(57)【要約】  第１化合物をアミン含有第２化合物に可逆的に連結するためのテトラペプチドリンカーを記載する。テトラペプチドリンカーを含む化合物及びテトラペプチドリンカーの使用方法も記載する。
2018517769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下によって表される構造：
【化１】
2018517769.tif 000027
（式中、
Ｒ4は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸の側鎖であり、
Ｒ3は、非荷電親水性、又は塩基性親水性のＬアミノ酸の側鎖であり、かつ
Ｒ2は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸の側鎖である）
を含む、テトラペプチドリンカー。
【請求項２】
Ｒ4及びＲ2が独立して、-ＣＨ（ＣＨ3）2、-ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、-ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は-ＣＨ2Ｃ6Ｈ6である、請求項１に記載のテトラペプチドリンカー。
【請求項３】
Ｒ3が、-（ＣＨ2）3ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＣＨ2ＣＯＮＨ2、-（ＣＨ2）4ＮＨ3+、及び-（ＣＨ2）3-ＮＨ-Ｃ（＝ＮＨ）-ＮＨ2である、請求項１に記載のテトラペプチドリンカー。
【請求項４】
Ｒ4及びＲ2が独立して、-ＣＨ（ＣＨ3）2、-ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、-ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は-ＣＨ2Ｃ6Ｈ6であり、かつ、Ｒ3が、-（ＣＨ2）3ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ2、-ＣＨ2ＣＯＮＨ2、-（ＣＨ2）4ＮＨ3+、及び-（ＣＨ2）3-ＮＨ-Ｃ（＝ＮＨ）-ＮＨ2である、請求項１に記載のテトラペプチドリンカー。
【請求項５】
以下によって表される構造：
【化２】
2018517769.tif 000028
を含む、請求項１に記載のテトラペプチドリンカー。
【請求項６】
以下：
Ｒ5-Ａ4-Ａ3-Ａ2-Ａ1-Ｒ6  （式ＩＶ）
（式中、
Ｒ5は、第１化合物であり、
Ｒ6は、アミン含有第２化合物であり、
Ａ4は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であり、
Ａ3は、非荷電親水性、又は塩基性親水性のＬアミノ酸であり、
Ａ2は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であり、
Ａ1は、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンであり、かつ
Ａ1は、アミド結合を介してＲ6に連結される）
を含む、組成物。
【請求項７】
Ｒ4及びＲ2が独立して、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、又はＬ−フェニルアラニンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ3が、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ4及びＲ2が独立して、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、又はＬ−フェニルアラニンであり、かつ、Ｒ3が、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｒ4及びＲ2がいずれもＬ−フェニルアラニンであり、Ｒ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ｒ1がプロリンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｒ6が、ポリアミンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｒ6が、膜活性ポリアミンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１３】
以下：
（Ｒ5-Ａ4-Ａ3-Ａ2-Ａ1）n-Ｐ
（式中、
Ｒ5は、標的基又は立体安定剤を含み、
Ａ4は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であり、
Ａ3は、非荷電又は塩基性親水性のＬアミノ酸であり、
Ａ2は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であり、
Ａ1は、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンであり、
Ｐは、ポリアミンを含み、
ｎは、１以上の整数であり、かつ
各Ａ1は、アミド結合を介してポリアミン上のアミンに連結される）
を含む、組成物。
【請求項１４】
Ａ4及びＡ2が独立して、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、又はＬ−フェニルアラニンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
Ａ3が、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
Ａ4及びＲ2が独立して、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、又はＬ−フェニルアラニンであり、かつ、Ａ3が、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
Ａ4及びＡ2がいずれもＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ1がプロリンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｐが、膜活性ポリアミンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
ｎが、ポリアミン上のアミンの数の５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５超である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
以下：
（Ｒ5-Ａ4-Ａ3-Ａ2-Ａ1）n-Ｐ-（Ａ1′-Ａ2′-Ａ3′-Ａ4′-Ｒ8）m
（式中、
Ａ4は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であり、
Ａ3は、非荷電又は塩基性親水性のＬアミノ酸であり、
Ａ2は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であり、
Ａ1は、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンであり、
Ａ4´は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であり、
Ａ3´は、非荷電又は塩基性親水性のＬアミノ酸であり、
Ａ2´は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であり、
Ａ1´は、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンであり、
Ｒ5は、標的基を含み、
Ｒ8は、立体安定剤を含み、
Ｐは、ポリアミンを含み、
ｎ及びｍはそれぞれ１以上の整数であり、かつ
各Ａ1及びＡ1´は、アミド結合を介してポリアミン上のアミンに連結される）
を含む、組成物。
【請求項２１】
Ａ4、Ａ4´、Ａ2、及びＡ2´が独立して、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、又はＬ−フェニルアラニンである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
Ａ3及びＡ3´が独立して、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
Ａ4、Ａ4´、Ａ2、及びＡ2´が独立して、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、又はＬ−フェニルアラニンであり、かつ、Ａ3及びＡ3´がＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
Ａ4、Ａ4´、Ａ2、及びＡ2´がそれぞれＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3及びＡ3´がそれぞれＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ1及びＡ1´がそれぞれプロリンである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
Ｐが膜活性ポリアミンである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
ｎ＋ｍの値が、ポリアミン上のアミンの数の５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５超である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
以下：
Ｒ5-Ａ4-Ａ3-Ａ2-Ａ1-Ｒ7
（式中、
Ｒ5は、第１化合物を表し、
Ａ4は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であり、
Ａ3は、非荷電又は塩基性親水性のＬアミノ酸であって、ここで、疎水性指標、
Ａ2は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であり、
Ａ1は、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンであり、かつ
Ｒ7は、アミン反応性基を含む）
を含む生物学的に不安定なテトラペプチドリンカーを介して、第１化合物をアミン含有化合物に可逆的に結合させるための、テトラペプチド修飾剤。
【請求項２８】
Ａ4及びＡ2が独立して、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、又はＬ−フェニルアラニンである、請求項２７に記載のテトラペプチド修飾剤。
【請求項２９】
Ａ3が、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである、請求項２７に記載のテトラペプチド修飾剤。
【請求項３０】
Ａ4及びＲ2が独立して、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、又はＬ−フェニルアラニンであり、かつ、Ａ3がＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである、請求項２７に記載のテトラペプチド修飾剤。
【請求項３１】
Ａ4及びＡ2がいずれもＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ1がプロリンである、請求項２７に記載のテトラペプチド修飾剤。
【請求項３２】
Ｒ7がテトラフルオロフェニル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項２７に記載のテトラペプチド修飾剤。
【請求項３３】
以下によって表される構造：
【化３】
2018517769.tif 000029
を有する、請求項２７に記載のテトラペプチド修飾剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
生理学的に不安定なリンカー又は修飾因子は、治療薬送達を含む様々なプロセスに有用である。リンカーの切断が、リンカー又は修飾因子が無い非修飾状態の元の成分の少なくとも１つを再生する場合、リンカー又は修飾因子の有用性はさらに増強され得る。
【０００２】
化合物を可逆的に連結又は修飾するための臨床及び前臨床の設定においていくつかの戦略が調査されている。そのような可逆的コンジュゲートは毒性効果を軽減し、かつ化合物の薬理学的特性を改善するために使用される。効果的であるためには、可逆的コンジュゲートが血流において安定なままでなければならず、さらに標的細胞とコンジュゲートとの相互作用後に化合物の放出を可能にしなければならない。さらに、リンカー又は修飾因子の切断は、化合物がその生化学的標的に到達し、かつそれと効果的に相互作用することが認められなければならない。しばしば、化合物は非修飾状態で放出されなければならない。
【０００３】
可逆的コンジュゲートの例としては、プロドラッグ、そのプロトタイプ形態では不活性なままであるが、体内で代謝されて活性薬剤を生成する薬物の誘導体、及びキャリア、例えば抗体−薬物コンジュゲートが挙げられる。可逆的コンジュゲートの形成は、抗腫瘍化学療法薬の開発及びヌクレオチド送達に有用であることが示されている。
【０００４】
Ｒｏｚｅｍａら（米国特許第８１３７６９５号明細書）は、ｐＨ感受性マレイミドリンケージを形成するジメチルマレイン酸無水物を用いてポリアミンの可逆的修飾を示した。修飾ポリマーの細胞への送達及び内在化は、エンドソームの還元されたｐＨ環境下でマレイミドリンケージの切断をもたらし、ポリマーアミンを再生する。
【０００５】
ｐＨ感受性リンケージに加えて、イン・ビボでプロテアーゼにより活性化されるペプチド含有リンケージが開発されている。Ｒｏｚｅｍａら（米国特許第８４２６５５４号明細書）は、ジペプチドｐ−アミドベンジル−カルバメートスペーサー（ＰＡＢＣ）を介してポリマーアミノ含有側鎖にコンジュゲートした立体安定剤又は標的基を用いて、膜活性ポリアミンの膜破壊活性を可逆的に調節する手段を提供した。公開された設計に従って、タンパク質分解酵素の存在下で、アニリド結合の加水分解が１，６−脱離カスケードを誘発し、復元された膜分解特性を有する非修飾ポリカチオンポリマーの生成をもたらす。
【０００６】
プロドラッグ設計における自己犠牲（self-immolative）ＰＡＢＣスペーサーの適用は、Ｃａｒｌらによって最初に提案された（１９８１）。この戦略は、共有アニリド結合の切断と所望の基質の自然放出とを組み合わせる。ＰＡＢＣスペーサーが、治療剤の制御された薬物放出のために、特に抗がん治療のために、広範に研究されている（Ｄｏｒｙｗａｌｓｋａら２０１５、Ｚｈａｎｇら２０１４、Ｆｌｏｒｅｎｔら１９９８、Ｔｏｋｉら２００２、Ｓｈａｍｉｓら２００４、Ａｍｉｒら２００５、Ａｍｉｒら２００５、Ｇｏｐｉｎら２００６、Ｚｈａｎｇら２０１３、Ｚｈａｎｇら２０１３）、しかしながら、ＰＡＢＣ脱離中に生成されるキノンイミンメチド（quinonimine methide）（ＱＩＭ）としても知られているアザ−キノンメチドは、Ｎ、Ｏ、及びＳ−求核試薬と反応する傾向があるため毒性源となり得ることが懸念されている（Ｒｅｂｏｕｄ−Ｒａｖａｕｘら２００９）。
【０００７】
【化１】
2018517769.tif 000003
ＰＡＢＣスペーサーを欠く特定のペプチドタンパク質分解性プロドラッグが記載されている（Ｚｈｏｎｇら２０１３、Ｃｈｏ  ＫＹら２０１２）。しかしながら、先に記載されたペプチドタンパク質分解性プロドラッグの制限は、自己犠牲ＰＡＢＣ型類縁体の速度に匹敵する速度で親薬物の一次アミン成分を遊離しないことである。プロドラッグのタンパク質分解中のエンドペプチダーゼによるＣ−末端アミノ酸残基の切断は、律速段階であると思われる（Ｍａｓｑｕｅｌｉｅｒら１９８０、Ｓｃｈｍｉｄら２００７、Ｓｃｈｍｉｄら２００７、Ｅｌｓａｄｅｋら２０１０、Ｔｒｏｕｅｔら１９８２）。
【発明の概要】
【０００８】
概要
本明細書に記載されるのは、第１化合物をアミン含有第２化合物に可逆的に連結するためのテトラペプチドリンカーである。生理学的に切断可能なリンカー（リンカー）は、一般に：−Ａ4−Ａ3−Ａ2−Ａ1−（式中、Ａ4は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、Ａ3は親水性Ｌ−アミノ酸であり、Ａ2は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、かつ、Ａ1はＬ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンである）を有するテトラペプチドを含む。テトラペプチドリンカーは、タンパク質分解酵素によって、例えば生物、特に哺乳動物、組織、細胞あるいは細胞内コンパートメント又はオルガネラに存在する内在性プロテアーゼによって切断（消化）される。さらに、タンパク質分解酵素は容易かつ迅速にＡ1のＣ−末端側のペプチド結合を切断し、アミン含有第２化合物を遊離させる。さらに記載されるのは、記載されたテトラペプチドリンカーを含有する組成物、並びに、２つの部分を可逆的に連結し、あるいはアミン又はアミン含有化合物を可逆的に修飾するためのテトラペプチドの使用方法である。記載された可逆的リンカー及び修飾因子は血清安定性修飾を提供し、イン・ビボで切断され得る。
