(57)【要約】  本発明は、Ｔｈ２型喘息の治療において使用されるＧＡＴＡ−３阻害剤に、特に、（ｉ）３％以上、詳細には４％以上、より詳細には５％以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉ）３５０×１０６／Ｌ以上、詳細には４５０×１０６／Ｌ以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉｉ）４０ｐｐｂ以上の呼気一酸化窒素濃度を特徴とする、アレルギー性喘息に罹患した患者の治療に使用される、ＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムに関する。
2018515611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）３％以上、詳細には４％以上、より詳細には５％以上の血中好酸球数、および／または、
（ｉｉ）３５０×１０６／Ｌ以上、詳細には４５０×１０６／Ｌ以上の血中好酸球数、および／または、
（ｉｉｉ）４０ｐｐｂ以上の呼気一酸化窒素濃度を有する、Ｔｈ２型喘息に罹患した患者の治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項２】
前記核酸に基づいた不活化物質が、ＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムである、請求項１に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項３】
前記患者の血中好酸球数が４％以上、より詳細には５％以上である、請求項１または２に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項４】
前記患者の血中好酸球数が３５０×１０６／Ｌ以上、より詳細には４５０×１０６／Ｌ以上である、請求項１から３のいずれか一項に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項５】
前記血中好酸球数が、
（ｉ）自動白血球分画、または、
（ｉｉ）従来の血液塗抹を用いた手動の顕微鏡的細胞鑑別によって判定される、請求項３または４に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項６】
前記患者の呼気一酸化窒素が４０ｐｐｂ以上である、請求項１から５のいずれか一項に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項７】
前記呼気一酸化窒素濃度が、携帯用のＮＩＯＸ  ＭＩＮＯ（登録商標）装置を用いて判定される、請求項６に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項８】
前記核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質がＤＮＡザイムｈｇｄ４０（配列番号３）である、請求項１から７のいずれか一項に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項９】
前記ｈｇｄ４０が吸入用製剤に含まれる、請求項８に記載の、治療に使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項１０】
前記ｈｇｄ４０がＰＢＳに溶解される、請求項９に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項１１】
５から５０ｍｇの間のｈｇｄ４０、特に５から２０ｍｇの間のｈｇｄ４０、特に１０ｍｇのｈｇｄ４０が２ｍｌのＰＢＳに溶解される、請求項１０に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項１２】
前記核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質が、１日に１回、１日に２回、または１日に３回、特に１日に１回投与される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項１３】
前記核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質が、１日に１回、持続的療法で、特に維持療法で投与される、請求項１２に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【請求項１４】
前記核酸ベースの不活化物質が、コルチコステロイド、長時間作用型ベータアゴニスト（ＬＡＢＡ）、長時間作用型ムスカリン性アンタゴニスト（ＬＡＭＡ）、抗ロイコトリエン、短時間作用型ベータアゴニスト（ＳＡＢＡ）、抗コリン物質、およびモノクローナル抗体から選択される、喘息治療用の１つまたは複数の吸入療法または経口療法に対する追加療法として使用される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の、治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｈ２型喘息の治療において使用されるＧＡＴＡ−３阻害剤に、特に、（ｉ）３％以上、詳細には４％以上、より詳細には５％以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉ）３５０×１０６／Ｌ以上、詳細には４５０×１０６／Ｌ以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉｉ）４０ｐｐｂ以上の呼気一酸化窒素濃度を特徴とする、アレルギー性喘息に罹患した患者の治療に使用される、ＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムに関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性炎症は、社会経済的重要性が高い医療問題領域増大の一因である。慢性炎症には、特に以下の病気群が含まれる：自己免疫疾患、およびリウマチ性疾患（とりわけ皮膚、肺、腎臓、血管系、神経系、結合組織、運動系、内分泌系での兆候）の領域の疾患、即時型アレルギー反応および喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、動脈硬化、乾癬および接触湿疹、ならびに器官および骨髄移植後の慢性拒絶反応。これらの疾患の多くは、工業国だけでなく、時には世界中で、ここ数十年、流行を増してきている。例えば、ヨーロッパ、北アメリカ、日本、およびオーストラリアでは、人口の２０％超がアレルギー性疾患および喘息に罹患している。慢性閉塞性肺疾患は現在、世界中で５番目に多い死因であり、ＷＨＯの計算によると、慢性閉塞性肺疾患は２０２０年には３番目に多い死因となる。心筋梗塞、脳卒中、および抹消動脈疾患という二次疾患を伴う動脈硬化は、罹患率および死亡率の統計において世界で一番である。神経皮膚炎と共に、乾癬および接触湿疹は概して、皮膚の慢性炎症性疾患で一番多い。
【０００３】
喘息は、可変性の気道閉塞、粘液分泌過多、気道炎症、および気道過敏症の増大を含む、気道の一般的な慢性炎症性疾患である。自然免疫反応および適応免疫反応の異常調節は、疾患の発症において中心的な役割を有すると考えられている。個体間の高度な不均質性が、異なる患者集団の間で同定されており、いくつかの臨床的フェノタイプおよび病態生理学的エンドタイプの定義をもたらしている１。最も研究された病態生理学的喘息症状は２型ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）型（アレルギー性）反応であり２、３、これは「ＴＨ２分子エンドタイプ」とも呼ばれる４、５。
【０００４】
およそ半分の喘息患者は、疾患重症度にかかわらず、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３などのサイトカインを生産するＴＨ２細胞の優勢な活性化を特徴とする、このＴＨ２エンドタイプを示す。全てのこれらのＴＨ２サイトカインの発現および生産は、ジンクフィンガー転写因子ＧＡＴＡ−３によって決定的に調節され、ＧＡＴＡ−３はＴＨ２細胞の分化および活性化に必須であり、免疫活性化の２型（ＴＨ２）経路のマスター転写因子であると考えられている６。ＧＡＴＡ−３は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴＨ２細胞への分化に主に関与する。このプロセスにおいて、ＴＨ２細胞の分化は、２つのシグナル伝達経路、すなわちＴ細胞受容体（ＴＺＲ）およびＩＬ−４受容体経路によって主に制御される。ＴＺＲから出されたシグナルは、ＴＨ２細胞特異的な転写因子ｃＭａｆおよびＧＡＴＡ−３、ならびにまた転写因子ＮＦＡＴおよびＡＰ−１を活性化する。ＩＬ−４受容体の活性化によって、ＳＴＡＴ６がＩＬ−４受容体の細胞質ドメインに結合し、ここでＳＴＡＴ６はＪａｋ１およびＪａｋ３キナーゼによってリン酸化される。ＳＴＡＴ６の一部がリン酸化されることによって、ＳＴＡＴ６は二量化し、核に移行し、核で、ＳＴＡＴ６はＧＡＴＡ−３および他の遺伝子の転写を活性化する。ＧＡＴＡ−３は、成熟ＴＨ２細胞において排他的に発現されＴＨ１細胞では発現されないジンクフィンガー転写因子である。ＧＡＴＡ−３の過剰発現は、ＧＩＮＡガイドラインに従った最適な治療法にもかかわらず重度の喘息を有する患者の気管支肺胞洗浄試料および肺生検において観察されている７。この免疫ネットワークは、したがって、有望な治療標的である。既に承認された抗ＩｇＥモノクローナル抗体に加えて、転写因子ＧＡＴＡ−３の下流にある個別の成分を標的化するいくつかの新規な治療法が開発中である８。
【０００５】
代替的なアプローチは、戦略的転写因子ＧＡＴＡ−３を直接的に標的化して、全ての下流分子／サイトカインに同時に干渉するようにする。ＧＡＴＡ−３の発現は、慢性炎症性疾患に罹患した患者の分子フェノタイプを判定するため、また、患者を「ＴＨ２高」および「ＴＨ２低」亜群に階層化するために分析されており、「ＴＨ２高」患者をＧＡＴＡ−３特異的な不活化物質で治療することが示唆された（例えば、特許文献１参照。）。ＧＡＴＡ−３は細胞内のみ発現されるため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞膜透過能力を有する、ＧＡＴＡ−３特異的ＤＮＡザイムなどの、核酸に基づくＧＡＴＡ−３不活化物質が開発されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００６】
