(57)【要約】機械的細胞破砕により細胞内に遺伝子編集コンポーネントを導入することによって遺伝子編集を行うことができる。関連する機器、システム、技術、及び物品も記載する。本発明の方法及びシステムは、標的細胞への遺伝子編集コンポーネント及び遺伝子編集複合体の細胞内送達の問題を解決する。本明細書に記載する結果は、細胞膜の機械的破砕による遺伝子編集コンポーネント、例えばタンパク質、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の送達が遺伝子編集の成功につながることを示す。遺伝子編集物質の細胞内送達は現在の課題であるので、本方法は、潜在的に有害なウイルスベクターまたは電界を用いることなく標的細胞を改変するためのロバストな機構を提供する。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内へのタンパク質及び核酸の送達方法であって、
溶液中の細胞を準備すること；
細胞変形狭窄部を含むマイクロ流体チャネルに前記溶液を通過させること；
前記狭窄部に前記細胞を通過させ、その結果、前記細胞に圧力が加わり、前記タンパク質及び前記核酸が透過するのに十分大きな前記細胞の摂動を引き起こすこと；ならびに
前記細胞が前記狭窄部を通過する前、その最中、及び／またはその後に、前記細胞を前記タンパク質及び前記核酸と接触させること；
を含む前記方法。
【請求項２】
前記細胞が前記狭窄部を通過する前、その最中、及び／またはその後に、前記溶液が、前記タンパク質及び前記核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質及び前記核酸が、タンパク質−核酸複合体を形成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質及び前記核酸が、前記タンパク質−核酸複合体のコンポーネントであるが、前記細胞への送達時には複合体化していない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質及び前記核酸が、前記細胞内への送達後にタンパク質−核酸複合体を形成する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質及び前記核酸が、前記細胞内への送達前にタンパク質−核酸複合体を形成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質及び前記核酸が、遺伝子編集コンポーネントを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質−核酸複合体が、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）前記タンパク質が、Ｃａｓタンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であり；
（ｂ）前記核酸が、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランスアクチベーティングｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）である；
請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体が、Ｃａｓタンパク質またはＣｐｆ１タンパク質及びｓｇＲＮＡをふくむＲＮＰであり、約０．５、２．０、２．５、または３．０モル濃度超の前記Ｃａｓタンパク質またはＣｐｆ１タンパク質を用いて、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃｐｆ１タンパク質及び前記ｓｇＲＮＡを複合体化させた、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質−核酸複合体が、第１ＲＮＰ及び第２ＲＮＰを含む、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１ＲＮＰ及び前記第２ＲＮＰが、両方ともニッカーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１ＲＮＰが、前記第２ＲＮＰの標的配列とは異なる標的配列にニックを入れる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質−核酸複合体が、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＣｒｅリコンビナーゼを含む、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸が、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質−核酸複合体が
（ａ）静電引力を介してタンパク質と複合体化している核酸分子；
（ｂ）タンパク質に巻きついた核酸分子；
（ｃ）ＤＮＡ及びヒストン；
（ｄ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）；
（ｅ）リボソーム、酵素テロメラーゼ、ヴォールトリボ核タンパク質、ＲＮａｓｅ  Ｐ、ｈｎＲＮＰ、もしくは核内低分子ＲＮＰ（ｓｎＲＮＰ）；または
（ｆ）タンパク質を含む染色体；
を含む、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液が、ドナーＤＮＡをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が前記狭窄部を通過する前、その最中、及び／またはその後に、前記溶液が、ドナーＤＮＡをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が哺乳類細胞を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞がヒト細胞を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記狭窄部の直径が、前記タンパク質及び前記核酸が通過するのに十分大きな前記細胞の膜の一時的な摂動を誘発するように選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記狭窄部の直径が、前記細胞の直径の約２０〜９９％である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記狭窄部の直径が、前記細胞の直径の約６０％である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記マイクロ流体チャネルが、マイクロ流体システムにおける複数の並列マイクロ流体チャネルのうちの１つである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数の並列マイクロ流体チャネルが、少なくとも約２、５、１０、２０、２５、３０、４０、４５、５０、７５、１００、５００、１，０００、または２〜１，０００のマイクロ流体チャネルを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が複数の細胞であり、複数の並列マイクロ流体チャネルのうちの１つに各細胞を通過させ、
前記複数の並列マイクロ流体チャネルの各マイクロ流体チャネルが、細胞変形狭窄部を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）前記狭窄部の直径が、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２〜１０μｍ、もしくは１０〜２０μｍであり；
（ｂ）前記狭窄部の長さが、約１０、１５、２０、２４、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、もしくは１０〜１００μｍであり；
（ｃ）前記マイクロ流体チャネルに前記溶液を通過させるために約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００もしくは１０〜１００ｐｓｉの圧力を用い；
（ｄ）前記細胞が、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１００〜３００、２００〜７００、２５０〜４００、１００〜１０００ｍｍ／ｓ、１〜１０００ｍｍ／ｓ、１ｍ／ｓ、２ｍ／ｓ、３ｍ／ｓ、４ｍ／ｓ、５ｍ／ｓ、６ｍ／ｓ、７ｍ／ｓ、８ｍ／ｓ、９ｍ／ｓ、１０ｍ／ｓ、０．０１〜５ｍ／ｓ、５〜１０ｍ／ｓ、もしくは０．０１〜１０ｍ／ｓの速度で前記マイクロ流体チャネルを通過し；
（ｅ）前記マイクロ流体チャネルが、直列した複数の細胞変形狭窄部を含み；
（ｆ）前記マイクロ流体チャネルが、単一の細胞変形狭窄部を含み；
（ｇ）前記細胞膜の前記摂動が、約１〜２０、１〜６００、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、もしくは６００ｎｍの最大直径を含み；及び／または
（ｈ）約１〜２０、１〜６００、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、もしくは６００ｎｍの最大直径を有する前記細胞膜の摂動が、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１〜１０分間前記細胞膜上で持続する；
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞に前記タンパク質及び前記核酸を送達した後、
（ａ）前記細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％もしくはこれより多く減少する；または
（ｂ）前記細胞が複数の細胞であり、前記複数の細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％もしくはこれより多く減少する；
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞に前記タンパク質及び前記核酸を送達した約１、２、５、１２、２４、１〜１２、６〜１２、６〜１８、１２〜２４、または１〜２４時間後、
（ａ）前記細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％もしくはこれより多く減少する；または
（ｂ）前記細胞が複数の細胞であり、前記複数の細胞における標的遺伝子の発現が少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％もしくはこれより多く減少する；
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞に前記タンパク質及び前記核酸を送達した後、
（ａ）前記細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００％もしくはこれより多く増加する；または
（ｂ）前記細胞が複数の細胞であり、前記複数の細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００％もしくはこれより多く増加する；
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞に前記タンパク質及び前記核酸を送達した約１、２、５、１２、２４、１〜１２、６〜１２、６〜１８、１２〜２４、または１〜２４時間後、
（ａ）前記細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００％もしくはこれより多く増加する；または
（ｂ）前記細胞が複数の細胞であり、前記複数の細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００％もしくはこれより多く増加する；
請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含み、前記チャネルが約３０μｍの狭窄部長さ及び約４μｍの狭窄部幅を備える、細胞にタンパク質−核酸複合体を送達するためのデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１５年１月１２日に出願された米国仮出願第６２／１０２，３４７号の優先権による利益を主張し、その全内容を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
連邦政府資金による研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって締結された認可番号Ｒ０１ＧＭ１０１４２０−０１Ａ１の下、政府援助を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書に記載する主題は、機械的細胞破砕により細胞内に遺伝子編集コンポーネントを導入することによる遺伝子編集に関する。
【０００４】
配列表の参照
本出願は、５１７キロバイトのサイズであり、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓとのオペレーティングシステム互換性を有するＩＢＭ−ＰＣマシンフォーマットで２０１６年１月１２日に作成された「３８１７２−５１０００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルにあるヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列を参照により援用し、これは本出願の一部としての２０１６年１月１２日に出願されたテキストファイル中に含まれている。
【背景技術】
【０００５】
ゲノム編集技術、例えばクラスター化等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などは、細胞の遺伝子コードを変化させる能力に大きな可能性を秘めていることがわかっている。したがって、これらの技術は創薬における新規な洞察を可能とし、次世代遺伝子治療の開発につながり得る。タンパク質コンポーネント及び核酸コンポーネント、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む遺伝子編集複合体は、細胞膜を容易に通過することができない。したがって、そのような複合体の送達が課題であった。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の方法及びシステムは、標的細胞への遺伝子編集コンポーネント及び遺伝子編集複合体の細胞内送達の問題を解決する。本明細書に記載する結果は、細胞膜の機械的破砕による遺伝子編集コンポーネント、例えばタンパク質、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の送達が遺伝子編集の成功につながることを示す。遺伝子編集物質の細胞内送達は現在の課題であるので、本方法は、潜在的に有害なウイルスベクターまたは電界を用いることなく標的細胞を改変するためのロバストな機構を提供する。さらに、プロセスのスケーラビリティ及び比較的単純性が幅広い普及に適している。本方策及び方法は研究及び治療におけるゲノム工学用途に適している。
【０００７】
したがって、細胞内へのタンパク質−核酸複合体の送達方法は、懸濁液中の細胞を準備すること；細胞変形狭窄部（cell-deforming constriction）を含むマイクロ流体チャネルに溶液を通過させること；狭窄部に細胞を通過させ、その結果、細胞に圧力が加わり、前記タンパク質−核酸複合体が透過するのに十分大きな細胞の摂動（perturbation）を引き起こすこと；及び細胞が狭窄部を通過する前またはその後に複合体含有溶液中で細胞を所定の時間インキュベートすることによって行われる。例示的なタンパク質−核酸複合体は遺伝子編集コンポーネントを含む。例えば、タンパク質−核酸複合体はＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９タンパク質など）及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはドナーＤＮＡを含む。他の例では、タンパク質−核酸複合体はＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、またはＣｒｅリコンビナーゼを含む。
【０００８】
本方法及びシステムは一般に、複合体、例えばタンパク質−タンパク質複合体、低分子＋ＲＮＡ複合体などのサイトゾル送達に適用可能である。
【０００９】
様々な標的細胞型をこのように処理する。例えば、細胞は哺乳類細胞、例えば免疫細胞（例えばＴ細胞）などまたは幹細胞、例えば造血幹細胞などを含む。
【００１０】
マイクロ流体システムは複数のマイクロ流体チャネルを含み得る。複数のマイクロ流体チャネルのそれぞれは内腔を画定し、バッファー中に懸濁した細胞が内腔を通過することができるように構成される。いくつかの実施形態において、マイクロ流体チャネルは１つ以上の細胞変形狭窄部を含む。いくつかの実施形態において、狭窄部の直径は細胞の直径の関数である。したがって、本発明のマイクロ流体システム内には多くのマイクロ流体チャネルが存在し得る。例えば、マイクロ流体システムは例えば２、５、１０、２０、４０、４５、５０、７５、１００、５００、１，０００またはこれより多くの並列に並んだ複数のマイクロ流体チャネルを含み得る。
【００１１】
複数の並列マイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体システムは細胞へのペイロードの高スループット送達を可能にする。多くの細胞が各並列チャネルを１つずつ通過することができる。文脈に応じて、「細胞」という言及は１つ以上の細胞のことをいう場合があると理解されるであろう。
【００１２】
狭窄部の直径は処理しようとする細胞型の大きさに応じて選択する。いくつかの実施形態において、細胞は流体の流れによって主に圧縮され得る。いくつかの実施形態において、直径は細胞の直径未満である。例えば、狭窄部の直径は細胞の直径のほぼまたは約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または２０〜９９％であり得る。例えば、狭窄部は細胞の直径のほぼ２０〜９９％である、例えば狭窄部の直径は細胞の直径のほぼ６０％である。狭窄部の直径の非限定例としては、ほぼまたは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２〜１０μｍ、または１０〜２０μｍが挙げられる。様々な長さの狭窄部も可能である。狭窄部の長さの非限定例としては、ほぼまたは約１０、１５、２０、２４、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、または１０〜１００μｍが挙げられる。
【００１３】
本明細書に記載する主題は、複合体のコンポーネント（またはそのコンポーネントをコードする核酸）を断片的に送達する方法に勝る多くの技術的な利点を提供する。ほとんどの遺伝子編集システムでは複合体形成が細胞内で発生する必要があり、これは非効率的なプロセスであり得る。ＲＮＡ及びＣａｓ（例えばＣａｓ９など）を複合体形態（または他のタンパク質／核酸遺伝子編集複合アセンブリ）で送達する利点としては、他の方法と比較してより良好な効率及び特異性が挙げられる。Ｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ９タンパク質など）を発現させるｍＲＮＡまたはＤＮＡ操作を不要とすることによって、細胞がタンパク質に曝露される時間を減少させ、それによりオフターゲット効果の可能性を減少させることができる。編集コンポーネントを複合体形態で細胞に送達することは、Ｃａｓ（例えばＣａｓ９など）が細胞内の他のＲＮＡ鎖と複合体化し、誤った部位を切断するリスクも排除／最小化する。例えば、ＲＮＡ単独では細胞内及び細胞外Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びパターン認識受容体によって検出され、インターフェロン応答または他の抗ウイルス経路を促進し得る。複合体形態はこれらの経路と相互作用せず、そのため望ましくない副作用を回避することができる。
【００１４】
細胞内への送達前のインビトロでの複合体化によって、Ｃａｓ（例えばＣａｓ９など）及びｇＲＮＡ複合体化反応を正確に制御することができ、ひいては最大限の機能が確保される一方で、サイトゾル内での複合体形成はそれほど効率的ではない場合がある。例えば、サイトゾルに複合体を送達することによって、Ｃａｓ（例えばＣａｓ９など）及びｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの同時相互作用が確実となる。本明細書に記載のインビトロで形成されて細胞に送達される複合体は完全な機能を有し、標的細胞の細胞質へのアクセスが得られればすぐに機能する。
【００１５】
送達プロセスは複合体の厳密なサイズ及び組成に依存せず、編集物質の複合体形成は最適条件の下、インビトロで発生して制御されるので、本明細書に記載のアプローチは、ヌクレアーゼをガイドする任意のタンパク質＋ＲＮＡ／ＤＮＡベースのシステムに関連する。
【００１６】
本発明の実施態様は以下の特徴の１つ以上も提供し得る。細胞の変形は、ほぼまたは約１μｓ〜１０ｍｓ、例えば１０μｓ、５０μｓ、１００μｓ、５００μｓ、及び７５０μｓ間の細胞の変形を含む。インキュベーションは０．０００１秒〜２０分またはこれより長く、例えばほぼまたは約１秒、約３０秒、約９０秒、約２７０秒、及び約９００秒間発生する。
【００１７】
細胞がマイクロ流体チャネルを通過する圧力及び速度も様々であり得る。いくつかの実施形態において、ほぼまたは約１０〜３５ｐｓｉの圧力を用いて、細胞を含有する溶液をマイクロ流体チャネルに通過させる。速度は様々な理由で調節され得るが、高ペイロード送達を維持しながら処理される細胞の生存率を改善することが挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞はほぼまたは約３００ｍｍ／ｓ、４００ｍｍ／ｓ、５００ｍｍ／ｓ、６００ｍｍ／ｓ、７００ｍｍ／ｓ、８００ｍｍ／ｓ、９００ｍｍ／ｓ、１００〜３００ｍｍ／ｓ、２００〜７００ｍｍ／ｓ、２５０〜４００ｍｍ／ｓ、１〜１０００ｍｍ／ｓ、１ｍ／ｓ、２ｍ／ｓ、３ｍ／ｓ、４ｍ／ｓ、５ｍ／ｓ、６ｍ／ｓ、７ｍ／ｓ、８ｍ／ｓ、９ｍ／ｓ、１０ｍ／ｓ、０．０１〜５ｍ／ｓ、５〜１０ｍ／ｓ、または０．０１〜１０ｍ／ｓの速度でマイクロ流体チャネルを通過する。細胞が複数の細胞である場合、ほぼまたは約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９０〜９５、もしくは８０〜９９％またはこれより多くの細胞が狭窄部を通過した後で生存可能であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は狭窄部を通過した後、少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、または４８時間のいずれかの間生存可能である。
【００１８】
いくつかの例では、本発明のデバイスは２、１０、２０、２５、４５、５０、７５、１００またはこれより多くのチャネルを含む。いくつかの実施形態において、圧力の印加によってチャネルまたは管路を通して細胞を移動させる、例えば押し進める。いくつかの実施形態において、細胞推進体が圧力を印加することができる。細胞推進体としては、例えば、圧力ポンプ、ガスボンベ、圧縮機、真空ポンプ、シリンジ、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、手動シリンジ、ピペット、ピストン、毛管作用体、及び重力を挙げることができる。チャネルに代えて、細胞をネットの形態の狭窄部に通過させてもよい。いずれの場合においても、細胞が通過する狭窄部の幅は、処理しようとする細胞の未狭窄状態、すなわち懸濁状態での幅または直径の２０〜９９％である。温度が組成物の取込みに影響を及ぼし、また生存率に影響を及ぼし得る。
【００１９】
ある実施形態において、０〜４５℃、例えば０〜２５℃の温度を細胞の処理中に用いる。様々な実施形態において、室温（例えば２０℃）、生理的温度（例えば３９℃）、生理的温度よりも高い温度、もしくは低温（例えば０．１℃）、またはこれらの例示的温度の間の温度（例えば０．１〜４０℃）で本方法を実施する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、免疫細胞に関して、未刺激Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／または単球の処理は、４〜８℃の温度、例えば氷上で実施する。別の例では、樹状細胞、活性化Ｔ細胞、及び／または活性化Ｂ細胞は、２０〜２５℃の温度、例えば典型的な室温で本デバイスを用いて処理する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、狭窄、伸展、及び／または高せん断速度のパルスによる細胞への制御した損傷（例えば摂動）の後、細胞内への導入を望む複合体を含有する送達溶液中で細胞をインキュベートする。制御した損傷は、細胞膜における小さな、例えば直径２００ｎｍの摂動として特徴づけられ得る。狭窄部を通過したことに起因する損傷が塞がる細胞の修復期間は数分のオーダーである。送達期間は、１〜１０分またはこれより長い時間、例えば１５、２０、３０、６０分以上を含み、室温で作業する場合には２〜５分が最適である。
【００２２】
本明細書に記載のデバイス及び方法のいくつかの実施形態において、幹細胞または前駆細胞、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの狭窄部チャネルの通過は分化を誘発しないが、細胞内への組成物の取込みを確実に誘発する。例えば、細胞内に因子（複数可）を導入した方法に伴う問題が生じることなく、そのような細胞内に遺伝子編集化合物が導入される。
【００２３】
細胞膜における一時的な摂動のサイズ及び持続時間は、様々な要因、例えば細胞変形狭窄部の直径及び細胞が狭窄部を通過する速度などを調節することによって修正することができる。本明細書に示す摂動のサイズ及び持続時間に関する開示は、限定するものと解釈すべきではない。Ｓｈａｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｉｎｔｅｇｒ．  Ｂｉｏｌ．，  ６，  ４７０−４７５に摂動及び修復の非限定的な記載が提供されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。いくつかの実施形態において、細胞膜の摂動はほぼまたは約１〜２０、１〜６００、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、または６００ｎｍの最大直径によって特徴づけられ得る。様々な実施形態において、ほぼまたは約１〜２０、１〜６００、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、または６００ｎｍの最大直径を有する細胞膜の摂動は、少なくともほぼまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１〜１０分間またはこれより長く（１１、１３、１５、１８、２０分以上）細胞膜上で持続する。
【００２４】
様々な実施形態において、直径は細胞の直径未満である。例えば、狭窄部の直径は細胞の直径のほぼまたは約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または２０〜９９％であり得る。狭窄部の直径の非限定例としては、ほぼまたは約４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、４〜１０μｍ、または１０〜２０μｍが挙げられる。様々な長さの狭窄部も可能である。狭窄部の長さの非限定例としては、ほぼまたは約１０、１５、２０、２４、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、または１０〜１００μｍが挙げられる。
【００２５】
多くの細胞は直径５〜２０μｍであり、例えば未刺激Ｔ細胞は直径７〜８μｍである。例えば、単細胞の処理に関しては、狭窄部の直径は４．５、５、５．５、６、または６．５μｍである。別の例では、ヒト卵の処理のための狭窄部のサイズ／直径は６０μｍ〜８０μｍであるが、より大きい及びより小さい狭窄部が可能である（ヒト卵子の直径はおよそ１００μｍである）。また別の例では、１２μｍ〜１７μｍの狭窄部直径を用いて胚（例えば２〜３細胞のクラスター）を処理する。未刺激Ｔ及びＢ細胞に関する非限定例において、デバイスは、約１０、１５、２０、２５、３０、もしくは１０〜３０μｍの長さ、約、３、３．５、４、もしくは３〜４μｍの幅、約１５、２０、２５、もしくは１５〜２５μｍの深さ、及び／または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは５〜１５度の角度を有する狭窄部を含む。免疫細胞へのペイロードの送達に有用なマイクロ流体デバイスの例は、２０１５年１０月３０日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５８４８９号，  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌｓに記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
【００２６】
単細胞に加えて、非常に大きな細胞、例えば卵（直径およそ２００μｍ）、細胞のクラスター、例えば２〜３細胞を含む胚などの２〜５細胞クラスターさえも標的組成物を取り込むように処理される。開口部のサイズは適宜、すなわち狭窄部の幅がちょうどクラスターのサイズ未満となるように調節する。例えば、チャネルの幅は細胞クラスターの幅の２０〜９９％である。
【００２７】
細胞または細胞クラスターは、所望の細胞型を精製／単離または富化する。本方法で用いられる樹状細胞もしくは他の細胞、例えばマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞、または幹細胞、例えば胚性幹細胞もしくはｉＰＳなどは、精製または富化される。例えば、細胞表面マーカーの発現または他の同定できる特徴によって細胞を単離または富化する。樹状細胞は、β−インターグリン（ｉｎｔｅｒｇｒｉｎ）、ＣＤ１１ｃまたは他の同定できる細胞表面マーカーの発現によって同定及び単離する。細胞に関して、用語「単離」は、細胞が天然ではともに発生する他の細胞型または細胞物質を実質的に含まないことを意味する。例えば、特定の組織型または表現型の細胞のサンプルは、細胞集団の少なくとも６０％である場合に「実質的に純粋」である。好ましくは、調製物は細胞集団の少なくとも７５％であり、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％または１００％である。純度は任意の適切な標準的方法によって、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定する。
【００２８】
ペイロード組成物、例えばポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の作用物質（例えばＣａｓ９及びｇＲＮＡ）などを精製及び／または単離する。具体的には、本明細書で用いる場合、「単離」または「精製」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、組換え技術によって産生した場合には他の細胞物質、もしくは培地を、または化学合成した場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。精製化合物は、対象とする化合物の少なくとも６０重量％（乾燥重量）である。好ましくは、調製物は対象とする化合物の少なくとも７５重量％であり、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％である。例えば、精製化合物は、重量基準で所望の化合物の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）のものである。純度は任意の適切な標準的方法によって、例えばカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって測定する。精製または単離ポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、その自然発生状態においてそれと隣接する遺伝子または配列を含まない。単離または精製核酸分子の例としては、（ａ）自然発生ゲノムＤＮＡ分子の一部であるが、それが天然に発生する生物のゲノムにおける分子のその部分に隣接する核酸配列が両方とも隣接していないＤＮＡ；（ｂ）結果として生じる分子がいかなる自然発生ベクターまたはゲノムＤＮＡとも同一でないように、ベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた核酸；（ｃ）分離した分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成された断片、または制限断片など；及び（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列が挙げられる。本発明に従う単離核酸分子には、合成的に生成された分子、ならびに化学的に改変された及び／または修飾主鎖を有する任意の核酸がさらに含まれる。
【００２９】
精製モジュールまたはコンポーネント、例えば精製タンパク質（複数可）ならびに精製核酸（ＲＮＡ及び／またはＤＮＡ）から複合体を調製する。したがって、コンポーネントの比は、所望の遺伝子編集結果が得られるように所望により制御及び調整される。本方法は、感受性の高いペイロード、例えばタンパク質−ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体、例えば４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、７５ｋＤａ、１００ｋＤａ、及び最大１２０、１３０、１５０、２００、２５０、３００ｋＤａ以上の複合体の送達に特に好適である。
【００３０】
フローバッファー中に界面活性剤（例えば０．１〜１０％ｗ／ｗ）（例えばポロキサマー、動物由来血清、アルブミンタンパク質）を任意により用いる。細胞内への分子の送達は界面活性剤の存在に影響されないが、動作中のデバイスの閉塞を軽減するために界面活性剤を任意により用いる。
【００３１】
いくつかの態様において、デバイスは、シリコン、金属（例えばステンレス鋼）、プラスチック（例えばポリスチレン）、セラミック、または１つ以上の適切なサイズのチャネルもしくは管路を形成するのに適した任意の他の材料から作製される。いくつかの態様において、デバイスは、ミクロンスケールの形体をエッチングするのに適した材料で形成され、細胞が通過する１つ以上のチャネルまたは管路を含む。シリコンが特に好適であるが、その理由は、この材料での微小パターン形成法が十分に確立されており、したがって、新たなデバイスの作製、デザインの変更などがより容易であるためである。加えて、シリコンの剛性により、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のようなより軟質の基板に勝る利点を得ることができるが、例えばより高い送達率である。例えば、デバイスは２、１０、２０、２５、４５、５０、７５、１００またはこれより多くのチャネルを含む。シリコンをエッチングすることによってデバイスを微細加工する。圧力の印加によってチャネルまたは管路を通して細胞を移動させる、例えば押し進める。細胞推進体が圧力を印加することができる。細胞推進体としては、例えば、圧力ポンプ、ガスボンベ、圧縮機、真空ポンプ、シリンジ、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、手動シリンジ、ピペット、ピストン、毛管作用体、及び重力を挙げることができる。チャネルに代えて、細胞をネットの形態の狭窄部に通過させてもよい。いずれの場合においても、細胞が通過する狭窄部の幅は、処理しようとする細胞の未狭窄状態、すなわち懸濁状態での幅または直径の２０〜９９％である。
【００３２】
本発明の様々な実施態様は以下の臨床及び研究における可能性の１つ以上も提供し得る。スクリーニングの向上及び投与量研究のための、細胞モデルへの遺伝子編集複合体またはそのコンポーネントの定量的送達を実現することができる。本方法は、タンパク質治療薬の同定または疾患機序の理解に役立つサイトゾル内でのタンパク質活性をスクリーニングする高スループット方法として採用され得る。本デバイス及び技術は、特定の循環血液細胞のサブセット（例えばリンパ球）、さらには全血への遺伝子編集複合体の細胞内送達；細胞、特に卵母細胞及び接合子内への複合体またはそのコンポーネントの高スループット送達；ｉＰＳ細胞を生成するための細胞リプログラミングを誘発する遺伝子編集を（任意によりドナーＤＮＡなどの遺伝物質とともに）導入することによる標的化した細胞分化；遺伝子導入または変異幹細胞株の開発のための胚性幹細胞内へのＤＮＡ及び／または組換え酵素の送達；遺伝子導入または変異生物の開発のための接合子内へのＤＮＡ及び／または組換え酵素の送達；樹状細胞（ＤＣ）の細胞活性化；ｉＰＳ細胞生成；１つ以上の遺伝子の細胞機能及び／または疾患への寄与を調べるための正常または疾患細胞（例えば癌細胞など）における変異の作製；ならびに幹細胞分化に有用である。形成外科に関連して用いられる皮膚細胞も、本明細書に記載のデバイス及び方法を用いて改変される。本明細書に開示の遺伝子編集タンパク質の送達方法は、遺伝子疾患及び他の疾患を治療するための、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生成、または造血幹細胞（ＨＳＣ）の遺伝子改変にも用いられ得る。ＨＳＣに関する実施形態において、被検者は、オートロガス、シンジェニック、またはアロジェニック編集ＨＳＣを与えられ得る。様々な実施形態において、被検者に遺伝子編集細胞を与える前に被検者の細胞が焼灼され得る。例えば、被検者に遺伝子編集ＨＳＣを与える前に被検者の骨髄細胞が放射線でまたは化学的に焼灼され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示の方法または組成物を用いて、βサラセミアまたは鎌状赤血球貧血に関連する遺伝子を編集する。本発明に従って、エクスビボまたはインビトロ、すなわち被検者の体外で処理した細胞は、病変の治療または診断を必要とする被検者へのその後の投与に有用である。代替的実施形態では、インビボ細胞プロセシングを行う。
【００３３】
様々な実施形態において、ＳＨＰ２遺伝子を編集／変異させ、その活性を減少させるか、またはＳＨＰ２発現をノックアウトもしくは減少させる。Ｔ細胞の遺伝子編集に関するそのような実施形態において、Ｔ細胞は免疫抑制シグナルへの応答性が低下し、腫瘍に対する活性が増加する。そのような実施形態において、Ｔ細胞は腫瘍抗原への応答性が高くなり、癌の治療により効果的となり得る。
【００３４】
本主題の態様は、細胞へのタンパク質−タンパク質複合体及びタンパク質−核酸複合体、例えば遺伝子編集複合体の迅速かつ一時的な送達に関する。複合体の核酸コンポーネントは、デオキシ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ）またはそれぞれ他の二本鎖もしくは一本鎖核酸化合物を含む。例えば、遺伝子編集複合体（例えばリボ核タンパク質（ＲＮＰ））の送達は、遺伝子編集複合体のコンポーネント（例えばＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡ）をコードする発現ベクターを細胞に送達した場合よりも早く遺伝子編集を達成し得る。例えば、同じ細胞が遺伝子編集複合体コンポーネントをコードする発現ベクターのマイクロ流体またはエレクトロポレーション媒介送達を受けた場合よりも０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、または０．１〜４時間早く、細胞内で遺伝子が編集（例えば変異または置換）され得る。
【００３５】
本明細書に開示の各実施形態は、他の開示した実施形態のそれぞれに適用可能なものと企図される。したがって、本明細書に記載の様々な要素のすべての組合せが本発明の範囲内である。
【００３６】
関連する機器、システム、技術、及び物品も記載する。
【００３７】
本明細書に記載する主題の１つ以上の変形の詳細を添付図面及び以下の説明で示す。本明細書に記載する主題の他の特徴及び利点が、説明及び図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】マイクロ流体システムの概略図であり、細胞は狭窄部を通過した後で送達物質（ペイロード）に曝露される。
【図１Ｂ】マイクロ流体システムの概略図であり、細胞は狭窄部を通過した後で送達物質（ペイロード）に曝露される。
【図２Ａ】マイクロ流体システムの実施形態の概略図であり、チャネル深さ、幅、及び長さなどのパラメータを示している。
【図２Ｂ】マイクロ流体システムの実施形態の概略図であり、チャネル深さ、幅、及び長さなどのパラメータを示している。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、図１〜２に示したマイクロ流体デバイスを用いて細胞質に遺伝子編集物質を送達されたＫ５６２レポーター細胞における、一連のフローサイトメトリープロット（図３Ａ）及び組換え効率の棒グラフ（図３Ｂ）である。用いたレポーターについて、細胞株にはフレームシフトＧＦＰ遺伝子が存在する。編集を行うために、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ複合体及びドナーオリゴヌクレオチドが送達されるであろう。複合体はＧＦＰ部位付近を切断し、オリゴヌクレオチドが切断部位に挿入される。オリゴの挿入に成功すると遺伝子が修正され、結果としてＧＦＰ発現が生じるが、それがこの図に見られるものである。したがって、このアッセイにおいて、あるものがオフであったのに対して遺伝子編集によりオンとなった。遺伝子（または文脈に応じてヌクレオチドもしくはその一部）がドナーオリゴヌクレオチドの不在下で欠失していた場合、遺伝子はオフになると予想される。
【図４】ＦＡＣＳを用いて得られた４つの異なる細胞集団についての送達されたデキストランに対するＭＨＣクラス１のβ２ミクログロブリンコンポーネント（Ｂ２Ｍ）発現を示す一連のＦＡＣｓプロットである。９０ｐｓｉで３０−４チップを用いたＲＮＰの送達の結果、エンドサイトーシス対照と比較してＢ２Ｍ発現は５４．４％減少する一方で、９０ｐｓｉで１０−４チップの結果、Ｂ２Ｍ発現の減少は２５．２％となる。ＣＡＳ９対照におけるＢ２Ｍ発現はエンドサイトーシス対照と有意差がない。狭窄部が長いチップの方が、ＲＮＰ複合体の送達が多く、Ｂ２Ｍ発現の減少が大きいという結果になる。
【図５】指定の条件での機能的な編集の尺度としての、ＦＡＣＳによって測定した投与量依存的なＢ２Ｍ発現の減少を示す一連のＦＡＣｓプロットである。
【図６】図６の最初の図面から図６の最後の図面にまで及ぶＦｏｘＰ３ゲノム配列（配列番号５６）を示す。ＦｏｘＰ３に属するエキソンを下線及びハイライトした文字で示す。ＦｏｘＰ３に属していないこの領域内の他のエキソンを下線のないハイライトした文字で示す。
【図７】ＦｏｘＰ３から翻訳されたアミノ酸配列（配列番号５７）を示す。交互にあるエキソンを下線あり及び下線なしで示す。イタリック体の太字はオーバーラップスプライス部位を示す。
【図８】図８の最初の図面から図８の最後の図面にまで及ぶＳＨＰ１ゲノム配列（配列番号５８）を示す。ＳＨＰ１に属するエキソンを下線及びハイライトした文字で示す。ＳＨＰ１に属していないこの領域内の他のエキソンを下線のないハイライトした文字で示す。
