化水素、及びアジ化ナトリウムを含む酵素不活性化組成物である。いくつかの実施態様では、過酸化物は、組成物の総重量の約０．２５％から約１．５％の範囲の量で存在し、防腐剤は、組成物の総重量の．約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する。
【００５３】
本発明のまた別の実施態様は、約１から約３．０の範囲のｐＨを有するシトレート；過酸化水素、及びアジ化ナトリウム及び塩化ナトリウムを含む酵素不活性化組成物である。いくつかの実施態様では、用いられる塩化ナトリウムのモル濃度は、約０．２５Ｍから約１Ｍの範囲である。
【００５４】
一実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、及びＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）を含む。別の実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約０．５％）、及びＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）を含む。別の実施態様では、酵素不活性化組成物は、約２．０のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、及びＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）を含む。別の実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）、及び塩化ナトリウム（約０．５Ｍ）を含む。別の実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）、及び塩化ナトリウム（約０．７５Ｍ）を含む。別の実施態様では、酵素不活性化組成物は、約１．５のｐＨを有するシトレート、Ｈ２Ｏ２（組成物の総重量の約１％）、ＮａＮ３（組成物の総重量の約０．０８％）、及び塩化ナトリウム（約１Ｍ）を含む。
【００５５】
酵素不活性化組成物と、同様に検出キット及び発色性検出試薬は、当技術分野で既知のいずれかの手段を用いて生物学的試料に適用することができる。例えば、検出キット及び酵素不活性化組成物は、自動標本処理装置を含む標本処理装置により生物学的試料に適用される。一般に、標本処理装置は、標本に対して広範囲の物質を適用するように構成されている。物質には、限定されないが、染色剤、プローブ、試薬、リンス剤及び／又は調節剤が含まれる。物質は流体（例えば、気体、液体、又は気体／液体混合物）などでよい。流体は、溶媒（例えば、極性溶媒、非極性溶媒など）、溶液（例えば、水溶液又は他の種類の溶液）などでよい。試薬には、限定されないが、染色剤、湿潤剤、抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など）、抗原回収流体（例えば、水性又は非水性ベースの抗原検索溶液、抗原回収バッファーなど）などが含まれる。いくつかの実施態様では、検出キット及び酵素不活性化組成物は、各々が標本処理装置により連続して付加される。
【００５６】
標本処理装置は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により販売されているＢＥＮＣＨＭＡＲＫ  ＸＴ装置及びＳＹＭＰＨＯＮＹ装置などの自動装置とすることができる。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、自動分析を実施するためのシステム及び方法を開示している、米国特許第５６５０３２７号、第５６５４２００号、第６２９６８０９号、第６３５２８６１号、第６８２７９０１号及び第６９４３０２９号、並びに米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び第２００４００５２６８５号を含む複数の米国特許の譲受人であり、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される。代替的に、標本を手動で処理することができる。
【００５７】
任意の量の酵素不活性化組成物が、生物学的試料に含有される酵素を適切に不活性化するために生物学的試料に付加されうる。いくつかの実施態様では、酵素不活性化を実施するために、約０．２５滴から約２滴の酵素不活性化組成物が生物学的試料に付加される。他の実施態様では、約１滴（約５０μＬから約１５０μＬ）の本発明の組成物が、生物学的試料と接触している、発色性検出試薬又はキット成分（例えば試料と接触する既存容積の流体）を含有する「パドル」に付加される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載される約１００μＬの酵素不活性化試薬が約３００μＬの容積を有するパドルに付加され、約２．５のｐＨを有するパドルが得られる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載される約１００μＬの酵素不活性化試薬が約３００μＬの容積を有するパドルに付加され、約２から約３のｐＨを有するパドルが得られる。いうまでもなく、生物学的試料中の酵素を不活性化するために必要な任意の量を、必要に応じて使用することができる。組成物は、生物学的試料の表面上に薄膜としても適用することができる。薄膜溶液は次いで、約２．５のｐＨで四分の一のバッファー濃度に適合され、調節なしでそのまま組織上に使用することができる。すべての試薬条件は、効果的にＡＰ及びＨＲＰ酵素の不活性化を行なった。
【００５８】
当業者であれば理解するように、組成物は特定のｐＨを有するが、組成物が生物学的試料に適用されるとき、生物学的試料と接触する結果として得られる「パドル」又は薄膜は、組成物のｐＨとほぼ同じｐＨを又は組成物のｐＨとは異なるｐＨを有しうる。例えば、付加される組成物のｐＨ（例えば１．５のｐＨ）より高いｐＨ（例えば２．５のｐＨ）を有する、生物学的試料と接触する既存の「パドル」に、開示される組成物を一滴付加する場合、その結果得られる新規の「パドル」は２．０のｐＨを有する。したがって、いくつかの実施態様では、生物学的試料と接触する蓄積パドルに特定のｐＨが望まれる場合、当業者は、既存のパドルより低いｐＨを有する不活性化用の組成物を付加することができる。
【００５９】
酵素不活性化組成物は、その中に含有されるいずれの試薬酵素又は内因性酵素も実質的に又は完全に不活性化されるような温度及び時間で生物学的試料に適用される。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物は、少なくとも約３分間、生物学的試料と連通状態に維持される。他の実施態様では、組成物は、少なくとも約４分間、生物学的試料と連通状態に維持される。他の実施態様では、組成物は、少なくとも約８分間、生物学的試料と連通状態に維持される。また別の実施態様では、組成物は、約３分から約１６分の範囲の期間にわたって生物学的試料と連通状態に維持される。さらなる実施態様では、組成物は、約４分から約１２分の範囲の期間にわたって生物学的試料と連通状態に維持される。さらに追加の実施態様では、組成物は、約４分から約８分の範囲の期間にわたって生物学的試料と連通状態に維持される。さらに追加の実施態様では、組成物は、約４分間、生物学的試料と連通状態に維持される。
【００６０】
いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物、生物学的試料、及び／又は組成物を生物学的試料に適用するための機器（まとめて「組成物の温度」と呼ぶ）は、酵素不活性化を行うための特定の温度に維持される。いくつかの実施態様では、組成物の温度は３０℃を上回る温度である。他の実施態様では、組成物の温度は約３０℃から約９０℃の範囲である。また別の実施態様では、組成物の温度は約３５℃から約５０℃の範囲である。また別の実施態様では、組成物の温度は約３５℃から約４１℃の範囲である。さらなる実施態様では、組成物の温度は約３７℃である。さらに追加の実施態様では、組成物の温度は約４１℃である。さらに追加の実施態様では、組成物の温度は約５０℃である。
【００６１】
いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、第１の発色性検出試薬を含む生物学的試料又は第１の検出キットに付加され、この生物学的試料及び／又は検出試薬／キットは、一又は複数のペルオキシダーゼ又はホスファターゼといった少なくとも一つの酵素を含む。いくつかの実施態様では、一又は複数の酵素が実質的に不活性化される又は完全に不活性化されるように、組成物は、所定量の時間にわたり所定の温度で、検出試薬／キットを含有する生物学的試料と接触させたままにする。
【００６２】
酵素の不活性化に続いて、第２の発色性検出試薬又は第２の検出キットが試料に付加され、この第２の発色性検出試薬又は第２の検出キットは第２の酵素を含む。第２の試薬／キットの付加に続き、第２の酵素を実質的に又は完全に不活性化するために、第２の酵素不活性化組成物が試料に付加される。当業者であれば、検出試薬／キットに続いて酵素不活性化を行う上記シーケンスを、多重化アッセイにおいて任意の回数にわたり繰り返すことができることを理解するであろう。多重化のレベルに応じて、本方法は、試料中において検出されるべき標的に数に基づき、一、二、三、四、五、六、七、八又は九回以上繰り返すことができる。
【００６３】
本発明の別の態様は、生物学的試料中の複数の標的を検出する方法であり、この方法は：（ａ）生物学的試料を、第１の酵素を有する第１の発色性検出試薬と接触させること；（ｂ）第１の発色性検出試薬からの第１のシグナルを検出すること；及び（ｃ）第１の酵素を、本明細書に開示される第１の酵素不活性化組成物を適用することにより不活性化することを含み、第１の酵素不活性化組成物又は生物学的試料の少なくとも一つは、約４分から約１６分の範囲の期間にわたり約３７℃から約５０℃の範囲の温度に維持される。いくつかの実施態様では、本方法は、（ｄ）生物学的試料を、第２の酵素を有する第２の発色性検出試薬と接触させる工程；（ｅ）第２の発色性検出試薬からの第２のシグナルを検出する工程；及び（ｆ）第２の酵素を、本明細書に開示される第２の酵素不活性化組成物を適用することにより不活性化する工程をさらに含み、第２の酵素不活性化組成物又は生物学的試料の少なくとも一つは、約４分から約１６分の範囲の期間にわたり約３７℃から約５０℃の範囲の温度に維持される。いくつかの実施態様では、追加的な発色性検出試薬、例えば第３、第４、及び第５の発色性検出試薬を検出するために工程を繰り返す。
【００６４】
いくつかの実施態様では、方法は、（ｉ）生物学的試料を、第１の検出プローブ（例えば抗体）と接触させる工程；（ｉｉ）生物学的試料を、第１の酵素を含む第１の標識化コンジュゲートと接触させる工程（標識化コンジュゲートは、検出プローブに特異的に結合するもので、酵素で標的を標識するように構成されている）；（ｉｉｉ）生物学的試料を、第１の潜在的反応生部分及び第１の発色部分を含む第１のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程；（ｉｖ）第１のシグナル伝達コンジュゲートの第１の発色部分により光の吸光度を通して第１の標的を検出する工程；並びに（ｖ）生物学的試料を、本明細書に開示される第１の酵素不活性化組成物と接触させ、生物学的試料に含有される第１の酵素を実質的に不活性化する又は完全に不活性化する工程を含む。シグナル伝達コンジュゲートは、標的を検出するために使用される検出可能なシグナルを提供する。発色団部分は、一般に、その色を担う分子の一部として記載される。潜在的反応性部分は、触媒活性化を経て、試料又は他の検出成分に共有結合することのできる反応種を形成するように構成される。触媒活性化は、一又は複数の酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）によってもたらされる。このようなタイプの特異的検出キット及びそれらの生物学的試料への適用は、米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７９にさらなる記載があり、この特許文献はその内容全体が参照により本明細書に包含される。
【００６５】
いくつかの実施態様では、第１の酵素を不活性化した後に、方法は、（ｖｉ）生物学的試料を第２の検出プローブと接触させる工程；（ｖｉｉ）生物学的試料を、第２の酵素を含む第２の標識化コンジュゲートと接触させる工程；（ｖｉｉｉ）生物学的試料を、第２の潜在的反応性部分及び第２の発色部分を含む第２のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程；（ｉｘ）第２のシグナル伝達コンジュゲートの第２の発色部分により光の吸光度を通して第２の標的を検出する工程；並びに（ｘ）生物学的試料を、本明細書に開示される第２の酵素不活性化組成物と接触させ、生物学的試料に含有される第２の試薬酵素を実質的に不活性化する又は完全に不活性化する工程をさらに含む。いくつかの実施態様では、第１の酵素不活性化組成物と第２の酵素不活性化組成物は同じであり、第１の酵素と第２の酵素は同じであるか又は異なる。
【００６６】
