(57)【要約】  本発明は、神経変性障害、特に、緑内障を含めた眼関連神経変性疾患におけるニューロン組織の軸索変性の処置における神経保護的医薬品又は遺伝子治療としてニコチンアミド（ＮＡＭ）及び／若しくはピルビン酸を含有する医薬組成物の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置を必要とする対象において緑内障を処置する方法であって、対象にニコチンアミド（ＮＡＭ）の治療有効量を含有する医薬組成物を投与し、それによって緑内障を処置する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記医薬組成物がピルビン酸を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記医薬組成物が、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びニコチンアミドリボース（ＮＲ）からなる群から選択される１つ又はそれ以上の化合物を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＡＭが、網膜神経節細胞の神経変性を減少させるための治療有効量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＡＭが、眼内圧を減少させるための治療有効量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＡＭ及びピルビン酸が、網膜神経節細胞の神経変性を減少させるための治療有効量で存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＡＭ及びピルビン酸が、眼内圧を減少させるための治療有効量で存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記対象がヒト対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、前記遺伝子組成物が、ＮＭＮＡＴ１をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、ウイルスベクター内にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ２．２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子組成物が、硝子体内又は眼内に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子組成物が、硝子体内に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、前記遺伝子組成物が、ＮＭＮＡＴ１をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
対象に追加の治療的薬剤を投与する工程を更に含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記追加の治療的薬剤が、β受容体遮断薬、非選択的アドレナリン作動薬、選択的α−２アドレナリン作動薬、炭酸脱水酵素阻害薬、プロスタグランジン類似体、副交感神経刺激様アゴニスト、カルバコール又はそれらの組合せである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記追加の治療的薬剤が、チモロール、レボブノロール、メチプラノロールカルテオロール、ベタキソロール、エピネフリン、アプラクロニジン、ブリモニジン、アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミド、ブリンゾールアミド、ラタノプロスト、トラボプロスト、ビマトプロスト、ピロカルピン、ヨウ化エコチオフェート、カルバコール又はそれらの組合せである請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
予防を必要とする対象において緑内障を予防する方法であって、対象にニコチンアミド（ＮＡＭ）の治療有効量を含有する医薬組成物を投与し、それによって緑内障を予防する工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記医薬組成物がピルビン酸を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記医薬組成物が、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びニコチンアミドリボース（ＮＲ）からなる群から選択される１つ又はそれ以上の化合物を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＡＭが、眼内圧を減少させるための治療有効量で存在する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＮＡＭ及びピルビン酸が、眼内圧を減少させるための治療有効量で存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象がヒト対象である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、前記遺伝子組成物が、ＮＭＮＡＴ１をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドがウイルスベクター内にある、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子組成物が、硝子体内又は眼内に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子組成物が、硝子体内に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、前記遺伝子組成物が、ＮＭＮＡＴ１をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
対象に追加の治療的薬剤を投与することを更に含む、請求項２１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記追加の治療的薬剤が、β受容体遮断薬、非選択的アドレナリン作動薬、選択的α−２アドレナリン作動薬、炭酸脱水酵素阻害薬、プロスタグランジン類似体、副交感神経刺激様アゴニスト、カルバコール又はそれらの組合せである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記追加の治療的薬剤が、チモロール、レボブノロール、メチプラノロールカルテオロール、ベタキソロール、エピネフリン、アプラクロニジン、ブリモニジン、アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミド、ブリンゾールアミド、ラタノプロスト、トラボプロスト、ビマトプロスト、ピロカルピン、ヨウ化エコチオフェート、カルバコール又はそれらの組合せである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
改善を必要とする対象において視覚機能を改善する方法であって、対象にニコチンアミド（ＮＡＭ）の治療有効量を含有する医薬組成物を投与し、それによって視覚機能を改善する工程を含む、前記方法。
【請求項３７】
前記医薬組成物がピルビン酸を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、前記遺伝子組成物が、ＮＭＮＡＴ１をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３６又は３７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金助成を受けた研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって与えられた助成番号Ｒ０１  ＥＹ０１１７２１で米国政府支援のもと行われた。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願に対する参照
本出願は、２０１５年１０月２３日に出願の米国仮出願番号第６２／２４５，４６７号及び２０１６年７月２５日に出願の６２／３６６，２１１号に対し３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて利益を主張し、その全ての内容を、全体において参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００３】
軸索傷害は、神経変性疾患における初期の事象である。神経変性疾患は、末梢又は中枢神経系の生存神経細胞の機能不全又は喪失によって特徴付けられる。多くの事例において、軸索変性は、軸索突起の近位よりも遠位端で常により顕著な過程である神経喪失に先行することが示されている。ニューロンにおいて神経変性カスケードを誘発する上流の分子シグナルは、依然として未知である。
【０００４】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びその関連化合物を使用して、軸索変性を減少させることを示唆する報告がある。例えば、米国特許出願公開第２００６／０，２１１，７４４号Ａ１（‘７４４出願）は、慢性神経変性を減少させるためのＮＡＤ、ＮＡＤＨ及びニコチンアミド（ＮＡＭ）を含めた薬剤の使用について記述している。‘７４４出願は切断された後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン軸索の細胞培養モデルを使用して、ＮＡＤが、これらニューロンに軸索変性に対する保護効果を与えたことを開示する。‘７４４出願は、ＮＡＭが実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）のマウスモデルにおいて神経変性を減少させることを更に開示している。米国特許第７，７７６，３２６号（‘３２６特許）は、傷ついたニューロンにおいてＮＡＤ活性を増加させる薬剤を投与することによって哺乳動物における神経障害疾患において軸索分解を処置する方法を開示している。３２６特許権者は後根神経節（脊髄神経由来）の初代細胞培養及び神経細胞体近くの場所における軸索切断（機械的切断）を使用して、‘ニコチン酸及びＮＡＭが、軸索変性を減弱させるために働かないと明確に結論した。眼注射研究において、‘３２６特許権者は、硝子体内に注射した場合にＮＡＭが、対照動物といかなる差も示さなかったことを再び述べた。
【０００５】
緑内障は、最も一般的な神経変性疾患の１つであり、不可逆的失明の主原因となっており、特に高齢者において、世界で７０００００００人以上が冒されている（Ｑｕｉｇｌｅｙ及びＢｒｏｍａｎ、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ９０、２６２〜２６７頁、２００６年）。緑内障は、視力喪失をもたらす網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の進行性の機能不全及び喪失によって特徴付けられる複合的な多因子疾患である。高眼内圧（ＩＯＰ）及び加齢は、緑内障の神経変性に対する感受性因子になる。最近の進歩は、疾患の初期段階で緑内障の組織に起こる様々な分子変化を示した（Ｈｏｗｅｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２１、１４２９〜１４４４頁、２０１１年；Ｎｉｃｋｅｌｌｓら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３５、１５３〜１７９頁、２０１２年）。ＲＧＣ内で緑内障の損傷を開始させる初期の細胞及び分子機序は、十分に知られていない。ＲＧＣは、網膜内の細胞体、樹状突起及びシナプス並びに視神経の軸索に影響を及ぼす変化を含めて、緑内障の極めて初期に複数部位で侵襲されるように見える。ヒトにおいて高ＩＯＰ及び老化が、ニューロンの脆弱性を引き起こし、緑内障を開始させる機序は今なお不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＩＯＰの上昇を軽減するために利用可能な戦略は存在するが、眼神経変性を標的する有効な処置又は予防措置は存在しない。従って、網膜及び軸索変性において、特に緑内障の処置においてＲＧＣ損傷を減少させる治療的介入を提供するために、最初の神経変性過程を起動する上流の分子シグナルを明らかにし、新たな分子標的を同定することが継続して必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ニコチンアミド（ＮＡＭ）若しくはピルビン酸又はそれらの組合せに、神経細胞体、軸索及び関連細胞型を保護する潜在的効果があり、従って神経変性（例えば、軸索変性）及び眼神経変性疾患（例えば、緑内障）の処置に有益であるという発見に主に基づく。
【０００８】
本発明の目的は、処置を必要とする対象にＮＡＭ及び／又はピルビン酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、緑内障を処置又は予防する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の目的は、処置を必要とする対象にＮＡＭ及び／又はピルビン酸を含む医薬組成物の治療有効量に投与する工程を含む、例えば、緑内障において眼内圧を低減する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の態様は、処置を必要とする対象にＮＡＭ及び／又はピルビン酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、緑内障である又はそれに悩まされている患者の視覚機能を改善する方法を提供することである。
【００１１】
本治療処置（医薬品及び／又は遺伝子治療）は、特定の理論に束縛されるものではないが、２つの主要な機序：１）眼房水産生を減少させる、及び／又は２）眼房水流出を増加させることによって眼内圧を低減することで働くと考えられる。本治療は、高ＩＯＰを低減することによる有効な処置として役立ち、従って視神経などの軸索を保存し、視覚機能のその後の喪失を予防することができる。
【００１２】
本治療処置は、緑内障における神経変性を処置又は予防するのに有用である。
本緑内障処置は、網膜（例えば、ＲＧＣ）のレベルで神経性機能不全及び神経変性を処置又は予防するのに有効である。緑内障は、どんなレベルの眼内圧でも（高ＩＯＰ又は正常眼圧）存在し得る。本治療処置は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）などの網膜細胞に対する神経保護的効果のＩＯＰ非依存的効果を提供する。
【００１３】
特定の実施形態において、本処置は、眼内圧を減少させることによって、緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障又はＰＯＡＧ）の進行を予防及び／又は遅延させる。緑内障を処置するための現在の戦略のほとんど全ては、ＩＯＰの上昇を低減又は予防することを意図する。
【００１４】
特定の実施形態において、本処置は、直接的な神経保護を提供すること及び眼内圧を減少させることの両方によって、緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障又はＰＯＡＧ）の進行を予防及び／又は遅延させる。本治療は、緑内障の処置において予想外の二重利益を提供する。
【００１５】
特定の実施形態において、本処置は、眼内圧を減少させることなく緑内障の進行を予防及び／又は遅延させる。従って、本治療方法は、予想外の利点を提供し、その点で医薬品及び／又は遺伝子治療は、ＩＯＰ非依存的な神経保護的効果を与える。
【００１６】
本治療方法は、視神経変化及び視野喪失の特徴的なパターンを保護することにより原発性開放隅角緑内障などの緑内障に対する処置を提供する。ＡＡＯの好ましい実践パターンによると、原発性開放隅角緑内障の診断のためには、３つの所見のうちの２つ（ＩＯＰの上昇、視神経の損傷又は視野喪失）が存在しなければならない。
【００１７】
本発明の目的は、処置を必要とする対象において神経変性障害（眼神経変性疾患、例えば、緑内障など）を処置する方法を提供することであり、方法は、対象にＮＡＤｔの細胞内レベルを増加させる又はＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＧＳＨ、ＧＳＳＧ、ＰＱＱ若しくはピルビン酸の細胞内レベルを増加させる１つ又はそれ以上の化合物を含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む。
【００１８】
特定の実施形態において、神経変性障害（眼神経変性疾患、例えば、緑内障など）は、軸索変性、ニューロン機能不全、神経細胞体収縮、シナプス喪失、樹状突起萎縮及び／又は正常なニューロンの老化と関係する。特定の実施形態において、神経変性障害（眼神経変性疾患、例えば緑内障など）は、軸索変性と関係する。
【００１９】
特定の実施形態において、神経変性障害（眼神経変性疾患、例えば緑内障など）は、ワーラー変性、ワーラー様変性又は遠位性軸索変性と関係する。例えば、ワーラー変性はニューロン傷害に起因する。ニューロン傷害は、疾患、外傷、化学療法薬又はニューロン老化に起因する場合がある。
【００２０】
特定の実施形態において、神経変性障害は、アルツハイマー病、多発性硬化症、糖尿病性神経障害、外傷性脳傷害、虚血、末梢神経障害、又は緑内障若しくは老人性眼疾患（例えば、加齢黄斑変性［ＡＭＤ］、レーベル視神経障害、優性視神経萎縮症、白内障、糖尿病性眼疾患／糖尿病性網膜症、網膜変性、ドライアイ、低視力）などの眼障害のうちの１つ又は複数である。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明の化合物は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）前駆体（例えば、ニコチン酸［Ｎａ］、ニコチンアミド［ＮＡＭ］、ニコチンアミドモノヌクレオチド［ＮＭＮ］、ニコチンアミドリボース配糖体［ＮＲ］又はそれらの組合せ）を含む。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明の化合物は、ニコチンアミド、ピルビン酸又はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含む。本発明の化合物は、細胞内ＮＡＤｔを補給する又はミトコンドリア電子伝達系を改善すると考えられる。
【００２３】
特定の実施形態において、本発明の化合物は：（ａ）ＮＡＭ；（ｂ）ピルビン酸；（ｃ）ＰＱＱ；（ｄ）ＮＡＭ及びピルビン酸；（ｄ）ＮＡＭ及びＰＱＱを含む。
本発明の目的は、処置を必要とする対象において神経変性障害（眼神経変性疾患、例えば緑内障など）を処置する方法を提供することであり、方法が、対象に遺伝子組成物を投与する工程を含む。遺伝子組成物は、Ｎｍｎａｔ（例えば、Ｎｍｎａｔ−１、Ｎｍｎａｔ−２又はＮｍｎａｔ−３）の発現を増加させる遺伝子を含有する。
【００２４】
特定の実施形態において、遺伝子はＮＭＮＡＴ１である。
特定の実施形態において、遺伝子はＷｌｄＳである。
特定の実施形態において、方法は、対象の眼にＮｍｎａｔ（例えば、Ｎｍｎａｔ−１、Ｎｍｎａｔ−２又はＮｍｎａｔ−３）及び／又はＷｌｄＳをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む。
【００２５】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、対象に局所的に投与される。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターで対象に投与される（例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど）。
【００２６】
特定の実施形態において、神経変性障害は緑内障又は老人性眼疾患であり；対象はヒトである。
本発明の目的は、処置を必要とする対象において神経変性障害を処置する方法を提供することであり、方法が、対象にＮＡＤｔの細胞内レベルを増加させる１つ又はそれ以上の化合物の治療有効量を投与する工程を含み、対象にＮａｍｐｔ、Ｎｍｎａｔ（例えば、Ｎｍｎａｔ−１）、及び／又はＷｌｄＳをコード並びに発現するポリヌクレオチドを投与する工程を更に含む。
【００２７】
本発明の目的は、対象にニコチンアミド（ＮＡＭ）の治療有効量を含有する医薬組成物を投与し、それによって緑内障を処置する工程を含む、処置を必要とする対象において緑内障を処置する方法を提供することである。
【００２８】
本発明の更に関連するが、特徴的な目的は、対象にニコチンアミド（ＮＡＭ）の治療有効量を含有する医薬組成物を投与し、それによって緑内障を予防する工程を含む、予防を必要とする対象において緑内障を予防する方法を提供することである。
【００２９】
特定の実施形態において、前記ＮＡＭは、網膜神経節細胞の神経変性を減少させるための治療有効量で存在する。例えば、特定の実施形態において、前記医薬組成物は、１日の摂取量についてＮＡＭ約０．５〜１０ｇ、ＮＡＭ約１〜５ｇ又はＮＡＭ約２．５ｇを含有する。
【００３０】
特定の実施形態において、前記ＮＡＭは、眼内圧を減少させるための治療有効量で存在する。例えば、特定の実施形態において、前記医薬組成物は、１日の摂取量についてＮＡＭ約２〜２５ｇ、ＮＡＭ約１０〜２０ｇ又はＮＡＭ約１０ｇを含有する。
【００３１】
特定の実施形態において、前記医薬組成物は、ピルビン酸を更に含む。好ましくは、前記ＮＡＭ及びピルビン酸は、網膜神経節細胞の神経変性を減少させるための治療有効量で存在する。例えば、特定の実施形態において、前記医薬組成物は、（１）１日の摂取量についてＮＡＭ約０．５〜１０ｇ、ＮＡＭ約１〜５ｇ、又はＮＡＭ約２．５ｇ；及び（２）１日の摂取量についてピルビン酸約０．５〜１０ｇ、ピルビン酸約１〜５ｇ、又はピルビン酸約２．５ｇをそれぞれ独立に含有する。好ましくは、前記ＮＡＭ及びピルビン酸は、眼内圧を減少させるための治療有効量で存在する。例えば、特定の実施形態において、前記医薬組成物は、（１）１日の摂取量についてＮＡＭ約２〜２５ｇ、ＮＡＭ約１０〜２０ｇ又はＮＡＭ約１０グラム；及び（２）１日の摂取量についてピルビン酸約２〜２５ｇ、ピルビン酸約１０〜２０ｇ、又はピルビン酸約１０ｇをそれぞれ独立に含有する。
【００３２】
特定の実施形態において、前記医薬組成物は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びニコチンアミドリボース（ＮＲ）からなる群から選択される１つ又はそれ以上の化合物を更に含む。特定の実施形態において、ＰＱＱが存在する場合、医薬組成物は、１日の摂取量についてＰＱＱ約１０ｍｇ〜１０ｇ、約５０ｍｇ〜１ｇ、又は約５００ｍｇを含む。
【００３３】
特定の実施形態において、本方法（ピルビン酸有り又は無し）は、遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、前記遺伝子組成物は、ＮＭＮＡＴ１をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【００３４】
特定の実施形態において、前記ウイルスベクターは、ＡＡＶである。特定の実施形態において、前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ２．２である。特定の実施形態において、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００３５】
特定の実施形態において、前記遺伝子組成物は、硝子体内又は眼内に投与される。好ましくは、前記遺伝子組成物は、硝子体内に投与される。
特定の実施形態において、前記対象は、ヒト対象である。
【００３６】
特定の実施形態において、前記対象は、約１２〜２１ｍｍＨｇの眼内圧がある。特定の実施形態において、前記対象は、２１ｍｍＨｇを超える眼内圧がある。
特定の実施形態において、前記対象は、緑内障の神経変性症状を発症していない。特定の実施形態において、前記対象は、緑内障の神経変性症状を発症している。
【００３７】
特定の実施形態において、前記対象は、視覚機能不全を発症している。
