(57)【要約】  本発明は、ポリメラーゼ存在下において、二本鎖ポリヌクレオチドへのｄｄＮＴＰの望ましくない結合を防止する方法に関する。このような方法を用いて、例えば配列検出法などの、ｄｄＮＴＰを用いる方法において、偽陽性の出現を防止し得る。本発明は、例えば、融解曲線分析法においてＴｍの誤った読み取りまたは疑似ＦＲＥＴ効果（偽陽性消光など）を回避する方法も提供する。特に、２つの標識を含む場合もあるしそうでない場合もある二本鎖分子を標的配列の有無に応じて生成し、２つの標識の存在を好ましくは融解曲線分析によって判断する方法を用いて、試験ポリヌクレオチドにおける標的ヌクレオチド配列を検出する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ存在下においてｄｄＮＴＰのポリヌクレオチドへの結合を防止する方法であって、該ポリヌクレオチドは、二本鎖であるが場合によっては長さが１０ヌクレオチドまでの一本鎖領域を含み、該一本鎖領域が５’突出配列を備える場合は、該ｄｄＮＴＰに相補的な塩基を二本鎖領域に隣接して含まず、該方法は、（ｉ）該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去すること、該ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去すること、および／または該ｄｄＮＴＰを別のｄｄＮＴＰと競合させること、を含み、かつ／あるいは（ｉｉ）長さが少なくとも１ヌクレオチドである３’突出配列、もしくは長さが少なくとも２ヌクレオチドである５’突出配列を備える一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用い、かつ／またはポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用い、該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じ、好ましくは、該方法は融解曲線分析を含む、方法。
【請求項２】
前記一本鎖領域が５’突出配列を備える場合は、前記一本鎖領域のいずれの位置においても前記ｄｄＮＴＰに相補的な塩基を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｄｄＮＴＰは第１の標識で標識化され、前記ポリヌクレオチドは第２の標識で標識化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の標識または前記第２の標識は、互いに近接していると、他方の標識によるシグナルに影響を及ぼす、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の標識または前記第２の標識は蛍光物質であり、他方の標識は、該蛍光物質に近接していると、該蛍光物質の蛍光に影響を及ぼす分子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記他方の標識は、消光分子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドの前記第２の標識は、蛍光物質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドの前記第２の標識は、前記二本鎖ポリヌクレオチドを形成する鎖のうちの一方の５’末端に存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が平滑末端化されている場合、前記ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去すること、前記ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去すること、および／または該ｄｄＮＴＰを別のｄｄＮＴＰと競合させること、を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が５’突出末端を有している場合、前記ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去すること、前記ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去すること、前記ｄｄＮＴＰを別のｄｄＮＴＰと競合させること、および／または長さが少なくとも２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いること、および／またはポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いることによって、５’突出鎖を形成することを含み、該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が３’突出末端を有している場合、前記ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去すること、前記ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去すること、前記ｄｄＮＴＰを別のｄｄＮＴＰと競合させること、および／または長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いること、および／または、ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いることによって、３’突出鎖を形成することを含み、該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを接触させることによって、前記二本鎖ポリヌクレオチドを形成するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、前記ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、前記ｄｄＮＴＰを競合させるステップ、および／または長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）もしくは２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いるステップ、および／またはポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いるステップ、であって、該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる、ステップを、前記二本鎖ポリヌクレオチドの生成前、生成中、および／または生成後に行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼは、プロテイナーゼＫによって不活性化または分解される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼは、洗浄剤、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム、によって、不活性化または分解される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｄｄＮＴＰは、シュリンプアルカリホスファターゼまたは仔ウシ小腸ホスファターゼによって脱リン酸化される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼまたはｄｄＮＴＰの除去は、アフィニティ結合によって、該ポリメラーゼまたはｄｄＮＴＰから、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記一方または両方の鎖を分離することを含み、好ましくは、該二本鎖ポリヌクレオチドは、結合対のうちの一方の結合パートナー、好ましくはビオチン、を保持している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
配列検出法において偽陽性を回避する方法であって、該配列検出法は、ｄｄＮＴＰと、ポリメラーゼと、互いにハイブリダイズして、場合によっては一本鎖領域を有する二本鎖ポリヌクレオチドである第３のポリヌクレオチドを形成する第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドと、を接触させるステップを含み、該二本鎖ポリヌクレオチドは、請求項１または２に記載のものであり、該ｄｄＮＴＰおよび／またはポリヌクレオチドは、場合によっては、請求項３〜８のいずれか１項に記載の標識で標識化されており、該方法は、ｄｄＮＴＰの該第３のポリヌクレオチドへの結合を、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって防止する、方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、前記ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、前記ｄｄＮＴＰを競合させるステップ、および／または長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）もしくは２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いるステップ、および／またはポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いるステップ、であって、該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる、ステップを、前記二本鎖ポリヌクレオチドの生成前、生成中、および／または生成後に行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または前記第２のポリヌクレオチドは、長さが１０〜１００ヌクレオチドである、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
融解温度（Ｔｍ）の誤った読み取り、および／または疑似ＦＲＥＴ効果（好ましくは、偽陽性消光）を回避する方法であって、好ましくは、該方法は、融解曲線分析法に含まれており、該方法は、ポリメラーゼと、場合によってはｄｄＮＴＰおよび／またはｄＮＴＰと、互いにハイブリダイズして、場合によっては一本鎖領域を有する二本鎖ポリヌクレオチドである第３のポリヌクレオチドを形成する第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドと、を接触させるステップを含み、疑似ＦＲＥＴ効果を回避する場合は、該第１のポリヌクレオチドが蛍光標識で標識化されており、該方法は、該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去した後に、Ｔｍおよび／もしくはＦＲＥＴ効果を評価するステップ、ならびに／または該方法において、疑似ＦＲＥＴ効果を回避する場合であって、ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを用いる場合は、該ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、ならびに／または該ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを他のｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰと競合させるステップ、をさらに含み、好ましくは、該二本鎖ポリヌクレオチドは、請求項１または２に記載のものであり、かつ／または、好ましくは、該方法は、請求項１２、好ましくは請求項１３、に記載の追加のステップを含み、かつ／または、好ましくは、該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、または該ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップは、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載されたように行われる、方法。
【請求項２２】
ｄＮＴＰおよび／またはｄｄＮＴＰが用いられる場合、該ｄＮＴＰおよび／またはｄｄＮＴＰならびに前記ポリヌクレオチドは、請求項３〜８のいずれか１項に記載されたように標識化され、ｄＮＴＰおよび／またはｄｄＮＴＰを用いない場合、前記第１のポリヌクレオチドは請求項４〜７のいずれか１項に記載されたような第１の標識で標識化されており、場合によっては、前記第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドは請求項４〜８のいずれか１項に記載されたような第２の標識で標識化されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
試験ポリヌクレオチド中の標的ヌクレオチド配列を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）該試験ポリヌクレオチドを、ｄｄＮＴＰと、未標識の標識プローブであって、プローブが、該標的ヌクレオチド配列が存在する場合は、ポリメラーゼ存在下において、該標的ヌクレオチド配列中の該ｄｄＮＴＰに相補的な塩基のすぐ５’側において該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、標識プローブと、に接触させるステップであって、該ｄｄＮＴＰは第１の標識で標識化されており、該標的配列が試験ポリヌクレオチド中に存在する場合、該未標識の標識プローブは、該試験ポリヌクレオチドにハイブリダイズして、該ポリメラーゼによって３’方向に伸長し、該未標識の標識プローブに該標識化ｄｄＮＴＰが付加されて標識化標識プローブが形成される、ステップと、
（ｂ）前記標識プローブを、標識化されていても、されていなくても、前記試験ポリヌクレオチドから分離するステップと、
（ｃ）該標識プローブを、第２の標識で標識化されたレポータープローブにハイブリダイズさせて二本鎖ポリヌクレオチドを形成するステップであって、前記第１の標識または第２の標識は、互いに近接していると、他方の標識によるシグナルに影響を及ぼし（好ましくは、該第１の標識または第２の標識は蛍光物質であり、他方の標識は、該蛍光物質に近接している場合に該蛍光物質の蛍光に影響を及ぼす分子であり）、該標識プローブが標識化されていない場合、前記第２の標識に最も近い末端において、該二本鎖ポリヌクレオチドが（ｉ）平滑末端化されているか、（ｉｉ）５’突出末端を有するか、または（ｉｉｉ）３’突出末端を有し、前記第２の標識から遠位にある末端において、該二本鎖ポリヌクレオチドが（ｉ）平滑末端化されているか、（ｉｉ）５’突出末端を有するか、または（ｉｉｉ）３’突出末端を有しており、該突出末端は一本鎖領域からなるものであって、該一本鎖領域が５’突出配列を備える場合、二本鎖領域に近接して、該ｄｄＮＴＰに相補的な塩基を含まない（好ましくは、該一本鎖領域のいずれの位置においても、該ｄｄＮＴＰに相補的な塩基を含まない）、ステップと、
（ｄ）該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、ステップａ）において付加しなかった該ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、該ｄｄＮＴＰを他のｄｄＮＴＰと競合させるステップ、および／または共に結合した場合に、長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）もしくは少なくとも２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を形成する標識プローブとレポータープローブとを用いるステップ、および／または共に結合した場合に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を形成する標識プローブとレポータープローブとを用いるステップ、であって、該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該二本鎖ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる、ステップであり、ステップ（ｄ）は、該二本鎖分子の生成前、生成中、および／または生成後に行われてもよい、ステップと、
（ｅ）前記二本鎖ポリヌクレオチドに伴うシグナルを評価することによって、該標識プローブが第１の標識で標識化されているかを決定するステップであって、前記第１の標識または第２の標識のシグナルの変化によって、該試験ポリヌクレオチド中の該標的配列の存在が示される、ステップと、
を含む、方法。
【請求項２４】
（ｉ）前記ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が、ステップ（ｃ）によって平滑末端化されている場合、ステップ（ｄ）において、前記ポリメラーゼが不活性化、分解、もしくは除去されること、ステップａ）において付加しなかった前記ｄｄＮＴＰが脱リン酸化もしくは除去されること、および／または前記ｄｄＮＴＰを他のｄｄＮＴＰと競合させること、が行われ、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が、ステップ（ｃ）によって５’突出末端を有する場合、ステップ（ｄ）において、該ポリメラーゼが不活性化、分解、もしくは除去されること、ステップａ）において付加しなかった該ｄｄＮＴＰが脱リン酸化もしくは除去されること、該ｄｄＮＴＰを他のｄｄＮＴＰと競合させること、および／または共に結合した場合に、長さが少なくとも２ヌクレオチドである該５’突出末端を形成する一本鎖領域を形成する標識プローブとレポータープローブとを用いること、および／または共に結合した場合に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を形成する標識プローブとレポータープローブとを用いること、が行われ、該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該二本鎖ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じ、かつ／あるいは
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が、ステップ（ｃ）によって３’突出末端を有する場合、ステップ（ｄ）において、該ポリメラーゼが不活性化、分解、もしくは除去されること、ステップａ）において付加しなかった該ｄｄＮＴＰが脱リン酸化もしくは除去されること、該ｄｄＮＴＰを他のｄｄＮＴＰと競合させること、および／または共に結合した場合に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである該３’突出末端を形成する一本鎖領域を形成する標識プローブとレポータープローブとを用いること、および／または共に結合した場合に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を形成する標識プローブとレポータープローブとを用いること、が行われ、該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該二本鎖ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の標識および／または第２の標識は、請求項５〜８のいずれか１項に記載のものであり、かつ／あるいは前記標識プローブおよび／またはレポータープローブは、長さが１０〜１００ヌクレオチドである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリメラーゼは、プロテイナーゼＫまたはＳＤＳによって不活性化または分解され、かつ／あるいは前記ｄｄＮＴＰは、シュリンプアルカリホスファターゼまたは仔ウシ小腸ホスファターゼによって脱リン酸化される、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリメラーゼまたはｄｄＮＴＰの除去は、アフィニティ結合によって、該ポリメラーゼまたはｄｄＮＴＰから、前記標識プローブおよび／またはレポータープローブを分離することを含み、好ましくは、該標識プローブまたはレポータープローブは、結合対のうちの一方の結合パートナー、好ましくはビオチン、を保持している、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的ヌクレオチド配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法において、少なくとも２つの標的ヌクレオチド配列、好ましくは少なくとも２つのＳＮＰ、が検出される、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
標識化されたｄｄＮＴＰが少なくとも２つ用いられ、好ましくは、異なる前記ｄｄＮＴＰの前記第１の標識は、異なっている、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも２つのレポータープローブ（および／または標識プローブ）が用いられ、好ましくは、異なる前記レポータープローブの前記第２の標識は、異なっている、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも２つのレポータープローブおよび／または少なくとも２つの標識プローブが用いられ、前記レポータープローブおよび標識プローブが互いにハイブリダイズする場合、融解温度が異なる、少なくとも２つの二本鎖ポリヌクレオチドを形成する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
複数の標識対が提供され、各標識対は、ｄｄＮＴＰ上の第１の標識およびレポータープローブ上の第２の標識を含み、各標識対は、他の標識対とは異なっており、好ましくは、各対は、他の標識対に見られる第１の標識および第２の標識とは異なる第１の標識および第２の標識を含んでいる、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記レポータープローブは、５’末端での３つのヌクレオチドのうちの１つ、好ましくは５’末端、が標識化されている、請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｅ）において、前記二本鎖ポリヌクレオチドは、解離され、該解離中の前記第１の標識または第２の標識のシグナル（好ましくは、蛍光）の変化は、前記試験ポリヌクレオチド中に前記標的配列が存在していることを示し、好ましくは、該解離は、加熱によって達成されて、該二本鎖ポリヌクレオチドが融解曲線分析に供される、請求項２３〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
過敏性腸症候群を診断する方法であって、該方法は、請求項２３〜３５のいずれか１項に記載の方法を含み、好ましくは、該方法において、少なくとも２つのＳＮＰが検出される、方法。
【請求項３７】
生物の遺伝子型解析を行う方法であって、該方法は、請求項２３〜３５のいずれか１項に記載の方法を含み、好ましくは、該方法において、少なくとも２つのＳＮＰが検出される、方法。
【請求項３８】
キットであって、該キットは、
（ａ）第１の標識で標識化された少なくとも１つのｄｄＮＴＰであって、好ましくは、該標識は、請求項５、６、２５、３０、または３３のいずれか１項に記載のものである、ｄｄＮＴＰと、
（ｂ）少なくとも１つの第１のポリヌクレオチド（または標識プローブ）であって、好ましくは、該第１のポリヌクレオチド（または標識プローブ）は、請求項２３、２５、３１、または３２のいずれか１項に記載のものである、第１のポリヌクレオチド（または標識プローブ）と、
（ｃ）第２の標識で標識化された少なくとも１つの第２のポリヌクレオチド（またはレポータープローブ）であって、好ましくは、該第２のポリヌクレオチド（またはレポータープローブ）は、請求項７、８、２３、２５、３１、３２、３３、または３４のいずれか１項に記載のものである、第２のポリヌクレオチド（またはレポータープローブ）と、
（ｄ）ポリメラーゼと、
（ｅ）さらに、
（ｉ）前記ポリメラーゼを不活性化するための手段（好ましくは洗浄剤であり、好ましくはＳＤＳ）、
（ｉｉ）前記ポリメラーゼを分解するための手段（好ましくはプロテイナーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫまたは洗浄剤、好ましくはＳＤＳ）、
（ｉｉｉ）前記ポリメラーゼを除去するための手段、
（ｉｖ）前記ｄｄＮＴＰを脱リン酸化するための手段（好ましくはホスファターゼ）、
（ｖ）前記ｄｄＮＴＰを除去するための手段、および
（ｖｉ）前記標識化ｄｄＮＴＰを競合させるための未標識のｄｄＮＴＰ
のうちの少なくとも１つと、を含み、
前記第１の標識または第２の標識は、互いに近接していると、他方の標識によるシグナルに影響を及ぼす、キット。
【請求項３９】
場合によっては一本鎖領域を有する二本鎖ポリヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）および／またはＦＲＥＴ（好ましくは、消光）に対するポリメラーゼの効果を評価する方法であって、好ましくは、該方法は融解曲線分析法であり、