開示される方法の工程（ｉ）から（ｘ）は、任意の適切な順序で行うことができ、本明細書に記載されるものに限定されない。いくつかの実施態様では、方法は、標識化コンジュゲートを生物学的試料に付加し、続いてシグナル伝達コンジュゲートを付加する工程を含む。開示される他の実施態様では、方法は、標識化コンジュゲートを生物学的試料に付加し、続いて増幅コンジュゲートを、追加の酵素コンジュゲート、及びシグナル伝達コンジュゲートを付加する工程を含む。本明細書に開示されるコンジュゲートは、同時に又は連続して付加することができる。これらコンジュゲートは、別々の溶液中において、又は二つ以上のコンジュゲートを含む組成物として、付加することができる。また、開示される方法に用いられるコンジュゲートの各クラスは、同じ又は異なるコンジュゲート成分を含んでもよい。例えば、複数のシグナル伝達コンジュゲートが試料に付加されるとき、コンジュゲートは同じ又は異なる発色部分及び／又は潜在的反応性部分を含む。単純に例として、一つのシグナル伝達コンジュゲートは、チラミン部分に結合したクマリン発色団を含むことができ、別のシグナル伝達コンジュゲートは、チラミン誘導体部分に結合したローダミン発色団を含むことができる。開示される多重化アッセイにおける使用に適したシグナル伝達コンジュゲートの数は、一つから少なくとも六つ、さらに典型的には二つから五つの範囲である。いくつかの実施態様では、方法は、三つから五つの異なるシグナル伝達コンジュゲートを用いて三つから五つの異なる標的を検出するために使用される。本明細書に開示される方法を用いて、複数の標的が単一のアッセイで検出されうる。別の実施態様では、本方法についてここに開示される工程のうちのいずれか一又は複数が、自動スライド染色装置により実行される。
【００６７】
本発明の酵素を不活性化する方法は、追加の工程、例えば検出キットの成分を溶出するように設計された工程及び／又は生物学的試料を洗浄又は精製するように設計された工程と組み合わせることもできる。
【００６８】
いくつかの実施態様では、生物学的試料は、内因性ペルオキシダーゼ活性を実質的に又は完全に不活性化するために酵素不活性化組成物で前処理される。例えば、いくつかの細胞又は組織は内因性ペルオキシダーゼを含む。ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いることにより、高度な非特異的背景の染色がもたらされうる。このような非特異的背景は、本明細書に開示される酵素不活性化組成物による試料の前処理により低減することができる。いくつかの実施態様では、過酸化水素（適切な前処理溶液の重量の約１％から約３％）のみで試料を前処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を低下させる。内因性ペルオキシダーゼ活性が低下又は不活性化されたら、上述のように、検出キットが追加され、続いて検出キット中に存在する酵素の不活性化が行われる。開示される酵素不活性化組成物及び方法は、内因性酵素のペルオキシダーゼ活性を不活性化する方法としても使用可能である。
【００６９】
いくつかの実施態様において、標本がパラフィン包埋試料である場合、適切な脱パラフィン液を用いて試料を脱パラフィン化することができる。廃棄物除去剤が脱パラフィン液を除去した後、任意の数の物質を標本に連続的に適用することができる。前記物質は、前処理（例えばタンパク質架橋、核酸の曝露など）、変性、ハイブリダイゼーション、洗浄（例えばストリンジェンシー洗浄）、検出（例えば視覚的又はマーカー分子をプローブに連結する）、増幅（タンパク質、遺伝子などの増幅）、対比染色、カバースリッピングなどのためでありうる。
【００７０】
標本を処理した後、ユーザは、解析又は他の下流の処理のために標本搭載スライドを画像化装置に移してもよい。例えば、画像化装置は、明視野イメージャスライドスキャナーであってもよい。一つの明視野イメージャは、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により販売されるｉＳｃａｎ  ＣｏｒｅｏＴＭ明視野スキャナーである。自動化の実施態様では、画像化装置は、「画像化システム及び技術（ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）」と題された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２号（国際公開第２０１１／０４９６０８号）、又は「画像化システム、カセット、及びそれらの使用方法（ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＡＳＳＥＴＴＥＳ，ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＳＡＭＥ）」と題された、２０１１年９月９日出願の米国特許出願第６１／５３３１１４号に開示されているようなデジタル病理装置である。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２７７２号及び米国特許出願公開第２０１４／０１７８１６９号は、全体が参照により援用される。他の実施態様では、画像化装置は、顕微鏡に結合されたデジタルカメラを含む。
【００７１】
本発明の別の態様は、約１から約３の範囲のｐＨを有するポリカルボン酸；並びに過酸化物又は防腐剤のうちの少なくとも一方を含む第１の成分であって、過酸化物は組成物の総重量の約０．２５％から約１．５％の範囲の量で存在し、防腐剤は組成物の総重量の約０．０５％から約１．０％の範囲の量で存在する、第１の成分；並びに溶出軽減剤を含む第２の成分を含むキットである。いくつかの実施態様では、溶出軽減剤は塩である。他の実施態様では、第２の成分は、バッファー、キレート化剤又はこれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、第１及び第２の成分には、発色性検出試薬成分又は検出キットの成分を含みうる第３の成分が提供される。
【実施例】
【００７２】
一般的な免疫組織化学（ＩＨＣ）プロトコール
すべてのＩＨＣ染色実験は、別途指定のない限り、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ；「Ｖｅｎｔａｎａ」）の試薬を用いるＶＥＮＴＡＮＡ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ自動組織染色プラットフォームにおいて実施された。ホースラディッシュペルオキシダーゼＩＨＣ検出は、Ｖｅｎｔａｎａ  ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＶＭＳＩ，＃７６０−５００）又はＶｅｎｔａｎａ  ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キット（ＶＭＳＩ，＃７６０−７００）を用いて実施された。アルカリホスファターゼＩＨＣ検出は、Ｖｅｎｔａｎａ  ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ検出キット（ＶＭＳＩ，＃７６０−５０１）を用いて実施された。ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅウサギ抗ホースラディッシュペルオキシダーゼは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（＃３２３−００５−０２１）から購入した。
【００７３】
一般的なｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出法
以下の共通工程を実施した：（１）ＥＺ  Ｐｒｅｐ清浄液（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＶＭＳＩ），＃９５０−１０１）による脱パラフィン工程（７５℃；２０分）；（２）反応バッファー（ＶＭＳＩ，＃９５０−３００）による洗浄工程；（３）Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  １（ＶＭＳＩ  ＃９５０−１２４）での抗原検索（９５℃；対象抗原に応じた時間）；（４）洗浄工程（工程２と同じ）；（５）ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＶＭＳＩ，＃２５３−４２９１）を用いて内因性ペルオキシダーゼを不活性化する工程（３７℃；４分）；（６）洗浄工程（工程２と同じ）；（７）一次抗体（Ａｂ）インキュベーション工程（３７℃；８〜３２分の範囲の一次抗体に応じた時間）；（８）洗浄工程（工程２と同じ）；（９）ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（ＶＭＳＩ，＃２５３−４２９０）による一次抗体検出工程（３７℃；８分）；（１０）洗浄工程（工程２と同じ）；（１１）ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ過酸化水素（ＶＭＳＩ，２５３−４２９３）及びｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ（ＶＭＳＩ，２５３−４２９２）の付加時にＨＲＰにより生成される褐色の沈殿物による可視化工程（３７℃；８分）；（１２）洗浄工程（工程２と同じ）；並びに（１３）ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  銅（ＶＭＳＩ，２５３−４２９４）の付加によりＤＡＢを調色する工程（３７℃；４分）。いくつかの事例では、染色された組織切片を、修飾されたＭａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン（ＶＭＳＩ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＩＩ，７９０−２２８０）を用いて対比染色し（３７℃；４分）、次いでＢｌｕｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＶＭＳＩ，７９０−２０３７）と共にインキュベートした（３７℃；４分）。次いでスライドを清浄水混合物ですすぎ、段階的エタノールシリーズで脱水し、キシレンで洗浄し、手動でカバーガラスをした。スライドを明視野顕微鏡で観察した。
【００７４】
一般的なＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出法
以下の共通工程を実施した：（１）ＥＺ  Ｐｒｅｐ清浄液（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＶＭＳＩ），＃９５０−１０１）による脱パラフィン工程（７５℃；２０分）；（２）Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＶＭＳＩ，＃９５０−３００）による洗浄工程；（３）Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  １（ＶＭＳＩ  ＃９５０−１２４）での抗原検索（９５℃；対象抗原に応じた時間）；（４）洗浄工程（工程２と同じ）；（５）ＯｐｔｉＶＩＥＷ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＶＭＳＩ，＃２５３−４５７８）を用いて内因性ペルオキシダーゼを不活性化する工程（３７℃；４分）；（６）洗浄工程（工程２と同じ）；（７）一次抗体（Ａｂ）インキュベーション工程（３７℃；８〜３２分の範囲の一次抗体に応じた時間）；（８）洗浄工程（工程２と同じ）；（９）ＯｐｔｉＶＩＥＷ  ＨＱ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌｉｎｋｅｒ（ＶＭＳＩ，＃２５３−４５８０）による一次抗体検出工程（３７℃；８分）；（８）洗浄工程（工程２と同じ）；（９）ＯｐｔｉＶＩＥＷ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（ＶＭＳＩ，＃２５３−４５８１）によるリンカー検出工程（３７℃；８  ｍｉｎ）；（１０）洗浄工程（工程２と同じ）；（１１）ＯｐｔｉＶＩＥＷ  Ｈ２Ｏ２（ＶＭＳＩ，２５３−４５８３）及びＯｐｔｉＶＩＥＷ  ＤＡＢ（ＶＭＳＩ，２５３−４５８２）の付加時にＨＲＰにより生成される褐色の沈殿物による可視化工程（３７℃；８分）；（１２）洗浄工程（工程２と同じ）；並びに（１３）ＯｐｔｉＶＩＥＷ  Ｃｏｐｐｅｒ（ＶＭＳＩ，２５３−４５８４）の付加によりＤＡＢを調色する工程（３７℃；４分）。いくつかの事例では、染色された組織切片を、修飾されたＭａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン（ＶＭＳＩ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＩＩ，７９０−２２８０）を用いて対比染色し（３７℃；４分）、次いでＢｌｕｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＶＭＳＩ，７９０−２０３７）と共にインキュベートした（３７℃；４分）。次いでスライドを清浄水混合物ですすぎ、段階的エタノールシリーズで脱水し、キシレンで洗浄し、手動でカバーガラスをした。スライドを明視野顕微鏡で観察した。
