(57)【要約】  改変されたケモカインペプチドであって以下のアミノ酸配列：（ａ）Ｎ末端がＥＬＲ配列を有し；（ｂ）Ｎ末端から３番目のシステイン残基の前がＰＡＳＱＦ配列であり；かつ（ｃ）Ｎ末端から１７番目のアミノ酸残基が改変されている、アミノ酸配列を含む改変ケモカインペプチドが提供される。このケモカインペプチドは、癌を処置すること、および腫瘍の増殖を阻害することに用いられ得る。【選択図】図２
2018517701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド配列を含む改変されたケモカインペプチドであって、ここで前記ペプチド配列のＮ末端が：
（ａ）「グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）−アルギニン（Ｒ）」配列であって、Ａ特徴の配列として定義され、ここで前記Ａ特徴の配列は、前記改変されたケモカインペプチドのＮ末端に位置する配列と；
（ｂ）「プロリン（Ｐ）−アラニン（Ａ）−セリン（Ｓ）−グルタミン（Ｑ）−フェニルアラニン（Ｆ）−Ｃｙｓ３」配列であって、Ｂ特徴の配列として定義され、ここで前記Ｂ特徴の配列は、ケモカインペプチドのＮ末端から数えて３番目のシステイン（Ｃ）の上流に隣接している配列と、
を含み、かつ
ここで、前記改変されたケモカインペプチドは、Ａ特徴の配列、Ｂ特徴の配列、および改変された位置からなり、ここで前記改変された位置は、改変されたケモカインペプチドのＮ末端から数えて１７番目、１２番目、または１３番目の位置に位置する、改変されたケモカインペプチド。
【請求項２】
前記改変されたケモカインペプチドのＮ末端から１７番目の位置のフェニルアラニン（Ｆ）が、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換されている、請求項１に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項３】
前記改変されたケモカインペプチドのＮ末端から１２番目の位置のトレオニン（Ｔ）が、セリン（Ｓ）で置換されている、請求項１に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項４】
前記改変されたケモカインペプチドのＮ末端から１３番目の位置のチロシン（Ｙ）が、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換されている、請求項１に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項５】
前記改変されたケモカインペプチドの未改変の前駆体が、起源のケモカインペプチドに由来し、ここで前記起源のケモカインペプチドが、Ｎ末端から第一のシステインと第二のシステインとの間に位置する、ゼロ〜２個のアミノ酸残基（単数または複数）を有し、かつ前記アミノ酸残基（単数または複数）が、前記アミノ酸残基の数が１〜２個である場合に荷電の有無の極性を有する、請求項１に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項６】
前記起源のケモカインペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項７】
前記改変されたケモカインペプチドが、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から選択される、請求項１に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項９】
前記改変されたケモカインペプチドが、癌を処置するため、または腫瘍増殖を阻害するために用いられる、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
治療上有効な量の請求項１に記載の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、癌を処置するため、および腫瘍増殖を阻害するための薬学的組成物。
【請求項１１】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、子宮癌、白血病、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、精巣癌、リンパ腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝臓癌、喉頭癌、胆嚢癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、または鼻咽頭癌を含む、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記癌が、ＣＸＣＲ１／２発現、またはＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６およびＣＸＣＬ７からなる多量のケモカインを有する細胞によって特徴付けられ、ここで前記癌が、ケモカイン受容体を発現する癌細胞によって特徴付けられる、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、治療用アンタゴニストであり得る改変されたケモカインペプチドに関する。具体的には、本発明は、癌を処置するためおよび腫瘍増殖を阻害するための改変されたケモカインに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ケモカインは、誘導性の、分泌性の、構造的にかつ関連する低分子（約８〜１４ｋＤ）の群である。ケモカインは、４つのサブファミリー、例えば、ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３ＣおよびＣに分けられる。ケモカインはまた、２つの主要な機能的サブファミリーにも分類される：「恒常的ケモカイン」および「炎症性ケモカイン」。
【０００３】
ケモカインは通常は、その構造に３つのβシートを有し、かつＣ末端にαらせん、およびＮ末端に４つの保存されたシステインを有する。ケモカインは、Ｎ末端に最初の２つのシステイン（Ｃｙｓ）を含む配列に基づいて、４つのサブファミリー（ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３ＣおよびＸＣ）に分類された。４つの種類の内でも、ＣＸＣおよびＣＣは、２つのメジャーなサブファミリーであるが、ＸＣおよびＣＸ３Ｃは、マイナーなサブファミリーである。細胞上のケモカインがケモカイン受容体とコンジュゲートした後に反応が起こる。ケモカイン受容体は、７つの膜貫通Ｇタンパク質結合受容体を備え、これはそれぞれ、結合標的上のリガンドの種類に応じて、ＣＸＣＲ、ＣＣＲ、ＣＸＲおよびＣＸ３ＣＲと命名される。ケモカイン受容体はさらに、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４などのように数に応じて配置される。しかし、標的細胞上には１つのケモカイン受容体が示されるだけでなく、浸潤した炎症細胞の結合標的は、１つのケモカイン受容体に特異的ではなく、従って、特定の刺激および誘導下で異なる細胞のいくつかのケモカイン受容体が発現されなければならない。
【０００４】
例えば、グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）−アルギニン（Ｒ）特徴的配列（ＥＬＲ特徴的配列）を有するＥＬＲ−ＣＸＣケモカインとは、Ｎ末端に特徴的なＥＬＲ−ＣＸＣのアミノ酸配列を有するタンパク質を指し、Ｘは、電荷の有無の状態の極性を有するアミノ酸であるか、またはＸは存在しない。ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインは、発癌物質、ＩＬ−８および好中球活性化タンパク質２（ＮＡＰ−２）の発現を調節し得る。それらの受容体は、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２であり、それらは、主に好中球を標的とする。ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインは、好中球の蓄積および活性化を促進し得る。したがって、この種のＥＬＲ−ＣＸＣケモカインは、広範囲の急性および慢性炎症疾患の発生に重要な役割を果たす。これらの炎症としては、乾癬および関節リウマチが挙げられる。
【０００５】
さらに、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインは、腫瘍発生に伴う血管新生に関連し、その誘導メカニズムは、この種のケモカイン、特にＩＬ−８に関連して、内皮細胞（ＥＣ）上のＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２とコンジュゲートすることによって生成される活性化である。現在、多くの異なる種類の腫瘍がＥＬＲ−ＣＸＣケモカインを分泌し得、かつこれらのケモカインを過剰発現する腫瘍は、予後不良と関連することが証明されている。
【０００６】
ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２とＥＬＲ−ＣＸＣケモカインとの抗コンジュゲーションは、ＣＸＣＲ１または／およびＣＸＣＲ２受容体の活性化によって誘導される異常なシグナル伝達が阻害されるように、２種の受容体を有する細胞の活性化に起因する関連疾患が処置されるように、実行可能なストラテジーである。従って、科学者は、ＣＸＣケモカインを阻害するための受容体タンパク質アナログを見出して調製することに努めている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、出願人は、先行技術において遭遇する上記の状況に対処することを試みる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
癌は先進国では最も一般的な死亡原因である。もし癌が早期に診断されれば、首尾よく処置される可能性は高い。癌の診断と処置にはかなりの進歩が見られているが、これらの薬物は深刻な副作用を引き起こすか、または無効である。したがって、癌の処置または癌の予防のための新規な方法または新規な組成物が必要とされている。
【０００９】
上記の問題を解決するために、本発明の一実施形態によれば、腫瘍増殖を阻害し、癌を処置するための改変されたケモカインが提供される。
【００１０】
本発明は、ペプチド配列を含む改変されたケモカインペプチドを提供する。ペプチド配列のＮ末端は、２つの特徴的な配列を含む。１つの特徴的な配列は、「（ａ）グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）−アルギニン（Ｒ）配列」であり、これは改変ケモカインペプチドのＮ末端に位置する。別の特徴的な配列は、「（ｂ）プロリン（Ｐ）−アラニン（Ａ）−セリン（Ｓ）−グルタミン（Ｑ）−フェニルアラニン（Ｆ）−Ｃｙｓ３配列」であり、これは、ケモカインペプチドのＮ末端から数えて、第３のシステイン（Ｃ）の上流に隣接する。改変されたケモカインペプチドは、（ａ）特徴的な配列、（ｂ）特徴的な配列、および改変された位置を含む。上述の改変された位置は、改変されたケモカインペプチドのＮ末端から数えて１７番目、１２番目または１３番目の位置にある。