【０００９】
本明細書に記載されるのは、テトラペプチド連結剤であって、以下：Ｒ5−Ａ4−Ａ3−Ａ2−Ａ1−Ｒ7（式中、Ｒ5は第１化合物を含み、Ａ4は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、Ａ3は親水性Ｌ−アミノ酸であり、Ａ2は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、かつ、Ａ1はＬ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンであり、かつ、Ｒ7はアミン反応性基である）を含む、テトラペプチド連結剤である。Ｒ7は、アミン又はアミン含有化合物との反応が、Ａ1とのアミド結合を形成するように選択される。いくつかの実施形態では、Ａ3は極性非荷電Ｌ−アミノ酸である。いくつかの実施形態では、テトラペプチド連結剤が、第１化合物をアミン含有化合物に可逆的に連結するために使用され得る。いくつかの実施形態では、テトラペプチド連結剤が、アミン含有化合物を可逆的に修飾するために使用され得る。いくつかの実施形態では、テトラペプチド連結剤が、ポリアミンを可逆的に修飾するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ポリアミンは膜活性ポリアミンである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、テトラペプチド連結剤を介して第２化合物に連結された第１化合物を含有する組成物について記載し、ここで、当該テトラペプチド連結剤は、以下、Ａ4Ａ3Ａ2Ａ1（式中、Ａ4は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、Ａ3は親水性Ｌ−アミノ酸であり、Ａ2は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、Ａ1はＬ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンであり、かつ、Ａ1はアミド結合を介して第２化合物に連結している）からなる。いくつかの実施形態では、Ａ3は極性非荷電Ｌ−アミノ酸である。イン・ビトロ又はイン・ビボでのタンパク質分解酵素によるテトラペプチドの切断（消化）は、Ａ1と第２化合物との間の切断をもたらし、第２化合物を遊離させる。いくつかの実施形態では、Ａ4Ａ3Ａ2Ａ1は、以下の配列：ＦＣｉｔＦＰ（配列番号１２）、ＶＣｉｔＦＰ（配列番号１９）、ＡＣｉｔＦＰ（配列番号３）、ＦＫＦＰ（配列番号１６）、ＦＣｉｔＶＰ（配列番号１３）、ＦＣｉｔＦＬ（配列番号１１）、ＦＣｉｔＦ（Ｎｍｅ）Ａ（配列番号９）、又はＦＣｉｔＡＰ（配列番号８）を有し、ここで、ＦはＬ−フェニルアラニンであり、ＣｉｔはＬ−シトルリンであり、ＰはＬ−プロリンであり、ＶはＬ−バリンであり、ＡはＬ−アラニンであり、ＫはＬ−リシンであり、ＬはＬ−ロイシンであり、（Ｎｍｅ）ＡはＬ−Ｎ−メチル−アラニンである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、可逆的に修飾されたポリアミンを含有する組成物が記載される。ポリアミンは、本明細書に記載されたテトラペプチド連結剤でのポリアミン上の複数のアミンの可逆的修飾によって修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミンは両親媒性膜活性ポリアミンである。いくつかの実施形態では、組成物はさらにＲＮＡｉトリガーを含む。ポリアミンはＲＮＡｉトリガーに共有結合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉトリガーへのポリアミンの共有結合のためのリンケージは、生理学的に不安定なリンケージ、例えばジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンはＲＮＡｉトリガーに共有結合しておらず、ＲＮＡｉトリガーは標的基に共有結合している。いくつかの実施形態では、組成物はさらに薬学的に許容される賦形剤を含有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、第１化合物をアミン含有第２化合物に連結するための方法が記載され、当該方法は、以下：テトラペプチドのアミノ末端に第１化合物を結合させ、そしてテトラペプチドのカルボキシ末端とアミン含有第２化合物との間にアミド結合を形成し、ここで、当該テトラペプチドは以下のアミノ酸配列、Ａ4Ａ3Ａ2Ａ1（式中、Ａ4は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、Ａ3は親水性Ｌ−アミノ酸であり、Ａ2は疎水性Ｌ−アミノ酸であり、かつ、Ａ1はＬ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンである）を有すること、を含む。いくつかの実施形態では、Ａ4はフェニルアラニンである。いくつかの実施形態では、Ａ3は極性非荷電Ｌ−アミノ酸である。いくつかの実施形態では、極性非荷電アミノ酸はＬ−シトルリンである。いくつかの実施形態では、Ａ2はフェニルアラニンである。いくつかの実施形態では、Ａ1はプロリンである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、テトラペプチドリンカー又は連結剤は、４つのアミノ酸配列を有し、当該アミノ酸配列は、以下：ＦＣｉｔＦＰ（配列番号１２）、ＶＣｉｔＦＰ（配列番号１９）、ＡＣｉｔＦＰ（配列番号３）、ＦＫＦＰ（配列番号１６）、ＦＣｉｔＶＰ（配列番号１３）、ＦＣｉｔＦＬ（配列番号１１）、ＦＣｉｔＦ（Ｎｍｅ）Ａ（配列番号９）、ＦＣｉｔＡＰ（配列番号８）、からなる群から選択され、ここで、ＦはＬ−フェニルアラニンであり、ＣｉｔはＬ−シトルリンであり、ＰはＬ−プロリンであり、ＶはＬ−バリンであり、ＡはＬ−アラニンであり、ＫはＬ−リシンであり、ＬはＬ−ロイシンであり、（Ｎｍｅ）ＡはＬ−Ｎ−メチル−アラニンである。
【００１４】
本明細書に記載されるのは、生理学的に切断可能なリンカーを形成するための、フェニルアラニン−シトルリン−フェニルアラニン−プロリン（ＦＣｉｔＦＰ（配列番号１２））テトラペプチドの使用である。ＦＣｉｔＦＰリンカーは、哺乳動物、哺乳動物組織、哺乳動物細胞、又は哺乳動物細胞内コンパートメント又はオルガネラにおけるタンパク質分解酵素によって迅速に切断される。いくつかの実施形態では、アミン含有化合物は、アミド結合を介してプロリンに連結している。プロリンＣ−末端アミド結合はイン・ビボでプロテアーゼによって効率的に切断され、アミン含有化合物を放出する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、第１化合物は、以下：標的基、細胞受容体リガンド、インテグリンリガンド、ＲＧＤリガンド、ＲＧＤ模倣体、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）リガンド、ガラクトース、ガラクトース誘導体、Ｎ−アセチルガラクトサミン、葉酸、立体安定剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヌクレオチド、ポリマー、ポリアミン、抗体、医薬品、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビタミン、ビオチン、フルオロフォア、抗体、モノクローナル抗体および抗体断片、からなる群から選択され得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、アミン含有第２化合物は、以下：標的基、細胞受容体リガンド、インテグリンリガンド、ＲＧＤリガンド、ＲＧＤ模倣体、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）リガンド、ガラクトース、ガラクトース誘導体、Ｎ−アセチルガラクトサミン、葉酸、立体安定剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヌクレオチド、ポリマー、ポリアミン、抗体、医薬品、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビタミン、ビオチン、抗体、モノクローナル抗体および抗体断片、からなる群から選択され得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉトリガーをイン・ビボで細胞に送達するための組成物が記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】記載されたテトラペプチドリンカーの調製又は試験に使用されるいくつかの成分の構造。
【図２】Ａ）化合物３９についての消化速度、及びＢ）化合物２９についての消化速度、を示すグラフ。
【図３】化合物２９及び３９についての反応速度論、時間（ｈｒ）にわたって生成した中間体の速度（％）を示すグラフ（Ｃ＝シトルリン）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
記載されるのは、第１化合物をアミン含有第２化合物と可逆的に連結し、及び／又は、アミン含有第２化合物を可逆的に修飾するのに有用なテトラペプチドリンカー及びテトラペプチド連結剤である。記載のテトラペプチドリンカーは、プロドラッグ送達のために使用される以前に記載されたペプチドリンカーを上回る切断の改善された切断の反応速度論を示す（Ｒｅｊｍａｎｏｖａら１９８３、Ｍａｌｕｇｉｎら２００７、Ｍｉｌｌｅｒら２００９、Ｓｏｌｅｒら２０１５、Ｃｈｕら２０１２）。テトラペプチドリンカーはタンパク質分解酵素の非存在下で加水分解に対して安定である。イン・ビトロ又はイン・ビボでタンパク質分解酵素（プロテイナーゼ、プロテアーゼ、又はペプチダーゼとも呼ばれる）の存在下で、テトラペプチドは容易に切断される。より具体的には、記載のテトラペプチドリンカー及びテトラペプチド連結剤は、テトラペプチドのカルボキシ末端アミノ酸とアミン含有第２化合物との間で迅速に切断され、アミン含有第２化合物を放出する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、テトラペプチドリンカーが記載され、当該テトラペプチドリンカーは、以下によって表される構造：
【化２】
2018517769.tif 000004
【００２１】
（式中、
Ｒ4は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸のＲ−基（側鎖）であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、４１以上であり、
Ｒ3は、非荷電親水性又は塩基性親水性Ｌアミノ酸のＲ−基（側鎖）であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、−２８以下であり、かつ
Ｒ2は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸のＲ基（側鎖）であって、ここでｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するのでグリシンに対して正規化され、４１以上である）
を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、Ｒ2及びＲ4は、独立して、以下：−ＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、及び−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6（フェニルアラニン）、からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は、以下：−（ＣＨ2）3ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、−（ＣＨ2）4ＮＨ3+、及び−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ3は、−（ＣＨ2）3ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ2である。
【００２４】
イン・ビボで、例えばリソソーム中でのプロテアーゼへの曝露後、テトラペプチドＣ−末端アミド結合は迅速に切断（消化）される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、テトラペプチドリンカーは、以下によって表される構造を含む：
【００２６】
【化３】
2018517769.tif 000005
【００２７】
いくつかの実施形態では、生物学的に不安定な化合物が記載され、ここで、生物学的に不安定な化合物は、テトラペプチドリンカーを介してアミン含有第２化合物に連結された第１化合物を含み、当該テトラペプチドリンカーは、以下：
Ｒ5−Ａ4−Ａ3−Ａ2−Ａ1−Ｒ6（式ＩＶ）
（式中、
Ｒ5は、第１化合物を表し、
Ｒ6は、アミン含有第２化合物を表し、
Ａ4は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、４１以上であり、
Ａ3は、非荷電又は塩基性親水性Ｌアミノ酸であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、−２８以下であり、
Ａ2は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、４１以上であり、
Ａ1は、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンであり、かつ
Ａ1は、アミド結合を介してＲ6に連結されている）
を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2及びＡ4は、独立してＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−フェニルアラニンであり（それぞれ、−ＣＨ3、−ＣＨＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6の側鎖）、かつ、Ａ3はＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである（それぞれ、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、−（ＣＨ2）4ＮＨ3+又は−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2の側鎖）。
【００２９】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2及びＡ4はＬ−フェニルアラニンであり、かつ、Ａ3はＬ−シトルリンである（ＦＣｉｔＦＰ（配列番号１２））。
【００３０】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3はＬ−リシンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＫＦＰ（配列番号１６））。
【００３１】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−バリンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＶＰ（配列番号１３））。
【００３２】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−バリンである（ＶＣｉｔＦＰ（配列番号１９））。
【００３３】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−アラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＡＰ（配列番号８））。
【００３４】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−アラニンである（ＡＣｉｔＦＰ（配列番号３））。
【００３５】
いくつかの実施形態では、Ａ1はロイシンであり、Ａ2及びＡ4は独立して、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−フェニルアラニンであり（それぞれ、−ＣＨ3、−ＣＨＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6の側鎖）、かつ、Ａ3はＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシン、又はＬ−アルギニンである（それぞれ、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、又は−（ＣＨ2）4ＮＨ3+の側鎖）。