【００７５】
一般的なｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  ＩＨＣ検出法
以下の共通工程を実施した：（１）ＥＺ  Ｐｒｅｐ清浄液（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＶＭＳＩ），＃９５０−１０１）による脱パラフィン工程（７５℃；２０分）；（２）Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＶＭＳＩ，＃９５０−３００）による洗浄工程；（３）Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  １（ＶＭＳＩ  ＃９５０−１２４）での抗原検索（９５℃；対象抗原に応じた時間）；（４）洗浄工程（工程２と同じ）；（５）一次抗体（Ａｂ）インキュベーション工程（３７℃；８〜３２分の範囲の一次抗体に応じた時間）；（６）洗浄工程（工程２と同じ）；（７）ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（ＶＭＳＩ，＃  ２５３−４３２７）による一次抗体検出工程（３７℃；８分）；（８）洗浄工程（工程２と同じ）；（９）ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＶＭＳＩ，２５３−４３２６）付加時にＡＰにより生成される赤色の沈殿物による可視化工程（３７℃；４分）；（１０）ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  Ａ（ＶＭＳＩ，２５３−４３２９）及びｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  Ｎａｐｈｔｈｏｌ（ＶＭＳＩ，２５３−４３２８）（３７℃；８分）；（１１）ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  Ｂ（ＶＭＳＩ，２５３−４３３０）（３７℃；８分）；並びに（１２）洗浄工程（工程２と同じ）。いくつかの事例では、染色された組織切片を、修飾されたＭａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン（ＶＭＳＩ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＩＩ，７９０−２２８０）を用いて対比染色し（３７℃；４分）、次いでＢｌｕｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＶＭＳＩ，７９０−２０３７）と共にインキュベートした（３７℃；４分）。次いでスライドを清浄水混合物ですすぎ、６０℃のオーブンで３０から６０分間乾燥させ、手動でカバーガラスをした。スライドを明視野顕微鏡で観察した。
【００７６】
一般的なホースラディッシュペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ酵素不活性化法
開示される組成物を用いたＨＲＰ及びＡＰ酵素不活性化を、ＩＨＣアッセイの間の様々な工程において試験し、以下の様々なＩＨＣ検出工程に対する試薬組成物及び機器法の影響を調べた：（１）抗原安定性（酵素不活性化工程を、抗原検索の後、一次抗体による抗原検出の前に配した）；（２）酵素不活性化（酵素不活性化工程を、酵素多量体による抗体検出の後、色素原検出の前に配した）；及び（３）検出溶出（酵素不活性化工程を、色素原堆積の後、対比染色が適用される場合対比染色の前に配した）。以下の共通工程を、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ自動組織染色プラットフォームにおいて実施した：（１）Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＶＭＳＩ，＃９５０−３００）による洗浄工程；（２）様々な温度（３７から５０℃）及びインキュベーション時間（４から２０分）での酵素不活性化試薬による処理工程；並びに（３）洗浄工程（工程１と同じ）。複数の殺傷工程を連続して実施する場合、このような三工程法を適切に繰り返した。
【００７７】
一般に用いられる他の酵素不活性化／阻害方法を、自動設定における試薬の性能を比較するために試験した。上記と同様の一般手順を、Ｖｅｎｔａｎａ  ＰＯ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＶＭＳＩ  ＃２５３−４５７８）及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＶＭＳＩ  ＃７６０−４８４０）を用いる酵素不活性化法に実施した。複数の処理を含む方法を、処理と処理の間に一回のＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＶＭＳＩ，＃９５０−３００）による洗浄工程を行って実施した。様々なＶｅｎｔａｎａ機器バルク試薬［Ｖｅｎｔａｎａ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＶＭＳＩ  ＃９５０−３００）、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  １（ＣＣ１，ＶＭＳＩ，＃９５０−１２４）；及びＶｅｎｔａｎａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  １（ＣＣ１，ＶＭＳＩ  ＃９５０−１２３）］が、高温で同様のプロトコールを用いて検出系を不活性化するために使用された。特定のプロトコールでは、試薬濃度の上昇を可能にするために、残留パドルの容積を低減することが望ましかった。「ジェット排水」手順が、試薬の付加に先立ち、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ自動組織染色プラットフォームにおいて行われ、パドルの容積を約２０から２５％の公称Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＶＭＳＩ，＃９５０−３００）に低減させた。
【００７８】
ＡＰ及びＨＲＰモデルの系を、本明細書の実施例に使用した（ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ又はｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＡＰ  Ｒｅｄ検出系，扁桃腺組織上のＣＤ２０、８分間ＣＣ１、１６分間ＣＤ２０）。
【００７９】
特に、ペルオキシダーゼ不活性化組成物／方法を、ＨＲＰ多量体のインキュベーションの後、ＤＡＢ検出の前に調べた（ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ＣＤ２０、扁桃腺組織、８分間ＣＣ１、１６分間ＣＤ２０）。ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＯｐｔｉＶｉｅｗ）は、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ及びウサギの一次抗体を検出するための、間接的な、ビオチンを含まない系である。キットは、ＶＥＮＴＡＮＡ自動スライド染色器で染色され、光学顕微鏡により可視化される、ホルマリン固定され、パラフィン包埋され、凍結された組織の切片中において、標的を、免疫組織化学（ＩＨＣ）により同定することを目的としている。
【００８０】
同様に、ウシ腸ＡＰ不活性化組成物／方法を、ＡＰ多量体のインキュベーションの後、ＡＰ  Ｒｅｄ検出の前に調べた（ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＡＰ  Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ＣＤ２０、扁桃腺組織、８分間ＣＣ１、１６分間ＣＤ２０）。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｖｅｎｔａｎａ）のｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔは、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ及びウサギの一次抗体を検出するための、間接的な、ビオチンを含まない系である。キットは、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ、及びＢｅｎｃｈｍａｒｋ  ＵＬＴＲＡ自動スライド染色器を含むＶｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｓｅｒｉｅｓ機器で染色される、ホルマリン固定され、パラフィン包埋され、凍結された組織の切片中において、標的を、免疫組織化学（ＩＨＣ）により同定することを目的としている。
【００８１】
ＤＡＢに関し、ここで参照される図面において、可視のＤＡＢの量が減少していることは、ＨＲＰ酵素の不活性化が増大していることを示している。例えば、試料が対比染色のみを示し、可視のＤＡＢシグナルがない場合、酵素不活性化は完全であるか又は完全に近い。同様に、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄの場合、可視のＦａｓｔ  Ｒｅｄの量が減少していることは、ＡＰ酵素の不活性化が増大していることを示している。例えば、試料が対比染色のみを示し、可視のＦａｓｔ  Ｒｅｄシグナルがない場合、酵素不活性化は完全であるか又は完全に近い。
【００８２】
実施例１−ペルオキシダーゼ阻害／不活性化に対する試薬のｐＨの影響
Ｖｅｎｔａｎａ  ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットがこの試験の間に用いられた。ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（ＶＭＳＩ，＃２５３−４２９０）検出工程の後、ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ色素原堆積の前に、上記一般的プロトコールに所望の酵素不活性化工程を挿入した。酵素不活性化工程を、約３７℃で約１６分間実施した。抗原検索を、Ｖｅｎｔａｎａ  ＣＣ１を用いて約８分間実施した。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｃｏｎｆｉｒｍ  ＭｓＡｎｔｉＣＤ２０（Ｃｌｏｎｅ  Ｌ２６，ＶＭＳＩ  ＃７６０−２５３１）一次抗体を、約３７℃で約１６分間用いた。ＨＲＰ不活性化／変性のｐＨ依存性を、１Ｍのシトレートバッファーを約０．５単位の増分でｐＨ＝約１．５から約３．０で用いる処理により確認した。約一滴の組成物をＶｅｎｔａｎａ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒパドルに付加したとき、試薬のｐＨの上昇は、組織が曝されたパドルのｐＨの上昇を引き起こした（試薬ｐＨ／凡その最終パドルのｐＨ：約１．５／約２．０；約２．０／約２．５から２．７５；約２．５／約３．０から３．２５；約３．０／約３．５から４．０）。ＨＲＰ酵素不活性化効率は、結果として得られるパドルのｐＨが上昇するにつれて低下した。１Ｍのシトレートベース（ｐＨ＝約１．５）は、ＨＲＰ酵素活性の完全な不活性化を示した。ＤＡＢ  ＩＨＣ染色強度及びパーセント染色細胞は、試薬ｐＨが上昇するにつれて上昇及び増加した。ペルオキシダーゼ不活性化処理の後、残留した内因性ペルオキシダーゼをＤＡＢ  ＩＨＣ検出により観察した。
【００８３】
実施例２−ペルオキシダーゼ阻害／不活性化に対する試薬適用温度の影響
Ｖｅｎｔａｎａ  ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットがこの試験の間に用いられた。ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（ＶＭＳＩ、＃２５３−４２９０）検出工程の後、ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ色素原堆積の前に、上記の一般的プロトコールに所望の酵素不活性化工程を挿入した。酵素不活性化工程を、可変の温度及びインキュベーション時間を用いて実施した。抗原検索を、Ｖｅｎｔａｎａ  ＣＣ１を用いて約８分間実施した。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｃｏｎｆｉｒｍ  ＭｓＡｎｔｉＣＤ２０（Ｃｌｏｎｅ  Ｌ２６，ＶＭＳＩ  ＃７６０−２５３１）一次抗体を、約３７℃で約１６分間用いた。組織抗原検出シグナル強度に対する組成物の影響は、併用試薬のｐＨ、適用時間及び温度の影響を受けると考えられた。温度がどのように酵素不活性化の短縮を助けるかを決定するために、１Ｍのシトレートベース（ｐＨ＝約１．５）を、高温において調べた。１Ｍのシトレートベース（ｐＨ＝約１．５）のインキュベーション時間は、約３７℃における約１６分から、約４１℃における約８分、又はＴ≧約４５℃における約４分まで、ＨＲＰ酵素活性の完全な阻害により短縮された。高い壊死を有する組織領域は、多量体の非特異的結合がより高く、より強いＤＡＢ  ＩＨＣ染色を生じ、且つ酵素不活性化を調査するために価値の高い部位と考えられた。ＤＡＢのＩＨＣ染色強度及びパーセント染色細胞は、酵素不活性化試薬のｐＨを上昇させたとき、約３７℃及び約１６分より約４１℃及び約８分でやや高かった。約４１℃及び約８分でのすべての酵素不活性化処理後、残留する内因性ペルオキシダーゼ活性を、ＤＡＢ  ＩＨＣ検出により観察した。
