(57)【要約】  本発明は、融合前コンフォメーションで安定化される組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチドを含む組成物であって、前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、野生型ＲＳＶ  Ｆポリペプチドと比較して、少なくとも１つの変異を含み、その少なくとも１つの変異は、ａ）４８６位のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）の変異、ｂ）４８９位のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）の変異、ならびにｃ）３９８位のアミノ酸のセリン（Ｓ）および／または３９４位のアミノ酸のリシン（Ｋ）の変異からなる群から選択される、組成物に関する。本発明はまた、前記安定なＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合前コンフォメーションで安定化される組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチドを含む組成物であって、前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、野生型ＲＳＶ  Ｆポリペプチドと比較して、少なくとも１つの変異を含み、前記少なくとも１つの変異は、ａ）４８６位のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）の変異、ｂ）４８９位のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）の変異、ならびにｃ）３９８位のアミノ酸のセリン（Ｓ）および／または３９４位のアミノ酸のリシン（Ｋ）の変異からなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
融合前コンフォメーションで安定化される組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物であって、前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、野生型ＲＳＶ  Ｆポリペプチドと比較して、少なくとも１つの変異を含み、前記少なくとも１つの変異は、ａ）４８６位のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）の変異、ｂ）４８９位のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）の変異、ならびにｃ）３９８位のアミノ酸のセリン（Ｓ）および／または３９４位のアミノ酸のリシン（Ｋ）の変異からなる群から選択される、組成物。
【請求項３】
前記核酸配列はベクター中に含まれる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記４８６位のアミノ酸の前記変異は、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への変異である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記４８９位のアミノ酸の前記変異は、アスパラギン酸（Ｄ）からチロシン（Ｙ）への変異である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記３９８位のアミノ酸の前記変異は、セリン（Ｓ）からロイシン（Ｌ）への変異であり、かつ／または前記３９４位の変異は、リシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）への変異である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、完全長ＲＳＶタンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、可溶性ＲＳＶ  Ｆタンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、５５℃、好ましくは５８℃、より好ましくは６０℃で少なくとも１０分間にわたり安定である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、配列番号２１〜２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ワクチンとして使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＲＳＶ感染の予防および／または処置に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＲＳＶに対するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
１９５０年代に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が発見されると、このウイルスは、直ちにヒトにおける上下気道感染症に関連した認定病原体になった。世界中で毎年６４００万件のＲＳウイルス感染が発生し、その結果、１６０，０００人が死亡していると推定されている（ＷＨＯ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｕｐｄａｔｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００９）。最も重篤な疾患が生じるのは、特に、未熟児、高齢者、および免疫無防備状態の個体である。２年未満の小児では、ＲＳＶは、最もよく見られる呼吸器病原体であり、呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピークとなるのは２〜４ヶ月齢である。ほとんどすべての小児が２歳までにＲＳＶに感染したことが報告されている。生涯にわたり繰り返し感染することは、自然免疫が効果を有さないことに起因する。高齢者では、ＲＳＶ疾患の負担は、一般的なインフルエンザＡ感染によって引き起こされるものと類似している。
【０００３】
ＲＳＶは、ニューモウイルス（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）亜科に属するパラミクソウイルスである。そのゲノムは、中和抗体の主要な抗原標的であるＲＳＶ糖タンパク質（Ｇ）およびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質として知られる膜タンパク質を含む種々のタンパク質をコードする。Ｆ１タンパク質の融合媒介部分に対する抗体は、細胞のウイルス取り込みを防止することができ、したがって、中和作用がある。
