(57)【要約】  パフィオペディルム・モーディアエ優質種苗の組織培養と迅速増殖の方法を開示した。本発明は、パフィオペディルム・モーディアエの母株に対して一連的な薬剤処理を行うことに基づいて、新発の腋芽を外植片とし、独特な培地を用いて不定芽誘導、生い茂る芽の増殖、及び生根培養を行い、優質種苗の迅速増殖方法を獲得し、パフィオペディルム・モーディアエ優質種苗の市場ニーズを満たすために有効な方法を提供することができる。該技術は、確実に実行可能であり、応用価値も高い。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）不定芽誘導と生い茂る芽の増殖ステップであって、パフィオペディルム・モーディアエの腋芽を切り取って外植片とし、消毒後に誘導用培地に接種し不定芽を誘導し、そして、誘導された不定芽を増殖用培地上に移して増殖培養し、生い茂る芽を獲得し、
前記誘導用培地と前記増殖用培地は、何れも１リットル毎に、６−ベンジルアデニン３．０〜１０．０ｍｇ、ナフチル０．５〜１．０ｍｇ、ココナツミルク１００〜２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０〜２００ｍｇ、ショ糖２０〜３０ｇ及び寒天６〜７ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であり、ｐＨ値は５．８〜６．０であることと、
ｂ）生根壮苗培養ステップであって、増殖して得た生い茂る芽を壮苗用培地に接種し壮苗させ、太くて大きい生い茂る芽を獲得し、そして、単芽に切ってから発根用培地中に移し生根培養し、完全な植株を獲得し、
前記壮苗用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン１．０〜２．０ｍｇ、ナフチル０．５〜１．０ｍｇ、ココナツミルク１００〜２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０〜２００ｍｇ、ショ糖２０〜３０ｇ及び寒天６〜７ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であり、ｐＨ値は５．８〜６．０であり、
前記発根用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン０．３〜０．５ｍｇ、ナフチル０．５〜１．０ｍｇ、ココナツミルク１００〜２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０〜２００ｍｇ、バナナホモジネート５０〜１５０ｇ、活性炭０．１〜１．０ｇ、ショ糖２０〜３０ｇ及び寒天６〜７ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であり、ｐＨ値は５．８〜６．０であることと、
ｃ）完全な植株を自然光の下に移し錬苗してから、その根部の培地を洗浄し、植金石：樹皮が質量比で１：１〜３：１である混合マトリックスに移して更に培養し、パフィオペディルム・モーディアエの種苗を獲得することと、
を含むことを特徴とする、
パフィオペディルム・モーディアエの優質種苗の組織培養と迅速増殖の方法。
【請求項２】
前記ステップａ）において誘導用培地に接種し、又は増殖用培地上に移して増殖培養する際、及び、前記ステップｂ）において生い茂る芽を壮苗用培地に接種し壮苗させ、又は単芽に切ってから発根用培地中に移し生根培養する際に、培養温度は２４〜２８℃であり、輝度は１５００〜２０００ｌｘであり、光照時間は１２〜１６時間／日であることを特徴とする、請求項１に記載のパフィオペディルム・モーディアエの優質種苗の組織培養と迅速増殖の方法。
【請求項３】
前記パフィオペディルム・モーディアエの腋芽を切り取り、そして消毒してから外植片とすることについては、
該外植片は、下記の方法で獲得される：
植株成長が強く、花形の丸いパフィオペディルム・モーディアエを母株とし、
外植片を切り取り消毒する３５日前に、まずはカルベンダジムの５００〜８００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、５日後に、３５％の尅土菌水和性粉剤の５００〜８００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、更に５日後に、７２％の農業用ストレプトマイシン可溶性散薬の３０００〜４０００倍の希釈液で１回水やりして葉片に散布し、そして、５日おきに、上記工程をもう１回繰り返し、最後の農業用ストレプトマイシンによる水やり後に、体積分率７５％のエタノール水溶液で消毒した解剖刀で、長さ１．５〜２．５ｃｍの腋芽を切り取って外植片とし、