アレルギー性喘息などの慢性炎症性障害において、適切な治療スキームの同定における問題は、それでもさらに複雑である。アレルギー反応では、ある特定の患者において好酸球数が増大し、その結果、好酸球増加症が生じることが知られている。好酸球は、ＧＡＴＡ−３も発現することが知られており（例えば、非特許文献１参照。）、ＧＡＴＡ−３の発現がＴ細胞に制限されず、ＧＡＴＡ−３の発現が好塩基球、マスト細胞、および上皮細胞においても確認されるためである。ＧＡＴＡ−３は、慢性炎症性疾患、特にアレルギー性喘息の免疫病因において中心的な役割を有する。アレルゲンでの急性の感作およびチャレンジによって、気道における高度の好酸球蓄積が生じ、リンパ球の動員が最少となること（例えば、非特許文献２参照。）、ならびにアレルゲンチャレンジが肺好酸球においてＧＡＴＡ−３およびＧＡＴＡ−３反応性遺伝子の発現を誘発することが示された。要するに、好酸球が炎症性反応に正のフィードバックをもたらすことが仮定された。逆に、アレルギー性喘息などの慢性的アレルギー性気道炎症において、ヒト肺組織におけるＧＡＴＡ−３陽性細胞の６０〜９０％がＣＤ３陽性Ｔ細胞であり、この細胞のわずか１５％未満が好酸球として同定されたことが示されている（例えば、非特許文献３参照。）。したがって、ヒト喘息において、ＧＡＴＡ−３反応性遺伝子の好酸球発現は気道炎症をもたらす炎症性サイトカインの主な由来源ではないが、慢性炎症性プロセスをサポートするＴＨ２サイトカインの余剰な由来源をもたらす可能性が高いと結論付けられた（例えば、非特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０４０８９１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０３３３１４号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｚｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  ８１（１９９３）３２３４〜３２４１
【非特許文献２】Ｐａｕｌ  Ｊｕｓｔｉｃｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８２（２００２）Ｌ３０２〜Ｌ３０９
【非特許文献３】Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０３（１９９９）２１５〜２２２
【非特許文献４】Ｓｏｎｔｏｒｏ  ＆  Ｊｏｙｃｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４（１９９７）４２６２〜４２６６
【非特許文献５】Ｄｉｃｋｅ  Ｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２０１２；２２（２）：１１７〜２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、ＴＨ２細胞内のＧＡＴＡ−３は、アレルギー性喘息などのアレルギー性障害のケースの治療介入のための魅力的な標的であると思われるが、ＧＡＴＡ−３を同様に発現する好酸球が同時に存在した場合の、このような治療アプローチの成功に与える影響は完全に未知であった。さらに、このようなアプローチの利益を特に受ける特定の患者集団を同定できるかどうかは全く予測不可能であった。
【００１０】
したがって、アレルギー性喘息患者の新規かつ効率的な治療法を開発するための大きなアンメットニーズ（ｕｎｍｅｔ  ｎｅｅｄｓ）が依然として存在する。特定のＧＡＴＡ−３阻害剤の投与の利益を特に受ける特定の患者集団の同定に基づく、本願に示される解決法はこれまでに知られておらず、また当業者によって予想されてこなかったものであった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、Ｔｈ２型喘息の治療において使用されるＧＡＴＡ−３阻害剤、特に、アレルギー性喘息に罹患した患者の特定の亜集団の治療に使用されるＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムに関する。
【００１２】
したがって、第１の態様では、本発明は、（ｉ）３％以上、詳細には４％以上、より詳細には５％以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉ）３５０×１０６／Ｌ以上、詳細には４５０×１０６／Ｌ以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉｉ）４０ｐｐｂ以上の呼気一酸化窒素濃度を特徴とする、アレルギー性喘息に罹患した患者の治療において使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質、特にＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムに関する。
【００１３】
第２の態様では、本発明は、（ｉ）３％以上、特にそれぞれ４％以上もしくは５％以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉ）３５０×１０６／Ｌ以上、特に４５０×１０６／Ｌ以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉｉ）４０ｐｐｂ以上の呼気一酸化窒素濃度を特徴とする、Ｔｈ２型喘息、特にアレルギー性喘息に罹患した患者の治療方法であって、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質、特にＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムを前記患者に投与するステップを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の研究設計およびフローチャートを示す図である。パネルＡは、研究設計および主な研究手順の概要を示す。パネルＢは、分析に登録され組み入れられた患者の数をまとめている。ＳＢ０１０群の２１人の患者は全ての研究評価を完了し、１人の患者は、治療前後のアレルゲンチャレンジにおいて異なるアレルゲン用量が投与されたため、評価に適格ではなかった。プラセボ群では、２人の患者が評価に適格ではなかった（１人の患者はアレルゲンチャレンジの間にＳＡＢＡを要し、１人の患者は治療前後のアレルゲンチャレンジにおいて異なるアレルゲン用量が投与された）。したがって、ＳＢ０１０群の２１人の評価可能な患者およびプラセボ群の１９人の評価可能な患者が研究を完了した「＊」。プラセボ群では、１人の患者のＬＡＲデータが存在しなかった。それは、連続肺活量測定がアレルゲン誘発の４時間後に意図せず停止したためである。
【図２】本発明の、治療前および治療の４週間後のアレルゲンチャレンジ後の肺機能の変化を示す図である。図２Ａ：アレルゲンチャレンジ後のベースラインＦＥＶ１に対するパーセンテージとしてＦＥＶ１レベルが示されている。アレルゲンチャレンジは、治療期間前（）および４週間の治療期間の完了後（）に行った。肺機能をアレルゲンチャレンジの７時間後に記録した。治療群当たりの平均値＋／−ＳＥＭが示されている。ＳＢ０１０での治療（三角）は、プラセボ（四角）と比較して、即時相喘息反応（Ｐ＝０．０４、ウィルコクソンの順位和検定）および遅発相喘息反応（Ｐ＝０．０２、ＡＮＣＯＶＡ）を有意に弱めた。研究群の結果をまとめてパネルＡに示す。事前に特定された亜群は、血中好酸球≧４％（パネルＢ）およびＦｅＮＯ≧４０ｐｐｂ（パネルＣ）であった。血中好酸球およびＦｅＮＯレベルを、ランダム化の前に測定した。両亜群は１２人のＳＢ０１０患者／１２人のプラセボ患者からなり、ＳＢ０１０群の９人の患者およびプラセボ群の１１人の患者が両亜群に存在する。ＥＡＲおよびＬＡＲは共に、血中好酸球≧４％の亜群（それぞれＰ＝０．０２およびＰ＝０．０５）およびＦｅＮＯ≧４０ｐｐｂの亜群（それぞれＰ＝０．０２およびＰ＝０．０５）で有意に向上した。アレルゲンチャレンジ後最初の１時間で、延びたｘ軸が拡大されていることに留意されたい。図２Ｂ：肺機能が、ベースラインＦＥＶ１に対するパーセントとして経時的に表されている。血中好酸球がそれぞれ≧３％、≧４％、および≧５％の３つの亜群でのＳＢ０１０およびプラセボ治療についての別々の治療前および治療後の曲線が示されている。治療群当たりの平均値＋／−ＳＥＭが示されている。挿入されているボックスは、即時相反応（左側のボックス）および遅発相反応（右側のボックス）についての、プラセボと比較した、ＳＢ０１０治療群におけるＦＥＶ１曲線下面積（ＡＵＣ）の向上％を示す。ＡＮＣＯＶＡによる統計分析。Ｘ軸が、アレルゲンチャレンジ後最初の１時間について異なるスケールに延ばされていることに留意されたい。ベースライン血中好酸球数に基づく、肺機能の連続的な向上。図２Ｃ：ここでは、ベースライン血中好酸球数について層別化された３つの亜群全てについて組み合わされた、ＳＢ０１０での２８日間の治療の後のアレルゲンチャレンジに対する反応が示されている。比較のために、血中好酸球≧３％の亜群に対する治療後プラセボ応答が示され、これは、他の２つの亜群におけるプラセボ応答と有意には異ならない。さらなる詳細については、図２についての説明文を参照されたい。
【図３】本発明の、遅発型喘息反応（ＬＡＲ）の間の曲線下面積（ＡＵＣ）における個々の絶対的変化を示す図である。ＳＢ０１０治療群（ｎ＝２１）およびプラセボ群（ｎ＝１８）の各患者で、遅発相反応（ＬＡＲ）の間のＡＵＣ値における絶対的変化を計算し、示した。線は平均を表し、黒い点はベースラインで血中好酸球数≧４％の患者を表し、円はベースラインで血中好酸球数＜４％の患者を表す。ＬＡＲ反応は、これらの２つの亜群の間で有意には異ならない。全群で、ＳＢ０１０治療は遅発相喘息反応を有意に弱めた（Ｐ＝０．０２、図２）。個々のデータポイントについては、補足用添付資料の表Ｓ４ＡおよびＳ４Ｂを参照されたい。
【図４】本発明の、ＳＢ０１０またはプラセボでの治療前後のアレルゲンチャレンジ後の血漿中ＩＬ−５レベルにおける変化を示す図である。治療前のアレルゲンチャレンジに反応して検出可能な血漿中ＩＬ−５レベルを示した患者の血漿中ＩＬ−５濃度における絶対的変化の平均±ＳＥＭが示され、これは、それぞれ、ＳＢ０１０群（１３人の患者）では４．２１±１．５１ｐｇ／ｍｌ、プラセボ群（１２人の患者）では４．０３±０．９２ｐｇ／ｍｌであった。差はＰ＝０．０５で統計的に有意である（＊）。
【図５】図５（補足用添付資料の図Ｓ１である）は、補足用添付資料において論じられる、アレルギー性喘息の発病におけるＴｈ２細胞およびＧＡＴＡ−３の中心的役割、ならびにＳＢ０１０の作用様式を示す。
【図６】図６（補足用添付資料の図Ｓ２である）は、本発明の、補足用添付資料において論じられる、ｍＲＮＡ切断活性およびＧＡＴＡ−３ＤＮＡザイムを示す図である。ＧＡＴＡ−３コピー（ｃ）ＲＮＡに対するＧＡＴＡ特異的ＤＮＡザイムｈｇｄ４０のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断活性。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された完全オープンリーディングフレームｃＲＮＡを、異なる時間間隔（動態−Ａ）と、または増大用量（用量依存性−Ｂ）のｈｇｄ４０とインキュベートし、得られた切断産物を分離し、アガロースゲル上でエチジウムブロマイド染色した。同様に、ＧＡＴＡ−３  ｃＲＮＡを、スクランブルされた結合ドメインを有するが無傷の触媒性配列も有する非特異的ＤＮＡザイム（スクランブルされたＤＮＡザイム１〜６）または異なる転写因子配列指向性ＤＮＡザイム（Ｔボックス転写因子Ｔｂｅｔ、Ｔｂｅｔ  ＤＮＡザイム１〜３）とインキュベートして、ＤＮＡザイムアプローチの配列特異性を実証した（Ｃ）。