【００３６】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−ロイシンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＦＬ（配列番号１１））。
【００３７】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−Ｎ−メチル−アラニンであり、Ａ2及びＡ4は独立して、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−フェニルアラニンであり（それぞれ、−ＣＨ3、−ＣＨＣＨ3，−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6の側鎖）、かつ、Ａ3はＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニンである（それぞれ、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、又は−（ＣＨ2）4ＮＨ3+又は−（ＣＨ2）4ＮＨ3+の側鎖）。
【００３８】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−Ｎ−メチル−アラニンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＦ（Ｎｍｅ）Ａ（配列番号９））。
【００３９】
いくつかの実施形態では、Ｒ5は、以下のリスト：立体安定剤、ＰＥＧ、Ｈ−（ＣＨ2）0-2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）1-500−Ｏ0-1−（ＣＨ2）0-2−、ＰＥＧ1-100、標的基、細胞受容体リガンド、インテグリン結合リガンド、ＲＧＤリガンド、ＲＧＤ模倣体、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）リガンド、ガラクトース、ガラクトース誘導体、Ｎ−アセチルガラクトサミン、葉酸塩、ポリヌクレオチド、ポリマー、ポリアミン、抗体、製剤、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビタミン、ビオチン、フルオロフォア、抗体、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、及び抗体断片、から選択される化合物を含む。
【００４０】
Ｒ6は、一次アミン含有化合物であって、当該一次アミン含有化合物は、以下：立体安定剤、ＰＥＧ、Ｈ−（ＣＨ2）0-2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）1-500−Ｏ0-1−（ＣＨ2）0-2−、ＰＥＧ1-100、標的基、細胞受容体リガンド、インテグリン結合リガンド、ＲＧＤリガンド、ＲＧＤ模倣体、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）リガンド、ガラクトース、ガラクトース誘導体、Ｎ−アセチルガラクトサミン、葉酸塩、ポリヌクレオチド、アミン−修飾されたポリヌクレオチド、ポリマー、アミン含有ポリマー、ポリアミン、両親媒性膜活性ポリアミン、抗体、製剤、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビタミン、ビオチン、フルオロフォア、抗体、モノクローナル抗体、及び抗体断片、を含む群から選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、生物学的に不安定なテトラペプチドリンカーを介して第１化合物をアミン含有第２化合物に可逆的に結合させるためのテトラペプチド修飾剤が記載され、当該テトラペプチド修飾剤は、以下：
Ｒ5−Ａ4−Ａ3−Ａ2−Ａ1−Ｒ7（式Ｖ）
（式中、
Ｒ5は、第１化合物を表し、
Ａ4は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、４１以上であり、
Ａ3は、非荷電又は塩基性親水性Ｌアミノ酸であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、−２８以下であり、
Ａ2は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、４１以上であり、
Ａ1は、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンであり、かつ
Ｒ7アミン反応性基を含み、例えば、これらに限定されるものではないが：ＴＦＰ（テトラフルオロフェニル）の活性エステル又はＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）２−ＭＴ（２−メルカプトチアゾリン）を含む）
を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、Ａ1はプロリンであり、Ａ2及びＡ4は独立してアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニンであり（それぞれ、−ＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6の側鎖）、かつ、Ａ3はシトルリン又はアスパラギンである（それぞれ、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＮＨ2の側鎖）。
【００４３】
いくつかの実施形態では、Ａ1はプロリンであり、Ａ2及びＡ4はフェニルアラニンであり、かつ、Ａ3はシトルリンである（ＦＣｉｔＦＰ（配列番号１２））。いくつかの実施形態では、Ａ1はプロリンであり、Ａ2はフェニルアラニンであり、Ａ3はシトルリンであり、かつ、Ａ4はアラニンである（ＡＣｉｔＦＰ（配列番号３））。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2及びＡ4は独立してＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−フェニルアラニンであり（それぞれ、−ＣＨ3、−ＣＨＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6の側鎖）、かつ、Ａ3はＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである（それぞれ、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、又は−（ＣＨ2）4ＮＨ3+の側鎖）。
【００４５】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2及びＡ4はＬ−フェニルアラニンであり、かつ、Ａ3はＬ−シトルリンである（ＦＣｉｔＦＰ（配列番号１２））。
【００４６】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3はＬ−リシンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＫＦＰ（配列番号１６））。
【００４７】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−バリンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＶＰ（配列番号１３））。
【００４８】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−バリンである（ＶＣｉｔＦＰ（配列番号１９））。
【００４９】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−アラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＡＰ（配列番号８））。
【００５０】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−アラニンである（ＡＣｉｔＦＰ（配列番号３））。
【００５１】
いくつかの実施形態では、Ａ1はロイシンであり、Ａ2及びＡ4は独立してＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−フェニルアラニンであり（それぞれ、−ＣＨ3、−ＣＨＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6の側鎖）、かつ、Ａ3はＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである（それぞれ、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、又は−（ＣＨ2）4ＮＨ3+の側鎖）。
【００５２】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−ロイシンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、かつ、Ａ3はＬ−リシンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＫＦＬ（配列番号１５））。
【００５３】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−ロイシンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＦＬ（配列番号１１））。
【００５４】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−Ｎ−メチル−アラニンであり、Ａ2及びＡ4は独立してＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−フェニルアラニンであり（それぞれ、−ＣＨ3、−ＣＨＣＨ3，−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6の側鎖）、かつ、Ａ3はＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである（それぞれ、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、又は−（ＣＨ2）4ＮＨ3+の側鎖）。
【００５５】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−Ｎ−メチル−アラニンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、かつ、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＦ（Ｎｍｅ）Ａ（配列番号９））。
【００５６】
いくつかの実施形態では、Ｒ5は、以下を含むリスト：立体安定剤、ＰＥＧ、Ｈ−（ＣＨ2）0-2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）1-500−Ｏ0-1−（ＣＨ2）0-2−、ＰＥＧｉ−ｉｏｏ、標的基、細胞受容体リガンド、インテグリン結合リガンド、ＲＧＤリガンド、ＲＧＤ模倣体、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）リガンド、ガラクトース、ガラクトース誘導体、Ｎ−アセチルガラクトサミン、葉酸塩、ポリヌクレオチド、ポリマー、ポリアミン、脂質、リポソーム、抗体、製剤、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビタミン、ビオチン、フルオロフォア、抗体、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、及び抗体断片、から選択される化合物を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、標的基は細胞表面受容体リガンドを含む。細胞表面受容体は、これらに限定されるものではないが、アシアロ糖タンパク質受容体及びインテグリン受容体を含み得る。アシアロ糖タンパク質受容体リガンドは、これらに限定されるものではないが、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミルガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイルガラクトサミン、及びＮ−イソ−ブタノイルガラクトサミン、あるいはその二量体、三量体又は四量体を含み得る。インテグリン受容体は、これらに限定されるものではないが、ανβ３インテグリン及びανβ６インテグリンを含み得る。インテグリン受容体リガンドは、これらに限定されるものではないが、ＲＧＤ又はＲＧＤ模倣体を含み得る（例えば、米国特許出願公開ＵＳ−２０１５−００４５５７３  Ａｌ（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００５８】
立体安定剤は、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。ＰＥＧは、１〜１２０個のエチレン単位、３〜３０個のエチレン単位、又は３〜２４個のエチレン単位を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、生物学的に不安定なテトラペプチドリンカーを介して第１化合物をアミン含有第２化合物に可逆的に結合させるための化合物が記載され、当該化合物は、以下によって表される構造：
【００６０】
【化４】
2018517769.tif 000006
【００６１】
（式中、
Ｒ5は、第１化合物を表し、
Ｒ4は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸のＲ−基（側鎖）であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、４１以上であり、
Ｒ3は、非荷電親水性又は塩基性親水性Ｌアミノ酸のＲ−基（側鎖）であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、−２８以下である、そして
Ｒ2は、天然の、非天然異性体の、又は合成疎水性のＬアミノ酸のＲ基（側鎖）であって、ここで、ｐＨ７における疎水性指標（Moneraら、J.Protein Sci.１９９５、１、３１９）は、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連するので、グリシンに対して正規化され、４１以上であり、
Ｒ7は、アミン反応性基を含む）
を含む。
【００６２】
Ｒ7は、アミン又はアミン含有化合物との反応が、Ａ1とのアミド結合を形成するように選択される。いくつかの実施形態では、アミン反応性基はＴＦＰ（テトラフルオロフェニル）、又はＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｒ2及びＲ4は独立して、以下：−ＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、及び−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6、からなる群から選択される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は、以下：−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2及び−ＣＨ2ＣＯＮＨ2からなる群から選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、生物学的に不安定なテトラペプチドリンカーを介して第１化合物をアミン含有第２化合物に可逆的に結合させるための化合物が記載され、当該化合物は、以下によって表される構造：
【００６６】
【化５】
2018517769.tif 000007
【００６７】
（式中、Ｒ5は第１化合物を表し、かつ、Ｒ7はアミン反応性基を含む）
を含む。Ｒ7は、アミン又はアミン含有化合物との反応が、Ａ1とのアミド結合を形成するように選択される。いくつかの実施形態では、アミン反応性基はＴＦＰ（テトラフルオロフェニル）、又はＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、可逆的に修飾されたポリアミンが記載され、可逆的に修飾されたポリアミンは、以下：
（Ｒ5−Ａ4−Ａ3−Ａ2−Ａ1）n−Ｐ  （式Ｘ）
（式中、
Ｒ5、Ａ4、Ａ3、Ａ2、及びＡ1はそれぞれ上記のとおりであり、
Ｐは、ポリアミンを含み、
ｎは、１以上の整数であり、かつ
各Ａ1は、アミド結合を介してポリアミン上のアミンに連結されている）
