(57)【要約】  癌を処置するための及び抗癌治療と組み合わせて低密度焦点式超音波を使用して転移を予防するためのシステムおよび方法が開示される。【選択図】図１０Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の化学療法薬を被験体に施す工程を含む、被験体における化学療法の有効性を高める方法であって、
ここで、化学療法薬は腫瘍細胞において小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）をもたらし、（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに、化学療法の有効性を高めるのに十分である、方法。
【請求項２】
被験体中のあらかじめ決められた体積の組織における化学療法の有効性を高める方法であって、前記体積が被験体全体未満であり、
前記方法は、（ｉ）ある量の化学療法薬を被験体に投与する工程であって、化学療法薬が腫瘍細胞において小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）をもたらす、工程と、（ｉｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）を、被験体のあらかじめ決められた体積の組織に施す工程とを含み、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに、あらかじめ決められた体積の組織内で化学療法の有効性を高めるのに十分である、方法。
【請求項３】
化学療法薬に耐性のある被験体の腫瘍を処置する方法であって、
前記方法は、
指定された化学療法薬に対する耐性を有する腫瘍を有していると被験体を特定する工程と、
（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の指定された化学療法薬を被験体に施す工程とを含み、ここで（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに、腫瘍を処置するのに十分である、方法。
【請求項４】
被験体の化学療法抵抗性の腫瘍を処置する方法であって、
腫瘍は以前に投与された化学療法薬に対して化学療法抵抗性になっており、
前記方法は、
（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の化学療法薬を被験体に施す工程を含み、
ここで（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに、化学療法抵抗性の腫瘍を処置するのに十分である、方法。
【請求項５】
化学療法薬は腫瘍細胞中で小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）をもたらす、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
化学療法薬は被験体に複数回投与されており、腫瘍は化学療法薬の初期の投与後に化学療法薬に対する耐性を有するものとして診断されたことがある、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
以前に投与された化学療法薬に対して化学療法抵抗性の腫瘍を有していると被験体を特定する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
化学療法薬は腫瘍細胞でＵＰＲをもたらす、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
化学療法薬は腫瘍細胞でＥＲストレスをもたらす、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するか、腫瘍細胞のアポトーシスを増加させるのに十分である、請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
投与された化学療法薬のみの量は、有効性を高めるものではなく、腫瘍を処置することに関して治療量以下の投与量である、請求項１、２、または８−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
被験体の腫瘍を処置する方法であって、
前記方法は、
（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と、（ｉｉ）ある量の化学療法あるいはある量の放射線療法あるいはある量の免疫療法を被験体に施す工程を含み、（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに、腫瘍を処置するのに十分である、方法。
【請求項１３】
被験体の腫瘍の転移を阻害する方法であって、
前記方法は、
ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）とある量の放射線療法を、腫瘍を抱える被験体に施す工程を含み、その量はともに、被験体の腫瘍の転移を阻害するのに十分である、方法。
【請求項１４】
前記量のＬＯＦＵと、前記量の放射線療法が被験体に施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記量のＬＯＦＵと、前記量の化学療法が被験体に施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記量のＬＯＦＵと、前記量の免疫療法が被験体に施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
放射線療法は切除型の小分割放射線治療である、請求項１２、１３、または１４に記載の方法。
【請求項１８】
施されるＬＯＦＵは被験体の腫瘍の位置に向けられる、請求項１−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
被験体の腫瘍を処置するのに必要とされる抗癌化学療法の有効な量を減らす方法であって、
前記方法は、
腫瘍を処置するために必要とされる有効な量の抗癌化学療法を減らすのに十分な低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）の量を、抗癌化学療法を受ける被験体に施す工程を含む、方法。
【請求項２０】
低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）は、化学療法あるいは放射線療法あるいは免疫療法の前、あるいはこれらと同時に、被験体に施される、請求項１−１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＬＯＦＵは放射線療法が施される前に被験体に施される、請求項１２、１３、１４、１７、または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ＬＯＦＵは化学療法が施される前に被験体に施される、請求項１−１２、１５、１８、または１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
化学療法薬はＨＳＰ９０阻害剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＬＯＦＵはトランスデューサーを含む超音波機械から超音波ビームによって送達され、超音波機械と被験体は腫瘍の少なくとも一部がトランスデューサーの焦点に位置するように位置付けられる、請求項１−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＬＯＦＵは腫瘍の少なくとも一部に送達され、被験体の腫瘍の位置は画像化技術によってモニタリングされる、請求項１−２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
画像化技術は磁気共鳴撮像である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＬＯＦＵは、１時間未満の時間のあいだに腫瘍内の複数の塊に少なくとも一度施される、請求項１−２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ＬＯＦＵは非切除的である、請求項１−２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ＬＯＦＵは、施される組織中でキャビテーションを引き起こさない、請求項１−２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ＬＯＦＵの超音波成分は０．５ＭＨｚから１．５ＭＨｚまでの周波数で施される、請求項１−２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ＬＯＦＵは１〜３秒間施される、請求項１−３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
処置ゾーンにおいて、インサイツ強度が被験体の１ｍｍ−７５ｍｍの組織深さで２５０Ｗ／ｃｍ２から７５０Ｗ／ｃｍ２となるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される、請求項１−３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
ＬＯＦＵは全腫瘍体積にわたって施される、請求項１−３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記方法は、腫瘍１ｃｃ当たり３００〜３０００ジュールの範囲のエネルギーを腫瘍に送達する、請求項１−３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）は被験体に施されない、請求項１−３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
放射線療法の量とＬＯＦＵの量は腫瘍の処置において相乗的である、請求項１２−１４、１７、１８、２０、２１、または２４−３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
被験体の腫瘍をある量の抗癌治療に感作させる方法であって、
前記方法は、抗癌治療の前に、被験体の腫瘍をある量の抗癌治療に感作させるのに効果的なある量の低密度焦点式超音波を、被験体に施す工程を含む、方法。
【請求項３８】
抗癌治療は化学療法、放射線療法、免疫療法、あるいは手術を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
被験体に抗癌治療を施す工程をさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
被験体はヒトである、請求項１−３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
腫瘍は、前立腺、乳房、鼻咽腔、咽頭、肺、硬骨、脳、唾液腺、胃、食道、精巣、卵巣、子宮、子宮内膜、肝臓、小腸、虫垂、結腸、直腸、膀胱、胆嚢、膵臓、腎臓、膀胱、頚部、膣、外陰、前立腺、甲状腺または皮膚、頭頸部の腫瘍、神経膠腫、あるいは軟部組織肉腫である、請求項１−４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
腫瘍は前立腺癌である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
転移は肺転移である、請求項１３、１７、１８、２０、または２４−３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
ＬＯＦＵは、以下を含む装置で施される：
周波数波形を生成する制御システム、および、
処置ゾーンで１−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーであって、
ここで、超音波は、０．５−５秒までの範囲の間に処置ゾーンで継続的に適用され、ここで、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲であり、および、任意のビームのメカニカルインデックスは４未満である、請求項１−４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
１つ以上のトランスデューサーの各々は、０．０５〜５ＭＨｚの範囲の中心周波数と、２０〜１０００Ｗ／ｃｍ２の音響出力強度とを備えた周波数波形に基づいて超音波ビームを生成するように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
１つ以上のトランスデューサーの各々は、０．５〜１．５ＭＨｚの範囲の中心周波数と、２０〜１０００Ｗ／ｃｍ２の音響出力強度とを備えた周波数波形に基づいて超音波ビームを生成するように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
各トランスデューサーは、−３ｄＢのビームプロファイルウエストが処置ゾーンで５ｍｍ以上となるように、カラム状の超音波を生成するように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
１つ以上のビームは処置中に機械的に動かされる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
１つ以上のトランスデューサーは、連続的にあるいは同時に動作し、かつ処置期間に処置ゾーンでの平均空間ピーク２５０Ｗ／ｃｍ２の超音波を生成するように構成された２つ以上のトランスデューサーを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
１つ以上のトランスデューサーは、１０ｋＨｚから３００ｋＨｚの範囲内の周波数を有する超音波を生成するように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
１つ以上のトランスデューサーは、３００ｋＨｚから３ＭＨｚの範囲内の周波数を有する超音波を生成するように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
１つ以上のトランスデューサーは、３００ｋＨｚから３ＭＨｚの周波数で動作し、１つ以上のトランスデューサーは３０〜３００ｋＨｚの周波数で動作する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
２つ以上の超音波トランスデューサーは、各ビームが１０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにＩｓｐｔａを有するような、処置ゾーンを通る超音波ビームを生成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
処置時間は１立方センチメートルの腫瘍当たり５秒未満である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
２つのトランスデューサーは、各々が５０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにＩｓｐｔａを有する、処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
３つのトランスデューサーは、各々が５０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにＩｓｐｔａを有する、処置ゾーンを通る超音波ビームを生成する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
１つ以上のトランスデューサーは、処置ゾーン内で互いに実質的に同位相である超音波ビームを生成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５８】
別々の超音波トランスデューサーから発せられる２つの超音波ビームは、実質的に同位相であり、処置ゾーン内で交差し、各ビームは７０〜１００Ｗ／ｃｍ２の範囲で、交差ゾーンで音響パワー空間ピーク強度を有し、超音波は連続して１〜５秒間適用される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
別々の超音波トランスデューサーから発せられる３つの超音波ビームは、実質的に同位相であり、処置ゾーン内で交差し、各ビームは５０〜７０Ｗ／ｃｍ２の範囲で、交差ゾーンで音響パワー空間ピーク強度を有し、超音波は連続して１〜５秒間適用される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
別々のトランスデューサーから始まる超音波ビームはそれぞれ、処置ゾーンで約１００〜１０００Ｗ／ｃｍ２の範囲のＩｓｐｔａを生成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも１つのトランスデューサーは、処置ゾーンよりもサイズが実質的に大きな高密度の直径を備えた超音波ビームを生成し、処置ゾーンが完全にビーム内にあるように向けられる、請求項４４に記載の方法。
【請求項６２】
２つ以上の超音波ビームが経路で交差する集中処置ゾーンが形成され、集中処置ゾーンは、送信されたエネルギー方向に垂直に約１ｃｍ以上であり、送信された方向に平行にも約１ｃｍ以上である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６３】
各トランスデューサーから処置ゾーンに加えられる音圧は０．１〜１０ＭＰａである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６４】
集中超音波処置ゾーンを提供するトランスデューサーの数は１−１０００の間である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６５】
１つ以上のトランスデューサーからの超音波は処置時間のあいだ継続的に適用される、請求項４４に記載の方法。
【請求項６６】
超音波は、１オン時間単位：９オフ時間単位の範囲のデューティサイクルで生成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項６７】
トランスデューサーは、単周波音あるいは多周波数チャープの超音波を生成するように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項６８】
１つ以上のトランスデューサーは時間内に連続して動作する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６９】
適用の全過程の間に標的組織と標的のまわりの所望の縁に送達される総エネルギーは、周囲組織に送達される総エネルギーよりも大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項７０】
１つ以上のトランスデューサーは、超音波の周波数が適用中に一掃されるように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項７１】
１つ以上のトランスデューサーは二次元のフェーズドアレイを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項７２】
１つ以上のトランスデューサーは環状アレイを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項７３】
１つ以上のトランスデューサーは三次元のフェーズドアレイを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項７４】
１つ以上のトランスデューサーは１つ以上の内視鏡装置に組み入れられる、請求項４４に記載の方法。
【請求項７５】
１つ以上のトランスデューサーは磁気共鳴撮像機械に組み入れられる、請求項４４に記載の方法。
【請求項７６】
１つ以上のトランスデューサーは放射線療法機械に組み入れられる、請求項４４に記載の方法。
【請求項７７】
１つ以上のトランスデューサーは、超音波が約２秒以下のあいだ処置ゾーンに適用される場合に、処置ゾーンで到達した最高温度が処置のあいだに４５°Ｃ未満であるように、超音波を生成するように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項７８】
１つ以上のトランスデューサーは、超音波が約２秒以下のあいだ処置ゾーンに適用される場合に、処置ゾーンで到達した最高温度が処置のあいだに５０°Ｃ未満であるように、超音波を生成するように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項７９】
１つ以上のトランスデューサーは、超音波が約２秒以下のあいだ処置ゾーンに適用される場合に、処置ゾーンで到達した最高温度が処置のあいだに５５°Ｃ未満であるように、超音波を生成するように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項８０】
システムであって、
超音波刺激療法装置であって、
周波数波形を生成する制御システム、および、
処置ゾーンで１−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーを含み、
超音波が０．５〜５秒の範囲の時間、継続的に適用され、および、超音波周波数が０．０１〜１０ＭＨｚの範囲である、超音波刺激療法装置と、
放射線療法機械と、
第１の量の超音波と第２の量の放射線療法が被験体に施されるように、超音波刺激療法装置と放射線療法機械を制御するように動作可能に構成された制御システムであって、第１の量と第２の量がともに、被験体の腫瘍を処置するのに十分である、制御システムとを備える、システム。
【請求項８１】
ＬＯＦＵと放射線療法はシステムにより施され、
前記システムは、
ＬＯＦＵ装置であって、
周波数波形を生成する制御システム；および、
処置ゾーンで１−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーを含み、ここで、超音波は、０．５から５秒の範囲の時間、継続的に適用され、および、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲である、ＬＯＦＵ装置と、
放射線療法機械と、
第１の量の超音波と第２の量の放射線療法が被験体に施されるように、ＬＯＦＵ装置と放射線療法機械を制御するように動作可能に構成された制御システムであって、第１の量と第２の量がともに、被験体の腫瘍を処置するのに十分である、制御システムとを備える、請求項１２−１４、１７、１８、２０、２１、２４、２５、３６、または３７−４３のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
システムであって、
前記システムは、
超音波刺激療法装置を含み、
超音波刺激療法装置は、
周波数波形を生成する制御システム、および、
処置ゾーンで１−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーを含み、超音波は０．５〜５秒の範囲の時間、継続的に適用され、および、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲であり、
超音波刺激療法装置は、第１の量の超音波と第２の量の化学療法が被験体に施されるように、化学療法と組み合わせて使用され、第１の量と第２の量はともに、被験体の腫瘍を処置するのに十分である、システム。
【請求項８３】
システムであって、
前記システムは、
超音波刺激療法装置を含み、
超音波刺激療法装置は、
周波数波形を生成する制御システム、および、
処置ゾーンで１−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーを含み、超音波は０．５〜５秒の範囲の時間、継続的に適用され、および、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲であり、
超音波刺激療法装置は、第１の量の超音波と第２の量の免疫療法が被験体に施されるように、免疫療法と組み合わせて使用され、第１の量と第２の量はともに、被験体の腫瘍を処置するのに十分である、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年６月３日に出願された米国仮特許出願第６２／１７０，３７８号と２０１５年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／２０４，３１２号の利益を主張するものであり、両文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援についての声明
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた認可番号ＥＢ００９０４０とＡＩ０５９７３８で政府の支援を受けて作られた。政府は本発明において一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
本出願全体にわたって、様々な出版物が括弧で引用される。これらの文献の十分な引用は明細書の最後に見られる。これらの出版物、および本明細書で参照されるすべての特許、特許出願公報、および文献の開示は、本発明が関係する技術を余すところなく記載するために本出願に全体として参照することにより組み込まれる。
【０００４】
癌細胞に対する免疫反応は、腫瘍微環境の免疫抑制性の性質によって頻繁に妨げられ、それは、腫瘍の免疫療法の有効性を妨げる原因でもある（１と２）。複数のメカニズムは、抑制的な活性によるサイトカインあるいは他の因子の分泌（３−５）、調節性Ｔ細胞と骨髄由来の抑制細胞の動員（６−９）、共抑制的な受容体用リガンドの発現の増加（１０−１３）、あるいは樹状細胞成熟の阻害（１４と１５）を含む免疫抑制環境を生成する腫瘍の能力の根底にあることが特定されている。そうしたメカニズムの結果として、Ｔ細胞は腫瘍抗原にしばしば無反応となる（１５）。腫瘍抗原への反応性の低下状態の誘発は、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方で生じ、往々にして、適応性のある免疫系が効率的な非腫瘍性反応を開始させることができない原因となる（１６−１８）。腫瘍抗原へのＴ細胞応答の減少は、固形腫瘍と血液の腫瘍の両方で生じ、樹状細胞による抗原の非効率的な提示によって引き起こされるように思われており、これは、転写因子ＮＦＡＴとＥｇｒ２に依存する遺伝子発現の免疫寛容原性プログラムの優先的な活性化をもたらす（１８−２１）。腫瘍によって引き起こされたＴ細胞の反応性低下のこのプロセスの重要な役割は、この免疫寛容原性遺伝子発現プログラムの誘発を防がれた遺伝子マウスモデルが、抗腫瘍Ｔ細胞応答の増強と腫瘍の増殖の制御をもたらしたという事実によって強調される（１９と２１）。
【０００５】
焦点式超音波（ＦＵＳ）による局所的な腫瘍の処置は、インサイツの腫瘍切除に一連の入力エネルギーを使用する、画像誘導型低侵襲性治療である（２２と２３）。生物学的組織へのＦＵＳの適用は、熱とキャビテーション効果の生成に関連付けられ、伝達されるエネルギーへ依存して標的細胞の生理機能の変化を引き起こす。高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）は局所的な腫瘍を熱により除去するために臨床的に使用された（２３−２６）。ＦＵＳ処置のモダリティによって生成された実質的な熱エネルギーは、標的とされた焦点で組織の迅速な凝固壊死を引き起こす。複数の研究によれば、リンパ球浸潤の増加、リンパ器官において腫瘍特異性のＴ細胞を産生するＩＦＮγの生成、および樹状細胞の腫瘍への成熟と移動を含む、いくつかの免疫調節効果が報告されているが、ＨＩＦＵ処置に起因する熱により引き起こされた凝固壊死は、腫瘍微環境内で免疫賦活性分子の放出を弱めることもできる（２６と２７）。したがって、確立された原発腫瘍の進行を停止させることはできるが、ＨＩＦＵは、残存する腫瘍細胞から発生する局所かつ遠隔の転移を防ぐことはできないこともある。
【０００６】
本発明は、低密度焦点式超音波を用いる腫瘍および癌の治療の改善と、化学増感を引き起こして癌治療処置の有効性を高める方法とをもたらす。
【発明の概要】
【０００７】
（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の化学療法薬を被験体に投与する工程を含む、被験体における化学療法の有効性を高める方法が提供され、ここで、化学療法薬は腫瘍細胞において小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）をもたらし、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量は化学療法の有効性を高めるのに十分である。
【０００８】
体積が被験体全体未満である被験体中のあらかじめ決められた体積の組織における化学療法の有効性を高める方法も提供され、該方法は、（ｉ）ある量の化学療法薬を被験体に投与する工程であって、化学療法薬が腫瘍細胞において小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を引き起こす、工程と、（ｉｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）を、被験体のあらかじめ決められた体積の組織に投与する工程とを含み、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに、あらかじめ決められた体積の組織内での化学療法の有効性を高めるのに十分である。
【０００９】
化学療法薬に耐性のある被験体の腫瘍を処置する方法が提供され、該方法は、指定された化学療法薬に対する耐性を有する腫瘍を有していると被験体を特定する工程と、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の指定された化学療法薬を被験体に投与する工程とを含み、ここで（ｉ）と（ｉｉ）の量は腫瘍を処置するのに十分である。
【００１０】
さらに、被験体の化学療法抵抗性の腫瘍を処置する方法も提供され、ここで腫瘍は以前に投与された化学療法薬に対して化学療法抵抗性になっており、該方法は、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の化学療法薬を被験体に投与する工程を含み、ここで（ｉ）と（ｉｉ）の量は化学療法抵抗性の腫瘍を処置するのに十分である。
【００１１】
本発明の様々な典型的な実施形態に係る超音波刺激療法（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ）（ＡＰＴ）システムは、処置ゾーンで１０−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均強度（Ｉｓｐｔａ）間の音響パワーを生成するように構成されたトランスデューサーを含み、超音波の周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲であり、メカニカルインデックスは４未満であり、超音波は、処置ゾーンにおける任意の特定の量について０．５−５秒の範囲の時間から継続的に適用される。そのような処置は、超音波刺激療法（ＡＰＴ）処置であると本明細書では特定される。
【００１２】
本発明の典型的な実施形態に係る超音波刺激療法装置は、以下を含む：周波数波形を生成する制御システム；および、０．５〜５ＭＨｚの範囲のピーク周波数と、２０〜１０００Ｗ／ｃｍ２の音響出力強度を有する周波数波形に基づいて超音波ビームを生成するように各々構成された１つ以上のトランスデューサー。
【００１３】
典型的な実施形態では、各トランスデューサーは、−３ｄＢのビームプロファイルウエストが処置ゾーンで５ｍｍ以上となるように、カラム状（ｃｏｌｕｍｎａｔｅｄ）の超音波を生成するように構成される。