特定の実施形態において、方法は対象に追加の治療的薬剤を投与する工程を更に含む。典型的な追加の治療的薬剤には、眼内圧を低減する薬剤がある。特定の実施形態において、前記追加の治療的薬剤は、β受容体遮断薬、非選択的アドレナリン作動薬、選択的α−２アドレナリン作動薬、炭酸脱水酵素阻害薬、プロスタグランジン類似体、副交感神経刺激様アゴニスト、カルバコール又はそれらの組合せである。特定の実施形態において、前記追加の治療的薬剤は、チモロール、レボブノロール、メチプラノロールカルテオロール、ベタキソロール、エピネフリン（epinepherine）、アプラクロニジン、ブリモニジン、アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミド、ブリンゾールアミド、ラタノプロスト、トラボプロスト（travaprost）、ビマトプロスト（bimataprost）、ピロカルピン、ヨウ化エコチオフェート、カルバコール又はそれらの組合せである。
【００３８】
更に本発明の目的は、対象にニコチンアミド（ＮＡＭ）の治療有効量を含有する医薬組成物を投与し、それによって視覚機能を改善する工程を含む、改善を必要とする対象において視覚機能を改善する方法を提供することである。
【００３９】
特定の実施形態において、前記医薬組成物は、ピルビン酸を更に含む。
特定の実施形態において、方法は、遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、前記遺伝子組成物は、ＮＭＮＡＴ１をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００４０】
明確に否定されない限り、本明細書に記述される全ての実施形態は、他の任意の実施形態と組み合わせることができると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】疾患の初期段階にあり、月齢が同じＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋又は若齢対照と形態学的に区別できないＤＢＡ／２Ｊ（Ｄ２）マウスにおいて分子的に決定された緑内障の段階を定義するための階層的クラスタ分析（ＨＣ）の結果を示す図である。ＨＣは、Ｄ２マウス及び対照から単離された網膜神経節細胞（ＲＧＣ）におけるＲＮＡ−配列決定に基づいた。ＨＣは、分子的に類似している対照及び若齢サンプルを含む固有の群へのＲＧＣサンプルのクラスタリングを可能にする（スピアマンのρ）。丸＝Ｄ２  ＲＧＣ由来サンプル、三角形＝Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋ＲＧＣＳ由来サンプル。挿入画：Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋と各群の間で差異的に発現される（ＤＥ）遺伝子の数（ｑ＜０．０５）。
【図２Ａ】４つのＤ２マウス群（群１、群２、群３及び群４）及びＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋対照群の間で差異的に発現される（ＤＥ）遺伝子の数を表す図である。
【図２Ｂ】全てのサンプルのヒートマップ相関を表す図である（スピアマンのρ、青色＝最も高い相関、赤色＝最も低い相関）。図１からのデンドログラムを灰色で示す。
【図３Ａ】対照からのＨＣ距離が増加するにつれて、ミトコンドリア：核のリード総比率が増加することを示す図である（９ヵ月齢マウス）。結果は、ミトコンドリア機能不全が、緑内障におけるＲＧＣ損傷の初期の駆動体であるという概念と整合している。
【図３Ｂ】疾患前Ｄ２マウス（９ヵ月齢Ｄ２マウス、群２、群３及び群４の３つのクラスタ）並びに同じ月齢及び性別の野生型対照（Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋）のＲＧＣから得られたＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用する、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）に基づいて有意に濃縮された、いくつかの上位の経路を示す図である。−ｌｏｇｐ値が大きいほど、濃縮はより大きい。濃縮された経路の上位３つのうちの２つは、ミトコンドリア機能不全及び酸化的リン酸化である。有意に濃縮された追加の経路については表３も参照のこと。Ｄ２群１において差異的に発現される経路がない点に留意すべきである。
【図３Ｃ】対照からＤ２群のＨＣ距離の増加につれて、転写産物発現が、主に核コードされているミトコンドリアタンパク質について増加することを示す図である（全て９ヵ月齢マウス）。結果は、ミトコンドリア機能不全が、緑内障におけるＲＧＣ損傷の初期の駆動体であるという概念と再び整合している。点は、個々の遺伝子を表す、灰色又はより明るい点＝差異的に発現しなかった、赤色又はより暗い点＝ｑ＜０．０５で差異的に発現された。遺伝子は、マウスＭｉｔｏＣａｒｔａ２．０（Ｃａｌｖｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４、Ｄ１２５１〜１２５７頁、２０１６年）から得た。
【図３Ｄ】ＲＮＡ−配列決定が、緑内障初期に増加したミトコンドリア分裂遺伝子転写産物を同定することを示す図である（９ヵ月齢マウス）。結果は、ミトコンドリア機能不全が、緑内障におけるＲＧＣ損傷の初期の駆動体であるという概念と整合している。
【図３Ｅ】対照と比較した初期のミトコンドリア小胞体ストレス応答を示す図である。示したデータは、Ｄ２群４（９ヵ月齢マウス）の場合である。結果は、ミトコンドリア機能不全が、緑内障におけるＲＧＣ損傷の初期の駆動体であるという概念と整合している。
【図３Ｆ】初期の緑内障（９ヵ月齢マウス）における代謝的及び酸化的事象を示す個々の遺伝子発現プロットの結果を表す図である。点は、個々の遺伝子を表す、灰色又はより明るい点＝差異的に発現しなかった、赤色又はより暗い点＝ｑ＜０．０５で差異的に発現された。また、酸化的リン酸化遺伝子は、最も高いレベルで差異的発現を示すものの１つであり、差異的発現は、対照からのＨＣ距離が増加するＤ２群において次第に高くなるように見える（群４＞群３及び２）。
【図３Ｇ】差異的に発現している遺伝子（ｎ＝４／月齢群）のウェスタンブロットタンパク質検証のデータ（図３Ｉ）を要約する棒グラフである。チトクロムｃにおいて、ＲＮＡ−配列決定によって評価される転写産物存在量と相関する全般的なタンパク質増加が存在した。棒グラフにおいて縦軸は、β−アクチンに対する相対密度である。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１。
【図３Ｈ】差異的に発現している遺伝子（ｎ＝４／月齢群）のウェスタンブロットタンパク質検証のデータ（図３Ｊ）を要約する棒グラフである。ｅＩＦ２αにおいて、ＲＮＡ−配列決定によって評価される転写産物存在量と相関する全般的なタンパク質増加が存在した。棒グラフにおいて縦軸は、β−アクチンに対する相対密度である。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１。
【図３Ｉ】差異的に発現している遺伝子（ｎ＝４／月齢群）のウェスタンブロットタンパク質検証のデータ。
【図３Ｊ】差異的に発現している遺伝子（ｎ＝４／月齢群）のウェスタンブロットタンパク質検証のデータ。
【図３Ｋ】酸化的リン酸化遺伝子が、対照からのＨＣ距離が増加するＤ２群においてますます高い発現で、全ての群にわたって差異的に発現されることを示す図である（群４＞群３＞群２＞群１）。赤色＝最も高い発現、青色＝最も低い発現、Ｉ〜Ｖ＝ミトコンドリア複合体Ｉ〜Ｖ（表１に作表される）、Ｇ＝Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋、１〜４＝Ｄ２群１〜４。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、９ヵ月齢のＤ２マウスが、ＲＧＣ神経細胞体及び樹状突起ミトコンドリアにおいてクリステ容積を低下させたことを示す図である。しかしながら、総ミトコンドリアサイズ／容積に有意差はない。スケールバー＝３５０ｎｍ。＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＝Ｐ＜０．００１。
【図５Ａ】ＮＡＤ（ｔ）レベルが、ＮＡＭＬｏ処置（５５０ｍｇ／ｋｇ／日）したＤ２マウス（ｎ＝２２／群）において増加することを示す図である。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図５Ｂ】ＧＳＨ／ＧＳＳＧレベルが、年齢に伴って低下することを示す図である（ｎ＝２２／群）。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図５Ｃ】Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋対照マウス（ｎ＝２２／群）においてもＮＡＤ（ｔ）レベルが年齢に伴って低下することを示す図である。＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図５Ｄ】ピルビン酸処置によって回復される月齢に伴うピルビン酸レベルの低下を示す図である。Ｄ２マウスは、６ヵ月齢から正常飲料水中の５００ｍｇ／ｋｇ／日のピルビン酸で処置された。
【図５Ｅ】Ｄ２網膜におけるＮＡＭ処置（５５０ｍｇ／ｋｇ／日）又はＷｌｄＳ対立遺伝子の追加によって回復される、年齢に伴う全ＮＡＤ（ＮＡＤ［ｔ］）（即ち、ＮＡＤ＋＋ＮＡＤＨ）の低下を示す図である。ＷｌｄＳ及びＮＡＭの組合せは、更なる利益をもたらす。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、免疫染色によって評価した通り、ＮＡＭ処置（５５０ｍｇ／ｋｇ／日）が、初期の緑内障においてＨＩＦ−１αの上方調節を小さくすることを示す図である（ｎ＝６／群）。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。結果は、ＮＡＭ処置が、Ｄ２緑内障において初期の損傷変化を予防することを実証する。
【図７Ａ】ＲＮＡ−配列決定により、細胞代謝に対する変化、特に、Ｄ２緑内障における脂肪酸代謝遺伝子変化が同定されることを示す図である。点は、個々の遺伝子を表す、灰色又はより明るい点＝差異的に発現しなかった、赤色又はより暗い点＝ｑ＜０．０５で差異的に発現された。
【図７Ｂ】オイルレッドＯを使用して染色した通り、ＩＯＰ侵襲された高齢Ｄ２眼における網膜内層細胞外脂質滴形成を示す図である。染色は、視神経変性なし（ＮＯＥ）又は重度（ＳＥＶ）両方のＤ２眼に存在した。外眼性脂肪を、陽性対照として使用した（ｎ＝６／群）。スケールバー＝２５μｍ。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、γＨ２ＡＸ染色によって評価したＤＮＡ損傷のレベル増加を示す図である（ｎ＝６／群）。結果を、γＨ２ＡＸ染色最大強度（ＡＵ）の棒グラフとして表す。＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、ＮＡＭが、緑内障においてＰＡＲＰ活性化を予防することを示す図である。ＰＡＲＰは、ＮＡＤ＋の主要な消費体であり、年齢に伴うＲＧＣにおけるＮＡＤ（ｔ）低下の一因になり得る。ＮＡＭの投与（５５０ｍｇ／ｋｇ／日）後に、ＰＡＲＰ発現（総ＰＡＲＰ免疫染色）は、ＮＡＭ処置した網膜において減少する（ｎ＝６／群）。＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。スケールバー＝１５μｍ。
【図１０Ａ】図１０Ａ（ＩＯＰプロファイル）は、保護的戦略が、処置された眼における臨床疾患の進行／提示を変化させないことを示す。虹彩疾患は、同じ時間枠内で、全ての群において、類似の速度で進行し、重度の状態に達した。ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日。ＮＡＭＨｉ＝２０００ｍｇ／ｋｇ／日。Ｎｍｎａｔ１＝外来性Ｎｍｎａｔ１を（ウイルスベクターで）発現させることによる遺伝子治療。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ（ＩＯＰ上昇虹彩疾患の臨床所見）は、保護的戦略が、処置された眼における臨床疾患の進行／提示を変化させないことを示す。虹彩疾患は、同じ時間枠内で、全ての群において、類似の速度で進行し、重度の状態に達した。ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日。ＮＡＭＨｉ＝２０００ｍｇ／ｋｇ／日。Ｎｍｎａｔ１＝外来性Ｎｍｎａｔ１を（ウイルスベクターで）発現させることによる遺伝子治療。
【図１０Ｃ】図１０Ｃ（ＩＯＰプロファイル）は、保護的戦略が、処置された眼における臨床疾患の進行／提示を変化させないことを示す。虹彩疾患は、同じ時間枠内で、全ての群において、類似の速度で進行し、重度の状態に達した。ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日。ＮＡＭＨｉ＝２０００ｍｇ／ｋｇ／日。Ｎｍｎａｔ１＝外来性Ｎｍｎａｔ１を（ウイルスベクターで）発現させることによる遺伝子治療。
【図１０Ｄ】図１０Ｄ（ＩＯＰ上昇虹彩疾患の臨床所見）は、保護的戦略が、処置された眼における臨床疾患の進行／提示を変化させないことを示す。虹彩疾患は、同じ時間枠内で、全ての群において、類似の速度で進行し、重度の状態に達した。ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日。ＮＡＭＨｉ＝２０００ｍｇ／ｋｇ／日。Ｎｍｎａｔ１＝外来性Ｎｍｎａｔ１を（ウイルスベクターで）発現させることによる遺伝子治療。
【図１１Ａ】ＮＡＭが視神経変性から保護することを示す図である。緑又はバーの下部＝緑内障でない又は初期の緑内障（ＮＯＥ）（神経損傷のない段階）、黄色又はバーの中間部＝中等度の損傷（ＭＯＤ）、赤又はバーの上部＝重度損傷（ＳＥＶ）。フィッシャーの正確確率検定：＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日。ＮＡＭＨｉ＝２０００ｍｇ／ｋｇ／日。初期開始＝処置を、６ヵ月齢で開始する（ほとんど全ての眼においてＩＯＰの上昇前）。後期開始−処置を、９ヵ月齢で開始する（ＩＯＰの上昇の発病後；この時点において大多数の眼にＩＯＰの上昇がある又はあった）。
【図１１Ｂ】１２ヵ月齢においてニコチンアミドが、Ｄ２緑内障の視神経変性に対する保護をもたらすことを示す図である。グラフは、検出可能な緑内障なし（ＮＯＥ；バーの下部）、中等度緑内障の損傷（ＭＯＤ；バーの中間部）、又は重度緑内障の損傷（ＳＥＶ；バーの上部）である神経のパーセンテージを示す。左から、ＤＢＡ／２Ｊ対照−標準飲料水によるＤ２マウス；ニコチンアミド（ＮＡＭＬｏ）初期開始−６ヵ月齢（疾患前）からＮＡＭ  ５５０ｍｇ／ｋｇ／日で補充した標準飲料水によるＤ２マウス；ニコチンアミド（ＮＡＭＬｏ）後期開始−９ヵ月齢（疾患中）からＮＡＭ  ５５０ｍｇ／ｋｇ／日で補充した標準飲料水によるＤ２マウス；ニコチンアミド（ＮＡＭＨｉ）初期開始−６ヵ月齢（疾患前）からＮＡＭ  ２０００ｍｇ／ｋｇ／日で補充した標準飲料水によるＤ２マウス；ピルビン酸−６ヵ月齢（ＩＯＰの上昇前）からピルビン酸５００ｍｇ／ｋｇ／日で補充した標準飲料水によるＤ２マウス；ＮＡＭＬｏ＋ピルビン酸−６ヵ月齢（疾患前）からＮＡＭ  ５５０ｍｇ／ｋｇ／日＋ピルビン酸５００ｍｇ／ｋｇ／日で補充した標準飲料水によるＤ２マウス；Ｄ２．ＷｌｄＳ−標準飲料水によるＷｌｄＳ導入遺伝子（酵素活性を増強する改変されたＮＭＮＡＴ酵素）を保有するＤ２マウス；Ｄ２．ＷｌｄＳ＋ニコチンアミド（ＮＡＭＬｏ）−６ヵ月齢（ＩＯＰの上昇前）からＮＡＭ  ５５０ｍｇ／ｋｇ／日を含む標準飲料水によるＷｌｄＳ導入遺伝子（改変されたＮＭＮＡＴ酵素）を保有するＤ２マウス。緑内障の神経変性を介入的に処置することに加えて、ＮＡＭはまた、緑内障の神経変性に対する予防的保護をもたらす点に留意すべきである。
【図１２Ａ】ＮＡＭ及びピルビン酸が、ＲＧＣ神経細胞体喪失（ｎ＝８／群）、網膜ＮＦＬ及びＩＰＬ薄層化（ｎ＝８／群）、視神経変性（ｎ＞５０／群）並びに順行性軸索原形質輸送の喪失（ｎ＝２０／群）から保護することを示す図である。対応するマーカー及び色分けは、各列の下にある。スケールバー：ＲＢＰＭＳ＝２０μｍ、Ｎｉｓｓｌ＝２０μｍ、ＰＰＤ＝２０μｍ、ＣＴ−β＝１００μｍ（網膜）、２００μｍ（ＬＧＮ、Ｓｕｐ．Ｃｏｌ．）。ＯＮＨ＝視神経頭、ＬＧＮ＝外側膝状核、Ｓｕｐ．Ｃｏｌ．＝上丘。白色星印は、ＯＮＨの部位における軸索輸送の喪失を意味する。
【図１２Ｂ】ＮＡＭ及びピルビン酸処置Ｄ２マウスにおける軸索輸送の回復を示す図である。軸索輸送の喪失は、緑内障に顕著な特徴であり、ニューロン健全性の測定基準として使用することができる。蛍光標識されたコレラ毒素（Ｃｔ−Ｂ；緑色）を使用して、網膜神経節細胞の眼部分から細胞の終末端（脳）への軸索輸送を、可視化することができる。最上列：Ｄ２．Ｇｐｎｍｂ（ｗｔ）マウスは、網膜から脳内の視覚中枢（ＬＧＮ；外側膝状核、Ｓｕｐ．ｃｏｌ．；上丘）への正常で、完全な軸索輸送を有する。第２列：Ｄ２マウスは、視神経内で停止している不完全な軸索輸送を有する（白色星印）。標識化が、脳の視覚中枢に存在しない。第３及び第４列：ＮＡＭ処置（第３列）又はピルビン酸処置（第４列）は、軸索輸送喪失を予防する。
【図１３Ａ】ＮＡＭが、ＲＧＣ神経細胞体喪失から保護することを示す図である（ｎ＝８／群、Ｄ２とＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋の間の密度下落は、圧力が伸張を誘導するためである）。＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図１３Ｂ】ＮＡＭＬｏ（５５０ｍｇ／ｋｇ／日）及びピルビン酸（５００ｍｇ／ｋｇ／日）が、ＲＧＣ神経細胞体喪失を予防することを示す図である（ＲＧＣの特異的マーカー；ＲＢＭＰＳを使用する）。
【図１４】ＮＡＭ（ＮＡＭＬｏ及びＮＡＭＨｉ）、ピルビン酸（５００ｍｇ／ｋｇ／日）、ＷｌｄＳ及びそれらの組合せの全てが、ＰＥＲＧ（パターン網膜電図）振幅を使用する視覚機能試験（ｎ＞２０／群）に基づく初期の視覚機能喪失からＤ２マウスを保護することを示す図である。ＰＥＲＧは、非常に高感度であり、緑内障の初期の評価基準である、従ってＮＡＭ又はピルビン酸処置は、緑内障の非常に初期の段階さえも予防する。ＮＡＭＬｏ＋ピルビン酸の併用及びＮＡＭＬｏ＋ＷｌｄＳの併用は両方とも、ＰＥＲＧ振幅の更なる回復を示す。ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日。ＮＡＭＨｉ＝２０００ｍｇ／ｋｇ／日。
【図１５】ＮＡＭＬｏ（５５０ｍｇ／ｋｇ／日）及びピルビン酸（５００ｍｇ／ｋｇ／日）が、高齢マウスにおいてもＰＥＲＧを保護することを示す図である。６ヵ月及び１２ヵ月Ｄ２並びに１２ヵ月ＮＡＭＬｏ処置マウス（５５０ｍｇ／ｋｇ／日）からの例図を示す。１２ヵ月ピルビン酸処置マウス及びＮＡＭＬｏ処置ＷｌｄＳマウスの結果も示す。
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、ＳＮＡＰ−２５染色によって評価した通り、ＮＡＭＬｏ−処置（５５０ｍｇ／ｋｇ／日）が、初期の緑内障においてシナプス喪失を予防することを示す図である（ｎ＝６／群）。＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。スケールバー＝２５μｍ。
【図１７Ａ】図１７Ａ及び１７Ｂは、ＮＡＭ（ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日）が、図４Ａ及び４Ｂに示す樹状突起のミトコンドリアにおける初期のミトコンドリア機能不全を予防することを示す図である。これらのデータは、ＰＥＲＧに対する初期の変化及び９ヵ月のＤ２網膜において以前に報告されているシナプス喪失と符合する。従って、ＩＯＰの上昇に誘導されるミトコンドリア機能不全は、初期の神経変性変化を駆動し得る。＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。ｎｓ＝統計的に有意でない。スケールバー＝３５０ｎｍ。
【図１７Ｂ】図１７Ａ及び１７Ｂは、ＮＡＭ（ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日）が、図４Ａ及び４Ｂに示す樹状突起のミトコンドリアにおける初期のミトコンドリア機能不全を予防することを示す図である。これらのデータは、ＰＥＲＧに対する初期の変化及び９ヵ月のＤ２網膜において以前に報告されているシナプス喪失と符合する。従って、ＩＯＰの上昇に誘導されるミトコンドリア機能不全は、初期の神経変性変化を駆動し得る。＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。ｎｓ＝統計的に有意でない。スケールバー＝３５０ｎｍ。
【図１８】ＮＡＭ処置（５５０ｍｇ／ｋｇ／日）が、網膜内層における脂質滴形成を予防する（１２ヵ月；図７Ｂのように）ことを示す図である。スケールバー＝２５μｍ。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、γＨ２ＡＸ染色によって評価された通り、ＮＡＭ処置（ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日）が、初期の緑内障においてＤＮＡ損傷を予防することを示す図である（ｎ＝６／群）。＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。スケールバー＝２５μｍ。
【図２０Ａ】代謝及びＤＮＡ損傷経路を示す個々の遺伝子発現プロットが、ＮＡＭ処置ＲＧＣＳにおいて正常に戻ることを表す図である。点は、個々の遺伝子を表す、Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋対照と比較して、灰色又はより明るい点＝差異的に発現しなかった、赤色又はより暗い点＝ｑ＜０．０５で差異的に発現された。
【図２０Ｂ】ＮＡＭ処置ＲＣＧが、対照と分子的に類似していることを示す遺伝子発現（発現されている全遺伝子）のヒートマップである。
【図２１Ａ】ＮＡＭ処置ＲＣＧが、若齢及び同月齢両方の緑内障ではない対照ＲＣＧと分子的に類似していることを示す図である。（スピアマンのρ）。丸＝Ｄ２  ＲＧＣ由来サンプル、三角形＝Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋ＲＧＣ由来サンプル、正方形＝ＮＡＭ処置（ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日）ＲＧＣ由来サンプル。従って、ＮＡＭ処置は、疾患及び老人性分子変化を予防する。
【図２１Ｂ】対照Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋群と比較して、Ｄ２群（群１、群２、群３及び群４）で差異的に発現される遺伝子の数を要約する図である。
【図２１Ｃ】図２１Ｃ及び２１Ｆは、ＮＡＭ−処置（ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日）が、９ヵ月のＤ２  ＲＧＣに見られるトランスクリプトーム不均衡及びＯＸＰＨＯＳ不均衡（ミトコンドリア：核ライブラリサイズ比）を予防することを示す図である。図２１Ｆにおいて、赤色＝最も高い発現、青色＝最も低い発現。Ｉ〜Ｖ＝ミトコンドリア複合体Ｉ〜Ｖ（表１に作表される）、Ｇ＝Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋、１〜４＝Ｄ２群１〜４、Ｎ＝ＮＡＭ。
【図２１Ｄ】Ｄ２マウスは、６ヵ月齢から正常飲料水中の５５０ｍｇ／ｋｇ／日ニコチンアミドで処置された（老齢ＮＡＭ）。ＮＡＭ処置マウス由来の網膜神経節細胞のＲＮＡ−ｓｅｑは、ＮＡＭが、月齢及び疾患に関連する遺伝子発現変化を予防することを示す。ＮＡＭ処置網膜神経節細胞は、同月齢の対照（老齢対照）よりも若齢対照（若齢対照）と最も類似している。これは、ＮＡＭが、月齢依存的な分子変化を予防することを示す。
【図２１Ｅ】全てのサンプルのヒートマップ相関を示す図である（スピアマンのρ、青色＝最も高い相関、赤色＝最も低い相関）。図２１Ａのデンドログラムを灰色で示す。
