(57)【要約】転移因子の動員のための方法が提供される。該方法はａ）ＤＮＡメチル化の阻害剤、及び／又は転写の阻害剤を提供する工程、及びｂ）不活性化された転移因子を含む細胞と該阻害剤とを接触させ、動員された転移因子を有する細胞を得る工程、を含む。本発明の第２の側面において、複数の真核生物における遺伝的及び／又はエピジェネティクス的な変異を増加させるための方法が提供される。該方法は、ｉ．ＤＮＡメチル化の阻害剤及び／又は転写の阻害剤を提供する工程、ｉｉ．該阻害剤と生物とを接触させる工程、及びｉｉｉ．該生物を増殖させる工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞における転移因子の動員のための方法であって、前記方法が、以下の
ａ）転移因子を含む真核細胞を提供し、
ｂ）前記細胞を転写の阻害剤と接触させ、
それにより動員された転移因子を有する真核細胞を得る、
工程を含む、
前記方法。
【請求項２】
工程ｂ）において、細胞をさらにＤＮＡメチル化の阻害剤と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡメチル化の阻害剤及び／又は転写の阻害剤が外因性化合物、特に外因性小分子化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｃ）前記細胞を非生物学的ストレス、生物学的ストレス又は化学的ストレスへ暴露する、
工程ｃ）をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
方法が、前記細胞を単離し、及び前記細胞の表現型が変化したかどうかを決定する後段の工程を含む、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記真核細胞が多細胞生物、特に非ヒト生物、特に植物の一部であり、並びに、前記細胞を工程ｃ）の暴露に供した後に、該細胞を培養して多細胞生物とし、及び前記多細胞生物の表現型、特にストレス要因への抵抗性を決定し、前記ストレス要因は工程ｃ）において適用されたストレスを引き起こすものである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記植物細胞が、作物性植物、特にイネ、サトウキビ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、オートムギ又はキビの一部である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
真核生物の集団において遺伝的及び／又はエピジェネティクス的な変異を増加させるための方法であって、
ｉ．真核生物を提供し、
ｉｉ．前記真核生物を、
−  ＤＮＡメチル化の阻害剤、及び／又は
−  転写の阻害剤
と接触させ、
ｉｉｉ．前記真核生物を増殖させ、増加した遺伝的及び／又はエピジェネティクス的な変異を有する真核生物の集団を得る、
工程を含む、前記方法。
【請求項９】
工程ｉｉ．に次いで、
ｉｉ．ａ  前記真核生物を非生物学的ストレス、生物学的ストレス又は化学的ストレスに暴露する、工程ｉｉ．ａをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
方法が、
ａ．前記生物においていずれかの遺伝的変化を決定し、及び／又は
ｂ．前記生物の表現型におけるいずれかの変化、特に工程ｉｉ．ａにおいて適用されるストレス要因への増加した耐性を決定すること
を含む後段の工程ｉｖを含み、
前記遺伝的又は表現型の変化は、構成する個々の真核生物において、若しくは真核生物の集団の代表的なサンプルについて、又は集団を構成する真核生物全てについて決定する、
請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１１】
ｉ．前記非生物学的ストレスは、熱、寒冷、干ばつ、沈水／水過剰、風、紫外線（ＵＶ照射）、核放射線、塩分、重金属、土壌ｐＨ、組織培養条件、及び、リン、窒素、光又はＣＯ２の欠乏、から選択され、及び／又は
ｉｉ．前記生物学的ストレスは、真菌、細菌、ウイルス、昆虫、草食動物による創傷及び生物学的競合の負の影響から選択され、及び／又は
ｉｉｉ．前記化学的ストレスは、除草剤、除草剤解毒剤、殺虫剤、殺菌剤、植物二次代謝物及び植物防御を誘導する合成又は天然化合物、特にフランジェリン、より特にｆｌｇ２２、から選択される、
請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡメチル化の阻害剤が、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン及びゼブラリンから選択される、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記転写の阻害剤が、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、特にＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ阻害剤又はＲＮＡポリメラーゼＶ阻害剤、より特にＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤である、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤が、
ｉ．アマトキシン、特にα−アマニチン、
ｉｉ．アマトキシンの誘導体、特にα−アマニチンオレアート、
ｉｉｉ．ヌクレオシド誘導体、特に５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）、
ｉｖ．アクチノマイシンＤ、
ｖ．フラボピリドール、
ｖｉ．トリプトライド、
から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アマトキシン、特にα−アマニチンが、０．０００５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、特に０．００１μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ、より特に０．００５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ、さらにより特に０．００５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの濃度で使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡメチル化の阻害剤、特にゼブラリンが、５μＭ〜１００μＭ、特に１０μＭ〜８０μＭ、より特に１０μＭ〜４０μＭ、さらにより特に２０μＭ〜４０μＭの濃度で使用される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
複数の真核生物における前記増加した遺伝的及び／又はエピジェネティクス的な変異が、前記生物が暴露された前記非生物学的、生物学的又は化学的ストレスに対する前記生物の増加した抵抗性をもたらす、
請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法における組成物の使用であって、組成物が、転写の阻害剤及びＤＮＡメチル化の阻害剤を含み、及び転写の阻害剤、特にα−アマニチンの、ＤＮＡメチル化の阻害剤、特にゼブラリンに対するモル濃度比が、０．０００００５〜１１、より特に０．０００１２５〜２、さらにより特に０．０００１２５〜０．１２５である、
前記組成物の使用。
【請求項１９】
−  前記ＤＮＡメチル化の阻害剤、特にゼブラリンが、５μＭ〜１００μＭ、特に１０μＭ〜８０μＭ、より特に１０μＭ〜４０μＭ、さらにより特に２０μＭ〜４０μＭの濃度で使用され、及び／又は
−  前記アマトキシン、特にα−アマニチンが、０．０００５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、特に０．００１μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ、より特に０．００５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ、さらにより特に０．００５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの濃度で使用される、
請求項１８に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は転移因子の動員及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
転移因子（ＴＥ）は、トウモロコシにおける殻粒の色素沈着に影響（斑入り）を及ぼす可能性があるその変異原性活性により、１９５０年代初頭にバーバラ  マクリントックによって最初に発見された（マクリントック，ＰＮＡＳ，１９５０  ３６（６）：３４４−５５）。それらの最初の発見以来、多くの機能がＴＥに起因してきた。実際にＴＥは現在ではゲノムを再形成する天然の分子ツールとして見なされる傾向にある（ビレら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２０１２；８５９：１−２８）。ＴＥは宿主ゲノムの形成において重要な（主要でないかもしれないが）役割を果たしていると同定されている；特にセントロメアの領域はＴＥが豊富である。長い末端反復（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンのコピー数は宿主ゲノム配列との強い相関が発見されており、そしてＴＥの動員は染色体破壊の誘導によって及び相同組換えに影響を及ぼすことによって、ゲノム組織化に影響を及ぼすことができる。遺伝子レベルでは、ＴＥは複数の効果を有している：遺伝子内に直接挿入により突然変異を引き起こし、ゲノム内の遺伝子を移動させ、新規の遺伝子を複製及び／又は作製し、遺伝子発現を制御し、新規の制御経路を作製し、及びエピジェネティクス的な制御下で遺伝子をもたらす。現在、ＴＥは宿主への変異原性の陽性結果を強調することができる変異原として考えられている（ベネッツェンら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ，２０１４，６５：５０５−３０）。
【０００３】
