(57)【要約】血栓形成を防止するための組成物および方法は、アンチトロンビンおよびヘパリンを含み得る。一例では、ヘパリンの少なくとも５０重量％がアンチトロンビンにコンジュゲートしている、アンチトロンビンおよびヘパリンのコンジュゲートが存在し得る。さらに、一例では、組成物におけるヘパリンの少なくとも９８重量％は、３，０００ダルトン超の分子量を有する。上記ヘパリンの少なくとも９５重量％は、１８個またはそれ超の単糖を含有する鎖を含み得る。
2018513217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチトロンビンおよびヘパリンを含む、血栓形成を防止するための組成物であって、前記ヘパリンの少なくとも５０重量％が、アンチトロンビンにコンジュゲートしており、前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９８重量％が、３，０００ダルトン超の分子量を有する、組成物。
【請求項２】
前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９５重量％が、５，０００ダルトン超の分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ヘパリンの少なくとも９５重量％が、１８個またはそれ超の単糖を含有する鎖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヘパリンが、以下のように五糖配列を含有する鎖を含む：
【化２】
2018513217.tif 000009
請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記五糖配列に加えて、前記ヘパリンの少なくとも９５重量％が、１８個またはそれ超の単糖を含有する鎖を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９５重量％が、３０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９５重量％が、２０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ヘパリンが、連結剤で前記アンチトロンビンにコンジュゲートしている、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９９重量％が、３，０００ダルトン超および３０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ヘパリンの少なくとも７５重量％が、アンチトロンビンにコンジュゲートしている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ヘパリンの少なくとも９０重量％が、アンチトロンビンにコンジュゲートしている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
血栓形成を防止するための組成物を製造する方法であって、
アンチトロンビンを対象の体外のヘパリンとコンジュゲートさせるステップであって、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを形成するステップ；
前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを
ｉ）水のみ、および前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート、
ｉｉ）水、０．０１〜０．０９モルのアラニンおよび前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート、または
ｉｉｉ）水、マンニトールおよびアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート
を含む溶液中で製剤化するステップ；ならびに
前記溶液を凍結乾燥させて凍結乾燥アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを形成するステップ
を含む方法。
【請求項１３】
前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９８重量％が、３，０００ダルトン超の分子量を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９５重量％が、５，０００ダルトン超の分子量を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
３，０００ダルトン未満の分子量を有する前記ヘパリンの少なくとも一部が、前記コンジュゲートさせるステップの前に除去される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヘパリンの前記一部が、透析、透析濾過、ゲル濾過、電気泳動およびそれらの組合せから選択されるプロセスにより除去される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記コンジュゲートさせるステップの前に、３，０００ダルトン未満の分子量を有する前記ヘパリンの少なくとも９９重量％が除去される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヘパリンの前記少なくとも９９重量％が、透析、透析濾過、ゲル濾過、電気泳動およびそれらの組合せから選択されるプロセスにより除去される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートが、凍結乾燥および再懸濁後に、そのトロンビン阻害活性の少なくとも８０％を保つ、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
血栓形成を防止するための組成物であって、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの水溶液を含み、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートが、前記溶液の総体積に対して９〜１１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、組成物。
【請求項２１】
血栓形成を防止するための組成物を製造する方法であって、アンチトロンビンをヘパリンとコンジュゲートさせるステップであって、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを製造するために使用されるアンチトロンビンの開始濃度に対して少なくとも６０重量％である、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの収率を有するアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート組成物を形成するステップを含む方法。
【請求項２２】
前記少なくとも６０重量％の収率が、コンジュゲートしていないアンチトロンビンをリサイクルし、前記コンジュゲートしていないアンチトロンビンを追加のヘパリンと反応させることによって少なくとも部分的に達成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも６０重量％収率が、アマドリ転位触媒を導入して、前記触媒が、コンジュゲーション中に前記アンチトロンビンおよびヘパリンと共に存在するようにすることによって少なくとも部分的に達成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記触媒が、２−ヒドロキシピリジン、第三級アミン塩、マロン酸エチル、フェニルアセトン、酢酸およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも６０重量％収率が、アマドリ転位を促進する溶媒系において前記アンチトロンビンを前記ヘパリンとコンジュゲートさせることによって少なくとも部分的に達成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶媒系が、水、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、エタノール、ジメチルスルホキシド、ピリジン、酢酸、トリメチルアミン、トリエチルアミンおよびそれらの組合せから選択される溶媒を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも６０重量％収率が、前記アンチトロンビンを前記ヘパリンと連結剤を介してコンジュゲートさせることによって少なくとも部分的に達成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記連結剤が、ヒドラジン基およびアミノ基を含有する分子である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アンチトロンビンヘパリンコンジュゲートが、圧力透析により濃縮される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを
ｉ）水のみ、および前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート、
ｉｉ）水、０．０１〜０．０９モルのアラニンおよび前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートまたは
ｉｉｉ）水、マンニトール、および前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート
を含む溶液中で製剤化するステップ、ならびに
前記溶液を凍結乾燥させて凍結乾燥アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを形成するステップ
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記収率が、少なくとも８０重量％である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
アンチトロンビン、ヘパリン、およびアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含む、血栓形成を防止するための組成物であって、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート組成物が、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを製造するために使用されるアンチトロンビンの開始濃度に対して少なくとも６０重量％である、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの収率を有する、組成物。
【請求項３３】
血栓形成の防止が、同一の有効性で血栓形成を防止するために単独で使用されるヘパリンの投与量の２５重量％未満である投与量の前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを利用する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ヘパリンの少なくとも５０重量％が、アンチトロンビンにコンジュゲートしており、前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９８重量％が、３，０００ダルトン超の分子量を有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９５重量％が、５，０００ダルトン超の分子量を有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ヘパリンの少なくとも９５重量％が、１８個もしくはそれ超の単糖を含有する鎖を含む、または前記ヘパリンが、以下のように五糖配列を含有する鎖を含む：