【００１１】
一実施形態では、１７位のフェニルアラニン（Ｆ）残基は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。
【００１２】
一実施形態では、改変ケモカインペプチドの未改変前駆体は、起源のケモカインに由来する。起源のケモカインのＮ末端の最初の２つのシステインの間にゼロ〜２個のアミノ酸残基が位置し、かつアミノ酸残基の数が１〜２の場合、そのアミノ酸残基は電荷の有無の状態で極性を有する。
【００１３】
一実施形態では、起源のケモカインペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１４】
一実施形態では、改変ケモカインペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から選択される。
【００１５】
本発明はまた、本発明の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。
【００１６】
一実施形態では、この改変されたケモカインペプチドは、癌の処置または腫瘍増殖の阻害のために使用される。
【００１７】
本発明はさらに、治療有効量の本発明の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、癌を処置するため、または腫瘍増殖を阻害するための薬学的組成物を提供する。
【００１８】
一実施形態において、上記癌は、前立腺癌、乳癌、子宮癌、白血病、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、精巣癌、リンパ腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝臓癌、喉頭癌、胆嚢癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、または鼻咽頭癌を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、起源のケモカインペプチド配列（配列番号１〜９）に対する配列アラインメント、すなわちＣＸＣＲ１または／およびＣＸＣＲ２に対して高い親和性を有するＥＬＲ−ＣＸＣケモカインのアミノ酸配列の比較を示す。
【図２】図２は、本発明における改変されたケモカインペプチド（配列番号１０〜配列番号１２）のアミノ酸配列に対する配列アラインメントの比較を示す。
【図３】図３は、本発明のＣＸＣＬ８で最大量の細胞が遊走したことを示す。
【図４】図４は、遊走した細胞の数を示す。黒のバーは、走化性がＣＸＣＬ８によって誘発されることを示す。灰色のバーは、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインおよびＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の両方による処置を表す。白いバーは、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインおよび１７ＬＩＰ１０の両方での処置を表す。
【図５】図５は、処置群（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）およびプラセボ群（生理食塩水）の腫瘍容積を示す。
【図６】図６は、処置群（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）およびプラセボ群（生理食塩水）の腫瘍重量を示す。
【図７】図７は、処置群（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）およびプラセボ群（生理食塩水）の微小血管密度を示す。
【図８】図８は、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０または生理食塩水の注射後の腫瘍容積を示す。Ａ群には、５００μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０を毎週４回注射した。Ｂ群には、５００μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０を毎週２回注射した。Ｃ群には、２５０μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０を毎週２回注射した。Ｄ群には毎日１００μｌの生理食塩水を皮下注射した。
【図９】図９は、マウス肺から得られた腫瘍組織の外観の画像を示す。毎週４回、５００μｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＣＸＣＬ８−ＩＰ１０（図９Ａ）または生理食塩水（図９Ｂ）を投与した２４日後にマウスを屠殺して、肺組織を得た。矢印で示された白い部分は、肺に広がっている癌の病巣であった。
【図１０】図１０は、癌細胞におけるＣＸＣＲ１およびＣＸＣＬ８の発現レベルを示す。
【図１１】図１１は、走化性による本発明の拮抗作用の有効性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、新規なケモカインを提供する。本発明の新規なケモカインは、ＣＸＣＬ１（配列番号３）、ＣＸＣＬ２（配列番号４）、ＣＸＣＬ３（配列番号５）、ＣＸＣＬ５（配列番号：６）、ＣＸＣＬ６（配列番号：７）、ＣＸＣＬ７（配列番号：８）、ＣＸＣＬ８（配列番号：２）およびｈＧ３１Ｐ（配列番号：１）などの、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインまたはＣＸＣＲ１もしくはＣＸＣＲ２に対する高い結合親和性を有する物質に由来する。本発明においては、本発明におけるこの種のケモカインに応じて改変されており、これは主に、元の３０ｓループ領域に置換されたＰＡＳＱＦの特徴的な配列に依存する（図１）。このＰＡＳＱＦは、非ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインであるＣＸＣＬ１０ケモカインにもともと存在する。
【００２１】
一実施形態では、本発明の改変ケモカインは、（ａ）「−Ｎ’−グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）−アルギニン（Ｒ）の特徴的な配列（これは、改変されたケモカインペプチドのＮ末端に位置する）、および（ｂ）「−Ｎ’−プロリン（Ｐ）−アラニン（Ａ）−セリン（Ｓ）−グルタミン（Ｑ）−フェニルアラニン（Ｆ）−Ｃｙｓ３」の特徴的な配列（これは、このケモカインペプチドのＮ末端から数えて、第３のシステイン（Ｃ）の上流に隣接する）を含む。本発明の改変ケモカインは、改変ケモカインペプチドのＮ末端から数えて１７番目の位置に変異（改変）をさらに含むことに留意されたい。
【００２２】
一実施形態では、１７位のもともとのアミノ酸残基はフェニルアラニン（Ｆ）であり、１７番目のアミノ酸残基は、単一アミノ酸変異により非フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸に置換されている。他の実施形態において、１７位のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、セレノシステイン（Ｕ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ピロリシン（Ｏ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、好ましくはロイシン（Ｌ）に置換されてもよい。アミノ酸置換のない起源のケモカインペプチドと比較して、改変されたケモカインは、より高い親和性を有し、かつ位置１７で置換されたアミノ酸残基の後に腫瘍増殖を効果的に阻害することができた。
【００２３】
必要に応じて、本発明の例示的な実施形態では、本発明の改変ケモカインとしては、限定するものではないが、配列番号１０、配列番号１１および／または配列番号１２が挙げられる（図２）。
【００２４】
例えば、配列番号１０は、ＥＬＲ−ＣＸｎＸのアミノ酸の特徴的な配列の規則を満たすためにＥＬＲ−ＣＱＣのＮ末端配列を含むだけでなく、オリゴペプチド配列Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（ＰＡＳＱＦ）も有する。ＰＡＳＱＦは、Ｎ末端から数えて３番目のシステイン（１０１９２）の上流に置換された改変された配列であり、この第３のシステインは、ＰＡＳＱＦオリゴペプチド配列のフェニルアラニンに隣接している。さらに重要なことには、１７番目の位置のアミノ酸残基（第１の改変された位置）は、フェニルアラニンではなくロイシンである。
【００２５】
図２に示す配列によれば、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアナログの配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２は、ＰＡＳＱＦ改変配列を有し、これはケモカインペプチドのＮ末端から数えて三番目のシステイン（Ｃ）の上流に隣接している。さらに、本発明のケモカインの１７位のアミノ酸残基は、ロイシンに変異されている。
【００２６】
本発明の改変ケモカイン、そのアナログおよびフラグメントは、血管新生に関連する疾患を処置し得る。血管新生関連の疾患としては、限定するものではないが、炎症性障害、慢性関節リウマチおよび乾癬、血管の不適切または不適当な侵襲に関連する障害、例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、再狭窄および細胞増殖性障害／疾患、例えば、新生物、および癌関連障害（例えば、前立腺癌、乳癌、子宮癌、白血病、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、精巣癌、リンパ腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝臓癌、喉頭癌、胆嚢癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、または鼻咽頭癌）が挙げられる。
【００２７】
本発明の改変されたケモカインは、必要に応じて従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、および所望のビヒクルを含む単位投薬製剤において、経口的に、口腔内に、非経口的に、吸入スプレーによって、直腸に、皮内に、経皮的に、または局所的に投与されてもよい。
【００２８】
本発明の改変されたケモカインは、単回投与で、２４時間にわたる複数回投与で、または連続注入によって投与されてもよい。連続注入によって投与する場合、化合物は、限定するものではないが、静脈内重力ドリップ、静脈内注入ポンプ、埋め込み型注入ポンプ、または任意の局所経路などの当該分野で周知の方法によって供給されてもよい。処置の長さは、多くの要因、例えば、血管新生状態の持続期間および重症度に依存して変化する。本発明の改変されたケモカインを単独で、または他の薬剤と組み合わせて用いる被験体の処置は、血管新生が消失するまで継続されてもよいし、または処置は被験体の生涯にわたって続いてもよい。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、癌を治処置し、腫瘍を阻害するための薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、有効量の本発明の改変ケモカインまたはそのアナログおよび薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体としては、溶媒、分散剤、コーティング、抗菌／抗真菌剤、等張剤、徐放性剤および／またはそのアナログを挙げてもよい。