【０００４】
現在、ＲＳＶ感染に対するワクチンは入手することができないが、疾患による高い負担のために要望されている。上述したように、ＲＳＶ融合糖タンパク質（ＲＳＶ  Ｆ）は、ヒト血清中の中和抗体の主要な標的であることから、魅力的なワクチン抗原である。実際、ＲＳＶ  Ｆに対する中和モノクローナル抗体（パリミズマブ）は、重い疾患を予防することができ、幼児の予防に承認されている。
【０００５】
ＲＳＶ  Ｆは、不可逆性タンパク質が不安定な融合前コンフォメーションから安定した融合後コンフォメーションにリフォールディングすることにより、ウイルスと宿主細胞膜とを融合する。両方のコンフォメーションの構造は、ＲＳＶ  Ｆについても（ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２，５９２−５９８（２０１３）；ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７，２４８−２５０（２０１０）；ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，１１１３−１１１７（２０１３）；Ｓｗａｎｓｏｎ  ＫＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８，９６１９−９６２４（２０１１））、関連するパラミクソウイルスの融合蛋白質についても決定されており、この複雑な融合装置のメカニズムを知る上での手掛かりとなっている。他のＩ型融合タンパク質のように、不活性な前駆体、ＲＳＶ  Ｆ０は、フーリン様プロテアーゼによって細胞内成熟中に切断される必要がある。ＲＳＶ  Ｆは２つのフーリン部位を有し、それにより３つのポリペプチド：Ｆ２、ｐ２７およびＦ１に分けられ、Ｆ１はそのＮ末端に疎水性融合ペプチド（ＦＰ）を有する。融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションにリフォールディングするために、ＦＰおよびヘプタッドリピートＡ（ＨＲＡ）を含むアミノ酸残基１３７〜２１６のリフォールディング領域１（ＲＲ１）は、へリックス、ループおよびストランドのアセンブリから長い連続へリックスに変形する必要がある。ＲＲ１のＮ末端セグメントに位置するＦＰは、その後、ウイルス膜から伸びて標的細胞の近位膜に入ることができる。次に、融合前ＦスパイクにおいてＣ末端ステムを形成し、かつヘプタッドリピートＢ（ＨＲＢ）を含むリフォールディング領域２（ＲＲ２）は、ＲＳＶ  Ｆヘッドの他方の側に位置を変え、ＨＲＡコイルドコイルトリマーをＨＲＢドメインと結合させて、６へリックスバンドルを形成する。６へリックスバンドルを完成するためのＲＲ１コイルドコイルの形成およびＲＲ２の移動は、リフォールディングの過程で起こる最も劇的な構造変化である。
【０００６】
ヒトの血清中の大半の中和抗体は、融合前コンフォメーションに向けられるが、融合前コンフォメーションは、その不安定さのために、溶液中およびビリオン表面のいずれでも融合後コンフォメーションに早期にリフォールディングする傾向がある。高い発現レベルを有し、かつ安定な融合前コンフォメーションを維持するＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶに対するサブユニットワクチンまたはベクターワクチンにおいて使用する有望な候補となるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、安定な組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチド、すなわち融合前コンフォメーションで安定化される組換えＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合前コンフォメーションのＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む。特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは可溶性の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドである。
【０００８】
本発明はまた、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。
【０００９】
特定の実施形態では、核酸分子は、融合前コンフォメーションで安定化される完全長の膜結合ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、可溶性の安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする。
【００１０】
特定の実施形態では、核酸はベクター中に存在する。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている。
【００１１】
本発明は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための、特にワクチンとして使用するための本明細書に記載の組成物をさらに提供する。
【００１２】
本発明はまた、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）免疫応答を誘導するための方法であって、有効量の本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む方法に関する。好ましくは、誘導される免疫応答は、ＲＳＶに対する中和抗体および／またはＲＳＶに対する防御免疫を特徴とする。特定の態様では、本発明は、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質中和抗体を誘導する方法であって、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを含む有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
【００１３】
本発明は、対象にＲＳＶに対するワクチンを接種する方法であって、本発明による組成物を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。
【００１４】
特定の実施形態では、組成物は筋肉内投与される。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明によるワクチンは、対象に２回以上投与される。
【００１６】
