(57)【要約】本発明は、クレブシエラ・ニューモニエのリポ多糖（ＬＰＳ）Ｏ３ｂ抗原構造のエピトープを特異的に認識する単離された抗体を提供し、それは、１以上のＯ３ｂ抗原マンノースホモポリマー繰り返し単位を含む式（Ｉ）の構造を含むＯ３ｂ抗原中に組み込まれたＯ３ｂエピトープであり、式中、ＭｅＰは、メチルホスフェートであり；そしてｎは、０〜５０である。本発明は、さらに、前記の抗体を含む医薬または診断製剤および前記の抗体を生成する方法を提供する。2018535671.tif 000005【選択図】なし
2018535671.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クレブシエラ・ニューモニエのリポ多糖（ＬＰＳ）Ｏ３ｂ抗原構造のエピトープを特異的に認識する単離された抗体であって、該エピトープが、１以上のＯ３ｂ抗原マンノースホモポリマー繰り返し単位を含む式（Ｉ）の構造を含むＯ３ｂ抗原中に組み込まれたＯ３ｂエピトープであり、式（Ｉ）が、以下：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｎ
（式中、
ＭｅＰは、メチルホスフェートであり；そして
ｎは、０〜５０である）
である、上記抗体。
【請求項２】
Ｏ３ａエピトープおよび／またはＯ３ｂエピトープと交差反応し、
ａ）該Ｏ３ａエピトープは、式（ＩＩ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３ａ抗原中に組み込まれており、１以上のＯ３ａ抗原マンノースホモポリマー繰り返し単位を含み、式（ＩＩ）は、以下：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｍ
（式中、ｍは０〜５０である）
であり；
そして
ｂ）該Ｏ３エピトープは、式（ＩＩＩ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３抗原中に組み込まれており、１以上のＯ３抗原マンノースホモポリマー繰り返し単位を含み、式（ＩＩＩ）は、以下：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｍ
（式中、ｍは０〜５０である）
である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｏ３ｂエピトープに特異的に結合し、且つＯ３ａエピトープおよびＯ３エピトープと交差反応する汎Ｏ３特異的抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
２Ｆ８−Ｇ６抗体であるか、またはその特異的エピトープに競合的に結合し、該２Ｆ８−Ｇ６抗体が、以下：
ａ）寄託された物質ＤＳＭ  ３２０５９中に組み込まれているＶＨ；および
ｂ）寄託された物質ＤＳＭ  ３２０６０中に組み込まれている軽鎖ＶＬ；
により特性付けられ、該寄託された物質は、２０１５年６月４日にＤＳＭＺに寄託されており、
好ましくは、結合の競合が、競合ＥＬＩＳＡ分析により、またはＦｏｒｔｅＢｉｏ分析により決定される、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
４Ｄ３−Ａ４抗体であるか、またはその特異的エピトープに競合的に結合し、該４Ｄ３−Ａ４抗体が、以下：
ａ）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  １、２、３、４、５、および６（ここで番号付けはＫａｂａｔに従う）により同定されるＣＤＲ１、２、３、４、５、および６である６個のＣＤＲ配列；もしくはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ７、８、９、１０、１１、および１２（ここで番号付けはＩＭＧＴに従う）により同定されるＣＤＲ１、２、３、４、５、および６である６個のＣＤＲ配列；ならびに／または
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  １５により同定されるＶＨ配列およびＳＥＱ  ＩＤ  １６により同定されるＶＬ配列である、ＶＨおよびＶＬ配列；ならびに／または
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  １３により同定されるＨＣ配列およびＳＥＱ  ＩＤ  １４により同定されるＬＣ配列である、ＨＣおよびＬＣ配列；
のいずれかにより特性付けられる、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
Ｏ３ａエピトープと比較してＯ３ｂエピトープに優先的に結合し、またはＯ３ａエピトープと交差反応せず、ここで、該Ｏ３ａエピトープは、クレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３ａ抗原構造のＯ３ａ抗原繰り返し単位中に組み込まれており、該Ｏ３ａ抗原繰り返し単位が式（ＩＩ）のマンノースホモポリマーである、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
Ｏ３エピトープと比較してＯ３ｂエピトープに優先的に結合し、またはＯ３エピトープと交差反応せず、ここで、該Ｏ３エピトープは、クレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３抗原構造のＯ３ａ抗原繰り返し単位中に組み込まれており、該Ｏ３抗原繰り返し単位が式（ＩＩＩ）のマンノースホモポリマーである、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープのいずれとも交差反応しない、請求項６または７に記載の抗体。
【請求項９】
クレブシエラ・ニューモニエの非Ｏ３  ＬＰＳ分子のエピトープと交差反応しない、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
Ｏ３ｂエピトープに１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、さらにより好ましくは１０−９Ｍ未満のＫｄで結合する親和性を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
【請求項１１】
Ｏ３ｂ  ＬＰＳ分子を発現するクレブシエラ・ニューモニエ株の内毒素を中和する、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
完全長モノクローナル抗体、結合部位を組み込む少なくとも１個の抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、または結合部位を組み込む少なくとも１個の抗体ドメインを含む融合タンパク質であり、特に、ランダム化されたアミノ酸配列または人工アミノ酸配列を含む非天然存在抗体である、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体。
【請求項１３】
モノクローナル抗体であり、好ましくはヒト、ヒト化、キメラ、またはマウス由来のモノクローナル抗体である、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体。
【請求項１４】
クレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成のリスクがある、またはそれを患っている対象の処置における使用のための、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体であって、該対象における感染を制限するため、または前記の感染の結果もたらされる疾患状態を改善するため、好ましくは原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかの処置または予防のために、該対象に有効量の抗体を投与することを含む、上記抗体。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体を含み、好ましくは非経口配合物または粘膜配合物を含み、場合により薬学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤を含有する、医薬製剤。
【請求項１６】
対象におけるクレブシエラ・ニューモニエの感染もしくはコロニー形成、または、原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、もしくは髄膜炎のような関連疾患の診断のための、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項１７】
対象が、免疫無防備状態の患者もしくは免疫抑制患者またはその接触者である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
抗体およびさらなる診断試薬を組成物またはキットの部分において含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体の診断製剤であって、以下の構成要素：
ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体；および
ｂ）さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに場合により該抗体および該診断試薬の少なくとも一方を固定するための固相；
を含む、上記診断製剤。
【請求項１９】
さらなる診断試薬が、抗体および／またはその抗原に結合する抗体の反応産物と特異的に反応する診断標識または試薬である、請求項１８に記載の診断製剤。
【請求項２０】
クレブシエラ・ニューモニエ株により引き起こされた対象におけるクレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成を診断する方法であって、以下の工程：
ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体を準備し；そして
ｂ）該抗体が試験されるべき対象の生物学的試料中のＯ３ｂエピトープと特異的に免疫反応するかどうかを検出し、それによりクレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成を診断する；
を含む、上記方法。
【請求項２１】
生物学的試料が、体液または組織試料、好ましくは、血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および、気管内吸引物、胸水、肺タップ、鼻スワブもしくは痰のような呼吸器管標本からなる群から選択される試料、または前記のいずれかに由来するクレブシエラ・ニューモニエ分離株である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項２３】
請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質性構築物を発現させるためのコード配列を含む、発現カセットまたはプラスミド。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現カセットまたはプラスミドを含む、宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２４に記載の宿主細胞を、前記抗体を産生する条件下で培養または維持する、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体を生成する方法。
【請求項２６】
以下の工程：
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を準備し；そして
ｂ）該試料中の抗体または該試料により産生される抗体の請求項１において定義されたＯ３ｂエピトープとの結合に関して評価し、ここで、該抗体および該エピトープの間の陽性反応が、該抗体を候補抗体として同定する；
を含む、候補抗体を同定する方法。
【請求項２７】
以下の工程：
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を準備し；そして
ｂ）該試料中の抗体または該試料により産生される抗体の請求項１において定義されたＯ３ｂエピトープとの結合に関して評価し、ここで、該抗体および該Ｏ３ｂエピトープの間の、請求項２に記載のＯ３ａエピトープおよび／もしくはＯ３エピトープと比較した特異的陽性反応、またはクレブシエラ・ニューモニエのあらゆる非Ｏ３  ＬＰＳ分子と比較した特異的陽性反応が、該抗体を候補抗体として同定する；
を含む、候補抗体を同定する方法。
【請求項２８】
以下の工程：
ａ）請求項２６または２７に従って同定された候補抗体を準備し；そして
ｂ）該候補抗体のモノクローナル抗体、または該候補抗体のヒト化もしくはヒトの形態、または該候補抗体と同じエピトープ結合特異性を有するそれらの誘導体を生成する；
を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のリポ多糖（ＬＰＳ）Ｏ３ｂ抗原構造のエピトープを特異的に認識する単離された抗体に関し、それは、今まで同定されていなかった構造を含むＯ３ｂ抗原中に組み込まれたＯ３ｂエピトープである。
【背景技術】
【０００２】
クレブシエラ・ニューモニエは、重大な罹患率および死亡率を引き起す院内感染症の原因である重要な腸内細菌性病原体である。多剤耐性（ＭＤＲ）株が、最近出現して世界的に広がっており、それに対する療法選択肢は、限られている。現在の目標は、ＭＤＲクレブシエラ属の株により引き起こされる感染症の予防および処置のための療法用モノクローナル抗体を開発することである。意図されるｍＡｂの分子標的は、クレブシエラ属の表面上の（唯一のではない場合）少数の抗原の１つであると考えられているＬＰＳ  Ｏ抗原である。
【０００３】
Ｏ型の分布に関する公開された疫学データ（１、２）に基づいて、臨床的に関連する分離株の大部分は、４つの血清型、すなわちＯ１、Ｏ２、Ｏ３およびＯ５に属する。Ｏ１およびＯ２抗原は、ガラクトースのホモポリマー（すなわちガラクタン類）により構築され、一方でＯ３およびＯ５血清群は、マンノースホモポリマー（すなわちマンナン類）からなる（３）。
【０００４】
Ｏ３血清型は、図１において示されている“古典的”ペンタマンノース構造により特性付けられる（（３）において公開されている）。クレブシエラ属Ｏ３抗原のペンタマンノース構造が、解明された（１０）。このＯ３抗原をコードしているｒｆｂオペロンは、Ｇｅｎｂａｎｋに受入番号ＡＢ７９５９４１．１の下で寄託されている。
【０００５】
大腸菌血清型Ｏ８およびＯ９は、構造的にそれぞれクレブシエラ属血清型Ｏ５およびＯ３と同じＯ特異的マンノースホモ多糖を有する。大腸菌Ｏ９の亜型である大腸菌Ｏ９ａを大腸菌Ｏ９と血清型的に識別するモノクローナル抗体が、記載されている(Sugiyama et al. 1998, J. Bacteriol. 180(10):2775-2778)。大腸菌Ｏ９およびＯ９ａは、構造的および血清学的に互いに類似している。
【０００６】
大腸菌Ｏ９の構造ならびにその遺伝的決定因子は、クレブシエラ属Ｏ３抗原の構造ならびにその遺伝的決定因子と同一である。血清群Ｏ９の亜型、すなわち大腸菌Ｏ９ａは、ＷｂｄＡ内の点変異の結果もたらされたことが証明された（７）。Ｏ９ａの構造は、テトラマンノース構造であることが示された（８）。
【０００７】
【表１】
2018535671.tif 000003
【０００８】
抗大腸菌Ｏ９ａモノクローナル抗体は、クレブシエラ属Ｏ３多糖と交差反応することが記載されており、これは、クレブシエラ属Ｏ３株における大腸菌Ｏ９ａ型Ｏ多糖類の存在を示唆している(Kido et al. 1997, Microbiol. Immunol. 41:519-525)。その抗体は、大腸菌Ｏ９ａ多糖を認識したが、大腸菌Ｏ９を認識しなかった。Ｏ９およびＯ９ａ多糖を定めるために必要とされる最小のマンノース残基の数は、４であることが決定され、４マンノース構造は、その抗体により結合されるエピトープに関する最短の候補であることが記載されている。
【０００９】
Van der Meerら(Infection and Immunity 1994, 62(3):1052-1057)は、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５に対して産生された、α−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸である内部コアの構造に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を記載している。その抗体は、クレブシエラ・ニューモニエのほぼ全てのＯ血清型と反応し、これは、Ｓ．ミネソタの内部コア中のエピトープに類似したＬＰＳのコア中のエピトープを示唆している。
【００１０】
国際公開第２００８／１３５４４６Ａ２号は、ペプチド性クレブシエラ属抗原および抗体を開示している。
Pollackら(Journal of Clinical Investigation 1987, 79(5):1421-1430)は、ＬＰＳのコア脂質Ａ領域中のエピトープを認識するｍＡｂを記載している。
【００１１】
Yokochiら(Infection and Immunity 1992, 60(11):4953-4956)は、Ｋ．ニューモニエからのＬＰＳのアジュバント活性を記載している。クレブシエラ属Ｏ３  ＬＰＳのアジュバント活性は、クレブシエラ属の脂質Ａ部分およびマンノースホモ多糖部分の組み合わせを必要とする可能性があることが、示唆されている。
【００１２】
Curvallら(Acta Chemica Scandinavica 1973, 27:2645-2649)は、クレブシエラ属Ｏ３  ＬＰＳ中のＯ特異的側鎖の構造を開示している。クレブシエラ属Ｏ３：Ｋ５８  ＬＰＳは、５糖繰り返し単位からなることが、記載されている。
【００１３】
クレブシエラ・ニューモニエの新規の標的に関する必要性が、存在する。特に、免疫的に関連し、療法および診断法を開発するために用いられることができる標的が、同定される必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００８／１３５４４６Ａ２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Sugiyama et al. 1998, J. Bacteriol. 180(10):2775-2778
【非特許文献２】Kido et al. 1997, Microbiol. Immunol. 41:519-525
【非特許文献３】Infection and Immunity 1994, 62(3):1052-1057
【非特許文献４】Journal of Clinical Investigation 1987, 79(5):1421-1430
【非特許文献５】Infection and Immunity 1992, 60(11):4953-4956
【非特許文献６】Acta Chemica Scandinavica 1973, 27:2645-2649
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
Ｋ．ニューモニエ感染症の予防または療法のために用いられるための、病原体を標的とする向上した関連性を有するＫ．ニューモニエに対して向けられた抗体を提供することが、本発明の目的である。迅速かつ信頼できる方法でＫ．ニューモニエ細菌を診断することができる手段および方法を提供することが、さらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
その目的は、本発明の対象により解決される。
本発明によれば、クレブシエラ・ニューモニエのリポ多糖（ＬＰＳ）Ｏ３ｂ抗原構造のエピトープを特異的に認識する単離された抗体が、提供され、それは、１以上のＯ３ｂ抗原マンノースホモポリマー繰り返し単位を含む式（Ｉ）の構造を含むＯ３ｂ抗原中に組み込まれたＯ３ｂエピトープであり、ここで、式（Ｉ）は、以下の構造である：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｎ
式中、
ＭｅＰは、メチルホスフェートであり；そして
ｎは、０〜５０である。
【００１８】
具体的には、メチルホスフェート基は、マンノース残基の非還元末端に位置している。
Ｏ３ｂエピトープは、特に式（Ｉ）において記載されているトリマンノース繰り返し単位により特性付けられる。
【００１９】
具体的には、抗体は、Ｏ３ｂ抗原構造に対して産生され、または工学および選択技法により得られ、その中に組み込まれているそのような構造またはＯ３ｂエピトープに対する結合により同定される。
【００２０】
具体的には、抗体は、そのようなＯ３ｂエピトープに結合することができる。
特定の側面によれば、抗体は、Ｏ３ａエピトープおよび／またはＯ３エピトープと交差反応し、ここで、
ａ）Ｏ３ａエピトープは、式（ＩＩ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３ａ抗原中に組み込まれており、１以上のＯ３ａ抗原マンノースホモポリマー繰り返し単位を含み、ここで、式（ＩＩ）は、以下の式であり：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｍ
式中、ｍは、０〜５０であり；
そして
ｂ）Ｏ３エピトープは、式（ＩＩＩ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３抗原中に組み込まれており、１以上のＯ３抗原マンノースホモポリマー繰り返し単位を含み、ここで、式（ＩＩＩ）は、以下の式であり：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｍ
式中、ｍは、０〜５０である。
【００２１】
Ｏ３ａエピトープは、特に式（ＩＩ）において記載されているテトラマンノース繰り返し単位により特性付けられる。
Ｏ３エピトープは、特に式（ＩＩＩ）において記載されているペンタマンノース繰り返し単位により特性付けられる。
【００２２】
そのような交差反応性抗体は、Ｏ３ｂエピトープに向けられたＯ３特異性ならびにさらにＯ３ａおよびＯ３エピトープの一方または両方に向けられた交差特異性により特性付けられる。
【００２３】
具体的には、抗体は、汎Ｏ３特異的抗体であり、Ｏ３ｂエピトープを特異的に認識し、またはそれに結合し、かつＯ３ａエピトープおよびＯ３エピトープと交差反応する。交差反応性は、特にＯ３ａおよびＯ３  ＬＰＳ抗原中のＯ３ｂエピトープの存在に基づいている。
【００２４】
例えば、抗体は、実施例において記載されており２Ｆ８−Ｇ６もしくは４Ｄ３−Ａ４と名付けられた汎Ｏ３特異的抗体、またはそのような抗体の機能的バリアント、例えば実質的に２Ｆ８−Ｇ６もしくは４Ｄ３−Ａ４抗体と同じ結合特異性を有する、もしくはＯ３ｂエピトープに競合的に結合する機能的バリアントである。２Ｆ８−Ｇ６は、特に本明細書で言及される寄託された物質中に組み込まれている６個のＣＤＲ配列および／またはＶＨ／ＶＬ配列により特性付けられる。４Ｄ３−Ａ４は、特に本明細書で記載されるＨＣおよびＬＣ配列中に組み込まれている６個のＣＤＲ配列および／またはＶＨ／ＶＬ配列により特性付けられる。
【００２５】
具体的には、２Ｆ８−Ｇ６または４Ｄ３−Ａ４抗体およびその機能的バリアントは、Ｏ３ｂエピトープおよび構造に向けられた結合特異性により特性付けられ、それは、Ｏ３ａおよびＯ３構造中にも組み込まれており、結果として交差反応性をもたらし、汎Ｏ３特異性とも呼ばれている。
【００２６】
バリアントを提供するため、そのような抗体は、本明細書において親抗体と呼ばれ、ＣＤＲまたはフレームワーク配列は、本明細書において親ＣＤＲまたは親フレームワーク配列と呼ばれる。