【実施例】
【００３０】
１．細胞走化性
ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーアッセイを用いて、ＬＭＶＥＣの遊走を評価した。ＬＭＶＥＣを、２％ＦＣＳを含むＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２上で、８時間培養した。細胞を、１．２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で、１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングしたポリカーボネート膜（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）上に播種した。１０ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、およびＣＸＣＬ８−ＩＰ１０またはＩＬ８−Ｆ１７ＬＩＰ１０を、それぞれ、ボイデンチャンバーの底に添加した。ＬＭＶＥＣを、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー上で３７℃で４時間培養し、次いでＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｈａｒｌｅｃｏ）で固定して染色した。遊走した細胞の数を、ＨＰＦ（Ｘ２００）によってカウントした。
【００３１】
この結果によって、ケモカインＣＸＣＬ８が存在する場合、多量の細胞が遊走したことが示される（図３）。
【００３２】
図４において、黒のバーはケモカイン誘導を示し、灰色のバーはケモカインおよびＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の併用処置を示しており、白いバーはケモカインおよびＩＬ８−１７ＬＩＰ１０による同時処置を示す。図４によれば、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０およびＩＬ８−１７ＬＩＰ１０の両方とも、細胞遊走を阻害する効果を有し、ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０は、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０より良好な細胞遊走阻害効果を有する。
【００３３】
２．投与された改変ケモカインペプチドによる異種移植片腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃヌード雄性マウス（Ｂｌｔｗ：ＮＵ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ、４〜６週齢）を入手して、特定の病原体のない条件下で、層流キャビネット内で飼育した。動物は自由に水道水および標準的なペレット食品にアクセスし、その健康状態を毎日モニターした。ヌードマウス異種移植アッセイのために、単層培養したＧＦＰ陽性ＰＣ３細胞（ＰＣ−３−ＧＦＰ）を採取し、３匹のヌードマウスの右脇腹にマウス１匹につき５×１０６細胞を皮下接種した。２〜４週間後、移植のために腫瘍を採取した。実験の最後に、これらの３匹のマウス由来の腫瘍異種移植片を、リセット（ｒｅｓｅｔ）し、スライスし（１ｍｍ３切片）、次いで、局所麻酔および滅菌手術条件下で、レシピエントのヌードマウスの前立腺組織に移植した。全部で２４匹の動物が移植物を受けた。５日後（０日目）、その動物を、１００μｌの生理食塩水（対照群）または本発明の配列（配列番号１３（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）、０．５ｍｇ／ｋｇ）（実験群）で２４日間の皮下注射について、２つの群に分類した（１２匹の動物／群）。成長腫瘍のＧＦＰ蛍光画像を、５１５ｎｍ発光フィルターを備える解剖顕微鏡の光学的構成の下で、デジタルカメラを用いて１２、１８および２４日に撮影した。腫瘍容積は、式：容積＝（長さ×幅２）／２を用いて算出した。２４日目に、全てのマウスを屠殺して、腫瘍のＧＦＰ蛍光画像を撮影した。血管の微小血管密度は、式：密度＝微小血管長／腫瘍面積を用いて算出した。各マウス由来の腫瘍サンプルを、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、その後の免疫組織化学分析のための標準的な手順を用いてパラフィンに包埋した。
【００３４】
その結果によって、１２、１８および２４日目に処置（実験）群およびプラセボ（対照）群の腫瘍容積が示される（図５）。図５によれば、本発明の配列（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）は、腫瘍増殖を効果的に阻害する。処置群の腫瘍容積は、プラセボ群と比較して５倍を超えて低下した。プラセボ群と比較して処置群について腫瘍容積のこの明らかな阻害は持続し、経時的にさらに顕著になった。
【００３５】
その結果によって、２４日目に処置（実験）群およびプラセボ（対照）群の腫瘍重量が示される（図６）。図６によれば、本発明の配列（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）は腫瘍増殖を効果的に阻害し、腫瘍重量は２倍を超えて減少した。
【００３６】
３．異種移植腫瘍組織の免疫組織化学的分析
パラフィン包埋前立腺癌異種移植切片を脱ろうし、ＰＢＳに再水和した。詳細には、切片をＰＢＳで３回リンスし、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中で１５分間熱処理した。３％の過酸化水素で１０分間処理することにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片を、ＰＢＳを用いて繰り返し３回すすぎ、タンパク質ブロッキング溶液（ＰＢＳ中に５％正常ウマ血清、ｐＨ７．５）と共に室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次いでマウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体（１：５０）、ウサギポリクローナル抗ＮＦ−κＢ抗体、またはヤギポリクローナル抗ＣＤ３１抗体（１：５０）とともに、４℃で２０時間インキュベートした。反応後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体の適切な希釈物とともに、３７℃で４０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、切片をビオチン化ヤギ抗マウスまたは抗ウサギ抗ヤギポリ免疫グロブリンと共に暗所で３０分間インキュベートした。発色のために、切片を、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、ジアミノベンジジン溶液中で１０分間インキュベートし、次いでヘマトキシリンで１分間対比染色した（Ｋｏｌｌｍａｒら、２００７）。陰性対照の切片を、一次抗体の代わりにＰＢＳとともにインキュベートした。染色された切片の強度は、撮影された切片をグレースケール（スケール０〜２５５）に変換した後に測定し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ６．０  Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔを使用して計算した集積光学濃度（ＩＯＤ）で表した。各群について、５つのマウス腫瘍異種移植片を分析した。異なる切片で無作為に選択された、１つの腫瘍あたり５つの撮影された切片を用いて、あらゆる腫瘍異種移植のグレイ値を平均した（Ｃｓｉｌｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＣＤ３１の免疫組織化学的分析を用いて微小血管密度を測定し、微小血管密度の測定値は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ６．０  Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔを使用して算出した、微小血管面積の平均パーセンテージを表している。
【００３７】
その結果によって、プラセボ（対照）群および処置（実験）群の微小血管密度が示される（図７）。図７によれば、本発明の配列（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）は、前立腺癌異種移植ヌードマウスの血管新生を効率的に阻害する。
【００３８】
４．投与された改変ケモカインペプチドによる、異種移植腫瘍を保有するＣ５７ＢＬ／６ヌードマウスにおける抗腫瘍効果
Ｃ５７ＢＬ／６ヌードマウスを、特定の病原体の下で層流キャビネット内で飼育した。動物は自由に水道水および標準的なペレット食品にアクセスし、その健康状態を毎日モニターした。５×１０６個の細胞のＬＬＷ２細胞（ルイス肺癌）を、マウス１匹あたり５×１０６個の細胞を用いて３匹のマウスの右四半分に注射した。２〜４週間後、移植のために腫瘍を採取した。この例では、２４匹のマウスに移植した。移植の５日後、２４匹のマウスを４つの群（１群６匹）に分類した。Ａ群：５００μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の週４回の投与。Ｂ群：５００μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の週２回の投与。Ｃ群：２５０μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の週２回の投与。Ｄ群：１００μｌの生理食塩水を毎日皮下投与した。腫瘍容積は、式：容積＝（長さ×幅２）／２を用いて算出した。２４日目に、全てのマウスを屠殺し、腫瘍のＧＦＰ蛍光画像を撮影した。血管の微小血管密度は、式：密度＝微小血管長／腫瘍面積を用いて算出した。各マウスの腫瘍サンプルを、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、その後の免疫組織化学分析のために標準的な手順を用いてパラフィンに包埋した。
【００３９】
図８によれば、Ａ群が腫瘍増殖阻害において最高の改善を示す。２４日目に、全てのマウスを屠殺して腫瘍容積を算出した。Ｄ群と比較して、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０（５００ｕｇ／ｋｇ）で１週間に４回処置した腫瘍容積は、Ａ群と比較して３０％減少していた。その結果、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０は、腫瘍増殖の有意な阻害を有したことが示される。
