(57)【要約】  本発明は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体、及び抗ＴｒｋＡ抗体を用いた治療方法を含む、ＴｒｋＡ受容体に対する抗体とその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴｒｋＡに結合するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片であって、重鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３と軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３とを含み、前記重鎖可変ドメインが、配列番号：１〜５からなる群から選択される配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号：６〜１３からなる群から選択される配列を含み、
前記重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域が、３７、４２、及び８９からなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、骨関連疼痛の治療のためにＫａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示されている、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片。
【請求項２】
前記骨関連疼痛が、骨損傷又は骨に影響を及ぼす病理から生じる疼痛を含む群から選択される、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片。
【請求項３】
前記骨関連疼痛が、骨折（fracture）、剥離、骨折（break）及び／又は炎症に起因する、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片。
【請求項４】
前記骨関連疼痛が、事故又は過剰使用もしくは反復運動傷害に起因する、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片。
【請求項５】
前記骨関連疼痛が、ホルモン欠乏、感染、骨がん又は骨への血液供給の中断により弱くなった骨に起因する、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片。
【請求項６】
前記骨関連疼痛が、骨がん、特に二次骨がん及び／又は転移性がん細胞に起因する、請求項１に記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において使用されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片と薬学的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項８】
治療剤に連結された、請求項１に記載の方法において使用されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を含むイムノコンジュゲート。
【請求項９】
他の薬学的に活性な薬剤を更に含有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
他の薬学的に活性な薬剤を更に含有し、該他の薬学的に活性な薬剤が、
ａ）鎮痛剤
ｂ）他の抗ＴｒｋＡ抗体
ｃ）ＮＧＦ
ｄ）抗がん剤
ｅ）抗ＮＧＦ抗体
の一又は複数である、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を含むＴｒｋＡ受容体に対する抗体とその使用及び抗ＴｒｋＡ抗体を用いた治療方法に関する。一態様では、本発明は、神経腫及び／又は骨関連疼痛を治療する方法に使用するための増強された阻害特性を有するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体に関する。
【０００２】
更なる態様では、本発明は、変化した交換特性を示す重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む、増強された阻害特性を有するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ニューロトロフィンは、ファミリーＮＧＦの最初のメンバー（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ Ｒ（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６（５）：１１４５〜５４）と構造的に関係したペプチド成長因子のファミリーである（Ｂａｒｄｅ ＹＡ（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２５（１１）：１３２９〜３３）。ニューロトロフィンは、ニューロンの分化及び生存、並びに末梢ニューロン及び中枢神経系双方のシナプス伝達を調節する。更にＮＧＦは、免疫細胞などの様々な非神経組織及び細胞に作用する。ＮＧＦは、標的細胞に存在する２種の膜受容体、すなわち低親和性ｐ７５受容体及びチロシンキナーゼ活性を有する１４０ｋＤａの高親和性膜貫通糖タンパク質ＴｒｋＡ（Ｋａｐｌａｎ ＤＲ等，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２（５００５）：５５４〜８；Ｋｌｅｉｎ Ｒ等，（１９９１）Ｃｅｌｌ ６５（１）：１８９〜９７）を介して作用する。ＴｒｋＡは、前脳基底部及び線条体のコリン作動性ニューロン、神経提ニューロン、交感神経ニューロンにおいて発現され、ＮＧＦ活性の重要な媒介物質となっている（Ｈｏｌｔｚｍａｎ ＤＭ等，（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ ９（３）：４６５〜７８；Ｖｅｒｇｅ ＶＭ等，（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２（１０）：４０１１〜２２）。ＴｒｋＡは、Ｂリンパ球を含む幾つかの非神経組織及び細胞にも発現される（Ｔｏｒｃｉａ Ｍ等，（１９９６）Ｃｅｌｌ ８５（３）：３４５〜５６）。
【０００４】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、元々は、発生途中の神経系において知覚神経及び交感神経ニューロンの生存因子として同定された（Ｇｏｒｉｎ ＰＤ及びＪｏｈｎｓｏｎ ＥＭ（１９７９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，７６（１０）：５３８２〜６）。成人において、ＮＧＦは生存に必要とされないが、幾つかの急性及び慢性疼痛状態での疼痛及び痛覚過敏の発生において重要な役割を有している。ＮＧＦの発現は、傷害組織及び炎症組織では高く、侵害受容ニューロン上でのｔｒｋＡの活性化が、複数のメカニズムによって疼痛シグナル伝達をトリガーし強める。炎症関連疼痛は、動物モデルにおいてＮＧＦ生物活性を中和することによって有意に緩和することができ（Ｗｏｏｌｆ ＣＪ等，（１９９４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６２（２）：３２７〜３１；ＭｃＭａｈｏｎ ＳＢ等，（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１（８）：７７４〜８０；Ｋｏｌｔｚｅｎｂｕｒｇ Ｍ等，（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１（５）：１６９８〜７０４）、これは、このニューロトロフィンのレベル増大が完全痛覚過敏応答を発生するために必要であることを意味している。驚くことに、他のニューロトロフィンの阻害は、誘発された痛覚過敏の拮抗を生じず、この作用がＮＧＦに特異的であることを示唆しており（ＭｃＭａｈｏｎ ＳＢ等，（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１（８）：７７４〜８０）；加えて、ＮＧＦ阻害は、異なった神経障害関連疼痛プロトコルで鎮痛をもたらす（Ｋｏｌｔｚｅｎｂｕｒｇ Ｍ等，（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１（５）：１６９８〜７０４；Ｒｏ ＬＳ等，（１９９９）Ｐａｉｎ ７９（２〜３）：２６５〜７４；Ｔｈｅｏｄｏｓｉｏｕ Ｍ等，（１９９９）Ｐａｉｎ，８１（３）：２４５〜５５；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＭＤ及びＨｕｌｓｅｂｏｓｃｈ ＣＥ（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４７（２）：４６３〜７５）。
【０００５】
疼痛の治療には、大きな未だ対処されていない医学的必要性がある。優位なクラスの鎮痛薬である非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）及びオピエートは、それらの効力及び忍容性に制限がある（Ｈｅｆｔｉ ＦＦ等，（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２７（２）：８５〜９１）。現在の治療法で十分な緩和を得るのは、慢性疼痛を有する患者の３０％未満であり、特に長期投与では多くの有害作用がある（Ｋａｌｓｏ Ｅ等，（２００４）Ｐａｉｎ １１２（３）：３７２〜８０）。成人においてＮＧＦが疼痛メカニズムにおいて中心的な役割を有するという認識は、全く新規なクラスの疼痛治療法を開発する機会を提供する。
【０００６】
ＮＧＦの代わりにＴｒｋＡをターゲティングすることは、この受容体が、ニューロン発生において広い機能を有するｐ７５受容体によって媒介されるＮＧＦ機能を妨害しないので、より良い治療選択になりうる。
【０００７】
本発明者等は、深部体性疼痛、特に骨に関連する疼痛、例えば外傷からの骨の損傷から、又は骨損傷、不適切な神経支配及び／又は骨関連疼痛を生じる他の影響に至りうるがんのような骨に影響を及ぼす病態の結果として生じる疼痛を治療する方法においてヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を使用する効力及び安全性を評価した。本発明者等はまた外傷又は別の病態の結果として不適切に形成された神経腫に起因する疼痛を治療する方法においてヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を使用する効力及び安全性を評価した。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は一般にヒト化抗ＴｒｋＡ抗体、それらの調製方法及び使用に関する。
一態様では、本開示は、
ａ）配列番号：１〜５からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメインと、
ｂ）配列番号：６〜１３からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメインと
を含むヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片であって、
重鎖可変ドメインのＣＤＲ２が、少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、及び／又は重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域が、３７、４２及び８９からなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を提供する。
更なる態様では、本開示は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片をコードする単離核酸、単離核酸を含むベクター、及び単離核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本開示によってまた提供されるのは、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を生産する方法である。
【０００９】
更なる態様では、本開示は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を含む組成物と、治療剤に連結されたヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を含むイムノコンジュゲートを提供する。
特に、本発明は、ヒトＴｒｋＡに結合するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片に関し、ここで、前記抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は重鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３と軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３を含み、重鎖可変ドメインは配列番号：１〜５からなる群より選択される配列を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号：６〜１３からなる群から選択される配列を含み、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域が、３７、４２、及び８９からなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置が骨関連疼痛の治療のためにＫａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示されている。
【００１０】
更なる態様では、本開示は、医薬に使用するため、疼痛の治療に使用するため、慢性疼痛の治療に使用するため、急性疼痛の治療に使用するため、膵炎、腎結石、子宮内膜症、ＩＢＤ、クローン病、術後癒着、胆嚢結石、頭痛、月経困難症、筋骨格痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢腫、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、術後疼痛、片頭痛、三叉神経痛、熱傷及び／又は創傷由来の疼痛、外傷に関連する疼痛、神経障害性疼痛、筋骨格疾患に関連する疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、関節周囲の病状、腫瘍性疼痛、骨転移からの疼痛、ＨＩＶ感染の一又は複数に関連する疼痛の治療に使用するため、がん、ニューロン障害、アルツハイマー病、糖尿病、糖尿病性腎症、ウイルス障害、ＨＩＶ媒介障害、ハンセン病、又は炎症性疾患の治療に使用するため、並びに診断又は予後に使用するためのヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片、組成物又はイムノコンジュゲートを提供する。
【００１１】
更なる態様では、本開示は、本発明に係るヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片の有効量を、必要とする個体に投与する工程を少なくとも含む、深部体性疼痛、特に骨に関連する疼痛を治療する方法に関する。
本発明によれば、骨関連疼痛とは、個体の一又は複数の骨に関連する傷害、変質又は任意の病理の結果として経験される任意の疼痛感覚を指すものである。
疼痛は、しびれ感、ビリビリ感、蟻走感、熱感又は冷感、絞扼感、鈍痛、例えば圧迫感や緊張感、重圧感、又はビリビリ感、鋭痛、例えば刺痛、電撃痛、引き裂くような痛み、ズキズキする痛みとして生じ得、疼痛は絶えず続くか、規則的又は不規則な時間間隔で拍動性又は断続的であり、又は部位が触れられたときのみ生じうる。
より具体的には、骨関連疼痛は、骨折（fracture）、剥離、骨折（break）又は任意の他の傷害もしくは炎症の結果でありうる。これは、事故のためあるいは過剰使用（オーバーユース）又は反復運動による損傷の結果としてであり得、あるいはホルモン欠乏症、感染症、骨がん、転移性悪性腫瘍、白血病、骨髄腫又は血液もしくは骨に関連する細胞に影響を及ぼす他のがんのためか又は骨への血液供給の中断のために弱くなった骨により生じうる。
【００１２】
本発明によれば、骨関連疼痛は、骨に影響を及ぼす病理の結果でありうる。骨に影響を及ぼす病理とは、個体の一又は複数の骨を直接的又は間接的に冒し、疼痛の感覚を生じさせる任意の病理を意味する。病理の例には、がん、感染症及び免疫系の機能不全が含まれる。
特に、骨関連疼痛は、骨がん、特に二次骨がん及び／又は転移性がん細胞と関連しているか、又はその結果である場合がある。
あるいは、骨関連疼痛は、特に骨がん又は任意の他の病理に起因する、一又は複数の神経腫の結果でありうる。
特に、本方法は、異常な神経発芽及び／又は神経腫形成又はサイズを最小にするか又は減少させるように、有効量の本発明に係るヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を投与することを含む。
【００１３】
本発明によれば、有効量のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片とは、医師又は他の有資格の医療専門家によって個体に投与される場合、それを必要とする個体において一又は複数の疼痛感覚の緩和又は休止に至るのに十分な量を意味するものである。
更なる態様では、本開示は、深部体性疼痛、特に骨関連疼痛又は神経腫関連疼痛の治療に使用するための、本発明のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片に関する。より具体的には、骨関連疼痛は、骨折（fracture）、剥離、骨折（break）又は任意の他の傷害もしくは炎症の結果でありうる。これは、事故のためあるいは過剰使用又は反復運動による損傷の結果としてであり得、あるいはホルモン欠乏症、感染症、骨がん、転移性悪性腫瘍、白血病、骨髄腫又は血液もしくは骨に関連する細胞に影響を及ぼす他のがんのためか又は骨への血液供給の中断のために弱くなった骨により生じうる。
【００１４】
本発明によれば、骨関連疼痛は、骨に影響を及ぼす病理の結果でありうる。骨に影響を及ぼす病理とは、個体の一又は複数の骨を直接的又は間接的に冒し、疼痛の感覚を生じさせる任意の病理を意味する。病理の例には、がん、感染症及び免疫系の機能不全が含まれる。
特に、骨関連疼痛は、骨がん、特に二次骨がん及び／又は転移性がん細胞と関連しているか、又はその結果である場合がある。
あるいは、骨関連疼痛は、特に骨がん又は任意の他の病理に起因する、一又は複数の神経腫の結果でありうる。
特に、本発明は、異常な神経発芽及び／又は神経腫の形成又はサイズを最小にするか又は減少させる治療において使用するための、本発明に係るヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片に関する。
【００１５】
更なる態様では、本開示は、炎症性疼痛、変形性関節症疼痛及び神経障害性疼痛を治療するための方法を提供する。一態様では、急性炎症性痛覚過敏のインビボモデルにおいて、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で急性炎症性痛覚過敏の有意な回復をもたらした。別の態様では、慢性炎症性痛覚過敏のインビボモデルにおいて、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で慢性炎症性痛覚過敏の有意かつ持続的な回復をもたらした。別の態様では、慢性変形性関節症痛覚過敏のインビボモデルにおいて、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で慢性変形性関節症痛覚過敏の有意かつ持続的な回復をもたらした。更なる態様では、神経障害性疼痛のインビボ慢性絞扼損傷モデルにおいて、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、１．０ｍｇ／ｋｇの用量で神経障害性疼痛の有意な回復をもたらした。
【００１６】
更なる態様では、本開示は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片、組成物又はイムノコンジュゲートを含む製造品を提供する。
更なる態様では、本開示は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片、組成物又はイムノコンジュゲートを含むキットを提供する。
特定の問題はまた抗体を含む安定で有効な薬学的製剤の生成に関係し、タンパク質が伝統的な有機及び無機薬物よりも大きく複雑であるという事実から生じる。タンパク質が生物学的に活性なままであるためには、製剤はタンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列の構造的完全性を損なわずに保持しなければならず、同時にタンパク質の複数の官能基を分解から保護しなければならない。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（すなわち、新しい化学物質をもたらす結合形成又は切断によるタンパク質の修飾を含む任意のプロセス）又は物理的不安定性（すなわち、タンパク質の高次構造の変化）を含みうる。化学的不安定性は、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、ベータ脱離又はジスルフィド交換から生じうる。物理的不安定性は、変性、凝集、沈殿又は吸着から生じうる。
【００１７】
本発明の更なる態様によれば、治療的有効量の抗ＴｒｋＡ抗体、緩衝剤、界面活性剤及び等張化剤を含む安定な水性薬学的製剤が提供され、該製剤のｐＨは約５から約７である。
本発明のこの態様によれば、抗ＴｒｋＡ抗体は、
ａ）配列番号：１〜５からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメインと、
ｂ）配列番号：６〜１３からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメインと
を含み、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２が少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、及び／又は重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域が、３７、４２及び８９からなる群より選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ＥＡ等（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版−米国保健社会福祉省，ＮＩＨ公開番号９１−３２４２）に記載の番号付けシステムを利用して示される。
【００１８】
本発明のこの態様によれば、抗ＴｒｋＡ抗体は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
本発明のこの態様によれば、抗ＴｒｋＡ抗体は、少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌ〜１７５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
本発明のこの態様によれば、抗ＴｒｋＡ抗体は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
本発明のこの態様によれば、抗ＴｒｋＡ抗体は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
本発明のこの態様によれば、抗ＴｒｋＡ抗体は、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
本発明のこの態様によれば、抗ＴｒｋＡ抗体は、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００１９】
本発明のこの態様によれば、緩衝剤は、クエン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を含む群から選択される。
本発明のこの態様によれば、安定化／等張化剤は、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、スクロース、ポリオール、糖類、アミノ酸、例えばヒスチジン、アルギニン、及びグリシン、メチオニン、プロリン、リジン、グルタミン酸、アミン及びトレハロースを含む群から選択される。
本発明のこの態様によれば、界面活性剤は、ツイーン２０／４０／８０、ポリソルベート２０／８０、ポロキサマー、ラウリル硫酸ナトリウムを含む群から選択される。
本発明のこの態様によれば、製剤のｐＨは５．７５である。
本発明のこの態様によれば、製剤のｐＨは６．０である。
本発明のこの態様によれば、製剤は、一又は複数種の賦形剤と増量剤を更に含みうる。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様によれば、
１０ｍｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＡ抗体；
２５ｍＭのクエン酸塩；
１５０ｍＭのＮａＣｌ；
０．０５％のツイーン８０
を含む、ｐＨ６．０に調整された抗ＴｒｋＡ抗体の低濃度水性製剤が提供される。
本発明の好ましい実施態様によれば、
少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＡ抗体；
５０ｍＭのヒスチジン；
１５０ｍＭのＮａＣｌ；
０．０５％のツイーン８０
を含む、ｐＨ６．０に調整された抗ＴｒｋＡ抗体の低濃度水性製剤が提供される。
本発明の好ましい実施態様によれば、
１００ｍｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＡ抗体；
５０ｍＭのヒスチジン；
１５０ｍＭのＮａＣｌ；
０．０５％のツイーン８０
を含む、ｐＨ５．７５又は６．０に調整された抗ＴｒｋＡ抗体の高濃度水性製剤が提供される。
本発明の好ましい実施態様によれば、
１５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＡ抗体；
５０ｍＭのヒスチジン；
１５０ｍＭのＮａＣｌ；
０．０５％のツイーン８０
を含む、ｐＨ５．７５又は６．０に調整された抗ＴｒｋＡ抗体の高濃度水性製剤が提供される。
【００２１】
本発明者等は、これらの製剤を開発している間に、一般にタンパク質、特に抗体を含む水性液体製剤に付随する問題を克服してきた。この研究プログラムの過程中に試みられた幾つかの代替製剤は、５℃、２５℃又は４０℃での長期安定性を欠いており、特に、上に列挙された成分の特定の組み合わせを含まない代替製剤の幾つかでは抗体が分解を受け、明白な不安定性にさらされた。
また、この皮下投与製剤の開発は、各投薬で投与される抗ＴｒｋＡ抗体の量とまた可能な投薬回数の両方の観点で、可能な投薬量を増加させた。更に、予備データは、本発明に係る皮下投与製剤が、以前に試験された方法及び製剤による抗ＴｒｋＡ抗体のより効果的な投与方法であることをまた示している。
【００２２】
本発明の更なる態様によれば、製剤は、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．１ｍｇの用量；特に少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇで、必要な人に投与される。
本発明の更なる態様によれば、製剤は必要な患者に一回投与される。
本発明の更なる態様によれば、製剤は、投薬間が少なくとも１時間、好ましくは投薬間が４時間／６時間／１２時間／２４時間の間隔で、必要とする患者に投与される。
本発明の更なる態様によれば、製剤は、要望に応じて必要な患者に投与される。
【００２３】
本発明の更なる態様によれば、製剤は、少なくとも１年間、好ましくは少なくとも２年間、５℃で安定である。
本発明の更なる態様によれば、製剤は、少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間、最も好ましくは１年間、２５℃で安定である。
本発明の更なる態様によれば、製剤は４０℃で少なくとも１ヶ月間、好ましくは３ヶ月間、安定である。
ここで、安定性は、製剤の透明度、着色度、乳白光度及び微粒子汚染（可視粒子）の変化の決定、製剤中に存在するタンパク質の濃度を決定する波長２８０ｎｍの光吸収の測定；抗体の重量及び又は分解の変化を決定するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル可視化；抗体の結合特性の変化を決定するＥＬＩＳＡ；製剤中の正／負抗体種構成の変化を決定するＨＰＬＣ−ＣＥＸ；製剤中に存在するキャピラリー電気泳動による抗体の等電点プロファイルの変化を決定するＨＰＬＣ−ＩＥＦ、製剤中の抗体の変化を決定するＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析を含む群から選択される一又は複数の方法で測定される。
【００２４】
本発明の更なる態様によれば、製剤は、製剤が体重１ｋｇ当たり少なくとも０．１ｍｇの用量で、特に少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇで、必要な人に投与されうるような抗ＴｒｋＡ抗体の量を含む。
本発明の別の態様によれば、治療有効量の抗ＴｒｋＡ抗体を含む本発明に係る製剤を投与することによって疼痛の個体を治療する方法もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】抗ＴｒｋＡ抗体の表面プラズモン共鳴測定。データは、応答数（略語ＲＵ；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）として表される。（図１Ａ）ＭＮＡＣ１３抗体。
【図１Ｂ】ＢＸｈＶＨ５ＶＬｌ抗体。
【図１Ｃ】ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体。
【図１Ｄ】ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体。
【図２Ａ】示差走査熱量測定を使用する抗ＴｒｋＡ抗体の熱安定性測定。データは、過剰モル熱容量（略語Ｃｐ［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃］；Ｙ軸）対温度（Ｘ軸）として表わされる。（図２Ａ）ＭＮＡＣ１３抗体（ＦＡＢ断片のＴｍは７４℃のＴｍ１）。
【図２Ｂ】ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１抗体（ＦＡＢ断片のＴｍは７６．５℃のＴｍ３）。
【図２Ｃ】ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体（ＦＡＢ断片のＴｍは７３．６℃のＴｍ１）。
【図２Ｄ】ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体（ＦＡＢ断片のＴｍは７３℃のＴｍ１）。
【図２Ｅ】図２Ｃと図２Ｄの重ね合わせ。
【図２Ｆ】図２Ｂと図２Ｄの重ね合わせ。
【図２Ｇ】図２Ａと図２Ｄの重ね合わせ。
【図３Ａ】抗ＴｒｋＡ抗体の機能的生理活性。ＮＧＦ誘導型ＴＦ−１細胞増殖に対するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の作用；データは、増殖応答％（Ｙ軸）対抗体濃度（μｇ／ｍｌ；Ｘ軸）として表わされる。（図３Ａ）ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１対ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１。
【図３Ｂ】ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１対ＭＮＡＣ１３。
【図３Ｃ】ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１対ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ。
【図３Ｄ】ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ３、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１対ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ３。
【図３Ｅ】ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ１、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１対ＧＢＲ ＶＨ３（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１。
【図４】ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は急性炎症性足痛を回復させる。足の急性炎症性痛覚過敏を、ＡＭＢ１マウスの後肢の足の片方にＣＦＡを足底内注射することによって誘発し、同側の（注射した）足への荷重負荷と対側の（注射していない）足への荷重負荷との間の％比として測定した。（％同側／対側、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．）。荷重負荷の読み取りは、ＣＦＡ注射の２３時間後（０時間）に行い、その後、ＣＦＡの２４時間後に０．０００１（白棒線）、０．００１（横線網かけ棒線）、０．０１（市松模様）、及び０．１ｍｇ／ｋｇ（斜線網かけ棒線）の抗ＴｒｋＡ抗体又は０．１ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（黒棒線）を単回ｉ．ｐ．注射して処置を開始し、続いて投与の４、８、２４、４８、７２、９６、及び１２０時間後に荷重負荷を測定した。陽性対照として、マウスを１０ｍｇ／ｋｇインドメタシンでｐ．ｏ処置した（縦線網かけ棒線）。
【図５】ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は慢性炎症性関節痛を回復させる。関節の慢性炎症性痛覚過敏を、ＡＭＢ１マウスの後肢膝関節の片方にＣＦＡを関節内注射することによって誘発させ、同側の（注射した）肢への荷重負荷と対側の（注射していない）肢への荷重負荷との間の％比として測定した（％同側／対側、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．）。荷重負荷の読み取りは、ＣＦＡ注射の直前（未処置）並びにＣＦＡの３、７及び１０日後に行い、その後ＣＦＡの１３日後に０．０１（白丸、点線）、１（黒三角）、及び１０ｍｇ／ｋｇ（白丸）の抗ＴｒｋＡ抗体又は１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（黒丸）を単回ｉ．ｐ．注射して処置を開始し、続いて投与の４、８、２４、４８、７２及び９６時間後に荷重負荷を測定した（カッコ内）。陽性対照として、１３日目からマウスを６０ｍｇ／ｋｇセレコキシブで１日２回処置し（白菱形）、ＣＦＡの１３日後の投与の１及び８時間後と、ついでＣＦＡの１４〜１７日後の投与の１時間後に荷重負荷を測定した。
