(57)【要約】  本開示は、一般に、約０．２〜約３５重量パーセントの抗生物質治療剤と、約０．０５〜約３０重量パーセントの疎水性酸と、約３５〜約９９．７５重量パーセントの生体適合性ポリマー、例えば、ジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールまたはジブロックポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールとを有するナノ粒子に関する。他の態様は、そのようなナノ粒子を作製する方法を含む。【図１】2018535228.tif 000012
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．２〜約３５重量パーセントの抗生物質治療剤と、
約０．０５〜約３０重量パーセントの疎水性酸と、
約３５〜約９９．７５重量パーセントのジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはジブロックポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーと
を含み、約１０〜約３０重量パーセントのポリ（エチレン）グリコールを含む治療用ナノ粒子。
【請求項２】
前記抗生物質がポリミキシンＢである、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項３】
前記抗生物質がポリミキシンＥである、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項４】
前記疎水性酸が、デカン酸（ＤＥＣ）、パモ酸（ＰＡＭ）、キシナホ酸（ＸＩＮ）、およびデオキシコール酸（ＤＥＯＣ）から選択されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項５】
前記疎水性酸が胆汁酸または脂肪酸である、請求項１から３に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項６】
前記脂肪酸が、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘンエイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリシン酸、ヘナトリアコンチル酸、ラッセル酸、プシリン酸、ゲダ酸、セロプラスチン酸、ヘキサトリアコンチル酸、およびこれらの組合せからなる群から選択される飽和脂肪酸である、請求項５に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項７】
前記脂肪酸が、ヘキサデカトリエン酸、アルファ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘンエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸、およびこれらの組合せからなる群から選択されるオメガ３脂肪酸である、請求項５に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項８】
前記脂肪酸が、リノール酸、ガンマ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、およびこれらの組合せからなる群から選択されるオメガ６脂肪酸である、請求項５に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項９】
前記脂肪酸が、オレイン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、ネルボン酸、およびこれらの組合せからなる群から選択されるオメガ９脂肪酸である、請求項５に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１０】
前記脂肪酸が、ルーメン酸、α−カレンド酸、β−カレンド酸、ジャカル酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、カタルプ酸、プニカ酸、ルメレン酸、α−パリナリン酸、β−パリナリン酸、ボセオペンタエン酸、ピノレン酸、ポドカルピン酸、およびこれらの組合せからなる群から選択される多価不飽和脂肪酸である、請求項５に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１１】
前記疎水性酸が、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ドデシル硫酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、パモ酸、ウンデカン酸、およびこれらの組合せからなる群から選択されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１２】
前記胆汁酸が、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、ハイコール酸、ベータ−ムリコール酸、コール酸、アミノ酸抱合胆汁酸、およびこれらの組合せからなる群から選択されている、請求項１から３に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１３】
前記アミノ酸抱合胆汁酸が、グリシン抱合胆汁酸またはタウリン抱合胆汁酸である、請求項１２に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１４】
前記治療用ナノ粒子の流体力学的直径が約６０〜約１５０ｎｍである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１５】
前記流体力学的直径が約９０〜約１４０ｎｍである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１６】
約１〜約１５重量パーセントの前記抗生物質治療剤を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１７】
約４〜約１５重量パーセントの前記抗生物質治療剤を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１８】
約５〜約１０重量パーセントの前記抗生物質治療剤を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１９】
約２〜約５重量パーセントの前記抗生物質治療剤を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２０】
前記治療用ナノ粒子が、３７℃のリン酸緩衝溶液に入れたとき前記抗生物質治療剤を少なくとも１分間実質的に保持する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２１】
前記治療用ナノ粒子が、３７℃のリン酸緩衝溶液に入れたとき約３０％未満の前記抗生物質治療剤しか実質的に直ちに放出しない、請求項１から１８のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２２】
約０．２〜約３０重量パーセントの、標的化リガンドで官能化されたポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーをさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２３】
前記ジブロックポリマーのポリ乳酸部分が、約１５ｋＤａ〜約１８ｋｄａの数平均分子量を有し、ポリ（エチレン）グリコール部分が、約４ｋＤａ〜約６ｋＤａの数平均分子量を有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれかに記載の複数の治療用ナノ粒子と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む薬学的に許容できる組成物。
【請求項２５】
それを必要とする患者において炎症および／または感染症を処置する方法であって、前記患者に、請求項１から２４のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子を含む治療有効量の組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】
患者へのある種の薬物を送達する（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とするか、または正常組織ではなく特定の患部組織を標的とする）か、または薬物の放出を制御する系は、有益であると長い間認識されてきた。
【０００３】
例えば、活性薬物を含み、かつ例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とするか、または正常組織ではなく特定の患部組織を標的とする治療法は、標的とされていない体の組織における薬物の量を低減し得る。周囲の非がん組織を死滅させることなしに細胞毒性用量の薬物ががん細胞に送達されることが望ましい状態、例えば、がんを処置するときに、これは特に重要である。有効な薬物標的化は、抗がん療法においては一般的である、望ましくなく、時には生命を危うくする副作用を低減し得る。さらに、このような治療法は、薬物がその他の治療法では到達することができないある種の組織に到達することを可能にし得る。
【０００４】
制御放出および／または標的療法を実現する治療法はまた、有効量の薬物を送達できなければならないが、これは他のナノ粒子送達系において公知の制限である。例えば、ナノ粒子のサイズを、有利な送達特性を有するのに十分に小さく保つ一方で、各ナノ粒子と会合する適当な量の薬物を有するナノ粒子系を調製することは挑戦であり得る。
【０００５】
抗生物質は、重要な一治療剤群である。しかし、ポリミキシン／コリスチンクラスなどの一部の部類の抗生物質は、高度に親水性であり、いずれのｐＨでも油相に分配されない。多剤耐性グラム陰性細菌が引き起こす感染症の処置の治療選択肢が減りつつあることに直面した結果、臨床家は、コリスチンを使用することが増えている。コリスチン硫酸塩（ＣＳ）の静脈内投与後の望ましくない毒性事象、主として腎毒性のために、コリスチンは、一般に、プロドラッグであるコリスチンメタンスルホン酸塩（ＣＭＳ）として投与される。ＣＭＳは、薬物動態（ＰＫ）が変わりやすく、患部組織への付着が不良であること、ならびにプロドラッグの活性部分への変換が非効率的であることと関連付けられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ポリミキシン／コリスチンクラス抗生物質などの抗生物質を治療レベルで送達して、患者の副作用も軽減しながら疾患および感染症を処置することができる治療用ナノ粒子、およびそのようなナノ粒子の作製方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書では、抗生物質、例えばポリミキシン／コリスチン抗生物質を含むポリマーナノ粒子、ならびにそのような治療用ナノ粒子を作製および使用する方法が記載される。
【０００８】
例えば、本明細書では、約０．２〜約３５重量パーセントの抗生物質（例えば、コリスチン）治療剤と、約０．０５〜約３０重量パーセントの疎水性酸と、約３５〜約９９．７５重量パーセントのジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはジブロックポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーとを含む治療用ナノ粒子が提供され、治療用ナノ粒子は、約１０〜約３０重量パーセントのポリ（エチレン）グリコールを含む。企図される治療用ナノ粒子は、流体力学的直径が約６０〜約１５０ｎｍ、約９０〜約１４０ｎｍ、約９０〜約１３０ｎｍ、または約１００〜約１２５ｎｍとなり得る。
【０００９】
本明細書では、ポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤、例えば、ポリミキシン／コリスチンクラスからのいずれかの抗生物質、例えば、コリスチン硫酸塩、コリスチメタン酸ナトリウム（ｃｏｌｉｓｔｉｍｅｔｈａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ）（コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム、コリスチンスルホメタン酸ナトリウム）、ポリミキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥを含むナノ粒子が企図される。ポリミキシンＢには、ポリミキシンＢ１およびＢ２が含まれ、ポリミキシンＥには、Ｅ１（コリスチンＡ）およびＥ２（コリスチンＢ）が含まれる。
【００１０】
さらに別の態様では、薬学的に許容できる組成物を提供する。薬学的に許容できる組成物は、本明細書に記載のとおりの複数の治療用ナノ粒子と、薬学的に許容できる賦形剤とを含み得る。
【００１１】
また別の態様では、それを必要とする患者において感染症を処置する方法を提供する。この方法は、患者に、本明細書に記載のとおりの治療用ナノ粒子を含む組成物を治療有効量投与することを含む。一部の実施形態では、感染症は、グラム陰性細菌によって引き起こされる場合がある。他の実施形態では、感染症は、特に、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によるｐａｎ耐性院内感染である場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】開示されるナノ粒子の一実施形態の描画表現による図である。
【図２】開示されるナノ粒子を形成するためのエマルジョンプロセスについてのフローチャートである。
【図３Ａ】開示されるエマルジョンプロセスについての流れ図である。
【図３Ｂ】開示されるエマルジョンプロセスについての流れ図である。
【図４】デカン酸（ＤＥＣ）、パモ酸（ＰＡＭ）、キシナホ酸（ｘｉｎａｐｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＸＩＮ）、またはデオキシコール酸（ＤＥＯＣ）を含むコリスチン含有ナノ粒子製剤についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出（ＩＶＲ）プロファイルを示すグラフである。
【図５】コリスチン含有ナノ粒子製剤ＡおよびＢについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出（ＩＶＲ）プロファイルを示すグラフである。
【図６】コリスチン含有ナノ粒子製剤Ｆ、ＵＳ、Ｉ、およびＳについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出（ＩＶＲ）プロファイルを示すグラフである。
【図７】表示されている酸を含むポリミキシンＢ含有ナノ粒子製剤についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出（ＩＶＲ）プロファイルを示すグラフである。
【図８】遊離コリスチン硫酸塩（ＣＳ）についての薬物動態を、製剤ＦおよびＳのコリスチン含有ナノ粒子と比較して示すグラフである。
【図９】表示されているサイズの静脈内単一用量に従うＣＤ−１マウスにおける、製剤Ｓのコリスチン含有ナノ粒子の忍容性を示すグラフである。
【図１０】従来のコリスチン硫酸塩の皮下投与（左）、製剤Ｓのコリスチン含有ナノ粒子の皮下投与（中央）、またはコリスチン含有ナノ粒子の静脈内投与（右）後の腎臓組織学を示す図である。
【図１１】Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）肺感染症モデルにおける従来の薬物（ＣＳ）と製剤Ｓのコリスチン含有ナノ粒子の比較有効性研究を示すグラフである。
【図１２】クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）腿部感染症モデルにおける、従来の薬物（ＣＳ）と表示されている製剤のＣＳ−ＮＰとの比較有効性研究を示すグラフである。
【図１３】クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）腿部感染症モデルにけるＣＳ−ＮＰの蓄積を示すグラフである。
【図１４】ビンクリスチンまたはビンクリスチンを含む典型的な開示ナノ粒子のいずれかで静脈内処置してから１、４、および２１時間後のマウス腿部における細菌負荷の比較を示すグラフであり、マウスは、免疫適格ＣＤ−１の雌とし、使用細菌は、Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）とした。
【図１５】ラットの腿部重量を感染（左）対非感染（右）について示すグラフである。
【図１６】（左）ビンクリスチンのみ（軸表示「Ｖｉｎ」で示される）対ビンクリスチン含有ナノ粒子（軸表示「Ｖｉｎ−Ａｃｃ」で示される）による処置の結果として生じるビンクリスチン血漿レベルを示すグラフ、および（右）ビンクリスチンのみで処置したラットの血漿レベルを示す、グラフの左側を拡大したグラフである。
【図１７】ビンクリスチン対ビンクリスチンを含む典型的な開示ナノ粒子の腿部組織レベルを示すグラフである。
【図１８】ビンクリスチンを含む典型的な開示ナノ粒子についてのビンクリスチンの腿部組織レベルを左腿部（感染）対右腿部（非感染）で示すグラフである。
【図１９】ビンクリスチンを含む典型的な開示ナノ粒子からのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのビンクリスチン放出を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書では、抗生物質治療剤を含むポリマーナノ粒子、ならびにそのような治療用ナノ粒子を作製および使用する方法を記載する。一部の実施形態では、疎水性酸（例えば、脂肪酸および／または胆汁酸）を、開示されるナノ粒子に含める（すなわち、ドープする）および／またはナノ粒子調製プロセスに含めることで、改善された薬物添加量を含むナノ粒子を得ることができる。さらに、ある特定の実施形態では、疎水性酸を含む、かつ／またはその存在下で調製されているナノ粒子は、改善された制御放出特性を示し得る。例えば、開示されるナノ粒子は、疎水性酸なしで調製されたナノ粒子に比べて、抗生物質治療剤をよりゆっくりと放出し得る。
【００１４】
理論に束縛されるものではないが、疎水性酸（例えば、脂肪酸および／または胆汁酸）を含む開示されるナノ粒子製剤は、例えば治療剤と、酸間に疎水性イオン対（ＨＩＰ）が形成されることで、かなり改善された製剤特性（例えば、薬物添加量および／または放出プロファイル）を備えると考えられる。本明細書において使用する場合、ＨＩＰとは、クーロン引力によってまとまった、逆の電荷を帯びた一対のイオンである。ここでも理論に束縛されるものではないが、一部の実施形態では、ＨＩＰを使用して、イオン化可能な基（例えば、アミン）を含有する酸性治療剤の疎水性を増大させることができる。一部の実施形態では、疎水性が増大した酸性治療剤は、ナノ粒子製剤にとって有益となり、治療剤の有機溶媒への溶解性をより高くし得るＨＩＰ形成をもたらす場合がある。本明細書で企図されるＨＩＰ形成によって、例えば、薬物添加量が増加しているナノ粒子を得ることができる。例えば一部の実施形態では、水溶液への治療剤の溶解性が低下するために、ナノ粒子からの治療剤の放出をより緩徐にすることもできる。さらに、治療剤を大きい疎水性対イオンと複合させることで、治療剤のポリマーマトリックス内での拡散を緩やかにすることもできる。有利なことに、ＨＩＰ形成は、疎水性基の治療剤への共有結合によるコンジュゲーションを必要とせずに起こる。
【００１５】
本明細書において開示されているナノ粒子は、１種、２種、３種またはそれ超の生体適合性および／または生分解性ポリマーを含み得る。例えば、企図されるナノ粒子は、約３５〜約９９．７５重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９９．７５重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９９．５重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９９重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９８重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９７重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９６重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９５重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９４重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９３重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９２重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９１重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９０重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約８５重量パーセント、および一部の実施形態では、約５０〜約８０重量パーセントの生分解性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む１種または複数のブロックコポリマー、ならびに約０〜約５０重量パーセントの生分解性ホモポリマーを含み得る。
