(57)【要約】  本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む新規な二重特異性抗原結合分子と、これらの分子を産生する方法及びその使用方法とに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつが、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合される、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーが、ＯＸ４０、４−１ＢＢ及びＧＩＴＲからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーがＯＸ４０である、請求項１から３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分の各々が、
（ｉ）配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、及び配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分の各々が、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される、請求項１から８の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、請求項１から８の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４１及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号４３及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号４５及び配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４７及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーが４−１ＢＢである、請求項１から３又は９から１１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分が、配列番号２３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項１から３、又は９から１１、又は１３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの部分の各々が、
（ｉ）配列番号２４９及び配列番号２５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２５１及び配列番号２５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、及び配列番号２５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号２５８及び配列番号２５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２６０及び配列番号２６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、及び配列番号２６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１から３、９から１１、又は１３又は１４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、及び配列番号２７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、及び配列番号２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む、請求項１から３、９から１１、又は１３から１５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分の各々が、
（ｉ）配列番号２６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号２７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖ）配列番号２７５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、請求項１から３、９から１１、又は１３から１６の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、及び配列番号２７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、及び配列番号２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から３、９から１１、又は１３から１７の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーがＧＩＴＲである、請求項１から３又は９から１１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分が、配列番号３５７のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項１から３、又は９から１１、又は１９の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
ＧＩＴＲに特異的に結合することができる４つの部分の各々が、配列番号３７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号３７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号３７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号３７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、請求項１から３、９から１１、又は１９又は２０の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号３８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む、請求項１から３、９から１１、又は１９から２１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号３８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む、請求項１から３、９から１１、又は１９から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２４】
（ｉ）ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号３８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から３、９から１１、又は１９から２３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２５】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分が、Ｆａｂ断片であり、そのうちの２つずつが、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合される、請求項１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２６】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片が、ＣＨ１ドメインのＣ末端で、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片のＶＨドメインに融合され、かつ、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片が、ＣＨ１ドメインのＣ末端で、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第４のＦａｂ断片のＶＨドメインに任意選択的にペプチドリンカーを介して融合される、請求項１から２５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができるＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される、請求項１から２６の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２８】
二重特異性抗原結合分子が、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である、請求項１から２７の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２９】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分がＶＨ及びＶＬドメインを含み、ＶＨドメインがペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に連結され、ＶＬドメインがペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に連結される、請求項１から２８の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３０】
二重特異性抗原結合分子が、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して二価である、請求項１から２７の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３１】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分が、Ｆａｂ断片又はクロスオーバーＦａｂ断片である、請求項１から２７、又は３０の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３２】
標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ断片又はクロスオーバーＦａｂ断片の各々が、ＶＨ又はＶＬドメインのＮ末端でペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＣ末端に融合される、請求項１から２７又は３０から３１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分がＶＨ−ＶＬクロスオーバーＦａｂ断片であり、各々がＶＬドメインのＮ末端でペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＣ末端に融合される、請求項１から２７又は３０から３２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
Ｆｃドメインがアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスである、請求項１から３３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３５】
請求項１から３４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項１から３４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項３７】
医薬としての使用のための、請求項１から３４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
（ｉｉｉ）感染症の治療における、
（ｉｖ）がんの治療における、
（ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、又は
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける
使用のための、請求項１から３４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項３７に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
がんの治療における使用のための、請求項１から３４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
二重特異性抗原結合分子が、化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療における使用のための、請求項１から３４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
腫瘍細胞の増殖を阻害するために、請求項１から３４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項３６に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む、新規な二重特異性抗原結合分子に関する。本発明は更に、これらの分子を産生する方法及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの幾つかのメンバーは、Ｔ細胞応答を維持するための初期Ｔ細胞活性化後に機能し、従って免疫系の構成及び機能において中心的役割を果たす。ＣＤ２７、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０、及びＧＩＴＲは、Ｔ細胞に対して共刺激効果を有することができ、それらは初期Ｔ細胞活性化後にＴ細胞応答を維持することを意味する（Watts T.H. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23, 23-68）。これらの共刺激ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー（本明細書ではＴＮＦＲファミリーメンバーと呼ばれる）の効果は、しばしば機能的に、時間的に、又は空間的にＣＤ２８のものから、及び互いに分離することができる。異なる共刺激因子によるＴ細胞活性化／生存シグナルの逐次的及び一時的な調節は、Ｔ細胞の生存の厳密な制御を維持しながら応答の長寿命を可能にするように機能し得る。疾患状態に応じて、共刺激ＴＮＦスーパーファミリーメンバーを介した刺激は、疾患を悪化させるか、又は改善する可能性がある。これらの複雑さにもかかわらず、ＴＮＦＲファミリー共刺激剤の刺激又は遮断は、がん、感染症、移植、及び自己免疫を含む幾つかの治療的適用に有望である。
【０００３】
幾つかの共刺激分子の中で、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーメンバーＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクター及び記憶Ｔ細胞の生存及び恒常性において重要な役割を果たしている（Croft M. et al. (2009), Immunological Reviews 229, 173-191）。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、幾つかのタイプの細胞で発現され、感染、腫瘍、及び自己抗原に対する免疫応答を調節し、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞並びに好中球の表面上でその発現が実証されており（Baumann R. et al. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 2268-2275）、種々の刺激シグナルに応答して厳密に誘導可能であるか、又は強力にアップレギュレートされることが示されている。分子の機能的活性は、あらゆるＯＸ４０発現細胞型において実証されており、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＯＸ４０媒介活性の複雑な制御を示唆している。Ｔ細胞受容体トリガー（T-cell receptor triggering）と組み合わせると、その天然リガンド又はアゴニスト抗体によるＴ細胞に対するＯＸ４０の関与は、ＰＩ３Ｋ及びＮＦκＢシグナル伝達経路の相乗的活性化をもたらしている（Song J. et al. (2008) J. Immunology 180(11), 7240-7248）。次に、これは増殖の亢進、サイトカイン受容体及びサイトカイン産生の増加、及び活性化Ｔ細胞のより良好な生存をもたらす。エフェクターＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるその共刺激活性に加えて、ＯＸ４０トリガーは、最近、Ｔ調節細胞の発達及び免疫抑制機能を阻害することが示されている。この効果は、少なくとも部分的に、抗腫瘍又は抗菌免疫応答に対するＯＸ４０の活性を増強することに関与する可能性が高い。ＯＸ４０の関与がＴ細胞集団を拡大し、サイトカイン分泌を促進し、Ｔ細胞記憶を支援し得ることを考えると、リガンドＯＸ４０Ｌの抗体及び可溶性形態を含むアゴニストは、様々な前臨床腫瘍モデルにおいて首尾よく使用されている（Weinberg et al. (2000), J. Immunol. 164, 2160-2169）。
【０００４】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの別の受容体であるグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体関連遺伝子（ＧＩＴＲ；ＴＮＦＲＳＦ１８）は、Ｔｒｅｇ及び活性化エフェクターＴ細胞のマーカーと考えられている（Petrillo et al. (2015), Autoimmun. Rev. 14, 117-26）。ＧＩＴＲトリガー（triggering）は、アポトーシス促進性作用及び抗アポトーシス性作用の両方を誘導し、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を無効にし、かつ、レスポンダーＴ細胞を共刺激し、後者の活性は免疫系を過度に刺激する（Nocentini et al. (2005), Eur. J. Immunol. 35, 1016-1022）。マウスＧＩＴＲに対するアゴニストモノクローナル抗体は、効果的に腫瘍特異的免疫を誘導し、マウス同系腫瘍モデルにおいて確立された腫瘍を減少させることが示されている（Ko et al. (2005), J. Exp. Med. 202, 885-891）。しかし、マウスとヒトのＧＩＴＲの間には構造的な違いがある。マウスＧＩＴＲは二量体であるが、ヒトＧＩＴＲは三量体である。この構造的複雑性に基づいて、抗ＧＩＴＲ抗体それ自体は貧弱なＧＩＴＲアゴニストであり、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化のためには、ＦｃＲエフェクター機能の増加が必要であることが示唆されている。従って、ＦｃＲエフェクター機能の増加とは無関係であり、それにもかかわらず三量体ヒトＧＩＴＲを活性化する能力が低い新しいフォーマットの抗ＧＩＴＲ抗体の提供が必要とされている。
【０００５】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、その発現がＴ細胞活性化によって誘導される分子として最初に同定されている（Kwon Y.H. and Weissman S.M. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1963-1967）。その後の研究は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球（Snell L.M. et al. (2011) Immunol. Rev. 244, 197-217又はZhang X.et al. (2010), J. Immunol. 184, 787-795）、ＮＫ細胞（Lin W. et al. (2008), Blood 112, 699-707）、ＮＫＴ細胞（Kim D.H. et al. (2008), J. Immunol. 180, 2062-2068）、単球（Kienzle G. and von Kempis J. (2000), Int. Immunol. 12, 73-82、又はSchwarz H. et al. (1995), Blood 85, 1043-1052）、好中球（Heinisch I.V. et al. (2000), Eur. J. Immunol. 30, 3441-3446）、肥満細胞（Nishimoto H. et al. (2005), Blood 106, 4241-4248）、及び樹状細胞、並びに非造血起源の細胞、例えば内皮細胞及び平滑筋細胞（Broll K. et al. (2001), Am. J. Clin. Pathol. 115, 543-549又はOlofsson P.S. et al. (2008), Circulation 117, 1292-1301）におけるにおける４−１ＢＢの発現を実証した。異なる細胞型における４−１ＢＢの発現は、主に誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガー、並びに炎症誘発性サイトカインの共刺激分子又は受容体を介して誘導されるシグナル伝達などの様々な刺激シグナルによって駆動される（Diehl L. et al. (2002), J. Immunol. 168, 3755-3762; von Kempis J. et al. (1997), Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406; Zhang X.et al. (2010), J. Immunol. 184, 787-795）。
【０００６】
ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＮＫ細胞のＩＦＮ分泌及び増殖を刺激するだけでなく（Buechele C. et al. (2012), Eur. J. Immunol. 42, 737-748; Lin W. et al. (2008), Blood 112, 699-707; Melero I. et al. (1998), Cell Immunol. 190, 167-172）、それらの生存の増加及びを分泌する能力及び共刺激分子のアップレギュレーションによって示されるＤＣ活性化を促進することが知られている（Choi B. K. et al. (2009), J. Immunol. 182, 4107-4115; Futagawa T. et al. (2002), Int. Immunol. 14, 275-286; Wilcox R. A. et al. (2002), J. Immunol. 168, 4262-4267）。しかし、ＣＤ１３７は、Ｔ細胞のＣＤ４＋サブセット及びＣＤ８＋サブセットの両方においてＴＣＲ誘導活性化を調節する共刺激分子として最もよく特徴づけられる。ＴＣＲトリガーと組み合わせて、アゴニスト４−１ＢＢ特異的抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Snell L.M. et al. (2011) Immunol. Rev. 244, 197-217）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞に対する４−１ＢＢ抗体のこれらの共刺激効果に沿って、腫瘍担持マウスへのそれらの投与は、多くの実験的腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍効果をもたらす（Melero I. et al. (1997), Nat. Med. 3, 682-685; Narazaki H. et al. (2010), Blood 115, 1941-1948）。Ｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇実験は、４−１ＢＢ特異的抗体の抗腫瘍効果において、ＣＤ８＋Ｔ細胞が最も重要な役割を果たすことを実証した。しかし、腫瘍モデル又は抗４−１ＢＢを含む併用療法に依存して、ＤＣ、ＮＫ細胞又はＣＤ４＋  Ｔ細胞などの他の型の細胞の寄与が報告されている（Melero et al., 2009; Murillo et al., -2436; Narazaki et al., 2011; Stagg et al., 108）。
【０００７】
異なるリンパ球サブセットに対するそれらの直接的な効果に加えて、４−１ＢＢアゴニストはまた、腫瘍血管内皮上の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）及び血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）の４−１ＢＢ媒介性アップレギュレーションを介して、腫瘍における活性化Ｔ細胞の浸潤及び保持を誘導することもできる（Palazon A. et al. (2011), Cancer Res. 71, 801-811）。４−１ＢＢトリガーはまた、腫瘍微小環境又は慢性感染の際の免疫寛容の破壊に寄与し得る可溶性抗原への曝露によって誘導されるＴ細胞アネルギーの状態を逆転させ得る（Wilcox R.A. et al. (2004), Blood 103, 177-184）。
【０００８】
これは、ＴＮＦＲ−スーパーファミリーの他のアポトーシス誘導性又は免疫調節性メンバーに特異的なアゴニスト抗体について記載されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの４−１ＢＢアゴニスト抗体の免疫調節特性は、抗体分子上の野生型Ｆｃ部分の存在を必要とし、それにより、そのような試薬の薬理学的活性に必要な重要な事象としてのＦｃ受容体結合を示唆していると思われる（Li F. and Ravetch J.V. (2011), Science 333, 1030-1034; Teng M.W. et al. (2009), J. Immunol. 183, 1911-1920）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを有する４−１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与はまた、マウスにおいて機能的Ｆｃ受容体が存在しない場合に、減少されるか又は有意に改善される肝臓毒性に関連するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導し得る（Dubrot J. et al. (2010), Cancer Immunol. Immunother. 59, 1223-1233）。ヒト臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ， ＮＣＴ００３０９０２３）では、３週間に１回１２週間投与されたＦｃ−コンピテント４−１ＢＢアゴニスト抗体（ＢＭＳ−６６３５１３）は、メラノーマ、卵巣癌、又は腎細胞癌の患者の疾患の安定化を誘導した。しかし、別の試験（ＮＣＴ００６１２６６４）で与えられた同じ抗体は、試験の終了につながるグレード４の肝炎を引き起こした（Simeone E. and Ascierto P.A. (2012), J. Immunotoxicology 9, 241-247）。よって、４−１ＢＢを造血細胞及び内皮細胞の表面に効果的に結合させるだけでなく、制御不能な副作用を回避するためにＦｃ受容体への結合以外の機構によっても達成することができる新世代アゴニストが必要とされている。
【０００９】
利用可能な前臨床及び臨床データは、がんに対する効果的な内因性免疫応答を誘導し、増強することができるＯｘ４０及び４−１ＢＢのような共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの有効なアゴニストに対する高い臨床的必要性が存在することを明らかに実証している。しかし、その影響は単一の細胞型に限定されることはほとんどなく、また単一の機構を介して作用することはほとんどなく、細胞間及び細胞内のシグナル伝達機構を解明するために設計された研究は、複雑さのレベルの増加を明らかにしている。従って、好ましくは単一細胞型に作用する「標的化」アゴニストの必要性が存在する。本発明の抗原結合分子は、腫瘍特異的又は腫瘍関連標的への好ましい結合が可能な部分を、共刺激ＴＮＦ受容体へのアゴニスト結合が可能な部分と組み合わせる。本発明の抗原結合分子は、効果的にだけでなく、所望の部位で極めて選択的にＴＮＦ受容体をトリガーすることができ、それによって望ましくない副作用を低減することができる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、すなわち共刺激ＴＮＦ受容体を標的とする４つの抗原結合部位を、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、すなわち標的細胞抗原を標的とする少なくとも１つの抗原結合部位と組み合わせる二重特異性抗原結合分子に関する。これらの二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に対する結合能力のために、標的細胞抗原が発現される部位で共刺激ＴＮＦ受容体を好ましくは活性化するので、有利である。
【００１１】
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
【００１２】
一態様では、本発明は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつが互いに融合している二重特異性抗原結合分子を提供する。任意選択的に、それらはペプチドリンカーを介して互いに融合される。特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつは互いに融合され、Ｃ末端でＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端に融合され、任意選択的に、それらはペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端にＣ末端で連結される。
【００１３】
特定の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、分子は２つの重鎖を含み、重鎖の各々は共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つの部分の可変ドメインと、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分の可変ドメインとを含む。
【００１４】
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分（ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０、４−１ＢＢ及びＧＩＴＲからなる群から選択される）、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
【００１５】
一態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーはＯＸ４０である。従って、特定の態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
【００１６】
更なる態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ｉ）配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、及び配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
【００１８】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分の各々は、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
【００１９】
別の態様では、二重特異性抗原結合分子は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分（ここで、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される）、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。より具体的には、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【００２０】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４１及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号４３及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号４５及び配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４７及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含む。
【００２１】
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００２２】
従って、更なる態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００２３】
別の態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは４−１ＢＢである。従って、特定の態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、配列番号２３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
【００２４】
特定の態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分の各々は、
（ｉ）配列番号２４９及び配列番号２５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２５１及び配列番号２５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、及び配列番号２５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号２５８及び配列番号２５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２６０及び配列番号２６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、及び配列番号２６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む。
【００２５】
更なる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、及び配列番号２７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、及び配列番号２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
【００２６】
更なる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分の各々は、
（ｉ）配列番号２６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号２７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖ）配列番号２７５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
【００２７】
従って、更なる態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、及び配列番号２７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、及び配列番号２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００２８】
更に別の態様では、本発明は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーがＧＩＴＲである、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子を提供する。従って、特定の態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、配列番号３５７のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
【００２９】
一態様では、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる４つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分の各々は、配列番号３７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号３７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号３７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号３７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【００３０】
更なる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号３８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
【００３１】
特定の態様では、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号３８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【００３２】
別の特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、
（ｉ）ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号３８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００３３】
一態様では、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分は、Ｆａｂ断片、クロスＦａｂ断片、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗原結合ドメイン、及び単一ドメイン抗体（例えば、ａＶＨ）からなる群から選択される抗体断片である。
【００３４】
別の態様では、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分は、Ｆａｂ断片であり、そのうちの２つずつは互いに連結している。
【００３５】
更なる態様では、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片は、ＣＨ１ドメインのＣ末端で、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片のＶＨドメインに融合され、かつ、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片は、ＣＨ１ドメインのＣ末端で、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第４のＦａｂ断片のＶＨドメインに、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合される。
【００３６】
別の態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができるＦａｂ断片では、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される。
【００３７】
更なる態様では、本発明は本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である。
【００３８】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分はＶＨ及びＶＬドメインを含み、ＶＨドメインはペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に連結され、ＶＬドメインはペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に連結される。
【００３９】
別の態様では、本発明は、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。具体的には、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む。より具体的には、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００４０】
別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【００４１】
更に、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して二価である。
【００４２】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分は、Ｆａｂ断片又はクロスオーバーＦａｂ断片である。
【００４３】
更なる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ断片又はクロスオーバーＦａｂ断片の各々が、ＶＨ又はＶＬドメインのＮ末端でペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＣ末端に融合される。
【００４４】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分はＶＨ−ＶＬクロスオーバーＦａｂ断片であり、各々がＶＬドメインのＮ末端でペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＣ末端に融合される。
【００４５】
より具体的には、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記抗原結合分子は、（ｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２２６の第１の軽鎖及び配列番号２２８の第２の軽鎖、又は（ｉｉ）配列番号２２４のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２２６の第１の軽鎖及び配列番号２２５の第２の軽鎖を含む。
【００４６】
更に別の態様では、本発明は、Ｆｃドメインがアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスである二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は更に、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターと、本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞とを提供する。幾つかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００４８】
別の態様では、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子を産生する方法であって、（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程を含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって産生される、二重特異性抗原結合分子、又はＯＸ４０に特異的に結合する抗体、又は４−１ＢＢに特異的に結合する抗体若しくはＧＩＴＲに特異的に結合する抗体を包含する。
【００４９】
本発明は更に、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００５０】
また、本発明には、医薬としての使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物が包含される。
【００５１】
一態様では、
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
（ｉｉｉ）感染症の治療における、
（ｉｖ）がんの治療における、
（ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、又は
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける
使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物が提供される。
【００５２】
特定の実施態様では、がんの治療における使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。別の特定の態様では、本発明は、がんの治療における使用のための、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、二重特異性抗原結合分子は、化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与される。
【００５３】
更なる態様では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害するために、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００５４】
また、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、特に、がんの治療のための医薬の製造のための、本発明の二重特異性抗原結合分子の使用、並びに薬学的に許容される形態の本発明の二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む個体における疾患を治療する方法が提供される。特定の態様では、疾患はがんである。上記の態様の何れかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１Ａは、ＴＮＦ受容体抗体の調製に使用されたＦｃ結合ＴＮＦ受容体抗原の単量体形態を示す。図１Ｂは、ＴＮＦリガンドの存在下でのＴＮＦ受容体抗体の結合の試験（リガンドブロッキング特性）のために使用されたＣ末端のＨａタグを有する二量体ヒトＴＮＦ受容体抗原Ｆｃ融合分子を示す。実施例２．４に記載された実験の模式的な設定を図１Ｃに示す。
【図２】図２Ａ−２Ｄは、活性化ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞への抗ＯＸ４０抗体の結合を示す。ＯＸ４０は、休止ヒトＰＢＭＣ上に発現しない（図２Ａ及び２Ｃ）。ヒトＰＢＭＣの活性化後、ＯＸ４０はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でアップレギュレートされる（図２Ｂ及び２Ｄ）。ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞よりも低い。示されたクローンは、ＯＸ４０陽性細胞に対する結合強度（ＥＣ５０値並びにシグナル強度）が異なった。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。全てのＯＸ４０クローンは、活性化ＯＸ４０発現ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合し、より低い程度で活性化ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合する。
【図３】図３Ａ−３Ｄは、活性化マウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞への抗ＯＸ４０抗体の結合を示す。ＯＸ４０は休止マウス脾細胞では検出されなかった（図３Ａ及び３Ｃ）。活性化後、ＯＸ４０はＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上でアップレギュレートされる（図３Ｂ及び３Ｄ）。マウス脾細胞を、６−８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られた機械的にホモジナイズした脾臓のＡＣＫ溶解緩衝液による赤血球溶解によって単離した。抗ＯＸ４０抗体の細胞表面タンパク質への結合は、ＦＡＣＳ分析を用いて、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的二次抗体を用いて検出した。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。クローン２０Ｂ７のみが、活性化されたＯＸ４０発現マウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合するが、休止Ｔ細胞には結合しない。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、それぞれカニクイザルの活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞に対する抗ＯＸ４０抗体の結合を示す。示されたクローンは、ＯＸ４０陽性活性化カニクイザルＣＤ４＋  Ｔ細胞に対する結合強度（ＥＣ５０値並びにシグナル強度）が異なった。活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＯＸ４０発現はこの条件下では低く、選択されたクローンの任意の結合はほとんど見出されなかった。抗ＯＸ４０抗体の細胞表面タンパク質への結合は、ＦＡＣＳ分析を用いて、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的二次抗体を用いて検出した。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。全てのＯＸ４０クローンは、活性化ＯＸ４０発現カニクイザルＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合し、より低い程度で活性化カニクイザルＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合する。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、ＯＸ４０陰性腫瘍細胞への結合の欠如を示す。示されたクローンは、ＯＸ４０陰性Ｕ−７８ ＭＧ（図５Ａ）及びＷＭ２６６−４腫瘍細胞（図５Ｂ）への結合を示さなかった。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。ＩｇＧフォーマットの全てのクローンは、ＯＸ４０陰性腫瘍細胞に結合しない。結合は、活性化された白血球上のＯＸ４０に特異的である。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、表面プラズモン共鳴によって測定した、抗Ｏｘ４０抗体８Ｈ９（図６Ａ）、Ｂ７（図６Ｂ）、１Ｇ４（図６Ｃ）、４９Ｂ４（図６Ｄ）、ＣＬＣ−５６３（図６Ｅ）、及びＣＬＣ−５６４（図６Ｆ）と、予め形成された複合体ｈｕＯｘ４０リガンド／ｈｕＯｘ４０−Ｆｃとの間の相互作用を示す。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞に対する本発明の抗ヒトＯＸ４０抗体の効果を示す。示されているのは、二次抗体による架橋あり（図７Ｂ）又は架橋なし（図７Ａ）のＰ３２９ＧＬＡＬＡ  ｈｕＩｇＧ１フォーマットにおける種々の抗ＯＸ４０バインダーを用いた、レポーター細胞株におけるＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化である。レポーター細胞を、架橋二次ポリクローナル抗ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２断片を１：２の比で含む又は含まない、示された濃度の抗ＯＸ４０構築物の存在下で６時間培養した。活性は、試験した抗Ｏｘ４０構築物のｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロットすることによって特徴づけられる。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。全てのクローンは、ＯＸ４０軸がヒトＯＸ４０＋レポーター細胞株において誘発される場合にＮＦκＢ活性化を誘導することができる。従って、全てのクローンはアゴニスト的であり、用量依存的に活性化する。二次Ｆｃ部分特異的抗体（Ａｂ）による架橋は、このアゴニズムを強く増加させる。
【図８】図８Ａ〜８Ｆは、事前活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞における抗ヒトＯＸ４０抗体の生物活性を示す。プレート固定化抗ＯＸ４０バインダー（ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）による共刺激は、最適以下に再刺激されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞の細胞増殖及び成熟を促進し、増強された活性化表現型を誘導した。ＰＨＡ−Ｌで事前活性化されたＣＦＳＥ標識ヒトＣＤ４  Ｔ細胞を、マウスＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体、ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（２μｇ／ｍＬ）、マウス抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、３ｎｇ／ｍＬ）、及び滴定抗Ｏｘ４０バインダー（ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）をプレコートしたプレート上で４日間培養した。示されるのは、４日目での、事象数、増殖性（ＣＦＳＥ低）細胞の割合、エフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７低／ＣＤ４５ＲＡ低）の割合、及びＣＤ６２Ｌ低、ＯＸ４０陽性又はＴｉｍ−３陽性細胞の割合である。プレート固定化抗ヒトＣＤ３のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、Ｏｘ４０刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激そのものの効果は目に見えない。全てのクローンは、プレートにコーティングされたときに、ＯＸ４０陽性の事前活性化ＣＤ４  Ｔ細胞において最適以下のＴＣＲ刺激を支持することができる。細胞はより生き残り、より多く増殖する。腫瘍の微小環境において、これはＴ細胞の抗腫瘍活性の増加につながり得る。
【図９】図９は、各クローンのアゴニスト能力のマーカーとしてのＥＣ５０値（全てのバイオマーカーについて）をまとめたものである（値は図８Ａ−８Ｆに示す曲線から計算された）。効力は左から右に向かって増加する。４日目の事象数、増殖性（ＣＦＳＥ低）細胞の割合、及びＣＤ６２Ｌ低、ＣＤ４５ＲＡ低又はＴｉｍ−３陽性細胞の割合を抗Ｏｘ４０抗体濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）における組み込みシグモイド用量応答引用を用いてＥＣ５０値を計算した。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｆは、溶液中の事前活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞における抗ヒトＯＸ４０抗体の生物活性を示す。最適以下に再刺激されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞の細胞増殖、成熟又は活性化状態に対する効果は、抗Ｏｘ４０バインダー（ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）のプレート固定化の非存在下では検出されなかった。ＰＨＡ−Ｌで事前活性化されたＣＦＳＥ標識ヒトＣＤ４  Ｔ細胞を、マウスＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（２μｇ／ｍＬ）及びマウス抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、３ｎｇ／ｍＬ）をプレコートしたプレート上で４日間培養した。滴定した抗Ｏｘ４０バインダー（ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）を培地に添加し、実験を通して溶液中に存在させた。示されるのは、４日目での、事象数、増殖性（ＣＦＳＥ低）細胞の割合、エフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７低  ＣＤ４５ＲＡ低）の割合、及びＣＤ６２Ｌ低、ＯＸ４０陽性又はＴｉｍ−３陽性細胞の割合である。プレート固定化抗ヒトＣＤ３のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激そのものの効果は目に見えない。強い架橋がない場合、改善されたＴＣＲ刺激はない（溶液中のＰ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）。従って、架橋は、二価のａＯｘ４０フォーマットがＴ細胞に対してアゴニスト的であるために不可欠である。この架橋は、腫瘍又は腫瘍間質細胞の細胞表面上に発現されるＦＡＰによって、標的化フォーマットで提供されるであろう。
【図１１】図１１は、異なる抗ＯＸ４０クローンの結合強度とアゴニスト能力との間の相関を示す。活性化ＣＤ４  Ｔ細胞上の抗ＯＸ４０クローン（ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）の結合を、実施例２．１．２に記載のように実施した。プラトー値は、クローン８Ｈ９（ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）で得られた値に正規化した。抗Ｏｘ４０クローン（ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）の生物活性試験を実施例３．２に記載のように行い、ＰＤ−１発現のプラトー値をクローン８Ｈ９（ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）について得られた値に正規化した。正規化された結合を正規化された生物活性に対してプロットして、結合強度とアゴニスト能力との間の相関を試験した。ほとんどのクローンについて、直接相関があった（線形回帰が示され、ｐ値０．９６；勾配０．９１）。しかし、２つのクローン（４９Ｂ４，１Ｇ４）は、それらの結合強度から予測できる、より強い生物活性を示した。低い結合能の面で予想外に高いアゴニスト効力を示すこのサブグループのクローンは、本発明の二重特異性抗原結合分子にとって特に重要である。
【図１２】図１２Ａには、本発明の例示的な二重特異性二価抗原結合分子（２＋２フォーマット）の概略図が示される。図１２Ｂは、本発明の例示的な二重特異性一価抗原結合分子（１＋１フォーマット）の概略図を示す。図１２Ｃには、固定化ヒトＯＸ４０及びヒトＦＡＰに対する同時結合を示すＳＰＲ実験のための設定が示されている。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｄは、二重特異性二価２＋２構築物（分析物１）の固定化ヒトＯＸ４０及びヒトＦＡＰ（分析物２）への同時結合のＳＰＲ図を示す。ＳＰＲ図は、ＯＸ４０クローンの８Ｈ９（図１３Ａ）、４９Ｂ４（図１３Ｂ）、１Ｇ４（図１３Ｃ）及び２０Ｂ７（図１３Ｄ）を有する２＋２構築物について示されている。図１３Ｅ−１３Ｈには、固定化ヒトＯｘ４０及びヒトＦＡＰ（分析物２）に対する二重特異性一価１＋１構築物（分析物１）の同時結合が示される。ＳＰＲ図は、ＯＸ４０クローンの８Ｈ９（図１３Ｅ）、４９Ｂ４（図１３Ｆ）、１Ｇ４（図１３Ｇ）及び２０Ｂ７（図１３Ｈ）を有する１＋１構築物について示されている。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｈは、休止及び活性化ヒトＰＢＭＣに対するＦＡＰ標的化一価又は二価フォーマットの選択された抗ＯＸ４０バインダー（クローン８Ｈ９、１Ｇ４）の結合を示す。ＯＸ４０陽性Ｔ細胞（図１４Ｂ及び１４Ｄ及び図１４Ｅ及び１４Ｆ）に対する結合特性は、従来の二価ｈｕ  ＩｇＧフォーマット（白四角）及びＦＡＰ標的化二価フォーマット（黒四角）のクローンに匹敵した。ＦＡＰ標的化一価フォーマット（黒三角）の同じクローンの結合は、アビディティー結合の喪失に起因して明らかに弱かった。ヒトＯＸ４０発現細胞の非存在下では、結合を観察することはできない（休止細胞、図１４Ａ及び１４Ｃ、図１４Ｇ及び１４Ｈ）。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。図１４Ｄでは、クローンＩＧ４は活性化ＯＸ４０発現ヒトＣＤ４  Ｔ細胞に結合し、より低い程度で活性化ヒトＣＤ８  Ｔ細胞に結合することが分かる。二価構築物は、一価構築物よりも強く結合する。構築物は、ＯＸ４０陰性休止Ｔ細胞に結合しない。図１４Ｅは、クローン８Ｈ９は活性化Ｏｘ４０発現ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合し、より低い程度で活性化ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合することを示す。二価構築物は、一価構築物よりも強く結合する。構築物は、Ｏｘ４０陰性休止Ｔ細胞に結合しない。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、ＦＡＰ標的化一価又は二価フォーマットの選択された抗ＯＸ４０バインダー（クローン８Ｈ９，１Ｇ４）のＦＡＰ陽性腫瘍細胞に対する結合を示す。トランスジェニック改変マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９又はＷＭ２６６−４細胞は、高レベルのヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を発現する。ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの同じクローン（白四角）ではなく、ＦＡＰ標的化一価及び二価抗Ｏｘ４０構築物（黒四角形及び三角形）のみが、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞（図１５Ａ）及びＷＭ２６６−４細胞（図１５Ｂ）のそれぞれに結合する。示されるのは、二次検出抗体として使用されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩはフローサイトメトリーによって測定された。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。二価ＦＡＰ構築物は、一価構築物よりも強く結合する。
【図１６】図１６Ａには、標的細胞抗原に対する一価性を有する本発明の例示的な二重特異性四価抗原結合分子（４＋１フォーマット）の概略図が示される。図１６Ｂは、標的細胞抗原に対する二価性を有する本発明の例示的な二重特異性四価抗原結合分子（４＋２フォーマット）の概略図を示す。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの抗ＯＸ４０バインダー（クローン４９Ｂ４）のヒトＦＡＰ陽性ＷＭ２６６−４細胞への結合を示す。ＷＭ２６６−４細胞は、高レベルのヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を発現する。非標的化４９Ｂ４構築物（白丸、四角及び三角）でなく、ＦＡＰ標的化一価及び二価の二重特異性４９Ｂ４構築物（黒丸、四角及び三角）のみが、ＷＭ２６６−４細胞に結合した。示されるのは、二次検出抗体として使用されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩはフローサイトメトリーによって測定された。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｄは、異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの抗ＯＸ４０バインダー（クローン４９Ｂ４）の休止及び活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞への結合を示す。ＯＸ４０は、休止ヒトＣＤ４  Ｔ細胞上に発現しない（図１８Ａ及び１８Ｃ）。ヒトＯＸ４０発現細胞の非存在下では、結合は観察されなかった。ヒトＰＢＭＣの活性化後、ＯＸ４０はＣＤ４＋  Ｔ細胞上でアップレギュレートされる（図１８Ｂ及び１８Ｄ）。バインダー４９Ｂ４を含有する全ての構築物は、Ｏｘ４０＋活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合した。四価ＯＸ４０結合（丸及び四角）は、ＯＸ４０へのアビディティーを強く増加させたが、ＦＡＰ結合部分の存在は影響を及ぼさなかった（白い記号対黒い記号を比較）。比較して、両方の二価構築物（三角形）は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞へのより弱い結合を示した。二価の二重特異性構築物におけるクローン４９Ｂ４の結合は、従来のＩｇＧフォーマットのものより明らかに強力であった。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｄは、異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの抗ＯＸ４０バインダー（クローン４９Ｂ４）の休止及び活性化ヒトＣＤ８  Ｔ細胞への結合を示す。ＯＸ４０は、休止ヒトＣＤ８  Ｔ細胞上に発現しない（図１９Ａ及び１９Ｃ）。ヒトＯＸ４０発現細胞の非存在下では、結合は観察されなかった。ヒトＰＢＭＣの活性化後、ＯＸ４０はＣＤ８＋  Ｔ細胞上でアップレギュレートされる（図１９Ｂ及び１９Ｄ）。ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞よりも低く、ドナーと時間点の間で変化する。ＯＸ４０の発現は、示されたＣＤ８  Ｔ細胞上で低かった。バインダー４９Ｂ４を含有する全ての構築物は、ＯＸ４０＋活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合した。四価ＯＸ４０結合（丸及び四角）は、ＯＸ４０へのアビディティーを強く増加させたが、ＦＡＰ結合部分の存在は影響を及ぼさなかった（白い記号対黒い記号を比較）。比較して、両方の二価構築物（三角形）は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞へのより弱い結合を示した。二価の二重特異性構築物におけるクローン４９Ｂ４の結合は、従来のＩｇＧフォーマットのものより明らかに強力であった。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｄは、異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの抗Ｏｘ４０バインダー４９Ｂ４の活性化カニクイザルＴ細胞への結合を示す。示された構築物は、ＯＸ４０陽性活性化カニクイザルＣＤ４＋  Ｔ細胞に対する結合強度（ＥＣ５０値）が異なった。四価のＯＸ４０結合部分を有する構築物は、二価の構築物よりも強いＯＸ４０＋  Ｔ細胞への結合を示した。ＯＸ４０への四価結合と二価結合との間のアビディティーの増加は、ヒトＯＸ４０について観察されたものよりも強かった。活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞上の発現はこの条件下では低く、弱い結合のみが見出された。抗ＯＸ４０抗体の細胞表面タンパク質への結合は、ＦＡＣＳ分析を用いて、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的二次抗体を用いて検出した。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。
【図２１】図２１Ａは、細胞ベースのＦＲＥＴアッセイにおけるヒトＯＸ４０競合結合の結果を示す。図２１Ｂには、固定化ヒトＯＸ４０及びヒトＦＡＰに対する同時結合を示すＳＰＲ実験のための設定が示されている。
【図２２】図２２Ａ、２２Ｂ及び２２Ｃは、二重特異性四価４＋１構築物（分析物１）の固定化ヒトＯＸ４０及びヒトＦＡＰ（分析物２）への同時結合のＳＰＲ図を示す。構築物４＋１（４９Ｂ４／２８Ｈ１）（図２２Ａ）及び４＋１（４９Ｂ４／４Ｂ９）（図２２Ｂ）は同時結合を示したが、構築物４＋１（４９Ｂ４／ＤＰ４７）はＯＸ４０への結合のみを示した。図２２Ｄには、二重特異性四価４＋２構築物（４９Ｂ４／２８Ｈ１）（分析物１）の固定化ヒトＯｘ４０及びヒトＦＡＰ（分析物２）への同時結合が示される。構築物４＋２（４９Ｂ４／ＤＰ４７）は同時結合を示さなかった（図２２Ｅ）。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｄは、異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの抗ＯＸ４０バインダー（クローン４９Ｂ４）のヒトＦＡＰヒトＯＸ４０陰性Ａ５４９細胞への結合に関する。示された構築物は、ＯＸ４０陰性ＦＡＰ陰性Ａ５４９腫瘍細胞への結合を示さなかった。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。比較のために、ヒトＦＡＰ陽性ＷＭ２６６−４細胞への結合のグラフを右の列に示す。ＷＭ２６６−４細胞は、高レベルのヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を発現する。示されるのは、二次検出抗体として使用されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩはフローサイトメトリーによって測定された。ｘ軸は、抗体構築物の濃度を示す。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｄは、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞における異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの抗ＯＸ４０バインダー（クローン４９Ｂ４）によるＮＦκＢ活性化を示す。示されているのは、二次抗体による架橋あり（図２４Ｂ及び２４Ｄ）又は架橋なし（図２４Ａ及び２４Ｄ）の異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ９を用いた、レポーター細胞株におけるＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化である。レポーター細胞を、架橋二次ポリクローナル抗ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２断片を１：２の比で含む又は含まない、示された濃度の抗ＯＸ４０構築物の存在下で６時間培養した。ＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、試験した化合物のｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロットすることによって特徴づけられた。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。四価構築物は、二価構築物よりもわずかに良好に機能した。