【図２１Ｆ】図２１Ｃ及び２１Ｆは、ＮＡＭ−処置（ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日）が、９ヵ月のＤ２  ＲＧＣに見られるトランスクリプトーム不均衡及びＯＸＰＨＯＳ不均衡（ミトコンドリア：核ライブラリサイズ比）を予防することを示す図である。図２１Ｆにおいて、赤色＝最も高い発現、青色＝最も低い発現。Ｉ〜Ｖ＝ミトコンドリア複合体Ｉ〜Ｖ（表１に作表される）、Ｇ＝Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋、１〜４＝Ｄ２群１〜４、Ｎ＝ＮＡＭ。
【図２２Ａ】図２２Ａは、ＮＡＭが、緑内障の侵襲をモデル化する神経変性処置に対して保護的であることを示す図である。ＮＡＭは、死（図２２Ａ）及びプレアポトーシス核収縮（図２２Ｂ）から神経細胞層細胞（ＧＣＬ細胞）を保護する魅力的な用量反応効果を示した。網膜神経節細胞損傷の軸索切断培養モデルにおいて、ニコチンアミド（ＮＡＭ）の添加は、用量依存的な様式の細胞収縮（細胞アポトーシス及び機能不全の徴候）に対する保護をもたらす（軸索切断５日後）。５日間異なる濃度のＮＡＭに曝露したＤ２マウス網膜のＤＡＰＩ標識核の平均核直径を測定した（０日目対照［正常網膜］、処置なし［軸索切断５日後］、１００ｍＭ及び５００ｍＭ  ＮＡＭ［軸索切断５日後］を含む）。ＮＡＭ処置網膜は、無傷の、ベースライン対照（０日目）と区別できなかった。β−ＮＡＤ及びβ−ＮＭＮで網膜を処置する有意な保護的効果も存在した（ｎ＝８網膜／群）。＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。スケールバー＝２０μｍ。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ＮＡＭが、緑内障の侵襲をモデル化する神経変性処置に対して保護的であることを示す図である。ＮＡＭは、死（図２２Ａ）及びプレアポトーシス核収縮（図２２Ｂ）から神経細胞層細胞（ＧＣＬ細胞）を保護する魅力的な用量反応効果を示した。網膜神経節細胞損傷の軸索切断培養モデルにおいて、ニコチンアミド（ＮＡＭ）の添加は、用量依存的な様式の細胞収縮（細胞アポトーシス及び機能不全の徴候）に対する保護をもたらす（軸索切断５日後）。５日間異なる濃度のＮＡＭに曝露したＤ２マウス網膜のＤＡＰＩ標識核の平均核直径を測定した（０日目対照［正常網膜］、処置なし［軸索切断５日後］、１００ｍＭ及び５００ｍＭ  ＮＡＭ［軸索切断５日後］を含む）。ＮＡＭ処置網膜は、無傷の、ベースライン対照（０日目）と区別できなかった。β−ＮＡＤ及びβ−ＮＭＮで網膜を処置する有意な保護的効果も存在した（ｎ＝８網膜／群）。＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。スケールバー＝２０μｍ。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｃは、ＮＡＭ（ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日）が、ＴＮＦα投与後１２週においてＴＮＦα注射された眼のＰＥＲＧ（図２３Ａ）及び神経細胞体喪失（図２３Ｂ及び２３Ｃ）を予防することを示す図である（ｎ＝２０／群）。＊＝Ｐ＜０．０５。ｎｓ＝統計的に有意でない。スケールバー＝２０μｍ。
【図２４−１】図２４Ａ及び２４Ｂは、遺伝子治療が、緑内障の神経変性から強く保護することを示す図である。Ｄ２眼は、ＣＭＶプロモーター下でマウスＮｍｎａｔ１を過剰発現させるためのプラスミドを保有するＡＡＶ２．２ウイルスベクターで５．５ヵ月に硝子体内に注射された。図２４Ａは、図１２Ａにおいて実証された通り、Ｎｍｎａｔ１過剰発現がＲＧＣ神経細胞体喪失及び順行性軸索原形質輸送の喪失を予防することを示す（ｎ＝１０／群）。スケールバーは、図２４Ａにおいて５０μｍであり、図２４Ｂにおいて１００μｍである。
【図２４−２】図２４Ｃ及び２４Ｄは、Ｎｍｎａｔ１遺伝子治療も、視神経変性（ｎ＞４０／群）（図２４Ｃ）、神経細胞体喪失（ｎ＝８／群）（図２４Ｄ、上パネル）、及びＰＥＲＧ振幅（ｎ＞２０／群）（図２４Ｄ、下パネル）に対してＩＯＰの上昇があるＤ２眼を保護することを示す図である。飲料水中のＮＡＭの添加（ＮＡＭＬｏ＝５５０ｍｇ／ｋｇ／日）は、視神経変性の更なる保護をもたらした（Ｎｍｎａｔ１＋ＮＡＭＬｏと比較したＮｍｎａｔ１＝Ｐ＜０．００１、フィッシャーの正確確率検定）（図２４Ｃ）。＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図２５】ＮＡＭ及びＮＭＮＡＴ１／ＷＬＤＳによるＮＡＤ再生経路を示す図である。
【図２６】図２６Ａ及び２６Ｂは、ＰＱＱで処置した軸索切断された網膜において、ＰＱＱ投与が核直径収縮（図２６Ａ）及び細胞密度の低下（図２６Ｂ）を予防することを示す図である。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｈは、ＦＡＣＳソートＲＧＣを示す図である。網膜サンプルを、抗体カクテルで染色した（材料及び方法を参照のこと）。図２７Ａは、生細胞（図２７Ｄ）を同定するためにゲートされた前方及び側方散乱（図２７Ｂ及び２７Ｃ）を示す。ＲＧＣは、ゲートされたＴｈｙ１．２＋事象（Ｃｄ１１ｂ−、Ｃｄ１１ｃ−、Ｃｄ３１−、Ｃｄ３４−、Ｃｄ４５．２−、ＧＦＡＰ−、ＤＡＰＩ−）として同定された。Ｃｄ１１ｂ、Ｃｄ４５及びＴｈｙ１．２プロットだけを示す（図２７Ｅ〜２７Ｇ）。図２７Ｈにおいて、ＦＡＣＳ陽性ＲＣＧを平板培養し、ＳＮＡＰ−２５及びβ−チューブリンで染色して、ＲＧＣの状態を確認した。スケールバー＝２５μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
定義
この出願に使用される用語は、以下の意味を持つものとする。
本明細書では、用語「緑内障」とは、網膜及び視神経に対する損傷及び視覚機能不全又は視力喪失をもたらす眼疾患のことを指す。緑内障は、老人の間で広く一般に起こる。緑内障による視力喪失は、恒久的であり、不可逆的である。
【００４３】
本明細書では、用語「その処置を必要とする対象／患者」とは、特定の神経変性疾患若しくは病態、特に緑内障を含めた眼神経変性に悩まされている又はそのような処置を必要と単に感じている人間と一般に理解される。
【００４４】
本明細書では、用語「緑内障」は、原発性開放隅角緑内障、二次性開放隅角緑内障、正常眼圧緑内障、過分泌緑内障、原発性閉寒隅角緑内障、二次性閉寒隅角緑内障、プラトー虹彩緑内障、色素性緑内障、混合型緑内障、発育異常緑内障、ステロイド緑内障、落屑緑内障、アミロイド緑内障、血管新生緑内障、悪性緑内障、水晶体嚢緑内障、プラトー虹彩症候群、等を包含する。
【００４５】
本明細書では、ヒトにおいて用語「正常眼内圧（「正常「ＩＯＰ」）とは、ＩＯＰ値１０ｍｍＨｇ〜２１ｍｍＨｇを有するヒト対象のことを指す。しかしながら、一部の患者は、正常ＩＯＰにもかかわらず、視神経損傷を発症することがある（正常眼圧緑内障として公知である）。
【００４６】
本明細書では、ヒトにおいて用語「高眼内圧」（高ＩＯＰ）とは、２１ｍｍＨｇ（又は、２．８ｋＰａ）を超えるＩＯＰ値を有するヒト対象のことを指す。高ＩＯＰは、緑内障の危険因子になることが公知である。しかしながら、一部の患者は、長年の間高ＩＯＰであり、視神経損傷を全く発症しない場合もある。
【００４７】
本明細書では、用語「神経保護的」又は「神経保護」とは、眼神経（例えば、視神経）、中枢又は末梢神経系におけるニューロン、そのシナプス、樹状突起、神経細胞体又は軸索を損傷（機能的な機能不全を含む）若しくは死から保護する、又はニューロン損傷若しくは死の発病を遅延させる、又はニューロンの集団の中のニューロン損傷の重症度／死の範囲を軽減する能力のことを指す。
【００４８】
本明細書では、用語「予防する」又は「予防」とは、例えば、一般的又は特に眼神経変性疾患（例えば、緑内障）におけるニューロン損傷若しくは死に関して、好ましくはそのような損傷、死若しくは疾患が起こる前に神経保護を与える本発明の化合物又は薬剤の能力のことを指す。従って、緑内障の予防は、緑内障の発症を回避する、緑内障を最終的に発症する危険性若しくは可能性を減少させる、緑内障の発病若しくは進行を遅延させる、又は緑内障を最終的に発症するはずのニューロンの集団の中のニューロン損傷の重症度／ニューロン死／喪失の範囲を減少させることを含む。
【００４９】
本明細書では、用語「処置する」又は「処置」は、対象に本発明の化合物若しくは薬剤を投与して、緑内障などの神経変性と関連する症状若しくは病態の発症を軽減する、抑える又は阻害することを含む。
【００５０】
本明細書では、「視力又は視覚機能を改善する」とは、そのような化合物若しくは薬剤を投与されていない対照対象と比較して、そのような化合物若しくは薬剤を投与された対象において視力又は視覚機能（視野試験又はＲＧＣのパターン網膜電図［ＰＥＲＧ］振幅など）を改善する本発明の化合物若しくは薬剤の効果のことを指す。
【００５１】
本明細書では、用語「治療有効量」は、対象に投与された場合に、それが投与される効果を生じる量を意味する。例えば、神経変性を阻害するために対象に投与された場合、「治療有効量」は、ＩＯＰ上昇を減少させ、及び／又はＲＧＣ機能を改善する（例えば、ＲＧＣ機能が悪化することを予防する）。
【００５２】
本明細書では、用語「対象」又は「患者」は互換的に使用され、齧歯動物、イヌ及びヒトなどの哺乳動物のことを指す。従って、本明細書では用語「対象」又は「患者」は、本発明の化合物を投与できる任意の哺乳動物の患者又は対象（例えば、ヒト）を意味する。
【００５３】
本明細書では、用語「医薬品」又は「医薬組成物」とは、疾患を処置、治癒若しくは改善する又は疾患の症状を処置、改善若しくは軽減するのに使用する医薬製剤のことを指す。
【００５４】
本明細書では、用語「発現ベクター」とは、そのような配列と適合する細胞に含有される遺伝子／核酸分子の発現を実行できる核酸分子のことを指す。発現ベクターは、少なくとも適切なプロモーター配列及び任意選択で転写終結シグナルを一般に含む。
【００５５】
以下の省略形が使用される：
ＮＡＭ−ニコチンアミド
ＮＡＭＰＴ−ニコチンアミドホスホリボシル転移酵素
ＮＭＮ又はβＮＭＮ−ニコチンアミドモノヌクレオチド
ＮＭＮＡＴ−ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリル転移酵素
ＮＡＤ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ＮａＭＮ−ニコチン酸モノヌクレオチド
ＮＲ−ニコチンアミドリボース配糖体
概要
本発明は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に対する最高水準の分子技術（ＲＮＡ配列決定；ＲＮＡ−ｓｅｑ）の使用に主に基づき、これは、検出可能な神経変性の前に起こるミトコンドリア異常が、ニューロン機能不全の初期の駆動体であるという発見につながった。ＤＢＡ／２Ｊ（Ｄ２）マウスモデル（慢性老人性、遺伝性緑内障）を使用して、本発明者らは、大部分の緑内障にとって鍵となる危険因子である加齢とＲＧＣにおけるニューロン変性の駆動における高ＩＯＰとの関係を更に明らかにした。
【００５６】
本発明者らは、網膜に治療的レベルのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を送達して、レベルが下降したＮＡＤ＋を補充する方法を開発した。本発明の特定の医薬組成物（例えば、ＮＡＭ及び／又はピルビン酸）の投与は、眼神経変性及び緑内障の処置における新規の手法となる。本治療方法は、老化ニューロンが疾患関連侵襲の影響を受けやすい場所の減少を含めた他の神経変性の処置に有用であり得る。
【００５７】
一態様において、本発明は、年齢依存的な神経変性を処置又は予防するため、例えば緑内障を処置又は予防するために標的した医薬組成物の治療上の使用を提供する。
特定の実施形態において、医薬組成物は、緑内障、好ましくは原発性開放隅角緑内障、正常眼圧緑内障及び原発性閉寒隅角緑内障を処置又は予防するのに有効である。特定の実施形態において、本発明の医薬製剤は、原発性開放隅角緑内障を処置又は予防するのに特に有効である。
【００５８】
特定の実施形態において、方法は神経変性障害（例えば、緑内障）の処置／予防を必要とする対象にニコチンアミド（ＮＡＭ）の治療有効量を投与する工程を含む。
特定の実施形態において、対象はピルビン酸と組み合わせてＮＡＭを投与される。ＮＡＭ及び／又はピルビン酸が、ＮＡＤｔ（ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨの総レベル）の細胞内レベルを増加させ、従って対象において神経変性障害を処置又は予防すると考えられる。
【００５９】
一態様において、本発明は、細胞内ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを増加させて、神経変性を予防し、それによって緑内障を処置するための遺伝子送達の治療上の使用を提供する。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明は、遺伝子治療（例えば、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ１［Ｎｍｎａｔ１］）の駆動発現）の方法を提供する。Ｎｍｎａｔ１タンパク質の発現が、非常に保護的であり、ＮＡＭと相乗的に作用する（即ち、眼の８４％に緑内障の神経変性がない）事が判明した。
【００６１】
本発明の利点は、緑内障を発症する危険因子を減少させることである。  本研究は、ＮＡＭ単独又は他の薬剤（ピルビン酸など）との組み合わせが、緑内障に対する危険因子を減少させることを明らかに示している。１２ヵ月齢の対照Ｄ２マウスにおいて、神経の約６０％は、重度の緑内障がある。これは、緑内障を発症する危険因子０．６に相当する。低用量ＮＡＭ投与（マウスに５５０ｍｇ／ｋｇ／日）の後、この危険因子は０．３６（危険因子においておよそ２分の１への下落）、又は高用量ＮＡＭ（マウスに２０００ｍｇ／ｋｇ／日）が投与される場合０．０６（危険因子において１０分の１への減少）まで減少した。
【００６２】
本発明の利点は、ＮＡＭと遺伝子治療の投与との相乗効果である（例えば、ＮＭＮＡＴ１遺伝子治療）。単独で危険因子を０．２９（危険因子においておよそ２分の１への減少）に減少させる遺伝子治療と比較して、ＮＡＭと組み合わせる遺伝子治療は、危険因子を０．１６（危険因子においておよそ４分の１への減少）に減少させる。従って、ＮＡＭと遺伝子治療の組み合わせは、ＩＯＰの上昇後に緑内障を発症する危険因子を相乗的に減少させる。
【００６３】
ＮＡＭ（単独又はピルビン酸など他の薬剤との組み合わせ）に関する保護的効果の本発見は、予想外である。本発見は、ＮＡＭには保護的効果がないと述べる‘３２６特許に報告されているそれと著しく対照的である。
【００６４】
少なくとも以下の理由で異なる所見の基礎が得られる。第１の理由は、‘３２６特許権者が、ｉｎ  ｖｉｖｏ効果、特に緑内障などの眼性関連疾患との関連性がほとんどない実験系を使用したということである。それらの実験において、‘３２６特許権者は、脊髄後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを単離し、その神経炎を切断することによって神経損傷を誘導した。機械的切断をＤＲＧニューロン細胞体の非常に近くに起こしたこの人工培養によって誘導された神経傷害は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの神経変性にほとんど似ていない。緑内障における初期の軸索損傷は、ＤＲＧ神経炎よりも、神経細胞体から大きく離れた距離で起こると認識されている。第２の理由は、‘３２６特許権者の培養系が、緑内障の神経変性と大いに関連するニューロンである網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を使用しなかったことである。第３の理由は、‘３２６特許権者が、完全な神経組織（それは、互いに通信し、支持し合う様々な細胞型で構成される）の代わりに人工細胞系を使用したことである。
【００６５】
最後に、‘３２６特許権者は、ｉｎ  ｖｉｖｏの完全な視神経横断面モデルに言及しており、そのモデルにおいて神経（その周囲の鞘を含む）は機械的に切断されている。これは、神経に急激に損傷を与え、軸索がある局所的環境を実質的に改変し、その改変は、１４日以内に９０％超の網膜神経節細胞の死の原因になる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２１６１０６７３を参照のこと）。侵襲が、神経上の正しい場所にあるにもかかわらず、緑内障の事例がない。全体として、‘３２６特許権者に採用された手法は、ヒト緑内障を再現しない網膜神経節細胞を破壊する非常に人工的で、急激な方法である。興味深いことに、その視神経横断面実験において、‘３２６特許権者は、化合物（ＮＡＭを含む）を硝子体内に注射して眼におけるＮＡＤの産生を駆動し、‘３２６特許権者は、このモデルにおいてＮＡＭがＲＧＣの軸索変性に対して保護的でないと明確に結論した。
【００６６】
この全てが、特に関連するものである。本発明者らの培養実験は、他の網膜細胞型に対して正常な関係にある網膜神経節細胞を含む完全な網膜組織を使用し、網膜神経節細胞軸索を緑内障において損傷が起こるのと同じ場所で切断したので、緑内障との関連性がより高い。緑内障における損傷は、ＲＧＣ軸索が、眼から出て、視神経になる視神経頭における真の軸索において起こると考えられる。
【００６７】
それに対し、本出願に提示されるデータは、緑内障におけるＮＡＭの神経保護的効果を明らかに示した。単独又は他の薬剤（例えば、ピルビン酸）と組み合わせるＮＡＭの本使用は、緑内障などの眼性関連疾患において神経保護的効果をもたらす。本出願において、神経保護的効果は、以下のパラメータの少なくとも１つによって証明される：（ｉ）神経細胞体喪失の予防（ＲＢＰＭＳ染色）；（ｉｉ）網膜薄層化及び神経線維層喪失の予防（Ｎｉｓｓｌ染色）；（ｉｉｉ）視神経変性及び軸索喪失の予防（ＰＰＤ染色）；（ｉｖ）順行性軸索原形質輸送の喪失の予防（Ｃｔ−Ｂ染色）；（ｖ）視覚機能の喪失の予防（ＰＥＲＧ）；（ｖｉ）異常なミトコンドリアクリステの予防（ＥＭ）；（ｖｉｉ）脂肪小滴の減少（オイルレッドＯ染色）；及び（ｖｉｉｉ）ＰＡＲＰ活性化の減少（ＰＡＲＰ染色）。
【００６８】
本発明者らは：（ｉ）ＨＩＦ−１α活性化の減少（ＨＩＦ−１α染色）；（ｉｉ）シナプス喪失の減少（ＳＮＡＰ−２５染色）；（ｉｉｉ）ミトコンドリアに対する核の転写産物存在量の回復（ＲＮＡ−ｓｅｑ）；及び（ｉｖ）老人性分子／遺伝子変化の予防（ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって明示されるように、単独又は他の薬剤（例えば、ピルビン酸）と組み合わせるＮＡＭの使用が、細胞内事象に影響を及ぼして、神経保護的効果を提供するということを更に発見した。
【００６９】
本発明の別の利点は、ＮＡＭの併用使用及びＮＡＤ送達における遺伝子治療である。遺伝子治療手法は、多くの臨床研究が示したことによって証明された通り、少なくとも３〜５年間持続すると考えられる。遺伝子治療は、緑内障並びにＩＯＰを低減することにおいてＮＡＭ及び／又はピルビン酸との相乗作用的な神経保護的効果をもたらす。
【００７０】
上で発明について一般的に説明したが、以下の節は、本発明の更なる態様のためのより詳細な説明を提供する。
ＤＢＡ／２Ｊマウスモデル
本発明者らは、ＤＢＡ／２Ｊ（Ｄ２）マウスモデルがヒト緑内障をよく模倣する遺伝性老人性緑内障を発症するので、このマウス系統の使用を選択した。Ｄ２マウスは、ヒト緑内障に起こるのと同じ疾患媒介分子（例えば補体成分分子）、視神経頭において鍵となる緑内障侵襲の同じ部位、及びＲＧＣ死の同じ局所解剖学的パターンの誘導を含め、ヒト緑内障との類似点が多く確立されている最も研究されている緑内障モデルの１つである。Ｄ２マウスは、約６〜８ヵ月齢で開始する虹彩疾患及び高い眼内圧を有する。９ヵ月齢まで、高い眼圧は、大部分のＤ２マウスの眼において持続中であった。Ｄ２マウスは、進行性の視力喪失、視神経損傷及び網膜内層機能不全をその後有する。１２ヵ月齢で、設計された実験が通常どおりに終わったとき、Ｄ２マウス眼のおよそ７０％が、網膜及び視神経の組織学検査に基づく重度疾患を有する。緑内障。化合物（例えば、メマンチン、チモロール又はラタノプロスト）の局所投与は、ヒト緑内障においてするのと同様に、Ｄ２マウスにおいてＩＯＰを低減し、神経変性を発症する危険性を減少させる。対照Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋は、緑内障を発症しない月齢及び系統が同じマウスである。
【００７１】
緑内障における眼圧
眼内圧（ＩＯＰ）は、例えば、ゴールドマン圧平眼圧測定（Ｈａａｇ  Ｓｔｒｅｉｔ、Ｂｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して決定することができる。ヒトにおいて、正常ＩＯＰは、１２〜２１ｍｍＨｇである。２１ｍｍＨｇを超えるＩＯＰは、高いと見なされる。ＩＯＰの上昇は、緑内障における主要な危険因子である。ＰＯＡＧ（原発性開放隅角緑内障、事例の９０％超を占める最も一般的な緑内障）である緑内障では、２５ｍｍＨｇが、無処置のベースラインＩＯＰ中央値である。
【００７２】
ボルティモア眼研究（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／１２０４９５７４）は、高い危険性＝ＩＯＰ＞２５．７５ｍｍＨｇ；中等度の危険性＝ＩＯＰ  ２３．７５〜２５．７５ｍｍＨｇ；及び低い危険性＝ＩＯＰ＜２３．７５ｍｍＨｇと報告した。２４ｍｍＨｇ以下のレベルにＩＯＰを２０％低減することにより、進行の危険性が５年で９．５％から４．４％に低下する。一方の眼の失明の可能性は、診断後の１０年後で２７％、及び２０年後で３８．１％である。両眼の失明可能性は、それぞれ６％及び１３．５％である。
【００７３】
原発性開放隅角緑内障（primary open agent glaucoma）（ＰＯＡＧ）患者などのヒト緑内障患者において、緑内障は非同期であり、老人性である（通常、４０歳超で起こる）。ＩＯＰが２１〜２５ｍｍＨｇである場合、無処置の緑内障は、初期から後期疾患に進行するのに平均で１４年間かかる。ＩＯＰが増加するにつれて、進行のこの速度は急速に増加する（ＩＯＰ＞３０ｍｍＨｇの場合、初期から後期疾患への進行におよそ３年）。
【００７４】
ヒト患者において、ＩＯＰを低減する処置（外科的又は薬理学的な）は、神経変性を発症する危険性を減少させる。疾患の進行の速度及び失明するパーセンテージ可能性は、診断されていない患者のため、誤って伝えられている可能性が高い。高ＩＯＰは、緑内障を必ずしも示さないと一般に考えられている（１０年後でおよそ３０％、２０年後でおよそ４０％の失明）。ＩＯＰを低減することにより、緑内障は治療されないが、５８％まで危険因子を減少させる。従来通りのＩＯＰ低減予防策にもかかわらず、視力喪失及び更に失明の危険性が今なお存在する。緑内障に利用可能な神経保護的戦略は限られている。緑内障における視力喪失は、不可逆的である。実際のところ、緑内障は、世界の不可逆的失明の主要な事例である。
【００７５】
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は、網膜の出力ニューロンである。それらは、介在ニューロン（即ち、双極細胞及びアマクリン細胞）を経て光受容器（即ち、桿体視細胞及び錐体視細胞）から視覚情報を受ける。この視覚情報は、光中の光子として開始し、網膜神経節細胞シナプスで電位になる。ＲＧＣは、細胞体を残す長い軸索を有し、軸索が眼から出る（視神経頭）視神経円板（即ち、盲点）へと網膜を超えて横断する。視神経頭（ミエリン移行帯）を越えたところで、網膜神経節細胞軸索はミエリン化し、視神経を形成する（即ち、視神経は網膜神経節細胞軸索の束であり、マウスにおいてこれは、系統によりおよそ５００００本である）。視神経中の軸索は、脳内の末端視覚中枢に最終的に到達し、脳は、次いでこれらのシグナルを中継する又はこの情報をそれ自体で処理する。網膜神経節細胞軸索が終わる２つの重要な視覚中枢は、外側膝状核（ＬＧＮ）及び上丘（ｓｕｐ．ｃｏｌ．／ＳＣ）である。
【００７６】