【００１４】
典型的な実施形態では、２つ以上のトランスデューサーは、連続的にあるいは同時に操作可能であり、治療期間に処置ゾーンで平均空間ピーク２５０Ｊ／ｃｍ２の超音波を生成することができる。
【００１５】
典型的な実施形態では、トランスデューサーは、超音波が０．１〜１０秒の範囲の治療期間のあいだに処置ゾーンで生成される、連続モードで操作される。
【００１６】
本発明の典型的な実施形態に係るシステムは、超音波刺激療法装置であって、周波数波形を生成する制御システム、および、処置ゾーンで１−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーを含み、超音波が０．５〜５秒の範囲の時間、継続的に適用され、および、超音波周波数が０．０１〜１０ＭＨｚの範囲である、超音波刺激療法装置と、放射線療法機械と、第１の量の超音波と第２の量の放射線療法が被験体に施されるように、超音波刺激療法装置と放射線療法機械を制御するように動作可能に構成された制御システムであって、第１の量と第２の量が被験体の腫瘍を処置するのに十分である、制御システムとを含む。
【００１７】
本発明の典型的な実施形態に係るシステムは、超音波刺激療法装置を含み、超音波刺激療法装置は、周波数波形を生成する制御システム、および、処置ゾーンで１−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーを含み、超音波は０．５〜５秒の範囲の時間、継続的に適用され、および、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲であり、超音波刺激療法装置は、第１の量の超音波と第２の量の化学療法が被験体に施されるように、化学療法と組み合わせて使用され、第１の量と第２の量は被験体の腫瘍を処置するのに十分である。
【００１８】
本発明の典型的な実施形態に係るシステムは、超音波刺激療法装置を含み、超音波刺激療法装置は、周波数波形を生成する制御システム、および、処置ゾーンで１−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーを含み、超音波は０．５〜５秒の範囲の時間、継続的に適用され、および、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲であり、超音波刺激療法装置は、第１の量の超音波と第２の量の免疫療法が被験体に施されるように、免疫療法と組み合わせて使用され、第１の量と第２の量は被験体の腫瘍を処置するのに十分である。
【００１９】
被験体の腫瘍を処置する方法は、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と、（ｉｉ）ある量の化学療法あるいはある量の放射線療法あるいはある量の免疫療法を被験体に投与する工程を含み、（ｉ）と（ｉｉ）の量は腫瘍を処置するのに十分である。
【００２０】
ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）とある量の放射線療法を、腫瘍を抱える被験体に施す工程を含む、被験体の腫瘍の転移を阻害する方法も提供され、その量は腫瘍を処置するのに十分である。
【００２１】
さらに、被験体の腫瘍を処置するのに必要とされる抗癌化学療法の有効な量を減らす方法が提供され、該方法は、腫瘍を処置するために有効な量の抗癌化学療法を減らすのに十分な低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）の量を、抗癌化学療法を受ける被験体に投与する工程を含む。
【００２２】
さらに、被験体の腫瘍をある量の抗癌治療に感作させる方法が提供され、該方法は、抗癌治療の前あるいは間に、被験体の腫瘍を追加の抗癌治療モダリティの量に感作させるのに効果的なある量の超音波刺激療法を、被験体に投与する工程を含む。
【００２３】
被験体の腫瘍を処置する方法が提供され、該方法は、（ｉ）ＡＰＴシステムで使用される超音波形態の典型的な実施形態を示す、ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と、（ｉｉ）ある量の化学療法あるいはある量の放射線療法あるいはある量の免疫療法を、被験体に投与する工程を含み、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量は腫瘍を処置するのに十分である。
【００２４】
さらに、被験体の腫瘍の転移を阻害する方法が提供され、該方法は、ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）とある量の放射線療法を、腫瘍を抱えている被験体に投与する工程を含み、その量はともに被験体の腫瘍の転移を阻害するのに十分である。
【００２５】
さらに、被験体における腫瘍を処置するために必要とされる抗癌化学療法の有効な量を減らす方法が提供され、該方法は、腫瘍を処置するために必要とされる抗癌化学療法の有効な量を減らすのに十分な量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）を、抗癌化学療法を受ける被験体に投与する工程を含む。
【００２６】
さらに、被験体の腫瘍をある量の抗癌治療に感作させる方法が提供され、該方法は、抗癌治療の前あるいは間に、被験体の腫瘍をある量の抗癌治療に感作させるのに効果的なある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）を、被験体に投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ａ−Ｆ。黒色腫腫瘍は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン産出を抑える：Ａ−Ｂ：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに３ｘ１０５  Ｂ１６−Ｆ１黒色腫細胞を腰椎の側腹部に投与した。腫瘍を７−８ｍｍ３のサイズまで成長させた。ＣＤ４＋Ｔ細胞を腫瘍ＤＬＮと遠位の反対側のＮＤＬＮから単離し、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の抗体で刺激した。ＩＬ−２とＩＦＮγをＥＬＩＳＡによって測定した。腫瘍のないマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を対照として用いた。Ｃ−Ｄ：ＯＴＩＩマウスに、記載されているように３ｘ１０５  Ｂ１６−Ｆ１−ＯＶＡ黒色腫細胞を投与した。Ｔ細胞をＯＶＡ３２３−３３９ペプチド負荷脾細胞で刺激し、ＩＬ−２とＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｅ−Ｆ．上に記載されているように、Ｂ１６−Ｆ１細胞を用いてＴｙｒｐ１マウス中で腫瘍を引き起こした。単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の抗体で刺激し、ＩＬ−２とＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって測定した。グラフは、４つ（Ａ−Ｂ）あるいは３つ（Ｃ−Ｆ）の独立した実験からの平均＋ＳＥＭを示す。結果は各実験につき３−５匹のマウスからの平均＋ＳＥＭとして示される。チューキーの検定（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）（＊＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５）を用いるＡＮＯＶＡ（分散分析）を使用してデータを分析した。
【図２】Ａ−Ｄ。ＬＯＦＵを用いる黒色腫腫瘍の処置は、腫瘍により誘発されたＣＤ４＋Ｔ細胞寛容を克服する：Ａ−Ｂ．腰椎の側腹部に３ｘ１０５  Ｂ１６−Ｆ１黒色腫細胞の皮下注射によってＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて腫瘍を引き起こした。腫瘍を未処置のままにするか、ＬＯＦＵで処置した。ＦＵＳ処置の３６時間後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を腫瘍ＤＬＮあるいはＮＤＬＮから単離し、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の抗体で刺激した。ＩＬ−２とＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって評価した。結果（各群中のＮＤＬＮとＤＬＮからのＴ細胞によって産生されたサイトカインレベルの総サイトカイン産生と比率）を、１つの条件当たり３つの異なるマウスからの平均＋ＳＥＭとして提示する。処置していないマウスあるいは処置されたマウス中のＤＬＮ  Ｔ細胞のサイトカイン産生間の差を、両側検定（＊Ｐ〈０．０５）を使用して分析した。Ｃ．腫瘍を引き起こすために、マウスに３ｘ１０５  Ｂ１６黒色腫細胞を投与した。腫瘍の発生後、総ＲＮＡサンプルを、癌を抱えているマウスと腫瘍のない対照マウスのＤＬＮとＮＤＬＮから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞から抽出した。アネルギーに関連する遺伝子の発現を定量のＲＴ−ＰＣＲによって測定した。結果は、腫瘍がないマウスから単離されたＴ細胞と比較して、腫瘍を抱えているマウス中のＤＬＮまたはＮＤＬＮの常在性Ｔ細胞中で遺伝子発現の倍誘発として示される。データは、３つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭを表す。Ｄ．処置していない、あるいはＬＯＦＵで処置したＴｙｒｐ１マウスにおいてＢ１６−Ｆ１黒色腫腫瘍を誘発した。様々なアネルギーに関連する遺伝子の発現を、ＤＬＮとＮＤＬＮから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞中でＲＴ−ＰＣＲによって測定した。アネルギーに関連する遺伝子の発現は、腫瘍を抱えていないＴｙｒｐ１マウスからのＴ細胞中で得られた値を上回る倍誘発（５つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭ）として提示される。
【図３】Ａ−Ｂ。ＬＯＦＵで処置されたＢ１６−Ｆ１黒色腫腫瘍からの溶解物は、アネルギーＴ細胞３Ａの反応性低下状態を覆すことができる。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｙｒｐ１マウスの脾臓とリンパ節から単離し、ＴＨ１細胞に分化させた。その後、細胞を１６時間、未処置のままにするか、抗ＣＤ３で処置することで、アネルギーを誘発した。その後、細胞をＩＬ−２が厳密に存在しない状態で７２時間静止させ、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の抗体で再度刺激した。ＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。結果は２つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示される。Ｂ．ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞を腫瘍がないＴｙｒｐ１マウスの脾臓から単離した。（３Ａ）（Ａ）に記載されるようなＴｙｒｐ１マウス由来ＣＤ４＋Ｔ細胞から生成されたアネルギーＴＨ１細胞を、処置していないあるいはＬＯＦＵで処置されたＢ１６−Ｆ１黒色腫腫瘍に由来する樹状細胞と腫瘍溶解物で共培養した。２４時間後に上清を集め、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２について分析した。結果は、各実験で使用される腫瘍溶解物の３つの独立したセットを用いて２つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示される。データはチューキーの検定（＊＊Ｐ＜０．０１）を用いる分散分析を使用して分析された。
【図４】Ａ−Ｄ．ＦＵＳ処置は、Ｈｓｐ７０の発現と細胞分布、およびＢ１６−Ｆ１黒色腫細胞のカルレティキュリンの変化を引き起こす。Ａ．処置していない、およびＬＯＦＵで処置されたＢ１６−Ｆ１黒色腫を抱えているマウスからの総ＤＬＮ常在細胞を単離させ、ＣＤ１１ｃについて免疫染色することで、樹状細胞をゲート（ｇａｔｅ）した。その後、Ｂ７．１、Ｂ７．２、およびＭＨＣＩＩの表面の発現をフローサイトメトリーによって評価した。適切なアイソタイプ対照を個々の原発性の抗体に使用した。代表的なヒストグラムを示す。Ｂ．処置していない、あるいは、ＬＯＦＵで処置したマウスから得られたＢ１６腫瘍細胞懸濁液の代表的なＦＡＣＳドット・プロットを、生存度マーカー（生きている／死んでいるＭｋ）で染色した。死細胞の相対的な定量化を報告する。ボックスと矢印は死細胞（生きている／死んでいるＭＫ＋）を示す。Ｃ．処置していないマウス、あるいはＬＯＦＵで処置したマウスから単離されたＢ１６−Ｆ１腫瘍組織の蛍光免疫染色。カルレティキュリンあるいはＨｓｐ７０およびＴＲＰ１を検知するために、組織切片を抗体で染色した。核をＤＡＰＩで染色した。拡大６０ｘ。Ｄ．ＬＯＦＵで処置されたマウスと処置していないマウスの腫瘍からの細胞を、ＣＤ４５と、ＴＲＰ１の発現のために染色した。その後、ＣＤ４５−ＴＲＰ１＋Ｂ１６細胞をＨｓｐ７０の発現について分析した。代表的なヒストグラムを示す。ゲートと矢印は、分析のための選択された集団を示す。
【図５】Ａ−Ｂ。黒色腫腫瘍のＦＵＳ処置は、樹状細胞を媒介としたＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激を増強する：Ａ．ＣＤ１１ｃ＋脾臓樹状細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスから精製し、ＯＴ−ＩＩマウスから単離された応答者ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞で共培養した。Ｂ１６−Ｆ１−ＯＶＡ黒色腫腫瘍溶解物を、処置していない、あるいは、ＬＯＦＵで処置した腫瘍を抱えているマウスから調製し、それぞれの培養物に添加することで樹状細胞を媒介としたＴ細胞刺激を駆り立てた。別々のサンプルでは、外因性のＯＶＡ３２３−３３９ペプチドも腫瘍溶解物と共に加えた。上清を２４時間後に集めて、ＩＬ−２産生をＥＬＩＳＡによって評価した。結果は４つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示され、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）とその後のチューキーの検定で分析した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ、有意でない）。Ｂ．Ｂ１６−Ｆ１黒色腫腫瘍を、未処置のままにするか、ＬＯＦＵで処置した。腫瘍ＤＬＮを単離し、Ｔ細胞を消耗させた。ＤＬＮ細胞をその後ナイーブＴｙｒｐ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞で共培養し、インビトロ培養物から得られたＢ１６黒色腫腫瘍溶解物で刺激した。上清を２４時間後に集め、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２レベルについて分析した。データは３つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示される。処置していないマウスあるいはＬＯＦＵで処置されたマウスからのＤＬＮ細胞を使用する培養物中でのサイトカイン産生間の差を、両側検定（＊Ｐ＜０．０５）を使用して分析した。
【図６】Ａ−Ｄ。ＦＵＳとその後の少分割ＩＧＲＴは、Ｔ細胞を媒介とした長期の原発腫瘍対照と遠位の転移の減少とをもたらした：Ａ  ５０ｍｍ３の皮下の背側の右後肢腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ／６マウスを４つの処置群：処置していない群、ＬＯＦＵ群、少分割ＩＧＲＴ群、あるいはＬＯＧＵ＋ＩＧＲＴ群のうちの１つに分け、６２日間、あるいは原発腫瘍が３００ｍｍ３を越えて増大するまで、腫瘍の増殖をモニタリングした。グラフは、２つの代表的な実験（１つの群当たり３−５匹のマウス）のうちの１つからの腫瘍体積の平均±ＳＥＭを示す。データは、一元配置分散分析とその後のボンフェローニ補正検定（２９日目の前）、あるいは両側スチューデントｔ検定（２９日目の後）により分析された。処置していないマウスあるいはＬＯＦＵで処置されたマウスと、ＩＧＲＴあるいはＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴとの間の有意差（＜０．０５をＰとして定義される）は、２５日目の後に生じ、ＩＧＲＴで処置されたマウスとＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴで処置されたマウスとの間の有意差は３５日目の後に生じた。特定の日の腫瘍サイズの分布を示す個々のグラフも示されている。Ｂ．Ａに記載される実験に類似する実験をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで行った。有意差はどの時間点でも様々な群で観察されなかった。Ｃ．Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを原発腫瘍進行／再発についてモニタリングし、多くの１５０ｍｍ３の体積に達する再発として、あるいは膝窩リンパ節または鼠径リンパ節への局所的な転移の進行のいずれかとして定義した。加えて、自然死した動物を、疾患を再発あるいは進行させたとしてスコアした。無再発生存データを、マンテル・コックス検定を用いて分析した。Ｄ．自然死したか、腫瘍量が非常に多すぎて安楽死を必要としたか、あるいは２か月間の長い実験の最後に犠牲にした動物から肺を収集した。その後、肺転移を測定した。融合してプラークになるか、２５０を超過する小結節を備えた肺は、あまりにも数が多すぎて数えることができないと考えられ、２５０の最大値を割り当てられた。各処置群について代表的な検体が示されている。結果は、クラスカル・ウォリス検定で、その後、ダン検定（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔｔｅｓｔ）により分析された、１つの群当たりｎ＝３−５匹のマウスの平均±ＳＥＭとして示されている。＊Ｐ＜０．０５．
【図７】Ａ−Ｇ：ＬＯＦＵはＵＰＲを誘発する。Ａ．ＬＯＦＵは、Ｂｉｐ／Ｇｒｐ７８とＥＤＥＭ  ｍＲＮＡの発現を増加させる。ＬＯＦＵで処置されたＲＭ１腫瘍から単離されたＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析は、未処置の対照と比較して、Ｂｉｐ／Ｇｒｐ７８で２９．７３±０．５６倍の増加、および、ＥＤＥＭ  ｍＲＮＡレベル９．２７±１．１８倍の増加を示した。Ｂ．ＬＯＦＵは、ＩＲＥ１αｍＲＮＡの発現を２．８±０．４倍増加させる。リアルタイムＰＣＲ分析は、ＬＯＦＵにより誘発されたＩＲＥ１α発現の増加が１７ＡＡＧ処置で変わらなかったことを実証する。Ｃ．ＬＯＦＵは、ＸＢＰ１  ｍＲＮＡのスプライシングを引き起こした。１７ＡＡＧ処置は、ＸＢＰ１のスプライシングを阻害する。ＸＢＰ１ｓ、ＸＢＰ１ｈ、およびＸＢＰ１ｕは、それぞれＸＢＰ１のスプライシングされた形態、ハイブリッド形態、およびスプライシングされていない形態を示す。Ｄ−Ｇ．ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ併用療法は、ＲＭ１腫瘍細胞のＥＲストレスを延ばす。ウェスタンブロットと棒グラフは、ＥＲＰ７８（Ｄ＆Ｅ）、ＥＲＰ５７（Ｄ＆Ｆ）およびＥＲｐ４４（Ｄ＆Ｇ）タンパク質の発現が併用療法群で誘発されたことを示す。
【図８】Ａ−Ｅ：ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧは、ＵＰＲのアポトーシス促進性の経路を活性化し、腫瘍細胞でアポトーシスを誘発する。Ａ＆Ｂ。ｐＰＥＲＫ（Ａ）とｐｅＩＦ２ａ（Ｂ）のウェスタンブロット。ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧはＰＥＲＫ（ｐＰＥＲＫ）のリン酸化によってＰＥＲＫを活性化し、これはさらにｅＩＦ２αリン酸化（ｐｅＩＦ２α）のリン酸化を誘発する。Ｃ．ＣＨＯＰ  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析。対照と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧで処置された群ではＣＨＯＰ転写物の２５±１．３倍の増加があった。Ｄ．ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧで処置された腫瘍から単離されたＲＮＡのリアルタイムＰＣＲアレイ。ヒートマップ分析は、処置していない対照あるいはＬＯＦＵ群と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置群がアポトーシスの遺伝子の転写物レベルを数倍増加させたことを示した。Ｅ．ＴＵＮＥＬ染色。免疫組織化学的染色は、対照あるいはＬＯＦＵ群と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置群中でｔｕｎｅｌ陽性細胞を優勢的に示した。１７ＡＡＧのみではＬＯＦＵによって増大された腫瘍組織中のアポトーシスをさらに誘発したことに注意する。
【図９】Ａ−Ｃ：ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置はＲＭ１腫瘍細胞中でシャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）を阻害する。（Ａ＆Ｂ）免疫ブロット分析は、併用療法群においてＳＭＡマーカーＬＡＭＰ２ａ発現レベルの数倍のダウンレギュレーションを示した。ＬＯＦＵまたは１７ＡＡＧのいずれかを用いる処置はＬＡＭＰ２ａ発現レベルをアップレギュレートする。（Ａ＆Ｃ）ＬＯＦＵと１７ＡＡＧの併用療法は、マクロオートファジーマーカーであるベクリンの発現レベルを変えなかった。
【図１０Ａ】ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置後のマウスとヒトの前立腺腫瘍の腫瘍増殖遅滞。１０Ａ．処置計画。２週間にわたって投与された５つの画分について３−４日ごとにＬＯＦＵで明白な腫瘍を処置した。動物はこの間に１７ＡＡＧを１週当たり３回受け取った。ＬＯＦＵの最後の分画の２４時間後に腫瘍を収集した。
【図１０Ｂ】ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置後のマウスとヒトの前立腺腫瘍の腫瘍増殖遅滞。１０Ｂ．ＲＭ１腫瘍。Ｃ５７Ｂｌ６マウスでは、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ併用療法は、対照と比較して、ＲＭ１腫瘍の増殖を有意に減少させた（ｐ＜０．００４）。ＬＯＦＵあるいは１７ＡＡＧのいずれかだけでは腫瘍を著しく制御することに失敗したことに注意する。ＬＯＦＵは、低用量（体重１ｋｇ当たり２５ｍｇ）の１７ＡＡＧの効果を感作した。
【図１０Ｃ】ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置後のマウスとヒトの前立腺腫瘍の腫瘍増殖遅滞。１０Ｃ．ＰＣ３腫瘍。ＢａｌｂＣ  ｎｕ／ｎｕマウスでは、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ併用療法は、ＰＣ３腫瘍の増殖の有意な減少を示した（ｐ＜０．００７）。
【図１１】Ａ−Ｆ：ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置は、ＲＭ１細胞において前立腺癌幹細胞マーカーの発現を減らした。単離されたＲＭ１腫瘍細胞のフローサイトメトリーは、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置後にＲＭ１腫瘍細胞上でＳＣＡ１（Ａ＆Ｂ）、ＣＤ４４（Ａ＆Ｃ）、ＣＤ１３３（Ａ＆Ｄ）、およびα２β１インテグリン（Ａ＆Ｅ）細胞表面発現の有意な減少を示した。（１１Ｆ）ｑＲＴ−ＰＣＲアレイとその後のヒートマップ分析は、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ併用療法群が幹細胞転写因子のｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートすることを示した。
【図１２】本発明の典型的な実施形態に係るＡＰＴ装置のブロック図である。
【図１３】本発明の別の典型的な実施形態に係るＡＰＴ装置のブロック図である。
【図１４】本発明の別の典型的な実施形態に係るＡＰＴ装置のブロック図である。
【図１５】一体型超音波画像化装置を含む本発明の典型的な実施形態に係るＡＰＴ装置のブロック図である。
【図１６】一体型超音波画像化装置を含む本発明の典型的な実施形態に係るＡＰＴ装置のブロック図である。
【図１７】一体型超音波画像化装置を含む本発明の典型的な実施形態に係るＡＰＴ装置のブロック図である。
【図１８】本発明の典型的な実施形態に係るトランスデューサーの斜視図である。
【図１９】本発明の典型的な実施形態に係る位置決め装置を例証する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ＨＩＦＵ形態と比較して、処置ゾーンに低減されたレベルのエネルギーを送達する超音波（ＵＳ）治療が本明細書で開示される。典型的な実施形態では、特定の病変量の処置は、腫瘍組織の温度を約４５°Ｃ未満に上昇させる、１ＭＨｚの常時電力で短時間（例えば〜１．５秒）ある。この超音波処置は、処置ゾーンで超音波を修飾させるために凹面のトランスデューサーを使用して生成され、本明細書では「低エネルギーの非切除型焦点式超音波」（ＬＯＦＵ）と呼ばれる命名され、腫瘍細胞で軽度の機械的かつ熱的なストレスを生成しつつ、組織を損傷させるキャビテーションと凝固壊死を回避するものである。非切除型の「音波」ストレス応答は腫瘍で誘発され、熱ショックタンパク質を実際に死滅させることなく、その発現を増加させる。ＬＯＦＵは、熱ショックタンパク質（２８と２９）を含む免疫調節性の因子を放出する可能性を有し、腫瘍に特有の免疫の活性化（３０と３１）を誘発する際に効果的であり得る。マウスＢ１６黒色腫腫瘍モデルを使用して、ＬＯＦＵ処置が腫瘍により誘発される耐性を覆し、腫瘍抗原に特有のＣＤ４＋Ｔ細胞中のエフェクターサイトカイン産生を増大させることが開示され、これは腫瘍細胞による免疫原性分子の放出によって引き起こされるように考えられている。さらに、ＬＯＦＵと切除型の少分割コーンビーム断層撮影法（ＣＴ）の画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）との組み合わせは、原発腫瘍の相乗的な制御をもたらし、さらに免疫適格マウスにおいて自発的な肺転移の減少を引き起こし、無再発生存期間を延ばす（実施例１を参照）。加えて、ＬＯＦＵは、化学療法薬に癌細胞（実施例における前立腺癌）を感作することが分かった（実施例２を参照）。
【００２９】
典型的な実施形態では、ＬＯＦＵ（本明細書で「超音波刺激療法」とも呼ばれる）は、超音波を０．５〜５秒の範囲の時間、継続的に適用する、処置ゾーンで１０−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均強度（Ｉｓｐｔａ）間の音響パワーでの超音波の適用を含み、ここで、周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲であり、メカニカルインデックスは４未満である。メカニカルインデックス（ＭＩ）は、ＭＨｚの単位で中心周波数の平方根上のＭＰａの単位での希薄化圧力である。適用される超音波のエネルギーと強度は、主として切除効果あるいは主として診断効果のいずれかを引き起こす超音波のエネルギーと強度の中間に位置するように意図される。
【００３０】
より詳細に以下に説明されるように、本明細書で議論される様々な処置方法は、処置ゾーンで１０−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均強度（ＩｓｐｔａＩｓｐｔａ）間の音響パワーを生成するトランスデューサーを含む、ＬＯＦＵまたは超音波刺激療法装置を使用して施されてもよい。超音波は、０．５〜５秒の範囲の時間で継続的に適用されるか、あるいは１〜１００ミリ秒の脈拍時間でパルス状であり、周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲である。いくつかの実施形態では、周波数は０．０５〜５ＭＨｚの範囲である。いくつかの実施形態では、周波数範囲は０．１〜２ＭＨｚである。いくつかの実施形態では、処置ゾーンでの任意の超音波ビームの最小直径は、約１ｃｍである。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で１０〜１００Ｗ／ｃｍ２のＩｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で１００〜２００Ｗ／ｃｍ２のＩｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で３００〜４００Ｗ／ｃｍ２のＩｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で４００〜５００Ｗ／ｃｍ２のＩｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で５００〜６００Ｗ／ｃｍ２のＩｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で６００〜７００Ｗ／ｃｍ２のＩｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で７００〜８００Ｗ／ｃｍ２のＩｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で８００〜９００Ｗ／ｃｍ２のＩｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で９００〜１０００Ｗ／ｃｍ２のＩｓｐｔａで施される。一実施形態では、超音波は、０．５〜１秒の範囲の時間に適用される。一実施形態では、超音波は、１〜２秒の範囲の時間に時に適用される。一実施形態では、超音波は、２〜３秒の範囲の時間に適用される。一実施形態では、超音波は、４〜５秒の範囲の時間に適用される。一実施形態では、超音波は、０．０１〜１ＭＨｚの周波数で適用される。一実施形態では、超音波は１〜２ＭＨｚの周波数で適用される。一実施形態では、超音波は２〜３ＭＨｚの周波数で適用される。一実施形態では、超音波は３〜４ＭＨｚの周波数で適用される。一実施形態では、超音波は４〜５ＭＨｚの周波数で適用される。一実施形態では、超音波は５〜６ＭＨｚの周波数で適用される。一実施形態では、超音波は６〜７ＭＨｚの周波数で適用される。一実施形態では、超音波は７〜８ＭＨｚの周波数で適用される。一実施形態では、超音波は８〜９ＭＨｚの周波数で適用される。一実施形態では、超音波は９〜１０ＭＨｚの周波数で適用される。
【００３１】
（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の化学療法薬を被験体に投与する工程を含む、被験体における化学療法の有効性を高める方法が提供され、ここで、化学療法薬は腫瘍細胞において小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を引き起こし、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量は化学療法の有効性を高めるのに十分である。
