(57)【要約】  本発明は、慢性炎症を特徴とする炎症性腸疾患の治療に関する。特に本発明は、クローン病の術後の再発を予測、治療または予防する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるクローン病を治療する方法であって、前記患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減することを含む、方法。
【請求項２】
外科的切除後の患者におけるクローン病の再発を治療または予防する方法であって、前記患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減することを含む、方法。
【請求項３】
前記患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する組成物を、前記患者に投与することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が医薬組成物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、外科的切除後に前記患者に投与される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記患者が、外科的切除後に、内視鏡検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩおよび／またはバイオマーカー分析によって疾患の再発を有すると同定される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
クローン病の術後再発を治療するための、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、プロテウス（Proteus）属細菌に対して殺菌性または静菌性である作用薬を含む、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減するための治療に、患者を選択することを含み、プロテウス（Proteus）属細菌が、前記患者から採取された試料中に存在すると検出される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、外科的切除後に前記患者から採取される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、外科的切除後約６か月〜約１８か月の時点で前記患者から採取される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
外科的切除後の疾患再発のリスクが高いクローン病患者を同定する方法であって、前記患者から採取された試料中のプロテウス（Proteus）属細菌の有無を決定することを含み、前記試料中のプロテウス（Proteus）属細菌の存在が、外科的切除後の疾患再発のリスクが高い患者を表す、方法。
【請求項１３】
外科的切除後の前記患者から採取された試料中のプロテウス（Proteus）属細菌の有無を決定することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者試料が、外科的切除後約６か月から外科的切除後約１８か月の時点で採取される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者試料が、外科的切除後約６か月の時点で採取される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、前記患者の回腸粘膜から採取される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する治療過程を、前記患者に推奨することをさらに含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法を実施することと、前記患者においてプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する組成物を前記患者に投与することと、を含む、クローン病を治療する方法。
【請求項１９】
プロテウス（Proteus）属細菌の有無が１６ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングによって決定される、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明の分野は、慢性炎症を特徴とする炎症性腸疾患に関する。特に、本発明の分野は、クローン病を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
クローン病は、口から肛門までの胃腸管のいずれかの部分に影響を及ぼし得る炎症性腸疾患(ＩＢＤ)である。胃腸管の内層（lining）の炎症を引き起こし、それによって、腹部痛、激しい下痢、疲労、体重減少および栄養失調が起こり得る。クローン病によって生じる炎症は、様々な人々における胃腸管の様々な領域を含み得る。クローン病によって生じる炎症は、影響を受ける腸組織の層内に深く広がる場合が多い。クローン病は、有痛性かつ消耗性であり、時に、生命にかかわる合併症を引き起こし得る。クローン病は、腸管閉塞、腸の潰瘍などの合併症を引き起こし、十分な栄養の獲得に関する問題を生じ得る。他の合併症も胃腸管外で生じる場合があり、貧血、発疹、関節炎、眼球の炎症、および疲労が挙げられる。この疾患を有する子供は、成長上の問題を有し得る。
【０００３】
治療は症状をコントロールするのに役立ち、その治療としては、薬、栄養サプリメント、および／または手術が挙げられる。症状がない場合には、一部の人々は長期間の寛解を有するが、クローン病には治癒はない。したがって、クローン病を管理および治療する方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
本発明の発明者らは、クローン病が、健康とは異なる微生物のシグネチャーと関連していることを突き止めた。特に、本発明の発明者らは、非常に低い存在量（abundance）にて検出される場合でさえ、プロテウス（Proteus）種は、クローン病の発症および術後の疾患再発に特別な役割を有することを突き止めた。
【０００５】
したがって、第１の態様では、患者におけるクローン病を治療する方法であって、その患者においてプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減することを含む方法を提供する。
【０００６】
第２の態様では、外科的切除後の患者におけるクローン病の再発を治療または予防する方法であって、その患者においてプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減することを含む方法を提供する。
【０００７】
第１および第２の態様の一実施形態において、その方法は、患者においてプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する組成物を、患者に投与することを含む。
【０００８】
一実施形態において、その組成物は医薬組成物である。
【０００９】
一実施形態において、その組成物は、外科的切除後に患者に投与される。
【００１０】
第１および第２の態様の別の実施形態において、患者は、外科的切除後に、内視鏡検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩおよび／またはバイオマーカー分析によって疾患の再発があると同定される。
【００１１】
第１および第２の態様のさらに別の実施形態において、その方法は、クローン病の術後再発を治療する方法である。
【００１２】
第１および第２の態様の一実施形態において、その組成物は、プロテウス（Proteus）属細菌に対して殺菌性または静菌性である作用薬（agent）を含む。一実施形態において、組成物は、抗菌組成物または抗生物質である。
【００１３】
第１および第２の態様のさらに別の実施形態において、その方法は、患者においてプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する治療のために、患者を選択することを含み、プロテウス（Proteus）属細菌は患者から採取される試料中に存在する。
【００１４】
一実施形態において、その試料は、外科的切除後の患者から採取される。
【００１５】
一実施形態において、試料は、外科的切除後約６か月〜約１８か月の時点で患者から採取される。
【００１６】
特定の一実施形態において、試料は、外科的切除後約６か月で採取される。
【００１７】
さらに別の実施形態において、試料は、患者の回腸粘膜から採取される。
【００１８】
