(57)【要約】  本発明は、バイオマーカーを用いた血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を用いて治療に対する感受性を予測する方法に関する。本発明によれば、肝臓癌患者の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を用いて治療に対する効果を予測することにより、肝臓癌に対する抗癌治療のための有効な手段及び抗癌療法を選定して治療効果を高め、肝臓癌治療の副作用を最小限に抑えることができる。【選択図】  図３
2018500046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）肝臓癌患者から分離されたサンプルにおけるｍＴＯＲ（mammalian target of rapamycin、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質)の発現レベルを測定するステップと；
（ｂ）前記ｍＴＯＲの発現レベルをｍＴＯＲ発現の基準レベルと比較して、基準レベル以上のサンプルを選別するステップと；
を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ：vascular endothelial growth factor receptor）阻害剤に対する感受性予測方法。
【請求項２】
前記（ａ）ステップは、ＶＥＧＦＲ２（Vascular endothelial growth factor receptor ２、血管内皮増殖因子受容体２）又はＰＤＧＦＲβ（Platelet-derived growth factor receptorβ、血小板由来増殖因子受容体β）から選択される一つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップをさらに含み、
前記（ｂ）ステップは、ＶＥＧＦＲ２又はＰＤＧＦＲβから選択される一つ以上のバイオマーカーをそれぞれのバイオマーカーの基準レベルと比較して、基準レベル以上のサンプルを選別するステップをさらに含む、請求項１に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測方法。
【請求項３】
前記血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤は、ブリバニブ、スニチニブ、リニファニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブのうちから選択されるいずれか一つ以上である、請求項１又は請求項２に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測方法。
【請求項４】
前記（ａ）ステップにおける発現レベルの測定は、ｍＲＮＡの発現レベルの測定である、請求項１又は請求項２に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測方法。
【請求項５】
前記ｍＲＮＡの発現レベルの測定は、ｍＴＯＲとＶＥＧＦＲ２又はＰＤＧＦＲβから選択される一つ以上のバイオマーカーのｍＲＮＡの発現量の合計を算出することである、請求項４に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤でに対する感受性予測方法。
【請求項６】
前記基準レベルは、ＡＵＣ（area under curve、曲線下面積）値を基準として０.６以上である、請求項１又は請求項２に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測方法。
【請求項７】
前記基準レベルは、ｍＴＯＲのｍＲＮＡ発現量をベースにして０.０００７以上である、請求項１に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測方法。
【請求項８】
前記ｍＴＯＲは、配列番号１の塩基配列を有する、請求項１又は請求項２に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測方法。
【請求項９】
ｍＴＯＲのｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物。
【請求項１０】
前記血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物は、ＶＥＧＦＲ２又はＰＤＧＦＲβから選択される一つ以上のバイオマーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤をさらに含むものである、請求項９に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物。
【請求項１１】
前記血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤は、ブリバニブ、スニチニブ、リニファニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブのうちから選択されるいずれか一つ以上である、請求項９に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物。
【請求項１２】
前記ｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤は、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー対、プローブ又はアンチセンスヌクレオチドである、請求項９に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物。
【請求項１３】
請求項９乃至請求項１２のいずれか一項による組成物を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用キット。
【請求項１４】
前記キットは、ＲＴ−ＰＣＲキット、競争的ＲＴ−ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲキット又はＤＮＡチップキットである、請求項１３に記載の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用キット。
【請求項１５】
（ａ）肝臓癌患者から分離されたサンプルにおけるｍＴＯＲの発現レベルを測定するステップと；
（ｂ）前記ｍＴＯＲの発現レベルをｍＴＯＲ発現の基準レベルと比較して、基準レベル以上のサンプルを選別するステップと；
