(57)【要約】本発明には、内因性心臓神経系を介して、不整脈及び心機能を測定、監視及び治療するためのシステム及び方法が含まれる。本システム及び方法は、健康な、そして患部心筋組織の両方と関係している内因性心臓神経系の神経シグネチャーを比較して、どのシグナル伝達が、患部心臓組織により影響を受けたかについて、求心性内因性心臓ニューロンを同定して標的化する。したがって、患部心筋から内因性心臓神経系、胸腔内心外性神経節、及び心軸索の高次中枢への、求心性神経シグナルへの変調方法を、虚血性心疾患を緩和する新規の治療的アプローチとして使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの内因性心臓ニューロンからの神経シグネチャーを示す複数の電気シグナルを測定することと、
前記測定したシグナルを、内因性心臓神経系の参照神経シグネチャーと比較することと、
前記測定したシグナルと前記神経シグネチャーとの差が閾値を超えるか否かを測定することと、
を含む、対象における虚血性心疾患の評価方法。
【請求項２】
前記閾値が超過した場合に、前記対象を少なくとも１つの治療用要素で治療することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの治療用要素は、薬剤または生物学的作用物質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの治療用要素は、対象の心筋組織の領域、または１つ以上の内因性心臓ニューロンへの電気的刺激である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、内因性心臓ニューロンの母集団において、相対量の求心性ニューロンを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記参照神経シグネチャーは前記対象に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記参照神経シグネチャーは、性別、年齢、活性レベル、食事、先天性欠損、遺伝的形質、及び代謝状態からなる群から選択される少なくとも１つの共通の特徴を有する対象母集団を基準にしている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記測定した神経シグネチャーは、内因性ニューロンの自発性発火レート、心周期段階中の活性、ニューロン間の時間的関係、機械感覚性入力に対する応答、交感神経系または副交感神経系の刺激に対する応答、心臓負荷条件の変化、心外膜ペーシングに対する応答、化学受容体刺激に対する応答、及び侵害受容性入力に対する応答からなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
患部心筋を有する対象の治療方法であって、
前記対象の心臓において患部心筋組織を同定することと、
前記患部心筋組織からの少なくとも１つの求心性内因性心臓ニューロンシグナル伝達を同定することと、
前記同定した求心性内因性心臓ニューロンからの前記シグナル伝達を修正することと、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記患部心筋組織からの少なくとも１つの求心性内因性心臓ニューロンシグナル伝達を同定することは、求心性ニューロンから測定した電気シグナルを、前記内因性心臓神経系の神経シグネチャーと比較することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記同定した求心性内因性心臓ニューロンからの前記シグナル伝達を修正することは、前記求心性内因性心臓ニューロンに電気的刺激を印加することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、前記対象において虚血性心疾患を監視及び治療するための閉じたループ系で使用される、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月２１日に出願された米国特許仮出願番号第６２／１５０，４６３号に対する優先権を主張し、本明細書中にその内容全体が参考として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
心室性不整脈による心臓突然死（ＳＣＤ）は、世界での死亡率の主要な原因であり、毎年、推定で４００〜５００万人の死亡がもたらされている（Ｃｈｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，５１（３）：２１３−２８）。心筋梗塞（ＭＩ）の後の自律神経系（ＡＮＳ）調節不全は、不整脈の発生と心不全の進行に決定的な役割を果たす（Ｖａｓｅｇｈｉ  ａｎｄ  Ｓｈｉｖｋｕｍａｒ，２００８，Ｐｒｏｇ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉｓ，５０（６）：４０４−１９；Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｚｉｐｅｓ，２０１４，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；１１４（６）：１００４−２１）。心軸索（ｃａｒｄｉａｃ  ｎｅｕｒａｘｉｓ）は、心臓の電気的及び機械的機能のダイナミックな制御を担い（Ａｒｍｏｕｒ，２００４，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ；２８７（２）：Ｒ２６２−７１；Ａｒｄｅｌｌ，２００４，Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：１８７−２１９）、心臓の高さ（Ａｒｍｏｕｒ，２００８，Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ；  ９３（２）：１６５−７６；Ｂｅａｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ；５９１（Ｐｔ  １８）：４５１５−３３）から島皮質の高さ（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｐｋｉｎｓ，１９９４，Ｎｅｕｒｏｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：３０９−４２；Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，１０４（１６）：６８１８−２３）に位置するニューラルネットワークが関係する。
【０００３】
臓器レベルでは、内因性心臓神経系（ＩＣＮＳ）は、神経節及び相互接続神経の分布ネットワークを含む（Ａｒｍｏｕｒ，２００８，Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ；９３（２）：１６５−７６）。ＩＣＮＳは、高次脊髄軸中枢（胸腔内心外性神経節、脊髄、脳幹、及び毛皮質）と共に、一心拍あたりで心機能を制御する（Ａｒｍｏｕｒ，２００４，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．；２８７（２）：Ｒ２６２−７１；Ａｒｄｅｌｌ，２００４，Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；１８７−２１９；Ｂｅａｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．；５９１（Ｐｔ  １８）：４５１５−３３）。ＩＣＮＳは、高次中枢とは独立した、心腔内反射制御に必要な全ての神経要素、即ち、感覚ニューロン、アドレナリン作動性及びコリン作動性の遠心性節後ニューロン、ならびに介在する局所回路ニューロン（ＬＣＮ）（Ａｒｍｏｕｒ，２００８，Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ；９３（２）：１６５−７６）を含有する（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．；６９（６）：１７６９−８１）。最大の部分母集団であるＬＣＮは、ＩＣＮＳ内のニューロン間で生じる神経節内、及び神経節間通信を引き起こし、局所情報処理を担っている（Ａｒｍｏｕｒ，２００８，Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３（２）：１６５−７６）。
【０００４】
ＭＩ等の心臓病は心筋に悪影響を及ぼし、関係する神経構成要素に影響を与える（Ｖｒａｃｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．；２２（２）：１３８−４６；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０１（１６）：１９６０−９；Ａｊｉｊｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｈｅａｒｔ  Ｒｈｙｔｈｍ．；Ｋｅｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；４５（１５）：６３８−４４）。心臓障害に関する神経シグナルは心臓の求心性神経により、複数のレベルの心軸索に変換される（Ａｒｍｏｕｒ，１９９９，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．；４１（１）：４１−５４）。ＭＩ後での心軸索内での神経リモデリング、及びその感覚シグナルの処理（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．；６４（４）：７４５−５５）は、神経ホルモン活性化（Ｚｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｃｌｉｎｉｃｓ．；８（１）：８７−９９）、及びＳＣＤの可能性に寄与する。虚血性心疾患を患うヒトの内因性心臓（ＩＣ）ニューロンは、封入対及び小胞を含有し、ならびに、樹枝状結晶及び軸索での退行性変化を示す（Ｈｏｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｈｅ  Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｒｅｃｏｒｄ．；２５９（４）：４２４−３６）。慢性ＭＩ動物に由来するＩＣニューロンの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞内研究は、向上した興奮性、変化したシナプス有効性、及び、神経化学表現型の適合性変化を示す（Ｈａｒｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ａｕｔｏｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ；１８１（４−１２））。しかし、治療された梗塞の文脈においては、ｉｎ  ｖｉｖｏの神経シグナル伝達におけるこのような変化の機能的効果は、直接的には記録されておらず、知識も限定されている。
【０００５】
必要とされているのは、ＩＣＮＳ内での形態的及び表現型のリモデリングの徹底的な調査、ならびに、求心性及び遠心性入力（交感神経及び副交感神経）のＩＣＮＳ処理のリモデリング評価、ならびに、ＬＣＮによるこれらの統合である。心臓ペーシングの効果もまた、更なる再検討が必要である。ペーシングは、デバイスを用いて、患者における心室ペーシングを最小限に抑えるための方法がなぜ、虚血性心疾患を患う患者に生残の有益性を付与することが示されているのかという、機械的視座からの理解に直接関係がある（Ｗｉｌｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，２００２，ＪＡＭＡ．；２８８（２４）：３１１５−２３；Ｓｗｅｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．；１０７（２３）：２９３２−７）。
【０００６】
病気の監視、及び、ＡＮＳを標的化し、心臓病の進行を緩和するための治療法の効果の監視を補助するための、虚血性心疾患と関係する、逆の神経シグネチャーを特徴決定するためのシステム及び方法の必要性が存在している。本発明は、この必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、本発明は、対象における、虚血性心疾患の評価方法を提供する。本方法は、少なくとも１つの内因性心臓ニューロンから、神経シグネチャーを示す複数の電気シグナルを測定することと；測定したシグナルを、内因性心臓神経系の参照神経シグネチャーと比較することと；測定したシグナルと神経シグネチャーとの差が閾値を超えるか否かを測定することとを含む。
【０００８】
一実施形態では、本方法は、閾値を超えた場合に、対象を少なくとも１つの治療用要素で治療することを含む。一実施形態では、少なくとも１つの治療用要素は、薬剤または生物学的作用物質である。一実施形態では、少なくとも１つの治療用要素は、対象の心筋組織の領域、または１つ以上の内因性心臓ニューロンへの電気的刺激である。
