(57)【要約】本開示の実施形態は、その上で発現されたネイティブでない機能性ポリペプチドを有し、そしてネイティブでない機能性ポリペプチドが機能するために最適化されたリンカードメインによってそれに接続されたアミロイド線維ファイバによって創出された、バイオフィルムのようなアミロイドベースの材料を創出するように細菌を遺伝子改変する方法を対象とする。一態様によると、リンカードメインは、ＣｓｇＡタンパク質を、アミロイドの状態にアセンブルする際に機能するように、および機能性ポリペプチドが機能するように最適化されたものである。例示的なバイオフィルムは、生細菌細胞、非生細菌細胞または生細菌細胞と非生細菌細胞との組合せを含んでよい。ネイティブでない機能性ポリペプチドが付着したバイオフィルムを作製する方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルムを作製する方法であって、
ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする核酸配列を含む細菌細胞を増殖させるステップであって、前記融合物を発現し、前記ネイティブでない機能性ポリペプチドが付着したバイオフィルムを形成する細菌細胞の集団を産生するステップを含み、
前記リンカーが、ＣｓｇＡタンパク質のＣ末端またはＮ末端のいずれかに付着した７つまたはそれ超のアミノ酸を含むポリペプチドである、方法。
【請求項２】
前記核酸配列を前記細菌細胞に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌細胞が非病原性細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌細胞が、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）、ＭＧ１６５５、ＬＳＲ１０またはＰＨＬ６２８である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌細胞が、ＣｓｇＡ遺伝子のゲノム欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌細胞が、前記ＣｓｇＡタンパク質をコードする核酸（単数または複数）が除去されるように遺伝子改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌細胞が、前記ＣｓｇＡタンパク質が除去されるように遺伝子改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細菌細胞が、天然のＣｓｇＡ遺伝子の発現を欠き、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）、ＭＧ１６５５、ＬＳＲ１０またはＰＨＬ６２８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記天然のＣｓｇＡ遺伝子の発現を欠く細菌細胞が、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）、ＭＧ１６５５、ＬＳＲ１０またはＰＨＬ６２８である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌細胞が、前記ＣｓｇＡ遺伝子に関してノックアウトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカーが、７アミノ酸〜２５０アミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンカーが、柔軟なリンカーまたは剛性リンカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記リンカーが、親水性または疎水性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記リンカーが、反復アミノ酸サブユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンカーが、２つまたはそれ超の反復アミノ酸サブユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記リンカーが、３つまたはそれ超の反復アミノ酸サブユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、３、６、または１２である整数である）（配列番号５〜７）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記リンカーが、［Ｐ］ｎ（式中、ｎは、１から３０までの整数である）（配列番号１３）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記リンカーが、［Ｐ］ｎ（式中、ｎは、１２または２４である整数である）（配列番号８〜９）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記リンカーが、［ＥＡＡＡＫ］ｎ（式中、ｎは、１から１５までの整数である）（配列番号１５）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンカーが、［ＥＡＡＡＫ］ｎ（式中、ｎは、３または９である整数である）（配列番号１０〜１１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記リンカーが、グリシン、セリン、アラニンまたはロイシンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）、［Ｐ］ｎ（式中、ｎは、１から３０までの整数である）（配列番号１３）または［ＥＡＡＡＫ］ｎ（式中、ｎは、１から１５までの整数である）（配列番号１５）のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記リンカーが、切断可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記リンカーが、酵素により切断可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ネイティブでない機能性ポリペプチドが、放出可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記リンカーが、
【化３】
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である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ネイティブでない機能性ポリペプチドが、治療用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、組織結合性ポリペプチド、細胞結合性ポリペプチド、抗菌性ポリペプチド、抗がん性ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチド、ポリマー結合性ポリペプチド、代謝産物結合性ポリペプチド、標的化ポリペプチドまたは分子の結合対の第１の対であるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌細胞がＮｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）であり、前記リンカーが［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、３、６、または１２である整数である）（配列番号５〜７）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の天然に存在しない融合物であって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、融合物。
【請求項３３】
ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする核酸配列であって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、核酸配列。
【請求項３４】
ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする核酸配列を含むベクターであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ベクター。
【請求項３５】
ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を含む細菌細胞であって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、細菌細胞。
【請求項３６】
ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする核酸配列を含むベクターを含む細菌細胞であって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、細菌細胞。
【請求項３７】
ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現する細菌細胞であって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、細菌細胞。
【請求項３８】
ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現する細菌細胞を含むバイオフィルムであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含、バイオフィルム。
【請求項３９】
細菌細胞を生物内の組織に送達する方法であって、
前記生物に、組織結合性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現する細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記細菌細胞が、前記組織に前記組織結合性ポリペプチドによって付着し、それにより、前記細菌細胞が前記組織に局在化する、方法。
【請求項４０】
前記細菌細胞が増殖し、前記組織に付着する、細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが形成される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細菌細胞がＮｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記組織結合性ポリペプチドが、ＣＰ１５、Ｐ８、Ａ１、Ｔ１８、ＴＴＦ１、ＴＴＦ２またはＴＴＦ３である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記生物内の組織が、胃腸管上皮組織である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記生物内の組織が、パイエル板である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記生物内の組織が、感染部位である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物内の組織が、上皮の損傷を受けた領域である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物内の組織が、腫瘍組織である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記生物内の組織が、炎症部位である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物内の組織が、結腸癌細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記生物内の組織が、腸粘膜である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記生物内の組織が、Ｍ細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
胃腸管の炎症を有する生物を処置する方法であって、
前記生物に、組織結合性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＮｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞が、胃腸管の組織に前記組織結合性ポリペプチドによって付着し、それにより、前記Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞が前記組織に、炎症を軽減する様式で局在化する、方法。
【請求項５３】
前記Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞が増殖し、前記組織に付着した、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが形成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記組織結合性ポリペプチドが、ＣＰ１５、Ｐ８、Ａ１、Ｔ１８、ＴＴＦ１、ＴＴＦ２またはＴＴＦ３である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記炎症が、炎症性腸疾患に由来する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記炎症が、クローン病または潰瘍性大腸炎に由来する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
胃腸管の炎症を有する生物を処置する方法であって、
前記生物に、抗炎症性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＮｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞が前記胃腸管内で増殖し、前記抗炎症性ポリペプチドを含む、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが、炎症を軽減する様式で形成される、方法。
【請求項５８】
前記抗炎症性ポリペプチドが、ＴＴＦ１、ＴＴＦ２またはＴＴＦ３である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記炎症が、炎症性腸疾患またはクローン病に由来する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗炎症性ポリペプチドが放出される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗炎症性ポリペプチドが、前記リンカーの切断によって放出される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗炎症性ポリペプチドが、酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗炎症性ポリペプチドが、炎症の結果として産生されるプロテアーゼによる前記リンカーの切断によって放出される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗炎症性ポリペプチドが、ＭＭＰプロテアーゼによる前記リンカーの切断によって放出される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
胃腸管のがんを有する生物を処置する方法であって、
前記生物に、抗がんポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＮｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞が胃腸管内で増殖し、抗がんポリペプチドを含む、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが、がんの増殖を低減する様式で形成される、方法。
【請求項６６】
前記抗がんポリペプチドが、成長阻害性の生物学的製剤である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗がんポリペプチドが放出される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗がんポリペプチドが、前記リンカーの切断によって放出される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗がんポリペプチドが、酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗がんポリペプチドが、胃腸管内の酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
胃腸管内に微生物病原体を有する生物を処置する方法であって、
前記生物に、抗微生物性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＮｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞が胃腸管内で増殖し、前記抗微生物性ポリペプチドを含む、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが、前記微生物病原体の増殖を低減する様式で形成される、方法。
【請求項７２】
前記微生物病原体がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗微生物性ポリペプチドが、コプリシン、ツリシンＣＤ、ランチビオティクス（lanibiotic）、ナイシン、アクタガルジン（ａｃｔａｇａｒｄｉｎｅ）、カテリシジンまたはＬＬ−３７である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗微生物性ポリペプチドが放出される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗微生物性ポリペプチドが、前記リンカーの切断によって放出される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗微生物性ポリペプチドが、酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗微生物性ポリペプチドが、胃腸管内の酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗微生物性ポリペプチドが、胃腸管内のプロテアーゼＣＤ２８３０による前記リンカーの切断によって放出される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７９】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗微生物性ポリペプチドが、微生物病原体に曝露すると放出される、請求項７１に記載の方法。
【請求項８０】
診断用ポリペプチドを生物の胃腸管に送達する方法であって、
前記生物に、診断用ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＮｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞が胃腸管内で増殖し、前記診断用ポリペプチドを含む、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが形成される、方法。
【請求項８１】
前記診断用ポリペプチドを検出する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記診断用ポリペプチドが、造影剤または色素をさらに含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記診断用ポリペプチドが放出される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記診断用ポリペプチドが、前記リンカーの切断によって放出される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記診断用ポリペプチドが、酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記診断用ポリペプチドが、胃腸管内の酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
生物の胃腸管内の標的を結合捕捉する方法であって、
前記生物に、捕捉剤ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＮｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞が胃腸管内で増殖し、前記捕捉剤ポリペプチドを含む、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが形成され、
前記捕捉標的が前記捕捉剤ポリペプチドに結合する、方法。
【請求項８８】
結合した捕捉標的を含むバイオフィルムが前記生物から排出される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
結合した捕捉標的を含むバイオフィルムが組織から除去され、前記生物から排出される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
結合した捕捉標的を含むバイオフィルムが天然のプロセスによって組織から除去され、前記生物から排出される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記捕捉剤ポリペプチドが放出される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記捕捉剤ポリペプチドが、前記リンカーの切断によって放出される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記捕捉剤ポリペプチドが、酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９４】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記捕捉剤ポリペプチドが、胃腸管内の酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９５】