該方法は、２つのサンプルに対して行われ、それぞれのサンプルについて、本方法は、該ポリメラーゼと、場合によってはｄｄＮＴＰおよび／またはｄＮＴＰと、互いにハイブリダイズして、該二本鎖ポリヌクレオチドである第３のポリヌクレオチドを形成する第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドと、を接触させるステップを含み、ＦＲＥＴ効果を評価する場合は、該第１のポリヌクレオチドは蛍光標識で標識化されており、
該サンプルのうちの一方のみに対して行われる該方法は、該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去した後に、Ｔｍおよび／もしくはＦＲＥＴ効果を評価するステップ、ならびに／または該方法において、ＦＲＥＴ効果を評価する場合であって、ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを用いる場合は、該ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、ならびに／または該ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを他のｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰと競合させるステップ、
前記２つのサンプルを融解温度分析および／もしくはＦＲＥＴ分析に供するステップ、ならびに
融解温度および／もしくはＦＲＥＴ効果が、前記２つのサンプル間で異なっているかどうかを評価して、該二本鎖ポリヌクレオチドの融解温度および／もしくはＦＲＥＴに対する該ポリメラーゼの効果を決定するステップ、をさらに含み、
好ましくは、該二本鎖ポリヌクレオチドは、請求項１または２に記載のものであり、かつ／または、好ましくは、該方法は、請求項１２、好ましくは請求項１３、に記載の追加のステップを含み、かつ／または、好ましくは、該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、または該ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップは、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載されたように行われる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ存在下において、二本鎖ポリヌクレオチドへのｄｄＮＴＰの望ましくない結合を防止する方法に関する。このような方法を用いて、例えば配列検出法などの、ｄｄＮＴＰを用いる方法において、偽陽性の出現を防止し得る。本発明は、例えば、融解曲線分析法においてＴｍの誤った読み取りまたは疑似ＦＲＥＴ効果（偽陽性消光など）を回避する方法も提供する。特に、２つの標識を含む場合もあるしそうでない場合もある二本鎖分子を標的配列の有無に応じて生成し、２つの標識の存在を好ましくは融解曲線分析によって判断する方法を用いて、試験ポリヌクレオチドにおける標的ヌクレオチド配列を検出する方法を提供する。
【発明の概要】
【０００２】
標的サンプル中のポリヌクレオチドの配列決定や、標的サンプル中の特定のポリヌクレオチド配列の同定は、長年、様々な方法によって行われ、これによってサンプル情報を収集することが可能になっており、この情報は、例えば診断目的で（例えば、汚染物質および／またはサンプル型の存在や、疾患の発生またはその傾向など）、様々な方法に用いられ得る。
【０００３】
多くの場合、関連情報は、配列中、例えば一塩基の変異を検出することによって得られ得る。このような変異は、対立遺伝子変異または対立遺伝子多型、点変異、あるいは遺伝物質の欠失または挿入によって生じ得る。一塩基多型（ＳＮＰ）の検出は、特に興味深い。これらのＳＮＰは、ある集団における自然変異を反映している。ＳＮＰによって、集団動態および進化の研究、複雑な表現型の遺伝的根拠の調査、および法医学的アッセイまたは診断アッセイに用いることができるマーカーが提供される。特に、ＳＮＰは、特定の疾患に関連していることが見出されており、そのため、これを用いて、その疾患を発症する傾向のある個人を特定し、かつ／またはその遺伝子型に基づいて、その個人に合わせた治療を行うことができる。
【０００４】
ＳＮＰの検出を含む配列決定法の多くは、ジデオキシＮＴＰを用いている。従来より、ＤＮＡの配列決定は、１９８０年代から用いられているサンガー（Sanger）のジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｎｉｃｋｌｅｎ，およびＣｏｕｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７７，７４，５４６３〜７）によって行われている。この方法は、クローン化されていてもよいＤＮＡの電気泳動によるふるい分けに基づく多分子法であり、最初にＤＮＡを酵素的に処理する。酵素的プロセスでは、ＤＮＡ鎖伸長を終結させる蛍光物質標識化ジデオキシＮＴＰと、終結させないｄＮＴＰとの混合物を用いた中断重合によって、一本鎖ＤＮＡを生じる。そのため、このプロセスを用いて、様々な鎖長の混合物が得られ、ここで各ＤＮＡ鎖の鎖長は、塩基の位置を表し、結合された蛍光物質の色は、３’末端の塩基が何であるかを表す。塩基が何であるかは、色分けされて一列に並んだ点として読み取られ、点からなる１本の線は、１つのＤＮＡ配列を表している。
【０００５】
標的配列にライゲーションするプローブとともにｄｄＮＴＰを用いる場合、ｄｄＮＴＰを用い得る他の配列決定法としては、段階的なライゲーションおよび切断によって行われる配列決定が挙げられる。
【０００６】
ＳＮＰを検出するのに通常用いられる方法には、様々なものがある。特定のＳＮＰに特異的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを利用し、例えばそのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることで、結合を検出し得る（すなわち、ＰＣＲでの増幅が、ＳＮＰ配列が存在することの証拠となる）。オリゴヌクレオチドは、ＳＮＰに結合してもよく（したがって、異なるオリゴヌクレオチドを用いて異なる配列に対応する必要がある）、ＳＮＰの上流に結合してもよい（プライマーとして作用するオリゴヌクレオチドによって、適切な配列のみが伸長される）。対立遺伝子特異的なライゲーション（結合した２つのプローブは、適切な配列に結合した場合のみ、ライゲーションすることができる）、または対立遺伝子特異的な酵素切断を用いてもよい。
【０００７】
本件において最も興味深いのは、オリゴヌクレオチド（プライマー）の結合レベルよりもむしろヌクレオチドの（伸長中の）取り込みレベルで差が生じる、対立遺伝子特異的な一塩基プライマー伸長を用いたＳＮＰの検出である。この場合、プライマーは、多型部位の１ヌクレオチド上流にアニールし、新生鎖に取り込まれる最初のヌクレオチドが多型部位と向き合う。種々異なる検出用の標識およびプラットフォームが用いられ得る。一選択肢において、目的のＳＮＰに特異的なｄｄＮＴＰを用いて、（ＳＮＰが存在する場合に）プライマーを伸長させて標識化プローブを生成し、その後、相補配列に結合することによってこの標識化プローブを捕捉し、相補配列に付いた標識の量によって目的のＳＮＰの存在（および量）が示される、検出方法が用いられ得る（ＷＯ９９／５０４４８）。
【０００８】
ｄｄＮＴＰを用いた単一ヌクレオチドプライマー伸長は、取り込まれる標識化ｄｄＮＴＰに基づいて、または伸長した分子の長さ（この方法ではｄＮＴＰも用いられ得る）に基づいて伸長反応が検出される、ＵＳ２００２１８７４７７においても用いられている。ＵＳ２００９３０５２４９号においても、単一ヌクレオチドプライマー伸長が用いられ、生成物の標識およびサイズに基づいて、標識化分子が検出される。ＷＯ２０１２／０４９２７９においても、ＩＰ／ＲＰ ＨＰＬＣにおいてそのサイズおよび塩基組成に基づいて区別され得る生成物を、単一ヌクレオチドプライマー伸長を用いて生成することについて論じられている。
【０００９】
上記の方法において、ｄｄＮＴＰを用いた場合、ｄｄＮＴＰは、相補塩基に結合して伸長反応を終結するのに用いられる。この分子の存在を利用して、サンプルである試験ポリヌクレオチド中の（該当する配列構成における）相補塩基の有無または量を同定し得る。
【００１０】
しかしながら、以下で述べるように、ある条件下において、正常なプライマー伸長反応以外の際も、ｄｄＮＴＰは、二本鎖ポリヌクレオチドに会合または結合し得ることが、現在見出されている。このことが、配列決定法／ＳＮＰ検出法において偽陽性につながる場合がある。しかしながら、以下で述べるように、多くの方法でこの結合を回避し得ることが、現在見出されている。したがって、本発明の方法は、二本鎖ポリヌクレオチドへのｄｄＮＴＰの誤った結合（または会合）を防止するのに役立ち、これによって、配列検出法において偽陽性を回避することが可能となる。さらに、融解温度に影響を及ぼし、蛍光標識の偽陽性消光などの疑似ＦＲＥＴ効果の原因となり得るポリヌクレオチド二本鎖が、ポリメラーゼによっても安定化されるということが見出されている。本発明の方法によって、特に融解曲線分析法において、これらの効果を回避することが可能となる。
【００１１】
特に、標識プローブと、第１の標識で標識された適切なｄｄＮＴＰとを用いて、特異的な一塩基プライマー伸長を行い、結果として得られる標識プローブ（これは、試験ポリヌクレオチドの配列中の対応する相補塩基の有無に応じて、標識化されている場合もあるし、されていない場合もある）が、第１の標識によって生じるシグナルに影響を及ぼす（またはその逆である）第２の標識で標識化されたレポータープローブに結合する、試験ポリヌクレオチドにおける標的ヌクレオチド配列を同定する方法に、本発明の方法の利点を用い得る。このようにして生じた複合体を、融解曲線分析に供する。複合体の変性プロセス（もしくは解離プロセス）および／またはハイブリダイゼーションプロセスの間、２つの標識は互いに離れており、一方の標識の他方の標識のシグナルに対する効果が変化する。このことによって、変性／ハイブリダイゼーションプロセス中のシグナル変化をモニターして、標識プローブ上の標識の存在（また、その結果、標的ＳＮＰの有無）を特定することが可能になる。このプロセスは、以下でより詳細に述べるように、融解温度が異なる複合体を生じる異なる標識およびプローブを用いて、容易に多重化され得る。
【００１２】
理論に拘束されることを望むものではないが、ｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの結合は、二本鎖ポリヌクレオチドの性質に応じて、様々な機構で起こると考えられる。その様々な機構は、以下のようにまとめられ得る。
ａ）結合のメディエーターまたはアダプターとしてポリメラーゼが作用する（例えば、本方法において分子を複合体化する）ことによるｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの非共有結合。
ｂ）ポリメラーゼの末端転移酵素活性によるｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの共有結合。
ｃ）ポリメラーゼによる非相補的ｄｄＮＴＰの無差別な取り込みによるｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの共有結合。
【００１３】
二本鎖ポリヌクレオチドが、ｄｄＮＴＰに対して陥凹３’末端およびこれに隣接する相補塩基を供する場合、共有結合は、通常のポリメラーゼ活性によるｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの取り込みによっても生じ得る。これは、通常、二本鎖ポリヌクレオチドの配列および／またはその構成配列の長さを適切に選択することによって、回避することができる。しかしながら、本明細書で述べる方法も、このような結合を回避するのに役立つ。
【００１４】
ポリメラーゼの存在が、二本鎖ポリヌクレオチドの融解温度に影響を及ぼす（上昇させる）ため、誤ったＴｍにつながることも見出されている。ポリメラーゼは、偽陽性消光などの疑似ＦＲＥＴ効果を生じ、これがｄｄＮＴＰが存在しない場合であっても結果に影響を及ぼす場合があるということも、見出されている。本明細書で述べるような、ポリメラーゼが除去される方法は、不正確な結果をもたらすこのような原因に対処するのにも役立つ。
【００１５】
このような結合は、以前には観察されていなかった。理論に拘束されることを望むものではないが、この種の結合が起こるかどうかは、少なくとも部分的に、二本鎖分子の種類によって規定される。ａ）の非共有結合は、平滑末端および３’または５’突出末端を有する分子において起こり得る。ｂ）の共有結合は、平滑末端を有する分子において起こるが、配列感受性であると思われる。これは、３’または５’突出末端を有する分子においては起こらないと思われる。ｃ）の共有結合は、５’突出末端を有する分子において起こる。共有結合は、５’から３’に向かう方向にポリヌクレオチドを伸長するポリメラーゼの酵素活性による、鎖伸長反応における塩基の取り込みによって起こると考えられる。Ｔｍに対するポリメラーゼ依存的効果および疑似ＦＲＥＴ効果の発生は、全ての種類の二本鎖分子において起こる。
【００１６】
ｄｄＮＴＰの結合は、様々な手段によって回避することができる。ａ）の非共有結合は、ポリメラーゼの効果的な除去、ｄｄＮＴＰの脱リン酸化もしくは除去、および／またはそのｄｄＮＴＰを他のｄｄＮＴＰ（例えば、未標識ｄｄＮＴＰ）と競合させることによって、除去され得る。類似の機構を用いて、ｂ）およびｃ）の共有結合を回避し得る。望ましくない非共有結合および／または共有結合は、二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖領域の長さを変化させて上述した結合が起こりにくい分子とすること（例えば、３’突出領域などの一本鎖領域を設けること、または一本鎖領域を長くすること）によっても、抑制または除去され得る。より長い一本鎖領域は、上記の望ましくない結合がより起こりにくく、かつ／またはこれを用いてｄｄＮＴＰの影響を抑制し得る（例えば、ｄｄＮＴＰが標識化されていて、二本鎖分子のどこか他にある標識と相互作用する場合、その影響は、他の標識からの距離が長くなることによって抑制され得る）。
【００１７】
したがって、第１の態様において、本発明は、ポリメラーゼ存在下においてｄｄＮＴＰのポリヌクレオチドへの結合を防止する方法を提供し、該ポリヌクレオチドは、二本鎖であるが場合によっては長さが１０ヌクレオチドまでの一本鎖領域を含み、該一本鎖領域が５’突出配列を備える場合は、該ｄｄＮＴＰに相補的な塩基を二本鎖領域に隣接して含まず（好ましくは、該一本鎖領域のいずれの位置においても該ｄｄＮＴＰに相補的な塩基を含まず）、該方法は、（ｉ）該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去すること、該ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去すること、および／または該ｄｄＮＴＰを別のｄｄＮＴＰと競合させること、を含み、かつ／あるいは（ｉｉ）長さが少なくとも１ヌクレオチド（好ましくは少なくとも２または３ヌクレオチド）である３’突出配列、もしくは長さが少なくとも２ヌクレオチド（好ましくは少なくとも３または４ヌクレオチド）である５’突出配列を備える一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用い、かつ／またはポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用い、該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる。少なくとも部分的にはミスマッチによって生じる一本鎖領域は、一方または両方の末端に、３’突出配列、または５’突出配列、またはその両方を備えていてもよく、例えば、一方の末端のミスマッチによって、その末端に３’突出配列および５’突出配列の両方が生じる。
一態様において、ｄｄＮＴＰは標識化されている。特に好ましい態様において、ｄｄＮＴＰが第１の標識によって標識化され、該ポリヌクレオチドが第２の標識によって標識化されており、第１の標識または第２の標識は、互いに近接していると、他方の標識によるシグナルに影響を及ぼす。好ましくは、第１の標識または第２の標識は蛍光物質であり、他方の標識は、該蛍光物質に近接していると、該蛍光物質の蛍光に影響を及ぼす分子である。
【００１８】
さらなる好ましい態様において、本方法は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド（これらは、結合が可能なほど十分に相補的である）とを、ハイブリダイゼーションが可能な条件下で接触させることによって、二本鎖ポリヌクレオチドを生成するステップも含む。
【００１９】
本明細書において、単数形の要素についての言及は、複数形の要素についての言及を含み、逆の場合も同様である。「および／または」なる語でつながれた選択肢の一覧についての言及は、その選択肢のいずれか、全て、またはあらゆる組み合わせが用いられ得るかまたは存在し得るということを示す。
【００２０】
本明細書において、ポリメラーゼ存在下においてｄｄＮＴＰのポリヌクレオチドへの結合を「防止する」ことについての言及は、絶対的な防止または部分的な防止のことをいい、すなわち、３’自由末端からの正常なポリメラーゼ媒介伸長反応によらない、ｄｄＮＴＰのポリヌクレオチドへの結合の全てまたは一部を防止することをいう。ポリメラーゼが、鋳型配列中の塩基に相補的な連続した塩基の取り込みによって、鋳型に相補的なｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰを５’から３’に向けて付加することで、ＤＮＡ鋳型鎖に相補的な新規のＤＮＡ鎖を合成する場合に、正常な伸長反応が起こる。
【００２１】
ｄｄＮＴＰの「結合」は、共有結合および非共有結合の両方を包含しており、ポリヌクレオチドとｄｄＮＴＰとが直接結合してもよいし、別の分子を介してｄｄＮＴＰがポリヌクレオチドと会合してもよい。
【００２２】
「ｄｄＮＴＰ」は、ＤＮＡポリメラーゼの鎖伸長阻害剤である２’，３’ジデオキシヌクレオチドである。ｄｄＮＴＰは、３’−水酸基を欠いているので、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長中のヌクレオチド鎖に付加されると、リン酸ジエステル結合を形成することができず、よって、ヌクレオチドをさらに付加することができなくなる。ｄｄＮＴＰは、５つの選択肢、すなわちｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ（またはｄｄＵＴＰ）、およびｄｄＣＴＰのうちの１つであり得、それぞれ、塩基であるグアニン、アデニン、チミン（またはウラシル）、およびシトシンに相当する鎖停止ヌクレオチドを備える。生理活性を有する非ヌクレオチド類似体（例えば、アシクロターミネーター（AcycloTerminator）（ａｃｙＮＴＰ）；パーキン・エルマー・ライフ・サイエンス（PerkinElmer Life Sciences））などの、ｄｄＮＴＰと機能的に同等な変異体、誘導体、または類似体を用いてもよい。機能的に同等な変異体、類似体、または誘導体は、鎖伸長中に、ＤＮＡポリメラーゼによって、伸長中のヌクレオチド鎖（ＤＮＡ）に取り込むことができるが、いったん取り込まれると、さらなる鎖伸長を妨げるという点において、ｄｄＮＴＰと同等または類似の機能を有する。好ましくは、機能的に同等な変異体、誘導体、または類似体は、ｄｄＮＴＰと共通の部分構造を有し、例えば、三リン酸基および／またはｄｄＮＴＰの塩基を含む。本明細書で述べるポリメラーゼは、ｄｄＮＴＰの変異体、誘導体、または類似体とともに用いられてもよく、あるいは、その変異体／類似体／誘導体に特異的な、パーキン・エルマー・ライフ・サイエンス社のアシクロポル（AcycloPol）などのポリメラーゼが用いられてもよい。本明細書における「ｄｄＮＴＰ」についての言及は、このようなｄｄＮＴＰの変異体、誘導体、および類似体を含む。好ましくは、ｄｄＮＴＰは、以下で述べるように標識化される。本明細書における「ｄＮＴＰ」についての言及は、ジデオキシヌクレオチドではなくデオキシヌクレオチド（三リン酸）に関して、同様に定義されるものであり、上述したような変異体、類似体、および誘導体を同様に含む。
【００２３】
本明細書において（交換可能に）用いられる「塩基」または「ヌクレオチド」なる語は、特に２’−デオキシの形態であるアデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルといった天然ヌクレオチド、または、同様に機能する、すなわち天然ヌクレオチドと相補塩基対を形成する、非天然ヌクレオチドを含む。
【００２４】
「相補塩基」についての言及は、ワトソン−クリックの対形成にしたがって、対となる塩基と特異的に塩基対を形成する塩基のことをいう。対となる塩基は、アデニンおよびチミン（またはウラシル）ならびにシトシンおよびグアニンである。相補配列は、相補塩基間の塩基対形成によって、配列のハイブリダイゼーションを可能にする、一連の相補塩基を含む配列である。
【００２５】
本明細書における「ポリヌクレオチド」は、複数のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列であり、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを包含する。配列は、第１の鎖と、相補塩基間の結合によって第１の鎖に結合することができる第２の相補鎖とを含む、二本鎖である。好ましくは、（最終形態の）二本鎖ポリヌクレオチドは、プライマーが伸長してその分子を形成することによって生じるものではない（すなわち、プライマーがポリヌクレオチドに結合し、伸長して、二本鎖分子を形成することに直接起因する二本鎖分子ではない）。したがって、第１の鎖および第２の鎖自体は、プライマー伸長反応によって生成されてもよいが、第１の鎖の一部または第２の鎖の一部がプライマーとして作用する場合には、好ましくは一緒に生成させないで、二本鎖分子を形成させる。プライマー伸長が実際に起こって二本鎖ポリヌクレオチドが形成される場合は、好ましくは、プライマー伸長は、６ヌクレオチド未満の長さ、例えば、１ヌクレオチド未満、２ヌクレオチド未満、３ヌクレオチド未満、４ヌクレオチド未満、または５ヌクレオチド未満の長さである。二本鎖ポリヌクレオチド配列は２つの配列からなり、それぞれどのような長さであってもよいが、好ましくは少なくともヌクレオチドを５つ含み、好ましくは長さが５〜２００ヌクレオチド、例えば１０〜１００ヌクレオチドや２０〜５０ヌクレオチドである。一選択肢において、２つの配列を有する第１の鎖および第２の鎖は、結合されていてもよく、例えば、自己結合性を示す単一ポリヌクレオチドに配されていてもよい。しかしながら、好ましい態様において、２つの配列を有する第１の鎖および第２の鎖は、別々の分子である。
【００２６】
二本鎖分子を形成することができるように、２つの配列は、その配列中の塩基の相補性によって互いに結合することができる。相補結合に関与する塩基の数は、安定な複合体を生成することができるくらいに十分でなければならない。平滑末端を有する二本鎖分子が生じる場合、全ての塩基が関与し得るが、以下でさらに述べるように、このような場合であっても、いくつかの塩基における非相補性（ミスマッチ）は許容され得る。突出末端を有する二本鎖分子が生じる場合、相補結合（ハイブリダイゼーションまたは二本鎖領域）に関与する塩基は、複合体を形成する短い配列の全てまたは一部、および複合体を形成する長い配列の一部を含み得る。好ましい特徴において、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する配列のうち、少なくとも５つの連続した塩基、好ましくは連続した５〜２００塩基、例えば連続した１０〜１００塩基や連続した２０〜５０塩基が、互いに相補的である（これは、配列の全長の５０〜１００％、例えば８０〜１００％をなすものである）（「連続した」塩基とは、ところどころにおいて塩基が、例えば分散した１つ以上の塩基が、ミスマッチとなっている可能性を包含する）。
【００２７】
好ましい特徴において、配列を結合して二本鎖ポリヌクレオチドを形成するのに関与している配列領域は、互いに１００％の相補性を有している。しかしながら、これは必須ではなく、完全な塩基対形成は必要ではない。したがって、この領域中のミスマッチは、２つの分子が、常用の融解温度分析を行えるくらい安定な複合体を形成することができるくらいに十分相補的であれば、許容され得る。よって、例えば、互いに結合する配列領域では、ほんの８０％、９０％、または９５％の相補性が、共有されていてもよい（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のミスマッチを有していてもよい）。本明細書で述べるように、ミスマッチ塩基を用いて、完全にまたは部分的に、二本鎖ポリヌクレオチドにおける一本鎖領域を形成し得、例えば、当該一本鎖領域は、１つ以上の塩基を含み得る。