前記消毒は、具体的に、クリーンベンチにおいて、切り取った外植片をまず体積分率７５％のエタノール水溶液中に１０〜３０秒間浸してから、有効塩素１．０％の次亜塩素酸溶液を用いて更に５〜１０分間浸し、そして、滅菌水で４〜５回洗い流し、質量分数０．１％の塩化第二水銀溶液で５〜１０分間消毒してから更に滅菌水で４〜５回洗い流し、続けて葉片を切り取り、医療用ストレプトマイシンの１５００〜２０００倍希釈液中において２４時間振とうして、消毒後の外植片を得る、
ことを特徴とする、
請求項１に記載のパフィオペディルム・モーディアエの優質種苗の組織培養と迅速増殖の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物生物技術分野に属し、特にパフィオペディルム・モーディアエの優質種苗の組織培養と迅速増殖の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パフィオペディルム・モーディアエ（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ  Ｍａｕｄｉａｅ）は、パフィオペディルム・ローレンセアナム（Ｐ．ｌａｗｒｅｎｃｅａｎｕｍ）とパフィオペディルム・カロッスム（Ｐ．ｃａｌｌｏｓｕｍ）の交配種である。それを親とし、たくさんの交配後代を育成してきて、市場では、パフィオペディルム・モーディアエの花形態と似ている花形態を持っているパフィオペディルムを、“パフィオペディルム・モーディアエ（Ｐ．Ｍａｕｄｉａｅｔｙｐｅ）”と総称し、それらの花色は非常に豊富で、紫、赤茶色から緑白までを有し、スポットや線形状も非常に豊富で、国際及び国内市場において、商品パフィオペディルムの主たる品種となっている。パフィオペディルム・モーディアエの通常繁殖として、分株を採用することができるが、しかし、繁殖速度が遅く、繁殖率が低く、商業市場のニーズを満たすことができない。現在、世界市場中に販売しているパフィオペディルム・モーディアエは、主に、無菌播種から得たものである。しかしながら、パフィオペディルム・モーディアエは交配種であるから、無菌播種による後代は、大きく分離しており、親の良い形質特性を維持する形質特性が均一的な種苗を獲得することができないため、その生産規模は深刻に制約されている。それに、パフィオペディルムは、組織培養の際に、外植片の除染困難と増殖速度の遅さ等の原因で、その組織培養がとても難しく、世界中において、温室から優良株を選び取り外植片としてパフィオペディルム・モーディアエを組織培養し迅速増殖させることについては、まだ報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、パフィオペディルム・モーディアエの優質種苗の組織培養と迅速増殖の方法を提供し、パフィオペディルム・モーディアエ優良株の無性クローンによって形質特性が同一となっている種苗を獲得することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明のパフィオペディルム・モーディアエの優質種苗の組織培養と迅速増殖の方法は、下記のステップを有する：
ａ）不定芽誘導と生い茂る芽の増殖ステップであって、パフィオペディルム・モーディアエの腋芽を切り取って外植片とし、消毒後に誘導用培地に接種し不定芽を誘導し、そして、誘導された不定芽を増殖用培地上に移して増殖培養し、生い茂る芽を獲得し、
前記誘導用培地と前記増殖用培地は、何れも１リットル毎に、６−ベンジルアデニン３．０〜１０．０ｍｇ、ナフチル０．５〜１．０ｍｇ、ココナツミルク１００〜２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０〜２００ｍｇ、ショ糖２０〜３０ｇ及び寒天６〜７ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であり、ｐＨ値は５．８〜６．０であり、６０日置きで１回継代して、第６代目のとき、増殖係数は２．５〜３．０倍となることと、
ｂ）生根壮苗培養ステップであって、増殖して得た生い茂る芽を壮苗用培地に接種し壮苗させ、太くて大きい生い茂る芽を獲得し、そして、単芽に切ってから発根用培地中に移し生根培養し、完全な植株を獲得し、
前記壮苗用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン１．０〜２．０ｍｇ、ナフチル０．５〜１．０ｍｇ、ココナツミルク１００〜２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０〜２００ｍｇ、ショ糖２０〜３０ｇ及び寒天６〜７ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であり、ｐＨ値は５．８〜６．０であり、
前記発根用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン０．３〜０．５ｍｇ、ナフチル０．５〜１．０ｍｇ、ココナツミルク１００〜２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０〜２００ｍｇ、バナナホモジネート５０〜１５０ｇ、活性炭０．１〜１．０ｇ、ショ糖２０〜３０ｇ及び寒天６〜７ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であり、ｐＨ値は５．８〜６．０であることと、
