(57)【要約】LNAオリゴヌクレオチドにおける最近の進歩として、LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドをコンジュゲート基につなぐための、アミンリンカーの使用が挙げられる（例えばWO 2014/118267を参照）。本発明は、脂肪族アミン基とDMF保護LNA Gヌクレオシドとを含むLNAオリゴヌクレオチドを脱保護する際に、+28Daの不純物が生じる問題を確認したことに始まる。この問題はLNA-G残基の環外窒素において、標準的なDMF保護基ではなくアシル保護基を用いることにより解決される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)アシル保護環外窒素を含む少なくとも1つのLNA-G単量体をオリゴヌクレオチドに組み込む工程；
b)少なくとも1つの保護されてもよい脂肪族アミン基を該オリゴヌクレオチドに組み込む工程；
c)アシル保護基を除去することによって、該少なくとも1つのLNA-G単量体の該アシル保護環外窒素を脱保護する工程
を含む、LNAオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、工程a)およびb)はどちらが先に行われてもよい、方法。
【請求項２】
保護されてもよい脂肪族アミン基が第一級または第二級アミンである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
保護されてもよい脂肪族アミン基が非ヌクレオシドアミン基である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
保護されてもよい脂肪族アミン基が、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、およびイミダゾールからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
保護されてもよい脂肪族アミン基が、5'-TFA-アミノ修飾因子-C5-CEホスホラミダイト、5'-TFA-アミノ修飾因子C6-CEホスホラミダイト、11-(トリフルオロアセトアミド)-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-イル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト、5'-TFA-アミノ修飾因子-C12-CEホスホラミダイト、アミノ修飾因子C2-dT-CEホスホラミダイト、アミノ修飾因子C6-dA-CEホスホラミダイト、アミノ修飾因子C6-dA-CEホスホラミダイト、アミノ修飾因子C6-dT-CEホスホラミダイト、N2-アミノ修飾因子C6 dG、Fmocアミノ修飾因子C6 dT、3'-アミノ修飾因子C7 CPG 1000、3'-アミノ修飾因子C6-dC CPG、3'-アミノ修飾因子C6-dC CPG、3'-PT-アミノ修飾因子C6 CPG、3'-アミノ修飾因子C6-dT CPG、PC 5'-アミノ修飾因子-CEホスホラミダイト、5'-アミノ修飾因子C6-PDA、5'-アミノ修飾因子C12-PDA、5'-アミノ修飾因子TEG PDA、アミノ修飾因子セリノール、および3'-アミノ修飾因子セリノールCPGからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
保護されてもよい脂肪族アミン基がアミノヘキシルリンカーである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
脂肪族アミン基が、アミノ修飾単量体の組み込みによって前記オリゴヌクレオチドに組み込まれる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
脂肪族アミノ修飾単量体がホスホラミダイト、H-ホスホネート、またはホスホトリエステル単量体である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
アミノ修飾単量体がホスホラミダイトである、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
LNA-G単量体の環外窒素におけるアシル保護基が、以下からなる群より選択される基からなるかまたは該基を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法：
置換されてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、またはアリール基、好ましくは置換されてもよいC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7シクロアルキル、またはフェニル基；ここで、置換される場合、R基は、例えばハロゲン、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アルコキシ、置換されてもよいアリールオキシ、または置換されてもよいアリールからなる群より選択される1つまたは複数の置換基によって、一置換または多置換されてもよい。
【請求項１１】
LNA-G単量体の環外窒素におけるアシル保護基が、イソブチリル（iBu）、アセチル（Ac）、フェノキシアセチル（PAC）、p-イソプロピルフェノキシアセチル（iPrPAC）、フェニルアセチル、イソプロピルオキシアセチル、メトキシアセチル、ベンゾイル、p-メトキシフェニルアセチル、ジフェニルアセチル、シクロヘキシルカルボニル、1,1-ジメチルプロパノイル、およびp-tert-ブチル-フェノキシアセチルからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
LNA-G単量体の環外窒素におけるアシル保護基が、イソブチリル（iBu）、アセチル（Ac）、フェノキシアセチル（PAC）、およびp-イソプロピルフェノキシアセチル（iPrPAC）からなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドに組み込まれた他のG残基が存在する場合、該G残基も、請求項10〜12のいずれか一項に記載のアシル保護基のようなアシル保護基を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
LNA-G単量体および存在する場合に任意で他のG単量体が、ホスホラミダイト、H-ホスホネート、またはホスホトリエステル単量体である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
LNA-G単量体および存在する場合に任意で他のG単量体が、ホスホラミダイトである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
LNA-G単量体がフラノース環中に2'-O-CH2-4'ビラジカルを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程c)が第一級アミン基の脱保護をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程c)が、水酸化アンモニウムを含む溶液を使用するなど、アンモニアの存在下で行われるオリゴヌクレオチドの脱保護を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程c)に続いて、脂肪族第一級アミン基にコンジュゲート基（conjugate group）を組み込むことを含む追加の工程d)が行われる、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
コンジュゲート基が、脂質、ステロール、炭水化物、ペプチド、およびタンパク質からなる群より選択される非ヌクレオチド部分である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも工程a)〜c)が固体支持体上で行われ、その後、工程c)中または工程c)の次に行われてよい、該固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断が続く、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