本発明はまた、例えば、対象の鼻道および肺におけるＲＳＶの感染および／または複製を低減する方法であって、本発明による組成物をその対象に投与することを含む方法を提供する。これは、対象のＲＳＶ感染から生じる悪影響を軽減し、したがって、ワクチンの投与により、そのような悪影響から対象を防御することに寄与するであろう。特定の実施形態では、ＲＳＶ感染の悪影響を実質的に予防することができる、すなわち、臨床的に重要でないほどの低レベルに低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】融合前コンフォメを安定化させるＲＳＶ  Ｆ変異である。上昇する温度での熱ショック後に融合前コンフォメーションに残る表面発現ＲＳＶ  Ｆ変異の割合。実験は様々な濃度で２〜５回行った。エラーバーが示されている場合、それらは、独立した実験から得られた少なくとも２つのデータポイントの標準偏差を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆ）は、感染に必要とされる宿主細胞膜とウイルス膜との融合に関与する。ＲＳＶ  Ｆ  ｍＲＮＡは、Ｆ０と称される５７４個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質に翻訳され、それはＮ末端に、小胞体内のシグナルペプチダーゼで除去されるシグナルペプチド配列（例えば、配列番号１で表わされるアミノ酸残基１〜２６）を含む。Ｆ０は、トランスゴルジにおいて、細胞プロテアーゼ（具体的には、フーリン）により２つの部位（アミノ酸残基１０９／１１０間および１３６／１３７間）で切断され、アミノ酸残基１１０〜１３６を含む短いグリコシル化介在配列（ｐ２７領域とも呼ばれる）が除去され、Ｆ１およびＦ２と称される２つのドメインまたはサブユニットが生成される。Ｆ１ドメイン（アミノ酸残基１３７〜５７４）は、そのＮ末端に疎水性融合ペプチドを有し、Ｃ末端に膜貫通（ＴＭ）（アミノ酸残基５３０〜５５０）領域および細胞質領域（アミノ酸残基５５１〜５７４）を有する。Ｆ２ドメイン（アミノ酸残基２７〜１０９）は、２つのジスルフィド架橋によりＦ１に共有結合する。Ｆ１−Ｆ２ヘテロ二量体は、ビリオン中でホモ三量体として集合している。
【００１９】
ＲＳＶ感染に対するワクチンは、現在入手可能ではないが所望されている。ヒトの血清中の大半の中和抗体は、融合前コンフォメーションに向けられるが、融合前コンフォメーションは、その不安定さのために、溶液中およびビリオン表面のいずれでも融合後コンフォメーションに早期にリフォールディングする傾向がある。
【００２０】
本発明は、安定な組換え融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、すなわち融合前コンフォメーションで安定化されるＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む組成物であって、前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、野生型ＲＳＶ  Ｆポリペプチドと比較して、少なくとも１つの変異を含み、その少なくとも１つの変異は、ａ）４８６位のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）の変異、ｂ）４８９位のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）の変異、またはｃ）３９８位のアミノ酸のセリン（Ｓ）および／もしくは３９４位のアミノ酸のリシン（Ｋ）の変異からなる群から選択される、組成物を提供する。
【００２１】
特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、可溶性ＲＳＶポリペプチドである。
【００２２】
本発明は、本明細書に記載のＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする、すなわち、野生型ＲＳＶ  Ｆポリペプチドと比較して、少なくとも１つの変異を含み、その少なくとも１つの変異は、ａ）４８６位のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）の変異、ｂ）４８９位のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）の変異、またはｃ）３９８位のアミノ酸のセリン（Ｓ）および／もしくは３９４位のアミノ酸のリシン（Ｋ）の変異からなる群から選択される、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む組成物をさらに提供する。
【００２３】
特定の実施形態では、核酸分子は、融合前コンフォメーションで安定化される完全長の膜結合ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする。組成物の投与後、前記核酸分子から発現される安定な完全長ＲＳＶタンパク質は、核酸分子が投与された対象の細胞の細胞膜上に存在するであろう。
【００２４】
特定の実施形態では、核酸分子は可溶性ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化される。コドンの最適化方法は知られており、これまでに記載がなされている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。野生型配列と比べて少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンで置換される場合、配列がコドン最適化されると考えられる。本明細書では、好ましくないコドンとは、生物において同じアミノ酸をコードする別のコドンと比べて使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンとは、生物において好ましくないコドンと比べてより高頻度に使用されるコドンである。特定の生物におけるコドン使用の頻度は、コドン頻度表、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎに見出すことができる。好ましくは２つ以上の好ましくないコドン、好ましくは、ほとんどまたはすべての好ましくないコドンがより好ましいコドンに置き換えられる。好ましくは、生物で最も高頻度に使用されるコドンがコドン最適化配列において使用される。好ましいコドンに置き換えると、概して発現が高くなる。
【００２６】