【００２７】
特定の側面によれば、バリアント抗体は、親抗体と同じエピトープに結合する。
さらなる特定の側面によれば、バリアント抗体は、親抗体と同じ結合部位を含む。
機能的に活性なバリアント抗体は、ＶＨもしくはＶＬ配列のいずれかにおいて異なり、または共通のＶＨおよびＶＬ配列を共有し、かつそれぞれのＦＲにおいて改変を含むことができる。変異誘発により親抗体から得られたバリアント抗体は、当該技術で周知の方法により生成されることができる。
【００２８】
抗体の機能的バリアントは、特に、例えば抗体の親和性を向上させるように、および／または親抗体により標的とされているエピトープと同じエピトープもしくはその付近のエピトープを標的とする（エピトープシフト）ようにＣＤＲが変異した抗体を得るために操作されていることができる。
【００２９】
具体的には、機能的に活性なバリアントは、親ＣＤＲ配列中に少なくとも１個の点変異を含み、かつ親ＣＤＲ配列と少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる機能的に活性なＣＤＲバリアントである。
【００３０】
特定の機能的バリアントは、Ｏ３ｂ抗原に１０−８Ｍ未満、好ましくは１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満、好ましくは１０−１１Ｍ未満のＫｄで、例えばピコモル濃度範囲の親和性で結合する親和性を有する。
【００３１】
特定のバリアントは、例えば親抗体のヒト化バリアントであり、ここで、親ＣＤＲ配列が、ヒトまたはヒト化フレームワーク配列中に組み込まれており、ここで、場合により親ＣＤＲ配列のそれぞれの１、２、３、または４個のアミノ酸残基が、親またはヒト化抗体の安定性、特異性および親和性を向上させるために点変異を導入することによりさらに変異していることができる。
【００３２】
特定の側面によれば、抗体は、例えば異なる由来の組み換えＣＤＲおよびフレームワーク配列を含み、ここで、ＣＤＲおよびフレームワーク配列の少なくとも１つは、ヒト、ヒト化、キメラ、マウスまたは親和性成熟配列を含み、好ましくはここで、フレームワーク配列は、あらゆる免疫グロブリンイソ型の、特にＩｇＧ抗体のものである。
【００３３】
本明細書において親和性成熟バリアントと呼ばれる親和性成熟により生成される親抗体のバリアントは、親抗体と比較して少なくとも１対数、または２対数、または３対数のＫｄの差により増大した結合親和性を有することができる。親和性成熟バリアントは、典型的には１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満のＫｄでＯ３ｂ抗原に結合する親和性を有する。親抗体が１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満のＫｄを有する親和性を有し、そして親抗体が親和性成熟を経ている場合、親和性成熟バリアントは、それぞれ１０−９Ｍ未満および１０−１０Ｍ未満のＫｄを有するさらに高い親和性を有することができる。
【００３４】
特定の態様によれば、抗体は、２Ｆ８−Ｇ６抗体、またはその特異的エピトープに競合的に結合する抗体であり、ここで、２Ｆ８−Ｇ６抗体は、本明細書で記載される寄託された物質中に組み込まれている重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）配列により特性付けられる。
【００３５】
具体的には、２Ｆ８−Ｇ６抗体は、以下：
ａ）寄託された物質ＤＳＭ  ３２０５９中に組み込まれているＶＨ；および
ｂ）寄託された物質ＤＳＭ  ３２０６０中に組み込まれている軽鎖ＶＬ；
により特性付けられる。
【００３６】
別の特定の態様によれば、
抗体は、４Ｄ３−Ａ４抗体またはその特異的エピトープに競合的に結合する抗体である。
【００３７】
具体的には、４Ｄ３−Ａ４抗体は、以下のいずれかにより特性付けられる：
ａ）図１０において、特にそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  １、２、３、４、５、および６（番号付けはＫａｂａｔに従う）により同定されるＣＤＲ１、２、３、４、５、および６により同定される６個のＣＤＲ配列；もしくはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ７、８、９、１０、１１、および１２（番号付けはＩＭＧＴに従う）により同定されるＣＤＲ１、２、３、４、５、および６により同定される６個のＣＤＲ配列；ならびに／または
ｂ）図１０において同定されるＶＨおよびＶＬ配列、特にＳＥＱ  ＩＤ  １５により同定されるＶＨ配列およびＳＥＱ  ＩＤ  １６により同定されるＶＬ配列；ならびに／または
ｃ）図１０において同定されるＨＣおよびＬＣ配列、特にＳＥＱ  ＩＤ  １３により同定されるＨＣ配列およびＳＥＱ  ＩＤ  １４により同定されるＬＣ配列。
【００３８】
具体的には、本明細書で言及されるＫａｂａｔに従うＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ命名法に従って決定された抗体のアミノ酸配列として理解されている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版 米国保健福祉省公衆衛生局(1991)を参照）。
【００３９】
具体的には、本明細書で言及されるＩＭＧＴに従うＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ系に従って決定された抗体のアミノ酸配列として理解されている（The international ImMunoGeneTics, Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212）。
【００４０】
好ましくは、結合の競合は、競合ＥＬＩＳＡ分析により、またはＦｏｒｔｅＢｉｏ分析により決定される。
２Ｆ８−Ｇ６または４Ｄ３−Ａ４抗体のいずれかに競合的に結合する抗体または例示された抗体のいずれかの機能的バリアントは、特に競合ＥＬＩＳＡ分析により、またはＦｏｒｔｅＢｉｏ分析により決定されるその標的への結合の相対的阻害により特性付けられ、その相対的阻害は、好ましくは３０％より大きい。
【００４１】
特定の側面によれば、抗体は、Ｏ３ａエピトープと比較してＯ３ｂエピトープに優先的に結合し、またはそれは、Ｏ３ａエピトープとは交差反応せず、ここで、Ｏ３ａエピトープは、クレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３ａ抗原構造のＯ３ａ抗原繰り返し単位中に組み込まれており、ここで、Ｏ３ａ抗原繰り返し単位は、式（ＩＩ）のマンノースホモポリマーである。
【００４２】
さらなる特定の側面によれば、抗体は、Ｏ３エピトープと比較してＯ３ｂエピトープに優先的に結合し、またはそれは、Ｏ３エピトープとは交差反応せず、ここで、Ｏ３エピトープは、クレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３抗原構造のＯ３抗原繰り返し単位中に組み込まれており、ここで、Ｏ３抗原繰り返し単位は、式（ＩＩＩ）のマンノースホモポリマーである。
【００４３】
具体的には、優先的結合は、抗体の特徴的特徴であり、それは、他のＯ３抗原（単数または複数）よりも高い親和性および／または結合力でＯ３ｂエピトープに結合することができ、特に、抗体は、Ｏ３ａエピトープおよび／またはＯ３エピトープと比較してＯ３ｂエピトープに優先的に結合し、例えば、他のＯ３抗原のいずれと比較してもＯ３ｂエピトープまたはＯ３ｂ抗原に結合するより高い親和性を有する。特定の態様によれば、抗体は、他のＯ３抗原のいずれと比較してもＯ３ｂエピトープまたはＯ３ｂ抗原への結合に関して少なくとも２倍大きい親和性を有し、特に少なくとも２倍の差、または少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、またはさらには少なくとも１０倍の差、例えば親和性および／または結合力における差で、Ｏ３ｂエピトープまたはＯ３ｂ抗原に結合する。例えば、Ｏ３ａ抗原および／またはＯ３抗原と比較してＯ３ｂ抗原に優先的に結合するＫｄの差は、免疫アッセイ、好ましくは免疫ブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的方法により決定された際に、少なくとも０．５もしくは１対数、またはさらには少なくとも２対数、または少なくとも３対数異なる。
【００４４】
さらなる特定の側面によれば、抗体は、Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープのいずれとも交差反応しない。具体的には、抗体は、他のＯ３抗原（単数または複数）のいずれに対してもより低い親和性で結合し、例えばここで、他のＯ３抗原（単数または複数）のいずれかと比較してＯ３ｂエピトープまたはＯ３ｂ抗原に優先的に結合するＫｄの差は、少なくとも２対数、好ましくは少なくとも３対数である。
【００４５】
さらなる特定の側面によれば、抗体は、クレブシエラ・ニューモニエの非Ｏ３  ＬＰＳ分子のエピトープと交差反応しない。そのような非Ｏ３  ＬＰＳ分子は、例えばＯ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１２  ＬＰＳ分子である。具体的には、抗体は、他のＫ．ニューモニエ抗原のいずれとも一切交差反応せず、かつ／または抗体は、あらゆる他のＫ．ニューモニエ抗原により低い親和性で結合し、例えばここで、（Ｏ３ｂ抗原以外の）他のＫ．ニューモニエ抗原と比較してＯ３ｂエピトープまたはＯ３ｂ抗原に優先的に結合するＫｄの差は、少なくとも２対数、好ましくは少なくとも３対数である。
【００４６】
具体的には、非交差反応は、ＥＬＩＳＡアッセイまたは免疫ブロットにより、Ｏ３ｂ抗原および抗体が有意に結合しないさらなる抗原（単数または複数）を用いて決定される。
特定の態様によれば、抗体は、Ｏ３ｂエピトープに１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、さらにもっと好ましくは１０−９Ｍ未満、または好ましくは１０−１０Ｍ未満、または好ましくは１０−１１Ｍ未満のＫｄで、例えばピコモル濃度範囲の親和性で結合する親和性を有する。
【００４７】
具体的には、汎Ｏ３特異的抗体は、Ｏ３ｂエピトープ、Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープのそれぞれに高い親和性で、例えば１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、さらにもっと好ましくは１０−９Ｍ未満のＫｄで結合することができる。
【００４８】
特定の側面によれば、抗体は、中和抗体である。具体的には、抗体は、例えばインビトロまたはインビボ検出法により決定されるように、Ｏ３ｂまたはＯ３ａもしくはＯ３  ＬＰＳ分子のいずれかを発現するクレブシエラ・ニューモニエ株の内毒素を中和する。具体的には、抗体は、特定のＬＰＳ分子の内毒素作用をインビトロで中和する。
【００４９】
具体的には、抗体は、Ｏ３ｂエピトープまたはＯ３ｂ抗原を発現するクレブシエラ・ニューモニエ株の内毒素を中和し、ここで、その中和効力は、少なくとも参照抗体（例えば本明細書において記載される４Ｄ３−Ａ４と名付けられた典型的な抗体）の効力である。
【００５０】
具体的には、抗体は、交差中和性抗体であり、それは、クレブシエラ・ニューモニエ株血清型Ｏ３ｂ、ならびにＯ３ａおよびＯ３の少なくとも一方または両方の内毒素を中和する中和効力を有し、その中和効力は、少なくとも参照抗体（例えば本明細書において記載される４Ｄ３−Ａ４と名付けられた典型的な抗体）の効力である。
【００５１】
具体的には、抗体は、Ｏ３ｂ型のクレブシエラ・ニューモニエの殺菌性殺傷のために提供される。
特定の側面によれば、本発明の抗体を用いる免疫療法は、例えば様々な動物モデルにおいて決定されるように、生菌負荷に対して有効に保護することができる。
【００５２】
抗体は、特に致死性内毒血症を中和することができる。そのような機能活性は、適切なインビボモデル（精製されたＬＰＳによる負荷）において決定されることができる。
抗体は、例えばインビトロ血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）により例えば対照試料（抗体が添加されていない、または無関係な対照ｍＡｂが添加されている）を上回る少なくとも２０％の細菌の殺傷で決定されるような補体に媒介される殺傷により、Ｏ３ｂ型のクレブシエラ・ニューモニエに対して特に有効である。
【００５３】
抗体は、例えばインビトロオプソニン化貪食作用性殺傷アッセイ（ＯＰＫ）により例えば対照試料（抗体が添加されていない、または無関係な対照ｍＡｂが添加されている）を上回る少なくとも２０％の入力細菌の取り込みまたは２０％低い最終ＣＦＵ計数で決定されるような抗体に媒介される食作用により、Ｏ３ｂ型のクレブシエラ・ニューモニエに対して特に有効である。
【００５４】
抗体は、例えばインビトロＬＡＬアッセイまたはｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）レポーターアッセイにより例えば対照試料（抗体が添加されていない、または無関係な対照ｍＡｂが添加されている）と比較した内毒素活性における少なくとも２０％の低減により決定されるような内毒素中和機能により、Ｏ３ｂ型のクレブシエラ・ニューモニエに対して特に有効である。
【００５５】
さらなる特定の側面によれば、抗体は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を含む動物において標的とされる病原体を中和し、そしてインビボで病理発生、好ましくは原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のあらゆるモデルを阻害する。
【００５６】
具体的には、抗体は、完全長モノクローナル抗体、結合部位を組み込む少なくとも１個の抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、または結合部位を組み込む少なくとも１個の抗体ドメインを含む融合タンパク質であり、特にここで、抗体は、ランダム化された、または人工アミノ酸配列を含む非天然存在抗体である。具体的には、抗体は、完全長ＩｇＧ１、二特異性ＩｇＧ１、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントのいずれかである。
【００５７】
具体的には、抗体は、マウス、ラマ、ウサギ、ヤギ、ウシ、キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体、重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖおよび単一ドメイン抗体、例えばＶＨ、ＶＨＨもしくはＶＬ、好ましくはヒトＩｇＧ抗体、またはマウスＩｇＧ抗体からなる群から選択される。
【００５８】
特定の態様によれば、抗体は、少なくとも抗体重鎖可変領域またはドメイン（ＶＨ）を含み、それは、例えば２Ｆ８−Ｇ６もしくは４Ｄ３−Ａ４抗体のＶＨ−ＣＤＲ１〜ＶＨ−ＣＤＲ３配列、またはその機能的に活性なＣＤＲバリアントのいずれかにより特性付けられる。ＣＤＲ配列は、特にＫａｂａｔの番号付けシステムに従って示される。
【００５９】
特定の側面によれば、抗体は、抗原結合部分としてＶＨドメインのみを含み、従って、例えば２Ｆ８−Ｇ６もしくは４Ｄ３−Ａ４抗体のＶＨ−ＣＤＲ１〜３または２Ｆ８−Ｇ６もしくは４Ｄ３−Ａ４抗体の機能的ＣＤＲバリアントを、それぞれのＶＬドメインを伴わずに含むことができる。
【００６０】
別の特定の側面によれば、抗体は、ＶＨドメインを含み、かつさらに抗体軽鎖可変領域またはドメイン（ＶＬ）を含み、それは、例えば２Ｆ８−Ｇ６もしくは４Ｄ３−Ａ４抗体のＶＬ−ＣＤＲ１〜ＶＬ−ＣＤＲ３配列、またはその機能的に活性なＣＤＲバリアントのいずれかにより特性付けられる。
【００６１】
別の特定の側面によれば、抗体は、ＶＨ−ＣＤＲ１〜３およびＶＬ−ＣＤＲ１〜３配列またはその機能的に活性なＣＤＲバリアントである６個のＣＤＲ配列により特性付けられる２Ｆ８−Ｇ６または４Ｄ３−Ａ４抗体のいずれか１つの結合部位を含む。
【００６２】
ＣＤＲ配列は、特にＫａｂａｔの番号付けシステムに従って示される。
特定の側面によれば、本発明は、特に配列リストにおいて同定される、または寄託された物質から得ることができるＶＨ配列のみもしくはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列両方のどちらかにより、またはそうでなければそれぞれのＣＤＲ配列により形成される特異的結合部位により特性付けられる親抗体と本質的に同じエピトープに結合するバリアントを含む、そのような親抗体の抗体バリアントを生成するための典型的な（親）２Ｆ８−Ｇ６または４Ｄ３−Ａ４抗体を提供する。そのような抗体は、例えば親抗体のそれぞれのＣＤＲまたは抗体の配列を改変することにより得られた機能的に活性なバリアント抗体であることができる。本明細書において記載されているあらゆる抗体配列は、例えば点変異による変動を受ける“親”配列と考えられることは、十分に理解されている。
【００６３】
実施例において記載される２Ｆ８−Ｇ６および４Ｄ３−Ａ４抗体は、マウス由来のものであり、それは、ヒト配列によりキメラ化されている。ヒト化および場合により親和性成熟により得られるバリアントは、周知の技法を用いて操作されることができる。これらのバリアント抗体は、標的抗原に結合し、従って機能的に活性であると考えられる。例えばそれぞれのＦＲまたはＣＤＲ配列において改変を有するバリアントＶＨまたはＶＬドメインであって、機能的に活性である、例えば親抗体と同じエピトープに結合する、または同じ結合部位を含む、または同じ結合特徴を有するバリアントＶＨまたはＶＬドメインも用いられることができることは、実現可能である。本明細書において記載される抗体のＦＲまたはＣＤＲ配列のいくつかが他の抗体のＦＲまたはＣＤＲ配列により交換されている事ができることも、実現可能である。
【００６４】
具体的には、抗体は、２Ｆ８−Ｇ６または４Ｄ３−Ａ４抗体のＣＤＲ配列のいずれかの機能的に活性なＣＤＲバリアントを含み、ここで、機能的に活性なＣＤＲバリアントは、以下：
ａ）親ＣＤＲ配列中の１、２、もしくは３個の点変異；および／または
ｂ）親ＣＤＲ配列の４つのＣ末端もしくは４つのＮ末端、もしくは４つの中央のアミノ酸位置のいずれかにおける１もしくは２個の点変異；および／または
ｃ）親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性；
の少なくとも１つを含み、好ましくはここで、機能的に活性なＣＤＲバリアントは、４または５アミノ酸未満からなるあらゆるＣＤＲ配列において１または２個の点変異を含む。
【００６５】
具体的には、機能的に活性なバリアントは、親抗体と、アミノ酸配列における、好ましくはＣＤＲにおける少なくとも１個の点変異において異なり、ここで、ＣＤＲアミノ酸配列のそれぞれにおける点変異の数は、０、１、２または３のいずれかである。
【００６６】
特定の側面によれば、点変異は、１以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失および／または挿入のいずれかである。
具体的には、抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、またはマウス由来の抗体である。
【００６７】
特定の側面によれば、本発明の抗体は、ＣＤＲおよびフレームワーク配列を含み、ここで、ＣＤＲおよびフレームワーク配列の少なくとも１つは、ヒト、ヒト化、キメラ、マウスまたは親和性成熟配列を含み、好ましくはここで、フレームワーク配列は、ＩｇＧ抗体の、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４亜型の、またはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体のものである。
【００６８】
特異的抗体は、例えば親抗体の製造可能性または耐容性を向上させるために、例えば低い免疫原可能性を有する向上した（変異した）抗体、例えば親抗体と比較してＣＤＲ配列および／またはフレームワーク配列のいずれかにおいて変異を有するヒト化抗体を提供するために、フレームワークが変異した抗体として提供される。
【００６９】
具体的には、抗体は、モノクローナル抗体である。特に、抗体は、非天然存在抗体、例えば人工可変および／または定常ドメイン配列、例えばランダム化された配列のライブラリーから得られる配列（例えばＦｃ配列のＣＤＲ）を含む非天然存在抗体である。
【００７０】
特定の側面によれば、抗体は、クレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成のリスクがある、またはそれを患っている対象の処置であって、対象における感染を制限するため、または前記の感染の結果もたらされる疾患状態を改善するため、好ましくは原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかの処置または予防のために、対象に有効量の抗体を投与することを含む処置における使用のために提供される。
【００７１】
好ましくは、療法的目的のために用いられる抗体は、標的病原体のＬＰＳを中和する中和抗体である。
従って、本発明は、さらに、それぞれの適応症において有効量の抗体を投与することにより対象を処置する方法を提供する。
【００７２】
具体的には、抗体は、対象における感染を制限するため、または前記の感染の結果もたらされる疾患状態を改善するため、好ましくは原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかの処置または予防のために、対象に有効量の抗体を投与することにより、用いられる。
【００７３】
具体的には、対象は、ヒトである。具体的には、対象は、健康である、または疾患を患っているあらゆるヒトである。具体的には、ヒトは、免疫無防備状態の患者もしくは免疫抑制患者またはその接触者である。
【００７４】
本発明は、さらに、本明細書で記載される抗体を含む医薬製剤であって、好ましくは非経口（例えば静脈内または筋内）または粘膜（例えば経口）配合物を含み、場合により薬学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤を含有する医薬製剤を提供する。粘膜配合物は、例えば乳化、ナノ粒子化、または噴霧される。
【００７５】
そのような医薬組成物は、抗体を唯一の有効物質として、または他の有効物質との組み合わせもしくは有効物質のカクテル、例えば少なくとも２もしくは３種類の異なる抗体の組み合わせもしくはカクテルで含有することができる。
【００７６】
本発明によれば、本発明の抗体は、特に医学的、診断的または分析的使用のために提供される。
本発明は、さらに、対象におけるクレブシエラ・ニューモニエの感染もしくはコロニー形成、または関連疾患、例えば原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、もしくは髄膜炎の診断のための本明細書で記載される抗体の使用を提供する。
【００７７】
具体的には、抗体は、本明細書で記載される使用のために提供され、ここで、対象におけるＯ３ｂ型のクレブシエラ・ニューモニエの全身感染またはコロニー形成が、前記の対象の生物学的試料を抗体と接触させることにより生体外で決定され、ここで、抗体の特異的免疫反応が、感染またはコロニー形成を決定する。
【００７８】