アシル保護基がイソブチリルであり、かつ脂肪族第一級アミン基がアミノヘキシルリンカーである、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
アシル保護環外窒素を含む少なくとも1つのLNA-G単量体と、少なくとも1つの保護されてもよい脂肪族アミン基とを含み、固体支持体に付着している、LNAオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
LNA-G単量体およびLNAオリゴマーの5'ヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に位置する脂肪族アミンリンカーを含むLNAオリゴマーコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、または補助剤とを含み、本質的に+28付加物を含まない、薬学的組成物。
【請求項２５】
脂肪族アミン含有LNAオリゴヌクレオチドの合成に使用するための、アシル保護環外窒素を含むLNA-G単量体の使用。
【請求項２６】
脂肪族アミン含有LNAオリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成に使用するための、アシル保護環外窒素を含むLNA-G単量体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの分野およびその合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
LNAオリゴヌクレオチドにおける最近の進歩として、LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドをコンジュゲート基（conjugate group）につなぐためのアミンリンカーの使用が挙げられる。例えばWO 2014/118267（特許文献1）を参照されたい。本発明は、脂肪族アミン基とDMF保護LNA Gヌクレオシドとを含むLNAオリゴヌクレオチドを脱保護する際に、+28Daの不純物が生じる問題を確認したことに始まる。この問題はLNA-G残基の環外窒素において、標準的なDMF保護基ではなくアシル保護基を用いることにより解決される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO 2014/118267
【発明の概要】
【０００４】
発明の説明
本発明は、以下の工程を含む、LNAオリゴヌクレオチドを調製する方法を提供する：
a)アシル保護環外窒素を含む少なくとも1つのLNA-G単量体をオリゴヌクレオチドに組み込む工程；
b)少なくとも1つの保護されてもよい脂肪族アミン基を該オリゴヌクレオチドに組み込む工程；および
c)アシル保護基を除去することにより、該少なくとも1つのLNA-G単量体の該アシル保護環外窒素を脱保護する工程；
ここで、工程a)およびb)はどちらが先に行われてもよい。
【０００５】
適切には、他のG単量体、例えばLNAオリゴヌクレオチドに組み込まれたDNA G単量体が存在する場合、それらも例えばDNA G単量体または2'置換G単量体（例えば2'-O-メトキシエチルG単量体または2'メチルG単量体）のようなG単量体を組み込む工程によって、環外窒素上でアシル保護される。ここでG単量体は、例えば式IのR基によって定義されるような本明細書に記載されるアシル保護基を用いるなどしてオリゴヌクレオチドに組み込まれたアシル保護環外窒素を含む。
【０００６】
本発明は、以下の工程を含む、本質的に+28付加物を含まないLNAオリゴヌクレオチドを調製する方法を提供する：
a)アシル保護環外窒素を含む少なくとも1つのLNA-G単量体をオリゴヌクレオチドに組み込む工程；
b)少なくとも1つの保護されてもよい脂肪族アミン基を該オリゴヌクレオチドに組み込む工程；および
c)アシル保護基を除去することにより、該少なくとも1つのLNA-G単量体の該アシル保護環外窒素を脱保護する工程；
ここで、工程a)およびb)はどちらが先に行われてもよい。
【０００７】
本発明は、以下の工程を含む、LNAオリゴヌクレオチドを調製する方法を提供する：
a)アシル保護環外窒素を含む少なくとも1つのG単量体をオリゴヌクレオチドに組み込む工程；
b)少なくとも1つの保護されてもよい脂肪族アミン基を該オリゴヌクレオチドに組み込む工程；および
c)アシル保護基を除去することにより、該少なくとも1つのG単量体の該アシル保護環外窒素を脱保護する工程；
ここで、工程a)およびb)はどちらが先に行われてもよい。
【０００８】
本発明は、アシル保護環外窒素を含む少なくとも1つのLNA-G単量体と、少なくとも1つの保護されてもよい脂肪族アミン基とを含み、固体支持体に付着している、LNAオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
本発明は、アシル保護環外窒素を含む少なくとも1つのG単量体と、少なくとも1つの保護されてもよい脂肪族アミン基とを含み、固体支持体に付着している、LNAオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
本発明は、少なくとも1つのLNA-G単量体および少なくとも1つの保護されてもよい脂肪族アミン基を含み、本質的に+28付加物を含まない、LNAオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１１】
本発明は、少なくとも1つのG単量体および少なくとも1つの保護されてもよい脂肪族アミン基を含み、本質的に+28付加物を含まない、LNAオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明は、LNA-G単量体およびLNAオリゴマーの5'ヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に位置する脂肪族アミンリンカーを含むLNAオリゴマーコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、または補助剤とを含み、本質的に+28付加物を含まない、薬学的組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、G単量体およびLNAオリゴマーの5'ヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に位置する脂肪族アミンリンカーを含むLNAオリゴマーコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、または補助剤とを含み、本質的に+28付加物を含まない、薬学的組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、脂肪族アミン含有LNAオリゴヌクレオチドの合成に使用するための、アシル保護環外窒素を含むLNA-G単量体の使用を提供する。
【００１５】
本発明は、脂肪族アミン含有LNAオリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成に使用するための、アシル保護環外窒素を含むLNA-G単量体の使用を提供する。
【００１６】
いくつかの態様において、LNA-G単量体は以下の式Iの単量体である：
2018526991.tif 000002
式中、Rは、置換されてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、またはアリール基から選択されてよく、好ましくは置換されてもよいC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7シクロアルキル、またはフェニル基から選択されてよい。
【００１７】
置換される場合、R基は、例えばハロゲン、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アルコキシ、置換されてもよいアリールオキシ、または置換されてもよいアリールからなる群より選択される1つまたは複数の置換基によって、一置換または多置換され得る。アリールにはフェニルが含まれ、アリールの任意の置換基は上記の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】脂肪族アミン基を含む、市販のアミノリンカーの例を示す。
【図１−２】脂肪族アミン基を含む、市販のアミノリンカーの例を示す。