【００３２】
体積が被験体全体未満である被験体中のあらかじめ決められた体積の組織における化学療法の有効性を高める方法も提供され、該方法は、（ｉ）ある量の化学療法薬を被験体に投与する工程であって、化学療法薬が腫瘍細胞において小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を引き起こす、工程と、（ｉｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）を、被験体のあらかじめ決められた体積の組織に投与する工程とを含み、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに、あらかじめ決められた体積の組織内での化学療法の有効性を高めるのに十分である。
【００３３】
化学療法薬に耐性のある被験体の腫瘍を処置する方法が提供され、該方法は、指定された化学療法薬に対する耐性を有する腫瘍を有していると被験体を特定する工程と、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の指定された化学療法薬を被験体に投与する工程とを含み、ここで（ｉ）と（ｉｉ）の量は腫瘍を処置するのに十分である。
【００３４】
さらに、被験体の化学療法抵抗性の腫瘍を処置する方法も提供され、ここで腫瘍は以前に投与された化学療法薬に対して化学療法抵抗性になっており、該方法は、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の化学療法薬を被験体に投与する工程を含み、ここで（ｉ）と（ｉｉ）の量は化学療法抵抗性の腫瘍を処置するのに十分である。
【００３５】
方法の一実施形態では、化学療法薬は腫瘍細胞中で小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）をもたらす。
【００３６】
方法の一実施形態では、化学療法薬は被験体に複数回投与されており、腫瘍は化学療法薬の初期の投与後に化学療法薬に対する耐性を有するものとして診断されていた。
【００３７】
化学耐性に関する方法の一実施形態では、方法は、以前に投与された化学療法薬に対して化学療法抵抗性の腫瘍を有していると被験体を特定する工程をさらに含むことができる。
【００３８】
方法の一実施形態では、化学療法薬は、腫瘍細胞でＵＰＲをもたらす。
【００３９】
方法の一実施形態では、化学療法薬は、腫瘍細胞でＥＲストレスをもたらす。
【００４０】
方法の一実施形態では、（ｉ）と（ｉｉ）の量は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するか、腫瘍細胞のアポトーシスを増加させるのに十分である。
【００４１】
方法の一実施形態では、投与された化学療法薬のみの量は、有効性を高めるものではなく、腫瘍を処置することに関して治療量以下の投与量である。
【００４２】
方法の一実施形態では、投与されたＬＯＦＵは、被験体の腫瘍の位置を目的としている。
【００４３】
方法の一実施形態では、低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）は、化学療法あるいは放射線療法あるいは免疫療法の前、あるいはこれらと同時に、被験体に施される。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは投与されている放射線療法の前に被験体に施される。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは投与されている化学療法の前に被験体に施される。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは投与されている免疫療法の前に被験体に施される。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは投与されている放射線療法と同時に被験体に施される。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは投与されている化学療法と同時に被験体に施される。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは投与されている免疫療法と同時に被験体に施される。
【００４４】
方法の一実施形態では、化学療法薬はＨＳＰ９０阻害剤である。一実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は１７ＡＡＧ（ｔａｎｅｓｐｉｍｙｃｉｎあるいは１７−Ｎアリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシナン（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎａｎ））である。一実施形態では、化学療法剤はＨＳＰ９０阻害剤である。ＨＳＰ９０阻害剤の一例は、１７ＡＡＧ（タネスピマイシンあるいは１７−Ｎアリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシナン）である。一実施形態では、化学療法剤はアルキル化薬である。一実施形態では、化学療法剤はトラベクテジンである。一実施形態では、化学療法剤はマスタードガス誘導体である。一実施形態では、化学療法剤は金属塩である。一実施形態では、化学療法剤は植物アルカロイドである。一実施形態では、化学療法剤は抗腫瘍抗生物質である。一実施形態では、化学療法剤は代謝拮抗薬である。一実施形態では、化学療法剤はトポイソメラーゼ阻害剤である。一実施形態では、化学療法剤はプロテアソーム阻害剤である。一実施形態では、化学療法剤は化学療法薬ＮＳＡＩＤである。一実施形態では、化学療法剤は以下に列挙された様々な抗悪性腫瘍薬の１つである。
【００４５】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵはトランスデューサーを含む超音波機械から超音波ビームによって送達され、機械と被験体は腫瘍の少なくとも一部がトランスデューサーの焦点に位置するように位置付けられる。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは腫瘍の少なくとも一部に送達され、被験体の腫瘍の位置は画像化技術によってモニタリングされる。方法の一実施形態では、画像化技術は磁気共鳴撮像である。方法の一実施形態では、画像化技術はコンピューター断層撮影である。方法の一実施形態では、画像化技術は超音波画像化である。
【００４６】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、１時間未満の時間のあいだに腫瘍内の複数の塊に少なくとも一度施される。
【００４７】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは非切除的である。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、施される組織中でキャビテーションを引き起こさない。
【００４８】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵの超音波成分は０．５ＭＨｚから１．５ＭＨｚまでの周波数で施される。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは１〜３秒間施される。方法の一実施形態では、処置ゾーンにおいて、インサイツ強度が被験体の１ｍｍ−７５ｍｍの組織深さで２５０Ｗ／ｃｍ２から７５０Ｗ／ｃｍ２となるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される。
【００４９】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは全腫瘍体積にわたって施される。方法の一実施形態では、方法は、腫瘍１ｃｃ当たり３００〜３０００ジュールの範囲のエネルギーを腫瘍に送達する。方法の一実施形態では、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）は被験体に投与されない。一実施形態では、ＨＩＦＵは、薬８０°Ｃ以上の焦点ゾーンの組織温度をもたらす集束超音波である。ＨＩＦＵは、固体の組織への数秒の暴露時間のあいだに最大で６０−８５°Ｃに温度を上昇させ、および／または組織中の熱切除を引き起こす。熱切除は、０．８〜７ＭＨｚの報告された周波数で１ｋＷ／ｃｍ２を越えるパワー強度で通常は達成される。他方で、ＬＯＦＵは、例えば１〜３Ｗ／ｃｍ２のパワー強度と、０．５〜３ＭＨｚの周波数で達成可能である（しかしながら、本明細書の他のＬＯＦＵ範囲を参照）。ＬＯＦＵは、デューティーサイクルの調節により、連続的（１００％ＤＣ）、あるいはパルス状（＜１００％ＤＣ。低密度パルス状超音波またはＬＩＰＵＳと呼ぶ文献もある）の集束超音波であり得る。１０分間の１ＭＨｚと１Ｗ／ｃｍ２の連続的なＬＯＦＵにより、組織中で０．１°Ｃ上昇させることができる。筋組織に関するインビボ実験は、１ＭＨｚの周波数の超音波処理が、０．５Ｗ／ｃｍ２で０．０４°Ｃ／分；１．０Ｗ／ｃｍ２で０．１６°Ｃ／分；１．５Ｗ／ｃｍ２で０．３３°Ｃ／分；２．０Ｗ／ｃｍ２で０．３８°Ｃ／分の率で温度を増加させることを示す。
【００５０】
方法の一実施形態では、放射線療法の量とＬＯＦＵの量の効果は、腫瘍を処置する際に相乗的である。
【００５１】
方法の一実施形態では、被験体はヒトである。
【００５２】
方法の一実施形態では、腫瘍は、前立腺、乳房、鼻咽腔、咽頭、肺、硬骨、脳、唾液腺、胃、食道、精巣、卵巣、子宮、子宮内膜、肝臓、小腸、虫垂、結腸、直腸、膀胱、胆嚢、膵臓、腎臓、膀胱、頚部、膣、外陰、前立腺、甲状腺、または皮膚、頭頸部の腫瘍、神経膠腫、あるいは軟部組織肉腫である。方法の一実施形態では、腫瘍は前立腺癌である。
【００５３】
方法の一実施形態では、転移は肺転移である。
【００５４】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、以下を含む装置で施される：周波数波形を生成する制御システム、および、処置ゾーンで１−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーを含み、ここで、超音波は、０．５−５秒までの範囲の間に処置ゾーンで継続的に適用され、ここで、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲であり、および、任意のビームのメカニカルインデックスは４未満である。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーの各々は、０．０５〜５ＭＨｚの範囲の中心周波数と、２０〜１０００Ｗ／ｃｍ２の音響出力強度中を備えた周波数波形に基づいて超音波ビームを生成するように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーの各々は、０．５〜１．５ＭＨｚの範囲の中心周波数と、２０〜１０００Ｗ／ｃｍ２の音響出力強度中を備えた周波数波形に基づいて超音波ビームを生成するように構成される。方法の一実施形態では、各トランスデューサーは、−３ｄＢのビームプロファイルウエストが処置ゾーンで５ｍｍ以上となるように、カラム状の超音波を生成するように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のビームは処置中に機械的に動かされる。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、連続的にあるいは同時に動作し、かつ処置期間に処置ゾーンでの平均空間ピーク２５０Ｗ／ｃｍ２の超音波を生成するように構成された２つ以上のトランスデューサーを含む。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、１０ｋＨｚから３００ｋＨｚの範囲内の周波数を有する超音波を生成するように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、３００ｋＨｚから３ＭＨｚの範囲内の周波数を有する超音波を生成するように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、３００ｋＨｚから３ＭＨｚの周波数で動作し、１つ以上のトランスデューサーは３０〜３００ｋＨｚの周波数で動作する。方法の一実施形態では、２つ以上の超音波トランスデューサーは、各ビームが１０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにＩｓｐｔａを有するような、処置ゾーンを通る超音波ビームを生成する。方法の一実施形態では、処置時間は１立方センチメートル腫瘍の当たり５秒未満である。方法の一実施形態では、２つのトランスデューサーは処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成し、各ビームは５０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにＩｓｐｔａを有する。方法の一実施形態では、３つのトランスデューサーは、処置ゾーンを通る超音波ビームを生成し、各々が５０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにＩｓｐｔａを有する。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、処置ゾーン内で互いに実質的に同位相である超音波ビームを生成する。方法の一実施形態では、別々の超音波トランスデューサーから発せられる２つの超音波ビームは、実質的に同位相であり、処置ゾーン内で交差し、各ビームは７０〜１００Ｗ／ｃｍ２の範囲で、交差ゾーンで音響パワー空間ピーク強度を有し、超音波は連続して１〜５秒適用される。
【００５５】
方法の一実施形態では、別々の超音波トランスデューサーから発せられる３つの超音波ビームは、実質的に同位相であり、処置ゾーン内で交差し、各ビームは５０〜７０Ｗ／ｃｍ２の範囲で、交差ゾーンで音響パワー空間ピーク強度を有し、超音波は連続して１〜５秒間適用される。方法の一実施形態では、別々のトランスデューサーから始まる超音波ビームはそれぞれ、処置ゾーンで約１００〜１０００Ｗ／ｃｍ２の範囲のＩｓｐｔａを生成する。方法の一実施形態では、少なくとも１つのトランスデューサーは、処置ゾーンよりもサイズが実質的に大きな高密度の直径を備えた超音波ビームを生成し、処置ゾーンが完全にビーム内にあるように向けられる。方法の一実施形態では、２つ以上の超音波ビームが経路で交差する集中処置ゾーンが形成され、集中処置ゾーンは、送信されたエネルギー方向に垂直に約１ｃｍ以上であり、送信された方向に平行にも約１ｃｍ以上である。方法の一実施形態では、各トランスデューサーから処置ゾーンに加えられる音圧は０．１〜１０ＭＰａである。方法の一実施形態では、集中超音波処置ゾーンを提供するトランスデューサーの数は１−１０００の間である。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーからの超音波は処置時間のあいだ継続的に適用される。方法の一実施形態では、超音波は、１オン時間単位：９オフ時間単位の範囲のデューティーサイクルで生成される。方法の一実施形態では、トランスデューサーは、単周波音あるいは多周波数チャープの超音波を生成するように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは時間内に連続して動作する。方法の一実施形態では、適用の全過程の間に標的組織と標的のまわりの所望の縁に送達される総エネルギーは、周囲組織に送達される総エネルギーよりも大きい。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、超音波の周波数が適用中に一掃されるように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは二次元のフェーズドアレイを含む。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは環状アレイを含む。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは三次元のフェーズドアレイを含む。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは１つ以上の内視鏡装置に組み入れられる。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは磁気共鳴撮像機械に組み入れられる。
【００５６】
方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは放射線療法機械に組み入れられる。
【００５７】
方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、超音波が約２秒以下のあいだ処置ゾーンに適用される場合に、処置ゾーンで到達した最高温度が処置のあいだに４５°Ｃ未満であるように、超音波を生成するように構成される。
【００５８】
方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、超音波が約２秒以下のあいだ処置ゾーンに適用される場合に、処置ゾーンで到達した最高温度が処置のあいだに５０°Ｃ未満であるように、超音波を生成するように構成される。
【００５９】
方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、超音波が約２秒以下のあいだ処置ゾーンに適用される場合に、処置ゾーンで到達した最高温度が処置のあいだに５５°Ｃ未満であるように、超音波を生成するように構成される。
【００６０】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵと放射線療法は、以下を含むシステムにより施される：ＬＯＦＵ装置であって、周波数波形を生成する制御システム；および、処置ゾーンで１−１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーを含み、ここで、超音波は、０．５から５秒の範囲の時間、継続的に適用され、および、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲である、ＬＯＦＵ装置と、放射線療法機械と、第１の量の超音波と第２の量の放射線療法が被験体に施されるように、ＬＯＦＵ装置と放射線療法機械を制御するように動作可能に構成された制御システムであって、第１の量と第２の量は被験体の腫瘍を処置するのに十分である、制御システム。
【００６１】
被験体の腫瘍を処置する方法は、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と、（ｉｉ）ある量の化学療法あるいはある量の放射線療法あるいはある量の免疫療法を被験体に投与する工程を含み、（ｉ）と（ｉｉ）の量は腫瘍を処置するのに十分である。
【００６２】
方法の一実施形態では、その量のＬＯＦＵとその量の放射線療法が被験体に施される。方法の別の実施形態では、その量のＬＯＦＵとその量の放射線療法が被験体に施される。方法の別の実施形態では、その量のＬＯＦＵとその量の免疫療法が被験体に施される。
【００６３】
被験体の腫瘍を処置する方法は、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の標的とされた抗癌治療を被験体に投与する工程を含み、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量は腫瘍を処置するのに十分である。一実施形態では、標的治療は、Ｈｅｒ２またはＶＥＧＦＲを対象としたｍＡｂを含む。一実施形態では、標的治療はチロシンキナーゼ阻害剤を含む。
【００６４】
さらに、被験体の腫瘍の転移を阻害する方法が提供され、該方法は、ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）とある量の放射線療法を、腫瘍を抱えている被験体に投与する工程を含み、その量はともに被験体の腫瘍の転移を阻害するのに十分である。
【００６５】
方法では、放射線療法は切除型の少分割放射線治療であり得る。
【００６６】
好ましくは、この方法では、ＬＯＦＵは被験体の腫瘍の位置に向けられる。
【００６７】
さらに、被験体における腫瘍を処置するために必要とされる抗癌化学療法の有効な量を減らす方法が提供され、該方法は、腫瘍を処置するために必要とされる抗癌化学療法の有効な量を減らすのに十分な量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）を、抗癌化学療法を受ける被験体に投与する工程を含む。
【００６８】
方法の各々の実施形態では、ＬＯＦＵは、化学療法あるいは放射線療法あるいは免疫療法の前に、またはこれらと同時に、被験体に施される。
【００６９】
一実施形態では、ＬＯＦＵは放射線療法の投与前に被験体に施される。
【００７０】
抗癌化学療法が施される方法では、一実施形態では、抗癌化学療法は、被験体へのＨＳＰ９０阻害剤の投与を含む。ＨＳＰ９０阻害剤は１７ＡＡＧ（タネスピマイシンあるいは１７−Ｎアリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシナン）でありえる。一実施形態では、化学療法剤はアルキル化薬である。一実施形態では、化学療法剤はトラベクテジンである。一実施形態では、化学療法剤はマスタードガス誘導体である。一実施形態では、化学療法剤は金属塩である。一実施形態では、化学療法剤は植物アルカロイドである。一実施形態では、化学療法剤は抗腫瘍抗生物質である。一実施形態では、化学療法剤は代謝拮抗薬である。一実施形態では、化学療法剤はトポイソメラーゼ阻害剤である。一実施形態では、化学療法剤はプロテアソーム阻害剤である。一実施形態では、化学療法剤は化学療法薬ＮＳＡＩＤである。一実施形態では、化学療法剤は以下に列挙された様々な抗悪性腫瘍薬の１つである。
【００７１】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵはトランスデューサーを含む超音波機械から超音波ビームによって送達され、機械と被験体は腫瘍の少なくとも一部がトランスデューサーの焦点長さに位置するように位置付けられる。
【００７２】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは腫瘍の少なくとも一部に送達され、腫瘍の位置は画像化技術によってモニタリングされる。磁気共鳴撮像はこうした画像化技術であり得る。
【００７３】
方法では、ＬＯＦＵは、１時間未満の時間のあいだ、腫瘍内の複数の点に少なくとも一度投与可能である。
【００７４】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは非切除型である。
【００７５】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは０．５ＭＨｚから１．５ＭＨｚまでの周波数で施される。
【００７６】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは１．５−３秒間施される。
【００７７】
方法の一実施形態では、超音波ビームの焦点において、インサイツ強度が２５０Ｗ／ｃｍ２から７５０Ｗ／ｃｍ２までとなるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される。方法の一実施形態では、超音波ビームの焦点において、インサイツ強度が被験体の１ｍｍ−７５ｍｍの組織深さで２５０Ｗ／ｃｍ２から７５０Ｗ／ｃｍ２となるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される。方法の一実施形態では、超音波ビームの焦点において、インサイツ強度が被験体の１ｍｍ−７５ｍｍの組織深さで３５０Ｗ／ｃｍ２から６５０Ｗ／ｃｍ２となるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される。方法の一実施形態では、超音波ビームの焦点において、インサイツ強度が被験体の１ｍｍ−７５ｍｍの組織深さで４５０Ｗ／ｃｍ２から５５０Ｗ／ｃｍ２となるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される。
【００７８】
ＬＯＦＵは全腫瘍体積に投与可能であるか、あるいは腫瘍体積の一部に投与可能である。好ましい実施形態では、ＬＯＦＵは全腫瘍体積に施される。
【００７９】
方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、腫瘍を介して１ｃｃの腫瘍組織当たり少なくとも５００〜５０００ジュールのエネルギーを送達する。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、１ｃｃの腫瘍組織当たり少なくとも１０００〜４０００ジュールのエネルギーを送達する。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、腫瘍を介して１ｃｃの腫瘍組織当たり少なくとも２０００〜３０００ジュールのエネルギーを送達する。
【００８０】
一実施形態では、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）は被験体に投与されない。一実施形態では、高密度焦点式超音波は被験体に投与されていない。一実施形態では、高密度焦点式超音波は腫瘍に投与されていない。ＬＯＦＵが抗癌治療の前に被験体に施される一実施形態では、ＬＯＦＵが投与された後、および抗癌治療が施される前には、高密度焦点式超音波は被験体に投与されない。
【００８１】
一実施形態では、放射線療法の量とＬＯＦＵの量の抗癌治療効果は相乗的である。
【００８２】
一実施形態では、投与されたＬＯＦＵは、組織／腫瘍の温度をせいぜい４０°Ｃ−４５°Ｃにしか上げない。一実施形態では、投与されたＬＯＦＵは組織／腫瘍の温度をせいぜい４０°Ｃにしか上げない。一実施形態では、投与されたＬＯＦＵは組織／腫瘍の温度をせいぜい４５°Ｃにしか上げない。一実施形態では、投与されたＬＯＦＵは組織／腫瘍の温度をせいぜい５０°Ｃにしか上げない。ＨＩＦＵは一般に、組織の温度をこれ以上上げる。
【００８３】
一実施形態では、ＬＯＦＵは０．５〜３秒間施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは１．５−３秒間施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは１００％のデューティーサイクルで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、あるいは９０％のデューティーサイクルの別の実施形態の１つで施される。
【００８４】
さらに、被験体の腫瘍をある量の抗癌治療に感作させる方法が提供され、該方法は、抗癌治療の前後、あるいはその最中に、被験体の腫瘍をある量の抗癌治療に感作させるのに効果的なある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）を、被験体に施す工程を含む。一実施形態では、抗癌治療は化学療法、放射線療法、あるいは免疫療法、あるいは標的治療、あるいは手術を含む。一実施形態では、抗癌治療は化学療法を含む。一実施形態では、抗癌治療は免疫療法を含む。一実施形態では、抗癌治療は放射線療法を含む。一実施形態では、抗癌治療は、例えば、腫瘍を切除するための外科手術を含む。方法は被験体に抗癌治療を施す工程をさらに含むことができる。ある量の抗癌治療へ腫瘍の感作させることで、腫瘍を処置に対してますます弱くなる。例えば、腫瘍体積の減少などの腫瘍処置を測定し得るパラメーターは、感作された腫瘍に適用された抗癌治療の所定量について、同じあるいは同等の被験体における同等の量の非感作腫瘍に適用される同じ量の抗癌治療、血管分布、位置、およびタイプと比較して、より大きくなる。一実施形態では、ある量の抗癌治療へ被験体の腫瘍を感作するのに効果的なＬＯＦＵと抗癌治療の量は効果が相乗的である。
【００８５】
本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、被験体は哺乳動物である。一実施形態では、被験体はヒトである。
【００８６】
方法で言及される腫瘍は、前立腺、乳房、鼻咽腔、咽頭、肺、硬骨、脳、唾液腺、胃、食道、精巣、卵巣、子宮、子宮内膜、肝臓、小腸、虫垂、結腸、直腸、膀胱、胆嚢、膵臓、腎臓、膀胱、頚部、膣、外陰、前立腺、甲状腺、または皮膚、頭頸部の腫瘍であるか、神経膠腫、あるいは軟部組織肉腫である。１つの実施形態では、腫瘍は前立腺癌である。１つの実施形態では、腫瘍は軟部組織肉腫である。一実施形態では、原発腫瘍が処置される。一実施形態では、二次腫瘍が治療される。一実施形態では、腫瘍の処置は、二次腫瘍の可能性を減らす。１つの実施形態では、転移は１つ以上の肺転移を含む。
【００８７】
用語「腫瘍」は、本明細書で使用されるように、別段の定めがない限り、新生細胞の増殖を指し、前癌性と癌性の細胞と組織を含む。腫瘍は通常病変またはしこりとして現れる。一実施形態では、腫瘍は悪性新生物である。
【００８８】
本明細書で使用されるように、「転移する」（あるいは文法的等価物）とは、癌または腫瘍に関して、被験体の１つの臓器あるいは組織から、最初の臓器あるいは組織から空間的に離れた被験体の別の臓器あるいは組織へと癌あるいは腫瘍が広がることを意味する。
【００８９】
本明細書で使用されるように、腫瘍を「処置する」ことは、腫瘍そのもの、腫瘍の血管新生、あるいは特徴としている他のパラメーターなどの疾患の１つ以上の症状が、減少し、改善され、阻害され、緩解の状態に置かれ、あるいは緩解の状態で維持されることを意味する。腫瘍を「処置する」ことはさらに、腫瘍の１つ以上の特徴が処置によって除去され、減らされ、あるいは防がれ得ることを意味する。そのような特徴の非限定的な例は、基底膜と近位の細胞外マトリックスの制御されない分解、内皮細胞の新しい機能的な毛細管への移動、分裂、および組織化、ならびにそのような機能的な毛細管の存続を含んでいる。一実施形態では、腫瘍を処置することは腫瘍のサイズあるいは量を減らすことを意味する。
【００９０】
本明細書で使用されるように、被験体の腫瘍の「転移を阻害する」ことは、特徴としているその１つ以上の症状あるいは１つ以上の他のパラメーターが減らされるか、改善されるか、あるいは阻害されることを意味する。こうしたパラメーターの非限定的な例は、基底膜と近位の細胞外マトリックスの制御されない分解、遠位か局所である第２の部位における、血流またはリンパ管を通る腫瘍細胞の移動、浸潤、調節異常性の癒着および増殖を含む。一実施形態では、転移を処置することは、発生を減らすこと、あるいは転移の進行の阻害を意味する。
【００９１】
放射線療法は当該技術分野で周知である。本明細書に包含されるような放射線療法は、身体外部にある機械により送達される医学治療用放射線（体外照射療法）、癌細胞付近の身体に配される放射性物質から送達される医学治療用放射線（体内照射療法）、又は全身放射線治療を含む。本明細書に包含されるような放射線療法は、三次元原体照射治療（３Ｄ−ＣＲＴ）、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）、画像誘発放射線治療（ＩＧＲＴ）、及びトモセラピーを含む。放射線療法はまた、定位手術的照射又は体幹部定位放射線治療（ＳＢＲＴ）の一部であり得る。例えば、当該技術分野で既知の任意の粒子ビームによる送達も包含され、例えば、陽子線治療、炭素イオン治療、又は、腫瘍のタイプと位置に依存した他の荷電粒子ビームである。