【００４０】
図９によれば、腫瘍転移は、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０によって有意に抑制された。５００μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０を週に４回（図９Ａ）または生理食塩水（図９Ｂ）を投与した後、マウスを２４日目に屠殺にして肺を得た。矢印で示された白い部分は、肺に広がっている癌の病巣であった。ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の投与後、マウス肺で転移性の病巣は生じなかった。
【００４１】
５．好中球走化性アッセイ
好中球の走化性は、改善されたボイデンチャンバーマイクロ走化性アッセイによって評価した。白血球は、一般的な濃度勾配により末梢血から採取した。好中球は、低濃度勾配領域の底から得て、赤血球混入は低張溶解によって除去した。精製した好中球（５×１０６／ｍｌ）をＨＢＳＳ溶液（４００ｍｇ／ＬのＫＣｌ、６０ｍｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、８０００ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ、３５０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、９０ｍｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４７Ｈ２Ｏおよび１０００ｍｇ／Ｌのグルコース）に再懸濁し、次いで、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）培地中で３７℃で３０分間培養した。ケモカイン（例えば、２０ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８）を、下部チャンバー上で、単独で、または他のアンタゴニスト（例えば、ＩＬ８−ＩＰ１０Ｆ１７Ｌ）と組み合わせて配置し、精製した好中球を上部チャンバー上に置いた。５μｍの細孔径のポリカーボネートフィルターを使用して、上部および下部チャンバーを分けた。細胞を５％ＣＯ２加湿雰囲気中で、３７℃で３０分間培養した後、未遊走細胞およびフィルターを除去し、遊走した細胞を溶解して、ＶＩＣＴＯＲ３（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＵＫ、励起：４８５ｎｍ；発光：５３０ｎｍ）を用いて分析した。細胞遊走のパーセンテージは、走化性指数（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘ：ＣＩ）の値によって示された。ＣＩ＝（アンタゴニスト強度−ＨＢＳＳ強度）／（ＣＸＣＬ８強度−ＨＢＳＳ強度）×１００％であり、ここで「アンタゴニスト強度」は、アンタゴニストによって引き起こされる細胞遊走であり、「ＣＸＣＬ８強度」は、ＣＸＣＬ８によって引き起こされる細胞遊走であり、かつ「ＨＢＳＳ強度」は、重力によって引き起こされる細胞遊走である。
【００４２】
６．腫瘍細胞におけるＣＸＣＲ１／２およびＣＸＣＬ８遺伝子の発現レベル
癌細胞株のＲＮＡ（表１）を、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｍｅｒｉｃａ）により、それぞれ標準的な手順を用いて抽出し、ＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計で定量した。ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ試薬キット、タカラ、日本）を用いて、サンプルのＲＮＡの逆転写を行い、そのサンプルを氷上に置いた後、遺伝子発現分析を行った。ＧＡＰＤＨは、内部対照群であった。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ（Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商標）、タカラ、日本）で行い、ここでは、ＣＸＣＬのプライマーは：５’−ｇａｇｃａｃｔｃｃａｔａａｇｇｃａｃａａａ−３’（フォワード）および５’−ａｔｇｇｔｔｃｃｔｔｃｃｇｇｔｇｇｔ−３’（リバース）を、ＣＸＣＬ８について；５’−ｇａｃｃａａｃａｔｃｇｃａｇａｃａｃａｔ−３’（フォワード）および５’−ｔｇｃｔｔｇｔｃｔｃｇｔｔｃｃａｃｔｔｇ−３’（リバース）をＣＸＣＲ１について；５’−ｇｇｃｔａａｇｃａａａａｔｇｔｇａｔａｔｇｔａｃｃ−３’（フォワード）および５’−ｃａａｇｇｔｔｃｇｔｃｃｇｔｇｔｔｇｔａ−３’（リバース）をＣＸＣＲ２について含んだ。
【００４３】
遺伝子発現は以下の式により算出した：遺伝子発現＝２−ΔΔＣｔ
【００４４】
【表１】
2018517701.tif 000003
【００４５】
図１０は、腫瘍細胞における高いＣＸＣＲ１発現を、部分的にＲＴ−ＰＣＲによって示す。多くの腫瘍細胞は、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体の物質であるＣＸＣＬ８を高度に発現した。したがって、ＣＸＣＲ１／２アンタゴニストは、腫瘍増殖および転移を阻害するために使用してもよい。
【００４６】
図１１は、アンタゴニストのより多くの設計を示す。ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０ペプチドの第１の改変位置および／または第２の改変位置および／または第３の改変位置のアミノ酸残基（単数または複数）を変更して、ＣＸＣＲ１／２によって誘導されるアンタゴニスト特性を改善した。これらのアンタゴニストは、ＣＸＣＲ１／２受容体の発現を効率的に抑制するか、または腫瘍細胞において、高いサイトカイン発現（ＣＸＣＬ１、２、３、５、６、７、および８など）に関連した、腫瘍増殖、薬物耐性、転移および血管新生を阻害した。
【００４７】
上述のように、本発明の改変されたケモカインは効率的に、腫瘍増殖および血管新生を阻害し、癌を処置し得る。
【００４８】
本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された各特徴は、他に明示的に記載されていない限り、同じ、等価または同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別段明記しない限り、開示された各特徴は、等価または同様の特徴の一般的なシリーズの一例に過ぎない。
【００４９】
示したとおり、これらの変更は、本発明の図示された実施形態の前述の説明を考慮して本発明に対してなされてもよく、本発明の精神および範囲内に含まれるべきである。したがって、本発明は、その特定の実施形態を参照して本明細書に記載されているが、上記の開示では、ある自由度の修正、様々な変更、および置換が意図されている。いくつかの例では、本発明の実施形態のいくつかの特徴は、記載された本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、他の特徴の対応する使用なしに採用されることが理解されよう。したがって、特定の状況または材料を本発明の本質的な範囲および趣旨に適合させるために、多くの改変が行われ得る。
【図１】
2018517701.tif 000004
【図２】
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【図３】
2018517701.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月11日(2018.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド配列を含む改変されたケモカインペプチドであって、ここで前記ペプチド配列のＮ末端が：
（ａ）「グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）−アルギニン（Ｒ）」配列であって、Ａ特徴の配列として定義され、ここで前記Ａ特徴の配列は、前記改変されたケモカインペプチドのＮ末端に位置する配列と；
（ｂ）「プロリン（Ｐ）−アラニン（Ａ）−セリン（Ｓ）−グルタミン（Ｑ）−フェニルアラニン（Ｆ）−Ｃｙｓ３」配列であって、Ｂ特徴の配列として定義され、ここで前記Ｂ特徴の配列は、ケモカインペプチドのＮ末端から数えて３番目のシステイン（Ｃ）の上流に隣接している配列と、
を含み、かつ
ここで、前記改変されたケモカインペプチドは、Ａ特徴の配列、Ｂ特徴の配列、および改変された位置からなり、ここで前記改変された位置は、改変されたケモカインペプチドのＮ末端から数えて１７番目、１２番目、または１３番目の位置に位置する、改変されたケモカインペプチド。
【請求項２】
前記改変されたケモカインペプチドのＮ末端から１７番目の位置のフェニルアラニン（Ｆ）が、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換されている、請求項１に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項３】
前記改変されたケモカインペプチドのＮ末端から１２番目の位置のトレオニン（Ｔ）が、セリン（Ｓ）で置換されている、請求項１に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項４】
前記改変されたケモカインペプチドのＮ末端から１３番目の位置のチロシン（Ｙ）が、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換されている、請求項１に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項５】
前記改変されたケモカインペプチドの未改変の前駆体が、起源のケモカインペプチドに由来し、ここで前記起源のケモカインペプチドが、Ｎ末端から第一のシステインと第二のシステインとの間に位置する、ゼロ〜２個のアミノ酸残基（単数または複数）を有し、かつ前記アミノ酸残基（単数または複数）が、前記アミノ酸残基の数が１〜２個である場合に荷電の有無の極性を有する、請求項１に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項６】
前記起源のケモカインペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項７】
前記改変されたケモカインペプチドが、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から選択される、請求項１に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項９】
前記改変されたケモカインペプチドが、癌を処置するため、または腫瘍増殖を阻害するために用いられる、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
治療上有効な量の請求項１に記載の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、癌を処置するため、および腫瘍増殖を阻害するための薬学的組成物。