機能性薬剤を生物の胃腸管に送達する方法であって、
前記生物に、分子の結合対の第１のメンバーであるポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＮｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップであって、
前記Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞が胃腸管内で増殖し、分子の結合対の第１のメンバーを含む、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが形成される、ステップと、
機能性薬剤が付着した、前記分子の結合対の第２のメンバーを胃腸管に導入するステップと、を含み、
前記分子の結合対の第１のメンバーおよび第２のメンバーが互いと結合し、それにより、前記機能性薬剤が前記バイオフィルムに付着する、方法。
【請求項９６】
ＣｓｇＡタンパク質をコードするネイティブな配列を欠くように遺伝子改変された細菌細胞。
【請求項９７】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項９６に記載の細菌。
【請求項９８】
Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）である、請求項９６に記載の細菌。
【請求項９９】
ＣｓｇＡタンパク質をコードするネイティブな配列を欠くように遺伝子改変されており、ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を含む細菌細胞であって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、細菌細胞。
【請求項１００】
ＣｓｇＡタンパク質をコードするネイティブな配列を欠くように遺伝子改変されており、ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする核酸配列を含むベクターを含む細菌細胞であって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、細菌細胞。
【請求項１０１】
ＣｓｇＡタンパク質をコードするネイティブな配列を欠くように遺伝子改変されており、ネイティブでない機能性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質融合物をコードする外来核酸配列を発現する細菌細胞であって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、細菌細胞。
【請求項１０２】
胃腸管の炎症を有する生物を処置する方法であって、
前記生物に、組織結合性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞が、胃腸管の組織に前記組織結合性ポリペプチドによって付着し、それにより、前記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞が前記組織に、炎症を軽減する様式で局在化する、方法。
【請求項１０３】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞が増殖し、前記組織に付着した、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが形成される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記組織結合性ポリペプチドが、ＣＰ１５、Ｐ８、Ａ１、Ｔ１８、ＴＴＦ１、ＴＴＦ２またはＴＴＦ３である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記炎症が、炎症性腸疾患に由来する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記炎症が、クローン病または潰瘍性大腸炎に由来する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
胃腸管の炎症を有する生物を処置する方法であって、
前記生物に、抗炎症性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞が前記胃腸管内で増殖し、前記抗炎症性ポリペプチドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが、炎症を軽減する様式で形成される、方法。
【請求項１０８】
前記抗炎症性ポリペプチドが、ＴＴＦ１、ＴＴＦ２またはＴＴＦ３である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記炎症が、炎症性腸疾患またはクローン病に由来する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記抗炎症性ポリペプチドが放出される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗炎症性ポリペプチドが、前記リンカーの切断によって放出される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１２】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗炎症性ポリペプチドが、酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１３】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗炎症性ポリペプチドが、炎症の結果として産生されるプロテアーゼによる前記リンカーの切断によって放出される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１４】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗炎症性ポリペプチドが、ＭＭＰプロテアーゼによる前記リンカーの切断によって放出される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１５】
胃腸管のがんを有する生物を処置する方法であって、
前記生物に、抗がんポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞が胃腸管内で増殖し、抗がんポリペプチドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが、がんの増殖を低減する様式で形成される、方法。
【請求項１１６】
前記抗がんポリペプチドが、成長阻害性の生物学的製剤である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記抗がんポリペプチドが放出される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗がんポリペプチドが、前記リンカーの切断によって放出される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１９】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗がんポリペプチドが、酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２０】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗がんポリペプチドが、胃腸管内の酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２１】
胃腸管内に微生物病原体を有する生物を処置する方法であって、
前記生物に、抗微生物性ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞が胃腸管内で増殖し、前記抗微生物性ポリペプチドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが前記微生物病原体の増殖を低減する様式で形成される、方法。
【請求項１２２】
前記微生物病原体がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記抗微生物性ポリペプチドが、コプリシン、ツリシンＣＤ、ランチビオティクス、ナイシン、アクタガルジン、カテリシジンまたはＬＬ−３７である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記抗微生物性ポリペプチドが放出される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗微生物性ポリペプチドが、前記リンカーの切断によって放出される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２６】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗微生物性ポリペプチドが、酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２７】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗微生物性ポリペプチドが、胃腸管内の酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２８】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗微生物性ポリペプチドが、胃腸管内のプロテアーゼＣＤ２８３０による前記リンカーの切断によって放出される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２９】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記抗微生物性ポリペプチドが、微生物病原体に曝露すると放出される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１３０】
診断用ポリペプチドを生物の胃腸管に送達する方法であって、
前記生物に、診断用ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞が胃腸管内で増殖し、前記診断用ポリペプチドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが形成される、方法。
【請求項１３１】
前記診断用ポリペプチドを検出する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記診断用ポリペプチドが、造影剤または色素をさらに含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
前記診断用ポリペプチドが放出される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３４】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記診断用ポリペプチドが、前記リンカーの切断によって放出される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３５】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記診断用ポリペプチドが、酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３６】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記診断用ポリペプチドが、胃腸管内の酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３７】
生物の胃腸管内の標的を結合捕捉する方法であって、
前記生物に、捕捉剤ポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップを含み、
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞が胃腸管内で増殖し、前記捕捉剤ポリペプチドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが形成され、
前記捕捉標的が前記捕捉剤ポリペプチドに結合する、方法。
【請求項１３８】
結合した捕捉標的を含むバイオフィルムが前記生物から排出される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
結合した捕捉標的を含むバイオフィルムが組織から除去され、前記生物から排出される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
結合した捕捉標的を含むバイオフィルムが天然のプロセスによって組織から除去され、そして前記生物から排出される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４１】
前記捕捉剤ポリペプチドが放出される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４２】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記捕捉剤ポリペプチドが、前記リンカーの切断によって放出される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４３】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記捕捉剤ポリペプチドが、酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４４】
前記リンカーが、切断可能なリンカーであり、前記捕捉剤ポリペプチドが、胃腸管内の酵素による前記リンカーの切断によって放出される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４５】
機能性薬剤を生物の胃腸管に送達する方法であって、
前記生物に、分子の結合対の第１のメンバーであるポリペプチドにリンカーによって連結されたＣｓｇＡタンパク質の融合物をコードする外来核酸配列を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞を導入するステップであって、前記リンカーが、［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、２から２０までの整数である）（配列番号１２）を含む、ステップであって、
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞が胃腸管内で増殖し、分子の結合対の第１のメンバーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞の集団を含むバイオフィルムが形成される、ステップと、
機能性薬剤が付着した、前記分子の結合対の第２のメンバーを胃腸管に導入するステップと、を含み、
前記分子の結合対の第１のメンバーと第２のメンバーが互いと結合し、それにより、前記機能性薬剤が前記バイオフィルムに付着する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１５年４月６日に出願された米国仮出願第６２／１４３，５６０号に基づく優先権を主張しており、この仮出願は、すべての目的のためにその全体が本明細書によって本明細書中に援用される。
【０００２】
（政府利益の陳述）
本発明は、米国国立科学財団によって授与されたＤＭＲ−１４１０７５１の下の政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有している。
【０００３】
（分野）
本明細書に記載されている技術は、操作されたポリペプチド、そのようなポリペプチドを含む細菌、操作された細菌、前記細菌細胞を含むバイオフィルム、操作された細菌細胞によって産生される、操作されたポリペプチドを含むバイオフィルム、および、操作された細菌細胞によって産生される、アミロイドに基づく細胞外マトリックス成分に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
天然では、大多数の細菌が、環境の厳しさから防御する、タンパク質、糖、脂質、および細胞外ＤＮＡの、自己生成する保護的なナノスケール足場内に存在するバイオフィルム群集として存在する。バイオフィルム形成は、天然の表面および人間により作製された表面のどちらに関しても細菌の接着および定着に必須である。これらの高度に進化した細胞外マトリックスは、有益なナノバイオテクノロジー操作プラットフォームとしての、まだ利用されていない潜在性を保持する。バイオフィルムは、排水処理および生体変換などの有益な目的に関して調査されているが、これらの試みは、天然に存在する生物の使用に焦点を当てたものである。バイオフィルムの構造を操作する試みが存在する。ＷＯ／２０１２／１６６９０６およびＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３５０９５を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１６６９０６号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本開示の実施形態は、細菌を遺伝子改変して、アミロイドに基づく材料、例えば、ネイティブでない機能性ポリペプチドが発現しており、ネイティブでない機能性ポリペプチドが機能するように最適化されたリンカードメインが接続した、アミロイドファイバにより創出されたバイオフィルムなどを創出する方法を対象とする。一態様によると、リンカードメインは、ＣｓｇＡタンパク質を、アミロイドの状態にアセンブルする際に機能するように、および機能性ポリペプチドが機能するように最適化されたものである。例示的なバイオフィルムは、生存細菌細胞、非生存細菌細胞または生存細菌細胞と非生存細菌細胞との組合せを含み得る。
【０００７】
本明細書に記載される例示的な細菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられる。本明細書に記載される例示的な細菌としては、非病原性細菌が挙げられる。本明細書に記載される例示的な細菌としては、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）、ＭＧ１６５５、Ｋ１２由来株、例えばＬＳＲ１０およびＰＨＬ６２８などが挙げられる。本明細書に記載される例示的な細菌としては、ＣｓｇＡタンパク質をコードする核酸配列（単数または複数）、すなわち、ＣｓｇＡ遺伝子が除去されるように遺伝子改変された細菌が挙げられる。本明細書に記載される例示的な細菌としては、ＣｓｇＡタンパク質をコードする核酸配列（単数または複数）、すなわち、ＣｓｇＡ遺伝子のゲノム欠失を含むように遺伝子改変された細菌が挙げられる。本明細書に記載される例示的な細菌は、同じく本明細書に記載される方法、例えば、本明細書に記載される治療方法なまたは診断方法などにおいて有用である。
【０００８】
一態様によると、機能性ポリペプチドをＣｓｇＡタンパク質にリンカーによって連結してＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造を形成する。一態様によると、ＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造をコードする１つもしくは複数の核酸配列を細菌細胞に含めるか、または、細菌細胞を、ＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造をコードする１つもしくは複数の核酸配列を含むように遺伝子改変する。外来核酸配列であってよい１つまたは複数の核酸配列を、当業者に公知の方法を使用して細菌に挿入し、細菌にＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造を発現させる。一態様によると、天然に存在する細菌を、１つまたは複数の外来核酸配列を含むように改変し、それにより、天然に存在しない細菌を生じさせる。一態様によると、天然に存在しないＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造を分泌およびアセンブルさせて、機能性ポリペプチドを含むアミロイドナノファイバーネットワークを産生させる。例示的な実施形態では、機能性ポリペプチドは、アミロイドナノファイバーネットワークの表面上にあり、機能性ポリペプチドの性質または特性を有するアミロイドナノファイバーネットワークがもたらされる。アミロイド形成をなお可能にしながら、また、機能性ポリペプチドの性質、特性、機能をバイオフィルムに付与しながら、ＣｓｇＡタンパク質に付着させるものとして、種々の長さ、二次構造、性質、特性、機能などの機能性ポリペプチドが構想される。
【０００９】
一態様によると、ＣｓｇＡタンパク質がリンカーおよび機能性ポリペプチドを含み、操作された細菌がＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造をコードする１つまたは複数の核酸配列を含む限りでは、操作されたＣｓｇＡタンパク質と同様に、操作された細菌が提供される。操作された細菌は、上記の天然のＣｓｇＡ遺伝子のゲノム欠失を含んでもよく、含まなくてもよい。この態様によると、操作された細菌および操作されたＣｓｇＡタンパク質はどちらも天然には存在しない。
【００１０】