【図７】図７（補足用添付資料の図Ｓ３である）は、本発明の、ＳＢ０１０の活性成分であるｈｇｄ４０の生物活性、ならびにヒト一次Ｔ細胞および鼻組織外植片に対するｈｇｄ４０治療の効果を示す図である。Ａ−ヒト極性Ｔｈ２細胞のｈｇｄ４０トランスフェクションによるＧＡＴＡ−３タンパク質発現の低減。Ｂ−ヒト極性Ｔｈ２細胞のｈｇｄ４０トランスフェクションによるＩＬ−１３分泌の低減。図Ｓ２ＡおよびＳ２Ｂのデータは、ＦＡＭ陽性トランスフェクト細胞の細胞内染色を表し、群当たりｎ＝８〜１０の平均＋ＳＥＭとして表されている。ＣおよびＤ−鼻ポリープを伴う慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）に罹患した患者から得られたヒト鼻ポリープ組織外植片内に存在するＣＤ３＋Ｔ細胞（緑色）による、蛍光標識されたｈｇｄ４０（赤色）の取り込み。結果は共焦点レーザー走査型顕微鏡によって得、未治療細胞（図Ｃ）およびｈｇｄ４０治療細胞（図Ｄ）につぃて両方の色を重ねて表した。Ｅ−ｅｘ  ｖｉｖｏでの組織アッセイにおける、ＣＲＳｗＮＰに罹患した患者から得られたヒト鼻ポリープ組織外植片におけるＧＡＴＡ−３  ｍＲＮＡの発現。データは正規化された相対発現単位として表し、群当たりｎ＝６の平均＋ＳＥＭとして表した。Ｆ−ｅｘ  ｖｉｖｏでの組織アッセイにおける、ヒト鼻ポリープからのＩＬ−５タンパク質の放出。データは、群当たりｎ＝１６の平均＋ＳＥＭとして表した。有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いるステューデントのｔ検定によって計算した。（＊）Ｐ＜０．０５、（＊＊）Ｐ＜０．０１。技術的詳細については、補足用添付資料の材料および方法を参照されたい。
【図８】図８（補足用添付資料の図Ｓ４である）は、本発明の、ＩＴＴ集団全体および事前に特定された亜群における平均的な治療差を示す図である。これは、ＳＢ０１０治療とプラセボ群との間の相対的変化のデルタを反映する群間の差の視覚化である。研究集団全体についての値を表Ｓ２に示し、血中好酸球≧４％の患者の事前に特定された亜群についての値を表Ｓ３ａに示し、ＦｅＮＯ＞４０ｐｐｂの患者の事前に特定された亜群についての値は表Ｓ３Ｂで見られる。上部：治療前と治療後との間の肺機能の変化パーセントが曲線下面積（ＡＵＣ）として示される。下部：肺機能の変化パーセントがＦＥＶ１の最大低下として表される。ＥＡＲ：即時相喘息反応、ＬＡＲ：遅発相喘息反応。
【図９】図９（補足用添付資料の図Ｓ５である）は、本発明の、喀痰中好酸球に対するＳＢ０１０およびプラセボ治療の効果を示す図である（パーセント表示）。測定は、材料および方法において記載されているように、アレルゲン吸入の前後に、誘発喀痰試料において行った。アレルゲン吸入は、ＳＢ０１０（三角）およびプラセボ（四角）での治療の前および２８日後に行った。各時点および治療群についての中央値ならびに２５および７５パーセンタイル範囲が示されている。左側のパネル：全体としての群、中央のパネル：事前に特定された亜群、血中好酸球≧４％、右側のパネル：事前に特定された亜群、ＦｅＮＯ≧４０ｐｐｂ。全体としての群において、チャレンジ後の好酸球パーセントの絶対的変化は、治療群間で非有意な傾向を示し（Ｐ＝０．０６）、好酸球亜群（Ｐ＝０．００９）およびＦｅＮＯ亜群（Ｐ＝０．０２）では有意となった。喀痰中好酸球パーセントのこの低下は、補足用添付資料の表Ｓ８で示すように、好中球流入の増大に起因するものではなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、Ｔｈ２型喘息の治療において使用される、核酸ベースの不活化物質、特にＤＮＡザイム、特に、ある特定の患者亜集団の治療において使用される、ＧＡＴＡ−３指向性核酸ベースの不活化物質、特にＤＮＡザイムに関する。
【００１６】
したがって、第１の態様では、本発明は、（ｉ）３％以上、詳細には４％以上、より詳細には５％以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉ）３５０×１０６／Ｌ以上、詳細には４５０×１０６／Ｌ以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉｉ）４０ｐｐｂ以上の呼気一酸化窒素濃度を特徴とする、アレルギー性喘息に罹患した患者の治療に使用される、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質、特にＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムに関する。
【００１７】
第２の態様では、本発明は、（ｉ）３％以上、特にそれぞれ４％以上もしくは５％以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉ）３５０×１０６／Ｌ以上、特に４５０×１０６／Ｌ以上の血中好酸球数、および／または（ｉｉｉ）４０ｐｐｂ以上の呼気一酸化窒素濃度を特徴とする、Ｔｈ２型喘息、特にアレルギー性喘息に罹患した患者を治療する方法であって、核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質、特にＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムを前記患者に投与するステップを含む方法に関する。
【００１８】
本発明の背景において、用語「核酸ベースの不活化物質」は、標的遺伝子配列に少なくとも部分的に相補的であり、かつ標的遺伝子活性を、例えば、二重化、転写、もしくは翻訳を遮断することによって、または標的配列を切断することによって不活化する、核酸ベースの物質を指す。核酸ベースの不活化物質は、リボヌクレオチド、デゾキシリボヌクレオチド、非天然のヌクレオチド、およびその混合物からなり、一本鎖配列、二本鎖配列、またはその混合物である。本発明に係る核酸ベースの不活化物質には、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、およびＤＮＡザイムが含まれる。
【００１９】
本発明の背景において、用語「ＤＮＡザイム」は天然ではない、触媒的に活性な一本鎖の合成ＤＮＡ分子を指す。１０−２３ファミリーのＤＮＡザイムがアンチセンス分子の新たなクラスに相当し、これらのＤＮＡザイムは、１９９０年代に開発されたが、最近臨床適用が見出されているに過ぎない９。
【００２０】
本発明の背景において、用語「１０−２３ファミリー」は、一般的なＤＮＡザイムモデルを指す（例えば、非特許文献４参照。）。１０−２３モデルのＤＮＡザイムは、「１０−２３ＤＮＡザイム」とも呼ばれるが、２つの基質結合ドメインが隣接している、１５のデゾキシリボヌクレオチドからなる触媒性ドメインを有する（国際公開第２００５／０３３３１４号パンフレットを参照されたい）。ＤＮＡザイムの潜在的利点には、比較的高い安定性、および細胞内酵素に依存しないことが含まれる。
【００２１】
特定の実施形態では、触媒性ドメインは、配列ｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａ（配列番号１）を有する。基質結合ドメインの長さは可変であり、この長さは等しいか、または異なる長さである。特定の実施形態では、基質結合ドメインは６から１４の間のヌクレオチドからなり、さらに具体的には、いずれのケースでも、少なくとも９つのヌクレオチドからなる。このようなＤＮＡザイムは、一般配列ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａｎｎｎｎｎｎｎｎｎ（配列番号２）を含む。本発明のある特定の実施形態では、基質結合ドメインは、タンパク質ＧＡＴＡ−３をコードするｍＲＮＡを結合する。
【００２２】
特定の中央触媒性ドメインｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａは、特定の実施形態にすぎない。当業者であれば、匹敵する生物学的活性を有する「１０−２３ＤＮＡザイム」が、修飾された触媒性ドメインで得られることを認識している。
【００２３】
特定の一実施形態では、基質結合ドメインは、切断部位に隣接する領域に完全に相補的である。しかし、標的ＲＮＡを結合するため、およびそれを切断するために、ＤＮＡザイムが完全に相補的である必要は必ずしもない。１０−２３型のＤＮＡザイムは、標的ｍＲＮＡをプリン−ピリミジン配列で切断する。本発明の範囲内では、ＤＮＡザイムは、国際公開第２００５／０３３３１４号パンフレットに従った、ＧＡＴＡ−３に対するｉｎ  ｖｉｖｏで活性なＤＮＡザイムを好ましくは含み、前記パンフレットの内容は、あらゆる適用可能な特許法の下で可能な限りにおいて参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本発明の特定の実施形態では、患者は血中好酸球数が４％以上である。
【００２５】
特定の実施形態では、患者は血中好酸球数が５％以上である。
【００２６】
本発明の特定の実施形態では、患者は血中好酸球数が３５０×１０６／Ｌ以上である。
【００２７】
特定の実施形態では、患者は血中好酸球数が４５０×１０６／Ｌ以上である。
【００２８】
本発明の特定の実施形態では、血中好酸球数は、（ｉ）従来の自動白血球分画化（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙまたはＳｙｓｍｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙまたは他の技術を用いて）、または（ｉｉ）従来の血液塗抹を用いる手動の顕微鏡的細胞鑑別によって判定される。
【００２９】
本発明の特定の実施形態では、患者は、呼気一酸化窒素濃度が４０ｐｐｂ以上である。
【００３０】
本発明の特定の実施形態では、呼気一酸化窒素濃度は、携帯用のＮＩＯＸ  ＭＩＮＯ（登録商標）装置を用いて判定される。
【００３１】
本発明の特定の実施形態では、ＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムは、国際公開第２００５／０３３３１４号パンフレットの配列ｈｇｄ１からｈｇｄ７０から選択され（国際公開第２００５／０３３３１４号パンフレットの図３を参照されたい）、詳細には、配列ｈｇｄ１１、ｈｇｄ１３、ｈｇｄ１７、およびｈｇｄ４０、より詳細には配列ｈｇｄ４０（５’−ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧ、配列番号３）から選択される。
【００３２】
本発明の背景において、用語「ｈｇｄ４０」は、配列５’−ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧを有する３４の塩基からなる、ＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムを指す。３’領域および５’領域の両方にある９つの塩基は、ＧＡＴＡ−３の標的ｍＲＮＡに非常に特異的に結合する２つの結合ドメインを形成する。分子の中心核は、ｈｇｄ４０がＧＡＴＡ−３  ｍＲＮＡに結合した後の標的の切断の原因となる触媒性ドメインに相当する１０（図５および６を参照されたい）。原薬ｈｇｄ４０は、吸入による薬剤送達の部位での高い生物活性および生物学的利用能を特徴とする１２。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、ｈｇｄ４０は、経口的に、直腸に、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、皮下に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、髄腔内に、血管内に、局所的に（粉末、軟膏剤、またはドロップ）、またはスプレーもしくは吸入剤の形態で患者に投与される製剤に含まれる。活性成分は、必要に応じて、無菌条件下で、生理学的に許容可能な賦形剤および可能な防腐剤、緩衝液、または推進剤と混合される。