【００９２】
一実施形態において、放射線療法は、ＣＴ画像により誘発される。一実施形態において、放射線療法は、少分割コーンビーム放射線療法である。一実施形態において、放射線療法は、少分割コーンビームＣＴ画像誘発放射線療法である。本明細書に記載される様々な要素の全ての組み合わせは、本明細書で指定されていない限り、又は文脈により明確に否定されていない限り、本発明の範囲内である。
【００９３】
本発明に使用され得る化学療法薬は様々である。化学療法薬の例は、次のものを含む：アルキル化剤（例えばトラベクチジン（ｔｒａｂｅｃｔｉｄｉｎ）（（１’Ｒ，６Ｒ，６ａＲ，７Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ）−６’，８，１４−トリヒドロキシ−７’，９−ジメトキシ−４，１０，２３−トリメチル−１９−オキソ−３’，４’，６，７，１２，１３，１４，１６−オクタヒドロスピロ［６，１６−（エピチオプロパノ−オキシメタノ）−７，１３−イミノ−６ａＨ−１，３−ジオキソロ［７，８］イソキノ［３，２−ｂ］［３］ベンザゾシン−２０，１’（２’Ｈ）−イソキノリン］−５−イル酢酸塩））；
マスタードガス誘発体（例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、及びイホスファミド）；
エチレンイミン（例えば、チオテパ及びヘキサメチルメラミン）；
スルホン酸アルキル（例えばブスルファン）；
ヒドラジン及びトリアジン（例えばアルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジン、及びテモゾロミド）；
ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）（例えばカルムスチン、ロムスチン、及びストレプトゾシン）；
金属塩（例えばカルボプラチン、シスプラチン、及びオキサリプラチン）；
植物アルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、及びビノレルビンなどのビンカアルカロイド、パクリタキセル及びドセタキセルなどのタキサン、エトポシド及びテニポシドなどのポドフィロトキシン、イリノテカン及びトポテカンなどのカンプトテカン類似体（トポイソメラーゼ阻害剤））；
抗腫瘍抗生物質（例えばアントラサイクリン：ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、及びイダルビシン；クロモマイシン：ダクチノマイシン及びプリカマイシン；マイトマイシン及びブレオマイシンなどの様々なもの）；
代謝拮抗薬（例えば葉酸桔抗体：メトトレキサート；ピリミジンアンタゴニスト：５−フルオロウラシル、フロクスウリジン（ｆｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、シタラビン、カペシタビン、及びゲムシタビン；プリンアンタゴニスト：６−メルカプトプリン及び６−チオグアニン；アデノシンデアミナーゼ阻害剤：クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、及びペントスタチン）；
トポイソメラーゼ阻害剤（例えばイリノテカン（ｉｒｏｎｏｔｅｃａｎ）、トポテカン；アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド）；
プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｓｏｍａｌ）阻害剤；
化学療法用のＮＳＡＩＤ；及び
様々な抗悪性腫瘍薬（例えばリボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤：ヒドロキシ尿素；副腎皮質ステロイド阻害剤：ミトタン；酵素：アスパラギナーゼ及びペガスパルガーゼ；微小管阻害薬：エストラムスチン；レチノイド：ベキサロテン、イソトレチノイン、トレチノイン（ＡＴＲＡ））。
【００９４】
細胞中の小胞体（ＥＲ）ストレスをもたらし及び／又は折り畳まれなかったタンパク質の応答（ＵＰＲ）をもたらす化学療法薬が、当該技術分野で知られている。例えば、プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ；ＰＳ−３４１として以前に知られている）は、ＥＲストレス応答を誘発する。また、プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブは、ＵＰＲを誘発する。ヒストン脱アセチル化酵素（Ｈｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）（ＨＤＡＣ）阻害剤は、ＥＲストレス応答を誘発する。化学療法用のＮＳＡＩＤ（例えば、インドメタシン、ジクロフェナク、及びセレコキシブ）はＥＲストレス応答を誘発することができ、且つＵＰＲを誘発することができる。エストロゲン受容体α阻害剤、ＢＨＰＩ（１，３−ジヒドロ−３，３−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−７−メチル−２Ｈ−インドール−２−オン）は、ＵＰＲを活性化することができる。白金含有抗癌剤：シスプラチンは、ＥＲストレス応答を誘発すると知られている。薬物のタキサンファミリー：パクリタキセルは、ＥＲストレス応答を誘発すると知られている。ドキソルビシンなどのアントラサイクリンは、ＥＲストレスを誘発すると知られている。シクロホスファミドはＥＲストレスを誘発すると知られている。また、引用により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｔｚ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， １２：７０３−７１９ （Ｓｅｐｔ．， ２０１３）の表２も参照されたい。
【００９５】
小胞体（ＥＲ）は、合成の部位と、分泌された膜結合型タンパク質及び幾つかの小器官標的化タンパク質の合成及びフォールディングの部位である。ＥＲは、細胞エネルギーレベル、レドックス状態、又はＣａ２＋濃度を乱すストレスに非常に敏感である。そのようなストレスは、ＥＲのタンパク質フォールディング能力を減らし、この能力は、折り畳まれなかったタンパク質の蓄積及び凝集、及び／又は、ＥＲにおける内在及び輸送タンパク質の負荷と、その負荷を処理する小器官の能力との間の不均衡を、結果としてもたらし得る。この条件は、本明細書及び当該技術分野において「ＥＲストレス」と呼ばれる。ＥＲストレス応答は、タンパク質フォールディングを増強するＥＲのシャペロン、酵素、及び構造成分のタンパク質合成及び／又はアップレギュレーションの全体的な減衰により、折り畳まれなかったタンパク質の負荷を軽減することにより、細胞の修復及び持続した生存を促進することができる。この応答は総じて、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）と名付けられる。折り畳まれなかったタンパク質の蓄積は、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６、及びＩＲＥｌからのＧＲＰ７８の解離を引き起こし、それによりＵＰＲを起こす。
【００９６】
【表１−１】
2018517495.tif 000003
【００９７】
【表１−２】
2018517495.tif 000004
【００９８】
【表１−３】
2018517495.tif 000005
【００９９】
【表１−４】
2018517495.tif 000006
【０１００】
方法の実施形態において、化学療法薬はＨＳＰ９０阻害剤である。ＨＳＰ９０阻害剤の一例は、１７ＡＡＧ（タネスピマイシン又は１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）である。一実施形態において、化学療法薬はアルキル化剤である。一実施形態において、化学療法薬はトラベクチジンである。一実施形態において、化学療法薬はマスタードガス誘発体である。一実施形態において、化学療法薬は金属塩である。一実施形態において、化学療法薬は植物アルカロイドである。一実施形態において、化学療法薬は抗腫瘍抗生物質である。一実施形態において、化学療法薬は代謝拮抗薬である。一実施形態において、化学療法薬はトポイソメラーゼ阻害剤である。一実施形態において、化学療法薬はプロテアソーム阻害剤である。一実施形態において、化学療法薬は化学療法用のＮＳＡＩＤである。一実施形態において、化学療法薬は、上記に列挙された様々な抗悪性腫瘍薬のうちの１つである。
【０１０１】
本発明により包含される化学療法薬又は薬剤の他の限定しない例は、他に明言されない限り、アントラサイクリン、マイタンシノイド、アルキル化剤、抗代謝物質、植物アルカロイド又はテルペノイド、及び細胞毒性抗生物質を含む。一実施形態において、化学療法剤は、シクロホスファミド、ブレオマイシン、エトポシド、白金薬剤（シスプラチン）、フルオロウラシル、ビンクリスチン、メトトレキサート、タキソール、エピルビシン、ロイコボリン（フォリン酸）、又はイリノテカンである。
【０１０２】
本明細書に包含される抗腫瘍免疫療法は、（ｉ）癌に関連する生体分子標的に高親和性で結合する、モノクローナル抗体（裸の、化学結合、放射結合、又は毒素結合の抗体、及び同様に二重特異性抗体）、Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントで構成されたフラグメントなどのその関連する抗原結合性フラグメント；（ｉｉ）腫瘍細胞及び腫瘍細胞抗原に関して非特異性のもの；サイトカイン又はサイトカイン受容体に結合する抗腫瘍免疫療法薬、例えばサイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、小有機分子（例えば１，５００ダルトン以下）、又は他の薬物；及び、免疫応答を標的とする、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、及び他の小さな有機分子、ペプチド及びアプタマーのうちの１つを含むがこれらに限定されない、チェックポイントを標的とする物質を含む。一実施形態において、本明細書に使用されるような免疫療法は、細菌ベースの抗癌性免疫療法又は抗腫瘍免疫療法を除外する。１つの実施形態において、本明細書に使用されるような免疫療法は、リステリア菌ベースの免疫療法を除外する。
【０１０３】
一実施形態において、処置の効果の増大は、適用される効果を増大させる方法が無い状態での、同じ量の処置（例えば与えられた処置用量）のために達成された範囲に対して達成された治療効果の範囲の増大を意味する。
【０１０４】
また、次のものを含む超音波刺激療法装置も提供される：周波数波形を生成する制御システム；及び処置ゾーンで１〜１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピークの一時的な平均の音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１以上のトランスデューサーであって、ここで、超音波は０．５〜５秒の範囲の時間にわたり処置ゾーンへと連続的に適用され、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲であり、任意のビームのメカニカルインデックスは４未満である。
【０１０５】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーの各々は、中心周波数が０．０５〜５ＭＨｚの範囲である周波数波形と、２０〜１０００Ｗ／ｃｍ２の音響出力強度に基づいて、超音波ビームを生成するように構成される。
【０１０６】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーの各々は、中心周波数が０．５〜１．５ＭＨｚの範囲である周波数波形と、２０〜１０００Ｗ／ｃｍ２の音響出力強度に基づいて、超音波ビームを生成するように構成される。
【０１０７】
装置の一実施形態において、各トランスデューサーは、−３ｄＢでのビームプロファイルのウエストが処置ゾーンにおいて少なくとも５ｍｍとなるように、カラム状（ｃｏｌｕｍｎａｔｅｄ）超音波を生成するように構成される。
【０１０８】
装置の一実施形態において、１以上のビームが、処置中に機械的に移動される。
【０１０９】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、連続して又は一斉に作動し、且つ、処置期間に処置ゾーンで平均空間ピーク２５０Ｗ／ｃｍ２の超音波を生成するように構成された、２以上のトランスデューサーを含む。
【０１１０】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、１０ｋＨｚ〜３００ｋＨｚの範囲内の周波数を有する超音波を生成するように構成される。
【０１１１】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、３００ｋＨｚ〜３ＭＨｚの範囲内の周波数を有する超音波を生成するように構成される。
【０１１２】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは３００ｋＨｚ〜３ＭＨｚの周波数で作動し、１以上のトランスデューサーは３０〜３００ｋＨｚの周波数で作動する。
【０１１３】
装置の一実施形態において、２以上の超音波トランスデューサーは、処置ゾーンを通過する超音波ビームを生成し、各ビームは、１０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにおいてＩｓｐｔａを有している。
【０１１４】
装置の一実施形態において、処置時間は、腫瘍１立方センチメートル当たり５秒未満である。
【０１１５】
装置の一実施形態において、２つのトランスデューサーは、処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成し、各ビームは、５０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにおいてＩｓｐｔａを有している。
【０１１６】
装置の一実施形態において、３つのトランスデューサーは、処置ゾーンを通過する超音波ビームを生成し、各ビームは、５０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにおいてＩｓｐｔａを有している。
【０１１７】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、処置ゾーン内で互いに実質的に同位相である超音波ビームを生成する。
【０１１８】
装置の一実施形態において、別個の超音波トランスデューサーから放たれる２つの超音波ビームは、処置ゾーン内でほぼ一致し且つ交差し、各ビームは、７０〜１００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにおいて音響パワーの空間ピーク強度を有しており、超音波は１〜５秒まで連続的に適用される。
【０１１９】
装置の一実施形態において、別個の超音波トランスデューサーから放たれる３つの超音波ビームは、処置ゾーン内でほぼ一致し且つ交差し、各ビームは、５０〜７０Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーンにおいて音響パワーの空間ピーク強度を有しており、超音波は１〜５秒にわたり連続的に適用される。
【０１２０】
装置の一実施形態において、別個のトランスデューサーから生じる超音波ビームはそれぞれ、処置ゾーンにおいておよそ１００〜１０００Ｗ／ｃｍ２の範囲のＩｓｐｔａを生成する。
【０１２１】
装置の一実施形態において、少なくとも１つのトランスデューサーは、処置ゾーンよりも実質的に大きなサイズであり、且つ処置ゾーンが完全にビーム内にあるように配向される、高強度直径を持つ超音波ビームを生成する。
【０１２２】
装置の一実施形態において、集中的処置ゾーンが形成され、そこでは、２以上の超音波ビームが経路を渡り、集中的処置ゾーンは、伝達されたエネルギー方向に対して垂直に約１ｃｍ以上であり、及び集中的処置ゾーンは、伝達された方向に対して平行に約１ｃｍ以上である。
【０１２３】
装置の一実施形態において、各トランスデューサーから処置ゾーンに加えられた音圧は０．１〜１０ＭＰａである。
【０１２４】
装置の一実施形態において、集中的超音波処置ゾーンをもたらすトランスデューサーの数は、１〜１０００である。
【０１２５】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーからの超音波は、処置時間中に連続的に適用される。
【０１２６】
装置の一実施形態において、超音波は、１のオン時間単位〜０乃至９のオフ時間単位の範囲のデューティーサイクルで生成される。
【０１２７】
装置の一実施形態において、トランスデューサーは、単一周波数音又は複数周波数のチャープを生成するように構成される。
【０１２８】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、時間内に連続して作動される。
【０１２９】
装置の一実施形態において、適用の全経過にわたる、標的組織及び標的組織周囲の所望の縁に送達される全エネルギーは、周囲の組織に送達されるものよりも大きい。装置の一実施形態において、超音波の周波数が適用中に掃引されるように、１以上のトランスデューサーが構成される。装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、二次元フェーズドアレイを含む。装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは環状アレイを含む。装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、三次元フェーズドアレイを含む。装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、１以上の内視鏡装置に組み込まれる。装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、磁気共鳴撮像機械に組み込まれる。装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、放射線療法機械に組み込まれる。
【０１３０】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、超音波が約２秒以下にわたり処置ゾーンに適用される処置中に処置ゾーンにおいて達する最高温度が４５℃未満となるよう、超音波を生成するように構成される。装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、超音波が約２秒以下にわたり処置ゾーンに適用される処置中に処置ゾーンにおいて達する最高温度が５０℃未満となるよう、超音波を生成するように構成される。
【０１３１】
装置の一実施形態において、１以上のトランスデューサーは、超音波が約２秒以下にわたり処置ゾーンに適用される処置中に処置ゾーンにおいて達する最高温度が５５℃未満となるよう、超音波を生成するように構成される。
【０１３２】
また、システムであって、
超音波刺激療法装置であって：
周波数波形を生成する制御システムと、
処置ゾーンで１〜１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピークの一時的な平均の音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１以上のトランスデューサーであって、ここで、超音波は０．５〜５秒の範囲の時間にわたり連続的に適用され、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲である、トランスデューサーと
を含む音響刺激装置；
放射線療法機械；及び
第１の量の超音波及び第２の量の放射線療法が被験体に施されるよう、超音波刺激療法装置及び放射線療法機械を制御するように動作可能に構成された制御システムであって、ここで、第１及び第２の量は共に、被験体の腫瘍を処置するのに十分なものである、制御システム
を含む、システムも提供される。
【０１３３】
また、超音波刺激療法装置を含むシステムも提供され：
該超音波刺激療法装置は：
周波数波形を生成する制御システムと、
処置ゾーンで１〜１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピークの一時的な平均の音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１以上のトランスデューサーであって、ここで、超音波は０．５〜５秒の範囲の時間にわたり連続的に適用され、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲である、トランスデューサーと
を含み、
超音波刺激療法装置は、第１の量の超音波及び第２の量の化学療法が被験体に施されるよう、化学療法と組み合わせて使用され、ここで、第１及び第２の量は共に、被験体の腫瘍を処置するのに十分なものである。
【０１３４】
また、超音波刺激療法装置を含むシステムも提供され：
該超音波刺激療法装置は：
周波数波形を生成する制御システムと
処置ゾーンで１〜１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピークの一時的な平均の音響出力強度（Ｉｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１以上のトランスデューサーであって、ここで、超音波は０．５〜５秒の範囲の時間にわたり連続的に適用され、超音波周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲である、トランスデューサーと
を含み、
超音波刺激療法装置は、第１の量の超音波及び第２の量の免疫療法が被験体に施されるよう、免疫療法と組み合わせて使用され、ここで、第１及び第２の量は共に、被験体の腫瘍を処置するのに十分なものである。
【０１３５】
本発明は、以下の実施例からより良く理解されるものである。しかし、当業者は、議論された特定の方法及び結果が、後に付随する特許請求の半においてより具体的に記載されるような発明の単なる例示にすぎないことを、容易に認識する。
【０１３６】
＜実施例１＞
Ｂ１６黒色腫腫瘍は、腫瘍に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２及びＩＦＮγの生成を抑止する：黒色腫細胞がどのようにして腫瘍により誘発されたエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞応答を調節するのかを判定するために、３つの異なるマウスモデルを使用した。最初に、Ｂ１６−Ｆ１黒色腫腫瘍を、腰椎の側腹部にＢ１６細胞を皮下注射することにより、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスにおいて誘発させた。腫瘍は７−８ｍｍの大きさに成長し、その後ＣＤ４＋Ｔ細胞を、同側の鼠蹊部の流入領域リンパ節（ＤＬＮ）と遠位の対側の非流入領域頚リンパ節（ＮＤＬＮ）の両方から単離した。Ｔ細胞も、腫瘍を抱いていなかった対照マウスから得た。マウスの黒色腫における腫瘍抗原に特異的なＴ細胞寛容の以前の報告を支持すると（１８、２１）、腫瘍ＤＬＮから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によりエキソビボでの刺激時に、同じマウスの遠位の対側のＮＤＬＮから、又は対照の腫瘍の無いマウスのリンパ節から単離された細胞よりも著しく少ないＩＬ−２を生成した。同様であるが、あまり明白でない効果も、ＩＦＮｙ（図１のＡとＢ）について観察した。
【０１３７】
これらのデータを確認するために、代用の腫瘍抗原としてＯＶＡを発現させるように安定してトランスフェクトされたＢ１６−Ｆ１黒色腫細胞株を、使用した。これら細胞を、ＯＴ−ＩＩマウス、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを認識する、トランスジェニックＭＨＣクラスＩＩ制限ＴＣＲを発現させるＴ細胞を持つマウスに皮下注射した。Ｔ細胞を記載されるようにこれらマウスから集めて、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを与えた脾細胞を使用してエキソビボで刺激した。再度生成された同側のＤＬＮからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、対側のＮＤＬＮ又は腫瘍の無いマウスからの細胞と比較して、ＩＬ−２及びＩＦＮγの量を著しく減少させた（図１のＣ及びＤ）。
【０１３８】
これらの結果は更に、Ｔｙｒｐ１マウスを使用して第３のモデルにおいて確証され、このマウスは、チロシナーゼ関連タンパク質１が不足しており、且つ、この内因性のメラノサイト分化抗原のＴＲＰ−１１１３−１２７ペプチドに特異的なＭＨＣクラスＩＩ制限ＴＣＲを発現するＴ細胞を有している。それらマウスにＢ１６−Ｆ１細胞を注入した。前の２つのモデルにおけるように、同側のＤＬＮから採取されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２及びＩＦＮγの生成は、対側のＮＤＬＮ又は腫瘍の無いマウスから採取された細胞と比較して著しく減少した（図１のＥ及びＦ）。総じて、これらの結果は、黒色腫腫瘍が、再刺激後にエフェクターサイトカインを生成する能力の減少において翻訳を行う、腫瘍抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞の低応答性を誘発することを支持している。
【０１３９】
ＬＯＦＵによる原発性Ｂ１６黒色腫の処置は、ＣＤ４＋Ｔ細胞における腫瘍誘発耐性を克服する：ＨＩＦＵは、凝固壊死につながる腫瘍組織内部の高度の熱量の生成により、腫瘍切除を優勢的に引き起こすように現在使用されている。ＨＩＦＵは、局所の腫瘍管理を達成するための非常に有効で非侵襲的な切除手順ではあるが、脈管構造と組織の下部構造をほぼ一瞬にして破壊し、それにより抗原の提示及び認識のために樹状細胞及び免疫細胞の浸潤を制限する。ＬＯＦＵの投与が、新しい腫瘍抗原を生成する腫瘍組織における非致死性の熱／機械ストレスを誘発し、及び／又は、腫瘍の免疫原性を増大させ且つＣＤ４＋Ｔ細胞の腫瘍により誘発された耐性を克服することができる、ストレスにより誘発されたタンパク質の発現を誘発するかどうかを、調べた。この可能性を調べるために、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの別個の群の上で成長した原発性Ｂ１６−Ｆ１黒色腫腫瘍を、未処置のままにするか、又はＬＯＦＵで処置した。ＬＯＦＵ処置の３６時間後、ＤＬＮ及びＮＤＬＮ内在ＣＤ４＋Ｔ細胞を、マウスの両方の群から単離して、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によりエキソビボで再刺激した。著しくもっと生成された、ＬＯＦＵで処置したマウスのＤＬＮからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍が未処置のままのマウスの群から得た細胞と比較して、著しくより多くのＩＬ−２を生成した。対照的に、対応するＮＤＬＮからのＴ細胞は、処置済み及び未処置のマウスにおいて同等量のＩＬ−２を生成した（図２のＡ）。同様ではあるがあまり明白でない効果を、これら同じマウスの実験群のＩＦＮγの生成上で観察した（図２のＢ）。全体として、これら結果は、Ｂ１６黒色腫腫瘍のＬＯＦＵ処置が、黒色腫腫瘍微小環境により誘発される、低応答性の状態を克服するためにＣＤ４＋Ｔ細胞を支えるように思われることを示しており、活性化の改善、及び腫瘍により誘発されたＴ細胞寛容の減少を示唆している。
【０１４０】
黒色腫腫瘍は、ＴＣＲシグナル伝達に干渉し、且つサイトカインの発現を直接阻害し、その結果ＣＤ４＋Ｔ細胞（２１）における機能性アネルギーの確立をもたらす、１セットのタンパク質を生成する遺伝子発現のＮＦ ＡＴＩに依存するプログラムを誘発し得ることが、以前に示されていた。ＬＯＦＵ処置が、アネルギー誘発を妨げることにより腫瘍により誘発されたＴ細胞寛容を阻害し、且つ、ＬＯＦＵでの処置後にＤＬＮ内在ＣＤ４＋Ｔ細胞に観察されたサイトカイン発現の増大に起因し得る可能性を判定するために、Ｂ１６腫瘍を持つマウスのＤＬＮから分離したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるそのようなアネルギー関連遺伝子の発現を、最初にモニタリングし、同じマウスのＮＤＬＮから採取したＴ細胞なかの遺伝子の発現と比較した。癌を患うマウスのＤＬＮからのＴ細胞は、Ｅ３ユビキチンリガーゼＧｒａｉｌ、Ｃｂｌ−ｂ、及びＩｔｃ、並びに転写因子Ｅｇｒ２を含む、より高レベルのアネルギー関連遺伝子を発現させた（図２のＣ）。しかし、Ｆｏｘｐ３の発現の差は、腫瘍を持つマウスのＤＬＮ及びＮＤＬＮ Ｔ細胞の間では観察されず、このことは、調節性Ｔ細胞の存在の増加が、この研究に使用される条件下でＣＤ４＋Ｔ細胞応答の減少におそらく起因しなかったことを示唆している（図２のＣ）。
【０１４１】
その後、ＬＯＦＵによるＢ１６黒色腫の処置が、Ｔ細胞中のそのようなアネルギー関連遺伝子の発現に対して効果があるかどうかを判定した。内因性の腫瘍抗原により誘発された応答を評価するために、Ｔｙｒｐ１マウス上で成長するＢ１６腫瘍を、未処置のままにするか、又はＬＯＦＵで処置した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＤＬＮ及びＮＤＬＮから分離し、様々なアネルギー関連遺伝子の発現を評価した。ＤＬＮ由来のＴ細胞は、Ｇｒａｉｌ、Ｉｔｃｈ、及びＣｂｌｂ、同様に、転写因子Ｅｇｒ２及びＧｒｇ４、並びにプロテアーゼＣａｓｐａｓｅ３を含む、分析された７つのアネルギー遺伝子のうち６つの、様々な程度のアップレギュレーションを示した（図２のＤ）。様々なインビトロ及びインビボのＴ細胞アネルギーモデルにおいてもアップレギュレートされる、別の転写因子（Ｉｋａｒｏｓ）は、腫瘍により誘発されたアネルギーのこの黒色腫モデルにおいては著しくアップレギュレートされず、そのレベルは、ＤＬＮ及びＮＤＬＮ由来のＴ細胞両方において大きく類似したままであった（図２のＤ）。興味深いことに、腫瘍をＬＯＦＵで処置すると、ＤＬＮから分離されたＴ細胞におけるそれらの遺伝子のうち５つ、Ｇｒａｉｌ、Ｉｔｃｈ、Ｃｂｌｂ、Ｅｇｒ２、及びとＧｒｇ４の発現はアップレギュレートされず、ＮＤＬＮ中のこれらの遺伝子の発現に匹敵するレベルを示し（図２のＤ）、このことは、ＬＯＦＵ処置が、腫瘍抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアネルギーを誘発する遺伝子の発現の誘発を阻害したことを支持している。
【０１４２】
ＬＯＦＵで処置した黒色腫腫瘍は、アネルギーの腫瘍抗原特異性Ｔ細胞を再活性化することができる：この結果は、腫瘍により誘発されたＴ細胞寛容がＬＯＦＵ処置後に克服され得ることを支持していた。この観察は、様々なアネルギー関連遺伝子の発現が腫瘍部位のＬＯＦＵ処置後に腫瘍ＤＬＮ由来のＴ細胞中で減少し、その一方で、活性化により誘発されたサイトカイン発現が、遠位のＮＤＬＮから分離されたＴ細胞又は対照の腫瘍が無いマウスから分離されたＴ細胞において検出されたものに近いレベルにまで回復されたという事実により、実証された。
【０１４３】
