(57)【要約】核酸、カチオン性ポリマー、及び炭水化物を含有する凍結乾燥前組成物が本明細書にて提供される。また、凍結乾燥された組成物、及び再構成された組成物、並びにその作製方法、患者の腫瘍を治療するためのその使用方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸、カチオン性ポリマー、及び炭水化物溶液を含み、前記核酸及び前記カチオン性ポリマーが、複合体を形成し、前記炭水化物対前記核酸−ポリマー複合体の重量／重量比が、５０から１０００である組成物。
【請求項２】
凍結乾燥前の形態又は凍結乾燥された形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記複合体が、前記少なくとも１つの核酸及び少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含むナノ粒子の形態である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ナノ粒子が、約４０から約９０ｎｍのサイズである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記比が、５００未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記比が、２５０未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの核酸が、少なくとも１つの核酸含有材料である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基類似体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記塩基類似体が、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシル−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記核酸が、プラスミドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記プラスミド核酸が、ＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記プラスミドが、Ｈ１９制御配列を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｈ１９配列が、Ｈ１９プロモーター、Ｈ１９エンハンサー、並びに前記Ｈ１９プロモーター及びＨ１９エンハンサーの両方から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｈ１９制御配列が、前記Ｈ１９プロモーター及エンハンサーを含み、前記異種配列が、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、リシン、コレラ毒素、網膜芽細胞腫遺伝子、ｐ５３、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ、水痘帯状疱疹ウィルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チトクロムｐ−４５０  ２Ｂ１、チミジンホスホリラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼＡ及びＧ２、リナマラーゼ、β−ラクタマーゼ、並びにキサンチンオキシダーゼから成る群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記制御配列が、ＩＧＦ−２  Ｐ４プロモーター又はＩＧＦ−２  Ｐ３プロモーターである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｈ１９エンハンサーが、前記異種配列に対して３’側にある、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記異種配列が、β−ガラクトシダーゼ；ジフテリア毒素；シュードモナス毒素；リシン；コレラ毒素；網膜芽細胞腫遺伝子；ｐ５３；単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ；水痘帯状疱疹ウィルスチミジンキナーゼ；シトシンデアミナーゼ；ニトロレダクターゼ；チトクロムｐ−４５０  ２Ｂ１；チミジンホスホリラーゼ；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；アルカリホスファターゼ；カルボキシペプチダーゼＡ及びＧ２；リナマラーゼ；β−ラクタマーゼ；キサンチンオキシダーゼのコード配列；並びにｃｄｋ２、ｃｄｋ８、ｃｄｋ２１、ｃｄｃ２５Ａ、ｃｙｃｌｉｎＤ１、ｃｙｃｌｉｎＥ、ｃｙｃｌｉｎＡ、ｃｄｋ４、発癌性形態のｐ５３、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｋｒ−ｒａｓ、及びＨｅｒ２／ｎｅｕから成る群より選択される遺伝子をコードする配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンス配列から選択され、前記異種配列は、ｃｄｋ２、ｃｄｋ８、ｃｄｋ２１、ｃｄｃ２５Ａ、ｃｙｃｌｉｎＤ１、ｃｙｃｌｉｎＥ、ｃｙｃｌｉｎＡ、ｃｄｋ４、発癌性形態のｐ５３、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｋｒ−ｒａｓ、及びＨｅｒ２／ｎｅｕから成る群より選択される遺伝子をコードするＲＮＡを特異的に開裂するリボザイムをコードしてもよい、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
少なくとも１つの炭水化物が、一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有し、サッカリド、ポリサッカリド、及びオリゴサッカリドから選択される化合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの炭水化物が、モノ−、ジ−、トリ−、及びオリゴ−サッカリド、並びにポリサッカリドから選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの炭水化物が、グリコーゲン、セルロース、及びデンプンから選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの炭水化物が、モノサッカリドから選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記モノサッカリドが、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、及びガラクトースから選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの炭水化物が、ジサッカリドから選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ジサッカリドが、トレハロース、スクロース、セロビオース、マルトース、及びラクトースから選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの炭水化物が、オリゴサッカリドから選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２７】
前記オリゴサッカリドが、ラフィノース、スタキオース、及びマルトデキストリンから選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの炭水化物が、トレハロース、グルコース、スクロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、ラフィノース、ＰＶＰ、及びデキストロースから選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの炭水化物が、グルコース又はスクロースではない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの炭水化物が、モノサッカリド及びジサッカリドから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの炭水化物が、トレハロースである、請求項１又は１９又は２５に記載の組成物。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、親水性又は両親媒性のカチオン性ポリマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記カチオン性ポリマーが、一級、二級、三級、及び／又は四級アミン基を含有するポリマーから選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリエーテルアミン、ポリビニルピリジン、正に帯電した官能基を有するポリサッカリド、ポリアミノ酸、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−ＤＬ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−ｅ−ＣＢＺ−０−リジン、ポリ−ｅ−ＣＢＺ−ＤＬ−リジン、ポリ−ｅ−ＣＢＺ−Ｌ−リジン、ポリ−ＯＬ−オルニチン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−ＤＥＬＴＡ−ＣＢＺ−ＤＬ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（−Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸）−ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グルタミン酸）−ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（Ｌ−チロシン、Ｌ−グルタミン酸）−ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンとトリプトファン、チロシン、又はセリンとのコポリマー、Ｄ−グルタミン酸とＤ−リジンとのコポリマー、Ｌ−グルタミン酸とリジン、オルニチン、又はリジン及びオルニチンの混合物とのコポリマー、並びにポリ−（Ｌ−グルタミン酸）から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ＰＥＩのアミン基の前記核酸のリン酸基のモル数に対するモル比が、２から１０である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物が、核酸／炭水化物溶液をカチオン性ポリマー／炭水化物溶液に、前記少なくとも１つの核酸と前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の複合体の形成が可能となる条件下で添加することによって作製される、請求項１から３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記核酸／炭水化物溶液及び前記カチオン性ポリマー／炭水化物溶液が、各々別々に、独立して作製される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記作製方法が：
（ａ）少なくとも１つの核酸及び少なくとも１つの炭水化物の溶液を得ること；
（ｂ）少なくとも１つのカチオン性ポリマー及び少なくとも１つの炭水化物の溶液を得ること；
（ｃ）前記核酸／炭水化物溶液を前記カチオン性ポリマー／炭水化物溶液に、前記少なくとも１つの核酸と前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の複合体の形成が可能となる条件下で添加すること；並びに
（ｄ）所望に応じて、前記混合された核酸／カチオン性ポリマー／炭水化物溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥された組成物を形成すること
を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
前記方法が、前記核酸／炭水化物溶液を形成する工程、及び前記カチオン性ポリマー／炭水化物溶液を形成する工程をさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記方法が：
（ａ）ある量の前記少なくとも１つの核酸を、第一の量の前記少なくとも１つの炭水化物と混合して、核酸／炭水化物溶液を形成すること；及び
（ｂ）ある量の前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーを、第二の量の前記少なくとも１つの炭水化物と混合して、カチオン性ポリマー／炭水化物溶液を形成すること
をさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記核酸／炭水化物溶液の前記カチオン性ポリマー／炭水化物溶液への前記添加が、室温で行われる、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４４】
凍結乾燥される、請求項１から４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのカチオン性ポリマー、及び少なくとも１つの炭水化物を含む組成物を作製するための方法であって、前記方法は、核酸／炭水化物溶液をカチオン性ポリマー／炭水化物溶液に、前記少なくとも１つの核酸と前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の複合体の形成が可能となる条件下で添加することを含む、方法。
【請求項４６】
前記核酸／炭水化物溶液及び前記カチオン性ポリマー／炭水化物溶液が、各々別々に、独立して作製される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
（ａ）少なくとも１つの核酸及び少なくとも１つの炭水化物の溶液を得ること；
（ｂ）少なくとも１つのカチオン性ポリマー及び少なくとも１つの炭水化物の溶液を得ること；
（ｃ）前記核酸／炭水化物溶液を前記カチオン性ポリマー／炭水化物溶液に、前記少なくとも１つの核酸と前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の複合体の形成が可能となる条件下で添加すること；並びに
（ｄ）所望に応じて、前記混合された核酸／カチオン性ポリマー／炭水化物溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥された組成物を形成すること
を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸／炭水化物溶液を形成する工程、及び前記カチオン性ポリマー／炭水化物溶液を形成する工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）ある量の前記少なくとも１つの核酸を、第一の量の前記少なくとも１つの炭水化物と混合して、核酸／炭水化物溶液を形成すること；及び
（ｂ）ある量の前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーを、第二の量の前記少なくとも１つの炭水化物と混合して、カチオン性ポリマー／炭水化物溶液を形成すること
を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの核酸と前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の前記複合体が、材料ナノ粒子に形成され、各ナノ粒子は、ナノメートルのサイズである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
各ナノ粒子が、前記少なくとも１つの核酸及び前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ナノ粒子が、約４０から約９０ｎｍのサイズである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸／炭水化物溶液の前記カチオン性ポリマー／炭水化物溶液への前記添加が、室温で行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記添加が、一定の速度及び一定の混合下である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記少なくとも１つの炭水化物の前記少なくとも１つの核酸に対する比が、１，０００未満、又は９５０未満、又は９００未満、又は８５０未満、又は８００未満、又は７５０未満、又は７００未満、又は６５０未満、又は６００未満、又は５５０未満、又は５００未満、又は４５０未満、又は４００未満、又は３５０未満、又は３００未満、又は２５０未満、又は２００未満、又は１５０未満、又は１００未満である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