【図２５−２６】ＦＡＰ陽性細胞の存在下でのＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞における異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットにおける抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４によるＮＦκＢの活性化を図２５Ａ−図２５Ｆ及び図２６Ａ−２６Ｃに示す。示されるのは、低ＦＡＰ発現ＷＭ２６６−４細胞（図２５Ａ−２５Ｃ）、中程度ＦＡＰ発現ＮＩＨ−３Ｔ３ヒトＦＡＰ細胞（図２５Ｄ−２５Ｆ）及び高ＦＡＰ発現ＮＩＨ−３Ｔ３マウスＦＡＰ細胞（図２６Ａ−２６Ｃ）の存在下における、異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４によるレポーター細胞におけるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化である（比率は４つのＦＡＰ＋腫瘍細胞対１つのレポーター細胞）。ＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、試験した化合物のｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロットすることによって特徴づけられた。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。値は、ブランクコントロールのＵＲＬを差し引くことによってベースライン補正する。全てのフォーマットのより良い比較のために、それぞれのブロットされた用量応答曲線の曲線下の面積を、各構築物のアゴニスト能力のマーカーとして定量した。面積は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。値は、ブランクコントロールの値を差し引くことによってベースライン補正する。全ての構築物は、Ｏｘ４０＋  ＨｅＬａレポーター細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導することができた。しかし、ＦＡＰ陽性細胞の添加による架橋は、ＦＡＰ標的化分子のアゴニスト潜在能力のみを増加させたが、非標的化コントロール分子のアゴニスト能力は増加させなかった。四価構築物は、二価構築物よりも良好に機能した。より高いＦＡＰ発現は、より良好な架橋をもたらし、従って、ＯＸ４０アゴニズムを更に増加させた。
【図２７】プレート固定化ＦＡＰ標的化一価及び二価抗ＯＸ４０（４９Ｂ４）構築物による事前活性化ＣＤ４  Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ再刺激のレスキューを図２７Ａ〜２７Ｈに示す。プレート固定化抗Ｏｘ４０構築物による共刺激は、最適以下に再刺激されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞の細胞増殖及び成熟を促進し、増強された活性化表現型を誘導した。ＰＨＡ−Ｌで事前活性化されたＣＦＳＥ標識ヒトＣＤ４  Ｔ細胞を、マウスＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体、ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（２μｇ／ｍＬ）、マウス抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、３ｎｇ／ｍＬ）、及び滴定抗Ｏｘ４０構築物をプレコートしたプレート上で４日間培養した。示されるのは、４日目での、事象数、増殖性（ＣＦＳＥ低）細胞の割合、エフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７低  ＣＤ４５ＲＡ低）の割合、及びＣＤ６２Ｌ低、ＯＸ４０陽性又はＴｉｍ−３陽性細胞の割合である。プレート固定化抗ヒトＣＤ３のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激そのものの効果は目に見えない。図２７Ａ〜２７Ｈでは、全てのＯＸ４０構築物は、プレートにコーティングされた場合、事前活性化されたＯｘ４０＋ ＣＤ４  Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューすることができたことが分かる。細胞は生存し、増殖はより良好であった。全ての四価構築物は、互いに匹敵し、プレートにコーティングした場合、二価構築物より良好に機能した。
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｄでは、溶液中の抗ＯＸ４０構築物は、事前活性化されたＣＤ４  Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ再刺激を変化させなかったことが示されている。最適以下に再刺激されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞の細胞増殖及び成熟に対する効果は、抗ＯＸ４０構築物（ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）のプレート固定化の非存在下では検出されなかった。ＰＨＡ−Ｌで事前活性化されたＣＦＳＥ標識ヒトＣＤ４  Ｔ細胞を、マウスＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（２μｇ／ｍＬ）及びマウス抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、３ｎｇ／ｍＬ）をプレコートしたプレート上で４日間培養した。滴定した抗ＯＸ４０構築物（ｈｕ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）を培地に添加し、実験を通して溶液中に存在させた。示されるのは、４日目の事象数及びエフェクターＴ細胞（ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡｌｏｗ）細胞の割合である。プレート固定化抗ヒトＣＤ３のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激そのものの効果は目に見えない。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｄは、最適以下にＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣのＯＸ４０媒介共刺激及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋に関する。非標的化四価抗Ｏｘ４０（４９Ｂ４）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（白四角）による共刺激は、最適以下にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞をレスキューしなかった。本発明のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ標的化二価及び四価抗Ｏｘ４０構築物の過架橋は、ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞における生存及び増殖を強く促進した。示されているのは、バイタルＣＤ４＋（図２９Ａ及び２９Ｂ）及びＣＤ８＋（図２９Ｃ及び２９Ｄ）Ｔ細胞の事象数である。抗ヒトＣＤ３（クローンＶ９、ｈｕＩｇＧ１）、休止ヒトＰＢＭＣ及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０共刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激自体の効果は示されていない。標的化四価構築物は、二価構築物よりも優れていた。ＦＡＰ陽性腫瘍の微小環境では、これは全身のＯＸ４０活性化の非存在下でのＴ細胞の抗腫瘍活性の増加をもたらし得る。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｄは、増殖段階における細胞表面固定化ＦＡＰ標的化四価抗Ｏｘ４０（４９Ｂ４）構築物による休止ヒトＰＢＭＣの最適以下のＴＣＲ刺激のレスキューに関する。非標的化四価抗Ｏｘ４０（４９Ｂ４）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（白四角）による共刺激は、最適以下にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞をレスキューしなかった。本発明のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ標的化二価及び四価抗Ｏｘ４０構築物の過架橋は、ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞における生存及び増殖を強く促進した。示されているのは、ＣＦＳＥ低のバイタルＣＤ４＋（図３０Ａ及び３０Ｂ）及びＣＤ８＋（図３０Ｃ及び３０Ｄ）Ｔ細胞の割合である。抗ヒトＣＤ３（クローンＶ９、ｈｕＩｇＧ１）、休止ヒトＰＢＭＣ及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０共刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激自体の効果は示されていない。標的化四価構築物は、二価構築物よりも優れていた。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｄは、活性化表現型ＣＤ２５を増強することによる細胞表面固定化ＦＡＰ標的化四価抗Ｏｘ４０（４９Ｂ４）構築物による休止ヒトＰＢＭＣの最適以下のＴＣＲ刺激のレスキューを示す。非標的化四価抗Ｏｘ４０（４９Ｂ４）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（白四角）による共刺激は、最適以下にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞をレスキューしなかった。本発明のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ標的化二価及び四価抗Ｏｘ４０構築物の過架橋は、ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞における活性化表現型を強く増強した。示されているのは、ＣＤ２５陽性のバイタルＣＤ４＋（図３１Ａ及び３１Ｂ）及びＣＤ８＋（図３１Ｃ及び３１Ｄ）Ｔ細胞の割合である。抗ヒトＣＤ３（クローンＶ９、ｈｕＩｇＧ１）、休止ヒトＰＢＭＣ及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９のみを含有する試料のベースライン値を差し引いた。従ってここでは、ＯＸ４０共刺激の増強効果は示されるが、最適以下の抗ＣＤ３刺激自体の効果は示されていない。標的化四価構築物は、二価構築物よりも良好に機能した。
【図３２】図３２Ａ〜図３２Ｃに要約を示す。本発明のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ標的化二価及び四価抗ＯＸ４０構築物の過架橋は、ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞における活性化表現型を強く増強し、生存と増殖を持続させた。全てのフォーマットのより良い比較のために、図２９Ａ〜図２９Ｄ、図３０Ａ〜図３０Ｄ及び図３１Ａ〜図３１Ｄのそれぞれのブロットされた用量応答曲線の曲線下の面積を、各構築物のアゴニスト能力のマーカーとして定量した。面積は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。値は、ブランクコントロールの値を差し引くことによってベースライン補正する。ＦＡＰ結合部分を含む構築物のみが、架橋がＦＡＰ陽性細胞（ＮＩＨ）によって提供された場合、休止ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューすることができた。細胞は、より強い増殖、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び活性化（ＣＤ２５）を示した。標的化四価構築物は、二価構築物よりも優れていた。ＦＡＰ陽性腫瘍の微小環境では、これは全身のＯＸ４０活性化の非存在下でのＴ細胞の抗腫瘍活性の増加をもたらし得る。
【図３３】ＥＣ５０値の比較を表３３に示す。全てのフォーマットのより良い比較のために、図２９Ａ〜図２９Ｄ、図３０Ａ〜図３０Ｄ及び図３１Ａ〜図３１Ｄのそれぞれのブロットされた用量応答曲線のＥＣ５０値を、各構築物のアゴニスト能力のマーカーとして定量した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。標的化４＋１及び４＋２構築物が２＋２構築物よりも良好に機能したことを容易に見ることができる。
【図３４】図３４Ａ−３４Ｄは、ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡフォーマットに移された４つの抗ヒト４−１ＢＢ特異的クローン（黒菱形：クローン２５Ｇ７、黒四角：クローン１２Ｂ３、黒星：クローン１１Ｄ５、上向き三角：クローン９Ｂ１１）、及びｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡフォーマットに移された１つの抗マウス４−１ＢＢ特異的クローン２０Ｇ２（下向き三角）の休止及び活性化ヒトＴ細胞への結合を示す。陰性コントロールとして、非４−１ＢＢ特異的クローンＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体を用いた（灰色白抜きの丸）。上のパネルは休止ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図３４Ａ）及び活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図３４Ｂ）への結合を示し、下のパネルは休止ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図３４Ｃ）及び活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図３４Ｄ）を示す。結合は、試験された一次抗４−１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体のｎＭ濃度に対して、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識又はＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光の中央値（ＭＦＩ）をプロットすることによって特徴づけられた。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロール（一次抗体なし）のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。
【図３５】図３５Ａ−３５Ｄは、４−１ＢＢ発現マウスＴ細胞への結合を示す。４つの抗ヒト４−１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体クローン（黒菱形：クローン２５Ｇ７、黒四角：クローン１２Ｂ３、黒星：クローン１１Ｄ５、上向き三角：クローン９Ｂ１１）、及び１つの抗マウス４−１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体クローン２０Ｇ２（下向き三角）の休止及び活性化マウスＴ細胞への結合が示される。陰性コントロールとして、非４−１ＢＢ結合性ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体を用いた（灰色の白抜きの丸）。上のパネルは休止マウスＣＤ４＋  Ｔ細胞（図３５Ａ）及び活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図３５Ｂ）への結合を示し、下のパネルは休止マウスＣＤ８＋  Ｔ細胞（図３５Ｃ）及び活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図３５Ｄ）を示す。結合は、試験された一次抗４−１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体のｎＭ濃度に対して、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片のＭＦＩをプロットすることによって特徴づけられた。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロール（一次抗体なし）のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。
【図３６】図３６Ａ−３６Ｄは、４−１ＢＢ発現マウスＴ細胞へのマウスＩｇＧの結合を示す。マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧ及びマウスＩｇＧ１野生型（ｗｔ）のフォーマットに移された抗マウス４−１ＢＢ結合クローン２０Ｇ２の休止及び活性化マウスＴ細胞への結合を示す。陰性コントロールとして、市販の非４−１ＢＢ結合マウスＩｇＧ１  ｗｔアイソタイプコントロールを用いた（灰色白抜きの丸、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１５３）。上のパネルでは、休止ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図３６Ａ）及び活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図３６Ｂ）への結合が示され、下のパネルでは、休止ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図３６Ｃ）及び活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図３６Ｄ）への結合が示される。結合は、試験された一次抗４−１ＢＢ結合ｍｏＩｇＧ抗体のｎＭ濃度に対して、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をプロットすることによって特徴づけられた。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロール（一次抗体なし）のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。
【図３７】図３７Ａ及び３７Ｂは、４−１ＢＢ発現カニクイザルＴ細胞への結合を示す。４つの抗ヒト４−１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体クローン（黒菱形：クローン２５Ｇ７、黒四角：クローン１２Ｂ３、黒星：クローン１１Ｄ５、上向き三角：クローン９Ｂ１１）の活性化カニクイザルＴ細胞への結合が示される。陰性コントロールとして、非４−１ＢＢ結合性ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体を用いた（灰色の白抜きの丸）。示されているのは、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図３７Ａ）及び活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図３７Ｂ）のそれぞれへの結合である。結合は、試験された一次抗４−１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体のｎＭ濃度に対して、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をプロットすることによって特徴づけられた。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロール（一次抗体なし）のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。
【図３８】図３８Ａ−３８Ｅは、表面プラズモン共鳴によって決定される本発明の抗４−１ＢＢ抗体のリガンド結合特性を示す。ヒト抗４−１ＢＢ  ＩｇＧ  ２５Ｇ７（図３８Ａ）、１１Ｄ５（図３８Ｂ）、９Ｂ１１（図３８Ｃ）、及び１２Ｂ３（図３８Ｄ）と予め形成された複合体ｈｕ４−１ＢＢリガンド／ｈｕ４−１ＢＢとの間の相互作用、並びにマウス抗４−１ＢＢクローン２０Ｇ２（図３８Ｅ）と予め形成された複合体ｍｕ４−１ＢＢリガンド／ｍｕ４−１ＢＢとの相互作用が示されている。
【図３９】図３９Ａ−３９Ｄは、異なる抗ヒト４−１ＢＢクローンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能特性を示す。事前に活性化されたヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体の非存在下で（図３９Ａ及び３９Ｃ）又は表面固定化抗ヒトＣＤ３抗体の最適以下の濃度の存在下で（図３９Ｂ及び３９Ｄ）、異なる濃度の表面固定化抗ヒト４−１ＢＢ特異的ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体で活性化した。表面固定化４−１ＢＢ結合ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡのｐＭ濃度に対する、ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団全体におけるＩＦＮγ＋（Ａ及びＢ）及びＴＮＦα＋（Ｃ及びＤ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度が示されている。ＣＤ３刺激の存在下では、４−１ＢＢ共刺激はＩＦＮγ（図３９Ｂ）及びＴＮＦα（図３９Ｄ）の分泌を濃度依存的に増加させた。ＣＤ３刺激の非存在下では、４−１ＢＢの活性化はＩＦＮγ（図３９Ａ）及びＴＮＦα（図３９Ｃ）の分泌に影響を及ぼさなかった。
【図４０】図４０Ａでは、２つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片及び２つの抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片を含む、本発明の例示的な二重特異性二価抗原結合分子（２＋２フォーマット）の概略図を示す。図４０Ｂは、１つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片及び１つの抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片を含む、本発明の例示的な二重特異性一価抗原結合分子（１＋１フォーマット）の概略図を示す。図４０Ｃでは、２つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂ断片、及びＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメインを含む、本発明の例示的な二重特異性二価抗原結合分子（２＋１フォーマット）の概略図が示される。黒丸は、ノブ・イントゥー・ホール突然変異を象徴する。図４０Ｃに示される構築物において、ＦＡＰ抗体のＶＨドメインは、Ｆｃノブ重鎖のＣ末端に融合されるが、図４０Ｄに示される構築物では、ＦＡＰ抗体のＶＨドメインは、Ｆｃホール鎖のＣ末端に結合している。図４０Ｅ及び４０Ｆには、ＦＡＰに対して一価性を有する本発明の例示的な二重特異性四価抗原結合分子（４＋１フォーマット）の概略図が示される。
【図４１】図４１Ａ〜４１Ｄは、二重特異性抗４−１ＢＢ×抗ＦＡＰ抗原結合分子（４＋１構築物）の同時結合を示す。図４１Ａでは、アッセイの設定が示される。図４１Ｂ〜４１Ｄには、二重特異性構築物（分析物１）の固定化ヒト４−１ＢＢ及びヒトＦＡＰ（分析物２）への同時結合が示される。図４１Ｂは、クローン１２Ｂ３を有する二重特異性４＋１構築物の結合を示し、図４１Ｃは、クローン２５Ｇ７を有する構築物を示し、図４１Ｄは、クローン１１Ｄ５を有する構築物を示す。
【図４２】図４２は、二価（ＩｇＧ）及び四価（４＋１）４−１ＢＢ×ＦＡＰ構築物の膜結合４−１ＢＢへの結合を評価するためのＦＲＥＴに基づく競合アッセイを示す。抗４−１ＢＢバインダー１２Ｂ３については、四価４＋１フォーマットは、それぞれの二価ＩｇＧ抗体よりも結合に関してより良好に競合する。
【図４３】図４３Ａ〜４３Ｄに、休止及び活性化ヒトＴ細胞への結合が示される。４−１ＢＢ結合分子の濃度は、ＰＥ結合二次検出抗体の蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均に対してブロットされる。全ての値は、ブランクコントロールのベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される（例えば、一次ではなく二次検出抗体のみ）。図４３Ａに休止ＣＤ４  Ｔ細胞への結合が示され、図４３Ｂには活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合が示される。図４３Ｃに休止ＣＤ８  Ｔ細胞への結合が示され、図４３Ｄには活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合が示される。１２Ｂ３  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（黒塗りの四角形）、１２Ｂ３×ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋２抗原結合分子（黒塗りの三角形）、１２Ｂ３×ＦＡＰ（２８Ｈ１）１＋１抗原結合分子（半分灰色の丸）又は１２Ｂ３×ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１抗原結合分子（半分灰色の四角形）のような４−１ＢＢ結合ドメイン含有構築物のみが４−１ＢＢ発現細胞に効率的に結合する。生殖細胞系列コントロール分子ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（黒丸、点線）で結合は検出されなかった。
【図４４】図４４は、活性化ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合をまとめたものである。異なる４−１ＢＢ特異的分子に対する高４−１ＢＢ発現活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。フォーマット及びそれぞれのＦＡＰ特異的クローン（２８Ｈ１又は４Ｂ９）は、グラフの下にピクトグラムとして示されている。４−１ＢＢ結合クローン１２Ｂ３は灰色のカラムで示され、アイソタイプコントロールＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡは白色カラム（ＩｇＧのみ、左のカラム）として示されている。
【図４５】図４５Ａ及び４５Ｂは、ヒトＦＡＰ発現細胞への結合に関する。４−１ＢＢ結合分子の濃度は、ＰＥ結合二次検出抗体の蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均に対してブロットされる。全ての値は、ブランクコントロールのベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される（例えば、一次ではなく二次検出抗体のみ）。図４５Ａにおいて中程度ＦＡＰ発現ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４への結合、及び図４５Ｂにおいて高ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞への結合が示される。１２Ｂ３×ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋２抗原結合分子（黒塗りの三角形）、１２Ｂ３×ＦＡＰ（２８Ｈ１）１＋１抗原結合分子（半分灰色の丸）又は１２Ｂ３×ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１抗原結合分子（半分灰色の四角形）のようなＦＡＰ結合ドメイン含有構築物のみがＦＡＰ発現細胞に効率的に結合する。非ＦＡＰ標的化分子である１２Ｂ３  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（黒塗り四角形）及びコントロール分子ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（黒丸、点線）で結合は検出されなかった。
【図４６】図４６は、ヒトＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞への結合をまとめたものである。異なる４−１ＢＢ特異的分子に対してブロットしたＦＡＰ高発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞に対する結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。フォーマット及びそれぞれのＦＡＰ特異的クローン（２８Ｈ１又は４Ｂ９）は、グラフの下にピクトグラムとして示されている。４−１ＢＢ結合クローンはカラム色で示され、アイソタイプコントロールＤＰ４７を白色で示し、４−１ＢＢ特異的クローン１２Ｂ３を含む分子を灰色で示す。
【図４７】図４７Ａ〜４７Ｉは、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株におけるＮＦκＢ制御ルシフェラーゼ発現に関する（実施例１０）。４−１ＢＢ結合分子の濃度は、インキュベーションの６時間後に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）に対してブロットされる。全ての値は、ブランクコントロール（例えば、抗体が加えられていない）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。図４７Ａ、Ｄ及びＧでは、ＦＡＰ標的非依存性の４−１ＢＢ活性化が示され、４−１ＢＢ結合は、任意のＦＡＰ媒介性の架橋を伴わずにレポーター細胞株においてＮＦκＢ制御ルシフェラーゼ発現を誘導する．構築物は、ＦＡＰ標的化非依存性活性化を誘導することができない。図４７Ｂ、図４７Ｅ及び図４７Ｈにおいて、ＦＡＰ−中程度発現ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４を、図４７Ｃ、図４７Ｆ及び図４７Ｉにおいて、高ＦＡＰ発現細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９をレポーター細胞株に対して５：１の比率で添加した。ＦＡＰ発現細胞は、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢ結合分子の架橋をもたらし、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株におけるＮＦｋＢ／ルフィセラーゼ活性化を誘導する可能性を高める。四価４−１ＢＢ  ＦＡＰ標的化４＋１分子は、ＦＡＰ発現細胞が存在するとすぐに最も強い活性化を示す。これは、クローン１２Ｂ３（半分灰色の四角形、半分点線、図４７Ｂ及びＣ）、クローン１１Ｄ５（灰色星、点線、図４７Ｅ及びＦ）及びクローン２５Ｇ７（半分黒塗りの三角形、点線、図４７Ｈ及びＩ）に当てはまる。
【図４８】図４８は、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞の存在下での４−１ＢＢ発現レポーター細胞株におけるＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性をまとめたものである。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞の存在下での活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す（図４７Ｃ、Ｆ及びＩに示される）。使用された抗体フォーマット及び抗ＦＡＰクローン（２８Ｈ１又は４Ｂ９）はグラフの下にピクトグラムとして示され、異なるアゴニスト４−１ＢＢクローンは異なるカラム色で示される。アイソタイプコントロールＤＰ４７は白（ベースライン）で示され、４−１ＢＢ特異的クローン１２Ｂ３は灰色で示され、４−１ＢＢ特異的クローン２５Ｇ７は黒で、４−１ＢＢ特異的クローン１１Ｄ５は白黒チェックで示される。グラフは、ＦＡＰ標的化分子のみがバックグラウンドを超える強い活性化を誘導することができ、ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４＋１構築物は他の全ての試験分子より優れていることを示している。
【図４９】図４９Ａ〜４９Ｄは、実施例１１．４．１．１に記載された抗ＧＩＴＲ抗体８Ａ０６の交差特異性の測定に関する。図４９Ａは、種交差反応性の測定のために設定されたアッセイの概略図である。図４９Ｂは、ヒトＧＩＴＲに対する抗体８Ａ０６の特異性を示す。カニクイザルＧＩＴＲの特異性は図４９Ｃに示され、図４９Ｄは８Ａ０６がマウスＧＩＴＲに結合しないことを示す。
【図５０】ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲに対するＧＩＴＲ特異的抗体８Ａ０６の親和性の決定のために設定されたアッセイを図５０Ａに示す。図５０ＢはヒトＧＩＴＲについての結果を示しているが、カニクイザルＧＩＴＲについての結果は図５０Ｃに示されている。
【図５１】図５１Ａ〜５１Ｃは、表面プラズモン共鳴によって決定された抗ＧＩＴＲクローン８Ａ０６のリガンドブロッキング特性を示す。実験の設定（実施例１１．４．１．２を参照）は図５１Ａに示され、抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ  ８Ａ０６と予め形成された複合体ｈｕＧＩＴＲ／ｈｕＧＩＴＲリガンドとの間の観察された相互作用を図５１Ｂに見ることができる。図５１Ｃは、抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ  ６Ｃ８と予め形成された複合体ｈｕＧＩＴＲ／ｈｕＧＩＴＲリガンドとの間の相互作用を示す。
【図５２】図５２Ａ〜５２Ｃは、実施例１１．４．１．３に記載されたエピトープビニングに関する。ＧＩＴＲと複合体を形成した予め形成された抗体への抗ＧＩＴＲ抗体の結合が測定された。図５２Ａにおいて、アッセイの設定が示され、抗ＧＩＴＲ  ８Ａ０６  ＩｇＧとクローン６Ｃ８／ｈｕＧＩＴＲの予め形成された複合体との間の相互作用が図５２Ｂに示され、抗ＧＩＴＲ  ６Ｃ８  ＩｇＧとクローン８Ａ０６／ｈｕＧＩＴＲの予め形成された複合体との相互作用が図５２Ｃに示される。
【図５３】図５３Ａには、ＦＡＰに対して一価性を有する本発明の例示的な二重特異性四価抗ＧＩＴＲ抗原結合分子（４＋１フォーマット）の概略図が示される。黒い点は、２つの異なる重鎖のより良好な対合を可能にするノブ・イントゥー・ホール修飾を象徴する。図５３Ｂは、ＦＡＰに対する二価性を有する本発明の例示的な二重特異性四価抗原結合分子（４＋２フォーマット）の概略図である。抗ＧＩＴＲ  Ｆａｂ断片の定常領域は、軽鎖とのより良好な対合を可能にするために修飾（荷電残基）を含み得る。
【図５４】図５４Ａ〜５４Ｃは、二重特異性４＋１及び４＋２抗ＧＩＴＲ×抗ＦＡＰ構築物の同時結合を示す。実験の設定を図５４Ａに示す。抗ＧＩＴＲクローン８Ａ０６を含む二重特異性４＋１構築物（分析物１）と固定化ヒトＧＩＴＲ及びヒトＦＡＰ（分析物２）との同時結合を図５４Ｂに示す。抗ＧＩＴＲクローン８Ａ０６を含む二重特異性４＋２構築物（分析物１）と固定化ヒトＧＩＴＲ及びヒトＦＡＰ（分析物２）との同時結合を図５４Ｃに示す。
【図５５】図５５Ａ及び５５Ｂは、ＧＩＴＲ発現ＨＥＫ細胞への結合に関する。図５５Ａに示すように、試験した全ての二重特異性抗ＧＩＴＲ構築物は、ヒトＧＩＴＲ発現ＨＥＫ細胞に効率的に結合したが、ＧＩＴＲ陰性コントロールのＨＥＫ細胞には全く結合しなかったか又は無視できる割合での結合であった（図５５Ｂ）。従って、抗ＧＩＴＲクローンのＧＩＴＲ特異性は、四価、二重特異性、ＦＡＰ標的化フォーマットでも維持される。全ての構築物は、抗ＧＩＴＲクローン８Ａ０６及び抗ＦＡＰクローン２８Ｈ１で作製され、又は非標的化バージョンでは、生殖細胞系列コントロールＤＰ４７ＧＳで作製される。４＋２は、本明細書に開示する４つの抗ＧＩＴＲ部分及び２つの抗ＦＡＰ部分を有する四価の二重特異性抗原結合分子を意味し、一方、４＋２ ＣＲは、本明細書に記載されるような付加的な荷電残基を有する分子を指す。
【図５６】図５６Ａ及び５６Ｂは、ＦＡＰ発現３Ｔ３細胞への結合に関する。図５６Ａに示すように、試験した二重特異性抗ＧＩＴＲ×抗ＦＡＰ構築物は、ヒトＦＡＰ発現３Ｔ３細胞に結合することができたが、ＦＡＰ陰性コントロールの３Ｔ３細胞には全く結合できなかったか又は無視できる割合での結合であった（図５６Ｂ）。従って、抗ＦＡＰクローンのＦＡＰ特異性は、Ｃ末端に一価又は二価のＦＡＰ標的化部分を有する四価の二重特異性フォーマットでも維持される。
【図５７】図５７Ａ及び５７Ｂは、最適以下に刺激されたＴＣＲのＧＩＴＲ媒介共刺激を示す。非標的化四価抗ＧＩＴＲ抗原結合分子（ＧＩＴＲ  ８Ａ０６  ＤＰ４７ＧＳ  ４＋１ ｓｆ ｗ（１ａ））（三角形）による共刺激は、最適以下にＴＣＲ刺激されたＣＤ４（図５７Ａ）及びＣＤ８  Ｔ細胞の増殖能に影響を及ぼさなかったが（図５７Ｂ）、このＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞によるＦＡＰ標的化抗ＧＩＴＲ構築物（ＧＩＴＲ  ８Ａ０６  ２８Ｈ１  ４＋１ ｓｆ Ｗ（１））（丸）の過架橋は、Ｔ細胞共刺激及び増殖の促進に必要である。
【００５６】
発明の詳細な記載
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
【００５７】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【００５８】
本明細書で使用される用語「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」とは、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えば、ＴＮＦファミリーリガンド三量体）を標的部位、例えば抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞又は腫瘍間質に導くことができる。標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分には、本明細書において更に定義される抗体及びその断片が含まれる。更に、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分としては、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメインが挙げられる（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）。
【００５９】
抗体又はその断片に関して、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む分子の部分を指す。特異的抗原結合が可能な部分は、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。特に、特異的抗原結合が可能な部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一態様では、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」は、Ｆａｂ断片又はクロスＦａｂ断片である。
【００６０】
用語「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分」は、共刺激ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーを介してシグナル伝達を活性化することができる。標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分には、本明細書において更に定義される抗体及びその断片が含まれる。更に、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分としては、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメインが挙げられる（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）。特に、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。特定の態様では、「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分」は、抗体断片である。一態様では、「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分」は、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）及び単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片及びクロスＦａｂ断片からなる群から選択される。より具体的には、「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分」は、Ｆａｂ断片又はクロスＦａｂ断片である。
【００６１】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００６２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる突然変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００６３】
本明細書で使用する用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、その各々は異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞上に発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００６４】
本出願において使用される「価数」という用語は、１つの異なる（区別できる）抗原決定基に特異的である抗原結合分子中の１つの異なる（区別できる）抗原決定基に特異的な特定の数の結合部位の存在を示す。そのようなものとして、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗原結合分子中に特定の抗原決定基に特異的であるそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。本発明の特定の態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であることができ、それらが前記抗原決定基に対してただ１つの結合部位を有することを意味し、又は特定の抗原決定基に対して２価であることができ、それらが前記抗原決定基に対して２つの結合部位を有することを意味する。本発明の特定の分子は、共刺激ＴＮＦ受容体に対して四価であり、これはそれらが共刺激ＴＮＦ受容体に対して４つの結合部位を有することを意味する。
【００６５】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）  を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの一つに割当てることができ、それらの幾つかは更にサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００６６】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）及び単一ドメイン抗体が含まれる。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００６７】
インタクトな抗体のパパイン消化は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）をそれぞれ含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生産する。本明細書で使用される場合、従って、用語「Ｆａｂ」とは、ＶＬドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。本発明によれば、用語「Ｆａｂ断片」は、以下に定義される「クロスＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」も含む。
【００６８】
「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方では、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００６９】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの１つを有し；前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。更に、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化され得る。
【００７０】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常  ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの１つを有し；ここでＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。更に、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化され得る。
【００７１】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、約１０個〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが、並びに溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続するか、又はその逆に接続することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載される。更に抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわちＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性、又はＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００７２】
「二重可変ドメイン」又は「ＤＶＤ」という用語は、２つの可変ドメインを有する２つの重鎖ポリペプチド及び２つの可変ドメインを有する２つの軽鎖ポリペプチドを含む抗原結合分子を指す。ＤＶＤ抗体（「ＤＶＤ−Ｉｇ」）において、各半分は、２つの標的結合部位を有する重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含む。各結合部位は、標的結合に関与する合計６個のＣＤＲを有する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質における各可変ドメイン（ＶＤ）は、１つ以上の所望の抗原又はエピトープに結合する１つ以上の「親」モノクローナル抗体（ｍＡｂ）から得ることができる。得られたＤＶＤ−Ｉｇ分子は、両方の親ｍＡｂの活性を保持する。更なる詳細については、例えば、国際公開第２００８／０２４１８８号を参照。
【００７３】
「足場抗原結合タンパク質」は当該技術分野で周知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）が、抗原結合ドメインのための代替の足場として使用されている（例えば、Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeuticsを参照）。Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及びStumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子、Ａ−ドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新規抗原受容体β−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッチンファミリー由来のタンパク質などのミクロボディー、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様のＩｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように改変されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディー（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）としても知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７Ｂ１号）。エビボディーは、抗体の単離された可変領域（例えば、ドメイン抗体）とほぼ同じサイズである。更なる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように改変することができる円錐構造の開放端に多数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０〜１８０アミノ酸のサイズであり、リポカリンに由来する。更なる詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、米国特許第７２５０２９７（Ｂ１）号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照。アフィボディは、抗原に結合するように改変することができる、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。そのドメインは、約５８個のアミノ酸の３つのらせん状の束からなる。ライブラリーは表面残基の無作為化によって生成されている。更なる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及び欧州特許第１６４１８１８（Ａ１）号を参照。アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）は、Ａドメインスキャフォールドファミリ��由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、定義されたジスルフィド結合構造をとる。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される自然のバリエーションをシャッフルすることによって生成される。更なる詳細は、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) 及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照。トランスフェリンは単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容される表面ループにペプチド配列を挿入することによって、異なる標的抗原に結合するように改変することができる。改変されたトランスフェリン足場の例にはトランスボディ（Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）が含まれる。更なる詳細は、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）に由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックス及びβターンからなる３３残基のモチーフである。それらは、第１のαヘリックス及び各リピートのβターンの残基を無作為化することによって、異なる標的抗原に結合するように改変することができる。それらの結合界面は、モジュールの数を増加させることによって増加させることができる（親和性成熟の方法）。更なる詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８Ａ１号を参照。単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科動物由来の抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ又はＶＨＨ断片）に由来した。更に、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように改変することができる足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５個の反復単位の第１０ドメインの天然のアミノ酸配列の骨格からなる。β−サンドイッチの一端の３つのループは、アドネクチンが関心のある治療標的を特異的に認識することを可能にするように改変することができる。更なる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８Ｂ１号を参照。ペプチドアプタマーは、定常性の足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細は、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)を参照。ミクロボディーは、３〜４個のシステイン架橋を含む長さが２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）に由来し、微小タンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、その微小タンパク質の全体的な折り畳みに影響を与えることなく最大２５個のアミノ酸を含むように改変することができるループを有する。改変されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照。
【００７４】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて参照分子とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
【００７５】
用語「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部位」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ相補的である領域を含む抗原結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は抗原の特定の部分にのみ結合することができ、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００７６】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見出すことができる。本明細書の抗原として有用なタンパク質は、他に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００７７】
「特異的に結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００７８】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表される。この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。従って、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当該技術分野で周知の一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００７９】
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較して、一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に一又は複数の変化があり、かかる変化が抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体を指す。
【００８０】
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。特に、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【００８１】
特に断りのない限り、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られている用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」の未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。その用語はまた、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体をも包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号５５）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０に及ぶ。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号５６及び５７に示す。マウスＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号５８）、又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１に及ぶ。配列番号５９及び６０は、それぞれＨｉｓタグ付きマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。配列番号６１及び６２は、それぞれＨｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。
【００８２】
特に断りのない限り、がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている用語「がん胎児性抗原（ＣＥＡ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＥＡを指す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号６３）に示されている。特に断りのない限り、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られている用語「メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＭＣＳＰを指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号６４）に示されている。特に断りのない限り、プロトオンコジーンｃ−ＥｒｂＢ−１又は受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１とも呼ばれる用語「上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＥＧＦＲを指す。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号６５）に示されている。特に断りのない限り、用語「ＣＤ１９」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ１９を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号６６）に示されている。特に断りのない限り、「ＣＤ２０」は、膜貫通型４ドメインサブファミリーメンバー１（ＭＳ４Ａ１）、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号６７）に示されている。特に断りのない限り、「ＣＤ３３」は、ＳＩＧＬＥＣ３又はｇｐ６７としても知られる骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ３３を含む。ヒトＣＤ３３のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０１３８（バージョン１５７、配列番号６８）に示されている。
【００８３】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【００８４】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計６つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、かつ／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指すために何れかの定義を適用することは、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表Ａに明記した。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、何れの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。
2018535665.tif 000002
【００８５】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００８６】
ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【００８７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）の次の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００８８】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００８９】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００９０】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明に包含される他の型の「ヒト化抗体」は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を生成するために、定常領域が元の抗体のそれから更に修飾されるか又は変更されているものである。
【００９１】
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００９２】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域はＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基に及ぶ。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合される。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端の残基（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）のストレッチを含む。本明細書のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインであり得る（例えば、１つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）を有するＣＨ３ドメイン及び他の鎖の対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するもの；参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５８２１３３３号を参照）。そのような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の２つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量化を促進するために使用され得る．一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書において他に特定されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００９３】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これら２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、従って二量体を更に安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【００９４】
「免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（抗体依存性細胞傷害など）を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない改変を有する変異体を含むように意図されている。例えば、一又は複数のアミノ酸を、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能を実質的に失うことなく欠失させることができる。そのような変異体は、活性に対して最小の影響を有するように、当該技術分野で周知の一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)を参照）。
【００９５】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００９６】
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞上の特殊な細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によって媒介され得る。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の食作用による抗体被覆病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して、対応する抗体で被覆された赤血球及び種々の他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524を参照）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性によって定義される：ＩｇＧ抗体のＦｃ受容体はＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；及びGessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248に記載される。
【００９７】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する受容体（ＦｃγＲ）の架橋は、食作用、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエーターの放出、並びに免疫複合体クリアランス及び抗体産生の調節を含む広範囲のエフェクター機能を誘発する。ヒトでは、ＦｃγＲの３つのクラスが特徴づけられており、
−ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は単量体ＩｇＧと高親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球上に発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つにおける、ＩｇＧのＦｃ領域における改変は、ＦｃγＲＩへの結合を減少させる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された位置２３３−２３６のＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩとの結合を千分の一に減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624）。
−ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、中程度から低い親和性で複合体化したＩｇＧに結合し、広く発現される。この受容体は、２つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、死滅に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）に見られ、死滅プロセスを活性化するようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球に見られる。Ｂ細胞では、更なる免疫グロブリン産生及び例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制するように機能するようである。マクロファージでは、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを介して媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球及び肥満細胞において、Ｂ型は、その別個の受容体へのＩｇＥ結合を介してこれらの細胞の活性化を抑制するのに役立ち得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４の少なくとも１つに突然変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について見出される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
−ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中程度から低い親和性でＩｇＧに結合し、２つのタイプとして存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、及び幾つかの単球及びＴ細胞上に見出され、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上で高度に発現される。ＦｃγＲＩＩＡへの結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６の少なくとも１つに突然変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について見出される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【００９８】
Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上記突然変異部位、及びＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法は、Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604に記載される。
【００９９】
用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害」は、Ｆｃ受容体結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下における本明細書中に報告される抗体による標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣを媒介する初期段階を誘導する抗体の能力を、ＦｃγＲＩ及び／又はＦｃγＲＩＩＡを組換え発現する細胞又はＮＫ細胞（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）などの、Ｆｃγ受容体を発現する細胞に対するそれらの結合を測定することによって調べる。特に、ＮＫ細胞上のＦｃγＲへの結合を測定する。
【０１００】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
【０１０１】
