(57)【要約】本発明は、乳癌から得られた組織試料を分類するための方法に関する。本方法は、組織試料上の複数の点のそれぞれについての剛性値を決定し、剛性分布を生じさせ、そして該剛性分布に基づいて該試料を乳癌サブタイプおよびリンパ節状態に割り当てる工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類腫瘍から得られた組織試料を分類する方法であって、該方法は、
−  特に、走査プローブ顕微鏡、より詳細には原子間力顕微鏡を使用して、該組織試料上の複数の点のそれぞれについての剛性値を決定し、剛性分布を生じさせる工程、および
−  該剛性分布に基づいて該試料を乳癌分子サブタイプに割り当てる工程
を含む、哺乳類腫瘍から得られた組織試料を分類する方法。
【請求項２】
前記乳癌分子サブタイプは、
−  ルミナルＡサブタイプ非転移乳癌、
−  ルミナルＢサブタイプ非転移乳癌、
−  ルミナルＡサブタイプ転移乳癌、
−  ルミナルＢサブタイプ転移乳癌、
−  ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプ転移乳癌、
−  基底サブタイプ非転移乳癌、および
−  基底サブタイプ転移乳癌
から選択され、
ここで、
−  ルミナルＡサブタイプ非転移乳癌またはルミナルＢサブタイプ非転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満の領域で０．４ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間に１つだけの周波数極大値および１．０ｋＰａ〜１．５ｋＰａの領域内で複数の周波数値を示す試料に割り当てられ、ここで該複数の周波数値は閾値より大であり、かつ該閾値は０．４ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間の該１つの周波数極大値の半分の周波数値に等しく、
−  ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満での２つの周波数極大値および２ｋＰａより大で周波数極大値を示す試料に割り当てられ、
−  ルミナルＢサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．２５ｋＰａ未満で周波数極大値を示す試料に割り当てられ、
−  ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．２５ｋＰａ〜０．４ｋＰａの間で周波数極大値および１．７ｋＰａ〜２．０ｋＰａの間で周波数極大値を示す試料に割り当てられ、
−  基底サブタイプ非転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満の領域で０．５ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間に１つだけの周波数極大値を示し、および１．０ｋＰａ〜１．５ｋＰａの間の領域で複数の周波数値を示す試料に割り当てられ、ここで、該複数の周波数値は閾値未満であり、および該閾値は、０．５ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間で該１つの周波数極大値の半分の周波数値に等しく、
−  基底サブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満で２つの周波数極大値を示し、かつ、１．３ｋＰａより大で他の周波数極大値がないことをさらに特徴とする試料に割り当てられ、および／または
−  ルミナルＢサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満で２つの周波数極大値および１．４ｋＰａ〜２．０ｋＰａの間で周波数極大値を示す試料に割り当てられる、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．３ｋＰａ〜０．９ｋＰａで複数の周波数極大値および／または２．０ｋＰａ〜２．５ｋＰａで周波数極大値を示す試料に割り当てられる、
請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．３７５ｋＰａ、０．８７５ｋＰａおよび２．０７５ｋＰａで周波数極大値を示す試料に割り当てられる、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプの転移乳癌である可能性の高いものは、０．３ｋＰａで周波数極大値を示し、および１．７ｋＰａ〜２．０ｋＰａの間で周波数極大値を示す試料に割り当てられる、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の点は、少なくとも１００μｍの空間分解能で決定される、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組織試料は、組織生検試料または切除標本である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の点は、領域または線内に配置される、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記同じ試料の少なくとも２つの異なる領域の剛性値が決定され、該領域の幾何学的中心間の距離は１００μｍ〜１ｍｍの範囲にある、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記線は、前記組織試料の長手軸に沿って延びる、
請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の点は、５０〜２１００００の範囲の剛性値を含む、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の点は６分〜６時間以内に記録される、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の点は、１秒あたり１０００〜０．１の荷重サイクルの速度範囲で記録される、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の点は、２００ｐＮ〜３ｍＮの範囲の最大荷重で記録される、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組織試料上または組織試料中に含まれるマーカーを決定する工程をさらに含み、ここで該マーカーは、ヒトエストロゲン受容体、ヒトプロゲステロン受容体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体および抗原Ｋｉ−６７から選択される、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
乳癌から得られた組織試料を分類するためのシステムであって、該システムは、
−  少なくとも１μｍの分解能で剛性値を決定するための装置、特に原子間力顕微鏡、
−  プログラムされた集積回路
を含み、
ここで、該プログラムされた集積回路は、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を実行するように指定され、かつ装備される、
乳癌から得られた組織試料を分類するためのシステム。
【請求項１７】
乳癌を治療するための方法であって、該方法は、
−  被験体の乳房腫瘍由来の組織試料を提供する工程、
−  請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって該組織試料を乳癌サブタイプに割り当てる工程、
−  決定されたサブタイプに基づいて該被験体に治療を施す工程
を含む、
乳癌を治療するための方法。
【請求項１８】
−  前記乳房腫瘍がルミナルＡサブタイプ非転移乳癌またはルミナルＢサブタイプ非転移乳癌として分類された場合、ホルモン療法が被験体に投与され、
−  前記乳房腫瘍が基底サブタイプ転移または非転移乳癌として分類された場合に、化学療法が被験体に投与され、
−  前記乳房腫瘍がルミナルＡサブタイプ転移乳癌、ルミナルＢサブタイプ転移乳癌として分類された場合に、化学療法を、特にホルモン療法と組み合わせて、被験体に投与され、および／または