網膜神経節細胞は、緑内障において特に影響を受ける（即ち、細胞消失）。ＲＧＣに対する損傷は、視神経頭の部位の軸索で起こる可能性が高い。異常に高いＩＯＰによって眼に誘導されるストレスのため、視神経頭は、網膜神経節細胞軸索への機械的侵襲が起こり得る眼の「弱点」であると推測される。眼全体に及ぶ圧力は、神経細胞体及び樹状突起にも同様に影響を及ぼすはずなので、軸索は、網膜神経節細胞における侵襲の唯一の点ではない。ＲＧＣ損傷がどのようかという正確な発症機序は、全く明らかでない。
【００７７】
ＤＢＡ／２Ｊ（Ｄ２）マウスにおいて、本発明者らは、ＩＯＰが高い時点で、視神経において検出可能な軸索喪失がない（即ち、眼神経変性がない）ことを示した。驚くべきことに、本発明者らは、初期のミトコンドリア及び分子変化、樹状突起萎縮、並びにシナプス喪失が存在することを発見した。この発見は、ＩＯＰの効果が、視神経における軸索だけではなく網膜神経節細胞の他の区画にも現れることを示唆する。
【００７８】
神経変性処置
特定の実施形態において、薬剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）前駆体（例えば、ニコチン酸、ニコチンアミド［ＮＡＭ］、ニコチンアミドモノヌクレオチド［ＮＭＮ］、ニコチンアミドリボース配糖体［ＮＲ］又はそれらの組合せ）、クレブス回路中間体若しくはその前駆体（例えば、ピルビン酸）、又はそれらの組合せを含む。
【００７９】
特定の実施形態において、薬剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）前駆体、例えば、ニコチン酸、ニコチンアミド（ＮＡＭ）、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボース配糖体又はそれらの組合せを含む。特定の実施形態において、ＮＡＤ＋前駆体は、ニコチンアミド又はニコチンアミドリボース配糖体である。
【００８０】
ニコチン酸（別名ナイアシン、ニコチネート、ビタミンＢ３及びビタミンＰＰ）は、ビタミンである。その対応するアミドは、ニコチンアミド又はナイアシンアミドと呼ばれる。これらのビタミンは、直接相互転換可能ではないが；ニコチネート及びニコチンアミドの両方は、酸化還元対ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及びＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の合成における前駆体である。ニコチネート及びニコチンアミド代謝経路は、ここではＮＡＤ＋合成経路と称することができる。
【００８１】
ＮＡＤ＋は、２つの代謝経路：サルベージ経路及び新生経路によって合成される。サルベージ経路において、ＮＡＤ＋は、前駆体化合物の外部供給源（例えば、ニコチン酸、ニコチンアミド、ニコチンアミドリボース配糖体など）から合成され得る。ＮＡＤ＋は、新生経路においてアミノ酸の代謝の間に産生されるキノリン酸（例えば、トリプトファン、アスパラギン酸など）から合成され得る。
【００８２】
本発明のＮＡＤ＋前駆体は、ニコチン酸、ニコチンアミド、ニコチンアミドリボース配糖体など、並びにその塩及びその類似体を含む。特定の実施形態において、本発明のＮＡＤ＋前駆体の投与は、ＮＡＤｔの細胞内レベルの増加を引き起こす。
【００８３】
特定の実施形態において、薬剤は、クレブス回路中間体若しくはその前駆体、又はそれらの組合せを含む。例えば、クレブス回路中間体又は前駆体は、オキサロ酢酸、アセチルＣｏＡ、クエン酸、ＣｏＡ−ＳＨ、ｃｉｓアコニット酸、Ｄ−イソクエン酸、ＮＡＤ＋、オキサロコハク酸、ＮＡＤＨ、αケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、ＧＤＰ、ユビキノン、コハク酸、フマル酸エステル、Ｌ−リンゴ酸、ピルビン酸、単糖類（グルコース、ガラクトース、フルクトースなど）、二糖類（ショ糖、マルトース、ラクトースなど）又はそれらの組合せである。
【００８４】
従って、本発明は、ニコチン酸及び／若しくはニコチンアミドリボース配糖体並びに／又はニコチンアミド及び／若しくはニコチン酸代謝産物を含む医薬組成物を提供する。ニコチン酸及び／若しくはニコチンアミドリボース配糖体並びに／又はニコチンアミド及び／若しくはニコチン酸代謝産物は、遊離形態で使用することができる。本明細書では要素に関して用語「遊離」は、要素がより大きい分子複合体に組み込まれていないことを示す。いくつかの実施形態において、ニコチン酸は、ナイアシンに含まれ得る。ニコチン酸及び／若しくはニコチンアミドリボース配糖体並びに／又はニコチンアミド及び／若しくはニコチン酸代謝産物は、塩形態であり得る。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記述される組成物のいずれも、塩、誘導体、代謝産物、異化産物、同化産物、前駆体及びその類似体であり得る。例えば、代謝産物には、ニコチニルＣｏＡ、ニコチン尿酸、ニコチネートモノヌクレオチド、ニコチネートアデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドがあり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、ニコチンアミドを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ニコチン酸代謝産物を実質的に含まないことができる。
【００８６】
特定の実施形態において、塩は、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、ギ酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゾアート、炭酸、クエン酸、カルバミン酸、ギ酸、グルコン酸、乳酸、臭化メチル、硫酸メチル、硝酸、リン酸、二リン酸、コハク酸、硫酸及びトリフルオロ酢酸塩からなる群から選択される。
【００８７】
ＮＡＭ／ニコチン酸類似体は、主題の発明においても使用され得る。ニコチン酸の適切な類似体には、例えば、イソニコチンアミド及びＮーメチルニコチンアミドがある。
特定の実施形態において、ＮＡＭのケト、エチル、ベンジル又は他の非塩実施形態を、本発明に使用することもできる。
【００８８】
ＮＡＭ／ニコチンアミド／ＮＡＤ／ＮＲ／ピルビン酸の毒性は低く、比較的大量を毒性効果なしに投与することができる。
マウスにおいて、本化合物（例えば、ＮＡＭ／ニコチンアミド／ＮＡＤ／ＮＲ／ピルビン酸）は、１日の投与量約２００〜１０００のｍｇ／ｋｇ／日で投与して、神経保護的効果を得ることができる。好ましくは、１日の投与量は約４００〜６００ｍｇ／ｋｇ／日である。より好ましくは、１日の投与量は約５５０ｍｇ／ｋｇ／日である。これらの投与量において、本化合物は、神経保護的効果をもたらす。
【００８９】
マウスにおいて、本化合物（例えば、ＮＡＭ／ニコチンアミド／ＮＡＤ／ＮＲ／ピルビン酸）を、約１０００〜５０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与して、ＩＯＰ低減効果を得ることができる。好ましくは、１日の投与量は約１５００〜３０００ｍｇ／ｋｇ／日である。より好ましくは、１日の投与量は約２０００ｍｇ／ｋｇ／日である。これらの投与量において、本化合物は、ＩＯＰ低減効果をもたらす。
【００９０】
ＰＱＱに関しては、マウスにおいて少なくとも２０００ｍｇ／ｋｇ／日で寛容される。ＰＱＱによって得られる神経保護的効果は、マウスにおいて約２０〜２０００ｍｇ／ｋｇ／日、約１００〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日又は約５００ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００９１】
ある種（例えば、マウス）からｍｇ／ｋｇを単位として表される医薬組成物の用量を、別の種（例えば、ヒト）においてｍｇ／ｋｇとして表される等価の表面積用量に変換するために、以下の表は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ、ｒａｔ、ｄｏｇ、ｍｏｎｋｅｙ  ａｎｄ  ｍａｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ．５０（４）：２１９〜２４４頁、１９６６年（参照により本明細書に組み込む）における仮定及び定数に基づいて、変換のためのおおよその係数を提供する。
【００９２】
【表１】
2018535956.tif 000002
【００９３】
従って、マウスにおける用量５５０ｍｇ／ｋｇは、サルにおいて５５０ｍｇ／ｋｇ×１／４＝１３７．５ｍｇ／ｋｇ、及び６０ｋｇのヒトにおいて５５０ｍｇ／ｋｇ×１／１２＝４５．８ｍｇ／ｋｇ（又は、２．８５ｇ）に等価である（ｍｇ／ｍ２に基づいて等価を仮定する）。
【００９４】
上の表において幾分単純化された変換係数は、それぞれの種について表面積に対する体重比［ｋｍ］に基づく。より正確な変換が望ましい場合、投与量変換は、以下に挙げたそれぞれの種のｋｍ係数に基づくこともできる。
【００９５】
【表２】
2018535956.tif 000003
【００９６】
従って、マウスにおける用量５５０ｍｇ／ｋｇは、６０ｋｇのヒト成人における５５０ｍｇ／ｋｇ×３．０／３７＝４４．６ｍｇ／ｋｇ（又は、２．６８ｇ）、及び２０ｋｇのヒト小児における５５０ｍｇ／ｋｇ×３．０／２５＝６６ｍｇ／ｋｇ（又は、１．３２ｇ）に等価である。
【００９７】
上記の表を使用して、適当なｋｍ因子で用量を乗算することにより、任意の所与の種における等価ｍｇ／平方メートル用量としてｍｇ／ｋｇ用量を表すこともできる。例えば、ヒト成人において、１００ｍｇ／ｋｇは、１００ｍｇ／ｋｇ×３７ｋｇ／平方メートル＝３７００ｍｇ／平方メートルに等価である。
【００９８】
ヒト（およそ６０ｋｇの患者）において、本化合物（例えば、ＮＡＭ／ニコチンアミド／ＮＡＤ／ＮＲ／ピルビン酸）を１日の投与量０．５〜１０ｇで投与して、神経保護的効果を得ることができる。好ましくは、１日の投与量は約１〜５ｇ／日である。好ましくは、１日の投与量は約２〜４ｇ／日である。より好ましくは、１日の投与量は約２．５ｇ／日である。これらの投与量において、本化合物は、神経保護的効果をもたらす。
【００９９】
ヒト（およそ６０ｋｇの患者）において、本化合物（例えば、ＮＡＭ／ニコチンアミド／ＮＡＤ／ＮＲ／ピルビン酸）を、１日の投与量約５〜２５ｇ／日で投与して、ＩＯＰ低減効果を得ることができる。好ましくは、１日の投与量は約１０〜２０ｇ／日である。好ましくは、１日の投与量は約８〜１５ｇ／日である。より好ましくは、１日の投与量は約１０ｇ／日である。これらの投与量において、本化合物は、ＩＯＰ低減効果をもたらす。
【０１００】
ヒト（およそ６０ｋｇの患者）において、ＰＱＱを、１日の投与量約２〜１６０ｍｇ／ｋｇ／日、又は約１０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、又は約５０ｍｇ／ｋｇ／日で投与して、神経保護的効果をもたらすことができる。特定の実施形態において、ＰＱＱは、１日におよそ１０ｍｇ〜１０ｇ、１日に約５０ｍｇ〜１ｇ、又は１日に約５００ｍｇの１日の投与量で投与することができる。
【０１０１】
理想的には、典型的な投薬は、１日に１、２又は３回とすることができる。総一日量は、単回で投与されても、又は２若しくは３回に分けた用量として（例えば、各用量が、１日の総量の１／２又は１／３で）投与されてもよい。複数回投薬の場合、各用量は、同一量又は異なる量とすることができる。医薬組成物は、朝又は夕方に投与されてもよい。医薬組成物は、食事の有無にかかわらず服用されてもよい。
神経変性障害を処置するための治療的薬剤
一態様において、本発明は、処置又は予防を必要とする対象において神経変性障害を処置又は予防する方法を提供し、方法が、対象にＮＡＤｔの細胞内レベルを増加させる又はＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＧＳＨ、ＧＳＳＧ、ピルビン酸若しくはＰＱＱの細胞内レベルを増加させる薬剤の治療有効量を投与する工程を含む。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、ＮＡＭ、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ又はβ−ＮＭＮ）、ＮＡＤ、ピルビン酸、ＰＱＱ又はグルタチオンの治療有効量を含む医薬組成物を提供する。
【０１０３】
医薬組成物に使用される薬剤は、緑内障など、そのような神経変性障害を処置又は予防するための神経保護的薬剤である。
多くの異なる型の侵襲又は神経変性疾患又は病態、例えば：低酸素、低血糖症、糖尿病、イオンホメオスタシスの喪失が原因の代謝的ストレス、ニューロンの物理的傷害、毒物への曝露及び遺伝又は非遺伝性神経変性障害を含む神経系に影響を及ぼす多数の疾患は、ニューロンの損傷又は死をもたらし得る。特定の実施形態において、神経変性障害は、軸索変性を含む。特定の実施形態において、神経変性障害は、ワーラー変性又はワーラー様変性を含む。例えば、ワーラー変性は、疾患、外傷又は化学療法薬に起因する傷害などのニューロン傷害に起因する場合がある。
【０１０４】
これが単なる例示的リストであることは言うまでもない。神経保護的薬剤の存在により、ニューロンは、保護されていないニューロンにおける機能的完全性の喪失の原因になり得る侵襲又は疾患病態への曝露に対して生存し続けることが可能になる。そのような薬剤は、ニューロンをより強くすることによって、ニューロンが侵襲に応じて損傷を受けることを予防することもできる。
【０１０５】
医薬組成物
医薬製剤は、投与される対象に対して有害でない形態の薬理学的活性成分、及び活性成分を安定化するように設計され、血液循環又は標的組織へのその吸収に影響を及ぼす追加の構成要素を含む。
【０１０６】
本発明による医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、１９９５年に開示されているものなど従来通りの技術に従って、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤並びに他の任意の公知のアジュバント及び賦形剤と配合されてもよい。
【０１０７】
適切な薬学の許容可能な担体には、不活性な固体の希釈剤又は充填材、滅菌水溶液及び様々な有機溶媒がある。固形担体の例は、ラクトース、白土、ショ糖、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及びセルロースの低級アルキルエーテルである。液状担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン及び水である。
【０１０８】
本発明による医薬組成物の投与は、様々な経路、例えば経口、非経口（皮下、筋肉内、真皮内を含む）、硝子体内、眼内（例えば、点眼薬の形態で）等、によることができる。好ましい一実施形態において、医薬組成物は、経口投与用である（飲料の一部としての医薬組成物の投与を含む）。好ましい一実施形態において、医薬組成物は、眼内投与用である。
【０１０９】
非経口投与は、注射器、任意選択でペン様の注射器による皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈注射によって実施することができる。別法として、非経口投与は、注入ポンプにより実施することができる。なお更なる選択肢として、本発明の製剤は、経皮投与、例えば、無針注射によって若しくはパッチ、任意選択でイオン導入パッチから、又は経粘膜、例えば口腔投与に適合させることもできる。
【０１１０】
本発明の医薬組成物は、適切な剤形、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、コーティング錠、カプセル剤、硬カプセル及び軟カプセル剤、点滴剤、点眼剤、眼軟膏、洗眼剤（ophthalmic rinse）、注射液剤、等として投与することができる。
【０１１１】
本発明の医薬組成物は、例えば共有結合、疎水的及び静電的相互作用によって、薬物担体、薬物送達系及び高度な薬物送達系に更に調合又は付加して、更に、組成物の安定性を増強させ、生物学的利用能を高め、可溶性を増加させ、有害作用を低下させ、当業技術者に周知の時間治療を実現し、患者の服薬順守を高める又はその任意の組合せを行うことができる。
【０１１２】
担体、薬物送達系及び高度な薬物送達系の例には、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ（ビニルアルコール）、アクリレート及びメタクリレートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸並びにそのブロック共重合体、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば、熱ゲル化系、例えば当業技術者に周知のブロック共重合体系、ミセル、リポソーム、微小球、ナノ粒子、液晶及びその分散液、脂質−水系における相挙動の当業技術者に周知のＬ２相及びその分散液、重合ミセル、多層乳剤、自己乳化、自己微乳化シクロデキストリン及びその誘導体、並びにデンドリマーがあるが、これに限定されない。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、制御された、持続性、延長性、遅延性、徐放性薬物送達系の組成物に有用であり得る。より具体的には、それだけには限らないが、医薬組成物は、非経口制御放出及び持続性放出系組成物（両方の系とも投与回数を、数分の１へと減少させる）に有用であり得、当業技術者に周知である。更により好ましくは、制御放出及び持続性放出系は、皮下投与される。本発明の範囲を制限するものではないが、有用な制御放出系及び組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、重合ミセル、微小球及びナノ粒子である。
【０１１４】
神経変性疾患
本発明の医薬組成物は、ワーラー変性などの軸索変性を含む神経変性障害の処置に有用性があると予測される。これらの変性が重要なものになり得る障害の例には、糖尿病性神経障害、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、末梢神経障害、脳卒中及び他の虚血性障害、外傷性脳傷害、等がある。このリストは単なる例示目的であり、制限的又は包括的でない。
【０１１５】
特定の実施形態において、神経変性障害は、糖尿病性神経障害、外傷性脳傷害、虚血、末梢神経障害又は緑内障などの眼障害のうちの１つ又は複数である。特定の実施形態において、神経変性障害は、緑内障である。
【０１１６】
一実施形態において、医薬組成物は、ニューロン傷害に起因する神経変性障害の処置又は予防における神経保護的医薬品としての使用を目的とする。更なる実施形態において、モジュレータは、ニューロン傷害に起因する軸索変性（例えば、ワーラー変性）に関係する神経変性障害の処置における神経保護的医薬品としての使用を目的とする。本明細書では用語「傷害」とは、細胞体又は軸索又は樹状突起かを問わず、ニューロンに加えられる損傷のことを指す。これは、従来通りの意味の物理的傷害、即ち、対象に加えられた外力が原因の脳、脊髄又は末梢神経に対する外傷性傷害であり得る。損傷の他の外因は、例えば、水銀及び他の重金属、ヒ素、農薬及び溶媒などの環境毒素である。あるいは、傷害は、対象内から生じるニューロンへの侵襲、例えば：虚血性脳卒中並びに糖尿病性神経障害にあるような酸素及びエネルギー供給の減少、多発性硬化症にあるような自己免疫性発作又は筋萎縮性側索硬化症において重要であると考えられている酸化的ストレス及びフリーラジカル生成に起因し得る。また傷害は、軸索輸送の機序におけるあらゆる欠損を指すためにここで使用される。
【０１１７】
別の実施形態において、対象とする医薬組成物は、神経保護的医薬品としての使用を目的とし、神経変性障害は、疾患に起因するニューロン傷害が原因である。
一実施形態において、ニューロン傷害は、老化に起因する。
【０１１８】
一実施形態において、ニューロン傷害は、外傷に起因する。一実施形態において、障害は、化学療法薬によって誘導されるニューロン傷害である。タキソール、ベルケイド及びビンクリスチンなどがん化学療法に使用される特定の薬物は、使用できる最大用量を制限する末梢神経障害の原因である。最近の研究は、タキソール又はビンクリスチン毒性に悩まされるニューロンは、その形態及び基礎となる分子事象にワーラー様変化を受けることを示唆する。ニューロンは、神経毒薬剤に一時的にしか曝露されないので、ワーラー変性の阻害は、この病態に特に有効になり得る。従ってワーラー変性を阻害する薬剤とタキソール又はビンクリスチンの同時投与により、本剤を、現在考え得るより実質的に高い用量で使用することが可能になり、従って、がんと更に闘うことができる。
【０１１９】
年齢は、大部分の緑内障にとって一般的な危険因子であり、本治療方法は、ＮＡＤの老人性下降に対する予防を提供し、緑内障の発症から患者を保護する（即ち、神経変性を予防する）。本発明は、ＮＡＭ及び／又はピルビン酸の投与（ＮＡＤレベルを補給するため）並びにＮＭＮＡＴ１遺伝子の遺伝子送達の併用療法を提供する。ＮＡＭ及び／又はピルビン酸並びに遺伝子治療の驚くべき効力を考えると、併用療法は、緑内障を処置及び予防するのに魅力的な手法である。
【０１２０】
神経変性を処置するための遺伝子治療
遺伝子治療は、服薬順守問題を克服し、有効性を改善するのに魅力的な方法である。本発明は、神経変性を処置するための遺伝子治療の方法を提供する。軸索変性は、治療必要性が満たされていない領域である。神経変性は、運動ニューロン疾患、緑内障、アルツハイマー病及び多発性硬化症における症状の原因になる。糖尿病において、それは神経障害性疼痛及び遠位感覚消失の原因になり、それは肢切断の主原因である。それは、がん化学療法において用量を制限する副作用でもある。伸張傷害による進行性軸索変性は、外傷性脳傷害における主要な病理であり、白質を保護できないことが、脳卒中の処置を制限する。ヒト集団のおよそ半分は、これらの障害の１つ又は複数を最終的に患うことになり、これは生活の質を有意に減少させる。
【０１２１】
特定の実施形態において、本発明は、眼における神経変性を処置する方法を提供する。本発明は、眼に対し機能不全遺伝子のコピーを置き換える方法を提供する。遺伝子は、ウイルス遺伝子送達を使用して導入される。特定の実施形態において、ベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）がある。好ましい実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２．２である。この出願のために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９などを含めた他のＡＡＶ血清型を包含するものとする。他の実施形態において、ベクターは、レンチウイルス、一般に偽ＨＩＶに基づくベクターである。
【０１２２】
遺伝子を標的化ＲＧＣに送達するために、ウイルスベクターは、硝子体腔に導入される。好ましい実施形態において、遺伝子送達は、網膜内層の近位に直接標的される。硝子体内注射は、眼科手術において常法通り行われ、診療所／クリニック場所において安全に実施され得る。
【０１２３】
ウイルス遺伝子送達は、トランスフェクトしようとする多数の細胞に生涯にわたり標的した遺伝子産物を送達することが可能なので、本発明は、魅力的な展望として眼へのウイルス遺伝子送達を提供する。発明者の知見の限りでは、眼における遺伝子治療は、緑内障処置の新規の手法となる。緑内障などのヒト複合疾患に適用されるＮＡＤ＋を増加させるためのそのような遺伝子治療は、処置の新規の手法となる。
【０１２４】
一態様において、本発明は、罹患した眼に遺伝子を送達して、それによりＮＡＤの発現を増強する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明による遺伝子治療組成物（例えば、ウイルスベクター上のポリヌクレオチド）は、硝子体内又は眼内に投与される。好ましい一実施形態において、遺伝子治療は、硝子体内投与である。好ましい経路が、処置しようとする対象の全身状態及び年齢、処置しようとする病態の性質並びに選択される活性成分によって決まることになることはいうまでもない。
【０１２５】
一態様において、本発明は、眼に遺伝子を送達して、Ｎｍｎａｔの発現を増加させる遺伝子治療を提供する。特定の実施形態において、Ｎｍｎａｔのタンパク質発現を増加させる遺伝子には、Ｎｍｎａｔ−１、Ｎｍｎａｔ−２又はＮｍｎａｔ−３がある。
【０１２６】
特定の実施形態において、遺伝子はＮｍｎａｔ−１（例えば、ヒトＮＭＮＡＴ１）である。