二本鎖ポリヌクレオチドは、「一本鎖領域」を含み得る。二本鎖ポリヌクレオチドを形成する配列長の全てが、相補的な塩基への結合に関与する訳ではない場合に、このような領域が存在する。特に、一本鎖領域は、二本鎖ポリヌクレオチドの末端に存在して、３’突出一本鎖領域または５’突出一本鎖領域を生じ得る。二本鎖分子を形成する配列のうちの一方の５’末端（または３’末端）において、存在する一本鎖領域が終結する場合に、５’突出配列（または３’突出配列）が存在する。塩基が互いに結合しないため、一本鎖領域に直接的に寄与するか、または適合した（相補的な）塩基対間の結合に対して、それらがもはや結合せず、そのために一本鎖領域に寄与するように、影響を及ぼす、ミスマッチ塩基対によって、一本鎖部分が存在し得る、または伸長され得る。
【００２８】
一本鎖領域が存在して５’突出配列を形成する場合、一本鎖領域は、二本鎖領域に隣接して、本方法で用いられるｄｄＮＴＰに相補的な塩基を含まない。好ましくは、一本鎖領域は、二本鎖領域に隣接して、本方法で用いられ得るｄＮＴＰに相補的な塩基を含まない。したがって、例えば、用いられるｄｄＮＴＰがｄｄＧＴＰである場合に、５’突出配列を形成する一本鎖領域は、二本鎖領域に隣接して、グアニンに相補的な塩基、すなわち、シトシンを含まない。ある方法において、複数のｄｄＮＴＰが用いられる場合、用いられるｄｄＮＴＰのいずれかに相補的な塩基（または、ｄｄＮＴＰが標識化されている場合は、用いられる標識化ｄｄＮＴＰのいずれかに相補的な塩基）は、５’突出配列を形成する一本鎖領域中、二本鎖領域に隣接して存在しない。二本鎖領域に「隣接した」とは、二本鎖領域の５’に存在する一本鎖領域の一番目の塩基のことをいう。これは、塩基対を形成し得る塩基が存在しない塩基であるか、または、ミスマッチ塩基の場合は、塩基対を形成し得る塩基は存在するが結合しない、塩基であり得る。一本鎖領域が５’突出配列を備える場合、好ましくは、当該一本鎖領域中のいずれの位置においても、ｄｄＮＴＰ（またはｄＮＴＰ）に相補的な塩基は含まれない。
【００２９】
一本鎖領域の長さは、１ヌクレオチドと短くてもよいし、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、または３０ヌクレオチドまで長くてもよい。ポリメラーゼ存在下においてｄｄＮＴＰのポリヌクレオチドへの結合を防止する方法において、一本鎖領域は１０ヌクレオチド以下である。しかしながら、このような方法は、より長い一本鎖領域が用いられるものであっても、包含される。より長い一本鎖領域は、本発明の他の方法において存在し得る。本方法が、ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、および／またはｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、および／またはｄｄＮＴＰを競合させるステップ、を含む場合、好ましくは、一本鎖領域の長さは１〜５ヌクレオチドであり、好ましくは１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または３ヌクレオチドである。
【００３０】
本明細書では、ポリメラーゼが「存在すること」について言及している。存在するポリメラーゼは、ｄｄＮＴＰおよび二本鎖ポリヌクレオチドの両方に直接接触する機能的に活性なポリメラーゼである。好ましくは、ポリメラーゼは、関連する相補ｄＮＴＰおよび／またはｄｄＮＴＰが存在する場合は、プライマー伸長を可能にする条件下で、プライマー伸長を可能とするくらいに十分な濃度で提供される。
【００３１】
本明細書で言及されるように、「ポリメラーゼ」は、５’から３’に向かう方向への二本鎖ポリヌクレオチドのプライマー伸長が可能なＤＮＡポリメラーゼである。好ましくは、ポリメラーゼは、本発明の方法、特に、温度サイクルステップを用いる方法で用いるために耐熱性である。好ましくは、ポリメラーゼは、ファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、またはＹのいずれかのものであり、好ましくは、ＥＣ２．７．７．７またはＥＣ２．７．７．４９に分類される。
【００３２】
ファミリーＡのポリメラーゼとしては、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ Ｉ、およびＤＮＡポリメラーゼγが挙げられる。ファミリーＢのポリメラーゼとしては、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ Ｂ、Ｐｏｌ ζ、Ｐｏｌ α、δ、およびεが挙げられ、ファミリーＣのポリメラーゼとしては、Ｐｏｌ ＩＩＩが挙げられる。ファミリーＤのポリメラーゼは、古細菌生物に見出される。ファミリーＸのポリメラーゼとしては、Ｐｏｌ β、Ｐｏｌ σ、Ｐｏｌ λ、およびＰｏｌ μが挙げられ、最後に、ファミリーＹのポリメラーゼとしては、Ｐｏｌ ι（イオタ）、Ｐｏｌ κ（カッパ）、Ｐｏｌ ＩＶ、およびＰｏｌ Ｖが挙げられる。ポリメラーゼは、原核生物由来のものであってもよいし、真核生物由来のものであってもよいし、古細菌由来のものであってもよい。好ましくは、ポリメラーゼは、ファミリーＡのポリメラーゼ、Ｐｏｌ ＩＩＩポリメラーゼ、ｐｏｌ βポリメラーゼ、または古細菌ポリメラーゼ、あるいは、同様の酵素的役割を促進する能力に関して、その親分子と同じ、または実質的に同様の機能的性質を保持するこれらポリメラーゼの突然変異体である。
特に、ファミリーＡのポリメラーゼ、中でもＴ７ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼ（エキソヌクレアーゼ活性を欠くサーモシークエナーゼ（ThermoSequenase）（商標）など）などのＰｏｌ Ｉポリメラーゼが好ましい。特に好ましい実施形態において、ＴＥＲＭＩＰｏｌ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼまたはＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ソリス・バイオダイン（Solis BioDyne））などの、サーモシークエナーゼ様ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。真正細菌ポリメラーゼが特に好ましい。効果的にｄｄＮＴＰを取り込むポリメラーゼも好ましい。
【００３３】
本発明の方法においては、ポリメラーゼは、不活性化、分解、または除去され得る。どの方法を選択するかは、ｄｄＮＴＰの結合が防止される二本鎖ポリヌクレオチドの性質次第であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、上述したように、ｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの非共有結合は、メディエーターまたはアダプターとしてポリメラーゼが作用することによって起こると考えられ、一方、共有結合は、ポリメラーゼの酵素活性によって起こると考えられる。したがって、後者の共有結合を回避するためには、ポリメラーゼの酵素活性のみを抑制または除去する必要があり、一方、非共有結合を回避するためには、好ましくは、ポリメラーゼを分解または除去する。以下で述べる融解曲線分析法などの方法においてＴｍの誤った読み取りまたは疑似ＦＲＥＴ効果（偽陽性消光など）を回避する方法では、好ましくは、ポリメラーゼは分解または除去される。しかしながら、ポリメラーゼの不活性化も検討される。
【００３４】
本明細書におけるポリメラーゼの「不活性化」とは、例えば、ポリメラーゼ活性および／または末端転移酵素活性および／またはＤＮＡ結合性などの酵素的性質、結合性、または構造的性質といったポリメラーゼの機能のうち、１つ以上を除去することをいう。酵素機能に対する不活性化効果は、ポリメラーゼの共有結合効果を説明する実施例において述べる方法を行うことによって、試験され得る。好都合なことには、カタルポール（catalpol）またはその類似体などの適切な阻害剤を用いることによって、または、例えば変性剤を用いて酵素の関連三次構造を破壊することによって、不活性化が達成され得る。好ましい態様において、タンパク質を可溶化するアニオン性洗浄剤などの洗浄剤を用いて、ポリメラーゼを不活性化させ得る。特に好ましい態様において、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が用いられ得る。好都合なことには、０．０５〜１．０％の濃度、好ましくは０．１〜０．２５％の濃度が用いられ得る。
【００３５】
あるいは、ポリメラーゼは「分解」され得る。これは、適切な化学的手段または酵素的手段によって達成され得る。好ましい態様において、ポリメラーゼは、プロテイナーゼを用いて分解される。特に好ましい態様において、プロテイナーゼは、用途が広く頑強なセリンプロテアーゼであるプロテイナーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．６４、例えばシグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）またはプロメガ（Promega）製、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０６８７３）である。洗浄剤を用いてポリメラーゼを（不活性化のみならず）分解してもよい。
本明細書におけるポリメラーゼの「除去」とは、ｄｄＮＴＰおよび／または二本鎖ポリヌクレオチドからポリメラーゼを空間的に分離することをいう。これは、ｄｄＮＴＰおよび／または二本鎖ポリヌクレオチドを回収するか、またはポリメラーゼを回収することによって達成され得る。したがって、例えば、混合物を、異なる成分の分離を可能にする精製技術（例えば、カラムクロマトグラフィーまたはアフィニティ分離）に供してもよい。例えば、固体の支持体（例えば、磁気ビーズ）に付着されていてもよい、ポリメラーゼに対する抗体を用いてポリメラーゼに結合させ、混合物の残部からの分離を可能にしてもよい。あるいは、例えば、クロロホルムなどの有機溶媒で抽出するなど、化学的除去方法を用いてもよい。
【００３６】
ポリメラーゼを効果的に除去するために、上記のように、二本鎖ポリヌクレオチドを回収してもよい（同様に、ｄｄＮＴＰを効果的に除去するか、または分子を分離してもよい）。好ましい方法において、これは、例えば、結合対を共に形成し、そのうちの一方が二本鎖ポリヌクレオチドに付加される、結合パートナー（これは、以下で述べ、また規定される）を用いるアフィニティ結合によって達成される。好ましい実施形態において、結合対は、ビオチン：ストレプトアビジンであり得る。例えば、二本鎖ポリヌクレオチドが、（例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の５’末端に）ビオチンを保持し、磁気ビーズなどの固体の支持体上に保持されているストレプトアビジンへのアフィニティ結合によって、回収されてもよい。したがって、ポリメラーゼ（またはｄｄＮＴＰ）を除去するステップは、上述したアフィニティ結合によって、ポリメラーゼまたはｄｄＮＴＰから二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を分離することを含んでいてもよい。以下で述べる、二本鎖ポリヌクレオチドが標識プローブおよびレポータープローブからなる方法において、標識プローブまたはレポータープローブ（好ましくは前者）は、上述した結合パートナーを保持していてもよい。この場合、ポリメラーゼまたはｄｄＮＴＰの除去は、アフィニティ結合によって、標識プローブおよび／またはレポータープローブをポリメラーゼまたはｄｄＮＴＰから分離することを含む。
【００３７】
別の方法において、ｄｄＮＴＰを脱リン酸化してもよい。この方法は、好ましくは、不適切な共有結合が起こりそうな場合に用いられる。適切なホスファターゼは、ＥＣ３．１．３．１に分類されるものであり、シュリンプアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）（例えば、シグマ・アルドリッチまたはアフィメトリクス（Affymetrix）製、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＢＨＴ８）、仔ウシ小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（例えば、プロメガまたはアフィメトリクス製、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１９１１１）、およびＦａｓｔＡＰ（サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific）製）などが挙げられる。
ｄｄＮＴＰの結合は、例えば分子を物理的に分離するなど、ｄｄＮＴＰを二本鎖ポリヌクレオチドから除去することによって、または他のｄｄＮＴＰと競合させることによって、防止され得る。ｄｄＮＴＰは、適切な手段によって除去され得、例えば、上述したように二本鎖ポリヌクレオチドを回収することによって、ｄｄＮＴＰから二本鎖ポリヌクレオチド除去／分離してもよい。
【００３８】
「競合」についての言及は、ｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの結合が抑制または防止されるように、他のｄｄＮＴＰを十分量提供することをいう。結合を防止または抑制するために用いられるｄｄＮＴＰは、結合を防止しようとしているｄｄＮＴＰとは異なるものである必要があり、異なる塩基（例えば、ｄｄＧＴＰの代わりにｄｄＡＴＰを用い、好ましくは、未標識であるかまたは異なる標識によって標識化された塩基）に相当していてもよいし、同じまたは異なる塩基に相当するが、標識化されていなくてもよい（例えば、標識化ｄｄＮＴＰを、未標識ｄｄＮＴＰと競合させてもよい）。
【００３９】
上述したように、長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）または少なくとも２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチド、および／またはポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いることによっても、ｄｄＮＴＰの結合を回避することができ、当該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる。このプロトコールを、ポリメラーゼおよび／またはｄｄＮＴＰの処理の代わりとして（またはそれに加えて）用いてもよい。これら後者の処理を用いる方法において、一本鎖領域は、好ましくは長さが１〜５ヌクレオチドであり、好ましくは長さが１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または３ヌクレオチドである。しかしながら、一本鎖領域の長さが、ｄｄＮＴＰ結合を防止するための唯一の機構として（または、上述した方法と共に）用いられる場合、好ましくは、一本鎖領域は、長さが少なくとも２ヌクレオチドであり、好ましくは長さが２〜２０（または２〜３０）ヌクレオチド、例えば３〜１５ヌクレオチドまたは４〜１０ヌクレオチド（特に好ましくは、長さが２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、または４ヌクレオチド）である。ポリメラーゼ存在下においてｄｄＮＴＰのポリヌクレオチドへの結合を防止する方法において、好ましくは、一本鎖領域は、１０ヌクレオチド以下である。これによって、確実に、望ましくないｄｄＮＴＰが一本鎖領域に結合しにくくなり、かつ／またはｄｄＮＴＰの影響が抑制される（例えば、ｄｄＮＴＰが標識化されていて、二本鎖分子のどこか別の位置の標識と相互作用する場合、その影響は、他の標識からの距離が長くなることによって抑制され得る）。
【００４０】
一本鎖領域を、例えば、元来は平滑末端である二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に導入する機構、または現存する一本鎖領域ををより長くする機構によって、二本鎖ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション領域の末端に、ミスマッチが導入される。したがって、例えば、平滑末端二本鎖ポリヌクレオチドを用いる代わりに、二本鎖ポリヌクレオチドを形成するポリヌクレオチドのうちの一方に、１つ以上のミスマッチを導入してもよい。本明細書における「ミスマッチ」とは、二本鎖ポリヌクレオチドにおいて対を形成する際に、対を形成する塩基に相補的に結合しない塩基のことをいう。「塩基対」とは、異なるポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、互いに相補的に結合する場合に、接近するその異なるポリヌクレオチドにおける塩基の対のことをいう。
【００４１】
好ましくは、二本鎖領域の末端、例えば、二本鎖領域の一方または両方の末端の１つ以上の塩基において、１つ以上のミスマッチが存在する。しかしながら、二本鎖領域の一方の末端の相補塩基間の結合を阻害する効果を有するミスマッチが用いられてもよい。好ましくは、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）の塩基を変更して、ミスマッチ塩基を供する。特に、このような方法は、二本鎖ポリヌクレオチドが標識プローブおよびレポータープローブを含んでいる、以下で述べる方法において、用いられてもよい。ミスマッチを用いることによって生じる一本鎖領域は、二本鎖ポリヌクレオチドを形成する一本鎖ポリヌクレオチドの長さが同じであったとしても、「突出」鎖となる、すなわち、塩基対間の結合がなければ、突出鎖が生じる。塩基対間の結合がないという観点から、突出鎖は、３’および５’の両方である。好ましい特徴において、一本鎖領域は、ミスマッチのみによって形成されるが、一本鎖領域を伸長するのにミスマッチを用いることも検討される。本明細書において、ミスマッチによって「少なくとも部分的に」生じる一本鎖領域は、一本鎖領域に対するミスマッチの寄与の程度を規定する。したがって、一本鎖領域の全体が、ミスマッチによって生じてもよいし、より長い一本鎖領域の３ヌクレオチド以下、例えば１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または３ヌクレオチドなど、その領域の一部のみが、ミスマッチによるものであってもよい。
【００４２】
上述したように、本方法は、さらに、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを、ハイブリダイゼーションが可能な条件下で接触させることによって、二本鎖ポリヌクレオチドを生成するステップを含んでいてもよい。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、以下で述べるように定義される。この場合、ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、ｄｄＮＴＰを競合させるステップ、および／または長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）もしくは少なくとも２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いるステップ、および／またはポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いるステップであって、一本鎖領域は、少なくとも部分的には、ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる、ステップを、二本鎖ポリヌクレオチドの生成前、生成中、および／または生成後に行ってもよい。二本鎖分子の生成前に行う場合は、これによって、後で切断することができない共有結合の生成が回避される。この処理を後にすると、ｄｄＮＴＰの非共有結合およびポリメラーゼの直接的な効果は回避され得るが、ｄｄＮＴＰの共有結合は回避されない。こういうわけで、ポリメラーゼ存在下においてｄｄＮＴＰの（二本鎖）ポリヌクレオチドへの結合を防止することについての言及、およびポリヌクレオチドがとる形態についての言及は、処理に着手する時点でまだ形成されていない場合であっても、形成される二本鎖ポリヌクレオチドに関するものである。
【００４３】
一態様において、ｄｄＮＴＰは標識化されている。本明細書における「標識」とは、検出可能であり、かつ／または直接的もしくは間接的にシグナルを発生させる分子または分子群のことである。好都合な標識としては、比色標識、化学発光標識、発色標識、放射性標識、および蛍光標識が挙げられる。上述したように、好ましい特徴において、ｄｄＮＴＰが第１の標識によって標識化され、ポリヌクレオチドが第２の標識によって標識化されている。これらの標識は、同じものではない。第１の標識または第２の標識は、互いに近接していると、他方の標識によるシグナルに影響を及ぼす。
【００４４】
本明細書における標識の「シグナル」とは、検出し得る物理的なシグナルのことであり、用いられる標識の性質に応じて、例えば、磁気、光学活性、蛍光、色などである。シグナルの有無またはレベルが決定され得る。
【００４５】
好ましい態様において、第１の標識または第２の標識は、蛍光物質であり、他方の標識は、蛍光物質に近接していると、蛍光物質の蛍光に影響を及ぼす分子であって、本発明の一実施形態においては、それ自体が蛍光物質であってもよい。
【００４６】
シグナル（例えば、蛍光）に対する上述した影響は、第１の標識と第２の標識とが、互いに十分に「近接」している場合にのみ観察される。標識間の近接度合とは、標識間の空間的な距離のことをいう。シグナル（例えば、蛍光）に対する影響が観察される近接度合は、選択された標識に応じて異なり得る。相互結合する塩基対形成に関与するヌクレオチド（すなわち、相補結合するヌクレオチド）上、またはポリヌクレオチド中の隣接するヌクレオチド上に標識が存在する場合、シグナル（例えば、蛍光）に対する影響が観察される。さらに、標識が、相補結合するヌクレオチドまたは隣接するヌクレオチド上にはないが、その代わり、三次元構造を持たない線状分子を考えた際に、相補ヌクレオチドまたは隣接するヌクレオチドから１〜３０（好ましくは１〜５、例えば１、２、または３）ヌクレオチド離れたヌクレオチド上にある場合に、シグナル（例えば、蛍光）に対する影響が観察され得る。したがって、例えば、第１の標識が、相補配列中のヌクレオチド１’に結合するヌクレオチド１上にあるが、第２の標識が、相補配列中の５’のヌクレオチドにある場合に、影響が観察され得る。実際には、標識が、配列中で大きく（例えば、３０ヌクレオチドよりも遠く）離れているが、標識が見出される分子の三次元構造に鑑みて標識がごく接近する（例えば、上記の距離まで）場合に（も）、シグナル（例えば、蛍光）に対する影響が観察され得る。
【００４７】
本明細書における「蛍光物質」とは、特定波長における光励起によって、光を再び発することができる蛍光性の化学物質のことである。この光は、本発明の方法を行っている間に検出され得、標識化された分子の有無および量に関する測定可能なシグナルを供給する。
【００４８】
近接している場合に他方の標識によるシグナルに影響を及ぼす分子（標識）は、測定可能なシグナルのレベルを上昇または低下させる。好ましい態様において、蛍光物質に近接している場合に蛍光物質の蛍光に影響を及ぼす分子は、蛍光物質に近接している場合に、蛍光物質の蛍光（すなわち、発光量）を増加させるかまたは減少させる。例えば、蛍光物質の蛍光強度を低下させる消光剤が用いられてもよい。これは、活性化後にエネルギーを消光剤に伝達することによって、発光することなく基底状態へと戻る励起蛍光物質によって達成され、一方、消光剤は励起状態へと活性化される。消光剤自体は、蛍光物質であってもよいし、そうではなく非蛍光物質であってもよい。好ましい態様において、蛍光物質が、消光剤（これ自体は蛍光物質である）へとエネルギーを伝達する蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が用いられる。これが生じるためには、蛍光物質の発光スペクトルは、消光剤の吸収スペクトルと重複していなければならない。消光剤も蛍光物質である場合、その分子からの（特定の波長における）発光が、（第１の蛍光物質のシグナルの）消光が起こったことの目安として用いられ得る。あるいは、蛍光物質からの励起エネルギーを吸収するが、そのエネルギーを光ではなく熱として放射する暗消光剤が用いられてもよい。
【００４９】
本発明で用いるのに適した蛍光物質を、下記表に示す（これらの蛍光物質のうちいずれか１つが、本発明の方法において用いられ得る）。
【００５０】
【表１】
2018503404.tif 000002
【００５１】
蛍光物質は、バイオサーチ・テクノロジー（Biosearch Technologies）、ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）、ライフ・テクノロジー（Life Technologies）、インテグレイテッド・ＤＮＡ・テクノロジー（Integrated DNA Technologies）、エポック・バイオサイエンス（Epoch Biosciences, Inc.）、およびアトーテック（Atto-tec GmbH）などの様々な商業的供給源から入手可能である。
【００５２】
適切な蛍光物質を選択すると、これらの蛍光物質は、一組の蛍光物質：消光剤も提供し得る。しかしながら、暗消光剤を含む他の適切な消光剤の例が、以下に挙げられる。本発明は、本明細書で述べる消光剤のいずれかを用いて行われ得る。
【００５３】
【表２】
2018503404.tif 000003
【００５４】
消光剤は、ユーロジェンテック（Eurogentec）、エポック・バイオサイエンス、インテグレイテッド・ＤＮＡ・テクノロジー、バイオサーチ・テクノロジー、ライフ・テクノロジー、およびアトーテックなどの様々な商業的供給源から入手可能である。