【図９】ＳＨＰ１から翻訳されたアミノ酸配列（配列番号５９）を示す。交互にあるエキソンを下線あり及び下線なしで示す。イタリック体の太字はオーバーラップスプライス部位を示す。
【図１０】図１０の最初の図面から図１０の最後の図面にまで及ぶＳＨＰ２ゲノム配列（配列番号６０）を示す。ＳＨＰ２に属するエキソンを下線及びハイライトした文字で示す。配列番号６０は以下の通りでもある。
【図１１】ＳＨＰ２から翻訳されたアミノ酸配列（配列番号６１）を示す。交互にあるエキソンを下線あり及び下線なしで示す。イタリック体の太字はオーバーラップスプライス部位を示す。
【００３９】
（配列番号６０）
2018500913.tif 000003
2018500913.tif 000004
2018500913.tif 000005
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個々の図面における同様の参照記号は同様の要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
タンパク質／核酸複合体またはアセンブリは、その脆弱性及び構造的完全性（例えば３次元コンフォメーション）の要件ゆえに扱うのが困難である。ゲノム編集技術、例えばクラスター化等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などは、細胞の遺伝子コードを変化させる能力に大きな可能性を秘めていることがわかっている。しかし、それらの活性は構造的及び立体配置的完全性に大きく依存する。
【００４１】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は遺伝子編集ツールの部類の例である。これらのキメラヌクレアーゼは、非特異的ＤＮＡ切断ドメインに連結したプログラム可能な配列特異的ＤＮＡ結合モジュールで構成される。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、特定のゲノム位置で誤りがちな非相同末端結合または相同組換え修復を刺激するＤＮＡ二本鎖切断を誘発することによって、広範囲の遺伝子改変を可能とする（Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１（７）：３９７−４０５；参照により本明細書に援用）。
【００４２】
多数の刊行物で、Ｃａｓ９及び／またはｇＲＮＡ及び／またはドナーオリゴヌクレオチド（関連する場合）をコードするためのウイルス、ｍＲＮＡ及びプラスミドの使用について記載されている。こうした方法に対して、本明細書に記載の方法及びシステムは異なる方針、すなわちガイドＲＮＡと複合体化させたタンパク質そのものの送達を用いる。このプロセスは、編集を行うのに細胞が翻訳／転写する必要がないので根本的に異なる。この理由により、またタンパク質／ガイド複合体は短い半減期を有するので、本発明のアプローチの結果、編集がより早く、より効率的となり、オフターゲット効果がより小さくなる。
【００４３】
リポソーム媒介タンパク質送達、マイクロインジェクション、及び細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）などの他のアプローチ
Ｃａｓ−９に融合したＧＦＰを用いるリポソーム媒介タンパク質送達の一例も用いられている（Ｚｕｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：７３−  ８０）。ＧＦＰは、電荷相互作用による従来のリポフェクション剤（例えばリポフェクタミン）との複合体化が可能であり、遺伝子編集反応を媒介すると思われる。このアプローチと比較した本発明の主な利点は、１）融合タンパク質を必要としない、２）毒性、エンドソームエスケープの課題、及び初代細胞へ移入する問題／課題を有し得るリポフェクション剤を必要としないことである。
【００４４】
マイクロインジェクション媒介複合体送達は、極めて低いスループットを特徴とし、ほとんどの哺乳類細胞型で実施するのが困難であり得る。後者の欠点は、胚、すなわち線維芽細胞またはＴ細胞（遺伝子編集の試みに望ましい標的細胞である細胞）よりもはるかに大きい細胞で実施されたという事実により浮き彫りにされている。高スループット及びより小さい初代細胞、例えば線維芽細胞、Ｔ細胞、幹細胞への移入を可能とすることにより、本明細書に記載の方法は大きな利点を有する。
【００４５】
ＣＰＰベースの方策は複合体を必要としない。そのような方策の一例がＲａｍａｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２４（６）：１０２０−７に記載されている。個々のコンポーネントのＣＰＰ媒介送達も欠点を伴う。ＣＰＰをガイド及びＣａｓ９に結合させるには、機能を阻害し、スケーラビリティを制限し得る追加の修飾が必要となる。ＣＰＰ媒介送達はエンドサイトーシスを経ることが知られており、非効率的または多くの初代細胞（特に免疫細胞）において効果がない。
【００４６】
標的細胞及びペイロード組成物
記載の遺伝子編集法を用いて任意の遺伝子を操作することができる。いくつかの標的遺伝子／タンパク質は特に臨床疾患に関連し、そのためそのような標的遺伝子／タンパク質の遺伝子編集は治療に有用である。例としては、Ｃ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の予防；主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）：移植片対宿主病の軽減；分化抗原群１（ＣＤ１）：移植片対宿主病の軽減；プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）タンパク質ファミリー、ＴＬＲタンパク質ファミリー、パターン認識受容体（ＰＲＲ）：エフェクタ−／抗ウイルス反応を促進または抑制する免疫の調節；フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）：Ｔｒｅｇ媒介寛容の除去；分化抗原群８０（ＣＤ８０）、分化抗原群８６（ＣＤ８６）及び他の共刺激分子：寛容を促進する共刺激能のノックアウト；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）：所望の特異性を有するＴ細胞及びＢ細胞の改変を可能とする内因性ＴＣＲまたはＢＣＲの除去；癌遺伝子（例えばＫｒａｓ、Ｍｙｃ、Ｔｐ５３）：癌治療が挙げられる。別の例では、細胞運命を変化させるために転写因子を標的とする、例えばＦｏｘＰ３を欠失させてＴｒｅｇ型機能を除去する。核内因子κＢ（ＮＦ−ｋＢ）、ｔ−ｂｅｔ、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）などを欠失させてＴ細胞分化を変化させる。
【００４７】
フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）のタンパク質コード配列は以下の通りである。
【００４８】
ATGCCCAACCCCAGGCCTGGCAAGCCCTCGGCCCCTTCCTTGGCCCTTGGCCCATCCCCAGGAGCCTCGCCCAGCTGGAGGGCTGCACCCAAAGCCTCAGACCTGCTGGGGGCCCGGGGCCCAGGGGGAACCTTCCAGGGCCGAGATCTTCGAGGCGGGGCCCATGCCTCCTCTTCTTCCTTGAACCCCATGCCACCATCGCAGCTGCAGCTGCCCACACTGCCCCTAGTCATGGTGGCACCCTCCGGGGCACGGCTGGGCCCCTTGCCCCACTTACAGGCACTCCTCCAGGACAGGCCACATTTCATGCACCAGCTCTCAACGGTGGATGCCCACGCCCGGACCCCTGTGCTGCAGGTGCACCCCCTGGAGAGCCCAGCCATGATCAGCCTCACACCACCCACCACCGCCACTGGGGTCTTCTCCCTCAAGGCCCGGCCTGGCCTCCCACCTGGGATCAACGTGGCCAGCCTGGAATGGGTGTCCAGGGAGCCGGCACTGCTCTGCACCTTCCCAAATCCCAGTGCACCCAGGAAGGACAGCACCCTTTCGGCTGTGCCCCAGAGCTCCTACCCACTGCTGGCAAATGGTGTCTGCAAGTGGCCCGGATGTGAGAAGGTCTTCGAAGAGCCAGAGGACTTCCTCAAGCACTGCCAGGCGGACCATCTTCTGGATGAGAAGGGCAGGGCACAATGTCTCCTCCAGAGAGAGATGGTACAGTCTCTGGAGCAGCAGCTGGTGCTGGAGAAGGAGAAGCTGAGTGCCATGCAGGCCCACCTGGCTGGGAAAATGGCACTGACCAAGGCTTCATCTGTGGCATCATCCGACAAGGGCTCCTGCTGCATCGTAGCTGCTGGCAGCCAAGGCCCTGTCGTCCCAGCCTGGTCTGGCCCCCGGGAGGCCCCTGACAGCCTGTTTGCTGTCCGGAGGCACCTGTGGGGTAGCCATGGAAACAGCACATTCCCAGAGTTCCTCCACAACATGGACTACTTCAAGTTCCACAACATGCGACCCCCTTTCACCTACGCCACGCTCATCCGCTGGGCCATCCTGGAGGCTCCAGAGAAGCAGCGGACACTCAATGAGATCTACCACTGGTTCACACGCATGTTTGCCTTCTTCAGAAACCATCCTGCCACCTGGAAGAACGCCATCCGCCACAACCTGAGTCTGCACAAGTGCTTTGTGCGGGTGGAGAGCGAGAAGGGGGCTGTGTGGACCGTGGATGAGCTGGAGTTCCGCAAGAAACGGAGCCAGAGGCCCAGCAGGTGTTCCAACCCTACACCTGGCCCCTGA
（配列番号６２）
【００４９】
Ｓｒｃ相同領域２ドメイン含有ホスファターゼ１（ＳＨＰ１）はチロシン−タンパク質ホスファターゼ非受容体６型（ＰＴＰＮ６）としても知られている。ＳＨＰ１のタンパク質コード配列は以下の通りである。
【００５０】
ATGGTGAGGTGGTTTCACCGAGACCTCAGTGGGCTGGATGCAGAGACCCTGCTCAAGGGCCGAGGTGTCCACGGTAGCTTCCTGGCTCGGCCCAGTCGCAAGAACCAGGGTGACTTCTCGCTCTCCGTCAGGGTGGGGGATCAGGTGACCCATATTCGGATCCAGAACTCAGGGGATTTCTATGACCTGTATGGAGGGGAGAAGTTTGCGACTCTGACAGAGCTGGTGGAGTACTACACTCAGCAGCAGGGTGTCCTGCAGGACCGCGACGGCACCATCATCCACCTCAAGTACCCGCTGAACTGCTCCGATCCCACTAGTGAGAGGTGGTACCATGGCCACATGTCTGGCGGGCAGGCAGAGACGCTGCTGCAGGCCAAGGGCGAGCCCTGGACGTTTCTTGTGCGTGAGAGCCTCAGCCAGCCTGGAGACTTCGTGCTTTCTGTGCTCAGTGACCAGCCCAAGGCTGGCCCAGGCTCCCCGCTCAGGGTCACCCACATCAAGGTCATGTGCGAGGGTGGACGCTACACAGTGGGTGGTTTGGAGACCTTCGACAGCCTCACGGACCTGGTGGAGCATTTCAAGAAGACGGGGATTGAGGAGGCCTCAGGCGCCTTTGTCTACCTGCGGCAGCCGTACTATGCCACGAGGGTGAATGCGGCTGACATTGAGAACCGAGTGTTGGAACTGAACAAGAAGCAGGAGTCCGAGGATACAGCCAAGGCTGGCTTCTGGGAGGAGTTTGAGAGTTTGCAGAAGCAGGAGGTGAAGAACTTGCACCAGCGTCTGGAAGGGCAGCGGCCAGAGAACAAGGGCAAGAACCGCTACAAGAACATTCTCCCCTTTGACCACAGCCGAGTGATCCTGCAGGGACGGGACAGTAACATCCCCGGGTCCGACTACATCAATGCCAACTACATCAAGAACCAGCTGCTAGGCCCTGATGAGAACGCTAAGACCTACATCGCCAGCCAGGGTTGTCTGGAGGCCACGGTCAATGACTTCTGGCAGATGGCGTGGCAGGAGAACAGCCGTGTCATCGTCATGACCACCCGAGAGGTGGAGAAAGGCCGGAACAAATGCGTCCCATACTGGCCCGAGGTGGGCATGCAGCGTGCTTATGGGCCCTACTCTGTGACCAACTGCGGGGAGCATGACACAACCGAATACAAACTCCGTACCTTACAGGTCTCCCCGCTGGACAATGGAGACCTGATTCGGGAGATCTGGCATTACCAGTACCTGAGCTGGCCCGACCATGGGGTCCCCAGTGAGCCTGGGGGTGTCCTCAGCTTCCTGGACCAGATCAACCAGCGGCAGGAAAGTCTGCCTCACGCAGGGCCCATCATCGTGCACTGCAGCGCCGGCATCGGCCGCACAGGCACCATCATTGTCATCGACATGCTCATGGAGAACATCTCCACCAAGGGCCTGGACTGTGACATTGACATCCAGAAGACCATCCAGATGGTGCGGGCGCAGCGCTCGGGCATGGTGCAGACGGAGGCGCAGTACAAGTTCATCTACGTGGCCATCGCCCAGTTCATTGAAACCACTAAGAAGAAGCTGGAGGTCCTGCAGTCGCAGAAGGGCCAGGAGTCGGAGTACGGGAACATCACCTATCCCCCAGCCATGAAGAATGCCCATGCCAAGGCCTCCCGCACCTCGTCCAAGAGCTTGGAGTCTAGTGCAGGGACCGTGGCTGCGTCACCTGTGAGACGGGGTGGCCAGAGGGGACTGCCAGTGCCGGGTCCCCCTGTGCTGTCTCCTGACCTGCACCAACTGCCTGTACTTGCCCCCCTGCACCCGGCTGCAGACACAAGGAGGATGTGTATGAGAACCTGCACACTAAGAACAAGAGGGAGGAGAAAGTGA
（配列番号６３）
【００５１】
Ｓｒｃ相同領域２ドメイン含有ホスファターゼ１（ＳＨＰ２）はチロシン−タンパク質ホスファターゼ非受容体１１型（ＰＴＰＮ１１）としても知られている。ＳＨＰ２のタンパク質コード配列は以下の通りである。
【００５２】
ATGACATCGCGGAGATGGTTTCACCCAAATATCACTGGTGTGGAGGCAGAAAACCTACTGTTGACAAGAGGAGTTGATGGCAGTTTTTTGGCAAGGCCTAGTAAAAGTAACCCTGGAGACTTCACACTTTCCGTTAGAAGAAATGGAGCTGTCACCCACATCAAGATTCAGAACACTGGTGATTACTATGACCTGTATGGAGGGGAGAAATTTGCCACTTTGGCTGAGTTGGTCCAGTATTACATGGAACATCACGGGCAATTAAAAGAGAAGAATGGAGATGTCATTGAGCTTAAATATCCTCTGAACTGTGCAGATCCTACCTCTGAAAGGTGGTTTCATGGACATCTCTCTGGGAAAGAAGCAGAGAAATTATTAACTGAAAAAGGAAAACATGGTAGTTTTCTTGTACGAGAGAGCCAGAGCCACCCTGGAGATTTTGTTCTTTCTGTGCGCACTGGTGATGACAAAGGGGAGAGCAATGACGGCAAGTCTAAAGTGACCCATGTTATGATTCGCTGTCAGGAACTGAAATACGACGTTGGTGGAGGAGAACGGTTTGATTCTTTGACAGATCTTGTGGAACATTATAAGAAGAATCCTATGGTGGAAACATTGGGTACAGTACTACAACTCAAGCAGCCCCTTAACACGACTCGTATAAATGCTGCTGAAATAGAAAGCAGAGTTCGAGAACTAAGCAAATTAGCTGAGACCACAGATAAAGTCAAACAAGGCTTTTGGGAAGAATTTGAGACACTACAACAACAGGAGTGCAAACTTCTCTACAGCCGAAAAGAGGGTCAAAGGCAAGAAAACAAAAACAAAAATAGATATAAAAACATCCTGCCCTTTGATCATACCAGGGTTGTCCTACACGATGGTGATCCCAATGAGCCTGTTTCAGATTACATCAATGCAAATATCATCATGCCTGAATTTGAAACCAAGTGCAACAATTCAAAGCCCAAAAAGAGTTACATTGCCACACAAGGCTGCCTGCAAAACACGGTGAATGACTTTTGGCGGATGGTGTTCCAAGAAAACTCCCGAGTGATTGTCATGACAACGAAAGAAGTGGAGAGAGGAAAGAGTAAATGTGTCAAATACTGGCCTGATGAGTATGCTCTAAAAGAATATGGCGTCATGCGTGTTAGGAACGTCAAAGAAAGCGCCGCTCATGACTATACGCTAAGAGAACTTAAACTTTCAAAGGTTGGACAAGGGAATACGGAGAGAACGGTCTGGCAATACCACTTTCGGACCTGGCCGGACCACGGCGTGCCCAGCGACCCTGGGGGCGTGCTGGACTTCCTGGAGGAGGTGCACCATAAGCAGGAGAGCATCATGGATGCAGGGCCGGTCGTGGTGCACTGCAGTGCTGGAATTGGCCGGACAGGGACGTTCATTGTGATTGATATTCTTATTGACATCATCAGAGAGAAAGGTGTTGACTGCGATATTGACGTTCCCAAAACCATCCAGATGGTGCGGTCTCAGAGGTCAGGGATGGTCCAGACAGAAGCACAGTACCGATTTATCTATATGGCGGTCCAGCATTATATTGAAACACTACAGCGCAGGATTGAAGAAGAGCAGAAAAGCAAGAGGAAAGGGCACGAATATACAAATATTAAGTATTCTCTAGCGGACCAGACGAGTGGAGATCAGAGCCCTCTCCCGCCTTGTACTCCAACGCCACCCTGTGCAGAAATGAGAGAAGACAGTGCTAGAGTCTATGAAAACGTGGGCCTGATGCAACAGCAGAAAAGTTTCAGATGA
（配列番号６４）
【００５３】
他の標的としては、プラスミドまたはドナーＤＮＡを挿入することができ、その結果、標的細胞が新たな遺伝子、例えば組換えＴＣＲ、組換えＢＣＲ、キメラ抗原受容体、蛍光タンパク質、リプログラミング因子を発現することができるゲノムの領域が挙げられる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、コーディング領域のゲノム配列を編集する。ある実施形態において、非コーディング領域のゲノム配列を編集する。
【００５５】
ＦｏｘＰ３に関する様々な実施形態において、ＦｏｘＰ３の上流の遺伝子領域が編集され得る。そのような実施形態において、Ｆｏｘｐ３の転写抑制因子が結合し得る領域を編集する。例えば、ＦｏｘＰ３転写開始部位の約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、０．５〜２．５、または０．５〜５ｋｂ上流の部位が編集され得る。
【００５６】
被検者の治療
本発明の態様は、複数の被検者細胞のゲノムの編集に関する。様々な実施形態において、被検者から細胞を取り出し、本主題の方法を用いて遺伝子編集複合体を取り込ませ、その後、被検者に再び導入し戻す。例えば、本明細書に記載の遺伝子編集複合体の送達を伴うプロセスにおいて変異細胞が生成され得る。変異細胞は変異させた対立遺伝子、疾患に関与する遺伝子がヘテロ接合型であってもよく、ホモ接合型であってもよい。ある実施形態において、変異細胞は疾患に関与する遺伝子の機能が喪失している。
【００５７】
骨髄由来の幹細胞（例えば造血幹細胞）、または全血中の循環免疫細胞などの細胞が、本明細書に記載の方法及びデバイスを用いて処理され得る。細胞は、病原体（例えばウイルス性もしくは細菌性病原体など）または毒素（例えば微生物性病原体毒素など）に対する受容体の発現を減少させるように遺伝子改変され得る。遺伝子編集タンパク質複合体またはそのコンポーネントは発現させる必要なく標的細胞内に直接導入され得るので、導入遺伝子の送達が必要ない。このアプローチは、異常な発現、挿入、及びサイレンシング、ならびに導入遺伝子コピー数の不定な送達に悩まされる従来の遺伝子治療アプローチに勝る重要な利点を有する。
【００５８】
一実施形態において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染している被検者の血液（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞など）または骨髄細胞（例えば造血幹細胞など）に、Ｃ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）遺伝子を標的とする遺伝子編集複合体を導入する。遺伝子編集複合体は、ＣＣＲ５遺伝子を変異させ、その結果、遺伝子編集複合体を取り込んだ細胞がＣＣＲ５を発現することがなくなるか、またはＣＣＲ５を低いレベルで発現するように設計され得る。一例において、ＨＩＶに結合するＣＣＲ５の型を発現する（またはＣＣＲ５を発現する子孫細胞を生成する）造血幹細胞を被検者から取り出し、ＨＩＶに結合するＣＣＲ５の型を発現することがないように改変し、その後、被検者に移植する。別の例では、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＨＩＶに結合するＣＣＲ５の型を発現することがないように、本明細書に記載の方法及びデバイスを用いて、被検者のＣＣＲ５発現ＣＤ４＋Ｔ細胞に遺伝子編集複合体を取り込ませる。その後、改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を被検者に戻す。ＣＤ４＋Ｔ細胞のそのような処理は被検者の全血で実施され得る。これらの及び他の実施形態において、ＨＩＶが結合するＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ４）を発現することがないように、骨髄細胞または血液細胞を改変する。同様に、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（腺ペスト）またはＶａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒ（天然痘）に関連する感染を治療または予防するために、被検者の細胞がＣＣＲ５発現を減少させるように改変され得る。
【００５９】
本明細書に開示の方法及びデバイスによって改変した細胞を有するヒト以外の被検者も規定する。そのような被検者としては、非ヒト脊椎動物、両生類、哺乳類、及び霊長類被検者が挙げられる。非限定例としては、Ｄａｎｉｏ  ｓｐ．、Ｆｕｇｕ  ｓｐ．、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｓｐ．、Ｍｕｓ  ｓｐ．、Ｒａｔｔｕｓ  ｓｐ．などが挙げられる。
【００６０】
細胞内への遺伝子編集タンパク質及び複合体の導入
予め形成したタンパク質複合体の送達により、研究している細胞を遺伝子改変することなく細胞プロセスの研究が可能となる。本主題は、細胞にＣＲＩＳＰＲをはじめとするタンパク質複合体及び遺伝子編集複合体を送達するのに有用である。
【００６１】
本明細書に記載の方法及びデバイスを用いてタンパク質複合体を送達する利点としては、細胞及びタンパク質複合体の機能の研究用の試験剤の制御された一時的な導入が挙げられる。導入遺伝子の発現及び複合体コンポーネントの細胞アセンブリが必要ではないので、複合体機能のタイミング及び比（タンパク質：ＲＮＡ）を制御することができる。加えて、オフターゲット効果または副次効果をもたらし得る長期発現ではなく、送達の一過性の性質により、一時的な機能に起因する変化の観察が可能となる。インビボホーミングの観点及び遺伝子発現様式から、マイクロ流体送達ではエレクトロポレーションよりも処理する細胞への副作用がはるかに少ない（１０倍）。
【００６２】
例えば、マイクロ流体送達の結果、エレクトロポレーションと比較して、異常な及び非特異的な遺伝子発現の変化が少なくなる。加えて、マイクロ流体的に圧搾した細胞の構造的及び機能的完全性は、エレクトロポレーション媒介カーゴ送達と比較して保持される。一例として、エクスビボでマイクロ流体送達に供した（その後被検者体内に導入した）Ｔ細胞は、エレクトロポレーションを受けたＴ細胞と比較してリンパ節にホーミングする数が多い。エレクトロポレーションによって処理され、その後被検者に投与された細胞（例えばＴ細胞）は、マイクロ流体送達によって処理された細胞と比較して、被検者から除去される可能性がより高い。そのようなクリアランスは、そのような細胞を体による破壊またはクリアランスに対して標識するエレクトロポレーション後の改変／異常遺伝子発現に関係している。
【００６３】
標的細胞及びペイロード組成物
マイクロ流体デバイスを用いて、任意の真核細胞、例えばヒトなどの哺乳類細胞を処理し、標的細胞のサイトゾル中へのタンパク質／核酸複合体またはアセンブリの導入のために細胞膜を変化させることができる。例示的な標的細胞としては、リンパ球／免疫細胞：ＤＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、好中球、好塩基球、好酸球、自然リンパ球、単球、マクロファージ、造血幹細胞、リンパ球系共通前駆細胞；幹細胞：胚性、間葉系、人工多能性；他の初代細胞：線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、ニューロン、上皮、表皮、内皮、膵島細胞；及び細胞株、例えば疾患研究のための細胞株：Ｔ細胞クローン、ジャーカット細胞、ヒーラ細胞、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。原核細胞を処理することもできる。デバイスの狭窄部の寸法は、処理しようとする細胞型に応じて調整する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞である。真核細胞の非限定例としては、原生動物、藻類、真菌、酵母、植物、動物、脊椎動物、無脊椎動物、節足動物、哺乳類、げっ歯類、霊長類、及びヒト細胞が挙げられる。細胞は、例えば単細胞生物または多細胞生物の細胞であり得る。細胞は、例えば初代真核細胞または不死化真核細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は癌細胞である。ある実施形態において、細胞はヒト細胞以外である。例えば、癌を治療するための組成物及び／または癌の治療方法もしくは癌を治療するための組成物の調製方法は、本明細書に記載の遺伝子編集方法を用いて、腫瘍細胞からの免疫抑制シグナルの発現／産生を減少させるように免疫細胞を処理することを含む。例としては、腫瘍に対する免疫活性を増加させるための減少またはＳＨＰ−２ノックアウトが挙げられる。
【００６５】
様々な実施形態において、細胞は２種以上の細胞型の混合物であり得る、または複数の細胞は２種以上の細胞型の混合物であり得る。細胞型の混合物は複数の細胞型（例えば本明細書に開示したもの２種以上など）の共培養物、または天然で一緒に存在する細胞型の混合物、例えば全血などであり得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、細胞は末梢血単核細胞である。様々な実施形態において、細胞懸濁液は精製された細胞集団を含む。ある実施形態において、細胞は初代細胞または細胞株細胞である。
【００６７】
いくつかの実施形態において、細胞は血液細胞である。いくつかの実施形態において、血液細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はリンパ球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、または好中球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は適応免疫細胞、例えばＴ細胞及びＢ細胞などである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は先天性免疫細胞である。例示的な先天性免疫細胞としては、自然リンパ球（ＩＬＣ；ＩＬＣ１、ＩＬＣ２、ＩＬＣ３）、好塩基球、好酸球、肥満細胞、ＮＫ細胞、好中球、及び単球が挙げられる。いくつかの実施形態において、免疫細胞はメモリー細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は初代ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はマウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、サル、またはウサギ細胞である。
【００６８】
いくつかの実施形態において、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞懸濁液はヒト細胞以外の細胞または非哺乳類細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞はニワトリ、カエル、昆虫、または線虫細胞である。
【００６９】
細胞を浸し／インキュベートし、デバイスを通して細胞を処理する溶液として、任意の生理学的に適合性のまたは細胞適合性のバッファー系を用いることができる。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）。低血清または無血清培地またはバッファー組成物が好ましい。バッファーまたは培地は、標的細胞の健康もしくは生存力及び／または遺伝子発現への効果を維持及び保存することに基づいて選択する。例えば、場合によっては、バッファー中のカルシウムの存在はｍＲＮＡ発現を促進または補助するのに望ましい。
【００７０】
ペイロード組成物は、タンパク質−核酸複合体またはアセンブリを含む。例示的な複合体は、上記の遺伝子編集システム、例えばヌクレアーゼ／ガイド核酸結合体またはアセンブリのコンポーネントまたはモジュールを含む。例えば、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９モル比は１：１００，０００〜１００，０００：１の範囲であり、例えば好ましい範囲は１：１０〜１０：１、例えば１：１または１：２、２：１である。送達を容易にするバッファー中の複合体濃度（モル濃度）は典型的には１００ｍＭ〜１ｎＭ、例えば１０ｕＭ〜１００ｎＭの範囲である。複合体は、狭窄部を通過する前またはその後で細胞と混合させることができる。
【００７１】
遺伝子編集複合体のマイクロ流体送達
効果的な遺伝子編集操作を行うために、例えばマイクロ流体プラットフォーム（例えば２０１４年４月１７日に出願された米国特許出願公開第２０１４０２８７５０９号；２０１４年８月１５日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５１３４３号；２０１５年１１月１３日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６０６８９号；及び２０１５年１０月３０日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５８４８９号に記載、それぞれ参照により本明細書に援用）を用いた機械的変形によって、Ｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ９タンパク質など）、ガイドＲＮＡ及びドナーＤＮＡを細胞に送達することができる。
【００７２】
図１〜２は、ゲノム編集タンパク質、ＲＮＡ、及びＤＮＡの送達に用いることのできるマイクロ流体システムの例を示す。マイクロ流体システム５は管状の内腔を画定するチャネル１０を含む。マイクロ流体チャネル１０は、好ましくは一度に１つの標的細胞２０のみが狭窄部１５を通過することができるように構成された狭窄部１５を含む。好ましくは、細胞２０は、送達物質３０も含む溶液バッファー２５中に懸濁されてチャネル１０を通過するが、細胞２０が狭窄部１５を通過した後に送達物質を溶液バッファー２５に加えることもできる。細胞２０が狭窄部１５に接近して通過する際に、狭窄部１５により細胞２０に圧力（例えば機械的圧縮）がかかり、細胞２０を圧搾する（例えば細胞２０１として示す）。狭窄部１５によって細胞にかかる圧力は細胞膜に摂動（例えば孔）を引き起こす（例えば細胞２０２）。細胞が狭窄部１５を通過すると、細胞２０は孔を通して、送達物質３０を含め溶液バッファー２５中の物質を取り込み始める（例えば細胞２０３）。細胞膜は時間の経過とともに修復し、送達物質３０の少なくとも一部は好ましくは細胞内に捕捉されたままとなる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、デバイスは、約５μｍ〜約５０μｍまたはこの間の任意の長さもしくは長さの範囲の狭窄部長さを備える。例えば、狭窄部長さは、約５μｍ〜約４０μｍ、約５μｍ〜約３０μｍ、約５μｍ〜約２０μｍ、または約５μｍ〜約１０μｍの範囲である。いくつかの実施形態において、狭窄部長さは、約１０μｍ〜約５０μｍ、約２０μｍ〜約５０μｍ、約３０μｍ〜約５０μｍ、または約４０μｍ〜約５０μｍの範囲である。いくつかの実施形態において、狭窄部深さは約２ｕｍ〜約２００ｕｍの範囲、またはこの間の任意の深さもしくは深さの範囲である。例えば、狭窄部深さは、約２μｍ〜約１５０μｍ、約２μｍ〜約１００μｍ、約２μｍ〜約５０μｍ、約２μｍ〜約２５μｍ、約２μｍ〜約１５μｍ、または約２μｍ〜約１０μｍの範囲である。いくつかの実施形態において、狭窄部深さは、約１０μｍ〜約２００μｍ、約２５μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約１００μｍ〜約２００μｍ、または約１５０μｍ〜約２００μｍの範囲である。いくつかの実施形態において、狭窄部の入口または出口部分の角度は約０度〜約９０度の範囲またはこの間の任意の角度もしくは角度の範囲である。例えば、角度は約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、または約９０度以上である。いくつかの実施形態において、圧力は約５０ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉの範囲、またはこの間の任意の圧力もしくは圧力の範囲である。例えば、圧力は約５０ｐｓｉ〜約１５０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ〜約１２５ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ〜約１００ｐｓｉ、または約５０ｐｓｉ〜約７５ｐｓｉの範囲である。いくつかの実施形態において、圧力は約７５ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉ、約１００ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉ、約１２５ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉ、約１５０ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉ、または約１７５ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉの範囲である。いくつかの実施形態において、デバイスは約２μｍ〜約１０μｍまたはこの間の任意の幅もしくは幅の範囲の狭窄部幅を備える。例えば、狭窄部幅は約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、または約７μｍのいずれか１つとすることができる。
【００７４】
以下に記載するデータは以下の物質及び方法を用いて得た。複合体は以下の通り作製した：Ｃａｓ９タンパク質で標識した１ｍｇ／ｍｌ核局在化シグナル（ＮＬＳ）１０μｌを１ｍｇ／ｍｌガイドＲＮＡ５μｌと混合する。２０分間氷上でインキュベートして複合体を形成させる。送達のために、無血清培地に１千万細胞／ｍｌで標的細胞を懸濁する。デバイス処理の直前に、複合体濃度が約０．１５ｍｇ／ｍｌとなるように細胞及びＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を混合する。標的細胞型に特異的な圧力、温度、チップデザイン及びバッファー条件を用いて、細胞をデバイスによって処理する。例えば、初代ヒトＴ細胞については、圧力はおよそ１００ｐｓｉであり、氷上で３０μｍの長さ、４μｍの幅の狭窄部を通す。２分間の処理後インキュベーションの後、細胞を培地で希釈し、洗浄して未送達複合体を除去する。その後、細胞を培養して遺伝子編集を発生させる（例えば１、２、５、１２、２４時間またはこれより長く（非臨床用途については、期間はアッセイ読取りに依存する、例えば２４時間以降））。臨床用途、例えば患者治療については、細胞はデバイス処理の直後に患者に注入し戻され得る。任意により、患者レシピエントへの細胞の注入前に、一定時間（例えば１、２、５、１２、２４時間またはこれより長く）細胞をインビトロでインキュベートする。分子の温度、濃度、繰り返しは標的細胞型に応じて異なる。
【００７５】
図３は、図１〜２に示したマイクロ流体デバイスを用いて細胞質に遺伝子編集物質を送達されたＫ５６２レポーター細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（登録商標）ＣＣＬ−２４３（商標）、慢性骨髄性白血病の患者に由来する骨髄由来細胞；リンパ芽球形態）における、一連のフローサイトメトリープロット及び組換え効率の棒グラフである。上はタンパク質Ｃａｓ９、部位特異的ｇＲＮＡ、及びドナーオリゴヌクレオチドが送達されたＫ５６２レポーター細胞のフローサイトメトリープロットである。ＣＲＩＳＰＲ複合体は約１５０ｋＤａである。これらのレポーター細胞はｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有していたので、通常であればプロットのＱ１に現れる。ドナーオリゴヌクレオチドの部位特異的ＤＮＡ切断及び挿入が成功すれば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現をもたらす、すなわち細胞はＱ２に現れる。下は、エンドサイトーシス（取込み）及び未処理（ＮＣ）対照と比較した、複数のデバイス条件についてのフローサイトメトリーに基づく組換え効率の定量化である。細胞圧搾によるＣａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ及びドナーＤＮＡの送達の結果、レポーター細胞株のゲノムの変化に成功した。これらのデータは、機械的細胞破砕による遺伝子編集コンポーネントの（複合体またはアセンブリの形態での）送達によって、効果的にゲノムの変化がもたらされることを示す。
【００７６】
ＴＡＬＥＮタンパク質もしくはｍＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＤＮＡを切断可能な任意の他の酵素の送達も、細胞膜の機械的破砕によって細胞の細胞質に送達することができる。例示的なＴＡＬＥＮゲノム編集システムは、例示的なＴＡＬＥＮタンパク質を含め、Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  １２，  ２３８−２５１に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  １２，  ２３８−２５１は、１５塩基対配列を認識する包括的ＴＡＬＥＮアミノ酸配列の非限定例を記載している。包括的ＴＡＬＥＮアミノ酸配列の非限定例は以下である。
2018500913.tif 000035
（配列番号６５）
2018500913.tif 000036
（配列番号６６）
【００７７】
配列番号６５及び６６において、Ｃを認識するにはＸＸ＝ＨＤ；Ｔを認識するにはＸＸ＝ＮＧ；Ａを認識するにはＸＸ＝ＮＩ；及びＧを認識するにはＸＸ＝ＮＮ、ただし最後の位置のみＸＸ＝ＮＫである。下線はＴＡＬエフェクタ−のＮ末端及びＣ末端を示す。
【００７８】
上記では少数の変形しか詳細に記載していないが、他の修正または追加が可能である。例えば、遺伝子編集物質には、細胞膜の機械的破砕によって細胞の細胞質に送達されるＴＡＬＥＮタンパク質、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＤＮＡを切断可能な任意の他の酵素を含めることができる。
【００７９】
複合体形態のＲＮＡ及びＣａｓ９の送達
得られた結果は、遺伝子複合体のマイクロ流体送達による遺伝子編集の成功を妨げる可能性のあった多数の要因を鑑みると驚くべきものであった。例えば、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、遺伝子編集機能及び／または存続を阻害したであろうＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）媒介または他のＰＲＲ（パターン認識受容体）媒介反応を引き起こす可能性があったが、この潜在的な問題は観察されなかった。細胞質に入っても複合体が安定である保証はないので、分解し、機能しなくなる可能性があったが、驚くべきことに、送達された複合体は変わらず編集することができた。
【００８０】
遺伝子編集複合体の完全性は、細胞へのマイクロ流体ベースの細胞圧搾送達を用いて保存された。複合体はｇＲＮＡのみまたはタンパク質のみと同じ物理的／化学的特性を有せず、そのため、その個々のコンポーネントに対して複合体の送達という状況において、送達プロセスが同様に振る舞うかどうかは不確実であった。複合体はその構成要素よりも大きく安定性が低い。複合体は、例えばせん断力によって分解し得る。加えて、機能する、または細胞標的に作用する機会を得る前に何らかの他の要素が複合体を分解し得るので、複合体は膜通過を経て、またはサイトゾル内で存続しない場合がある。複合体は、送達される複合体の能力に影響を及ぼし得る異なる電荷分布も有する。形状ひいては輸送特性も複合体構成要素と比較して変化し得る。本送達方法では複合体の構造的及び機能的完全性が首尾よく保存された。
【００８１】
送達プロセスに関与するせん断力は、タンパク質／ｇＲＮＡ複合体を破壊し、機能させなくしていた可能性もあったが、驚くべきことに、本送達システムは細胞内に複合体を導入するのに効果的であり、遺伝子編集は変わらず行われた。ＮＬＳを有する非複合体Ｃａｓ（例えばＣａｓ９など）タンパク質のみと比較して、複合体が核局在化挙動を変わらず有するかも明らかではなかったが、上記の遺伝子発現結果に実証されるように挙動及び機能はプロセス全体を通して保存されていた。
【００８２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは当該技術分野において公知である。２０１４年４月１５日に発行された米国特許第８，６９７，３５９号にこのシステムの非限定態様が記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
【００８３】