ＴＥは非常に有用な遺伝子ツールであることが証明されており、多種多様な生物における遺伝子破壊及び遺伝子導入のために広く利用されてきた。しかし、ＴＥは元来、正常な成長条件下では活性状態であることは非常に希であるため、現在、活性なＴＥはわずかにだけしか知れていない。したがって、非常に限定された数のＴＥだけが活発に遺伝子改変のために使用されている。いくつかの例では、Ｐ因子（ショウジョウバエ）、ＰｉｇｇｙＢａｃ（昆虫、ヒト細胞株）、Ｌ１  ＬＩＮＥ因子（マウス）、Ｍａｒｉｎｅｒ（脊椎動物）、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ（動物）を含む。遺伝的多様性を作製するために、これらのＴＥは遺伝子導入を介して、目的の生物内へ導入される。しかし、それらは現行法により遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）として見なされるため、そのような方法において改変された生物の使用は制限される。
【０００４】
植物において、転移因子の移動性は、ＤＮＡのメチル化及び特定のヒストン標識によって制限されることが実証されている（ミウラら，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１（６８３４）：２１２−４；  ミロウズら，  Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６１（７２６２）：４２７−３０）。したがって、遺伝子変異におけるＤＮＡメチル化の抑制は、転移因子の動員をもたらすことができる。ＤＮＡメチル化を減少させる薬剤（例えば、５−アザ−２’−デオキシシチジン）が特定のＤＮＡ  ＴＥを動員できることも示されている（スコーテシーら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７，３８（３）：３３６−４３）。ＲＮＡ指向性ＤＮＡメチル化（ＲｄＤＭ）が欠損している植物において、ストレスは転移因子を活性化することが報告されている（イトウ  Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７２：１１５−１９）。しかし、ＴＥに対する防御に関連する構成要件において遺伝子変異という要件は、非モデル生物又は形質転換が困難な生物においてＴＥを活性化する可能性を限定している。したがって、遺伝的及びエピジェネティクス的な多様性を得るために内在性のＴＥを活用することは、現在非常に限られている。
【０００５】
正常な成長条件下で、ＴＥが動員されることは非常に希であり、そして、真核生物において、ＴＥを活性化するための異なる処置は、非常に非効率的であった。ゲノムＤＮＡメチル化レベルを減少させる薬剤での処置は、ＴＥの緩やかな活性化を可能にすることが知られている（ボーべック  Ｔ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，２００９  ５７：５４２−５４）が、これらのＴＥの新しい挿入はもたらされない。ＲＮＡ指向性ＤＮＡメチル化の経路に関連する因子の変異は、高頻度でＴＥを動員することが、植物において示されている。これらのアプローチにおいて重要な制限は、非効率的（前記の薬物処置）であるか、又は、特に非モデル生物においては、得ることが困難な遺伝子変異を必要とすることのいずれかである。したがって、これらの技術的課題は、ほとんどの生物における転移因子の使用や研究を制限する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】マクリントック，  ＰＮＡＳ，１９５０  ３６（６）：３４４−５５
【非特許文献２】ビレら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０１２；８５９：１−２８
【非特許文献３】ベネッツェンら，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ，２０１４，６５：５０５−３０
【非特許文献４】ミウラら，  Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１（６８３４）：２１２−４
【非特許文献５】ミロウズら，  Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６１（７２６２）：４２７−３０
【非特許文献６】スコーテシーら,  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７，３８（３）：３３６−４３
【非特許文献７】イトウ  Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７２：１１５−１９
【非特許文献８】ボーべック  Ｔ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，２００９，５７：５４２−５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の根底にある課題は、転移因子の効率的な動員のための方法を提供することである。  
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この課題は、独立請求項の主題によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は薬理学的処置及び熱ストレスにおけるＯＮＳＥＮ染色体外ＤＮＡの蓄積を示す。（ａ）野生型（ＷＴ）及びｎｒｐｂ２−３植物におけるコントロールストレス（ＣＳ）、熱ストレス（ＨＳ）処置、及びα−アマニチン（Ａ、５μｇ／ｍｌ）又はゼブラリン（Ｚ、１０μＭ）での処置の直後にｑＰＣＲにより測定されたＯＮＳＥＮ  ＤＮＡの集積（平均±標準誤差、ｎ＝６  生物学的反復、ＡＣＴＩＮ２に対する値）。（ｂ）コントロールストレス（ＣＳ：２４時間  ６℃）、熱ストレス（ＨＳ：２４時間  ６℃及び２４時間  ３７℃）処置、及びＡ（５μｇ／ｍｌ）、Ｚ（４０μＭ）又はそれらの併用（Ａ＆Ｚ）の処置の直後にコロンビア（Ｃｏｌ）ＷＴの苗において定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定されたＯＮＳＥＮのコピー数（平均±標準誤差、ｎ＝３  生物学的反復）。二重の処置（Ａ＆Ｚ）は、ＯＮＳＥＮの非常に強い熱ストレス依存活性化をもたらし、結果として最大７００のＯＮＳＥＮ染色体外ＤＮＡのコピー数をもたらした。
【図２】図２はＯＮＳＥＮ動員のストレス依存性を示す。グラフは、ＣＳに続いて、ＷＴ、ｎｒｐｂ２−３及びｎｒｐｄ１植物においてＡ（５μｇ／ｍｌ）、Ｚ（４０μＭ）又はＡとＺとの併用（Ａ＆Ｚ）の化学処置後のシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）の苗におけるＯＮＳＥＮコピー数を示している。ｑＰＣＲより測定したＯＮＳＥＮコピー数（平均±標準誤差、ｎ＝３  生物学的反復、ＡＣＴＩＮ２に対する値）。この結果はＯＮＳＥＮ染色体外ＤＮＡの産生は熱ストレス依存であることを示している。
【図３ａｂ】図３は、メチルトランスフェラーゼ及びＰｏｌ  ＩＩの同時阻害がｎｒｐｄ１変異体を模倣することを示している。（ａ）ＣＳ後、ＷＴ及びｎｒｐｄ１変異体の未処置及び、Ａ（５μｇ／ｍｌ）、Ｚ（４０μＭ）又はＡ＆Ｚ処置したＷＴ苗におけるＯＮＳＥＮ  ＬＴＲ、及びｓｏｌｏＬＴＲの非対称メチル化分析。ＧＨＨメチル化感受性制限酵素ＤｄｅＩで消化されていない（入力）又は消化後に使用されたゲノムＤＮＡから得られたＰＣＲ産物。ＡＣＴＩＮ２は、完全なＤｄｅＩ消化のためのコントロールとして含まれている。Ａ（５μｇ／ｍｌ）及びＺ（４０μＭ）を用いたＡ＆Ｚ二重処置は、ｎｒｐｄ１変異体に匹敵するＯＮＳＥＮ及びｓｏｌｏＬＴＲでのＤＮＡメチル化の非常に強い減少をもたらした。（ｂ）ＷＴ及びｎｒｐｄ１変異体におけるＣＳ、ＨＳ及び、Ａ（５μｇ／ｍｌ）、Ｚ（４０μＭ）又はＡ＆Ｚの併用の処置を加えたＨＳの直後のＯＮＳＥＮ転写を示すノーザンブロット。ミドリ染色されたアガロースゲルは、ローディングコントロールとして示された。熱ストレス及び、Ａ（５μｇ／ｍｌ）とＺ（４０μＭ）との二重処置後の全長ＯＮＳＥＮ転写物のレベルは、ｎｒｐｄ１変異体に匹敵する。
【図３ｃ】（ｃ）ＣＳ、ＨＳ及び、Ａ（５μｇ／ｍｌ）、Ｚ（４０μＭ）又はＡ＆Ｚ併用の処置を加えたＨＳの直後のＷＴ植物、ｒｄｒ６植物、ｄｃｌ２／３／４植物及びｎｒｐｄ１変異体植物の苗におけるｑＰＣＲにより測定されたＯＮＳＥＮ  ＤＮＡの集積。この結果はＰｏｌ  ＩＩがＤＩＣＥＲ様酵素の活性な上流であることを示している。
【図４ａ】図４は野生型シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物におけるＯＮＳＥＮの薬剤誘導動員を示す。（ａ）ＨＳ（ＨＳコントロール）並びに、Ａ（５μｇ／ｍｌ）及びＺ（４０μＭ）とＨＳとを処置したＷＴ植物（ＨＳ＋Ａ＆Ｚ）のＦ２世代における新規ＯＮＳＥＮ挿入を確認するトランスポゾンディスプレイ。挿入されたＯＮＳＥＮコピーはｑＰＣＲによる測定（上部）、及びトランスポゾンディスプレイによる検出（下部）を行った。７つの個々に選択された非関連植物のＯＮＳＥＮコピー数を示す。ＨＳ＋Ａ＆Ｚ処置されたＣｏｌ  ＷＴ植物において、ｑＰＣＲによって測定された８より多いコピー数（上部）及びトランスポゾンディスプレイ上での観測された追加のバンドは、追加されたＯＮＳＥＮコピーの新規挿入を示す。Ｍは１ｋｂサイズのマーカーである。
【図４ｂ】（ｂ）ｑＰＣＲにより測定されたＦ１、Ｆ２及びＦ３世代におけるＯＮＳＥＮコピー数（ｎ＝３  技術的反復、ＡＣＴＩＮ２に対する値）。系統１−７において８より多いコピー数は追加のＯＮＳＥＮコピーの挿入を示す。
【図４ｃｄ】（ｃ）及び（ｄ）  長日条件下（ｃ）及び短日条件下（ｄ）で育成した場合のＨＳ＋Ａ＆Ｚにより誘導された、均一及びストレス依存的の両方の表現型変動性を示す新規ＯＮＳＥＮ挿入を含むＦ２植物の写真。（ｃ）及び（ｄ）における表現型の図と同様に（ｂ）におけるライン６のＦ３世代についてのｑＰＣＲデータも、このラインの不毛及び消失により欠損している。新規ＯＮＳＥＮ挿入を有する系統（系統１−７）において観測された表現型の例は、短日条件下の高いバイオマス（系統３）、長日条件下の早期開花（ライン７）及びクロロフィル蓄積の減少（系統１）を含む。要約すると、このデータセットは、Ａ＆Ｚ処置は、効率的で爆発的なＯＮＳＥＮ転移をもたらす。新しいＯＮＳＥＮ挿入は、数世代にわたり安定して遺伝し、そして表現型の変化を引き起こす。