【００５５】
本発明で用いるのに好ましい標識としては、ＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ、およびＦＡＭが挙げられ、これらは全て、市販品を容易に入手することができる。好ましい特徴において、用いられる２つの標識は、ＴＡＭＲＡおよびＦＡＭであり、それぞれが、例えば、ｄｄＮＴＰおよび二本鎖ポリヌクレオチド（または以下で述べるレポータープローブ）を標識化している。暗消光剤および蛍光物質の好ましい他の組み合わせとしては、ＡＴＴＯ５４０Ｑ／ＦＡＭ、ＡＴＴＯ５４０Ｑ／Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＡＴＴＯ５８０Ｑ／ＡＴＴＯ５５０、およびＡＴＴＯ５８０Ｑ／ＡＴＴＯ５６５が挙げられる。他の好ましい組み合わせとしては、ＡＴＴＯ６１２Ｑ／ＡＴＴＯ５６５、ＡＴＴＯ６１２Ｑ／ＲＯＸ、ＡＴＴＯ６１２Ｑ／ＣＹ５、ＡＴＴＯ６１２Ｑ／ＣＹ５．５、ＤＹＱ６６０／ＡＴＴＯ５６５、ＤＹＱ６６０／ＲＯＸ、ＤＹＱ６６０／ＣＹ５、ＤＹＱ６６０／ＣＹ５．５が挙げられる。好ましくは、二本鎖ポリヌクレオチド上の第２の標識は、蛍光物質であり、ｄｄＮＴＰ上の第１の標識は、蛍光物質の蛍光に影響を及ぼす標識である。
【００５６】
標識は、当該技術分野において周知の技術によって、ｄｄＮＴＰに付加され得る。標識化されたポリヌクレオチドは、標識化されたヌクレオチドを用いて、当該技術分野において周知の技術によって調製され得る。このような分子は、市販品を容易に入手することができる。ポリヌクレオチドは、そのヌクレオチドのいずれかが標識化され得る。しかしながら、好ましくは、ポリヌクレオチドは、その一方の鎖の５’末端での３つのヌクレオチドのうちの１つが標識化されている。特に好ましくは、ポリヌクレオチドを形成する鎖のうちの一方の５’末端（すなわち、５’末端のヌクレオチド）が標識化されている。
標識化は、直接的であってもよいし（例えば、適切な結合化学反応によって、またはリンカーによって、標識をｄｄＮＴＰまたはポリヌクレオチドに直接付加する）、結合パートナーによって付加されてもよい。これらは、共有結合または非共有結合を生じさせ得る。この場合、結合対の第１の結合パートナーは、ｄｄＮＴＰまたはポリヌクレオチドに付加され、結合対の第２の結合パートナーは、標識化されている。本明細書における「結合対」とは、特定の安定な相互作用を形成する一対の分子のことをいう。例としては、ＤＮＡ：ＤＮＡ相互作用、リガンド：受容体相互作用、抗体：抗原相互作用が挙げられる。このような結合部は、当該技術分野において周知であり、例えば、ビオチン／ストレプトアビジンなどが挙げられる。
【００５７】
二本鎖ポリヌクレオチドは、様々な形態を取り得る。特に、ポリヌクレオチドが単一分子で構成されていない場合は、二本鎖分子の末端には、様々な選択肢がある。したがって、二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端は、平滑末端化されていてもよい。二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端は、５’突出末端を有していてもよい。二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端は、３’突出末端を有していてもよい。したがって、例えば、両末端が平滑末端化されていてもよいし、一方の末端が平滑末端化されて、他方の末端が５’突出末端を有していてもよい。上述したように、ｄｄＮＴＰは、異なる様々な機構の結果として二本鎖分子に結合し、用いられる機構は、二本鎖ポリヌクレオチドに存在する末端の種類に影響を受けることが見出されている。
【００５８】
本明細書における「平滑」末端とは、二本鎖分子の関連末端で起こる相補塩基対形成のことをいい、すなわち、対になっていない末端塩基が残らない。「３’突出末端または５’突出末端」とは、結果として突出部となる対になっていない１つ以上の末端塩基が存在することをいう。５’突出末端は、その末端、すなわち５’ホスホリル末端に、対になっていない５’塩基を有している。二本鎖分子の末端にミスマッチがある場合、その分子の末端に、３’突出末端および５’突出末端が生じ得る。
【００５９】
理論に拘束されることを望むものではないが、平滑末端があると、結合のメディエーターまたはアダプターとしてポリメラーゼが作用することによって、ｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの非共有結合が可能となり得、また、ポリメラーゼの末端転移酵素活性によるｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの共有結合も可能となり得ると思われる。したがって、この結合を防止するステップは、ポリメラーゼもしくはその活性（例えば、酵素活性またはＤＮＡ結合活性）の除去、またはｄｄＮＴＰの除去に焦点を合わせている。よって、好ましい態様において、二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が平滑末端化されている場合、本方法は、ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去すること、ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去すること、および／またはｄｄＮＴＰを別のｄｄＮＴＰと競合させること、を含む。
【００６０】
同様に、５’突出末端があると、結合のメディエーターまたはアダプターとしてポリメラーゼが作用することによって、ｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの非共有結合が可能となり得、また、ポリメラーゼの末端転移酵素活性またはポリメラーゼによる非相補的ｄｄＮＴＰの無差別な取り込みによるｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの共有結合も可能となり得ると思われる。したがって、この結合を防止するステップは、ポリメラーゼもしくはその活性の除去、またはｄｄＮＴＰの除去に焦点を合わせている。また、５’突出末端が伸長することによっても、非共有結合を減少させ得る。したがって、さらに好ましい態様において、二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が５’突出末端を有している場合、本方法は、ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去すること、ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去すること、ｄｄＮＴＰを別のｄｄＮＴＰと競合させること、および／または長さが少なくとも２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いること、を含む。あるいは、ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いることによって、５’突出鎖を形成してもよく、その一本鎖領域は、少なくとも部分的には、ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じている。
【００６１】
最後に、３’突出末端があると、結合のメディエーターまたはアダプターとしてポリメラーゼが作用することによって、ｄｄＮＴＰの二本鎖ポリヌクレオチドへの非共有結合が可能となり得ると思われる。したがって、この結合を防止するステップは、ポリメラーゼもしくはその活性の除去、またはｄｄＮＴＰの除去、あるいは３’突出末端を伸長させて非共有結合を減少させることに焦点を合わせている。したがって、またさらなる好ましい態様において、二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が３’突出末端を有している場合、本方法は、ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去すること、ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去すること、ｄｄＮＴＰを別のｄｄＮＴＰと競合させること、および／または長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いること、を含む。あるいは、ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いることによって、３’突出鎖を形成してもよく、その一本鎖領域は、少なくとも部分的には、ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じている。
【００６２】
ポリメラーゼを除去、変性、または不活性化する方法は、疑似ＦＲＥＴ効果などの、ポリメラーゼに直接依存する効果を除去するのにも役立つ。
【００６３】
上述したように、ｄｄＮＴＰが相補ヌクレオチドに結合する様々な方法において、特に、ポリメラーゼなどの関連酵素の制御下において鎖伸長が行われる方法において、ｄｄＮＴＰが用いられている。特に、本方法および本発明の他の方法において、以下で述べるように、二本鎖分子を解離させ、好ましくは、この解離は、加熱によって達成され、二本鎖ポリヌクレオチドは融解曲線分析に供される。したがって、好ましい方法において、その方法は、融解曲線分析を含む。ｄｄＮＴＰは、例えば配列決定反応において、しばしば標識化されている。したがって、不適切なｄｄＮＴＰの結合を防止するのに用いられ得る上述した方法は、特に配列検出法において、偽陽性の発生を防止するのに特に有用である。
【００６４】
したがって、さらに好ましい態様において、本発明は、配列検出法において偽陽性を回避する方法を提供し、該配列検出法は、ｄｄＮＴＰと、ポリメラーゼと、互いにハイブリダイズして、場合によっては一本鎖領域を有する二本鎖ポリヌクレオチドである第３のポリヌクレオチドを形成する第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドと、を接触させるステップを含み、該一本鎖領域が５’突出配列を備える場合は、該ｄｄＮＴＰに相補的な塩基を二本鎖領域に隣接して含まず、該方法は、（ｉ）該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去すること、該ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去すること、および／または該ｄｄＮＴＰを別のｄｄＮＴＰと競合させること、を含み、かつ／あるいは（ｉｉ）長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）であるか、もしくは長さが少なくとも２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用い、かつ／またはポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いる、方法であって、該一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる、方法によって、ｄｄＮＴＰの該第３のポリヌクレオチドへの結合を防止する。
【００６５】
好ましい態様において、ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、ｄｄＮＴＰを競合させるステップ、および／または長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）もしくは少なくとも２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いるステップ、および／またはポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いるステップ、であって、一本鎖領域は、少なくとも部分的には、ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる、ステップを、二本鎖ポリヌクレオチド（第３のポリヌクレオチド）の生成前、生成中、および／または生成後に行う。
【００６６】
この方法は、上述したように、ポリメラーゼ存在下において、ｄｄＮＴＰのポリヌクレオチドへの結合を防止する方法を含む。
【００６７】
上記示した定義および好ましい選択肢は、本方法にも同様に適用可能である。特に、一本鎖領域、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）、ならびにポリメラーゼについては、上述したとおりである。「第１の」ポリヌクレオチドおよび「第２の」ポリヌクレオチドは、上述した第１の鎖および第２の鎖に相当し、単一のポリヌクレオチド上に存在していてもよいが、好ましくは別々の分子上に配されている。二本鎖ポリヌクレオチドである第３のポリヌクレオチドは、上述した二本鎖ポリヌクレオチドに相当する。ｄｄＮＴＰおよび二本鎖ポリヌクレオチドは、上述したように、標識化されていてもよい。用いられる処理およびこの処理が適用される二本鎖分子の種類は、この方法にも適用可能である。
【００６８】
本明細書における「偽陽性」とは、試験によって同定しようとしている特性が、存在していないのに存在していると示す結果のことをいう。これは、存在しているかもしれないが結果で示されるほどではない特性の、誤った、見かけの増加にも及ぶものである。配列検出法の場合、偽陽性とは、ある特定のヌクレオチド、塩基、または配列が存在しないのに、そのヌクレオチド、塩基、または配列を同定してしまうことに相当する。例えば、本方法を用いて、試験ポリヌクレオチドがＳＮＰを含んでいることを見出したが、そのＳＮＰは、実際には試験ポリヌクレオチド中にはない、といったことが挙げられる。
【００６９】
本明細書における「配列検出法」は、ヌクレオチド配列を決定する方法のことである。全配列が決定されてもよいし、部分配列が決定されてもよい。配列中の塩基１つのみまたは複数の塩基（ヌクレオチド）が、場合によっては決定され得るが、これは、一般的にはその周辺配列と関連するものであり、したがって、例えば、その構成配列中のＳＮＰの有無が、この試験によって確認される。用いられる方法に応じて、少なくとも１つのヌクレオチド／塩基が決定され、特に本方法を複数回繰り返して用いる場合に、少なくとも、２つ、３つ、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、４０００個、６０００個、または１００００個以上のヌクレオチドが決定され得る。
【００７０】
ヌクレオチド配列の決定は、特定の位置において特定の塩基（すなわち、Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｇ、またはＣ）を同定すること、すなわち絶対的な同定を含むか、または、その塩基を部分的に同定する。例えば、本方法によって、塩基の選択肢、例えばＧまたはＣではなくＡまたはＴ、あるいはＣではなくＡ、Ｔ、またはＧからなる４つ未満（すなわち、３つまたは２つ）の塩基の組が同定され得る。
【００７１】
本発明のこの態様において、ｄｄＮＴＰと、ポリメラーゼと、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドとを互いに接触させる。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズして、第３の（二本鎖）ポリヌクレオチドを形成する。したがって、少なくとも第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションを可能にする適切な条件下（例えば、温度、濃度、緩衝液の条件など）において、接触させる。ｄｄＮＴＰおよびポリメラーゼも、これらの分子と接触させる（すなわち、同じ反応容器中で、これらの分子との物理的な接触が可能とされる）。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドとを互いに接触させるのと同時に、ｄｄＮＴＰおよび／またはポリメラーゼを反応混合物に添加しても（または存在させても）よいし、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの一方または両方を混合物に添加した後、ｄｄＮＴＰおよびポリメラーゼを反応混合物に添加してもよい。すなわち、４つの成分は、連続的にまたは（４つの成分のうち２つ以上を）同時に、どのような順番で反応混合物に添加されてもよい。ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、ｄｄＮＴＰを競合させるステップ、および／または長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）もしくは少なくとも２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いるステップ、および／またはポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを用いるステップ、であって、一本鎖領域は、少なくとも部分的には、ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる、ステップを、二本鎖ポリヌクレオチドの生成前、生成中、および／または生成後に行ってもよい。したがって、特定の分子、例えば、ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼおよび／または洗浄剤を添加する場合、最初の試薬と共に添加してもよいし、反応のもっと遅い時点で添加してもよい。
【００７２】
本方法は、他の試薬の存在下で行われてもよい。本方法は、通常の伸長反応後、またはその途中に行われ得るので、１つ以上のｄＮＴＰなど、その伸長反応に用いられる他の試薬が存在していてもよい。
【００７３】
好ましい配列検出法は、ポリメラーゼによる鎖伸長反応への標識化ｄｄＮＴＰの取り込みに基づくものであり、サンガーのジデオキシ法ならびに段階的なライゲーションおよび切断が挙げられる。しかしながら、好ましい態様において、一塩基プライマー伸長反応が配列検出に含まれる方法が用いられる。
【００７４】
したがって、さらなる好ましい態様において、本発明は、試験ポリヌクレオチド中の標的ヌクレオチドを同定する方法を提供し、該方法は、
（ａ）該試験ポリヌクレオチドを、ｄｄＮＴＰと、未標識の標識プローブであって、プローブが、該標的ヌクレオチド配列が存在する場合は、ポリメラーゼ存在下において、該標的ヌクレオチド配列中の該ｄｄＮＴＰに相補的な塩基のすぐ５’側において該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、標識プローブと、に接触させるステップであって、該ｄｄＮＴＰは第１の標識で標識化されており、該標的配列が試験ポリヌクレオチド中に存在する場合、該未標識の標識プローブは、該試験ポリヌクレオチドにハイブリダイズして、該ポリメラーゼによって３’方向に伸長し、該未標識の標識プローブに該標識化ｄｄＮＴＰが付加されて標識化標識プローブが形成される、ステップと、
（ｂ）前記標識プローブを、標識化されていても、されていなくても、前記試験ポリヌクレオチドから分離するステップと、
（ｃ）該標識プローブを、第２の標識で標識化されたレポータープローブにハイブリダイズさせて二本鎖ポリヌクレオチド（上記定義されたもの）を形成するステップであって、前記第１の標識または第２の標識は、互いに近接していると、他方の標識によるシグナルに影響を及ぼし（好ましくは、該第１の標識または第２の標識は蛍光物質であり、他方の標識は、該蛍光物質に近接している場合に該蛍光物質の蛍光に影響を及ぼす分子であり）、該標識プローブが標識化されていない場合、前記第２の標識に最も近い末端において、該二本鎖ポリヌクレオチドが（ｉ）平滑末端化されているか、（ｉｉ）５’突出末端を有するか、または（ｉｉｉ）３’突出末端を有し、前記第２の標識から遠位にある末端において、該二本鎖ポリヌクレオチドが（ｉ）平滑末端化されているか、（ｉｉ）５’突出末端を有するか、または（ｉｉｉ）３’突出末端を有しており、該突出末端は一本鎖領域からなるものであって、該一本鎖領域が５’突出配列を備える場合、二本鎖領域に近接して、該ｄｄＮＴＰに相補的な塩基を含まない（好ましくは、該一本鎖領域のいずれの位置においても、該ｄｄＮＴＰに相補的な塩基を含まない）、ステップと、
（ｄ）該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、ステップａ）において付加しなかった該ｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、該ｄｄＮＴＰを他のｄｄＮＴＰと競合させるステップ、および／または共に結合した場合に、長さが少なくとも１ヌクレオチド（３’突出）もしくは少なくとも２ヌクレオチド（５’突出）である一本鎖領域を形成する標識プローブとレポータープローブとを用いるステップ、および／または共に結合した場合に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を形成する標識プローブとレポータープローブとを用いるステップ、であって、一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該二本鎖ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる、ステップであり、ステップ（ｄ）は、該二本鎖分子の生成前、生成中、および／または生成後に行われてもよい、ステップと、
（ｅ）前記二本鎖ポリヌクレオチドに伴うシグナルを評価することによって、該標識プローブが第１の標識で標識化されているかを決定するステップであって、前記第１の標識または第２の標識のシグナルの変化によって、該試験ポリヌクレオチド中の該標的配列の存在が示される、ステップと、
を含む、方法である。
【００７５】
本方法の好ましい態様において、生成される二本鎖分子の形態に応じて、本方法は、
（ｉ）該ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が、ステップ（ｃ）によって平滑末端化されている場合、ステップ（ｄ）において、該ポリメラーゼが不活性化、分解、もしくは除去されること、ステップａ）において付加しなかった該ｄｄＮＴＰが脱リン酸化もしくは除去されること、および／または該ｄｄＮＴＰを他のｄｄＮＴＰと競合させること、が行われ、
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が、ステップ（ｃ）によって５’突出末端を有する場合、ステップ（ｄ）において、該ポリメラーゼが不活性化、分解、もしくは除去されること、ステップａ）において付加しなかった該ｄｄＮＴＰが脱リン酸化もしくは除去されること、該ｄｄＮＴＰを他のｄｄＮＴＰと競合させること、および／または共に結合した場合に、長さが少なくとも２ヌクレオチドである該５’突出末端を形成する一本鎖領域を形成する（これは、例えば、ミスマッチ塩基を用いるか、またはプローブのうちの一方を伸長させることによって達成され得る）標識プローブとレポータープローブとを用いること、および／または共に結合した場合に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を形成する標識プローブとレポータープローブとを用いること、が行われ、一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該二本鎖ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じ、かつ／あるいは
（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドの一方または両方の末端が、ステップ（ｃ）によって３’突出末端を有する場合、ステップ（ｄ）において、該ポリメラーゼが不活性化、分解、もしくは除去される（好ましくは、分解もしくは除去される）こと、ステップａ）において付加しなかった該ｄｄＮＴＰが脱リン酸化されること、該ｄｄＮＴＰを他のｄｄＮＴＰと競合させること、および／または共に結合した場合に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである該３’突出末端を形成する一本鎖領域を形成する（これは、例えば、ミスマッチ塩基を用いるか、またはプローブのうちの一方を伸長させることによって達成され得る）標識プローブとレポータープローブとを用いること、および／または共に結合した場合に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端に、長さが少なくとも１ヌクレオチドである一本鎖領域を形成する標識プローブとレポータープローブとを用いること、が行われ、一本鎖領域は、少なくとも部分的には、該二本鎖ポリヌクレオチド中の１つ以上の塩基対間のミスマッチによって生じる、
ように、変更されてもよい。
【００７６】
上記方法において、好ましくは、第１の標識または第２の標識は蛍光物質であり、他方の標識は、蛍光物質に近接している場合に蛍光物質の蛍光に影響を及ぼす分子である。その場合、標識プローブが第１の標識で標識化されているかを決定するために、二本鎖ポリヌクレオチド中の蛍光物質の蛍光が評価され、ここで、蛍光の変化によって、試験ポリヌクレオチド中の該標的配列の存在が示される。