（ｃ）治療学的に有効量の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を、基準レベル以上のｍＴＯＲの発現を示す肝臓癌患者に投与するステップと；
を含む、肝臓癌を治療する方法。
【請求項１６】
ｍＴＯＲの発現レベルを測定する製剤の、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測のための用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓癌の患者が血管内皮細胞増殖因子受容体阻害剤を用いた治療から治療効果を得ることができるか否かについての感受性を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌はヒトの健康に最も致命的な疾患の一つである。米国では、癌は毎年約１３０万人の新規患者に影響を及ぼし、心血管疾患に続く死亡原因の第２位であり、死者４人に約１人を占める。一部の癌の医学的治療に大きな進歩があったものの、全ての癌の全体的な５年生存率は過去２０年間でほんの約１０％向上したにすぎない。また、癌、又は悪性腫瘍は、転移し、制御不能な様態で急速に増殖し、時宜を得た検出と治療を非常に困難にしている。
癌は、その種類に応じて、化学療法、放射線及び抗体系薬物を含む様々な治療方法によって治療が行われるが、これらの治療効果は、患者及び癌の特性に応じて個別に異なる結果を示す。
特に、肝臓癌（肝癌）は抗癌治療に高い耐性を有する癌種であり、多くの種類の分子標的薬が化学療法に用いられる治療剤として研究されてきているが、これらのうち一部だけが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの承認を得て市販されているだけである。さらに、承認を得て市販されている肝臓癌の抗癌剤であっても、癌患者の癌の性質、進行病変に応じて非常に低い治療効果を示す。一例として、肝細胞癌の治療を目的として許可された新薬であるネクサバール（成分名：ソラフェニブ）は、肝臓癌の患者に対して約２〜３％の低い治癒率を示し、その副作用も非常に高い。つまり、現行の肝細胞癌の治療ガイドラインは、腫瘍の分子特性をベースにしていないため、その治療効果を保証することができないという限界がある。また、現在までにバイオマーカーとして知られている遺伝子が一部存在しているが、これらに対する耐性又は感受性を予測する閾値（threshold value）及び診断性能（diagnostic performance）の評価が適切に行われなくて、臨床的有用性については、追加研究を通じて証明する必要がある。
したがって、ある患者がいかなる治療に反応するかどうかを確認することができる具体的なバイオマーカー、これを用いて耐性又は感受性を予測する閾値（threshold value）及び診断性能（diagnostic performance）の研究開発が必要であり、抗癌療法の採択を経て適切な抗癌剤を患者に効率よく導入して抗癌治療を達成することができる方法を開発しなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、肝臓癌患者から分離されたサンプルにおけるｍＴＯＲ（mammalian target of rapamycin、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質)の発現レベルを測定するステップと；前記ｍＴＯＲの発現レベルをｍＴＯＲ発現の基準レベルと比較して、基準レベル以上のサンプルを選別するステップと；を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ：vascular endothelial growth factor receptor）阻害剤に対する感受性予測方法を提供する。
本発明は、ｍＴＯＲのｍＲＮＡ（messenger ＲＮＡ）の発現レベルを測定する製剤を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物を提供する。
本発明は、また、前記組成物を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用キットを提供する。
本発明は、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を用いた肝臓癌を治療する方法であり、（ａ）肝臓癌患者から分離されたサンプルにおけるｍＴＯＲの発現レベルを測定するステップと；（ｂ）前記ｍＴＯＲの発現レベルをｍＴＯＲ発現の基準レベルと比較して、基準レベル以上のサンプルを選別するステップと、（ｃ）治療学的に有効量の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を、基準レベル以上のｍＴＯＲの発現を示す肝臓癌患者に投与するステップと；を含む、肝臓癌を治療する方法を提供する。
本発明は、また、ｍＴＯＲの発現レベルを測定する製剤の、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測のための用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対して高い感受性を有する患者を選別して抗癌治療の効果を最大限に高めるために鋭意努力した結果、ｍＴＯＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲβ、ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦの発現量を測定し、その発現量及び治療利得スコア（treatment benefit score）をベースとして、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性の予測が可能であることを確認して、本発明を完成した。
本発明は、肝臓癌患者から分離されたサンプルにおけるｍＴＯＲの発現レベルを測定するステップと；前記ｍＴＯＲの発現レベルをｍＴＯＲ発現の基準レベルと比較して、基準レベル以上のサンプルを選別するステップと；を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測方法を提供する。