【００８４】
実施例３−ペルオキシダーゼ酵素不活性化に対する追加的添加剤の影響
シトレートベースの酵素不活性化試薬は、標的とする貯蔵寿命を達成するために抗菌性試薬を必要とする。予想される試薬のｐＨ＝約１．５から約２．０は、Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）試薬の耐性ｐＨ範囲以下であった。Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０はｐＨ＝約２から約１２のｐＨ耐性範囲を有し、他のＰｒｏｃｌｉｎ試薬のｐＨはｐＨ ≧約２．５の耐性を有していると思われた。アジ化ナトリウム（約０．０８ ｗｔ％）は、静菌性のオキシダーゼ阻害剤として作用するだけでなく、可逆的にペルオキシダーゼを阻害することもできると考えられるため、利用可能な静菌性防腐剤候補と決定された。
【００８５】
Ｖｅｎｔａｎａ  ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットがこの試験の間に用いられた。ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（ＶＭＳＩ、＃２５３−４２９０）検出工程の後、ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ色素原堆積の前に、上記の一般的プロトコールに所望の酵素不活性化工程を挿入した。酵素不活性化工程を、約３７℃で約４分間実施した。抗原検索を、Ｖｅｎｔａｎａ  ＣＣ１を用いて８分間実施した。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｃｏｎｆｉｒｍ  ＭｓＡｎｔｉＣＤ２０（Ｃｌｏｎｅ  Ｌ２６，ＶＭＳＩ  ＃７６０−２５３１）一次抗体を、約３７℃で約１６分間用いた。過酸化水素力価（約０．１、約０．５から約１．０ｗｔ％）を、１Ｍのシトレートベース試薬（ｐＨ＝約１．５）において調べ、付加された内因性及び検出に基づくペルオキシダーゼ阻害能を評価した。約４分間約３７℃で約０．５又は約１．０ｗｔ％の過酸化水素を追加することにより、ペルオキシダーゼ不活性化効率の上昇が観察された。過酸化水素は、残留ＨＲＰ活性が観察される約０．１ｗｔ％では同じ効果を有さないと思われた。上記シトレート−過酸化水素組成物に対するアジ化ナトリウムの付加（約０．０８ｗｔ％）は同様の結果をもたらした。約０．５又は約１．０ｗｔ％の過酸化水素に、内因性又は検出キットのペルオキシダーゼ活性は実質的に観察されなかった。この試薬組成物は、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ自動組織染色プラットフォーム（Ｔ＝約３７℃）における追加的熱の非存在下で、約４分のインキュベーションにおいて酵素不活性化／阻害を達成した。
【００８６】
塩化ナトリウムは、以前の研究において検出キットの溶出を最小化することが以前に観察されており、検出キットを最小化するために酵素不活性化の間に必要であると予測された。塩化ナトリウムを、約０．２５Ｍから約４ＭのＮａＣｌで、ベースシトレート試薬［約１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）＋約１．０ｗｔ％のＨ２Ｏ２＋約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３］中に滴定した。ＮａＣｌの追加は試薬をより強いタンパク質変性試薬にすると考えられるため、ペルオキシダーゼ不活性化の効率に実質的な変化は観察されなかった。しかしながら、塩化ナトリウムはＯｐｔｉＶｉｅｗ検出キットの溶出を最小化すると思われた。
【００８７】
Ｔｈｅ  Ｖｅｎｔａｎａ  ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（ＶＭＳＩ  ＃７６０−７００）がこの試験の間に使用された。ＯｐｔｉＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（ＶＭＳＩ，＃２５３−４５８１）検出工程の後に、上記の一般的プロトコールに所望の酵素不活性化工程を挿入した。酵素不活性化工程を、約３７℃で約４分間実施した。組織に対し、ＲｂＡｎｔｉＨＲＰ検出（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃３２３−００５−０２１）（約３７℃で約１６分間）、洗浄工程、ＵｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＨＲＰ多量体（約３７℃で約８分間）（ＶＭＳＩ，＃２５３−４２９０）、及びＯｐｔｉＶＩＥＷ  ＤＡＢ色素原検出を行った。抗原検索を、Ｖｅｎｔａｎａ  ＣＣ１を用いて約６４分間実施した。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｃｏｎｆｉｒｍ  ＭｓＡｎｔｉｂｃｌ２（Ｃｌｏｎｅ  １２４，ＶＭＳＩ  ＃７９０−４４６４）一次抗体を、約３７℃で約１６分間用いた。溶出処理を行わないｂｃｌ２コントロール標準でのＲｂＡｎｔｉＨＲＰ検出は、ＤＡＢ  ＩＨＣの検出を増幅し、背景を増大させた。ベースシトレート試薬による酵素不活性化は、増幅を行わないコントロールスライドよりＩＨＣ検出が弱かった場合に有意な検出キットの溶出を生じさせた。塩化ナトリウムの付加は、ＲｂＡｎｔｉＨＲＰ  ＩＨＣ検出により［ＮａＣｌ］≧１．０Ｍが、病理学的評価によりコントロール標準スライドと概ね同等と決定された場合、検出キットの溶出を低減させた。
【００８８】
実施例４−アルカリホスファターゼの阻害／不活性化における温度対試薬ｐＨのバリエーション
Ｖｅｎｔａｎａ  ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌの  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットが本試験に用いられた。ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＡＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（ＶＭＳＩ，＃２５３−４３２７）検出工程の後、ｕｌｔｒａＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＡＰ  Ｒｅｄ色素原堆積の前に、上記一般的プロトコールに所望の酵素不活性化工程を挿入した。酵素不活性化工程を、可変の温度及びインキュベーション時間で実施した。抗原検索を、Ｖｅｎｔａｎａ  ＣＣ１を用いて８分間実施した。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｃｏｎｆｉｒｍ  ＭｓＡｎｔｉＣＤ２０（Ｃｌｏｎｅ  Ｌ２６，ＶＭＳＩ  ＃７６０−２５３１）一次抗体を、約３７℃で約１６分間用いた。ＨＲＰを用いて実施したときのウシ腸アルカリホスファターゼ不活性化／変性のｐＨの依存性を、約１Ｍのシトレートバッファーを約０．５ｐＨ単位の増分でｐＨ＝約１．５から約３．０で用いる処理により確認した。上述のように、試薬のｐＨの上昇は、組織が曝されたパドルのｐＨの上昇を引き起こした（試薬のｐＨ／凡そのパドルのｐＨ：約１．５／約２．０；約２．０／約２．５から２．７５；約２．５／約３．０から２．２５；約３．０／約３．５から４．０）（実施例１参照）。ＡＰ酵素不活性化の効率は、パドルｐＨが上昇するにつれて低下した。わずか１Ｍのシトレートベース（ｐＨ＝約１．５から約２．０）は、約３７℃において約１２分で完全なＡＰ酵素活性の消失を示した。ＡＰ  Ｒｅｄ  ＩＨＣ染色強度及びパーセント染色細胞は、試薬のｐＨが上昇するにつれて増加した。約３７℃でのより短い酵素不活性化工程について、ｐＨ ＝ 約２．０で１Ｍのシトレートベースを用いると、ｐＨ＝約１．５で同ベースを用いた場合より高い強度のＡＰ  Ｒｅｄ染色が観察された。約４１℃への温度上昇により、約１Ｍのシトレートベース（ｐＨ＝約１．５）を用いて約４１℃で約４分での酵素不活性化が可能であった。約１Ｍのシトレートベース（ｐＨ＝約２．０）は、約４１℃で約８分を要した。
【００８９】
実施例５−アルカリホスファターゼの不活性化に対する添加剤の影響
これは実施例４で説明したようにして実施された。ペルオキシダーゼ不活性化に使用される酵素不活性化組成物（上記実施例３参照）を、アルカリホスファターゼ不活性化について試験し、それらが不活性化効率を上昇させるかどうかを評価した。過酸化水素又はアジ化ナトリウムの付加には、有意な利点は観察されなかった。塩化ナトリウムの付加は、約４分でアルカリホスファターゼ不活性化に必要な温度を約４１℃から約３７℃に低下させた。
【００９０】
実施例６−酵素不活性化／方法比較試験
酵素不活性化組成物の有力な候補を、ＶＭＳＩ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ及びＵｌｔｒａプラットフォームに適合し、同機器で現在利用されている先行技術の酵素不活性化（及び検出溶出）方法と対比させた（表１参照）。酵素不活性化、溶出効率、ＤＡＢ色素原の色相／安定性、組織抗原検出シグナル強度、及び対比染色の外観に対するそれらの影響を比較するための試験を実施した。次いで、上位五つの有力な組成物／方法を、腫瘍のツアー（ｔｏｕｒ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ）（ＴＯＴ）及び身体のツアー（ｔｏｕｒ  ｏｆ  ｂｏｄｙ）（ＴＭＢ）の組織スライドを用いて、組織形態に対するそれらの影響について試験した。
【００９１】
2018520647.tif 000003
【００９２】
実施例７−ペルオキシダーゼ阻害／不活性化組成物／方法の比較
正常な扁桃腺組織上のＣＤ２０（Ｃｌｏｎｅ  Ｌ２６，ＶＭＳＩ  ＃７６０−２５３１）によるＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出（ＶＭＳＩ  ＃７６０−７００）を用いて（約８分間ＣＣ１、約１６分間ＣＤ２０）、表１の酵素不活性化組成物を、内因性の及び検出キットのペルオキシダーゼ活性を不活性化する能力についてスクリーニングした。ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣアッセイにおいて、酵素コンジュゲートインキュベーション工程の後、ＤＡＢ色素原検出の前に、酵素不活性化組成物の各々を実施した（一次（１°）Ａｂインキュベーション−ＨＲＰ多量体インキュベーション−酵素不活性化／検出溶出−標準ＤＡＢ検出）。結果を表２にまとめ、図１に示す。
【００９３】
図１Ａ及び１ＢのＩＨＣ  ＤＡＢは、未処理の標準組織試料−ＣＤ２０、扁桃腺（８分間ＣＣ１、１６分間ＣＤ２０）を示す。これら画像は、倍率２０倍で取得された。；図１Ｃは、未処理のＩＨＣ  ＤＡＢ標準−ＣＤ２０、扁桃腺（８分間ＣＣ１、１６分間ＣＤ２０）を示す；図１Ｄ及び１Ｅは、組成物Ａで処理された組織試料を示す；図１Ｆ及び１Ｇは、組成物Ｂで処理された組織試料を示す；図１Ｈ及び１Ｉは、組成物Ｃで処理された組織試料を示す；図１Ｋ及び１Ｊは、組成物Ｄで処理された組織試料を示す；図１Ｌは、組成物Ｅで処理された組織試料を示す；図１Ｍは、組成物Ｆで処理された組織試料を示す；図１Ｎは、組成物Ｇで処理された組織試料を示す；図１Ｏ及び１Ｐは、組成物Ｈで処理された組織試料を示す；図１Ｑ及び１Ｒは、組成物Ｉで処理された組織試料を示す；図１Ｓ及び１Ｔは、組成物Ｊで処理された組織試料を示す；図１Ｕ及び１Ｖは、組成物Ｋで処理された組織試料を示す；図１Ｗ及び１Ｘは、組成物Ｌで処理された組織試料を示す；図１Ｙ及び１Ｚは、組成物Ｍで処理された組織試料を示す；図１ＡＡ及び１ＢＢは、組成物Ｎで処理された組織試料を示す；図１ＣＣ及び１ＤＤは、組成物Ｏで処理された組織試料を示す；図１ＥＥ及び１ＦＦは、組成物Ｐで処理された組織試料を示す；図１ＧＧ及び１ＨＨは、組成物Ｑで処理された組織試料を示す。
【００９４】
残留ＨＲＰ酵素活性（検出キット）は、組成物Ｉ＞Ｊ＞＞Ｈ≒Ａ（ランク順）についてのみ観察された。他のすべての組成物は、ＨＲＰ酵素活性を完全に阻害した。残留内因性ペルオキシダーゼ活性は、方法ＢからＧを除き、すべての組成物について観察された。この比較試験に基づく有力候補は組成物ＢからＧであった。
【００９５】
2018520647.tif 000004
2018520647.tif 000005
【００９６】
実施例８−アルカリホスファターゼ阻害／不活性化組成物／方法の比較