一態様によると、ＣｓｇＡには、それぞれが機能性ポリペプチドまたは官能基に付着した２つまたはそれ超のリンカーを付着させることができる。一態様によると、アミロイドネットワークは、それぞれがそれ自体のリンカーに付着した２つまたはそれ超のＣｓｇＡ種を含んでよい。この態様によると、ＣｓｇＡタンパク質には、それぞれに機能性ポリペプチドまたは官能基が付着していても付着していなくてもよい２つまたはそれ超または複数のリンカーを付着させて、２つまたはそれ超または複数の機能性ポリペプチドまたは官能基が付着したＣｓｇＡタンパク質をもたらすことができる。各機能性ポリペプチドまたは官能基は同じであっても異なってもよい。例えば、第１のリンカーを介してＣｓｇＡタンパク質に付着した１つの機能性ポリペプチドまたは基は、細胞に特異的な結合性機能性ポリペプチドまたは官能基であってよく、第２のリンカーを介して異なるＣｓｇＡに付着した異なる機能性ポリペプチドまたは官能基は、治療用または診断用の機能性ポリペプチドまたは官能基であってよい。この態様によると、２つのＣｓｇＡバリアントで構成されるアセンブルしたハイブリッドアミロイドファイバは、特定の型の組織または細胞を標的とすることが可能であり、また、その型の組織または細胞に治療剤または診断剤を送達することも可能である。リンカーは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端との間の位置を含む、ＣｓｇＡタンパク質の任意の可能な位置に付着させることができる。さらに、２つまたはそれ超または複数のリンカードメインを、各リンカーに付着した機能性ポリペプチドまたは基に連続して付着させ、それにより、２つまたはそれ超または複数の機能性ポリペプチドまたは基をＣｓｇＡタンパク質にもたらすことができる。
【００１１】
したがって、本明細書に記載の方法は、機能性ポリペプチドを含むｃｕｒｌｉファイバおよびバイオフィルムを創出するために、細菌細胞（単数または複数）を増殖させて外来核酸を発現する細菌細胞の集団を創出することを含む。
【００１２】
本開示による態様は、本明細書に記載の細菌を、治療目的または診断目的で生物に投与することを含む。生物は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物などの哺乳動物を含む。
【００１３】
本発明のある特定の実施形態のさらなる特徴および利点は、以下の実施形態の説明およびその図面において、ならびに特許請求の範囲から、より詳細に明らかになる。
【００１４】
本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（単数または複数）を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供される。本実施形態の前述および他の特徴および利点は、以下の例示的な実施形態の詳細な説明を付属の図面と併せて利用して、より詳細に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、培養スポットが赤く染色されることによって細胞外アミロイドファイバの存在が示される、コンゴーレッドプレートアッセイの結果を示す。データは、ＬＳＲ１０株から得たものである。
【図２】図２は、ＦＬＡＧタグ機能性についての全細胞イムノドットブロット分析の結果を示す。種々のリンカードメインを有するＣｓｇＡ−ＦＬＡＧキメラ上の利用可能なＦＬＡＧエピトープを、蛍光ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０とコンジュゲートした抗ＦＬＡＧ抗体を使用してプローブした。データは、ＬＳＲ１０株から得たものである。
【図３】図３は、機能性ポリペプチド（「材料」）性能に対する最適化されたリンカーの影響を示す、最適化されたリンカーデザインのための戦略を示す概略図である。最適化されていないリンカードメインは、機能的ドメインに対する結合性部位をふさぐこと、いずれかのドメインの適切なフォールディングを妨げること、アミロイドファイバのアセンブルを妨害すること、または分泌を妨害することにより、バイオフィルムに基づく材料の性能を妨害する可能性がある。最適化されたリンカーでは、これらの問題が最小限になり、それにより、材料全体の所望の機能が改善される。
【図４】図４は、種々の長さの柔軟なリンカードメインを有する種々のＣｓｇＡ−ＴＦＦ構築物についてのＣＲ吸光度アッセイによって決定された、トレフォイルファクタータンパク質と融合したｃｕｒｌｉナノファイバーの発現を示すグラフである。データは、ＰＨＬ６２８株から得たものである。
【図５】図５は、特定の腸管組織に結合することが示されている４つの異なるペプチドと融合したＣｓｇＡと比較した、野生型ＣｓｇＡのコンゴーレッド結合アッセイを使用した、腸管結合性の短鎖ペプチドドメインと融合したｃｕｒｌｉナノファイバーの発現を示すグラフである。データは、ＰＨＬ６２８株から得たものである。
【図６】図６は、腸管結合性ドメインを有するＬＳＲ１０細胞のＣａｃｏ−２細胞への接着を示すグラフである。Ｆ４８リンカーを有し、トレフォイルドメインＴＴＦ１、ＴＴＦ２、およびＴＴＦ３、または低分子ペプチドＴ１８、Ａ１、ＣＰ１５およびＰ８を含有する構築物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣａｃｏ−２単層への結合について試験した。結合した細胞を回収し、ＣＦＵ分析によって定量化した。
【図７】図７は、操作されたｃｕｒｌｉファイバを産生するＰＨＬ６２８細胞のＣａｃｏ−２細胞単層への接着を示すグラフである。ｃｕｒｌｉが産生されない場合、接着が有意に減少し、これにより、野生型ｃｕｒｌｉファイバが上皮表面への接着において役割を果たし得ることが示唆される。ＴＴＦ１およびＴＴＦ３により上皮表面への接着が増大する。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｄは、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７のｃｓｇＡ欠失突然変異体の構築を示す図である。図８Ａは、ＮｉｓｓｌｅにおいてｃｓｇＡ遺伝子を欠失させるためのＬａｍｄａ  ｒｅｄ組換え戦略を示す。図８Ｂは、ｃｓｇＡ遺伝子座におけるクロラムフェニコールカセット挿入のＰＣＲによる検証により、２つの陽性クローンが同定される（黒色の矢印）ことを示す。図８Ｃは、これらの２つのクローンを２６５ｂｐ、１５８ｂｐ、および１１１３ｂｐのアンプリコンの存在について検証したことを示す。図８Ｄは、ｃｓｇＡ遺伝子に隣接する領域の配列決定による検証により、上首尾のＣＡＴカセット組み込みが示される（黄色で強調表示されている）（配列番号２）ことを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｄは、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７のｃｓｇＡ欠失突然変異体の構築を示す図である。図８Ａは、ＮｉｓｓｌｅにおいてｃｓｇＡ遺伝子を欠失させるためのＬａｍｄａ  ｒｅｄ組換え戦略を示す。図８Ｂは、ｃｓｇＡ遺伝子座におけるクロラムフェニコールカセット挿入のＰＣＲによる検証により、２つの陽性クローンが同定される（黒色の矢印）ことを示す。図８Ｃは、これらの２つのクローンを２６５ｂｐ、１５８ｂｐ、および１１１３ｂｐのアンプリコンの存在について検証したことを示す。図８Ｄは、ｃｓｇＡ遺伝子に隣接する領域の配列決定による検証により、上首尾のＣＡＴカセット組み込みが示される（黄色で強調表示されている）（配列番号２）ことを示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｄは、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７のｃｓｇＡ欠失突然変異体の構築を示す図である。図８Ａは、ＮｉｓｓｌｅにおいてｃｓｇＡ遺伝子を欠失させるためのＬａｍｄａ  ｒｅｄ組換え戦略を示す。図８Ｂは、ｃｓｇＡ遺伝子座におけるクロラムフェニコールカセット挿入のＰＣＲによる検証により、２つの陽性クローンが同定される（黒色の矢印）ことを示す。図８Ｃは、これらの２つのクローンを２６５ｂｐ、１５８ｂｐ、および１１１３ｂｐのアンプリコンの存在について検証したことを示す。図８Ｄは、ｃｓｇＡ遺伝子に隣接する領域の配列決定による検証により、上首尾のＣＡＴカセット組み込みが示される（黄色で強調表示されている）（配列番号２）ことを示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｄは、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７のｃｓｇＡ欠失突然変異体の構築を示す図である。図８Ａは、ＮｉｓｓｌｅにおいてｃｓｇＡ遺伝子を欠失させるためのＬａｍｄａ  ｒｅｄ組換え戦略を示す。図８Ｂは、ｃｓｇＡ遺伝子座におけるクロラムフェニコールカセット挿入のＰＣＲによる検証により、２つの陽性クローンが同定される（黒色の矢印）ことを示す。図８Ｃは、これらの２つのクローンを２６５ｂｐ、１５８ｂｐ、および１１１３ｂｐのアンプリコンの存在について検証したことを示す。図８Ｄは、ｃｓｇＡ遺伝子に隣接する領域の配列決定による検証により、上首尾のＣＡＴカセット組み込みが示される（黄色で強調表示されている）（配列番号２）ことを示す。
【図９】図９は、腸管結合性ＴＦＦを有するＮｉｓｓｌｅ  ＰＢＰ１７のＣａｃｏ−２細胞への接着を示すグラフである。Ｆ４８リンカーを有し、トレフォイルドメイン（ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３）を含有する構築物をＮｉｓｓｌｅ  ΔｃｓｇＡ突然変異体（ＰＢＰ１７）において発現させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣａｃｏ−２単層への結合について試験した。結合した細胞を回収し、ＣＦＵ分析によって定量化し、データを最初の接種物と比較したパーセント結合として示す。
【図１０】図１０は、合成およびスクリーニングされるＣｓｇＡ−リンカー−ＡＭＰ構築物の図である。Ｓｅｃは、輸送後に切断されるペリプラズム分泌タグである。Ｎ２２は、外膜分泌タグである。ＣｓｇＡは、タンパク質のアミロイド形成領域である。リンカーは、一般的な配列（ＧＧＳ）ｎＸＸＸＸ（式中、ｎ＝３、４、または５であり、ＸＸＸＸ＝ＰＰＰ、ＰＰＩＰ、またはＰＰＶＰである）（配列番号３）を有する。総パネルサイズは９メンバーであり、融合したドメインは２２アミノ酸から２８アミノ酸までにわたる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（詳細な説明）
本開示の態様は、リンカードメインによって相互接続した自己アセンブルドメインと可変性機能性ドメインとを有する構造を対象とする。一態様によると、自己アセンブルドメインは、細菌マトリックスタンパク質である。一態様によると、自己アセンブルドメインは、アミロイド形成タンパク質である。
【００１７】
一態様によると、自己アセンブルドメインは、アミロイド形成タンパク質、ＣｓｇＡである。本明細書で使用される場合、「ＣｓｇＡ」（操作されたＣｓｇＡポリペプチドとは区別される）とは、ｃｕｒｌｉの主要な構造サブユニットを指す。いくつもの種におけるＣｓｇＡおよびそのホモログの配列が公知であり、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣｓｇＡの配列が公知である（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号：９４９０５５；配列番号１（ポリペプチド））。
【化１】
2018517398.tif 000003
【００１８】
一部の実施形態では、「ＣｓｇＡ」とは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣｓｇＡを指す。一部の実施形態では、「ＣｓｇＡ」とは、配列番号１に対して少なくとも８０％の相同性（例えば、８０％またはそれ超の相同性、９０％またはそれ超の相同性、または９５％またはそれ超の相同性）を有するポリペプチド、例えば、ＣｓｇＡの自然に生じた突然変異もしくはバリアント、ＣｓｇＡのホモログ、またはＣｓｇＡの操作された突然変異もしくはバリアントを指す。本明細書で使用される場合、「操作されたＣｓｇＡポリペプチド」とは、ＣｓｇＡに、ＣｓｇＡポリペプチドの配列を中断させることなくＣ末端またはＮ末端またはその両方において付着したリンカーおよび機能性ポリペプチドを含むＣｓｇＡポリペプチドを指す。
【００１９】
一態様によると、本開示による構造は、ＣｓｇＡタンパク質、リンカーおよび機能性ポリペプチドを含む。一態様によると、ＣｓｇＡタンパク質は、リンカーによって機能性ポリペプチドに付着している。一態様によると、機能性ポリペプチドは、異種性のペプチドまたはタンパク質ドメインである。一態様によると、機能性ポリペプチドは、異種性のペプチドまたはタンパク質ドメインを発現させる細菌細胞に対して外来のものである、異種性のペプチドまたはタンパク質ドメインである。一態様によると、ＣｓｇＡタンパク質、リンカーおよび機能性ポリペプチドは、連続して付着しており、例えば、ＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチドの構造を有する。一態様によると、ＣｓｇＡタンパク質および機能性ポリペプチドは、リンカーを通じて一緒に結合しながら、それぞれ機能性を示す。一態様によると、リンカーおよび機能性ポリペプチドの全て合わせた長さは、１０〜５００アミノ酸、１０〜４５０アミノ酸、１０〜４００アミノ酸、１０〜３５０アミノ酸または１０〜３００アミノ酸の範囲内であり得る。
【００２０】
一態様によると、細菌を、ＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造をコードする核酸を含むように改変する。核酸を細菌細胞に導入する方法は、当業者に公知である。改変された細菌は、ＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造を分泌し、その結果、ｃｕｒｌｉファイバ産生、その後、バイオフィルム形成がもたらされる。ＣｓｇＡ、リンカーおよび機能性タンパク質の構造は、操作されたまたは天然に存在しない細菌によって産生され、ＣｓｇＡおよび機能性タンパク質は、適切なフォールディングを示し、機能性を示す。一態様によると、細菌を、細菌から移出され、細胞外アミロイドファイバにアセンブルするＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造を産生するように操作するための方法が提供される。分泌後、ＣｓｇＡは核形成して細胞表面にアミロイドを形成し、次いで、長いファイバに重合し続け、最終的に細胞を封入し、構造支持体を有するバイオフィルムをもたらす。融合物として、各ＣｓｇＡにリンカーおよび機能性ポリペプチドが付着している。構造は分泌され、機能性ポリペプチドが細胞外アミロイドネットワークの表面上にディスプレイされる。ドメインは、それらがバイオフィルム全体の性質を変化させるか、または増強することが可能な機能を有し得るように選択し、リンカーは、ドメインがそれらの特定の機能を有することが可能になるように選択する。
【００２１】
本開示の範囲内に入る機能性ポリペプチドは、所望の機能を有するペプチドまたはタンパク質を含む。そのような機能としては、触媒機能、認識機能または構造的機能が挙げられる。例示的な機能性ポリペプチドとして、ターゲティングドメインが挙げられる。例示的な機能性ポリペプチドとして、治療用ポリペプチドが挙げられる。例示的な機能性ポリペプチドとして、診断用ポリペプチドが挙げられる。例示的な機能性ポリペプチドとして、抗がん性ポリペプチドが挙げられる。例示的な機能性ポリペプチドとして、抗菌性ポリペプチドが挙げられる。例示的な機能性ポリペプチドとして、抗炎症性ポリペプチドが挙げられる。例示的な機能性ポリペプチドとして、ポリマー結合性ポリペプチドが挙げられる。例示的な機能性ポリペプチドとして、代謝産物結合性ポリペプチドが挙げられる。例示的な機能性ポリペプチドとして、標的化ポリペプチドが挙げられる。例示的な機能性ポリペプチドとして、組織または細胞または基質に結合する機能性ポリペプチドが挙げられる。例えば、公知のスチール結合能を有するドメインをＣｓｇＡに付け加えることにより、スチール表面に接着する能力を有するバイオフィルムが産生されるが、野生型バイオフィルムはこの能力を有さない。例示的な機能性ポリペプチドとして、公知の結合対の第１のメンバーが挙げられる。発現すると、結合対の第１のメンバーは、例えば治療目的または診断目的で機能性ポリペプチドを付着させたものであり得る結合対の第２のメンバーとの結合に利用可能である。このように、例えば機能性ポリペプチドの特性を有するバイオフィルムをもたらすために、結合対の第２のメンバーに伴う機能性ポリペプチドをバイオフィルムと接触させて機能性ポリペプチドをバイオフィルムに付加することができる。例示的な機能性ポリペプチドは、官能基を直接またはリンカーを通じて共有結合により付着させることができるポリペプチドである。例えば、ＣｓｇＡに、自発的な共有結合性の修飾を受けることが可能なペプチドを付け加えることによって、その後目的のタンパク質または目的の化合物を付加することにより表面を任意の目的のタンパク質または目的の化合物で修飾することが可能なバイオフィルムを創出することができる。
【００２２】
例示的な治療用ポリペプチドとして、治療的機能を有する操作されたポリペプチド、抗炎症生理活性を有するポリペプチド（トレフォイルファクター−例えば、ＴＦＦ１−３、インターロイキン−例えば、ＩＬ−１０、他の抗炎症性サイトカイン、抗ＴＮＦα因子）、抗微生物生理活性を有するポリペプチド（例えば、コプリシン（ｃｏｐｒｉｓｉｎ）、カテリシジン、ＬＬ−３７、ツリシン（ｔｈｕｒｉｃｉｎ）ＣＤ、ランチビオティクス）、抗がん生理活性を有するポリペプチド（成長を阻害する生物学的製剤）が挙げられる。
【００２３】
例示的な診断用ポリペプチドとしては、当業者に公知であり、文献検索により同定されるポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
例示的な抗がん性ポリペプチドとしては、抗がん生理活性を有するポリペプチド（成長を阻害する生物学的製剤）が挙げられ、また、抗がん性ポリペプチドとしては、当業者に公知であり、文献検索により同定されるポリペプチドが挙げられる。
【００２５】
例示的な抗菌性ポリペプチドとしては、コプリシン、カテリシジン、ＬＬ−３７、ツリシンＣＤ、ランチビオティクス、および当業者に公知であり、文献検索により同定される抗菌性ポリペプチドが挙げられる。
【００２６】
例示的な抗炎症性ポリペプチドとしては、トレフォイルファクター−例えば、ＴＦＦ１−３、インターロイキン−例えば、ＩＬ−１０、他の抗炎症性サイトカイン、抗ＴＮＦα因子、および当業者に公知であり、文献検索により同定される抗炎症性ポリペプチドが挙げられる。
【００２７】
例示的なポリマー結合性ポリペプチドとしては、当業者に公知であり、文献検索により同定されるポリペプチドが挙げられる。
【００２８】
例示的な代謝産物結合性ポリペプチドとしては、当業者に公知であり、文献検索により同定されるポリペプチドが挙げられる。
【００２９】
例示的な標的化ポリペプチドとしては、当業者に公知であり、文献検索により同定されるポリペプチドが挙げられる。
【００３０】
例示的な組織結合性ポリペプチドとしては、Ｔ１８、ＣＰ１５、および当業者に公知であり、文献検索により同定されるポリペプチドが挙げられる。
【００３１】
例示的な細胞結合性ポリペプチドとしては、Ｔ１８、ＣＰ１５、および当業者に公知であり、文献検索により同定されるポリペプチドが挙げられる。
【００３２】
分子の結合対の第１の対である例示的なポリペプチドとしては、ＳｙｎＺｉｐｓ、Ｔｒｐ−Ｚｉｐドメインなどのコイルドコイルドメイン、ＦＬＡＧなどのアフィニティータグなど、および当業者に公知であり、文献検索により同定されるポリペプチドが挙げられる。
【００３３】
本開示の範囲内に入るリンカーは、アミノ酸含有量、長さ、剛性および二次構造に関して特徴付けられる。本開示の範囲内に入るリンカーは、アミロイドドメインと機能性ポリペプチドドメインとを分離し、各ドメインの適切なフォールディングおよび機能を可能にするものである。このように、リンカーは、特定のアミロイドドメインおよび特定の機能性ポリペプチドドメインに対して調整することができる。一態様によると、細菌細胞の移出およびアセンブルプロセスの間のドメイン間の立体的な干渉を制限するために、構造ドメイン（すなわち、ＣｓｇＡ）および融合（異種性）ドメインの機能的独立を適切なリンカーによって最大化する。一態様によると、型（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４）のより長くより柔軟なリンカーが例示的なものである。追加的な態様によると、融合物タンパク質の全体の長さを制限することによって細胞ストレスを最小化にする。より長いリンカー配列およびより高い誘導レベルにより、細胞の生合成機構にストレスがかかり、それにより、細胞増殖が阻害され、極度の場合には細胞溶解に至る。
【００３４】
本開示の範囲内に入るリンカーは、ＣｓｇＡドメインおよび機能性ペプチドドメインの機能を容易にするものである。本開示の範囲内に入るリンカーは、効率的なタンパク質プロセシングを可能にし、細菌のｃｕｒｌｉ分泌機構を通じて移出し、ならびに、アミロイドおよび機能的ドメインの適切な空間的および物理化学的分離をもたらして、それらのそれぞれの機能を保持させるものである。
【００３５】
本開示の範囲内に入るリンカーは、アミノ酸残基を含む。アミノ酸残基は、任意の天然に存在するアミノ酸残基であってよい。アミノ酸残基は、当業者に公知の合成アミノ酸であってもよい。リンカーに使用することができる代表的なアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、システイン、セレノシステイン、トレオニン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。
【００３６】
本開示の範囲内であるリンカーは、切断部位を含む。切断部位および切断用の酵素は、当業者に公知である。この実施形態によると、例えば治療目的または診断目的で、機能性ポリペプチドをリンカーから切断し、周囲の環境に放出させることができる。例示的な酵素としては、独自の認識配列を有するマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のファミリーに由来する酵素、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のＣＤ２８３０などの、病原体から分泌されるプロテアーゼなどが挙げられる。