【化３】
2018513217.tif 000010
またはその両方を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９５重量％が、３０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９５重量％が、２０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９９重量％が、３，０００ダルトン超および３０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ヘパリンの少なくとも７５重量％が、アンチトロンビンにコンジュゲートしている、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ヘパリンの少なくとも９０重量％が、アンチトロンビンにコンジュゲートしている、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４２】
状態または疾患を処置する方法であって、
それを必要とする哺乳動物に、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート組成物を投与するステップを含み、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート組成物が、
ｉ）アンチトロンビンにコンジュゲートしている前記ヘパリンを少なくとも５０重量％含み、前記組成物における前記ヘパリンの少なくとも９８重量％が、３，０００ダルトン超の分子量を有する；または
ｉｉ）アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの水溶液を含み、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートが、前記溶液の総体積に対して９〜１１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する；または
ｉｉｉ）アンチトロンビン、ヘパリン、およびアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含み、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート組成物が、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを製造するために使用されるアンチトロンビンの開始濃度に対して少なくとも６０重量％である、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの収率を有する、方法。
【請求項４３】
前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート組成物を投与するステップが、同一の有効性で前記状態または疾患を処置するために使用されるヘパリンの用量の２５重量％未満である用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート組成物を投与するステップが、１日につき前記哺乳動物の体重１キログラム当たり０．００１から５０ｍｇである用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与することを含む、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
ヘパリンは、ヘキスロン酸および２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースの交互配列から主になる硫酸化多糖である。ヘパリンおよび関連化合物のデルマタン硫酸は、血栓症および関連疾患の防止における臨床的使用のための抗凝固物質として、きわめて重要である。これらは、ヘキソサミンおよびウロン酸を含有する硫酸化反復二糖単位の直鎖であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ファミリーのメンバーである。ＧＡＧ（例えばヘパリンおよびデルマタン硫酸）を使用した抗凝固は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）、例えばアンチトロンビンＩＩＩ（本明細書では単に「アンチトロンビン」または「ＡＴ」と呼ばれる）およびヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣＩＩ）により凝固酵素（重大なものはトロンビンである）を阻害するそれらの触媒作用で進行する。触媒によるセルピンの結合は、その作用に重要であり、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の直鎖状炭水化物鎖に沿った特異的配列で発生する。ヘパリンは、五糖配列を介したＡＴへの結合により作用し、したがって、様々な凝固酵素（トロンビンの場合は、ヘパリンも酵素に結合する）の阻害を増強する。ヘパリンは、セルピンＨＣＩＩに結合することによりトロンビンの阻害も増強できる。デルマタン硫酸は、六糖配列を介してＨＣＩＩに特異的に結合することにより作用し、したがってトロンビンの阻害のみを増強する。グリコサミノグリカン（特にヘパリン）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで他の分子に結合できるか、または、様々な機構により作用部位から外れ得るので、ＧＡＧが共有結合でセルピンと持続的につながり続けることは有利であり得る。さらに詳細には、高い生物学的活性（例えば、抗凝固活性）および改善した薬物動態学的性質を保つ、ヘパリンおよび関連したグリコサミノグリカンの共有結合コンジュゲート、ならびにそれらの調製のための簡単な方法を提供することが望ましいであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００２】
【図１】図１は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００クロマトグラフィーカラムから溶出した、ヘパリンの各分画の吸光度（Ｈ２Ｏに対するＡ２１５）のグラフである。
【０００３】
【図２】図２は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００クロマトグラフィーカラムから溶出した、ヘパリンとコンジュゲートしているＡＴの分画、およびＡＴ単体の分画の吸光度のグラフである。
【０００４】
【図３】図３は、アンチトロンビン−ヘパリン共有結合複合体を調査する、４つの異なる反応の反応混合物の吸光度（Ｈ２Ｏに対するＡ４０５）のグラフである。
【０００５】
【図４】図４は、高（濃縮）塩溶液から凍結乾燥させたアンチトロンビン−ヘパリン共有結合複合体を調査する、３つの異なる反応の反応混合物の吸光度（Ｈ２Ｏに対するＡ４０５）のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
図は、いくつかの実施形態の例示にすぎず、それにより本技術の範囲を限定するものではないことに留意すべきである。
【０００７】
ここで、例示的な実施形態を参照し、特定の用語を使用して同実施形態を説明する。しかし、それによって意図される本開示の範囲が限定されるものではないことは理解され得る。当業者および本開示を手にする者であれば想到するであろう、本明細書に記載されている本発明の特徴の変更およびさらなる改変、ならびに本明細書に記載されている技術の原理の追加適用は、本開示の範囲内と考えられるべきである。さらに、特定の実施形態が開示され、記載される前に、本開示は、特定のプロセスに限定されず、本明細書で開示されている材料自体がある程度変動できることは理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態について記載する目的のみに使用され、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ定義されるので、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【０００８】
本技術についての説明および主張において、以下の専門用語が使用されることになる。
【０００９】
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうではないことを明確に指示しない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「添加剤」への言及は、そのような成分の１つまたは複数への言及を含み、「溶液」は、そのような材料の１つまたは複数への言及を含み、「混合するステップ」は、そのようなステップの１つまたは複数を指す。
【００１０】
本明細書で使用される場合、「実質的な」は、材料の数量もしくは量、またはその具体的な特性に関して使用される場合、材料または特性が提供するとされている効果を得るのに十分な量を指す。許容可能な偏差の正確な程度は、一部のケースでは、具体的な文脈に左右され得る。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「約」は、識別されている特定の性質に典型的な、実験の誤差に基づく偏差の程度を指す。「約」という用語に備わる自由度は、具体的な文脈および特定の性質に左右されることになり、当業者により容易に見分けられ得る。「約」という用語は、別の方法で特定の値が与えられ得る等価物の程度を拡張することも、限定することも意図されていない。さらに、特に述べられていない限り、「約」という用語は、範囲および数値データに関する以下の検討と一致する「正確に」を明確に含むものとする。
【００１２】
濃度、寸法、量および他の数値データは、ある範囲の形で本明細書に提示され得る。そのような範囲の形は、便宜上、簡潔に表現するために使用されているにすぎないことは理解されるべきであり、範囲の端点として明示されている数値を含むだけではなく、各数値および部分的範囲が明示されているように、その範囲内に包含される、すべての個々の数値または部分的範囲も含むと柔軟に解釈されるべきである。例えば、約１から約２００の範囲は、明示された端点の１および２００を含むだけではなく、個々の数、例えば２、３、４、および部分的範囲、例えば１０から５０、２０から１００なども含むと解釈されるべきである。
【００１３】