【００１６】
本明細書では、抗生物質、例えば、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）またはバチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）のある特定の菌株によって産生される抗生物質が企図される。
【００１７】
一部の実施形態では、開示されているナノ粒子は、約０．２〜約３５重量パーセント、約０．２〜約２０重量パーセント、約０．２〜約１０重量パーセント、約０．２〜約５重量パーセント、約０．５〜約５重量パーセント、約０．７５〜約５重量パーセント、約１〜約５重量パーセント、約２〜約５重量パーセント、約３〜約５重量パーセント、約１〜約２０重量パーセント、約２〜約２０重量パーセント、約５〜約２０重量パーセント、約１〜約１５重量パーセント、約２〜約１５重量パーセント、約３〜約１５重量パーセント、約４〜約１５重量パーセント、約５〜約１５重量パーセント、約１〜約１０重量パーセント、約２〜約１０重量パーセント、約３〜約１０重量パーセント、約４〜約１０重量パーセント、約５〜約１０重量パーセント、約１０〜約３０重量パーセント、または約１５〜約２５重量パーセントの抗生物質治療剤を含み得る。
【００１８】
ある特定の実施形態では、開示されるナノ粒子は、疎水性酸（例えば、脂肪酸および／または胆汁酸）を含む、かつ／または疎水性酸を含む方法によって調製される。そのようなナノ粒子は、疎水性酸なしの方法によって調製されたナノ粒子より高い薬物添加量を備え得る。例えば、疎水性酸を含む方法によって調製された開示されるナノ粒子の（例えば重量による）薬物添加量は、疎水性酸なしの方法によって調製された開示されるナノ粒子より約２倍〜約１０倍高い、またはなおより高い場合もある。一部の実施形態では、疎水性酸を含む第１の方法によって調製された開示されるナノ粒子の（重量による）薬物添加量は、疎水性酸を含まないことを除き、第１の方法と同一である第２の方法によって調製された開示されるナノ粒子より少なくとも約２倍高い、少なくとも約３倍高い、少なくとも約４倍高い、少なくとも約５倍高い、または少なくとも約１０倍高い場合がある。
【００１９】
いかなる適切な疎水性酸も企図される。一部の実施形態では、疎水性酸は、カルボン酸（例えば、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸など）、スルフィン酸、スルフェン酸、またはスルホン酸である場合がある。場合によって、企図される疎水性酸には、２種以上の酸の混合物を含めることもできる。場合によって、疎水性酸の塩を製剤中に使用してもよい。
【００２０】
例えば、開示されるカルボン酸は、脂肪族カルボン酸（例えば、環式または非環式、分岐または非分岐炭化水素鎖を有するカルボン酸）である場合がある。開示されるカルボン酸は、一部の実施形態では、限定はしないが、ハロゲン（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）、スルホニル、ニトロ、およびオキソを始めとする１つまたは複数の官能基で置換されている場合もある。ある特定の実施形態では、開示されるカルボン酸は、非置換である場合もある。
【００２１】
例示的なカルボン酸として、置換または非置換の脂肪酸（例えば、Ｃ６〜Ｃ５０脂肪酸）を挙げることができる。一部の例では、脂肪酸は、Ｃ１０〜Ｃ２０脂肪酸である場合がある。他の例では、脂肪酸は、Ｃ１５〜Ｃ２０脂肪酸である場合がある。脂肪酸は、場合によって、飽和である。他の実施形態では、脂肪酸は、不飽和である場合もある。例えば、脂肪酸は、一価不飽和脂肪酸または多価不飽和脂肪酸である場合がある。一部の実施形態では、不飽和脂肪酸基の二重結合は、シス配座である場合がある。一部の実施形態では、不飽和脂肪酸の二重結合は、トランス配座である場合がある。不飽和脂肪酸には、限定はしないが、オメガ３脂肪酸、オメガ６脂肪酸、およびオメガ９脂肪酸が含まれる。
【００２２】
飽和脂肪酸の非限定的な例としては、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ヘンエイコサン酸、ベヘン酸、トリコサン酸、リグノセリン酸、ペンタコサン酸、セロチン酸、ヘプタコサン酸、モンタン酸、ノナコサン酸、メリシン酸、ヘナトリアコンタン酸（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ラッセル酸、プシリン酸（ｐｓｙｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ゲジン酸（ｇｅｄｄｉｃ  ａｃｉｄ）、セロプラスチン酸（ｃｅｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘキサトリアコンタン酸、およびこれらの組合せが挙げられる。
【００２３】
不飽和脂肪酸の非限定的な例としては、ヘキサデカトリエン酸、アルファ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘンエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸、リノール酸、ガンマ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸（ａｄｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、オレイン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、ネルボン酸、ルーメン酸、α−カレンド酸、β−カレンド酸、ジャカル酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、カタルプ酸、プニカ酸、ルメレン酸（ｒｕｍｅｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、α−パリナリン酸、β−パリナリン酸、ボセオペンタエン酸、ピノレン酸、ポドカルピン酸、パルミトレイン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、およびこれらの組合せが挙げられる。
【００２４】
疎水性酸の他の非限定的な例としては、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、パモ酸、ケイ皮酸、フェニル酢酸、およびこれらの組合せなどの、芳香族酸が挙げられる。
【００２５】
一部の実施形態では、疎水性酸は、胆汁酸である場合もある。胆汁酸の非限定的な例としては、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、ハイコール酸（ｈｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ベータ−ムリコール酸、コール酸、アミノ酸抱合胆汁酸、およびこれらの組合せが挙げられる。アミノ酸にコンジュゲートさせた胆汁酸は、いかなる適切なアミノ酸にコンジュゲートしていてもよい。一部の実施形態では、アミノ酸抱合胆汁酸は、グリシン抱合胆汁酸またはタウリン抱合胆汁酸である。
【００２６】
場合によって、企図される酸は、分子量が約１０００Ｄａ未満、一部の実施形態では、約５００Ｄａ未満、一部の実施形態では、約４００Ｄａ未満、一部の実施形態では、約３００Ｄａ未満、一部の実施形態では、約２５０Ｄａ未満、一部の実施形態では、約２００Ｄａ未満、一部の実施形態では、約１５０Ｄａ未満である場合がある。場合によって、酸は、約１００Ｄａ〜約１０００Ｄａの間、一部の実施形態では、約２００Ｄａ〜約８００Ｄａの間、一部の実施形態では、約２００Ｄａ〜約６００Ｄａの間、一部の実施形態では、約１００Ｄａ〜約３００Ｄａの間、一部の実施形態では、約２００Ｄａ〜約４００Ｄａの間、一部の実施形態では、約３００Ｄａ〜約５００Ｄａの間の分子量を有することがある。
【００２７】
一部の実施形態では、疎水性酸は、少なくともある程度は、酸の強度に基づいて選択することができる。例えば、疎水性酸は、２５℃で求められる水中での酸解離定数（ｐＫａ）が、約−５〜約７、一部の実施形態では、約−３〜約５、一部の実施形態では、約−３〜約４、一部の実施形態では、約−３〜約３．５、一部の実施形態では、約−３〜約３、一部の実施形態では、約−３〜約２、一部の実施形態では、約−３〜約１、一部の実施形態では、約−３〜約０．５、一部の実施形態では、約−０．５〜約０．５、一部の実施形態では、約１〜約７、一部の実施形態では、約２〜約７、一部の実施形態では、約３〜約７、一部の実施形態では、約４〜約６、一部の実施形態では、約４〜約５．５、一部の実施形態では、約４〜約５、一部の実施形態では、約４．５〜約５である場合がある。一部の実施形態では、酸は、２５℃で求められるｐＫａが、約７未満、約５未満、約３．５未満、約３未満、約２未満、約１未満、または約０未満である場合がある。
【００２８】
一部の実施形態では、企図される疎水性酸は、例えば、最終治療用ナノ粒子における治療用ナノ粒子の特性を改善するのに有利である相転移温度を有する場合がある。例えば、酸は、約３００℃未満、場合によって、約１００℃未満、場合によって、約５０℃未満である融点を有することがある。ある特定の実施形態では、酸は、約５℃〜約２５℃の間、場合によって、約１５℃〜約５０℃の間、場合によって、約３０℃〜約１００℃の間、場合によって、約７５℃〜約１５０℃の間、場合によって、約１２５℃〜約２００℃の間、場合によって、約１５０℃〜約２５０℃の間、場合によって、約２００℃〜約３００℃の間の融点を有することがある。場合によって、酸は、約１５℃未満、場合によって、約１０℃未満、または場合によって、約０℃未満の融点を有することがある。ある特定の実施形態では、酸は、約−３０℃〜約０℃の間、または場合によって、約−２０℃〜約−１０℃の間の融点を有することがある。
【００２９】
例えば、本明細書で開示される方法およびナノ粒子において使用する酸は、少なくとも部分的に、酸を含む溶媒への抗生物質治療剤の溶解度に基づいて選択することができる。例えば、一部の実施形態では、酸を含む溶媒に溶解したポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤は、約７００ｍｇ／ｍＬ〜約９００ｍｇ／ｍＬの間、約６００ｍｇ／ｍＬ〜約８００ｍｇ／ｍＬの間、約５００ｍｇ／ｍＬ〜約７００ｍｇ／ｍＬ〜約８００ｍｇ／ｍＬの間、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの間、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの間、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの間、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの間、約７５ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの間、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの間、約１２５ｍｇ／ｍＬ〜約１７５ｍｇ／ｍＬの間、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの間、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬの間の溶解度を有する場合がある。一部の実施形態では、酸を含む溶媒に溶解した抗生物質治療剤は、約１０ｍｇ／ｍＬを超える、約５０ｍｇ／ｍＬを超える、または約１００ｍｇ／ｍＬを超える溶解度を有する場合がある。一部の実施形態では、疎水性酸を含む溶媒に溶解した抗生物質治療剤（例えば、治療剤と溶媒と疎水性酸とからなる第１の溶液）は、抗生物質治療剤が、疎水性酸を含有しない溶媒（例えば、治療剤と溶媒とからなる第２の溶液）に溶解している場合の、少なくとも約２倍高い、一部の実施形態では、少なくとも約５倍高い、一部の実施形態では、少なくとも約１０倍高い、一部の実施形態では、少なくとも約２０倍高い、一部の実施形態では、約２倍〜約２０倍高い、または一部の実施形態では、約１０倍〜約２０倍高い溶解度を有する場合がある。
【００３０】
場合によって、薬剤溶液（すなわち抗生物質治療剤溶液）中の酸の濃度は、約１重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約２重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約３重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約４重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約５重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約６重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約８重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１０重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１２重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１４重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１６重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１重量パーセント〜約５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約３重量パーセント〜約９重量パーセントの間、一部の実施形態では、約６重量パーセント〜約１２重量パーセントの間、一部の実施形態では、約９重量パーセント〜約１５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１２重量パーセント〜約１８重量パーセントの間、および一部の実施形態では、約１５重量パーセント〜約２１重量パーセントの間でよい。ある特定の実施形態では、薬剤溶液中の疎水性酸の濃度は、少なくとも約１重量パーセント、一部の実施形態では、少なくとも約２重量パーセント、一部の実施形態では、少なくとも約３重量パーセント、一部の実施形態では、少なくとも約５重量パーセント、一部の実施形態では、少なくとも約１０重量パーセント、一部の実施形態では、少なくとも約１５重量パーセント、および一部の実施形態では、少なくとも約２０重量パーセントでよい。
【００３１】
ある特定の実施形態では、疎水性酸は、２５℃で求められる溶解度が、水１００ｍＬあたり約２ｇ未満、一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１ｇ未満、一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１００ｍｇ未満、一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１０ｍｇ未満、および一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１ｍｇ未満となり得る。他の実施形態では、酸は、２５℃で求められる溶解度が、水１００ｍＬあたり約１ｍｇ〜水１００ｍＬあたり約２ｇの間、一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１ｍｇ〜水１００ｍＬあたり約１ｇの間、一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１ｍｇ〜水１００ｍＬあたり約５００ｍｇの間、および一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１ｍｇ〜水１００ｍＬあたり約１００ｍｇの間となり得る。一部の実施形態では、疎水性酸は、２５℃において水に本質的に不溶性でよい。
【００３２】
一部の実施形態では、開示されるナノ粒子は、ナノ粒子を調製する際に、疎水性酸が本質的に使用されていなくてもよい。他の実施形態では、開示されるナノ粒子は疎水性酸を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、酸の、開示されるナノ粒子中の含有量は、約０．０５重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約０．５重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約２重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約３重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約５重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約７重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１０重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１５重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約２０重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約０．０５重量パーセント〜約０．５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約０．０５重量パーセント〜約５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１重量パーセント〜約５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約３重量パーセント〜約１０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約５重量パーセント〜約１５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１０重量パーセント〜約２０重量パーセントの間でよい。
【００３３】
一部の実施形態では、開示されるナノ粒子は、例えば、室温（例えば２５℃）および／または３７℃のリン酸緩衝溶液に入れたとき、（例えば、約１分〜約３０分、約１分〜約２５分、約５分〜約３０分、約５分〜約１時間、約１時間、または約２４時間かけて、）約２％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満、約３０％未満、もしくは４０％未満の抗生物質治療剤しか実質的に直ちに放出しない。ある特定の実施形態では、抗生物質治療剤を含むナノ粒子は、例えば２５℃および／または３７℃の水溶液（例えばリン酸緩衝溶液）に入れたとき、抗生物質治療剤の約０．０１〜約５０％、一部の実施形態では約０．０１〜約２５％、一部の実施形態では約０．０１〜約１５％、一部の実施形態では約０．０１〜約１０％、一部の実施形態では約１〜約４０％、一部の実施形態では約５〜約４０％、および一部の実施形態では約１０〜約４０％が約１時間かけて放出されるのに実質的に相当する速度で、抗生物質治療剤を放出し得る。一部の実施形態では、抗生物質治療剤を含むナノ粒子は、水溶液（例えば、リン酸緩衝溶液）中に、例えば、２５℃にて、および／または３７℃にて置かれたとき、ポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤の約１０〜約７０％、一部の実施形態では、約１０〜約４５％、一部の実施形態では、約１０〜約３５％、または一部の実施形態では、約１０〜約２５％が約４時間にわたり放出されることに実質的に対応する速度で、抗生物質治療剤を放出し得る。