具体的には、生物学的試料は、体液または組織試料、好ましくは血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸器管標本、例えば気管内吸引物、胸水、肺タップ（ｌｕｎｇ  ｔａｐ）、鼻スワブもしくは痰、または前記のいずれかに由来するクレブシエラ・ニューモニエ分離株からなる群から選択される試料である。具体的には、体液の試料は、特異的免疫反応に関して試験され、その試料は、尿、血液、血液分離株または血液培養物、吸引物、痰、挿管された対象の洗浄液および便からなる群から選択される。
【００７９】
具体的には、生物学的試料は、その生物学的試料由来のクレブシエラ・ニューモニエ分離株を生成するために処理され、その分離株は、そのＯ３ｂ遺伝子型もしくは表現型および／またはＯ３ｂ抗原発現のレベルに関してさらに特性付けられることができる。細菌分離株を生成するための好ましい試料調製法は、細菌富化および培養工程を用いている。
【００８０】
具体的には、生物学的試料は、場合によりマトリックス効果を低減するためならびに試験の特異性および感度を増大させるための富化または精製の予備工程の後、試料において直接Ｏ３ｂ抗原レベルを決定するために処理される。予備工程は、生物学的標本を標準的な培養手順に従って培養すること、例えば（排他的にではないが）ルーチン的な微生物学実験室において実施されているような標準的な増殖培地中での血液培養ならびに標本の固体寒天上での培養（表現型決定−すなわち耐性記録を含む）を含む。細菌は、病毒性因子の発現を増進するために異なる増殖培地（標準的な培地および／または化学的に明確な培地；高栄養素、低栄養素、制限増殖培地組成物）においてＣＦＵの拡張のために継代培養されることができる。細菌懸濁液は、可能性のあるマトリックス効果を除去するために標準的な緩衝溶液中で調製および洗浄されることができる。
【００８１】
具体的には、Ｏ３ｂ抗原は、免疫アッセイの少なくとも１つ、好ましくはＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、ディプスティックアッセイおよびウェスタンブロット／免疫ブロットのいずれか、バイオセンサー、アレイ技術、または質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）により決定される。
【００８２】
具体的には、本発明に従う診断的使用は、臨床標本から回収された純粋なクレブシエラ・ニューモニエ培養物からインビトロでクレブシエラ・ニューモニエの血清型を決定し、その細菌がＯ３ｂ型の細菌であるか否かを決定することを指す。
【００８３】
本発明は、さらに、本明細書で記載される抗体の診断製剤であって、抗体およびさらなる診断試薬を以下の構成要素：
ａ）本明細書で記載される抗体；および
ｂ）さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに場合により抗体および診断試薬の少なくとも一方を固定するための固相；
を含む組成物または部分のキット中に含む診断製剤を提供する。
【００８４】
診断製剤は、場合により本発明の抗体およびさらなる診断試薬を組成物または部分のキット中に含む。
診断キットは、好ましくは生物学的試料中のＯ３ｂ抗原発現を決定するための全ての本質的な構成要素を、場合により一般的な、または非特異的な物質または構成要素、例えば水、緩衝剤または賦形剤を伴わずに含む。貯蔵安定キットは、好ましくは少なくとも６ヵ月間、より好ましくは少なくとも１または２年間貯蔵されることができる。それは、乾燥した（例えば凍結乾燥された）構成要素で構成されていることができ、かつ／または保存剤を含むことができる。
【００８５】
好ましい診断キットは、包装された、または事前包装された単位として提供され、例えばここで、構成要素は、１つの包装のみの中に収容され、それは、ルーチン的な実験を促進する。そのような包装は、例えば一連の生物学的試料の試験を実施するのに適した、１回以上の試験に必要な試薬を含むことができる。キットは、さらに適切には、標準または参照対照としてＯ３ｂ抗原製剤を含有することができる。
【００８６】
診断組成物は、生物学的試料を含む反応混合物中での使用の準備ができた試薬、またはそのような試薬の保存形態、例えば貯蔵安定形態、例えば凍結乾燥形態；（例えば液体窒素中での）スナップフリーズ形態、超低温貯蔵（−７０℃および−８０℃）、低温貯蔵（−２０℃および５℃）および制御された室温（１５℃〜２７℃）；例えばグリセロールストック、組織パラフィンブロック、（バッカル）スワブおよび他の標準的な生物学的試料貯蔵法としての標準的な試料貯蔵形態であることができ、その試薬の保存形態は、使用の準備ができた試薬を得るために再構成または調製されることができる。そのような使用の準備ができた試薬は、典型的には水溶液、特に（生理学的）緩衝条件（例えばＥＤＴＡ緩衝、リン酸緩衝液、ＨＢＳＳ、クエン酸緩衝液等）の形態である。
【００８７】
具体的には、さらなる診断試薬は、抗体および／またはその抗原に結合する抗体の反応産物と特異的に反応する試薬である。適切な診断試薬は、対象においてクレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成を診断またはモニターするための免疫アッセイを実施するために適切に用いられる。適切な診断試薬は、溶媒、緩衝液、染料、抗凝固薬、本発明の抗体および／または抗体−抗原免疫複合体に特異的に結合するリガンドであることができる。
【００８８】
具体的には、本発明は、場合により標識を有する抗体および／または標識を有するさらなる診断試薬、例えば抗体または抗体のそれぞれの標的抗原との免疫複合体を特異的に認識する試薬、ならびに／または抗体および診断試薬の少なくとも一方を固定するための固相を含有する、本発明の抗体の診断製剤を提供する。
【００８９】
具体的には、さらなる診断試薬は、診断標識または抗体および／もしくはその抗原に対する抗体結合の反応産物と特異的に反応する試薬である。
抗体または診断試薬は、直接標識されることも間接的に標識されることもできる。間接的な標識は、Ｏ３ｂ抗原に対する抗体または診断試薬と複合体を形成する標識された結合剤を含むことができる。
【００９０】
標識は、典型的にはアッセイにおいて検出されることができる分子または分子の一部である。典型的な標識は、発色団、蛍光色素、または放射性分子である。ある態様において、抗体または診断試薬は、検出可能な標識にコンジュゲートしており、それは、それら自体が検出可能である分子（例えば蛍光部分、電気化学的標識、金属キレート等）ならびに検出可能な反応産物の生成により（例えば酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、またはそれ自体が検出可能であることができる特異的な結合分子により（例えばビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルアルセネート、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ等）間接的に検出されることができる分子を含み得る。
【００９１】
好ましい診断製剤またはアッセイは、例えば試験されるべき試料から得られたＯ３ｂ型の細菌の抗体による凝集を試験するために、固相、例えばラテックスビーズ、金粒子等の上に固定された本発明の抗体を含む。
【００９２】
本発明は、さらに、クレブシエラ・ニューモニエにより引き起こされた対象におけるクレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成を診断する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）本明細書で記載される抗体を準備し、そして
ｂ）抗体が試験されるべき対象の生物学的試料中のＯ３ｂエピトープと特異的に免疫反応するかどうかを検出し、それによりクレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成を診断する。
【００９３】
具体的には、生物学的試料は、体液または組織試料、好ましくは血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸器管標本、例えば気管内吸引物、胸水、肺タップ、鼻スワブもしくは痰、または前記のいずれかに由来するクレブシエラ・ニューモニエ分離株からなる群から選択される試料である。
【００９４】
そのような診断は、特にＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエによる感染又はコロニー形成の症例、特にＯ３ｂ型のＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエへの対処において、必要が示される。場合により、診断アッセイは、様々なＯ３抗原を可能な限り識別するためにＯ３ｂ抗原ならびに／またはさらなるＯ３ａ抗原およびＯ３抗原のいずれかに結合する異なる特異性および／または親和性を有する２種類の異なる抗体を含むことができる。
【００９５】
特定の側面によれば、本発明は、対象のクレブシエラ・ニューモニエによる感染を、そのような感染に対する療法による処置（例えば免疫療法の使用、例えば本発明の抗体による処置）の基礎を提供するために、本発明の診断学または本発明の診断法により決定するためのコンパニオン診断を提供する。
【００９６】
特定の側面によれば、本発明は、対象のクレブシエラ・ニューモニエによる感染を、例えば生菌の量が限られている臨床標本から遊離のＬＰＳを決定することにより診断するための高感度ベッドサイド診断学を提供する。そのようなアッセイの感度は、特に１００ｎｇ未満、好ましくは１０ｎｇ未満のＬＰＳである。
【００９７】
本発明は、さらに、本明細書において記載される抗体をコードする単離された核酸を提供する。
本発明は、さらに、本明細書で記載される抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質性構築物、例えばポリペプチドもしくはタンパク質を含むかもしくはそれからなるタンパク質性構築物、またはタンパク質誘導体を発現させるためのコード配列を含む発現カセットまたはプラスミドを提供する。
【００９８】
本発明は、さらに、本明細書で記載される発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、さらに、本明細書で記載される抗体を生成する方法を提供し、ここで、宿主細胞は、前記の抗体を産生する条件下で培養または維持される。
【００９９】
特に好ましいのは、宿主細胞およびそのような宿主細胞を用いる生成法であり、その宿主細胞は、以下のものを含む：
−抗体軽鎖を発現するためのコード配列を組み込んでいる、本発明のプラスミドまたは発現カセット；および
−抗体重鎖を発現するためのコード配列を組み込んでいる、本発明のプラスミドまたは発現カセット。
【０１００】
さらなる側面によれば、本発明は、本発明の抗体を生成する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）非ヒト動物をクレブシエラ・ニューモニエのＯ３ｂ抗原で免疫し、抗体を産生するＢ細胞を単離し；
ｂ）単離されたＢ細胞から不死化した細胞株を形成し；
ｃ）細胞株をスクリーニングしてＯ３ｂ抗原ならびに場合によりＯ３ａ抗原および／またはＯ３抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し、例えばここで、他のＯ３抗原（単数または複数）のいずれかと比較したＯ３ｂ抗原に対する優先的結合が決定され；そして
ｄ）モノクローナル抗体またはそのモノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を有する抗体のヒト化もしくはヒト形態またはその誘導体を生成する。
【０１０１】
あるいは、方法は、スクリーニング工程として以下の工程を含む：末梢血から単離されたヒト提供者のＢ細胞のスクリーニングならびに標的抗原に結合するＢ細胞の単一細胞選別の後の免疫グロブリン遺伝子のクローニングおよび配列決定。
【０１０２】
本発明は、さらに、以下の工程を含む候補抗体を同定する方法を提供する：
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を準備し；そして
ｂ）試料中の抗体または試料により産生される抗体の本明細書で定められたＯ３ｂエピトープとの結合に関して評価し、ここで、抗体およびエピトープの間の陽性反応は、その抗体を候補抗体として同定する。
【０１０３】
本発明は、さらに、以下の工程を含む候補抗体を同定する方法を提供する：
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を準備し；そして
ｂ）試料中の抗体または試料により産生される抗体の本明細書で定められたＯ３ｂエピトープとの結合に関して評価し、ここで、抗体およびＯ３ｂエピトープの間の、本明細書で定められたＯ３ａエピトープおよび／もしくはＯ３エピトープと比較した、またはクレブシエラ・ニューモニエのあらゆる非Ｏ３  ＬＰＳ分子と比較した特異的陽性反応は、その抗体を候補抗体として同定する。
【０１０４】
具体的には、候補抗体がＯ３ｂエピトープ、Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープを認識する場合、汎Ｏ３特異的抗体が、同定される。
具体的には、汎Ｏ３特異的抗体は、Ｏ３ｂエピトープ、Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープのそれぞれに高い親和性で、例えば１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、さらにもっと好ましくは１０−９Ｍ未満のＫｄで結合することができる。
【０１０５】
具体的には、汎Ｏ３特異的抗体は、非Ｏ３エピトープ、例えばＯ１、Ｏ２、Ｏ４およびＯ１２とは交差反応しないか、または有意には交差反応しない。
本発明は、さらに、以下の工程を含む、本明細書で記載された抗体を生成する方法を提供する：
ａ）本明細書で記載されたように同定された候補抗体を準備し；そして
ｂ）候補抗体のモノクローナル抗体、もしくはヒト化もしくはヒト形態、または候補抗体と同じエピトープ結合特異性を有するその誘導体を生成する。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】クレブシエラ・ニューモニエの古典的Ｏ３抗原の構造。ＮおよびＱにより形成される二糖構造は、ペンタマンノースＯ抗原サブユニットをキャリヤー−プライマー（ＣＰ）に架橋するいわゆるアダプターである。最後のＯ抗原リピートは、ターミネーター分子（Ｔ）によりキャップされており、それは、実際にはKubler-Kielbら（４）により解明されたように３位に結合したメチルホスフェートである。
【図２】Ｏ３血清群に属するＫ．ニューモニエ株のＬＰＳパターンの不均一性。レーン１：ＰＣＭ−１１、２：Ｋｐ１４、３：Ｋｐ６２、４：Ｋｐ１８、５：Ｋｐ３５。
【図３】Ｋ．ニューモニエの異なるＯ３（レーン４〜９）および無関連の血清型（レーン１〜３）株から精製されたＬＰＳ試料のＰｒｏＱ染色（Ａ）および免疫ブロット（ＢおよびＣ）。免疫ブロットは、１μｇ／ｍｌのｍＡｂ  １Ｇ６−Ｂ８（Ｂ）または２Ｆ８−Ｇ６（Ｃ）を用いて実施された。レーン１：＃６３（Ｏ１：Ｋ２）、２：＃７９（Ｏ２：Ｋ２７）、３：Ｋｐ１０８（Ｏ５）、４：ＰＣＭ−１１、５：Ｋｐ１４、６：Ｋｐ６２、７：Ｋｐ１８、８：Ｋｐ３５、９：Ｋｐ８２。
【図４−１】Ｋ．ニューモニエＫｐ８１  ＬＰＳのＯ−ＰＳ画分１ａ、１ｂ、１ｃの１Ｈ  ＮＭＲ（左のパネル）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（右のパネル）スペクトル。挿入図の構造は、Ｋｐ８１  Ｏ−ＰＳを示す。＊ＭｅＰ−メチルホスフェート。
【図４−２】同上。
【図５】Ｋ．ニューモニエＫｐ８１  ＬＰＳの画分１ｂの陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。
【図６】様々な特異性のｍＡｂによる異なるＯ３抗原を発現している生きたクレブシエラ属の株の表面染色。
【図７】表１．Ｋ．ニューモニエＬＰＳ、Ｋｐ８１株から単離されたＯ−ＰＳ（１ａ）に関して観察された１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲの化学シフトおよび残基間の連結性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）。ＭｅＰ：３．６１、３．６３／５３．７、１１．０ＨｚのＪＰ，Ｈ。３１Ｐ、１Ｈ  ＨＭＢＣは、Ｐ（約２ｐｐｍ）ならびにＭｅＰのプロトン（３．６１および３．６３ｐｐｍ）およびＣ’のＨ−３（４．２６ｐｐｍ）の間の相関を示した。３１Ｐ、１Ｈ  ＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹは、Ｃ’残基のＰおよびＨ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５の間の相関を示した。糖残基のアノマー配置（α）は、１７１〜１７４Ｈｚ．b, c, d, e, f, gの重複した信号のＪＨ１，Ｃ１に基づいて決定された。
【図８】クレブシエラ・ニューモニエＯ３株の血清感受性。示されたＯ３亜型の対数中期培養物（３×１０３ＣＦＵ／ｍｌ）が、５０％正常ヒト血清中でインキュベートされた。細菌数が、０、９０、および１８０分の時点で２通りで決定された。
【図９】Ｏ３ａ（Ａ）またはＯ３ｂ（Ｂ）クレブシエラ・ニューモニエ株から抽出されたＬＰＳのＴＬＲ−４シグナル伝達のインビトロ中和。ＬＰＳは、９６ウェルプレートにおいて異なる濃度の抗体またはポリミキシンＢと混合され、室温で３０分間インキュベートされた。その後、ウェルあたり５×１０４個のｈＴＬＲ４  ＨＥＫ  Ｂｌｕｅ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）が、反応に添加され、混合物は、３７℃および５％ＣＯ２において一夜インキュベートされた。ＯＤ６３０における吸光度が、測定され、中和能力が、次の式：％阻害＝１００−［１００×ＳＥＡＰ（ｍＡｂ）／ＳＥＡＰ（ＬＰＳのみの対照）］により分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）誘導の％阻害として表され、ここで、ＳＥＡＰは、ＬＰＳの非存在下でのモック未処理対照の信号と比較したそれぞれの処置の信号である。
【図１０】４Ｄ３−Ａ４抗体の配列  Ｋａｂａｔシステムに従って同定された抗体４Ｄ３−Ａ４のＣＤＲ配列、ＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  １）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ２）、ＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ３）、ＣＤＲ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ４）、ＣＤＲ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ５）、ＣＤＲ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ６）、（Ａ）；およびＩＭＧＴシステムに従ってＣＤＲ領域を示す同じ抗体の列挙、ＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ７）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ８）、ＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ９）、ＣＤＲ４（ＳＥＱ  ＩＤ  １０）、ＣＤＲ５（ＳＥＱ  ＩＤ  １１）、ＣＤＲ６（ＳＥＱ  ＩＤ  １２）、（Ｂ）。  略語：  ＣＤＲ１  ＝  ＶＨ−ＣＤＲ１  ＣＤＲ２  ＝  ＶＨ−ＣＤＲ２  ＣＤＲ３  ＝  ＶＨ−ＣＤＲ３  ＣＤＲ４  ＝  ＶＬ−ＣＤＲ４またはＶＬ−ＣＤＲ１  ＣＤＲ５  ＝  ＶＬ−ＣＤＲ５またはＶＬ−ＣＤＲ２  ＣＤＲ６  ＝  ＶＬ−ＣＤＲ６またはＶＬ−ＣＤＲ３  可変および定常領域ＶＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  １５）およびＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  １６）を同定する重鎖の完全長配列（ＨＣ、ＳＥＱ  ＩＤ  １３）および軽鎖の完全長配列（ＬＣ、ＳＥＱ  ＩＤ  １４）（Ｃ）。  可変領域ＶＨまたはＶＬ：太字かつ下線が引かれた大文字  定常領域：通常の大文字
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
用語“抗体”は、本明細書で用いられる際、抗体ドメインからなる、またはそれを含むポリペプチドまたはタンパク質を指すものとし、それは、リンカー配列を含む、または含まない免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインとして理解されている。ポリペプチドは、ループ配列により連結された抗体ドメイン構造の少なくとも２個のベータストランドからなるベータバレル構造を含む場合、抗体ドメインとみなされる。抗体ドメインは、天然の構造のものであることができ、または例えば抗原結合特性もしくはあらゆる他の特性、例えば安定性もしくは機能的特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎおよび／もしくはＦｃガンマ受容体への結合を改変するために変異誘発もしくは誘導体化により改変されていることもできる。
【０１０８】
本明細書で用いられる抗体は、１以上の抗原またはそのような抗原の１以上のエピトープに結合するための特異的結合部位、特に単一の可変抗体ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨのＣＤＲ結合部位、または可変抗体ドメインの対、例えばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインを含む抗体、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、もしくは完全長抗体の結合部位を含む特異的結合部位を有する。
【０１０９】
用語“抗体”は、本明細書で用いられる際、特に例えばＩｇＧ型（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４亜型）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体の単一の可変抗体ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨ、または連結配列もしくはヒンジ領域を含むかもしくは含まない可変および／もしくは定常抗体ドメインの組み合わせ（可変抗体ドメインの対、例えばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインを含むかもしくはそれからなる抗体、例えば重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、もしくは完全長抗体を含む）を含むかまたはそれからなる抗体形式を指す。用語“完全長抗体”は、天然存在抗体単量体中に一般的に見られるＦｃドメインおよび他のドメインの少なくともほとんどを含むあらゆる抗体分子を指して用いられることができる。この句は、本明細書において、個々の抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するために用いられている。