−  前記乳房腫瘍がルミナルＡサブタイプ転移乳癌、ルミナルＢサブタイプ転移乳癌、ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプ転移乳癌、または基底サブタイプ転移乳癌として分類された場合に、放射線療法が被験体に投与される、
請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
乳癌分子サブタイプのナノメカニカルプロファイリング
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、最も頻繁に起こる悪性腫瘍であり、先進国の女性の癌死の２番目に多い原因である。しかし、原発腫瘍は致死的ではないが、癌に関連した死亡の大半は転移にある。転移の進行の予後マーカーとなるいくつかのパラメータがあるが、かなりの努力にもかかわらず、依然として個々のリスクを正確に予測することは不可能である。したがって、補助療法は、手術および抗ホルモン療法単独で治癒した可能性がある患者に頻繁に投与される。予後マーカーおよび予測マーカーを含む現在の乳癌の分類は、依然として主に臨床的および病理組織学的基準、すなわち患者の年齢、腫瘍の大きさ、リンパ節の関与、腫瘍の組織学的型、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体の発現、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、およびＫｉ−６７および腫瘍グレードに基づいている。
【０００３】
しかし、臨床病理学的パラメータのみに基づくリスク階層化は、誤解を招く可能性がある。特に初期のＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性乳癌（すなわちステージＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＩＡ）では、これらの臨床病理学的因子は、実質的な過度または過小治療が起こり得るため、特に補助化学療法に関して臨床的意思決定には不十分である。２００７年以降、国際的なガイドラインは、確立されたリスクアセスメントにさらなる試験を加えることを推奨している。
【０００４】
したがって、乳癌の研究の主な目標は、品質保証認定テストによって評価され、日常的に使用され、費用が許容できる予後マーカーの開発である。これらのマーカーは、癌の診断を最適化し、治療の選択を推し進め、患者のフォローアップを支援するのに役立つはずである。
【０００５】
しかし、現在利用可能なすべての試験には一定の欠点がある。一般に、それらは、患者の明確に定義されたサブグループ、例えば中程度に分化した腫瘍を有するリンパ節転移陰性患者においてのみ有効である。さらに、この試験は主に中央施設で実施されており、腫瘍試料の中央検査室への搬送に時間がかかる。さらに、試料の処理全体に対する局所（品質）管理がない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、この背景に基づいて、本発明の目的は、乳癌試料のサブタイプ化および／または乳癌に関する予後および／または予測情報を提供するための信頼性の高い簡単な方法を提供することである。
【０００７】
その目的は、独立請求項の主題によって達成される。
【０００８】
定義
本明細書の文脈における剛性、弾力性または接触剛性という用語は、加えられた力による変形に対する組織試料または組織の抵抗性を指す。剛性または弾性は、パスカル（Ｐａ）で組織試料の弾性率として測定される。軟組織試料は、低い剛性値によって特徴付けられ、硬い組織は、高い剛性値によって特徴付けられる。
【０００９】
そのような変形力は、組織試料または組織に衝突するインテンダーまたはスタイラス（例えば、原子間力顕微鏡の一部として）によって組織試料または組織に適用され得、ここでインテンダーまたは組織試料のいずれかが互いに垂直方向に移動する。試料上の複数の点を測定するために、インテンダーまたは試料をさらに横方向に移動させることができ、ここで、本発明の意味における横方向とは、垂直方向に直交する方向を意味する。
【００１０】
インテンダーまたはスタイラスは、尖ったチップまたはプローブとして作用する吸着コロイド粒子を有するカンチレバーであってもよい。本明細書の文脈におけるカンチレバーは、一方の端部のみに固定されたビームまたはアームを意味する。試料表面とチップとの間の反発力または引力によって引き起こされるカンチレバーのたわみは、例えば、カンチレバーの背面に集束されたレーザまたは干渉計によって光学的に検出され、スプリットフォトダイオード上に反射され、ここで、フォトダイオードは電圧差としてカンチレバーのたわみを記録し、これをナノメータに変換することができる。あるいは、カンチレバーのたわみは、カンチレバーの歪みを電荷に変換できる圧電センサーによって検出されてもよい。また、あるいは、ピエゾ抵抗ブリッジ（ｐｉｅｚｏ−ｒｅｓｉｓｔｏｒ  ｂｒｉｄｇｅ）および熱ヒーターを備えたシリコンカンチレバーなどのＰＲＳＡ（Ｐｉｅｚｏ−Ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｅ）プローブのような自己感知カンチレバーを使用することもできる。有利には、このようなカンチレバーでは、レーザ調整は必要ない。
【００１１】
本明細書の文脈における領域という用語は、（測定）点のグリッドによって画定される領域を指し、各点は、上述のスタイラスの押し込みフットプリントに対応し、各点は、１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ、２０μｍ、１０μｍまたは１μｍ次の点から離れたところにある。非限定的な例として、領域は、２５μｍ２、５０μｍ２、１００μｍ２、２００μｍ２、３００μｍ２、４００μｍ２、５００μｍ２、６００μｍ２、７５０μｍ２、１０００μｍ２、５０００μｍ２または１０，０００μｍ２であり、２つの領域の幾何学的中心点どうしは、少なくとも１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍまたは１ｍｍ離れている。
【００１２】
与えられた試料の測定された力および押し込み深さは、カンチレバーのばね定数およびチップ半径に依存する。
【００１３】
本明細書の文脈における空間分解能という用語は、その２つの点がその剛性に関して識別され得る組織または組織試料上の２点間の最小距離を指す。少なくとも１ｍｍ、好ましくは１００μｍ、１０μｍまたは１μｍの空間分解能とは、２つの点が依然として識別できる最大距離が１ｍｍ、好ましくは１００μｍ、１０μｍまたは１μｍであることを意味する。少なくとも１００μｍ、好ましくは１０μｍまたは１μｍの空間分解能は、また、より高い分解能を包含する。１μｍより高い分解能は、依然として１μｍ未満の距離を有する２つの点を識別することができることを意味する。１００μｍより高い分解能の例は、１０μｍおよび１μｍである。１μｍより高い分解能の例は、０．５μｍ、０．１μｍおよび１０ｎｍである。
【００１４】
本明細書の文脈における組織試料という用語は、連続細胞および細胞外マトリックスを含む組織試料を指す。そのような組織試料は、生検または切除によって得ることができる。
【００１５】
本明細書の文脈における切除標本という用語は、器官または身体から取り出された器官または身体の少なくとも一部を表す試料を指す。切除標本はまた、全器官または身体部分を含むことができる。
【００１６】
本明細書の文脈における組織生検試料という用語は、生検によって得られ、連続細胞および細胞外マトリックスを含む組織試料を指す。
【００１７】
本明細書の文脈における生検という用語は、検査のために組織部分または組織を除去する方法を指す。そのような生検は、針吸引生検、パンチ生検、真空補助コア生検、中核針生検または鉗子生検であり得る。除去は、中空針、円形の鋭いナイフまたはメスのような適切なツールの助けを借りて行うことができる。内視鏡または内視鏡法によって組織生検試料をさらに得ることができる。
【００１８】
生検処置は、超音波またはＣＴ（Ｘ線コンピュータ断層撮影法）などの適切な方法によって誘導されてもよく、ここで腫瘍または顕著な病変が検出または位置付けされ得る。
【００１９】