【００７７】
標的ヌクレオチド配列を同定する方法は、本明細書で述べるように、配列検出法において偽陽性を回避する方法と、ｄｄＮＴＰを防止する方法と、Ｔｍの誤った読み取りまたは疑似ＦＲＥＴ効果を回避する方法と、を含む。本発明のこの態様における用語の意味は、上述した通りであるか、または以下でさらに述べる通りである。
【００７８】
本明細書における「試験」ポリヌクレオチドとは、本方法によって、標的配列を含む（含有するか、または構成される）かどうかが試験されるサンプル中に存在するポリヌクレオチドのことをいう。「サンプル」は、得られ得る、または調製され得る、あらゆるサンプルであり、関連ポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、その本来の形態、例えば生体から供給される生物サンプルで供給されてもよいが、より好ましくは、本来の天然ポリヌクレオチドの増幅産物である。したがって、試験ポリヌクレオチドは、本方法で用いる増幅ｃＤＮＡを産生するための天然ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはリボソームＲＮＡ）またはＤＮＡの増幅によって得られてもよい。好ましくは、試験ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはｃＤＮＡである。試験ポリヌクレオチドは、二本鎖であってもよいし、一本鎖であってもよい。
【００７９】
天然ＲＮＡ（まずｃＤＮＡに逆転写されてもよい）またはＤＮＡは、適切なプライマー（例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＮＡＳＢＡ、またはリガーゼ連鎖反応などの公知の増幅技術によって、増幅されてもよい。あるいは、天然ＤＮＡまたはｃＤＮＡ（あるいはそれらの関連部位）を、ベクターを用いてクローン化し、これを用いて大腸菌（E. coli）などの細菌を形質転換し、その後細菌を増殖させて核酸分子を複製してもよい。ＤＮＡまたはｃＤＮＡの配列が不明である場合、導入された核酸分子の領域に、プライマーを導入してもよい。したがって、例えば、ＤＮＡ分子を増幅するために、ＤＮＡ分子およびこれらの一部に導入されたプライマーに、アダプターをライゲーションしてもよい。あるいは、真核生物のサンプルの場合は、適切なプライマーを調製するために、ＲＮＡのポリＡテールおよびキャップを利用してもよい。
【００８０】
本来の天然ポリヌクレオチドは、生体から得られる。ポリヌクレオチドは、例えば調査対象であるヒトまたはヒト以外の動物の、例えば組織、体液、または老廃物から直接得られてもよく、原核生物の場合は生体自体から得られてもよい。「体液」は、血液、唾液、脊椎液、精液、リンパ液を含む。「老廃物」は、尿、吐き出された物質（肺疾患患者）、糞便などを含む。「組織サンプル」は、生検、外科的介入、または他の手段によって得られる、胎盤などの組織を含む。これらの組織、体液、または老廃物から、試験ポリヌクレオチドが存在するサンプル、または、例えば増幅によって、試験ポリヌクレオチドが抽出され得るサンプルが得られ得る。あるいは、サンプルは、生体自体に由来するものでなくてもよく、例えば環境サンプル（例えば、関連細胞または遺伝物質を含む）などの、その生体由来の遺伝物質を含むものである。
【００８１】
目的の生体は、原核生物または真核生物であり、ヒト、他の哺乳類や動物、鳥類、昆虫、魚類、植物などのあらゆる真核生物、および細菌などのあらゆる原核生物であってもよい。
【００８２】
好ましいヒト以外の動物としては、魚類および哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい哺乳類としては、霊長類、飼育動物、家畜、および実験動物が挙げられる。したがって、好ましい哺乳類としては、マウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、およびウマが挙げられる。
【００８３】
「標的ヌクレオチド配列の同定」は、配列検出法に関して上記用いたものと同じ意味を有する。すなわち、配列中の少なくとも１ヌクレオチドの絶対的な配列同定または部分的な配列同定である。
【００８４】
「標的」配列は、試験ポリヌクレオチド中で同定される、目的の配列である。本方法を用いることで、特定のヌクレオチド（例えば、ＳＮＰ）を同定し得る（また、これは、同定された配列であると見なされ得る）が、これは、その周辺配列と関連するものであり、したがって、標的配列の存在が同定される。好ましくは、標的配列の長さは、６〜３０ヌクレオチドである。
【００８５】
「未標識の標識プローブ」（上述した第１のポリヌクレオチドに相当する）は、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。このプローブの長さは、上述したように、適切に、また特異的に標的配列にハイブリダイズし、存在し得る他の配列にはハイブリダイズしない程度に長く、しかし、過度な化学合成を回避できる程度には短い。標識プローブと、試料分子に含まれる標的配列との間のいくつかのミスマッチは、許容され得る。好ましくは、共にハイブリダイズする分子の領域（標識プローブの場合、これは、その分子の全てまたは一部であり得る）は、互いに１００％相補的である。しかしながら、これは必須ではなく、完全な塩基対形成は必要ではない。したがって、この領域中のミスマッチは、２つの分子が、常用の融解温度分析を行えるくらい安定な複合体を形成することができるくらいに十分相補的であれば、許容され得る。よって、例えば、互いに結合する配列領域では、ほんの８０％、９０％、または９５％の相補性が、共有されていてもよい（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のミスマッチを有していてもよい）。本発明のある実施形態において、ミスマッチを用いることは、上述したように、好ましい。
【００８６】
プローブは、検出可能なシグナルを発生する、上述した標識で標識化されない限りは、未標識である。
【００８７】
「ハイブリダイズする」配列は、高ストリンジェンシーな条件下において結合したままである、すなわち、非ストリンジェントな条件下（例えば、６×ＳＳＣ／５０％ ホルムアミド、室温）で結合し、高ストリンジェンシーな条件下（２×ＳＳＣ、６５℃；ここで、ＳＳＣとは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２であり、例えば７０個以上のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに用いられる）（または、ＴＭＡＣｌ洗浄液、５０〜８０℃；ここでＴＭＡＣｌ洗浄液とは、３．０Ｍ ＴＭＡＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、１ｍｇ／ｍｌ ＳＤＳであり、例えば１７〜５０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに用いられる）で洗浄した際も結合したままである、配列である。
【００８８】
標識プローブは、本方法で用いられるｄｄＮＴＰに相補的な塩基のすぐ５’側（すなわち、上流）において標的ヌクレオチド配列に結合する。したがって、標識プローブは、標的ヌクレオチド配列の一部にのみ結合する。標的配列がＳＮＰを含む場合、標識プローブは、ＳＮＰがある塩基を除く標的ヌクレオチド配列全体に結合してもよい。この場合、二本鎖分子が形成され、その後、ｄｄＮＴＰが、通常の鎖伸長反応によって結合され得る。本明細書における「塩基のすぐ５’側に結合する」とは、標識プローブの３’末端最後のヌクレオチドが、標的配列中の、ｄｄＮＴＰに相補的な塩基の５’側に隣接するヌクレオチドに結合するような、標的配列への結合をいう。これによって、少なくともこの相補塩基において、鎖伸長が可能になる。以下で述べるように、この第１のヌクレオチドを越えて鎖を伸長させることも検討される。
【００８９】
標識プローブは、好ましくは少なくとも５ヌクレオチドであり、好ましくは長さが５〜２００ヌクレオチド、例えば１０〜１００ヌクレオチドや２０〜５０ヌクレオチドである。
【００９０】
標識プローブは、標的配列と完全に相補的でなくてもよい（二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖と第２の鎖との結合に関して上述したのと同様である）。相補結合に関与する塩基の数は、安定な複合体を形成できるくらい十分でなければならない。好ましくは、標識プローブの少なくとも５つの連続した塩基、好ましくは連続した５〜２００塩基、例えば連続した１０〜１００塩基や連続した２０〜５０塩基が、標的配列の塩基に相補的である。好ましくは、標識プローブは、標的配列またはその領域と、完全に（すなわち、１００％）相補的である。
本明細書における「相補性」は、２つの分子（またはその領域）間の関係を定義し、分子間の相補結合が起こり得るように、すなわち相補塩基が同じ順序で配されるように、分子が相補ヌクレオチド／相補塩基を含んでいる程度を表す。配列が１００％の相補性を有する場合、ミスマッチ無く結合する。相補性が１００％未満の場合、１つ以上のミスマッチが存在する。
【００９１】
ｄｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、第１の標識および第２の標識は、上述した通りである。第２の標識は、レポータープローブに結合する。
【００９２】
標的配列が存在する場合、未標識の標識プローブは、試験ポリヌクレオチドにハイブリダイズして、ポリメラーゼによって３’方向に伸長し、未標識の標識プローブに標識化ｄｄＮＴＰが付加されて標識化標識プローブが形成される。これを達成することができるように、標識プローブ、ｄｄＮＴＰ、およびポリメラーゼを、適切な条件下（例えば、温度および濃度など）で、ハイブリダイゼーションおよび鎖伸長の両方を可能にするのに適切な時間、提供する。この目的に適した条件は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning : A laboratory manual）第２版、コールド・スプリング・ハーバーラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州を参照）。
【００９３】
このように形成された標識化標識プローブは、鎖伸長によって標識化ｄｄＮＴＰが取り込まれた一本鎖ポリヌクレオチドである。ｄｄＮＴＰは、鎖伸長反応において、第１のヌクレオチドとして取り込まれてもよいし、第２のヌクレオチドまたはそれに続くヌクレオチドとして取り込まれてもよい（例えば、ｄＮＴＰも用いる場合）。
【００９４】
標的配列が存在しない場合、例えば、特定のＳＮＰが存在しない場合、標識プローブは、引き続き試験ポリヌクレオチドに結合し得るが（ＳＮＰの場合、特定のＳＮＰが存在しなくても、標的ポリヌクレオチド配列の大部分（すなわち、その上流の構成配列）は存在し得る）、鎖伸長は起こらず、よって標識プローブは未標識のままである。
【００９５】
標識プローブを試験ポリヌクレオチドから分離するには、少なくとも、これらの分子間の塩基対結合を開裂させること、すなわち、ハイブリダイズした複合体を融解させることが必要となる。好都合なことには、これは、複合体を保持している溶液の温度を、複合体の融解温度（Ｔｍ、以下で説明する）よりも高くすることによって、達成され得る。
【００９６】
必須ではないが、標識プローブと試験ポリヌクレオチドとを、物理的にさらに分離してもよい（それでも、好ましい態様において、分子を、別の領域または溶液に物理的にさらに分離はしない。例えば、異なる分子および結合しなかったｄｄＮＴＰを分離するために、電荷またはサイズに基づいた分離は行わない）。例えば、これは、親和性によって達成され得、例えば、標識プローブまたは試験ポリヌクレオチドは、他方の要素（標識プローブまたは試験ポリヌクレオチド）には存在せず、また結合パートナー（例えば、固体の支持体に付着される）を配し得る、配列または分子（例えば、調整時、または増幅時に導入されたもの）を含む。例えば、上述したように、標識プローブは、結合パートナーを付加されていてもよく、また、その結合パートナーを、固体の支持体に付加されていてもよい結合対の他の結合パートナーに結合させることによって、回収されてもよい。
【００９７】
試験ポリヌクレオチドから一旦分離されると、（標識化されたまたは未標識の）標識プローブは、第２の標識で標識化されたレポータープローブにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション、および第２の標識については、上述した通りである。このハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖ポリヌクレオチドも、上述した通りである。
【００９８】
（標識化されたまたは未標識の）標識プローブおよびレポータープローブは、共にハイブリダイズして第３のポリヌクレオチド（上述した二本鎖ポリヌクレオチド）を形成する、本明細書における第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドに相当する。したがって、上記説明したこれらのポリヌクレオチドについての定義が適用可能である。よって、例えば、レポータープローブの長さは、好ましくは５ヌクレオチドであり、好ましくは長さが５〜２００ヌクレオチド、例えば１０〜１００ヌクレオチドや２０〜５０ヌクレオチドであり、好ましくは蛍光物質である第２の標識で標識化されている。必要な相互作用が、近さに基づいて達成され得るように、第１の標識および第２の標識を選択する場合は、プローブ分子中のいずれのヌクレオチドにおいて、レポータープローブが標識化されてもよい。好ましくは、レポータープローブは、５’末端において、例えば、５’側終端のヌクレオチドなど、５’末端での３つのヌクレオチドのうちの１つにおいて、標識化される。
【００９９】
標識プローブおよびレポータープローブを設計する際に、内因性消光活性（例えば、実施例に示す）を生じる塩基は、避けるべきである。したがって、グアニン残基が、シグナルを測定する標識のごく近くに来るようにすることは、避けるべきである。よって、レポーター分子が、その５’末端において標識化されている場合は、Ｇリッチな３’末端を有する標識プローブは、避けるべきである。さらに、レポーター分子において、５’のグアニンは避けるべきである。
【０１００】
このように形成された二本鎖ポリヌクレオチドは、上述した意味を持つ平滑鎖または突出鎖を、一方または両方の末端に有する。第２の標識に最も近い末端は、標識化されたヌクレオチドに最も近い末端である。好ましい特徴において、第２の標識は、レポータープローブの５’末端に存在し、この（最も近い）末端に標識プローブが結合すると、平滑末端または突出末端が生じる。この場合、この標識から遠位にある末端は、レポータープローブの３’末端側である。
【０１０１】
好ましい特徴において、突出鎖の一本鎖領域の長さは、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または３ヌクレオチドである。
【０１０２】
二本鎖ポリヌクレオチドは、末端の種類（平滑末端または突出末端）に応じて、上述したように、すなわち、ポリメラーゼの処理もしくは除去、ｄｄＮＴＰの脱リン酸化もしくは除去、ｄｄＮＴＰの競合、またはより長い一本鎖領域もしくはミスマッチ塩基対を有する二本鎖分子の使用によって、処理されてもよい。上述したように、ポリメラーゼによって、異なる結合様式が仲介される。回避されるべき結合様式に応じて、この処理のタイミングが適切に選択され得る。二本鎖分子の生成前に（ｄｄＮＴＰの不適切な共有結合を回避するために）、処理が行われてもよく、かつ／あるいは二本鎖分子の生成中および／または生成後（であるが、シグナル検出前）に、処理が行われてもよく、ここで、原理上の懸念は、疑似ＦＲＥＴ効果またはポリメラーゼの安定化効果である。好都合なことには、この目的で用いられる試薬は、二本鎖分子の生成中に存在していてもよく、例えば、二本鎖分子の生成と同時に、プロテイナーゼまたは洗浄剤を添加してもよい。プロテイナーゼを用いる場合、特に好ましくは、二本鎖分子の生成に先立って、プロテイナーゼを添加する。洗浄剤を用いる場合、より迅速な効果の観点から、好ましくは、二本鎖ポリヌクレオチドの生成に先立って、または生成途中に、洗浄剤を添加する。
【０１０３】
このステップを行った後、ｄｄＮＴＰを取り込む鎖伸長反応中に最初に調製または導入されたように、ポリヌクレオチド中に存在する標識のみが、存在するであろう。標的配列が存在するかを決定するために、標識プローブが第１の標識で標識化されているかどうかを決定する必要がある（すなわち、ｄｄＮＴＰが取り込まれると、標的配列全体が存在することが示される）。
【０１０４】
この決定は、二本鎖ポリヌクレオチドに伴うシグナルを評価することによって行われ得る。用いられる標識およびそれによって発生されるシグナルに応じて、適切な決定法が用いられ得る。以下でより詳細に言及するように、例えば、標識の１つは蛍光物質であってもよく、そのシグナル（蛍光）の程度が試験されてもよい。
【０１０５】
本明細書における「シグナルの変化」とは、基準値に対するシグナルのレベル（その有無を含む）または種類の変化をいう。その変化は、シグナルの増加であってもよいし、減少であってもよい。二本鎖ポリヌクレオチドの形成が、シグナルの変化をもたらすかどうかを評価する場合、基準値は、互いに近接していない場合の第１の標識または第２の標識のシグナルである。したがって、例えば、蛍光物質および消光剤の場合、蛍光物質が、レポータープローブ上に存在する第２の標識であり、ｄｄＮＴＰ上の第１の標識が消光剤である場合には、ｄｄＮＴＰが標識プローブに取り込まれ、そのプローブがレポータープローブに結合して標識が近接している場合、蛍光物質からのシグナルが変化する（すなわち、蛍光が消光し、それによって、その標識からの検出可能な蛍光が減少する）。
【０１０６】
行われる決定は、定性的（すなわち、試験配列の有無を同定すること）および／または定量的（すなわち、試験配列の量またはレベルを同定すること）であってもよい。これは、絶対値として表されてもよいし、百分率として表されてもよいし、比率または同様の指標として表されてもよい。
【０１０７】
シグナル変化は、例えばレポータープローブによって生じるシグナルといった、標識の非結合シグナルなど、開始時点と比較して、評価され得る。しかしながら、好都合なことには、シグナル変化は、レポータープローブを標識プローブ（標識化されているか、または未標識である）から分離し、その解離途中のシグナル変化を評価することによって、評価される。好都合なことには、これは、融解曲線分析を用いて行われる。
【０１０８】
したがって、好ましい態様において、本発明は、二本鎖分子を解離させることを含み、解離中の第１の標識のシグナルまたは第２の標識のシグナル（好ましくは蛍光）の変化は、該試験ポリヌクレオチド中の該標的配列の存在を示すものである。好ましくは、加熱によって解離が起こり、二本鎖ポリヌクレオチドは、融解曲線分析に供される。
【０１０９】
好ましい態様において、蛍光物質（これは、好ましくはレポータープローブ上にある）である標識の蛍光レベルが評価される。蛍光物質がレポータープローブ上に存在する場合、その分子は蛍光を発するが、蛍光は、第１の標識が標識プローブ上に存在するかどうかに、影響を受け得る。蛍光物質が標識プローブ（標識化されている場合）上に存在する場合、蛍光は、標識プローブが存在する場合にのみ発せられ、その蛍光は、レポータープローブ上の第２の標識の有無に影響を受ける。
【０１１０】
蛍光物質の蛍光を評価するためには、好都合な手段が用いられ得る。例えば、２光子および３光子時間分解蛍光分光、蛍光寿命イメージング、または蛍光共鳴エネルギー転移が調べられてもよい。蛍光は、例えば、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナ、分光蛍光計、またはフローサイトメーターなどの適切な検出器を用いて検出され得る。好都合なことには、分光蛍光計が用いられる。例えば、好都合なことにはアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）７５００Ｆａｓｔおよびキアゲン（QIagen）Ｒｏｔｏｒ−Ｑなどの機器が用いられ得る。
【０１１１】
以下でより詳細に述べるように、多重化法において、２つ以上の蛍光標識が用いられてもよく（例えば、２つ以上の標識プローブまたはレポータープローブが用いられる場合）、その場合、異なる標識の蛍光を区別することができる検出器が必要となる。
【０１１２】
好ましくは、本方法は、ハイスループットなスクリーニングのために、自動化または半自動化されている。好都合なことには、自動化は、コンピュータソフトによって制御される。
【０１１３】
上述したように、好都合なことには、決定は融解曲線分析によって行われる。融解曲線分析は、加熱プロセス中の、二本鎖ＤＮＡの解離特性を評価するものである。温度が上昇することによって、塩基対間の結合が開裂するにつれ、二本鎖分子が一本鎖分子に解離する。融解温度（Ｔｍ）は、二本鎖分子の５０％が一本鎖分子に解離する温度である。融解温度は、結合対間の相補性の程度、関与分子の長さ、および分子のＧＣ含量などの様々な要因に影響を受け、これらの要因は全て、二本鎖分子の安定性に影響を及ぼすものである。
【０１１４】
この場合、二本鎖分子は、標的配列が存在しているかどうかに応じて、異なる２つの形態をとる。標的配列が存在する場合、標識プローブは、第１の標識で標識化される。その後、第２の標識で標識化されているレポータープローブに結合する。これらの標識の一方は、他方の標識のシグナルに影響を及ぼす。好ましくは、これらの標識の一方が蛍光物質であり、他方の標識がその蛍光に影響を及ぼす。標識化標識プローブおよびレポータープローブが結合している場合、標識は、シグナル（例えば、蛍光物質の蛍光）が影響を受けるくらい十分に近接している。したがって、これらの分子がハイブリダイズすると、シグナル（例えば、蛍光物質の蛍光）が影響を受ける。しかしながら、これらの分子が解離すると（例えば、融解曲線分析の途中に）、標識は効果的に分離され、シグナル（例えば、蛍光物質の蛍光）は影響を受けなくなる。したがって、融解曲線分析の過程において、分子が解離するにつれて、シグナル（例えば、蛍光物質の蛍光）は変化する。これは、融解曲線分析中に、シグナル（例えば、蛍光）を評価することによってモニターされても良い。融解曲線分析によって、第１の標識および第２の標識が共に存在するかどうかと、これらの標識で標識化された２つのポリヌクレオチドが解離する温度との両方を、同定することが可能になる。両方の標識が存在する場合、これは、標識プローブが標識化されたこと、すなわち、ｄｄＮＴＰが標的配列に結合したことを示す。
【０１１５】
熱に基づいた解離法の代わりに、別の解離法が用いられてもよい。したがって、例えば、ＮａＯＨ、ホルムアミド、または一本鎖結合タンパク質を用いて標識プローブおよびレポータープローブを分離する方法などの、他の変性法が用いられてもよい。これらの変性剤は、異なる濃度で用いられてもよいし、単一濃度で経時的に用いられてもよい。電場を用いて変性を援助してもよい。２本の鎖の変性および解離の進行（および、それによる標識のシグナルへの影響）は、上述したように、解離中のシグナル（例えば、蛍光）の変化を評価することによって適宜モニターされてもよい。本明細書で述べるように、このような方法は、二本鎖分子を形成する鎖の配列に応じて、異なる複合体がこれらの方法において異なる時間／濃度で解離し得るため、多重化され得る。
【０１１６】
好ましくは、用いられる標識は、蛍光物質および消光剤である。この場合、融解曲線分析中、二本鎖分子が解離して蛍光物質が消光剤から離れるにつれて、蛍光が上昇する。
【０１１７】
好ましい態様において、本明細書における二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、融解曲線分析に供される分子）の一方の末端が、平滑末端化されている、かつ／または５’突出末端を有している（例えば、両方の末端が平滑末端化されていてもよいし、両方の末端が５’突出末端を有していてもよいし、一方が平滑末端で他方が５’突出末端であってもよい）。５’突出末端が存在する場合、好ましくは、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または３ヌクレオチドが突出している。ミスマッチ塩基対が用いられる場合、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の末端に、５’突出末端に加えて３’突出末端が存在していてもよい。
【０１１８】
上述した通り、ポリメラーゼが存在することによっても、二本鎖ポリヌクレオチドの融解温度が上昇し、これが融解曲線分析法において誤ったＴｍの原因となる。さらに、他の蛍光供与体または消光分子の非存在下であっても、ポリメラーゼによって、蛍光標識に対する疑似ＦＲＥＴ効果（例えば、偽陽性消光効果）が起こることが見出されている。これは、蛍光標識の蛍光レベル（これは消光および／または供与体の蛍光の影響を受け得る）を用いて、対象となる要素、例えば、消光分子が付加されたポリヌクレオチドが、蛍光物質で標識化されたポリヌクレオチドに対して、蛍光物質の蛍光に影響を及ぼすくらいに近接した状態に結合すること、を同定または定量化する方法において、誤った結果を生じる効果を有する。典型的には、このような効果は、融解曲線分析法においてモニターされ得る。このような効果は、上述した方法において、ポリメラーゼの不活性化、変性、または除去によって、抑制され得る。