前記比が、５００未満である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記比が、２５０未満である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物を凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも１つの核酸が、少なくとも１つの核酸含有材料である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基類似体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記塩基類似体が、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシル−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンから選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸が、プラスミドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
前記プラスミド核酸が、ＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びオリゴヌクレオチドから選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記プラスミドが、Ｈ１９制御配列を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｈ１９配列が、Ｈ１９プロモーター、Ｈ１９エンハンサー、並びに前記Ｈ１９プロモーター及びＨ１９エンハンサーの両方から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｈ１９制御配列が、前記Ｈ１９プロモーター及エンハンサーを含み、前記異種配列が、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、リシン、コレラ毒素、網膜芽細胞腫遺伝子、ｐ５３、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ、水痘帯状疱疹ウィルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チトクロムｐ−４５０  ２Ｂ１、チミジンホスホリラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼＡ及びＧ２、リナマラーゼ、β−ラクタマーゼ、並びにキサンチンオキシダーゼから成る群より選択されるタンパク質をコードする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記制御配列が、ＩＧＦ−２  Ｐ４プロモーター又はＩＧＦ−２  Ｐ３プロモーターである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｈ１９エンハンサーが、前記異種配列に対して３’側にある、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記異種配列が、β−ガラクトシダーゼ；ジフテリア毒素；シュードモナス毒素；リシン；コレラ毒素；網膜芽細胞腫遺伝子；ｐ５３；単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ；水痘帯状疱疹ウィルスチミジンキナーゼ；シトシンデアミナーゼ；ニトロレダクターゼ；チトクロムｐ−４５０  ２Ｂ１；チミジンホスホリラーゼ；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；アルカリホスファターゼ；カルボキシペプチダーゼＡ及びＧ２；リナマラーゼ；β−ラクタマーゼ；キサンチンオキシダーゼのコード配列；並びにｃｄｋ２、ｃｄｋ８、ｃｄｋ２１、ｃｄｃ２５Ａ、ｃｙｃｌｉｎＤ１、ｃｙｃｌｉｎＥ、ｃｙｃｌｉｎＡ、ｃｄｋ４、発癌性形態のｐ５３、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｋｒ−ｒａｓ、及びＨｅｒ２／ｎｅｕから成る群より選択される遺伝子をコードする配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンス配列から選択され、前記異種配列は、ｃｄｋ２、ｃｄｋ８、ｃｄｋ２１、ｃｄｃ２５Ａ、ｃｙｃｌｉｎＤ１、ｃｙｃｌｉｎＥ、ｃｙｃｌｉｎＡ、ｃｄｋ４、発癌性形態のｐ５３、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｋｒ−ｒａｓ、及びＨｅｒ２／ｎｅｕから成る群より選択される遺伝子をコードするＲＮＡを特異的に開裂するリボザイムをコードしてもよい、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも１つの炭水化物が、一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有し、サッカリド、ポリサッカリド、及びオリゴサッカリドから選択される化合物である、請求項４５に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの炭水化物が、モノ−、ジ−、トリ−、及びオリゴ−サッカリド、並びにポリサッカリドから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項７３】
前記少なくとも１つの炭水化物が、グリコーゲン、セルロース、及びデンプンから選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記少なくとも１つの炭水化物が、モノサッカリドから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項７５】
前記モノサッカリドが、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、及びガラクトースから選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記少なくとも１つの炭水化物が、ジサッカリドから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ジサッカリドが、トレハロース、スクロース、セロビオース、マルトース、及びラクトースから選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記少なくとも１つの炭水化物が、オリゴサッカリドから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項７９】
前記オリゴサッカリドが、ラフィノース、スタキオース、及びマルトデキストリンから選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記少なくとも１つの炭水化物が、トレハロース、グルコース、スクロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、ラフィノース、ＰＶＰ、及びデキストロースから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項８１】
前記少なくとも１つの炭水化物が、グルコース又はスクロースではない、請求項４５に記載の方法。
【請求項８２】
前記少なくとも１つの炭水化物が、モノサッカリド及びジサッカリドから選択される、請求項４５に記載方法。
【請求項８３】
前記少なくとも１つの炭水化物が、トレハロースである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、親水性又は両親媒性のカチオン性ポリマーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項８５】
前記カチオン性ポリマーが、一級、二級、三級、及び／又は四級アミン基を含有するポリマーから選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリエーテルアミン、ポリビニルピリジン、正に帯電した官能基を有するポリサッカリド、ポリアミノ酸、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−ＤＬ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−ｅ−ＣＢＺ−０−リジン、ポリ−ｅ−ＣＢＺ−ＤＬ−リジン、ポリ−ｅ−ＣＢＺ−Ｌ−リジン、ポリ−ＯＬ−オルニチン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−ＤＥＬＴＡ−ＣＢＺ−ＤＬ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（−Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸）−ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グルタミン酸）−ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（Ｌ−チロシン、Ｌ−グルタミン酸）−ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンとトリプトファン、チロシン、又はセリンとのコポリマー、Ｄ−グルタミン酸とＤ−リジンとのコポリマー、Ｌ−グルタミン酸とリジン、オルニチン、又はリジン及びオルニチンの混合物とのコポリマー、並びにポリ−（Ｌ−グルタミン酸）から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＰＥＩのアミン基の前記核酸のリン酸基のモル数に対するモル比が、２から１０である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記少なくとも１つの核酸が、プラスミドであり、前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、ＰＥＩであり、少なくとも１つの炭水化物が、トレハロースである、請求項４５に記載の方法。
【請求項９１】
前記少なくとも１つの核酸及び前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、複合体を形成し、前記炭水化物対前記核酸−ポリマー複合体の重量／重量比が、５０から１０００である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記少なくとも１つの核酸が、プラスミドであり、前記少なくとも１つのカチオン性ポリマーが、ＰＥＩであり、少なくとも１つの炭水化物が、トレハロースである、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞生物学、遺伝子治療法、及び癌治療の分野全般に関する。より詳細には、本発明は、凍結乾燥することができる核酸及びカチオン性ポリマーの組成物、並びにその作製方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者の細胞への治療的送達によって疾患を治療するための薬物としてのＤＮＡプラスミドの使用は、これまで治療不能と見なされてきた広範囲にわたる病態に対する新規な薬剤の開発における来るべき技術の１つである。
【０００３】
身体内でのヌクレアーゼ分解を克服することによって細胞内部への機能性ＤＮＡプラスミドの効果的な送達を達成するために、核酸分子は、「ベクター」内に組み込まれるべきである。
【０００４】
遺伝子治療法に関するほとんどの初期の研究は、ウィルス媒介ベクターの開発が焦点であったが、非ウィルス系トランスフェクタントが、安全で効果的である可能性のある遺伝子治療法での送達方法として開発されてきた。
【０００５】
ウィルス系ベクターと比較して、このような非ウィルス系送達システムは、低い毒性及び免疫原性、ヌクレアーゼに対する耐性、及び改善された安全プロファイルを含むいくつかの利点を示す。
【０００６】
そのような非ウィルス系送達システムの限定されない例としては、トランスフェクションプロセスの過程での分解からＤＮＡを保護することができる新たに作り出されたリポプレックス及び／又はポリプレックスなどの新規な分子が挙げられる。
【０００７】
リポプレックスを形成するためには、プラスミドＤＮＡは、組織化された構造を有するカチオン性脂質（例：ミセル又はリポソーム）で覆われる。負に帯電したＤＮＡ及び正に帯電した脂質によるこのようなカチオン性脂質複合体は、細胞膜との相互作用も起こし、それによって、リポプレックスのエンドサイトーシスが発生する。続いて、リポプレックス中のＤＮＡが、細胞質中に放出される。
【０００８】
ポリプレックスは、ＤＮＡとポリマーとの複合体である。典型的には、ポリプレックスは、カチオン性ポリマーを用い、それが、ポリアニオン性ＤＮＡと相互作用し、複合体形成する。
【０００９】
開発されてきた広範囲に及ぶ非ウィルス系ベクターの中でも、カチオン性ポリマーの直鎖状ポリエチレンアミン（ＰＥＩ）（その全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第６，０１３，２４０号参照）は、プラスミド送達においていくつかの利点を示しており（Pathak et al., Biotechnol. J. 4:1559-1572 (2009)；Kasper et al. Journal of Controlled Release 151:246-255 (2011)参照）、臨床試験で用いられている（Gofrit et al., The Journal of Urology 191(6):1697-1702 (2014)；Abraham et al., The Journal of Urology 180(6):2379-2383 (2008)参照）。したがって、ＰＥＩは、非ウィルス系ベクターの「至適基準」と見なされている（Pathak et al., Biotechnol. J. 4:1559-1572 (2009)；Kasper et al. Journal of Controlled Release 151:246-255(2011)参照）。
【００１０】
直鎖状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）とＤＮＡプラスミドとをベースとするポリプレックスは、広範な様々なトランスフェクタントと比較したトランスフェクション効率という点での有利な性質で知られている。しかし、水溶液中でのそのような複合体の安定性は、限定的であり、投与前に新たに複合体を作製する必要があることは、特に高ＤＮＡ濃度溶液において、バッチ間の変動のリスクを高める。そのような条件下では、このような複合体の再現性及び品質の制御を、医薬品で求められる程度まで保証することはできない。
【００１１】
先行技術
［１］米国特許第６，０１３，２４０号
［２］Pathak et al., Biotechnol. J. 4:1559-1572 (2009)
［３］Kasper et al. Journal of Controlled Release 151:246-255 (2011)
［４］Gofrit et al., The Journal of Urology 191(6):1697-1702 (2014)
［５］Abraham et al., The Journal of Urology 180(6):2379-2383 (2008)
［６］Pathak et al., Biotechnol. J. 4:1559-1572 (2009)
［７］国際出願ＰＣＴ／ＩＬ１９９８／０００４８６（国際公開第１９９９／０１８１９５号）
［８］国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００８／００１４０５（国際公開第２００９／０５３９８２号）
［９］国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００６／００１１１０（国際公開第２００７／０３４４８７号）
［１０］国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００６／０００７８５（米国特許第８，０６７，５７３号）