本発明において、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤は、血管内皮細胞増殖因子受容体（vascular endothelial growth factor receptor：ＶＥＧＦＲ）の阻害及び抑制により抗癌効果を有する治療剤であり、例えば、ブリバニブ、スニチニブ、リニファニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブなどの抗癌剤が挙げられる。本発明の一実施形態に係る前記血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤は、ソラフェニブである。
本発明において、感受性とは、標的抗癌治療剤である血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を用いた治療から利益や治療効果を得ることができる特性のことである。例えば、抗癌治療後の腫瘍の大きさが５％、１０、％１５％、２０％、２５％、３０％又はそれ以上縮小することをいい、好ましくは腫瘍の大きさが３０％又はそれ以上縮小すること［抗癌剤に対する固形癌の反応を評価する基準であるＲＥＣＩＳＴ（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors、固形癌効果判定基準 ）による完全反応及び部分反応］をいう。
すなわち、本発明は、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性を予測することにより、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を用いた治療の可能性及び治療による予後を予測し、抗癌治療のための有効な手段及び抗癌療法を選定して治療効果を高め、癌治療の副作用を最小限に抑える。
特に、本発明では、ｍＴＯＲ単独のバイオマーカーに対する発現量を測定するだけで高い正確度を示すソラフェニブ治療効果を奏することができ、ｍＴＯＲのｍＲＮＡレベルの増加が、ソラフェニブ治療に対する高い感受性を示すことを確認したというところから、従来の発明とは異なる利点を有する。また、細胞株ではない患者のサンプルからの直接的な感受性を確認する実験結果をもって、高いレベルの感受性予測結果を示す。
本発明の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測方法は、肝臓癌患者から分離されたサンプルにおけるｍＴＯＲの発現レベルを測定するステップを含む。
前記肝臓癌の患者は、肝臓に発生する悪性腫瘍である肝臓癌のうち、肝臓が発生元である原発性肝癌の患者を意味し、原発性肝癌である肝細胞癌と肝内胆管癌の中でも、特に肝細胞癌の患者を意味する。また、前記サンプルは、肝臓癌患者から分離された全血、血漿、血清、組織（tissue）などを含み、本発明の一実施形態によれば、肝腫瘍組織を使用する。これらのサンプルは、発現レベルの測定のために、当業界に公知されている方法により適切に加工され得る。
本発明において、発現レベルの測定は、ｍＲＮＡ発現レベルの測定を含む。本発明において、「ｍＲＮＡ発現レベルの測定」とは、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性を予測するために、サンプルにおける、遺伝子のｍＲＮＡの存在有無及び発現程度を確認する過程であり、ｍＲＮＡの量を測定することによって把握できる。このための分析方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ （Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、競争的ＲＴ−ＰＣＲ（Competitive ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Real-time ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ：ＲＮａｓｅ protection assay ）、ノーザンブロッテイング（Northern blotting）、ＤＮＡチップなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一実施形態によれば、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Real-time ＲＴ−ＰＣＲ）を行いｍＲＮＡの発現レベルを測定する。また、各遺伝子のＣＴ（cycle threshold、サイクル閾値：閾値を達成するのに必要とされるサイクル数）を測定し、ΔＣＴ値（各マーカーのＣＴ−参照遺伝子の平均ＣＴ）を算出する。そのΔＣＴ値から、ｍＲＮＡの発現量を２−ΔＣＴとして定量化することができる。本発明において、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測のためにｍＴＯＲの発現レベルが測定される。ｍＴＯＲ（Mammalian target of rapamycin）は、哺乳動物でラパマイシンのターゲットとして作用するセリン／スレオニンキナーゼ（serine／threonine kinase）の遺伝子であり、配列番号１の塩基配列を有する。
本発明において、基準レベルとは、本願に記載された方法によって基準サンプルから検出及び判断される高い診断の予測性を示すことができる遺伝子の発現レベルと同一のレベルを意味する。基準レベルは、同じ癌を患う被験体、年齢範囲が同一又は類似の被験体、人種群が同一又は類似の被験体、癌に対する家族歴がある被験体を含む群集研究から得られる個数又は数値に対して相対的であったり、癌の治療を受ける被験体の出発サンプルに対して相対的であったりすることができる。このような基準レベルは、数学的なアルゴリズム及び算出された指数から得られた、群集の統計学的分析及び／又は危険性予測データから誘導され得る。基準となる特定の係数も、統計学的及び構造的分類アルゴリズム及びその他の方法を用いて構成され、使用できる。
一部の実施形態において、本願における用語「基準レベル」とは、予め測定された値を意味し、例えば、当業者は、基準レベルを、予め測定し、特異性、敏感性及び／又は正確性の観点から要件を満たすように設定することができる。一例を挙げると、敏感性又は特異性は、それぞれの所定の限界、例えば、８０％、９０％又は９５％と設定することができ、これらの要件は、陽性又は陰性の予測値の観点から定義することもできる。基準レベルは、健康な個体から予め測定してもよく、患者が属する疾患体（disease entity）から予め測定してもよい。
本発明において、発現レベルの基準レベルを決定するために、平均値算出やＲＯＣ(Receiver Operating Characteristic、受信者動作特性)曲線分析などの統計的分析方法を用いることができる。