ＬＯＦＵは、腫瘍抗原特異性Ｔ細胞アネルギーの誘発を妨げるだけでなく、確立されたアネルギーを逆転し、且つ前に寛容されたＴ細胞における生産的なエフェクター応答を生成するかどうかについてが、調査された。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｙｒｐｌマウスの脾臓とリンパ節から分離し、インビトロでＴＨ１細胞に分化し、且つ、共刺激の無い状態で抗ＣＤ３抗体を用いた部分的な刺激によりこれらを活性化することにより、アネルギー化した。予想通りに、Ｔ細胞は低応答性になり、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の抗体での再刺激後にＩＬ−２生成の深刻な減少を示した（図３のＡ）。その後、これらアネルギー性細胞を、未処置の又はＬＯＦＵで処置した黒色腫腫瘍の何れかに由来する溶解物を与えたＣＤ１１ｃ＋樹状細胞で再活性化させた。予想通りに、未処置のＢ１６−Ｆ１黒色腫由来の腫瘍溶解物を与えた樹状細胞で刺激したアネルギー性Ｔｙｒｐ１ Ｔ細胞は、ごく少量のＩＬ−２を生成した。しかし、樹状細胞に、ＬＯＦＵで処置した腫瘍から調製した腫瘍溶解物を与えると、以前にアネルギー化したＴ細胞は、未処置の溶解物で活性化されたものより著しく多くのＩＬ−２を生成した（図３のＢ）。これらの結果は、黒色腫腫瘍のＬＯＦＵ処置が、耐性を破ることが可能な活性化シグナルを樹状細胞に送達させることを可能にし、その他にアネルギー性Ｔ細胞が抗原との再遭遇に応答し且つ生産的な応答を生成することを可能にすることができる、免疫原分子の生成を結果としてもたらす。
【０１４４】
ＬＯＦＵによる黒色腫の処置は、メラノーマ腫瘍細胞における分子シャペロンカルレティキュリン及びＨｓｐ７０の発現と細胞内分布の変化を誘発する：樹状細胞によるメラノーマに特異的なＴ細胞の活性化は、それらの運命を判定するのに重要な事象である。エフェクターＴ細胞応答を誘発することができる優れた抗原提示事象は、寛容原性の刺激を伝える樹状細胞の活性化状態に大きく依存する。結果は、ＬＯＦＵでの黒色腫腫瘍の処置が、腫瘍により誘発されたＴ細胞寛容の妨害の結果としてＣＤ４＋Ｔ細胞活性化の増大をもたらしたことを示す。このことは、より多くの免疫原性の樹状細胞集団の生成に潜在的に起因し得る。Ｔ細胞へと効率的に提示される抗原の樹状細胞の能力に対するＬＯＦＵの効果を試験するために、腫瘍を持つマウスのＤＬＮ由来の全細胞を最初に分離し、処置せず又はＬＯＦＵで処置し、免疫染色して、フローサイトメトリーによりＣＤ１１ｃ＋樹状細胞集団上でのＢ７．１、Ｂ７．２、及びＭＨＣＩＩの発現を測定した。ＬＯＦＵで処置されたマウスにおけるこれらのタンパク質の発現の著しい増強は、検出されなかった（図４のＡ）。
【０１４５】
カルレティキュリン及びＨｓｐ７０を含む分子シャペロンによる腫瘍抗原の輸送も、Ｔ細胞（３２−３５）への抗原の後の生産的な提示に重要である。インビボ及びインビトロ両方の方法を利用して、未処置の及びＬＯＦＵで処置したＢ１６黒色腫腫瘍における膜のカルレティキュリン及びＨｓｐ７０を検出した。未処置のまま、又はＬＯＦＵで処置した何れかの腫瘍を、腫瘍を持つマウスから採取し、単個細胞浮遊液にして、生／死のマーカーで染色して、細胞の生存率を評価した。細胞の生存率の差異はＬＯＦＵ処置に応じて観察されず、このことは、ＦＵＳの低エネルギー形態が腫瘍細胞死を直接誘発していなかったという考えを支持している（図４のＢ）。Ｂ１６黒色腫腫瘍を未処置のままにし、又はＬＯＦＵ処置に晒して、腫瘍組織切片をスライド上に置いた。免疫蛍光による後の検出のために、抗Ｈｓｐ７０抗体又は抗カルレティキュリン抗体による染色に、スライドをさらした。ＬＯＦＵで処置した黒色腫の免疫蛍光分析は、ＬＯＦＵがＨｓｐ７０の発現増加を誘発したことを確認した（図４のＣ）。興味深いことに、未処置の細胞と比較したので、ＬＯＦＵで処置した細胞も、Ｂ１６細胞上の原形質膜の不連続部位に蓄積するように思われるカルレティキュリンの分布の変化を示した（図４のＣ）。Ｈｓｐ７０発現の増大も、このタンパク質の膜における存在の増大と相互に関連したかどうかを判定するために、非透過性のＣＤ４５−ＴＲＰ−１＋Ｂ１６黒色腫細胞をＨｓｐ７０について染色し、ＬＯＦＵ処置後の細胞表面発現をＦＡＣＳにより評価した。この分析は、Ｂ１６黒色腫のＬＯＦＵ処置が腫瘍細胞におけるＨｓｐ−７０の膜の存在の増大を引き起こしたことを確認した（図４のＤ）。
【０１４６】
メラノーマ腫瘍のＬＯＦＵ処置は、より強力なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するために、樹状細胞を媒介とした腫瘍抗原提示を強化する：腫瘍のＬＯＦＵ処置が、内在する樹状細胞の刺激能の増大を結果としてもたらし得る可能性を判定するために、ＬＯＦＵで処置したマウスから調製した溶解物が、抗原特異性Ｔ細胞の刺激の増大を誘発して、より強固なエフェクター応答を引き起こすのかどうかを、直接試験した。この実験のために、Ｂ１６−Ｆ１−ＯＶＡ黒色腫細胞を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍を誘発させた。溶解物を、未処置の及びＬＯＦＵで処置した腫瘍から調製した。脾臓樹状細胞、及びレスポンダーであるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、それぞれＣ５７ＢＬ／６とＯＴ−ＩＩの腫瘍の無いマウスから分離して、上述の異なる腫瘍溶解物の存在下、又は不在下で共培養した。腫瘍溶解物を含有するＯＶＡは、レスポンダーＴ細胞を刺激するために腫瘍抗原のソースとして作用し得るが、外因性のＯＶＡ３２３−３３９ペプチドも追加して、全ての条件下でこのペプチドを持つ樹状細胞の均一な充填を確保して、異なる腫瘍溶解物の寛容原性又は活性化の性質をより正確に判定した。
【０１４７】
予想通りに、対照のレスポンダーＯＴ−ＩＩ Ｔ細胞は、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを与えた樹状細胞による活性化の後、高レベルのＩＬ−２生成による強力な応答を示した。しかし、外因性のＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを培養物に加えたとしても、未処置の腫瘍から得た溶解物は、ＯＴ−ＩＩ応答を著しく阻害し、結果としてＩＬ−２生成の深刻な減少をもたらした（図５のＡ）。興味深いことに、未処置の溶解物とは反対に、ＬＯＦＵで処置した腫瘍由来の溶解物は、ＯＶＡ３２３−３３９に対するＯＴ−ＩＩ細胞の応答に対する負の効果を持たないだけでなく、外因性のペプチドが無い状態でさえもＯＴ−ＩＩレスポンダーＴ細胞の強力な活性化を誘発することができる（図５のＡ）。これらの結果は、Ｂ１６黒色腫腫瘍のＬＯＦＵ処置が、腫瘍内微小環境において通常は生じる樹状細胞のＴ細胞刺激能力に対する負の効果を妨げるという観察の更なる指示を広げた。
【０１４８】
次に、腫瘍ＤＬＮの内在する抗原提示細胞が、黒色腫腫瘍のＬＯＦＵ処置後の標的Ｔ細胞の活性化において、機能的に更に効果的となるのかどうかを判定した。その効果に対し、Ｂ１６−Ｆ１黒色腫をＣ５７ＢＬ／６マウスに誘発させ、未処置のままにするか、又はＬＯＦＵで処置した。ＤＬＮ細胞懸濁液はＴ細胞が枯渇しており、これを使用して、腫瘍抗原特異生Ｔ細胞を活性化する能力及びＤＬＮ抗原提示細胞を試験した。故に、Ｔ細胞を枯渇したＤＬＮ細胞を、ナイーブＴｙｒｐ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＢ１６のインビトロの培養物から調製した溶解物と共に、２４時間共培養した。ＩＬ−２生成をＥＬＩＳＡにより測定し、レスポンダーＴ細胞の刺激をモニタリングした。ＬＯＦＵで処置した腫瘍を持つマウスのＤＬＮから分離した細胞は、未処置のマウスから分離した細胞と比較して、Ｔｙｒｐ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する能力を著しく増大させたことを示した（図５のＢ）。これらのデータは、Ｂ１６黒色腫のＬＯＦＵ処置が、腫瘍抗原レスポンダーＴ細胞の活性化において機能的に更に効果的である抗原提示細胞の生成を結果としてもたらすことを支持している。
【０１４９】
ＬＯＦＵ、続く少分割ＩＧＲＴによる腫瘍の切除の結果、原発性黒色腫病変のＴ細胞を媒介とした制御の増強をもたらした：ＬＯＦＵ治療が腫瘍免疫原性を調節し、且つ抗腫瘍免疫応答を増強することができるという観察の結果を更に判定するために、原発腫瘍対照を評価する一連のインビボの処置の戦略は、右の背側後肢において皮下に位置する定着されたＢ１６−Ｍ１腫瘍を持つマウス１匹当たり、１０Ｇｙの少分割ＩＧＲＴから３０Ｇｙの全用量までを毎日使用する腫瘍切除と組み合わせて、又は組み合わせずにＬＯＦＵを使用して、実行された。腫瘍体積が〜５０ｍｍ３に到達した時に、全てのマウスについて処置を開始した。その後、各群における腫瘍体積を、６２日までの間、週に３回測定した（図６のＡ）。未処置のＣ５７ＢＬ／６、又はＬＯＦＵで処置されたマウスのみが、急速な原発腫瘍増殖を経験し続け、処置の１０日以内に≧３００ｍｍ３の体積に到達し、その時点で、膝下の切断（ＢＫＡ）を行った（図６のＡ）。対照的に、少分割ＩＧＲＴ又はＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴの群内のマウスは、処置後３週間までにわたり著しい成長の遅れを経験し、その後、ＩＧＲＴのみで処置されたマウスは原発腫瘍の再成長を示し始め、およそ５週間で＞３００ｍｍ３の体積に到達した。著しいことに、ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴ群におけるマウスは持続した応答を有しており、処置後６週間以上にわたり腫瘍増殖は制限されていた。ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴ又はＩＧＲＴを受ける群における腫瘍体積の減少は、未処置又はＬＯＦＵのみの群と比較して、２５日目まで統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。更に、ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴの群における腫瘍体積の減少は、ＩＧＲＴのみと比較して、３５日目まで統計的に有意であり、実験期間にわたって統計的に有意なままであった（Ｐ＜０．０５）（図６のＡ）。加えて、ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴの群におけるマウスは、ベースライン測定値からの腫瘍の退行を実証し、完全な腫瘍の無い応答を、５匹のマウスのうち４匹で確認した。
【０１５０】
ＬＯＦＵの免疫修飾効果を確証するために、同様の実験を、免疫無防備状態のＢＡＬＢ／ｃヌードモデルを使用して行った。これらのマウスにおいて、Ｂ１６−Ｍ１腫瘍は非常に急速に成長し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスよりもおよそ１週間早く≧３００ｍｍ３に到達する。全体的な処置応答は同様であり、未処置及びＬＯＦＵのみは結果として著しい原発性腫瘍制御をもたらさない一方で、ＩＧＲＴとＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴは原発腫瘍増殖を遅らせた（図６のＢ）。しかし、ＩＧＲＴとＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴ処置の両方において、原発性の対照は短命であった。実際、ＢＫＡは、処置の開始後２週間でＩＧＲＴ群に、及び３週間未満でＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴの群に必要とされた。加えて、免疫無防備状態のマウスにおけるＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴは、ＩＧＲＴのみと比較すると、統計的に有意な原発性腫瘍の制御を結果としてもたらすことはできなかった（図６のＢ）。
【０１５１】
ＬＯＦＵ、次いで少分割ＩＧＲＴの結果、再発の無い生存の延長、及び肺転移の減少がもたらされる：データに基づき、ＬＯＦＵで誘発された、増強された抗腫瘍Ｔ細胞応答は、治療的なＩＧＲＴを増大させる場合があり、局所疾患だけでなく微視的病変及び遠隔転移のより優れた制御を達成する。Ｂ１６−Ｆ１０は、処置されない場合に許容できないサイズへと急速に成長する活動的な細胞株であるため、＞３００ｍｍ３の原発腫瘍を持つマウスは、ＢＫＡを必要とした。注目すべきことに、ＢＫＡが行われる時間まで、原発腫瘍由来の細胞は既に、流出する膝窩のＬＮへと広がっていた（データは示されず）。その後数週間以内に、流出する膝窩のＬＮは急速に成長し、眼に見えて大きくなった一方で、より遠位の鼠蹊部のＬＮは明らかに触知可能となった。腫瘍がこの点に到達すると、不快感を緩和するために実行され得る手順は無く、これらのマウスを屠殺した。結果的に、全生存は、大量の腫瘍量を持つマウスにおいて十分に査定することができない。それ故、２つの他のパラメーターを評価することが決定された：過度の局所再発の腫瘍負荷を持つ、自然死した又は屠殺した動物が正の事象として記録された、再発の無い生存；及び肺転移の進行。
【０１５２】
ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴの組み合わせは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける何れかの処置のみにわたって、統計的に有意な（Ｐ＝０．０４）再発の無い生存優位性をもたらした（図６のＣ）。著しくは、Ｃ５７ＢＬ／６ ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴ以外の全ての群において、流出する膝窩又は鼠蹊部のＬＮへの局所転移は頻繁に、屠殺の使用を必要とした。更に、ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴで処置されたマウスは、肺転移の厳密な制御を示したが、他の３つの群において、比較的小さな局所再発を伴う動物までもが、圧倒的な肺転移により最終的に死亡した（図６のＤ）。
【０１５３】
＜考察＞
適応免疫系は、悪性に変形した細胞を絶えず調査する（ｓｕｒｖｅｙｓ）。これは、抗腫瘍免疫応答を開始するために適切なＴ細胞レパートリーを刺激する、腫瘍関連抗原の認識により主に達成される。しかし、腫瘍はまた、適応免疫系を回避し、且つ抗腫瘍Ｔ細胞応答を妨害するための多様な機構を利用する（１）。その結果、癌に対する優れた治療は、腫瘍に誘発された耐性の主な障害を克服しなければならない（３６）。様々な機構が、異なるＴ細胞の亜型において腫瘍がどのようにして耐性を誘発するのかを説明するために記載されており、腫瘍抗原の不完全な提示及び抗原提示細胞の不適切な活性化、共阻害受容体によるシグナル伝達、腫瘍内微小環境内に放出された因子による免疫抑制、及び抑制細胞の局所動員を含む（９、１５−１７、２０、３７−３９）。癌細胞の免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を促進する処置は、耐性を軽減し、且つその逆転を駆り立てることができる。ＩＣＤの特徴は、損傷に関連する分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出、細胞表面への特定のシャペロン複合体の転位、及び腫瘍関連抗原の樹状細胞を媒介とする交差提示の増大を含む（４０）。この研究において、非切除的ＬＯＦＵを使用する黒色腫の新たな処置が、腫瘍により誘発される耐性の予防、逆転、又は緩和、並びにそれ故抗腫瘍免疫応答の増強を結果としてもたらすかどうかを調べることが、求められた。
【０１５４】
熱切除的ＨＩＦＵは、原発腫瘍を制御することが可能な一方で、周囲又は遠くの組織における微小転移侵襲において典型的に有効ではなく、このことは、このＦＵＳモダリティにより引き起こされた細胞死が、適応抗腫瘍免疫応答を十分に刺激しないことを示唆している。実際、局所又は遠位の微小転移侵襲は、最初の切除処置を回避する細胞の比較的小さな腫瘍負荷を排除することが可能な、十分に刺激された免疫系により予防又は改善され得る。この研究において、Ｂ１６マウス黒色腫モデルを使用して、非切除的ＬＯＦＵ処置の使用が、腫瘍内微小環境の寛容化効果の克服によりＴ細胞エフェクター応答を増強し、且つ、切除処置前に施された時に、局所再発と遠位の転移を予防することを示す。
【０１５５】
腫瘍抗原に対して低応答性のＴ細胞の発達は、様々なマウス腫瘍モデル及びヒト癌の中のＴ細胞において記載されている（１５、１８、４１）。この研究室は、腫瘍抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞が、腫瘍を持つマウスにおいてアネルギーとなり、且つ、エフェクターサイトカインを増殖及び生成する能力を妨げると示された一連のアネルギー関連遺伝子を発現することを、以前に報告した（２１、４２）。更に、アネルギーを誘発する遺伝子の発現に起因する２つの転写因子である（４３−４５）、ＮＦＡＴ１又はＥｇｒ２を欠くマウスにおけるそれら遺伝子の発現の予防は、腫瘍抗原特異性Ｔ細胞の低応答性の阻害、及び局所腫瘍増殖の制御の改善へと繋がる（１９、２１）。２つの異なるＢ１６マウス黒色腫モデルを使用して、データは、腫瘍ＤＬＮにおける内在する腫瘍抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ｇｒａｉｌ、Ｉｔｃｈ、Ｃｂｌｂ、Ｇｒｇ４、及びＥｇｒ２を含むアネルギー関連遺伝子の発現をアップレギュレートすることを確認した。遺伝子発現のこのプログラムの活性化は、エキソビボでの再刺激後にサイトカインを生成する能力の減少と十分に関連しており、このことは、Ｂ１６黒色腫が、腫瘍抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞の低応答性の固有状態を誘発することを支持している。重要なことに、ＬＯＦＵによる原発腫瘍の処置は、再刺激後にサイトカインを生成するという、それら腫瘍抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞の能力の増大を結果としてもたらした。ＴＣＲ結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に対して反応的なＵＳにより誘発された回復は、その他アネルギー細胞において、大半のアネルギーを誘発する遺伝子の発現の、異なる程度までの減少を伴った。しかし、腫瘍を持つマウスにおけるＤＬＮの内在するＣＤ４＋Ｔ細胞中のＦｏｘｐ３転写物の、ＦＵＳにより誘発される変化が無いことは、ＦＵＳがＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの移動又は分化に影響を及ぼさず、且つ、ＬＯＦＵがＴ細胞アネルギーの阻害により腫瘍により誘発される耐性を妨げたことを、示唆している。
【０１５６】
腫瘍により誘発されたＴ細胞アネルギーに対する初期検査は、このプロセスにおいて抗原提示細胞が果たす重要な役割を識別し、不完全な樹状細胞の成熟は、腫瘍抗原特異性Ｔ細胞の非能率的な刺激の主な決定要因として定められた（２０、４６）。近年、Ｔ細胞と腫瘍抗原を提示する樹状細胞との間に形成される不安定な免疫学的シナプスが、ＮＦＡＴの核輸出の遅延、及び、Ｅｇｒ２を含む遺伝子発現の寛容原性ＮＦＡＴ依存性プログラムの起こり得る活性化を結果としてもたらすことが、示されてきた（４７）。Ｂ１６黒色腫のＬＯＦＵ処置に続く、Ｔ細胞活性化の増大は、様々な異なる現象から潜在的に結果として生じる場合もある。最初に、ＬＯＦＵでの腫瘍の処置は、腫瘍細胞に対する、熱的及び機械的両方のストレスを伝える。このストレスは、新たな固有の「非自己」腫瘍抗原の生成を支援することができ、これは次に、腫瘍をより免疫原性のものとし、且つ耐性をあまり誘発できないようにする場合がある。代替的に又は付加的に、腫瘍細胞による、ストレスによって誘発された危険信号の放出は、標的とする樹状細胞がＴ細胞における耐性の誘発にあまり貢献しないことが分かる腫瘍内微小環境を生成することができる。熱ショックタンパク質及びカルレティキュリンを含む、ストレス関連分子シャペロンは、樹状細胞の成熟、及び抗腫瘍免疫の増強に関係した（３２、４８−５１）。原発腫瘍溶解物は、樹状細胞において成熟信号を引き起こすことが可能な熱ショックタンパク質において豊富であるという証拠が存在する（５２）。重要なことに、熱ショックタンパク質はまた、腫瘍細胞から樹状細胞まで抗原ペプチドに結合し且つそれを送達することが可能であり、更に、腫瘍細胞の原形質膜中のそれらの存在は、免疫応答の増大に関連した（５３−５５）。カルレティキュリンも、抗腫瘍応答において重要な役割を果たすと説明されており、その腫瘍細胞の表面への転位は、樹状細胞及び免疫活性化による細胞の食作用の増大に関連していた（５６、５７）。マウス腺癌モデルにおいてＨＩＦＵを使用する以前の研究は、この処置、著しく、樹状細胞上での共刺激分子の発現を著しく増大させて、更により高レベルのＩＬ−１２を生成し且つその結果ＣＴＬ活性を増大させたことを示した（５８、５９）。データは、ＬＯＦＵがＢ１６細胞中のカルレティキュリンの再分布、及び誘発可能な熱ショックタンパク質Ｈｓｐ７０の発現の増大を誘発することを示しており、このことは、ＬＯＦＵにより媒介される細胞ストレスが、そのようなストレスにより誘発されたタンパク質の発現の変化を誘発することができることを示唆している。ＭＨＣ−ＩＩ又はＢ７タンパク質の発現の有意差は検出されなかったが、ＬＯＦＵが、腫瘍抗原の効果的な提示の増強に寄与し得る樹状細胞機能における他の変化も誘発し得ることを、無視することはできない。いかなる場合も、データは、ＬＯＦＵにより課された熱的／機械的ストレスがおそらく、腫瘍免疫原性の増強、及びアネルギー上のＴ細胞活性化の促進に起因することを支持している。
【０１５７】
腫瘍抗原により誘発されたＴ細胞寛容は、癌の処置における主な障害のままである。腫瘍特異性Ｔ細胞における耐性の有効な逆転は、臨床的抗腫瘍戦略における重要な目標である。データは、ＬＯＦＵで処置した黒色腫腫瘍から調製した溶解物によりＴ細胞中の予め確立されたアネルギーを逆転することができることを見出している。この観察は、腫瘍のＬＯＦＵ処置が、Ｔ細胞中の予め確立された腫瘍耐性を妨げるだけでなく逆転する腫瘍細胞から新たな免疫原性分子を放つことができる可能性を広げている。ＩＬ−２受容体によるシグナル伝達は長く、Ｔ細胞におけるクローンアネルギーを妨げ且つ逆転すると知られている（６０−６２）。しかし、ＩＬ−２の量の上昇は、未処置又はＬＯＦＵで処置した溶解物の何れかにおいて検出することができず（データは示されず）、これにより、ＩＬ−２の存在を、この実験においてアネルギーの逆転を引き起こした候補とはさせにくくする。しかし、他の要因がこの表現型に寄与し得ることが起こり得る。実際、ＴＮＦＲファミリーメンバーＯＸ−４０リガンドによるＴ細胞の共刺激はまた、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋両方のＴ細胞のエフェクター応答の増大に加えて、Ｔ細胞アネルギーを予防且つ克服すると示された（６３−６５）。ＣＤ１３７、ＣＤ４０の結合、及びＰＤ１の遮断も、インビボで予め定着されたＣＤ８＋Ｔ細胞寛容を予防且つ逆転すると報告された（６６−６８）。
【０１５８】
少分割ＩＧＲＴを使用する切除治療を行う前のＬＯＦＵによる黒色腫腫瘍の前処置の結果、腫瘍増殖の著しい遅延がもたらされ、及び、様々な場合において、腫瘍の完全回帰を免疫適格性のマウスにのみ観察した。これらのマウスの再発の無い生存も、そのプロトコル後に著しく改善した。加えて、肺転移の発生率は、切除的ＩＧＲＴのみを受けたマウスと比較して、腫瘍切除前にＬＯＦＵを受けたマウスにおいて最小であった。著しいことに、ＬＯＦＵは、同様の実験がＴ細胞の不足したヌードマウスで実行された時に、同様の保護をもたらさなかった。この観察は、ＬＯＦＵの保護効果が、原発腫瘍を制御するように制限されるだけでなく、局所又は遠位の何れかでの転移巣の確立を妨げることができることを示している。このような転移からの保護は恐らく、腫瘍抗原に対するＴ細胞寛容の予防／逆転、或いはその両方の結果として生じ得る。ＬＯＦＵの前処理は、より効果的に腫瘍増殖を制御しただけでなく、前に示すように、転移からの保護をもたらし且つより長い再発の無い生存を確保した、強力な免疫原性のＩＧＲＴで誘発された腫瘍死の生成をおそらくもたらした。
【０１５９】
内因性の腫瘍抗原に対するＴ細胞寛容の予防は、癌を処置する際に最高に重要なものである。本明細書中の研究は、ＬＯＦＵでの原発腫瘍の処置がそれを達成することができることを示しており、それをインサイツの自己腫瘍ワクチンの開発のための候補治療とする。固形腫瘍のＦＵＳ処置は、切除方法と組み合わせて、転移の予防と同様に原発腫瘍撲滅の効果を強化することを証明することが可能である。
【０１６０】
方法と材料
【０１６１】
マウス：６−８週齢のＣ５７ＢＬ／６、Ｂ６．Ｃｇ−ＲａｇｌｔｍｌＭｏｍＴｙｒｐｌＢ−ｗＴｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）９Ｒｅｓｔ／Ｊ（Ｔｙｒｐｌ）及びＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）４２５Ｃｂｎ／Ｊ（ＯＴ−ＩＩ）のマウス菌株を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＢＡＬＢｃ／ヌードマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒを経由して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た。チャールズ川を通って分布したので、米国国立癌研究所から得られた。マウスを全て収容し、病原体の無い設備で維持した。
【０１６２】
Ｂ１６細胞株と原発性ＣＤ４＋Ｔ細胞の培養：Ｂ１６−Ｆ１とＢ１６−Ｆ１０の黒色腫細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。Ｂ１６−Ｆ１０（Ｂ１６−Ｍ１）の高度に活動的なサブクローンを、確立された原発腫瘍の外科切除の６週間後にＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて生じた転移性クローンを分離且つ拡張することにより、生成した。Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫細胞株は、親切にもＥ．Ｍ． Ｌｏｒｄ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）から提供された。Ｂ１６−ＯＶＡ細胞によるＯＶＡの発現を、リアルタイムＰＣＲにより確認した。全ての黒色腫細胞を、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び２５０ＩＵのペニシリン／ストレプトマイシンで補われたＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において培養した。
【０１６３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコルに従って抗ＣＤ４を結合した磁気のＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分離した。ここで示されるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、マウスＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗マウスＩＬ−４抗体（クローン１１Ｃ．１１；１０μｇ／ｍｌ）、及び１０Ｕ／ｍＬの組換え型ヒトＩＬ−２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の存在下で、プレート結合抗ＣＤ３Σ（クローン２Ｃ１１；
【０１６４】
【数１】
2018517495.tif 000007
）及び抗ＣＤ２８（クローン３７．５１；
【０１６５】
【数２】
2018517495.tif 000008
）抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での活性化によりＴＨ１ヘルパー細胞へと分化され、及び、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、
【０１６６】
【数３】
2018517495.tif 000009
の２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、及び必須ビタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ）で補われたＤＭＥＭにおいて６日間培養された。
【０１６７】
腫瘍モデル：ハンクス緩衝塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で懸濁した３×１０５ Ｂ１６−Ｆ１黒色腫細胞を、マウスの腰椎の側腹部に皮下注射した。右後肢の背部に２×１０５ Ｂ１６−Ｍ１細胞を注入することにより、足蹠に黒色腫腫瘍を誘発させた。
【０１６８】
腫瘍増殖のモニタリング：原発性Ｂ１６−Ｍ１黒色腫の背側の後肢にある腫瘍を、ノギスを用いて週に３回測定した。楕円体の式を使用して腫瘍体積を計算した：Ｖ＝（π／６×長さ×幅×高さ）。原発性の背側の後肢にある腫瘍は、３０−５０ｍｍ３のＩ期体積、９０−１５０ｍｍ３のＩＩ期体積、及び３００−５００ｍｍ３のＩＩＩ期体積を有する、ゴルペンツ成長を示す。それ故、処置効果を、９０−１５０ｍｍ３までの腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）を判定することにより判定し、そこでは腫瘍は対数期ＩＩである。３００−５００ｍｍ３に到達する腫瘍は、解剖及び血管の制限により位相ＩＩＩに入り始める。結果的に、膝下の切断を、ＩＡＣＵＣに承認されたプロトコルに従い、＞３００−５００ｍｍ３の腫瘍を持つマウスに行った。
【０１６９】
ＥＬＩＳＡ：１．５〜２．５×１０４のＴ細胞を、静止したままにするか、或いは、抗ＣＤ３Σ＋抗ＣＤ２８抗体、１：５のＴ細胞：脾細胞の比率でＴ細胞が枯渇したＯＶＡペプチド３２３−３３９（ＯＶＡ３２３−３３９）を与えられた脾細胞、又は１：３の樹状細胞：Ｔ細胞の比率でＯＶＡ３２３−３３９又は黒色腫腫瘍溶解物を与えたＣＤ１１ｃ＋精製樹状細胞（ＣＤ１１ｃ−ビーズを使用する；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の何れかで刺激した。培養上清を典型的に、刺激の２４時間後に採取し、ＩＬ−２又はＩＦＮのレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定した。
【０１７０】
腫瘍溶解物：腫瘍を持つマウスから腫瘍を切除し、１−２ｍｍの片に切断し、
【０１７１】
【数４】
2018517495.tif 000010
のナイロンメッシュに通した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、血清を含まないＤＭＥＭの中で再懸濁した。その後、細胞懸濁液を液体窒素中で急速凍結し、光顕微鏡検査による完全な溶解の５回の目視確認のために３７℃で溶解した。溶解物を４℃で１５分間、１０，０００ｇで回転し、細胞破片を持つペレットを廃棄した。精製樹状細胞と共に上清を使用して、Ｔ細胞を刺激した。
【０１７２】
免疫蛍光染色腫瘍組織を分離し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＯＣＴ化合物（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に包埋した。組織切片（５μｍ）を調製し、５分間アセトンで透過され、３０分間ヤギ血清でインキュベートして、非特異性タンパク質間相互作用を遮断した。組織切片を、以下の抗体で一晩インキュベートした：抗カルレティキュリン（Ｐｉｅｒｃｅ， ＰＡ５−２５９２２）、抗Ｔｒｐｌ（Ａｂｅａｍ， ａｂ３３１２；クローンＴＡ９９）、及び抗Ｈｓｐ７０（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， ＮＢＰ１−７７４５５）。適切な二次抗体を室温で３０分間使用した。ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して核を検出した。少なくとも１０のフィールド／サンプルを、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｏｌｙｍｐｕｓ １Ｘ８１蛍光顕微鏡で盲検的に分析した。