「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」又は「ＴＮＦ受容体スーパーファミリー」は、現在、２７の受容体からなる。これは、細胞外システインリッチドメイン（ＣＲＤ）を介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力を特徴とするサイトカイン受容体の群である。これらの偽リピートは、受容体鎖内の高度に保存されたシステイン残基によって生成される鎖内ジスルフィドによって定義される。神経成長因子（ＮＧＦ）を除いて、全てのＴＮＦは典型的なＴＮＦアルファに相同である。それらの活性型では、大部分のＴＮＦ受容体は、血漿膜中に三量体複合体を形成する。従って、ほとんどのＴＮＦ受容体は膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む。これらの受容体の幾つかはまた、リガンド結合後にカスパーゼ相互作用タンパク質を補充してカスパーゼ活性化の外因性経路を開始させる細胞内デスドメイン（ＤＤ）を含む。デスドメインを欠いている他のＴＮＦスーパーファミリー受容体は、ＴＮＦ受容体関連因子に結合し、増殖又は分化を引き起こし得る細胞内シグナル伝達経路を活性化する。これらの受容体はまた、アポトーシスを開始することもできるが、間接的な機構を介してアポトーシスを開始する。アポトーシスを調節することに加えて、幾つかのＴＮＦスーパーファミリー受容体は、Ｂ細胞恒常性及び活性化、ナチュラルキラー細胞活性化、及びＴ細胞同時刺激などの免疫細胞機能の調節に関与する。幾つかの他のものは、毛包発達及び破骨細胞発達などの細胞型特異的応答を調節する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーには、以下が含まれる：腫瘍壊死因子受容体１（１Ａ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＣＤ１２０ａ）、腫瘍壊死因子受容体２（１Ｂ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＣＤ１２０ｂ）、リンパ毒素ベータ受容体（ＬＴＢＲ、ＣＤ１８）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４）、ＣＤ４０（Ｂｐ５０）、Ｆａｓ受容体（Ａｐｏ−１、ＣＤ９５、ＦＡＳ）、デコイ受容体３（ＴＲ６、Ｍ６８、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔｐ５５）、ＣＤ３０（Ｋｉ−１、ＴＮＦＲＳＦ８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１、Ａｐｏ−２、ＣＤ２６１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２、ＣＤ２６２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ３、ＣＤ２６３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、デコイ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ４、ＣＤ２６４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＲＡＮＫ（ＣＤ２６５、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、オステオプロテゲリン（ＯＣＩＦ、ＴＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４、ＣＤ２６６、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＡＣＩ（ＣＤ２６７、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＢＡＦＦ受容体（ＣＤ２６８、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ヘルペスウイルスエントリメディエーター（ＨＶＥＭ、ＴＲ２、ＣＤ２７０、ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経成長因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ２７１、ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、グルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＤＲ６（ＣＤ３５８、ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＤＲ３（Ａｐｏ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳ−１、ＴＮＦＲＳＦ２５）、及びエクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２Ｒ）。
【０１０２】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーの幾つかのメンバーは、Ｔ細胞応答を維持するための初期Ｔ細胞活性化後に機能する。「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦスーパーファミリー受容体」という用語は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができるＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーのサブグループを指す。この用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＴＮＦファミリー受容体を指す。本発明の特定の実施態様では、共刺激ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＣＤ３０、及びＧＩＴＲからなる群から選択され、それらの全てがＴ細胞に対して共刺激効果を有することができる。より具体的には、共刺激ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、ＯＸ４０及び４−１ＢＢからなる群から選択される。
【０１０３】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの更なる情報、特に配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）などの公的に入手可能なデータベースから得ることができる。例えば、ヒト共刺激ＴＮＦ受容体は、以下のアミノ酸配列を有する：ヒトＯＸ４０（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４３４８９、配列番号６９）、ヒト４−１ＢＢ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１、配列番号７０）、ヒトＣＤ２７（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２６８４２、配列番号７１）、ヒトＨＶＥＭ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９２９５６、配列番号７２）、ヒトＣＤ３０（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２８９０８、配列番号７３）、及びヒトＧＩＴＲ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５、配列番号７４）。
【０１０４】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＯＸ４０」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＯＸ４０を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＯＸ４０、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＯＸ４０を含む。その用語はまた、ＯＸ４０の天然に生じる変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を含む。例示的なヒトＯＸ４０のアミノ酸配列を配列番号１（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４３４８９、バージョン１１２）に示し、例示的なマウスＯＸ４０のアミノ酸配列を配列番号７５（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４７７４１、バージョン１０１）に示す。
【０１０５】
用語「抗ＯＸ４０抗体」、「抗ＯＸ４０」、「ＯＸ４０抗体」及び「ＯＸ４０に特異的に結合する抗体」は、ＯＸ４０を標的とするうえで診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性でＯＸ４０に結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗ＯＸ４０抗体の、無関係な、非ＯＸ４０タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体のＯＸ４０への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＯＸ４０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１０６】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「４−１ＢＢ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型４−１ＢＢを指す。その用語は、「完全長」で未処理の４−１ＢＢ、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態の４−１ＢＢを含む。その用語はまた、４−１ＢＢの天然に生じる変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を含む。例示的なヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号７０（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１）に示され、例示的なマウス４−１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号７６（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０３３４）に示され、例示的なカニクイザル４−１ＢＢ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来）のアミノ酸配列は配列番号７７（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｆ６Ｗ５Ｇ６）に示される。
【０１０７】
用語「抗４−１ＢＢ抗体」、「抗４−１ＢＢ」、「４−１ＢＢ抗体」及び「４−１ＢＢに特異的に結合する抗体」は、４−１ＢＢを標的とするうえで診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性で４−１ＢＢに結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗４−１ＢＢ抗体の、無関係な、非４−１ＢＢタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体の４−１ＢＢへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、４−１ＢＢに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１０８】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＧＩＴＲ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＧＩＴＲを指す。その用語は、「完全長」の未処理のＧＩＴＲ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＧＩＴＲを包含する。その用語はまた、天然に存在するＧＩＴＲの変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体をも包含する。例示的なヒトＧＩＴＲのアミノ酸配列を配列番号７４（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４３４８９、バージョン１１２）に示す。
【０１０９】
用語「抗ＧＩＴＲ抗体」、「抗ＧＩＴＲ」、「ＧＩＴＲ抗体」及び「ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体」は、ＧＩＴＲを標的とするうえで診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性でＧＩＴＲに結合することができる抗体を指す。一態様では、抗ＧＩＴＲ抗体の、無関係な、非ＧＩＴＲタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体のＧＩＴＲへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＧＩＴＲに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１１０】
用語「ペプチドリンカー」は、１つ以上のアミノ酸、典型的には約２〜２０アミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当該技術分野において周知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎのペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は、一般に１〜１０の数、典型的には２〜４の間の数、特に２であり、すなわち、ペプチドはＧＧＧＧＳ（配列番号７８）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７９）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号８０）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号８１）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号８２）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号８３）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号８４）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号８５）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号８６）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号８７）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号８８）、ＧＧＳＧ（配列番号８９）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号９０）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号９１）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号９２）も含む。特に興味のあるペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号７８）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７９）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号８４）である。
【０１１１】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【０１１２】
「融合された」又は「連結された」とは、構成要素（例えば、抗体の重鎖及びＦａｂ断片）が、直接的に又は１つ以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
【０１１３】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したようにして得られる。
【０１１４】
特定の実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを最終構築物に到達させることができる。置換変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は表Ｂの「好ましい置換」という見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラス（１）〜（６）を参照して以下で更に説明する。アミノ酸置換は、目的の分子に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
2018535665.tif 000003
【０１１５】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０１１６】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換する必要があろう。
【０１１７】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般に、更なる研究のために選択された得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に作成することができる。簡潔には、一又は複数のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、一又は複数のＨＶＲ内に置換、挿入又は欠失が生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低減させない保存的改変（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定するために使用される。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１１８】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する本発明の二重特異性抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体には、二重特異性抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
【０１１９】
特定の態様では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、一又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に得ることができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合した糖は改変され得る。哺乳類細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって一般に結合される分枝鎖の二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。幾つかの実施態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子におけるオリゴ糖の修飾が、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有する本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。別の態様では、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。そのような変異体は、フコシル化が低減されている可能性があり、かつ／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairetら）；米国特許第６６０２６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）を参照。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体もまた提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有してもよく、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【０１２０】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン改変変異体（cysteine engineered variants）、例えば分子の一又は複数の残基がシステイン残基で置換された「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作ることが望ましい場合がある。特定の態様では、置換される残基は抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせ、イムノコンジュゲートを作るために使用することができる。特定の態様では、以下の残基のうちの何れかの一又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１２１】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１２２】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖形式及びマイナス鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった調節エレメントであり得るか又はそれらを含み得る。
【０１２３】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除され又は別のヌクレオチドで置換されても良く、又は参照配列に含まれる全てのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で、参照配列中の残基の間に個別に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において散在して生じ得る。特定の事項として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
【０１２４】
「発現カセット」という用語は、標的細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え技術又は合成技術により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１２５】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞性転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１２６】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる何れかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
【０１２７】
「有効量」の薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１２８】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１２９】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１３０】
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【０１３１】
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤は、限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定剤又は保存剤を含む。
【０１３２】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１３３】
本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１３４】
本明細書で使用する用語「がん」は、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫などの増殖性疾患を意味し、上記がんの任意の難治性のもの、又は上記がんのうちの一又は複数の組み合わせを含む。
【０１３５】
本発明の二重特異性抗体
本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物学的活性、標的化効率、及び低減された毒性などの特に有利な特性を有する新規な二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３６】
例示的な二重特異性抗原結合分子
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、該分子は
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
【０１３７】
特定の態様では、これらの二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーへのアゴニスト結合によって特徴づけられる。特に、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０、４−１ＢＢ及びＧＩＴＲからなる群から選択される。より具体的には、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０及び４−１ＢＢからなる群から選択される。
【０１３８】
ＯＸ４０に結合する二重特異性四価抗原結合分子
一態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーはＯＸ４０である。特に、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
【０１３９】
一態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ｉ）配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１４０】
特に、ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号８から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｇ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１４１】
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、及び配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
【０１４２】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
【０１４３】
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
【０１４４】
より具体的には二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【０１４５】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含むことによって更に特徴づけられる。従って、二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる従来の抗体に対する優位性を有し、典型的にはがん細胞である標的細胞において共刺激Ｔ細胞応答を選択的に誘導する。一態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。
【０１４６】
特定の態様では、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。ＦＡＰ結合部分は、国際公開第２０１２／０２００６号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に興味のあるＦＡＰ結合部分を以下に記載する。
【０１４７】
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４１及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号４３及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号４５及び配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４７及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む。
【０１４８】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１４９】
更なる態様にて、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１５０】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｃ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｄ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｅ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｆ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｇ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｈ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｊ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｋ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｌ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｍ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、又は
（ｎ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１５１】
より具体的には、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか、又はここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１５２】
一態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつが互いに融合している二重特異性抗原結合分子を提供する。任意選択的に、それらはペプチドリンカーを介して互いに融合される。特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつは互いに融合され、Ｃ末端でＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端に融合され、任意選択的に、それらはペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端にそのＣ末端で連結される。
【０１５３】
特定の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、分子は２つの重鎖を含み、重鎖の各々はＯＸ４０に特異的に結合することができる２つの部分の可変ドメインと、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分の可変ドメインとを含む。
【０１５４】
別の態様では、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分は、Ｆａｂ断片であり、そのうちの２つずつは互いに連結している。更なる態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分はそれぞれ、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１５５】
４−１ＢＢに結合する二重特異性四価抗原結合分子
一態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。特に、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、配列番号２３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
【０１５６】
一態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ｉ）配列番号２４９及び配列番号２５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２５１及び配列番号２５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、及び配列番号２５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号２５８及び配列番号２５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２６０及び配列番号２６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、及び配列番号２６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１５７】
特に、４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、
（ａ）配列番号２４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｂ）配列番号２４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｃ）配列番号２４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２５６から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、
（ｄ）配列番号２４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号２５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１５８】
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、及び配列番号２７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、及び配列番号２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
【０１５９】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号２６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号２７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖ）配列番号２７５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む。
【０１６０】
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２６７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。より具体的には二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【０１６１】
別の特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２６９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２７０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。より具体的には二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【０１６２】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含むことによって更に特徴づけられる。従って、二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる従来の抗体に対する優位性を有し、典型的にはがん細胞である標的細胞において共刺激Ｔ細胞応答を選択的に誘導する。一態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。
【０１６３】
特定の態様では、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。ＦＡＰ結合部分は、国際公開第２０１２／０２００６号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に興味のあるＦＡＰ結合部分を以下に記載する。
【０１６４】
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４１及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号４３及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号４５及び配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４７及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む。
【０１６５】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１６６】
更なる態様にて、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、及び配列番号２７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、及び配列番号２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１６７】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｂ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｃ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｄ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｅ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｆ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｇ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｈ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
（ｉ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２７５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、又は
（ｊ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号２７５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１６８】
一態様では、本発明は、４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつが互いに融合している二重特異性抗原結合分子を提供する。任意選択的に、それらはペプチドリンカーを介して互いに融合される。特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつは互いに融合され、Ｃ末端でＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端に融合され、任意選択的に、それらはペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端にそのＣ末端で連結される。
【０１６９】
特定の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、分子は２つの重鎖を含み、重鎖の各々は４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの部分の可変ドメインと、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分の可変ドメインとを含む。
【０１７０】
別の態様では、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの部分は、Ｆａｂ断片であり、そのうちの２つずつは互いに連結している。更なる態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分はそれぞれ、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１７１】
ＧＩＴＲに結合する二重特異性四価抗原結合分子
一態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーはＧＩＴＲである。特に、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分は、配列番号３５７のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
【０１７２】
一態様では、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる４つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、配列番号３７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号３７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号３７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号３７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０１７３】
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号３８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
【０１７４】
具体的には二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分は、配列番号３８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【０１７５】
更なる態様では、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる４つの部分を含む二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、前記部分は、配列番号３７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号３７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号３８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号３８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０１７６】
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号３８５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む。
【０１７７】
具体的には二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分は、配列番号３８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【０１７８】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含むことによって更に特徴づけられる。従って、二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる従来の抗体に対する優位性を有し、典型的にはがん細胞である標的細胞において共刺激Ｔ細胞応答を選択的に誘導する。一態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。
【０１７９】
特定の態様では、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。ＦＡＰ結合部分は、国際公開第２０１２／０２００６号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に興味のあるＦＡＰ結合部分を以下に記載する。
【０１８０】
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号３９及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４１及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号４３及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号４５及び配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４７及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む。
【０１８１】
特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１８２】
更なる態様にて、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号３８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１８３】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ａ）ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分は、配列番号３８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、又は
（ｂ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号３８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１８４】
更なる態様にて、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ｉ）ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分の各々は、配列番号３８５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号５１又は配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１８５】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、
（ａ）ＧＩＴＲに特異的に結合することができる部分は、配列番号３８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、又は
（ｂ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる部分は、配列番号３８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１８６】
一態様では、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつが互いに融合している二重特異性抗原結合分子を提供する。任意選択的に、それらはペプチドリンカーを介して互いに融合される。特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつは互いに融合され、Ｃ末端でＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端に融合され、任意選択的に、それらはペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端にそのＣ末端で連結される。
【０１８７】
特定の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、分子は２つの重鎖を含み、重鎖の各々はＧＩＴＲに特異的に結合することができる２つの部分の可変ドメインと、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分の可変ドメインとを含む。
【０１８８】
別の態様では、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる４つの部分は、Ｆａｂ断片であり、そのうちの２つずつは互いに連結している。更なる態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分はそれぞれ、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１８９】
更なる態様では、本発明は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつが互いに融合している二重特異性抗原結合分子を提供する。任意選択的に、それらはペプチドリンカーを介して互いに融合される。特に、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分のうちの２つずつはそのＣ末端でＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端に更に融合され、任意選択的に、それらはペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端にそのＣ末端で連結される。
【０１９０】
特定の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、分子は２つの重鎖を含み、重鎖の各々は共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つの部分の可変ドメインと、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分の可変ドメインとを含む。従って、本発明は本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分は、Ｆａｂ断片であり、そのうちの２つずつは互いに連結している。
【０１９１】
更なる態様では、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片は、ＣＨ１ドメインのＣ末端で、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片のＶＨドメインに融合され、かつ、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片は、ＣＨ１ドメインのＣ末端で、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第４のＦａｂ断片のＶＨドメインに、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合される。
【０１９２】
標的細胞抗原に対して一価性を有する四価の二重特異性抗原結合分子（４＋１フォーマット）
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である。従って、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１９３】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
【０１９４】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
【０１９５】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分はＶＨ及びＶＬドメインを含み、ＶＨドメインはペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に連結され、ＶＬドメインはペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に連結される。特定の態様では、ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）４である。
【０１９６】
一態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含み、かつ、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨドメインは、ノブを含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＬドメインは、ホールを含むＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結される。
【０１９７】
別の態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含み、かつ、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＬドメインは、ノブを含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結され、かつ、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨドメインは、ホールを含むＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結される。
【０１９８】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
【０１９９】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【０２００】
更なる特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２３４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０２０１】
別の特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、配列番号２３７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０２０２】
更なる態様にて、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
【０２０３】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３２７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３２８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２８９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３３１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｉｉｉ）配列番号３３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
（ｉｖ）配列番号３３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３０１のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【０２０４】
更に特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３４３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２８９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｉｉｉ）配列番号３５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２９７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
（ｉｖ）配列番号３５５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３０１のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【０２０５】
更なる態様にて、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記分子は、
（ａ）ＧＩＴＲに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨ及びＶＬドメイン、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む。
【０２０６】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、配列番号４０１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４０２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３９３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０２０７】
別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、配列番号４０５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４０６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３９７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０２０８】
標的細胞抗原に対して二価性を有する四価の二重特異性抗原結合分子（４＋２フォーマット）
別の態様では、本発明は、
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２０９】
一態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、二重特異性抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して二価である。
【０２１０】
一態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分は、Ｆａｂ断片又はクロスオーバーＦａｂ断片である。
【０２１１】
更なる態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ断片又はクロスオーバーＦａｂ断片の各々が、ＶＨ又はＶＬドメインのＮ末端でペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＣ末端に融合される。特定の態様では、ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）４である。
【０２１２】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分はＶＨ−ＶＬクロスオーバーＦａｂ断片であり、各々がＶＬドメインのＮ末端でペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＣ末端に融合される。
【０２１３】
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分はＣＨ−ＣＬクロスオーバーＦａｂ断片であり、各々がＶＨドメインのＮ末端でペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＣ末端に融合される。
【０２１４】
特定の態様では、本発明は、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２１５】
より具体的には、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、（ｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２２６の第１の軽鎖及び配列番号２２８の第２の軽鎖を含む。
【０２１６】
特定の態様では、本発明は、
（ａ）ＧＩＴＲに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、
（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる２つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２１７】
より具体的には、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、（ｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号３９３の第１の軽鎖及び配列番号４１０の第２の軽鎖を含む。
【０２１８】
別の態様では、二重特異性抗原結合分子が提供され、前記抗原結合分子は、（ｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号３９７の第１の軽鎖及び配列番号４１０の第２の軽鎖を含む。
【０２１９】
Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。
【０２２０】
特定の態様では、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２２１】
Ｆｃドメインは、標的組織中への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比を含む、本発明の二重特異性抗体に望ましい薬物動態特性を付与する。しかしながら、同時に、好ましい抗原保有細胞よりはむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対しての、本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を導く可能性がある。従って、特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低減した結合親和性及び／又は低減したエフェクター機能を示す。より具体的には、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【０２２２】
１つのそのような態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満を示し、かつ／又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、エフェクター機能の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満を示す。一態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌のうちの一又は複数である。特定の態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の約７０％を超える、具体的には約８０％を超える、より具体的には約９０％を超えるＦｃＲｎへの結合親和性を示すときに達成される。
【０２２３】
特定の態様では、Ｆｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較して低減した、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を有するように改変される。特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ一又は複数のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる。別の態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低減させる。一態様では、改変されたＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、改変されていないＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体と比較して、２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。他の態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。幾つかの態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。幾つかの態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）がＦｃドメインの改変されていない形態（又はＦｃドメインの前記改変されていない形態を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％、及び場合によっては約９０％を上回る親和性を呈し得る。特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較してエフェクター機能が低減するように改変される。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。
【０２２４】
エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体についての記載がある。（米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。
【０２２５】
本発明の一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。幾つかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（「ＬＡＬＡ」）。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一態様では、ＦｃドメインはＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。より特定の態様では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換、及びＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓからなる群から選択される更なるアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載されるように、アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させる。前記文献はまた、そのような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定する方法を記載する。かかる抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するか又は突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ又はＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスによる番号付け、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）。
【０２２６】
一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）の位置にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照）。
【０２２７】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593、及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一又は複数に置換を有するもの、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）を有するものが含まれる。また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照。
【０２２８】
Ｆｃ受容体への結合は、例えばＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、及び組換え発現によって得ることができるＦｃ受容体を用いて、容易に決定することができる。適切なそのような結合アッセイが本明細書に記載される。あるいは、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞を用いて評価してもよい。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で周知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号； Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０２２９】
以下のセクションは、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメイン修飾を含む本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、該Ｆｃドメインが、抗体の、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合親和性を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む二重特異性抗原結合分子に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、該Ｆｃドメインがエフェクター機能を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスである。