【図５】図５は、熱ストレスを与えた及び処置した植物のＦ１プールにおけるＯＮＳＥＮコピー数の増加を示す。独立した実験において（記号ａ−ｃ）、親植物にＡ（５μｇ／ｍｌ）及びＺ（４０μＭ）の併用処置及び熱ストレスを与えた。有意にＯＮＳＥＮコピー数が増加した（＞１０）プールは濃いグレーで強調した。ｑＰＣＲにより測定されたＯＮＳＥＮコピー数（平均±標準誤差、ｎ＝３  技術的反復、ＡＣＴＩＮ２に対する値）。熱ストレスを与えた、及びＡ＋Ｚで処置した野生型植物の試験したＦ１プールのうち、およそ２９．４％は、ＯＮＳＥＮコピー数の有意な増加を示した。
【図６ａ】図６は、確認された新規ＯＮＳＥＮ挿入の概要を示す。（ａ）広域のゲノム分布。
【図６ｂ１】（ｂ）選択されたＨＳ＋Ａ＆Ｚで処置したＷＴ植物（系統＃３）のＦ２世代における新しいＯＮＳＥＮ挿入を有するゲノム領域のクローズアップ。ＯＮＳＥＮ挿入の方向は中央矢印で示す。
【図６ｂ２】ゲノム領域のクローズアップのつづき。
【図７ａ】図７はイネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）におけるＨｏｕｂａレトロトランスポゾンの薬剤誘導活性化を示す。コントロール条件（Ｃ）、Ａ（５μｇ／ｍｌ）、Ｚ（４０μＭ）及びＡ＆Ｚ併用における育成後の苗から抽出したＤＮＡのモビローム解析。（ａ）１つのＨｏｕｂａ因子において解読した配列を整列した後に得られた、未処置のコントロール植物と比較し、正規化した被覆深度の詳細。
【図７ｂｃｄ】（ｂ）プライマーの局在のスキーム（黒色バー：Ｈｏｕｂａ因子、矢印：ＰＣＲプライマー、ｂｏｘ：ＬＴＲ）。（ｃ）Ｈｏｕｂａの染色体外環状形態は、Ａ＆Ｚの両方で処置した植物中において、図４ｂで示すプライマーを用いたインバースＰＣＲを使用して特異的に検出される。（ｄ）環状葉緑体ＤＮＡ上の特異的ＰＣＲをローディングコントロールとして示す。ローリングサークル増幅されたｔｏｔａｌ  ＤＮＡを鋳型として使用した。これらの結果は、イネにおけるＨｏｕｂａトランスポゾンの効率的なＡ＆Ｚ依存性動員を実証している。
【図８ａ】図８は処置されたシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）苗のＦ２世代における増加した熱耐性を示す。熱ストレス処置のみ（コントロール）、又は熱ストレス処置かつＡ（５μｇ／ｍｌ）及びＺ（４０μＭ）で処置（＃１−３）のいずれかの野生型の植物のＦ２子孫における反復熱ストレス（４２℃）に対する耐性。（ａ）２つの生物学的複製物を示す（Ｉ及びＩＩ）。
【図８ｂ】（ｂ）生存する苗のパーセンテージ（平均±標準誤差、ｎ＝２  生物学的反復）。熱ストレスのみの処置をした植物（生存する苗１０％）のＦ２と比較して、熱ストレス及びＡ＆Ｚ処置をした植物に由来するＦ２苗は、熱耐性が有意に増加した（生存する苗＞６０％）。これは熱ストレス応答性トランスポゾンのＡ＆Ｚ依存性動員が、熱ストレスにより適合した植物を生産することができることを実証している。
【図９】図９は薬理学的処置及び熱ストレスに対するＯＮＳＥＮ染色体外ＤＮＡの用量依存的蓄積を示す。ＯＮＳＥＮコピー数は、コントロールストレス（ＣＳ）、熱ストレス（ＨＳ）、及び異なるμｇ／ｍｌ濃度のα−アマニチンでの処置の直後のコロンビア（Ｃｏｌ）野生型の苗において、ｑＰＣＲにより測定した（平均±標準誤差、ｎ＝３  技術的反復）。これは、動員されたトランスポゾンの数は、処置のために使用されるＡの量によって調節され得ることを示す。
【図１０ａｂ】図１０は、植物及びヒト細胞をＡで処置することによって誘導されたＤＮＡメチル化レベルでのエピジェネティクス的な変化を示す。（ａ）コントロールストレス（ＣＳ：２４時間  ６℃）、熱ストレス（ＨＳ：２４時間  ６℃及び２４時間  ３７℃）、及びＡ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｚ（１０μＭ）又はそれらの併用（Ａ＆Ｚ）での処置の直後のＷＴ（Ｃｏｌ）苗における薬理学的処置及び熱ストレスに対するＯＮＳＥＮ  ＬＴＲでのメチル化の減少を示すミドリ染色アガロースゲル。未消化のＤＮＡをローディングコントロール（入力）のためのＰＣＲ鋳型として使用した。ＤｄｅＩで消化したＤＮＡにおけるＰＣＲは、Ａ、Ｚ又はＡ＆Ｚ併用での処置後のＤＮＡメチル化の減少を示す。（ｂ）Ａを含む、又は含まない培地中で増殖させたＣＳ植物において実施したバイサルファイトシーケンシングで評価したＯＮＳＥＮ  ＬＴＲでのＣＨＨメチル化状態。
【図１０ｃｄ】（ｃ）コントロール培地及びＡを０．５μｇ／ｍｌ含む培地中で増殖させたヒトＡ５４９癌細胞において評価したＬＩＮＥ−１  ＤＮＡメチル化レベル。これはＡが、植物及びヒト細胞における強力なＤＮＡ脱メチル化剤として使用され得ることを示す。
【図１１】図１１は、薬理学的処置及びフラジェリン処置を併用した処置に対するＯＮＳＥＮ染色体外ＤＮＡの蓄積を示す。コントロールストレス直後、フラジェリン（ｆｌｇ２２）単独で、又はフラジェリンとＡ（５μｇ／ｍｌ）、Ｚ（４０μＭ）若しくはそれらの併用（Ａ＆Ｚ）とを組合せた処置の５時間後のＣｏｌ野生型の苗において定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定したＯＮＳＥＮコピー数（平均±標準誤差、ｎ＝３  技術的反復）。
【図１２】図１２は、薬理学的処置及びフラジェリン処置の併用に対するＡＴＣＯＰＩＡ１７の活性化を示す。コントロールストレス直後、フラジェリン（ｆｌｇ２２）単独で、又はフラジェリンとＡ（５μｇ／ｍｌ）、Ｚ（４０μＭ）若しくはそれらの併用（Ａ＆Ｚ）とを組合せた処置の５時間後のＣｏｌ野生型の苗中のｔｏｔａｌ  ＤＮＡにおいて定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定したＯＮＳＥＮコピー数（平均±標準誤差、ｎ＝３  技術的反復）。
【図１３】図１３は、薬理学的処置及び熱ストレスに対するＯＮＳＥＮ染色体外ＤＮＡの蓄積を示す。ＯＮＳＥＮコピー数は、コントロールストレス（ＣＳ：２４時間  ６℃）、熱ストレス（ＨＳ：２４時間  ６℃及び２４時間  ３７℃）並びに、α−アミニチン（Ａ、２０μｇ／ｍｌ）、ゼブラリン（Ｚ、１０μＭ）及びそれらの併用（Ａ＆Ｚ）処置を加えたＨＳの直後の野生型の苗中のｔｏｔａｌ  ＤＮＡにおいて定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定した。この結果は、Ａ及びＺの相対濃度に依存しない処置の堅牢性を実証する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者らは、本明細書において、真核生物における転移因子を動員することができる薬剤に基づく処置を提供する。さらに、この処置と特定のストレスとの併用は、この特定のストレスに応答する特定のＴＥの動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）をもたらす。この処置は、処置された生物において活性化されたＴＥの染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）の高い蓄積をもたらす。さらに、処置された生物の子孫は、ゲノム中に多数のＴＥコピーの安定した挿入を示し、処置の一部であるストレスへの抵抗性を増大させる。したがって、本発明の方法は、ＴＥ防御を不活性化するための遺伝的変異の必要性を克服し、ゆえに実質的に任意の真核生物において転移因子を効率的に活性化することができる。本発明は、ゲノムのサイズ及び構造におけるＴＥを介した変異の導入、内在性遺伝子発現の調節、遺伝子形質導入、雑種強勢、相同的組換え並びにストレス適応を可能にする。さらに本発明は新規な機能的ＴＥの同定を可能にする。
【００１１】
本発明の第１の側面によれば、真核細胞の、特にゲノム内の転移因子の動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）のための方法を提供する。該方法は、
ａ）１つ又は複数の休止の、すなわち不活性な転移因子を含む真核細胞を提供し、
ｂ）細胞を転写の阻害剤と接触させ、及び任意に細胞を付加的にＤＮＡメチル化阻害剤と接触させ、
それにより、１つ又は複数の動員された転移因子を有する真核細胞を得る、
ことを含む。
【００１２】
本明細書の文脈において、転移因子、又はトランスポゾンという用語は、分子遺伝学の分野で知られるその意味で使用される；それらは、ゲノム内のそれらの位置を変化させることができる（カットアンドペースト機構）、又はゲノム内に挿入する自身の新規コピーを作製することができる（コピーアンドペースト機構）生物のゲノム中のＤＮＡ配列を指す。転移は、その因子の増殖をもたらすことができ、それによりゲノムのサイズに影響を及ぼすことができる。レトロトランスポゾンとも呼ばれるクラス１トランスポゾン及びＤＮＡトランスポゾンと呼ばれるクラス２トランスポゾンの２クラスのトランスポゾンが存在する。レトロトランスポゾンは、まず、宿主細胞によって提供される分子装置によってＲＮＡに転写され、次いで、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と呼ばれるＲＮＡコピーの二本鎖ＤＮＡに逆転写され、ゲノム内の新規の位置に挿入される。それらは、レトロウイルスと、逆転写酵素の依存性といったいくつかの特徴を共有する。ＤＮＡトランスポゾンはＲＮＡ中間体を有さず、トランスポゼース（トランスポザーゼ）によってゲノム中の新しい位置に移される。ゲノム中のトランスポゾンの大部分は、不活性であり、そして複製又は位置を変化させない。したがって、トランスポゾンの活性化はまた、トランスポゾンの動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）とも呼ばれる。特定のストレスに反応するトランスポゾンの例を表１に示す。これらのトランスポゾンは、ある程度までは示されたストレスによって活性化させる。しかし、本発明の方法の使用は、提供した実施例において見られるとおり、これらのトランスポゾンをより大きな程度に動員する。
【００１３】
本発明の任意の側面の一実施態様において、クラス１トランスポゾンが動員される。
【００１４】
本発明の任意の側面の一実施態様において、クラス２トランスポゾンが動員される。
【００１５】