第３の態様では、患者から採取された試料におけるプロテウス（Proteus）属の有無を決定することを含む、外科的切除後の疾患再発のリスクが高いクローン病患者を同定する方法であって、試料におけるプロテウス（Proteus）属の存在が、外科的切除後の臨床的再発のリスクが高い患者を表す、方法を提供する。
【００１９】
第３の態様の一実施形態において、その方法は、患者から試料を採取することを含む。
【００２０】
第３の態様の一実施形態において、その方法は、外科的切除後の患者から採取された試料におけるプロテウス（Proteus）属の有無を決定することを含む。
【００２１】
第３の態様の別の実施形態において、患者の試料は、外科的切除後約６か月から外科的切除後約１８か月の時点で採取される。
【００２２】
第３の態様の別の実施形態において、患者の試料は、外科的切除後約６か月で採取される。
【００２３】
第３の態様の一実施形態において、試料は患者の胃腸管から採取される。第３の態様のさらに別の実施形態において、試料は患者の回腸粘膜から採取される。
【００２４】
第３の態様の一実施形態において、その方法はさらに、患者におけるプロテウス（Proteus）属のレベルを低減する治療過程を患者に推奨することを含む。
【００２５】
第３の態様の別の実施形態において、その方法はさらに、外科的切除後の臨床的再発のリスクが高い患者に、患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する組成物を投与することを含む。
【００２６】
第３の態様の一実施形態において、その方法は：
ａ．患者から試料を採取すること；
ｂ．試料中にプロテウス（Proteus）属が存在するかどうかを検出すること；
ｃ．プロテウス（Proteus）属の存在が検出された場合に、外科的切除後の臨床的再発のリスクが高いと患者を診断すること；および
ｄ．患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する組成物を、診断された患者に投与すること；
を含む。
【００２７】
第４の態様は、患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減するために、クローン病患者を選択する方法であって、外科的切除後の患者から採取された試料中に存在するプロテウス（Proteus）属細菌を有する患者を同定することを含み、試料中に存在するプロテウス（Proteus）属細菌を有する患者が、治療のために選択される方法を提供する。
【００２８】
第４の態様の一実施形態において、その方法は：
ａ．患者から試料を採取すること；
ｂ．試料中にプロテウス（Proteus）属が存在するかどうかを検出すること；
ｃ．その患者試料中にプロテウス（Proteus）属が存在した場合に、患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する治療のために、患者を選択すること；および
ｄ．患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する組成物を、選択された患者に投与すること；
を含む。
【００２９】
第５の態様では、第３または第４の態様の方法を実施すること、および患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する組成物を患者に投与することを含む、クローン病を治療する方法を提供する。
【００３０】
第４および第５の態様の一実施形態において、プロテウス（Proteus）属細菌の有無は、細菌の１６ｓ  ｒＲＮＡシーケンシング、ＰＣＲおよび／または培養によって決定される。
【００３１】
第１から第５の態様の一実施形態において、その方法は、患者の胃腸管におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減することを含む。特定の一実施形態において、その方法は、患者の回腸および／または結腸におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減することを含む。
【００３２】
第１の態様の一実施形態では、クローン病を治療するための薬物の製造での、患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する作用薬の使用を提供する。
【００３３】
第２の態様の一実施形態では、クローン病の術後の再発の治療または予防のための薬物の製造での、患者の回腸および／または結腸におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する作用薬の使用を提供する。
【００３４】
第１の態様の別の実施形態では、クローン病の治療に使用するための、患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する作用薬を提供する。
【００３５】
第２の態様の別の実施形態では、クローン病の術後の再発の治療または予防で使用される、プロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する作用薬を提供する。
【００３６】
本明細書に記載の使用または作用薬の一実施形態において、クローン病の再発は臨床的再発である。
【００３７】
上記の態様それぞれの一実施形態において、この方法は、さらなる治療薬を患者に投与することを含む。クローン病を治療するための他の治療薬は、当業者には公知であるだろう。例えば、さらなる治療薬は、抗炎症性薬物または免疫システム抑制剤であり得る。クローン病の治療に使用される抗炎症性薬物の例としては、５−アミノサリチル酸およびコルチコステロイドが挙げられる。免疫システム抑制剤の例としては、アザチオプリン、メルカプトプリン、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、メトトレキセート、シクロスポリン、タクロリムス、ナタリズマブ、ベドリズマブ、およびウステリムマブが挙げられる。
【００３８】
第１から第５の態様の別の実施形態において、プロテウス（Proteus）属細菌のレベルの低減は、細菌の増殖を抑制する、または細菌を殺すことを含む。一実施形態において、患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルの低減は、患者から細菌を排除することを含む。
【００３９】
第６の態様では、患者におけるクローン病の治療の有効性をモニターする方法であって、その対象に対してクローン病の治療をすること、次いで、患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌の有無を決定することを含み、プロテウス（Proteus）属細菌の存在が、疾患の悪化または再発を表す方法を提供する。
【００４０】
第７の態様では、患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌の有無を決定することを含む、患者におけるクローン病をモニターする方法であって、プロテウス（Proteus）属細菌の存在が、患者における疾患の悪化または再発を表す、方法を提供する。
【００４１】
第８の態様では、クローン病の治療または予防のための候補化合物を同定する方法であって：
候補化合物をプロテウス（Proteus）属細菌と接触させることと、
候補化合物が細菌を殺滅する、または細菌の増殖を抑制するかどうかを決定することと、を含み、
細菌を殺滅する、または細菌の増殖を抑制する候補化合物が、クローン病を治療するための候補化合物である、方法を提供する。
【００４２】
本明細書に記載の態様それぞれの一実施形態において、プロテウス（Proteus）属細菌は、Ｐ．ミラビリス（P. mirabilis）、Ｐ．ブルガリス（P. vulgaris）およびＰ．ペンネリ（P. penneri）から選択される。特定の一実施形態において、プロテウス（Proteus）属細菌はＰ．ミラビリス（P. mirabilis）である。
【００４３】
明らかであるように、本発明の一態様の好ましい特徴および特性は、本発明の他の多くの態様に当てはまる。
【００４４】
この明細書全体を通して、「含む（comprise）」という用語、または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などのバリエーションは、記載の要素、整数もしくは工程、または要素、整数または工程のグループを包含することを意味すると理解されるが、他のいずれかの要素、整数もしくは工程、または要素、整数または工程のグループの排除は意味しない。
【００４５】