Ｃａｓタンパク質の非限定例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、またはこれらの改変型が挙げられる。これらの酵素は公知であり、例えば、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースで受託番号Ｑ９９ＺＷ２の下に見出され得る。いくつかの実施形態において、非改変ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤＮＡ切断活性、例えばＣａｓ９などを有する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＣａｓ９であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は標的配列の位置、例えば標的配列内及び／または標的配列の相補鎖内などで一方または両方の鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはこれより多くの塩基対以内で、一方または両方の鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態において、ベクターが、変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。例えば、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメインのアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（片方の鎖のみ切断）にＣａｓ９を変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例としては、限定はしないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが挙げられる。本発明の態様において、ニッカーゼは相同組換えを介したゲノム編集に用いられ得る。
【００８４】
Ｃａｓ９アミノ酸及びｃＤＮＡ配列の非限定例を以下に示す。
【００８５】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースで受託番号Ｑ９９ＺＷ２の下に見出され得る。このアミノ酸配列は以下である。
【００８６】
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
（配列番号１）
【００８７】
配列番号１はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｃｈｉｖｅで受託番号ＡＡＫ３３９３６．２の下に見出される以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００８８】
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA
（配列番号２）
【００８９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースで受託番号Ｑ０３ＪＩ６．１の下に見出され得る。Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３９：９２７５−９２８２も参照。このアミノ酸配列は以下である。
【００９０】
MTKPYSIGLDIGTNSVGWAVTTDNYKVPSKKMKVLGNTSKKYIKKNLLGVLLFDSGITAEGRRLKRTARRRYTRRRNRILYLQEIFSTEMATLDDAFFQRLDDSFLVPDDKRDSKYPIFGNLVEEKAYHDEFPTIYHLRKYLADSTKKADLRLVYLALAHMIKYRGHFLIEGEFNSKNNDIQKNFQDFLDTYNAIFESDLSLENSKQLEEIVKDKISKLEKKDRILKLFPGEKNSGIFSEFLKLIVGNQADFRKCFNLDEKASLHFSKESYDEDLETLLGYIGDDYSDVFLKAKKLYDAILLSGFLTVTDNETEAPLSSAMIKRYNEHKEDLALLKEYIRNISLKTYNEVFKDDTKNGYAGYIDGKTNQEDFYVYLKKLLAEFEGADYFLEKIDREDFLRKQRTFDNGSIPYQIHLQEMRAILDKQAKFYPFLAKNKERIEKILTFRIPYYVGPLARGNSDFAWSIRKRNEKITPWNFEDVIDKESSAEAFINRMTSFDLYLPEEKVLPKHSLLYETFNVYNELTKVRFIAESMRDYQFLDSKQKKDIVRLYFKDKRKVTDKDIIEYLHAIYGYDGIELKGIEKQFNSSLSTYHDLLNIINDKEFLDDSSNEAIIEEIIHTLTIFEDREMIKQRLSKFENIFDKSVLKKLSRRHYTGWGKLSAKLINGIRDEKSGNTILDYLIDDGISNRNFMQLIHDDALSFKKKIQKAQIIGDEDKGNIKEVVKSLPGSPAIKKGILQSIKIVDELVKVMGGRKPESIVVEMARENQYTNQGKSNSQQRLKRLEKSLKELGSKILKENIPAKLSKIDNNALQNDRLYLYYLQNGKDMYTGDDLDIDRLSNYDIDHIIPQAFLKDNSIDNKVLVSSASNRGKSDDVPSLEVVKKRKTFWYQLLKSKLISQRKFDNLTKAERGGLSPEDKAGFIQRQLVETRQITKHVARLLDEKFNNKKDENNRAVRTVKIITLKSTLVSQFRKDFELYKVREINDFHHAHDAYLNAVVASALLKKYPKLEPEFVYGDYPKYNSFRERKSATEKVYFYSNIMNIFKKSISLADGRVIERPLIEVNEETGESVWNKESDLATVRRVLSYPQVNVVKKVEEQNHGLDRGKPKGLFNANLSSKPKPNSNENLVGAKEYLDPKKYGGYAGISNSFTVLVKGTIEKGAKKKITNVLEFQGISILDRINYRKDKLNFLLEKGYKDIELIIELPKYSLFELSDGSRRMLASILSTNNKRGEIHKGNQIFLSQKFVKLLYHAKRISNTINENHRKYVENHKKEFEELFYYILEFNENYVGAKKNGKLLNSAFQSWQNHSIDELCSSFIGPTGSERKGLFELTSRGSAADFEFLGVKIPRYRDYTPSSLLKDATLIHQSVTGLYETRIDLAKLGEG
（配列番号３）
【００９１】
配列番号３はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｃｈｉｖｅで受託番号ＡＢＪ６６６３６．１の下に見出される以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００９２】
ATGACTAAGCCATACTCAATTGGACTTGATATTGGAACGAATAGTGTTGGATGGGCTGTAACAACTGATAATTACAAGGTTCCGTCTAAAAAAATGAAAGTCTTAGGAAATACGAGTAAAAAGTATATCAAAAAGAACCTGTTAGGTGTATTACTCTTTGACTCTGGAATCACAGCAGAAGGAAGAAGATTGAAGCGTACTGCAAGAAGACGTTATACTAGACGCCGTAATCGTATCCTTTATTTGCAGGAAATTTTTAGCACAGAGATGGCTACATTAGATGATGCTTTCTTTCAAAGACTTGACGATTCGTTTTTAGTTCCTGATGATAAACGTGATAGTAAGTATCCGATATTTGGAAACTTAGTAGAAGAAAAAGCCTATCATGATGAATTTCCAACTATCTATCATTTAAGGAAATATTTAGCAGATAGTACTAAAAAAGCAGATTTGCGTCTAGTTTATCTTGCATTGGCTCATATGATTAAATATAGAGGTCACTTCTTAATTGAAGGAGAGTTTAATTCAAAAAATAATGATATTCAGAAGAATTTTCAAGACTTTTTGGACACTTATAATGCTATTTTTGAATCGGATTTATCACTTGAGAATAGTAAACAACTTGAGGAAATTGTTAAAGATAAGATTAGTAAATTAGAAAAGAAAGATCGTATTTTAAAACTCTTCCCTGGGGAGAAGAATTCGGGGATTTTTTCAGAGTTTCTAAAGTTGATTGTAGGAAATCAAGCTGATTTTAGGAAATGTTTTAATTTAGACGAAAAAGCCTCCTTACATTTTTCCAAAGAAAGCTATGATGAAGATTTAGAGACTTTGTTAGGTTATATTGGAGATGATTACAGTGATGTCTTTCTCAAAGCAAAGAAACTTTATGATGCTATTCTTTTATCGGGTTTTCTGACTGTAACTGATAATGAGACAGAAGCACCTCTCTCTTCTGCTATGATAAAGCGATATAATGAACACAAAGAAGATTTAGCGTTACTAAAGGAATATATAAGAAATATTTCACTAAAAACGTATAATGAAGTATTTAAAGATGACACCAAAAATGGTTATGCTGGTTATATTGATGGAAAAACAAATCAGGAAGATTTCTACGTATATCTAAAAAAACTATTGGCTGAATTTGAAGGTGCGGATTATTTTCTTGAAAAAATTGATCGAGAAGATTTTTTGAGAAAGCAACGTACATTTGACAATGGTTCGATACCATATCAGATTCATCTTCAAGAAATGAGAGCAATTCTTGATAAGCAAGCTAAATTTTATCCTTTCTTGGCTAAAAATAAAGAAAGAATCGAGAAGATTTTAACCTTCCGAATTCCTTATTATGTAGGTCCACTTGCGAGAGGGAATAGTGATTTTGCCTGGTCAATAAGAAAACGAAATGAAAAAATTACACCTTGGAATTTTGAGGACGTTATTGACAAAGAATCTTCGGCAGAGGCCTTCATTAATCGAATGACTAGTTTTGATTTGTATTTGCCAGAAGAGAAGGTACTTCCAAAGCATAGTCTCTTATACGAAACTTTTAATGTATATAATGAATTAACAAAAGTTAGATTTATTGCCGAAAGTATGAGAGATTATCAATTTTTAGATAGTAAGCAGAAGAAAGATATTGTTAGACTTTATTTTAAAGATAAAAGGAAAGTTACTGATAAGGATATTATTGAATATTTACATGCAATTTATGGGTATGATGGAATTGAATTAAAAGGCATAGAGAAACAGTTTAATTCTAGTTTATCTACTTATCACGATCTTTTAAATATTATTAATGATAAAGAGTTTTTGGATGATAGTTCAAATGAAGCGATTATCGAAGAAATTATCCATACTTTGACAATTTTTGAAGATAGAGAGATGATAAAACAACGTCTTTCAAAATTTGAGAATATATTCGATAAATCCGTTTTGAAAAAGTTATCTCGTAGACATTACACTGGCTGGGGTAAGTTATCTGCTAAGCTTATTAATGGTATTCGAGATGAAAAATCTGGTAATACTATTCTTGATTACTTAATTGATGATGGTATTTCTAACCGTAATTTCATGCAACTTATTCACGATGATGCTCTTTCTTTTAAAAAGAAGATACAGAAAGCACAAATTATTGGTGACGAAGATAAAGGTAATATTAAAGAGGTCGTTAAGTCTTTGCCAGGTAGTCCTGCGATTAAAAAAGGTATTTTACAAAGCATAAAAATTGTAGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGAGGAAGAAAACCCGAGTCAATTGTTGTTGAGATGGCTCGTGAAAATCAATATACCAATCAAGGTAAGTCTAATTCCCAACAACGCTTGAAACGTTTAGAAAAATCTCTCAAAGAGTTAGGTAGTAAGATACTTAAGGAAAATATTCCTGCAAAACTTTCTAAAATAGACAATAACGCACTTCAAAATGATCGACTTTACTTATACTATCTTCAAAATGGAAAAGATATGTATACCGGAGATGATTTAGATATTGATAGATTAAGTAATTATGATATTGATCATATTATTCCTCAAGCTTTTTTGAAAGATAATTCTATTGACAATAAAGTACTTGTTTCATCTGCTAGTAACCGTGGTAAATCAGATGATGTTCCAAGTTTAGAGGTTGTCAAAAAAAGAAAGACATTTTGGTATCAATTATTGAAATCAAAATTAATTTCTCAACGAAAATTTGATAATCTGACAAAAGCTGAACGGGGAGGATTGTCACCTGAGGACAAAGCTGGTTTTATTCAACGCCAGTTGGTTGAAACACGTCAAATAACAAAACATGTAGCTCGTTTACTTGATGAGAAATTTAATAATAAAAAAGATGAAAATAATAGAGCGGTACGAACAGTAAAAATTATTACCTTGAAATCTACCTTAGTTTCTCAATTTCGTAAGGATTTTGAACTTTATAAAGTTCGTGAAATCAATGATTTTCATCATGCTCATGATGCTTACTTGAATGCCGTTGTAGCAAGTGCTTTACTTAAGAAATACCCTAAACTAGAGCCAGAATTTGTGTACGGTGATTATCCAAAATACAATAGTTTTAGAGAAAGAAAGTCCGCTACAGAAAAGGTATATTTCTATTCAAATATCATGAATATCTTTAAAAAATCTATTTCTTTAGCTGATGGTAGAGTTATTGAAAGACCACTTATTGAGGTAAATGAGGAGACCGGCGAATCCGTTTGGAATAAAGAATCTGATTTAGCAACTGTAAGGAGAGTACTCTCTTATCCGCAAGTAAATGTTGTGAAAAAAGTTGAGGAACAGAATCACGGATTGGATAGAGGAAAACCAAAGGGATTGTTTAATGCAAATCTTTCCTCAAAGCCAAAACCAAATAGTAATGAAAATTTAGTAGGTGCTAAAGAGTATCTTGACCCCAAAAAGTATGGGGGGTATGCTGGAATTTCTAATTCTTTTACTGTTCTTGTTAAAGGGACAATTGAAAAAGGTGCTAAGAAAAAAATAACAAATGTACTAGAATTTCAAGGTATTTCTATTTTAGATAGGATTAATTATAGAAAAGATAAACTTAATTTTTTACTTGAAAAAGGTTATAAAGATATTGAGTTAATTATTGAACTACCTAAATATAGTTTATTTGAACTTTCAGATGGTTCACGTCGTATGTTGGCTAGTATTTTGTCAACGAATAATAAGAGGGGAGAGATTCACAAAGGAAATCAGATTTTTCTTTCACAGAAGTTTGTGAAATTACTTTATCATGCTAAGAGAATAAGTAACACAATTAATGAGAATCATAGAAAATATGTTGAGAACCATAAAAAAGAGTTTGAAGAATTATTTTACTACATTCTTGAGTTTAATGAGAATTATGTTGGAGCTAAAAAGAATGGTAAACTCTTAAACTCTGCCTTTCAATCTTGGCAAAATCATAGTATAGATGAACTCTGTAGTAGTTTTATAGGACCTACCGGAAGTGAAAGAAAGGGGCTATTTGAATTAACCTCTCGTGGAAGTGCTGCTGATTTTGAATTTTTAGGTGTTAAAATTCCAAGGTATAGAGACTATACCCCATCATCCCTATTAAAAGATGCCACACTTATTCATCAATCTGTTACAGGCCTCTATGAAACACGAATAGACCTTGCCAAACTAGGAGAGGGTTAA
（配列番号４）
【００９３】
核局在化シグナル（ＧＧＳＧＰＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号５）をそのＣ末端に含むＣａｓ９タンパク質の一例は以下のアミノ酸配列を有する。
【００９４】
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGSGPPKKKRKV
（配列番号６）
【００９５】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列（複数可）、例えばＤＮＡ標的のセンス及びアンチセンス鎖をそれぞれ標的とする２つのガイド配列とともに用いられ得る。この組合せにより、両方の鎖がニックされ、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を誘発するのに用いられることが可能となる。
【００９６】
さらなる例として、すべてのＤＮＡ切断活性が実質的に欠失している変異Ｃａｓ９を生成するように、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、及びＲｕｖＣ  ＩＩＩ）が変異させられ得る。いくつかの実施形態において、Ｄ１０Ａ変異をＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせて、すべてのＤＮＡ切断活性が実質的に欠失しているＣａｓ９酵素を生成する（ここでアミノ酸番号は配列番号１の通りである）。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、変異酵素のＤＮＡ切断活性がその非変異形態に対して約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％未満、またはこれより低い場合、すべてのＤＮＡ切断活性が実質的に欠失していると考えられる。他の変異が有用である場合もあり、Ｃａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ酵素がＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ以外の種由来の場合、類似の効果を得るために対応するアミノ酸の変異がなされ得る。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば真核細胞などでの発現に最適化されたコドンである。真核細胞は、特定の生物、例えば限定はしないがヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類をはじめとした哺乳類などのものまたは由来するものであり得る。一般に、コドン最適化は、対象とする宿主細胞における発現を強化するために、元のアミノ酸配列を維持しながら、元の配列の少なくとも１つのコドン（例えば約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上、またはこれより多くのコドン）を、その宿主細胞の遺伝子に用いられる頻度がより高いまたは最も高いコドンで置換することによって、核酸配列を改変するプロセスのことをいう。様々な種が特定のアミノ酸の決まったコドンに特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用頻度の差）はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関があることが多く、そしてまた、この効率はとりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内で選ばれたｔＲＮＡが圧倒的多数を占めているのは一般に、ペプチド合成に使用される頻度が最も高いコドンを反映している。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適遺伝子発現に遺伝子を適合させることができる。コドン使用頻度表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に利用可能であり、これらの表は様々な方法で応用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：  ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００”  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：２９２  （２０００）を参照。特定の宿主細胞における発現に対して特定の配列をコドン最適化するコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、例えばＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；  Ｊａｃｏｂｕｓ，  Ｐａ．）なども利用可能である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列における１つ以上のコドン（例えば１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上、またはすべてのコドン）が、特定のアミノ酸に対して使用される頻度が最も高いコドンと一致する。
【００９８】
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するための、標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適アラインメントした場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上またはこれより高い。最適アラインメントは、配列をアラインメントする任意の好適なアルゴリズムを用いて決定され得るが、その非限定例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づいたアルゴリズム（例えばＢｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ガイド配列は約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５以上またはこれより多いヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、ガイド配列は約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２未満、またはこれより少ないヌクレオチドの長さである。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイによって評価され得る。例えば、試験しようとするガイド配列を含め、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネントが、例えばＣＲＩＳＰＲ配列のコンポーネントをコードするベクターの形質移入などによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に与えられ、その後、例えば本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどによって標的配列内の選択的切断が評価され得る。標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体のコンポーネント及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を準備し、試験用及び対照用のガイド配列の反応間の標的配列における結合または切断率を比較することによって、試験管内でも同様に評価され得る。他のアッセイも可能であり、当業者であれば考え付くであろう。
【００９９】
ガイド配列は任意の標的配列を標的化するように選択され得る。いくつかの実施形態において、標的配列は細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列としては、標的ゲノムに特有のものが挙げられる。例えば、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９について、ゲノム中の特有の標的配列には、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ型のＣａｓ９標的部位が含まれ得るが、この場合、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘはデオキシヌクレオチドとすることができる）はゲノム中で一度しか出現しない。ゲノム中の特有の標的配列には、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ型のＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９標的部位が含まれ得るが、この場合、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘはデオキシヌクレオチドとすることができる）はゲノム中で一度しか出現しない。Ｓ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ１  Ｃａｓ９について、ゲノム中の特有の標的配列には、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号７）型のＣａｓ９標的部位が含まれ得るが、この場合、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号８）（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘはデオキシヌクレオチドとすることができ、ＷはＡまたはＴである）はゲノム中で一度しか出現しない。ゲノム中の特有の標的配列には、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号９）型のＳ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ１  Ｃａｓ９標的部位が含まれ得るが、この場合、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号１０）（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘはデオキシヌクレオチドとすることができ、ＷはＡまたはＴである）はゲノム中で一度しか出現しない。Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９について、ゲノム中の特有の標的配列には、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ型のＣａｓ９標的部位が含まれ得るが、この場合、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘはデオキシヌクレオチドとすることができる）はゲノム中で一度しか出現しない。ゲノム中の特有の標的配列には、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ型のＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９標的部位が含まれ得るが、この場合、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、Ｘはデオキシヌクレオチドとすることができる）はゲノム中で一度しか出現しない。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」はＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣであってよく、配列を特有なものとして識別する際に考慮する必要はない。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ガイド配列内の二次構造の程度を減少させるようにガイド配列を選択する。二次構造は、任意の好適なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって確認され得る。いくつかのプログラムは最小ギブス自由エネルギーの計算に基づいている。そのようなアルゴリズムの１つの例はｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ及びＳｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ９  （１９８１），  １３３−１４８）によって記載されている。別の例のフォールディングアルゴリズムは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＶｉｅｎｎａのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙで開発された、重心構造予測アルゴリズムを用いたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えばＡ．  Ｒ．  Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｃｅｌｌ  １０６（１）：  ２３−２４；及びＰＡ  Ｃａｒｒ  ａｎｄ  ＧＭ  Ｃｈｕｒｃｈ，  ２００９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（１２）：  １１５１−６２を参照）。米国特許出願第６１／８３６，０８０号（参照により本明細書に援用）にさらなるアルゴリズムが見出され得る。
【０１０１】
本主題の態様は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ／Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  １由来ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｐｆ１）遺伝子編集複合体またはそのコンポーネント（例えばＣＰｆ１タンパク質）の送達に関する。ヒトコドン最適化Ｃｐｆ１ファミリータンパク質の例を以下に示す。
【０１０２】
ヒトコドン最適化Ｃｐｆ１ファミリータンパク質
Ｃｐｆ１ファミリータンパク質配列の非限定例、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１遺伝子編集の態様が、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １６３，  ７５９−  ７７１，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２２，  ２０１５に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０１０３】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１；ｐＹ００４）：
【０１０４】
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNNKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号１１）
【０１０５】
配列番号１１は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１０６】
配列番号１１は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１０７】
ATGAGCATCTACCAGGAGTTCGTCAACAAGTATTCACTGAGTAAGACACTGCGGTTCGAGCTGATCCCACAGGGCAAGACACTGGAGAACATCAAGGCCCGAGGCCTGATTCTGGACGATGAGAAGCGGGCAAAAGACTATAAGAAAGCCAAGCAGATCATTGATAAATACCACCAGTTCTTTATCGAGGAAATTCTGAGCTCCGTGTGCATCAGTGAGGATCTGCTGCAGAATTACTCAGACGTGTACTTCAAGCTGAAGAAGAGCGACGATGACAACCTGCAGAAGGACTTCAAGTCCGCCAAGGACACCATCAAGAAACAGATTAGCGAGTACATCAAGGACTCCGAAAAGTTTAAAAATCTGTTCAACCAGAATCTGATCGATGCTAAGAAAGGCCAGGAGTCCGACCTGATCCTGTGGCTGAAACAGTCTAAGGACAATGGGATTGAACTGTTCAAGGCTAACTCCGATATCACTGATATTGACGAGGCACTGGAAATCATCAAGAGCTTCAAGGGATGGACCACATACTTTAAAGGCTTCCACGAGAACCGCAAGAACGTGTACTCCAGCAACGACATTCCTACCTCCATCATCTACCGAATCGTCGATGACAATCTGCCAAAGTTCCTGGAGAACAAGGCCAAATATGAATCTCTGAAGGACAAAGCTCCCGAGGCAATTAATTACGAACAGATCAAGAAAGATCTGGCTGAGGAACTGACATTCGATATCGACTATAAGACTAGCGAGGTGAACCAGAGGGTCTTTTCCCTGGACGAGGTGTTTGAAATCGCCAATTTCAACAATTACCTGAACCAGTCCGGCATTACTAAATTCAATACCATCATTGGCGGGAAGTTTGTGAACGGGGAGAATACCAAGCGCAAGGGAATTAACGAATACATCAATCTGTATAGCCAGCAGATCAACGACAAAACTCTGAAGAAATACAAGATGTCTGTGCTGTTCAAACAGATCCTGAGTGATACCGAGTCCAAGTCTTTTGTCATTGATAAACTGGAAGATGACTCAGACGTGGTCACTACCATGCAGAGCTTTTATGAGCAGATCGCCGCTTTCAAGACAGTGGAGGAAAAATCTATTAAGGAAACTCTGAGTCTGCTGTTCGATGACCTGAAAGCCCAGAAGCTGGACCTGAGTAAGATCTACTTCAAAAACGATAAGAGTCTGACAGACCTGTCACAGCAGGTGTTTGATGACTATTCCGTGATTGGGACCGCCGTCCTGGAGTACATTACACAGCAGATCGCTCCAAAGAACCTGGATAATCCCTCTAAGAAAGAGCAGGAACTGATCGCTAAGAAAACCGAGAAGGCAAAATATCTGAGTCTGGAAACAATTAAGCTGGCACTGGAGGAGTTCAACAAGCACAGGGATATTGACAAACAGTGCCGCTTTGAGGAAATCCTGGCCAACTTCGCAGCCATCCCCATGATTTTTGATGAGATCGCCCAGAACAAAGACAATCTGGCTCAGATCAGTATTAAGTACCAGAACCAGGGCAAGAAAGACCTGCTGCAGGCTTCAGCAGAAGATGACGTGAAAGCCATCAAGGATCTGCTGGACCAGACCAACAATCTGCTGCACAAGCTGAAAATCTTCCATATTAGTCAGTCAGAGGATAAGGCTAATATCCTGGATAAAGACGAACACTTCTACCTGGTGTTCGAGGAATGTTACTTCGAGCTGGCAAACATTGTCCCCCTGTATAACAAGATTAGGAACTACATCACACAGAAGCCTTACTCTGACGAGAAGTTTAAACTGAACTTCGAAAATAGTACCCTGGCCAACGGGTGGGATAAGAACAAGGAGCCTGACAACACAGCTATCCTGTTCATCAAGGATGACAAGTACTATCTGGGAGTGATGAATAAGAAAAACAATAAGATCTTCGATGACAAAGCCATTAAGGAGAACAAAGGGGAAGGATACAAGAAAATCGTGTATAAGCTGCTGCCCGGCGCAAATAAGATGCTGCCTAAGGTGTTCTTCAGCGCCAAGAGTATCAAATTCTACAACCCATCCGAGGACATCCTGCGGATTAGAAATCACTCAACACATACTAAGAACGGGAGCCCCCAGAAGGGATATGAGAAATTTGAGTTCAACATCGAGGATTGCAGGAAGTTTATTGACTTCTACAAGCAGAGCATCTCCAAACACCCTGAATGGAAGGATTTTGGCTTCCGGTTTTCCGACACACAGAGATATAACTCTATCGACGAGTTCTACCGCGAGGTGGAAAATCAGGGGTATAAGCTGACTTTTGAGAACATTTCTGAAAGTTACATCGACAGCGTGGTCAATCAGGGAAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAACAAAGATTTTTCAGCATACAGCAAGGGCAGACCAAACCTGCATACACTGTACTGGAAGGCCCTGTTCGATGAGAGGAATCTGCAGGACGTGGTCTATAAACTGAACGGAGAGGCCGAACTGTTTTACCGGAAGCAGTCTATTCCTAAGAAAATCACTCACCCAGCTAAGGAGGCCATCGCTAACAAGAACAAGGACAATCCTAAGAAAGAGAGCGTGTTCGAATACGATCTGATTAAGGACAAGCGGTTCACCGAAGATAAGTTCTTTTTCCATTGTCCAATCACCATTAACTTCAAGTCAAGCGGCGCTAACAAGTTCAACGACGAGATCAATCTGCTGCTGAAGGAAAAAGCAAACGATGTGCACATCCTGAGCATTGACCGAGGAGAGCGGCATCTGGCCTACTATACCCTGGTGGATGGCAAAGGGAATATCATTAAGCAGGATACATTCAACATCATTGGCAATGACCGGATGAAAACCAACTACCACGATAAACTGGCTGCAATCGAGAAGGATAGAGACTCAGCTAGGAAGGACTGGAAGAAAATCAACAACATTAAGGAGATGAAGGAAGGCTATCTGAGCCAGGTGGTCCATGAGATTGCAAAGCTGGTCATCGAATACAATGCCATTGTGGTGTTCGAGGATCTGAACTTCGGCTTTAAGAGGGGGCGCTTTAAGGTGGAAAAACAGGTCTATCAGAAGCTGGAGAAAATGCTGATCGAAAAGCTGAATTACCTGGTGTTTAAAGATAACGAGTTCGACAAGACCGGAGGCGTCCTGAGAGCCTACCAGCTGACAGCTCCCTTTGAAACTTTCAAGAAAATGGGAAAACAGACAGGCATCATCTACTATGTGCCAGCCGGATTCACTTCCAAGATCTGCCCCGTGACCGGCTTTGTCAACCAGCTGTACCCTAAATATGAGTCAGTGAGCAAGTCCCAGGAATTTTTCAGCAAGTTCGATAAGATCTGTTATAATCTGGACAAGGGGTACTTCGAGTTTTCCTTCGATTACAAGAACTTCGGCGACAAGGCCGCTAAGGGGAAATGGACCATTGCCTCCTTCGGATCTCGCCTGATCAACTTTCGAAATTCCGATAAAAACCACAATTGGGACACTAGGGAGGTGTACCCAACCAAGGAGCTGGAAAAGCTGCTGAAAGACTACTCTATCGAGTATGGACATGGCGAATGCATCAAGGCAGCCATCTGTGGCGAGAGTGATAAGAAATTTTTCGCCAAGCTGACCTCAGTGCTGAATACAATCCTGCAGATGCGGAACTCAAAGACCGGGACAGAACTGGACTATCTGATTAGCCCCGTGGCTGATGTCAACGGAAACTTCTTCGACAGCAGACAGGCACCCAAAAATATGCCTCAGGATGCAGACGCCAACGGGGCCTACCACATCGGGCTGAAGGGACTGATGCTGCTGGGCCGGATCAAGAACAATCAGGAGGGGAAGAAGCTGAACCTGGTCATTAAGAACGAGGAATACTTCGAGTTTGTCCAGAATAGAAATAACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号１４）
【０１０８】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＣ２０１７（Ｌｂ３Ｃｐｆ１；ｐＹ００５）：
【０１０９】
MDYGNGQFERRAPLTKTITLRLKPIGETRETIREQKLLEQDAAFRKLVETVTPIVDDCIRKIADNALCHFGTEYDFSCLGNAISKNDSKAIKKETEKVEKLLAKVLTENLPDGLRKVNDINSAAFIQDTLTSFVQDDADKRVLIQELKGKTVLMQRFLTTRITALTVWLPDRVFENFNIFIENAEKMRILLDSPLNEKIMKFDPDAEQYASLEFYGQCLSQKDIDSYNLIISGIYADDEVKNPGINEIVKEYNQQIRGDKDESPLPKLKKLHKQILMPVEKAFFVRVLSNDSDARSILEKILKDTEMLPSKIIEAMKEADAGDIAVYGSRLHELSHVIYGDHGKLSQIIYDKESKRISELMETLSPKERKESKKRLEGLEEHIRKSTYTFDELNRYAEKNVMAAYIAAVEESCAEIMRKEKDLRTLLSKEDVKIRGNRHNTLIVKNYFNAWTVFRNLIRILRRKSEAEIDSDFYDVLDDSVEVLSLTYKGENLCRSYITKKIGSDLKPEIATYGSALRPNSRWWSPGEKFNVKFHTIVRRDGRLYYFILPKGAKPVELEDMDGDIECLQMRKIPNPTIFLPKLVFKDPEAFFRDNPEADEFVFLSGMKAPVTITRETYEAYRYKLYTVGKLRDGEVSEEEYKRALLQVLTAYKEFLENRMIYADLNFGFKDLEEYKDSSEFIKQVETHNTFMCWAKVSSSQLDDLVKSGNGLLFEIWSERLESYYKYGNEKVLRGYEGVLLSILKDENLVSMRTLLNSRPMLVYRPKESSKPMVVHRDGSRVVDRFDKDGKYIPPEVHDELYRFFNNLLIKEKLGEKARKILDNKKVKVKVLESERVKWSKFYDEQFAVTFSVKKNADCLDTTKDLNAEVMEQYSESNRLILIRNTTDILYYLVLDKNGKVLKQRSLNIINDGARDVDWKERFRQVTKDRNEGYNEWDYSRTSNDLKEVYLNYALKEIAEAVIEYNAILIIEKMSNAFKDKYSFLDDVTFKGFETKLLAKLSDLHFRGIKDGEPCSFTNPLQLCQNDSNKILQDGVIFMVPNSMTRSLDPDTGFIFAINDHNIRTKKAKLNFLSKFDQLKVSSEGCLIMKYSGDSLPTHNTDNRVWNCCCNHPITNYDRETKKVEFIEEPVEELSRVLEENGIETDTELNKLNERENVPGKVVDAIYSLVLNYLRGTVSGVAGQRAVYYSPVTGKKYDISFIQAMNLNRKCDYYRIGSKERGEWTDFVAQLINKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号１５）