【００３４】
一部の実施形態では、開示されるナノ粒子は、３７℃のリン酸緩衝溶液に入れたとき、ポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤を、例えば、少なくとも約１分間、少なくとも約１時間、またはそれより長時間、実質的に保持し得る。
【００３５】
一実施形態では、開示される治療用ナノ粒子は、標的化リガンド、例えば、前立腺特異的膜抗原を標的とするまたはこれに結合するのに有効な低分子量ＰＳＭＡリガンドを含む場合がある。ある特定の実施形態では、低分子量リガンドはポリマーにコンジュゲートしており、ナノ粒子は、特定の比のリガンドがコンジュゲートしたポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ−リガンド）と非官能化ポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧ）とを含む。有効量のリガンドが、疾患または障害、例えば、がんの処置のためのナノ粒子と会合するように、ナノ粒子は、最適化された比のこれらの２種のポリマーを有することができる。例えば、リガンド密度の増加は、標的結合（細胞結合／標的取込み）を増加させ、ナノ粒子を「標的特異的」とし得る。代わりに、ナノ粒子における非官能化ポリマー（例えば、非官能化ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマー）のある特定の濃度は、炎症および／または免疫原性（すなわち、免疫応答を誘発する能力）を制御し、かつナノ粒子が、疾患または障害（例えば、前立腺がん）の処置のために適した循環半減期を有することを可能とする。さらに、非官能化ポリマーは、一部の実施形態では、細網内皮系（ＲＥＳ）を介した循環器系からのクリアランスの速度を低下し得る。このように、非官能化ポリマーは、投与によって粒子が体内を移動することを可能とし得る特徴を有するナノ粒子を提供し得る。一部の実施形態では、非官能化ポリマーは、それ以外の場合では高濃度になってしまうリガンドを相殺することができる。リガンドが高濃度であったなら、対象によるクリアランスが加速され、標的細胞への送達が低下してしまっていた可能性がある。
【００３６】
一部の実施形態では、本明細書において開示されているナノ粒子は、ナノ粒子の全ポリマー組成物（すなわち、官能化＋非官能化ポリマー）の概ね０．１〜５０モルパーセント、例えば、０．１〜３０モルパーセント、例えば、０．１〜２０モルパーセント、例えば、０．１〜１０モルパーセントを構成する、リガンドにコンジュゲートした官能化ポリマーを含み得る。別の実施形態では、１種または複数の低分子量リガンドとコンジュゲート（すなわち、共有結合（例えば、リンカー（例えば、アルキレンリンカー）を介した）または結合）したポリマーを含むナノ粒子が本明細書においてまた開示され、総ポリマーに対する低分子量リガンドの重量パーセントは、約０．００１〜５、例えば、約０．００１〜２、例えば、約０．００１〜１である。
【００３７】
一部の実施形態では、開示されているナノ粒子は、生物学的実体、例えば、特定の膜成分もしくは細胞表面受容体と効率的に結合するか、そうでなければ会合することができる場合がある。（例えば、特定の組織もしくは細胞型への、正常組織ではなく特定の患部組織などへの）治療剤の標的化は、組織特異的疾患、例えば、固形腫瘍がん（例えば、前立腺がん）の処置のために望ましい。例えば、細胞毒性抗がん剤の全身的送達と対照的に、本明細書において開示されているナノ粒子は、この薬剤が健康な細胞を死滅させることを実質的に防止し得る。さらに、開示されているナノ粒子は、（開示されているナノ粒子または製剤を伴わずに投与された有効量の薬剤と比較して）薬剤のより低い用量の投与を可能としてもよく、これは伝統的な化学療法と一般に関連する望ましくない副作用を低減し得る。
【００３８】
一般に、「ナノ粒子」は、１０００ｎｍ未満、例えば、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有する任意の粒子を指す。開示されている治療用ナノ粒子は、約６０〜約１２０ｎｍ、または約７０〜約１２０ｎｍ、または約８０〜約１２０ｎｍ、または約９０〜約１２０ｎｍ、または約１００〜約１２０ｎｍ、または約６０〜約１３０ｎｍ、または約７０〜約１３０ｎｍ、または約８０〜約１３０ｎｍ、または約９０〜約１３０ｎｍ、または約１００〜約１３０ｎｍ、または約１１０〜約１３０ｎｍ、または約６０〜約１４０ｎｍ、または約７０〜約１４０ｎｍ、または約８０〜約１４０ｎｍ、または約９０〜約１４０ｎｍ、または約１００〜約１４０ｎｍ、または約１１０〜約１４０ｎｍ、または約６０〜約１５０ｎｍ、または約７０〜約１５０ｎｍ、または約８０〜約１５０ｎｍ、または約９０〜約１５０ｎｍ、または約１００〜約１５０ｎｍ、または約１１０〜約１５０ｎｍ、または約１２０〜約１５０ｎｍの直径を有するナノ粒子を含み得る。
【００３９】
ポリマー
一部の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーのマトリックスと治療剤とを含んでいてもよい。一部の実施形態では、治療剤および／または標的化部分（すなわち、低分子量ＰＳＭＡリガンド）は、ポリマーマトリックスの少なくとも一部と会合させることができる。例えば、一部の実施形態では、標的化部分（例えば、リガンド）は、ポリマーマトリックスの表面と共有結合的に会合させることができる。一部の実施形態では、共有結合的会合は、リンカーによって媒介される。治療剤は、ポリマーマトリックスの表面と会合するか、ポリマーマトリックス内にカプセル化されるか、ポリマーマトリックスによって囲まれるか、かつ／またはポリマーマトリックスにわたって分散し得る。
【００４０】
多種多様のポリマーおよびそこから粒子を形成する方法は、薬物送達の当技術分野において公知である。一部の実施形態では、本開示は、少なくとも２つの巨大分子を有するナノ粒子を対象とし、第１の巨大分子は、低分子量リガンド（例えば、標的化部分）に結合した第１のポリマーを含み、第２の巨大分子は、標的化部分に結合していない第２のポリマーを含む。ナノ粒子は、１種または複数のさらなる非官能化ポリマーを場合により含むことができる。
【００４１】
任意の適切なポリマーを、開示されているナノ粒子において使用することができる。ポリマーは、天然または非天然（合成）のポリマーでよい。ポリマーは、２種またはそれ超のモノマーを含むホモポリマーまたはコポリマーでよい。配列に関して、コポリマーは、ランダム、ブロックでよいか、またはランダムおよびブロック配列の組合せを含むことができる。典型的には、ポリマーは、有機ポリマーである。
【００４２】
用語「ポリマー」は、本明細書において使用する場合、当技術分野で使用されるようなその通常の意味を与えられ、すなわち、分子構造は、共有結合によって連結した１つまたは複数の繰り返し単位（モノマー）を含む。繰り返し単位は、全て同一であり得るか、または場合によって、ポリマー内に存在する２種以上のタイプの繰り返し単位があり得る。場合によって、ポリマーは、生物学的に由来するもの、すなわち、生体ポリマーでよい。非限定的例には、ペプチドまたはタンパク質が含まれる。場合によって、さらなる部分、例えば、生物学的部分、例えば、下記に記載したものがまた、ポリマー中に存在し得る。２種以上のタイプの繰り返し単位がポリマー内に存在する場合、ポリマーは、「コポリマー」と言われる。ポリマーを用いる任意の実施形態では、用いられるポリマーは、場合によって、コポリマーであり得ることを理解すべきである。コポリマーを形成する繰り返し単位は、任意の様式で配置し得る。例えば、繰り返し単位は、ランダムな順序で、交互の順序で、またはブロックコポリマーとして配置してもよく、すなわち、それぞれが第１の繰り返し単位（例えば、第１のブロック）を含む１つまたは複数の領域、およびそれぞれが第２の繰り返し単位（例えば、第２のブロック）を含む１つまたは複数の領域などを含む。ブロックコポリマーは、２つ（ジブロックコポリマー）、３つ（トリブロックコポリマー）、またはそれ超の数の別個のブロックを有し得る。
【００４３】
開示されている粒子は、コポリマーを含むことができ、これは一部の実施形態では、通常、２種またはそれ超のポリマーが一緒の共有結合によって互いに会合している、２種またはそれ超のポリマー（例えば、本明細書に記載されているもの）を説明する。このように、コポリマーは、第１のポリマーおよび第２のポリマーを含んでいてもよく、これらは一緒にコンジュゲートされて、ブロックコポリマーを形成し、第１のポリマーは、ブロックコポリマーの第１のブロックでよく、第２のポリマーは、ブロックコポリマーの第２のブロックでよい。当然ながら、ブロックコポリマーは、場合によって、ポリマーの複数のブロックを含有してもよく、「ブロックコポリマー」は、本明細書において使用する場合、単一の第１のブロックおよび単一の第２のブロックのみを有するブロックコポリマーのみに限定されないことを当業者は理解する。例えば、ブロックコポリマーは、第１のポリマーを含む第１のブロック、第２のポリマーを含む第２のブロック、および第３のポリマーまたは第１のポリマーなどを含む第３のブロックを含み得る。場合によって、ブロックコポリマーは、任意の数の第１のポリマーの第１のブロック、および第２のポリマーの第２のブロック（およびある特定の場合では、第３のブロック、第４のブロックなど）を含有することができる。さらに、ブロックコポリマーはまた、場合によって、他のブロックコポリマーから形成することができることに留意すべきである。例えば、第１のブロックコポリマーは、別のポリマー（ホモポリマー、生体ポリマー、別のブロックコポリマーなどでよい）にコンジュゲートして複数のタイプのブロックを含有する新規なブロックコポリマーを形成し、かつ／または他の部分（例えば、非ポリマー部分）にコンジュゲートし得る。
【００４４】
一部の実施形態では、ポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）は、両親媒性でよく、すなわち、親水性部分および疎水性部分、または相対的に親水性部分および相対的に疎水性部分を有する。親水性ポリマーは、一般に水を引きつけるものでよく、疎水性ポリマーは、一般に水をはねかえすものでよい。親水性または疎水性ポリマーは、例えば、ポリマーの試料を調製し、水とのその接触角を測定する（典型的には、ポリマーは、６０°未満の接触角を有し、一方、疎水性ポリマーは、約６０°超の接触角を有する）ことによって同定することができる。場合によって、２種またはそれ超のポリマーの親水性は、互いに対して測定してもよく、すなわち、第１のポリマーは、第２のポリマーより親水性であり得る。例えば、第１のポリマーは、第２のポリマーより小さな接触角を有し得る。
【００４５】
一組の実施形態では、本明細書において企図されるポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）は、生体適合性ポリマー、すなわち、典型的には、生きている対象中に挿入または注射されたとき、例えば、Ｔ細胞応答によるかなりの炎症および／または免疫系によるポリマーの急性拒絶を伴わずに有害な応答を惹起しないポリマーを含む。したがって、本明細書において企図される治療用粒子は、非免疫原性であり得る。非免疫原性という用語は、本明細書において使用する場合、循環抗体、Ｔ細胞、もしくは反応性免疫細胞を通常引き起こさないか、または最小レベルのみを引き起こし、個体においてそれ自体に対する免疫応答を通常引き起こさない、その天然状態における内在性成長因子を指す。
【００４６】
生体適合性は典型的には、免疫系の少なくとも一部による材料の急性拒絶を指し、すなわち、対象中に植え込んだ非生体適合性材料が、対象において十分に重大であり得る免疫応答を誘発し、免疫系による材料の拒絶は、適当に制御することができず、材料を対象から除去しなくてはならないような程度であることが多い。生体適合性を決定するための１つの単純な試験は、ポリマーを細胞へとｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露させることでよい。生体適合性ポリマーは、典型的には中程度の濃度で、例えば、５０マイクログラム／１０６個の細胞の濃度でかなりの細胞死をもたらさないポリマーである。例えば、生体適合性ポリマーは、細胞、例えば、線維芽細胞または上皮細胞に曝露したとき、たとえこのような細胞によって貪食されるか、そうでなければ取り込まれるかしても、約２０％未満の細胞死をもたらし得る。様々な実施形態において有用であり得る生体適合性ポリマーの非限定的例には、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレート、ポリ（グリセロールセバシン酸）、ポリグリコリド（すなわち、ポリ（グリコール）酸）（ＰＧＡ）、ポリラクチド（すなわち、ポリ（乳）酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、またはこれらおよび／もしくは他のポリマーを含めたコポリマーまたは誘導体が含まれる。
【００４７】
ある特定の実施形態では、企図される生体適合性ポリマーは、生分解性でよく、すなわち、ポリマーは、生理学的環境内、例えば、体内で、化学的および／または生物学的に分解することができる。本明細書において使用する場合、「生分解性」ポリマーは、細胞中に導入されるとき、細胞の機構によって（生物学的に分解可能）、および／または化学プロセス、例えば、加水分解によって（化学的に分解可能）、細胞に対してかなりの毒性効果を伴わずに細胞が再使用または処分することができる成分へと分解されるものである。一実施形態では、生分解性ポリマーおよびこれらの分解副生成物は、生体適合性であり得る。
【００４８】
本明細書において開示されている粒子は、ＰＥＧを含有してもよいか、またはしなくてもよい。さらに、ある特定の実施形態は、ポリ（エステル−エーテル）を含有するコポリマー、例えば、エステル結合（例えば、Ｒ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’結合）およびエーテル結合（例えば、Ｒ−Ｏ−Ｒ’結合）によって結合した繰り返し単位を有するポリマーを対象とすることができる。一部の実施形態では、生分解性ポリマー、例えば、カルボン酸基を含有する加水分解性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）繰り返し単位とコンジュゲートして、ポリ（エステル−エーテル）を形成し得る。ポリ（エチレングリコール）繰り返し単位を含有するポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）はまた、「ペグ化」ポリマーと称することができる。
【００４９】
例えば、企図されるポリマーは、（例えば、対象内で）水への曝露によって自発的に加水分解するものでよく、ポリマーは、（例えば、約３７℃の温度での）熱への曝露によって分解し得る。ポリマーの分解は、使用するポリマーまたはコポリマーによって様々な速度で起こり得る。例えば、ポリマーの半減期（ポリマーの５０％がモノマーおよび／または他の非ポリマー部分に分解することができる時間）は、ポリマーによって数日、数週間、数カ月、または数年程度であり得る。ポリマーは、例えば、酵素活性または細胞の機構によって、場合によって、例えば、リゾチーム（例えば、相対的に低ｐＨを有する）への曝露によって、生物学的に分解し得る。場合によって、ポリマーは、細胞に対して有意な毒性効果を伴わずに、細胞が再使用するか、または処分することができる、モノマーおよび／または他の非ポリマー部分に分解し得る（例えば、ポリラクチドは加水分解して、乳酸を形成し得、ポリグリコリドは加水分解して、グリコール酸などを形成し得る）。
【００５０】
一部の実施形態では、ポリマーは、本明細書において「ＰＬＧＡ」と集団的に称される、乳酸およびグリコール酸単位を含むコポリマー、例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ならびに本明細書において「ＰＧＡ」と称される、グリコール酸単位、ならびに本明細書において「ＰＬＡ」と集団的に称される、乳酸単位、例えば、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチド、およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドを含むホモポリマーを含めた、ポリエステルであり得る。一部の実施形態では、例示的なポリエステルには、例えば、ポリヒドロキシ酸；ラクチドおよびグリコリドのペグ化ポリマーおよびコポリマー（例えば、ペグ化ＰＬＡ、ペグ化ＰＧＡ、ペグ化ＰＬＧＡ、およびその誘導体）が含まれる。一部の実施形態では、ポリエステルは、例えば、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、ペグ化ポリ（オルトエステル）、ポリ（カプロラクトン）、ペグ化ポリ（カプロラクトン）、ポリリシン、ペグ化ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ペグ化ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］、およびその誘導体を含む。
【００５１】
一部の実施形態では、ポリマーは、ＰＬＧＡであり得る。ＰＬＧＡは、乳酸およびグリコール酸の生体適合性および生分解性コポリマーであり、様々な形態のＰＬＧＡは、乳酸：グリコール酸の比によって特性決定することができる。乳酸は、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、またはＤ，Ｌ−乳酸でよい。ＰＬＧＡの分解速度は、乳酸−グリコール酸の比を変化させることによって調節することができる。一部の実施形態では、ＰＬＧＡは、概ね８５：１５、概ね７５：２５、概ね６０：４０、概ね５０：５０、概ね４０：６０、概ね２５：７５、または概ね１５：８５の乳酸：グリコール酸比によって特性決定することができる。一部の実施形態では、粒子のポリマー（例えば、ＰＬＧＡブロックコポリマーまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー）中の乳酸のグリコール酸モノマーに対する比を選択して、様々なパラメーター、例えば、水の取込み、治療剤の放出および／またはポリマー分解の反応速度について最適化し得る。
【００５２】
一部の実施形態では、ポリマーは、１種または複数のアクリルポリマーであり得る。ある特定の実施形態では、アクリルポリマーは、例えば、アクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メタクリル酸メチルコポリマー、メタクリル酸エトキシエチル、メタクリル酸シアノエチル、メタクリル酸アミノアルキルコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、メタクリル酸アルキルアミドコポリマー、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリアクリルアミド、メタクリル酸アミノアルキルコポリマー、メタクリル酸グリシジルコポリマー、ポリシアノアクリレート、および上記のポリマーの１つまたは複数を含む組合せを含む。アクリルポリマーは、低含量の第四級アンモニウム基を有するアクリル酸およびメタクリル酸エステルの完全に重合されたコポリマーを含み得る。
【００５３】
一部の実施形態では、ポリマーは、カチオン性ポリマーでよい。一般に、カチオン性ポリマーは、負に帯電している核酸鎖（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその誘導体）を凝縮および／または保護することができる。アミン含有ポリマー、例えば、ポリ（リシン）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびポリ（アミドアミン）デンドリマーは、一部の実施形態では、開示されている粒子における使用のために企図される。
【００５４】
一部の実施形態では、ポリマーは、カチオン性側鎖を担持する分解性ポリエステルでよい。これらのポリエステルの例には、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）が含まれる。
【００５５】
例えば、ＰＥＧがリガンドにコンジュゲートしていないとき、ＰＥＧは、終端しており、末端基を含んでいてもよいことが企図されている。例えば、ＰＥＧは、ヒドロキシル、メトキシもしくは他のアルコキシル基、メチルもしくは他のアルキル基、アリール基、カルボン酸、アミン、アミド、アセチル基、グアニジノ基、またはイミダゾールで終端し得る。他の企図される末端基には、アジド、アルキン、マレイミド、アルデヒド、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、アルコキシアミン、またはチオール部分が含まれる。
【００５６】