【００３７】
本開示の範囲内に入るＣｓｇＡは、アミロイド構造に自己アセンブルするアミロイドドメインを含む。ある特定の態様によると、リンカーをＣ末端またはＮ末端のいずれかに付着させることもでき、別々のリンカーをＣ末端およびＮ末端の両方に付着させることもできる。
【００３８】
一態様によると、リンカーの長さは、ＣｓｇＡタンパク質と機能性ポリペプチドとを連結した場合に細菌細胞などの細胞から発現させることができる任意の長さであってよい。一態様によると、機能性ポリペプチドの長さは、リンカーによってＣｓｇＡタンパク質と連結した場合に、細菌細胞などの細胞から発現させることができる任意の長さであってよい。一態様によると、リンカーと機能性ポリペプチドとの組合せは、５００以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーと機能性ポリペプチドとの組合せは、４００以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーと機能性ポリペプチドとの組合せは、３００以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーと機能性ポリペプチドとの組合せは、２００以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーと機能性ポリペプチドとの組合せは、１００以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーと機能性ポリペプチドとの組合せは、５０以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーと機能性ポリペプチドとの組合せは、４０以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーと機能性ポリペプチドとの組合せは、３０以下のアミノ酸を含む。
【００３９】
一態様によると、リンカー配列は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、２４、４８またはそれ超のアミノ酸のポリペプチド配列である。一部の実施形態では、リンカー配列は、約７アミノ酸〜約２５０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約７アミノ酸〜約２００アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約７アミノ酸〜約１５０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約７アミノ酸〜約１００アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約１２アミノ酸〜約２５０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約１２アミノ酸〜約２００アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約１２アミノ酸〜約１５０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約１２アミノ酸〜約１００アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約２４アミノ酸〜約１００アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約４８アミノ酸〜約２５０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約４８アミノ酸〜約２００アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約４８アミノ酸〜約１５０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約４８アミノ酸〜約１００アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約７アミノ酸〜約３０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約２０アミノ酸〜約５０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約６アミノ酸〜約２０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、約７〜約１０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、柔軟なポリペプチド、例えば、剛性の二次構造および／または三次構造を有さないポリペプチドを含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、グリシン残基およびセリン残基を含む。一部の実施形態では、リンカー配列に含まれるアミノ酸の少なくとも５０％がグリシン残基またはセリン残基であり、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ超がグリシン残基またはセリン残基である。一部の実施形態では、リンカー配列は、グリシン残基およびセリン残基からなる。
【００４０】
機能性ポリペプチドとしては、バイオフィルム中に存在すると、バイオフィルムに、ポリペプチドの活性の非存在下では有さない性質、機能、または活性が付与されるような活性または機能を有するポリペプチドが挙げられる。したがって、活性ポリペプチドは、例えば、別の分子、結合性ドメイン、別の分子（例えば、リガンドまたはエピトープ）が結合したペプチドなどに結合する酵素、ポリペプチドであり得る。活性ポリペプチドとして使用するためのポリペプチドの例としては、これらだけに限定されないが、金属結合性ドメイン（ＭＢＤ）；ＳｐｙＴａｇ；グラフェン結合性（ＧＢＰ）；炭素ナノチューブ結合性（ＣＢＰ）；金結合性（Ａ３）；ＣＴ４３；ＦＬＡＧ；Ｚ８；Ｅ１４；ＱＢＰ１；ＣＬＰ１２；およびＡＦＰ８が挙げられる。
【００４１】
ある特定の態様によると、操作されたＣｓｇＡポリペプチドの一部として存在する場合の機能性ポリペプチドは、機能性である。ポリペプチドが、単離されたポリペプチドとして有する活性（例えば、酵素活性または結合活性）の少なくとも約５０％を保持すれば、そのポリペプチドは「機能性」であると言えるまたは「機能性」ポリペプチドと表される。当業者は、例えば質量分析（例えば、とりわけ、ＭＡＤＬＩ／ＴＯＦ、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＭＳなどを含むＭＳ）を使用して反応産物の増大を検出することおよび／もしくは反応基質の減少を検出すること、または、例えばイムノアッセイによって結合パートナーとの結合の増大または減少を検出することが容易にできる。一部の実施形態では、機能活性ポリペプチドは、単離されたポリペプチドの活性の少なくとも５０％、例えば、活性の５０％もしくはそれ超、活性の６０％もしくはそれ超、活性の７５％もしくはそれ超、また単離されたポリペプチドの活性の９０％もしくはそれ超を保持し得る。
【００４２】
一部の実施形態では、機能性ポリペプチドは、コンジュゲーションドメインであってよい。そのような実施形態では、例えば、標的タンパク質が、ＣｓｇＡとの融合物として発現させるには大きすぎる場合に、標的タンパク質をバイオフィルム中に固定化することが可能になり得る。操作されたＣｓｇＡポリペプチド上に存在するコンジュゲーションドメインは、標的タンパク質の一部としてパートナーコンジュゲーションドメインに特異的に結合することができ、それにより、標的タンパク質がバイオフィルム中に組み入れられる。そのようなコンジュゲーションドメインは、本明細書では、分子の結合対の第１のメンバーおよび分子の結合対の対の第２のメンバーとも称される。本明細書で使用される場合、「コンジュゲーションドメイン」は、例えば、バイオフィルムの成長に適した条件下でパートナーコンジュゲーションドメインに特異的に結合し得る、および／またはパートナーコンジュゲーションドメインが特異的に結合し得るポリペプチドを包含する。コンジュゲーションドメインは、例えば、約１００アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約７５アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約５０アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約４０アミノ酸もしくはそれ未満、またはより小さなサイズであり得る。パートナーコンジュゲーションドメインは、コンジュゲーションドメインとほぼ同じまたはより大きなサイズであり得、例えば、パートナーコンジュゲーションドメインは、約４０００アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約３０００アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約２０００アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約１０００アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約５００アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約２００アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約１００アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約７５アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約５０アミノ酸もしくはそれ未満のサイズ、約４０アミノ酸もしくはそれ未満、またはより小さなサイズであり得る。一部の実施形態では、コンジュゲーションドメインとパートナーコンジュゲーションドメインとの結合は共有結合である。コンジュゲーションドメインの例は、当技術分野で公知であり、それらとして、これらだけに限定されないが、ＳｐｙＴａｇ；ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）；ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）；およびＬＰＸＴＧ（配列番号３０）モチーフを含むペプチドが挙げられる。同様に、パートナーコンジュゲーションドメインは、当技術分野で公知であり、それらとして、これらだけに限定されないが、それぞれ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ストレプトアビジン；ストレプトアビジン；およびアミノグリシンを含むペプチドが挙げられる。コンジュゲーションドメインとパートナーコンジュゲーションドメインとを含むコンジュゲーション系のさらなる考察は、例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるMaoら、J  Am  Chem  Soc、２００４年、１２６巻：２６７０〜１頁；Zakeriら、PNAS、２０１２年、１０９巻：Ｅ６９０〜Ｅ６９７頁；およびMaedaら、Appl  Environ  Microbil、２００８年、７４巻：５１３９〜５１４５頁に見いだされる。
【００４３】
機能性ポリペプチドがコンジュゲーションドメインである場合、パートナーコンジュゲーションドメインを含む標的ポリペプチドは、機能性薬剤をさらに含んでよい。機能性薬剤は、バイオフィルム中に存在すると、バイオフィルムに、ポリペプチドの非存在下では有さない性質、機能、または活性が付与されるような活性または機能を有する。機能性薬剤は、任意のサイズのものであってよく、操作されたＣｓｇＡポリペプチドの一部ではない。例示的な機能性薬剤としては、例えば、酵素、別の分子、抗体、治療剤、診断剤、金属、抗菌剤、抗炎症剤、抗がん剤などに結合するポリペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、機能化ポリペプチドおよびコンジュゲーションドメインを含むポリペプチドは、細胞外局在化タグ、例えば、ポリペプチドを発現する細胞にポリペプチドを分泌させる配列をさらに含んでよい。
【００４４】
機能化した操作されたＣｓｇＡポリペプチドまたは機能化したバイオフィルムは、コンジュゲーションドメインを含む操作されたＣｓｇＡポリペプチド（またはそのポリペプチドを含む細胞および／もしくはバイオフィルム）を、パートナーコンジュゲーションドメインを含むポリペプチドと接触させることによってもたらすことができる。一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドとパートナーコンジュゲーションドメインを含むポリペプチドとを、ある期間にわたって接触させて維持する、すなわち、「結合ステップ」。一部の実施形態では、結合ステップの後に、例えば過剰な結合していないポリペプチドを除去するために、洗浄ステップを続ける。
【００４５】
一部の実施形態では、コンジュゲーションドメインを含む操作されたＣｓｇＡポリペプチドは、アルブミンの存在下でパートナーコンジュゲーションドメインと結合している（または結合する）（すなわち、「結合ステップ」）。一部の実施形態では、アルブミンはＢＳＡである。一部の実施形態では、アルブミンは、約０．１％〜約１０％で存在する。一部の実施形態では、アルブミンは、約０．５％〜約５％で存在する。一部の実施形態では、アルブミンは、約１％〜約２％で存在する。一部の実施形態では、結合ステップは、少なくとも約２時間、例えば、約２時間もしくはそれ超、約６時間もしくはそれ超、約１２時間もしくはそれ超、または約２４時間もしくはそれ超にわたって進行させる。一部の実施形態では、結合ステップは、アルブミンの存在下で進行させる。
【００４６】
一部の実施形態では、洗浄ステップは、約１０分〜約６時間にわたって進行する。一部の実施形態では、洗浄ステップは、約３０分〜約３時間にわたって進行する。一部の実施形態では、洗浄ステップは、約９０分にわたって進行する。一部の実施形態では、洗浄ステップの間、ポリペプチドをかきまぜる（例えば、振とうする）。一部の実施形態では、洗浄ステップは、ポリペプチドをアルブミンの溶液中で洗浄することを含む。一部の実施形態では、アルブミンはＢＳＡである。一部の実施形態では、アルブミンは、約０．０１％〜約３％で存在する。一部の実施形態では、アルブミンは、約０．１％〜約１％で存在する。一部の実施形態では、アルブミンは、約０．３％で存在する。一部の実施形態では、洗浄ステップは、２回またはそれ超の連続的な洗浄を含む。一部の実施形態では、洗浄ステップは、３回の連続的な洗浄を含む。
【００４７】
「特異的な結合」は、２つの分子、化合物、細胞および／または粒子の間の化学的相互作用を含み、ここで、第１の実体は、第２の標的実体に、標的でない第３の実体に結合するよりも高い特異性および親和性で結合する。一部の実施形態では、特異的な結合とは、第１の実体の第２の標的実体に対する親和性が、第３の標的外実体に対する親和性の少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍またはそれ超であることを指し得る。所与の標的に特異的な試薬とは、利用するアッセイの条件下でその標的に対する特異的な結合を示す試薬である。
【００４８】
一態様では、本明細書に記載の操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸配列が本明細書に記載される。一態様では、本明細書に記載の操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターが本明細書に記載される。「ベクター」は、宿主細胞への送達または異なる宿主細胞間の移行のためにデザインされた核酸構築物を含む。ベクターは、ウイルスベクターであっても非ウイルスベクターであってもよい。遺伝子を標的細胞に移行させるために有用な多くのベクターが利用可能であり、例えば、ベクターは、エピソームベクター、例えば、プラスミド、ウイルスに由来するベクターであってもよく、相同組換えまたはランダムな組み込みによって標的細胞ゲノムに組み込むこともできる。一部の実施形態では、ベクターは発現ベクターであってよい。「発現ベクター」は、細胞に異種核酸断片を組み入れ、それを発現させる能力を有するベクターであってよい。発現ベクターは、追加的なエレメントを含んでよく、例えば、発現ベクターは、複製系を２つ有してよく、したがって、発現ベクターを２つの生物において維持することが可能になる。ベクターに組み入れられる核酸は、発現制御配列によりそのポリヌクレオチド配列の転写および翻訳が制御および調節される場合、発現制御配列に作動可能に連結していてよい。
【００４９】
一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸は、プラスミドの一部内に存在し得る。プラスミドベクターとしては、これらだけに限定されないが、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ  ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  ＋／−またはＫＳ  ＋／−（参照により本明細書に組み込まれる「Stratagene  Cloning  Systems」、Catalog（１９９３年）、Stratagene、La  Jolla、Califを参照されたい）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴシリーズ（その全体が参照により本明細書に組み込まれるStudierら、「Use  of  T7  RNA  Polymerase  to  Direct  Expression  of  Cloned  Genes」、Gene  Expression  Technology、１８５巻（１９９０年）を参照されたい）を挙げることができる。
【００５０】
「ウイルスベクター」は、ウイルス起源のエレメントを少なくとも１つ含み、ウイルスベクター粒子内にパッケージングすることが可能な核酸ベクター構築物であり得る。ウイルスベクターは、必須ではないウイルス遺伝子の代わりにトランスジェニック遺伝子を含有し得る。ベクターおよび／または粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおいて任意の核酸を細胞内に移行させるために利用することができる。例えば、ラムダベクター系ｇｔ１１、ｇｔ  ＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ  ４など、多数のウイルスベクターが当技術分野で公知であり、細胞内への核酸の担体として使用することができる。
【００５１】
一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸を構成的に発現させることができる。一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸を構成的プロモーターに作動可能に連結することができる。一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸を誘導的に発現させることができる。一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸を誘導性プロモーターに作動可能に連結することができる。一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸をネイティブなＣｓｇＡプロモーターに作動可能に連結することができる。
【００５２】
「誘導性プロモーター」は、誘導因子または誘導剤の存在下、それによる影響下、またはそれとの接触下にある場合に、誘導因子または誘導剤の存在下、それによる影響下、またはそれとの接触下にない場合と比較して、転写活性を開始または増強することを特徴とするプロモーターであり得る。「誘導因子」または「誘導剤」は、誘導性プロモーターからの転写活性の誘導において活性になるように投与される、内在性、または通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。一部の実施形態では、誘導因子または誘導剤、例えば、化学薬品、化合物またはタンパク質は、それ自体が誘導性プロモーターの制御下にある、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得る（例えば、誘導因子は、転写抑制因子タンパク質であり得る）。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、これらだけに限定されないが、ｌａｃオペロンプロモーター、窒素感受性プロモーター、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、塩誘導性プロモーター、およびテトラサイクリン、ステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられる。原核生物の系において使用するための誘導性プロモーターは、当技術分野で周知であり、例えば、ベータ．−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Changら、Nature、２７５巻：６１５頁（１９７８年）、参照により本明細書に組み込まれる）；Goeddelら、Nature、２８１巻：５４４頁（１９７９年）、参照により本明細書に組み込まれる）、ａｒａＢＡＤプロモーターを含むアラビノースプロモーター系（Guzmanら、J  .  Bacteriol.、１７４巻：７７１６〜７７２８頁（１９９２年）、参照により本明細書に組み込まれる；Guzmanら、J.  Bacteriol.、１７７巻：４１２１〜４１３０頁（１９９５年）、参照により本明細書に組み込まれる；SiegeleおよびHu、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９４巻：８１６８〜８１７２頁（１９９７年）、参照により本明細書に組み込まれる）、ラムノースプロモーター（Haldimannら、J.  Bacteriol.、１８０巻：１２７７〜１２８６頁（１９９８年）、参照により本明細書に組み込まれる）、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel、Nucleic  Acids  Res.、８巻：４０５７頁（１９８０年）、参照により本明細書に組み込まれる）、ＰＬｔｅｔＯ−１プロモーターおよびＰｌａｃ／ａｒｅ−１プロモーター（LutzおよびBujard、Nucleic  Acids  Res.、２５巻：１２０３〜１２１０頁（１９９７年）、参照により本明細書に組み込まれる）、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター（deBoerら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８０巻：２１〜２５頁（１９８３年）、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００５３】