【図１−３】脂肪族アミン基を含む、市販のアミノリンカーの例を示す。
【図２】GalNAcコンジュゲートの例を示す。
【図３】FLおよびFL+28の質量スペクトルを示す（5倍荷電イオンを表示）。
【図４】b4イオンのMS/MS（MS2MS3フラグメンテーションパターン（抜粋質量範囲500〜1500Da））を示す。質量差+28Daのピークおよび未修飾分子における対応するピークを示す。
【図５】b4フラグメントならびにMS3実験により生じたa2塩基（a2-B）およびb4シトシン（b4-C）フラグメントの構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明は、少なくとも1つのLNA-Gヌクレオシドと脂肪族アミン基とを含むオリゴヌクレオチドを調製する方法を提供する。脂肪族アミンの存在下でDMF保護LNA-Gを脱保護する際に、+28Daの付加物（本明細書において+28付加物と呼ぶ）が形成されることが本発明者らによって見出された。+28付加物の形成はアシル保護基を使用することによって回避し得る。+28付加物の存在は、質量分析法を用いて、オリゴヌクレオチド中の分子量+28の混入物により同定し得る。実施例において説明するように、+28付加物は質量分析法を用いて測定することができ、約+28の分子量を有し、例えば+28付加物は+27.5〜+28.5（Da）の分子量、例えば+27.9〜+28.1（Da）の分子量を有してよい。この不純物は所望のオリゴヌクレオチド産物から分離するのは困難であり、追加の下流の精製工程を必要とし、製造費用を増大させ、オリゴヌクレオチド収量を激減させる。そのため、+28付加物の産生を回避することは非常に望ましく、本発明者らはDMF以外のG保護基、特にアシルまたはカルバメート保護基を用いることによって、その回避が達成され得ることを見出した。
【００２０】
LNAオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む、オリゴヌクレオチドである。従って本発明は、少なくとも1つのLNA-G単量体と少なくとも1つの脂肪族アミン基とを含むLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製する方法に関する。LNAオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。本明細書において使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者に通常理解されるように、2つまたはそれ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いるために、オリゴヌクレオチドは一般的に7〜30ヌクレオチドの長さで合成される。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的核酸、特に標的核酸上の連続した配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的核酸への相補性によって定義することもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖でなく、それゆえsiRNAではない。アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的核酸に相補的な、連続したヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般的に、1つまたは複数の修飾ヌクレオシド間結合を含み、限定されない一例として、LNAギャップマーまたは混合ウイングギャップマーの形状であり得る。他の態様において、オリゴヌクレオチドはLNAミクスマー（LNAおよび非LNAオリゴヌクレオチド、例えばLNAおよびDNA（例えば参照により本明細書に組み入れられるWO2007/112754を参照）もしくはLNAおよび2'-O-MOEヌクレオチド、もしくはLNA、DNA、および2'O-MOEヌクレオチド）またはLNAトータルマー（LNAヌクレオチドのみ−例えば参照により本明細書に組み入れられるWO2009/043353を参照）であってもよい。
【００２２】
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、当業者に通常理解されるように、2つのヌクレオシドを共有結合的に連結する、ホスホジエステル（PO）結合以外の結合と定義される。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボでの使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化させるのに特に有用であり、ヌクレアーゼによる切断から保護するのに役立ち得る。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有利な薬物動態、および製造の容易さにより、特に有用である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたはその連続したヌクレオチド配列におけるヌクレオシド間結合の、少なくとも70％、例えば少なくとも80％または少なくとも90％は、ホスホロチオエートである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたはその連続したヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートである。さらなるヌクレオシド間リンカーはWO2009/124238（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている。
【００２３】
用語「本質的に含まない」とは、+28付加物のレベルが、本発明の方法により調製されたオリゴヌクレオチド組成物の5％未満、例えば1％未満、例えば0.5％未満、例えば0.1％未満であることと定義される。従って、+28付加物を「本質的に含まない」オリゴヌクレオチドは、+28付加物を少量しか含まず、いくつかの態様において、+28付加物のレベルは質量分析法を用いた検出レベルを下回る可能性がある。「本質的に含まない」という用語には、オリゴヌクレオチド産物が+28付加物を含まない態様が含まれる。
【００２４】
用語「核酸塩基」には、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在する、プリン（例えばアデニンおよびグアニン）ならびにピリミジン（例えばウラシル、チミン、およびシトシン）部分が含まれる。本発明の文脈において「核酸塩基」という用語は、天然の核酸塩基とは異なる可能性があるが核酸ハイブリダイゼーションにおいて機能的な、修飾核酸塩基も包含する。いくつかの態様において、核酸塩基部分は核酸塩基を修飾または差し替えることにより修飾される。この文脈で「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、およびヒポキサンチンのような天然の核酸塩基、ならびに非天然の変種の両方を意味する。そのような変種は、例えばHirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.に記載される。
【００２５】
ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの基本要素であり、本発明の目的においては、天然および非天然の両方のヌクレオチドを含む。自然界では、DNAおよびRNAヌクレオチドのようなヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および1つまたは複数のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、または修飾ヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合に修飾を導入することにより、対応するDNAまたはRNAヌクレオシド／ヌクレオチドと比較して修飾される。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、区別なく「単位」または「単量体」とも呼ばれ得る。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」とは、糖部分または（核酸）塩基部分に1つまたは複数の修飾を導入することにより、対応するDNAまたはRNAヌクレオシドと比較して修飾されているヌクレオシドを意味する。「修飾ヌクレオシド」という用語はまた、本明細書において「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「単量体」と区別なく使用される。修飾ヌクレオシドの例は、別の節「オリゴマー修飾」およびその中の小節に記載される。