当業者は、例えば、開環重合技術（ＲＯＭＰ）などによって、ポリマーをアミンで終端しているＰＥＧ基に反応させるＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を使用することによって、ポリマーをペグ化するための方法および技術について知っている。
【００５７】
一実施形態では、ポリマーの分子量（または、例えば、コポリマーの異なるブロックの分子量の比）は、本明細書に開示されている有効な処置のために最適化することができる。例えば、ポリマーの分子量は、粒子分解速度（例えば、生分解性ポリマーの分子量を調節することができるとき）、溶解度、水の取込み、および薬物放出動態に影響を与えてもよい。例えば、ポリマーの分子量（または、例えば、コポリマーの異なるブロックの分子量の比）は、粒子が合理的な期間（数時間から１〜２週間、３〜４週間、５〜６週間、７〜８週間などの範囲）内で、処置される対象において生分解するように調節することができる。
【００５８】
開示されている粒子は、例えば、ＰＥＧおよびＰＬ（Ｇ）Ａのジブロックコポリマーを含むことができ、例えば、ＰＥＧ部分は、約１，０００〜２０，０００、例えば、約２，０００〜２０，０００、例えば、約２〜約１０，０００の数平均分子量を有してもよく、ＰＬ（Ｇ）Ａ部分は、約５，０００〜約２０，０００、または約５，０００〜１００，０００、例えば、約２０，０００〜７０，０００、例えば、約１５，０００〜５０，０００の数平均分子量を有してもよい。
【００５９】
例えば、約１０〜約９９重量パーセントのポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、または約２０〜約８０重量パーセント、約４０〜約８０重量パーセント、もしくは約３０〜約５０重量パーセント、もしくは約７０〜約９０重量パーセントのポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーを含む例示的な治療用ナノ粒子が本明細書において開示される。例示的なポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーは、約１５〜約２０ｋＤａ、または約１０〜約２５ｋＤａの数平均分子量のポリ（乳）酸および約４〜約６、または約２ｋＤａ〜約１０ｋＤａの数平均分子量のポリ（エチレン）グリコールを含むことができる。
【００６０】
一部の実施形態では、ポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーは、約０．６〜約０．９５、一部の実施形態では、約０．７〜約０．９、一部の実施形態では、約０．６〜約０．８、一部の実施形態では、約０．７〜約０．８、一部の実施形態では、約０．７５〜約０．８５、一部の実施形態では、約０．８〜約０．９、および一部の実施形態では、約０．８５〜約０．９５の数平均分子量比率のポリ（乳）酸を有し得る。ポリ（乳）酸の数平均分子量比率は、コポリマーのポリ（乳）酸成分の数平均分子量を、ポリ（乳）酸成分の数平均分子量およびポリ（エチレン）グリコール成分の数平均分子量の合計で除することによって計算し得ることを理解すべきである。
【００６１】
開示されているナノ粒子は、約１〜約５０重量パーセントのポリ（乳）酸またはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸（ＰＥＧを含まない）を場合により含んでいてもよいか、または約１〜約５０重量パーセント、もしくは約１０〜約５０重量パーセントもしくは約３０〜約５０重量パーセントのポリ（乳）酸もしくはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸を場合により含んでいてもよい。例えば、ポリ（乳）酸またはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸は、約５〜約１５ｋＤａ、または約５〜約１２ｋＤａの数平均分子量を有し得る。例示的なＰＬＡは、約５〜約１０ｋＤａの数平均分子量を有し得る。例示的なＰＬＧＡは、約８〜約１２ｋＤａの数平均分子量を有し得る。
【００６２】
治療用ナノ粒子は、一部の実施形態では、約１０〜約３０重量パーセント、一部の実施形態では、約１０〜約２５重量パーセント、一部の実施形態では、約１０〜約２０重量パーセント、一部の実施形態では、約１０〜約１５重量パーセント、一部の実施形態では、約１５〜約２０重量パーセント、一部の実施形態では、約１５〜約２５重量パーセント、一部の実施形態では、約２０〜約２５重量パーセント、一部の実施形態では、約２０〜約３０重量パーセント、または一部の実施形態では、約２５〜約３０重量パーセントのポリ（エチレン）グリコールを含有してもよく、ポリ（エチレン）グリコールは、ポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、ポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、またはポリ（エチレン）グリコールホモポリマーとして存在し得る。
【００６３】
一実施形態では、任意選択の低分子標的化部分は、ナノ粒子の脂質成分に結合、例えば、共有結合している。例えば、本明細書では、ポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤（例えば、コリスチン硫酸塩）と、官能化ポリマーおよび非官能化ポリマーを含むポリマーマトリックスと、任意選択で脂質と、任意選択で低分子量ＰＳＭＡ標的化リガンドとを含むナノ粒子であって、標的化リガンドは、ナノ粒子の脂質成分に結合、例えば共有結合している、ナノ粒子が提供される。一実施形態では、低分子標的化部分に結合している脂質成分は、式Ｖのものである。別の実施形態では、ポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤（例えば、コリスチン硫酸塩）と、ポリマーマトリックスと、ＤＳＰＥと、低分子量ＰＳＭＡ標的化リガンドとを含み、リガンドはＤＳＰＥに結合、例えば共有結合している、標的特異的ナノ粒子が提供される。例えば、ナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−リガンドを含むポリマーマトリックスを含む場合がある。
【００６４】
標的化部分
本明細書では、任意選択の標的化部分、すなわち、生物学的実体、例えば、膜成分、細胞表面受容体、前立腺特異的膜抗原などに結合、または代わりに会合し得る部分を含み得るナノ粒子が提供される。粒子の表面上に存在する標的化部分は、粒子が特定の標的化部位、例えば、腫瘍、疾患部位、組織、器官、細胞のタイプなどにおいて局在化することを可能とし得る。したがって、ナノ粒子は、「標的特異的」であり得る。次いで、薬物または他のペイロードは、場合によって、粒子から放出され、特定の標的化部位と局所的に相互作用することを可能とし得る。
【００６５】
一実施形態では、開示されるナノ粒子は、低分子量リガンド、例えば、低分子量ＰＳＭＡリガンドである標的化部分を含む。用語「結合」または「結合すること」は、本明細書において使用する場合、典型的には、これらに限定されないが、生化学的、生理的、および／または化学的相互作用を含めた特異的または非特異的な結合または相互作用による、相互親和性または結合能力を示す、対応する分子の対またはその部分の間の相互作用を指す。「生物学的結合」は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモンなどを含めた分子の対の間に起こる相互作用のタイプを定義する。用語「結合パートナー」は、特定の分子と結合することができる分子を指す。「特異的結合」は、他の同様の生物学的実体に対してより実質的により高い程度まで結合パートナー（または限定された数の結合パートナー）に結合するか、認識することができる分子、例えば、ポリヌクレオチドを指す。一組の実施形態では、標的化部分は、約１マイクロモル未満、少なくとも約１０マイクロモル、または少なくとも約１００マイクロモルの親和性（解離定数によって測定すると）を有する。
【００６６】
例えば、標的化部は、粒子が、使用する標的化部分によって、対象の体内の腫瘍（例えば、固形腫瘍）、疾患の部位、組織、器官、あるタイプの細胞などへと局在化することをもたらし得る。例えば、低分子量ＰＳＭＡリガンドは、固形腫瘍、例えば、乳房腫瘍もしくは前立腺腫瘍またはがん細胞に局在化し得る。対象は、ヒトまたはヒトではない動物であり得る。対象の例には、これらに限定されないが、哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ロバ、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、霊長類、ヒトなどが含まれる。
【００６７】
企図される標的化部分は、低分子を含み得る。ある特定の実施形態では、用語「低分子」は、天然に生じたか、または人工的に創出した（例えば、化学合成による）、相対的に低分子量を有し、かつタンパク質、ポリペプチド、または核酸でない有機化合物を指す。低分子は典型的には、複数の炭素−炭素結合を有する。ある特定の実施形態では、低分子は、サイズが約２０００ｇ／ｍｏｌ未満である。一部の実施形態では、低分子は、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満または約１０００ｇ／ｍｏｌ未満である。一部の実施形態では、低分子は、約８００ｇ／ｍｏｌ未満または約５００ｇ／ｍｏｌ未満、例えば、約１００ｇ／ｍｏｌ〜約６００ｇ／ｍｏｌ、または約２００ｇ／ｍｏｌ〜約５００ｇ／ｍｏｌである。
【００６８】
例えば、標的部分は、前立腺がん腫瘍を標的とすることができ、例えば、標的化部分は、ＰＳＭＡペプチダーゼ阻害剤である場合がある。こうした部分を、本明細書では、「低分子量ＰＳＭＡリガンド」とも呼ぶ。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の発現は、正常組織における発現と比較すると、悪性前立腺において正常組織の少なくとも１０倍過剰発現され、ＰＳＭＡ発現のレベルは、疾患が転移相へと進行するにつれて、さらに上向調節される（Ｓｉｌｖｅｒら、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、３：８１）。
【００６９】
一部の実施形態では、低分子量ＰＳＭＡリガンドは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのもの：
【００７０】
【化１】
2018535228.tif 000003
およびエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはそのラセミ化合物であり、
式中、ｍおよびｎは、それぞれ独立に、０、１、２または３であり、ｐは、０または１であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、置換もしくは非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜１０−アルキル、Ｃ１〜６−アルキル、またはＣ１〜４−アルキル）、置換もしくは非置換アリール（例えば、フェニルまたはピリジニル）、および任意のこれらの組合せからなる群から選択され、Ｒ３は、ＨまたはＣ１〜６−アルキル（例えば、ＣＨ３）である。
【００７１】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの化合物について、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４またはＲ５は、ナノ粒子への結合点、例えば、開示されているナノ粒子の一部を形成するポリマー、例えば、ＰＥＧへの結合点を含む。結合点は、共有結合、イオン結合、水素結合、化学的吸着および物理的吸着を含めた吸着によって形成される結合、ファンデルワールス結合によって形成される結合、または分散力によって形成し得る。例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、またはＲ５が、アニリンまたはＣ１〜６−アルキル−ＮＨ２基と定義されている場合、これらの官能基の任意の水素（例えば、アミノ水素）は、除去することができ、低分子量ＰＳＭＡリガンドが、ナノ粒子のポリマーマトリックス（例えば、ポリマーマトリックスのＰＥＧ−ブロック）に共有結合している。本明細書において使用する場合、用語「共有結合」は、少なくとも一対の電子を共有することによって形成される２個の原子の間の結合を指す。
【００７２】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｃ１〜６−アルキルもしくはフェニル、またはＣ１〜６−アルキルもしくはフェニルの任意の組合せであり、これらはＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、またはＣＯ２Ｈで１回または複数回独立に置換されており、アルキル基は、Ｎ（Ｈ）、Ｓ、またはＯによって中断し得る。別の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、ＣＨ２−Ｐｈ、（ＣＨ２）２−ＳＨ、ＣＨ２−ＳＨ、（ＣＨ２）２Ｃ（Ｈ）（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｈ）（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈ、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、（ＣＨ２）２Ｃ（Ｈ）（ＳＨ）ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｐｈ、Ｏ−ＣＨ２−Ｐｈ、またはＯ−（ＣＨ２）２−Ｐｈであり、各Ｐｈは、独立に、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＯ２Ｈ、またはＳＨで１回または複数回置換し得る。これらの式について、ＮＨ２、ＯＨまたはＳＨ基は、ナノ粒子（例えば、−Ｎ（Ｈ）−ＰＥＧ、−Ｏ−ＰＥＧ、または−Ｓ−ＰＥＧ）への共有結合点としての役割を果たす。
【００７３】
さらに別の実施形態では、低分子量ＰＳＭＡリガンドは、
【００７４】
【化２】
2018535228.tif 000004
ならびにこれらのエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ化合物からなる群から選択され、ＮＨ２基、ＯＨ基、またはＳＨ基が、ナノ粒子（例えば、−Ｎ（Ｈ）−ＰＥＧ、−Ｏ−ＰＥＧ、または−Ｓ−ＰＥＧ）への共有結合点として働く。
【００７５】
別の実施形態では、低分子量ＰＳＭＡリガンドは、
【００７６】
【化３】
2018535228.tif 000005
ならびにこれらのエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ化合物からなる群から選択され、Ｒは、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ；ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、またはＣＯ２Ｈで置換されているＣ１−６アルキル；およびＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、またはＣＯ２Ｈで置換されているフェニルからなる群から独立に選択され、Ｒが、ナノ粒子（例えば、−Ｎ（Ｈ）−ＰＥＧ、−Ｓ−ＰＥＧ、−Ｏ−ＰＥＧ、またはＣＯ２−ＰＥＧ）への共有結合点として働く。
【００７７】
別の実施形態では、低分子量ＰＳＭＡリガンドは、
【００７８】
【化４】
2018535228.tif 000006
ならびにこれらのエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ化合物からなる群から選択され、ＮＨ２基またはＣＯ２Ｈ基が、ナノ粒子（例えば、−Ｎ（Ｈ）−ＰＥＧまたはＣＯ２−ＰＥＧ）への共有結合点として働く。これらの化合物は、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、もしくはＣＯ２Ｈで置換されているＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、Ｃ１〜６−アルキル、またはＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、もしくはＣＯ２Ｈで置換されているフェニルでさらに置換されていてもよく、これらの官能基はまた、ナノ粒子への共有結合点としての役割を果たすことができる。
【００７９】
別の実施形態では、低分子量ＰＳＭＡリガンドは、
【００８０】
【化５】
2018535228.tif 000007
およびそのエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ化合物であり、ｎは、１、２、３、４、５、または６である。このリガンドについては、ＮＨ２基が、ナノ粒子（例えば、−Ｎ（Ｈ）−ＰＥＧ）への共有結合点として働く。
【００８１】
さらに別の実施形態では、低分子量ＰＳＭＡリガンドは、
【００８２】
【化６】
2018535228.tif 000008
およびそのエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ化合物である。とりわけ、ブチル−アミン化合物は、特にベンゼン環をもたないことから、合成しやすいという利点を有する。さらに、理論に束縛されるものではないが、ブチル−アミン化合物は、天然に存在する分子（例えば、リシンやグルタミン酸）へと容易に分解し、その結果、毒性の懸念が最小限に抑えられると思われる。
【００８３】
一部の実施形態では、細菌感染によって損傷した細胞または組織を標的とするために、標的化部分を使用することができる。一部の実施形態では、組織中の細菌を標的とするために、標的化部分を使用することができる。一部の実施形態では、例えば、敗血症の場合において、血中の細菌を標的とするために、標的化部分を使用することができる。
【００８４】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、細菌感染によって引き起こされる疾患および障害、例えば、梅毒、結核、サルモネラ、髄膜炎などを処置するのに使用される。一部の実施形態では、細菌感染によって損傷した細胞を標的とする標的化部分を使用する場合がある。一部の実施形態では、身体の特定の組織、臓器、または部位を標的とするために、標的化部分を使用することができる。
【００８５】
一部の実施形態では、標的化部分は、肺組織を標的とする場合がある。例えば、一部の実施形態では、本発明のナノ粒子は、嚢胞性線維症を処置するために、肺組織を標的とするのに使用することができる。
【００８６】
一部の実施形態では、標的化部分は、増殖の遅いまたは休眠状態の細菌を標的とする場合がある。例えば、本発明のナノ粒子は、結核またはバイオフィルム媒介感染症を標的とし、処置するために使用する場合がある。
【００８７】
一部の実施形態では、標的化部分は、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の種、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の種、およびエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の種を始めとするグラム陰性細菌を標的とする場合がある。
【００８８】
例えば、企図される標的化部分は、核酸、ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、または脂質を含み得る。例えば、標的化部分は、細胞型特異的マーカーに結合する核酸標的化部分（例えば、アプタマー、例えば、Ａ１０アプタマー）でよい。一般に、アプタマーは、特定の標的、例えば、ポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその類似体もしくは誘導体）である。一部の実施形態では、標的化部分は、細胞表面受容体のための天然または合成リガンド、例えば、成長因子、ホルモン、ＬＤＬ、トランスフェリンなどでよい。標的化部分は抗体でよく、この用語は抗体フラグメントを含むものとし、抗体の特徴的部分、単鎖標的化部分は、例えば、手順、例えば、ファージディスプレイを使用して同定することができる。
【００８９】