を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ポリアミンは膜活性ポリアミンである。いくつかの実施形態では、膜活性ポリアミンは両親媒性膜活性ポリアミンである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2及びＡ4は独立してＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−フェニルアラニンであり（それぞれ、−ＣＨ3、−ＣＨＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6の側鎖）、かつ、Ａ3はＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである（それぞれ、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、又は−（ＣＨ2）4ＮＨ3+の側鎖）。
【００７１】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2及びＡ4はＬ−フェニルアラニンであり、かつ、Ａ3はＬ−シトルリンである（ＦＣｉｔＦＰ（配列番号１２））。
【００７２】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3はＬ−リシンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＫＦＰ（配列番号１６））。
【００７３】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−バリンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＶＰ（配列番号１３））。
【００７４】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−バリンである（ＶＣｉｔＦＰ（配列番号１９））。
【００７５】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−アラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＡＰ（配列番号８））。
【００７６】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−プロリンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−アラニンである（ＡＣｉｔＦＰ（配列番号３））。
【００７７】
いくつかの実施形態では、Ａ1はロイシンであり、Ａ2及びＡ4は独立してＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−フェニルアラニンであり（それぞれ、−ＣＨ3、−ＣＨＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6の側鎖）、かつ、Ａ3はＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである（それぞれ、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、又は−（ＣＨ2）4ＮＨ3+の側鎖）。
【００７８】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−ロイシンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3はＬ−リシンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＫＦＬ（配列番号１５））。
【００７９】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−ロイシンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＦＬ（配列番号１１））。
【００８０】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−Ｎ−メチル−アラニンであり、Ａ2及びＡ4は独立してＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−フェニルアラニンであり（それぞれ、−ＣＨ3、−ＣＨＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6の側鎖）、かつ、Ａ3はＬ−シトルリン、Ｌ−アスパラギン、又はＬ−リシンである（それぞれ、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、又は−（ＣＨ2）4ＮＨ3+の側鎖）。
【００８１】
いくつかの実施形態では、Ａ1はＬ−Ｎ−メチル−アラニンであり、Ａ2はＬ−フェニルアラニンであり、かつ、Ａ3がＬ−シトルリンであり、かつ、Ａ4はＬ−フェニルアラニンである（ＦＣｉｔＦ（Ｎｍｅ）Ａ（配列番号９））。
【００８２】
いくつかの実施形態では、可逆的に修飾されたポリアミンは、ポリアミンと、複数の記載のテトラペプチド修飾剤とを反応させることによって形成される。いくつかの実施形態では、膜活性ポリアミンへのテトラペプチド修飾剤の結合が、マスクされたポリアミン又は送達ポリマーを形成することによって、膜活性ポリアミンの膜活性をマスクする。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの５０％超が修飾される（ｎの値がポリアミン上のアミンの数の５０％超である）。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの６０％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの７０％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの７５％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの８０％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの８５％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの９０％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの９５％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの１００％が修飾される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、Ｒ5は標的基を含み、かつ、可逆的に修飾されたポリアミンはさらにＲＮＡｉトリガーにコンジュゲートされる。ＲＮＡｉトリガー−可逆的に修飾されたポリアミンコンジュゲートは、標的遺伝子発現をノックダウンする目的で、ＲＮＡｉトリガーをイン・ビボで細胞へと送達するために使用され得る。コンジュゲートは形成され、患者に投与される。投与は、これらに限定されるものではないが、血管内注射及び皮下注射で有り得る。イン・ビトロ又はイン・ビボでのタンパク質分解酵素によるテトラペプチドの切断（消化）は、Ａ1とポリアミンとの間の切断をもたらし、ポリアミンを遊離させる。ポリアミンの放出速度は、薬物又はＲＮＡｉトリガー送達を提供するのに十分である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、可逆的に修飾されたポリアミンが記載され、可逆的に修飾されたポリアミンは、以下：
（Ｒ9−Ａ4−Ａ3−Ａ2−Ａ1）n−Ｐ−（Ａ1´−Ａ2´−Ａ3´−Ａ4´−Ｒ8）m （式ＸＩ）
（式中、
Ａ4、Ａ3、Ａ2、及びＡ1はそれぞれ上記のとおりであり、
Ａ1´、Ａ2´、Ａ3´、及びＡ4´は独立して、それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、及びＡ4について上記したとおりであり、
Ｒ9は、標的基を含み、
Ｒ8は、立体安定剤を含み、
Ｐは、ポリアミンを含み、
ｎ及びｍはそれぞれ１以上の整数であり、かつ
各Ａ1及びＡ1´は、アミド結合を介してポリアミン上のアミンに連結される）
を含む。
【００８６】
可逆的に修飾されたポリアミンは、ポリアミンと複数の記載のテトラペプチド修飾剤とを反応させることによって形成される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ポリアミンは膜活性ポリアミンである。いくつかの実施形態では、膜活性ポリアミンは両親媒性膜活性ポリアミンである。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの５０％超が修飾される（ｎ＋ｍの値がポリアミン上のアミンの数の５０％超である）。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの６０％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの７０％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの７５％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの８０％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの８５％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの９０％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの９５％超が修飾される。いくつかの実施形態では、ポリアミン上のアミンの１００％が修飾される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、可逆的に修飾されたポリアミンはさらにＲＮＡｉトリガーにコンジュゲートされる。ＲＮＡｉトリガー−可逆的に修飾されたポリアミンコンジュゲートは、標的遺伝子発現をノックダウンする目的で、ＲＮＡｉトリガーをイン・ビボでの細胞へと送達するために使用され得る。コンジュゲートが形成され、患者に投与される。投与は、これらに限定されるものではないが、血管内注射及び皮下注射で有り得る。イン・ビトロ又はイン・ビボでのタンパク質分解酵素によるテトラペプチドの切断（消化）は、Ａ1とポリアミンとの間の切断をもたらし、ポリアミンを遊離させる。ポリアミンの放出速度は、薬物又はＲＮＡｉトリガー送達を提供するのに十分である。
【００９０】
驚くべきことに、テトラペプチドリンカーのＣ−末端Ｌ−プロリン残基の挿入が、リンカーの切断特性を大いに改善することを示す。Ｌ−プロリンがＡ1に存在する場合、Ｈ2Ｎ−Ｒ6（式Ｘ及びＸＩからのＨ2Ｎ−Ｐ）の再生は、著しく速い速度で起こる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、内在性酵素がＡ3とＡ2との間でテトラペプチドを迅速に切断して、Ａ4−Ａ3ジペプチドに連結された第１化合物（Ｒ5−Ａ4−Ａ3−ＣＯ2Ｈ）及びＡ2−Ａ1ジペプチドに連結された第２化合物（Ｈ2Ｎ−Ａ2−Ａ1−Ｎ（Ｈ）−Ｒ6）を生成すると考えられる。Ａ1におけるプロリンの存在は、Ａ2とＡ1との間の切断を抑制する。プロリン以外の数個のアミノ酸が位置Ａ1に存在する場合、内在性エキソプロテアーゼは、（Ｈ2Ｎ−Ａ2−Ａ1−Ｎ（Ｈ）−Ｒ6）からＡ2を迅速に切断して、Ｈ2Ｎ−Ａ2−ＣＯ2ＨプラスＨ2Ｎ−Ａ1−Ｎ（Ｈ）−Ｒ6を得ると考えられる。第２化合物からの単一アミノ酸の切断は遅く、元のアミン含有化合物（Ｈ2Ｎ−Ｒ6）の遅い再生をもたらすと考えられる。位置Ａ1におけるプロリンの非存在下では、本発明者らは、Ａ2とＡ1との間の最初の切断によって、あるいは、Ａ3とＡ2との間の切断に次ぐＡ2とＡ1との間の切断のいずれかによって、単一アミノ酸コンジュゲート（Ｈ2Ｎ−Ａ1−Ｎ（Ｈ）−Ｒ2）が容易に形成されることを観察した。対照的に、プロリンが位置Ａ1に存在する場合、ジペプチドＡ2−Ａ1は、内在性ジペプチダーゼによって迅速に切断されて、Ｈ2Ｎ−Ａ2−Ｐｒｏ−ＣＯ2Ｈ及び放出された第２化合物Ｈ2Ｎ−Ｒ6を得ると考えられる。同様の結果が、Ｌ−ロイシン又はＮ−メチルアラニン及び位置Ａ1で達成される。
【００９１】
本明細書で使用される場合、膜活性ポリアミンは表面活性の、両親媒性ポリマーであって、当該ポリマーは生体膜に対して以下の効果の１つ又は複数を誘導することができる：非膜透過性分子を細胞に入れ又は膜を横切らせる膜の変質又は破壊、膜における孔形成、膜の分裂、あるいは膜の破壊又は溶解。本明細書で使用される場合、膜又は細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変質又は破壊は、少なくとも１つの以下のアッセイにおけるポリマーの活性によって機能的に定義することができる：赤血球細胞溶解（溶血）、リポソーム漏出（leakage）、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、及びエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こす膜活性ポリマーは膜溶解性ポリマーとも呼ばれる。原形質膜を越えてエンドソーム又はリソソームの破壊を選択的に引き起こすポリマーは、エンドソーム溶解性（endosomolytic）であると考えられる。細胞膜に対する膜活性ポリマーの影響は一時的であり得る。膜活性ポリマーは、膜に親和性を有し、二重層構造の変性又は変形を引き起こす。膜活性ポリマーは合成又は非天然の両親媒性ポリマーであってもよい。
【００９２】
ポリヌクレオチドの細胞への送達は、原形質膜又は内部小胞膜（例えばエンドソーム又はリソソーム）を破壊又は不安定化する膜活性ポリマーによって媒介され、膜に細孔を形成すること、あるいは、エンドソーム又はリソソーム小胞を破壊し、それによって細胞質中に小胞の内容物の放出を可能にすることによるものを含む。
【００９３】
本明細書で使用される場合、立体安定剤は、立体安定剤を含まない分子と比較して、それが結合している分子の分子内又は分子間相互作用を防止又は阻害する、非イオン性の親水性ポリマー（天然、合成、又は非天然のいずれか）である。立体安定剤はそれが結合している分子が静電相互作用に関与するのを妨げる。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による２つ以上の物質の非共有的会合である。立体安定剤は、血液成分との相互作用、従ってオプソニン化、食作用、及び細網内皮系による取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定剤は、それらが結合している分子の循環時間を増加させることができる。立体安定剤はまた、分子の凝集を阻害することができる。いくつかの実施形態では、立体安定剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＰＥＧ誘導体である。好適なＰＥＧ分子は約１〜１２０個のエチレングリコールモノマーを有する。
【００９４】
標的基（また、標的リガンド）は、標的細胞若しくは組織、又は特定の細胞型への化合物の標的化又は送達に使用される。標的基は、標的細胞との分子の会合を増強する。したがって、標的基は、それらが結合しているコンジュゲートの薬物動態特性又は生体内分布特性を増強して、コンジュゲートの細胞分布及び細胞取り込みを改善することができる。細胞又は細胞受容体への標的基、例えばリガンドの結合はエンドサイト―シスを開始し得る。標的基は、以下を含む群：細胞表面分子に親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、及び抗体、抗体断片、並びに細胞表面分子に親和性を有する抗体模倣物、から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、標的基は細胞受容体リガンドを含む。様々なリガンドが、薬物及び遺伝子を、細胞及び特定の細胞受容体に標的化するために使用されてきた。細胞受容体リガンドは、以下を含む群：炭水化物、グリカン、糖類（これらに限定されるものではないが：ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノース、及びマンノース誘導体を含む）、ビタミン、葉酸塩、ビオチン、アプタマー、ペプチド（これらに限定されるものではないが：ＲＧＤ含有ペプチド、インスリン、ＥＧＦ、及びトランスフェリンを含む）、及びＲＧＣ模倣体、から選択されてもよい。
【００９５】
本明細書で使用される場合、ＡＳＧＰｒリガンド（又はＡＳＧＰｒリガンド）は、ガラクトースと等しいかそれを超えるＡＳＧＰｒに対する親和性を有する、ガラクトース及びガラクトース誘導体を含む。ガラクトース標的基のＡＳＧＰｒ（複数）への結合は、肝細胞への送達ペプチドの細胞特異的標的化、及び肝細胞内への送達ペプチドのエンドサイトーシスを促進する。ＡＳＧＰｒリガンドは、以下を含む群：ラクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミルガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイルガラクトサミン、及びＮ−イソ−ブタノイル−ガラクトサミン、から選択されてもよい（ｌｏｂｓｔ、Ｓ．Ｔ．及びＤｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｋ．J.Ｂ．Ｃ．１９９６、２７１、６６８６）。ＡＳＧＰｒリガンドは、単量体（例えば、単一ガラクトサミンを有する）又は多量体（例えば、複数のガラクトサミンを有する）で有り得る。