多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸分子が、遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることが当業者に理解されるであろう。当業者は、ポリペプチドが発現されることになる任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するように、核酸分子によりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を、ルーチン的な手法を用いて行い得ることも理解される。したがって、特に指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでも含まなくてもよい。
【００２７】
核酸配列は、通常の分子生物学技術を用いてクローン化され得るか、またはＤＮＡ合成により新規に作製され得、それは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野の事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、通常の方法を用いて実施され得る。
【００２８】
特定の実施形態では、核酸分子はベクターの一部である。したがって、本発明はまた、上記のような核酸分子を含むベクターを含む組成物を提供する。このようなベクターは、当業者によく知られた方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞および／または真核細胞において複製できるように設計することができる。あるいは、ベクターは複製できないように設計することができる。本発明による好適なベクターは、例えば、Ａｄ２６またはＡＤ３５などのアデノベクター、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクターなどである。当業者は好適な発現ベクターを選択し、機能的方法で本発明の核酸配列を挿入することができる。
【００２９】
驚くべきことに、本発明によれば、本明細書に記載の変異は、単独でまたは組み合わされて、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を融合前コンフォメーションで安定化させ得ることがわかった。したがって、本発明の組成物中に含まれるＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、特に、配列番号１のＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、少なくとも１つの変異を含む。
【００３０】
特定の実施形態では、安定なＲＳＶ  Ｆポリペプチドは完全長のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む。本発明によれば、完全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶビリオン内に存在しない。したがって、本発明は、組換えにより発現したＲＳＶ  Ｆポリペプチドに関する。
【００３１】
本発明の安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合前コンフォメーションで存在する、すなわち、それらは、融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む（示す）。融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的なエピトープは、融合後コンフォメーションでは現れないエピトープである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションは、天然ＲＳＶビリオンで発現するＲＳＶ  Ｆタンパク質のものと同じエピトープを含有することができ、したがって、予防的中和抗体を誘発する利点を備え得ると考えられる。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号９の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（以下、ＣＲ９５０１と称する）、ならびに／または配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（ＣＲ９５０２と称する）によって認識される少なくとも１つのエピトープを含む。ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０２は、それぞれ抗体５８Ｃ５および３０Ｄ８の重鎖および軽鎖可変領域を含み、したがって、それらの抗体の結合特異性を有するが、それらの抗体は、融合後コンフォメーションではなく、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合することが以前より示されている（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレットを参照）。
【００３３】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、４８６位にアミノ酸残基アスパラギン酸（Ｄ）のアスパラギン（Ｎ）への変異（Ｄ４８９Ｙ）を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、４８９位にアミノ酸残基アスパラギン酸（Ｄ）のチロシン（Ｙ）への変異（Ｄ４８９Ｙ）を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、３９８位のアミノ酸残基セリン（Ｓ）のロイシン（Ｌ）への変異（Ｓ３９８Ｌ）、および／または３９４位のアミノ酸残基リシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への変異（Ｋ３９４Ｒ）を含む。特定の実施形態では、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、３９８位のアミノ酸残基セリン（Ｓ）のロイシン（Ｌ）への変異（Ｓ３９８Ｌ）、および３９４位のアミノ酸残基リシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への変異（Ｋ３９４Ｒ）を含む。
【００３６】
本発明によれば、驚くべきことに、これらの変異が、融合前コンフォメーションにあるＲＳＶ  Ｆタンパク質を、特にＲＳＶ  Ｆタンパク質が完全長の膜結合ＲＳＶ  Ｆタンパク質である場合に安定化させ得ることがわかった。
【００３７】
特定の実施形態では、安定化されたＲＳＶ  Ｆポリペプチドは可溶性のＲＳＶＦポリペプチドである。
【００３８】
