(57)【要約】細菌性膣症（ＢＶ）を診断するための方法が開示されている。開示した方法は一般に、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよび／またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの選ばれた種を検出するステップと、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選ばれた種を任意選択で検出するステップとを含む。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選ばれた種由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはそのコード遺伝子を検出するための核酸オリゴマーおよび関連組成物も開示されている。
2018500918.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における細菌性膣症（ＢＶ）を診断するための方法であって、
（ａ）ＢＶを有すると疑われる被験体から試料を得るステップと、
（ｂ）該試料中のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ属およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ属のそれぞれにおける選ばれた細菌種を検出するためのアッセイを実施するステップと
を含み、
該アッセイは、配列番号１に示した配列と少なくとも９８％同一である核酸塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在によって特徴付けられるＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種を検出するが、他のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種を検出せず、
該アッセイは、Ｐ．ａｍｎｉｉ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰ．ｂｉｖｉａを検出するが、他のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種を検出せず、
ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのうちの少なくとも一方の検出が、該被験体におけるＢＶを示す、方法。
【請求項２】
前記アッセイが、前記被験体において選ばれたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種をさらに検出するが、Ｌ．ｉｎｅｒｓを検出せず、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが検出されない場合、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのうちの少なくとも一方の検出が、該被験体におけるＢＶを示し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが検出される場合、そのときは、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの両方の検出が、該被験体におけるＢＶを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａを検出するための前記アッセイが、核酸に基づく検出アッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸に基づく検出アッセイが、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡを標的とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸に基づく検出アッセイが、
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域、および／または
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域
を標的とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸に基づく検出アッセイが、増幅に基づかないアッセイである、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅に基づかないアッセイが、切断に基づくアッセイである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記切断に基づくアッセイが、ＲＮＡ標的核酸を検出し、ＲＮＡ：ＤＮＡ線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記切断に基づくアッセイが、ＤＮＡ標的核酸を検出し、ＤＮＡ：ＤＮＡ線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの検出が、ホモジニアス検出反応を使用して実施される、請求項３から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの検出が、リアルタイムで実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸に基づく検出アッセイが、
（ｉ）前記試料を、
（Ａ）配列番号１内の標的配列に特異的にハイブリダイズするＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的プライマー、および
（Ｂ）配列番号２内の標的配列に特異的にハイブリダイズするＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的プライマー
と接触させるステップであって、
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡが存在する場合、該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ内のそのそれぞれの１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列にそれぞれのプライマーが特異的にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
（ｉｉ）それぞれのハイブリダイズしたプライマーの３’末端が伸長され、それによって該ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡの領域に相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを生成する反応条件を提供するステップであって、該領域は、該それぞれのプライマー標的配列の５’に位置する、ステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの任意のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡを
（Ａ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第１の標的配列に特異的にハイブリダイズする３’部分および該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズしない５’部分を有する第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｂ）該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第１の標的配列に特異的にハイブリダイズする３’部分および該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズしない５’部分を有する第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｃ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の、第２の標的配列に特異的にハイブリダイズする５’部分を有する第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドであって、該第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列は、該第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列の３’に位置し、それに隣接する、第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、ならびに
（Ｄ）該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第２の標的配列に特異的にハイブリダイズする５’部分を有する第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドであって、該第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列は、該第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列の３’に位置し、それに隣接する、第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、
該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡが存在する場合、該第１および第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドは、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの線状の二重鎖切断構造を形成するように該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡに安定にハイブリダイズする反応条件下で、および
該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡが存在する場合、該第１および第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドは、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの線状二重鎖切断構造を形成するように該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡに安定にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
（ｉｖ）該試料を
該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造が存在する場合、該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造の切断が起きて、該第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの該５’部分を含むＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物を生成する反応条件下で、
該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造が存在する場合、該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造の切断が起きて、該第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの該５’部分を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を生成する反応条件下で、ステップ（ｉｉｉ）からの任意の切断構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、
（ｖ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物の存在または非存在を検出するステップと
を含む切断に基づくアッセイである、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的プライマーが、配列番号６に示した配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的プライマーが、配列番号９に示した配列を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記３’部分が、配列番号４の残基１１〜２７に示した配列を含む、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記３’部分が、配列番号７の残基１１〜２５に示した配列を含む、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号５の残基１〜２０に示した配列を含む、請求項１２から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号８の残基１〜２４に示した配列を含む、請求項１２から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を検出するステップが、
該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物を第１の蛍光標識および第１のクエンチャーを含む第１のＦＲＥＴカセットと接触させ、該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を第２の蛍光標識および第２のクエンチャーを含む第２のＦＲＥＴカセットと接触させることであって、
それぞれのＦＲＥＴカセットが、前記フラップエンドヌクレアーゼによって切断され得る第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造を形成するように該それぞれの切断生成物とハイブリダイズし、
該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物が存在する場合、該第１の蛍光標識が、該第１のクエンチャーを含む該第１のＦＲＥＴカセットから放出され、
該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物が存在する場合、該第２の蛍光標識が、該第２のクエンチャーを含む該第２のＦＲＥＴカセットから放出されることと、
該放出された第１または第２の蛍光標識を検出することと
を含む、請求項１２から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のクエンチャーおよび前記第２のクエンチャーが同じである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物が、配列番号４の残基１〜１１に示した配列を含み、配列番号４の残基１１が、該切断生成物の３’終末端に対応する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のＦＲＥＴカセットが、配列番号１４に示した配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物が、配列番号７の残基１〜１１に示した配列を含み、配列番号７の残基１１が、該切断生成物の３’終末端に対応する、請求項１９から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のＦＲＥＴカセットが、配列番号１５に示した配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを検出するためのアッセイが、核酸に基づく検出アッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸に基づく検出アッセイが、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡを標的とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸に基づく検出アッセイが、
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域、
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域、および／または
（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド位置８３７〜９４４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域
を標的とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸に基づく検出アッセイが、増幅に基づかないアッセイである、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅に基づかないアッセイが、切断に基づくアッセイである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記切断に基づくアッセイが、ＲＮＡ標的核酸を検出し、ＲＮＡ：ＤＮＡ線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記切断に基づくアッセイが、ＤＮＡ標的核酸を検出し、ＤＮＡ：ＤＮＡ線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの検出が、ホモジニアス検出反応を使用して実施される、請求項２５から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの検出が、リアルタイムで実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸に基づく検出アッセイが、
（ｉ）前記試料を、
（Ａ）配列番号１内の標的配列に特異的にハイブリダイズするＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的プライマー、
（Ｂ）配列番号２内の標的配列に特異的にハイブリダイズするＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的プライマー、および
（Ｃ）配列番号３内の標的配列に特異的にハイブリダイズするＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的プライマー
と接触させるステップであって、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡが存在する場合、該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ内のそのそれぞれの１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列にそれぞれのプライマーが特異的にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
（ｉｉ）それぞれのハイブリダイズしたプライマーの３’末端が伸長され、それによって該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡの領域に相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを生成する反応条件を提供するステップであって、該領域は、該それぞれのプライマー標的配列の５’に位置する、ステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの任意のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡを
（Ａ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第１の標的配列に特異的にハイブリダイズする３’部分および該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズしない５’部分を有する第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｂ）該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第１の標的配列に特異的にハイブリダイズする３’部分および該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズしない５’部分を有する第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｃ）該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡ内の第１の標的配列に特異的にハイブリダイズする３’部分および該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズしない５’部分を有する第１のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｄ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第２の標的配列に特異的にハイブリダイズする５’部分を有する第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドであって、該第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列は、該第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列の３’に位置し、それに隣接する、第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｅ）該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第２の標的配列に特異的にハイブリダイズする５’部分を有する第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドであって、該第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列は、該第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列の３’に位置し、それに隣接する、第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、ならびに
（Ｆ）該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡ内の第２の標的配列に特異的にハイブリダイズする５’部分を有する第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチドであって、該第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡ標的配列は、該第１のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡ標的配列の３’に位置し、それに隣接する、第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、
該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡが存在する場合、該第１および第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドは、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの線状二重鎖切断構造を形成するように該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡに安定にハイブリダイズする反応条件下で、
該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡが存在する場合、該第１および第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドは、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの線状二重鎖切断構造を形成するように該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡに安定にハイブリダイズする反応条件下で、および
該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡが存在する場合、該第１および第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチドは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの線状二重鎖切断構造を形成するように該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡに安定にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
（ｉｖ）該試料を、
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造が存在する場合、該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造の切断が起きて、該第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの該５’部分を含むＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物を生成する反応条件下で、
前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造が存在する場合、該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造の切断が起きて、該第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの該５’部分を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を生成する反応条件下で、
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断構造が存在する場合、該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断構造の切断が起きて、該第１のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチドの該５’部分を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物を生成する
反応条件下で、ステップ（ｉｉｉ）からの任意の切断構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、
（ｖ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物の存在または非存在を検出するステップと
を含む切断に基づくアッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的プライマーが、配列番号６に示した配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的プライマーが、配列番号９に示した配列を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的プライマーが、配列番号１３に示した配列を含む、請求項３４から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの３’部分が、配列番号４の残基１１〜２７に示した配列を含む、請求項３４から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの３’部分が、配列番号７の残基１１〜２５に示した配列を含む、請求項３４から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記第１のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチドの３’部分が、配列番号１０の残基１１〜２７に示した配列を含む、請求項３４から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号５の残基１〜２０に示した配列を含む、請求項３４から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号８の残基１〜２４に示した配列を含む、請求項３４から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、（１）配列番号１１の残基１〜２７に示した配列および（２）配列番号１２の残基１〜３２に示した配列からなる群から選択される配列を含む、請求項３４から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物を検出するステップが、
該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物を第１の蛍光標識および第１のクエンチャーを含む第１のＦＲＥＴカセットと接触させること、該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を第２の蛍光標識および第２のクエンチャーを含む第２のＦＲＥＴカセットと接触させること、および該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物を第３の蛍光標識および第３のクエンチャーを含む第３の（thirs）ＦＲＥＴカセットと接触させることであって、
それぞれのＦＲＥＴカセットが、前記フラップエンドヌクレアーゼによって切断され得る第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断構造を形成するように該それぞれの切断生成物とハイブリダイズし、
該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物が存在する場合、該第１の蛍光標識が、該第１のクエンチャーを含む該第１のＦＲＥＴカセットから放出され、
該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物が存在する場合、該第２の蛍光標識が、該第２のクエンチャーを含む該第２のＦＲＥＴカセットから放出され、
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物が存在する場合、前記第３の蛍光標識が、該第３のクエンチャーを含む該第３のＦＲＥＴカセットから放出されることと、
該放出された第１、第２、または第３の蛍光標識を検出することと
を含む、請求項３４から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記第１、第２、および第３のクエンチャーが同じである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物が、配列番号４の残基１〜１１に示した配列を含み、配列番号４の残基１１が、該切断生成物の３’終末端に対応する、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のＦＲＥＴカセットが、配列番号１４に示した配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物が、配列番号７の残基１〜１１に示した配列を含み、配列番号７の残基１１が、該切断生成物の３’終末端に対応する、請求項４４から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記第２のＦＲＥＴカセットが、配列番号１５に示した配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物が、配列番号１０の残基１〜１１に示した配列を含み、配列番号１０の残基１１が、該切断生成物の３’終末端に対応する、請求項４４から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記第３のＦＲＥＴカセットが、配列番号１６に示した配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＢＶに関連した１０種以下の細菌属の検出を含む、請求項１から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
ＢＶに関連した５種以下の細菌属の検出を含む、請求項１から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ以外のＢＶに関連した細菌属の検出を含まない、請求項１から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