【０１１９】
したがって、本発明は、（好ましくは、融解曲線分析法において、または融解曲線分析法を含む）Ｔｍの誤った読み取り、および／または疑似ＦＲＥＴ効果（例えば、偽陽性消光）を回避する方法も提供し、該方法は、ポリメラーゼと、場合によってはｄＮＴＰおよび／またはｄｄＮＴＰと、互いにハイブリダイズして、場合によっては一本鎖領域を有する二本鎖ポリヌクレオチドである第３のポリヌクレオチドを形成する第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドと、を接触させるステップを含み、疑似ＦＲＥＴ効果（例えば、偽陽性消光）を回避する場合は、該第１のポリヌクレオチドが蛍光物質で標識化されており、該方法は、該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去した後に、Ｔｍおよび／もしくはＦＲＥＴ効果を評価する（例えば、該融解曲線分析が用いられる場合は、融解曲線分析を行う）ステップ、ならびに／または該方法において、疑似ＦＲＥＴ効果（例えば、偽陽性消光）を回避する場合であって、ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを用いる場合は、該ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、ならびに／または該ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを他のｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰと競合させるステップ、をさらに含み、該用語は、好ましくは上述した意味を有する該二本鎖ポリヌクレオチドを除いて、上述したような意味を有している。
【０１２０】
疑似ＦＲＥＴ効果は、ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去すること、ならびに／またはｄＮＴＰもしくはｄｄＮＴＰを除去および／もしくは競合させることによって、回避され得る。疑似ＦＲＥＴ効果（例えば、偽陽性消光）を回避する方法は、例えば、蛍光標識の蛍光レベルの上昇もしくは低下によって、標的分子または標的配列の存在（もしくは量）が示される、融解曲線分析または他の方法（例えば、蛍光標識に対する近さによって、標的分子または標的配列の存在（もしくは量）が示される、蛍光供与体もしくは消光剤によって標識化されている１つ以上のプローブもしくはプライマーを用いる方法）において、適宜用いられ得る。このような方法は、例えば、タックマン（Taqman）プローブ、スコーピオンプローブ、および分子ビーコンの使用を含む。融解曲線分析は、上述したように行われ得る。
【０１２１】
上述した方法において、ｄＮＴＰが用いられる場合、本方法で他に用いられ得るｄｄＮＴＰの代わりとして（またはｄｄＮＴＰと共に）用いられ得る。したがって、本明細書におけるｄｄＮＴＰに関する教示は、適宜、ｄＮＴＰと同様に適用され得る。
本明細書における「Ｔｍの誤った読み取り」とは、本方法が行われる際に実験的に観察される、インシリコにおける計算とは異なる融解温度のことであり、その実験結果のうち、ポリメラーゼを除去、不活性化、または分解することによってＴｍの正しい読み取りに戻すことができるものである。正しい読み取りは、実施例に示すように、例えば、プロテイナーゼまたは洗浄剤の有無にかかわらず、ポリメラーゼ存在下においてＴｍの分析を行うなど、上記概説したプロトコールのうちの１つを用いて誤った読み取りを回避することによって、実験的に容易に同定することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、ポリメラーゼは、安定化効果を有し、二本鎖ポリヌクレオチドのＴｍを上昇させると思われる。Ｔｍは、少なくとも１℃、好ましくは少なくとも３℃、４℃または５℃、例えば３℃または５℃以上１０℃以下、上昇し得る。読み取りは、本方法において直接評価されなくてもよい、すなわち、正確なＴｍは、評価または記録されなくてもよいが、その代わりに、融解曲線を検討することによって、例えば認識可能なピークの欠如またはピークが他のピークに重なることなど、誤ったＴｍが明らかになる程度には、明らかになっても良い。Ｔｍを「評価する」ことは、このような観察にも及ぶ。
【０１２２】
本明細書における「疑似ＦＲＥＴ効果」とは、消光分子または蛍光供与体分子の存在によって生じるものではない、蛍光標識の蛍光の上昇または低下のことをいう。本明細書における「ＦＲＥＴ」とは、蛍光共鳴エネルギー転移のことをいう。このように、ポリメラーゼは、消光分子または蛍光供与体分子として働き得る（しかしながら、ポリメラーゼは、本システムにおいてそのようなものとしては認識されていない）。このような蛍光の変化は、所与の温度および／または波長における蛍光の上昇または低下であり得る。ＦＲＥＴ効果を「評価する」ことは、本方法の全てまたは一部において、蛍光を試験することにも及ぶ。
【０１２３】
本明細書における「偽陽性消光」とは、消光分子の存在によって生じるものではない、蛍光物質の蛍光の変化（低下）のことである。このように、ポリメラーゼは、消光分子として働き得る（しかしながら、ポリメラーゼは、本システムにおいて消光分子としては認識されていない）。
【０１２４】
Ｔｍの誤った読み取りを回避する方法は、両方の鎖の長さが６０ヌクレオチド未満である、好ましくは、その長さが５０ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、または２５ヌクレオチド未満であり、例えば、１０〜２０ヌクレオチドである、二本鎖分子に特に有効である。好ましくは、本方法は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下において接触させることによって、二本鎖ポリヌクレオチドを形成させるステップをさらに含み、好ましくは、ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去するステップ、またはｄＮＴＰもしくはｄｄＮＴＰを脱リン酸化、除去、もしくは競合させるステップが、二本鎖ポリヌクレオチドの生成前、生成中、および／または生成後に、上述した方法にしたがって行われる。好都合なことには、この目的で用いられる試薬は、二本鎖分子が生成する間、存在していてもよく、例えば、プロテイナーゼまたは洗浄剤を、二本鎖分子を生成させるのと同時に添加してもよい。好ましくは、ｄｄＮＴＰも用いられる方法において、洗浄剤またはプロテイナーゼは、二本鎖分子の形成前に添加されて、誤ったｄｄＮＴＰの取り込みも防止する。特に、プロテイナーゼの場合は、ポリメラーゼに対するプロテイナーゼの作用が遅いことを考慮して、好ましくは二本鎖分子生成のいくらか前に添加される。洗浄剤が用いられる場合は、その作用の速さを考慮して、例えば二本鎖分子の形成中など、より後の段階で添加されてもよい。上述した目的に適した１つ以上の試薬を、本方法において用いてもよい。
【０１２５】
本方法において、ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰが用いられる場合、ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰ、およびポリヌクレオチドは、上述したように標識化されてもよい。しかしながら、ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰが用いられない場合は、第１のポリヌクレオチドが、上述したような第１の標識で標識化され、場合によっては、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドが、上述したような第２の標識で標識化される。疑似ＦＲＥＴ効果（例えば、偽陽性消光）は、蛍光物質のみが存在する場合であっても観察され、したがって、本方法において、第１の標識のみが存在していてもよい。上述したように、特に、蛍光物質は、ＨＥＸまたはＦＡＭであってもよい。
【０１２６】
この方法は、融解曲線分析が行われるあらゆる方法に有用である。したがって、例えば、蛍光物質（または消光剤）で標識化された標的分子の存在を、試験分子への結合を示す蛍光の消光の有無（または蛍光物質の蛍光を消光したかどうか）に基づいて同定または定量化する方法において、上記方法は、存在し得るポリメラーゼが存在するために結果が疑似ＦＲＥＴを示す（例えば、結果が偽陽性消光を示す）ことを回避する。本発明のこれらの方法が適用され得る、蛍光検出消光は、例えば、分子ビーコン、スコーピオンプローブ（試験プローブが、消光剤および蛍光物質の両方で標識化されている）、またはタックマンプローブ、および、特に、一方が消光分子で標識化され、他方が蛍光物質で標識化されている、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが加熱中に解離し、蛍光の変化がモニターされる、上述した方法など、様々な方法に採用されている。このような方法において、ポリメラーゼの除去／不活性化／分解は、必要とされるその伸長性が本方法において完全なものになった場合にのみ、行われる。
【０１２７】
本方法は、また、Ｔｍ値が、定性的な測定または定量的な測定に重要である場合にも、有用である。多重化が意図され、異なる標的分子の同定を可能にするためにピーク分離が必要である場合に、特に、正しいＴｍ値が重要である。
【０１２８】
Ｔｍ値に対するポリメラーゼの効果は、その実施または結果に融解温度が関係する方法を設計または実施する場合に、考慮される場合もある。したがって、例えば、ある方法において、解離ステップおよび会合ステップ中にポリメラーゼが存在する場合は、その効果は考慮される必要がある。例えば、ＰＣＲ法においては、プロセス中に形成する二本鎖分子のＴｍが高くなる可能性を考慮して、それに応じて温度を選択するべきである。また、Ｔｍの効果を用いて、予想よりも高いＴｍ値が観察される結果が解釈されるべきである。
本発明によって、また、本方法を実施するのに適した分子、または特定の方法におけるポリメラーゼの影響の範囲を評価するのに適した分子の選択も可能になる。
【０１２９】
したがって、さらなる態様において、本発明は、場合によっては一本鎖領域を有する二本鎖ポリヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）および／またはＦＲＥＴ（好ましくは、消光）に対するポリメラーゼの効果を評価する方法を提供し、好ましくは、該方法は融解曲線分析法であり、
【０１３０】
該方法は、２つのサンプルに対して行われ、それぞれのサンプルについて、本方法は、該ポリメラーゼと、場合によってはｄｄＮＴＰおよび／またはｄＮＴＰと、互いにハイブリダイズして、該二本鎖ポリヌクレオチドである第３のポリヌクレオチドを形成する第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドと、を接触させるステップを含み、ＦＲＥＴ効果を評価する場合は、該第１のポリヌクレオチドは蛍光標識で標識化されており、
【０１３１】
該サンプルのうちの一方のみに対して行われる該方法は、該ポリメラーゼを不活性化、分解、もしくは除去した後に、Ｔｍおよび／もしくはＦＲＥＴ効果を評価するステップ、ならびに／または該方法において、ＦＲＥＴ効果を評価する場合であって、ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを用いる場合は、該ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを脱リン酸化もしくは除去するステップ、ならびに／または該ｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰを他のｄＮＴＰおよび／もしくはｄｄＮＴＰと競合させるステップ、
【０１３２】
前記２つのサンプルを融解温度分析および／もしくはＦＲＥＴ分析に供するステップ、ならびに
【０１３３】
融解温度および／もしくはＦＲＥＴ効果が、前記２つのサンプル間で異なっているかどうかを評価して、該二本鎖ポリヌクレオチドの融解温度および／もしくはＦＲＥＴに対する該ポリメラーゼの効果を決定するステップ、をさらに含み、
【０１３４】
好ましくは、該二本鎖ポリヌクレオチドおよび／または好ましくは前記ステップの実施は、前述した通りである。該方法で用いられるポリメラーゼ、ポリヌクレオチド、および他の要素は、本明細書で述べた通りである。
【０１３５】
本方法で用いられるポリメラーゼは、試験ポリメラーゼであり、例えば、そのＦＲＥＴ／Ｔｍ効果を評価するための、公知のポリメラーゼの変異体である。これは、例えば、変異によってＦＲＥＴ／Ｔｍ効果の変化がもたらされるのかを評価するために変異体を得たポリメラーゼなどの、公知のポリメラーゼと比較して評価されてもよい。あるいは、二本鎖ポリヌクレオチドは、そのＦＲＥＴ／Ｔｍがポリメラーゼの作用に影響を受けるのかを評価するための試験分子であってもよい。これは、ＦＲＥＴ／Ｔｍがその役割を果たす配列決定および他の方法で用いるための分子を設計するのに役立ち得る。場合によっては、本方法は、得られた結果を、コントロールポリメラーゼまたはコントロールポリヌクレオチドの結果と比較することを含む。
【０１３６】
用いられる２つのサンプルは、本質的には同一である（すなわち、本方法は、二連で行われる）が、サンプルのうちの一方のみが、疑似ＦＲＥＴ／誤ったＴｍの読み取りを除く働きをするステップに供される。
【０１３７】
Ｔｍ／ＦＲＥＴ効果は、本明細書で述べるようにＴｍ効果またはＦＲＥＴ効果を測定することによって、評価される。２つのサンプル間でＴｍの読み取りが異なる場合、または蛍光の有無またはそのレベルが異なる場合、異なる効果が観察される。
【０１３８】
本明細書で述べる方法を実施するためのキットも、本発明によって提供される。このようなキットは、以下の構成要素を１つ以上含み得る：第１の標識で標識化された少なくとも１つのｄｄＮＴＰ（ｄｄＮＴＰを２つ以上用いる場合、上述したように、また以下で述べるように、同じ標識が用いられてもよいし、好ましくは、異なる標識が用いられてもよい）；少なくとも１つの第１のポリヌクレオチド（または標識プローブ）；第２の標識で標識化された少なくとも１つの第２のポリヌクレオチド（またはレポータープローブ）（第２のポリヌクレオチドを２つ以上用いる場合、上述したように、また以下で述べるように、同じ標識が用いられてもよいし、好ましくは、異なる標識が用いられてもよい）；ポリメラーゼ；ポリメラーゼを不活性化するための手段（例えば、ＳＤＳなどの洗浄剤）；ポリメラーゼを分解するための手段（例えば、プロテイナーゼＫなどのプロテイナーゼ、またはＳＤＳなどの洗浄剤）；ポリメラーゼを除去するための手段（例えば、ポリメラーゼに特異的な抗体を用いる、またはビオチン結合標識プローブを用いる場合は、ストレプトアビジン結合磁気ビーズなどによって、標識プローブをポリメラーゼから分離する）；ｄｄＮＴＰを脱リン酸化するための手段（例えば、シュリンプアルカリホスファターゼまたは仔ウシ小腸ホスファターゼなどのホスファターゼ）；ｄｄＮＴＰを除去するための手段（例えば、有機抽出用の試薬を用いる、またはビオチン結合標識プローブを用いる場合は、ストレプトアビジン結合磁気ビーズなどによって、標識プローブをｄｄＮＴＰから分離する）；標識化ｄｄＮＴＰを競合させるための未標識のｄｄＮＴＰ；および、例えばｄＮＴＰおよび／または未標識のｄｄＮＴＰなどの、本方法で用いるのに有用な他の試薬。
【０１３９】
これらの要素は、上述したように定義され、上述した好ましい選択肢を有する。
【０１４０】
したがって、好ましい態様において、本発明は、キットを提供し、該キットは、
ａ）上述したような、第１の標識で標識化された少なくとも１つのｄｄＮＴＰと、
ｂ）上述したような、少なくとも１つの第１のポリヌクレオチド（または標識プローブ）と、
ｃ）上述したような、第２の標識で標識化された少なくとも１つの第２のポリヌクレオチド（またはレポータープローブ）と、
ｄ）ポリメラーゼと、さらに、
（ｉ）前記ポリメラーゼを不活性化するための手段（例えば、ＳＤＳなどの洗浄剤）、
（ｉｉ）前記ポリメラーゼを分解するための手段（例えば、プロテイナーゼＫなどのプロテイナーゼ、またはＳＤＳなどの洗浄剤）、
（ｉｉｉ）前記ポリメラーゼを除去するための手段（例えば、ポリメラーゼに特異的な抗体を用いる、またはビオチン結合標識プローブを用いる場合は、ストレプトアビジン結合磁気ビーズなどによって、標識プローブをポリメラーゼから分離する）
（ｉｖ）前記ｄｄＮＴＰを脱リン酸化するための手段（例えば、シュリンプアルカリホスファターゼまたは仔ウシ小腸ホスファターゼなどのホスファターゼ）
（ｖ）前記ｄｄＮＴＰを除去するための手段（例えば、有機抽出用の試薬を用いる、またはビオチン結合標識プローブを用いる場合は、ストレプトアビジン結合磁気ビーズなどによって、標識プローブをｄｄＮＴＰから分離する）、および
（ｖｉ）前記標識化ｄｄＮＴＰを競合させるための未標識のｄｄＮＴＰ
のうちの少なくとも１つと、を含み、
前記第１の標識または第２の標識は、互いに近接していると、他方の標識によるシグナルに影響を及ぼす。
【０１４１】
本キットで用いられる第１のポリヌクレオチドまたは標識プローブは、標的ヌクレオチド配列に結合することができる。この標的配列、またそれに応じた標識プローブは、本キットの意図する有用性に基づいて選択され得る。本実施形態の目的のために、標識プローブは、標的配列が存在し得るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。
【０１４２】
場合によっては、本キットは、例えば、比較用の、健常な生体および／もしくは病気である生体に由来するｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、または基準となる試験ポリヌクレオチドなどの標準化物質、増幅用プライマー、ならびに／あるいは、適切な酵素、緩衝液、および溶液を含んでいてもよい。場合によっては、本キットは、本発明の方法をどのように行うべきかが記載され、場合によっては本発明が実施された際に得られる結果を解釈するための標準グラフ、データ、またはソフトウェアを提供する、添付文書を含んでいてもよい。
【０１４３】
このようなキットを用いて、試験ポリヌクレオチド中の標的ヌクレオチド配列を同定することは、上述したように、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１４４】
以下、実例として、本発明を実施する方法をより詳細に説明する。本発明は、このような方法に限定されるものではないが、ここで述べる好ましい態様は、本明細書における全ての方法に適用可能な好ましい態様である。
【０１４５】
試験ポリヌクレオチド中の標的ヌクレオチド配列の同定は、試験ポリヌクレオチド中の複数の標的ヌクレオチド配列の同定を含む。単一の方法において複数の標的を同定できる能力のことを、本明細書では「多重化」と称する。したがって、本方法によって多重化が可能となり、単一の方法において２つ以上の標的ヌクレオチド配列（例えば、２つ、４つ、８つ、または１６個を越える配列）が同定され得る。これは、識別し得るシグナルを有する異なる標識を用いることによって、達成され得る。したがって、例えば、標識が、蛍光シグナルに基づいて検出される場合、異なる波長で蛍光発光し、それによって識別され得る、異なる蛍光標識が選択され得る。
【０１４６】
検出される異なる標的ヌクレオチド配列は、単一の試験分子および／または複数の別個の試験分子に存在していてもよい。標的ヌクレオチド配列が同じ試験分子に存在する場合、その配列は、試験分子中の同じ箇所に存在していてもよいし、異なる箇所に存在していてもよい。同じ箇所に存在している場合、本方法を用いて、例えば、ＳＮＰアリルを検出するなど、考えられる多くの配列のうちのどれがその箇所に存在しているかを同定する（この場合、異なる標識で標識化されたｄｄＮＴＰが用いられ得る）。標的配列が同じ箇所に存在しない場合、例えば複数のＳＮＰなどの異なる標的配列が、単一の方法において検出され得る。
【０１４７】
したがって、好ましい態様において、本方法は、２つ以上の標識（これらは、識別し得るシグナルを有する）を用いることによって、多重化される。これらの異なる標識は、ｄｄＮＴＰおよび／または標識化ポリヌクレオチド（例えば、レポータープローブ）上に存在してもよい。一対の標識が用いられ、これらが近接していると、一方の標識のシグナルが他方に影響を及ぼす場合、多重化のために、得られるシグナルが区別できるように、複数の標識対を選択する。例えば、蛍光物質および消光剤が用いられる場合、それぞれの対による消光されたシグナルおよび消光されないシグナルは、他の標識対によるシグナルと区別可能であるべきである。標識対の１つの標識は、他の標識対と共通であってもよい。したがって、例えば、２つの区別可能な蛍光物質の発光を消光することができ、得られた消光シグナルを識別可能であれば、共通する消光剤を用いてもよい。
【０１４８】
したがって、本発明の好ましい態様において、好ましくは、少なくとも２つの標識化されたｄｄＮＴＰを用い、好ましくは、異なるｄｄＮＴＰ上の第１の標識は異なっている。さらに好ましい実施形態は、少なくとも２つのレポータープローブ（および／または少なくとも２つの標識プローブ）の使用を含み、好ましくは、異なるレポータープローブ上の第２の標識は異なっている。特に、複数の標識対が用いられてもよく、それぞれの標識対は、ｄｄＮＴＰ上の第１の標識と、レポータープローブ上の第２の標識とを含み、それぞれの標識対は、他の標識対とは異なっており、好ましくは、それぞれの対は、他の標識対に見出される第１の標識および第２の標識とは異なる第１の標識および第２の標識を含む。
検出方法によって、本方法を多重化する他の手段が可能になり得る。したがって、得られた二本鎖分子は、それらが標識化されている標識に基づくだけでなく、二本鎖分子の形態に基づいても、識別され得る。この形態は、配列、長さ、または二本鎖分子の区別可能な他の特徴に関連していてもよい。異なる配列を用いて、（例えば、親和性に基づく方法における）パートナーに対する結合能などについて、異なる特性を与えてもよいし、より大きいまたはより小さい親和性によって、二本鎖分子の２本の鎖を結合させてもよい。例えば、検出方法が、融解温度分析を介するものである場合、本方法で用いられる二本鎖分子は、融解温度が異なるように、選択されてもよい。この場合、標識プローブおよびレポータープローブが、二本鎖分子を形成する。これらは、適切に選択されて、例えば、その長さまたは配列に応じて、特定の融解温度（Ｔｍ）を示してもよい。例えば、Ｔｍは、より長い配列の選択、より高いＧＣ含量、および／または配列間の高い相補性（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％）によって、上昇し得る。Ｔｍは、より短い配列の使用、より低いＧＣ含量、および／または１００％未満の相補性（例えば、９５％未満、９０％未満、または８０％未満）によって、低下し得る。
【０１４９】
異なるＴｍ値は、用いられるレポータープローブおよび／または標識プローブの特性を変化させることによって得られ得る。したがって、一例において、レポータープローブおよび標識プローブの対は、各試験配列を検出するのに用いられ得、各対が、本方法において用いられる他のどのプローブ対とも異なっており、他のプローブ対によって形成される他のどの複合体からも（例えばその融解温度に関して）識別され得る複合体（二本鎖ポリヌクレオチド）を生じる。しかしながら、レポータープローブ（または標識プローブ）は１つのみだが、他のプローブは様々な形態のものを提供することによって、それぞれの特性（例えば、融解温度）が異なる様々な複合体を形成することも可能である。このような方法において、複合体は、その標識、および、例えば融解温度などのハイブリダイゼーション特性によって区別される。
【０１５０】
したがって、好ましい態様において、少なくとも２つのレポータープローブおよび／または少なくとも２つの標識プローブが用いられ、レポータープローブおよび標識プローブが互いにハイブリダイズすると、融解温度が異なる少なくとも２つの二本鎖ポリヌクレオチドが生じる。好ましい態様において、レポータープローブおよび標識プローブの複数の対が提供され、各プローブ対は、他のプローブ対とは異なっており、好ましくは、各対のレポータープローブの標識は、他のどのプローブ対のレポータープローブの標識とも異なっている。
【０１５１】
配列は、融解曲線分析において区別することができるＴｍを示すように選択され、例えば、Ｔｍの差は、0．1〜４０℃であり、好ましくは、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、または少なくとも１０℃である。
【０１５２】
好ましい態様において、多重化の方法は、組み合わされる。したがって、例えば、融解曲線分析の場合、２つ以上の異なる第１の標識および第２の標識の対が用いられ、２つ以上の異なる融解温度が用いられる。２つの異なる第１の標識および第２の標識の対、および２つの異なる融解温度を用いることによって、４つの異なる配列を検出することが可能になる（すなわち、各融解温度において、標識対を両方用いる場合）。３つの異なる標識対および３つの異なる融解温度などを用いることによって、９つの異なる配列の多重化を容易に達成することができる。
【０１５３】