本発明の一実施形態によるＲＯＣ曲線分析は、診断の性能を示す曲線であり、敏感度（sensitivity）、特異度（specificity）、正確度（accuracy）より構成される。本発明において、敏感度（sensitivity）は、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性がある人の中の陽性者割合であり、特異度（specificity）は、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性がない人の中の陰性者割合であり、正確度（accuracy）は、全体の事例の中の検査結果の的中率を示す。ここで、特異度及び敏感度の両方が高いとき、検査の正確度が高くなるので、ＲＯＣ曲線において、ｘ軸が１−特異度となり、ｙ軸が敏感度となり、正確度（accuracy）を示すＡＵＣ（area under curve、曲線下面積）はＲＯＣ曲線の曲線下面積を意味する。
本発明の一実施形態によれば、「基準レベル」は、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性を予測するに際して、高い予測効果を示す閾値（Threshold value）である。感受性予測のために、ｍＴＯＲの発現量は、ｍＴＯＲのＲＯＣ曲線分析において、ＡＵＣ値が中等レベル（約０.６レベル）以上、好ましくはＡＵＣ値が最高レベルの遺伝子発現量を最適閾値（best threshold value）（Criterion）とし、基準レベル以上のサンプルに対して、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性が高いということを予測する。例えば、本発明の一実施形態による基準レベルは、ｍＲＮＡ発現量をベースにして０.０００７（Criterion）、好ましくは０.０００４であることができる。
本発明において、用語「以上」又は「超過」とは、基準レベルを超えるレベルを意味するか、基準サンプル発現レベルに比べて、本願に記載された方法によって検出された発現レベルにおける１％、２％、５％ 、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の全体増加を意味する。本発明において、用語「以下」又は「未満」とは、基準レベルに及ばないレベルを意味するか、基準サンプル発現レベルに比べて、本願に記載された方法によって検出された発現レベルにおける１％、２％、５％ 、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の全体減少を意味する。
本発明は、また、ＶＥＧＦＲ２（Vascular endothelial growth factor receptor ２、血管内皮増殖因子受容体２）又はＰＤＧＦＲβ（Platelet-derived growth factor receptorβ、血小板由来増殖因子受容体β）から選択される一つ以上のバイオマーカーをさらに含み、ｍＴＯＲ発現レベルを測定するとともにそれらの発現レベルを測定するステップと、ｍＴＯＲ発現レベルを基準レベルと比較するとともに、それらの発現レベルをそれぞれのバイオマーカーの基準レベルと比較して、基準レベル以上のサンプルを選別するステップと、をさらに含むことができる。
本発明において、ＶＥＧＦＲ２（Vascular endothelial growth factor receptor ２）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅの受容体として作用するチロシンキナーゼ（tyrosine kinase）をコードする遺伝子であり、配列番号２の塩基配列を有する。
本発明において、ＰＤＧＦＲβ（Platelet-derived growth factor receptorβ）は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の受容体として作用するチロシンキナーゼ（tyrosine kinase）をコードする遺伝子であり、配列番号３の塩基配列を有する。
好ましくは、ｍＴＯＲと一緒に感受性予測方法に用いられるバイオマーカーは、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＧＦＲβである。
前記感受性予測方法において、ｍＴＯＲの発現量から治療利得スコア（Treatment benefit score、ＴＢＳ）を算出し、この値から血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性を予測することができる。好ましくは、ｍＴＯＲとＶＥＧＦＲ２又はＰＤＧＦＲβから選択される一つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定し、それらの発現量の合計を算出して治療利得スコア（Treatment benefit score、ＴＢＳ）を算出することにより、この値から血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性を予測することができる。本発明において、治療利得スコアとは、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤から治療効果が得られるということについての情報を数値化するということであり、基準レベルをベースにして所定のスコア以上の治療利得スコアを有する場合にソラフェニブに対して感受性を有する。本発明の一実施形態によれば、治療利得スコアは、２−ΔＣｔによって定量化されたｍＲＮＡの発現量の合計に１００を乗じて得ることができ、ここで、基準レベルは、治療利得スコアのＲＯＣ曲線分析において、ＡＵＣ値が中等レベル（約０.６レベル）以上、好ましくはＡＵＣ値が最も高いレベルを最適閾値（best threshold value）（Criterion）として得られる。
本発明は、また、ｍＴＯＲのｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物を提供する。
前記血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物は、ｍＴＯＲのｍＲＮＡの発現レベルを測定することにより、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性を予測することができる。