特定の実施形態では、したがって、本発明は、安定な可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は膜貫通（ＴＭ）領域および細胞質領域の欠失によって短縮して、可溶性分泌型Ｆタンパク質（ｓＦ）が生成されている。ＴＭ領域は膜アンカリングおよび三量体形成を担うため、アンカーなしの可溶性Ｆタンパク質は、完全長タンパク質よりもかなり不安定であり、融合後最終状態に容易にリフォールディングすることになる。したがって、高い発現レベルおよび高い安定性を示す安定な融合前コンフォメーションの可溶性Ｆタンパク質を得るために、融合前コンフォメーションを安定化する必要がある。Ｃ末端の異種三量化ドメインと、タンパク質先端部の２つの安定化変異とによって安定化された可溶性ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレットに記載されている。特に、Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐ変異が、融合前コンフォメーションにある可溶性組換えＲＳＶ  Ｆポリペプチドを安定化できることが示された。本発明による改良により、国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレットに記載の可溶性ＲＳＶ  Ｆタンパク質はさらに安定化される。
【００３９】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む組成物であって、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、上記の少なくとも１つの変異を、６７位のアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）もしくはスレオニン（Ｔ）の変異、および／または２１５位のアミノ酸残基セリン（Ｓ）の変異と組み合わせて含む組成物を提供する。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の組成物中の可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、少なくとも１つの本明細書に記載の変異を、６７位のアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）もしくはスレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への変異（Ｎ／Ｔ６７Ｉ）、および／または２１５位のアミノ酸残基セリン（Ｓ）のプロリン（Ｐ）への変異（Ｓ２１５Ｐ）と組み合わせて含む。
【００４１】
特定の実施形態では、可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレットに記載の、短縮されたＦ１ドメインに連結した異種三量化ドメインをさらに含む。本明細書で使用される場合、「短縮された」Ｆ１ドメインは、完全長Ｆ１ドメインでないＦ１ドメインを指す、すなわち、Ｎ末端またはＣ末端において、１つまたは複数のアミノ酸残基が欠失している。本発明によれば、少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質側末端は、可溶性外部ドメインとしての発現を可能にするために欠失されている。
【００４２】
特定の実施形態では、三量化ドメインは、配列番号３を含み、ＲＳＶ  Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１３に直接またはリンカーを介して連結している。
特定の実施形態では、リンカーはアミノ酸配列ＳＡＩＧを含む。
【００４３】
ＲＳＶは、２つの抗原性サブグループ：ＡおよびＢを有する単一血清型として存在することが知られている。２つのグループのプロセシングされた成熟Ｆタンパク質のアミノ酸配列は約９３％同一である。本出願の全体にわたって使用されるように、アミノ酸位置は、Ａ２株由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質の配列（配列番号１）を参照して付与される。したがって、本発明で使用される場合、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質の「ｘ」位のアミノ酸」という表現は、配列番号１からなるＲＳＶ  Ａ２株のＲＳＶ  Ｆタンパク質の「ｘ」位にあるアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。本出願の全体にわたって使用される番号方式では、１は未成熟Ｆ０タンパク質（配列番号１）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意されたい。Ａ２株と異なるＲＳＶ株が使用される場合、Ｆタンパク質のアミノ酸位置の番号付与は、配列番号１のＡ２株のＦタンパク質の番号付与に準拠し、配列番号１のＦタンパク質を有する他のＲＳＶ株の配列を、必要に応じてギャップを挿入してアライメントすることにより行われる。配列アライメントは、当該技術分野でよく知られた方法、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｂｉｏｅｄｉｔ、またはＣＬＣ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを使用して行うことができる。
【００４４】
本発明によるアミノ酸は、２０種の天然アミノ酸（もしくは「標準」アミノ酸）、または例えばＤ−アミノ酸（キラル中心を有するアミノ酸のＤ−エナンチオマー）などのそれらの変異体のいずれであってもよく、または例えばノルロイシンなどのタンパク質中に天然には見出されない、いずれの変異体であってもよい。標準アミノ酸は、それらの特性に基づいていくつかのグループに分類することができる。重要な因子としては、電荷、親水性または疎水性、サイズ、および官能基がある。これらの特性は、タンパク質構造およびタンパク質−タンパク質間相互作用にとって重要である。アミノ酸の中には、他のシステイン残基とジスルフィド共有結合（またはジスルフィド架橋）を形成することができるシステイン、ポリペプチド骨格のターンを誘導するプロリン、および他のアミノ酸よりもフレキシブルなグリシンなど、特別な特性を有するものがある。表１は、標準アミノ酸の略語および特性を示す。
【００４５】