ＢＶが前記被験体において示される場合、該被験体にＢＶの処置レジメンを施すステップをさらに含む、請求項１から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記被験体におけるＢＶを監視するための方法であり、該被験体が、ステップ（ａ）の前にＢＶの処置レジメンを受けている、請求項１から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
ＢＶが前記被験体において示される場合、（ｉ）該被験体にＢＶの前記処置レジメンを施すステップ、または（ｉｉ）該被験体にＢＶの異なる処置レジメンを施すステップのいずれかをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの検出が、前記標的のそれぞれについて、検出シグナルを該標的の所定の検出閾値と比較することを含む、請求項１および３から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの検出が、前記標的のそれぞれについて、検出シグナルを該標的の所定の検出閾値と比較することを含む、請求項２および２５から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸を検出するための反応混合物であって、
配列番号１に示した配列と少なくとも９８％同一である核酸塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在によって特徴付けられるＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種の標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、他のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種由来の核酸内の配列に特異的にハイブリダイズしないＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチド、および
Ｐ．ａｍｎｉｉ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰ．ｂｉｖｉａの標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、他のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種由来の核酸内の配列に特異的にハイブリダイズしない、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的なオリゴヌクレオチド
を含む反応混合物。
【請求項６１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、Ｌ．ｉｎｅｒｓ由来の核酸内の配列に特異的にハイブリダイズしない、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項６０に記載の反応混合物。
【請求項６２】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸が、それぞれＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡである、請求項６０に記載の反応混合物。
【請求項６３】
（ｉ）前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とし、かつ／または
（ｉｉ）前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とする、
請求項６２に記載の反応混合物。
【請求項６４】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、
配列番号６に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号４の残基１１〜２７に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および
配列番号５の残基１〜２０に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択される、請求項６３に記載の反応混合物。
【請求項６５】
前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、
配列番号９に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号７の残基１１〜２５に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および
配列番号８の残基１〜２４に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項６３または６４に記載の反応混合物。
【請求項６５】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸内の２つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、および／または前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸内の２つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項６０から６５のいずれかに記載の反応混合物。
【請求項６６】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的核酸が、それぞれＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡである、請求項６１に記載の反応混合物。
【請求項６７】
（ｉ）前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とし、
（ｉｉ）前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とし、かつ／または
（ｉｉｉ）前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号３のヌクレオチド位置８３７〜９４４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とする、
請求項６６に記載の反応混合物。
【請求項６８】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、
配列番号６に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号４の残基１１〜２７に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および
配列番号５の残基１〜２０に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項６７に記載の反応混合物。
【請求項６９】
前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、
配列番号９に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号７の残基１１〜２５に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および
配列番号８の残基１〜２４に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項６７または６８に記載の反応混合物。
【請求項７０】
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドが、
配列番号１３に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号１０の残基１１〜２７に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号１１の残基１〜２７に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および
配列番号１２の残基１〜３２に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択される、請求項６７から６９のいずれかに記載の反応混合物。
【請求項７１】
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸内の２つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸内の２つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、および／または前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的核酸内の２つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項６０および６６から７０のいずれかに記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
国民健康栄養調査によれば、１４歳から４９歳の間の女性のほぼ３分の１が細菌性膣症（ＢＶ）を有する。AllsworthおよびPeipert、Obstetrics  and  Gynecology、１０９巻：１１４〜１２０頁、２００７年を参照。ＢＶは、膣分泌物の最も一般的な原因および多くの女性が医学的手当を求める理由である。これはまた、早産、低出生時体重、骨盤内炎症性疾患、ＨＩＶを含むＳＴＤ感染症の増大、およびセックスパートナーにＨＩＶを広めるより大きいリスクと関連している。SrinivasanおよびFredricks、Interdisciplinary  Perspectives  on  Infectious  Diseases、２００８巻、文書番号７５０４７９、２２頁、２００８年を参照）。細菌性膣症を有する女性は、悪臭膣分泌物または刺激を含む症状を有し得るが、診断可能なＢＶを有する女性の半数もが明らかな症状を有さない（SrivinvasanおよびFredricks、上記を参照）。
【０００２】
ほとんどの研究者およびＣＤＣは、細菌性膣症を膣の正常な細菌フローラの破壊の結果であると考えている。一般的な感染症と異なり、このディスバイオーシスは、個々の細菌種の結果ではない。CDC  Factsheet、２０１４年（BV-Fact-Sheet-March-2014.pdf、ＣＤＣウェブサイトから）を参照。ディスバイオーシスは、膣などの体環境内の正常な微生物叢の破壊である。Nibaliら、Journal  of  Oral  Microbiology、６巻：２２９６２頁、２０１４年を参照。
【０００３】
ＢＶは、Ａｍｓｅｌ基準を使用して診療所において、およびＮｕｇｅｎｔスコアシステムを使用して検査室において診断される。後者は、グラム染色を活用して細菌形態型をカウントすることに基づく。このように、Ｎｕｇｅｎｔスコアは、ディスバイオーシスの視覚的評価であり、これは、良性細菌に対して悪性細菌をスコア付けする。Nugentら、Journal  of  Clinical  Microbiology、２９巻：２９７〜３０１頁、１９９１年を参照。Ａｍｓｅｌ基準では、ＢＶに関連した重要な症状である、手掛かりとなる細胞の存在、ｐＨ、色、および臭気について試料を評価する。Amselら、Am.  J.  Med.、７４巻：１４〜２２頁、１９８３年を参照。Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓから主になると考えられている細菌で覆われたヒト上皮細胞である、手掛かりとなる細胞を検出するために、試料のウェットマウントが顕微鏡で検査される。
【０００４】
分子試験は一般に、細菌性膣症と強い相関を有する複数の生物を標的とする。どの生物が標的とされるかは、試験によって変動する。ほとんどすべての場合において、高存在量の嫌気性細菌、例えば、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ種、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ種、およびＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ種が標的とされる。
【０００５】
ＢＶについてのただ１つのＦＤＡ承認試験（ＢＤ  Ａｆｆｉｒｍ  ＶＰＩＩＩ  ２０１０）は、Cartwrightら（Journal  of  Clinical  Microbiology、５１巻：３６９４〜３６９９頁、２０１３年）による研究において６７．６％の感度および７６．４％の特異性を有することが判明した。ＢＶを診断する目的に関して、Ａｆｆｉｒｍプロダクト（Affirm  product）は、その唯一の指標としてＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出する。プロダクト添付文書は、Ａｆｆｉｒｍプロダクトが、スコア付けされたグラム染色法と比較したとき、９５．１％の感度および８３．３％の特異性であることを示す。
Cartwrightら、上記は、ＢＶの診断用Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ、ＢＶＡＢ−２およびＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ−１を検出するためにマルチプレックスアッセイを使用した。彼らは、３２３人の女性の集団（９３％アフリカ系アメリカ人、７％非ヒスパニック系白人）におけるＮｕｇｅｎｔおよびＡｍｓｅｌの結果の組合せに対するこのアッセイの性能を測定した。彼らは、この試験が、ＮｕｇｅｎｔスコアおよびＡｍｓｅｌスコアの組合せと比較したとき、９６．９％の感度および９２．６％の特異性であったことを報告した。彼らは、Ｎｕｇｅｎｔスコア単独に対するこのアッセイの結果を報告しなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】AllsworthおよびPeipert、Obstetrics  and  Gynecology、１０９巻：１１４〜１２０頁、２００７年
【非特許文献２】SrinivasanおよびFredricks、Interdisciplinary  Perspectives  on  Infectious  Diseases、２００８巻、文書番号７５０４７９、２２頁、２００８年
【非特許文献３】Nibaliら、Journal  of  Oral  Microbiology、６巻：２２９６２頁、２０１４年
【非特許文献４】Nugentら、Journal  of  Clinical  Microbiology、２９巻：２９７〜３０１頁、１９９１年
【非特許文献５】Amselら、Am.  J.  Med.、７４巻：１４〜２２頁、１９８３年
【非特許文献６】Cartwrightら（Journal  of  Clinical  Microbiology、５１巻：３６９４〜３６９９頁、２０１３年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、被験体における細菌性膣症（ＢＶ）を診断するための方法を提供する。本方法は一般に、（ａ）ＢＶを有すると疑われる被験体から試料を得るステップと、（ｂ）試料中のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ属およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ属のそれぞれにおける選ばれた細菌種を検出するためのアッセイを実施するステップとを含み、アッセイは、配列番号１に示した配列と少なくとも９８％同一（例えば、少なくとも９９％または１００％同一）である核酸塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在によって特徴付けられるＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種を検出するが、他のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種を検出せず、アッセイは、Ｐ．ａｍｎｉｉ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰ．ｂｉｖｉａを検出するが、他のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種を検出しない。ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのうちの少なくとも一方の検出は、被験体におけるＢＶを示す。
【０００８】
上記の方法のある特定の実施形態では、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａを検出するためのアッセイは、核酸に基づく検出アッセイである。一部のそのような実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡを標的とする。特定の変更形態では、核酸に基づく検出アッセイは、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域、および／または（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域を標的とする。他の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、例えば、切断に基づくアッセイなどの増幅に基づかないアッセイである。一部のそのような実施形態では、切断に基づくアッセイは、ＲＮＡ標的核酸を検出し、ＲＮＡ：ＤＮＡ線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用し、他の実施形態では、切断に基づくアッセイは、ＤＮＡ標的核酸を検出し、ＤＮＡ：ＤＮＡ線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する。核酸に基づく検出アッセイを使用する方法の一部の変更形態では、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの検出は、ホモジニアス検出反応（homogeneous  detection  reaction）を使用して実施される。ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの検出はさらに、リアルタイムで実施することができる。
【０００９】
切断に基づくアッセイを利用する方法の一部の実施形態では、アッセイは、以下のステップを包含する：
（ｉ）前記試料を、
（Ａ）配列番号１内の標的配列に特異的にハイブリダイズするＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的プライマー、および
（Ｂ）配列番号２内の標的配列に特異的にハイブリダイズするＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的プライマー
と接触させるステップであって、
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡが存在する場合、該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ内のそのそれぞれの１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列にそれぞれのプライマーが特異的にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
（ｉｉ）それぞれのハイブリダイズしたプライマーの３’末端が伸長され、それによって該ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡの領域に相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを生成する反応条件を提供するステップであって、該領域は、該それぞれのプライマー標的配列の５’に位置する、ステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの任意のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡを
（Ａ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第１の標的配列に特異的にハイブリダイズする３’部分および該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズしない５’部分を有する第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｂ）該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第１の標的配列に特異的にハイブリダイズする３’部分および該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズしない５’部分を有する第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｃ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の、第２の標的配列に特異的にハイブリダイズする５’部分を有する第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドであって、該第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列は、該第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列の３’に位置し、それに隣接する、第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、ならびに
（Ｄ）該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第２の標的配列に特異的にハイブリダイズする５’部分を有する第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドであって、該第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列は、該第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列の３’に位置し、それに隣接する、第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、
該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡが存在する場合、該第１および第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドは、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの線状の二重鎖切断構造を形成するように該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡに安定にハイブリダイズする反応条件下で、および
該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡが存在する場合、該第１および第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドは、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの線状二重鎖切断構造を形成するように該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡに安定にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
（ｉｖ）該試料を
該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造が存在する場合、該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造の切断が起きて、該第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの該５’部分を含むＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物を生成する反応条件下で、
該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造が存在する場合、該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造の切断が起きて、該第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの該５’部分を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を生成する反応条件下で、ステップ（ｉｉｉ）からの任意の切断構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、
（ｖ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物の存在または非存在を検出するステップと
を含む。
【００１０】
上記のとおりの切断に基づくアッセイを含む方法の一部の変更形態では、以下の条件のうちの任意の１つまたは複数が存在する：
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的プライマーが、配列番号６に示した配列を含む；
前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的プライマーが、配列番号９に示した配列を含む；
前記第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記３’部分が、配列番号４の残基１１〜２７に示した配列を含む；
前記第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記３’部分が、配列番号７の残基１１〜２５に示した配列を含む；
前記第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号５の残基１〜２０に示した配列を含む；および／または
前記第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号８の残基１〜２４に示した配列を含む。
【００１１】
上記のとおりの切断に基づくアッセイを含む方法の特定の実施形態では、前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を検出するステップが、該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物を第１の蛍光標識および第１のクエンチャーを含む第１のＦＲＥＴカセットと接触させ、該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を第２の蛍光標識および第２のクエンチャーを含む第２のＦＲＥＴカセットと接触させることを包含し、それぞれのＦＲＥＴカセットが、前記フラップエンドヌクレアーゼによって切断され得る第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造を形成するように該それぞれの切断生成物とハイブリダイズする。該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物が存在する場合、該第１の蛍光標識が、該第１のクエンチャーを含む該第１のＦＲＥＴカセットから放出され、そして該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物が存在する場合、該第２の蛍光標識が、該第２のクエンチャーを含む該第２のＦＲＥＴカセットから放出される。次いで、該放出された第１および／または第２の蛍光標識を検出する。第１のＦＲＥＴカセットおよび第２のＦＲＥＴカセットを利用する一部の変更形態では、前記第１のクエンチャーおよび前記第２のクエンチャーが同じである。一部の特定の実施形態では、該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物が、配列番号４の残基１〜１１に示した配列を含み、配列番号４の残基１１が、該切断生成物の３’終末端に対応し、前記第１のＦＲＥＴカセットが、必要に応じて、配列番号１４に示した配列を含む；および／または前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物が、配列番号７の残基１〜１１に示した配列を含み、配列番号７の残基１１が、該切断生成物の３’終末端に対応し、前記第２のＦＲＥＴカセットが、必要に応じて、配列番号１５に示した配列を含む。
【００１２】
上記のＢＶを診断するための方法の他の実施形態では、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの検出は、それぞれの標的について、検出シグナルを標的の所定の検出閾値と比較することを含む。
【００１３】
被験体におけるＢＶを診断するための方法の一部の実施形態では、試料中のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ属およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ属のそれぞれにおける選ばれた細菌種を検出するためのアッセイは、被験体において選ばれたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種をさらに検出するが、Ｌ．ｉｎｅｒｓを検出しない。このような実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが検出されない場合、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのうちの少なくとも一方の検出が、被験体におけるＢＶを示し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが検出される場合、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの両方の検出が、被験体におけるＢＶを示す。
【００１４】
上記のとおりのＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの検出を含む方法の特定の実施形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを検出するためのアッセイが、核酸に基づく検出アッセイである。一部のこのような実施形態では、前記核酸に基づく検出アッセイが、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡを標的とする。特定の変更形態では、前記核酸に基づく検出アッセイが、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域、および／または（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド位置８３７〜９４４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域を標的とする。他の実施形態では、前記核酸に基づく検出アッセイが、増幅に基づかないアッセイ、例えば、切断に基づくアッセイなどである。一部のこのような実施形態では、前記切断に基づくアッセイが、ＲＮＡ標的核酸を検出し、ＲＮＡ：ＤＮＡ線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する；他の実施形態では、前記切断に基づくアッセイが、ＤＮＡ標的核酸を検出し、ＤＮＡ：ＤＮＡ線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する。核酸に基づく検出アッセイを用いる方法の一部の変更形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの検出は、ホモジニアス検出反応を使用して実施される。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの検出はさらに、リアルタイムで実施され得る。
【００１５】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの検出のための切断に基づくアッセイを利用する方法の一部の実施形態では、アッセイが、以下のステップを包含する：
（ｉ）前記試料を、
（Ａ）配列番号１内の標的配列に特異的にハイブリダイズするＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的プライマー、