標的化部分は、約５０残基までの長さを有する標的化ペプチドまたは標的化ペプチド模倣物であり得る。例えば、標的化部分は、アミノ酸配列ＡＫＥＲＣ、ＣＲＥＫＡ、ＡＲＹＬＱＫＬＮ、またはＡＸＹＬＺＺＬＮを有してもよく、ＸおよびＺは、可変のアミノ酸、またはその保存的バリアントもしくはペプチド模倣物である。特定の実施形態では、標的化部分は、アミノ酸配列ＡＫＥＲＣ、ＣＲＥＫＡ、ＡＲＹＬＱＫＬＮ、またはＡＸＹＬＺＺＬＮを含むペプチドであり、ＸおよびＺは、可変のアミノ酸であり、２０個未満、５０個未満または１００個未満の残基の長さを有する。ＣＲＥＫＡ（Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ）ペプチドもしくはそのペプチド模倣物またはオクタペプチドＡＸＹＬＺＺＬＮも、標的化部分として企図され、また、コラーゲンＩＶと結合するもしくは複合体を形成する、または組織基底膜（例えば血管の基底膜）を標的とするペプチドまたはその保存的バリアントもしくはペプチド模倣物を標的化部分として使用してもよい。例示的な標的化部分は、ＩＣＡＭ（細胞間接着分子、例えば、ＩＣＡＭ−１）を標的とするペプチドを含む。
【００９０】
本明細書において開示されている標的化部分は、一部の実施形態では、開示されているポリマーまたはコポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ）にコンジュゲートすることができ、このようなポリマーコンジュゲートは、開示されているナノ粒子の一部を形成し得る。  
【００９１】
一部の実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリマー−薬物コンジュゲートを含み得る。例えば、薬物は、開示されているポリマーまたはコポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ）にコンジュゲートしていてもよく、このようなポリマー−薬物コンジュゲートは、開示されているナノ粒子の一部を形成し得る。例えば、開示されている治療用ナノ粒子は、約０．２〜約３０重量パーセントのＰＬＡ−ＰＥＧまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧを場合により含んでいてもよく、ＰＥＧは、薬物（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ−薬物）で官能化されている。
【００９２】
開示されているポリマーコンジュゲートは、任意の適切なコンジュゲーション技術を使用して形成し得る。例えば、２種の化合物、例えば、標的化部分または薬物および生体適合性ポリマー（例えば、生体適合性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール））は、ＥＤＣ−ＮＨＳ化学反応（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド）などの技術、またはチオール、アミン、または同様に官能化されたポリエーテルの１つの末端にコンジュゲートすることができるマレイミドもしくはカルボン酸が関与する反応を使用して一緒にコンジュゲートし得る。ポリマー−標的化部分コンジュゲートまたはポリマー−薬物コンジュゲートを形成させる標的化部分または薬物およびポリマーのコンジュゲーションは、これらに限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトンなどなどの有機溶媒中で行うことができる。特定の反応条件は、単に通例の実験法を使用して当業者が決定することができる。
【００９３】
別の組の実施形態では、コンジュゲーション反応は、カルボン酸官能基（例えば、ポリ（エステル−エーテル）化合物）を含むポリマーと、アミンを含むポリマーまたは他の部分（例えば、標的化部分または薬物）とを反応させることによって行い得る。例えば、標的化部分、例えば、ＰＳＭＡ低分子量リガンド、または薬物、例えば、ダサチニブは、アミンと反応して、アミン含有部分を形成してもよく、これは次いで、ポリマーのカルボン酸にコンジュゲートすることができる。このような反応は、単一ステップの反応として起こり得、すなわち、コンジュゲーションは、中間体、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはマレイミドを使用することなく行われる。一部の実施形態では、薬物は、アミン含有リンカーと反応して、アミン含有薬物を形成してもよく、次いで、これは上記のようなポリマーのカルボン酸にコンジュゲートすることができる。アミン含有部分およびカルボン酸末端ポリマー（例えば、ポリ（エステル−エーテル）化合物）の間のコンジュゲーション反応は、一組の実施形態では、（これらに限定されないが）ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、アセトン、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジオキサン、またはジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に可溶化したアミン含有部分を、カルボン酸末端ポリマーを含有する溶液に加えることによって達成し得る。カルボン酸末端ポリマーは、これらに限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、またはアセトンなどの有機溶媒中に含有し得る。アミン含有部分およびカルボン酸末端ポリマーの間の反応は、場合によって、自発的に起こり得る。コンジュゲートしていない反応物は、このような反応の後に洗い流してもよく、ポリマーは、溶媒、例えば、エチルエーテル、ヘキサン、メタノール、またはエタノール中で沈殿し得る。ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、ポリマーのアルコール含有部分およびカルボン酸官能基の間に形成してもよく、これはアミンおよびカルボン酸のコンジュゲートについて上で記載したのと同様に達成することができる。
【００９４】
詳細な一例として、低分子量ＰＳＭＡリガンドは、次のとおりに、粒子における標的化部分として調製することができる。カルボン酸で修飾されたポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ）を、アミンで修飾されたヘテロ二官能性ポリ（エチレングリコール）（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）にコンジュゲートさせて、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコポリマーを生成することができる。アミンで修飾された低分子量ＰＳＭＡリガンド（ＮＨ２−Ｌｉｇ）の使用によって、ＰＥＧのカルボン酸末端を、リガンド上のアミン官能基にコンジュゲートさせることにより、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｌｉｇのトリブロックポリマーを生成することができる。次いで、マルチブロックポリマーを、例えば、以下で論述するとおりに、例えば治療用途向けに使用することができる。
【００９５】
ナノ粒子
ここで図１について、企図されるナノ粒子を非限定的な例として示す。この図では、本開示のポリマーコンジュゲートを使用して、ナノ粒子１０が生成されている。ナノ粒子１０を形成するポリマーは、粒子の表面に存在する低分子量リガンド１５と、生体適合性部分１７とを含む。場合によって、ここに示すとおり、標的化部分１５は、生体適合性部分１７にコンジュゲートされていてもよい。しかし、生体適合性部分１７のすべてが標的化部分１５にコンジュゲートされているとは示されていない。例えば、場合によって、ナノ粒子１０などのナノ粒子は、生体適合性部分１７および低分子量リガンド１５を含む第１のポリマーと、生体適合性部分１７を含むが標的化部分１５は含まない第２のポリマーとを使用して生成することができる。第１ポリマーの第２ポリマーに対する比を制御することにより、異なる特性を有するナノ粒子を生成することができ、場合によって、そのようなナノ粒子のライブラリーを生成することもできる。加えて、ナノ粒子１０は、ポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤１２を含有する。場合によって、治療剤１２は、ナノ粒子の表面と会合していても、ナノ粒子内にカプセル化されていても、ナノ粒子に取り囲まれていても、またはナノ粒子全体に分散していてもよい。別の実施形態では、治療剤は、ナノ粒子の疎水性コア内にカプセル化されている。
【００９６】
開示されるナノ粒子は、例えば、糖を含有する場合もある溶液中において、室温で、または２５℃で、少なくとも約３日、約４日、または少なくとも約５日間安定し得る（例えば、実質的にすべての活性薬剤を保持し得る）。
【００９７】
一部の実施形態では、開示されるナノ粒子は、脂肪アルコールも含む場合があり、これによって、薬物放出の速度は増大し得る。例えば、開示されるナノ粒子は、セチルアルコール、オクタノール、ステアリルアルコール、アラキジルアルコール、ドコソナール（ｄｏｃｏｓｏｎａｌ）、オクタソナール（ｏｃｔａｓｏｎａｌ）などのＣ８〜Ｃ３０アルコールを含む場合がある。
【００９８】
ナノ粒子は、制御放出特性を備える場合もあり、例えば、一定量のポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤を、長期間かけて、例えば、１日、１週間、またはより長時間かけて、患者、例えば患者の特定の部位に送達し得る場合がある。
【００９９】
一部の実施形態では、開示されるナノ粒子または開示されるナノ粒子を含む組成物が対象または患者に投与された後、患者におけるポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤のピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）は、（例えば、ナノ粒子の一部としてではなく）単独で投与した場合の治療剤のＣｍａｘに比べて、実質的によち高い。
【０１００】
別の実施形態では、治療剤を含む開示ナノ粒子は、対象に投与されたとき、治療剤のｔｍａｘが、単独で投与された治療剤のｔｍａｘに比べて、実質的により長い場合がある。
【０１０１】
このような粒子のライブラリーも作り上げることができる。例えば、粒子内の２種（またはより多種）のポリマーの比率を様々にすることにより、そうしたライブラリーは、スクリーニング試験、高処理アッセイなどに有用となり得る。ライブラリー内の実体は、上述のものなどの特性により様々にすることができ、場合によって、粒子の２つ以上の特性を、ライブラリー内で様々にすることもできる。したがって、一実施形態は、違った特性を備えるポリマーを異なる比率で有するナノ粒子のライブラリーを対象とする。ライブラリーは、ポリマーをいずれかの適切な比率で含んでよい。
【０１０２】
一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、疎水性ポリマーである。生体適合性ポリマーの非限定的な例としては、ポリラクチド、ポリグリコリド、および／またはポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が挙げられる。
【０１０３】
異なる実施形態では、本開示は、１）ポリマーマトリックスと、２）任意選択で、ポリマーマトリックスを取り囲むまたはポリマーマトリックス内に分散して、粒子の連続または不連続のシェルを形成する両親媒性化合物または層と、３）ポリマーマトリックスの一部をなし得る非官能化ポリマーと、４）任意選択で、ポリマーマトリックスの一部をなし得るポリマーに共有結合している、ＰＳＭＡなどの標的タンパク質コンジュゲートを結合する低分子量リガンドとを含むナノ粒子を提供する。例えば、両親媒性層は、ナノ粒子への透水を低減し、それによって、薬物カプセル化効率を向上させ、薬物放出を緩徐化し得る。
【０１０４】
本明細書で使用するとき、用語「両親媒性」とは、分子が、極性の部分と非極性の部分の両方を有する性質を指す。多くの場合、両親媒性化合物は、極性の頭部が、長い疎水性の尾部に結合している。一部の実施形態では、極性部分は、水に可溶性であり、非極性部分は、水に不溶性である。加えて、極性部分は、正の形式電荷または負の形式電荷のいずれかを有する場合がある。別法として、極性部分は、正と負両方の形式電荷を有し、双性イオンまたは分子内塩になる場合もある。一部の実施形態では、両親媒性化合物は、限定はしないが、親水性と疎水性両方の部分を有する天然由来の脂質、界面活性剤、または合成された化合物の１種または複数でよい。
【０１０５】
両親媒性化合物の詳細な例としては、限定はしないが、０．０１〜６０の間（脂質重量／ポリマーｗ）、最も好ましくは、０．１〜３０の間（脂質重量／ポリマーｗ）の比で混ぜられた、１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルファチジルコリン（ＤＬＰＣ）などのリン脂質が挙げられる。使用することができるリン脂質には、限定はしないが、ホスファチジン酸、飽和および不飽和両方の脂質を有するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジル誘導体、カルジオリピン、およびβ−アシル−ｙ−アルキルリン脂質が含まれる。リン脂質の例としては、限定はしないが、ホスファチジルコリン、例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルファチジルコリン（ＤＬＰＣ）；およびホスファチジルエタノールアミン、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンや１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンが挙げられる。非対称のアシル鎖を有する（例えば、一方のアシル鎖が６炭素であり、もう一方のアシル鎖が１２炭素である）合成リン脂質を使用してもよい。
【０１０６】
特定の実施形態では、両親媒性層の生成に使用することができる両親媒性成分は、レシチン、詳細には、ホスファチジルコリンである。レシチンは、両親媒性の脂質であり、そのため、大抵は水性であるその周囲に面している親水性（極性）の頭部と、互いに面している疎水性の尾部とを有するリン脂質二重層を形成する。レシチンは、例えば大豆から入手可能である天然の脂質であるという利点を有し、他の送達デバイスにおける使用についてすでにＦＤＡ承認を取得している。加えて、レシチンなどの脂質の混合物は、１種の単一純粋脂質より有利である。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、開示されるナノ粒子は、層がリン脂質二重層ではないが、ナノ粒子の周りまたはナノ粒子内に単一の連続または不連続層として存在するという意味で、両親媒性の単層を有する。この両親媒性層は、ポリマーシェルの外側を取り囲む、またはナノ粒子を構成するポリマー内に分散しているなどして、ポリマーマトリックスにある程度近傍に位置するという意味で、ナノ粒子と「会合」している。
【０１０８】
治療剤
ポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤には、いずれかの抗生物質、例えばポリミキシン／コリスチンファミリーの抗生物質を含めることができる。ポリミキシンは、カチオン性ポリペプチド抗生物質の一群であり、化学的に異なる５種の化合物（ポリミキシンＡ〜Ｅ）からなる。コリスチンは、Ｎ末端において脂肪酸でアシル化されたトリペプチド側鎖を有する環状ヘプタペプチドからなるカチオン性の多成分リポペプチドである。コリスチンの二大成分は、コリスチンＡ（ポリミキシンＥ１）およびコリスチンＢ（ポリミキシンＥ２）である。コリスチンおよびポリミキシンＢのカチオン性ポリペプチドは、グラム陰性細菌の外膜にあるアニオン性リポ多糖（ＬＰＳ）分子と相互に作用することで、ＬＰＳ膜を安定化させるカルシウム（Ｃａ２＋）およびマグネシウム（Ｍｇ２＋）を置換させ、したがって、細胞膜の撹乱を引き起こす。この結果、細胞膜の透過性、細胞内容物の漏出、および最終的には細胞死が増進される。コリスチンは、強力な抗内毒素活性も有する。グラム陰性生物の内毒素は、ＬＰＳ分子のリピドＡ部分であり、コリスチンは、このＬＰＳ分子を結合し、中和する。ポリミキシン／コリスチンファミリーの抗生物質の別の形態、例えば、薬学的に許容できるその塩形態、遊離塩基形態、硫酸塩、水和物、異性体、およびプロドラッグを使用してもよい。例えば、コリスチン硫酸塩およびＣＭＳ（コリスチメタン酸ナトリウム、コリスチンメタン硫酸塩、コリスチメタン硫酸五ナトリウム、およびコリスチンスルホニルメタン酸塩）のいずれかの形態のコリスチンを使用することができる。ＣＭＳは、コリスチンの不活性プロドラッグであり、コリスチン硫酸塩より強力でなく、毒性でもない。ポリミキシンＢとコリスチンは、そのアミノ酸成分だけが異なる。ポリミキシンＢおよびコリスチンは、知られている抗菌剤である。コリスチンとポリミキシンＢはどちらも、ＭＤＲグラム陰性細菌に対して、強力で濃度依存的な致死力を有する。コリスチンは、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の種（ＭＩＣ９０≦２ｍｇ／Ｌ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＭＩＣ９０≦４ｍｇ／Ｌ）、Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＭＩＣ９０≦１ｍｇ／Ｌ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＭＩＣ９０≦２ｍｇ／Ｌ）、およびエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の種（ＭＩＣ５０≦１ｍｇ／Ｌ）を始めとする、ほとんどのグラム陰性好気性桿菌に対して殺菌活性を有する。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種（ＭＩＣ９０≦１ｍｇ／Ｌ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の種（ＭＩＣ９０≦０．５ｍｇ／Ｌ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）の種（ＭＩＣ９０≦１ｍｇ／Ｌ）、偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、およびいくつかのマイコバクテリアの種に対しても活性となり得る。プロビデンチア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｔｉａ）の種、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の種、およびブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）の種は、コリスチンに対して耐性となる場合がある。
【０１０９】
ポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤は、細菌膜の構造を破壊し、またはその機能を阻害し得る。形質膜および外膜の完全性は、細菌にとって不可欠であり、膜を破壊する化合物は、細胞を速やかに死に至らしめる。
【０１１０】
一組の実施形態では、ペイロードは、薬物もしくは抗生物質、または１種を越える薬物もしくは抗生物質の組合せである。そのような粒子は、例えば、薬物を含有する粒子を対象内の特定の限局された場所に向かわせるのに標的化部分を使用して、例えば、薬物の局所的な送達がなされるのを可能にし得る実施形態において有用となり得る。
【０１１１】
医薬製剤
【０１１２】
本明細書で開示するナノ粒子は、別の態様によれば、薬学的に許容できる担体と組み合わせて、医薬組成物としてもよい。当業者が理解するように、担体は、下記のような投与経路、標的組織の場所、送達される薬物、薬物の送達の時間経過などに基づいて選択し得る。
【０１１３】
医薬組成物は、経口および非経口経路を含めた当技術分野において公知の任意の手段によって患者に投与することができる。用語「患者」は、本明細書において使用する場合、ヒト、ならびに例えば、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、および魚を含めた非ヒトを指す。例えば、非ヒトは、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、霊長類、またはブタ）であり得る。ある特定の実施形態では、非経口経路が、消化管において見出される消化酵素との接触を回避するために望ましい。このような実施形態によると、本発明の組成物は、注射（例えば、静脈内、皮下または筋内、腹腔内注射）、直腸、経膣的、局所的（散剤、クリーム剤、軟膏剤、もしくは点眼剤によるなど）によって、または吸入（スプレーによるなど）によって投与し得る。
【０１１４】
特定の実施形態では、ナノ粒子は、それを必要とする対象に全身的に、例えば、ＩＶ注入または注射によって投与される。
【０１１５】