【０１７３】
焦点式超音波治療法システム。治療及び撮像プローブのシステム（ＴＩＰＳ， Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｂｒｉａｒｃｌｉｆｆ Ｍａｎｏｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）を、全ての超音波照射に利用した。このシステムは、焦点式且つ時空的に制御した超音波エネルギーを伝えることができ、且つ、治療制御作業端末、ＲＦ発生器及び制御電子回路、８つの要素球形シェル環状アレイ超音波トランスデューサー（８０ｍｍの曲率半径、８０ｍｍの開口部）、同様に、面内のトランスデューサーの動作及び超音波ビーム軸に対し垂直な正確な位置決めを可能にする移動ステージから成る。焦点式超音波ビームも、焦点の電子偏向を使用して面外のおよそ±１５ｍｍで操作され得る。超音波ビームは、薄い（２５μｍ）円形のプラスチック膜を介して標的へと垂直に広がり、音響結合が脱気水によりもたらされる。治療中、システムは、音響出力パワー、超音波照射期間、デューティーサイクル、及び超音波振動数の調整を可能にする。
【０１７４】
インビボでの焦点式超音波（ＦＵＳ）療法。純酸素中の１．５％のイソフルランの１．５リットル／分の連続流でマウスに麻酔をかけた。適切な音響結合を確かなものとするために、腫瘍を抱えている脚または腰椎の側腹部を慎重に剪毛した。動物が治療のために位置付けられると、腫瘍を脱気水および超音波ゲルを使用してＴＩＰＳシステムに音響的に（ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ）結合した。その後、腫瘍の中央部を、トランスデューサーから８０ｍｍの焦点距離に置いた。超音波照射を、全腫瘍体積にわたって伸長する１ｍｍのグリッドパターンを使用して、腫瘍に送達した。（５ｍｍ間隔で置かれた）グリッド点の二層を各腫瘍に設け、結果として１腫瘍当たりおよそ１６０の離散性病巣および５分の暴露期間につながった。超音波トランスデューサーを１．０ＭＨｚで操作し、結果として、楕円軸に沿って測定されるように、直径およそ１．５ｍｍおよび長さ１２ｍｍ（−６ｄＢの圧力）の楕円焦点がもたらされた。超音波照射を、全腫瘍体積にわたって伸長する１ｍｍのグリッドパターンを使用して、腫瘍に送達した。治療前に、腫瘍体積を、特定の処置に対するグリッドサイズを計算するために測定した。各グリッド点での超音波照射の持続時間は、１．５秒であり、その後、トランスデューサーは次のグリッド点上に自動的に位置付けられ、全腫瘍体積が覆われるまで手順を繰り返した。グリッド点の二層を各腫瘍に設けた。治療用超音波装置を、具体的な音響パワー／圧力計画：音響パワー３Ｗ、ピーク負圧＝２．９３ＭＰａ（８０ｍｍの焦点距離）／３．８１ＭＰａ（８５ｍｍの焦点距離）で、連続波モードにおいて操作して、非切除型の低エネルギーＦＵＳ（ＬＯＦＵ）をもたらした。焦点で結果として生じるインサイツでの密度（Ｉｓｐｔａ）を、組織中の４ｍｍの深さで５５０Ｗ／ｃｍ２となると推測した。腫瘍への総エネルギー付与はおよそ９００Ｊであった。
【０１７５】
インビボでの少分割コーンビームＣＴ画像誘導放射線治療（ＩＧＲＴ）：３４１秒で１０Ｇｙの線量を標的腫瘍に送達するために、Ｘｓｔｒａｈｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ’ｓ Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｌａｔｆｏｒｍ （ＳＡＲＲＰ）を使用して、放射線をすべて送達した。麻酔をかけられた動物を、電動プラットフォームに付けられたステージ上に置き、腫瘍を抱えている右後肢を、１．５ｃｍの接着プラットフォームまで伸ばし、上げて、固定して、外部からの組織暴露を最小限にした。固定されると、コーンビームＣＴ（ＣＢＣＴ）を実行し、データを、組織分節（ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）および治療計画のために３Ｄスライサーで開いた。３０Ｇｙの総少分割用量に対して、３日間連続で１０Ｇｙずつ送達した。併用療法のグループにおいて、ＬＯＦＵをＣＢＣＴの２−４時間前に実行した。
【０１７６】
肺転移の評価：肺が、自発的に死亡した動物から分離されたか、安楽死させられたか、または８週間の実験の終わりに屠殺された。１ｍＬのＦｅｋｅｔｅの溶液（エタノール、氷酢酸およびホルムアルデヒドベースの漂白定着液）を肺に注入して吹き込んだ。その後、気管をクランプし、肺および心臓全体を一括して取り除き、ＰＢＳで洗浄した。その後、肺をＦｅｋｅｔｅの溶液に入れ、分析前に４８時間漂白した。左肺と、右肺の４葉を分離し、解剖顕微鏡の助けによって小結節をカウントした。不明瞭な又は融合した小結節は確実に数えあげることができない；それ故、肺を、数が多すぎて考慮に入れることができないものとして標識付けし、２５０の恣意的な転移数を割り当てた。ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定を使用して、統計分析を行い、続いて多重比較のためのダンのポスト検定（Ｄｕｎｎ’ｓ ｐｏｓｔｔｅｓｔ）を行った。
【０１７７】
無再発生存：以下の事象を、我々の無再発生存分析において正の事象としてスコア化した：腫瘍病変の検死確認による自発的な死亡、排出する膝窩または鼠径のリンパ節への広範囲な局所転移による安楽死、または広範囲な全身腫瘍量を示す瀕死状態による安楽死。以下の非腫瘍依存性の死亡を、打ち切りデータとして処理した：切断の２４−４８時間以内の死亡または８週間の実験の終わりでのあらゆる動物の屠殺。対照の又は処置した動物の選択的屠殺を防ぐために、動物研究所の獣医が処置および対照群から盲検化される（ｂｌｉｎｄｅｄ）ように、英数字コードを使用してケージを標識付けした。マンテル・コックス検定を使用して、無再発生存を分析し、統計的有意差をＰ＜０．０５として定義した。
【０１７８】
リアルタイムＰＣＲ：ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞から総ＲＮＡを抽出し、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡサンプルを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でレポーター色素としてＰｏｗｅｒＳＹＢＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、リアルタイムＰＣＲにさらした。試験した転写物の発現を、ベータアクチンに正規化した。使用されるプライマーセットは以下である：
ａｃｔｉｎｂ：Ｆ−ＧＴＧＡＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｒ−ＧＣＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
Ｃｂｌｂ：Ｆ−ＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＴＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、Ｒ−ＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＣＴＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
Ｇｒａｉｌ：Ｆ−ＡＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、Ｒ−ＧＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣＣＡＡＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；
Ｉｋａｒｏｓ：Ｆ−ＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、Ｒ−ＣＧＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；
Ｃａｓｐａｓｅ３：Ｆ−ＡＣＧＣＧＣＡＣＡＡＧＣＴＡＧＡＡＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｒ−ＣＴＴＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；
Ｅｇｒ２：Ｆ−ＴＣＡＧＴＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、Ｒ−ＧＡＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）；
Ｇｒｇ４：Ｆ−ＴＣＡＣＴＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、Ｒ−ＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；
Ｉｔｃｈ：Ｆ−ＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、Ｒ−ＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）；
Ｆｏｘｐ３：Ｆ−ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）；
Ｒ−ＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＴＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）。
【０１７９】
フローサイトメトリー：免疫染色前に、細胞をＦｃブロック（ＣＤ１６／ＣＤ３２）抗体であらかじめブロックした。以下の蛍光色素抱合抗体を使用した：抗Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ４５の抗体の他に、それらそれぞれのアイソタイプ対照抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；抗Ｈｓｐ７０（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）および抗ＴＲＰ１（Ａｂｃａｍ）。ＵＶ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標） Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって、死細胞を検出した。免疫染色した細胞を、ＬＳＲ−ＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して取得後の分析を行った。
【０１８０】
実施例２
低酸素腫瘍微小環境は、酸化小胞体（ＥＲ）ストレスをもたらし、結果として、タンパク質のミスフォールディングおよび小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）につながる。ＵＰＲは、ＵＰＲの延長された活性化が細胞死を誘発するが、タンパク質のミスフォールディングを補正し、癌細胞の生存および殺腫瘍性の治療に対する耐性を改善する、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）を含む幾つかの分子シャペロンを誘発する。ＨＳＰ９０阻害剤、１７ＡＡＧは、前立腺癌（ＰＣ）を含む、様々な固形腫瘍に対する見込みを示した。しかしながら、１７ＡＡＧの治療量は全身毒性を引き出す。本明細書には、新しいパラダイムが開示され、ここで非切除性および非侵襲性の低エネルギー焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と無毒な低用量の１７ＡＡＧとの併用療法が、マウスおよびヒトのＰＣ異種移植片中の合成致死および有意な殺腫瘍効果を引き起こす。ＬＯＦＵは、細胞死を誘発することなく、腫瘍細胞においてＥＲストレスおよびＵＰＲを誘発する。無毒な用量の１７ＡＡＧによる処置はさらに、ＬＯＦＵ処置したＰＣにおいてＥＲストレスを増加させ、腫瘍においてＵＰＲを細胞保護的な応答からアポトーシス応答に切り替え、結果として、アポトーシスおよび腫瘍増殖遅滞の有意な誘発をもたらした。ＬＯＦＵ誘発性のＥＲストレスは、超音波処置した腫瘍を１７ＡＡＧなどの化学療法剤に対してより感受性にする。ＬＯＦＵ誘発性の化学増感は、腫瘍、例えば、局所に進行した及び再発性の腫瘍に対して使用することができる新しい治療である。
【０１８１】
ＬＯＦＵおよび１７ＡＡＧ治療の処置計画および毒性：各グリッド位置に対して、１００％のデューティーサイクル、３Ｗの音響パワーで、および１ＭＨｚの超音波周波数を使用して、ＬＯＦＵを１．５秒間施した。このプロトコルは、２７０Ｗ／ｃｍ２のおよそのインサイツでの空間ピークの時間平均音響密度をもたらし、結果として３．２℃の予測された平均の腫瘍内の温度上昇につながった。処置後、脱毛、熱的損傷、または皮膚創傷などの、正常組織毒性の徴候はなかった。マウスにおける前臨床の薬物動態試験は、１７ＡＡＧが広く分布し、広範囲な肝代謝を受けることを示した。１７ＡＡＧの全身投与は、有意な肝毒性に関連することが知られており、これは、トランスアミナーゼおよび胆汁酸の増加、および胆嚢、総胆管、および胃腸管における薬物関連の組織病理学的病変を特徴とする。それ故、我々の治療に対しては無毒であった１７ＡＡＧの用量を判定した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、１週当たり３回、１７ＡＡＧ（２５−７５ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射で処置した。対照マウスに等量のビヒクルＤＭＳＯを注入し、これを１７ＡＡＧを可溶性にするために使用した。より高用量の１７ＡＡＧ（体重の５０−７５ｍｇ／ｋｇ）処置は、未処置の対照と比較して、有意な腫瘍増殖遅滞を達成した（それぞれ、未処置の腫瘍、１８７９±９８．６５ｍｍ３対１７ＡＡＧ ７５ｍｇ／ｋｇ体重（ｂ．ｗ．）、４８５±２４．２５ｍｍ３、ｐ＜０．００３および５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．、９６４ｍｍ３およびｐ＜０．００７）が、カプラン・マイヤー法は、体重の７５ｍｇ／ｋｇの用量での２１日間の処置後にマウスの５０％における死亡を示した。
【０１８２】
無毒であると分かった１７ＡＡＧの低用量は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて２５ｍｇ／ｋｇおよびＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて１４ｍｇ／ｋｇであった。したがって、これらの用量レベルを現在の試験のために選択した。その目的は、治療量以下であるのにもかかわらず、無毒である、２つの治療を組み合わせること、およびその組み合わせが治療的であり得るかどうかを検査することであった。ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用治療はＥＲストレスを増幅させる：ＥＲにおける誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積は、タンパク質のミスフォールディングの補正を助けるシャペロンタンパク質の誘導でストレス応答を誘発する。ＥＲストレスのレベルを検出するために、ＥＲシャペロン、ＥＲｐ４４、ＥＲｐ５７、およびＥＲｐ７２の発現レベルを、異なる処置群間で定量化した。ＥＲｐ４４は、酸化タンパク質フォールディングの原因である［６９］。ＥＲｐ５７はＥＲ常在性ジスルフィドオキシドレダクターゼであり［７０］、一方でＥｒｐ７２はジスルフィドイソメラーゼである。これらのすべてのタンパク質は、ＥＲのタンパク質フォールディングの機構に関与する。処置を受けなかった又はＬＯＦＵまたは１７ＡＡＧ単独を受けた動物からの腫瘍組織と比較して、イムノブロット解析は、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧとの併用療法後に腫瘍組織におけるＥＲｐ７８（ｐ＜０．０３、図７のＤおよび７Ｅ）、ＥＲｐ４４（ｐ＜０．０５、図７のＤおよびＧ）、およびＥＲｐ５７（ｐ＜０．０４、図７のＤおよびＦ）のタンパク質レベルの発現の有意な増加を実証した。これは、ＨＳＰ９０の１７ＡＡＧ媒介性の阻害が、ＥＲにおいて折り畳まれていないタンパク質負荷を増大し、それによって、ＥＲストレスを延長させ得ることを示唆している。
【０１８３】
ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧは、ＵＰＲのアポトーシス促進性の経路を活性化し、マウスおよびヒトの前立腺癌組織中のアポトーシスを誘発する：ＥＲストレスは、ＵＰＲの３つの群（ａｒｍｓ）を同時に活性化し、それによって、拮抗性の細胞保護的な及びアポトーシスのシグナルを同時に生成する。細胞の運命は、ＥＲストレスを低下させて、それによって、ＵＰＲを減弱する、そのタンパク質補正機構の能力に左右される。ＥＲストレスが持続する場合、細胞保護的な経路は、最終的に、細胞死を引き起こすＰＥＲＫ媒介性のアポトーシス経路の慢性の活性化で圧倒される（ｏｖｅｒｗｈｅｌｍｅｄ）。Ｔｈｒ９８０でのＰＥＲＫのリン酸化が、その活性化状態に対するマーカーとして働くため、１７ＡＡＧによる処置後に腫瘍組織におけるｐＰＥＲＫレベルの有意な増加を示したイムノブロット解析を実行した（図８のＡ）。リン酸化されたＰＥＲＫレベルは、未処置の腫瘍およびＬＯＦＵ処置した腫瘍中に存在しなかった。しかしながら、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用療法は、ＰＥＲＫリン酸化の最も高いレベルを示した（図８のＡ）。
【０１８４】
延長されたＰＥＲＫ活性化が、セリン５１で翻訳開始因子ｅＩＦ２ａのリン酸化を介するＥＲストレスに応じてタンパク質合成を減弱するため、リン酸化されたｅＩＦ２αのレベルを判定した。１７ＡＡＧによるＲＭ１腫瘍の処置は、未処置の対照における基礎レベルを超えるｅＩＦ２αのリン酸化を誘発した。ＬＯＦＵ処置は、結果として、リン酸化されたｅＩＦ２αレベルのわずかな低下をもたらした。しかしながら、リン酸化されたｅＩＦ２αの最も高いレベルが、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧによる併用療法を受けた腫瘍において見られ（図８のＢ）、これは、他の基と比較した、これらの腫瘍におけるＰＥＲＫリン酸化の最も高い活性化で確証している。
【０１８５】
リン酸化されたｅＩＦ２αは、生存促進および抗アポトーシスのタンパク質を含む、ほとんどの細胞タンパク質の翻訳を減少させるが、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）などの、アポトーシス促進遺伝子の転写を誘発する原因である転写因子、ＡＴＦ４の翻訳を増加させ、それによって、誤って折り畳まれたタンパク質が修復されずＥＲストレスが持続する場合にプログラム細胞死に対して細胞を調製する［７１］。予測通り、ＬＯＦＵ処置は、未処置の対照にわたってＣＨＯＰレベル（１．６±０．７倍）を誘発することに失敗した。対照的に、１７ＡＡＧ単独による処置は、１４．８±２倍までＣＨＯＰ転写レベルを誘発し、これはさらに、未処置の対照と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用療法の群において２５±１．３倍まで（ｐ＜０．００６）増加した（図８のＣ）。
【０１８６】
下流のアポトーシス遺伝子がＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用療法によるＣＨＯＰ誘発後に発現されたかどうかを検査するために、マウスのＵＰＲ ｑＲＴ−ＰＣＲ Ａｒｒａｙを、様々な処置群の腫瘍組織から単離された総ＲＮＡ上で使用した。Ｈｅａｔｍａｐ解析は、Ｂａｘ、Ｖｃｐ、Ｐｄｉａ３、Ａｒｍｅｔ、Ｄｄｉｔ３、Ｍａｐｋ８、Ｍａｐｋ９、およびＭａｐｋ１０などの、アポトーシス促進性の標的遺伝子が、未処置の対照と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧによる併用療法後に数倍誘発されたことを実証した（図８のＤ）。ＬＯＦＵ単独または１７ＡＡＧ単独による処置でアポトーシス促進性の遺伝子の最小の誘発が生じた。この結果は、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用療法が、ＰＥＲＫを活性化し、ＣＨＯＰを誘発し、およびＵＰＲのアポトーシス促進性の経路上で切り替わることを示す。実際には、ＴＵＮＥＬ染色は、ＬＯＦＵが未処置の対照にわたって最小のアポトーシスを誘発することを実証した。１７ＡＡＧによる処置は、前立腺腫瘍において有意なアポトーシスを誘発し、これは、ＬＯＦＵによってさらに増加された（ｐ＜０．００４）（図８のＥ）。したがって、ＨＳＰ９０の１７ＡＡＧ媒介性の阻害およびＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用によるＣＨＯＰの活性化は、前立腺腫瘍のアポトーシス細胞死上で切り替わった。ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧは、腫瘍細胞においてシャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）を阻害する。
【０１８７】
誤って折り畳まれたタンパク質の分解は、プロテオソーム経路およびオートファジーによって媒介される。オートファジーは、文脈依存的な役割において腫瘍形成プロセスに関係しており、ここで、それは、アミノ酸および他の必須栄養素を栄養不足である低酸素の腫瘍の代謝経路に提供するかもしれない［７２］。実際には、ＣＭＡ活性の増加は、種々様々なヒト腫瘍において見られ、ＣＭＡは腫瘍細胞の生存、増殖、および転移に関係している［７３］。それ故、オートファジーに関与する２つの重要なタンパク質、即ち、マクロオートファジーのマーカーであるベクリン、および様々な処置コホートの腫瘍組織におけるＣＭＡのマーカーであるＬＡＭＰ−２Ａリソソーム受容体のレベルを定量化した。図１０に示されるように、ベクリンのレベルは、ＬＯＦＵまたは１７ＡＡＧ、あるいは併用療法では変化しないままであり（図９のＡおよびＣ）、これは、マクロオートファジーが超音波療法で変更されなかったことを示している。しかしながら、ＬＯＦＵ単独または１７ＡＡＧ単独は、ＬＡＭＰ−２Ａの発現を誘発し（図９のＡおよびＢ）、これは、ＥＲにおいて誤って折り畳まれたタンパク質の負荷を増加させる治療後のＣＭＡの代償的増加を示している。興味深いことに、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの組み合わせは、これらの腫瘍中に見られた基礎レベルより下のＬＡＭＰ−２Ａのレベルを阻害した。これは、併用療法が、腫瘍細胞の増殖を低減し、ＣＭＡを抑制しながらＥＲストレスを増大させることによってアポトーシスを誘発することを示唆している。
【０１８８】
ＬＯＦＵは、ヒトおよびマウスの前立腺癌移植片を無毒な低用量の１７ＡＡＧに感作する：ＬＯＦＵ単独または低用量の１７ＡＡＧ（２５ｍｇ／ｋｇ体重）単独による処置は、正常組織の毒作用を示さなかったが、腫瘍増殖の阻害に失敗した。しかしながら、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用療法は、マウスＲＭ１腫瘍の増殖を低減した（図１０Ｂ）。平均の推測される腫瘍増殖は、対照群と比較して、ＬＯＦＵ、１７ＡＡＧおよびＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧコホートにおいて５％（ｐ＜０．０００１）、９％（ｐ＜０．０００１）、および１１％（ｐ＜０．０００１）遅い。対照、ＬＯＦＵ、およびＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧにおいて腫瘍サイズ２０００ｍｍ３を達成するまでの中位時間は、それぞれ、１８、２２、および４２日であった。１７ＡＡＧ群における動物はすべて、２６−３０日の時間間隔内でそのサイズを達成した。
【０１８９】
無毒な低用量の１７ＡＡＧ（体重の１４ｍｇ／ｋｇ）と一緒にＬＯＦＵを適用することで、ＢａｌｂＣｎｕ／ｎｕマウス中のヒトＰＣ３腫瘍において、類似した程度の化学増感が観察され、即時の有害な副作用なしで有意な腫瘍増殖遅滞（ｐ＜０．００７）が達成された（図５のＣ）。
【０１９０】
ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置は、腫瘍組織において前立腺癌幹細胞集団を減少させる：ＰＣ幹／前駆集団に対するＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ誘発性のＥＲストレスの効果を、ＰＣ幹／前駆細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析によって評価した［２４、２５］。細胞表面ＳＣＡ１（図１１のＡおよびＢ）（ｐ＜０．００４）、ＣＤ４４（図１１のＡおよびＣ）（ｐ＜０．００３）、ＣＤ１３３（図１１のＡおよびＤ）（ｐ＜０．００７）、およびα２β１インテグリン（ｐ＜０．００５）（図１１のＡおよびＥ）を発現する細胞のパーセンテージは、対照または単一処置のコホートと比較して、併用療法の群において有意に低下した。これらのすべてのマーカーの平均の蛍光強度（ＭＦＩ）は、すべての３つの群において変更されないままであった。幹細胞転写因子のｑＲＴ−ＰＣＲアレイは、ＴＩｘ３、Ｈｏｘａ１１、Ｐｃｎａ、Ｇｌｉ２、Ｒｕｎｘ１、Ｆｏｘａ２、Ｓｐ１、Ｔｂｘ５、Ｈｏｘａ１０、Ｎｆａｔｃ１、Ｇａｔａ６、およびＮｏｔｃｈ２のｍＲＮＡレベルの増加（＞２倍）を実証し（図１１のＦ）、これは、ＬＯＦＵがＰＣ幹細胞転写シグナル伝達を誘発することを示している。１７ＡＡＧによる処置はまた、ＬＯＦＵ処置した腫瘍中に存在するＦｏｘＰ１、Ｎｒｆ２ｆ、およびＰｏｕ５ｆ１などの、幾つかの転写因子ｍＲＮＡの発現を増大させた。しかしながら、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧにより処置した腫瘍は、これらの遺伝子の発現をダウンレギュレートし、これは、併用療法によるＥＲストレスの最大化が、腫瘍中のＰＣ幹／前駆細胞集団を減少させるかもしれないことを示唆している。
【０１９１】
＜議論＞
結果は、ＬＯＦＵと化学療法の併用療法が、腫瘍中のアポトーシス促進性の遺伝子の発現を再プログラムし、腫瘍異種移植片中の広範なアポトーシスを誘発し、結果として、マウスおよびヒトのＰＣ腫瘍の有意な腫瘍増殖遅滞をもたらすことを実証している。ＬＯＦＵの効果は化学療法に対する耐性を改善することができ、化学増感を達成することができる。
【０１９２】
＜方法および材料＞
＜動物＞
５〜６週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６（ＮＣＩ−Ｆｏｒｔ Ｄｉｅｔｒｉｃｈ， ＭＤ， ＵＳＡ）マウスおよび胸腺欠損ヌード（ＢａｌｂＣｎｕ／ｎｕマウス、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｙ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ， ＵＳＡ）マウスを、自由に維持し、すべての試験を、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅのガイドラインおよびプロトコルの下で実行した。
【０１９３】
＜腫瘍モデルおよび処置＞
Ｃ５７Ｂｌ／６およびＢａｌｂＣｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に、それぞれ、１×１０５ＲＭ−１（マウス前立腺癌細胞株）および１×１０６ＰＣ３（ヒト前立腺癌細胞株）の細胞を皮下注射した。およそ１０日後に、腫瘍が触知可能になる（直径３−５ｍｍ）と、ＬＯＦＵ処置を開始した。マウスを、処置を受けない群、ＬＯＦＵ、１７ＡＡＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）、および１７ＡＡＧ＋ＬＯＦＵを受ける群の４つの群（ｎ＝５／群）に分けた。触知可能な腫瘍を、２週間にわたって投与される５つの分画に対して３−４日ごとにＬＯＦＵにより処置した。動物は、この間に１７ＡＡＧを１週当たり３回受けた。腫瘍体積の測定を、全身毒性の徴候（倦怠感および下痢）の同時の物理的評価とともに、ノギスを使用して週２回実行した。
【０１９４】
＜ＬＯＦＵシステム＞
治療および画像化プローブシステム（ＴＩＰＳ， Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｂｒｉａｒｃｌｉｆｆ Ｍａｎｏｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）を、すべての超音波照射に対して利用した。該システムは、８要素の球殻環状アレイトランスデューサー（８−ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｓｈｅｌｌ ａｎｎｕｌａｒ ａｒｒａｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）（８０ｍｍの曲率半径、８０ｍｍの開口部）の他に、トランスデューサーの移動および正確な位置決めを可能にする移動ステージも含む。トランスデューサーは１．０ＭＨｚで操作され、結果として、直径およそ１．５ｍｍおよび長さ１２ｍｍ（−６ｄＢの圧力）の焦点がもたらされた［１２、１３］。
【０１９５】
＜ＬＯＦＵ処置プロトコル＞
処置日に、ケタミンおよびキシラジン（１００ｌ／マウスに対して７：１ｍｇ／ｍｌ、腹腔内（ｉ．ｐ．））で動物に麻酔をかけた。治療のために位置付けられると、腫瘍を脱気水および超音波ゲルを使用してＴＩＰＳシステムに音響的に結合した。
【０１９６】
超音波照射パラメーターは以下の通りであった：０．５ｄＢ ｃｍ−１ ＭＨｚ−１の減衰係数を想定して［７５］、組織中の３ｍｍの超音波処理深さで２７０Ｗ／ｃｍ２のおよそのインサイツでの空間ピークの時間平均密度（Ｉｓｐｔａ）をもたらす［７４］、３Ｗの音響パワーおよび１００％のデューティーサイクル。超音波照射を、全腫瘍体積にわたって伸長する２ｍｍのグリッドパターンを使用して、腫瘍に送達した。ＬＯＦＵ前に、腫瘍体積を、特定の処置に対するグリッドサイズを計算するために測定した。各グリッド点でのＬＯＦＵ照射の持続時間は、１．５秒であり、その後、トランスデューサーは次のグリッド点上に自動的に位置付けられ、全腫瘍体積が覆われるまで手順を繰り返した。これは、腫瘍への不均一なエネルギー送達をもたらした。
【０１９７】
＜インビトロでの温度上昇予測＞
侵襲性の手段による腫瘍内の温度の予測は、併用療法の治療効果を不必要に変調し得る。それ故、上に記載されたセットアップおよび治療プロトコルを使用して腫瘍内の温度上昇を予測するために、超音波照射を、組織模倣ファントム内の６ｍｍ×６ｍｍの領域内で実行し、［７６］そこに、Ｔ型熱電対（直径２００μｍ）を３ｍｍの深さで埋め込んだ。これらのインビトロでの照射を５回繰り返し、結果を平均した。
【０１９８】
＜インサイツでのアポトーシスの検出＞