【００２７】
アシル保護環外窒素
グアニンの環外窒素基を以下に示す（囲んで示す）。この基は本発明の方法の工程a)およびb)においてアシル基によって保護され、脱保護工程c)において除去される。
2018526991.tif 000003
【００２８】
脂肪族アミン基
脂肪族アミンは窒素原子上に直接芳香環がないアミンであり、それゆえ一般的に非ヌクレオシドアミン基である。ヌクレオシドアミン基は、アミンの窒素原子がプリンまたはピリミジン塩基の芳香環に直接結合しているアミン基である。脂肪族アミン基は第一級アミンまたは第二級アミンであってもよい。いくつかの態様において、脂肪族アミン基は、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、およびイミダゾールからなる群より選択される。いくつかの態様において、脂肪族アミン基は以下からなる群より選択される：5'-TFA-アミノ修飾因子-C5-CEホスホラミダイト、5'-TFA-アミノ修飾因子C6-CEホスホラミダイト、11-(トリフルオロアセトアミド)-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-イル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト、5'-TFA-アミノ修飾因子-C12-CEホスホラミダイト、アミノ修飾因子C2-dT-CEホスホラミダイト、アミノ修飾因子C6-dA-CEホスホラミダイト、アミノ修飾因子C6-dA-CEホスホラミダイト、アミノ修飾因子C6-dT-CEホスホラミダイト、N2-アミノ修飾因子C6 dG、Fmocアミノ修飾因子C6 dT、3'-アミノ修飾因子C7 CPG 1000、3'-アミノ修飾因子C6-dC CPG、3'-アミノ修飾因子C6-dC CPG、3'-PT-アミノ修飾因子C6 CPG、3'-アミノ修飾因子C6-dT CPG、PC 5'-アミノ修飾因子-CEホスホラミダイト、5'-アミノ修飾因子C6-PDA、5'-アミノ修飾因子C12-PDA、5'-アミノ修飾因子TEG PDA、アミノ修飾因子セリノール、および3'-アミノ修飾因子セリノールCPG。
【００２９】
いくつかの態様において、脂肪族アミン基はアミノリンカーの形状である（すなわち、アミノリンカーが脂肪族アミン基を含む）。市販のアミノリンカーの例を図1に示す。いくつかの態様において、アミノリンカーはC2-12アミノアルキルリンカーのようなアミノアルキルリンカーであり、例えばアミノヘキシルリンカーである。
【００３０】
いくつかの態様において、脂肪族アミノ基は、例えばトリフルオロアセチル（TFA）、トリクロロアセチル（TCA）、モノメトキシトリチル（MMT）、ジメトキシトリチル（DMT）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）、フタルイミド、または2-(メチルアミノカルボニル)-ベンゾエートからなるリストより選択される保護基によって保護されている。いくつかの態様において、アミン保護基が存在する場合、それは脱保護工程c)の前または脱保護工程c)中に除去される。
【００３１】
一部の脂肪族アミン保護基は、工程c)を切り抜けて残存する可能性があると認識され、そのため+28付加物を回避する別の方法が提供される。従って本発明は、以下の工程を含む、LNAオリゴヌクレオチドを調製する別の方法を提供する：
a)少なくとも1つの保護環外窒素LNA-G単量体をオリゴヌクレオチドに組み込む工程；
b)少なくとも1つの保護脂肪族アミン基を該オリゴヌクレオチドに組み込む工程；
c)環外窒素保護基を除去することにより、少なくとも1つの環外窒素LNA-G単量体含有オリゴヌクレオチドを脱保護する工程；および
d)工程c)に続いて、該脂肪族アミン基を脱保護する工程。
脱保護工程c)はオリゴヌクレオチドを水酸化アンモニウムに曝露することを含んでもよく、適切には脂肪族アミン保護基は工程c)の脱保護条件下では（すなわち、水酸化アンモニウム処理では）切断されない。上記の方法において、環外窒素保護基はアシル基であっても、またはジメチルホルムアミド（DMF）のような別の保護基であってもよい。脂肪族アミン保護基は、例えばTFA、モノメトキシトリチル（MMT）、DMT、Fmoc、フタルイミド、または2-(メチルアミノカルボニル)-ベンゾエートからなる群より選択されてもよい。
【００３２】
いくつかの態様において、アミノリンカーのような脂肪族アミン基は、オリゴヌクレオチド合成に使用される固体支持体に付着している。そのため、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断する（工程c）で行われてよい）ことにより、固体支持体から脂肪族アミン基が切断され、それによって固体支持体からオリゴヌクレオチドが遊離される。いくつかの態様において、脂肪族アミン基は、アミノ修飾単量体を組み込むことにより、オリゴヌクレオチドに組み込まれる。いくつかの態様において、脂肪族アミノ修飾単量体は、ホスホラミダイト、H-ホスホネート、またはホスホトリエステル単量体である。いくつかの態様において、アミノ修飾単量体はホスホラミダイトである。そのようなアミノ修飾単量体の例を図1に示す。
【００３３】
脂肪族アミン基は、H-ホスホネート合成、ホスホジエステル合成、ホスホトリエステル合成、亜リン酸トリエステル合成、またはホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成のような、任意の好適なオリゴヌクレオチド合成法によって、オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。いくつかの態様において、脂肪族アミン基は、ホスホラミダイト、H-ホスホネート、またはホスホトリエステルとしてオリゴヌクレオチドに組み込まれる。いくつかの態様において、脂肪族アミン基は、ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成中にオリゴヌクレオチドに組み込まれる。
【００３４】
アシル保護基
G残基の環外窒素においてアシル保護基を使用することにより、脂肪族アミン含有オリゴヌクレオチドの合成法において、+28付加物を回避することができる。
【００３５】
LNA-G単量体の環外窒素における、好適なアシル保護基のいくつかの非限定的な例は、イソブチリル（iBu）、アセチル（Ac）、フェノキシアセチル（PAC）、p-イソプロピルフェノキシアセチル（iPrPAC）、フェニルアセチル、イソプロピルオキシアセチル、メトキシアセチル、ベンゾイル、p-メトキシフェニルアセチル、ジフェニルアセチル、シクロヘキシルカルボニル、1,1-ジメチルプロパノイル、およびp-tert-ブチル-フェノキシアセチルからなる群より選択され得る。
【００３６】
いくつかの態様において、LNA-G単量体の環外窒素におけるアシル保護基は、イソブチリル（iBu）、アセチル（Ac）、フェノキシアセチル（PAC）、およびp-イソプロピルフェノキシアセチル（iPrPAC）からなる群より選択される。
【００３７】
別の態様において、アシル保護基はカルバメート保護基と差し替えてもよい。
【００３８】
LNA G単量体
用語「LNA-G」とは、フラノース環における2'-4'ビラジカルおよびグアニン核酸塩基を含む、ヌクレオシドを意味する。LNA-G単量体は、H-ホスホネート合成、ホスホジエステル合成、ホスホトリエステル合成、亜リン酸トリエステル合成、またはホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成のような、任意の好適なオリゴヌクレオチド合成法によって、オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。いくつかの態様において、LNA-G単量体はホスホラミダイト、H-ホスホネート、またはホスホトリエステルとしてオリゴヌクレオチドに組み込まれる。いくつかの態様において、LNA-G単量体はホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成中にオリゴヌクレオチドに組み込まれる。