本明細書の文脈における正常組織という用語は、正常な、制御された成長および正常な細胞機能および細胞外機能および構造によって特徴付けられる、同一の生理学的機能を有する連続細胞および細胞外マトリックスのアンサンブルを指す。
【００２０】
本明細書の文脈における腫瘍という用語は、新生物細胞の異常増殖によって形成される新生物または病変を指す。腫瘍は良性、前悪性または悪性であり得る。ヒト乳癌からの組織生検試料の分類が好ましい。本明細書の文脈における良性病変または腫瘍という用語は、転移する能力を欠いている腫瘍を指す。
【００２１】
本明細書の文脈における原発腫瘍という用語は、周囲の器官または組織と同じ組織型に由来する腫瘍を指す。
【００２２】
本明細書の文脈における転移、複数の転移または転移した腫瘍という用語は、原発腫瘍から、隣接する組織、隣接するリンパ節、腋窩リンパ節または異なる器官のような遠隔部位に広がっている腫瘍を指す。
【００２３】
本明細書の文脈における悪性または「悪性腫瘍」という用語は、腫瘍が基底膜を貫通し、隣接する組織に侵入し、または身体を通して広がる腫瘍の能力を指す。悪性腫瘍は、悪性新生物または癌、特に浸潤性癌と同義である。
【００２４】
本明細書の文脈における腫瘍の境界という用語は、腫瘍と隣接する組織との間の丸い、滑らかな、はっきりとした境界（大部分は良性腫瘍）または不規則ではっきりとしない境界（しばしば悪性腫瘍の場合）として定義される。組織学的には、腫瘍細胞が見出される腫瘍の最も外側の部分として定義される。
【００２５】
本明細書の文脈における隣接組織という用語は、腫瘍以外の組織または器官の一部として定義される。隣接する組織は、典型的には原発腫瘍を取り囲むが、腫瘍が存在していない器官の組織の任意の部分とみなすこともできる。
【００２６】
本明細書の文脈における原発腫瘍に隣接するリンパ節または隣接リンパ節という用語は、特に、腫瘍を排出するリンパ節を指す。このような隣接するリンパ節は、センチネルリンパ節とも呼ばれる。
【００２７】
本明細書の文脈における腋窩リンパ節という用語は、乳房の側方象限からのリンパ管、臍のレベルより上の腹壁および胸壁の表在リンパ管から、および上肢からのリンパ管を排出するリンパ節を指す。腋窩リンパ節は、脇の下のリンパ節とも呼ばれる。
【００２８】
本明細書の文脈における分子サブタイプという用語は、乳癌または乳腺腫瘍、またはその腫瘍細胞の定義された発現プロファイルまたはパターンを指し、ここで、乳癌または乳腺腫瘍又はその腫瘍細胞の発現プロファイルまたはパターンにより異なるサブタイプが識別可能である。
【００２９】
本明細書の文脈においてルミナル（ｌｕｍｉｎａｌ）Ａサブタイプという用語は、エストロゲン受容体に対して陽性であり、腫瘍の癌細胞の少なくとも２０％がプロゲステロン受容体に対して陽性であり、癌細胞の２０％未満がタンパク質Ｋｉ−６７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４６０１３）に対して陽性である、癌細胞を含む腫瘍を指す。
【００３０】
本明細書においてルミナルＢサブタイプという用語は、エストロゲン受容体に対して陽性であり、腫瘍の癌細胞の２０％未満がプロゲステロン受容体に対して陽性であるか、または癌細胞の少なくとも２０％がタンパク質Ｋｉ−６７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４６０１３）に対して陽性である、癌細胞を含む腫瘍を指す。
【００３１】
本明細書の文脈におけるルミナル様Ｂ（Ｈｅｒ２＋）サブタイプという用語は、エストロゲン受容体およびＨｅｒ２受容体に対して陽性である癌細胞を含む腫瘍を指す。
【００３２】
本明細書の文脈における基底サブタイプという用語は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨｅｒ２受容体に対して陰性である、三種陰性癌細胞を含む腫瘍を指す。
【００３３】
本明細書の文脈における剛性分布という用語は、個々の組織生検試料から決定された異なる剛性値の周波数を指す。決定された剛性分布は、ガウス関数にさらに適合させることができる。単峰性の剛性分布は、均一な剛性を有する試料を示す、単一の極大値を有する離散的な剛性値の分布である。二峰性分布関数は２つの極大値を持つ。このような分布は、２つの硬さの異なる部分、例えば軟腫瘍コアおよび堅い周辺部を有する試料によって引き起こされ得る。本発明の意味における三峰性の剛性分布は、３つの極大値によって特徴付けられる分布を意味する。三峰性分布は、正常な組織、硬質間質によって特徴付けられる境界領域および軟部腫瘍核が分布を構成する値に寄与していることを示し得る。少なくとも二峰性の剛性分布の試料は、二峰性、三峰性又はｎ峰性（ｎ−ｍｏｄａｌ）（ｎは整数＞１）分布関数を有する。
【００３４】
本明細書の文脈における異種剛性分布という用語は、ｎ峰性分布関数（ｎは整数＞１である）を指す。
【００３５】
本明細書の文脈における複数の剛性値は、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、９００、１０００、１６００、２５００、３６００、４９００、６４００、８１００、１００００または２１０００の剛性値を指す。
【００３６】
予後マーカーは、がんの発症および／または再発のリスクを提供し、または言い換えれば、疾患の進行の可能性の指標を与える。
【００３７】
予測マーカーは、特定の治療に対する患者の応答の指標を提供する。
【００３８】
本明細書の文脈におけるピークという用語は、剛性値分布における局所的最大値を指し、試料内の最も高い周波数を有する剛性値、または直接隣接する値内の剛性値を意味する。
【００３９】
本明細書の文脈において、剛性値分布に関して使用する場合の周波数極大値という用語は、剛性値全体について剛性値の周波数をプロットするグラフの局所的または絶対的（グローバル）最大値を指し、ここで周波数極大値は周波数値および剛性値によって特徴づけられる。
【００４０】
本明細書の文脈における生理学的条件という用語は、任意の化学物質または物理的薬剤による組織の生存性を維持しながら、生検組織試料の構造的完全性および機械的特性を保存するために必要な条件を指し、特に、収集後、試料を生理学的緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、またはカストジオール（Ｃｕｓｔｏｄｉｏｌ）のような移植用緩衝液に保存し、剛性の決定を２０、２５、３０または３７℃で行うことを含む。リンガー溶液はさらに、グルコースおよびプロテアーゼカクテルを補充することができる。さらに、採取後１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間または７２時間以内に、生検組織試料の剛性決定を、試料の機械的特性を変えることなく行うことができる。「生理学的条件」は、特に、凍結組織、解凍組織やパラフィン包埋試料を含まない。
【００４１】
本明細書の文脈における放射線療法という用語は、特に、悪性細胞を制御または死滅させるために、腫瘍を含むかまたはそれを含むと疑われる組織に対する電離放射線の適用を指す。
【００４２】
本明細書の文脈における化学療法という用語は、特に、１つ以上の抗癌剤または化学療法剤を、それを必要とする被験体に対して投与することを指し、ここで化学療法剤は、悪性細胞の細胞分裂を減少させ得るか、または悪性細胞においてアポトーシスを誘導する細胞毒性剤である。乳癌の治療のための化学療法剤の非限定的な例としては、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシンまたは、ラパマイシン（ＣＡＳ−Ｎｏ  ５３１２３−８８−９）などのｍＴＯＲ阻害剤が挙げられる。
【００４３】
本明細書の文脈におけるホルモン療法または内分泌療法という用語は、特に、ヒトエストロゲン、ヒトプロゲステロンまたはその受容体の生物学的活性を調節する化合物を、例えば受容体アンタゴニストまたは受容体阻害剤として、それを必要とする被験体に投与することを指す。
【００４４】
ＵｎｉＰｒｏｔの番号は、ＵｎｉＰｒｏｔ知識ベース（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）のエントリを指す。
【課題を解決するための手段】