【請求項１１】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、子宮癌、白血病、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、精巣癌、リンパ腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝臓癌、喉頭癌、胆嚢癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、または鼻咽頭癌を含む、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記癌が、ＣＸＣＲ１／２発現、またはＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６およびＣＸＣＬ７からなる多量のケモカインを有する細胞によって特徴付けられ、ここで前記癌が、ケモカイン受容体を発現する癌細胞によって特徴付けられる、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
ペプチド配列を含む改変されたケモカインペプチドであって、ここで前記ペプチド配列のＮ末端が：
グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）−アルギニン（Ｒ）配列であって、第一の特徴的配列として規定され、ここで前記第一の特徴の配列は、前記改変されたケモカインペプチドのＮ末端に位置しており、ここで前記改変されたケモカインペプチドが複数の改変された位置を有する配列と；
プロリン（Ｐ）−アラニン（Ａ）−セリン（Ｓ）−グルタミン（Ｑ）−フェニルアラニン（Ｆ）配列であって、第二の特徴的配列として規定され、ここで前記第二の特徴の配列は、３番目のシステイン（Ｃｙｓ３）と前記第三のシステインから１アミノ酸位置後ろのアミノ酸残基との間に位置している配列と、
を含み、かつ
ここで、前記改変されたケモカインペプチドの未改変の前駆体は、起源のケモカインペプチドに由来し、ここで前記起源のケモカインペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、
ここで、Ｎ末端からの前記起源のケモカインペプチドの前記第一の特徴の配列は、Ｎ末端から配列番号１の４番目、５番目、６番目の位置と整列され、ここで第一のＥＬＲ配列からＣ末端への前記起源のケモカインペプチドの第一のリシン（Ｋ）は、Ｎ末端から配列番号１の２０番目の位置と整列され、ここで第一の改変された位置は、Ｎ末端からの前記起源のケモカインペプチドの第一のヒスチジン（Ｈ）から１アミノ酸後方の第一のアミノ酸残基に位置し、ここで前記第一の改変された位置は、配列番号１の１７番目の位置と整列され、ここで第二の改変された位置は、第一の特徴の配列からＣ末端へ数えて、前記起源のケモカインペプチドの第一のトレオニンに位置し、ここで前記第二の改変された位置は、配列番号１の１２番目の位置と整列され、ここで第三の改変された位置は、前記第二の改変された位置からＣ末端へ前方１アミノ酸残基の第三のアミノ酸残基に位置する、改変されたケモカインペプチド。
【請求項１４】
前記第一の改変された位置が、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換されている、請求項１３に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項１５】
前記第二の改変された位置が、セリン（Ｓ）で置換されている、請求項１３に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項１６】
前記第三の改変された位置が、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換されている、請求項１３に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項１７】
前記起源のケモカインペプチドのＮ末端の第一のシステインと第二のシステインとの間の配列が、１アミノ酸残基を有し、かつ前記１アミノ酸残基が、荷電の有無の極性を有する、請求項１３に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項１８】
前記改変されたケモカインペプチドが、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から選択される、請求項１３に記載の改変されたケモカインペプチド。
【請求項１９】
癌の治療のための薬剤の調製に用いる改変されたケモカインペプチドの用途であって、請求項１３に記載の有効量の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤からなる、ケモカインペプチドの用途。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、治療用アンタゴニストであり得る改変されたケモカインペプチドに関する。具体的には、本発明は、癌を処置するためおよび腫瘍増殖を阻害するための改変されたケモカインに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ケモカインは、誘導性の、分泌性の、構造的にかつ関連する低分子（約８〜１４ｋＤ）の群である。ケモカインは、４つのサブファミリー、例えば、ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３ＣおよびＣに分けられる。ケモカインはまた、２つの主要な機能的サブファミリーにも分類される：「恒常的ケモカイン」および「炎症性ケモカイン」。
【０００３】
ケモカインは通常は、その構造に３つのβシートを有し、かつＣ末端にαらせん、およびＮ末端に４つの保存されたシステインを有する。ケモカインは、Ｎ末端に最初の２つのシステイン（Ｃｙｓ）を含む配列に基づいて、４つのサブファミリー（ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３ＣおよびＸＣ）に分類された。４つの種類の内でも、ＣＸＣおよびＣＣは、２つのメジャーなサブファミリーであるが、ＸＣおよびＣＸ３Ｃは、マイナーなサブファミリーである。細胞上のケモカインがケモカイン受容体とコンジュゲートした後に反応が起こる。ケモカイン受容体は、７つの膜貫通Ｇタンパク質結合受容体を備え、これはそれぞれ、結合標的上のリガンドの種類に応じて、ＣＸＣＲ、ＣＣＲ、ＣＸＲおよびＣＸ３ＣＲと命名される。ケモカイン受容体はさらに、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４などのように数に応じて配置される。しかし、標的細胞上には１つのケモカイン受容体が示されるだけでなく、浸潤した炎症細胞の結合標的は、１つのケモカイン受容体に特異的ではなく、従って、特定の刺激および誘導下で異なる細胞のいくつかのケモカイン受容体が発現されなければならない。
【０００４】
例えば、グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）−アルギニン（Ｒ）特徴的配列（ＥＬＲ特徴的配列）を有するＥＬＲ−ＣＸＣケモカインとは、Ｎ末端に特徴的なＥＬＲ−ＣＸＣのアミノ酸配列を有するタンパク質を指し、Ｘは、電荷の有無の状態の極性を有するアミノ酸であるか、またはＸは存在しない。ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインは、発癌物質、ＩＬ−８および好中球活性化タンパク質２（ＮＡＰ−２）の発現を調節し得る。それらの受容体は、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２であり、それらは、主に好中球を標的とする。ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインは、好中球の蓄積および活性化を促進し得る。したがって、この種のＥＬＲ−ＣＸＣケモカインは、広範囲の急性および慢性炎症疾患の発生に重要な役割を果たす。これらの炎症としては、乾癬および関節リウマチが挙げられる。
【０００５】
さらに、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインは、腫瘍発生に伴う血管新生に関連し、その誘導メカニズムは、この種のケモカイン、特にＩＬ−８に関連して、内皮細胞（ＥＣ）上のＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２とコンジュゲートすることによって生成される活性化である。現在、多くの異なる種類の腫瘍がＥＬＲ−ＣＸＣケモカインを分泌し得、かつこれらのケモカインを過剰発現する腫瘍は、予後不良と関連することが証明されている。
【０００６】
ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２とＥＬＲ−ＣＸＣケモカインとの抗コンジュゲーションは、ＣＸＣＲ１または／およびＣＸＣＲ２受容体の活性化によって誘導される異常なシグナル伝達が阻害されるように、２種の受容体を有する細胞の活性化に起因する関連疾患が処置されるように、実行可能なストラテジーである。従って、科学者は、ＣＸＣケモカインを阻害するための受容体タンパク質アナログを見出して調製することに努めている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、出願人は、先行技術において遭遇する上記の状況に対処することを試みる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
癌は先進国では最も一般的な死亡原因である。もし癌が早期に診断されれば、首尾よく処置される可能性は高い。癌の診断と処置にはかなりの進歩が見られているが、これらの薬物は深刻な副作用を引き起こすか、または無効である。したがって、癌の処置または癌の予防のための新規な方法または新規な組成物が必要とされている。
【０００９】
上記の問題を解決するために、本発明の一実施形態によれば、腫瘍増殖を阻害し、癌を処置するための改変されたケモカインが提供される。
【００１０】
本発明は、ペプチド配列を含む改変されたケモカインペプチドを提供する。ペプチド配列のＮ末端は、２つの特徴的な配列を含む。１つの特徴的な配列は、「（ａ）グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）−アルギニン（Ｒ）配列」であり、これは改変ケモカインペプチドのＮ末端に位置する。別の特徴的な配列は、「（ｂ）プロリン（Ｐ）−アラニン（Ａ）−セリン（Ｓ）−グルタミン（Ｑ）−フェニルアラニン（Ｆ）−Ｃｙｓ３配列」であり、これは、ケモカインペプチドのＮ末端から数えて、第３のシステイン（Ｃ）の上流に隣接する。改変されたケモカインペプチドは、（ａ）特徴的な配列、（ｂ）特徴的な配列、および改変された位置を含む。上述の改変された位置は、改変されたケモカインペプチドのＮ末端から数えて１７番目、１２番目または１３番目の位置にある。
【００１１】
一実施形態では、１７位のフェニルアラニン（Ｆ）残基は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。
【００１２】