【００３９】
いくつかの態様において、LNAオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのG単量体、例えば少なくとも2つのG単量体、例えば少なくとも3つのG単量体、例えば少なくとも4つのG単量体を含む。
【００４０】
オリゴヌクレオチド合成（工程aまたは工程a）およびb)）
オリゴヌクレオチドを調製する方法は、H-ホスホネート合成、ホスホジエステル合成、ホスホトリエステル合成、亜リン酸トリエステル合成、またはホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成のような、任意の好適なオリゴヌクレオチド合成法を使用してもよい。LNA-G単量体および任意で脂肪族アミン基（保護されてもよい）は、そのような標準のオリゴヌクレオチド法の最中にオリゴヌクレオチドに組み込まれること（例えばホスホラミダイトとして）を可能にする形状であり得る。
【００４１】
脱保護工程c)
本発明の方法の工程c)は、オリゴヌクレオチドに組み込まれたLNA-G単量体における、環外窒素からのアシル保護基の除去を含む。脱保護はさらに他の塩基保護基の除去を含んでもよく、脂肪族アミン保護基が存在する場合は任意でその除去を含んでもよい。オリゴヌクレオチドの固相合成中に、脱保護工程の結果、さらに固体支持体からオリゴヌクレオチドが切断され得る。オリゴヌクレオチドの脱保護（および任意で切断）は、アンモニアの存在下で、例えば水酸化アンモニウムを含む溶液を用いて、行われてもよい。例えば、濃縮した水酸化アンモニウムを使用してもよい（例えば、28〜33％NH3水溶液または水酸化アンモニウムおよびメチルアミン水溶液（AMA）の1:1混合物）。他の脱保護法も当技術分野において公知である。
【００４２】
コンジュゲーション工程
本発明の方法に従って合成されたオリゴヌクレオチドは、脂肪族アミン基が適したコンジュゲーション部位を提供するため、オリゴヌクレオチドコンジュゲートを作製するのに特に有用である。オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば脂質、ステロール、炭水化物、ペプチド、およびタンパク質であってよい非ヌクレオシド部分に共有結合している、オリゴヌクレオチドを含む。参照によって本明細書に組み入れられるWO2014/076195およびWO2014/179620にコンジュゲート部分の例が開示されている。
【００４３】
いくつかの態様において、本発明の方法は、脂肪族第一級アミン基にコンジュゲート基を組み込むことを含む、工程c)に続いて行われる追加の工程を含む。
【００４４】
従って本発明は、以下の工程を含む、LNAオリゴヌクレオチドコンジュゲートを調製する方法を提供する：
a)アシル保護環外窒素を含む少なくとも1つの窒素LNA-G単量体をオリゴヌクレオチドに組み込む工程；
b)少なくとも1つの保護されてもよい脂肪族アミン基を該オリゴヌクレオチドに組み込む工程；
c)アシル保護基を除去することによって、少なくとも1つのLNA-G単量体オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのアシル保護環外窒素を脱保護する工程；および
d)該脂肪族アミン基にコンジュゲート基を組み込む工程。
ここで、工程a)およびb)はどちらが先に行われても同時に行われてもよい。
【００４５】
いくつかの態様において、コンジュゲート部分は炭水化物、例えばN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）コンジュゲート（参照により本明細書に組み入れられるWO2014/118267を参照）である。GalNAcコンジュゲートは肝臓細胞のような細胞への取り込みを増大させるのに有用であり、通常はGalNAcクラスター、例えば三価のGalNAcクラスターとして使用される。本発明の方法を用いてオリゴヌクレオチドに組み込まれ得るGalNAcコンジュゲートの例を図2に示す。
【００４６】
リンカー
結合またはリンカーは、1つまたは複数の共有結合を介して、1つの関心対象の化学基またはセグメントを別の関心対象の化学基またはセグメントにつなぐ、二原子間の連結である。コンジュゲート部分は直接または結合部分（例えばリンカーまたはテザー）を介して、オリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカーは第3の領域、例えばコンジュゲート部分を第1の領域、例えばオリゴヌクレオチド（領域A）に、共有結合的に連結するのに役立つ。本発明の文脈において、リンカーは第一級または第二級脂肪族アミン基のような、脂肪族アミン基を含んでもよい。いくつかの態様において、リンカーは例えばC6〜C12脂肪族アミノアルキル基を含む、C2〜C36脂肪族アミノアルキル基のような、脂肪族アミノアルキルである。いくつかの態様において、リンカーはC6脂肪族アミノアルキル基である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはDNAホスホジエステルヌクレオチドの領域、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドと脂肪族アミノリンカーとの間に位置する1〜5個のDNA POヌクレオチドを含む（参照により本明細書に組み入れられるWO2014/076195を参照）。
【００４７】
ロックド核酸ヌクレオシド（LNA）
LNAヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボース糖環のC2'とC4'との間にリンカー基（ビラジカルまたはブリッジと呼ばれる）を含む、修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献では架橋核酸または二環式核酸（BNA）とも呼ばれる。
【００４８】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーの修飾ヌクレオシドまたはLNAヌクレオシドは、式IまたはIIの一般構造を有する：
2018526991.tif 000004
式中、Wは-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(RaRb)-から選択され、例えばいくつかの態様において-O-であり；
Bは核酸塩基または修飾核酸塩基部分を示し；
Zは隣接するヌクレオシドへのヌクレオシド間結合または5'末端基を示し；
Z*は隣接するヌクレオシドへのヌクレオシド間結合または3'末端基を示し；
Xは-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zからなるリストより選択される基を示す。
【００４９】
いくつかの態様において、Xは-O-、-S-、NH-、NRaRb、-CH2-、CRaRb、-C(=CH2)-、および-C(=CRaRb)-からなる群より選択される。
【００５０】
いくつかの態様において、Xは-O-であり、Yは-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zからなる群より選択される基を示す。
【００５１】
いくつかの態様において、Yは-CH2-、C(RaRb)-、-CH2CH2-、-C(RaRb)-C(RaRb)-、-CH2CH2CH2-、-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、および-C(Ra)=N-からなる群より選択される。
【００５２】
いくつかの態様において、Yは-CH2-、-CHRa-、-CHCH3-、CRaRb-からなる群より選択されるか、または-X-Y-は合わせて二価のリンカー基（ラジカルとも呼ばれる）を示し、合わせて-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zからなる群より選択される、1個、2個、または3個の基／原子からなる二価のリンカー基を示す。
【００５３】