【０１１０】
用語“抗体”は、特に単離された形態の抗体を含むものとし、それは、異なる標的抗原に対して向けられた、または抗体ドメインの異なる構造配置を含む他の抗体を実質的に含まない。なお、単離された抗体は、単離された抗体の例えば少なくとも１種類の他の抗体、例えば異なる特異性を有するモノクローナル抗体または抗体フラグメントとの組み合わせを含有する組み合わせ製剤中に含まれることができる。
【０１１１】
用語“抗体”は、ヒト種を含む動物、例えばヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、ラマ、ウシおよびウマを含む哺乳類、または鳥類、例えば雌鳥由来の抗体に適用されるものとし、その用語は、特に動物由来の配列、例えばヒト配列に基づく組み換え抗体を含むものとする。
【０１１２】
用語“抗体”は、さらに異なる種由来の配列、例えばマウスおよびヒト由来の配列を有するキメラ抗体に適用される。
用語“キメラ”は、抗体に関して用いられる際、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部分が特定の種由来の抗体または特定のクラスに属する抗体における対応する配列に相同性であり、一方でその鎖の残りの区分が別の種またはクラスにおける対応する配列に相同性である抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、ある哺乳類種由来の抗体の可変領域を模しており、一方で定常部分は、別の種由来の抗体の配列に相同性である。例えば、可変領域は、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域との組み合わせで、非ヒト宿主生物からの容易に利用可能なＢ細胞またはハイブリドーマを用いる現在既知の源に由来することができる。
【０１１３】
用語“抗体”は、さらにヒト化抗体に適用されることができる。
用語“ヒト化”は、抗体に関して用いられる際、実質的に非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有する分子を指し、ここで、その分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいている。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合した完全な可変ドメインを含むか、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むかのどちらであることもできる。抗原結合部位は、野生型であるか、または例えば１以上のアミノ酸置換により改変されていることができ、好ましくはヒトの免疫グロブリンにより近く似るように改変されていることができる。ヒト化抗体のある形態は、全てのＣＤＲ配列を保持している（例えば、マウス抗体からの６個のＣＤＲ全部を含有するヒト化マウス抗体）。他の形態は、元の抗体に関して変更されている１個以上のＣＤＲを有する。
【０１１４】
用語“抗体”は、さらにヒト抗体に適用される。
用語“ヒト”は、抗体に関して用いられる際、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むように理解されている。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボで体細胞突然変異により導入された変異）を、例えばＣＤＲ中に含むことができる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１以上のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックである動物から単離された抗体を含む。
【０１１５】
用語“抗体”は、特にあらゆるクラスまたは下位クラスの抗体に適用される。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は、抗体の主なクラスであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てられることができ、これらのいくつかは、さらに下位クラス（イソ型）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けられることができる。
【０１１６】
その用語は、さらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、特に組み換え抗体に適用され、その用語は、組み換え手段により調製、発現、作製または単離される全ての抗体および抗体構造、例えば動物、例えばヒトを含む哺乳類由来の抗体を含み、それは、異なる由来からの遺伝子または配列、例えばマウス、キメラ、ヒト化抗体、またはハイブリドーマ由来の抗体を含む。さらなる例は、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、または抗体もしくは抗体ドメインの組み換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、または抗体遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むあらゆる他の手段により調製、発現、作製もしくは単離された抗体を指す。
【０１１７】
用語“抗体”は、抗体の誘導体、特に機能的に活性な誘導体も指すことは、理解されている。抗体誘導体は、１以上の抗体ドメインもしくは抗体のあらゆる組み合わせおよび／または融合タンパク質として理解されており、ここで、抗体のあらゆるドメインは、１以上の他のタンパク質、例えば他の抗体、例えばＣＤＲループ、受容体ポリペプチドだけなくリガンド、骨格タンパク質、酵素、毒素等も含む結合構造のあらゆる位置において融合していることができる。抗体の誘導体は、様々な化学的技法、例えば共有結合カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合等による他の物質への会合または結合により得られることができる。抗体に結合する他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機および無機分子またはそのあらゆる組み合わせ（例えばＰＥＧ、プロドラッグまたは薬物）であることができる。特定の態様において、抗体は、生物学的に許容可能な化合物との特異的相互作用を可能にする追加のタグを含む誘導体である。本発明において使用可能なタグに関して、それが抗体のその標的に対する結合への負の影響を有しない、または許容可能な負の影響を有する限り、特定の制限は存在しない。適切なタグの例は、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、カルモジュリンタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、およびＳタグを含む。別の特定の態様において、抗体は、標識を含む誘導体である。用語“標識”は、本明細書において用いられる際、“標識された”抗体を生成するために抗体に直接または間接的にコンジュゲートしている検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であることができ（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒することもできる。
【０１１８】
本明細書で記載される好ましい誘導体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくはそれは、例えばＳＢＡ、ＯＰＫもしくはＬＡＬアッセイにおいて決定されるようにＫ．ニューモニエと戦う、または細菌負荷に対して保護する、または内毒血症を中和する効力を有する。
【０１１９】
具体的には、本発明の抗体由来の抗体は、Ｏ３ｂ抗原への差次的結合において機能的に活性である、例えばＯ３ｂ抗原に特異的または選択的に結合するそのＣＤＲ領域またはＣＤＲバリアントの少なくとも１以上を含むことができる。
【０１２０】
親抗体または抗体配列、例えば親ＣＤＲまたはＦＲ配列由来の抗体は、本明細書において特に、例えばインシリコもしくは組み換え工学により、またはそうでなければ化学的誘導体化もしくは合成により得られた変異体またはバリアントとして理解されている。
【０１２１】
用語“抗体”は、親ＣＤＲ配列の機能的に活性なＣＤＲバリアントを有する抗体および親抗体の機能的に活性なバリアント抗体を含む抗体のバリアントも指すことは、理解されている。
【０１２２】
具体的には、本発明の抗体由来の抗体は、そのＣＤＲ領域またはＣＤＲバリアントの少なくとも１個以上、例えば重鎖可変領域の少なくとも３個のＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域の少なくとも３個のＣＤＲを、そのＣＤＲもしくはＦＲ領域の少なくとも一方における、またはＨＣもしくはＬＣの定常領域における少なくとも１個の点変異を伴って含むことができ、機能的に活性であり、例えばＯ３ｂ抗原に特異的に結合する。
【０１２３】
用語“バリアント”は、例えば、特に例えば抗体の安定性、エフェクター機能もしくは半減期を操作するために定常ドメインにおいて、または例えば当該技術で利用可能な親和性成熟技法により抗原結合特性を向上させるために可変ドメインにおいて特定の抗体アミノ酸配列もしくは領域を削除する、交換する、その中に挿入断片を導入する、またはアミノ酸配列を化学的に誘導体化するための変異誘発法により得られた抗体、例えば変異体抗体または抗体のフラグメントを特に指すものとする。例えばランダム化技法により得られる所望の位置における点変異を含め、既知の変異誘発法のいずれが用いられることもできる。ある場合には、位置は、例えば抗体配列をランダム化するために可能なアミノ酸の全てまたは好ましいアミノ酸の選択のどちらかにより、ランダムに選ばれる。用語“変異誘発”は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を変更するためのあらゆる当該技術で認識されている技法を指す。好ましいタイプの変異誘発は、エラープローンＰＣＲ変異誘発、飽和変異誘発、または他の部位特異的変異誘発を含む。
【０１２４】
用語“バリアント”は、特に機能的に活性なバリアントを包含するものとする。
ＣＤＲ配列の“機能的に活性なバリアント”という用語は、本明細書で用いられる際、“機能的に活性なＣＤＲバリアント”として理解され、抗体の“機能的に活性なバリアント”は、本明細書で用いられる際、“機能的に活性な抗体バリアント”として理解される。機能的に活性なバリアントは、１個以上のアミノ酸の挿入、削除もしくは置換によるこの配列（親抗体または親配列）の改変、またはアミノ酸配列中の（または配列の遠位端のどちらかもしくは両方における）１個以上のアミノ酸残基、もしくはヌクレオチド配列内の（または配列の遠位端のどちらかもしくは両方における）１個以上のヌクレオチドの化学的誘導体化、例えばＣＤＲ配列において、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１、２、３、もしくは４個のアミノ酸、および／または中央の（すなわちＣＤＲ配列の中央における）１、２、３、もしくは４個のアミノ酸の配列の改変または化学的誘導体化の結果もたらされる配列を意味し、その改変は、この配列の活性に影響を及ぼさず、特にそれを損なわない。選択された標的抗原に対する特異性を有する結合部位の場合、抗体の機能的に活性なバリアントは、なお予め決定された結合特異性を有するであろうが、これは、例えば特定のエピトープに対する細かい特異性、親和性、結合力、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ比等を変更するように、変更されていることができるであろう。例えば、親和性成熟抗体は、特に機能的に活性なバリアント抗体として理解されている。従って、親和性成熟抗体中の改変されたＣＤＲ配列は、機能的に活性なＣＤＲバリアントとして理解されている。
【０１２５】
具体的には、本発明の抗体の機能的に活性なバリアントは、Ｏ３ｂ抗原に結合する効力、または他のＯ３抗原もしくはＫ．ニューモニエのあらゆる他の抗原と比較してＯ３ｂ抗原に優先的に結合する特異性もしくは選択性、例えばＯ３ｂ抗原に結合し、かつＫ．ニューモニエのＯ３ａ抗原にもＯ３抗原にも結合しない（または実質的に結合しない）、もしくはＯ３ａ抗原にもＯ３抗原にも実質的に結合しない、かつ／もしくはＫ．ニューモニエの他の抗原に結合しない特異性もしくは選択性を有する。
【０１２６】
機能的に活性なバリアントは、例えば親抗体の配列を変更することにより得られることができ、それは、例えば２Ｆ８−Ｇ６抗体と同じ結合部位を含むが結合部位以外の抗体領域内に改変を有する抗体、またはそのような親抗体から結合部位内であるが抗原結合を損なわない改変により得られた抗体であり、好ましくは親抗体と実質的に同じ生物学的活性またはさらには向上した活性（Ｏ３ｂ抗原に特異的または選択的に結合する能力を含む）を有するであろう。
【０１２７】
場合により、機能的に活性なバリアントは、例えば特異的結合アッセイまたはＫ．ニューモニエを標的とする機能試験により決定されるような実質的に同じ生物学的活性で、さらにＳＢＡアッセイにおける中和効力および／もしくは補体に媒介される殺傷の効力を含むことができ、かつ／または場合によりさらにＯＰＫアッセイにおける抗体に媒介される食作用の効力を含むことができ、かつ／または場合によりさらにＬＳＬアッセイにおける内毒素中和機能を含むことができる。
【０１２８】
標的抗原への結合または生物学的活性に関する用語“実質的に同じ”は、本明細書で用いられる際、実質的に同じ活性が、比較可能な抗体または親抗体に関して決定された活性の少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、例えば少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、または例えば２００％まで、またはさらに高い活性であることにより示されるような活性を指す。
【０１２９】
本明細書で記載された好ましいバリアントまたは誘導体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくはそれは、Ｏ３ｂ抗原に特異的に結合する効力、または他のＯ３抗原もしくはＫ．ニューモニエのあらゆる他の抗原と比較してＯ３ｂ抗原に優先的に結合する特異性もしくは選択性、例えばＯ３ｂ抗原に結合し、かつＫ．ニューモニエのＯ３ａ抗原にもＯ３抗原にも結合しない（または実質的に結合しない）、もしくはＯ３ａ抗原にもＯ３抗原にも実質的に結合しない、かつ／もしくはＫ．ニューモニエの他の抗原に結合しない特異性もしくは選択性を有する。好ましいバリアントは、Ｋ．ニューモニエの他の抗原に結合せず（少なくとも２対数、好ましくは少なくとも３対数のＫｄ値の差を有する）、かつ場合によりさらに、例えばＫ．ニューモニエを標的とする特異的結合アッセイまたは機能試験により決定されるような実質的に同じ生物学的活性で、ＳＢＡアッセイにおける補体に媒介される殺傷の効力を含み（例えば抗体を含有しない対照試料と比較した細菌計数における有意な低減を達成する）、かつ／または場合によりさらに、ＯＰＫアッセイにおける抗体に媒介される食作用の効力を含み（例えば抗体を含有しない対照試料と比較した細菌計数における有意な低減を達成する）、かつ／または場合によりさらに、ＬＡＬもしくはＴＬＲ４シグナル伝達アッセイにおける内毒素中和機能を含む（例えば抗体を含有しない対照試料と比較した内毒素活性の有意な低減を達成する）。様々なアッセイにおける活性の有意な低減は、典型的には少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％、約１００％（＋／−１％）の完全な低減に至るまでの低減を意味する。
【０１３０】
好ましい態様において、親抗体の機能的に活性なバリアントは、
ａ）抗体の生物学的に活性なフラグメントであり、そのフラグメントは、その分子の配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％もしくは９９％を含み；
ｂ）少なくとも１アミノ酸の置換、付加および／もしくは欠失によりその抗体から得られ、ここで、機能的に活性なバリアントは、その分子もしくはその一部、例えば抗体に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにもっと好ましくは少なくとも９０％、さらにもっと好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有し；かつ／または
ｃ）抗体もしくはその機能的に活性なバリアントおよびさらにそのポリペプチドもしくはヌクレオチド配列に対して異種である少なくとも１個のアミノ酸もしくはヌクレオチドからなる。
【０１３１】
本発明のある好ましい態様において、本発明に従う抗体の機能的に活性なバリアントは、上記のバリアントと本質的に同一であるが、それが異なる種の相同性配列に由来する点で、そのポリペプチドまたはヌクレオチド配列とはそれぞれ異なっている。これらは、天然存在バリアントまたは類似体と呼ばれる。
【０１３２】
用語“機能的に活性なバリアント”は、天然存在対立遺伝子バリアント、ならびに変異体またはあらゆる他の非天然存在バリアントも含む。当該技術で既知であるように、対立遺伝子バリアントは、そのポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない１個以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有することを特徴とする（ポリ）ペプチドの代わりの形態である。
【０１３３】
機能的に活性なバリアントは、例えば１個以上の点変異によるポリペプチドまたはヌクレオチド配列における配列の変更により得られることができ、ここで、その配列の変更は、本発明の組み合わせにおいて用いられる場合、変更されていないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持しているかまたは向上させている。そのような配列の変更は、（保存的）置換、付加、欠失、変異および挿入を含み得るが、それらに限定されない。
【０１３４】
特定の機能的に活性なバリアントは、ＣＤＲバリアントである。ＣＤＲバリアントは、ＣＤＲ領域における少なくとも１個のアミノ酸により改変されたアミノ酸配列を含み、ここで、前記の改変は、アミノ酸配列の化学的または部分的変更であることができ、その改変は、そのバリアントが未改変配列の生物学的特徴を保持することを可能にする。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変更は、１個〜数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の欠失もしくは置換によることができ、または１個〜数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の付加もしくは挿入によることもでき、または１個〜数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の化学的誘導体化によることもでき、またはそれらの組み合わせによることもできる。アミノ酸残基における置換は、例えばある疎水性アミノ酸で代わりの疎水性アミノ酸を置換する保存的置換であることができる。
【０１３５】
保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性において関連しているアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖を有する、酸性側鎖を有する、非極性脂肪族側鎖を有する、非極性芳香族側鎖を有する、非荷電極性側鎖を有する、小さい側鎖を有する、大きい側鎖を有するアミノ酸等である。
【０１３６】
点変異は、特に、結果として異なるアミノ酸に関する１以上の単一の（非保存的）アミノ酸またはアミノ酸のダブレットの置換もしくは交換、欠失または挿入において操作されていないアミノ酸配列と異なっているアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として理解されている。
【０１３７】
好ましい点変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を指す。この点において、アミノ酸は、６４種類の３つ組コドンによりコードされる２０種類の天然存在アミノ酸を指す。これらの２０種類のアミノ酸は、中性電荷、陽性電荷、および陰性電荷を有するアミノ酸に分けられることができる：
“中性”アミノ酸が、下記でそれらのそれぞれの３文字および１文字コードならびに極性と共に示されている：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）  非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）  極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）  非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）  極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）  非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）  非極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）  非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）  非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）  非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）  非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）  極性、中性；
スレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）  極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）  非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）  極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）  非極性、中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）  極性、陽性（１０％）  中性（９０％）。
【０１３８】
“正に”荷電したアミノ酸は、以下のアミノ酸である：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）  極性、陽性；および
リジン：（Ｌｙｓ、Ｋ）  極性、陽性。
【０１３９】
“負に”荷電したアミノ酸は、以下のアミノ酸である：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）  極性、陰性；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）  極性、陰性。
【０１４０】