【０１１０】
配列番号１５は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１１１】
配列番号１５は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１１２】
ATGGATTACGGCAACGGCCAGTTTGAGCGGAGAGCCCCCCTGACCAAGACAATCACCCTGCGCCTGAAGCCTATCGGCGAGACACGGGAGACAATCCGCGAGCAGAAGCTGCTGGAGCAGGACGCCGCCTTCAGAAAGCTGGTGGAGACAGTGACCCCTATCGTGGACGATTGTATCAGGAAGATCGCCGATAACGCCCTGTGCCACTTTGGCACCGAGTATGACTTCAGCTGTCTGGGCAACGCCATCTCTAAGAATGACAGCAAGGCCATCAAGAAGGAGACAGAGAAGGTGGAGAAGCTGCTGGCCAAGGTGCTGACCGAGAATCTGCCAGATGGCCTGCGCAAGGTGAACGACATCAATTCCGCCGCCTTTATCCAGGATACACTGACCTCTTTCGTGCAGGACGATGCCGACAAGCGGGTGCTGATCCAGGAGCTGAAGGGCAAGACCGTGCTGATGCAGCGGTTCCTGACCACACGGATCACAGCCCTGACCGTGTGGCTGCCCGACAGAGTGTTCGAGAACTTTAATATCTTCATCGAGAACGCCGAGAAGATGAGAATCCTGCTGGACTCCCCTCTGAATGAGAAGATCATGAAGTTTGACCCAGATGCCGAGCAGTACGCCTCTCTGGAGTTCTATGGCCAGTGCCTGTCTCAGAAGGACATCGATAGCTACAACCTGATCATCTCCGGCATCTATGCCGACGATGAGGTGAAGAACCCTGGCATCAATGAGATCGTGAAGGAGTACAATCAGCAGATCCGGGGCGACAAGGATGAGTCCCCACTGCCCAAGCTGAAGAAGCTGCACAAGCAGATCCTGATGCCAGTGGAGAAGGCCTTCTTTGTGCGCGTGCTGTCTAACGACAGCGATGCCCGGAGCATCCTGGAGAAGATCCTGAAGGACACAGAGATGCTGCCCTCCAAGATCATCGAGGCCATGAAGGAGGCAGATGCAGGCGACATCGCCGTGTACGGCAGCCGGCTGCACGAGCTGAGCCACGTGATCTACGGCGATCACGGCAAGCTGTCCCAGATCATCTATGACAAGGAGTCCAAGAGGATCTCTGAGCTGATGGAGACACTGTCTCCAAAGGAGCGCAAGGAGAGCAAGAAGCGGCTGGAGGGCCTGGAGGAGCACATCAGAAAGTCTACATACACCTTCGACGAGCTGAACAGGTATGCCGAGAAGAATGTGATGGCAGCATACATCGCAGCAGTGGAGGAGTCTTGTGCCGAGATCATGAGAAAGGAGAAGGATCTGAGGACCCTGCTGAGCAAGGAGGACGTGAAGATCCGGGGCAACAGACACAATACACTGATCGTGAAGAACTACTTTAATGCCTGGACCGTGTTCCGGAACCTGATCAGAATCCTGAGGCGCAAGTCCGAGGCCGAGATCGACTCTGACTTCTACGATGTGCTGGACGATTCCGTGGAGGTGCTGTCTCTGACATACAAGGGCGAGAATCTGTGCCGCAGCTATATCACCAAGAAGATCGGCTCCGACCTGAAGCCCGAGATCGCCACATACGGCAGCGCCCTGAGGCCTAACAGCCGCTGGTGGTCCCCAGGAGAGAAGTTTAATGTGAAGTTCCACACCATCGTGCGGAGAGATGGCCGGCTGTACTATTTCATCCTGCCCAAGGGCGCCAAGCCTGTGGAGCTGGAGGACATGGATGGCGACATCGAGTGTCTGCAGATGAGAAAGATCCCTAACCCAACAATCTTTCTGCCCAAGCTGGTGTTCAAGGACCCTGAGGCCTTCTTTAGGGATAATCCAGAGGCCGACGAGTTCGTGTTTCTGAGCGGCATGAAGGCCCCCGTGACAATCACCAGAGAGACATACGAGGCCTACAGGTATAAGCTGTATACCGTGGGCAAGCTGCGCGATGGCGAGGTGTCCGAAGAGGAGTACAAGCGGGCCCTGCTGCAGGTGCTGACCGCCTACAAGGAGTTTCTGGAGAACAGAATGATCTATGCCGACCTGAATTTCGGCTTTAAGGATCTGGAGGAGTATAAGGACAGCTCCGAGTTTATCAAGCAGGTGGAGACACACAACACCTTCATGTGCTGGGCCAAGGTGTCTAGCTCCCAGCTGGACGATCTGGTGAAGTCTGGCAACGGCCTGCTGTTCGAGATCTGGAGCGAGCGCCTGGAGTCCTACTATAAGTACGGCAATGAGAAGGTGCTGCGGGGCTATGAGGGCGTGCTGCTGAGCATCCTGAAGGATGAGAACCTGGTGTCCATGCGGACCCTGCTGAACAGCCGGCCCATGCTGGTGTACCGGCCAAAGGAGTCTAGCAAGCCTATGGTGGTGCACCGGGATGGCAGCAGAGTGGTGGACAGGTTTGATAAGGACGGCAAGTACATCCCCCCTGAGGTGCACGACGAGCTGTATCGCTTCTTTAACAATCTGCTGATCAAGGAGAAGCTGGGCGAGAAGGCCCGGAAGATCCTGGACAACAAGAAGGTGAAGGTGAAGGTGCTGGAGAGCGAGAGAGTGAAGTGGTCCAAGTTCTACGATGAGCAGTTTGCCGTGACCTTCAGCGTGAAGAAGAACGCCGATTGTCTGGACACCACAAAGGACCTGAATGCCGAAGTGATGGAGCAGTATAGCGAGTCCAACAGACTGATCCTGATCAGGAATACCACAGATATCCTGTACTATCTGGTGCTGGACAAGAATGGCAAGGTGCTGAAGCAGAGATCCCTGAACATCATCAATGACGGCGCCAGGGATGTGGACTGGAAGGAGAGGTTCCGCCAGGTGACAAAGGATAGAAACGAGGGCTACAATGAGTGGGATTATTCCAGGACCTCTAACGACCTGAAGGAGGTGTACCTGAATTATGCCCTGAAGGAGATCGCCGAGGCCGTGATCGAGTACAACGCCATCCTGATCATCGAGAAGATGTCTAATGCCTTTAAGGACAAGTATAGCTTCCTGGACGACGTGACCTTCAAGGGCTTCGAGACAAAGCTGCTGGCCAAGCTGAGCGATCTGCACTTTAGGGGCATCAAGGACGGCGAGCCATGTTCCTTCACAAACCCCCTGCAGCTGTGCCAGAACGATTCTAATAAGATCCTGCAGGACGGCGTGATCTTTATGGTGCCAAATTCTATGACACGGAGCCTGGACCCCGACACCGGCTTCATCTTTGCCATCAACGACCACAATATCAGGACCAAGAAGGCCAAGCTGAACTTTCTGAGCAAGTTCGATCAGCTGAAGGTGTCCTCTGAGGGCTGCCTGATCATGAAGTACAGCGGCGATTCCCTGCCTACACACAACACCGACAATCGCGTGTGGAACTGCTGTTGCAATCACCCAATCACAAACTATGACCGGGAGACAAAGAAGGTGGAGTTCATCGAGGAGCCCGTGGAGGAGCTGTCCCGCGTGCTGGAGGAGAATGGCATCGAGACAGACACCGAGCTGAACAAGCTGAATGAGCGGGAGAACGTGCCTGGCAAGGTGGTGGATGCCATCTACTCTCTGGTGCTGAATTATCTGCGCGGCACAGTGAGCGGAGTGGCAGGACAGAGGGCCGTGTACTATAGCCCTGTGACCGGCAAGAAGTACGATATCTCCTTTATCCAGGCCATGAACCTGAATAGGAAGTGTGACTACTATAGGATCGGCTCCAAGGAGAGGGGAGAGTGGACCGATTTCGTGGCCCAGCTGATCAACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
【０１１３】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ（ＢｐＣｐｆ１；ｐＹ００６）：
【０１１４】
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNNKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号１７）
【０１１５】
配列番号１７は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１１６】
配列番号１７は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１１７】
ATGAGCATCTACCAGGAGTTCGTCAACAAGTATTCACTGAGTAAGACACTGCGGTTCGAGCTGATCCCACAGGGCAAGACACTGGAGAACATCAAGGCCCGAGGCCTGATTCTGGACGATGAGAAGCGGGCAAAAGACTATAAGAAAGCCAAGCAGATCATTGATAAATACCACCAGTTCTTTATCGAGGAAATTCTGAGCTCCGTGTGCATCAGTGAGGATCTGCTGCAGAATTACTCAGACGTGTACTTCAAGCTGAAGAAGAGCGACGATGACAACCTGCAGAAGGACTTCAAGTCCGCCAAGGACACCATCAAGAAACAGATTAGCGAGTACATCAAGGACTCCGAAAAGTTTAAAAATCTGTTCAACCAGAATCTGATCGATGCTAAGAAAGGCCAGGAGTCCGACCTGATCCTGTGGCTGAAACAGTCTAAGGACAATGGGATTGAACTGTTCAAGGCTAACTCCGATATCACTGATATTGACGAGGCACTGGAAATCATCAAGAGCTTCAAGGGATGGACCACATACTTTAAAGGCTTCCACGAGAACCGCAAGAACGTGTACTCCAGCAACGACATTCCTACCTCCATCATCTACCGAATCGTCGATGACAATCTGCCAAAGTTCCTGGAGAACAAGGCCAAATATGAATCTCTGAAGGACAAAGCTCCCGAGGCAATTAATTACGAACAGATCAAGAAAGATCTGGCTGAGGAACTGACATTCGATATCGACTATAAGACTAGCGAGGTGAACCAGAGGGTCTTTTCCCTGGACGAGGTGTTTGAAATCGCCAATTTCAACAATTACCTGAACCAGTCCGGCATTACTAAATTCAATACCATCATTGGCGGGAAGTTTGTGAACGGGGAGAATACCAAGCGCAAGGGAATTAACGAATACATCAATCTGTATAGCCAGCAGATCAACGACAAAACTCTGAAGAAATACAAGATGTCTGTGCTGTTCAAACAGATCCTGAGTGATACCGAGTCCAAGTCTTTTGTCATTGATAAACTGGAAGATGACTCAGACGTGGTCACTACCATGCAGAGCTTTTATGAGCAGATCGCCGCTTTCAAGACAGTGGAGGAAAAATCTATTAAGGAAACTCTGAGTCTGCTGTTCGATGACCTGAAAGCCCAGAAGCTGGACCTGAGTAAGATCTACTTCAAAAACGATAAGAGTCTGACAGACCTGTCACAGCAGGTGTTTGATGACTATTCCGTGATTGGGACCGCCGTCCTGGAGTACATTACACAGCAGATCGCTCCAAAGAACCTGGATAATCCCTCTAAGAAAGAGCAGGAACTGATCGCTAAGAAAACCGAGAAGGCAAAATATCTGAGTCTGGAAACAATTAAGCTGGCACTGGAGGAGTTCAACAAGCACAGGGATATTGACAAACAGTGCCGCTTTGAGGAAATCCTGGCCAACTTCGCAGCCATCCCCATGATTTTTGATGAGATCGCCCAGAACAAAGACAATCTGGCTCAGATCAGTATTAAGTACCAGAACCAGGGCAAGAAAGACCTGCTGCAGGCTTCAGCAGAAGATGACGTGAAAGCCATCAAGGATCTGCTGGACCAGACCAACAATCTGCTGCACAAGCTGAAAATCTTCCATATTAGTCAGTCAGAGGATAAGGCTAATATCCTGGATAAAGACGAACACTTCTACCTGGTGTTCGAGGAATGTTACTTCGAGCTGGCAAACATTGTCCCCCTGTATAACAAGATTAGGAACTACATCACACAGAAGCCTTACTCTGACGAGAAGTTTAAACTGAACTTCGAAAATAGTACCCTGGCCAACGGGTGGGATAAGAACAAGGAGCCTGACAACACAGCTATCCTGTTCATCAAGGATGACAAGTACTATCTGGGAGTGATGAATAAGAAAAACAATAAGATCTTCGATGACAAAGCCATTAAGGAGAACAAAGGGGAAGGATACAAGAAAATCGTGTATAAGCTGCTGCCCGGCGCAAATAAGATGCTGCCTAAGGTGTTCTTCAGCGCCAAGAGTATCAAATTCTACAACCCATCCGAGGACATCCTGCGGATTAGAAATCACTCAACACATACTAAGAACGGGAGCCCCCAGAAGGGATATGAGAAATTTGAGTTCAACATCGAGGATTGCAGGAAGTTTATTGACTTCTACAAGCAGAGCATCTCCAAACACCCTGAATGGAAGGATTTTGGCTTCCGGTTTTCCGACACACAGAGATATAACTCTATCGACGAGTTCTACCGCGAGGTGGAAAATCAGGGGTATAAGCTGACTTTTGAGAACATTTCTGAAAGTTACATCGACAGCGTGGTCAATCAGGGAAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAACAAAGATTTTTCAGCATACAGCAAGGGCAGACCAAACCTGCATACACTGTACTGGAAGGCCCTGTTCGATGAGAGGAATCTGCAGGACGTGGTCTATAAACTGAACGGAGAGGCCGAACTGTTTTACCGGAAGCAGTCTATTCCTAAGAAAATCACTCACCCAGCTAAGGAGGCCATCGCTAACAAGAACAAGGACAATCCTAAGAAAGAGAGCGTGTTCGAATACGATCTGATTAAGGACAAGCGGTTCACCGAAGATAAGTTCTTTTTCCATTGTCCAATCACCATTAACTTCAAGTCAAGCGGCGCTAACAAGTTCAACGACGAGATCAATCTGCTGCTGAAGGAAAAAGCAAACGATGTGCACATCCTGAGCATTGACCGAGGAGAGCGGCATCTGGCCTACTATACCCTGGTGGATGGCAAAGGGAATATCATTAAGCAGGATACATTCAACATCATTGGCAATGACCGGATGAAAACCAACTACCACGATAAACTGGCTGCAATCGAGAAGGATAGAGACTCAGCTAGGAAGGACTGGAAGAAAATCAACAACATTAAGGAGATGAAGGAAGGCTATCTGAGCCAGGTGGTCCATGAGATTGCAAAGCTGGTCATCGAATACAATGCCATTGTGGTGTTCGAGGATCTGAACTTCGGCTTTAAGAGGGGGCGCTTTAAGGTGGAAAAACAGGTCTATCAGAAGCTGGAGAAAATGCTGATCGAAAAGCTGAATTACCTGGTGTTTAAAGATAACGAGTTCGACAAGACCGGAGGCGTCCTGAGAGCCTACCAGCTGACAGCTCCCTTTGAAACTTTCAAGAAAATGGGAAAACAGACAGGCATCATCTACTATGTGCCAGCCGGATTCACTTCCAAGATCTGCCCCGTGACCGGCTTTGTCAACCAGCTGTACCCTAAATATGAGTCAGTGAGCAAGTCCCAGGAATTTTTCAGCAAGTTCGATAAGATCTGTTATAATCTGGACAAGGGGTACTTCGAGTTTTCCTTCGATTACAAGAACTTCGGCGACAAGGCCGCTAAGGGGAAATGGACCATTGCCTCCTTCGGATCTCGCCTGATCAACTTTCGAAATTCCGATAAAAACCACAATTGGGACACTAGGGAGGTGTACCCAACCAAGGAGCTGGAAAAGCTGCTGAAAGACTACTCTATCGAGTATGGACATGGCGAATGCATCAAGGCAGCCATCTGTGGCGAGAGTGATAAGAAATTTTTCGCCAAGCTGACCTCAGTGCTGAATACAATCCTGCAGATGCGGAACTCAAAGACCGGGACAGAACTGGACTATCTGATTAGCCCCGTGGCTGATGTCAACGGAAACTTCTTCGACAGCAGACAGGCACCCAAAAATATGCCTCAGGATGCAGACGCCAACGGGGCCTACCACATCGGGCTGAAGGGACTGATGCTGCTGGGCCGGATCAAGAACAATCAGGAGGGGAAGAAGCTGAACCTGGTCATTAAGAACGAGGAATACTTCGAGTTTGTCCAGAATAGAAATAACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号１８）
【０１１８】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＰｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０（ＰｅＣｐｆ１；ｐＹ００７）：
【０１１９】
MSNFFKNFTNLYELSKTLRFELKPVGDTLTNMKDHLEYDEKLQTFLKDQNIDDAYQALKPQFDEIHEEFITDSLESKKAKEIDFSEYLDLFQEKKELNDSEKKLRNKIGETFNKAGEKWKKEKYPQYEWKKGSKIANGADILSCQDMLQFIKYKNPEDEKIKNYIDDTLKGFFTYFGGFNQNRANYYETKKEASTAVATRIVHENLPKFCDNVIQFKHIIKRKKDGTVEKTERKTEYLNAYQYLKNNNKITQIKDAETEKMIESTPIAEKIFDVYYFSSCLSQKQIEEYNRIIGHYNLLINLYNQAKRSEGKHLSANEKKYKDLPKFKTLYKQIGCGKKKDLFYTIKCDTEEEANKSRNEGKESHSVEEIINKAQEAINKYFKSNNDCENINTVPDFINYILTKENYEGVYWSKAAMNTISDKYFANYHDLQDRLKEAKVFQKADKKSEDDIKIPEAIELSGLFGVLDSLADWQTTLFKSSILSNEDKLKIITDSQTPSEALLKMIFNDIEKNMESFLKETNDIITLKKYKGNKEGTEKIKQWFDYTLAINRMLKYFLVKENKIKGNSLDTNISEALKTLIYSDDAEWFKWYDALRNYLTQKPQDEAKENKLKLNFDNPSLAGGWDVNKECSNFCVILKDKNEKKYLAIMKKGENTLFQKEWTEGRGKNLTKKSNPLFEINNCEILSKMEYDFWADVSKMIPKCSTQLKAVVNHFKQSDNEFIFPIGYKVTSGEKFREECKISKQDFELNNKVFNKNELSVTAMRYDLSSTQEKQYIKAFQKEYWELLFKQEKRDTKLTNNEIFNEWINFCNKKYSELLSWERKYKDALTNWINFCKYFLSKYPKTTLFNYSFKESENYNSLDEFYRDVDICSYKLNINTTINKSILDRLVEEGKLYLFEIKNQDSNDGKSIGHKNNLHTIYWNAIFENFDNRPKLNGEAEIFYRKAISKDKLGIVKGKKTKNGTEIIKNYRFSKEKFILHVPITLNFCSNNEYVNDIVNTKFYNFSNLHFLGIDRGEKHLAYYSLVNKNGEIVDQGTLNLPFTDKDGNQRSIKKEKYFYNKQEDKWEAKEVDCWNYNDLLDAMASNRDMARKNWQRIGTIKEAKNGYVSLVIRKIADLAVNNERPAFIVLEDLNTGFKRSRQKIDKSVYQKFELALAKKLNFLVDKNAKRDEIGSPTKALQLTPPVNNYGDIENKKQAGIMLYTRANYTSQTDPATGWRKTIYLKAGPEETTYKKDGKIKNKSVKDQIIETFTDIGFDGKDYYFEYDKGEFVDEKTGEIKPKKWRLYSGENGKSLDRFRGEREKDKYEWKIDKIDIVKILDDLFVNFDKNISLLKQLKEGVELTRNNEHGTGESLRFAINLIQQIRNTGNNERDNDFILSPVRDENGKHFDSREYWDKETKGEKISMPSSGDANGAFNIARKGIIMNAHILANSDSKDLSLFVSDEEWDLHLNNKTEWKKQLNIFSSRKAMAKRKKKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号１９）
【０１２０】
配列番号１９は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１２１】
配列番号１９は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１２２】
ATGTCCAACTTCTTTAAGAATTTCACCAACCTGTATGAGCTGTCCAAGACACTGAGGTTTGAGCTGAAGCCCGTGGGCGACACCCTGACAAACATGAAGGACCACCTGGAGTACGATGAGAAGCTGCAGACCTTCCTGAAGGATCAGAATATCGACGATGCCTATCAGGCCCTGAAGCCTCAGTTCGACGAGATCCACGAGGAGTTTATCACAGATTCTCTGGAGAGCAAGAAGGCCAAGGAGATCGACTTCTCCGAGTACCTGGATCTGTTTCAGGAGAAGAAGGAGCTGAACGACTCTGAGAAGAAGCTGCGCAACAAGATCGGCGAGACATTCAACAAGGCCGGCGAGAAGTGGAAGAAGGAGAAGTACCCTCAGTATGAGTGGAAGAAGGGCTCCAAGATCGCCAATGGCGCCGACATCCTGTCTTGCCAGGATATGCTGCAGTTTATCAAGTATAAGAACCCAGAGGATGAGAAGATCAAGAATTACATCGACGATACACTGAAGGGCTTCTTTACCTATTTCGGCGGCTTTAATCAGAACAGGGCCAACTACTATGAGACAAAGAAGGAGGCCTCCACCGCAGTGGCAACAAGGATCGTGCACGAGAACCTGCCAAAGTTCTGTGACAATGTGATCCAGTTTAAGCACATCATCAAGCGGAAGAAGGATGGCACCGTGGAGAAAACCGAGAGAAAGACCGAGTACCTGAACGCCTACCAGTATCTGAAGAACAATAACAAGATCACACAGATCAAGGACGCCGAGACAGAGAAGATGATCGAGTCTACACCCATCGCCGAGAAGATCTTCGACGTGTACTACTTCAGCAGCTGCCTGAGCCAGAAGCAGATCGAGGAGTACAACCGGATCATCGGCCACTATAATCTGCTGATCAACCTGTATAACCAGGCCAAGAGATCTGAGGGCAAGCACCTGAGCGCCAACGAGAAGAAGTATAAGGACCTGCCTAAGTTCAAGACCCTGTATAAGCAGATCGGCTGCGGCAAGAAGAAGGACCTGTTTTACACAATCAAGTGTGATACCGAGGAGGAGGCCAATAAGTCCCGGAACGAGGGCAAGGAGTCCCACTCTGTGGAGGAGATCATCAACAAGGCCCAGGAGGCCATCAATAAGTACTTCAAGTCTAATAACGACTGTGAGAATATCAACACCGTGCCCGACTTCATCAACTATATCCTGACAAAGGAGAATTACGAGGGCGTGTATTGGAGCAAGGCCGCCATGAACACCATCTCCGACAAGTACTTCGCCAATTATCACGACCTGCAGGATAGACTGAAGGAGGCCAAGGTGTTTCAGAAGGCCGATAAGAAGTCCGAGGACGATATCAAGATCCCAGAGGCCATCGAGCTGTCTGGCCTGTTCGGCGTGCTGGACAGCCTGGCCGATTGGCAGACCACACTGTTTAAGTCTAGCATCCTGAGCAACGAGGACAAGCTGAAGATCATCACAGATTCCCAGACCCCCTCTGAGGCCCTGCTGAAGATGATCTTCAATGACATCGAGAAGAACATGGAGTCCTTTCTGAAGGAGACAAACGATATCATCACCCTGAAGAAGTATAAGGGCAATAAGGAGGGCACCGAGAAGATCAAGCAGTGGTTCGACTATACACTGGCCATCAACCGGATGCTGAAGTACTTTCTGGTGAAGGAGAATAAGATCAAGGGCAACTCCCTGGATACCAATATCTCTGAGGCCCTGAAAACCCTGATCTACAGCGACGATGCCGAGTGGTTCAAGTGGTACGACGCCCTGAGAAACTATCTGACCCAGAAGCCTCAGGATGAGGCCAAGGAGAATAAGCTGAAGCTGAATTTCGACAACCCATCTCTGGCCGGCGGCTGGGATGTGAACAAGGAGTGCAGCAATTTTTGCGTGATCCTGAAGGACAAGAACGAGAAGAAGTACCTGGCCATCATGAAGAAGGGCGAGAATACCCTGTTCCAGAAGGAGTGGACAGAGGGCCGGGGCAAGAACCTGACAAAGAAGTCTAATCCACTGTTCGAGATCAATAACTGCGAGATCCTGAGCAAGATGGAGTATGACTTTTGGGCCGACGTGAGCAAGATGATCCCCAAGTGTAGCACCCAGCTGAAGGCCGTGGTGAACCACTTCAAGCAGTCCGACAATGAGTTCATCTTTCCTATCGGCTACAAGGTGACAAGCGGCGAGAAGTTTAGGGAGGAGTGCAAGATCTCCAAGCAGGACTTCGAGCTGAATAACAAGGTGTTTAATAAGAACGAGCTGAGCGTGACCGCCATGCGCTACGATCTGTCCTCTACACAGGAGAAGCAGTATATCAAGGCCTTCCAGAAGGAGTACTGGGAGCTGCTGTTTAAGCAGGAGAAGCGGGACACCAAGCTGACAAATAACGAGATCTTCAACGAGTGGATCAATTTTTGCAACAAGAAGTATAGCGAGCTGCTGTCCTGGGAGAGAAAGTACAAGGATGCCCTGACCAATTGGATCAACTTCTGTAAGTACTTTCTGAGCAAGTATCCCAAGACCACACTGTTCAACTACTCTTTTAAGGAGAGCGAGAATTATAACTCCCTGGACGAGTTCTACCGGGACGTGGATATCTGTTCTTACAAGCTGAATATCAACACCACAATCAATAAGAGCATCCTGGATAGACTGGTGGAGGAGGGCAAGCTGTACCTGTTTGAGATCAAGAATCAGGACAGCAACGATGGCAAGTCCATCGGCCACAAGAATAACCTGCACACCATCTACTGGAACGCCATCTTCGAGAATTTTGACAACAGGCCTAAGCTGAATGGCGAGGCCGAGATCTTCTATCGCAAGGCCATCTCCAAGGATAAGCTGGGCATCGTGAAGGGCAAGAAAACCAAGAACGGCACCGAGATCATCAAGAATTACAGATTCAGCAAGGAGAAGTTTATCCTGCACGTGCCAATCACCCTGAACTTCTGCTCCAATAACGAGTATGTGAATGACATCGTGAACACAAAGTTCTACAATTTTTCCAACCTGCACTTTCTGGGCATCGATAGGGGCGAGAAGCACCTGGCCTACTATTCTCTGGTGAATAAGAACGGCGAGATCGTGGACCAGGGCACACTGAACCTGCCTTTCACCGACAAGGATGGCAATCAGCGCAGCATCAAGAAGGAGAAGTACTTTTATAACAAGCAGGAGGACAAGTGGGAGGCCAAGGAGGTGGATTGTTGGAATTATAACGACCTGCTGGATGCCATGGCCTCTAACCGGGACATGGCCAGAAAGAATTGGCAGAGGATCGGCACCATCAAGGAGGCCAAGAACGGCTACGTGAGCCTGGTCATCAGGAAGATCGCCGATCTGGCCGTGAATAACGAGCGCCCCGCCTTCATCGTGCTGGAGGACCTGAATACAGGCTTTAAGCGGTCCAGACAGAAGATCGATAAGAGCGTGTACCAGAAGTTCGAGCTGGCCCTGGCCAAGAAGCTGAACTTTCTGGTGGACAAGAATGCCAAGCGCGATGAGATCGGCTCCCCTACAAAGGCCCTGCAGCTGACCCCCCCTGTGAATAACTACGGCGACATTGAGAACAAGAAGCAGGCCGGCATCATGCTGTATACCCGGGCCAATTATACCTCTCAGACAGATCCAGCCACAGGCTGGAGAAAGACCATCTATCTGAAGGCCGGCCCCGAGGAGACAACATACAAGAAGGACGGCAAGATCAAGAACAAGAGCGTGAAGGACCAGATCATCGAGACATTCACCGATATCGGCTTTGACGGCAAGGATTACTATTTCGAGTACGACAAGGGCGAGTTTGTGGATGAGAAAACCGGCGAGATCAAGCCCAAGAAGTGGCGGCTGTACTCCGGCGAGAATGGCAAGTCCCTGGACAGGTTCCGCGGAGAGAGGGAGAAGGATAAGTATGAGTGGAAGATCGACAAGATCGATATCGTGAAGATCCTGGACGATCTGTTCGTGAATTTTGACAAGAACATCAGCCTGCTGAAGCAGCTGAAGGAGGGCGTGGAGCTGACCCGGAATAACGAGCACGGCACAGGCGAGTCCCTGAGATTCGCCATCAACCTGATCCAGCAGATCCGGAATACCGGCAATAACGAGAGAGACAACGATTTCATCCTGTCCCCAGTGAGGGACGAGAATGGCAAGCACTTTGACTCTCGCGAGTACTGGGATAAGGAGACAAAGGGCGAGAAGATCAGCATGCCCAGCTCCGGCGATGCCAATGGCGCCTTCAACATCGCCCGGAAGGGCATCATCATGAACGCCCACATCCTGGCCAATAGCGACTCCAAGGATCTGTCCCTGTTCGTGTCTGACGAGGAGTGGGATCTGCACCTGAATAACAAGACCGAGTGGAAGAAGCAGCTGAACATCTTTTCTAGCAGGAAGGCCATGGCCAAGCGCAAGAAGAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号２０）
【０１２３】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＰａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（ＰｂＣｐｆ１；ｐＹ００８）：
【０１２４】
MENIFDQFIGKYSLSKTLRFELKPVGKTEDFLKINKVFEKDQTIDDSYNQAKFYFDSLHQKFIDAALASDKTSELSFQNFADVLEKQNKIILDKKREMGALRKRDKNAVGIDRLQKEINDAEDIIQKEKEKIYKDVRTLFDNEAESWKTYYQEREVDGKKITFSKADLKQKGADFLTAAGILKVLKYEFPEEKEKEFQAKNQPSLFVEEKENPGQKRYIFDSFDKFAGYLTKFQQTKKNLYAADGTSTAVATRIADNFIIFHQNTKVFRDKYKNNHTDLGFDEENIFEIERYKNCLLQREIEHIKNENSYNKIIGRINKKIKEYRDQKAKDTKLTKSDFPFFKNLDKQILGEVEKEKQLIEKTREKTEEDVLIERFKEFIENNEERFTAAKKLMNAFCNGEFESEYEGIYLKNKAINTISRRWFVSDRDFELKLPQQKSKNKSEKNEPKVKKFISIAEIKNAVEELDGDIFKAVFYDKKIIAQGGSKLEQFLVIWKYEFEYLFRDIERENGEKLLGYDSCLKIAKQLGIFPQEKEAREKATAVIKNYADAGLGIFQMMKYFSLDDKDRKNTPGQLSTNFYAEYDGYYKDFEFIKYYNEFRNFITKKPFDEDKIKLNFENGALLKGWDENKEYDFMGVILKKEGRLYLGIMHKNHRKLFQSMGNAKGDNANRYQKMIYKQIADASKDVPRLLLTSKKAMEKFKPSQEILRIKKEKTFKRESKNFSLRDLHALIEYYRNCIPQYSNWSFYDFQFQDTGKYQNIKEFTDDVQKYGYKISFRDIDDEYINQALNEGKMYLFEVVNKDIYNTKNGSKNLHTLYFEHILSAENLNDPVFKLSGMAEIFQRQPSVNEREKITTQKNQCILDKGDRAYKYRRYTEKKIMFHMSLVLNTGKGEIKQVQFNKIINQRISSSDNEMRVNVIGIDRGEKNLLYYSVVKQNGEIIEQASLNEINGVNYRDKLIEREKERLKNRQSWKPVVKIKDLKKGYISHVIHKICQLIEKYSAIVVLEDLNMRFKQIRGGIERSVYQQFEKALIDKLGYLVFKDNRDLRAPGGVLNGYQLSAPFVSFEKMRKQTGILFYTQAEYTSKTDPITGFRKNVYISNSASLDKIKEAVKKFDAIGWDGKEQSYFFKYNPYNLADEKYKNSTVSKEWAIFASAPRIRRQKGEDGYWKYDRVKVNEEFEKLLKVWNFVNPKATDIKQEIIKKEKAGDLQGEKELDGRLRNFWHSFIYLFNLVLELRNSFSLQIKIKAGEVIAVDEGVDFIASPVKPFFTTPNPYIPSNLCWLAVENADANGAYNIARKGVMILKKIREHAKKDPEFKKLPNLFISNAEWDEAARDWGKYAGTTALNLDHKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号２１）
【０１２５】
配列番号２１は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１２６】
配列番号２１は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１２７】
ATGGAGAACATCTTCGACCAGTTTATCGGCAAGTACAGCCTGTCCAAGACCCTGAGATTCGAGCTGAAGCCCGTGGGCAAGACAGAGGACTTCCTGAAGATCAACAAGGTGTTTGAGAAGGATCAGACCATCGACGATAGCTACAATCAGGCCAAGTTCTATTTTGATTCCCTGCACCAGAAGTTTATCGACGCCGCCCTGGCCTCCGATAAGACATCCGAGCTGTCTTTCCAGAACTTTGCCGACGTGCTGGAGAAGCAGAATAAGATCATCCTGGATAAGAAGAGAGAGATGGGCGCCCTGAGGAAGCGCGACAAGAACGCCGTGGGCATCGATAGGCTGCAGAAGGAGATCAATGACGCCGAGGATATCATCCAGAAGGAGAAGGAGAAGATCTACAAGGACGTGCGCACCCTGTTCGATAACGAGGCCGAGTCTTGGAAAACCTACTATCAGGAGCGGGAGGTGGACGGCAAGAAGATCACCTTCAGCAAGGCCGACCTGAAGCAGAAGGGCGCCGATTTTCTGACAGCCGCCGGCATCCTGAAGGTGCTGAAGTATGAGTTCCCCGAGGAGAAGGAGAAGGAGTTTCAGGCCAAGAACCAGCCCTCCCTGTTCGTGGAGGAGAAGGAGAATCCTGGCCAGAAGAGGTACATCTTCGACTCTTTTGATAAGTTCGCCGGCTATCTGACCAAGTTTCAGCAGACAAAGAAGAATCTGTACGCAGCAGACGGCACCAGCACAGCAGTGGCCACCCGCATCGCCGATAACTTTATCATCTTCCACCAGAATACCAAGGTGTTCCGGGACAAGTACAAGAACAATCACACAGACCTGGGCTTCGATGAGGAGAACATCTTTGAGATCGAGAGGTATAAGAATTGCCTGCTGCAGCGCGAGATCGAGCACATCAAGAATGAGAATAGCTACAACAAGATCATCGGCCGGATCAATAAGAAGATCAAGGAGTATCGGGACCAGAAGGCCAAGGATACCAAGCTGACAAAGTCCGACTTCCCTTTCTTTAAGAACCTGGATAAGCAGATCCTGGGCGAGGTGGAGAAGGAGAAGCAGCTGATCGAGAAAACCCGGGAGAAAACCGAGGAGGACGTGCTGATCGAGCGGTTCAAGGAGTTCATCGAGAACAATGAGGAGAGGTTCACCGCCGCCAAGAAGCTGATGAATGCCTTCTGTAACGGCGAGTTTGAGTCCGAGTACGAGGGCATCTATCTGAAGAATAAGGCCATCAACACAATCTCCCGGAGATGGTTCGTGTCTGACAGAGATTTTGAGCTGAAGCTGCCTCAGCAGAAGTCCAAGAACAAGTCTGAGAAGAATGAGCCAAAGGTGAAGAAGTTCATCTCCATCGCCGAGATCAAGAACGCCGTGGAGGAGCTGGACGGCGATATCTTTAAGGCCGTGTTCTACGACAAGAAGATCATCGCCCAGGGCGGCTCTAAGCTGGAGCAGTTCCTGGTCATCTGGAAGTACGAGTTTGAGTATCTGTTCCGGGACATCGAGAGAGAGAACGGCGAGAAGCTGCTGGGCTATGATAGCTGCCTGAAGATCGCCAAGCAGCTGGGCATCTTCCCACAGGAGAAGGAGGCCCGCGAGAAGGCAACCGCCGTGATCAAGAATTACGCCGACGCCGGCCTGGGCATCTTCCAGATGATGAAGTATTTTTCTCTGGACGATAAGGATCGGAAGAACACCCCCGGCCAGCTGAGCACAAATTTCTACGCCGAGTATGACGGCTACTACAAGGATTTCGAGTTTATCAAGTACTACAACGAGTTTAGGAACTTCATCACCAAGAAGCCTTTCGACGAGGATAAGATCAAGCTGAACTTTGAGAATGGCGCCCTGCTGAAGGGCTGGGACGAGAACAAGGAGTACGATTTCATGGGCGTGATCCTGAAGAAGGAGGGCCGCCTGTATCTGGGCATCATGCACAAGAACCACCGGAAGCTGTTTCAGTCCATGGGCAATGCCAAGGGCGACAACGCCAATAGATACCAGAAGATGATCTATAAGCAGATCGCCGACGCCTCTAAGGATGTGCCCAGGCTGCTGCTGACCAGCAAGAAGGCCATGGAGAAGTTCAAGCCTTCCCAGGAGATCCTGAGAATCAAGAAGGAGAAAACCTTCAAGCGGGAGAGCAAGAACTTTTCCCTGAGAGATCTGCACGCCCTGATCGAGTACTATAGGAACTGCATCCCTCAGTACAGCAATTGGTCCTTTTATGACTTCCAGTTTCAGGATACCGGCAAGTACCAGAATATCAAGGAGTTCACAGACGATGTGCAGAAGTACGGCTATAAGATCTCCTTTCGCGACATCGACGATGAGTATATCAATCAGGCCCTGAACGAGGGCAAGATGTACCTGTTCGAGGTGGTGAACAAGGATATCTATAACACCAAGAATGGCTCCAAGAATCTGCACACACTGTACTTTGAGCACATCCTGTCTGCCGAGAACCTGAATGACCCAGTGTTCAAGCTGTCTGGCATGGCCGAGATCTTTCAGCGGCAGCCCAGCGTGAACGAAAGAGAGAAGATCACCACACAGAAGAATCAGTGTATCCTGGACAAGGGCGATAGAGCCTACAAGTATAGGCGCTACACCGAGAAGAAGATCATGTTCCACATGAGCCTGGTGCTGAACACAGGCAAGGGCGAGATCAAGCAGGTGCAGTTTAATAAGATCATCAACCAGAGGATCAGCTCCTCTGACAACGAGATGAGGGTGAATGTGATCGGCATCGATCGCGGCGAGAAGAACCTGCTGTACTATAGCGTGGTGAAGCAGAATGGCGAGATCATCGAGCAGGCCTCCCTGAACGAGATCAATGGCGTGAACTACCGGGACAAGCTGATCGAGAGGGAGAAGGAGCGCCTGAAGAACCGGCAGAGCTGGAAGCCTGTGGTGAAGATCAAGGATCTGAAGAAGGGCTACATCTCCCACGTGATCCACAAGATCTGCCAGCTGATCGAGAAGTATTCTGCCATCGTGGTGCTGGAGGACCTGAATATGAGATTCAAGCAGATCAGGGGAGGAATCGAGCGGAGCGTGTACCAGCAGTTCGAGAAGGCCCTGATCGATAAGCTGGGCTATCTGGTGTTTAAGGACAACAGGGATCTGAGGGCACCAGGAGGCGTGCTGAATGGCTACCAGCTGTCTGCCCCCTTTGTGAGCTTCGAGAAGATGCGCAAGCAGACCGGCATCCTGTTCTACACACAGGCCGAGTATACCAGCAAGACAGACCCAATCACCGGCTTTCGGAAGAACGTGTATATCTCTAATAGCGCCTCCCTGGATAAGATCAAGGAGGCCGTGAAGAAGTTCGACGCCATCGGCTGGGATGGCAAGGAGCAGTCTTACTTCTTTAAGTACAACCCTTACAACCTGGCCGACGAGAAGTATAAGAACTCTACCGTGAGCAAGGAGTGGGCCATCTTTGCCAGCGCCCCAAGAATCCGGAGACAGAAGGGCGAGGACGGCTACTGGAAGTATGATAGGGTGAAAGTGAATGAGGAGTTCGAGAAGCTGCTGAAGGTCTGGAATTTTGTGAACCCAAAGGCCACAGATATCAAGCAGGAGATCATCAAGAAGGAGAAGGCAGGCGACCTGCAGGGAGAGAAGGAGCTGGATGGCCGGCTGAGAAACTTTTGGCACTCTTTCATCTACCTGTTTAACCTGGTGCTGGAGCTGCGCAATTCTTTCAGCCTGCAGATCAAGATCAAGGCAGGAGAAGTGATCGCAGTGGACGAGGGCGTGGACTTCATCGCCAGCCCAGTGAAGCCCTTCTTTACCACACCCAACCCTTACATCCCCTCCAACCTGTGCTGGCTGGCCGTGGAGAATGCAGACGCAAACGGAGCCTATAATATCGCCAGGAAGGGCGTGATGATCCTGAAGAAGATCCGCGAGCACGCCAAGAAGGACCCCGAGTTCAAGAAGCTGCCAAACCTGTTTATCAGCAATGCAGAGTGGGACGAGGCAGCCCGGGATTGGGGCAAGTACGCAGGCACCACAGCCCTGAACCTGGACCACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号２２）