【００９６】
ＲＮＡｉトリガー（ｄｓＲＮＡｉトリガーとも呼ばれる）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害する。ＲＮＡｉトリガーは、典型的には１５〜５０塩基対又は１８〜２６塩基対を含む、二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を含み、そして、細胞内で発現される標的遺伝子におけるコーディング配列とコア領域にわたって少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する。ＲＮＡｉトリガーには、これらに限定されるものではないが、以下：低分子干渉ＲＮＡ（short interfering RNA）（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（short hairpin RNA）（ｓｈＲＮＡ）、及びダイサー基質、が挙げられる（米国特許第８，０８４，５９９  ８，３４９，８０９及び８，５１３，２０７号明細書）。
【００９７】
遺伝子発現を阻害、下方制御、又はノックダウンするとは、遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベル、あるいはｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチド、タンパク質又はタンパク質サブユニットのレベルによって測定された遺伝子の発現が、本明細書に記載されたブロッキングポリヌクレオチド−コンジュゲートの非存在下で観察されたものよりも低いことを意味する。本明細書に記載の組成物によって送達されるポリヌクレオチドによる遺伝子発現の阻害、下方制御、又はノックダウンは、対照不活性核酸、スクランブル配列を有するか不活性化ミスマッチを有する核酸の存在下で、あるいは、可逆的に修飾されたポリマーへのポリヌクレオチドのコンジュゲーションの非存在下で、観察されたレベルを下回る。薬理学及び毒物学において、投与経路は、薬物、流体、毒、又は他の物質を身体に接触させる経路である。一般的に、哺乳動物の治療のための薬物及び核酸の投与方法は当該技術分野においてよく知られており、本明細書に記載の組成物の投与に適用することができる。本明細書に記載の組成物は、非経口を含む、その経路に適切に合わせた調製物で、任意の好適な経路を介して投与することができる。したがって、本明細書に記載の化合物は、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内に、注射によって投与することができる。従って、本明細書に記載の組成物は医薬組成物に含まれてもよく、及び／又は、薬学的に許容される担体又は賦形剤の一部を成してもよい。
【００９８】
投与の非経口経路は、シリンジ及び針又はカテーテルを使用する、血管内（静脈内、動脈内）、筋肉内、実質内、皮内、真皮下、皮下、腫瘍内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜下、硬膜外、及びリンパ内注射を含む。
【００９９】
記載の組成物は、薬学的に許容される担体溶液で注入される。薬学的に許容されるとは、薬理学的／毒物学的観点から哺乳動物に許容されるそれらの特性及び／又は物質をいう。薬学的に許容されるというフレーズは、哺乳動物に投与された際に、生理学的に耐容され、かつ、典型的にはアレルギー又は他の有害又は毒性反応を生じない、分子実体、組成物、及び特性をいう。薬学的に許容されるという用語は、連邦又は州政府の規制当局によって承認され、あるいは、米国薬局方、又は動物及びより具体的にはヒトにおける使用のために一般的に認められた他の薬局方に記載され得ることを意味する。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、薬理学的有効量の活性医薬成分（ＡＰＩ、また、治療用製品、例えば、ＲＮＡｉトリガー）、薬学的に許容される担体、及び任意により１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含有する。薬学的に許容される賦形剤（賦形剤）は、安全性について適切に評価された、薬物送達システムに意図的に含まれる、ＡＰＩ以外の物質である。賦形剤は、意図された投与量で治療効果を発揮しないか、発揮することが意図されない。賦形剤は、ａ）製造中の薬物送達システムの処理に役立ち、ｂ）ＡＰＩの安定性、生物学的利用能又は患者受容性を保護、支持又は増強し、ｃ）製品の識別を助け、及び／又は、ｄ）保存又は使用中にＡＰＩの全体の安全性、有効性、送達の任意の他の属性を増強するように、作用し得る。
【０１０１】
賦形剤には、これらに限定されるものではないが、以下：吸収促進剤、抗付着剤、消泡剤、抗酸化剤、結合剤、結合剤、緩衝剤、担体、被覆材、着色料、送達促進剤、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香味料、流動促進剤、保湿剤、潤滑剤、油、ポリマー、保存剤、生理食塩水、塩、溶媒、糖類、懸濁化剤、徐放性マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、防水材、及び湿潤剤、が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤は不活性物質であってもなくてもよい。
【０１０２】
本明細書に記載の医薬組成物は、医薬組成物に一般的に見られる他の付加的な成分を含有することができる。薬学的に活性な物質は、これらに限定されるものではないが：抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔、又は抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン、ジフェンヒドラミン等）を含んでもよい。本明細書に定義されたＲＮＡｉトリガーを発現し又は含む細胞、組織又は単離された器官が「医薬組成物」として使用され得ることも想定される。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」「治療上有効量」又は単に「有効量」とは、意図される薬理学的、治療的又は予防的結果を生じるためのＲＮＡｉトリガーの量をいう。
【０１０３】
テトラペプチドリンカーを含有する薬剤はまた、そのような薬剤の製造のためのプロセスである場合、本発明の目的であり、当該プロセスは、テトラペプチドリンカーを含有する１つ又は複数の化合物、並びに、所望される場合、１つ又は複数の他の治療上有益な物質をガレヌス（galenical）投与形態とすることを含む。
【実施例】
【０１０４】
実施例
実施例１．テトラペプチドリンカー及び、テトラペプチドリンカーを有するコンジュゲートの合成
Ａ）ペプチド及びＡＥＮＡ標識ペプチドの合成
【０１０５】
【化６】
2018517769.tif 000008
【０１０６】
（ｉ）化合物１〜２１の固相合成：ペプチド酸を、プロリン、ロイシン、アラニン又はＮ−メチルアラニンで予め充填した市販の２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂（EMD Millipore、ビレリカ、ＭＡ）から合成した。固相合成の技術分野で標準的な方法を用いて、段階的添加を行った。カップリングを、ＰＹＢＯＰ（４当量）、アミノ酸（４当量）、及びＤＩＥＡ（８当量）を用いて行った。Ｆｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて行った。
【０１０７】
ペプチド合成後、Ｎ−末端アミノ酸を脱保護し、指示されたＲ5基とカップリングした。４当量のＤＩＥＡを含有するＤＭＦ中の、ＮＡＧ（ＯＡｃ）3（US8802773及びＲｏｚｅｍａら２０１５で調製した）又はＰＥＧ12（Quanta Biodesign、Plain City、OH、CAS #：756525-94-7）のいずれかの２当量のＮＨＳ活性化エステルを用いて、カップリングを行った。他のＲ5基は同様の合成法を用いて結合することができる。Ｒ5の結合後、ペプチドを０．２５時間、ＤＣＭ中のＨＦＩＰ（３０％）を用いて樹脂から切断した。溶媒除去後、残渣をＥｔ２０でトリチュレートした。基質をその後さらに精製することなく使用した。
【０１０８】
（ｉｉ）化合物２２〜４３の一般的調製（２２ａ、２４ａ、２５ａ、３２ａ、３４ａ）：粗ペプチド基質（１〜２１）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（２当量）、ＤＩＥＡ（２ｅａ）、次いでＡＥＮＡ（２当量）を添加し、１時間室温で攪拌した。完了時に、溶媒を真空中で除去した。化合物２４ａ、２５ａ、３２ａ、及び３４ａをその後さらに精製することなく使用した。全ての他の基質を、０．１％ギ酸で緩衝したアセトニトリル及び水の勾配を溶出するThermo Scientific Aquasil C 18逆相カラム（２５０ｘ２１．２、ウォルサム、ＭＡ）を備えたＨＰＬＣ用いて精製した。精製後に、全ての化合物を凍結乾燥によって乾燥した。
【０１０９】
（ｉｉｉ）化合物２２ｂ、２４ｂ、２５ｂ、３２ｂ及び３４ｂの調製：化合物２４ａ及び２５ａを１５分間ＤＭＦ中の２％ヒドラジンで処理し、その後全ての溶媒を真空中で除去した。化合物３２ａをＤＣＭ中の５０％ＴＦＡで１時間処理し、その後全ての溶媒を真空中で除去した。化合物３４ａを１８時間無溶媒（neat）のギ酸で処理し、その後全ての溶媒を真空中で除去した。未精製化合物２２ａの一部をＭｅＯＨ（２５％）、Ｈ2Ｏ（４５％）、及びＴＥＡ（３５％）で処理し、室温で一晩攪拌し、その後全ての溶媒を真空中で除去した。上述のとおり脱保護した全ての化合物を、その後ステップ（ｉｉ）に記載のとおりＨＰＬＣにより精製した。
【０１１０】
Ｂ）化合物４４ａ、４４ｂ、４５ａ、４５ｂ及び３４ｂの一般的調製、ペプチド基質のエステル活性化（ｉｖ）：
【０１１１】
【化７】
2018517769.tif 000009
【０１１２】
粗化合物０１ａ、０１ｂ、０８ａ、０８ｂ、１５ｂ、及び２０を、ステップ（ｉｉ）に記載のとおりＨＰＬＣで第１精製した。ＨＰＬＣによる精製前に、化合物０１ａ及び０８ａを、ステップ（ｉｉｉ）に記載した２２ｂの調製のように、ＭｅＯＨ（２５％）、Ｈ2Ｏ（４５％）、及びＴＥＡ（３５％）で処理した。その後全ての化合物を次のように活性化した。火炎乾燥したフラスコ中で、０．２Ｍの濃度でＤＭＦ又はＤＣＭ中に精製した基質を含有する０℃の溶液に、ＮＨＳ（３当量）及びＤＣＣ（３当量）を添加し、室温、アルゴン下で、一晩、撹拌させた。完了時に、混合物を部分的に濃縮し、−２０℃に冷却し、濾過し、次いで全ての溶媒を真空中で除去した。残渣を最小限のＤＣＭ及びＭｅＯＨに溶解し、冷Ｅｔ2Ｏ中に沈殿させ、遠心分離後に溶媒のデカンテーションによって回収した。Ｅｔ2Ｏ中での沈殿を、残留ジシクロヘキシル尿素がＮＭＲによる確認で検出可能でなくなるまで繰り返した。全ての調製した化合物をその後さらに精製することなく使用した。
【０１１３】
Ｃ）ＥＤＡＮＳ標識基質の合成、化合物４８〜５９の一般的調製：
【０１１４】
【化８】
2018517769.tif 000010
【０１１５】
各ペプチド酸を、エタノールアミンで予め充填した市販の２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂（EMD Millipore、ビレリカ、ＭＡ）から合成した。段階的固相合成をステップ（ｉ）に記載のとおり行った。ペプチド合成後、Ｎ−末端ＦＭＯＣを除去し、配列を０．５時間ＤＣＭ中の５％ＴＦＡ、５％Ｈ2Ｏを用いて樹脂から切断し、ステップ（ｉｉ）に記載のとおりＨＰＬＣにより精製した。精製前に、化合物５２及び５３を、ＤＣＭ中の５０％ＴＦＡ、５％ＴＩＳ、５％Ｈ2Ｏで１時間処理した。
【０１１６】
Ｄ）化合物６０の調製（ｖｉ）、消化アッセイのためのコントロールの合成：
【０１１７】
【化９】
2018517769.tif 000011
【０１１８】
以前に記載のとおり調製した（US8802733、Ｒｏｚｅｍａら２０１５、Ｃａｒｌｓｏｎら２０１５）、ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（０．０５２ｍｍｏｌ、５６ｍｇ）を含有する溶液に、ＤＭＦ（４００ｕＬ）中のＴＥＡ（０．０７８ｍｍｏｌ、１０．８μｌ）及びＥＤＡＮＳ（０．０５２ｍｍｏｌ、１４ｍｇ）を加え、懸濁液として室温アルゴン下で一晩撹拌した。完了時に全ての溶媒を真空中で除去し、粗残留物をＥｔ2Ｏでトリチュレートし、ＣＨＣｌ3中のＭｅＯＨ（１０−２０％）の勾配を溶出するＳｉＯ2を用いて精製した。収率５８ｍｇ（９２％）。
【０１１９】
【表１−１】
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【表１−２】
2018517769.tif 000013
【０１２０】
実施例２．テトラペプチドリンカーの切断の速度
様々なアミノ酸の組み合わせ、テトラペプチドを使用して、様々な第１部分（Ｒ5）及びＡＥＮＡレポート基（report group）第２化合物（Ｒ6）を連結し、アッセイ基質（基質）を形成した。ペプチドの切断速度を、ラットリソソーム抽出物の存在下で基質の消化の分析によって評価した。
【０１２１】
レポーティング基（Reporting group）を、ＵＶ−ｖｉｓモニタリングのために上述のペプチド基質のＣ−末端にカップリングさせ、ＨＰＬＣによってペプチド分解の反応速度論に対するアミノ酸配列の影響を調べた。吸光係数もλｍａｘもペプチドからの切断後に影響しなかったので、Ｎ−（２−アミノエチル）−４−ニトロアニリン（ＡＥＮＡ）又はＮ−（アミノエチル）−５−ナフチルアミン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を、ＨＰＬＣモニタリングのためのレポーティング基として使用した。各ペプチド基質のＮ−末端を、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ12）又はＮ−アセチルガラクトサミン（ＮＡＧ（ＯＲ）3）のいずれかで修飾した（図１）。
【０１２２】
消化アッセイ：３７℃でインキュベートした１％ＣＨＡＰＳ及び１．８ｍＭのＤＴＴを含有するｐＨ５に緩衝した２５ｍＭのＭＥＳ溶液中の肝臓リソソーム（酵素）抽出物（０．４５μｇ／μＬ）を用いて、固定基質濃度（０．５１μｍｏｌ）で、タンパク質分解消化実験を行った。酵素抽出物を、ＡＥＮＡ標識ペプチド基質の添加前に、３７℃で１５分間ＤＴＴの存在下で活性化した。２６時間までの様々な時点で２０μｌのアリコートを取り出し、ＴＦＡでｐＨ３に酸性化した。画分の分析を、Aquasil C 18逆相カラム（２５０ｘ４．６、Thermofisher、ウォルサム、ＭＡ）を備えたＨＰＬＣを用いて行い、３９０ｎｍ及び３３５ｎｍでそれぞれＡＥＮＡ及びＥＤＡＮＳについてモニターした。０．１％ギ酸で緩衝したアセトニトリル及び水の勾配を用いて溶出を行った。非修飾リポーター分子の生成を測定した。凍結解凍サイクルを最小限に抑えるため、リソソーム抽出物を−８０℃での保存前に、複数のアリコートに分注した。新しいアリコートを各試験に用い、解凍直後に使用した。リソソーム抽出物は、分画密度勾配遠心分離（differential density gradient centrifugation）によって雌Hans Wistarラットから供給された（Ｇｒａｈａｍら２０００）。リソソーム抽出物のタンパク質濃度を、標準ＢＣＡタンパク質アッセイプロトコルによって決定した。化合物６０を実験間の速度の正規化のために使用した（表２〜４）。６０について複数のアッセイにわたって観察された平均実験速度は１２３．８ｎｍｏｌ／ｈであった。正規化されたサンプル速度を以下のように計算した：
［（平均化合物６０速度÷実験化合物６０速度）］×サンプル実験速度
【０１２３】
速度（Rate）（分解の速度（velocity of degradation）又は速度（velocity）とも呼ばれる）初期線形回転（early linear turnover）の間に外挿された（表２）。本明細書で使用される場合、速度は、５０％未満の完了時にレポーティング基生成の線形速度として定義される（消化速度は５０％未満の完了時に線形であると仮定された）。切断が連続的な一次速度論から逸脱した基質については、消化の終点で遊離したレポーティング基のパーセントを比較の基準として使用した。
【０１２４】
表２におけるデータは、位置Ａ2及びＡ4にかさ高い（bulky）疎水性アミノ酸、位置Ａ3にかさ高い親水性（極性）アミノ酸、並びに、位置Ａ1にプロリン又はロイシンを有するテトラペプチドにより、切断の最も早い速度が観察されたことを示す。いくつかの実施形態では、位置Ａ1におけるアミノ酸はプロリンである。
【０１２５】