前記血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物は、ＶＥＧＦＲ２又はＰＤＧＦＲβから選択される１種以上のバイオマーカーに対するｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤をさらに含むことができる。より好ましくは、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物は、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＧＦＲβのｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤をさらに含む。
好ましくは、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物は、ｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤であり、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー対、プローブ又はアンチセンスヌクレオチドのいずれか一つ以上を含むことができる。本発明で提供される塩基配列から、前記プライマー対、プローブ又はアンチセンスヌクレオチドは、当業者が容易に配列をデザインすることができる。本発明の一実施形態によれば、前記ｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤は、プライマー対及びプローブであり、下記の表１に記載されたｍＴＯＲ、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＰＤＧＦＲβのプライマー対及びプローブ配列を有することができる。
本発明は、また、ｍＴＯＲのｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用キットを提供する。
前記血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用キットは、ＶＥＧＦＲ２又はＰＤＧＦＲβから選択される１種以上のバイオマーカーに対するｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤をさらに含むことができる。より好ましくは、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用キットは、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＧＦＲβのｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤をさらに含む。
キットは、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのうちいずれか一つ以上の発現レベルを確認することにより検出することができる。本発明のキットは、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測のために発現レベルを測定するためのプライマー又はプローブだけでなく、前記ポリヌクレオチドの分析方法に適した一つ又はそれ以上の他の構成成分組成物又は装置が含まれ得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチド又は遺伝子定量検出のための診断キットは、前記４種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する１種以上のオリゴヌクレオチドを含んでもよいが、これらの一部配列に対応するプライマー、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰＣＲ用プライマー及びｄＮＴＰを含んでもよく、ポリヌクレオチド発現レベルを測定するために、前記「ｍＲＮＡ発現レベルの測定」と関連して記述された分析方法を用いたキットを用いてもよい。例えば、前記キットは、ＲＴ−ＰＣＲキット、競争的ＲＴ−ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲキット又はＤＮＡチップキットのうちから選択することができる。
また、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を用いた肝臓癌を治療する方法として、（ａ）肝臓癌患者から分離されたサンプルにおけるｍＴＯＲの発現レベルを測定するステップと；（ｂ）前記ｍＴＯＲの発現レベルをｍＴＯＲ発現の基準レベルと比較して、基準レベル以上のサンプルを選別するステップと；（ｃ）治療学的に有効量の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を、基準レベル以上のｍＴＯＲの発現を示す肝臓癌患者に投与するステップと；を含む、肝臓癌を治療する方法を提供する。
より好ましくは、前記肝臓癌を治療する方法は、ｍＴＯＲと一緒にＶＥＧＦＲ２又はＰＤＧＦＲβから選択される一つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップと；これらの発現レベルの合計を算出し、この値を発現レベルの合計の基準レベルと比較して、基準レベル以上のサンプルを選別するステップと；をさらに含むことができる。さらに好ましくは、ｍＴＯＲと一緒にレベルが測定されて比較されるバイオマーカーは、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＧＦＲβある。
これらの発現レベル、好ましくはｍＲＮＡ発現レベルの測定は、ｍＴＯＲと一緒に合算された発現量をベースにして、基準レベル以上の治療利得スコアを有するサンプルを選別する。前記サンプルを選別した後、治療学的に有効量の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を、基準レベル以上の治療利得スコアを示す肝臓癌患者に投与することができる。
前記血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤は、例えば、ブリバニブ、スニチニブ、リニファニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブのうちから選択されるいずれか一つ以上である。また、前記方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤及びこれらの組合物よりなる群から選択された治療剤の治療学的有効量を投与するステップをさらに含むことができる。