本明細書で記載される抗体配列および相同体に関する“パーセント（％）アミノ酸配列同一性”は、配列をアラインメントして必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後の、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義されており、保存的置換は配列同一性の一部としては一切考えない。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１４１】
抗体バリアントは、特に、例えば糖鎖工学により生成される特定の糖鎖付加パターンを有する相同体、類似体、フラグメント、改変またはバリアントを含むように理解されており、それは、機能的であり、機能的均等物の役目を果たすことができる（例えば特異的標的に結合し、機能的特性を有する）。
【０１４２】
本発明の抗体は、Ｆｃエフェクター機能を示す可能性があり、示さない可能性もある。作用方式は、主にＦｃエフェクター機能を有しない中和抗体により媒介されるが、Ｆｃは、補体を集め、免疫複合体の形成により、循環からの標的抗原、例えば毒素の排除を助けることができる。
【０１４３】
特定の抗体は、活性なＦｃ部分を欠いていることができ、従って、抗体のＦｃ部分を含有しない、もしくはＦｃガンマ受容体結合部位を含有しない抗体ドメインで構成されているか、または例えばＦｃエフェクター機能を低減するような、特にＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣ活性を無効にするかもしくは低減するような改変によりＦｃエフェクター機能を欠いている抗体ドメインを含むかのどちらであることもできる。代わりの抗体が、Ｆｃエフェクター機能を増大させるような、特にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を高めるような改変を組み込むように設計されることができる。
【０１４４】
そのような改変は、Ｆｃエフェクター機能の低減または増大を達成するような変異誘発、例えばＦｃガンマ受容体結合部位における変異により、または抗体形式のＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣ活性に干渉するような誘導体もしくは薬剤により達成されることができる。
【０１４５】
Ｆｃエフェクター機能の有意な低減は、典型的にはＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性により測定された際の未改変の（野生型）形式の１０％未満、好ましくは５％未満のＦｃエフェクター機能を指すように理解される。Ｆｃエフェクター機能の有意な増大は、典型的にはＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性により測定された際の未改変の（野生型）形式の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％のＦｃエフェクター機能における増大を指すように理解される。
【０１４６】
抗体配列に関する“糖鎖を操作された”バリアントという用語は、糖鎖工学の結果として改変された免疫調節（例えば抗炎症）特性を有する糖鎖付加バリアントを指すものとする。全ての抗体は、重鎖定常領域中の保存された位置において炭水化物構造を含有し、それぞれのイソ型は、Ｎ−連結型炭水化物構造の異なるアレイを有し、それは、タンパク質の組み立て、分泌または機能活性に可変的に影響を及ぼす。ＩｇＧ１型抗体は、それぞれのＣＨ２ドメイン中のＮ２９７における保存されたＮ結合型糖鎖付加部位を有する糖タンパク質である。Ｎ２９７に結合した２つの複雑な２分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋もれてポリペプチド主鎖との広範囲にわたる接触を形成しており、それらの存在は、抗体にとってＦｃ受容体に結合してエフェクター機能を媒介するために必須である。例えばＮ２９７を例えばＡに変異させることによるＮ２９７またはＴ２９９におけるＮ−グリカンの除去は、典型的には結果として低減したＡＤＣＣを有する脱糖鎖された（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体形式をもたらす。具体的には、本発明の抗体は、糖鎖付加もしくは糖鎖を操作された、または脱糖鎖された抗体であることができる。
【０１４７】
抗体の糖鎖付加における主な違いは、細胞株の間で存在し、または異なる培養条件下で増殖した同じ細胞株に関してさえも存在する。細菌細胞における発現は、典型的には脱糖鎖された抗体を提供する。ヒトベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１およびベータ−ガラクトシドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１酵素をコードする遺伝子をトランスフェクションされたＣＨＯ細胞は、ガラクトシル化およびアルファ−２，６−シアリル化を有する抗体を提供する。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組み換え生成の間の糖鎖付加に影響を及ぼす因子は、増殖方式、培地の配合、培養密度、酸素添加（ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）、ｐＨ、精製スキーム等を含む。
【０１４８】
用語“抗原結合部位”または“結合部位”は、抗原結合に参加する抗体の部分を指す。抗原結合部位は、重（“Ｈ”）および／もしくは軽（“Ｌ”）鎖のＮ末端可変（“Ｖ”）領域またはその可変ドメインのアミノ酸残基により形成される。重および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様な区間（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）は、“超可変領域”と呼ばれ、フレームワーク領域として知られるより保存された隣接する区間の間に挟まれている。抗原結合部位は、結合するエピトープまたは抗原の三次元表面に相補的である表面を提供し、超可変領域は、“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”と呼ばれる。ＣＤＲ中に組み込まれている結合部位は、本明細書において“ＣＤＲ結合部位”とも呼ばれる。
【０１４９】
本明細書で用語“標的”または“標的抗原”と互換的に用いられている用語“抗原”は、抗体結合部位により認識される標的分子全体またはそのような分子のフラグメントを指すものとする。具体的には、免疫学的に関連する、一般に“エピトープ”、例えばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープと呼ばれる抗原の部分構造、例えばポリペプチドまたは炭水化物構造は、そのような結合部位により認識され得る。様々なＯ３抗原のような特定の抗原は、炭水化物（マンナン）構造であり、場合により人工のキャリヤー上に提供される単離された抗原として、または他の場合にはその抗原を発現するＫ．ニューモニエ細胞もしくはその細胞画分の形態で提供されることができる。
【０１５０】
用語“エピトープ”は、本明細書で用いられる際、特に、抗体の結合部位に対する特異的結合パートナーを完全に構成することができる、または特異的結合パートナーの一部であることができる分子構造を指すものとする。エピトープは、炭水化物、ペプチド構造、脂肪酸、有機物、生化学的物質、もしくは無機物、またはそれらの誘導体およびそれらのあらゆる組み合わせのいずれで構成されていることもできる。エピトープがペプチド構造、例えばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中に含まれている場合、それは、通常は少なくとも３アミノ酸、好ましくは５〜４０アミノ酸、より好ましくは約１０〜２０アミノ酸を含むであろう。エピトープは、線状エピトープであることも立体構造エピトープであることもできる。線状エピトープは、ポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一の区分で構成されている。線状エピトープは、隣接している、または重複していることができる。
【０１５１】
立体構造エピトープは、ポリペプチドが折り畳まれて三次構造を形成することにより寄せ集められたアミノ酸または炭水化物で構成され、そのアミノ酸は、線状配列中で必ずしも互いに隣接していない。具体的には、そしてポリペプチド抗原に関して、立体構造または不連続エピトープは、一次配列中で隔てられているがポリペプチドが折り畳まれて未変性のタンパク質／抗原になる際に組み立てられて分子の表面上の一貫した構造になる２個以上の別々のアミノ酸残基の存在を特徴とする。
【０１５２】
本明細書において、用語“エピトープ”は、特に抗体により認識される単一のエピトープ、または少なくとも２つの異なる抗原により共有されており場合により交差反応性抗体により認識される交差反応性エピトープを指すものとする。
【０１５３】
用語“発現”は、以下のように理解されている。発現産物、例えば本明細書で記載される抗体の所望のコード配列を含有する核酸分子および作動可能に連結された制御配列、例えばプロモーターが、発現目的のために用いられることができる。これらの配列により形質転換された、またはこれらの配列をトランスフェクションされた宿主は、コードされたタンパク質を生成することができる。形質転換を達成するために、その発現系は、ベクター中に含まれることができる；しかし、関連するＤＮＡは、宿主の染色体中に組み込まれることもできる。具体的には、その用語は、ベクターにより担持されて宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現に関する適切な条件下の宿主細胞および適合性ベクターを指す。
【０１５４】
コードＤＮＡは、例えば抗体のような特定のポリペプチドまたはタンパク質に関する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始、制御、または他の方法で媒介もしくは調節するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であることも異なる遺伝子由来であることもでき、同じ生物由来であることも異なる生物由来であることもできる。組み換えクローニングベクターは、しばしばクローニングまたは発現のための１以上の複製系、宿主中での選択のための１以上のマーカー、例えば抗生物質耐性、および１以上の発現カセットを含むであろう。
【０１５５】
本明細書で用いられる“ベクター”は、クローニングされた組み換えヌクレオチド配列の、すなわち組み換え遺伝子の転写および適切な宿主生物中でのそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列として定義されている。
【０１５６】
“発現カセット”は、発現産物をコードしておりベクター中に定められた制限部位において挿入されることができるＤＮＡコード配列またはＤＮＡの区分を指す。カセットの制限部位は、カセットの正しい読み枠での挿入を確実にするように設計されている。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１以上の制限部位において挿入され、次いでベクターにより宿主細胞中に送達可能なベクターＤＮＡと一緒に運び込まれる。挿入された、または付加されたＤＮＡを有するＤＮＡの区分または配列、例えば発現ベクターは、“ＤＮＡコンストラクト”と呼ばれることもできる。
【０１５７】
発現ベクターは、発現カセットを含み、さらに通常は宿主細胞中での自律複製のための起点またはゲノム組み込み部位、１以上の選択マーカー（例えばアミノ酸合成遺伝子または抗生物質、例えばｚｅｏｃｉｎ、カナマイシン、Ｇ４１８もしくはハイグロマイシンに対する耐性を与える遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列および転写ターミネーターを含み、その構成要素は作動可能であるように一緒に連結されている。用語“ベクター”は、本明細書で用いられる際、自律複製するヌクレオチド配列ならびにゲノム組み込み型ヌクレオチド配列を含む。一般的なタイプのベクターは、“プラスミド”であり、それは、一般に追加の（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二本鎖ＤＮＡの自己完結的分子であり、それは、適切な宿主細胞中に容易に導入されることができる。プラスミドベクターは、しばしばコードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡを挿入するために適した１以上の制限部位を有する。具体的には、用語“ベクター”または“プラスミド”は、それによりＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）が、宿主細胞中に、その宿主を形質転換して導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するために導入されることができる媒介物を指す。
【０１５８】
用語“宿主細胞”は、本明細書で用いられる際、特定の組み換えタンパク質、例えば本明細書で記載される抗体を産生するように形質転換された一次対象細胞およびそのあらゆる子孫を指すものとする。（意図的な、もしくは偶発性の変異または環境における違いのため）全ての子孫が親細胞と正確に同一であるわけではないが、そのような変化した子孫は、その子孫が元の形質転換された細胞の機能性と同じ機能性を保持している限り、これらの用語に含まれることは、理解されるべきである。用語“宿主細胞株”は、組み換え遺伝子を発現して組み換えポリペプチド、例えば組み換え抗体を生成するために用いられるような宿主細胞の細胞株を指す。用語“細胞株”は、本明細書で用いられる際、長期間にわたって増殖する能力を獲得している特定の細胞株の確立されたクローンを指す。そのような宿主細胞または宿主細胞株は、細胞培養状態で維持される、および／または組み換えポリペプチドを生成するように培養されることができる。
【０１５９】
用語“単離された”または“単離”は、本明細書で核酸、抗体または他の化合物に関して用いられる際、それが“実質的に純粋な”形態で存在するために天然に関係しているであろう環境からうまく分離されているそのような化合物を指すものとする。“単離された”は、他の化合物もしくは物質を含む人工もしくは合成混合物、または根本的な活性に干渉せず、例えば不完全な精製のために存在し得る不純物の存在の除外を必ずしも意味しない。特に、本発明の単離された核酸分子は、天然存在ではない核酸分子、例えばコドン最適化された核酸もしくはｃＤＮＡ、または化学合成された核酸分子を含むことも、意味されている。
【０１６０】
同様に、本発明の単離された抗体は、例えばその組み合わせが天然に存在しない別の抗体もしくは有効薬剤との組み合わせ製剤において提供されている場合、特に非天然存在であり、または天然存在抗体の最適化されたバリアントもしくは親和性成熟バリアントであり、または抗体の製造可能性を向上させるように操作されているフレームワーク領域を有する抗体である。そのような最適化または操作により、抗体は、天然の抗体の状況においては見付からないであろう１以上の合成配列または特徴を含む。
【０１６１】
本発明の核酸に関して、用語“単離された核酸”が、時々用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが由来する生物の天然存在ゲノム中でそのすぐ隣りにある配列から分離されているＤＮＡ分子を指す。例えば、“単離された核酸”は、ベクター、例えばプラスミドもしくはウイルスベクター中に挿入された、または原核もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれたＤＮＡ分子を含むことができる。ＲＮＡに適用される場合、用語“単離された核酸”は、主に上記で定義されたような単離されたＤＮＡ分子によりコードされているＲＮＡ分子を指す。あるいは、その用語は、それがその天然の状態で（例えば細胞または組織中で）会合しているであろう他の核酸からうまく分離されているＲＮＡ分子を指すことができる。“単離された核酸”（ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでも）は、さらに、生物学的または合成的手段により直接生成され、その生成の間に存在する他の構成要素から分離された分子を表すことができる。
【０１６２】
ポリペプチドまたはタンパク質、例えば本発明の単離された抗体またはエピトープに関して、用語“単離された”は、特にそれらが天然に関係している物質、例えばそれらがそれらの天然の環境、またはそのような調製がインビトロもしくはインビボで実施される組み換えＤＮＡ技術による場合にそれらが調製された環境（例えば細胞培養）において一緒に存在する他の化合物を含まない、または実質的に含まない化合物を指すものとする。単離された化合物は、希釈剤またはアジュバントと共に配合され、なお実際上単離されていることができる−例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、診断または療法において用いられる場合、薬学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤と混合されることができる。特に、本発明の単離された抗体は、それが単離された、かつ純粋な形態で提供されている、好ましくは単離された抗体を唯一の有効物質として含む製剤において提供されているため、Ｋ．ニューモニエ株に対して産生されたポリクローナル血清製剤とは異なる。しかし、これは、単離された抗体が限られた数のさらなる十分に定められた（単離された）抗体を含む組み合わせ製品において提供されることを除外しない。単離された抗体は、固体、半液体または液体キャリヤー、例えばビーズ上で提供されることもできる。
【０１６３】
用語“中和すること”または“中和”は、本明細書において最も広い意味で用いられており、中和が達成される機序に関わらず、病原体、例えばＫ．ニューモニエが対象に感染するのを阻害するあらゆる分子、または病原体が内毒素を産生することにより感染を促進するのを阻害すること、または内毒素がそれらの生物学的活性を発揮するのを阻害することを指す。中和は、例えば粘膜表面のＫ．ニューモニエによるコロニー形成、無菌の体の部位への侵入、および宿主における有害な生物学的信号の誘発（最悪の場合では敗血症性ショックの誘導）を阻害する抗体により達成されることができる。
【０１６４】
厳密な意味で、中和は、特定のＬＰＳのその同族の受容体への結合（例えばＴｏｌｌ様受容体−４複合体）、従って生物学的活性の誘発の阻害を意味する。この中和効力は、典型的には標準的なアッセイ、例えばインビトロまたはインビボ中和アッセイ、例えば内毒素の生物学的活性の阻害が例えば比色定量により測定されるＬＡＬ試験またはＴＬＲ−４ベースのアッセイにおいて決定される。
【０１６５】
Ｋ．ニューモニエと戦う、またはそれを中和する抗体は、病原体および病原性反応に干渉し、そうして感染を制限もしくは予防する、および／もしくはそのような感染の結果もたらされる疾患状態を改善する、またはＫ．ニューモニエの病態形成、特に宿主の無菌の体の区画／部位中または内への播種および複製を阻害することができる。この点で、中和抗体は、“防御抗体”としても理解されており、それは、その抗体が能動または受動免疫において観察される感染性因子に対する免疫の原因であることを意味する。特に、本明細書で記載される中和または防御抗体は、おそらく療法目的のために、例えば病原体により誘導される疾患症状、副作用または疾患の進行を防止する、改善する、処置する、または少なくとも部分的に停止させるための予防または療法のために用いられる。具体的には、防御抗体は、療法的適用後に（すなわち確立された感染に対して与えられる）、例えば血清殺菌もしくはオプソニン化貪食作用活性を誘導することにより生きたＫ．ニューモニエの細胞を殺す、もしくはその複製を妨げる、または細菌細胞全体もしくはそのＬＰＳ分子を無菌の体の部位から除去することができる。あるいは、予防的に適用される防御抗体は、上記の機序または他の機序の１つにより感染の確立（すなわちＫ．ニューモニエの無菌ではない部位から無菌の体の区画への拡散）を阻害する。
【０１６６】
本明細書で用いられる用語“生物学的試料”は、対象、例えばヒトから得られるあらゆる材料を指すものとし、それは、Ｋ．ニューモニエを含有し得る生物学的材料を含有するか、または含有する可能性がある。生物学的試料は、体液または細胞培養試料であることができる。本発明に従う使用のための試料の例は、患者試料、例えば組織または体液、特に呼吸器管標本、例えば気管内吸引物、胸水、肺タップ、鼻スワブもしくは痰、血液試料、便試料、皮膚および尿試料または脳脊髄液を含むが、それらに限定されない。
【０１６７】
生物学的試料は、典型的には複雑な生物学的マトリックス、例えば多数のタイプの生物学的分子および小さい有機分子を含有する複雑な粘性生物学的流体、例えばタンパク質物質に富む粘液性滲出物を含む。適切な添加剤または抽出手順が、試料中のマトリックスと関係している可能性のある非特異的結合を低減する、ならびに／または試料マトリックスの粘性もしくは固体構成要素を溶解する、および／もしくは分解することによりマトリックスの粘度を低下させるために、用いられることができる。生物からマーカーを遊離させる、ならびに／または生物学的マトリックスを分解する、および／もしくは液化させる試料調製法が、用いられることができる。分析されることができる生物学的マトリックスは、粘液を含有する試料、例えば鼻分泌物、痰（ｓｐｕｔｕｍ）、痰（ｐｈｌｅｇｍ）、咽頭滲出物、尿道または膣分泌物、およびそのような膜表面の洗浄物を含む。
【０１６８】
適切な試料調製法は、生物学的マトリックスのアッセイへの作用を低減するための方法工程を含む。そのような方法工程は、例えば捕捉、クロマトグラフィー、遠心分離および透析を含み得るが、それらに限定されない。
【０１６９】
対象から得られる物質は、細菌分離株の形態、例えば分離されたＫ．ニューモニエを培養するための細胞培養物または細胞培養産物の形態であることもできる。培養培地は、Ｋ．ニューモニエ集団のみを富化するように選択的であることができ、または非選択的であることもできる。
【０１７０】
細菌分離株の調製は、典型的には試料をＫ．ニューモニエの増殖を増進する条件下で維持し、それにより試料中のＫ．ニューモニエ集団を富化するための培養工程を含む。
一度分離株が得られたら、細菌は、さらに例えばＯ型および発現されているＯ３ｂ抗原のレベルを決定するために生化学的および／または血清学的試験により調べられることができる。いくつかのタイピング法が、Ｋ．ニューモニエ株を研究するために利用可能である。これらの方法は、典型的には血清タイピング、毒素タイピング、多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）、またはパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を含む遺伝的関係／系統に関する標準的なタイピングを含む。
【０１７１】