扁桃腺におけるＣＤ２０（Ｃｌｏｎｅ  Ｌ２６，ＶＭＳＩ  ＃７６０−２５３１）のｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＡＰ  Ｒｅｄ  ＩＨＣ検出キット（ＶＭＳＩ  ＃７６０−５０１）染色を用いて（約８分間ＣＣ１、約１６分間ＣＤ２０）、表１の酵素不活性化組成物を、内因性の及び検出キットのアルカリホスファターゼ活性を不活性化する能力についてスクリーニングした。ＩＨＣアッセイにおいて、酵素コンジュゲートインキュベーション工程の後、ＡＰ  Ｒｅｄ色素原検出の前に、酵素不活性化組成物の各々を試験した（一次（１°）Ａｂインキュベーション−ＨＲＰ多量体インキュベーション−酵素不活性化／検出溶出−標準ＡＰ  Ｒｅｄ検出）。結果を表３及び図２にまとめる。
【００９７】
図２Ａは、未処理のＩＨＣ  ＡＰ  Ｒｅｄ標準−ＣＤ２０、扁桃腺（８分間ＣＣ１、１６分間ＣＤ２０）を示す（１０倍の代表画像）；図２Ｂは、未処理のＩＨＣ  ＡＰ  Ｒｅｄ標準−ＣＤ２０、扁桃腺（８分間ＣＣ１、１６分間ＣＤ２０）を示す（１０倍の代表画像）；図２Ｃは、組成物Ａで処理された組織試料を示す；図２Ｄは、組成物Ｂで処理された組織試料を示す；図２Ｅは、組成物Ｃで処理された組織試料を示す；図２Ｅは、組成物Ｃで処理された組織試料を示す；図２Ｆは、組成物Ｄで処理された組織試料を示す；図２Ｇは、組成物Ｅで処理された組織試料を示す；図２Ｈは、組成物Ｆで処理された組織試料を示す；図２Ｉは、組成物で処理された組織試料を示す；図２Ｊは、組成物Ｈで処理された組織試料を示す；図２Ｋは、組成物Ｉで処理された組織試料を示す；図２Ｌは、組成物Ｊで処理された組織試料を示す；図２Ｍは、組成物Ｋで処理された組織試料を示す；図２Ｎは、組成物Ｌで処理された組織試料を示す；図２Ｏは、組成物Ｍで処理された組織試料を示す；図２Ｐは、組成物Ｎで処理された組織試料を示す；図２Ｑは、組成物Ｏで処理された組織試料を示す；図２Ｒは、組成物Ｐで処理された組織試料を示す；図２Ｓは、組成物Ｑで処理された組織試料を示す。
【００９８】
残留ＡＰ酵素活性（検出キット）は、組成物Ｈ〜Ｊについてのみ観察された。組成物Ｊは、組織を取り囲む非特異的ＡＰ  Ｒｅｄ色素原染色の増大を示した。他のすべての組成物は、ＡＰ酵素活性を完全に阻害した。この比較試験に基づく有力な候補は、組成物ＡからＧ及びＫからＱであった。
【００９９】
2018520647.tif 000006
2018520647.tif 000007
【０１００】
実施例９−酵素不活性化と検出キット溶出の対比
扁桃腺上のＣＤ２０（Ｃｌｏｎｅ  Ｌ２６，ＶＭＳＩ  ＃７６０−２５３１）（約８分間ＣＣ１、約１６分間ＣＤ２０）又は扁桃腺上のｂｃｌ２（Ｃｌｏｎｅ  １２４，ＶＭＳＩ  ＃７９０−４４６４）（６４分間ＣＣ１、３２分間ｂｃｌ２）のＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出染色（ＶＭＳＩ  ＃７６０−７００）、ＲｂＡｎｔｉＨＲＰ検出（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃３２３−００５−０２１）（約３７℃で約１６分）及びｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（ＶＭＳＩ，＃２５３−４２９０）（約３７℃で約８分）を用いた酵素ペルオキシダーゼ不活性化に続いて、表１の酵素不活性化方法を、それらの検出キット溶出能についてスクリーニングした。酵素不活性化組成物の各々を、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＨＲＰ多量体インキュベーション工程の後、ＲｂＡｎｔｉＨＲＰ  検出の前に、ＩＨＣアッセイにおいて試験した（一次（１°）Ａｂインキュベーション−ＯｐｔｉＶｉｅｗ二次（２°）インキュベーション−ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＨＲＰ多量体インキュベーション−酵素不活性化／検出溶出−ＲｂＡｎｔｉＨＲＰインキュベーション−ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＨＲＰ多量体インキュベーション−標準ＤＡＢ検出）。いずれの処理方法を用いても、完全な検出キットの溶出は観察されなかった（図３参照）。
【０１０１】
図３Ａ及び図３Ｂは、未処理でＩＨＣ  ＤＡＢ標準により染色された組織を示している（図３Ａ：ＣＤ２０、扁桃腺（８分間ＣＣ１、１６分間ＣＤ２０）；図３Ｂ：ｂｃｌ２、扁桃腺（６４分間ＣＣ１、３２分間ｂｃｌ２））。図３Ａ及び図３Ｂは、組成物Ａ、及びＥからＧのみに関する。代表画像は１０倍である。図３Ｃ及び３Ｄは、ＲｂＡｎｔｉＨＲＰ／ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎを用いた、ＩＨＣ  ＤＡＢ  Ｓｔａｎｄａｒｄで染色された組織を示している（図３ＣはＣＤ２０、扁桃腺（８分間ＣＣ１、１６分間ＣＤ２０）であり、図３Ｄはｂｃｌ２、扁桃腺（６４分間ＣＣ１、３２分間ｂｃｌ２）である）。図３及び３Ｆは、組成物Ａで処理された組織試料を示しており（図３ＥはＣＤ２０、扁桃腺（８分間ＣＣ１、１６分間ＣＤ２０）であり、図３Ｆはｂｃｌ２、扁桃腺（６４分間ＣＣ１、３２分間ｂｃｌ２）である）；図３Ｇは、組成物Ｂで処理された組織試料を示し；図２Ｈは、組成物Ｃで処理された組織試料を示し；図３Ｉは、組成物Ｄで処理された組織試料を示し；図３Ｊは、組成物Ｅで処理された組織試料を示し；図３Ｋは、組成物Ｆで処理された組織試料を示し；図３Ｌは、組成物Ｇで処理された組織試料を示し；図３Ｍは、組成物Ｈで処理された組織試料を示し；図３Ｎは、組成物Ｉで処理された組織試料を示し；図３Ｏは、組成物Ｊで処理された組織試料を示し；図３Ｐは、組成物Ｋで処理された組織試料を示し；図３Ｑは、組成物Ｌで処理された組織試料を示し；図３Ｒは、組成物Ｍで処理された組織試料を示し；図３Ｓは、組成物Ｎで処理された組織試料を示し；図３Ｔは、組成物Ｏで処理された組織試料を示し；図３Ｕは、組成物Ｐで処理された組織試料を示し；図３Ｖは、組成物Ｑで処理された組織試料を示す。
【０１０２】
いずれかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、残留ＨＲＰ酵素は変性し、組織上でのＲｂＡｎｔｉＨＲＰ検出を可能にすると考えられた；しかしながら、部分的溶出が生じる。塩化ナトリウム（及び他の塩）を含有するベースシトレート組成物は、低レベルの溶出を呈した。約０．５ＭのＮａＣｌを含む組成物Ｅは、若干の検出溶出を示した。しかしながら、組成物Ｆ及びＧ（それぞれ約０．７５から約１．０ＭのＮａＣｌを含む）は、標準及びＲｂＡｎｔｉＨＲＰ検出に対し、ＲｂＡｎｔｉＨＲＰ検出において検知可能な変化を示さなかった。組成物Ｍは、抗体結合の破壊を示した；しかしながら、検出系は非特異的に組織に広がった（非特異的背景染色を増加させた）。病理学的評価により、最良のＨＲＰ多量体溶出が組成物Ｌ＞Ｐ≒Ｑ＞Ｎ≒Ｏ＞ＡからＤ＞＞Ｋ＞＞Ｍ（ランク順）によって達成されることが示唆された。
【０１０３】
実施例１０−ＤＡＢ  ＩＨＣ色素原染色に対する酵素不活性化組成物の影響
扁桃腺組織を、ｂｃｌ２（ＶＭＳＩ，＃２５３−４２９０）について、ヘマトキシリン対比染色あり及びなしで、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ検出（ＶＭＳＩ  ＃７６０−７００）により染色した。ＤＡＢ染色は過度に飽和しておらず、わずかな変化を検出できるようにするため、ｂｃｌ２  ＤＡＢ  ＩＨＣモデルが用いられた。スライドは、ＤＡＢ染色とヘマトキシリン染色の共存は見かけ上のＤＡＢ強度を上昇させることが観察されたため、ヘマトキシリン対比染色なしでも染色された。ベースシトレート酵素不活性化組成物［１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）、約１．０ｗｔ％のＨ２Ｏ２、約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３］を、ＩＨＣアッセイにおいて、標準ＤＡＢ色素原検出（ＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２の後ＣｕＳＯ４調色の直後に、約３７℃で約４分間加えた）［ＨＲＰ多量体インキュベーション−標準ＤＡＢ検出−酵素不活性化組成物−Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＩＩ対比染色（使用した場合）］。酵素不活性化組成物は、ＤＡＢの色相を、チョコレート色又は褐色／赤色から褐色／橙色にシフトさせた。このようなＤＡＢの色相は通常、銅ＤＡＢ染色調色をしない場合に観察された。酵素不活性化の後に追加された余分な銅調色工程は、若干のＤＡＢ色相を回復した。しかしながら、ＤＡＢの染色強度は、未処理の標準程強くなかった。同様のＤＡＢの色相シフトが、ヘマトキシリン対比染色あり及びなしで観察された。ＤＡＢの色相の変化は、低発現及び中程度発現のＩＨＣ抗原上で一貫して観察された。しかしながら、同じＤＡＢ色相のシフトは、より強いＤＡＢ染色密度により、扁桃腺上のＣＤ２０といったより強い抗原のＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣにおいて顕著に観察されなかった。
【０１０４】
シトレート酵素不活性化組成物［１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）＋約１．０ｗｔ％のＨ２Ｏ２＋約０．５ＭのＮａＣｌ＋約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３］を含有する塩化ナトリウムを用いて同様の実験を実施した。塩化ナトリウムの付加は、１倍及び４倍処理の両方においてベースシトレート組成物に観察されるＤＡＢ色素原の色相シフトを最小化した。銅の調色に影響している可能性が最も高い過酸化水素により、わずかな色相シフトが依然として生じた。しかしながら、塩化ナトリウムの付加は、見かけ上のＤＡＢの色相シフトを低減する検出キットの溶出を減少させた。ＤＡＢの色相への影響における差異は、約０．５から約１．０Ｍの塩化ナトリウムの導入により最小化されると考えられた。
【０１０５】
実施例１１−ＤＡＢ  ＩＨＣの染色：酵素不活性化組成物／方法の影響の比較
上記実施例９及び１０に記載したように、ＤＡＢ染色（強度及び色相）は、ＤＡＢ検出後に過酸化水素を含有する酵素不活性化組成物へ色素原を曝露させることにより影響を受けた。組成物は、ＤＡＢの色相を、チョコレート色又は褐色／赤色から、銅の調色をしないＤＡＢ染色に通常観察される褐色／橙色にシフトさせた。酵素不活性化組成物による処理後の余分な銅調色工程は、若干のＤＡＢ色相を回復した；しかしながら、それは未処理標準程強くなかった。ＤＡＢ色相の変化は、低発現及び中程度発現のＩＨＣ抗原全体に一貫して観察された；しかしながら、同じＤＡＢの色相シフトは、より高いＤＡＢ染色強度により、強い抗原のＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ染色においてｈａ顕著に観察されなかった。
【０１０６】
表１の酵素不活性化組成物を、扁桃腺上におけるｂｃｌ２のＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ染色（約６４分間ＣＣ１、約３２分間ｂｃｌ２）に対するその影響についてスクリーニングした。酵素不活性化組成物の各々は、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ色素原の堆積／銅の調色の後でＩＨＣ  アッセイにおいて試験された。ＤＡＢの色相及び染色強度のよりよい評価を可能にするために、ヘマトキシリン  対比染色は実施しなかった（一次（１°）Ａｂインキュベーション−ＨＲＰ多量体インキュベーション−標準ＤＡＢ検出−酵素不活性化／検出溶出）。多重検出アッセイにおいて実施されうる複数のシーケンスの蓄積作用を調べるため、各酵素不活性化方法を、１倍及び４倍で実施した（図４参照）。
【０１０７】
図４Ａ及び図４Ｂは、未処理のＩＨＣ  ＤＡＢ  Ｓｔａｎｄａｒｄで染色された組織−ｂｃｌ２、扁桃腺を示している（６４分間ＣＣ１、３２分間ｂｃｌ２）。（第２の試薬製剤ラウンド標準  -４Ｂ−組成物Ａ２、ＥからＧのみについて）１０倍の代表画像；図４Ｃ及び４Ｄは、組成物Ａで処理された組織試料を示す；図４Ｅ及び４Ｆは、組成物Ｂで処理された組織試料を示す；図４Ｇ及び４Ｈは、組成物Ｃで処理された組織試料を示す；図４Ｉ及び４Ｊは、組成物Ｄで処理された組織試料を示す；図４Ｋ及び４Ｌは、組成物Ｅで処理された組織試料を示す；図４Ｍ及び４Ｎは、組成物Ｆで処理された組織試料を示す；図４Ｏ及び４Ｐは、組成物Ｇで処理された組織試料を示す；図４Ｑ及び４Ｒは、組成物Ｈで処理された組織試料を示す；組成物Ｉについてデータは収集されなかった；図４Ｓ及び４Ｔは、組成物Ｊで処理された組織試料を示す；図４Ｕ及び４Ｖは、組成物Ｋで処理された組織試料を示す；図４Ｗ及び４Ｘは、組成物Ｌで処理された組織試料を示す；図４Ｙ及び４Ｚは、組成物Ｍで処理された組織試料を示す；図４ＡＡ及び４ＢＢは、組成物Ｎで処理された組織試料を示す；図４ＣＣ及び４ＤＤは、組成物Ｏで処理された組織試料を示す；図４ＥＥ及び４ＦＦは、組成物Ｐで処理された組織試料を示す；図４ＧＧ及び４ＨＨは、組成物Ｑで処理された組織試料を示す。
【０１０８】