一実施形態では、改変ケモカインペプチドの未改変前駆体は、起源のケモカインに由来する。起源のケモカインのＮ末端の最初の２つのシステインの間にゼロ〜２個のアミノ酸残基が位置し、かつアミノ酸残基の数が１〜２の場合、そのアミノ酸残基は電荷の有無の状態で極性を有する。
【００１３】
一実施形態では、起源のケモカインペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１４】
一実施形態では、改変ケモカインペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から選択される。
【００１５】
本発明はまた、本発明の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。
【００１６】
一実施形態では、この改変されたケモカインペプチドは、癌の処置または腫瘍増殖の阻害のために使用される。
【００１７】
本発明はさらに、治療有効量の本発明の改変されたケモカインペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、癌を処置するため、または腫瘍増殖を阻害するための薬学的組成物を提供する。
【００１８】
一実施形態において、上記癌は、前立腺癌、乳癌、子宮癌、白血病、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、精巣癌、リンパ腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝臓癌、喉頭癌、胆嚢癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、または鼻咽頭癌を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、起源のケモカインペプチド配列（配列番号１〜９）に対する配列アラインメント、すなわちＣＸＣＲ１または／およびＣＸＣＲ２に対して高い親和性を有するＥＬＲ−ＣＸＣケモカインのアミノ酸配列の比較を示す。
【図２】図２は、本発明における改変されたケモカインペプチド（配列番号１０〜配列番号１２）のアミノ酸配列に対する配列アラインメントの比較を示す。
【図３】図３は、本発明のＣＸＣＬ８で最大量の細胞が遊走したことを示す。
【図４】図４は、遊走した細胞の数を示す。黒のバーは、走化性がＣＸＣＬ８によって誘発されることを示す。灰色のバーは、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインおよびＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の両方による処置を表す。白いバーは、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインおよび１７ＬＩＰ１０の両方での処置を表す。
【図５】図５は、処置群（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）およびプラセボ群（生理食塩水）の腫瘍容積を示す。
【図６】図６は、処置群（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）およびプラセボ群（生理食塩水）の腫瘍重量を示す。
【図７】図７は、処置群（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）およびプラセボ群（生理食塩水）の微小血管密度を示す。
【図８】図８は、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０または生理食塩水の注射後の腫瘍容積を示す。Ａ群には、５００μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０を毎週４回注射した。Ｂ群には、５００μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０を毎週２回注射した。Ｃ群には、２５０μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０を毎週２回注射した。Ｄ群には毎日１００μｌの生理食塩水を皮下注射した。
【図９】図９は、マウス肺から得られた腫瘍組織の外観の画像を示す。毎週４回、５００μｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＣＸＣＬ８−ＩＰ１０（図９Ａ）または生理食塩水（図９Ｂ）を投与した２４日後にマウスを屠殺して、肺組織を得た。矢印で示された白い部分は、肺に広がっている癌の病巣であった。
【図１０】図１０は、癌細胞におけるＣＸＣＲ１およびＣＸＣＬ８の発現レベルを示す。
【図１１】図１１は、走化性による本発明の拮抗作用の有効性を示す。
【図１２】図１２は、本発明の改変ケモカインペプチドをｉ．ｐ．で異種移植片ヌードマウスモデルに投与する、プラセボ群と比較した腫瘍重量を示す。
【図１３】図１３は、本発明の改変ケモカインペプチドを投与した異種移植片ヌードマウスの全生存率を対照群と比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、新規なケモカインを提供する。本発明の新規なケモカインは、ＣＸＣＬ１（配列番号３）、ＣＸＣＬ２（配列番号４）、ＣＸＣＬ３（配列番号５）、ＣＸＣＬ５（配列番号：６）、ＣＸＣＬ６（配列番号：７）、ＣＸＣＬ７（配列番号：８）、ＣＸＣＬ８（配列番号：２）およびｈＧ３１Ｐ（配列番号：１）などの、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインまたはＣＸＣＲ１もしくはＣＸＣＲ２に対する高い結合親和性を有する物質に由来する。本発明においては、本発明におけるこの種のケモカインに応じて改変されており、これは主に、元の３０ｓループ領域に置換されたＰＡＳＱＦの特徴的な配列に依存する（図１）。このＰＡＳＱＦは、非ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインであるＣＸＣＬ１０ケモカインにもともと存在する。
【００２１】
一実施形態では、本発明の改変ケモカインは、（ａ）「−Ｎ’−グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）−アルギニン（Ｒ）の特徴的な配列（これは、改変されたケモカインペプチドのＮ末端に位置する）、および（ｂ）「−Ｎ’−プロリン（Ｐ）−アラニン（Ａ）−セリン（Ｓ）−グルタミン（Ｑ）−フェニルアラニン（Ｆ）−Ｃｙｓ３」の特徴的な配列（これは、このケモカインペプチドのＮ末端から数えて、第３のシステイン（Ｃ）の上流に隣接する）を含む。本発明の改変ケモカインは、改変ケモカインペプチドのＮ末端から数えて１７番目の位置に変異（改変）をさらに含むことに留意されたい。
【００２２】
一実施形態では、１７位のもともとのアミノ酸残基はフェニルアラニン（Ｆ）であり、１７番目のアミノ酸残基は、単一アミノ酸変異により非フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸に置換されている。他の実施形態において、１７位のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、セレノシステイン（Ｕ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ピロリシン（Ｏ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、好ましくはロイシン（Ｌ）に置換されてもよい。アミノ酸置換のない起源のケモカインペプチドと比較して、改変されたケモカインは、より高い親和性を有し、かつ位置１７で置換されたアミノ酸残基の後に腫瘍増殖を効果的に阻害することができた。
【００２３】
必要に応じて、本発明の例示的な実施形態では、本発明の改変ケモカインとしては、限定するものではないが、配列番号１０、配列番号１１および／または配列番号１２が挙げられる（図２）。
【００２４】
例えば、配列番号１０は、ＥＬＲ−ＣＸｎＸのアミノ酸の特徴的な配列の規則を満たすためにＥＬＲ−ＣＱＣのＮ末端配列を含むだけでなく、オリゴペプチド配列Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（ＰＡＳＱＦ）も有する。ＰＡＳＱＦは、Ｎ末端から数えて３番目のシステイン（１０１９２）の上流に置換された改変された配列であり、この第３のシステインは、ＰＡＳＱＦオリゴペプチド配列のフェニルアラニンに隣接している。さらに重要なことには、１７番目の位置のアミノ酸残基（第１の改変された位置）は、フェニルアラニンではなくロイシンである。
【００２５】
図２に示す配列によれば、ＥＬＲ−ＣＸＣケモカインアナログの配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２は、ＰＡＳＱＦ改変配列を有し、これはケモカインペプチドのＮ末端から数えて三番目のシステイン（Ｃ）の上流に隣接している。さらに、本発明のケモカインの１７位のアミノ酸残基は、ロイシンに変異されている。
【００２６】
本発明の改変ケモカイン、そのアナログおよびフラグメントは、血管新生に関連する疾患を処置し得る。血管新生関連の疾患としては、限定するものではないが、炎症性障害、慢性関節リウマチおよび乾癬、血管の不適切または不適当な侵襲に関連する障害、例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、再狭窄および細胞増殖性障害／疾患、例えば、新生物、および癌関連障害（例えば、前立腺癌、乳癌、子宮癌、白血病、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、精巣癌、リンパ腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝臓癌、喉頭癌、胆嚢癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、または鼻咽頭癌）が挙げられる。
【００２７】
本発明の改変されたケモカインは、必要に応じて従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、および所望のビヒクルを含む単位投薬製剤において、経口的に、口腔内に、非経口的に、吸入スプレーによって、直腸に、皮内に、経皮的に、または局所的に投与されてもよい。
【００２８】
本発明の改変されたケモカインは、単回投与で、２４時間にわたる複数回投与で、または連続注入によって投与されてもよい。連続注入によって投与する場合、化合物は、限定するものではないが、静脈内重力ドリップ、静脈内注入ポンプ、埋め込み型注入ポンプ、または任意の局所経路などの当該分野で周知の方法によって供給されてもよい。処置の長さは、多くの要因、例えば、血管新生状態の持続期間および重症度に依存して変化する。本発明の改変されたケモカインを単独で、または他の薬剤と組み合わせて用いる被験体の処置は、血管新生が消失するまで継続されてもよいし、または処置は被験体の生涯にわたって続いてもよい。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、癌を治処置し、腫瘍を阻害するための薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、有効量の本発明の改変ケモカインまたはそのアナログおよび薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体としては、溶媒、分散剤、コーティング、抗菌／抗真菌剤、等張剤、徐放性剤および／またはそのアナログを挙げてもよい。