【０２３０】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明の幾つかの態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合された異なる抗原結合部位を含み、従ってＦｃドメインの２つのサブユニットは２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれ得る。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量体形成は、２つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善するためには、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインに導入することが有利であろう。
【０２３１】
従って、本発明の特定の態様は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、該Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む二重特異性抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。従って、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０２３２】
特定の態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。従って、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、該Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、かつ、該Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２３３】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０２３４】
従って、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内において、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６の位置のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７の位置のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３６６の位置のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８の位置のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。
【０２３５】
更なる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体を更に安定化する（Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２３６】
別の態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にて、荷電したアミノ酸残基による一又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
【０２３７】
Ｆａｂドメインにおける修飾
一態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片において、又は標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片において、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬの何れかが交換されている二重特異性抗原結合分子に関する。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０２３８】
１つの結合アームにおけるドメイン置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びSchaefer、W.et al、PNAS、108(2011)11187-1191に詳細に記載されている。それらは明らかに、第２の抗原に対する間違った重鎖との第１の抗原に対する軽鎖のミスマッチに起因する副産物を（このようなドメイン交換のないアプローチと比較して）減少させる。
【０２３９】
一態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２４０】
別の態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２４１】
別の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、該分子は
（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の４つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片であって、前記追加のＦａｂ断片はそれぞれペプチドリンカー、特に（Ｇ４Ｓ）４を介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている、２つの追加のＦａｂ断片を含む。特定の態様では、追加のＦａｂ断片はクロスＦａｂ断片であり、ここで、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置換されているか、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置換されている。
【０２４２】
従って、特定の態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の４つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子を含み、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる前記２つの追加のＦａｂ断片はクロスオーバーＦａｂ断片であり、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換され、ＶＬ−ＣＨ鎖はそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている。特定の態様では、ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）４である。
【０２４３】
別の態様では、異なる重鎖及び軽鎖の正確な対合を更に改善するために、（ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の４つの軽鎖及び２つの重鎖、並びに（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの修飾は、交差又は非交差ＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。一態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片のＣＬドメインのうちの１つの定常ドメインＣＬにおいて、１２３位のアミノ酸がＲで置換され、１２４位のアミノ酸がＫで置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。更なる態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのうちの１つの定常ドメインＣＨ１において、１４７位と２１３位のアミノ酸がＥで置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２４４】
特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片のＣＬドメインのうちの１つにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのうちの１つにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）と２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【０２４５】
より具体的には、本発明はＦａｂ断片を含む二重特異性結合分子に関し、ここで、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる可変ドメインに隣接するＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【０２４６】
本発明の例示的な抗体
一態様では、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合する新規抗体及びその断片を提供する。特定の態様では、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体が提供され、ここで、該抗体は、（ａ）配列番号３７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、及び、配列番号３７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号３７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＬドメインを含む。
【０２４７】
一態様にて、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体が提供され、前記抗体は配列番号３８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【０２４８】
更なる態様では、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体と、結合を競合する抗体が提供され、前記抗体は配列番号３８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【０２４９】
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２５０】
本発明の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。同時発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分からの別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。同時発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。
【０２５１】
幾つかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による二重特異性分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２５２】
一態様では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７５、配列番号１８４、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２３５及び配列番号２３６からなる群から選択される配列を含む。特に、配列番号１５５、配列番号２１１及び配列番号２１２の配列を含むポリヌクレオチドによって又は配列番号１５５、配列番号２１５及び配列番号２１６の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされた二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０２５３】
一態様では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２８７、配列番号２９１、配列番号２９５、配列番号２９９、配列番号３０３、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２９、配列番号３３０、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５３及び配列番号３５４からなる群から選択される配列を含む。
【０２５４】
別の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３９１、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０７、及び配列番号４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２５５】
一態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とする。
【０２５６】
別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とする。
【０２５７】
更なる態様では、本発明は、（ａ）ＧＩＴＲに特異的に結合することができる４つの部分、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とする。
【０２５８】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であり得る。
【０２５９】
組換え法
本発明の二重特異性抗体は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドを、例えば上記のように単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片（すなわちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子若しくはそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードす��ｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるであろう。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０２６０】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連結した最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、内部リボソーム侵入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２６１】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２６２】
後の精製を容易にするため（例えば、ヒスチジンタグ）、又は融合タンパク質を標識するのを補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれ得る。
【０２６３】
本発明の更なる態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴の何れかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう改変できる何れかの種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当該技術分野で周知である。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現後、可溶性画分中の細菌細胞ペーストからポリペプチドを単離し、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。
【０２６４】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁状態で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術は当該技術分野で周知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方を発現するように改変することができる。
【０２６５】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を産生する方法が提供され、ここで該方法は、本明細書で提供される本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で培養すること、及び本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含む。
【０２６６】
本明細書で記載のように調製される本発明の二重特異性分子は、当該技術分野で周知の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを、本質的に実施例に記載されるように抗原結合分子を単離するために使用することができる。二重特異性抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法の何れかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現された二重特異性抗原結合分子は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるようにインタクトであり、正しく組み立てられていることが示された。
【０２６７】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子が、同定され、当該技術分野で周知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけられる。
【０２６８】
１．親和性アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子、抗体及び抗体断片の、その対応するＴＮＦ受容体に対する親和性を、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。二重特異性抗原結合分子の、その標的細胞抗原に対する親和性も、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、実施例２で説明される。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２６９】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の、その対応する受容体発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。一態様では、ＴＮＦ受容体を発現する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイに使用される。これらの細胞は、単離直後（ナイーブＰＭＢＣ）又は刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用される。別の態様では、活性化マウス脾細胞（ＴＮＦ受容体分子を発現する）を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の、その対応するＴＮＦ受容体発現細胞への結合を実証した。更なる態様では、健常なＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのヘパリン処置血液から単離したＰＢＭＣを使用して、対応するカニクイザルＴＮＦ受容体発現細胞に対する二重特異性抗原結合分子又は抗体を示した。
【０２７０】
更なる態様では、標的細胞抗原、例えばＦＡＰを発現するがん細胞株を用いて、抗原結合分子の標的細胞抗原への結合を実証した。
【０２７１】
別の態様では、競合アッセイを使用して、標的又はＴＮＦ受容体にそれぞれ結合する特異的抗体又は抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗原結合分子は、特異的抗標的抗体又は特異的抗ＴＮＦ受容体抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための代表的な方法が、Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)に掲載のMorris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」に詳細に示されている。
【０２７２】
３．活性のアッセイ
一態様では、特定の標的細胞抗原及び生物学的活性を有する特定のＴＮＦ受容体に結合する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上のＴＮＦ受容体を介したアゴニストシグナル伝達を含み得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこのような生物学的活性を有するものとして本アッセイによって同定されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子も提供される。
【０２７３】
特定の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、そのような生物学的活性について試験される。更に、細胞溶解を検出するためのアッセイ（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）、誘導性アポトーシスキネティクスを検出するためのアッセイ（例えば、カスパーゼ３／７活性の測定による）又はアポトーシスを検出するためのアッセイ（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを用いる）は、当該技術分野において周知である。加えて、そのような複合体の生物学的活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はγδＴ細胞などの様々なリンパ球サブセットの生存、増殖及びリンホカイン分泌に対するそれらの効果を評価することによって、又は樹状細胞、単球／マクロファージ若しくはＢ細胞などの抗原提示細胞の表現型及び機能を調節するそれらの能力を評価することによって評価することができる。
【０２７４】
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子又は抗体の何れかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の何れかと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の何れかと、少なくとも１つの追加的な治療剤とを、例えば後述するように含む。
【０２７５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤中に溶解又は分散された一又は複数の二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という句は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一つの本発明による二重特異性抗原結合分子又は抗体と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990によって例示されているように、本開示に照らして当業者には周知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者には周知であるように、任意の及び全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、安定剤及びそれらの組み合わせを含む。
【０２７６】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中において製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。あるいは、二重特異性抗原結合分子又は抗体は、使用前は、適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）を用いた組成用の粉末形態であってもよい。滅菌注射溶液は、本発明の抗原結合分子を、必要に応じて、以下に列挙する様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要量で組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過された液体媒質からの活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、十分な生理食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。内毒素汚染は、安全なレベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれるべきであることが理解されよう。適切な薬学的に許容される賦形剤は、限定されるものではないが、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。
【０２７７】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって作られたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（methylmethacylate））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入されてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなど）を組成物に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【０２７８】
本明細書における例示的な薬学的に許容される賦形剤は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一又は複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２７９】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝剤を含む。
【０２８０】
前に記載した組成物に加えて、抗原結合分子はデポー製剤としても製剤化することができる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、許容可能な油中のエマルジョン）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２８１】
本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる従来の方式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０２８２】
二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、水性及び他のプロトン性溶媒中で、対応する遊離塩基形態よりも可溶性である傾向がある。
【０２８３】
本明細書中の組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２８４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
【０２８５】
治療的方法及び組成物
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子又は抗体の何れかが、治療方法において使用され得る。
【０２８６】
治療法における使用のために、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、良好な医療行為と一致する様式で処方され、投薬され、投与され得る。これに関連して考慮すべき因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。
【０２８７】
一態様では、医薬としての使用のための本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体が提供される。
【０２８８】
更なる態様では、（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激又は増強することに使用のため、（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することに使用のため、（ｉｉｉ）感染症の治療における使用のため、（ｉｖ）がんの治療における使用のため、（ｖ）がんの進行を遅延させることに使用のため、又は（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける使用のための、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体が提供される。特定の態様では、疾患の治療、特にがんの治療における使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は抗体が提供される。
【０２８９】
特定の態様では、治療方法における使用のための本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体が提供される。一態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子又は抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子又は抗体の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法における使用のための二重特異性抗原結合分子又は抗体を提供する。特定の態様では、治療される疾患はがんである。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【０２９０】
一態様では、（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激又は増強する、（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持する、（ｉｉｉ）感染症を治療する、（ｉｖ）がんを治療する、（ｖ）がんの進行を遅延させる、又は（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長するための方法が提供され、ここで、該方法は、治療的有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【０２９１】
更なる態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの例には、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがんからなる群より選択される。当業者は、多くの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は治癒をもたらし得ないが、恩恵を提供し得ることを容易に認識する。幾つかの態様では、何らかの利益を有する生理学的変化も、治療的に有益であると考えられる。従って、幾つかの態様では、生理的変化をもたらす本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。
【０２９２】
疾患の予防又は治療のために、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の適切な用量は（単独で使用されるか、あるいは一又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるときの）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、特定の分子、疾患の重症度及び経過、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体が予防目的又は治療目的のために投与されるのかどうか、以前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴、及び本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。何れの場合にも、投与の責任を負う施術者は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。限定されないが、単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書において考慮される。
【０２９３】
本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、患者に対して、単回で、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。一つの典型的な一日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで一般に持続されるであろう。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量は、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１μｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ、体重１ｋｇあたり約１０μｇ、体重１ｋｇあたり約５０μｇ、体重１ｋｇあたり約１００μｇ、体重１ｋｇあたり約２００μｇ、体重１ｋｇあたり約３５０μｇ、体重１ｋｇあたり約５００μｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ以上及びそこから導かれるあらゆる範囲を含み得る。本明細書に列挙した数値からの誘導可能な範囲の例では、上記の数値に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ〜体重１ｋｇあたり約５００ｍｇなどを投与することができる。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週毎に（例えば患者が融合タンパク質の約２から約２０用量、例えば約６用量を受けるように）投与され得る。初期の高負荷用量の後、一つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２９４】
本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるであろう。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の二重特異性抗原結合分子若しくは抗体又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２９５】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
【０２９６】
初期投与量は、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０２９７】
投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分な本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の血漿レベルを提供するために個々に調整されてもよい。注射による投与のための通常の患者投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０２９８】
局所投与又は選択的取り込みの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０２９９】
本明細書に記載される本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の治療的に有効な用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利益を提供するであろう。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養アッセイ及び動物試験を使用することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる治療指数である。大きな治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1参照。この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０３００】
本発明の融合タンパク質を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療をより高いレベルに調整することも分かっているであろう。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。状態の重篤度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価され得る。更に、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変動するであろう。
【０３０１】
その他の薬剤及び治療
本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、治療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与され得る。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、少なくとも１つの追加的治療剤と同時投与され得る。用語「治療剤」は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与することができる任意の薬剤を包含する。このような追加的治療剤は、治療される特定の徴候に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。特定の実施態様では、追加的治療剤は別の抗がん剤である。
【０３０２】
このような他の薬剤は、意図される目的に対して効果的な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の要因に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載された用量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路によって使用される。
【０３０３】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起き得る分離投与を包含する。
【０３０４】
製造品
本発明の他の態様では、上述した疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上又は容器に付属するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体である。
【０３０５】
ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状を治療するために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の二重特異性抗原結合分子を含有する組成物を中に含む第１の容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性又はその他の治療的薬剤を中に含む組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の症状を治療するために使用できることを示す添付文書を更に含んでもよい。
【０３０６】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望まれる他の材料を更に含んでもよい。
2018535665.tif 000004
2018535665.tif 000005
2018535665.tif 000006
2018535665.tif 000007
2018535665.tif 000008
2018535665.tif 000009
2018535665.tif 000010
2018535665.tif 000011
2018535665.tif 000012
2018535665.tif 000013
2018535665.tif 000014
2018535665.tif 000015
2018535665.tif 000016
2018535665.tif 000017
2018535665.tif 000018
2018535665.tif 000019
2018535665.tif 000020
2018535665.tif 000021
2018535665.tif 000022
2018535665.tif 000023
2018535665.tif 000024
2018535665.tif 000025
2018535665.tif 000026
2018535665.tif 000027
2018535665.tif 000028
【０３０７】
全てのヌクレオチド配列は、それぞれの終止コドン配列なしで提示される。
【０３０８】
以下において、本発明の特定の実施態様が列挙される：
１．  （ａ）共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、及び
（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む、二重特異性抗原結合分子。
２．  共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーが、ＯＸ４０及び４−１ＢＢからなる群から選択される、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
３．  共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーがＯＸ４０である、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
４．  共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項１から３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
５．  ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つの部分の各々が、
（ｉ）配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
６．  ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、及び配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬとを含む、請求項１から５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
７．  ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分の各々が、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
８．  標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される、請求項１から７の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
９．  標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、請求項１から８の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１０．  ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号６８及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号７０及び配列番号７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメイン、
並びに
（ｉｖ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号７６及び配列番号７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号７８及び配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１から９の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１１．  （ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分の各々が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、
（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、配列番号８０又は配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨと、配列番号８１又は配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１２．  共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる４つの部分が、Ｆａｂ断片であり、そのうちの２つずつが互いに連結している、請求項１から１１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１３．  共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片が、ＣＨ１ドメインのＣ末端で、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片のＶＨドメインに融合され、かつ、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片が、ＣＨ１ドメインのＣ末端で、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる第４のＦａｂ断片のＶＨドメインに任意選択的にペプチドリンカーを介して融合される、請求項１から１２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１４．  共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができるＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換され、かつ、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）によって独立に置換される、請求項１から１３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１５．  二重特異性抗原結合分子が、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して一価である、請求項１から１４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１６．  標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分がＶＨ及びＶＬドメインを含み、ＶＨドメインがペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に連結され、ＶＬドメインがペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に連結される、請求項１から１５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１７．  Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項１から１６の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１８．  ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１９．  Ｆｃドメインの第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項１から１８の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
２０．  前記二重特異性抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
２１．  二重特異性抗原結合分子が、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対して四価であり、かつ、標的細胞抗原に対して二価である、請求項１から１４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２２．  標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分が、Ｆａｂ断片又はクロスオーバーＦａｂ断片である、請求項１から１４又は２１の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２３．  標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ断片又はクロスオーバーＦａｂ断片の各々が、ＶＨ又はＶＬドメインのＮ末端でペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＣ末端に融合される、請求項１から１４又は２１から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２４．  標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの部分がＶＨ−ＶＬクロスオーバーＦａｂ断片であり、各々がＶＬドメインのＮ末端でペプチドリンカーを介してＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＣ末端に融合される、請求項１から１４又は２１から２３の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２５．  前記二重特異性抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２２６の第１の軽鎖及び配列番号２２８の第２の軽鎖を含む、請求項１から１４又は２１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２６．  Ｆｃドメインがアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスである、請求項１から２５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２７．  請求項１から２６の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
２８．  請求項１から２７の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
２９．  医薬としての使用のための、請求項１から２５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２８に記載の薬学的組成物。
３０．  （ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
（ｉｉｉ）感染症の治療における、
（ｉｖ）がんの治療における、
（ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、又は
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長することにおける
使用のための、請求項１から２５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２８に記載の薬学的組成物。
３１．  がんの治療における使用のための、請求項１から２５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２８に記載の薬学的組成物。
３２．  二重特異性抗原結合分子が、化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療における使用のための、請求項１から２５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２８に記載の薬学的組成物。
３３．  腫瘍細胞の増殖を阻害するために、請求項１から２５の何れか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２８に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【実施例】
【０３０９】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０３１０】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている。
ＤＮＡ配列決定
【０３１１】
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
遺伝子合成
【０３１２】
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いたＰＣＲによって生成されるか、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成された。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
タンパク質の精製
【０３１３】
標準プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出は、ｐＨ２．８で達成され、続いて試料を直ちに中和した。凝集したタンパク質をＰＢＳ又は２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ６．０中のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を用いて濃縮し（必要に応じて）、−２０℃又は−８０℃で凍結保存した。試料の一部が、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析的特徴づけのために提供された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【０３１４】
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用した。特に、１０％又は４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０３１５】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の測定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システム上の３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステム上の２ｘＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出したタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄゲルろ過スタンダード１５１−１９０１が標準の役割を果たした。
質量分析
【０３１６】
このセクションでは、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ／ＣＬ交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ）の特徴づけについて、それらの正確な組み立てに重点を置いて記載する。期待される一次構造は、脱グリコシル化されたインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂ、及び脱グリコシル化／プラスミン消化ＣｒｏｓｓＭａｂ又は代わりに脱グリコシル化／限定ＬｙｓＣ消化ＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析された。
【０３１７】
ＣｒｏｓｓＭａｂを、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で３７℃で最大１７時間、リン酸又はトリス緩衝液中でＮ−グリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。プラスミン消化又は限定ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化は、脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂ１００μｇを用いて、トリス緩衝液ｐＨ８中で室温で１２０時間、３７℃で４０分間、それぞれ行った。質量分析に先立ち、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＨＰＬＣにより試料を脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上でＥＳＩ−ＭＳによって全質量を測定した。
【０３１８】
実施例１
ＯＸ４０抗体及びツールのバインダーの生成
１．１  抗原の調製、精製及び特徴づけ、並びにファージディスプレイによる新規ＯＸ４０バインダーの生成のためのスクリーニングツール
ヒト、マウス又はカニクイザルＯＸ４０のエクトドメインをコードするＤＮＡ配列（表１）を、ノブについてのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant et al., 1998）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。指示されたビオチン化のためのＡｖｉタグを抗原−ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖との組み合わせは、ＯＸ４０エクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成を可能にし、従ってＦｃ結合抗原の単量体型を作り出す（図１Ａ）。表１は、様々なＯＸ４０エクトドメインのアミノ酸配列を示す。表２は、図１に示される単量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
2018535665.tif 000029
2018535665.tif 000030
2018535665.tif 000031
2018535665.tif 000032
2018535665.tif 000033
【０３１９】
ＯＸ４０−Ｆｃ融合体をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含んでいた。
【０３２０】
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）、並びにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのプラスミドで同時トランスフェクトした。対応するベクターを２：１：０．０５比（「抗原ＥＣＤ−ＡｃＴＥＶ−Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
【０３２１】
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質産生のために、４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのため、細胞を、２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地で置換した。発現ベクターを２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄを培地に加えた。培養の７日後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４℃に保った。
【０３２２】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。未結合タンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０に対して作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（０〜５００ｍＭ）を用いて溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０で洗浄した。
【０３２３】
収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０３２４】
１．２  一般的なＦａｂ及び共通軽鎖ライブラリーからのＯｘ４０特異的８Ｈ９、２０Ｂ７、４９Ｂ４、１Ｇ４、ＣＬＣ−５６３、ＣＬＣ−５６４及び１７Ａ９抗体の選択
抗ＯＸ４０抗体を、３つの異なる一般的なファージディスプレイライブラリー：ＤＰ８８−４（クローン２０Ｂ７、８Ｈ９  １Ｇ４及び４９Ｂ４）、共通軽鎖ライブラリーＶｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３（クローンＣＬＣ−５６３及びＣＬＣ−５６４）及びラムダ−ＤＰ４７（クローン１７Ａ９）から選択した。
【０３２５】
ＤＰ８８−４ライブラリーは、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３、３つの異なる長さ）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に無作為化配列空間を含む、Ｖドメイン対合Ｖｋ１＿５（カッパ軽鎖）及びＶＨ１＿６９（重鎖）を用いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する３つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施した。断片１は無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３からＨ３にわたる中央の定常断片であり、一方、断片３は抗体遺伝子の無作為化されたＨ３及び３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを使用して、ＤＰ８８−４ライブラリーのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿Ｓ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＹ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＰＹと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＲＪＨ３２と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ３１）及び断片３（フォワードプライマーＤＰ８８−ｖ４−４又はＤＰ８８−ｖ４−６又はＤＰ８８−ｖ４−８とリバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇを組み合わせたもの）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分、７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比のゲル精製単一断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性及び９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分の５サイクルであった。この段階で、外側プライマー（ＬＭＢ３及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に２０サイクルを行った。十分な量の全長無作為化Ｆａｂ構築物を集めた後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製されたライゲーションを、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換のために使用した。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。これらのライブラリー構築工程を３回繰り返して、４．４×１０９の最終ライブラリーサイズを得た。ドットブロットにおけるＣ末端タグ検出によって決定されるように、機能的クローンの割合は、軽鎖については９２．６％、重鎖については９３．７％であった。
【０３２６】
共通軽鎖ライブラリーＶｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３は、定常非無作為化共通軽鎖Ｖｋ３＿２０及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に無作為化配列空間を含む、Ｖ−ドメイン対合Ｖｋ３＿２０（κ軽鎖）及びＶＨ３＿２３（重鎖）を用いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する２つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施した。断片１は、Ｌ３からＨ３にわたる定常断片であり、断片２は抗体遺伝子の無作為化されたＨ３及び３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを使用して、Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３共通軽鎖ライブラリーのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ．）と組み合わせたフォワードプライマーＭＳ６４）及び断片２（フォワードプライマーＤＰ４７−ｖ４−４、ＤＰ４７−ｖ４−６、ＤＰ４７−ｖ４−８とリバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇを組み合わせたもの）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分、７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比のゲル精製単一断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性及び９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分の５サイクルであった。この段階で、外側プライマー（ＭＳ６４及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に１８サイクルを行った。十分な量の全長無作為化ＶＨ構築物を集めた後、それらをＭｕｎＩ／ＮｏｔＩで消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製されたライゲーションを、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換のために使用した。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。３．７５×１０９の最終ライブラリーサイズが得られた。ドットブロットにおけるＣ末端タグ検出によって決定されるように、機能的クローンの割合は、軽鎖については９８．９％、重鎖については８９．５％であった。
【０３２７】
ラムダ−ＤＰ４７ライブラリーは、以下のＶ−ドメイン対合を使用してヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築された：Ｖ１３＿１９ラムダ軽鎖とＶＨ３＿２３重鎖。ライブラリーは軽鎖（Ｌ３）のＣＤＲ３及び重鎖（Ｈ３）のＣＤＲ３において無作為化され、「オーバーラップ伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって３つの断片から構築された。断片１は無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３の末端からＨ３の開始点にわたる中央の定常断片であり、一方、断片３は無作為化されたＨ３及びＦａｂ断片の３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを用いて、ライブラリー用のライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３−Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶ）、断片２（ＲＪＨ８０−ＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ））及び断片３（ＤＰ４７−ｖ４−４／ＤＰ４７−ｖ４−６／ＤＰ４７−ｖ４−８−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で６０秒、５５℃で６０秒、７２℃で６０秒、及び７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比の３つの断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性、及び９４℃で６０秒、５５℃で６０秒、７２℃で１２０秒の５サイクルであった。この段階で、外側プライマーを添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に２０サイクルを行った。十分な量の全長無作為化Ｆａｂ断片を集めた後、それらを同様に処理されたアクセプターファージミドベクターとともにＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化した。Ｆａｂライブラリーインサートの１５ｕｇが、ファージミドベクターの１３．３ｕｇと連結された。精製されたライゲーションは６０の形質転換のために使用され、１．５×１０９個の形質転換体が得られた。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。
【０３２８】
ファージディスプレイ選択のための抗原としてのヒトＯＸ４０（ＣＤ１３４）を、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞におけるＮ末端単量体Ｆｃ融合体として一時的に発現させ、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列でのＢｉｒＡビオチンリガーゼの同時発現を介してｉｎ  ｖｉｖｏで部位特異的にビオチン化した。
【０３２９】
選択ラウンド（バイオパニング）を以下のパターンに従って溶液中で行った：
１．  抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために、１０ｕｇ／ｍｌの無関係のヒトＩｇＧでコーティングされたｍａｘｉｓｏｒｐプレート上において約１０１２個のファージミド粒子を事前清澄化する；
２．  全容量１ｍｌ中のＦｃバインダーの更なる枯渇のために、非結合ファージミド粒子を、１００ｎＭの無関係な非ビオチン化Ｆｃノブ・イントゥー・ホール構築物の存在下で、１００ｎＭのビオチン化ヒトＯＸ４０と０．５時間インキュベートする；
３．  ビオチン化ｈｕ  ＯＸ４０及び付着した特異的に結合するファージを、ニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレートの４つのウェルに１０分間（ラウンド１及びラウンド３で）移すことによって捕捉する；
４．  ５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×ＰＢＳを用いてそれぞれのウェルを洗浄する；
５．  １ウェルあたり１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）２５０ｕｌを１０分間添加することによりファージ粒子を溶出し、１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５００ｕｌを４つのウェルからのプールされた溶出液に添加することによって中和する；