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は、乳癌組織試料がそのナノメカニカル特性に基づいて乳癌サブタイプに分類され得るという驚くべき発見に基づいている。
【００４６】
本発明の第１の態様によれば、乳房腫瘍から得られた組織試料を分類するための方法が提供される。この方法は、組織試料上の複数の点のそれぞれについての剛性値を決定し、剛性分布を生じさせ、そして決定された剛性分布に基づいて試料を乳癌分子サブタイプに割り当てる工程を含む。
【００４７】
好都合なことに、本発明の方法は、遺伝子発現プロファイリングまたは免疫組織化学的方法のような現在使用されている最先端の方法よりも、より正確で、信頼性が高く、迅速である。
【００４８】
特定の実施形態では、剛性値は、例えば、原子間力顕微鏡のような走査型プローブ顕微鏡を用いて決定される。
【００４９】
特定の実施形態において、剛性値は、ナノ圧子基底を用いて決定される。
【００５０】
特定の実施形態では、分子サブタイプは、
−  ルミナルＡサブタイプ非転移乳癌、
−  ルミナルＢサブタイプ非転移乳癌、
−  ルミナルＡサブタイプ転移乳癌、
−  ルミナルＢサブタイプ転移乳癌、
−  ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプ転移乳癌、
−  基底サブタイプ非転移乳癌、および
−  基底サブタイプ転移乳癌
を含む群から選択される。
【００５１】
特定の実施形態では、ルミナルＡサブタイプ非転移乳癌またはルミナルＢサブタイプ非転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満の領域で０．４ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間に１つだけの周波数極大値および１．０ｋＰａ〜１．５ｋＰａの領域内の複数の周波数値を示す試料に割り当てられ、ここで該複数の周波数値は閾値より大であり、かつ該閾値は０．４ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間での該１つの周波数極大値の半分の周波数値に等しい（例えば、０．４ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間での周波数極大値の周波数値が１００の場合、１．０ｋＰａ〜１．５ｋＰａの間の領域の複数の周波数値は５０より大きい）。
【００５２】
特定の実施形態では、ルミナルＡサブタイプ非転移乳癌またはルミナルＢサブタイプ非転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満の領域で０．４ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間でグローバル周波数極大値および１．０ｋＰａ〜１．５ｋＰａの間の領域で複数の周波数値を示す試料に割り当てられ、ここで複数の周波数値は閾値より大であり、かつ閾値は０．４ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間でのグローバル周波数極大値の半分の周波数値に等しい（例えば、０．４ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間での周波数極大値の周波数が１００の場合、１．０ｋＰａ〜１．５ｋＰａの間の領域での周波数値は５０より大きい）。
【００５３】
特に、転移していないルミナルＡまたはルミナルＢのサブタイプは、処置の良好な予後、投与された処置に対する良好な応答および化学療法の非投与を示す。さらに、乳癌の非転移ルミナルａまたはルミナルＢのサブタイプは、適切な標準療法の後に再発の危険性または確率が低いことを特徴とする。
【００５４】
特に、非転移ルミナルＡサブタイプは、エストロゲンまたはその受容体の生物学的活性を調節する化合物、例えば、エストロゲン受容体のアンタゴニストであるタモキシフェン（ＣＡＳ番号  １０５４０−２９−１）、またはレトロゾール（ＣＡＳ番号  １１２８０９−５１−５）またはアナストロゾール（ＣＡＳ番号  １２０５１１−７３−１）のようなアロマターゼ阻害剤を、特に外科手術に伴う補助療法として処置することができる。
【００５５】
特に、非転移ルミナルＢサブタイプは、プロゲステロンまたはその受容体の生物学的活性を調節する化合物で治療することができる。非限定的な例には、特に外科手術に伴う補助療法または手術前の補助療法（ネオアジュバント）として、メゲストロールアセタート（ＣＡＳ番号  ５９５−３３−５）およびメドロヒドロプロゲルステロンアセタート（ＣＡＳ番号  ７１−５９−９）などのプロゲスチンが含まれる。
【００５６】
特定の実施形態では、ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満で２つの周波数極大値および２ｋＰａより大で周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態では、ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．３ｋＰａ〜０．９ｋＰａの間で２つの周波数極大値および２ｋＰａより大で周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態では、ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満で２つの周波数極大値および２．０ｋＰａ〜２．５ｋＰａで１つの周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態では、ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．３ｋＰａ〜０．９ｋＰａで２つの周波数極大値および２．０ｋＰａ〜２．５ｋＰａで周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態では、ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．３７５ｋＰａおよび０．８７５ｋＰａで周波数極大値および２ｋＰａより大で、周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態において、ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．３７５ｋＰａおよび０．８７５ｋＰａで周波数極大値を示し、２．０ｋＰａ〜２．５ｋＰａの間で周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態において、ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性が高いものは、０．３７５ｋＰａおよび０．８７５ｋＰａで周波数極大値を示し、２．０７５ｋＰａで周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態では、ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満で２つの周波数極大値および２．０７５ｋＰａで周波数値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態では、ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．３ｋＰａ〜０．９ｋＰａの２つの周波数極大値および２．０７５ｋＰａでの周波数値を示す試料に割り当てられる。特に、上記のような組織試料は、隣接するリンパ節または腋窩リンパ節に広がる可能性が非常に高い腫瘍を意味する。
【００５７】
特に、転移したルミナルＡサブタイプは、予後不良および化学療法の投与、特に、エストロゲンの作用を調節する化合物、例えば、エストロゲン受容体のアンタゴニストであるタモキシフェン（ＣＡＳ番号  １０５４０−２９−１）、またはレトロゾール（ＣＡＳ番号  １１２８０９−５１−５）またはアナストロゾール（ＣＡＳ番号  １２０５１１−７３−１）のようなアロマターゼ阻害剤の投与を、特に外科手術に伴う補助的療法および／または放射線療法としておこなうことに対して可もなく不可もないことを示す。特に、転移したルミナルＡサブタイプは、適切な標準的療法後の再発の危険性や確率が高いことを特徴とする。