注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液は、適切な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して公知技術によって製剤化し得る。無菌の注射可能な調製物はまた、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルジョン、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液でよい。用いることができる許容できるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張食塩液がある。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として従来用いられる。この目的のために、合成のモノまたはジグリセリドを含めた任意の刺激の少ない不揮発性油を用いることができる。さらに、脂肪酸、例えば、オレイン酸は、注射剤の調製において使用される。一実施形態では、本発明のコンジュゲートを、１％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（商標）８０を含む担体液に懸濁させる。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、または使用前に滅菌水もしくは他の無菌の注射可能な媒体に溶解もしくは分散させることができる無菌の固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、無菌化することができる。
【０１１６】
経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤を含む。このような固体剤形において、カプセル化されたか、またはカプセル化されていないコンジュゲートを、少なくとも１種の不活性な薬学的に許容できる添加剤または担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウム、ならびに／または（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシア、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリケート、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール、（ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ、ならびに（ｉ）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物と混合する。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含む。
【０１１７】
抗生物質治療剤を含有するナノ粒子の正確な投与量は、処置される患者を考慮して個々の医師によって選択され、一般に、投与量および投与は、有効量の抗生物質治療剤ナノ粒子を処置される患者に提供するように調節されることを認識されたい。本明細書において使用する場合、抗生物質治療剤を含有するナノ粒子の「有効量」は、所望の生物学的応答を引き出すのに必要な量を指す。当業者が理解するように、ポリミキシン／コリスチン抗生物質治療剤を含有するナノ粒子の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬物、標的組織、投与経路などの要因によって変わり得る。例えば、抗生物質治療剤を含有するナノ粒子の有効量は、所望の期間にわたり所望の量の腫瘍サイズの低減をもたらす量であり得る。考慮し得るさらなる要因は、病態の重症度；処置される患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時間および頻度；薬物の組合せ；反応感受性；ならびに治療に対する耐性／応答を含む。
【０１１８】
ナノ粒子は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与量単位形態で製剤化し得る。「投与量単位形態」という表現は、本明細書において使用する場合、処置される患者に適当なナノ粒子の物理的個別単位を指す。しかし、組成物の一日の総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決められることが理解される。任意のナノ粒子について、治療有効用量は、細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常、マウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいて最初に推定することができる。動物モデルをまた使用して、望ましい濃度範囲および投与経路を達成する。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量および経路を決定することができる。ナノ粒子の治療有効性および毒性、例えば、ＥＤ５０（用量は集団の５０％において治療的に有効である）およびＬＤ５０（用量は集団の５０％まで致死的である）は、細胞培養物または実験動物において標準的な医薬手順によって決定することができる。毒性効果の治療効果に対する用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物は、一部の実施形態では有用であり得る。細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒト使用のための投与量範囲の配合において使用することができる。
【０１１９】
ある実施形態では、本明細書において開示されている組成物は、約１０ｐｐｍ未満のパラジウム、または約８ｐｐｍ未満、または約６ｐｐｍ未満のパラジウムを含み得る。例えば、ポリマーコンジュゲートを有するナノ粒子を含む組成物が本明細書において提供され、組成物は、約１０ｐｐｍ未満のパラジウムを有する。
【０１２０】
一部の実施形態では、本明細書において開示されているナノ粒子を含む冷凍に適した組成物が企図され、冷凍に適した溶液、例えば、糖、例えば、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、例えば、スクロースおよび／もしくはトレハロース、ならびに／または塩および／もしくはシクロデキストリン溶液を、ナノ粒子懸濁液に加える。糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）は、例えば、粒子が冷凍によって凝集することを防止する凍結防止剤として作用し得る。例えば、複数の開示されているナノ粒子、スクロース、イオン性ハロゲン化物、および水を含むナノ粒子製剤であり、ナノ粒子／スクロース／水／イオン性ハロゲン化物は、約３〜４０％／１０〜４０％／２０〜９５％／０．１〜１０％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）または約５〜１０％／１０〜１５％／８０〜９０％／１〜１０％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）が本明細書において提供される。例えば、このような溶液は、本明細書に開示されているナノ粒子、約５重量％〜約２０重量％のスクロースおよび約１０〜１００ｍＭの濃度のイオン性ハロゲン化物、例えば、塩化ナトリウムを含み得る。別の例では、複数の開示されているナノ粒子、トレハロース、シクロデキストリン、および水を含むナノ粒子製剤が本明細書において提供され、ナノ粒子／トレハロース／水／シクロデキストリンは、約３〜４０％／１〜２５％／２０〜９５％／１〜２５％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）または約５〜１０％／１〜２５％／８０〜９０％／１０〜１５％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）である。
【０１２１】
例えば、企図される溶液は、本明細書に開示されているナノ粒子、約１重量％〜約２５重量％の二糖類、例えば、トレハロースもしくはスクロース（例えば、約５重量％〜約２５重量％のトレハロースもしくはスクロース、例えば、約１０重量％のトレハロースもしくはスクロース、または約１５重量％のトレハロースもしくはスクロース、例えば、約５重量％のスクロース）、および約１重量％〜約２５重量％の濃度のシクロデキストリン、例えば、β−シクロデキストリン（例えば、約５重量％〜約２０重量％、例えば、１０重量％もしくは約２０重量％、または約１５重量％〜約２０重量％のシクロデキストリン）を含み得る。企図される製剤は、複数の開示されているナノ粒子（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧおよび活性剤を有するナノ粒子）、および約２重量％〜約１５重量％（または約４重量％〜約６重量％、例えば、約５重量％）のスクロースおよび約５重量％〜約２０重量％（例えば、約７重量パーセント〜約１２重量％、例えば、約１０重量％）のシクロデキストリン、例えば、ＨＰｂＣＤを含み得る。
【０１２２】
本開示は、復元されたとき、最小量の大きな凝集体を有する凍結乾燥した医薬組成物に部分的に関する。このような大きな凝集体は、約０．５μｍ超、約１μｍ超、または約１０μｍ超のサイズを有してもよく、復元された溶液中で望ましくないことがあり得る。凝集体サイズは、参照により本明細書に組み込まれている米国薬局方の３２＜７８８＞において示されるものを含めた種々の技術を使用して測定することができる。ＵＳＰ３２＜７８８＞において概略が述べられている試験は、光遮蔽粒子計数試験、顕微鏡粒子計数試験、レーザー回折、および単一粒子光学検知を含む。一実施形態では、所与の試料中の粒径は、レーザー回折および／または単一粒子光学検知を使用して測定される。
【０１２３】
光遮蔽粒子計数試験によるＵＳＰ３２＜７８８＞は、懸濁液中の粒径のサンプリングのためのガイドラインを規定する。１００ｍＬと等しい、またはこれ未満を有する溶液について、存在する粒子の平均数が、容器毎に≧１０μｍである６０００個および容器毎に≧２５μｍである６００個を超えない場合、調製は試験に準拠する。
【０１２４】
ＵＳＰ３２＜７８８＞において概略が述べられているように、顕微鏡粒子計数試験は、接眼マイクロメーターを有する１００±１０×の拡大率に調節した双眼顕微鏡を使用して粒子量を決定するためのガイドラインを規定する。接眼マイクロメーターは、１００×の拡大率で見たとき、１０μｍおよび２５μｍを表す黒の基準円を有する象限に分割された円からなる円形直径グラティキュールである。直線状スケールは、グラティキュールの下に提供される。１０μｍおよび２５μｍに関する粒子の数を視覚的に符合させる。１００ｍＬと等しい、またはこれ未満を有する溶液について、存在する粒子の平均数が、容器毎に≧１０μｍである３０００個、および容器毎に≧２５μｍである３００個を超えない場合、調製は試験に準拠する。
【０１２５】
一部の実施形態では、開示されている組成物の復元による１０ｍＬの水性試料は、１ｍｌ毎に６００個未満の１０ミクロンと等しい、もしくはこれ超のサイズを有する粒子；および／または１ｍｌ毎に６０個未満の２５ミクロンと等しい、もしくはこれ超のサイズを有する粒子を含む。
【０１２６】
動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、粒径を測定し得るが、これはブラウン運動に依存し、そのためこの技術は、いくつかのより大きな粒子を検出し得ない。レーザー回折は、粒子および懸濁培地の間の屈折率における差異に依存する。この技術は、サブミクロンからミリメートル範囲にて粒子を検出することができる。相対的に少量（例えば、約１〜５重量％）のより大きな粒子を、ナノ粒子懸濁液中で決定することができる。単一粒子光学検知（ＳＰＯＳ）は、約０．５μｍの個々の粒子を計数する希薄な懸濁液の光遮蔽を使用する。測定した試料の粒子濃度を知ることによって、凝集体の重量パーセントまたは凝集体濃度（粒子／ｍＬ）を計算することができる。
【０１２７】
凝集体の形成は、粒子の表面の脱水によって凍結乾燥の間に起こり得る。この脱水は、凍結乾燥の前に懸濁液中で凍結保護剤、例えば、二糖類を使用することによって回避することができる。適切な二糖類は、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、またはセロビオース、および／またはこれらの混合物を含む。他の企図される二糖類は、コウジビオース、ニゲロース、イソマルトース、β，β−トレハロース、α，β−トレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノーゼ、ゲンチオビオース、マンノビオース、メリビオース、メリビウオース（ｍｅｌｉｂｉｕｌｏｓｅ）、ルチノース、ルチヌノース（ｒｕｔｉｎｕｌｏｓｅ）、およびキシロビオースを含む。復元は、開始懸濁液と比較したときの等しいＤＬＳサイズ分布を示す。しかし、レーザー回折は、いくらかの復元された溶液中でサイズが＞１０μｍの粒子を検出することができる。さらに、ＳＰＯＳはまた、ＦＤＡガイドラインの濃度超の濃度（＞１０μｍの粒子について１０４〜１０５個の粒子／ｍＬ）で＞１０μｍサイズの粒子を検出し得る。
【０１２８】
一部の実施形態では、１種または複数のイオン性ハロゲン化塩は、糖、例えば、スクロース、トレハロースまたはこれらの混合物に対するさらなる凍結保護剤として使用し得る。糖は、二糖類、単糖類、三糖類、および／または多糖類を含んでいてもよく、かつ他の添加剤、例えば、グリセロールおよび／または界面活性剤を含んでいてもよい。場合により、シクロデキストリンを、さらなる凍結保護剤として含んでいてもよい。シクロデキストリンは、イオン性ハロゲン化塩の代わりに加え得る。代わりに、シクロデキストリンを、イオン性ハロゲン化塩に加え得る。
【０１２９】
適切なイオン性ハロゲン化塩は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、またはこれらの混合物を含み得る。さらなる適切なイオン性ハロゲン化塩は、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カルシウム、臭化亜鉛、臭化カリウム、臭化マグネシウム、臭化アンモニウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カルシウム、ヨウ化亜鉛、ヨウ化カリウム、ヨウ化マグネシウム、またはヨウ化アンモニウム、および／またはこれらの混合物を含む。一実施形態では、約１〜約１５重量パーセントのスクロースを、イオン性ハロゲン化塩と共に使用し得る。一実施形態では、凍結乾燥した医薬組成物は、約１０〜約１００ｍＭの塩化ナトリウムを含み得る。別の実施形態では、凍結乾燥した医薬組成物は、約１００〜約５００ｍＭの二価のイオン性塩化物塩、例えば、塩化カルシウムまたは塩化亜鉛を含み得る。さらに別の実施形態では、凍結乾燥される懸濁液は、シクロデキストリンをさらに含み得、例えば、約１〜約２５重量パーセントのシクロデキストリンを使用し得る。
【０１３０】
適切なシクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、またはこれらの混合物を含み得る。本明細書において開示されている組成物における使用のために企図される例示的なシクロデキストリンには、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチルエチル−β−シクロデキストリン、ジエチル−β−シクロデキストリン、トリ−Ｏ−アルキル−β−シクロデキストリン、グルコシル−β−シクロデキストリン、およびマルトシル−β−シクロデキストリンが含まれる。一実施形態では、約１〜約２５重量パーセントのトレハロース（例えば、約１０重量％〜約１５重量％、例えば、５〜約２０重量％）を、シクロデキストリンと共に使用し得る。一実施形態では、凍結乾燥した医薬組成物は、約１〜約２５重量パーセントのβ−シクロデキストリンを含み得る。例示的な組成物は、ＰＬＡ−ＰＥＧ、活性／治療剤、約４％〜約６％（例えば、約５重量パーセント）のスクロース、および約８〜約１２重量パーセント（例えば、約１０重量％）のＨＰｂＣＤを含むナノ粒子を含み得る。
【０１３１】
一態様では、開示されているナノ粒子を含む凍結乾燥した医薬組成物を提供し、１００ｍＬ未満または約１００ｍＬの水性媒体中で約５０ｍｇ／ｍＬのナノ粒子濃度での凍結乾燥した医薬組成物の復元によって、非経口投与に適した復元された組成物は、６０００個未満、例えば、３０００個未満の１０ミクロンと等しい、もしくはこれ超の微粒子；および／または６００個未満、例えば、３００個未満の２５ミクロンと等しい、もしくはこれ超の微粒子を含む。
【０１３２】
微粒子の数は、例えば、光遮蔽粒子計数試験によるＵＳＰ３２＜７８８＞、顕微鏡粒子計数試験によるＵＳＰ３２＜７８８＞、レーザー回折、および単一粒子光学検知などの手段によって決定することができる。
【０１３３】
ある態様では、それぞれが疎水性ポリマーセグメントおよび親水性ポリマーセグメント；活性剤；糖；ならびにシクロデキストリンを有するコポリマーを含む複数種の治療用粒子を含む、復元による非経口使用に適した医薬組成物を提供する。
【０１３４】
例えば、コポリマーは、ポリ（乳）酸−ブロック−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーであり得る。復元によって、１００ｍＬの水性試料は、６０００個未満の１０ミクロンと等しい、もしくはこれ超のサイズを有する粒子；および６００個未満の２５ミクロンと等しい、もしくはこれ超のサイズを有する粒子を含み得る。
【０１３５】
二糖類およびイオン性ハロゲン化塩を加えるステップは、約５〜約１５重量パーセントのスクロースまたは約５〜約２０重量パーセントのトレハロース（例えば、約１０〜約２０重量パーセントのトレハロース）、および約１０〜約５００ｍＭのイオン性ハロゲン化塩を加えることを含み得る。イオン性ハロゲン化塩は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、および塩化亜鉛、またはこれらの混合物から選択し得る。ある実施形態では、約１〜約２５重量パーセントのシクロデキストリンをまた加える。
【０１３６】
別の実施形態では、二糖類およびシクロデキストリンを加えるステップは、約５〜約１５重量パーセントのスクロースまたは約５〜約２０重量パーセントのトレハロース（例えば、約１０〜約２０重量パーセントのトレハロース）、および約１〜約２５重量パーセントのシクロデキストリンを加えることを含み得る。ある実施形態では、約１０〜約１５重量パーセントのシクロデキストリンを加える。シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、またはこれらの混合物から選択し得る。
【０１３７】
別の態様では、糖および塩を凍結乾燥した製剤に加え、復元によるナノ粒子の凝集を防止することを含む、医薬ナノ粒子組成物中で粒子の実質的な凝集を防止する方法を提供する。ある実施形態では、シクロデキストリンをまた、凍結乾燥した製剤に加える。さらに別の態様では、糖およびシクロデキストリンを凍結乾燥した製剤に加えて、復元によるナノ粒子の凝集を防止することを含む、医薬ナノ粒子組成物中の粒子の実質的な凝集を防止する方法を提供する。
【０１３８】
企図される凍結乾燥した組成物は、約４０ｍｇ／ｍＬ超の治療用粒子濃度を有し得る。非経口投与に適した製剤は、１０ｍＬの用量中に１０ミクロン超のサイズを有する約６００個未満の粒子を有し得る。凍結乾燥は、組成物を約−４０℃超、または例えば、約−３０℃未満の温度で冷凍し、冷凍した組成物を形成させ、冷凍した組成物を乾燥させ、凍結乾燥した組成物を形成することを含み得る。乾燥のステップは、約５０ｍＴｏｒｒで約−２５〜約−３４℃、または約−３０〜約−３４℃の温度にて起こり得る。
【０１３９】
処置方法
一部の実施形態では、標的化ナノ粒子は、疾患、障害、および／または状態を処置し、緩和し、回復させ、軽減し、その発生を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し、かつ／またはその１つもしくは複数の症状もしくは特色の発生率を低減するのに使用することができる。一部の実施形態では、標的化ナノ粒子は、感染症、例えば、グラム陰性細菌によって引き起こされる感染症の処置に使用することができる。グラム陰性細菌は、医療の場において、肺炎、血流感染症、創傷部位感染症または手術部位感染症、および髄膜炎を始めとする感染症を引き起こす。グラム陰性細菌は、いくつもの薬物に耐性を有し、利用可能なほとんどの抗生物質に対してますます耐性になっている。ある特定の実施形態では、標的化ナノ粒子は、一細菌、または少なくとも１種類の細菌が関与するいずれかの感染症の処置に使用することができる。
【０１４０】