【０００９】
一実施形態では、本方法は、内因性心臓ニューロンの母集団において、相対量の求心性ニューロンを検出することを含む。
【００１０】
一実施形態では、参照神経シグネチャーは対象に特異的である。一実施形態では、参照神経シグネチャーは、性別、年齢、活性レベル、食事、先天性欠損、遺伝的形質、及び代謝状態からなる群から選択される少なくとも１つの共通の特徴を有する対象母集団を基準にしている。
【００１１】
一実施形態では、測定した神経シグネチャーは、内因性ニューロンの自発性発火レート、心周期段階中の活動、ニューロン間の時間的関係、機械感覚性入力に対する応答、交感神経系または副交感神経系の刺激に対する応答、心臓負荷条件の変化、心外膜ペーシングに対する応答、化学受容体刺激に対する応答、及び侵害受容性（ｎｏｃｅｐｔｉｖｅ）入力に対する応答からなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを含む。
【００１２】
一態様では、本発明は、患部心筋を有する対象の治療方法を提供する。本方法は、対象の心臓内の患部心筋組織を同定することと；患部心筋組織から少なくとも１つの求心性内因性心臓ニューロンシグナル伝達を同定することと；同定した求心性内因性心臓ニューロンからのシグナル伝達を修正することと、を含む。
【００１３】
一実施形態では、患部心筋組織から少なくとも１つの求心性内因性心臓ニューロンシグナル伝達を同定することは、求心性ニューロンから測定した電気シグナルを、内因性心臓神経系の神経シグネチャーと比較することを含む。
【００１４】
一実施形態では、同定した求心性内因性心臓ニューロンからのシグナル伝達を修正することは、求心性内因性心臓ニューロンに電気的刺激を印加することを含む。
【００１５】
一実施形態では、本方法は、対象において虚血性心疾患を監視及び治療するための閉じたループ系で使用される。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態についての以下の詳細の説明は、添付図面と共に読んだ場合に、より理解されるであろう。本発明を表す目的のために、図面では、本明細書で実施した研究を支持する代表的実施形態及び実験データを示す。しかし、本発明は、図面に示す実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことが理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の例示的方法のフローチャートである。
【図２】本発明の別の例示的な方法のフローチャートである。
【図３Ａ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照と心筋梗塞（ＭＩ）動物における、腹側心室間神経叢（ＶＩＶ  ＧＰ）からの、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色したニューロンを示す顕微鏡写真である。
【図３Ｂ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、内因性心神経サイズ分布のヒストグラムである。
【図３Ｃ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、平均ＩＣ神経サイズである。
【図３Ｄ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）で染色したＶＩＶ  ＧＰを示す顕微鏡写真である。ＣｈＡＴは、アセチルコリンの合成を触媒し、推定のコリン作動性ニューロンを同定するために使用した。
【図３Ｅ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、ＣｈＡＴ陽性ＩＣニューロンの割合である。
【図３Ｆ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）で染色したＶＩＶ  ＧＰを示す顕微鏡写真である。ＴＨは、ノルエピネフィリンの合成における律速段階を触媒し、推定のアドレナリン作動性ニューロン（黒の矢印）を同定するために使用した。
【図３Ｇ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、ＴＨ陽性ＩＣニューロンの割合を示す。
【図３Ｈ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、血管作動小腸ペプチド（ＶＩＰ）で染色したＶＩＶ  ＧＰを示す顕微鏡写真である。ＶＩＰは、心機能の重要なモジュレーターであり、推定の求心性ニューロンのマーカーである。
【図３Ｉ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、ＶＩＰ陽性ニューロンの割合を示す。
【図３Ｊ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。慢性前頂（ａｎｔｅｒｏａｐｉｃａｌ）ＭＩを患うブタ患者の画像である。梗塞瘢痕（白の破線痕）に対するＶＩＶ  ＧＰの位置を示す。
【図３Ｋ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの形態的及び表現型のリモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対応する、心臓の短軸心臓磁気共鳴画像を示す。白の矢印は、瘢痕組織により生じた、遅れた超増強領域を示す。全ての顕微鏡写真において、スケールバーは５０μｍである。
【図４Ａ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの異なった形態的及び神経化学的リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。右心房神経叢（ＲＡ  ＧＰ）、右結腸縁動脈神経叢（ＲＭＡ  ＧＰ）、背面心室間神経叢（ＤＩＶ  ＧＰ）、及びＶＩＶ  ＧＰの位置を示す概略図である。ＲＡ  ＧＰ及びＲＭＡ  ＧＰはそれぞれ、右心房及びＲＶに優位的に影響を及ぼすが、ＤＩＶ  ＧＰ及びＶＩＶ  ＧＰはＬＶに対して、優位的に影響を及ぼす。
【図４Ｂ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの異なった形態的及び神経化学的リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物において研究した神経叢からの、Ｈ＆Ｅで染色したニューロンを示す顕微鏡写真である。
【図４Ｃ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの異なった形態的及び神経化学的リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における神経叢での、平均ＩＣ神経サイズを示す。
【図４Ｄ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの異なった形態的及び神経化学的リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、ＶＩＰで染色した神経叢を示す顕微鏡写真である。
【図４Ｅ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの異なった形態的及び神経化学的リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における神経叢での、ＶＩＰ陽性ニューロンの割合を示す。全ての顕微鏡写真において、スケールバーは５０μｍである。
【図５Ａ】内因性心臓神経の記録に使用される実験的方法に関する、一連の画像である。神経活動が記録されたＶＩＶ  ＧＰからの位置を示す概略図である。
【図５Ｂ】内因性心臓神経の記録に使用される実験的方法に関する、一連の画像である。ＶＩＶ  ＧＰに含有される、複数の個別のニューロンのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を記録するために使用した、１６チャネル線状微小電極アレイ（ＬＭＡ）の概略図である。
【図５Ｃ】内因性心臓神経の記録に使用される実験的方法に関する、一連の画像である。単一チャネルのＬＭＡから同定した、２つのＩＣニューロン（ＩＣＮ）の活動を示す代表的な結果である。
【図５Ｄ】内因性心臓神経の記録に使用される実験的方法に関する、一連の画像である。心周期と関係する、パネル５ＡのＩＣニューロンの基本活性を示す。心収縮期の間に、両方のニューロンの活性が優位的に集まることに注意されたい。ＥＣＧ＝心電図；ＬＶＰ＝左室圧。
【図６Ａ】内因性心臓ニューロンの分析及び機能分類に関する一連の画像である。対照の心臓における５つのＩＣニューロンから記録した、スパイキング活性を示す。垂直の点線は、左心室（ＬＶ）心外膜の機械的刺激の開始と終了を示す。ニューロンの部分母集団は、ベースラインからの増加（ＩＣＮ２）、低下（ＩＣＮ３、４及び５）、または、活性の無変化（ＩＣＮ１）を示したことに注意されたい。有意水準の、誘発された活性の変化を、各結果の右側に示す。方法にて記載した分析に基づいてＰ値を導出した。
【図６Ｂ】内因性心臓ニューロンの分析及び機能分類に関する一連の画像である。ＭＩ動物での心臓血管刺激に対応する、ＩＣ神経活性における、誘発された変化の一覧である。水平の列は、所与の刺激（垂直の列）に対する、個別のニューロンの応答を表す。緑は、活性の有意な増加（ｐ＜０．０５）を示し、赤は、有意な低下（ｐ＜０．０５）を示す。
【図６Ｃ】内因性心臓ニューロンの分析及び機能分類に関する一連の画像である。図６Ｂに示すＩＣニューロンの機能分類である。心臓血管刺激に対する応答に基づいて、ニューロンを求心性、遠心性、または収束性に分類した。求心性ニューロンは、単に右（ＲＶ）もしくは左心室（ＬＶ）の心外膜機械的刺激；下大静脈（ＩＶＣ）の一時的閉塞；及び／または下行胸大動脈の一時的閉塞に応答したものとして規定した。遠心性ニューロンは単に、左（ＬＣＶ）もしくは右頸部迷走神経（ＲＣＶ）の電気刺激；左（ＬＳＧ）もしくは右星状神経節（ＲＳＧ）の電気刺激；及び／または両側頸動脈（ＢＣＡ）の一時的閉塞に応答したものとして規定した。求心性及び遠心性入力の両方の活性に応答したニューロンを、収束性と規定した。
【図７Ａ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの機能的または時間的特徴の全体的な変化を誘発しないことを示す一連の画像である。対照とＭＩ心臓で同定されたＩＣニューロンのベースライン発火率のヒストグラムである。
【図７Ｂ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの機能的または時間的特徴の全体的な変化を誘発しないことを示す一連の画像である。対照とＭＩ心臓における、ＩＣニューロンの機能分類である。
【図７Ｃ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの機能的または時間的特徴の全体的な変化を誘発しないことを示す一連の画像である。対照とＭＩ心臓における、ＩＣニューロンの心周期が関係する周期性を示す。ニューロンの亜集団は、拡張期関連活動、収縮期関連活動、拡張期及び収縮期関連活動、または確率的挙動を示したことに注意されたい。ＭＩは、ニューロンの機能的または時間的特徴を有意に変えなかった。カイ二乗検定を、群間での有意性を測定するために使用した。
【図８Ａ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの求心性及び遠心性リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。ＩＣニューロンが、ＲＶまたはＬＶから生じる機械感覚性の求心性入力を変換する能力を評価するために、心外膜機械的刺激を使用したことを示す。
【図８Ｂ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの求心性及び遠心性リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ心臓におけるＬＶの心突部（梗塞領域）と、ＲＶ及びＬＶ（境界及び遠隔領域）から生じる、機械感覚的入力を受信するＩＣニューロンの割合を示す。
【図８Ｃ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの求心性及び遠心性リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ心臓における、一過性ＩＶＣまたは大動脈閉塞に応答するＩＣニューロンの割合を示す。ＩＶＣ及び大動脈閉塞を使用して、それぞれ前負荷及び後負荷における変化を、ニューロンが変換することができる能力を評価した。
【図８Ｄ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの求心性及び遠心性リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ心臓における、複数の求心性入力を変換するＩＣニューロンの割合を示す。