ＮＭＮＡＴ
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ１（Ｎｍｎａｔ１［マウス］、ＮＭＮＡＴ１［ヒト］）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の生合成において鍵となる工程を触媒する酵素をコードする。コードされている酵素は、いくつかのニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼの１つであり、細胞核に特異的に限局する。この遺伝子の選択的スプライシングは、複数の（少なくとも３つ）転写産物バリアントをもたらす。
【０１２７】
ヒトＮＭＮＡＴ１、アイソフォーム（１）に対するＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）には、以下がある：ＮＭ＿０２２７８７．３（ヌクレオチド）及びＮＰ＿０７３６２４．２（タンパク質）、そのヌクレオチド配列は、より長いＮＭＮＡＴ１アイソフォーム（１）をコードする転写バリアント（１）として公知である；及びＮＭ＿００１２９７７７８．１（ヌクレオチド）及びＮＰ＿００１２８４７０７．１（タンパク質）、そのヌクレオチド配列は、バリアント１と比較した場合に５’ＵＴＲ領域において異なる転写産物バリアント（２）として公知である。バリアント１及び２は、同じアイソフォーム（１）をコードし、本発明の方法に全て使用できる。全ての配列を参照により組み込む。
【０１２８】
核に限局し、偏在して発現される他のヒトファミリーメンバーとは異なる、関連するニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ２（ｎｍｎａｔ２）、この酵素は細胞質性であり、脳において主に発現される。この遺伝子の選択的スプライシングは、２つの転写産物バリアントをもたらす。
【０１２９】
ヒトＮＭＮＡＴ２アイソフォーム（１）に対するＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）には、以下がある：ＮＭ＿０１５０３９．３（ヌクレオチド）及びＮＰ＿０５５８５４．１（タンパク質）、そのヌクレオチド配列は、本発明の方法に使用することができる。全ての配列を参照により組み込む。
【０１３０】
関連するニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ３（ｎｍｎａｔ３）は、ミトコンドリアに限局するタンパク質をコードし、分子シャペロンとして神経保護的役割を担う可能性もある。あるいは、この遺伝子について複数のアイソフォーム（少なくとも５つ）をコードするスプライスされた転写産物バリアント（少なくとも６つ）が、観察された。
【０１３１】
ヒトＮＭＮＡＴ３、アイソフォーム（３）に対するＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）には、以下がある：ＮＭ＿００１３２０５１０．１（ヌクレオチド）及びＮＰ＿００１３０７４３９．１（タンパク質）、そのヌクレオチド配列は、最も長いアイソフォーム（３）をコードする転写バリアント３であり、本発明の方法に使用し得る。全ての配列を参照により組み込む。
【０１３２】
ＮＭＮＡＴ２は、軸索における重要なＮＡＤ生成酵素として現れ、軸索変性から保護する。ＲＧＣにおいて持続中のストレスは、Ｎｍｎａｔ２発現に負に影響を与える（Ｄ２緑内障群４、緑内障変性前に検出される最終段階においてｑ＜０．０５）。この下降は、緑内障における軸索変性への移行に重要である可能性がある。ＮＭＮＡＴ２発現は、アルツハイマー病の脳において低下し、高齢の死後のヒト脳において大きなばらつきの減退があり、そのばらつきは、これら病態に対する多様な脆弱性の一因になる可能性がある。
【０１３３】
異なる動物種（ハツカネズミマウスなど）における多数の関連するｎｍｎａｔ配列は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ、ＧｅｎＢａｎｋ、等などの公開データベースからすぐに利用できる。全ての配列を、参照により本明細書に組み込む。
【０１３４】
ＮＡＭＰＴを使う遺伝子治療は、細胞中のＮＡＤ＋レベルを上昇させるが、軸索細胞毒性をもたらすことになると考えられる。ＮＡＭＰＴは、ＮＡＭをＮＭＮに変換するように機能し、次いでＮＭＮは、ＮＡＤ＋に変換される。細胞内ＮＡＤ＋は、軸索変性と関連する鍵となる分子である。ＮＡＤ＋レベルが低い場合、軸索は急速に変性する。座骨神経軸索における軸索傷害の後、ＮＭＮが急速に蓄積することも確立されている。このモデル軸索変性において、ＮＭＮレベルは、１２時間以内に上昇し、続いて傷害後３６時間で神経傷害が起こる。ＦＫ８６６を使用するＮＭＮ生成酵素ＮＡＭＰＴの遮断は、この軸索変性を潜在的に阻害し、このことは、ＮＭＮがニューロンに有毒であることを暗示した。軸索変性は、ＮＭＮ依存的であり、ＦＫ８６６を使用するＮＭＮの増加の阻害は、軸索変性から保護するように見える。軸索変性のゼブラフィッシュモデル（２光子レーザー軸索切断）において、ＦＫ８６６は、軸索変性を強力に遅延させた。神経突起変性の細胞培養モデル（上頸神経節；ＳＣＧ）において、ＮＭＮを急速に除去する（ＮＭＮをＮＡＭＮに変換する細菌性酵素ＮＭＮデアミダーゼの過剰発現による）ことにより、軸索変性から強力に保護される。
【０１３５】
従って、本発明は、ＮＭＮＡＴを使う遺伝子治療が、ＮＡＭＰＴのそれとは異なり、眼神経変性を保護するのに有効であるという予想外の発見を示す。
Ｎａｍｐｔ過剰発現は、ＮＭＮの産生を駆動することになり、ＮＭＮは、適切に除去しないとニューロンに有毒なので、従って、ＮａｍｐｔよりもＮｍｎａｔ１を選択した。
【０１３６】
ＷｌｄＳ
軸索変性は、神経変性疾患の一般的な要素である。遠位軸索変性のこのより大きな程度を説明しようと試みる２つのモデルがある。第１は、変性が神経末端から逆行的に広がる「遠位性」である。第２は、ワーラー変性であり、この場合変性が、病変型に従って病変の部位からいずれの方向にも広がり、遠位から病変部位への軸索の喪失を最終的にもたらし、近位部分が完全に残る。厳密に言えば、ワーラー変性は、軸索の物理的傷害に応じてしか起こらず、そのような傷害が起こらなかった疾患においては類似の機序が作動する。後者は、「ワーラー様」変性と称される。両方の型の変性は、「ワーラー変性」として以下で一緒に称されることになる。
【０１３７】
最近発見されたＷｌｄＳマウスは、これら２つの過程の理解に進展をもたらした。これらの動物において、ワーラー変性は、野生型動物よりおよそ１０倍遅い速度で起こる。研究は、この突然変異が、軸索末端の「遠位性」に関係すると考えられる病変も遅延させることを示した。従って、ＷｌｄＳ遺伝子は、軸索変性の２つのモデル間の機械学的連結を提供する。
【０１３８】
ＷｌｄＳ遺伝子の同定及び特徴付けにもかかわらず、ワーラー変性の分子的引き金の理解に向けた進展は、限られている。この引き金の知見は、「遠位性」神経変性疾患の初期段階の理解に多大な影響がある可能性がある。
【０１３９】
ＷｌｄＳ遺伝子を持つマウスは、ワーラー変性を遅延させた。ＷｌｄＳ突然変異は、マウス４番染色体に起こる常染色体優性突然変異である。遺伝子変異は、天然に存在する８５ｋｂの直列の三重化であり、２つの関連する遺伝子：ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリル転移酵素１（Ｎｍｎａｔ−１）及びユビキチン化因子ｅ４ｂ（Ｕｂｅ４ｂ）、並びに１８アミノ酸をコードするリンカー領域を含有する変異領域をもたらす。作製されるタンパク質は、核内に局在し、軸索においては検出できない。
【０１４０】
突然変異は、マウスに対する有害性の原因にならないように見える。唯一の公知の効果は、ワーラー変性が、神経の傷害の後に平均で最長３週間まで遅延するということである。最近の研究は、突然変異が、十分に解明されていない機序によって軸索を保護することを示唆する。いかなる特定の理論によっても束縛されないが、ＷｌｄＳ突然変異が、Ｎｍｎａｔタンパク質（例えば、Ｎｍｎａｔ−１）の過剰発現及び／又は局在化の改善をもたらし、ＮＡＤ合成を増加させる可能性が高い。
【０１４１】
特定の実施形態において、方法は、対象にＮｍｎａｔ（例えば、Ｎｍｎａｔ−１−２又は−３）又はＷｌｄＳをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＷｌｄＳ又はそのヒト配列相当物をコードする。
【０１４２】
特定の実施形態において、方法は、対象にＮＡＭ又は前駆体、及びＷｌｄＳをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、対象に局所的に投与される。
例えば、緑内障を処置するために、薬剤は、冒された眼に局所的に送達されてもよい。
【０１４３】
ベクター
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターで対象に投与される。典型的な適切なウイルスベクターには、それだけには限らないが、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、等がある。好ましくは、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター又はレンチウイルスベクターである。
【０１４４】
例えば、ポリヌクレオチドは、１つ又はそれ以上の対象となる標的遺伝子の発現をモジュレートすることができる外来性遺伝物質として対象に導入することができる。そのような種類の遺伝子治療は、例えば、損傷した又は疾患のある組織、ニューロン組織など、を修復するために行われる方法に使用することができる。要約すると、アデノウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルス遺伝子送達媒体（下記参照）を含めた任意の適切なベクターを使用して、対象にＤＮＡ及び／又はＲＮＡの様な遺伝情報を送達することができる。当業者は、遺伝子治療において標的される特定の遺伝子を置き換える又は修復することができる。例えば、正常遺伝子を、疾患のある細胞のゲノム内の非特異的な場所に挿入して、機能しない遺伝子を置き換えることができる。別の例において、異常な遺伝子配列を、相同組換えにより正常遺伝子配列と置き換えることができる。別法として、選択的復帰突然変異は、その正常機能に遺伝子を戻すことができる。更なる例は、特定の遺伝子の調節（遺伝子が、オン又はオフにされる程度）を改変する。特定の実施形態において、標的細胞（ニューロン幹細胞など）が、遺伝子治療手法によってｅｘ  ｖｉｖｏで処置され、哺乳動物、好ましくは処置を必要とするヒトへその後移される。
【０１４５】
様々な核酸構築物によるトランスフェクション及び感染（例えば、ウイルスベクターによって）を含めた、遺伝子操作に関する当業者に認められた任意の方法を、使用することができる。
【０１４６】
例えば、異種核酸（例えば、ＤＮＡ）は、物理的処置（例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション（impalefection）、ハイドロダイナミック送達、ナノ粒子、マグネットフェクション）によって、化学材料又は生物学的ベクター（ウイルス）を使用して対象に導入することができる。化学性トランスフェクションは、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストラン又はポリエチレンイミンなどの陽イオン性ポリマー）、デンドリマーなど高度に分枝化した有機化合物、リポソーム（陽イオン性リポソームなど、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、等を使用するリポフェクションなどのリポフェクション）又はナノ粒子（化学又はウイルス官能化有り無し）に基づき得る。
【０１４７】
核酸構築物は、対象の核酸分子を含み、それが導入された細胞内で対象の核酸分子の発現を指令することが一般に可能である。
特定の実施形態において、核酸構築物は、ポリペプチドなどの遺伝子産物又はポリペプチドの発現をアンタゴナイズする核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス配列、アプタマー、リボザイム、アンタゴｍｉｒ、ＲＮＡスポンジ、等）をコードする核酸分子が、標的細胞における核酸分子の発現を指令可能なプロモーターに作動的に連結されている発現ベクターである。
【０１４８】
特定の細胞への導入のために調製されるＤＮＡ構築物は、細胞によって認識される複製系、所望のポリペプチドをコードする意図するＤＮＡ区分、並びにポリペプチドをコードする区分に作動的に連結された転写及び翻訳開始及び終結調節配列を一般に含む。ＤＮＡ区分は、それが別のＤＮＡ区分と機能的な関係に置かれる場合、「作動的に連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写を刺激する場合、コード配列に作動的に連結される。シグナル配列のためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動的に連結される。一般に、作動的に連結されているＤＮＡ配列は連続しており、シグナル配列の場合、両方が連続し、読み枠相にある。しかしながら、エンハンサーは、それが転写を制御するコード配列と連続する必要がない。連結は、簡便な制限部位又はその代わりに挿入されるアダプタ若しくはリンカーでのライゲーションによって完成される。
【０１４９】
適当なプロモーター配列の選択は、ＤＮＡ区分の発現のために選択された宿主細胞によって一般に決まる。適切なプロモーター配列の例には、当業者に周知の真核生物プロモーターがある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３編、２００１年を参照のこと）。転写調節配列は、細胞によって認識される異種エンハンサー又はプロモーターを一般に含む。適切なプロモーターには、ＣＭＶプロモーターがある。複製系並びにポリペプチドコード区分の挿入部位と一緒に転写及び翻訳の調節配列を含む発現ベクターを、使うことができる。細胞株及び発現ベクターの実行可能な組合せの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年、上記）及びＭｅｔｚｇｅｒら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ、３３４：３１〜３６頁に記述されている。
【０１５０】
本発明のいくつかの態様は、上で定義したヌクレオチド配列を含む核酸構築物又は発現ベクターの使用に関し、ベクターは、遺伝子治療に適切なベクターである。
遺伝子治療に適切なベクターは、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ、３９２：２５〜３０頁、１９９８年）；Ｗａｌｔｈｅｒ及びＳｔｅｉｎ（Ｄｒｕｇｓ、６０：２４９〜７１頁、２０００年）；Ｋａｙら（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、７：３３〜４０頁、２００１年）；Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、８１：２５７３〜６０４頁、２０００年）；
Ａｍａｄｏ及びＣｈｅｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：６７４〜６頁、１９９９年）；Ｆｅｄｅｒｉｃｏ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：４４８〜５３頁、１９９９年）；Ｖｉｇｎａ及びＮａｌｄｉｎｉ（Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、２：３０８〜１６頁、２０００年）；Ｍａｒｉｎら（Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ、３：３９６〜４０３頁、１９９７年）；Ｐｅｎｇ及びＲｕｓｓｅｌｌ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：４５４〜７頁、１９９９年）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、８０：３０４９〜６４頁、１９９９年）；Ｒｅｉｓｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７：９１０〜３頁、２０００年）；及びその中に引用される文献（参照により全て組み込む）に記述されるものなど当業者に公知である。例には、レトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス並びにヘルペスウイルスに基づくものなど組み込み型及び非組み込み型ベクターがある。
【０１５１】
特に適切な遺伝子治療ベクターには、アデノウイルス（Ａｄ）及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターがある。これらのベクターは、大多数の分裂及び非分裂細胞型に感染する。加えて、アデノウイルスベクターは、高レベルの導入遺伝子発現が可能である。しかしながら、（Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、８１：２５７３〜２６０４頁、２０００年；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ、Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．、２（１）：４３頁、２００５年）に記載の通り、細胞侵入後のアデノウイルス及びＡＡＶベクターのエピソーム性性質のため、これらのウイルスベクターは、導入遺伝子の一過性の発現しか必要としない治療適用に最も適している。Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００年、上記）によって見直されたように、好ましいアデノウイルスベクターは、宿主応答を減少させるために修飾される。ＡＡＶ遺伝子導入の安全性及び有効性は、肝臓、筋肉、ＣＮＳ及び網膜にける有望な結果と共にヒトにおいて徹底的に研究された（Ｍａｎｎｏら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００６年；Ｓｔｒｏｅｓら、ＡＴＶＢ、２００８年；Ｋａｐｌｉｔｔ、Ｆｅｉｇｉｎ、Ｌａｎｃｅｔ、２００９年；Ｍａｇｕｉｒｅ、Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉら、ＮＥＪＭ、２００８年；Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅら、ＮＥＪＭ、２００８年）。
【０１５２】
ＡＡＶ２は、ヒト及び実験モデル両方において遺伝子導入研究のために最も特徴付けられた血清型である。ＡＡＶ２は、骨格筋、ニューロン、血管平滑筋細胞及び肝細胞に向かう天然の向性を示す。アデノ随伴ウイルスに基づく非組み込み型ベクターの他の例には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及び偽型ＡＡＶがある。ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の様な非ヒト血清型の使用は、対象におけるこれらの免疫学的応答を克服するのに有用となる可能性があり、臨床試験がちょうど始まった（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ  ｄｏｔ  ｇｏｖ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００９７９２３８）。肝細胞への遺伝子導入の場合、アデノウイルス血清型５又はＡＡＶ血清型２、７若しくは８は有効なベクターであり、従って好ましいＡｄ又はＡＡＶ血清型になると示された（Ｇａｏ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１３：７７〜８７頁、２００６年）。
【０１５３】
本発明における適用のための典型的なレトロウイルスベクターは、レンチウイルスに基づく発現構築物である。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染する固有の能力を有する（Ａｍａｄｏ及びＣｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：６７４〜６７６頁、１９９９年）。レンチウイルスに基づく発現構築物の構築及び使用に関する方法は、米国特許第６，１６５，７８２号、第６，２０７，４５５号、第６，２１８，１８１号、第６，２７７，６３３号及び第６，３２３，０３１号並びにＦｅｄｅｒｉｃｏ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４４８〜５３頁、１９９９年）及びＶｉｇｎａら（Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２：３０８〜１６頁、２０００年）に記述されている。
【０１５４】
一般に、遺伝子治療ベクターは、発現しようとする本発明の遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含み、前述の通りヌクレオチド配列が適当な調節配列に作動的に連結されるという意味で上述した発現ベクターのことになる。そのような調節配列は、プロモーター配列を少なくとも含むことになる。遺伝子治療ベクターからポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるのに適切なプロモーターには、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中初期プロモーター、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス又はＨＴＬＶ−１由来などのウイルス性末端反復配列プロモーター（ＬＴＲ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターがある。更なる適切なプロモーターについては、以下で記述される。
【０１５５】
小さい有機又は無機化合物の投与によって誘導し得るいくつかの誘導可能なプロモーター系が、記述されてきた。そのような誘導可能なプロモーターには、メタロチオネイン（metallothionine）プロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９〜４２頁、１９８２年；Ｍａｙｏら、Ｃｅｌｌ、２９：９９〜１０８頁、１９８２年）など重金属、ＲＵ−４８６（プロゲステロンアンタゴニスト）（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１：８１８０〜８１８４頁、１９９４年）、ステロイド（Ｍａｄｅｒ及びＷｈｉｔｅ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０：５６０３〜５６０７頁、１９９３年）、テトラサイクリン（Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５５１頁、１９９２年；米国特許第５，４６４，７５８号；Ｆｕｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１：９３０２〜９３０６頁、１９９４年；Ｈｏｗｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：１４１６８〜１４１７４頁、１９９５年；Ｒｅｓｎｉｔｚｋｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４：１６６９〜１６７９頁、１９９４年；Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９２：６５２２〜６５２６頁、１９９５年）並びにＶＰ１６の活性化ドメインとしてｔｅｔＲポリペプチド及びエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインで構成されるマルチキメラトランス活性化因子に基づくｔＴＡＥＲ系（Ｙｅｅら、２００２年、米国特許第６，４３２，７０５号）によって制御されるものがある。
【０１５６】