【図６Ａ】ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は慢性変形性関節症性疼痛を回復させる。慢性変形性関節症性痛覚過敏を、ＡＭＢ１マウスの後肢膝関節の片方にＭＩＡを関節内注射することによって誘発させ、同側の（注射した）肢への荷重負荷と対側の（注射していない）肢への荷重負荷との間の％比として測定した（％同側／対側、平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。ベースライン（ＢＬ）荷重負荷の読み取りを、ＭＩＡ注射の直前並びにＭＩＡの３、７及び１０日後に行い、その後、ＭＩＡの１４日後に１（白三角）、１０（白菱形）、及び１００μｇ／ｋｇ（黒丸、点線）の抗ＴｒｋＡ抗体又は１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（黒四角）を単回ｉ．ｐ．注射して処置を開始した（図６Ａ）。
【図６Ｂ】比較対照薬として、ＭＩＡの１４日後に動物を１０ｍｇ／ｋｇトラマドール又は３０ｍｇ／ｋｇプレガバリンでｐ．ｏ．処置し、続いてＭＩＡの１６〜２２日後に３０ｍｇ／ｋｇトラマドール又は１００ｍｇ／ｋｇプレガバリンで隔日処置した（図６Ｂ）。抗体処置群についてはＭＩＡの１４日後の投与の４、８、及び２４時間後と、続いて２４時間毎に、トラマドール及びプレガバリン処置群については投与の１及び２４時間後に、荷重負荷を使用して全ての動物を評価した。
【図７Ａ】ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は神経障害性疼痛を回復させる。慢性神経障害性痛覚過敏及び異痛を、ＡＭＢ１マウスの坐骨神経の慢性絞扼損傷によって誘発させ、それぞれ足挙げに必要な閾値力（ｇ）及びコールドプレートからの足挙げの潜時（秒）として測定した。読み取りは、手術前及び手術７日後の処置開始前日（０ｈ）に行った。次に、動物を１０００μｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（黒三角形）又は１０（黒円形）、１００（黒矩形）及び１０００μｇ／ｋｇ（黒菱形）の抗ＴｒｋＡ抗体の何れかの単回ｉ．ｐ．注射で処置した。３０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ、ｐ．ｏ．のプレガバリン（黒逆三角形）又は食塩水（白円形）を７日の投与後の期間にわたり１日１回投与した。投与後の読み取りは、４時間、２４時間、及びついで投与後７日目まで隔日で記録した。投与後読み取りは、全ての日にプレガバリン又は食塩水投与の１時間後に記録した。
【図７Ｂ】コールドプレートからの足挙げの潜時（秒）。
【図８】ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ（標識ＧＢＲ）（三角形）、タネズマブ（矩形）又はＰＢＳ（円形）で出生後１日目から４週間処置した新生仔ＡＭＢ１マウスの右ＳＣＧ（４匹のマウス／処置＝４の神経節／処置）の形態計測分析。統計学的分析は、ＰＢＳ処置とのＤｕｎｎｅｔｔ事後検定比較を用いた一元配置ＡＮＯＶＡとして実施した：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図９】ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ（標識ＧＢＲ）（三角形）、タネズマブ（矩形）又はＰＢＳ（円形）で４週間処置した成体ＡＭＢ１マウスの左右のＳＣＧ（８〜９匹のマウス／処置＝１５〜１８結節／処置）の形態計測分析。統計学的分析は、ＰＢＳ処置とのＤｕｎｎｅｔｔ事後検定比較を用いた一元配置ＡＮＯＶＡとして実施した：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１０】ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ（ラベルＧＢＲ）（１９０４個のニューロン、円形）、ＰＢＳ（１５４７個のニューロン、矩形）又はタネズマブ（１４２０ニューロン、菱形）で処置した成体ＡＭＢ１マウス由来の全てのＳＣＧニューロン細胞体の直径の周波数プロット。標準パラメータを使用してＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍでビニングを実施した。
【図１１】ＰＢＳ処置された成体動物由来のＳＣＧの代表的なＨ＆Ｅ染色切片、タネズマブ処置動物のＳＣＧの最小のもの、及びＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ（標識ＧＢＲ）処置動物のＳＣＧの最大のもの。ニューロン細胞体は黒い矢印が付されている。
【図１２】神経障害性疼痛がＡＭＢ１マウスの坐骨神経の慢性収縮損傷によって誘発された。機械的痛覚過敏（Ａ）を足挙げに必要とされる閾値力（ｇ）として測定し、冷感異痛（Ｂ）をコールドプレートからの足挙げの潜時（秒）として測定した。読み取りは、手術前（−７ｄ）及び手術後７日目で処置開始前（０ｈ）に行った。ついで、動物を、生理食塩水対照（円形）又は０．３（三角形）及び１ｍｇ／ｋｇ（逆三角形）のＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ（標識ＧＢＲ）又は０．３（矩形）及び１ｍｇ／ｋｇ（菱形）のタネズマブの何れかの単回のｉ．ｐ．注射で処置した。投与後の読み取りは、４ｈ、１日及びその後投与後９日目まで隔日に記録し、投与の１４日後を最終読み取りとした。
【図１３】慢性炎症性関節痛を、ＡＭＢ１マウスの膝関節に複数回のＣＦＡの関節内注射によって誘発させた。Ｄ０：最初のＣＦＡ注射の日；Ｄ３、Ｄ１０、Ｄ１７、Ｄ２４：最初のＣＦＡ注射の３、１０、１７及び２４日後。矢印は、０、７、１４及び２１日目の関節内注射（ＰＢＳ又はＣＦＡ）を示す。４ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７６ｈ、９６ｈ及び１２０ｈ：Ｄ２４での投与の４、８、２４、４８、７６、９６及び１２０時間後。＊：Ｐ＜０．０５，ＣＦＡ＋ビヒクル群との比較、一元配置ＡＮＯＶＡ。シャム＋ビヒクル群（菱形）ではｎ＝６、ＣＦＡ＋ビヒクル群（矩形）ではｎ＝８、ＣＦＡ＋ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ（三角）及びＣＦＡ＋タネズマブ（十字）群ではｎ＝１０。
【図１４】骨折後の２日目、５日目、７日目、１４日目及び２０日目のマウスの縦方向のインビボモニタリング。術後値は術前値に関連する。Ａ）活動性の評価；Ｂ）手術した肢の地面反力（ＧＲＦ）の分析。結果は平均値±ＳＥＭとして示される；ｎ＝５〜７。アステリスクはｐ＜０．０５、抗ＴｒｋＡ対ＰＢＳを示す。
【図１５】サフラニン−Ｏ／ファストグリーンで染色された骨折大腿骨の代表的な組織学的切片及びカルス組成の評価。Ａ〜Ｃ：ＰＢＳ処理、Ｄ〜Ｆ：抗ＮＧＦ抗体、Ｇ〜Ｉ：抗ＴｒｋＡ抗体。スケールバー＝５００μｍ。Ｊ〜Ｌ：７日目（Ｊ）、１４日目（Ｋ）及び２５日目（Ｌ）におけるカルス組成の組織形態計測的評価。結果は平均値±ＳＥＭとして示される；ｎ＝５〜８。白棒線：ＰＢＳ処置、薄灰色棒線：抗ＮＧＦ抗体；暗灰色棒線：抗ＴｒｋＡ抗体。
【図１６】２５日の治癒期間後にＰＢＳ、抗ＮＧＦ抗体又は抗ＴｒｋＡ抗体で処置したマウスにおける骨折カルスの曲げ剛性。データは平均値±ＳＥＭとして示される；ｎ＝６〜８。
【図１７】５℃での低濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）製剤の安定性データ。
【図１８】２５℃での低濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）製剤の安定性データ。
【図１９】４０℃での低濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）製剤の安定性データ。
【図２０】５℃での高濃度（１００ｍｇ／ｍｌ）製剤Ａ（ｐＨ５．７５）の安定性データ。
【図２１】２５℃での高濃度（１００ｍｇ／ｍｌ）製剤Ａ（ｐＨ５．７５）の安定性データ。
【図２２】４０℃での高濃度（１００ｍｇ／ｍｌ）の製剤Ａ（ｐＨ５．７５）の安定性データ。
【図２３】５℃での高濃度（１００ｍｇ／ｍｌ）製剤Ｂ（ｐＨ６）の安定性データ。
【図２４】２５℃での高濃度（１００ｍｇ／ｍｌ）製剤Ｂ（ｐＨ６）の安定性データ。
【図２５】４０℃での高濃度（１００ｍｇ／ｍｌ）製剤Ｂ（ｐＨ６）の安定性データ。
【図２６】５℃での高濃度（１５０ｍｇ／ｍｌ）製剤Ａ（ｐＨ５．７５）の安定性データ。
【図２７】２５℃での高濃度（１５０ｍｇ／ｍｌ）製剤Ａ（ｐＨ５．７５）の安定性データ。
【図２８】４０℃での高濃度（１５０ｍｇ／ｍｌ）製剤Ａ（ｐＨ５．７５）の安定性データ。
【図２９】５℃での高濃度（１５０ｍｇ／ｍｌ）製剤Ｂ（ｐＨ６）の安定性データ。
【図３０】２５℃での高濃度（１５０ｍｇ／ｍｌ）製剤Ｂ（ｐＨ６）の安定性データ。
【図３１】４０℃での高濃度（１５０ｍｇ／ｍｌ）製剤Ｂ（ｐＨ６）の安定性データ。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本開示は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片、それらの調製方法及び使用に関する。
「ＴｒｋＡ」、「ヒトＴｒｋＡ」、「ＴｒｋＡ受容体」又は「ヒトＴｒｋＡ受容体」という用語は、ここで同等に使用され、特に他の定義が示されない限り「ヒトＴｒｋＡ」を意味する。ここで使用されるヒトＴｒｋＡには、ヒトＴｒｋＡの変異体、アイソフォーム、及び種相同体が含まれる。従って、この開示の抗体は、ある場合にヒト以外の種由来のＴｒｋＡと交差反応することがある。ある実施態様では、抗体は、一又は複数のヒトＴｒｋＡタンパク質に完全に特異的なことがあり、種交差反応性も他の種類の非ヒト交差反応性も示さないことがある。
【００２７】
ＴｒｋＡは、高親和性神経成長因子受容体又は神経栄養性チロシンキナーゼ受容体１又はＴＲＫ１−形質転換チロシンキナーゼタンパク質又はトロポミオシン関連キナーゼＡ又はチロシンキナーゼ受容体又はチロシンキナーゼ受容体Ａ又はＴｒｋ−Ａ又はｇｐ１４０ｔｒｋ又はｐ１４０−ＴｒｋＡ又はＭＴＣ又はＴＲＫとしても知られている。ＴｒｋＡは、交感神経ニューロン及び神経ニューロンの増殖、分化及び生存の調節により中枢及び末梢神経系の発生及び成熟に関与する受容体型チロシンキナーゼである。ＴｒｋＡは、その主リガンドであるＮＧＦに対する高親和性受容体であり；また、ＮＴＦ３／ニューロトロフィン−３と結合し、それによって活性化されうる。
【００２８】
４種の既知のヒトＴｒｋＡアイソフォームの完全アミノ酸配列がＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２９（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ＴＵ，（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０（Ｄ１）：Ｄ７１〜Ｄ５）に見出される。４種のアイソフォームは選択的スプライシングによって産生される：アイソフォームＴｒｋＡ−Ｉは大部分の非神経組織に見出され（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２９−２）、一方でアイソフォームＴｒｋＡ−ＩＩは主として神経細胞に発現され（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２９−１）、アイソフォームＴｒｋＡ−ＩＩＩは多能性神経幹前駆細胞及び神経提前駆細胞によって特異的に発現される（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２９−４）。残基１〜７１においてアイソフォームＴｒｋＡ−ＩＩと異なり、残基３９３〜３９８を欠く４番目のアイソフォームはアイソフォーム３として知られている（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２９−３）。ＴｒｋＡ−ＩＩアイソフォームは、ＴｒｋＡの主要な既知のアイソフォームである。アイソフォームＴｒｋＡ−ＩがＮＴＦ３ニューロトロフィンに対して増強した反応性を有する一方、アイソフォームＴｒｋＡ−ＩＩＩは構成的に活性であり、ＮＧＦと結合しない。好ましい実施態様では、ここで使用されるＴｒｋＡアイソフォームは、配列番号：２５の配列を含むその細胞外領域を有する配列番号：７２のＴｒｋＡ−ＩＩアイソフォームである。
【００２９】
ここで使用される「抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片」又は「ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片」という用語には、５００ｎＭ以下、好ましくは３５０ｎＭ以下、より好ましくは１５０ｎＭ以下、更により好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは５０ｎＭ以下、特に３０ｎＭ以下の親和性（ＫＤ）で、ヒトＴｒｋＡ、例えば単離された形態のヒトＴｒｋＡに結合する抗体又はその断片、具体的にはＴｒｋＡ−ＩＩアイソフォーム（配列番号７２）に結合する抗体又はその断片、より具体的にはＴｒｋＡ−ＩＩアイソフォームの一価形態のヒトＴｒｋＡ細胞外領域（配列番号２５）に結合する抗体又はその断片が含まれる。通常、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、ＴｒｋＡの機能的活性化を阻害する能力があり、及び／又はさもなければＴｒｋＡへのＮＧＦの結合によって誘導されるであろう一又は複数の生物活性を遮断し又は低減する能力がある。
【００３０】
ここで使用される場合、「抗ＮＧＦ抗体」は、ＮＧＦ、好ましくはヒトＮＧＦに結合することができる抗体を意味する。通常、抗ＮＧＦ抗体は、ＴｒｋＡの機能的活性化を阻害する能力があり、及び／又はＴｒｋＡの一又は複数の生物活性を遮断し又は低減する能力がある。ＮＧＦ（ｈＮＧＦなど）に対する抗ＮＧＦ抗体の結合親和性は、５００ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下でありうる。通常、抗ＮＧＦ抗体は、次の何れか一又は複数の特徴を示すはずである：（ａ）ＮＧＦに結合し、ＮＧＦの生物活性及び／又はＮＧＦシグナル伝達機能によって媒介される下流経路を阻害する；（ｂ）（ＴｒｋＡ受容体の二量体化及び／又は自己リン酸化を含む）ＮＧＦ受容体の活性化を遮断又は低下させる；（ｃ）ＮＧＦのクリアランスを増大させる；（ｄ）ＮＧＦの合成、産生又は放出を阻害（低減）する。抗ＮＧＦ抗体は、当該技術分野において知られており、例えばＰＣＴ公報国際公開第０１／７８６９８号、国際公開第０１／６４２４７号、米国特許第５８４４０９２号、同第５８７７０１６号及び同第６１５３１８９号；Ｈｏｎｇｏ等，（２０００）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９：２１５〜２２７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３９６０８、Ｕ３９６０９、Ｌ１７０７８又はＬ１７０７７を参照のこと。
【００３１】
ここで使用される「Ｔｒｋの機能的活性化を阻害する能力があるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片」という用語は、次の特徴の何れか一又は複数を示すヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を意味する：（ａ）ＴｒｋＡに結合し、ＴｒｋＡの生物活性及び／又はＮＧＦの結合もしくはＮＴＦ３／ニューロトロフィン−３シグナル伝達機能によって媒介される下流経路を阻害する；（ｂ）疼痛の任意の態様を予防、改善、又は治療する；（ｃ）ＴｒｋＡの活性化、あるいは二量体化及び／又は自己リン酸化を遮断し又は減少させる；（ｄ）ＴｒｋＡのクリアランスを増大させる；（ｅ）ＴｒｋＡの合成及び／又は細胞表面発現を阻害し又は低減する。
【００３２】
ここで使用される「ＴｒｋＡの一又は複数の生物活性を遮断し又は低減する能力があるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片」という用語は、ＴｒｋＡの生物活性を直接的又は間接的に低減し、阻害し、中和し、又は消失させるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を意味する。
【００３３】
ここで使用される「ＴｒｋＡの生物活性」又は「ＴｒｋＡ生物活性」という用語は、限定することなく、次の何れか一又は複数を意味する：ＮＧＦ又は他のニューロトロフィンに結合できること；ホモ二量体化もしくはヘテロ二量体化及び／又は自己リン酸化できること；ＮＧＦ誘導型シグナル伝達経路を活性化できること；細胞分化、増殖、生存、成長、遊走、並びに細胞生理における他の変化、例えば（末梢ニューロン及び中枢ニューロンを含むニューロンの場合）ニューロンの形態変化、シナプス形成、シナプス機能、神経伝達因子及び／又は神経ペプチドの放出、並びに損傷後の再生を促進できること；並びに骨転移に関連する疼痛及びがん性疼痛を媒介できること。
【００３４】
ここで使用される「ＩＣ５０」という用語は、化合物が生物学的機能を阻害する有効性、例えばＮＧＦ誘導型ＴＦ−１細胞の増殖に対するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の阻害の尺度である最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を記述する。
ここで言及される「抗体」という用語には、全長抗体及びその任意の抗原結合断片又は単鎖が含まれる。抗体、特に天然に生じる抗体は、４本のポリペプチド鎖から構成されるＹ形単位の一又は複数のコピーとして存在する糖タンパク質である。各「Ｙ」形は、重（Ｈ）鎖の２つの同一のコピー及び軽（Ｌ）鎖の２つの同一のコピーを含み、それらの鎖は、そのようにそれらの相対分子量により名付けられる。各軽鎖は重鎖と対形成し、各重鎖は別の重鎖と対形成する。共有結合性鎖内ジスルフィド結合及び非共有結合性相互作用が鎖を相互に連結する。抗体、特に天然に生じる抗体は、抗原結合部位の２つのコピーである可変領域を含む。タンパク質分解酵素パパインは「Ｙ」形を３つの別々の分子に分割し、２つはいわゆる「Ｆａｂ」断片（Ｆａｂ＝抗原結合性断片）であり、１つはいわゆる「Ｆｃ」断片又は「Ｆｃ領域」（Ｆｃ＝結晶化可能断片）である。Ｆａｂ断片は、軽鎖全体と重鎖の一部からなる。重鎖は、１つの可変ドメイン（重鎖可変ドメイン又はＶＨ）及び３つ又は４つの何れかの定常ドメイン（抗体クラス又はアイソタイプに応じてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を含む。ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域はヒンジ領域と呼ばれ、Ｙ形抗体分子の２つのＦａｂアーム間の柔軟性を可能にし、一定距離で分離された２つの抗原決定基への結合と適応するようにそれらを開放し閉鎖する。ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの重鎖は、それぞれ４つのドメイン、すなわち１つの可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨ１〜３）を有する。ＩｇＥ及びＩｇＭは、重鎖上に１つの可変ドメインと４つの定常ドメイン（ＣＨ１〜４）を有する。抗体の定常領域は、様々な免疫系細胞（例えばエフェクター細胞）と補体系古典経路の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への結合を媒介しうる。各軽鎖は、通常、１個の共有ジスルフィド結合で重鎖に連結している。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（軽鎖可変ドメイン又はＶＬ）と１つの軽鎖定常ドメインを含む。軽鎖定常ドメインは、ここではＩＧＫＣと呼ばれるκ軽鎖定常ドメインであるか、又はここではＩＧＬＣと呼ばれるλ軽鎖定常ドメインである。ＩＧＫＣは、ここではＣκ又はＣＫと同等に使用され、同じ意味を有する。ＩＧＬＣは、ここではＣλ又はＣＬと同等に使用され、同じ意味を有する。ここで使用される「ＩＧＬＣドメイン」という用語は、全てのλ軽鎖定常ドメイン、例えばＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６及びＩＧＬＣ７からなる群から選択される全てのλ軽鎖定常ドメインのことを指す。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられる超可変領域と、そこに分散される、より保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷ又は「非ＣＤＲ領域」）と呼ばれる領域とに更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端方向に次の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００３５】
抗体は、定常領域により遺伝子的に決定される、アイソタイプとも呼ばれるクラスにグループ分けされる。ヒト定常軽鎖は、カッパ（ＣΚ）及びラムダ（Ｃλ）軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、又はイプシロン（ε）として分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。よって、ここで使用される「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的及び抗原的特徴により定義される免疫グロブリンのクラス及び／又はサブクラスの何れかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）及びＩｇＥ（ＩＧＨＥ）である。いわゆるヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、配列決定されているが、スイッチ領域の変更によりタンパク質をコードしない更なるヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子を表す（Ｂｅｎｓｍａｎａ Ｍ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（７）：３１０８頁）。スイッチ領域が変更されているにもかかわらず、ヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、全ての重鎖定常ドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ３）及びヒンジについてのオープンリーディングフレームを有する。その重鎖定常ドメインについての全てのオープンリーディングフレームは、予測される構造的特徴を有する全てのヒト免疫グロブリン定常ドメインと良好に整列されるタンパク質ドメインをコードする。この更なる偽ガンマアイソタイプは、ここではＩｇＧＰ又はＩＧＨＧＰと称される。ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインイプシロンＰ１及びＰ２偽遺伝子（ＩＧＨＥＰ１及びＩＧＨＥＰ２）などの他の偽免疫グロブリン遺伝子が報告されている。ＩｇＧクラスは、治療目的のために最も一般的に用いられている。ヒトにおいて、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。マウスにおいて、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ及びＩｇＧ３を含む。
【００３６】
ここで使用される「キメラ抗体」又は「キメラ抗ＴｒｋＡ抗体」は、可変領域配列がある種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を含む。
ここで使用される「ヒト化抗体」又は「ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含む。更なるフレームワーク領域改変を、ヒトフレームワーク配列内及び別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列内で作製してもよい。
ここで使用される「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを含む。Ｆａｂは、単離されたこの領域又は全長抗体もしくは抗体断片の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
【００３７】
ここで使用される「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」という用語は、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除外した抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインからＮ末端側にあるフレキシブルヒンジとのことを言う。ＩｇＡ及びＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含むことがある。ＩｇＧについて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３と、ＣγｌとＣγ２との間のヒンジとを含む。Ｆｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、残基Ｃ２２６又はＰ２３０をそのカルボキシル末端に含むと通常定義され、ここで番号付けはＥＵ番号付けシステムによる（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭ等，（１９６９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５頁）。ヒトＩｇＧ１について、Ｆｃ領域は、ここでは残基Ｐ２３２をそのカルボキシル末端に含むと定義され、ここで番号付けはＥＵ番号付けシステムによる。Ｆｃは、単離されたこの領域又はＦｃポリペプチド、例えば抗体の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
【００３８】
ここでの「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」という用語は、抗体の第１定常ドメインと第２定常ドメインとの間のアミノ酸を含むフレキシブルポリペプチドを含む。ここで言及される「ヒンジ領域」は、６〜６２アミノ酸長で、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧのみに存在し、２つの重鎖を架橋するシステイン残基を包含する配列領域である。構造的には、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインは、ＥＵ位２２０において終了し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、ＥＵ位２３７の残基において開始する。よって、ＩｇＧについて、抗体ヒンジは、２２１位（ＩｇＧ１におけるＤ２２１）〜２３１位（ＩｇＧ１におけるＡ２３１）を含むとここでは定義され、番号付けはＥＵ番号付けシステムによる。
【００３９】
ここでは同等に使用される「親抗体」、「親免疫グロブリン」、「親の抗体」又は「親の免疫グロブリン」という用語には、変異体を作製するために後で改変される未改変抗体が含まれる。前記親抗体は、天然に生じる抗体又は天然に生じる抗体の変異体もしくはその加工型でありうる。親抗体は、抗体自体、親抗体を含む組成物、又は親抗体をコードするアミノ酸配列のことをいうことがある。ここで使用される「親のマウス抗体」又は「対応する親のマウス抗体」は、ヒトＴｒｋＡと結合する抗体又は免疫グロブリンであって、変異体を作製するために改変された抗体又は免疫グロブリン、具体的には国際公開第００／７３３４４号に開示されたマウス抗体ＭＮＡＣ１３を意味する。
【００４０】
ここで使用される「変異体抗体」又は「抗体変異体」という用語は、親と比較して少なくとも一つのアミノ酸修飾により親抗体配列のものと異なる抗体配列を含む。ここでの変異体抗体配列は、親抗体配列と好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。抗体変異体は、抗体自体、抗体変異体を含む組成物又は抗体変異体をコードするアミノ酸配列のことをいうことがある。
【００４１】
ここでの「アミノ酸修飾」という用語は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含む。ここでの「アミノ酸置換」又は「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置での別のアミノ酸へのアミノ酸の置き換えを意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、変異体ポリペプチド、この場合、９４位のアルギニンがリシンで置き換えられた重鎖可変フレームワーク領域変異体のことをいう。前出の例について、９４Ｋは、９４位のリシンでの置換を示す。ここでの目的のために、複数の置換は、斜線により典型的に分けられる。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖは、置換Ｒ９４Ｋ及びＬ７８Ｖを含む２重変異体のことをいう。ここで使用される「アミノ酸挿入」又は「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入−９４は、９４位での挿入を示す。ここで使用される「アミノ酸欠失」又は「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４位でのアルギニンの欠失を示す。
【００４２】
ここで使用される場合、「保存的修飾」又は「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響しないか又は前記特性を有意に変更しないアミノ酸修飾のことを言うことを意図する。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、挿入及び欠失を含む。修飾は、本発明の抗体に、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当該技術分野において知られている標準的な技術により導入されうる。保存アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定められている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。よって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内又はフレームワーク領域内の一又は複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変化した抗体（変異体抗体）を、保持された機能について試験できる。
【００４３】
全てのヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインについて、番号付けは「ＥＵ番号付けシステム」による（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭ等，同著）。ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＩＧＫＣ）について、番号付けは「ＥＵ番号付けシステム」による（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭ等，同著）。ヒトラムダ免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、及びＩＧＬＣ７）について、番号付けは、Ｄａｒｉａｖａｃｈ Ｐ等，（１９８７）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８４（２４）：９０７４〜８頁及びＦｒａｎｇｉｏｎｅ Ｂ等，（１９８５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２（１０）：３４１５〜９頁により記載されるように、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」による（Ｋａｂａｔ ＥＡ等，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版−ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ出版第９１−３２４２号）。
【００４４】
「可変ドメイン」という用語は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定めるドメインのことを言う。天然に生じる抗体では、抗原結合部位は、特異性を定める２つの可変ドメイン（一方はここでは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と称される重鎖中に位置し、他方はここでは軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と称される軽鎖中に位置する）からなる。幾つかの場合、特異性は、ラクダに見出される重鎖抗体からの単一ドメイン抗体のように、２つのドメインの一方のみに専ら存在することがある。Ｖ領域は、通常、約１１０アミノ酸長であり、７〜１７アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる非常に可変性のより短い領域で分けられた、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ又は非ＣＤＲ領域）と呼ばれる比較的インバリアントなアミノ酸配列の伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、ループを形成する３つの超可変領域により連結されたベータシート構造を全般的に採用する４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域は、ＦＲにより近接して一緒にされ、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ＥＡ等，同著を参照）。ここで使用される「超可変領域」という用語は、抗原結合を担う、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、配列可変性が最高であり、及び／又は抗原認識に関与する「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を一般的に含む。全ての可変ドメインについて、番号付けは、Ｋａｂａｔによる（Ｋａｂａｔ ＥＡ等，同著）。