６．  Ｆｃバインダーを最終的に除去するために、１００ｎＭのビオチン捕捉したＦｃノブ・イントゥー・ホール構築物を有するニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレート上でのインキュベーションにより中和溶出液を事後清澄化する；
７．  溶出されたファージ粒子の上清により対数期大腸菌ＴＧ１細胞を再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３により感染させ、振盪機で３０℃で一晩インキュベートし、続いて次の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させる。
【０３３０】
選択は１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて３ラウンド又は４ラウンドにわたって実施した。カニクイザルＯＸ４０だけでなくマウスＯＸ４０に対しても交差反応性であるバインダーの可能性を高めるために、幾つかの選択ラウンドでは、ヒトＯＸ４０の代わりにマウス標的が使用された。ラウンド２及び４では、ニュートラアビジンに対するバインダーの濃縮を避けるために、抗原：ファージ複合体の捕捉を、５．４×１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加によって行った。ＥＬＩＳＡにより、以下のようにして特異的バインダーが同定された。１００ｕｌの２５ｎＭのビオチン化ヒトＯＸ４０及び１０ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧを、それぞれニュートラアビジンプレート及びｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングした。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いて、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグを介して検出した。ヒトＯＸ４０に対するシグナルを示し、ヒトＩｇＧに対して陰性であるクローンは、更なる分析のためにリストに載せられ、カニクイザル及びマウスＯＸ４０に対して同様の方法で試験された。それらは、０．５リットルの培養体積で細菌で発現され、アフィニティー精製され、更にＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを用いたＳＰＲ分析によって特徴づけられた。
【０３３１】
表３は、一般的なファージディスプレイ抗体ライブラリー（ＤＰ８８−４）の配列を示し、表４は、ライブラリーＤＰ８８−４生殖細胞系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供し、表５は、ＤＰ８８−４生殖細胞系列テンプレートの生成に使用されるプライマー配列を示す。
2018535665.tif 000034
2018535665.tif 000035
2018535665.tif 000036
2018535665.tif 000037
【０３３２】
表６は、一般的なファージディスプレイ抗体共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）の配列を示す。表７は、共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）生殖細胞系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供し、表８は、共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）の生成に使用されるプライマー配列を示す。
2018535665.tif 000038
2018535665.tif 000039
2018535665.tif 000040
2018535665.tif 000041
【０３３３】
表９は、ＰＣＲに使用される一般的なファージディスプレイラムダ−ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）テンプレートの配列を示す。表１０はラムダ−ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）生殖細胞系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供し、表１１はラムダ−ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）の生成に使用されるプライマー配列を示す。
2018535665.tif 000042
2018535665.tif 000043
2018535665.tif 000044
ラムダ−ＤＰ４７ライブラリー、すなわちＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ．）、ＤＰ４７−ｖ４−４、ＤＰ４７−ｖ４−６、ＤＰ４７−ｖ４−８及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇの構築のために使用される更なるプライマーは、共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）の構築に使用されたプライマーと同一であり、既に表８に列挙されている。
【０３３４】
クローン８Ｈ９、２０Ｂ７、４９Ｂ４、１Ｇ４、ＣＬＣ−５６３、ＣＬＣ−５６４及び１７Ａ９は、上記の手順によりヒトＯｘ４０特異的バインダーとして同定された。それらの可変領域のｃＤＮＡ配列は以下の表１２に示され、対応するアミノ酸配列を表Ｃに見出すことができる。
2018535665.tif 000045
2018535665.tif 000046
2018535665.tif 000047
【０３３５】
１．３  抗Ｏｘ４０  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体の調製、精製及び特徴づけ
選択された抗Ｏｘ４０バインダーの重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとフレーム内にサブクローニングした。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０３３６】
抗Ｏｘ４０クローンのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を表１３に示す。抗Ｏｘ４０−Ｆｃ融合体をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。加えて、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
2018535665.tif 000048
2018535665.tif 000049
2018535665.tif 000050
2018535665.tif 000051
2018535665.tif 000052
2018535665.tif 000053
2018535665.tif 000054
2018535665.tif 000055
2018535665.tif 000056
【０３３７】
抗Ｏｘ４０抗体は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトされた。
【０３３８】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７°Ｃで３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及びサプリメントを含む７％のＦｅｅｄを加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０３３９】
細胞培養上清からの抗体分子の精製は、抗原Ｆｃ融合体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
【０３４０】
タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０３４１】
精製された抗体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。抗体の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０３４２】
表１４は、抗Ｏｘ４０  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１抗体の収率及び最終含有量をまとめたものである。
2018535665.tif 000057
【０３４３】
実施例２
抗ＯＸ４０抗体の特徴づけ
２．１  ヒトＯＸ４０への結合
２．１．１  表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来ＯＸ４０特異的抗体の組換えＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５°Ｃで行った。
【０３４４】
同じ実験において、ファージディスプレイ由来の抗ＯＸ４０クローン８Ｈ９、４９Ｂ４、１Ｇ４、２０Ｂ７、ＣＬＣ−５６３、ＣＬＣ−５６４及び１７Ａ９（全てヒトのＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換えＯＸ４０（ヒト、カニクイザル及びマウス）の間の種選択性並びに相互作用のアビディティーが決定された。ビオチン化ヒト、カニクイザル及びマウスＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大６００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。
【０３４５】
ファージディスプレイ由来の抗ＯＸ４０ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、２〜５００ｎＭ（３倍希釈）の濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。複合体の解離を２１０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
【０３４６】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表１６）。
【０３４７】
同じ実験において、ファージディスプレイ由来抗体８Ｈ９，４９Ｂ４，１Ｇ４，２０Ｂ７、ＣＬＣ−５６３及びＣＬＣ−５６４（ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換えＯＸ４０との間の相互作用の親和性を決定した。この目的のために、ヒト又はマウスＯｘ４０のエクトドメインもまた、ａｖｉ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）及びヘキサヒスチジンタグ（これらの配列については表１５を参照のこと）とフレーム内でサブクローニングされ、又はＡｃＴＥＶプロテアーゼによる切断及びクロマトグラフィー法によるＦｃの除去によって得られた。
2018535665.tif 000058
【０３４８】
タンパク質の産生を、Ｆｃ融合タンパク質について上記のように行った。分泌されたタンパク質は、キレートクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。
【０３４９】
最初のクロマトグラフィー工程は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｎＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で平衡化したＮｉＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）で行った。溶出は、５％〜４５％の溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｎＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）からの１２カラム容量に対する勾配を適用することによって行った。
【０３５０】
タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０３５１】
親和性の決定は、２つの設定を用いて行った。
設定１）抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約９０００ＲＵであった。ＯＸ４０に対するファージディスプレイ由来抗体を２５〜５０ｎＭの濃度で６０秒間捕捉した。組換えヒトＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）を４〜１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ−ＥＰが注入された。
【０３５２】
設定２）抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約８０００ＲＵであった。Ｏｘ４０に対するファージディスプレイ由来抗体を２０ｎＭの濃度で６０秒間捕捉した。組換えヒトＯｘ４０  ａｖｉ  Ｈｉｓを２．３〜６００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ−ＥＰが注入された。
【０３５３】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
【０３５４】
クローン４９Ｂ４、１Ｇ４及びＣＬＣ−５６４は、クローン８Ｈ９、２０Ｂ７及びＣＬＣ−５６３よりも低い親和性でヒトＯｘ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）に結合する。
【０３５５】
抗ＯＸ４０  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１とヒトＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用の親和性定数を、１：１ラングミュア結合に適合させることによって決定した。
2018535665.tif 000059
【０３５６】
２．１．２  ヒトＯｘ４０発現細胞への結合：ナイーブ及び活性化ヒト末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容量のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０３２６）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）が供給され、バフィコート溶液をそのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７の上に重ねた。試験管を４００×ｇ、室温で、低加速度でブレーキ無しで３０分間遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から採取し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６０００−０４４、Ｌｏｔ  ９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を供給されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１−０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５００３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。
【０３５７】
ＰＢＭＣは単離直後に使用され（ナイーブなヒトＰＢＭＣへの結合）、又はそれらは、Ｔ細胞の細胞表面上の強いヒトＯｘ４０発現を受けるように刺激された（活性化ヒトＰＢＭＣへの結合）。従って、ナイーブＰＢＭＣを、６ウェル組織培養プレート中に２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ及び２ｕｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌを供給したＴ細胞培地で５日間培養し、次いで、プレコートした６ウェル組織培養プレート［２ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び２ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）］上で、３７℃、５％ＣＯ２で、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地中で１日間培養した。
【０３５８】
Ｏｘ４０の検出のために、ナイーブヒトＰＢＭＣと活性化ヒトＰＢＭＣとを混合した。活性化されたヒトＰＢＭＣからナイーブＰＢＭＣの識別を可能にするために、休止細胞を、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を用いて結合アッセイの前に標識した。
【０３５９】
標識のために、細胞を収集し、予熱した（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中で１×１０７細胞／ｍＬの細胞密度に調整した。ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を最終濃度２．５ｍＭ及びＤＰＢＳ中の最終細胞密度０．５×１０７細胞／ｍＬでナイーブなヒトＰＢＭＣの懸濁液に添加した。次いで、細胞を暗所で室温で１０分間インキュベートした。標識反応を停止させるために、２ｍＬのＦＢＳを添加し、細胞をＴ細胞培地で３回洗浄した。１×１０５個のナイーブ、ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの１：１混合物を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加した（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）。
【０３６０】
プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を、４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）２００μＬで１回洗浄した。細胞を、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物を含む４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェル中で、４℃で１２０分間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄して結合していない構築物を除去した。
【０３６１】
細胞を暗所で４℃で３０分間、蛍光標識された抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）、抗ヒトＣＤ４５（クローンＨＩ３０、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４０２８）、及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９ ０９６ ０９８）を含有する２５μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液中で染色した。
【０３６２】
プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
【０３６３】
図２に示すように、Ｏｘ４０に特異的な抗体構築物は、Ｏｘ４０を発現しない休止ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、全ての構築物は、Ｏｘ４０を発現する活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強力であった。活性化ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞上に検出されたＯｘ４０レベルのほんの一部のみを発現する。違いは、ドナーと時間に依存する。分析した抗Ｏｘ４０クローンはその結合強度において様々であった。ＥＣ５０値を表１７に示す。二価及び一価ＦＡＰ標的化構築物の更なる評価のために、高い（８Ｈ９）及び低い（４９Ｂ４／１Ｇ４）結合能力を有するクローンを選択した。
2018535665.tif 000060
【０３６４】
２．２  マウスＯＸ４０への結合
２．２．１  表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来ＯＸ４０特異的抗体２０Ｂ７の組換えマウスＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、ヒトＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）について上記したように表面プラズモン共鳴によって評価した（実施例２．１．１を参照）。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表１８）。
【０３６５】
親和性決定のために、Ｆｃ融合タンパク質と基準フローセルとの非特異的相互作用のために、ＡｃＴＥＶプロテアーゼで切断されたマウスＯｘ４０  Ｈｉｓ（実施例２．１．２参照）又はＯｘ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）を使用した。抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約８０００ＲＵであった。ＯＸ４０に対するファージディスプレイ由来抗体を２５ｎＭの濃度で６０秒間捕捉した。組換えマウスＯＸ４０（配布者の指示に従ってＡｃＴＥＶ消化により切断された）を、４．１〜１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ−ＥＰが注入された。
【０３６６】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。クローン２０Ｂ７がマウスＯＸ４０に結合することが示された（表１８）。
【０３６７】
抗ＯＸ４０  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡのＩｇＧ１分子とマウスＯＸ４０との間の相互作用の親和性定数をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
2018535665.tif 000061
【０３６８】
２．２．２  マウスＯＸ４０発現細胞への結合：ナイーブ及び活性化マウス脾細胞（選択されたクローン）
マウス脾臓を３ｍＬのＰＢＳに集め、ｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  カタログ番号１３０−０９６−３３４）及びｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｏｃｔｏ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて単一細胞懸濁液を生成した。その後、脾細胞を３０μｍの前分離（ｐｒｅ−ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）フィルター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  カタログ番号１３０−０４１−４０７）に通して濾過し、４℃、３５０ｘｇで７分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｐ４３３３）を供給したＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。１０６細胞／ｍＬを、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３εアルメニアハムスターＩｇＧ（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００３３１）及び２μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ２８シリアンハムスターＩｇＧ（クローン３７．５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０２１０２）をコーティングした６ウェル組織培養プレート中で３日間培養した。活性化又は新鮮なマウス脾細胞を収集し、ＤＰＢＳで洗浄し、計数し、０．１×１０６個の細胞を９６個のＵ底非組織培養処理プレートの各ウェルに移した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、異なる濃度の抗ＯＸ４０ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（選択されたバインダーのみ）を含有する５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で染色した。細胞を４℃で１２０分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、抗マウスＣＤ８ｂラットＩｇＧ２ｂκ−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７１４、クローン５３−６．７）、抗マウスＣＤ４ラットＩｇＧ２ｂκ−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４２２、クローンＧＫ１．５）及びＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９８）を含有するＦＡＣＳ緩衝液２５μＬ／ウェル中で４℃で３０分間染色した。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
【０３６９】
図３に示すように、クローン２０Ｂ７及び良く特徴づけられたマウス特異的ベンチマーク抗体ＯＸ８６のみが、活性化マウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合を示した。休止マウス脾細胞においては結合は観察されなかった。
【０３７０】
２．３  カニクイザルＯＸ４０への結合
選択された抗ＯＸ４０バインダーのカニクイザル細胞との反応性を試験するために、健常なＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＰＢＭＣを、ヒト細胞について記載したような密度勾配遠心分離を軽微な修正を加えて用いてヘパリン処置血液から単離した。ＤＰＢＳで希釈したリンパ球プレパラート培地（９０％ｖ／ｖ、Ａｘｏｎ  Ｌａｂ、カタログ番号１１１４５４５）を用いて、ヘパリン処理した新鮮な血液から密度勾配遠心分離を用いてカニクイザルＰＢＭＣを単離した。遠心分離は、５２０ｘｇで、室温で３０分間ブレーキ無しで行った。血小板数を減少させるために、１５０ｘｇで室温で１５分間の隣接した遠心分離を行った後、無菌ＤＰＢＳでＰＢＭＣを洗浄するために室温で１０分間４００ｘｇで数回遠心分離を行った。ＰＢＭＣは、Ｔ細胞の細胞表面上で強いＯｘ４０発現を受けるように刺激された（活性化されたカニクイザルＰＢＭＣへの結合）。従って、ナイーブＰＢＭＣを、プレコートした１２ウェル組織培養プレート［１０μｇ／ｍＬのカニクイザル交差反応性抗ヒトＣＤ３（クローンＳＰ３４）及び２μｇ／ｍＬのカニクイザル交差反応性抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）］上で、３７℃、５％ＣＯ２で２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地中で７２時間培養した。
【０３７１】
次いで、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに０．５×１０５個の活性化カニクイザルＰＢＭＣを添加した。細胞を２００μＬの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物を含む４℃の冷ＦＡＣＳの５０μＬ／ウェル中で４℃で１２０分間インキュベートした。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄した。細胞を、蛍光標識したカニクイザル交差反応性抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ−４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢＤ、カタログ番号３１７４２８）、抗ヒトＣＤ８（クローンＨＩＴ８ａ、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢＤ、カタログ番号５５５３６９）及びＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９８）を含む２５μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
【０３７２】
図４に示すように、ほとんどの構築物が活性化ＣＤ４＋カニクイザルＴ細胞に結合した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強力であった。ＯＸ４０の発現レベルは、動力学及び刺激の強さに依存しており、ＣＤ４＋カニクイザルＴ細胞に対しては最適化されたが、ＣＤ８＋カニクイザルＴ細胞に対しては最適化されなかったので、ＣＤ８＋  Ｔ細胞ではほとんどＯＸ４０発現が誘導されなかった。分析した抗ＯＸ４０クローンはその結合強度において様々であった。ＥＣ５０値を表１９に示す。非典型的な曲線適合のため、クローン８Ｈ９、４９Ｂ４、２１Ｈ４についてはＥＣ５０値は計算できなかった。
2018535665.tif 000062
【０３７３】
２．３．１  表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来ＯＸ４０特異的抗体（全てヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）の組換えカニクイザルＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
【０３７４】
ビオチン化カニクイザルＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大８００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。
【０３７５】
ファージディスプレイ由来の抗ＯＸ４０ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、２〜５００ｎＭ（３倍希釈）の濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。複合体の解離を２１０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
【０３７６】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表２０）。
【０３７７】
同じ実験において、ファージディスプレイ由来抗体（ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換えカニクイザルＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用の親和性を決定した。抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約９０００ＲＵであった。Ｏｘ４０に対するファージディスプレイ由来抗体を２５〜５０ｎＭの濃度で６０秒間捕捉した。組換えカニクイザルＯｘ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）を４〜１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ−ＥＰが注入された。
【０３７８】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた（表２０）。
【０３７９】
クローン４９Ｂ４、１Ｇ４及びＣＬＣ−５６４は、クローン８Ｈ９、２０Ｂ７及びＣＬＣ−５６３よりも低い親和性でカニクイザルＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）に結合する。
【０３８０】
抗ＯＸ４０  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡのＩｇＧ１とカニクイザルＯＸ４０との間の相互作用の親和性定数をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
2018535665.tif 000063
【０３８１】
２．３．２  カニクイザルＯＸ４０発現細胞への結合：活性化されたカニクイザル末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
Ｏｘ４０陰性腫瘍細胞への結合
Ｏｘ４０陰性腫瘍細胞への結合の欠如は、ＷＭ２６６−４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６７６）及びＵ−８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）腫瘍細胞を用いて試験した。両方の腫瘍細胞の分離を可能にするために、ＷＭ２６６−４細胞をＰＫＨ−２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＫＨ２６ＧＬ）で予め標識した。細胞を収集し、ＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄した。ペレットを、新たに調製したＰＫＨ２６−赤色染色溶液（提供された希釈液Ｃ中で最終濃度［１ｎＭ］）中、１×１０７個の細胞の最終細胞密度で、暗所で室温で５分間染色した。過剰のＦＢＳを添加して標識反応を停止させ、細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを補充したＲＰＭＩ １６４０培地で４回洗浄して過剰の色素を除去した。
【０３８２】
ＤＰＢＳ中の５×１０４個のＰＫＨ２６標識ＷＭ２６６−４細胞と非標識Ｕ−８７ ＭＧ細胞の混合物を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを短時間の穏やかなボルテックスで再懸濁した。全ての試料を、滴定濃度の抗Ｏｘ４０ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体構築物を含有する４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェルに４℃で１２０分間再懸濁した。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄した。細胞を、ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９８）を含む２５μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
【０３８３】
図５に示すように、ＯＸ４０に特異的な抗体構築物は、ＯＸ４０陰性ヒト腫瘍細胞ＷＭ２６６−４及びＵ−７８ＭＧに結合しなかった。
【０３８４】
２．４  リガンドブロッキング特性
ＯＸ４０／ＯＸ４０−リガンド相互作用を妨げるＯＸ４０特異的ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体分子の能力を決定するために、ヒトＯＸ４０リガンド（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＯＸ４０とＯＸ４０リガンドとの間の相互作用の親和性が低いため、Ｃ末端のＨａタグを有する二量体ヒトＯＸ４０  Ｆｃ融合体を調製した（図１Ｂ）。この二量体ヒトＯｘ４０  Ｆｃ融合分子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表２１に示す。産生及び精製を、実施例１．１の単量体ＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）について記載したように実施した。
2018535665.tif 000064
【０３８５】
ヒトＯＸ４０リガンド（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、標準アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０で、ＣＭ５チップの２つのフローセルに約２５００ＲＵで直接連結させた。組換えヒトＯｘ４０  Ｆｃを、第２のフローセル上で２００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を省略し、ファージ由来の抗Ｏｘ４０ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９ＬＡＬＡを、両方のフローセル上で５００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を６０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗体を固定化ヒトＯＸ４０リガンドを有する表面上に流したが、その上には組換えヒトＯＸ４０  Ｆｃの代わりにＨＢＳ−ＳＰが注入された図１Ｃは実験の設計を示す。
【０３８６】
ファージ由来クローン２０Ｂ７は、ヒトＯＸ４０とそのＯＸ４０リガンドとの複合体に結合した（表２２、図６）。従って、この抗体は、ヒトＯＸ４０への結合についてリガンドと競合せず、従って、「非リガンドブロッキング」と呼ばれる。対照的に、クローン８Ｈ９，１Ｇ４，４９Ｂ４、ＣＬＣ−５６３及びＣＬＣ−５６４は、そのリガンドと複合体を形成したヒトＯＸ４０に結合せず、従って「リガンドブロッキング」と呼ばれる。
2018535665.tif 000065
【０３８７】
実施例３
抗ヒトＯＸ４０結合クローンの機能特性
３．１  ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞
ＯＸ４０のそのリガンドへのアゴニスト結合は、核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化を介した下流シグナル伝達を誘導する（A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972）。組換えレポーター細胞株ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１を作成し、その表面にヒトＯｘ４０を発現させた。更に、それはＮＦκＢ感受性エンハンサーセグメントの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを保持している。Ｏｘ４０トリガーは、ＮＦκＢの用量依存的活性化を誘導し、これは核内に移行し、レポータープラスミドのＮＦκＢ感受性エンハンサーに結合して、ルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させるルシフェラーゼはルシフェリン酸化を触媒し、光を放出するオキシルシフェリンを生じる。これは、ルミノメーターで定量することができる。１つの実験の範囲は、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導するためのＰ３２９ＧＬＡＬＡ  ｈｕＩｇＧ１フォーマットにおける様々な抗Ｏｘ４０バインダーの能力を試験することであった。
【０３８８】
接着性ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を用いて３７℃で１０分間収集した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２２５６１−０２１）、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％（ｖ／ｖ）の非必須アミノ酸を含むアッセイ培地中で２×１０５の細胞密度に調整した。細胞を、蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（グライナー・バイオ・ワン、カタログ番号６５５０８３）にウェルあたり０．３×１０５細胞の密度で播種し、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩維持した。
【０３８９】
翌日、ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１を、Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ｈｕＩｇＧ１フォーマットの様々な滴定抗ＯＸ４０バインダーを含有するアッセイ培地を添加して６時間刺激した。抗ＯＸ４０抗体に対する過架橋の効果を試験するために、二次抗体抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９８）を含む培地５０μＬ／ウェルを１：２の比（一次の単一抗ＯＸ４０  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ｈｕＩｇＧ１よりも２倍多い二次抗体）で添加した。インキュベーション後、上清を吸引し、プレートをＤＰＢＳで２回洗浄した。ルシフェラーゼ１０００アッセイ系及びレポーター溶解緩衝液（両方ともＰｒｏｍｅｇａであり、カタログ番号Ｅ４５５０及びカタログ番号Ｅ３９７１）を製造者の指示に従って使用して、発光の定量化を行った。簡単には、ウェル当たり３０μＬの１×溶解緩衝液を添加することにより、細胞を−２０℃で１０分間溶解させた。細胞を３７℃で２０分間解凍した後、ウェル当たり９０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加した。全ての波長を収集するためのフィルターを使用せずに、５００ｍｓの積分時間を使用して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて発光を直ちに定量した。放出された相対光単位（ＵＲＬ）を、ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞の基底発光によって補正し、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて対数一次抗体濃度に対してブロットした。曲線は、組み込みのＳ字状線量応答を用いて適合させた。
【０３９０】
図７に示されるように、限定された用量依存性のＮＦκＢ活性化は、抗ＯＸ４０  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ｈｕＩｇＧ１抗体（左側）をレポーター細胞株に添加することによって既に誘導された。抗ヒトＩｇＧ特異的二次抗体による抗ＯＸ４０抗体の過架橋は、濃度依存的にＮＦκＢ媒介性ルシフェラーゼ活性化の誘導を強く増加させた（右側）。活性化のＥＣ５０値を表２３にまとめる。
2018535665.tif 000066
【０３９１】
３．２  最適以下にＴＣＲトリガーされた事前活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞のＯＸ４０媒介共刺激
ＯＸ４０のライゲーションは、最適以下のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後にＴ細胞の分裂及び生存を促進する相乗的な共刺激シグナルを提供する（M. Croft et al., Immunol. Rev. 2009, 229(1), 173-191）。更に、幾つかのサイトカインの産生及びＴ細胞活性化マーカーの表面発現が増加する（I. Gramaglia et al., J. Immunol. 1998, 161(12), 6510-6517; S. M. Jensen et al., Seminars in Oncology 2010, 37(5), 524-532）。
【０３９２】
種々の抗ＯＸ４０結合剤のアゴニスト特性を試験するために、事前に活性化されたＯｘ４０陽性ＣＤ４  Ｔ細胞を、溶液中又はプレート表面上に固定化されている抗ＯＸ４０抗体の存在下で、プレート固定された抗ＣＤ３抗体の最適以下の濃度で７２時間刺激した。Ｔ細胞の生存及び増殖に対する影響を、フローサイトメトリーにより生存細胞における総細胞数及びＣＦＳＥ希釈のモニタリングによって分析した。更に、Ｔ細胞活性化及び分化マーカー、例えばＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ、Ｔｉｍ−３、ＣＤ６２Ｌ及びＯＸ４０それ自体に対する蛍光標識抗体で細胞を同時染色した。
【０３９３】
ヒトＰＢＭＣをフィコール密度遠心分離により単離し、実施例２．１．２に記載したように、ＰＨＡ−Ｌ［２μｇ／ｍＬ］及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ［２００Ｕ／ｍＬ］で３日間刺激した。次いで細胞を、最終濃度［５０ｎＭ］のＣＦＤＡ−ＳＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２１８８）を用いて１ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度でＣＦＳＥにより染色した。その後、細胞をＦＢＳ（１０％ｖ／ｖ）を含む過剰のＤＰＢＳで２回洗浄した。標識された細胞を、３７℃で３０分間Ｔ細胞培地中で休ませた。その後、ＤＰＢＳを用いた２回の更なる洗浄工程によって、非変換ＣＦＤＡ−ＳＥを除去した。事前活性化されたＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣからのＣＤ４  Ｔ細胞の単離を、ＭＡＣＳ陰性ＣＤ４  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、製造者の指示に従って行った。
【０３９４】
Ｍｏｒｒｉｓらは、従来の抗Ｏｘ４０抗体によるアゴニスト共刺激が表面固定化に依存することを示した（N. P. Morris et al., Mol. Immunol. 2007, 44(12), 3112-3121）。従って、ヤギ抗マウスＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１１−５００−５００８）を、ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００６−０９８）の存在下（表面固定化抗ＯＸ４０）又は非存在下（溶液中の抗ＯＸ４０）で、４℃で一晩ＰＢＳ中で［２μｇ／ｍＬ］の濃度で９６ウェルＵ底細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ）の表面にコーティングした。その後、ＢＳＡを含むＤＰＢＳ（１％ｖ／ｗ）でプレート表面をブロックした。以下の全てのインキュベーション工程は、ＢＳＡ（１％ｖ／ｗ）を含有するＰＢＳ中で３７℃で９０分間行われた。インキュベーション工程の間に、プレートをＤＰＢＳで洗浄した。
【０３９５】
マウス抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６−００３７−８５、固定濃度［３ｎｇ／ｍＬ］）を、表面被覆抗マウスＦｃγ特異的抗体を介して、次のインキュベーション工程で捕捉した。１つの実験において、滴定したヒト抗ＯＸ４０抗体（ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）を、ＤＰＢＳ中における更なるインキュベーション工程によってプレート上に固定化した。第２の実験では、抗ＯＸ４０抗体を、活性化アッセイの間に、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体でプレコートされていないプレートの培地に直接添加した。
【０３９６】
ＣＦＳＥ標識事前活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞を２００μＬのＴ細胞培地中０．６×１０５細胞／ウェルの細胞密度でプレコートプレートに添加し、９６時間培養した。細胞を、蛍光色素標識マウス抗ヒトＯｘ４０（クローンＢｅｒＡＣＴ３５、Ｂｉｏｌｅｄｇｅｎｄ、カタログ番号３５００８）、ＴＩＭ−３（クローンＦ３８−２Ｅ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４５００８）、ＣＤ１２７（クローンＡ０１９Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５１２３４）、ＣＤ６２Ｌ（クローンＤＲＥＧ５６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４８３４）及びＣＤ４５ＲＡ（クローンＨＩ１００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５４８９）の組み合わせで４℃、暗所で２０分間染色した。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
【０３９７】
ＤＡＰＩ陰性生細胞を、増殖のマーカーとしてＣＦＳＥ蛍光の中央値の減少について分析した。ＯＸ４０陽性、ＣＤ６２Ｌ低及びＴＩＭ−３陽性Ｔ細胞の割合をＴ細胞活性化のマーカーとしてモニターした。ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１２７の発現を分析してＴ細胞の成熟状態における変化を決定し、それによってＣＤ４５ＲＡ低ＣＤ１２７低細胞をエフェクターＴ細胞として分類した。
【０３９８】
プレート固定化抗体による共刺激は、プレート固定化抗ヒトＣＤ３による事前活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞の最適以下の刺激を用量依存的に強く亢進した（図８）。Ｔ細胞はより強く増殖し、より高い割合のエフェクターＴ細胞を有するより成熟した表現型を示し、ＣＤ６２Ｌ低、Ｔｉｍ−３陽性及びＯＸ４０陽性活性化細胞のより高い割合を有していた。幾つかのクローン（８Ｈ９，２０Ｂ７）は、市販の検出抗体を細胞ＯＸ４０への結合において打ち負かした。それらについてはＥＣ５０値の計算は不可能であり、従ってＯＸ４０誘導についての全てのＥＣ５０値は、全般的なＥＣ５０値の計算から除外された。Ｔ細胞活性化の他の全てのパラメーターにおける最大半量の変化は、３〜７００ｐＭの範囲の濃度で達成され、図９及び表２４にまとめられる。抗Ｏｘ４０抗体を表面固定化の非存在下で溶液中に添加した場合、最適以下のＴＣＲ刺激の増強は見られなかった（図１０）。これは、ＯＸ４０受容体の過架橋に対するＯｘ４０軸活性化の強い依存性を再び実証した。
【０３９９】
抗ＯＸ４０抗体（ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマット）の結合強度とアゴニスト活性（生物活性）との相関を図１１に示す。ほとんどのクローンについて、直接相関があったが、驚くべきことに、２つのクローン（４９Ｂ４，１Ｇ４）は、それらの結合強度から予測されたより強い生物活性を示した。
2018535665.tif 000067
【０４００】
実施例４
Ｏｘ４０及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性構築物の生成
４．１  Ｏｘ４０及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性二価抗原結合分子の生成（２＋２フォーマット、比較例）
Ｏｘ４０及びＦＡＰに対する二価結合を有する二重特異性アゴニストＯｘ４０抗体を調製した。誤って対形成された軽鎖の形成を減少させるために、国際特許出願第ＷＯ２００／１４５７９２（Ａ１）号によるクロスマブ（ｃｒｏｓｓｍａｂ）技術が適用された。
【０４０１】
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０２】
この実施例では、ＦＡＰバインダー２８Ｈ１の交差Ｆａｂ単位（ＶＨＣＬ）を（Ｇ４Ｓ）４コネクタ配列を用いて抗ＯＸ４０  ｈｕＩｇＧ１の重鎖にＣ末端融合させた。この重鎖融合体を、抗ＯＸ４０の軽鎖及び対応するＦＡＰ交差軽鎖（ＶＬＣＨ１）と同時発現させた。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入されている。得られた二重特異性二価構築物を図１２Ａに示す。
【０４０３】
表２５は、成熟二重特異性二価抗ＯＸ４０／抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
2018535665.tif 000068
2018535665.tif 000069
2018535665.tif 000070
2018535665.tif 000071
2018535665.tif 000072
2018535665.tif 000073
2018535665.tif 000074
2018535665.tif 000075
2018535665.tif 000076
2018535665.tif 000077
【０４０４】
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
【０４０５】
二重特異性抗Ｏｘ４０、抗ＦＡＰ構築物は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
【０４０６】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７°Ｃで３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０４０７】
細胞培養上清からの二重特異性構築物の精製は、抗原Ｆｃ融合体及び抗体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
【０４０８】
タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０４０９】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した（表２６）。
2018535665.tif 000078
【０４１０】
４．２  Ｏｘ４０及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性一価抗原結合分子の生成（１＋１フォーマット、比較例）
Ｏｘ４０及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性アゴニストＯｘ４０抗体は、誤って対形成された軽鎖の形成を減少させるために、国際特許出願ＷＯ２０１０１４５７９２（Ａ１）号によるクロスマブ技術を適用することによって調製された。
【０４１１】
この実施例では、ＦＡＰバインダー２８Ｈ１の交差Ｆａｂ単位（ＶＨＣＬ）をｈｕＩｇＧ１のホール重鎖に融合させた。抗Ｏｘ４０に対するＦａｂをノブ重鎖に融合させた。標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホールと抗Ｏｘ４０−Ｆｃノブ鎖との組み合わせは、ＦＡＰ結合Ｆａｂ及びＯｘ４０結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図１２Ｂ）。
【０４１２】
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入されている。
【０４１３】
得られた二重特異性一価構築物は図１２Ｂに示され、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は表２７に見出すことができる。
2018535665.tif 000079
2018535665.tif 000080
2018535665.tif 000081
2018535665.tif 000082
2018535665.tif 000083
2018535665.tif 000084
2018535665.tif 000085
2018535665.tif 000086
【０４１４】
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
【０４１５】
二重特異性抗Ｏｘ４０、抗ＦＡＰ構築物は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１：１の比（「ベクター重鎖ホール」：「ベクター重鎖ノブ」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
【０４１６】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７°Ｃで３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０４１７】
細胞培養上清からの二重特異性抗原結合分子の精製は、抗原Ｆｃ融合体及び抗体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
【０４１８】
タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０４１９】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０４２０】
表２８は、二価特異的一価抗Ｏｘ４０／抗ＦＡＰ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  ｋｉｈ抗原結合分子の生化学分析をまとめたものである。
2018535665.tif 000087
【０４２１】
４．３  Ｏｘ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性二価構築物の特徴づけ
４．３．１  表面プラズモン共鳴（同時結合）
ヒトＯｘ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰを同時に結合させる能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。ビオチン化カニクイザルＯｘ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大１０００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。
【０４２２】
Ｏｘ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性構築物を、２５０ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速でフローセルに９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、２５０ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルを通して３０μＬ／分の流速で第２分析物として注入した（図１２Ｃ）。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
【０４２３】
２＋２構築物について図１３Ａ−１３Ｄのグラフに、及び図１３Ｅ−１３Ｈに見られるように、全ての二重特異性構築物はヒトＯｘ４０とヒトＦＡＰとを同時に結合することができた。
【０４２４】
４．３．２  細胞への結合
４．３．２．１  ＦＡＰ標的化抗ヒトＯｘ４０抗体のヒトＰＢＭＣへの結合；ナイーブ対活性化ヒトＰＢＭＣ
ヒトＰＢＭＣを、実施例２．１．２に記載のフィコール密度勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣは単離直後に使用され（休止ヒトＰＢＭＣへの結合）、又はそれらは、Ｔ細胞の細胞表面上の強いヒトＯｘ４０発現を受けるように刺激された（活性化ヒトＰＢＭＣへの結合）。従って、ナイーブＰＢＭＣを、６ウェル組織培養プレート中に２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ及び２ｕｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌを供給したＴ細胞培地で４〜７日間培養し、次いで、プレコートした６ウェル組織培養プレート［１０ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び２ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）］上で、３７℃、５％ＣＯ２で、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地中で１日間培養した。
【０４２５】
Ｏｘ４０の検出のために、ナイーブヒトＰＢＭＣと活性化ヒトＰＢＭＣとを混合した。活性化されたヒトＰＢＭＣからナイーブＰＢＭＣの識別を可能にするために、ナイーブ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を用いて結合アッセイの前に標識した。１×１０５個のナイーブ、ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの１：１混合物を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加し（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）、結合アッセイを実施例２．１．２に記載のように実施した。１×１０５個のナイーブ、ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの１：１混合物を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加し（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）、結合アッセイをセクション２．１．２に記載のように実施した。
【０４２６】
一次抗体は、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物であり、４℃で１２０分間インキュベートされた。二次抗体溶液は、蛍光標識された抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９８）の混合物であり、暗所で４℃で３０分間インキュベートされた。プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
【０４２７】
図１４Ａ及び１４Ｂに示すように、Ｏｘ４０に特異的な抗原結合分子は、休止ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、全ての抗原結合分子は活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、実施例１．４．１．２において既に記載したものと同様に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強力であった。図１４Ａ及び１４Ｂに示すように、二価ＦＡＰ標的化Ｏｘ４０構築物は、従来のＩｇＧ抗体フォーマットのそれぞれのクローンと類似した、Ｏｘ４０陽性細胞及び陰性細胞への結合特性を示したが、一価抗体は、アビディティーの減少のためＯｘ４０陽性細胞に結合する能力が明らかに低下していた。
【０４２８】
４．３．２．２  ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合
細胞表面ＦＡＰへの結合を、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）発現細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９又はＷＭ２６６−４細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６７６）を使用して試験した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９は、マウス胎仔線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５８）を発現ベクターｐＥＴＲ４９２１でトランスフェクションし、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択下でｈｕＦＡＰを発現させることによって生成された。幾つかのアッセイでは、実施例２．３．２に記載のように、ＷＭ２６６−４細胞をＰＫＨ−２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＫＨ２６ＧＬ）で予め標識し、これらの腫瘍細胞を、存在する他の細胞（例えば、ヒトＰＢＭＣ）からの分離を可能にした。
【０４２９】
０．５×１０５個のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９又はＷＭ２６６−４細胞を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加し（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）、結合アッセイを実施例２．３．２に記載したのと同様の方法で実施した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを短時間の穏やかなボルテックスで再懸濁した。示された濃度範囲（滴定）で二重特異性抗原結合分子（一次抗体）を含有する４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェルに全ての試料を再懸濁し、４℃で１２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄し、短いボルテックスにより再懸濁した。細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９８）を含む２５μＬ／ウェルの４℃の冷二次抗体溶液で更に染色し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
【０４３０】
図１５Ａに示されるように、ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットの同一のクローンではなく、ＦＡＰ標的化一価及び二価抗Ｏｘ４０抗原結合分子は、ヒトＦＡＰ発現標的細胞に効率的に結合した。従って、ＦＡＰ標的化一価及び二価抗Ｏｘ４０抗原結合分子のみが、直接腫瘍標的化特性を示す。二価構築物（黒四角）は、一価フォーマットに比べて二価のアビディティーの増加によって説明される、一価構築物よりも強いＦＡＰへの結合を示した。これは、低ＦＡＰ発現ＷＭ２６６−４細胞よりも、高ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞（左のグラフ）においてより顕著であった。ＷＭ２６６−４細胞上のより低い密度の表面ＦＡＰは、抗ＯＸ４０構築物の二価結合を常に可能にするＦＡＰ分子の近接性を提供しないかもしれない。活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞及びＦＡＰ陽性腫瘍細胞への結合のＥＣ５０値を表２９にまとめる。
2018535665.tif 000088
【０４３１】
４．４  Ｏｘ４０及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性四価抗原結合分子の生成（４＋１フォーマット）
２つの異なる重鎖の組み立てを可能にするノブ・イントゥー・ホール技術を適用することによって、Ｏｘ４０に対する四価結合及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性アゴニストＯｘ４０抗体を調製した。
【０４３２】
この実施例では、第１の重鎖（ＨＣ１）は、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の２つのＦａｂ単位（ＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１）、続いて（Ｇ４Ｓ）リンカーにより抗ＦＡＰバインダー２８Ｈ１又は４Ｂ９のＶＨドメインに融合されたＦｃノブ鎖を含んでいた。構築物の第２の重鎖（ＨＣ２）は、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の２つのＦａｂ単位（ＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１）、続いて（Ｇ４Ｓ）リンカーにより抗ＦＡＰバインダー２８Ｈ１又は４Ｂ９のＶＬドメインに融合されたＦｃホール鎖を含んでいた。
【０４３３】
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０４３４】
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入された。重鎖融合タンパク質を抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の軽鎖（ＣＬＶＬ）と同時発現させた。得られた二重特異性四価構築物は図１６Ａに示され、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は表３０に見出すことができる。
【０４３５】
更に、抗ＦＡＰバインダーのＶＨ及びＶＬドメインが、抗原に結合しないＤＰ４７と呼ばれる生殖細胞系列コントロールによって置換された、「非標的化」４＋１構築物を調製した。
2018535665.tif 000089
2018535665.tif 000090
2018535665.tif 000091
2018535665.tif 000092
2018535665.tif 000093
2018535665.tif 000094
2018535665.tif 000095
2018535665.tif 000096
2018535665.tif 000097
2018535665.tif 000098
【０４３６】
更なる実施例では、第１の重鎖（ＨＣ１）は、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の２つのＦａｂ単位（ＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１）、続いて（Ｇ４Ｓ）リンカーにより抗ＦＡＰバインダー４Ｂ９のＶＬドメインに融合されたＦｃノブ鎖を含む。構築物の第２の重鎖（ＨＣ２）は、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の２つのＦａｂ単位（ＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１）、続いて（Ｇ４Ｓ）リンカーにより抗ＦＡＰバインダー４Ｂ９のＶＨドメインに融合されたＦｃホール鎖を含む。
【０４３７】
ノブに融合したａ−ＦＡＰ  ＶＬ及びホール鎖に融合したＶＨを有する４＋１抗Ｏｘ４０、抗ＦＡＰ構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表３１に見出すことができる。
2018535665.tif 000099
【０４３８】
更に、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を含まない４＋１抗ＯＸ４０、抗ＦＡＰ構築物の塩基対及びアミノ酸配列はそれぞれ表３２に見出すことができる。
2018535665.tif 000100
2018535665.tif 000101
2018535665.tif 000102
2018535665.tif 000103
【０４３９】
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
【０４４０】
二重特異性抗Ｏｘ４０／抗ＦＡＰ  ４＋１構築物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：４の比（「ベクターＨＣ１」：「ベクターＨＣ２」：「ベクターＬＣ」）でトランスフェクトした。
【０４４１】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での２００ｍＬの産生のために、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ培地（Ｓｉｇｍａ）中でトランスフェクションの２４時間前に２億５，０００万個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間、１６５ｒｐｍで振盪させてインキュベートした。インキュベーション後、サプリメント（１ｍＭバルプロ酸、５ｇ／ｌのＰｅｐＳｏｙ、６ｍＭのＬ−グルタミン）を含むＥｘｃｅｌｌ培地１６０ｍＬを添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの２４時間後、１２％最終容量（２４ｍＬ）及び３ｇ／Ｌグルコース（５００ｇ／Ｌストックから１．２ｍＬ）でアミノ酸及びグルコース供給物を細胞に補充した。７日間培養した後、２０００−３０００×ｇで４５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０４４２】