ｃ）完全な植株を自然光の下に移し錬苗してから、その根部の培地を洗浄し、植金石：樹皮が質量比で１：１〜３：１である混合マトリックスに移して更に培養し、パフィオペディルム・モーディアエの種苗を獲得することと、
を含むことを特徴とする。通常、適切な換気と適切な湿度を維持すれば、移植の生存率を９０％までにとどめる事ができる。
【０００５】
前記ステップａ）において誘導用培地に接種し、又は増殖用培地上に移して増殖培養する際、及び、前記ステップｂ）において生い茂る芽を壮苗用培地に接種し壮苗させ、又は単芽に切ってから発根用培地中に移し生根培養する際に、培養温度は２４〜２８℃であり、輝度は１５００〜２０００ｌｘであり、光照時間は１２〜１６時間／日である。
【０００６】
前記パフィオペディルム・モーディアエの腋芽を切り取り、そして消毒してから外植片とすることについては、
該外植片は、下記の方法で獲得される：
植株成長が強く、花形の丸いパフィオペディルム・モーディアエを母株とし、
外植片を切り取り消毒する３５日前に、まずはカルベンダジムの５００〜８００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、５日後に、３５％の尅土菌（ＥＴＲＩＤＩＡＺＯＬＥ  エトリジアゾール）水和性粉剤の５００〜８００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、更に５日後に、７２％の農業用ストレプトマイシン可溶性散薬の３０００〜４０００倍の希釈液で１回水やりして葉片に散布し、そして、５日後に、上記工程を繰り返し、最後の農業用ストレプトマイシンによる水やり後に、体積分率７５％のエタノール水溶液で消毒した解剖刀で、長さ１．５〜２．５ｃｍの腋芽を切り取って外植片とし、
前記消毒は、具体的に、クリーンベンチ（超浄作業台）において、切り取った外植片をまず体積分率７５％のエタノール水溶液中に１０〜３０秒間浸してから、有効塩素１．０％の次亜塩素酸溶液を用いて更に５〜１０分間浸し、そして、滅菌水で４〜５回洗い流し、質量分数０．１％の塩化第二水銀溶液で５〜１０分間消毒してから更に滅菌水で４〜５回洗い流し、続けて葉片を切り取り、医療用ストレプトマイシンの１５００〜２０００倍希釈液中において２４時間振とうして、消毒後の外植片を得る。そのような処理によれば、消毒成功率を５０〜６０％まで達成させることができ、それによって外植片の除染課題を効果的に解決した。
【０００７】
ＭＳ培地は国際通用培地であり、その成分と調製方法は、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｔ，  Ｓｋｏｏｇ  Ｆ（１９６２）（Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ１５：４７３−４９７）に記載されている。１／２ＭＳ培地とは、ＭＳ培地中の大量元素の使用量が従来の１／２となる以外、その他の成分は同様である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、パフィオペディルム・モーディアエの母株に対して一連的な薬剤処理を行うことに基づいて、新発の腋芽を外植片とし、独特な培地を用いて不定芽誘導、生い茂る芽の増殖、及び生根培養を行い、優質種苗の迅速増殖方法を獲得し、パフィオペディルム・モーディアエの優質種苗の市場ニーズを満たすために有効な方法を提供することができる。該技術は、確実に実行可能であり、応用価値も高い。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
下記実施例は、ただ本発明を更に説明するために付されるものであり、本発明を限定するものではない。
【００１０】
実施例１：赤いモーディアエ−奇跡（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ  ＳＣＢＧ  Ｍｉｒａｃｌｅ）の組織培養
【００１１】
（１）材料の選択及び処理
植株成長が強く、花形の丸いパフィオペディルム・モーディアエ［赤いモーディアエ−奇跡］を母株とした。外植片を切り取り消毒する３５日前に、まずはカルベンダジムの５００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、５日後に、３５％の尅土菌水和性粉剤の５００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、更に５日後に、７２％の農業用ストレプトマイシン可溶性散薬の３０００倍の希釈液で１回水やりして葉片に散布し、そして、５日おきで、上記工程をもう１回繰り返して、最後の農業用ストレプトマイシンによる水やり後に、体積分率７５％のエタノール水溶液で消毒した解剖刀で、長さ２．５ｃｍの腋芽を切り取って外植片とした。