本明細書の文脈において、ＤＮＡメチル化という用語は、分子生物学及び分子遺伝学の分野で知られるその意味で使用される；それは真核生物では主にシトシンで生じる、ＤＮＡへのメチル基の付加を指す。ＤＮＡのメチル化はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）によって触媒され、新たに合成されたＤＮＡ鎖上にメチル化パターンを伝達するのに必要な維持メチル化と、新規のメチル化とに分けられる。ＤＮＡのメチル化は遺伝子発現の不活性化及びトランスポゾンのサイレンシングに関連する。ＤＮＡメチル化は次世代に引き継がれることが可能であり、したがってエピジェネティクス的な変化の共通の形態を示す。
【００１６】
表１：トランスポゾンの例
【表１】
2018535686.tif 000002
【００１７】
一実施態様において、ＤＮＡメチル化の阻害剤は外因性化合物である。
【００１８】
一実施態様において、転写の阻害剤は外因性化合物である。
【００１９】
一実施態様において、外因性化合物は、１０００ｕ以下、特に９２０ｕ以下の分子量を有する低分子化合物である。
【００２０】
本明細書の文脈において、外因性化合物という用語は、技術的に加えない限り、生理条件下で細胞中に存在しない分子を指す。
【００２１】
一実施態様において、メチル化の阻害剤は、少なくともいくつかの生理条件下で少なくともいくつかの細胞中には、ほんの僅かな量で存在するかもしれないが、本発明の方法においては細胞生理条件の有意な影響を及ぼすために、はるかに高い濃度で添加される。これを達成するために、化合物は、細胞の内部で観測されるＤＮＡメチル化の阻害剤の濃度より少なくとも１０倍高くなるように選択された濃度で細胞の培地中に存在する。
【００２２】
一実施態様において、転写の阻害剤は、細胞の内部で観測される転写の阻害剤の濃度の少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍又はさらに１０，０００倍となるように選択された濃度で培地中に存在し、及び生理学的条件下の細胞中に存在する。
【００２３】
一実施態様において、本明細書で開示される任意の側面又は実施態様として特定される本発明の方法は、
ｃ）細胞を非生物学的ストレス、生物学的ストレス又は化学的ストレスにさらす、
工程ｃ）をさらに含む。
【００２４】
本明細書の文脈において、非生物学的ストレスという用語は、特定の環境において生物に対する非生存因子の負の影響を指す。非生存変数はその正常な変動範囲を超えて環境に影響を与える。非生物学的ストレスの非限定的な例は、熱、寒冷、干ばつ、水没／水過剰、風、紫外線（ＵＶ照射）、核放射線、塩分、重金属、土壌ｐＨ、組織培養条件及びリン、窒素、光、ＣＯ２等の欠乏である。対照的に生物学的ストレスという用語は、真菌、細菌、ウイルス、昆虫、草食動物による創傷及び生物学的競合などの負の影響を指す。
【００２５】
化学的ストレスという用語は、生物における化学物質（「ストレス要因」）の負の影響を指す。これら物質はまた、非生物学的又は生物学的ストレスを模倣するストレス模倣物質である物質を含んでもよい。化学的ストレスの非限定的な例は、除草剤、除草剤解毒剤、殺虫剤、殺菌剤、植物二次代謝物、植物防御を誘導する合成又は天然化合物である。
【００２６】
除草剤解毒剤という用語は、単子葉植物を除草剤の損傷から選択的に保護し、一方で双子葉植物は除草剤によって影響を受ける化合物を指す。イネ、コムギ、トウモロコシなどのような一般的な作物性植物だけでなく、飼料牧草、サトウキビ及び竹は単子葉植物であり、一方で大部分の雑草種は双子葉植物である。除草剤解毒剤は播種前に種子の被覆として、農業の土壌を調製するために、又は栽培植物の葉に適用してもよい。２つの後者の場合、除草剤解毒剤は、除草剤と一緒に適用することができる。一般的な除草剤解毒剤の例は、ベノキサコール（Ｂｅｎｏｘａｃｏｒ）（ＣＡＳ  ９８７３０−０４−２）、クロキントセット−メキシル（Ｃｌｏｑｕｉｎｔｏｃｅｔ−ｍｅｘｙｌ）（ＣＡＳ  ９９６０７−７０−２）、シオメトリニル（Ｃｙｏｍｅｔｒｉｎｉｌ）（ＣＡＳ  ６３２７８−３３−１）、ジクロルミド（Ｄｉｃｈｌｏｒｍｉｄ）（ＣＡＳ  ３７７６４−２５−３）、フェンクロラゾール−エチル（Ｆｅｎｃｈｌｏｒａｚｏｌｅ−ｅｔｈｙｌ）（ＣＡＳ  １０３１１２−３５−２）、フェンクロリム（Ｆｅｎｃｌｏｒｉｍ）（ＣＡＳ  ３７４０−９２−９）、フルラゾール（Ｆｌｕｒａｚｏｌｅ）（ＣＡＳ  ７２８５０−６４−７）、フルキソフェニム（Ｆｌｕｘｏｆｅｎｉｍ）（ＣＡＳ  ８８４８５−３７−４）、フリラゾール（Ｆｕｒｉｌａｚｏｌｅ）（ＣＡＳ  １２１７７６−３３−８）、メフェンピルジエチル（Ｍｅｆｅｎｐｙｒ−ｄｉｅｔｈｙｌ）（ＣＡＳ  １３５５９０−９１−９）、ＭＧ  １９１（ＣＡＳ  ９６４２０−７２−３）、ナフタル酸無水物（Ｎａｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（ＣＡＳ  ８１−８４−５）、ＭＯＮ−１３９００（ＣＡＳ  １２１７７６−３３−８）、ＬＡＢ  １４５１３８（ＣＡＳ  ７９２６０−７１−２）及びオキサベトリニル（Ｏｘａｂｅｔｒｉｎｉｌ）（ＣＡＳ  ７４７８２−２３−３）である。
【００２７】
一実施態様において、転移因子はレトロトランスポゾンである。
【００２８】
一実施態様において、細胞は多細胞生物の一部である。一実施態様において真核細胞は、非ヒト生物の一部である。
【００２９】
一実施態様において、真核細胞は植物細胞である。一実施態様において、植物細胞はシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、特にシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）である。
【００３０】
一実施態様において、植物細胞は、作物性植物の一部、特にイネ、サトウキビ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、オートムギ又はキビなどの植物を含むイネ科の植物の一部である。一実施態様において、本方法は、前記細胞を単離し、細胞の表現型が変化したかどうかを決定する後段の工程を含む。
【００３１】
一実施態様において、真核細胞は多細胞生物、特に植物の一部であり、そして、細胞を工程ｃ）の暴露に供した後、細胞を培養して多細胞生物を生じさせ、多細胞生物の表現型を決定する。
【００３２】
一実施態様において、生物の表現型は、ストレス要因に対する耐性を決定することを含み、前記ストレス要因は工程ｃ）において適用されるストレスを引き起こすものである。
【００３３】
一実施態様において、工程ｃ）において適用されるストレスを引き起こすストレス要因に対する耐性は、本発明の方法を適用後に増加する。
【００３４】
本発明の第２の側面によれば、真核生物の集団において遺伝的及び／又はエピジェネティクス的な変異を増加させるための方法が提供される。本方法は、
ｉ．真核生物を提供し、
ｉｉ．該真核生物に
ＤＮＡメチル化の阻害剤及び／又は
転写の阻害剤
を接触させ、
ｉｉｉ．真核生物を増殖させ、増加した遺伝的及び／又はエピジェネティクス的な変異を有する真核生物集団を得る工程
を含む。
【００３５】
本方法は、真核生物内の休止状態、すなわち不活性な、現在は転写又は逆転写されていない転移因子を動員する。発明者の知見によれば、全ての真核生物はそのゲノム内に休止状態の転移因子を含み、用語「真核生物」は、「休止状態の転移因子を含む真核生物」と同義である。
【００３６】
一実施態様において、本方法は、本明細書中に列挙した特定の転移因子のいずれかの１つを含んでいる真核生物に使用される。
【００３７】
本発明の第２の側面の一実施態様において、本方法は工程ｉｉに次いで、
ｉｉ．ａ  真核生物を非生物学的ストレス、生物学的ストレス又は化学的ストレスに暴露する、
工程ｉｉ．ａをさらに含む。
【００３８】
一実施態様において、ＤＮＡメチル化の阻害剤及び／又は転写の阻害剤は、極性溶媒、特に極性非プロトン性溶媒、より特にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の溶液として提供される。
【００３９】
一実施態様において、ＤＮＡメチル化の阻害剤及び／又は転写の阻害剤は、極性溶媒、特に水溶液として提供される。
【００４０】
一実施態様において、本方法は、
ａ．いずれかの遺伝的及び／又はエピジェネティクス的な変化を決定し、又は
ｂ．いずれかの表現型における変化、特に工程ｉｉ．ａにおいて適用したいずれかのストレスへの耐性を決定すること、
を含む後段の工程ｉｖを含み、
前記変化は、構成する個々の真核生物において若しくは真核生物の集団体表的なサンプルについて、又は集団を構成する真核生物全てについて決定する。
【００４１】
本発明の第１及び第２の側面の一実施態様において、非生物学的ストレスは、熱、寒冷、干ばつ、水没／水過剰、風、紫外線（ＵＶ照射）、核放射線、塩分、重金属、土壌ｐＨ、組織培養条件及び欠乏（リン、窒素、光、ＣＯ２など）から選択される。
【００４２】
本発明の第１及び第２の側面の一実施態様において、生物学的ストレスは、真菌、細菌、ウイルス、昆虫、草食動物による創傷及び生物学的競合の負の影響から選択される。負の影響を有する真菌の非限定的な例としては、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）（ポテト枯病）及びイネイモチ病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）（イネイモチ病）であろう。負の影響を有する細菌の非限定的な例としては、灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（灰色カビ）、ピアス病菌（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓ）（Ｏｌｉｖｅ  Ｑｕｉｃｋ  Ｄｅｃｌｉｎｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及びプクシニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐｐ）（小麦錆）である。負の影響を有するウイルスの非限定的な例としては、タバコモザイクウイルス及びトマト黄化壊疽ウイルスである。負の影響を有する昆虫についての非限定的な例としては、ヨウトガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）（Ｃａｂｂａｇｅ  ｍｏｔｈ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）（ｃｏｒｎ  ｅａｒｗｏｒｍ）、アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｒｎ  ｂｏｒｅｒ）である。生物学的競合のために負の影響を有する他の生物の非限定的な例は、ハマウツボ属（Ｏｒｏｂａｎｃｈｅ）（ｂｒｏｏｍｒａｐｅ）及びオオブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ｔｒｉｆｉｄａ）（ｇｉａｎｔ  ｒａｇｗｅｅｄ）である。