（Ｂ）配列番号２内の標的配列に特異的にハイブリダイズするＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的プライマー、および
（Ｃ）配列番号３内の標的配列に特異的にハイブリダイズするＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的プライマー
と接触させるステップであって、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡが存在する場合、該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡ内のそのそれぞれの１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列にそれぞれのプライマーが特異的にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
（ｉｉ）それぞれのハイブリダイズしたプライマーの３’末端が伸長され、それによって該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ標的１６Ｓ  ｒＲＮＡの領域に相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを生成する反応条件を提供するステップであって、該領域は、該それぞれのプライマー標的配列の５’に位置する、ステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの任意のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡを
（Ａ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第１の標的配列に特異的にハイブリダイズする３’部分および該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズしない５’部分を有する第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｂ）該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第１の標的配列に特異的にハイブリダイズする３’部分および該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズしない５’部分を有する第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｃ）該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡ内の第１の標的配列に特異的にハイブリダイズする３’部分および該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズしない５’部分を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｄ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第２の標的配列に特異的にハイブリダイズする５’部分を有する第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドであって、該第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列は、該第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列の３’に位置し、それに隣接する、第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、
（Ｅ）該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ内の第２の標的配列に特異的にハイブリダイズする５’部分を有する第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドであって、該第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列は、該第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡ標的配列の３’に位置し、それに隣接する、第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチド、ならびに
（Ｆ）該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡ内の第２の標的配列に特異的にハイブリダイズする５’部分を有する第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチドであって、該第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡ標的配列は、該第１のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡ標的配列の３’に位置し、それに隣接する、第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、
該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡが存在する場合、該第１および第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドは、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの線状二重鎖切断構造を形成するように該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｃＤＮＡに安定にハイブリダイズする反応条件下で、
該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡが存在する場合、該第１および第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドは、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの線状二重鎖切断構造を形成するように該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃＤＮＡに安定にハイブリダイズする反応条件下で、および
該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡが存在する場合、該第１および第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチドは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの線状二重鎖切断構造を形成するように該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃＤＮＡに安定にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
（ｉｖ）該試料を、
前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造が存在する場合、該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造の切断が起きて、該第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの該５’部分を含むＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物を生成する反応条件下で、
前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造が存在する場合、該Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造の切断が起きて、該第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの該５’部分を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を生成する反応条件下で、
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断構造が存在する場合、該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断構造の切断が起きて、該第１のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチドの該５’部分を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物を生成する
反応条件下で、ステップ（ｉｉｉ）からの任意の切断構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、
（ｖ）該Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物の存在または非存在を検出するステップ。
【００１６】
上記のとおりのＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの検出のための切断に基づくアッセイを含む方法の一部の変更形態では、以下の条件のうちの任意の１つまたは複数が存在する：前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的プライマーが、配列番号６に示した配列を含む；前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的プライマーが、配列番号９に示した配列を含む；前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的プライマーが、配列番号１３に示した配列を含む；前記第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの３’部分が、配列番号４の残基１１〜２７に示した配列を含む；前記第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの３’部分が、配列番号７の残基１１〜２５に示した配列を含む；前記第１のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチドの３’部分が、配列番号１０の残基１１〜２７に示した配列を含む；前記第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号５の残基１〜２０に示した配列を含む；前記第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａプローブオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号８の残基１〜２４に示した配列を含む；ならびに／または前記第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプローブオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、（１）配列番号１１の残基１〜２７に示した配列および（２）配列番号１２の残基１〜３２に示した配列からなる群から選択される配列を含む。
【００１７】
上記のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを検出するための切断に基づくアッセイを含む方法のある特定の実施形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物を検出するステップは、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物を第１の蛍光標識および第１のクエンチャーを含む第１のＦＲＥＴカセットと接触させること、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を第２の蛍光標識および第２のクエンチャーを含む第２のＦＲＥＴカセットと接触させること、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物を第３の蛍光標識および第３のクエンチャーを含む第３のＦＲＥＴカセットと接触させることを含み、それぞれのＦＲＥＴカセットは、フラップエンドヌクレアーゼによって切断され得る第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断構造を形成するようにそれぞれの切断生成物とハイブリダイズする。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物が存在する場合、第１の蛍光標識が、第１のクエンチャーを含む第１のＦＲＥＴカセットから放出され、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物が存在する場合、第２の蛍光標識が、第２のクエンチャーを含む第２のＦＲＥＴカセットから放出され、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物が存在する場合、第３の蛍光標識が、第３のクエンチャーを含む第３のＦＲＥＴカセットから放出される。次いで放出された第１、第２、または第３の蛍光標識が検出される。第１、第２、および第３のＦＲＥＴカセットを利用する一部の変更形態では、第１のクエンチャー、第２のクエンチャー、および第３のクエンチャーは、同じである。一部の特定の実施形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物は、配列番号４の残基１〜１１に示した配列を含み、配列番号４の残基１１は、前記切断生成物の３’終末端に対応し、第１のＦＲＥＴカセットは、配列番号１４に示した配列を任意選択で含み、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物は、配列番号７の残基１〜１１に示した配列を含み、配列番号７の残基１１は、前記切断生成物の３’終末端に対応し、第２のＦＲＥＴカセットは、配列番号１５に示した配列を任意選択で含み、かつ／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物は、配列番号１０の残基１〜１１に示した配列を含み、配列番号１０の残基１１は、前記切断生成物の３’終末端に対応し、第３のＦＲＥＴカセットは、配列番号１６に示した配列を任意選択で含む。
【００１８】
上記のＢＶを診断するための方法のある特定の実施形態では、方法は、１０種以下のＢＶに関連した細菌属の検出を含む。例えば、一部の実施形態では、方法は、５種以下のＢＶに関連した細菌属の検出を含み、または方法は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ以外のＢＶに関連した細菌属の検出を含まない。
【００１９】
上記のＢＶを診断するための方法の一部の実施形態では、ＢＶが被験体において示される場合、方法は、被験体にＢＶの処置レジメンを施すステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、被験体におけるＢＶを監視するための方法であり、被験体は、ステップ（ａ）の前にＢＶの処置レジメンを受けており、一部のこのような変更形態では、ＢＶが被験体において示される場合、方法は、（ｉ）被験体にＢＶの処置レジメンを施すステップ（すなわち、ステップ（ａ）の前に被験体に施された同じ処置レジメンを施し続けるステップ）、または（ｉｉ）被験体にＢＶの異なる処置レジメンを施すステップをさらに含む。
【００２０】
ＢＶを診断するための、かつ上記のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの検出を含む方法の他の実施形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの検出は、それぞれの標的について、検出シグナルを標的の所定の検出閾値と比較することを含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸を検出するための反応混合物を提供する。本反応混合物は一般に、配列番号１に示した配列と少なくとも９８％同一（例えば、少なくとも９９％または１００％同一）である核酸塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在によって特徴付けられるＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種の標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、他のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種由来の核酸内の配列に特異的にハイブリダイズしないＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチド、ならびにＰ．ａｍｎｉｉ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰ．ｂｉｖｉａの標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、他のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種由来の核酸内の配列に特異的にハイブリダイズしない、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的なオリゴヌクレオチドを含む。
【００２２】
上記のとおりの反応混合物の一部の実施形態では、前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸が、それぞれＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡである。例えば、一部の実施形態では、（ｉ）前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とし、かつ／または（ｉｉ）前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とする。ヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とする特に適切なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号６に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４の残基１１〜２７に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号５の残基１〜２０に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とする特に適切なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号９に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号７の残基１１〜２５に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号８の残基１〜２４に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。上記のとおりの反応混合物の特定の実施形態では、混合物は、（ａ）前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸内の２つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチド（例えば、少なくとも３つの異なるＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも３つのオリゴヌクレオチド）、および／または前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸内の２つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチド（例えば、少なくとも３つの異なるＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも３つのオリゴヌクレオチド）を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸を検出するための反応混合物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、Ｌ．ｉｎｅｒｓ由来の核酸内の配列に特異的にハイブリダイズしない、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドを含む。特定の変更形態では、前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的核酸が、それぞれＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡである。例えば、一部の実施形態では、（ｉ）前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とし、（ｉｉ）前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とし、かつ／または（ｉｉｉ）前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号３のヌクレオチド位置８３７〜９４４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とする。ヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とする特に適切なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号６に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４の残基１１〜２７に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号５の残基１〜２０に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とする特に適切なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号９に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号７の残基１１〜２５に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号８の残基１〜２４に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番号３のヌクレオチド位置８３７〜９４４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とする特に適切なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１３に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１０の残基１１〜２７に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１１の残基１〜２７に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号１２の残基１〜３２に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。上記のとおりの反応混合物の特定の実施形���では、混合物が、（ａ）前記Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的核酸内の２つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチド（例えば、少なくとも３つの異なるＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも３つのオリゴヌクレオチド）、（ｂ）前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的核酸内の２つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチド（例えば、少なくとも３つの異なるＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも３つのオリゴヌクレオチド）、および／または（ｃ）前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的核酸内の２つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチド（例えば、少なくとも３つの異なるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも３つのオリゴヌクレオチド）を含む。
【００２４】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明および添付の図面を参照すると明白になる。
【００２５】
定義
別段に定義されていない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、記載した方法および組成物に関係する当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、別段に指定されていない限り、それらに帰される意味を有する。
【００２６】
用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、脈絡により別段に明らかに示されていない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、「核酸（a  nucleic  acid）」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の核酸を表すように理解される。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」は、本明細書で互換的に使用され得る。
【００２７】
「試料」は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、またはその構成成分、例えば、核酸もしくは核酸の断片を含有し得る任意の検体を含む。試料は、例えば、膣スワブ試料、頸部ブラシ試料、呼吸器組織もしくは滲出液、例えば、気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、もしくは肺生検、痰、唾液、末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、精液、または他の体液もしくは材料を含む、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、またはその構成成分（例えば、それに由来する標的核酸）を含有し得る、生きているまたは死んでいるヒトに由来する任意の組織または材料を含む「生体試料」を含む。生体試料を処理して組織または細胞構造を物理的または機械的に破壊し、こうして溶液中に細胞内構成成分を放出させることができ、その溶液は酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などをさらに含有し得、標準方法を使用して、分析用生体試料を調製するのに使用される。また、試料は、加工された試料、例えば、濾過デバイス上もしくは濾過デバイスを通して試料を通過させることから、または遠心分離後に、あるいは媒体、マトリックス、または支持体への付着によって得られるものを含み得る。
【００２８】
本明細書で「Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ」属、「Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ」属、または「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ」属への言及は、本開示の方法におけるＢＶを診断するための検出用標的としての特定の脈絡において、かつ脈絡による別段の明らかな指示のない限り、本開示によるこれらの属から選ばれた種、具体的には（ｉ）Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａについて、他のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種を除くＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの無培養種であって、配列番号１に示した配列と少なくとも９８％同一（例えば、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一）である核酸塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在によって特徴付けられる、無培養Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種；（ｉｉ）Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａについて、他のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種を除くＰ．ａｍｎｉｉ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰ．ｂｉｖｉａ；ならびに（ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓについて、Ｌ．ｉｎｅｒｓを除く任意のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の検出を意味すると理解される。
【００２９】
「核酸」は、窒素複素環式塩基または塩基類似体を有する２つまたはそれ超の共有結合的に結合したヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指し、ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合または他の連結によって一緒に連結されてポリヌクレオチドを形成する。核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはキメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマーもしくはオリゴヌクレオチド、およびその類似体がある。核酸「骨格」は、糖−ホスホジエステル連結、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」もしくはＰＮＡにおける、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９５／３２３０５号を参照）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはこれらの組合せの１つまたは複数を含む様々な連結で構成され得る。核酸の糖部分は、リボースもしくはデオキシリボース、または公知の置換、例えば、２’−メトキシ置換および２’−ハロゲン化物置換（例えば、２’−Ｆ）などを有する同様の化合物のいずれかであり得る。窒素塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、これらの類似体（例えば、イノシン、５−メチルイソシトシン、イソグアニン；例えば、The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids、５〜３６頁、Adamsら編、１１版、１９９２年；Abrahamら、２００７年、BioTechniques、４３巻：６１７〜２４頁を参照）であり得、これらにはプリンまたはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン（methyl  deoxygaunosine）、デアザ−またはアザ−プリン、デアザ−またはアザ−ピリミジン、５または６位で置換基を有するピリミジン塩基、２、６、および／または８位で変更された置換基または置き換え置換基を有するプリン塩基、例えば、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン、ならびに非置換または３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンなどのピラゾロ化合物；それぞれ本明細書に参照により組み込まれている、米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号、および国際特許出願公開第ＷＯ９３／１３１２１号）が含まれる。核酸は、骨格が１つまたは複数の残基について窒素塩基を含まない「脱塩基」残基を含み得る（例えば、本明細書に参照により組み込まれている米国特許第５，５８５，４８１号を参照）。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡにおいて見出される従来の糖、塩基、および連結のみを含む場合があり、あるいは従来の構成成分および置換を含む場合がある（例えば、２’−メトキシ骨格によって連結された従来の塩基、または従来の塩基および１つもしくは複数の塩基類似体の混合物を含む核酸）。核酸として、１つまたは複数のヌクレオチドモノマーが、糖立体配座を模倣するＲＮＡ中でロックされた二環式フラノース単位を有する「ロックされた核酸」（ＬＮＡ）を挙げることができ、この二環式フラノース単位は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相補配列に向けたハイブリダイゼーション親和性を増強する（本明細書に参照により組み込まれている、Vesterら、Biochemistry、４３巻：１３２３３〜４１頁、２００４年）。核酸は、核酸の機能ま���は挙動を変更する修飾塩基、例えば、追加のヌクレオチドが核酸に付加されることを遮断するための３’終端ジデオキシヌクレオチドの付加を含み得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を作製するための合成法は、当技術分野で周知であるが、核酸は、慣例的な技法を使用して天然源から精製することができる。