タンパク質に対する変異は、ルーチン的な分子生物学手順により行い得ることが当業者に認識される。本発明の組成物中の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは安定である、すなわち、例えば、精製、凍結融解サイクルおよび／または保管などのポリペプチドのプロセシングにより融合後コンフォメーションに容易に変わらない。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、前記変異のないＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、熱に曝されたときの安定性が増大している。特定の実施形態では、融合前ＲＥＶ  Ｆポリペプチドは、５５℃の温度、好ましくは５８℃の温度、より好ましくは６０℃の温度で少なくとも１０分間にわたり熱に安定である。「熱に安定」とは、例えば、実施例１に記載の方法による測定で、ポリペプチドが、少なくとも１０分間、高温（すなわち、５５℃以上の温度）に曝された後も依然として少なくとも１つの融合前特異的エピトープを示すことを意味する。
【００４７】
特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、ＲＳＶ  Ａ株に由来する。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号１からなるＲＳＶ  Ａ２株由来である。
【００４８】
特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、ＲＳＶ  Ｂ株に由来する。特定の実施形態では、Ｆ１および／またはＦ２ドメインは、配列番号２からなるＲＳＶ  Ｂ株由来である。
【００４９】
特定の好ましい実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号２１〜２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
本出願の全体にわたって使用される場合、当該技術分野での慣例として、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で提示され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で提示される。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明によるコード化ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜２６、または配列番号２のアミノ酸１〜２６に対応する、シグナル配列またはシグナルペプチドとも呼ばれるリーダー配列をさらに含む。これは、分泌経路に向かうことが運命付けられている新しく合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短い（一般に、５〜３０アミノ酸長）ペプチドである。特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドはリーダー配列を含まない。
【００５２】
特定の実施形態では、ポリペプチドはＨＩＳタグを含む。Ｈｉｓタグまたはポリヒスチジンタグは、多くの場合、タンパク質のＮ末端またはＣ末端にある、少なくとも５個のヒスチジン（Ｈ）残基からなる、タンパク質中のアミノ酸モチーフであり、一般に精製目的のために使用される。
【００５３】
本明細書に記載するように、本発明は、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、すなわち、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションには存在するが、融合後コンフォメーションには存在しないエピトープを示すＲＳＶ  Ｆポリペプチド、および／またはそのような安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。
【００５４】
本発明は、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／または本明細書に記載のベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、使用する用量および濃度で、それらを投与する対象に望ましくないまたは有害な効果を引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたは核酸分子は、凍結乾燥製剤を利用することも可能であり得るが、無菌溶液として製剤化し、投与することが好ましい。滅菌溶液は、滅菌濾過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は凍結乾燥または医薬投与容器に充填される。一般に、溶液のｐＨは、ｐＨ３．０〜９．５、例えば、ｐＨ５．０〜７．５である。ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、通常、薬学的に許容される好適な緩衝剤を含む溶液中に存在し、組成物はまた塩を含有してもよい。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは注射剤に製剤化することができる。
【００５５】
さらに、対象においてＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を誘導するための方法であって、有効量の本発明による組成物を対象に投与することを含む方法が提供される。また、対象のＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための、特にワクチンとして使用するための本明細書による組成物が提供される。さらに、対象のＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用する医薬を製造するための、本明細書による組成物の使用が提供される。誘導される免疫応答は、好ましくは、ＲＳＶに対する中和抗体および／またはＲＳＶに対する防御免疫を特徴とする。
【００５６】
特定の態様では、本発明は、対象において抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質中和抗体を誘導するための方法であって、有効量の本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
【００５７】
本発明はまた、対象の例えば鼻道および肺におけるＲＳＶの感染および／または複製を低減する方法であって、本発明による組成物をその対象に投与することを含む方法を提供する。これは、対象のＲＳＶ感染から生じる悪影響を軽減し、したがって、ワクチンの投与により、そのような悪影響から対象を防御することに寄与するであろう。特定の実施形態では、ＲＳＶ感染の悪影響を実質的に予防することができる、すなわち、臨床的に重要でないほど低レベルに低減することができる。
【００５８】