【００４５】
多くのＣＤＲの定義が使用されており、ここに包含される。Ｋａｂａｔの定義は、配列多様性に基づき、最も一般的に用いられる（Ｋａｂａｔ ＥＡ等，同著）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ Ｊ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁）。ＡｂＭの定義は、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の間の折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用されている（Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ等，（１９８９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８６：９２６８〜９２７２頁；Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ等，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１〜１５３頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＪＴ等，（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ １：１２６〜１３６頁；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（編），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１〜１７２頁中のＲｅｅｓ ＡＲ等，（１９９６））。接触による定義は最近導入され（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ等，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５頁）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋにおいて入手できる入手可能な複合体構造の分析に基づく。ＩＭＧＴ（登録商標）、すなわちｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によるＣＤＲの定義は、全ての免疫グロブリン及び全ての種のＴ細胞受容体Ｖ領域についてＩＭＧＴ番号付けに基づく（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ等，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（１）：２０９〜１２頁；Ｒｕｉｚ Ｍ等，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１）：２１９〜２１頁；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１）：２０７〜９頁；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１）：３０７〜１０頁；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ等，（２００５）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：１８５〜２０３頁；Ｋａａｓ Ｑ等，（２００７）Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，６（４）：２５３〜６４頁）。
【００４６】
本発明において言及される全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）は、好ましくは次のように定義される（Ｋａｂａｔ ＥＡ等，既出による番号付け）：ＬＣＤＲ１：２４〜３４；ＬＣＤＲ２：５０〜５６；ＬＣＤＲ３：８９〜９８；ＨＣＤＲ１：２６〜３５；ＨＣＤＲ２：５０〜６５；及びＨＣＤＲ３：９５〜１０２。可変ドメインの「非ＣＤＲ領域」は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られている。ここで使用されるＶＬ領域の「非ＣＤＲ領域」は、アミノ酸配列１〜２３（ＦＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、及び９９〜１０７（ＦＲ４）を含む。ここで使用されるＶＨ領域の「非ＣＤＲ領域」は、アミノ酸配列１〜２５（ＦＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、及び１０３〜１１３（ＦＲ４）を含む。
【００４７】
ここで使用される「全長抗体」という用語は、可変及び定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を含む。例えば、ヒト及びマウスを含む殆どの哺乳動物では、ＩｇＧクラスの全長抗体は、４量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１つの軽鎖と１つの重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインＶＬ及びＣＬを含み、各重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２（Ｃγ２）、及びＣＨ３（Ｃγ３）を含む。幾つかの哺乳動物、例えばラクダ及びラマでは、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖のみからなることがあり、各重鎖はＦｃ領域に結合した可変ドメインを含む。
【００４８】
ここで使用される抗体断片は、抗原結合断片のことを言い、それらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ'及びＦａｂ'−ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一可変ドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ等，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６頁）、（ｖ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ'）２断片、（ｖｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインとが、２つのドメインが結合して抗原結合部位を形成できるようにするペプチドリンカーで連結された単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ等，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎ等，（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３頁）、（ｖｉｉ）２重特異性単鎖Ｆｖ２量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、（ｖｉｉｉ）遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性断片である「ダイアボディ」又は「トリアボディ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ｉ等，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１〜４７９頁；国際公開第９４／１３８０４号；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ等，（１９９３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８頁）及び（ｉｘ）同じ又は異なる抗体と遺伝子的に融合されたｓｃＦｖ（Ｃｏｌｏｍａ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１５９〜１６３頁）を含む。
【００４９】
ここで使用される「エフェクター機能」という用語は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体又はリガンドとの相互作用に起因する生化学的事象を含む。エフェクター機能は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用）及びＡＤＣＰ（抗体依存性細胞媒介性食作用）などのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能、並びにＣＤＣ（補体依存性細胞傷害作用）などの補体媒介性エフェクター機能を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ受容体又は補体成分などのエフェクター分子についての抗体の親和性を変更、すなわち増強又は低減、好ましくは増強することにより変更できる。結合親和性は、エフェクター分子結合部位を修飾することにより一般的に変動され、この場合、対象の部位を見つけ、その部位の少なくとも一部を適切な方法で修飾することが適当である。エフェクター分子についての抗体上の結合部位における変更は、全体的な結合親和性を著しく変更する必要はないが、相互作用の幾何学的配置を変更して、非生産的結合におけるようにエフェクター機序を無効にすることも更に想定される。エフェクター分子結合に直接関与しないがエフェクター機能の性能に関与する部位を修飾することにより、エフェクター機能を変更することも更に想定されうる。抗体のエフェクター機能を変更することにより、免疫応答の様々な態様を制御すること、例えば免疫系の様々な反応を増強又は抑制することが可能になり、診断及び治療において有益な効果がある可能性がある。
【００５０】
ここで使用される場合、「対象」という用語は任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物、例えば霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等々を含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００５１】
［本発明の抗体］
第１の態様では、本発明は、
ａ）配列番号：１〜５からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメインと、
ｂ）配列番号：６〜１３からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含むヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片であって、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２が、少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、及び／又は重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域が、３７、４２及び８９からなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を提供する。
幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２は、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を含む。
幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域は、３７、４２及び８９からなる群から選択されるアミノ酸位置に保存的アミノ酸置換を含む。
幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２は、配列番号：１５の配列を含む。
幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインは、配列番号：１、３及び５からなる群から選択される配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号：６及び８からなる群から選択される配列を含む。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、配列番号：１と配列番号：６、配列番号：３と配列番号：６、配列番号：３と配列番号：８、配列番号：５と配列番号：６、並びに配列番号：５と配列番号：８からなる群から選択される配列；好ましくは配列番号：５と配列番号：６の配列又は配列番号：５と配列番号：８の配列；より好ましくは配列番号：５と配列番号：６の配列を含む重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの組み合わせを含む。
幾つかの実施態様では、本開示によって提供されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片の重鎖可変ドメインは、配列番号：７１の配列を含まない。
【００５２】
幾つかの実施態様では、本開示によって提供されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片の重鎖可変ドメインは、位置８７にセリンを欠き、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。
幾つかの実施態様では、本開示によって提供されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片の重鎖可変ドメインは、位置８７にスレオニンを含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。
幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２のアミノ酸置換は、５０、６０及び６２からなる群から選択され、好ましくは６０及び６２からなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。
幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２のアミノ酸置換は、Ｙ５０Ａ、Ｐ６０Ａ及びＴ６２Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を含まず、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。
幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又は断片のアミノ酸置換がＡ４９Ｓである場合、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又は断片のアミノ酸置換はＹ５０Ａではない。
幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又は断片のアミノ酸置換はＡ４９Ｓではなく、及び／又は重鎖可変ドメインのＣＤＲ２におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又は断片のアミノ酸置換はＹ５０Ａではない。
【００５３】
幾つかの実施態様では、抗体又はその断片の重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換は、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ及びＶ８９Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換、好ましくはＶ３７Ａを含み、アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。
幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号：３の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換は、Ｖ３７Ａ、Ｔ４０Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｒ４４Ｇ、Ａ４９Ｓ及びＶ８９Ｌからなる群から選択され、好ましくはＶ３７Ａ、Ｔ４０Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｒ４４Ｇ及びＶ８９Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。
幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号：３と配列番号：６の配列を含むか、又は配列番号：３と配列番号：８の配列を含む重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの組み合わせを含み、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換は、Ｖ３７Ａ、Ｔ４０Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｒ４４Ｇ、Ａ４９Ｓ及びＶ８９Ｌからなる群から選択され、好ましくはＶ３７Ａ、Ｔ４０Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｒ４４Ｇ及びＶ８９Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。
【００５４】
幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換は、Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ａ４９Ｓ、Ｖ８９Ｌ及びＲ９４Ｋからなる群から選択され、好ましくはＫ３Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｖ８９Ｌ及びＲ９４Ｋからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、より好ましくはアミノ酸置換Ｋ３Ｑ及びＶ３７Ａを含み、最も好ましくはアミノ酸置換Ｖ３７Ａを含み、各群のメンバーのアミノ酸位置はＫａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。等しく最も好ましいのは、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換が、Ｖ３７Ａ及びＫ３Ｑ、Ｖ３７Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む実施態様であり、各群のメンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。
幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号：５の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換は、Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ａ４９Ｓ、Ｖ８９Ｌ及びＲ９４Ｋからなる群から選択され、好ましくはＫ３Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、Ｖ８９Ｌ及びＲ９４Ｋからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、より好ましくはアミノ酸置換Ｋ３Ｑ及びＶ３７Ａを含み、最も好ましくはアミノ酸置換Ｖ３７Ａを含み、各群のメンバーのアミノ酸位置はＫａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。等しく最も好ましくは、抗体が配列番号：５の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインの非ＣＤＲ領域のアミノ酸置換が、Ｖ３７Ａ及びＫ３Ｑ、Ｖ３７Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む実施態様であり、各群のメンバーのアミノ酸位置はＫａｂａｔに記載の番号付けシステムを利用して示される。
【００５５】
更なる態様では、本発明は、
ａ）配列番号：３１〜４９からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメインと、
ｂ）配列番号：６〜１３からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含むヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を提供する。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、
ａ）配列番号：３２、３６、３９、４３、４８及び４９からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメインと、
ｂ）配列番号：６〜１３からなる群から選択され、又は配列番号：６及び８からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、
ａ）配列番号：３２、３６、４８及び４９からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメインと、
ｂ）配列番号：６又は配列番号：８の配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、
ａ）配列番号：３２及び３６からなる群から選択される配列を含む重鎖可変ドメインと、
ｂ）配列番号：６の配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、
ａ）配列番号：３６の配列を含む重鎖可変ドメインと、
ｂ）配列番号：６の配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
【００５６】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は、配列番号：３２と配列番号：６、配列番号：３２と配列番号：８、配列番号：３６と配列番号：６、配列番号：４８と配列番号：６、配列番号：４９と配列番号：６、及び配列番号：４９と配列番号：８の配列を含む群から選択され、好ましくは配列番号：３２と配列番号：６、配列番号：３２と配列番号：８、配列番号：３６と配列番号：６、配列番号：４９と配列番号：６、及び配列番号：４９と配列番号：８の配列を含む群から選択され、最も好ましくは配列番号：３６と配列番号：６の配列の組み合わせから選択される重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの組み合わせを含む。
【００５７】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、重鎖及び／又は軽鎖定常領域、好ましくは重鎖及び／又は軽鎖定常領域とヒンジ領域を更に含む。好ましくは、重鎖定常領域はヒト起源であり、例えば、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧｌ）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）、又はＩｇＥ（ＩＧＨＥ）アイソタイプである。より好ましくは、重鎖定常領域は、ヒトＩＧＨＧ１アイソタイプであり又はヒトＩＧＨＧ４アイソタイプである。好ましくは、軽鎖定常領域は、ヒト起源であり、ヒトκ（ＣＫ）又はヒトλ（Ｃλ）軽鎖定常ドメイン、好ましくはヒトκ軽鎖定常ドメインである。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、重鎖及び／又は軽鎖定常領域とヒンジ領域を更に含み、重鎖定常領域とヒンジ領域は、ヒトＩＧＨＧ１アイソタイプ又はヒトＩＧＨＧ４アイソタイプである。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、重鎖及び／又は軽鎖定常領域とヒンジ領域を更に含み、重鎖定常領域とヒンジ領域は、ヒトＩＧＨＧ４アイソタイプであり、ヒンジ領域は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムを利用して示される。
【００５８】
更なる態様では、本発明は、
ａ）配列番号：５０〜７０からなる群から選択される配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号：２９及び３０からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含むヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を提供する。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、
ａ）配列番号：５１、５２、５６、５７、６０、６４、６９及び７０からなる群から選択される配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号：２９及び３０、好ましくは配列番号：２９からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含む。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、
ａ）配列番号：５１、５２、５６、５７、６９及び７０からなる群から選択される配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号：２９及び３０、好ましくは配列番号：２９からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含む。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、
ａ）配列番号：５１、５２、５６、５７、及び７０からなる群から選択される配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号：２９及び３０、好ましくは配列番号：２９からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含む。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、
ａ）配列番号：５１、５２、５６及び５７からなる群から選択される配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号：２９及び３０、好ましくは配列番号：２９からなる群から選択される配列を含む軽鎖
を含む。
好ましい実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、
ａ）配列番号：５７の配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号：２９の配列を含む軽鎖
を含む。
【００５９】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、全長抗体である。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ、２重特異性単鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディ並びに同じ又は異なる抗体に遺伝子的に融合したｓｃＦｖからなる群から選択される抗体断片；好ましくはｓｃＦｖ又はＦａｂ；より好ましくはｓｃＦｖ二量体又はダイアボディ又はＦ（ａｂ'）2である。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、親抗体のＦｃ領域と比べて少なくとも一つのアミノ酸修飾を含むバリアントＦｃ領域を含み、バリアントＦｃ領域を含む抗体は、親抗体と比較して変化したエフェクター機能を示す。
【００６０】
Ｆｃ領域内のアミノ酸修飾は、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体もしくはリガンド結合に関係するエフェクター機能、及び／又は抗原依存性細胞性細胞傷害作用などの抗体の一又は複数の機能的特性を変化させる。以下に概説されるＦｃ領域内の修飾は、Ｆｃ領域中の残基のＥＵ番号付けに従う。一実施態様では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変化するように、例えば増加又は減少するように修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ等によって米国特許第５６７７４２５号に更に説明されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば軽鎖及び重鎖の集合を促進するように、又は抗体の安定性を増大もしくは減少させるように修飾される。別の実施態様では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように突然変異誘発される。より具体的には、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインのブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合に比べてＳｐＡ結合の障害を有するように、一又は複数のアミノ酸突然変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄ等によって米国特許第６１６５７４５号に更に詳細に説明されている。別の実施態様では、抗体は、その生物学的半減期を増大するように修飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、次の突然変異の一又は複数を導入することができる：Ｗａｒｄの米国特許第６２７７３７５号に記載のＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、Ｐｒｅｓｔａ等によって米国特許第５８６９０４６号及び同第６１２１０２２号に記載されているように、生物学的半減期を増大するために、抗体をＣＨ１又はＣＬ領域内で変化させて、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含ませることができる。更なる実施態様では、抗体のエフェクター機能を変化させるために、Ｆｃ領域が、少なくとも一つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することによって変化される。例えば、抗体がエフェクターリガンドに対して変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２から選択される一又は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基に置換することができる。それに対する親和性が変化されたエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体Ｃ１成分でありうる。このアプローチは、米国特許第５６２４８２１号及び同第５６４８２６０号に、何れもＷｉｎｔｅｒ等によって更に詳細に記載されている。別の例では、抗体がＣ１ｑ結合性の変化及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の低減もしくは消失を有するように、アミノ酸残基３２９、３３１及び３２２から選択される一又は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基に置換することができる。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ等によって米国特許第６１９４５５１号に更に詳細に記載されている。別の例では、ＣＨ２ドメインのＮ末端領域中のアミノ酸位置２３１〜２３８内の一又は複数のアミノ酸残基が変化され、それによって抗体が補体を固定する能力が変化される。このアプローチは、更にＢｏｄｍｅｒ等によってＰＣＴ公報国際公開第９４／２９３５１号に記載されている。更に別の例では、抗体が抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増大するように、及び／又はＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増大するように、次の位置で一又は複数のアミノ酸を修飾することによってＦｃ領域が修飾される：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによってＰＣＴ公報国際公開第００／４２０７２号に更に記載されている。更に、本発明の抗体は、化学的に修飾しても（例えば、一又は複数の化学的部分を抗体に結合させることができる）、又はそのグリコシル化を変化させるように修飾してもよい。
【００６１】
［本発明の抗体の特性］
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、ＴｒｋＡの機能的活性化を阻害する能力がある。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は、ＴｒｋＡの一又は複数の生物活性を遮断し又は低減させる能力がある。
幾つかの実施態様では、例えばＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）又は当該技術分野において知られている同等の装置を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、分析物として組換え一価ヒトＴｒｋＡ細胞外ドメイン（配列番号：２５）を使用して装置センサーチップ上に抗体を捕捉することによって測定した場合、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、５００ｎＭ以下、好ましくは３５０ｎＭ以下、より好ましくは１５０ｎＭ以下、更により好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは５０ｎＭ以下、特に３０ｎＭ以下の親和性（ＫD）でヒトＴｒｋＡに結合する。ＴｒｋＡ受容体を使用する親和性測定に関してここで使用される「一価」とは、例えばそのドメインのアミノ末端が免疫グロブリンＦｃ部分と融合すると受けるような人工的な二量体化も多量体化もされていないか、又は例えばそのドメインがその天然リガンドＮＧＦと結合すると受けるような天然二量体化がされていない、ヒトＴｒｋＡ細胞外ドメインのようなヒトＴｒｋＡ受容体ドメインのことをいう。
例えばＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、及びフローサイトメトリー分析を含む、例えばヒトＴｒｋＡに対する抗体の結合能を評価するための標準的アッセイが当該技術分野において知られている。適切なアッセイは実施例に詳細に記載される。抗体の結合動態（例えばＫDのような結合親和性）もまた、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム分析のような、当該技術分野において知られている標準的アッセイによって評価することができる。相対結合親和性Ｋiは、当該技術分野において知られている標準的競合アッセイによって評価することができる。操作抗ＴｒｋＡ抗体は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいてＴｒｋＡの機能的活性化を阻害するその能力についてアッセイすることができる。化合物が生物学的機能を阻害する効果の尺度である最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を、好ましい抗体を選択するために使用することができる。
【００６２】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイで、例えば、因子依存性ヒト赤白血病細胞株ＴＦ−１（Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ等，（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １４０（２）：３２３〜３４）を使用して抗体が細胞表面ＴｒｋＡ／β−ＮＧＦ媒介性細胞増殖を遮断する能力によって測定するとき、対応する親のマウス抗体と少なくとも均等かそれよりも低いＩＣ５０を有する。好ましくは、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイで１μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．７５μｇ／ｍｌ、更により好ましくは０．５μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは０．３μｇ／ｍｌ以下、特に０．１μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有する。
幾つかの実施態様では、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片は、６５℃よりも高い、好ましくは７０℃よりも高いＦＡＢ断片熱安定性温度を有する。ＦＡＢ断片熱安定性の分析には、示差走査熱量測定が使用される一方、全長ＩｇＧの状況でＦＡＢ断片の中点融解温度が同定される。これらの種類の熱量測定は、当業者に知られており、例えばＧａｒｂｅｒ及びＤｅｍａｒｅｓｔ（２００７）ＢＢＲＣ ３５５：７５１〜７に従って実施することができる。驚くことに、本発明のヒト化抗体は、親マウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度と同等のＦＡＢ断片熱安定性温度を有するが、ＳＰＲによって測定して同等の親和性とＴＦ−１細胞増殖アッセイによって測定して向上した効力を有することが見出された。従って、本開示は、また、親マウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度と同等のＦＡＢ断片熱安定性温度を有し、ヒトＴｒｋＡに対して同等の親和性及び向上した阻害特性を有するヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を提供する。
【００６３】
この文脈においてここで使用される「親のマウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度と同等の」は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片が、親マウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度の±２０％の範囲内、好ましくは±１５％の範囲内、より好ましくは±１０％の範囲内、更により好ましくは±５％の範囲内であるＦＡＢ断片熱安定性温度を有することを意味する。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、親マウス抗体のＦＡＢ断片熱安定性温度からの低下が１５％以内のＦＡＢ断片熱安定性温度を有する。
この文脈においてここで使用される「ヒトＴｒｋＡに対して同等の親和性」は、ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片が、親マウス抗体の±２０％の範囲内、好ましくは±１５％の範囲内、より好ましくは±１０％の範囲内の親和性を有することを意味する。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、親マウス抗体のＫDよりも少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％低いＫDを有する。
【００６４】
本発明は、また、疼痛を治療するために使用することができるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を提供する。
ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の効果を、後足へのフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）の足底内注射によって誘発された急性炎症性痛覚過敏を患うマウスで試験した（実施例２参照）。０．０１ｍｇ／ｋｇ以上の用量のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、痛覚過敏の有意な回復をもたらし、それは、ＮＳＡＩＤであるインドメタシンで観察されたものに類似していた。
ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の効果を、膝関節へのＣＦＡの関節内注射によって誘発された慢性炎症性痛覚過敏を患うマウスで試験した（実施例３参照）。０．０１ｍｇ／ｋｇ以上の単一用量でのヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、痛覚過敏の有意な回復をもたらし、それは、ＣＯＸ−２選択的ＮＳＡＩＤであるセレコキシブの複数回投与で観察されるものに匹敵していた。
ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の効果を、膝関節へのヨード酢酸一ナトリウム（ＭＩＡ）の関節内注射によって誘発された慢性変形性関節症性痛覚過敏を患うマウスで試験した（実施例４参照）。０．０１ｍｇ／ｋｇ以上の単一用量でのヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、痛覚過敏の有意な回復をもたらし、それは、オピエートであるトラマドール及びプレガバリンの複数回投与で観察されるものに匹敵していた。
ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の効果を、坐骨神経の慢性絞扼によって誘発された神経障害性疼痛を患うマウスで試験した（ＣＣＩモデル；実施例５参照）。０．０１ｍｇ／ｋｇ以上の単一用量でのヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の投与は、機械的痛覚過敏及び冷感異痛の有意な回復をもたらし、それは、試験した最高用量１ｍｇ／ｋｇにおいて、プレガバリンの複数回投与で観察されるものに匹敵していた。
【００６５】
従って、本発明の好ましい実施態様は、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、変形性関節症性疼痛、及び／又は神経障害性疼痛を患う患者の治療のためのヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を提供する。
【００６６】
［核酸、ベクター及び宿主細胞］
本開示は、また、抗ＴｒｋＡ抗体及びその断片をコードする単離核酸、ベクター、並びに核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。核酸は、全細胞中、細胞溶解物中、又は部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野において周知の他のものを含む標準的な技法によって、他の細胞成分又は他の混入物、例えば他の細胞性核酸又はタンパク質から精製される場合、「単離され」又は「実質的に純粋にされ」ている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ等編（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。本発明の核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでいても含んでいなくてもよい。好ましい実施態様では、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【００６７】
本発明の核酸は標準的な分子生物学的技法を用いて得ることができ、例えば抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡあるいはＶＨ及びＶＬセグメントをコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技法によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えばファージディスプレイ技法を用いて）得られる抗体については、抗体をコードする一又は複数の核酸をライブラリーから回収することができる。宿主細胞に外因性核酸を導入する方法は、当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞により様々である。技法には、非限定的に、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、ポリエチレンイミン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス又はファージ感染、リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入、及び核内へのＤＮＡの直接のマイクロインジェクションが含まれる。哺乳動物細胞の場合、トランスフェクションは一過性又は安定的の何れかでありうる。
幾つかの実施態様では、抗ＴｒｋＡ抗体及びその断片をコードする単離核酸は、配列番号７３〜１１６からなる群から選択される核酸配列、通常は、配列番号：１１３、１１４、１１５及び１１６からなる群から選択される軽鎖可変領域もしくは軽鎖、及び／又は配列番号：７３〜１１２からなる群から選択される重鎖可変領域もしくは重鎖をコードする核酸分子を含む。
【００６８】
本発明の好ましい核酸分子は、配列番号：１１３及び１１４からなる群から選択される軽鎖可変領域、及び／又は配列番号：７４、７８、８１、８５、９０及び９１からなる群から選択される重鎖可変領域をコードするものである。より好ましいのは、配列番号：７４及び７８からなる群から選択される重鎖可変領域をコードし、及び／又は配列番号：１１３及び１１４からなる群から選択される軽鎖可変領域をコードする核酸分子である。最も好ましいのは、配列番号７４又は７８の核酸配列を含む重鎖可変領域をコードし、及び／又は配列番号：１１３の核酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸分子である。
本発明の更に好ましい核酸分子は、配列番号：１１５及び１１６からなる群から選択される軽鎖、及び／又は配列番号：９３、９４、９８、９９、１０２、１０６、１１１及び１１２からなる群から選択される重鎖をコードするものである。より好ましいのは、配列番号９３、９４、９８、及び９９の核酸配列を含む重鎖をコードし、及び／又は配列番号：１１５及び１１６からなる群から選択される軽鎖をコードする核酸分子である。最も好ましいのは、配列番号：９３、９４、９８、及び９９の核酸配列を含む重鎖をコードし、及び／又は配列番号：１１５の核酸配列を含む軽鎖をコードする核酸分子である。
【００６９】
ひとたびＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られれば、これらＤＮＡ断片を更に標準的組換えＤＮＡ技法により操作して、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、又は上述の断片に対応する断片遺伝子、例えばＦａｂ断片遺伝子に、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は可動性リンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈で使用される「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片が該２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままとなるように結合されることを意味するものである。ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において知られており（例えば既出のＫａｂａｔ，ＥＡ等を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域でありうるが、最も好ましくはＩｇＧ４定常領域であり、好ましくはヒンジ領域がアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩＧＨＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において知られており（例えば既出のＫａｂａｔ ＥＡ等を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。好ましい実施態様では、軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域、好ましくはκ定常領域でありうる。ｓｃＦｖ遺伝子を創出するために、ＶＨをコードするＤＮＡ断片とＶＬをコードするＤＮＡ断片が、可動性リンカー、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結され、それにより、ＶＬ及びＶＨ領域が可動性リンカーによって結合された連続する単鎖タンパク質としてＶＨ及びＶＬ配列を発現させることができる（例えば、Ｂｉｒｄ等，既出；Ｈｕｓｔｏｎ等，既出；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４参照）。抗体の抗体断片の産生のための様々な技法が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質消化を経て得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ等，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７〜１１７及びＢｒｅｎｎａｎ等，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１参照）。しかし、これらの断片は、今は組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ'−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ'）2断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ等，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３〜１６７）。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ'）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技法は、当業者に明らかであろう。他の実施態様では、最適な抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。例えば国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号を参照。抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載のような「線状抗体」でもありうる。
【００７０】
本発明の抗体をコードする核酸は、タンパク質を発現させるために、ベクター、好ましくは発現ベクターに組み込むことができる。様々な発現ベクターをタンパク質発現のために利用することができる。発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターを含みうる。発現ベクターは、宿主細胞型と適合性があるように構築される。従って、本発明での用途が見出されるベクター、好ましくは発現ベクターには、非限定的に、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母、及びインビトロ系でのタンパク質発現を可能にするものが含まれる。当該分野において知られているように、本発明において抗体発現のための用途が見出されうる様々な発現ベクターが、商業的又はその他の方法で入手可能である。
【００７１】
発現ベクターは、典型的には、制御もしくは調節配列、選択マーカー、任意の融合パートナー、及び／又は追加的なエレメントと作動可能に連結されたタンパク質を含む。ここで「作動可能に連結された」とは、核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれることを意味する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））に記載されている。一般に、これら発現ベクターは、抗体をコードする核酸に作動可能に連結した転写及び翻訳調節核酸を含み、典型的にはタンパク質を発現させるために使用される宿主細胞に適している。一般に、転写及び翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が含まれうる。当該技術分野でまた知られているように、発現ベクターは、発現ベクターを含む形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択遺伝子又はマーカーを典型的には含む。選択遺伝子は、当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞により変わりうる。例えば、典型的には選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞にメトトレキセート選択／増幅を行って使用するため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
ここのベクター中のＤＮＡをクローニング又は発現するのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物には、グラム陰性生物又はグラム陽性生物を含む真正細菌、例えばエシェリキア、例えば大腸菌、エンテロバクター、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばサルモネラ・チフィリウム、セラチア、例えばセラチア・マルセセンス（Serratia marcescans）、及び赤痢菌などの腸内細菌科、並びにバチルス、例えば枯草菌及びバチルス・リケニフォルミス、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスが含まれる。適切な大腸菌クローニング宿主には、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌ＸＩ７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）が含まれる。
【００７２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ又は一般的なパン酵母が、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用される。本発明の組換え抗体を発現するための宿主細胞は、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ（１９８０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７７：４２１６〜４２２０に記載されたｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞など、例えばＫａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１〜６２１に記載のＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞及びＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）が含まれる哺乳動物宿主細胞である。特に、ＮＳ０骨髄腫細胞と共に使用するための別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号、及び欧州特許出願公開第０３３８８４１号に開示されたＧＳ遺伝子発現系である。
【００７３】
［抗体の構築と産生］
ＴｒｋＡポリペプチドに対して作製された抗体は、よく知られた常套的なプロトコールを使用して、動物の免疫化によって、すなわち、動物、好ましくは非ヒト動物にポリペプチドを投与することによって、得ることができる。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｅｉｒ ＤＭ（編）、第４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８６）を参照。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタなどの多くの温血動物を免疫処置することができる。しかし、マウス、ウサギ、ブタ、及びラット、特にマウスが、一般に最も適切である。同様に抗体は、当業者に知られている組換えＤＮＡ法によって産生することができる。加えて、抗体は、天然に生じる抗体の酵素的又は化学的切断によって産生することができる。本発明のヒト化抗体は、非ヒト動物（例えばマウス）由来のＶＨ及び／又はＶＬ領域からヒトＶＨ及び／又はＶＬ領域由来の一又は複数のフレームワーク領域に一又は複数のＣＤＲ又はその部分を移すことによって構築することができる。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、国際公開第００／７３３４４号に開示のマウスＭＮＡＣ１３抗体由来のＶＨ及び／又はＶＬ領域からヒトＶＨ及び／又はＶＬ領域由来の一又は複数のフレームワーク領域に一又は複数のＣＤＲ又はその部分を移すことによって構築される。場合によっては、必要な場合又は抗体の免疫原性を減少及び／又は結合親和性を維持するために望まれる場合、ＶＨ及び／又はＶＬ領域中にこのように存在するヒトフレームワーク残基を、対応する非ヒト（例えばマウス）残基によって置換することができる。場合によっては、ＣＤＲ中に存在する非ヒトアミノ酸残基を、ヒト残基と置換することができる。本発明のキメラ抗体又はヒト化抗体は、上記のようにして調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、関心のある非ヒトハイブリドーマから得て、標準的な分子生物学的技法を使用して非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体をつくるために、当該技術分野で知られている方法を使用して、マウス可変領域をヒト定常領域に連結することができる（例えばＣａｂｉｌｌｙ等の米国特許第４８１６５６７号参照）。ヒト化抗体をつくるために、当該技術分野において知られている方法を使用して、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５２２５５３９号、及びＱｕｅｅｎ等の米国特許第５５３０１０１号；同第５５８５０８９号；同第５６９３７６２号及び同第６１８０３７０号参照）。
【００７４】
重鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子が、潜在的アクセプター分子可変領域とマウス抗体の重鎖可変領域との間の相同性を考慮して選択される本発明のヒト化抗体を構築することができる。潜在的な免疫原性を低減するためには、生殖細胞系候補ヒトアクセプター分子が好ましい。生殖細胞系データベースは、重鎖ＦＷ３領域の末端を通って部分的にＣＤＲ３配列まで読み取る抗体配列から構成されている。ＦＷ４領域の選択のために、選択された生殖細胞系分子から得られた成熟抗体配列のデータベースを検索することができ、又はヒトドナーから選択された生殖細胞系分子から得られた抗体配列を使用することができる。ヒトアクセプター分子は、好ましくはマウスドナー分子と同じ重鎖クラスから選択され、マウスドナー分子の可変領域の同じカノニカル構造クラスである。重鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子を選択するための二次的考慮には、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長の相同性が含まれる。ヒトアクセプター抗体分子は、好ましくはＶ−ＢＡＳＥデータベースへの相同性検索によって選択されるが、Ｋａｂａｔ及び公的ＮＣＢＩデータベースなどの他のデータベースも同様に使用することができる。
【００７５】
軽鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子が、潜在的アクセプター分子可変領域とマウス抗体の軽鎖可変領域との間の相同性を考慮して選択される本発明のヒト化抗体を構築することができる。潜在的な免疫原性を低減するためには、生殖細胞系候補ヒトアクセプター分子が好ましい。生殖細胞系データベースは、重鎖ＦＷ３領域の末端を通って部分的にＣＤＲ３配列まで読み取る抗体配列から構成されている。ＦＷ４領域の選択のために、選択された生殖細胞系分子から得られた成熟抗体配列のデータベースを検索することができ、又はヒトドナーから選択された生殖細胞系分子から得られた抗体配列を使用することができる。ヒトアクセプター分子は、好ましくはマウスドナー分子と同じ軽鎖クラスから選択され、マウスドナー分子の可変領域の同じカノニカル構造クラスである。軽鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子を選択するための二次的考慮には、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長の相同性が含まれる。ヒトアクセプター抗体分子は、好ましくはＶ−ＢＡＳＥデータベースへの相同性検索によって選択されるが、Ｋａｂａｔ及び公的ＮＣＢＩデータベースなどの他のデータベースも同様に使用することができる。
抗体が、例えば哺乳動物宿主細胞中に遺伝子を導入することによって組換え抗体として産生される場合、その抗体は、宿主細胞中での抗体の発現又はより好ましくは宿主細胞が成長される培養培地中への抗体の分泌を可能にするために十分な時間、宿主細胞を培養することによって産生される。ヒトＴｒｋＡに結合する抗体を産生するために有用な宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、最小必須培地（ＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３、ＨＥＫ２９３無血清培地（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）などの市販培地が宿主細胞の培養に適している。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。
【００７６】
発現されたタンパク質のターゲティング、精製、スクリーニング、ディスプレイなどを可能にするために、抗体は融合パートナーと作動可能に連結されうる。融合パートナーは、リンカー配列を介して抗体配列に連結されうる。リンカー配列は、一般に少数のアミノ酸、典型的には１０個未満のアミノ酸を含むが、より長いリンカーもまた使用されうる。典型的には、リンカー配列は、可動性及び分解抵抗性であるように選択される。当業者によって理解されるように、多種多様な配列のうち任意の配列をリンカーとして使用することができる。例えば、一般的リンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを含む。融合パートナーは、抗体及び任意の関連する融合パートナーを所望の細胞位置又は細胞外媒質に方向づけるターゲティング又はシグナル配列でありうる。当該技術分野において知られているように、ある種のシグナル伝達配列は、タンパク質が増殖培地中又は細胞内膜と外膜の間に位置する細胞膜周辺腔中の何れかに分泌されるようにターゲティングすることができる。融合パートナーは、また、精製及び／又はスクリーニングを可能にするペプチド又はタンパク質をコードする配列でありうる。そのような融合パートナーには、非限定的に、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）（例えばＨ６及びＨ１０又は固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）システム（例えばＮｉ2+アフィニティーカラム）で使用するための他のタグ）、ＧＳＴ融合体、ＭＢＰ融合体、Ｓｔｒｅｐタグ、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化ターゲット配列、及び抗体によってターゲティングされるエピトープタグ（例えばｃ−ｍｙｃタグ、ｆｌａｇタグなど）が含まれる。当業者によって理解されるように、そのようなタグは、精製、スクリーニング、又はその両方で有用でありうる。
【００７７】
［抗ＴｒｋＡ抗体の特徴づけと精製］
抗体のスクリーニングは、ヒトＴｒｋＡへの結合性を測定するアッセイ及び／又はＴｒｋＡからそのリガンドＮＧＦへの結合を遮断する能力を測定するアッセイを使用して実施されうる。結合アッセイの一例はＥＬＩＳＡである。加えて、例えば実施例で使用される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析は、抗体の結合動態についての結合及び解離速度定数を測定するために適用することができる。ブロッキングアッセイの一例は、ＴｒｋＡへのＮＧＦ結合の遮断を測定するフローサイトメトリーに基づくアッセイである。抗ＴｒｋＡ抗体の機能的活性を評価するためのアッセイとして、例えば、抗体が細胞表面ＴｒｋＡ／β−ＮＧＦ媒介性細胞増殖を遮断する能力が因子依存性ヒト赤白血病細胞系ＴＦ−１を使用してアッセイされるＴＦ−１細胞増殖アッセイを使用することができる（Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ等，（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １４０（２）：３２３〜３４）。
【００７８】
本発明の抗体は、当業者に知られている様々な方法で単離又は精製されうる。標準的な精製方法には、大気圧で、又はＦＰＬＣ及びＨＰＬＣなどのシステムを使用して高圧で、実施される、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー、サイジング又はゲル濾過及び逆相を含むクロマトグラフィー技法が含まれる。精製方法には、また、電気泳動、免疫学的、沈降、透析、及び等電点電気泳動の技法が含まれる。タンパク質濃縮と共に限外濾過及びダイアフィルトレーション技法もまた有用である。ＴｒｋＡ抗体を精製するために、選択された宿主細胞を、例えばモノクローナル抗体精製用のスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過し、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーの前に濃縮することができる。溶出された抗体をゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィーによってチェックして、純度を確認することができる。このように、本発明の好ましい抗体は、ヒトＴｒｋＡに結合する単離及び／又は精製抗体である。
【００７９】
［イムノコンジュゲート］