【０１２８】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＳｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．  ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７（ＳｓＣｐｆ１；ｐＹ００９）：
【０１２９】
MQTLFENFTNQYPVSKTLRFELIPQGKTKDFIEQKGLLKKDEDRAEKYKKVKNIIDEYHKDFIEKSLNGLKLDGLEKYKTLYLKQEKDDKDKKAFDKEKENLRKQIANAFRNNEKFKTLFAKELIKNDLMSFACEEDKKNVKEFEAFTTYFTGFHQNRANMYVADEKRTAIASRLIHENLPKFIDNIKIFEKMKKEAPELLSPFNQTLKDMKDVIKGTTLEEIFSLDYFNKTLTQSGIDIYNSVIGGRTPEEGKTKIKGLNEYINTDFNQKQTDKKKRQPKFKQLYKQILSDRQSLSFIAEAFKNDTEILEAIEKFYVNELLHFSNEGKSTNVLDAIKNAVSNLESFNLTKMYFRSGASLTDVSRKVFGEWSIINRALDNYYATTYPIKPREKSEKYEERKEKWLKQDFNVSLIQTAIDEYDNETVKGKNSGKVIADYFAKFCDDKETDLIQKVNEGYIAVKDLLNTPCPENEKLGSNKDQVKQIKAFMDSIMDIMHFVRPLSLKDTDKEKDETFYSLFTPLYDHLTQTIALYNKVRNYLTQKPYSTEKIKLNFENSTLLGGWDLNKETDNTAIILRKDNLYYLGIMDKRHNRIFRNVPKADKKDFCYEKMVYKLLPGANKMLPKVFFSQSRIQEFTPSAKLLENYANETHKKGDNFNLNHCHKLIDFFKDSINKHEDWKNFDFRFSATSTYADLSGFYHEVEHQGYKISFQSVADSFIDDLVNEGKLYLFQIYNKDFSPFSKGKPNLHTLYWKMLFDENNLKDVVYKLNGEAEVFYRKKSIAEKNTTIHKANESIINKNPDNPKATSTFNYDIVKDKRYTIDKFQFHIPITMNFKAEGIFNMNQRVNQFLKANPDINIIGIDRGERHLLYYALINQKGKILKQDTLNVIANEKQKVDYHNLLDKKEGDRATARQEWGVIETIKELKEGYLSQVIHKLTDLMIENNAIIVMEDLNFGFKRGRQKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYLVDKNKKANELGGLLNAFQLANKFESFQKMGKQNGFIFYVPAWNTSKTDPATGFIDFLKPRYENLNQAKDFFEKFDSIRLNSKADYFEFAFDFKNFTEKADGGRTKWTVCTTNEDRYAWNRALNNNRGSQEKYDITAELKSLFDGKVDYKSGKDLKQQIASQESADFFKALMKNLSITLSLRHNNGEKGDNEQDYILSPVADSKGRFFDSRKADDDMPKNADANGAYHIALKGLWCLEQISKTDDLKKVKLAISNKEWLEFVQTLKGKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号２３）
【０１３０】
配列番号２３は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１３１】
配列番号２３は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１３２】
ATGCAGACCCTGTTTGAGAACTTCACAAATCAGTACCCAGTGTCCAAGACCCTGCGCTTTGAGCTGATCCCCCAGGGCAAGACAAAGGACTTCATCGAGCAGAAGGGCCTGCTGAAGAAGGATGAGGACCGGGCCGAGAAGTATAAGAAGGTGAAGAACATCATCGATGAGTACCACAAGGACTTCATCGAGAAGTCTCTGAATGGCCTGAAGCTGGACGGCCTGGAGAAGTACAAGACCCTGTATCTGAAGCAGGAGAAGGACGATAAGGATAAGAAGGCCTTTGACAAGGAGAAGGAGAACCTGCGCAAGCAGATCGCCAATGCCTTCCGGAACAATGAGAAGTTTAAGACACTGTTCGCCAAGGAGCTGATCAAGAACGATCTGATGTCTTTCGCCTGCGAGGAGGACAAGAAGAATGTGAAGGAGTTTGAGGCCTTCACCACATACTTCACCGGCTTCCACCAGAACCGCGCCAATATGTACGTGGCCGATGAGAAGAGAACAGCCATCGCCAGCAGGCTGATCCACGAGAACCTGCCAAAGTTTATCGACAATATCAAGATCTTCGAGAAGATGAAGAAGGAGGCCCCCGAGCTGCTGTCTCCTTTCAACCAGACCCTGAAGGATATGAAGGACGTGATCAAGGGCACCACACTGGAGGAGATCTTTAGCCTGGATTATTTCAACAAGACCCTGACACAGAGCGGCATCGACATCTACAATTCCGTGATCGGCGGCAGAACCCCTGAGGAGGGCAAGACAAAGATCAAGGGCCTGAACGAGTACATCAATACCGACTTCAACCAGAAGCAGACAGACAAGAAGAAGCGGCAGCCAAAGTTCAAGCAGCTGTATAAGCAGATCCTGAGCGATAGGCAGAGCCTGTCCTTTATCGCCGAGGCCTTCAAGAACGACACCGAGATCCTGGAGGCCATCGAGAAGTTTTACGTGAATGAGCTGCTGCACTTCAGCAATGAGGGCAAGTCCACAAACGTGCTGGACGCCATCAAGAATGCCGTGTCTAACCTGGAGAGCTTTAACCTGACCAAGATGTATTTCCGCTCCGGCGCCTCTCTGACAGACGTGAGCCGGAAGGTGTTTGGCGAGTGGAGCATCATCAATAGAGCCCTGGACAACTACTATGCCACCACATATCCAATCAAGCCCAGAGAGAAGTCTGAGAAGTACGAGGAGAGGAAGGAGAAGTGGCTGAAGCAGGACTTCAACGTGAGCCTGATCCAGACCGCCATCGATGAGTACGACAACGAGACAGTGAAGGGCAAGAACAGCGGCAAAGTGATCGCCGATTATTTTGCCAAGTTCTGCGACGATAAGGAGACAGACCTGATCCAGAAGGTGAACGAGGGCTACATCGCCGTGAAGGATCTGCTGAATACACCCTGTCCTGAGAACGAGAAGCTGGGCAGCAATAAGGACCAGGTGAAGCAGATCAAGGCCTTTATGGATTCTATCATGGACATCATGCACTTCGTGCGCCCCCTGAGCCTGAAGGATACCGACAAGGAGAAGGATGAGACATTCTACTCCCTGTTCACACCTCTGTACGACCACCTGACCCAGACAATCGCCCTGTATAACAAGGTGCGGAACTATCTGACCCAGAAGCCTTACAGCACAGAGAAGATCAAGCTGAACTTCGAGAACAGCACCCTGCTGGGCGGCTGGGATCTGAATAAGGAGACAGACAACACAGCCATCATCCTGAGGAAGGATAACCTGTACTATCTGGGCATCATGGACAAGAGGCACAATCGCATCTTTCGGAACGTGCCCAAGGCCGATAAGAAGGACTTCTGCTACGAGAAGATGGTGTATAAGCTGCTGCCTGGCGCCAACAAGATGCTGCCAAAGGTGTTCTTTTCTCAGAGCAGAATCCAGGAGTTTACCCCTTCCGCCAAGCTGCTGGAGAACTACGCCAATGAGACACACAAGAAGGGCGATAATTTCAACCTGAATCACTGTCACAAGCTGATCGATTTCTTTAAGGACTCTATCAACAAGCACGAGGATTGGAAGAATTTCGACTTTAGGTTCAGCGCCACCTCCACCTACGCCGACCTGAGCGGCTTTTACCACGAGGTGGAGCACCAGGGCTACAAGATCTCTTTTCAGAGCGTGGCCGATTCCTTCATCGACGATCTGGTGAACGAGGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAATAAGGACTTTTCCCCATTCTCTAAGGGCAAGCCCAACCTGCACACCCTGTACTGGAAGATGCTGTTTGATGAGAACAATCTGAAGGACGTGGTGTATAAGCTGAATGGCGAGGCCGAGGTGTTCTACCGCAAGAAGAGCATTGCCGAGAAGAACACCACAATCCACAAGGCCAATGAGTCCATCATCAACAAGAATCCTGATAACCCAAAGGCCACCAGCACCTTCAACTATGATATCGTGAAGGACAAGAGATACACCATCGACAAGTTTCAGTTCCACATCCCAATCACAATGAACTTTAAGGCCGAGGGCATCTTCAACATGAATCAGAGGGTGAATCAGTTCCTGAAGGCCAATCCCGATATCAACATCATCGGCATCGACAGAGGCGAGAGGCACCTGCTGTACTATGCCCTGATCAACCAGAAGGGCAAGATCCTGAAGCAGGATACCCTGAATGTGATCGCCAACGAGAAGCAGAAGGTGGACTACCACAATCTGCTGGATAAGAAGGAGGGCGACCGCGCAACCGCAAGGCAGGAGTGGGGCGTGATCGAGACAATCAAGGAGCTGAAGGAGGGCTATCTGTCCCAGGTCATCCACAAGCTGACCGATCTGATGATCGAGAACAATGCCATCATCGTGATGGAGGACCTGAACTTTGGCTTCAAGCGGGGCAGACAGAAGGTGGAGAAGCAGGTGTATCAGAAGTTTGAGAAGATGCTGATCGATAAGCTGAATTACCTGGTGGACAAGAATAAGAAGGCAAACGAGCTGGGAGGCCTGCTGAACGCATTCCAGCTGGCCAATAAGTTTGAGTCCTTCCAGAAGATGGGCAAGCAGAACGGCTTTATCTTCTACGTGCCCGCCTGGAATACCTCTAAGACAGATCCTGCCACCGGCTTTATCGACTTCCTGAAGCCCCGCTATGAGAACCTGAATCAGGCCAAGGATTTCTTTGAGAAGTTTGACTCTATCCGGCTGAACAGCAAGGCCGATTACTTTGAGTTCGCCTTTGACTTCAAGAATTTCACCGAGAAGGCCGATGGCGGCAGAACCAAGTGGACAGTGTGCACCACAAACGAGGACAGATATGCCTGGAATAGGGCCCTGAACAATAACAGGGGCAGCCAGGAGAAGTACGACATCACAGCCGAGCTGAAGTCCCTGTTCGATGGCAAGGTGGACTATAAGTCTGGCAAGGATCTGAAGCAGCAGATCGCCAGCCAGGAGTCCGCCGACTTCTTTAAGGCCCTGATGAAGAACCTGTCCATCACCCTGTCTCTGAGACACAATAACGGCGAGAAGGGCGATAATGAGCAGGACTACATCCTGTCCCCTGTGGCCGATTCTAAGGGCCGCTTCTTTGACTCCCGGAAGGCCGACGATGACATGCCAAAGAATGCCGACGCCAACGGCGCCTATCACATCGCCCTGAAGGGCCTGTGGTGTCTGGAGCAGATCAGCAAGACCGATGACCTGAAGAAGGTGAAGCTGGCCATCTCCAACAAGGAGTGGCTGGAGTTCGTGCAGACACTGAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号２４）
【０１３３】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１；ｐＹ０１０）：
【０１３４】
MTQFEGFTNLYQVSKTLRFELIPQGKTLKHIQEQGFIEEDKARNDHYKELKPIIDRIYKTYADQCLQLVQLDWENLSAAIDSYRKEKTEETRNALIEEQATYRNAIHDYFIGRTDNLTDAINKRHAEIYKGLFKAELFNGKVLKQLGTVTTTEHENALLRSFDKFTTYFSGFYENRKNVFSAEDISTAIPHRIVQDNFPKFKENCHIFTRLITAVPSLREHFENVKKAIGIFVSTSIEEVFSFPFYNQLLTQTQIDLYNQLLGGISREAGTEKIKGLNEVLNLAIQKNDETAHIIASLPHRFIPLFKQILSDRNTLSFILEEFKSDEEVIQSFCKYKTLLRNENVLETAEALFNELNSIDLTHIFISHKKLETISSALCDHWDTLRNALYERRISELTGKITKSAKEKVQRSLKHEDINLQEIISAAGKELSEAFKQKTSEILSHAHAALDQPLPTTLKKQEEKEILKSQLDSLLGLYHLLDWFAVDESNEVDPEFSARLTGIKLEMEPSLSFYNKARNYATKKPYSVEKFKLNFQMPTLASGWDVNKEKNNGAILFVKNGLYYLGIMPKQKGRYKALSFEPTEKTSEGFDKMYYDYFPDAAKMIPKCSTQLKAVTAHFQTHTTPILLSNNFIEPLEITKEIYDLNNPEKEPKKFQTAYAKKTGDQKGYREALCKWIDFTRDFLSKYTKTTSIDLSSLRPSSQYKDLGEYYAELNPLLYHISFQRIAEKEIMDAVETGKLYLFQIYNKDFAKGHHGKPNLHTLYWTGLFSPENLAKTSIKLNGQAELFYRPKSRMKRMAHRLGEKMLNKKLKDQKTPIPDTLYQELYDYVNHRLSHDLSDEARALLPNVITKEVSHEIIKDRRFTSDKFFFHVPITLNYQAANSPSKFNQRVNAYLKEHPETPIIGIDRGERNLIYITVIDSTGKILEQRSLNTIQQFDYQKKLDNREKERVAARQAWSVVGTIKDLKQGYLSQVIHEIVDLMIHYQAVVVLENLNFGFKSKRTGIAEKAVYQQFEKMLIDKLNCLVLKDYPAEKVGGVLNPYQLTDQFTSFAKMGTQSGFLFYVPAPYTSKIDPLTGFVDPFVWKTIKNHESRKHFLEGFDFLHYDVKTGDFILHFKMNRNLSFQRGLPGFMPAWDIVFEKNETQFDAKGTPFIAGKRIVPVIENHRFTGRYRDLYPANELIALLEEKGIVFRDGSNILPKLLENDDSHAIDTMVALIRSVLQMRNSNAATGEDYINSPVRDLNGVCFDSRFQNPEWPMDADANGAYHIALKGQLLLNHLKESKDLKLQNGISNQDWLAYIQELRNKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号２５）
【０１３５】
配列番号２５は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１３６】
配列番号２５は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１３７】
ATGACACAGTTCGAGGGCTTTACCAACCTGTATCAGGTGAGCAAGACACTGCGGTTTGAGCTGATCCCACAGGGCAAGACCCTGAAGCACATCCAGGAGCAGGGCTTCATCGAGGAGGACAAGGCCCGCAATGATCACTACAAGGAGCTGAAGCCCATCATCGATCGGATCTACAAGACCTATGCCGACCAGTGCCTGCAGCTGGTGCAGCTGGATTGGGAGAACCTGAGCGCCGCCATCGACTCCTATAGAAAGGAGAAAACCGAGGAGACAAGGAACGCCCTGATCGAGGAGCAGGCCACATATCGCAATGCCATCCACGACTACTTCATCGGCCGGACAGACAACCTGACCGATGCCATCAATAAGAGACACGCCGAGATCTACAAGGGCCTGTTCAAGGCCGAGCTGTTTAATGGCAAGGTGCTGAAGCAGCTGGGCACCGTGACCACAACCGAGCACGAGAACGCCCTGCTGCGGAGCTTCGACAAGTTTACAACCTACTTCTCCGGCTTTTATGAGAACAGGAAGAACGTGTTCAGCGCCGAGGATATCAGCACAGCCATCCCACACCGCATCGTGCAGGACAACTTCCCCAAGTTTAAGGAGAATTGTCACATCTTCACACGCCTGATCACCGCCGTGCCCAGCCTGCGGGAGCACTTTGAGAACGTGAAGAAGGCCATCGGCATCTTCGTGAGCACCTCCATCGAGGAGGTGTTTTCCTTCCCTTTTTATAACCAGCTGCTGACACAGACCCAGATCGACCTGTATAACCAGCTGCTGGGAGGAATCTCTCGGGAGGCAGGCACCGAGAAGATCAAGGGCCTGAACGAGGTGCTGAATCTGGCCATCCAGAAGAATGATGAGACAGCCCACATCATCGCCTCCCTGCCACACAGATTCATCCCCCTGTTTAAGCAGATCCTGTCCGATAGGAACACCCTGTCTTTCATCCTGGAGGAGTTTAAGAGCGACGAGGAAGTGATCCAGTCCTTCTGCAAGTACAAGACACTGCTGAGAAACGAGAACGTGCTGGAGACAGCCGAGGCCCTGTTTAACGAGCTGAACAGCATCGACCTGACACACATCTTCATCAGCCACAAGAAGCTGGAGACAATCAGCAGCGCCCTGTGCGACCACTGGGATACACTGAGGAATGCCCTGTATGAGCGGAGAATCTCCGAGCTGACAGGCAAGATCACCAAGTCTGCCAAGGAGAAGGTGCAGCGCAGCCTGAAGCACGAGGATATCAACCTGCAGGAGATCATCTCTGCCGCAGGCAAGGAGCTGAGCGAGGCCTTCAAGCAGAAAACCAGCGAGATCCTGTCCCACGCACACGCCGCCCTGGATCAGCCACTGCCTACAACCCTGAAGAAGCAGGAGGAGAAGGAGATCCTGAAGTCTCAGCTGGACAGCCTGCTGGGCCTGTACCACCTGCTGGACTGGTTTGCCGTGGATGAGTCCAACGAGGTGGACCCCGAGTTCTCTGCCCGGCTGACCGGCATCAAGCTGGAGATGGAGCCTTCTCTGAGCTTCTACAACAAGGCCAGAAATTATGCCACCAAGAAGCCCTACTCCGTGGAGAAGTTCAAGCTGAACTTTCAGATGCCTACACTGGCCTCTGGCTGGGACGTGAATAAGGAGAAGAACAATGGCGCCATCCTGTTTGTGAAGAACGGCCTGTACTATCTGGGCATCATGCCAAAGCAGAAGGGCAGGTATAAGGCCCTGAGCTTCGAGCCCACAGAGAAAACCAGCGAGGGCTTTGATAAGATGTACTATGACTACTTCCCTGATGCCGCCAAGATGATCCCAAAGTGCAGCACCCAGCTGAAGGCCGTGACAGCCCACTTTCAGACCCACACAACCCCCATCCTGCTGTCCAACAATTTCATCGAGCCTCTGGAGATCACAAAGGAGATCTACGACCTGAACAATCCTGAGAAGGAGCCAAAGAAGTTTCAGACAGCCTACGCCAAGAAAACCGGCGACCAGAAGGGCTACAGAGAGGCCCTGTGCAAGTGGATCGACTTCACAAGGGATTTTCTGTCCAAGTATACCAAGACAACCTCTATCGATCTGTCTAGCCTGCGGCCATCCTCTCAGTATAAGGACCTGGGCGAGTACTATGCCGAGCTGAATCCCCTGCTGTACCACATCAGCTTCCAGAGAATCGCCGAGAAGGAGATCATGGATGCCGTGGAGACAGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAACAAGGACTTTGCCAAGGGCCACCACGGCAAGCCTAATCTGCACACACTGTATTGGACCGGCCTGTTTTCTCCAGAGAACCTGGCCAAGACAAGCATCAAGCTGAATGGCCAGGCCGAGCTGTTCTACCGCCCTAAGTCCAGGATGAAGAGGATGGCACACCGGCTGGGAGAGAAGATGCTGAACAAGAAGCTGAAGGATCAGAAAACCCCAATCCCCGACACCCTGTACCAGGAGCTGTACGACTATGTGAATCACAGACTGTCCCACGACCTGTCTGATGAGGCCAGGGCCCTGCTGCCCAACGTGATCACCAAGGAGGTGTCTCACGAGATCATCAAGGATAGGCGCTTTACCAGCGACAAGTTCTTTTTCCACGTGCCTATCACACTGAACTATCAGGCCGCCAATTCCCCATCTAAGTTCAACCAGAGGGTGAATGCCTACCTGAAGGAGCACCCCGAGACACCTATCATCGGCATCGATCGGGGCGAGAGAAACCTGATCTATATCACAGTGATCGACTCCACCGGCAAGATCCTGGAGCAGCGGAGCCTGAACACCATCCAGCAGTTTGATTACCAGAAGAAGCTGGACAACAGGGAGAAGGAGAGGGTGGCAGCAAGGCAGGCCTGGTCTGTGGTGGGCACAATCAAGGATCTGAAGCAGGGCTATCTGAGCCAGGTCATCCACGAGATCGTGGACCTGATGATCCACTACCAGGCCGTGGTGGTGCTGGAGAACCTGAATTTCGGCTTTAAGAGCAAGAGGACCGGCATCGCCGAGAAGGCCGTGTACCAGCAGTTCGAGAAGATGCTGATCGATAAGCTGAATTGCCTGGTGCTGAAGGACTATCCAGCAGAGAAAGTGGGAGGCGTGCTGAACCCATACCAGCTGACAGACCAGTTCACCTCCTTTGCCAAGATGGGCACCCAGTCTGGCTTCCTGTTTTACGTGCCTGCCCCATATACATCTAAGATCGATCCCCTGACCGGCTTCGTGGACCCCTTCGTGTGGAAAACCATCAAGAATCACGAGAGCCGCAAGCACTTCCTGGAGGGCTTCGACTTTCTGCACTACGACGTGAAAACCGGCGACTTCATCCTGCACTTTAAGATGAACAGAAATCTGTCCTTCCAGAGGGGCCTGCCCGGCTTTATGCCTGCATGGGATATCGTGTTCGAGAAGAACGAGACACAGTTTGACGCCAAGGGCACCCCTTTCATCGCCGGCAAGAGAATCGTGCCAGTGATCGAGAATCACAGATTCACCGGCAGATACCGGGACCTGTATCCTGCCAACGAGCTGATCGCCCTGCTGGAGGAGAAGGGCATCGTGTTCAGGGATGGCTCCAACATCCTGCCAAAGCTGCTGGAGAATGACGATTCTCACGCCATCGACACCATGGTGGCCCTGATCCGCAGCGTGCTGCAGATGCGGAACTCCAATGCCGCCACAGGCGAGGACTATATCAACAGCCCCGTGCGCGATCTGAATGGCGTGTGCTTCGACTCCCGGTTTCAGAACCCAGAGTGGCCCATGGACGCCGATGCCAATGGCGCCTACCACATCGCCCTGAAGGGCCAGCTGCTGCTGAATCACCTGAAGGAGAGCAAGGATCTGAAGCTGCAGAACGGCATCTCCAATCAGGACTGGCTGGCCTACATCCAGGAGCTGCGCAACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号２６）
【０１３８】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１；ｐＹ０１１）：
【０１３９】
MYYESLTKQYPVSKTIRNELIPIGKTLDNIRQNNILESDVKRKQNYEHVKGILDEYHKQLINEALDNCTLPSLKIAAEIYLKNQKEVSDREDFNKTQDLLRKEVVEKLKAHENFTKIGKKDILDLLEKLPSISEDDYNALESFRNFYTYFTSYNKVRENLYSDKEKSSTVAYRLINENFPKFLDNVKSYRFVKTAGILADGLGEEEQDSLFIVETFNKTLTQDGIDTYNSQVGKINSSINLYNQKNQKANGFRKIPKMKMLYKQILSDREESFIDEFQSDEVLIDNVESYGSVLIESLKSSKVSAFFDALRESKGKNVYVKNDLAKTAMSNIVFENWRTFDDLLNQEYDLANENKKKDDKYFEKRQKELKKNKSYSLEHLCNLSEDSCNLIENYIHQISDDIENIIINNETFLRIVINEHDRSRKLAKNRKAVKAIKDFLDSIKVLERELKLINSSGQELEKDLIVYSAHEELLVELKQVDSLYNMTRNYLTKKPFSTEKVKLNFNRSTLLNGWDRNKETDNLGVLLLKDGKYYLGIMNTSANKAFVNPPVAKTEKVFKKVDYKLLPVPNQMLPKVFFAKSNIDFYNPSSEIYSNYKKGTHKKGNMFSLEDCHNLIDFFKESISKHEDWSKFGFKFSDTASYNDISEFYREVEKQGYKLTYTDIDETYINDLIERNELYLFQIYNKDFSMYSKGKLNLHTLYFMMLFDQRNIDDVVYKLNGEAEVFYRPASISEDELIIHKAGEEIKNKNPNRARTKETSTFSYDIVKDKRYSKDKFTLHIPITMNFGVDEVKRFNDAVNSAIRIDENVNVIGIDRGERNLLYVVVIDSKGNILEQISLNSIINKEYDIETDYHALLDEREGGRDKARKDWNTVENIRDLKAGYLSQVVNVVAKLVLKYNAIICLEDLNFGFKRGRQKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYLVIDKSREQTSPKELGGALNALQLTSKFKSFKELGKQSGVIYYVPAYLTSKIDPTTGFANLFYMKCENVEKSKRFFDGFDFIRFNALENVFEFGFDYRSFTQRACGINSKWTVCTNGERIIKYRNPDKNNMFDEKVVVVTDEMKNLFEQYKIPYEDGRNVKDMIISNEEAEFYRRLYRLLQQTLQMRNSTSDGTRDYIISPVKNKREAYFNSELSDGSVPKDADANGAYNIARKGLWVLEQIRQKSEGEKINLAMTNAEWLEYAQTHLLKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号２７）
【０１４０】
配列番号２７は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１４１】
配列番号２７は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１４２】
ATGTACTATGAGTCCCTGACCAAGCAGTACCCCGTGTCTAAGACAATCCGGAATGAGCTGATCCCTATCGGCAAGACACTGGATAACATCCGCCAGAACAATATCCTGGAGAGCGACGTGAAGCGGAAGCAGAACTACGAGCACGTGAAGGGCATCCTGGATGAGTATCACAAGCAGCTGATCAACGAGGCCCTGGACAATTGCACCCTGCCATCCCTGAAGATCGCCGCCGAGATCTACCTGAAGAATCAGAAGGAGGTGTCTGACAGAGAGGATTTCAACAAGACACAGGACCTGCTGAGGAAGGAGGTGGTGGAGAAGCTGAAGGCCCACGAGAACTTTACCAAGATCGGCAAGAAGGACATCCTGGATCTGCTGGAGAAGCTGCCTTCCATCTCTGAGGACGATTACAATGCCCTGGAGAGCTTCCGCAACTTTTACACCTATTTCACATCCTACAACAAGGTGCGGGAGAATCTGTATTCTGATAAGGAGAAGAGCTCCACAGTGGCCTACAGACTGATCAACGAGAATTTCCCAAAGTTTCTGGACAATGTGAAGAGCTATAGGTTTGTGAAAACCGCAGGCATCCTGGCAGATGGCCTGGGAGAGGAGGAGCAGGACTCCCTGTTCATCGTGGAGACATTCAACAAGACCCTGACACAGGACGGCATCGATACCTACAATTCTCAAGTGGGCAAGATCAACTCTAGCATCAATCTGTATAACCAGAAGAATCAGAAGGCCAATGGCTTCAGAAAGATCCCCAAGATGAAGATGCTGTATAAGCAGATCCTGTCCGATAGGGAGGAGTCTTTCATCGACGAGTTTCAGAGCGATGAGGTGCTGATCGACAACGTGGAGTCTTATGGCAGCGTGCTGATCGAGTCTCTGAAGTCCTCTAAGGTGAGCGCCTTCTTTGATGCCCTGAGAGAGTCTAAGGGCAAGAACGTGTACGTGAAGAATGACCTGGCCAAGACAGCCATGAGCAACATCGTGTTCGAGAATTGGAGGACCTTTGACGATCTGCTGAACCAGGAGTACGACCTGGCCAACGAGAACAAGAAGAAGGACGATAAGTATTTCGAGAAGCGCCAGAAGGAGCTGAAGAAGAATAAGAGCTACTCCCTGGAGCACCTGTGCAACCTGTCCGAGGATTCTTGTAACCTGATCGAGAATTATATCCACCAGATCTCCGACGATATCGAGAATATCATCATCAACAATGAGACATTCCTGCGCATCGTGATCAATGAGCACGACAGGTCCCGCAAGCTGGCCAAGAACCGGAAGGCCGTGAAGGCCATCAAGGACTTTCTGGATTCTATCAAGGTGCTGGAGCGGGAGCTGAAGCTGATCAACAGCTCCGGCCAGGAGCTGGAGAAGGATCTGATCGTGTACTCTGCCCACGAGGAGCTGCTGGTGGAGCTGAAGCAGGTGGACAGCCTGTATAACATGACCAGAAATTATCTGACAAAGAAGCCTTTCTCTACCGAGAAGGTGAAGCTGAACTTTAATCGCAGCACACTGCTGAACGGCTGGGATCGGAATAAGGAGACAGACAACCTGGGCGTGCTGCTGCTGAAGGACGGCAAGTACTATCTGGGCATCATGAACACAAGCGCCAATAAGGCCTTCGTGAATCCCCCTGTGGCCAAGACCGAGAAGGTGTTTAAGAAGGTGGATTACAAGCTGCTGCCAGTGCCCAACCAGATGCTGCCAAAGGTGTTCTTTGCCAAGAGCAATATCGACTTCTATAACCCCTCTAGCGAGATCTACTCCAATTATAAGAAGGGCACCCACAAGAAGGGCAATATGTTTTCCCTGGAGGATTGTCACAACCTGATCGACTTCTTTAAGGAGTCTATCAGCAAGCACGAGGACTGGAGCAAGTTCGGCTTTAAGTTCAGCGATACAGCCTCCTACAACGACATCTCCGAGTTCTATCGCGAGGTGGAGAAGCAGGGCTACAAGCTGACCTATACAGACATCGATGAGACATACATCAATGATCTGATCGAGCGGAACGAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAATAAGGACTTTAGCATGTACTCCAAGGGCAAGCTGAACCTGCACACACTGTATTTCATGATGCTGTTTGATCAGCGCAATATCGACGACGTGGTGTATAAGCTGAACGGAGAGGCAGAGGTGTTCTATAGGCCAGCCTCCATCTCTGAGGACGAGCTGATCATCCACAAGGCCGGCGAGGAGATCAAGAACAAGAATCCTAACCGGGCCAGAACCAAGGAGACAAGCACCTTCAGCTACGACATCGTGAAGGATAAGCGGTATAGCAAGGATAAGTTTACCCTGCACATCCCCATCACAATGAACTTCGGCGTGGATGAGGTGAAGCGGTTCAACGACGCCGTGAACAGCGCCATCCGGATCGATGAGAATGTGAACGTGATCGGCATCGACCGGGGCGAGAGAAATCTGCTGTACGTGGTGGTCATCGACTCTAAGGGCAACATCCTGGAGCAGATCTCCCTGAACTCTATCATCAATAAGGAGTACGACATCGAGACAGATTATCACGCACTGCTGGATGAGAGGGAGGGCGGCAGAGATAAGGCCCGGAAGGACTGGAACACCGTGGAGAATATCAGGGACCTGAAGGCCGGCTACCTGAGCCAGGTGGTGAACGTGGTGGCCAAGCTGGTGCTGAAGTATAATGCCATCATCTGCCTGGAGGACCTGAACTTTGGCTTCAAGAGGGGCCGCCAGAAGGTGGAGAAGCAGGTGTACCAGAAGTTCGAGAAGATGCTGATCGATAAGCTGAATTACCTGGTCATCGACAAGAGCCGCGAGCAGACATCCCCTAAGGAGCTGGGAGGCGCCCTGAACGCACTGCAGCTGACCTCTAAGTTCAAGAGCTTTAAGGAGCTGGGCAAGCAGTCCGGCGTGATCTACTATGTGCCTGCCTACCTGACCTCTAAGATCGATCCAACCACAGGCTTCGCCAATCTGTTTTATATGAAGTGTGAGAACGTGGAGAAGTCCAAGAGATTCTTTGACGGCTTTGATTTCATCAGGTTCAACGCCCTGGAGAACGTGTTCGAGTTCGGCTTTGACTACCGGAGCTTCACCCAGAGGGCCTGCGGCATCAATTCCAAGTGGACCGTGTGCACCAACGGCGAGCGCATCATCAAGTATCGGAATCCAGATAAGAACAATATGTTCGACGAGAAGGTGGTGGTGGTGACCGATGAGATGAAGAACCTGTTTGAGCAGTACAAGATCCCCTATGAGGATGGCAGAAATGTGAAGGACATGATCATCAGCAACGAGGAGGCCGAGTTCTACCGGAGACTGTATAGGCTGCTGCAGCAGACCCTGCAGATGAGAAACAGCACCTCCGACGGCACAAGGGATTACATCATCTCCCCTGTGAAGAATAAGAGAGAGGCCTACTTCAACAGCGAGCTGTCCGACGGCTCTGTGCCAAAGGACGCCGATGCCAACGGCGCCTACAATATCGCCAGAAAGGGCCTGTGGGTGCTGGAGCAGATCAGGCAGAAGAGCGAGGGCGAGAAGATCAATCTGGCCATGACCAACGCCGAGTGGCTGGAGTATGCCCAGACACACCTGCTGAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号２８）
【０１４３】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ（ＣＭｔＣｐｆ１；ｐＹ０１２）：
【０１４４】
MNNYDEFTKLYPIQKTIRFELKPQGRTMEHLETFNFFEEDRDRAEKYKILKEAIDEYHKKFIDEHLTNMSLDWNSLKQISEKYYKSREEKDKKVFLSEQKRMRQEIVSEFKKDDRFKDLFSKKLFSELLKEEIYKKGNHQEIDALKSFDKFSGYFIGLHENRKNMYSDGDEITAISNRIVNENFPKFLDNLQKYQEARKKYPEWIIKAESALVAHNIKMDEVFSLEYFNKVLNQEGIQRYNLALGGYVTKSGEKMMGLNDALNLAHQSEKSSKGRIHMTPLFKQILSEKESFSYIPDVFTEDSQLLPSIGGFFAQIENDKDGNIFDRALELISSYAEYDTERIYIRQADINRVSNVIFGEWGTLGGLMREYKADSINDINLERTCKKVDKWLDSKEFALSDVLEAIKRTGNNDAFNEYISKMRTAREKIDAARKEMKFISEKISGDEESIHIIKTLLDSVQQFLHFFNLFKARQDIPLDGAFYAEFDEVHSKLFAIVPLYNKVRNYLTKNNLNTKKIKLNFKNPTLANGWDQNKVYDYASLIFLRDGNYYLGIINPKRKKNIKFEQGSGNGPFYRKMVYKQIPGPNKNLPRVFLTSTKGKKEYKPSKEIIEGYEADKHIRGDKFDLDFCHKLIDFFKESIEKHKDWSKFNFYFSPTESYGDISEFYLDVEKQGYRMHFENISAETIDEYVEKGDLFLFQIYNKDFVKAATGKKDMHTIYWNAAFSPENLQDVVVKLNGEAELFYRDKSDIKEIVHREGEILVNRTYNGRTPVPDKIHKKLTDYHNGRTKDLGEAKEYLDKVRYFKAHYDITKDRRYLNDKIYFHVPLTLNFKANGKKNLNKMVIEKFLSDEKAHIIGIDRGERNLLYYSIIDRSGKIIDQQSLNVIDGFDYREKLNQREIEMKDARQSWNAIGKIKDLKEGYLSKAVHEITKMAIQYNAIVVMEELNYGFKRGRFKVEKQIYQKFENMLIDKMNYLVFKDAPDESPGGVLNAYQLTNPLESFAKLGKQTGILFYVPAAYTSKIDPTTGFVNLFNTSSKTNAQERKEFLQKFESISYSAKDGGIFAFAFDYRKFGTSKTDHKNVWTAYTNGERMRYIKEKKRNELFDPSKEIKEALTSSGIKYDGGQNILPDILRSNNNGLIYTMYSSFIAAIQMRVYDGKEDYIISPIKNSKGEFFRTDPKRRELPIDADANGAYNIALRGELTMRAIAEKFDPDSEKMAKLELKHKDWFEFMQTRGDKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号２９）
【０１４５】
配列番号２９は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１４６】
配列番号２９は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１４７】