組成物（組成物Ｂ〜Ｊ）を含有するすべての過酸化水素は、チョコレート色又は褐色／赤色から褐色／橙色へのＤＡＢ染色の色相の変化に対して若干の潜在的影響を有していた。より高濃度の過酸化水素、より高いインキュベーション温度又はより長いインキュベーション時間での曝露は、さらに劇的な変化を生じさせた。過酸化水素の非存在下での約１Ｍのシトレート組成物（ｐＨ＝約１．５）［組成物Ａ］は、ＤＡＢ染色に対して識別可能な影響を有さなかった。塩化ナトリウムの付加は、シトレート−過酸化水素組成物（Ｅ〜Ｇ）のＤＡＢの色相に対する影響を大きく減少させた。約１．０ｗｔ％のＳＤＳを含有する２５ｍＭのグリシン又はシトレート組成物は、組成物Ａ〜Ｄに対する過酸化水素に観察されたものと同様の色相シフトを生じさせた。組成物Ｋ及びＬは、標準及び１倍処理に対して４倍の処理により、ＤＡＢ染色の強度を低下させた。組成物Ｍに明らかな変化は観察されなかった。本発明者らは、ＤＡＢ染色が多重検出アッセイの最後に実施されるのであれば、すべての組成物が使用可能であると考える。
【０１０９】
実施例１２−アルカリホスファターゼ  Ｒｅｄ  ＩＨＣ色素原染色に対する酵素不活性化組成物の影響
扁桃腺組織を、ｂｃｌ２（ＶＭＳＩ，＃２５３−４２９０）について、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＩＩ対比染色ありで、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＡＰ  Ｒｅｄ検出（ＶＭＳＩ  ＃７６０−５０１）により染色した。ＡＰ  Ｒｅｄ染色は過度に飽和しておらず、ＤＡＢの場合と同様わずかな変化も可視化するため、ｂｃｌ２  ＡＰ  Ｒｅｄ  ＩＨＣモデルが用いられた。酵素不活性化組成物［１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）、約１．０ｗｔ％のＨ２Ｏ２、約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３］を、ＩＨＣアッセイにおいて、標準ＡＰ  Ｒｅｄ色素原検出の後、ヘマトキシリン対比染色の前に加えた（ＡＰ多量体インキュベーション−Ｓｔｄ．  ＡＰ  Ｒｅｄ検出-酵素不活性化組成物-Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＩＩ対比染色）。ＡＰ酵素不活性化シーケンスを、１倍及び４倍で、約４１℃で約４分間実施した。４倍までの酵素不活性化処理の前又は後の一次ＡＰ  Ｒｅｄ色素原染色において、識別可能な差異は観察されなかった。観察された変化はいずれもＤＡＢ色素原の場合より小さく、機器及びｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｒｅｄ検出系の上下動の範囲内であろうと思われた。
【０１１０】
実施例１３−組織抗原染色強度（ｂｃｌ２組織抗原−正常扁桃腺）に対する酵素不活性化組成物の影響
様々な自動組織処理の影響を受けることが知られているため、例示的試験ケースとしてｂｃｌ２抗原が選択された。酵素不活性化組成物［１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）、４ＮのＮａＣｌあり又はなし］を、ＩＨＣアッセイにおいて、細胞調整の後、一次（１°）Ａｂインキュベーションの前に加えた（細胞調製−溶出組成物−一次（１°）Ａｂインキュベーション−ＨＲＰ多量体インキュベーション−標準ＤＡＢ検出）。酵素不活性化シーケンスを、１倍及び４倍において約３７℃で約１６分間、過酸化水素の非存在下のＨＲＰ酵素不活性化条件で実施した。１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）ベースのみが、長時間の処理によりｂｃｌ２  ＤＡＢ  ＩＨＣ染色に悪影響を与える可能性があると思われた。１倍及び４倍の処理により、同様のｂｃｌ２  ＩＨＣ染色パターンが得られた。しかしながら、４倍処理された試料のＤＡＢ染色強度は１倍処理された試料より低く、未処理標準と同等であった。ｂｃｌ２  ＤＡＢ  ＩＨＣの強度は、４ＮのＮａＣｌの付加により大きく低下した。インキュベーション時間の約１６分から約４分への短縮が、塩化ナトリウムのタンパク質変性への影響を低下させる可能性があると考えられた。
【０１１１】
酵素不活性化シーケンスを、約３７℃で約４分間、追加的な約１．０ｗｔ％のＨ２Ｏ２＋約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３あり及びなしで、過酸化水素の存在下での阻害条件で、１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）を用いて実施した。１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）ベースは、細胞調整の後、一次（１°）Ａｂインキュベーションの前の４倍での不活性化処理により、ここでもｂｃｌ２  ＤＡＢ  ＩＨＣ強度を低下させることが確認された。約１ｗｔ％のＨ２Ｏ２及び約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３の付加により、シトレートベースの組織染色に対する悪影響が低減した。ＤＡＢ  ＩＨＣ染色に観察されたいずれの変動も、機器及び検出系の上下動の想定内と思われた。ｂｃｌ２抗原の検出シグナル強度の影響は、ＶＭＳＩ  ＰＯ阻害剤、同様の過酸化水素濃度の中性試薬に観察されるもとの同様であった。組成物に対する添加剤として塩化ナトリウムを用いた最初の評価は、付加が、シトレートベースの上記試薬に実質的な悪影響を与えないことを示唆するものである。ＩＨＣ検出は、塩を含まない名目上のシトレートベースより、開示される塩ベースド酵素不活性化組成物を用いる場合にわずかに軽かいだけであった。
【０１１２】
実施例１４−組織抗原検出シグナル強度に対する酵素不活性化組成物の影響（ＣＤ８組織抗原−正常組織）
過酸化水素試薬の影響を受けることが知られているため、例示的試験ケースのためにＣＤ８抗原が選択された。酵素不活性化シーケンスを、約３７℃で約４分間、追加的な約１．０ｗｔ％のＨ２Ｏ２＋約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３あり及びなしで、１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）を用いて実施した（細胞調整−酵素不活性化組成物−一次（１°）Ａｂインキュベーション−ＨＲＰ多量体インキュベーション−標準ＤＡＢ検出）。酵素不活性化シーケンスを、１倍及び４倍において、約３７℃で約４分間、過酸化水素の存在下のＨＲＰ阻害条件で実施した。酵素不活性化組成物は、過酸化水素の有無に関係なく、ＣＤ８抗原の検出シグナル強度に識別可能な影響を有さないと評価された。ＤＡＢ  ＩＨＣの染色パターン及び強度は、未処理標準と同等であると判断された。組成物に対する添加剤として塩化ナトリウムを用いた最初の評価は、その添加によりシトレート−ベースド上記試薬に実質的な悪影響が生じないことを示唆するものである。開示される塩ベースド酵素不活性化組成物によるＣＤ８  ＩＨＣ検出は、塩を含まない名目上のシトレートベースよりわずかに軽いだけであった。ＤＡＢ  ＩＨＣ染色に観察されたいずれの変動も、機器及び検出系の上下動の想定内と考えられた。
【０１１３】
実施例１５−組織抗原検出シグナル強度に対する酵素不活性化組成物の影響（ＨＥＲ２抗原）
ｂｃｌ２のような様々な自動組織処理の影響を受けることが知られているため、例示的試験のためにＨＥＲ２抗原が選択された。酵素不活性化シーケンスを、約３７℃で約４分間、追加的な約１．０ｗｔ％のＨ２Ｏ２＋約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３あり及びなしで、１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）を用いて実施した（細胞調整−溶出試薬−一次（１°）Ａｂインキュベーション−ＨＲＰ多量体インキュベーション−標準ＤＡＢ検出）。酵素不活性化シーケンスを、１倍及び４倍において約３７℃で約４分間（過酸化水素の非存在下のＨＲＰ阻害条件で）実施した。ＨＥＲ２抗原検出シグナル強度に対する酵素不活性化組成物の影響は、スライドが連続する組織切片ではなく個々の細胞を含んでいたため、評価することが困難であった。約１．０ｗｔ％のＨ２Ｏ２＋約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３染色パターンを有する及び有さない１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）ベース組成物のためのＨＥＲ２  ＤＡＢ  ＩＨＣ染色は、未処理標準のスライドと同等であると判断された；しかしながら、すべての処理スライドのＤＡＢ  ＩＨＣ染色強度は、概ね標準スライドと同等又はそれより濃いと判断された。いずれの場合も、酵素不活性化処理は、標準スライドに対するＨＥＲ２診断を変えることはなかった。組成物に対する添加剤として塩化ナトリウムを用いた最初の評価は、シトレートベースの上記試薬に対する実質的な悪影響がないことを示唆した。開示される塩ベースド酵素不活性化組成物によるＩＨＣ検出は、塩を含まない名目上のシトレートベースよりわずかに軽いだけであった。ＤＡＢ  ＩＨＣ染色に観察されたいずれの変動も、機器及び検出系の上下動の想定内と考えられた。
【０１１４】
実施例１６−組織抗原検出シグナル強度：酵素不活性化組成物／方法の影響の比較
実施例１３、１４、及び１５において上述したように、酵素不活性化組成物（試薬のｐＨ、Ｈ２Ｏ２の濃度，塩の濃度など）及び機器適用条件（インキュベーション温度、時間など）は、組織標的の抗原検出シグナル強度に影響を与える可能性がありうる。ｂｃｌ２／扁桃腺のＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ染色（約６４分間ＣＣ１、約３２分間ｂｃｌ２）、ＣＤ８／扁桃腺（約６４分間ＣＣ１、約１６分のＣＤ８）及びＨＥＲ２／ＶＭＳＩ  ＰａｔｈｗａｙＴＭ  ＨＥＲ２  ４−ｉｎ−１試験スライド（約３２分間ＣＣ１、約３２分間ＨＥＲ２）を用いて、表１の酵素不活性化組成物／方法を、抗原検出シグナル強度に対するその影響についてスクリーニングした。酵素不活性化組成物の各々は、ＩＨＣアッセイにおいて、細胞調整の後、一次（１°）Ａｂインキュベーションの前に試験された（細胞調整−溶出試薬-  一次（１°）Ａｂインキュベーション−二次（２°）Ａｂインキュベーション−ＨＲＰ多量体インキュベーション−標準ＤＡＢ検出）。酵素不活性化シーケンスを１倍及び４倍で実施し、それらの潜在的な累積抗原検出シグナル強度の影響を評価した。複製に対して条件毎に一つのスライドを染色し、劇的な変化のチェックの実現可能性の条件を最初に調べた。スライドは３名の病理学者と２名の有資格読者により評価された。スライドは、標準スライドに対する抗原検出シグナル強度についてスコア付けされた。検出された抗原シグナル強度が標準に対して上昇している場合、値Ａ＋１を割り付け、標準と同等の場合は０を、標準より低い場合は−１を割り付けた。評価を合算し、その個別の及び全体としての検出抗原シグナル強度の影響について評価した。結果を表４と、図５、６、及び７に示す。
【０１１５】
2018520647.tif 000008
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【０１１６】
図５Ａ及び図５Ｂは、未処理のＩＨＣ  ＤＡＢ  Ｓｔａｎｄａｒｄで染色された組織−ｂｃｌ２、扁桃腺（６４分間ＣＣ１、３２分間ｂｃｌ２）を示す；５倍の代表画像。（５Ｂの第２の試薬製剤ラウンド標準）；図５Ｃ及び５Ｄは、組成物Ａにより処理された組織試料を示す；図５Ｅ及び５Ｆは、組成物Ｂで処理された組織試料を示す；図５Ｇ及び５Ｈは、組成物Ｃで処理された組織試料を示す；図５Ｉ及び５Ｊは、組成物Ｄで処理された組織試料を示す；図５Ｋ及び５Ｌは、組成物Ｅで処理された組織試料を示す；図５Ｍ及び５Ｎは、組成物Ｆで処理された組織試料を示す；図５Ｏ及び５Ｐは、組成物Ｇで処理された組織試料を示す；図５Ｑ及び５Ｒは、組成物Ｈで処理された組織試料を示す；組成物Ｉについてデータは収集されなかった；図５Ｓ及び５Ｔは、組成物Ｊで処理された組織試料を示す；図５Ｕ及び５Ｖは、組成物Ｋで処理された組織試料を示す；図５Ｗ及び５Ｘは、組成物Ｌで処理された組織試料を示す；図５Ｙ及び５Ｚは、組成物Ｍで処理された組織試料を示す；図５ＡＡ及び５ＢＢは、組成物Ｎで処理された組織試料を示す；図５ＣＣ及び５ＤＤは、組成物Ｏで処理された組織試料を示す；図５ＥＥ及び５ＦＦは、組成物Ｐで処理された組織試料を示す；図５ＧＧ及び５ＨＨは、組成物Ｑで処理された組織試料を示す。
【０１１７】
図６Ａ及び図６Ｂは、未処理のＩＨＣ  ＤＡＢ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｎｏ．１で染色された組織−ＣＤ８、扁桃腺（６４分間ＣＣ１、１６分のＣＤ８）を示す；１０倍の代表画像。（５の第２の試薬製剤ラウンド標準）１０倍の代表画像；図６Ｃ及び６Ｄは、組成物Ａで処理された組織試料を示す；図６Ｅ及び６Ｆは、組成物Ｂで処理された組織試料を示す；図６Ｇ及び６Ｈは、組成物Ｃで処理された組織試料を示す；図６Ｉ及び６Ｊは、組成物Ｄで処理された組織試料を示す；図６Ｋ及び６Ｌは、組成物Ｅで処理された組織試料を示す；図６Ｍ及び６Ｎは、組成物Ｆで処理された組織試料を示す；図６Ｏ及び６Ｐは、組成物Ｇで処理された組織試料を示す；図６Ｑ及び６Ｒは、組成物Ｈで処理された組織試料を示す；組成物Ｉについてデータは収集されなかった；図６Ｓ及び６Ｔは、組成物Ｊで処理された組織試料を示す；図６Ｕ及び６Ｖは、組成物Ｋで処理された組織試料を示す；図６Ｗ及び６Ｘは、組成物Ｌで処理された組織試料を示す；図６Ｙ及び６Ｚは、組成物Ｍで処理された組織試料を示す；図６ＡＡ及び６ＢＢは、組成物Ｎで処理された組織試料を示す；図６ＣＣ及び６ＤＤは、組成物Ｏで処理された組織試料を示す；図６ＥＥ及び６ＦＦは、組成物Ｐで処理された組織試料を示す；図６ＧＧ及び６ＨＨは、組成物Ｑで処理された組織試料を示す。