［１１］国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００８／００００７１（米国特許第７，９２８，０８３号）
［１２］Brus et al., Journal of Controlled Release 95:119-131 (2004)
［１３］Kasper et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 77:182-185(2011)
［１４］Julia Christina Kasper, Doctoral Thesis “Lyophilization of Nucleic Acid Nanoparticles-Formulation Development, Stabilization Mechanisms, and Process Monitoring” (2012)
【発明の概要】
【００１２】
したがって、本技術分野において、より効率的であり、工業的に有用な規模に容易にスケール変更可能である核酸−カチオン性ポリマー組成物を作製する方法が求められている。
【００１３】
本明細書で開示される本発明の発明者らは、核酸、カチオン性ポリマー、及び炭水化物を含有し、水溶液中での安定性がはるかに改善され、本技術分野にて公知の類似の組成物に対する非常に優れた代替品を提供する凍結乾燥前、凍結乾燥された、及び再構成された組成物／配合物を作製するための独特の方法を開発した。本発明の方法、並びにそれによって作製された組成物は、精密に作製され、安全であり、工業的なスケール変更が可能である治療用途のための複合体の必要性に対する解決策を提供する。
【００１４】
本発明の方法により、配合物のいずれの成分の構造、完全性、安定性、及び生物学的利用度にも悪影響を与えることなく、凍結乾燥された又は凍結乾燥前配合物に製剤することができる安定で、精密な投与が可能であり、均一な組成物／配合物の工業的な製造が可能となる。
【００１５】
したがって、第一の態様では、本発明は、少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのカチオン性ポリマー、及び少なくとも１つの炭水化物を含む組成物を作製するための方法を提供し、その方法は、核酸／炭水化物溶液をカチオン性ポリマー／炭水化物溶液中に、少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の複合体の形成が可能となる条件下で添加することを含む。
【００１６】
ある実施形態では、核酸／炭水化物溶液及びカチオン性ポリマー／炭水化物溶液は、各々別々に、独立して作製されてよい。溶液の各々は、記載されるように、混合を行うかなり前に、混合と同時に、又は混合と異なる時点で作製されてよい。
【００１７】
ある実施形態では、この方法は、２つの溶液の各々を入手すること、及び核酸／炭水化物溶液をカチオン性ポリマー／炭水化物溶液中に、その逆ではなく、少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の複合体の形成が可能となる条件下で添加して、本発明の組成物を得ることを含む。
【００１８】
ある実施形態では、この方法は：
（ａ）少なくとも１つの核酸及び少なくとも１つの炭水化物の溶液を得ること；
（ｂ）少なくとも１つのカチオン性ポリマー及び少なくとも１つの炭水化物の溶液を得ること；
（ｃ）核酸／炭水化物溶液をカチオン性ポリマー／炭水化物溶液に、少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の複合体の形成が可能となる条件下で添加すること；並びに
（ｄ）所望に応じて、混合された核酸／カチオン性ポリマー／炭水化物溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥された組成物を形成すること
を含む。
【００１９】
ある実施形態では、この方法は、核酸／炭水化物溶液を作製する工程、及びカチオン性ポリマー／炭水化物溶液を作製するための別の工程を含む。
【００２０】
ある実施形態では、この方法は、したがって：
（ａ）ある量の少なくとも１つの核酸を、第一の量の少なくとも１つの炭水化物と混合して、核酸／炭水化物溶液を形成すること；及び
（ｂ）ある量の少なくとも１つのカチオン性ポリマーを、第二の量の少なくとも１つの炭水化物と混合して、カチオン性ポリマー／炭水化物溶液を形成すること
を含む。
【００２１】
上記で記載したように、少なくとも１つの炭水化物は、本発明の方法において、別個のバッチ又は分量で用いられる。第一のバッチ若しくは分量、又は第一の量は、少なくとも１つの核酸と混合され、第二のバッチ若しくは分量、又は第二の量は、少なくとも１つのカチオン性ポリマーと混合される。第一又は第二の量は、複合体を形成し、安定で、所望に応じて固体であってもよい製品を提供することを可能とするのに充分な最少量の少なくとも１つの炭水化物となるように決定され、選択される。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、本発明の組成物又は配合物は、少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の複合体を含み、組成物の安定性及び独特さは、このことに起因する。「複合体」、「ポリプレックス」、「ポリプレックス配合物」、「ポリプレックス組成物」、「組成物」などの用語は、本明細書において交換可能に用いられ、本発明の組成物／配合物を、そのいずれかの特定の成分ではなく、全体として意味する。
【００２３】
本明細書で例示されるように、工程（ａ）及び（ｂ）の溶液の各々は、他方に対して独立して作製されてよく、使用前に保存されていてもよい。溶液の各々は、工程（ｃ）に示される通りに互いに対して添加される、すなわち、核酸／炭水化物溶液をカチオン性ポリマー／炭水化物溶液に添加し、その逆ではない限りにおいて、上記で説明したように、順に作製されても、又は他のいかなる順序で作製されてもよい。この溶液の一方を他方へ特定の決まった順序で添加することにより、少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の独特で安定な複合体の容易な形成が可能となり、溶液が逆方向に添加されると、複合体を大量に形成することができない。
【００２４】
説明したように、この組成物成分の一方を他方に対して添加し、その逆ではないことにより、炭水化物材料の量を低減することもでき、したがって、組成物中の少なくとも１つの核酸の相対量を増加することができる。言い換えると、少なくとも１つの炭水化物の量を低減することができることにより、組成物中の少なくとも１つの核酸の量を維持しながら、少なくとも１つの炭水化物の少なくとも１つの核酸に対する比を、１桁又は２桁分減少させることができる。
【００２５】
少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのカチオン性ポリマーとの間の複合体は、材料ナノ粒子に形成され、ここで、各ナノ粒子は、ナノメートルのサイズであり（ナノ粒子が球形状である場合、直径がナノメートルであり、又はナノ粒子が球形状でない場合、軸線がナノメートルである）、各々は、少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのカチオン性ポリマー、及び所望に応じて含まれていてよい少量の少なくとも１つの炭水化物を含む。凍結乾燥前組成物中の形成されたナノ粒子は、凍結乾燥された組成物中にも、さらには再構成された配合物中にも存在し、凍結乾燥前組成物中では、約４０から約５０ｎｍのサイズであり、一方再構成された組成物中では、ナノ粒子サイズは、約８０から約９０ｎｍの範囲内である。以下で詳細に述べるように、高い濃度が用いられる程、大きいナノ粒子が得られる。
【００２６】
核酸／炭水化物溶液のカチオン性ポリマー／炭水化物溶液中への添加は、とりわけ、用いられる特定の成分、組成物の体積、及び他のパラメーターに応じて、室温で、又は所望されるいかなる温度で行われてもよい。ある実施形態では、添加は、一定の速度及び一定の混合下で行われて、核酸／カチオン性ポリマー混合溶液が形成される。ある実施形態では、速度は、作製される各体積に対して改変され、適切な一定速度の決定は、本技術分野における通常レベルの技術の範囲内である。
【００２７】
ある実施形態では、上記で記載した添加は、少量作製の場合は、２から７ｍｌ／分の速度で行われ、又は１リットル作製の場合は、８０ｍｌ／分であってもよく、又は作製されるべき組成物／配合物若しくは製剤の体積に応じて変動（増加又は減少）してもよい。これらよりも大きい速度が用いられてもよい。
【００２８】
例えば、１リットルの溶液中に合計０．４ｇの場合、核酸、例えば初期濃度４ｍｇ／ｍｌのプラスミドの１００ｍｌを含有するポリプレックスの１リットルが用いられる。１リットルの溶液は、１００ｇの炭水化物、例えばトレハロースを含有する。したがって、この例では、１リットル溶液中のトレハロース重量の１リットル溶液中のＤＮＡ重量に対する比は、１００／０．４又は２５０である。
【００２９】
別の例では、核酸の量は、約２．５ｍｌから約１００ｍｌであり、１０重量／体積％のトレハロース溶液の第一の有効量は、約１０ｍｌから約４００ｍｌである。加えて（又は別の選択肢として）、カチオン性ポリマーの量は、約１．２ｍｌから約４８ｍｌであり、１０重量／体積％のトレハロース溶液の第二の有効量は、約１１．３ｍｌから約４５２ｍｌである。
【００３０】
理解され得るように、様々な体積の本発明の組成物又は溶液が作製されてよく、例えば、約２５ｍｌから約１０００ｍｌであり；２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、又は１０００ｍｌなどである。これよりも大きい体積、又は小さい体積、又は中間の体積が作製されてもよい。
【００３１】
当業者であれば、本明細書で述べる方法が、１０００ｍｌよりも非常に大きい体積、例えば、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００ｍｌ、又はそれ以上の核酸／カチオン性ポリマー混合溶液を形成するために、容易に改変可能であることは認識される。
【００３２】
本技術分野の組成物の多くとは異なり、核酸／カチオン性ポリマー溶液を含む本発明の方法に従って作製された組成物は、均一な懸濁液を形成する。本明細書で用いられる場合、本発明の「組成物」、「配合物」、「製剤」は、液体の形態、例えば、溶液、懸濁液、若しくは分散液であってよく、又は所望に応じて凍結乾燥されていてよい固体の形態であってもよい。ある実施形態では、組成物が液体組成物である場合、それは、水懸濁液の形態である。ある実施形態では、液体組成物は、全体として、組成物の成分のいずれか１つの量が完全に又は部分的に可溶性である懸濁液の形態であってよい。ある実施形態では、組成物が固体の形態である場合、それは、凍結乾燥された組成物である。
【００３３】
本発明の方法は、凍結乾燥された組成物を得る目的で、本発明の組成物を凍結乾燥する工程を所望に応じて含んでよい。凍結乾燥された組成物は、使用の直前に再構成されてよい。
【００３４】
したがって、本発明に従う方法は、凍結乾燥工程を含んでいなくてもよく、その場合、得られる組成物又は配合物は、凍結乾燥前組成物又は配合物である。凍結乾燥工程が必要であるか、又は所望される場合、組成物は、湿潤組成物を凍結乾燥するための本技術分野で公知の条件下などで処理されてよい。
【００３５】
ある実施形態では、本発明の方法は、溶液を０℃未満の温度で凍結することを含む凍結乾燥サイクルを含む。ある実施形態では、温度は、−５０℃から０℃、−４５℃から０℃、−４０℃から０℃、−３５℃から０℃である。ある実施形態では、凍結乾燥は、約−４５±５℃の温度で達成される。
【００３６】
ある実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１２時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも５２時間、少なくとも６０時間、少なくとも６６時間、少なくとも７２時間にわたって溶液を凍結することを含む凍結乾燥サイクルを含む。
【００３７】
ある実施形態では、溶液は、少なくとも２４から７２時間凍結乾燥される。
【００３８】
ある実施形態では、本発明の方法は、約−４５±５℃の温度で、少なくとも１２時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも５２時間、少なくとも６０時間、少なくとも６６時間、少なくとも７２時間にわたって溶液を凍結することを含む凍結乾燥サイクルを含む。
【００３９】
凍結乾燥された組成物は、本技術分野で公知のいかなる方法を用いて再構成されて、再構成された組成物が作製されてもよい。例えば、それは、適切な体積の二回蒸留水ＤＤＷ又は注射用ＩＶ水を添加することによって再構成されてよい。典型的には、凍結乾燥された組成物に添加される体積は、凍結乾燥前にバイアルに最初に添加された体積である。
【００４０】
本明細書で述べる方法に従って作製された凍結乾燥前組成物におけるナノ粒子は、約４０から５０ｎｍの範囲であり、一方再構成された組成物におけるナノ粒子は、約８０から約９０ｎｍの範囲である。
【００４１】
核酸とカチオン性ポリマーとの間で形成される複合体は、炭水化物対複合体中核酸−カチオン性ポリマーの重量／重量比が、とりわけ、組成物を形成するために用いられる特定の炭水化物及び核酸に応じて変動し得るようなものであってよい。ある実施形態では、比は、５０から５０００である。
【００４２】
ある実施形態では、比は、５０から４０００である。ある実施形態では、比は、５０から３０００である。ある実施形態では、比は、５０から２０００である。ある実施形態では、比は、５０から１０００である。ある実施形態では、比は、５０から５００である。
【００４３】
ある実施形態では、比は、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、又は５００である。
【００４４】
ある実施形態では、比は、約９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、１０００、１００５、１０１０、１０１５、１０２０、１０２５、１０３０、１０３５、１０４０、１０４５、１０５０、１０５５、１０６０、１０６５、１０７０、１０７５、１０８０、１０８５、１０９０、１０９５、２０００、２００５、２０１０、２０１５、２０２０、２０２５、２０３０、２０３５、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、３０００、３００５、３０１０、３０１５、３０２０、３０２５、３０３０、３０３５、３０４０、３０４５、３０５０、３０５５、３０６０、３０６５、３０７０、３０７５、３０８０、３０８５、３０９０、３０９５、４０００、４００５、４０１０、４０１５、４０２０、４０２５、４０３０、４０３５、４０４０、４０４５、４０５０、４０５５、４０６０、４０６５、４０７０、４０７５、４０８０、４０８５、４０９０、４０９５、又は５０００である。
【００４５】
ある実施形態では、比は、約１２５、又は２５０、又は５００、又は１０００である。
【００４６】
ある実施形態では、比は、１０００未満である。ある実施形態では、比は、１２５又は５００である。
【００４７】
別の態様では、本発明は、本発明の方法から誘導される製品を提供する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのカチオン性ポリマー、及び少なくとも１つの炭水化物を含む凍結乾燥された組成物を提供し、ここで、少なくとも１つの核酸及び少なくとも１つのカチオン性ポリマーは、少なくとも１つの炭水化物の核酸−カチオン性ポリマーに対する重量／重量比が５０から５０００であるように、複合体を形成する。
【００４９】
本発明の製品、本発明の方法によって作製されたもの、及び他の方法によって作製され、それ自体が新規であるものは、少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのカチオン性ポリマー、及び少なくとも１つの炭水化物を含む凍結乾燥前、凍結乾燥された、及び再構成された組成物又は溶液であってよく、ここで、少なくとも１つの核酸及び少なくとも１つのカチオン性ポリマーは、少なくとも１つの炭水化物の核酸−カチオン性ポリマーに対する重量／重量比が５０から５０００であるように、複合体を形成する。
【００５０】
「凍結乾燥前組成物」などの用語は、本明細書で述べる方法に従って作製された中間体を意味する。具体的には、凍結乾燥前組成物は、核酸がポリマーに添加される「逆の」順序で作製される。そのような「凍結乾燥前組成物」は、核酸（例：ＤＮＡ）、ポリマー（例：ＰＥＩ）、及び炭水化物溶液（例：トレハロース）を含む。
【００５１】
「凍結乾燥された組成物」などの用語は、乾燥材料（すなわち、凍結乾燥後の凍結乾燥前組成物）を意味する。
【００５２】