アポトーシス細胞を、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ媒介性のジゴキシゲニン標識したｄＵＴＰニック末端標識）染色を行うことによってインサイツで検出した。簡潔には、パラフィン包埋の切片を、脱パラフィンし、段階的なアルコールによって再水和し、ＡｐｏｐＴａｇキット（Ｉｎｔｒｅｇｅｎ Ｃｏ， Ｎｏｒｃｒｏｓｓ， ＧＡ， ＵＳＡ）を使用して染色した。腫瘍細胞におけるアポトーシスの比率を、各々の高倍率視野におけるアポトーシス細胞のパーセントをカウントすることによって定量化した。
【０１９９】
＜イムノブロット解析＞
ＬＯＦＵの２４時間後に、腫瘍細胞を採取し、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、ＴＰＥＲ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， ＵＳＡ）を使用して溶解した。細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにさらし、フッ化ポリビニリデン膜に移し、ＰＥＲＫ、ｐＰＥＲＫ、ｅＩＦ２、ｐｅＩＦ２、ＥＲｐ７２、ＥＲｐ４４、ＥＲｐ５７、ベクリン（細胞シグナル伝達、Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ， ＵＳＡ）、Ｌａｍｐ２ａ（Ａｂｃａｍ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ， ＵＳＡ）に対する一次抗体、および西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体でイムノブロットした。ブロットを、ＥＣＬキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ， ＵＳＡ）を使用して発展させた。各ブロットの免疫反応性バンドのデンシトメトリー分析を撮影し、その後、画像をデジタル化し、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用することによって分析した。
【０２００】
ＵＰＲ標的遺伝子のリアルタイムＰＣＲ解析。ＬＯＦＵ処置の２４時間後に、ＲＭ１腫瘍細胞を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ， ＵＳＡ）から１％のβメルカプトエタノールと混合されたＲＬＴ緩衝液を使用して溶解した。
【０２０１】
オンカラムＤＮＡ消化を有するＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉキットのためのＱｉａｇｅｎのプロトコルを使用して、腫瘍溶解物からＲＮＡを単離した。ＲＮＡサンプルを、さらなる使用前に−８０℃で保存した。単離したＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ， ＵＳＡ）を使用して、ｃＤＮＡ合成にさらした。ＸＢＰ１ ＲＮＡのスプライシングを、以下のプライマー対５’−ＡＣＴＣＧＧＴＣＴＧＧＡＡＡＴＣＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）および５’−ＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＧＴＣＴＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）を使用して検出した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ， ＰＡ， ＵＳＡ）［７７］。リアルタイムＰＣＲを、標準のＡＢｇｅｎｅプロトコルに従って、Ａｂｓｏｌｕｔｅ ＱＰＣＲ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ （ＡＢｇｅｎｅ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）を使用して、Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）において実行した。プライマー増幅の特異性を確認するために、ＰＣＲの終わりに融解曲線を生成し、同じプライマー対を含有している異なるサンプルは、一致するアンプリコン融解温度を示した。
【０２０２】
リアルタイムＰＣＲのために使用されるプライマーは、ＧＲＰ７８ ５’ＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＣ  ＴＧＧＡＴＡＡＧＡＧＧＧ３を’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）および５’ＴＧＴＡＣＣＣＴＴＧＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）；ＥＤＥＭ’５ ＴＣＡＴＣＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣ’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）３および５’ＴＴＧＡＣＡＴＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を含んだ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ｑＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ実験をすべて、３回繰り返した。アポトーシス遺伝子および幹細胞転写因子に対するｑＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲアレイを、製造業者のプロトコルに従って、ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＰＣＲアレイシステム（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ， ＵＳＡ）によって実行した。要するに、ＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、精製された総ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、その後、ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰＣＲアレイキットを使用して、ＰＣＲアレイを実行した。ＳＡ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのウェブベースのＰＣＲアレイデータ解析ソフトウェアによって、データを解析した。
【０２０３】
＜フローサイトメトリー解析＞
様々なコホートにおいて、ＬＯＦＵ、１７ＡＡＧ、およびＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧにより、側腹部腫瘍を処置した。処置の２４時間後に、腫瘍細胞を、コラゲナーゼ消化によって分離し、前立腺癌幹細胞マーカー、ＳＣＡ１、ＣＤ４４、およびＣＤ１３３の発現のためにフローサイトメトリーによって分析した。単離した腫瘍細胞を、ＦＩＴＣと抱合した抗ＳＣＡ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅと抱合した抗ＣＤ１３３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）、およびＰＥと抱合した抗ＣＤ４４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）で染色した。ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、データ取得を実行し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ．７．１（Ｔｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ， ＵＳＡ）ソフトウェアによって分析した。
【０２０４】
＜カプラン・マイヤー法＞
異なる処置群におけるマウス生存／死亡率を、Ｓｉｇｍａ−ＰｌｏｔおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ ｆｏｒ ＯＳ Ｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）ソフトウェアを使用して放射線量に応じたカプラン・マイヤー法によって分析した。
【０２０５】
＜統計分析＞
デジタル画像に関して、サンプリング領域を、データ定量化のためのデジタル取得に対してランダムに選択した。デジタル画像データを、あらゆる処置に関して盲検方法で評価した。両側スチューデントｔ検定を使用して、代表的な平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を有する実験コホート間の有意差（ｐ＜０．０５）を判定した。
【０２０６】
図１２は、本発明の典型的な実施形態による、参照符号（１）によって全般的に指定された、超音波刺激療法（ＡＰＴ）装置を示す。ＡＰＴ装置（１）は、電源（図示せず）によって動力を供給され、制御システム（１０）、増幅器（１２）、整合変成器（１４）およびトランスデューサー（１６）を含む。処置を提供するために、超音波トランスデューサー（１６）は、患者の身体（１０００） の領域の近く又はその領域内に位置付けられ得る。臨床医は、制御システム（１０）で関数発生器を使用してトランスデューサー（１６）によって送達される超音波パルスの周波数および持続時間に対する適切な調節を行ってもよい。超音波トランスデューサー（１６）が励起されるときに、トランスデューサー素子の伝達面は、超音波トランスデューサー（１６）を囲む体液中に圧力波を生成する。圧力波は、その後、患者の身体（１０００） 内の流体および組織に伝播し、最終的に標的部位に達して、それによって、標的組織に対する非切除性の音波ストレスを引き起こす。本明細書でさらに詳細に説明されるように、組織に送達された音波ストレスは、多くの治療用途を有し得、癌治療の場合には、例えば、腫瘍中の癌細胞のそのようなストレスは、結果として免疫原性の調節、放射線増感および化学増感につながり得る。超音波トランスデューサー（１６）は、さらなる処置のために患者の身体の隣接領域に再配置されてもよい。
【０２０７】
整合変成器（１４）は、電源と超音波トランスデューサーとの間にインピーダンス変換を提供する。
【０２０８】
増幅器（１２）は、制御システム（１０）の出力信号に基づいてトランスデューサー（１６）を駆動させるためのトランスデューサー駆動信号を生成する。典型的な実施形態では、増幅器（１２）は、スイッチド共振型電力増幅器（ｓｗｉｔｃｈｅｄ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｐｏｗｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）であり得、その一例は、米国特許第７，３９６，３３６号に開示され、その内容は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、低インピーダンス超音波駆動トランスデューサーシステムが使用され得る［７８］。
【０２０９】
トランスデューサー（１６）は、処置領域において１０〜１０００Ｗ／ｃｍ２の空間ピーク時間平均密度（Ｉｓｐｔａ）の間の音響パワーを生成する。超音波は、０．５秒から５秒までの範囲内の時間の間継続的に適用され、ここで周波数は０．０１〜１０ＭＨｚの範囲内にある。幾つかの実施形態では、処置領域における超音波ビームの最小径は、約１ｃｍである。
【０２１０】
図１２に示される実施形態では、ＡＰＴ装置１によって生成された超音波の周波数は、約１０ｋＨｚから約３００ｋＨｚまでの範囲内にある。しかしながら、本発明によるＡＰＴ装置は、例えば、約３００ｋＨｚから約３ＭＨｚまでの範囲内の周波数などの、より高い周波数を生成し得る。図１３において示されるように、参照符号（１００）によって全般的に指定された、そのようなＡＰＴ装置の一実施形態は、制御システム（１１０）、増幅器（１１２）、整合変成器（１４）、およびトランスデューサー（１１６）を含み得、そのような構成要素は、図１２に関連して記載された機能および構造と同じ機能および構造を有する。実施形態では、トランスデューサー（１１６）は、別のタイプのエネルギーを音響エネルギーに変換する単一または複数の要素で構成された平面または凹面のピストン式トランスデューサーであってもよい。
【０２１１】
図１４に示されるように、ＡＰＴ装置（１）およびＡＰＴ装置（１００）は、参照符号（２００）によって全般的に指定された単一のシステムへと統合されて、効果の改善及び／又はより低い全体的なエネルギー入力をもたらし得る。総合システム（２００）は、ＡＰＴ処置のための焦点式低周波および平行にされた（ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ）高周波ビームを提供する。幾つかの実施形態では、低周波超音波は、与えられた周波数または周波数の範囲を達成可能であるものに従って実質的に集中され、中間周波数が平行にされる。幾つかの実施形態では、低周波数を生成するために使用されるトランスデューサーは凹面であり、中間周波数を生成するために使用されるトランスデューサーは平面である。
【０２１２】
図１５−１７に示されるように、ＡＰＴ装置（１）、（１００）、（２００）は、参照符号（３００）によって全般的に指定された超音波モニタリングシステムと協働し得る。超音波モニタリングシステム（３００）は、電源（図示せず）によって動力を供給され得、制御システム（３１０）、増幅器（３１２）およびパルス受信システム（３１４）を含む。超音波モニタリングシステム（３００）は、ＡＰＴ処置の前、間、及び／又は後に標的組織をモニタリングする及び／又は標的組織の画像化を提供するために使用され得、特に、パルス受信システム（３１４）は、標的組織内から反射された、あるいは標的組織によって又は標的組織内から生成された圧力波を受信するトランスデューサーを含み得、および増幅器（３１２）は、受信した圧力波に対応する電気信号を生成する。制御システム（３１０）は、処置状態及び／又は他のパラメーターを判定するために臨床医によって使用され得る電気信号に基づいて出力を生成する。超音波モニタリングシステム（３００）は、ＡＰＴ装置（１）、（１００）、（２００）とは別の構成要素として示されるが、モニタリングおよびＡＰＴ送達が、ユニタリシステムによって実行され得ることが認識されるべきである。
【０２１３】
幾つかの実施形態では、超音波モニタリングシステム（３００）は、処置される組織の場所についての情報を提供するために使用される。１つ以上の非治療的な超音波送信および受信のサブシステムが、ＡＰＴ処置および組織に対する処置の効果をモニタリングするために使用されてもよい。
【０２１４】
幾つかの実施形態では、放射線治療を計画するために収集される及び使用されるデータも、超音波処置を計画するために少なくとも部分的に使用される。
【０２１５】
幾つかの実施形態では、ＡＰＴ処置の計画またはＡＰＴ処置のために収集されたデータは、放射線治療の計画に使用される。幾つかの実施形態では、放射線治療の計画のために収集されたデータは、ＡＰＴ処置の計画のために使用される。幾つかの実施形態では、ＡＰＴ処置の間に収集されたデータは、放射線治療の計画に使用される。
【０２１６】
幾つかの実施形態では、より高い周波数で実行される超音波画像化によって部分的に特定された特定の場所を処置するために、超音波がより低い周波数で適用される。
【０２１７】
ＡＰＴ処置の間に組織中のパワー付与をモニタリングするために、様々な超音波ベースの画像化およびモニタリングのモダリティが使用されてもよい。幾つかの実施形態では、組織温度は、音響手段によってモニタリングされ得る［７９］。
【０２１８】
幾つかの実施形態では、処置をモニタリングするために、超音波エラストグラフィーが使用される。幾つかの実施形態では、処置をモニタリングするために、ハーモニック画像化が使用される。幾つかの実施形態では、熱ひずみが測定される。幾つかの実施形態では、システムは、組織のひずみ（ｓｔｒａｉｎ）を測定するために使用される、１つ以上の超音波送信および受信のトランスデューサーサブシステムで構成される。処置用の超音波ビームを望ましい組織に向けるために、および幾つかの実施形態において処置用のトランスデューサーに十分な処置パワーを適用する前に、組織のひずみ情報が使用されてもよい。例えば、一実施形態では、パワーが、意図された処置パワーの１０〜５０％で処置用のトランスデューサーの１つ以上に適用され、標的組織のひずみが超音波フィードバックを使用して測定される。ＡＰＴトランスデューサーが、ひずみの画像化に基づいて標的組織に物理的にまたは電子的に再配置され得るか、またはそれに有効に配向され得る。幾つかの実施形態では、全出力が１つ以上のトランスデューサーから適用されるが、その時間は、望ましい標的化が確認されるまでのひずみの測定期間の間の治療効果に対して使用される時間よりも短い。
【０２１９】
幾つかの実施形態では、処置をモニタリングするために、検温が使用される。
【０２２０】
ＡＰＴシステム（１）、（１００）、（２００）の各トランスデューサーは、単一のトランスデューサーまたは一連の複数のトランスデューサーであってもよい。図１８は、本発明の典型的な実施形態による、参照符号（４００）によって全般的に指定されたトランスデューサーの斜視図である。トランスデューサー（４００）は、一連のトランスデューサー素子（４０２）を含む。あらゆる数のトランスデューサー素子（４０２）が、方位軸に沿って連続して配されてもよい。トランスデューサー素子（４０２）は、バッキングブロック（ｂａｃｋｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）（４０４）上で支持される。信号リードは、周知のように、各トランスデューサー素子（４０２）の電極と連結し、回路網を送受信する。トランスデューサー素子（４０２）は、送信回路網によって提供された電気信号を圧力波に変換する。
【０２２１】
幾つかの中間周波数の実施形態（約３００ｋＨｚ〜約３ＭＨｚ）において、２つ以上の超音波トランスデューサーは、本明細書では交差ゾーンとして示される処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成し、各ビームは、１０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲内で交差ゾーン中にＩｓｐｔａを有している。実施形態では、２つのトランスデューサーは、処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成し、各ビームは、５０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲内で交差ゾーン中にＩｓｐｔａを有している。実施形態では、３つのトランスデューサーは、処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成し、各ビームは、５０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲内で交差ゾーン中にＩｓｐｔａを有している。
【０２２２】
幾つかの実施形態では、複数のビームが、互いに実質的に同位相である。幾つかの実施形態では、別の超音波トランスデューサーから放射される２つの超音波ビームは、実質的に同位相であり、処置ゾーン内で交差し、および各ビームは、７０〜１００Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーン中に音響パワーの空間ピーク密度を有し、超音波は継続的に１〜５秒適用される。幾つかの実施形態では、別の超音波トランスデューサーから放射される３つの超音波ビームは、実質的に同じ周波数および同位相であり、処置ゾーン内で交差し、および各ビームは、５０〜７０Ｗ／ｃｍ２の範囲で交差ゾーン中に音響パワーの空間ピーク密度を有し、超音波は継続的に１〜５秒適用される。
【０２２３】
幾つかの実施形態では、別のトランスデューサーまたはトランスデューサー素子から生じるビームはそれぞれ、処置ゾーン中でおよそ３００Ｗ／ｃｍ２のＩｓｐｔａを生成する。
【０２２４】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つのトランスデューサーの直径、およびこのトランスデューサーから放射される超音波ビームは、処置ゾーンより実質的に大きい。より小さなトランスデューサーと組み合わせた、そのような大きなトランスデューサーの１つ以上の使用は、有効な且つより速い処置を達成しながら、それほど正確でない高パワーの、大量のビームの照準を好都合に可能にする。
【０２２５】
幾つかの実施形態では、２つ以上のビームが互いに交差する、集中処置ゾーンが形成され、集中処置ゾーンは、送信されたエネルギーの方向に垂直に約１ｃｍ以上であり、送信された方向に平行に約１ｃｍ以上である。
【０２２６】
幾つかの実施形態では、各トランスデューサーから処置ゾーンに適用された音圧は、０．１〜１０ＭＰａである。
【０２２７】
幾つかの実施形態では、集中超音波処置ゾーンを提供するトランスデューサーの数は、１から１０００の間である。
【０２２８】
幾つかの実施形態では、１つ以上の中央周波数が、約１００ｋＨｚから２０ＭＨｚに範囲の中央周波数による処置の間に利用される。
【０２２９】
幾つかの実施形態では、与えられたトランスデューサーからの超音波は、継続的に適用される。幾つかの実施形態では、与えられたトランスデューサーから放射される超音波は、デューティーサイクルとして知られているオン時間単位およびオフ時間単位を繰り返すパルスで適用される。デューティーサイクルは、１オン時間単位からタイムユニットから９オフ時間単位までの範囲であり得る。
【０２３０】
幾つかの実施形態では、トランスデューサーは、単一周波音または多周波数チャープを送信する。
【０２３１】
幾つかの実施形態では、トランスデューサーは、適用の全経過の間に標的組織に送達された総エネルギーが、周囲の組織に対する総エネルギーより大きいように、連続して操作される。
【０２３２】
幾つかの実施形態では、周波数は適用中に掃引され、部分的にトランスデューサーの近くのゾーンに不必要に高密度のゾーンを減少させる。
【０２３３】
幾つかの実施形態では、治療ヘッド（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｈｅａｄ）を含むトランスデューサーは、機械的に振動させられる。
【０２３４】
幾つかの実施形態では、トランスデューサーは、二次元フェーズドアレイ、環状アレイ及び／又は三次元フェーズドアレイで構成される。
【０２３５】
幾つかの実施形態では、１つ以上の超音波トランスデューサーは、１つ以上の内視鏡装置に組み込まれる。
【０２３６】
本明細書に開示されたＡＰＴ処置システムは、体温上昇およびアブレーション熱の（ａｂｌａｔｉｖｅ ｔｈｅｒｍａｌ）治療に共通の熱の投与スキームと比較して、温熱量が少ない。幾つかの実施形態では、処置ゾーン中で達した最高温度は、約２秒以下続く処置の間に４５℃である。
【０２３７】
温熱量を考慮すると、治療効果が熱的機構によって得られることが予期される。理論によって縛られたくないが、熱効果と結び付けられた機械的効果は、開示された装置、システムおよび方法を使用して、処置の効果の観察を部分的に説明し得る。
【０２３８】
幾つかの実施形態では、接触媒質が、トランスデューサーと患者の身体との間で使用されて、超音波が効率的に送信され、幾つかの実施形態では、トランスデューサーと処置ゾーンとの間の望ましい距離が提供される。幾つかの実施形態では、接触媒質は循環されて、処置の間にトランスデューサーまたは患者の身体を冷却するか、またはその両方を冷却する。超音波を送信する、間隔を提供する、および患者およびシステムコンポーネントを冷却する目的のために、別の流体が使用されてもよい。
【０２３９】
理論によって縛られないが、本明細書に記載されるシステムを使用するＡＰＴ処置は、細胞間、および細胞とマトリックスタンパク質との間の相互作用を促進することができる。癌細胞と免疫細胞との間の相互作用および免疫細胞間、例えばＴ細胞とＤＣとの間の相互作用。
【０２４０】
幾つかの実施形態では、ＡＰＴ処置は、タンパク質複合体、例えばタンパク質フォールディングの複合体を破壊し得る。
【０２４１】
複数のモダリティによる処置から恩恵を得る疾患、標的とされた処置ゾーン全体の浸透およびこれらのゾーン内の病変を有する患者のために、各モダリティの適用および短期間の処置の緩和が望まれる。
【０２４２】
本発明の典型的な実施形態によるＡＰＴ処置装置およびＡＰＴ処置モダリティの様々な他の態様はが、ここで記載される：
【０２４３】
＜位置決め装置＞
幾つかの実施形態では、トランスデューサーアプリケーターは、臨床医または介護者によって携帯され得るように設計されている。幾つかの実施形態では、アプリケーターは、図１９に例証される位置決め装置（５００）などの、機械的位置決め装置に取り付けられる。位置決め装置（５００）は、手動で操作されるか、またはロボット制御され得る。本実施形態では、位置決め装置（５００）は、トランスデューサーが移動する円弧状のレールであり、特に、トランスデューサーは、順にレールに載せられるケーブル駆動の運び台に取り付けられてもよい。トランスデューサーが三次元で位置決めされ得るように、レール自体は回転可能であってもよい。位置決め装置（５００）は、トランスデューサーの下に及びその目標範囲内に患者が適合することができるように十分に大きくあり得る。図１９は、レール上に位置決めされた１つのトランスデューサーのみを示すが、１つを超えるトランスデューサーがレール上に配されること、及び／又は１つ以上の他のトランスデューサーを支持する他のレールが設けられてもよいことが認識されるべきである。幾つかの実施形態では、時にヘキサポッドと呼ばれる、スチュワートプラットホームが、位置決め装置において使用されてもよい。処置パラメーターを設定し、位置決め装置を操作するために、コンピュータープログラミングが使用されてもよい。
【０２４４】
＜機器および患者の冷却＞
幾つかの実施形態では、処置システムは、超音波エネルギーまたは他のエネルギーに暴露された皮膚を冷却するための患者冷却機構を含む。
【０２４５】
＜引用文献＞
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５． Ｇｅｒｌｉｎｉ， Ｇ．， Ｔｕｎ−Ｋｙｉ， Ａ．， Ｄｕｄｌｉ， Ｃ．， Ｂｕｒｇ， Ｇ．， Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉ， Ｎ．， ａｎｄ Ｎｅｓｔｌｅ， Ｆ．Ｏ． ２００４． Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＩＬ−１０ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＣＤ１ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｌｅｓｉｏｎｓ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６５：１８５３−１８６３．
６． Ｔｕｒｋ， Ｍ．Ｊ．， Ｇｕｅｖａｒａ−Ｐａｔｉｎｏ， Ｊ．Ａ．， Ｒｉｚｚｕｔｏ， Ｇ．Ａ．， Ｅｎｇｅｌｈｏｒｎ， Ｍ．Ｅ．， Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， Ｓ．， ａｎｄ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ａ．Ｎ． ２００４． Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ａ ｐｏｏｒｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｓ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００：７７１−７８２． 
７． Ｈｕａｎｇ， Ｂ．， Ｐａｎ， Ｐ．Ｙ．， Ｌｉ， Ｑ．， Ｓａｔｏ， Ａ．Ｉ．， Ｌｅｖｙ， Ｄ．Ｅ．， Ｂｒｏｍｂｅｒｇ， Ｊ．， Ｄｉｖｉｎｏ， Ｃ．Ｍ．， ａｎｄ Ｃｈｅｎ， Ｓ．Ｈ． ２００６． Ｇｒ−１＋ＣＤ１１５＋ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｎｅｒｇｙ ｉｎ ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ ｈｏｓｔ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：１１２３−１１３１． 
８． Ｓｉｃａ， Ａ．， ａｎｄ Ｂｒｏｎｔｅ， Ｖ． ２００７． Ａｌｔｅｒｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：１１５５−１１６６． 
９． Ｃｕｒｉｅｌ， Ｔ．Ｊ．， Ｃｏｕｋｏｓ， Ｇ．， Ｚｏｕ， Ｌ．， Ａｌｖａｒｅｚ， Ｘ．， Ｃｈｅｎｇ， Ｐ．， Ｍｏｔｔｒａｍ， Ｐ．， Ｅｖｄｅｍｏｎ−Ｈｏｇａｎ， Ｍ．， Ｃｏｎｅｊｏ−Ｇａｒｃｉａ， Ｊ．Ｒ．， Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｂｕｒｏｗ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． ２００４． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｆｏｓｔｅｒｓ ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：９４２−９４９． 
１０． ｖａｎ Ｅｌｓａｓ， Ａ．， Ｈｕｒｗｉｔｚ， Ａ．Ａ．， ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ， Ｊ．Ｐ． １９９９． Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉ−ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ４ （ＣＴＬＡ−４） ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ （ＧＭ−ＣＳＦ）−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｅｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９０：３５５−３６６．
１１． Ｐｈａｎ， Ｇ．Ｑ．， Ｙａｎｇ， Ｊ．Ｃ．， Ｓｈｅｒｒｙ， Ｒ．Ｍ．， Ｈｗｕ， Ｐ．， Ｔｏｐａｌｉａｎ， Ｓ．Ｌ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｔｒｕｂｅｒ， Ｄ．Ｊ．， Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎ．Ｐ．， Ｈａｗｏｒｔｈ， Ｌ．Ｒ．， Ｓｅｉｐｐ， Ｃ．Ａ．， Ｆｒｅｅｚｅｒ， Ｌ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． ２００３． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：８３７２−８３７７． 