【００１２】
（２）外植片の消毒
クリーンベンチにおいて、切り取った外植片をまず体積分率７５％のエタノール水溶液中に３０秒間浸してから、有効塩素１．０％の次亜塩素酸溶液を用いて更に１０分間浸して、そして、滅菌水で５回洗い流して、そして質量分数０．１％の塩化第二水銀溶液で１０分間消毒してから更に滅菌水で５回洗い流した。消毒後の外植片を得て、続けて葉片を切り取って、医療用ストレプトマイシンの２０００倍希釈液中において２４時間振とうしてから、誘導用培地に接種し培養した。培養温度は２８℃であって、輝度は２０００ｌｘであって、光照時間は１６時間／日であった。前記誘導用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン（６−ＢＡ）１０．０ｍｇ、ナフチル１．０ｍｇ、ココナツミルク２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０ｍｇ、ショ糖２０ｇ及び寒天６ｇを含有して、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。その調製方法として、上記培地中の各成分を均一に混合してから、消毒し滅菌して、誘導用培地（以下、同様）を得た。消毒成功率は、６０％となった。
【００１３】
（３）不定芽誘導及び生い茂る芽の増殖
接種後の外植片は、１０日頃に、明らかな褐色の分泌物の形成を確認できて、３０日目に、新たな誘導用培地に移して更に２５日間培養して、外植片上に不定芽が形成された。そして、不定芽を増殖用培地中に接種して、継代増殖培養を行った。前記増殖用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン（６−ＢＡ）４．０ｍｇ、ナフチル１．０ｍｇ、ココナツミルク２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０ｍｇ、ショ糖２０ｇ及び寒天６ｇを含有して、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。培養温度は２８℃であって、輝度は２０００ｌｘであって、光照時間は１６時間／日であった。６０日おきで１回継代して、第６代目のとき、増殖係数は３．０倍となって、生い茂る芽を獲得した。
【００１４】
（４）生根壮苗培養
増殖して得た生い茂る芽を壮苗用培地に接種し壮苗させた。培養温度は２８℃であって、輝度は２０００ｌｘであって、光照時間は１６時間／日であった。６０日後に、高さ３．０ｃｍの生い茂る芽を単芽に切ってから、発根用培地中に移し生根培養した。培養温度は２８℃であって、輝度は２０００ｌｘであって、光照時間は１６時間／日であった。６０日後に、高さ６．０ｃｍの完全な植株を獲得した。前記壮苗用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン１．５ｍｇ、ナフチル０．７５ｍｇ、ココナツミルク１５０ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１７５ｍｇ、ショ糖２０ｇ及び寒天６ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。その調製方法として、上記培地中の各成分を均一に混合してから、消毒し滅菌して、壮苗用培地（以下、同様）を得た。前記発根用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン０．５ｍｇ、ナフチル１．０ｍｇ、ココナツミルク２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム２００ｍｇ、バナナホモジネート１５０ｇ、活性炭１．０ｇ、ショ糖２０ｇ及び寒天６ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。その調製方法として、上記培地中の各成分を均一に混合してから、消毒し滅菌して、発根用培地（以下、同様）を得た。
【００１５】
（５）試管苗の移植
高さ約６ｃｍの完全植株の培養瓶を自然光の温室に移して、２０日間錬苗してしてから、ガラス瓶から取り出して、その根部の培地を洗浄した。植金石（日本からの輸入品）：樹皮が質量比で３：１である混合マトリックスに移して、適切な換気と適切な湿度を維持すると、移植の生存率を９５％までにとどめる事ができた。
【００１６】
実施例２：緑モーディアエ−雲の君（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ  ＳＣＢＧ  Ｙｕｎｚｈｉｊｕｎ）の組織培養
【００１７】
（１）材料の選択及び処理