「再構成された組成物」などの用語は、凍結乾燥された組成物及び再構成のために用いられる液体キャリア（例：ＤＤＷ又は注射用ＩＶ水）を意味する。典型的には、再構成された組成物は、医師によって、例えば患者に投与する前に医師によって再構成される。
【００５３】
ある実施形態では、組成物は、水を例とする液体媒体も含む凍結乾燥前組成物又は溶液である。ある実施形態では、凍結乾燥された組成物は、水を含まない乾燥組成物である。
【００５４】
本明細書で述べる凍結乾燥された組成物は、アモルファス粉末である。凍結乾燥前組成物及び再構成された組成物（すなわち、注射用水による再構成後）の色は、僅かな乳白色のままである（すなわち、分解の徴候を示していない）。
【００５５】
さらに、凍結乾燥前組成物は、長期間にわたる保存のために、凍結乾燥された組成物を作製する目的の本技術分野で公知の、又は本明細書で述べるいかなる凍結乾燥法を用いて凍結乾燥されてもよい。凍結乾燥後、凍結乾燥された組成物は、少なくとも１２ヶ月の保存期間を有する（例：少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４ヶ月、又はそれ以上）。
【００５６】
凍結乾燥された組成物は、使用前に、再構成された組成物を提供する目的の本技術分野で公知の、又は本明細書で述べるいかなる方法を用いて再構成されてもよい。再構成後、再構成された組成物の色は、僅かな乳白色のままである（すなわち、分解の徴候を示していない）。
【００５７】
本発明の組成物又は配合物に製剤され得る少なくとも１つの核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含むいかなる核酸含有分子であってもよい。「核酸」の用語は、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシル−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンなど、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれを含む配列も包含する。
【００５８】
ある実施形態では、核酸は、プラスミド、すなわち、細胞毒性遺伝子産物をコードする異種配列と作動可能に連結された制御配列を含有するポリヌクレオチドであり、ここで、制御配列は、癌細胞中で特異的に発現されるゲノムインプリント遺伝子由来である。
【００５９】
ある実施形態では、「プラスミド」の用語は、本明細書で用いられる場合、定められるように、いずれの核酸（すなわち、ＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなど）をも意味することを意図している。
【００６０】
ある実施形態では、少なくとも１つの核酸は、参照により本明細書に援用される国際出願ＰＣＴ／ＩＬ１９９８／０００４８６（国際公開第１９９９／０１８１９５号）又はそれから派生したいずれかの米国特許出願に挙げられているプラスミドである。
【００６１】
ある実施形態では、少なくとも１つの核酸は、参照により本明細書に援用される国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００８／００１４０５（国際公開第２００９／０５３９８２号）又はそれから派生したいずれかの米国特許出願に挙げられているプラスミドである。
【００６２】
ある実施形態では、少なくとも１つの核酸は、参照により本明細書に援用される国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００６／００１１１０（国際公開第２００７／０３４４８７号）又はそれから派生したいずれかの米国特許出願に挙げられているプラスミドである。
【００６３】
ある実施形態では、少なくとも１つの核酸は、参照により本明細書に援用される国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００６／０００７８５（米国特許第８，０６７，５７３号）又はそれから派生したいずれかの米国特許出願に挙げられているプラスミドである。
【００６４】
ある実施形態では、少なくとも１つの核酸は、参照により本明細書に援用される国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００８／００００７１（米国特許第７，９２８，０８３号）又はそれから派生したいずれかの米国特許出願に挙げられているプラスミドである。
【００６５】
ある実施形態では、プラスミド中の制御配列は、Ｈ１９制御配列であってよい（例：Ｈ１９プロモーター、Ｈ１９エンハンサー、又はＨ１９プロモーター及びＨ１９エンハンサーの両方）。例えば、Ｈ１９制御配列は、Ｈ１９プロモーター及びエンハンサーを含んでよく、異種配列は、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、リシン、コレラ毒素、網膜芽細胞腫遺伝子、ｐ５３、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ、水痘帯状疱疹ウィルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チトクロムｐ−４５０  ２Ｂ１、チミジンホスホリラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼＡ及びＧ２、リナマラーゼ、β−ラクタマーゼ、並びにキサンチンオキシダーゼから成る群より選択されるタンパク質をコードする。
【００６６】
他の実施形態では、制御配列は、ＩＧＦ−２  Ｐ４プロモーター又はＩＧＦ−２  Ｐ３プロモーターである。
【００６７】
本明細書で述べる方法での使用に適するプラスミドは、細胞毒性遺伝子産物をコードする異種配列と作動可能に連結された制御配列を含有するポリヌクレオチドを含んでよく、ここで、制御配列は、癌細胞中で特異的に発現されるゲノムインプリント遺伝子由来である。
【００６８】
制御配列は、Ｈ１９制御配列（例：Ｈ１９プロモーター、Ｈ１９エンハンサー、又はＨ１９プロモーター及びＨ１９エンハンサーの両方）、ＩＧＦ−２  Ｐ４プロモーター、又はＩＧＦ−２  Ｐ３プロモーターであってよい。例えば、Ｈ１９制御配列は、Ｈ１９プロモーター及びエンハンサーであってよく、異種配列は、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、リシン、コレラ毒素、網膜芽細胞腫遺伝子、ｐ５３、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ、水痘帯状疱疹ウィルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チトクロムｐ−４５０  ２Ｂ１、チミジンホスホリラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼＡ及びＧ２、リナマラーゼ、β−ラクタマーゼ、並びにキサンチンオキシダーゼから成る群より選択されるタンパク質をコードする。Ｈ１９エンハンサーは、異種配列に対して３’側に配置されてよい。
【００６９】
当業者であれば、異種配列が以下のいずれか１つ以上：β−ガラクトシダーゼ；ジフテリア毒素；シュードモナス毒素；リシン；コレラ毒素；網膜芽細胞腫遺伝子；ｐ５３；単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ；水痘帯状疱疹ウィルスチミジンキナーゼ；シトシンデアミナーゼ；ニトロレダクターゼ；チトクロムｐ−４５０  ２Ｂ１；チミジンホスホリラーゼ；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；アルカリホスファターゼ；カルボキシペプチダーゼＡ及びＧ２；リナマラーゼ；β−ラクタマーゼ；キサンチンオキシダーゼのコード配列；並びにｃｄｋ２、ｃｄｋ８、ｃｄｋ２１、ｃｄｃ２５Ａ、ｃｙｃｌｉｎＤ１、ｃｙｃｌｉｎＥ、ｃｙｃｌｉｎＡ、ｃｄｋ４、発癌性形態のｐ５３、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｋｒ−ｒａｓ、及びＨｅｒ２／ｎｅｕから成る群より選択される遺伝子をコードする配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンス配列、から選択されてよいことは認識される。異種配列は、ｃｄｋ２、ｃｄｋ８、ｃｄｋ２１、ｃｄｃ２５Ａ、ｃｙｃｌｉｎＤ１、ｃｙｃｌｉｎＥ、ｃｙｃｌｉｎＡ、ｃｄｋ４、発癌性形態のｐ５３、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｋｒ−ｒａｓ、及びＨｅｒ２／ｎｅｕから成る群より選択される遺伝子をコードするＲＮＡを特異的に開裂するリボザイムをコードしてもよい。
【００７０】
本明細書で述べる凍結乾燥前組成物及び再構成された組成物中の核酸濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬから０．８ｍｇ／ｍＬ（例：０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、若しくは０．８ｍｇ／ｍＬ）、又はそれより低くてもよい。この核酸濃度は、先行技術の組成物で見られる核酸充填量（すなわち、約０．０１〜０．０５ｍｇ／ｍＬ）よりもおよそ８から４０倍高い。本明細書で述べる凍結乾燥前組成物及び再構成された組成物では、核酸及びＰＥＩの両方が、トレハロース溶液中に希釈されている。
【００７１】
本発明の方法及び配合物で用いられる少なくとも１つの炭水化物は、本技術分野で公知のいかなる炭水化物材料であってもよい。本明細書で用いられる場合、「炭水化物」は、炭水化物化学の技術分野で公知であるように、一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有するいずれの化合物をも含むことを意図しており、「サッカリド」、「ポリサッカリド」、「オリゴサッカリド」、及び「糖」の用語と交換可能に用いられてよい。
【００７２】
炭水化物は、モノ−、ジ−、トリ−、及びオリゴ−サッカリド、さらにはグリコーゲン、セルロース、及びデンプンなどのポリサッカリドのいずれか１つであってよい。
【００７３】
ある実施形態では、少なくとも１つの炭水化物は、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースなどのモノサッカリド；トレハロース、スクロース、セロビオース、マルトース、ラクトースなどのジサッカリド；ラフィノース、スタキオース、マルトデキストリンなどのオリゴサッカリド；セルロース、ヘミセルロース、デンプンなどのポリサッカリドから選択される。
【００７４】
ある実施形態では、少なくとも１つの炭水化物は、トレハロース、グルコース、スクロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、ラフィノース、ＰＶＰ、及びデキストロースから選択される。
【００７５】
ある実施形態では、少なくとも１つの炭水化物は、グルコース又はスクロースではない。
【００７６】
ある実施形態では、少なくとも１つの炭水化物は、モノサッカリド又はジサッカリドである。
【００７７】
ある実施形態では、少なくとも１つの炭水化物は、トレハロースである。
【００７８】
「カチオン性ポリマー」の用語は、カチオン性基及び／又はイオン化されてカチオン性基となることのできる基を含む、天然、合成、又は半合成のいずれのポリマーであってもよい。カチオン性ポリマーは、親水性又は両親媒性であってよい。ある実施形態では、カチオン性ポリマーは、一級、二級、三級、及び／又は四級アミン基を含有するポリマーから選択される。アミン基は、主ポリマー鎖の一部であってよく、又は主鎖上のペンダント基であってもよく、又は主鎖に接続された１つ以上の側基を介して主鎖と結合されていてもよい。
【００７９】
ある実施形態では、少なくとも１つのカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリエーテルアミン、ポリビニルピリジン、正に帯電した官能基を有するポリサッカリド、ポリアミノ酸、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−ＤＬ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−ｅ−ＣＢＺ−０−リジン、ポリ−ｅ−ＣＢＺ−ＤＬ−リジン、ポリ−ｅ−ＣＢＺ−Ｌ−リジン、ポリ−ＯＬ−オルニチン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−ＤＥＬＴＡ−ＣＢＺ−ＤＬ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（−Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸）−ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グルタミン酸）−ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（Ｌ−チロシン、Ｌ−グルタミン酸）−ポリ−ＤＬ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンとトリプトファン、チロシン、又はセリンとのコポリマー、Ｄ−グルタミン酸とＤ−リジンとのコポリマー、Ｌ−グルタミン酸とリジン、オルニチン、又はリジン及びオルニチンの混合物とのコポリマー、並びにポリ−（Ｌ−グルタミン酸）から選択される。
【００８０】
ある実施形態では、少なくとも１つのカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。
【００８１】
理論に束縛されるものではないが、本明細書で述べる凍結乾燥前組成物、凍結乾燥された組成物、及び再構成された組成物において、３つの成分（すなわち、プラスミド、カチオン性ポリマー、及び炭水化物）が一緒に組み合わされて、新規な材料形態が提供されるものと考えられる。対照的に、先行技術の組成物では、炭水化物は、既に形成された複合体に添加され、単に凍結保護剤及び安定化剤の両方として働くだけであり、そのため、本発明の組成物と比較して、より高い比率が必要とされる。したがって、本明細書で述べる組成物中での炭水化物の核酸に対する比は、先行技術で用いられる比よりも、およそ約４０から約４００倍低い。
【００８２】
ある実施形態では、ＰＥＩのアミン基のモル数の核酸のリン酸基のモル数に対する比は、２から１０である（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は６から８）。
【００８３】
ある実施形態では、組成物は、ヒスチジン及び／又は塩化ナトリウムを含有しない。
【００８４】
このような組成物では、正に帯電したＰＥＩ及び負に帯電した核酸が、炭水化物（例：トレハロース）の存在下でナノ粒子を形成する。凍結乾燥前溶液におけるナノ粒子は、約４０から約５０ｎｍの範囲であり（例：約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ｎｍ）、再構成品におけるナノ粒子は、約８０から約９０ｎｍの範囲である（例：約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、又は９０ｎｍ）。
【００８５】
一般的に述べると、とりわけ、ナノ粒子を成す正に帯電したＰＥＩ及び負に帯電した核酸に応じて、ナノ粒子のサイズは、４０ｎｍから約５００ｎｍの間で変動し得る。したがって、ナノ粒子は、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、及び５００から選択されるサイズを有してよい。
【００８６】
本発明はさらに、本明細書で開示される配合物も考慮する。
【００８７】
さらに、本発明に従う組成物、配合物、及び製剤の使用も考慮される。ある実施形態では、本発明に従う組成物、配合物、及び製剤は、医療での使用のために製剤されてよい。したがって、本発明は、さらに、医薬組成物、配合物、及び製剤も提供する。
【００８８】
本発明は、本発明に従う組成物、配合物、又は製剤の医薬の作製における使用も提供する。
【００８９】
ある実施形態では、医薬は、本発明に従って用いられる１つ以上の核酸によって治療可能である疾患又は障害に罹患している対象の治療方法で使用するためのものである。
【００９０】
ある実施形態では、１つ以上の核酸によって治療可能である疾患又は障害は、増殖性の疾患及び障害から選択される。
【００９１】
ある実施形態では、疾患は、関節リウマチである。
【００９２】
したがって、少なくとも１つの増殖性疾患若しくは障害を治療又は予防する方法、及び関節リウマチを治療又は予防する方法も提供される。
【００９３】
少なくとも１つの増殖性疾患又は障害は、癌の中から選択されてよい。したがって、本発明は、さらに、患者における腫瘍の治療又は予防での使用も考慮する。本発明に従う治療の概略的方法は、凍結乾燥された組成物を得ること、及びその組成物を、例えば二回蒸留水（ＤＤＷ）又は注射用ＩＶ水を用いて再構成して、有効量の組成物とすること、及び再構成された組成物を対象に投与することを含んでよい。