【００５８】
特定の実施形態において、ルミナルＢサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．２５ｋＰａ未満で周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態において、ルミナルＢサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．１ｋＰａ〜０．２５ｋＰａの間で、特に０．２ｋＰａで１つの周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態では、ルミナルＢサブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．２５ｋＰａ未満、特に０．１ｋＰａ〜０．２５ｋＰａの間、より具体的には０．２ｋＰａで１つの周波数極大値、および１．４ｋＰａ〜１．６ｋＰａの間で周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特に、上記のような組織試料は、隣接するリンパ節または腋窩リンパ節に広がる可能性が非常に高い腫瘍を意味する。
【００５９】
特に、転移したルミナルＢサブタイプの腫瘍は、不良な予後および化学療法の投与を示す。特に、転移したルミナルＢサブタイプは、適切な標準的治療後に再発の危険性または確率が高いことを特徴とする。特に、転移したルミナルＢサブタイプは、放射線療法および／またはｍＴＯＲ、ＰＩ３ＫまたはＩＧＦＲ−１の阻害剤で、特に放射線療法および／または外科手術の前（ネオジュアント）またはそれに付随する補助療法として治療することができる。
【００６０】
特定の実施形態において、ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプの転移乳癌である可能性の高いものは、０．２５ｋＰａ〜０．４ｋＰａの間で周波数極大値および１．７ｋＰａ〜２．０ｋＰａの間で周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特定の実施形態において、ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプの転移乳癌である可能性の高いものは、０．３ｋＰａで周波数極大値を示し、および１．７ｋＰａ〜２．０ｋＰａの間で周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特に、上記のような組織試料は、隣接するリンパ節または腋窩リンパ節に広がる可能性が非常に高い腫瘍を意味する。
【００６１】
特に、転移したルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプは予後不良であり、化学療法の投与、特にトラスツズマブ（ハーセプチン；ＣＡＳ番号１８０２８８−６９−１としても知られている）のような化合物の投与を示す。特に、転移したルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプは、適切な標準的治療後に再発の危険性または確率が高いことを特徴とする。特に、転移したルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプは、特に外科手術および／または化学療法に伴う補助的療法として、放射線療法で治療することができる。
【００６２】
特定の実施形態では、基底サブタイプ非転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満の領域で０．５ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間に１つだけの周波数極大値を示し、および１．０ｋＰａ〜１．５ｋＰａの間の領域で複数の周波数を示す試料に割り当てられ、ここで、該複数の周波数値は閾値未満であり、および該閾値は、０．５ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間で該１つの周波数極大値の半分の周波数値に等しい（例えば、０．５ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間で周波数極大値が１００の場合、１．０ｋＰａ〜１．５ｋＰａの間の領域での周波数値は５０未満である）。
【００６３】
特に、非転移基底サブタイプは予後不良を示す。特に、非転移基底サブタイプは、適切な標準的治療後に再発の危険性または確率が低いという特徴がある。特に、転移した基底サブタイプは、化学療法、特に手術に伴う補助療法または手術前のネオアジュバント療法として治療することができる。
【００６４】
特定の実施形態では、基底サブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満で２つの周波数極大値を示し、かつ１．３ｋＰａより大で他の周波数極大値がないことによってさらに特徴付けられる試料に割り当てられる。特定の実施形態では、基底サブタイプ転移乳癌である可能性の高いものは、０．２ｋＰａ〜１．０ｋＰａの間で２つの周波数極大値を示す試料に割り当てられ、１．３ｋＰａより大の他の周波数極大値がないことをさらに特徴とする。特定の実施形態では、基底サブタイプ転移乳癌である可能性が高いものは、０．３ｋＰａ〜０．９ｋＰａの間で２つの周波数極大値を示し、かつ、１．３ｋＰａより大の他の周波数極大値がないことを特徴とする試料に割り当てられる。特に、上記のような組織試料は、隣接するリンパ節または腋窩リンパ節に広がる可能性が非常に高い腫瘍を意味する。
【００６５】
特に、転移した基底サブタイプは、予後が非常に悪いことを示す。特に、転移した基底サブタイプは、適切な標準的治療後に再発の危険性または確率が高いことを特徴とする。特に、転移した基底サブタイプは、特に外科手術または化学療法に伴う補助的療法として放射線療法で治療され得る。特に、転移した基底サブタイプは、特に手術前のネオアジュバント療法として化学療法で治療することができる。
【００６６】
本発明の上記第１の態様とは別の態様によれば、乳房腫瘍から得られた組織試料を分類する方法が提供され、この方法は、組織試料上の複数の点の各々について剛性値を決定し、剛性分布を生じさせ、そして前記決定された剛性分布に基づいて前記試料を乳癌分子サブタイプに割り当てる工程を含み、
前記分類スキーマのクラスは：
−  ルミナルＡサブタイプ非転移乳癌、
−  ルミナルＢサブタイプ非転性乳癌、
−  ルミナルＡサブタイプ転移乳癌、
−  ルミナルＢサブタイプ転移乳癌、
−  ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプ転移乳癌、
−  基底サブタイプ非転移乳癌、および／または
−  基底サブタイプ転移乳癌
であって、
ここで
−  ルミナルＡサブタイプ非転移乳癌またはルミナルＢサブタイプ非転移乳癌である可能性が高いものは、１ｋＰａ未満の領域で０．４ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間に１つのみの周波数極大値および１．０ｋＰａ〜１．５ｋＰａの領域内で複数の周波数値を示す試料に割り当てられ、ここで複数の周波数値は閾値より大であり、かつ閾値は０．４ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間の１つの周波数極大値の半分の周波数値に等しい、
−  ルミナルＡサブタイプ転移乳癌である可能性が高いものは、１ｋＰａ未満で２つの周波数極大値および２ｋＰａより大で周波数極大値を示す試料に割り当てられ、
−  ルミナルＢサブタイプ転移乳癌である可能性が高いものは、０．２５ｋＰａ未満で周波数極大値を示す試料に割り当てられ、
−  ルミナルＢ様サブタイプ転移乳癌である可能性が高いものは、０．２５ｋＰａ〜０．４ｋＰａの間で周波数極大値、および１．７ｋＰａ〜２．０ｋＰａの間で周波数極大値を示す試料に割り当てられ、