本明細書で使用するとき、用語「感染症」は、細菌感染症、微生物感染症、または真菌感染症を包含し得る。一部の実施形態では、感染症は、疾患原因物質による生物の体組織への侵襲、それらの増殖、ならびにこうした生物およびそれが産生する毒素に対する宿主組織の反応である。感染症は、生物が、身体に侵入し、成長し、増殖することにより首尾よく定着したときに始まる。いくつかの生物は、最初の侵入部位で成長する場合もあるが、多くは、移動し、種々の臓器において全身性感染を引き起こす。宿主細胞内（細胞内）で成長する病原体もあれば、体液中で自由に成長するものもある。微生物は、様々な毒素または破壊的な酵素を放出することにより、組織損傷を引き起こし得る。例えば、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）は、筋肉を麻痺させる毒素を放出し、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）は、ショックおよび敗血症を生じさせる毒素を放出する。
【０１４１】
感染症は、感染性疾患を包含し得る。例えば、感染性疾患は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）細菌、ＭＲＳＡ、ライム病、梅毒、ハンセン病、結核、破傷風、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ボツリヌス中毒、腺ペスト、コレラ、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、髄膜炎、淋疾、腸チフス、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、およびジフテリアである、またはこれらによって引き起こされる場合がある。
【０１４２】
一部の実施形態では、ナノ粒子が、関連疾患および障害を処置するために、抗菌剤として使用される。抗菌剤として、微生物は、殺され、またはその成長が阻害される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、感染症を処置するための抗菌医薬（抗菌化学療法）として使用される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、感染症を予防するための抗菌医薬（抗菌予防法）として使用される。例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）と関連する疾患および障害（例えば、炎症および敗血症）を処置するのに、本発明のナノ粒子を使用することができる。
【０１４３】
一部の実施形態では、ナノ粒子が、抗真菌剤として使用される。抗真菌剤として、ナノ粒子は、真菌を死滅させ、またはそのさらなる成長を妨げる。例えば、この種のナノ粒子は、足白癬、白癬、鵞口瘡などの感染症の処置に使用することができる。この種のナノ粒子は、宿主に危険な影響を及ぼすことなく真菌生物を根絶する。例えば、ナノ粒子を使用して、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の成長を阻害することができる。
【０１４４】
一態様では、感染症（例えば、結核、嚢胞性線維症）を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、感染症の処置は、それを必要とする対象に、所望の結果を得るのに必要となるような量で、そのような時間をかけて、発明の標的化粒子を治療有効量投与することを含む。ある特定の実施形態では、発明の標的化粒子の「治療有効量」とは、がんを処置し、緩和し、回復させ、軽減し、その発生を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し、かつ／またはその１つもしくは複数の症状もしくは特色の発生率を低減するのに有効な量である。
【０１４５】
一態様では、感染症（例えば、結核、嚢胞性線維症）に罹患している対象に発明組成物を投与する方法が提供される。一部の実施形態では、所望の結果（すなわち、感染症の処置）を実現するのに必要となるような量で、そのような時間をかけて、対象に粒子を投与することができる。ある特定の実施形態では、発明の標的化粒子の「治療有効量」とは、感染症を処置し、緩和し、回復させ、軽減し、その発生を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し、かつ／またはその１つもしくは複数の症状もしくは特色の発生率を低減するのに有効な量である。
【０１４６】
本明細書では、活性剤を含む、本明細書で開示するナノ粒子を患者に投与する方法であって、患者への投与の際、このようなナノ粒子が、薬剤単独の投与（すなわち、開示されるナノ粒子としてでない）に比べて、分布体積を実質的に縮小し、かつ／または遊離Ｃｍａｘを実質的に低減する方法も提供される。
【０１４７】
「Ｄｒｕｇ  Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓａｍｅ」と題された２０１２年６月２６日発行の米国特許第８，２０６，７４７号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０１４８】
本発明について、ここまでは大まかに述べており、以下の実施例を参照することで、これについてより容易に理解されるところとなるが、実施例は、ある特定の態様および実施形態を説明する目的で含めているにすぎず、本発明を一切限定するものでない。
【０１４９】
（実施例１）
コリスチン含有ナノ粒子の調製
図２および３に概略を述べる一般プロセスを使用して、ナノ粒子を調製した。３つの一般戦略をナノ粒子（ＮＰ）の調製に適用した。第１の戦略では、対イオンとしての疎水性酸を、ＰＬＡ−ＰＥＧポリマーと共に油相に溶解させた。コリスチン硫酸塩（ＣＳ）を、水溶液としての水相に加えた。さらに、水相に、計算された量のＮａＯＨを加え、コリスチンアミンを完全に中和した。油相を水相と混合し、微細エマルジョンが得られるように処理した。エマルジョンをｐＨ６〜８の緩衝溶液または純水中でクエンチした。第２の戦略では、対イオンとしての疎水性酸を、ＰＬＡ−ＰＥＧポリマーと共に油相に溶解させた。コリスチン硫酸塩を、水溶液としての水相に加えた。油相を水相と混合し、微細エマルジョンが得られるように処理した。エマルジョンをｐＨ６〜８の緩衝溶液中でクエンチした。第３の戦略では、ＰＬＡ−ＰＥＧを油相に溶解させ、微細エマルジョンが得られるように処理した。微細エマルジョンに、水に溶解させた計算された量の疎水性酸のナトリウム塩を加えた後、水に溶解させたコリスチン硫酸塩を加えた。得られる混合物を純水またはｐＨ６〜８の緩衝溶液中でクエンチした。さらなる例によって、ナノ粒子の調製手順をより詳細に示す。
【０１５０】
すべての戦略によって、コリスチンのナノ粒子へのカプセル化が実現された。第１と第３の戦略では、同様の添加量およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出（ＩＶＲ）プロファイルを有するナノ粒子が得られた（すなわち、対イオンとしてのデカン酸について、添加量は１０％前後であり、２４時間時点のＩＶＲは１５〜２０％前後であった）。第２の戦略では、添加量は、より少なくなり、放出プロファイルは、有意により緩徐になった（すなわち、対イオンとしてのデカン酸について、添加量は５％前後であり、２４時間時点のＩＶＲは５％前後であった）。このような結果は、コリスチンが水相においてイオン対を形成し、この形で微細エマルジョンに移ったはずであるという事実によって説明できるであろう。第２の戦略において、緩衝溶液中でクエンチする際に対イオンの中和が不完全である結果、コリスチンのカプセル化は不十分となり、最終ＮＰ中の疎水性酸の量はより多くなり、そのため、より緩徐な放出が促進される。対イオンのコリスチンに対する比は、５／１〜１０／１の間の範囲が最適である。これらより高い値および低い値では、薬物の不十分なカプセル化が認められ、放出速度に対する実際的な影響は得られなかった。
【０１５１】
大半の製剤の調製について、戦略１をベースラインとして使用した。
【０１５２】
（実施例２）
コリスチン含有ナノ粒子の調製−対イオンスクリーニング
５／１のＣＳ／ＣＩ比でのナノ粒子の生成についてスクリーニングした種々の対イオン（ＣＩ）には、脂肪族酸（Ｃ５〜Ｃ１８）、芳香族酸（キシナホ（ｘｉｎａｐｈｏｉｃ）、パモ、ナフトエ）、およびコール酸（コール酸およびデオキシコール酸）を含めた。
【０１５３】
詳細な製剤は、次のとおりである。デカン酸製剤Ｓについて、油相は、１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１０ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．２ｇのコリスチン硫酸塩を０．５ｍｌの脱イオン水に溶解させることにより、コリスチン硫酸塩溶液を調製した。０．４５ｍｌの脱イオン水に０．１２３ｇのデカン酸（ＤＡ）および０．０５ｍｌのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えることにより、デカン酸溶液を調製した。水相は、４％のＢＡおよび０．４％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を脱イオン水に溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理に向けて、５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。激しく混合しながら、微細エマルジョンにデカン酸溶液を加えた後、コリスチン硫酸塩溶液を加えた。最終エマルジョンを氷上で１分間インキュベートし、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびデカン酸を、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって除去した。得られる粒子は、サイズが１００〜１１０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのコリスチン（１０％）を含有していたことがわかった。
【０１５４】
デオキシコール酸製剤について、油相は、１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１０ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．２ｇのコリスチン硫酸塩を０．５ｍｌの脱イオン水に溶解させることにより、コリスチン硫酸塩溶液を調製した。０．４５ｍｌの脱イオン水に０．３０３ｇのデオキシコール酸（ＤＡ）および０．０５ｍｌのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えることにより、デオキシコール酸溶液を調製した。水相は、４％のＢＡおよび０．４％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を脱イオン水に溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理に向けて、５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。激しく混合しながら、微細エマルジョンにデオキシコール酸溶液を加えた後、コリスチン硫酸塩溶液を加えた。最終エマルジョンを氷上で１分間インキュベートし、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびデオキシコール酸を、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって除去した。得られる粒子は、サイズが１００〜１１０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのコリスチン（１０％）を含有していたことがわかった。
【０１５５】
パモ酸製剤について、油相は、１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１０ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．５ｍｌの脱イオン水に０．２ｇのコリスチン硫酸塩を溶解させることにより、コリスチン硫酸塩溶液を調製した。０．４５ｍｌの脱イオン水に０．１３９ｇのパモ酸（ＤＡ）および０．０５ｍｌのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えることにより、パモ酸溶液を調製した。水相は、４％のＢＡおよび０．４％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を脱イオン水に溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理に向けて、５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。激しく混合しながら、微細エマルジョンにパモ酸溶液を加えた後、コリスチン硫酸塩溶液を加えた。最終エマルジョンを氷上で１分間インキュベートし、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびパモ酸を除去した。得られる粒子は、サイズが１００〜１１０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が４０  ｍｇのコリスチン（４％）を含有していたことがわかった。
【０１５６】
芳香族酸は、コリスチンのカプセル化に、相対的に不十分な潜在的可能性を示した。添加量は、５％を超えず、概して３〜４％の範囲にあった。コール酸およびデオキシコール酸は、油相への溶解性が低いために、戦略３だけしか、ナノ粒子の調製に適用することができなかった。デオキシコール酸を用いたＮＰは、相対的に高い添加量（１０％前後）を示した。脂肪族酸については、Ｃ９〜Ｃ１２の範囲で、粒子が最適な添加量を示した。疎水性が弱めである酸では、ＮＰへの良好なカプセル化が実現されず、脂肪性尾部が長めである酸（すなわち、オレイン酸）では、相対的に高いバースト放出（＞２０％）が示された。諸製剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出速度を、図４に示す。
【０１５７】
（実施例３）
コリスチン含有ナノ粒子の調製−デカン酸製剤
デカン酸の使用が、この先の調査に最適であることがわかった。コリスチン硫酸塩ＮＰ（ＣＳ−ＮＰ）をデカン酸で最適化すると、製剤の調製に使用された理論添加量パラメーターに応じて、異なる２種の製剤が取得できたことが明らかになった。２０％の理論添加量で調製された製剤では、概ね１０％の添加量を有するＮＰが得られ、ＩＶＲは緩徐になった（２４時間時点で１５〜２０％）。より高い理論添加量を適用した場合、得られるＮＰは、同様の量のコリスチン（１０％）を含有したが、より急速にコリスチンを放出した（２４時間時点で３０〜４０％）。
【０１５８】
詳細な製剤は、次のとおりである。デカン酸製剤Ａについて、油相は、０．２４６ｇのデカン酸（ＤＡ）および１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１６ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．４ｇのコリスチン硫酸塩を０．５ｍｌの脱イオン水に溶解させることにより、コリスチン硫酸塩溶液を調製した。水相は、脱イオン水に４％のＢＡおよび０．６％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理の前に、水相に０．１ｍＬのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えた。短時間混合した後、水相に、０．４ｇのコリスチンを含有する溶液を加えた。処理に向けて、水相に０．１ｍｌのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加え、短時間混合した後、０．２ｇのコリスチンを含有する溶液を加えた。５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。微細エマルジョンを、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびデカン酸を除去した。得られる粒子は、サイズが１１５〜１２０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのコリスチン（１０％）を含有していたことがわかった。
【０１５９】
デカン酸製剤Ｂについて、油相は、０．１２３ｇのデカン酸（ＤＡ）および１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１６ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．５ｍｌの脱イオン水に０．２ｇのコリスチン硫酸塩を溶解させることにより、コリスチン硫酸塩溶液を調製した。水相は、脱イオン水に４％のＢＡおよび０．６％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理の前に、水相に０．１ｍＬのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えた。短時間混合した後、水相に、０．２ｇのコリスチンを含有する溶液を加えた。処理に向けて、２５ｇの水相に０．１ｍｌのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加え、短時間混合した後、０．２ｇのコリスチンを含有する溶液を加えた。５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。微細エマルジョンを、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって、有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびデカン酸を除去した。得られる粒子は、サイズが１１５〜１２０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのコリスチン（１０％）を含有していたことがわかった。
【０１６０】
デカン酸製剤Ｆについて、油相は、０．２４６ｇのデカン酸（ＤＡ）および１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１６ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）／ベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．５ｍｌの脱イオン水に０．４ｇのコリスチン硫酸塩を溶解させることにより、コリスチン硫酸塩溶液を調製した。水相は、４％のＢＡおよび０．２％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を脱イオン水に溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理の前に、水相に０．１ｍＬのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えた。短時間混合した後、水相に、０．４ｇのコリスチンを含有する溶液を加えた。処理に向けて、５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。微細エマルジョンを、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびデカン酸を、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって除去した。得られる粒子は、サイズが１１５〜１２０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのコリスチン（１０％）を含有していたことがわかった。
【０１６１】
デカン酸製剤Ｓについて、油相は、０．１２３ｇのデカン酸（ＤＡ）および１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１６ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．２ｇのコリスチン硫酸塩を０．５ｍｌの脱イオン水に溶解させることにより、コリスチン硫酸塩溶液を調製した。水相は、脱イオン水に４％のＢＡおよび０．６％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理の前に、水相に０．０５ｍＬのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えた。短時間混合した後、水相に、０．２ｇのコリスチンを含有する溶液を加えた。処理に向けて、５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。微細エマルジョンを、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびデカン酸を除去した。得られる粒子は、サイズが１００〜１１０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのコリスチン（１０％）を含有していたことがわかった。