【実施例】
【００３０】
１．細胞走化性
ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーアッセイを用いて、ＬＭＶＥＣの遊走を評価した。ＬＭＶＥＣを、２％ＦＣＳを含むＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２上で、８時間培養した。細胞を、１．２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で、１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングしたポリカーボネート膜（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）上に播種した。１０ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、およびＣＸＣＬ８−ＩＰ１０またはＩＬ８−Ｆ１７ＬＩＰ１０を、それぞれ、ボイデンチャンバーの底に添加した。ＬＭＶＥＣを、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー上で３７℃で４時間培養し、次いでＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｈａｒｌｅｃｏ）で固定して染色した。遊走した細胞の数を、ＨＰＦ（Ｘ２００）によってカウントした。
【００３１】
この結果によって、ケモカインＣＸＣＬ８が存在する場合、多量の細胞が遊走したことが示される（図３）。
【００３２】
図４において、黒のバーはケモカイン誘導を示し、灰色のバーはケモカインおよびＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の併用処置を示しており、白いバーはケモカインおよびＩＬ８−１７ＬＩＰ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）による同時処置を示す。図４によれば、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０およびＩＬ８−１７ＬＩＰ１０の両方とも、細胞遊走を阻害する効果を有し、ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０は、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０より良好な細胞遊走阻害効果を有する。
【００３３】
２．投与された改変ケモカインペプチドによる異種移植片腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃヌード雄性マウス（Ｂｌｔｗ：ＮＵ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ、４〜６週齢）を入手して、特定の病原体のない条件下で、層流キャビネット内で飼育した。動物は自由に水道水および標準的なペレット食品にアクセスし、その健康状態を毎日モニターした。ヌードマウス異種移植アッセイのために、単層培養したＧＦＰ陽性ＰＣ３細胞（ＰＣ−３−ＧＦＰ）を採取し、３匹のヌードマウスの右脇腹にマウス１匹につき５×１０６細胞を皮下接種した。２〜４週間後、移植のために腫瘍を採取した。実験の最後に、これらの３匹のマウス由来の腫瘍異種移植片を、リセット（ｒｅｓｅｔ）し、スライスし（１ｍｍ３切片）、次いで、局所麻酔および滅菌手術条件下で、レシピエントのヌードマウスの前立腺組織に移植した。全部で２４匹の動物が移植物を受けた。５日後（０日目）、その動物を、１００μｌの生理食塩水（対照群）または本発明の配列（配列番号１２（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）、０．５ｍｇ／ｋｇ）（実験群）で２４日間の皮下注射について、２つの群に分類した（１２匹の動物／群）。成長腫瘍のＧＦＰ蛍光画像を、５１５ｎｍ発光フィルターを備える解剖顕微鏡の光学的構成の下で、デジタルカメラを用いて１２、１８および２４日に撮影した。腫瘍容積は、式：容積＝（長さ×幅２）／２を用いて算出した。２４日目に、全てのマウスを屠殺して、腫瘍のＧＦＰ蛍光画像を撮影した。血管の微小血管密度は、式：密度＝微小血管長／腫瘍面積を用いて算出した。各マウス由来の腫瘍サンプルを、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、その後の免疫組織化学分析のための標準的な手順を用いてパラフィンに包埋した。
【００３４】
その結果によって、１２、１８および２４日目に処置（実験）群およびプラセボ（対照）群の腫瘍容積が示される（図５）。図５によれば、本発明の配列（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）は、腫瘍増殖を効果的に阻害する。処置群の腫瘍容積は、プラセボ群と比較して５倍を超えて低下した。プラセボ群と比較して処置群について腫瘍容積のこの明らかな阻害は持続し、経時的にさらに顕著になった。
【００３５】
その結果によって、２４日目に処置（実験）群およびプラセボ（対照）群の腫瘍重量が示される（図６）。図６によれば、本発明の配列（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）は腫瘍増殖を効果的に阻害し、腫瘍重量は２倍を超えて減少した。
【００３６】
３．異種移植腫瘍組織の免疫組織化学的分析
パラフィン包埋前立腺癌異種移植切片を脱ろうし、ＰＢＳに再水和した。詳細には、切片をＰＢＳで３回リンスし、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中で１５分間熱処理した。３％の過酸化水素で１０分間処理することにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片を、ＰＢＳを用いて繰り返し３回すすぎ、タンパク質ブロッキング溶液（ＰＢＳ中に５％正常ウマ血清、ｐＨ７．５）と共に室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次いでマウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体（１：５０）、ウサギポリクローナル抗ＮＦ−κＢ抗体、またはヤギポリクローナル抗ＣＤ３１抗体（１：５０）とともに、４℃で２０時間インキュベートした。反応後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体の適切な希釈物とともに、３７℃で４０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、切片をビオチン化ヤギ抗マウスまたは抗ウサギ抗ヤギポリ免疫グロブリンと共に暗所で３０分間インキュベートした。発色のために、切片を、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、ジアミノベンジジン溶液中で１０分間インキュベートし、次いでヘマトキシリンで１分間対比染色した（Ｋｏｌｌｍａｒら、２００７）。陰性対照の切片を、一次抗体の代わりにＰＢＳとともにインキュベートした。染色された切片の強度は、撮影された切片をグレースケール（スケール０〜２５５）に変換した後に測定し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ６．０  Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔを使用して計算した集積光学濃度（ＩＯＤ）で表した。各群について、５つのマウス腫瘍異種移植片を分析した。異なる切片で無作為に選択された、１つの腫瘍あたり５つの撮影された切片を用いて、あらゆる腫瘍異種移植のグレイ値を平均した（Ｃｓｉｌｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＣＤ３１の免疫組織化学的分析を用いて微小血管密度を測定し、微小血管密度の測定値は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ６．０  Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔを使用して算出した、微小血管面積の平均パーセンテージを表している。
【００３７】
その結果によって、プラセボ（対照）群および処置（実験）群の微小血管密度が示される（図７）。図７によれば、本発明の配列（ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０）は、前立腺癌異種移植ヌードマウスの血管新生を効率的に阻害する。
【００３８】
４．投与された改変ケモカインペプチドによる、異種移植腫瘍を保有するＣ５７ＢＬ／６ヌードマウスにおける抗腫瘍効果
Ｃ５７ＢＬ／６ヌードマウスを、特定の病原体の下で層流キャビネット内で飼育した。動物は自由に水道水および標準的なペレット食品にアクセスし、その健康状態を毎日モニターした。５×１０６個の細胞のＬＬＷ２細胞（ルイス肺癌）を、マウス１匹あたり５×１０６個の細胞を用いて３匹のマウスの右四半分に注射した。２〜４週間後、移植のために腫瘍を採取した。この例では、２４匹のマウスに移植した。移植の５日後、２４匹のマウスを４つの群（１群６匹）に分類した。Ａ群：５００μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の週４回の投与。Ｂ群：５００μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の週２回の投与。Ｃ群：２５０μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の週２回の投与。Ｄ群：１００μｌの生理食塩水を毎日皮下投与した。腫瘍容積は、式：容積＝（長さ×幅２）／２を用いて算出した。２４日目に、全てのマウスを屠殺し、腫瘍のＧＦＰ蛍光画像を撮影した。血管の微小血管密度は、式：密度＝微小血管長／腫瘍面積を用いて算出した。各マウスの腫瘍サンプルを、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、その後の免疫組織化学分析のために標準的な手順を用いてパラフィンに包埋した。
【００３９】
図８によれば、Ａ群が腫瘍増殖阻害において最高の改善を示す。２４日目に、全てのマウスを屠殺して腫瘍容積を算出した。Ｄ群と比較して、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０（５００ｕｇ／ｋｇ）で１週間に４回処置した腫瘍容積は、Ａ群と比較して３０％減少していた。その結果、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０は、腫瘍増殖の有意な阻害を有したことが示される。