本明細書に開示されている方法および系において有用な誘導性プロモーターは、ｐＨ、温度、放射線、浸透圧、生理食塩水勾配、細胞表面結合、および１つまたは複数の外因性または内因性の誘導剤の濃度の変化などの１つまたは複数の生理的条件によって誘導され得る。外因性誘導因子または誘導剤は、アミノ酸およびアミノ酸類似体、糖類および多糖、核酸、タンパク質転写活性化因子および抑制因子、サイトカイン、毒素、石油に基づく化合物、金属を含有する化合物、塩、イオン、酵素基質類似体、ホルモン、ならびにこれらの組合せを含み得る。特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、化学薬品の濃度、金属、温度、放射線、栄養素の変化またはｐＨの変化などの環境条件の変化に応答して活性化または抑制される。したがって、本明細書に開示されている方法および系において有用な誘導性プロモーターは、ファージ誘導性プロモーター、栄養素誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター、放射線誘導性プロモーター、金属誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、ならびに／またはこれらのハイブリッドおよび組合せであり得る。適切な環境誘導因子としては、これらだけに限定されないが、熱（すなわち、熱的パルスまたは一定の熱への曝露）、種々のステロイド化合物、二価カチオン（Ｃｕ２＋およびＺｎ２＋を含む）、ガラクトース、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄチオガラクトシド）、ならびに他の天然に存在するおよび合成の誘導剤および無償の誘導因子への曝露を挙げることができる。
【００５４】
本明細書に開示されている方法および系において有用な誘導性プロモーターは、環境、外部の薬剤、または別の遺伝子の産物の作用によって不活化を受ける「転写抑制因子」によって抑制されるプロモーターも包む。そのような誘導性プロモーターは、「抑制可能なプロモーター」と称することもでき、本明細書に記載の生物学的スイッチコンバーターの所与のモジュールまたは成分内の他の型のプロモーター間で区別することが必要である。本発明において使用するための好ましい抑制因子は、生理的に良性の薬剤による不活化に対して感受性である。したがって、ｌａｃＯオペレーター配列を含有するように操作されたプロモーター配列の発現を制御するためにｌａｃ抑制因子タンパク質を使用する場合、ＩＰＴＧを用いて宿主細胞を処理することにより、ｌａｃＯオペレーター配列を含有する操作されたプロモーターからのｌａｃ抑制因子の解離が引き起こされ、転写が開始される。同様に、ｔｅｔＯオペレーター配列を含有するように操作されたプロモーター配列の発現を制御するためにｔｅｔ抑制因子を使用する場合、テトラサイクリンを用いて宿主細胞を処理することにより、操作されたプロモーターからのｔｅｔ抑制因子の解離が引き起こされ、操作されたプロモーターの下流の配列の転写が開始される。
【００５５】
一態様では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドを含む、および／またはそのようなポリペプチドをコードするベクターまたは核酸を含む操作された微生物細胞が本明細書に記載される。
【００５６】
一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドは、コンジュゲーションドメインを含む機能性ポリペプチドを含んでよい。一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする、および／またはそれを含む細胞は、パートナーコンジュゲーションドメインおよび機能化ポリペプチドを含む第２の操作されたポリペプチドをさらにコードし得る、および／または含み得るコンジュゲーションドメインを含む活性ポリペプチドを含んでよい。一部の実施形態では、コンジュゲーションドメインを含む活性ポリペプチドを含む操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする、および／またはそれを含む第１の細胞型、ならびにパートナーコンジュゲーションドメインおよび機能化ポリペプチドを含む第２の操作されたポリペプチドをコードする、および／またはそれを含む第２の細胞型の２つの細胞型を含む細胞の集団が本明細書に記載される。すなわち、本明細書では、単一の細胞が、コンジュゲーションドメインを有するＣｓｇＡポリペプチドを含み、かつ、そのＣｓｇＡポリペプチドに結合する、および／またはそのＣｓｇＡポリペプチドが結合するポリペプチドも含んでよいこと、または、第１の細胞がコンジュゲーションドメインを有するＣｓｇＡポリペプチドを含み、第２の細胞がそのＣｓｇＡポリペプチドに結合する、および／またはそのＣｓｇＡポリペプチドが結合するポリペプチドを含んでよいことが企図されている。さらに、コンジュゲーションドメインを有する操作されたＣｓｇＡポリペプチドを、パートナーコンジュゲーションドメインおよび機能化ポリペプチドを含む第２のポリペプチドと接触させることができることが企図されており、例えば、ＣｓｇＡポリペプチドが細胞表面上に存在する、および／またはバイオフィルム中に存在する場合、例えば、第２のポリペプチドを産生（例えば、細菌または真核細胞によって）および／または合成（および場合によって単離または精製）し、次いで、操作されたＣｓｇＡポリペプチドと接触させる。
【００５７】
本明細書に記載の方法および組成物の細菌細胞は、あらゆる種のいずれのものであってもよい。細菌細胞は、培養および遺伝子操作を行うことができる種および／または株のものであることが好ましい。一部の実施形態では、細菌細胞は、グラム陽性菌細胞であってよい。一部の実施形態では、細菌細胞は、グラム陰性菌細胞であってよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されている技術の細菌細胞の親株は、タンパク質の発現用に最適化された株であってよい。本技術における使用に適した細菌の種および株の非限定的な例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｕｎｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１、および前述のいずれかの誘導体が挙げられる。タンパク質の発現用の細菌株は、例えば、ＥＸＰＲＥＳＳ（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（カタログ番号Ｃ２５２３；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）など、市販されている。一部の実施形態では、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００５８】
一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸を、野生型ＣｓｇＡを発現する細胞に含める。一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸を、例えば細胞が野生型ＣｓｇＡを発現しないような、野生型ＣｓｇＡ遺伝子の突然変異および／または欠失を有する細胞に含める。一部の実施形態では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸を、細胞に、相同組換えにより、例えば、細胞において操作されたＣｓｇＡポリペプチドをコードする核酸により野生型ＣｓｇＡ遺伝子が置き換えられるように導入する。
【００５９】
一態様では、１つまたは複数の操作されたＣｓｇＡポリペプチドを含む、および／またはそのようなポリペプチドをコードするベクターもしくは核酸を含む、操作された微生物細胞を含むバイオフィルムが本明細書に記載される。本明細書で使用される場合、「バイオフィルム」とは、表面に接着することができるまたは接着している微生物の集団を指す。バイオフィルムは、これらだけに限定されないが、細胞外ＤＮＡ、タンパク質、糖ペプチド、および多糖を含む、細胞外ポリマー物質のマトリックスを含む。バイオフィルムの構造および組成などの性質は、バイオフィルム中に存在する特定の細菌の種に左右され得る。バイオフィルム中に存在する細菌は、一般に、単離された細菌またはコロニー中の細菌などの、バイオフィルム中に存在しない対応する細菌とは遺伝的にまたは表現型的に異なる。
【００６０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている技術は、操作されたＣｓｇＡポリペプチドを含む（および／またはそのようなポリペプチドをコードするベクターまたは核酸を含む）操作された微生物細胞をバイオフィルムの産生に適した条件下で培養することによって産生されるバイオフィルムに関する。バイオフィルムの産生に適した条件は、これらだけに限定されないが、微生物細胞が対数成長および／またはポリペプチド合成できる条件を含み得る。条件は、選択される微生物細胞の種および株に応じて変動し得る。微生物細胞を培養するための条件は当技術分野で周知である。バイオフィルム産生は、当技術分野で周知の方法、例えば、細胞を阻害濃度未満のベータ−ラクタム系もしくはアミノグリコシド系抗生物質と接触させること、細胞を流体の流れに曝露すること、細胞を外因性ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）と接触させること、または細胞をクオラムセンシングシグナル分子と接触させることによって誘導および／または増強することができる。一部の実施形態では、バイオフィルムの産生に適した条件は、例えば、ＣｓｇＤを外因的に発現させることによってＣｓｇＡの発現および分泌を増大させる条件も含み得る。
【００６１】
一部の実施形態では、バイオフィルムは、バイオフィルムを産生した細胞を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＣｓｇＡポリペプチドを含む組成物が本明明細書に記載される。
【００６２】
ＣｓｇＡ単位は、ｃｕｒｌｉを形成することができる細胞、例えばＣｓｇＡ、ＣｓｇＢ、ＣｓｇＣ、ＣｓｇＤ、ＣｓｇＥ、ＣｓｇＦ、およびＣｓｇＧまたはその一部のサブセットを発現する細胞によって発現されると、アセンブルしてｃｕｒｌｉフィラメント、例えば、ＣｓｇＡのポリマー鎖を形成する。一部の実施形態では、ポリペプチドのフィラメントが組成物中に存在し得る。一部の実施形態では、フィラメントは、タンパク質性ネットワークの一部、例えば、例えば互いと混交、オーバーラップ、および／または接触し得る多数のフィラメントであり得る。一部の実施形態では、タンパク質性ネットワークは、追加的なバイオフィルム成分、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルムに一般に見いだされる材料を含み得る。バイオフィルム成分の非限定的な例としては、バイオフィルムタンパク質（例えば、ＦｉｍＡ、ＦｉｍＨ、Ａｇ４３、ＡｉｄＡ、および／またはＴｉｂＡ）および／または非タンパク質性バイオフィルム成分（例えば、セルロース、ＰＧＡおよび／またはコラン酸（colonic  acid））を挙げることができる。一部の実施形態では、組成物は、操作されたＣｓｇＡポリペプチドを含む、および／またはそのようなポリペプチドをコードするベクターまたは核酸を含む操作された微生物細胞をさらに含み得る。
【００６３】
一態様では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドを含む（および／またはそのようなポリペプチドをコードするベクターまたは核酸を含む）細胞、組成物、またはバイオフィルムの、ポリペプチドを、例えば、バイオフィルム内、組成物内、および／または細胞表面上にディスプレイするための使用が本明細書に記載される。本明細書で使用される場合、「ディスプレイする」とは、ポリペプチド（例えば、活性ポリペプチドとして）を、細胞外の環境と接触するように発現させることを指す。ディスプレイされたポリペプチドは、結合パートナーと結合すること、酵素反応を触媒すること、および／または単離されたポリペプチドとして発揮する任意の他の活性を発揮することが可能であり得る。
【００６４】
本明細書では、バイオフィルム内でディスプレイされるポリペプチド（例えば、活性ポリペプチドおよび／または機能化ポリペプチド）は、そのポリペプチドの可溶性型を超える活性を保持することが企図されている。本明細書では、バイオフィルム内でディスプレイされるポリペプチド（例えば、活性ポリペプチドおよび／または機能化ポリペプチド）は、例えば、高ｐＨまたは低ｐＨ、有機溶媒、乾燥、高温または低温、放射線などの活性低下条件に曝露した際に、そのポリペプチドの可溶性型を超える活性を保持することが企図されている。
【００６５】
一態様では、操作されたＣｓｇＡポリペプチドを含む（および／またはそのようなポリペプチドをコードするベクターまたは核酸を含む）細胞、組成物、またはバイオフィルムの、生体触媒；工業的な生体触媒；固定化された生体触媒；化学的生成；濾過；水溶液からの分子の単離；水濾過；バイオレメディエーション；ナノ粒子合成；ナノワイヤー合成；光学的に活性な材料のディスプレイ；バイオセンサー；表面コーティング；治療用バイオマテリアル；生物学的足場；物体の構造的補強；および治療剤の送達系からなる群から選択される適用における使用が本明細書に記載される。そのような適用およびそれに使用するための特異的活性ポリペプチドの例示的な、非限定的な実施形態は、本明細書の実施例に記載されている。
【００６６】
本明細書では、細胞、組成物および／またはバイオフィルムは、多数の異なる操作されたＣｓｇＡポリペプチドを含んでよく、そのそれぞれが、異なる活性ポリペプチド、例えば、酵素活性ポリペプチドを含む操作されたＣｓｇＡポリペプチドおよび結合性ドメイン活性ポリペプチドを含む操作されたＣｓｇＡポリペプチドを含むことが企図されている。細胞、組成物、および／またはバイオフィルムは、１種または複数の操作されたＣｓｇＡポリペプチド、例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、またはそれ超の操作されたＣｓｇＡポリペプチドを含んでよい。
【００６７】
「増大（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、または「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」という用語は全て、本明細書では、統計学的に有意な量の増大を意味するために使用される。一部の実施形態では、「増大（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、または「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増大、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％もしくは１００％を含めて１００％までの増大、または参照レベルと比較して１０〜１００％の任意の増大、または、参照レベルと比較して少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の増大、または２倍から１０倍もしくはそれ超の間の増大を意味し得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、隣接する残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって互いと接続された一連のアミノ酸残基を示すために互換的に使用される。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾された（例えば、リン酸化された、糖化された、グリコシル化されたなど）アミノ酸およびアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、多くの場合、比較的大きなポリペプチドに関して使用され、「ペプチド」という用語は、多くの場合、小さなポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、遺伝子産物およびその断片について言及する場合、互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片ならびに前述のものの他の等価物、バリアント、断片、および類似体が挙げられる。
【００６９】
「核酸」または「核酸配列」とは、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはその類似体の単位が組み入れられる任意の分子、好ましくはポリマー分子であってよい。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一本鎖核酸は、変性した二本鎖ＤＮＡの一方の核酸鎖であってよい。あるいは、一本鎖核酸は、いかなる二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であってよい。一態様では、核酸はＤＮＡであってよい。別の態様では、核酸はＲＮＡであってよい。適切な核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡである。他の適切な核酸分子は、ｍＲＮＡを含むＲＮＡである。
【００７０】
細胞生物学および分子生物学における一般用語の定義は、The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology、Blackwell  Science  Ltd.より出版、１９９４年（ISBN  0-632-02182-9）；Benjamin  Lewin、Genes  X、Jones  &  Bartlett  Publishingより出版、２００９年（ISBN-10:0763766321）；Kendrewら（編）、Molecular  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference、VCH  Publishers,  Inc.より出版、１９９５年（ISBN  1-56081-569-8）およびCurrent  Protocols  in  Protein  Sciences、２００９年、Wiley  Intersciences、Coliganら編において見出すことができる。
【００７１】
別段の指定のない限り、本発明は、例えば、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual（第３版）、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、USA（２００１年）；Davisら、Basic  Methods  in  Molecular  Biology、Elsevier  Science  Publishing,  Inc.、New  York、USA（１９９５年）；またはMethods  in  Enzymology:  Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques１５２巻、S.  L.  BergerおよびA.  R.  Kimmel編、Academic  Press  Inc.、San  Diego、USA（１９８７年）；およびCurrent  Protocols  in  Protein  Science  （CPPS）（John  E.  Coliganら編、John  Wiley  and  Sons,  Inc.）に記載されている標準の手順を使用して実施した。
【００７２】
本開示の実施形態についての記載は、網羅的なものでもなく、開示されている形態そのものに本開示を限定するものでもない。本開示の特定の実施形態、および実施例が例示目的で本明細書に記載されているが、当業者には理解される通り、本開示の範囲内に入る種々の等価の改変が可能である。例えば、方法のステップまたは機能は所与の順序で示されているが、代替的な実施形態では、機能を異なる順序で実施することもでき、機能を実質的に同時に実施することもできる。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態をもたらすことができる。本開示の態様は、必要であれば、上記の参考文献および適用の組成物、機能および概念を用いるように改変して、本開示のなおさらなる実施形態をもたらすことができる。さらに、生物学的機能の同等性の考察から、生物学的または化学的作用の種類および量に影響を及ぼすことなく、タンパク質の構造にいくらかの変更を行うことができる。これらおよび他の変更は、本開示に対して、詳細な説明を踏まえて行うことができる。そのような改変は全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【００７３】
前述の実施形態のいずれかの特定の要素を他の実施形態における要素と組み合わせるまたはそれで置換することができる。さらに、本開示のある特定の実施形態に付随する利点がこれらの実施形態の状況で記載されているが、他の実施形態でもそのような利点が示され得、また、本開示の範囲内に入るために全ての実施形態がそのような利点を示す必要はない。