植株成長が強く、花形の丸いパフィオペディルム・モーディアエ［緑モーディアエ−雲の君］を母株とした。外植片を切り取り消毒する３５日前に、まずはカルベンダジムの６００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、５日後に、３５％の尅土菌水和性粉剤の６００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、更に５日後に、７２％の農業用ストレプトマイシン可溶性散薬の３５００倍の希釈液で１回水やりして葉片に散布し、そして、５日おきで、上記工程をもう１回繰り返して、最後の農業用ストレプトマイシンによる水やり後に、体積分率７５％のエタノール水溶液で消毒した解剖刀で、長さ２．５ｃｍの腋芽を切り取って外植片とした。
【００１８】
（２）外植片の消毒
クリーンベンチにおいて、切り取った外植片をまず体積分率７５％のエタノール水溶液中に２０秒間浸してから、有効塩素１．０％の次亜塩素酸溶液を用いて更に７．５分間浸して、そして、滅菌水で５回洗い流して、そして質量分数０．１％の塩化第二水銀溶液で７．５分間消毒してから更に滅菌水で５回洗い流した。消毒後の外植片を得て、続けて葉片を切り取って、医療用ストレプトマイシンの１７５０倍希釈液中において２４時間振とうしてから、誘導用培地に接種し培養した。培養温度は２４℃であって、輝度は１５００ｌｘであって、光照時間は１２時間／日であった。前記誘導用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン（６−ＢＡ）７．５ｍｇ、ナフチル０．７５ｍｇ、ココナツミルク１５０ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１７５ｍｇ、ショ糖３０ｇ及び寒天７ｇを含有して、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。その調製方法として、上記培地中の各成分を均一に混合してから、消毒し滅菌して、誘導用培地（以下、同様）を得た。消毒成功率は、５５％となった。
【００１９】
（３）不定芽誘導及び生い茂る芽の増殖
接種後の外植片は、１０日頃に、明らかな褐色の分泌物の形成を確認できて、３０日目に、新たな誘導用培地に移して更に２８日間培養して、外植片上に不定芽が形成された。そして、不定芽を増殖用培地中に接種して、継代増殖培養を行った。前記増殖用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン（６−ＢＡ）１０ｍｇ、ナフチル０．５ｍｇ、ココナツミルク１００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム２００ｍｇ、ショ糖３０ｇ及び寒天７ｇを含有して、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。培養温度は２４℃であって、輝度は１５００ｌｘであって、光照時間は１２時間／日であった。６０日おきで１回継代して、第６代目のとき、増殖係数は２．８倍となって、生い茂る芽を獲得した。
【００２０】
（４）生根壮苗培養
増殖して得た生い茂る芽を壮苗用培地に接種し壮苗させた。培養温度は２４℃であって、輝度は１５００ｌｘであって、光照時間は１２時間／日であった。６０日後に、高さ２．５ｃｍの生い茂る芽を単芽に切ってから発根用培地中に移し生根培養した。培養温度は２４℃であって、輝度は１５００ｌｘであって、光照時間は１２時間／日であった。６０日後に、高さ５．５ｃｍの完全な植株を獲得した。前記壮苗用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン２ｍｇ、ナフチル１ｍｇ、ココナツミルク２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム２００ｍｇ、ショ糖３０ｇ及び寒天７ｇを含有して、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。前記発根用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン０．４ｍｇ、ナフチル０．７５ｍｇ、ココナツミルク１５０ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１７５ｍｇ、バナナホモジネート１００ｇ、活性炭０．５ｇ、ショ糖３０ｇ及び寒天７ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。
【００２１】
（５）試管苗の移植
高さ約５．５ｃｍの完全植株の培養瓶を自然光の温室に移して、１５日間錬苗してから、ガラス瓶から取り出して、その根部の培地を洗浄した。植金石（日本からの輸入品）：樹皮が質量比で２：１である混合マトリックスに移して、適切な換気と適切な湿度を維持すると、移植の生存率を９３％までにとどめる事ができた。