Ａ1位置にプロリンを有するテトラペプチドリンカーは最も速い速度を有した。化合物３０（ＦＣｉｔＡＰ（配列番号８））、及び２３（ＦＣｉｔＦＰ（配列番号１２））のプロリンがアラニンに変更されると、化合物３３（ＦＣｉｔＡＡ（配列番号７））及び３９（ＦＣｉｔＦＡ（配列番号１０））、速度及び消化の完了時間の劇的な低下が観察された。化合物２３に示されるように、化合物２７のＡ1におけるロイシンをプロリンで置換することは、プロリン含有テトラペプチドについての速度の大幅な増加をもたらした。ロイシン含有化合物２５ｂにおける場合と比較して、プロリン含有化合物２４ｂで速度のわずかな増大も観察された。
【０１２６】
位置Ａ2及びＡ4により大きな（かさ高い）疎水性アミノ酸を有するテトラペプチドはまた、一般により高い速度を示した。Ａ2位置における側鎖のかさ（bulk）が増大すると、化合物３０、２６及び２３は、消化の速度が増加した。同様に、Ａ4位置における側鎖のかさの増大は、それぞれ化合物３１、２８及び２３で示されたように消化の速度を増加させた。
【０１２７】
位置Ａ3にかさ高い極性（天然又は正に荷電した）アミノ酸を有するテトラペプチドは、より速い切断速度を示した。化合物２３、２４ｂ、３２ｂ、及び３４ｂを参照のこと。
【０１２８】
化合物２９を得るためのＡ1における化合物３９のＮ−メチル化は、より速い速度及びより速い消化の完了をもたらした（図２も参照）。
【０１２９】
【表２】
2018517769.tif 000014
【０１３０】
所与のテトラペプチドについて、切断の速度（非修飾Ｈ2Ｎ−Ｒ6の遊離の速度）は、化合物Ｒ5の同一性によって有意に影響を受けなかった。化合物２２ａ及び２３は、タンパク質分解消化の速度について本質的に同等であった（表３）。同様に、アセチル修飾されたＮＡＧ（ＯＡｃ）3、化合物２２ａは、非修飾類縁体である化合物２２ｂと比較して、消化の速度に対する無視できる影響を有することが示された（表３）。
【０１３１】
【表３】
2018517769.tif 000015
【０１３２】
実施例３．ジペプチドの消化速度に対するアミノ酸Ａ1及びＡ2の影響
アミン末端及びＣ−末端（Ｒ6）ＥＤＡＮＳリポーターを有するジペプチド基質を、切断速度に対するアミノ酸Ａ1及びＡ2の影響をさらに分析するために作成した。ジペプチド基質は、アミノ酸Ａ2とＡ3との間のテトラペプチド第１切断事象に続いてテトラペプチドリンカーを模倣する。ジペプチドを抽出物で処理し、消化産物を上述のように分析した。表４に見られるように、Ａ1にプロリンを有するジペプチドは、より速い切断速度を示した。表２のデータと一致して、切断速度は位置Ａ1におけるアミノ酸、並びに位置Ａ2としてのアミノ酸のサイズ及び電荷に依存することがわかる（表４）。位置Ａ1にプロリンを有するペプチドは最大切断速度を有する。切断の速度はまた、化合物４８、４９、５０、５２、５５及び５８について見られるように、Ａ2アミノ酸の大きさ及び疎水性が増大するにつれて増加した。
【０１３３】
（それぞれ化合物５４及び５６を得るための）化合物５７及び５９へのフェニルアラニンの付加は、付加的なアミノ酸にもかかわらず、消化の速度の実質的な増加をもたらした。
【０１３４】
【表４】
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【０１３５】
実施例４．異なる供給源からの抽出物を用いた消化の分析
観察された切断速度はタンパク質分解酵素の供給源に依存しなかった。市販のラット及びヒト肝臓Ｓ９抽出物（Xenotech LLC、Lenexa、ＫＳ）を使用して消化した場合、増加速度の順序（２３＞３０＞３７＞４２）は維持された（表５）。したがって、切断速度は、異なる種及び細胞型を越えて同様であると予想される。
【０１３６】
【表５】
2018517769.tif 000017
【０１３７】
実施例５．ペプチドリンカー消化中間体の分析
実施例２及び３からのアリコートをＨＰＬＣ及びエレクトロ−スプレーイオン化質量分析法によってさらに分析し、消化中間体を同定した。分析は、基質分解の初期細胞内タンパク質分解事象のための複数の切断可能な位置を示した。位置Ａ1にプロリンを有するテトラペプチドリンカー（２２ａ、２２ｂ、２３、２４ｂ、２６、２８、３０、３１、３４ｂ、３７、及び４２）は、有意な量のＨ2Ｎ−Ｐｒｏ−Ｒ6中間体を生成しないようであった。すなわち、Ａ1におけるプロリンと位置Ａ2におけるアミノ酸との間に有意な消化は見られなかった。Ａ2−プロリン−ＡＥＮＡ又は遊離ＡＥＮＡのみが観察された。Ａ1がアラニン又はロイシンであった場合、律速段階は最終残基のタンパク質分解であった。消化中間体は、図２に化合物３９（ＦＣｉｔＦＡ（配列番号１０））及び２９（ＦＣｉｔＦ（Ｎｍｅ）Ａ（配列番号９））について示されている。
【０１３８】
実施例６．Ｈ2Ｎ−Ｒ6の放出はＲ6におけるポリマー化合物の立体的かさ高さによって損なわれなかった。
ＰＥＧテトラペプチド修飾剤を、Ｒ5におけるＰＥＧ基及びＲ7における活性化エステルを用いることによって合成した（式Ｖ）。膜活性ポリアミン（下記参照）を、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡ、ＣＤＭ−ＮＡＧ及び指示されたテトラペプチド（４５ｂ、４６）又は以前に記載されたトリペプチドコントロール（４７）修飾剤（米国特許第８１３７６９５及び８４２６５５４号明細書）により修飾して、動的ポリコンジュゲート送達ポリマーを形成した。次いで、０．２５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡにコンジュゲートした１ｍｇ／ｋｇのポリマーをマウスに注入した。５日目に、サンプルを回収し、第ＶＩＩ因子についてアッセイした。第ＶＩＩ因子のノックダウンは、以前に記載されたＣＤＭマスキング剤及びジペプチド−ＰＡＢＣマスキング剤と同様の速度での、ポリアミンからの修飾剤の切断を必要とする。表６に示されるように、記載のテトラペプチド剤（４５ｂ、４６）はＤＰＣ−媒介ｓｉＲＮＡ送達で用いられる場合に有効な修飾剤であり（米国特許第８１３７６９５及び８４２６５５４合明細書）、細胞内での迅速な切断を示し、膜活性ポリアミンを放出した。有効なイン・ビトロノックダウンはまた、ＰＥＧ基の存在がイン・ビボでのリンカーの消化に悪影響を及ぼさなかったことを示す。ＰＥＧ12で官能化されたテトラペプチドで修飾された動的ポリコンジュゲート送達ポリマーについて、イン・ビボでのノックダウン増加の順序（４５ｂ＞４６＞４７）は、イン・ビトロの速度論的結果と相関した。速度論的評価のためのイン・ビトロモデルの検証は動物研究で得られた結果によって示された。
【０１３９】
【表６】
2018517769.tif 000018
【０１４０】
実施例７．不安定性のイン・ビボ分析
ＤＰＣ−媒介ｓｉＲＮＡ送達のための修飾剤としてのリンカーを試験することによって、テトラペプチドをイン・ビボの不安定性及び可逆性について分析した。
【０１４１】
Ａ）ＲＮＡ干渉トリガー（ｓｉＲＮＡ）
ｓｉＲＮＡ合成：以下の配列のコントロールｓｉＲＮＡを、標準的なホスホロアミダイト化学を用いて合成した。
【０１４２】
siF7 sense:   5′-(NH2-C6)-GfcAfaAfgGfcGfuGfcCfaAfcUfcAf(invdT)-3′ 配列番号4
siF7 antisense:   5′dTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfcdTsdT-3′ 配列番号6
（小文字、２´−ＯＭｅ置換；ｆ、２´−Ｆ置換；ｄ、２´−デオキシ置換；及びｓ、ホスホロチオエートリンケージ）
【０１４３】
ＤＢＣＯジスルフィドによるアミンｓｉＲＮＡの修飾：５´アミン−修飾ｓｉＲＮＡと、１重量当量（wt.eq.）のジベンゾシクロオクチン−Ｓ−Ｓ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＡＬＤＲＩＣＨカタログ＃７６１５３２）及び水中の０．３６重量当量のＮａＨＣＯ3との４℃で１６時間の反応によって、ＤＢＣＯ−修飾ｓｉＲＮＡを合成した。次いで修飾されたｓｉＲＮＡを９容量のエタノールの添加、及び−８０℃で２時間のインキュベートによって沈殿させた。沈殿物をＲＮａｓｅ−フリーのＰＢＳ緩衝液に溶解し、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。
【０１４４】
Ｂ）ポリマー合成：
Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及びｓｅｃ−ブチルアクリレート（ＥＡＢ）のＲＡＦＴコポリマー：酢酸ブチル中のＡＩＢＮ（１．００ｍｇ／ｍＬ）及びＲＡＦＴ剤ＣＰＣＰＡ（１０．０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を調製した。モノマーモル供給量は、５５％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート、４５％ｓｅｃ−ブチルアクリレート（ＣＡＳ＃２９９８−０８−５）であった。理論Ｍｗは１００，０００であった。Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート（０．８９０ｇ、３．４３ｍｍｏｌ）ｓｅｃ−ブチルアクリレート（０．３９１ｍＬ、０．３６０ｇ、２．８１ｍｍｏｌ）ＣＰＣＰＡ溶液（０．３５０ｍＬ、０．０１２５ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ溶液（０．３０８ｍＬ、０．００１８８ｍｍｏｌ）、及び酢酸ブチル（５．３ｍＬ）を、スターラーバーを備えた２０ｍＬガラスバイアルに加えた。バイアルをセプタムキャップで密封し、出口としての第２シリンジを有するロングシリンジを用いて１時間、溶液を窒素でバブリング（bubbled）した。シリンジを除去し、バイアルを８０℃に１６時間、油浴を用いて加熱した。溶液を室温に冷却し、ヘキサン（３５ｍＬ）を溶液に添加する前に、５０ｍＬ遠心管に移した。溶液を２分間４，４００ｒｐｍで遠心分離した。上清層を注意深くデカントし、底部（固体又はゲル状）層をヘキサンですすいだ。次に底部層をＤＣＭ（７ｍＬ）に再溶解し、ヘキサン（４０ｍＬ）で沈殿させ、再度遠心分離した。上清をデカントし、底部層をヘキサンですすいだ後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥させた。粗ＥＡＢコポリマーの収量は０．８５６ｇであった。粗ポリマーのサンプルを多角度光散乱（ＭＡＬＳ）のために採取した。乾燥した粗コポリマーをＤＣＭ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。ヘキサンを曇り点に達する直後まで添加した。得られた乳状溶液を遠心分離した。底部層を抽出し、ヘキサン中に完全に沈殿させた。画分を遠心分離し、その後コポリマーを単離し、そして真空中で乾燥させた。ＥＡＢコポリマーの単離された画分の収量は０．４７８ｇであった。分画コポリマーのサンプルを1Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＳのために採取した。1Ｈ−ＮＭＲによって決定された組成物は６１％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミン及びアクリレート、３９％ｓｅｃ−ブチルアクリレートであった。
【０１４５】
ＭＡＬＳ分析：約１０ｍｇのコポリマーを、０．５ｍＬの７５％ジクロロメタン、２０％テトラヒドロフラン、５％アセトニトリルに溶解した。分子量及び多分散性（ＰＤＩ）を、Jordi 5μ 7.8 x300 Mixed Bed LS DVBカラムを使用するShimadzu Prominence HPLCを取り付けたWyatt Heleos II多角度光散乱検出器を用いて測定した。粗ポリマー：ＭＷ：５９，０００（ＰＤＩ  １．３）、分画ポリマー：ＭＷ７０，０００（ＰＤＩ：１．１）。
【０１４６】
脱保護／透析：乾燥したサンプルを酢酸中の２ＭのＨＣｌ（〜７ｍｌ）で１時間処理して、ＢＯＣ保護基を除去した。次に反応物を２０ｍｌの水で希釈し、１０〜１５分間撹拌した。次に、高塩、高塩、及び水でそれぞれ１５時間、８時間、及び１５時間、３５００ＭＷ透析チューブを用いて画分を透析した。次に画分を５０ｍｌ遠心管に移し、３日間又は乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥サンプルをさらなる研究のために水で２０ｍｇ／ｍｌに調製した。
【０１４７】
Ｃ）可逆的に修飾されたｓｉＲＮＡ−ポリアミンコンジュゲートの形成：５ｍＭのｐＨ８．０  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のポリアクリレートＥＡＢを、１．５ｗｔ％Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル活性化ＰＥＧ4アジド（アジド−ｄＰＥＧ4−ＮＨＳエステル、Quanta Biodesignから）で修飾し、ｓｉＲＮＡのその後の結合のためのアジド基を提供した。次に、アジド−修飾ポリマーを、６０ｍｇ／ｍＬのＨＥＰＥＳ塩基で５ｍｇ／ｍＬに希釈した。この溶液に、１５ｍｇ／ｍＬ（３重量当量）の指示されたプロテアーゼ−切断可能なＰＥＧ修飾試薬（本明細書に記載のテトラペプチド剤又はＰＥＧ12−ＦＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（８４２６５５４）を添加して、４０〜５０％の利用可能なアミン基を修飾した。１時間後、ＤＢＣＯ−修飾げっ歯類第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡ（ポリマーに対して０．２５重量当量）をポリマー溶液に添加した。一晩インキュベーション後、利用可能なアミン基に対してモル過剰のＮ−アセチルガラクトサミン誘導体ＣＤＭ−ＮＡＧ、ＮＡＧ−Ａ4−Ａ3−Ａ2−Ａ1−ＮＨＳ又はＮＡＧ−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（米国特許第８４２６５５４号明細書、Ｒｏｚｅｍａら２０１５、Ｃａｒｌｓｏｎら２０１５）の添加によってコンジュゲートをさらに修飾し、３０分間インキュベートして、残りのポリマーＥＡＢアミンを可逆的に修飾した。
【０１４８】
Ｄ）イン・ビボアッセイ
マウス及び注入手順
６〜８週齢の雄のWistar Hanラット及び雌のＩＣＲマウスを、Harlan Sprague-Dawley（インディアナポリス、ＩＮ）から入手した。Arrowhead Madison Incの動物実験委員会によって承認された動物使用プロトコルに従って動物を取り扱った。げっ歯類を、１２時間の明／暗サイクルで、水及び食料（Harlan Teklad Rodent Diet、ハーラン、マディソン、ＷＩ）への自由なアクセスで維持した。動物に０．２５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡにコンジュゲートした１ｍｇ／ｋｇのポリマーを注入した。サンプルを注入後５日に採取した。
【０１４９】
血清ＦＶＩＩ活性測定
血清サンプルを、標準的な手順に従って、０．１０９Ｍのクエン酸ナトリウム抗凝固剤（１容量）を含むマイクロ遠心管に顎下出血により血液を採取することによって調製した。血清中のＦＶＩＩ活性を、製造業者の推奨に従って試験キット（BIOPHEN VII、アニアラ、メイソン、OH）を用いて発色法により測定した。比色展開（colorimetric development）の吸光度を、４０５ｎｍでＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ−２マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
【０１５０】
表７のデータは、テトラペプチド修飾ＤＰＣ送達ポリマーがイン・ビボでのｓｉＲＮＡの送達に有効であったことを示す。さらに、テトラペプチド剤は、以前に記載されたジペプチド−ＰＡＢＣ修飾剤と同様に有効であった。タンパク質分解ＦＣｉｔＦＰ（配列番号１２）四量体を含む、４４ａ及び４４ｂを有するコンジュゲートは、ノックダウンのためにＰＡＢＣ媒介分解を利用するコンジュゲートと同等の活性を示した（表７）。有効なｓｉＲＮＡ送達は、有効なポリアミンの修飾及び標的化、並びに細胞への送達後の肝細胞におけるポリマーの消化及び放出の成功を示す。
【０１５１】
イン・ビボ活性及び機能はＦＣｉｔＦＰ（配列番号１２）修飾ＤＰＣ送達ポリマーでのイン・ビトロ消化速度データに相関し、ＦＣｉｔＡＰ修飾ＤＰＣ送達ポリマーよりも優れたｓｉＲＮＡ送達を示した。したがって、イン・ビトロの消化速度データは、イン・ビボでの消化及び放出データを正確に予測した。
【０１５２】
【表７】
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【０１５３】
実施例８．ＲＧＤ模倣体テトラペプチド及びＰＥＧ−テトラペプチド修飾ＤＰＣ送達ポリマー
Ａ）ＡＰＮ  １１７０−１００Ａ（１００Ａ）及びＡＰＮ１２０３−００６（００６）両親媒性膜活性ポリアミンの合成
【０１５４】
【表８−１】
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【０１５５】
ｉ）材料