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）又は放射性毒素などの治療剤に連結された、ヒトＴｒｋＡに結合するＴｒｋＡ抗体又はその断片を提供する。そのような複合体は、ここでは「イムノコンジュゲート」と呼ばれる。一又は複数の細胞毒を含むイムノコンジュゲートは、「免疫毒素」と呼ばれる。細胞毒又は細胞毒性剤には、細胞に有害な（例えば死滅させる）任意の薬剤が含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにそれらのアナログ又はホモログが含まれる。治療剤には、例えば代謝拮抗薬（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロフォスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））及び有糸分裂阻害薬（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）もまた含まれる。本発明の抗体と連結されうる治療用細胞毒の他の例には、デュオカルマイシン、カリチアマイシン、メイタンシン及びオーリスタチン、並びにそれらの誘導体が含まれる。カリチアマイシン抗体複合体の一例は、市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。細胞毒は、本発明の抗体と、当該技術分野において利用可能なリンカー技法を使用して連結することができる。抗体に細胞毒をコンジュゲートするために使用されているリンカー型の例には、非限定的に、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、及びペプチド含有リンカーが含まれる。例えばリソソーム区画内の低ｐＨによる切断に感受性であるか又はカテプシン（例えばカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの、腫瘍組織に優先的に発現されるプロテアーゼなどのプロテアーゼによる切断に感受性であるリンカーを選択することができる。細胞毒の型、リンカー及び抗体に治療剤をコンジュゲートするための方法の更なる考察については、Ｓａｉｔｏ Ｇ等，（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９〜２１５；Ｔｒａｉｌ ＰＡ等，（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８〜３３７；Ｐａｙｎｅ Ｇ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７〜２１２；Ａｌｌｅｎ ＴＭ（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２：７５０〜７６３���Ｐａｓｔａｎ Ｉ及びＫｒｅｉｔｍａｎ ＲＪ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ３：１０８９〜１０９１；Ｓｅｎｔｅｒ ＰＤ及びＳｐｒｉｎｇｅｒ ＣＪ（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７〜２６４も参照のこと。本発明の抗体は、放射性同位体に連結して、放射性イムノコンジュゲート（ラジオイムノコンジュゲート）とも呼ばれる細胞傷害性放射性医薬品を作製することもできる。診断又は治療的に用いるために抗体にコンジュゲートできる放射性同位体の例には、非限定的に、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０及びルテニウム１７７が含まれる。放射性イムノコンジュゲートを調製する方法は、当該技術分野において確立されている。放射性イムノコンジュゲートの例は、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（ＥＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及びＢｅｘｘａｒ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含めて市販されており、同様の方法を使用して、本発明の抗体を使用して放射性イムノコンジュゲートを調製することができる。本発明の抗体イムノコンジュゲートを使用して所定の生物学的応答を変更することができ、薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定して解釈されるべきでない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドでありうる。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素などの酵素活性毒素又はその活性断片；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−γなどのタンパク質；又は例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、もしくは他の増殖因子などの生物学的応答調節物質が含まれうる。
そのような治療剤を抗体に連結する技法は周知であり、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ等（編），２４３〜５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）中のＡｒｎｏｎ等，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等（編）、６２３〜５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）中のＨｅｌｌｓｔｒｏｍ等，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ'８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ等（編），４７５〜５０６頁（１９８５）中のＴｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ等（編）、３０３〜１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）中の「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、及びＴｈｏｒｐｅ等，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８頁（１９８２）を参照のこと。
【００８０】
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）又は放射性毒素などの治療剤と一緒に投与される、ヒトＴｒｋＡに結合する抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片を提供する。
【００８１】
［薬学的組成物］
別の態様では、本発明は、本発明の抗体又はその断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、一種もしくは組み合わせの（例えば２種以上の異なる）抗体、及び／又は本発明のイムノコンジュゲート、及び／又は上記のような細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）もしくは放射性毒素などの治療剤を含みうる。例えば、本発明の薬学的組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、又は相補的な活性を有する抗体（又はイムノコンジュゲート）の組み合わせを含みうる。本発明の薬学的組成物はまた併用療法において投与することもでき、すなわち以下に更に概説される他の薬剤と組み合わせることができる。
ここで使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性がある任意及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤、等張化及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体又はイムノコンジュゲートを材料中に入れてコーティングして、化合物を不活性化させる虞のある酸及び他の自然条件の作用からその化合物を保護することができる。薬学的に許容される担体には、無菌水溶液又は分散液、及び無菌注射液又は分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において知られている。任意の従来の媒質又は薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の薬学的組成物におけるその使用が考えられる。補助的活性化合物もまた組成物中に組み入れることができる。
【００８２】
別の態様では、本発明は、本発明のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体又はその断片と、別の薬学的に活性な薬剤とを含む組成物を提供する。好ましくは、薬学的に活性な薬剤は、以下に更に概説されるように、
ａ）鎮痛剤、ｂ）別の抗ＴｒｋＡ抗体、ｃ）ＮＧＦ、ｄ）抗がん剤、ｅ）抗ＮＧＦ抗体
の一又は複数である。
別の態様では、本発明は、治療剤に連結されたヒトＴｒｋＡに結合する抗体又はその断片を含むイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。使用できるイムノコンジュゲートと治療剤は、上記の通りである。
【００８３】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤もまた含みうる。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が含まれる。本発明の薬学的組成物に用いることができる適切な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料の使用、分散物の場合に必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。これらの組成物は、また、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの佐剤を含みうる。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順並びに様々な抗細菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有の両方によって確実にできる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含有させることが望ましいこともある。加えて、注射用医薬剤形の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の含有によってもたらされうる。
【００８４】
［治療的及び他の使用］
本発明の抗体は、以下の様々な項目で述べられるように、様々な障害／状態を治療するために医薬に使用することができる。
本発明は、従って、後述の病態の治療方法であって、それを必要とする対象、適切には哺乳動物対象、特にヒト対象に、ここに記載の抗体又は誘導体の治療有効量を投与することによりその病態が治療されることを含む方法を提供する。
本発明は、また、後述の病態の治療のための医薬の製造におけるここに記載の抗体又は誘導体の使用を提供する。
ここで、「治療」という用語には、既存の障害／病態の治療的処置が含まれる。この用語にはまた予防的処置も含まれる。この用語には、たとえ患者の所定の障害／病態が治癒されなくても、一又は複数の有害症状が改善することが更に含まれる。例えば、疼痛が緩和又は軽減されうる。
【００８５】
好ましい医学的使用は、疼痛の治療である。国際疼痛学会（「ＩＡＳＰ」）によると、疼痛は、一般に「実際のもしくは潜在的な組織損傷に関連する、又はそのような損傷により説明される、あるいはその両方である不快な感覚及び精神的体験」と定義されている。疼痛の全ての形態における必須の要素は、生物に潜在的な組織損傷を警告する専門の高閾値受容器及び神経線維の活性化である。炎症細胞及び炎症過程の関与は、多くの疼痛状態に共通の要素である。「急性疼痛」という用語は、切傷、挫傷、熱傷などの傷害、又は化学的刺激によってもたらされた、即時の、一般に高閾値の疼痛を意味する。ここで使用される「慢性疼痛」という用語は、炎症及び神経障害起源の両方の、急性疼痛以外の疼痛を意味する。慢性疼痛は、多くの場合に比較的長期間、例えば数か月又は数年であり、持続性又は間欠性でありうることが理解される。本発明の抗体は、慢性疼痛又は急性疼痛を治療するために使用することができる。慢性疼痛の治療が好ましい。
疼痛は、例えば次の何れかでありうるか、又はそれと関連しうる：炎症性疼痛、手術後疼痛、術後疼痛（歯痛を含む）、神経障害性疼痛、末梢神経障害、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、骨折痛、痛風性関節痛、帯状疱疹後神経痛、がん性疼痛、変形性関節症性又は関節リウマチ疼痛、坐骨神経痛、鎌状赤血球クリーゼ関連疼痛、頭痛（例えば片頭痛、緊張性頭痛、群発頭痛）、月経困難症、子宮内膜症、子宮筋腫、筋骨格痛、慢性腰痛、線維筋痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢腫、前立腺炎、慢性骨盤痛症候群、膀胱炎、間質性膀胱炎、有痛性膀胱症候群及び／又は膀胱痛症候群、慢性無菌性前立腺炎関連痛、切開痛、片頭痛、三叉神経痛、熱傷及び／又は創傷からの疼痛、外傷に関連する疼痛、筋骨格疾患に関連する疼痛、強直性脊椎炎、関節周囲の病状、骨転移由来の疼痛、ＨＩＶ由来の疼痛、皮膚紅痛症又は膵炎もしくは腎結石によって起こる疼痛、悪性黒色腫、シェーグレン症候群、喘息（例えば重症気道過敏症を伴う制御不能の喘息）、難治性咳嗽、脱髄疾患、慢性アルコール依存症、脳卒中、視床痛症候群、毒素由来の疼痛、化学療法由来の疼痛、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、炎症性眼疾患、炎症性又は不安定膀胱障害、乾癬、炎症成分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症状態、炎症性疼痛並びに関連する痛覚過敏及び異痛、神経障害性疼痛及び関連する痛覚過敏又は異痛、糖尿病性神経障害痛、灼熱痛、交感神経依存性疼痛、求心路遮断症候群、上皮組織損傷又は機能障害、呼吸器、尿生殖器、消化管又は血管領域での内臓運動障害、アレルギー性皮膚反応、掻痒症、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動性又はアレルギー性鼻炎、気管支障害、消化不良、胃食道逆流、膵炎、臓器痛及び線維性骨形成異常（ＦＤ）。
【００８６】
疼痛は、例えば次の何れかでありうるか、又はそれと関連しうる：膵炎、腎結石、子宮内膜症、ＩＢＤ、クローン病、術後癒着、胆嚢結石、頭痛、月経困難症、筋骨格痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢腫、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、術後疼痛、片頭痛、三叉神経痛、熱傷及び／又は創傷由来の疼痛、外傷に関連する疼痛、神経障害性疼痛、筋骨格疾患に関連する疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、関節周囲の病理、腫瘍性疼痛、骨転移由来の疼痛、ＨＩＶ感染。
疼痛を評価するための様々なモデルが知られており、抗体／その誘導体のスクリーニングに使用することができる。例えば、国際公開第００／７３３４４号に開示された痛覚ホットプレート試験を使用することができる。該実験は、ＭｃＭａｈｏｎ等，１９９５（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：７７４〜７８０）に従ってイムノアドヘシンとして抗体／誘導体を使用して実施することができる。抗体／誘導体は、成体ラットの後足に３週間皮下注入されるか、又は浸透圧ミニポンプによって注入される。痛覚感受性は、炎症又は神経の部分損傷後の痛覚過敏状況を模倣するホットプレート試験（Ｅｄｄｙ及びＬｅｉｍｂａｃｈ（１９５３）Ｊ．Ｐｈａｒ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１０７：３８５〜３９３）を使用して間隔をあけて評価される。そのような場合、痛覚刺激は、単純反射よりも高く統合された協応と推定する応答（足をなめる、及び／又はジャンプする）を誘導する。その試験によれば、動物は、ベースとして所望の温度、通常は５６℃に加熱されたプレートを有する檻に入れられる。対照動物（無関係の抗体で処置）と抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体で処置された動物において任意の２種の応答（足をなめる及びジャンプする）の潜時が測定される。
ホットプレート試験の代替として、ホルマリンに対する痛覚反応を評価することができる。この試験は、Ｐｏｒｒｏ及びＣａｖａｚｚｕｔｉ，１９９３（Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，４１：５６５−６０７）によって開示され、国際公開第０６／１３７１０６号において使用された。この試験は、試験前に所定の候補が投与されるときに、続いて起こる足をなめる行動の任意の低減を分析することによって、疼痛反応における低減を評価することを伴う。生理食塩水が典型的には陰性対照として使用される。
【００８７】
痛覚過敏の評価は、荷重負荷法を使用して決定することができる。マウスは、普通、２本の肢の間にその体重を等しく配分する。例えば後足（足底内）又は膝関節（関節内）へのフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）又はヨード酢酸一ナトリウム（ＭＩＡ）の局所注射による肢への有痛刺激後に、注射された肢にかける体重を減少させ、注射されていない肢にかける体重を増大させるように体重が再配分される。荷重負荷は、インキャパシタンステスターを使用して別々のセンサー上に置いた後足及び両方の後肢によって及ぼされる平均の力を記録して測定される。荷重負荷を使用して、それぞれ実施例２、３及び４に詳述されるように、ＣＦＡの足底内注射に起因する急性炎症性痛覚過敏、ＣＦＡの関節内注射に起因する慢性炎症性痛覚過敏、又はＭＩＡの関節内注射に起因する慢性変形性関節症性痛覚過敏を評価することができる。
機械的痛覚過敏の評価は、多くの方法、例えばフォンフレイ式フィラメント又はランダル−セリット式無痛覚計によって実施することができる。フォンフレイ式フィラメントにより後足底表面又はランダル−セリット式無痛覚計のくさび形プローブにより後足の背側表面に適用された漸増性圧刺激に応答する足挙げ閾値が測定される。後足挙げの潜時が、対照動物及び抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体で処置された動物において測定される。実施例５に詳述されるように、これらの方法を使用して、慢性絞扼損傷（ＣＣＩ）動物モデルに起因する機械的痛覚過敏を評価することができる。
【００８８】
ＣＣＩモデルもまたよく知られた動物モデルである。それは、坐骨神経の慢性絞扼を伴い、マウス又はラットなどの齧歯類における神経障害性の慢性疼痛を誘導するために使用される。このモデルは、Ｂｅｎｎｅｔｔ及びＸｉｅ，１９９８ Ｐａｉｎ ３３：８７〜１０７に記載されている。これは、例えば国際公開第０６／１３１５９２号に使用された。多くの神経障害性疼痛状態の主な特徴は、普通は無害の寒温刺激が疼痛を生じ始めることである。無痛刺激に対する反応増加は異痛（アロディニア）と呼ばれる。従って、実施例５に詳述されるように、誘導された神経障害性疼痛状態の程度は、異痛についてコールドプレート試験を使用して測定することができる。動物は、−５℃〜１５℃の範囲内でありうる所望の温度に冷却されたプレートを有する檻に入れられる。後足挙げの潜時が、対照動物及び抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体で処置された動物において測定される。典型的には、挙上の潜時は、５℃以下の表面温度でベースラインと異なるようになる。
【００８９】
抗体は、がん、ニューロン障害、アルツハイマー病、糖尿病、糖尿病性腎症、ウイルス疾患、ＨＩＶ媒介疾患、ハンセン病又は炎症性疾患の治療に使用することができる。加えて、抗体は、例えば、エリテマトーデス、帯状疱疹、帯状疱疹後神経痛、及び痛覚過敏を含む、ＮＧＦのレベル増加に関連しうる他の疾患の治療にも有用である。
様々ながんがＴｒｋＡを発現する。ＴｒｋＡとＮＧＦとの相互作用は、（例えば前立腺がん及び膵臓がんの）腫瘍発生に関与しうる。実際、ある形態のがんでは、過剰のＮＧＦが神経線維の成長及び浸潤を促進する場合がある。ＮＧＦの作用を遮断することによって、神経腫の形成を有意に低減することが可能である。更に、単に遮断効果を提供することの代替として、抗体を細胞傷害剤とカップリングさせることができ、ＴｒｋＡを発現しているがん細胞をターゲティングするために使用することができる。しかしながら、抗体を毒素とカップリングさせることは必要ではない。ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害作用）は、抗体が、ターゲット細胞を被覆することによって、それらを系による（例えばＴ細胞、補体活性化などによる）攻撃に脆弱にすることができる免疫応答が原因で生じる。治療される好ましいがんは、前立腺がん、甲状腺がん、肺がん、プロラクチノーマ、黒色腫又は骨転移に関連するがん性疼痛を含む骨がん性疼痛である。治療される好ましいがんは、骨転移に関連するがん性疼痛を含む骨がん性疼痛である。
【００９０】
抗体は、神経変性疾患を含む様々なニューロン障害の治療にも使用することができ、例えば、抗体を使用して神経腫の形成を低減させることができる。それらは、また、アルツハイマー病の治療又は神経再生療法において使用することができる。本発明の抗体は、そのような治療においてＮＧＦの望まれないアゴニスト作用を低減するために有用でありうる（以下の「併用療法」セクションもまた参照のこと）。更に、抗体は、上で検討されたように、神経障害性疼痛の治療に使用することができる。これは、神経系の病変又は機能障害と関連しうる。ＮＧＦは、糖尿病及びハンセン病の治療において潜在的用途を有するが、疼痛感受性の増大を含む望まれないアゴニスト特性を有し、これは、本発明の抗体を使用することによって回避されうる。
【００９１】
また更なる有用性は、炎症性疾患の治療においてである。ＮＧＦは、マスト細胞、線維芽細胞、及び炎症過程が起こる末梢部位内の他の細胞型によって放出される。特に、マスト細胞が基本的な役割を果たすようである。マスト細胞はＮＧＦを産生し、同時にその表面に機能的ＴｒｋＡ受容体を発現する。ＮＧＦ／ＴｒｋＡ系は、発痛性炎症シグナルの局所的増幅を可能にする自己分泌ポジティブフィードバックメカニズムによりマスト細胞活性化を媒介するようである。治療されうる炎症性疾患の例には、尿路及び骨盤部の炎症形態、変形性関節症、多発性硬化症、大腸炎、炎症性腸疾患、膀胱炎、湿疹、接触皮膚炎、慢性関節炎及び関節リウマチを含む関節炎、クローン病、乾癬並びに喘息が挙げられる。
本発明の抗体は、ＮＧＦの望まれないアゴニスト作用を低減する上述のような治療において有用でありうる。
【００９２】
本発明の抗体又はその誘導体は、併用療法において一又は複数の他の活性薬剤、例えば薬学的に活性な薬剤と一緒に使用することができる。それらは、医薬中での同時、連続、又は協調投与に使用されうる。
例えば、抗体又は誘導体は、鎮痛性オピオイド又は非オピオイド系鎮痛剤などの鎮痛剤と組み合わせることができる。国際公開第０６／１３７１０６号には、ＴｒｋＡの生物活性を遮断することができる少量の分子が、オピオイドの鎮痛効果を増強できることが開示されている。そのような鎮痛性オピオイドには、次のものから選択される一又は複数の化合物が含まれる：モルヒネ、コデイン、ジヒドロコデイン、ジアセチルモルヒネ、ヒドロコドン、ヒドロモルホン、レボルファノール、オキシモルホン、アルフェンタニル、ブプレノルフィン、ブトルファノール、フェンタニル、スフェンタニル、メペリジン、メサドン、ナブメトン、プロポキシフェン、ペンタゾシン；及びそれらの薬学的に許容される誘導体（例えばそれらの薬学的に許容される塩）。適切な非オピオイド系鎮痛剤には、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）並びにアセトアミノフェンなどの他の鎮痛剤が含まれる。急性炎症性疼痛を治療するために一般に入手可能なＮＳＡＩＤには、アスピリン、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン及びケトプロフェンが含まれ、慢性炎症性疼痛を治療するためのＮＳＡＩＤには、セレコキシブ及びメロキシカムが含まれる。
更なる組み合わせは、一又は複数の他の抗体と一緒にした一又は複数の本発明の抗体の組み合わせである。好ましい組み合わせは、一又は複数の他の抗ＴｒｋＡ及び／又は抗ＮＧＦ抗体との組み合わせである。そのような組み合わせは、単一の抗体での治療に比べて、ここで検討された一又は複数の疾患の治療において増大した効力をもたらしうる。例えば、ここで使用されるアッセイ手順においてその中で最も有効であることが見出された２種以上の抗体の組み合わせを使用することができる。
【００９３】
更なる組み合わせは、本発明の抗体のＮＧＦとの組み合わせである。上で検討されたように、アルツハイマー病、糖尿病、ハンセン病などを含む様々な疾患の治療におけるＮＧＦの使用が提案されてきたが、末梢標的に対するアゴニスト特性に起因する疼痛感受性の増大が指摘されていた。改めて、本発明の抗体又は誘導体を使用することによって、疼痛感受性を低減するができ、それによりＮＧＦに基づく治療をより魅力的にすることができる。
更なる組み合わせは、本発明の抗体と、例えばアルキル化剤、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、有糸分裂阻害薬、又は白金誘導体などの抗がん剤との組み合わせである。
【００９４】
本発明の抗体は、任意の適切な経路で投与することができる。これには、（非限定的に）腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、気管内、経口、経腸、非経口、鼻腔内、又は経皮投与が含まれる。
抗体は、典型的には液体製剤の注射（腹腔内又は頭蓋内、典型的には脳室内、又は心膜内もしくは滑液包内）又は固体製剤（丸剤、錠剤、カプセル剤の剤形）もしくは液体製剤（乳剤及び液剤の剤形）の摂取による局所適用のために投与することができる。
非経口投与用の組成物は、通常、適合性の、好ましくは水溶液に溶解された免疫グロブリンの溶液を含む。これらの製剤中の抗体／誘導体の濃度は、０．００５％未満から１５〜２０％ｗ／ｖまで変動しうる。濃度は、主に液体の体積、粘度などに応じて、また所望の特定の投与様式に応じて選択される。あるいは、抗体は、固体剤形での投与用に調製することができる。抗体は、異なる不活性物質又は賦形物質と組み合わせることができ、それらには、微結晶セルロース、ゼラチンもしくはアラビアゴムなどのリガンド；乳糖もしくはデンプンなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプンなどの薬剤；ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素などの滑沢剤；サッカロースもしくはサッカリンなどの甘味料；又はミント及びサリチル酸メチルなどの香料が含まれうる。他の医薬投与系には、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、リポソーム、マイクロカプセル、マイクロエマルション、ミクロスフェアなどが含まれる。
疾患が限局性である場合、疾患／それに近いものに冒された部位での直接の局所注射が、好ましい投与様式である。抗ＴｒｋＡ抗体は、適宜、全身投与される。全身投与は、注射、例えば連続静脈内注入、ボーラス静脈内注入、皮下又は筋肉内注射によって実施することができる。
【００９５】
あるいは、他の投与形態（例えば経口、粘膜、吸入、舌下など）もまた使用されうる。しかし、所望ならば、抗体／誘導体の送達は、患部組織近くへの局所投与（例えば、関節内注射又は皮下、筋肉内注射）によって実施されうる。
抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体は、適宜、意図された投与経路に適した薬学的組成物に製剤化される。注射液は、必要に応じて適切な緩衝剤及びモル濃度調整剤（例えばリン酸塩、塩及び／又はデキストロース）を含む水性媒体（例えば注射用水）中に溶解又は分散された抗体／誘導体を適宜含む。
治療方式（すなわち用量、タイミング及び反復）は、選択された投与経路による製品の単回又は反復投与（例えば注射）により表すことができる。
用量投与の間隔は、臨床応答の程度及び期間、並びに特定の個体及び個体の臨床歴に応じて変更されうる。
【００９６】
適切には、抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体は長い作用時間を有する。特に、投与後の抗体の臨床効果は、動物試験から決定して２１日という長さでありうる。更に、抗ＴｒｋＡ抗体は、その投与後にその存在が血清又は血漿などの関連する生体マトリックスから検出されうる期間よりも長い期間、臨床的有用性を現しうる。
意図された長い作用期間（すなわち、適宜少なくとも１週間、又は好ましくは少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間又は少なくとも４週間持続する効果）に照らして、抗体／誘導体は、適宜、１週間に１回以下、例えば２週間に１回以下又は３週間に１回以下又は４週間に１回以下の頻度で対象に投与されうる。
抗ＴｒｋＡ抗体／誘導体の適切な１日の用量は、典型的には、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。急性及び慢性炎症性疼痛の治療に適切な抗ＴｒｋＡ抗体の用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ（実施例２及び３参照）である。変形性関節症性疼痛の治療に適切な抗ＴｒｋＡ抗体の用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇである（実施例４参照）。神経障害性疼痛の治療に適切な抗ＴｒｋＡ抗体の用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１ｍｇ／ｋｇである（実施例５参照）。これらの用量は、マウスのみのインビボ状態に関係するものである。本発明は、急性炎症性疼痛の治療におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の使用であって、痛覚過敏がＮＳＡＩＤの投与で観察される程度と同じ程度まで効果的に回復される使用に関する。本発明は、また、慢性炎症性疼痛の治療におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の使用であって、痛覚過敏がＮＳＡＩＤの投与で観察される程度と同じ程度まで効果的に回復される使用に関する。本発明は、また、変形性関節症性疼痛の治療におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の使用であって、痛覚過敏がプレガバリン及びオピエートの投与で観察される程度と同じ程度まで効果的に回復される使用に関する。本発明は、また、神経障害性疼痛の治療におけるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体の使用であって、痛覚過敏がプレガバリンの投与で観察される程度と同じ程度まで効果的に回復される使用に関する。
【００９７】
次に具体的に腫瘍に関する投与を検討すると、投与は、腫瘍又は腫瘍部位近くの組織への直接及び局所注射による場合がある。全身投与では、用量は、１日０．０５ｍｇ／ｋｇから１日５００ｍｇ／ｋｇまで変動するが、その範囲のより低い領域にある投薬量が、投与が容易であるので好ましい。例えば抗体／誘導体の特定の血漿中レベルを保証するために投薬量を較正し（約５〜３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜１５ｍｇ／ｍＬの間の範囲）、臨床結果が達成されるまでこのレベルを所定期間維持することができる。
膵臓又は前立腺腫瘍の病期を測定し又は評価するための効果的な方法は、血中前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の測定、膵臓腫瘍では生存期間の測定、両方の腫瘍型の場合には、転移の拡散の減速又は阻害の測定に基づく。
腫瘍部位レベルでの直接注射では、投薬量は、多くの他の変数と共に、腫瘍の型、病期、及び体積を含む異なる要因に依存する。
腫瘍体積に応じて、典型的な治療用量は、０．０１ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬの注射と変動し得、それら注射は必要な頻度で施されうる。
【００９８】
治療の性質が何であろうと、ヒト化抗体は、非ヒト化抗体よりもずっとゆっくりと排出され、有効血漿中濃度を維持するためにより低い投薬量を必要としうる。更に、高親和性抗体を用いると、低親和性を有する抗体よりも頻度が低く、大きさが小さい場合がある。
各抗体／誘導体の治療的に有効な投薬量は、熟練の医師による治療の間に決定されうる。必要ならば、投薬量は、減少（例えば副作用を低減するため）又は増大（治療効果を増大させるため）させることができる。
投与前に、本発明の抗体調製物は、凍結又は凍結乾燥することによって保存することができる。次に、それらを使用直前に適切な緩衝剤に入れて再構成することができる。凍結乾燥及び再構成は、活性喪失を招くおそれがあることを考えれば、この事実を埋め合わせるために抗体の投与レベルを較正することができる。（一般的免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも大きく活性を喪失する傾向にある。）
抗体がある保存期間を過ぎて使用されないように、有効期間がまた指定されうる。
【００９９】
本発明の抗体又はその誘導体は、医学的使用に関連して上で検討した何れかの疾患／病態の診断又は予後に使用することができる。
例えば、それを、アルツハイマー病などの反乱の早発マーカーのようなＴｒｋＡ陽性腫瘍マーカーの検出を容易にするために使用することができる。
それは、また、ＣＩＰＡ（「先天性無痛無汗症」）の診断に使用することができる。これは、再発する突発性の発熱、無汗症、痛覚刺激に対する反応不在、精神遅滞及び自傷傾向によって特徴づけられる遺伝的劣性常染色体症候群である。それは、ＴｒｋＡ遺伝子の突然変異に起因する。実際、本発明の抗体又は誘導体は、ＴｒｋＡの異常発現（健康な個体もしくは健康な組織試料中のＴｒｋＡの発現に比べて）を伴う広範囲の状態又はＴｒｋＡを伴う異常活性の診断又は予後に使用することができる。従って、本発明は、その範囲内に患者から得られた生物学的試料を得ることと、その試料を本発明の抗体又は誘導体と接触させることを含む方法を含む。所望ならば、抗体／誘導体は固定化されうる。次に、その方法は、前記試料への抗体／誘導体の結合を定量的又は定性的にアッセイすることを含みうる。所望ならば、これは、基準と共に、及び／又は陽性対照（健康な状態を示す）もしくは陰性対照（疾患の存在／見込みを示す）に対して行うことができる。診断目的では、抗体は、両方とも検出可能なマーカーでマークすることができ、又はマークしなくてもよい。（「マーカー」という用語は、ここでは、ラベル又は任意の他の検出可能な部分／検出可能な変化をトリガーできる部分を含んで使用される。）
【０１００】
［製造品及びキット］
本開示の別の実施態様では、製造品は、一又は複数の上述の疾患／病態の治療のための、本発明の抗体もしくはその断片、組成物、又はイムノコンジュゲートを含む。製造品は、容器と、容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含みうる。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、又はシリンジが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、病態の治療に有効でありうる組成物を収容し、無菌アクセスポートを有しうる（例えば容器は、皮下注射針で刺通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤が、ここに記載の抗体でありうる。ラベル又は添付文書は、選択された病態の治療に組成物を使用できることを示している場合がある。