【００２２】
実施例３：モーディアエ−ルビー（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ  ＳＣＢＧ  Ｒｅｄ  Ｊｅｗｌ）の組織培養
【００２３】
（１）材料の選択及び処理
植株成長が強く、花形の丸いパフィオペディルム・モーディアエ［モーディアエ−ルビー］を母株とした。外植片を切り取り消毒する３５日前に、まずはカルベンダジムの８００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、５日後に、３５％の尅土菌水和性粉剤の８００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、更に５日後に、７２％の農業用ストレプトマイシン可溶性散薬の４０００倍の希釈液で１回水やりして葉片に散布し、そして、５日おきで、上記工程をもう１回繰り返して、最後の農業用ストレプトマイシンによる水やり後に、体積分率７５％のエタノール水溶液で消毒した解剖刀で、長さ１．５ｃｍの腋芽を切り取って外植片とした。
【００２４】
（２）外植片の消毒
クリーンベンチにおいて、切り取った外植片をまず体積分率７５％のエタノール水溶液中に１０秒間浸してから、有効塩素１．０％の次亜塩素酸溶液を用いて更に５分間浸して、そして、滅菌水で４回洗い流して、そして質量分数０．１％の塩化第二水銀溶液で５分間消毒してから更に滅菌水で４回洗い流した。消毒後の外植片を得て、続けて葉片を切り取って、医療用ストレプトマイシンの２０００倍希釈液中において２４時間振とうしてから、誘導用培地に接種し培養した。培養温度は２６℃であって、輝度は１８００ｌｘであって、光照時間は１４時間／日であった。前記誘導用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン（６−ＢＡ）３ｍｇ、ナフチル０．５ｍｇ、ココナツミルク１００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム２００ｍｇ、ショ糖３０ｇ及び寒天６．５ｇを含有して、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。その調製方法として、上記培地中の各成分を均一に混合してから、消毒し滅菌して、誘導用培地（以下、同様）を得た。消毒成功率は、５０％となった。
【００２５】
（３）不定芽誘導及び生い茂る芽の増殖
接種後の外植片は、１０日頃に、明らかな褐色の分泌物の形成を確認できて、３０日目に、新たな誘導用培地に移して更に３０日間培養して、外植片上に不定芽が形成された。そして、不定芽を増殖用培地中に接種して、継代増殖培養を行った。前記増殖用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン（６−ＢＡ）３．０ｍｇ、ナフチル１．０ｍｇ、ココナツミルク２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０ｍｇ、ショ糖２０ｇ及び寒天６．５ｇを含有して、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。培養温度は２６℃であって、輝度は１８００ｌｘであって、光照時間は１４時間／日であった。６０日おきで１回継代して、第６代目のとき、増殖係数は２．５倍となって、生い茂る芽を獲得した。
【００２６】
（４）生根壮苗培養
増殖して得た生い茂る芽を壮苗用培地に接種し壮苗させた。培養温度は２６℃であって、輝度は１８００ｌｘであって、光照時間は１４時間／日であった。６０日後に、高さ２．０ｃｍの生い茂る芽を単芽に切ってから発根用培地中に移し生根培養した。培養温度は２６℃であって、輝度は１８００ｌｘであって、光照時間は１４時間／日であった。６０日後に、高さ５ｃｍの完全な植株を獲得した。前記壮苗用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン１ｍｇ、ナフチル０．５ｍｇ、ココナツミルク１００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０ｍｇ、ショ糖３０ｇ及び寒天６ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。前記発根用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン０．３ｍｇ、ナフチル０．５ｍｇ、ココナツミルク１００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０ｍｇ、バナナホモジネート５０ｇ、活性炭０．１ｇ、ショ糖３０ｇ及び寒天６．５ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であって、ｐＨ値は５．８〜６．０であった。
【００２７】