本明細書で使用される場合、複数の項目、構造的要素、組成要素および／または材料は、便宜上共通の列記として提示され得る。しかし、これらの列記は、列記の各要素が、別々および特有の要素として、個々に識別されているように受け取られるべきである。したがって、そのような列記の個々の要素は、反対の指示なしに共通のグループにおけるそれらの提示だけに基づく同列記の他のいずれかの要素の事実上の等価物と受け取られるべきではない。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「ヘキソース」は、６個の炭素原子を有する炭水化物（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）を指す。ヘキソースは、アルドヘキソース、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、イドース、グロース、タロース、アロースおよびアルトロースであってよく、これらの開鎖形態は、アルデヒド基を含有する。あるいは、ヘキソースは、ケトース、例えばフルクトース、ソルボース、アルロースおよびタガトースであってよく、これらの開鎖形態は、ケトン基を含有する。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「ウロン酸」は、炭水化物の第一級ヒドロキシル基の酸化により形成されるカルボン酸を指し、典型的には、それらが由来する炭水化物にちなんで名付けられる。したがって、グルコースのＣ６ヒドロキシルの酸化は、グルクロン酸を生じ、ガラクトースのＣ６ヒドロキシルの酸化はガラクツロン酸を生じ、イドースのＣ６ヒドロキシルの酸化はイズロン酸を生じる。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「ヘキソサミン」は、少なくとも１つのヒドロキシ基、典型的にはＣ２ヒドロキシ基が、アミンにより置き換えられているヘキソース誘導体を指す。アミンは、任意選択でアルキル化、典型的にはアセチル基によりアシル化（例えばムラミン酸を用いて）、スルホン化（ＯまたはＮ−硫酸化）、スルホニル化、リン酸化、ホスホニル化などされていてもよい。ヘキソサミンの代表的な例は、グルコサミン、ガラクトサミン、タガトサミン、フルクトサミン、それらの修飾した類似体などを含む。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「グリコサミノグリカン」は、ヘキソサミンおよびウロン酸を含有する、大規模な反復二糖単位の直鎖を指す。ヘキソサミンおよびウロン酸の正確な種類は大きく異なることがあり、それぞれの代表的な例は上の定義で得られる。二糖は、アルキル化、アシル化、スルホン化（Ｏ−またはＮ−硫酸化）、スルホニル化、リン酸化、ホスホニル化などにより任意選択で修飾され得る。そのような修飾の程度は、変動させてよく、ヒドロキシ基上であってもアミノ基上であってもよい。ごく通常では、Ｃ６ヒドロキシルおよびＣ２アミンは硫酸化される。鎖の長さは変動させてよく、グリコサミノグリカンは、２００，０００ダルトン超、典型的には１００，０００ダルトンまで、より典型的には５０，０００ダルトン未満の分子量を有し得る。グリコサミノグリカンは、典型的には、ムコ多糖として見出される。代表的な例は、ヘパリン、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ヒアルロン酸、Ｎ−アセチル単糖含有ポリマー（例えばＮ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびＮ−アセチルムラミン酸）など、ならびにガム、例えばアラビアガム、ガムトラガカントなどを含む。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、アルブミン、グロブリン（例えば、免疫グロブリン）、ヒストン、レクチン、プロタミン、プロラミン、グルテリン、ホスホリパーゼ、抗生物質タンパク質および硬タンパク質、ならびにコンジュゲートしているタンパク質、例えばリンタンパク質、色素タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、核タンパク質を含むが、それらに限定されない。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「セルピン」は、セリンプロテアーゼ阻害剤を指し、例えばアンチトロンビンおよびヘパリン補因子ＩＩなどの化学種が挙げられる。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「アミン」は、第一級アミン、ＲＮＨ２、第二級アミン、ＲＮＨ（Ｒ’）、および第三級アミン、ＲＮ（Ｒ’）（Ｒ”）を指す。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「アミノ」は、ＮＨまたはＮＨ２基を指す。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「イミン」は、Ｃ＝Ｎ基およびその塩を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、哺乳動物における状態および／または疾患の「処置」または「処置すること」という用語は、状態もしくは疾患を防止すること、すなわち、疾患のいかなる臨床症状も避けること；状態もしくは疾患を阻害すること、すなわち、臨床症状の発現もしくは進行を停止すること；および／または状態または疾患を緩和すること、すなわち、臨床症状の回復を引き起こすことを意味する。処置は、医学的手順の前、最中または後での投与を伴う、医学的手順に関連する本開示の組成物の使用も含む。
【００２４】
これに従って、本開示は、ヘパリンおよびアンチトロンビンコンジュゲートを調製するための組成物および方法、ならびに本開示の組成物を用いた対象の処置を対象とする。一例では、血栓形成を防止するための組成物は、アンチトロンビンおよびヘパリンを含み得、ヘパリンの少なくとも５０重量％は、アンチトロンビンにコンジュゲートしており、組成物におけるヘパリンの少なくとも９８重量％は、３，０００ダルトン超の分子量を有する。
【００２５】
別の例では、血栓形成を防止するための組成物を製造する方法は、アンチトロンビンを対象の体外のヘパリンとコンジュゲートさせるステップであって、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを形成するステップ；アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを溶液中で調製するステップ；およびアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを凍結乾燥させるステップを含み得る。この例では、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートは、例えば、水のみ、水および０．０１〜０．０９モルのアラニンまたは水およびマンニトールの溶液中に存在し得る。
【００２６】
別の例では、血栓形成を防止するための組成物は、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの水溶液であって、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートが溶液の総体積に対して９〜１１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、水溶液を含み得る。アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートは、アンチトロンビンを対象の体外のヘパリンとコンジュゲートさせることにより形成され得る。
【００２７】
さらに別の例では、血栓形成を防止するための組成物を製造する方法は、アンチトロンビンを対象の体外のヘパリンと含んで、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを形成することができ、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの収率は、反応に利用される開始アンチトロンビンの少なくとも６０重量％がヘパリンとのコンジュゲートとなる（すなわち、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを製造するために使用される）ように定義される。
【００２８】
なお別の例では、血栓形成を防止するための組成物は、アンチトロンビン、ヘパリンおよびアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含み得、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートは、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを製造するために使用される開始アンチトロンビンの少なくとも６０重量％の収率で存在する。
【００２９】
別の例では、状態または疾患を処置する方法は、それを必要とする哺乳動物に、本技術の例に従って調製されたアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含み得る。さらに詳細には、これらの処置は、そのような処置を必要とする対象、例えばヒトに、本開示のヘパリンおよびアンチトロンビンコンジュゲートを投与することによって実行され得る。本明細書に記載されているコンジュゲート組成物を使用して処置できる状態および疾患は、心筋梗塞および数々の血栓状態を含む。これらは、数例を挙げれば、新生児呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群、肺の原発癌、非ホジキンリンパ腫、線維性肺胞炎および肺移植で見出されるフィブリン沈着を含む。また、本組成物は、後天性ＡＴ欠乏状態、例えば新生児呼吸窮迫症候群、Ｌ−アスパラギナーゼにより誘導される欠乏、心肺バイパス法により誘導される欠乏、敗血症または先天性ＡＴ欠乏状態も処置できる。先天性ＡＴ欠乏のケースでは、ＡＴに加えてヘパリンを必要とするヘテロ接合体において、ＡＴが０．２５単位／ｍｌ未満のレベルである生命に関わる血栓性合併症は、米国において毎年乳児１または２名までに発生することがある。本開示において処置される状態および疾患は、過剰なトロンビン生成または活性により特徴付けられるものを含む。そのような状態は、対象が外傷を負っている場合、例えば手術患者において発生することが多い。創傷または手術によって引き起こされる外傷は、血管損傷および血液凝固の二次活性化をもたらす。これらの望ましくない影響は、一般的なまたは整形外科手術、婦人科手術、心臓もしくは血管手術または他の手術手技の後で発生し得る。過剰なトロンビンは、自然疾患、例えば心臓発作を引き起こし得るアテローム性動脈硬化症、卒中または四肢の壊疽の進行も悪化させ得る。したがって、本技術の方法および組成物を使用して、不安定狭心症、急性心筋梗塞（心臓発作）、脳血管障害（卒中）、肺塞栓症、深部静脈血栓症、動脈血栓症などを含む、いくつかの重要な心血管系合併症を処置、防止または阻害できる。本技術の組成物および方法を使用して、透析中の血液凝固を低下または防止でき、心臓切開手術手技中の血管内凝固を低下または防止できる。さらに詳細には、本開示の態様では、止血を妨害する医学的状態（例えば、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症など）による血栓が発生する危険性の高い患者におけるトロンビンの生成または活性を防止または阻害するための方法および組成物が提供される。別の態様では、医学的手順、例えば心臓手術、血管手術または経皮冠動脈インターベンション後に血栓が発生する危険性の高い患者に対する方法および組成物が提供される。実施形態では、本開示の方法および組成物は、心肺バイパス法手術に使用される。組成物は、医学的手順の前、最中または後で投与され得る。
【００３０】