本発明は、以下の非制限的な実施例によって、かつ添付の図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】（Ａ）  患者の群：クローン病（ＣＤ）、健康なコントロール（Ｈ）および手術コントロール（Ｓ）に応じて着色した試料でのunweighted UniFrac距離の主座標を示す。数字は、ＣＤを有する患者の試料を採取した時点を示す（０：ベースライン、１：６か月、２：１８か月）。ＰＣ１、ＰＣ２、およびＰＣ３は、違いの大部分を捕らえる、上位３つの主座標を表す。（Ｂ）及び（Ｃ）  試料部位（吻合および回腸）に基づいて着色された、（Ｂ）６か月時点の試料および（Ｃ）１８か月時点の試料でのunweighted UniFrac距離の主座標プロットを示す。黒線は、同時点で同じ患者からの試料に加わる。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
詳細な説明
一般的技術および定義
特に指定がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的かつ科学的用語は、当業者（例えば、微生物学、生物化学、および免疫学）によって一般に理解されるものと同じ意味を有すると解釈される。
【００４８】
別段の指定がない限り、本発明で用いられる微生物学、生物化学、および免疫学の技術は、当業者によく知られているように標準技術である。かかる技術は、J,Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001)、R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3rd edn, Springer (1994)、T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)、F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 現在までのすべての最新版を含む)、Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)、およびJ.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (現在までのすべての最新版を含む)などの文献全体に、記述かつ説明されている。
【００４９】
「および／または」、例えば「Ｘおよび／またはＹ」という用語は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味またはいずれかの意味に明確なサポートを提供すると解釈される。
【００５０】
本明細書で使用される、「治療すること（treating）」、「治療する（treat）」、または「治療（treatment）」という用語は、患者におけるプロテウス（Proteus）属のレベルを低減するのに十分な、かつクローン病の発症または進行を低減する、もしくは遅らせるのに十分な、またはクローン病の少なくとも１つの症状を軽減する、または解消するのに十分な、治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００５１】
本明細書で使用される「予防（prevention）」、「防ぐ（prevent）」、「予防する（preventing）」という用語は、クローン病の少なくとも１つの兆候または診断所見または症状を患者が発症するのを防止すること、またはクローン病の症状の重症度を低減することを意味する。
【００５２】
本明細書で使用される「投与」とは、広く解釈されるべきであり、対象または患者に本明細書に記載の組成物または治療薬を投与すること、ならびに例えば、患者へのプロドラッグの供給によるものなど、組成物または治療薬を細胞に提供することを含む。
【００５３】
本明細書で使用される「細菌のレベルを低減する」というフレーズは、本明細書に記載の治療の結果としての、かつ本明細書に記載の方法に従って治療されていない患者と比較した場合の、患者における細菌の数、濃度または量の減少を意味する。「細菌のレベルを低減する」とは、患者から細菌を無くすことも含む。
【００５４】
クローン病／再発の治療および予防
１６ｓ  ｒＲＮＡの次世代シーケンシングにより、患者試料におけるミクロフローラを研究することによって、本発明の発明者らは、クローン病患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減することによって、術後の再発を含むクローン病を治療または予防することができることを突き止めた。さらに、本発明者らは、外科的切除後のプロテウス（Proteus）属細菌の有無を検出することによって、患者が疾患再発のリスクが高いかどうかを見極めることが可能であり、それによって、適切な治療的または予防的療法を推奨することが可能であることを見出した。
【００５５】
クローン病の再発は、組織学的に、内視鏡的に、Ｘ線撮影により、またはＣＴスキャン、超音波もしくはＭＲＩなどの他の画像化技術、または臨床的に（症状を示すことによって）定義することができる。重要なことには、症状の存在に基づく臨床的再発は、内視鏡／組織学的／バイオマーカー（炎症の糞便または血清マーカーなど）による再発よりも遅れる傾向があり、大部分の患者は、炎症の内視鏡、生化学的または組織学的証拠を有するにもかかわらず、臨床的には無症状の疾患を有する。この理由から、患者は、術後６〜１２か月で吻合の大腸内視鏡検査を受けることが推奨される。
【００５６】
粘膜の治癒は、クローン病の医療的処置の新生の第一エンドポイントであったが、内視鏡的な再発は、術後の状況における今後の合併症の最良の予測子（predictor）として大いに推奨されている。内視鏡的再発のスコアリングシステムがRutgeertsによって開発されている(Rutgeertsスコア)。このスコアリングシステムは、術後のクローン病患者における回結腸の吻合での粘膜の内視鏡的外観に注目している。本明細書に記載の治療方法を用いて、軽度から重度の疾患のあらゆる段階にて、かつ手術前または手術後に、クローン病を治療することができる。
【００５７】
患者におけるクローン病の治療の有効性をモニターする方法、ならびに患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌の有無を決定することを含む、疾患の進行または再発をモニターする方法も提供される。本明細書で使用される、「進行」という用語は、重くなっていく患者の疾患状態を意味する。例えば、患者における疾患の進行は、臨床的に明らかな疾患、または内視鏡によって、他のイメージング技術によって、もしくはバイオマーカー解析によって検出される亜臨床的再発であり得る、疾患の寛解状態から疾患の再発まで進行する患者を含む。疾患の進行は、軽度から中度または中度から重度の疾患のクローン病患者の進行も含む。
【００５８】
プロテウス（Proteus）属のレベルの低減
プロテウス（Proteus）属は、グラム陰性プロテオバクテリアの属である。プロテウス・バシラス（Proteus bacilli）は、腐生菌として天然に広く分布しており、腐敗している動物質、汚水、肥料土壌およびヒトおよび動物の排泄物に見られる。それらは、一般に泌尿器および敗血性の感染症、しばしば院内感染の原因となる日和見病原体である。Ｐ．ミリビリス（P. miribilis）、Ｐ．ブルガリス（P. vulgaris）、およびＰ．ペンネリ（P. penneri）の３つの種は、尿路感染症の原因となる病原体など、ヒトの日和見病原体である。
【００５９】
種、株、亜種または亜系などのプロテウス（Proteus）属細菌のレベルは、抗生物質、またはその生物がそれに対して感受性の他の薬物を投与することによって低減されるか、または排除され得る。かかる薬物としては、静菌性および殺菌性組成物などの、抗菌化合物および抗生物質が挙げられる。当業者であれば、プロテウス（Proteus）属種に対して活性な適切な抗菌性または抗生組成物を容易に決定することができる。例えば、Ｐ．ミラビリス（P. mirabilis）株は、アンピシリンおよびセファロスポリンに対して感受性であることが知られている。プロテウス（Proteus）属感染症の治療に使用されている抗生物質の例としては、ゲンタマイシン、トブラマイシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、アンピシリン−スルバクタム、ピペラシリン−タゾバクタム、セファゾリン、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、およびトリメトプリム−スルファメトキサゾールが挙げられる。
【００６０】
その代わりとして、患者におけるプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減する組成物は、細菌分子またはタンパク質に結合し、かつ／またはそれを中和する抗体を含んでもよいし、あるいはその組成物は、プロテウス（Proteus）属細菌を殺滅することができるバクテリオファージを含み得る。