本発明の組成物は、ＲＳＶ感染の防止（予防）および／または処置に使用することができる。特定の実施形態では、防止および／または処置は、ＲＳＶに感染しやすい患者群を標的にすることができる。そのような患者群としては、以下に限定されるものではないが、例えば、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若齢者（例えば、５歳以下、１歳以下）、入院患者、および抗ウイルス性化合物で処置されたが、不十分な抗ウイルス応答を示した患者が挙げられる。
【００５９】
本発明による組成物は、例えば、ＲＳＶを原因とする疾患もしくは病態のスタンドアロンの処置および／または予防に、あるいは（既存または将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／またはモノクローナル抗体など、他の予防処置および／または治療処置と組み合わせて使用することができる。
【００６０】
本発明は、本発明による組成物を利用して、対象のＲＳＶ感染を防止および／または処置するための方法をさらに提供する。特定の実施形態では、対象のＲＳＶ感染を防止および／または処置するための方法は、本明細書に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターの有効量を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。治療有効量は、ＲＳＶによる感染から生じる疾患または病態を防止、寛解、および／または処置するのに効果のあるポリペプチド、核酸分子、またはベクターの量を指す。防止は、ＲＳＶの伝播の阻害もしくは低減、またはＲＳＶによる感染に関連した症状の１つもしくは複数の発症、進展、もしくは進行を阻害もしくは低減することを包含する。本明細書で使用される寛解は、目に見えるもしくは認知できる疾患の症状、ウイルス血症、またはインフルエンザ感染の他の任意の計測可能な徴候の低減を指す。
【００６１】
特定の実施形態では、本発明による組成物は、１種または複数のアジュバントをさらに含む。当該技術分野では、適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに高めるアジュバントが知られている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種または複数の物質と定義される。これに関連して、アジュバントは、本発明のＲＳＶ  Ｆポリペプチドに対する免疫応答を増強するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；油−エマルジョン組成物（または水中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌または微生物の派生物（これらの例には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその変異体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどがある）；真核生物のタンパク質（例えば、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、抗原自体またはＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８０に向けられたもの）および受容体へのリガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦなど）（これらは受容細胞と相互作用すると同時に免疫応答を刺激する））が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合わせの形態のアルミニウムを、１用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇの濃度のアルミニウム含有量で、アジュバントとして含んでいる。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明による組成物は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンとして使用される。「ワクチン」という用語は、特定の病原体または疾患に対して対象にある程度の免疫を誘導するのに効果的な活性成分を含有する組成物を指し、これにより、病原体による感染に関連した症状または疾患の重症度、期間、または他の徴候が少なくとも低減（最大で完全に消失）する。本発明では、ワクチンは、有効量の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子および／または前記核酸分子を含むベクターを含み、これにより、ＲＳＶのＦタンパク質に対する免疫応答がもたらされる。ワクチンは、入院が必要となる重篤な下気道疾患を予防し、対象のＲＳＶ感染および複製による肺炎および細気管支炎などの合併症の頻度を低減するために使用することができる。特定の実施形態では、ワクチンは、例えばＲＳＶの他のタンパク質および／または他の感染因子に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組合せワクチンであってもよい。さらなる活性成分の投与は、例えば、別個の投与によって行われても、本発明のワクチンとさらなる活性成分との併用製剤を投与することによって行われてもよい。
【００６３】
本発明は、対象にＲＳＶに対するワクチンを接種する方法であって、本発明による組成物を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。
【００６４】
本発明による組成物は対象、例えばヒト対象に投与することができる。推奨用量の決定は実験により行われ、当業者にはルーチン的である。
【００６５】
本発明による組成物の投与は、標準投与経路を使用して実施することができる。非限定的実施形態としては、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、または例えば鼻腔内、口腔内などの粘膜投与などの非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は筋肉内注射により投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、例えばワクチンなどの組成物を投与する様々な可能性を認識している。特定の実施形態では、本発明の組成物は筋肉内投与される。
【００６６】
本明細書で使用する対象は、好ましくは哺乳動物、例えば、マウス、コットンラットなどのげっ歯類、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒト対象である。
【００６７】