【００３０】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、核酸鎖を表す。本願全体にわたって、核酸は、５’終端から３’終端によって明示される。標準的な核酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは、典型的には、「５’から３’」に、すなわち、成長中の核酸の３’終端にヌクレオチドを付加することによって合成される。
【００３１】
「ヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、リン酸基、五炭糖、および窒素塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡにおいて見出される五炭糖は、リボースである。ＤＮＡでは、五炭糖は、２’−デオキシリボースである。この用語は、このようなサブユニットの類似体、例えば、リボースの２’位におけるメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）も含む。
【００３２】
「非ヌクレオチド単位」は、本明細書で使用される場合、ポリマーのハイブリダイゼーションに大きく関与しない単位である。このような単位は、例えば、ヌクレオチドとの任意の有意な水素結合に関与してはならず、構成成分として５つのヌクレオチド塩基またはその類似体のうちの１つを有する単位を除外する。
【００３３】
「核酸に基づく検出アッセイ」は、本明細書で使用される場合、標的核酸内の標的配列を検出するための、かつ標的配列に特異的にハイブリダイズするもう１つのオリゴヌクレオチドを利用するアッセイである。
【００３４】
本発明によるある特定の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、「増幅に基づくアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅するための１つまたは複数のステップを利用するアッセイである。検出アッセイにおいて使用するための様々な増幅法が当技術分野で公知であり、これらのいくつかを本明細書でさらに要約する。明確さの目的のために、増幅に基づくアッセイは、標的配列を増幅しない１つまたは複数のステップ、例えば、増幅に基づかないアッセイ法（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイまたは切断に基づくアッセイ）において使用されるステップなどを含み得る。
【００３５】
他の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、「増幅に基づかないアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅するためのいずれのステップにも依拠しないアッセイである。明確さの目的のために、任意の対応する下流増幅オリゴマーの非存在下でプライマーを伸長するための反応（例えば、ＲＮＡ標的に相補的な一本鎖ｃＤＮＡをもたらすがｃＤＮＡのコピーを生成しない、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を生成するための逆転写酵素によるプライマーの伸長、その後のＲＮＡのＲＮａｓｅ消化）を含む核酸に基づく検出アッセイは、増幅に基づかないアッセイであると理解される。
【００３６】
例示的な増幅に基づかないアッセイは、「切断に基づくアッセイ」であり、これは、重複オリゴヌクレオチドの標的核酸への特異的ハイブリダイゼーションによって形成される線状二重鎖切断構造のフラップエンドヌクレアーゼによる特異的切断に基づくアッセイである。これらのアッセイでは、標的にハイブリダイズしないフラップ領域を含有するプローブオリゴヌクレオチドがフラップエンドヌクレアーゼによる重複依存様式で切断されて、切断生成物を放出し、次いでこれが検出される。切断に基づくアッセイの原理は、当技術分野で周知であり、例示的なアッセイは、例えば、Lyamichevら（Nat.  Biotechnol.、１７巻：２９２〜２９６頁、１９９９年）、Ryanら（Mol.  Diagn.、４巻：１３５〜１４４頁、１９９９年）、Allawiら（J.  Clin.  Microbiol.、４４巻：３４４３〜３４４７頁、２００６年）、Browらへの米国特許第５，８４６，７１７号および同第６，７０６，４７１号、ならびにDahlbergらへの米国特許第５，６１４，４０２号に記載されている。切断に基づくアッセイとしては、例えば、市販のＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が挙げられる。
【００３７】
第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一領域および第２の異なるオリゴヌクレオチドの少なくとも一領域が同じ線状の相補核酸配列の異なる領域にアニールし、第２のオリゴヌクレオチドのアニールされた領域の３’末端が、第１のオリゴヌクレオチドのアニールされた領域の５’末端の側に向いており、またはそれに隣接するとき、第２のオリゴヌクレオチドを、「上流」オリゴヌクレオチドと、そして第１のオリゴヌクレオチドを、「下流」オリゴヌクレオチドと呼ぶことができる。
【００３８】
用語「切断構造」は、本明細書で使用される場合、二重鎖を形成するためのプローブオリゴヌクレオチドと標的核酸との相互作用によって形成される構造を指し、得られる構造は、フラップエンドヌクレアーゼによって切断可能である。切断構造は、二次構造を考慮せずに（すなわち、二重鎖構造の形成が要求されない）核酸分子を切断する、ホスホジエステラーゼなどの作用物質による非特異的切断の基質である核酸分子とは対照的に、フラップエンドヌクレアーゼによる特異的切断の基質である。
【００３９】
「フラップエンドヌクレアーゼ」は、本明細書で使用される場合、核酸の別の鎖によって置換される（すなわち、その結果、隣接する第１および第２のプローブが標的にハイブリダイズする重複ヌクレオチドが存在する）鎖の一方上で、一本鎖５’オーバーハング、またはフラップを含有する二重鎖を有する核酸構造上の構造特異的５’エンドヌクレアーゼとして作用する核酸分解酵素のクラスを指す。フラップエンドヌクレアーゼは、「５’エンドヌクレアーゼ」と、または略して頭字語「ＦＥＮ］によって呼ばれる場合もある。ＦＥＮは、単鎖および二本鎖核酸の結合部におけるホスホジエステル結合の加水分解切断を触媒し、オーバーハングまたはフラップを放出する。ＦＥＮは、CeskaおよびSavers（Trends  Biochem.  Sci.、２３巻：３３１〜３３６頁、１９９８年）ならびにLiuら（Annu.  Rev.  Biochem.、７３巻：５８９〜６１５頁、２００４年）によって総説されている。フラップエンドヌクレアーゼは、単に５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に制限されない。例えば、フラップエンドヌクレアーゼは、５’ヌクレアーゼ活性を有する天然ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ）または合成活性を欠くことによって５’ヌクレアーゼ活性を有する修飾ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素）であり得る。
【００４０】
「重複領域」は、標的にハイブリダイズし、第２のプローブオリゴヌクレオチドが重複する第１のプローブオリゴヌクレオチドの塩基（複数可）からなる。第２のプローブオリゴヌクレオチドの３’末端の塩基は、重複領域の末端を決定し、標的にハイブリダイズしてもよく、またはしなくてもよい。
【００４１】
切断に基づく検出アッセイへの言及における「第１のプローブオリゴヌクレオチド」は、第１のプローブオリゴヌクレオチドの上流の領域にハイブリダイズする「第２のプローブオリゴヌクレオチド」の存在下で標的核酸と相互作用して切断構造を形成するオリゴヌクレオチドを指す。標的核酸にアニールするとき、第１のプローブオリゴヌクレオチドおよび標的は、切断構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼによる切断を第１のプローブオリゴヌクレオチド内で行うことができる。標的核酸に沿った第１のプローブオリゴヌクレオチドの上流の重複する第２のプローブオリゴヌクレオチドの存在下では、第１のプローブオリゴヌクレオチド内の切断の部位は、最後の重複塩基の後に生じる（切断は、第１のプローブの標的にハイブリダイズした塩基との第２のプローブの少なくとも１つの重複塩基に依存する）。標的核酸内の標的配列にハイブリダイズする標的にハイブリダイズする領域に加えて、第１のプローブオリゴヌクレオチドは、５’末端で標的にハイブリダイズしない領域を含有する（「フラップ領域」とも呼ばれる）。第１および第２のプローブオリゴヌクレオチドが標的核酸にアニールされるとき、フラップエンドヌクレアーゼによる部位特異的切断が起きて、第１のプローブオリゴヌクレオチドのフラップ領域および重複領域を含有する切断生成物を生成する。
【００４２】
切断に基づく検出アッセイへの言及における「第２のプローブオリゴヌクレオチド」は、標的核酸にアニールされるとき、下流の第１のプローブオリゴヌクレオチド内の標的にハイブリダイズする配列の５’末端と重複するその３’末端において配列を含有するオリゴヌクレオチドを指す。典型的には、これらの領域は、相補標的核酸に沿った同じセグメントへのハイブリダイゼーションについて競合する。第２のプローブオリゴヌクレオチドの３’終端ヌクレオチドは、標的核酸中のヌクレオチドと塩基対合してもよく、またはしなくてもよい。一部の変更形態では、３’終端ヌクレオチドのみが第１のプローブオリゴヌクレオチドの標的にハイブリダイズする配列の５’末端と重複する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「ＦＲＥＴカセット」は、フルオロフォア部分およびフルオロフォアを消光する近傍のクエンチャー部分を含有するヘアピンオリゴヌクレオチドを指す。切断生成物のＦＲＥＴカセットとのハイブリダイゼーションにより、フラップエンドヌクレアーゼの二次基質が生じる。この基質が形成されると、５’フルオロフォア含有塩基がカセットから切断され、それによって蛍光シグナルが発生する。
【００４４】
「標的核酸」は、本明細書で使用される場合、検出される標的配列を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、一本鎖または二本鎖であり得る。標的核酸は、標的配列のほかに他の配列を含む場合がある。
【００４５】
「単離された」とは、標的核酸を含有する試料がその天然環境から引き出されていることを意味するが、この用語は、精製のいずれの程度も暗示しない。
【００４６】
用語「標的配列」は、本明細書で使用される場合、検出される標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」は、オリゴヌクレオチド（例えば、プローブオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド、および／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が、検出プロセス（例えば、増幅に基づく検出アッセイ、例えば、ＴＭＡもしくはＰＣＲなど、または増幅に基づかない検出アッセイ、例えば、５’−エンドヌクレアーゼ（endonucleose）に基づくアッセイなど）の間に複合体形成する複合体形成配列を含む。標的核酸が元々一本鎖である場合、用語「標的配列」は、標的核酸中に存在する「標的配列」に相補的な配列も指す。標的核酸が元々二本鎖である場合、用語「標的配列」は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（−）鎖の両方を指す。標的配列の選択において、当業者であれば、「ユニークな」配列が、無関係の標的核酸または密接に関連した標的核酸を区別するように選択されるべきであることが理解されよう。
【００４７】
「標的にハイブリダイズする配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されているオリゴマーの部分を指すのに本明細書で使用される。好ましくは、標的にハイブリダイズする配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成されている。標的にハイブリダイズする配列は、これらがハイブリダイズするように構成されている標的配列の部分に１００％相補的であり得るが、必ずしもそうではない。標的にハイブリダイズする配列は、標的配列に対して挿入、欠失、および／または置換されたヌクレオチド残基も含み得る。標的配列に対する標的にハイブリダイズする配列の１００％未満の相補性は、例えば、Ｌ．ｉｎｅｒｓを除くＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの様々な株にハイブリダイズするように構成され、またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのＰ．ａｍｎｉｉ種、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓ種、およびＰ．ｂｉｖｉａ種にハイブリダイズするように構成されたオリゴマーについて当てはまるなど、標的核酸が種内の複数の株であるとき生じ得る。標的核酸に対して１００％未満の相補性を有するように標的にハイブリダイズする配列を構成する他の理由が存在することが理解される。
【００４８】
特異的配列を参照することによって（例えば、配列番号１、２、または３内の領域を参照することによって）本明細書に定義されるオリゴマー標的にハイブリダイズする配列も、脈絡による別段の明らかな指示のない限り、その機能的相補体を含むように理解される。よって、例えば、オリゴマーの標的にハイブリダイズする領域が、標的核酸に対応する特異的配列を参照することによって定義される場合、オリゴマーは、特異的な参照配列の相補体である標的にハイブリダイズする配列を有する機能的オリゴマーを含み得ることが理解される。またはオリゴマーが、特異的配列にハイブリダイズするためのその構成によって定義される場合、オリゴマーは、特異的参照配列の相補体にハイブリダイズするように構成された標的にハイブリダイズする配列を有する機能的オリゴマーを含み得ることが理解される。
【００４９】
用語「配列を標的とする」は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ核酸の領域を参照して本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドが本明細書に記載の検出を可能にする様式で標的配列にハイブリダイズするプロセスを指す。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的化Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ核酸配列と相補的であり、ミスマッチを含有しない。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的化Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ核酸配列と相補的であるが、１、２、３、４、または５個のミスマッチを含有する。好ましくは、標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、標的配列と相補的な少なくとも１０から５０もの多くのヌクレオチドを含む。少なくとも１０および５０もの多くは、１０、５０、およびその間のそれぞれの整数が含まれるような包含範囲であることが理解される。好ましくは、オリゴマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズする。
【００５０】
用語「〜ように構成された」は、参照されたオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズする配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を表す。例えば、標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照された配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する。
【００５１】
用語「〜に特異的にハイブリダイズするように構成された」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドの標的にハイブリダイズする領域が、参照されたＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ標的領域の配列を標的とすることができるポリヌクレオチド配列を有するようにデザインされることを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、その配列のみを標的とすることに限定されず、むしろ、キットにおける、またはＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的核酸を標的とするための方法における組成物として有用である。オリゴヌクレオチドは、試料からＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを検出するためのアッセイの構成成分として機能するようにデザインされ、したがって、試験試料中に一般に見出される他の核酸の存在下でＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを標的とするようにデザインされる。当技術分野で理解されているように、いくらかの小レベルの非標的核酸へのハイブリダイゼーションが起こり得るので、「〜に特異的にハイブリダイズする」は、排他的にハイブリダイズすることを意味しない。むしろ、「〜に特異的にハイブリダイズする」は、オリゴヌクレオチドが、標的に主にハイブリダイズするようにアッセイにおいて機能するように構成され、その結果、試料中の標的核酸の正確な検出が確定され得ることを意味する。用語「〜ように構成された」は、オリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズする配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を表す。
【００５２】
用語「断片」は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ標的化核酸を参照して本明細書で使用される場合、連続した核酸の一片を指す。ある特定の実施形態では、断片は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  １６ＳリボソームＲＮＡ由来の連続したヌクレオチドを含み、断片中の１６Ｓの連続したヌクレオチドの数は、１６Ｓ全体についての数より少ない。
【００５３】
用語「領域」は、本明細書で使用される場合、核酸の部分を指し、前記部分は、核酸全体より小さい。例えば、参照中の核酸がオリゴヌクレオチドプロモータープライマーであるとき、用語「領域」は、オリゴヌクレオチド全体のより小さいプロモーター部分を指すのに使用され得る。同様に、かつやはり例のみとして、核酸が１６ＳリボソームＲＮＡであるとき、用語「領域」は、核酸のより小さいエリアを指すのに使用することができ、より小さいエリアは、本発明の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドによって標的とされる。別の非限定的な例として、参照中の核酸がアンプリコンであるとき、用語の領域は、プローブの標的にハイブリダイズする配列によるハイブリダイゼーションについて同定されるより小さいヌクレオチド配列を指すのに使用することができる。
【００５４】
互換性のある用語「オリゴマー」、「オリゴ」、および「オリゴヌクレオチド」は、約５ヌクレオチド（ｎｔ）残基の下限および約５００〜９００ｎｔの残基の上限を有する範囲内のポリマーを含む、一般に１，０００ｎｔ未満の残基を有する核酸を指す。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１２〜１５ｎｔの下限および約５０〜６００ｎｔの上限を有するサイズ範囲内であり、他の実施形態は、約１５〜２０ｎｔの下限および約２２〜１００ｎｔの上限を有する範囲内である。オリゴヌクレオチドは、天然に存在する源から精製することができ、または様々な周知の酵素的もしくは化学的方法のいずれかを使用して合成することができる。用語オリゴヌクレオチドは、試薬に対するいずれの特定の機能も表さず、むしろこれは、本明細書に記載のすべてのこのような試薬を包含するように一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たし得る。例えば、これが相補鎖に特異的であり、相補鎖にハイブリダイズすることができ、核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長され得る場合、これは、プライマーとして機能することができ、これがＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含有し、転写（例えば、Ｔ７プライマー）を可能にする場合、これは、プライマーとして機能し、プロモーターを提供することができ、これが標的核酸またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることができ、検出可能部分（例えば、アクリジニウム−エステル化合物）をさらに提供する場合、これは、標的核酸を検出するように機能し得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、指定された参照核酸配列「に実質的に対応する」オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが参照核酸配列と十分に同様であり、その結果、オリゴヌクレオチドは、それがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリダイズする点で参照核酸配列と同様のハイブリダイゼーション性質を有することを意味する。当業者であれば、「実質的に対応するオリゴヌクレオチド」は、参照配列とは異なり得るが、依然として同じ標的核酸配列にハイブリダイズすることができることを理解されよう。第２の核酸に対応する第１の核酸は、脈絡による別段の明らかな指示のない限り、そのＲＮＡおよびＤＮＡを含み、その相補体を含むことも理解される。核酸からのこのバリエーションは、配列内の同一塩基のパーセンテージ、またはプローブもしくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基のパーセンテージの観点から述べることができる。よって、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、塩基同一性または相補性のこれらのパーセンテージが１００％〜約８０％である場合、参照核酸配列に「実質的に対応する」。好ましい実施形態では、パーセンテージは、１００％〜約８５％である。より好ましい実施形態では、このパーセンテージは、１００％〜約９０％であり、他の好ましい実施形態では、このパーセンテージは、１００％〜約９５％である。同様に、核酸または増幅核酸の領域は、参照核酸配列に対応すると本明細書で見なすことができる。当業者であれば、許容できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを引き起こすことなく特異的標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために相補性の様々なパーセンテージで必要とされ得るハイブリダイゼーション条件に対する様々な改変を理解されよう。
【００５６】
「増幅オリゴマー」は、その少なくとも３’末端が標的核酸に相補的であり、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴマーである。増幅オリゴマーの例は、標的核酸にハイブリダイズし、増幅プロセスにおいてポリメラーゼによって伸長される３’ＯＨ末端を含有する「プライマー」である。増幅オリゴマーの別の例は、ポリメラーゼによって伸長されない（例えば、それが３’封鎖末端を有するため）が、増幅に関与し、または増幅を促進するオリゴマーである。例えば、増幅オリゴヌクレオチドの５’領域は、標的核酸に非相補的であるプロモーター配列（これは、「プロモータープライマー」または「プロモータープロバイダー」と呼ばれる場合がある）を含み得る。当業者であれば、プライマーとして機能する増幅オリゴマーを、５’プロモーター配列を含み、よってプロモータープライマーとして機能するように修飾することができることを理解されよう。３’封鎖末端の組込みは、プロモータープライマーをさらに修飾し、これはその時、標的核酸にハイブリダイズし、転写を開始する機能を果たすが、オリゴ伸長のためのプライマーを提供しない上流プロモーター配列をもたらすことができる。このような修飾オリゴは、「プロモーター提プロバイダー」オリゴマーと本明細書で呼ばれる。増幅オリゴヌクレオチドのサイズ範囲には、長さ約１０〜約７０ｎｔであり（いずれのプロモーター配列またはポリ−Ａテールも含まない）、標的核酸配列（またはその相補鎖）の領域に相補的である少なくとも約１０の連続した塩基またはさらには少なくとも１２の連続した塩基を含有するものが含まれる。連続した塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に少なくとも８０％または少なくとも９０％、または完全に相補的である。増幅オリゴマーは、修飾ヌクレオチドもしくは類似体、または増幅反応に関与するが、標的核酸もしくは鋳型配列に相補的でなく、もしくはそれに含有されている追加のヌクレオチドを任意選択で含み得る。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、または他の核酸の長さの範囲を参照するとき、範囲は、すべての整数を含む（例えば、長さが１９〜２５の連続したヌクレオチドは、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５を含む）ことが理解される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、核酸に結合するためのシグナルとしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によって認識され、特異的部位でＲＮＡの転写を始める特異的核酸配列である。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「プロモータープロバイダー」または「プロバイダー」は、第１および第２の領域を含み、その３’終端からのＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの「第１の領域」は、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする塩基配列を含み、ハイブリダイズさせる配列は、３’に位置するが、プロモーター領域に必ずしも隣接していない。プロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズさせる部分は、典型的には長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、長さが最大で５０またはそれ超のヌクレオチドに伸長し得る。「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む。プロモーターオリゴヌクレオチドは、それが、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素によって伸長することができず、好ましくは上述の通りその３’終端でブロッキング部分を含むように操作されている。本明細書で参照する場合、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列をもたらすブロックされたプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドである。
【００５９】
「増幅」は、標的核酸配列もしくはその相補体またはこれらの断片の複数のコピーを得るための任意の公知の手順を指す。複数のコピーは、アンプリコンまたは増幅生成物と呼ばれる場合がある。「断片」の増幅は、例えば、標的核酸の内部位置にハイブリダイズし、この位置から重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを使用することによって生じる完全な標的核酸またはその相補体より小さいものを含有する増幅核酸が生じることを指す。公知の増幅法としては、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介または転写関連増幅が挙げられる。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する（例えば、本明細書に参照により組み込まれている米国特許第４，７８６，６００号を参照）。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの対、および温度サイクリングを使用して、ｄｓＤＮＡのまたはｃＤＮＡ由来の２本の相補鎖の複数のコピーを合成する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，８００，１５９号を参照；それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）。ＬＣＲ増幅は、４つまたはそれ超の異なるオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数のサイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する（例えば、それぞれ本明細書に参照により組み込まれている米国特許第５，４２７，９３０号および同第５，５１６，６６３号を参照）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼ、および標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二重鎖の１本の鎖をニックするエンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを使用し、それによって増幅が一連のプライマー伸長および鎖置換ステップにおいて起こる（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号；同第５，５４７，８６１号；および同第５，６４８，２１１号を参照；それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）。
【００６０】
「転写関連増幅」または「転写媒介増幅」（ＴＭＡ）」は、ＲＮＡポリメラーゼを使用して核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写物を生ずる核酸増幅を指す。これらの方法は一般に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、ならびにプロモーター配列を含み、かつ任意選択で、１つまたは複数の他のオリゴヌクレオチドを含み得る鋳型相補オリゴヌクレオチドを使用する。ＴＭＡ法および単一プライマー転写関連増幅法は、本明細書に記載のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ標的配列を検出するのに使用される増幅に基づくアッセイ法の実施形態である。転写関連増幅の変更形態は、以前に詳細に開示されているように当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，８６８，１０５号；同第５，１２４，２４６号；同第５，１３０，２３８号；同第５，３９９，４９１号；同第５，４３７，９９０号；同第５，５５４，５１６号；および同第７，３７４，８８５号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１３０２号；同第ＷＯ８８／１０３１５号；および同第ＷＯ９５／０３４３０号を参照；それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）。当業者であれば、開示した組成物をポリメラーゼによるオリゴマー配列の伸長に基づく増幅法において使用することができることを察知されよう。