【００３４】
本発明の特定の実施形態では、ｈｇｄ４０は、吸入用製剤に含まれる。
【００３５】
本発明の特定の実施形態では、前記ｈｇｄ４０はＰＢＳに溶解される。
【００３６】
投薬のタイプおよび投薬スキームは、臨床的因子に従って担当医によって決定される。当業者であれば、投薬のタイプおよび投薬スキームが、例えば、患者の体のサイズ、体重、体表面、年齢、性別、または全体的健康などの様々な因子に依存するが、投与される作用物質、期間、および投与タイプ、ならびに同時に投与される他の薬剤にも依存することを認識している。このプロセスにおいて、特に有利な実施形態に従うと、薬剤の活性成分の量は、測定される発現レベルに適合される。したがって、亜群「Ｔｈ２高」を置き、確立された非常に高いＧＡＴＡ−３遺伝子発現のケースでは、増大用量の活性成分、特に、ＧＡＴＡ−３に特異的なＤＮＡザイムが投与される。それに応じて、亜群「Ｔｈ１高」を置き、確立された非常に高いＴｂｅｔ遺伝子発現のケースでは、増大用量の活性成分、特に、Ｔｂｅｔに特異的なＤＮＡザイムが投与される。
【００３７】
本発明の特定の実施形態では、投薬は、５から５０ｍｇの間のｈｇｄ４０、特に５から２０ｍｇの間のｈｇｄ４０、特に１０ｍｇのｈｇｄ４０からなる。特定の実施形態では、投薬量は、２ｍｌのＰＢＳに溶解される。特定の実施形態では、これらの投薬量は１日投薬量である。
【００３８】
本発明の特定の実施形態では、前記核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質が、１日に１回、１日に２回、または１日に３回、特に１日に１回投与される。
【００３９】
本発明の特定の実施形態では、前記ＧＡＴＡ−３指向性ＤＮＡザイムは、１日に１回、２８日連続して、持続的療法で、特に維持療法で投与される。
【００４０】
本発明の特定の実施形態では、前記核酸ベースのＧＡＴＡ−３不活化物質は、コルチコステロイド、長時間作用型ベータアゴニスト（ＬＡＢＡ）、長時間作用型ムスカリン性アンタゴニスト（ＬＡＭＡ）、抗ロイコトリエン、短時間作用型ベータアゴニスト（ＳＡＢＡ）、抗コリン物質、およびモノクローナル抗体から選択される、喘息治療用の１つまたは複数の吸入療法または経口療法に対する追加療法として使用される。
【００４１】
本発明のさらなる特徴、詳細、および利点は、特許請求の範囲の記載、および図面を参考にしての典型的な実施形態の以下の説明に基づく。
【００４２】
実施例
実施例１：臨床研究「吸入されたＧＡＴＡ−３特異的ＤＮＡザイムによるアレルゲン誘発型喘息反応の弱まり」
要約
背景
最も普及している喘息フェノタイプは、ＴＨ２型好酸球支配型の炎症を特徴とする。ＴＨ２経路のマスター転写因子であるＧＡＴＡ−３の治療標的化が有利である。本発明者らは、ＧＡＴＡ−３  ｍＲＮＡ（ＳＢ０１０）に特異的に向けられた新規なＤＮＡザイムの安全性および有効性を評価した。
【００４３】
方法
このランダム化された、二重盲式の、プラセボ対照の、多施設臨床試験において、アレルゲン誘発後に二相性の即時相および遅発相喘息反応（ＥＡＲおよびＬＡＲ）を示す、喀痰中好酸球増加を伴うアレルギー性喘息患者を、１日に１回数日間、吸入によって１０ｍｇのＳＢ０１０（２１人の評価可能な患者）またはプラセボ（１９人の評価可能な患者）を投与するように割り当てた。アレルゲンチャレンジを治療の前後に行った。ＬＡＲでのＦＥＶ１曲線下面積（ＡＵＣ）の変化がプライマリエンドポイントであった。
【００４４】
結果
２８日間の治療の後、ＳＢ０１０は、平均ＬＡＲ  ＡＵＣを治療前と比較して３４％弱め、一方、ＬＡＲ  ＡＵＣの１％の増大がプラセボ群で観察された（Ｐ＝０．０２）。ＥＡＲ  ＡＵＣはＳＢ０１０によって１１％弱められ、これに対し、プラセボ後では１０％増大した（Ｐ＝０．０３）。これらの効果は、血中好酸球増加が≧４％（ＬＡＲで４１．７％の向上、Ｐ＝０．０５；ＥＡＲで２８．３％の向上、Ｐ＝０．０２）の、またはＦｅＮＯ≧４０ｐｐｂの事前に特定された患者亜群において、より明白であった。ＳＢ０１０によるＬＡＲの阻害は、アレルゲン誘発型の喀痰中好酸球増加の弱まり（群全体でＰ＝０．０６、好酸球亜群でＰ＝０．００９、ＦｅＮＯ亜群でＰ＝０．０２）、喀痰中トリプターゼの低下（Ｐ＝０．０５）、および血漿中ＩＬ−５レベルの低下（Ｐ＝０．０５）と関連した。アレルゲン誘発型のＦｅＮＯレベルおよびメタコリンに対する気道過敏症は、治療による影響を受けなかった。
【００４５】
結論
ＳＢ０１０治療は、アレルゲン誘発後のアレルギー性喘息においてＬＡＲおよびＥＡＲの両方を有意に弱めた。バイオマーカー分析によって、ＴＨ２調節型の炎症性反応に対する明白な効果が確認された（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ−ｇｏｖナンバー、ＮＣＴ  ０１７４３７６８）。
【００４６】
導入
ＳＢ０１０の活性製剤の中心核は、ＧＡＴＡ−３  ｍＲＮＡへのｈｇｄ４０の結合後の標的の切断の原因となる触媒性ドメインに相当する１０（補足用添付資料の図Ｓ１およびＳ２を参照されたい）。Ｓｅｌら１１は、ＤＮＡザイムの開発がＧＡＴＡ−３  ｍＲＮＡの切断を可能にすることを報告し、アレルギー性気道炎症の前臨床モデルにおけるこれらの有効性を実証した。原薬ｈｇｄ４０は、吸入による薬剤送達の部位での高い生物活性および生物学的利用能を特徴とし１２、したがって、さらなる臨床開発に選ばれた。ｈｇｄ４０は、ＧＡＴＡ−３  ｍＲＮＡおよびタンパク質を、ならびにその後、ヒトＴ細胞および組織外植片におけるＴＨ２サイトカインの生産を有意に低減させた（図Ｓ３、補足用添付資料）。望ましくないオフターゲット効果は排除され１３、大きな安全性懸念は、広範囲の毒物学プログラムで同定されなかった１４。対応する製剤であるＳＢ０１０を、３つの最近完了した、ランダム化された、プラセボ対照の、用量漸増第Ｉ相試験（改稿）で調べた。有望な結果によって、ＳＢ０１０の有効性を評価するための第ＩＩａ相試験が正当であることが分かった。この研究は、現在までの吸入型ＤＮＡザイムの最初の第ＩＩａ相試験に相当する。
【００４７】
方法
研究設計および見落とし
このランダム化された、二重盲式の、プラセボ対照の研究は、２０１３年の１月（最初の患者の登録）から１０月（最後の患者の最後の訪問）の間に、呼吸器研究に特化したドイツの７つの研究箇所で行った。スクリーニングおよびベースライン評価の後、参加者を、活性治療またはプラセボでの４週間の治療期間に層別化せずに、中央で作成されたランダム化リスト（Ｉｎａｍｅｄ  ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてランダム化した。３回の吸入型アレルゲンチャレンジを、スクリーニング時（適格性）、ランダム化の前（治療前）、および２８日目（治療後）に行った。試験は、ドイツ規制当局「Ｂｕｎｄｅｓｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  ｕｎｄ  Ｍｅｄｉｚｉｎｐｒｏｄｕｋｔｅ（ＢｆＡｒＭ）」によって、ならびに、中央の倫理委員会および参加している各中央の地方の倫理委員会によって、開始前に承認された。研究は、医薬品臨床試験の実施基準の原則およびヘルシンキ宣言に従って行った。全ての参加者は、あらゆる研究特異的な手順を行う前に、文書でインフォームドコンセントを提出した。データは各研究箇所で回収し、ＩＮＡＭＥＤ  ＧｍｂＨ（Ｇａｕｔｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のデータベースに入れた。統計分析は、ＦＧＫ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＧｍｂＨ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって独立して行われた。原稿の最初の下書きは最初および最後の著者が作成し、これらの著者が、その原稿を公開するための決定も行った。スポンサーから資金提供されているプロのメディカルライターが執筆および編集をサポートした。最初および最後の著者、ならびにスポンサーの従業員である著者らが、データの正確性および完全性、統計分析、ならびに最終プロトコルまでの試験の忠実性を保証する。
【００４８】
患者
本発明者らは、スクリーニングの少なくとも６カ月前にＧＩＮＡガイドラインに従って１５軽症喘息と診断され、かつ吸入型の短時間作用型気管支拡張薬以外のいかなる喘息薬でも治療されていない、１８から６４歳の白人男性患者を募集した。スクリーニングでは、ＦＥＶ１は、短時間作用型気管支拡張薬のあらゆる摂取の少なくとも６時間後に、予測される正常の≧７０％でなくてはならなかった。彼らの喘息のアレルギー性は、一般的な空中アレルゲンに対する正の皮膚プリックテストならびに正のアレルゲン誘発型の即時相および遅発相反応（ＦＥＶ１がそれぞれ≧２０％および≧１５％低下する）を介して実証されなくてはならなかった。喀痰中好酸球の存在は、スクリーニング時アレルゲンチャレンジの前または後に実証されなくてはならなかった。組み入れ基準および排除基準の完全な詳細は、補足用添付資料で確認することができる。
【００４９】
研究治療
製剤ＳＢ０１０は、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（または適合するプラセボ）内の１０ｍｇのヒトＧＡＴＡ−３特異的ＤＮＡザイムｈｇｄ４０（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙによって製造された）であった。最終製剤は、盲検化を確実にするために個別包装で、中央で（ＢＡＧ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  ＧｍｂＨ、Ｌｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）調製された。製剤またはプラセボを、ＡＫＩＴＡ２  ＡＰＩＸＮＥＢネブライザー（Ａｃｔｉｖａｅｒｏ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｍｕｎｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１日に１回、朝、およそ３〜８分続く流量および容積制御型の吸入によって、２８日連続して投与して、薬剤沈着の最適化が確実となるようにした１６。登録の前に、患者には装置の使用について必須の練習を課した。治療期間の間の各訪問で、活性治療またはプラセボを、研究スタッフの監督下で、研究箇所で投与した。残りの用量は自己投与し、装置のスマートカードを用いてコンプライアンスをチェックした。
【００５０】
研究手順
主な研究手順および介入の概要を図１Ａに示す（研究手順の完全な概要は、補足用添付資料で確認することができる）。
【００５１】
・アレルゲンチャレンジおよび肺機能試験