【００９４】
ある実施形態では、増殖性疾患が癌である場合、それは、膀胱癌、肝細胞癌、肝芽腫（hapatoblastoma）、横紋筋肉腫（rhabdomysarcoma）、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、甲状腺癌、星状細胞腫、神経節芽腫、及び神経芽細胞腫から成る群より選択されてよい。
【００９５】
１つの実施形態では、膀胱癌は、筋層非浸潤性膀胱癌であり、組成物は、膀胱内投与、静脈内投与、腫瘍内投与されるか、又は本技術分野で公知の適切な他のいかなる方法を用いて投与されてもよい。
【００９６】
特に定めのない限り、本明細書で用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で述べるものと類似する又は同等の方法及び材料が、本発明の実践又は試験に用いられてよいが、以下では、適切な方法及び材料について記載する。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び例は、単なる実例であり、限定することを意図するものではない。
【００９７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な記述及び請求項から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
本明細書で開示される主題をより良く理解する目的で、及びそれを実際に実施することのできる方法を例示する目的で、実施形態を、単なる限定されない例として、添付の図面を参照しながらここで記載する。
【００９９】
【図１】図１Ａ−図１Ｂは、凍結乾燥前（凍結乾燥前組成物、図１Ａ）及び再構成後（再構成された、図１Ｂ）の溶液の効力を実証するアッセイを示すグラフである。Ｌｕｃ  ４＝効力なし（ベースライン；最大発光；すべての細胞が生存）；Ｃｏｍｐ＝従来の製剤における効力；Ｒｅｖ＝本発明の新規な作製方法における効力；及びＵｓｕａｌ＝新たな組成物
【図２】図２は、サンプルの電気泳動の結果を示す。Ｌａｎｅ１は、マーカーであり；Ｌａｎｅ２は、プラスミドＢＣ−８１９であり；Ｌａｎｅ３は、５％  グルコース中のＢＣ−８１９／ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）組成物であり（標準的作製）；Ｌａｎｅ４は、トレハロース中の組成物であり（逆プロトコル）；Ｌａｎｅ５は、ＤＤＷによる再構成後の凍結乾燥された組成物であり（再構成された組成物）；Ｌａｎｅ６は、５％  トレハロース中のＢＣ−８１９／ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）組成物である。
【図３】図３は、本明細書で述べる標準的方法及び逆方法の両方を用いて作製されたＰＥＩ／ＢＣ−８１９組成物の粒子の体積によるサイズ分布を示すグラフである。
【図４】図４は、本明細書で述べる標準的方法及び逆方法の両方を用いて作製されたＰＥＩ／ＢＣ−８１９組成物の粒子のゼータ電位分布を示すグラフである。
【図５】図５は、以下の例３で述べる分光光度測定試験の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、以下の例３で述べる方法を用いたさらなるサンプルの電気泳動の結果を示す。Ｌａｎｅ１は、ラダーであり；Ｌａｎｅ２は、ＢＣ−８１９プラスミドであり；Ｌａｎｅ３は、グルコース溶液中の組成物である（標準的プロトコル）；Ｌａｎｅ４は、トレハロース中の組成物であり（逆プロトコル）；Ｌａｎｅ５は、再水和後の凍結乾燥されたポリプレックス（再構成された組成物）；及びＬａｎｅ６は、トレハロース溶液中の組成物である。
【図７】図７Ａ−図７Ｂは、グルコース組成物（図７Ａ）及びトレハロース組成物（図７Ｂ）の外観を示すＴＥＭ写真である。
【図８】図８は、組成物の析出後のサンプルを示すＴＥＭ写真である。
【図９】図９Ａ−図９Ｂは、透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）の結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、５％  グルコースコントロールと比較して、先行技術の組成物又は再構成された凍結乾燥組成物の注射を３回受けたヌードマウス中のＨＣＴ−１１６細胞の腫瘍進行を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本明細書で用いられる場合、「グルコースポリプレックス」、「グルコース組成物」などの用語は、ポリサッカリドとしてトレハロースではなくグルコースを用いて作製された先行技術の組成物を意味する。同様に、「標準的ポリプレックス製剤」、「標準的組成物」などの用語は、ポリマーをプラスミドに添加することによって（すなわち、「逆ではない」順序で）作製された先行技術の組成物を意味する。
【０１０１】
本明細書で用いられる場合、「凝集」、「凝集物」などの用語は、許容可能であると見なされる最大粒子サイズよりも大きいサイズを有する粒子を意味する。許容可能な最大粒子サイズを特定するために、光散乱の異なる測定値を提供し、標準的作製法と新規作製法とを比較して、何らかの相違があるかどうかを調べる。
【０１０２】
異種コード配列の腫瘍細胞特異的発現を指向するために用いることのできる制御配列は、本技術分野にて公知である。例えば、上流Ｈ１９プロモーター領域及び／又は下流Ｈ１９エンハンサー領域を含むＨ１９制御配列は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，０８７，１６４号に記載されている。ヒトＨ１９遺伝子の下流エンハンサー領域が、所望に応じて、腫瘍細胞特異的発現のレベルを高める目的で、Ｈ１９プロモーター／異種遺伝子コンストラクトに付加されてもよい。
【０１０３】
米国特許第６，０８７，１６４号には、Ｈ１９エンハンサー又はその活性断片と組み合わせたＩＧＦ−２  Ｐ３及びＰ４プロモーターの使用についても記載されている。
【０１０４】
当業者であれば、Ｈ１９発現癌細胞（例：例を挙げると、膀胱癌細胞）を例とする適切な宿主細胞中での異種コード配列の腫瘍特異的発現を指向する目的で、癌細胞中で発現されるゲノムインプリント遺伝子及び非インプリント遺伝子からの制御配列を用いることができる。腫瘍特異的発現を指向する能力を維持するいかなる変化された制御配列も、さらなる使用のための組換え発現ベクター中に組み込まれてよい。
【０１０５】
毒性の遺伝子産物、毒性の可能性のある遺伝子産物、及び抗増殖性又は細胞増殖抑制性遺伝子産物をコードする遺伝子など、広範な様々な異種遺伝子が、これらの制御配列の制御下で発現可能である。酵素（例：ＣＡＴ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質、又は抗原マーカーを含むマーカー遺伝子も発現可能である。
【０１０６】
細胞毒性遺伝子産物は、広くは、毒素及びアポトーシス誘導剤の両方を含むとして定義される。加えて、細胞毒性遺伝子産物は、プロドラッグを細胞毒性産物に変換する薬物代謝酵素も含む。本発明の方法で用いられてよい細胞毒性遺伝子産物の例は、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、リシン、コレラ毒素、ＰＥ４０、並びに網膜芽細胞腫遺伝子及びｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子を含む。加えて、細胞アポトーシスを誘導するアポトーシスペプチドをコードする配列も用いられてよい。そのようはアポトーシスペプチドとしては、アルツハイマー病のＡベータペプチド（LaFerla et al., Nat. Genet. 9:21-30 (1995)参照）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（Wu et al., J. Biol. Chem. 272:14860-14866 (1997)参照）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Sakuta et al., J. Neuroimmunol. 67:103-109 (1996)参照）、並びに公知の又は発見されることになる他のアポトーシスペプチドが挙げられる。
【０１０７】
プロドラッグを細胞毒性産物に変換する薬物代謝酵素としては、チミジンキナーゼ（単純ヘルペスウィルス又は水痘帯状疱疹ウィルス由来）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チトクロムｐ−４５０  ２Ｂ１、チミジンホスホリラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼＡ及びＧ２、リナマラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、並びにキサンチンオキシダーゼが挙げられる（背景については、Rigg and Sikora, Mol. Med. Today, pp. 359-366 (August 1997)参照）。
【０１０８】
加えて、アンチセンス、アンチジーン、又はアプタマーオリゴヌクレオチドも、発現コンストラクトを用いて癌細胞へ送達され得る。リボザイム又は一本鎖ＲＮＡも、癌細胞中で発現されて、対象とする特定の遺伝子の発現を阻害し得る。これらのアンチセンス又はリボザイム分子の標的遺伝子は、細胞の維持又は癌細胞表現型の維持に必須である遺伝子産物をコードする遺伝子であるべきである。そのような標的遺伝子としては、これらに限定されないが、ｃｄｋ２、ｃｄｋ８、ｃｄｋ２１、ｃｄｃ２５Ａ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、サイクリンＡ、及びｃｄｋ４が挙げられる。
【０１０９】
例えば、内在性遺伝子の発現を下方制御する目的で、癌細胞中で発現されるインプリント遺伝子又はＩＧＦ−１プロモーターからの制御配列の制御下、ｐ５３、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｋｒ−ｒａｓ、及び／又はＨｅｒ２／ｎｅｕの癌遺伝子形態の転写物に対して特異的なアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムを発現するベクターが細胞に導入される。Ｈ１９を発現し、Ｈ１９制御配列を活性化し得る（又はＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２  Ｐ３、若しくはＰ４プロモーターを特異的に活性化する）腫瘍細胞が、アンチセンスＲＮＡ又はリボザイムＲＮＡの発現において特異的に標的とされ得る。
【０１１０】
アンチセンスの手法は、標的ｍＲＮＡに対して相補的であるオリゴヌクレオチド(この場合はｍＲＮＡ)の設計を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的ｍＲＮＡ転写物と結合し、翻訳を阻止する。完全な相補性は必要とされない。本明細書中で言及される場合、ＲＮＡの一部分に対して「相補的」である配列とは、そのＲＮＡにハイブリダイズして安定な二重鎖を形成可能であるのに充分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、相補性の度合い及びアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとの塩基のミスマッチをより多く含有する可能性があるが、それでも安定な二重鎖（又は場合によっては三重鎖）を形成する。当業者であれば、二重鎖の融点を決定するための標準的な手順を用いることで、ミスマッチの許容可能な度合いを確認することができる。
【０１１１】
標的メッセージの５’末端、例えば、５’側非翻訳配列からＡＵＧ開始コドンを含むまでに対して相補的であるオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害において最も効果的に作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’側非翻訳配列に対して相補的である配列も、ｍＲＮＡの翻訳の阻害に効果的であることが最近示された。全般については、Wagner, R., Nature 372:333-335 (1994)を参照されたい。したがって、内在性遺伝子の翻訳を阻害するために、標的遺伝子転写物の５’又は３’側非翻訳非コード領域のいずれかに対して相補的であるオリゴヌクレオチドが、アンチセンス手法で用いられ得る。ｍＲＮＡの５’側非翻訳領域に対して相補的であるオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に対して相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効果のより低い翻訳阻害物質であるが、本発明に従って用いられ得る。標的ｍＲＮＡの５’側、３’側、又はコード領域のいずれとハイブリダイズするように設計されるかどうかに関わらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであるべきであり、好ましくは、６から約５０ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、又は少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０１１２】
必須標的遺伝子を触媒的に開裂するように設計されたリボザイム分子も、標的ｍＲＮＡの翻訳の阻止に用いられ得る（例えば、１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ国際出願公開第９０／１１３６４号；Sarver et al., Science 247:1222-1225 (1990)参照）。リボザイムが、癌細胞増殖において必須のタンパク質をコードする遺伝子転写物に対して特異的である場合、そのようなリボザイムは、癌性の細胞表現型を逆転させ得る。標的ｍＲＮＡの破壊には、ｍＲＮＡを部位特異的認識配列で開裂するリボザイムが用いられ得るが、ハンマーヘッド型リボザイムを用いることが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって決定される位置でｍＲＮＡを開裂する。唯一の必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基の配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び作製は、本技術分野において公知であり、Haseloff and Gerlach, Nature, 334:585-591 (1988)に、より詳細に記載されている。好ましくは、リボザイムは、開裂認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端近傍に位置するように、すなわち、効率を高め、非機能性ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小限に抑えるように遺伝子操作される。
【０１１３】
リボザイムはまた、テトラヒメナ・サーモフィラ（Tetrahymena thermophila）に天然に存在し（ＩＶＳ又はＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られる）、Ｔｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈ及び共同研究者らによって広く報告されたものなどのＲＮＡエンドリボヌクレアーゼも含む（Zaug et al., Science, 224:574-578 (1984)；Zaug and Cech, Science, 231:470-475 (1986)；Zaug et al., Nature, 324:429-433 (1986)；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｔｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．による国際特許出願公開第８８／０４３００号；Been and Cech, Cell, 47:207-216 (1986)）（以降、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」と称する）。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズし、その後に標的ＲＮＡの開裂を起こす８塩基対の活性部位を有する。
【０１１４】