【００６１】
用語「アンプリコン」または用語「増幅生成物」は、本明細書で使用される場合、標的配列内に含有される配列に相補的または相同である、増幅手順中に生成される核酸分子を指す。アンプリコンの相補配列または相同配列は、時に「標的特異的配列」と本明細書で呼ばれる。本発明の増幅オリゴマーを使用して生成されるアンプリコンは、非標的特異的配列を含み得る。アンプリコンは、二本鎖または一本鎖であり得、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含み得る。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写媒介増幅手順中に二本鎖ＤＮＡから一本鎖アンプリコンを転写する。これらの一本鎖アンプリコンは、ＲＮＡアンプリコンであり、増幅オリゴマーがどのように構成されているかに応じて二本鎖複合体のいずれかの鎖であり得る。よって、アンプリコンは、一本鎖ＲＮＡであり得る。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型に相補的であるＤＮＡ鎖を合成する。よって、アンプリコンは、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡハイブリッドであり得る。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、多くの場合ＲＮａｓｅ活性を含み、またはＲＮａｓｅと併せて使用され、ＲＮａｓｅは、ＲＮＡ鎖を分解する。よって、アンプリコンは、一本鎖ＤＮＡであり得る。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型から相補ＤＮＡ鎖を合成する。よって、アンプリコンは、二本鎖ＤＮＡであり得る。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型からＲＮＡを合成する。よって、アンプリコンは、二本鎖ＲＮＡであり得る。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、二本鎖ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成し、転写とも呼ばれる。よって、アンプリコンは、一本鎖ＲＮＡであり得る。アンプリコンおよびアンプリコンを生成するための方法は、当業者に公知である。本明細書で便宜上、ＲＮＡの一本鎖またはＤＮＡの一本鎖は、本発明の増幅オリゴマー組合せによって生成されるアンプリコンを表現し得る。このような表現は、示した表現にアンプリコンを限定するように意味していない。本開示を把握している当業者であれば、増幅オリゴマーおよびポリメラーゼ酵素を使用して、すべて本発明の趣旨および範囲内である多数のタイプのアンプリコンのいずれかを生成する。
【００６２】
「非標的特異的配列」は、本明細書で使用される場合、オリゴマー配列の領域を指し、前記領域は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で標的配列と安定にハイブリダイズしない。非標的特異的配列を有するオリゴマーの一例は、本明細書に記載の切断に基づくアッセイにおいて使用するためのプローブオリゴヌクレオチドであり、プローブオリゴヌクレオチドは、標的または標的配列に相補的でない５’「フラップ」領域を含む。非標的特異的配列を有する他のオリゴマーとしては、それだけに限らないが、プロモータープライマーおよび分子ビーコンが挙げられる。増幅オリゴマーは、標的または鋳型配列に相補的でない配列を含有し得る。例えば、プライマーの５’領域は、標的核酸に非相補的であるプロモーター配列（「プロモータープライマー」と呼ばれる）を含み得る。当業者であれば、プライマーとして機能する増幅オリゴマーは、５’プロモーター配列を含むように、よってプロモータープライマーとして機能するように修飾され得ることを理解されよう。同様に、プロモータープライマーは、プロモーター配列の除去、またはプロモーター配列を用いない合成によって修飾することができ、依然としてプライマーとして機能する。３’封鎖増幅オリゴマーは、プロモーター配列をもたらし、重合のための鋳型として機能を果たすことができる（「プロモータープロバイダー」と呼ばれる）。よって、プロモータープライマーなどの増幅オリゴマーメンバーによって生成されるアンプリコンは、標的特異的配列および非標的特異的配列を含む。
【００６３】
「検出プローブ」、「検出オリゴヌクレオチド」、および「検出プローブオリゴマー」は互換的に使用され、ハイブリダイゼーションを促して標的配列または増幅核酸の検出を可能にする条件下で核酸中または増幅核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを指す。検出は、直接的（例えば、その標的配列に直接的にハイブリダイズしたプローブ）または間接的（例えば、中間分子構造を介してその標的に連結されたプローブ）であり得る。検出プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体、またはこれらの組合せであり得、これらは、標識されていてもよく、または標識されていなくてもよい。検出プローブは、例えば、２’−Ｏ−メチル連結などの代替の骨格連結をさらに含み得る。検出プローブの「標的配列」は一般に、標準的な塩基対合によってプローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、より大きい核酸配列内のより小さい核酸配列領域を指す。検出プローブは、標的特異的配列およびプローブの３次元立体構造に寄与する他の配列を含み得る（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号；同第５，３１２，７２８号；同第６，８４９，４１２号；同第６，８３５，５４２号；同第６，５３４，２７４号；および同第６，３６１，９４５号；ならびに米国特許出願公開第２００６００６８４１７号を参照；それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）。
【００６４】
「安定な」または「検出に安定な」は、反応混合物の温度が核酸二重鎖の融解温度を少なくとも２℃を下回ることを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「標識」は、検出され、または検出可能なシグナルをもたらす、プローブに直接的または間接的に結合された部分または化合物を指す。直接的標識は、共有結合または非共有結合性相互作用、例えば、水素結合、疎水性相互作用およびイオン相互作用、またはキレートもしくは配位錯体の形成を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用によって行うことができる。間接的標識は、直接的または間接的に標識され、検出可能なシグナルを増幅することができる架橋部分または「リンカー」、例えば、結合対メンバー、抗体または追加のオリゴマーを使用して行うことができる。標識としては、任意の検出可能部分、例えば、放射性核種、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン）、酵素もしくは酵素基質、反応基、または発色団（例えば、検出可能な色を付与する色素、粒子、もしくはビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光標識、リン光標識、もしくは化学発光標識）、またはフルオロフォアが挙げられる。標識は、混合物中の結合した標識プローブが、非結合標識プローブのものと異なる検出可能な変化、例えば、不安定性または差動劣化性質を呈するホモジニアスアッセイにおいて検出可能であり得る。「均質な検出可能標識」は、標識または標識プローブの非結合形態から結合形態を物理的に除去することなく検出することができる（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号；同第５，６５６，２０７号；および同第５，６５８，７３７号を参照；それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）。標識としては、化学発光化合物、例えば、標準的なアクリジウムエステル（「ＡＥ」）および誘導体を含むＡＥ化合物が挙げられる（例えば、米国特許第５，６５６，２０７号；同第５，６５８，７３７号；および同第５，６３９，６０４号を参照；それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）。合成ならびに標識を核酸に結合する、および標識を検出する方法は、周知である。（例えば、本明細書に参照により組み込まれている、Sambrookら、Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual、２版（Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Habor、ＮＹ、１９８９年）、１０章を参照。米国特許第５，６５８，７３７号；同第５，６５６，２０７号；同第５，５４７，８４２号；同第５，２８３，１７４号；および同第４，５８１，３３３号も参照；それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）。１つを超える標識および１種を超えるタイプの標識が特定のプローブ上に存在する場合があり、または検出は、それぞれのプローブが検出可能なシグナルを生じる化合物で標識されるプローブの混合物を使用することができる（例えば、それぞれ本明細書に参照により組み込まれている米国特許第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号を参照）。
【００６６】
「捕捉用プローブ」、「捕捉用オリゴヌクレオチド」、および「捕捉用プローブオリゴマー」は互換的に使用され、標準的な塩基対合によって標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズし、固定化されているプローブ上で結合パートナーに結合して標的核酸を支持体に捕捉する核酸オリゴマーを指す。捕捉用オリゴマーの一例は、通常同じオリゴマー上に２つの結合領域：配列結合領域（例えば、標的特異的部分）および固定化されているプローブ結合領域を含むが、２つの領域は、１つまたは複数のリンカーによって一緒に結合された２つの異なるオリゴマー上に存在する場合がある。捕捉用オリゴマーの別の実施形態は、標的核酸に非特異的に結合し、それを支持体上の固定化されているプローブに連結するためのランダムまたは非ランダムなポリ−ＧＵ配列、ポリ−ＧＴ配列、またはポリＵ配列を含む標的配列結合領域を使用する。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「固定化されているオリゴヌクレオチド」、「固定化されているプローブ」、または「固定化されている核酸」は、直接的または間接的に捕捉用オリゴマーを支持体に結合する核酸結合パートナーを指す。支持体に結合した固定化されているプローブは、試料中の非結合材料から捕捉用プローブ結合標的の分離を容易にする。固定化されているプローブの一実施形態は、試料中の非結合材料からの結合標的配列の分離を容易にする支持体に結合したオリゴマーである。支持体として、公知の材料、例えば、溶液中で遊離したマトリックスおよび粒子を挙げることができ、これらは、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属、または他の組成物で作製され得、このうち一実施形態は、磁気吸引粒子（magnetically  attractable  particle）である。支持体は、固定化されているプローブが直接的に（共有結合性連結、キレート化、もしくはイオン相互作用を介して）または間接的に（１つもしくは複数のリンカーを介して）結合されている単分散磁気球（例えば、均一なサイズ±５％）であり得、この場合、プローブと支持体との連結または相互作用は、ハイブリダイゼーション条件の間、安定である。
【００６８】
「相補的な」とは、２つの一本鎖核酸の同様の領域または同じ一本鎖核酸の異なる領域のヌクレオチド配列が、一本鎖領域がストリンジェントなハイブリダイゼーションまたは増幅条件下で、安定な二本鎖水素結合領域において、一緒にハイブリダイズすることを可能にするヌクレオチド塩基組成を有することを意味する。互いにハイブリダイズする配列は、標準的な核酸塩基対合（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕ対合）によって意図された標的配列に完全に相補的または部分的に相補的であり得る。「十分に相補的な」とは、一連の相補的な塩基間で水素結合によって別の配列にハイブリダイズすることができる連続した配列を意味し、それは、標準的な塩基対合によって配列中のそれぞれの位置で相補的であり得、または相補的でない脱塩基残基を含む１つまたは複数の残基を含有し得る。十分に相補的な連続した配列は、典型的には、オリゴマーが特異的にハイブリダイズするように意図された配列に少なくとも８０％、または少なくとも９０％相補的である。「十分に相補的」である配列は、配列が完全には相補的でない場合であっても、適切なハイブリダイゼーション条件下で、核酸オリゴマーのその標的配列との安定なハイブリダイゼーションを可能にする。一方の一本鎖領域のヌクレオチドの連続した配列が、他方の一本鎖領域のヌクレオチドの類似の配列と一連の「カノニカル」水素結合塩基対を形成することができ、その結果、ＡがＵと対合しており、またはＴおよびＣがＧと対合しているとき、ヌクレオチド配列は、「完全に」相補的である（例えば、本明細書に参照により組み込まれている、Sambrookら、Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual、２版（Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、NY、１９８９年）の１．９０〜１．９１、７．３７〜７．５７、９．４７〜９．５１、および１１．４７〜１１．５７章、特に９．５０〜９．５１、１１．１２〜１１．１３、１１．４５〜１１．４７、および１１．５５〜１１．５７章を参照）。パーセント同一性の範囲は、すべての整数および部分数（partial  number）を含む（例えば、少なくとも９０％は、９０、９１、９３．５、９７．６８７などを含む）ことが理解される。
【００６９】
「優先的にハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、プローブがこれらの標的配列またはその複製体にハイブリダイズして安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する一方、同時に、安定なプローブ：非標的ハイブリッドの形成が最小限にされることを意味する。よって、プローブは、非標的配列より十分大きい程度に標的配列またはその複製体にハイブリダイズして、当業者が標的配列またはその複製体を正確に検出することを可能にする。適切なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で周知であり、配列組成に基づいて予測される場合があり、または慣例的な試験方法を使用することによって決定することができる（本明細書に参照により組み込まれている、Sambrookら、Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual、２版（Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、NY、１９８９年の１．９０〜１．９１、７．３７〜７．５７、９．４７〜９．５１、および１１．４７〜１１．５７章、特に９．５０〜９．５１、１１．１２〜１１．１３、１１．４５〜１１．４７、および１１．５５〜１１．５７章）を参照）。
【００７０】
「核酸ハイブリッド」、「ハイブリッド」、または「二重鎖」とは、二本鎖水素結合領域を含有する核酸構造を意味し、それぞれの鎖は、他方と相補的であり、領域は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で十分に安定であることによって、それだけに限らないが、化学発光もしくは蛍光検出、オートラジオグラフィー、またはゲル電気泳動を含む手段によって検出される。このようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子を含み得る。
【００７１】
「試料調製」は、試料中に存在するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、またはその構成成分の後続の検出のために試料を処理する任意のステップまたは方法を指す。試料調製として、より大きい体積の試料からの空中もしくは水中の粒子の濾過、または標準的な微生物学方法を使用することによる試料からの微生物の単離などによって、より大きい試料体積から微生物または核酸などの構成成分を濃縮する任意の公知の方法を挙げることができる。試料調製は、細胞内構成成分を実質的に水性相または有機相中に放出するための細胞構成成分の物理的破壊および／または化学的溶解、ならびに濾過、遠心分離、または吸着を使用することなどによる残屑の除去を含み得る。試料調製は、標的核酸を選択的または非特異的に捕捉し、それを他の試料構成成分から分離する核酸オリゴヌクレオチドの使用を含み得る（例えば、それぞれ本明細書に参照により組み込まれている、米国特許第６，１１０，６７８号および国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０１６９８８号に記載されている通り）。
【００７２】
「分離すること」または「精製すること」は、試料の１つまたは複数の構成成分が他の試料構成成分から取り出され、または分離されることを意味する。試料構成成分は、通常、一般に水性の溶液相中に標的核酸を含み、これは、細胞断片、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の核酸も含み得る。分離することまたは精製することにより、他の試料構成成分から試料構成成分の少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９５％が取り出される。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型から相補ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、またはバクテリオファージＴ４、Ｐｈｉ−２９、Ｍ２、もしくはＴ５由来のＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、細菌もしくはバクテリオファージから単離された天然に存在する酵素であり得、または組換えにより発現させることができ、あるいはある特定の望ましい特性、例えば、熱安定性、または様々な修飾鋳型からＤＮＡ鎖を認識もしくは合成する能力を有するように操作された修飾または「進化」形態であり得る。すべての公知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始するのに相補プライマーを必要とする。適当な条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型から相補ＤＮＡコピーを合成することができることが公知である。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、典型的には、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性も有する。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「転写酵素」は、通常二本鎖であるプロモーター配列を有する二本鎖または部分的二本鎖のＤＮＡ分子から複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。ＲＮＡ分子（「転写物」）は、プロモーターのちょうど下流の特異的位置で始まって５’から３’方向に合成される。転写酵素の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、ならびにバクテリオファージ、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」（「ＲＴ」）は、ＲＮＡ鋳型から相補ＤＮＡコピーを合成する酵素である。すべての公知の逆転写酵素は、ＤＮＡ鋳型から相補ＤＮＡコピーを作製する能力も有し、よってこれらは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの両方である。プライマーは、ＲＮＡおよびＤＮＡ鋳型の両方で合成を開始するのに要求される。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「反応混合物」は、ある期間にわたって適切な外部条件下で一緒に反応して生成物を生ずることができる試薬の混合物である。反応混合物は、例えば、増幅アッセイ試薬、ハイブリダイゼーションアッセイ試薬、および／または切断に基づくアッセイ試薬を含有することができ（man  contain）、これらのレシピは、独立して当技術分野で公知である。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「コロニー形成単位」（「ＣＦＵ」）は、試料中の生存可能な微生物の尺度として使用される。ＣＦＵは、固形培地上で目に見えるコロニーを形成することができる個々の生存可能な細胞であり、その個々の細胞は、１個の親細胞から細胞分裂によって得られる。１ＣＦＵは、約１０００コピーのｒＲＮＡに対応する。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「処置レジメン」は、ＢＶと診断された被験体との関連で、被験体に投与される治療剤の量および投薬頻度の組合せを指す。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの１６ＳリボソームＲＮＡの遺伝子についての参照配列を示す（未培養細菌クローンｒＲＮＡ２５０の１６ＳリボソームＲＮＡの遺伝子、部分配列、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＡＹ９５９０２３．１  ＧＩ：６６８７８７２９下に見出される）。
【００８０】
【図２】図２は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６ＳリボソームＲＮＡの遺伝子についての参照配列を示す（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ株ＳＥＱ１９５の１６ＳリボソームＲＮＡの遺伝子、部分配列、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＪＮ８６７２７０．１  ＧＩ：３５９５５０８２８下に見出される）。
【００８１】
【図３】図３は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６ＳリボソームＲＮＡの遺伝子についての参照を示す（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓのＳＴ１完全ゲノム、ＳＴ１株、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＦＮ６９２０３７．１  ＧＩ：２９５０２９９６８下に見出される）。
【００８２】
【図４】図４は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ属の、対象とした種を示す系統樹である。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの未培養（ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ）種から得られた配列を、対象とし、ボックスにより示す。系統樹は、最尤法を使用して、１００のブートストラップ値を用いて構築した。それぞれの分岐選択（ｂｒａｎｃｈ  ｃｈｏｉｃｅ）における数は、分岐選択の頻度を示す。
【００８３】
【図５】図５は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属の、対象とした種を示す系統樹である。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属から選択された配列を、対象とし、ボックスにより示す。系統樹は、最尤法を使用して、１００のブートストラップ値を用いて構築した。それぞれの分岐選択における数は、分岐選択の頻度を示す。
【００８４】
【図６】図６は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の、対象とした種を示す系統樹である。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属から選択された配列を、対象とし、ボックスにより示す。系統樹は、最尤法を使用して、１００のブートストラップ値を用いて構築した。それぞれの分岐点（ｂｒａｎｃｈ  ｐｏｉｎｔ）における数は、分岐選択の頻度を示す。
【００８５】
【図７】図７は、アッセイの速度（Ｖｅｌｏｃｉｔｙ）（Ｖ）から細菌性膣症の状況を示すために使用した論理を示す流れ図である（実施例１を参照されたい）。選択されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの速度が、閾値に等しいまたはそれを下回る場合、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのいずれかについての閾値を上回るＶ値は、細菌性膣症について陽性であることを示す。ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＶ値が、閾値を上回る場合、ＢＶが示されるには、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの両方についてのＶ値が、閾値を上回らなければならない。
【００８６】
【図８】図８は、Ｎｕｇｅｎｔ陽性試料とＮｕｇｅｎｔ陰性試料との間の分離を示す、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの選択された種についての速度の対数およびＢＶの状況を示す（実施例１を参照されたい）。実施例１の研究において使用した閾値を、赤色の破線により示す。
【００８７】
【図９】図９は、Ｎｕｇｅｎｔ陽性試料とＮｕｇｅｎｔ陰性試料との間の分離を示す、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの選択された種についての速度の対数およびＢＶの状況を示す（実施例１を参照されたい）。実施例１の研究において使用した閾値を、赤色の破線により示す。
【００８８】
【図１０】図１０は、Ｎｕｇｅｎｔ陽性試料とＮｕｇｅｎｔ陰性試料との間の分離を示す、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された種についての速度の対数およびＢＶの状況を示す（実施例１を参照されたい）。実施例１の研究において使用した閾値を、赤色の破線により示す。
【００８９】
【図１１】図１１は、Ｎｕｇｅｎｔ陽性試料とＮｕｇｅｎｔ陰性試料との間の分離を示す、Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの選択された種についての速度の対数およびＢＶの状況を示す。
【００９０】
【図１２】図１２は、Ｎｕｇｅｎｔ陽性試料とＮｕｇｅｎｔ陰性試料との間の分離を示す、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａの１型の選択された種についての速度の対数およびＢＶの状況を示す。
【００９１】
【図１３】図１３は、細菌標的濃度の対数に対する速度の対数の関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
詳細な説明  
本発明は、被験体における細菌性膣症（ＢＶ）を診断するための方法および組成物を提供する。これらの方法は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ属およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する、特異性の高い、低い存在量の嫌気性細菌を活用するものである。これらの方法は一般に、ＢＶを有することが疑われる被験体由来の試料中に、これらの属のそれぞれのうちの選択された細菌種の有無を検出するステップを含む。特に、アッセイを実施して、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの未培養種の、試料中の特異的検出を行うが、他のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種は検出せず、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの未培養種は、配列番号１に示す配列と少なくとも９８％同一である核酸塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子の存在により特徴付けられ；アッセイを実施して、Ｐ．ａｍｎｉｉ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓおよびＰ  ｂｉｖｉａの、試料中の特異的検出を行うが、他のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種は検出しない。これらの種特異的アッセイを利用すると、試料中にＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのうちの少なくとも一方の検出は、一般に、いくつかの現存する検査よりも高い感度および特異性で、被験体におけるＢＶを示す。
【００９３】
ＢＶを診断するためのＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ／Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの組合せの性能は、膣の健康状態の指標としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを含めることによって改善することができる。したがって、一部の実施形態では、方法は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された種の有無を検出するステップをさらに含む。特に、アッセイを実施して、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の、試料中の特異的検出を行い、ここでは、アッセイは、Ｌ．ｉｎｅｒｓを検出しない。これらの実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが検出されない場合、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのいずれかの検出は、被験体におけるＢＶを示し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが検出される場合、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの両方の検出は、被験体におけるＢＶを示す。本明細書でさらに記載するように、こうした細菌標的の組合せおよび論理を使用する例示的なアッセイは、Ｎｕｇｅｎｔスコアと比較する場合、９５．６％の感度および９７．３％の特異性がある検査をもたらした。
【００９４】
一部の実施形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの未培養種は、配列番号１に示す配列と、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％または１００％同一である核酸塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子の存在により特徴付けられる。典型的には、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの未培養種の１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド位置６１５〜６７９と１００％同一である領域を有する。