いくつかの態様において、-X-Y-は、-X-CH2-、-X-CRaRb-、-X-CHRa-、-X-C(HCH3)-、-O-Y-、-O-CH2-、-S-CH2-、-NH-CH2-、-O-CHCH3-、-CH2-O-CH2-、-O-CH(CH3CH3)-、-O-CH2-CH2-、OCH2-CH2-CH2-、-O-CH2OCH2-、-O-NCH2-、-C(=CH2)-CH2-、-NRa-CH2-、N-O-CH2、-S-CRaRb-、および-S-CHRa-からなる群より選択される、ビラジカルを示す。
【００５４】
いくつかの態様において、-X-Y-は-O-CH2-または-O-CH(CH3)-を示す。
ここでZは-O-、-S-、および-N(Ra)-から選択され、Raおよび存在する場合にRbはそれぞれ独立して、水素、置換されてもよいC1-6アルキル、置換されてもよいC2-6アルケニル、置換されてもよいC2-6アルキニル、ヒドロキシ、置換されてもよいC1-6アルコキシ、C2-6アルコキシアルキル、C2-6アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-6アルコキシカルボニル、C1-6アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6アルキル)アミノ-C1-6アルキル-アミノカルボニル、C1-6アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6アルカノイルオキシ、スルホン、C1-6アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6アルキルチオ、ハロゲンから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されてもよく、2個のジェミナルな置換基RaおよびRbは共に、置換されてもよいメチレン（=CH2）を示してもよく、全てのキラル中心に関して、不斉基はRまたはS配向のどちらかであり得る。
ここでR1、R2、R3、R5およびR5*は独立して、水素、置換されてもよいC1-6アルキル、置換されてもよいC2-6アルケニル、置換されてもよいC2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、C2-6アルコキシアルキル、C2-6アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-6アルコキシカルボニル、C1-6アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6アルキル)アミノ-C1-6アルキル-アミノカルボニル、C1-6アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6アルカノイルオキシ、スルホン、C1-6アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6アルキルチオ、ハロゲンからなる群より選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されてもよく、2個のジェミナルな置換基は共に、オキソ、チオキソ、イミノ、または置換されてもよいメチレンを示してもよい。
【００５５】
いくつかの態様において、R1、R2、R3、R5およびR5*は独立して、メチルのようなC1-6アルキルおよび水素から選択される。
【００５６】
いくつかの態様において、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。
【００５７】
いくつかの態様において、R1、R2、R3は全て水素であり、R5およびR5*のどちらかも水素であり、R5およびR5*のもう一方は水素以外、例えばメチルのようなC1-6アルキルである。
【００５８】
いくつかの態様において、Raは水素またはメチルのどちらかである。いくつかの態様において、Rbは存在する場合、水素またはメチルのどちらかである。
【００５９】
いくつかの態様において、RaおよびRbの一方または両方が水素である。
【００６０】
いくつかの態様において、RaおよびRbの一方は水素であり、他方は水素以外である。
【００６１】
いくつかの態様において、RaおよびRbの一方はメチルであり、他方は水素である。
【００６２】
いくつかの態様において、RaおよびRbの両方がメチルである。
【００６３】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。そのようなLNAヌクレオシドは、参照により全て本明細書に組み入れられるWO99/014226、WOOO/66604、WO98/039352、およびWO2004/046160に開示されており、β-D-オキシLNAおよびα-L-オキシLNAヌクレオシドとして一般に知られているものを含む。
【００６４】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-S-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。そのようなチオLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO99/014226およびWO2004/046160に開示されている。
【００６５】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-NH-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。そのようなアミノLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO99/014226およびWO2004/046160に開示されている。
【００６６】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CH2-CH2-または-O-CH2-CH2-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。そのようなLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO00/047599およびMorita et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76に開示されており、2'-O-4'C-エチレン架橋核酸（ENA）として一般に知られているものを含む。
【００６７】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3の全てならびにR5およびR5*の一方は水素であり、R5およびR5*の他方は水素以外、例えばメチルのようなC1-6アルキルである。そのような5'置換LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO2007/134181に開示されている。
【００６８】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CRaRb-であり、ここでRaおよびRbの一方または両方が水素以外、例えばメチルであり、WはOであり、R1、R2、R3の全てならびにR5およびR5*の一方は水素であり、R5およびR5*の他方は水素以外、例えばメチルのようなC1-6アルキルである。そのようなビス修飾LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO2010/077578に開示されている。
【００６９】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は二価のリンカー基-O-CH(CH2OCH3)-（2'O-メトキシエチル二環式核酸−Seth et al., 2010, J. Org. Chem., 2010, 75(5), pp 1569-1581）を示す。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は二価のリンカー基-O-CH(CH2CH3)-（2'O-エチル二環式核酸−Seth et al., 2010, J. Org. Chem）を示す。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CHRa-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。そのような6'置換LNAヌクレオシドは、どちらも参照により本明細書に組み入れられるWO10036698およびWO07090071に開示されている。