更に、製造品は、（ａ）ここでの抗体を含む組成物がその中に入れられた第１の容器と、（ｂ）抗体以外の治療剤を含む組成物がその中に入れられた第２の容器を含みうる。本開示のこの実施態様における製造品は、第１及び第２の組成物を併用できることを示す添付文書を更に含みうる。そのような治療剤は、前節に記載の任意の補助療法でありうる（例えば、血栓溶解剤、抗血小板剤、化学療法剤、抗血管新生剤、抗ホルモン化合物、心保護薬、及び／又はサイトカインを含む哺乳動物における免疫機能の調節因子）。あるいは、又は追加的に、製造品は、薬学的に許容される緩衝剤、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３）の容器を更に含みうる。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の物質を更に含みうる。
また本発明の範囲内に入るのは、本発明の抗体、組成物又はイムノコンジュゲートと、使用説明書とを含むキットである。キットは、免疫抑制試薬、細胞傷害性薬剤、もしくは放射性毒性剤などの一又は複数の追加的な試薬、又は一又は複数の追加的な本発明の抗体（例えばＴｒｋＡ抗原中のエピトープに結合する相補的活性を有する、第１の抗体と別個の抗体）を更に含みうる。
【０１０１】
更なる説明なしに、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して本開示の薬剤を製造しかつ利用し、請求項記載の方法を実施することができると考えられる。次の実施例は、本開示の実施を容易にするために提供されるものであり、決して本開示の残りを限定するものと見なすべきではない。
【実施例】
【０１０２】
ここに記載のヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は、抗ＴｒｋＡ抗体の新規なサブグループであり、ＴｒｋＡの機能活性化の阻害に非常に効果的である。国際公開第００／７３３４４号に開示されたＭＮＡＣ１３として知られている抗ＴｒｋＡマウスモノクローナル抗体と、国際公開第０９／０９８２３８号に開示されたそのヒト化変異体は、所定の状況下、例えば、阻害レベルが高いと治療効果を増大することができる疼痛及びがん関連疼痛の治療で望まれる同じ阻害レベルを達成することはできない。従って、高度のＴｒｋＡの阻害を示すヒト化抗ＴｒｋＡ抗体を開発することが所望されている。
【０１０３】
ＴｒｋＡの機能的活性化の抗体媒介阻害性の評価方法は、当該分野ではよく知られており、細胞表面ＴｒｋＡ／β−ＮＧＦ媒介細胞増殖を遮断する抗体の能力が因子依存性ヒト赤白血病細胞株ＴＦ−１を使用してアッセイされるＴＦ−１細胞増殖アッセイが含まれる（Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ等，（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １４０（２）：３２３〜３４）。国際公開第０９／０９８２３８号に開示されたヒト化抗体は、ＴＦ−１増殖アッセイにおいて阻害活性を示し、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１候補は、ＭＮＡＣ１３マウス抗体のヒト化変異体の中で最も高い阻害度を有する。加えて、国際公開第０９／０９８２３８号に開示されたヒト化抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して、ＴｒｋＡの細胞外領域に直接結合することが示された。従って、ヒトＴｒｋＡに対する結合親和性が改善され、更に重要なことにはＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいてＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ヒト化変異体よりも阻害能力が改善されたマウスＭＮＡＣ１３抗体の新規ヒト化変異体を設計するために、国際公開第０９／０９８２３８号に開示されたヒト化抗体から選択されたサブセットを操作の開始点として使用した。
【０１０４】
「ＢＸｈ」に続く文字は、ＶＨ又はＶＬ又はその両方である。ＶＨ又はＶＬはそれぞれ、特定の数字によって表された特定の重鎖可変ドメイン、例えば、ＢＸｈＶＨ５を備えたＩＧＨＧ１アイソタイプを有する重鎖、又は特定の数字によって表された特定の軽鎖可変ドメイン、例えば、ＢＸｈＶＬ１を備えたカッパアイソタイプを有する軽鎖を示す。特定の数字を有するＶＨ並びに特定の数字を有するＶＬの両方を「ＢＸｈ」の後に表す場合、例えば、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１は、重鎖及び軽鎖の特定の組み合わせからなる特定の抗体分子を示しており、例えば、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１抗体は、ＢＸｈＶＨ５重鎖とＢＸｈＶＬ１軽鎖を有する抗体のことを指す。国際公開第０９／０９８２３８号に記載されたＶＨ及びＶＬ可変ドメインの選択されたサブセットに基づいて新たに操作されたヒト化変異体は、「ＧＢＲ」抗体と称される。反対に、同じ命名法はＧＢＲ抗体に関しても有効である。ここで使用される可変重鎖ドメイン内でなされた特定の置換は更に括弧内に示される。ＧＢＲ抗体は全て、別の定義が記載されない限り、カッパアイソタイプ軽鎖を備えたＩＧＨＧ１重鎖アイソタイプであった。
【０１０５】
実施例１：抗体エンジニアリング
国際公開第０９／０９８２３８号に開示された４０種類の抗体のうち、５種類のヒト化抗体を操作のための入力として選択した：重鎖可変ドメインＶＨ１（配列番号：１）と軽鎖可変ドメインＶＬ１（配列番号：６）を有するＢＸｈＶＨ１ＶＬ１、重鎖可変ドメインＶＨ３（配列番号：３）と軽鎖可変ドメインＶＬ１を有するＢＸｈＶＨ３ＶＬ１、重鎖可変ドメインＶＨ３と軽鎖可変ドメインＶＬ３（配列番号：８）を有するＢＸｈＶＨ３ＶＬ３、重鎖可変ドメインＶＨ５（配列番号：５）と軽鎖可変ドメインＶＬ１を有するＢＸｈＶＨ５ＶＬ１、並びに重鎖可変ドメインＶＨ５と軽鎖可変ドメインＶＬ１を有するＢＸｈＶＨ５ＶＬ３。ここで使用されるＭＮＡＣ１３マウス抗体は、配列番号：２０の重鎖可変ドメインＭＮＡＣ１３ＶＨ、配列番号：２１の重鎖、及び配列番号：２２の軽鎖を有する。
驚くべきことに、操作した抗体は全て、重鎖可変ドメインの３７位（Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔ ＥＡ等，同著）のバリンからアラニンへの単純な変化（マウス逆突然変異）によって利益を得る。この置換は、ＳＰＲによって測定したところ、操作した抗体全ての中でもヒトＴｒｋＡの親和性を広く増強する独特の特性を有していた。より重要なことに、同置換が、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて殆どの変異体に能力の増加をもたらし、予期せぬことに、ＶＬ１ドメインと対をなしたＶＨ５ドメイン（ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体）に導入すると、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ヒト化抗体と比較して１０倍の増加であった。特に、同ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体はまた、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて、ＭＮＡＣ１３マウス抗体と比較したとき３倍の能力増加を示した。
【０１０６】
ヒト化抗体中のマウス由来の残基の数が増加すると、免疫原性の危険性が増加する可能性があるので（Ｈａｒｄｉｎｇ ＦＡ等，（２０１０）ＭＡｂｓ ２（３）：２５６〜６５）、操作した抗体におけるマウス残基の数を低下させるために更に研究を行った。ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体において、３位のマウス残基リシンをグルタミンに変化させることによって、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１ヒト化抗体と比較して同数のマウス残基を有するが、結合親和性が増加し、親マウスＭＮＡＣ１３抗体とＦＡＢ熱安定性が同等で、阻害能力が増加したＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体が生じた。
最後に、抗体媒介性エフェクター機能は、ＴｒｋＡ遮断のみが必要な治療には有害になりうるので、免疫細胞によってＴｒｋＡ発現細胞の死滅を媒介することなく、ＴｒｋＡを阻害する抗ＴｒｋＡ抗体を開発することが望ましい。ヒトＩＧＨＧ４アイソタイプは、ＡＤＣＣ又はＣＤＣなどのエフェクター機能を有さず、エフェクター機能が必要ないか、又は治療に有害である場合、それ自体特に適した抗体形式である。しかし、天然に生じるヒトＩＧＨＧ４アイソタイプの一つの欠点は「ＦＡＢ交換」現象で、それによって天然に生じるヒトＩＧＨＧ４がインビボで重鎖を交換することが知られている（Ｌａｂｒｉｊｎ ＡＦ等，（２００９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７６７〜７１）。組換えＩＧＨＧ４と内在性ヒトＩＧＨＧ４と間の重鎖交換を遮断する方法は当該分野で知られており、交換はヒンジ領域に位置する２２８位のセリン残基をプロリン残基に置換することによって効率よく遮断され（ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ，Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭ等，同著）、それによってヒトＩＧＨＧ１アイソタイプに見い出される立体的ヒンジ構造が模倣されることが知られている（Ｌｅｗｉｓ ＫＢ等，（２００９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６（１６）：３４８８〜９４）。ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１及びＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１は両方とも、前述の治療目的のためにＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ免疫グロブリンとしてフォーマットされ、その対応するＩＧＨＧ１アイソタイプと同等の能力を示し、それによってＴｒｋＡ遮断のみが必要とされるヒト治療に適したＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ及びＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ抗体の両方が作製される。
【０１０７】
［方法］
（操作した変異体の設計）
可変ドメインのＶＨ５−ＶＬ１対の３Ｄモデルは、自動モードに設定された構造相同性モデリングサーバーＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（Ａｒｎｏｌｄ Ｋ等，（２００６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２（２）：１９５〜２０１；ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）を使用して計算した。検索されたモデルテンプレートは、実験的に解明されたＭＮＡＣ１３ ＦＡＢ ３Ｄ構造（ＰＤＢコード１ＳＥＱ，ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ，Ｂｅｒｍａｎ ＨＭ等，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１）：２３５〜４２，Ｃｏｖａｃｅｕｓｚａｃｈ Ｓ等，（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５８（３）：７１７〜２７）であった。ＭＮＡＣ１３ＶＨ、ＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５及び生殖系列ＶＨ３−０２３*０１（配列番号：２３）ドメインの配列アラインメントは、３、５、１９、３７、４０、４２、４４、４９、５０、５２Ａ、５３、６０、６２、７４、８２Ａ、８３、８４、８９、及び９４位（Ｋａｂａｔ番号付け）の位置において異なるアミノ酸含量を示した。モデル解析によって、ＣＤＲ領域及び／又は重鎖−軽鎖可変ドメイン充填に対して予測される影響に基づいた位置のサブセットの選択が可能となった。この位置のサブセットは、３、３７、４０、４２、４４、４９、５０、６０、６２、８９、及び９４（Ｋａｂａｔ番号付け）から構成された。従って、操作した抗体は、前述の位置のサブセットから選択された前述の可変ドメイン配列（それぞれ配列番号：１、３、５を有するＶＨ１、ＶＨ３、及びＶＨ５）に単一又は複数の位置の置換を包含する重鎖可変ドメインを有していた。より具体的には、操作した抗体は、既に記載した２つの軽鎖可変ドメインＶＬ１又はＶＬ３（配列番号：６及び８）の１つと組み合わせた上述のような置換された重鎖可変ドメインから構成された。
【０１０８】
（分子生物学）
操作された重鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を、国際公開第０９／０９８２３８号に記載されたＢＸｈＶＨ１、ＢＸｈＶＨ３及びＢＸｈＶＨ５のベクターＤＮＡをＰＣＲ鋳型として使用して、標準的突然変異誘発技法によって作出した。同様に、軽鎖可変ドメインｃＤＮＡを、国際公開第０９／０９８２３８号に記載されたＢＸｈＶＬ１及びＢＸｈＶＬ３のベクターＤＮＡから直接増幅した。可変ドメインｃＤＮＡを、ＰＣＲアセンブリ技術を使用して、それらのそれぞれの定常ドメインｃＤＮＡ配列（複数可）の上流で更に組み立てた。最後に、完全重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する修飾ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）をベースにした独立ベクターにライゲーションした。軽鎖特異的ベクターは、ＢａｍＨＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素部位を使用して、カッパ軽鎖定常ドメインｃＤＮＡの前に対象の軽鎖可変ドメインｃＤＮＡを連結することによって、カッパアイソタイプ軽鎖の発現を可能にしたが、重鎖特異的ベクターは、ＢａｍＨＩ及びＳａｉＩ制限酵素部位を使用して、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１、ＩＧＨＧ１ヒンジ領域、ＩＧＨＧ１ ＣＨ２及びＩＧＨＧ１ ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の前に対象の重鎖可変ドメインｃＤＮＡをライゲーションすることを可能にするように操作された。重鎖及び軽鎖両方の発現ベクターにおいて、分泌は、ＢａｍＨＩ部位を含むマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより駆動した。ＢｓｉＷＩ制限酵素部位は、カッパ定常ドメイン中にあり、ＳａｌＩ制限酵素部位は、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメイン中で見い出される。
置換Ｓ２２８Ｐを有するＩＧＨＧ４免疫グロブリンフォーマットは、前述の重鎖特異的ベクターにおいて、ＩＧＨＧ１ ＣＨＩ、ＩＧＨＧ１ヒンジ領域、ＩＧＨＧ１ ＣＨ２及びＩＧＨＧ１ ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列をＩＧＨＧ４ ＣＨ１、Ｓ２２８Ｐ置換を有するＩＧＨＧ４ヒンジ領域、ＩＧＨＧ４ ＣＨ２及びＩＧＨＧ４ ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列と置き換えることによって達成した。置換Ｓ２２８Ｐは、標準的ＰＣＲ突然変異誘発技法によって、ヒトＩＧＨＧ４重鎖ｃＤＮＡ鋳型に導入された。
【０１０９】
（抗体産生）
抗体を一過的に発現するために、懸濁に適応されたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）にポリエチレンイミン（ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、等量の重鎖及び軽鎖ベクターを同時にトランスフェクトした。典型的には、１ｍｌ当たり８０〜１２０万細胞の密度で懸濁した細胞１００ｍｌを、重鎖をコードする発現ベクター５０μｇ及び軽鎖をコードする発現ベクター５０μｇを含むＤＮＡ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）混合物でトランスフェクトする。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入すると、抗体が、細胞を更に４から５日間培養して、０．１％プルロニック酸、グルタミン４ｍＭ及びジェネテシン０．２５μｇ／ｍｌを補填した培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３，ＨＥＫ２９３無血清培地：Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に分泌させて産生する。
抗体は、組換えプロテインＡストリームライン媒体（ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ｍｅｄｉａ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して無細胞上清から精製し、アッセイ前にリン酸緩衝生理食塩水に緩衝剤を交換した。
【０１１０】
（示差走査熱量測定を使用する安定性試験）
熱量測定を、ＶＰ−ＤＳＣ示差走査マイクロ熱量計（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実施した。セル容量は０．１２８ｍｌであり、加熱速度は２００℃／ｈであり、過剰圧力は６５ｐ．ｓ．ｉ．に維持した。全ての抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。各タンパク質のモル熱容量は、タンパク質を除いた同一の緩衝剤を含む２連の試料との比較により推定した。部分モル熱容量及び融解曲線を、標準的手順を使用して分析した。サーモグラムをベースライン補正し、濃度で標準化した後、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ｖ７．０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で非二状態モデルを使用して更に解析した。
【０１１１】
（ＳＰＲによる親和性の測定）
ＳＰＲ分析を使用して、様々な抗体（マウス及びヒト化抗体）の結合動態の結合及び解離速度定数を測定した。マウス抗体及びヒト化変異体の結合動態は、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で室温にて測定し、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ｖ４．１，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で解析した。
抗体は２価分子であるので、抗体をセンサーチップ上に固定することが最も良い。抗体を分析物として使用する場合、ＳＰＲ測定には、親和性に加えて結合価成分も関与する。ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアは、二価性をモデル化し、親和性定数を引き出すことができるが、できる限り一価分析物で操作することによってあらゆる結合価の影響を回避することが好ましい。この目的のために、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞中で作製した組換えヒトＴｒｋＡ−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号：２４）の消化によって、一価型のヒトＴｒｋＡ細胞外領域を作製した。融合タンパク質は、ＩＧＨＧ１ Ｆｃ領域に融合したヒトＴｒｋＡ細胞外領域（配列番号：２５）から構成され、プロテアーゼ特異的切断配列（ＴＥＶ切断プロテアーゼアミノ酸配列：ＥＮＬＹＦＱＳ）が２つの領域間に含まれていた。プロテアーゼ切断後、Ｆｃ断片を除去するためにプロテインＡ工程を含む標準的クロマトグラフィー技術を使用して、一価型のヒトＴｒｋＡ細胞外領域を更に精製して均一にした。最後に、一価ヒトＴｒｋＡ細胞外領域タンパク質を、緩衝剤をＰＢＳに交換した後、親和性測定のためにＢｉａｃｏｒｅランニング緩衝剤で希釈した。試料純度、均一性及び分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除分析によって確認した。
【０１１２】
抗体を、センサーチップ表面への正確な方向付けを可能にするために、そのＦｃ部分を捕捉することによって固定した。マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体センサーチップを使用して、そのアイソタイプに関わらずヒト化抗体全てを捕捉し（ヒト抗体捕捉キット，カタログ番号ＢＲ−１００８−３９，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）、ウサギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体センサーチップを使用して、ＭＮＡＣ１３マウス抗体を捕捉した（マウス抗体捕捉キット，カタログ番号ＢＲ−１００８−３８，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）。
データ（センサグラム：ｆｃ２−ｆｃｌ）を、物質移動試験では物質移動制限が殆どないにもかかわらず、物質移動ありの１：１ラングミュアモデルにフィットさせた。それぞれの測定の開始時に捕捉抗体における実験的な変動を説明するために、Ｒｍａｘ値を全てのフィットにおいてローカルに設定した。解離時間は少なくとも３５０秒間であった。測定は、３回繰り返し実施し、参考のためにゼロ濃度試料を含めた。Ｃｈｉ２及び残存値の両方を用いて、実験データと個々の結合モデルとの間のフィットの質を評価した。
【０１１３】
（ＴＦ−１細胞での増殖アッセイ）
懸濁に適応させたＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２００３）を、１０％のＦＣＳ及び５ｎｇ／ｍｌのｒｈｕβＮＧＦ（組換えヒトベータ−ＮＧＦ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）を含む完全ＲＰＭＩ培地で増殖させた。アッセイのために、ＴＦ−１細胞を、ヒトベータＮＧＦを含まない完全ＲＰＭＩ中で５時間インキュベートした。この飢餓段階の後、細胞を遠心分離し、様々な濃度の各抗体及び固定濃度の組換えベータＮＧＦを含む平底９６ウェルプレートに播種した。ＴＦ−１細胞を７０００細胞／ウェルの密度で播種し、抗体−細胞混合物の全体積は２００μｌで、ヒトベータＮＧＦは５ｎｇ／ｍｌ（最終濃度）であった。この混合物を、ＣＯ2を補給して３７℃で４日間インキュベートした。３日目に、インキュベーション条件には如何なる変更も行わずに、比色定量用色素アラマーブルー（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡｂＤ ＧｍｂＨ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を各ウェルに添加した。４日目に、蛍光をＢｉｏ−Ｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）２分光光度計／マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ，Ｌｕｚｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、励起波長５３０から５６０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍで読み取った。実験は、少なくとも２回実施し、各抗体濃度の測定は３連で行った。
【０１１４】
［結果］
（ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１をベースにした新規ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体のエンジニアリング）
可変ドメインのＶＨ５−ＶＬ１対の３Ｄモデルをベースにして、様々な重鎖可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＨ３、及びＶＨ５）内の共通の３Ｄ位置のサブセットをマウスからヒト並びにヒトからマウスへの突然変異のために選択した；この群は３、３７、４０、４２、４４、４９、５０、６０、６２、８９、及び９４（Ｋａｂａｔ番号付け）の位置から構成された。ここで使用された置換の組み合わせに関する操作方策は、ＣＤＲ領域及び／又は可変ドメイン充填及び／又は免疫原性に対してその推定される影響に関する様々な置換の相補性に基づいている。
最初のアプローチでは、マウスからヒト及びヒトからマウスへの突然変異は、ＩＧＨＧ１アイソタイプ形式のＢＸｈＶＨ５ＶＬ１候補において操作した。実施したマウスからヒトへの突然変異には、次の置換：Ｋ３Ｑ、Ｔ４０Ａ、Ｒ４４Ｇ、Ａ４９Ｓ、Ｙ５０Ａ、Ｐ６０Ａ、Ｔ６２Ｓ、及びＲ９４Ｋが含まれた。これら１個の置換又は置換の組み合わせをベースにして操作した抗ＴｒｋＡ抗体の幾つかの生成収率及び親和性をそれぞれ表１及び２に示す。マウスからヒトへの突然変異の殆ど又は全てを一緒にすると、生成収率は不十分になり、ＴｒｋＡに対する結合の完全な消失が引き起こされた。例えば、マウスからヒトへの置換Ａ４９ＳをＹ５０Ａと一緒にすると、結合の完全な抑止が誘導され、その他のマウスからヒトへの置換では復帰せず、マウスからヒトへの置換Ｋ３Ｑ、Ｔ４０Ａ、Ｒ４４Ｇ、及びＲ９４Ｋは、単独でも、又はその他のマウスからヒトへの置換と組み合わせても、親和性の如何なる改善も引き起こさなかった。
実施したヒトからマウスへの突然変異には、次の置換：Ｖ３７Ａ、Ｇ４２Ｅ、及びＶ８９Ｌが含まれた。ヒトからマウスへの置換Ｖ３７Ａは、最も正の影響をもたらし、親和性の少なくとも２倍の増加を引き起こし（ＫDは少なくとも２倍減少する）（表２及び図１）、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ１抗体では親和性の２．５倍の増加が記録された。この親和性の増加は、ヒトからマウスへの置換Ｖ３７Ａとマウスからヒトへの置換Ｐ６０Ａ及びＴ６２Ｓを一緒にすると抑止されるが、マウスからヒトへの置換Ｋ３Ｑ及び／又はＲ４４Ｇと組み合わせると維持された。
これらの結果を一緒に考えると、結合を可能にするために４９位及び５０位が重要であること、及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ１の親和性を少なくとも２倍増強するのにヒトからマウスへの置換Ｖ３７Ａが特有の特性を有することが確認された。抗体媒介性エフェクター機能は、ＴｒｋＡ遮断のみが必要な治療では有害になりうるので、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１及びＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１は両方とも、Ｓ２２８Ｐ置換を有する前述のＩＧＨＧ４アイソタイプに再フォーマットした。操作した両抗体は、そのＩＧＨＧ１アイソタイプ対応物に類似の親和性を示し、Ｖ３７Ａ置換によってもたらされた親和性の改善は、アイソタイプスイッチによっては影響を受けないことが示された。
【０１１５】
（ＢＸｈＶＨ１ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ１、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ１及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ３をベースにした新規ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体のエンジニアリング）
第２のアプローチでは、Ｖ３７Ａ置換を国際公開第０９／０９８２３８号から得られた他の選択候補に導入し、操作された抗ＴｒｋＡ抗体の親和性をＢＸｈＶＨ５ＶＬ１及びＭＮＡＣ１３抗体に対してＳＰＲによって評価した。表３及び４はそれぞれ、Ｖ３７Ａを置換した抗体の生成収率及び親和性を示す。操作した抗体はその生成収率が異なるが、操作した抗体は全て、Ｖ３７Ａ置換を導入することによって親和性の増強を示した。親和性は、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ１では８％、ＢＸｈＶＨ１ＶＬ１では２０％、ＢＸｈＶＨ３ＶＬ３では３０％、及びＢＸｈＶＨ５ＶＬ３では５５％改善した。従って、ヒトからマウスへの置換Ｖ３７Ａは、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１に導入した場合、親和性の増加を引き起こすだけではなく、最も驚くべきことに、全ヒト化変異体に対する親和性の増加を引き起こした。特に、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１又はＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１は両方とも、ＩＧＨＧ１又はＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐアイソタイプとして、ＭＮＡＣ１３マウス抗体で測定された親和性に匹敵する親和性を示し（表２及び４）、両方とも、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１抗体と比較した場合、少なくとも２倍増加した（ＫDはそれぞれ、２．５から２．７倍に減少した）。
表３及び図２は、操作した抗体内で測定されたＦＡＢ部分の融解温度を含む。モノクローナル抗体融解プロファイルは、それらのアイソタイプに特徴的であるが、ＦＡＢ断片の中点融解温度（Ｔｍ）は、全長免疫グロブリンの関係においてさえも簡単に同定できる（Ｇａｒｂｅｒ Ｅ ａｎｄ Ｄｅｍａｒｅｓｔ ＳＪ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５（３）：７５１〜７）。ＦＡＢ部分のこのような中点融解を使用して、操作候補の安定性をモニターした。ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１及びＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＦＡＢ断片はそれぞれ、７３．６及び７３℃でそれぞれ１回移行を示し、密に折り畳まれたＦＡＢ断片について通常観察される協同的アンフォールディングと一貫するＦＡＢ転移の形状及び振幅を示す同等の熱安定性を有し、この操作方法がＦＡＢ安定性の保持に成功したことを示した。これは、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１又はＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１のＦＡＢ ＴｍをＭＮＡＣ１３ ＦＡＢ Ｔｍ（７４℃）と比較したとき更に実証され、差は１℃以内である。
【０１１６】
（操作した抗ＴｒｋＡ抗体の機能試験）
操作した抗ＴｒｋＡ抗体が、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて、ＴｒｋＡの機能的活性化を阻害する能力をアッセイした（図３）。生物学的機能を阻害する化合物の有効性の基準である最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を各曲線について計算し、結果を表５にまとめる。ＧＢＲ ＶＨ１（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１は、ＳＲＰによるその親和性が低いため、アッセイしなかったことに留意されたい。
ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１が最も性能がよく、同一のＩＣ５０を有するＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ、及びＧＢＲ ＶＨ３（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１がその次であることが見い出された。ＧＢＲ ＶＨ３（Ｖ３７Ａ）ＶＬ３及びＧＢＲＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ３抗体は、僅かにＩＣ５０が高いが、試験した操作抗体は全て、ＢＸｈＶＨ５ＶＬ１よりも性能が良く、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１は１０倍優れていた。特に、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｖ３７Ａ）ＶＬ１抗体はまた、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて、ＭＮＡＣ１３マウス抗体と比較して３倍の能力増加を示した。Ｖ３７Ａ変異体は全て、マウス親抗体と比較した場合、ＩＣ５０は同等以上であった。
【０１１７】
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【０１１８】
2018505853.tif 000003
【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
実施例２：ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体はＣＦＡの足蹠注射によって誘発された足の急性炎症性痛覚過敏を回復させる
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）をマウスの後足の一方に足蹠注射することによって、荷重負荷法を使用して評価することができる急性炎症性痛覚過敏を引き起こす。ナイーブマウスは、通常、体重を２本の後足の間に等分に分配する。しかし、ＣＦＡを注射した後足が炎症を起こして痛みがある場合、注射した足（同側）にかかる体重を少なくし、注射されていない（反対側）の後足にかかる体重を増加させるように体重が再配分される。
【０１２３】
（方法）