次に、本開示に関連した様々な実施形態および詳細を検討すると、ヘパリンは、幅広い分子量の分子を含有する未分画形態で、容易に利用できることが知られている。ヘパリンをアンチトロンビンとコンジュゲートさせる前に、３，０００ダルトン未満の分子量を有するヘパリン分子の大半からすべてを除去することにより、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの活性を向上できる。追加の実施形態では、５，０００ダルトン未満の分子量を有するヘパリン分子は、大半から完全に除去できる。
【００３１】
低分子量ヘパリン分子が除去されたヘパリンを使用して形成されたアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートは、他のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートとは組成として異なる。低分子量ヘパリン鎖は、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート（ＡＴＨ）を合成するために、ＡＴとの反応前にヘパリンから除去してよい。したがって、ＡＴＨには、ＡＴにコンジュゲートしている低分子量ヘパリン鎖はない。
【００３２】
低分子量ヘパリン鎖は、ＡＴＨを形成するためにヘパリンとＡＴを反応させる前に、市販のヘパリンから除去してよい。これにより、ＡＴとの反応前に低分子量ヘパリンを除去しない未分画ヘパリンから形成されるＡＴＨとは、組成として異なるＡＴＨが生成される。さらに、未分画ヘパリンからＡＴＨを形成し、次いで、その後低分子量ＡＴＨを除去しても、本開示のＡＴＨと同一の生成物が生成されない。いかなる特定の理論にも束縛されないが、低分子量ヘパリン鎖（例えば３，０００ダルトン未満または５，０００ダルトン未満）は、ＡＴにコンジュゲートさせるために、より長い鎖のヘパリンと競合すると考えられる。超低分子量ヘパリン鎖は、ＡＴと反応するアルドース末端の比率が高い。したがって、超低分子量ヘパリン鎖は、より素早くＡＴとコンジュゲートし、より高分子量のヘパリン鎖に勝る傾向がある。しかし、超低分子量ヘパリン鎖がＡＴに結合すると、鎖は、トロンビン、および凝固カスケードに関与する酵素の第Ｘａ因子に結合するのに十分な部位または長さを含有しない。第Ｘａ因子およびトロンビンに対する阻害活性は、ヘパリン分子の最低の分子量範囲に劇的に下落する。したがって、これらの超低分子量ヘパリン鎖から形成されるＡＴＨは、血栓形成を防止するための活性は本質的にゼロである。商用のヘパリンは、相対的に低い割合の、５，０００ダルトンを下回るヘパリン鎖を含有するが、これらの超低分子量ヘパリン鎖は、ＡＴとのとても高い反応性を有するので、形成される著しい量のＡＴＨが超低分子量ヘパリン鎖を含有する。
【００３３】
コンジュゲーションの前に超低分子量ヘパリンが最初に除去されない場合、この集団における、より高分子量のヘパリンの比率に対するより高い比率の反応性末端は、分子量スペクトル全体にわたって、程度の差はあれ他のヘパリン分子に勝る傾向がある（アルドース末端の比率は、ヘパリンの分子量範囲全体にわたって継続的に変動するので）。これは、最終ＡＴＨに対して副作用を有する恐れがある。第１に、ＡＴＨは、活性を示さないきわめて短いヘパリン鎖を含有するＡＴＨ分子の有意な集団を含有するであろう。第２に、残りのＡＴＨ分子（この超低分子量範囲の外のＡＴＨ）は、不活性な低分子量ヘパリン鎖と競合するアルドース末端が少なかった、離散した分子量範囲におけるヘパリン鎖の比率が低いヘパリンの集団を含有する。この低アルドース型ヘパリンは、きわめて長い鎖の中に存在する傾向があるが、ＡＴへの連結を必要とするヘパリン鎖の長さおよびアルドース末端の間の直接的関係によって完全には定義されない。
【００３４】
さらに、少なくとも１８個の単糖単位を有するヘパリンも、トロンビンの阻害においてより有効であり得る。少なくとも１８個の単糖単位はアンチトロンビンおよびトロンビンの両方を結合するために使用される。ヘパリンがアンチトロンビンおよびトロンビンに結合する機構は、鋳型または架橋機構と呼ばれる。ヘパリンは、ＡＴに結合し、ＡＴを、凝固プロテアーゼにきわめて反応性である構造的形態にアロステリックに変換することにより立体配座活性化によるその効果を発揮することができる。あるいは、ヘパリンは、阻害剤および酵素の両方に結合することにより鋳型として作用し得、したがって、分子を反応のために局在させる。この機構において、ヘパリンによるＡＴの立体配座活性化が発生するが、ヘパリンが酵素に同時に結合することで、したがって、活性化された阻害剤に対する凝固因子のアプローチを補助することにより、さらなる反応速度の向上が達成される。特定の最小限の鎖の長さである１８個の単糖により、低分子量のヘパリン分画内でトロンビンに対する活性のきわめて急激な下落が生じる理由が説明できる。モノ硫酸化ウロン酸−ジ硫酸化グルコサミンヘパリン二糖の構造から、すなわち、塩形態で見出されるナトリウムまたは他のイオンなしで、１８個の単糖（９個の二糖）鎖のＭＷは、約４５００ダルトンになるであろう。
【００３５】
ややより低分子量のヘパリン鎖は、第Ｘａ因子を阻害するのに有用であり得る。ヘパリン中の特定の五糖配列は、ＡＴに結合でき、第Ｘａ因子を阻害するためにＡＴを活性化できる。特定の五糖配列は、それ自体を医薬品「Ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ」として利用可能になったが、配列はヘパリン鎖でも同様に発生し得る。単糖の配列は、式Ｉに示されている：
【化１】
2018513217.tif 000003
【００３６】
したがって、この五糖配列を含有する１８個未満の単糖を有するヘパリン鎖は、鎖が、ＡＴおよびトロンビンに結合するのに十分に長くないとしても、ＡＴを活性化して、第Ｘａ因子を阻害できることがある。
【００３７】
最長のヘパリン鎖は、一部のケースでは、最高の阻害活性を有し得る。しかし、一部の中型および低分子量ヘパリン鎖は、他の血漿タンパク質および血小板への望ましくない結合が有意に少ないことがある。したがって、これらの中型ヘパリン鎖は、トロンビンおよび第Ｘａ因子の阻害に対してより選択的であり得、望ましくない副作用、例えば血小板との結合および他の材料の結合による血小板機能不全を引き起こさない。
【００３８】
コンジュゲーションの後に、より高い分子量のＡＴＨを単離して、きわめて長い鎖のＡＴＨを得ても、コンジュゲーションの前にヘパリンを（実質的にまたは完全に）分離する本技術と比較してより望ましくなく、そして別個の生成物を提供する。例えば、この部分母集団における２つの五糖の高活性分子の比率は変わり得、その理由は、コンジュゲーションに関して超低分子量ヘパリンと競合する、これらの高活性鎖の異なる能力のためである。さらに、高分子量のＡＴＨをコンジュゲーションの後に単離することにより、中型およびより小さいサイズのヘパリン鎖を有し、活性でもあり、他の望ましい特性、例えば血漿タンパク質および血小板への非選択的結合の抑制を有するＡＴＨ分子が取り除かれる。
【００３９】
あるいは、反応混合物中でＡＴ対ヘパリンの比を増加させることにより、すべてのアルドース末端ヘパリン鎖を、ＡＴと反応させようとする試みは成功しにくく、その理由は、ＡＴのＡＴＨへの変換は、数倍の過剰濃度および定型的な最高濃度で、アルドースを含有するヘパリンを用いてさえも、６０重量％までしか得られないことが多くの実験により示されているためである。ヘパリン対ＡＴの比率をより一層低下させると、ＡＴＨ収率をさらに低下させるだけであり、活性な長い鎖が生成物中にすべて組み込まれる見込みはない。
【００４０】
一部の実施形態では、血栓形成を防止するための組成物は、３，０００ダルトン未満の分子量を有するヘパリン鎖の実質的にすべてが除去されている商用のヘパリンから形成されたＡＴＨを含有し得る（例えば、少なくとも９８重量％の残ったヘパリン鎖は、３，０００ダルトン超の分子量を有し得る）。他の実施形態では、５，０００ダルトン未満の分子量を有するヘパリン鎖は、実質的に除去できる、または除去できる。したがって、ＡＴＨ生成物は、３，０００ダルトン（または５，０００ダルトン）の分子量から、商用ヘパリンに含有される最大分子量までに及ぶヘパリン鎖を含有し得る。ある例では、この範囲の分子量は、３，０００ダルトンから５０，０００ダルトン、または５，０００ダルトンから５０，０００ダルトンであってよい。さらなる例では、ヘパリン鎖の少なくとも一部は、中分子量範囲であってよい。例えば、ＡＴＨ中のヘパリン鎖の少なくとも一部は、３，０００ダルトンから３０，０００ダルトン、３，０００ダルトンから２０，０００ダルトン、３，０００ダルトンから１５，０００ダルトン、３，０００ダルトンから１０，０００ダルトン、５，０００ダルトンから３０，０００ダルトン、５，０００ダルトンから２０，０００ダルトン、５，０００ダルトンから１５，０００ダルトンまたは５，０００ダルトンから１０，０００ダルトンの分子量を有し得る。したがって、ＡＴＨは、３，０００ダルトンまたは５，０００ダルトンを下回る分子量を有するヘパリン鎖を含まなくても実質的に含まなくてもよい。
【００４１】
商用のヘパリンは、典型的には、１，０００ダルトンまたはそれ未満から５０，０００ダルトンまたはそれ超の範囲の分子量を有するある範囲のヘパリン鎖を含有し得る。最低分子量の分画、例えば３，０００または５，０００ダルトンを下回る分子量を有する鎖は、任意の適切な方法により除去できる。低分子量鎖を除去する方法の非限定的な例は、透析、透析濾過、ゲル濾過および電気泳動を含む。透析または透析濾過は、高塩条件下で行われ得る。例えば、透析または透析濾過のための高塩条件は、約１Ｍ  ＮａＣｌから約４Ｍ  ＮａＣｌの塩濃度を含み得る。ＮａＣｌ以外の塩も使用してよい。高塩濃度は、適切な孔径を有する膜を通した短い鎖の移動を補助できる。ゲル濾過は、サイズによって分子を分離するために、適切な媒体を使用して行うことができる。特定の一例では、ゲル濾過は、１，０００から２００，０００ダルトンの範囲の分子量を有する分子を分離するためのゲル媒体であるＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００で行うことができる。商用のヘパリンは、ゲル媒体のカラムでゲル濾過でき、最大分子量の鎖を含有する最初の分画、および徐々に少なくなる分子量を含有する後続の分画を有する一連の分画を溶出できる。各分画におけるヘパリンの分子量は判定してよく、望ましい分子量を有する分画はプールしてよい。この方法を使用して、３，０００または５，０００ダルトンの閾値を下回る分子量を有するヘパリンを含有する分画は、排除できる。必要に応じて、ある閾値を上回るヘパリン鎖も排除できる。例えば、５０，０００ダルトン、３０，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、１５，０００ダルトンまたは１０，０００ダルトンを上回るヘパリンを含有する分画は、必要に応じて排除できる。次いで、望ましい範囲の分子量を有するプールした分画は、ＡＴＨを合成するために使用できる。
【００４２】
上記の、超低分子量ヘパリン鎖を除去する方法は、例示にすぎないことに留意すべきであり、限定するとみなされるべきではない。本開示では、ある閾値の分子量を下回るヘパリン鎖を除去するために、商用のヘパリンを加工する任意の方法を使用してよい。
【００４３】