アレルゲンチャレンジのための適切なアレルゲンを、最初のスクリーニング訪問での皮膚プリックテストによって同定した（詳細については、補足用添付資料の表Ｓ１を参照されたい）。２度目のスクリーニング訪問（最初のスクリーニング訪問の少なくとも１週間後）での、気道反応性（メタコリン誘発による）と組み合わせた、その後の皮膚プリック希釈試験を用いて、スクリーニング時アレルゲンチャレンジのための安全開始濃度を規定した１７。増大濃度の吸入型空中アレルゲンを、ＦＥＶ１が≧２０％低下するまで投与した１８。ＦＥＶ１を２０％低下させた吸入型空中アレルゲンの最後の３つの濃縮ステップを、ランダム化の前（治療前）および２８日間の治療期間の後（治療後）に同一の様式で投与した１９。連続的な肺活量測定を、最近のガイドラインに従って、アレルゲンチャレンジ後１０から１８０分の間（即時相喘息反応、ＥＡＲ）、および  から７時間の間（遅発相喘息反応、ＬＡＲ）、２回行った２０。チャレンジ間の適切なウォッシュアウト時間を行って、さらなるチャレンジの前に全患者においてＦＥＶ１およびＦｅＮＯレベルがベースライン値に確実に戻るようにした。
【００５２】
・メタコリンチャレンジ試験
気道反応性を、ＡＴＳガイドラインに従って、図１Ａで示す時間に、ＦＥＶ１（ＰＣ２０濃度）を≧２０％低下させたメタコリン（Ｐｒｏｖｏｃｈｏｌｉｎｅ，Ｍｅｔａｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｔｆｏｒｄ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）濃度として評価した２１。
【００５３】
・吐出された一酸化窒素測定
呼気一酸化窒素（ＦｅＮＯ）濃度レベルを、製造者の指示に従って、ＡＴＳ／ＥＲＳ推奨に即して２２携帯用のＮＩＯＸ  ＭＩＮＯ（登録商標）装置（Ａｅｒｏｃｒｉｎｅ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、図１Ａで示す時間に測定した。
【００５４】
・喀痰誘発
誘発喀痰試料を、スクリーニング時、治療前チャレンジの前（２週間まで）および２４時間後、ならびに治療の前（２４〜４８時間）および２４時間後の、５つの時点で採取した（図１Ａ）。細胞分布および上清内のメディエーター分析を中央の実験室で評価した。
【００５５】
免疫学的パラメータの測定
血漿および／または喀痰上清内のサイトカインおよびケモカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８  ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１β、ＭＤＣ、ＩＰ１０およびＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３、およびＩＦＮ−γを、製造者の指示に従って、ＴＨ１／ＴＨ２およびケモカインマルチプレックスアッセイで測定した（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）。喀痰上清内の好酸球陽イオン性タンパク質（ＥＣＰ）およびトリプターゼを、製造者の指示に従って、市販されているＥＬＩＳＡ（ＥＣＰおよびトリプターゼ：Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００５６】
安全性の評価
有害事象および併用薬を全ての訪問で評価した。安全性の実験室分析（血液学、臨床化学、および尿検査を含む）を、最初の投与の前、および治療の間の２週間間隔で行った（詳細については、補足用添付資料を参照されたい）。さらに、ＤＮＡザイムに基づく薬剤での治療に起因する（自己）抗体の発生を排除するために、抗核抗体（免疫蛍光スクリーニング試験）およびリウマチ性血清学（ＩｇＭ）を治療の前後に測定した。
【００５７】
研究評価基準
第１の評価基準は、ＦＥＶ１曲線下面積（ＡＵＣ）に対する吸入型ＳＢ０１０の複数回投与の影響であり、これは、ＬＡＲ（アレルゲンチャレンジの４時間後）の間の、ベースラインＦＥＶ１に対するパーセンテージとして表される。ＡＵＣは、台形公式を用いて計算した。探索的エンドポイントには、ＥＡＲ（０〜３時間）の間のＦＥＶ１曲線下面積に対するＳＢ０１０の影響、気道反応性におけるアレルゲン誘発型の変化（ＰＣ２０メタコリン）、ＦｅＮＯレベル、ならびに血漿および喀痰中のバイオマーカーが含まれる。
【００５８】
試料サイズおよび統計分析
第Ｉ種過誤の可能性が１０％、治療群間の影響サイズの差が８％、および検出力が少なくとも８０％であると仮定すると、少なくとも３８の評価可能な対象が必要であった。１５％の予想される脱落率に基づいて、４３の対象をランダム化し、試験薬剤またはプラセボに曝露した。有効性および薬力学的結果を、図１に示すように、全ての評価可能な患者（治療の意思がある集団）において分析した。
【００５９】
主要有効性評価項目（ＬＡＲにおけるＡＵＣ）を、ＬＡＲにおけるベースラインＡＵＣを共変量として有するＡＮＣＯＶＡモデルを用いて、治療群間で比較した。ＳＢ０１０群の４人の患者およびプラセボ群の３人の患者は、最初の治療前アレルゲンチャレンジでＬＡＲのみを示した。これらの患者では、このアレルゲンチャレンジから得た肺機能データを治療前の値として用いた。統計分析プランにおいて規定されているように、同一モデルで、または変化パーセントの群間の比較についてのウィルコクソンの順位和検定を用いて、他のエンドポイントも分析した。安全性評価基準を患者ごとにリストし、記述統計を計算した。統計方法のさらなる詳細は、補足用添付資料で確認することができる。
【００６０】
結果
患者
ＳＢ０１０群では２１人の患者が全ての研究評価を完了し、プラセボ群ではそれぞれ１８人および１９人の患者がＬＡＲおよびＥＡＲ評価を完了した（図１Ｂ）。これらの患者についてのデモグラフィックデータおよびベースラインデータを表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【００６１】
即時相および遅発相喘息反応
図２Ａで示すように（補足用添付資料の表Ｓ２）、ＬＡＲはＳＢ０１０治療後に弱まり、平均曲線下面積（ＡＵＣ）が３３．７％（Ｐ＝０．０２）有意に向上し、ＦＥＶ１の最大低下が３１．６％（Ｐ＝０．０９）向上した。ＥＡＲも有意に弱まり、平均ＡＵＣが１１．３％（Ｐ＝０．０４）向上し、ＦＥＶ１の最大低下が２１．５％（Ｐ＝０．０４）向上した。
【００６２】
事前に特定された亜群における即時相および遅発相喘息反応
事前に特定された亜群において、ベースラインの相対的血中好酸球数が≧４％の患者は、ＬＡＲにおけるＡＵＣで大きな向上を示し、またＳＢ０１０治療後のＥＡＲに対する明白な効果を示した（図２Ｂおよび補足用添付資料のＳ３Ａ）。ＬＡＲにおけるＡＵＣの低下は、ＳＢ０１０群において４１．７％弱まった（（Ｐ＝０．０５）表Ｓ３Ａ）。これに伴って、ＥＡＲが２８．３％弱まった（Ｐ＝０．０２）。ＳＢ０１０およびプラセボ治療後のＡＵＣにおける個々の変化を図３（および補足用添付資料の表Ｓ４ＡおよびＳ４Ｂ）に示す。類似の観察が、ベースラインでＦｅＮＯ≧４０ｐｐｂの亜群で報告された（図２Ｃ、補足用添付資料の表Ｓ３Ｂ）。亜群の層間の不均質性についての試験は有意ではなかった。
【００６３】
ＴＨ２型炎症のマーカーでの干渉
２８日間の治療の後、ＳＢ０１０はアレルゲン誘発型の喀痰中好酸球増加をプラセボよりも弱めたが、この差は研究群全体では統計的有意性を有しておらず（Ｐ＝０．０６）、しかし、血中好酸球が≧４％（Ｐ＝０．００９）およびＦｅＮＯ≧４０ｐｐｂ（Ｐ＝０．０２）の事前に特定された亜群では有意となった。喀痰中好酸球増加の変化に伴って、血中ＩＬ−５レベルに有意差があった（Ｐ＝０．０５）（図４）。プラセボ群において観察された、ＩＬ−５レベルの治療後の増大は、ＳＢ０１０治療後では見られなかった。２８日間の治療期間の最後に、ＳＢ０１０治療群（中央値６．３９  ＩＱＲ  ２．０３〜１３．８８ｎｇ／ｍＬ）の喀痰中トリプターゼレベルは、プラセボ（中央値１３．１０  ＩＱＲ  ６．０５〜２２．７７ｎｇ／ｍＬ）と比較して有意に（Ｐ＝０．０５）低かった。チャレンジの２４時間後のアレルゲン誘発型ＦｅＮＯレベルおよびメタコリンに対する気道過敏症は、研究治療によって影響されないままであった（補足用添付資料の表Ｓ５）。
【００６４】
安全性および忍容性
治療中に発生した有害事象（ＴＥＡＥ）における注目すべき差は、ＳＢ０１０またはプラセボを投与された患者の間で見られなかった。プラセボ群において、８人の患者がＴＥＡＥを有し、それと比較して、ＳＢ０１０群では６人の患者であった（表３）。重篤なＴＥＡＥはなく、いかなる考えらえるまたは確かなＳＢ０１０関連ＴＥＡＥもなかった。２人の患者における２つのＴＥＡＥ（吐き気およびそう痒症）が、ＳＢ０１０に関連する可能性があった。重篤なＴＥＡＥはなかった。他の安全性変数は、補足用添付資料にリストされた全ての安全性エンドポイントを含むいかなる安全性の懸念も明らかにしなかった。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１β、ＭＤＣ、およびＩＰ−１０の治療前後の測定は、研究群間での有意差を明らかにせず（補足用添付資料の表Ｓ７）、リウマチ性血清学および検出された抗核抗体における有意な増大も明らかにせず、これらは合わせて、自然免疫活性化の不存在およびオフターゲット効果の不存在を示す。
【００６５】
考察
吸入型気管支アレルゲンチャレンジは、アレルギー性炎症および気管支収縮のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて広く認められており１８、早期臨床試験におけるＬＡＲの治療的阻害は、薬剤開発プログラムの後期段階における臨床的有効性についての合理的に良好な予測因子である２４。例には、ＩＬ−４２５、２６、２７、ＩＬ−５２８、２９、３０、ＩＬ−１３３１、３２、およびＴＳＬＰ３３などのＴＨ２サイトカインの経路の標的化が含まれる。この研究において、ＳＢ０１０での治療は、アレルゲン吸入後のＥＡＲおよびＬＡＲの両方の間で肺機能を有意に向上させた。ＳＢ０１０は転写因子ＧＡＴＡ−３を特異的かつ選択的に標的化するため、これらのデータは、ＧＡＴＡ−３依存性の重要性、およびＴＨ２型喘息フェノタイプを有する患者におけるアレルゲン吸入後の喘息反応における調節された経路６を強くサポートし、ＳＢ０１０がアレルギー性喘息の有望な治療であることを示唆する。
【００６６】