【図８Ｅ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの求心性及び遠心性リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ心臓において、それぞれ頸部迷走神経刺激（ＶＮＳ）及び星状神経節刺激（ＳＧＳ）により評価した、副交感神経及び／または交感神経節前ニューロンから遠心性入力を受信するＩＣニューロンの割合を示す。
【図８Ｆ】心筋梗塞が、内因性心臓ニューロンの求心性及び遠心性リモデリングを誘発することを示す一連の画像である。対照とＭＩ心臓における一時的両側頚動脈閉塞に応答するＩＣニューロンの割合を示す。両側頚動脈閉塞を使用して、圧受容体反射が、ニューロンへの遠心性入力を変調する能力を評価した。カイ二乗検定を、群間での有意性を測定するために使用した。
【図９Ａ】ペーシングに応答するＩＣニューロンの分析及び機能的分類を示す一連の画像である。対照動物の５つのＩＣニューロンから記録したスパイキング活性を示す。垂直の点線は、右室流出路（ＲＶＯＴ）における心外膜ペーシングの開始と終了を示す。ニューロンの部分母集団は、ベースラインからの、活性の増加、低下、または無変化を示したことに注意されたい。有意水準の、各ニューロンに対して誘発された活性の変化を、結果の右に示す。
【図９Ｂ】ペーシングに応答するＩＣニューロンの分析及び機能的分類を示す一連の画像である。他の心臓血管刺激に対する応答と共に、ＭＩ動物における局所的な心外膜ペーシングに対応する、ＩＣ神経活動における、誘発された変化の一覧である。緑は、活性の有意な増加（ｐ＜０．０５）を示し、赤は、有意な低下（ｐ＜０．０５）を示す。
【図９Ｃ】ペーシングに応答するＩＣニューロンの分析及び機能的分類を示す一連の画像である。図６に概要を示したプロトコールを使用した、図９Ｂに示すペース応答性ＩＣニューロンの機能分類を示す。
【図１０Ａ】心筋梗塞が、ペーシングに対する内因性心臓ニューロンの応答及び特徴を変えることを示す一連の画像である。対照とＭＩ心臓における、右心耳（ＲＡＡ）、ＲＶＯＴ、ＲＶ突部、またはＬＶ突部での心外膜ペーシングに応答するＩＣニューロンの割合を示す。ＭＩは、心室と心房ペーシングに対する神経応答において、異なる低下を誘発した。
【図１０Ｂ】心筋梗塞が、ペーシングに対する内因性心臓ニューロンの応答及び特徴を変えることを示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、ペース応答性ＩＣニューロンの機能分類を示す。ＭＩは、梗塞（ＬＶ突部）及び遠隔領域（ＲＶＯＴ）の両方にて、ペーシングに対する応答の特徴を変えた。カイ二乗検定を、群間での有意性を測定するために使用した。
【図１１】内因性心臓ニューロンの状態依存を示す一連の画像である。対照とＭＩ動物における、ベースライン（ＢＬ）での、及び、ＲＡＡ、ＲＶＯＴ、ＲＶ突部、またはＬＶ突部における心外膜ペーシングに応答する、ＩＣ神経活動。ペーシングに応答する活性の、誘発された増加と低下に基づいて、ニューロンを細分した。低い基本活性を有したニューロンはペーシングによって活性化されたが、高い基本活性を有するものは抑制され、状態に依存した性質を示唆している。＊＝Ｐ＜０．０１。
【図１２】誘発されたストレッサーに対する、ＩＣニューロンの発火特性を示す表である。対照とＭＩ動物における、ベースラインの、及び心臓血管刺激に応答するＩＣ神経活動（平均±ＳＥ）。所与の刺激に対応する、誘発された活性の増加（上パネル）と低下（下パネル）に基づいて、ニューロンを細分した。
【図１３Ａ】心筋梗塞モデルを示す一連の画像である。微小塞栓技術を使用した、第３対角枝（白い矢印）の高さにおける、左前区下行冠動脈の梗塞前（左パネル）及び後（右パネル）の血管造影画像である。
【図１３Ｂ】心筋梗塞モデルを示す一連の画像である。ＳＴセグメント上昇を示す梗塞前（上パネル）及び直後（下パネル）の、第２誘導の心電図である。
【図１４Ａ】心筋梗塞が、内因性心臓神経系内の機能的ネットワークの接続性を低下させることを示す分析を示す。対照動物において、１つの刺激（Ｘ、ｘ軸）に応答したＩＣニューロンは、別の刺激（Ｙ、ｙ軸）にも応答したという条件付き確率を示す。
【図１４Ｂ】心筋梗塞が、内因性心臓神経系内の機能的ネットワークの接続性を低下させることを示す分析を示す。対照動物における、刺激間での相互依存した相互作用の図式表示を示す。
【図１４Ｃ】心筋梗塞が、内因性心臓神経系内の機能的ネットワークの接続性を低下させることを示す分析を示す。ＭＩ動物において、１つの刺激（Ｘ、ｘ軸）に応答したニューロンは、別の刺激（Ｙ、ｙ軸）にもまた応答したという条件付き確率を示す。
【図１４Ｄ】心筋梗塞が、内因性心臓神経系内の機能的ネットワークの接続性を低下させることを示す分析を示す。ＭＩ動物における、刺激間での相互依存した相互作用の図式表示である。図１４Ａ及び図１４Ｃのカラースケールは、それぞれの発生の可能性レベルを示す。図１４Ｂ及び図１４Ｄの矢印の太さは、条件付き確率の強度に比例する。≧０．６の確率を有する繋がりのみを示している。求心性及び遠心性刺激はそれぞれ、青と赤で表している。心房（Ａペース）及び心室ペーシング（Ｖペース）は黒で示している。
【図１５Ａ】心筋梗塞後の、内因性心臓神経系の機能リモデリングの略図である。健康状態における内因性心臓神経系（ＩＣＮＳ）と心臓との神経接続、及び心軸索の高次中枢からの入力を示す概略図である。
【図１５Ｂ】心筋梗塞後の、内因性心臓神経系の機能リモデリングの略図である。ＭＩ後に生じる、ＩＣＮＳと心臓との神経接続の変化を示す概略図である。収束性局所回路ニューロン（ＬＣＮ）への、交感神経及び副交感神経入力は増加しているものの、心臓の境界及び遠隔領域と比較して、梗塞からの求心性入力は減少している。緑色及び赤色の破線及び実線はそれぞれ、節前及び節後線維を表している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の図及び説明は、明確性の目的のために、不整脈及び心機能を監視及び治療するための典型的なシステム及び方法で見出される、他の多くの構成要素を取り除きながら、本発明を明確に理解にするのに関係する構成要素を示すために簡略化されていることと理解されなければならない。当業者は、本発明の実施において、他の構成要素及び／または工程が望まれる、かつ／または必要とされることを理解し得る。しかし、このような構成要素及び工程が当該技術分野において周知であるため、そして、これらは本発明をよりよく理解することを容易にするものではないため、このような構成要素及び工程についての議論は、本明細書において提供しない。本明細書における開示は、当業者に知られているこのような構成要素及び方法に対する、このような全ての変化及び修正に関する。
【００１９】
別段定めがない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似の、または等しい任意の方法及び材料が本発明の実践または試験に使用可能であるに関わらず、好ましい方法及び材料が記載される。
【００２０】
本明細書で使用する場合、以下の用語はそれぞれ、本セクションに関係する意味を有する。
【００２１】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は本明細書において、１つ、または２つ以上（即ち少なくとも１つ）の、冠詞の文法上の目的物を意味するように用いられる。例えば、「構成要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの構成要素、または２つ以上の構成要素を意味する。
【００２２】
量、時間等の、測定可能な値を指す際に本明細書で用いられる「約」は、具体的な値の±２０％、±１０％、±５％、±１％、及び±０．１％の変化を、このような変化が適切であるため、包含することを意味する。
【００２３】
本開示を通して、本発明の種々の態様を、範囲の形式で示すことができる。範囲の形式での記載は単に、便宜上、かつ簡便化のためと理解されるべきであり、本発明の範囲の、柔軟性を欠く限定と解釈してはならない。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された起こりうる全ての部分範囲、及びその範囲内の個別の数値を有するものと考えられなければならない。例えば、１〜６等の範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の、具体的に開示された部分範囲、ならびに、その範囲内の個別の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、６、ならびに、これらの数字の間の任意の全体的及び部分的増加を有すると考えられなければならない。これは、範囲の大きさに関係なく適用される。
【００２４】
本明細書においては、内因性心臓神経系を介して、不整脈及び心機能を測定、監視及び治療するためのシステム及び方法を想到する。特定の実施形態において、本システム及び方法は、健康な、そして患部心筋組織の両方と関係する内因性心臓神経系の神経シグネチャーを比較して、どのシグナル伝達が患部心臓組織により影響を受けたかに関して、内因性心臓ニューロンを同定し標的化する。したがって、患部心筋から内因性心臓神経系、胸腔内心外姓神経節、及び心軸索の高次中枢への求心性神経シグナルの調節は、虚血性心疾患を緩和する（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ）ための新規の治療的アプローチを表す。ＩＣＮＳ内での遠心性入力の処理の変調は、虚血性心疾患を緩和するための新規の治療的アプローチを表す。この変調は、直接経路−神経節前及び神経節後ニューロンで、または、神経節内及び神経節間の神経相互作用を伴う経路を介して、行うことができる。
【００２５】
一例示的実施形態では、本発明は、内因性心臓神経シグナル伝達を測定、調節、及び／または刺激するためのシステムを含む。本システムは、内因性心臓ニューロンにより生じた電気シグナルを検出するための複数の電極を組み込む、少なくとも１つの埋込型または部分的な埋込型センサを含んでよい。例えば、一実施形態において、センサは、直線微小電極アレイ（ＬＭＡ）を含む。特定の実施形態において、ＬＭＡは、複数の電極を含む。例えば、一実施態様において、ＬＭＡは、１６個の白金／イリジウム電極を含む。センサは、１つ以上の内因性心臓ニューロンでの電気シグナルの検出に好適な、任意の好適な種類及びサイズの電極を含んでよい。例示的な電極としては、単一のシャンク電極、２Ｄマルチシャンク電極、３Ｄマルチシャンク電極、及びマルチ電極アレイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
任意の内因性心臓ニューロン、または心筋組織の任意の領域に限局的電気的刺激を印加するために、同一のまたは異なる電極を使用してよい。対象の内因性心臓ニューロンまたは神経節の中に挿入して（または、これらと接触させて）、電極と接続したセンサ制御ユニットで記録を行うためにニューロンの電気活動を効果的に検出するために、これらの電極を設計してよい。電極は対象に埋込可能であるが、制御ユニットは所望により、対象に埋込可能であるか、または対象の外側にあるかのいずれかであってよい。
【００２７】
一実施形態では、センサは、検出した電気シグナルを処理するための、１つ以上の前置増幅器、増幅器、またはフィルターを含んでよい。このような構成要素は、埋め込まれたセンサ上に配置されてもよく、あるいは、外部ハードウェア上に存在してもよい。例えば、一実施形態において、前置増幅器は、利得制御により、低い、及び高いパスフィルタリングを提供する。一実施形態では、フィルタリング範囲は、最大５Ｋの利得を含む３００〜３ＫＨｚである。特定の実施形態において、前置増幅器のフィルタリング範囲及び／または利得を調節して、信号対雑音比を最適化することができる。一実施形態では、前置増幅器及び制御デバイスは、心房または心室組織により生成された電気的刺激または電気活動と関係しているため、入力シグナルの一時的なブロッキングを可能にする。
【００２８】
したがって、センサ制御ユニットは、標準的な電池、外部動力移行のための標準的な配線を含む、当該技術分野において理解されている任意の方法により駆動されてよく、または、ワイヤレス動力移行のための受信用コイルを含んでもよい。制御ユニットは、マイクロプロセッサ、ならびに、制御ソフトウェアと、任意の受信及び／または処理データを保管するための任意の形態のメモリを含んでよい。制御ユニットは、トランシーバー、または、測定される各ニューロン内で記録される活動を更に分析するための外部処理ユニットにより、データを送達する、及び／または受信するために必要な任意のハードウェア及びソフトウェアを更に含んでもよい。外部処理ユニットは１つ以上の演算器であってよく、また、デスクトップ、ラップトップ、タブレット、スマートフォン、もしくは他のワイヤレスデジタル／携帯電話、腕時計、テレビ、または当業者によって理解される他の薄型クライアントデバイスを含む任意の種類のコンピュータデバイスであるか、またはこれらを含んでよい。一般に、本明細書に記載する任意のコンピュータデバイスは、少なくとも１つのプロセッサ、標準的な入力及び出力装置、ならびに、データを保管するため、及びプログラムを実行するため、ならびに、必要であればネットワーク上でデータの送受信を行うためのコンピュータデバイスで通常見出されるあらゆるハードウェア及びソフトウェアを含んでよい。システム内の外部処理ユニット、または接続された他のコンピュータデバイスにより、所望される場合、データを分析及び表示するために、任意の他の種類の更なる処理のために、記録データを更にフィルタリング（例えば増幅）してよいこともまた認識されなければならない。