ATGAACAATTACGACGAGTTCACCAAGCTGTATCCTATCCAGAAAACCATCCGGTTTGAGCTGAAGCCACAGGGCAGAACCATGGAGCACCTGGAGACATTCAACTTCTTTGAGGAGGACCGGGATAGAGCCGAGAAGTATAAGATCCTGAAGGAGGCCATCGACGAGTACCACAAGAAGTTTATCGATGAGCACCTGACCAATATGTCCCTGGATTGGAACTCTCTGAAGCAGATCAGCGAGAAGTACTATAAGAGCAGGGAGGAGAAGGACAAGAAGGTGTTCCTGTCCGAGCAGAAGAGGATGCGCCAGGAGATCGTGTCTGAGTTTAAGAAGGACGATCGCTTCAAGGACCTGTTTTCCAAGAAGCTGTTCTCTGAGCTGCTGAAGGAGGAGATCTACAAGAAGGGCAACCACCAGGAGATCGACGCCCTGAAGAGCTTCGATAAGTTTTCCGGCTATTTCATCGGCCTGCACGAGAATAGGAAGAACATGTACTCCGACGGCGATGAGATCACCGCCATCTCCAATCGCATCGTGAATGAGAACTTCCCCAAGTTTCTGGATAACCTGCAGAAGTACCAGGAGGCCAGGAAGAAGTATCCTGAGTGGATCATCAAGGCCGAGAGCGCCCTGGTGGCCCACAATATCAAGATGGACGAGGTGTTCTCCCTGGAGTACTTTAATAAGGTGCTGAACCAGGAGGGCATCCAGCGGTACAACCTGGCCCTGGGCGGCTATGTGACCAAGAGCGGCGAGAAGATGATGGGCCTGAATGATGCCCTGAACCTGGCCCACCAGTCCGAGAAGAGCTCCAAGGGCAGAATCCACATGACCCCCCTGTTCAAGCAGATCCTGTCCGAGAAGGAGTCCTTCTCTTACATCCCCGACGTGTTTACAGAGGATTCTCAGCTGCTGCCTAGCATCGGCGGCTTCTTTGCCCAGATCGAGAATGACAAGGATGGCAACATCTTCGACCGGGCCCTGGAGCTGATCTCTAGCTACGCCGAGTATGATACCGAGCGGATCTATATCAGACAGGCCGACATCAATAGAGTGTCCAACGTGATCTTTGGAGAGTGGGGCACCCTGGGAGGCCTGATGAGGGAGTACAAGGCCGACTCTATCAATGATATCAACCTGGAGCGCACATGCAAGAAGGTGGACAAGTGGCTGGATTCTAAGGAGTTTGCCCTGAGCGATGTGCTGGAGGCCATCAAGAGGACCGGCAACAATGACGCCTTCAACGAGTATATCTCCAAGATGCGGACAGCCAGAGAGAAGATCGATGCCGCCCGCAAGGAGATGAAGTTCATCAGCGAGAAGATCTCCGGCGATGAGGAGTCTATCCACATCATCAAGACCCTGCTGGACAGCGTGCAGCAGTTCCTGCACTTCTTTAATCTGTTTAAGGCAAGGCAGGACATCCCACTGGATGGAGCCTTCTACGCCGAGTTTGACGAGGTGCACAGCAAGCTGTTTGCCATCGTGCCCCTGTATAACAAGGTGCGGAACTATCTGACCAAGAACAATCTGAACACAAAGAAGATCAAGCTGAATTTCAAGAACCCTACACTGGCCAATGGCTGGGACCAGAACAAGGTGTACGATTATGCCTCCCTGATCTTTCTGCGGGACGGCAATTACTATCTGGGCATCATCAATCCTAAGAGAAAGAAGAACATCAAGTTCGAGCAGGGCTCTGGCAACGGCCCCTTCTACCGGAAGATGGTGTATAAGCAGATCCCCGGCCCTAATAAGAACCTGCCAAGAGTGTTCCTGACCTCCACAAAGGGCAAGAAGGAGTATAAGCCCTCTAAGGAGATCATCGAGGGCTACGAGGCCGACAAGCACATCAGGGGCGATAAGTTCGACCTGGATTTTTGTCACAAGCTGATCGATTTCTTTAAGGAGTCCATCGAGAAGCACAAGGACTGGTCTAAGTTCAACTTCTACTTCAGCCCAACCGAGAGCTATGGCGACATCTCTGAGTTCTACCTGGATGTGGAGAAGCAGGGCTATCGCATGCACTTTGAGAATATCAGCGCCGAGACAATCGACGAGTATGTGGAGAAGGGCGATCTGTTTCTGTTCCAGATCTACAACAAGGATTTTGTGAAGGCCGCCACCGGCAAGAAGGACATGCACACAATCTACTGGAATGCCGCCTTCAGCCCCGAGAACCTGCAGGACGTGGTGGTGAAGCTGAACGGCGAGGCCGAGCTGTTTTATAGGGACAAGTCCGATATCAAGGAGATCGTGCACCGCGAGGGCGAGATCCTGGTGAATAGGACCTACAACGGCCGCACACCAGTGCCCGACAAGATCCACAAGAAGCTGACCGATTATCACAATGGCCGGACAAAGGACCTGGGCGAGGCCAAGGAGTACCTGGATAAGGTGAGATACTTCAAGGCCCACTATGACATCACCAAGGATCGGAGATACCTGAACGACAAGATCTATTTCCACGTGCCTCTGACCCTGAACTTCAAGGCCAACGGCAAGAAGAATCTGAACAAGATGGTCATCGAGAAGTTCCTGTCCGATGAGAAGGCCCACATCATCGGCATCGACAGGGGCGAGCGCAATCTGCTGTACTATTCCATCATCGACAGGTCTGGCAAGATCATCGATCAGCAGAGCCTGAATGTGATCGACGGCTTTGATTATCGGGAGAAGCTGAACCAGAGAGAGATCGAGATGAAGGATGCCCGCCAGTCTTGGAACGCCATCGGCAAGATCAAGGACCTGAAGGAGGGCTACCTGAGCAAGGCCGTGCACGAGATCACCAAGATGGCCATCCAGTATAATGCCATCGTGGTCATGGAGGAGCTGAACTACGGCTTCAAGCGGGGCCGGTTCAAGGTGGAGAAGCAGATCTATCAGAAGTTCGAGAATATGCTGATCGATAAGATGAACTACCTGGTGTTTAAGGACGCACCTGATGAGTCCCCAGGAGGCGTGCTGAATGCCTACCAGCTGACAAACCCACTGGAGTCTTTCGCCAAGCTGGGCAAGCAGACCGGCATCCTGTTTTACGTGCCAGCCGCCTATACATCCAAGATCGACCCCACCACAGGCTTCGTGAATCTGTTTAACACCTCCTCTAAGACAAACGCCCAGGAGCGGAAGGAGTTCCTGCAGAAGTTTGAGAGCATCTCCTATTCTGCCAAGGATGGCGGCATCTTTGCCTTCGCCTTTGACTACAGAAAGTTCGGCACCAGCAAGACAGATCACAAGAACGTGTGGACCGCCTATACAAACGGCGAGAGGATGCGCTACATCAAGGAGAAGAAGCGGAATGAGCTGTTTGACCCTTCTAAGGAGATCAAGGAGGCCCTGACCAGCTCCGGCATCAAGTACGATGGCGGCCAGAACATCCTGCCAGACATCCTGAGGAGCAACAATAACGGCCTGATCTACACAATGTATTCTAGCTTCATCGCCGCCATCCAGATGCGCGTGTACGACGGCAAGGAGGATTATATCATCAGCCCCATCAAGAACTCCAAGGGCGAGTTCTTTAGGACCGACCCCAAGAGGCGCGAGCTGCCTATCGACGCCGATGCCAATGGCGCCTACAACATCGCCCTGAGGGGAGAGCTGACAATGAGGGCAATCGCAGAGAAGTTCGACCCTGATAGCGAGAAGATGGCCAAGCTGGAGCTGAAGCACAAGGATTGGTTCGAGTTTATGCAGACCAGAGGCGACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号３０）
【０１４８】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ（ＥｅＣｐｆ１；ｐＹ０１３）：
【０１４９】
MNGNRSIVYREFVGVIPVAKTLRNELRPVGHTQEHIIQNGLIQEDELRQEKSTELKNIMDDYYREYIDKSLSGVTDLDFTLLFELMNLVQSSPSKDNKKALEKEQSKMREQICTHLQSDSNYKNIFNAKLLKEILPDFIKNYNQYDVKDKAGKLETLALFNGFSTYFTDFFEKRKNVFTKEAVSTSIAYRIVHENSLIFLANMTSYKKISEKALDEIEVIEKNNQDKMGDWELNQIFNPDFYNMVLIQSGIDFYNEICGVVNAHMNLYCQQTKNNYNLFKMRKLHKQILAYTSTSFEVPKMFEDDMSVYNAVNAFIDETEKGNIIGKLKDIVNKYDELDEKRIYISKDFYETLSCFMSGNWNLITGCVENFYDENIHAKGKSKEEKVKKAVKEDKYKSINDVNDLVEKYIDEKERNEFKNSNAKQYIREISNIITDTETAHLEYDDHISLIESEEKADEMKKRLDMYMNMYHWAKAFIVDEVLDRDEMFYSDIDDIYNILENIVPLYNRVRNYVTQKPYNSKKIKLNFQSPTLANGWSQSKEFDNNAIILIRDNKYYLAIFNAKNKPDKKIIQGNSDKKNDNDYKKMVYNLLPGANKMLPKVFLSKKGIETFKPSDYIISGYNAHKHIKTSENFDISFCRDLIDYFKNSIEKHAEWRKYEFKFSATDSYSDISEFYREVEMQGYRIDWTYISEADINKLDEEGKIYLFQIYNKDFAENSTGKENLHTMYFKNIFSEENLKDIIIKLNGQAELFYRRASVKNPVKHKKDSVLVNKTYKNQLDNGDVVRIPIPDDIYNEIYKMYNGYIKESDLSEAAKEYLDKVEVRTAQKDIVKDYRYTVDKYFIHTPITINYKVTARNNVNDMVVKYIAQNDDIHVIGIDRGERNLIYISVIDSHGNIVKQKSYNILNNYDYKKKLVEKEKTREYARKNWKSIGNIKELKEGYISGVVHEIAMLIVEYNAIIAMEDLNYGFKRGRFKVERQVYQKFESMLINKLNYFASKEKSVDEPGGLLKGYQLTYVPDNIKNLGKQCGVIFYVPAAFTSKIDPSTGFISAFNFKSISTNASRKQFFMQFDEIRYCAEKDMFSFGFDYNNFDTYNITMGKTQWTVYTNGERLQSEFNNARRTGKTKSINLTETIKLLLEDNEINYADGHDIRIDMEKMDEDKKSEFFAQLLSLYKLTVQMRNSYTEAEEQENGISYDKIISPVINDEGEFFDSDNYKESDDKECKMPKDADANGAYCIALKGLYEVLKIKSEWTEDGFDRNCLKLPHAEWLDFIQNKRYEKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号３１）
【０１５０】
配列番号３１は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１５１】
配列番号３１は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１５２】
ATGAACGGCAATAGGTCCATCGTGTACCGCGAGTTCGTGGGCGTGATCCCCGTGGCCAAGACCCTGAGGAATGAGCTGCGCCCTGTGGGCCACACACAGGAGCACATCATCCAGAACGGCCTGATCCAGGAGGACGAGCTGCGGCAGGAGAAGAGCACCGAGCTGAAGAACATCATGGACGATTACTATAGAGAGTACATCGATAAGTCTCTGAGCGGCGTGACCGACCTGGACTTCACCCTGCTGTTCGAGCTGATGAACCTGGTGCAGAGCTCCCCCTCCAAGGACAATAAGAAGGCCCTGGAGAAGGAGCAGTCTAAGATGAGGGAGCAGATCTGCACCCACCTGCAGTCCGACTCTAACTACAAGAATATCTTTAACGCCAAGCTGCTGAAGGAGATCCTGCCTGATTTCATCAAGAACTACAATCAGTATGACGTGAAGGATAAGGCCGGCAAGCTGGAGACACTGGCCCTGTTTAATGGCTTCAGCACATACTTTACCGACTTCTTTGAGAAGAGGAAGAACGTGTTCACCAAGGAGGCCGTGAGCACATCCATCGCCTACCGCATCGTGCACGAGAACTCCCTGATCTTCCTGGCCAATATGACCTCTTATAAGAAGATCAGCGAGAAGGCCCTGGATGAGATCGAAGTGATCGAGAAGAACAATCAGGACAAGATGGGCGATTGGGAGCTGAATCAGATCTTTAACCCTGACTTCTACAATATGGTGCTGATCCAGTCCGGCATCGACTTCTACAACGAGATCTGCGGCGTGGTGAATGCCCACATGAACCTGTACTGTCAGCAGACCAAGAACAATTATAACCTGTTCAAGATGCGGAAGCTGCACAAGCAGATCCTGGCCTACACCAGCACCAGCTTCGAGGTGCCCAAGATGTTCGAGGACGATATGAGCGTGTATAACGCCGTGAACGCCTTCATCGACGAGACAGAGAAGGGCAACATCATCGGCAAGCTGAAGGATATCGTGAATAAGTACGACGAGCTGGATGAGAAGAGAATCTATATCAGCAAGGACTTTTACGAGACACTGAGCTGCTTCATGTCCGGCAACTGGAATCTGATCACAGGCTGCGTGGAGAACTTCTACGATGAGAACATCCACGCCAAGGGCAAGTCCAAGGAGGAGAAGGTGAAGAAGGCCGTGAAGGAGGACAAGTACAAGTCTATCAATGACGTGAACGATCTGGTGGAGAAGTATATCGATGAGAAGGAGAGGAATGAGTTCAAGAACAGCAATGCCAAGCAGTACATCCGCGAGATCTCCAACATCATCACCGACACAGAGACAGCCCACCTGGAGTATGACGATCACATCTCTCTGATCGAGAGCGAGGAGAAGGCCGACGAGATGAAGAAGCGGCTGGATATGTATATGAACATGTACCACTGGGCCAAGGCCTTTATCGTGGACGAGGTGCTGGACAGAGATGAGATGTTCTACAGCGATATCGACGATATCTATAATATCCTGGAGAACATCGTGCCACTGTATAATCGGGTGAGAAACTACGTGACCCAGAAGCCCTACAACTCTAAGAAGATCAAGCTGAATTTCCAGAGCCCTACACTGGCCAATGGCTGGTCCCAGTCTAAGGAGTTCGACAACAATGCCATCATCCTGATCAGAGATAACAAGTACTATCTGGCCATCTTCAATGCCAAGAACAAGCCAGACAAGAAGATCATCCAGGGCAACTCCGATAAGAAGAACGACAACGATTACAAGAAGATGGTGTATAACCTGCTGCCAGGCGCCAACAAGATGCTGCCCAAGGTGTTTCTGTCTAAGAAGGGCATCGAGACATTCAAGCCCTCCGACTATATCATCTCTGGCTACAACGCCCACAAGCACATCAAGACAAGCGAGAATTTTGATATCTCCTTCTGTCGGGACCTGATCGATTACTTCAAGAACAGCATCGAGAAGCACGCCGAGTGGAGAAAGTATGAGTTCAAGTTTTCCGCCACCGACAGCTACTCCGATATCTCTGAGTTCTATCGGGAGGTGGAGATGCAGGGCTACAGAATCGACTGGACATATATCAGCGAGGCCGACATCAACAAGCTGGATGAGGAGGGCAAGATCTATCTGTTTCAGATCTACAATAAGGATTTCGCCGAGAACAGCACCGGCAAGGAGAATCTGCACACAATGTACTTTAAGAACATCTTCTCCGAGGAGAATCTGAAGGACATCATCATCAAGCTGAACGGCCAGGCCGAGCTGTTTTATCGGAGAGCCTCTGTGAAGAATCCCGTGAAGCACAAGAAGGATAGCGTGCTGGTGAACAAGACCTACAAGAATCAGCTGGACAACGGCGACGTGGTGAGAATCCCCATCCCTGACGATATCTATAACGAGATCTACAAGATGTATAATGGCTACATCAAGGAGTCCGACCTGTCTGAGGCCGCCAAGGAGTACCTGGATAAGGTGGAGGTGAGGACCGCCCAGAAGGACATCGTGAAGGATTACCGCTATACAGTGGACAAGTACTTCATCCACACACCTATCACCATCAACTATAAGGTGACCGCCCGCAACAATGTGAATGATATGGTGGTGAAGTACATCGCCCAGAACGACGATATCCACGTGATCGGCATCGACCGGGGCGAGAGAAACCTGATCTACATCTCCGTGATCGATTCTCACGGCAACATCGTGAAGCAGAAATCCTACAACATCCTGAACAACTACGACTACAAGAAGAAGCTGGTGGAGAAGGAGAAAACCCGGGAGTACGCCAGAAAGAACTGGAAGAGCATCGGCAATATCAAGGAGCTGAAGGAGGGCTATATCTCCGGCGTGGTGCACGAGATCGCCATGCTGATCGTGGAGTACAACGCCATCATCGCCATGGAGGACCTGAATTATGGCTTTAAGAGGGGCCGCTTCAAGGTGGAGCGGCAGGTGTACCAGAAGTTTGAGAGCATGCTGATCAATAAGCTGAACTATTTCGCCAGCAAGGAGAAGTCCGTGGACGAGCCAGGAGGCCTGCTGAAGGGCTATCAGCTGACCTACGTGCCCGATAATATCAAGAACCTGGGCAAGCAGTGCGGCGTGATCTTTTACGTGCCTGCCGCCTTCACCAGCAAGATCGACCCATCCACAGGCTTTATCTCTGCCTTCAACTTTAAGTCTATCAGCACAAATGCCTCTCGGAAGCAGTTCTTTATGCAGTTTGACGAGATCAGATACTGTGCCGAGAAGGATATGTTCAGCTTTGGCTTCGACTACAACAACTTCGATACCTACAACATCACAATGGGCAAGACACAGTGGACCGTGTATACAAACGGCGAGAGACTGCAGTCTGAGTTCAACAATGCCAGGCGCACCGGCAAGACAAAGAGCATCAATCTGACAGAGACAATCAAGCTGCTGCTGGAGGACAATGAGATCAACTACGCCGACGGCCACGATATCAGGATCGATATGGAGAAGATGGACGAGGATAAGAAGAGCGAGTTCTTTGCCCAGCTGCTGAGCCTGTATAAGCTGACCGTGCAGATGCGCAATTCCTATACAGAGGCCGAGGAGCAGGAGAACGGCATCTCTTACGACAAGATCATCAGCCCTGTGATCAATGATGAGGGCGAGTTCTTTGACTCCGATAACTATAAGGAGTCTGACGATAAGGAGTGCAAGATGCCAAAGGACGCCGATGCCAACGGCGCCTACTGTATCGCCCTGAAGGGCCTGTATGAGGTGCTGAAGATCAAGAGCGAGTGGACCGAGGACGGCTTTGATAGGAATTGCCTGAAGCTGCCACACGCAGAGTGGCTGGACTTCATCCAGAACAAGCGGTACGAGAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号３２）
【０１５３】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７（ＭｂＣｐｆ１；ｐＹ０１４）：
【０１５４】
MLFQDFTHLYPLSKTVRFELKPIDRTLEHIHAKNFLSQDETMADMHQKVKVILDDYHRDFIADMMGEVKLTKLAEFYDVYLKFRKNPKDDELQKQLKDLQAVLRKEIVKPIGNGGKYKAGYDRLFGAKLFKDGKELGDLAKFVIAQEGESSPKLAHLAHFEKFSTYFTGFHDNRKNMYSDEDKHTAIAYRLIHENLPRFIDNLQILTTIKQKHSALYDQIINELTASGLDVSLASHLDGYHKLLTQEGITAYNTLLGGISGEAGSPKIQGINELINSHHNQHCHKSERIAKLRPLHKQILSDGMSVSFLPSKFADDSEMCQAVNEFYRHYADVFAKVQSLFDGFDDHQKDGIYVEHKNLNELSKQAFGDFALLGRVLDGYYVDVVNPEFNERFAKAKTDNAKAKLTKEKDKFIKGVHSLASLEQAIEHYTARHDDESVQAGKLGQYFKHGLAGVDNPIQKIHNNHSTIKGFLERERPAGERALPKIKSGKNPEMTQLRQLKELLDNALNVAHFAKLLTTKTTLDNQDGNFYGEFGVLYDELAKIPTLYNKVRDYLSQKPFSTEKYKLNFGNPTLLNGWDLNKEKDNFGVILQKDGCYYLALLDKAHKKVFDNAPNTGKSIYQKMIYKYLEVRKQFPKVFFSKEAIAINYHPSKELVEIKDKGRQRSDDERLKLYRFILECLKIHPKYDKKFEGAIGDIQLFKKDKKGREVPISEKDLFDKINGIFSSKPKLEMEDFFIGEFKRYNPSQDLVDQYNIYKKIDSNDNRKKENFYNNHPKFKKDLVRYYYESMCKHEEWEESFEFSKKLQDIGCYVDVNELFTEIETRRLNYKISFCNINADYIDELVEQGQLYLFQIYNKDFSPKAHGKPNLHTLYFKALFSEDNLADPIYKLNGEAQIFYRKASLDMNETTIHRAGEVLENKNPDNPKKRQFVYDIIKDKRYTQDKFMLHVPITMNFGVQGMTIKEFNKKVNQSIQQYDEVNVIGIDRGERHLLYLTVINSKGEILEQCSLNDITTASANGTQMTTPYHKILDKREIERLNARVGWGEIETIKELKSGYLSHVVHQISQLMLKYNAIVVLEDLNFGFKRGRFKVEKQIYQNFENALIKKLNHLVLKDKADDEIGSYKNALQLTNNFTDLKSIGKQTGFLFYVPAWNTSKIDPETGFVDLLKPRYENIAQSQAFFGKFDKICYNADKDYFEFHIDYAKFTDKAKNSRQIWTICSHGDKRYVYDKTANQNKGAAKGINVNDELKSLFARHHINEKQPNLVMDICQNNDKEFHKSLMYLLKTLLALRYSNASSDEDFILSPVANDEGVFFNSALADDTQPQNADANGAYHIALKGLWLLNELKNSDDLNKVKLAIDNQTWLNFAQNRKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号３３）
【０１５５】
配列番号３３は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１５６】
配列番号３３は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１５７】
ATGCTGTTCCAGGACTTTACCCACCTGTATCCACTGTCCAAGACAGTGAGATTTGAGCTGAAGCCCATCGATAGGACCCTGGAGCACATCCACGCCAAGAACTTCCTGTCTCAGGACGAGACAATGGCCGATATGCACCAGAAGGTGAAAGTGATCCTGGACGATTACCACCGCGACTTCATCGCCGATATGATGGGCGAGGTGAAGCTGACCAAGCTGGCCGAGTTCTATGACGTGTACCTGAAGTTTCGGAAGAACCCAAAGGACGATGAGCTGCAGAAGCAGCTGAAGGATCTGCAGGCCGTGCTGAGAAAGGAGATCGTGAAGCCCATCGGCAATGGCGGCAAGTATAAGGCCGGCTACGACAGGCTGTTCGGCGCCAAGCTGTTTAAGGACGGCAAGGAGCTGGGCGATCTGGCCAAGTTCGTGATCGCACAGGAGGGAGAGAGCTCCCCAAAGCTGGCCCACCTGGCCCACTTCGAGAAGTTTTCCACCTATTTCACAGGCTTTCACGATAACCGGAAGAATATGTATTCTGACGAGGATAAGCACACCGCCATCGCCTACCGCCTGATCCACGAGAACCTGCCCCGGTTTATCGACAATCTGCAGATCCTGACCACAATCAAGCAGAAGCACTCTGCCCTGTACGATCAGATCATCAACGAGCTGACCGCCAGCGGCCTGGACGTGTCTCTGGCCAGCCACCTGGATGGCTATCACAAGCTGCTGACACAGGAGGGCATCACCGCCTACAATACACTGCTGGGAGGAATCTCCGGAGAGGCAGGCTCTCCTAAGATCCAGGGCATCAACGAGCTGATCAATTCTCACCACAACCAGCACTGCCACAAGAGCGAGAGAATCGCCAAGCTGAGGCCACTGCACAAGCAGATCCTGTCCGACGGCATGAGCGTGTCCTTCCTGCCCTCTAAGTTTGCCGACGATAGCGAGATGTGCCAGGCCGTGAACGAGTTCTATCGCCACTACGCCGACGTGTTCGCCAAGGTGCAGAGCCTGTTCGACGGCTTTGACGATCACCAGAAGGATGGCATCTACGTGGAGCACAAGAACCTGAATGAGCTGTCCAAGCAGGCCTTCGGCGACTTTGCACTGCTGGGACGCGTGCTGGACGGATACTATGTGGATGTGGTGAATCCAGAGTTCAACGAGCGGTTTGCCAAGGCCAAGACCGACAATGCCAAGGCCAAGCTGACAAAGGAGAAGGATAAGTTCATCAAGGGCGTGCACTCCCTGGCCTCTCTGGAGCAGGCCATCGAGCACTATACCGCAAGGCACGACGATGAGAGCGTGCAGGCAGGCAAGCTGGGACAGTACTTCAAGCACGGCCTGGCCGGAGTGGACAACCCCATCCAGAAGATCCACAACAATCACAGCACCATCAAGGGCTTTCTGGAGAGGGAGCGCCCTGCAGGAGAGAGAGCCCTGCCAAAGATCAAGTCCGGCAAGAATCCTGAGATGACACAGCTGAGGCAGCTGAAGGAGCTGCTGGATAACGCCCTGAATGTGGCCCACTTCGCCAAGCTGCTGACCACAAAGACCACACTGGACAATCAGGATGGCAACTTCTATGGCGAGTTTGGCGTGCTGTACGACGAGCTGGCCAAGATCCCCACCCTGTATAACAAGGTGAGAGATTACCTGAGCCAGAAGCCTTTCTCCACCGAGAAGTACAAGCTGAACTTTGGCAATCCAACACTGCTGAATGGCTGGGACCTGAACAAGGAGAAGGATAATTTCGGCGTGATCCTGCAGAAGGACGGCTGCTACTATCTGGCCCTGCTGGACAAGGCCCACAAGAAGGTGTTTGATAACGCCCCTAATACAGGCAAGAGCATCTATCAGAAGATGATCTATAAGTACCTGGAGGTGAGGAAGCAGTTCCCCAAGGTGTTCTTTTCCAAGGAGGCCATCGCCATCAACTACCACCCTTCTAAGGAGCTGGTGGAGATCAAGGACAAGGGCCGGCAGAGATCCGACGATGAGCGCCTGAAGCTGTATCGGTTTATCCTGGAGTGTCTGAAGATCCACCCTAAGTACGATAAGAAGTTCGAGGGCGCCATCGGCGACATCCAGCTGTTTAAGAAGGATAAGAAGGGCAGAGAGGTGCCAATCAGCGAGAAGGACCTGTTCGATAAGATCAACGGCATCTTTTCTAGCAAGCCTAAGCTGGAGATGGAGGACTTCTTTATCGGCGAGTTCAAGAGGTATAACCCAAGCCAGGACCTGGTGGATCAGTATAATATCTACAAGAAGATCGACTCCAACGATAATCGCAAGAAGGAGAATTTCTACAACAATCACCCCAAGTTTAAGAAGGATCTGGTGCGGTACTATTACGAGTCTATGTGCAAGCACGAGGAGTGGGAGGAGAGCTTCGAGTTTTCCAAGAAGCTGCAGGACATCGGCTGTTACGTGGATGTGAACGAGCTGTTTACCGAGATCGAGACACGGAGACTGAATTATAAGATCTCCTTCTGCAACATCAATGCCGACTACATCGATGAGCTGGTGGAGCAGGGCCAGCTGTATCTGTTCCAGATCTACAACAAGGACTTTTCCCCAAAGGCCCACGGCAAGCCCAATCTGCACACCCTGTACTTCAAGGCCCTGTTTTCTGAGGACAACCTGGCCGATCCTATCTATAAGCTGAATGGCGAGGCCCAGATCTTCTACAGAAAGGCCTCCCTGGACATGAACGAGACAACAATCCACAGGGCCGGCGAGGTGCTGGAGAACAAGAATCCCGATAATCCTAAGAAGAGACAGTTCGTGTACGACATCATCAAGGATAAGAGGTACACACAGGACAAGTTCATGCTGCACGTGCCAATCACCATGAACTTTGGCGTGCAGGGCATGACAATCAAGGAGTTCAATAAGAAGGTGAACCAGTCTATCCAGCAGTATGACGAGGTGAACGTGATCGGCATCGATCGGGGCGAGAGACACCTGCTGTACCTGACCGTGATCAATAGCAAGGGCGAGATCCTGGAGCAGTGTTCCCTGAACGACATCACCACAGCCTCTGCCAATGGCACACAGATGACCACACCTTACCACAAGATCCTGGATAAGAGGGAGATCGAGCGCCTGAACGCCCGGGTGGGATGGGGCGAGATCGAGACAATCAAGGAGCTGAAGTCTGGCTATCTGAGCCACGTGGTGCACCAGATCAGCCAGCTGATGCTGAAGTACAACGCCATCGTGGTGCTGGAGGACCTGAATTTCGGCTTTAAGAGGGGCCGCTTTAAGGTGGAGAAGCAGATCTATCAGAACTTCGAGAATGCCCTGATCAAGAAGCTGAACCACCTGGTGCTGAAGGACAAGGCCGACGATGAGATCGGCTCTTACAAGAATGCCCTGCAGCTGACCAACAATTTCACAGATCTGAAGAGCATCGGCAAGCAGACCGGCTTCCTGTTTTATGTGCCCGCCTGGAACACCTCTAAGATCGACCCTGAGACAGGCTTTGTGGATCTGCTGAAGCCAAGATACGAGAACATCGCCCAGAGCCAGGCCTTCTTTGGCAAGTTCGACAAGATCTGCTATAATGCCGACAAGGATTACTTCGAGTTTCACATCGACTACGCCAAGTTTACCGATAAGGCCAAGAATAGCCGCCAGATCTGGACAATCTGTTCCCACGGCGACAAGCGGTACGTGTACGATAAGACAGCCAACCAGAATAAGGGCGCCGCCAAGGGCATCAACGTGAATGATGAGCTGAAGTCCCTGTTCGCCCGCCACCACATCAACGAGAAGCAGCCCAACCTGGTCATGGACATCTGCCAGAACAATGATAAGGAGTTTCACAAGTCTCTGATGTACCTGCTGAAAACCCTGCTGGCCCTGCGGTACAGCAACGCCTCCTCTGACGAGGATTTCATCCTGTCCCCCGTGGCAAACGACGAGGGCGTGTTCTTTAATAGCGCCCTGGCCGACGATACACAGCCTCAGAATGCCGATGCCAACGGCGCCTACCACATCGCCCTGAAGGGCCTGTGGCTGCTGAATGAGCTGAAGAACTCCGACGATCTGAACAAGGTGAAGCTGGCCATCGACAATCAGACCTGGCTGAATTTCGCCCAGAACAGGAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号３４）
【０１５８】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ（ＬｉＣｐｆ１；ｐＹ０１５）：
【０１５９】
MEDYSGFVNIYSIQKTLRFELKPVGKTLEHIEKKGFLKKDKIRAEDYKAVKKIIDKYHRAYIEEVFDSVLHQKKKKDKTRFSTQFIKEIKEFSELYYKTEKNIPDKERLEALSEKLRKMLVGAFKGEFSEEVAEKYKNLFSKELIRNEIEKFCETDEERKQVSNFKSFTTYFTGFHSNRQNIYSDEKKSTAIGYRIIHQNLPKFLDNLKIIESIQRRFKDFPWSDLKKNLKKIDKNIKLTEYFSIDGFVNVLNQKGIDAYNTILGGKSEESGEKIQGLNEYINLYRQKNNIDRKNLPNVKILFKQILGDRETKSFIPEAFPDDQSVLNSITEFAKYLKLDKKKKSIIAELKKFLSSFNRYELDGIYLANDNSLASISTFLFDDWSFIKKSVSFKYDESVGDPKKKIKSPLKYEKEKEKWLKQKYYTISFLNDAIESYSKSQDEKRVKIRLEAYFAEFKSKDDAKKQFDLLERIEEAYAIVEPLLGAEYPRDRNLKADKKEVGKIKDFLDSIKSLQFFLKPLLSAEIFDEKDLGFYNQLEGYYEEIDSIGHLYNKVRNYLTGKIYSKEKFKLNFENSTLLKGWDENREVANLCVIFREDQKYYLGVMDKENNTILSDIPKVKPNELFYEKMVYKLIPTPHMQLPRIIFSSDNLSIYNPSKSILKIREAKSFKEGKNFKLKDCHKFIDFYKESISKNEDWSRFDFKFSKTSSYENISEFYREVERQGYNLDFKKVSKFYIDSLVEDGKLYLFQIYNKDFSIFSKGKPNLHTIYFRSLFSKENLKDVCLKLNGEAEMFFRKKSINYDEKKKREGHHPELFEKLKYPILKDKRYSEDKFQFHLPISLNFKSKERLNFNLKVNEFLKRNKDINIIGIDRGERNLLYLVMINQKGEILKQTLLDSMQSGKGRPEINYKEKLQEKEIERDKARKSWGTVENIKELKEGYLSIVIHQISKLMVENNAIVVLEDLNIGFKRGRQKVERQVYQKFEKMLIDKLNFLVFKENKPTEPGGVLKAYQLTDEFQSFEKLSKQTGFLFYVPSWNTSKIDPRTGFIDFLHPAYENIEKAKQWINKFDSIRFNSKMDWFEFTADTRKFSENLMLGKNRVWVICTTNVERYFTSKTANSSIQYNSIQITEKLKELFVDIPFSNGQDLKPEILRKNDAVFFKSLLFYIKTTLSLRQNNGKKGEEEKDFILSPVVDSKGRFFNSLEASDDEPKDADANGAYHIALKGLMNLLVLNETKEENLSRPKWKIKNKDWLEFVWERNRKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号３５）
【０１６０】
配列番号３５は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１６１】
配列番号３５は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１６２】
ATGGAGGACTATTCCGGCTTTGTGAACATCTACTCTATCCAGAAAACCCTGAGGTTCGAGCTGAAGCCAGTGGGCAAGACACTGGAGCACATCGAGAAGAAGGGCTTCCTGAAGAAGGACAAGATCCGGGCCGAGGATTACAAGGCCGTGAAGAAGATCATCGATAAGTACCACAGAGCCTATATCGAGGAGGTGTTTGATTCCGTGCTGCACCAGAAGAAGAAGAAGGACAAGACCCGCTTTTCTACACAGTTCATCAAGGAGATCAAGGAGTTCAGCGAGCTGTACTATAAGACCGAGAAGAACATCCCCGACAAGGAGAGGCTGGAGGCCCTGAGCGAGAAGCTGCGCAAGATGCTGGTGGGCGCCTTTAAGGGCGAGTTCTCCGAGGAGGTGGCCGAGAAGTATAAGAACCTGTTTTCTAAGGAGCTGATCAGGAATGAGATCGAGAAGTTCTGCGAGACAGACGAGGAGCGCAAGCAGGTGTCTAACTTCAAGAGCTTCACCACATACTTTACCGGCTTCCACTCCAACAGGCAGAATATCTATTCCGACGAGAAGAAGTCTACAGCCATCGGCTACCGCATCATCCACCAGAACCTGCCTAAGTTCCTGGATAATCTGAAGATCATCGAGTCCATCCAGCGGCGGTTCAAGGACTTCCCATGGTCTGATCTGAAGAAGAACCTGAAGAAGATCGATAAGAATATCAAGCTGACCGAGTACTTCAGCATCGACGGCTTCGTGAACGTGCTGAATCAGAAGGGCATCGATGCCTACAACACAATCCTGGGCGGCAAGTCCGAGGAGTCTGGCGAGAAGATCCAGGGCCTGAACGAGTACATCAATCTGTATCGGCAGAAGAACAATATCGACAGAAAGAACCTGCCCAATGTGAAGATCCTGTTTAAGCAGATCCTGGGCGATAGGGAGACAAAGAGCTTTATCCCTGAGGCCTTCCCAGACGATCAGTCCGTGCTGAACTCTATCACAGAGTTCGCCAAGTACCTGAAGCTGGATAAGAAGAAGAAGAGCATCATCGCCGAGCTGAAGAAGTTTCTGAGCTCCTTCAATCGCTACGAGCTGGACGGCATCTATCTGGCCAACGATAATAGCCTGGCCTCTATCAGCACCTTCCTGTTTGACGATTGGTCCTTTATCAAGAAGTCCGTGTCTTTCAAGTATGACGAGTCCGTGGGCGACCCCAAGAAGAAGATCAAGTCTCCCCTGAAGTACGAGAAGGAGAAGGAGAAGTGGCTGAAGCAGAAGTACTATACAATCTCTTTCCTGAACGATGCCATCGAGAGCTATTCCAAGTCTCAGGACGAGAAGAGGGTGAAGATCCGCCTGGAGGCCTACTTTGCCGAGTTCAAGAGCAAGGACGATGCCAAGAAGCAGTTCGACCTGCTGGAGAGGATCGAGGAGGCCTATGCCATCGTGGAGCCTCTGCTGGGAGCAGAGTACCCAAGGGACCGCAACCTGAAGGCCGATAAGAAGGAAGTGGGCAAGATCAAGGACTTCCTGGATAGCATCAAGTCCCTGCAGTTCTTTCTGAAGCCTCTGCTGTCCGCCGAGATCTTTGACGAGAAGGATCTGGGCTTCTACAATCAGCTGGAGGGCTACTATGAGGAGATCGATTCTATCGGCCACCTGTATAACAAGGTGCGGAATTATCTGACCGGCAAGATCTACAGCAAGGAGAAGTTTAAGCTGAACTTCGAGAACAGCACCCTGCTGAAGGGCTGGGACGAGAACCGGGAGGTGGCCAATCTGTGCGTGATCTTCAGAGAGGACCAGAAGTACTATCTGGGCGTGATGGATAAGGAGAACAATACCATCCTGTCCGACATCCCCAAGGTGAAGCCTAACGAGCTGTTTTACGAGAAGATGGTGTATAAGCTGATCCCCACACCTCACATGCAGCTGCCCCGGATCATCTTCTCTAGCGACAACCTGTCTATCTATAATCCTAGCAAGTCCATCCTGAAGATCAGAGAGGCCAAGAGCTTTAAGGAGGGCAAGAACTTCAAGCTGAAGGACTGTCACAAGTTTATCGATTTCTACAAGGAGTCTATCAGCAAGAATGAGGACTGGAGCAGATTCGACTTCAAGTTCAGCAAGACCAGCAGCTACGAGAACATCAGCGAGTTTTACCGGGAGGTGGAGAGACAGGGCTATAACCTGGACTTCAAGAAGGTGTCTAAGTTCTACATCGACAGCCTGGTGGAGGATGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAACAAGGACTTTTCTATCTTCAGCAAGGGCAAGCCCAATCTGCACACCATCTATTTTCGGTCCCTGTTCTCTAAGGAGAACCTGAAGGACGTGTGCCTGAAGCTGAATGGCGAGGCCGAGATGTTCTTTCGGAAGAAGTCCATCAACTACGATGAGAAGAAGAAGCGGGAGGGCCACCACCCCGAGCTGTTTGAGAAGCTGAAGTATCCTATCCTGAAGGACAAGAGATACAGCGAGGATAAGTTTCAGTTCCACCTGCCCATCAGCCTGAACTTCAAGTCCAAGGAGCGGCTGAACTTTAATCTGAAAGTGAATGAGTTCCTGAAGAGAAACAAGGACATCAATATCATCGGCATCGATCGGGGCGAGAGAAACCTGCTGTACCTGGTCATGATCAATCAGAAGGGCGAGATCCTGAAGCAGACCCTGCTGGACAGCATGCAGTCCGGCAAGGGCCGGCCTGAGATCAACTACAAGGAGAAGCTGCAGGAGAAGGAGATCGAGAGGGATAAGGCCCGCAAGAGCTGGGGCACAGTGGAGAATATCAAGGAGCTGAAGGAGGGCTATCTGTCTATCGTGATCCACCAGATCAGCAAGCTGATGGTGGAGAACAATGCCATCGTGGTGCTGGAGGACCTGAACATCGGCTTTAAGCGGGGCAGACAGAAGGTGGAGCGGCAGGTGTACCAGAAGTTCGAGAAGATGCTGATCGATAAGCTGAACTTTCTGGTGTTCAAGGAGAATAAGCCAACCGAGCCAGGAGGCGTGCTGAAGGCCTATCAGCTGACAGACGAGTTTCAGTCTTTCGAGAAGCTGAGCAAGCAGACCGGCTTTCTGTTCTACGTGCCAAGCTGGAACACCTCCAAGATCGACCCCAGAACAGGCTTTATCGATTTCCTGCACCCTGCCTACGAGAATATCGAGAAGGCCAAGCAGTGGATCAACAAGTTTGATTCCATCAGGTTCAATTCTAAGATGGACTGGTTTGAGTTCACCGCCGATACACGCAAGTTTTCCGAGAACCTGATGCTGGGCAAGAATCGGGTGTGGGTCATCTGCACCACAAATGTGGAGCGGTACTTCACCAGCAAGACCGCCAACAGCTCCATCCAGTACAATAGCATCCAGATCACCGAGAAGCTGAAGGAGCTGTTTGTGGACATCCCTTTCAGCAACGGCCAGGATCTGAAGCCAGAGATCCTGAGGAAGAATGACGCCGTGTTCTTTAAGAGCCTGCTGTTTTACATCAAGACCACACTGTCCCTGCGCCAGAACAATGGCAAGAAGGGCGAGGAGGAGAAGGACTTCATCCTGAGCCCAGTGGTGGATTCCAAGGGCCGGTTCTTTAACTCTCTGGAGGCCAGCGACGATGAGCCCAAGGACGCCGATGCCAATGGCGCCTACCACATCGCCCTGAAGGGCCTGATGAACCTGCTGGTGCTGAATGAGACAAAGGAGGAGAACCTGAGCAGACCAAAGTGGAAGATCAAGAATAAGGACTGGCTGGAGTTCGTGTGGGAGAGGAACCGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号３６）
【０１６３】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１；ｐＹ０１６）：
【０１６４】