本発明の患者は、増加した血中および喀痰中好酸球ならびに増加したＦｅＮＯレベルによって示される典型的なＴＨ２型エンドタイプを有する、軽症のアレルギー性喘息を有していた３４、３５。この２型エンドタイプは、プロトタイプのアトピー性およびアレルギー性喘息に存在するだけでなく、好酸球増加性の遅発型喘息、持続性かつ重度の喘息、およびアスピリン感受性喘息を含む、他の臨床的喘息フェノタイプにおいても最近見られている５、３６、３７。組み入れ基準は、このエンドタイプ（例えば「喀痰中好酸球の存在」のみ）を有する広範囲の患者を網羅するように規定され、肺機能データは、ＳＢ０１０がこの研究群に対する有意な効果を全体として有していたことを示す。しかし、事前に特定された亜群の分析において、さらに明白なＴＨ２型フェノタイプ（少なくとも４％の血中好酸球レベルまたは少なくとも４０ｐｐｂのＦｅＮＯレベル）を有する患者が、ＳＢ０１０治療の利益を特異的に受けることが分かった。ＬＡＲに対するさらに明白な治療効果に加えて、ＥＡＲもまた、有意な弱まりを示した。喘息反応の両方の相にわたるこの二重作用様式は、抗ＩｇＥ以来のいかなる生物学的薬剤候補３８、最近では抗ＴＳＬＰ３３でも報告されていない。ＳＢ０１０治療が重篤な憎悪の傾向がある患者に特に有利であるかどうかは、近々行われる臨床試験で調べる必要がある３６。ＴＨ２反応の調節におけるＧＡＴＡ−３の中心的役割は、良く確立されている。ＴＨ２エフェクター機能の発生および維持の両方は、ＧＡＴＡ−３に大きく依存している３９。さらに最近では、ＧＡＴＡ−３の必須の機能が２型自然リンパ球において同定された４０。しかし、この転写因子はまた、ＴＨ２−細胞サブセットを大きく上回る重要な機能も発揮する。ＧＡＴＡ−３はまた、マスト細胞３９、好酸球４１、および気道上皮細胞においても発現され、ここで、ＧＡＴＡ−３は、アレルゲン誘発型アレルギー性反応に関連する重要な機能およびエフェクターメカニズムを制御する４２、４３。アレルゲンチャレンジ後、ＥＡＲは、マスト細胞の脱顆粒に依存し、一方、ＬＡＲは、選択的にＴ細胞依存性であり、気道および気道内腔への好酸球の顕著な流入を伴うと考えられる。マスト細胞トリプターゼは、マスト細胞の活性化およびマスト細胞の脱顆粒を反映する、信頼性がありロバストなマーカーである。この結果は、ＳＢ０１０治療が喘息反応のこれらのエフェクター細胞に直接的または間接的に影響することを示す。ＳＢ０１０がこの阻害機能および調節機能を二重様式で行う可能性が高く、これら両方は、ＴＨ２細胞を調節し、ひいてはエフェクター細胞から生存因子および活性化因子を奪うことによるもの、ならびに局所の炎症組織内の好酸球およびマスト細胞におけるＧＡＴＡ−３  ｍＲＮＡへの直接的な干渉を介するものであるが、さらなる機械論研究が、ＧＡＴＡ−３  ＤＮＡザイム治療の全ての生物学的効果を完全に明らかにするために必要である。
【００６７】
この研究において曝露された患者は、第Ｉ相プログラムの間に曝露された個体と組み合わされて、そのうちの３９人が喘息を有していた１２０人を超える個体における１２００超の適用の安全性データベースを構成する。安全性シグナルは臨床開発の間にこれまで検出されておらず、広範囲の非臨床的プログラムの結果と一致する。結論として、この概念実証試験は、アレルゲン誘発後の即時相喘息反応および遅発相喘息反応の両方を有意に弱めた、吸入型ＤＮＡザイムＳＢ０１０治療の有効性を証明する。さらなる臨床研究によって、これらの効果が、主要なＴＨ２フェノタイプを有する症候性で持続性の喘息患者における臨床的利益となるかどうかが調べられる。
【００６８】
【表１】
2018515611.tif 000003
【００６９】
全てのデータは、喀痰中好酸球（中央値、第１および第３四分位数）を除いて、平均（ＳＤ）で表す。呼気一酸化窒素濃度（ＦｅＮＯ）、気道過敏症（ＰＣ２０）、血中好酸球、および誘発喀痰中好酸球を、ランダム化の前に測定した。喀痰中好酸球値は、ＳＢ０１０ではｎ＝２０、プラセボ群ではｎ＝１７にそれぞれ基づく。Ｐ値はウィルコクソンの順位和検定に従った（材料および方法を参照されたい）。
【００７０】
【表２】
2018515611.tif 000004
【００７１】
全てのデータは平均（ＳＤ）で表す。呼気一酸化窒素濃度（ＦｅＮＯ）、気道過敏症（ＰＣ２０）、血中好酸球、および誘発喀痰中の好酸球を、ランダム化の前に測定した。Ｐ値はウィルコクソンの順位和検定に従った（材料および方法を参照されたい）。
【００７２】
【表３】
2018515611.tif 000005
【００７３】
遅発型喘息反応（ＬＡＲ）および即時型喘息反応（ＥＡＲ）についての曲線下面積（ＡＵＣ）の平均値を示す。治療前から治療後のＡＵＣ値の低下は、肺機能の向上を反映する。ＡＵＣの治療前および治療後の値と、その後の、ＳＢ０１０群およびプラセボ群それぞれについての肺機能の変化とを示す。これらの変化は、ＡＵＣの前後値として、および治療前と治療後との間の変化のパーセントとして表される。正の値は肺機能の向上を反映し、負の値は、治療前と比較して大きな、治療後チャレンジでの曲線下面積に対応する。完全なデータセットについては、補足用添付資料の表Ｓ２を参照されたい。
【００７４】
【表４】
2018515611.tif 000006
【００７５】
補足用添付資料：吸入型ＧＡＴＡ−３特異的ＤＮＡザイムによるアレルゲン誘発型喘息反応の弱まり
材料および方法
組み入れおよび排除の基準
組み入れ基準
１．成人男性の白人患者、年齢≧１８および≦６０歳。
２．スクリーニングの少なくとも６カ月前の、軽症喘息（ＧＩＮＡガイドライン２００８に従った）の臨床診断。吸入型ｓｈｏｒｔ７５作用性気管支拡張薬を除いて喘息治療を伴わない。
３．吸入型短時間作用型気管支拡張薬を少なくとも６時間洗い流した後の予測正常値（ＥＣＳＣ）の、ＦＥＶ１≧７０％のスクリーニングＦＥＶ１値
４．患者は十分な誘発喀痰生産を示さなくてはならない。
５．一般的な空中アレルゲン（例えば、動物上皮、チリダニ）に対する正の皮膚プリックテスト（皮膚反応性）。
６．患者は、正のアレルゲン誘発型の即時相および遅発相気道気管支収縮を示さなくてはならない。
７．ＡＣおよびＭＣｈの前の全ての時点で、患者は予想される６５％を下回らないＦＥＶ１を示さなくてはならない。
８．スクリーニング時アレルゲンチャレンジの前または後（第１のまたは第２の誘発喀痰）の喀痰中好酸球の存在。
９.患者は、臨床試験の目的、方法、予想される利益および潜在的リスク、ならびに晒される不快について口頭および書面で説明されており、試験開始前、および試験に関連するあらゆる手順の前に、試験への参加についての同意を文書で提出している。
１０．患者は、理解、および文書のインフォームドコンセントの提出が可能であり、研究者の研究倫理委員会によって承認された文書のインフォームドコンセントフォームにサインしている。
１１．非喫煙者、または臨床研究が開始する少なくとも１年前に禁煙した＜１０パックイヤーの禁煙者。
１２．適切な様式で吸入する能力（患者は、スクリーニング訪問で、プラセボ薬剤を有するＡＫＩＴＡ２  ＡＰＩＸＮＥＢ（登録商標）装置から吸入する練習をする）。
１３．ＳＢ０１０の最後の投与後６カ月間にわたり子供を世話することを望まない男性のみがこの研究に組み入れられる。
【００７６】
排除基準
１．研究者の意見では試験への参加によって患者にリスクが与えられ得る、喘息以外の臨床的に重大な疾患（心血管疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、胃腸疾患、血液疾患、神経疾患、泌尿生殖器疾患、自己免疫疾患、内分泌疾患、代謝疾患など）、または研究結果もしくは患者が研究に参加する能力に影響する疾患の存在。
２．
・既知の活動性結核、
・間質性肺疾患または肺血栓塞栓性疾患の病歴、
・過去１２カ月間の肺の切除、
・喘息重積状態の病歴、
・呼吸器疾患に続く気管支拡張症（例えば、嚢胞性線維症、カルタゲナー症候群など）の病歴、
・最初の朝のＩＭＰ投与前４週間以内の、慢性気管支炎、気腫、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、または呼吸器感染の病歴、
などの、関連する肺疾患または胸部外科学的病歴の存在。
３．研究者によって判断される、吸入型短時間作用型の気管支拡張薬を除く併用療法中の患者。
４．研究訪問２、３、４、５、１１、および１２の前６時間の短時間作用型β２−アゴニストの使用。
５．スクリーニング前６カ月、スクリーニングと治療期間開始との間の、急性喘息での入院または緊急治療室での治療。
６．スクリーニング訪問前６カ月以内の喘息憎悪の管理のための、挿管（過去に）または２４時間を超える入院。
７．臨床的に関連するアレルギーまたは薬剤特異性の病歴または現在のエビデンス。
８．ネブライザー溶液のあらゆる活性成分または不活性成分に対するアレルギー反応の病歴。
９．臨床的関連のＥＣＧ異常。
１０．安静時心拍数が＜４５ｂｐｍ、収縮期血圧が＜１００ｍｍＨｇ、拡張期血圧が＜６０ｍｍＨｇの対象。
１１．起立性異常調節、失神、または一次的意識喪失の傾向。
１２．切除された基底細胞癌を除く、過去５年以内の悪性腫瘍の病歴。
１３．研究者によって判断される、臨床化学的、血液学的、またはあらゆる他の実験室変数における臨床的に関連する異常。
１４．ＡＣ前４週間での臨床的に関連する急性感染。
１５．臨床的に関連する慢性感染。
１６．急性または慢性感染性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＢ／Ｃ型肝炎ウイルス感染のウイルス学試験のいずれかにおける陽性の結果。
１７．正の薬剤スクリーン。
１８．アルコールまたは薬剤の乱用。
１９．正のコチニン試験。
２０．試験薬剤の最初の投与前３０日間以内または試験の治療期間の間の、あらゆる既知の酵素誘発剤または阻害剤（セイヨウオトギリ（セントジョーンズワート）、バルビツレート、フェノチアジン、シメチジン、ケトコナゾールなど）での治療。
２１．最初の試験薬剤投与前２週間以内、またはそれぞれの薬剤の半減期の＜１０倍以内、または薬力学的効果の期間のいずれか長い方での、あらゆる禁止併用薬の使用（生物製剤では、６カ月またはそれぞれの薬剤の半減期の１０倍）、あるいは治療期間の間の予想される併用薬。
２２．最初の試験薬剤投与前１４日以内および試験の治療期間の間の、酵素を誘発または阻害するあらゆる食物および飲料（例えば、ブロッコリー、芽キャベツ、グレープフルーツ、グレープフルーツジュース、スターフルーツなど）の消費。
２３．各研究訪問での最初の手順の６時間前の、あらゆるカフェイン含有製品の消費。
２４．飲み込まれた画分の薬剤吸収に干渉する消化管の外科手術（注：これは虫垂切除術またはヘルニア切開術などのマイナーな腹部手術には適用されない）。
２５．スクリーニング前最後の３０日以内の献血。
２６．試験期間中またはその後６カ月以内の、生殖細胞、血液、器官、または骨髄の計画的提供。
２７．最後の１カ月以内、またはそれぞれの薬剤の半減期の１０倍以内の、研究薬剤または装置を用いる別の臨床試験への参加。生物製剤では、この試験に組み入れられる前の最短期間は、少なくとも６カ月、または薬力学的効果の期間、またはそれぞれの薬剤の半減期の１０倍である。
２８．インフォームドコンセントを提出する能力もしくは意志の欠如、または適切に協力できないこと。
２９．試験訪問／手順が不可能であることが予想される。
３０．弱い対象（例えば、拘留されている人）。
３１．研究箇所の従業員、研究者の親戚または配偶者。
【００７７】
Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ実験
Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ実験を、ＧＡＴＡ−３  ＤＮＡザイムの切断活性および特異性を実証するために行った。生物活性および作用様式を、末梢血Ｔ細胞および副鼻腔組織断片を粘膜気道組織のモデルとして用いて、細胞培養実験において評価した。
【００７８】
・切断アッセイ（補足用添付資料の図Ｓ２）
ＤＮＡザイムのＲＮＡ切断触媒活性の分析を、以前に記載されているようなｉｎ−ｖｉｔｒｏ切断アッセイを用いて行った（Ｓｅｌら、ＪＡＣＩ  ２００８）。簡潔に述べると、２μｌのｉｎ−ｖｉｔｒｏで転写されたＧＡＴＡ−３コピー（ｃ）ＲＮＡ（２５０ｎｇ／μｌ）を、４μｌのＲＮＡｓｅを含有しない水、１μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、１μｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１μｌの５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４の混合物に添加した。１μｌのそれぞれのＤＮＡザイム（ｈｇｄ４０、スクランブルされた結合領域を有するが無傷の触媒性配列も有する、スクランブルされたＤＮＡザイム１〜６、転写因子Ｔｂｅｔ特異的ＤＮＡザイム１〜３）、または水（陰性対照）を添加し、混合物を３７℃でインキュベートした。別段の指示がない限り、ＤＮＡザイムは１０μＭの濃度でアプライされ、標準的なインキュベーション時間は６０分であった。その後、反応混合物をアガロースゲルを用いて電気泳動によって分離し、標準的な手順を用いてエチジウムブロマイド染色によって視覚化した。