本発明は、また、ｍＴＯＲの発現レベルを測定する製剤の、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測のための用途を提供する。本発明 は、ｍＴＯＲと一緒にＶＥＧＦＲ２又はＰＤＧＦＲβから選択される１種以上のバイオマーカーの発現レベルを測定する製剤の用途をさらに含むことができ、好ましくは、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＧＦＲβの発現レベルを測定する製剤の用途を含む。
本発明は、肝臓癌患者から分離されたサンプルにおけるＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ（Epidermal growth factor receptor）又はｃＲＡＦの発現レベルを測定するステップと；前記ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦの発現レベルをそれぞれのバイオマーカーの基準レベルと比較して、サンプルを選別するステップと；を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測方法を提供する。
本発明は、また、ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦのｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物を提供する。
本発明は、また、ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦのｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用組成物を含む、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測用キットを提供する。
本発明は、また、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を用いた肝臓癌を治療する方法として、（ａ）肝臓癌患者から分離されたサンプルにおけるＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦの発現レベルを測定するステップと；（ｂ）前記ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦの発現レベルを、ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦの基準レベルと比較して、サンプルを選別するステップと；（ｃ）治療学的に有効量の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を、選別された肝臓癌患者に投与するステップと；を含む、肝臓癌を治療する方法を提供する。
本発明は、また、ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦの発現レベルを測定する製剤の、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤に対する感受性予測のための用途を提供する。
本発明において、ＦＧＦＲ１（Fibroblast growth factor receptor １、線維芽細胞増殖因子受容体１）は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の受容体として作用するチロシンキナーゼ（tyrosine kinase）をコードする遺伝子であり、配列番号４の塩基配列を有する。
本発明において、ｃＫＩＴは、幹細胞因子（ＳＣＦ）の受容体として作用するチロシンキナーゼ（tyrosine kinase）をコードする遺伝子であり、配列番号５の塩基配列を有する。
本発明において、ＥＧＦＲ（Epidermal growth factor receptor、上皮増殖因子受容体）は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）の受容体として作用するチロシンキナーゼ（tyrosine kinase）をコードする遺伝子であり、配列番号６の塩基配列を有する。
本発明において、ｃＲＡＦは、発癌遺伝子（oncogene）としてよく知られているＲＡＦセリン／トレオニンキナーゼ（ＲＡＦ serine/threonine kinase）グループに属しているキナーゼ（kinase）をコードする遺伝子であり、配列番号７の塩基配列を有する。
本発明の予測方法、組成物、キット、治療方法及び用途において言及された事項は、互いに矛盾しない限り、同様に適用される。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、肝臓癌患者の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を用いて治療に対する効果を予測することにより、肝臓癌に対する抗癌治療のための有効な手段及び抗癌療法を選定して治療効果を高め、肝臓癌治療の副作用を最小限に抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ｍＴＯＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲβ、ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦ遺伝子を用いて、ソラフェニブに対する感受性患者（Responder）と非感受性患者（non-responder）における個々の遺伝子の発現量の分布を確認した結果を示す。
【図２】ｍＴＯＲ；ｍＴＯＲ及びＶＥＧＦＲ２；ｍＴＯＲ及びＰＤＧＦＲβ；又はｍＴＯＲ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＧＦＲβの個々の遺伝子又は遺伝子の組み合わせを用いて、ソラフェニブに対する感受性患者（Responder）と非感受性患者（non-responder）の治療利得スコアの分布を確認した結果を示す。
【図３】治療利得スコアがソラフェニブに対する感受性患者と非感受性患者を予測及び分類する性能を確認するためにＲＯＣ（Receiver operating characteristic）曲線の分析を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すると明確になるであろう。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態に具現できるものであり、但し、本実施例は、本発明の開示が完全になるようにし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