各後肢にかかる荷重負荷を、インキャパシタンステスター（Ｌｉｎｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を使用して測定した。マウスをインキャパシタンステスターに置き、後足を別々のセンサー上に載せ、両後肢によって生じる平均力を２秒間記録した。ナイーブＡＭＢ１マウスは、そのホームケージの処置室に馴化させ、食物と水は自由に取らせた。ＡＭＢ１マウスは、マウスＴｒｋＡのエキソン１をヒト対応物のエキソン１と置き換えることによって作製したもので、それ自体は専らヒトＴｒｋＡタンパク質を発現する。インキャパシタンステスターへの慣化を、数日間かけて実施した。ベースラインとなる荷重負荷は、傷害を誘導する前に記録した。炎症性痛覚過敏は、ＣＦＡ（１．５ｍｇ／ｍｌ溶液２０μｌ）を左後足に足蹠注射することによって誘発させた。処置前の荷重を、ＣＦＡの２３時間後の痛覚過敏を評価するために読み取った。次に、動物は、ラテン方格法のＣＦＡウインドウに従って順位付けし、無作為化した。ＣＦＡの２４時間後、動物をアイソタイプ対照０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．又は抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ、０．０００１、０．００１、０．０１及び０．１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．（１０ｍｌ／ｋｇ用量体積）の単回ｉ．ｐ．注射で処置した。非選択的ＮＳＡＩＤインドメタシンを陽性対照として１０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．（５ｍｌ／ｋｇ用量体積）で使用した。荷重負荷は、抗体／薬物処理の４、８、２４、４８、７２、９６及び１２０時間後に読み取った。
行動評価はブラインドで実施した。荷重負荷（ｇ）は、同側及び反対側後足両方で読み取り、％荷重差負荷（％同側／反対側）で表した。データは、各時点で処理群をアイソタイプ対照群と比較することによって分析した。統計学的分析は、反復測定ＡＮＯＶＡについでＩｎＶｉｖｏＳｔａｔを使用する計画的比較試験として実施した（ｐ＜０．０５は有意と見なした）。
【０１２４】
（結果）
ＣＦＡの足蹠注射によって、ＣＦＡの２３時間後に、同側から反対側後足へ荷重負荷がシフトし、％同側／反対側比の下降が生じることによって検出された著しい痛覚過敏が誘発された（図４）。ＣＦＡの２４時間後に開始したアイソタイプ対照による処置では、痛覚過敏に対する影響は示されなかった。痛覚過敏の著しい回復は、アイソタイプ対照と比較した場合、投与の４〜４８時間後に抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの０．０１及び０．１ｍｇ／ｋｇで観察された。抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの０．００１ｍｇ／ｋｇ以下の用量は、痛覚過敏を回復させるのに効果がなかった。インドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇ）は、試験した時点全てにおいて痛覚過敏の有意な回復を示した。結論として、抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐは、インドメタシンと類似の足の急性炎症性痛覚過敏の有意な回復をもたらした。更に、投与したＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ、Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの有効用量（０．０１及び０．１ｍｇ／ｋｇ）は、インドメタシンの有効用量（１０ｍｇ／ｋｇ）よりも何倍も少なく、抗ＴｒｋＡ抗体をこの病態に対する標準的治療よりも遙かに低い用量で投与できることを証明している。
【０１２５】
実施例３：ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体はＣＦＡの関節内注射によって誘発された膝関節の慢性炎症性痛覚過敏を回復させる
ＣＦＡをマウスの後肢膝関節の一つに関節内注射することによって、荷重負荷法を使用して評価することができる慢性炎症性痛覚過敏が誘発される。ＣＦＡを注射された関節が炎症を起こして痛みがある場合、注射した（同側）関節の肢にかかる重量を少なくし、注射していない（反対側）関節の肢にかかる重量を増加させるように重量が再配分される。この動物モデルにおけるこれらの徴候の発生は、変形関節炎及び関節リウマチなどの基礎症状に関連した慢性炎症性関節痛を呈する患者が示す症状を反映しているので、臨床的に関連があると考えられる。
【０１２６】
（方法）
ナイーブＡＭＢ１マウスを、そのホームケージの処置室に馴化させ、食べ物と水は自由に取らせた。ＡＭＢ１マウスは、マウスＴｒｋＡのエキソン１をヒトＴｒｋＡのエキソン１と置き換えることによって作製されたもので、それ自体は専らヒトＴｒｋＡタンパク質を発現する。インキャパシタンステスターへの慣化を実施した。ベースライン荷重負荷は、ＣＦＡ注射直前に読み取った。動物を、滅菌状態で３：１に混合したイソフルラン及び酸素を使用して麻酔した。膝領域を剪毛し、希釈したヒビスクラブ溶液で清潔にした。左膝に１０ｍｇ／ｍｌのＣＦＡを１０μｌ注射した。動物を、そのホームケージに戻す前に暖かい環境で回復させた。ＣＦＡの４、７及び１０日後に、荷重負荷法を使用して動物を炎症性痛覚過敏の発症について評価した。ＣＦＡの１０日後の測定に基づいて、動物をそのＣＦＡウインドウに従って順位付けし、処置群に無作為化した。ＣＦＡの１３日後に、痛覚過敏が十分に確立されたとき、動物を、アイソタイプ対照抗体１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．又は抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ、０．０１、１及び１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．の何れかの単回注射で処置した。ＣＯＸ−２選択的ＮＳＡＩＤセレコキシブを陽性対照として６０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．で１日２回使用した。抗体処置群では、荷重負荷は投与の４、８、２４及び９６時間後に測定した。セレコキシブ処置群では、荷重負荷はＣＦＡの１３日後の投与の１及び８時間後、ついでＣＦＡの１４〜１７日後の投与の１時間後に測定した。行動評価はブラインドで実施した。荷重負荷（ｇ）は、同側及び反対側後肢の両方で読み取り、％荷重負荷差（％同側／反対側）として表した。データは、各時点で処理群をアイソタイプ対照群と比較することによって分析した。統計学的分析は、反復測定ＡＮＯＶＡと、ついでＩｎＶｉｖｏＳｔａｔを使用した計画的比較試験として実施した（ｐ＜０．０５は有意と見なした）。
【０１２７】
（結果）
ＣＦＡの膝関節への注射によって、同側から反対側後肢へ荷重負荷がシフトし、％同側／反対側比の下降が生じることが検出され、３日目以降から著しくかつ長期継続する痛覚過敏が引き起こされた（図５）。アイソタイプ対照抗体処置は、痛覚過敏に対する影響がなかった。治療経過中、投与して１時間後にセレコキシブ（６０ｍｇ／ｋｇ）による痛覚過敏の有意な回復が見られた。痛覚過敏の有意な回復は、投与の４〜７２時間後に抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの０．０１、１及び１０ｍｇ／ｋｇの単回注射で観察され、アイソタイプ対照と比較したとき、最も高い２用量のみが９６時間後に有意であった。結論として、抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの０．０１ｍｇ／ｋｇ以上の単回投与は、セレコキシブの複数回投与と類似の、膝関節の慢性炎症性痛覚過敏の有意で持続した回復をもたらした。更に、セレコキシブ６０ｍｇ／ｋｇの複数回投与に相当する効果を達成するために必要なのは、抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの０．０１ｍｇ／ｋｇの単回投与のみであり、抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐは、現在の標準的治療法であるＮＳＡＩＤセレコキシブよりも遙かに低い用量、少ない頻度で与えることができることを示している。
【０１２８】
実施例４：ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体はＭＩＡの関節内注射によって誘発された膝関節の慢性骨関節炎性痛覚過敏を回復させる
ヨード酢酸一ナトリウム（ＭＩＡ）をマウス膝関節に間接内注射することによって、軟骨退化を伴った局所関節炎に付随する慢性痛覚過敏の発症を引き起こした。このように、ＭＩＡモデルで測定された痛覚過敏は、骨関節炎関連疼痛によく似ている。更に、軟骨退化は、神経障害に類似した特性の慢性神経障害を招く。抗痙攣薬であるプレガバリンは、神経障害性疼痛の治療に推奨される第一選択薬物であるので、ここではプレガバリンを比較化合物として使用する。弱いμオピオイド受容体アゴニストであるトラマドールは、ＮＳＡＩＤとは対照的に、消化管出血又は腎臓の問題を生じず、関節軟骨にも影響を及ぼさないので、ＯＡの治療に益々使用されている。このため、トラマドールを、プレガバリンと並んで抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの比較物として使用した。
【０１２９】
（方法）
ナイーブＡＭＢ１マウスを、そのホームケージの処置室に馴化させ、食べ物と水は自由に取らせた。ＡＭＢ１マウスは、マウスＴｒｋＡのエキソン１をヒトＴｒｋＡのエキソン１と置換することによって作製し、それ自体は専らヒトＴｒｋＡタンパク質を発現する。インキャパシタンステスターへの慣化は、数日間かけて実施した。ベースライン荷重負荷を読み取って測定した。動物を、滅菌状態で３：１に混合したイソフルラン及び酸素を使用して麻酔した。膝領域を剪毛し、希釈したヒビスクラブ溶液で清潔にした。ＭＩＡ １００ｍｇ／ｍｌの５μｌ（５００μｇ）又は生理食塩水（疑似処置）を左後肢の膝関節に注射した。動物は、ホームケージに戻す前に暖かい環境で回復させた。ＭＩＡの３〜２３日後に、膝関節痛覚過敏の発症のために荷重負荷を使用して、定期的な間隔で動物を評価した。ＭＩＡの１４日後に、荷重負荷測定を行い、動物はＭＩＡ応答ウインドウに従って順位付けし、処置群に無作為化し、ついで抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの１、１０、１００μｇ／ｋｇ又はアイソタイプ対照抗体１００μｇ／ｋｇの単回ｉ．ｐ．注射（５ｍｌ／ｋｇ用量体積）で処置した。比較対照として、動物をＭＩＡの１４日後にトラマドール１０ｍｇ／ｋｇ又はプレガバリン３０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．（５ｍｌ／ｋｇ用量体積）、ついで、ＭＩＡの１６〜２２日後に１日おきにトラマドール３０ｍｇ／ｋｇ又はプレガバリン１００ｍｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ用量体積）で処置した。動物は全て、ＭＩＡの１４日後の投与の４、８及び２４時間後に、ついで、抗体処置群では２４時間毎、トラマドール及びプレガバリン処置群では投与の１及び２４時間後に荷重負荷を使用して評価した。行動評価はブラインドで実施した。荷重負荷（ｇ）は、同側及び反対側後肢の両方で読み取り、％荷重差（％同側／反対側）として表した。データは、各時点において（ＭＩＡの３〜１４日後）、痛覚過敏に対するＭＩＡの効果を、処置群と疑似処置群とを比較することによって分析した。投与後のデータは、各時点で処置群をアイソタイプ対照群と比較することによって分析した。統計学的分析は、反復測定ＡＮＯＶＡと、ついでＩｎＶｉｖｏＳｔａｔを使用した計画的比較試験によって実施した（ｐ＜０．０５は有意と見なした）。
【０１３０】
（結果）
ＭＩＡ５００μｇを膝関節に注射することによって、同側から反対側後肢へ荷重負荷がシフトし、％同側／反対側比の下降が生じることが検出され、３日目以降から著しい痛覚過敏が引き起こされた。痛覚過敏の有意な回復は、各時点でアイソタイプ対照と比較した場合、投与して４時間〜７日後の抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ、１０及び１００μｇ／ｋｇの単回注射によって見られた（図６Ａ）。抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐは、１μｇ／ｋｇでは痛覚過敏に対して効果がなかった。トラマドール（１０ｍｇ／ｋｇ）及びプレガバリン（３０ｍｇ／ｋｇ）は、ＭＩＡの１４日後の投与の１時間後では効果がなかったが、投与の４時間後に痛覚過敏の有意な回復を示した（図６Ｂ）。ＭＩＡの１４日後の投与の１時間後では効果がないので、トラマドールを３０ｍｇ／ｋｇに増加させ、プレガバリンを１００ｍｇ／ｋｇに増加させると、何れもＭＩＡの１６、１８及び２０日後の投与の１時間後で痛覚過敏の有意な回復を示した。結論として、抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの１０μｇ／ｋｇ以上の単回投与は、トラマドール及びプレガバリンの複数回投与と類似の膝関節の慢性骨関節炎性痛覚過敏の有意で、持続した回復をもたらした。更に、より高い用量（それぞれ３０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ）で使用した２種類の薬物、トラマドール及びプレガバリンの複数回投与に相当する効果を達成するために必要なのは、抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ １０μｇ／ｋｇの単回投与のみであった。従って、抗ＴｒｋＡ抗体はプレガバリン及びトラマドールよりも更に低い用量、少ない投与頻度で投与することができる。
【０１３１】
実施例５：ヒト化抗ＴｒｋＡ抗体は坐骨神経の慢性狭窄損傷によって誘発された末梢神経因性痛覚過敏及び異痛を回復させる
末梢神経障害性疼痛は、末梢神経系の損傷、機能障害又は疾患から生じる慢性形態の疼痛である。通常、痛覚過敏（疼痛刺激に対する強い応答）並びに異痛（無痛刺激に対する疼痛反応）が含まれる。神経障害性疼痛は、末梢神経の実験的損傷によって動物に誘発させることができ、これは典型的には、坐骨神経の軽い結紮による慢性狭窄損傷（ＣＣＩ）によって実現される（Ｂｅｎｎｅｔｔ及び Ｘｉｅ（１９９８）Ｐａｉｎ，３３：８７〜１０７）。プレガバリンは、神経障害性疼痛の治療に推奨される第一選択薬物であるので、ここではプレガバリンを比較化合物として使用する。
【０１３２】
（方法）
ＣＣＩ手術は、雌雄ＡＭＢ１マウスにケタミン・キシラジン（１００及び１０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ，ｉ．ｐ．）麻酔下で行った。ＡＭＢ１マウスは、マウスＴｒｋＡのエキソン１をヒトＴｒｋＡのエキソン１と置き換えることによって作製し、それ自体は専らヒトＴｒｋＡタンパク質を発現する。毛をクリップで挟んだ後、麻酔して左坐骨神経を中大腿部まで露出させた。坐骨神経の周りを神経分岐前１〜２ｍｍで軽く３本（４−０黒い絹糸を使用）で結紮した。手術部位は、皮膚縫合後、ベタディン溶液で処理した。動物は翌７日間、回復させた。実験１日前に、動物を測定装置（コールドプレート）に馴化させ、投与前の足挙げ閾値を記録した（０時間）。次に、動物を６つの群に再度群分けした。翌日、動物をアイソタイプ対照抗体（１０００μｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）又は様々な用量の抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ（１０、１００＆１０００μｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）の単回ｉ．ｐ．注射で処置した。プレガバリン（３０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ，ｐ．ｏ．）又は生理食塩水を、投与期間後７日間にわたって１日１回投与した。投与後の読み取りは、４時間後、２４時間後に記録し、その後投与して７日後までは１日おきに記録した。投与後の読み取りは、プレガバリン又は生理食塩水を投与して１時間後に毎日記録した。投与後の読み取りは、最初に機械的痛覚過敏を記録し、５分後に冷感異痛を記録した。機械的痛覚過敏は、ダイナミックプランター・エステシオメーター（Ｐｌａｎｔａｒ Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ Ｓｒｉ，Ｉｔａｌｙ）を使用して、足挙げを惹起するために必要な力の閾値（ｇ）として測定した。冷感異痛は、コールドプレートから足を挙げるまでの秒での時間として測定した（ＩＩＴＣ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）。
【０１３３】
（結果）
ＣＣＩ手術の７日後に、その足挙げ閾値及び足挙げ潜時それぞれの鋭い低下によって分かるように、マウスは著しい機械的痛覚過敏（図７Ａ）及び冷感異痛（図７Ｂ）を示した。抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの全用量で、足挙げ閾値の上昇（図７Ａ）に見られるような機械的痛覚過敏及び足挙げ潜時の増加に見られるような冷感異痛（図７Ｂ）の回復がもたらされた。この回復の程度及び持続期間は、明らかに用量依存的で、何れの読み取りも最高用量１ｍｇ／ｋｇ（１０００μｇ／ｋｇ）のプレガバリンに相当した。抗体ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐのこの用量１ｍｇ／ｋｇは、単回投与として投与する場合、プレガバリン３０ｍｇ／ｋｇの複数回投与と比較して有効で、標準的治療のプレガバリンと比較して抗ＴｒｋＡ抗体を、より低用量で、より投与頻度が少なく投与することができることを再度示した。
【０１３４】
実施例６：新生仔発育中の感覚及び交感神経ニューロンに対する抗ＴｒｋＡ抗体の効果
ＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達は、発達中の感覚及び交感神経ニューロンの生存に極めて重要である（Ｂｉｂｅｌ及びＢａｒｄｅ，２０００ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １４（２３）：２９１９−３７）。胚期又は新生期の間の能動又は受動免疫の何れかによるＮＧＦの対応する遮断は、ニューロン細胞体及び関連するニューロン構造、例えば交感神経節の顕著な萎縮を生じる（Ｃａｔｔａｎｅｏ，（２０１３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１３；Ｍａｒ ２６；１１０（１３）：４８７７−８５）。逆に、新生仔動物をＮＧＦで処置すると、交感神経ニューロンの肥大及び過形成が生じ、交感神経節が拡大する（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ及びＢｏｏｋｅｒ，１９６０ａ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ Ｍａｒ；４６（３）：３７３−８４；Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ及びＣｏｈｅｎ，１９６０ Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９６０ Ｍａｒ ２９；８５：３２４−４１；Ｂａｎｋｓ等，１９７５ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍａｙ；２４７（２）：２８９−９８）。
抗ＮＧＦ抗体と比較しての交感神経ニューロンの生存及び形態に及ぼす新生仔期中の抗ＴｒｋＡ抗体処置の影響を決定するために、上頚部神経節（ＳＣＧ）に位置する交感神経ニューロンの詳細な定量的及び形態計測分析を、ヒトＴｒｋＡノックイン（ＡＭＢ１）マウスの４週間の処置の後に実施した。ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐが齧歯類ＴｒｋＡに対して弱い交差反応性を有するので、ヒトＴｒｋＡノックインマウスが必要とされた。新生仔マウスを、マウスＮＧＦに完全に交差反応性であるタネズマブの配列に基づく抗ＮＧＦ（Ｃａｔｔａｎｅｏ，２０１０ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１２，９４−１０６）の、１００ｍｇ／ｋｇのＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ又はＰＢＳで、生後１日目から４週間の間、週に１回、腹腔内（ｉ．ｐ．）処置した。
処置期間の終わりに、マウスをケタラール［（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）７５ｍｇ／ｋｇ体重］及びキシラジン［（Ｓｔｒｅｕｌｉ）１０ｍｇ／ｋｇ体重］の混合物で麻酔し、ついで０．９％ＮａＣｌと続いて新たに調製した０．１Ｍリン酸緩衝剤（ｐＨ７．３）中の４％パラホルムアルデヒドで灌流した。
【０１３５】
頸部の右上頸髄神経節（ＳＣＧ）を解剖し、プラスチック包埋カセット中に発泡体で保護し、４℃で２４時間、同じ固定液中で後固定した。ＳＣＧを周囲の動脈で切開し、組織学的処置中のより良い同定を可能にした。ついでそれらをパラフィン（ＴＣＡ４４−７２０ Ｍｅｄｉｔｅ ａｕｔｏｍａｔｅ）に包埋し、ライカ−ミクロトーム（３μｍの薄切片；ライカＲＭ２１３５）で切断した。連続切片のバンドを調製し、各１０番目（成体）又は２０番目（新生仔）の切片を「スーパーフロスト・プラス」（Ｍｅｎｚｅｌ）ガラススライド上に載せ、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。切片をＨａｍａｍａｔｓｕ（Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ）スライドスキャンシステムでスキャンし、４０倍の対物レンズで拡大した。画像（．ｎｄｐｉ）をＮＤＰ−Ｖｉｅｗｅｒ２ソフトウェアで１０倍又は２０倍の対物レンズで拡大し、体積決定のためにｊｐｅｇ形式でエクスポートした。神経節の体積は、Ｃａｖａｌｉｅｒｉ法（Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１２ Ｎｏｖ １；２０１２（１１）：１１２９−３９；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｔｏｐ０７１７８７）に従って決定した。適切なプラグイン（「格子」及び「細胞計数器」）を備えたＩｍａｇｅＪソフトウェアを体積決定に使用した。格子サイズは、神経節当たり約１００点又はそれ以上を得るように選択された。
体積は次のようにして計算した：神経節の体積＝神経節組織上の点の数×格子面積×厚さ×スライス間の距離。細胞の平均体積は、核剤原理に従って決定した（Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｔｏｒ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｓｃ．１９８８ Ｊｕｌ；１５１（Ｐｔ １）：３−２１）。物体の面積（Ａ）と半径（Ｒ）は、細胞のような不規則な物体についてもまたその体積（Ｖ）と相関する。従って、多数の細胞の面積を測定することにより、神経節における平均細胞体積の非常に良好な近似を得ることができる。神経節当たり１００個以上のランダムに選択された細胞の面積を測定した。各面積（Ａ）について、半径（ｒ＝√（Ａ／π））と、ついで体積（体積＝（４／３）π＊ｒ３）を計算した。全体積の平均を神経節の平均細胞体積とした。１つの神経節における細胞数は、以下の式に従って計算した：神経節の総細胞体積／神経節における平均細胞体積。細胞密度は次の式に従って計算した：神経節における細胞数／神経節の体積。
新生仔マウスをタネズマブで処置すると、ＳＣＧニューロン細胞直径の有意な減少、全ＳＣＧの萎縮、及びＰＢＳ処理と比較した神経節当たりのニューロン細胞の数の有意な減少が生じた（図８）。対照的に、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ処置は、ＳＣＧニューロン細胞直径の有意な増加、全ＳＣＧの肥大及びＰＢＳ処置と比較した神経節当たりのニューロン細胞の数の有意な増加が生じた。
【０１３６】
実施例７：成体期中の交感神経ニューロン生存に対する抗ＴｒｋＡ抗体の効果
新生仔期の後、感覚ニューロンの生存はＮＧＦ非依存性になる。しかし、交感神経ニューロンの場合、ＮＧＦは成体期にその形態を継続して調節する。成体齧歯類では、能動免疫又は受動免疫の何れかによるＮＧＦ遮断は、全体的に交感神経節の萎縮に寄与する交感神経ニューロン細胞体の萎縮をもたらす（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ及びＢｏｏｋｅｒ，１９６０ｂ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｍａｒ；４６（３）：３８４−９１；Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ等，１９７１ａ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ａｐｒ ２；２７（２）：３４３−５５；Ｂｊｅｒｒｅ等，１９７５ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｊｕｌ １１；９２（２）：２５７−７８；Ｇｏｅｄｅｒｔ等，１９７８ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｊｕｎ ９；１４８（１）：２６４−８；Ｏｔｔｅｎ等，１９７９ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｏｃｔ ２６；１７６（１）：７９−９０；Ｇｏｒｉｎ及びＪｏｈｎｓｏｎ，１９８０ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９８０ Ｓｅｐ２９；１９８（１）：２７−４２；Ｊｏｈｎｓｏｎ等，１９８２；Ｒｕｉｔ等，１９９０ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｊｕｌ；１０（７）：２４１２−９）。一方、ＮＧＦでの成体齧歯類の処置は、交感神経ニューロンの肥大をもたらすが、新生仔における処置とは異なり、過形成に至らない（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ及びＢｏｏｋｅｒ，１９６０ｂ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｍａｒ；４６（３）：３８４−９１；Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ等，１９７１ｂ Ｊ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ Ｒｅｓ．１９７１ｂ Ｊｕｌ；３６（１）：２４−３６；Ｂｕｅｋｅｒ及びＳｃｈｅｎｋｅｉｎ，１９６４ Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｏｃｔ ９；１１８：１８３−２０５）。
交感神経ニューロンの生存及び形態に対する抗ＮＧＦと比較した成体期中のＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ処置の影響を決定するために、成体（２．５ヶ月齢）のマウスを、１００ｍｇ／ｋｇのＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ、タネズマブ又はＰＢＳで４週間の間、週１回、ｉ．ｐ．処置し、左右両方のＳＣＧを、実施例６に記載のようにして分析した。
【０１３７】
成体マウスをタネツマブで処置すると、ＳＣＧニューロン細胞の直径が有意に減少し、ＳＣＧ全体の萎縮が起こったが、新生仔とは異なり、神経節当たりのニューロン細胞の数には影響しなかった（図９）。ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ処置は、ＳＣＧニューロン細胞直径の有意な増加と、ＳＣＧ全体の肥大をもたらしたが、再び神経節当たりのニューロン細胞数は影響を受けなかった。タネズマブの萎縮作用は新生仔と成体の両方で同等であったが、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの肥大効果は新生仔では成体よりも遙かに顕著であった（図８及び９を比較のこと）。
成体マウスでは、ＳＣＧニューロン細胞直径に対するＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの効果は有意であったが、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ処置マウスの細胞直径の範囲は、ＰＢＳ処置動物のものと完全にオーバーラップする一方、タネズマブ処置動物のＳＣＧニューロン細胞直径の有意な割合がＰＢＳ処置動物の範囲外及びその下にあった（図１０）。
視覚的には、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ処置動物のＳＣＧニューロン細胞体は、ＰＢＳ処置動物のものと類似しているようであったが、タネズマブ処置動物のものは細胞質が密で収縮しているようであった（図１１）。
タネズマブで得られた結果は過去の研究と一致しており、ＮＧＦ遮断が、新生仔の交感神経ニューロン細胞の喪失と新生仔及び成体双方における交感神経ニューロン細胞体及び神経節の萎縮をもたらすことを証明している。ＳＣＧに対するＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの肥大及び新生仔における過形成の影響は、ＮＧＦ処置に対して報告されたものと類似している。従って、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ及びタネズマブは、新生仔及び成体動物の両方で交感神経ニューロンに明らかに反対の作用を奏するが、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの効果は後者では減少する。
【０１３８】
実施例８：末梢神経障害性疼痛に対する抗ＴｒｋＡ抗体の効果
末梢神経障害性疼痛は、末梢神経系の傷害／機能不全／疾患から生じる慢性形態の疼痛である（Ｂｒｉｄｇｅｓ等，（２００１）Ｂｒ Ｊ Ａｎａｅｓｔｈ．ｕｌ；８７（１）：１２−２６）。これは、典型的には、痛覚過敏（痛みを伴う刺激に対する反応の高まり）並びに異痛（痛みのない刺激に対する痛みのある反応）を含む。神経障害性疼痛は、末梢神経の実験的損傷によって動物において誘発させることができ、これは、典型的には、緩い結紮による坐骨神経の慢性狭窄傷害（ＣＣＩ）によって達成される。
雄及び雌ＡＭＢ１マウスにおいて、機械的痛覚過敏を、足挙げを誘発するのに必要な閾値力（ｇ）として測定し、冷感異痛は、コールドプレートからの足挙げに要した時間（秒）として測定した。ついで、ケタミン・キシラジン（１００及び１０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌ，ｉ．ｐ．）麻酔下でＣＣＩ手術を実施した。ヘアクリッピング後、左坐骨神経を、大腿中央部で無菌的に曝露した。３本の緩い結紮（４−０黒絹を使用）を、神経の枝分かれ前に１〜２ｍｍの坐骨神経の周囲に配した。手術部位を皮膚縫合後にベタジン溶液で処置した。動物を次の７日間で回復させた。動物を測定装置（コールドプレート）に順応させ、投与前の足挙げ量を記録した（０時間）。ついで、動物を、０．３及び１ｍｇ／ｋｇのＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ、タネズマブ又は生理食塩水の一回の腹腔内注射で処置した。投与後の読み取りは、４時間後、１日後及びその後、投与後１４日目の最終読み取りで、投与後９日目まで１日おきに記録した。
投与後の読み取りは、機械的痛覚過敏に対して最初に記録し、５分後に寒冷異痛に対して記録した。ＣＣＩ手術の７日後（０時間）、マウスは、それぞれその足挙げ閾値及び足挙げ潜時の急激な減少によって分かるように、顕著な機械的異痛（図１２Ａ）及び冷感異痛を示した（図１２Ｂ）。両方の用量でのＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐは、足挙げ閾値の増加によって見られるような機械的痛覚過敏と、足挙げ潜時の増加によって見られる冷感異痛の双方の持続的な回復をもたらした。同等の用量で、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐは、タネズマブに基づく抗ＮＧＦ抗体よりも機械的痛覚過敏及び冷感異痛の回復を明らかにもたらした。
【０１３９】
実施例９：異常な感覚及び交感神経発芽に対する抗ＴｒｋＡ抗体の効果
マウスにおける数週間にわたる完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の複数回の関節内注射によって誘発された持続性膝関節炎症は、侵害受容行動と共に関節内の異所性感覚及び交感神経発芽をもたらす（Ｇｈｉｌａｒｄｉ等，２０１２ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．Ｊｕｌ；６４（７）：２２２３−３２）。骨がん疼痛のマウスモデルにおいても同様の異所性発芽が観察され、疼痛の維持に関与していることが提案されている（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ａｎｄｒａｄｅ等，２０１１ Ｐａｉｎ．Ｎｏｖ；１５２（１１）：２５６４−７４）。両方のモデルにおいて、抗ＮＧＦ処置は、異所的なニューロン発芽及び侵害受容行動を減少させ、このプロセスにおけるＮＧＦの役割を示している（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ａｎｄｒａｄｅ等，２０１１ Ｐａｉｎ．Ｎｏｖ；１５２（１１）：２５６４−７４；Ｇｈｉｌａｒｄｉ等，２０１２ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．Ｊｕｌ；６４（７）：２２２３−３２）。
複数回ＣＦＡ膝関節疼痛モデルにおけるタネズマブに基づく抗ＮＧＦ抗体と比較してのＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐの効果を評価するために、成体雌ＡＭＢ１マウスを９５％酸素と混合した３％イソフルランで軽く麻酔した。左膝関節に１０μｌのＣＦＡ（Ｈ３７ ＲＡ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ，鉱油中２．５ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）を注射した。ＣＦＡ注射後、動物をそのホームケージに戻した。注射後の動物の状態をモニターするために規則的な観察を実施した。ＣＦＡ注射を７、１４及び２１日目に繰り返した。
【０１４０】
１群の動物（ｎ＝６）に１０μｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を関節内注射して、擬似対照とした。そのマウスを、インキャパシタンスメーター（荷重負荷装置，Ｌｉｎｔｏｎ）のパッド上に２〜３分間立てるように訓練することによって、３日間、実験のための環境に順応させた。５秒間にわたって左（同側）及び右（対側）後肢によって加えられた荷重負荷の平均値を記録した。