【００７４】
以下の実施例は、本開示の代表的なものとして記載されている。これらおよび他の等価の実施形態は本開示、図面および付随する特許請求の範囲を考慮すれば明らかであるので、これらの実施例は本開示の範囲の限定とは解釈されない。
【実施例】
【００７５】
（実施例Ｉ）
リンカーのデザイン
アミロイドドメイン（ＣｓｇＡ）と機能性ペプチドドメイン（ＦＬＡＧ）との間の種々のリンカーデザインを試験するために、試験アミロイドキメラタンパク質ライブラリーを構築した。ＣｓｇＡタンパク質は、細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉから分泌され、次いで、当該タンパク質が自己アセンブルして、直径約４〜７ｎｍの高度にロバストな機能性アミロイドナノファイバーになる。これらのアミロイドファイバは「ｃｕｒｌｉ」として公知であり、細胞を封入する、延長した絡み合ったネットワークとして存在する。ＦＬＡＧドメインは、アフィニティークロマトグラフィーおよびエピトープ−タグを付けたタンパク質検出のために使用されるオクタペプチドポリペプチドタグである。
【００７６】
以下の表１に記載の通り、ＣｓｇＡとＦＬＡＧドメインとを接続するリンカーとして６種の異なるドメインをデザインした。
【表１】
2018517398.tif 000004
【００７７】
一態様によると、リンカーは、７アミノ酸〜５０アミノ酸を含み得る。一態様によると、リンカーは、８アミノ酸〜５０アミノ酸を含み得る。一態様によると、リンカーは、９アミノ酸〜５０アミノ酸を含み得る。一態様によると、リンカーは、１０アミノ酸〜５０アミノ酸を含み得る。一態様によると、リンカーは、１１アミノ酸〜５０アミノ酸を含み得る。一態様によると、リンカーは、１２アミノ酸〜５０アミノ酸を含み得る。一態様によると、リンカーは、１５アミノ酸〜５０アミノ酸を含み得る。一態様によると、リンカーは、２０アミノ酸〜５０アミノ酸を含み得る。一態様によると、リンカーは、２４アミノ酸〜５０アミノ酸を含み得る。一態様によると、リンカーは、４５アミノ酸〜５０アミノ酸を含み得る。
【００７８】
一態様によると、リンカーは、柔軟なリンカーまたは剛性のリンカーであり得る。リンカーは、１つまたは複数のまたは複数の反復アミノ酸サブユニットを含み得る。
【００７９】
一態様によると、リンカーは、疎水性または親水性であり得る。
【００８０】
一態様によると、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０またはそれ超のアミノ酸サブユニットを含み得る。一態様によると、リンカーは、２反復サブユニットもしくはそれ超、３反復サブユニットもしくはそれ超、４反復サブユニットもしくはそれ超、５反復サブユニットもしくはそれ超、６反復サブユニットもしくはそれ超、７反復サブユニットもしくはそれ超、８反復サブユニットもしくはそれ超、９反復サブユニットもしくはそれ超、１０反復サブユニットもしくはそれ超、１１反復サブユニットもしくはそれ超、１２反復サブユニットもしくはそれ超、１３反復サブユニットもしくはそれ超、１４反復サブユニットもしくはそれ超、または１５反復サブユニットもしくはそれ超を含み得る。一態様によると、複数のアミノ酸サブユニットにより、柔軟なリンカーがもたらされる。柔軟なリンカーは、溶液中で固有の二次構造または三次構造を欠く配列を有するリンカーを含み得る。一態様によると、複数のアミノ酸サブユニットにより、剛性リンカーがもたらされる。剛性リンカーは、溶液中で定義済みのコンフォメーションを維持することを可能にする二次構造または三次構造を有する配列を有するリンカーを含み得る。
【００８１】
例示的なアミノ酸サブユニットは、ＧＧＧＳ（配列番号４）である。一態様によると、リンカーは構造［ＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは、１から２０までの整数である）（配列番号１２）を有する。ｎの例示的な値としては、３、６、および１２が挙げられる。一態様によると、複数のＧＧＧＳ（配列番号４）サブユニットを有するリンカーは、全体的または部分的に柔軟なリンカーである。
【００８２】
例示的なアミノ酸サブユニットはＰである。一態様によると、リンカーは、構造［Ｐ］ｎ（式中、ｎは、１から３０までの整数である）（配列番号１３）を有する。一態様によると、Ｐの反復を有するリンカーは、延長されたＩＩ型トランスへリックスを含む。ｎの例示的な値としては、１２および２４が挙げられる。一態様によると、複数のＰサブユニットを有するリンカーは、全体的または部分的に剛性のリンカーである。
【００８３】
例示的なアミノ酸サブユニットは、ＥＡＡＡＫ（配列番号１４）などのアルファヘリックスモチーフである。一態様によると、リンカーは、構造［ＥＡＡＡＫ］ｎ（式中、ｎは、１から１５までの整数である）（配列番号１５）を有する。ｎの例示的な値としては、３および９が挙げられる。一態様によると、複数のＥＡＡＡＫ（配列番号１４）サブユニットを有するリンカーは、全体的または部分的に剛性のリンカーであり、親水性部分および疎水性部分を含む。
【００８４】
例示的なアミノ酸残基としては、１２もしくはそれ超のアミノ酸、２４もしくはそれ超のアミノ酸または４８もしくはそれ超のアミノ酸が挙げられる。一態様によると、アミノ酸は、柔軟なアミノ酸である。一態様によると、アミノ酸は、グリシン、セリン、アラニンまたはロイシンのうちの１つまたは複数である。一態様によると、対応する細胞外ｃｕｒｌｉファイバの増大は、リンカーの長さの増大によりもたらされる。一態様によると、対応する機能性ドメイン利用可能性の増大は、リンカーの長さの増大によりもたらされる。
【００８５】
例示的なリンカーとしては
【化２】
2018517398.tif 000005
が挙げられる。
【００８６】
（実施例ＩＩ）
アミロイドナノファイバー産生の分析
種々の介在リンカーを有するＣｓｇＡ−リンカー−ＦＬＡＧキメラを、ｃｕｒｌｉナノファイバーへの最適な自己アセンブルについて試験した。種々のリンカーを有するタンパク質ライブラリーのｃｕｒｌｉナノファイバーへの自己アセンブルを、アミロイドの比色定量検出のために使用される標準の染色であるコンゴーレッド（ＣＲ）を使用して検出した。首尾よく分泌され、アミロイドナノファイバーへの自己アセンブルに関してコンピテントな融合タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞のみが赤色に染色される。図１に示されている通り、柔軟なリンカー（Ｆ１２、Ｆ２４、およびＦ４８）の全てで、いくらかの中間のレベルのＣＲ染色が示され、最長のリンカーで最大の量が示される。剛性リンカーに関しては、より長いポリプロリンリンカーではＣＲ染色が示されず、ＥＫ３リンカーについて最大量のＣＲ染色が得られた。より長い剛性リンカーを有するポリプロリンおよびＥＡＡＡＫ（配列番号１４）リンカーにより、より少ない染色がもたらされる傾向がみられる。これは単に代表的な実施形態であること、および、プロリンを２４個有するポリプロリンリンカーが所与の機能性ポリペプチドに対して有用なリンカーであり得ることが理解されるべきである。
【００８７】
（実施例ＩＩＩ）
ペプチドドメイン機能性の決定
ＦＬＡＧエピトープタグが利用可能であり、抗ＦＬＡＧ抗体に結合するというその規定された機能を適正に果たすことができるかどうかを決定するために、全細胞培養物試料のイムノブロット分析を実施した。柔軟なリンカーを有するＣｓｇＡ−リンカー−ＦＬＡＧ構造では、リンカーの長さに応じて蛍光の単調な増大が実証された。ポリプロリン剛性リンカーを有するＣｓｇＡ−リンカー−ＦＬＡＧ構造では蛍光がなかった。科学的理論に縛られることを望むものではないが、これらの疎水性リンカーは、ペプチドタグの適切な機能を妨害する可能性がある。アルファヘリックスＥＡＡＡＫ（配列番号１４）リンカーを有するＣｓｇＡ−リンカー−ＦＬＡＧ構造では、ＥＫ９構築物よりも多くのＣＲ染色を有したＥＫ３リンカー構築物（図１を参照されたい）では蛍光がより少ないことが示された。対照的に、ＣＲ結合がより少ないＥＫ９リンカー構築物では蛍光シグナルが高く、これにより、ＦＬＡＧエピトープタグの利用可能性がより大きいことが示される。図２を参照されたい。
【００８８】
（実施例ＩＶ）
リンカーのデザインを最適化する方法
本開示の態様は、ＣｓｇＡと機能性ポリペプチドとを連結するためのリンカーのデザインを最適化する方法を対象とする。この態様によると、ＣｓｇＡと連結するための機能性ポリペプチドを選択する。次いで、リンカーのデザインを選択してＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造を形成する。次いで、細菌を、ＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造をコードする核酸配列を含むように改変する。次いで、改変された細菌を増殖させて細菌の集団にし、ＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造の発現についてアッセイする。次いで、改変された細菌を増殖させて細菌の集団にし、ＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造のバイオフィルムの形成についてアッセイする。バイオフィルムを、機能性ポリペプチドの機能特性についてアッセイすることができる。したがって、本明細書に記載の例示的なリンカーにより、自己アセンブルが可能になり、ＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチド構造の機能的ドメインが互いに干渉せずに作動または機能することが可能になる。バイオフィルム形成および機能性ポリペプチドの機能特性に対するリンカーの影響を決定する例示的な方法を図３に示す。最適化されていないリンカードメインは、機能的ドメインに対する結合性部位をふさぐこと、ＣｓｇＡもしくは機能性ポリペプチドドメインの適切なフォールディングを妨げること、アミロイドファイバのアセンブリを妨害すること、または分泌を妨害することにより、バイオフィルムに基づく材料の性能を妨害する可能性がある。最適化されたリンカーでは、これらの問題が最小限になり、バイオフィルムの所望の機能が改善される。最適化されたリンカードメインにより、広範囲の条件下（極度の温度、極度のｐＨ、好ましくない溶媒の存在下、屋外での適用における要素への曝露など）での優れた機械的および生物物理学的安定性を有するバイオフィルムに基づく材料の製作が容易になる。最適化されたリンカードメインにより、各機能性ペプチドドメインが独立に作動することが可能になり、マイクロスケールまたはマクロスケールでの所望の挙動に寄与する材料中の機能性ペプチドドメインの数が有効に増大する。例えば、バイオフィルムに基づく材料の所望の機能が金属結合性である場合、不適切なリンカードメインによって生じる分子の混み合いまたは望ましくない分子間相互作用が原因で材料の安定性または金属結合親和性が阻害される。最適化されたリンカードメインにより、望ましくない分子間相互作用が起こることが減り、最終的に材料の性能が増強される。
【００８９】
（実施例Ｖ）
腸管上皮結合
本開示の態様は、健康であるか疾患にかかっているかにかかわらず、特定の組織または細胞に結合する異種ドメインを有するバイオフィルムを創出するための、操作された細菌の使用方法を対象とする。一態様によると、細菌は、非病原性細菌である。例示的な非病原性細菌としては、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（ＥｃＮ）、ＭＧ１６５５、Ｋ１２由来株、ＰＨＬ６２８、ＬＳＲ１０、ＬＳＲ６などが挙げられる。Ｍｕｔａｆｌｏｒという商品名でプロバイオティクスとして販売されている野生型ＥｃＮは、経口的に送達することができ、上部胃腸管を生きて移行し、次いで、回腸および結腸で最初の投与から数日間、一過性に定着する。この定着プロセスの間に、ＥｃＮはｃｕｒｌｉファイバを産生する。
【００９０】
例示的な結合性ドメインとしては、以下の表２において同定されるものが挙げられる。
【表２−１】
2018517398.tif 000006
【表２−２】
2018517398.tif 000007
【００９１】
本発明者らは、異なる融合ドメインのそれぞれについて、最適なｃｕｒｌｉファイバ形成を導くリンカー配列と培養条件との特定の組合せを同定し、以下の表３に提示する。
【表３Ａ】
2018517398.tif 000008
【００９２】
機能性ポリペプチドとしては、胃腸（ＧＩ）管の上皮表面に対する結合親和性を示すポリペプチドまたはタンパク質配列が挙げられる。例示的なポリペプチドまたはタンパク質配列は、当業者に公知であるか、または生体組織におけるファージディスプレイから、天然に存在する生物に存在する配列から、もしくは特定の表面に結合するようにいくつかの他のやり方で操作された配列から、決定することができる。例えば、胃腸管に関連する組織または細胞に対する親和性を有する例示的なポリペプチドまたはタンパク質配列は、腸管上皮の構造を模倣するマイクロ流体系から決定することができる。そのような系は、「Ｇｕｔ  ｏｎ  ａ  ＣＨＩＰ」と称することができる。そのような系では、蠕動を模倣するために流れおよび周期的ひずみの動きを組み入れる。腸管結合性官能基を有する本明細書に記載の操作された細菌株をそのような系に導入することができ、系におけるマイクロスケールでの局在化および滞留時間をモニタリングして、ＣｓｇＡ−リンカー−機能性ポリペプチドの発現を通じた細胞の系への結合を決定することができる。そのような系は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Lab  Chip、２０１２年、１２巻、２１６５〜２１７４頁に記載されている。
【００９３】
胃腸管に関連する組織または細胞に対する親和性を有する例示的なポリペプチドまたはタンパク質配列は、マウスモデルにおける時空間分布をモニタリングまたは決定することから決定することができる。この態様によると、操作されたＮｉｓｓｌｅ株などの操作された細菌株を、健康なマウス腸管に、例えば単回投与などで、経口投与し、その後、通常の給餌の期間をおく。操作された株の滞留時間を毎日採集する糞便試料からのＣＦＵ計数によって測定する。腸管内の空間的局在化を、腸管組織を採取し、切片作製し、操作された株の存在をホモジナイズした組織からのＣＦＵ計数および組織学的な組織切片の免疫染色から追跡することによってモニタリングする。
【００９４】
腸管上皮に局在化した様式で結合することが分かっているポリペプチドドメインのライブラリーにおいて、いくつかのリンカーを試験した。トレフォイルファクター（ＴＦＦ）として公知であるこのポリペプチドファミリーは、胃腸粘膜から分泌され、胃腸管の異なる領域に差次的に結合する３種の同定されたペプチド（ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３）からなる。全てのトレフォイルファクターが共通して、３つの保存されたジスルフィド結合からなるトレフォイルドメインを有する。操作してＣｓｇＡ−リンカーにした各ＴＦＦ構築物についての配列が上の表２に示されている。
【００９５】
ＴＦＦ１は、６０アミノ酸の単一のトレフォイルドメインを含有する。ＴＦＦ２は、２つの相同なトレフォイルドメインを含有し、その結果、合計６つのジスルフィド結合が生じており、長さは１００アミノ酸を超える。前述の実験において同定された柔軟なリンカーを介してＴＦＦ２と融合したＣｓｇＡを含有する種々の構築物を作製した。単一のトレフォイルドメイン構築物（ＴＦＦ１）に関しては、より長い柔軟なリンカードメインにより、定量的コンゴーレッド結合アッセイによって測定される発現レベルの顕著な改善がもたらされた（図４）。
【００９６】
ＴＦＦ１では、柔軟なリンカーの長さを２４残基から４８残基まで増大させたところ、ほぼ５倍の増大が示された。対照的に、ＴＦＦ２では、リンカーの長さの関数としての改善は示されず、これは、タンパク質の複雑さ（６つのジスルフィド）または長さがより大きいこと（＞１００アミノ酸）に起因する可能性がある。
【００９７】
表４に示されているＦ４８リンカーを使用して種々の短いペプチド（７〜１２アミノ酸）を試験した。
【表３Ｂ】
2018517398.tif 000009
【００９８】
これらのペプチドは、腸粘膜への結合についてファージディスプレイ技法によって同定された。図５に示されている通り、これらの短いペプチド構築物の全てで、野生型ＣｓｇＡと同等の移出およびｃｕｒｌｉ−自己アセンブルレベルが実証された。
【００９９】
これらの種々の腸管結合性ドメイン（ＴＦＦおよび短いペプチド）が、ｃｕｒｌｉナノファイバー上にディスプレイされた際にそれらの組織ホーミング機能を保持するかどうかを決定するために、Ｃａｃｏ−２細胞単層への細菌の結合についての標準のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施した。Ｃａｃｏ−２細胞株は、ヒト小腸を裏打ちする腸内円柱上皮細胞と表現型的に類似している。これらの細胞株は、モデルｉｎ  ｖｉｔｒｏ系として研究所において広く使用されている。全てＦ４８リンカードメインを含有する種々のＣｓｇＡ構築物をＥ．ｃｏｌｉ  ＬＳＲ１０株において発現させた。このＥ．ｃｏｌｉの株は、他の細胞外細胞小器官（セルロース、鞭毛、線毛など）を産生しない実験室用Ｋ−１２株であり、したがって、機能を明白に見分けることが可能になる。図６は、腸管結合性ドメインを有するＣｓｇＡ構築物を発現するＬＳＲ１０細胞のＣａｃｏ−２細胞への接着を示す。全てＦ４８リンカードメインを含有する種々のＣｓｇＡ構築物をＥ．ｃｏｌｉ  ＰＨＬ６２８株において発現させた。図７は、腸管結合性ドメインを有するＣｓｇＡ構築物を発現するＰＨＬ６２８細胞のＣａｃｏ−２細胞への接着を示す。
【０１００】
構築物の発現および結合を、ｃｕｒｌｉナノファイバーを発現するＥ．ｃｏｌｉのプロバイオティクス株であるＮｉｓｓｌｅ  １９１７においてさらに試験した。Ｎｉｓｓｌｅ株は、ＷＷＩ中に、感染性腸管病原性下痢に対して抵抗性であった兵士の糞便試料から単離された。さらなる試験により、Ｎｉｓｓｌｅ株が胃浸潤性細菌からの保護能力を有する重大なプロバイオティクスであること、ならびに、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、およびクローン病などの他の胃腸障害を好転させることが示された。したがって、本開示の態様は、Ｎｉｓｓｌｅ  Ｅ．ｃｏｌｉの腸管組織への付着を対象とする。
【０１０１】
Ｌａｍｂｄａ  Ｒｅｄゲノム欠失技法を使用して内在性ＣｓｇＡ遺伝子をＮｉｓｓｌｅ株から除去し、それにより、的確なｃｓｇＡ欠失を伴うＮｉｓｓｌｅの操作された株をもたらした（Ｎｉｓｓｌｅ突然変異体、ＰＢＰ１７）。図８Ａ〜８Ｄは、Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７のＣｓｇＡ欠失突然変異体の構築を示す。図８Ａは、ＮｉｓｓｌｅにおいてｃｓｇＡ遺伝子を欠失させるためのｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ組換え戦略を示す。図８Ｂは、ｃｓｇＡ遺伝子座におけるクロラムフェニコールカセット挿入のＰＣＲによる検証により、２つの陽性クローンが同定されることを示す（黒色の矢印）。図８Ｃは、２６５ｂｐ、１５８ｂｐ、および１１３ｂｐのアンプリコンの存在について検証された２つのクローンを示す。図８Ｄは、ｃｓｇＡ遺伝子に隣接する領域の配列決定による検証により、上首尾のＣＡＴカセット組み込みが示されることを示す（黄色で強調表示されている）。ＰＢＰ１７において発現させた種々の構築物の接着機能性を試験するために、Ｃａｃｏ−２細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける結合試験を上記の通り実施した。Ｆ４８リンカーを有し、トレフォイルドメイン（ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３）を含有する構築物をＮｉｓｓｌｅ  ΔｃｓｇＡ突然変異体（ＰＢＰ１７）において発現させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣａｃｏ−２単層への結合について試験した。結合した細胞を回収し、ＣＦＵ分析によって定量化し、データを図９において、Ｃａｃｏ−２単層に接着したままであった総接種細菌細胞の％として示す。
【０１０２】
例示的な構造として、
ＣｓｇＡ−（ＧＧＧＳ）ｎ−ＴＴＦ１（式中、ｎは、３、６または９である）（配列番号４１）
ＣｓｇＡ−（ＧＧＧＳ）ｎ−ＴＴＦ２（式中、ｎは、３、６または９である）（配列番号４１）
ＣｓｇＡ−（ＧＧＧＳ）ｎ−ＴＴＦ３（式中、ｎは、３、６または９である）（配列番号４１）
ＣｓｇＡ−（ＧＧＧＳ）ｎ−Ｔ１８（式中、ｎは、３、６または９である）（配列番号４１）
ＣｓｇＡ−（ＧＧＧＳ）ｎ−ＣＰ１５（式中、ｎは、３、６または９である）（配列番号４１）
ＣｓｇＡ−（ＧＧＧＳ）ｎ−Ｐ８（式中、ｎは、３、６または９である）（配列番号４１）
が挙げられる。
【０１０３】
（実施例ＶＩ）
腸管の慢性炎症性疾患の処置
本開示の態様は、炎症性腸疾患およびクローン病などの腸管の慢性炎症性疾患を、それを必要とする個体に本明細書に記載されているある特定の操作された細菌株（単数または複数）を投与することによって処置する方法を対象とする。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−抗炎症性ポリペプチド構築物を発現させる。
【０１０４】
細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−抗炎症性ポリペプチド構築物を発現させ、抗炎症性ポリペプチドにより腸管の慢性炎症性疾患を処置する。
【０１０５】
一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−結合対ポリペプチドの第１のメンバー構築物を発現させる。次いで、抗炎症性化合物に付着した結合対の第２のメンバーを投与する。結合対の第１のメンバーと結合対の第２のメンバーとを結合させ、それにより、抗炎症性化合物を、胃腸管の慢性炎症性疾患の処置のために、例えば腸管に局在化させる。
【０１０６】
一態様によると、細菌株は、Ｎｉｓｓｌｅ株または例えばＭＧ１６５５、Ｋ１２由来株などの当業者に公知の任意の他の非病原性株などの非病原性細菌株である。
【０１０７】