ＡＴＨは、ＡＴを、ここでは超低分子量鎖がないヘパリンとコンジュゲートさせることにより形成され得る。ヘパリンをＡＴとコンジュゲートさせる例示的な方法は、米国特許第７，０４５，５８５号で開示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法を適用して、本明細書に記載されている超低分子量鎖が除去されているヘパリンを使用して、ＡＴＨを形成することができる。ヘパリンは、単純な一段法によりＡＴとコンジュゲートさせることができ、これは、アミン含有部分（例えば、以下に限定されないが、アミン含有オリゴ糖（多糖）、アミン含有脂質、タンパク質、核酸および任意のアミン含有生体異物）のアミンの、ヘパリン鎖の末端アルドース残基への直接共有結合を示す。ＡＴＨの形成に関して、アミン含有部分は、ＡＴに存在するが、他のタンパク質を、同一の方法を使用してコンジュゲートできる。本明細書で提供される穏和な非破壊的方法は、タンパク質の生物学的活性の最大限の保持を可能にし、中間体スペーサー基の必要がないタンパク質の直接連結を可能にする。
【００４４】
一実施形態では、ヘパリンは、アミンおよびヘパリンの末端アルドースまたはケトース残基の間でのイミン形成に適しているｐＨで、ＡＴとインキュベートする。末端アルドースおよびケトース残基は、一般的に、閉環した環状ヘミアセタールまたはヘミケタール形態、および対応する開環したアルデヒドまたはケトン等価物の間の平衡として存在する。一般的に、アミンは、イミン（シッフ塩基）を生成するために開環した形態と反応することが可能である。典型的には、開環形態の対応するアルデヒドがアミンに対してより反応性であるため、アルドースはより反応性である。したがって、アミンおよびヘパリンの末端アルドース残基の共有結合コンジュゲートの形成は、アミンを含有するＡＴをヘパリンに付着させる方法を提供する。
【００４５】
反応は、典型的には、約４．５〜約９、より典型的には約５〜約８、およびより一層典型的には約７〜約８のｐＨで実行される。反応は、一般的に水性媒体中で行われる。しかし、有機媒体、とりわけ極性親水性有機溶媒、例えばアルコール、エーテルおよびホルムアミドなどは、必要な場合は、反応物の溶解度または反応性を上昇させるために、約４０％までの比率で用いられ得る。非求核性緩衝液、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸水素塩なども用いられ得る。
【００４６】
一部のケースでは、ＡＴのアミンと、ヘパリンの末端アルドース残基の縮合により形成されるイミンは、対応するアミンに還元される。この還元は、イミン形成と同時に、または続いて達成され得る。数々の還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化シアノホウ素ナトリウムを含む水素化物還元剤が使用され得る。一例では、ジスルフィド結合を還元しない任意の還元剤が使用され得る。
【００４７】
あるいは、中間体イミンの還元が望ましくない場合、イミンは、中間体イミンのアマドリ転位を可能にするために、十分な期間、典型的には約１日から１ヶ月、より典型的には約３日間から２週間インキュベートされ得る。本開示により提供される方法によりコンジュゲートしたヘパリンの末端アルドース残基は、末端アルドース残基におけるＣ２ヒドロキシ基、すなわち、ヘパリンにコンジュゲートさせるＡＴのアミンとの縮合により２−ヒドロキシイミンに変換される２−ヒドロキシカルボニル部分を頻繁に所有する。炭水化物では特に一般的であるアマドリ転位では、最初の縮合により形成されるα−ヒドロキシイミン（Ｃ１はイミン、Ｃ２はヒドロキシ）は、（エノール化および再プロトン化によるα−ケトアミン（Ｃ２はケト、Ｃ１はアミン））を形成するように転位し得る。得られたα−カルボニルアミンは、前駆体α−ヒドロキシイミンよりも熱力学的に好ましく、したがって、ヘパリン鎖の崩壊が最小限の安定な付加体が得られる。したがって、この実施態様では、本技術は、ヘパリンの末端アルドース残基のＣ１で、アミン連結を経由して、アミンを含有するＡＴに共有結合によってコンジュゲートしたヘパリン鎖を提供する。必要に応じて、得られるコンジュゲートは、放射標識（例えば、ＮａＢ３Ｈ４）などの標識試薬でのＣ２カルボニル基の還元により、還元もしくは標識してよく、または第２のアミン含有化学種、例えば蛍光標識にコンジュゲートさせてもよい。
【００４８】
上記説明は、ヘパリンおよびＡＴに焦点を合わせているが、様々な異なるアミン含有化学種は、本明細書で開示されている方法により、様々なグリコサミノグリカンにコンジュゲートできる。第一級アミンは、小分子、例えば薬物もしくは蛍光もしくは色素原標識、または高分子、例えば、タンパク質（抗体、酵素、受容体、増殖因子など）、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの混合したポリマー）もしくは多糖に存在し得る。一般的に、タンパク質が、グリコサミノグリカンにコンジュゲートしている場合、連結は、リシン残基のε−アミノ基により生じる。あるいは、Ｎ末端アミノ酸残基のα−アミノ基によっても連結は達成され得る。さらに、アミン官能性を高分子に導入するために、当業者に公知の多くの他の方法が使用できる。
【００４９】
特に、本技術は、長い半減期および血液凝固の考慮が重要である他の治療的に有用な、様々なタンパク質に適用され得る。これらは、血液酵素、抗体、ホルモンなど、ならびに関連したプラスミノーゲン活性化物質、例えばストレプトキナーゼおよびそれらの誘導体を含む。特に、本技術は、ヘパリンまたはデルマタン硫酸とアンチトロンビン、ヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣＩＩ）またはヘパリン補因子ＩＩの類似体のコンジュゲートを提供する。
【００５０】
本開示の方法は、生物学的活性を最大限保持するグリコサミノグリカンコンジュゲートを提供する。特に、インタクトなコンジュゲートしていないヘパリンアンチトロンビン活性の＞６０重量％、典型的には＞９０重量％、より典型的には＞９５重量％、最も典型的には＞９８重量％を有する、ヘパリンまたはデルマタン硫酸とＡＴまたはＨＣＩＩのコンジュゲートが提供される。本技術の方法は、アンチトロンビンまたはヘパリン補因子ＩＩにコンジュゲートしているインタクトなヘパリン分子を提供する。したがって、コンジュゲーション前のヘパリンの断片化または他の改変に関連する生物学的活性の損失は避けられる。本技術のヘパリンコンジュゲートは、インタクトなヘパリンからの調製であるため、その抗凝固活性を保つ。したがって、本明細書で開示されている方法を使用して、まず、ヘパリンにコンジュゲートさせることが求められている化学種（またはグリコサミノグリカンが使用されるものなら何でも）に連結基およびスペーサーを付着させ、続いて、これをヘパリンに付着させることにより活性なヘパリンコンジュゲートを調製できる。反応性アミノ基を他の分子および固相担体に組み込む多数の方法は、参照により組み込まれるInmunoTechnology  Catalog  and  Handbook、Pierce  Chemical  Company（１９９０年）に記載されている。それにより、反応性アミノ基を所有する、または現在公知の、もしくは将来公知になる任意の方法によりそのようなアミノ基を含有するように改変することが可能である任意の化学種は、本明細書で開示されている方法により、グリコサミノグリカン、例えばヘパリンに共有結合によってコンジュゲートでき、そのようなすべてのコンジュゲートは、本開示により意図される。
【００５１】
上に記載したように、本技術は、天然の（腸粘膜から単離された）ヘパリン、ならびにデルマタン硫酸が、ヘミアセタールおよびアルデヒド形態の間の平衡として存在し得るアルドース末端を有する分子を既に含有することを利用する。したがって、ヘパリンまたはデルマタン硫酸は、ヘパリンまたはデルマタン硫酸におけるアルドース末端アルデヒドおよびセルピンにおけるアミノの間で自発的に形成される単一のシッフ塩基の還元により、アンチトロンビンセルピンにコンジュゲートできる。ヘパリンまたはデルマタン硫酸は、コンジュゲーションの前に修飾されず（活性が低下していない）、セルピンのブロックされていない活性化基または架橋を伴わずに、分子の一末端の一特異的部位に連結する。
【００５２】
本開示の別の態様では、共有結合複合体は、ヘパリンおよびＡＴを緩衝液中で単に混合すること、およびヘパリンアルドース末端およびＡＴアミノ基の間でアマドリ転位によってケト−アミンを自発的に形成させることにより生成できる。したがって、本技術は、アマドリ転位を使用して、グリコサミノグリカンと、アミン含有化学種、特にタンパク質とのコンジュゲートを調製する方法を提供する。これは、特に穏和で簡単なコンジュゲーションの方法であり、これは、グリコサミノグリカンの改変を最小にし、したがってその生物学的活性の保持を最大にする。
【００５３】
本技術の別の態様は、グリコサミノグリカンの末端アルドース残基においてアミン含有化学種で末端標識された、グリコサミノグリカン、特にヘパリンの共有結合コンジュゲートを提供する。例えば、ヘパリンおよびＡＴは、互いに直接的に連結することができ、その結果、ヘパリンにおけるＡＴに対する活性な五糖配列は、結合するために近接する。これは、ＡＴが活性な配列に結合できる場合にのみ、ヘパリンがＡＴを介して阻害を促進するので、共有結合ヘパリン−ＡＴ複合体を製造する根本的理由の１つである。コンジュゲートにおけるＨ（ヘパリン）が内因性ＡＴを化学量論的に活性化するが、外因性ＡＴを触媒的に活性化するという特有の性質をＡＴＨが有することは注目すべきである。典型的には、１つのアミン含有化学種は、各グリコサミノグリカンに付着する。しかし、アミン含有化学種対グリコサミノグリカンの比は、反応物のモル比または反応時間を調整することにより１を下回って低下し得ることは明らかになり得る。
【００５４】
グリコサミノグリカンは、様々な形態および分子量で利用できる。例えば、ヘパリンは、ブタの腸またはウシの肺から単離されるムコ多糖であり、分子のサイズおよび化学構造に関して不均一である。これは、主に、（１−４）連結２−アミノ−２−デキソキシ−α−Ｄ−グルオピラノシル（gluopyranosyl）およびα−Ｌ−イドピラノシルウロン酸の残基と比較的少量のβ−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸残基からなる。ヒドロキシルおよびアミン基は、硫酸化およびアセチル化により様々な程度に、誘導体化される。
【００５５】
ヘパリン分子は、それらの五糖含有量に基づいても分類できる。約３分の１のヘパリンは、ＡＴに対する親和性が高い特有の五糖の１つのコピーを有する鎖を含有する一方、はるかに小さい比率（合計ヘパリンの約１％と推定される）は、親和性が高い五糖の複数のコピーを含有する鎖からなる。残り（約６６％）のヘパリンは、五糖を含有しない。したがって、いわゆる「標準のヘパリン」は、３つの化学種、すなわち、五糖のコピーを欠く「親和性が低い」ヘパリンと、五糖の少なくとも１つのコピーを含有する化学種を豊富に含む「親和性が高い」ヘパリンと、五糖の複数のコピーを含有する約１％の分子を指す「親和性がきわめて高い」ヘパリンとの混合物を構成する。これらの３つの化学種は、定型的なクロマトグラフの方法、例えばアンチトロンビン親和性のカラムを通したクロマトグラフィーを使用して互いに分離できる。
【００５６】
本明細書で開示されているゆるやかな糖化プロセスを使用して、ヘパリンおよび少なくとも１つの第一級アミノ基（例えば、ＡＴ）を含有する化学種の間でコンジュゲートを形成する１つの利点は、２つの五糖を有するヘパリン鎖に対する明らかな選択である。したがって、例えば、本開示の方法により調製されるＡＴＨは、２つの五糖を含有するヘパリン種を豊富に含むと思われる。標準のヘパリン（約１％の２つの五糖ヘパリンを含有する）が、出発原料として使用される場合、通常、生じるＡＴＨの１０％超は、２つの五糖ヘパリンを含み、より多くは約２０％超、頻繁には３５％超および多くは約５０％超のＡＴＨが２つの五糖ヘパリンを含む。
【００５７】