−  基底サブタイプ非転移乳癌である可能性の高いものは、１ｋＰａ未満の領域において０．５ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間に１つのみの周波数極大値および１．０ｋＰａ〜１．５ｋＰａの間の領域に複数の周波数値を示す試料に割り当てられ、ここで複数の周波数値は、閾値未満であり、および閾値は、０．５ｋＰａ〜０．７ｋＰａの間での１つの周波数極大値の半分の周波数値に等しい、
−  基底サブタイプ転移乳癌の可能性の高いものは、１ｋＰａ未満の２つの周波数極大値を示す試料であり、かつ１．３ｋＰａより大の他の周波数極大値が存在しないことを特徴とする試料に割り当てられ、および／または
−  ルミナルＢサブタイプの転移乳癌の可能性が高いものは、１ｋＰａ未満の２つの周波数極大値、および１．４ｋＰａ〜２．０ｋＰａの間で周波数極大値を示す試料に割り当てられる。
【００６７】
特定の実施形態では、組織試料は、組織生検試料または切除標本である。
【００６８】
特定の実施形態において、ルミナルＢサブタイプ転移乳癌である可能性が高いものは、１ｋＰａ未満で２つの周波数極大値および１．４ｋＰａ〜２．０ｋＰａの間で周波数極大値を示す試料に割り当てられる。特に、上記のこのような組織試料は、血管系に非常に広がっている可能性のある腫瘍を意味する。
【００６９】
特定の実施形態では、複数の点は、少なくとも１００μｍ、５０μｍ、２０μｍ、１０μｍまたは１μｍの空間分解能で決定される。
【００７０】
特定の実施形態では、組織試料は、乳房腫瘍のコアの少なくとも一部および乳房腫瘍の周辺の少なくとも一部を含む。
【００７１】
特定の実施形態では、組織試料は、乳房腫瘍の断面の少なくとも半分を表し、乳房腫瘍のコアから周辺に明確な配向を示す。
【００７２】
特定の実施形態では、組織生検試料は、円筒形または角柱状の生検である。
【００７３】
特定の実施形態では、複数の点は、領域または線内に配置される。
【００７４】
特定の実施形態では、複数の点は、ｎ１とｎ２が互いに独立して＞１の整数である領域を定義するグリッド、ｎ１×ｎ２の点のグリッドとして配置される。
【００７５】
特定の実施形態では、複数の点は、グリッド内または領域内に不規則に配置される。
【００７６】
特定の実施形態では、複数の点は、組織試料の表面上の線に沿って決定され、ここで特に線は組織試料、特に組織生検試料の長手軸に平行であり、かつ、特に、複数の点は、線に沿って均質にまたは均一に分布する。特定の実施形態では、線は、組織試料の長手軸の少なくとも１／４、１／２または３／４の長さにわたって延びる。特定の実施形態では、線は、組織試料の長手軸の全体にわたって延びる。特定の実施形態では、線は直線または波状または蛇行線である。特定の実施形態では、線は少なくとも２点、特に２〜１０点の幅を有する。特定の実施形態では、０．２５μｍ〜６μｍの範囲の間隔で、５０００〜２０００００の力曲線を測定して、試料全体（５ｍｍ〜１５ｍｍ）にわたって数行の押し込み曲線が測定される。
【００７７】
ある実施形態では、５×５点（２５点をもたらす）、７×７点、１０×１０点、１５×１５点、２０×２０点、５０×５０点または１００×１００点のグリッドが１つの領域に対して測定される。特定の実施形態では、領域は、４００μｍ２のサイズを有する２４×２４点のグリッドで画定される。
【００７８】
特定の実施形態では、同じ試料の少なくとも２つの異なる領域の剛性値が決定され、領域の幾何学的中心間の距離は１００μｍ〜１ｃｍである。特定の実施形態では、領域の幾何学的中心間の距離は、１ｍｍ〜５ｍｍである。いくつかの実施形態では、領域の幾何学的中心間の距離は、５ｍｍ〜１０ｍｍである。いくつかの実施形態では、領域の幾何学的中心間の距離は１０ｍｍ〜１００ｍｍである。いくつかの実施形態では、領域の幾何学的中心間の距離は、１００ｍｍ〜５００ｍｍである。特定の実施形態では、同じ試料の少なくとも２つの異なる領域の剛性値が決定され、かつ領域の幾何学的中心間の距離は１００μｍ〜１ｍｍである。
【００７９】
特定の実施形態では、同じ試料の少なくとも２つの異なる領域の剛性値が決定され、領域の幾何学的中心間の距離は空間分解能の倍数であり、前記倍数は空間分解能の少なくとも１０倍である。特定の実施形態では、倍数は２０、３０または５０である。
【００８０】
特定の実施形態では、組織試料の領域は、試料の長手軸に沿って、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍまたは２０ｍｍの距離にわたって試料の表面上に配置される。
【００８１】
特定の実施形態では、複数の点は、５０〜２１０００の範囲の剛性値を含む。特定の実施形態では、複数の点は、１００〜２１０００の範囲の剛性値を含む。特定の実施形態では、複数の点は、４００〜２１０００の範囲の剛性値を含む。特定の実施形態では、複数の点は、９００〜１００００の範囲の剛性値を含む。特定の実施形態では、複数の点は、１０００〜８１００の範囲の剛性値を含む。特定の実施形態では、複数の点は、１６００〜６４００の範囲の剛性値を含む。特定の実施形態では、複数の点は、２５００〜４９００の範囲の剛性値を含む。特定の実施形態では、複数の点は、３６００〜４９００の範囲の剛性値を含む。特定の実施形態では、複数の点は、５０、１００、４００、９００、１０００、１６００、２５００、３６００、４９００、６４００、８１００、１００００または２１０００の剛性値を含む。
【００８２】
特定の実施形態では、組織生検試料は、少なくとも７μｍの直径を有する円筒形または角型の生検である。特定の実施形態では、生検組織試料は、少なくとも０．５ｍｍの直径を有する円筒形または角型の生検である。
【００８３】
特定の実施形態では、剛性値は生理学的条件下で決定される。
【００８４】
ある実施形態では、複数の点は６分〜６時間以内に記録される。
【００８５】
特定の実施形態では、複数の点は、１秒あたり、１０００〜０．１の荷重サイクルの速度範囲で記録される。特定の実施形態では、複数の点は、１秒あたり、１０００〜１００の荷重サイクルの速度範囲で記録される。特定の実施形態では、複数の点は、１秒あたり１００〜１０の荷重サイクルの速度範囲で記録される。特定の実施形態では、複数の点は、１秒あたり、１０〜０．１の荷重サイクルの速度範囲で記録される。
【００８６】
特定の実施形態において、複数の点は、２００ｐＮ〜３ｍＮ、特に０．２ｎＮ〜２０ｎＮの範囲の最大荷重で記録される。
【００８７】
特定の実施形態では、複数の点は、２ｍＮ／ｍ〜２０Ｎ／ｍの剛性範囲の１つ以上の圧子を用いて記録される。特定の実施形態において、複数の点は、２ｍＮ／ｍ〜２００ｍＮ／ｍの剛性範囲の圧子を用いて記録される。特定の実施形態では、複数の点は、２００ｍＮ／ｍ〜２Ｎ／ｍの剛性範囲の圧子を用いて記録される。
【００８８】
特定の実施形態では、本発明の方法は、組織試料上または組織試料中に含まれるマーカーの決定、特に検出または定量をさらに含み、表面マーカーは、
−  ヒトエストロゲン受容体（表面マーカー、ＵｎｉＰｒｏｔ．  Ｐ０３３７２）；
−  ヒトプロゲステロン受容体（表面マーカー、ＵｎｉＰｒｏｔ．  Ｐ０６４０１）；
−  ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体（表面マーカー、ＵｎｉＰｒｏｔ．  Ｐ０４２６）、および
−  抗原Ｋｉ−６７
を含む群から選択される。
【００８９】
本発明の別の態様によれば、乳癌から得られた組織試料を分類するためのシステムが提供される。このシステムは、
−  空間分解能では、少なくとも１μｍ（１μｍ以下）の分解能、及び／又は剛性値および対応する硬度値で少なくとも１ｋＰａ（１ｋＰａ以下）の分解能で剛性値を決定するための装置、特に原子間力顕微鏡、
−  プログラムされた集積回路
を含み、
プログラムされた集積回路は、本発明の方法を実行するように装備され、指定または構成されている。
【００９０】
特定の実施形態では、プログラムされた集積回路は、本発明の方法を実行するように装備され指定または構成されたプログラムされたマイクロプロセッサ内に含まれるか、またはプログラムされたマイクロプロセッサである。
【００９１】
本発明のさらなる態様によれば、乳癌を治療するための方法であって、該方法は、
−  被験体の乳房腫瘍由来の組織試料を提供する工程、
−  本発明の方法によって組織試料を乳癌サブタイプに割り当てる工程、
−  決定されたサブタイプに基づいて被験体に治療を施す工程
を含む。
【００９２】