“Ｏ３ｂ型”とも呼ばれる用語“Ｏ３ｂ抗原”は、本明細書において用いられる際、特にマンナンポリマーおよび式（Ｉ）に含まれているトリマンノース繰り返し単位の少なくとも１つを含む構造を含む、式（Ｉ）において描写されているＫ．ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ抗原の（メチルホスフェートを含有する）炭水化物構造を指すものとする。そのような構造およびトリマンノース繰り返し単位は、今まで同定されていなかった。その構造は、Ｏ３ａ抗原（式（ＩＩ））またはＯ３抗原（式（ＩＩＩ））の構造と類似しているが異なる。従って、新規に同定されたＯ３ｂ構造が、異なるエピトープを含むことは、驚くべきことである。以前に、Ｏ３抗原のペンタマンノース構造を特異的に認識する抗体は、Ｏ３ａ抗原（テトラマンノース構造）を認識しないことが分かった。Ｏ３ａおよびＯ３多糖を定めるために必要とされるマンノース残基の最小数は、先行技術において、４であることが記載されており、抗体エピトープに関する最短の候補は、テトラマンナンであることが分かった（（７）参照）。Ｏ３ｂは、本明細書において新規の血清型決定因子として理解されており、それは、他のＯ３抗原の存在およびＯ３ｂ（トリマンノース）構造の非存在により特性付けられるＯ３ａまたはＯ３血清型と類似しているが異なる。
【０１７２】
Ｏ３ｂ構造を含むそれぞれのＯ抗原は、本明細書において“Ｏ３ｂ抗原”と呼ばれ、それは、本発明のＯ３ｂ特異的抗体により認識される“Ｏ３ｂエピトープ”を含む。Ｏ３ｂ抗原は、Ｏ３ｂのＯ型のＫ．ニューモニエのＬＰＳの外側部分として理解されており、それは、その中に組み込まれた１以上の特異的なＯ３ｂエピトープを含む表面の接近可能な抗原性炭水化物構造である。
【０１７３】
Ｏ３ｂ型のＫ．ニューモニエの遺伝子型は、特に遺伝子ｗｂｄＤおよびｗｂｄＡの配列における、Ｏ３およびＯ３ａ型Ｋ．ニューモニエ株のｒｆｂオペロン中の対応する遺伝子と比較した低い相同性により特性付けられる。
【０１７４】
少なくとも１つのＯ３ｂ構造を含むＬＰＳ  Ｏ抗原により特性付けられるあらゆるＫ．ニューモニエは、本明細書においてＯ３ｂ型のＫ．ニューモニエと呼ばれる。Ｏ３ｂ型のＫ．ニューモニエのＬＰＳは、Ｏ３ｂ構造またはＯ３ｂならびにＯ３ａおよび／もしくはＯ３構造の両方を含むことができる。
【０１７５】
Ｏ３ａ抗原は、Ｏ３ａ型のＫ．ニューモニエのＬＰＳの外側部分として理解されており、それは、その中に組み込まれた１以上の特異的なＯ３ａエピトープを含み、かつＯ３ｂ構造を一切含まない表面の接近可能な抗原性炭水化物構造である。
【０１７６】
Ｏ３抗原は、Ｏ３型のＫ．ニューモニエのＬＰＳの外側部分として理解されており、それは、その中に組み込まれた１以上の特異的なＯ３エピトープを含み、かつＯ３ｂ構造もＯ３ａ構造も一切含まない表面の接近可能な抗原性炭水化物構造である。
【０１７７】
用語“Ｏ３抗原”は、本明細書で用いられる際、Ｏ３ｂ、Ｏ３ａおよびＯ３抗原の全てを指すものとする。Ｏ３ｂ抗原を他のＯ３抗原（単数または複数）に対して比較する際、他のＯ３抗原（単数または複数）は、Ｏ３ａ抗原および／またはＯ３抗原を指すものとする。
【０１７８】
“汎Ｏ３抗体”により認識される標的抗原に関する用語“汎Ｏ３”は、本明細書で用いられる際、Ｏ３ｂ抗原、Ｏ３ａ抗原およびＯ３抗原の全てを指すものとし、交差反応性であるがＯ３特異的な抗体は、Ｏ３ｂ抗原、Ｏ３ａ抗原およびＯ３抗原のそれぞれを認識する。
【０１７９】
“特異的”結合、認識または標的化は、本明細書で用いられる際、結合剤、例えば抗体またはその抗原結合部分が、分子の不均一な集団において標的抗原またはそれぞれのエピトープに関する認識可能な親和性を示すことを意味する。従って、指定された条件（例えば免疫アッセイ）下で、結合剤は、標的Ｏ３ｂ抗原に特異的に結合し、試料中に存在する他の分子には有意な量では結合しない。特異的結合は、結合が、選択されたように標的の同一性、高い、中程度の、または低い結合親和性または結合力の点で選択的であることを意味する。選択的結合は、通常は、結合定数または結合力学が別の標的と比較した場合に少なくとも１０倍異なる（少なくとも１対数の差として理解される）場合に達成され、好ましくは、その違いは、少なくとも１００倍であり（少なくとも２対数の差として理解される）、より好ましくは少なくとも１０００倍である（少なくとも３対数の差として理解される）。
【０１８０】
用語“特異性”は、１以上の分子に結合する結合剤、例えば交差特異性結合剤に適用されることも、理解されている。少なくとも２つの異なる標的もしくはエピトープもしくはそのような標的のヌクレオチド配列を標的とする、または少なくとも２つの異なる標的上の交差反応性エピトープもしくはヌクレオチド配列を標的とする好ましい交差特異性（多特異性または交差反応性とも呼ばれる）結合剤は、標的に実質的に類似した結合親和性で、例えば１００倍未満の差もしくはさらには１０倍未満の差で、または実質的に異なる親和性で、例えば少なくとも１０倍もしくは少なくとも１００倍の差で特異的に結合する。第２標的と比べて第１標的に優先的に結合する、第１（例えばＯ３ｂ抗原）および第２（例えばＯ３ａ抗原および場合によりＯ３抗原も）標的の両方を認識する交差特異性結合剤は、典型的には第２標的と比較して第１標的に対する等しい親和性またはより高い親和性により特性付けられ、特にここで、第２抗原と比較して第１抗原に優先的に結合する差次的結合親和性は、特に少なくとも等しいか、または同等より大きく、例えば少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い。そのような差次的結合は、免疫アッセイ、好ましくは免疫ブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的方法により決定されることができる。
【０１８１】
本発明の好ましい抗体は、Ｏ３ｂ抗原に高い親和性で、特に高いオンおよび／もしくは低いオフ速度または高い結合力で結合している（Ｏ３ｂのみに結合するか、またはＯ３ａ抗原および／もしくはＯ３抗原と比較してＯ３ｂに優先的に結合する）。抗体の結合親和性は、通常は解離定数（ＫｄまたはＫＤ）として知られる抗原結合部位の半分が占められる抗体の濃度に関して特性付けられる。通常、Ｋｄ＜１０−７Ｍを有する、ある場合には、例えば療法目的に関して、より高い親和性を有する、例えばＫｄ＜１０−８Ｍ、好ましくはＫｄ＜１０−９Ｍ、さらにもっと好ましくはＫｄ＜１０−１０Ｍを有する結合剤は、高親和性結合剤とみなされる。
【０１８２】
なお、特に好ましい態様において、個々の抗原結合親和性は、例えば少なくとも２つの抗原への結合の際に、中程度の親和性であり、例えば１０−６Ｍ未満であり１０−８ＭまでのＫｄを有する。
【０１８３】
中程度の親和性の結合剤は、本発明に従って、好ましくは必要に応じて親和性成熟プロセスと合わせて提供されることができる。
親和性成熟は、それにより標的抗原に関する増大した親和性を有する抗体が生成されるプロセスである。当該技術で利用可能な親和性成熟ライブラリーを調製および／または使用するあらゆる１以上の方法が、本明細書で開示される本発明の様々な態様に従って親和性成熟抗体を生成するために用いられることができる。典型的なそのような親和性成熟法および使用、例えばランダム変異誘発、細菌変異誘発株継代、部位特異的変異誘発、変異ホットスポットターゲッティング（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｈｏｔｓｐｏｔｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、倹約変異誘発（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、抗体シャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、軽鎖シャフリング、重鎖シャフリング、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ１変異誘発、ならびに本明細書で開示されている本発明の様々な態様に従う方法および使用の実施を受け入れられる親和性成熟ライブラリーを生成および使用する方法は、例えば、以下：Prassler et al. (2009); Immunotherapy, Vol. 1(4), pp. 571-583; Sheedy et al. (2007), Biotechnol. Adv., Vol. 25(4), pp. 333-352；国際公開第２０１２／００９５６８号；国際公開第２００９／０３６３７９号；国際公開第２０１０／１０５２５６号；米国特許出願公開第２００２／０１７７１７０号；国際公開第２００３／０７４６７９号において開示されている方法を含む。
【０１８４】
アミノ酸変異誘発または免疫グロブリン遺伝子分節中の体細胞突然変異の結果としてを含め、抗体の構造変化により、抗原への結合部位のバリアントが生成され、より大きい親和性に関して選択される。親和性成熟抗体は、親抗体よりも数対数倍（ｌｏｇｆｏｌｄ）大きい親和性を示し得る。単一の親抗体が、親和性成熟を受けることができる。あるいは、標的抗原に対する類似の結合親和性を有する抗体のプールが、親和性成熟した単一の抗体またはそのような抗体の親和性成熟したプールを得るために変更される親構造として考えられることができる。
【０１８５】
本発明に従う抗体の好ましい親和性成熟バリアントは、結合の親和性において少なくとも２倍の増大、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、または好ましくは少なくとも１００倍の増大を示す。親和性成熟は、結合親和性Ｋｄ＜１０−８Ｍの特異的標的結合特性を有する本発明の抗体を得るための親分子のそれぞれのライブラリー（いずれも中程度の結合親和性を有する抗体を用いる）を用いる選択キャンペーン（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｃａｍｐａｉｇｎｓ）の過程で用いられることができる。あるいは、親和性は、本発明に従う抗体の親和性成熟により、１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満、またはさらには１０−１１Ｍ未満、最も好ましくはピコモル濃度範囲のＫｄに対応する高い値を得るように、さらにもっと増大させられることができる。
【０１８６】
特定の態様において、結合親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイにより決定される。特定の態様において、結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＦｏｒｔｅＢｉｏまたはＭＳＤアッセイにより決定される。特定の態様において、結合親和性は、速度論的方法により決定される。特定の態様において、結合親和性は、平衡／溶液法により決定される。
【０１８７】
用語“同じ特異性を有する”、“同じ結合部位を有する”または“同じエピトープに結合する”の使用は、均等なモノクローナル抗体が、同じまたは本質的に同じ、すなわち類似の免疫反応（結合）特徴を示し、予め選択された標的結合配列への結合に関して競合することを示す。抗体分子の特定の標的に関する相対的特異性は、例えばHarlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, 1988において記載されているような競合アッセイにより相対的に決定されることができる。
【０１８８】
用語“競合する”は、本明細書で抗体に関して用いられる際、第１抗体またはその抗原結合部分が、あるエピトープに、第１抗体のその同族エピトープとの結合の結果が第２抗体の非存在下での第１抗体の結合と比較して第２抗体の存在下で検出可能なほどに低下するように、第２抗体またはその抗原結合部分の結合と十分に類似した様式で結合することを意味する。第２抗体のそのエピトープへの結合も第１抗体の存在下で検出可能なほどに低下するという代替案は、事実で有り得るが、事実である必要はない。すなわち、第２抗体が第１抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第１抗体は第２抗体のそのエピトープへの結合を阻害し得る。しかし、それぞれの抗体が他方の抗体のその同族のエピトープとの結合を（同程度まで、より大きい程度まで、またはより低い程度までのいずれであれ）検出可能なほどに阻害する場合、その抗体は、それらのそれぞれのエピトープ（単数または複数）の結合に関して互いと“競合する”と言われる。Ｏ３ｂ抗原への結合に関して例示された抗体のいずれかと競合する抗体は、本発明により特に包含される。
【０１８９】
本明細書における“競合的に結合すること”または競合は、競合ＥＬＩＳＡ分析により、またはＦｏｒｔｅＢｉｏ分析により決定された際に約３０％より大きい相対的阻害を意味する。特定の状況において、例えば、競合分析が、抗原の結合の意図される機能を有するように設計された新規の抗体を選択する、またはスクリーニングするために用いられる場合、何が競合の適切なレベルであるかの基準として、相対的阻害のより高い閾値を設定することが、望ましい可能性がある。従って、例えば、抗体が十分に競合的であると考えられる前に、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはさらには少なくとも１００％の相対的阻害が検出される競合的結合に関する基準を設定することが、可能である。
【０１９０】
用語“診断キット”は、本明細書で用いられる際、キットまたは部分のセットを指し、それは、組み合わせまたは混合物で、１種類以上の分析物もしくはマーカーの測定／検出を実施して疾患もしくは疾患状態を決定する、または疾患もしくは疾患の進行を予測するために用いられることができる。特に、キットは、少なくとも検出分子および／または結合剤を含有し、ここで、検出分子および／または結合剤は、分析物もしくはマーカーまたはそのような分析物もしくはマーカーの反応産物を特異的に認識する。加えて、様々な試薬またはツールが、キット中に含まれることができる。診断キットは、マイクロビーズまたは平面状のアレイもしくはウェルのような支持体、バイオマーカーの単離のための試薬、特異的な標的に向けられた検出分子、核酸の配列決定または増幅のためのプライマーのような試薬、核酸ハイブリダイゼーションのためのアレイ、検出可能な標識、溶媒または緩衝剤等、様々なリンカー、様々なアッセイ構成要素、ブロッキング剤等を含め、対象の方法を実施するためのあらゆる有用な試薬を含むことができる。
【０１９１】
キットは、診断法における使用のための説明書も含むことができる。そのような説明書は、例えば、キット中に含まれるデバイス、例えば診断目的のために生物学的試料を調製する、例えばマーカーを決定する前に細胞および／またはタンパク質含有画分を分離するためのツールまたはデバイス上で提供されることができる。キットは、貯蔵安定形態で好都合に提供されることができる（例えば少なくとも６ヵ月間の貯蔵寿命を有する商業的なキット）。
【０１９２】
特定の診断キットは、対象のマーカーに対して向けられた検出分子を含む、または検出分子の固定されたパターン化されたアレイを有する、好ましくは第１マーカーに対して向けられた第１結合試薬を含有する第１領域および第２マーカーに対して向けられた第２結合試薬を含有する第２領域を含む固体支持体も含む。
【０１９３】
特に、サンドイッチ形式が、用いられることができる。例えば、１種類以上の結合剤が、生物学的試料との接触の前に支持体にコンジュゲートしている。１種類以上の結合剤は、検出分子の役目を果たすために検出可能標識にコンジュゲートしていることができる。他の態様において、１種類以上の結合剤は、検出可能標識にコンジュゲートしている。この構成において、１種類以上の結合剤は、捕捉剤の役目を果たすために生物学的試料との接触の前に支持体にコンジュゲートしていることができる。さらに、１種類以上の結合剤は、生物学的試料との接触の前に支持体にコンジュゲートしていることができ、かつ／または１種類以上の結合剤は、検出可能標識にコンジュゲートしている。そのような場合、１種類以上の結合剤は、捕捉剤および検出剤のどちらかまたは両方の役目を果たすことができる。
【０１９４】
診断キットは、特に免疫アッセイにおける使用のために提供され、ここで、検出分子は、免疫反応により分析物またはマーカーに結合する特異的な結合剤である。そのような結合剤は、標的抗原に結合する抗体または抗体フラグメントまたは抗体様骨格であることができる。
【０１９５】
適切な免疫アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、ディップスティックアッセイおよびウェスタンブロットのいずれかである。
【０１９６】
用語“Ｋ．ニューモニエ感染”および“Ｋ．ニューモニエのコロニー形成”は、以下のように理解されている：クレブシエラ・ニューモニエは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバーであるグラム陰性細菌である。それは、遍在性細菌であり、それは、ヒト宿主にも、典型的には腸または上気道においてコロニー形成することができる。日和見病原体であり、それは、免疫系により適切に制御されない場合、これらの部位から無菌の体の部位に侵入することができる。これらの部位における制御されない細菌複製は、大部分においてＫ．ニューモニエから放出される内毒素（すなわちＬＰＳ）分子により媒介される炎症を誘導するであろう。菌血症の場合、内毒素分子は、敗血症性ショックを誘発し得る。
【０１９７】
Ｋ．ニューモニエのコロニー形成は、対象が十分に高い濃度のＫ．ニューモニエ細菌をそれらが検出され得る部位において有するが、細菌が徴候も症状も引き起こしていないことを意味する。コロニー形成は、長期間持続する可能性があり、解決は、生物に対する免疫応答、他の生物からのその部位における競合、そして時々抗微生物薬の使用により影響を受ける。
【０１９８】
一般に、Ｋ．ニューモニエにより引き起こされる菌血症は、既知の従来の抗細菌療法、例えば抗生物質、ステロイドおよび非ステロイド系の炎症阻害剤による処置により、うまく処置されることができる。本発明は、Ｋ．ニューモニエを特異的に認識する抗生物質を用いる新規の免疫療法を提供し、それは、場合により抗細菌または抗炎症療法と組み合わせられる。Ｋ．ニューモニエ感染を有する患者を処置するために用いられる典型的な抗生物質は、アミノグリコシド系、セファロスポリン系、アミノペニシリン系、カルバペネム系、フルオロキノロン系、チゲサイクリン、コリスチン等である。
【０１９９】
多剤耐性（ＭＤＲ）Ｋ．ニューモニエは、特に、３クラス以上の抗生物質、例えば以下の薬剤／群：ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバペネム系、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、フルオロキノロン系、ニトロフラントイン、トリメトプリム（およびその組み合わせ）、ホスホマイシン、ポリミキシン系、クロラムフェニコール、アズトレオナム、またはチゲサイクリンへの耐性を示す株として理解されている。
【０２００】
最近の抗生物質耐性株の出現により、この性質の菌血症の処置は、有意により困難になっている。Ｋ．ニューモニエ疾患を発現している患者は、Ｋ．ニューモニエ疾患を有しない患者よりも長い病院およびＩＣＵ滞在、高い死亡率、およびより大きい健康管理費用を有する。患者がＫ．ニューモニエにより重度にコロニー形成されている場合、Ｋ．ニューモニエ疾患を処置するよりもむしろ防止することにより、患者のケアが、向上する可能性があり、院内感染が、低減する可能性がある。
【０２０１】
Ｋ．ニューモニエ疾患は、特にＫ．ニューモニエ感染により引き起こされる疾患として理解されている。そのような疾患は、局所性および全身性疾患を含む。疾患の重症例は、例えば原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎である。
【０２０２】
用語“組み換え”は、本明細書で用いられる際、“遺伝子工学により調製されたこと、またはその結果であること”を意味するものとする。組み換え宿主は、特に発現ベクターもしくはクローニングベクターを含み、またはそれは、特に宿主に対して外来の核酸配列を用いて、組み換え核酸配列を含有するように遺伝子操作されている。組み換えタンパク質は、それぞれの組み換え核酸を宿主中で発現させることにより生成される。用語“組み換え抗体”は、本明細書で用いられる際、組み換え的手段により調製、発現、作製または単離される抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである、もしくは染色体導入されている動物（例えばマウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）その抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体、（ｃ）組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーまたは抗体の抗原結合配列のライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むあらゆる他の手段により調製、発現、作製または単離された抗体を含む。そのような組み換え抗体は、例えば抗体成熟の間に起こる再編成および変異を含むように操作された抗体を含む。本発明によれば、当該分野の技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技法が、用いられることができる。そのような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)”を参照。
【０２０３】
選択的結合は、当該技術で既知の組み換え抗体最適化法によりさらに向上させられることができる。例えば、本明細書で記載される免疫グロブリン鎖の可変領域の特定の領域は、選択されたＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域の軽鎖シャフリング、デスティネイショナル変異誘発（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、ＣＤＲアマルガム化（ＣＤＲ  ａｍａｌｇａｍａｔｉｏｎ）、および定方向変異誘発を含む１種類以上の最適化戦略を施されることができる。
【０２０４】
用語“対象”は、本明細書で用いられる際、温血哺乳類、特にヒトまたは非ヒト動物を指すものとする。Ｋ．ニューモニエは、臨床的に重要なヒトの病原体であり、それは、獣医学において現れつつある懸念でもある。それは、広い範囲の非ヒト動物種に存在する。従って、用語“対象”は、特にイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタおよび家禽を含む動物を指す。特に、本発明の医学的使用またはそれぞれの処置の方法は、Ｋ．ニューモニエ感染と関係する疾患状態の予防または処置を必要とする対象に適用される。その対象は、Ｋ．ニューモニエ感染のリスクがある、または早期もしくは後期疾患を含め疾患を患っている患者であることができる。用語“患者”は、予防的または療法的処置のどちらかを受けているヒトおよび他の哺乳類の対象を含む。従って、用語“処置”は、予防的および療法的処置の両方を含むことが意味されている。
【０２０５】
対象は、例えばＫ．ニューモニエ疾患状態の予防または療法のために処置される。特に、感染のリスクがあるかもしくはそのような疾患もしくは疾患の再発を発現しているかのどちらかである対象、またはそのような感染および／もしくはそのような感染と関係する疾患を患っている対象が、処置される。
【０２０６】
具体的には、用語“予防”は、病態形成の開始の防止または病態形成のリスクを低減するための予防的手段を包含することが意図されている防止手段を指す。
具体的には、処置は、病気の起因物としてのＫ．ニューモニエの病態形成に干渉することによることができる。
【０２０７】
用語“実質的に純粋な”または“精製された”は、本明細書で用いられる際、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の化合物、例えば核酸分子または抗体を含む調製物を指すものとする。純度は、その化合物に適した方法（例えばクロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析等）により測定される。