このような豊化が、ＡＴＨのいくつかの有用な性質の原因になり得る。本技術のＡＴＨは、それがコンジュゲートするＡＴを化学量論的手法で活性化するが、外因性ＡＴを触媒的手法で活性化する。したがって、ＡＴＨ複合体内のヘパリンは、全身性抗凝固物質としてＡＴＨが投与される場合、および表面をコーティングするためにＡＴＨが使用され、これらを非血栓形成性にする場合の両方で、触媒的に作用する。本技術の方法により、きわめて高い特定の抗因子ＩＩａ活性を有するＡＴＨ複合体が生成される。さらに、ＡＴＨ複合体における第２の五糖鎖は、外因性ＡＴ分子と相互作用することができ、それにより、コンジュゲートしているヘパリンは、触媒活性を有することができる。さらに、ＡＴＨ複合体におけるヘパリンは、ＡＴＨ複合体がプロテーゼ表面に結合する場合、五糖が循環するＡＴ分子に結合および活性化できるように配向され得る。
【００５８】
目的のヘパリンコンジュゲート（例えば、ＡＴＨ）は、少なくとも１つの第一級アミノ基（例えば、ＡＴ）を含有する化学種を、精製したきわめて親和性が高いヘパリン（すなわち、２つの五糖基を含有する）と、またはきわめて親和性が高いヘパリンを豊富に含む分画とインキュベートすることによっても生成できることは理解されるであろう。
【００５９】
本技術は、主にヘパリンに関して例証されているが、すべてのグリコサミノグリカンは、末端アルドース残基を所有するという条件で、それらの分子量および誘導体化に関わりなく、本明細書で開示されている方法によりコンジュゲートできることは明らかである。すべてのそのようなグリコサミノグリカンのコンジュゲートおよび本明細書の方法によるそれらの調製は、本開示の範囲内である。例えば、リン酸塩、スルホン酸塩などにより誘導体化されるヘパリンのコンジュゲート、ならびにヘパリンの分子量より低いまたは高い分子量を有するグリコサミノグリカンは、本開示の範囲内である。
【００６０】
本開示のさらなる態様では、血栓形成を防止するための組成物を製造する方法は、ＡＴを対象の体外のヘパリンとコンジュゲートさせるステップであってアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを形成するステップを含み得、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート中で得られるアンチトロンビンの量は、合成に使用される開始アンチトロンビンに対して６０重量％超、６５重量％超、７５重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超である。収率は、様々な方法により増加させることができる。一例では、ＡＴは、上記の方法によりヘパリンにコンジュゲートさせることができる。コンジュゲーションの後で、結合していないＡＴがあれば、リサイクルし、ヘパリンとの別のコンジュゲーション反応に使用することができる。ＡＴをヘパリンとインキュベートする各ステップの後で、結合していないＡＴは、リサイクルし、追加のＡＴＨを製造するために使用することができる。
【００６１】
別の例では、ＡＴＨの収率は、アマドリ転位触媒を使用することにより増加させることができる。アマドリ転位の速度を増加させることができる触媒の非限定的な例は、２−ヒドロキシピリジン、第三級アミン塩、マロン酸エチル、フェニルアセトン、酢酸、ならびに他の酸を含む。特定の例では、ＡＴおよびヘパリンは、水中で、またはきわめて両親媒性の溶媒、例えばホルムアミド中で、加熱しながら、２−ヒドロキシピリジンの存在下で反応させることができる。さらなる例では、ＡＴおよびヘパリンは、トリメチルアミンまたはトリメチルアミン塩の存在下で反応させることができる。
【００６２】
アマドリ転位の速度は、アマドリ転位を促進する溶媒系によっても増加させることができる。溶媒の非限定的な例は、水と、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、エタノール、ジメチルスルホキシド、ピリジン、酢酸、トリメチルアミン、トリエチルアミンおよびそれらの組合せの混合物を含む。ヘパリンおよびＡＴは、これらの溶媒系中で反応して、アマドリ転位を促進してＡＴＨを形成できる。
【００６３】
ヘパリンアルドースをアミン含有分子にコンジュゲートさせる速度を増加させるための追加の方法は、連結剤を使用することを含む。連結剤は、一方の末端にヘパリンのアルドースに対して反応性の基を有し、他の末端に、ＡＴへの連結、または次いでＡＴに連結できる第２の連結剤への連結に使用できる異なる基を有するヘテロ二官能性剤であってよい。特定の一例では、連結剤は、一方の末端にアミノ基、他の末端にヒドラジンを含有し得る、例えば２−アミノエチルヒドラジンである。この連結剤は、ヘパリンと反応させて、ヘパリンのアルドースアルデヒドと共にヒドラジンを形成できる。生成物は、いずれかの未反応の連結剤と共に、分子量３，０００または５，０００ダルトン未満のヘパリン鎖を除去する膜により透析または透析濾過できる。次いで、ヘパリン−ヒドラゾン生成物は、大過剰の第２の連結剤と反応できる。第２の連結剤は、各末端で活性化されたカルボキシル基を所有するホモ二官能性試薬、例えばコハク酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル（縮合剤、例えばカルボニルジイミダゾールまたはカルボジイミドを使用して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでコハク酸をエステル化することにより調製される）であってよく、その結果、ヒドラジン連結剤におけるアミノ基は、第２の連結剤における活性化されたカルボキシルの１つのみと反応する。反応混合物は、未反応の第２の連結剤を除去するために透析または透析濾過できる。この時点で、生成物は、アミノ−ヒドラジン連結剤ならびに第２の連結剤で改変したヘパリンである。この生成物は、緩衝Ｈ２Ｏ中でＡＴとインキュベートすることができ、その結果、ＡＴにおけるアミノ基を、第２の連結剤における第２の活性化させたカルボキシル基と反応させて、ＡＴ−ヘパリンコンジュゲートを形成し、ＡＴおよびヘパリンは、連結剤および第２の連結剤により連結する。
【００６４】
ＡＴＨを形成した後で、保存のためにＡＴＨは凍結乾燥（フリーズドライ）させてよい。一実施形態では、ＡＴＨは、水のみを含有する溶液中で調製し、次いで凍結乾燥できる。別の実施形態では、ＡＴＨは、水およびアラニンを有する溶液中で、０．０１〜０．０９モルの濃度で調製し、次いで凍結乾燥できる。さらに別の実施形態では、ＡＴＨは、水およびマンニトールを含有する溶液中で調製し、次いで凍結乾燥できる。これらの方法のそれぞれは独立して使用でき、各方法は、その独自の利点を提供することができる。これらの方法のいずれかを使用した凍結乾燥後、ＡＴＨは、再構成し、凍結乾燥前のその活性と比較して、トロンビンを阻害する有意量のその活性を保つことができる。いくつかのケースでは、ＡＴＨは、トロンビンを阻害するためのその活性の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％を保つことができる。ＡＴＨを凍結乾燥させる他の方法の使用、例えば、凍結乾燥前に１モル超の塩を含有する溶液中でのＡＴＨの調製により、ＡＴＨの活性は破壊され得ることが見出されている。
【００６５】
ＡＴＨが凍結乾燥されているかいないかを問わず、ＡＴＨは、溶液の総体積に対して９〜１１ｍｇ／ｍＬのＡＴＨを含有する水溶液として調製できる。１１ｍｇ／ｍＬより高いＡＴＨ濃度を有する溶液を形成すると、元に戻すことが困難または不可能なＡＴＨの凝集が引き起こされ得ることが見出された。しかし、安定な水溶液は、９〜１１ｍｇ／ｍｌのＡＴＨ濃度を用いて調製できる。この溶液は、本明細書に記載されている状態のいずれかを処置する目的で、対象に投与するために製剤化できる。溶液は、対象への投与に適している様々な添加剤も含み得る。
【００６６】
診療において、本技術のヘパリンコンジュゲートは、臨床的使用のための市販のヘパリンと同一の手段で、および同一形態の医薬調製物で一般的に使用され得る。したがって、本技術によって提供されるヘパリンコンジュゲートは、注射（静脈内、皮下など）もしくは静脈内注入のための水性溶液に、または皮膚および粘膜を介した投与のための軟膏調製物に組み込まれ得る。予防的および治癒的の両方の、現在公知の、または将来利用でき、ヘパリン治療が指し示される任意の形態の治療は、本技術により提供されるヘパリンコンジュゲートを用いて実践され得る。
【００６７】
本技術のヘパリンコンジュゲートは、新生児および成人呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の処置に特に有用性を見出す。非共有結合ヘパリン−ＡＴ複合体の使用と対照的に、本技術の共有結合ヘパリンコンジュゲートの使用は、ＡＴからの解離による肺腔中でのヘパリンの損失を防止する。このケースでは、生理学的緩衝液中の共有結合複合体の溶液は、カテーテルまたはプファーを経由して気道を下って肺中へと噴霧化したスプレーとして送達され得る。その大きなサイズのため、ＡＴＨは、より長い時間にわたり肺胞に留まるであろう。ＡＴＨは、特発性肺線維症の処置にも有用である。
【００６８】
循環における長期の使用は、生理学的緩衝液中の複合体の静脈内または皮下注射によって実行され得る。本技術の共有結合コンジュゲートは、血栓性合併症、例えば心肺バイパス法、体外分子酸化などにより特徴付けられる後天性ＡＴ欠乏状態の処置にも使用され得るが、これは、共有結合複合体の半減期が長いほど、処置およびモニタリングを少なくすることができるためである。さらに、本開示は、深部静脈血栓症の危険性がある成人患者の予防的処置を提供する。
【００６９】
本技術のＡＴＨコンジュゲートは、複合体化していないＡＴおよび標準のヘパリンを上回る多数の利点を有する。ＡＴがヘパリンに共有結合により連結されるので、ＡＴＨの血漿タンパク質への非特異的結合は、標準のヘパリンで発生するよりも少なく、標準のヘパリンに対して存在するよりもＡＴＨに対する用量反応で、少ない個体間変化を生じるであろう。ヒトにおける静脈内注射後のＡＴＨのより長い半減期は、持続した抗凝固効果が、複合体化していないＡＴおよび標準のヘパリンに必要とされるよりも少ない頻度でＡＴＨを投与することによって得られる得ることを意味する。ＡＴＨは、ＡＴよりもはるかに有効なトロンビンおよび第Ｘａ因子の不活性化因子であり、ＡＴ欠乏を有する患者においてＡＴよりもはるかに低い濃度で使用される場合に有効であり得る。さらに、ＡＴＨは、フィブリンに結合したトロンビンに接近し、阻害できる。最終的に、プロテーゼ表面（例えば、血管内グラフト）に連結（例えば、共有結合により連結）された場合、ＡＴＨは、共有結合により連結したＡＴまたは共有結合により連結したヘパリンまたは共有結合により連結したヒルジンよりも、ｉｎ  ｖｉｖｏではるかに大きな抗血栓性活性を示した。
【００７０】
未熟児は、補助換気での処置を必要とする重度の肺疾患である呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の高い発生率を有する。長期間の補助換気は、血漿凝固タンパク質を肺の肺胞腔中に移動させる、肺傷害の結果としての気管支肺異形成（ＢＰＤ）の発症を引き起こす。これは、トロンビンおよび続くフィブリンの生成を招く。肺組織および空気腔内のフィブリンが広範に存在することが、ＲＤＳで死亡する乳児で一貫して観察される。空気腔内のこのフィブリンゲルは、肺の空気腔からの流体の運搬を害し、持続的で、悪化する肺水腫をもたらす。本技術は、「抗血栓環境」を維持し、かつ／または肺組織内のフィブリン溶解を向上させ、それによって肺の空気腔中のフィブリン負荷を減少させることによって、肺胞内フィブリン形成を防止することによる、肺組織におけるそのようなフィブリン媒介性疾患の処置を提供する。