特定の実施形態では、乳房腫瘍がルミナルＡサブタイプ非転移乳癌またはルミナルＢサブタイプ非転移乳癌として分類された場合、ホルモンまたは内分泌療法が被験体に投与される。
【００９３】
特定の実施形態において、エストロゲンまたはその受容体の効果を調節する化合物は、乳房腫瘍がルミナルＡ非転移サブタイプ乳癌として分類された場合に被験体に投与され、ここで特に化合物はエストロゲン受容体のアンタゴニスト、例えば、タモキシフェン（ＣＡＳ番号  １０５４０−２９−１）、またはアロマターゼ阻害剤、例えばレトロゾール（ＣＡＳ番号  １１２８０９−５１−５）またはアナストロゾール（ＣＡＳ番号  １２０５１１−７３−１）である。
【００９４】
特定の実施形態において、プロゲステロンまたはその受容体の作用を調節する化合物は、乳房腫瘍がルミナルＢサブタイプ非転移乳癌として分類された場合に被験体に投与され、ここで特に化合物はプロゲスチン、例えばメゲストロールアセタート（ＣＡＳ番号５９５−３３−５）またはメドロヒドロプロゲルステロンアセタート（ＣＡＳ番号７１−５９−９）である。
【００９５】
特定の実施形態において、化学療法は、乳房腫瘍が基底転移または非転移乳癌に分類された場合に、特に外科手術に伴う補助療法として、特に手術前（ネオアジュバント）または手術後の補助療法として、被験体に投与される。特に、そのような化学療法は、被験体における乳癌の再発の危険性を低減するために有益である。
【００９６】
特定の実施形態では、乳房腫瘍がルミナルＡサブタイプ転移乳癌またはルミナルＢサブタイプ転移乳癌として分類された場合に、化学療法は、特にホルモン療法および／または外科手術と組み合わせた補助療法として、被験体に投与される。特に、そのような化学療法は、被験体における乳癌の再発の危険性を低減するために有益である。
【００９７】
特定の実施形態では、乳房腫瘍がルミナルＡサブタイプ転移乳癌、ルミナルＢサブタイプ転移乳癌、ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプ転移乳癌、または基底サブタイプ転移乳癌として分類された場合には、放射線療法は、特に外科手術に伴う補助療法、特に外科手術の前後の補助療法として、被験体に投与される。特に、そのような放射線療法は、被験体における乳癌の再発の危険性を低減するために有益である。
【００９８】
特定の実施形態では、乳房腫瘍が、ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプ転移乳癌に分類された場合には、特に放射線治療および／または外科手術と組み合わせて、トラスツズマブ（ハーセプチン；ＣＡＳ番号１８０２８８−６９−１としても知られている）を被験体に投与する。
【００９９】
特定の実施形態では、ｍＴＯＲの阻害剤（例えば、ラパマイシンなど）またはＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３キナーゼ）阻害剤またはＩＧＦＲ−１（インスリン様成長因子１受容体）阻害剤は、乳腺腫瘍が、ルミナルＢ様Ｈｅｒ２＋サブタイプ転移乳癌に分類された場合に、特に放射線療法および／または外科手術と組み合わせて、被験体に投与される。
【０１００】
特定の実施形態では、ｍＴＯＲの阻害剤（例えば、ラパマイシンなど）またはＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３キナーゼ）阻害剤またはＩＧＦＲ−１（インスリン様成長因子１受容体）阻害剤は、乳房腫瘍が、ルミナルＢサブタイプ転移乳癌として分類された場合に、特に、放射線療法、ホルモン療法および／または外科手術と組み合わせて、被験体に投与される。
【０１０１】
単一の分離可能な特徴の代替物が「実施形態」として本明細書に記載されている場合は、そのような代替物を自由に組み合わせて、本明細書に開示する本発明の別個の実施形態を形成できることを理解されたい。
【０１０２】
本発明は、以下の実施例および図面によりさらに説明され、それからさらなる実施形態および利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、基底Ｎ０（ｎ＝１）およびＮ＋（ｎ＝２）の患者の乳房腫瘍（生検試料）のナノメカニカルプロファイルを表す正規化ヒストグラムを示す。Ｎ０の患者は０．６２５ｋＰａで非常に明確な癌ピークを示し、Ｎ＋の患者は０．５２５ｋＰａでピークになるが、より広い剛性分布を示す。さらに、Ｎ０患者はＮ＋患者よりも硬い成分を有する。Ｎ０は、ＴＮＭグレーディングにおけるｐＮ０を表し、原発腫瘍が局所リンパ節を含むように進行していないことを意味する。Ｎ＋は、ＴＮＭグレーディングにおいてｐＮ１以上を表し、原発腫瘍が局所リンパ節を含むように進行したことを意味する。
【図２】図２は、ルミナルＡ  Ｎ０（ｎ＝５）およびルミナルＡ  Ｎ＋（ｎ＝３）の乳房腫瘍（生検試料）のナノメカニカルプロファイルを表す正規化されたヒストグラム（同じ面積）を示す。ルミナルＡ（ＬｕｍＡ）Ｎ＋患者は、ルミナル（Ｌｕｍ）Ｎ０患者よりも不均一な剛性分布を示す。ルミナルＡ（ＬｕｍＡ）Ｎ０患者は０．５７５ｋＰａおよび１．４２５ｋＰａの顕著なピークを示し、Ｎ＋患者はこれらのピークを欠いている。対照的に、Ｎ＋患者は、Ｎ０患者において優位ではない０．３７５ｋＰａ、０．８７５ｋＰａおよび２．０７５ｋＰａで強いシグナルを示す。１ｋＰａ未満の癌領域では、ルミナルＡ（ＬｕｍＡ）Ｎ０は、ルミナルＡ（ＬｕｍＡ）Ｎ＋（２つのピーク、０．３７５ｋＰａおよび０．８７５ｋＰａ）よりも均質（０．５７５ｋＰａで１ピーク）である。
【図３】図３は、ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）Ｎ０（ｎ＝５）およびルミナルＢ（ＬｕｍＢ）Ｎ＋（ｎ＝７）の乳房腫瘍（生検試料）のナノメカニカルプロファイルを表す正規化ヒストグラム（同じ面積）を示す。ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）Ｎ０は、Ｎ＋患者より不均一な剛性分布を示し、２ｋＰａより大の剛性部分においてより多く不均一となっている。ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）Ｎ＋の軟質部分は、ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）Ｎ０の軟質部分よりもかなり柔らかい。
【図４】図４は、Ｎ０：ルミナルＡ（ｎ＝５）、ルミナルＢ（ｎ＝５）および基底（ｎ＝１）の患者の乳房腫瘍（生検試料）のナノメカニカルプロファイルを表す正規化ヒストグラムを示す。
【図５】図５は、Ｎ０のルミナルＡ（ＬｕｍＡ）（ｎ＝５）およびルミナルＢ（ＬｕｍＢ）（ｎ＝５）患者の原発腫瘍（生検試料）のナノメカニカルプロファイルを表す正規化ヒストグラムを示す。２つのヒストグラムは非常によく似ており、いずれの場合もがん領域は０．５７５ｋＰａでピークに達するが、ピークはそれほど明確ではなく、分布が非常に広い。
【図６】図６は、Ｎ＋：基底（ｎ＝２）、ルミナルＡ（ｎ＝３）およびルミナルＢ（ｎ＝７）の患者の乳房腫瘍（生検試料）のナノメカニカルプロファイルを表す正規化ヒストグラムを示す。
【図７】図７は、Ｎ＋のルミナルＡ（ＬｕｍＡ）（ｎ＝３）およびルミナルＢ（ＬｕｍＢ）（ｎ＝７）の患者の乳房腫瘍（生検試料）のナノメカニカルプロファイルを表す正規化ヒストグラムを示す。Ｎ＋患者では、ルミナルＡ（ＬｕｍＡ）患者はルミナルＢ（ＬｕｍＢ）患者よりも不均質な分布を示す。ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）患者の癌領域は、ルミナルＡ（ＬｕｍＡ）患者の場合よりもはるかに柔らかく、０．２ｋＰａ付近に広いピークがあり、一方でルミナルＡ（ＬｕｍＡ）の部分は、０．３７５ｋＰａおよび０．８７５ｋＰａのピークを有する二峰性である。
【図８】図８は、Ｎ＋：ルミナルＢ（ｎ＝７）およびＨｅｒ２＋ルミナルＢ様（ｎ＝２）患者の乳房腫瘍（生検試料）のナノメカニカルプロファイルを表す正規化ヒストグラムを示す。一般的に、２ｋＰａ未満の分布は、ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）（Ｈｅｒ２−）患者のものよりもルミナルＢ（ＬｕｍＢ）様の患者のものの方がより硬い。ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）（Ｈｅｒ２−）の癌領域は、０．２ｋＰａでピークに達し、ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）様（Ｈｅｒ２＋）の場合には約０．３ｋＰａでわずかに硬くピークとなっている。