【００９５】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからの選択された細菌種は、任意の適切な方法を使用して検出することができるが、現在のところ、選択された種を、核酸に基づく検出アッセイを使用して検出するのが好ましい。本発明に従う、核酸に基づく検出アッセイは一般に、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された種の標的核酸に特異的にハイブリダイズし、試料中にあることが疑われる他の核酸に対しては、最低限の交差反応性しか示さないオリゴヌクレオチドを利用する。すでに示したように、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの未培養種を検出するためのアッセイは、他のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種を検出せず；Ｐ．ａｍｎｉｉ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓおよびＰ  ｂｉｖｉａを検出するためのアッセイは、他のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種を検出せず；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種を検出するためのアッセイは、Ｌ．ｉｎｅｒｓを検出しない。したがって、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された種の核酸に基づく検出のためのオリゴヌクレオチドは、それぞれの属内の標的種に特異的にハイブリダイズし、非標的種に対しては最低限の交差反応性しか示さない。さらに、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された種の核酸に基づく検出のためのオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．；Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ；Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ目に属する細菌；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ様ｓｐ．；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｓｐ．；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ；Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｓ；Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ａｍｎｉｏｎｉｉ；Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｓｐ．；Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ  ｓｐ．；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ；Ｓｎｅａｔｈｉａ  ｓａｎｇｕｉｎｅｇｅｎｓ；Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｔｒａｄｉｕｓ；Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐ．；Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ；Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓａｎｇｕｉｎｅｇｅｎｓ；およびＦｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａを含めた、他の細菌属内の種に対しても最低限の交差反応性を有する。一態様では、本発明に従う、核酸に基づく検出アッセイは、これらの生物の１種もしくは複数種（one  of  more）またはＢＶと関連がある他の細菌属を検出するための構成成分をさらに含む。
【００９６】
特定の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子を標的とする。１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはコード遺伝子の特に適切な標的領域は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域；（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域；および（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド位置８３７〜９４４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域である。上記のような１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域を標的とする核酸に基づく検出アッセイの具体的な変更形態では、（ａ）Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号６に示す配列に実質的に対応する配列、配列番号４の残基１１〜２７に示す配列に実質的に対応する配列もしくは配列番号５の残基１〜２０に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含み；（ｂ）Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号９に示す配列に実質的に対応する配列、配列番号７の残基１１〜２５に示す配列に実質的に対応する配列もしくは配列番号８の残基１〜２４に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含み；かつ／または（ｃ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号１３に示す配列に実質的に対応する配列、配列番号１０の残基１１〜２７に示す配列に実質的に対応する配列、配列番号１１の残基１〜２７に示す配列に実質的に対応する配列もしくは配列番号１２の残基１〜３２ｓに示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含む。一部のそのような実施形態では、（ａ）Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号６に示す配列、配列番号４の残基１１〜２７に示す配列もしくは配列番号５の残基１〜２０に示す配列を含むまたはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み；（ｂ）Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号９に示す配列、配列番号７の残基１１〜２５に示す配列もしくは配列番号８の残基１〜２４に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み；かつ／あるいは（ｃ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号１３に示す配列、配列番号１０の残基１１〜２７に示す配列、配列番号１１の残基１〜２７に示す配列もしくは配列番号１２の残基１〜３２ｓに示す配列を含むまたはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含む。ある特定の実施形態では、核酸に基づく検出アッセイは、少なくとも２もしくは３つのＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチド、少なくとも２もしくは３つのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドおよび／または少なくとも２もしくは３つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドを利用し、これらは、上記で特定したオリゴヌクレオチドから選択されるオリゴヌクレオチドであり得る。
【００９７】
核酸ベースの検出アッセイの使用を含む方法の一部の実施形態では、増幅に基づくアッセイを使用して、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された細菌種を検出する。そのような変更形態は一般に、細菌の標的核酸内の標的配列を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける核酸増幅反応を利用して増幅するステップと、例えば、増幅生成物を、試料中の選択された細菌種の存在を示すためのシグナルを提供する核酸検出用プローブと特異的にハイブリダイズさせることによって、増幅生成物を検出するステップとを含む。増幅ステップは、試料を、標的核酸中の標的配列（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の標的配列）に特異的な２つまたはそれ超の増幅用オリゴマーと接触させて、標的核酸が試料中に存在する場合には、増幅生成物を生成することを含む。増幅用オリゴマー（プライマー）から鋳型鎖を使用して配列を伸長するために、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼを使用することによって、増幅により、標的配列またはその相補体の追加のコピーが合成される。増幅生成物を検出するための一実施形態は、ハイブリダイズさせるステップを使用し、そのステップは、増幅生成物を、選択された増幅用オリゴマーにより増幅された配列に特異的な少なくとも１つのプローブと接触させることを含み、増幅された配列は、例えば、一対の選択されたプライマーに挟まれた、標的配列中に含有される配列である。適切な増幅方法として、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介増幅または転写関連増幅（ＴＭＡ）が挙げられる。そのような増幅方法は、当技術分野で周知であり（例えば、上記の定義の項の増幅方法の論述を参照されたい）、本発明の方法に従って容易に使用される。
【００９８】
例えば、ＴＭＡ増幅を使用する一部の増幅方法は、以下のステップを含む。手短に述べると、増幅しようとする配列を含有する標的核酸を、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として提供する。当業者であれば、二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の従来の融解を使用して、一本鎖の標的核酸を提供することができることを理解されよう。プロモータープライマーが、標的核酸にその標的配列において特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）が、標的鎖を鋳型として使用して、プロモータープライマーの３’末端を伸長して、標的配列鎖のｃＤＮＡのコピーを生成し、結果として、ＲＮＡ：ＤＮＡの二重鎖が生じる。ＲＮａｓｅが、ＲＮＡ：ＤＮＡの二重鎖のＲＮＡ鎖を消化し、第２のプライマーが、プロモータープライマーの末端から下流のｃＤＮＡ鎖上に位置する、その標的配列に特異的に結合する。ＲＴが、第１のｃＤＮＡ鋳型を使用して、第２のプライマーの３’末端を伸長することによって、新たなＤＮＡ鎖を合成して、機能性のプロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを生成する。次いで、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼが転写を開始して、ＲＮＡ転写物を生成し、これらの転写物は、最初の標的鎖の、反応物中で増幅された約１００〜１０００個のコピー（「アンプリコン」）である。第２のプライマーが、それぞれのアンプリコン中のその標的配列に特異的に結合し、ＲＴが、アンプリコンのＲＮＡ鋳型からＤＮＡコピーを生成して、ＲＮＡ：ＤＮＡの二重鎖を生成する場合に、増幅は継続する。反応混合物中のＲＮａｓｅが、ＲＮＡ：ＤＮＡの二重鎖からアンプリコンのＲＮＡを消化し、プロモータープライマーが、新たに合成されたＤＮＡ中のその相補配列に特異的に結合する。ＲＴが、プロモータープライマーの３’末端を伸長して、機能性のプロモーターを含有するｄｓＤＮＡを生成し、このプロモーターに、ＲＮＡポリメラーゼが結合して、標的鎖に相補的である追加のアンプリコンを転写する。反応が進む間に、より多くのアンプリコンのコピーを作製する自己触媒性のサイクルが繰り返され、結果として、試料中に存在する標的核酸の約１０億倍の増幅が生じる。増幅生成物中に含有される標的配列に特異的に結合するプローブを使用することによって、増幅の間にリアルタイムでまたは増幅反応の終わりに、増幅生成物を検出することができる。結合しているプローブから生じるシグナルの検出は、試料中に標的核酸が存在することを示す。
【００９９】
一部の実施形態では、方法は、「リバース」ＴＭＡ反応を利用する。そのような変更形態では、最初のまたは「フォワード」増幅用オリゴマーは、標的領域の３’末端の付近にある標的核酸にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである。逆転写酵素（ＲＴ）が、標的核酸を鋳型として使用して、プライマーの３’末端を伸長することによって、ｃＤＮＡ鎖を合成する。第２のまたは「リバース」増幅用オリゴマーは、合成されたｃＤＮＡ鎖内に含有される標的配列にハイブリダイズするような、標的にハイブリダイズする配列構成を有するプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。第２の増幅用オリゴマーがプロモータープライマーである場合、ＲＴが、ｃＤＮＡ鎖を鋳型として使用して、プロモータープライマーの３’末端を伸長して、標的配列鎖の第２の、ｃＤＮＡのコピーを生成し、それにより、機能性のプロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを生成する。次いで、増幅は、ＲＮＡポリメラーゼを利用する、プロモーター配列からの転写の開始について上記で記載したように、本質的に継続する。代わりに、第２の増幅用オリゴマーがプロモータープロバイダーである場合には、標的領域の５’末端の付近にある標的配列にハイブリダイズする終結用オリゴヌクレオチドを典型的には利用して、プライミングオリゴマーの伸長を、終結用オリゴヌクレオチドの３’末端において終結させ、それにより、プライミングオリゴマーからの伸長により合成された最初のｃＤＮＡ鎖に、定まった（defined）３’末端をもたらす。次いで、プロモータープロバイダーの、標的にハイブリダイズする配列が、最初のｃＤＮＡ鎖の定まった３’末端にハイブリダイズし、ｃＤＮＡ鎖の３’末端を伸長して、プロモータープロバイダーのプロモーター配列に相補的な配列を付加し、結果として、二本鎖のプロモーター配列の形成が生じる。次いで、二本鎖のプロモーターを認識し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用し、最初のｃＤＮＡ鎖を鋳型として使用して、プロモーター部分を含まない、最初のｃＤＮＡ鎖に相補的な複数のＲＮＡ転写物が転写される。次いで、これらのＲＮＡ転写物のそれぞれが利用可能になり、第１のプライミング増幅用オリゴマーからのさらなる増幅のための鋳型として働く。
【０１００】
増幅に基づく検出アッセイを含むある特定の実施形態では、少なくとも２つの増幅用オリゴマーの組合せを利用して、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の検出を行う。オリゴマーの組合せは、配列番号１の約ヌクレオチド位置６１５〜約ヌクレオチド位置６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの核酸標的領域を増幅するために、第１および第２の増幅用オリゴマーを含むことができる。例えば、一部の実施形態では、第１の増幅用オリゴマーは、配列番号６に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含み、第２の増幅用オリゴマーは、配列番号４の残基１１〜２７に示す配列に実質的に対応する配列または配列番号５の残基１〜２０に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含む。より特定の変更形態では、第１の増幅用オリゴマーは、配列番号６に示す配列を含むまたはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み、第２の増幅用オリゴマーは、配列番号４の残基１１〜２７に示す配列を含むもしくはそれからなるまたは配列番号５の残基１〜２０に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含む。
【０１０１】
増幅に基づく検出アッセイを含むある特定の実施形態では、少なくとも２つの増幅用オリゴマーの組合せを利用して、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の検出を行う。オリゴマーの組合せは、配列番号２の約ヌクレオチド位置９５４〜約ヌクレオチド位置１０３４に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの核酸標的領域を増幅するために、第１および第２の増幅用オリゴマーを含むことができる。例えば、一部の実施形態では、第１の増幅用オリゴマーは、配列番号９に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含み、第２の増幅用オリゴマーは、配列番号７の残基１１〜２５に示す配列に実質的に対応する配列または配列番号８の残基１〜２４に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含む。より特定の変更形態では、第１の増幅用オリゴマーは、配列番号９に示す配列を含むまたはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み、第２の増幅用オリゴマーは、配列番号７の残基１１〜２５に示す配列を含むもしくはそれからなるまたは配列番号８の残基１〜２４に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含む。
【０１０２】
増幅に基づく検出アッセイを含むある特定の態様では、少なくとも２つの増幅用オリゴマーの組合せを利用して、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の検出を行う。オリゴマーの組合せは、配列番号３の約ヌクレオチド位置８３７〜約ヌクレオチド位置９４４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの核酸標的領域を増幅するために、第１および第２の増幅用オリゴマーを含むことができる。例えば、一部の実施形態では、第１の増幅用オリゴマーは、配列番号１３に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含み、第２の増幅用オリゴマーは、配列番号１０の残基１１〜２７に示す配列に実質的に対応する配列、配列番号１１の残基１〜２７に示す配列に実質的に対応する配列または配列番号１２の残基１〜３２に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域を含む。より特定の変更形態では、第１の増幅用オリゴマーは、配列番号１３に示す配列を含むまたはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み、第２の増幅用オリゴマーは、配列番号１０の残基１１〜２７に示す配列を含むもしくはそれからなる、配列番号１１の残基１〜２７に示す配列を含むもしくはそれからなるまたは配列番号１２の残基１〜３２に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含む。
【０１０３】
増幅生成物の検出は、増幅された標的配列と特異的に関連があるシグナルを検出するための多様な方法により達成することができる。核酸を、物理的変化、例として、検出可能な電気的変化をもたらす表面に会合させることができる。増幅された核酸は、マトリックスの中または上に核酸を濃縮し；核酸または核酸と会合している色素（例えば、インターカレート剤、例として、臭化エチジウムもしくはサイバーグリーン）を検出するか、あるいは核酸と会合している色素の増加を溶液相中で検出することによって検出することができる。他の検出方法は、増幅生成物中の配列に特異的にハイブリダイズするように構成されている核酸検出用プローブを使用して、プローブ：生成物の複合体の存在を検出する、または増幅生成物と関連がある検出可能なシグナルを増幅することができるプローブの複合体を使用することによって検出することができる（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号；同第５，４５１，５０３号；および同第５，８４９，４８１号；これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれている）。増幅生成物に特異的に会合する、直接的または間接的に標識されたプローブは、試料中に標的核酸が存在することを示す、検出可能なシグナルを提供する。例えば、標的核酸が、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡである場合には、増幅生成物は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の配列中の標的配列または１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の配列に相補的な標的配列を含有し、プローブは、増幅生成物中に含有される配列に直接的または間接的に結合して、検査試料中のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡの存在を示す。
【０１０４】
増幅された相補配列にハイブリダイズする検出用プローブは、ＤＮＡもしくはＲＮＡのオリゴマー、またはＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドの組合せを含有するオリゴマー、または改変骨格を用いて合成されたオリゴマー、例えば、１つもしくは複数の２’−メトキシ置換リボヌクレオチドを含むオリゴマーであり得る。増幅された配列を検出するために使用するプローブは、未標識であり、間接的に（例えば、別の結合パートナーの、プローブ上の部分への結合により）検出してもよく、または多様な検出可能な標識を用いて標識してもよい。ＢＶを診断するための方法の一部の実施形態、例として、転写媒介増幅（ＴＭＡ）を使用するある特定の実施形態では、検出用プローブは、例えば、線状のアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブ等の線状の化学発光標識プローブである。
【０１０５】
検出ステップはまた、増幅された配列についての追加情報、例えば、その核酸塩基（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｓｅ）配列の全部または一部等も提供することができる。検出は、増幅反応が完了してから実施してもよく、または標的領域を増幅するのと同時に、例えば、リアルタイムで実施してもよい。一実施形態では、検出ステップは、ホモジニアス検出、例えば、混合物からハイブリダイズしていない（ｕｎｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）プローブを除去せずに、ハイブリダイズしたプローブを検出することを可能にする（例えば、米国特許第５，６３９，６０４号および同第５，２８３，１７４号を参照されたい；これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１０６】
増幅生成物を増幅ステップの終了が近付いたらまたは終了時に検出する実施形態では、線状の検出用プローブを使用してシグナルを得て、プローブの増幅生成物へのハイブリダイゼーションを示すことができる。そのような検出の１つの例は、標的核酸にハイブリダイズする発光標識プローブを使用する。次いで、ハイブリダイズしていない（ｎｏｎ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）プローブから発光標識を加水分解する。ルミノメーターを使用して、化学発光により検出を実施する。（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願公開ＷＯ８９／００２４７６を参照されたい）。リアルタイム検出を使用する他の実施形態では、検出用プローブは、プローブが増幅生成物に結合する場合に検出されるレポーター部分を用いて標識されているヘアピンプローブ、例えば、分子ビーコン、分子トーチまたはハイブリダイゼーションスイッチプローブ等であり得る。そのようなプローブは、標的にハイブリダイズする配列および標的にハイブリダイズしない配列を含むことができる。そのようなプローブの多様な形態が、これまでに記載されている（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号；同第５，３１２，７２８号；同第５，９２５，５１７号；同第６，１５０，０９７号；同第６，８４９，４１２号；同第６，８３５，５４２号；同第６，５３４，２７４号；および同第６，３６１，９４５号；ならびに米国特許出願公開第２００６００６８４１７Ａ１号および同第２００６０１９４２４０Ａ１号を参照されたい；これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１０７】
核酸に基づく検出アッセイの使用を含む方法の一部の実施形態では、増幅に基づかないアッセイを使用して、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された細菌種を検出する。一部のそのような実施形態では、増幅に基づかないアッセイは、特異的検出用プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを含むハイブリダイゼーションアッセイである。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを行うための方法は、当技術分野で十分に開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、用途に依存して変化し、公知の一般的な結合方法に従って選択され、それらの方法として、例えば、Maniatisら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual（３版  Cold  Spring  Harbor、N.Y.、２００２年）、ならびにBergerおよびKimmel、Methods  in  Enzymology、１５２巻、Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques（Academic  Press,  Inc.、San  Diego、Calif.、１９８７年）の中で言及されているものが挙げられる。一般に、プローブおよび試料を、特異的核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合し、次いで、プローブの、その個別の標的への特異的ハイブリダイゼーションを検出する。核酸ハイブリダイゼーションは、多様なアッセイフォーマットに対して適応性がある。１つの適切なフォーマットが、サンドイッチアッセイのフォーマットであり、これは、非変性性の条件下におけるハイブリダイゼーションに対して特に適応性がある。サンドイッチ型アッセイの主要な構成成分は、固体の支持体であり、該支持体は、それに吸着させるかまたはそれに共有結合性にカップリングさせて固定化されている核酸プローブを有し、該プローブは、未標識であり、ＤＮＡ配列の一方の部分に相補的である。標的核酸が、固定化されているプローブにハイブリダイズし、第２の、標識されている検出用プローブ（これは、同じＤＮＡ鎖の第２のかつ異なる領域に相補的であり、該ＤＮＡ鎖には、固定化されている未標識の核酸プローブがハイブリダイズする）が、［標的核酸］：［固定化されているプローブ］の二重鎖にハイブリダイズして、標的核酸を検出する。別の例示的なフォーマットは、シグナルトランスデューサーとしての適切な電極表面上に固定化されている未標識の検出用プローブにハイブリダイズする標的核酸の電気化学的な検出を利用する。例えば、Drummondら、Nat.  Biotechnol.、２１巻：１１９２頁、２００３年；Gooding、Electroanalysis、１４巻：１１４９頁、２００２年；Wang、Anal.  Chim.  Acta、４６９巻：６３頁、２００２年；Cagninら、Sensors  ９巻：３１２２頁、２００９年；KatzおよびWillner、Electroanalysis  １５巻：９１３頁、２００３年；DanielsおよびPourmand、Electroanalysis  １９巻：１２３９頁、２００７年を参照されたい。
【０１０８】
ハイブリダイゼーションアッセイを含むある特定の実施形態では、検出用プローブを利用して、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の検出を行う。そのような実施形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくはＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号１の約ヌクレオチド位置６１５〜約ヌクレオチド位置６７９位に対応する核酸標的領域に特異的にハイブリダイズし；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号２の約ヌクレオチド位置９５４〜約ヌクレオチド位置１０３４に対応する核酸標的領域に特異的にハイブリダイズし；かつ／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子を検出するためのプローブは、配列番号３の約ヌクレオチド位置８３７〜約ヌクレオチド位置９４４に対応する核酸標的領域に特異的にハイブリダイズする。例えば、一部の変更形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａを検出するためのプローブは、配列番号６に示す配列に実質的に対応する配列、配列番号４の残基１１〜２７に示す配列に実質的に対応する配列または配列番号５の残基１〜２０に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域（例えば、配列番号６、配列番号４の残基１１〜２７もしくは配列番号５の残基１〜２０に示す配列を含むまたはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域）を含む。一部の変更形態では、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａを検出するためのプローブは、配列番号９に示す配列に実質的に対応する配列、配列番号７の残基１１〜２５に示す配列に実質的に対応する配列または配列番号８の残基１〜２４に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域（例えば、配列番号９、配列番号７の残基１１〜２５もしくは配列番号８の残基１〜２４に示す配列を含むまたはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域）を含む。一部の変更形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを検出するためのプローブは、配列番号１３に示す配列に実質的に対応する配列、配列番号１０の残基１１〜２７に示す配列に実質的に対応する配列、配列番号１１の残基１〜２７に示す配列に実質的に対応する配列または配列番号１２の残基１〜３２に示す配列に実質的に対応する配列を含む、標的にハイブリダイズする領域（例えば、配列番号１３、配列番号１０の残基１１〜２７、配列番号１１の残基１〜２７もしくは配列番号１２の残基１〜３２に示す配列を含むまたはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域）を含む。
【０１０９】