【００２９】
一実施例において、かつ制限されることなく、本システムは、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤのＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅｓにより製造されたもの等の、直線微小電極アレイ（ＬＭＡ）を利用してよい。簡単に説明すると、ＬＭＡは、約２ｍｍの露出突部、及び１ｋＨｚにて０．３〜０．５ＭΩのインピーダンスを有する、約２５μｍの直径を有する１６個の白金／イリジウム電極を含んでよい。しかし、本発明のシステムは、このような電極ユニットが、内因性心臓ニューロンへの接続に適しているのであれば、当業者によって理解される任意のセンサ／電極セットを用いてよいことが理解されなければならない。これらとしては、単一のシャンク、２Ｄ及び３Ｄシャンク電極、ならびに、内因性心臓神経節、ならびに心房及び心室組織に対するこれらの突起を覆う平面状電極が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
特定の実施形態において、本発明のシステムは、求心性内因性心臓ニューロンを刺激するための１つ以上の構成要素を含む。例えば、一実施形態において、システムは、刃先の鈍い物体（例えばカテーテル、電極、針、ロッド等）、または組織に送達可能な流体（液体もしくは気体）を含むがこれらに限定されない、心筋組織に機械的な力を送達するのに好適な構成要素を含む。一実施形態では、１つ以上の構成要素を使用して局所に化学物質を注入し、求心性ニューロンの活動を変化させる。一実施形態では、システムは、前負荷または後負荷を変えるための１つ以上の構成要素を含む。特定の実施形態において、システムは、遠心性の内因性心臓ニューロンを刺激するために使用される、交感神経または副交感神経系に電気シグナルを印加するための、１つ以上の刺激性電極を含む。例示的な電極としては、カフ電極、針状電極等が挙げられる。一実施形態では、システムは、１つ以上の心外膜部位にて心臓電気刺激を印加するのに好適な、１つ以上のペーシング電極を含む。
【００３１】
システムは、１つ以上のセンサの機能を制御するため、そして、測定した内因性心臓ニューロンのこれまでの、またはリアルタイムでの電気活動、及び、これまでの、またはリアルタイムでの、対象の心機能の測定に関する情報を表示させるための、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を有するソフトウェアプラットフォームを更に含んでもよい。特定の実施形態において、センサ制御ユニット及び外部処理ユニットへの、そして、これらからの、ワイヤレス通信情報の移動は、広域ネットワークを介してよく、また、データを、例えば、オープンな広域ネットワーク（例えばインターネット）、電気的ネットワーク、光学的ネットワーク、ワイヤレスネットワーク、物理的に安全なネットワークまたは仮想プライベートネットワーク、及びこれらの任意の組み合わせ等の追加のコンピュータデバイスに通信する当業者により理解される任意の好適なネットワーク化システムの一部を形成してよい。このような拡張されたネットワークは、ネットワークが、システム全体にわたり、情報項目及び他のデータの伝達に好適であり得るように、任意の中間ノード、例えば、ゲートウェイ、ルーター、ブリッジ、インターネットサービスプロバーダーネットワーク、公衆交換電話網、プロキシサーバー、ファイアーウォール等もまた含んでよい。
【００３２】
当業者によって理解されるように、外部処理ユニットは、例えば、ワイヤレスモデム、ワイヤレスルーター、ワイヤレスブリッジ等を通して、拡張ネットワークにワイヤレスで接続されてよい。更に、システムのソフトウェアプラットフォームは、任意の従来の操作プラットフォーム、またはプラットフォームの組み合わせ（Ｗｉｎｄｏｗｓ、Ｍａｃ  ＯＳ、Ｕｎｉｘ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ等）を利用してよく、当業者によって理解される任意の従来のネットワーキング及び通信ソフトウェアを利用してよい。
【００３３】
データを保護するために、暗号化規格を使用して、ネットワーク上の認証されていない傍受からファイルを保護してよい。当業者により理解され得る任意の暗号化規格または認証法を、本発明のシステムの任意の箇所で使用してよい。例えば、暗号化は、デュアルキー暗号化を伴うＳｅｃｕｒｅ  Ｓｏｃｋｅｔ  Ｌａｙｅｒ（ＳＳＬ）を使用することで、出力ファイルを暗号化することにより完了してよい。更に、本システムは、データ操作または情報アクセスを制限してよい。アクセスまたは使用制限は、ユーザーのために任意のレベルで実装されてよい。このような制限としては、例えば、本発明の使用、または、補助ユーザーが確認もしくは操作可能となる１つ以上のデータの種類の選択を可能にするユーザー名とパスワードの割り当てを挙げてよい。
【００３４】
特定の実施形態において、ネットワークは、センサ制御ユニットから外部処理ユニット、及び逆の遠隔計測データ移動を提供する。例えば、データ移動は任意のワイヤレス通信により行われることが可能であり、無線信号、近接場通信システム、極超音速信号、赤外線システム、細胞シグナル、ＧＳＭ（登録商標）等を含むがこれらに限定されない、任意のワイヤレスベース技術を含んでよい。いくつかの実施形態では、データ移動は特定のネットワークを用いることなく実施される。特定の実施形態においてはむしろ、データは、上記システムにより、センサ制御ユニット及び外部処理ユニットに、ならびに、これらから直接移動される。
【００３５】
ソフトウェアは、少なくとも１つの既存のソフトウェアプラットフォームの使用の容易性を最適化し、少なくとも１つの既存のソフトウェアプラットフォームの能力もまた拡大し得る、ソフトウェアフレームワークまたはアーキテクチャを含んでよい。ソフトウェアは、１つ以上の機能を実施するために、１人以上のユーザー（例えば患者、臨床医等）がアクセス可能なアプリケーションを提供する。このようなアプリケーションは、ユーザーと同じ位置で、またはユーザーとは離れた位置で利用可能であってよい。各アプリケーションは、ユーザーの、システム内に存在する情報との交流を容易にするためのグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を提供してよい。本発明の例示的ＧＵＩは、ユーザーがセンサの機能またはモードを制御する能力、及び、個々の内因性心臓ニューロン活性、プールされたニューロン活性、または当業者によって理解される一般的な心機能のデータを表示する能力を含んでよい。このようなデータは、互いの神経活動の時間的関係、心臓の電気または機械的事象に対する時間的関係、ペーシング、機械的、または化学的ストレッサーを含む、制御された事象に対する時間的関係を含むがこれらに限定されない、ネットワーク機能の指標を含んでよい。ＧＵＩは、ユーザー、一連のユーザー、もしくはユーザーの種類に対して特異的であってよく、または、全てのユーザー、もしくは選択されたユーザーの部分集合で同一であってよい。システムソフトウェアは、ユーザーが、１つ以上の他のアプリケーションのＧＵＩを選択する、もしくはこれらと交流することを可能にする、または、ユーザーが種々の情報に同時にアクセスでき、別様においては、システムの任意の部分を介して利用可能とすることができる、マスターＧＵＩセットもまた提供してよい。ソフトウェアによるデータの提示は、任意の種類及び数の、選択可能なフォーマットであってよい。例えば、多層フォーマットを使用してよく、ここでは、連続したより下層の提示情報を確認することにより追加情報が入手可能である。このような層は、ドロップダウンメニュー、タブフォルダーファイル、または、当業者によって理解される他の層化技術を使用することにより入手可能となってよい。
【００３６】
ソフトウェアは、印刷可能な結果レポート、または、生成されたＥメールメッセージ、テキストもしくはファイル添付等の、通信可能に接続された任意のコンピュータデバイスに伝達可能な電気的結果レポートを生成する等の標準レポートメカニズムもまた含んでよい。同様に、上述のシステムの特定の結果は、アラートシグナル（例えば、アラートＥメール、テキストまたは電話コール）を引き起こし、患者、医者、看護師、救急医療技士、または他のヘルスケア提供者に、特定の結果の警告を出すことができる。
【００３７】
本明細書で記載されるシステムを使用することにより、本発明は更に、内因性心臓神経系内で内因性心臓ニューロンシグナル活性を測定する方法、ならびに、対象における不整脈及び心機能の治療方法を含む。
【００３８】
本明細書で実証されるとおり、内因性心臓神経系の内因性心臓ニューロンは、個別に、かつ／または一括して、健康な心筋組織、患部心筋組織を示す神経シグネチャーに到達するシグナル活性を監視することができるか、または、神経シグネチャーは、対象が不整脈、心筋虚血、または心機能を退化させる一般的状態の危険性にある、病気になりやすい状態を示し得る。
【００３９】
一例示的実施形態では、神経シグネチャーは、ベースラインまたは参照シグネチャーとして機能し得、これは、神経シグネチャーの、対象を試験した際に記録または測定される、後の神経シグネチャーとの比較に使用するための健康状態のプロファイルを表すことを意味する。ベースラインまたは参照神経シグネチャーは患者特異的であってよく、またはこれらは、少なくとも１つの特徴を共通に有する対象の平均値を表す集合データもしくはプールされたデータであってよい。例示的な特徴としては、患者の性別、年齢、活性レベル、食事、先天性欠損、遺伝的形質、代謝状態等を挙げてもよい。特定の実施形態において、ベースラインまたは参照神経シグネチャーは、運動、起立性ストレス、温度、ヴァルサルヴァ法、及びスパイロメトリー試験を含むがこれらに限定されない、１つ以上の心臓血管ストレッサーに対して規定される。健康な状態を示すベースラインまたは参照神経シグネチャーを確立した後、内因性心臓神経活性の後の測定を行い、対象が治療を必要としているか否かの決定を行うことができるように、ベースラインまたは参照との比較のためのリアルタイム神経シグネチャーを確立する。
【００４０】
本明細書で想到されるとおり、神経シグネチャーは、限定されないが、内因性ニューロン自発性発火レート、心周期段階中の活動、ニューロン間の時間的関係、機械感覚性入力に対する応答、心臓負荷条件の変化、心外膜ペーシングに対する応答、化学受容体及び侵害受容性入力に関係するパラメータを含む、１つ以上のパラメータを含んでよい。各パラメータに関して、治療、または特定の治療の種類が必要な対象を示す閾値が確立されてよい。特定の実施形態において、１つのみの閾値を超過することは、治療の必要性及び／または治療の種類を確定的となし得るが、別の実施形態では、治療の必要性、または特定の治療の種類を確定的にし得るために、複数の閾値が超過してよい。更に別の実施形態では、スコアリングアルゴリズムを使用して、神経シグネチャーの比較における差が、治療の必要性、または特定の治療の種類を示すか否かを測定してよい。特定の実施形態において、スコアリングは、個別または一群となった活動の変化、２つ以上のニューロン間でのこのような活動及び時間的関係の変化の方向性を含む。
【００４１】
本方法を使用して、心臓状態の診断、心臓状態の回復の評価、心臓状態の治療効果の評価、将来的な心臓事象の可能性の測定、または、以前に心臓事象が生じたことの測定を行ってよい。
【００４２】
本明細書中に記載する方法により検出される、または監視される例示的な心臓状態または心臓事象としては、虚血性心疾患、心筋梗塞、心室性期外収縮、不整脈、駆出低下心不全、駆出保存心不全等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
内因性心臓神経系のニューロンシグネチャーは、１つ以上の内因性心臓ニューロンにおいて１つ以上のパラメータを測定することにより評価されてよい。本方法により評価される１つ以上の内因性心臓ニューロンは、腹側心室間神経叢（ＶＩＶ  ＧＰ）、背面心室間神経叢（ｇｌａｎｇｌｉｏｎａｔｅｄ  ｐｌｅｘｕｓ）（ＤＩＶ  ＧＰ）、右結腸縁動脈神経叢、右心房神経叢、または、任意の他の内因性心臓神経系のニューロン構造であってよい。
【００４４】
特定の実施形態において、本方法は、求心性、遠心性または収束性ニューロンである内因性心臓ニューロンの数または割合を測定することを含む。例えば、本明細書において、心筋梗塞は、隣接または遠隔心臓領域からの求心性入力を維持しながら、梗塞領域からの相対量の求心性入力を著しく減少させた内因性心臓神経系のリモデリングを誘発することが示されている。この境界条件は、心臓病の神経シグネチャーの実施形態を表す。