【００６１】
一実施形態において、プロテウス（Proteus）属細菌のレベルは、プロバイオティック組成物の存在下にてプロテウス（Proteus）属細菌を打ち負かす、または増殖することができる細菌の有利な株の成長を促進するプロバイオティック組成物を患者に投与する、または摂取させることによって低減され得る。
【００６２】
さらなる治療薬
本明細書に記載の方法において、患者をさらなる治療薬で治療してもよい。クローン病を治療するためのかかる治療薬は当技術分野で公知である。治療薬は、例えば、抗炎症薬または免疫システム抑制剤であり得る。クローン病の治療で使用される抗炎症薬物の例としては、５−アミノサリチル酸およびコルチコステロイドが挙げられる。免疫システム抑制剤の例としては、アザチオプリン、メルカプトプリン、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、メトトレキセート、シクロスポリン、タクロリムス、ナタリズマブ、ベドリズマブ、およびウステリムマブが挙げられる。
【００６３】
プロテウス（Proteus）属の検出
患者の試料における細菌のレベルまたは量を決定する方法は、当業者には公知である。プロテウス（Proteus）属種の存在は、限定されないが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、核酸ハイブリダイゼーションまたはシーケンシング技術などの微生物培養技術、生化学的アッセイまたは分子技術を用いて同定することができる。代わりに、その方法は、ＰＣＲおよびクローニングおよび／または核酸シーケンシングなどの技術によって、細菌の核酸配列を増幅することを含み得る。細菌の同定は、次世代ハイスループットシーケンシング技術の使用など、１６ｓ  ｒＲＮＡのシーケンシングによって達成することもできる。
【００６４】
免疫学的方法を用いて、細菌を検出することもできる。例えば、プロテウス（Proteus）属細菌と交差反応性の抗血清または抗体が、適切な免疫学的アッセイにおいて使用され得る。免疫学的アッセイとしては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、およびディップスティック式アッセイなど固体担体を使用したアッセイが挙げられる。かかる免疫学的アッセイでは、蛍光、放射性もしくは化学発光標識化抗体または色素分子を含むラベル付けされた抗体が用いられ得る。
【００６５】
タンパク質検出技術
一実施形態において、プロテウス（Proteus）属細菌からの細菌抗原、タンパク質またはタンパク質の免疫原性断片が、患者試料中に検出される。別の実施形態において、その細菌に特異的な抗体が、患者試料中に検出される。例えば、この方法は、細菌抗原またはタンパク質に結合することができる抗体と、患者に由来する生体試料を接触させ、抗原−抗体複合体の形成を検出することを含む。
【００６６】
本明細書で企図される検出システムは、ヒト対象から単離された生体試料中のタンパク質または非タンパク質抗原などの抗原を検出する既知のアッセイ、例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法、ＳＤＳ／ＰＡＧＥを含む２次元ゲル電気泳動および等電点電気泳動法、イムノアッセイ、フローサイトメトリー、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、例えば、小分子（例えば、化学化合物、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック修飾物質、タンパク質の競合的阻害剤、または非競合的阻害剤）などの抗体もしくは非抗体化合物を用いた検出ベースシステムなどを含む。これらの実施形態にしたがって、抗体または小分子は、タンパク質の検出に適用可能な、いずれかの標準的固相または液相アッセイ方式で使用され得る。例えば、質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、バイオセンサー技術、エバネッセント光ファイバー、または蛍光共鳴エネルギー移動を用いた光学または蛍光検出は明らかに、本発明によって包含される。質量（mass）試料のハイスループットスクリーニングで使用するのに適したアッセイシステム、例えばハイスループット共鳴分光法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、エレクトロスプレーＭＳまたはナノエレクトロスプレーＭＳ）もまた企図される。
【００６７】
イムノアッセイ方式が特に適しており、例えば免疫ブロット法、ウェスタンブロット、ドットブロット法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法からなる群から選択される。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、同位体コード親和性タグ（ＩＣＡＴ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、バイオセンサー技術、エバネッセント光ファイバー技術またはタンパク質チップ技術を用いた改良されたイムノアッセイも有用である。
【００６８】
一実施形態において、アッセイは、半定量的アッセイまたは定量的アッセイである。標準固相ＥＬＩＳＡ方式は、様々な患者試料からのタンパク質または抗原の濃度を決定するのに有用である。
【００６９】
一つの形態において、かかるアッセイは、例えばポリスチレンまたはポリカーボネートミクロウェルまたはディップスティック、膜、またはガラス支持体（例えば、ガラススライド）などの固形マトリックス上に、プロテウス（Proteus）属細菌由来の抗原またはタンパク質に対する抗体、またはその免疫原性断片を含む生体試料を固定化することを含む。
【００７０】
核酸検出技術
組織中のプロテウス（Proteus）属細菌からの核酸の定性的および／または定量的検出を可能にする、いずれかの適切な技術が用いられる。標準コントロール、またはネガティブコントロールを参照して、比較が行われる。核酸は、標識され、遺伝子アレイ上でハイブリダイズされ、その場合には、遺伝子濃度は、アレイで生じた放射性シグナルまたは蛍光シグナルの強度に正比例する。
【００７１】
特定の一実施例において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にて核酸プローブと、患者試料から単離された核酸を接触させ、その核酸プローブと、プロテウス（Proteus）属細菌由来の核酸とのハイブリッド複合体の形成が可能にし、かつ試料中のハイブリッド複合体の存在を検出することによって、クローン病、疾患の再発または疾患の進行が診断され得る。診断剤としての使用のために、その検出を助けるために核酸プローブを標識化することが好ましい。検出のこのレベルは、例えば、健康な検体または標準コントロールからの遺伝子レベルなど、コントロールのレベルと比較され；患者組織からのハイブリッド複合体の変化したレベルの検出は、疾患、疾患の再発または疾患の進行を意味する。
【００７２】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、水素結合によって互いに２つの核酸が結合することを意味する。この結合に影響する因子としては：溶媒の種類および体積；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；固体担体への液相分子の非特異的な付着をブロックする作用物質（デンハルト剤（Denhardt’s reagent）またはＢＬＯＴＴＯ）；分子の濃度；分子の結合の割合を増加する化合物の使用(デキストラン硫酸塩またはポリエチレングリコール)；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェント(Sambrook et al. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (2001)参照）が挙げられる。
【００７３】
「ストリンジェント」とは、異なる分子の結合よりも、非常に類似した分子の結合を支持するハイブリダイゼーション反応における条件を意味する。高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％デキストラン硫酸塩、および変性剪断サケ精子ＤＮＡ２０μｇ／ｍｌを含む溶液中で４２℃にて一晩インキュベートし、続いて約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することとして定義される。低ストリンジェント条件は、５３５℃にて行われるハイブリダイゼーション反応を伴う。好ましくは、本発明の方法におけるハイブリダイゼーションに使用される条件は、高ストリンジェントの条件である。核酸は好ましくは、試験用の試料から分離される。適切な方法は当業者には公知である。