本発明の組成物は、初回免疫としてまたは追加免疫として、同種または異種初回免疫−追加免疫レジメンで投与することができる。追加免疫ワクチン接種を実施する場合、通常、そのような追加免疫ワクチン接種は、最初に対象に組成物を投与した後（このような場合には「初回ワクチン接種」と呼ばれる）、１週〜１年、好ましくは２週〜４ヶ月のある時点で同じ対象に投与される。特定の実施形態では、投与は初回免疫投与および少なくとも１回の追加免疫投与を含む。
【００６８】
本発明は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの融合前コンフォメーションを安定化させる方法であって、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に変異を導入することを含み、その１つまたは複数の変異が以下の群から選択される、方法をさらに提供する。
【００６９】
このような方法によって得ることができ、かつ／または得られる安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドも上記のようなその使用と共に本発明の一部を形成する。
【００７０】
以下の実施例で本発明をさらに説明する。実施例は、決して本発明を限定するものではない。それらは、発明を明確化する役割を果たすのみである。
【実施例】
【００７１】
実施例１
安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの調製
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質に結合する治療小分子は、膜融合を阻害し、準安定なＲＳＶ  Ｆ融合前コンフォメーションの中心空洞内の３重対称ポケットに結合する。阻害剤の結合は、膜融合を促進するには大きい構造転位を受ける必要がある、２つの領域を拘束することにより、このコンフォメーションを安定化させる。本発明によれば、融合前コンフォメーションを逆説的に安定化させるのは、驚くべきことに、エスケープ変異であることがわかった。したがって、本発明によれば、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆを安定化させるために、このクラスのエスケープ変異に対応するアミノ酸置換を使用できることが示された。
【００７２】
本発明に至る研究で、融合前Ｆの安定性に対する変異の影響を評価するために、温度トリガーによる分析法を開発した。溶融曲線を得ることができるように、野生型ＲＳＶ  Ｆまたは変異ＲＳＶ  Ｆを発現するＨＥＫ２９３細胞に、１０分間温度を上昇させて熱ショックを加えた。Ｄ４８９Ｙ変異などの変異は、トリガーに必要な温度を大きく上昇させ（図１）、したがって、それらの変異がＲＳＶ  Ｆポリペプチドを安定化させることが示された。完全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質（野生型で、かつ本発明による変異を１つまたは複数含む）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で一時的に発現させた。遺伝子を導入して４８時間後、ＥＤＴＡ含有バッファーを使用して細胞を分離し、１０分間の熱ショックを加えた。融合前ＲＳＶ  Ｆに特異的である（抗体ＣＲ９５０１）か、融合前および融合後コンフォメーションの両方を認識する（抗体ＣＲ９５０３、これはＲＳＶ  Ｆ抗体モタビズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含む）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−標識抗体で細胞を染色した。ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を生死細胞の染色に使用し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーにより細胞を分析した。ＦｌｏｗＪｏ  ９．６ソフトウェアを使用してデータを分析し、熱ショックを与えた試料を未処理（３７℃）の試料に対して正規化して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。
【００７３】
Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でコンストラクトを合成し、コドンを最適化した。部位特異的変異誘発およびＰＣＲに関する分野で広く知られている標準的方法により、コンストラクトをｐＣＤＮＡ２００４にクローニングまたは生成し、配列を決定した。
【００７４】
【表１】
2018520159.tif 000002
【００７５】
【表２】
2018520159.tif 000003
【００７６】
配列
ＲＳＶ  Ｆタンパク質Ａ２完全長配列（配列番号１）
【化１】
2018520159.tif 000004
ＲＳＶ  Ｆタンパク質Ｂ１完全長配列（配列番号２）
【化２】
2018520159.tif 000005
配列番号３
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
ＣＲ９５０１重鎖（配列番号１６）：
【化３】
2018520159.tif 000006
ＣＲ９５０１軽鎖（配列番号１７）：
【化４】
2018520159.tif 000007
ＣＲ９５０２重鎖（配列番号１８）：
【化５】
2018520159.tif 000008
ＣＲ９５０２軽鎖（配列番号１９）：
【化６】
2018520159.tif 000009
ＰｒｅＦ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号２０）（可溶性、フィブリチンを含む野生型）
【化７】
2018520159.tif 000010
ＰｒｅＦ、ＲＳＶ  Ａ２、（配列番号２１）Ｄ４８６Ｎ
【化８】
2018520159.tif 000011
ＰｒｅＦ、ＲＳＶ  Ａ２、（配列番号２２）Ｄ４８９Ｙ
【化９】
2018520159.tif 000012
ＰｒｅＦ、ＲＳＶ  Ａ２、（配列番号２３）Ｓ３９８Ｌ、Ｋ３９４Ｒ
【化１０】
2018520159.tif 000013
可溶性ＰｒｅＦ、ＲＳＶ  Ａ２、（配列番号２４）Ｄ４８６Ｎ
【化１１】
2018520159.tif 000014
可溶性ＰｒｅＦ、ＲＳＶ  Ａ２、（配列番号２５）Ｄ４８９Ｙ
【化１２】
2018520159.tif 000015
可溶性ＰｒｅＦ、ＲＳＶ  Ａ２、（配列番号２６）Ｓ３９８Ｌ、Ｋ３９４Ｒ
【化１３】
2018520159.tif 000016
【図１】
2018520159.tif 000017
【配列表】
2018520159000001.app
【国際調査報告】
2018520159.tif 000018
2018520159.tif 000019
2018520159.tif 000020