抗炎症性化合物は、腸管における炎症プロセスを抑止することが可能なタンパク質配列であってよい。例示的なタンパク質配列としては、ペプチドのトレフォイルファクターファミリー（ＴＦＦ）が挙げられ、これは、ＴＦＦが哺乳動物の腸管における内在性シグナル伝達分子であり、診療所におけるＩＢＤおよびクローン病の処置における有効性が実証されており、それらの可溶性の形態がこれらの適応症に対する生物学的製剤として開発中であることが理由である。
【０１０８】
一態様によると、抗炎症性化合物、タンパク質またはポリペプチドは、操作されたｃｕｒｌｉファイバに付着したまま、その効果を発揮し得る。一態様によると、抗炎症性化合物、タンパク質またはポリペプチドは、プロテアーゼによってｃｕｒｌｉファイバから切断された後に可溶性タンパク質または化合物としてその効果を発揮し得る。ＭＭＰファミリーのいくつかのプロテアーゼ（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９など）は、炎症中に上方制御され、抗炎症性化合物、タンパク質またはポリペプチドをリンカードメインから切断するために使用することができる。
【０１０９】
一態様によると、生理活性のあるタンパク質およびペプチドを、炎症を起こした腸管に局所的に送達するための方法が提供される。一態様によると、生理活性のあるタンパク質およびペプチドを、特定の炎症のキューに応答して、炎症を起こした腸管に局所的に送達するための方法が提供される。
【０１１０】
抗炎症性化合物、タンパク質またはポリペプチドは、ＴＴＦドメインに関して下に記載されている例示的な方法によって同定することができる。２Ｄ培養物中で成長させたＣａｃｏ−２腸上皮細胞を、ＴＦＦドメインをディスプレイする精製されたｃｕｒｌｉファイバを用いて処理する。ＴＦＦは細胞遊走を促進することが公知であるので、細胞遊走のスピードなどの、ＴＦＦ生理活性を示すバイオマーカーをモニタリングする。ｗｔ−ＣｓｇＡ（陰性対照）、ＣｓｇＡ−ＴＦＦ、または可溶性ＴＦＦ（陽性対照）のいずれかで構成されるアセンブルしたｃｕｒｌｉファイバについて遊走スピードを比較する。遊走スピードは、集密的な単層における創傷治癒アッセイを使用して測定する。ＴＦＦが活性であれば、遊走スピードが増大し、可溶性ＴＦＦに匹敵する。
【０１１１】
別の方法によると、３つの細胞集団におけるＣＯＸ−２発現のレベルをウエスタンブロットによって比較する。陰性対照を上回る発現により、ｃｕｒｌｉと結合したＴＦＦの生理活性が確認される。
【０１１２】
別の方法によると、より生理的に関連するモデル系を使用してｃｕｒｌｉと結合したＴＦＦの生理活性を測定するために、Ｇｕｔ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ系を使用する。上皮層、内皮層、および循環免疫細胞を含有するチップに炎症性薬剤（例えば、ＬＰＳ）を添加することにより、慢性炎症をシミュレートする。Kimら、LabChip、１２巻、２１６５頁（２０１２年）およびKimら、Integrative  biology：quantitative  Biosciences  from  nano  to  Macro、５巻、１１３０頁（２０１３年）を参照されたい。次いで、ｃｕｒｌｉと結合したＴＦＦを用いた処理に応答した、重要な炎症マーカー（ＮＦ−κＢ、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＣＯＸ−２、ＥＧＦＲ活性化など）の発現をモニタリングする。
【０１１３】
別の方法によると、小腸炎の確立されたマウスモデル（ＤＳＳ、ＩＬ−１０ノックアウトなど）を使用して、ｃｕｒｌｉと結合したＴＦＦの抗炎症効果を試験する。炎症反応の抑止を組織学的検査によって定性的に測定し、重要な炎症性サイトカインのｑＰＣＲを用いて定量的に測定する。
【０１１４】
（実施例ＶＩＩ）
腸管のがんの処置
本開示の態様は、胃腸管のがんなどのがんを、それを必要とする個体に本明細書に記載されているある特定の操作された細菌株（単数または複数）を投与することによって処置する方法を対象とする。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−がん処置用ポリペプチド構築物を発現させる。ある特定のがん処置用ポリペプチドとしては、例えばベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブなどの成長阻害因子を含めた、がんに対する公知の活性を有するものが挙げられる。
【０１１５】
細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−がん処置用ポリペプチド構築物を発現させ、がん処置用ポリペプチドにより、がん組織またはがん細胞を処置する。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−結合対ポリペプチドの第１のメンバー構築物を発現させる。細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−結合対ポリペプチドの第１のメンバー構築物を発現させる。次いで、がん治療用化合物に付着した結合対の第２のメンバーを投与する。結合対の第１のメンバーと結合対の第２のメンバーとを結合させ、それにより、がん治療用化合物を、胃腸管のがんなどのがんの処置のために、例えば腸管に局在化させる。
【０１１６】
有用な細菌株としては、例えばＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７（ＥｃＮ）、ＭＧ１６５５、Ｋ１２由来株などの非病原性Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられる。
【０１１７】
一態様によると、がん処置用タンパク質またはポリペプチドは、操作されたｃｕｒｌｉファイバに付着したまま、その効果を発揮し得る。一態様によると、がん処置用タンパク質またはポリペプチドドメインは、プロテアーゼによってｃｕｒｌｉファイバから切断された後に可溶性タンパク質としてその効果を発揮し得る。ＭＭＰファミリーのいくつかのプロテアーゼは、炎症中に上方制御され、がん処置用ポリペプチドをリンカードメインから切断するために使用することができる。
【０１１８】
本開示のこの実施形態のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性のどちらも上記の方法を使用して確認することができる。
【０１１９】
（実施例ＶＩＩＩ）
診断方法
本開示の態様は、マーカーなどの診断剤を、哺乳動物内の部位に、哺乳動物に本明細書に記載されているある特定の操作された細菌株（単数または複数）を投与することによって送達する方法を対象とする。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−診断用ポリペプチド構築物を発現させる。
【０１２０】
細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−診断用ポリペプチド構築物を発現させ、診断用ポリペプチドを検出する。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−結合対ポリペプチドの第１のメンバー構築物を発現させる。細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−結合対ポリペプチドの第１のメンバー構築物を発現させる。次いで、診断用化合物に付着した結合対の第２のメンバーを投与する。診断用化合物としては、造影剤または色素を挙げることができる。結合対の第１のメンバーと結合対の第２のメンバーとを結合させ、それにより、診断用化合物を腸管などの目的の場所に局在化させる。
【０１２１】
有用な細菌株としては、例えばＮｉｓｓｌｅ株、ＭＧ１６５５、Ｋ１２由来株などの非病原性Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられる。
【０１２２】
一態様によると、診断用ポリペプチドまたは診断用化合物は、操作されたｃｕｒｌｉファイバに付着したままであってよい。一態様によると、診断用ポリペプチドまたは診断用化合物は、プロテアーゼによってｃｕｒｌｉファイバから切断することができる。ＭＭＰファミリーのいくつかのプロテアーゼは、炎症中に上方制御され、診断用ポリペプチドまたは診断用化合物をリンカードメインから切断するために使用することができる。
【０１２３】
一態様によると、診断用ポリペプチドまたは診断用化合物は、プロテアーゼにより切断可能なリンカーを使用してｃｕｒｌｉファイバから放出させることができる。この態様によると、リンカードメインが、プロテアーゼ酵素によって認識および切断されるアミノ酸配列を含む、ＣｓｇＡ−リンカー−診断用ポリペプチドの組換え構築物を作製する。そのようなアミノ酸配列および関連するプロテアーゼ酵素は当業者に公知であり、それらとして、ＭＭＰ、ＣＤ２８３０などが挙げられる。リンカーは、炎症の部位において局所的に産生される酵素（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９など）による切断を受けやすいように選択することができる。本開示のこの実施形態のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性のどちらも上記の方法を使用して確認することができる。
【０１２４】
（実施例ＩＸ）
腸管媒介性病原体の処置
本開示の態様は、腸管媒介性病原体を、それを必要とする個体に本明細書に記載されているある特定の操作された細菌株（単数または複数）を投与することによって処置する方法を対象とする。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−抗菌性ポリペプチド構築物を発現させる。ある特定の抗菌性ポリペプチドまたはタンパク質は、抗菌活性を有する任意のポリペプチドまたはタンパク質配列を含む。治療的な状況において使用するための抗菌性ペプチドは、当業者に公知である。Cotter,  P.  D.、Ross,  R.  P.およびHill,  C.  Bacteriocins  -  a  viable  alternative  to  antibiotics?  Nat  Rev  Micro、１１巻、９５〜１０５頁（２０１２年）；Hing,  T.  C.ら、The  antimicrobial  peptide  cathelicidin  modulates  Clostridium  difficile-associated  colitis  and  toxin  A-mediated  enteritis  in  mice.  Gut、６２巻、１２９５〜１３０５頁（２０１３年）；Nuding,  S.、Frasch,  T.、Schaller,  M.、Stange,  E.  F.およびZabel,  L.  T.  Synergistic  Effects  of  Antimicrobial  Peptides  and  Antibiotics  against  Clostridium  difficile.  Antimicrobial  Agents  and  Chemotherapy、５８巻、５７１９〜５７２５頁（２０１４年）；Rea,  M.  C.ら、Thuricin  CD,  a  posttranslationally  modified  bacteriocin  with  a  narrow  spectrum  of  activity  against  Clostridium  difficile.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA、１０７巻、９３５２〜９３５７頁（２０１０年）；Petrof,  E.  Probiotics  and  Gastrointestinal  Disease：Clinical  Evidence  and  Basic  Science.  AIAAMC、８巻、２６０〜２６９頁（２００９年）；Kang、J.  K.ら、The  Insect  Peptide  Coprisin  Prevents  Clostridium  difficile-Mediated  Acute  Inflammation  and  Mucosal  Damage  through  Selective  Antimicrobial  Activity.  Antimicrobial  Agents  and  Chemotherapy、５５巻、４８５０〜４８５７頁（２０１１年）；およびOstaff,  M.  J.、Stange,  E.  F.およびWehkamp,  J.、Antimicrobial  peptides  and  gut  microbiota  in  homeostasis  and  pathology.、EMBO  Mol  Med、５巻、１４６５〜１４８３頁（２０１３年）を参照されたい。
【０１２５】
一態様によると、腸管媒介性病原体としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ（腸管病原性大腸菌）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉなどが挙げられる。
【０１２６】
細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−抗菌性ポリペプチド構築物を発現させ、抗菌性ポリペプチドにより、腸管媒介性病原体を、腸管媒介性病原体が減少するまたは排除される様式で処置する。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−組織または細胞結合性ポリペプチド構築物を発現させる。細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−組織または細胞結合性ポリペプチド構築物を発現させ、細菌株により、腸管媒介性病原体を、腸管媒介性病原体が減少するまたは排除される様式で処置する。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−結合対ポリペプチドの第１のメンバー構築物を発現させる。細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−結合対ポリペプチドの第１のメンバー構築物を発現させる。次いで、抗菌性化合物に付着した結合対の第２のメンバーを投与する。結合対の第１のメンバーと結合対の第２のメンバーとを結合させ、それにより、抗菌性化合物を、腸管媒介性病原体が減少するまたは排除される様式で腸管媒介性病原体を処置するために、腸管に局在化させる。
【０１２７】
有用な細菌株としては、例えばＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７（ＥｃＮ）、ＭＧ１６５５、Ｋ１２由来株などの非病原性Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられる。
【０１２８】
一態様によると、抗菌性タンパク質またはポリペプチドは、操作されたｃｕｒｌｉファイバに付着したまま、その効果を発揮し得る。一態様によると、抗菌性タンパク質またはポリペプチドは、プロテアーゼによってｃｕｒｌｉファイバから切断された後に可溶性タンパク質としてその効果を発揮し得る。ＭＭＰファミリーのいくつかのプロテアーゼは、炎症中に上方制御され、生理活性ドメインをリンカードメインから切断するために使用することができる。
【０１２９】
一態様によると、抗菌性タンパク質またはペプチドは、プロテアーゼにより切断可能なリンカーを使用してｃｕｒｌｉファイバから放出させることができる。この態様によると、リンカードメインが、プロテアーゼ酵素によって認識および切断されるアミノ酸配列を含む、ＣｓｇＡ−リンカー−抗菌薬の組換え構築物を作製する。そのようなアミノ酸配列および関連するプロテアーゼ酵素は、当業者に公知である。リンカーは、炎症の部位において局所的に産生される酵素（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９など）による切断を受けやすいように選択することができる。一態様によると、抗菌性タンパク質を、タンパク質分解性ビルレンス因子ＣＤ２８３０による切断を受けやすいリンカーを介してｃｕｒｌｉファイバと融合する。一態様によると、抗菌性タンパク質は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅビルレンス因子の存在下でのみ、腸管の内側に放出される。抗菌性タンパク質を局所的に送達して、侵入している病原体を死滅させる。
【０１３０】
本開示のこの実施形態のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性のどちらも上記の方法を使用して確認することができる。
【０１３１】
ツリシンＣＤ、ナイシンおよびアクタガルジンのようなランチビオティクス、カテリシジン、ならびにＬＬ−３７を含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性が実証されている抗菌性タンパク質の例がいくつか存在する。
【０１３２】
１つの例示的な抗菌性タンパク質は、最近、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に対する処置としての見込みが示されている、Ｃｏｐｒｉｓ  ｔｒｉｐａｒｔｉｔｕｓ（朝鮮フンコロガシ）から最初に単離されたペプチドであるコプリシンである。コプリシンは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して高い効力を有し（ＭＩＣが、バンコマイシンでは３．０μｇ／ｍＬであるのと比較して、１．５μｇ／ｍＬである）、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのような一般的な腸管共生生物に対しては活性を欠く。完全なコプリシンペプチドは４３アミノ酸であるが、９アミノ酸の短縮された類似体（ＬＬＣＩＡＬＲＫＫ）（配列番号２９）がより高い抗生物質活性を示す。コプリシン由来の配列を、感染中にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから分泌されるプロテアーゼビルレンス因子の存在下で切断を受けやすいリンカーを通じてＣｓｇＡと融合する。Hensbergen,  P.  J.ら、A  novel  secreted  metalloprotease  (CD2830)  from  Clostridium  difficile  cleaves  specific  proline  sequences  in  LPXTG  (SEQ  ID  NO:30)  cell  surface  proteins.  Molecular  &  Cellular  Proteomics、１３巻、１２３１〜１２４４頁（２０１４年）を参照されたい。ＣＤ２８３０は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって細胞外空間に活発に分泌されるメタロプロテアーゼであり、上皮細胞表面に結合する接着を切断することにより、病原体の運動性において役割を果たすと考えられている。重要なことに、ＣＤ２８３０は、プロリンリッチ配列、特にＰｒｏ−Ｐｒｏおよびソルターゼ様ＬＰＸＴＧ（配列番号３０）配列の切断に対して特異性を示すことが公知である。
【０１３３】
ＣｓｇＡ−リンカー−コプリシンバリアントのパネルを、ペプチド挿入断片の直接合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）とオーバーラップ伸長ＰＣＲとの組合せを使用して構築する。この遺伝子パネルは、移出および切断に最適な配列を同定するために、図１０に示されている通り、リンカー領域の長さおよび配列を変動させたものである。Ｈｅｎｓｂｅｒｇｅｎらにより報告された、ＣＤ２８３０に供した際の最も速い切断速度に基づいて、プロリンリッチ領域を選択した。図１０は、合成およびスクリーニングのためのＣｓｇＡ−リンカー−ＡＭＰ構築物の図である。Ｓｅｃは、輸送後に切断されるペリプラズム分泌タグである。Ｎ２２は、外膜分泌タグである。ＣｓｇＡは、タンパク質のアミロイド形成領域である。リンカーは、一般的な配列（ＧＧＳ）ｎＸＸＸＸ（式中、ｎ＝３、４、または５であり、ＸＸＸＸ＝ＰＰＰ、ＰＰＩＰ、またはＰＰＶＰである）（配列番号３１）を有する。総パネルサイズは９メンバーであり、融合したドメインは２２アミノ酸から２８アミノ酸までにわたる。
【０１３４】
これらの遺伝子を、以前報告されたプロトコールを使用して適切なプラスミドに組み入れる。プラスミドは、抗生物質による選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を有し、ＣｓｇＡ融合タンパク質をコードする遺伝子は、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下におく。
【０１３５】
遺伝子構築物を作製し、ＥｃＮに導入し、リンカー−ＡＭＰドメインをディスプレイするｃｕｒｌｉファイバを合成し、分泌し、アセンブルさせるＥｃＮの能力を試験する。ＣｓｇＡ−リンカー−ＡＭＰ構築物をコードするプラスミドを、ｃｓｇＡ遺伝子のゲノムコピーを欠失させ、抗生物質による選択マーカーで置き換えたＥｃＮの突然変異体（ＥｃＮ−ΔｃｓｇＡ）に形質転換する。この突然変異体は、それ自体のｃｕｒｌｉファイバを産生することができず、したがって、プラスミドによる形質転換後に得られるｃｕｒｌｉに関連するシグナルはいずれも、操作されたｃｕｒｌｉ構築物から生じるものである。コンゴーレッド染色を使用して、操作されたＥ．ｃｏｌｉバリアントにおけるｃｕｒｌｉ産生について迅速にスクリーニングする。さらに、ｃｕｒｌｉ産生を、誘導されたＥｃＮ−ΔｃｓｇＡ形質転換体を膜で濾過し、抗ＣｓｇＡ抗体を用いて直接プローブする全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを使用してアッセイする。ＳＥＭを使用して形質転換体を特徴付けて、改変されたｃｕｒｌｉファイバの形態が野生型ファイバと定性的に同様であることを確認する。リンカー−ＡＭＰドメインが分泌およびアセンブルプロセスの間、インタクトなままであり、分解されていないことを確認するために、確立された精製プロトコールを使用して純粋なｃｕｒｌｉファイバを得、それを脱アセンブルさせ、ＭＡＬＤＩ−質量分析に供す。最小培地における種々の形質転換体およびＥｃＮ−ΔｃｓｇＡの成長速度の比較を、適応度に対する代用物として使用する。