【０００８】
＜実施例１＞ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
肝臓癌発病が診断されて肝切除術又は肝移植術を受けたが再発してネクサバール（成分：ソラフェニブ）治療を受けた３１名の肝臓癌患者の肝臓癌組織を、韓国の亞洲（ＡＪＯＵ）大学校医療院、高麗（ＫＯＲＥＡ）大学校安岩病院、啓明（ＫＥＩＭＹＵＮＧ）大学校東山病院で治療を受けた患者から、説明後同意（informed consent）を得て入手した。下記の方式によって各組織のＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ドイツのＱｉａｇｅｎ社）を用い、使用者説明書に基づいて肝臓癌組織及び周辺正常組織から全ＲＮＡを抽出した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（米国のＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、得られたＲＮＡ抽出物の全ＲＮＡを定量した。抽出ステップにおいてＤＮａｓｅＩを処理し、ＲＮＡ抽出物で汚染したゲノムＤＮＡを取り除いた。全ＲＮＡ４μgを含むサンプルを１μＭオリゴｄ（Ｔ）１８プライマー（韓国のＧｅｎｏｔｅｃｈ社）２μｌと共に７０℃で７分間反応させ、氷の上で５分間冷やした。酵素混合液［０.１Ｍ ＤＴＴ（オランダのＤｕｃｈｅｆａ社）２μｌ、１０×逆転写緩衝液２μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ、２００Ｕ／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素１μｌ、及び４０Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤（韓国のＥｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社）１μｌ；合計１１μｌ］を別途に準備した。酵素混合液を前記全ＲＮＡを含むサンプルに添加し、４２℃で９０分間反応させ、次いで、８０℃で１０分間反応させ、逆転写酵素を不活性化させた。前記サンプルにジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）−処理した水を添加し、最終容量が４００μｌとなるようにした。
【０００９】
＜実施例２＞定量的リアルタイムＰＣＲ
ｍＴＯＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲβ、ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦのｍＲＮＡ発現量を測定するために、実施例１で得られたｃＤＮＡサンプルのそれぞれに対して、ＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（米国のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、使用者説明書に基づいて下記の表１に記載された遺伝子マーカーに対してリアルタイムＰＣＲ増幅を行った。
リアルタイムＰＣＲ分析は、２×ＴａｑＭａｎ遺伝子発現株混合液（米国のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μｌ、５μＭフォワード及びリバースプライマーの各１μｌ、１μＭプローブ（韓国のＧｅｎｏｔｅｃｈ社）１μｌ、ｃＤＮＡ２μｌ（対照群の場合、同量の水）からなる合計１０μｌの容量でリアルタイムＰＣＲ分析を行った。９５℃で１０分間解離ステップを経た後、９５℃で１５秒間解離、６０℃で１分間合成の循環を行い増幅させた。プライマー及びプローブの配列は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ３.０（米国のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて考案し、全てのプローブ配列は、５'末端にＦＡＭを、３'末端にＴＡＭＲＡをそれぞれ標識した。各マーカーに対して、下記表１のようなプライマー及びプローブ配列が用いられた。
2018500046.tif 000003
各マーカー遺伝子の発現を３回繰り返して測定した後、５種の参照遺伝子（Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＨＭＢＳ、ＨＰＲＴ１、及びＳＤＨＡ）の平均的な発現を差し引いて標準化した。参照遺伝子に対しては下記の表２のようなプライマー及びプローブの配列が用いられた。
2018500046.tif 000004
各マーカーのＣＴ（閾値を達成するのに必要とされるサイクル数）を測定し、ΔＣＴ値（各マーカーのＣＴ−参照遺伝子の平均ＣＴ）を算出し、このΔＣＴ値から、ｍＲＮＡの発現量を２−ΔＣｔとして算出した。
【００１０】
＜実施例３＞統計的分析
実施例２で得られた各マーカーの発現量（２−ΔＣｔ）を用いて、下記の個々の遺伝子の発現分布、ＲＯＣ曲線分析、治療利得スコア、治療利得スコアのＲＯＣ曲線分析という全４つの統計的分析を行った。
（１）個々の遺伝子の発現分布解析
ソラフェニブの効能と個々のマーカーの発現量（２−ΔＣｔ）との間の相関関係を調べるために、ソラフェニブ感受性患者とソラフェニブ非感受性患者とに分けて、７種の個々のマーカーの発現量及びその分布を確認し、その結果を図１に示した。
図１は、ｍＴＯＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲβ、ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ又はｃＲＡＦの７種の遺伝子のｍＲＮＡ発現を、感受性患者と非感受性患者とに対してそれぞれ分析した結果を示す。
これらのマーカーのそれぞれについて説明すると、ｍＴＯＲは、統計的有意性（Ｐ＝０.００９２）を有し、非感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.０００３）に比べて、感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.００２６）において上向調節されることを確認した。また、ＶＥＧＦＲ２は、統計的有意性（Ｐ＝０.０１８１）を有し、非感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.０００１）に比べて、感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.００３４）において上向調節されることを確認した。また、ＰＤＧＦＲβは、統計的有意性（Ｐ＝０.００４３）を有し、非感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.０００１）に比べて、感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.００４３）において上向調節されることを確認した。また、ＦＧＦＲ１は、非感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.０００２）に比べて、感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.００５３）において上向調節されることを確認した。