【０２０８】
本明細書において化合物、例えば本発明の抗体の“有効量”または“十分量”という用語のいずれとも互換的に用いられている“療法上有効量”という用語は、対象に投与された際に臨床的結果を含む有益な、または所望の結果を達成するために十分な量または活性であり、従って、有効量またはその同意語は、それが適用されている文脈に依存する。
【０２０９】
有効量は、そのような疾患または障害を処置、予防または阻害するために十分である化合物の量を意味することが意図されている。疾患の文脈において、本明細書で記載される抗体の療法上有効量は、特に疾患または病気を処置する、調節する、弱める、逆行させる、またはそれに影響を及ぼすために用いられ、それは、Ｋ．ニューモニエの病態形成、例えば粘膜表面の接着およびコロニー形成、無菌の体の部位内での制御されない複製、ならびに細菌生成物による宿主細胞の毒性の阻害から利益を得る。
【０２１０】
そのような有効量に対応するであろう化合物の量は、様々な要因、例えば所与の薬物または化合物、医薬配合、投与経路、疾患または障害のタイプ、処置されている対象または宿主の同一性等に依存して変動するであろうが、それでもなお当業者によりルーチン的に決定されることができる。
【０２１１】
例えばそれを必要とするヒト患者に提供される本明細書で記載される抗体の療法上有効量は、特に０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲、さらにもっと好ましくは２０ｍｇ／ｋｇまで、１０ｍｇ／ｋｇまで、５ｍｇ／ｋｇまでであることができるが、例えば急性疾患状態を処置するために、より高い用量の必要が示される可能性がある。用量は、非常に強力な抗体が用いられる場合、はるかに低いことができる。そのような場合、有効量は、０．００５〜５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜１ｍｇ／ｋｇの範囲であることができる。
【０２１２】
さらに、療法上有効量の本発明の抗体を用いた対象の処置または予防計画は、１回の投与で構成されることができ、あるいは一連の適用を含むことができる。例えば、抗体は、少なくとも１年に１回、少なくとも半年に１回または少なくとも１ヵ月に１回投与されることができる。しかし、別の態様において、抗体は、対象に、所与の処置に関しておよそ週あたり１回からおよそ毎日の投与まで投与されることができる。処置期間の長さは、様々な要因、例えば疾患の重症度、急性または慢性疾患のどちらか、患者の年齢、抗体形式の濃度および活性に依存する。処置または予防のために用いられる有効投与量は、特定の処置または予防計画の過程にわたって増大または減少し得ることも、理解されるであろう。投与量における変化は、当該技術で既知の標準的な診断アッセイの結果もたらされ、それにより明らかになる可能性がある。ある場合には、慢性投与が必要とされる可能性がある。
【０２１３】
Ｏ３ｂに高度に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、特に汎Ｏ３抗体は、クレブシエラ・ニューモニエの同定のための診断試薬として大きな可能性を有する。さらに、特にヒト化の後、これらのｍＡｂは、Ｋ．ニューモニエ感染症の（例えば高リスク群に関する）予防および処置のために用いられるために適している。
【０２１４】
Ｏ３血清群は、以前は単一の独特の構造であると考えられていたが、それは、驚くべきことに、繰り返し単位内のマンノース残基の数において異なる３種類の異なる亜型を含むことが分かった。構造におけるこれらの変化は、Ｏ３血清群に特異的なモノクローナル抗体の反応性パターンにより証明される抗原性の違いに相当する。Ｏ３血清群内の３種類の異なる血清群全てと交差反応するモノクローナル抗体の選択は、推定上の製品開発に関して高い関連性を有する。
【０２１５】
マンノース重合、すなわちＯ抗原サブユニットの合成をコードする対応する遺伝子の遺伝学的分析は、観察された構造変化を正当化する違いを明らかにした。遺伝学的および表現型的な違いに基づいて、我々は、Ｏ３ａおよびＯ３ｂと名付けられた新しく記載された血清型を、それらをＯ３血清型として知られている公開された“古典的な”ペンタマンノース構造（図１−（３）において公開されている）と区別するために提案する。
【０２１６】
１５０を超える臨床分離株のコレクションのスクリーニングは、新規に記載されたＯ３ｂ血清型があらゆる他のマンナン型（すなわちＯ３、Ｏ３ａおよびＯ５）を合わせたよりも多い分離株により発現されていることを示した。
【０２１７】
Ｏ抗原繰り返し単位の構造的多様性が、本明細書においてＬＰＳ分離パターンに基づいてＯ３血清群Ｋ．ニューモニエ株の間で示唆されている。Ｏ３側鎖をコードするｒｆｂオペロン内での遺伝学的不均一性は、提案された構造的な違いを確証した。これらのバリアントの１つに特異的であるか、またはＯ３血清群内の３つのタイプ全てと交差反応するかのどちらかであるｍＡｂが、選択された。
【０２１８】
生化学的構造分析の予備的データは、ペンタマンノース繰り返し単位構造が四糖および三糖繰り返し単位により置き換えられ、従って異なる抗原構造に相当することを暗示した；本明細書において血清型Ｏ３ａおよびＯ３ｂと名付けられた。
【０２１９】
クレブシエラ属のＯ３ａサブユニットは、大腸菌のＯ９ａのそれと同一であるが、Ｏ３ｂ抗原は、新規の構造に相当し、従ってＯ３ｂに特異的な抗体ならびにＯ３、Ｏ３ａおよびＯ３ｂに交差反応する抗体は、例えば免疫療法および／または免疫診断のための貴重な手段である。Ｏ３交差反応性（汎Ｏ３反応性）ｍＡｂは、全てのクレブシエラ属の分離株のほぼ４分の１（２３．２％）に特異的であり、従ってそのようなｍＡｂの診断用および／または療法用製品候補としてのさらなる開発が、正当化され得る。
【０２２０】
一度所望の結合特性を有する抗体が同定されたら、抗体フラグメントを含むそのような抗体は、例えばハイブリドーマ技法または組み換えＤＮＡ技術を含む当該技術で周知の方法により生成されることができる。
【０２２１】
組み換えモノクローナル抗体は、例えば、必要とされる抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、組み換え宿主細胞にそのコード配列を発現のために、周知の組み換え発現ベクター、例えば本発明のプラスミドまたは抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセット（単数または複数）を用いてトランスフェクションすることにより、産生されることができる。組み換え宿主細胞は、原核および真核細胞、例えば上記の原核および真核細胞であることができる。
【０２２２】
特定の側面によれば、ヌクレオチド配列は、抗体をヒト化するための、または抗体の親和性もしくは他の特徴を向上させるための遺伝子操作のために用いられることができる。例えば、定常領域は、抗体がヒトにおける臨床試験および処置において用いられる場合、免疫反応を避けるためにヒトの定常領域により近く似るように操作されることができる。Ｏ３ｂ標的に対するより大きな親和性およびクレブシエラ・ニューモニエに対するより大きな有効性を得るために、抗体配列を遺伝子操作することが、望ましい可能性がある。当業者には、１以上のポリヌクレオチドの変更が、抗体に対してなされ、なおその標的Ｏ３ｂ抗原に対する結合能力を維持することができることは、明らかであろう。
【０２２３】
様々な手段による抗体分子の生成は、一般に十分に理解されている。例えば、米国特許第６３３１４１５号(Cabilly et al.)は、抗体の組み換え生成のための方法を記載しており、ここで、重鎖および軽鎖は、単一の細胞中で単一のベクターから、または２つの別々のベクターから同時に発現される。Wibbenmeyerら(1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)ならびにLeeおよびKwak(2003, J. Biotechnology 101 :189-198)は、宿主細胞の別々の培養物中で発現されたプラスミドを用いる、別々に生成された重鎖および軽鎖からのモノクローナル抗体の生成を記載している。抗体の生成に関連する様々な他の技法が、例えばHarlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1988)において提供されている。
【０２２４】
所望であれば、本発明の抗体、例えば２Ｆ８−Ｇ６抗体またはその機能的バリアントが、配列決定され、次いでポリヌクレオチド配列が、発現または増殖のためにベクター中にクローニングされることができる。抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター中で維持されることができ、次いで宿主細胞は、将来の使用のために拡張され、凍結されることができる。細胞培養における組み換えモノクローナル抗体の生成は、Ｂ細胞からの抗体遺伝子の当該技術で既知の手段によるクローニングにより実施されることができる。
【０２２５】
別の側面において、本発明は、本発明の組み換え抗体の生成に関してコードする配列を含む単離された核酸を提供する。
抗体をコードする核酸は、あらゆる適切な特徴を有することができ、あらゆる適切な特色またはその組み合わせを含むことができる。従って、例えば、抗体をコードしている核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのハイブリッドの形態であることができ、非天然存在塩基、改変された主鎖、例えば核酸の安定性を促進するホスホロチオエート主鎖、または両方を含むことができる。核酸は、好都合には標的宿主細胞（単数または複数）における所望の発現、複製、および／または選択を促進する特色を含む発現カセット、ベクターまたは本発明のプラスミド中に組み込まれることができる。そのような特色の例は、複製起点構成要素、選択遺伝子構成要素、プロモーター構成要素、エンハンサーエレメント構成要素、ポリアデニル化配列構成要素、終結構成要素等を含み、その数多くの適切な例が、既知である。
【０２２６】
本開示は、さらに、本明細書で記載されるヌクレオチド配列の１以上を含む組み換えＤＮＡコンストラクトを提供する。これらの組み換えコンストラクトは、ベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターと連結させて用いられ、あらゆる開示された抗体をコードするＤＮＡ分子が、その中に挿入される。
【０２２７】
モノクローナル抗体は、培養状態の細胞株により抗体分子を生成するあらゆる方法、例えば組み換え真核（哺乳類または昆虫）または原核（細菌）宿主細胞の培養を用いて生成される。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例は、Kohlerらのハイブリドーマ法(1975, Nature 256:495-497)およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001;およびBrodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク), pp. 51-63)を含む。
【０２２８】
本発明の抗体は、ハイブリドーマ法を用いて同定または獲得されることができる。そのような方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターが、免疫処置のために用いられたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を引き出すために免疫される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫されることができる。次いで、リンパ球は、適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合させられてハイブリドーマ細胞を形成する。
【０２２９】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、またはインビトロ結合アッセイ、例えば放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定される。
【０２３０】
次いで、ｍＡｂは、そのＯ３ｂ抗原の特異的結合に関する、そしておそらくあらゆる他のＯ３またはＯ抗原と比較してＯ３ｂ抗原に優先的に結合するその差次的結合親和性に関するさらなる試験および例えば異なる診断または療法目的のための抗体の操作のために、ハイブリドーマ上清から精製されることができる。
【０２３１】
Ｏ３ｂ特異的抗体は、ある場合には、単一のＯ３ｂ抗原に対するスクリーニングを通して現れる。差次的に結合するクローンを単離する可能性を増大させるために、異なる抗原に対して進行的にスクリーニングすることにより多数の選択圧を適用するであろう。特別なｍＡｂ選択戦略は、Ｏ３ｂおよびＯ３ａもしくはＯ３構成要素または他のＫ．ニューモニエ抗原を、交互の様式で用いる。
【０２３２】
所望の選択的結合特性を有する抗体を同定するためのスクリーニング法は、抗体配列またはその抗原結合配列を提示するライブラリーを用いるディスプレイ技術（例えばファージ、細菌、酵母もしくは哺乳類細胞の使用；または核酸情報をそれぞれの（ポリ）ペプチドに翻訳するインビトロディスプレイシステム）により行われることができる。反応性は、例えば標準的なアッセイを用いるＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングまたはフローサイトメトリーを伴う表面染色に基づいて評価されることができる。
【０２３３】
単離された抗原（単数または複数）は、例えば抗体ライブラリー、例えば酵母ディスプレイ式抗体ライブラリーから抗体を選択するために用いられることができる。
例えば、本発明は、特にＯ３ｂ特異的抗体を提供し、それは、Ｏ３ｂ抗原に結合する特異性を有する抗体を同定するためのプロセスにより、例えば特異的発見選択スキームにより得られる。従って、Ｏ３ｂ標的との反応性を示す抗体を含む抗体ライブラリーは、標的との反応性に関して選択されることができる。
【０２３４】
本発明は、さらに、本明細書で記載される抗体および薬学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、本発明に従って、大量瞬時注射もしくは注入として、または継続的な注入により投与されることができる。そのような投与手段を容易にするために適した医薬用キャリヤーは、当該技術で周知である。
【０２３５】
薬学的に許容可能なキャリヤーは、一般に、本発明により提供される抗体または関連する組成物もしくは組み合わせと生理学的に適合性であるあらゆるおよび全ての適切な溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。薬学的に許容可能なキャリヤーのさらなる例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにあらゆるそれらの組み合わせを含む。
【０２３６】
あるそのような側面において、抗体は、所望の投与経路に適した１種類以上のキャリヤーと組み合わせられることができ、抗体は、例えばラクトース、スクロース、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル類、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩類、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールのいずれかと混合され、場合によりさらに従来の投与のために打錠またはカプセル封入されることができる。あるいは、抗体は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントガム、および／または様々な緩衝液中で溶解されることができる。他のキャリヤー、アジュバント、および投与方式は、医薬の技術分野において周知である。キャリヤーは、制御放出材料または時間遅延材料、例えば単独もしくはろう剤を伴うモノステアリン酸グリセリンもしくはジステアリン酸グリセリン、または当該技術で周知の他の材料を含むことができる。
【０２３７】
追加の薬学的に許容可能なキャリヤーは、当該技術で既知であり、例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳにおいて記載されている。液体配合物は、溶液、エマルジョンまたは懸濁液であることができ、賦形剤、例えば懸濁化剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤、およびキレート剤を含むことができる。
【０２３８】
本発明の抗体および１種類以上の療法的に有効な薬剤が配合されている医薬組成物が、意図されている。本発明の抗体の安定な配合物は、所望の程度の純度を有する前記の免疫グロブリンを、任意の薬学的に許容可能なキャリヤー、賦形剤または安定化剤と、凍結乾燥された配合物または水溶液の形態で混合することにより、貯蔵のために調製される。インビボ投与のために用いられるべき配合物は、特に無菌であり、好ましくは無菌水溶液の形態である。これは、滅菌濾過膜を通す濾過または他の方法により容易に成し遂げられる。本明細書で開示される抗体および他の療法的に有効な薬剤は、イムノリポソームとして配合されることもでき、かつ／またはマイクロカプセル中に封入されていることもできる。
【０２３９】
本発明の抗体を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻内、耳内（ｉｎｔｒａｏｔｉｃａｌｌｙ）、経皮、粘膜、局所、例えばゲル、軟膏、ローション、クリーム等、腹腔内、筋内、肺内（例えば吸入可能な技術または肺送達システムを用いる）、経膣、非経口、直腸、または眼内を含む様々な方法でなされることができる。
【０２４０】
非経口投与のために用いられる典型的な配合物は、例えば無菌溶液、エマルジョンまたは懸濁液としての皮下、筋内または静脈内注射に適した配合物を含む。
一態様において、本発明の抗体は、例えば疾患を修正または防止する単独療法としての、対象に投与される唯一の療法的に有効な薬剤である。
【０２４１】
別の態様において、本発明の抗体は、クレブシエラ・ニューモニエを標的とするためにカクテル中で、そのカクテルが例えば疾患を修正または防止する併用療法として対象に投与される１種類より多くの療法的に有効な薬剤を含有するように、さらなる抗体と組み合わせられ、例えば混合物または部分のキット中で組み合わせられる。
【０２４２】
さらに、本発明の抗体は、標準的な処置、例えば抗生物質、ステロイド系および非ステロイド系の炎症阻害剤、ならびに／または他の抗体ベースの療法を含むがそれらに限定されない１種類以上の他の療法または予防剤との組み合わせで、例えば抗細菌または抗炎症剤を利用して投与されることができる。
【０２４３】
併用療法は、特に、例えばクレブシエラ・ニューモニエによる感染を処置するために用いられるような標準的な計画を利用している。これは、抗生物質、例えばチゲサイクリン、コリスチン、ポリミキシンＢ、および非ベータラクタム系阻害剤を伴う、または伴わないベータラクタム系阻害剤を含むことができる。
【０２４４】
併用療法において、抗体は、混合物として、または１以上の他の療法計画と同時に（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ）、例えば同時（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）療法の前、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）もしくは後のいずれで投与されることもできる。
【０２４５】
本発明の抗体またはそれぞれの医薬製剤の生物学的特性は、生体外で細胞、組織、および生物全体での実験において特性付けられることができる。当該技術で既知であるように、薬物は、疾患もしくは疾患モデルに対する処置に関する薬物の有効性を測定するために、または薬物の薬物動態、薬力学、毒性および他の特性を測定するために、しばしばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含むがそれらに限定されない動物においてインビボで試験される。動物は、疾患モデルと呼ばれ得る。療法は、しばしばヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むがそれらに限定されないマウスにおいて試験される。そのような実験法は、適切な半減期、エフェクター機能、（交差）中和活性および／または能動もしくは受動免疫療法の際の免疫反応を有する療法薬として、または予防薬として用いられる抗体の可能性の決定のために意味のあるデータを提供することができる。あらゆる生物、好ましくは哺乳類が、試験のために用いられることができる。例えば、それらのヒトに対する遺伝的類似性のため、霊長類、サルが、適切な療法モデルである可能性があり、従って対象の薬剤または組成物の有効性、毒性、薬物動態、薬力学、半減期、または他の特性を試験するために用いられることができる。ヒトにおける試験が、最終的に薬物としての認可のために必要とされ、従って、これらの実験は当然意図されている。従って、本発明の抗体およびそれぞれの医薬組成物は、ヒトにおいてそれらの療法的もしくは予防的有効性、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または他の臨床的特性を決定するために試験されることができる。
【０２４６】
２Ｆ８−Ｇ６と名付けられた抗体、特に抗体軽鎖および／または重鎖は、DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b / Inhoffenstraβe 7B, 38124 Braunschweig (DE)に本明細書で示された受入番号の下で寄託された生物学的材料により特性付けられる。
【０２４７】
ＤＳＭ  ３２０５９は、２Ｆ８−Ｇ６  ＶＨのコード配列を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌宿主細胞である：大腸菌２Ｆ８−Ｇ６  ＶＨ  ＝  ＤＳＭ  ３２０５９、寄託日：２０１５年６月４日；寄託者：Ａｒｓａｎｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ、オーストリア、ウィーン。
【０２４８】
ＤＳＭ  ３２０６０は、２Ｆ８−Ｇ６  ＶＬのコード配列を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌宿主細胞である：大腸菌２Ｆ８−Ｇ６  ＶＬ  ＝  ＤＳＭ  ３２０６０；寄託日：２０１５年６月４日；寄託者：Ａｒｓａｎｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ、オーストリア、ウィーン。
【０２４９】
以下の定義の主題は、考えられた本発明の態様である：
１．クレブシエラ・ニューモニエのリポ多糖（ＬＰＳ）Ｏ３ｂ抗原構造のエピトープを特異的に認識する単離された抗体であって、それが、１以上のＯ３ｂ抗原マンノースホモポリマー繰り返し単位を含む式（Ｉ）の構造を含むＯ３ｂ抗原中に組み込まれたＯ３ｂエピトープであり、ここで、式（Ｉ）は、以下の構造であり：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｎ
式中、
ＭｅＰは、メチルホスフェートであり；そして
ｎは、０〜５０である、上記抗体。
【０２５０】