MSKLEKFTNCYSLSKTLRFKAIPVGKTQENIDNKRLLVEDEKRAEDYKGVKKLLDRYYLSFINDVLHSIKLKNLNNYISLFRKKTRTEKENKELENLEINLRKEIAKAFKGNEGYKSLFKKDIIETILPEFLDDKDEIALVNSFNGFTTAFTGFFDNRENMFSEEAKSTSIAFRCINENLTRYISNMDIFEKVDAIFDKHEVQEIKEKILNSDYDVEDFFEGEFFNFVLTQEGIDVYNAIIGGFVTESGEKIKGLNEYINLYNQKTKQKLPKFKPLYKQVLSDRESLSFYGEGYTSDEEVLEVFRNTLNKNSEIFSSIKKLEKLFKNFDEYSSAGIFVKNGPAISTISKDIFGEWNVIRDKWNAEYDDIHLKKKAVVTEKYEDDRRKSFKKIGSFSLEQLQEYADADLSVVEKLKEIIIQKVDEIYKVYGSSEKLFDADFVLEKSLKKNDAVVAIMKDLLDSVKSFENYIKAFFGEGKETNRDESFYGDFVLAYDILLKVDHIYDAIRNYVTQKPYSKDKFKLYFQNPQFMGGWDKDKETDYRATILRYGSKYYLAIMDKKYAKCLQKIDKDDVNGNYEKINYKLLPGPNKMLPKVFFSKKWMAYYNPSEDIQKIYKNGTFKKGDMFNLNDCHKLIDFFKDSISRYPKWSNAYDFNFSETEKYKDIAGFYREVEEQGYKVSFESASKKEVDKLVEEGKLYMFQIYNKDFSDKSHGTPNLHTMYFKLLFDENNHGQIRLSGGAELFMRRASLKKEELVVHPANSPIANKNPDNPKKTTTLSYDVYKDKRFSEDQYELHIPIAINKCPKNIFKINTEVRVLLKHDDNPYVIGIDRGERNLLYIVVVDGKGNIVEQYSLNEIINNFNGIRIKTDYHSLLDKKEKERFEARQNWTSIENIKELKAGYISQVVHKICELVEKYDAVIALEDLNSGFKNSRVKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYMVDKKSNPCATGGALKGYQITNKFESFKSMSTQNGFIFYIPAWLTSKIDPSTGFVNLLKTKYTSIADSKKFISSFDRIMYVPEEDLFEFALDYKNFSRTDADYIKKWKLYSYGNRIRIFRNPKKNNVFDWEEVCLTSAYKELFNKYGINYQQGDIRALLCEQSDKAFYSSFMALMSLMLQMRNSITGRTDVDFLISPVKNSDGIFYDSRNYEAQENAILPKNADANGAYNIARKVLWAIGQFKKAEDEKLDKVKIAISNKEWLEYAQTSVKHKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号３７）
【０１６５】
配列番号３７は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１６６】
配列番号３７は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１６７】
ATGAGCAAGCTGGAGAAGTTTACAAACTGCTACTCCCTGTCTAAGACCCTGAGGTTCAAGGCCATCCCTGTGGGCAAGACCCAGGAGAACATCGACAATAAGCGGCTGCTGGTGGAGGACGAGAAGAGAGCCGAGGATTATAAGGGCGTGAAGAAGCTGCTGGATCGCTACTATCTGTCTTTTATCAACGACGTGCTGCACAGCATCAAGCTGAAGAATCTGAACAATTACATCAGCCTGTTCCGGAAGAAAACCAGAACCGAGAAGGAGAATAAGGAGCTGGAGAACCTGGAGATCAATCTGCGGAAGGAGATCGCCAAGGCCTTCAAGGGCAACGAGGGCTACAAGTCCCTGTTTAAGAAGGATATCATCGAGACAATCCTGCCAGAGTTCCTGGACGATAAGGACGAGATCGCCCTGGTGAACAGCTTCAATGGCTTTACCACAGCCTTCACCGGCTTCTTTGATAACAGAGAGAATATGTTTTCCGAGGAGGCCAAGAGCACATCCATCGCCTTCAGGTGTATCAACGAGAATCTGACCCGCTACATCTCTAATATGGACATCTTCGAGAAGGTGGACGCCATCTTTGATAAGCACGAGGTGCAGGAGATCAAGGAGAAGATCCTGAACAGCGACTATGATGTGGAGGATTTCTTTGAGGGCGAGTTCTTTAACTTTGTGCTGACACAGGAGGGCATCGACGTGTATAACGCCATCATCGGCGGCTTCGTGACCGAGAGCGGCGAGAAGATCAAGGGCCTGAACGAGTACATCAACCTGTATAATCAGAAAACCAAGCAGAAGCTGCCTAAGTTTAAGCCACTGTATAAGCAGGTGCTGAGCGATCGGGAGTCTCTGAGCTTCTACGGCGAGGGCTATACATCCGATGAGGAGGTGCTGGAGGTGTTTAGAAACACCCTGAACAAGAACAGCGAGATCTTCAGCTCCATCAAGAAGCTGGAGAAGCTGTTCAAGAATTTTGACGAGTACTCTAGCGCCGGCATCTTTGTGAAGAACGGCCCCGCCATCAGCACAATCTCCAAGGATATCTTCGGCGAGTGGAACGTGATCCGGGACAAGTGGAATGCCGAGTATGACGATATCCACCTGAAGAAGAAGGCCGTGGTGACCGAGAAGTACGAGGACGATCGGAGAAAGTCCTTCAAGAAGATCGGCTCCTTTTCTCTGGAGCAGCTGCAGGAGTACGCCGACGCCGATCTGTCTGTGGTGGAGAAGCTGAAGGAGATCATCATCCAGAAGGTGGATGAGATCTACAAGGTGTATGGCTCCTCTGAGAAGCTGTTCGACGCCGATTTTGTGCTGGAGAAGAGCCTGAAGAAGAACGACGCCGTGGTGGCCATCATGAAGGACCTGCTGGATTCTGTGAAGAGCTTCGAGAATTACATCAAGGCCTTCTTTGGCGAGGGCAAGGAGACAAACAGGGACGAGTCCTTCTATGGCGATTTTGTGCTGGCCTACGACATCCTGCTGAAGGTGGACCACATCTACGATGCCATCCGCAATTATGTGACCCAGAAGCCCTACTCTAAGGATAAGTTCAAGCTGTATTTTCAGAACCCTCAGTTCATGGGCGGCTGGGACAAGGATAAGGAGACAGACTATCGGGCCACCATCCTGAGATACGGCTCCAAGTACTATCTGGCCATCATGGATAAGAAGTACGCCAAGTGCCTGCAGAAGATCGACAAGGACGATGTGAACGGCAATTACGAGAAGATCAACTATAAGCTGCTGCCCGGCCCTAATAAGATGCTGCCAAAGGTGTTCTTTTCTAAGAAGTGGATGGCCTACTATAACCCCAGCGAGGACATCCAGAAGATCTACAAGAATGGCACATTCAAGAAGGGCGATATGTTTAACCTGAATGACTGTCACAAGCTGATCGACTTCTTTAAGGATAGCATCTCCCGGTATCCAAAGTGGTCCAATGCCTACGATTTCAACTTTTCTGAGACAGAGAAGTATAAGGACATCGCCGGCTTTTACAGAGAGGTGGAGGAGCAGGGCTATAAGGTGAGCTTCGAGTCTGCCAGCAAGAAGGAGGTGGATAAGCTGGTGGAGGAGGGCAAGCTGTATATGTTCCAGATCTATAACAAGGACTTTTCCGATAAGTCTCACGGCACACCCAATCTGCACACCATGTACTTCAAGCTGCTGTTTGACGAGAACAATCACGGACAGATCAGGCTGAGCGGAGGAGCAGAGCTGTTCATGAGGCGCGCCTCCCTGAAGAAGGAGGAGCTGGTGGTGCACCCAGCCAACTCCCCTATCGCCAACAAGAATCCAGATAATCCCAAGAAAACCACAACCCTGTCCTACGACGTGTATAAGGATAAGAGGTTTTCTGAGGACCAGTACGAGCTGCACATCCCAATCGCCATCAATAAGTGCCCCAAGAACATCTTCAAGATCAATACAGAGGTGCGCGTGCTGCTGAAGCACGACGATAACCCCTATGTGATCGGCATCGATAGGGGCGAGCGCAATCTGCTGTATATCGTGGTGGTGGACGGCAAGGGCAACATCGTGGAGCAGTATTCCCTGAACGAGATCATCAACAACTTCAACGGCATCAGGATCAAGACAGATTACCACTCTCTGCTGGACAAGAAGGAGAAGGAGAGGTTCGAGGCCCGCCAGAACTGGACCTCCATCGAGAATATCAAGGAGCTGAAGGCCGGCTATATCTCTCAGGTGGTGCACAAGATCTGCGAGCTGGTGGAGAAGTACGATGCCGTGATCGCCCTGGAGGACCTGAACTCTGGCTTTAAGAATAGCCGCGTGAAGGTGGAGAAGCAGGTGTATCAGAAGTTCGAGAAGATGCTGATCGATAAGCTGAACTACATGGTGGACAAGAAGTCTAATCCTTGTGCAACAGGCGGCGCCCTGAAGGGCTATCAGATCACCAATAAGTTCGAGAGCTTTAAGTCCATGTCTACCCAGAACGGCTTCATCTTTTACATCCCTGCCTGGCTGACATCCAAGATCGATCCATCTACCGGCTTTGTGAACCTGCTGAAAACCAAGTATACCAGCATCGCCGATTCCAAGAAGTTCATCAGCTCCTTTGACAGGATCATGTACGTGCCCGAGGAGGATCTGTTCGAGTTTGCCCTGGACTATAAGAACTTCTCTCGCACAGACGCCGATTACATCAAGAAGTGGAAGCTGTACTCCTACGGCAACCGGATCAGAATCTTCCGGAATCCTAAGAAGAACAACGTGTTCGACTGGGAGGAGGTGTGCCTGACCAGCGCCTATAAGGAGCTGTTCAACAAGTACGGCATCAATTATCAGCAGGGCGATATCAGAGCCCTGCTGTGCGAGCAGTCCGACAAGGCCTTCTACTCTAGCTTTATGGCCCTGATGAGCCTGATGCTGCAGATGCGGAACAGCATCACAGGCCGCACCGACGTGGATTTTCTGATCAGCCCTGTGAAGAACTCCGACGGCATCTTCTACGATAGCCGGAACTATGAGGCCCAGGAGAATGCCATCCTGCCAAAGAACGCCGACGCCAATGGCGCCTATAACATCGCCAGAAAGGTGCTGTGGGCCATCGGCCAGTTCAAGAAGGCCGAGGACGAGAAGCTGGATAAGGTGAAGATCGCCATCTCTAACAAGGAGTGGCTGGAGTACGCCCAGACCAGCGTGAAGCACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号３８）
【０１６８】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ（ＰｃＣｐｆ１；ｐＹ０１７）：
【０１６９】
MDSLKDFTNLYPVSKTLRFELKPVGKTLENIEKAGILKEDEHRAESYRRVKKIIDTYHKVFIDSSLENMAKMGIENEIKAMLQSFCELYKKDHRTEGEDKALDKIRAVLRGLIVGAFTGVCGRRENTVQNEKYESLFKEKLIKEILPDFVLSTEAESLPFSVEEATRSLKEFDSFTSYFAGFYENRKNIYSTKPQSTAIAYRLIHENLPKFIDNILVFQKIKEPIAKELEHIRADFSAGGYIKKDERLEDIFSLNYYIHVLSQAGIEKYNALIGKIVTEGDGEMKGLNEHINLYNQQRGREDRLPLFRPLYKQILSDREQLSYLPESFEKDEELLRALKEFYDHIAEDILGRTQQLMTSISEYDLSRIYVRNDSQLTDISKKMLGDWNAIYMARERAYDHEQAPKRITAKYERDRIKALKGEESISLANLNSCIAFLDNVRDCRVDTYLSTLGQKEGPHGLSNLVENVFASYHEAEQLLSFPYPEENNLIQDKDNVVLIKNLLDNISDLQRFLKPLWGMGDEPDKDERFYGEYNYIRGALDQVIPLYNKVRNYLTRKPYSTRKVKLNFGNSQLLSGWDRNKEKDNSCVILRKGQNFYLAIMNNRHKRSFENKMLPEYKEGEPYFEKMDYKFLPDPNKMLPKVFLSKKGIEIYKPSPKLLEQYGHGTHKKGDTFSMDDLHELIDFFKHSIEAHEDWKQFGFKFSDTATYENVSSFYREVEDQGYKLSFRKVSESYVYSLIDQGKLYLFQIYNKDFSPCSKGTPNLHTLYWRMLFDERNLADVIYKLDGKAEIFFREKSLKNDHPTHPAGKPIKKKSRQKKGEESLFEYDLVKDRRYTMDKFQFHVPITMNFKCSAGSKVNDMVNAHIREAKDMHVIGIDRGERNLLYICVIDSRGTILDQISLNTINDIDYHDLLESRDKDRQQEHRNWQTIEGIKELKQGYLSQAVHRIAELMVAYKAVVALEDLNMGFKRGRQKVESSVYQQFEKQLIDKLNYLVDKKKRPEDIGGLLRAYQFTAPFKSFKEMGKQNGFLFYIPAWNTSNIDPTTGFVNLFHVQYENVDKAKSFFQKFDSISYNPKKDWFEFAFDYKNFTKKAEGSRSMWILCTHGSRIKNFRNSQKNGQWDSEEFALTEAFKSLFVRYEIDYTADLKTAIVDEKQKDFFVDLLKLFKLTVQMRNSWKEKDLDYLISPVAGADGRFFDTREGNKSLPKDADANGAYNIALKGLWALRQIRQTSEGGKLKLAISNKEWLQFVQERSYEKDKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号３９）
【０１７０】
配列番号３９は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１７１】
配列番号３９は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１７２】
ATGGACAGCCTGAAGGATTTCACCAACCTGTACCCCGTGTCCAAGACACTGCGGTTTGAGCTGAAGCCTGTGGGCAAGACCCTGGAGAATATCGAGAAGGCCGGCATCCTGAAGGAGGATGAGCACAGAGCCGAGAGCTACCGGAGAGTGAAGAAGATCATCGATACATATCACAAGGTGTTCATCGACAGCTCCCTGGAGAACATGGCCAAGATGGGCATCGAGAATGAGATCAAGGCCATGCTGCAGTCCTTTTGCGAGCTGTATAAGAAGGACCACAGGACCGAGGGAGAGGACAAGGCCCTGGATAAGATCAGGGCCGTGCTGAGGGGCCTGATCGTGGGAGCCTTCACCGGCGTGTGCGGCCGGCGGGAGAACACAGTGCAGAATGAGAAGTATGAGAGCCTGTTTAAGGAGAAGCTGATCAAGGAGATCCTGCCAGATTTCGTGCTGTCTACAGAGGCCGAGTCCCTGCCCTTTTCTGTGGAGGAGGCCACCAGAAGCCTGAAGGAGTTCGACTCCTTTACATCTTACTTCGCCGGCTTTTATGAGAACCGGAAGAATATCTACTCTACCAAGCCCCAGAGCACAGCCATCGCCTATAGACTGATCCACGAGAACCTGCCTAAGTTCATCGATAATATCCTGGTGTTTCAGAAGATCAAGGAGCCAATCGCCAAGGAGCTGGAGCACATCAGGGCAGACTTCAGCGCCGGCGGCTACATCAAGAAGGATGAGCGCCTGGAGGACATCTTTTCCCTGAACTACTATATCCACGTGCTGTCTCAGGCCGGCATCGAGAAGTACAATGCCCTGATCGGCAAGATCGTGACCGAGGGCGATGGCGAGATGAAGGGCCTGAACGAGCACATCAACCTGTATAATCAGCAGAGGGGCCGCGAGGACCGGCTGCCACTGTTCAGACCCCTGTATAAGCAGATCCTGTCTGATAGGGAGCAGCTGTCCTATCTGCCAGAGTCTTTCGAGAAGGACGAGGAGCTGCTGAGGGCCCTGAAGGAGTTTTACGATCACATCGCAGAGGACATCCTGGGAAGGACCCAGCAGCTGATGACAAGCATCTCCGAGTACGATCTGTCCCGGATCTATGTGAGAAACGATAGCCAGCTGACCGACATCTCCAAGAAGATGCTGGGCGATTGGAATGCCATCTACATGGCCCGGGAGAGAGCCTATGACCACGAGCAGGCCCCCAAGCGCATCACAGCCAAGTACGAGAGGGACCGCATCAAGGCCCTGAAGGGCGAGGAGTCTATCAGCCTGGCCAACCTGAACAGCTGCATCGCCTTCCTGGACAACGTGAGGGATTGTCGCGTGGACACCTATCTGTCTACACTGGGACAGAAGGAGGGACCTCACGGCCTGAGCAACCTGGTGGAGAACGTGTTCGCCTCCTACCACGAGGCCGAGCAGCTGCTGTCTTTTCCCTATCCTGAGGAGAACAATCTGATCCAGGACAAGGATAACGTGGTGCTGATCAAGAACCTGCTGGATAATATCAGCGACCTGCAGAGGTTCCTGAAGCCACTGTGGGGCATGGGCGATGAGCCCGACAAGGATGAGAGGTTTTACGGCGAGTACAATTATATCAGGGGCGCCCTGGACCAGGTCATCCCTCTGTATAACAAGGTGCGGAATTATCTGACCCGCAAGCCATACTCCACACGCAAGGTGAAGCTGAACTTCGGCAATAGCCAGCTGCTGTCCGGCTGGGATAGGAACAAGGAGAAGGACAATTCTTGCGTGATCCTGCGCAAGGGCCAGAACTTCTACCTGGCCATCATGAACAATCGGCACAAGCGGAGCTTCGAGAATAAGATGCTGCCCGAGTATAAGGAGGGCGAGCCTTACTTCGAGAAGATGGATTATAAGTTTCTGCCAGACCCCAACAAGATGCTGCCCAAGGTGTTCCTGTCTAAGAAGGGCATCGAGATCTACAAGCCTAGCCCAAAGCTGCTGGAGCAGTATGGCCACGGCACCCACAAGAAGGGCGATACCTTCAGCATGGACGATCTGCACGAGCTGATCGACTTCTTTAAGCACTCCATCGAGGCCCACGAGGATTGGAAGCAGTTCGGCTTTAAGTTCAGCGACACCGCCACATACGAGAACGTGAGCAGCTTCTACCGGGAGGTGGAGGACCAGGGCTACAAGCTGTCTTTTAGAAAGGTGTCCGAGTCTTACGTGTATAGCCTGATCGATCAGGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAACAAGGACTTTAGCCCTTGTTCCAAGGGCACCCCAAATCTGCACACACTGTACTGGCGGATGCTGTTCGATGAGAGAAACCTGGCCGACGTGATCTATAAGCTGGATGGCAAGGCCGAGATCTTCTTTCGGGAGAAGTCCCTGAAGAATGACCACCCAACCCACCCTGCAGGCAAGCCCATCAAGAAGAAGAGCCGGCAGAAGAAGGGCGAGGAGAGCCTGTTCGAGTACGATCTGGTGAAGGACCGGAGATATACCATGGATAAGTTTCAGTTCCACGTGCCAATCACAATGAACTTTAAGTGCTCTGCCGGCAGCAAGGTGAACGACATGGTGAATGCCCACATCAGGGAGGCCAAGGACATGCACGTGATCGGCATCGATAGGGGCGAGCGCAATCTGCTGTATATCTGCGTGATCGACAGCCGCGGCACCATCCTGGATCAGATCTCCCTGAACACAATCAATGACATCGATTATCACGATCTGCTGGAGTCCAGGGACAAGGATCGCCAGCAGGAGCACAGGAACTGGCAGACCATCGAGGGCATCAAGGAGCTGAAGCAGGGCTACCTGTCTCAGGCCGTGCACCGCATCGCCGAGCTGATGGTGGCCTATAAGGCCGTGGTGGCCCTGGAGGACCTGAACATGGGCTTCAAGCGGGGCAGACAGAAGGTGGAGAGCAGCGTGTACCAGCAGTTTGAGAAGCAGCTGATCGACAAGCTGAATTATCTGGTGGATAAGAAGAAGCGGCCCGAGGACATCGGAGGCCTGCTGAGAGCCTACCAGTTCACCGCCCCTTTCAAGAGCTTTAAGGAGATGGGCAAGCAGAACGGCTTTCTGTTCTATATCCCTGCCTGGAACACATCCAATATCGACCCAACCACAGGCTTCGTGAACCTGTTTCACGTGCAGTACGAGAATGTGGATAAGGCCAAGAGCTTCTTTCAGAAGTTCGACAGCATCTCCTACAACCCTAAGAAGGATTGGTTTGAGTTCGCCTTTGACTATAAGAACTTCACCAAGAAGGCCGAGGGCTCTAGGAGCATGTGGATTCTGTGCACCCACGGCTCCCGGATCAAGAACTTCAGAAATTCTCAGAAGAATGGCCAGTGGGATAGCGAGGAGTTTGCCCTGACCGAGGCCTTCAAGTCCCTGTTTGTGCGGTACGAGATCGATTATACCGCCGACCTGAAAACCGCCATCGTGGACGAGAAGCAGAAGGATTTCTTTGTGGACCTGCTGAAGCTGTTCAAGCTGACCGTGCAGATGAGAAACTCCTGGAAGGAGAAGGACCTGGATTACCTGATCTCTCCAGTGGCCGGCGCCGATGGCAGGTTCTTTGACACACGCGAGGGCAATAAGAGCCTGCCCAAGGACGCAGATGCAAACGGAGCCTATAATATCGCCCTGAAGGGCCTGTGGGCACTGAGGCAGATCAGACAGACCTCCGAGGGCGGCAAGCTGAAGCTGGCCATCTCTAACAAGGAGTGGCTGCAGTTTGTGCAGGAGAGATCCTACGAGAAGGACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号４０）
【０１７３】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ（ＰｄＣｐｆ１；ｐＹ０１８）：
【０１７４】
MENYQEFTNLFQLNKTLRFELKPIGKTCELLEEGKIFASGSFLEKDKVRADNVSYVKKEIDKKHKIFIEETLSSFSISNDLLKQYFDCYNELKAFKKDCKSDEEEVKKTALRNKCTSIQRAMREAISQAFLKSPQKKLLAIKNLIENVFKADENVQHFSEFTSYFSGFETNRENFYSDEEKSTSIAYRLVHDNLPIFIKNIYIFEKLKEQFDAKTLSEIFENYKLYVAGSSLDEVFSLEYFNNTLTQKGIDNYNAVIGKIVKEDKQEIQGLNEHINLYNQKHKDRRLPFFISLKKQILSDREALSWLPDMFKNDSEVIKALKGFYIEDGFENNVLTPLATLLSSLDKYNLNGIFIRNNEALSSLSQNVYRNFSIDEAIDANAELQTFNNYELIANALRAKIKKETKQGRKSFEKYEEYIDKKVKAIDSLSIQEINELVENYVSEFNSNSGNMPRKVEDYFSLMRKGDFGSNDLIENIKTKLSAAEKLLGTKYQETAKDIFKKDENSKLIKELLDATKQFQHFIKPLLGTGEEADRDLVFYGDFLPLYEKFEELTLLYNKVRNRLTQKPYSKDKIRLCFNKPKLMTGWVDSKTEKSDNGTQYGGYLFRKKNEIGEYDYFLGISSKAQLFRKNEAVIGDYERLDYYQPKANTIYGSAYEGENSYKEDKKRLNKVIIAYIEQIKQTNIKKSIIESISKYPNISDDDKVTPSSLLEKIKKVSIDSYNGILSFKSFQSVNKEVIDNLLKTISPLKNKAEFLDLINKDYQIFTEVQAVIDEICKQKTFIYFPISNVELEKEMGDKDKPLCLFQISNKDLSFAKTFSANLRKKRGAENLHTMLFKALMEGNQDNLDLGSGAIFYRAKSLDGNKPTHPANEAIKCRNVANKDKVSLFTYDIYKNRRYMENKFLFHLSIVQNYKAANDSAQLNSSATEYIRKADDLHIIGIDRGERNLLYYSVIDMKGNIVEQDSLNIIRNNDLETDYHDLLDKREKERKANRQNWEAVEGIKDLKKGYLSQAVHQIAQLMLKYNAIIALEDLGQMFVTRGQKIEKAVYQQFEKSLVDKLSYLVDKKRPYNELGGILKAYQLASSITKNNSDKQNGFLFYVPAWNTSKIDPVTGFTDLLRPKAMTIKEAQDFFGAFDNISYNDKGYFEFETNYDKFKIRMKSAQTRWTICTFGNRIKRKKDKNYWNYEEVELTEEFKKLFKDSNIDYENCNLKEEIQNKDNRKFFDDLIKLLQLTLQMRNSDDKGNDYIISPVANAEGQFFDSRNGDKKLPLDADANGAYNIARKGLWNIRQIKQTKNDKKLNLSISSTEWLDFVREKPYLKKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号４１）
【０１７５】
配列番号４１は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１７６】
配列番号４１は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１７７】
ATGGAGAACTATCAGGAGTTCACCAACCTGTTTCAGCTGAATAAGACACTGAGATTCGAGCTGAAGCCCATCGGCAAGACCTGCGAGCTGCTGGAGGAGGGCAAGATCTTCGCCAGCGGCTCCTTTCTGGAGAAGGACAAGGTGAGGGCCGATAACGTGAGCTACGTGAAGAAGGAGATCGACAAGAAGCACAAGATCTTTATCGAGGAGACACTGAGCTCCTTCTCTATCAGCAACGATCTGCTGAAGCAGTACTTTGACTGCTATAATGAGCTGAAGGCCTTCAAGAAGGACTGTAAGAGCGATGAGGAGGAGGTGAAGAAAACCGCCCTGCGCAACAAGTGTACCTCCATCCAGAGGGCCATGCGCGAGGCCATCTCTCAGGCCTTTCTGAAGAGCCCCCAGAAGAAGCTGCTGGCCATCAAGAACCTGATCGAGAACGTGTTCAAGGCCGACGAGAATGTGCAGCACTTCTCCGAGTTTACCAGCTATTTCTCCGGCTTTGAGACAAACAGAGAGAATTTCTACTCTGACGAGGAGAAGTCCACATCTATCGCCTATAGGCTGGTGCACGATAACCTGCCTATCTTCATCAAGAACATCTACATCTTCGAGAAGCTGAAGGAGCAGTTCGACGCCAAGACCCTGAGCGAGATCTTCGAGAACTACAAGCTGTATGTGGCCGGCTCTAGCCTGGATGAGGTGTTCTCCCTGGAGTACTTTAACAATACCCTGACACAGAAGGGCATCGACAACTATAATGCCGTGATCGGCAAGATCGTGAAGGAGGATAAGCAGGAGATCCAGGGCCTGAACGAGCACATCAACCTGTATAATCAGAAGCACAAGGACCGGAGACTGCCCTTCTTTATCTCCCTGAAGAAGCAGATCCTGTCCGATCGGGAGGCCCTGTCTTGGCTGCCTGACATGTTCAAGAATGATTCTGAAGTGATCAAGGCCCTGAAGGGCTTCTACATCGAGGACGGCTTTGAGAACAATGTGCTGACACCTCTGGCCACCCTGCTGTCCTCTCTGGATAAGTACAACCTGAATGGCATCTTTATCCGCAACAATGAGGCCCTGAGCTCCCTGTCCCAGAACGTGTATCGGAATTTTTCTATCGACGAGGCCATCGATGCCAACGCCGAGCTGCAGACCTTCAACAATTACGAGCTGATCGCCAATGCCCTGCGCGCCAAGATCAAGAAGGAGACAAAGCAGGGCCGGAAGTCTTTCGAGAAGTACGAGGAGTATATCGATAAGAAGGTGAAGGCCATCGACAGCCTGTCCATCCAGGAGATCAACGAGCTGGTGGAGAATTACGTGAGCGAGTTTAACTCTAATAGCGGCAACATGCCAAGAAAGGTGGAGGACTACTTCAGCCTGATGAGGAAGGGCGACTTCGGCTCCAACGATCTGATCGAAAATATCAAGACCAAGCTGAGCGCCGCAGAGAAGCTGCTGGGCACAAAGTACCAGGAGACAGCCAAGGACATCTTCAAGAAGGATGAGAACTCCAAGCTGATCAAGGAGCTGCTGGACGCCACCAAGCAGTTCCAGCACTTTATCAAGCCACTGCTGGGCACAGGCGAGGAGGCAGATCGGGACCTGGTGTTCTACGGCGATTTTCTGCCCCTGTATGAGAAGTTTGAGGAGCTGACCCTGCTGTATAACAAGGTGCGGAATAGACTGACACAGAAGCCCTATTCCAAGGACAAGATCCGCCTGTGCTTCAACAAGCCTAAGCTGATGACAGGCTGGGTGGATTCCAAGACCGAGAAGTCTGACAACGGCACACAGTACGGCGGCTATCTGTTTCGGAAGAAGAATGAGATCGGCGAGTACGATTATTTTCTGGGCATCTCTAGCAAGGCCCAGCTGTTCAGAAAGAACGAGGCCGTGATCGGCGACTACGAGAGGCTGGATTACTATCAGCCAAAGGCCAATACCATCTACGGCTCTGCCTATGAGGGCGAGAACAGCTACAAGGAGGACAAGAAGCGGCTGAACAAAGTGATCATCGCCTATATCGAGCAGATCAAGCAGACAAACATCAAGAAGTCTATCATCGAGTCCATCTCTAAGTATCCTAATATCAGCGACGATGACAAGGTGACCCCATCCTCTCTGCTGGAGAAGATCAAGAAGGTGTCTATCGACAGCTACAACGGCATCCTGTCCTTCAAGTCTTTTCAGAGCGTGAACAAGGAAGTGATCGATAACCTGCTGAAAACCATCAGCCCCCTGAAGAACAAGGCCGAGTTTCTGGACCTGATCAATAAGGATTATCAGATCTTCACCGAGGTGCAGGCCGTGATCGACGAGATCTGCAAGCAGAAAACCTTCATCTACTTTCCAATCTCCAACGTGGAGCTGGAGAAGGAGATGGGCGATAAGGACAAGCCCCTGTGCCTGTTCCAGATCAGCAATAAGGATCTGTCCTTCGCCAAGACCTTTAGCGCCAACCTGCGGAAGAAGAGAGGCGCCGAGAATCTGCACACAATGCTGTTTAAGGCCCTGATGGAGGGCAACCAGGATAATCTGGACCTGGGCTCTGGCGCCATCTTCTACAGAGCCAAGAGCCTGGACGGCAACAAGCCCACACACCCTGCCAATGAGGCCATCAAGTGTAGGAACGTGGCCAATAAGGATAAGGTGTCCCTGTTCACCTACGACATCTATAAGAACAGGCGCTACATGGAGAATAAGTTCCTGTTTCACCTGAGCATCGTGCAGAACTATAAGGCCGCCAATGACTCCGCCCAGCTGAACAGCTCCGCCACCGAGTATATCAGAAAGGCCGATGACCTGCACATCATCGGCATCGATAGGGGCGAGCGCAATCTGCTGTACTATTCCGTGATCGATATGAAGGGCAACATCGTGGAGCAGGACTCTCTGAATATCATCAGGAACAATGACCTGGAGACAGATTACCACGACCTGCTGGATAAGAGGGAGAAGGAGCGCAAGGCCAACCGGCAGAATTGGGAGGCCGTGGAGGGCATCAAGGACCTGAAGAAGGGCTACCTGAGCCAGGCCGTGCACCAGATCGCCCAGCTGATGCTGAAGTATAACGCCATCATCGCCCTGGAGGATCTGGGCCAGATGTTTGTGACCCGCGGCCAGAAGATCGAGAAGGCCGTGTACCAGCAGTTCGAGAAGAGCCTGGTGGATAAGCTGTCCTACCTGGTGGACAAGAAGCGGCCTTATAATGAGCTGGGCGGCATCCTGAAGGCCTACCAGCTGGCCTCTAGCATCACCAAGAACAATTCTGACAAGCAGAACGGCTTCCTGTTTTATGTGCCAGCCTGGAATACAAGCAAGATCGATCCCGTGACCGGCTTTACAGACCTGCTGCGGCCCAAGGCCATGACCATCAAGGAGGCCCAGGACTTCTTTGGCGCCTTCGATAACATCTCTTACAATGACAAGGGCTATTTCGAGTTTGAGACAAACTACGACAAGTTTAAGATCAGAATGAAGAGCGCCCAGACCAGGTGGACAATCTGCACCTTCGGCAATCGGATCAAGAGAAAGAAGGATAAGAACTACTGGAATTATGAGGAGGTGGAGCTGACCGAGGAGTTCAAGAAGCTGTTTAAGGACAGCAACATCGATTACGAGAACTGTAATCTGAAGGAGGAGATCCAGAACAAGGACAATCGCAAGTTCTTTGATGACCTGATCAAGCTGCTGCAGCTGACACTGCAGATGCGGAACTCCGATGACAAGGGCAATGATTATATCATCTCTCCTGTGGCCAACGCCGAGGGCCAGTTCTTTGACTCCCGCAATGGCGATAAGAAGCTGCCACTGGATGCAGACGCAAACGGAGCCTACAATATCGCCCGCAAGGGCCTGTGGAACATCCGGCAGATCAAGCAGACCAAGAACGACAAGAAGCTGAATCTGAGCATCTCCTCTACAGAGTGGCTGGATTTCGTGCGGGAGAAGCCTTACCTGAAGAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号４２）
【０１７８】
ＮＬＳ及びＨＡタグを含むＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ（ＰｍＣｐｆ１；ｐＹ０９）：
【０１７９】
MKTQHFFEDFTSLYSLSKTIRFELKPIGKTLENIKKNGLIRRDEQRLDDYEKLKKVIDEYHEDFIANILSSFSFSEEILQSYIQNLSESEARAKIEKTMRDTLAKAFSEDERYKSIFKKELVKKDIPVWCPAYKSLCKKFDNFTTSLVPFHENRKNLYTSNEITASIPYRIVHVNLPKFIQNIEALCELQKKMGADLYLEMMENLRNVWPSFVKTPDDLCNLKTYNHLMVQSSISEYNRFVGGYSTEDGTKHQGINEWINIYRQRNKEMRLPGLVFLHKQILAKVDSSSFISDTLENDDQVFCVLRQFRKLFWNTVSSKEDDAASLKDLFCGLSGYDPEAIYVSDAHLATISKNIFDRWNYISDAIRRKTEVLMPRKKESVERYAEKISKQIKKRQSYSLAELDDLLAHYSEESLPAGFSLLSYFTSLGGQKYLVSDGEVILYEEGSNIWDEVLIAFRDLQVILDKDFTEKKLGKDEEAVSVIKKALDSALRLRKFFDLLSGTGAEIRRDSSFYALYTDRMDKLKGLLKMYDKVRNYLTKKPYSIEKFKLHFDNPSLLSGWDKNKELNNLSVIFRQNGYYYLGIMTPKGKNLFKTLPKLGAEEMFYEKMEYKQIAEPMLMLPKVFFPKKTKPAFAPDQSVVDIYNKKTFKTGQKGFNKKDLYRLIDFYKEALTVHEWKLFNFSFSPTEQYRNIGEFFDEVREQAYKVSMVNVPASYIDEAVENGKLYLFQIYNKDFSPYSKGIPNLHTLYWKALFSEQNQSRVYKLCGGGELFYRKASLHMQDTTVHPKGISIHKKNLNKKGETSLFNYDLVKDKRFTEDKFFFHVPISINYKNKKITNVNQMVRDYIAQNDDLQIIGIDRGERNLLYISRIDTRGNLLEQFSLNVIESDKGDLRTDYQKILGDREQERLRRRQEWKSIESIKDLKDGYMSQVVHKICNMVVEHKAIVVLENLNLSFMKGRKKVEKSVYEKFERMLVDKLNYLVVDKKNLSNEPGGLYAAYQLTNPLFSFEELHRYPQSGILFFVDPWNTSLTDPSTGFVNLLGRINYTNVGDARKFFDRFNAIRYDGKGNILFDLDLSRFDVRVETQRKLWTLTTFGSRIAKSKKSGKWMVERIENLSLCFLELFEQFNIGYRVEKDLKKAILSQDRKEFYVRLIYLFNLMMQIRNSDGEEDYILSPALNEKNLQFDSRLIEAKDLPVDADANGAYNVARKGLMVVQRIKRGDHESIHRIGRAQWLRYVQEGIVEKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
（配列番号４３）
【０１８０】
配列番号４３は、核局在化シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号１２）、その次にグリシン−セリンリンカー（ＧＳ）、その次にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１３）を含む。
【０１８１】
配列番号４３は以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１８２】