【０１１８】
図７Ａ及び７Ｂは、ＩＨＣ  ＤＡＢ  Ｓｔａｎｄａｒｄで染色された未処理の組織−ＨＥＲ２（ＶＭＳＩ  ＰａｔｈｗａｙＴＭ  ＨＥＲ２  ４−ｉｎ−１試験スライド）（３２分間ＣＣ１、３２分間ＨＥＲ２）を示す；最高発現細胞の１０倍の標準画像；（７Ｂの第２の試薬製剤ラウンド標準；図７Ｃ及び７Ｄは、組成物Ａで処理された組織試料を示す；図７Ｅ及び７Ｆは、組成物Ｂで処理された組織試料を示す；図７Ｇ及び７Ｈは、組成物Ｃで処理された組織試料を示す；図７Ｉ及び７Ｊは、組成物Ｄで処理された組織試料を示す；図７Ｋ及び７Ｌは、組成物Ｅで処理された組織試料を示す；図７Ｍ及び７Ｎは、組成物Ｆで処理された組織試料を示す；図７Ｏ及び７Ｐは、組成物Ｇで処理された組織試料を示す；図７Ｑ及び７Ｒは、組成物Ｈで処理された組織試料を示す；組成物Ｉについてデータは収集されなかった；図７Ｓ及び７Ｔは、組成物Ｊで処理された組織試料を示す；図７Ｕ及び７Ｖは、組成物Ｋで処理された組織試料を示す；図７Ｗ及び７Ｘは、組成物Ｌで処理された組織試料を示す；図７Ｙ及び７Ｚは、組成物Ｍで処理された組織試料を示す；図７ＡＡ及び７ＢＢは、組成物Ｎで処理された組織試料を示す；図７ＣＣ及び７ＤＤは、組成物Ｏで処理された組織試料を示す；図７ＥＥ及び７ＦＦは、組成物Ｐで処理された組織試料を示す；図７ＧＧ及び７ＨＨは、組成物Ｑで処理された組織試料を示す。
【０１１９】
いずれかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、好ましい酵素不活性化法は、個々のマーカー又はマーカーの群のいずれについても、組織抗原検出シグナル強度に対して最小の影響を有するべきである。上記抗原検出シグナル強度の結果は、すべての酵素不活性化法が、組織抗原検出シグナル強度に対して他よりいくらか明らかな影響を有しうることを示すものである。各酵素不活性化法は、多重検出アッセイに用いられた抗原パネル及び組織モデルの両方に対して今後の検証を必要とする。抗原検出シグナル強度に対する影響は、一次抗体をプールし、いずれかの内因性酵素又は検出化学酵素不活性化に先立ち同時にインキュベートした場合、最小であろう。これは、複数の一次（１°）抗体種又はハプテン標識された一次（１°）抗体を用いる極めて特異的な検出系酵素検出下において可能であろう。
【０１２０】
実施例１７−組織形態の影響の比較
腫瘍のツアー（ＴＯＴ）及び身体のツアー（ＴＯＢ）マイクロアレイスライドを、酵素不活性化あり又はなしで、Ｋｉ６７（ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ、約６４分間ＣＣ１、約１６分間Ｋｉ６７での一次（１°）Ａｂインキュベーション）及びＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＩＩ対比染色で染色した。各条件を、抗原検索の後、一次抗体インキュベーションの前の一回の処理により試験した（細胞調整−溶出試薬−一次（１°）Ａｂインキュベーション−ＨＲＰ多量体インキュベーション−標準ＤＡＢ検出）。いずれの酵素不活性化法についても、未処理標準に対する明らかな組織形態の変化は観察されないと考えられた。
【０１２１】
実施例１８−パドル系対薄膜
開示される酵素不活性化／検出溶出組成物を、「薄膜」形態においても調べた。これら実施例では、約１２０μＬの試薬を、回転混合しながらカバーガラス下で試験ケースと直接接触させた。試薬組成物を、スライドから取り除き、水で、次いで反応バッファーで洗浄した後Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＩＩで対比染色した。有力な組成物候補である１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）、約１．０％のＨ２Ｏ２、約０．０８％のＮａＮ３を、反応バッファー中において約１から約４の比率に希釈し、試験ケースに適用した。別の実施例では、２５０ｍＭのシトレート（ｐＨ＝約２．５）、約１．０％のＨ２Ｏ２、約０．０８％のＮａＮ３が試験ケースに適用された。ｐＨ＝約２．５が、約１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）、約１．０％のＨ２Ｏ２、約０．０８％のＮａＮ３を反応バッファー中において約１から約４の比率に希釈したとき達成された。試薬組成物濃度を上昇させると薄膜ＩＨＣ  ＤＡＢ染色にさらに一貫した結果が得られることが示されたため、約１．０％のＨ２Ｏ２が最初の標的とされた。他の組成物中においては、Ｈ２Ｏ２濃度は約１．０ｗｔ％から約０．２５ｗｔ％に低下しうると考えられる。
【０１２２】
実施例１９−多重検出アッセイにおける酵素不活性化（Ｄｕａｌ  ＨＲＰ媒介組織染色）
ＨＲＰ媒介多重検出アッセイを実施し、開示される酵素不活性化組成物／方法［１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）＋約１．０ｗｔ％のＨ２Ｏ２＋約０．５ＭのＮａＣｌ＋約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３、約３７℃、約４分］を、好ましい酵素不活性化法［Ｖｅｎｔａｎａ  ＤＩＳＣＯ阻害剤（３×約１２分、約３７℃）］と比較した。チラミド色素原検出を、一次（１°）抗体を混合せずに順次実施した。第１の抗体検出シーケンスを、第２の抗体検出シーケンスの前に完了させた（一次（１°）Ａｂインキュベーション１−ＨＲＰ−Ａｂインキュベーション  １−チラミド色素原検出１−酵素不活性化−一次（１°）Ａｂインキュベーション２−ＨＲＰ−Ａｂインキュベーション２−チラミド組織原検出２）。各一次抗体（事前稀釈）を、適切なＶＭＳＩ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＵｌｔｒａＭａｐ抗種抗体−ＨＲＰ  コンジュゲート（ＶＭＳＩ  ＃７６０−４３１３及び７６０−４３１５）を用いて検出した。ＶｅｎｔａｎａウサギＡｎｔｉＣＤ８抗体クローンＳＰ５７（ＶＭＳＩ  ＃７９０−４４６０）がＴＡＭＲＡチラミド検出により検出され、ＶｅｎｔａｎａマウスＡｎｔｉ−ＣＤ１６３抗体クローンＭＲＱ−２６（ＶＭＳＩ  ＃７６０−４４３７）がＲｈｏｄ１１０チラミド検出により検出された。一次抗体のインキュベーションを約３７℃で約３２分間実施し、二次（２°）抗種Ａｂ−ＨＲＰコンジュゲートのインキュベーションを約３７℃で約３２分間実施した。すべてのチラミド検出を、チラミドについて約４０分間、３７℃で、１００μＭのチラミド濃度で実施した。各実験を２回実施した。観察されたいずれのチラミド色素原組織の染色強度差も、機器及びアッセイにありうる上下動に観察されるものの範囲内であった。開示される酵素不活性化組成物／方法は、ＨＲＰ酵素不活性化工程を約６０分から約１２分まで短縮した。これは、有意な時間利得を反映し、より高次の連続多重検出アッセイにおいて組織染色アッセイの時間を短縮する。同様の結果が、同じＨＲＰ酵素阻害アッセイを用いるＨＲＰ媒介ＤＡＢ／チラミド色素原検出アッセイで達成された。
【０１２３】
実施例２０−多重検出アッセイにおける酵素不活性化（Ｄｕａｌ  ＡＰ媒介組織染色）
ＨＲＰ媒介多重検出アッセイを実施し、開示される酵素不活性化組成物／方法［１Ｍのシトレート（ｐＨ＝約１．５）＋約１．０ｗｔ％のＨ２Ｏ２＋約０．５ＭのＮａＣｌ＋約０．０８ｗｔ％のＮａＮ３、約３７℃、約４分］を、ＡＰ多重検出アッセイに利用されてい好ましい酵素不活性化法［反応バッファー中での熱変性、約９０℃、約４分］と比較した。各検出工程間に適切な酵素不活性化を行う連続タンデム型一次（１°）抗体及び色素原検出を用いて、ＣＤ８及びＣＤ１６３についての二重ＡＰ媒介色素原組織染色を扁桃腺組織に実施した（一次（１°）Ａｂインキュベーション１−ＡＰ−Ａｂインキュベーション  １−ＡＰ色素原検出１−酵素不活性化−一次（１°）Ａｂインキュベーション２−ＡＰ−Ａｂインキュベーション２−ＡＰ色素原検出２）。一次（１°）抗体を、ＶＭＳＩ抗体希釈剤（ＶＭＳＩ  ＃２５１−０１８）中において１：１に希釈し、直接的ＡＰ染色強度及び背景の両方を制御した。［Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＵｌｔｒａＭａｐ  Ｂｌｕｅ  Ａｎｔｉ−Ｒｂ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＶＭＳＩ  ＃７６０−１５５）でのＶＭＳＩウサギＡｎｔｉＣＤ８抗体（ＶＭＳＩ  ＃７９０−４４６０、クローンＳＰ５７）；Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＵｌｔｒａＭａｐ  Ｒｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｍｓ検出キット（ＶＭＳＩ  ＃７６０−１５４）でのＶＭＳＩマウスＡｎｔｉＣＤ１６３抗体（ＶＭＳＩ  ＃７６０−４４３７、クローンＭＲＱ−２６）；約３２分間の一次（１°）Ａｂインキュベーション（上述のように１：１に希釈）；約３２分間の二次（２°）Ａｂ−ＡＰコンジュゲートインキュベーション（事前稀釈）；約８分間の全ＡＰ色素原堆積時間］。各組織染色実験を２回行った。
【０１２４】
開示される低ｐＨのシトレート酵素不活性化組成物及び方法が、第１のＡＰ色素原シグナル強度を低下させることなく、ＡＰを完全に変性及び阻害することが示された。反応バッファー中における約９０℃での熱ＡＰ酵素不活性化法は同様の結果をもたらした。観察されたいずれのＡＰ色素原組織の染色強度差も、機器及びアッセイにありうる上下動に観察されうるものの範囲内であった。
【０１２５】
ＣＤ８及びＣＤ１６３抗体染色は、各酵素不活性化組成物又は方法が第２の抗体検出に対して有しうる影響の可能性を示した。ＣＤ１６３がＣＤ８の前に検出されるとき、ＡＰ色素原検出シグナル／背景の比率は、対応する標準から期待されるものを厳密に反映し、色素原強度又は背景のいずれにも殆ど影響を与えなかった。しかしながら、ＣＤ８がＣＤ１６３の前に検出されるとき、反対の結果が観察された。両方の酵素不活性化法において、ＣＤ１６３の背景染色の増加が観察され、反応バッファー中における約９０℃での熱酵素不活性化法は有意に高い背景をもたらし、次いでより低い温度は組成物法を開示した。さらに重要なことに、付加された要素は、ポジティブなＡＰ色素原組織の染色がほぼ完全に失われるまでＣＤ１６３抗原を変性させた。開示される低ｐＨの酵素不活性化組成物及び方法は、熱を使用せずに同様の酵素不活性化時間を可能にしながら、標準レベルに類似のポジティブなＣＤ１６３組織ＡＰ染色をもたらした。
【０１２６】
本明細書において言及された及び／又は出願データシートにおいて列挙されたすべての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許文献は、その全体が参照により本明細書に包含される。実施形態の態様は、さらなる実施態様を提供するために様々な特許、出願及び公開文献の概念を利用することが必要であれば修正することができる。
【０１２７】
特定の実施態様に言及して本発明について記載したが、これら実施態様は単に本発明の原理及び応用を説明するものである。したがって、これら説明的実施態様に多数の修正を行うことができ、且つ特許請求の範囲に規定される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく他の構成が考案されうることを理解されたい。
【図１Ａ】
2018520647.tif 000010
【図１Ｂ】
2018520647.tif 000011
【図１Ｃ】
2018520647.tif 000012
【図１Ｄ】
2018520647.tif 000013
【図１Ｅ】
2018520647.tif 000014
【図１Ｆ】
2018520647.tif 000015
【図１Ｇ】
2018520647.tif 000016
【図１Ｈ】
2018520647.tif 000017
【図１Ｉ】
2018520647.tif 000018
【図１Ｊ】
2018520647.tif 000019
【図１Ｋ】
2018520647.tif 000020
【図１Ｌ】
2018520647.tif 000021
【図１Ｍ】
2018520647.tif 000022
【図１Ｎ】
2018520647.tif 000023
【図１Ｏ】
2018520647.tif 000024
【図１Ｐ】
2018520647.tif 000025
【図１Ｑ】
2018520647.tif 000026
【図１Ｒ】
2018520647.tif 000027
【図１Ｓ】
2018520647.tif 000028
【図１Ｔ】