２．定義１の抗体であって、Ｏ３ａエピトープおよび／またはＯ３ｂエピトープと交差反応し、ここで、
ａ）Ｏ３ａエピトープは、式（ＩＩ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３ａ抗原中に組み込まれており、１以上のＯ３ａ抗原マンノースホモポリマー繰り返し単位を含み、ここで、式（ＩＩ）は、以下の式であり：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｍ
式中、ｍは、０〜５０であり；
そして
ｂ）Ｏ３エピトープは、式（ＩＩＩ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３抗原中に組み込まれており、１以上のＯ３抗原マンノースホモポリマー繰り返し単位を含み、ここで、式（ＩＩＩ）は、以下の式であり：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｍ
式中、ｍは、０〜５０である、上記抗体。
【０２５１】
３．定義２の抗体であって、Ｏ３ｂエピトープに特異的に結合し、かつＯ３ａエピトープおよびＯ３エピトープと交差反応する汎Ｏ３特異的抗体である抗体。
４．定義３の抗体であって、２Ｆ８−Ｇ６抗体であるか、またはその特異的エピトープに競合的に結合し、ここで、２Ｆ８−Ｇ６抗体が、以下：
ａ）寄託された物質ＤＳＭ  ３２０５９中に組み込まれているＶＨ；および
ｂ）寄託された物質ＤＳＭ  ３２０６０中に組み込まれている軽鎖ＶＬ；
により特性付けられる抗体。
【０２５２】
５．定義３の抗体であって、４Ｄ３−Ａ４抗体であるか、またはその特異的エピトープに競合的に結合し、ここで、４Ｄ３−Ａ４抗体が、以下：
ａ）それぞれＳＥＱ  ＩＤ  １、２、３、４、５、および６（番号付けはＫａｂａｔに従う）により同定されるＣＤＲ１、２、３、４、５、および６である６個のＣＤＲ配列；もしくはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ７、８、９、１０、１１、および１２（番号付けはＩＭＧＴに従う）により同定されるＣＤＲ１、２、３、４、５、および６である６個のＣＤＲ配列；ならびに／または
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  １５により同定されるＶＨ配列およびＳＥＱ  ＩＤ  １６により同定されるＶＬ配列である、ＶＨおよびＶＬ配列；ならびに／または
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  １３により同定されるＨＣ配列およびＳＥＱ  ＩＤ  １４により同定されるＬＣ配列である、ＨＣおよびＬＣ配列；
のいずれかにより特性付けられる抗体。
【０２５３】
６．定義１の抗体であって、Ｏ３ａエピトープと比較してＯ３ｂエピトープに優先的に結合し、またはＯ３ａエピトープと交差反応せず、ここで、Ｏ３ａエピトープは、クレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３ａ抗原構造のＯ３ａ抗原繰り返し単位中に組み込まれており、ここで、Ｏ３ａ抗原繰り返し単位は、式（ＩＩ）のマンノースホモポリマーである抗体。
【０２５４】
７．定義１の抗体であって、Ｏ３エピトープと比較してＯ３ｂエピトープに優先的に結合し、またはＯ３エピトープと交差反応せず、ここで、Ｏ３エピトープは、クレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３抗原構造のＯ３ａ抗原繰り返し単位中に組み込まれており、ここで、Ｏ３抗原繰り返し単位は、式（ＩＩＩ）のマンノースホモポリマーである抗体。
【０２５５】
８．定義６または７の抗体であって、Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープのいずれとも交差反応しない抗体。
９．定義１〜８のいずれかの抗体であって、クレブシエラ・ニューモニエの非Ｏ３  ＬＰＳ分子のエピトープと交差反応しない抗体。
【０２５６】
１０．定義１〜９のいずれかの抗体であって、Ｏ３ｂエピトープに１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、さらにもっと好ましくは１０−９Ｍ未満のＫｄで結合する親和性を有する抗体。
【０２５７】
１１．定義１〜１０のいずれかの抗体であって、Ｏ３ｂ  ＬＰＳ分子を発現するクレブシエラ・ニューモニエ株の内毒素を中和する抗体。
１２．定義１〜１１のいずれかの抗体であって、完全長モノクローナル抗体、結合部位を組み込む少なくとも１個の抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、または結合部位を組み込む少なくとも１個の抗体ドメインを含む融合タンパク質であり、特にここで、抗体が、ランダム化された、または人工アミノ酸配列を含む非天然存在抗体である抗体。
【０２５８】
１３．定義１〜１２のいずれかの抗体であって、ヒト、ヒト化、キメラ、またはマウス由来である抗体。
１４．定義１〜１３のいずれかの抗体であって、モノクローナル抗体である抗体。
【０２５９】
１５．定義１〜１４のいずれかの抗体であって、クレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成のリスクがある、またはそれを患っている対象の処置であって、対象における感染を制限するため、または前記の感染の結果もたらされる疾患状態を改善するため、好ましくは原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかの処置または予防のために、対象に有効量の抗体を投与することを含む処置における使用のための抗体。
【０２６０】
１６．定義１〜１４のいずれかの抗体を含む医薬製剤であって、好ましくは非経口または粘膜配合物を含み、場合により薬学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤を含有する医薬製剤。
【０２６１】
１７．定義１〜１４のいずれかの抗体の使用であって、対象におけるクレブシエラ・ニューモニエの感染もしくはコロニー形成、または関連疾患、例えば原発性および続発性菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎の診断のための使用。
【０２６２】
１８．定義１７に従う使用であって、対象が、免疫無防備状態の患者もしくは免疫抑制患者またはその接触者である使用。
１９．定義１〜１４のいずれかの抗体の診断製剤であって、抗体およびさらなる診断試薬を組成物またはキットの部分において含み、以下の構成要素：
ａ）定義１〜１４のいずれかの抗体；ならびに
ｂ）さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに場合により抗体および診断試薬の少なくとも一方を固定するための固相；
を含む診断製剤。
【０２６３】
２０．定義１９の診断製剤であって、さらなる診断試薬が、抗体および／またはその抗原に結合する抗体の反応産物と特異的に反応する診断標識または試薬である診断製剤。
２１．  クレブシエラ・ニューモニエ株により引き起こされた対象におけるクレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成を診断する方法であって、以下の工程：
ａ）定義１〜１４のいずれかの抗体を準備し、そして
ｂ）抗体が試験されるべき対象の生物学的試料中のＯ３ｂエピトープと特異的に免疫反応するかどうかを検出し、それによりクレブシエラ・ニューモニエの感染またはコロニー形成を診断する；
を含む方法。
【０２６４】
２２．定義２１の方法であって、生物学的試料が、体液または組織試料、好ましくは、血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸器管標本、例えば気管内吸引物、胸水、肺タップ、鼻スワブもしくは痰からなる群から選択され、または前記のいずれかに由来するクレブシエラ・ニューモニエ分離株である方法。
【０２６５】
２３．定義１〜１４のいずれかの抗体をコードする単離された核酸。
２５．定義１〜１４のいずれかの抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質性構築物を発現させるためのコード配列を含む発現カセットまたはプラスミド。
【０２６６】
２５．定義２４の発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞。
２６．定義１〜１４のいずれかの抗体を生成する方法であって、請求項２５の宿主細胞が、前記の抗体を産生する条件下で培養または維持される方法。
【０２６７】
２７．候補抗体を同定する方法であって、以下の工程：
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を準備し；そして
ｂ）試料中の抗体または試料により産生される抗体の定義１において定義されたＯ３ｂエピトープとの結合に関して評価し、ここで、抗体およびエピトープの間の陽性反応は、その抗体を候補抗体として同定する；
を含む方法。
【０２６８】
２８．候補抗体を同定する方法であって、以下の工程：
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を準備し；そして
ｂ）試料中の抗体または試料により産生される抗体の定義１において定義されたＯ３ｂエピトープとの結合に関して評価し、ここで、抗体およびＯ３ｂエピトープの間の、定義２において定義されたＯ３ａエピトープおよび／もしくはＯ３エピトープと比較した、またはクレブシエラ・ニューモニエのあらゆる非Ｏ３  ＬＰＳ分子と比較した特異的陽性反応は、その抗体を候補抗体として同定する；
を含む方法。
【０２６９】
２９．定義１〜１４のいずれかの抗体を生成する方法であって、以下の工程：
ａ）定義２７または２８に従って同定された候補抗体を準備し；そして
ｂ）候補抗体のモノクローナル抗体、または該候補抗体のヒト化もしくはヒト形態、または候補抗体と同じエピトープ結合特異性を有するそれらの誘導体を生成する；
を含む方法。
【０２７０】
本発明は、さらに、以下の実施例により、それに限定されることなく説明される。
【実施例】
【０２７１】
実施例１：Ｏ３血清群のＫ．ニューモニエ株の間の異なるＯ抗原繰り返し単位の大きさの同定
ＬＰＳが、商業的なＬＰＳ精製キット（Ｉｎｔｒｏｎ）を用いて、異なるＯ３株から精製された（ＩＩＴＤ  ＰＡＮ  Ｗｒｏｃｌａｗ，ポーランド微生物コレクション（Ｐｏｌｉｓｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）からのＰＣＭ−１１  Ｏ３：Ｋ１１；臨床コレクションならびに無関係な血清型からのＫｐ１４、Ｋｐ６２、Ｋｐ１８およびＫｐ３５）。約１μｇのＬＰＳが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ＰｒｏＱ（登録商標）Ｅｍｅｒａｌｄ  ３００リポ多糖染色キット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により染色された。
【０２７２】
臨床試料および商業的コレクション由来の株から得られたＬＰＳが、分離および染色された。興味深いことに、図２において可視化されているように、ＬＰＳのパターンは、重要な変動性を示した。３つの異なるタイプが、識別されることができ、それは、Ｏ抗原の形態上の（ｍｏｄａｌ）長さ（すなわちＯ抗原サブユニットの平均数）だけでなく、“梯子の段（ｌａｄｄｅｒ−ｓｔｅｐｓ）”の分離においても異なっていた。この典型的な梯子様構造を考慮して、個々の“梯子の段”は、１つの単一のＯ抗原繰り返し単位の違いに相当し、梯子の段の間の距離は、繰り返し単位の大きさに関して特徴的である。明らかに、Ｏ３血清群内の３種類の異なるＬＰＳ分子は、それらの繰り返し単位の異なる大きさを示している：レーン２および３＞レーン１＞レーン４および５。これに基づいて、我々は、Ｏ抗原繰り返し単位内のマンノース分子の数において異なる、Ｏ３血清群の３種類のバリアントが存在することを提案した。
【０２７３】
実施例２：全てのＯ３血清型と交差反応するｍＡｂの同定
Ｂａｌｂ／ｃマウスが、１０７ＣＦＵ個の生きたＫ．ニューモニエ原型株ＰＣＭ−１１（Ｏ３：Ｋ１１、ＩＩＴＤ  ＰＡＮ  Ｗｒｏｃｌａｗ、ポーランド微生物コレクション）を用いて２週間の間隔で３回静脈内に免疫処置された。マウスのハイブリドーマが、標準的な手順により生成され、免疫株由来の精製されたＯ多糖に対する特異的なマウスｍＡｂを分泌するクローンが、選択された。
【０２７４】
上記のように分離されたＬＰＳ試料が、免疫ブロッティングのためにＰＶＤＦ膜に転写された。膜は、１μｇ／ｍｌのマウスｍＡｂおよび二次ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと反応させられた。ブロットは、ＥＣＬ試薬により現像された。
【０２７５】
ＰＣＭ−１１で免疫処置されたマウスから選択されたＯ３特異的ｍＡｂ（図３中のレーン４）は、異なる反応性パターンを示した。１Ｇ６−Ｂ８に代表される一部のｍＡｂ（図３Ｂ）は、主に免疫処置株と反応したが、他のＯ３株とははるかに少なく反応し、異なる染色パターンを示した（図２および３Ａ）。対照的に、２Ｆ８−Ｇ６に代表される他のｍＡｂは、全てのＯ３バリアントに対して比較できるほどに反応した（図３Ｃ）。これらのｍＡｂはいずれも、非Ｏ３  ＬＰＳ分子、例えばＯ１、Ｏ２、およびＯ５のいずれも一切染色しなかった（それぞれレーン１、２、および３）。
【０２７６】
これらの発見は、類似しない分離パターンにより暗に示される異なるタイプは、実際に抗原的に異なる構造を表していることを確証する。一方で、異なるタイプはまた、共通のエピトープを共有しており、それは、汎Ｏ３交差反応性ｍＡｂの選択により確認された。
【０２７７】
実施例３：新規のクレブシエラ・ニューモニエＯ抗原の構造的特性付け
Ｋ．ニューモニエＯ３ｂ株Ｋｐ８１（臨床分離株）が、１０Ｌ発酵槽においてＬＢ培地中で培養され（３７℃、１２時間、２００ｒｐｍの撹拌、５Ｌ／分のガス流）、１％フェノールで６０℃において２時間処理され、遠心分離され、洗浄され、水中で再懸濁され、凍結乾燥された。Ｋ．ニューモニエＫｐ８１のＬＰＳが、高温フェノール／水法により単離され、透析および超遠心分離により精製された（９）。ガラス綿フィルターを通した濾過が、透析および超遠心分離の間に追加の工程として加えられた。Ｏ特異的多糖類（Ｏ−ＰＳ）および異なるオリゴ糖構成要素が、穏やかな酸加水分解（１．５％ＣＨ３ＣＯＯＨ、２０分間、１００℃）により遊離された。水溶性多糖類およびオリゴ糖類が、莢膜抗原の残り（Ｋ抗原、ＣＰＳ）を除去するために、超遠心分離（６時間、１０５０００×ｇ、４℃）された。得られた多糖類およびオリゴ糖類が、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０（−４００メッシュ）（Ｂｉｏｒａｄ，米国）またはＨＷ−４０Ｆ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ，米国）上でのゲル濾過により分画され、画分１ａ、１ｂ、１ｃ、２、３および４をもたらした。全ての画分が、ＮＭＲ分光法および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）により分析され、画分１ａ〜ｃ中のＯ−ＰＳの存在を示した（図４）。これらの画分は、プライマーアダプター配列および次の一般構造：Ｋｄｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−［ＲＵ］ｎを有する外側コアオリゴ糖の共通部分に連結された異なる数のＯ−ＰＳ繰り返し単位（ＲＵ）を含有していた。
【０２７８】
Ｋｐ８１株からのＬＰＳ  Ｏ−ＰＳの繰り返し単位（ＲＵ）の構造が、画分１ａに関して、糖およびメチル化分析、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ分光法、ならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの使用により決定された。糖およびメチル化分析の組み合わせられた結果は、３個の一般的な（ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ）残基：２−および３−置換マンノピラノース（Ｍａｎｐ）の存在を確証した。Ｏ−ＰＳ  Ｋｐ８１  １Ｈおよび１３Ｃ共鳴の完全な割り当て（図７）は、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹ、ならびにＨＳＱＣ−ＤＥＰＴ、ＨＭＢＣ、およびＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ実験の解釈により達成された。１Ｈ、１３Ｃ  ＨＳＱＣ−ＤＥＰＴスペクトルは、３個の主なアノマープロトンおよび炭素（残基Ａ、Ｂ、Ｃ）ならびにより小さい（ｍｉｎｏｒ）スピン系（残基Ａ’、Ｂ’、Ｃ’）に関する信号を含有していた（図７、表１）。加えて、メチルホスフェート（ＭｅＰ）が、１１．０ＨｚのＪＰ，Ｈを有する二重項としてのメチル基の２個の鋭いプロトン信号（δＨ  ３．６１，３．６３；δＣ  ５３．７ｐｐｍ）の存在（そのホスフェート基（Ｐ）による置換を示している）に基づいて同定された。隣接する糖残基の間の残基間の連結性が、ＮＯＥＳＹおよびＨＭＢＣ実験により観察された（図７）。主な信号のセットは、Ｋｐ８１のＯ−ＰＳの生物学的ＲＵの三糖構造に帰せられた：［→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｎ（［→３）−Ｃ−（１→２）−Ａ−（１→３）−Ｂ−（１→］ｎ）（図４、挿入図の構造）。１Ｈ，３１Ｐ  ＨＭＢＣスペクトルは、ＭｅＰホスフェート基の残基Ｃ’（α−Ｄ−Ｍａｎｐ３ＰＭｅ）のＨ−３に対する相関を示した。加えて、３１Ｐ，１Ｈ  ＨＭＱＣ−ＴＯＣＳＹは、ＭｅＰホスフェート基の残基Ｃ’のＨ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５に対する相関を示し、これは、ＭｅＰによるＣ’の置換を支持する。さらに、残基Ａ’（→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ）およびＢ’（→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ）が、同定され、Ｃ’と共に、Ｋｐ８１のＯ−ＰＳの非還元末端の構成要素であることが分かった。非還元末端を含むＫｐ８１のＯ−ＰＳの完全な構造が、図１において示されており、それは、以下の模式的配列を有する：Ｃ’−（１→２）−Ａ’−（１→３）−Ｂ’−（１［→３）−Ｃ−（１→２）−Ａ−（１→３）−Ｂ−（１→］ｎ。
【０２７９】
Ｏ−ＰＳ  Ｋｐ８１繰り返し単位（Ｍａｎｐの三糖）の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの使用により確証された。画分１ａ、１ｂ、１ｃの質量スペクトルは、Ｋｄｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−［ＲＵ］ｎの異なる形態に帰せられるイオンのクラスターを示した（［Ｍ−Ｈ］−、脱水形態、ヘプトースおよびＭｅＰ置換を含む）。これらのイオンの間の平均モノアイソトピック質量の差は、４８６．４９Ｄａであり、ＮＭＲの結果に基づいて計算された質量（４８６．４２Ｄａ）と一致した。加えて、画分１ｂの質量スペクトル（図５）は、ＭｅＰ−［Ｍａｎ］ｎで構築されたＯ−ＰＳフラグメントに帰せられる［Ｍ−Ｈ２Ｏ−Ｈ］−イオンを含有していた（例えば、ｍ／ｚ  １２２７．３９、１３８９．４５、１５５１．５２、１７１３．５８、１８７５．６６、２０３７．７３、２１９９．７９、２３６１．８５、２５２３．９０）。１６２Ｄａのイオン間の質量の差は、Ｍａｎ残基に帰せられた。例えば、ｍ／ｚ  １７１３．５８におけるイオンは、ＭｅＰ−［Ｍａｎ］１０ポリマーに帰せられた。これらの断片は、天然のＯ−ＰＳのＭＡＬＤＩインソース断片化の結果もたらされ、Ｏ−ＰＳあたり１個のＭｅＰ基の存在を示している。
【０２８０】
実施例４：ＬＰＳ−Ｏ３交差反応性ｍＡｂによる表面結合
生きたクレブシエラ属の株に対する異なるマンナン特異性のｍＡｂによる表面染色（図６）が、フローサイトメトリーにより調べられた。洗浄された細菌（１０６ＣＦＵ）が、Ｏ３特異的ｍＡｂ（４０μｇ／ｍｌ）と反応させられた後、２μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５μＭのＳＹＴＯ−６２核酸染色剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による染色が行われた。試料は、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において定量化され、データは、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアバージョン４（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析された。
【０２８１】
交差反応性ｍＡｂ  ２Ｆ８−Ｇ６は、調べられた全てのＯ３クレブシエラ属の株の表面に、発現されるＯ抗原のマンナン構造にかかわらず強く結合した。対照的に、比較可能なｍＡｂ  １Ｇ６−Ｂ８は、Ｏ３ａ免疫処置株（ＰＣＭ−１１）のみを強く染色した。それは、Ｏ３抗原を発現しているＫｐ１４株の表面上に弱く結合し、Ｏ３ｂ抗原を発現しているＫｐ８２株には全く結合しなかった。
【０２８２】
従って、フローサイトメトリー分析は、マンナン特異的ｍＡｂによる対応する生きたクレブシエラ属の株の表面染色は、抗原特異性により排他的に決定され、様々なｓｍｏｏｔｈ型ＬＰＳ分子により制限されないことを確証した。従って、広い特異性を有する抗体は、可能性のある抗細菌剤としてのさらなる開発のための有望な候補である。
【０２８３】
実施例５：Ｏ３型ＬＰＳ分子の内毒素活性の交差中和
Ｋ．ニューモニエＯ３株は、正常ヒト血清の殺菌作用に感受性である（図８）ため、見込みのある療法用ｍＡｂに関する臨床的に関連する作用様式は、そのようなｍＡｂの抗炎症性の可能性である。溶解された細菌から放出された内毒素（すなわちＬＰＳ分子の脂質Ａ部分）は、その生得的（ｉｎｎａｔｅ）受容体複合体ＴＬＲ−４／ＣＤ１４／ＭＤ２を介したシグナル伝達により強い炎症反応を誘発する。ｍＡｂ  ４Ｄ３−Ａ４の異なるＫ．ニューモニエＯ３型ＬＰＳ分子により引き出されるシグナル伝達に対する影響が、細胞ベースのインビトロ系（ＨＥＫ  Ｂｌｕｅ，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）において調べられた。細胞により発現されるヒトＴＬＲ−４複合体によるシグナル伝達は、比色定量性信号に変換される。図９は、ｍＡｂ  ４Ｄ３−Ａ４がシグナル伝達を阻害する、すなわち抽出され精製されたＬＰＳ分子の内毒素作用を中和することができたことを示している。重要なことだが、用量依存性の中和が、異なるＯ３亜型に関して観察され、すなわち、Ｏ３交差反応性ｍＡｂは、Ｏ３ａ（ＩＩＴＤ  ＰＡＮ  Ｗｒｏｃｌａｗ、ポーランド微生物コレクションからのＰＣＭ−１１株；図９Ａ）またはＯ３ｂ（臨床コレクションからの臨床分離株であるＫｐ８１株；図９Ｂ）のどちらから抽出されたＬＰＳに対しても比較可能なほどに強力であった。
【０２８４】
参考文献
【０２８５】
【化１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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