【図９】図９は、浸潤または癌陽性（Ｎ＋）リンパ節（生検試料）のナノメカニカルプロファイルを表す正規化ヒストグラムを示す。癌細胞陽性（Ｎ＋）リンパ節は、０．４ｋＰａ付近に強く、柔らかいピークを有する。
【図１０】図１０は、ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）Ｎ０；Ｖ０（ｎ＝３）対Ｖ１（ｎ＝１）の患者の乳房腫瘍（生検試料）のナノメカニカルプロファイルを表す正規化されたヒストグラムを示す。Ｖ１：診断機能は、血管系への浸潤を示すが、遠隔転移の兆候はない（手術時）。Ｖ１試料は、０．３ｋＰａ付近の明瞭な追加の柔らかいピークを示す。
【図１１】図１１は、特定の乳癌分子サブタイプの特徴の概要を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
実施例：
ＡＲＴＩＤＩＳ技術（「自動化および信頼性のある組織診断」；米国特許第８，７５６，７１１Ｂ２号、米国特許第２０１４３３８０７３Ａ１号、国際公開第２０１４０９０９７１Ａ１号、国際公開第２０１５００１１１９Ａ１号、国際公開第２０１５０１８８６５Ａ１号は参照として本明細書に組み込まれる）を、腫瘍切除または生検によって得られた未固定（生理学的水性環境または凍結組織で測定）のヒト乳癌試料の分析およびサブタイプ分類のために最適化した。〜２時間続くＡＲＴＩＤＩＳアッセイでは、〜１０ｎｍの尖鋭なスタイラスまたはチップを使用して、生検表面全体に〜１００００の極小の押し込みを作る。
【０１０５】
この目的のために、種々のサブタイプおよびステージの乳癌の組織試料を、２６人の患者の切除または生検によって採取した。典型的には、採取された生検試料は、長さが０．５ｃｍ〜１．５ｃｍ、直径が１ｍｍ〜２ｍｍの円筒形であった。１０〜２０のマップは、試料に対して等距離で測定され、２５０μｍ〜１５００μｍの範囲の間隔を生じる。マップのサイズは２０×２０μｍ〜４０×４０μｍの範囲であり、通常１０２４の測定点を含む。したがって、標本に対して１０×１０２４〜２０×１０２４の測定が行われる。
【０１０６】
切除は、通常、幅５×５ｍｍ、長さ４×４のマップで、平均で１ｍｍの間隔を生じさせた。
【０１０７】
試料のナノメカニカル測定は、米国特許第８，７５６，７１１Ｂ２に開示されているように行った。簡潔には、可能性のある異質性を説明するために、試料表面全体にわたってＦＶマップを均一に分布させることによって、各試料を系統的に検査した。約５００μｍの規則的な距離が、マイクロメータスクリューまたは自動位置決めシステムのいずれかを使用する走査間で維持された。これは、総生検サイズに依存して、標本あたり約１０〜１５ＦＶマップをもたらした。
【０１０８】
ＡＦＭによる試料の分析のために、２成分５分間速乾性エポキシ接着剤を用いて生検材料を培養皿上に接着させた。２分間の予備乾燥工程（エポキシと標本緩衝液の混合を避けるため）の後、押し込みの角度を最適化し、外部構成要素（例えばカンチレバーホルダー）からの影響を避けるために、標本を接着剤上に平らに置いた。「傾斜路」として働くピペットのチップを、高さの一貫性を維持するために、各標本の不均一な部分の直ぐ下に置いた。過度の力（例えば、引き裂きまたは引っ張り）の使用は、標本の取扱い中常に、最小限に抑えられた。全ての調製工程は、汚染を防止するため、および標本が生体内に近い状態に保たれていることを保証するために、移植バッファーまたはプロテアーゼ阻害剤を補充した滅菌緩衝液環境のいずれかで行った。マウントされた標本は、室温または３７℃で実施されるナノメカニカル試験をおこなうまで、氷冷リンガー溶液またはカストジオール（Ｃｕｓｔｏｄｉｏｌ）中に保持された。
【０１０９】
鋭いピラミッドチップ（２０５μｍ長さの窒化ケイ素カンチレバー、公称カンチレバーばね定数ｋ＝０．０６Ｎｍ−１、共鳴周波数［空気］＝１８ｋＨｚ）に対して、カンチレバーの正確なばね定数ｋは、無限剛性標準物質として固体ガラス基板を使用して流体中で偏向感度を測定しながら、熱同調法を用いて、各実験前に測定した。
【０１１０】
生検の接触剛性（弾性率、Ｅ）測定は以下のようにして行った。力の押し込み曲線とも呼ばれる荷重−変位曲線を、荷重および除荷の両方の間中、所与の部位で指向して記録した。約５００μｍの規則的な距離を、マイクロメータスクリューまたは自動位置決めシステムのいずれかを用いて走査領域間に維持した。個々のデータセットは、１６μｍ／ｓの押し込み速度で、１，０２４荷重−変位曲線から構成された。この結果、１試料あたり約１５〜２０の力量マップが得られた。可能であれば、毎秒約１回の荷重および除荷サイクルの速度で２０×２０μｍの走査サイズを有する３２×３２の点グリッド上に力−容積マップ（ＦＶ）を作成した。各荷重−変位曲線は、少なくとも５１２個のデータ点から構成され、Ｚの長さは、分析領域の特性に応じて５μｍ〜８μｍに設定された。（ｉ）実験時間を最適化するだけでなく、（ｉｉ）組織内の全ての成分（例えば、細胞および細胞外マトリックス）を取り込む十分に大きな領域を提供するために、各ＦＶマップを、２０×２０μｍ２に設定した。印加された最大荷重力は１．８ｎＮに設定され、押し込み深さは約１５０〜３０００ｎｍに設定された。関心のある主要領域にわたる空間分解能を高めるために、追加の７２×７２ＦＶマップ（１マップにつき５１８４個の力−変位曲線および２７７ｎｍのピクセルサイズ）が得られた。
【０１１１】
力の押し込み曲線を、以前に記載された方法を用いて分析した（Ｌｏｐａｒｉｃら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、９８（１１）：ｐ．２７３１−４０、２０１０、Ｐｌｏｄｉｎｅｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，．１７４（３）：ｐ．４７６−４８４、２０１１）。簡単に説明すると、ＦＶデータの自動分析のためにＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、米国）でソフトウェアが開発された。接触点を決定した。圧電変位からチップ−試料間距離に変換し、これはカンチレバーの曲げを説明し、カンチレバーの変位ｄに、バネ定数ｋを掛けて、荷重Ｆを得ることにより、力曲線が得られた。除荷力曲線は、最大荷重Ｆ＝１．８ｎＮと０．９ｎＮの荷重との間の剛性を規定する力曲線の上方５０％まで直線適合させて分析した。この手順により、粘着力などの力曲線に対する外力による影響を回避することができる。ポアソン比は０．５に設定した。ヤング率はＯｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｒ法（Ｏｌｉｖｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７（６）、１５６４−１５８３、１９９２）に従って決定した。剛性値は空間的にプロットされ、解析され、ＡＲＴＩＤＩＳ  ＯＦＦＬＩＮＥ  ＳＯＦＴＷＡＲＥに表示された。
【０１１２】
典型的には、１試料あたり１０，０００〜２０，０００の力曲線が測定され、１０００個の力曲線の力マップに試料全体にわたって均一に分布させた。
【０１１３】
ここに示されたデータは、以下の目的でクリニックにおけるＡＲＴＩＤＩＳを使用したナノメカニカルプロファイリングの適用可能性を実証する：
１）がんの進行と再発の予後
２）治療反応の予測
３）乳房腫瘍のナノメカニカルプロファイルに基づくレジメンの経過観察及び適切な治療法の決定
【０１１４】
本発明のナノメカニカルプロファイリング法は、標本の迅速なオンサイト評価を可能にし、例えば、Ｋｉ−６７などのように、その他のマーカーのような観察者間の変動性に悩まされないので、日々の使用において理想的には適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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