【００７４】
本発明の特定の実施形態において、リボソームＲＮＡ（「ｒＲＮＡ」）を使用して、細菌を区別かつ検出することができる。例えば、細菌性リボソームは、小さなサブユニットおよび大きなサブユニットで構成され、それぞれのサブユニットはさらに、リボソームＲＮＡおよびタンパク質で構成される。小さなサブユニットからのｒＲＮＡは、ＳＳＵ  ｒＲＮＡと呼ばれ、大きなサブユニットからのｒＲＮＡは、ＬＳＵ  ｒＲＮＡと呼ばれる。多数のｒＲＮＡはシークエンスされており、これらはアクセス可能な様々なデータベースで公的に入手可能である。したがって、一実施形態において、プロテウス（Proteus）属細菌は、ゲノムＤＮＡから増幅するドメイン−レベルＰＣＲ反応によって産生される１６ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子アンプリコンをシーケンシングすることによって、患者試料において検出される。従来から、ｒＲＮＡのシーケンシングは、クローニングおよびＰＣＲアンプリコンのSanger（キャピラリー電気泳動）シーケンシングによって行われた。次世代シーケンシングの出現は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを大きく簡略化し、シーケンシング深度を増大した。卓上シークエンサーの導入によって、当業者は数日以内にインハウスで１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングを実施し、解析することが可能となる。
【実施例】
【００７５】
実施例１．クローン病患者における１６ｓミクロビオータプロファイルの同定
クローン病におけるマイクロバイオームの本発明者らの理解を高めるために、本発明者らは、十分に特徴付けられ、かつ固有の、クローン病患者のコホートにおける研究を実施し、手術時点から術後１８か月までを追跡して、術後のクローン病の再発および寛解を予測する、またはそれと関連する、１６Ｓミクロビオータプロファイルを同定した。本発明者らは、手術前、次いで術後、すべての肉眼的疾患の切除後に採取された、クローン病患者３４名からの粘膜生検試料１４１個について次世代シーケンシング解析を行った。異なる部位（回腸および吻合）の試料サイズおよび同時サンプリング、および次世代シーケンシングの使用は、疾患に関連するマイクロバイオームの理解への重要かつ有意な寄与を表す。
【００７６】
実施例２．材料および方法
対象および倫理承認
本発明の研究は、術後のクローン病（ＣＤ）の管理を調べる研究（術後クローン病の内視鏡的再発（「ＰＯＣＥＰ」）研究）と並行して実施された。この研究は、Human Research Ethics Committees of St Vincent’s Public and Private Hospitals, Melbourne, AustraliaおよびThe Royal Melbourne Hospital, Melbourne, Australiaによって承認された。
【００７７】
ＰＯＣＥＲ研究は、術後の内視鏡アセスメントの値および初期の粘膜再発の治療ステップアップの評価を目的とする、予定される、ランダム化された、コントロールされた試験であった。患者は再発のリスクに応じて層化された。喫煙者、穿孔性疾患を有する患者、または１つまたは複数の以前の切除を有する患者を「高リスク」と分類し；他のすべての患者を「低リスク」と分類した。すべての患者が、肉眼的疾患すべての切除を受け、次いでメトロニダゾールを３か月投与された。高リスク患者には、アザチオプリン（２ｍｇ／ｋｇ／日）または６−メルカプトプリン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）も毎日投与された。チオプリンに不耐性の高リスク患者には、アダリムマブ導入（１６０ｍｇ／８０ｍｇ）を行い、隔週で４０ｍｇを投与した。低リスク患者はさらなる投薬を受けなかった。
【００７８】
６か月時点で結腸鏡検査あり（積極的治療）、または結腸鏡検査なし（標準的治療）に患者をランダム化した。６か月時点での内視鏡的再発（Rutgeertsスコア≧ｉ２）に関しては、患者はチオプリン、隔週でチオプリンと共にアダリムマブ、または週１回のアダリムマブにステップアップした。主要評価項目（プライマリーエンドポイント）は１８か月時点での内視鏡的再発であった。内視鏡的敵寛解は、Rutgeert’sスコアを用いて定義された。
【００７９】
インタクトな結腸を有し、腸癌の家族歴を有する患者を健康なコントロールとしてリクルートし、結腸鏡検査が正常である場合のみ含めた。手術コントロールは、以前に回腸−結腸の切除または結腸癌の右半結腸切除を受けたことがある、監視結腸鏡検査を受ける患者を含んだ。
【００８０】
クローン病患者からの粘膜試料は、切除時点で、かつ術後６か月および／または１２か月の結腸鏡検査の時点で採取され、コントロールでは、スクリーニング結腸鏡検査の時点で１回採取された。便のカルプロテクチン（ＦＣ）を測定するために、便試料を術後６か月および１８か月の時点で採取した。
【００８１】
手術の前月には、クローン病患者は、抗生物質またはプロバイオティックを投与されていない。結腸鏡検査前の前月に、健康なコントロールは、抗生物質またはプロバイオティックを投与されていない。手術の前日に、患者はポリエチレングリコールでの腸管洗浄を受け、結腸鏡検査前に患者および健康なコントロールにおいて同じ配合物（preparation）を使用した。
【００８２】
組織の採取およびＤＮＡ抽出法
クローン病患者において、罹患した回腸の領域の切除試料から組織試料５〜１０ｍｇを得た。６か月および１８か月の結腸鏡検査にて、吻合および新しい末端回腸にて同じ患者から６つの組織試料（約５〜１０ｍｇ）を採取した。健康なコントロールにおいて、バイオプシーを回腸から採取し、手術コントロールにおいて、バイオプシーを吻合および新しい末端回腸から採取した。標準的な内視鏡的鉗子を使用し、１ｍｌ  ＲＮＡを含有する滅菌チューブに組織を入れ(Ambion)、４℃で一晩保持して、完全に組織に浸透させ、次いで分析前に−８０℃で保存した。続いて、組織試料を解凍し、ホモジナイズし、QIAGEN AllPrep Mini Kitを製造元の説明書に従って使用して、ホモジネートからＤＮＡを抽出した。
【００８３】
糞便の採取
ＦＣの測定のために、術後６か月および１８か月の時点で便試料を採取した。来院前３日以内に、あるいは、結腸鏡検査が行われるべき場合には、腸の標本（preparation）を開始する前に、結腸鏡検査の３日前に、患者に便試料を採取するように指示した。試料は患者の自宅の冷凍庫で−２０℃にて保存され、氷上で輸送され、臨床的研究が終わるまで、治験実施医療機関（study centre）にて−８０℃で保存した。次いで、すべての試料を中央検査室において同時に分析した。
【００８４】
１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシング
Expand High Fidelity PCR kit (Roche)を使用して、Illuminaインデックス／アダプターでのＰＣＲによって、細菌１６ｓ  ｒＲＮＡ可変領域２を増幅した。Qiagen DNA extraction kit (Qiagen)を使用して、ＰＣＲ産物を精製し、両端からの２５０ｂｐシーケンシングを可能にする２５０サイクルのケミストリーを用いて、Australian Genome Research Facility（ＡＧＲＦ）にて実施されたIllumina MiSeqシーケンシング前に、Nanodropを使用して定量化した。
【００８５】
バイオインフォマティクスおよび統計解析
MiSeqで作成された重複ペアエンド配列リードをつなぎ合わせ、QIME 1.8.0を使用して実装されたデータパイプラインにおいて処理した。リードをFastxtoolkit version 0.0.14を使用して２００ｂｐにトリミングし、Flash version 1.2.7.16を使用して、ペアエンドリードをマージした。マージされた配列を以下のようにクオリティフィルターにかけた：トリミング前に許容される、≦３  低クオリティｂｐ（Phredクオリティスコア＜３）、≧１８９  不要なベース（Ｎｓ）を含まない連続した高クオリティｂｐ。ＵＣＨＩＭＥ参照ベースの方法を用いて、キメラ１７個を除去した。合計２，４６４，８４８配列をフィルター排除し（７％）、解析用の３５，０３４，３１６が残った。Greengenes９７％  ＯＴＵレファレンスセット、version 13 5.19と共に、QIIME vl.818においてサブサンプルされたオープンレファレンス法を用いて、クオリティフィルターにかけられた配列を操作的分類単位（operational taxonomic unit）（ＯＴＵ）に割り当てた。簡潔には、６０％の低パーセント同一性で設定されたレファレンスに対して、インプット配列をプレフィルターにかけて、おそらくシーケンシングエラーである配列を除去した。次に、フィルターされた配列に、クローズドリファレンスＯＴＵピッキングを適用した（クローズドレファレンス法では、データベースに対してそれぞれのリードをサーチするためにＵＣＬＵＳＴ２０が使用され、配列同一性≧９７％でのベストヒットに基づくＯＴＵにそのリードが割り当てられる）。次に、クローズドレファレンス工程でリファレンスに合致しないすべての配列は、類似性９７％にて新たに（de novo）クラスター形成される。シングルトンＯＴＵは廃棄される。この結果、試料１つにつき分類割り当て（taxonomy-assigned）配列平均＞１９０，０００（範囲７５０２０〜４６５４００）が得られる。