したがって、本発明の方法において、好都合なことには、第１の標識で標識化された２つ以上のｄｄＮＴＰが提供される（好ましくは、各ｄｄＮＴＰの第１の標識は異なっている）。よって、例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ（またはｄｄＵＴＰ）、およびｄｄＣＴＰのそれぞれは、異なる第１の標識で標識化されている。そして、レポータープローブ（または、第２のポリヌクレオチド）は、４つの異なる第２の標識で標識化されていてもよい（上述したように、標識によるシグナルが、異なる対の間で識別され得る場合は、共通の標識がいくつか用いられてもよい）。複数の未標識の標識プローブ（または第１のポリヌクレオチド）が、異なる標的ヌクレオチド配列に向けて提供され得、レポータープローブ（または、第２のポリヌクレオチド）に結合すると、識別され得る。これは、未標識の標識プローブ（または、第１のポリヌクレオチド）および／またはレポータープローブ（または、第２のポリヌクレオチド）の配列および／または長さを適切に選択することによって、達成され得る。
【０１５４】
配列検出法を行う際には、まず、試験ポリヌクレオチドを単離し、配列決定のために調製すべきである。多重化が行われる場合は、２種以上の試験ポリヌクレオチドが用いられてもよい。場合によっては、サンプルから得たポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡ）を上述したように増幅して、本方法で用いるのに適した標的配列を含むアンプリコンを提供してもよい。プライマーを適切に選択することによって、標的配列を含むアンプリコンが提供され得る。複数の試験ポリヌクレオチドおよび／または複数の標的配列が用いられる場合、複数のプライマーが用いられる。フォワードプライマーおよびリバースプライマーが用いられ得る。好都合なことには、アンプリコンは、長さが５０〜５０００ヌクレオチドであり、例えば、長さが５０〜１５００ヌクレオチドや１００〜５００ヌクレオチドである。
【０１５５】
ＰＣＲ後、一本鎖ポリヌクレオチドは分解するが二本鎖伸長産物は分解しないヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）、およびホスファターゼ（例えば、上述したようなホスファターゼ）を添加して、反応に用いられたＰＣＲプライマーおよびｄＮＴＰを分解してもよい。これらの酵素は、その後、次のステップに進む前に、例えば８５℃で処理するなど、不活性化処理を行う必要がある。
【０１５６】
標識化ｄｄＮＴＰおよび未標識の標識プローブ（または、第１のポリヌクレオチド）を、標的配列が存在する場合にｄｄＮＴＰの取り込みを可能にする条件下において、試験ポリヌクレオチドおよびポリメラーゼと接触させる。上記したように、これらの成分は、一緒に添加されてもよいし、異なる時間に添加されてもよいし、様々な組み合わせで添加されてもよい。多重化が行われる場合、様々なｄｄＮＴＰおよび／または未標識の標識プローブも、一緒に添加されてもよいし、順次添加されてもよいし、様々な組み合わせで添加されてもよい。その条件によって、標的配列が存在する場合に、標的配列への未標識の標識プローブ（または、第１のポリヌクレオチド）の結合が可能になり、また、ポリメラーゼによる鎖伸長が可能になる。
【０１５７】
本方法は、ｄＮＴＰなどの他の分子の存在下において行われてもよい。１つ以上のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ）が用いられ得る。この種の方法において、鎖伸長は、さらなる伸長を阻害する関連ｄｄＮＴＰが取り込まれるまで続く。このような方法において、目的のｄｄＮＴＰおよび他のｄＮＴＰを添加して、考えられる全てのヌクレオチド（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）に対する相補塩基を提供してもよい。例えば、標識化ｄｄＮＴＰ以外のｄｄＮＴＰとして、未標識のｄｄＮＴＰが用いられてもよい。これによって、相補性がない場合に、標識化ｄｄＮＴＰが誤って取り込まれることが防止される。これは、さらなるミスマッチが許容されにくくなるように、標的配列に対していくつかの不連続なミスマッチを有する標識プローブを用いることによっても、達成することができる。これらの機構は、本方法の特異性の助けとなる。
【０１５８】
好都合なことには、ｄｄＮＴＰの標識化を複数サイクル行って、達成される標識化を最大化してもよい（すなわち、感度を向上させてもよい）。例えば、第１回目の標識化を行った後、反応物を加熱して一本鎖分子を得、その後、ハイブリダイゼーションが可能になるように冷却して、標識化ステップを繰り返してもよい。好都合なことには、１〜５０サイクルが用いられ、例えば、１〜２０サイクルや５〜２０サイクルが用いられる。
【０１５９】
本方法をどのように行うかにもよるが、いったん共有結合が形成されると、特に、結合しなかった塩基および／または他のポリヌクレオチドが、シグナルが検出される標識で標識化されている場合は、複合体を洗浄して、結合しなかった塩基および／または他のポリヌクレオチドを除去してもよく、そうでなければ、バックグラウンドの読み取りが高くなってしまう。これは、例えば、標識プローブ（または、第１のポリヌクレオチド）が、対の他方が固体の支持体上にある結合対の結合パートナーなど、アフィニティ結合に用いられ得る成分で標識化されている場合に、達成され得る。しかしながら、好都合なことには、本方法によって、完全な方法が行われることが可能になり、続く方法のステップを、前のステップの試薬の存在下で実行することが可能になる。好ましい態様において、本方法は、関係する分子を固体の支持体に結合する必要なく、溶液中で行われる。
【０１６０】
このステップの後に、標識プローブ（または、第１のポリヌクレオチド）（未標識であってもよいし、標識化ｄｄＮＴＰの取り込みによる標識化がされていなくてもよい）を、試験ポリヌクレオチドから分離する。好都合なことには、これは、複合体を加熱して解離させることによって達成される。
【０１６１】
その後、結果として得られた一本鎖分子を、レポータープローブ（第２のポリヌクレオチド）への標識プローブ（第１のポリヌクレオチド）のハイブリダイゼーションを可能にする条件下において、第２の標識で標識化されたレポータープローブ（第２のポリヌクレオチド）と接触させる。多重化の方法が用いられる場合、異なるレポータープローブ（または、第２のポリヌクレオチド）は、一緒に添加されてもよいし、別々に添加されてもよいし、様々な組み合わせで添加されてもよい。結果として得られた二本鎖分子は、上述したように、平滑末端、３’突出末端、または５’突出末端から選択される末端を有する。
【０１６２】
ｄｄＮＴＰ標識の不適切な取り込みを回避するために、上述したような、ポリメラーゼ／ｄｄＮＴＰの除去／不活性化／分解／競合処理、一本鎖部分の伸長処理が、行われる。この処理は、ｄｄＮＴＰを取り込む鎖伸長反応が始まるとすぐ（またはそのプロセス中に）、行われてもよい。したがって、この処理は、ｄｄＮＴＰを取り込むポリメラーゼ反応と同時に開始されてもよいし（ポリメラーゼがすぐに不活性化されない場合）、この反応中に開始されてもよいし、標識プローブ（第１のポリヌクレオチド）を標識化するステップのすぐ後に行われてもよいし、かつ／または、標識プローブおよびレポータープローブ（第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド）に関わるハイブリダイゼーションステップの途中および／もしくはその後に実施されてもよい。好ましくは、この処理は、ｄｄＮＴＰを取り込むポリメラーゼ反応の後、ハイブリダイゼーションステップ／レポータープローブ（または、第２のポリヌクレオチド）の添加前に行われる。
【０１６３】
この処理／二本鎖ポリヌクレオチドの調製に続いて、分析を行って、レポータープローブ（第２のポリヌクレオチド）が標識化標識プローブ（第１のポリヌクレオチド）に結合しているかどうかを決定する。標識のシグナルは、本方法を行っている間、様々な時点において検出され得る。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが、互いに結合しているかどうかを示すコントロールシグナルレベルと、測定値とを比較することができるのであれば（例えば、定量的な測定が行われる場合）、場合によっては、１回の測定のみが必要である場合がある。測定は、二本鎖分子の調製前、調製中、および／または調製後に行われ（それによって、二本鎖分子が形成される際のシグナルの違いが評価され）てもよい。あるいは、または、さらに、測定は、二本鎖分子の解離前、解離中、および／または解離後に行われてもよい。
【０１６４】
好都合なことには、上述したように、これは、融解曲線分析を用いたものであってもよい。その場合、温度を上昇させて二本鎖分子を融解させるプロトコールを行う間、シグナルは、連続的または周期的に検出される。
【０１６５】
融解曲線分析が行われる方法において、必要に応じて、ハイブリダイゼーションが可能になるように冷却し、解離を可能にするように温度上昇を繰り返すことによって、融解曲線分析が繰り返されてもよい。好ましくは、処理（ポリメラーゼなどを除去するためのもの）は、二本鎖分子の調製前、調製中、および／または調製直後に行われるが、一態様においては、処理は、例えば、第１の融解曲線分析後、第２の融解曲線分析前など、第１の融解曲線分析の後にのみ行われてもよい。これは、第２の分析前に除去され得る、ポリメラーゼ依存的疑似ＦＲＥＴ効果（あるいは、ｄｄＮＴＰの非共有結合）を同定するのにいくらかの長所を有しており、ｄｄＮＴＰの共有結合とは対照的に、その疑似ＦＲＥＴ効果（あるいは、非共有結合）の定性的および定量的な同定を可能にする。コントロール反応は、上記処理の有無にかかわらず（例えば、プロテアーゼの有無にかかわらず）上述した方法を行い、かつ／または誤ったｄｄＮＴＰの結合および／もしくは疑似ＦＲＥＴ効果の程度を（定性的および定量的に）評価する内部標準を用いることによっても行われ得る。例えば、融解曲線分析が２回行われ（実施例参照）、消光が第１の融解曲線では観察されたが、ポリメラーゼの除去／不活性化／分解後に行われる第２の融解曲線では観察されなかった場合、第１の融解曲線において観察された消光は、ポリメラーゼ依存的疑似ＦＲＥＴ効果（あるいは、いくつかのｄｄＮＴＰ非共有結合）に起因すると考えられ得る。
【０１６６】
融解曲線分析法において多重化が行われる場合、考えられる複合体のうちいずれかの最も低いＴｍより少なくとも５℃低い温度から、考えられる複合体のうちいずれかの最も高いＴｍより少なくとも５℃高い温度まで、温度が上昇するにつれて、シグナル（例えば、蛍光）の変化をモニターする。標識の組み合わせとして蛍光物質：消光剤を用い、両方の標識が同じ複合体に付加されて、消光剤が蛍光物質のシグナルに影響を及ぼす場合、融解中、鎖が融解して解離するにつれて、蛍光シグナルは変化（上昇）する。このシグナル（例えば、蛍光）の変化が、例えば上述したように、モニターされ得る。多重化が用いられる場合、２つ以上の波長における蛍光がモニターされ得る。好都合なことには、得られた結果は、温度に対する蛍光変化の導関数（すなわち、蛍光導関数（−ｄＦ／ｄＴ））として表され、Ｔｍをピークとして同定することができる。
【０１６７】
試験ポリヌクレオチドを、異なる標識プローブおよびレポーター分子を用いる方法のさらなる繰り返しに用いることによって、試験ポリヌクレオチド中の２つ以上の標的配列が同定されるように、上記の方法を必要に応じて繰り返してもよい。
【０１６８】
好都合なことには、本方法は、試験ポリヌクレオチド中の標的配列を同定するのに用いられ得る。本方法を用いて、標的配列中の１つ以上の未知のヌクレオチドが同定され得る。これは、例えば、それぞれが異なる隣接配列の方を向く複数の標識プローブ（第１のポリヌクレオチド）（これらは、上述した多重化法を用いることによって識別され得る）を用いることによって、達成され得、標識プローブは、例えば、その末端が、３’末端において１ヌクレオチド違いで結合する。あるいは（または、さらに）、考えられる異なる配列に特異的な（しかし、標的配列の同じ箇所に結合する）標識プローブが用いられてもよく、そのシグナルは、特異的なＴｍおよび／または標識のシグナルに基づいて同定される。したがって、例えば、ＸＸＸＸＡ、ＸＸＸＸＴ、ＸＸＸＸＣ、ＸＸＸＸＧなど、３’末端のヌクレオチドが異なる標識プローブ一式が用いられてもよい。その後、これらのプローブを伸長反応に用い、ｄｄＮＴＰの結合によって、次のヌクレオチドが何であるかを決定する。これらの標識プローブを区別することができる場合（標識プローブが結合するレポータープローブ上の標識、または形成される複合体のＴｍのいずれかによる）、２つのヌクレオチドの配列を、本方法を行っている間に決定してもよい。したがって、上述した多重化法を用いる本方法において、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のヌクレオチドが配列決定／同定される。
【０１６９】
配列変位が考えられるが、これによってプローブの結合が阻害されない場合は、適宜、１つ以上のヌクレオチドが縮重している標識プローブのセットを用いてもよい。
【０１７０】
好都合なことには、本方法を用いてＳＮＰが検出される。したがって、好ましい態様において、標的ヌクレオチド配列はＳＮＰである。さらに好ましい態様において、少なくとも２つの標的ヌクレオチド配列が、好ましくは少なくとも２つのＳＮＰ（例えば、少なくとも４つ、６つ、８つ、または１６個のＳＮＰ）が、本方法において検出される。
【０１７１】
この場合、好都合なことには、多重化が行われて、１回のアッセイで複数のＳＮＰの評価が可能になり、かつ／またはＳＮＰのホモ接合性が評価される。後者の場合、例えば、問題のヌクレオチドは、アデニン塩基またはグアニン塩基を有し得る。鎖伸長反応においては、標識プローブが用いられ、またそれぞれが異なる標識で標識化された少なくとも２つのｄｄＮＴＰ（ｄｄＵＴＰおよびｄｄＣＴＰ）が用いられる。そして、ｄｄＵＴＰまたはｄｄＣＴＰの結合が、二本鎖分子が生じた際のシグナルに基づいて評価される。ｄｄＵＴＰおよびｄｄＣＴＰの両方が結合したことが見出された場合は、遺伝子型は、Ａ／Ｇについてヘテロ接合であり、ｄｄＵＴＰまたはｄｄＣＴＰのうちの一方のみが結合している場合は、ホモ接合のＡＡまたはＧＧが同定され得る。
【０１７２】
例えば、診断や、感染または汚染生物もしくは病原体の検出、臨床モニタリング、法医学、ならびに食品および環境の安全性およびモニタリングなどの、核酸の検出が必要とされる方法において、異なる細胞種を区別するために、また例えば組織適合試験などにおける多型の変異を検出、分析するために、かつ一般的な分子生物学のツールとして、本発明の方法が用いられ得る。
【０１７３】
本方法は、１つ以上のＳＮＰが素早くかつ効率的に検出される方法に、特に適用される。ＳＮＰ分析は、生殖パラメータに関するマーカーとして、また、生物サンプルおよび環境サンプル中の微生物を検出、分類、および定量化するために、ヒト、動物、および植物における疾患に対する遺伝的素因の検査などの、一連の診断に適用される。好都合なことには、本方法は、診断方法または遺伝子型解析方法に用いられ得る。例えば、本方法を用いて、重要な遺伝マーカーが同定され得、例えば、罹患しやすさまたは罹患の危険性が同定され得る。例えば、サケの生殖に関わる遺伝マーカーが評価され得る。現在、非常に多くの個人（１年あたり＞１００，０００）において、比較的少数（＜１００）のＳＮＰに関する生殖関連のプレスクリーニングを行う必要性を、効率的かつ安価に満たす技術は存在しない。本発明の方法を用いて個人のＳＮＰを同定し、血統、および重要な生殖形質（例えば、ＩＰＮ抵抗性）の存在が決定され得る。
【０１７４】
ヘテロ接合状態が、上述したように評価されてもよい。本方法を診断的に用い、例えば、微生物マーカーを検査することによって、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を診断してもよい。６０個までのＳＮＰが、同時に評価され得る。
【０１７５】
したがって、好ましい態様において、本方法を用いてＳＮＰが検出され得、特に、２種以上の微生物が原因となっているＩＢＳを、その微生物のＳＮＰマーカーを同定することによって診断するのに、本方法が用いられ得る。よって、さらに好ましい態様において、本方法は、上述した方法を含む、過敏性腸症候群を診断する方法を提供し、好ましくは、少なくとも２つのＳＮＰが、該方法において検出される。
【０１７６】
本方法は、遺伝子型解析にも用いられ得る。したがって、さらに好ましい態様において、本発明は、上述した方法を含む、生物の遺伝子型を解析する方法を提供し、好ましくは、少なくとも２つのＳＮＰが、該方法において検出される。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、本発明の好ましい方法の概略を示すものであり、本方法を用いて、（増幅後）試験ポリヌクレオチド中の２つのＳＮＰの存在が同定される（図１Ｂ参照）か、またはＳＮＰアリルが同定される（図１Ｃ参照）。実施例で述べる方法は、本発明のさらに好ましい態様を形成する。  上述した好ましい特徴の全ての組み合わせが、特に実施例で述べるように、検討される。ここで、図面を参照し、限定されない実施例を用いて、本発明を説明する。図面は以下の通りである。  図１は、ＳＮＰ型決定のための液体アレイ診断（ＬＡＤ）技術の概略を示す。（Ａ）は、ＬＡＤの主要なステップを示す。（Ｂ）は、ＳＮＰ型決定にＬＡＤを適用することによる、微生物種の同定／定量を示す。（Ｃ）は、非半数体種のＳＮＰ型決定におけるＬＡＤの適用を示す。
【図２】図２は、非鋳型性ポリメラーゼ依存的消光の証拠を示す。相補的なＲＰ ２＿１＿ｉｎ１ｂＦＡＭＲｅｖＣｏｍｐが、ｄｄＣＴＰTAMRAおよびＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌの存在下において、未標識の標識プローブによって消光される。
【図３】図３は、クロロホルム抽出によるｄｄＣＴＰTAMRAおよび／またはＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌの除去によって、非鋳型依存的偽陽性消光現象が低減されることを示す。図２に示す同じ「＋ポリメラーゼ」サンプルを再度解離させ、次いでクロロホルム抽出を行った。なお、見かけのＴｍは、消光応答中にシフトする。
【図４】図４は、プロテイナーゼＫによっても、偽陽性消光が低減されることを示す。ＲＰ ２＿１＿ｉｎ１ｂＦＡＭＲｅｖＣｏｍｐの消光は、未標識の相補的なＬＰ ２＿１ ＬＰ存在下、ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ存在下、プロテイナーゼＫ非存在下において起こる。
【図５】図５は、プロテイナーゼＫ処理を取り込んだＬＡＤ技術を示し、用量依存的な、鋳型に基づく消光応答の証拠を示す。
【図６】及び
【図６ｃｏｎｔ．】図６は、ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌの末端転移酵素様活性を示す。（Ａ）〜（Ｃ）は、ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌおよびｄｄＣＴＰTAMRA存在下、プロテイナーゼＫ存在下（薄い曲線）または非存在下（濃い曲線）において、３つのＬＰ−ＲＰ二本鎖を組み合わせたものである。（Ｄ）〜（Ｆ）は、Ａ〜ＣのプロテイナーゼＫ未処理サンプルをプロテイナーゼＫで処理し、全てのサンプルを第２の解離処理に供したものである。ＡおよびＤは、一方に平滑末端、他方に突出した５’ＦＡＭ−Ｇを形成するＦａｅｃａｌｉ ＬＰ／Ｆａｅｃａｌｉ ＲｅｖＣｏｍｐ ＋１ ＦＡＭの二本鎖であり、ＢおよびＥは、両末端が平滑化されている２＿１ ＬＰ／２＿１＿ｉｎ１ｂＦＡＭＲｅｖＣｏｍｐの二本鎖であり、ＣおよびＦは、両末端が平滑化されているＦａｅｃａｌｉ ＬＰ／Ｆａｅｃａｌｉ ＲｅｖＣｏｍｐ ＦＡＭの二本鎖である。
【図７】図７は、疑似ＦＲＥＴ効果が、活性ポリメラーゼのみに依存し、ｄｄＮＴＰ消光剤を必要としないということを示す。全て鋳型を欠き、＋／−ＬＰ、＋／−ｄｄＵＴＰ−ＡＴＴＯ５４０Ｑの全ての組み合わせを含むモック（Mock）標識化反応では、まず、９５℃で１０分間インキュベーションを行って、ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼを活性化した。次に、各反応液を２分割し、一方の組には、プロテイナーゼＫ（１×バッファーＣ中）を、終濃度が５８μｇ／ｍＬとなるように添加し、他方の組には、同体積の１×バッファーＣを添加した。両方のサンプルの組を５６℃で３０分間インキュベートした後、３０℃〜９５℃で融解曲線を作成した。（Ａ）は、ＦＡＭ標識化ＲＰ Ｃ３１３Ｙ ＲＰ （Ｕ）ＦＡＭが、相補的なＬＰであるＣ３１３Ｙ ＬＰ （Ｃ＿Ｕ）を含むサンプルにおいて、ｄｄＮＴＰ−Ｑの有無にかかわらず、消光応答を示したことを示すが、サンプルは全てプロテイナーゼＫ未処理であり、ポリメラーゼは活性なままである。（Ｂ）は、ＨＥＸ標識化ＲＰ ｎｔ８２１ ＲＰ （Ｕ）ＨＥＸおよびこれに相補的なＬＰであるｎｔ８２１ （ｄｅｌ１１） ＬＰ （Ｕ）に対する異なる蛍光チャンネルにおいて、同様の結果が観察されたことを示す。
【図８】図８は、ＳＤＳ処理が、Ｔｍシフトを低減する点で、プロテイナーゼＫと同様に効果的であることを示す。（Ａ）では、まず、ＬＰ ｎｔ８２１ （ｄｅｌ１１） ＬＰ （Ｕ）を、鋳型存在下においてｄｄＵＴＰ−ＡＴＴＯ５４０Ｑで標識化し、続いて、プロテイナーゼＫ（１×バッファーＣ中５８μｇ／ｍＬ）、ＳＤＳ（１×バッファーＣ中０．１％）、ＢＳＡ（１×バッファーＣ中５８μｇ／ｍＬ）存在下において５６℃でインキュベートした後、または処理せずに（１×バッファーＣ）、ＲＰ ｎｔ８２１ ＲＰ （Ｕ） ＨＥＸの添加および融解曲線の決定を行った。活性ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼをいまだ含んでいる未処理サンプルおよびＢＳＡ処理サンプルの両方が、プロテイナーゼＫ処理サンプルおよびＳＤＳ処理サンプルよりもＴｍが高い消光曲線を示す。（Ｂ）は、Ｑ２０４Ｘ ＬＰ （Ｃ＿Ｕ）／Ｑ２０４Ｘ ＲＰ２ （Ｃ） ＲＯＸのＬＰ／ＲＰ二本鎖について、同様の結果が観察されたを示す。
【図９】図９は、ＳＤＳ処理が、疑似ＦＲＥＴ効果を低減する点で、プロテイナーゼＫと同様に効果的であることを示す。（Ａ）では、鋳型を欠くが、ＬＰ ｎｔ８２１ （ｄｅｌ１１） ＬＰ （Ｕ）、ｄｄＵＴＰ−ＡＴＴＯ５４０Ｑを含むモック標識化反応を、５０μＬの容量で行った。続いて、１０μＬずつ４つ分取し、これをプロテイナーゼＫ（１×バッファーＣ中５８μｇ／ｍＬ）、ＳＤＳ（１×バッファーＣ中０．１％）、ＢＳＡ（１×バッファーＣ中５８μｇ／ｍＬ）存在下において５６℃でインキュベートした後、または、処理せずに（１×バッファーＣ）、ＲＰ ｎｔ８２１ ＲＰ （Ｕ） ＨＥＸの添加および融解曲線の決定を行った。ＢＳＡ処理サンプルおよび１×バッファーＣ処理サンプルは、温度依存的な消光（ＦＲＥＴ）効果を示したが、ＳＤＳ処理サンプルおよびプロテイナーゼＫ処理サンプルでは、両方ともそのような効果を示さなかった。（Ｂ）では、上記と同様の実験構成を採用したが、Ｅ２９１Ｘ ＬＰ （Ｃ）／Ｅ２９１Ｘ ＲＰ （Ｃ） ＣＹ５のＬＰ／ＲＰ二本鎖、およびｄｄＣＴＰ−ＡＴＴＯ６１２Ｑを用いた。ここで、未処理サンプルおよびＢＳＡ処理サンプルは、温度依存的な蛍光（ＦＲＥＴ）効果を示したが、ＳＤＳ処理サンプルおよびプロテイナーゼＫ処理サンプルはそのような効果を示さなかった。
【図１０】及び
【図１０ｃｏｎｔ．】図１０は、「通常の」Ｔａｑポリメラーゼであるｈｏｔ ＦＩＲＥＰｏｌも、ＬＰ−ＲＰ二本鎖を安定化し、Ｔｍシフトを引き起こすことを示す。標準的な反応条件である３７℃で６０分間、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ；ＮＥＢ社）を用いて、標識プローブをｄｄＮＴＰ消光剤で標識化し、その後、７５℃で３０分間、酵素を不活性化した。次いで、Ｈｏｔ ＦＩＲＥＰｏｌを各反応液に添加し、９５℃で１０分間活性化した後、対応するＲＰを０．１％ＳＤＳ（１×ＴｄＴバッファー）中または１×ＴｄＴバッファー（未処理）中のいずれかにおいて終濃度が０．１μＭとなるように添加した。全てのパネル（Ａ：ＬＰは、ｄｄＵＴＰ−ＡＴＴＯ５４０Ｑで標識化したＱ２０４Ｘ ＬＰ （Ｃ＿Ｕ）；ＲＰは、Ｑ２０４Ｘ ＲＰ （Ｕ） ＦＡＭ）（Ｂ：ＬＰは、ｄｄＵＴＰ−ＡＴＴＯ５４０Ｑで標識化したＥ２２６Ｘ ＬＰ （Ｕ）；ＲＰは、Ｅ２２６Ｘ ＲＰ （Ｕ） ＹＹ）（Ｃ：ＬＰは、ｄｄＣＴＰ−ＡＴＴＯ６１２Ｑで標識化したＱ２０４Ｘ ＬＰ （Ｃ＿Ｕ）；ＲＰは、Ｑ２０４Ｘ ＲＰ３ （Ｃ） ＲＯＸ）（Ｄ：ＬＰは、ｄｄＣＴＰ−ＡＴＴＯ６１２Ｑで標識化したＤ１８２Ｎ ＬＰ （Ｃ＿Ｕ）；ＲＰは、Ｄ１８２Ｎ ＲＰ （Ｃ） ＣＹ５）において、未処理サンプルは、ＳＤＳ処理したもの（不活性化ポリメラーゼ）よりも高い温度で消光応答を示した。
【図１１】及び
【図１１ｃｏｎｔ．】図１１は、活性ＤＮＡポリメラーゼも、ｄｓＤＮＡ介在型蛍光色素であるＥｖａＧｒｅｅｎによって検出されるように、未標識ＬＰ−ＲＰ二本鎖を安定化させることを示す。相補的なオリゴ二本鎖を、４０μＬ（１×バッファーＣ、５Ｕ ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ、１Ｘ ＥｖａＧｒｅｅｎ）中０．１μＭの濃度で結合させ、反応液をそれぞれ１０μＬずつ分取して３つに分けた。各組の３つのサンプルのうちの１つにプロテイナーゼＫもしくはＢＳＡを５８μｇ／ｍＬ（１×バッファーＣ中）の濃度で添加するか、または何も添加せず、５６℃で３０分間インキュベートした後、融解曲線を決定した。（Ａ）は、ＡＳＰ１６／ＳＰ６０の二本鎖の結果を、（Ｂ）は、ＡＳＰ２０／ＳＰ６０の二本鎖の結果を、（Ｃ）はＡＳＰ３０／ＳＰ６０の二本鎖の結果を、（Ｄ）は、ＡＳＰ６０／ＳＰ６０の二本鎖の結果を示す。全ての二本鎖について、ＢＳＡ処理サンプルおよび未処理サンプルは、プロテイナーゼＫによってポリメラーゼを不活性化したサンプルよりも、Ｔｍが見かけ上高いｄＦ／ｄＴ導関数曲線を示すが、Ｔｍシフト効果は、パネル（Ａ）およびパネル（Ｂ）における最も短い二本鎖において最も顕著であった。