ＲＮＡ干渉（下記参照）によって特定の遺伝子をノックダウンするためのスモールＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に適切なプロモーターには、上記のポリメラーゼＩＩプロモーターに加えて、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターがある。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）は、５Ｓ、Ｕ６、アデノウイルスＶＡ１、Ｖａｕｌｔ、テロメラーゼＲＮＡ及びｔＲＮＡを含めた多種多様な、核内及び細胞質性非コード低分子ＲＮＡの合成に関与する。これらＲＮＡをコードする多数の遺伝子のプロモーター構造が決定され、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが、３つの型の構造に分類されることが分かっている（総説については、Ｇｅｉｄｕｓｃｈｅｋ及びＴｏｃｃｈｉｎｉ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７：８７３〜９１４頁、１９８８年；Ｗｉｌｌｉｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１２：１〜１１頁、１９９３年；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：２６７３３〜３６頁、２００１年を参照のこと）。ｓｉＲＮＡの発現に特に適切なのは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの３型であり、それにより転写は、５’−隣接領域、即ち転写開始点の上流においてのみ見られるシス作用エレメントによって駆動される。上流の配列エレメントには、従来のＴＡＴＡボックス（Ｍａｔｔａｊら、Ｃｅｌｌ、５５：４３５〜４４２頁、１９８８年）、近位配列エレメント及び遠位配列エレメント（ＤＳＥ；Ｇｕｐｔａ及びＲｅｄｄｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：２０７３〜２０７５頁、１９９１年）がある。３型ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下にある遺伝子の例は、Ｕ６核内低分子ＲＮＡ（Ｕ６  ｓｎＲＮＡ）、７ＳＫ、Ｙ、ＭＲＰ、ＨＩ及びテロメラーゼＲＮＡ遺伝子である（例えば、Ｍｙｓｌｉｎｓｋｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１：２５０２〜０９頁、２００１年を参照のこと）。
【０１５７】
遺伝子治療ベクターは、第２の又は更なるポリペプチドをコードする第２の又は１つ又はそれ以上の更なるヌクレオチド配列を任意選択で含むことができる。第２の又は更なるポリペプチドは、発現構築物を含有する細胞の同定、選択及び／又はスクリーニングを可能にする（選択可能な）マーカーポリペプチドとすることができる。この目的に適切なマーカータンパク質は、例えば、蛍光タンパク質ＧＦＰ、並びに選択可能なマーカー遺伝子であるＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地における選択のため）、細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢに対する選択のため）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８に対する選択のため）及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（メトトレキサートに対する選択のため）、ＣＤ２０、低親和性神経成長因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子を得るための供給源及びその使用のための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年に提供される。
【０１５８】
別法として、必要とみなされる場合、第２の又は更なるヌクレオチド配列は、対象がトランスジェニック細胞から治癒されることを可能にする二重安全機序を提供するポリペプチドをコードすることができる。しばしば自殺遺伝子と称されるそのようなヌクレオチド配列は、プロドラッグを、ポリペプチドが発現されているトランスジェニック細胞を死滅させることができる毒性物質に変換することが可能なポリペプチドをコードする。そのような自殺遺伝子の適切な例には、例えば、大腸菌シトシンデアミナーゼ遺伝子又は単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子のうちの１つがあり、この場合ガンシクロビルをプロドラッグとして使用して、対象内のＩＬ−１０トランスジェニック細胞を死滅させることができる（例えば、Ｃｌａｉｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３１：８４４〜８４９頁、１９８７年を参照のこと）。
【０１５９】
眼における遺伝子治療のための投与経路
一態様において、本発明は、眼変性疾患を処置するための遺伝子治療の方法を提供する。当業者は、硝子体内投与又は眼内投与を含む眼における遺伝子治療の経路を認識するだろう。
【０１６０】
眼内投与は、眼球どこへでも遺伝子組成物を送達する。
好ましい実施形態において、遺伝子組成物は、硝子体内に注射される。硝子体内投与は、遺伝子組成物を眼の硝子体区画、即ち、網膜に直ぐ近接する眼の後部を構成する液体に直接送達する。特定の実施形態において、注射の間硝子体は、薬物のための空間を作るために除去される。
【０１６１】
硝子体内注射は、一般に診療所において行われるが、病院の手術室において行うこともできる。患者は、プロパラカイン、リドカイン、その他など日常的な薬物で局所麻酔（通常点眼薬又は浸漬したスポンジ／綿棒）を一般に受ける。
【０１６２】
特定の実施形態において、遺伝子組成物は、網膜下に注射される（即ち、網膜の下）。
注射の場合、２７〜３２ゲージの注射針サイズを使用することができる。好ましい実施形態において、注射針サイズは、３０ゲージである。注射針注射は、眼に薬剤を注射するための普及している技術であり、全く危険性はない。注射は、深部又は表面であり得る。注射は、垂直（即ち眼の表面に対して９０°で）、斜め（４５〜６０°）又はダブルペイン（double-pane）（斜めに、外へ垂直に）とすることができる。
【０１６３】
眼における遺伝子治療
本発明は、遺伝子組成物を使用して、ＲＧＣにおいてＮＡＤ＋を上昇させる遺伝子治療を提供する。眼は、サイズが小さく（即ち、トランスフェクトする細胞が少ない）、容易に接近でき、部分的に／ほとんど免疫特権化されており（即ち、免疫応答を引き起こす可能性が低い／ほとんどない）、他眼が対側性対照及び予備として役立つので、遺伝子治療を利用するには理想的な器官である。
【０１６４】
いくつかの眼に基づく遺伝子治療臨床試験が、失明に至る障害に対して行われてきた。例えば、レーバー先天性黒内障を処置するためのＡＡＶ２ベクターによるＲＰＥ６５遺伝子の遺伝子治療は、第３相臨床試験（ＮＣＴ００４８１５４６、ＮＣＴ００５１６４７７、ＮＣＴ００６４３７４７及びＮＣＴ００９９９６０９）であり；網膜色素変性を処置するためにＡＡＶ２ベクターを使用するＭＥＲＴＫ遺伝子の遺伝子治療は、第１相（ＮＣＴ０１４８２２１９５）であり；シュタルガルト病を処置するためにＥＩＡＶレンチウイルスベクターを使用するＡＢＣＡ４遺伝子の遺伝子治療は、現在第２相（ＮＣＴ０１３６７４４４）であり；コロイデレミア（Chorioderemia）を処置するためにＡＡＶ２ベクターを使用するＲＥＰ−１遺伝子の遺伝子治療は、現在第２相（ＮＣＴ０２５５３１３５）である。いくつかのクリニックにおける臨床研究は、眼への遺伝子送達が安全に許容されるように見えることを実証する。
【０１６５】
併用療法−更なる治療的薬剤
特定の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒトに神経細胞（例えば、ＲＧＣ）におけるＮＡＤ＋細胞内レベルを増強させる化合物及び更なる治療的薬剤を投与することによる神経変性の併用療法処置の方法を提供する。
【０１６６】
特定の実施形態において、緑内障を処置するための本発明の更なる治療的薬剤は、ＩＯＰを低減する薬剤を含むが、これに限定されない。更なる典型的な治療的薬剤には、β受容体遮断薬（マレイン酸チモロール、チモロール半水和物、レボブノロールＨＣＬ、メチプラノロール、カルテオロール、ベタキソロール、など）、非選択的アドレナリン作動薬（エピネフリン、ジピベフリンＨＣＬなど）、選択的α−２アドレナリン作動薬（アプラクロニジンＨＣＬ、ブリモニジン酒石酸塩、及びプリテ中のブリモニジン酒石酸塩など）又は炭酸脱水酵素阻害薬（アセタゾラミド［経口］、アセタゾラミド［非経口］、メタゾラミド［経口］、ドルゾラミド［局所］及びブリンゾールアミド［局所］などのＣＡＩ）があるが、これに限定されない。
【０１６７】
特定の実施形態において、更なる治療的薬剤には、プロスタグランジン類似体（ラタノプロスト、トラボプロスト及びビマトプロスト［プロスタミド］など）、副交感神経刺激性アゴニスト（ピロカルピンＨＣＬなどの直接コリン作動性アゴニスト；並びにヨウ化エコチオフェート、ヨウ化デメカリウム（demercarium）及びフィソスチグミンイソフルオロフェートなどの間接的コリン作動薬を含む）及びカルバコール（混合直接アゴニスト／アセチルコリン遊離薬）がある。
【０１６８】
特定の実施形態において、更なる治療的薬剤は、利便性、服薬順守、有効性及び費用を高めた潜在的利点を提供する配合薬品を含む。配合物は、プロスタグランジン類似体、αアドレナリン作動薬アゴニスト又は局所性炭酸脱水酵素阻害薬と組み合わせた局所性β受容体遮断薬を含むことができる。典型的な配合には：（１）２％ドルゾラミド塩酸塩及び０．５％マレイン酸チモロール点眼液など、ドルゾラミド及びチモロール（例えば、コソプト、現在後発品として利用可能である）、（２）０．２％ブリモニジン酒石酸塩及び０．５％マレイン酸チモロール点眼液（例えば、コンビガン）並びに０．２％ブリモニジン酒石酸塩及び１％ブリンゾールアミド（例えば、シンブリンザ）など、チモロール又はブリンゾールアミドを含むブリモニジン、又は（３）ラタノプロスト及びチモロールがある。
【０１６９】
特定の実施形態において、更なる治療的薬剤は、経口グリセリン、経口イソソルビド及び硝子体容積を低下させることによってＩＯＰを急速に低減することができる静脈内マンニトールなどの高浸透圧薬剤を含む。それらは、血液眼関門を横断しない、従って、硝子体を脱水する膠質浸透圧を及ぼさない。高浸透圧薬剤は、より決定的な処置が提供できるまで、高ＩＯＰを一時的に減少させるために急性局面で一般に使用される。
【０１７０】
本発明は、以下の非限定的な例によって例示される。
【実施例】
【０１７１】
［実施例１］緑内障感受性遺伝子／経路の同定
（Ａ）ヒトにおける神経変性を模倣するマウスモデルの選択
ＤＢＡ／２Ｊ  Ｄ２（Ｄ２）マウスモデルを選択してヒトにおける神経変性の病因を調べた。Ｄ２マウスは、緑内障の広く使用されているモデルであり、ヒト緑内障の顕著な特徴を概括する。Ｄ２マウスにおいて、２つの遺伝子（ＧｐｎｍｂＲ２５０Ｘ、Ｔｙｒｐ１ｂ）の変異対立遺伝子は、進行性虹彩疾患の原因になる。この虹彩疾患には、２つの主要な要素：虹彩間質性萎縮（ヒトの本態性虹彩萎縮に非常に似ている）及び虹彩色素脱出表現型（ヒトの色素脱出症候群に非常に似ている）がある。本態性虹彩萎縮及び色素脱出症候群は、ヒトにおいてＩＯＰ上昇及び緑内障を誘導する。Ｄ２眼における虹彩疾患は、８〜９ヵ月齢までの大多数の眼に老人性の眼内圧（ＩＯＰ）上昇をもたらす。視神経変性は、１２ヵ月齢までにほぼ完了する（一般に、７０％超の神経が、重度の損傷を有する）。
【０１７２】
本研究において、Ｄ２マウスは、老人性ＩＯＰ増加後に眼神経変性を受けることが検証された。特に、３つの月齢；即ち、４、９、及び１２ヵ月齢のＤ２マウスを使用した。
（ｉ）４ヵ月齢Ｄ２マウスが、正常眼内圧（ＩＯＰ）（即ち、１０〜１３ｍｍＨｇ）であり、緑内障を呈しないことを検証した（即ち、これらのマウスは、ＩＯＰ及び前緑内障の発症前の月齢である；検出可能な神経変性はない）。この月齢において、Ｄ２マウスは、対照マウスと区別がつかない。
【０１７３】
（ｉｉ）９ヵ月齢Ｄ２マウスが、高ＩＯＰ（即ち、２１ｍｍＨｇ超）であるが神経変性を呈しないことを検証した。従来通りの緑内障は、この発育段階（即ち、前神経変性）において存在しないが、９ヵ月齢Ｄ２マウスの眼は、本明細書において「初期の緑内障」を有すると定義される分子変化を受ける。
【０１７４】
（ｉｉｉ）１２ヵ月齢のＤ２マウスが、様々な高ＩＯＰ（即ち、１４〜＞２１ｍｍＨｇ）を呈することを検証し、神経変性が、明らかになる（即ち、緑内障；６０％超の眼が、重度の神経変性を有する）。
【０１７５】
（ｉｖ）対照Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋マウスは、老化に伴う高ＩＯＰも神経変性も呈さないので、このマウスを本研究に使用した。これらのマウスは、虹彩疾患を引き起こすＧｐｎｍｂＲ２５０Ｘ突然変異の修正を除いてＤ２マウスと同一である。
【０１７６】
（Ｂ）Ｄ２マウスの網膜からの網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の単離
（ｉ）４ヵ月齢ＤＢＡ／２Ｊ  Ｄ２マウス、（ｉｉ）９ヵ月齢ＤＢＡ／２Ｊ  Ｄ２マウス、及び（ｉｉｉ）月齢、性別及び系統が同じＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋野生型対照から得た眼から網膜を採取した。
【０１７７】
網膜サンプルを、抗体カクテルで最初に染色した。網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を、Ｔｈｙ１．２＋細胞（及びＣｄ１１ｂ−、Ｃｄ１１ｃ−、Ｃｄ３１−、Ｃｄ３４−、Ｃｄ４５．２−、ＧＦＡＰ−、ＤＡＰＩ−に陰性）として同定した。ＦＡＣＳ陽性ＲＣＧを平板培養し、ＳＮＡＰ−２５及びβ−チューブリン（ＲＧＣの特異的マーカー）で染色して、ＲＧＣの状態を確認した。
【０１７８】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣソーティング）を使用して、これら３つの群のマウスにおいて新たに採取した網膜からＲＧＣを次いで単離した。図２７Ａ〜図２７Ｈを参照のこと。
【０１７９】
（Ｃ）ＲＮＡ配列決定
緑内障をもたらす感受性遺伝子／経路を同定するために、（Ｂ）において上で得られたＲＧＣのＲＮＡからＲＮＡ−配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を実施して、神経変性に先行するＲＧＣ内の非常に初期の分子変化を説明した。増幅させたｄｓｃＤＮＡライブラリ（二本鎖コピーＤＮＡ）をＲＮＡから生成し、サンプル当たり３５００００００個のリード深度で読んだ。データ分析を、偽発見率ｑ＜０．０５の（ＦＤＲ、ｑ）で実施した。全ての群のサンプル（Ｂ）は、成功裏に増幅され、配列決定された。
【０１８０】
４、９、及び１２ヵ月齢Ｄ２並びにＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋眼由来神経網膜の更なる代謝的プロファイリングを実施した。代謝的プロファイリングを、製造業者の推奨に従って標的アッセイを使用して実施した。以下の代謝産物がプロファイルされた：ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ（即ち全ＮＡＤ、ＮＡＤ［ｔ］）、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ（即ち全グルタチオン、グルタチオン［ｔ］）及びピルビン酸。
【０１８１】
（Ｄ）階層的クラスタ分析（ＨＣ）
本研究において、サンプル当たり３５００００００個のリード深度で、単離されたＲＧＣ由来のＲＮＡを配列決定した。教師なし階層的クラスタリング（ＨＣ）を使用して、疾患の初期段階にあり、同月齢のＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋又は若齢対照と形態学的に区別がつかないサンプル間で分子的に決定される緑内障の段階を定義した。
【０１８２】
ＨＣは、９ヵ月齢Ｄ２サンプルの固有の４つの群（即ち、群１、群２、群３及び群４）を同定した。群１は、対照サンプルの全てでクラスタ形成し、分子レベルで検出可能な緑内障がないＤ２  ＲＧＣを表す。群２〜４の全てのサンプルは、初期の疾患段階であり、群番号の増加が、対照からの距離の増加を反映する（トランスクリプトームレベルでより大きい疾患の進行）ことが観察された（図１、図２Ａ及び図２Ｂ）。
【０１８３】
疾患が進行するにつれて、ミトコンドリアリードに対して最も顕著な転写産物存在量の増加があった（図３Ａ）。核及びミトコンドリアゲノムにコードされるミトコンドリア分子の相対的な割合の不均衡は、ミトコンドリア機能に負の影響力を与える。Ｄ２群２〜群４において、ミトコンドリア機能不全及び酸化的リン酸化経路におけるミトコンドリアタンパク質をコードする遺伝子の差異的発現並びに差異的に発現される遺伝子の有意な濃縮（月齢及び性別が同じＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋対照ＲＧＣＳと比較して）は、ＲＧＣ内のミトコンドリア異常を更に指し示す（図３Ａ〜図３Ｊ及び図３Ｋ、並びに下記の表１〜表３）。
【０１８４】
トランスクリプトーム全体の総リード存在量（即ち転写された遺伝子全て）を、核トランスクリプトーム（即ち、核にコードされている）又はミトコンドリアトランスクリプトーム（即ち、ミトコンドリアでコードされている）から得られるリードに分割した。Ｄ２  ＲＧＣにおけるリード存在量は、両方のトランスクリプトームで増加したが、ミトコンドリア由来リードにおいて最も豊富であった。このことはミトコンドリア機能不全を促すだろう不均衡を示す（図３Ａ）。
【０１８５】
Ｄ２群２、３及び４に現れる濃縮された上位の経路（ＩＰＡ）。差異的に発現される（ＤＥ）遺伝子が１つしかないので、Ｄ２群１に濃縮された経路はない。このＤ２群１は、緑内障の侵襲を受けなかった眼を表す（図３Ｂ）。
【０１８６】
核遺伝子にコードされる（ミトコンドリアにコードされない）ミトコンドリアタンパク質全てのプロットを作成した。ＤＥ遺伝子を、赤色で示す。非ＤＥ遺伝子を、灰色で示す。ミトコンドリアタンパク質をコードする核由来転写産物の存在量の増加は、ミトコンドリアの代謝回転又は機能における不均衡を更に示す（図３Ｃ）。
【０１８７】
ミトコンドリア分裂遺伝子（Ｄｎｍ１及びＦｉｓ１）の発現の増加は、緑内障初期のミトコンドリアにおける前分裂事象を示す。分裂の増加は、ミトコンドリアの代謝回転及び疾患の増加と関係している。ミトコンドリア融合／分裂動態に影響を及ぼす突然変異は、一般に致死的である、又は神経学的病態の原因になる（優性視神経萎縮症、シャルコーマリーツース病を含むがこれに限定されない）（図３Ｄ）。
【０１８８】
ミトコンドリア小胞体ストレス応答に関係する遺伝子の発現が増加した。これは、アポトーシス（プログラム細胞死）に一般にしばしば先行する細胞内のストレス応答である（図３Ｅ）。
【０１８９】
ミトコンドリアに関連する経路にある遺伝子の個々のプロットを作成した。ＤＥ遺伝子を、赤色で示し、非ＤＥ遺伝子を、灰色で示す。経路全体、特に酸化的リン酸化及び活性酸素種代謝におけるミトコンドリア遺伝子の上方調節は、細胞内のエネルギー危機を指し示す点に留意すべきである（図３Ｆ）。
【０１９０】
網膜由来ミトコンドリアアポトーシス促進性分子チトクロムＣのタンパク質分析（ウェスタンブロット）は、初期の緑内障（９ヵ月）の間にチトクロムＣが遺伝子及びタンパク質レベル両方で上方調節され、１２ヵ月まで有意に上方調節されたことを示す（図３Ｇ及び図３Ｉ）。
【０１９１】
タンパク質分析は、網膜内のｅＩＦ２上方調節があったことも確認する（図３Ｈ及び図３Ｊ）。
【０１９２】
【表３−１】
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【０１９３】
【表３−２】
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【０１９４】
【表３−３】
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【０１９５】
【表４−１】
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【０１９６】
【表４−２】
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【０１９７】
【表４−３】
2018535956.tif 000009
【０１９８】
（Ｅ）ＩＰＡ分析に基づく濃縮された上位の経路
表３は、ＩＰＡ分析に基づく最も濃縮された１０個の経路を挙げる。２０１６年７月２５日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／３６６，２１１の図１は、Ｄ２マウスとＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋対照の間の濃縮された上位の経路の予備分析の結果を提供する（その開示を、参照により組み込む）。
【０１９９】
【表５−１】
2018535956.tif 000010
【０２００】
【表５−２】
2018535956.tif 000011
【０２０１】
経路分析によって、ｅＩＦ２及びｍＴＯＲシグナル伝達転写産物の濃縮が同定され（図３Ｂ及び図３Ｆ）、ｅＩＦ２シグナル伝達が、群２において最も濃縮された経路であった（対照と識別可能な最初の段階）。
【０２０２】
ミトコンドリア分裂遺伝子（Ｄｎｍ１及びＦｉｓ１）の有意な上方調節（図３Ｄ）及びミトコンドリア小胞体ストレス応答（ＵＰＲｍｔ）に対する有意な変化（図３Ｅ）があり、ミトコンドリア機能不全を更に示した。
【０２０３】
（Ｆ）形態により、ミトコンドリア異常が明らかになる
本研究において、これらマウスの網膜に対して電子顕微鏡検査（ＥＭ）を実施することによって形態学的な交替を評価した。ＥＭは、細胞内オルガネラ（ミトコンドリアなど）の形態を研究するのに利用可能な最大の分解能を現在与える。ＥＭにより、Ｄ２  ＲＧＣの樹状突起においてミトコンドリアクリステ容積が減少した機能不全のミトコンドリアが明らかになったが、対照ＲＧＣにはなかった（図４Ａ及び図４Ｂ）。これらのミトコンドリアＥＭ所見は、９ヵ月齢Ｄ２網膜におけるシナプス喪失、パターン網膜電図振幅（ＰＥＲＧ、ヒト患者及び動物両方におけるＲＧＣ活性の高感度の評価基準）の初期の減少（図１４）、及び網膜チトクロムｃレベルの増加（図３Ｇ）と一致する。
【０２０４】
示したこれらのデータは、ミトコンドリアの乱れが、遺伝性老人性緑内障においてｉｎ  ｖｉｖｏ  ＲＧＣ内に起こる最初の変化の１つであることを明らかに実証する。本発見は、培養細胞が、圧力に供された場合に、ミトコンドリア異常を受けると報告されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究と整合している。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、緑内障におけるｉｎ  ｖｉｖｏのミトコンドリア異常が、どれくらい初期に起こるかを立証できない（一方で本発見は立証する）。
【０２０５】
要約すれば、本ＲＮＡ−ｓｅｑ研究により、検出不可能な神経変性表現型がある緑内障傾向がある眼のＲＧＣにおける転写プロセシング及びミトコンドリア機能不全が明らかになった。ミトコンドリア機能不全は、標的化代謝性アッセイ及びＥＭによって確認され、初期のエネルギー危機とともに緑内障における初期の異常なミトコンドリアが示された。
【０２０６】
［実施例２］代謝的プロファイリング
疾患の前及び最初期段階（即ち、４ヵ月［前緑内障］、どんな神経変性もなしに高ＩＯＰが存在する場合には９ヵ月齢、及び大多数の眼において神経変性が存在する／重度である場合１２ヵ月）の間に、ミトコンドリア機能不全／エネルギー危機が、（対照Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋マウスと比較して）Ｄ２マウスに存在するかどうか決定するために、神経網膜の代謝プロファイリングを実施した。
【０２０７】