細胞培養上清からの二重特異性構築物の精製は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０４４３】
アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、３０ｍＬの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＰｒｏｔＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。非結合タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含有する６−１０カラム容量の緩衝液で洗浄することにより、除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０の１５ＣＶ（０〜１００％）の段階又は線形ｐＨ勾配の何れかを用いて溶出させた。次いで、カラムを２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０を含む１０カラム容量の溶液で洗浄し、その後再平衡化工程を行った。
【０４４４】
収集した画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０４４５】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した（表３１）。
2018535665.tif 000104
【０４４６】
４．５  ＯＸ４０及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性四価抗原結合分子の生成（４＋２フォーマット）
ＯＸ４０に対して四価結合を有し、ＦＡＰに対して二価結合を有する二重特異性アゴニストＯＸ４０抗体を調製した。誤って対形成された軽鎖の形成を減少させるために、国際特許出願第ＷＯ２００／１４５７９２（Ａ１）号によるクロスマブ（ｃｒｏｓｓｍａｂ）技術が適用された。
【０４４７】
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０４４８】
この実施例では、ＦＡＰバインダー２８Ｈ１の交差Ｆａｂ単位（ＶＬＣＨ）を両方の重鎖のＦｃ部分のＣ末端に融合させた。ＯＸ４０に対する２つのＦａｂを、実施例４．３に記載したように各重鎖のＮ末端に融合させた。抗ＯＸ４０  ＦａｂのＣＨ及びＣＬは、Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓタンパク質の生成を防ぎ、かつ、軽鎖の正確な対形成を更に安定化させるために、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４のＣＨ１ドメイン（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）及びＣＬ（Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）にアミノ酸変異（いわゆる荷電残基）を含んでいた。この場合、両方の重鎖が同じドメインを含むので、ノブ・イントゥー・ホールの導入は必要ではなかった。
【０４４９】
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入された。得られた二重特異性四価構築物を図１６Ｂに示す。
【０４５０】
表３４は、成熟二重特異性四価抗ＯＸ４０／抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【０４５１】
更に、抗ＦＡＰバインダーのＦａｂドメインが、抗原に結合しないＤＰ４７と呼ばれる生殖細胞系列コントロールのＦａｂドメインによって置換された、「非標的化」４＋２構築物を調製した。
2018535665.tif 000105
2018535665.tif 000106
2018535665.tif 000107
2018535665.tif 000108
2018535665.tif 000109
【０４５２】
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
【０４５３】
二重特異性抗Ｏｘ４０／抗ＦＡＰ構築物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：２：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
【０４５４】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での２００ｍＬの産生のために、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ（Ｓｉｇｍａ）培地中でトランスフェクションの２４時間前に２億５，０００万個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｏｃｏ）中で混合した。５４０μＬのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間、１６５ｒｐｍで振盪させてインキュベートした。インキュベーション後、サプリメント（１ｍＭバルプロ酸、５ｇ／ｌのＰｅｐＳｏｙ、６ｍＭのＬ−グルタミン）を含むＥｘｃｅｌｌ培地（Ｓｉｇｍａ）１６０ｍＬを添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの２４時間後、１２％最終容量（２４ｍＬ）及び３ｇ／Ｌグルコース（５００ｇ／Ｌストックから１．２ｍＬ）でアミノ酸及びグルコース供給物を細胞に補充した。７日間培養した後、２０００−３０００×ｇで４５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４°Ｃに保った。
【０４５５】
アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、３０ｍＬの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＰｒｏｔＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。非結合タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を含有する６−１０カラム容量の緩衝液で洗浄することにより、除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０の８ＣＶの段階溶出を用いて溶出させた。
【０４５６】
収集した画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０４５７】
精製された二重特異性四価４＋２構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで２５°Ｃで平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した（表３５）。
2018535665.tif 000110
【０４５８】
４．６  二重特異性四価４＋１及び４＋２抗ＯＸ４０抗原結合分子の凝集温度の測定
全てのフォーマットを直接比較するために、熱安定性を静的光散乱（ＳＬＳ）によって、加えられた温度ストレスに応答する内因性タンパク質の蛍光を測定することにより、熱安定性をモニターした。タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌの濾過されたタンパク質試料３０μｇを、Ｏｐｔｉｍ ２機器（Ａｖａｃｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｔｄ）に２回適用した。温度を２５℃から８５℃まで０．１℃／分で上昇させ、半径及び全散乱強度を収集した。内因性タンパク質蛍光の測定のために、試料を２６６ｎｍで励起し、発光を２７５ｎｍと４６０ｎｍとの間で収集した。
【０４５９】
全ての構築物について、凝集温度は、バインダーの組み合わせ及びフォーマットに依存して、４９℃〜６７℃の間であった。
【０４６０】
４．７  Ｏｘ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性四価構築物の特徴づけ
４．７．１  ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合
細胞表面ＦＡＰへの結合を、ＷＭ２６６−４細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６７６）を使用して試験した。丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに０．５×１０５個のＷＭ２６６−４細胞を添加した。細胞を、滴定した抗ＯＸ４０抗体構築物を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＢＳＡ（０．１％ｖ／ｗ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９４１８）を含むＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０３２６））中、暗所で４℃で１２０分間染色した。過剰のＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を暗所で４℃で４５分間、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９８）を含有する４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液２５μＬ／ウェル中で染色した。
【０４６１】
プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
【０４６２】
図１７に示すように、非標的化ＯＸ４０構築物ではなく、ＦＡＰ標的化二重特異性四価ＯＸ４０構築物が効率的にヒトＦＡＰ発現標的細胞に結合した。従って、ＦＡＰ標的化抗ＯＸ４０構築物は直接腫瘍標的化特性を示す。４＋１フォーマットの場合、ＦＡＰクローン４Ｂ９は、使用された洗浄条件下ではフローサイトメトリー分析でほとんど結合が観察されないＦＡＰクローン２８Ｈ１よりも、ヒトＦＡＰに対する結合がはるかに強かった。クローン２８Ｈ１については、２＋２及び４＋２構築物（黒丸及び三角形）は、一価フォーマットに比べて二価のアビディティーの増加によって説明される、４＋１構築物（正方形）よりも強いＦＡＰへの結合を示した。同じ二価ＦＡＰ結合部分を含む四価４９Ｂ４構築物と二価４９Ｂ４構築物との間のＦＡＰ結合の違い（黒三角形対丸）は、おそらく四価構築物のより大きなサイズのために、ＦＡＰ結合における立体障害が既に存在することを示唆する。活性化ヒト及びカニクイザルＣＤ４  Ｔ細胞への結合のＥＣ５０値（実施例４．３．２．１及び４．３．２．２に記載されているように測定）及びＦＡＰ陽性腫瘍細胞への結合のＥＣ５０値を表３６にまとめる。
2018535665.tif 000111
【０４６３】
４．７．２  表面プラズモン共鳴
ヒト、マウス及びカニクイザルＦＡＰに結合する二重特異性構築物の能力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ）において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて２５℃で行った。
【０４６４】
Ｈｉｓタグ付きヒト、マウス又はカニクイザル二量体ＦＡＰを、５００ｎＭのｈｕＦＡＰを１０μＬ／分の流速で６０秒間、１０ｎＭのマウスＦＡＰを２０μＬ／分の流速で２０秒間、及び１０ｎＭのｃｙｎｏＦＡＰを２０Ｌｌ／分の流速で２０秒間注入することにより、抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号３４６６０）で固定したＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に捕捉した。最大１８０００の共鳴単位（ＲＵ）までの抗Ｈｉｓ抗体の固定化レベルを使用した。
【０４６５】
捕捉工程の後、二重特異性構築物及びコントロール分子を、３０μＬ／分の流速で２８０ｓ及び１８０ｓの解離相で、０．００６−１００ｎＭの範囲の濃度でチップ表面上を直ちに通過させた。バルク屈折率の差は、ＦＡＰが固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。親和性は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１曲線適合を用いて決定した。二価結合については、同じ１：１適合を使用して、見掛けのＫＤ値を導いた。
2018535665.tif 000112
【０４６６】
４．７．３  ＯＸ４０への結合
４．７．３．１  ヒトＯｘ４０発現細胞への結合：ナイーブ及び活性化ヒト末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容量のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０３２６）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）が供給され、バフィコート溶液をそのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７の上に重ねた。試験管を４００×ｇ、室温で、低加速度でブレーキ無しで３０分間遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から採取し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６０００−０４４、Ｌｏｔ９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を供給されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１−０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５００３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。
【０４６７】
ＰＢＭＣは単離直後に使用され（休止ヒトＰＢＭＣへの結合）、又はそれらは、Ｔ細胞の細胞表面上の強いヒトＯｘ４０発現を受けるように刺激された（活性化ヒトＰＢＭＣへの結合）。従って、ナイーブＰＢＭＣを、６ウェル組織培養プレート中に２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及び２ｕｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌ２７６９−１０）を供給したＴ細胞培地で４日間培養し、次いで、プレコートした６ウェル組織培養プレート［２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６−００３７−８５）及び［２ｕｇ／ｍＬの］抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６−０２８９−８５）上で、３７℃、５％ＣＯ２で、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地中で１日間培養した。
【０４６８】
ＯＸ４０の検出のために、ナイーブヒトＰＢＭＣと活性化ヒトＰＢＭＣとを混合した。活性化されたヒトＰＢＭＣからナイーブＰＢＭＣの識別を可能にするために、ナイーブ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を用いて結合アッセイの前に標識した。
【０４６９】
標識のために、細胞を収集し、予熱した（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中で１×１０７細胞／ｍＬの細胞密度に調整した。ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を最終濃度２．５ｍＭ及びＤＰＢＳ中の最終細胞密度０．５×１０７細胞／ｍＬでナイーブなヒトＰＢＭＣの懸濁液に添加した。次いで、細胞を暗所で室温で１０分間インキュベートした。標識反応を停止させるために、４ｍＬの熱不活性化ＦＢＳを添加し、細胞をＴ細胞培地で３回洗浄した。１×１０５個の休止ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと０．５×１０５個の非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの２：１混合物を丸底懸濁細胞９６ウェルプレートの各ウェルに添加した（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）。
【０４７０】
細胞を、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液中、暗所で４℃で１２０分間染色した。過剰のＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、蛍光標識された抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）の混合物を含有する４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液２５μＬ／ウェル中で、４℃で暗所で４５分間染色した。
【０４７１】
プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
【０４７２】
図１８及び図１９に示すように、ＯＸ４０に特異的な抗体構築物は、ＯＸ４０に対して陰性である休止ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、全ての構築物は、ＯＸ４０を発現する活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強力であった。活性化ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞上に検出されたＯＸ４０レベルのほんの一部のみを発現する。ＯＸ４０の発現レベルは、動態及び刺激の強さに依存し、ここではＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現について条件が最適化されたが、ＣＤ８＋  Ｔ細胞についての条件は最適化されなかった。従って、Ｏｘ４０の発現は、ＣＤ８  Ｔ細胞においてわずかしか誘導されなかった。分析された二重特異性抗ＯＸ４０構築物は、それらの結合強度が変化した（ＥＣ５０値は表３４を参照）。四価ＯＸ４０結合（丸及び四角形）はＯＸ４０の結合活性を強く増加させた。比較して、両方の二価構築物（三角形）は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞へのより弱い結合を示した。ＦＡＰ結合部分の存在は、四価ＯＸ４０バインダーについてのＯＸ４０結合に影響を及ぼさなかった（例えば、立体障害による、白い記号対黒い記号を比較）。しかしながら二価の二重特異性構築物におけるクローン４９Ｂ９の結合は、従来のＩｇＧフォーマットのものより明らかに強力であった。
【０４７３】
４．７．３．２  カニクイザルＯＸ４０発現細胞への結合：活性化されたカニクイザル末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
抗ＯＸ４０構築物のカニクイザル細胞との反応性を試験するために、健常なＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＰＢＭＣを、セクション４．７．３．１にヒト細胞について記載したような密度勾配遠心分離を軽微な修正を加えて用いてヘパリン処置血液から単離した。カニクイザルＰＢＭＣを、ＤＰＢＳ（９０％ｖ／ｖ）で希釈したＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウムを密度１．０７７ｇ／ｍＬに調整したもの）を用いて、ヘパリン処理した新鮮な血液から密度勾配遠心分離により単離した。遠心分離は、５２０ｘｇで、室温で３０分間ブレーキ無しで行った。ＰＢＭＣは、Ｔ細胞の細胞表面上で強いＯＸ４０発現を受けるように刺激された（活性化されたカニクイザルＰＢＭＣへの結合）。従って、ナイーブＰＢＭＣを、プレコートした１２ウェル組織培養プレート［１０μｇ／ｍＬのカニクイザル交差反応性抗ヒトＣＤ３（クローンＳＰ３４−２、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５１９１６）及び［２μｇ／ｍＬ］のカニクイザル交差反応性抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６−０２８９−８５）上で、３７℃、５％ＣＯ２で２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地中で７２時間培養した。
【０４７４】
次いで、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに０．５×１０５個の活性化カニクイザルＰＢＭＣを添加した。細胞を２００μＬの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物を含む４℃の冷ＦＡＣＳの５０μＬ／ウェル中で４℃で１２０分間インキュベートした。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄した。細胞を、蛍光標識したカニクイザル交差反応性抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ−４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢＤ、カタログ番号３１７４２８）、抗ヒトＣＤ８（クローンＨＩＴ８ａ、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢＤ、カタログ番号５５５３６９）及びＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９８）を含む２５μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、暗所で４℃で６０分間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
【０４７５】
図２０に示すように、全ての４９Ｂ４構築物が活性化ＣＤ４＋カニクイザルＴ細胞に結合した。分析された抗ＯＸ４０抗体構築物は、それらの結合強度が変化した（ＥＣ５０値は表３４にまとめられる）。四価のＯＸ４０結合部分を有する構築物は、二価の構築物よりも強いＯＸ４０＋  Ｔ細胞への結合を示した。ＯＸ４０への四価結合と二価結合との間のアビディティーの増加は、ヒトＯＸ４０について観察されたものよりも弱かった（約５倍の増加対約５０倍の増加、表３４の値を比較）。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強力であった。ＯＸ４０の発現レベルは、動力学及び刺激の強さに依存しており、ＣＤ４＋カニクイザルＴ細胞に対しては最適化されたが、ＣＤ８＋カニクイザルＴ細胞に対しては最適化されなかったので、ＣＤ８＋  Ｔ細胞ではほとんどＯＸ４０発現が誘導されなかった。
【０４７６】
４．７．３．３  ヒトＯＸ４０への結合−二価対四価のＯｘ４０結合の競合結合
４つの抗ＯＸ４０  Ｆａｂドメインの全てのｈｕＯＸ４０に結合する能力を確認するために、細胞ベースのＦＲＥＴアッセイ（ＴａｇＬｉｔｅ）を適用した。従って、ｈｕＯＸ４０−ＳＮＡＰ融合体でトランスフェクトされ、ＦＲＥＴドナーであるテルビウム（Ｃｉｓｂｉｏ）で標識した９００  Ｈｅｋ２９３  ＥＢＮＡ細胞／ウェルを、ＦＲＥＴアクセプターｄ２（Ｃｉｓｂｉｏ）で標識した１．５６ｎＭ（４９Ｂ４）のＩｇＧと混合した。更に、（４９Ｂ４）ＩｇＧ又は二重特異性構築物４９Ｂ４／２８Ｈ１（２＋１）の何れかからの０．０１−７５０ｎＭの範囲の濃度希釈液を加えて、室温で２−４時間インキュベートした。蛍光シグナルは、蛍光ドナー（Ｔｅｒｂｉｕｍ）については６２０ｎｍで、蛍光アクセプター色素（Ｍ１００  Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）については６６５ｎｍで測定した。６６５／６２０＊１０００の比を計算し、基準（細胞のみ）を差し引いた（図２１Ａ）。ＥＣ５０の決定のために、結果をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ ５で分析した。観察されたＥＣ５０値を表３８に示す。
2018535665.tif 000113
【０４７７】
４．７．４  ＯＸ４０とＦＡＰへの同時結合
ヒトＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰを同時に結合させる能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  （Ｂｉａｃｏｒｅ）において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて２５℃で行った。
【０４７８】
ビオチン化カニクイザルＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大１０００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。
【０４７９】
ＯＸ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体を、２５０ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速でチップ表面を９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、２５０ｎＭの濃度で９０秒間３０μＬ／分の流速で第２分析物として注入した（図２１Ｂを参照）。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
【０４８０】
全ての二重特異性構築物は、ＤＰ４７コントロール分子とは別に、ヒトＯＸ４０及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた（図２２）。
【０４８１】
４．７．５  ＯＸ４０及びＦＡＰ陰性腫瘍細胞への結合
ＯＸ４０陰性ＦＡＰ陰性腫瘍細胞への結合の欠如は、標識されていないヒトＦＡＰ陽性ＷＭ２６６−４細胞からの分離を可能にするために、核に限定されたＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ蛍光タンパク質を発現するＡ５４９  ＮｕｃＬｉｇｈｔＴＭ  Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４４９１）を用いて試験した。親のＡ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）は、標準的なＥｓｓｅｎプロトコルに従って、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で、ＭＯＩを３（ＴＵ／細胞）で、Ｅｓｓｅｎ  ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４４７６；ＥＦ１α、ピューロマイシン）を形質導入した。これは、≧７０％の形質導入効率をもたらした。
【０４８２】
ＦＡＣＳ緩衝液中の５×１０４個の非標識ＷＭ２６６−４細胞と非標識Ａ５４９  ＮｕｃＬｉｇｈｔＴＭ  Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓとの混合物を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレートに添加し、結合アッセイをセクション４．７．１に記載したように実施した。
【０４８３】
図２３に示すように、４９Ｂ４抗体構築物はＯｘ４０陰性ＦＡＰ陰性ヒト腫瘍細胞に結合しなかった。
【０４８４】
実施例５
二重特異性抗ヒトＯＸ４０結合分子の機能特性
５．１  ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞
Ｏｘ４０のそのリガンドへのアゴニスト結合は、核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化を介した下流シグナル伝達を誘導する（A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972）。組換えレポーター細胞株ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１を作成し、その表面にヒトＯＸ４０を発現させた。更に、それはＮＦκＢ感受性エンハンサーセグメントの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを保持している。ＯＸ４０トリガーは、ＮＦκＢの用量依存的活性化を誘導し、これは核内に移行し、レポータープラスミドのＮＦκＢ感受性エンハンサーに結合して、ルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させるルシフェラーゼはルシフェリン酸化を触媒し、光を放出するオキシルシフェリンを生じる。これは、ルミノメーターで定量することができる。従って、様々な抗ＯＸ４０抗原結合分子がＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導する能力を、生物活性の尺度として分析した。
【０４８５】
接着性ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を用いて３７℃で１０分間収集した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２２５６１−０２１）、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％（ｖ／ｖ）の非必須アミノ酸を含むアッセイ培地中で０．６４×１０５の細胞密度に調整した。細胞を、蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）にウェルあたり０．１×１０５細胞の密度で播種し、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩維持した。
【０４８６】
翌日、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１を、Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ｈｕＩｇＧ１フォーマットの様々な滴定二重特異性抗ＯＸ４０（クローン４９Ｂ４）抗体を含有するアッセイ培地を添加して６時間刺激した。抗Ｏｘ４０抗体に対する過架橋の効果を試験するために、二次抗体抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９８）を含む培地２５μＬ／ウェルを１：２の比（一次抗Ｏｘ４０  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ｈｕＩｇＧ１よりも２倍多い二次抗体）で添加した。インキュベーション後、上清を吸引し、プレートをＤＰＢＳで２回洗浄した。ルシフェラーゼ１００アッセイ系及びレポーター溶解緩衝液（両方ともＰｒｏｍｅｇａであり、カタログ番号Ｅ４５５０及びカタログ番号Ｅ３９７１）を製造者の指示に従って使用して、発光の定量化を行った。簡単には、ウェル当たり３０μＬの１×溶解緩衝液を添加することにより、細胞を−２０℃で１０分間溶解させた。細胞を３７℃で２０分間解凍した後、ウェル当たり９０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加した。全ての波長を収集するためのフィルターを使用せずに、５００ｍｓの積分時間を使用して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて発光を直ちに定量した。放出された相対光単位（ＵＲＬ）を、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞の基底発光によって補正し、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて対数一次抗体濃度に対してブロットした。曲線は、組み込みのＳ字状線量応答を用いて適合させた。
【０４８７】
図２４に示されるように、限定された用量依存性のＮＦκＢ活性化は、抗ＯＸ４０  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ｈｕＩｇＧ１抗体（左側）をレポーター細胞株に添加することによって既に誘導された。四価のＯＸ４０結合部分を有する構築物は、二価のＯＸ４０結合部分を有する構築物よりも強いＮＦｋＢ活性化を誘導した。これは、ＯＸ４０受容体の最小シグナル伝達単位が三量体であるという知見と一致する（M. Croft, Nat rev Immunol. 2009, 9, 271- 285）。抗ヒトＩｇＧ特異的二次抗体による抗ＯＸ４０抗体の過架橋は、濃度依存的にＮＦκＢ媒介性ルシフェラーゼ活性化の誘導を強く増加させた（右側）。増加は、四価及び二価の構築物群内であった。
【０４８８】
その結果として、ＦＡＰ＋腫瘍細胞株による構築物の過架橋を伴う異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットにおけるａＯｘ４０バインダー４９Ｂ９のＮＦｋＢ活性化能力を試験した。
【０４８９】
試験した腫瘍細胞株は、ＷＭ２６６−４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６７６）、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍｏＦＡＰクローン２６及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９であった。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｍｏＦＡＰクローン２６は、マウス胎仔線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５８）を、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択下で、ｈｕＦＡＰを発現する発現ベクターｐＥＴＲ４９２１及びｍｏＦＡＰを発現する発現ベクターｐＥＴＲ４９０６でトランスフェクションすることによって生成された。ＦＡＰの表面発現をＱｕｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏカタログ番号Ｋ００７８）を用いて製造者の指示に従って定量した。細胞表面ＦＡＰ発現を検出するために使用された一次抗体は、ヒト／マウス交差反応性クローンＦ１１−２４（マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号ＯＰ１８８）であった。ＷＭ２６６−４細胞上の表面発現は、細胞当たり平均約４００００ｈｕＦＡＰ（低発現、ＦＡＰ＋／−）であり、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９では細胞当たり約９００００ ｈｕＦＡＰ（中程度発現、ＦＡＰ＋）及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｍｏＦＡＰクローン２６では細胞あたり約１６００００ｍＦＡＰ（高発現、ＦＡＰ＋＋）であった。
【０４９０】
本明細書で前に記載したように、接着性ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞をウェル当たり０．１×１０５個の細胞密度で一晩培養し、滴定した抗ＯＸ４０構築物を含有するアッセイ培地で５〜６時間刺激した。細胞表面ＦＡＰ結合による過架橋の効果を試験するために、ＦＡＰ＋腫瘍細胞（ＷＭ２６６−４、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｍｏＦＡＰ ｃｌ ２６）を含む培地２５μＬを４：１の比（ウェルあたりレポーター細胞よりも４倍のＦＡＰ＋腫瘍細胞）で共培養した。活性化ＮＦκＢを、本明細書で前に記載したように、ルシフェラーゼ１００アッセイ系及びレポーター溶解緩衝液（両方ともＰｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０及びカタログ番号Ｅ３９７１）を用いて発光を測定することによって定量した。
【０４９１】
図２５及び図２６に示すように、全ての抗ＯＸ４０構築物の存在は、制限されたＮＦκＢ活性化を誘導した。ＦＡＰ発現腫瘍細胞は、ＦＡＰ標的化分子（黒丸、正方形、三角形）を使用した場合にはＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化の誘導を強く増加させたが、非標的化二重特異性構築物（それぞれの白丸、正方形及び三角形を比較する）が加えられた場合はそうではなかった。
【０４９２】
全てのフォーマットのより良い比較のために、それぞれのブロットされた用量応答曲線の曲線下の面積を、各構築物のアゴニスト能力のマーカーとして定量した。図２６に示すように、四価のＦＡＰ標的化構築物は、二価のＦＡＰ標的化分子よりも優れていた。ＦＡＰの高発現は、より高度の架橋を確実にし、従って、ＦＡＰ標的化構築物のより良好なアゴニスト効果を確実にした（低ＦＡＰ発現ＷＭ２６６−４細胞を、中程度ＦＡＰ発現ＮＩＨ−３Ｔ３ヒトＦＡＰ細胞と、高ＦＡＰ発現ＮＩＨ−３Ｔ３マウスＦＡＰ細胞と比較）。
【０４９３】
５．２  最適以下にＴＣＲトリガーされた事前活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞のＯＸ４０媒介共刺激
ＯＸ４０のライゲーションは、最適以下のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後にＴ細胞の分裂及び生存を促進する相乗的な共刺激シグナルを提供する（M. Croft et al., Immunol. Rev. 2009, 229(1), 173-191）。更に、幾つかのサイトカインの産生及びＴ細胞活性化マーカーの表面発現が増加する（I. Gramaglia et al., J. Immunol. 1998, 161(12), 6510-6517; S. M. Jensen et al., Seminars in Oncology 2010, 37(5), 524-532）。
【０４９４】
異なる二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットにおけるクローン４９Ｂ９のアゴニスト特性を試験するために、事前に活性化されたＯＸ４０陽性ＣＤ４  Ｔ細胞を、溶液中又はプレート表面上に固定化されている抗ＯＸ４０抗体の存在下で、プレート固定された抗ＣＤ３抗体の最適以下の濃度で７２時間刺激した。Ｔ細胞の生存及び増殖に対する影響を、フローサイトメトリーにより生存細胞における総細胞数及びＣＦＳＥ希釈のモニタリングによって分析した。更に、Ｔ細胞活性化及び分化マーカー、例えばＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ、Ｔｉｍ−３、ＣＤ６２Ｌ及びＯＸ４０それ自体に対する蛍光標識抗体で細胞を同時染色した。
【０４９５】
ヒトＰＢＭＣをフィコール密度遠心分離により単離し、実施例４．７．３．１に記載したように、ＰＨＡ−Ｌ［２μｇ／ｍＬ］及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ［２００Ｕ／ｍＬ］で３日間刺激した。次いで細胞を、最終濃度［５０ｎＭ］のＣＦＤＡ−ＳＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２１８８）を用いて１ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度でＣＦＳＥにより染色した。その後、細胞をＦＢＳ（１０％ｖ／ｖ）を含む過剰のＤＰＢＳで２回洗浄した。標識された細胞を、３７℃で３０分間Ｔ細胞培地中で休ませた。その後、ＤＰＢＳを用いた２回の更なる洗浄工程によって、非変換ＣＦＤＡ−ＳＥを除去した。事前活性化されたＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣからのＣＤ４  Ｔ細胞の単離を、ＭＡＣＳ陰性ＣＤ４  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９６．５３３）を使用して、製造者の指示に従って行った。
【０４９６】
Ｍｏｒｒｉｓらは、従来の抗Ｏｘ４０抗体によるアゴニスト共刺激が表面固定化に依存することを示した（N. P. Morris et al., Mol. Immunol. 2007, 44(12), 3112-3121）。従って、ヤギ抗マウスＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１１−５００−５００８）を、ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００６−０９８）の存在下（表面固定化抗ＯＸ４０）又は非存在下（溶液中の抗ＯＸ４０）で、４℃で一晩ＰＢＳ中で［２μｇ／ｍＬ］の濃度で９６ウェルＵ底細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ）の表面にコーティングした。その後、ＢＳＡを含むＤＰＢＳ（１％ｖ／ｗ）でプレート表面をブロックした。以下の全てのインキュベーション工程は、ＢＳＡ（１％ｖ／ｗ）を含有するＰＢＳ中で３７℃で９０分間行われた。インキュベーション工程の間に、プレートをＤＰＢＳで洗浄した。
【０４９７】
マウス抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６−００３７−８５、固定濃度［３ｎｇ／ｍＬ］）を、表面被覆抗マウスＦｃγ特異的抗体を介して、次のインキュベーション工程で捕捉した。１つの実験において、滴定したヒト抗ＯＸ４０抗原結合分子を、ＤＰＢＳ中における更なるインキュベーション工程によってプレート上に固定化した。第２の実験では、抗ＯＸ４０抗原結合分子を、活性化アッセイの間に、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体でプレコートされていないプレートの培地に直接添加した。
【０４９８】
ＣＦＳＥ標識事前活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞を２００μＬのＴ細胞培地中０．５×１０５細胞／ウェルの細胞密度でプレコートプレートに添加し、９６時間培養した。細胞を、蛍光色素標識マウス抗ヒトＯｘ４０（クローンＢｅｒＡＣＴ３５、Ｂｉｏｌｅｄｇｅｎｄ、カタログ番号３５００８）、ＴＩＭ−３（クローンＦ３８−２Ｅ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４５００８）、ＣＤ１２７（クローンＡ０１９Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５１２３４）、ＣＤ２５（クローンＭ−ＡＱ２５１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５６１１２）及びＣＤ４５ＲＡ（クローンＨＩ１００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５４８９）の組み合わせで４℃、暗所で２０分間染色した。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、最終的に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
【０４９９】
ＤＡＰＩ陰性生細胞を、増殖のマーカーとしてＣＦＳＥ蛍光の中央値の減少について分析した。ＯＸ４０陽性、ＣＤ２５高及びＴＩＭ−３陽性Ｔ細胞の割合をＴ細胞活性化のマーカーとしてモニターした。ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１２７の発現を分析してＴ細胞の成熟状態における変化を決定し、それによってＣＤ４５ＲＡ低ＣＤ１２７低細胞をエフェクターＴ細胞として分類した。
【０５００】
プレート固定化抗体による共刺激は、プレート固定化抗ヒトＣＤ３による事前活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞の最適以下の刺激を用量依存的に強く亢進した（図２７）。Ｔ細胞はより強く増殖し、より高い割合のエフェクターＴ細胞を有するより成熟した表現型を示し、Ｏｘ４０陽性活性化細胞のより高い割合を有していた。四価ＯＸ４０結合部分を有する分子は、ＯＸ４０への二価結合のみを有する分子よりも強いアゴニストであった。５つの四価分子及び２つの二価分子は全て、同様の程度でＴＣＲ刺激を増強することができた。従って、これらの２つの群内のＦＡＰ＋腫瘍細胞の存在下での活性化の潜在力の差異は、異なるＦＡＰ結合能力及び架橋によって媒介され、ＯＸ４０に対処する能力が異なるためではない。抗ＯＸ４０抗原結合分子を表面固定化の非存在下で溶液中に添加した場合、最適以下のＴＣＲ刺激の増強は見られなかった（図２８）。これは、ＯＸ４０受容体の過架橋に対するＯＸ４０軸活性化の強い依存性を再び実証した。
【０５０１】
５．３  最適以下にＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣのＯｘ４０媒介共刺激及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋
実施例５．１において、ＦＡＰ＋腫瘍細胞の添加は、ＯＸ４０受容体の強力なオリゴマー化を提供することによって、ヒトＯＸ４０陽性レポーター細胞株におけるＦＡＰ標的化四価抗ＯＸ４０構築物によって誘導されるＮＦκＢ活性を強く増加させることができると示された。同様に、発明者らは、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞の存在下において、ＦＡＰ標的化四価抗ＯＸ４０構築物を、休止ヒトＰＢＭＣ細胞の最適以下のＴＣＲ刺激をレスキューする能力について試験した。
【０５０２】
ヒトＰＢＭＣ調製物は、（１）休止中のＯＸ４０陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞、並びに（２）細胞表面上に種々のＦｃγ受容体分子を有する抗原提示細胞、例えばＢ細胞及び単球を含む。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ヒトＣＤ３抗体は、そのＦｃ部分がこれらのＦｃγ受容体分子に結合し、休止中のＯＸ４０陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上において遷延性ＴＣＲ活性化を媒介することができる。これらの細胞は、数時間以内にＯＸ４０を発現し始める。ＯＸ４０に対する機能的アゴニスト化合物は、活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞上に存在するＯＸ４０受容体を介してシグナル伝達し、ＴＣＲ媒介刺激を支持し得る。
【０５０３】
休止ＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣを、照射ＦＡＰ＋  ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞及び滴定した抗ＯＸ４０構築物の存在下で、最適以下の濃度の抗ＣＤ３抗体で５日間刺激した。Ｔ細胞の生存及び増殖に対する影響を、フローサイトメトリーにより生存細胞における総細胞数及びＣＦＳＥ希釈のモニタリングによって分析した。更に、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５に対する蛍光標識抗体で細胞を同時染色した。
【０５０４】
マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞（実施例４．３．２．２を参照）を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を用いて３７℃で１０分間収集した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２下で一晩、無菌９６ウェル丸底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）中のＴ細胞培地中で０．２×１０５細胞／ウェルの密度で培養した。翌日、それらは、腫瘍細胞株によるヒトＰＢＭＣの後の過剰増殖を防ぐために、４５００ｒａｄの線量を用いてｘＲａｙ照射器中で照射された。
【０５０５】
ヒトＰＢＭＣを、実施例４．３．２．１に記載されるように、フィコール密度勾配遠心分離によって単離し、ＣＦＳＥで標識した。細胞をウェルあたり０．５×１０５細胞の密度で各ウェルに添加した。［１０ｎＭ］の最終濃度の抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＶ９、ヒトＩｇＧ１、Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992) 及び米国特許第６，０５４，２９７号に記載）を添加し、抗Ｏｘ４０構築物を指示濃度で添加した。細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２で５日間活性化した。次いで、細胞を、蛍光色素結合抗体抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、ＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）、ＣＤ２５（クローンＭ−Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５６１１２）で４℃で３０分間、表面染色した。細胞膜を透過性にするために、細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、５０μＬ／ウェルの新たに調製したＦｏｘＰ３  Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−５１２３及び００−５２２３）に暗所で室温で４５分間再懸濁した。Ｐｅｒｍ−Ｗａｓｈ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−８３３３−５６）で３回洗浄した後、細胞を、抗ヒトグランザイムＢ抗体（クローンＧＢ−１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５６１１４２）を含有する２５μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｗａｓｈ緩衝液で暗所で室温で１時間細胞内染色した。細胞を８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて取得した。
【０５０６】
図２９、３０及び３１に示されるように、非標的化四価抗ＯＸ４０（４９Ｂ４）４＋１構築物（白四角）及びＯＸ４０（４９Ｂ４）４＋２（白丸）による共刺激は、ごく僅かに最適以下にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞をレスキューした。本発明のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ標的化４＋１（黒い四角形及び半塗りの四角形）及び４＋２（黒丸）抗ＯＸ４０構築物の過架橋は、増殖（図２９）、生存（図３０）を強く促進し、ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞において亢進された活性化表現型（図３１）を誘導した。ＦＡＰ標的化四価ＯＸ４０バインダーは、ＦＡＰ標的化二価ＯＸ４０バインダーよりも明らかに優れていた（図２９〜３０：黒い三角形、比較のために図３２及び３３を参照）。しかし、二価ＯＸ４０アゴニストの細胞表面固定化は、非標的化四価ＯＸ４０アゴニストの添加よりも活性化を支持する上でより有効であった（図３２及び３３の２＋２（２８Ｈ１）対４＋１（ＤＰ４７）／４＋２（ＤＰ４７）を比較）。一次細胞の設定におけるこの知見は、ＮＦκＢレポーターアッセイで観察された観察とは僅かに異なっていた（図２６）。ここで、ＯＸ４０の四価は、表面が固定化されていない場合でも、二価と比較してより強いＮＦκＢの活性化をもたらした。従って、Ｔ細胞に対して最適なＯＸ４０アゴニズムを得るために、ＯＸ４０受容体の十分なオリゴマーを得る必要があるだけでなく、更にＯＸ４０受容体オリゴマーの細胞表面固定化を得る必要がある。ＦＡＰへの二価結合は、ＦＡＰへの一価結合と比較して四価ＯＸ４０分子のアゴニスト能力を低下させた（図３１の４＋１（２８Ｈ１）対４＋２（２８Ｈ１）を比較）。これは、ＦＡＰ陽性細胞ごとに結合することができるＦＡＰ標的化ＯＸ４０分子の数が減少したためであろう。一価ＦＡＰバインダーのＦＡＰに対するより高い親和性は、恐らくはＯＸ４０受容体オリゴマーの最適化された過架橋によって、更に四価ＯＸ４０アゴニストのアゴニスト能力を増加させた（図３１の４＋１（２８Ｈ１）対４＋１（４Ｂ９）を比較）。
【０５０７】
実施例６
４−１ＢＢ抗体及びツールのバインダーの生成
６．１  抗原の調製、精製及び特徴づけ、並びにファージディスプレイによる新規４−１ＢＢバインダーの生成のためのスクリーニングツール
ヒト、マウス又はカニクイザル４−１ＢＢのエクトドメインをコードするＤＮＡ配列（表３９）を、ノブについてのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant et al., 1998）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。指示されたビオチン化のためのＡｖｉタグを抗原−ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖との組み合わせは、４−１ＢＢエクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成を可能にし、従ってＦｃ結合抗原の単量体型を作り出す（図１Ａ）。表４０は、抗原Ｆｃ融合構築物のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
2018535665.tif 000114
2018535665.tif 000115
2018535665.tif 000116
2018535665.tif 000117
【０５０８】
４−１ＢＢ−Ｆｃ融合分子をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
【０５０９】
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）、並びにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのプラスミドで同時トランスフェクトした。対応するベクターを２：１：０．０５比（「抗原ＥＣＤ−ＡｃＴＥＶ−Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
【０５１０】
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質産生のために、４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地により上清を置換した。発現ベクターを２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７°Ｃで３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。生産培地に５μＭキフネンシンを補充した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄを培地に加えた。培養の７日後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４°Ｃに保った。
【０５１１】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。未結合タンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０に対して作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（０〜５００ｍＭ）を用いて溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０で洗浄した。収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０５１２】
６．２  一般的なＦ（ａｂ）ライブラリーからの４−１ＢＢ特異的１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５、９Ｂ１１及び２０Ｇ２抗体の選択
ヒト及びカニクイザル４−１ＢＢに対して特異性を有する抗体１１Ｄ５、９Ｂ１１、及び１２Ｂ３は、Ｆａｂフォーマットの一般的なファージディスプレイ抗体ライブラリー（ＤＰ８８−４）から選択された。同じライブラリーから、マウス４−１ＢＢに対する反応性を有する付加的な抗体、クローン２０Ｇ２も同様に選択した。このライブラリーは、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３、３つの異なる長さ）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に無作為化配列空間を含む、Ｖドメイン対合Ｖｋ１＿５（カッパ軽鎖）及びＶＨ１＿６９（重鎖）を用いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する３つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施した。断片１は無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３からＨ３にわたる中央の定常断片であり、一方、断片３は抗体遺伝子の無作為化されたＨ３及び３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを使用して、ＤＰ８８−４ライブラリーのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿Ｓ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＹ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＰＹと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＲＪＨ３２と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ３１）及び断片３（フォワードプライマーＤＰ８８−ｖ４−４又はＤＰ８８−ｖ４−６又はＤＰ８８−ｖ４−８とリバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇを組み合わせたもの）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分、７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比のゲル精製単一断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性及び９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分の５サイクルであった。この段階で、外側プライマー（ＬＭＢ３及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に２０サイクルを行った。十分な量の全長無作為化Ｆａｂ構築物を集めた後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製されたライゲーションを、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換のために使用した。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。これらのライブラリー構築工程を３回繰り返して、４．４×１０９の最終ライブラリーサイズを得た。ドットブロットにおけるＣ末端タグ検出によって決定されるように、機能的クローンの割合は、軽鎖については９２．６％、重鎖については９３．７％であった。
【０５１３】
ヒト及びカニクイザル４−１ＢＢに対して特異性を有する抗体２５Ｇ７は、Ｆａｂフォーマットの一般的なファージディスプレイ抗体ライブラリー（λ−ＤＰ４７）から選択された。このライブラリーは、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３、３つの異なる長さ）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に無作為化配列空間を含む、Ｖドメイン対合Ｖｌ３＿１９（ラムダ軽鎖）及びＶＨ３＿２３（重鎖）を用いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する３つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施した。断片１は無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３からＨ３にわたる中央の定常断片であり、一方、断片３は抗体遺伝子の無作為化されたＨ３及び３’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを使用して、λ−ＤＰ４７ライブラリーのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ又はＶｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ又はＶｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＭＳ６３と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ８０）及び断片３（フォワードプライマーＤＰ４７−ｖ４−４又はＤＰ４７−ｖ４−６又はＤＰ４７−ｖ４−８とリバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇを組み合わせたもの）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分、７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比のゲル精製単一断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性及び９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分の５サイクルであった。この段階で、外側プライマー（ＬＭＢ３及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に２０サイクルを行った。十分な量の全長無作為化Ｆａｂ構築物を集めた後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製されたライゲーションを、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換のために使用した。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。９．５×１０９の最終ライブラリーサイズが得られた。ドットブロットにおけるＣ末端タグ検出によって決定されるように、機能的クローンの割合は、軽鎖については８１．１％、重鎖については８３．２％であった。
【０５１４】
表４１は、一般的なファージディスプレイ抗体ライブラリー（ＤＰ８８−４）の配列を示し、表４２は、ライブラリーＤＰ８８−４生殖細胞系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供し、表４３は、ＤＰ８８−４生殖細胞系列テンプレートの生成に使用されるプライマー配列を示す。
2018535665.tif 000118
2018535665.tif 000119
2018535665.tif 000120
【０５１５】
表４４は、ＰＣＲに使用される一般的なファージディスプレイラムダ−ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）テンプレートの配列を示す。表４５はラムダ−ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）生殖細胞系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供し、表４６はラムダ−ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）の生成に使用されるプライマー配列を示す。
2018535665.tif 000121
2018535665.tif 000122
2018535665.tif 000123
【０５１６】
ファージディスプレイ選択並びにＥＬＩＳＡ及びＳＰＲに基づくスクリーニングのための抗原としてのヒト、マウス及びカニクイザル４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞におけるＮ末端単量体Ｆｃ融合体として一過性に発現させ、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉ−タグ認識配列におけるＢｉｒＡビオチンリガーゼの同時発現を介してｉｎ  ｖｉｖｏで部位特異的にビオチン化した。
【０５１７】
選択ラウンド（バイオパニング）を以下の手順に従って溶液中で行った。第１工程、抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために、１０ｕｇ／ｍｌの無関係のヒトＩｇＧでコーティングされたｍａｘｉｓｏｒｐプレート上において約１０１２個のファージミド粒子を事前清澄化する；第２工程、全容量１ｍｌ中のＦｃバインダーの更なる枯渇のために、非結合ファージミド粒子を、１００ｎＭの無関係な非ビオチン化Ｆｃノブ・イントゥー・ホール構築物の存在下で、１００ｎＭのビオチン化ヒト又はマウスＯＸ４０と０．５時間インキュベートする；第３工程、ビオチン化ｈｕ  ４−１ＢＢ及び付着した特異的に結合するファージをニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレートの４つのウェルに１０分間（ラウンド１及びラウンド３で）移すことによって捕捉する；第４工程、５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×ＰＢＳを用いてそれぞれのウェルを洗浄する；第５工程、１ウェルあたり１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）２５０ｕｌを１０分間添加することによりファージ粒子を溶出し、１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５００ｕｌを４つのウェルからのプールされた溶出液に添加することによって中和する；第６工程、Ｆｃバインダーを最終的に除去するために、１００ｎＭのビオチン捕捉したＦｃノブ・イントゥー・ホール構築物を有するニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレート上でのインキュベーションにより中和溶出液を事後清澄化する；第７工程、溶出されたファージ粒子の上清により対数期大腸菌ＴＧ１細胞を再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３により感染させ、振盪機で３０℃で一晩インキュベートし、続いて次の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させる。選択は１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて３ラウンド又は４ラウンドにわたって行った。ラウンド２及び４では、ニュートラアビジンに対する結合体の濃縮を避けるために、抗原：ファージ複合体の捕捉を、５．４×１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加によって行った。ＥＬＩＳＡにより、以下のようにして特異的バインダーが同定された。１００μｌの２５ｎＭのビオチン化ヒト又はマウス４−１ＢＢ及び１０ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧを、それぞれニュートラアビジンプレート及びｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングした。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いて、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグを介して検出した。ヒト又はマウス４−１ＢＢに対するシグナルを示し、ヒトＩｇＧに対して陰性であるクローンは、更なる分析のためにリストに載せられ、４−１ＢＢの残りの２種に対して同様に試験された。それらは、０．５リットルの培養体積で細菌で発現され、アフィニティー精製され、更にＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを用いたＳＰＲ分析によって特徴づけられた。
【０５１８】
クローン１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５及び９Ｂ１１は、上記の手順によりヒト４−１ＢＢ特異的バインダーとして同定された。クローン２０Ｇ２は、上記の手順によりマウス４−１ＢＢ特異的バインダーとして同定された。それらの可変領域のｃＤＮＡ配列は以下の表４７に示され、対応するアミノ酸配列を表Ｃに見出すことができる。
2018535665.tif 000124
2018535665.tif 000125
【０５１９】
６．３  抗４−１ＢＢ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体の調製、精製及び特徴づけ
選択された抗４−１ＢＢバインダーの重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとフレーム内にサブクローニングした。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０５２０】
抗４−１ＢＢクローンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を表４８に示す。抗４−１ＢＢ−Ｆｃ融合体をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
2018535665.tif 000126
2018535665.tif 000127
2018535665.tif 000128
2018535665.tif 000129
2018535665.tif 000130
2018535665.tif 000131
2018535665.tif 000132
【０５２１】
抗４−ＢＢ抗体は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトされた。
【０５２２】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及びサプリメントを含む７％のＦｅｅｄを加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０５２３】
細胞培養上清からの抗体分子の精製は、抗原Ｆｃ融合体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
【０５２４】
タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０５２５】
精製された抗体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。抗体の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０５２６】
表４９は、抗４−ＢＢ  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１抗体の収率及び最終含有量をまとめたものである。