【００４５】
特定の実施形態において、求心性ニューロンの数または割合は、どのニューロンが、応答を心筋組織の機械的刺激に変換するか、前負荷での（即ち、一時的ＩＶＣ閉塞による）変化、または後負荷での（即ち、下行大動脈の一時的閉塞による）変化を測定することにより評価することができる。特定の実施形態において、本方法は、どのニューロンが、応答を種々の位置における機械的刺激、例えば、梗塞領域、境界領域、及び遠隔領域における刺激に変換するかを同定することを含む。機械的刺激は、力を心筋組織に加えることにより生成されてよく、この力は、刃先の鈍い物体（例えば電極、針、もしくはカテーテル）、または、組織への液体もしくは気体の流れにより生成されてよい。特定の実施形態において、求心性ニューロンの数または割合は、どのニューロンが、記録されるニューロンの知覚領域に隣接して送達される化学的刺激を変換するかを測定することにより評価することができる。例えば、好適な化学物質は、カテーテルまたは針により、心筋組織または内因性心臓神経節の限局的領域へ送達されてよい。
【００４６】
特定の実施形態において、遠心性ニューロンの数または割合は、どのニューロンが、迷走神経、星状神経節、または縦隔神経節への刺激を含むがこれらに限定されない、上流副交感神経または交感神経入力に送達される電気的刺激を変換するかを測定することにより評価することができる。送達される刺激は、典型的な遠心性内因性心臓ニューロンにより変換されることが知られている、任意の強さ、周波数、または期間であってよい。
【００４７】
一実施形態では、安静時に、または、心筋梗塞に関係する場合、心臓血管ストレッサーに応答して、内因性心臓ニューロンの活性が増加することができる。一実施形態では、安静時に、または、心筋梗塞に関係する場合、心臓血管ストレッサーに応答して、内因性心臓ニューロンの活性が低下することができる。別の実施形態では、活性は、内因性心臓ニューロンのサブセットで増加することができ、内因性心臓ニューロンのサブセットで低下することができ、また、内因性心臓ニューロンのサブセットで無変化のままであることができる。これらの変化は、記録されるニューロンの種類（求心性、遠心性または収束性ニューロン）、与えられるストレッサーの特徴（例えば機械的、化学的、侵害受容性）、及び、心臓疾患における神経／筋細胞リモデリングの構造／機能を反映している。
【００４８】
一実施形態では、心周期に対する内因性心臓ニューロンの時間的関係は、心筋梗塞により変化する可能性がある。これには、活性が時間的に、拡張期（心臓弛緩）、収縮期（駆出期）、ならびに等容収縮及び弛緩に関係しているこれらのニューロンを含むことができる。
【００４９】
一実施形態では、ある内因性心臓ニューロンと他の内因性心臓ニューロンとの時間的関係は、心筋梗塞により変化する可能性がある。この時間的関係は、１つの機能的分類（例えば求心性関連）における内因性心臓ニューロンを含んでよく、または、分類に沿って拡張してもよい（求心性から遠心性、求心性から収束性、遠心性から求心性、そして遠心性から収束性）。
【００５０】
例えば、一実施形態において、内因性ニューロンの自発性発火レートは、心筋疾患組織と関係している場合、少なくとも５％の低下を示し得る。別の実施形態では、内因性ニューロンの自発性発火レートは、心筋疾患組織と関係している場合、種々の変化の程度、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、そして更には少なくとも３５％以上の低下を示し得る。一実施形態では、心周期段階中の内因性ニューロン活性は、心筋疾患組織と関係している場合、拡張期関連活性の間に少なくとも５％の低下を示し得る。別の実施形態では、心周期段階中の内因性ニューロン活性は、心筋疾患組織と関係している場合、拡張期関連活性の間に、少なくとも１０％、少なくとも１５％、あるいは少なくとも２０％以上の低下を示し得る。別の実施形態では、心周期段階中の内因性ニューロン活性は、心筋疾患組織と関係している場合に、収縮期関連活性の間に、少なくとも５％の増加を示し得る。別の実施形態では、心周期段階中の内因性ニューロン活性は、心筋疾患組織と関係している場合、収縮期関連活性の間に、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、あるいは少なくとも５０％以上の増加を示し得る。別の実施形態では、心周期段階中の内因性ニューロン活性は、心筋疾患組織と関係している場合、拡張期及び収縮期の２つの関連活性において、少なくとも５％の低下を示し得る。別の実施形態では、心周期段階中の内因性ニューロン活性は、心筋疾患組織と関係している場合、拡張期及び収縮期の２つの関連活性において、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、あるいは少なくとも５０％以上の低下を示し得る。
【００５１】
一実施形態では、内因性ニューロンの機械感覚性入力に対する応答は、心筋疾患組織と関係している場合、少なくとも５％の低下を示し得る。別の実施形態では、内因性ニューロンの機械感覚性入力に対する応答は、心筋疾患組織と関係している場合、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、そして更に少なくとも５０％以上の低下を示し得る。
【００５２】
別の実施形態では、心筋疾患組織と関係している場合、心臓負荷条件の変化を内因性ニューロンが変換できる能力は、前負荷状態の低下に対する神経応答の、少なくとも５％の低下を含んでよい。別の実施形態では、心筋疾患組織と関係している場合、心臓負荷条件の変化を内因性ニューロンが変換できる能力は、前負荷状態の低下に対する神経応答の、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、そして更に少なくとも３５％以上の低下を含んでよい。
【００５３】
別の実施形態では、心外膜ペーシングに対する内因性ニューロンの応答は、心筋疾患組織に関係する、ペーシング応答性の収束性ニューロンの上方制御を含んでよい。更に別の実施形態において、心外膜ペーシングに対する内因性ニューロンの応答は、心筋疾患組織に関係するペーシング応答性の求心性ニューロンの下方制御を含んでよい。
【００５４】
したがって、そして図１に示すように、本発明の例示的方法１００が図示されている。まず、工程１１０において、少なくとも１つの内因性心臓ニューロンからの複数の電気シグナルが測定される。次に、工程１２０において、測定したシグナルを、内因性心臓神経系の参照神経シグネチャーと比較する。工程１３０において、測定したシグナルと神経シグネチャーとの差が閾値を超えるか否かが測定される。次に、工程１４０において、閾値を超えると、対象が少なくとも１つの治療用要素で治療される。特定の実施形態において、治療は、薬剤、化合物、または他の化学的もしくは生体物質の投与であってよいが、他の実施形態では、治療は、任意の心筋組織、または心筋組織と関係する任意の内因性ニューロンを含む、心臓の１つ以上の領域への電気的刺激の投与であってよい。特定の実施形態において、治療を、胸腔内神経節、迷走交感神経幹及び脊髄を含むがこれらに限定されない心外細隙結合点に投与してよい。
【００５５】
別の例示的な方法において、図２に示すように、患部心筋の領域を有することが予め測定された対象の治療のために、方法２００を使用してよい。例えば、工程２１０において、心筋組織の疾患領域が、対象の心臓にて同定される。工程２２０において、患部心筋組織からの少なくとも１つの求心性内因性心臓ニューロンシグナル伝達が同定され、工程２３０において、同定した求心性内因性心臓ニューロンからのシグナル伝達が修正される。求心性ニューロンの修正例としては、電気的刺激の印加、または、薬剤、化合物、もしくは化学的もしくは生体物質の投与が挙げられるが、これらに限定されない。患部心筋組織からの少なくとも１つの求心性の内因性心臓ニューロンシグナル伝達を同定するプロセスは、本明細書の他の場所に記載されているように、求心性ニューロンから測定した電気シグナルを、内因性心臓神経系の神経シグネチャーと比較するプロセスを含んでよいことが理解されなければならない。
【００５６】
実験実施例
ここでは本発明を、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は説明目的のためだけに提供され、本発明はこれらの実施例に限定されず、むしろ、本明細書において提供する教示の結果としての、全ての明白な変化を包含する。
【００５７】
実施例１：心筋梗塞は心臓神経シグネチャーを変え、神経リモデリングを誘発する
本明細書では、ＩＣＮＳ内での形態的及び表現型のリモデリングを調査し、求心性及び遠心性入力（交感神経性及び副交感神経性）のＩＣＮＳ処理のリモデリング、ならびにＬＣＮによるこれらの統合を直接評価するように設計された実験を提示する。心臓ペーシングの効果もまた、研究した。ペーシングは、患者において、デバイスを用いて心室ペーシングを最小限に抑える方法が、虚血性心疾患を患う患者に生残の有益性を付与することが臨床試験で示されてきた理由を、機械的視座から理解することについて、直接的な関係性を有する。
【００５８】
本明細書では、ＭＩがＩＣＮＳ内での形態学的及び神経化学的変化を誘発することが示されている。この構造的リモデリングは、このニューラルネットワークによる求心性及び遠心性神経シグナルの処理における、機能的変化により並行して行われる。求心性神経シグナルの不均質性は、収束性ニューロンのリモデリングと組み合わせて、不整脈及び心不全への進行を担う反射ＡＮＳの活性化の、臓器レベルでの神経異常による機能変化を提示する可能性が高い。虚血性心疾患と関係する逆の神経シグネチャーの特性決定は、病気と、治療法の有効性を監視して、ＡＮＳを標的化し、心臓病の進行の緩和を補助することができる。
【００５９】
本明細書で提示される研究は、ブタモデル（対照（ｎ＝１６）と治療した慢性前頂ＭＩ（ｎ＝１６））における、ＭＩ後のＩＣＮＳの構造的及び機能的リモデリングを特性決定する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの基本活性の微小電極記録、ならびに、求心性及び遠心性刺激に対する応答を、内因性心臓ニューロンから記録した。対照から１１８個のニューロンを、そして、ＭＩ動物から１０２個のニューロンを、求心性、遠心性、または収束性（求心性及び遠心性入力の両方を受信する）として機能的に分類した。対照及びＭＩにおいて、収束性ニューロンは最も大きな部分母集団（それぞれ４７％及び４８％）を示し、ＭＩの後で、向上した変換能力を有した。ニューロンへの遠心性入力は、ＭＩ後も維持された。梗塞領域からは求心性入力が弱まり（対照では１９％、ＭＩでは７％；Ｐ＝０．０３）、「神経感覚境界領域」、即ち求心性情報における不均質性を生み出す。ＭＩは、前負荷における変化の転換を低下させた（対照では５４％、ＭＩでは４１％；Ｐ＝０．０５）。ＩＣＮＳ内での、全体の機能的ネットワークの接続性、即ち、ニューロンが刺激の独立ペアに応答する能力は、ＭＩの後に低下した。ニューロン応答は、ＭＩ後に心室と心房ペーシングで、異なって低下した（心室ペーシングに対しては、対照では６３％、ＭＩでは４４％；Ｐ＜０．０１）。ＭＩはＩＣＮＳ内で、形態的及び表現型の変化を誘発した。求心性神経シグナルの変化、及び収束性ニューロンのリモデリングは、虚血性心臓疾患の「神経シグネチャー」を表す。
【００６０】
動物
通常の心臓を持つヨークシャーブタ（ｎ＝１６；８匹がオス、８匹がメス；４９±３ｋｇ）と、慢性前頂ＭＩを治療したヨークシャーブタ（ｎ＝１６；６匹がオス、１０匹がメス；４６±２ｋｇ）を実施例１で使用した。
【００６１】
心筋梗塞の作製
テラゾール［８ｍｇ／ｋｇ、筋肉内投与］で動物を鎮静させ、挿管して気道管理をした。全身麻酔は、イソフルラン［１〜２％、鼻孔内］から構成された。１２個のリードの心電図（ＥＣＧ）、及び動脈圧を監視した。左大腿の動脈にアクセスし、アンプラッツ型カテーテルを、蛍光透視法の元で左冠状大動脈にガイディングした。３ｍｍの血管形成用バルーンカテーテルを次に通し、左冠状動脈前下行枝（ＬＡＤ）動脈から発している第３対角の冠状動脈にて、膨張させた。バルーン膨張の３０秒後、１ｍＬのポリスチレン微粒子（（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，９０μｍ直径のポリビーズ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を含有する、５ｍＬの生理食塩水懸濁液を、その動脈に遠位から注入した。動脈の閉塞が血管造影法により可視化され、急性ＭＩが、ＥＣＧの第ＩＩまたは第ＩＩＩ誘導におけるＳＴセグメント上昇の存在により、確認された（図１３）。
【００６２】
心筋梗塞後の実験プロトコール