【００８６】
多様性算出前に、レアファクションを用いて、リードカウントを７５，０００リードに正規化した。α多様性測定値（シャノン指数（Shannon’s index）、ＯＴＵのchao 1および数）を試料１つにつき１０の独立的レアファクションランで評価した。UniFrac メトリックを用いて、β多様性を算出した。unweighted UniFrac distance マトリックスで主座標解析を行った。最も有意な値が報告された最初の３台のＰＣで回帰分析を行った。
【００８７】
分類学的解析では、統計的有意性は、Ｐ値＜０．０５として定義され、複数の比較について補正するために、偽発見率（ＦＤＲ）の調整なしと調整ありの両方で実施された。
【００８８】
内視鏡的目視評価
回腸−結腸鏡検査にて、内視鏡医によってRutgeertsスコアに従って、吻合および新しい末端回腸での粘膜再発を評価した。６か月および１８か月時点の結腸鏡検査では、内視鏡的寛解は、Rutgeertsスコアｉ０（病変なし）またはｉ１（アフタ性病変≦５）として定義し、再発はｉ２（吻合にアフタ性病変または吻合に限局するより大きな病変＞５）、ｉ３（びまん性回腸炎）、またはｉ４（大きな潰瘍および／または狭窄を伴うびまん性炎症）と定義する。吻合および新しい末端回腸の写真が、内視鏡医のスコアおよび患者の情報および治療に対して盲検化された研究者２名によって独立してスコアリングされた。最終的なコンセンサススコアは、その盲検化された２名の査定者によって決定された。
【００８９】
便のバイオマーカーアッセイ
特許データの知識なく、製造元の説明書に従って、定量的酵素免疫測定法（fCAL（商標）, Buhlmann, Schonenbuch, Switzerland）によって、便のカルプロテクチン（ＦＣ）を測定した。濃度はμｇ／ｇ（便）と表した。本発明者らは、１００μｇ／ｇを超えるＦＣが、術後のクローン病の内視鏡的再発の診断に感受性があり、解析のためにこのカットオフが選択されることを以前に示している。
【００９０】
実施例３．結果
術後のクローン病の固有のコホート
クローン病患者３４名（男性４１％、年齢中央値２８、範囲２３〜４３歳）によって、外科的切除標本（ベースライン）からの、かつ術後６か月および／または１８か月時点の回腸および吻合からの合計１４１の粘膜バイオプシー試料が提供された。２８コントロール試料が得られ、これらは、正常な結腸を有する健康な患者（健康なコントロール）１２名からの結腸試料１２個ならびに、手術コントロール８名からの回腸および吻合試料１６個を含み、クローン病患者およびコントロールの人口統計を表１に示す。クローン病患者の中央値年齢は、健康なコントロールと手術コントロールの両方よりも低かった。
【００９１】
クローン病患者３４名のうち、２７名が６か月の時点で結腸鏡検査を受け、このうち１７名が内視鏡的寛解状態にあり、１０名に疾患の再発があった。１８か月の時点で、患者２７名が結腸鏡検査を受け、このうち１３名が内視鏡的寛解状態にあり、１４名に疾患の再発があった。
【００９２】
【表１】
2018517775.tif 000002
【００９３】
【表２】
2018517775.tif 000003
【００９４】
Illumina MiSeqプラットフォームを用いて、試料１つにつき分類割り当て１６Ｓ配列平均＞１９０，０００（範囲７５０２０〜４６５４００）が得られた。リードカウントは、多様性算出前にそれぞれの試料をランダムに７５０００リード（レアファクション）にサブサンプリングすることによって、正規化された。数には関係なく、いずれかのリードが検出された場合には、タクソン（Taxa）は検出されたと分類された。すべての試料の＜１０％で存在するタクソンは除外された。
【００９５】
α多様性
操作的分類単位（ＯＴＵ）数によって測定された場合に（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＝０．３６８）、クローン病は、手術コントロールではなく、健康なコントロールと比較して系統発生的豊富さ（phylogenetic richness）（α多様性）の全体的な低下を伴った。Shannon多様性指数（それぞれｐ＝０．００２およびｐ＝０．５５２）およびChao多様性指数（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＝０．６０７）。
【００９６】
ベースラインと術後の試料とを比較した場合に、クローン病患者におけるα多様性の統計学的に有意な差はなかった。内視鏡的再発に進んだ患者に対して、６か月または１８か月の時点で内視鏡的寛解状態のままであった患者の間に、ベースラインでの差は検出することができなかった。再発の患者（Rutgeerts≧ｉ２）に対する内視鏡的寛解状態の患者の間と、重篤な再発の患者（Rutgeertsｉ３およびｉ４）に対する粘膜の正常性（Rutgeertsｉ０）を有する患者の間とのいずれも、α多様性の統計学的に有意な差はなかった。喫煙者は、非喫煙者と比較して、α多様性に有意な違いはなかった。再発および寛解の個々の尺度として、ＦＣ＞１００μｇ／ｇは、ＦＣ≦１００μｇ／ｇと比較した場合、α多様性の有意な変化を伴わなかった。
【００９７】
ＣＤコホート内で、吻合と比較した場合、新しい末端回腸から採取された試料間でα多様性の統計学的に有意な差はなかった。
【００９８】
β多様性
クローン病および健康
ＣＤ（ベースラインでの）と健康なコントロール（Ｐ＜０．００１）の間では、微生物組成が有意に異なった。術後の回腸切除および回腸−結腸の吻合を考慮して、術後６か月および１８か月時点でのクローン病は、手術コントロールと有意に異なった（それぞれＰ＝０．０２２およびＰ＝０．０２７）、図１Ａ。
【００９９】
クローン病−時間および試料部位
微生物組成は、時間の経過にしたがってクローン病患者内で変化した。ベースラインの切除試料は、６か月（Ｐ＝０．００５）および１８か月（Ｐ＝０．００１）の時点において結腸鏡検査で採取された試料と有意に異なった。６か月時点での試料の組成は、１８か月で採取された試料と有意に異なった（Ｐ＝０．０２３）。同時に同一患者から採取された回腸および吻合からの対の試料は、同じ時点で異なる患者の同一部位から採取された試料よりも有意に類似していた（平均unweighted Unifracがそれぞれ０．３９対０．６３、Ｐ＜０．００１）、図１Ｂおよび１Ｃ。
【０１００】
クローン病−内視鏡的再発、便のカルプロテクチンおよび喫煙
内視鏡的再発を発症したクローン病患者、および６か月または１８か月の時点で内視鏡的寛解状態のままであった患者（それぞれＰ＝０．４７６およびＰ＝０．１９８）からの切除試料（ベースライン）を比較した場合に、β多様性の有意な差はなかった。β多様性は、内視鏡的再発を有するクローン病患者（ｉ２、ｉ３、およびｉ４）と内視鏡的寛解状態の患者との間で６か月または１８か月の時点（それぞれＰ＝０．９２６およびＰ＝０．０７４）で有意な違いはなかった。クローン病の重篤な内視鏡的再発（ｉ３およびｉ４）は、６か月の時点で粘膜の正常性（ｉ０）と比較して有意な差はなかったが（ｎ＝５  ｖ  ｎ＝８；β多様性Ｐ＝０．８４７）、１８か月の時点では有意な差があった（ｎ＝７  ｖ  ｎ＝５；β多様性Ｐ＝０．０１０）。ＦＣ＞１００μｇ／ｇを有する患者に対してＦＣ＜１００μｇ／ｇを有する患者の間（Ｐ＝０．８０１およびＰ＝０．７９８）にも、喫煙者および非喫煙者（それぞれＰ＝０．３２６およびＰ＝０．４４８）の間にも、６か月または１８か月時点でβ多様性の有意な差はなかった。
【０１０１】
疾患および再発に関連する細菌
クローン病および健康