2018535665.tif 000133
【０５２７】
実施例７
抗４−ＢＢ抗体の特徴づけ
７．１  ヒト４−１ＢＢへの結合
７．１．１  表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来４−１ＢＢ特異的抗体の組換え４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５°Ｃで行った。
【０５２８】
同じ実験において、ファージディスプレイ由来の抗４−ＢＢクローン１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５、９Ｂ１１及び２０Ｇ２（全てヒトのＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換え４−ＢＢ（ヒト、カニクイザル及びマウス）の間の種選択性並びに相互作用のアビディティーが決定された。ビオチン化ヒト、カニクイザル及びマウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大１００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。ファージディスプレイ由来抗４−１ＢＢヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、３０μＬ／分の流速で４〜４５０ｎＭ（３倍希釈）の濃度範囲で１２０秒間にわたってフローセルを通過させた。複合体の解離を２２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
【０５２９】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表５０）。
【０５３０】
同じ実験において、ファージディスプレイ由来抗体（ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換え４−１ＢＢ（ヒト、カニクイザル及びマウス）との間の相互作用の親和性を決定した。抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約７５００ＲＵであった。４−１ＢＢに対するファージディスプレイ由来抗体を２５ｎＭからの濃度で６０秒間捕捉した。組換えヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を４．１〜１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ−ＥＰが注入された。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
【０５３１】
クローン２５Ｇ７及び９Ｂ１１は、クローン１２Ｂ３及び１１Ｄ５よりも低い親和性でヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）に結合する。クローン２０Ｇ２はヒト４−１ＢＢに結合しない。抗４−１ＢＢ  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１とヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用の親和性定数を、１：１ラングミュア結合に適合させることによって決定した。
2018535665.tif 000134
【０５３２】
７．１．２  ヒト４−１ＢＢ発現細胞への結合：休止及び活性化ヒト末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
ヒト４−１ＢＢの発現は、休止及びナイーブヒトＴ細胞には存在しない（Kienzle G. and von Kempis J (2000), Int. Immunol. 12(1):, 73-82, Wen T. et al. (2002), J. Immunol. 168, 4897-4906）。固定化抗ヒトＣＤ３アゴニスト抗体による活性化後、４−１ＢＢはＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上でアップレギュレートされる。４−１ＢＢの発現は、活性化ヒトＮＫ細胞（Baessler T. et. al. (2010) Blood 115(15), 3058-3069）、活性化ヒトＮＫＴ細胞  （Cole S.L. et al. (2014) J. Immunol. 192(8), 3898-3907）、活性化ヒトＢ細胞（Zhang et al. (2010) J. Immunol. 184(2), 787-795）、活性化ヒト好酸球（Heinisch et al. 2001）、恒常的にヒト好中球（Heinisch I.V. (2000) J Allergy Clin Immunol. 108(1), 21-28）、活性化ヒト単球（Langstein J.et al. (1998) J Immunol. 160(5), 2488-2494, Kwajah M. and Schwarz H. (2010) Eur J Immunol. 40(7), 1938-1949）、恒常的にヒト制御性Ｔ細胞（Bacher P. et al. (2014) Mucosal Immunol. 7(4), 916-928）、ヒト濾胞性樹状細胞（Pauly S. et al. (2002) J Leukoc Biol. 72(1), 35-42）、活性化ヒト樹状細胞（Zhang L. et al. (2004) Cell Mol Immunol. 1(1), 71-76）及び悪性ヒト腫瘍の血管（Broll K. et al. (2001) Am J Clin Pathol. 115(4), 543-549）についても報告されている。
【０５３３】
本発明者らの抗４−１ＢＢクローンの自然に細胞発現したヒト４−１ＢＢへの結合を試験するために、新鮮な単離された休止末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又はＰＨＡ−Ｌ／Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ事前活性化ＰＢＭＣ及びＣＤ３／ＣＤ２８再活性化ＰＢＭＣを使用した。チューリッヒ献血センターから得られたバフィコートからのＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）を用いたフィコール密度遠心分離によって単離し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を供給されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１−０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。ＰＢＭＣは単離直後に使用され（休止細胞）、又は６ウェル組織培養プレート中で２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  ＡＧ、ＣＨＣＬＢ−Ｐ−４７６−７００−１０３４０）及び２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｌ２７６９）を補充したＴ細胞培地中で３〜５日間培養し、次いで２日間、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３１５）及び２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９２８）でコーティングされた６ウェル組織培養プレート中、３７℃、５％ＣＯ２でＴ細胞培地中において培養することによって、Ｔ細胞の細胞表面で４−１ＢＢ発現を誘導するように刺激された。
【０５３４】
ヒトＰＢＭＣによって発現されるヒト４−１ＢＢへの結合を決定するために、０．１−０．２×１０６個の新たに単離又は活性化されたＰＢＭＣを、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の丸底懸濁細胞の各ウェルに添加した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄し、次いで、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６４−０８６３−１８）又はＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４−１８）を含む１００μＬ／ｍＬのＤＰＢＳと４℃で３０分間インキュベートした。その後細胞を、２００μＬ／ウェルの冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）で１回洗浄した。次に、滴定した抗ヒト４−１ＢＢバインダーを含む４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェルを添加し、細胞を４℃で１２０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄して、結合していない分子を除去した。その後、細胞を、２．５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）又は３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）、抗ヒトＣＤ４５  ＡＦ４８８（クローンＨＩ３０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４０１９）、０．６７μｇ／ｍＬのＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ３  ｍｏＩｇＧ１κ（クローンＵＣＨ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００４２６）又は０．１２５μｇ／ｍＬのＰＥ結合抗ヒトＣＤ３マウスＩｇＧ１κ（クローンＳＫ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４８０６）又は０．６７μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒトＣＤ３マウスＩｇＧ１κ（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００４３０）、０．１２５μｇ／ｍＬのＢＶ４２１結合抗ヒトＣＤ４  ｍｏＩｇＧ１κ（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）又は０．２３μｇ／ｍＬのＢＶ４２１結合抗ヒトＣＤ４マウスＩｇＧ２ｂκ（クローンＯＫＴ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）又は０．０８μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ４マウスＩｇＧ１κ（クローンＳＫ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４６１２）、０．１７μｇ／ｍＬのＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ８（マウスＩｇＧ１κ、クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０１６）又は０．１２５μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ８ａ（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０１２）又は０．３３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８  ＢＶ５１０（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７３２）及び０．２５μｇ／ｍＬのＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ５６（マウスＩｇＧ１κ、クローンＨＣＤ５６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１８３１０）又は１μＬのＡＦ４８８結合抗ヒトＣＤ５６（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＢ１５９、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５７６９９）及び０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ／Ｃｙ７（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＨＩＢ１９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２２１６）を含む５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液とともに更にインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。
【０５３５】
細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェルで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁することにより固定した。３レーザーＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）又は５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）又は３レーザーＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、細胞を同日又は翌日に取得した。ゲートをＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞にセットし、二次検出抗体の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）又は蛍光強度の幾何平均（ｇｅｏ  ｍｅａｎ）を用いて、一次抗体の結合を分析した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して、ブランク値を差し引いて（一次抗体を添加しない）データをベースライン化し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を用いて計算した。
【０５３６】
ヒトＴ細胞は休止状態では４−１ＢＢ発現を欠くが、活性化後は４−１ＢＢをアップレギュレートする。ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔよりも強力なアップレギュレーションを示す。生成された抗ヒト４−１ＢＢ特異的抗体は、図３４Ａ−３４Ｄに示すように、活性化ヒトＴ細胞によって発現されたヒト４−１ＢＢに結合することができる。示された抗ヒト４−１ＢＢクローンは、強い結合（クローン１２Ｂ３及び１１Ｄ５）及び弱い結合体（クローン２５Ｇ７及び９Ｂ１１）に分類することができる。ＥＣ５０値だけでなく、ＭＦＩでも差が見られる。活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合のＥＣ５０値を表５１に示す。抗マウス４−１ＢＢ特異的クローン２０Ｇ２はヒト４−１ＢＢに結合せず、従ってヒト交差反応性ではない。
2018535665.tif 000135
【０５３７】
７．２  マウス４−１ＢＢへの結合
７．２．１  表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来４−１ＢＢ特異的抗体２０Ｇ２の組換えマウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）について上記したように表面プラズモン共鳴によって評価した（実施例７．１．１を参照）。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表５２）。
【０５３８】
親和性決定のために、Ｆｃ融合タンパク質と基準フローセルとの非特異的相互作用のために、マウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）をＡｃＴＥＶプロテアーゼで切断し、Ｆｃ部分をクロマトグラフィー法により除去した。抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約７５００ＲＵであった。４−１ＢＢに対するファージディスプレイ由来抗体を２５ｎＭからの濃度で６０秒間捕捉した。組換えマウス４−１ＢＢ  ＡｃＴＥＶを４．１〜１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここで、抗原は、固定化された抗ヒトＦｃ抗体を有するが、その上には抗体でなくＨＢＳ−ＥＰが注入された表面上を流された。
【０５３９】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。クローン２０Ｇ２がマウス４−１ＢＢに結合することが示された（表５２）。
【０５４０】
抗４−１ＢＢ  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡのＩｇＧ１分子とマウス４−１ＢＢとの間の相互作用の親和性定数をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
2018535665.tif 000136
【０５４１】
７．２．２  マウス４−１ＢＢ発現細胞への結合：休止及び活性化マウス脾細胞（選択されたクローン）
ヒトと同様に、新たに単離された休止マウスＴ細胞は４−１ＢＢを発現しないが、ペプチドパルスＡＰＣ（Cannons J.et al. (2001) J. Immunol. 167(3): 1313-1324）又は固定化抗マウスＣＤ３又は抗マウスＣＤ３と抗マウスＣＤ２８抗体との組み合わせ（Pollok K. et al. (1995), European J. Immunol. 25(2), 488-494）を介したＴＣＲ活性化によって発現を誘導することができる。表面固定化抗ＣＤ３抗体による活性化の後、４−１ＢＢ発現はＣＤ８＋  Ｔ細胞上でより高いと報告されているが（Shuford W, et al. (1997) J. of Experimental Med. 186(1), 47-55）、これは活性化プロトコールに依存し得る。更なる４−１ＢＢ発現は、活性化マウスＮＫ細胞（Melero et al. (1998) Cell Immunol. 190(2), 167-172）、活性化マウスＮＫＴ細胞（Vinay D, et al. (2004) J Immunol. 173(6), 4218-4229）、活性化マウスＢ細胞（Vinay, Kwon (2011) Cell Mol Immunol. 8(4), 281-284）、恒常的にマウス好中球に（Lee S. et al. (2005) Infect Immun. 73(8), 5144-5151）、並びにマウス調節性Ｔ細胞（Gavin et al. (2002) Nat Immunol. 3(1), 33-41）、マウスＩｇＥ刺激肥満細胞（Nishimoto et al. (2005) Blood 106(13): 4241-4248）、マウス骨髄系統細胞（Lee et al. (2008) Nat Immunol. 9(8), 917-926）、マウス濾胞性樹状細胞（Middendorp et al. (2009) Blood 114(11), 2280-2289）及び活性化マウス樹状細胞（Wilcox, Chapoval et al. (2002) J Immunol. 168(9),4262-4267）についても報告されている。
【０５４２】
抗４−１ＢＢ特異的抗体結合を、健常な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞の単離の後、並びに表面固定化アゴニスト抗マウスＣＤ３及び抗マウスＣＤ２８抗体での７２時間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化の後に直接試験した。雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（７−９週齢）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｎｃｅで購入した。動物は到着後１週間、新しい環境に慣れるため及び観察のために維持された。マウスは、特定の病原体を含まない条件下で、関係したガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って随意的な餌と水の摂取及び１２時間明／１２時間暗の毎日のサイクルで維持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。マウスを頚椎脱臼により屠殺した。脾臓を解剖し、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを補充したＲＰＭＩ １６４０中で氷上で保存した。単一細胞溶液を得るために、脾臓を７０μｍ細胞ストレーナ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ；Ｇｅｒｍａｎｙ）でホモジナイズし、ＡＣＫ溶解緩衝液（ｄｄＨ２Ｏ中で０．１５ＭのＮＨ４ＣＬ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中で３７℃で１０分間赤血球溶解させた。滅菌ＤＰＢＳで２回洗浄した後、Ｔ細胞培地で脾細胞を再構成した。細胞は新たに使用されたか（休止）、又は１０６細胞／ｍＬの脾細胞が、１μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３抗体（ラットＩｇＧ２ｂ、クローン１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００２２３）及び２μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ２８抗体（シリアンハムスター、クローン３７．５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号１０２１１２）でコーティングした６ウェル細胞培養プレート上で、１０％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭメルカプトエタノールを供給したＲＰＭＩ １６４０培地からなるＴ細胞培地中で更に７２時間刺激された。
【０５４３】
マウス４−１ＢＢへの結合を試験するために、新たに単離又は活性化されたマウス脾細胞をＤＰＢＳに再懸濁し、０．１×１０６／ウェルの脾細胞を、丸底９６−懸濁細胞プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）に移した。細胞を４℃、４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を除去した。１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６３−１８）又はＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４−１８）を含む１００μ／ウェルＤＰＢＳ中での再懸濁後、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液、及びｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ又はマウスＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧとして、抗ヒト４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体−クローン１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５、９Ｂ１１及び抗マウス４−１ＢＢ特異的クローン２０Ｇ２の滴定された濃度を含有する５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。４℃で１時間インキュベートした後、細胞を４回洗浄して過剰な抗体を除去した。マウスＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧフォーマットとしての抗マウス２０Ｇ２の結合が試験される場合、細胞を、３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギＦ（ａｂ’）γ断片を含む５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェル中で４℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  Ｆｃ断片を含む抗４−１ＢＢバインダーの結合を試験した場合、この工程はスキップされた。その後、細胞を、０．６７μｇ／ｍＬのＰＥ結合抗マウスＣＤ３（ラットＩｇＧ２ｂκ、クローン１７Ａ２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５２７５）又はＡＰＣ−Ｃｙ７結合抗マウスＣＤ３（ラットＩｇＧ２ａκ、クローン５３−６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７０８）、０．６７μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗マウスＣＤ４（ラットＩｇＧ２ｂκ、クローンＧＫ１．５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４２２）、０．６７μｇ／ｍＬのＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗マウスＣＤ８（ラットＩｇＧ２ａκ、クローン５３−６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７１４１）又はＰＥ結合抗マウスＣＤ８（ラットＩｇＧ２ａκ、クローン５３−６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７０８）、２μｇ／ｍＬのＡＰＣ結合抗マウスＮＫ１．１（マウスＩｇＧ２ａκ、クローンＰＫ１３６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０８７１０）又はＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗マウスＮＫ１．１（マウスＩｇＧ２ａκ、クローンＰＫ１３６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０８７２８）及び１０μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（マウスＦｃ−Ｂｌｏｃｋ、ラットＩｇＧ２ｂκ、クローン２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５３１４２）を含む５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェル中でインキュベートした。ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  Ｆｃ断片を含む抗４−１ＢＢバインダーの結合を��験した場合、３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）も添加した。細胞を４℃で３０分間インキュベートし、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで固定するために再懸濁した。翌日、細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、２−レーザーＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）又は５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて取得した。ゲートをＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞にセットし、二次検出抗体の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を用いて、一次抗体の結合を分析した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して、ブランク値を差し引いて（一次抗体を添加しない）データをベースライン化し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を用いて計算した。
【０５４４】
図３５Ｂ及び３５Ｄに示すように、抗マウス４−１ＢＢ結合クローン２０Ｇ２のみが活性化マウスＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞に結合したが、抗ヒト４−１ＢＢ結合クローン９Ｂ１１、１１Ｄ５、１２Ｂ３及び２５Ｇ７はマウス４−１ＢＢに結合せず、従ってマウス交差反応性ではない。試験したクローンからはクローン２０Ｇ２のみがマウス代用物として使用することができる。予想通り、抗４−１ＢＢ結合クローンの何れも、新しく単離された休止マウスＴ細胞への結合を示さなかった（図３５Ａ及び３５Ｃ）。活性化ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞と同様に、活性化マウスＣＤ４＋  Ｔ細胞も、活性化マウスＣＤ８＋Ｔ細胞よりも少ない４−１ＢＢを発現する。しかしながら、違いはヒトＴ細胞ほど強くないが、これは異なる活性化プロトコルに関連している可能性もある。ＥＣ５０値を表５３に示す。
2018535665.tif 000137
【０５４５】
図３６Ｂ及び３６Ｄに示すように、抗マウス４−１ＢＢ結合クローン２０Ｇ２は、同様の方法で、活性化マウスＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞にｍｏＩｇＧ１野生型（ｗｔ）又はｍｏＩｇＧ１  ＤＡＰＧフォーマットとして結合する。結合は、図３５Ｂ及び３５Ｄに示される結合と類似している。従ってフォーマットの変更は結合特性に影響しない。発明者らは、免疫コンピテントマウスにおける抗薬物抗体（ＡＤＡ）のトリガーを防ぐために、クローン２０Ｇ２をｍｏＩｇＧに移した。ＤＡＰＧ突然変異は、ヒトＩｇＧ１構築物中のＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異と同等であり、例えばそれはＦｃＲ＋免疫細胞による架橋を防止する。ＥＣ５０値を表５４に示す。
2018535665.tif 000138
【０５４６】
７．３  カニクイザル４−１ＢＢへの結合
７．３．１  表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
ファージ由来４−１ＢＢ特異的抗体１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５及び９Ｂ１１の組換えカニクイザル４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）について上記したように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した（実施例７．１．１を参照）。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（表５５）。
【０５４７】
同じ実験において、ファージディスプレイ由来抗体（ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換えカニクイザル４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用の親和性を決定した。抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約９０００ＲＵであった。４−１ＢＢに対するファージディスプレイ由来抗体を２５〜１００ｎＭの濃度を使用して捕捉した。実験は、ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ（実施例７．１．１））について記載したように行った。
【０５４８】
クローン１２Ｂ３、２５Ｇ７、１１Ｄ５及び９Ｂ１１は、類似の親和性（表５５）でカニクイザル４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）に結合したが、１２Ｂ３及び１１Ｄ５は、カニクイザル４−１ＢＢを発現する細胞により高いアビディティーで結合した。抗４−１ＢＢ  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡのＩｇＧ１とカニクイザル４−１ＢＢとの間の相互作用の親和性定数をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
2018535665.tif 000139
【０５４９】
７．３．２  カニクイザル４−１ＢＢ発現細胞への結合：活性化されたカニクイザル末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
抗ヒト４−１ＢＢ結合クローンのカニクイザル細胞への交差反応性を試験するために、健常なカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰＢＭＣをヒトＰＢＭＣ（７．１．２）について記載したような密度勾配遠心分離（軽微な違いを含む）を用いてヘパリン処置血液から単離した。単離したＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍＬの抗カニクイザル交差反応性ＣＤ３（抗ＩｇＧ３λ、抗ヒトＣＤ３、クローンＳＰ３４、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５６６１０）及び２μｇ／ｍＬの抗カニクイザル交差反応性ＣＤ２８（ｍｏＩｇＧ１κ、抗ヒトＣＤ２８、クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１４０７８６）抗体をコーティングした６ウェル細胞培養プレート上で、１０％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭのβメルカプトエタノール（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を供給されたＲＰＭＩ １６４０培地からなるＴ細胞培地中で、１．５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で７２時間培養した。７２時間の刺激の後、細胞を収集し、０．１×１０６細胞／ウェルの濃度で丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）に播種した。細胞を、異なる濃度の一次抗ヒト４−１ＢＢ特異的ｈｕＩｇＧ  Ｐ３２Ｇ  ＬＡＬＡ抗体を含む５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で４℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄し、２μＬのＰＥ結合抗カニクイザル交差反応性ＣＤ４（ｍｏＩｇＧ２ａκ、抗ヒトＣＤ４、クローンＭ−Ｔ４７７、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５６６１６）、１μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗カニクイザル反応性ＣＤ８（ｍｏＩｇＧ１κ、抗ヒトＣＤ８、クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０３２）及び３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）を含む５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で４℃で３０分間更にインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを供給した１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、生存細胞から死滅したことを識別した。細胞は、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて直ちに取得した。ゲートをＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞にセットし、二次検出抗体の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を用いて、一次抗体の結合を分析した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して、ブランク値を差し引いて（一次抗体を添加しない）データをベースライン化し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を用いて計算した。
【０５５０】
図３７Ａ及び３７Ｂに示されるように、少なくとも３つの抗ヒト４−１ＢＢクローン、すなわち１２Ｂ３、１１Ｄ５及び２５Ｇ７はまた、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上に発現されるカニクイザル４−１ＢＢに対して交差反応性である。興味深いことに、結合曲線はヒト４−１ＢＢと同様に見え、例えば１２Ｂ３及び１１Ｄ５は、試験した全ての構築物の最高ＭＦＩ値及び最低ＥＣ５０値を示すが、２５Ｇ７は、より低いＭＦＩ値及びより高いＥＣ５０値を有するより弱いバインダーである（表５６）。クローン９Ｂ１１は、１００ｎＭの最高濃度でのみ結合する。これは、クローン９Ｂ１１がクローン２５Ｇ７と比較して優れているヒト４−１ＢＢへの結合に反している。活性化されたカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞における４−１ＢＢ発現レベルの更なる差異は活性化ヒトＴ細胞に類似しており、例えばＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもはるかに少ない４−１ＢＢを発現する。
2018535665.tif 000140
【０５５１】
７．４  リガンドブロッキング特性
４−１ＢＢ／４−１ＢＢ−リガンド相互作用を妨げる４−１ＢＢ特異的ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体分子の能力を決定するために、ヒト４−１ＢＢリガンド（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。同様に、マウス４−１ＢＢリガンド（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、抗マウス４−１ＢＢ特異的ＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体２０Ｇ２のリガンドブロッキング特性を評価した。
【０５５２】
ヒト又はマウス４−１ＢＢリガンドを、標準アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０で、ＣＭ５チップの２つのフローセルに約１５００ＲＵで直接連結させた。組換えヒト又はマウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、第２のフローセル上で５００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を省略し、ファージ由来の抗４−１ＢＢヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡを、両方のフローセル上で２００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を６０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗体を固定化されたヒト又はマウス４−１ＢＢリガンドを有する表面上に流したが、その上には組換えヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）の代わりにＨＢＳ−ＥＰが注入された。
【０５５３】
ファージ由来クローン２５Ｇ７は、ヒト４−１ＢＢとその４−１ＢＢリガンドとの複合体に結合した（表５７、図３８Ａ）。従って、この抗体は、ヒト４−１ＢＢへの結合についてリガンドと競合せず、従って、「非リガンドブロッキング」と呼ばれる。対照的に、クローン１２Ｂ３、１１Ｄ５及び９Ｂ１１は、リガンドと会合したヒト４−１ＢＢに結合せず、従って「リガンドブロッキング」と呼ばれる。マウス代用物２０Ｇ２は、そのリガンドと会合したマウス４−１ＢＢに結合せず、「リガンドブロッキング」とも呼ばれる。
2018535665.tif 000141
【０５５４】
実施例８
抗４−１ＢＢ結合クローンの機能特性
４−１ＢＢは共刺激受容体として働き、ＴＣＲ依存的にＴ細胞の増殖、サイトカイン産生及び機能的特性を改善する。表面固定化抗ＣＤ３抗体又はペプチドパルス化抗原提示細胞によるＴＣＲ活性化は、Ｔ細胞上の４−１ＢＢのアップレギュレーションを誘導し（Pollok et al. (1993) J. Immunol. 150(3): 771-781）、結合後に増殖及びサイトカイン放出を促進することにより免疫応答を支持する（Hurtado et al. (1995) J Immunology 155(7), 3360-3367）。生成した抗ヒト４−１ＢＢ抗体のブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）能力を試験するために、丸底懸濁９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）を、２μｇ／ｍＬのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００６−００８）及び２μｇ／ｍＬのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−００５−００８）を含むＤＰＢＳで一晩にわたってコーティングした。プレートをＤＰＢＳで洗浄して余分な分子を除去し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＤＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ３０５９−１００Ｇ）で３７℃で９０分間ブロックした。上清を除去し、プレートを１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含み、１０ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３１５、クローンＯＫＴ３）を含むか又は含まないＤＰＢＳと共に３７℃で９０分間インキュベートした。プレートをＤＰＢＳで洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び異なる濃度の滴定抗ヒト４−１ＢＢ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９  Ｇ  ＬＡＬＡ抗体を供給したＤＰＢＳと共にインキュベートした。プレートをＤＰＢＳで洗浄し、上清を吸引した。
【０５５５】
前に記載されているように（７．１．２）、ヒトＰＢＭＣを単離し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１、２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ及び２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０中で５日間活性化した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１及び２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０中で更に２１日間、１−２×１０６細胞／ｍＬの密度で更に培養した。長時間培養したＰＢＭＣを収集し、洗浄し、ＣＤ８  Ｔ細胞を、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９６−４９５）を用いて製造者のプロトコルに従って単離した。事前活性化されて選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭのβメルカプトエタノールを供給したＲＰＭＩ １６４０培地からなるＴ細胞培地２００μＬ／ウェルに、７×１０４細胞／ウェルで播種した。細胞を７２時間、最後の４時間はＧｏｌｇｉ−Ｓｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５４７２４）の存在下でインキュベートした。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１：５０００希釈ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ−２３１０１）を含む１００μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中、４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、０．５μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒトＣＤ８（マウスＩｇＧ１κ、クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０３２）、０．５μｇ／ｍＬのＰＥ／Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ２５（マウスＩｇＧ１κ、クローンＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２６１２）及び１μｇ／ｍＬのＡＰＣ／Ｃｙ７結合抗ヒトＰＤ−１（マウスＩｇＧ１κ、クローンＥＨ１２．２Ｈ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９２２）を含む５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、新たに調製した固定／透過化溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−５５２３−００）中に５０μＬ／ウェルで再懸濁した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を新たに調製した透過化緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−５５２３−００）で洗浄し、２μｇ／ｍＬのＡＰＣ標識抗ヒトＩＦＮγ（ｍｏ  ＩｇＧ１κ、クローンＢ２７、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４７０２）及び２μｇ／ｍＬのＰＥ結合抗ヒトＴＮＦα（ｍｏ  ＩｇＧ１κ、クローンＭＡｂ１１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４５１３）を含む５０μＬ／ウェルのＰｅｒｍ緩衝液と共に４℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含むＤＰＢＳで固定した。翌日、２レーザーＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ、ＤＩＶＡソフトウェア）を用いて細胞を取得した。ゲートをＣＤ８＋Ｔ細胞にセットし、ＴＮＦα及びＩＦＮγを分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を決定した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用してデータをブロットし、曲線を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を用いて計算した。
【０５５６】
前に記述したように、ＴＣＲ又はＣＤ３刺激の非存在下では、４−１ＢＢの関与はＣＤ８＋Ｔ細胞機能に影響を及ぼさないが（Pollok 1995）一方で、４−１ＢＢの最適以下のＣＤ３活性化共刺激の存在下ではサイトカイン分泌を増加させる（図３９Ａ又は３９Ｃ）。ＣＤ３抗体を介した最適以下の活性化は、全ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団のうちの３０％のＣＤ８＋  Ｔ細胞においてＩＦＮγ分泌を誘導する。４−１ＢＢ共刺激の添加は、濃度依存的に最大５５％までＩＦＮγ＋  ＣＤ８  Ｔ細胞集団を増加させる（図３９Ｂ）。表５８は、対応するＥＣ５０値を示す。ＴＮＦα分泌は、全ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団の２３％から３９％へと増加させることができた（図３９Ｄ）。それらの結合特性と同様に、クローン１２Ｂ３及び１１Ｄ５は、頻度及びＥＣ５０において２５Ｇ７及び９Ｂ１１よりも優れたＩＮＦγ発現を増加させる。従って、我々の生成クローンは機能的であり、ＴＣＲ媒介性Ｔ細胞活性化及び機能を改善することができる。抗４−１ＢＢ特異的抗体が表面固定化されていない場合、それらはＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化を改善しなかった（示さず）。
2018535665.tif 000142
【０５５７】
実施例９
４−１ＢＢ及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする二重特異性二価抗体の調製、精製及び特徴づけ
９．１  ４−１ＢＢ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性二価抗体の生成（２＋２フォーマット、比較例）
４−１ＢＢ及びＦＡＰに対する二価結合を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体を調製した。クロスマブ技術は、国際特許出願番号ＷＯ２００／１４５７９２（Ａ１）号に記載されているように、誤って対になった軽鎖の形成を減少させるために適用された。
【０５５８】
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６（Ａ２）号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０５５９】
この実施例では、ＦＡＰバインダー２８Ｈ１の交差Ｆａｂ単位（ＶＨＣＬ）を（Ｇ４Ｓ）４コネクタ配列を用いて抗４−１ＢＢ  ｈｕ  ＩｇＧ１の重鎖にＣ末端融合させた。この重鎖融合体を、抗４−１ＢＢの軽鎖及び対応するＦＡＰ交差軽鎖（ＶＬＣＨ１）と同時発現させた。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入されている。得られた二重特異性二価構築物は、図４０Ａに示されるものと類似している。
表５９は、成熟二重特異性二価抗４−１ＢＢ／抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
2018535665.tif 000143
2018535665.tif 000144
2018535665.tif 000145
2018535665.tif 000146
2018535665.tif 000147
2018535665.tif 000148
【０５６０】
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
【０５６１】
二重特異性抗４−１ＢＢ／抗ＦＡＰ構築物は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
【０５６２】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７°Ｃで３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０５６３】
細胞培養上清からの二重特異性構築物の精製は、抗原Ｆｃ融合体及び抗体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
【０５６４】
タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０５６５】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した（表６０）。
2018535665.tif 000149
【０５６６】
９．２  一価フォーマットの４−１ＢＢ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性抗体の生成（１＋１フォーマット、比較例）
４−１ＢＢ及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体を調製した。クロスマブ技術は、国際特許出願番号ＷＯ２００／１４５７９２（Ａ１）号に記載されているように、誤って対になった軽鎖の形成を減少させるために適用された。
【０５６７】
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６（Ａ２）号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０５６８】
二重特異性構築物は、４−１ＢＢ及びＦＡＰに一価的に結合する（図４０Ｂ）。これは、抗４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ１（Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む）のノブ重鎖に融合したＦＡＰバインダーの交差Ｆａｂ単位（ＶＨＣＬ）を含む。Ｆｃホール重鎖（Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む）は抗４−１ＢＢに対するＦａｂに融合される。標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃノブと抗４−１ＢＢ−Ｆｃホール鎖との組み合わせは、ＦＡＰに特異的に結合するＦａｂと４−１ＢＢに特異的に結合するＦａｂとを含むヘテロ二量体の生成を可能にする。
【０５６９】
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０５７０】
二重特異性一価抗４−１ＢＢ及び抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡは、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１：１の比（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクターホール重鎖」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
【０５７１】
得られた二重特異性一価構築物は、二重特異性の二価抗４−１ＢＢ及び抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡについて記載したように産生及び精製された（実施例９．１を参照のこと）。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、表６１に見出すことができる。
2018535665.tif 000150
2018535665.tif 000151
2018535665.tif 000152
2018535665.tif 000153
【０５７２】
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。
【０５７３】
二重特異性抗４−１ＢＢ／抗ＦＡＰ構築物は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１：１の比（「ベクター重ノブ鎖」：「ベクター重ホール鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
【０５７４】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０５７５】
細胞培養上清からの二重特異性構築物の精製は、抗原／Ｆｃ融合分子又は抗体の精製のための上記のプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで２５℃で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
2018535665.tif 000154
【０５７６】
９．３  ４−１ＢＢへの二価結合及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）への一価結合を有する二重特異性抗体の生成（２＋１フォーマット、比較例）
４−１ＢＢに対する二価結合及びＦＡＰに対する一価結合（２＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体は、図４０Ｃ及び４０Ｄに示すように調製されている。
【０５７７】
この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分：抗４−１ＢＢバインダーのＶＨＣＨ１、続いて抗ＦＡＰバインダーのＣ末端ＶＬ又はＶＨが融合されたＦｃノブで構成された。第２の重鎖ＨＣ２は、抗４−１ＢＢのＶＨＣＨ１、続いて抗ＦＡＰバインダー（クローン４Ｂ９）のＣ末端のＶＨ又はＶＬのそれぞれが融合したＦｃホールで構成された。ＦＡＰバインダー４Ｂ９の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。４−１ＢＢ（１２Ｂ３、９Ｂ１１、１１Ｄ５及び２５Ｇ７）に対するバインダーを実施例６に記載のように生成した。標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃノブと抗４−１ＢＢ−Ｆｃホール鎖との組み合わせは、ＦＡＰ結合部分及び２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４０Ｃ及び４０Ｄ）。
【０５７８】
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０５７９】
二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ  抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）でトランスフェクトした。構築物は、二重特異性の二価抗４−１ＢＢ及び抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体について記載したように産生及び精製された（実施例９．１を参照のこと）。
【０５８０】
ノブに融合したａ−ＦＡＰ  ＶＨ及びホール鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表６３に見出すことができる。
2018535665.tif 000155
2018535665.tif 000156
2018535665.tif 000157
2018535665.tif 000158
2018535665.tif 000159
2018535665.tif 000160
2018535665.tif 000161
【０５８１】
９．４  スクリーニングツールとしてのＦＡＰ抗原の調製、精製及び特徴づけ
ＦＡＰへの結合を試験するために、Ｃ末端Ｈｉｓタグに融合したヒト、マウス又はカニクイザルＦＡＰのエクトドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターを含む発現ベクターにクローニングした。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号８５及び８６に示す。配列番号８８及び８９は、それぞれＨｉｓタグ付きマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。配列番号９０及び９１は、それぞれＨｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【０５８２】
ＦＡＰ抗原は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。
【０５８３】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での２００ｍＬの産生のために、１００％のＦ１７＋６ｍＭグルタミン中でトランスフェクションの２４時間前に３億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、４億個の細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）２０ｍＬと交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後、再懸濁した細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間、１６５ｒｐｍで振盪させてインキュベートした。インキュベーション後、１６０ｍＬのＦ１７培地及びサプリメント（１ｍＭバルプロ酸、５ｇ／ｌのＰｅｐｓｏｙ及び６ｍＭのＬ−グルタミン）を添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの２４時間後、細胞に最終量１２％（２４ｍＬ）のアミノ酸及びグルコース飼料を補充した。７日間培養した後、２０００−３０００×ｇで４５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０５８４】
細胞培養上清からの抗原の精製を、最初に５ｍｌのＩＭＡＣカラム（Ｒｏｃｈｅ）又は５ｍｌのＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）の何れかを使用するアフィニティークロマトグラフィー工程、続いて２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０又は２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３のそれぞれで平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いた２工程の精製で行った。
【０５８５】
ＩＭＡＣカラム（Ｒｏｃｈｅ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーでは、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０を用いて８ＣＶで平衡化を行った。上清をロードし、１０ＣＶの２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０で洗浄することにより未結合タンパク質を洗い流した。結合したタンパク質を２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０の２０ＣＶの線形勾配（０〜１００％）を用いて溶出し、続いて８ＣＶで１００％の工程を行った。
【０５８６】
ＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーでは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０を用いて８ＣＶで平衡化を行った。上清をロードし、１０カラム容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で洗浄することにより未結合タンパク質を除去した。５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４の２０ＣＶの直線勾配（０〜１００％）を用いて結合したタンパク質を溶出し、続いて５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４の５ＣＶの工程を行った。次いで、カラムを８ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で再平衡化した。
【０５８７】
次に、収集した画分に１／１０（ｖ／ｖ）の０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を補充した。タンパク質をＶｉｖａｓｐｉｎカラム（３０ｋＤカットオフ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３、又は２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０５８８】
精製された抗原のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。抗原の純度及び分子量が、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析された。抗原の凝集物含有量を、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで２５℃で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０５８９】
９．５  ４−１ＢＢ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性四価抗原結合分子の生成（４＋１フォーマット）
４−１ＢＢに対する四価結合及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体（４＋１二重特異性抗原結合分子とも呼ばれる）は、図４０Ｅ及び４０Ｆに示すように調製された。
【０５９０】
この実施例では、構築物のＨＣ１は、以下の成分：抗４−１ＢＢのＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、続いて抗ＦＡＰバインダー（クローン４Ｂ９）のＣ末端ＶＬ又はＶＨそれぞれが融合されたＦｃホールで構成された。ＨＣ２は、抗４−１ＢＢのＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、続いて抗ＦＡＰバインダーのＣ末端のＶＨ又はＶＬが融合したＦｃノブで構成された。
【０５９１】
４−１ＢＢ、１２Ｂ３、９Ｂ１１、１１Ｄ５及び２５Ｇ７に対するバインダーを実施例６に記載のように生成した。ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０５９２】
標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃノブと抗４−１ＢＢ−Ｆｃホール鎖との組み合わせは、ＦＡＰ結合部分及び４つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入された。重鎖融合タンパク質を抗４−１ＢＢバインダーの軽鎖（ＣＬＶＬ）と同時発現させた。得られた二重特異性四価構築物は図４０Ｅ及び４０Ｆに示され、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は表６５に見出すことができる。
【０５９３】
二重特異性４＋１抗４−１ＢＢ  抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡは、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）でトランスフェクトした。４＋１二重特異性抗原結合分子は、二重特異性の二価抗４−１ＢＢ及び抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡについて記載したように産生及び精製された（実施例９．１を参照のこと）。
【０５９４】
更に、抗ＦＡＰバインダーのＶＨ及びＶＬドメインが、抗原に結合しないＤＰ４７と呼ばれる生殖細胞系列コントロールによって置換された、「非標的化」４＋１構築物を調製した。
2018535665.tif 000162
2018535665.tif 000163
2018535665.tif 000164
2018535665.tif 000165
2018535665.tif 000166
2018535665.tif 000167
2018535665.tif 000168
2018535665.tif 000169
2018535665.tif 000170
2018535665.tif 000171
2018535665.tif 000172
2018535665.tif 000173
2018535665.tif 000174
2018535665.tif 000175
【０５９５】
ノブに融合したａ−ＦＡＰ  ＶＬ及びホール鎖に融合したＶＨを有する４＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ構築物の塩基対及びアミノ酸配列は、それぞれ表６６に見出すことができる。
2018535665.tif 000176
2018535665.tif 000177
2018535665.tif 000178
2018535665.tif 000179
2018535665.tif 000180
2018535665.tif 000181
2018535665.tif 000182
2018535665.tif 000183
2018535665.tif 000184
2018535665.tif 000185
2018535665.tif 000186
2018535665.tif 000187
2018535665.tif 000188
2018535665.tif 000189
2018535665.tif 000190
【０５９６】
９．６  ４−１ＢＢ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性二価抗体の特徴づけ
９．６．１  表面プラズモン共鳴（同時結合）
ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰを同時に結合させる能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５°Ｃで行った。
【０５９７】
ビオチン化カニクイザル４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大４００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。４−１ＢＢ及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体を、２００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速でフローセルに９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、５００ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルを通して３０μＬ／分の流速で第２分析物として注入した。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
【０５９８】
図４１Ｂ−４１Ｄに示す通り、全ての二重特異性構築物は、ヒト４−１ＢＢ及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた。
【０５９９】
９．６．２  ヒト４−１ＢＢへの結合  −  二価４−１ＢＢ抗体対四価抗４−１ＢＢ抗原結合分子の競合アッセイ
４つの抗４−１ＢＢ  Ｆａｂドメインの全てのヒト４−１ＢＢに結合する能力を確認するために、細胞ベースのＦＲＥＴアッセイ（ＴａｇＬｉｔｅ）を適用した。従って、ｈｕ４−１ＢＢ−ＳＮＡＰ融合タンパク質でトランスフェクトされ、ＦＲＥＴドナーであるテルビウム（Ｃｉｓｂｉｏ）で標識した２５００  Ｈｅｋ２９３  ＥＢＮＡ細胞／ウェルを、ＦＲＥＴアクセプターｄ２（Ｃｉｓｂｉｏ）で標識した０．６ｎＭの抗４−１ＢＢウレルマブ又は０．３９ｎＭの抗４−１ＢＢ  １２Ｂ３の何れかと混合した。更に、非標識ＩｇＧ（１２Ｂ３）又は四価（１２Ｂ３／４Ｂ９  ４＋１）二重特異性抗体の０．００６−１０００ｎＭの範囲の濃度希釈液を加えて、室温で２〜４時間インキュベートした。蛍光シグナルは、蛍光ドナー（Ｔｅｒｂｉｕｍ）については６２０ｎｍで、蛍光アクセプター色素（Ｍ１００  Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）については６６５ｎｍで測定した。６６５／６２０＊１０００の比を計算し、基準（細胞のみ）を差し引いた。ＥＣ５０の決定のために、結果をＧｒａｐｈ  ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。４時間のインキュベーション後の観察された５０値を表６８に示す。対応する曲線を図４２に示す。