【００４３】
本発明の第１及び第２の態様の一実施態様において、化学的ストレスは、除草剤、除草剤解毒剤、殺虫剤、殺菌剤、植物二次代謝物、植物防御を誘導する合成又は天然の化合物から選択される。植物防御を誘導する化合物の非限定的な例は、フランジェリン（天然化合物、細菌エリシター；  フェリックスら、１９９９、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．）、フランジェリンの保存されたＮ末端部分の２２アミノ酸配列（ｆｌｇ２２）、サリチル酸及び類似体、例えばＢｉｏｎ（登録商標）（合成類似体を有する天然化合物；（ボルトら，２００９，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．；フリードリヒら，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．））、ジャスモン酸及びジャスモン酸メチルエステル（天然化合物；コーエンら，１９９３，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）エチレン（天然化合物；ヴァンルーンら，  ２００６，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．）、アブシジン酸（天然化合物；マウク−マニとマウク，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．）及びテルペン及び緑葉揮発性物質（天然化合物；アンシッカーらによるレビュー，  ２００９，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ）のような揮発性物質である。
【００４４】
本発明の第１及び第２の態様の一実施態様において、ＤＮＡメチル化の阻害剤はヌクレオシド類似体である。
【００４５】
本発明の第１及び第２の態様の一実施態様において、ＤＮＡメチル化の阻害剤は、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン及びゼブラリンから選択される。
【００４６】
本発明の第１及び第２の態様の一実施態様において、転写の阻害剤は、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、特にＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ阻害剤又はＲＮＡポリメラーゼＶ阻害剤、より特にＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤である。
【００４７】
本発明の第１及び第２の態様の一実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤は、
−  アマトキシン、特にα−アマニチン（ＣＡＳ  ２３１０９−０５−９）、
−  アマトキシンの誘導体、特にα−アマニチンオレエート（ａｌｐｈａ−ａｍａｎｉｔｉｎ  ｏｌｅａｔｅ）、
−  ヌクレオシド類似体、特に５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ；  ＣＡＳ  ５３−８５−０）、
−  アクチノマイシンＤ（ＣＡＳ  ５０−７６−０）、
−  フラボピリドール（ＣＡＳ  １４６４２６−４０−６）、
−  トリプライド（ＣＡＳ  ３８７４８−３２−２）
から選択される。
【００４８】
本明細書中で開示される本発明のいずれかの側面の一実施態様において、アマトキシン、特にα−アマニチンは、０．０００５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、特に０．００１μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ、より特に０．００５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ、さらにより特に０．００５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの濃度で使用される。
【００４９】
本明細書中で開示される本発明のいずれかの側面の一実施態様において、ＤＮＡメチル化の阻害剤、特にゼブラリンは、５μＭ〜１００μＭ、特に１０μＭ〜８０μＭ、より特に１０μＭ〜４０μＭ、さらにより特に２０μＭ〜４０μＭの濃度で使用される。
【００５０】
本発明の第２の側面の一実施態様において、複数の真核生物中の増加した遺伝的及び／又はエピジェネティクス的な変異は、該生物が暴露された非生物学的又は生物学的ストレスに対する該生物の耐性の増加をもたらす。換言すれば、例えば化学的変異原から予想されるように、遺伝的及びエピジェネティクス的な変異における増加はランダムではない。該増加は、本方法において使用されるストレスに対する耐性に対して方向付けられている。例えば、非生物学的ストレスである熱を用いると、優先的に熱耐性の生物をもたらす。理論によって縛られることは望まないが、本発明者らは、前もって適用したストレスに対応することができる新しい遺伝子調節経路を作製する遺伝子近傍でゲノム中に優先的にトランスポゾンは挿入されると仮定する。これにより、それぞれのストレスによって活性化される遺伝子において遺伝的多様性がもたらされ、それにより、それぞれのストレスに対する増加した耐性が得られるかもしれない。
【００５１】
本発明の第３の側面によれば、本発明の第１及び第２の側面に記載の方法における組成物の使用が提供される。該組成物はＤＮＡメチル化の阻害剤及び転写の阻害剤を含む。
【００５２】
一実施態様において、ＤＮＡメチル化の阻害剤はヌクレオシド類似体である。
【００５３】
一実施態様において、ＤＮＡメチルメチル化の阻害剤は、５−アザシチジン（ＣＡＳ  ３２０−６７−２）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＣＡＳ  ２３５３−３３−５）、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン（ＣＡＳ  １０３５６−７６−０）、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン（ＣＡＳ  ６２４８８−５７−７）及びゼブラリン（ＣＡＳ  ３６９０−１０−６）から選択される。
【００５４】
一実施態様において、転写の阻害剤は、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、特にＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ阻害剤又はＲＮＡポリメラーゼＶ阻害剤、より特にＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤である。
【００５５】
一実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤は、
−  アマトキシン、特にα−アマニチン（ＣＡＳ  ２３１０９−０５−９）、
−  アマトキシンの誘導体、特にα−アマニチンオレエート（ａｌｐｈａ−ａｍａｎｉｔｉｎ  ｏｌｅａｔｅ）、
−  ヌクレオシド類似体、特に５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ；  ＣＡＳ  ５３−８５−０）、
−  アクチノマイシンＤ（ＣＡＳ  ５０−７６−０）、
−  フラボピリドール（ＣＡＳ  １４６４２６−４０−６）、
−  トリプライド（ＣＡＳ  ３８７４８−３２−２）
から選択される。
【００５６】
一実施態様において、アマトキシン、特にα−アマニチンは０．５ｎＭ〜５５μＭ、特に１ｎＭ〜２７．５μＭ、より特に５ｎＭ〜２０μＭ、さらにより特に５ｎＭ〜５μＭの濃度で使用される。
【００５７】
本明細書中で開示される本発明のいずれかの側面の一実施態様において、転写の阻害剤、特にα−アマニチンの、ＤＮＡメチル化の阻害剤、特にゼブラリンに対するモル濃度比は、０．０００００５〜１１、より特に０．０００１２５〜２、さらにより特に０．０００１２５〜０．１２５である。
【００５８】
一実施態様において、モル濃度比は濃度ａ及び濃度ｂに依存し、それらは以下の通りである：
ａ）ＤＮＡメチル化の阻害剤、特にゼブラリンは５μＭ〜１００μＭ、特に１０μＭ〜８０μＭ、より特に１０μＭ〜４０μＭ、さらにより特に２０μＭ〜４０μＭの濃度で使用される。
ｂ）アマトキシン、特にα−アマニチンは、０．０００５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、特に０．００１μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ、より特に０．００５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ、さらにより特に０．００５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの濃度で使用される。
【００５９】
本発明の第４の側面は、本発明の第１及び第２の側面に記載の方法において使用するためのキットを提供する。パーツキットは、ＤＮＡメチル化の阻害剤及び転写の阻害剤を含む。
【００６０】
一実施態様において、ＤＮＡメチル化の阻害剤はヌクレオシド類似体である。
【００６１】
一実施態様において、ＤＮＡメチルメチル化の阻害剤は、５−アザシチジン（ＣＡＳ  ３２０−６７−２）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＣＡＳ  ２３５３−３３−５）、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン（ＣＡＳ  １０３５６−７６−０）、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン（ＣＡＳ  ６２４８８−５７−７）及びゼブラリン（ＣＡＳ  ３６９０−１０−６）から選択される。