一部の好ましい実施形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを検出するための、増幅に基づかないアッセイは、切断に基づくアッセイであり、この場合、標的にハイブリダイズしないフラップ領域を含有するプローブのオリゴヌクレオチドが、オーバーラップ依存性の様式で、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、切断生成物を放出し、次いで、該生成物を検出する。例示的な、切断に基づくアッセイ用試薬が、例えば、Lyamichevら（Nat.  Biotechnol.  １７巻：２９２〜２９６頁、１９９９年）、Ryanら（Mol.  Diagn.  ４巻：１３５〜１４４頁、１９９９年）、およびAllawiら（J.  Clin.  Microbiol.  ４４巻：３４４３〜３４４７頁、２００６年）に記載されている。フラップエンドヌクレアーゼ反応についての適切な条件は、公知であるか、または当技術分野で公知の方法を使用して容易に決定することができる（例えば、Kaiserら、J.  Biol.  Chem.  ２７４巻：２１３８〜７２１３９４頁、１９９９年を参照されたい）。この方法において使用することができる例示的なフラップエンドヌクレアーゼとして、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩ、哺乳動物のＦＥＮ−１、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓのＦＥＮ−１、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＦＥＮ−１、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのＦＥＮ−１、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍのＦＥＮ−１、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＦＥＮ−１、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲＴＨ１、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲＡＤ２７、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのｒａｄ２、バクテリオファージＴ５の５’−３’エキソヌクレアーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＦＥＮ−１、ヒトのエンドヌクレアーゼ１、仔ウシ胸腺の５’−３’エキソヌクレアーゼが挙げられ、真正細菌、真核生物および古細菌中のそれらの相同体、例として、構造特異的酵素のクラスＩＩファミリーのメンバー、ならびにそれらの酵素的に活性な変異体またはバリアントも挙げられる。フラップエンドヌクレアーゼについての記載は、例えば、Lyamichevら、Science  ２６０巻：７７８〜７８３頁、１９９３年；Eisら、Nat.  Biotechnol.  １９巻：６７３〜６７６頁、２００１年；Shenら、Trends  in  Bio.  Sci.  ２３巻：１７１〜１７３頁、１９９８年；Kaiserら、J.  Biol.  Chem.  ２７４巻：２１３８７〜２１３９４頁、１９９９年；Maら、J.  Biol.  Chem.  ２７５巻：２４６９３〜２４７００頁、２０００年；Allawiら、J.  Mol.  Biol.  ３２８巻：５３７〜５５４頁、２００３年；Sharmaら、J.  Biol.  Chem.  ２７８巻：２３４８７〜２３４９６頁、２００３年；およびFengら、Nat.  Struct.  Mol.  Biol.  １１巻：４５０〜４５６頁、２００４年に見出すことができる。
【０１１０】
ある特定の変更形態では、切断に基づくアッセイは、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＲＮＡ標的核酸を検出し、切断に基づくアッセイは、ＲＮＡ：ＤＮＡの線状二重鎖構造の切断を行うことが可能であるフラップエンドヌクレアーゼ、およびＲＮＡ：ＤＮＡの線状二重鎖構造を利用する。一部の代替の実施形態では、切断に基づくアッセイは、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＤＮＡ標的核酸を検出し、切断に基づくアッセイは、ＤＮＡ：ＤＮＡの線状二重鎖構造の切断を行うことが可能であるフラップエンドヌクレアーゼ、およびＤＮＡ：ＤＮＡの線状二重鎖構造を利用する。ＲＮＡ：ＤＮＡの二重鎖を切断することが可能な例示的なフラップエンドヌクレアーゼとして、Ｔｈｅｒｍｕｓ属のポリメラーゼ欠損５’ヌクレアーゼ、ならびに特定のＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）酵素（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、例えば、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＢＮ（ＢｓｔＸ−ＮｏｔＩを欠失させたＴａｑポリメラーゼ等、米国特許第５，６１４，４０２号を参照されたい）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＩＩ（完全長Ｔａｑポリメラーゼの「ＡＧ」変異体、米国特許第５，６１４，４０２号を参照されたい）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＶＩＩ（合成欠損変異を有する完全長のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのポリメラーゼ）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＩＸ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ欠損変異体）、およびＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＸＩＩ（ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ断片とＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ断片とから構築されたポリメラーゼ欠損キメラポリメラーゼ）等が挙げられる。ＤＮＡ：ＤＮＡの二重鎖を切断することが可能な例示的なフラップエンドヌクレアーゼとして、上記で示したフラップエンドヌクレアーゼ、ならびにＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）２．０（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓのＦＥＮ−１）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）２．１（Ｃ末端上に６つのヒスチジンを有するＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓのＦＥＮ−１）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）３．０（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓのＦＥＮ−１）、およびＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）３．１（Ｃ末端上に６つのヒスチジンを有するＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓのＦＥＮ−１）が挙げられる。
【０１１１】
一部の実施形態では、切断に基づくアッセイは、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＲＮＡ標的核酸を検出し、アッセイは、ＲＮＡ標的領域のＤＮＡ相補体を合成するためのステップを含み、この場合、次にｃＤＮＡ鎖を、オーバーラップする第１および第２のプローブのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて、フラップエンドヌクレアーゼによる切断のための線状二重鎖切断構造を形成する。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を使用してＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成するための反応条件は、当技術分野で周知である。
【０１１２】
一部の実施形態では、切断に基づくアッセイは、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子を標的とする。ある特定の変更形態では、切断に基づくアッセイは、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域、および／または（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド位置８３７〜９４４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域を標的とする。
【０１１３】
例えば、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡの標的領域を標的とし、オーバーラップする第１および第２のオリゴヌクレオチドを利用する、切断に基づくアッセイのある特定の実施形態では、第１のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号４の残基１１〜２７に示す配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする領域を含み、かつ／または第２のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号５の残基１〜２０に示す配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする領域を含む。一部の変更形態では、逆転写酵素反応、例えば、配列番号６に示す配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする領域を有するプライマーを利用する逆転写酵素反応等を実施して、１６Ｓ  ｒＲＮＡのｃＤＮＡのコピーを合成する。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａを検出するためのより特定の変更形態では、第１のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号４の残基１１〜２７に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み；第２のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号５の残基１〜２０に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み；かつ／または逆転写酵素用プライマーが、配列番号６に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする配列を含む。
【０１１４】
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡの標的領域を標的とし、オーバーラップする第１および第２のオリゴヌクレオチドを利用する、切断に基づくアッセイの一部の実施形態では、第１のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号７の残基１１〜２５に示す配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする領域を含み、かつ／または第２のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号８の残基１〜２４に示す配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする領域を含む。一部の変更形態では、逆転写酵素反応、例えば、配列番号９に示す配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする領域を有するプライマーを利用する逆転写酵素反応等を実施して、１６Ｓ  ｒＲＮＡのｃＤＮＡのコピーを合成する。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａを検出するためのより特定の変更形態では、第１のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号７の残基１１〜２５に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み；第２のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号８の残基１〜２４に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み；かつ／または逆転写酵素用プライマーが、配列番号９に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする配列を含む。
【０１１５】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的領域を標的とし、オーバーラップする第１および第２のオリゴヌクレオチドを利用する、切断に基づくアッセイの一部の実施形態では、第１のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号１０の残基１１〜２７に示す配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする領域を含み、かつ／または第２のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の残基１〜２７に示す配列および配列番号１２の残基１〜３２に示す配列（the  sequence  shown  is）から選択される配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする領域を含む。一部の変更形態では、逆転写酵素反応、例えば、配列番号１３に示す配列に実質的に対応する、標的にハイブリダイズする領域を有するプライマーを利用する逆転写酵素反応等を実施して、１６Ｓ  ｒＲＮＡのｃＤＮＡのコピーを合成する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを検出するためのより特定の変更形態では、第１のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号１０の残基１１〜２７に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み；第２のプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の残基１〜２７に示す配列および配列番号１２の残基１〜３２に示す配列から選択される配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする領域を含み；かつ／または逆転写酵素用プライマーが、配列番号１３に示す配列を含むもしくはそれからなる、標的にハイブリダイズする配列を含む。
【０１１６】
切断に基づく検出アッセイの典型的な変更形態では、切断生成物を、ＦＲＥＴカセットとして公知のヘアピンオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出し、これは、フルオロフォアをその５’末端に含有し、フルオロフォアを消光するクエンチャーを付近に含有する。切断生成物のＦＲＥＴカセットとのハイブリダイゼーションにより、フラップエンドヌクレアーゼのための二次基質が生成され、フラップエンドヌクレアーゼにより、カセットから５’フルオロフォア含有塩基が切断され、それにより、蛍光シグナルが発生する。切断に基づくアッセイにおいて使用するためのＦＲＥＴカセットのデザインおよび構築を支配する原理は、当技術分野で周知であり、当業者であれば、そのようなプローブを本発明のある特定の実施形態に従って使用するために、これらの原理を容易に適応することができる。具体的な実施形態では、（ｉ）Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物が、配列番号４の残基１〜１１に示す配列を含み、残基１１が、切断生成物の３’終末端に相当する場合、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物を検出するためのＦＲＥＴカセットは、配列番号１４に示す配列を含むもしくはそれからなり；（ｉｉ）Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物が、配列番号７の残基１〜１１に示す配列を含み、残基１１が、切断生成物の３’終末端に相当する場合、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物を検出するためのＦＲＥＴカセットは、配列番号１５に示す配列を含むもしくはそれからなり；かつ／または（ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物が、配列番号１０の残基１〜１１に示す配列を含み、残基１１が、切断生成物の３’終末端に相当する場合、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物を検出するためのＦＲＥＴカセットは、配列番号１６に示す配列を含むまたはそれからなる。また本明細書では、ＦＲＥＴカセットの、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断生成物、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断生成物またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断生成物へのハイブリダイゼーションにより形成された二次基質（それぞれが、第１のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａのプローブのオリゴヌクレオチド、第１のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのプローブのオリゴヌクレオチドまたは第１のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのプローブのオリゴヌクレオチドの５’部分をそれぞれ含む）をそれぞれ、「第２のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの切断構造」、「第２のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの切断構造」または「第２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの切断構造」とも呼ぶ。明確にするために述べるが、この文脈における用語「第２の［Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］の切断構造」の使用により、ＦＲＥＴカセットがＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的配列に対する任意の特異性を有することを示唆する意図はない；というのは、対応する第１のプローブのオリゴヌクレオチドの５’部分自体はそれぞれの標的にハイブリダイズしないと理解されるからである。
【０１１７】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを検出するためのアッセイは、それぞれの標的に関して、検出シグナルを、それぞれの標的についての所定の検出閾値と比較することを含むことができる。それぞれの標的についての閾値は、例えば、医療機関に通う女性集団であって、ＢＶの存在について、例えば、Ｎｕｇｅｎｔスコアおよび／またはＡｍｓｅｌ基準を使用してスコア化されている集団からの試料を分析することによって決定することができる。そのような実施形態では、試料をアッセイして、それぞれの標的についての検出シグナルを決定し、検出閾値は、ＢＶについて陽性とスコア化されている被験体からの試料とＢＶについて陰性とスコア化されている被験体からの試料との間で観察された分離（例えば、Ｎｕｇｅｎｔ陽性試料とＮｕｇｅｎｔ陰性試料との間で観察された分離）に基づいて定義する。例えば、切断に基づく検出アッセイを利用する方法の一部の実施形態では、検出閾値は、ＦＥＮエンドヌクレアーゼ反応の初期速度（initial  rate）に基づいて決定し、その速度は、ＦＲＥＴカセットの切断から発生する蛍光シグナルと相関する。切断に基づくアッセイにおける初期反応速度に基づく、標的細菌の有無を決定するための検出閾値の例示的な使用については、本明細書の実施例１でさらに論じる。
【０１１８】
核酸に基づく検出アッセイを利用するある特定の実施形態では、方法は、試料中の他の構成成分からＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的核酸を精製することをさらに含む。そのような精製は、他の試料構成成分から、試料中に含有されている生物を分離および／または濃縮する方法を含むことができる含むことができる（may  include  may  include）。特定の実施形態では、標的核酸を精製することは、標的核酸を捕捉して、他の試料構成成分から標的核酸を特異的または非特異的に分離することを含む。非特異的な標的捕捉方法には、実質的に水性の混合物から核酸を選択的に沈殿させ、核酸を支持体に付着させ、該支持体を洗浄して、他の試料構成成分を除去すること、またはＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの核酸と他の試料構成成分とを含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の手段が含まれ得る。
【０１１９】
一部の実施形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的核酸（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡの標的核酸または１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子）を、他の試料構成成分から、標的核酸を捕捉用プローブのオリゴマーにハイブリダイズさせることによって分離する。捕捉用プローブのオリゴマーは、標的核酸に特異的または非特異的にハイブリダイズし、その結果、他の試料構成成分から分離される［標的核酸］：［捕捉用プローブ］の複合体を形成するように構成されている、標的にハイブリダイズする配列を含む。標的核酸を非特異的に捕捉するのに適切な、標的にハイブリダイズする配列を含む捕捉用プローブは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている国際ＰＣＴ公開ＷＯ２００８／０１６９８８に記載されている。好ましい変更形態では、捕捉用プローブは、［標的核酸］：［捕捉用プローブ］の複合体を、固定化されているプローブに結合させて、［標的核酸］：［捕捉用プローブ］：［固定化されているプローブ］の複合体を形成し、この複合体を、試料から分離し、任意選択で、洗浄して、標的以外の試料構成成分を除去する（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号；同第６，２８０，９５２号；および同第６，５３４，２７３号を参照されたい；これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれている）。そのような変更形態では、捕捉用プローブのオリゴマーは、捕捉用プローブを、それが結合している標的配列と共に、固体の支持体に結合させた（attached）固定化されているプローブに結合させる／結合させる（binds  attaches）配列または部分をさらに含み、それにより、ハイブリダイズさせた標的核酸を、他の試料構成成分から分離することが可能になる。
【０１２０】
より具体的な実施形態では、捕捉用プローブのオリゴマーは、標的核酸に相補的でないが、固定化されているプローブ上の配列には特異的にハイブリダイズし、それにより、他の試料構成成分からの標的核酸の分離を可能にする部分として働くテール部分（例えば、３’テール）を含み、このことは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，１１０，６７８号等にすでに記載されている。任意の配列を、テール領域において使用することができ、テール領域は一般に、約５〜５０ｎｔ長であり、好ましい実施形態は、約１０〜４０ｎｔの実質的にホモポリマー性のテール（例えば、Ａ１０〜Ａ４０）、より好ましくは、約１４〜３３ｎｔ（例えば、Ａ１４〜Ａ３０またはＴ３Ａ１４〜Ｔ３Ａ３０）を含み、テールは、固体の支持体、例えば、マトリックスまたは粒子に結合している、相補的な固定化されている配列（例えば、ｐｏｌｙ−Ｔ）に結合する。
【０１２１】
標的の捕捉は典型的には、ハイブリダイゼーション条件下、通常、［テール配列］：［固定化されているプローブ配列］の二重鎖のＴｍよりも高い温度で、標的核酸にハイブリダイズする１つまたは複数の捕捉用プローブのオリゴマーを含有する溶液相の混合物中で行う。捕捉用プローブのテールを含む実施形態の場合、［標的核酸］：［捕捉用プローブ］の複合体を、ハイブリダイゼーション条件を、捕捉用プローブのテールが、固定化されているプローブにハイブリダイズするように調整することによって捕捉し、次いで、固体の支持体上の複合体全体を、他の試料構成成分から分離する。［固定化されているプローブ］：［捕捉用プローブ］：［標的核酸］が結合している支持体を、１または複数回洗浄して、さらに、他の試料構成成分を除去することができる。好ましい実施形態は、粒子状の固体の支持体、例として、常磁性ビーズを使用し、したがって、［標的核酸］：［捕捉用プローブ］：［固定化されているプローブ］の複合体が結合している粒子を、洗浄用溶液中に懸濁させ、好ましくは、磁力を使用することによって、洗浄用溶液から回収することができる。増幅に基づく検出アッセイの使用を含む方法の実施形態では、取扱いのステップの数を制限するために、支持体上の複合体中の標的核酸を増幅用オリゴマーと単に混合し、増幅ステップを開始することによって、標的核酸を増幅することができる。
【０１２２】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよび／またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの検出が、被験体におけるＢＶを示す、ＢＶを診断するための方法の一部の実施形態では、方法は、被験体におけるＢＶを処置することをさらに含む。ＢＶのための処置レジメンは一般に、当技術分野で公知であり、例えば、抗菌薬（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｄｒｕｇ）、例として、メトロニダゾール（例えば、ＦＬＡＧＹＬ、ＭＥＴＲＯＧＥＬ−ＶＡＧＩＮＡＬ）、クリンダマイシン（例えば、ＣＬＥＯＣＩＮ、ＣＬＩＮＤＥＳＳＥ）、およびチニダゾール（例えば、ＴＩＮＤＡＭＡＸ）の投与を含む。ある特定の変更形態では、被験体は、ＢＶを有すると診断されたことがこれまでにない。他の実施形態では、被験体は、ＢＶを有するとすでに診断されており、本開示の診断方法が実施される時点で、ＢＶのための処置を受けている。そのような変更形態は、被験体におけるＢＶの処置をモニタリングするのに特に有用である。例えば、この方法が、ＢＶが被験体において依然として存在することを示す場合には、被験体は、処置を継続することができる。一部の実施形態では、同じ処置レジメン（すなわち、本診断方法が実施される時点で被験体が受けている同じ処置）を、被験体に再び施す。代わりに、処置を受けている被験体においてＢＶが存在し続けることは、進行中の処置を変更する必要があることを示し得、異なる処置レジメン（例えば、異なる薬物療法、または薬物の投与量および／もしくは頻度の増加）を、被験体に施す。
【０１２３】
本発明によれば、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの有無を検出すること、またはＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの有無を検出することは、各標的について別個に（例えば、別個の反応槽中で、逐次的に、もしくは平行して）実施しても、またはマルチプレックス反応系として一緒に実施してもよい。したがって、一部の実施形態では、ＢＶを診断するための方法は、マルチプレックス反応を利用し、ここで、反応ミックスは、複数の（例えば、少なくとも２、３、４つまたはそれ超）異なる標的配列を平行してアッセイするための試薬を含有する。これらの事例では、検出アッセイを実施するために、反応ミックスは、複数の異なる、標的特異的オリゴヌクレオチドを含有することができる。例えば、増幅に基づく検出アッセイを利用する方法においては、マルチプレックス反応は、増幅用オリゴマーの複数のセット（例えば、複数の対）（例えば、ＰＣＲ用プライマーの複数の対、またはＴＭＡ増幅用オリゴマーの複数の対（例えば、ＴＭＡのための、プロモータープライマーおよび非プロモータープライマーの複数の対、もしくはプロモータープロバイダーおよび非プロモータープライマーの複数の対））を含有することができる。切断に基づく検出アッセイを利用する他の実施形態では、マルチプレックス反応は、異なるフラップを有する、複数の第１のプローブのオリゴヌクレオチド；複数の異なる、オーバーラップする第２のプローブのオリゴヌクレオチド、および異なるフラップを、それらが切断されたら検出するための、複数の異なるＦＲＥＴカセットを含有することができる。ＦＲＥＴカセットが切断されると、複数の区別可能な蛍光シグナルを観察することができる。当技術分野では、オリゴヌクレオチドを蛍光標識するための化合物が周知であり、かつ一般に入手可能であり、励起化合物、および任意選択で、消光用化合物を含有する標識オリゴヌクレオチドを調製し、使用するための多様なＦＲＥＴおよび非ＦＲＥＴ技法も周知であり、かつ一般に入手可能である（例えば、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ、ドイツ；Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡを参照されたい）。
【０１２４】
追加の微生物検出アッセイも同様に実施して、ＢＶに関与する複数の微生物の存在および／または相対量を決定することができる。例に過ぎないが、そのような複数の微生物として、１種または複数種の嫌気性グラム陽性球菌；Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．；Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ；Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．；Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ目に属する細菌；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ様ｓｐ．；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｓｐ．；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ；腸内細菌；Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｓ；Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ａｍｎｉｏｎｉｉ；Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｓｐ．；Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ  ｓｐ．；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ；Ｓｎｅａｔｈｉａ  ｓａｎｇｕｉｎｅｇｅｎｓ；Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｔｒａｄｉｕｓ；Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐ．；Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ；Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓａｎｇｕｉｎｅｇｅｎｓおよびＦｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａを挙げることができる。アッセイは、別個に実施しても、またはマルチプレックス化してもよい。したがって、ＢＶの診断は、試料中の複数の微生物を同定すること、および任意選択で、それらの相対的な存在量を決定することを含むことができる。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、ＢＶを診断するための方法は、ＢＶと関連がある１０種以下の細菌属の検出を含む。他の実施形態では、方法は、ＢＶと関連がある９種以下、８種以下、７種以下、６種以下、５種以下または４種以下の（nor  more  than  four）細菌属の検出を含む。一部の変更形態では、方法は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ以外の、ＢＶと関連がある細菌属の検出を含まない。
【０１２６】