【０１６２】
デカン酸製剤ＵＳについて、油相は、０．１２３ｇのデカン酸（ＤＡ）および１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１６ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．５ｍｌの脱イオン水に０．２ｇのコリスチン硫酸塩を溶解させることにより、コリスチン硫酸塩溶液を調製した。水相は、４％のＢＡおよび０．６％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を脱イオン水に溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理の前に、水相に、０．２ｇのコリスチンを含有する溶液を加えた。処理に向けて、５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。微細エマルジョンを、混合しながらｐＨ７の冷０．１Ｍリン酸緩衝溶液（＜２℃）３００ｇ中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびデカン酸を除去した。得られる粒子は、サイズが１００〜１１０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのコリスチン（８％）を含有していたことがわかった。
【０１６３】
デカン酸製剤Ｉについて、油相は、０．１２３ｇのデカン酸（ＤＡ）および１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１０ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）９ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．５ｍｌの脱イオン水に０．２ｇのコリスチン硫酸塩を溶解させることにより、コリスチン硫酸塩溶液を調製した。水相は、脱イオン水に４％のＢＡおよび０．４％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理の前に、水相に０．０５ｍＬのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えた。短時間混合した後、水相に、０．２ｇのコリスチンを含有する溶液を加えた。処理に向けて、５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。微細エマルジョンを、混合しながら６００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびデカン酸を除去した。得られる粒子は、サイズが１００〜１１０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのコリスチン（１０％）を含有していたことがわかった。
【０１６４】
ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出（ＩＶＲ）速度を、図５および図６に示す。製剤Ｆと製剤Ｓは、生理的条件下でインキュベートし始めて１時間後に、同様の放出速度を示し、最初の１時間の間は、製剤Ｆの放出速度の方が速い点で異なっている。後のデータから、製剤Ｆのスケールアップによって、ＩＶＲが製剤Ａに似通ったものに変わったことが明らかになった。さらに、製剤Ｆを調整した結果、製剤Ｓに似通ったＩＶＲプロファイルが得られた。したがって、最初の１時間の間に放出された緩く結合した製剤Ｂ成分は、調整する際に除去される可能性がある。それでも、本発明者らは、これを動物試験に含めて、急速放出成分のレベルが上昇することの、生物学的成果にとっての重要性を評価することにした。
【０１６５】
要約すると、コリスチンは、１０％までの添加量でカプセル化することができ、コリスチン含有ナノ粒子（ＣＳ−ＮＰ）は、活性薬物の何日にもわたる持続放出を示す。
【０１６６】
（実施例４）
ポリミキシンＢ含有ナノ粒子の調製
ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）含有ナノ粒子の詳細な製剤は、次のとおりである。デカン酸製剤について、油相は、０．１２３ｇのデカン酸（ＤＡ）および１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１０ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．５ｍｌの脱イオン水に０．２ｇのＰＭＢ硫酸塩を溶解させることにより、ＰＭＢ硫酸塩溶液を調製した。水相は、脱イオン水に４％のＢＡおよび０．４％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理の前に、水相に０．０５ｍＬのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えた。短時間混合した後、水相に、０．２ｇのＰＭＢを含有する溶液を加えた。処理に向けて、５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。微細エマルジョンを、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびデカン酸を除去した。得られる粒子は、サイズが１１５〜１２０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのＰＭＢ（１０％）を含有していたことがわかった。
【０１６７】
ウンデシレン酸製剤Ｓについて、油相は、０．１３２ｇのウンデシレン酸（ＵＡ）および１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１０ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．５ｍｌの脱イオン水に０．２ｇのＰＭＢ硫酸塩を溶解させることにより、ＰＭＢ硫酸塩溶液を調製した。水相は、脱イオン水に４％のＢＡおよび０．４％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理の前に、水相に０．０５ｍＬのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えた。短時間混合した後、水相に、０．２ｇのＰＭＢを含有する溶液を加えた。処理に向けて、５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。微細エマルジョンを、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって、有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびウンデシレン酸を除去した。得られる粒子は、サイズが１００〜１１０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのＰＭＢ（１７％）を含有していたことがわかった。
【０１６８】
デオキシコール酸製剤について、油相は、１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１０ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．５ｍｌの脱イオン水に０．２ｇのＰＭＢ硫酸塩を溶解させることにより、ＰＭＢ硫酸塩溶液を調製した。０．４５ｍｌの脱イオン水に０．３０３ｇのデオキシコール酸（ＤＡ）および０．０５ｍｌのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えることにより、デオキシコール酸溶液を調製した。水相は、脱イオン水に４％のＢＡおよび０．４％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。水相に、０．５ｍｌのＰＭＢ溶液を加えた。処理に向けて、５ｇの油相溶液に０．５ｇのデオキシコール酸溶液を加え、高速ローターホモジナイザーによって混合した。水相に得られるエマルジョンを加え、高速ローターホモジナイザーによって混合した。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１００００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。最終エマルジョンを氷上で１分間インキュベートし、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびデオキシコール酸を除去した。得られる粒子は、サイズが１００〜１１０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が１００ｍｇのＰＭＢ（１０％）を含有していたことがわかった。
【０１６９】
キシナホ酸について、油相は、０．１３４ｇのキシナホ酸（ＸＡ）および１．０ｇのポリ乳酸−ブロック−ポリエチレングリコールジブロック−コポリマー（ＰＬＡ−ＰＥＧ）（１０ｋＤａ  ＰＬＡ−５ｋＤａ  ＰＥＧ）を、酢酸エチル（ＥＡ）とベンジルアルコール（ＢＡ）の混合物（７９／２１ｗ／ｗ）４ｇに溶解させたものを用いて調製した。０．５ｍｌの脱イオン水に０．２ｇのＰＭＢ硫酸塩を溶解させることにより、ＰＭＢ硫酸塩溶液を調製した。水相は、４％のＢＡおよび０．４％のＢｒｉｊ  Ｓ１００を脱イオン水に溶解させ、次いで、溶液を概ね２℃に冷却することにより調製した。処理の前に、水相に０．０５ｍＬのＮａＯＨ溶液（４０％ｗ／ｗ）を加えた。短時間混合した後、水相に、０．２ｇのＰＭＢを含有する溶液を加えた。処理に向けて、５ｇの油相溶液を、激しく混合しながら水相に流し込んだ。得られる粗エマルジョンを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｐ装置において１０，０００ｐｓｉで処理して、微細エマルジョンを得た。微細エマルジョンを、混合しながら３００ｇの冷水（＜２℃）中に流し込んだ。２８ｇのＴｗｅｅｎ８０水溶液（３５％ｗ／ｗ）を加え、３分間混合した。下流にて、タンジェンシャルフロー濾過システムにおいて、ダイアフィルトレーション（３００ｋＤａの膜を介して４Ｌの脱イオン水）によって有機溶媒、処理助剤、結合していない薬物、およびキシナホ酸を除去した。得られる粒子は、サイズが１１５〜１２０ｎｍであり、ＰＤＩが０．１５〜０．１８であった。１ｇの固体重量のナノ粒子が６０ｍｇのＰＭＢ（１０％）を含有していたことがわかった。
【０１７０】
ポリミキシンＢは、コリスチンと比較して、調製およびＩＶＲ速度において同様の傾向を示した。ＰＭＢナノ粒子の粒子パラメーターを表１に要約し、ＩＶＲ速度を図７に示す。
【０１７１】
【表１】
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【０１７２】
（実施例５）
コリスチン含有ナノ粒子−薬物動態
コリスチン含有ナノ粒子（ＣＳ−ＮＰ）の薬物動態（ＰＫ）を評価するために、ラットに、遊離コリスチン硫酸塩、製剤Ｆ  ＣＳ−ＮＰ、または製剤Ｓ  ＣＳ−ＮＰを、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で注射した（静脈内）。図８で認められるとおり、ＣＳ−ＮＰでは、血漿におけるコリスチンの循環が、遊離薬物に比べてはるかに長く延長された。急速製剤Ｆは、緩徐製剤Ｓに比べて急速に浄化される。さらに、血流からのクリアランスは、ＩＶＲについて見出されたものと似通った傾向を示す。詳細には、製剤Ｆの場合では、ＩＶＲ実験における放出薬物の急速な増加は、ＰＫ実験において観察された血中コリスチン濃度の最初の降下に対応する。より長期間では、血漿濃度は、両方の製剤について、ほぼ同じ速度で低下する。ＣＳ−ＮＰ薬物動態は、遊離ＣＳとの間で十分に差異が認められ、血管区画におけるＣＳの緩徐な放出およびＮＰの保持を示している。
【０１７３】
（実施例６）
コリスチン含有ナノ粒子−忍容性
遊離薬物、製剤Ｆ  ＣＳ−ＮＰ、または製剤Ｓ  ＣＳ−ＮＰの静脈内注射後の忍容性を研究した。結果を表２および図９に示す。遊離コリスチンは、むしろ低い忍容性を示し、ＬＤ５０は６ｍｇ／ｋｇであった。製剤Ｆ  ＣＳ−ＮＰについては、マウスは、はるかに高いＬＤ５０および同様のＭＴＤを示した。製剤Ｓの場合では、はるかに高い忍容性が認められた。ＬＤ５０用量は、遊離薬物に比べて１０倍の高さを超え（８０ｍｇ／ｋｇ）、副作用は、４０ｍｇ／ｋｇを上回ると現れ始めるにとどまった。ＣＳ−ＮＰの副作用には、嗜眠および呼吸速度の増大が含まれ、こうした副作用は、投与開始から数分以内に認められ、１５以内に解消された。投与後１４日以内に、ＢＷ変化は観察されなかった。ＣＳ−ＮＰの毒性が低減されたのは、ＮＰ内での保持および緩徐な薬物放出の結果、全身の遊離コリスチン濃度が低下したためであると思われる。
【０１７４】
【表２】
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【０１７５】
ＣＳ−ＮＰを、腎毒性についてさらに評価した。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの遊離ＣＳ（皮下）および製剤Ｓ  ＣＳ−ＮＰ（皮下および静脈内の両方）を２時間毎に投与した。マウスには、合計６用量を与え、各実験群は、５匹のマウスを擁した。最初の投与から３０時間後、腎臓を採取し、ホルマリン固定した後、Ｈ＆Ｅ染色した。
【０１７６】
図１０に、各実験群について組織学的に観察される、腎臓における尿細管の崩壊および壊死を示す、腎臓の様相の視覚的変化を示す。遊離ＣＳ群では、５匹のうち５匹の動物が、尿細管上皮のいくつもの壊死部位、およびいくつかの尿細管について認められる好酸性無細胞物質の蓄積を含めて、尿細管壊死を伴った。両方のＣＳ−ＮＰ群（静脈内および皮下）において、５匹のうち５匹の動物が、腎毒性の徴候を示さなかった。
【０１７７】
結論として、製剤Ｓは、ＬＤ５０が１０倍超にのぼり、腎毒性も認められず、遊離コリスチンより忍容性があり、毒性が低い。
【０１７８】
（実施例７）
腿部および肺感染症モデルにおいてコリスチン含有ナノ粒子の有効性および体内分布を評価する
Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）肺感染症モデルにおいて、ＣＳ−ＮＰをその有効性について試験した。結果を図１１に示す。４０ｍｇ／ｋｇの一用量のＣＳ−ＮＰを皮下投与および静脈内投与した後、同じ用量での従来の薬物の皮下投与について５０％（ｎ＝６）であったのに比べて、３３％および６７％の動物が無菌化されたので、従来の薬物と製剤Ｓ  ＣＳ−ＮＰは、互角の有効性を有した。
【０１７９】
クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）腿部感染症モデルにおいて、ＣＳ−ＮＰをその有効性および体内分布についてさらに試験した。結果を図１２および図１３に示す。ＣＳおよびＣＳ−ＮＰで処置した結果、感染部位における細菌カウントが有意に減少し、菌血症が予防され、２４時間後に、遊離ＣＳとナノ粒子製剤とに有意差は認められなかった。２４時間後、感染した腿部には、健康な腿部に比べて、ＣＳ−ＮＰの有意に高い蓄積があった。要約すると、ＣＳ−ＮＰは、腿部感染症モデルにおいて、２４時間後に、遊離ＣＳと同じ有効性を有する。
【０１８０】
（実施例８）
抗生物質含有ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗菌活性
抗生物質添加ナノ粒子（ＡＢ−ＮＰ）を、細胞内感染に対するそのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗菌活性について、次のとおりに試験した。０．１６μＭの酢酸ミリスチン酸ホルボールを使用して、１〜２×１０６細胞／ｍＬのＴＨＰ−１細胞を活性化した。活性化してから２４時間後、細胞を、細菌対マクロファージを１：５０として野兎病菌（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）で感染させた。３時間後、ＴＨＰ−１細胞を２回洗浄して、貪食されていない細菌を除去し、遊離ＧＮＴおよびＧＮＴ添加ナノ粒子（ＧＮＴ−ＮＰ）の段階希釈物を細胞に加えた。３時間、２４時間、および４８時間の時点で細胞を溶解させて、細胞中に残存する生存可能細菌（ＣＦＵ）の濃度を求めた。結果を表に示す。
【０１８１】
【表３】
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【０１８２】
ＡＢ−ＮＰは、２４時間の時点で、遊離ＡＢに比べて、細胞内の野兎病菌（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）に対して有効であった（ＭＩＣは、遊離ＡＢより低かった）。２４時間時点でのＮＰのより高い抗菌活性は、遊離での緩徐な浸透とは対照的な、ＴＨＰ−１細胞によるＮＰの迅速な内部移行に続く、細胞内部でのＡＢ放出によって説明することができる。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、抗生物質を添加されたＮＰが、細胞内感染を処置する潜在的可能性を有することが実証される。
【０１８３】
（実施例９）
マウス腿部感染症モデルにおいて、ビンクリスチン含有ナノ粒子対遊離ビンクリスチンの蓄積を評価する
コリスチン含有ナノ粒子の潜在的な利益を実証するために、マウスモデルにおいて、ビンクリスチン含有ナノ粒子を、感染筋組織におけるその蓄積能力について試験した。ビンクリスチン含有ナノ粒子が投与されたマウスの腿部筋肉における合計ビンクリスチンのレベルを、遊離ビンクリスチンが投与されたものと比較した。加えて、各マウスについて、感染していない腿部も、ビンクリスチンレベルに関して査定して、感染対非感染腿部におけるビンクリスチンの比を求めた。
【０１８４】
研究パラメーターは、次のとおりである。マウス：雌ＣＤ−１、免疫適格；細菌：Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）＃８４７；１×１０８ＣＦＵ／マウス、筋肉内；ビンクリスチンまたはビンクリスチン含有ナノ粒子の投与量、投与レジメン、および投与経路：０．７７ｍｇ／ｋｇのビンクリスチン、静脈内、（感染から３時間後）毎日、０．７７ｍｇ／ｋｇの活性ＡＰＩ当量のビンクリスチン含有ナノ粒子（全材料用量１８．６ｍｇ／ｋｇ）、静脈内、（感染から３時間後）毎日；組織採取時点：投与後１時間、４時間、および２１時間；左腿部（感染）−ＣＦＵ測定およびバイオアナリシス；右腿部（非感染）−バイオアナリシス；血漿用血液−バイオアナリシス。図１４に、ビンクリスチンまたはビンクリスチンを含む典型的な開示ナノ粒子のいずれかで静脈内処置してから１、４、および２１時間後のマウス腿部における細菌負荷の比較を示す。図１５には、ラットの腿部重量を感染（左）対非感染（右）について示す。図１６は、（左）ビンクリスチンのみ（軸表示「Ｖｉｎ」で示される）対ビンクリスチン含有ナノ粒子（軸表示「Ｖｉｎ−Ａｃｃ」で示される）による処置の結果として生じるビンクリスチン血漿レベル、および（右）ビンクリスチンのみで処置したラットの血漿レベルを示す、グラフの左側の拡大を示すものである。
【０１８５】
図１７は、ビンクリスチン対ビンクリスチンを含む典型的な開示ナノ粒子の腿部組織レベルを示すものである。図１８は、ビンクリスチンを含む典型的な開示ナノ粒子についてのビンクリスチンの腿部組織レベルを左腿部（感染）対右腿部（非感染）で示すものである。重要な点で、治療用ナノ粒子は、非感染組織とは対照的に感染組織において蓄積し、したがって、感染の付近に活性薬剤を放出し、したがって、活性薬剤の局所濃度が高くなる。図１９は、ラットにおけるビンクリスチンを含む典型的な開示ナノ粒子からのビンクリスチン放出の薬物動態を示すものである。見て取ることができるように、ナノ粒子は、その活性薬剤を約３５０時間にわたって放出する。
【０１８６】
均等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、確認することができる。このような均等物は、下記の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【０１８７】
参照による組込み
本明細書において引用した全ての特許、公開された特許出願、ウェブサイト、および他の参照文献の全内容は、参照によりその全体が明確に本明細書において組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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