本技術分野にて公知のいずれのプラスミドも、本発明の方法及び組成物に用いられてよい。限定されない例として、プラスミドＢＣ−８１９及びＢＣ−８２１（ＢｉｏＣａｎｃｅｌｌ、イスラエル）が用いられてよい。これらのプラスミドは、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，０８７，１６４号及び米国特許出願公開第２０１００２５６２２５号により詳細に記載されている。
【０１１５】
インプリント遺伝子の発現を再活性化する細胞は、異種遺伝子に作動可能に連結されたそのようなインプリント遺伝子制御領域を含有する発現コンストラクトを特異的に活性化することもできる。そのような細胞、特に腫瘍細胞は、本発明の遺伝子治療法における適切な標的である。腫瘍及び細胞株の両方におけるＨ１９、並びにＩＧＦ−２  Ｐ３及びＰ４の特異的な発現は、ＲＮＡ分析の技術、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びレポーター遺伝子コンストラクトを用いて特定され得る。加えて、活性化されたＩＧＦ−１遺伝子発現を伴う腫瘍細胞も、同様にして特定され得るものであり、ＩＧＦ−１プロモーターを用いて異種遺伝子の発現を指向する遺伝子治療法において標的とされ得る。
【０１１６】
活性化されたＨ１９発現を伴う代表的な腫瘍型は、以下の通りである：
Ａ．小児の固形腫瘍
１．ウィルムス腫瘍
２．肝芽腫
３．胎児性横紋筋肉腫
Ｂ．胚細胞性腫瘍及び絨毛性腫瘍
１．精巣胚細胞腫瘍
２．未成熟卵巣奇形腫
３．仙尾骨腫瘍
４．絨毛癌
５．胎盤部絨毛性腫瘍
Ｃ．成人上皮性腫瘍
１．膀胱癌
２．肝細胞癌
３．卵巣癌
４．子宮頸癌
５．肺癌
６．乳癌
７．頭頸部扁平上皮癌
８．食道癌
９．甲状腺癌
Ｄ．神経性腫瘍
１．星状細胞腫
２．神経節芽腫
３．神経芽細胞腫
【０１１７】
これらの癌のいずれも、本発明の方法によって治療可能である。実際、Ｈ１９発現を活性化するいずれの腫瘍も、本発明の方法で治療され得る。加えて、ＩＧＦ−１、並びにＩＧＦ−２  Ｐ３及びＰ４プロモーターを活性化する腫瘍も、本発明の方法によって治療可能である。例えば、ＩＧＦ−２  Ｐ３及びＰ４プロモーターは、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、及び肝芽腫などの小児腫瘍中で活性化される。
【０１１８】
治療法
本発明はまた、癌及び過剰増殖性疾患を治療するための治療法での使用のための異種遺伝子に作動可能に連結された制御領域を含有するポリヌクレオチドの使用も包含する。治療目的のために、本発明の発現コンストラクトは、生物学的に有効ないかなるキャリア中で投与されてもよく、例えば、ヌクレオチドコンストラクトを生体内で細胞へ有効に送達することのできるいずれの配合物又は組成物であってもよい。
【０１１９】
ウィルス導入法に加えて、非ウィルス法も、動物の組織中での所望される異種遺伝子の指向された発現を引き起こすために用いられてよい。遺伝子導入のほとんどの非ウィルス法は、哺乳類細胞が高分子の取り込み及び細胞内輸送のために用いている通常のメカニズムに依存している。ある実施形態では、本発明の非ウィルス遺伝子送達システムは、標的とする細胞による対象の発現コンストラクトの取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依存している。このタイプの代表的な遺伝子送達システムとしては、例えばポリプレックスが挙げられる。
【０１２０】
ポリプレックス形成及び凍結乾燥
本明細書で述べるように、カチオン性ポリマーは、細胞及び組織への効率的な核酸（例：ＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなど）の送達を媒介する目的で、プラスミドを例とする核酸と組み合わせたトランスフェクション試薬として用いられ得る。組成物は、核酸がカチオン性ポリマーと複合体を形成した場合に形成される。
【０１２１】
当業者であれば、例えば、脂質、リポソーム、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ミセル、ヒアルロン酸、タンパク質、乳化剤、界面活性剤、ウィルス系ベクター、及び／又は標的指向化部分などの本技術分野において一般的に用いられる他の添加剤も、本発明の組成物に用いられてよいことは認識される。
【０１２２】
しかし、ある実施形態では、ポリプレックス配合物（例：凍結乾燥前組成物）は、核酸、カチオン性ポリマー、糖、及び所望に応じて含まれてよい緩衝剤しか含有していない。対照的に、本技術分野で用いられる他の配合物は、例えばヒスチジンなどの他の成分を含有する。
【０１２３】
ポリプレックス形成に用いるための１つの代表的なカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である（参照により援用される米国特許第６，０１３，２４０号参照）。例えば、直鎖状ポリエチレンイミン（ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓ．Ａ．、フランス）が用いられてよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）は、窒素残基で表される１５０ｍＭの溶液である。別の選択肢として、直鎖状ＰＥＩは、市販の分岐鎖状ＰＥＩの加水分解によって、又は本技術分野において公知の他のいかなる方法によって作製されてもよい。
【０１２４】
当業者であれば、カチオン性ポリマー／核酸組成物中でのイオンバランスが極めて重要であること、及び効果的な細胞への進入のために、組成物がカチオン性であるべきであることは認識される。Ｎ／Ｐ比は、核酸のリン酸基あたりのカチオン性ポリマー中の窒素残基数として定義される。好ましくは、生体内核酸送達のために、Ｎ／Ｐ比は、２〜１０である（例：６〜８）。Ｎ／Ｐ比の決定は、本技術分野における通常の技術レベルの範囲内である。
【０１２５】
核酸−ＰＥＩ組成物（例：凍結乾燥前組成物）は、ＰＥＩ、プラスミドＤＮＡ、及び炭水化物の混合の過程で形成されるナノ粒子を含有する。混合されると、カチオン性ポリマーの正電荷とプラスミドの負電荷がナノ粒子を形成する。
【０１２６】
適切ないかなる送達経路が用いられてもよく、例えば：静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、腫瘍内、皮下、局所、くも膜下腔内、皮内、硝子体内、皮内、皮質内、精巣内、動脈内、膀胱内（例：膀胱中へ）、門脈内（intraporteal）、脳内、後眼窩注射、鼻腔内などである。ある実施形態では、遺伝子送達媒体は、カテーテルによって導入されてよい（米国特許第５，３２８，４７０号参照）。細胞又は組織中への核酸の送達は、器内、生体内、生体外、又はｉｎ  ｓｉｔｕで行われてよい。
【０１２７】
以下の例１で概説されるように、標準的なポリプレックス形成は、５％  デキストロース溶液で希釈されたトランスフェクション試薬（例：ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標））を、５％  デキストロース溶液で希釈されたＤＮＡプラスミド（例：ＢＣ−８１９プラスミド）中へ導入し、続いて激しく混合することによって達成される。プラスミド／カチオン性ポリマー組成物を作製するためのこの標準的なプロセスは、非常に感受性が高く、正しい順序で行われない場合、析出を起こし易い。さらに、得られたポリプレックス組成物は、不安定であり得、室温で３時間後には、黄色味がかった色が観察される。加えて、標準的なプロトコルで作製される場合、プロセスを逆転させてプラスミドをトランスフェクション試薬へ添加するこれまでの試みでは、ナノ粒子が形成される結果とはならなかった。さらに、これらの溶液は、マイクロ体積に限定されており、凍結乾燥を達成するために、凍結保護剤のナノ粒子に対する高い比率が必要である。
【０１２８】
したがって、大スケールでの作製のために、並びに予測可能な品質及び再水和時の安定性の向上が確保される明確で安定な溶液又は凍結乾燥された組成物の長期保存のために、スケールアップすることのできるポリプレックス形成の方法が求められている。
【０１２９】
いくつかのこれまでの研究では、ＤＮＡプラスミド／ＬＰＥＩ組成物を、高濃度の凍結乾燥保護剤の存在下で凍結乾燥し（すなわち、炭水化物／ＤＮＡプラスミドの高い重量／重量比）、その初期品質を維持することができることが示されている（Brus et al., Journal of Controlled Release 95:119-131 (2004)参照）。ＰＥＩを用いた場合、糖／ＤＮＡの比が７５００の場合に複合体が保護されたと報告されている。さらに、カチオン性脂質−ＤＮＡ（ＬＰＥＩではない）では、２５０の比が必要であった。しかし、Brus et al.で用いられた凍結乾燥プロセスは、大スケールでは再現性がない。さらに、これらの研究で用いられた高濃度の凍結乾燥保護剤は、生体内では許容されない可能性があり、したがって、臨床研究での使用に適さない可能性のある最終製品が得られ得る。
【０１３０】
実際、本発明の発明者らは、驚くべきことに、凍結乾燥プロセスにおいて、非常により低い炭水化物（糖）対核酸比を用いることが可能であり、それによって、低減された炭水化物対核酸比を有する組成物が得られる結果となることを見出した。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、本明細書で述べる組成物の３つの成分（ＤＮＡ、Ｊｅｔ−ＰＥＩ、及び炭水化物）が組み合わされて、容易に凍結乾燥することのできる新規な化学要素が形成されたものと考えている。したがって、必要な炭水化物の濃度が、非常に低くなる。
【０１３１】
このようなより低い濃度は、生体内での適用において許容され易い。例えば、ヒトの血液のモル浸透圧濃度の正常な生理学的範囲は、およそ２８０から３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであるが、グルコースで作製された組成物の場合は、２５０であり、膀胱に用いるためのトレハロースでの組成物の場合は、２８０である。したがって、膀胱用に作製されている溶液は、僅かに低浸透圧であるが、それは、膀胱内投与されている。ＩＶ製剤の場合、濃度は、３００までのＤＮＡ／トレハロース比まで増加されることになる。
【０１３２】
これらの研究はまた、大体積のポリプレックス溶液を作製するという困難な側面も提起しており、この目的を達成するためのマイクロミキサーシステムによる方法の開発が報告されている（Kasper et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 77:182-185(2011)）。しかし、マイクロミキサーシステムは、工業的スケールに持っていくためには、依然としてスケールアップのための開発が必要である。
【０１３３】
以下の例３では、５％  トレハロース溶液の存在下での、Ｈ１９遺伝子制御配列の制御下でジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴＡ）を発現する非ウィルス系ベクターＢＣ−８１９、及びｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）から構成される凍結乾燥前組成物の作製について述べる。
【０１３４】
ＢＣ−８１９（Ｈ１９−ＤＴＡとしても知られる）及びＢＣ−８２１プラスミド（Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＩＧＦ２としても知られる）が、Ｈ１９（ＢＣ−８１９の場合）又はＨ１９及びＩＧＦ２  Ｐ４（ＢＣ−８２１の場合）制御エレメントの制御下でＤＴＡの発現を駆動して、選択的に癌細胞を標的化する新規なＤＮＡベースの治療法を癌の治療に用いることは、すでに報告されている（Ohana et al., International Journal of Cancer 98(5):645-650 (2002)；Ohana et al., The Journal of Gene Medicine 7(3):366-374 (2005)；Abraham et al., The Journal of Urology 180(6):2379-2383 (2008)参照）。これらの治療法は、結腸から肝臓への転移、膀胱癌、膵臓癌、及び卵巣癌の治療において良好な結果を示した（Ohana et al., The Journal of Gene Medicine 7(3):366-374 (2005)；Mizrahi et al., Journal of Translational Medicine 7:69 (2009)；Ohana et al., Gene Therapy and Molecular Biology 8:181-192 (2004)；Scaiewicz et la., Journal of Oncology 178174 (2010)；Sorin et al., International Journal of Oncology 39(6):1407-12 (2011)；Abraham et al., The Journal of Urology 180(6):2379-2383 (2008)参照）。
【０１３５】
これらの膀胱癌臨床試験では、ＢＣ−８１９が、ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）との複合体として（Ｎ／Ｐ＝６）、最終体積５０ｍｌの５％  グルコース中０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度で投与される。
【０１３６】
しかし、成分混合における推奨事項の厳密さ及びこの濃度で形成される組成物の相対的な不安定性により、良好な品質の組成物の作製は、依然として課題である（Kasper et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 77:182-185(2011)参照）。
【０１３７】
以下の例１で述べるように、患者のベッドサイドで、プラスミド及びＰＥＩ溶液はいずれも別々に、５重量／体積％  グルコース溶液中に希釈され、次に非常に素早くプラスミド溶液に添加される。このプロトコルからのいかなる逸脱も、組成物の品質の低下、又はさらに悪いことには、析出にさえ繋がり得る。したがって、組成物の作製は、各用量の投与において、高い技能を持つスタッフの関与が必要である。加えて、得られたポリプレックス溶液は、保存期間が短い。
【０１３８】
したがって、再現性のある良好な品質のポリプレックスの投与を確保する最適な方法は、少なくとも２４ヶ月の保存期間を有するすぐに使用できる製品（例：凍結乾燥された組成物）を薬局へ提供することである。この製品は、使用前に水による簡便な再構成が必要である。
【０１３９】
本明細書で述べる方法により、組成物溶液を、所望される濃度の大体積で、例えばトレハロース溶液として作製することが可能となり、それは続いて治療用量で凍結乾燥することができる。
【０１４０】
作製の過程で用いられる最終トレハロース濃度は、安定な組成物の形成を可能とする等張性環境を提供し、生体内に投与される場合、新たに作製された溶液と同様に許容される。
【０１４１】
安定な凍結乾燥前組成物溶液の形成は、凍結乾燥プロセスを確実に成功させるために極めて重要である。
【０１４２】
この方法を用いることはまた、両成分を混合する順序を逆転させることにより、大体積のポリプレックスを作製する際の技術的限界を克服することも可能とする。ここで、凍結乾燥させることができる比較的高濃度の等張性で安定な凍結乾燥前組成物溶液の作製が、製品を変更することなく達成された。
【０１４３】
この方法は、工業的製造へスケールアップすることができるプラスミド−ＬＰＥＩ（直鎖状ＰＥＩ）組成物の作製における画期的な進歩であり、容易に保存することができ、患者への投与前に均一な作製が可能である安定な製品を提供するものである。
【０１４４】
標準的なポリプレックス形成方法の限界を克服するために、本明細書では、核酸（例：ＢＣ−８１９プラスミド）、カチオン性ポリマー（例：ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標」）、及び炭水化物（例：トレハロース）が逆の順序（標準的なプロトコルと比較して）で混合される凍結乾燥前組成物溶液形成方法が提供される。この方法は、本明細書にて、「逆方法（reverse process）」、「逆方法（reverse method）」、及び／又は「逆ポリプレックス形成」と交換可能に称される。この方法では、プラスミドが、トランスフェクション試薬へ、形成された組成物溶液の連続的な混合を伴うゆっくりであり制御された方法で添加される。重要なことには、凍結乾燥前組成物溶液は、核酸、ＬＰＥＩ、及び炭水化物から構成されて、良好な凍結乾燥製品が確保される非常に安定な新規な化学要素（ＮＣＥ）を形成する。
【０１４５】
得られる凍結乾燥された組成物は、ＰＥＩ、ＤＮＡプラスミド、及びトレハロースの３つの成分しか含有していない。さらに、組成物は、もはや複合体形成されたＰＥＩ／プラスミドと定義されるものではない。そうではなく、それは、異なる化学構造を有するアモルファス粉末である。