ATGAAAACCCAGCACTTCTTTGAGGACTTCACAAGCCTGTACTCTCTGAGCAAGACCATCCGGTTTGAGCTGAAGCCAATCGGCAAGACCCTGGAGAACATCAAGAAGAATGGCCTGATCCGGAGAGATGAGCAGAGACTGGACGATTACGAGAAGCTGAAGAAAGTGATCGACGAGTATCACGAGGATTTCATCGCCAACATCCTGAGCTCCTTTTCCTTCTCTGAGGAGATCCTGCAGTCCTACATCCAGAATCTGAGCGAGTCCGAGGCCAGGGCCAAGATCGAGAAAACCATGCGCGACACACTGGCCAAGGCCTTCTCTGAGGATGAGAGGTACAAGAGCATCTTTAAGAAGGAGCTGGTGAAGAAGGACATCCCCGTGTGGTGCCCTGCCTATAAGAGCCTGTGCAAGAAGTTCGATAACTTTACCACATCTCTGGTGCCCTTCCACGAGAACAGGAAGAACCTGTATACCAGCAATGAGATCACAGCCTCTATCCCTTATCGCATCGTGCACGTGAACCTGCCAAAGTTTATCCAGAATATCGAGGCCCTGTGCGAGCTGCAGAAGAAGATGGGCGCCGACCTGTACCTGGAGATGATGGAGAACCTGCGCAACGTGTGGCCCAGCTTCGTGAAAACCCCAGACGACCTGTGCAACCTGAAAACCTATAATCACCTGATGGTGCAGTCTAGCATCAGCGAGTACAACAGGTTTGTGGGCGGCTATTCCACCGAGGACGGCACAAAGCACCAGGGCATCAACGAGTGGATCAATATCTACAGACAGAGGAATAAGGAGATGCGCCTGCCTGGCCTGGTGTTCCTGCACAAGCAGATCCTGGCCAAGGTGGACTCCTCTAGCTTCATCAGCGATACACTGGAGAACGACGATCAGGTGTTTTGCGTGCTGAGACAGTTCAGGAAGCTGTTTTGGAATACCGTGTCCTCTAAGGAGGACGATGCCGCCTCCCTGAAGGACCTGTTCTGTGGCCTGTCTGGCTATGACCCTGAGGCCATCTACGTGAGCGATGCCCACCTGGCCACAATCTCCAAGAACATCTTTGACAGATGGAATTACATCTCCGATGCCATCAGGCGCAAGACCGAGGTGCTGATGCCACGGAAGAAGGAGAGCGTGGAGAGATATGCCGAGAAGATCTCCAAGCAGATCAAGAAGAGACAGTCTTACAGCCTGGCCGAGCTGGACGATCTGCTGGCCCACTATAGCGAGGAGTCCCTGCCCGCAGGCTTCTCTCTGCTGAGCTACTTTACATCTCTGGGCGGCCAGAAGTATCTGGTGAGCGACGGCGAAGTGATCCTGTACGAGGAGGGCAGCAACATCTGGGACGAGGTGCTGATCGCCTTCAGGGATCTGCAGGTCATCCTGGACAAGGACTTCACCGAGAAGAAGCTGGGCAAGGATGAGGAGGCCGTGTCTGTGATCAAGAAGGCCCTGGACAGCGCCCTGCGCCTGCGGAAGTTCTTTGATCTGCTGTCCGGCACAGGCGCAGAGATCAGGAGAGACAGCTCCTTCTATGCCCTGTATACCGACCGGATGGATAAGCTGAAGGGCCTGCTGAAGATGTATGATAAGGTGAGAAACTACCTGACCAAGAAGCCTTATTCCATCGAGAAGTTCAAGCTGCACTTTGACAACCCATCCCTGCTGTCTGGCTGGGATAAGAATAAGGAGCTGAACAATCTGTCTGTGATCTTCCGGCAGAACGGCTACTATTACCTGGGCATCATGACACCCAAGGGCAAGAATCTGTTCAAGACCCTGCCTAAGCTGGGCGCCGAGGAGATGTTTTATGAGAAGATGGAGTACAAGCAGATCGCCGAGCCTATGCTGATGCTGCCAAAGGTGTTCTTTCCCAAGAAAACCAAGCCAGCCTTCGCCCCAGACCAGAGCGTGGTGGATATCTACAACAAGAAAACCTTCAAGACAGGCCAGAAGGGCTTTAATAAGAAGGACCTGTACCGGCTGATCGACTTCTACAAGGAGGCCCTGACAGTGCACGAGTGGAAGCTGTTTAACTTCTCCTTTTCTCCAACCGAGCAGTATCGGAATATCGGCGAGTTCTTTGACGAGGTGAGAGAGCAGGCCTACAAGGTGTCCATGGTGAACGTGCCCGCCTCTTATATCGACGAGGCCGTGGAGAACGGCAAGCTGTATCTGTTCCAGATCTACAATAAGGACTTCAGCCCCTACTCCAAGGGCATCCCTAACCTGCACACACTGTATTGGAAGGCCCTGTTCAGCGAGCAGAATCAGAGCCGGGTGTATAAGCTGTGCGGAGGAGGAGAGCTGTTTTATAGAAAGGCCAGCCTGCACATGCAGGACACCACAGTGCACCCCAAGGGCATCTCTATCCACAAGAAGAACCTGAATAAGAAGGGCGAGACAAGCCTGTTCAACTACGACCTGGTGAAGGATAAGAGGTTTACCGAGGACAAGTTCTTTTTCCACGTGCCTATCTCTATCAACTACAAGAATAAGAAGATCACCAACGTGAATCAGATGGTGCGCGATTATATCGCCCAGAACGACGATCTGCAGATCATCGGCATCGACCGCGGCGAGCGGAATCTGCTGTATATCAGCCGGATCGATACAAGGGGCAACCTGCTGGAGCAGTTCAGCCTGAATGTGATCGAGTCCGACAAGGGCGATCTGAGAACCGACTATCAGAAGATCCTGGGCGATCGCGAGCAGGAGCGGCTGAGGCGCCGGCAGGAGTGGAAGTCTATCGAGAGCATCAAGGACCTGAAGGATGGCTACATGAGCCAGGTGGTGCACAAGATCTGTAACATGGTGGTGGAGCACAAGGCCATCGTGGTGCTGGAGAACCTGAATCTGAGCTTCATGAAGGGCAGGAAGAAGGTGGAGAAGTCCGTGTACGAGAAGTTTGAGCGCATGCTGGTGGACAAGCTGAACTATCTGGTGGTGGATAAGAAGAACCTGTCCAATGAGCCAGGAGGCCTGTATGCAGCATACCAGCTGACCAATCCACTGTTCTCTTTTGAGGAGCTGCACAGATACCCCCAGAGCGGCATCCTGTTTTTCGTGGACCCATGGAACACCTCTCTGACAGATCCCAGCACAGGCTTCGTGAATCTGCTGGGCAGAATCAACTACACCAATGTGGGCGACGCCCGCAAGTTTTTCGATCGGTTTAACGCCATCAGATATGACGGCAAGGGCAATATCCTGTTCGACCTGGATCTGTCCAGATTTGATGTGAGGGTGGAGACACAGAGGAAGCTGTGGACACTGACCACATTCGGCTCTCGCATCGCCAAATCCAAGAAGTCTGGCAAGTGGATGGTGGAGCGGATCGAGAACCTGAGCCTGTGCTTTCTGGAGCTGTTCGAGCAGTTTAATATCGGCTACAGAGTGGAGAAGGACCTGAAGAAGGCCATCCTGAGCCAGGATAGGAAGGAGTTCTATGTGCGCCTGATCTACCTGTTTAACCTGATGATGCAGATCCGGAACAGCGACGGCGAGGAGGATTATATCCTGTCTCCCGCCCTGAACGAGAAGAATCTGCAGTTCGACAGCAGGCTGATCGAGGCCAAGGATCTGCCTGTGGACGCAGATGCAAACGGAGCATACAATGTGGCCCGCAAGGGCCTGATGGTGGTGCAGAGAATCAAGAGGGGCGACCACGAGTCCATCCACAGGATCGGAAGGGCACAGTGGCTGAGATATGTGCAGGAGGGCATCGTGGAGAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA
（配列番号４４）
【０１８３】
上記の非限定的な配列のいくつかは、核局在化シグナル及び／またはタグ配列（例えばＨＡタグなど）などの配列を含む。様々な実施形態において、異なる核局在化シグナルが存在し得る。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルを用いない。ある実施形態において、タグ（例えばＨＡタグ）を用いない。
【０１８４】
タンパク質（例えば遺伝子編集複合体中のタンパク質など）に関する様々な実施形態において、タンパク質は核局在化シグナルを含み得る。例えば、タンパク質（例えばＣａｓタンパク質）は核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。そのようなシグナルは当該技術分野において公知であり、Ｋａｌｄｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｃｅｌｌ  ３９  （３  Ｐｔ  ２）：  ４９９−５０９；  Ｍａｋｋｅｒｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  ６  （８）：  １０２５−７；及びＤｉｎｇｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６  （１２）：  ４７８−８１に非限定例が記載されており、それぞれの内容を参照により本明細書に援用する。核局在化シグナルの具体的な非限定例としては、ＧＧＳＧＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１２）、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４５）、ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号４６）、ＫＲ［ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ］ＫＫＫＫ（配列番号４７）、ＫＫＸＫ（配列番号４８）、ＫＲＸＫ（配列番号４９）、ＫＫＸＲ（配列番号５０）、ＫＲＸＲ（配列番号５１）、ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号５２）、ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号５３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５４）、及びＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号５５）が挙げられる。
【０１８５】
全般的な定義及び全般的な技術
別途具体的に定義しない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、当業者（例えば細胞培養、分子遺伝学、及び生化学における）によって一般に理解されるものと同じ意味を有するとみなすものとする。
【０１８６】
本明細書で用いる場合、数値または範囲との関連における用語「約」は、文脈上より限定された範囲に解釈されない限り、列挙または特許請求した数値または範囲の±１０％を意味する。
【０１８７】
上記の説明及び特許請求の範囲において、「の少なくとも１つ」または「の１つ以上」などの語句が要素または特徴の一連のリストの前に現れる場合がある。用語「及び／または」が２つ以上の要素または特徴のリストの中に現れる場合がある。用いられる文脈と暗示的または明示的に別途矛盾しない限り、そのような語句は、リストに挙げた要素もしくは特徴のいずれかを個別に、または列挙した要素もしくは特徴のいずれかを他の列挙した要素もしくは特徴のいずれかと併せて意味することを意図する。例えば、語句「Ａ及びＢの少なくとも１つ」、「Ａ及びＢの１つ以上」、ならびに「Ａ及び／またはＢ」はすべて、「Ａのみ、Ｂのみ、またはＡ及びＢともに」を意味することを意図する。３つ以上の事項を含むリストについても同様の解釈を意図する。例えば、語句「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、及びＣの１つ以上」、ならびに「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」はすべて、「Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢともに、Ａ及びＣともに、Ｂ及びＣともに、またはＡ及びＢ及びＣともに」を意味することを意図する。さらに、上記及び特許請求の範囲における用語「に基づく」の使用は、「に少なくとも部分的に基づく」を意味することを意図し、そのため、列挙していない特徴または要素も許容される。
【０１８８】
用語「原形質膜」及び「細胞膜」は、本明細書では同じ意味で用いられ、細胞の外側の環境から細胞の内部を隔てる半透膜のことをいう。
【０１８９】
本明細書で用いる場合、「発現ベクター」は、１つ以上のポリヌクレオチドの発現を引き起こすことのできるＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。発現ベクターは宿主細胞内で複製も可能であることが好ましい。発現ベクターは原核性または真核性のいずれかとすることができ、典型的にはプラスミドである。本発明の発現ベクターには、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞、例えば原生動物、藻類、真菌、酵母、植物、動物、脊椎動物、無脊椎動物、節足動物、哺乳類、げっ歯類、霊長類、またはヒト細胞のうちの１つなどの本発明の宿主細胞において機能する（すなわち遺伝子発現を誘導する）任意のベクターが含まれる。本発明の発現ベクターは、調節配列、例えば転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、及び宿主細胞と適合性のあり、ポリヌクレオチドの発現を制御する他の調節配列などを含有する。特に、本発明の発現ベクターは転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び終了を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御するもの、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列などである。好適な転写制御配列としては、本発明の細胞の少なくとも１つにおいて機能することのできる任意の転写制御配列が挙げられる。様々なそのような転写制御配列が当業者には公知である。好ましい実施形態において、本方法は、核酸分子またはコンストラクトを送達するためのウイルスベクター、例えばアデノウイルスなどの使用を含まない。
【０１９０】
パラメータ範囲を規定する場合、その範囲内のすべての整数及びその１０分の１も本発明によって規定されることが理解される。例えば、「０．２〜５ｍｇ」は、５．０ｍｇ以下の０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇなどの開示である。
【０１９１】
用いられる文脈と暗示的または明示的に別途矛盾しない限り、細胞の「圧搾」、「圧搾すること」、「変形」などへの言及は、最小限の細胞傷害性で細胞のサイトゾル内に巨大分子を直接送達するために用いられるプロセスのことをいう。このアプローチの根底にある原理は、標的細胞の急速な機械的変形、または圧搾による一時的な膜破砕であり、これが液状媒体中の巨大分子の拡散による取込みを可能とし、その後、細胞膜修復が生じる（例えば２０１４年９月２５日に公開された米国特許出願公開第２０１４／０２８７５０９号；２０１５年１０月３０日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５８４８９号；及び２０１５年１１月１３日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／２０１５／０６０６８９号を参照、それぞれの全内容を参照により本明細書に援用する）。
【０１９２】
本明細書で用いる場合、「ｇＲＮＡ」はＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡのことをいう。
【０１９３】
本明細書で用いる場合、用語「タンパク質複合体」は、結合パートナーとのタンパク質の特異的結合から生じる複合ユニットのことをいい、ここで前記結合パートナーは、前記タンパク質複合体を形成する１つ以上のタンパク質、１つ以上の核酸、または１つ以上のタンパク質及び１つ以上の核酸の組合せなどとすることができる。タンパク質複合体はタンパク質−タンパク質複合体、タンパク質−核酸複合体などであり得る。ある実施形態において、タンパク質複合体はタンパク質−タンパク質相互作用、例えば異なるタンパク質間の相互作用、または同じタンパク質の二量体、三量体、四量体もしくはより高位のオリゴマーを含み得る。タンパク質複合体のサブユニット間の（例えば２つ以上のタンパク質を含むタンパク質−タンパク質複合体もしくはタンパク質−核酸複合体における）またはタンパク質と核酸との間の（例えばタンパク質−核酸複合体における）相互作用は、一般に非結合性相互作用、例えば水素架橋、π電子系、例えば（任意により共役）Ｃ−−Ｃ二重結合または芳香環、例えばフェニル、及びヘテロ芳香環、例えばピロール、イミダゾール、インドール、ピリミジンもしくはプリン環などに起因する相互作用、ならびに金属原子と酸素、窒素または硫黄原子との間の相互作用などであるが、弱い、特に可逆的な共有結合性相互作用、例えば硫黄−硫黄架橋でもあり得る。
【０１９４】
「タンパク質−タンパク質複合体」は、タンパク質間の相互作用によって形成された２つ以上のタンパク質の組合せである複合ユニットを意味する。必ずしもこれに限らないが典型的には、「タンパク質複合体」は特異的な非共有結合性親和力を介した２つ以上のタンパク質同士の結合によって形成される。しかし、相互作用しているパートナー間で共有結合も存在し得る。例えば、２つの相互作用しているパートナーは、タンパク質複合体がより安定となるように共有結合で架橋される場合もある。
【０１９５】
同様に、「タンパク質−核酸複合体」は、タンパク質と核酸との間の相互作用を含む相互作用によって形成された少なくとも１つのタンパク質及び少なくとも１つの核酸の組合せである複合ユニットを意味する。典型的には、「タンパク質−核酸複合体」は非共有結合性親和力を介したタンパク質及び核酸の結合によって形成されるが、必ずしもこれに限らない。
【０１９６】
様々な実施形態において、遺伝子編集複合体はタンパク質−核酸複合体、例えばＲＮＰなどである。ＲＮＰの非限定例はＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＲＮＰである。
【０１９７】
本明細書に記載の方法及びデバイスは、完全で機能的な遺伝子編集複合体を細胞内に送達する。遺伝子編集複合体のコンポーネントは送達中に解離することなく、細胞内への送達後も機能を維持する。
【０１９８】
完全で機能的な遺伝子編集複合体が細胞に送達されたかどうか判定するために、様々なアッセイが利用可能である。例えば、完全で機能的な遺伝子編集複合体が細胞に送達されたことを示すために、遺伝子編集複合体による遺伝子編集の検出が用いられ得る。代替としてまたは追加で、遺伝子編集複合体が送達された細胞は非変性条件（例えば非変性バッファーまたはフレンチプレスなど）を用いて溶解され、非変性ゲルを用いてライセートが分析され、遺伝子編集複合体が細胞内で完全な状態であったかどうか判定され得る。代替としてまたは追加で、細胞は非変性条件を用いて溶解され、その後、免疫沈降を用いてライセートから遺伝子編集複合体が単離され得る（すなわち、免疫沈降を用いて複合体の１つのコンポーネントを別のコンポーネントと共単離できることを確認するため）。単離した遺伝子編集複合体は、遺伝子編集複合体が送達前／細胞圧搾前バッファー中に存在したかどうか、また、複合体がマイクロ流体／圧搾処理の後で処理した細胞内に存在し、完全及び／または機能的であるかどうか判定するために、非変性ゲルまたは変性アッセイ（例えばドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動など）を用いて、細胞への送達の前または後にアッセイすることができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ＲＮＰに関するいくつかの実施形態において、約１４５、１５０、１５５、または１４５〜１６０ｋＤａの非変性ゲル上のバンドは、ＲＮＰが完全で機能的な遺伝子編集複合体として細胞内に送達されたことを示し得る。
【０１９９】
本明細書で用いる場合、デバイス寸法は長さ、幅、及び任意により狭窄部の数を示す一連の数値で表される（例えば３０μｍ−６ｍ×５は長さ３０μｍ、幅６μｍ、及び５つの狭窄部のデバイスを表す）。
【０２００】
例示的実施形態
本主題の態様は、溶液中の細胞を準備すること；細胞変形狭窄部を含むマイクロ流体チャネルに溶液を通過させること；狭窄部に細胞を通過させ、その結果、細胞に圧力が加わり、タンパク質及び核酸が透過するのに十分大きな細胞の摂動を引き起こすこと；ならびに細胞が狭窄部を通過する前、その最中、及び／またはその後に、細胞をタンパク質及び核酸と接触させることを含む、細胞内へのタンパク質及び核酸の送達方法を提供する。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、前記溶液は、細胞が狭窄部を通過する前、その最中、及び／またはその後にタンパク質及び核酸を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、タンパク質及び核酸はタンパク質−核酸複合体を形成する。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、タンパク質及び核酸はタンパク質−核酸複合体のコンポーネントであるが、細胞への送達時には複合体化していない。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、タンパク質及び核酸は細胞内への送達後にタンパク質−核酸複合体を形成する。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、タンパク質及び核酸は細胞内への送達前にタンパク質−核酸複合体を形成する。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、タンパク質及び核酸は遺伝子編集コンポーネント含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、前記タンパク質−核酸複合体はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、（ａ）タンパク質はＣａｓタンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であり；（ｂ）核酸はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランスアクチベーティングｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）である。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、複合体はＣａｓタンパク質またはＣｐｆ１タンパク質及びｓｇＲＮＡをふくむＲＮＰであり、Ｃａｓタンパク質またはＣｐｆ１タンパク質及びｓｇＲＮＡは約０．５、２．０、２．５、または３．０モル濃度超（molar excess）のＣａｓタンパク質またはＣｐｆ１タンパク質を用いて複合体化されている。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、前記タンパク質−核酸複合体は第１ＲＮＰ及び第２ＲＮＰを含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、第１ＲＮＰ及び第２ＲＮＰは両方ともニッカーゼである。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、第１ＲＮＰは第２ＲＮＰの標的配列とは異なる標的配列にニックを入れる。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、前記タンパク質−核酸複合体はＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＣｒｅリコンビナーゼを含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、核酸はＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、前記タンパク質−核酸複合体は、（ａ）静電引力を介してタンパク質と複合体化している核酸分子；（ｂ）タンパク質に巻きついた核酸分子；（ｃ）ＤＮＡ及びヒストン；（ｄ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）；（ｅ）リボソーム、酵素テロメラーゼ、ヴォールトリボ核タンパク質、ＲＮａｓｅ  Ｐ、ｈｎＲＮＰ、もしくは核内低分子ＲＮＰ（ｓｎＲＮＰ）；または（ｆ）タンパク質を含む染色体を含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、溶液はドナーＤＮＡをさらに含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、溶液は、細胞が狭窄部を通過する前、その最中、及び／またはその後に、ドナーＤＮＡをさらに含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳類細胞を含む。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞を含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、狭窄部の直径は、タンパク質及び核酸が通過するのに十分大きな細胞膜の一時的な摂動を誘発するように選択される。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、狭窄部の直径は細胞の直径の約２０〜９９％である。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、狭窄部の直径は細胞の直径の約６０％である。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体チャネルはマイクロ流体システムにおける複数の並列マイクロ流体チャネルのうちの１つである。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、複数の並列マイクロ流体チャネルは少なくとも約２、５、１０、２０、２５、３０、４０、４５、５０、７５、１００、５００、１，０００、または２〜１，０００のマイクロ流体チャネルを含む。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、細胞は複数の細胞であり、複数の並列マイクロ流体チャネルのうちの１つに各細胞を通過させ、複数の並列マイクロ流体チャネルの各マイクロ流体チャネルは細胞変形狭窄部を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、（ａ）狭窄部の直径は約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２〜１０μｍ、もしくは１０〜２０μｍであり；（ｂ）狭窄部の長さは約１０、１５、２０、２４、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、もしくは１０〜１００μｍであり；（ｃ）マイクロ流体チャネルに溶液を通過させるために約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００もしくは１０〜１００ｐｓｉの圧力を用い；（ｄ）細胞は約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１００〜３００、２００〜７００、２５０〜４００、１００〜１０００ｍｍ／ｓ、１〜１０００ｍｍ／ｓ、１ｍ／ｓ、２ｍ／ｓ、３ｍ／ｓ、４ｍ／ｓ、５ｍ／ｓ、６ｍ／ｓ、７ｍ／ｓ、８ｍ／ｓ、９ｍ／ｓ、１０ｍ／ｓ、０．０１〜５ｍ／ｓ、５〜１０ｍ／ｓ、もしくは０．０１〜１０ｍ／ｓの速度でマイクロ流体チャネルを通過し；（ｅ）前記マイクロ流体チャネルは直列した複数の細胞変形狭窄部を含み；（ｆ）前記マイクロ流体チャネルは単一の細胞変形狭窄部を含み；（ｇ）細胞膜の摂動は約１〜２０、１〜６００、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、もしくは６００ｎｍの最大直径を含み；及び／または（ｈ）約１〜２０、１〜６００、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、もしくは６００ｎｍの最大直径を有する細胞膜の摂動は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１〜１０分間細胞膜上で持続する。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、細胞にタンパク質及び核酸を送達した後、（ａ）細胞における標的遺伝子の発現が少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％もしくはこれより多く減少する；または（ｂ）細胞が複数の細胞であり、複数の細胞における標的遺伝子の発現が少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％もしくはこれより多く減少する。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、細胞にタンパク質及び核酸を送達した約１、２、５、１２、２４、１〜１２、６〜１２、６〜１８、１２〜２４、または１〜２４時間後、（ａ）細胞における標的遺伝子の発現が少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％もしくはこれより多く減少する；または（ｂ）細胞が複数の細胞であり、複数の細胞における標的遺伝子の発現が少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％もしくはこれより多く減少する。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、細胞にタンパク質及び核酸を送達した後、（ａ）細胞における標的遺伝子の発現が少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００％もしくはこれより多く増加する；または（ｂ）細胞が複数の細胞であり、複数の細胞における標的遺伝子の発現が少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００％もしくはこれより多く増加する。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、細胞にタンパク質及び核酸を送達した約１、２、５、１２、２４、１〜１２、６〜１２、６〜１８、１２〜２４、または１〜２４時間後、（ａ）細胞における標的遺伝子の発現が少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００％もしくはこれより多く増加する；または（ｂ）細胞が複数の細胞であり、複数の細胞における標的遺伝子の発現が少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００％もしくはこれより多く増加する。
【０２３２】
本主題の態様は、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含み、前記チャネルが約３０μｍの狭窄部長さ及び約４μｍの狭窄部幅を備える、細胞にタンパク質−核酸複合体を送達するためのデバイスを提供する。
【０２３３】
本発明のより完全な理解を容易にするために実施例を以下に提供する。以下の実施例は本発明を実行及び実施する例示的な様式を示す。しかし、同様の結果を得るために代替的方法を利用することができるので、本発明の範囲はこれらの実施例において開示する特定の実施形態に限定されず、これらは例示目的にすぎない。
【実施例】
【０２３４】
実施例１：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集複合体を送達するためにＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅ（ＳＱＺ）を用いた初代ヒトＴ細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子座の編集
ＳＱＺプラットフォームのＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ；シングルガイドＲＮＡと複合体化した組換えＣａｓ９タンパク質）を送達し、モデル遺伝子座としてのＭＨＣクラス１のβ２ミクログロブリンコンポーネント（Ｂ２Ｍ）の効率的なゲノム編集を達成する能力を実証するために、未刺激ヒトＴ細胞において一連の実験を行った。
【０２３５】
未刺激ヒトＴ細胞へのＣａｓ９  ＲＮＰの送達
標準的なＦｉｃｏｌｌグラジエントを用いて新鮮なＰＢＭＣをヒト血液から単離した。次に、Ｔ細胞をネガティブセレクション（ヒトＴ細胞富化キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、計数、洗浄して、送達のためにＯｐｔｉＭＥＭ中に１０〜２０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。Ｂ２Ｍ遺伝子座を特異的に標的化するように設計された２．５モル濃度超の非改変ｇＲＮＡ（ＰＮＡ  Ｂｉｏ）と１０μｇの組換えＣＡＳ９（ＰＮＡ  Ｂｉｏ）を予め複合体化した。組換えＣＡＳ９を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＫＣ１、１％スクロースの最終濃度の溶液に再構成する。ＣＡＳ９溶液にｇＲＮＡを直接添加し、氷上で２０分間インキュベートして複合体を形成させる。再懸濁した細胞に複合体を直接添加する。ＳＱＺ媒介送達の前にＲＮＰ複合体を氷上で２０分間インキュベートした。送達効率の代理として用いた３ｋＤ−Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅデキストラン（０．１５ｍｇ／ｍＬ）とともにＲＮＰ（２．２ｕＭ）を共送達した。２つの異なるチップ、１０−４及び３０−４を用いて６０及び９０ｐｓｉの圧力で複合体を送達した。チップは同じ幅（４μｍ）の狭窄部を有するが、２つの異なる狭窄部長さ（３０対１０μｍ）を有する。
【０２３６】
送達の４８時間後、ＦＡＣＳベースの読取りを用いてＢ２Ｍタンパク質レベルを測定した。Ｂ２Ｍ発現の減少を機能的な編集の尺度として用いた。１）Ｃｅｌｌ  Ｓｑｕｅｅｚｅプロセスを用いた送達プロセスと同じ時間室温でＲＮＰ複合体とともにインキュベートしたＴ細胞（エンドサイトーシス対照；「ｅｎｄｏ対照」）、及び２）ｇＲＮＡはなしでＣａｓ９タンパク質とともに圧搾したＴ細胞の２つの対照を用いた。４つの異なる細胞集団についてＢ２Ｍ発現対送達されたデキストランのプロットを示す（図４）。Ｃａｓ９対照におけるＢ２Ｍ発現はエンドサイトーシス対照と有意差がなかった。９０ｐｓｉで３０−４チップを用いたＲＮＰの送達の結果、ｅｎｄｏ対照と比較してＢ２Ｍ発現は５４．４％減少した一方で、９０ｐｓｉで１０−４チップの結果、Ｂ２Ｍ発現の減少は２５．２％となった。狭窄部が長いチップの方が、ＲＮＰ複合体の送達が多く、Ｂ２Ｍ発現の減少が大きいという結果になった。
【０２３７】
低、中及び高送達集団の境界を定めるためにデキストラン送達を用いた。そして、Ｂ２Ｍ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて、これらの特定の集団についてのＢ２Ｍノックダウンの効率の差を求めた。１０−４チップでは、中程度に送達された集団の７１，１７３及び低度または送達されなかった集団の８３，６７６に対して、高度に送達された集団のＭＦＩは１８，６３７であった。この高送達集団でのＢ２Ｍ染色の５倍近い低下は、送達がＲＮＰ活性に影響を及ぼす程度を実証している。同様に、３０−４チップでは、中程度に送達された集団の４４，２０７及び低度に送達された集団の５４，１５９に対して、高度に送達された集団のＭＦＩは１６，４６０であった。これらのデータは、編集効率に対して、単一集団内でさえも、細胞のサイトゾルへの遺伝子編集複合体の細胞圧搾送達システムが重要性を有することを実証している。
【０２３８】
ＦＡＣＳ読取りを確証するために、第２の配列ベースの分析も用いたが、この分析では、標的領域に隣接するプライマーを用いてＤＮＡを抽出して増幅し、これにより次世代シーケンシング（ＮＧＳ）用の編集領域のアンプリコンを生成した。ＮＧＳ読取りからＣＲＩＳＰＲバリアントを検出するように設計された単純なアルゴリズムを用いてシーケンシング結果を分析した。予想した通り、配列ベースの読取りはより高い編集効率を示した。実際に、シーケンシングにおいて同定されたインデルの中には依然として機能的な全長タンパク質が得られるものがあった（すなわち、得られるアミノ酸を変化させなかった一塩基置換）。
【０２３９】
【表１】
2018500913.tif 000037
【０２４０】
これらのデータにより、Ｃｅｌｌ  Ｓｑｕｅｅｚｅプラットフォームによって送達された場合におけるＲＮＰ複合体の編集を成功させる能力が実証された。
【０２４１】
編集効率に対するＲＮＰ複合体の量による影響
３０−４チップを用いて、１）標準１×ＲＮＰ複合体（１０ｕｇ  Ｃａｓ９、２．５モル濃度超のｇＲＮＡ）及び２）０．１×標準ＲＮＰ複合体量の２つの異なるＲＮＰ量で、未刺激ヒトＴ細胞にＲＮＰ複合体を送達した。送達の４８時間後、ＦＡＣＳベースの読取りを用いてＢ２Ｍタンパク質レベルを測定した。Ｂ２Ｍ発現の減少を機能的な編集の尺度として用いた。４つの異なる細胞集団についてＢ２Ｍ発現対送達されたデキストランのプロットを以下に示す。１）Ｃｅｌｌ  Ｓｑｕｅｅｚｅプロセスを用いた送達プロセスと同じ時間室温で１×ＲＮＰ複合体でインキュベートしたＴ細胞（エンドサイトーシス対照）、及び２）ｇＲＮＡはなしでＣａｓ９タンパク質とともに圧搾したＴ細胞の２つの対照を用いた（図５）。
【０２４２】
Ｃａｓ９対照（ｇＲＮＡなしのＣａｓ９タンパク質）におけるＢ２Ｍ発現はエンドサイトーシス対照と有意差がない。多い量のＲＮＰ複合体（１×ＲＮＰ複合体（１０ｕｇ  ＣＡＳ９、２．５モル濃度超のｇＲＮＡ））でのＢ２Ｍ陽性細胞の減少は５５．４％であったのに対して、少ない量のＲＮＰ複合体（０．１×ＲＮＰ）ではＢ２Ｍ陽性細胞の減少は２０．７％となった。この実験はＲＮＰの送達に直接関連する投与量依存的反応を実証している。
【０２４３】
その他の実施形態
引用文献は参照により本明細書に援用される。援用した内容のいずれかが本開示と矛盾する場合には、本開示が優先するものとする。さらに、特許請求の範囲の有効性を維持するのに必要である場合、必要な範囲で、参照により本明細書に援用する内容は無視されるべきである。
【０２４４】
さらに、上記の説明では本発明について言及しているが、説明は２つ以上の発明を含み得る。
【０２４５】
本明細書に記載の主題は、所望の構成に応じて、システム、機器、方法、及び／または物品で具現化することができる。上述の説明で示した実施態様は、本明細書に記載の主題に合致するすべて実施態様を表すものではない。むしろ、記載した主題に関する態様と合致するいくつかの例にすぎない。上記では少数の変形しか詳細に記載していないが、他の修正または追加が可能である。特に、本明細書に記載のものに加えて、さらなる特徴及び／または変形がもたらされ得る。例えば、上記の実施態様は、開示した特徴の様々な組合せ及び部分的組合せ、及び／または上述のいくつかのさらなる特徴の組合せ及び部分的組合せを対象とすることができる。さらに、添付の図に示した及び／または本明細書に記載した論理の流れは、望ましい結果を得るためには、必ずしも示した特定の順序、または順番である必要はない。他の実施態様が以下の特許請求の範囲内であり得る。
【図１Ａ】
2018500913.tif 000038
【図１Ｂ】
2018500913.tif 000039
【図２Ａ】
2018500913.tif 000040
【図２Ｂ】
2018500913.tif 000041
【図３Ａ】
2018500913.tif 000042
【図３Ｂ】
2018500913.tif 000043
【図４】
2018500913.tif 000044
【図５】
2018500913.tif 000045
【図６−１】
2018500913.tif 000046
【図６−２】
2018500913.tif 000047
【図６−３】
2018500913.tif 000048
【図６−４】
2018500913.tif 000049
【図６−５】
2018500913.tif 000050
【図６−６】
2018500913.tif 000051
【図６−７】
2018500913.tif 000052
【図６−８】
2018500913.tif 000053
【図６−９】
2018500913.tif 000054
【図６−１０】
2018500913.tif 000055
【図７】
2018500913.tif 000056
【図８−１】
2018500913.tif 000057
【図８−２】
2018500913.tif 000058
【図８−３】
2018500913.tif 000059
【図８−４】
2018500913.tif 000060
【図８−５】
2018500913.tif 000061
【図８−６】
2018500913.tif 000062
【図８−７】
2018500913.tif 000063
【図８−８】
2018500913.tif 000064
【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【図１０−１１】
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【図１０−１２】
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【図１０−１３】
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【図１０−１４】
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【図１０−１５】
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【図１０−１６】
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【図１０−１７】
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【図１０−１８】
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【図１０−１９】
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【図１０−２０】
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【図１０−２１】
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【図１０−２２】
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【図１０−２３】
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【図１０−２４】
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【図１０−２５】
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【図１０−２６】
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【図１０−２７】
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【図１０−２８】
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【図１０−２９】
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【図１０−３０】
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【図１０−３１】
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【図１０−３２】
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【図１０−３３】
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【図１０−３４】
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【図１０−３５】
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【図１０−３６】
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【図１０−３７】
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【図１０−３８】
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【図１０−３９】
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【図１０−４０】
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【図１０−４１】
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【図１０−４２】
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【図１０−４３】
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【図１０−４４】
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【図１０−４５】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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