４、９、及び１２ヵ月齢Ｄ２並びにＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋眼由来神経網膜の更なる代謝的プロファイリングを実施した。代謝的プロファイリングを、製造業者の推奨に従って標的アッセイを使用して実施した。以下の代謝産物をプロファイルした：ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ（即ち全ＮＡＤ、ＮＡＤ［ｔ］）、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ（即ち全グルタチオン、グルタチオン［ｔ］）及びピルビン酸。有意な老人性減少が、プロファイルされた全ての代謝産物にあった。これらの代謝プロファイルの変化は、検出可能なあらゆる神経変性表現型の前にも起こり、同年齢の、緑内障ではない、対照Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋網膜にも起こる（図５Ａ〜図５Ｄ）。
【０２０８】
これらは、細胞の代謝及び細胞のストレスからの保護において鍵となる分子なので、これらの年齢依存的下降は、疾患関連ストレス及びミトコンドリア機能不全に対して網膜ニューロンを鋭敏にすると思われる。
【０２０９】
データは、ＨＩＦ−１α（乱れた酸化還元状態の間に鍵となる代謝調節因子）が、緑内障初期に神経節細胞層において誘導されたことを示す（ＲＮＡ−ｓｅｑ及び免疫染色による：図６Ａ及び図６Ｂ）。これは、ＲＧＣが、緑内障初期に代謝の乱れ（及び活性酸素種のその後の過剰な生成）を受けることを更に示唆する。
【０２１０】
ＩＯＰの上昇、ミトコンドリア機能不全、代謝物質除去（特にＮＡＤ）及び細胞のストレスの間の連結を研究するために、初期の緑内障におけるＤＮＡ損傷及びＰＡＲＰ（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ）の役割を調べた。ＰＡＲＰは、ＤＮＡ損傷に応答し、細胞内ＮＡＤの主要な消費体である。
【０２１１】
ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットは、ＲＧＣがミトコンドリアストレス及び代謝物質除去の期間を経て、潜在的に脂肪酸代謝の方へ進むことを示唆する（初期緑内障の間の網膜における脂質沈着の増加と一致する、図７Ａ及び図７Ｂ）。
【０２１２】
脂肪酸β酸化の１つ結末は、フリーラジカル／活性酸素種（ＲＯＳ）生成の増加である。従って、ＲＯＳ誘導性ＤＮＡ損傷の徴候について、網膜を更に評価した（ＲＮＡ−ｓｅｑ、図３Ｆ；及びｄｓＤＮＡ切断の高感度マーカーであるγ−Ｈ２ＡＸ免疫染色による）。γ−Ｈ２ＡＸ＋核は、Ｄ２網膜の神経節細胞層の全体に存在するが対照には存在しないことが判明し、このことは、ＤＮＡ損傷が緑内障の非常に初期に増加することを示した（図８Ａ及び図８Ｂ）。
【０２１３】
ＰＡＲＰ活性が、ＲＧＣにおいて年齢に伴って誘導されることが判明し（図９Ａ及び図９Ｂ）、このことはＤＮＡ損傷とＲＧＣ内の代謝的ストレスの増加とのつながりを提供した。本発見は、ＰＡＲＰがＤＮＡ損傷によって誘導され、主要なＮＡＤ＋消費酵素であり、ヘキソキナーゼのＰＡＲ阻害により解糖を阻害するという仮説と整合する。
【０２１４】
Ｄ２マウスモデルは、年齢が、緑内障及び他の様々な神経変性疾患の主要な危険因子であるというパラダイムを明らかに支持する。代謝プロファイルデータは、加齢が、ニューロンの主要代謝産物の除去によって損傷に対するニューロンの脆弱性をどのように増加させ得るかについて示唆する。
【０２１５】
全体として、本明細書に提示されるデータは、網膜におけるＮＡＤ及びグルタチオンの年齢依存的な下降が、緑内障及びおそらく他の老人性疾患に対してＲＧＣを鋭敏にする新しいモデルを支持する。ＲＧＣは、有害な高ＩＯＰ及び緑内障に特に影響を受けやすい。従って、年齢依存的な代謝物質下降並びにＲＧＣ内のＰＡＲＰ活性化は、細胞代謝の混乱及び持続中のＩＯＰ誘導ストレスに対する感受性の増加に至り、ＲＧＣの決定的な損傷をもたらす。
【０２１６】
Ｄ２マウスにおいて、緑内障の神経変性は、老人性であり、慢性的、非同期である。Ｄ２緑内障の発症の間、ＲＧＣは、接続性の初期の喪失、並びに代謝及び分子変化を受け、その変化の全ては、全体の神経細胞体喪失、軸索喪失及び視神経の変性の前に起こる。これらの初期の変化は、細胞代謝の確実性を低下させ、ＲＧＣが持続中のＩＯＰ誘導ストレス下にある場合、年齢に伴う細胞の不全の確率を増加させると思われる。
【０２１７】
要約すれば、ＲＮＡ−配列決定及び代謝性アッセイに基づくと、網膜内のニューロンは、変性前に代謝危機を経るということを発見した。これは、ミトコンドリア機能の方法を改変又は補充することができる代謝分子が、鍵となる役割を担うことを示唆する。これらの機能不全の過程を修正することは、緑内障の他にも利益があり、より全般的な老人性変化に関連する可能性が高い。
【０２１８】
これまでのところのデータは、ＮＡＤの下降が、緑内障に対する老人性ニューロン脆弱性にとって中心的であることをこれまで示している。
［実施例３］ＮＡＭは、軸索切断培養において神経細胞喪失を保護する
この一連の研究において、ＮＡＤレベルを増加させることにより、侵襲された眼を神経変性変化から保護できるかどうか調べた。軸索切断（即ち軸索を分断すること）は、いくつかの緑内障に見られる急性の重度の侵襲を模倣し、これらのより重度の侵襲を試験するための重要なモデルである。
【０２１９】
本研究は、代謝／エネルギー不全の確率を低下させることにより、外部ストレスに対してより強いＲＧＣを提供できるはずであるという仮説に基づく。
ミトコンドリアで作用がある多量の薬物を、軸索切断培養において試験して、Ｄ２マウスにおいて観察されるミトコンドリア機能不全／エネルギー危機を潜在的にアンタゴナイズする候補薬物を同定した。スクリーニングにより、ニコチンアミド（ＮＡＭ）が、核リモデリングプレアポトーシスの顕著な特徴である核収縮に対して最も強力な保護を与えると同定された。図２２Ａ及び図２２Ｂ。
【０２２０】
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発見は、実施例３におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの結果と整合している。
［実施例４］ＮＡＭは、Ｄ２マウスにおいて緑内障を軽減する
Ｄ２マウスの大きなコホートを使用してｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った。
【０２２１】
この実験において、視神経を３つの損傷レベル：ＮＯ（緑内障でない）、ＭＯＤ（中等度の損傷）及びＳＥＶ（重度の損傷）に分類した。
実験的なＤ２マウスを以下の群に分割し、与えた：
Ｗ＝水（標準マウス水）
ＮＡＭ又はＮＡＭＬｏ＝飲料水中の５５０ｍｇ／ｋｇ／日のＮＡＭ
初期＝初期開始＝＝プレ緑内障＝６ヵ月齢（即ち予防的）
後期＝後期開始＝緑内障中＝９ヵ月齢（マウスがすでに高ＩＯＰである場合、即ち介入的、ヒト緑内障により関係する）
ＮＡＤレベルは、Ｄ２マウスにニコチンアミド（ＮＡＭ；ＮＡＤの前駆体）を投与することによって増加した（図５Ａ、図１１〜図１４、図２０Ａ及び図２０Ｂを参照のこと）。マウスを、１２ヵ月目に視神経損傷、神経細胞体喪失、視覚機能及び軸索輸送について次いで評価した。
【０２２２】
飲料水中のＮＡＭ投与（５５０ｍｇ／ｋｇ／日、ＮＡＭＬｏ）は、１２ヵ月目までＮＡＤレベルの下降を予防した（この緑内障モデルにおいて神経変性を評価するための標準的な最終段階）（図５Ａ及び図５Ｅ）。
【０２２３】
（Ａ）ＮＡＭは、緑内障の検出可能な徴候の全てからマウスを保護する
ニューロン脆弱性仮説を支持することには、ＮＡＭは、ＩＯＰを改変しなかった（図１０Ａ〜図１０Ｄ）が、緑内障から強力に保護し、即ち、ＮＡＭは神経保護的薬剤である。重要なことに、ＮＡＭは、予防的（６ヵ月目に開始する、初期開始；コロニー内の大多数の眼においてＩＯＰ上昇の前）及び介入として（９ヵ月目に開始する、後期開始；大多数の眼が継続的なＩＯＰ上昇を有した場合）両方で保護的であった。これは、ＮＡＭが、ニューロン傷害が起こること及びニューロン傷害を、すでに侵襲されたニューロンに制限することの両方から予防できることを意味する（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。これは、疾患が症状を示す、従って検出可能になったときだけ処置が開始されることになるヒト疾患で重要である。
【０２２４】
これらのデータは、ＮＡＭを予防的に使用して、ヒト緑内障を処置できることを支持する。例えば、家族歴、眼外傷、公知の遺伝子変異のため緑内障の危険性がある、又はＩＯＰがより高いように見られるが、緑内障の損傷が存在しない場合のいずれかの対象において。
【０２２５】
（Ｂ）ＮＡＭは、網膜神経節細胞機能不全及び変性を強力に予防する
ＮＡＭは有意に、視神経変性の発病率を減少させ（図１１Ａ及び図１２Ａ）、ＲＧＣ神経細胞体喪失及び網膜薄層化を予防し（通常の方法 、例えばＯＣＴ、眼底検査によってヒトクリニックにおいて検出可能）（図１２Ａ及び図１３Ａ）、順行性軸索輸送（Ｃｔ−β追跡によって評価され；軸索機能不全及び変性の重要な初期マーカー）（図１２Ａ）及びパターン網膜電図によって評価される視覚機能（ＰＥＲＧ）（図１４及び図１５）を回復した。ＰＥＲＧは、非常に高感度であり、ヒト及び動物モデル両方において緑内障の視覚機能不全の初期の評価基準であることが示され（Ｓａｌｅｈら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４８、４５６４〜４５７２頁、２００７年）；従って、ＮＡＭは緑内障の最初期の徴候を予防する。
【０２２６】
（Ｃ）ＮＡＭは、網膜における初期のシナプス喪失及び脂質滴形成を保護する
ＮＡＭ投与はまた、このモデルにおいて起こる初期のシナプス喪失（ＳＮＡＰ−２５免疫染色）から保護し（図１６Ａ及び図１６Ｂ）、ＥＭによって評価される異常なクリステを持つ機能不全ミトコンドリアの形成を阻害するのに充分であった（図１７Ａ及び図１７Ｂ）。
【０２２７】
脂質滴形成も、高齢のＤ２網膜において予防された（図１８）。
（Ｄ）ＮＡＭはＰＡＲＰ活性化を低下させ、緑内障の分子徴候を予防する
ＮＡＭは、乱れが少ない細胞代謝を反映するＰＡＲＰ活性化、限られたレベルのＤＮＡ損傷及びＨＩＦ−１αの転写誘導も低下させる（図９Ａ、図９Ｂ、図１９Ａ及び図１９Ｂ）。ＮＡＭは、上流のエフェクターを修正すること、即ちミトコンドリア内の代謝物質除去及び酸化還元緩衝作用によってこれらの損傷機序をおそらく予防する。
【０２２８】
ＮＡＭは、ＲＮＡ−ｓｅｑによって評価した通り、処置された眼の大多数において緑内障の最初期の分子徴候さえ予防した。ＮＡＭ処置サンプルは、対照と分子的に類似しており、同年齢及び若齢対照サンプル両方の中でクラスタ形成された（図２０Ａ、図２０Ｂ及び図２１Ａ〜図２１Ｆ）。
【０２２９】
（Ｅ）ＮＡＭは、ＲＧＣにおける老人性遺伝子発現を予防する
ＮＡＭは、ＲＧＣ内の老人性遺伝子発現変化の大多数も予防した（ｎ＝ＤＥ遺伝子数；４ヵ月のＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋対９ヵ月のＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋＝４６９９、９ヵ月のＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋対ＮＡＭ＝４４３７、４ヵ月のＤ２−Ｇｐｎｍｂ＋対ＮＡＭ＝８３）。分子保護のこの驚くべき程度は、高ＩＯＰの眼における代謝の混乱及び緑内障の確率を低下させる際のＮＡＭの予想外の効力を強調する。年齢は、緑内障の病因における主要な危険因子であり、老人性変化に損傷を与えることを阻害することは、ヒト緑内障及び徐々に変性する他の神経変性疾患の多くの例において神経変性を予防する潜在性を有する。
【０２３０】
処置された眼の大部分において、ＮＡＭ投与は、ＰＥＲＧなどの初期疾患の非常に高感度の評価基準に基づく結果を含め、緑内障を完全に予防する。加えて、多くの眼及び神経変性疾患は、損傷に対する感受性を増加させる年齢依存的分子可能性のため高齢者に起こる。ＮＡＭ処置は、遺伝子発現（これらの変化の非常に高感度な評価基準）によって評価される老人性分子変化を予防する。
【０２３１】
更に、軸索変性及び神経細胞体の収縮は、いくつかの神経変性疾患における一般的な要素を表す可能性がある。ＮＡＭは、少なくとも緑内障処置において上記のデータに基づくこれらの変化を予防する。更に、上記のデータは、ＮＡＭが緑内障において軸索変性及び神経細胞体の収縮を予防することを示している。
【０２３２】
［実施例５］食物由来ＮＡＭの増加は、Ｄ２マウスにおいてＩＯＰ上昇の程度を更に小さくする
ＮＡＭは、高用量でも安全に寛容されると考えられる。いくつかの研究は、ヒトにおいて１日当たり４ｇ超のＮＡＭの用量で肝毒性の発病率を示唆した。しかしながら、これらは古くなった調製品の不純物に起因した。高用量のニコチンアミド又はナイアシンに対する患者６０００名の最近の調査において、黄疸の事例が３つしか報告されていない。これらの１例において（６ｇ／日ナイアシン）黄疸は、異なるが、同時に投与された薬物（ナイアシンではない）を止めた後に消散し、もう一方において黄疸は継続的なナイアシン処置でも消散した。高用量のニコチンアミドについて、異常肝臓酵素試験は、肝臓細胞損傷を示さないが、むしろ肝臓酵素発現の変化を示し、薬物を中止するとそれは急速に元に戻ることを示唆した。肝臓毒性の希な事例は、個々の遺伝的感受性又は他の個々の因子を反映する場合がある。非常に高い用量の長期の効果は、更なる評価を必要とするが、経験は、長期のニコチンアミド処置の利益に対する危険性の比が非常に有利になることを示唆する。
【０２３３】
緑内障の確率を更に低下させ、ＩＯＰ誘導侵襲からより多くの眼を保護する試みにおいて、Ｄ２マウスに投与されるＮＡＭ用量の増加（２０００ｍｇ／ｋｇ／日で元のより低い用量の４倍に相当する、ＮＡＭＨｉ）を使用した。
【０２３４】
意外なことに、ＮＡＭ（この用量で）は、緑内障の視神経損傷がない処置された眼の９３％で極めて保護的であると判明した（図１１Ａ）。これは、緑内障を発症する危険因子の、およそ１０分の１への低下に相当する。この単一分子を投与することによってもたらされる保護の程度は、前例がなく、全く意外である。
【０２３５】
マウスにおいて５５０ｍｇ／ｋｇ／日のＮＡＭは、明らかな神経保護的効果を実証し（ＩＯＰが改変されなかったとして）、増加させた用量２０００ｍｇ／ｋｇ／日は、ＩＯＰ上昇の程度を小さくする（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。これは、ＮＡＭが、ＲＧＣに対する更なる細胞型において老人性発病過程から保護することを示す。
【０２３６】
本データは、ＮＡＭが、ＩＯＰ上昇及び神経脆弱性の両方から保護し、従ってヒト緑内障の処置において二重の利益及び大きな臨床潜在性を有することを示す。ＩＯＰが改変されないより低い用量５５０ｍｇ／ｋｇ／日でも、ＩＯＰを低減する処置（手術又は点眼薬など）をＮＡＭ補充と組み合わせて、神経変性に対するより高い保護を得られる可能性がある。
【０２３７】
［実施例６］ＮＡＭは、緑内障の侵襲に対するＲＧＣ死の２つのモデルにおいて有効である
緑内障は、複数の侵襲に関係する複合疾患である。それには、ＲＧＣ区画（例えば、神経細胞体、軸索、樹状突起）が異なる影響を受け得る幅広い発病因子がある。機械的軸索損傷及び局所炎症は、緑内障の間のＲＧＣ変性の２つの重要な要因を示す。
【０２３８】
異なる状況におけるＮＡＭ処置の有効度を評価するために、ＲＧＣ死の２つのモデルでＮＡＭ有効性を試験した。第１の緑内障侵襲モデルは、軸索切断の組織培養モデルの使用に関係し、第２の緑内障侵襲モデルは、局所炎症を駆動し、緑内障に関係する可溶性マウスＴＮＦαの硝子体内注射の使用に関する。
【０２３９】
ＮＡＭは、ＲＧＣ神経細胞体の変性から培養網膜を強力に保護した（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。ＮＡＭは、ＰＥＲＧ振幅の喪失及びＴＮＦα注射した眼における細胞喪失からも保護した（図２３Ａ〜図２３Ｃ）。
【０２４０】
重度急性侵襲からのこれら保護及び緑内障と他の神経変性疾患との共通性を考慮すると、ＮＡＭは、緑内障及び他の老人性神経変性疾患の処置に広い意味を有する可能性がある。
【０２４１】
［実施例７］Ｎｍｎａｔ１遺伝子治療は、Ｄ２マウスにおいて緑内障を軽減する
本研究において、Ｎｍｎａｔ１、ＮＡＤ＋産生において鍵となる酵素、の過剰発現（図２５）が、ＮＡＤ＋産生細胞機構を支持することを実証する。
【０２４２】
ＣＭＶプロモーター下で単一転写産物として発現されるＮｍｎａｔ１遺伝子及びＧＦＰレポータを含有するＡＡＶ２．２ベクターで５．５ヵ月のＤ２マウス眼を一回注射した。マウスを麻酔し、ウイルスベクター（３×１０８Ｕ／ｍＬ）１．５μＬで硝子体内（即ち、レンズ及び中心網膜を避けて、硝子体腔へ４５〜６０°の角度で角膜輪部の後方）に注射した。両眼に注射した。注射の直後に、水和している点眼薬を局所的に投与し、マウスを太陽灯下で目覚めさせておいた。注射後の複数の時点で眼を臨床的に調べて、眼に損傷がないことを確認した。視覚機能判定（ＰＥＲＧによる）を、注射の前後に実施し、最初の注射及びウイルストランスフェクションの有害作用がないことを確認した。
【０２４３】
Ｎｍｎａｔ１発現（ＧＦＰ発現によって評価される）は、ＡＡＶ２．２注射後少なくとも第１週時点で検出可能であり、注射２週間後にＲＧＣにおいて強力であり（ＲＧＣの８３％超で発現される）、最終段階時点（１２ヵ月）まで強力なままであった。大多数のＲＧＣは形質導入され、網膜中のＲＧＣ細胞神経細胞体並びに外側膝状核（ＬＧＮ）及び上丘（colliculs）（ｓｕｐ．ｃｏｌ．）を含めた脳内のそれらの末端点におけるＧＦＰ蛍光によって証明されるようにウイルスで送達された遺伝子産物を発現した。
【０２４４】
Ｎｍｎａｔ１の過剰発現は、軸索及び神経細胞体喪失を予防し（図２４Ａ〜図２４Ｃ及び図２４Ｄ、上パネル）、ＲＧＣにおける軸索原形質輸送及び電気的活性（ＰＥＲＧ）を保存する（図２４Ｂ及び図２４Ｄ、下パネル）のに十分であった。緑内障の神経損傷は、処置した眼の７０％超において存在しなかった。この強い保護は、ヒト緑内障を予防するための類似の遺伝子治療戦略の使用を促す。
【０２４５】
［実施例８］Ｎｍｎａｔ１遺伝子治療及びＮＡＭを使用する併用治療
本研究において、実施例４及び実施例７に詳述される実験を組み合わせることによって、Ｎｍｎａｔ１及びＮＡＭ（ＮＡＭＬｏ）の組み合わせの治療による効果を調べた。簡潔には、マウスは、上記の通り遺伝子治療を受け、１週間のウイルス排出期間後に、マウスを通常のコロニーに戻し、正常飲料水中のＮＡＭ  ５５０ｍｇ／ｋｇ／日を投与した。
【０２４６】
この組合せは、８４％の眼に１２ヵ月齢で検出可能な緑内障の損傷がない有意な更なる保護をもたらした。これは、無処置のＤ２対照と比較してＩＯＰに誘導される緑内障の神経変性を発症する危険性の、およそ４分の１への低下に相当する。
【０２４７】
遺伝子治療と組み合わせたＮＡＭの用量増加は更に保護的である。
［実施例９］ＷｌｄＳは、Ｄ２マウスにおいて緑内障を軽減する
ワーラー変性が遅い対立遺伝子（ＷｌｄＳ）は、Ｄ２緑内障において部分的な保護を示した。ＷＬＤＳタンパク質は、修飾されたＮＭＮＡＴ１タンパク質（ＮＭＮをＮＡＤに変換する酵素）である。変異体タンパク質ＷＬＤＳを含有する細胞は、酵素活性の増加を示し、より速く又はより効率的にＮＭＮをＮＡＤに変換する。
【０２４８】
この実験において、ＷｌｄＳ突然変異があるＤ２マウスにおいて、ＮＡＭ及びＷｌｄＳの組合せは、ＷｌｄＳ単独より、緑内障に対するよりよい保護をもたらすことを実証した。ＮＡＭを投与され、ＷｌｄＳ突然変異を保有するマウスは、緑内障の損傷からの多大な保護（およそ９５％が緑内障なし）を示す。
【０２４９】
実験は、基本的に実施例４と同様に行われたが、ワーラー変性が遅い対立遺伝子（ＷｌｄＳ）を持つＤ２マウスを使用した。結果を、図１１Ｂにも示した。ＷｌｄＳ単独又はＮＡＭ単独が、Ｄ２緑内障に対する保護をもたらすことは明白であるが、ＷｌｄＳ及びＮＡＭの組合せはＷｌｄＳ単独より有意に優れている。
【０２５０】
特に、ＮＡＭ単独は、緑内障において約７０％保護的である。一方で、ＮＡＭ＋ＷｌｄＳは、緑内障においておよそ９５％保護的である。ＮＡＭ及びＮＡＭ＋ＷｌｄＳの両方とも、細胞及び視神経の全ての部分を保護する（データ不掲載）。従って、ＮＡＭ及びＷｌｄＳは、それぞれ部分的に保護的であるが、組合せは、有意な相乗効果を呈した（即ち、およそ７０％保護からおよそ９５％）。
【０２５１】
いかなる特定の理論にも束縛されないが、ＷｌｄＳ突然変異を使用することによるＮｍｎａｔ発現の増加は、より多くのＮＡＭをＮＡＤｔに変換することを可能にすると考えられ、組合せは緑内障において神経変性に対する相乗的保護をもたらす。
【０２５２】
この理論と整合して、ＤＢＡ／２Ｊマウスにおいて、年齢及び疾患に関連する低下が、ＮＡＤｔ及び他のＴＣＡ／クレブス回路要素の細胞レベルに存在する（ピルビン酸など、図５Ｄ）。従ってＮＡＤｔ（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ）の細胞レベルを、処置した動物において決定した。
【０２５３】
ＮＡＤｔ（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ）のレベルが、ＮＡＭ処置マウス及びＷｌｄＳマウスにおいて回復したことが判明した。ＷｌｄＳマウスをＮＡＭで更に処置する場合、ＮＡＤｔレベルの回復は、ＮＡＭ＋ＷｌｄＳ処置マウスにおいて相乗的である（図５Ｅを参照のこと）。
【０２５４】
この実施例の結果は、実施例８のそれと整合している。
ＮＡＤｔ（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ）レベルは、老化及び神経変性疾患において変化すると考えられる。本明細書において得られるデータは、ＮＡＭ、ＮＡＭ誘導体及び／又はＮＭＮＡＴ酵素の投与／補充が、老化及び疾患表現型の大きな範囲で保護的になり得ることを実証する。
【０２５５】
［実施例１０］ピルビン酸は、Ｄ２マウスにおいて緑内障を軽減／予防する
この実施例は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）及び／又はピルビン酸（グルコースの単純な代謝物質）との組み合わせが、ＤＢＡ／２Ｊマウスを視力喪失、軸索輸送の喪失、網膜及び視神経損傷から強力に保護することを実証する。遺伝子発現実験は、ニコチンアミドで処置したマウスが、同年齢の非緑内障のマウスよりも若齢対照マウスに対して分子的により近く一致していることを実証する。データは、ニコチンアミドが、年齢依存的な機序によってある程度働いており、緑内障に対する感受性の年齢依存的増加を遅延させ得ることを示唆する。ＮＡＭが提供する保護の規模は、完全に予想外であり、驚く程である。
【０２５６】
ピルビン酸は、それがグルコースから産生される代謝に関係する重要な単純なα−ケト酸である。ピルビン酸は、クレブス回路（クエン酸回路）に対する主要な入力であるアセチル補酵素Ａに変換される。酸素正常状態（正常状態）の間、ピルビン酸はＮＡＤＨレベルを増加させる。
【０２５７】
ピルビン酸レベルは、網膜において年齢に伴って低下し、高眼内圧による緑内障の損傷に対して網膜ニューロンを鋭敏にする（図５Ｄ）。正常飲料水中のピルビン酸を投与されたマウスは、網膜におけるピルビン酸のレベルを増加させた（図５Ｄ）。正常飲料水中のピルビン酸を投与されたマウスは、緑内障における視神経軸索変性、細胞喪失及び視覚機能不全に抵抗性であった（ＰＥＲＧによって評価した）（図１１Ｂ、図１２Ｂ、図１３Ｂ及び図１４）。
【０２５８】
上記の所見は、ＮＡＭ及びピルビン酸両方を投与されたマウスにおける効力の増加を示し、ニューロン変性を予防するためのＮＡＭとびピルビン酸処置の相乗効果を実証した。
［実施例１１］ＰＱＱは、核直径収縮及び細胞密度の低下を予防する
更なる神経保護的薬剤を試験して、神経変性疾患におけるそれらの役割も決定した。
【０２５９】
一実験において、類似の実験を設定して、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）の神経保護的機能を決定した。ＰＱＱは、ニコチンアミドと類似する、重要な酸化還元補因子である。ＰＱＱは、ミトコンドリア生合成を促進し、その神経保護的機能は、酸化防止剤としてのその機能によって決まると考えられる。図２６は、ＰＱＱが網膜組織培養において保護的であることを示す。