【０１４６】
本明細書で述べる逆方法に従って作製された組成物では、炭水化物対核酸−ポリマー組成物比が、本技術分野で公知である他のポリプレックス形成法を用いた場合に見られる比よりも非常に低い。
【０１４７】
凍結乾燥は、加熱が媒介する蒸発を行わない溶解された化合物の脱水プロセスである。凍結乾燥プロセスでは、溶液は凍結され、低圧力環境に付され、その環境下では、水の昇華プロセスが促進され、溶解された化合物に対する損傷は、ゼロから最小限である。
【０１４８】
逆プロトコルを用いてカチオン性ポリマーが核酸と複合体形成されると、それは、本明細書で述べる、又は本技術分野で公知のいかなる凍結乾燥法に従って凍結乾燥されてもよい。本発明以前は、トレハロース、マンニトール、又はスクロースを１０から５０μｇ／ｍＬの濃度でポリプレックスに添加すると、凍結乾燥後に効率の低下が見られた（Brus et al., Journal of Controlled Release 95 (2004) 119-131参照）。
【０１４９】
凍結乾燥された組成物は、使用まで凍結乾燥された形態で保存して、患者への注射前に再構成（例：ＤＤＷにより）することができる。凍結乾燥された組成物は、３か月を超える保存期間を有する（すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４ヶ月超、又はそれ以上）。
【０１５０】
再構成後、組成物の外観は、逆作製法に従って新たに作製された組成物溶液に類似しており、析出は見られない。同様に、再構成されたサンプルは、標準的な作製方法又は新規な作製方法のいずれとも相違を示さない。重要なことには、ポリプレックス溶液中の核酸濃度は、凍結乾燥プロセスによる影響を受けない。
【０１５１】
先行技術の方法によって新たに作製された複合体では、５０〜５００ｎｍの範囲の粒子が得られた。逆順序での凍結乾燥前溶液の作製では、４０〜５０ｎｍの範囲の粒子が得られた。凍結乾燥後の再構成されたサンプル（逆順序を用いた）では、８０〜９０ｎｍの範囲の粒子が得られた。したがって、再構成後、ナノ粒子のサイズは、新たな組成物と同等であった。対照的に、Kasper et al.に記載されるように、低ＤＮＡ濃度の複合体のためにマイクロミキサーを用いて作製した場合、得られた粒子は、６５〜１７０ｎｍの範囲であった。
【０１５２】
室温で３時間後、先行技術の方法（グルコースを用いて作製）によって新たに作製された組成物は、分解の徴候を示した（すなわち、僅かに黄色味がかった色）。対照的に、逆作製法に従って作製された再構成されたサンプル及び溶液（トレハロース中の凍結乾燥前の場合）はいずれも、視認可能な分解の徴候を示さず、色は僅かに乳白色であった。室温で２４時間後、先行技術の方法（グルコースを用いて作製）によって新たに作製された組成物は、黄色であったが、逆作製法に従って作製された再構成されたサンプル及び溶液（トレハロース中の凍結乾燥前）は、視認可能な分解の徴候を示さず、色は僅かに乳白色のままであった。
【０１５３】
したがって、逆作製法を凍結乾燥と組み合わせて用いることにより、標準的なプロセスに付随する問題の多くが解決されるはずである。
【０１５４】
例えば、患者のベッドサイドで、医師は、凍結乾燥された組成物を使用前に再構成するために、凍結乾燥された粉末（凍結乾燥された組成物）を注射用ＩＶ水に溶解する必要があるだけであり、それによって、作製及び投与が単純化される。さらに、その安定性の改善が期待されることから、凍結乾燥された粉末の輸送がより容易となる。加えて、凍結乾燥された製品の特性は、元の含水（すなわち、凍結乾燥されていない状態の）プラスミドと同等である。
【０１５５】
本明細書で述べる逆ポリプレックス製剤法（トレハロース中の凍結乾燥前組成物）は、「Lyophilization of Nucleic Acid Nanoparticles-Formulation Development, Stabilization Mechanisms, and Process Monitoring」と題するJulia Christina Kasperの２０１２年の博士論文に記載される方法とも異なる。Kasperは、安定なポリプレックス溶液を作製するための明確な方法の必要性を認識しており、ポリプレックスの凍結乾燥を試みた場合に一般的に見られるナノ粒子の凝集が、凍結乾燥の凍結工程で現れることを理解していた。
【０１５６】
これらの課題を克服するために、Kasperは、ポリプレックスを作製するための異なる方法を開発した。本明細書で述べる逆プロトコル（トレハロース中での凍結乾燥前）と比較したこの方法の概要を表１に示す。
【０１５７】
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【０１５８】
以下の表２は、Kasperのポリプレックス作製及び凍結乾燥プロトコルと本明細書で述べる逆ポリプレックス作製及び凍結乾燥法との技術的態様の比較を示す。
【０１５９】
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【０１６０】
Kasperは、安定な組成物を作製することの重要性、及び凍結乾燥プロセスの凍結工程の影響についても記載している。以下の表３は、Kasperの研究室でのKasperのポリプレックス作製及び凍結乾燥と本明細書で述べる逆ポリプレックス作製及び凍結乾燥法との技術的態様の概要を示す。
【０１６１】
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【０１６２】
Kasperに記載されているように、ポリプレックスのサイズは、凍結乾燥による影響を受け、粒子サイズは、スクロース対プラスミドＤＮＡ比が増加するほど、良好に保存される。
【０１６３】
具体的には、Kasperの教示によると、０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液は、少なくとも２８００のスクロース／ＤＮＡ比で安定化可能である。Kasperによると、安定化剤／ＤＮＡ比は、完全な安定化を達成するために極めて重要である。限界比は、凍結方法に依存する。
【０１６４】
対照的に、本明細書で述べる逆ポリプレックス、凍結乾燥、及び再構成の方法では、粒子の凝集は見られない。加えて、これらの方法で用いられるトレハロース対核酸の比は、１２５及び２５０であり、Kasperに記載の比よりも非常に低い。
【０１６５】
加えて、本明細書で述べる逆方法で作製される凍結乾燥前溶液は、約４０〜５０ｎｍのサイズ範囲の組成物（例：凍結乾燥前組成物又はポリプレックス）という結果となる。再構成後、再構成された組成物は、約８０〜９０ｎｍの粒子サイズを有していた。対照的に、Kasperに記載のマイクロミキサーでは、凍結乾燥前で、６５〜１７０ｎｍのサイズ範囲を有するポリプレックスという結果となった。さらに、Kasperの報告では、凍結乾燥後、ポリプレックスのｚ径が僅かに増加した。さらに、Kasperの教示よると、凍結フェーズの過程での粒子の動きを避けるのに充分に高い粘度である限りにおいて、賦形剤の選択はそれほど重要ではない。棚冷却法は、組成物を凍結するための検査した他のいずれの方法よりもストレスが少ない。
【０１６６】
したがって、Kasperは、プラスミドＤＮＡもｓｉＲＮＡも、制限なしに良好に凍結乾燥はされなかったと結論付けている。例えば、第一の凍結−解凍実験では、粒子サイズを維持するために、高濃度の一般的に用いられるジサッカリドであるスクロース又はトレハロースが必要であり、これらは、等張性レベルを大きく超えており、それによって、安定化剤対ポリプレックスの限界比の必須条件（約４０００）が示唆されている。実際、Kasperでは、ラクトスクロース、ヒドロキシルプロピルベータデクス（ＨＰ−ｂ−ＣＤ）、又はポビドン（ＰＶＰ）などのより高分子量の賦形剤が、凍結及び乾燥の過程で低浸透圧での充分な粒子安定化のために有益であった。１４％  ラクトスクロース、１０％  ＨＰ−ｂ−ＣＤ／６．５％  スクロース、又は１０％  ＰＶＰ／６．３％  スクロースによる等張性配合物を用いると、ポリプレックスサイズは、凍結乾燥及び４０℃まででの６週間にわたる保存後、過去の実験と比較してはるかに良好に保存された（＜１７０ｎｍ）。
【０１６７】
したがって、ラクトスクロース又はＣＤ／スクロース配合物を用いることによって、Kasperは、ｐＤＮＡ／ＬＰＥＩポリプレックスを、サイズが僅かに増加するだけであり、生物学的活性は保存された状態で凍結乾燥可能であることを示した。
【０１６８】
さらに、Kasperは、組成物を作製する目的で彼らが開発したマイクロミキサー装置についても記載している（Kasper 2012、図４−１参照）。この装置を用いることで、ＬＰＥＩ及びプラスミドの溶液をＴコネクターの接合部で混合することによって、５ｍｌまでの体積でプラスミド−ＬＰＥＩ組成物が作製された。混合速度は、装置へ溶液を注入するシリンジを用いて制御された。
【０１６９】
この方法で良好に作製可能であった組成物は、Ｎ／Ｐ比＝６（ＬＰＥＩ窒素（Ｎ）対ＤＮＡリン酸（Ｐ）のモル比；ポリプレックス濃度を示し、サンプルのプラスミドＤＮＡ濃度を意味する）でＬＰＥＩを含む５０μｇ／ｍｌまでであった。しかし、より高いプラスミド濃度の溶液（特に、４００μｇ／ｍｌ溶液）は、ナノ粒子のサイズが大きい不安定な組成物が得られる結果となった。
【０１７０】
さらに、Kasperの方法では、プラスミド及びＬＰＥＩの両方が、１０ｍＭ  ヒスチジン緩衝液  ｐＨ６に混合されており、組成物溶液は、凍結乾燥プロセスの過程でそれを安定化させる目的で、さらなる高濃度の賦形剤が必要であった。具体的には、Kasperの炭水化物／ＤＮＡ比は、１２００から１４０００であった。
【０１７１】
対照的に、本明細書で述べる逆方法は、ピンチパドルタービン（pinch paddle turbine）を有する標準的な混合容器で行われる。この逆方法は、再現性のある良好な品質を有するポリプレックス溶液（すなわち、凍結乾燥前組成物）の大スケールでの作製を確保する方法を提供する。
【０１７２】
具体的には、上記で記載したように、高品質の凍結乾燥前組成物を確保するには、混合順序が極めて重要である。ここで、ＬＰＥＩ溶液及びプラスミドは、各々、５％  トレハロース溶液と混合される。ＰＥＩ溶液は、次に、混合容器中に投入され、撹拌しながら、プラスミド溶液がＬＰＥＩへ添加される。
【０１７３】
驚くべきことに、負に帯電したプラスミド溶液を、強く正に帯電したＬＰＥＩ溶液へ、トレハロースの存在下で投入することにより、ナノ粒子サイズが小さく（約５０ｎｍ）、高い安定性の均一な凍結乾燥前組成物溶液が得られる結果となる。
【０１７４】
この方法により、Ｎ／Ｐ比＝６（ＬＰＥＩ窒素（Ｎ）対ＤＮＡリン酸（Ｐ）のモル比；ポリプレックス濃度を示し、サンプルのプラスミドＤＮＡ濃度を意味する）でｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）と複合体形成したＤＮＡの濃度４００μｇ／ｍｌで１０００ｍｌの溶液が得られた。炭水化物（トレハロース）／ＤＮＡの比は、１２５である。
【０１７５】
得られた溶液は、次に、１００ｍｌバイアルに充填され、凍結乾燥されて、凍結乾燥された組成物が作製されてよい。１つの限定されない例では、バイアルは、実験用凍結乾燥機ＬｙｏＢｅｔａ  ２５中で、−４５℃での少なくとも４時間にわたる凍結工程、少なくとも４１時間、好ましくは、少なくとも８０時間、より好ましくは、少なくとも１４０時間（例：少なくとも４１、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、又は１４０時間）の２５℃での一次乾燥、及び少なくとも８時間の二次乾燥を含み、乾燥圧力はいずれも０．１５０ｍｂである凍結乾燥サイクルに掛けられた。
【０１７６】
当業者であれば、凍結乾燥された組成物は、適切ないかなる方法を用いて再構成されて、再構成された組成物が形成されてもよいことは認識される。
【０１７７】
これまでのところ、Kasperの装置は、比較的高濃度で良好な品質（低い粒子サイズ、安定な組成物など）である組成物溶液を大体積で作製することはできていない。対照的に、本明細書で述べる逆ポリプレックス形成法は、単純であり、比較的高濃度の高品質で安定な凍結乾燥前組成物溶液が、凍結乾燥プロセスに掛けられる間に組成物を保護するための賦形剤の必要なく得られる結果となる。
【０１７８】
治療エンドポイント及び用量
当業者であれば、医師又は患者の観点から、癌病状に伴う望ましくな症状（例：疼痛、過敏性、体重減少など）の実質的にいかなる軽減又は防止も望ましいことは理解される。加えて、腫瘍の質量又は成長速度のいかなる低減も望ましく、さらには腫瘍の病理組織学的所見の改善も望ましい。したがって、本明細書で用いられる場合、本明細書で用いられる「治療」、「治療的使用」、又は「医薬的使用」の用語は、疾患状態若しくは症状を治療するか、又はそうでなければ、疾患若しくはその他の望ましくない症状の進行をいかなる形であっても防止、妨害、遅延、若しくは逆行させる請求される組成物のあらゆる使用を意味するものとする。
【０１７９】
有効な用量及び治療プロトコルは、従来の手段によって決定されてよく、実験動物での低用量から開始し、続いて効果をモニタリングしながら用量を増やし、体系的に投与レジメンも変化させる。動物実験、好ましくは哺乳動物実験が、体重１キログラムあたりの生物活性剤の最大耐用量又はＭＴＤを決定するために一般的に用いられる。当業者であれば、効果、及びヒトを含む他の種への毒性を回避するための用量の外挿による推定を、通常から行っている。
【０１８０】
効果についてのヒトでの試験が行われる前に、患者での第Ｉ相臨床試験が、安全な用量を確立する補助となる。ある対象に対する最適用量を決定する際、数多くの因子が医師によって考慮され得る。これらの中でも主要なものは、選択された異種遺伝子産物の毒性及び半減期である。さらなる因子としては、患者のサイズ、患者の年齢、患者の全体的状態、治療される特定の癌疾患、疾患の重篤度、患者における他の薬物の存在、遺伝子産物の生体内活性などが挙げられる。試験用量は、動物実験の結果及び臨床文献を考慮した後に選択されることになる。
【０１８１】
細胞毒性剤をコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＨ１９制御領域又はＩＧＦ−２  Ｐ３若しくはＰ４プロモーター領域を含有するアデノウィルス系ベクターのヒトでの有効用量の例は、米国特許第６，０８７，１６４号に提供されている。
【０１８２】
対象における癌病状の治療に用いる場合、本発明は、その態様の１つとして、核酸、カチオン性ポリマー、炭水化物（例：トレハロース）溶液を含有する（すなわち、凍結乾燥された組成物）滅菌充填バイアル若しくはアンプルの形態のキット又はパッケージも提供する。１つの実施形態では、キットは、本明細書で述べる逆方法によって作製された凍結乾燥された形態のポリプレックス溶液を、単位用量又は複数用量のいずれかの量で含有し、ここで、パッケージには、再構成された組成物を形成するための再構成及び癌の治療のためのその内容物の使用を説明するラベルが組み込まれている。
【０１８３】
本発明について記載してきたが、以下の例は、限定ではなく説明のために提供される。
【実施例】
【０１８４】
例１：現行のポリプレックス作製方法
ポリプレックス作製の現行の方法では、プラスミド（ＢＣ−８１９）及びカチオン性ポリマー（ＰＥＩ）は、２つの成分として別々に供給される。ＢＣ−８１９（以前はＤＴＡ−Ｈ１９として知られていた）は、４ｍｇ／ｍＬの濃度で５．３ｍＬを含有するバイアルとして提供され、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、１５０ｍＭの滅菌溶液の２．６ｍＬを含有するバイアルとして提供される。
【０１８５】
2018515479.tif 000005
【０１８６】
例２：凍結乾燥プロトコル
このプロトコルの目的は、ＢＣ−８１９プラスミド及びｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（ポリエチレンイミン）を含有するすぐに使用できる凍結乾燥された組成物を作製することである。このプロトコルでは、ＢＣ−８１９／ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）組成物は、実際には、患者のベッドサイドで作製される。
【０１８７】
重要なことには、プロトコル作製からのいかなる逸脱も、治療結果に影響を与え得る不良な組成物品質をもたらす結果となり得る。
【０１８８】
この凍結乾燥された組成物の使用は、治療の質の偏りのリスクを低減する。
【０１８９】
材料及び装置：
材料
【０１９０】
2018515479.tif 000006
【０１９１】
装置
【０１９２】
2018515479.tif 000007
【０１９３】
安全要求事項
この手順を行う間は、ラテックス又はニトリルグローブ及び清浄な実験用白衣を着用するべきである。試験を必要とするいくつかの材料は、生物災害を引き起こす可能性があり得るため、適切に廃棄されるべきである。