2018535665.tif 000191
【０６００】
９．６．３  細胞への結合
９．６．３．１  ヒト４−１ＢＢ発現細胞への結合：休止及び活性化ヒト末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
ヒト４−１ＢＢの発現は、休止（ナイーブ）ヒトＴ細胞には存在しない（Kienzle G. and von Kempis J (2000), Int. Immunol. 12(1):, 73-82, Wen T. et al. (2002), J. Immunol. 168, 4897-4906）。固定化抗ヒトＣＤ３アゴニスト抗体による活性化後、４−１ＢＢはＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上でアップレギュレートされる。４−１ＢＢの発現は、活性化ヒトＮＫ細胞（Baessler T. et. al. (2010) Blood 115(15), 3058-3069）、活性化ヒトＮＫＴ細胞  （Cole S.L. et al. (2014) J. Immunol. 192(8), 3898-3907）、活性化ヒトＢ細胞（Zhang et al. (2010) J. Immunol. 184(2), 787-795)、活性化ヒト好酸球(Heinisch et al. 2001）、恒常的にヒト好中球（Heinisch I.V. (2000) J Allergy Clin Immunol. 108(1), 21-28）、活性化ヒト単球（Langstein J.et al. (1998) J Immunol. 160(5), 2488-2494, Kwajah M. and Schwarz H. (2010) Eur J Immunol. 40(7), 1938-1949）、恒常的にヒト制御性Ｔ細胞（Bacher P. et al. (2014) Mucosal Immunol. 7(4), 916-928）、ヒト濾胞性樹状細胞（Pauly S. et al. (2002) J Leukoc Biol. 72(1), 35-42）、活性化ヒト樹状細胞（Zhang L. et al. (2004) Cell Mol Immunol. 1(1), 71-76）及び悪性ヒト腫瘍の血管（Broll K. et al. (2001) Am J Clin Pathol. 115(4), 543-549）についても報告されている。
【０６０１】
本発明者らの抗４−１ＢＢクローンの自然に細胞発現したヒト４−１ＢＢへの結合を試験するために、休止末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又はＰＨＡ−Ｌ／Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ事前活性化ＰＢＭＣ及びＣＤ３／ＣＤ２８再活性化ＰＢＭＣを使用した。チューリッヒ献血センターから得られたバフィコートからのＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）を用いたフィコール密度遠心分離によって単離し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を供給されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１−０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。ＰＢＭＣは単離直後に使用され（休止細胞）、又は６ウェル組織培養プレート中で２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  ＡＧ、ＣＨＣＬＢ−Ｐ−４７６−７００−１０３４０）及び２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｌ２７６９）を補充したＴ細胞培地中で３〜５日間培養し、次いで２日間、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３１５）及び２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９２８）でコーティングされた６ウェル組織培養プレート中、３７℃、５％ＣＯ２でＴ細胞培地中において培養することによって、Ｔ細胞の細胞表面で４−１ＢＢ発現を誘導するように刺激された。
【０６０２】
ヒトＰＢＭＣによって発現されるヒト４−１ＢＢへの結合を決定するために、０．１−０．２×１０６個の新たに単離された例えば休止又は活性化ＰＢＭＣを、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の丸底懸濁細胞の各ウェルに添加した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄し、次いで、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４−１８）を含む１００μＬ／ｍＬのＤＰＢＳと４℃で３０分間インキュベートした。その後細胞を、２００μＬ／ウェルの冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）で１回洗浄した。次に、滴定した抗ヒト４−１ＢＢバインダーを含む４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェルを添加し、細胞を４℃で１２０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄して、結合していない分子を除去した。その後、細胞を、２．５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）、抗ヒトＣＤ４５  ＡＦ４８８（クローンＨＩ３０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４０１９）、０．６７μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒトＣＤ３マウスＩｇＧ１κ（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００４３０）、０．１２５μｇ／ｍＬのＢＶ４２１結合抗ヒトＣＤ４  ｍｏＩｇＧ１κ（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）又は０．２３μｇ／ｍＬのＢＶ４２１結合抗ヒトＣＤ４マウスＩｇＧ２ｂκ（クローンＯＫＴ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）、０．３３μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ８−ＢＶ５１０（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７３２）及び０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ／Ｃｙ７（ｍｏＩｇＧ１κ、クローンＨＩＢ１９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２２１６）を含有する５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液と共に更にインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。
【０６０３】
細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェルで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁することにより固定した。細胞を、３レーザーＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、同日又は翌日に取得した。ゲートをＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞にセットし、二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均（ＭＦＩ）を用いて、一次抗体の結合を分析した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して、ブランク値を差し引いて（一次抗体を添加しない）データをベースライン化し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線適合（ロバストフィット）を用いて計算した。
【０６０４】
ヒトＴ細胞は休止状態では４−１ＢＢ発現を欠くが、活性化後は４−１ＢＢをアップレギュレートする。ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞よりも強いアップレギュレーションを示す。生成された抗ヒト４−１ＢＢ特異的抗体は、図４３Ｂ及び４３Ｄに示されるように、活性化ヒトＴ細胞によって発現されるヒト４−１ＢＢに結合することができるが、一方、休止ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞では、有意な結合を検出することはできない（図４３Ａ及び４３Ｃ）。結合は、細胞の４−１ＢＢ発現レベルによって影響を受け、例えば４−１ＢＢ特異的分子は、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図４３Ｂ）よりも活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図４３Ｄ）に強く結合する。また、分子のフォーマットによって観察される差異もあり、例えば一価の４−１ＢＢバインダーは、二価又は四価の４−１ＢＢ抗原結合分子とは異なる結合をする。一価４−１ＢＢ結合は、より低い結合親和性に起因するＥＣ５０値の増加及びＭＦＩの減少を導き、四価４−１ＢＢバインダーは、より強い親和性のために、しかしまた４−１ＢＢ特異的エピトープをめぐる内部の競合のために、異なる結合曲線を示す可能性がある。Ｆｃ融合ＦＡＰ標的化ドメイン（例えば、ＦＡＰ標的化２＋２又は４＋１フォーマットであるが、１＋１フォーマットではない）を含む分子は、ＭＦＩ及びＥＣ５０値に影響を及ぼし得るポリクローナル二次検出抗体のエピトープを遮蔽し得る。活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合のＥＣ５０値を表６９に示す。図４４に、図４３に示す結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）をまとめる。
2018535665.tif 000192
【０６０５】
９．６．３．２  ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合
細胞表面発現ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）への結合については、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞又はヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６７６）を使用した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９は、マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）を、ＣＭＶプロモーター下でヒトＦＡＰをコードする発現ｐＥＴＲ４９２１プラスミドでトランスフェクションすることによって生成した。１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ａｎｔ−ｐｒ−５）の存在下で細胞を維持した。丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに２×１０５個のＦＡＰ発現腫瘍細胞を添加した。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５０８６３１８）又はＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４−１８）を含む１００μＬ／ウェルの４℃の冷ＤＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。プレートを４℃で３０時間インキュベートし、２００μＬの４℃の冷ＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後細胞を、４−１ＢＢ特異的ＦＡＰ標的化抗体及び非標的化抗体の異なる滴定濃度を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、続いて４℃で１時間インキュベートした。２００μＬ／ウェルで４回洗浄した後、細胞を、２．５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）又は３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）を含む５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液で４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで固定のために１％ホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁した。同日又は翌日、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）又はＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて取得した。
【０６０６】
図４５Ａ及び４５Ｂに示されるように、ＦＡＰ標的化分子は（しかしＤＰ４７標的化又は親ｈｕＩｇＧ１  Ｐ２９３Ｇ  ＬＡＬＡクローン１２Ｂ３ではなく）、ヒトＦＡＰ発現ＷＭ−２６６−４細胞（Ａ）及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞（Ｂ）に効率的に結合する。従って、ＦＡＰ結合側を含むことは、ヒトＦＡＰ発現細胞に対する効率的な標的化効果を誘導する。ＦＡＰ結合側の部分（例えば、１＋１又は２＋２又は４＋１）並びにＦＡＰ結合クローン（２８Ｈ１又は４Ｂ９）は役割を果たし、ＦＡＰ発現細胞への結合のＥＣ５０（表７０）及びＡＵＣ（図４６）に影響を与える。４−１ＢＢ（１２Ｂ３）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋２（黒塗りの三角形）、４−１ＢＢ（１２Ｂ３）×ＦＡＰ（２８Ｈ１）１＋１（半分灰色の丸）、４−１ＢＢ（１２Ｂ３）×ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１（半分灰色の四角形）は、結合の差異を示しており（図４５Ｂ）、それらはまた、それらの架橋及び従って活性化潜在力にも影響を与え得る（図４７Ａ−図４７Ｋに示され、実施例１０において論じられる）。
2018535665.tif 000193
【０６０７】
実施例１０
二重特異性抗ヒト４−１ＢＢ結合分子の機能特性
１０．１  ＮＦκＢの活性化
１０．１．１  ヒト４−１ＢＢ及びＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞の生成
子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に、ＣＭＶ−プロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子の制御下にあるヒト４−１ＢＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１）の配列を含む発現ベクターｐＥＴＲ１０８２９に基づくプラスミドを形質導入した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１及び３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。
【０６０８】
４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、フローサイトメトリーによる４−１ＢＢ発現について試験した：０．２×１０６個の生存細胞を、０．１μｇのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒト４−１ＢＢマウスＩｇＧ１κクローン４Ｂ４−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）又はそのアイソタイプコントロール（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体クローンＭＯＰＣ２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１５０）を含む１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．０６μｇのＤＡＰＩを含む３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、同日に５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア）を使用して取得した。限界希釈を行って、記載される単一のクローンを生成した：ヒト４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、１０、５及び２．５細胞／ｍＬの密度まで培地に再懸濁し、細胞懸濁液２００μＬを丸底組織培養処理９６ウェルプレート（６プレート／細胞濃度、ＴＰＰカタログ番号９２６９７）に移した。単一のクローンを収集し、増やし、上記のように４−１ＢＢ発現について試験した。ＮＦκＢ−ルシフェラーゼ発現ベクター５４９５ｐ  Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢでのその後のトランスフェクションのために、４−１ＢＢ（クローン５）の最高発現を有するクローンを選択した。このベクターは、ＮＦ−ｋＢ応答エレメント（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、カタログ番号ＬＲ００５１）の制御下で、ハイグロマイシンＢに対する耐性及びルシフェラーゼを発現する能力の両方を有するトランスフェクトされた細胞を与える。トランスフェクションのために、ヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を７０％コンフルエントになるまで培養した。５０μｇ（４０μＬ）の直線化した（制限酵素ＡｓｅＩ及びＳａｌＩ）５４９５ｐＴｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢ発現ベクターを、滅菌０．４ｃｍ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５−２０８１）に添加した。２．５×１０６個のヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を４００μｌの無添加ＤＭＥＭ培地に加え、プラスミド溶液と注意深く混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌトータルシステム（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５２６６０）を用いて以下の設定で細胞のトランスフェクションを行った：指数パルス、容量５００μＦ、電圧１６０Ｖ、抵抗∞。パルスの直後に、トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉを供給された３７℃の温ＤＭＥＭ培地１５ｍＬを含む７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ＴＰＰ、カタログ番号９００７５）に移した。翌日、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０８４３５５５００１）を含む培地を添加した。生存細胞を増殖させ、上記のように限界希釈を行って単一のクローンを生成した。
【０６０９】
クローンを上記のように４−１ＢＢ発現及び以下のようにＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性について試験した：クローンを選択培地で収集し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｖｉ−ｃｅｌｌ  ｘｒ ２．０３（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号７３１０５０）を用いて計数した。細胞を０．３３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に設定し、１５０μＬのこの細胞懸濁液を、蓋の付いた滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移した。細胞を細胞培養器（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ）中で３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｒｈＴＮＦα、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３０００１Ａ）を含む培地５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎｇ／ウェルのｒｈＴＮＦαの最終濃度が得られた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、次いで２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで３回洗浄した。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し（４０μｌ）、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温まで解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、プレートを可能な限り迅速に測定した。コントロール（ｒｈＴＮＦαを添加していない）より上の５００ｍｓ／ウェル（ＵＲＬ）の放出光の測定単位をルシフェラーゼ活性とした。ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃクローン２６は、最も高いルシフェラーゼ活性及びかなりのレベルの４−１ＢＢ発現を示し、更なる使用のために選択された。
【０６１０】
１０．１．２  ＦＡＰ発現腫瘍細胞と共培養したヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化
ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃクローン２６細胞を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に０．２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬ（２×１０４細胞）を蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、滴定したＦＡＰ標的化抗ヒト４−１ＢＢ構築物又はそれらの親ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体を含む培地５０μＬを添加した。ＦＡＰを発現するＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９又はＷＭ−２６６−４を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。
【０６１１】
ＦＡＰ発現腫瘍細胞の懸濁液（５０μｌ）又は陰性コントロールとしての培地を各ウェルに添加し、プレートを細胞インキュベーター中で３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄した。４０μｌの新たに調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温で解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を可能な限り迅速に測定した。
【０６１２】
図４７Ａ−４７Ｋには、異なるＦＡＰ標的化４−１ＢＢ特異的構築物の活性化特性が示されている。上のパネルでは、ＦＡＰの非存在下での活性化特性が示されている（図４７Ａ、Ｄ及びＧ）。ＦＡＰの非存在下では、４−１ＢＢ結合クローンとは無関係に活性化を検出することはできない。中間のパネルでは、中程度ＦＡＰ発現ヒトＷＭ−２６６−４の存在下での活性化が示されている。４＋１及び２＋１ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化構築物の存在下でのみ、ＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化が観察され得る；すなわち、図４７Ｂの４−１ＢＢ（１２Ｂ３）×ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１（半分灰色の四角形、半分点線）、図４７Ｅの４−１ＢＢ（１１Ｄ５）×ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１（灰色星、点線）及び４−１ＢＢ（１１Ｄ５）×ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１（黒色のクロス、点線）並びに図４７Ｉの４−１ＢＢ（２５Ｇ７）×ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１（上向き、半分が黒い三角形、点線）及び４−１ＢＢ（２５Ｇ７）×ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１（下向き、半分が黒い三角形）。下のパネルでは、高ＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９の存在下での活性化が示されている。ここでは、４＋１及び２＋１ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化構築物だけでなく、２＋２及び１＋１ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化構築物も、レポーター細胞株においてＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化を誘導することができる。これらの結果はまた、活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）として図４８Ａ及びＢにまとめられている。使用されたフォーマット及びＦＡＰ結合クローンはグラフの下にピクトグラムとして示され、使用されたクローンはカラムパターンによって示される。明らかに、四価４−１ＢＢ  ｘ  ＦＡＰ  ４＋１分子は、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株において最も強いＮＦκＢ／ルシフェラーゼ活性化を誘導した。
2018535665.tif 000194
【０６１３】
実施例１１
ＧＩＴＲ抗体及びツールのバインダーの生成
１１．１  ファージディスプレイによる新規ＧＩＴＲバインダーの生成のためのスクリーニングツールとしての抗原Ｆｃ融合体の調製、精製及び特徴づけ
ヒト、マウス又はカニクイザルＧＩＴＲのエクトドメインをコードするＤＮＡ配列（表７２）を、Ｆｃノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内に融合させた（Merchant et al., 1998）。ＩｇＡｓｅプロテアーゼ切断部位を、抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。指示されたビオチン化のためのＡｖｉタグを抗原−Ｆｃノブ融合体のＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖との組み合わせは、１つのＧＩＴＲエクトドメイン鎖を含むヘテロ二量体の生成を可能にし、従ってＦｃ結合抗原の単量体型を作り出す（図１Ａ）。表７３は、抗原Ｆｃ融合構築物のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
2018535665.tif 000195
2018535665.tif 000196
2018535665.tif 000197
2018535665.tif 000198
【０６１４】
ＧＩＴＲ−Ｆｃ融合分子をコードする全ての配列を、キメラＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡ配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ｏｒｉＰ配列を含む。
【０６１５】
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）、並びにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのプラスミドで同時トランスフェクトした。対応するベクターを２：１：０．０５比（「抗原ＥＣＤ−ＩｇＡｓｅ−Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
【０６１６】
抗原の産生及び精製は、実施例１（１．１）に記載の手順と同様に実施した。３種の異なるＧＩＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質の収率、濃度及び品質を表７４にまとめる。
2018535665.tif 000199
【０６１７】
１１．２  一般的なＦ（ａｂ）ライブラリーからの抗ＧＩＴＲ抗体の選択
抗ＧＩＴＲ抗体８Ａ０６は、一般的なファージディスプレイライブラリーλ−ＤＰ８８由来のＦａｂ−フォーマットにおいて選択した。
【０６１８】
ライブラリー構築
λ−ＤＰ８８ライブラリーは、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３、３つの異なる長さ）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に無作為化配列空間を含む、Ｖドメイン対合Ｖｌ３＿１９（ラムダ軽鎖）及びＶＨ１＿６９（重鎖）を用いて、ヒト生殖細胞系列遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する３つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施した。断片１は無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３からＨ３にわたる中央の定常断片であり、一方、断片３は抗体遺伝子の無作為化されたＨ３及び３’末端を含む。以下のプライマーの組み合わせを使用して、λ−ＤＰ８８ライブラリーのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ又はＶｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ又はＶｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＲＪＨ３２と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ８０）及び断片３（フォワードプライマーＤＰ８８−ｖ４−４又はＤＰ８８−ｖ４−６又はＤＰ８８−ｖ４−８とリバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇを組み合わせたもの）。ライブラリー断片の作製のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分間の初期変性、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分、７２℃で１０分間の末端伸長の２５サイクルであった。テンプレートとして等モル比のゲル精製単一断片を使用するアセンブリＰＣＲのために、パラメーターは、９４℃で３分間の初期変性及び９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分の５サイクルであった。この段階で、外側プライマー（ＬＭＢ３及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長の前に更に２０サイクルを行った。十分な量の全長無作為化Ｆａｂ構築物を集めた後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製されたライゲーションを、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換のために使用した。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。９．０×１０９の最終ライブラリーサイズが得られた。ドットブロットにおけるＣ末端タグ検出によって決定されるように、機能的クローンの割合は、軽鎖については７３．７％、重鎖については８０．０％であった。
【０６１９】
ファージディスプレイの選択とＥＬＩＳＡスクリーニング
ファージディスプレイ選択のための抗原としてのヒトＧＩＴＲＬを、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞におけるＮ末端単量体Ｆｃ融合体（Ｆｃのノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化）として一時的に発現させ、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列でのＢｉｒＡビオチンリガーゼの同時発現を介してｉｎ  ｖｉｖｏで部位特異的にビオチン化した。
【０６２０】
選択ラウンド（バイオパニング）を以下のパターンに従って溶液中で行った：１． 抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために、１０μｇ／ｍｌでＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングされたヒトＩｇＧを用いて約１０１２個のファージミド粒子を事前清澄化する；２． １００ｎＭのビオチン化ヒトＧＩＴＲを含む上清中で事前清澄化されたファージミド粒子を全容量１ｍｌ中で０．５時間インキュベートする；３． ビオチン化ヒトＧＩＴＲ及び特異的に結合するファージをニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレートの４つのウェルに１０分間（ラウンド１及びラウンド３で）移すことによって捕捉する；４． ５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×ＰＢＳを用いてそれぞれのウェルを洗浄する；５． １ウェルあたり１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）２５０ｕｌを１０分間添加することによりファージ粒子を溶出し、１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５００ｕｌを４つのウェルからのプールされた溶出液に添加することによって中和する；６． 溶出されたファージ粒子の上清により対数期大腸菌ＴＧ１細胞を再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３により感染させ、振盪機で３０℃で一晩インキュベートし、続いて次の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させる。選択は１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて４ラウンドにわたって行った。ラウンド２及び４では、ニュートラアビジンに対するバインダーの濃縮を避けるために、抗原：ファージ複合体の捕捉を、５．４×１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加によって行った。ラウンド４の後にＥＬＩＳＡにより、以下のようにして特異的バインダーが同定された。１００ｎＭの１００ｎＭビオチン化ヒトＧＩＴＲをニュートラアビジンプレートにコーティングした。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いて、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグを介して検出した。ヒトＧＩＴＲに対してシグナルを示し、ヒトＦｃに対して陰性であるクローンを、更なる分析のために選考に残した。それらは０．５リットルの培養体積で細菌で発現され、アフィニティー精製され、結合反応速度を決定し、カニクイザル及びマウスＧＩＴＲに対する交差反応性を試験するために、ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを用いたＳＰＲ分析によって特徴づけられた。
【０６２１】
ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを用いたＳＰＲ分析
クローン８Ａ０６のヒト、カニクイザル及びマウスＧＩＴＲに対する親和性（ＫＤ）を、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定化されたビオチン化ヒト、カニクイザル及びマウスＧＩＴＲ抗原を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．４、０．００５のＴｗｅｅｎ ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、垂直方向に３０μｌ／分で注入した。分析物の注入：「ワンショットキネティクス」測定のために、注入方向を水平方向に変更し、２倍希釈系列の精製Ｆａｂを、２００秒の会合時間及び２４０秒の解離時間で、別々のチャネル１−５に沿って同時に注入した。基準用に「インライン」ブランクを提供するために、第６のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることにより、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアの単純な１対１ラングミュア結合モデルを用いて計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。クローン８Ａ０６は、ヒト及びカニクイザル単量体ＧＩＴＲ−Ｆｃ融合体にそれぞれ４．４及び６７ｎＭの親和性で結合した。マウス単量体ＧＩＴＲ−Ｆｃ融合体に対して結合は検出されなかった。
【０６２２】
ｐＲＪＨ５２ライブラリーテンプレートλ−ＤＰ８８ライブラリーは、軽鎖についてＰｅｌＢリーダー配列＋Ｖｌ３＿１９ラムダＶ−ドメイン＋ＣＬ定常ドメインと、重鎖についてｐｅｌＢ＋ＶＨ１＿６９  Ｖ−ドメイン＋ＣＨ１定常ドメインとをタグを含んで含む完全なＦａｂコード領域に基づいている。表７５は、ＰＣＲに使用される一般的なファージディスプレイλ−ＤＰ８８ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ１＿６９）テンプレートの配列を示し、表７６は、λ−ＤＰ８８ライブラリーテンプレートの作製に使用したプライマー配列を示す。
2018535665.tif 000200
2018535665.tif 000201
2018535665.tif 000202
2018535665.tif 000203
【０６２３】
クローン８Ａ０６は、上記の手順によりヒトＧＩＴＲ特異的バインダーとして同定された。それらの可変領域のｃＤＮＡ配列を以下の表７７に示し、その対応するアミノ酸配列は表Ｃに見ることができる。更に、ベンチマーク抗体６Ｃ８（国際公開第２００６／１０５０２１号に従って調製）の可変領域のｃＤＮＡ配列を表７７に示す。
2018535665.tif 000204
【０６２４】
１１．３  抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体の調製、精製及び特徴づけ
選択された抗ＧＩＴＲバインダーの重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとフレーム内にサブクローニングした。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入されている。
【０６２５】
抗ＧＩＴＲクローンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を表７８に示す。抗ＧＩＴＲ抗体は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトされた。ＧＩＴＲ特異的抗体８Ａ０６の産生及び精製は、実施例１．３に記載したのと同様に行った。表７９は、ファージディスプレイによって選択されたクローン８Ａ０６の産生及び精製の結果をまとめたものである。
2018535665.tif 000205
2018535665.tif 000206
2018535665.tif 000207
2018535665.tif 000208
【０６２６】
１１．４  ＧＩＴＲクローン８Ａ０６の特徴づけ
１１．４．１  表面プラズモン共鳴（アビディティー＋親和性）
１１．４．１．１  クローン８Ａ０６及び６Ｃ８の種交差反応性及び親和性
ＧＩＴＲ特異的抗体（クローン８Ａ０６及び６Ｃ８）の組換えＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。同じ実験において、種選択性及びＧＩＴＲバインダー（ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換えＧＩＴＲ（ヒト、カニクイザル及びマウス）との間の相互作用のアビディティーを決定した。ビオチン化ヒト、カニクイザル及びマウスＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大１００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。
【０６２７】
抗ＧＩＴＲヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、０．２〜５００ｎＭ（４倍希釈）の濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルを通過させた。複合体の解離を１８０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめ、定性的にアビディティーを推定するために使用した（図４９Ａ−４９Ｄ）。
【０６２８】
同じ実験において、ＧＩＴＲ抗体（ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ）と組換えＧＩＴＲ（ヒト及びカニクイザル）との間の相互作用の親和性を決定した。抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約７０００ＲＵであった。ＧＩＴＲ抗体を５ｎＭで９０秒間捕捉した。組換えヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を２．７〜２０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１８０秒間フローセルを通過させた。解離を１８０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗原を固定化抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗体でなくＨＢＳ−ＥＰが注入された（図５０Ａ）。速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。抗ＧＩＴＲ  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧ１（クローン８Ａ０６）とＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用の親和性定数を、１：１ラングミュア結合に適合させることによって決定した（表８０）。
【０６２９】
クローン８Ａ０６及び６Ｃ８は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）に結合するが、マウスＧＩＴＲに対しては交差反応性ではない。
2018535665.tif 000209
【０６３０】
１１．４．１．２  リガンドブロッキング特性
ＧＩＴＲ特異的ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体８Ａ０６がＧＩＴＲ／ＧＩＴＲ−リガンド相互作用を妨害する能力を決定するために、我々はヒトＧＩＴＲリガンド（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【０６３１】
ヒトＧＩＴＲリガンドを、標準アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０で、ＣＭ５チップの２つのフローセルに約２０００ＲＵで直接連結させた。組換えヒトＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、第２のフローセル上で１００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を省略し、抗ＧＩＴＲヒトＩｇＧ１Ｐ３２９ＬＡＬＡを、両方のフローセル上で５００ｎＭの濃度で３０ｕＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を６０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、抗体を固定化ヒトＧＩＴＲリガンドを有する表面上に流したが、その上には組換えヒトＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）の代わりにＨＢＳ−ＳＰが注入された。
【０６３２】
ＧＩＴＲクローン８Ａ０６は、ヒトＧＩＴＲとそのＧＩＴＲリガンドとの複合体に結合した（図５１）。従って、この抗体は、ヒトＧＩＴＲへの結合についてリガンドと競合せず、従って、「非リガンドブロッキング」と呼ばれる。
2018535665.tif 000210
【０６３３】
１１．４．１．３  エピトープビニング
抗ＧＩＴＲ抗体によって認識されるエピトープは、表面プラズモン共鳴によって特徴づけられた。最初に、ヒトＧＩＴＲへの結合を競合する抗体の能力を表面プラズモン共鳴によって評価した。これらの実験の目的は、「エピトープビン（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎ）」を定義することであった。類似又は重複エピトープについて競合する抗体は、ＧＩＴＲに同時に結合することができず、「エピトープビン」に属する。ＧＩＴＲに同時に結合することができる抗ＧＩＴＲ抗体は、エピトープ又はその一部を共有しないので、異なるエピトープビンに分類される。
【０６３４】
抗ＧＩＴＲヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡのヒト又はマウス受容体に対する競合的結合を分析するために、標準的なアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ファージ由来抗ＧＩＴＲクローン８Ａ０６及びベンチマーク抗体６Ｃ８をそれぞれＣＭ５チップに約１０００ＲＵでｐＨ５．５で直接連結させた。組換えヒトＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、２００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で１８０秒間注入させた。解離を省略し、第２の抗ＧＩＴＲヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を２００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を９０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
【０６３５】
ＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
【０６３６】
競合結合実験は、２つの抗体がヒトＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）に同時に結合することができるので、抗ＧＩＴＲクローン８Ａ０６及び６Ｃ８は異なる空間エピトープに結合する
ことを示している（表８２、図５２Ｂ及び５２Ｃ）。
2018535665.tif 000211
【０６３７】
実施例１２
ＧＩＴＲ及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする二重特異性二価抗体の調製、精製及び特徴づけ
１２．１  ＧＩＴＲ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性四価構築物の生成（４＋１及び４＋２フォーマット）
ＧＩＴＲに対する四価結合及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性アゴニストＧＩＴＲ抗体（４＋１二重特異性抗原結合分子とも呼ばれる）は、図５３Ａに示すように調製された。
【０６３８】
構築物の１つの重鎖ＨＣ１は、以下の成分：抗ＧＩＴＲのＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、続いて抗ＦＡＰバインダー（クローン２８Ｈ１）のＣ末端ＶＬ又はＶＨそれぞれが融合されたＦｃホールで構成された。重鎖ＨＣ２は、抗ＧＩＴＲのＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、続いて抗ＦＡＰバインダーのＣ末端のＶＨ又はＶＬが融合したＦｃノブで構成された。
【０６３９】
実施例１１に記載したように、ＧＩＴＲに対するバインダーを生成した。ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６（Ａ２）号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０６４０】
両方の重鎖の組み合わせにより、ＦＡＰ結合部分及び４つのＧＩＴＲ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする。国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入された。重鎖融合タンパク質を抗ＧＩＴＲバインダーの軽鎖（ＣＬＶＬ）と同時発現させた。得られた二重特異性四価構築物のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、表８３に見出すことができる。
2018535665.tif 000212
2018535665.tif 000213
2018535665.tif 000214
2018535665.tif 000215
2018535665.tif 000216
2018535665.tif 000217
2018535665.tif 000218
2018535665.tif 000219
【０６４１】
ＧＩＴＲに対して四価結合を有し、ＦＡＰに対して二価結合を有する二重特異性アゴニストＧＩＴＲ抗体（４＋２構築物）も調製した。誤って対形成された軽鎖の形成を減少させるために、国際特許出願第ＷＯ２０１０／１４５７９２（Ａ１）号によるクロスマブ（ｃｒｏｓｓｍａｂ）技術が適用された。この実施例では、ＦＡＰバインダー２８Ｈ１の交差Ｆａｂ単位（ＶＨＣＬ）を両方の重鎖のＦｃ部分のＣ末端に融合させた。ＧＩＴＲに対する２つのＦａｂを、実施例４．２に記載したように各重鎖のＮ末端に融合させた。この場合、両方の重鎖が同じドメインを含むので、ノブ・イントゥー・ホールの導入は必要ではなかった。
【０６４２】
国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異が重鎖の定常領域に導入された。得られた二重特異性四価構築物を図５３Ｂに示す。表８４は、成熟二重特異性四価抗ＯＸ４０／抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
2018535665.tif 000220
2018535665.tif 000221
2018535665.tif 000222
2018535665.tif 000223
2018535665.tif 000224
【０６４３】
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過性に発現された。発現ベクターはまた、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス・核抗原）におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域を含む。二重特異性抗ＧＩＴＲ／抗ＦＡＰ構築物は、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１：１の比（「ベクター重鎖１」：「ベクター重鎖２」：「ベクター軽鎖」又は「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）でトランスフェクトした。
【０６４４】
産生及び精製は、Ｏｘ４０二重特異性分子の産生のためにセクション４．５で使用されたプロトコールに従って行った。
2018535665.tif 000225
【０６４５】
１２．２  二重特異性ＧＩＴＲ／ＦＡＰ構築物の同時結合
ヒトＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰを同時に結合させる能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。ビオチン化カニクイザルＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接結合させた。最大１０００の共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。ＧＩＴＲ及びＦＡＰを標的とする二重特異性構築物を、２００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速でフローセルに９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＦＡＰを、５００ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルを通して３０μＬ／分の流速で第２分析物として注入した。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
【０６４６】
全ての二重特異性構築物は、ヒトＧＩＴＲ及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた（図５４Ｂ及び５４Ｃ）。
【０６４７】
１２．３  ＧＩＴＲ発現ＨＥＫ細胞及びＦＡＰ発現３Ｔ３細胞への結合
細胞表面ＧＩＴＲへの結合を、４−１ＢＢについて実施例９．６．２に記載したのと同様の方法で、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ−ＧＩＴＲ）を用いてヒトＧＩＴＲタンパク質を過剰発現するように操作されたヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ）細胞を用いて試験した。ＨＥＫ−ＧＩＴＲ細胞又はコントロールとしての親ＧＩＴＲ陰性ＨＥＫ細胞（ＨＥＫ  ＷＴ）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０−０７１）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３５０５０−０６１）を補充し、ＨＥＫ−ＧＩＴＲ細胞のみについて１μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４２４３０−０２５）中で増殖させた。ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を発現するようにトランスフェクトされた３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）を用いて、細胞表面ＦＡＰへの結合を試験した（実施例９．６．３．２を参照）。親３Ｔ３細胞を、１０％ＣＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ８０５６）を補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞を、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含むＤＭＥＭ＋１０％ＣＳ中で増殖させた。
【０６４８】
細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２００１２−０１９）で洗浄し、ＰＢＳ中で１×１０７細胞／ｍＬの細胞密度に調整した。コントロール細胞（ＨＥＫ  ＷＴ及び３Ｔ３  ＷＴ）をＰＢＳ中２．５μＭの細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ  ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）で３７℃で７分間標識した。細胞を完全培地で２回、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中で細胞密度を１×１０７細胞／ｍＬに調整した。丸底９６ウェルプレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）のウェルあたり２×１０５個の細胞（１０５個のＨＥＫ  ＷＴ＋１０５個のＨＥＫ  ＧＩＴＲ又は１０５個の３Ｔ３  ＷＴ＋１０５個の３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ）を播種した。
【０６４９】
プレートを４℃で６００×ｇで３分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物を含む４℃の冷ＰＢＳ＋２％ＦＢＳの５０μＬ／ウェル中で、４℃で１２０分間再懸濁した。プレートを２００μＬ／ウェルの４℃のＰＢＳ＋２％のＦＢＳで２回洗浄して結合していない構築物を除去した。細胞をＰＢＳ中でＺｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）及び二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）で４℃で３０分間染色した。プレートを４℃で６００×ｇで３分間遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。細胞をＰＢＳ＋２％ホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号０４０１８）で室温で２０分間固定した。プレートを４℃で６００×ｇで３分間遠心分離し、上清を払い落とした。細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−４２２２−２６）で洗浄し、最終的に、４レーザーＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて翌日採取するために１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
【０６５０】
図５５Ａに示すように、試験した全ての二重特異性抗ＧＩＴＲ構築物は、ヒトＧＩＴＲ発現標的細胞に効率的に結合したが、ＧＩＴＲ陰性コントロール細胞には全く結合しなかったか又は無視できる割合での結合であった（図５５Ｂ）。従って、抗ＧＩＴＲ抗体は、二重特異性のＦＡＰ標的フォーマットとして発現される場合にも、そのＧＩＴＲ特異性を維持する。
2018535665.tif 000226
【０６５１】
図５６Ａに示すように、試験した全ての二重特異性抗ＧＩＴＲ構築物は、ヒトＦＡＰ発現標的細胞に効率的に結合したが、親の３Ｔ３細胞には全く結合しなかったか又は無視できる割合での結合であった（陰性コントロール、図５６Ｂ）。従って、二重特異性抗ＧＩＴＲ／抗ＧＩＴＲ抗体は、二重特異性フォーマットにおけるそれらのＦＡＰ特異性を維持する。
【０６５２】
実施例１３
二重特異性抗ヒトＧＩＴＲ結合分子の機能特性
１３．１  最適以下のＴＣＲ刺激の存在下でのヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のＧＩＴＲ媒介共刺激
ＧＩＴＲのライゲーションは、最適以下のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後にＴ細胞の分裂及び生存を促進する相乗的な共刺激シグナルを提供する（Clouthier et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2014 Apr;25(2):91-106）。
【０６５３】
二重特異性抗ヒトＧＩＴＲ結合分子のアゴニスト特性を分析するために、ＦＡＰ標的化一価フォーマット又はコントロールとしての対応する非標的化バージョンの選択されたバインダー（クローン８Ａ０６）を、表面固定化でＴ細胞を共活性化する能力について試験した。このために、休止ｅｆ４５０標識ヒトＰＢＭＣを、照射ＦＡＰ＋ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞及び滴定した抗ＧＩＴＲ構築物の存在下で、最適以下の濃度の抗ＣＤ３抗体で６日間刺激した。Ｔ細胞増殖に対する影響を、フローサイトメトリーにより生存細胞における総細胞数及びｅｆ４５０希釈のモニタリングによって分析した。
【０６５４】
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容量のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２００１２−０１９）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号０７８５１）を供給し、バフィコート溶液をそのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐの上に重ねた。試験管を４００×ｇ、室温で、加速無し、ブレーキ無しで３０分間遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６１４０−０７１）、１％（ｖ／ｖ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）を供給されたＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号７２４００−０２１）を予め補充したＲＰＭＩ １６４０培地からなるＴ細胞培地に再懸濁した。ＰＢＭＣは単離直後に使用された。
【０６５５】
ＰＢＭＣを、ＰＢＳ中で３７℃で８分間希釈した最終濃度２．５μＭのｅｆ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４２−８５）を用いて、１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で、ｅｆ４５０により標識した。その後、細胞をＴ細胞培地で２回洗浄した。標識された細胞を、３７℃で３０分間Ｔ細胞培地中で休ませた。
【０６５６】
マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞（実施例４．３．２．２を参照）を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を用いて３７℃で１０分間収集した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した。細胞をＰＢＳ中１０７／ｍｌで再懸濁させ、腫瘍細胞株によるヒトＰＢＭＣの後の過剰増殖を防ぐために、ｘＲａｙ照射器中で５０００ｒａｄの線量で照射された。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中で３７℃及び５％ＣＯ２下で一晩、無菌９６ウェル平底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９６）中のＴ細胞培地中に０．２５×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。
【０６５７】
１６時間後、ヒトｅｆ４５０標識ＰＢＭＣをウェルあたり０．７５×１０５細胞の密度で各ウェルに添加した。０．１２ｎｇ／ｍｌの最終濃度の抗ヒトＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＯＫＴ３、Ｒｅｆ：１６−００３７−８５）及びＦＡＰ標的化一価及び二価抗ＧＩＴＲ抗原結合分子を指示濃度で添加した。細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２で６日間培養した。次いで、細胞を蛍光色素結合抗体の抗ヒトＣＤ４（クローンＬ２００、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５０６３１）、ＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４）、ＣＤ２５（ＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２６３２）及び生／死の識別用のＺｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）で表面染色し、ＰＢＳで希釈し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、１４０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液＋１０μＬ／ウェルの絶対数のビーズ（ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃ３６９５０）に再懸濁し、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて取得した。
【０６５８】
Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ陰性生細胞を、増殖のマーカーとしてｅｆ４５０の蛍光の中央値の減少について分析した。
【０６５９】
図５７Ａ及び図５７Ｂに示すように、非標的化抗ＧＩＴＲ（ＧＩＴＲ  ８Ａ０６  ＤＰ４７ＧＳ  ４＋１  ｓｆ  ｗ（１ａ））（三角形）を用いた共刺激は、最適以下にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の増殖能に影響を及ぼさなかった。このＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞によるＦＡＰ標的化抗ＧＩＴＲ構築物（ＧＩＴＲ  ８Ａ０６  ２８Ｈ１  ４＋１  ｓｆ  Ｗ（１））（丸）の過架橋は、Ｔ細胞共刺激に必要であり、明らかに増殖を促進した。
【図１】
2018535665.tif 000227
【図２】
2018535665.tif 000228
【図３】
2018535665.tif 000229
【図４】
2018535665.tif 000230
【図５】
2018535665.tif 000231
【図６】
2018535665.tif 000232
【図７】
2018535665.tif 000233
【図８】
2018535665.tif 000234
【図９】
2018535665.tif 000235
【図１０】
2018535665.tif 000236
【図１１】
2018535665.tif 000237
【図１２】
2018535665.tif 000238
【図１３Ａ−１３Ｄ】
2018535665.tif 000239
【図１３Ｅ−１３Ｈ】
2018535665.tif 000240
【図１４Ａ−１４Ｄ】
2018535665.tif 000241
【図１４Ｅ−１４Ｈ】
2018535665.tif 000242
【図１５】
2018535665.tif 000243
【図１６】
2018535665.tif 000244
【図１７】
2018535665.tif 000245
【図１８】
2018535665.tif 000246
【図１９】
2018535665.tif 000247
【図２０】
2018535665.tif 000248
【図２１】
2018535665.tif 000249
【図２２Ａ−２２Ｃ】
2018535665.tif 000250
【図２２Ｄ−２２Ｅ】
2018535665.tif 000251
【図２３】
2018535665.tif 000252
【図２４】
2018535665.tif 000253
【図２５Ａ−２５Ｃ】
2018535665.tif 000254
【図２５Ｄ−２５Ｆ】
2018535665.tif 000255
【図２６】
2018535665.tif 000256
【図２７Ａ−２７Ｄ】
2018535665.tif 000257
【図２７Ｅ−２７Ｈ】
2018535665.tif 000258
【図２８】
2018535665.tif 000259
【図２９】
2018535665.tif 000260
【図３０】
2018535665.tif 000261
【図３１】
2018535665.tif 000262
【図３２】
2018535665.tif 000263
【図３３】
2018535665.tif 000264
【図３４】
2018535665.tif 000265
【図３５】
2018535665.tif 000266
【図３６】
2018535665.tif 000267
【図３７】
2018535665.tif 000268
【図３８】
2018535665.tif 000269
【図３９】
2018535665.tif 000270
【図４０Ａ−４０Ｄ】
2018535665.tif 000271
【図４０Ｅ−４０Ｆ】
2018535665.tif 000272
【図４１Ａ−４１Ｂ】
2018535665.tif 000273
【図４１Ｃ−４１Ｄ】
2018535665.tif 000274
【図４２】
2018535665.tif 000275
【図４３】
2018535665.tif 000276
【図４４】
2018535665.tif 000277
【図４５】
2018535665.tif 000278
【図４６】
2018535665.tif 000279
【図４７Ａ−４７Ｃ】
2018535665.tif 000280
【図４７Ｄ−４７Ｆ】
2018535665.tif 000281
【図４７Ｇ−４７Ｉ】
2018535665.tif 000282
【図４８】
2018535665.tif 000283
【図４９】
2018535665.tif 000284
【図５０】
2018535665.tif 000285
【図５１】
2018535665.tif 000286
【図５２】
2018535665.tif 000287
【図５３】
2018535665.tif 000288
【図５４】
2018535665.tif 000289
【図５５】
2018535665.tif 000290
【図５６】
2018535665.tif 000291
【図５７】
2018535665.tif 000292
【配列表】
2018535665000001.app
【国際調査報告】
2018535665.tif 000293
2018535665.tif 000294
2018535665.tif 000295
2018535665.tif 000296
2018535665.tif 000297
2018535665.tif 000298
2018535665.tif 000299