（５）試管苗の移植
高さ約５ｃｍの完全植株の培養瓶を自然光の温室に移して、１０日間錬苗してしてから、ガラス瓶から取り出して、その根部の培地を洗浄した。植金石（日本からの輸入品）：樹皮が質量比で１：１である混合マトリックスに移して、適切な換気と適切な湿度を維持すると、移植の生存率を９０％までにとどめる事ができた。
【００２８】
（付記）
（付記１）
ａ）不定芽誘導と生い茂る芽の増殖ステップであって、パフィオペディルム・モーディアエの腋芽を切り取って外植片とし、消毒後に誘導用培地に接種し不定芽を誘導し、そして、誘導された不定芽を増殖用培地上に移して増殖培養し、生い茂る芽を獲得し、
前記誘導用培地と前記増殖用培地は、何れも１リットル毎に、６−ベンジルアデニン３．０〜１０．０ｍｇ、ナフチル０．５〜１．０ｍｇ、ココナツミルク１００〜２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０〜２００ｍｇ、ショ糖２０〜３０ｇ及び寒天６〜７ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であり、ｐＨ値は５．８〜６．０であることと、
ｂ）生根壮苗培養ステップであって、増殖して得た生い茂る芽を壮苗用培地に接種し壮苗させ、太くて大きい生い茂る芽を獲得し、そして、単芽に切ってから発根用培地中に移し生根培養し、完全な植株を獲得し、
前記壮苗用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン１．０〜２．０ｍｇ、ナフチル０．５〜１．０ｍｇ、ココナツミルク１００〜２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０〜２００ｍｇ、ショ糖２０〜３０ｇ及び寒天６〜７ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であり、ｐＨ値は５．８〜６．０であり、
前記発根用培地は、１リットル毎に、６−ベンジルアデニン０．３〜０．５ｍｇ、ナフチル０．５〜１．０ｍｇ、ココナツミルク１００〜２００ｍｌ、リン酸二水素ナトリウム１５０〜２００ｍｇ、バナナホモジネート５０〜１５０ｇ、活性炭０．１〜１．０ｇ、ショ糖２０〜３０ｇ及び寒天６〜７ｇを含有し、残量部は１／２ＭＳ培地であり、ｐＨ値は５．８〜６．０であることと、
ｃ）完全な植株を自然光の下に移し錬苗してから、その根部の培地を洗浄し、植金石：樹皮が質量比で１：１〜３：１である混合マトリックスに移して更に培養し、パフィオペディルム・モーディアエの種苗を獲得することと、
を含むことを特徴とする、
パフィオペディルム・モーディアエの優質種苗の組織培養と迅速増殖の方法。
【００２９】
（付記２）
前記ステップａ）において誘導用培地に接種し、又は増殖用培地上に移して増殖培養する際、及び、前記ステップｂ）において生い茂る芽を壮苗用培地に接種し壮苗させ、又は単芽に切ってから発根用培地中に移し生根培養する際に、培養温度は２４〜２８℃であり、輝度は１５００〜２０００ｌｘであり、光照時間は１２〜１６時間／日であることを特徴とする、付記１に記載のパフィオペディルム・モーディアエの優質種苗の組織培養と迅速増殖の方法。
【００３０】
（付記３）
前記パフィオペディルム・モーディアエの腋芽を切り取り、そして消毒してから外植片とすることについては、
該外植片は、下記の方法で獲得される：
植株成長が強く、花形の丸いパフィオペディルム・モーディアエを母株とし、
外植片を切り取り消毒する３５日前に、まずはカルベンダジムの５００〜８００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、５日後に、３５％の尅土菌水和性粉剤の５００〜８００倍希釈液で１回水やりして葉片に散布し、更に５日後に、７２％の農業用ストレプトマイシン可溶性散薬の３０００〜４０００倍の希釈液で１回水やりして葉片に散布し、そして、５日おきに、上記工程をもう１回繰り返し、最後の農業用ストレプトマイシンによる水やり後に、体積分率７５％のエタノール水溶液で消毒した解剖刀で、長さ１．５〜２．５ｃｍの腋芽を切り取って外植片とし、
前記消毒は、具体的に、クリーンベンチにおいて、切り取った外植片をまず体積分率７５％のエタノール水溶液中に１０〜３０秒間浸してから、有効塩素１．０％の次亜塩素酸溶液を用いて更に５〜１０分間浸し、そして、滅菌水で４〜５回洗い流し、質量分数０．１％の塩化第二水銀溶液で５〜１０分間消毒してから更に滅菌水で４〜５回洗い流し、続けて葉片を切り取り、医療用ストレプトマイシンの１５００〜２０００倍希釈液中において２４時間振とうして、消毒後の外植片を得る、
ことを特徴とする、
付記１に記載のパフィオペディルム・モーディアエの優質種苗の組織培養と迅速増殖の方法。
【国際調査報告】
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