【０１９４】
手順：
器内細胞培養での使用のために作製される溶液はすべて、無菌状態のラミナーフローフード中で作製されるべきである。
【０１９５】
１．  作製
ａ．ＢＣ−８１９のバイアル１つ及びｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）のバイアル１つを解凍する。
ｂ．５０ｍｌのポリプロピレン管中で、２．５ｍｌのＢＣ−８１９を、１０ｍｌの５％  トレハロース溶液と混合する。
ｃ．１２５ｍｌのポリプロピレンカップ中で、１．２ｍｌのｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）を、１１．３ｍｌの５％  トレハロース溶液と混合し、スターラーを入れる。
ｄ．ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）／トレハロース溶液を含有するカップを、マグネティックプレート上に置き、運転する。
ｅ．ＢＣ−８１９／トレハロース溶液を、ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）／トレハロース溶液へ、２ｍｌ／分の速度で滴下する。
ｆ．さらに３分間、マグネティックプレート上で組成物を形成させる。
ｇ．凍結乾燥用に作られたガラス器具へこの溶液を移す。
ｈ．形成された組成物を、−２０Ｃ±５Ｃの冷凍庫に４８時間移す。
ｉ．瓶を、氷を充填したプラスチック容器に移す。
ｊ．瓶を凍結乾燥機に接続し、氷を取り換えながら７２時間運転する。
ｋ．得られた粉末は、再構成まで乾燥器中に保管する。
【０１９６】
２．  ２５ｍｌの滅菌二回蒸留水（ＤＤＷ）を添加することによって粉末を再構成する。再構成された溶液は、析出をまったく示さないはずである。外観は、僅かに乳白色である。再構成された溶液は、効力アッセイで検査する（図１Ａ及び１Ｂ参照）。
【０１９７】
例３：安定化されたＢＣ８１９プラスミド−ポリエチレンイミン組成物の開発
材料：
ＢＣ−８１９は、過去に方向された通りに作製し（Ohana et al., International Journal of Cancer 98(5) (2002) 645-650；Ohana et al., The Journal of Gene Medicine 7(3) (2005) 366-374参照）、Ａｌｔｈｅａの施設（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）で大量に作製した。ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）は、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、フランス）から購入した。
【０１９８】
１００ｍｌのガラスバイアル、ブロモブチルストッパー、及びシーラーは、Ｓｃｈｏｔｔ（ドイツ）から購入した。
【０１９９】
方法：
小スケールでの組成物作製：
ＴＥ緩衝液中の４ｍｇ／ｍｌ  ＢＣ−８１９溶液の５ｍｌを、２０ｍｌの５％  トレハロース溶液に添加した。
【０２００】
２．４ｍｌのｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）を、２２．６ｍｌの５％  トレハロース溶液に添加した。次に、このプラスミド溶液を、撹拌しながらＰＥＩ溶液に添加して、両成分を完全に均一化させた。この溶液を、１時間未満、室温でインキュベートした。この方法により、Ｎ／Ｐ比＝６（ＬＰＥＩ窒素（Ｎ）対ＤＮＡリン酸（Ｐ）モル比）でｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）と複合体形成した０．４ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡの溶液５０ｍｌを得た。示されるポリプレックス濃度は、サンプルのプラスミドＤＮＡ濃度を意味する。
【０２０１】
中スケールでの組成物作製：
ＴＥ緩衝液中の４ｍｇ／ｍｌ  ＢＣ−８１９溶液の１００ｍｌを、４００ｍｌの５％  トレハロース溶液に添加した。４８ｍｌのｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）を、４５２ｍｌの５％  トレハロース溶液に添加した。次に、このプラスミド溶液を、撹拌しながらＰＥＩ溶液に添加して、両成分を完全に均一化させた。この溶液を、１時間未満、室温でインキュベートした。この方法により、Ｎ／Ｐ比＝６（ＬＰＥＩ窒素（Ｎ）対ＤＮＡリン酸（Ｐ）モル比）でｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）と複合体形成した０．４ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡの溶液１０００ｍｌを得た。示されるポリプレックス濃度は、サンプルのプラスミドＤＮＡ濃度を意味する。
【０２０２】
ポリプレックス溶液をバイアルに充填し、以下で述べるように凍結乾燥する。
【０２０３】
溶液の作製は、標準的プロトコルと比較した逆の順序で行う。この逆ポリプレックス作製プロトコルは、装置の開発をまったく必要とせず、いかなる工業的施設においても容易にスケールアップすることができる。
【０２０４】
凍結乾燥：
凍結乾燥前組成物溶液を、上記で述べた通りに新たに作製し、凍結乾燥プロセス用の１００ｍｌバイアルに移した。
【０２０５】
瓶のサンプルを、実験用凍結乾燥機ＬｙｏＢｅｔａ  ２５中、−４５Ｃでの少なくとも４時間にわたる凍結工程、２５Ｃで少なくとも４１時間の一次乾燥、及び少なくとも８時間の二次乾燥を含み、乾燥圧力はいずれも０．１５０ｍｂである凍結乾燥サイクルに掛けた。
【０２０６】
粒子サイズ特定：
サンプルのｚ平均粒子径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｅｒｒｅｎｂｅｒｇ、ドイツ）製のｚｅｔａｓｉｚｅｒ（ｎａｎｏ−ｓ）を用い、角度１８０°、波長６３３ｍｍ、２５℃（粘度、屈折率）で測定した。
【０２０７】
ゼータ電位特定：
サンプルのゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｅｒｒｅｎｂｅｒｇ、ドイツ）製のｚｅｔａｓｉｚｅｒ（ｎａｎｏ−ｓ）を用いて特定した。
【０２０８】
分光光度測定／濁度
ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光光度計）を用いて試験を行い、サンプルは、２６０ｎｍで溶液中のＤＮＡ濃度を評価し、６００ｎｍで溶液の濁度を評価することで検査した。
【０２０９】
溶液のスペクトルは、２００から４００ｎｍの範囲とした（図５参照）。
【０２１０】
電気泳動ゲル：
サンプルを、１％  アガロースゲルへローディングし、１００ｍＶで１時間行った。この試験では、ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）と複合体形成していないいずれのＤＮＡプラスミドも、又はいずれの分解も認識する（図６参照）。
【０２１１】
ＴＥＭ（形状及びサイズ、又は原子間力顕微鏡）：
サンプルを、Ｆｏｒｍｖａｒコーティングした銅グリッドに吸着させた。グリッドを、１％（重量／体積）酢酸ウラニルで染色し、空気乾燥させた。サンプルを、ＭｅｇａＶｉｅｗ  ＩＩ  ＣＣＤカメラ及びＡｎａｌｙｓｉｓ（登録商標）バージョン３．０ソフトウェア（ＳｏｆｔＩｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｓｔａｒ、ドイツ）を備えたＴｅｃｎａｉ  １２  ＴＥＭ  １００ｋＶ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ）で観察した。
【０２１２】
サンプルを検査して、溶液中又は乾燥製品中のポリプレックスの形状を評価した。
【０２１３】
溶液のｐＨ：
溶液のｐＨは、ｐＨメーター（ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、スイス）を用いて検査した。
【０２１４】
浸透圧測定：
サンプルの浸透圧測定は、ｆｉｓｋｅ（登録商標）微量浸透圧計モデル２０１（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ）を用いて試験した。
【０２１５】
トランスフェクション：
水含有量／ＬＯＤ：
生体内効力評価：
安定性：
【０２１６】
結果：
サンプルは、その元の体積量のろ過済み二回蒸留水（ＤＤＷ）での再水和後直ちに溶解し、以下の試験で用いる前に、５分間インキュベートした。
【０２１７】
2018515479.tif 000008
【０２１８】
図３に示されるように、凍結乾燥後に得られた組成物は、トレハロース又はグルコース溶液で新たに作製された組成物と大きな相違は示していない。新たに作製した時点で、グルコース溶液は、５０から２４０ｎｍのサイズ範囲を示した。
【０２１９】
2018515479.tif 000009
【０２２０】
分光光度測定：
以下の表９及び図５に示されるように、再水和された溶液中のＤＮＡ濃度は、トレハロース又はグルコース中で新たに作製された溶液と比較した場合、大きな相違は示していない。
【０２２１】
2018515479.tif 000010
【０２２２】
ＴＥＭ（形状及びサイズ、又は原子間力顕微鏡）：
観察したサンプルは、グルコース中又はトレハロース中での比較の場合、相違を示していない（図７Ａ〜Ｂ参照）。図８は、析出後のサンプルを示す。
【０２２３】
溶液のｐＨ：
５％  グルコース又はトレハロースで作製したサンプルはすべて、凍結乾燥の前後で約ｐＨ３．０であった。
【０２２４】
浸透圧測定：
【０２２５】
2018515479.tif 000011
【０２２６】
トランスフェクション：
水含有量／ＬＯＤ：
第一サイクル後に乾燥製品で試験した水含有量は、２．４％であった。
【０２２７】
生体内効力評価：
安定性：
【０２２８】
結論：
結論として、この研究の結果は、比較的高濃度のＢＣ−８１９／ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）ポリプレックスを、工業的スケールへ容易に移行することのできる技術を用いて大スケールで作製することができることを実証するものである。
【０２２９】
作製された組成物の品質により、追加の賦形剤の必要なく、ＢＣ−８１９／ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）の凍結乾燥が可能となる。
【０２３０】
予備実験の結果から、凍結乾燥されたポリプレックスは、ベッドサイドで作製される組成物の必要とされる特徴を、追加の利点と共に保持していることが示され、５Ｃで２週間保存された乾燥製品は、再現性のあるポリプレックスのサイズ、再現性のあるゼータ電位、及び再水和後の製品の安定性を示した。
【０２３１】
したがって、組成物は、すぐに再構成できる凍結乾燥された粉末として臨床試験サイトに提供することができる。この新規な配合物により、臨床使用のための再現性のある投与が確保される。
【０２３２】
例４：異なる溶液の安定性の試験
特定の所定の時間間隔で（すなわち、作製／再構成から１時間以内、３時間、３日間、１週間）、異なる溶液の安定性を調べるための実験を行った。具体的には、（５％  グルコース中（先行技術での作製）、トレハロース中で新たに作製（凍結乾燥前（逆作製法））、及び凍結乾燥物から再構成されたトレハロース中（１０ｍｌの注射用ＩＶ水で再構成）の３つの複合体溶液を試験し、以下のパラメーター：ナノサイザー（nanosizer）、ゼータ電位、浸透圧計、ｐＨメーター、ネガティブ染色による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、ｎａｎｏｄｒｏｐ−ＤＮＡ濃度、６００ｎｍでの濁度、及びゲル電気泳動について比較した。
【０２３３】
これらの試験に加えて、乾燥製品に対して以下の試験：走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、カールフィッシャー、低温ＴＥＭ、及びｘ線も行う予定である。
【０２３４】
外観
先行技術の作製（グルコースサンプル）では、室温で３時間後に黄色に変色したが、凍結乾燥前（トレハロース中での逆方法）及び再構成された凍結乾燥製品は、外観の変化を示さなかった。
【０２３５】
ＴＥＭ
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の結果を図９Ａに示す。一行目の３つの写真は、３つの異なる時間点での標準的な作製に従って作製した複合体（小さい黒い点）を示す。１週間後には見られる黒い点の数が少なくなっており、このことから、複合体の分解が示唆され得る。
【０２３６】
二行目の３つの写真は、３つの時間点での凍結乾燥前サンプル（逆作製）を示す。黒い点の減少は見られない。
【０２３７】
そして、一番下の行の３つの写真は、３つの時間点での再構成製品を示す。やはり、黒い点の減少は見られない。
【０２３８】
図９Ｂは、トレハロース中での析出複合体を示す。
【０２３９】
ｐＨメーター
以下の表１１は、観察されたｐＨ値の範囲を示す。
【０２４０】
2018515479.tif 000012
【０２４１】
これらの結果は、溶液間で、及び様々な時間間隔間で、ｐＨの変化がないことを示している。
【０２４２】
モル浸透圧濃度（ｍｏｓｍ／ｋｇ）
モル浸透圧濃度は、液体から固体粒子の濃度を評価するために測定する。以下の表１２は、観察された値の範囲を示す。
【０２４３】
2018515479.tif 000013
【０２４４】
2018515479.tif 000014
【０２４５】
上記の結果は、トレハロース中の新たな溶液と凍結乾燥物との間で相違が見られないことを示している。グルコース中の複合体は、より高いモル浸透圧濃度を示している。膀胱に投与した際のこの相違が示唆することを調べ、理解するための実験を行う予定である。
【０２４６】
ナノサイズ（ｄ．ｎｍ）
ＤＬＳ法は、成分の粘度及び屈折率を考慮に入れて、粒子サイズを決定する。以下の表１４は、観察された値の範囲（ｎｍ）を示す。
【０２４７】
2018515479.tif 000015
【０２４８】
これらの結果は、各溶液において、粒子サイズに経時での大きな変化がないことを示している。
【０２４９】
ゼータ電位（ｍＶ）
ゼータ電位は、コロイド分散体中の界面動電位であり、系の安定性の指標である。以下の表１５は、観察された値の範囲を示す。
【０２５０】
2018515479.tif 000016
【０２５１】
2018515479.tif 000017
【０２５２】
これらの結果は、溶液が測定を行った時間にわたって安定性を示したこと、及び検査したすべてのサンプルの間で相違がないことを示している。
【０２５３】
ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μｌ）
以下の表１６は、観察された値の範囲を示す。
【０２５４】
2018515479.tif 000018
【０２５５】
これらの結果は、ＤＮＡ濃度が、経時で正常な範囲内に維持されていることを示している。低下は見られなかった。
【０２５６】
濁度（細胞／ｍｌ）
以下の表１７は、観察された値の範囲を示す（６００ｎｍでの吸収）。
【０２５７】
2018515479.tif 000019
【０２５８】
経時での溶液中の濁度は、測定できなかった。濁度を測定するために、さらなる実験を行う予定である。
【０２５９】
２５０から６００ｎｍのスペクトル
観察された時間にわたって、グルコース中で作製された複合体は、約３８０ｎｍ（紫色）で吸収を示した。この吸収を引き起こした残留化合物が何かを特定するためのさらなる実験を行う予定である。
【０２６０】
例５：生体内試験
２００万個のＨＣＴ−１１６細胞を、胸腺欠損ヌードマウスの背中側に注射した。腫瘍が治療すべきサイズに到達したところで、マウスに、５％  グルコース（コントロール）に対して先行技術サンプル又は再構成サンプルの３回の注射を施した。結果を図１０に示す。
【図１】
2018515479.tif 000020
【図２】
2018515479.tif 000021
【図３】
2018515479.tif 000022
【図４】
2018515479.tif 000023
【図５】
2018515479.tif 000024
【図６】
2018515479.tif 000025
【図７Ａ】
2018515479.tif 000026
【図７Ｂ】
2018515479.tif 000027
【図８】
2018515479.tif 000028
【図９Ａ】
2018515479.tif 000029
【図９Ｂ】
2018515479.tif 000030
【図１０】
2018515479.tif 000031
【国際調査報告】
2018515479.tif 000032
2018515479.tif 000033
2018515479.tif 000034
2018515479.tif 000035