また、ｃＫＩＴは、統計的有意性（Ｐ＝０.０４０８）を有し、非感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.０００５）に比べて、感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.０１９２）において上向調節されることを確認した。また、ＥＧＦＲは、統計的有意性（Ｐ＝０.０４９５）を有し、非感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.００２２）に比べて、感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.０３０２）において上向調節されることを確認した。また、ｃＲＡＦは、統計的有意性（Ｐ＝０.８０８９）を有しなく、非感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.０３１０）に比べて、感受性患者（２−ΔＣｔの平均値は０.０２７６）においてやや下向調節されることを確認した。
（２）ＲＯＣ曲線の分析
上記算出された３１人の患者の個々のマーカーの発現量を用いて、ソラフェニブ感受性患者とソラフェニブ非感受性患者を予測及び分類する性能を確認するために、様々なカットオフ値（cut-off value）を適用してＲＯＣ（Receiver operating characteristic、受信者動作特性）曲線の分析を行った。
また、ＲＯＣ曲線においてＡＵＣ値が中等（約０.６レベル）程度又は最も高いときの遺伝子の発現量をベースにして閾値（best threshold value、Criterion）を得、各分類子（classifiers）別に、該当閾値を適用したときの敏感度、特異度、及びＡＵＣ値とＰ値を得た。前記実行結果を下記の表３に示した。
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前記表３は、ＲＯＣ曲線を分析した結果であり、個々のマーカーの発現量をベースにしてソラフェニブ反応を予測するために行われた結果を示す。ＲＯＣ曲線分析の結果、最も高いＡＵＣは、ｍＴＯＲから０.８６０（p ＜０.０００１）が確認され、特にｍＴＯＲ、ＶＥＧＲＦ２及びＰＤＧＦＲβから他のマーカーのよりも高いＡＵＣ値が確認された。
（３）治療利得スコア（ＴＢＳ）の算出
ソラフェニブの効能とｍＴＯＲ、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＰＤＧＦＲβの発現ベースの治療利得スコアとの間の相関関係を確認するために治療利得スコアを算出した。
治療利得スコアの算出は、前記高いＡＵＣ値を有する各マーカーを選別して組み合わせて、それらの発現量の合計を算出し、この値に１００を乗算することにより得られた。
高いＡＵＣ値を示したｍＴＯＲ、ＶＥＧＲＦ２及びＰＤＧＦＲβの組み合わせをベースとする治療利得スコアの算出結果を、感受性患者と非感受性患者とに分けて図２に示した。
図２に示すように、ｍＴＯＲの治療利得スコアは、統計的有意性（Ｐ＝０.００９２）を有し、非感受性患者（ＴＢＳの平均値は０.０３）に比べて、感受性患者（ＴＢＳの平均値は０.２６）において上向調節されることを確認した。また、ｍＴＯＲ及びＶＥＧＲＦ２の併用時の治療利得スコアは、統計的有意性（Ｐ＝０.０１３０）を有し、非感受性患者（ＴＢＳの平均値は０.０４）に比べて、感受性患者（ＴＢＳの平均値は０.６１）において上向調節されることを確認した。また、ｍＴＯＲ及びＰＤＧＦＲβの併用時の治療利得スコアは、統計的有意性（Ｐ＝０.００４８）を有し、非感受性患者（ＴＢＳの平均値は０.０５）に比べて、感受性患者（ＴＢＳの平均値は０.６９）において上向調節されることを確認した。また、ｍＴＯＲ、ＶＥＧＲＦ２及びＰＤＧＦＲβの併用時の治療利得スコアは、統計的有意性（Ｐ＝０.００７４）を有し、非感受性患者（ＴＢＳの平均値は０.０５）に比べて、感受性患者（ＴＢＳの平均値は１.０４）において上向調節されることを確認した。
（４）治療利得スコアのＲＯＣ曲線分析
上記算出された治療利得スコアからソラフェニブの治療効果予測能を評価するために、様々なカットオフ値（cut-off value）を適用してＲＯＣ（Receiver operating characteristic）曲線の分析を行った。
また、ＲＯＣ曲線においてＡＵＣ値が中等（約０.６レベル）程度又は最も高いときの遺伝子の発現量をベースにして閾値（best threshold value、Criterion）を得、各分類子（classifiers）別に、該当閾値を適用したときの敏感度、特異度、及びＡＵＣ値とＰ値を得た。前記実行結果を図３及び下記の表４に示した。
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図３及び表４は、ｍＴＯＲ、ＶＥＧＲＦ２及びＰＤＧＦＲβの個別又は組み合わせによる治療利得スコアをベースにしたＲＯＣ曲線を示す。分析の結果を説明すると、ｍＴＯＲの治療予測スコアをベースにしてＲＯＣ曲線を分析した結果、ＡＵＣ値は０.８６０であり、ｍＴＯＲ及びＶＥＧＲＦ２の併用時のＡＵＣ値は０.８２０であり、ｍＴＯＲ及びＰＤＧＦＲβの併用時のＡＵＣ値は０.７７３であり、ｍＴＯＲ 、ＶＥＧＲＦ２及びＰＤＧＦＲβの併用時のＡＵＣ値は０.８０７であった。
上述したように、本発明のマーカー及び予測方法は、ソラフェニブ治療効果を予測するのに顕著な効果を奏することが確認でき、特に、ｍＴＯＲ及びｍＴＯＲと組み合わせられるさらなるマーカーから導出される治療利得スコアから更に正確なソラフェニブ治療効果を予測することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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