2018520647.tif 000029
【図１Ｕ】
2018520647.tif 000030
【図１Ｖ】
2018520647.tif 000031
【図１Ｗ】
2018520647.tif 000032
【図１Ｘ】
2018520647.tif 000033
【図１Ｙ】
2018520647.tif 000034
【図１Ｚ】
2018520647.tif 000035
【図１ＡＡ】
2018520647.tif 000036
【図１ＢＢ】
2018520647.tif 000037
【図１ＣＣ】
2018520647.tif 000038
【図１ＤＤ】
2018520647.tif 000039
【図１ＥＥ】
2018520647.tif 000040
【図１ＦＦ】
2018520647.tif 000041
【図１ＧＧ】
2018520647.tif 000042
【図１ＨＨ】
2018520647.tif 000043
【図２Ａ】
2018520647.tif 000044
【図２Ｂ】
2018520647.tif 000045
【図２Ｃ】
2018520647.tif 000046
【図２Ｄ】
2018520647.tif 000047
【図２Ｅ】
2018520647.tif 000048
【図２Ｆ】
2018520647.tif 000049
【図２Ｇ】
2018520647.tif 000050
【図２Ｈ】
2018520647.tif 000051
【図２Ｉ】
2018520647.tif 000052
【図２Ｊ】
2018520647.tif 000053
【図２Ｋ】
2018520647.tif 000054
【図２Ｌ】
2018520647.tif 000055
【図２Ｍ】
2018520647.tif 000056
【図２Ｎ】
2018520647.tif 000057
【図２Ｏ】
2018520647.tif 000058
【図２Ｐ】
2018520647.tif 000059
【図２Ｑ】
2018520647.tif 000060
【図２Ｒ】
2018520647.tif 000061
【図２Ｓ】
2018520647.tif 000062
【図３Ａ】
2018520647.tif 000063
【図３Ｂ】
2018520647.tif 000064
【図３Ｃ】
2018520647.tif 000065
【図３Ｄ】
2018520647.tif 000066
【図３Ｅ】
2018520647.tif 000067
【図３Ｆ】
2018520647.tif 000068
【図３Ｇ】
2018520647.tif 000069
【図３Ｈ】
2018520647.tif 000070
【図３Ｉ】
2018520647.tif 000071
【図３Ｊ】
2018520647.tif 000072
【図３Ｋ】
2018520647.tif 000073
【図３Ｌ】
2018520647.tif 000074
【図３Ｍ】
2018520647.tif 000075
【図３Ｎ】
2018520647.tif 000076
【図３Ｏ】
2018520647.tif 000077
【図３Ｐ】
2018520647.tif 000078
【図３Ｑ】
2018520647.tif 000079
【図３Ｒ】
2018520647.tif 000080
【図３Ｓ】
2018520647.tif 000081
【図３Ｔ】
2018520647.tif 000082
【図３Ｕ】
2018520647.tif 000083
【図３Ｖ】
2018520647.tif 000084
【図４Ａ】
2018520647.tif 000085
【図４Ｂ】
2018520647.tif 000086
【図４Ｃ】
2018520647.tif 000087
【図４Ｄ】
2018520647.tif 000088
【図４Ｅ】
2018520647.tif 000089
【図４Ｆ】
2018520647.tif 000090
【図４Ｇ】
2018520647.tif 000091
【図４Ｈ】
2018520647.tif 000092
【図４Ｉ】
2018520647.tif 000093
【図４Ｊ】
2018520647.tif 000094
【図４Ｋ】
2018520647.tif 000095
【図４Ｌ】
2018520647.tif 000096
【図４Ｍ】
2018520647.tif 000097
【図４Ｎ】
2018520647.tif 000098
【図４Ｏ】
2018520647.tif 000099
【図４Ｐ】
2018520647.tif 000100
【図４Ｑ】
2018520647.tif 000101
【図４Ｒ】
2018520647.tif 000102
【図４Ｓ】
2018520647.tif 000103
【図４Ｔ】
2018520647.tif 000104
【図４Ｕ】
2018520647.tif 000105
【図４Ｖ】
2018520647.tif 000106
【図４Ｗ】
2018520647.tif 000107
【図４Ｘ】
2018520647.tif 000108
【図４Ｙ】
2018520647.tif 000109
【図４Ｚ】
2018520647.tif 000110
【図４ＡＡ】
2018520647.tif 000111
【図４ＢＢ】
2018520647.tif 000112
【図４ＣＣ】
2018520647.tif 000113
【図４ＤＤ】
2018520647.tif 000114
【図４ＥＥ】
2018520647.tif 000115
【図４ＦＦ】
2018520647.tif 000116
【図４ＧＧ】
2018520647.tif 000117
【図４ＨＨ】
2018520647.tif 000118
【図５Ａ】
2018520647.tif 000119
【図５Ｂ】
2018520647.tif 000120
【図５Ｃ】
2018520647.tif 000121
【図５Ｄ】
2018520647.tif 000122
【図５Ｅ】
2018520647.tif 000123
【図５Ｆ】
2018520647.tif 000124
【図５Ｇ】
2018520647.tif 000125
【図５Ｈ】
2018520647.tif 000126
【図５Ｉ】
2018520647.tif 000127
【図５Ｊ】
2018520647.tif 000128
【図５Ｋ】
2018520647.tif 000129
【図５Ｌ】
2018520647.tif 000130
【図５Ｍ】
2018520647.tif 000131
【図５Ｎ】
2018520647.tif 000132
【図５Ｏ】
2018520647.tif 000133
【図５Ｐ】
2018520647.tif 000134
【図５Ｑ】
2018520647.tif 000135
【図５Ｒ】
2018520647.tif 000136
【図５Ｓ】
2018520647.tif 000137
【図５Ｔ】
2018520647.tif 000138
【図５Ｕ】
2018520647.tif 000139
【図５Ｖ】
2018520647.tif 000140
【図５Ｗ】
2018520647.tif 000141
【図５Ｘ】
2018520647.tif 000142
【図５Ｙ】
2018520647.tif 000143
【図５Ｚ】
2018520647.tif 000144
【図５ＡＡ】
2018520647.tif 000145
【図５ＢＢ】
2018520647.tif 000146
【図５ＣＣ】
2018520647.tif 000147
【図５ＤＤ】
2018520647.tif 000148
【図５ＥＥ】
2018520647.tif 000149
【図５ＦＦ】
2018520647.tif 000150
【図５ＧＧ】
2018520647.tif 000151
【図５ＨＨ】
2018520647.tif 000152
【図６Ａ】
2018520647.tif 000153
【図６Ｂ】
2018520647.tif 000154
【図６Ｃ】
2018520647.tif 000155
【図６Ｄ】
2018520647.tif 000156
【図６Ｅ】
2018520647.tif 000157
【図６Ｆ】
2018520647.tif 000158
【図６Ｇ】
2018520647.tif 000159
【図６Ｈ】
2018520647.tif 000160
【図６Ｉ】
2018520647.tif 000161
【図６Ｊ】
2018520647.tif 000162
【図６Ｋ】
2018520647.tif 000163
【図６Ｌ】
2018520647.tif 000164
【図６Ｍ】
2018520647.tif 000165
【図６Ｎ】
2018520647.tif 000166
【図６Ｏ】
2018520647.tif 000167
【図６Ｐ】
2018520647.tif 000168
【図６Ｑ】
2018520647.tif 000169
【図６Ｒ】
2018520647.tif 000170
【図６Ｓ】
2018520647.tif 000171
【図６Ｔ】
2018520647.tif 000172
【図６Ｕ】
2018520647.tif 000173
【図６Ｖ】
2018520647.tif 000174
【図６Ｗ】
2018520647.tif 000175
【図６Ｘ】
2018520647.tif 000176
【図６Ｙ】
2018520647.tif 000177
【図６Ｚ】
2018520647.tif 000178
【図６ＡＡ】
2018520647.tif 000179
【図６ＢＢ】
2018520647.tif 000180
【図６ＣＣ】
2018520647.tif 000181
【図６ＤＤ】
2018520647.tif 000182
【図６ＥＥ】
2018520647.tif 000183
【図６ＦＦ】
2018520647.tif 000184
【図６ＧＧ】
2018520647.tif 000185
【図６ＨＨ】
2018520647.tif 000186
【図７Ａ】
2018520647.tif 000187
【図７Ｂ】
2018520647.tif 000188
【図７Ｃ】
2018520647.tif 000189
【図７Ｄ】
2018520647.tif 000190
【図７Ｅ】
2018520647.tif 000191
【図７Ｆ】
2018520647.tif 000192
【図７Ｇ】
2018520647.tif 000193
【図７Ｈ】
2018520647.tif 000194
【図７Ｉ】
2018520647.tif 000195
【図７Ｊ】
2018520647.tif 000196
【図７Ｋ】
2018520647.tif 000197
【図７Ｌ】
2018520647.tif 000198
【図７Ｍ】
2018520647.tif 000199
【図７Ｎ】
2018520647.tif 000200
【図７Ｏ】
2018520647.tif 000201
【図７Ｐ】
2018520647.tif 000202
【図７Ｑ】
2018520647.tif 000203
【図７Ｒ】
2018520647.tif 000204
【図７Ｓ】
2018520647.tif 000205
【図７Ｔ】
2018520647.tif 000206
【図７Ｕ】
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【図７Ｖ】
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【図７Ｗ】
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【図７Ｘ】
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【図７Ｙ】
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【図７Ｚ】
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【図７ＡＡ】
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【図７ＢＢ】
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【図７ＣＣ】
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【図７ＤＤ】
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【図７ＥＥ】
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【図７ＦＦ】
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【図７ＧＧ】
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【図７ＨＨ】
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【国際調査報告】
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