２，２´−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５、ラジカル開始剤）をWako Pure Chemical Industriesから購入した。アクリル酸プロピルをPolysciences Incから購入した。Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシ−エチルアミンアクリレートはWuXi Incから入手した。２−（ドデシルチオ−カルボノチオイルチオ）−２−メチルプロピオン酸（ＤＤＭＡＴ、ＲＡＦＴ剤）、１，１´−アゾビス−（シクロ−ヘキサンカルボニトリル）（ＡＣＨＮ）、１−エチルピペリジン次亜りん酸塩（ＥＰＨＰ）、ペンタフルオロフェノール、Ν，Ν´−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びΝ，Ν−ジイソプロピル−エチルアミンをSigma Aldrichから購入した。Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ´−（２−アジドエチル）トリエチレングリコール（アジド−ＰＥＧ4−アミン）はBiomatrik Incから購入した。
【０１５６】
ｉｉ）Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及びプロピルアクリレート（ＥＡＰ）のＲＡＦＴコポリマー
酢酸ブチル中のＶ−６５（２ｍｇ／ｍＬ）及びＲＡＦＴ剤ＤＤＭＡＴ（１０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を調製した。モノマーモル供給は５２％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート、４８％プロピルアクリレートであった。理論Ｍｗは７５，０００であった。開始剤（Ｖ−６５）に対するＲＡＦＴ剤（ＤＤＭＡＴ）のモル比は６．６７：１であった。
【０１５７】
Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート（１．７７８ｇ、６．８６ｍｍｏｌ）、プロピルアクリレート（０．７９４ｍＬ、０．７２２ｇ、６．３３ｍｍｏｌ）、ＤＤＭＡＴ溶液（１．２１５ｍＬ、０．０３３３ｍｍｏｌ）、Ｖ−６５溶液（０．６２１ｍＬ、０．００５ｍｍｏｌ）、及び酢酸ブチル（１０．２ｍＬ）を、スターラーバーを備えた２０ｍＬガラスバイアルに加えた。バイアルをセプタムキャップで密封し、出口としての第２ニードルを有するロングニードルを用いて１時間、溶液を窒素でバブリングした。ニードルを除去し、バイアルを２４時間撹拌しながら５０℃に加熱した。溶液を室温に冷却し、２本の５０ｍＬ遠心管間に等分した後、ヘキサン（３５ｍＬ）を両方の管に添加した。溶液を２分間４４００ｒｐｍで遠心分離した。上清層を注意深くデカントし、底部層をヘキサンですすいだ。次いで各管の底部層をジクロロメタン（７ｍＬ）に再溶解し、ヘキサン（４０ｍＬ）中に沈殿させ、再度遠心分離した。上清をデカントし、底部層をヘキサンですすいだ後、層を１本の５０ｍＬ遠心管にあわせ、ポリマーを減圧下で数時間乾燥させた。粗ＥＡＰコポリマーの収量は２．１ｇであった。コポリマーのサンプルを、多角度光散乱法（multi-angle light scattering）（ＭＡＬＳ）、及び1Ｈ−ＮＭＲのために採取した。
【０１５８】
ポリマー００６：1Ｈ−ＮＭＲにより決定された組成は５５％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４５％プロピルアクリレートであった。ＭＡＬＳによって決定された００６についてのＭｗは５８，６００ｇ／ｍｏｌであり、多分散指数（ＰＤＩ）は１．０４であった。
【０１５９】
ポリマー１００Ａ：1Ｈ−ＮＭＲによる組成：５６％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４４％プロピルアクリレート。ＭＡＬＳによるＭＷ：６５，１５０、１．１２２のＰＤＩ。
【０１６０】
ｉｉｉ）ラジカル誘導ω−末端基除去（ポリマー００６のみ）
１，１’−アゾビス−（シクロヘキサンカルボニトリル）（ＡＣＨＮ、２０ｍｇ／ｍＬ）及び１−エチルピペリジン次亜りん酸塩（ＥＰＨＰ、１００ｍｇ／ｍＬ）の溶液をトルエン中で調製した。ＥＡＰ（２ｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）、ＡＣＨＮ（０．２１３ｍＬ、０．５当量、０．０１７４ｍｍｏｌ）、ＥＰＨＰ（１．２５ｍＬ、２０当量、０．６９７ｍｍｏｌ）、及びトルエン（２５．２ｍＬ）を、スターラーバーを備えた４０ｍＬガラスバイアルに加えた。バイアルをセプタムキャップで密封し、出口としての第２ニードルを有するロングニードルを用いて１時間、溶液を窒素でバブリングした。ニードルを除去し、バイアルを２時間１００℃に加熱した。溶液を室温に冷却し、〜２０ｍＬのトルエンをロータリーエバポレーションにより除去した。残りの溶液を５０ｍＬ遠心バイアルに移し、ヘキサン（３５ｍＬ）を加えた。溶液を２分間４４００ｒｐｍで遠心分離した。上清層を注意深くデカントし、底部層をヘキサンですすいだ。次いで、底部層をジクロロメタン（７ｍＬ）に再溶解し、ヘキサン（４０ｍＬ）中に沈殿させ、再度遠心分離した。上清をデカントし、底部層をヘキサンですすいだ後、ポリマーを減圧下で〜１時間乾燥させた。ポリマーをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（８０ｍＬ）に溶解し、分液漏斗に移した。次いで、溶液を３×３０ｍＬ容量のＨ2Ｏで、続いて３ｘ３０ｍＬ容量の飽和ＮａＣｌで洗浄した。次いで、ポリマー溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、０．４５μｍＧＨＰフィルターを通して真空ろ過した。ＭＴＢＥをロータリーエバポレーション及び高真空によって除去した。ＵＶ分光光度計を用いて末端基の除去のモニタリングのために、サンプルを採取した。末端基除去率は９９％と計算された。サンプルをＭＡＬＳ、ＧＣ−ＦＩＤ、及び1Ｈ−ＮＭＲのために採取した。1Ｈ−ＮＭＲによる００６の組成は、５５％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４５％プロピルアクリレートであった。ＧＣ−ＦＩＤによって決定された００６の転化率（conversion）はＮ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレートについて８１．４％、及びプロピルアクリレートについて７７．３％であった。ＧＣ−ＦＩＤ転化率によって決定された１００Ａの転化率は、Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレートについて８７％、及びプロピルアクリレートについて８３％であった。ＭＡＬＳによって決定されたポリマー００６についてのＭｗは５７，７００ｇ／ｍｏｌであり、多分散指数（ＰＤＩ）は１．０６であった。
【０１６１】
ｉｖ）α−末端基のペンタフルオロフェノール活性化
ＥＡＰポリマー（２ｇ、０．０３４７ｍｍｏｌ）、ペンタフルオロフェノール（６３．８ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７１．５ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）、及びジクロロメタン（４０ｍＬ）を、スターラーバーを備えた１００ｍＬ丸底フラスコに加えた。フラスコをゴム製セプタムで栓をし、系を窒素で１５分間パージした。溶液を１６時間室温で攪拌した。追加のペンタフルオロフェノール（６３．８ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７１．５ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコをゴム製セプタムで栓をし、系を窒素で１５分間パージした。溶液を３時間室温で攪拌した。ポリマーをヘキサン（〜１０ｘ容量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを最小限のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（〜１０ｘ容量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを最小限の酢酸エチルに溶解し、ヘキサン（〜１０ｘ容量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿物を、固体が恒量に達するまで、高真空下で乾燥させた。
【０１６２】
ｖ）α−末端基のアジド官能化
ゴム製セプタム及びスターラーバーを備えた１００ｍｌ丸底フラスコ中に、先のステップからのポリマー（１．９ｇ、０．０３２９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３８ｍＬ）に溶解した。アジド−ＰＥＧ4−アミン（８６．４ｍｇ、０．３２９３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４６．８ｍｇ、６３．１μｌ、０．３６２２ｍｍｏｌ）を撹拌しながらフラスコに添加した。系を窒素で１５分間パージし、反応物を室温で一晩撹拌したままにした。追加のアジドＰＥＧ4アミン（８６．４ｍｇ、０．３２９３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４６．８ｍｇ、６３．１μｌ、０．３６２２ｍｍｏｌ）をフラスコに添加し、系をＮ2ガスでパージし、反応物を３時間室温で攪拌した。ポリマーをヘキサン（〜１０ｘ容量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを最小限のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（〜１０ｘ容量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿物を、固体が恒量に達するまで、高真空下で乾燥させた。アジド官能化ＥＡＰの収量は１．７７ｇであった。コポリマーのサンプルを多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）、及び1Ｈ−ＮＭＲのために採取した。
【０１６３】
ポリマー００６：1Ｈ−ＮＭＲによって決定した組成は、５６％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４４％プロピルアクリレートであった。ＭＡＬＳによって決定したＭｗは６０，３３０ｇ／ｍｏｌであり、多分散指数（ＰＤＩ）は１．０５であった。
【０１６４】
ポリマー１００Ａ：1Ｈ−ΝΜΡによる組成は、５６％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４４％プロピルアクリレートであった。ＭＡＬＳによって決定したＭｗ：６４，４３０、ＰＤＩは１．２１７であった。
【０１６５】
モノ−アジド：用語「モノ−アジド」又は「モノ−アジドポリマー」とは、上記手順のステップＤ及びＥを行い、アジド基をポリマーのα−末端基にカップリングさせたことを示す。
【０１６６】
ｖｉ）Ｂｏｃ脱保護及びタンジェンシャルフローろ過（Tangential Flow Filtration）
１００ｍＬ丸底フラスコ中で、酢酸中の２ＭのＨＣｌ（２８ｍＬ）をアジド官能化ＥＡＰコポリマー（１．６７ｇ、０．０２７７ｍｍｏｌ）に添加した。反応物を室温で１時間攪拌した。脱イオン化Ｈ2Ｏ（５６ｍＬ）を添加し、１０分間攪拌した。次いで溶液を、タンジェンシャルフローろ過システム（KrosFlo Research）を備えたｍＰＥＳ  ３０ｋＤ  １１５ｃｍ2フィルターモジュールを用いて、１０当量容量の５ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５）で直ちに交換した。次いで溶液を装置を用いて５５ｍＬの最終容量まで濃縮した。５．１のｐＨ値を記録した。ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによる濃度測定のためにサンプルを採取した。アリコートを凍結乾燥し、次いで1Ｈ−ＮＭＲ分析のために１０ｍｇ／ｍＬの濃度での酸化重水素中の３３．３％アセトニトリル−ｄで再構成した。理論ＭＷは、００６及び１００Ａについてそれぞれ、４３，０２６ｇ／ｍｏｌ、４５，７６５ｇ／ｍｏｌと計算された。
【０１６７】
ｖｉｉ）同様の技術を用いて、同様の両親媒性膜活性ポリアミンが容易に形成され得る。特に、分子量（Ｍｗ）４０〜１２０ｋ保護（２５ｋ〜８５ｋ脱保護）、１．０３〜１．２のＰＤＩ範囲、及び３５％アミンモノマー／６５％疎水性基モノマー〜７０％アミンモノマー／３０％疎水性基モノマーのモノマー比を有する両親媒性膜活性ポリアミン。
【０１６８】
Ｂ）ＡＰＮ１０９５−１２６（１２６）の合成
【０１６９】
【表８−２】
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【０１７０】
１００Ａ及び００６の合成に使用したトリチオカーボネート部分ＲＡＦＴ剤及びＶ−６５ＲＡＦＴ開始剤と比較して、ＡＰＮ１０９５−１２６の合成はジチオベンゾアート部分ＲＡＦＴ剤及びＡＩＢＮ  ＲＡＦＴ開始剤を使用した。この重合のための条件は、異なる加熱温度及び時間を必要とした。さらに、このポリマーは、分別沈殿を必要とした。ポリマーはエンドキャップされていないが、アジド付加の方法は１００Ａ及び００６と同じであった。
【０１７１】
ｉ）材料
プロピルアクリレートをPolysciences Incから購入した。Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレートをWuXi Incから入手した。４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸（ＣＰＣＰＡ、ＲＡＦＴ剤）、２，２´−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ、ラジカル開始剤）、ペンタフルオロフェノール、Ν，Ν´−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを、Sigma Aldrichから購入した。Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ´−（２−アジドエチル）トリエチレングリコール（アジド−ＰＥＧ4−アミン）をBiomatrik Incから購入した。
【０１７２】
ｉｉ）Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及びプロピルアクリレート（ＥＡＰ）のＲＡＦＴコポリマー
以下の手順を８回繰り返して、合計４．５５１３ｇの分画ＥＡＰコポリマーを得た。酢酸ブチル中のＡＩＢＮ（１．０３５ｍｇ／ｍＬ）及びＲＡＦＴ剤ＣＰＣＰＡ（５０．５４ｍｇ／ｍＬ）の溶液を調製した。モノマーモル供給は、５２％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート、４８％プロピルアクリレートであった。理論Ｍｗは７５，０００であった。ＲＡＦＴ剤（ＣＰＣＰＡ）対開始剤（ＡＩＢＮ）のモル比は６．６７：１であった。
【０１７３】
Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート（１．７８７９ｇ、６．９ｍｍｏｌ）、プロピルアクリレート（０．７７４ｍＬ、０．７１２１ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）、ＣＰＣＰＡ溶液（０．１８４ｍＬ、０．０３３３ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ溶液（０．７９３ｍＬ、０．００５ｍｍｏｌ）、及び酢酸ブチル（１１．０２ｍＬ）を、スターラーバーを備えた２０ｍＬガラスバイアルに加えた。バイアルをセプタムキャップで密封し、出口としての第２ニードルを有するロングニードルを用いて１時間、溶液を窒素でバブリングした。ニードルを除去し、バイアルを撹拌しながら５０℃に２４時間加熱した。溶液を室温に冷却し、５０ｍＬ遠心管に移した後、ヘキサン（３５ｍＬ）を添加した。溶液を２分間４４００ｒｐｍで遠心分離した。上清層を注意深くデカントし、底部層をヘキサンですすいだ。次いで各管の底部層をジクロロメタン（７ｍＬ）に再溶解し、ヘキサン（４０ｍＬ）中に沈殿させ、再度遠心分離した。上清をデカントし、底部層をヘキサンですすいだ後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥させた。粗ＥＡＰコポリマーの収量は１．７３４ｇであった。粗コポリマーのサンプルを、多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）、及び1Ｈ−ＮＭＲのために採取した。乾燥した粗コポリマーをＤＣＭ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた。ヘキサンを曇り点に達する直後まで添加した。得られた乳状溶液を遠心分離した。底部層を抽出し、ヘキサン中に完全に沈殿させた。画分を遠心分離し、その後コポリマーを単離し、真空下で乾燥させた。ＥＡＰコポリマーの単離画分の収量は０．６０２ｇであった。分画コポリマーのサンプルを1Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＳのために採取した。1Ｈ−ＮＭＲによって決定した組成は、５６％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４４％プロピルアクリレートであった。ＭＡＬＳによって決定したＭｗは６２，０１０ｇ／ｍｏｌであり、多分散指数（ＰＤＦ）は１．１４であった。