【００７０】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CH(CH2OCH3)-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。そのようなLNAヌクレオシドは、当技術分野において環状MOE（cMOE）としても知られており、WO07090071に開示されている。
【００７１】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-はR配置またはS配置のどちらかにある、二価のリンカー基-O-CH(CH3)-を示す。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は合わせて二価のリンカー基-O-CH2-O-CH2-（Seth et al., 2010, J. Org. Chem）を示す。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CH(CH3)-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。そのような6'メチルLNAヌクレオシドは、当技術分野においてcETヌクレオシドとしても知られており、どちらも参照により本明細書に組み入れられるWO07090071（β-D）およびWO2010/036698（α-L）に開示されているように、(S)cETまたは(R)cET立体異性体のどちらかであってよい。
【００７２】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CRaRb-であり、ここでRaもRbも水素ではなく、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。いくつかの態様において、RaおよびRbはどちらもメチルである。そのような6'二置換LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO2009006478に開示されている。
【００７３】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-S-CHRa-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。そのような6'置換チオLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO11156202に開示されている。いくつかの6'置換チオLNAの態様において、Raはメチルである。
【００７４】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-C(=CH2)-C(RaRb)-、例えば-C(=CH2)-CH2-または-C(=CH2)-CH(CH3)-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。そのようなビニルカルボLNAヌクレオシドは、どちらも参照により本明細書に組み入れられるWO08154401およびWO09067647に開示されている。
【００７５】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-N(-ORa)-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。いくつかの態様において、RaはC1-6アルキル、例えばメチルである。そのようなLNAヌクレオシドはN置換LNAとしても知られており、参照により本明細書に組み入れられるWO2008/150729に開示されている。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は合わせて二価のリンカー基-O-NRa-CH3-（Seth et al., 2010, J. Org. Chem）を示す。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-N(Ra)-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。いくつかの態様において、RaはC1-6アルキル、例えばメチルである。
【００７６】
いくつかの態様において、R5およびR5*の一方または両方が水素であり、置換される場合、R5およびR5*の他方はC1-6アルキル、例えばメチルである。そのような態様において、R1、R2、R3は全て水素であってよく、ビラジカル-X-Y-は-O-CH2-または-O-C(HCRa)-、例えば-O-C(HCH3)-から選択され得る。
【００７７】
いくつかの態様において、ビラジカルは-CRaRb-O-CRaRb-、例えばCH2-O-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。いくつかの態様において、RaはC1-6アルキル、例えばメチルである。そのようなLNAヌクレオシドは立体配座的に制限されたヌクレオチド（CRN）としても知られており、参照により本明細書に組み入れられるWO2013036868に開示されている。
【００７８】
いくつかの態様において、ビラジカルは-O-CRaRb-O-CRaRb-、例えばO-CH2-O-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て水素である。いくつかの態様において、RaはC1-6アルキル、例えばメチルである。そのようなLNAヌクレオシドはCOCヌクレオチドとしても知られており、参照により本明細書に組み入れられる、Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238に開示されている。
【００７９】
明記されない限り、LNAヌクレオシドはβ-Dまたはα-Lステレオアイソフォームであってもよい。
【００８０】
LNAヌクレオシドの一例をスキーム1に提示する。
スキーム1
2018526991.tif 000005
【００８１】
例示するように、本発明のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドにおけるLNAヌクレオシドはβ-D-オキシLNAヌクレオシドであるか、またはそれを含む。
【００８２】
ギャップマー
本明細書で使用される場合、用語「ギャップマー」とは、5'および3'側で1つまたは複数の親和性増強修飾ヌクレオシド（フランク）と隣接している、リボヌクレアーゼH動員オリゴヌクレオチド領域（ギャップ）を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。様々なギャップマーの設計を本明細書に記載する。ヘッドマーおよびテイルマーは、リボヌクレアーゼHを動員することができるオリゴヌクレオチドであって、フランクの1つが欠けている、すなわちオリゴヌクレオチド末端の一方のみが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む、オリゴヌクレオチドである。ヘッドマーに関しては3'フランクが欠けており（すなわち5'フランクが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）、テイルマーに関しては5'フランクが欠けている（すなわち3'フランクが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）。
【００８３】
LNAギャップマー
用語「LNAギャップマー」は、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも1つがLNAヌクレオシドである、ギャップマーオリゴヌクレオチドのことである。
【００８４】
混合ウイングギャップマー
用語「混合ウイングギャップマー」とは、フランク領域が少なくとも1つのLNAヌクレオシドならびに少なくとも1つの非LNA修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも1つの2'置換修飾ヌクレオシド、例えば2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸（ANA）、2'-フルオロ-ANA、および2'-F-ANAヌクレオシドを含む、LNAギャップマーを意味する。いくつかの態様において、混合ウイングギャップマーは、LNAヌクレオシドを含む一方のフランク（例えば5'または3'）および2'置換修飾ヌクレオシドを含むもう一方のフランク（それぞれ3'または5'）を有する。