３回の測定を行い、各時点について平均値を算出した。パッド上にかかる体重のベースライン値を、ＣＦＡの最初の注射の前日（第０日）に調べ、３、１０、１７及び２４日目の各後続注射の３日後、並びに２４日目の化合物投与の４、８、２４、４８、７２、９６及び１２０時間後に再評価した。
行動実験から得られたデータを、荷重負荷比の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして計算した（ＷＢＲ＝同側の荷重負荷／対側の荷重負荷×１００）。１群６匹のマウスを偽対照として無作為に選択し、７日間毎に２１日間、左膝関節に１回のＰＢＳ注射を行い、合計４回の注射（シャムＣＦＡ群）を与え、最初の膝の注射の後の２４日目にビヒクルを腹腔内投与した。
他のマウスには０、７、１４及び２１日目に合計４回のＣＦＡ注射を行った。２４日目に、７０％未満の荷重負荷比を有するマウスを、ビヒクル対照群、１ｍｇ／ｋｇのＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ群及び１ｍｇ／ｋｇのタネズマブ群に無作為に分けた。全てのビヒクル／化合物は５ｍｌ／ｋｇの単回用量で腹腔内投与した。ＣＦＡの複数回の関節内注射は、同側から後側の後肢への荷重負荷のシフトによって検出される持続性痛覚過敏を誘発し、約５０％までの％ｉｐｓｉ／ｃｏｎｔｒａ比の低下の低下がもたらされた（図１３）。痛覚過敏が十分に確立された２４日目の単一ｉ．ｐ．注射後に、１ｍｇ／ｋｇのＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐが、ビヒクル対照と比較して痛覚過敏の有意な回復をもたらす一方、タネズマブに基づく抗ＮＧＦ抗体は、同じ用量で有意な効果はなかった。
【０１４１】
実施例１０：抗ＴｒｋＡ抗体の骨治癒に対する効果
［序］
適切な骨折関連疼痛治療は、患者の幸福にとって重要である。しかしながら、現在入手可能な鎮痛薬はかなりの副作用を及ぼすことがある。中等度から重度の疼痛を治療するために使用されるオピオイドは、しばしば悪心、鎮静及び眠気並びに呼吸抑制を引き起こす。更に、オピオイド中毒が起こることがあり、この物質クラスが骨折治癒に影響を及ぼすかどうかは不明である。対照的に、軽度から中程度の筋骨格痛の治療のためにしばしば処方される非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、かなりの消化器副作用を生じることが示されている（Ｄｉｂ等，（２０１４），Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，７８５−９）。ＮＳＡＩＤの抗炎症作用は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２の選択的又は非選択的阻害に基づいており、従ってアラキドン酸からのプロスタグランジン（ＰＧ）の合成を阻害する。しかし、ＰＧＥ−２は骨に対して多面的効果を有しており、ＣＯＸ−２機能は骨治癒に必須である（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ等，（２０１０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，２１，２９４〜３０１；Ｓｉｍｏｎ等，（２００２）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，１７，９６３−７６）。齧歯動物では、治癒期間中にＮＳＡＩＤが適用されたときに骨折の治癒が妨げられたという強い証拠がある（Ｓｐｉｒｏ等，（２０１０）Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，２８，７８５−７９１；Ｋｒｉｓｃｈａｋ等，（２００７ａ）Ａｒｃｈ Ｏｒｔｈｏｐ Ｔｒａｕｍａ Ｓｕｒｇ，１２７，４５３〜８：Ｋｒｉｓｃｈａｋ等，（２００７ｂ）Ａｒｃｈ Ｏｒｔｈｏｐ Ｔｒａｕｍａ Ｓｕｒｇ，１２７，３〜９）。加えて、ヒトにおけるＮＳＡＩＤもまた骨治癒に負の影響を及ぼすと考えられている。
骨折関連疼痛を治療するための別のアプローチは、神経成長因子（ＮＧＦ）／神経栄養性チロシンキナーゼ受容体１型（ＴｒｋＡ）シグナル伝達の遮断でありうる。抗ＮＧＦモノクローナル抗体を使用するこのシグナル伝達経路の遮断は、慢性腰痛及び関節症の治療に有効であることが示された（Ｋａｔｚ等，（２０１１）Ｐａｉｎ，１５２，２２４８〜２２５８：ＭｃＫｅｌｖｅｙ等，（２０１３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，１２４，２７６〜８９）。ＴｒｋＡへのＮＧＦの結合は、受容体二量体化及び受容体自己リン酸化による活性化をもたらす。リガンド−受容体相互作用は、ＮＧＦに選択的に結合して中和する特異的抗体の適用によって、又はＴｒｋ受容体のキナーゼ活性の低分子量阻害剤の適用によって消失させることができる（Ｋｕｍａｒ及びＭａｈａｌ，（２０１２）Ｊ Ｐａｉｎ Ｒｅｓ，５，２７９〜８７：Ｗａｔｓｏｎ等，（２００８）．Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，２２，３４９〜３５９）。
骨折修復に対するＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達の影響は十分には解明されていない。最近、２つの研究が、中和抗ＮＧＦモノクローナル抗体又は低分子量Ｔｒｋキナーゼ阻害剤の適用によりＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達を遮断した後の疼痛関連行動の有意な減少を報告している（Ｋｏｅｗｌｅｒ等，（２００７）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２２，１７３２〜４２：Ｇｈｉｌａｒｄｉ等，（２０１１）Ｂｏｎｅ，４８，３８９−９８）。しかし、両方の研究でカルスのサイズの増加が報告され、治癒した骨の生体力学的特性が僅かに低下したこともまた一方のレポート（Ｋｏｅｗｌｅｒ等，（２００７）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２２，１７３２〜４２）において示されており、おそらく骨折治癒過程の干渉を示している。両方の研究で観察された効果は比較的小さいので、更なる明確化が必要である。従って、我々は、機械的に定義された骨折治癒マウスモデルにおいて、ＮＧＦ及びＴｒｋＡをそれぞれ標的とする中和モノクローナル抗体を適用することによって、この問題に取り組んだ。
【０１４２】
［方法］
（抗体）
中和抗ＮＧＦモノクローナル抗体は、タネズマブの配列に基づくヒトＩｇＧ２であり、マウスＮＧＦに対して完全に交差反応性である（Ｃａｔｔａｎｅｏ，（２０１０）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１２，９４〜１０６）。中和抗ＴｒｋＡ抗体は、ＧＢＲ ＶＨ５（Ｋ３Ｑ，Ｖ３７Ａ）ＶＬ１ ＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐである。
【０１４３】
（動物モデルと畜産）
動物実験は、実験動物のケア及び使用に関する国内及び国際ガイドラインに従って実施され、地方の倫理委員会（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｅｓｉｄｉｕｍ Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｎｏ．１１４４）によって承認された。雄のＡＭＢ１マウスは、マウスＴｒｋＡ遺伝子座にヒトＴｒｋＡのノックインを有し、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｔａｌｉａ，Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ）から入手した。マウスを、２３℃及び５５±１０％の湿度で１４時間の明、１０時間の暗サイクルで４匹までの動物群で収容した。標準的な齧歯類の餌と水は自由に入手可能とした。手術手順は無菌条件下で行った。
【０１４４】
（研究デザイン）
骨折治癒に対するＮＧＦ−ＴｒｋＡシグナル遮断の影響を調べるために、以前に詳細に記載されているような（Ｒｏｅｎｔｇｅｎ等，（２０１０）Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，２８，１４５６〜６２）標準化された骨切り術を１３週齢マウスの右大腿骨になした。手短に言えば、全身麻酔（２体積％イソフルラン，Ｆｏｒｅｎｅ（登録商標），Ａｂｂｏｔｔ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、Ｇｉｇｌｉワイヤソー（ＲＩＳｙｓｔｅｍ，Ｄａｖｏｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して右大腿骨の中軸に骨切り隙間をつくった。切開術は、外部固定具（剛性３Ｎ×ｍｍ−１；ＲＩＳｙｓｔｅｍ，Ｄａｖｏｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して安定化させた。手術前に、マウスに抗生物質（クリンダマイシン−２−ジヒドロゲンホスフェート，４５ｍｇ×ｋｇ−１；クリンダマイシン，Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ，Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を単回投与した。鎮痛には、トラマドール−塩酸塩（２５ｍｇ×Ｌ−１，Ｇｒｕｅｎｅｎｔｈａｌ，Ａａｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、手術の１日前と後に飲料水を介して提供した。
手術前に、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）（対照，ｎ＝２４）、抗ＮＧＦ抗体（ｎ＝２５）又はＴｒｋＡ抗体（ｎ＝２４）（両方の抗体は、Ｇｌｅｎｍａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって提供された）の投与のために３群に無作為に割り当てた。抗体は、１０ｍｇ×ｋｇ−１体重の濃度で腹腔内投与した。この物質は、手術後１日目、６日目及び１１日目に投与した。
手術後の７、１４又は２５日目にマウスを安楽死させ、手術された対側大腿骨を外科的に移植した。
【０１４５】
（活動性と地面反力の測定）
投与された抗体の鎮痛効果を決定するために、疼痛が活動低下をもたらし、恐らく骨切り肢の負荷を減少させるので、手術後のマウスの活動性と手術された肢の垂直地面反力（ＧＲＦ）を評価した。手術後２、５、７、１４及び２０日目に分析を実施した。垂直ＧＲＦを評価するために、マウスを、床にフォースプレートを含むアクリルガラストンネル（ＨＥ６×６，ＡＭＴＩ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を自由に移動させた。手術された肢の立脚期中のピーク垂直ＧＲＦを、盲検観察者によって記録し、時点当たりの各マウスの少なくとも４回の測定から平均した。マウスの活動性を、特殊なケージに取り付けられた赤外線ビームシステム（ＡｃｔｉＭｏｔ，ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ，Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して一晩記録した。術後値は術前測定値と関連していた。
【０１４６】
（生体力学的試験）
機械的特性を調べるために、２５日目に外植した無傷及び骨切り大腿骨を、以前に記載されているように（Ｒｏｅｎｔｇｅｎ等，（２０１０）Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，２８，１４５６〜６２；Ｗｅｈｒｌｅ等，（２０１４）Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，３２，１００６〜１３）、非破壊的な３点曲げ試験に供した。簡単に述べると、大腿骨の近位端をアルミニウムシリンダーに固定し、ついでこれを３点曲げ装置（Ｚ１０，Ｚｗｉｃｋ Ｒｏｅｌｌ，Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のヒンジ継手に固定した。大腿骨顆部を曲げ支持体上に固定しないで載せた。軸方向荷重を、大腿部の中間軸の矢状面に加えた。曲げ剛性を、フォース−たわみカーブの線形領域の傾き（ｋ）から計算した。骨折カルスが支持体の中間（ｌ／２）に正確に位置していない場合、荷重ベクトルと近位（ａ）及び遠位（ｂ）支持体との間の距離を考慮した。曲げ剛性（ＥＩ）は、非対称曲げの式：ＥＩ＝ｋ（（ａ２ｂ２）×３ｌ−１）に従って計算した。
【０１４７】
（マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ））
１４日目及び２５日目に採取した大腿骨を、μＣＴ装置（Ｓｋｙｓｃａｎ １１７２，Ｓｋｙｓｃａｎ，Ｋｏｎｔｉｃｈ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、５０ｋＶの電圧及び２００μＡでピクセルあたり８μｍの分解能でスキャンした。各スキャン内で、定まった密度のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）（２５０及び７５０ｍｇ×ｃｍ−３）を有する２つのファントムを走査して、骨密度（ＢＭＤ）を決定した。
１４日目に、総体積（ＴＶ）、骨体積（ＢＶ）、骨密度（ＢＶ／ＴＶ）及びＢＭＤについてカルス全体を分析した。２５日目に、２つの関心領域であるカルス全体と以前の骨切り隙間を上記パラメータについて分析した。石灰化組織と非石灰化組織を区別するために、６４１．９ｍｇＨＡ×ｃｍ−３に対応する全体的閾値を適用した（Ｍｏｒｇａｎ等，（２００９）Ｂｏｎｅ，４４，３３５〜４４）。
【０１４８】
（組織形態計測）
大腿骨を４％ホルマリン中で２４時間固定し、２０％のエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ７．２〜７．４）中で１０〜１２日間脱灰し、パラフィンに包埋した（Ｐａｒａｐｌａｓｔ，Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。厚さ６μｍの縦断面を切断し、サフラニン−Ｏ及びファストグリーンを使用して染色した。５０倍の倍率で光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ６０００Ｂ；ソフトウェアＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標），Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、組織組成の評価を実施した。全ての時点で、骨膜カルス及び骨切り間隙からなるカルス全体を、線維組織、軟骨及び骨の相対量について分析した。
【０１４９】
（統計分析）
結果は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示される。データは、シャピロ・ウイルク検定を使用して正規分布について試験した。データ解析には、ＳＰＳＳ統計ソフトウェア（バージョン２１，ＩＢＭ Ｃｏｒｐ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用した。群はＡＮＯＶＡを使用して比較した。事後分析はフィッシャーのＬＳＤ検定を使用して実施した。有意性はｐ≦０．０５であると仮定した。
【０１５０】
［結果］
（活動性とＧＲＦの評価）
手術１〜２日前及び手術後２、５、７、１４及び２０日目に、マウスの活動性と垂直ＧＲＦを評価した。予想された通り、全ての群で手術後に活動性は低下した。２日目に、抗ＴｒｋＡ抗体処置マウスは、ＰＢＳ処置動物と比較して有意に高い活動性を示し（図１４Ａ）、これは抗体処置マウスの痛みが軽減したことを示している。ＰＢＳと抗ＮＧＦ抗体又は抗ＮＧＦ抗体及び抗ＴｒｋＡ抗体処置との間に有意差はなかった。後の時点で、有意な群間差は検出されなかった（図１４Ａ）。
垂直ＧＲＦの分析は、２日目に全ての処置群において術前の値の８３〜９０％までの減少を示した（図１４Ｂ）。垂直ＧＲＦは５日目まで更に減少し、ついでＧＲＦが術前の値の９０〜１００％に達した２０日目までゆっくり増加した。任意の与えられた時点で群間に有意差はなかった（図１４Ｂ）。
【０１５１】
（骨折治癒に及ぼすＮＧＦ−ＴｒｋＡシグナル伝達遮断の影響）
カルス組成の組織形態計測評価を７、１４及び２５日目に実施した。代表的な切片を図１５Ａ〜Ｉに示す。我々は、何れの時点においても処置群間でカルス組成の統計的に有意な差を検出しなかった（図１５Ｊ〜Ｌ）。μＣＴを使用する１４日目のカルスの３次元評価において、カルスサイズ、ＢＶ、ＢＶ／ＴＶ又はＢＭＤに有意差はなかった（表６）。２５日目に骨切り術又は全カルスの分析についても同じことが見出された（表７）。非破壊的な３点曲げ試験を使用して決定されたカルスの曲げ剛性は、ＰＢＳ投与と比較して抗ＮＧＦ抗体又は抗ＴｒｋＡ抗体によって有意な影響はなかった（図１６）。
2018505853.tif 000007
2018505853.tif 000008
まとめると、データは、ＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達の遮断が骨折治癒に悪影響を及ぼさないことを示した。
【０１５２】
［考察と結論］
骨折関連疼痛の軽減は患者の治療における重要な問題である。しかし、ＮＳＡＩＤを使用する一般的な治療は骨折治癒には不利に見える。
ここで、鎮痛のためのＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達の遮断が骨折治癒に影響を及ぼすかどうかを調べた。我々の結果は、中和抗ＮＧＦ又は抗ＴｒｋＡ抗体で処置した動物ではカルス形成及び成熟が正常に起こったので、選択的抗体を使用するＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達の遮断によって骨再生が影響を受けないことを示している。
ＰＢＳ、抗ＮＧＦ又は抗ＴｒｋＡ抗体で処置した動物において、７、１４及び２５日目に組織学的に又は１４日目及び２５日目に実施されたμＣＴ分析によって評価されたカルス組成に有意差は観察されなかった。更に、曲げ剛性は影響を受けておらず、ＮＧＦ／ＴｒｋＡ遮断による鎮痛が骨治癒に関して安全でありうることを示している。
【０１５３】
ＮＧＦとその受容体ＴｒｋＡの両方が骨細胞によって発現されるので、ＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達が骨形成及び治癒を調節しうるという証拠がある（Ａｓａｕｍｉ等，（２０００）Ｂｏｎｅ，２６，６２５〜３３）。インビトロデータは、前造骨性ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＮＧＦ／ＴｒｋＡの抗アポトーシス作用（Ｍｏｇｉ等，（２０００）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，６７，１１９７〜２０６）と、ＮＧＦ−処置後のこれら細胞におけるアルカリホスファターゼの誘導を示唆しており、それにより骨芽細胞分化を促進する（Ｙａｄａ等，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２０５，１１８７〜９３）。マウスでの研究で、増殖、成熟及び肥大性軟骨細胞並びに骨芽細胞における骨折治癒の間のＴｒｋＡ発現が実証された（Ａｓａｕｍｉ等，（２０００）Ｂｏｎｅ，２６，６２５〜３３）。また、ＮＧＦ発現が、増殖性、成熟及び肥大性軟骨細胞及び骨化前面付近の骨芽細胞において実証された。これらの知見は、骨折治癒の間のＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達の機能を意味するが、正確な役割は解明されていない。局所ＮＧＦ投与がラットの肋骨骨折モデルにおいて骨折治癒を改善したことが実証された（Ｇｒｉｌｌｓ等，（１９９７）Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，１５，２３５〜４２）。基本的機序は広くは調査されていないが、著者等は、交感神経支配の増加が軟骨細胞への骨前駆細胞の分化を刺激したと推測した（Ｇｒｉｌｌｓ等，（１９９７）Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，１５，２３５〜４２）。骨折治癒中の中和抗ＮＧＦモノクローナル抗体又は低分子量Ｔｒｋキナーゼ阻害剤の投与によるＮＧＦシグナル伝達の遮断後、著しく大きいカルスの形成が報告された（Ｋｏｅｗｌｅｒ等，（２００７）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２２，１７３２〜４２：Ｇｈｉｌａｒｄｉ等，（２０１１）Ｂｏｎｅ，４８，３８９〜９８）。これらの知見は、治癒過程の僅かな遅延を意味する。しかし、我々の知見は他者のものと共に（Ｋｏｅｗｌｅｒ等，（２００７）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２２，１７３２〜４２：Ｇｈｉｌａｒｄｉ等，（２０１１）Ｂｏｎｅ，４８，３８９〜９８）骨折治癒の間の骨細胞とその前駆体におけるこのシグナル伝達経路の、もしあれば、下位の役割を意味する。
【０１５４】
抗体処置の鎮痛効果を評価するために、我々はマウスの活動性と手術した肢の縦方向のＧＲＦを決定した。手術後２日目のＰＢＳ処理動物と比較して、抗ＴｒｋＡ抗体処置マウスで有意に高い活動性が見出された。抗ＮＧＦ抗体で処置したマウスではより大きな活動性の傾向もあったが、これは統計学的有意に達しなかった。対照的に、我々は両方の抗体を比較したとき統計学的に有意な差はなく、よって少なくとも同等の鎮痛効果を示すことを見出した。これらの活動性の知見は、中和抗ＮＧＦ抗体の投与後の疼痛関連行動の有意な減少を報告したＫｏｅｗｌｅｒ等，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２２，１７３２〜４２の観察によって裏付けられている（Ｋｏｅｗｌｅｒ等，２００７ Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２２，１７３２〜４２）。一般に、治癒期間にわたるＰＢＳ処置と比較して、抗ＴｒｋＡ抗体で処置したマウスにおけるより大きな活動性の傾向が見出された。これは、ＰＢＳを投与されたマウスが、鎮痛抗体の一つを投与された動物より手術及び術後疼痛によってより影響を受けたことを示しており、治癒過程全体にわたるマウスの幸福に対する十分な早期疼痛制御の正の効果を示している。垂直ＧＲＦで表される手術した肢の負荷は、如何なる時点でも有意な群間差異を示さなかった。これはまた他者の報告と一致している（Ｋｏｅｗｌｅｒ等，（２００７）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２２，１７３２〜４２）。我々は、ＧＲＦにおける僅かな減少は骨折関連の疼痛とは無関係である可能性があることを示唆している。我々は、手術中の筋肉の切開が機能を変化させ、よって負荷を減少させていると仮定する。
【０１５５】
結論として、前記結果は、生体力学的性質及びカルス組成が抗体処置によって変化しなかったので、特異的抗体を使用する齧歯類における骨折治癒に対するＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達の遮断の負の効果を示していない。
【０１５６】
実施例１１−低濃度水性製剤の安定性データ
本発明者等は、
配列番号：５を含む軽鎖可変配列と配列番号：７を含む重鎖可変領域とを含む１０ｍｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＡ抗体；
２５ｍＭのクエン酸塩；
１５０ｍＭのＮａＣｌ；
０．０５％のツイーン８０
を含有する、ｐＨ６．０に調整された抗ＴｒｋＡ抗体の第一低濃度液体製剤を作製し、試験した。
本発明者等は、Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ６、Ｔ９、Ｔ１２、Ｔ１８、Ｔ２４、Ｔ３０の時点（月）において、５℃、２５℃及び４０℃で多くの基準を使用して抗ＴｒｋＡ抗体の安定性を特徴付けた。
特に、製剤中に存在する抗体を、製剤又はその一部の透明度、着色度、乳白光度及び微粒子汚染度（可視粒子）の決定；製剤中に存在するタンパク質の濃度を決定する波長２８０ｎｍの光吸収の測定；抗体の重量及び又は分解の変化を決定するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル可視化；抗体の結合特性の変化を決定するＥＬＩＳＡ；製剤中の正／負抗体種構成の変化を決定するＨＰＬＣ−ＣＥＸ；製剤中に存在するキャピラリー電気泳動による抗体の等電点プロファイルの変化を決定するＨＰＬＣ−ＩＥＦ；製剤中の抗体の変化を決定するＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析によって、関連時点で特徴付けた。
製剤及びその中の抗体の特性評価の各々は、標準的な技術を使用して行った。
それぞれの場合、比較は、一又は複数の時点とＴ０値及び／又は品質保証及び品質管理目的のための標準物質として使用される抗体に対して以前に確立された標準との間で少なくともなされる。
安定性データは、図１７では５℃、図１８では２５℃、図１９では４０℃に対して提供される。
【０１５７】
実施例１２−高濃度水性製剤の安定性データ
本発明者等は、
配列番号：５を含む軽鎖可変配列と配列番号：７を含む重鎖可変領域とを含む１００ｍｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＡ抗体；
５０ｍＭのヒスチジン；
１５０ｍＭのＮａＣｌ；
０．０５％のツイーン８０
を含有する、ｐＨ５．７５又は６．０に調整された抗ＴｒｋＡ抗体の液体製剤を作製し、試験した。
本発明者等は、Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ６、Ｔ９、Ｔ１２、Ｔ１８、Ｔ２４、Ｔ３０の時点（月）において、５℃、２５℃及び４０℃で多くの基準を使用して抗ＴｒｋＡ抗体の安定性を特徴付けた。
特に、製剤中に存在する抗体を、製剤の透明度、着色度、乳白光度及び微粒子汚染度（可視粒子）の変化の決定；製剤中に存在するタンパク質の濃度を決定する波長２８０ｎｍの光吸収の測定；抗体の重量及び又は分解の変化を決定するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル可視化；抗体の結合特性の変化を決定するＥＬＩＳＡ；製剤中の正／負抗体種構成の変化を決定するＨＰＬＣ−ＣＥＸ；製剤中に存在するキャピラリー電気泳動による抗体の等電点プロファイルの変化を決定するＨＰＬＣ−ＩＥＦ、製剤中の抗体の変化を決定するＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析によって、一又は複数の時点で特徴付けた。それぞれの場合、比較は、Ｔ０値の各時点と品質保証及び品質管理目的のための標準物質として使用される抗体に対して以前に確立された標準との間でなされる。
安定性データは、図２０では２５℃、図２１では２５℃及び図２２では４０℃でｐＨ５．７５に調整された製剤に対して提供される。安定性データは、図２３では５℃、図２４では２５℃及び図２５では４０℃でｐＨ６に調整された製剤に対して提供される。
【０１５８】
実施例１３−高濃度水性製剤の安定性データ
本発明者等は、
配列番号：５を含む軽鎖可変配列と配列番号：７を含む重鎖可変領域とを含む１５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＡ抗体；
５０ｍＭのヒスチジン；
１５０ｍＭのＮａＣｌ；
０．０５％のツイーン８０
を含有する抗ＴｒｋＡ抗体の第一低濃度液体製剤を作製し、試験した。
本発明者等は、Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ６、Ｔ９、Ｔ１２、Ｔ１８、Ｔ２４、Ｔ３０の時点（月）において、５℃、２５℃及び４０℃で多くの基準を使用して抗ＴｒｋＡ抗体の安定性を特徴付けた。
特に、製剤中に存在する抗体を、製剤の透明度、着色度、乳白光度及び微粒子汚染度（可視粒子）の変化の決定；製剤中に存在するタンパク質の濃度を決定する波長２８０ｎｍの光吸収の測定；抗体の重量及び又は分解の変化を決定するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル可視化；抗体の結合特性の変化を決定するＥＬＩＳＡ；製剤中の正／負抗体種構成の変化を決定するＨＰＬＣ−ＣＥＸ；製剤中に存在するキャピラリー電気泳動による抗体の等電点プロファイルの変化を決定するＨＰＬＣ−ＩＥＦ、製剤中の抗体の変化を決定するＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析によって、一又は複数の時点で特徴付けた。
それぞれの場合、比較は、Ｔ０値の各時点と品質保証及び品質管理目的のための標準物質として使用される抗体に対して以前に確立された標準との間でなされた。
安定性データは、図２６では５℃、図２７では２５℃及び図２８では４０℃でｐＨ５．７５に調整された製剤に対して提供される。安定性データは、図２９では５℃、図３０では２５℃及び図３１では４０℃でｐＨ６に調整された製剤に対して提供される。
【０１５９】
実施例１４−１００ｍｇ／ｍｌ製剤及び１５０ｍｇ／ｍｌ製剤のサブビジブル粒子、粘度及び注射針通過性
本発明の高濃度液体製剤の特性を更に特徴づけるために、一連の更なる実験を実施して、サブビジブル粒子の存在、並びに製剤の粘度及び注射針通過性を決定した。実験は５℃で９〜１２ヶ月間保存されたサンプルについて実施した。
【０１６０】
−サブビジブル粒子
治療用タンパク質の有効性を損なう可能性のある一つの手段は、望ましくない免疫応答を誘導し、タンパク質の活性の抗体媒介性中和又はバイオアベイラビリティの変化をもたらすことによる。治療用タンパク質製品中のタンパク質凝集体が免疫原性を高めうることは十分に確立されており、従ってそのような影響は製品品質を評価する際に考慮すべき重要なリスク因子である。そのような凝集体は、製剤中にサブビジブル粒子として現れる。
タンパク質は、通常、分子の天然状態アンサンブルの一部でありうる部分的に折り畳まれていない分子から凝集する。製剤が天然状態で存在するタンパク質分子の割合を最大化し維持するように開発されても、特に薬学的に関連する時間スケール及びストレス条件下では、有意な量の凝集体が形成されうる。所与の製品中に存在するタンパク質粒子のレベル及びサイズは、治療用タンパク質の商業的生産に関連する多くの要因によって変化しうる。
タンパク質分子が天然の立体配座を有する抗原の反復配列を有する大きなタンパク質アセンブリは、通常、免疫応答を誘導するのに最も強力であることが知られている。更に、より効果的なワクチンを開発する努力は、抗原性タンパク質を他の物質（例えば、コロイド状アルミニウム塩又はポリスチレン）からなるナノ粒子又はマイクロ粒子に吸着させることが免疫原性を大きく増加させることを実証した。これらの教訓を治療用タンパク質製品に適用すると、天然様の立体構造を有するタンパク質分子を含む大きな凝集体が、患者において有害な免疫応答を引き起こす最大のリスクを引き起こすと主張されている。
サブビジブル微粒子の分析のための標準試験では、粒径が１０μｍを超える粒子が６０００粒子／ｍｌ以下に制御され、２５μｍを超える粒子が６００粒子／ｍｌ以下に制限されることが規定されている。
サブビジブル粒子分析は、ＨＩＡＣシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、製造者によって提供されたプロトコールを使用して実施した。測定は光の不明瞭化に基づいており、粒子の幾何学的形状に基づく粒子の測定を含む。
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全ての製剤は、許容可能なレベル下のサブビジブル粒子であり、観察された粒子の欠如は、処方された抗体の高レベルのタンパク質安定性の良好な指標を提供する。
【０１６１】
−粘度
治療剤としてのモノクローナル抗体の使用には、一般に、多用量のタンパク質の送達が必要となる。そのような濃縮溶液には溶液粘度を含む多くの課題が伴う。注射溶液の許容可能な粘度についての業界標準は存在しないが、２５〜３０ｍＰＡ．ｓの値が、一般的にソフトな上限と考えられ、５０ｍＰＡ．ｓを超える粘度では注射の実施を可能にするのに一般に非標準的な投与技術／装置が必要とされる。
粘度分析は、Ｈａａｋｅ Ｒｅｏｓｔｒｅｓｓ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、製造者によって提供されたプロトコールを使用して実施した。
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驚くべきことに、１５０ｍｇ／ｍｌ製剤Ａ（５０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ツイーン８０−０．０５％、ｐＨ５．７５、１５０ｍｇ／ｍｌ）は、試験した１００ｍｇ／ｍｌ製剤のものに近い粘度を有する例外的な特性を示した。第２の試験した１５０ｍｇ／ｍｌ製剤（５０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ツイーン８０−０．０５％、ｐＨ６、１５０ｍｇ／ｍｌ）もまた良好な特性で、同等の市販の１５０ｍｇ／ｍｌの治療用抗体製剤よりも良好な特性を示した。
【０１６２】
−注射針通過性
注射針通過性は、任意の非経口剤形の重要な製品性能パラメータである。これは、注射前にバイアルからの移送時に皮下注射針を容易に通過する注射可能な治療薬の能力を指す。注射針通過性は、抜きやすさ、目詰まりや起泡傾向、用量測定の精度などの要因が含まれる。注射針通過性は、針の幾何形状、すなわち内径、長さ、開口形状、並びにシリンジの表面仕上げによって影響されうる（４）。これは、非常に細い針が備えられたペン及び自動注射器のような自己注射装置にとっては特に重要である。実際、患者は２９−３１−Ｇ針を用いるペンインジェクターを使用することができる。予め充填されたシリンジに関する限り、皮下投薬のための一般的な針構成は、２７Ｇ及び２５Ｇである（４，５）。細い針は、注射の痛みを軽減する一方で、薬物を注射するために大きな力を必要とする。現時点では、薬局方では、公定の試験手順は規定されていないが、一般に、５〜８Ｎ未満の力が、ヒトの注射に対して許容可能であると考えられる。
注射針通過性分析は、ＴＡ−ＸＴ Ｐｌｕｓ（Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、製造者によって提供されたプロトコールを使用して実施した。
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２７Ｇ針データの注射針通過性は良好であったが、３０Ｇ針については例外的であった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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