【０２６０】
［実施例１２］網膜におけるグルタチオンレベルは、年齢に伴って低下する
Ｎ−アセチルシステイン（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン又はＮＡＣ）は、Ｌ−システインの前駆体、グルタチオンの前駆体、強い生物学的酸化防止剤及びニューロンにおける主要な酸化還元緩衝剤である。図５Ｂのデータは、網膜中のグルタチオンレベルが、年齢に伴って低下することを示す。
【０２６１】
ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤから産生される）は、ＧＳＳＧからのＧＳＨ合成に必要である。従って、ＮＡＤ及びＧＳＨレベルは、本質的に連鎖している。
材料及び方法
１．マウス系統、育種及び管理
マウスを、これまでに報告されているように、飼料及び水を不断給餌で１４時間明／１０時間暗周期で飼育した（Ｈｏｗｅｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２１、１４２９〜１４４４頁、２０１１年）。全ての育種及び実験手順は、Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ＲｅｓｅａｒｃｈのためのＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔに従って行われた。ジャクソン研究所の機関内安全委員会及び動物実験委員会が、本研究を承認した。
【０２６２】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）、ＤＢＡ／２Ｊ（Ｄ２）及びＤＢＡ／２Ｊ−ＧｐｎｍｂＲ１５０Ｘ（Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋）系統を利用し、他の場所で詳述した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３０、８１〜８５頁、２００２年）。Ｄ２−Ｇｐｎｍｂ＋マウスは高ＩＯＰを発症せず、従って緑内障の神経変性を発症しない（Ｌｉｂｂｙら、Ｖｉｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２、６３７〜６４８頁、２００５年）。それらは、ＤＢＡ／２Ｊマウスに対して遺伝的に一致した対照である。
【０２６３】
高齢の緑内障実験の場合、マウスは、６ヵ月（予防的、ほとんど全ての眼においてＩＯＰ上昇前）又は９ヵ月（大多数の眼は、高ＩＯＰ及び分子変化があるが、検出可能な神経変性がない時）に開始して飼料及び／若しくは水中のＮＡＭが与された（Ｈｏｗｅｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２１、１４２９〜１４４４頁、２０１１年）。これらの分子変化は、ＰＥＲＧ欠損及び順行性軸索原形質輸送の喪失の前である。低用量ＮＡＭ（ＮＡＭＬｏ、５５０ｍｇ／ｋｇ／日、ＰａｎＲｅａｃ  ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を、日常的な酸性飲料水（３５０ｍＬ）に溶解し、１週間に一回変えた。高用量ＮＡＭ（ＮＡＭＨｉ、２０００ｍｇ／ｋｇ／日）の場合、ＮＡＭは、水（５５０ｍｇ／ｋｇ／日）及び飼料（１４５０ｍｇ／ｋｇ／日）の両方で利用可能であり、１週間に一回変えた。ＮＡＭ飼料は、これまでに公開されている、食味のために特別注文の西洋型の食事で調製した（ＬａｂＤｉｅｔ）（Ｇｒａｈａｍら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ６、２１５６８頁、２０１６年）。対照マウスは、ＮＡＭ添加なしで同じ食餌を受けた。この食餌は、マウスの眼の健全性に効果がない。
【０２６４】
２．ＲＧＣのＦＡＣソーティング
細胞採集の前に、全ての表面及び容積を、７０％エタノール及びＲＮａｓｅＺａｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）溶液、続けてｄＨ２Ｏで清浄にした。マウスを安楽死させ、眼を摘出し、氷冷ＨＢＳＳに直ちに入れた。網膜を、眼から氷上のＨＢＳＳ中に解剖し（４又は９ヵ月齢、ＰＰＤ染色によって軸索変性がないことを確認した、データ不掲載）、特別注文のＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ディスパーゼ（５Ｕ／ｍＬ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮａｓｅ Ｉ（２０００Ｕ／ｍＬ）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）及びＳＵＰＥＲａｓｅ（１Ｕ／μＬ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）溶液１００μＬ中に直接置いた。全ての網膜は、ＰＰＤ染色及び分析によって緑内障の軸索変性がない眼に由来した（下記の視神経判定を参照のこと）。網膜を、３７℃で２０分間インキュベートし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ中で３５０ＲＰＭで振盪し、その後２００μＬピペットを使用して穏やかに粉砕した。サンプルを、ＨＢＳＳ中の２％ＢＳＡ、ＳＵＰＥＲａｓｅ（１Ｕ／μＬ）でブロッキングし、Ｃｄ１１ｂ、Ｃｄ１１ｃ、Ｃｄ３４、Ｃｄ４５．２、ＧＦＡＰ、Ｔｈｙ１．２並びにＤＡＰＩに対するコンジュゲート抗体で染色した。このカクテルにより、ＦＡＣＳの間に他の網膜細胞型を正確に除去できた。
【０２６５】
ＦＡＣＳを、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。Ｔｈｙ１．２＋（及び他の全てのマーカーについて陰性）ＲＧＣを、緩衝液ＲＬＴ＋１％  β−ＭＥ  ３００μＬ中にソートし、ボルテックスし、更なる加工まで−８０℃で凍らせた。
【０２６６】
３．ＲＮＡ−配列決定
ＦＡＣソートされたＲＧＣサンプルを氷上で解凍し、ＲＬＴ緩衝液中で注射器でホモジナイズした（総容積３００μＬ）。トータルＲＮＡを、製造業者の手順に従ってＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、任意でＤＮａｓｅ処理工程を含めて単離し、品質をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して評価した。濃度を、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して決定した。増幅したｄｓｃＤＮＡライブラリを、Ｎｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖを使用して作製した。ＳＰＩＡ  ｄｓｃＤＮＡを、Ｄｉｏｇｅｎｏｄｅ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒを使用して長さ３００ｂｐに剪断した。品質管理を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ及びＤＮＡ  １０００チップアッセイを使用して実施した。
【０２６７】
産生したライブラリサイズを、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎキット／Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ／ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＰＣＲを使用して分析した。ライブラリをバーコード化し、プールし、ＨｉＳｅｑ  ２５００シーケンサ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で１レーン当たり６サンプルを配列決定し、サンプル当たりリード深度３０００００００〜３５００００００個を得た。
【０２６８】
４．差異的な遺伝子発現及び経路分析
サンプルを、特別注文の品質管理Ｐｙｔｈｏｎ  Ｓｃｒｉｐｔによって品質管理分析に供した。塩基の７０％が塩基クオリティスコア≧３０を有するリードを、更なる分析のために保持した。リード整列化を、ＴｏｐＨａｔ  ｖ２．０．７（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １４、Ｒ３６頁、２０１３年）を使用して実施し、発現評価を、ＤＢＡ／２Ｊマウスゲノム（ｂｕｉｌｄ−ｍｍ１０）に対して与えられた注釈及び初期設定パラメータを用いてＨＴＳｅｑ（Ａｎｄｅｒｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３１、１６６〜１６９頁、２０１５年）を使用して実施した。Ｂａｍｔｏｏｌｓ  ｖ １．０．２（Ｂａｒｎｅｔｔら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７、１６９１〜１６９２頁、２０１１年を使用して、マッピング統計を算出した。
【０２６９】
ＲＵＶＳｅｑを使用して一括修正し、外れ値サンプル及び２つより多いサンプルにおいて５つ未満のリードの遺伝子を除去することによって低発現遺伝子を除去した後、群間の差異的遺伝子発現分析を、ｅｄｇｅＲ  ｖ３．１０．５（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６、１３９〜１４０頁、２０１０年）を使用して実施した。標準化を、トリム平均のＭ値（ＴＭＭ）を使用して実施した。
【０２７０】
教師なしＨＣを、Ｒで実施した（１ｃｏｒ、スピアマンのρ）。全ての群にわたって合計７２個のサンプルを成功裏に増幅し、配列決定し、ＨＣパイプラインの後、９つのサンプルを外れ値として除去した。複数の試験に対する調整を、偽発見率（ＦＤＲ）を使用して実施した。遺伝子は、ＦＤＲ＜０．０５で有意に差異的な発現と見なした。
【０２７１】
老人性変化を研究するために、比較を、４ヵ月及び９ヵ月のＤ２−Ｇｐｍｎｂ＋サンプルとＮＡＭＬｏサンプルの間で行った。経路分析のために、ＱＩＡＧＥＮのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、有意に差異的に発現される遺伝子全体にわたるネットワークを生成した。有意に差異的に発現された遺伝子のリストを、ＩＰＡにアップロードし、ＩＰＡ知識ベースを使用してマウスＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌｓにマップした。これらの対象を、ＩＰＡ知識ベースに含有される情報から開発される標準経路上へ次いで重層することになる。ＩＰＡの内蔵ネットワーク得点アルゴリズムを使用して、生成されたネットワークをランク付けすることになる。
【０２７２】
５．代謝的表現型検査
ＧＳＨ／ＧＳＳＧ及びＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ定量化のために、網膜を分離し（上記のように）、化合物を製造業者の指示に従って測定した（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ；ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）。結果を、キットの標準を使用することによって生成した標準曲線により算出した。各サンプルに対する最終的な代謝物質濃度を、ブラッドフォードアッセイによって測定した総タンパク質濃度に対して標準化した。
【０２７３】
６．全網膜移植片培養
マウスを安楽死させ、眼を摘出し、氷冷ＨＢＳＳに直ちに入れた。網膜を、眼から氷上のＨＢＳＳ中に解剖し、神経節細胞層を上にして細胞カルチャーインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に平らに載せ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、１％ペニシリンストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍＬ）、１％グルタミン（１００×）、１％  Ｎ−２（１００×）及び１％  Ｂ−２７（５０×）（全てＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する組織培養培地中に浸漬した。
【０２７４】
薬物処置網膜の場合、組織培養培地を、上記のように作り、以下の化合物：β−ＮＡＤ、ＮＡＭ（ＰａｎＲｅａｃ  ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）、β−ＮＭＮのうち１つ（別段の指示がなければ全てＳｉｇｍａ）で補充した。網膜を、３７℃、４％  ＣＯ２で、５日間６ウェルプレート中でインキュベートし、その後４％  ＰＦＡに固定し、ＤＡＰＩで染色した。（無処置の「０日目」対照の場合、網膜を解剖し、４％ＰＦＡ中にそのまま置いた。）網膜は、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒで撮像した。
【０２７５】
７．可溶性マウスＴＮＦα注射
遅延性網膜神経節細胞変性を誘導するために、可溶性マウスＴＮＦα（１ｎｇ／μＬ）を、前述の通り硝子体内に（intravitrally）注射した（Ｎａｋａｚａｗａら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６、１２６３３〜１２６４１頁、２００６年）。１０週齢のＢ６マウスを、ＴＮＦα注射の前に２週間ＮＡＭで前処置し、ＰＥＲＧを、８、１０及び１２週齢で実施した。１２週目にマウスを屠殺し、ＲＧＣ計数を実施した。
【０２７６】
８．臨床表現型決定
Ｄ２マウスにおけるＩＯＰ上昇は、色素分散虹彩疾患の後に続く。全ての実験において、変異体又は薬物処置マウスにおける虹彩疾患及び眼内圧の進行を、前述のとおり対照Ｄ２マウスと比較した（Ｊｏｈｎら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３９、９５１〜９６２頁、１９９８年）。各実験において、虹彩疾患及び眼内圧を評価した。
【０２７７】
虹彩疾患を、６ヵ月齢で開始して実験完了まで２ヵ月間隔で評価した。
眼内圧を、８．５〜９ヵ月で開始して実験完了まで４５日間隔で測定した。
９．パターン網膜電図（ＰＥＲＧ）
これまでに報告されているように、ＰＥＲＧを、鼻口部から皮下記録した。簡潔には：ＬＥＤパネルで生成されるパターン刺激（格子０．０５周期／度、コントラスト１００％）を、およそ１Ｈｚわずかに異なる周波数で別々に各眼に見せた。波形を、非同期加算平均方法を使用して読み取った（Ｃｈｏｕら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５５、２４６９〜２４７５頁、２０１４年）。
【０２７８】
マウスを、ケタミン／キシラジン（Ｓａｖｉｎｏｖａら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔ  ２、１２頁、２００１年）を使用して麻酔し、体温を、直腸検温器によって監視されるフィードバックコントロールされた加熱台上で３７℃に維持した。
【０２７９】
１０．緑内障の損傷の視覚神経判定及び決定
視神経の加工及びパラフェニレンジアミン（ＰＰＤ）による染色は、公開されている（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｙｅ．、Ａｎａｔｏｍｙ、ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、２００２年）。ＰＰＤは、全ての軸索のミエリン鞘を染色するが、損傷を受けた軸索だけの軸索原形質を暗く染色する。視神経損傷の非常に高感度の評価基準を提供することが、確立されている（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｙｅ．、Ａｎａｔｏｍｙ、ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、２００２年）。
【０２８０】
簡潔には、視神経の頭蓋内部分を、ＲＴで４８時間４％ＰＦＡに固定し、加工し、プラスチックに包埋した。強膜の後面から１ｍｍまでの領域内からの視神経の区分を、切片化し（１μｍ厚切片）、ＰＰＤで染色した。一般に、３０〜５０枚の切片を、各神経からとる。
【０２８１】
損傷レベルを決定する場合は、各神経の複数の切片を考慮した。視神経を分析し、３つの損傷レベルの１つを有するように決定した：
（１）損傷なし又は初期の損傷（ＮＯＥ）−５％未満の軸索が損傷を受けている及びグリオーシスでない。このレベルの損傷は、同じ年齢及び性別の非緑内障のマウスに見られ、緑内障によるものではない。これらの眼のいずれも緑内障の神経損傷を呈しないが、これらの眼のいくつかは、神経変性に先行する初期の分子変化を有するので、この損傷レベルは、緑内障でない又は初期の緑内障と呼ばれる。これらの分子変化は、遺伝子発現研究によって検出することができる（Ｈｏｗｅｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２１、１４２９〜１４４４頁、２０１１年）。本明細書において代謝的、ミトコンドリア、遺伝子発現変化について論ずる場合、これらの初期の分子変化があるが、変性がない眼を、初期の緑内障であると見なす。
【０２８２】
（２）中等度損傷（ＭＯＤ）−平均３０％の軸索喪失及び初期のグリオーシス。
（３）重度（ＳＥＶ）→５０％の軸索喪失及び顕著なグリオーシスがある損傷。
１１．順行性軸索輸送
マウスを、ケタミン／キシラジンを使用して麻酔し、ＡＦ４８８又はＡＦ５９４コレラ毒素サブユニットＢ（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２μＬで硝子体内に注射した。７２時間後、マウスを麻酔し、４％ＰＦＡ心灌流によって安楽死させた。脳及び眼を、４％ＰＦＡ中で更に２４時間後固定し、ＰＢＳ中の３０％ショ糖で終夜（ＯＮ）凍結防止し、ＯＣＴ凍結包埋（cryoembedded）し、２０μｍで切片化した。ＡＦ４８８を、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ又はＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒを使用して可視化した。
【０２８３】
１２．組織検査
免疫蛍光染色の場合、マウスを、頚椎脱臼によって安楽死させ、その眼を摘出し、４％ＰＦＡ中にＯＮ置いた。網膜を解剖し、スライド上へ平らに載せ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで１５分間透過処理し、ＰＢＳ中の２％  ＢＳＡでブロッキングし、一次抗体中でＲＴでＯＮ染色した（抗体のリストについては下記参照）。
【０２８４】
一次抗体インキュベーションの後、網膜をＰＢＳで５回洗浄し、二次抗体でＲＴで４時間染色した。スライドを次いでＰＢＳで更に５回を洗浄し、ＤＡＰＩで１５分間染色し、フルオロマウントで封入し、カバーガラスを被せ、マニキュアで密閉した。
【０２８５】
網膜切片の場合、眼を３０％ショ糖中でＯＮ凍結防止し、ＯＣＴで凍結させ、１８μｍで凍結切片にした。スライドを室温に暖め、上記の手順に従った。網膜を、低分解能カウントでＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒで撮像した。網膜切片を、高分解能像でＬｅｉｃａ  ＳＰ８で撮像した。
【０２８６】
ニッスル染色の場合、凍結切片を室温に暖め、１：１アルコール：クロロホルム中に置きＯＮ、連続アルコール勾配によって再水和した。スライドを、蒸留水で一回洗浄し、蒸留水中の０．１％クレシルバイオレットで１５分間染色する前に９５％アルコールで分別し、１００％アルコールで脱水し、キシレンで透徹した。スライドを、上記のように調製した。ニッスル染色した網膜切片を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ２００を使用して撮像した。
【０２８７】
オイルレッドＯ染色の場合、スライドを室温に暖め、６０％イソプロパノールで速やかに洗浄し、オイルレッドＯ及びヘマトキシリン中でＲＴで１５分間インキュベートし、６０％イソプロパノールで再洗浄し、封入し、カバーガラスを被せた。オイルレッドＯで染色した網膜切片を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ２００を使用して撮像した。
【０２８８】
１３．ウェスタンブロッティング
マウスを、頚椎脱臼によって安楽死させ、眼を摘出し、氷冷ＨＢＳＳに直ちに入れた。網膜を、眼からＨＢＳＳ中に解剖し、ＲＩＰＡ緩衝液に直接入れ、ホモジナイズした。タンパク質抽出物を、成型ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ｉＢｌｏｔ  ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＶＤＦ膜へ移した。膜を、０．１％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％ミルク又は５％  ＢＳＡ中でブロッキングし、抗体インキュベーションを、ブロッキング溶液中で実施した。抗体染色を、ＥＣＬを使用して検出した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイによって評価し、デンシトメトリーを使用してハウスキーピングタンパク質に対して標準化した。
【０２８９】
１４．電子顕微鏡観察
マウスを安楽死させ、眼を摘出し、次いでＳｍｉｔｈ−Ｒｕｄｔ（０．１Ｍリン酸緩衝液中の０．８％ＰＦＡ及び１．２％グルタルアルデヒド（gluteraldehyde））中でＯＮ固定した。角膜及びレンズを、解剖し、残りの後部アイカップ（eye-cup）（網膜及びＯＮＨを含有する）を、２％水性四酸化オスミウムで後固定し、エチルアルコールで脱水した。サンプルを、次いで浸潤させ、Ｅｍｂｅｄ  ８１２／Ａｒａｌｄｉｔｅ樹脂（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に平らに載せ、正面切片にさせた。ブロックを、６０℃で４８時間重合させ、９０ｎｍミクロトーム切片を、３００メッシュ銅グリッド上に切断（Ｌｅｉｃａ  ＵＣ６、Ｌｅｉｃａ）した。グリッドを、１％水性の酢酸ウラニル／レイノルドのクエン酸鉛で染色し、ＪＥＯＬ  ＪＥＭ  １２３０  ＴＥＭで視た。画像を、ＡＭＴ  ２Ｋカメラで採取した。
【０２９０】
１５．遺伝子治療
ウイルスで送達される遺伝子治療の場合、マウスを麻酔し（上記の通り）、ＧＦＰレポータと共にＣＭＶプロモーター下にあるＡＡＶ２．２マウスＮｍｎａｔ１  １．５μＬ（３．１×１０１０ｇｃ／ｍＬ）で硝子体内に注射した（主文においてＮｍｎａｔ１と称する；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ＃ＡＤＶ−２６５８８０）。マウスを、ＢＳＬ２研究室において５．５ヵ月齢で注射し、２週間後に通常のマウスコロニーへ移動させた。
【０２９１】
更なるＮＡＭ処置を受けるＮｍｎａｔ１マウスの場合、マウスに、６ヵ月齢から正常飲料水中のＮＡＭ  ５５０ｍｇ／ｋｇ／日を与えた。マウスを、１２ヵ月に安楽死させた。
１６．抗体
上の実施例で使用した抗体を、以下に記載する。ＩＦ：免疫蛍光。Ｗｂ：ウェスタンブロット
【０２９２】
【表６】
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【０２９３】
１７．統計分析
サンプルサイズ（眼の数、ｎ）を、各図の凡例に示す。グラフ化及び統計分析を、Ｒで実施した。スチューデントｔ検定を、定量的プロットにおけるペアワイズ分析に使用し、エラーバーは、特に明記しない限り平均値の標準誤差のことを指す。
【０２９４】
全ての引用文献を参照により組み込む。本発明の特定の実施形態について前述したが、それらに対する多くの均等物、修飾形態、置換形態及び変形形態を、添付の請求項に定義される本発明の精神と範囲から逸脱することなく得ることができることは、当業技術者に認められることになる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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