【００７１】
ヘパリンコンジュゲートは、気道を経由して、予防的に（乳児が初めて呼吸をする前に）、肺の空気腔に直接送達され得る。これは、抗血栓剤が、潜在的なフィブリン沈着部位に直接的に利用可能であること、および全身性抗血栓症治療法に関連する出血の危険性が避けられることを確実にする。さらに、抗血栓剤は、最初の傷害に付随する換気補助の開始前に肺に既に存在し、すなわち、肺の空気腔への投与薬物の通過が肺傷害の後まで生じない全身性アンチトロンビン投与とは異なる。ヘパリンはＡＴに共有結合により付着されるので、これは肺の空気腔に留まる。これは、ＲＤＳおよびＢＰＤを防止するために現在投与される界面活性剤への付加的治療でもあり得る。「肺界面活性剤」は、肺の空気腔に通常存在する石鹸のような物質を意味し、その主な役割は空気腔の虚脱の防止、ならびに気体の移送の補助である。コンジュゲートは、気管内チューブを経由して、または吸入エーロゾルとして繰り返しても送達され得る。付加的治療は、吸入器（例えば、ベクロメタゾンジプロピオネートなどの抗炎症性ステロイド）、他の抗喘息剤、例えばクロモリンナトリウム（１，３−ビス（２−カルボキシクロモン−５−イルオキシ）−２−ヒドロキシプロパンの二ナトリウム塩、（「ＩＮＴＡＬ」））、および気管支拡張剤、例えばアルブテロール硫酸による喘息薬物でも実践され得る。
【００７２】
上昇したトロンビン活性および／またはフィブリン沈着に関連する様々な他の疾患は、本開示のコンジュゲートの投与により処置できる。成人呼吸窮迫症候群に関与する炎症のプロセスは、新生児ＲＤＳと根本的に同様であり、記載されている抗血栓性治療により処置できる。自発的肺線維症は、肺の空気腔において凝固／線維素溶解カスケードの活性化を有することも示されている。肺の線維性疾患は、がん化学療法に関連する副作用であることが多く、本技術の共有結合ヘパリンコンジュゲートのＲＤＳ抗血栓性投与は、肺線維症を防止するためにがん化学療法の前に予防的に投与され得る。投与は、フィブリン形成がないことを確実にするために化学療法の後で繰り返される。アンチトロンビン活性の低下および敗血症におけるトロンビン活性の増大も、十分に立証される。敗血症は、成人ＲＤＳを発生させる最も一般的な危険因子である。したがって、本開示のヘパリンコンジュゲートを使用して、敗血症性ショックに関連する死亡率を低下させることができる。
【００７３】
本開示のコンジュゲートは、治療有効投与量で、すなわち、それを必要とする哺乳動物に投与される場合は、上に記載した処置を達成する（例えば、哺乳動物における血栓症を抑制する、あるいは処置する、またはクロット形成後トロンビンを不活化する、または血栓増大を阻害する）のに十分な量で投与できる。本明細書に記載されている活性化合物および塩の投与は、類似した有用性を示す作用剤のための、認められている投与様式のいずれかを経由してよい。
【００７４】
一般的に、許容される１日用量は、１日につきレシピエントの体重１キログラム当たり約０．００１から５０ｍｇ、１日につき体重１キログラム当たり約０．０５から２５ｍｇ、または１日につき体重１キログラム当たり約０．０１から１０ｍｇの用量である。したがって、７０ｋｇのヒトに投与するために、処置される個体および疾患状態に応じて、投与量の範囲は、１日につき約０．０７ｍｇから３．５ｇ、１日につき約３．５ｍｇから１．７５ｇ、または１日につき約０．７ｍｇから０．７ｇであってよい。ＡＴＨのケースでは、長い半減期により、標準のヘパリンより少ない頻度で化合物を投与できる（例えば、１週間に１回または２回）。
【００７５】
投与は、任意の認められる全身または局所経路を経由してよく、例えば、非経口、静脈内、経鼻、気管支吸入（すなわちエーロゾル製剤）、経皮的または局所経路を経由し、固体、半固体または液体剤形の形態で、例えば錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁液剤、エーロゾル剤、エマルション剤など、例えば、正確な投与量の単純な投与に適している単位剤形であってよい。通常、水性製剤が使用できる。コンジュゲートは、非毒性、不活性、薬学的に許容される担体媒体中で、約３〜８のｐＨで、または約６〜８のｐＨで製剤化できる。一般的に、水性製剤は、培地または灌流媒体と適合できる。組成物は、従来の医薬担体または賦形剤、およびグリコサミノグリカンのコンジュゲートを含み、さらに、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバントなどを含み得る。担体は、石油、動物、植物、または合成起源の油を含む様々な油、例えば、落花生油、大豆油、ミネラル油、ゴマ油などから選択され得る。水、生理食塩水、水性デキストロースまたはマンニトール、およびグリコールは、特に、注入可能な溶液のための適切な液体担体の例である。適切な医薬担体は、デンプン、セルロース、滑石、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。他の適切な医薬担体およびそれらの製剤は、E.  W.  Martin著Remington's  Pharmaceutical  Science（１９８５年）に記載されている。
【００７６】
必要に応じて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなども含有していてよい。
【００７７】
本開示の化合物は、グリコサミノグリカンのコンジュゲートと組み合わせた医薬賦形剤を含む医薬組成物として投与され得る。製剤におけるコンジュゲートのレベルは、当業者により用いられる全範囲内、例えば、全体の製剤に対して約０．０１パーセント重量（％ｗ）から約９９．９９％ｗの薬物、および約０．０１％ｗから９９．９９％ｗの賦形剤で、異なっていてよい。一例では、製剤は、約３．５〜６０重量％の医薬活性化合物であり得、残りは適切な医薬賦形剤である。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例は、本開示の、現在最もよく知られている実施形態を例証する。しかし、以下は、本技術の原理の適用の例示または例証にすぎないことは理解されるべきである。多数の改変および代替組成物、方法および系は、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、当業者により考案され得る。添付の特許請求の範囲は、そのような改変および構成を包括することが意図されている。したがって、本開示は、上で詳細に記載されているが、以下の実施例は、本開示の実用的な実施形態と現在みなされるものに関連するさらなる詳細を提供する。
（実施例１）
超低分子量ヘパリン鎖の除去
【００７９】
ヘパリン（０．５ｍｌの１０，０００Ｉ．Ｕ．／Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｌｅｏ（登録商標）１ｍｌ）を、４９ｃｍ×１ｃｍ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００クロマトグラフィーカラムで濾過した。ヘパリンを１Ｍ  ＮａＣｌで溶出し、２０滴の分画（１分画当たり１．２７ｇ）を収集した。各分画の吸光度は表１および図１で示されている。
【表１】
2018513217.tif 000004
【００８０】
分画２４〜３０をプールした。これらの分画から、超低分子量ヘパリン鎖（分画３１〜４０）を排除した。分画１〜２３のより高分子量のヘパリン鎖は、後続のステップにおいて、未反応のヘパリンを分離し易くするためにＡＴＨから排除した。分画２４〜３０におけるヘパリン鎖は、約１８，０００ダルトンもの高い分子量を有していた。より大きいヘパリン鎖の排除により、生成物を精製した場合、ヘパリンはＡＴおよびＡＴＨと重複しないことを確実にした。しかし、より高分子量のヘパリン鎖は、他の実施例における生成物に含まれ得る。
【００８１】
４９ｃｍ×１ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００クロマトグラフィーカラムでの、ヘパリン（０．５ｍｌの１０，０００Ｉ．Ｕ．／Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｌｅｏ（登録商標）１ｍｌ）の別のゲル濾過を実行した。再度、ヘパリンを１Ｍ  ＮａＣｌで溶出させ、２０滴の分画（１分画当たり１．２３ｇ）を収集した。各分画の吸光度は、表２で以下に示されている。
【表２】
2018513217.tif 000005
【００８２】
表２におけるクロマトグラフィーの結果は、上記表１におけるヘパリンの最初のゲル濾過からのものに対する溶出プロファイルに類似していた。分画２４〜３０をプールし、結果が表１で示されている最初のクロマトグラフィーからプールした分画と組み合わせた。組み合わせたプール分画を、４℃にてＨ２Ｏに対して透析し、次いでフリーズドライさせた。
（実施例２）
ＡＴとのヘパリンの反応
【００８３】
ヒトＡＴを、１３．８７ミリグラム／ｍｌの濃度まで圧力透析し、次いで、４℃にて、０．０２Ｍリン酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に対してさらに透析し、続いて、透析後に−６０℃で保存した。上の実施例１においてフリーズドライさせた１９．１２ｍｇのヘパリン分画を、無菌０．２ミクロン孔径アクロディスクで濾過した１ｍｌの０．３Ｍリン酸水素二ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５に溶解した。生じた溶液を１２ｍｍ×７５ｍｍプラスチック試験管に入れ、混合しながら７２マイクロリットルのヒトＡＴを添加した。試験管をプラスチックのキャップで閉じ、パラフィルムを用いてキャップの外側周囲を封止した。試験管および内容物を３７℃にて水浴中で１４日間加熱した。
【００８４】
１４日間のインキュベーション後、ヘパリンおよびＡＴの混合物を、１Ｍ  ＮａＣｌを用いてＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００の４８．５ｃｍ×１ｃｍのカラムでゲル濾過し、２０滴の分画を収集した。各分画の吸光度（absorbence）は、表３および図２で示されている。同じＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００カラムで実施した、ＡＴ単体の別のクロマトグラフィーは、比較のために図２において同時にプロットされている。
【表３】
2018513217.tif 000006
【００８５】
ＡＴＨ生成物を含有する分画１４〜１６は、プールし、０．７４８３２ｇの最終質量まで０．１５Ｍ  ＮａＣｌに対して圧力透析した。
（実施例３）
ＡＴＨによるトロンビン活性の阻害
【００８６】
トロンビンと、実施例２からの、圧力透析し、プールしたＡＴＨの分画の反応を評価するための実験を行った。各反応において、分析される１１４マイクロリットルの材料を、プラスチックエッペンドルフチューブ中で、５．８３マイクロリットルの２０Ｕ  ウシＩＩａ（トロンビン）／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １ｍｌと混合し、２３℃で１０分間置いた。１０分後、１００マイクロリットルの溶液を、８７５マイクロリットルの０．０３６Ｍ酢酸ナトリウム、０．０３６Ｍバルビタールナトリウム、０．１４５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、および２５マイクロリットルの３．１２５ｍｇ  Ｓ−２２３８／Ｈ２Ｏ  １ｍｌの溶液とキュベット中で２３℃にて時計回りに混合した。Ｓ−２２３８はトロンビンの発色基質である。生じた溶液の４０５ｎｍでのＨ２Ｏに対する吸光度は、１０秒ごとに５分間測定した。以下の反応を実行した：