【００４０】
図９によれば、腫瘍転移は、ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０によって有意に抑制された。５００μｇ／ｋｇのＣＸＣＬ８−ＩＰ１０を週に４回（図９Ａ）または生理食塩水（図９Ｂ）を投与した後、マウスを２４日目に屠殺にして肺を得た。矢印で示された白い部分は、肺に広がっている癌の病巣であった。ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０の投与後、マウス肺で転移性の病巣は生じなかった。
【００４１】
５．好中球走化性アッセイ
好中球の走化性は、改善されたボイデンチャンバーマイクロ走化性アッセイによって評価した。白血球は、一般的な濃度勾配により末梢血から採取した。好中球は、低濃度勾配領域の底から得て、赤血球混入は低張溶解によって除去した。精製した好中球（５×１０６／ｍｌ）をＨＢＳＳ溶液（４００ｍｇ／ＬのＫＣｌ、６０ｍｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、８０００ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ、３５０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、９０ｍｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４７Ｈ２Ｏおよび１０００ｍｇ／Ｌのグルコース）に再懸濁し、次いで、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）培地中で３７℃で３０分間培養した。ケモカイン（例えば、２０ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ８）を、下部チャンバー上で、単独で、または他のアンタゴニスト（例えば、ＩＬ８−ＩＰ１０Ｆ１７Ｌ）と組み合わせて配置し、精製した好中球を上部チャンバー上に置いた。５μｍの細孔径のポリカーボネートフィルターを使用して、上部および下部チャンバーを分けた。細胞を５％ＣＯ２加湿雰囲気中で、３７℃で３０分間培養した後、未遊走細胞およびフィルターを除去し、遊走した細胞を溶解して、ＶＩＣＴＯＲ３（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＵＫ、励起：４８５ｎｍ；発光：５３０ｎｍ）を用いて分析した。細胞遊走のパーセンテージは、走化性指数（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘ：ＣＩ）の値によって示された。ＣＩ＝（アンタゴニスト強度−ＨＢＳＳ強度）／（ＣＸＣＬ８強度−ＨＢＳＳ強度）×１００％であり、ここで「アンタゴニスト強度」は、アンタゴニストによって引き起こされる細胞遊走であり、「ＣＸＣＬ８強度」は、ＣＸＣＬ８によって引き起こされる細胞遊走であり、かつ「ＨＢＳＳ強度」は、重力によって引き起こされる細胞遊走である。
【００４２】
６．腫瘍細胞におけるＣＸＣＲ１／２およびＣＸＣＬ８遺伝子の発現レベル
癌細胞株のＲＮＡ（表１）を、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｍｅｒｉｃａ）により、それぞれ標準的な手順を用いて抽出し、ＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計で定量した。ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ試薬キット、タカラ、日本）を用いて、サンプルのＲＮＡの逆転写を行い、そのサンプルを氷上に置いた後、遺伝子発現分析を行った。ＧＡＰＤＨは、内部対照群であった。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ（Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商標）、タカラ、日本）で行い、ここでは、ＣＸＣＬのプライマーは：５’−ｇａｇｃａｃｔｃｃａｔａａｇｇｃａｃａａａ−３’（フォワード）および５’−ａｔｇｇｔｔｃｃｔｔｃｃｇｇｔｇｇｔ−３’（リバース）を、ＣＸＣＬ８について；５’−ｇａｃｃａａｃａｔｃｇｃａｇａｃａｃａｔ−３’（フォワード）および５’−ｔｇｃｔｔｇｔｃｔｃｇｔｔｃｃａｃｔｔｇ−３’（リバース）をＣＸＣＲ１について；５’−ｇｇｃｔａａｇｃａａａａｔｇｔｇａｔａｔｇｔａｃｃ−３’（フォワード）および５’−ｃａａｇｇｔｔｃｇｔｃｃｇｔｇｔｔｇｔａ−３’（リバース）をＣＸＣＲ２について含んだ。
【００４３】
遺伝子発現は以下の式により算出した：遺伝子発現＝２−ΔΔＣｔ
【００４４】
【表１】
2018517701.tif 000015
【００４５】
図１０は、腫瘍細胞における高いＣＸＣＲ１発現を、部分的にＲＴ−ＰＣＲによって示す。多くの腫瘍細胞は、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体の物質であるＣＸＣＬ８を高度に発現した。したがって、ＣＸＣＲ１／２アンタゴニストは、腫瘍増殖および転移を阻害するために使用してもよい。
【００４６】
図１１は、アンタゴニストのより多くの設計を示す。ＣＸＣＬ８−ＩＰ１０ペプチドの第１の改変位置および／または第２の改変位置および／または第３の改変位置のアミノ酸残基（単数または複数）を変更して、ＣＸＣＲ１／２によって誘導されるアンタゴニスト特性を改善した。これらのアンタゴニストは、ＣＸＣＲ１／２受容体の発現を効率的に抑制するか、または腫瘍細胞において、高いサイトカイン発現（ＣＸＣＬ１、２、３、５、６、７、および８など）に関連した、腫瘍増殖、薬物耐性、転移および血管新生を阻害した。
【００４７】
実施例７．投与された改変ケモカインペプチドによる異種移植腫瘍を有するヌードマウスにおける抗腫瘍効果および生存率
ヌードマウス（４〜６週齢）は、国立実験動物センター（台湾）から購入した。ＰＣ９細胞を採取し、滅菌リン酸緩衝食塩水中に１×１０７細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。実験群では、ＰＣ９細胞を、ＩＬ８Ｔ１２ＳＩＰ１０、ＣＸＣＬ５Ｔ１２ＳＩＰ１０、ＩＬ８Ｔ１２Ｓ、およびＣＸＣＬ５Ｔ１２Ｓを含む改変ケモカインペプチド２００μｇ／ｍｌで前処理した。１×１０６個のＰＣ９細胞（混合等容積マトリゲル）を、マウスの背部（対照群、ＩＬ８Ｔ１２ＳＩＰ１０群、およびＣＸＣＬ５Ｔ１２ＳＩＰ１０群について１０匹のマウス；その他はＩＬ８Ｔ１２Ｓ群およびＣＸＣＬ５Ｔ１２Ｓ群について３匹のマウス）に皮下注射した。次いで、改変ケモカインペプチド（５００μｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（対照群）を、週３日毎に腹腔内注射により投与した。全てのマウスを２１日目に屠殺した。
【００４８】
結果によって、２１日目の実験群および対照群の腫瘍重量が示される（図１２）。図１２によれば、本発明の配列（「ＩＬ８Ｔ１２ＳＩＰ１０」および「ＣＸＣＬ５Ｔ１２ＳＩＰ１０」）は、腫瘍増殖を効果的に阻害することが可能で、腫瘍重量は２倍を超えて低下した。
【００４９】
一方、投与された改変ケモカインペプチド、例えば、限定するものではないが、「ＩＬ８Ｔ１２ＳＩＰ１０」および「ＣＸＣＬ５Ｔ１２ＳＩＰ１０」の投与による異種移植片腫瘍を有するヌードマウスの生存日数は、明らかに対照群よりも長かった（図１３）。
【００５０】
上述のように、本発明の改変されたケモカインは効率的に、腫瘍増殖および血管新生を阻害し、癌を処置し得る。
【００５１】
要約すると、本発明の改変ケモカインによって、起源のケモカインペプチドのＮ末端から数えて、３番目のシステイン（Ｃ）の上流に隣接する「プロリン（Ｐ）−アラニン（Ａ）−セリン（Ｓ）−グルタミン（Ｑ）−フェニルアラニン（Ｆ）」特徴的配列（すなわち、「ＩＰ１０」）が示された。すなわち、「ＰＡＳＱＦ」特徴的配列は、第３のシステイン（Ｃｙｓ３）と、第３のシステインから１アミノ酸後方のアミノ酸残基との間に位置する。
【００５２】
他方、本発明は、配列番号１の１７番目のアミノ酸残基が、改変されることを実証した。すなわち、Ｎ末端からの起源のケモカインペプチドの第１のヒスチジン（Ｈ）により１アミノ酸が後方に移動することを意味する「改変アミノ酸残基の１つ」の位置が修飾されるであろう。例えば、一実施形態では、Ｆ１７ＬおよびＦ１７Ｖが表された。
【００５３】
さらに、本発明は、配列番号１の１２番目のアミノ酸残基が改変されることを実証した。すなわち、「別の修飾アミノ酸残基」の位置は、「グルタミン酸（Ｅ）−ロイシン（Ｌ）−アルギニン（Ｒ）」特徴的配列Ｃ末端に向かって数えた起源のケモカインペプチドの第１トレオニン（Ｔ）（すなわち、Ｎ末端からの配列番号１の第４位、第５位、第６位）に位置し、改変される。例えば、一実施形態ではＴ１２Ｓが示された。
【００５４】
さらに、本発明は、配列番号１の１３番目のアミノ酸残基が改変されることを実証した。すなわち、「改変アミノ酸残基の他方」の位置とは、上記の「改変アミノ酸残基のもう一方」からＣ末端に向かって、起源のケモカインペプチドに沿って前方に移動するアミノ酸の１つを改変することを意味する。例えば、一実施形態では、Ｙ１３ＦおよびＹ１３Ｗが表されている。
【００５５】
要約すると、配列番号１２は、ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０も表す。ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０の「１７Ｌ」は、ロイシンで置換された起源ケモカインペプチドの１７番目のアミノ酸残基のアミノ酸残基を意味する。ＩＬ８−１７ＬＩＰ１０の「ＩＰ１０」は、「ＰＡＳＱＦ」特徴的配列を意味する。
【００５６】
本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された各特徴は、他に明示的に記載されていない限り、同じ、等価または同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別段明記しない限り、開示された各特徴は、等価または同様の特徴の一般的なシリーズの一例に過ぎない。
【００５７】
示したとおり、これらの変更は、本発明の図示された実施形態の前述の説明を考慮して本発明に対してなされてもよく、本発明の精神および範囲内に含まれるべきである。したがって、本発明は、その特定の実施形態を参照して本明細書に記載されているが、上記の開示では、ある自由度の修正、様々な変更、および置換が意図されている。いくつかの例では、本発明の実施形態のいくつかの特徴は、記載された本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、他の特徴の対応する使用なしに採用されることが理解されよう。したがって、特定の状況または材料を本発明の本質的な範囲および趣旨に適合させるために、多くの改変が行われ得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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