【００６２】
一実施態様において、転写の阻害剤は、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、特にＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ阻害剤又はＲＮＡポリメラーゼＶ阻害剤、より特にＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤である。
【００６３】
一実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤は、
−  アマトキシン、特にα−アマニチン（ＣＡＳ  ２３１０９−０５−９）、
−  アマトキシンの誘導体、特にα−アマニチンオレエート（ａｌｐｈａ−ａｍａｎｉｔｉｎ  ｏｌｅａｔｅ）、
−  ヌクレオシド類似体、特に５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ；  ＣＡＳ  ５３−８５−０）、
−  アクチノマイシンＤ（ＣＡＳ  ５０−７６−０）、
−  フラボピリドール（ＣＡＳ  １４６４２６−４０−６）、
−  トリプライド（ＣＡＳ  ３８７４８−３２−２）
から選択される。
【００６４】
例えば、生物又は阻害剤の型のような単一の分離可能な特徴についての選択肢が、本明細書の「実施態様」としてどこに示されている場合でも、そのような選択肢は自由に組合せて、本明細書で開示する本発明の別々の実施態様を形成することができると理解される。
【００６５】
本発明は、以下の実施例及び図面によりさらに説明され、それからさらなる実施態様及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６６】
本発明者らは、真核生物においてＴＥを活性化及び動員する高効率な方法を発見した。処置は、高度に保存された真核生物の機構：ＤＮＡメチル化及び転写をターゲットとする薬物を含む。
【００６７】
実施例１
ＴＥ動員性におけるＰｏｌ  ＩＩの役割を調査するために、本発明者らは、十分に特徴付けられたシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の熱応答性コピア（ｃｏｐｉａ）様ＯＮＳＥＮレトロトランスポゾン（イトウ  Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１１，４７２：１１５−１１９）を選択した。本発明者らは、最初にＰｏｌ  ＩＩ欠損植物が、増強されたＴＥ活性を示すかどうかを試験した。この目的のために、本発明者らは、ＮＲＰＢ２タンパク質レベルの蓄積が減少した低形質のｎｒｐｂ２−３変異対立遺伝子を利用した（ソウ  Ｂ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００９，２３：２８５０−２８６０）。リアルタイムＰＣＲを用いて、熱ストレス（本明細書ではＨＳと呼ぶ）によるｎｒｐｂ２−３苗への適用は、野生型と比較してＯＮＳＥＮ  ｅｃＤＮＡの軽度の増加をもたらすことが判明した（図１ａ）。この結果は、Ｐｏｌ  ＩＶ又はＰｏｌ  Ｖに影響を及ぼさない強力なＰｏｌ  ＩＩ阻害剤である、α−アマニチン（本明細書ではＡと呼ぶ。）を５μｇ／ｍｌ用いたＰｏｌ  ＩＩの薬理学的不活性化後のＯＮＳＥＮ  ｅｃＤＮＡにおいて観測された増加によって裏付けられる（ハーグ  Ｊ．Ｒ．ら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，２０１２，４８：８１１−８１８）（図１ａ、ｂ）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）による転写はα−アマニチン、その誘導体又は他のＰｏｌ  ＩＩ阻害剤によって阻害される。全体的なＤＮＡメチル化の阻害は、ゼブラリン又は５−アザ−２’−デオキシシチジン（及びその誘導体）による処置によって達成される。Ｐｏｌ  ＩＩを介したＴＥ活性の抑制とＤＮＡメチル化との間の相互作用を試験するために、本発明者らは、適度な量のゼブラリン（本明細書ではＺと呼ぶ。野生型植物については４０μＭ、ｎｒｐｂ２−３植物についてはｎｒｐｂ２−３苗の生存率を確保するために１０μＭ）、植物中の活性なＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤を添加した培地で野生型及びｎｒｐｂ２−３植物を育成し（ボーべック  Ｔ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，２００９，５７：５４２−５５４）、そしてそれらをＨＳに暴露した。ＨＳ中の培地中のＺの存在は、一般的にＯＮＳＥＮ  ｅｃＤＮＡの生産を増強した。注目すべきことに、ｅｃＤＮＡ蓄積における誘導された増加は、ｎｒｐｂ２−３バックグラウンドにおいて、より明確であった（図１ａ）。これは、ＤＮＡメチル化及びＰｏｌ  ＩＩ転写活性の両方がＯＮＳＥＮ  ｅｃＤＮＡの生産の抑制に寄与することを示した。異なる薬剤の添加によってＤＮＡメチル化及びＰｏｌ  ＩＩの両方を特異的に阻害することができるため、本発明者らは、野生型植物のＡ及びＺの両方での同時の処置は、熱ストレス処置後ＯＮＳＥＮを強力に活性化し、動員することができるかどうかを試験した。本発明者らは、各薬剤を個別に及び両方を併用して補充したＭＳ培地でＷＴ苗を育成した。熱ストレスを与えた及びＺ処置したｎｒｐｂ２−３苗におけるＯＮＳＥＮの強力な活性化と一致して、ＷＴの併用処置（Ａ＋Ｚ）は、ｎｒｐｄ１変異体に匹敵するＯＮＳＥＮ  ｅｃＤＮＡの非常に高く（図１ｂ）、ＨＳ依存性の（図２）蓄積を生じた（図３ｃ）。
【００６８】
実施例２
ＨＳ後のＯＮＳＥＮの活性化の増加の根底にある、ＤＮＡレベルで薬剤が有する効果をより理解するために、本発明者らは、それらが、選択されたＯＮＳＥＮ内因性遺伝子座（ＡＴ１ＴＥ１２２９５）の長い末端反復（ＬＴＲ）で、及び関連性のない十分に特徴付けられたＲｄＤＭ標的（ｓｏｌｏＬＴＲ）で、ＤＮＡメチル化にどのように影響を与えるかを評価した。植物をＡ又はＺでの個別に処置すると、ＣＳ後のＯＮＳＥＮ  ＬＴＲでのＣＨＨのメチル化レベルは減少した（図３ａ）。２つの薬剤を併用することでｎｒｐｄ１変異体に匹敵するＤＮＡメチル化の減少がもたらされた。ＳｏｌｏＬＴＲでのＤＮＡメチル化は、薬物処置に対する異なる応答を示し、ＤＮＡメチル化レベルの減少はＡ及びＺ併用の処置に共する植物のみで観測された。次いで、発明者らは、ＣＨＨメチル化においての減少の程度が、ＨＳ直後の増加したＯＮＳＥＮ転写レベルと一致するかどうかをノーザンブロットによって調査した。本発明者らは、Ｚ単独での処置がＨＳ直後に最も高いＯＮＳＥＮ転写レベルをもたらすことを見出した（図３ｂ）。この観測から、本発明者はこれらの付加的なＺ誘導転写は、ＯＮＳＥＮ  ｅｃＤＮＡの生産のための適切な鋳型ではないと結論付けた（図１及び図３を比較）。
【００６９】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）において、Ｐｏｌ  ＩＩを介したアンチセンス転写がＤｉｃｅｒ−２依存的方法でＴＥ由来ｓｉＲＮＡの生産をもたらすことが示されている（ラッソ  Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１６，２０２：１０７−２１）。シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）についてのこの概念を支持して、最近の刊行物えは、ｄｄｍ１バックグランドにおけるＯＮＳＥＮの制御において、ＤＣＬ３の重要性を指摘した（パンダ  Ｋら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，２０１６，１７：１−１９）。Ｐｏｌ  ＩＩ阻害の効果もＤｉｃｅｒ依存的であるかどうかを明らかにするために、本発明者らは、ＨＳを適用したＡについて、ｒｄｒ６変異体及びｄｃｌ２／３／４三重変異体（４つの植物ｄｉｃｅｒ様酵素、ＤＣＬｓのうち３つを欠損）の両方を育成し、ＯＮＳＥＮ  ｅｃＤＮＡを測定した。本発明者らは、Ａがｒｄｒ６変異体においては依然としてｅｃＤＮＡの蓄積を増強するのに対して、ｄｃｌ２／３／４三重変異体においては、Ｐｏｌ  ＩＩの阻害の効果がないことを見出した（図３ｃ）。この発見は、Ｐｏｌ  ＩＩがＤＣＬｓによって触媒する処理工程の上流に作用するという概念を支持する。
【００７０】
実施例３
植物における内因性ＴＥの動員は、これまで非常に非効率的であり、したがって、基礎研究及び植物育種においてのその使用を制限している。これまでにＨＳ処置した野生型植物においてＯＮＳＥＮの転移は観測されていない（イトウ，Ｈ．ら．  Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７２：１１５−１１９）。Ａ＆Ｚ薬剤処置がｎｒｐｄ１におけるような同程度にまでＯＮＳＥＮ  ｅｃＤＮＡの蓄積を増加させたため、本発明者らは、併用薬物処置が野生型植物において効率的なＯＮＳＥＮの動員をもたらすことができるかどうか試験した。最初に、本発明者らは、Ａ＆Ｚ処置及び熱ストレスを受けた植物の子孫において、新しいＯＮＳＥＮコピーが検出されるかどうか、及びその頻度をリアルタイムＰＣＲによって評価した。本発明者らは、試験したＦ１プール（ｎ＝５１）の２９．４％において新しいＯＮＳＥＮの挿入を発見し、該プールの平均コピー数は５２にまで達していた（図５）。次いで本発明者らは、トランスポゾンディスプレイ（図４ａ）、リアルタイムＰＣＲ（図４ｂ）及び選択された高コピー系統（＃３）においていくつかの挿入のシークエンシング（図６）によって、独立した個々の高コピー植物のサブセットにおいて、安定した新規のＯＮＳＥＮを確認した。ＨＳ、Ａ及びＺの併用は、ＲｄＤＭ欠損植物において、前に観測されたのと同様の染色体外ＯＮＳＥＮコピー数をもたらした。本発明者らは、処置した植物の２７％の子孫において新規のＯＮＳＥＮの挿入を検出した。ｑＰＣＲ測定によれば、Ａ、Ｚ及びＨＳ処置した植物のＦ２及び連続した世代の個々の植物において、最大９０±６個の挿入されたコピーが観測された（図４ａ）。これらの挿入はトランスポゾンディスプレイによりさらに確認された。３世代にわたるＯＮＳＥＮコピー数のさらなる増加は観測されず、新しい挿入は安定しており、ＯＮＳＥＮはもはや転移しないことを示した（図４ｂ）。