治療したＭＩ動物を、ＭＩ後４２±２日間調査した。ＭＩ、及び年齢が一致する対照動物をテラゾール［８ｍｇ／ｋｇ、筋肉内投与］で鎮静させ、挿管して気道管理をした。全身麻酔をイソフルラン［１〜２％、鼻孔内投与］により維持した。血流力学指標、顎の色合い、及び足引き込み反射により、麻酔の深度を監視した。必要により麻酔を調節した。補液のために右大腿静脈にアクセスし、動脈圧の監視のための右大腿動脈にアクセスした。胸骨正中切開を実施して、心臓及び星状神経節、ＩＶＣ、ならびに下行胸大動脈を露出させた。首の横下部に切り込みを入れ、頸部迷走神経及び頸動脈を露出させた。スネアオクルーダーを血管（ＩＶＣ、大動脈、及び頸動脈）の周りに配置し、刺激電極を自律神経系の遠心性神経構造の周辺（迷走神経）またはその中（星状神経節）に配置した。手術の完了後、全身麻酔をαクロラロースに変更した［１０ｍｇ／ｋｇ／時間の静脈内連続点滴による、５０ｍｇ／ｋｇ、ボーラス静脈内投与］。体温を監視し、加熱パッドにより維持した。酸塩基状態を１時間毎に測定した。呼吸速度と一回呼吸量を調節し、血液ガスの恒常性の維持が必要であれば、重炭酸塩を注入した。実験完了時に、ペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与）、続いて塩化カリウム（１５０ｍｇｋｇ−１、静脈内投与）を用いて心臓を停止させることで、動物を深い麻酔の元で人道的に安楽死させた。
【００６３】
内因性心臓神経活動の記録
直線微小電極アレイ（ＬＭＡ）（ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、ＶＩＶ  ＧＰ内のニューロンにより生成されるｉｎ  ｖｉｖｏ活動を記録した。ＬＭＡは、１６個の白金／イリジウム電極で構成された（２ｍｍの露出突部：１ｋＨｚにてインピーダンス０．３〜０．５ＭΩを有する、２５μｍ直径の電極）（図５Ｂ）。電極を、左大冠動脈からのＬＡＤの起点付近に存在するＶＩＶ  ＧＰ内に埋め込んだ（図３Ｊ及び図５Ａ）。ＬＭＡを可撓性ケーブルに取り付けることで、ＬＭＡを半浮動性とすることができる。電極ワイヤ、ならびにアース及び参照電極を、ヘッドステージ前置増幅器が付いている１６チャネルの微小電極増幅器（Ａ−Ｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ  ３６００，Ｃａｒｌｓｂｏｒｇ，ＷＡ，ＵＳＡ）に接続した。各チャネルに関して、フィルターを、ゲイン５０００で３００Ｈｚ〜３ｋＨｚに設定した。電極を右心房心筋に縫い合わせ、参照右心房電位図（ＲＡＥ）を得た。神経波形、心電図、ＲＡＥ及び血流力学データを、データ収集システム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｒ１４０１，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に入力した。上述したように（Ｂｅａｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．；５９１（Ｐｔ  １８）：４５１５−３３）、ソフトウェアＳｐｉｋｅ２（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ）を使用して、データをオフラインで分析した。
【００６４】
左心室の血流力学的評価
圧力カテーテル（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｉｋｒｏ−Ｔｉｐ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を左大腿動脈から左心室（ＬＶ  ｃｈａｍｂｅｒ）に入れ、制御ユニット（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＰＣＵ  ２０００）に接続した。ＬＶの収縮能を、収縮終期圧、及び圧力変化の最大速度（ｄＰ／ｄｔ  ｍａｘｉｍｕｍ）により評価した。ＬＶの拡張能を、拡張終期圧、及び室圧変化の最小速度（ｄＰ／ｄｔ  ｍｉｎｉｍｕｍ）により評価した。
【００６５】
求心性神経入力評価
ＩＣニューロンが機械感覚的求心性入力を変換する能力を測定するために、心外膜機械的刺激（穏やかな接触）を、以下の４つの部位：ＲＶＯＴ、ＲＶ突部、ＬＶの中上部壁、及びＬＶ突部にて１０秒間加えた。次に、ＩＣニューロンが、前負荷及び後負荷のそれぞれにおける急性な変化を変換する能力を測定するために、スネアオクルーダーを使用してＩＶＣ及び大動脈の一時（３０秒）閉塞を行った。
【００６６】
遠心性神経入力評価
どのＩＣニューロンが、副交感神経及び交感神経の遠心性節前入力を受信するかを測定するために、複極式螺旋状カフ電極（Ｃｙｂｅｒｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．，ＰｅｒｅｎｎｉａＦｌｅｘ  Ｍｏｄｅｌ  ３０４，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を頸部迷走神経の周辺に配置し、複極式針状電極を星状神経節の両側に挿置した。分離ユニットを有する刺激装置（Ｇｒａｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓ８８及びＰＳＩＵ６，Ｗａｒｗｉｃｋ，ＲＩ，ＵＳＡ）を使用して、遠心性入力をＩＣニューロンに変調した。各迷走神経に関して、閾値を、心拍数またはＢＰの１０％低下を誘発するのに必要な電流（２０Ｈｚ周波数、１ｍｓのパルス幅）として規定した。各星状神経節に関して、閾値を、心拍数またはＢＰの１０％増加を誘発するのに必要な電流（４Ｈｚ周波数、４ｍｓのパルス幅）として規定した。次に、各迷走神経及び星状神経節を個別に、閾値の１．２倍の電流、及び１Ｈｚの周波数で１分間刺激した。心機能のあらゆる変化に関係なく、ＩＣＮＳへの直接入力を評価するためにこれを行った。次に、スネアオクルーダーを使用して両側の頸動脈（尾側から頚動脈洞）での一時的（１分）閉塞を行い、頚動脈圧受容性反射が、ＩＣニューロンを遠心性入力に変調する能力を測定した。
【００６７】
心外膜ペーシング
ＩＣニューロンが心臓電気刺激に応答する能力を測定するために、複極式ペーシング電極（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）を種々の心外膜部位に配置し、ペーシング（６ｍＡの電流；２ｍｓのパルス幅）を、１０回の捕捉収縮について、ベースライン心拍数の１０％上で行った。以下の４つの部位をペーシングした：１）右心耳、２）ＲＶ流出路、３）ＲＶ突部、及び４）ＬＶ突部。
【００６８】
心室頻脈性不整脈の誘発率
対照（ｎ＝８）及び治療した慢性前頂ＭＩ動物（ｎ＝８）の別々の集団において、２つの異なる部位（ＲＶ突部及びＬＶ前壁心外膜）からの、最大３回の余剰刺激（最低２００ｍｓ）を含む、２つの異なる周期長（６００及び４００ｍｓ）における、プログラムした心室刺激（ＥＰＳ３２０；Ｍｉｃｒｏｐａｃｅ，Ｃａｎｔｅｒｂｕｒｙ，Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により、心室頻脈性不整脈（ＶＴ）の誘発率を評価した。
【００６９】
組織プロセシング
ＩＣ神経の記録が完了した後、動物を犠牲にし、直ちに心臓を切除した。ＶＩＶ  ＧＰ、背側の心室間神経叢（ＤＩＶ  ＧＰ）、右結腸縁動脈神経叢（ＲＭＡ  ＧＰ）、及び右心房神経叢（ＲＡ  ＧＰ）を除去して冷生理食塩水（４℃）で洗い流し、１０％の冷ホスフェート緩衝ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）に４日間移した。その後、組織を７０％エタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）に移し、３日以内にパラフィンで包埋した。４μｍ厚の断片をパラフィン塊から切り出した。
【００７０】
組織学的染色
ＩＣニューロンのサイズを、コンピュータ化形態分析（Ａｐｅｒｉｏ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ，Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した断片（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＰＲＯＴＯＣＯＬ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）から測定した。
【００７１】
免疫組織化学的染色
ＩＣニューロンのアドレナリン作動性表現型を、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）への免疫反応性（１：２０００希釈、Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１１２，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）；ＣｈＡＴへの免疫反応性によるニューロンコリン作動性表現型（１：２００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ１４４−Ｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）；及び、抗ＶＩＰ  Ａｂによる血管作動小腸ペプチド（ＶＩＰ）への免疫反応性（ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ、カタログ番号２００７７，Ｈｕｄｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）により定量化した。ＴＨ及びＶＩＰについては、１：５００にてＤａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ標識ポリマー抗−ウサギ（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｋ４００３，Ｃａｒｐｉｎｅｔｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、そして、ＣｈＡＴについてはポリクローナルウサギ抗ヤギ免疫グロブリン／ビオチン化（Ｄａｋｏ，Ｅ０４６６）により、二次検出を行った。二次免疫反応性を、メーカーが推奨する、あらゆる染色のためのプロトコールに従い、ジアミノベンジジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒｅｅｎ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）により検出した。次に、スライドをデジタル方式で走査し、電子画像上で分析を行った。スライドに存在する全てのニューロンを、２０〜４０Ｘ倍率にて、コンピュータ化画像解析（Ａｐｅｒｉｏ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ）を使用して定量化した。群の染色及び定量化を、盲検方式で実施した。
【００７２】
データ分析：マルチユニットの内因性心臓神経活性の、シグナル処理
オフライン分析を使用して、アーチファクトを取り除き、ＩＣニューロンの同定を行った（図５Ｃ）。手短に言えば、隣接する心房及び心室筋の活動から生じる、内因性の電気的アーチファクトにより、そして、自律神経系の遠心性神経の刺激により生じる外因性の電気的アーチファクトにより、記録したＩＣニューロンの活動が、コンタミネーションされた。ＬＭＡの４つ以上の隣接チャネルにおいて類似の波形を示す、同時に発生する活動もまた、アーチファクトであると考えた。同定後、アーチファクトをブランキングにより、全てのチャネルから取り除いた。本プロセスにより、全シグナルの最大３％のロスがもたらされた。アーチファクトを取り除いた後、波形形状の主成分分析（Ｂｅａｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．；５９１（Ｐｔ  １８）：４５１５−３３）を使用して、個々のユニットを分類した。
【００７３】
データ分析：個々の内因性心臓ニューロンの活動の監視
心外膜機械的刺激、及び自律神経系の遠心性神経刺激に関して、刺激（ベースライン）前と刺激中で１分間、ＩＣニューロンの活性を比較した。血管閉塞及びペーシングに関して、ベースラインと刺激中において、及び、ベースラインと刺激後１分（回復）において、ＩＣニューロンの活性を比較した。各刺激の後、ＩＣニューロンの活性及び血行力学動態について、進行前のベースラインレベルに戻すために、少なくとも５分の待機期間を取った。心臓血管刺激に対する応答特徴に基づいて、ＩＣニューロンを機能的に、求心性、遠心性または収束性に分類した（図６Ｂ及び図６Ｃ）。求心性ＩＣニューロンは、単に、心外膜機械的刺激、及び／またはＩＶＣもしくは大動脈の閉塞に応答したものとして規定した。遠心性ＩＣニューロンは、単に、自律神経系の遠心性神経（迷走神経もしくは星状神経節）刺激、及び／または両側の頸動脈の閉塞に応答したものとして規定した。求心性及び遠心性入力の両方の活性化に応答したＩＣニューロンを、収束性として規定した（Ｂｅａｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．；５９１（Ｐｔ  １８）：４５１５−３３）。
【００７４】
データ分析：条件付き確率