１２． Ｄｏｎｇ， Ｈ．， Ｓｔｒｏｍｅ， Ｓ．Ｅ．， Ｓａｌｏｍａｏ， Ｄ．Ｒ．， Ｔａｍｕｒａ， Ｈ．， Ｈｉｒａｎｏ， Ｆ．， Ｆｌｉｅｓ， Ｄ．Ｂ．， Ｒｏｃｈｅ， Ｐ．Ｃ．， Ｌｕ， Ｊ．， Ｚｈｕ， Ｇ．， Ｔａｍａｄａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． ２００２． Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｂ７−Ｈ１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ８：７９３−８００． 
１３． Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ， Ｎ．， Ａｌｖａｒｅｚ， Ｍ．， Ｚｗｉｒｎｅｒ， Ｎ．Ｗ．， Ｔｏｓｃａｎｏ， Ｍ．Ａ．， Ｉｌａｒｒｅｇｕｉ， Ｊ．Ｍ．， Ｂｒａｖｏ， Ａ．， Ｍｏｒｄｏｈ， Ｊ．， Ｆａｉｎｂｏｉｍ， Ｌ．， Ｐｏｄｈａｊｃｅｒ， Ｏ．Ｌ．， ａｎｄ Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ， Ｇ．Ａ． ２００４． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌｅｃｔｉｎ−１ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｈｅｉｇｈｔｅｎｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ； Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：２４１−２５１． 
１４． Ｔｒｏｙ， Ａ．Ｊ．， Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｋ．Ｌ．， Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｐ．Ｊ．， Ａｔｋｉｎｓｏｎ， Ｃ．Ｈ．， ａｎｄ Ｈａｒｔ， Ｄ．Ｎ． １９９８． Ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４：５８５−５９３． 
１５． Ｓｔａｖｅｌｅｙ−Ｏ'Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｋ．， Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ， Ｅ．， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ， Ｊ．， Ｂｏｒｒｅｌｌｏ， Ｉ．， Ｈｗａｎｇ， Ｌ．， Ｆｅｉｎ， Ｓ．， Ｐａｒｄｏｌｌ， Ｄ．， ａｎｄ Ｌｅｖｉｔｓｋｙ， Ｈ． １９９８． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｅｒｇｙ： Ａｎ ｅａｒｌｙ ｅｖｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５：１１７８−１１８３．
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１７． Ｏｖｅｒｗｉｊｋ， Ｗ．Ｗ．， Ｔｈｅｏｒｅｔ， Ｍ．Ｒ．， Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ， Ｓ．Ｅ．， Ｓｕｒｍａｎ， Ｄ．Ｒ．， ｄｅ Ｊｏｎｇ， Ｌ．Ａ．， Ｖｙｔｈ−Ｄｒｅｅｓｅ， Ｆ．Ａ．， Ｄｅｌｌｅｍｉｊｎ， Ｔ．Ａ．， Ａｎｔｏｎｙ， Ｐ．Ａ．， Ｓｐｉｅｓｓ， Ｐ．Ｊ．， Ｐａｌｍｅｒ， Ｄ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． ２００３． Ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：５６９−５８０． 
１８． Ｃｕｅｎｃａ， Ａ．， Ｃｈｅｎｇ， Ｆ．， Ｗａｎｇ， Ｈ．， Ｂｒａｙｅｒ， Ｊ．， Ｈｏｒｎａ， Ｐ．， Ｇｕ， Ｌ．， Ｂｉｅｎ， Ｈ．， Ｂｏｒｒｅｌｌｏ， Ｉ．Ｍ．， Ｌｅｖｉｔｓｋｙ， Ｈ．Ｉ．， ａｎｄ Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ， Ｅ．Ｍ． ２００３． Ｅｘｔｒａ−ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｓ ｎｏｔ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｉｇｎｏｒｅｄ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｎｅｒｇｙ： ｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｒｏｓｓ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：９００７−９０１５． 
１９． Ｚｈｅｎｇ， Ｙ．， Ｚｈａ， Ｙ．， Ｄｒｉｅｓｓｅｎｓ， Ｇ．， Ｌｏｃｋｅ， Ｆ．， ａｎｄ Ｇａｊｅｗｓｋｉ， Ｔ．Ｆ． ２０１２． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅ ２ （Ｅｇｒ２） ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｅｒｇｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０９：２１５７−２１６３．
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３３． Ｃａｓｔｅｌｌｉ， Ｃ．， Ｃｉｕｐｉｔｕ， Ａ．Ｍ．， Ｒｉｎｉ， Ｆ．， Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ， Ｌ．， Ｍａｚｚｏｃｃｈｉ， Ａ．， Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ， Ｒ．， ａｎｄ Ｐａｒｍｉａｎｉ， Ｇ． ２００１． Ｈｕｍａｎ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅ ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：２２２−２２７． 
３４． Ｈａｕｇ， Ｍ．， Ｄａｎｎｅｃｋｅｒ， Ｌ．， Ｓｃｈｅｐｐ， Ｃ．Ｐ．， Ｋｗｏｋ， Ｗ．Ｗ．， Ｗｅｒｎｅｔ， Ｄ．， Ｂｕｃｋｎｅｒ， Ｊ．Ｈ．， Ｋａｌｂａｃｈｅｒ， Ｈ．， Ｄａｎｎｅｃｋｅｒ， Ｇ．Ｅ．， ａｎｄ Ｈｏｌｚｅｒ， Ｕ． ２００５． Ｔｈｅ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｓｐ７０ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３５：３１６３−３１７２． 
３５． Ｐａｗａｒｉａ， Ｓ．， ａｎｄ Ｂｉｎｄｅｒ， Ｒ．Ｊ． ２０１１． ＣＤ９１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２：５２１．
３６． Ｇａｊｅｗｓｋｉ， Ｔ．Ｆ．， Ｗｏｏ， Ｓ．Ｒ．， Ｚｈａ， Ｙ．， Ｓｐａａｐｅｎ， Ｒ．， Ｚｈｅｎｇ， Ｙ．， Ｃｏｒｒａｌｅｓ， Ｌ．， ａｎｄ Ｓｐｒａｎｇｅｒ， Ｓ． ２０１３． Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：２６８−２７６． 
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４０． Ｇｒｅｅｎ， Ｄ．Ｒ．， Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｔ．， Ｚｉｔｖｏｇｅｌ， Ｌ．， ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ， Ｇ． ２００９． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：３５３−３６３．
４１． Ｌｅｅ， Ｐ．Ｐ．， Ｙｅｅ， Ｃ．， Ｓａｖａｇｅ， Ｐ．Ａ．， Ｆｏｎｇ， Ｌ．， Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ， Ｄ．， Ｗｅｂｅｒ， Ｊ．Ｓ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｄ．， Ｓｗｅｔｔｅｒ， Ｓ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．， Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｐ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ５：６７７−６８５． 
４２． Ｖａｌｄｏｒ， Ｒ．， ａｎｄ Ｍａｃｉａｎ， Ｆ． ２０１３． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｅｒｇｉｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：３１３−３２０． 
４３． Ｍａｃｉａｎ， Ｆ．， Ｇａｒｃｉａ−Ｃｏｚａｒ， Ｆ．， Ｉｍ， Ｓ．Ｈ．， Ｈｏｒｔｏｎ， Ｈ．Ｆ．， Ｂｙｒｎｅ， Ｍ．Ｃ．， ａｎｄ Ｒａｏ， Ａ． ２００２． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ． Ｃｅｌｌ １０９：７１９−７３１． 
４４． Ｓａｆｆｏｒｄ， Ｍ．， Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｓ．， Ｌｕｔｚ， Ｍ．Ａ．， Ａｌｌｅｎ， Ａ．， Ｈｕａｎｇ， Ｃ．Ｔ．， Ｋｏｗａｌｓｋｉ， Ｊ．， Ｂｌａｃｋｆｏｒｄ， Ａ．， Ｈｏｒｔｏｎ， Ｍ．Ｒ．， Ｄｒａｋｅ， Ｃ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｒ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ． ２００５． Ｅｇｒ−２ ａｎｄ Ｅｇｒ−３ ａｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：４７２−４８０． 
４５． Ｓｏｔｏ−Ｎｉｅｖｅｓ， Ｎ．， Ｐｕｇａ， Ｉ．， Ａｂｅ， Ｂ．Ｔ．， Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ， Ｓ．， Ｂａｉｎｅ， Ｉ．， Ｒａｏ， Ａ．， ａｎｄ Ｍａｃｉａｎ， Ｆ． ２００９． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＮＦＡＴ ｄｉｍｅｒｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０６：８６７−８７６．
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４７． Ｍａｒａｎｇｏｎｉ， Ｆ．， Ｍｕｒｏｏｋａ， Ｔ．Ｔ．， Ｍａｎｚｏ， Ｔ．， Ｋｉｍ， Ｅ．Ｙ．， Ｃａｒｒｉｚｏｓａ， Ｅ．， Ｅｌｐｅｋ， Ｎ．Ｍ．， ａｎｄ Ｍｅｍｐｅｌ， Ｔ．Ｒ． ２０１３． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＮＦＡＴ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｓｉｇｎａｌ ｍｅｍｏｒｙ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｒｉａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３８：２３７−２４９． 
４８． Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｐ． ２００２． Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ： ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：３９５−４２５． 
４９． Ｕｄｏｎｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｐ．Ｋ． １９９３． Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：１３９１−１３９６． 
５０． Ｕｄｏｎｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｐ．Ｋ． １９９４． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｇｐ９６， ｈｓｐ９０， ａｎｄ ｈｓｐ７０． Ｊ Ｉｍｕｎｏｌ １５２：５３９８−５４０３．
５１． Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ｓ．Ｊ．， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｅ．Ａ．， Ｌａｗ， Ｌ．Ｗ．， Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ， Ｍ．， ａｎｄ Ａｐｐｅｌｌａ， Ｅ． １９８６． Ａ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ａ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８３：３１２１−３１２５． 
５２． Ｓｏｍｅｒｓａｎ， Ｓ．， Ｌａｒｓｓｏｎ， Ｍ．， Ｆｏｎｔｅｎｅａｕ， Ｊ．Ｆ．， Ｂａｓｕ， Ｓ．， Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｐ．， ａｎｄ Ｂｈａｒｄｗａｊ， Ｎ． ２００１． Ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓａｔｅｓ ａｒｅ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：４８４４−４８５２． 
５３． Ｌｉｕ， Ｂ．， ＤｅＦｉｌｉｐｐｏ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｌｉ， Ｚ． ２００２． Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ｂｙ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：１１４７−１１５１． 
５４． Ｃｈｅｎ， Ｘ．， Ｔａｏ， Ｑ．， Ｙｕ， Ｈ．， Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， ａｎｄ Ｃａｏ， Ｘ． ２００２． Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｅｌｉｃｉｔｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８４：８１−８７． 
５５． Ｖｅｇａ， Ｖ．Ｌ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｓｉｌｖａ， Ｍ．， Ｆｒｅｙ， Ｔ．， Ｇｅｈｒｍａｎｎ， Ｍ．， Ｄｉａｚ， Ｊ．Ｃ．， Ｓｔｅｉｎｅｍ， Ｃ．， Ｍｕｌｔｈｏｆｆ， Ｇ．， Ａｒｉｓｐｅ， Ｎ．， ａｎｄ Ｄｅ Ｍａｉｏ， Ａ． ２００８． Ｈｓｐ７０ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｆｔｅｒ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｏｒｍ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０：４２９９−４３０７．
５６． Ｂａｓｕ， Ｓ．， Ｂｉｎｄｅｒ， Ｒ．Ｊ．， Ｓｕｔｏ， Ｒ．， Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｋ．Ｍ．， ａｎｄ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｐ．Ｋ． ２０００． Ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｂｕｔ ｎｏｔ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｗｈｉｃｈ ｄｅｌｉｖｅｒ ａ ｐａｒｔｉａｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ｐａｔｈｗａｙ． Ｉｎｔ ｉｍｍｕｎｏｌ １２：１５３９−１５４６． 
５７． Ｏｂｅｉｄ， Ｍ．， Ｐａｎａｒｅｔａｋｉｓ， Ｔ．， Ｔｅｓｎｉｅｒｅ， Ａ．， Ｊｏｚａ， Ｎ．， Ｔｕｆｉ， Ｒ．， Ａｐｅｔｏｈ， Ｌ．， Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ， Ｆ．， Ｚｉｔｖｏｇｅｌ， Ｌ．， ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ， Ｇ． ２００７． Ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ： ｍｏｖｉｎｇ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｎｖｅｒｔｓ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｄｅａｔｈ ｆｒｏｍ "ｓｉｌｅｎｔ" ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：７９４１−７９４４．５８． Ｈｕ， Ｚ．， Ｙａｎｇ， Ｘ．Ｙ．， Ｌｉｕ， Ｙ．， Ｍｏｒｓｅ， Ｍ．Ａ．， Ｌｙｅｒｌｙ， Ｈ．Ｋ．， Ｃｌａｙ， Ｔ．Ｍ．， ａｎｄ Ｚｈｏｎｇ， Ｐ． ２００５． Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｄａｎｇｅｒ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ＨＩＦＵ−ｔｒｅａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ＡＰＣｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ３３５：１２４−１３１． 
５９． Ｈｕ， Ｚ．， Ｙａｎｇ， Ｘ．Ｙ．， Ｌｉｕ， Ｙ．， Ｓａｎｋｉｎ， Ｇ．Ｎ．， Ｐｕａ， Ｅ．Ｃ．， Ｍｏｒｓｅ， Ｍ．Ａ．， Ｌｙｅｒｌｙ， Ｈ．Ｋ．， Ｃｌａｙ， Ｔ．Ｍ．， ａｎｄ Ｚｈｏｎｇ， Ｐ． ２００７． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＦＵ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ． Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５：３４−３４． 
６０． Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ， Ｖ．Ａ．， Ｂａｒｂｅｒ， Ｄ．Ｌ．， Ｎａｋａｒａｉ， Ｔ．， Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｇ．Ｊ．， Ｇｒｉｂｂｅｎ， Ｊ．Ｇ．， Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｇ．Ｍ．， Ｄ'Ａｎｄｒｅａ， Ａ．Ｄ．， Ｒｉｔｚ， Ｊ．， ａｎｄ Ｎａｄｌｅｒ， Ｌ．Ｍ． １９９４． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｅｒｇｙ ｂｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｇａｍｍａ ｃ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１０３９−１０４２．
６１． Ｄｕｒｅ， Ｍ．， ａｎｄ Ｍａｃｉａｎ， Ｆ． ２００９． ＩＬ−２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｅｒｇｙ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｅｒｇｙ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｇｅｎｅｓ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４６：９９９−１００６． 
６２． Ｇａｏ， Ｂ．， Ｋｏｎｇ， Ｑ．， Ｋｅｍｐ， Ｋ．， Ｚｈａｏ， Ｙ．Ｓ．， ａｎｄ Ｆａｎｇ， Ｄ． ２０１２． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｒｔｕｉｎ １ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−２−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９：８９９−９０４． 
６３． Ｇｒａｍａｇｌｉａ， Ｉ．， Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ａ．Ｄ．， Ｌｅｍｏｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｃｒｏｆｔ， Ｍ． １９９８． Ｏｘ−４０ ｌｉｇａｎｄ： ａ ｐｏｔｅｎｔ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：６５１０−６５１７． 
６４． Ｌａｔｈｒｏｐ， Ｓ．Ｋ．， Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ， Ｃ．Ａ．， Ｄｕｌｌｆｏｒｃｅ， Ｐ．Ａ．， Ｍｏｎｔｆｏｒｔ， Ｍ．Ｊ．， Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ａ．Ｄ．， ａｎｄ Ｐａｒｋｅｒ， Ｄ．Ｃ． ２００４． Ａ ｓｉｇｎａｌ ｔｈｒｏｕｇｈ ＯＸ４０ （ＣＤ１３４） ａｌｌｏｗｓ ａｎｅｒｇｉｃ， ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：６７３５−６７４３． 
６５． Ｍｕｒａｔａ， Ｓ．， Ｌａｄｌｅ， Ｂ．Ｈ．， Ｋｉｍ， Ｐ．Ｓ．， Ｌｕｔｚ， Ｅ．Ｒ．， Ｗｏｌｐｏｅ， Ｍ．Ｅ．， Ｉｖｉｅ， Ｓ．Ｅ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｈ．Ｍ．， Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｔ．Ｄ．， Ｅｍｅｎｓ， Ｌ．Ａ．， Ｊａｆｆｅｅ， Ｅ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． ２００６． ＯＸ４０ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ ｗｉｔｈ ＧＭ−ＣＳＦ ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：９７４−９８３．
６６． Ｔｓｕｓｈｉｍａ， Ｆ．， Ｙａｏ， Ｓ．， Ｓｈｉｎ， Ｔ．， Ｆｌｉｅｓ， Ａ．， Ｆｌｉｅｓ， Ｓ．， Ｘｕ， Ｈ．， Ｔａｍａｄａ， Ｋ．， Ｐａｒｄｏｌｌ， Ｄ．Ｍ．， ａｎｄ Ｃｈｅｎ， Ｌ． ２００７． Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂ７−Ｈ１ ａｎｄ ＰＤ−１ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｎｅｒｇｙ． Ｂｌｏｏｄ １１０：１８０−１８５． 
６７． Ｗｉｌｃｏｘ， Ｒ．Ａ．， Ｔａｍａｄａ， Ｋ．， Ｆｌｉｅｓ， Ｄ．Ｂ．， Ｚｈｕ， Ｇ．， Ｃｈａｐｏｖａｌ， Ａ．Ｉ．， Ｂｌａｚａｒ， Ｂ．Ｒ．， Ｋａｓｔ， Ｗ．Ｍ．， ａｎｄ Ｃｈｅｎ， Ｌ． ２００４． Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１３７ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｅｒｇｙ ｏｆ ＣＤ８＋ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｂｌｏｏｄ １０３：１７７−１８４． 
６８． Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｃｈｅｎ， Ｘ．， Ｌｉｕ， Ｘ．， Ｋｌｉｎｅ， Ｄ．Ｅ．， Ｔｅａｇｕｅ， Ｒ．Ｍ．， Ｇａｊｅｗｓｋｉ， Ｔ．Ｆ．， ａｎｄ Ｋｌｉｎｅ， Ｊ． ２０１３． ＣＤ４０ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３：１９９９−２０１０． 
６９． Ａｎｅｌｌｉ Ｔ， Ａｌｅｓｓｉｏ Ｍ， Ｍｅｚｇｈｒａｎｉ Ａ， Ｓｉｍｍｅｎ Ｔ， Ｔａｌａｍｏ Ｆ， Ｂａｃｈｉ Ａ ａｎｄ Ｓｉｔｉａ Ｒ． ＥＲｐ４４， ａ ｎｏｖｅｌ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｓｓｉｓｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｆａｍｉｌｙ． ＥＭＢＯ Ｊ． ２００２； ２１（４）：８３５−８４４． 
７０．Ｊｅｓｓｏｐ ＣＥ， Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｉ Ｓ， Ｇａｒｂｉ Ｎ， Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ＧＪ， Ｌｏｖｅｌｌ Ｓ ａｎｄ Ｂｕｌｌｅｉｄ ＮＪ． ＥＲｐ５７ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｈａｒｉｎｇ ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｏｍａｉｎｓ． ＥＭＢＯ Ｊ． ２００７； ２６（１）：２８−４０．
７１．Ｒｏｎ Ｄ ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ Ｐ． Ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００７； ８（７）：５１９−５２９． 
７２．Ｗｈｉｔｅ Ｅ． Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１２； １２（６）：４０１−４１０． 
７３． Ｋｏｎ Ｍ， Ｋｉｆｆｉｎ Ｒ， Ｋｏｇａ Ｈ， Ｃｈａｐｏｃｈｎｉｃｋ Ｊ， Ｍａｃｉａｎ Ｆ， Ｖａｒｔｉｃｏｖｓｋｉ Ｌ ａｎｄ Ｃｕｅｒｖｏ ＡＭ． Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１１； ３（１０９）：１０９ｒａ１１７． 
７４．Ｈａａｒ Ｇ， Ｓｈａｗ Ａ， Ｐｙｅ Ｓ， Ｗａｒｄ Ｂ， Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ Ｆ， Ｎｏｌａｎ Ｒ ａｎｄ Ｃｏａｄｙ ＡＭ． Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏ−ｅｆｆｅｃｔｓ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ． ２０１１； ３７（２）：１７７−１８３． 
７５．Ｄｕｃｋ ＦＡ． （１９９０）． Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｏｏｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）．
７６．Ｐａｒｔａｎｅｎ Ａ， Ｔｉｌｌａｎｄｅｒ Ｍ， Ｙａｒｍｏｌｅｎｋｏ ＰＳ， Ｗｏｏｄ ＢＪ， Ｄｒｅｈｅｒ ＭＲ ａｎｄ Ｋｏｈｌｅｒ ＭＯ． Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅａｋ ａｃｏｕｓｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ａｎｄ ｓｈａｐｉｎｇ ｏｆ ｈｅａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｆｏｃｉ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＭＲ−ｇｕｉｄｅｄ ｈｉｇｈ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｆｏｃｕｓｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｌｄ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ． Ｍｅｄ Ｐｈｙｓ． ２０１３； ４０（１）：０１３３０１． 
７７．Ｂａｃｋ ＳＨ， Ｓｃｈｒｏｄｅｒ Ｍ， Ｌｅｅ Ｋ， Ｚｈａｎｇ Ｋ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ． ＥＲ ｓｔｒｅｓｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ： ＩＲＥ１／ＨＡＣ１／ ＸＢＰ１． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２００５； ３５（４）：３９５−４１６． 
７８．Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｏｌｂｒｉｃｈｔ， Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ８０， １１４７０４ （２００９）． 
７９．Ｐｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ ２０１０； ２９：１５９５−１６０６． 
８０．Ｓａｈｕ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｔｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４ 『ｔ（Ｄｅｃ ３）ｔ』；４：７３０３． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓｒｅｐ０７３０３．
【図１】
2018517495.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2018517495.tif 000020
【図１０Ｂ】
2018517495.tif 000021
【図１０Ｃ】
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【図１１】
2018517495.tif 000023
【図１２】
2018517495.tif 000024
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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