【００７９】
・患者および試料の収集（補足用添付資料の図Ｓ３、Ｃ〜Ｆ）
研究対象を、鼻ポリープを伴う慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）についての文書化された病歴、病理学的鼻内視鏡検査、および洞のＣＴスキャンに基づいて選択した。篩骨洞の試料を、Ｇｈｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＢｅｌｇｉｕｍにあるＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙで、現在の欧州および米国ガイドラインに従って、この研究と関係なく示される機能的内視鏡洞外科手術（ＦＥＳＳ）手順の間に、ｎ＝１６の患者（１６〜７２歳、中央値は４４歳、１１人の男性、５人の女性、８人のアトピー患者、および１０人の喘息患者）から回収した。全ての患者は参加前にインフォームドコンセントを提出し、研究は地方の倫理委員会によって承認された。メディエーターの測定に対する影響が考えられるいかなる経口または局所的薬剤の使用も、外科手術の少なくとも４週間前に全ての対象において止められた。
【００８０】
・副鼻腔組織断片の調製および治療（補足用添付資料の図Ｓ３、Ｃ、およびＤ）
患者から鼻ポリープを外科的に切除した直後に、それぞれ約０．９ｍｍ３の組織断片を、副鼻腔外植片を切断することによって調製した。組織断片をＲＰＭＩ−１６４０培地内に懸濁し、組織培養培地（ＴＣＭ）のみまたは４ｍｇ／ｍｌのＤＮＡザイムｈｇｄ４０と、６時間（ＲＮＡ）および２４時間（タンパク質）インキュベートした。次いで、組織断片および上清を液体窒素瞬間冷凍し、タンパク質およびｍＲＮＡ分析まで−２０℃／−８０℃で保存した。ＤＮＡザイムｈｇｄ４０の取り込みを調べるために、組織断片を、ＴＣＭのみまたは４ｍｇ／ｍｌのローダミン６Ｇで標識されたｈｇｄ４０と、リポフェクタミントランスフェクション試薬の存在下で、２４時間インキュベートした。次いで、組織断片を包埋し、すぐに液体窒素瞬間冷凍し、５μｍの切片に切断した。切片を、製造者の推奨に従って、ＣＤ３マーカーについて染色した。その後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いてスライドを評価した。
【００８１】
・極性Ｔｈ２細胞の生成およびトランスフェクション（補足用添付資料の図Ｓ３、Ａ、およびＢ）
ナイーブヒトＣＤ４＋細胞を全血またはバフィーコートから、フィコール勾配遠心分離、およびナイーブＣＤ４  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を製造者の指示に従って用いた濃縮によって単離した。単離された細胞を、以前に記載されているように、ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）、および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）の存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で１０日間刺激することによって、Ｔｈ２細胞に極性化した。極性化の後、Ｔｈ２細胞を、ＦＡＭ標識されたヒトＧＡＴＡ−３特異的ＤＮＡザイムｈｇｄ４０またはＦＡＭ標識されたスクランブルされた対照ＤＮＡザイムＯＤＮｇ３を用いて、Ａｍａｘａ系を用いるエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を再播種し、２２時間インキュベートした。
【００８２】
・極性Ｔｈ２細胞におけるＧＡＴＡ−３発現分析（補足用添付資料の図Ｓ３Ａ）
インキュベーション期間の後、トランスフェクトされた細胞を採取し、ＧＡＴＡ−３タンパク質発現について蛍光フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析によって分析した。つまり、細胞を、ＧＡＴＡ−３タンパク質について、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識されたマウス抗ＧＡＴＡ抗体（Ｃｌｏｎｅ  Ｌ５０−８２３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ」（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の指示に従って用いて、細胞内染色した。分析のために、ゲートを正にトランスフェクトされた細胞にセットし、ＧＡＴＡ−３の発現レベルをこれらの細胞における幾何平均レベルとして判定した。ＦＡＭの正値性によって制御される、トランスフェクトされた細胞におけるＧＡＴＡ−３タンパク質発現の幾何平均レベルを、ｈｇｄ４０でトランスフェクトされた細胞と対照でトランスフェクトされた細胞との間で比較した。
【００８３】
・副鼻腔組織断片におけるＧＡＴＡ−３遺伝子発現（補足用添付資料の図Ｓ３Ｅ）
６時間のインキュベーション時間の後、総ＲＮＡをＡｕｒｕｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて抽出し、ｃＤＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で合成した。リアルタイムＰＣＲ増幅を以下の条件で行った：９５℃で１０分間、その後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で１０秒を４５サイクル、そして６０℃から９５℃での解離曲線分析。β−アクチン（ＡＣＴＢ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１、および伸長因子１を、正規化のための内部参照として使用した。
【００８４】
・ＩＬ−５タンパク質測定（補足用添付資料の図Ｓ３Ｆ）
２４時間のインキュベーション期間の後、上清を回収し、ＩＬ−５の濃度を、市販されているＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  ＭＡＰ  Ｋｉｔｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ）を製造者のガイドラインに従って用いてＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで測定し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ２００  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。検出限界は１．５ｐｇ／ｍｌであった。
【００８５】
・ＩＬ−１３分泌アッセイ（補足用添付資料の図Ｓ３Ｂ）
ＩＬ−１３放出の分析のために、トランスフェクトされた細胞を、１μｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で２２時間刺激した。ＩＬ−１３の分泌を、ＩＬ−１３分泌アッセイ検出キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を製造者の指示に従って用いて、ＦＡＣＳ分析によって検出した。分析のために、ゲートは正にトランスフェクトされた細胞にセットし、ＩＬ−１３の発現レベルを、これらの細胞における幾何学的平均レベルとして判定した（ＧｅｏＭｅａｎ）。ＦＡＭの正値性によって制御される、トランスフェクトされた細胞におけるＩＬ１３タンパク質の発現の幾何学的平均レベルを、ｈｇｄ４０でトランスフェクトされた細胞と対照でトランスフェクトされた細胞との間で比較した。
【００８６】
安全性エンドポイント
以下の臨床化学的パラメータを評価した：クレアチニン、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、アラニンアミノ基転移酵素、アスパルテートアミノ基転移酵素、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、総タンパク質、尿酸、尿素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物、グルコース（空腹時）、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびクレアチンホスホキナーゼ。血液学的パラメータは、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球数、白血球分画を伴う白血球数（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球）、および血小板数、活性化部分トロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間、ＩＮＲ、フィブリノーゲンであった。以下の尿検査パラメータを評価した：白血球、亜硝酸塩、ｐＨ、タンパク質、グルコース、ケトン、ウロビリノーゲン、ビリルビン、血液（ヘモグロビンおよび赤血球）。以下のＥＣＧパラメータを記録した：１２誘導ＥＣＧを、背臥位で５分休んだ後に、ＥｉｎｔｈｏｖｅｎおよびＧｏｌｄｂｅｒｇｅｒに従った導出、ならびにＷｉｌｓｏｎに従った６胸部導出を用いて記録した。
【００８７】
統計分析
統計分析を、ＦＧＫ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＧｍｂＨ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるＳＡＳ（バージョン９．３）ソフトウェアを用いて行った。図Ｓ２を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５．０）ソフトウェアを用いて作製した。
【００８８】
図Ｓ１の考察：