【００８７】
反応１（対照）：１１４マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌを分析した。
【００８８】
反応２：１１４マイクロリットルのＡＴＨを分析した。
【００８９】
反応３：８５．５マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌに添加した２８．５マイクロリットルのＡＴＨを分析した。
【００９０】
反応４：１０２．６マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌに添加した１１．４マイクロリットルのＡＴＨを分析した。
【００９１】
４０５ｎｍでの吸光度は、キュベット中に残るトロンビンによる、Ｓ−２２３８基質から切り離された生成物の直接的尺度である。各反応に対して１０秒ごとに記録した吸光度は、表４および図３で示されている。
【表４】
2018513217.tif 000007
【００９２】
これら４つの反応からのデータにより、０．１５Ｍ  ＮａＣｌのみを有する対照反応（反応１）と比較して、小さい体積のＡＴＨ濃縮物でさえも、トロンビン活性を中和することが可能であると示される。
（実施例４）
ＡＴＨとの凝血時間
【００９３】
１０マイクロリットルの２０Ｕ  ウシＩＩａ（トロンビン）／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １ｍｌを、９０マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、８５マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋上の実施例２からの５マイクロリットルのＡＴＨ濃縮物、または８０マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋１０マイクロリットルのＡＴＨ濃縮物のいずれかと混合した。混合物を、３７℃にて１分間プラスチックチューブ中で加熱した。次いで、１００マイクロリットルの０．２ｇヒトフィブリノーゲン／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １００ｍｌを、時計回りに混合した。かき混ぜに使用されるワイヤーループの末端に血餅が最初に見られた際に、時間を記録した。連続トライアルにおいて、９０マイクロリットルの純粋０．１５Ｍ  ＮａＣｌで、２６．２秒、２５．２秒、および２６．０秒の凝血時間が示された。８５マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌに加えての５マイクロリットルのＡＴＨ濃縮物で、３４．０および３３．８秒の凝血時間が示された。８０マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌに加えての１０マイクロリットルのＡＴＨ濃縮物で、３９．２および３９．６秒の凝血時間が示された。より長い凝血時間によって、ＡＴＨ濃縮物との反応におけるトロンビン活性の低下が指し示される。
（実施例５）
ＡＴＨとの凝血時間
【００９４】
１００マイクロリットルの０．２ｇヒトフィブリノーゲン／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １００ｍｌを、９０マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、８５マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋上の実施例２からの５マイクロリットルのＡＴＨ濃縮物、または８０マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋１０マイクロリットルのＡＴＨ濃縮物のいずれかと混合した。混合物をプラスチックチューブ中で３７℃にて１分間加熱した。次いで、１０マイクロリットルの２０Ｕ  ウシＩＩａ（トロンビン）／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １ｍｌを時計回りに混合した。かき混ぜに使用されるワイヤーループの末端に血餅が最初に見られた際に、時間を記録した。連続したトライアルでは、９０マイクロリットルの純粋な０．１５Ｍ  ＮａＣｌで、２５．８および２６．０秒の凝血時間が示された。８５マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌに加えての５マイクロリットルのＡＴＨ濃縮物で、３０．６および３１．２秒の凝血時間が示された。８０マイクロリットルの０．１５Ｍ  ＮａＣｌに加えての１０マイクロリットルのＡＴＨ濃縮物で、３７．２および３５．２秒の凝血時間が示された。より長い凝血時間によって、ＡＴＨ濃縮物との反応におけるトロンビン活性の低下が指し示される。
（実施例６）
高塩溶液中での凍結乾燥
【００９５】
ＡＴＨを、上の実施例１および２に記載されているように調製した。１Ｍ  ＮａＣｌを用いてＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００から溶出したＡＴＨを含有する分画１３〜１６（１分画当たり２０滴、それぞれ約１．２ｇから１．３ｇの重量になる）を、プールし、凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥させた材料を０．５ｍｌの水に再懸濁し、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液に対して透析した。次いで、再懸濁したＡＴＨを、トロンビン活性の阻害について試験した。緩衝液（０．０３６Ｍ  酢酸ナトリウム、０．０３６Ｍ  バルビタールナトリウム、０．１４５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、再懸濁したＡＴＨ、ＡＴ  １３．８７マイクログラム／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １ｍｌの溶液、ヘパリン（ＡＴＨを製造するために使用されるものと同様）１０マイクログラム／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １ｍｌの溶液、Ｓ−２２３８  ３．１２５ｍｇ／Ｈ２Ｏ  １ｍｌの溶液、およびウシＩＩａ（トロンビン）１０Ｕ  ＩＩａ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １ｍｌの溶液を使用して、３つの反応を行った。
【００９６】
反応１：１１４マイクロリットルの緩衝液、５．８３マイクロリットルのＩＩａ。
【００９７】
反応２：１０４．５マイクロリットルの緩衝液、９．６マイクロリットルの再懸濁したＡＴＨ、５．８３マイクロリットルのＩＩａ。
【００９８】
反応３：５５．０マイクロリットルの緩衝液、３２．９マイクロリットルのＡＴ溶液、２６．３マイクロリットルのヘパリン溶液、５．８３マイクロリットルのＩＩａ。
【００９９】
各添加後に混合しながら、上の各反応について示されている順序で、これらの成分をプラスチックチューブ中に添加した。２３℃での１０分のインキュベーション後、反応の１００マイクロリットルのアリコートを取り出し、キュベット中の、２５マイクロリットルのＳ−２２３８＋８７５マイクロリットルの緩衝液を含有する溶液中に時計回りに混合した。Ｈ２Ｏに対する吸光度読み込み値を、４０５ｎｍで１０秒ごとに計った。反応の結果を、図４で示す。この結果から、ＡＴ＋ヘパリン混合物と対照的に、再懸濁したＡＴＨは、トロンビンを阻害する能力がなかったことが示される。再懸濁したＡＴＨがトロンビンと混合される場合、トロンビン単体（図４で白四角として示されている）と比較して、トロンビン活性における有意な低下はなかった。
【０１００】
同じ再懸濁したＡＴＨをまた、再懸濁したＡＴＨとトロンビンおよびヒト血漿を組み合わせることにより試験した。一定体積の、緩衝液、ＡＴＨおよび／またはヘパリン分画の試料（ＡＴＨを製造するために使用されるものと同様）、ならびに一定体積のウシのＩＩａ（トロンビン）を、６ｍｍ×５０ｍｍホウケイ酸ガラスチューブ中で３７℃にて混合した。１分後、一定体積のヒト血漿（使用する直前に２３℃にした）を添加し、時計回りに混合した。かき混ぜに使用されるワイヤーループの末端に血餅が最初に見られた際に、時間を記録した。各反応に関しては、ウシのＩＩａの体積は、１０マイクロリットルの１５Ｕ  ＩＩａ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １ｍｌであり、ヒト血漿の体積は、１００マイクロリットルであった。他の成分の体積および凝血時間は、表５に示されている。
【表５】
2018513217.tif 000008
【０１０１】
これらのデータから、再懸濁したＡＴＨは、トロンビンの阻害にそれ自体は活性を有さなかったが、再懸濁したＡＴＨのヘパリン鎖は、ヒト血漿に見出される外因性ＡＴにより、トロンビンの阻害を触媒することが可能であったと確認される。ＡＴＨを含む反応に対する凝血時間は、１２０秒を超えて大いに増加した。したがって、トロンビンを阻害するのに明らかに十分な量のＡＴＨが存在していたが、ＡＴＨは、それ自体がトロンビンを阻害するいかなる活性も有さなかった。これらのデータから、ＡＴＨの活性は、ＡＴＨを高（濃縮）塩溶液中で凍結乾燥させることにより破壊されたことが示唆される。
（実施例７）
ＡＴのリサイクル
【０１０２】
ＡＴと未分画ヘパリンをコンジュゲートさせることにより、ＡＴＨを合成した。この調製からの収率は、３５．２８％であり、ＡＴＨとして回収された開始ＡＴの百分率と定義された。これにより、１００−３５．２８＝６４．７２％の、複合体化していない元のＡＴが残った。コンジュゲーションの後で、余りのコンジュゲートしていないＡＴを分離した。次いで、このコンジュゲートしていないＡＴを、追加の合成に使用し、この合成で、リサイクルしたＡＴを追加のヘパリンと反応させて、ＡＴＨを形成した。リサイクルしたＡＴの５８．５９％を、ＡＴＨに変換した。したがって、最初のＡＴＨ調製で複合体化していない６４．７２％のＡＴのうち、さらに５８．５９％を、第２のＡＴＨ合成でＡＴＨに変換した。したがって、さらに６４．７２×５８．５９／１００＝３７．９２％の、最初のＡＴＨ調製に使用された元の開始ＡＴを、第２のＡＴＨ合成の際に、結合していないＡＴをリサイクルすることによりＡＴＨとして得た。最終的に、２種のＡＴＨ調製物からの結果を組み合わせると、最初の合成の開始時の元のＡＴに対する、ＡＴＨの合計収率は、３５．２８＋３７．９２＝７３．２０％であった。このＡＴＨの合計収率は、単一のＡＴＨ合成でこれまで得られた最大６０％の収率を大いに上回る。さらに、リサイクルしたＡＴを用いてＡＴＨ合成から回収されたコンジュゲートしていないＡＴは、第３のＡＴＨ合成に再度使用して、元のＡＴに対して、コンジュゲート収率をさらに一層押し上げることができたと容易に分かる。
【０１０３】
上で言及されている構成は、本開示の原理に対する適用の例証であることは理解されるべきである。したがって、本技術は、例示的な実施形態に関連して上で記載されているが、当業者には、多数の改変および代替の構成は、特許請求の範囲に明記されている本開示の原理および概念から逸脱することなく行われ得ることが明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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