条件付き確率分析を使用して、上述したように（Ｂｅａｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．；５９１（Ｐｔ  １８）：４５１５−３３）、１つの刺激に応答したＩＣニューロンが別の刺激にもまた応答したか否かを測定した。各動物で同定したニューロン内での刺激Ｘと刺激Ｙとの機能的関係についての可能性を、刺激Ｙに応答したニューロンが刺激Ｘにもまた応答したという条件付き確率として定量化した。条件付き確率（確率：Ｙへの応答｜Ｘへの応答）を、刺激Ｘに応答したニューロンの数により除した、刺激Ｘ及び刺激Ｙの両方に応答したニューロンの数として推定した。
【００７５】
統計
ベースラインと刺激／回復期間との間の、各ＩＣニューロンの発火率の変化の有意水準を、Ｓｋｅｌｌａｍ分布に基づいて、皮質ニューロン用に開発した統計テストを使用して評価した。カイ二乗検定を使用して、ＭＩと対照動物における、ＩＣ神経応答を比較した。ウィルコクソンの符号順位検定またはマン・ホイットニーＵ検定を使用して、ＭＩと対照動物における、ＩＣニューロンの発火頻度、休止血流力学指数、ならびに、ＩＣニューロンの形態学的及び表現型の変化を比較した。データは、平均±標準誤差として示す。０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であると考えた。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １２．０（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、統計学的分析を行った。
【００７６】
結果
左心室（ＬＶ）拡張終期圧（ＭＩでは３±１ｍｍＨｇと、対照では４±１ｍｍＨｇ（ｐ＝０．５９））、及びＬＶ  ｄＰ／ｄｔ  ｍａｘｉｍｕｍ（ＭＩでは１４３６±１１２ｍｍＨｇ／ｓと、対照では１４２６±１５１ｍｍＨｇ／ｓ（ｐ＝１．００））等の休止血流力学指数の変化の欠落により明示されるように、治療した慢性前頂ＭＩ動物は、慢性的な代償性状態にあり、顕在的な心不全ではなかった。図３Ｊ〜図３Ｋは、微小塞栓技術により誘発される瘢痕形成の典型的な模様を示す。
【００７７】
心筋梗塞は、内因性心臓ニューロンの拡大と表現型の変化を誘発する
ＭＩにより誘発された形態学的及び神経化学的変化を評価するために、腹側心室間神経叢（ＶＩＶ  ＧＰ）からのニューロンを、サイズ、アドレナリン作動性−コリン作動性表現型、及び血管作動小腸ペプチド（ＶＩＰ）表現型について組織学的及び免疫組織化学的分析に通した。ＶＩＰは心機能のモジュレーター、及び潜在的な求心性マーカーである。ＭＩ動物からのＶＩＶ  ＧＰニューロンは、対照のＶＩＶ  ＧＰニューロンよりも大きかった（それぞれ９４６±２３μｍ２と７５５±２２μｍ２；ｐ＜０．０１）（図３Ａ〜図３Ｃ）。ＭＩ及び対照動物からのニューロンサイズ分布のヒストグラムを、図３Ｂに示す。ＶＩＶ  ＧＰ、背面心室間神経叢（ＤＩＶ  ＧＰ）、及び右結腸縁動脈神経叢でニューロンの拡大が観察され、このことは心室に好ましい影響を与える。右心房神経叢では観察されず、このことは心房に好ましい影響を与える（図４Ａ〜図４Ｃ）。
【００７８】
対照と比較して、ＭＩ動物ではコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現するＩＣニューロンの割合の有意な低下があった（それぞれ８７±２％と９１±２％；ｐ＝０．０４）（図３Ｄ〜図３Ｅ）。対照的に、対照動物と比較して、ＭＩではチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現の差は存在しなかった（それぞれ３±１％と２±１％、ｐ＝０．１５）（図３Ｆ〜図３Ｇ）。ＭＩと対照動物では、ＶＩＰ発現が増加した（それぞれ６６±２％と３７±３％；ｐ＜０．０１）（図３Ｈ〜図３Ｉ）。調査した全ての他の神経叢（ＧＰ）では、ＶＩＰ発現もまた有意に増加した（図４Ｄ及び図４Ｅ）。
【００７９】
心筋梗塞後の内因性心臓ニューロンの機能的特性決定
ＭＩにより誘発された神経応答の特徴の機能的変化を測定するために、 直線微小電極アレイ（ＬＭＡ）を使用してＶＩＶ  ＧＰからのニューロンのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を、対照とＭＩ動物で記録した（図５及び図６）。８匹の対照動物では、ＶＩＶ  ＧＰからの１１８個のＩＣニューロンから生じた活性を調査した（平均：動物１匹あたり１５±３個のニューロン）（図７Ａ、左パネル）。８匹の動物では、１０２個のニューロンから生じた活性を調査した（平均：動物１匹あたり１０±２個のニューロン）（図７Ａ、右パネル）。ニューロンの自発性発火レートを、ベースライン間隔からプールしたデータから導出した。対照動物からのニューロンの平均自発性発火レートは０．３１Ｈｚ（範囲：０〜４．４２Ｈｚ）であったが、ＭＩ動物からのニューロンの平均自発性発火レートは０．２１Ｈｚ（範囲：０〜１．５９Ｈｚ）であった。分布は両方の状態において全体的に類似しており、ニューロンの９０％超が１Ｈｚ以下で発火した。
【００８０】
心臓血管刺激への応答特徴に基づいて、ＩＣニューロンを機能的に、求心性、遠心性または収束性に分類した（図６Ｂ、図６Ｃ及び図７Ｂ）。対照及びＭＩ動物において、収束性ニューロンが最大の部分母集団（それぞれ４７％と４８％）を示し、より少ない求心性（それぞれ２７％と１８％）、ならびに遠心性（それぞれ１３％と１５％）ニューロンが続いた（図７Ｂ）。対照動物におけるニューロンの１３％と、ＭＩ動物における２０％は、いずれの刺激にも応答しなかった。いずれの状態においても、全体的な分類に差は存在しなかった（ｐ＝０．２６）。
【００８１】
ＩＣニューロンが心周期に関係する周期性を示したか否かを測定するために、ＩＣニューロンの活性を、心周期と比較した（図５Ｄ及び図７Ｃ）。活性ヒストグラムに基づいて、ベースラインにて少なくとも１００個の活性電位を生じたニューロンは、３０％を超える活性が、所与のフェーズの間に発生した場合に、心周期の特定のフェーズに関係しているものとして分類した。この基準を満たした、対照動物での４６個のニューロン（３９％）及びＭＩ動物での３０個のニューロン（２９％）を、心臓関連周期性について分析した（図７Ｃ）。対照動物では、ニューロンの５２％が拡張期関連活性を示し、２８％が収縮期関連活性を示し、１７％が２つの拡張期及び収縮期関連活性を示し、２％が確率的挙動を示した。対照的に、ＭＩ動物では、ニューロンの４３％が拡張期関連活性を示し、５０％が収縮期関連活性を示し、３％が２つの拡張期及び収縮期関連活性を示し、３％が確率的挙動を示した。
【００８２】
心筋梗塞後の、内因性心臓ニューロンの求心性リモデリング
梗塞と境界及び心臓の遠隔領域を覆う心筋組織に機械的刺激を印加することにより算出したように、ＩＣニューロンが、これらの領域から生じる機械感覚的求心性入力を変換する能力に、ＭＩは異なった影響を及ぼした（図８Ａ〜図８Ｂ）。ＭＩ動物の境界及び遠隔領域（ＲＶＯＴ、右心室（ＲＶ）突部、及びＬＶの中上部壁）から生じる機械感覚的入力の活性化に対する神経応答は、対照における神経応答に類似していた（ＭＩでは３４％と、対照では２４％；ｐ＝０．１２）。対照的に、ＶＩＶ  ＧＰから記録したより少ないニューロンがＭＩ後、梗塞領域（ＬＶ突部）から生じる機械感覚的入力の活性化に応答した（ＭＩでは７％と、対照では１９％；ｐ＝０．０３）。
【００８３】
心臓負荷条件の変化をＩＣニューロンが変換する能力もまた、ＭＩ後に影響を受けた（図８Ｃ）。ＭＩ動物では、一時的な下大静脈（ＩＶＣ）閉塞により誘発される前負荷の減少に対するニューロン応答が減少した（ＭＩでは４１％と、対照では５４％；ｐ＝０．０５）。下行大動脈の一時的閉塞により誘発された後負荷の増加に対する神経応答に差はなかった（ＭＩでは４７％と、対照では３５％；ｐ＝０．１３）。ＭＩは同様に、ニューロンが多峰性求心性神経シグナルを変換する全体的な能力を変えなかった（図８Ｄ；両方の状態において、同様の割合のニューロンが１、２、または３個を超える求心性入力を受けた（ｐ＝０．８４））。これらの求心性入力は、ＩＶＣ及び大動脈の心外膜機械的刺激及び一時的閉塞を含んだ。
【００８４】
心筋梗塞後の、内因性心臓ニューロンの遠心性リモデリング
それぞれ頸部迷走神経及び星状神経節の低周波数刺激により算出したように、ＭＩは、ＩＣニューロンが副交感神経及び交感神経の遠心性入力を個々に変換する能力に影響を及ぼさなかった（図８Ｅ）。これらの自律神経系の遠心性神経への刺激を低周波数で行い、心機能の変化により得られる間接的な応答ではなく、ＩＣＮＳへの直接的な遠心性入力を評価した。対照と比較して、ＭＩ動物における左（ＬＣＶ）または右頸部迷走神経（ＲＣＶ）のいずれかからの入力を受信するニューロンの割合に差はなかった（それぞれ３５％と２７％；ｐ＝０．２３）。左（ＬＳＧ）または右星状神経節（ＲＳＧ）のいずれかからの入力を受信するニューロンの割合についても、同様のパターンが観察された（ＭＩでは４１％と、対照では３１％；ｐ＝０．１２）。興味深いことに、対照と比較して、ＭＩ動物においては、ＡＮＳの交感神経及び副交感神経区画の両方から遠心性入力を受信したニューロンの割合は増加した（それぞれ２１％と１０％；ｐ＝０．０３）。交感神経及び副交感神経入力の両方を受けたこれらのニューロンのうち、９０％は、対照（１１個のニューロンのうち１０個）、及びＭＩ（２１個のニューロンのうち１９個）の両方における、１つ以上の求心性入力の活性化にもまた応答した。そのため、これらのニューロンを収束性として分類した。
【００８５】
ＩＣニューロンへの遠心性入力の圧受容体反射変調における、ＭＩの効果を評価するために、両側の頸動脈を頚動脈洞の尾側で閉塞した（図８Ｆ）。いずれかの状態における頚動脈閉塞に応答するニューロンの割合に、差はなかった（ＭＩでは３４％と、対照では３２％；ｐ＝０．７７）。
【００８６】
心筋梗塞は、ペーシングに対する内因性心臓神経応答の変化を誘発する
ＭＩは、心外膜ペーシングに対するＩＣニューロンの応答に異なった影響を及ぼした（図９Ａ及び図１０Ａ）。（心室捕捉を行った）右心耳（ＲＡＡ）ペーシングに対するニューロン応答は変化しなかった（ＭＩでは３１％と、対照では３６％；Ｐ＝０．４６）が、心室ペーシングに対する応答は低下した（ＭＩでは４４％と、対照では６３％；Ｐ＜０．０１）。ペーシングに応答したニューロンを、機能的に求心性、遠心性または収束性として分類した（図９Ａ、図９Ｂ及び図１０Ｂ）。右室流出路（ＲＶＯＴ）（遠隔領域）及びＬＶ突部（梗塞）でのペーシングから誘発されたニューロン応答が最も劇的に、ＭＩ後に影響を受けた（ｐ＝０．０５）。この変化は主に、ペーシング応答性の収束性ニューロンの上方制御、及び、対応するペーシング応答性の求心性ニューロンの下方制御として反映された。対照動物で評価した全ての部位、及びＭＩ動物での大部分の部位において、ペーシングはニューロンの独自の部分母集団に関係し（図１０Ｂ）、この部分母集団はペーシングのみに応答し、他の求心性または遠心性刺激のいずれにも反応しなかったことも注目に値する。
【００８７】
内因性心臓ニューロンの状態依存性：誘発された応答に対する影響
基本活性は、ペーシングを含む、後の心臓血管刺激に対するＩＣ神経応答に影響を及ぼす（図１１及び図１２）。対照及びＭＩ動物の両方において、低い基本活性を有するニューロンは、ペーシングにより活性化される傾向にあった（ｐ＜０．０１）。逆に、高い基本活性を有するニューロンは、ペーシングにより抑制される傾向にあった（ｐ＜０．０１）。これらの結果は、このようなニューロンの状態依存性の性質を示している。
【００８８】
心筋梗塞後の、刺激に対する内因性心臓ニューロン応答の相互依存
ＩＣニューロン応答と求心性及び遠心性刺激、ならびにペーシングとの関係を、対照及びＭＩ動物の両方で測定した。１つの刺激に応答したニューロンが別の刺激にも応答したか否かについての条件付き確率を、マトリックス形式で表す（図１４Ａ及び図１４Ｃ）。これらのデータを、ネットワークとして図形を用いて表す。条件的確率が≧０．６の繋がりのみを示す（図１４Ｂ及び図１４Ｄ）。これらの関係は、独立した刺激の対により誘発されたＶＩＶ  ＧＰニューロン集団間での一致する挙動を反映する。ＭＩは、ＩＣＮＳ内での全体的な機能的ネットワークの接続性を低下させる。
【００８９】
本研究は、ＭＩの進展中における、ＩＣＮＳ内の神経構成要素のｉｎ  ｖｉｖｏでの構造的及び機能的リモデリングを特徴付けた。ＩＣＮＳのニューラルネットワークの機能を、主に心室機能の制御と関係している結節点であるＶＩＶ  ＧＰにて評価した。本研究におけるいくつかの主な所見が存在する。まず、ＩＣニューロンはＭＩ後に別々に拡大して、表現型の変化を受ける。損傷部位が、どの神経節がリモデリングするのかを決定する。２番目に、梗塞領域からＩＣニューロンへの求心性神経シグナルは弱まるが、境界及び遠隔領域からの神経シグナルはＭＩ後に維持され、「神経感覚境界領域」、即ち、損傷した心筋組織と、隣接する非損傷心筋組織からの求心性情報における不均質性をもたらす（図１５）。求心性神経シグナルの変化は、前負荷の変化をＩＣニューロンが変換する能力の低下によってもまた明らかである。３番目に、ＩＣＮＳへの自律神経系遠心性入力は、ＭＩ後にも維持された（図１５）。第４に、求心性及び遠心性入力の両方を受信するものである、収束性ＩＣ  ＬＣＮは、ＭＩ後の変換能力を高めた（図１５）。第５に、ＩＣＮＳ内の機能的ネットワークの接続性は、ＭＩに低下する。最後に、ＭＩは応答を低下させ、ＩＣニューロンの心室ペーシングに対する特性を変化させる。