【０１３６】
一態様によると、生理活性のあるペプチドは、プロテアーゼに応答して切断され、ｃｕｒｌｉファイバから放出する。適切なプロテアーゼは、プロテアーゼＣＤ２８３０により例示される以下の方法を使用して同定することができる。ＣＤ２８３０プロテアーゼは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって活発に分泌され、病原体によって産生される宿主タンパク質結合性接着を切断し、それにより、運動性の表現型を促進することによってビルレンス因子としての機能を果たすとされている。ＣＤ２８３０は、プロリンリッチ配列を切断する。したがって、リンカードメインは、１つまたは複数のプロリンを含む。
【０１３７】
ＣＤ２８３０をＥ．ｃｏｌｉにおいて組換えにより発現させ、精製する。バイオフィルムを種々の条件に供するため、およびバイオフィルムからの可溶性実体の捕捉または放出をモニタリングするために、９６ウェルフィルタープレートアッセイを使用する。操作されたＥｃＮバリアントのパネルを浮遊培養物中で成長させ、誘導し、次いで、それらの関連するｃｕｒｌｉファイバを用いてフィルタープレート上に固定化する。バイオフィルムを洗浄して全ての可溶性または弱く結合した生体分子を除去する。バイオフィルムを種々の濃度の組換えＣＤ２８３０で処理する。様々な時点でＡＭＰの放出をモニタリングして、アセンブルしたｃｕｒｌｉファイバからの切断の速度論的パラメータを決定する。ＡＭＰ放出を、プロテアーゼ処理後に採集した画分のＬＣ−ＭＳ分析によってモニタリングする。生きたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株（ＡＴＣＣ４３２５５）を用い、濾過したバイオフィルムを嫌気性チャンバーの内部の病原体を曝露することによって同様の放出試験を実施する。
【０１３８】
改変されたｃｕｒｌｉファイバの２つの異なるアッセイ−従来の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）アッセイを模倣する一方のアッセイ、およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細胞の細胞傷害性を、改変されたｃｕｒｌｉファイバの存在下で培養した後にモニタリングする他方のアッセイによる、コプリシンなどの抗菌性タンパク質の抗菌活性。第１のアッセイでは、組換えＣＤ２８３０に応答して活性なＡＭＰを放出するそれらの能力について選択されたＥｃＮバリアントをＹＥＳＣＡ培地において誘導して、改変されたｃｕｒｌｉファイバを形成させる。誘導された細胞培養物をＯＤ６００＝１まで成長させ、次いで、熱処理してＥｃＮ細胞を死滅させた後、嫌気性チャンバーに移す。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ培養物を、嫌気条件下で一晩、定常期まで成長させることによって調製する。次いで、それらを、種々の濃度の、ＡＭＰをディスプレイするｃｕｒｌｉファイバと一緒に様々な時間にわたってインキュベートする。最後に、生存可能なＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細胞を、適切な成長培地を有する寒天プレート上に段階希釈物をプレーティングし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数することによって計数する。第２のアッセイでは、操作されたＥｃＮバリアントの、ヒト上皮細胞層を増殖性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる浸潤から保護する能力を試験する。公開されたプロトコールを使用して、結腸直腸がん由来のＣａｃｏ−２細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ３７）を９６ウェルプレートにおいて集密度まで成長させる。Wagner,  R.  D.、Johnson,  S.  J.およびCerniglia,  C.  E.、In  Vitro  Model  of  Colonization  Resistance  by  the  Enteric  Microbiota:  Effects  of  Antimicrobial  Agents  Used  in  Food-Producing  Animals.、Antimicrobial  Agents  and  Chemotherapy、５２巻、１２３０〜１２３７頁（２００８年）；Banerjee,  P.、Merkel,  G.  J.およびBhunia,  A.  K.、Lactobacillus  delbrueckii  ssp.  bulgaricus  B-30892  can  inhibit  cytotoxic  effects  and  adhesion  of  pathogenic  Clostridium  difficile  to  Caco-2  cells.  Gut  Pathog、１巻、８頁（２００９年）を参照されたい。次いで、細胞株を、操作されたＥｃＮバリアントと一緒に３時間インキュベートした後、細胞培養培地で洗浄して接着していない細胞を除去する。細胞単層を好気条件下で増殖性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細胞に曝露し、３時間共インキュベートする。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ蛍光染色アッセイと細胞計数の画像に基づく検出とを組み合わせて細胞傷害性をモニタリングする。
【０１３９】
変更されたＣｓｇＡ遺伝子をＥｃＮのゲノムに組み入れる。ｌａｍｂｄａ  Ｒｅｄ組換え技法を使用することによってｃｓｇＡ遺伝子が抗生物質による選択マーカーで置き換えられ、ｃｓｇＡ遺伝子座に特異的な相同性ドメインに挟まれた所望の選択マーカーを含有する二本鎖ＤＮＡ挿入断片が、ｌａｍｂｄａ  Ｒｅｄ組換え因子と一緒に細菌細胞に導入された、ＥｃＮの突然変異体を生成する。Datsenko,  K.  A.およびWanner,  B.  L.  One-step  inactivation  of  chromosomal  genes  in  Escherichia  coli  K-12  using  PCR  products.、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、９７巻、６６４０〜６６４５頁（２０００年）を参照されたい。ゲノムが編集されたクローンを、抗生物質選択的プレート上でプレーティングすることにより選択し、正確な挿入の存在をＰＣＲおよび配列決定によって確認する。結果得られる、ＥｃＮ−ΔｃｓｇＡと称される株は、ｃｕｒｌｉファイバを産生しない。同様のＬａｍｂｄａ  Ｒｅｄ組換え戦略を使用して、野生型ＥｃＮのｃｓｇＡ遺伝子をＣｓｇＡ−リンカー−ＡＭＰバリアントをコードする遺伝子で置き換える。遺伝子挿入カセットは、キメラ配列、および首尾よく編集されたクローンを選択するための抗生物質耐性マーカーの両方を含有する。耐性遺伝子は、軽度の熱によって処理した際に自己切除可能なフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）ドメインに挟まれている。そのような方法により、ｃｓｇＡバリアントの「傷跡のない」挿入がもたらされる。
【０１４０】
首尾よく編集されたクローンを、様々な特徴付けプロトコールに供して、それらのクローンがｃｕｒｌｉファイバを産生することを確実にする。全細胞ＥＬＩＳＡを使用して、ファイバ内にアセンブルしたＣｓｇＡが存在することを確認する。ＳＥＭを使用して、操作されたファイバの全体の形態が野生型ｃｕｒｌｉファイバの形態と類似していることを確認する。精製されたｃｕｒｌｉファイバのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を使用して、リンカーおよびＡＭＰドメインが分泌およびアセンブルプロセスの間に分解されないことを確認する。最後に、野生型ＥｃＮ、ＥｃＮ−ΔｃｓｇＡ、およびＣｓｇＡ−リンカー−ＡＭＰ構築物のそれぞれについて浮遊培養物中での成長速度をモニタリングする。
【０１４１】
健康なマウス腸管におけるＥｃＮゲノム突然変異体の生存能力を試験する。操作されたＥｃＮ突然変異体は、マウス腸管において、宿主を害することなく生存し、一過性に定着する。ゲノムが変更されたＥｃＮ突然変異体を健康なマウスに約１０８のＣＦＵ値で与える。接種を１回行い、マウスに通常の食餌を１０日間与える。マウス腸管における操作されたＥｃＮバリアントの滞留時間を、糞便試料を毎日採集し、Ｍａｃｃｏｎｋｅｙ寒天プレート上で適切な抗生物質による選択を用いて生存可能なコロニーを計数することによってモニタリングする。細菌感染の症状がないことを確認するために、マウスを観察し、体重を毎日測定する。実験終了時に、ＥｃＮ細胞の空間的分布を決定するために、マウスを屠殺し、その器官を採取する。胃腸管の上部切片、下部切片、および中央切片の切片作製を行い、ホモジナイズした後、選択プレート上の段階希釈によってＣＦＵを計数する。浸潤性の表現型を確認するために、同様のプロトコールを肝臓および脾臓に適用する。
【０１４２】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染後の腸管炎症に対する操作されたＥｃＮバリアントの治療効果を、Ｋａｎｇらによって開発された、他の利用可能なモデルと比較してヒト疾患応答によりよく似ている、抗生物質により誘導されるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患（ＣＤＡＤ）のマウスモデルを使用してモニタリングする。同様の試験群内のマウスを一緒に収容し、抗生物質（適切な投与量のゲンタマイシン、メトロニダキソール、バンコマイシン（vancmycin）、およびコリスチン）のカクテルを含有する水を用いて前処置する。対照マウスには、クリンダマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に単回投与し、実験マウスには、腹腔内へのクリンダマイシンに加えて、１０８ＣＦＵの操作されたＥｃＮバリアントを経口強制飼養によって与える。１日後、全てのマウスに、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株ＶＰＩ  １０４６３（５×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）の懸濁液０．５ｍｌを経口強制飼養することによって感染させる。対照マウスには、さらに飲料水を単独で与え、実験マウスには、さらにＥｃＮバリアントを６日間経口投与し、体重減少および生存についてモニタリングする。糞便試料を毎日採集し、組織を１０日目に採集し、ＥｃＮの局在化をＣＦＵ計数および免疫組織化学的検査によって測定する。
【０１４３】
（実施例Ｘ）
有害な薬剤、毒素または代謝産物の選択的捕捉
本開示の態様は、有害な薬剤、毒素または代謝産物などの捕捉標的を、それを必要とする個体に本明細書に記載されているある特定の操作された細菌株（単数または複数）を投与することによって捕捉する方法を対象とする。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−捕捉剤ポリペプチド構築物を発現させる。ある特定の捕捉剤および関連する捕捉標的としては、コレステロールおよびコレステロール結合性ペプチド、リン酸およびリン酸結合性ペプチド、グリアジンおよびグリアジン結合性ペプチドなど、ならびに文献検索によって容易に同定されるものが挙げられる。代表例を以下の表５に示す。
【表５−１】
2018517398.tif 000010
【表５−２】
2018517398.tif 000011
【０１４４】
細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−捕捉剤ポリペプチド構築物および捕捉標的に結合する捕捉剤を発現させる。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−結合対ポリペプチドの第１のメンバー構築物を発現させる。次いで、捕捉剤に付着した結合対の第２のメンバーを投与する。結合対の第１のメンバーと結合対の第２のメンバーとを結合させ、それにより、捕捉剤を細菌細胞に局在化させる。
【０１４５】
有用な細菌株としては、例えばＮｉｓｓｌｅ株、ＭＧ１６５５、Ｋ１２由来株などの非病原性Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられる。
【０１４６】
一態様によると、捕捉剤タンパク質またはポリペプチドは、操作されたｃｕｒｌｉファイバに付着したまま、その効果を発揮し得る。一態様によると、捕捉剤タンパク質またはポリペプチドは、プロテアーゼによってｃｕｒｌｉファイバから切断された後に可溶性タンパク質としてその効果を発揮し得る。ＭＭＰファミリーのいくつかのプロテアーゼは、炎症中に上方制御される、または上方制御されなくても胃腸管内で利用可能であり、生理活性ドメインをリンカードメインから切断するために使用することができる。
【０１４７】
一態様によると、捕捉剤タンパク質またはペプチドは、プロテアーゼにより切断可能なリンカーを使用してｃｕｒｌｉファイバから放出させることができる。この態様によると、リンカードメインが、プロテアーゼ酵素によって認識および切断されるアミノ酸配列を含む、ＣｓｇＡ−リンカー−捕捉剤の組換え構築物を作製する。そのようなアミノ酸配列および関連するプロテアーゼ酵素は、当業者に公知である。リンカーは、炎症の部位において局所的に産生される酵素（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９など）による切断を受けやすいように選択することができる。本開示のこの実施形態のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性のどちらも上記の方法を使用して確認することができる。
【０１４８】
（実施例ＸＩ）
生診断薬としての操作された細菌
本開示の態様は、マーカーなどの診断剤を、哺乳動物内の部位に、哺乳動物に本明細書に記載されているある特定の操作された細菌株（単数または複数）を投与することによって送達する方法を対象とする。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−診断用ポリペプチド構築物を発現させる。
【０１４９】
細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−診断用ポリペプチド構築物を発現させ、診断用ポリペプチドを検出する。一態様によると、細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−結合対ポリペプチドの第１のメンバー構築物を発現させる。細菌株に、ＣｓｇＡ−リンカー−結合対ポリペプチドの第１のメンバー構築物を発現させる。次いで、診断用化合物に付着した結合対の第２のメンバーを投与する。結合対の第１のメンバーと結合対の第２のメンバーとを結合させ、それにより、診断用化合物を腸管などの目的の場所に局在化させる。
【０１５０】
有用な細菌株としては、例えばＮｉｓｓｌｅ株、ＭＧ１６５５、Ｋ１２由来株などの非病原性Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられる。
【０１５１】
一態様によると、診断用ポリペプチドまたは診断用化合物は、操作されたｃｕｒｌｉファイバに付着したままであってよい。一態様によると、診断用ポリペプチドまたは診断用化合物は、プロテアーゼによってｃｕｒｌｉファイバから切断することができる。ＭＭＰファミリーのいくつかのプロテアーゼは、炎症中に上方制御され、診断用ポリペプチドまたは診断用化合物をリンカードメインから切断するために使用することができる。
【０１５２】
一態様によると、診断用ポリペプチドまたは診断用化合物は、プロテアーゼにより切断可能なリンカーを使用してｃｕｒｌｉファイバから放出させることができる。この態様によると、リンカードメインが、プロテアーゼ酵素によって認識および切断されるアミノ酸配列を含む、ＣｓｇＡ−リンカー−診断用ポリペプチドの組換え構築物を作製する。そのようなアミノ酸配列および関連するプロテアーゼ酵素は、当業者に公知である。リンカーは、炎症の部位において局所的に産生される酵素（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９など）による切断を受けやすいように選択することができる。本開示のこの実施形態のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性のどちらも上記の方法を使用して確認することができる。
【０１５３】
（実施例ＸＩＩ）
追加的な適用
本開示の態様では、生体触媒として、ＣｓｇＡタンパク質とネイティブでない機能性ポリペプチドとがリンカーによって連結した融合物を発現する、改変された細胞を利用する。この態様によると、本明細書に記載のｃｕｒｌｉに由来する材料およびバイオフィルムを、工業への適用（水の精製、バイオ燃料の生成など）および医薬への適用（薬物中間体の合成）において化学的変換を実施するために使用する酵素などの酵素の固定化のための機能化可能な表面として使用するための方法が提供される。ＣｓｇＡ−リンカー−固定化酵素は、本明細書に記載のリンカーを含む。
【０１５４】
追加的な態様によると、金属を除去または回収するための方法が提供される。この態様によると、本明細書に記載のｃｕｒｌｉに由来する材料およびバイオフィルムを、金属の固定化のための機能化可能な表面として使用するための方法が提供される。ＣｓｇＡ−リンカー−金属結合性ポリペプチドまたは薬剤は、本明細書に記載のリンカーを含む。金属結合性ポリペプチドまたは薬剤は、イオン形態および金属形態の特定の金属に結合し得る。
【０１５５】
追加的な態様によると、アフィニティー精製マトリックスをもたらすことによるものなどの、バイオレメディエーションのため、および精製のための方法が提供される。
【０１５６】
本明細書に記載のｃｕｒｌｉ系は、別の化学的または生物学的実体を特異的に固定するように、または特異的な結合性を示すようにプログラミングすることが可能な、生物学的に産生されるペプチド−機能化表面コーティングである。ディスプレイされたペプチドは、他の外因的に付加された機能性成分、例えば、無機ナノ粒子（特に興味深い光電子性もしくは磁気応答性を有するもの）、炭素に基づくナノ構造（すなわち、伝導率を付与し得るグラフェンもしくはナノチューブ）、または環境毒素（すなわち、ホルモンもしくは毒性金属）への結合性などの内因的性質を有し得る。操作されたバイオフィルムは、無機材料または有機材料の形成の鋳型となるペプチドをディスプレイするために使用することもできる、異なる材料に特異的に結合するペプチドを用いてバイオフィルムを機能化することにより、これらの材料を遺伝的にプログラム可能な様式で表面コーティングすることが可能になる。さらに、生バイオフィルムを使用して任意のタンパク質を固定し、提示する適用は、生体触媒、バイオテンプレーティング、またはバイオセンシング適用に有用であり得るので、特に企図されている。一態様によると、本明細書に記載の材料の合成およびアセンブルは、プログラミングされたナノ材料を産生するための工場として機能する細菌細胞によって完全に実現される。
【０１５７】
追加的な特定の適用として、ペプチド／固定化されたタンパク質自体から、または鋳型化された材料を誘導することによって、プログラム可能な、光学的性質、磁気抵抗性または半導体の性質を有する生物学的に産生されたナノ材料が挙げられる。触媒ペプチドまたは酵素をｃｕｒｌｉバイオフィルム上にディスプレイすることにより、種々の固定化基質をバイオフィルムの接着に使用することができ、任意のバイオリアクターデザインにおいて使用することができる高効率の固定化された生体触媒の系がもたらされる。ペプチド／固定化されたタンパク質は、バイオフィルムが組織足場またはワクチン送達材料としての機能を果たすことを可能にする生物学的に活性な生体分子もコードし得る。合成ホルモン、小分子、または毒性金属などの環境毒素に結合するまたはそれを酵素的に中和するペプチド／固定化されたタンパク質の発現を、バイオレメディエーションのための、バイオフィルムに基づく技術として使用する。本明細書に記載のバイオフィルム上の金、銀、白金、およびロジウムなどの貴金属に特異的に結合し得るペプチドを発現させることにより、そのような貴重な材料を有益に回収するための活性表面積がもたらされる。ｃｕｒｌｉナノファイバーは、本質的に伝導性のペプチド／タンパク質をディスプレイすることによって、または伝導性の材料を鋳型化／固着することによって、多数の進歩した材料の適用のための伝導性ナノワイヤーとして工学的に作製することができる。ＦｅＰＯ４などの伝導性または半伝導性材料を鋳型化することが可能なペプチドのｃｕｒｌｉバイオフィルム上での発現に基づいてエネルギー貯蔵のためのナノワイヤーを生成するための細菌の使用が提供される。細菌は、具体的に、ディスプレイされたペプチドにより、スチール、ガラス、または金などの特定の基質に強力に結合するように操作することができる。そのような材料に特異的な結合により、バイオフィルムに基づくバイオセンシング器具をもたらすことができる。ｃｕｒｌｉナノファイバーマトリックスはまた、別の材料の機械的特性を増強するまたは変化させるために、他の分子と相互作用するペプチド／タンパク質をディスプレイするように操作することもできる。ｃｕｒｌｉを、特定の材料に接着するように操作することにより、バイオフィルムは、多種多様な固定化基質上の生体触媒などの適応性および再生利益、材料への腐食抵抗性、微生物燃料電池への適用のための、バイオフィルムによる被覆度の増強をもたらすことが可能な生コーティングとしての機能を果たし得る、または環境応答性の有機（バイオフィルム）−無機の（基質）材料としての機能を果たし得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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