【００８５】
長さ
本明細書において言及するヌクレオチド分子の長さについては、単量体単位がヌクレオチドであるかまたはヌクレオチド類似体であるかに関わらず、長さは単量体単位、すなわちヌクレオチドの数に相当する。ヌクレオチドに関しては、「単量体」および「単位」という用語は、本明細書において区別なく使用される。
【００８６】
本発明のプロセスは、例えば7〜30ヌクレオチド、例えば7〜10、例えば7、8、9、10、または10〜20ヌクレオチド、例えば12〜18ヌクレオチド、例えば12、13、14、15、16、17、もしくは18ヌクレオチドからなる、短いオリゴヌクレオチドの精製に特に適する。
【実施例】
【００８７】
実施例1
イソブチリル保護LNA-Gホスホラミダイトの合成は、Koshkin et al, Tetrahedron (1998), 54(14), 3607-3630に記載されている。
【００８８】
粗ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、3'-アミノ修飾因子C7 CPG支持体上で合成したエントリー17〜18以外は、標準的なホスホラミダイト化学によって、NittoPhase UnyLinker 200ポリスチレン支持体上で、20μmolスケールでのDMT-OFFモードにて合成した。4,5-ジシアノイミダゾールをアクチベーターとして使用し、水素化キサンタンをチオ酸化（thiooxidation）に使用した。ベンゾイル保護AおよびCを有する標準的なDNAホスホラミダイトを用いた。ベンゾイル保護Aおよび5-メチル-Cを有するLNAホスホラミダイトを使用した。以下の表に示すように、LNA-GはDMF保護またはiBu保護された。
【００８９】
Link Technologies、Lanakshire、Scotlandから入手可能な、5'-TFA-アミノ修飾因子C6-CEホスホラミダイトを用いて、5'末端に6-アミノヘキシルリンカー（AM-C6）を導入した。
【００９０】
Glen Research、Sterling、VAから入手可能な、アミノ修飾因子C6-dT-CEホスホラミダイト(5'-ジメトキシトリチル-5-[N-(トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン)、3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]ホスホラミダイトを用いて、5-[N-(アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジンリンカー（tAMC6）を導入した。
【００９１】
Link Technologies、Lanakshire、Scotlandから入手可能な、11-(トリフルオロアセトアミド)-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-イル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイトを用いて、5'末端に11-アミノ-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-イル基（AM-TEG）を導入した。
【００９２】
Glen Research、Sterling、VAから入手可能な、3'-アミノ修飾因子C7 CPG（2-ジメトキシトリチルオキシメチル-6-フルオレニルメトキシカルボニルアミノ-ヘキサン-1-スクシノイル)-長鎖アルキルアミノ-CPG）を用いて、3'末端に6-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-ヘキシル基（AM-C7）を導入した。この際、合成の終了後に、支持体をまずジエチルアミン溶液、次にDMF中の20%ピペリジンで処理し、Fmoc基を除去した。
【００９３】
最終合成の後、支持体はジエチルアミン溶液で洗浄し、次に1mLの濃縮水酸化アンモニウム中で一晩60℃で懸濁した。支持体をろ過し、溶液を真空状態で乾燥するまで蒸発させた。この粗製物質をUPLC-MSにより分析し、適正品と比較した+28Da不純物の割合を260nmでのピーク面積によって判断した。
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大文字＝LNA、小文字＝DNA。AM-C6＝6-アミノヘキシル、tAMC6＝5-[N-(アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン、AM-TEG＝11-アミノ-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-イル、AM-C7＝6-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-ヘキシル。例は全てホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、LNA単量体はβ-D-オキシLNAであった。LNA-C単量体は5-メチルシトシンLNA単量体である。
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【００９４】
実施例2
実施例1に記載したようなDMF保護LNA-GおよびiBu保護DNA-Gホスホラミダイトを用いて、5'-AM-C6-caGCGtaaagagAGG-3'配列を有する5'-アミノヘキシル結合ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを調製した。粗製物質は、全長産物（FL）および約20％のホルミル（HCO、+28）不純物（FL+28）を含有した。
【００９５】
超高分解能質量分析計（FT-ICR-MS型；Thermo LTQ-FT Ultra）を用いた分析により、本発明者らは27.9968Daに対する2つの[M-5H]5-ピークの正確な質量差を決定した（FL が1044.11945Da、FL+28が1049.71881Da）（図1）。5倍荷電イオンに関して5.59936Daの質量差であることから、無荷電分子に関しては5.59936Da * 5 = 27.9968Daとなる（図3）。
【００９６】
測定した質量はカルボニル基（CO）に対するΔ=1.885mmuの精度の範囲内にあり、次に行われうる公称質量+28Daの修飾は「N2」であって、ここで正確な質量差は-9.348mmuであり、使用した機器の質量精度の範囲をすでに越えている。
【００９７】
CO修飾の正確な位置を決定するため、同じ機器を用いたMS/MSによって、分子の質量分析配列決定を行った。オリゴヌクレオチドフラグメンテーションの命名法に関しては、McLuckey et al, J. Am. Chem. Soc, 115, 25, 12085-12095を参照のこと。
【００９８】
MS/MS実験において、両方の5倍荷電イオン（修飾ありおよび修飾なし）が断片化された。ここで本発明者らは、8番目のヌクレオチドまでの5'末端由来のイオンに修飾を確認したが、3'末端由来のヌクレオチドは修飾されることなく同じ位置で分解した。より長い配列の3'フラグメントは他には検出できなかった。生じたスペクトルでは、FLにおいておよびFL+28においてもb4イオン（図4）が観察された。MS3でのb4イオンのさらなるフラグメンテーション（図4）の結果、他のシグナルの中でa2-Bイオンおよび最初のヌクレオチドにおけるb4シトシンイオン（b4-C）を示すスペクトルが得られた。この2つのイオンが、C6-アミノリンカー上に修飾が位置するという提唱につながった（図5）。
【００９９】
修飾のための可能な反応パートナーとして両者の構造に存在するのはアミノリンカー基のみであるため、本発明者らはホルミルアミドはその位置で形成されると結論付ける（図6）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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