【０１７４】
ｉｉｉ）α−末端基のペンタフルオロフェノール活性化
ＥＡＰポリマー（２ｇ、０．０３４７ｍｍｏｌ）、ペンタフルオロフェノール（６３．８ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７１．５ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）、及びジクロロメタン（４０ｍＬ）を、スターラーバーを備えた１００ｍＬ丸底フラスコに加えた。フラスコをゴム製セプタムで栓をし、系を窒素で１５分間パージした。溶液を１６時間室温で攪拌した。追加のペンタフルオロフェノール（６３．８ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７１．５ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコをゴム製セプタムで栓をし、系を窒素で１５分間パージした。溶液を３時間室温で攪拌した。ポリマーをヘキサン（〜１０ｘ容量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを最小限のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（〜１０ｘ容量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを最小限の酢酸エチルに溶解し、ヘキサン（〜１０ｘ容量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿物を、固体が恒量に達するまで、高真空下で乾燥させた。
【０１７５】
ｉｖ）α−末端基のアジド官能化
ゴム製セプタム及びスターラーバーを備えた１００ｍｌ丸底フラスコ中に、先のステップからのポリマー（１．９ｇ、０．０３２９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３８ｍＬ）に溶解した。アジド−ＰＥＧ4−アミン（８６．４ｍｇ、０．３２９３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミン（４６．８ｍｇ、６３．１μｌ、０．３６２２ｍｍｏｌ）を撹拌しながらフラスコに添加した。系を窒素で１５分間パージし、反応物を室温で一晩撹拌したままにした。追加のアジドＰＥＧ4アミン（８６．４ｍｇ、０．３２９３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミン（４６．８ｍｇ、６３．１μｌ、０．３６２２ｍｍｏｌ）をフラスコに添加し、系をＮ2ガスでパージし、反応物を３時間室温で攪拌した。ポリマーをヘキサン（〜１０ｘ容量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを最小限のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（〜１０ｘ容量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿物を、固体が恒量に達するまで、高真空下で乾燥させた。アジド官能化ＥＡＰの収量は１．７７ｇであった。コポリマーのサンプルを多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）、及び1Ｈ−ＮＭＲのために採取した。1Ｈ−ＮＭＲによって決定した組成は、５６％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４４％プロピルアクリレートであった。ＭＡＬＳによって決定したＭｗは６６，６７０ｇ／ｍｏｌであり、多分散指数（ＰＤＩ）は１．１１であった。
【０１７６】
ｖ）Ｂｏｃ脱保護及びタンジェンシャルフローろ過
１００ｍＬ丸底フラスコ中で、酢酸中の２ＭのＨＣｌ（２８ｍＬ）をアジド官能化ＥＡＰコポリマー（１．６７ｇ、０．０２７７ｍｍｏｌ）に添加した。反応物を室温で１時間攪拌した。脱イオン化Ｈ2Ｏ（５６ｍＬ）を添加し、１０分間攪拌した。次いで溶液を、タンジェンシャルフローろ過システム（KrosFlo Research）を備えたｍＰＥＳ  ３０ｋＤ  １１５ｃｍ2フィルターモジュールを用いて、１０当量容量の５ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５）で直ちに交換した。次いで溶液を装置を用いて５５ｍＬの最終容量まで濃縮した。５．１のｐＨ値を記録した。ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによる濃度測定のためにサンプルを採取した。アリコートを凍結乾燥し、次いで1Ｈ−ＮＭＲ分析のために１０ｍｇ／ｍＬの濃度での酸化重水素中の３３．３％アセトニトリル−ｄで再構成した。理論ＭＷは、４３，０２６ｇ／ｍｏｌと計算された。
【０１７７】
Ｃ）ＲＧＤ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ及びＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ剤合成
修飾剤前駆体（ｄｉ−Ｂｏｃ）ＲＧＤ（ＯｔＢｕ）−ＡＰＢＡ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ−ＣＯＯＨを、Ｆｍｏｃ−プロリン−ＯＨを予め充填した２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂を用いる、一般的なＦｍｏｃ化学固相合成を用いて調製した。樹脂−Ｐｒｏ−Ｆｍｏｃに、以下を連続して加えた（各ステップでのＦｍｏｃ脱保護後に）：ＦＭｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧn−ＣＯＯＨ、４−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｐ−アミノフェノキシ）−酪酸（ＡＰＢＡ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、及びｄｉｂｏｃ−ｍ−グアニジノ安息香酸。
【０１７８】
（ｄｉｂｏｃ）ＲＧＤ（ＯｔＢｕ）−ＡＰＢＡ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ−ＣＯＯＨ（４５８ｍｇ、０．２００ｍｍｏｌ）及びＴＦＰ（６６．５ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（５．０ｍＬ）に溶解し、アルゴン下で撹拌しながら氷／水浴中で０℃に冷却した。ＥＤＣ（７７ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を氷／水浴中で０℃で３０分間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（８．５：１．５  ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ）によってモニターし、ＴＬＣによる出発物質が観察されなくなった９０分後に完了した。反応混合物をＤＣＭで１００ｍＬの総容量に希釈し、３×４０ｍＬのＤＩ  Ｈ2Ｏ（ｐＨ＝５）で洗浄し、１×４０ｍＬの水性飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。次いで有機物をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ロータリーエバポレータ―で濃縮して、４４８ｍｇ（９２％収量）の褐色／橙色の泡状物を得た。構造を1Ｈ−ＮＭＲ、及びＥＳＩ  ＭＳによって確認した（ＰＥＧ20（ｎ＝２０）について上記に示された反応）。
【０１７９】
【化１０】
2018517769.tif 000022
【０１８０】
（ｄｉｂｏｃ）ＲＧＤ（ＯｔＢｕ）−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ（４９７ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）を［９．２５：０．７５：０．５０］ＴＦＡ：Ｈ2Ｏ：チオアニソール（５．０ｍＬ）に溶解し、密閉したフラスコ中で４５分間室温で撹拌した。反応完了をＭＳ（ＥＳＩ、scan neg、３００−３０００）により確認し、出発物質又は部分的に脱保護された中間体に関する質量は観察されなかった。次いで、反応混合物を４５ｍＬのジエチルエーテルに沈殿させ、スピンダウンし、上清を注ぎ出し、２ｘ１０ｍＬジエチルエーテルで洗浄し、高真空下で一晩乾燥させた。最終産物を、Thermo Aquasil C18 5 umセミ分取カラムを用いて、移動相はＨ2Ｏ及びＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡで、分取ＨＰＬＣにより精製した。各注入は、（％Ｂで示された）３９−（５）−３９−（３５）−４３−（５）−９５−（１０）−９５−（２）−３９−（５）−３９の勾配で実施される［６１：３９］Ｈ2Ｏ：ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡの３．０ｍＬに溶解した粗材料の５０ｍｇであった。注入のための各サンプルを注入の１５分以内に調製（溶解）し、陽性画分を１つのフラスコにプールし、その日の最後の注入が完了するまで冷凍庫で冷やしておいた。次いで、陽性画分を３２℃の浴温でロータリーエバポレータ―で濃縮乾固し、次いでＡＣＮ／トルエンで２ｘ、次にＡＣＮで３ｘ追跡し、次いで高真空下で一晩乾燥させた。２５７ｍｇの注入された粗生成物のうち、１８０ｍｇ（７０％）が純粋な物質として単離された（ＰＥＧ20（ｎ＝２０）について上記に示された反応）。
【０１８１】
【化１１】
2018517769.tif 000023
【０１８２】
４−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｐ−アミノフェノキシ）−酪酸１合成
ｐ−ニトロ−フェノール（２）（７．５ｇ、５３．９ｍｍｏｌ）を、４−ブロモ酪酸エチル（８．４５ｍｌ、５９ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（７５ｍＬ）中のＫ2ＣＯ3（７．５ｇ、５４ｍｍｏｌ）と合わせた。混合物を２時間１００℃で撹拌した。ＤＭＦを除去し、粗生成物を、２ＮのＮａＯＨとメタノールとの３：１混合の混合物で希釈し、４時間ＲＴで攪拌した。反応混合物を６ＭのＨＣｌで酸性化した。白色沈殿物を回収し、４−（ｐ−ニトロフェニルオキシ）−酪酸３：（１０．９ｇ、９０％収率）を得た。
【０１８３】
４−（ｐ−ニトロフェニルオキシ）−酪酸３（３７．１ｇ、１６５ｍｍｏｌ）を、ギ酸アンモニウム（３５ｇ、５５５ｍｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ（１Ｌ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（Degussa Type）（３．５ｇ）を添加した。混合物を６５℃で一晩還流した。反応物をセライト（celite）で濾過して、赤褐色固体の生成物４−（ｐ−アミノフェニルオキシ）−酪酸４（３０．５ｇ、９５％収率）を得た。
【０１８４】
４−（ｐ−アミノフェニルオキシ）−酪酸４（５．１ｇ、２６ｍｍｏｌ）を、Ｈ2Ｏ（４５０ｍＬ）中の水性飽和ＮａＨＣＯ3（３．３６ｇ、４０ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（３００ｍｌ）との６：４混合物に溶解して、白色スラリーを作成した。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（８．８２ｇ、２６．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を４時間攪拌した。アセトンを除去し、反応物を酸性化し（ＨＣｌ）、オフホワイトの沈殿物を回収し、１ＮのＨＣｌでトリチュレートして、９．６ｇの生成物４−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｐ−アミノフェノキシ）−酪酸１（８８％収率）を得た。
【０１８５】
【化１２】
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diBoc-m-グアニジノ安息香酸5を、Riches AG et al. Tetrahedron (2012) 68、p. 9448-9455に従って合成した。
【０１８６】
ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ修飾剤を同様の化学反応を用いて作成した。
【０１８７】
Ｄ）ポリマーのマスキング（修飾）
モノアジド−ポリマーを、プロテアーゼ切断可能な−ＲＧＤ剤（ＲＧＤ−ＰＥＧ8−ＡＣｉｔ−ＰＮＰ、ＲＤＧ−ＰＥＧ8−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ、ＲＧＤ−ＰＥＧ15−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ、ＲＧＤ−ＰＥＧ19−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ、又はＲＧＤ−ＰＥＧ20−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ）と、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中の１：０．１２５、１：０．２５、１：０．５、１：１、１：１．５、１：２（ポリマー：ＲＧＤ）の重量比で、ｐＨ８．５緩衝液中４時間ＲＴで反応させた。次いで、修飾されたポリマーを、プロテアーゼ切断可能な−ＰＥＧ剤（ＰＥＧ6−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ、ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ、ＰＥＧ12−ＦＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ、ＰＥＧ12−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ）と、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中の１：８（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で、ｐＨ８．５緩衝液中２時間ＲＴで反応させた。１：０．３（ポリマー：アルキン−ＲＮＡｉトリガー）の重量比でのアルキン−ＲＮＡｉトリガーを、ｐＨ５．０で５日間ＲＴで、１００ｍＭの酢酸ナトリウム−酢酸緩衝溶液中の修飾されたポリマーに添加した。完成したコンジュゲートをＴＦＦ精製し、コンジュゲーション効率を決定した。
【０１８８】
Ｅ）テトラペプチド修飾ＤＰＣ送達ポリマーを用いたイン・ビボ送達の評価
腎臓ＲＣＣ腫瘍−担持マウスを、等張グルコース（Ｇｌ）又は指示されたＨｉｆ２α−ＩＴＧ−ＤＰＣ（Ｈｉｆ２α−ＩＴＧ−ＤＰＣ＝Ｈｉｆ２α  ＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲート）の単一尾静脈注射によって処理した。送達ポリマーは、ＲＧＤリガンド及びＰＥＧ修飾剤によって修飾されている。マウスを注射の７２時間後に安楽死させ、全ＲＮＡを、製造業者の推奨に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて腎臓腫瘍から調製した。相対ＨｉＦ２α  ｍＲＮＡレベルを以下に記載のとおりＲＴ−ｑＰＣＲによって決定し、送達緩衝液（等張グルコース）のみで処理したマウスと比較した（表８）。
【０１８９】
【表８−３】
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【０１９０】
実施例９．記載のテトラペプチドリンカーの実用性を説明する追加の構造
【０１９１】
【化１３】
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【図１】
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【図２】
2018517769.tif 000031
【図３】
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【配列表】
2018517769000001.app
【国際調査報告】
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