健康なコントロールと比較して、ＣＤ（ベースライン）は、いくつかのタクソンの存在量の変化、例えば門レベルでのプロテオバクテリア、アクチノバクテリアおよびフソバクテリア、科レベルでの腸内細菌科（Enterobacteriaceae）および属レベルでのベイヨネラ（Veillonella）、ヘモフィルス（Haemophilus）、エンテロコッカス（Enterococcus）およびフソバクテリウム（Fusobacterium）の増加；およびバクテロイデス(門)およびルミノコッカス（Ruminococcus）およびラクノスピラ（Lachnospira）（属）の減少などを伴った。
【０１０２】
手術コントロールと６か月および１８か月時点でのＣＤを比較した場合に、α多様性の有意な差はなかったが、いくつかのタクソンの存在量が両方の時点で有意に異なった。６か月および１８か月の両時点で、手術コントロールと比較した術後のＣＤ試料は、クリステンセネラセエ（Christensellaceae）科およびプレボテラ（Prevotella）属の減少およびトラブルシエラ（Traubulsiella）属の増加を示した。ＣＤと健康なコントロールとの間に確認される分類学的シフトの大部分は、ＣＤおよび手術コントロール患者が比較された場合には確認されず、クローン病患者において術後に確認される微生物の差の多くは、炎症性疾患の存在よりもむしろ、手術の結果および再構成された解剖学的構造の結果であり得ると示唆される。
【０１０３】
切除およびその後の再発時点での細菌
ベースラインでの、特定のタクソンの有意な差が、６か月または１８か月のいずれかの時点で寛解状態のままである患者に対して、内視鏡的再発に進行した患者の間で確認されたが、どちらの時点でも再発を伴わなかった。切除時点でのフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）の存在量またはプロテウス（Proteus）属の有無によって、６か月または１８か月のいずれかの時点で内視鏡的再発を予想することができなかった。
【０１０４】
時間の経過による術後のクローン病および内視鏡的再発
ＣＤにおける細菌組成は、時間の経過にしたがって変化した（表２）。ストレプトコッカセエ（Streptococacceae）および02d06は、術後にベースラインと６か月との間に、かつ６か月と１８か月との間に有意に増加した唯一のタクソンであった。６か月の時点で、内視鏡的再発は、寛解と比較してプロテウス（Proteus）属の存在量の増加を伴った（Ｐ＝０．００８）。喫煙状態の補正のためにロジスティック回帰分析を用いて、６か月時点でのプロテウス（Proteus）属の検出は、検出不可能なプロテウス（Proteus）属と比較して、有意に高い再発のリスクと関連付けられた［ＯＲ１３（１．１−１５０）、Ｐ＝０．０３９］。
【０１０５】
１８か月の時点で、内視鏡的再発は、科レベルでのデスルホビブリオ（Desulfovibrinaceae）（Ｐ＝０．００４）およびルミノコッカス（Ruminococcaceae）（Ｐ＝０．０１４）および属レベルでのフィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)（Ｐ＝０．００１）、デスルホビブリオ（Desulfovibrio）（Ｐ＝０．０１１）およびバイロフィラ（Bilophila）（Ｐ＝０．０２２）の存在量の低下を伴った。喫煙状態に対する補正を行った場合、ごく低い存在量（＜０．１％）のフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）が内視鏡的再発の危険因子であった［ＯＲ１４（１．７−１１０）、Ｐ＝０．０１３］。
【０１０６】
検出可能な場合には、プロテウス（Proteus）属の存在量は非常に低かった。それと対照的に、検出可能な場合には、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）は、それより多い存在量で存在した。プロテウス（Proteus）属は、クローン病患者１４名（２１試料）において一部の時点（ベースライン、６か月および１８か月）で検出された。存在する場合に、各試料からのリードの中央値は３５［四分位数間範囲（ＩＱＲ）７−８２］であった。プロテウス（Proteus）属は健康な、または手術コントロールで検出されなかった。６か月の時点で、プロテウス（Proteus）属を有した患者６名のうち５名は内視鏡的再発を有した。１８か月の時点で、患者１名にプロテウス（Proteus）属が検出され、この患者は内視鏡的再発を有した。
【０１０７】
【表３】
2018517775.tif 000004
【０１０８】
ベースラインおよび６か月または１８か月のいずれかの時点で、患者７名にプロテウス（Proteus）属が検出され；これらのうち６名が、重篤な再発（ｉ３またはｉ４）を有する４名を含む内視鏡的再発を有した。患者１名は、６か月時点で検出可能なプロテウス（Proteus）属にもかかわらず、内視鏡的寛解（ｉ０）のままであった。１８か月時点で、完全な粘膜の正常性と比較した場合に重篤な内視鏡的再発（Rutgeerts  ｉ３およびｉ４）は、プロテオバクテリア門（Ｐ＝０．０１８）の増加；ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）（Ｐ＝０．００３）、リケネラ科（Rikenellaceae）（Ｐ＝０．０３３）およびツリシバクター科（Turicibacteraceae）（Ｐ＝０．３３）の減少、およびフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）属（Ｐ＝０．００５）、デスルホビブリオ（Desulfovibrio）属（Ｐ＝０．００９）、ラクノバクテリウム（Lachnobacterium）属（Ｐ＝０．００９）、オシロスピラ（Oscillospira）属（Ｐ＝０．０２３）、パラプレボテラ（Paraprevotella）属（Ｐ＝０．０３３）、アトポビウム（Atopobium）属（Ｐ＝０．０３３）、オドリバクター（Odoribacter）属（Ｐ＝０．０３３）およびツリシバクター（Turicibacter）属（Ｐ＝０．０３３）の減少を伴った。これらの変化は６か月時点で確認されなかった。
【０１０９】
喫煙の影響
このコホートにおけるアクティブな喫煙は、内視鏡的再発［ＯＲ３．３（１−１１）Ｐ＝０．０４９］を伴い、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）およびプロテウス（Proteus）属の存在とは無関係であった。アクティブな喫煙は、６か月および１８か月時点で非喫煙者と比較して、いくつかのタクソンの有意な差を伴った（表５）。６か月時点で、プロテウス（Proteus）属が、非喫煙者と比較して、喫煙者において増加した（Ｐ＝０．０３７）。
【０１１０】
便のカルプロテクチン
これらの３４名のクローン病患者において、ＦＣ＞１００μｇ／ｇは、内視鏡的再発［ＯＲ６．４（１．０２−５１．４）Ｐ＝０．０３２］を伴った。６か月時点では、シュードモナス（Pseudomonas）およびパルビモナス（Parvimonas）が、ＦＣ＞１００μｇ／ｇを有する患者において増加した（それぞれ、Ｐ＝０．０３０およびＰ＝０．０４２）。
【０１１１】
プロテウス（Proteus）、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）、喫煙および内視鏡的再発の間の関係
喫煙は、術後のプロテウス（Proteus）の存在量の増加を伴った。プロテウス（Proteus）の存在およびフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）の低い存在量もまた、内視鏡的再発のリスクの増加と非依存的に関連付けられた。６か月および／または１８か月時点で再発を有する患者２４名のうち、２０名が、低いフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）存在量またはプロテウス（Proteus）の存在を伴った。
【０１１２】
フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）の高い存在量を含み、かつプロテウス（Proteus）属を含まない、６か月または１８か月時点での微生物プロファイルは、内視鏡的寛解の感度８４％、特異度６９％、陽性的中率（ＰＰＶ）７０％および陰性的中率（ＮＰＶ）８３％を有した。
【０１１３】
内視鏡的再発の診断における、プロテウス（Proteus）の存在、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）の存在量、および喫煙状態に関して、回腸粘膜の微生物解析の使用の精度は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析を用いてモデリングされ、内視鏡的再発の予想に適度な精度が得られた（ＡＵＣ  ０．７４０、９５％ＣＩ  ０．６９〜０．７９）。
【０１１４】
種のレベルでの分類学的同定