【００９０】
対照とＭＩ動物との唯一の違いは、梗塞瘢痕の存在であった。したがって、本明細書で述べる構造的及び機能的変化は、ＭＩに起因する可能性がある。平均で、ＭＩの発生から６週間後に、ＩＣＮＳの機能的リモデリングを調査した。このことは、自律神経系適応の安定期を表し、筋細胞死と神経退化を特徴とする、急性期リモデリングを過ぎている。ＬＶ拡張終期圧及び収縮性等の血流力学的指数に基づくと、動物は慢性的な代償性状態にあり、顕在的な心不全に移らなかった。更に、ＶＩＶ  ＧＰが心室機能の制御に主に関係しており、神経体（ｎｅｕｒａｌ  ｓｏｍａｔａ）が梗塞領域の上流に位置しているため、ＶＩＶ  ＧＰから神経活性を記録した。したがって、観察された神経リモデリングは、ニューロンへの直接的な虚血性損傷に起因していない。
【００９１】
ＭＩは、ＶＩＶ  ＧＰ内のニューロンの形態的及び表現型の変化を誘発し、このことは、ニューロンの拡大とコリン作動性表現型の減少により明らかとなる。興味深いことに、神経の拡大はＶＩＶ  ＧＰ、ＤＩＶ  ＧＰ及びＲＭＡ  ＧＰのみで観察され、このことは心室に優先的に影響を及ぼす。ＲＡ  ＧＰでは神経の拡大は観察されず、このことは、心房に優先的に影響を及ぼす。ＭＩの後、全ての神経叢においてＶＩＰの発現も増加した。ＶＩＰは心機能の重要なモジュレーターであり、求心性シグナル伝達に潜在的な役割を有している。これらの構造的変化は、虚血性心筋症のヒト及び動物モデルの両方における胸腔内心外性神経節で報告される変化に類似している。この神経リモデリングは、神経親和性因子の放出、ならびに求心性及び遠心性神経シグナル伝達の変化から生じることが推測されている。ＭＩが誘発する、ＩＣＮＳへの上行性及び下行性入力の変化についての直接的な機能的証拠を本明細書において提供する。
【００９２】
梗塞境界領域からの神経感覚入力
ＭＩ後の遠心性神経シグナルの構造的／形態的リモデリングは広範にわたって研究されてきたが、損傷した心筋組織と、隣接する非損傷の心筋組織から発生する求心性神経シグナルにはほとんど注意が向けられてこなかった。解剖学的及び機能的研究は、心房及び心室組織に位置する感覚性神経突起を有するＩＣ神経節における単極性ニューロンを同定した。これらの求心性ニューロンは、心臓の局在的な機械的及び化学的環境を変換する。各ＧＰに含有される求心性ニューロンは、空間的に広がった受容野を有し、広範囲にわたる心臓領域からの感覚的情報の変換を可能にする。ここでは、左の大冠動脈からの左前区下行冠動脈（ＬＡＤ）の起点に隣接して位置するＶＩＶ  ＧＰニューロンが、右及び左心室を覆う多様な心臓領域から生じる感覚的入力を変換することを示す。
【００９３】
ＭＩの後、虚血に続き、梗塞領域で心筋壊死が生じる。更に、エネルギー基質の欠如、及び活性酸素種等の分子の増加は、梗塞境界領域内での筋細胞のリモデリングをもたらす、細胞内シグナル伝達プロセスのカスケードを引き起こす。筋細胞リモデリングと同時に、ＩＣＮＳを含む心軸索の複数のレベルで生じる、適応性及び不適応性変化が存在する。急性状態では、損傷心筋組織からの求心性シグナルを変換するＩＣニューロンの過度及び異常な活性化が存在する。本明細書で提示するデータは、慢性状態では、梗塞領域からＩＣＮＳへの求心性シグナルは減少したが完全には消滅しておらず、一方、境界及び遠隔領域からの求心性シグナルは維持されていることを示す。求心性神経シグナルでのこの不均質性が、境界状態、及び瘢痕形成により誘発される心筋境界領域に類似する「神経感覚境界領域」を生じさせる。網膜神経節細胞が均一でない光照射野を検出することができる増加した視覚系等の、感覚境界状態の重要性は他の神経回路でも既に示されてきている。ＭＩが誘発する、ＩＣＮＳへの求心性入力の非対称性によって、交感神経の興奮を含む、ＡＮＳの反射活性化が起こり得ると考えられている。これに関し、ＭＩ後に、一過性受容体電位バニロイド１の潜在的なアゴニストである、レシニフェラトキシンを加えることにより、心臓の求心性かつ侵害受容性のシグナル伝達が減少し、交感神経の興奮が減少し、これは、維持された心機能と関係している。これらのデータは、心臓病の進行における求心性神経シグナルの基本的な必要性、及び、病気の過程を管理するための治療標的としての、レシニフェラトキシンの役割を示している。
【００９４】
収束性局所回路ニューロン：内因性心臓神経系内での情報処理
本実施例では、収束性ＬＣＮと呼ばれるＩＣニューロンの部分母集団が、求心性及び遠心性入力の両方を受信することが示されている。収束性ＬＣＮは、求心性及び遠心性ニューロンと共に、ＩＣ神経回路網の基本的構成要素を形成する。この回路内では、収束性ＬＣＮが情報を統合して処理し、ＭＩ状態の場合でさえもこれらのニューロンの大きな部分母集団が存在することは、局所情報処理の能力が維持されていることを示す。ＭＩ後にニューロンの全体的な機能分類（求心性、遠心性及び収束性）に差はなかったが、心臓血管刺激に対する統合されたネットワークの応答は適応する／リモデリングされる。このことは、減少した前負荷、及び局所的なペーシングに対する神経応答において明らかであった。ペーシングに応答した大部分のニューロンは、ダイナミックな心臓血管変化を変換することが見出されたが、ペーシングのみに応答した独特なサブセットも存在した。梗塞領域だけでなく、心臓の遠隔領域におけるペーシングに対する変化したＩＣＮＳ応答は、ペーシングが、ＭＩによりもたらされた、心臓頂部のＩＣＮＳへの追加のストレスを加える場合があることを示す。梗塞瘢痕の存在下における心室ペーシングは、心室の肥大及び非同期を含む、心機能への有害作用を有することが示されている。最終的に、この有害作用は心不全への進行を加速させ、死亡率を高める。これらの有害事象に存在する、提示されたメカニズムは、神経内分泌系の活性化に関係している。したがって、ＭＩが誘発する求心性神経シグナルのリモデリングと共に、ＩＣＮＳ活性の変調は、ペーシングと神経内分泌系活性化との不可欠な関係となる可能性があると考えられている。
【００９５】
遠心性神経支配
ＩＣＮＳは伝統的に、副交感神経節前遠心性突起の、心臓への単純な中継局と見られてきた。この見解とは反対に、そして、イヌ科動物モデルで得られたデータが支持しているように、高い割合のブタＩＣニューロンが、交感神経または副交感神経節前ニューロンからの入力、及び、複雑な心臓血管求心性入力を受信したことが示されている。ＩＣニューロンのサブセットが、集合した遠心性入力（星状神経節及び迷走神経の両方からの入力）を受信したという事実は、著しい程度の交感神経相互作用がＩＣＮＳ内で生じることを示唆している。
【００９６】
ＭＩ後の遠心性神経シグナルのリモデリングは、心軸索の複数のレベルで生じる。臓器レベルでは、梗塞心筋の交感神経除神経、及び境界領域の過剰神経支配が観察された。形態学的及び神経化学的変化もまた、星状神経節等の交感神経性神経節に含有されるニューロンで認められた。交感神経性影響の増加は、中枢神経が媒介する副交感神経性影響の離脱に付随する。交感神経と迷走神経におけるバランスのこれらの変化に関わらず、本明細書で提示するデータは、ＩＣＮＳへの交感神経及び副交感神経入力がＭＩ後にも無変化のままであることを示す。実のところ、収束性の遠心性入力を受信するＩＣニューロンの割合は、ＭＩ後に二倍になった。したがって、これらのＩＣニューロンの圧倒的多数は、これらの９０％が１つ以上の求心性刺激により影響を受けたという事実により明らかであるように、本質的に局所回路であった。この適用は、交感神経と迷走神経のバランス、ならびに、梗塞と心室の境界及び遠隔領域から生じる非対称の求心性入力によりもたらされる効果の不安定化にもかかわらず、末梢ネットワークの安定性を維持する試みであり得る。
【００９７】
本研究は、ＩＣＮＳの神経シグネチャーがＭＩで変化し、心臓病の原因を明らかにする一助となる神経記録の実用性の基礎をなすという直接的な証拠を提供する。求心性神経シグナルの不均質性はＡＮＳの反射活性化に不可欠である可能性があり、これによって、不整脈の可能性及び心不全の進行に影響を与える。患部心筋からＩＣＮＳ、胸腔内心外性神経節、及び心軸索の高次中枢への、求心性神経シグナルの変調は、虚血性心疾患を低減する（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ）ための新規の治療的アプローチを表す。これらの所見は、心臓の神経電気検査は、心臓生理学及び病態生理学の研究のための追加様式として機能することができることもまた強調している。
【００９８】
本明細書で見出される結果は、慢性的ＭＩが、ＩＣＮＳでの情報処理を変えることを示唆する。梗塞領域からＩＣＮＳへの求心性シグナル伝達の著しい減少ことが観察された。誘発されたＩＣＮＳへの遠心性シグナル伝達では変化は観察されなかったが、ＩＶＣ閉塞に対する、統合されたＩＣ反射応答は著しく弱まった。ＭＩが仲立ちする、ＩＣＮＳにおける情報処理のこれらの変化は、変化した心臓求心性シグナルの「神経シグネチャー」を表し、この神経シグネチャーは、不整脈及び心不全を担う病態生理学的プロセスを開始する。
【００９９】
本明細書で引用するそれぞれの、及び全ての特許、特許出願、及び出版物の開示は、それら全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【０１００】
本発明は特定の実施形態を参照して開示されてきたが、本発明の他の実施形態及び変化は、本発明の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく、他の当業者により創案され得ることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、このような全ての実施形態、及び等価な変化を含むように解釈されることを目的としている。
【図１】
2018515184.tif 000002
【図２】
2018515184.tif 000003
【図３Ａ】
2018515184.tif 000004
【図３Ｂ】
2018515184.tif 000005
【図３Ｃ】
2018515184.tif 000006
【図３Ｄ】
2018515184.tif 000007
【図３Ｅ】
2018515184.tif 000008
【図３Ｆ】
2018515184.tif 000009
【図３Ｇ】
2018515184.tif 000010
【図３Ｈ】
2018515184.tif 000011
【図３Ｉ】
2018515184.tif 000012
【図３Ｊ】
2018515184.tif 000013
【図３Ｋ】
2018515184.tif 000014
【図４Ａ】
2018515184.tif 000015
【図４Ｂ】
2018515184.tif 000016
【図４Ｃ】
2018515184.tif 000017
【図４Ｄ】
2018515184.tif 000018
【図４Ｅ】
2018515184.tif 000019
【図５Ａ】
2018515184.tif 000020
【図５Ｂ】
2018515184.tif 000021
【図５Ｃ】
2018515184.tif 000022
【図５Ｄ】
2018515184.tif 000023
【図６Ａ】
2018515184.tif 000024
【図６Ｂ】
2018515184.tif 000025
【図６Ｃ】
2018515184.tif 000026
【図７Ａ】
2018515184.tif 000027
【図７Ｂ】
2018515184.tif 000028
【図７Ｃ】
2018515184.tif 000029
【図８Ａ】
2018515184.tif 000030
【図８Ｂ】
2018515184.tif 000031
【図８Ｃ】
2018515184.tif 000032
【図８Ｄ】
2018515184.tif 000033
【図８Ｅ】
2018515184.tif 000034
【図８Ｆ】
2018515184.tif 000035
【図９Ａ】
2018515184.tif 000036
【図９Ｂ】
2018515184.tif 000037
【図９Ｃ】
2018515184.tif 000038
【図１０Ａ】
2018515184.tif 000039
【図１０Ｂ】
2018515184.tif 000040
【図１１】
2018515184.tif 000041
【図１２】
2018515184.tif 000042
【図１３Ａ】
2018515184.tif 000043
【図１３Ｂ】
2018515184.tif 000044
【図１４Ａ】
2018515184.tif 000045
【図１４Ｂ】
2018515184.tif 000046
【図１４Ｃ】
2018515184.tif 000047
【図１４Ｄ】
2018515184.tif 000048
【図１５Ａ】
2018515184.tif 000049
【図１５Ｂ】
2018515184.tif 000050