また、対象の発明は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的核酸を検出するための反応混合物も提供する。本発明に従う反応混合物は一般に、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのうちの１種または複数種の選択された種の標的核酸を検出するために、本明細書の記載の通りのオリゴマーまたはオリゴマーの組合せを含む。反応混合物は一般に、（ｉ）配列番号１に示す核酸塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子の存在により特徴付けられるＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種の標的核酸内の標的配列には特異的にハイブリダイズするが、他のＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ種に由来する核酸内の配列には特異的にハイブリダイズしないＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチド、（ｉｉ）Ｐ．ａｍｎｉｉ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓおよびＰ．ｂｉｖｉａの標的核酸内の標的配列には特異的にハイブリダイズするが、他のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種に由来する核酸内の配列には特異的にハイブリダイズしないＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチド、ならびに／または（ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の標的核酸内の標的配列には特異的にハイブリダイズするが、Ｌ．ｉｎｅｒｓに由来する核酸内の配列には特異的にハイブリダイズしないＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドを含む。典型的な変更形態では、反応混合物は、少なくとも１つの、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチド（例えば、それぞれが異なる標的配列に結合する、少なくとも２または３つの、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチド）、および少なくとも１つの、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチド（例えば、それぞれが異なる標的配列に結合する、少なくとも２または３つの、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチド）を含み；一部のそのような変更形態では、反応混合物は、少なくとも１つの、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチド（例えば、それぞれが異なる標的配列に結合する、少なくとも２または３つの、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチド）をさらに含む。反応混合物は、いくつかの任意選択の構成成分、例えば、捕捉用プローブの核酸（例えば、標的核酸を非特異的に捕捉するための捕捉用プローブ）または捕捉用プローブの核酸のアレイ等をさらに含むこともできる。増幅反応混合物の場合、反応混合物は典型的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増幅を実施するのに適切な他の試薬、例えば、緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）ならびに／または酵素（例えば、逆転写酵素および／もしくはＲＮＡポリメラーゼ）等を含み、典型的には、検査試料構成成分を含み、この中には、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的核酸が存在する場合またはしない場合がある。切断に基づくアッセイの反応混合物の場合、反応混合物は典型的には、例えば、緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成する場合には、ｄＡＴ��、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、ならびに／または酵素（例えば、フラップエンドヌクレアーゼ、およびＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成する場合には、逆転写酵素）を含めた、切断構造の形成、切断構造の切断ならびに切断生成物の検出を実施するのに適切な他の試薬を含み、典型的には、検査試料構成成分を含み、この中には、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの標的核酸が存在する場合またはしない場合がある。検出用プローブを増幅用オリゴマーの組合せと一緒に含む反応混合物の場合、反応混合物のための、増幅用オリゴマーおよび検出用プローブオリゴマーの選択には、共通の標的領域が関わる（すなわち、反応混合物の増幅用オリゴマーの組合せによる増幅が可能な配列に結合するプローブを、反応混合物は含む）。切断に基づくアッセイを介する検出のために、第１および第２のオーバーラップするプローブのオリゴヌクレオチドならびにＦＲＥＴカセットを含む反応混合物の場合、第１および第２のオーバーラップするプローブのオリゴヌクレオチドにより形成された切断構造の、フラップエンドヌクレアーゼが媒介する切断により生成される切断生成物に、ＦＲＥＴカセットが結合するように、反応混合物のためのオリゴマーが構成され、この場合、ＦＲＥＴカセットが切断生成物に結合すると、フラップエンドヌクレアーゼのための二次基質が形成される。
【０１２７】
上記のような反応混合物の一部の実施形態では、（ｉ）Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド位置６１５〜６７９に対応するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とし、（ｉｉ）Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド位置９５４〜１０３７に対応するＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とし、かつ／または（ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド位置８３７〜９４４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域内の配列を標的とする。上記のような、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域を標的とするオリゴヌクレオチドの具体的な変更形態では、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号６に示す配列に実質的に対応する、該配列を含むもしくは該配列からなる、標的にハイブリダイズする配列；配列番号４の残基１１〜２７に示す配列に実質的に対応する、該配列を含むもしくは該配列からなる、標的にハイブリダイズする配列；または配列番号５の残基１〜２０に示す配列に実質的に対応する、該配列を含むもしくは該配列からなる、標的にハイブリダイズする配列を含む。上記のような、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域を標的とするオリゴヌクレオチドの具体的な変更形態では、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号９に示す配列に実質的に対応する、該配列を含むもしくは該配列からなる、標的にハイブリダイズする配列；配列番号７の残基１１〜２５に示す配列に実質的に対応する、該配列を含むもしくは該配列からなる、標的にハイブリダイズする配列；または配列番号８の残基１〜２４に示す配列に実質的に対応する、該配列を含むもしくは該配列からなる、標的にハイブリダイズする配列を含む。上記のような、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域を標的とするオリゴヌクレオチドの具体的な変更形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号１３に示す配列に実質的に対応する、該配列を含むもしくは該配列からなる、標的にハイブリダイズする配列；配列番号１０の残基１１〜２７に示す配列に実質的に対応する、該配列を含むもしくは該配列からなる、標的にハイブリダイズする配列；配列番号１１の残基１〜２７に示す配列に実質的に対応する、該配列を含むもしくは該配列からなる、標的にハイブリダイズする配列；または配列番号１２の残基１〜３２に示す配列に実質的に対応する、該配列を含むもしくは該配列からなる、標的にハイブリダイズする配列を含む。
【０１２８】
本発明を、以下の非限定的な実施例によりさらに例示する。
【実施例】
【０１２９】
（実施例１）
この実施例は、選ばれたＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの種の検出を組み合わせて、（Ｎｕｇｅｎｔスコアと比較して）９５．６％の感度、９７．３％の特異性がある検査を生み出した研究について記載する。
【０１３０】
方法  
試料の収集および参加者の人口統計学  
本明細書で解析する試料は、より大きな収集研究の一部として収集した試料のサブセットからなった。この実施例に記載する研究のために、試料を利用可能な収集場所のそれぞれから入手し、２００個のサブセットを選んだ。２００個の試料は、Cartwrightら（Journal  of  Clinical  Microbiology  ５１巻：３６９４〜３６９９頁、２０１３年）において使用された判定基準に従って、ＢＶについて陽性である９９個の試料および陰性である１０１個の試料からなった。
【０１３１】
研究集団は、医療機関に通う女性からなった。女性は、１４歳またはそれ超で、ＩＲＢが承認した権利放棄の証書（IRB-approved  waiver）にサインしなければならない。初経前の（premenarchal）女性および閉経後の女性を、研究から除外する。また、試料を収集する施設は、それぞれの試料について、ＮｕｇｅｎｔスコアおよびＡｍｓｅｌ基準の結果も提供する必要があった。本明細書で解析するために使用する試料は、膣スワブ（ＡＰＴＩＭＡ（登録商標）膣スワブ検体収集キット）を使用して収集した。全部で８０人の女性が白人であり、１１１人がアフリカ系アメリカ人であり、２人がネイティブアメリカンまたはアラスカネイティブであり、２人がアジア人であることが報告され、５人の被験体の人種については、記録がなかった。
【０１３２】
この解析で使用した、試料を収集し、ＡｍｓｅｌおよびＮｕｇｅｎｔの結果を報告した場所は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ  ａｔ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ（ＵＡＢ、５０個の試料）、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＬＳＵ、５０個の試料）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ＵＯＷ、５０個の試料）、およびＷｏｍｅｎ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃ  ｏｆ  Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ（ＷＣＬ、５０個の試料）であった。
【０１３３】
ＲＴ−Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）によるリアルタイム化学反応
特異的な細菌のリボソームＲＮＡを、Ｐａｎｔｈｅｒ（登録商標）系上で、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）化学反応を使用して、ｃＤＮＡに変換してから検出した。Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）反応は、Ｈｏｌｏｇｉｃが製造し、他の箇所で記載されているＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素による特異的な核酸構造の切断に依拠する。例えば、Hallら  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  ９７巻：８２７２〜８２７７頁、１９９９年；Kaiserら、J.  Biol.  Chem.  ２７４巻：２１３８７〜２１３９４頁、１９９９年を参照されたい。手短に述べると、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素は、５’オーバーハングを切断するＦＥＮエンドヌクレアーゼに由来する。Ｉｎｖａｄｅｒ検出化学反応では、２つの反応が生じる。一次反応において、プローブが切断されて、フラップと呼ばれる５’断片を放出し、二次反応において、切断されたフラップが、ＦＲＥＴ分子にハイブリダイズして、オーバーハングを生じ、このオーバーハングが、結合しているフルオロフォアを含有するＦＲＥＴ用オリゴの５’末端の切断を可能にする。ＦＲＥＴ用オリゴはまた、未切断のＦＲＥＴからの蛍光の放出を抑制するクエンチャーも含有する。一次反応および二次反応は、ＢＶアッセイのためにＰａｎｔｈｅｒ（登録商標）装置上で実施する場合、異なる温度で連続的に生じる。さらに、蛍光は、二次反応が生じる間にのみ収集される。正味の結果は蛍光の蓄積であり、蛍光の蓄積は、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素の反応速度（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に直接関係する。このことにより、標的のレベルを、標準的な酵素の動態、または初期速度として一般に公知である動態を使用して推定することが可能になる。
【０１３４】
それぞれのアッセイのためのオリゴが、標的捕捉用のオリゴ、単一のＲＴ用プライマー、Ｉｎｖａｄｅｒオリゴ、プローブのオリゴおよびＦＲＥＴ用オリゴを含んだ。この実施例における標的捕捉用のオリゴは、ビーズにハイブリダイズする一般的なオリゴであり、核酸に無差別にハイブリダイズした。ＲＴ用プライマーは、捕捉された標的にハイブリダイズし、逆転写酵素により伸長されて、標的のＤＮＡ相補体を生成した。下流のプライマーはなく、したがって、標的領域は増幅されなかった。プローブのオリゴが、Ｉｎｖａｄｅｒオリゴに隣接する、標的領域のＤＮＡ相補体にハイブリダイズし、プローブ中に５’オーバーハングが生じる。Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）反応において、プローブのフラップが放出され、フラップが、ＦＲＥＴにハイブリダイズして、二次のＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）反応により、ＦＲＥＴの切断が可能になり、蛍光が放出された。
【０１３５】
Ｐａｎｔｈｅｒ装置は、試料を以下の通り処理した。標的捕捉ステップを、６４℃で２８分間行い、それに続いて、９分間冷やし、（２０分間の）洗浄ステップを行った。オリゴ、酵素およびＦＲＥＴを添加し、逆転写ステップを４４℃で１１分２秒間行った。これに続いて、一次反応のステップを６４℃で２０分３４秒間行い、最後に、二次のＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）反応を４３℃で約５３分間行った。ＦＲＥＴ用オリゴに対するフラップ断片の融解温度は４３℃であることから、二次反応は、４３℃のステップまで生じず、この温度に達した時点で、蛍光が読み取られた。
【０１３６】
配合  
オリゴミックスは、緩衝液（ＳＤ  ＰＮ：ＴＮ７２９４−１０８）中、０．５μＭのプローブのオリゴ、０．２５μＭのＩｎｖａｄｅｒオリゴ、０．２μＭのＲＴ−プライマー、０．２５μＭのＦＲＥＴからなった。酵素ミックスは、緩衝液（ＳＤ  ＰＮ：  ＴＮ７２９４−１０９）中、Ｃｌｅａｖａｓｅ  Ｘ、７００ＵおよびＭＭＬＶ、１５００Ｕ、ＭｇＣｌ、１８ｍＭからなった。濃度は全て、最終の反応濃度で示した。標的捕捉用の試薬は、ＡＰＴＩＭＡ（登録商標）緩衝液中、２６５ｍｇ／ｍＬの磁性ビーズおよび０．４μＭの捕捉用のオリゴ（ゆらぎプローブ（ｗｏｂｂｌｅ  ｐｒｏｂｅ）；５’−Ｋ１８Ｔ３Ａ３０−３’；例えば、ＷＯ２００８／０１６９８８（Ａ９）を参照されたい）からなった。
【０１３７】
オリゴ配列
この研究で使用したオリゴ配列を、表１に含めた。
【表１】
2018500918.tif 000003
【０１３８】
細菌性膣症に関連する種を標的とするオリゴのデザイン  
細菌性膣症を決定するために、それぞれの属内の最も関連する種のみを標的とするように、オリゴをデザインした。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属中の種を標的とするオリゴは、Ｌ．ｉｎｅｒｓ種を検出しなかった。同様に、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａを標的とするオリゴも、同様に、これらの属の選択されたメンバーのみを標的とするようにデザインした。図４、図５および図６の系統樹は、それぞれの属内の標的とした種、および近縁種に対する関係を示す。
【０１３９】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの場合、デザインの焦点は、膣環境中で見出される未培養種であった。Fredricksら、J.  Clin.  Microbiol.  ４５巻：３２７０〜３２７６頁、２００７年を参照されたい。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａをデザインするためには、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａデザインのＢＶとの関連性を補足する傾向がある種を選んだ。具体的には、Ｐ．ａｍｎｉｉ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓおよびＰ．ｂｉｖｉａを標的し、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの他の近縁種は標的としなかった。このアプローチにより、特異性を犠牲にすることなく、感度を改善するに至ったと考えている。全てのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種を含める場合には、特異性が犠牲になることが予測される。
【０１４０】
蛍光データの収集および解析
Ｐａｎｔｈｅｒ装置により、処理中、４３℃のステップの間に、４色についての蛍光の読取りをおおよそ２４秒の間隔で収集した。発生したシグナルは、以前に得た較正値を使用して、ブリードスルー、検出器ゲインおよび検出器のオフセットの効果について補正した。較正値は、制御した量の蛍光色素およびブランクを使用して得た。色素の較正を必要としない代替の補正も探索し、これらが等しく有効であることを見出した。次いで、反応の初期速度を、曲線の初期の線状部分から計算した。便宜上、この速度（rate）を、１，０００，０００で乗算した。この値を、速度（Velocity）（Ｖ）と呼んでいる。
【０１４１】
速度の閾値、およびアッセイからのＢＶの状況の決定
それぞれの標的についての閾値を、研究集団全体を使用して決定した。３つの標的のそれぞれについて、速度において、おおよそ０．５ログの範囲（a  range  of  roughly  0.5  logs）が、最もＮｕｇｅｎｔ陽性の試料と最もＮｕｇｅｎｔ陰性の試料との間で観察された分離であった。この研究のために、以下の閾値を使用した。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａについては、閾値をＶの対数値２．６７に設定し（図８を参照されたい）；Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａについては、閾値をＶの対数値２．５８に設定し（図９を参照されたい）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓについては、閾値をＶの対数値３．４４に設定した（図１０を参照されたい）。
【０１４２】
閾値を上回る速度の値（velocity  value）を有するそれぞれの試料には、１の値を割り当て；これら以外には、ゼロの値を割り当てた。値のこの決定を、それぞれの標的について実施した。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ単独について、この結果を、複合結果またはＮｕｇｅｎｔスコアのいずれかと比較した。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された種の組合せについて、個々の標的の結果を組み合わせ、これを、図７に示すフローチャートに表示する。単に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓについての速度（Ｖ）が、閾値に等しいまたはそれを下回る場合に、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのいずれかについての閾値を上回るＶ値を有する試料を、陽性とみなした（ＢＶを示した）。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓについての速度（Ｖ）が、閾値を上回る場合に、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの両方についての閾値を上回るＶ値を有する試料を、陽性とみなした。他の試料は全て、ＢＶ陰性であるとみなした（ＢＶを示さなかった）。この決定の論理はまた、以下のとおり表示することができる：ＢＶスコア＝ｂ１＋ｂ２−ｇ１、式中、ｂ１およびｂ２はそれぞれ、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａを示し、ｇ１は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを示し、ｂ１、ｂ２およびｇ１に割り当てる値は、Ｖ値が、閾値に等しいもしくは閾値を下回る、または閾値を上回るかどうかに依存してそれぞれ、０または１であり；１またはそれ超のＢＶスコアは、ＢＶ陽性である。
【０１４３】
上記の論理を使用して、アッセイを使用しＢＶの状況を決定すると、この状況は、２００個の試料について、複合コンパレーターまたはＮｕｇｅｎｔスコアと相関した。
【０１４４】
結果  
女性におけるＢＶの状況を決定する、受け入れられている２つの方法は、ＮｕｇｅｎｔスコアおよびＡｍｓｅｌ基準である。しばしば、それぞれをそれだけで使用して、細菌性膣症に対して女性を処置すべきであるか否かを決定しており、このことは、これらが同じ状態を検出する２つの異なる方法であることを示唆する。Ａｍｓｅｌ基準の結果とＮｕｇｅｎｔスコアの決定結果との比較から、他方に対するそれぞれの検査の性能が比較的不良であることが示された。表２を参照されたい。これらの結果は、以前の観察結果に類似した。Schwebkeら、Obstetrics  &  Gynecology  ８８巻：５７３〜５７６頁、１９９６年；Mastrobattistaら、Obstetrics  &  Gynecology  ９６巻：５０４〜５０６頁、２０００年を参照されたい。検査室の目的では、Ｎｕｇｅｎｔスコアは、至適基準であるとみなされている。残念なことに、有意なパーセンテージの女性が、診断を困難にする中間の範囲に入るＮｕｇｅｎｔスコアを有する。この実施例の研究群において、全被験体のうちの１６％が、中間の範囲のＮｕｇｅｎｔスコアを有した。
【表２】
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【０１４５】
Ａｍｓｅｌ基準は、至適基準としてのＮｕｇｅｎｔスコアに対して測定した場合、６７．０％の感度および９１．８％の特異性であることが見出された。この場合、３６個のＮｕｇｅｎｔが中間の試料は、解析から除外した。というのは、これらは、真陽性でも真陰性でもないからである。Ｎｕｇｅｎｔスコアは、Ａｍｓｅｌ基準に対して測定した場合、８１．３％の感度および７６．０％の特異性であることが見出され、この場合は、中間のＮｕｇｅｎｔスコアを陰性であるとみなした。中間のＮｕｇｅｎｔスコアを陽性であるとみなすと、Ｎｕｇｅｎｔスコアは、Ａｍｓｅｌ基準に対して測定した場合、９２．０％の感度および５３．６％の特異性であった。３６個のＮｕｇｅｎｔスコアが中間の試料を除外すると、Ｎｕｇｅｎｔスコアは、Ａｍｓｅｌ基準と比較する場合、９１．０％の感度および６９．１％の特異性を示した。
【０１４６】
ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａについてのリアルタイムＲＴ−Ｉｎｖａｄｅｒアッセイの性能を、Ａｍｓｅｌ基準とＮｕｇｅｎｔスコアとを組み合わせる複合コンパレーターと比較した。表３を参照されたい。複合コンパレーターについては、Ａｍｓｅｌ基準の結果およびＮｕｇｅｎｔスコアの結果が陽性である場合に限って、試料を陽性とし、Ａｍｓｅｌ基準の結果およびＮｕｇｅｎｔスコアの結果が陰性である場合に限って、試料を陰性とした。他の試料は全て除外し、結果として、この解析では、全部で１２９個の試料を得た。アッセイの性能はまた、Ｎｕｇｅｎｔスコア単独とも比較した。表４を参照されたい。
【表３】
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【表４】
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【０１４７】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ単独についてのリアルタイムＲＴ−Ｉｎｖａｄｅｒアッセイは、複合コンパレーターと比較する場合、１００．０％感度および９２．６％の特異性が見出された。ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａについてのリアルタイムＲＴ−Ｉｎｖａｄｅｒアッセイは、（３６個のＮｕｇｅｎｔスコアが中間の試料は除外して）Ｎｕｇｅｎｔスコアと比較する場合、９２．３％の感度および９４．５％の特異性が見出された。
【０１４８】
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａに加えて、いくつかの細菌種の検出を組み合わせるアッセイの性能も調べた。表５および表６に、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された種を標的としたアッセイの性能を要約する。
【表５】
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【表６】
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【０１４９】
アッセイの性能は、複合コンパレーターと比較する場合（表５）、１００％の感度および９５．６％の特異性を示した。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された種を組み合わせたアッセイから、（３６個のＮｕｇｅｎｔスコアが中間の試料は除外して）Ｎｕｇｅｎｔスコアと比較する場合、９５．６％の感度および９７．３％の特異性を示す検査を得た。
【０１５０】
考察  
Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａについての結果から、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ単独を利用する検査は、Ｎｕｇｅｎｔスコアと比較する場合、この現在市販されている、ＦＤＡが承認している唯一の検査に有意に優っていることが示される。さらに、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａのアッセイは、ＢＶの診断のために通常標的とされる細菌の間で、特異的であり、適度に高感度であることが見出され、その一方Ｎｕｇｅｎｔ陽性試料とＮｕｇｅｎｔ陰性試料との間で非常に明らかな分離も維持する（図９を参照されたい）。対照的に、高い存在量の標的、例として、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓは、Ｎｕｇｅｎｔ陽性試料とＮｕｇｅｎｔ陰性試料との間でアッセイの連続した読取り（Ｖの対数）を示す傾向があった（図１１を参照されたい）。Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａの１型等の標的の場合、高い特異性は可能であるが、感度が大きく失われてしまう（図１２を参照されたい）。
【０１５１】
これまでの研究の焦点は、細菌性膣症を診断する目的で、ディスバイオーシスの細菌指標を組み合わせることであった。この実施例の研究では、ＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのアッセイに、大きな重複があり、感度を補完するように、標的を選択し、アッセイをデザインした。９１個のＮｕｇｅｎｔ陽性試料のうち８個（９％）において、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａのアッセイが陽性であるか、またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのアッセイが陽性であるかのいずれかであったが、両方のアッセイが陽性であることはなかった。９１個のＮｕｇｅｎｔ陽性試料のうち８０個（８８％）において、ＥｇｇｅｔｈｅｌｌａのアッセイおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのアッセイの両方が陽性であった。
【０１５２】
Ravelら（J.  Clin.  Micobiol.  ５１巻：３６９４〜３６９９頁、２０１１年）では、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａが当時、無症状の女性の集団の６５％において見出され、このことは、この属を標的とすると、擬陽性の結果が得られるであろうことを示唆している。この実施例のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのアッセイをデザインする場合、その属のうちの特異的な数種しか標的としなかった。さらに、ＢＶについての高い特異的指標として、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの結果とＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの結果との組合せに、膣の健康状態の指標としてのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの結果を関連させた。このアプローチは、独特なことに、組み合わせたアッセイの感度および特異性の両方を向上させた。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａのアッセイを、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの選択された種についてのアッセイおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの選択された種についてのアッセイと組み合わせることによって、感度および特異性の両方が改善した。
【０１５３】
速度が、試料中の細菌標的の存在量に関係するというのがこのアッセイの基礎をなす仮定である。このことは、以前の実験で、細菌標的の制御した量の滴定を使用して確立した（図１３に示す例）。
【０１５４】
この実施例の研究から、とりわけ、ＢＶの診断のために、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａの選択された種を標的とすることは臨床的に有用であることが実証された。この研究では、性能（９２．３％の感度／９３．５％の特異性）は、現在市販されている、ＢＶについてＦＤＡが承認している唯一の検査の性能を上回った。さらに、いくつかの他の標的に対するアッセイとは異なり、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａのアッセイにより、Ｎｕｇｅｎｔ陽性試料とＮｕｇｅｎｔ陰性試料との間を明らかに識別する結果も得られた。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａのアッセイの結果を、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓと組み合わせると、Ｎｕｇｅｎｔスコアと比較する場合、高い感度（９５．６％）および特異性（９７．３％）を示す、ＢＶについての検査が得られた。独特なことには、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのアッセイの結果に依存して変化する論理を使用して、これら３つのアッセイの結果を組み合わせて、より高い感度および特異性を得た。
【０１５５】
上記から、本発明の具体的な実施形態を、例証の目的で本明細書に記載してきたが、多様な改変を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができることが理解されよう。したがって、本発明を制限するものは、添付の特許請求の範囲以外にはない。本明細書に引用した刊行物、特許および特許出願は全て、それらの全体が、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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