【００７１】
ＴＥ挿入は、エピジェネティクス的標識の補充、又は３’ＬＴＲから隣接領域内へストレス依存的な読み出し転写のいずれかによって、遺伝子を遮断又はそれらの発現を変更することができる（リシュ  Ｄ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ，２０１３，１４：４９−６１）。これを試験するために、本発明者らは、長日条件及び短日条件下で、上記選択された高コピー数系統のＦ２世代を育成した。本発明者らは、異なる育成条件に応じて、多くの系統が明瞭及び均質な表現型（植物の大きさ、クロロフィル含量及び開花時期、図４ｃ及びｄ）を示したことを観測した。
【００７２】
実施例４
本発明者らは、Ｐｏｌ  ＩＩが植物中のＴＥの抑制において、より一般的な役割を果たすかどうかを試験した。シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）と比較して、その顕著に異なるエピジェネティクス的なランドスケープにより、本発明者らは、遺伝的に十分に特徴付けられた単子葉イネ、Ｏ．ｓａｔｉｖａを選択した（カワハラ  Ｙ．ら、２０１３，Ｒｉｃｅ，６：４−１０）。薬剤誘導動員されたＴＥを捕捉するために、本発明者らは、薬剤なし、Ａのみ、Ｚのみ又はＡとＺとの併用のずれかを補充したＭＳ培地で育成したイネ作物（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）の苗において、染色体外環状ＤＮＡ（ｅｃｃＤＮＡ）を特異的にシークエンシングできる方法を用いて、活性のあるモビロームを特徴付けた。ｅｃｃＤＮＡはＬＴＲレトロトランスポゾンのライフサイクルの副産物である。このアプローチを使用して、本発明者らは、Ａ及びＺの両方で植物を処置した場合のみ高く活性化されるように、コピア（ｃｏｐｉａ）様レトロトランスポゾン、Ｈｏｕｂａを同定した（図７ａ）。シークエンシングデータは、Ｈｏｕｂａ  ＬＴＲ上のｅｃｃＤＮＡ特異的ＰＣＲによって確認した（図７ｂ及びｃ）。
【００７３】
実施例５
Ａ単独での処置はシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるＤＮＡメチル化を減少させたため（図３ａ）、本発明者らはこの処置の堅牢性及び一般性の試験を試みた。堅牢性を確認するために、植物をＡ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｚ（１０  μｇ／ｍｌ）及びＡ＆Ｚで処置した。Ａのみがこのより高い濃度でＤＮＡメチル化を強く減少させ（図１０ａ）、この結果は、バイサルファイトシークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（各サンプルについて１０個の配列決定したクローンの平均）によるＣＨＨコンテキストにおけるＤＮＡメチル化の集積によって、さらに支持された。Ａは高度に保存されたＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ酵素を阻害し、そしてＡはまたヒト細胞中でも活性であるため、本発明者らはＡ５４９ヒト癌細胞株においてＤＮＡメチル化に対するＡの効果を試験した。細胞内の全体的なＤＮＡメチル化含量を評価し、未処置細胞又はＺ処置細胞と比較した。増殖培地にＡ（０．５μｇ／ｍｌ）を補充すると、ＤＮＡメチル化が４０％減少した。この減少はＤＮＡ脱メチル化剤Ｚ（３５０μＭ）での処置と同等であった（図１０ｃ）。次いで、本発明者らはまた、長鎖散在反復配列（ｌｏｎｇ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ  １）（ＬＩＮＥ−１）トランスポゾンでのＤＮＡメチル化レベルを評価した。ＬＩＮＥ−１では、Ａは、ＺよりもＤＮＡメチル化の減少に対してより一層顕著な効果を示した（それぞれ４０％対２０％の減少）。これらの結果は、転写の阻害剤が、真核細胞における強力なＤＮＡ脱メチル化剤として使用され得ることを実証する。
【００７４】
植物及び育成条件
４℃で２日間層別化した後、それぞれ２４℃（昼）及び２２℃（夜）で、長日条件（１６時間の明り）下で、１％スクロースを含み、かつｐＨ５．８である滅菌した１／２ＭＳ培地（コントロール培地）でシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物（アクセッション  Ｃｏｌ−０）を育成した。イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）植物は、２７℃（夜）及び２８℃（昼）で１６時間、１％スクロースを含み、かつｐＨ５．８である滅菌した１／２ＭＳ培地（コントロール培地）で育成した。
【００７５】
連続する世代を分析するために、苗を土壌に移し、苗が成熟するまで、サンヨー  ＭＬＲ−３５０育成チャンバー内で、２４℃（昼）及び２２℃（夜）で、長日条件（１６時間の明り）下で、育成した（シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ））。
【００７６】
表現型分類のために、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物を２４℃（昼）及び２２℃（夜）で、長日条件（１６時間の明り）下で、並びに、２１℃（昼）及び１８℃（夜）で、短日条件（１０時間の明り）下で、育成した。
【００７７】
シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）苗のエピジェネティクス的な変化の誘導と、転移因子の活性化と安定な挿入は、ゼブラリン（終濃度：１０〜４０μＭ）、α−アマニチン（終濃度：０．００５〜２０μｇ／ｍｌ）又は両方の化学物質を併用して含有する１／２ＭＳ培地（誘導培地）上で、それらを発芽させ成長させることによって強化された。
【００７８】
熱応答レトロトランスポゾンＯＮＳＥＮの転移を誘発するために、育成チャンバー内（サンヨー）で制御された条件下で、７日齢の苗を６℃で２４時間寒冷ショックにさらし、次いで３７℃で２４時間熱ストレス（熱ストレス、ＨＳ）を与えた。コントロール植物は、６℃で２４時間寒冷処置をした後、２４℃（昼）及び２２℃（夜）の長日条件に戻した（ＣＳ、コントロールストレス、イトウら、２０１１に記載）。
【００７９】
生物学的ストレス応答を誘発するために、９日齢のシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）苗を５μｇ／ｍｌ  α−アマニチン及び４０μＭ  ゼブラリンで９日間育成し、そしてｆｌｇ２２（１０μＭ）を噴霧した。５時間のインキュベーション後、苗の地上に出ている部分からｔｏｔａｌ  ＤＮＡを抽出し、ＴＥコピー数をｑＰＣＲによって評価した。
【００８０】
ＯＮＳＥＮ及びＣＯＰＩＡ１７コピー数を測定するためのｔｏｔａｌ  ＤＮＡにおけるｑＰＣＲ
苗及び成体植物からｔｏｔａｌ  ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて単離した。
【００８１】
ＣＳ／ＨＳ及び未処置／処置された苗におけるＯＮＳＥＮの染色体外ＤＮＡのコピー数の測定に備えて、熱ストレス直後に根を切断し、ＤＮＡ抽出まで、植物を直ちに液体窒素中で凍結させた。
【００８２】
コントロール及び高コピー系統のＦ１〜Ｆ３世代のＯＮＳＥＮコピー数を追跡するために、本葉からＤＮＡを抽出した。
【００８３】
ＯＮＳＥＮ転移頻度の推定のために、ＨＳ＋Ａ＆Ｚ処置した植物の子孫の少なくとも８つの苗からなるプールのｔｏｔａｌ  ＤＮＡを単離した。ＤＮＡ濃度はＱｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。
【００８４】
ＯＮＳＥＮのコピー数は、Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（ロシュ）を用い、終容量１０μｌのＴａｑＭａｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを用いて、ｔｏｔａｌ  ＤＮＡにおいてｑＰＣＲで測定した。ＡＣＴＯＰＩＡ１７コピー数は、Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  （Ｒｏｃｈｅ）を用い、ＸＹＢＲ  ４２１  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定した。Ａｃｔｉｎ２  （Ａｔ３ｇ１８７８０）は標準化のための標準遺伝子として使用した。ｑＰＣＲのためのプライマー及びプローブを表２に示す。
【００８５】
モビローム−配列分析（ｍｏｂｉｌｏｍｅ−ｓｅｑ  ａｎａｌｙｓｉｓ）のために、３つのイネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）苗の地上に出ている部分からＤＮＡを以前に報告されたとおりに抽出した（メット  Ｍ．ら、ＥＭＢＯＪ，１９９９，１８：２４１−２４８）。
【００８６】
Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ｋｉｔ（ＭＰＢｉｏ、アメリカ合衆国）を用いて、製造元取扱説明書にしたがって、各試料についてゲノムＤＮＡ５μｇを精製した。ＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ  ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、アメリカ合衆国）を用いて、１７時間３７℃インキュベーションを行ったこと以外は製造元取扱説明書にしたがって、精製遺伝子産物からｅｃＤＮＡを単離した。０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、２．５容量のエタノール及び１μｌのグリコーゲン（フィッシャー、アメリカ合衆国）を添加し、−２０℃で一晩インキュベートすることによってＤＮＡサンプルを沈殿させた。沈殿した環状ＤＮＡを、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア、アメリカ合衆国）を使用して、２８℃で６５時間インキュベーションを行ったこと以外は製造元取扱説明書にしたがってランダムローリングサークル増幅により増幅した。ＤＮＡの濃度は、ＤＮＡ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｋｉｔ（インビトロジェン、アメリカ合衆国）  を用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（ロシュ、アメリカ合衆国）を用いて、測定した。Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｋｉｔ  （イルミナ、アメリカ合衆国）を用いて、製造元取扱説明書にしたがって、各試料から増幅されたｅｃＤＮＡを１ナノグラム使用して、ライブラリーを調製した。高感度ＤＮＡバイオアナライザーチップ（アジレントテクノロジーズ、アメリカ合衆国）を使用して、ＤＮＡの品質及び濃度を測定した。試料をプールし、ＭｉＳｅｑプラットフォーム（イルミナ、アメリカ合衆国）上にロードし、２×２５０ヌクレオチド対末端シークエンシングを行った。ＦＡＳＴＱファイルの品質管理は、ＦａｓｔＱＣツール（ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．１０．１）を用いて評価した。オルガネラ環状ゲノムに由来する読み取りを除去するために、読み取りは、センシティブローカルマッピング（−−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌｏｃａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ）でＢｏｗｔｉｅ２  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．２  ７１プログラムを使用して、ミトコンドリア及び葉緑体ゲノムに対して、１９８マッピングした。マッピングされていない読み取りは、以下のパラメーターを使用して、参照ゲノムＩＲＧＳＰ１．０（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／Ｅ／ＩＲＧＳＰ／  Ｂｕｉｌｄ５．ｈｔｍｌ）に対してマッピングした：−−センシティブローカル、−ｋ１。核ゲノムに挿入されたミトコンドリア及び葉緑体ゲノムの両方から得られたＤＮＡをマスクした（１，６９７，４００ｂｐ）。ＴＥ含有領域は、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）において、１９４，２２４，８００ｂｐにわたる。最後に、各ライブラリーについて、豊富なゲノム領域に対応するａ．ｂａｍアラインメントファイルを統計分析のために考慮し、インテグラミックゲノムミクスビュアー（ＩＧＶ）ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｉｇｖ／ｈｏｍｅ）で可視化した。
【００８７】
表２：染色体外ＯＮＳＥＮ  ＤＮＡコピーの総数を測定するためのｑＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ、ライフテクノロジーズ）に使用されたプライマー及びプローブの配列。Ａｃｔｉｎ２は、正規化のためのコントロール遺伝子として使用した。
【表２】
2018535686.tif 000003
【００８８】
新しいＯＮＳＥＮコピーの挿入を確認するトランスポゾンディスプレイ
熱ストレス及び処置した植物のゲノム内へのＯＮＳＥＮ  ＴＥの追加コピーの安定な挿入は、２０１１年イトウらの文献に記載されているＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｋｉｔ（クロンテック  ラボラトリーズ）に基づく簡略化トランスポゾンディスプレイによって確認した。
【００８９】
ＨＳ＋／−Ａ＆ＺのＦ２世代由来の成体植物由来のｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  ３００ｎｇをＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （キアゲン）で抽出し、平滑切断制限酵素（Ｄｒａ  Ｉ）で消化した。消化したＤＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ）で精製した後、アニールしたＧｅｎＷａｌｋＡｄａｐｔｅｒｓ１＆２へライゲーションした。ＰＣＲのために、アダプター特異的プライマーＡＰ１及びＯＮＳＥＮ特的プライマーＣｏｐｉａ  ７８  ３’ＬＴＲを使用した。ＰＣＲ産物は、ミドリグリーン核酸染色溶液で染色した２％アガロースゲル上で分離した。配列情報については表２及び３を参照する。
【００９０】
新規挿入のクローニング、シークエンシング及びジェノタイピング
新しいＯＮＳＥＮ挿入ゲノム領域を同定するために、トランスポゾンディスプレイのＰＣＲ産物は、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、大腸菌へ形質転換した。青白選択後、陽性クローンを挿入増幅及びシークセンシング（ＳｔａｒＳＥＱ）のために使用した。得られた配列をＧｅｎｅｉｏｕｓ  ８．２．１で分析し、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）参照ゲノムに対してＢＬＡＳＴを行った。ＯＮＳＥＮ特的プライマー「Ｃｏｐｉａ  ７８ＴＥディスプレイ  ３’ＬＴＲ」と、表２及び３に列挙したプライマーとの組合せで、新規のＯＮＳＥＮ挿入を証明するための標準的なジェノタイピングＰＣＲを実施した。
【００９１】
表３：プライマーの名称、目的及び配列
【表３】
2018535686.tif 000004
【００９２】
染色体外Ｈｏｕｂａ  ＤＮＡにおけるＰＣＲ
環状Ｈｏｕｂａコピーの存在は、シークエンシングにも使用されたローリングサークル増幅テンプレート  ７ｎｇに対するインバースＰＣＲによって証明した。葉緑体ＤＮＡに特異的なＰＣＲをローディングコントロールとした。ＰＣＲ産物を、ミドリグリーン核酸染色溶液（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）で染色した１％アガロースゲルで分離した。プライマー配列は表４に示す。
【００９３】
表４：染色体外ＨｏｕｂａＤＮＡの総数を測定するためのＰＣＲについて使用したプライマー及びプローブの配列
【表４】
2018535686.tif 000005
【００９４】
ＲＮＡ分析及びノーザンブロット
ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（シグマ）を用いて、製造元取扱説明書にしたがって、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）苗の大部分からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度を測定し（Ｑｕｂｉｔ  ＲＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、サーモフィッシャー）、１５μｇのＲＮＡを変性１．５％アガロースゲル上で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（ＧＥ  ヘルスケア）膜上でブロットし、ゲル精製してＰ３２ラベル化した全長ＯＮＳＥＮ転写物に特異的なプローブ（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥヘルスケア）（配列については表３参照）２５ｎｇでハイブリダイズした。
【００９５】
ＤＮＡメチル化分析
シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）苗から単離したｔｏｔａｌゲノムＤＮＡ  ２０ｎｇを、メチル化感受性制限酵素、ＤｄｅＩ（ＮＥＢ）で、一晩３７℃で消化した。６０℃で２０分間、熱不活性化後、消化したＤＮＡをｃｈｏｐＰＣＲの鋳型として使用した。Ａｃｔｉｎ２は、消化のコントロールとした。未消化のＤＮＡをローディングコントロールとして使用した。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル上で分離し、ミドリグリーンで染色した。
【００９６】
Ａ５４９ヒト癌細胞株について、処置なし、又はＺ（３５０μＭ）若しくはＡ（０．５μｇ／ｍｌ）のいずれかを補充した培地で細胞を増殖し、ＱｉａＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン、フランス）を用いてＤＮＡを抽出した。次いで、５−ｍＣ  ＤＮＡ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、製造元取扱説明書にしたがって５−メチルシトシンの存在を定量することで、全体的なＤＮＡメチル化を評価した。ＬＩＮＥ−１トランスポゾンでのＤＮＡメチル化は、Ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ−ＬＩＮＥ−１  ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）で評価した。  
【図１】
2018535686.tif 000006
【図２】
2018535686.tif 000007
【図３ａｂ】
2018535686.tif 000008
【図３ｃ】
2018535686.tif 000009
【図４ａ】
2018535686.tif 000010
【図４ｂ】
2018535686.tif 000011
【図４ｃｄ】
2018535686.tif 000012
【図５】
2018535686.tif 000013
【図６ａ】
2018535686.tif 000014
【図６ｂ１】
2018535686.tif 000015
【図６ｂ２】
2018535686.tif 000016
【図７ａ】
2018535686.tif 000017
【図７ｂｃｄ】
2018535686.tif 000018
【図８ａ】
2018535686.tif 000019
【図８ｂ】
2018535686.tif 000020
【図９】
2018535686.tif 000021
【図１０ａｂ】
2018535686.tif 000022
【図１０ｃｄ】
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【図１１】
2018535686.tif 000024
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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