アレルゲン曝露の後、気道樹状細胞は、ＴＳＬＰ、ＩＬ２５、およびＩＬ−３３、および最初のＩＬ−４（例えば、２型自然リンパ球［ＩＬＣ２］によって生産された）などの上皮由来サイトカインの影響下でＴｈ２細胞に分化するＴｈ０細胞に対するアレルゲンを表す。ＧＡＴＡ−３は、Ｔｈ２の分化および活性化のマスター転写因子であり、Ｔｈ２サイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３の生産に不可欠である。これらのサイトカインの放出によって、Ｔｈ２細胞は、Ｂ細胞によるＩｇＥの生産とその後のマスト細胞への結合、好酸球の動員および活性化、ならびに杯細胞過形成の発症などの、いくつかのエフェクターメカニズムを伴う。これらのエフェクター細胞によって放出されるメディエーターは、炎症をさらに促進し、平滑筋収縮および粘液生産ならびにその後の気道狭窄および血管漏出をもたらす。ＳＢ０１０は、Ｔｈ２細胞内のＧＡＴＡ−３のメッセンジャーＲＮＡを特異的に切断することによって、このプロセスの非常に上流に干渉する。その結果、ＧＡＴＡ−３タンパク質はあまり生成されず、このタンパク質は次いで、転写Ｔｈ２サイトカインを十分にトランス活性化しない可能性があり、その後、全ての下流プロセスが阻害される。Ｔｈ２細胞におけるＳＢ０１０の作用と同様に、ＳＢ０１０はまた、ＩＬＣ２、マスト細胞、および好酸球などの他のＧＡＴＡ−３発現細胞におけるＧＡＴＡ−３の生産を抑制でき、これに伴い、マスト細胞および好酸球における２型サイトカインの放出ならびにエフェクター分子の生産が下流で阻害される。図Ｓ１はさらに、ＳＢ０１０の活性化合物であるｈｇｄ４０の生物活性を示す。ＳＢ０１０における活性なＧＡＴＡ−３  ＤＮＡザイムであるｈｇｄ４０の、ＧＡＴＡ−３発現に対する直接的かつ特異的な効果および下流の生物学的効果についての明らかな証拠がある。一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｓｉｔｕ実験は、ＳＢ０１０の作用態様を明らかに実証し、その結果は図Ｓ２およびＳ３として含められる（技術的詳細については、補足用添付資料を参照されたい）。初めに、ＳＢ０１０における活性なＧＡＴＡ−３  ＤＮＡザイムであるｈｇｄ４０の特異的な活性を、１０−２３ＤＮＡザイムの触媒活性を判定するための高度に特異的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である切断アッセイ（追加の図Ｓ２）を用いて示した。このために、本ケースではヒトＧＡＴＡ−３  ｃＲＮＡである、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたコピーＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を、ＤＮＡザイムとインキュベートした。このインキュベーションの間、活性ＤＮＡザイムは標的ｃＲＮＡを２つの切断産物に触媒的に切断し、これはアガロースゲル電気泳動によって実証される。一連の切断アッセイ分析に基づいて、ＳＢ０１０における活性成分であるｈｇｄ４０が、ＧＡＴＡ−３  ｃＲＮＡ切断活性に関して最も活性なＤＮＡザイムであることが明らかになった。ｈｇｄ４０は、用量および時間依存的にＧＡＴＡ−３  ｃＲＮＡを切断することが示された（図Ｓ２ＡおよびＳ２Ｂ）。切断は、ＧＡＴＡ−３  ｃＲＮＡに対するＧＡＴＡ−３非特異的ＤＮＡザイムの有効性の分析によって実証されるように、高度に配列特異的である（図Ｓ２Ｃ）。ｈｇｄ４０が低濃度でも（０．５μＭ  ｈｇｄ４０）一本鎖ＲＮＡを特異的に切断すること、および高濃度でも（２０μＭ  ｈｇｄ４０）二本鎖ＤＮＡを切断しないことも実証された。さらに、自然免疫細胞の活性化などの望ましくないオフターゲット効果または細胞が関与するアレルギー性エフェクターメカニズムは事前に排除された（例えば、非特許文献５参照。）。その後、本発明者らは、ヒトの細胞および組織材料におけるこの分子の生物活性を実証した（追加の図Ｓ３）。ｈｇｄ４０でのヒト極性化ＣＤ４＋ＴＨ２細胞のトランスフェクションは、ＧＡＴＡ−３タンパク質の発現およびその後のＩＬ−１３生産を、スクランブルされた対照ＤＮＡザイムＯＤＮｇ３でトランスフェクトされた細胞と比較して有意に抑制した（図Ｓ３Ａ、Ｓ３Ｂ）。次に、アトピー性喘息患者から得た鼻組織移植片を、ｈｇｄ４０  ＤＮＡザイムとインキュベートした。図３Ｃおよび３Ｄに示すように、ｈｇｄ４０をＣＤ３＋およびＣＤ３−細胞によって移植片内に取り込み、６時間以内のＧＡＴＡ−３  ｍＲＮＡレベルを有意に低減させ（図Ｓ３Ｅ）、同時に、２４時間目のＩＬ−５の生産を有意に低減させた（図Ｓ３Ｆ）。
【００８９】
補足用添付資料の表Ｓ１．アレルゲン誘発に使用したアレルゲン
【００９０】
【表５】
2018515611.tif 000007
【００９１】
補足用添付資料の表Ｓ２．治療前後のアレルゲンチャレンジ後の遅発相および即時相反応における変化−肺機能データの完全なセット
【００９２】
【表６】
2018515611.tif 000008
【００９３】
表Ｓ２の説明文：治療前後のアレルゲンチャレンジ後の遅発相および即時相反応における変化−肺機能データの完全なセット
アレルゲン誘発を、治療の前（前）および２８日後（後）にＳＢ０１０またはプラセボで行った。遅発型喘息反応（ＬＡＲ）および即時型喘息反応（ＥＡＲ）についての曲線下面積（ＡＵＣ）の平均値を示す。治療前から治療後のＡＵＣ値の低下は、肺機能の向上を反映する。治療前後の値のＡＵＣと、その後の、ＳＢ０１０群およびプラセボ群それぞれについての肺機能の変化とを示す。これらの変化は、ＡＵＣの前後値として、および治療前と治療後との間の変化パーセントとして表される。正の値は肺機能の向上を反映し、負の値は、治療前と比較して大きな、治療チャレンジ後の曲線下面積に対応する。群の差は、ＳＢ０１０群とプラセボ群との間の相対的変化のデルタを示す。ＬＡＲ  ＡＵＣのＰ値ならびにＬＡＲおよびＥＡＲにおける最大ＦＥＶ１の低下はＡＮＣＯＶＡモデルによって計算し、ＥＡＲ  ＡＵＣのＰ値はウィルコクソンの順位和検定によって計算した。
【００９４】
補足用添付資料の表Ｓ３Ａ．治療前後のアレルゲンチャレンジ後の遅発相および即時相反応における変化−血中好酸球が≧４％の患者の事前に特定された亜群の分析
【００９５】
【表７】
2018515611.tif 000009
【００９６】
表Ｓ３Ａの説明文：治療前後のアレルゲンチャレンジ後の遅発相および即時相反応における変化−血中好酸球が≧４％の患者の事前に特定された亜群の分析
アレルゲン誘発を、治療の前（前）および２８日後（後）にＳＢ０１０またはプラセボで行った。遅発型喘息反応（ＬＡＲ）および即時型喘息反応（ＥＡＲ）についての曲線下面積（ＡＵＣ）の平均値を示す。治療前から治療後のＡＵＣ値の低下は、肺機能の向上を反映する。治療前後の値のＡＵＣと、その後の、ＳＢ０１０群およびプラセボ群それぞれについての肺機能の変化とを示す。これらの変化は、ＡＵＣの前後値として、および治療前と治療後との間の変化パーセントとして表される。正の値は肺機能の向上を反映し、負の値は、治療前と比較して大きな、治療チャレンジ後の曲線下面積に対応する。群の差は、ＳＢ０１０群とプラセボ群との間の相対的変化のデルタを示す。ＬＡＲ  ＡＵＣのＰ値はＡＮＣＯＶＡモデルによって計算し、ＥＡＲ  ＡＵＣのＰ値ならびにＬＡＲおよびＥＡＲにおける最大ＦＥＶ１の低下はウィルコクソンの順位和検定によって計算した。
【００９７】
補足用添付資料の表Ｓ３Ｂ。治療前後のアレルゲンチャレンジ後の遅発相および即時相反応における変化−ＦｅＮＯ≧４０ｐｐｂの患者の事前に特定された亜群の分析
【００９８】
【表８】
2018515611.tif 000010
【００９９】
表Ｓ３Ｂの説明文：治療前後のアレルゲンチャレンジ後の遅発相および即時相反応における変化−ＦｅＮＯ≧４０ｐｐｂの患者の事前に特定された亜群の分析
アレルゲン誘発を、治療の前（前）および２８日後（後）にＳＢ０１０またはプラセボで行った。遅発型喘息反応（ＬＡＲ）および即時型喘息反応（ＥＡＲ）についての曲線下面積（ＡＵＣ）の平均値を示す。治療前から治療後へのＡＵＣ値の低下は、肺機能の向上を反映する。治療前後の値のＡＵＣと、その後の、ＳＢ０１０群およびプラセボ群それぞれについての肺機能の変化とを示す。これらの変化は、ＡＵＣの前後値として、および治療前と治療後との間の変化パーセントとして表される。正の値は肺機能の向上を反映し、負の値は、治療前と比較して大きな、治療チャレンジ後の曲線下面積に対応する。群の差は、ＳＢ０１０群とプラセボ群との間の相対的変化のデルタを示す。ＬＡＲ  ＡＵＣのＰ値ならびにＬＡＲおよびＥＡＲにおける最大ＦＥＶ１の低下はＡＮＣＯＶＡモデルによって計算し、ＥＡＲ  ＡＵＣのＰ値はウィルコクソンの順位和検定によって計算した。
【０１００】
補足用添付資料の表Ｓ４Ａ：アレルゲンチャレンジに対する個体反応、遅発相喘息反応（ＬＡＲ、３〜７時間）
【０１０１】
【表９】
2018515611.tif 000011
【０１０２】
補足用添付資料の表Ｓ４Ｂ：アレルゲンチャレンジに対する個々の即時相喘息反応（ＥＡＲ、０〜３時間）
【０１０３】
【表１０】
2018515611.tif 000012
【０１０４】
補足用添付資料の表Ｓ５．チャレンジ後のＦｅＮＯおよびＰＣ２０レベルに対する２８日間のＳＢ０１０またはプラセボ治療の効果
【０１０５】
【表１１】
2018515611.tif 000013
【０１０６】
表Ｓ５の説明文：チャレンジ後のＦｅＮＯおよびＰＣ２０レベルに対する２８日間のＳＢ０１０またはプラセボ治療の効果
ＦｅＮＯおよびＰＣ２０レベルに対する２８日間のＳＢ０１０またはプラセボ治療の効果。ＦｅＮＯレベルの測定および気道過敏症（ＰＣ２０）の評価は、２８日間のＳＢ０１０またはプラセボ治療の前後のアレルゲンチャレンジの後に行った。ＦｅＮＯレベルはｐｐｂで表され、ＰＣ２０はメタコリンｍｇ／ｄｌで表される。Ｐ値は、ウィルコクソンの順位和検定によって計算した。
【０１０７】
補足用添付資料の表Ｓ６．チャレンジされていないＦｅＮＯレベルに対する２８日間のＳＢ０１０またはプラセボ治療の効果
【０１０８】
【表１２】
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【０１０９】
表Ｓ６の説明文：チャレンジされていないＦｅＮＯレベルに対する２８日間のＳＢ０１０またはプラセボ治療の効果
ＦｅＮＯはベースラインのアレルゲンチャレンジ前および治療前に測定し、その後、６０日の追跡期間の最後の８８日目に測定した。インテンション・トゥ・トリート研究集団について、および血中Ｅｏｓ≧４％かつベースラインＦｅＮＯ≧４０ｐｐｂの事前に特定された亜群についての中央値および四分位範囲（ＩＱＲ）が示される。Ｐ値はウィルコクソンの順位和検定によって計算した。
【０１１０】
補足用添付資料の表Ｓ７：安全性バイオマーカー
【０１１１】
【表１３】
2018515611.tif 000015
【０１１２】
補足用添付資料の表Ｓ８：喀痰における白血球分画  −  喀痰１ｇ中の細胞×１０６で表される
【０１１３】
【表１４】
2018515611.tif 000016
【０１１４】
表は、平均値＋標準偏差／治療前後それぞれのアレルゲン変化後を示す。
【０１１５】
補足用添付資料の表Ｓ９：研究エンドポイントのリスト
【０１１６】
【表１５】
2018515611.tif 000017
【０１１７】
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【図１Ａ】
2018515611.tif 000018
【図１Ｂ】
2018515611.tif 000019
【図２Ａ】
2018515611.tif 000020
【図２Ｂ】
2018515611.tif 000021
【図２Ｃ】
2018515611.tif 000022
【図３】
2018515611.tif 000023
【図４】
2018515611.tif 000024
【図５】
2018515611.tif 000025
【図６】
2018515611.tif 000026
【図７】
2018515611.tif 000027
【図８】
2018515611.tif 000028
【図９】
2018515611.tif 000029
【国際調査報告】
2018515611.tif 000030
2018515611.tif 000031
2018515611.tif 000032
2018515611.tif 000033
2018515611.tif 000034