この研究コホートにおいて、８６７個のＯＴＵがフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）として同定された。これらの８５７（９９％）が、種レベルにてＦ  プラウスニッツィイ（F prausnitzii）として同定された。
【０１１５】
４つの別々のＯＴＵ（Greengenes  ＯＴＵ４４４０４９７、８１４１１２、５６０６２９および新たな（de novo）ＯＵＴ；Greengenes  １６ｓ  ｒＲＮＡデータベース；greengenes.lbl.gov）が、プロテウス（Proteus）属に属すると同定されたが、これらは、種レベルでは同定することができなかった。これらのうち、ＯＴＵ８１４１１２は最も豊富であり（すべてのリードのうち６５％）、かつプロテウス（Proteus）属が検出された２１試料のうちの１９試料において少なくとも一部存在した。このＯＴＵの代表的な完全長１６Ｓ配列を調べ、かつNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）ＢＬＡＳＴ参照データベースと比較すると、Ｐ．ミラビリス（P. mirabilis）と最も近くマッチした(クエリーカバー１００％、Ｅ値０．０、同一性９５％）。ＯＴＵ５６０６２９もまた、Ｐ．ミラビリス（P. mirabilis）とベストマッチであることが判明した（クエリーカバー１００％、Ｅ値０．０、同一性９８％）。
【０１１６】
実施例４．考察
ＣＤを有する患者の８０％がその生存期間中に手術を受けるが、疾患の再発は、手術から１年以内に患者の大部分で吻合および新しい末端回腸にて確認することができる。したがって、新たな末端回腸での微生物コミュニティーの術後の研究は、原因となる重要な生物を同定する可能性を有する。
【０１１７】
本発明者らは、健康なコントロールと比較して、ＣＤを有する患者における微生物プロファイルの有意な差を確認した。さらなるタクソンが、ＣＤと関連することが確認された（表２）。この研究では、ディープシーケンシングを提供し、かつ低存在量の生物の潜在的な同定を提供する、ハイスループットIlluminaシーケンシングを用いた。
【０１１８】
回腸生検材料の分析がこの研究に選択された。回腸は、ＣＤにおける主要な免疫学的誘導性部位であると考えられる。さらに、吻合からの生検材料は、回腸または結腸粘膜がサンプリングされたかどうかに関しては厳密ではない。
【０１１９】
４つの重要な発見がこの研究から生まれた。第一に、回腸−盲腸の外科的切除（虫垂切除、回腸−盲腸弁の除去、および変えられた解剖学的構造を含む）が、微生物プロファイルの変化を伴い、原疾患には無関係である。第二に、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）およびプロテウス（Proteus）属は、術後の再発に有意に関連し、喫煙とは無関係である。第三に、低グレードの粘膜炎症（高いＦＣによって確認される）から重篤な内視鏡的再発までの、再発性疾患の進行は、時間の経過にしたがった腸の微生物プロファイルの変化に関連する。最後に、本発明者らは、微生物要因および環境要因を含む再発のモデルを特徴付けた。
【０１２０】
回腸−盲腸切除後の微生物変化は、以前に記述されていない。これは、切除のみ、回腸盲腸弁の除去、または虫垂の除去に関係し得る。虫垂は、腸内の有益な微生物もしくは片利共生微生物の保持または保護に一役割を果たし得る。虫垂切除は、潰瘍性大腸炎の発症を防ぐことが示されているが、クローン病においては、虫垂切除は、疾患発症の危険因子であり得る。
【０１２１】
先の研究と同様に、Ｆ．プラウスニッツィイ（F. prausnitzii）の存在量は、本発明者らのコホートにおいて、術後の持続的な内視鏡的寛解と関連することが示された。Ｆ．プラウスニッツィイ（F. prausnitzii）は、抗炎症性を示すことが判明しており、健康なコントロールと比較して、ＣＤの患者において有意に低い存在量であると思われ、この種は、ＣＤの予防または治療において予防的または治療的役割を有し得るという推測が導かれる。
【０１２２】
本発明者らは、ＣＤの患者２１名（４１％）においてプロテウス（Proteus）属を検出した。健康なコントロールまたは手術コントロールのいずれにもそれを見出さなかった。回腸において術後６か月時点で検出した場合には、それは強く再発と関連し、喫煙に無関係であり、再発のリスクを１３倍高めた。プロテウス（Proteus）属は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）のメンバーであり、正常な腸内フローラにおいて見つけることができる。胃腸管において病原性であると従来から考えられていないが、プロテウス（Proteus）属は通常、複雑な尿路感染症と関連している。プロテウス（Proteus）属は、慢性関節リウマチの病因論に関わっている。この研究では、術後の疾患再発を有する患者の８８％（２１／２４）を潜在的に、喫煙、低存在量のフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）、またはプロテウス（Proteus）属の存在のうちの１つまたは複数によって説明することができた。これらの因子の少なくとも１つが、重篤な再発を有する患者１２名すべてに存在した（Rutgeerts  ｉ３およびｉ４）。
【０１２３】
カルプロテクチン、カルシウム結合性タンパク質のＳ１００ファミリーのメンバーが、存在する炎症の程度に比例して組織に存在する。術後に便のカルプロテクチン＞１００μｇ／ｇによって、患者が内視鏡的に同定可能な再発を有するらしいことが確認される。シュードモナス（Pseudomonas）属は、この研究においてＦＣ＞１００μｇ／ｇと有意に関連した。シュードモナス（Pseudomonas）属は、健康なコントロールと比較してＣＤを有する子供の回腸粘膜により多く蔓延していることが判明し、ＣＤの病因に関係している。現在の研究では、シュードモナス（Pseudomonas）は高いＦＣと関連しているが、内視鏡的再発を有する患者においてそれほど豊富ではなかった。対照的に、プロテウス（Proteus）の検出およびＦ．プラウスニッツィイ（F.prausnitzii）の低存在量は内視鏡的再発と関連付けられるが、ＦＣの増加はなかった。Ｆ．プラウスニッツィイ（F. prausnitzii）の低存在量のみが重篤な再発に関連付けられ、これは、術後１８か月の時点でのみ、β多様性の有意な減少および他の分類学的な差と共に確認された。これらの知見から、様々なステージの再発性の炎症の進化があり、かつこれらのステージは、様々な微生物プロファイルおよび影響と関連し得ることが示唆される。
【０１２４】
この研究におけるすべてのクローン病患者は、術後の最初の３か月間、メトロニダゾール療法を受け、一部の患者は、チオプリンまたはアダリムマブを投与された。薬物療法に関する術後の回腸マイクロバイオームの詳細な評価は、臨床研究で用いられる異種な（heterogenous）治療計画および各薬物投与計画コホートにおける比較的少ない数によって制限された。薬物療法に関わらず、本発明者らの知見によって、再発自体が微生物の変化を反映するらしいことが示された。
【０１２５】
まとめると、新しい末端回腸で術後に、非常に低い存在量でさえ検出される場合のプロテウス（Proteus）属は、早期の術後再発の発生において一役割を果たし得る。したがって、クローン病および疾患の術後再発は、クローン病患者の胃腸管内のプロテウス（Proteus）属細菌のレベルを低減することによって治療または予防することができる。
【０１２６】
広く記述される本発明の範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態に示されるように、本発明に多数の変更および／または修正を加えてもよいことは当業者には理解されよう。したがって、本発明の実施形態は、すべての点で説明的なものであり、制限的なものではないと見なされるべきである。
【０１２７】
本明細書で論述かつ／または参照されるすべての出版物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、オーストラリア国特許第２０１５９０２２８６号からの優先権を主張する。
【０１２９】
本明細書に包含されている、文書、行為、材料、デバイス、物品等のいずれの記述も、単に本発明のコンテクストを提供する目的のためである。この出願の各請求の優先権日付前にそれが存在するため、これらの物のいずれか、もしくはすべてが先行技術ベースの一部を形成するか、または本発明に関連した分野で一般的な知識であるという許可として解釈すべきではない。
【図１】
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【国際調査報告】
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