【図１２】及び
【図１２ｃｏｎｔ．】図１２は、１チャンネルあたり融解温度が２つである４チャンネルを用いる八重化ＬＡＤアッセイによって、４つのウシ多型遺伝子座におけるヘテロ接合体を区別することに成功したことを示す。ウシのミオスタチン遺伝子（受託番号ＮＣ＿００７３００、２０１２年１月６日より）のヌクレオチド３７１〜４８０、２３２９〜２６８８および４７８７〜４９７６を表す３つの多重化アンプリコンが、３つのＳＮＰおよび１つのインデル多型についてのヘテロ接合体を表す配列から生成された。その後、Ｅｘｏ−ＳＡＰ処理したアンプリコンを、ｄｄＵＴＰ−ＡＴＴＯ５４０ＱおよびｄｄＣＴＰ−ＡＴＴＯ６１２Ｑの両方を含む、ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌに基づく多重化ＬＰ標識化反応で用いた。次いで、４つの異なる蛍光色素で標識化した対応する８つのＲＰを、０．１％ＳＤＳおよび１×バッファーＣ中０．１μＭの濃度になるまで添加した。（Ａ）は、ＦＡＭチャンネルにおける異なる融解温度での２つの消光シグナルを示し、（Ｂ）は、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（ＹＹ）チャンネルにおける対応する２つのシグナルを示し、ＲＯＸチャンネル（Ｃ）およびＣＹ５チャンネル（Ｄ）の両方でも同様であり、したがって、四重ヘテロ接合体の正しい遺伝子型が示される。鋳型のないネガティブコントロール（矢印なし）は、いずれのパネルにおいても、消光シグナルを示さない。
【実施例】
【０１７８】
実施例１
材料および方法
ＬＰ標識化のための鋳型生成
大腸菌またはフィーカリバクテリウム種由来の１６Ｓ ｒＤＮＡを含むプラスミドをポリメラーゼ連鎖反応に用いて、標識プローブ（ＬＰ）の標識化用の鋳型を生成した。手短に言うと、プラスミドクローンを含む細菌の溶解液１μＬを、以下の反応成分に添加した：１．２５Ｕ ＨＯＴ ＦＩＲＥＰｏｌ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、１×Ｂ２バッファー、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2（ここまで全てソリス・バイオダイン（Solis Biodyne）製、エストニア）、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、米国）、０．２μＭ ＨＵプライマーおよび０．２μＭ ＨＲプライマー（プライマー配列は表３を参照）、全量３０μＬ。アプライド・バイオシステムＶｅｒｉｔｉ（商標）サーマルサイクラー（ライフ・テクノロジー、米国）を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、この増幅は、９５℃で１２分間の初期活性化ステップを含み、その後、９５℃で３０秒間の変性、６５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分３０秒間の伸長を３０サイクル行い、さらに７２℃で７分間の最終伸長ステップを含むものであった。１×ＴＡＥバッファーおよび０．６μｇ／ｍＬ 臭化エチジウムを含む１％アガロースゲル上にて各反応液５μＬを電気泳動した後、ＵＶ照射によってＰＣＲ産物を可視化した。各反応液の残り２５μＬに、３ＵのエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ；バイオラボ（BioLabs Inc.）、イプスウイッチ、マサチューセッツ州、米国）および８Ｕのシュリンプアルカリホスファターゼ（ＵＳＢコーポレーション（USB Corporation）、クリーブランド、オハイオ州、米国）を添加した後、３７℃で９０分間インキュベートし、８０℃で１５分間インキュベートして氷上に置いた。
【０１７９】
標識プライマーの末端標識化
Ｅｘｏ−ＳＡＰ処理したＰＣＲ産物である鋳型の４μＬの希釈列（未希釈、１０-1、１０-2、１０-3および１０-4希釈）（または、鋳型を含まないコントロールとしてのＨ2Ｏ）を、全反応体積が２０μＬとなるように、１６μＬの標識化反応マスターミックス［５Ｕ ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、１×反応バッファーＣ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2（ここまで全てソリス・バイオダイン製）、０．４μＭ ｄｄＣＴＰTAMRA（ＴＡＭＲＡ標識化ジデオキシシチジン三リン酸；ジェナ・バイオサイエンス（Jena Bioscience）、ドイツ）およびＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない水に溶解させた０．１μＭ ＬＰ（表３）］に添加した。用いた熱サイクル条件は以下の通りである：９５℃で１０〜１２分間の初期活性化ステップを行い、その後、９６℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリングおよび伸長の組み合わせを１０サイクル行い、最後は１０℃で維持した。
【０１８０】
融解曲線分析
各ＬＰ標識化反応液に、５’蛍光標識化レポータープローブ（ＲＰ）を、プロテイナーゼＫ（終濃度は２５〜５０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下において、終濃度が０．０５〜０．１μＭとなるように添加した。反応液を、以下の温度プロファイルで、蛍光検出サーモサイクラー（ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ、アプライド・バイオシステム）にセットした：５６℃で３０分間、９５℃で１５秒間、４０℃で１５秒間、９５℃で１５秒間、および６０℃で１５秒間。これらの最後の４ステップは、蛍光が検出され、温度測定値に対する蛍光の導関数（ｄＦ／ｄＴ）として、解離曲線で表される、解離段階を含む。
【０１８１】
偽陽性消光を除去するための有機抽出
一実験において、クロロホルム抽出（１：１ｖ／ｖ）を、最初の解離の後、第２の解離（上述した通り）を行って抽出の効果を評価する前に、融解曲線反応液に対して行った。
【０１８２】
偽陽性消光を除去するためのプロテイナーゼＫ処理
まず、レポータープローブと同時に、終濃度が２５〜５０μｇ／ｍＬとなるように、プロテイナーゼＫを添加した後、解離分析を行った。その後、濃度を１００μｇ／ｍＬまで上げ、５６℃で３０分間、酵素による処理を進めた後、レポータープローブを添加した。さらに、その後、プロテイナーゼＫで処理していない、融解曲線分析に供するサンプルを酵素で処理した後、第２の解離を行った。
【０１８３】
ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼの末端転移酵素様活性の分析
ｄｄＣＴＰTAMRA存在下において、ＬＰ−ＲＰ二本鎖とＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼとの間の相互作用を試験する場合、反応液は、１×バッファーＣ中のポリメラーゼ、ｄｄＣＴＰTAMRA、およびＭｇＣｌ2と共に、上記の通り構成した。これらの反応液は、まず、９５℃で１０〜１２分間加熱されてポリメラーゼを活性化した後、ＬＰを添加し、反応液を二等分して、プロテイナーゼＫ（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を加えた後、５６℃で３０分間インキュベートした。その後、対応するＲＰを添加し、反応液をさらに二等分して、一方を上記の解離に、他方をキャピラリー電気泳動（下記参照）に供した。
【０１８４】
キャピラリー電気泳動
標識鋳型（Ｅｘｏ−ＳＡＰ処理したＰＣＲ産物）、相補的なオリゴヌクレオチド、またはプロテイナーゼＫ処理の有無を問わず、ｄｄＣＴＰTAMRAによる潜在的な共有結合性のＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌに基づくオリゴヌクレオチド（ＬＰおよび／またはＲＰ）の標識化を評価するために、まず、融解曲線反応液を仔ウシ小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して、取り込まれなかったｄｄＣＴＰTAMRAからリン酸基を除去した後、ＧＳＬＩＺ１２０サイズ標準の有無にかかわらず、ＤｙｅＳｅｔ Ｇ５を用いて、ＡＢＩ３１３０ｘｌジェネティックアナライザー（アプライド・バイオシステム、米国）にてキャピラリー電気泳動に供した。ここで、ＴＡＭＲＡ標識は、この色素のセットのうち、黄色（ＮＥＤ）色素として検出される。
【０１８５】
結果および考察
図１は、液体アレイ診断（ＬＡＤ）ＳＮＰ型決定技術の一例を示す。簡潔に言うと、各ＳＮＰを含む鋳型を、ゲノムＤＮＡから多重にＰＣＲ増幅する（簡単にするため、図１は、このような鋳型／ＳＮＰを１つのみ示す）。エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）およびシュリンプアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を用いた処理によって、ＰＣＲプライマーおよびｄＮＴＰをそれぞれ除去した後、ＳＮＰ変異体に相補的な消光剤標識化ｄｄＮＴＰを用いて、３’末端がＳＮＰに隣接するように鋳型にアニールする標識プローブ（ＬＰ）を標識化する、１ヌクレオチド伸長反応の鋳型として、ＰＣＲ産物を用いる。ＬＰ標識化を評価するために、相補的な、５’蛍光標識化レポータープローブ（ＲＰ）を添加し、融解曲線分析を行う。温度依存的で蛍光色素特異的な消光は、ＬＰが標識化されていることを示す。この方法を用いて、種特異的なＳＮＰの方決定を行うと、サンプル中に存在する微生物種を定量することができる（図１Ｂ）か、または非半数体種のＳＮＰアリルの型決定を行うことができる（図１Ｃ）。いくつかの蛍光色素検出チャンネルのそれぞれについて、様々な長さ（Ｔｍ）のＬＰ−ＲＰ二本鎖を用いることによって、多重化の程度を増し、これによって、１サンプルにつき２０〜３０ＳＮＰを型決定することができる。
【０１８６】
偽陽性消光およびその低減
微生物種の存在を定量化するための技術を開発する最初の実験は、鋳型として用いる１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を増幅して、鋳型鎖のＧに隣接する種特異的なＬＰを末端標識化することを含んでいた。これらの実験は、大腸菌またはフィーカリバクテリウム種由来の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含むプラスミドを含んでいる形質転換体の溶解物を用い、またプラスミド特異的なＰＣＲプライマー（ＨＵおよびＨＲ；表３を参照）を用いることによって、微生物の宿主配列の増幅を回避した。図２に示す様に、予想外に、鋳型の量と消光応答との間には逆相関が観察され、「鋳型を含まない」コントロールで、消光の程度が最も大きくなった。さらに、鋳型濃度にかかわらず、全ての消光応答において、ポリメラーゼの存在が必要であった。ＬＰの標識化によって、各ＲＰと二本鎖を形成した際に、レポーター標識の近くにｄｄＣＴＰTAMRAの３’突出が形成されるように、ＬＰ−ＲＰプライマー二本鎖を設計した。したがって、未標識のＬＰとＲＰとの二本鎖は、平滑末端（両方の末端）を形成するため、融解曲線分析中、いまだ活性を有するポリメラーゼによる、ＲＰのほうを向いた偽陽性プライマー伸長は起こり得ない。ポリメラーゼが、未標識のＬＰ−ＲＰ二本鎖およびｄｄＣＴＰTAMRAの両方と結合し、それによってレポーター蛍光色素の近くに消光剤を拘束しているかどうかを調べる目的で、図２の消光陽性のサンプルについて容易なクロロホルム抽出を行った。図３に示すように、有機抽出によって、偽陽性消光現象が明らかに低減され、これによって、鋳型用量依存的な消光応答が明らかになったが、消光応答のＴｍは、有機抽出前の約７２度（図２）から、有機抽出後には約６６℃に低下していた（図３）。クロロホルムによって、恐らく、ｄｄＣＴＰTAMRAは、ＴＡＭＲＡ標識の疎水的な性質のために有機相に分画され、ポリメラーゼも、一部が同様に分画され得る。この結果は、ポリメラーゼによって直接生じる疑似ＦＲＥＴ効果によっても説明され得る。
偽陽性効果が完全にポリメラーゼ依存的であったという観察に従って、有機抽出の代替手段として、ポリメラーゼを不活性化するプロテイナーゼＫステップを含むことが、クロロホルム抽出を置き換えることができるかどうかを調べることを選択した。ｄｄＣＴＰTAMRAの存在下、かつＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼおよびプロテイナーゼＫの両方の存在下／非存在下において、２＿１ ＬＰおよび２＿１＿ｉｎ１ｂＦＡＭＲｅｖＣｏｍｐ ＲＰ（配列については表３を参照）を結合させた。プロテイナーゼＫがポリメラーゼを不活性化できるように、ポリメラーゼ活性化後、融解曲線の生成前に、５６℃で３０分間のインキュベーションを行った。プロテイナーゼＫなしでポリメラーゼを含むサンプルのみが、消光応答を示した（図４）。ポリメラーゼを欠いているサンプルか、またはプロテイナーゼＫで処理した後のサンプルのいずれかでは、偽陽性消光は観察されなかった。
【０１８７】
プロテイナーゼＫ処理を用いて偽陽性効果を回避することによって、ＬＡＤ法の新しい試験を行った。図５は、プロテイナーゼＫ処理を行ってからＬＰ−ＲＰを解離させた場合、ＬＡＤ法は、対応する示差的な消光応答を生じる鋳型用量依存的な標識プローブの標識化を示し、鋳型またはＤＮＡポリメラーゼを欠くコントロールサンプルは、予想通り、消光を示さなかったということを示す。
【０１８８】
偽陽性消光に関わると考えられる末端転移酵素様活性
ポリメラーゼを不活性化するためにプロテイナーゼＫ処理を含むことによって、偽陽性効果は低減され、これによって、ＬＡＤ法をうまく行うことができたが、ＬＰ−ＲＰプローブ二本鎖の設計パラメーターに関わる情報を提供する、偽陽性効果を生じる機構を調査しようと考えた。偽陽性効果を生じる機構が、ｄｄＣＴＰTAMRAの共有結合的な付加に関わっているかどうかを検討するために、以下の実験を行った。それぞれが２つの平滑末端を形成する二組のＬＰ−ＲＰ二本鎖（２＿１ ＬＰ／２＿１＿ｉｎ１ｂＦＡＭＲｅｖＣｏｍｐ ＲＰおよびＦａｅｃａｌｉ ＬＰ／Ｆａｅｃａｌｉ ＲｅｖＣｏｍｐ ＦＡＭ）、およびＲＰが、相補的なＬＰと二本鎖（Ｆａｅｃａｌｉ ＬＰ／Ｆａｅｃａｌｉ ＲｅｖＣｏｍｐ ＋１ ＦＡＭ）を形成した際に、一方の末端に５’−ＦＡＭ−Ｇの突出を形成する第３の組を、それぞれ、活性化したＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄｄＣＴＰTAMRA、バッファー/ＭｇＣｌ2を含み、プロテイナーゼＫをさらに含む反応混合物および含まない反応混合物に入れた。サンプルを、まず、５６℃で３０分間インキュベートしてから、融解曲線分析に供した。その後、プロテイナーゼＫ未処理サンプルをプロテイナーゼＫで処理し、両方のサンプルの組をもう一度解離させた。２つの末端が平滑化されている最初の２つの二本鎖は、ＬＡＤで用いられる二本鎖を表し、５’に突出したＧを有する第３の二本鎖は、ｄｄＣＴＰTAMRAが、５’から３’に向かう酵素のポリメラーゼ活性によって、この残基と向かい合って取り込まれるため、ポリメラーゼプライマー伸長活性のポジティブコントロールとして働くと考えられた。
【０１８９】
図６および表４は、これらの実験の結果をまとめたものである。図６Ａ〜図６Ｃ（７０℃を越えたところにピークを有する濃い曲線）に示すように、３つの二本鎖は全て、プロテイナーゼＫで処理されていない場合は、消光応答を示す。さらに、ポジティブコントロールの二本鎖（５’にＧの突出を含む、表４の二本鎖３）は、プロテイナーゼＫで処理したサンプルにおいても消光を示し（７０℃未満にピークを有する薄い曲線）、一方、プロテイナーゼＫで処理した他の二本鎖は、消光を示さなかった（図６Ｂおよび図６Ｃの、ピークを示さない薄い曲線；表４の二本鎖１および２）。あらかじめプロテイナーゼＫで処理していないサンプルをプロテイナーゼＫ処理した後の第２の解離によって、ポジティブコントロールである二本鎖３について、特に、両方のサンプルが消光応答を示した（図６Ｄ）という、予想通りの結果が明らかになったが、ここで、プロテイナーゼＫで処理していない第１の解離のサンプルは、消光を示し、そのＴｍは、あらかじめプロテイナーゼＫで処理した第１の解離のサンプルのＴｍと同程度まで低下していた。２つの末端が平滑化された２＿１ ＬＰ／ＲＰ二本鎖１（表４）のサンプルは、いずれも、消光を示さなかった（図６Ｂおよび図６Ｅ）が、一方で、第１の解離の間、消光を示した（プロテイナーゼＫで処理していない場合；図６Ｃ）２つの末端が平滑化されたＦａｅｃａｌｉ ＬＰ／ＲＰの二本鎖２（表４）のサンプルは、プロテイナーゼＫ処理後の第２の解離の間、著しい、しかし減少した消光を示し続け、この場合、Ｔｍも明らかに低下していた（図６Ｆ）。
【０１９０】
ポジティブコントロールの二本鎖の結果は、第１の解離前のプロテイナーゼＫ処理では、ポリメラーゼによって起こる、ｄｄＣＴＰTAMRAを用いたＬＰ伸長は、十分に阻害されなかったが、プロテイナーゼＫによる、両方のサンプルの最終的な不活性化によって、消光応答においてＴｍが明らかに低下した。２つの末端が平滑化された２＿１二本鎖のサンプルのいずれも、図６Ｅにおいて消光を示さなかったという事実は、この二本鎖は、ポリメラーゼによって、共有結合的にｄｄＣＴＰTAMRAで修飾されておらず、この二本鎖の第１の解離で観察された消光（図６Ｂ）は、他の機構によって生じたということを示す。２つの末端が平滑化された二本鎖２（Ｆａｅｃａｌｉ ＬＰ／Ｆａｅｃａｌｉ ＲｅｖＣｏｍｐ ＦＡＭ）の結果は、プロテイナーゼＫ処理を行わない場合、ポリメラーゼが、二本鎖の３’末端の一方または両方に、ｄｄＣＴＰTAMRAを鋳型非依存的に付加することができたということを示唆している。これらの結果は、ｄｄＣＴＰTAMRA存在下における二本鎖に対する、サーモシクエナーゼ様のＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼの効果を、いくつか示すものである。ポリメラーゼは、特定の平滑末端化二本鎖にｄｄＣＴＰTAMRAを付加することができるが、その他には付加することができない、末端転移酵素活性を有する場合があり、これは、恐らく、末端配列特異性またはこの活性の傾向を示している。（特定のＤＮＡポリメラーゼは、そのうちのいくつかは熱安定性であるが、鋳型非依存的なポリメラーゼ活性を実行して、平滑末端化された二本鎖に３’ｄＡＭＰを１つ付加することができる（クラーク（Clark），１９８８ｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：２０，ｐ９６７７〜９６８６）ということが知られており、実際、ＰＣＲアンプリコンの、いわゆるＴ／Ａクローニングに広く利用されている。しかしながら、これは、ｄｄＮＴＰについては観察されていない。）
【０１９１】
ポリメラーゼは、また、ｄｄＣＴＰTAMRAの存在下において、蛍光標識化ＲＰが、相補的な未標識のＬＰと二本鎖を形成している場合、偽陽性消光を生じ得る。第３に、ポリメラーゼは、ｄｄＣＴＰTAMRAを結合／拘束する性質にかかわらず、消光した二本鎖に対する明らかな安定化効果を有しており、ポリメラーゼの不活性化によって、消光応答のＴｍが低下する。
【０１９２】
これらの結果は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの、鋳型非依存的な末端デオキシリボヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）様の活性によって、平滑末端化オリゴヌクレオチド二本鎖を、ｄＡＴＰで効率的に標識化することができるが、ｄＧＴＰでの同様の標識化はそれほど効率的でなく、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰについては、ほぼ検出することができなかったということを見出したクラークの観察（１９８８、上掲）に鑑みて、予想できないものである。
【０１９３】
ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌのＴｄＴ様活性の確認
先の実験において、２つの平滑末端化二本鎖のうちの一方のみが、ＴｄＴ様活性によって標識化されたが、これは、恐らく、この活性の配列構成特異性を示すものである。また、プロテイナーゼＫは、レポータープローブと同時に添加され、このため、プロテイナーゼＫによって完全に不活性化される前のポリメラーゼ活性が考慮される。ＴｄＴ様活性は、また、融解曲線の生成中の消光の観察に基づいて、間接的に検出された。キャピラリー電気泳動によって、オリゴヌクレオチドの蛍光標識化を直接検出することによって、２つの末端が平滑化された第３のＬＰ−ＲＰ二本鎖の、ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌによる潜在的な標識化を試験しようと考えた。このような標識化のポリメラーゼ依存性を決定するために、活性化されたポリメラーゼを含む反応液を、プロテイナーゼＫによって処理した後、ＲＰを添加した。この実験の概要は、表５に示されている。活性ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼの存在下において（すなわち、プロテイナーゼＫ処理を行わない場合）、二本鎖４の両方のオリゴヌクレオチドは、ｄｄＣＴＰTAMRAでの鋳型非依存的標識化を示し、また、二本鎖は、対応する偽陽性消光およびＴｍシフト応答を示した。なお、二本鎖は、また、プロテイナーゼＫによって処理された場合、バックグラウンドの消光応答も示した。この二本鎖のＬＰの３’末端は、内因性消光活性を有することが知られている（マラス（Marras）ら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｅ１２２；セイデル（Seidel）ら，１９９６，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，１００，ｐ５５４１〜５５５３）２つの末端グアニン塩基を含んでいる。
【０１９４】
ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌのＴｄＴ様活性を回避するための他の二本鎖構造
平滑末端化されたオリゴヌクレオチド二本鎖の末端に、ｄｄＣＴＰを１つ付加することができる、ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼの新規のＴｄＴ様活性を示した。さらに、この証拠は、活性ポリメラーゼが、取り込まれなかったｄｄＣＴＰTAMRAを、未知の機構によって蛍光標識を含む二本鎖に拘束し、これによって、ポリメラーゼの二本鎖安定化効果を示す、Ｔｍの上昇が示される、温度依存的な消光応答を生じる能力を支持するものである。これは、直接的なポリメラーゼ依存的疑似ＦＲＥＴ効果によっても生じ得る。これらの効果は、融解曲線分析の前にポリメラーゼの不活性化ステップ（プロテイナーゼＫ処理による）を含むことによって、一括的に抑制され得る。
【０１９５】
これらの効果の一部または全てを抑制することを目的として、５’の非相補的突出末端および／または一部がレポーター蛍光色素で標識化された３’突出末端の組み合わせを含む他の二本鎖構造を評価し、活性または不活性のＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼの存在下において、それらのｄｄＣＴＰTAMRA標識化、および温度依存的な消光の挙動を分析した。
【０１９６】
表６に示す様に、５’のＴ突出（ＦＡＭ標識存在下または非存在下における１つまたは２つのＴ）、または３’のＣ突出もしくはＧ突出を形成する二本鎖５〜９のオリゴヌクレオチドは、いずれも、活性ＤＮＡポリメラーゼの存在下または非存在下において、ｄｄＣＴＰTAMRAで標識化されない。ＦＡＭ標識化Ｔを含む５’突出が存在すると（二本鎖５）、二本鎖４と比較して、活性ポリメラーゼ非存在下において、未標識のＬＰの、２つのＧの内因性消光効果が、いくらか低減された（表５）。二本鎖７において、ＬＰにおけるこれらの２つのＧ塩基と、５’ＦＡＭ標識との間の距離を大きくすると、この効果はさらに低減された。プロテイナーゼＫによって処理されていない活性ポリメラーゼの存在下において、二本鎖５および二本鎖７の両方が、消光の上昇を示し、これは、二本鎖５の場合は、２つのＧ効果ならびに偽陽性ｄｄＣＴＰTAMRA拘束効果、および／またはポリメラーゼ依存的疑似ＦＲＥＴ効果の組み合わせであり、二本鎖７の場合は、前者はそれほどでもなく、後者の効果がより大きかった。両方の二本鎖が、それに対応するＴｍシフトを示した。二本鎖８は２つのグアニンの近くに位置するＦＡＭ標識を有し、それに応じて、２つのＧによる消光効果が増大した。
【０１９７】
驚くべきことに、わずかなＴｍの上昇から判断される通り、活性ポリメラーゼが存在することによって、偽陽性効果を介した消光の上昇、および二本鎖の顕著な安定化のいずれも起こらなかった。この結果は、５’に凹部を有する二本鎖の末端において、ポリメラーゼの結合が抑制されることを示し得る。
【０１９８】
表６の結果は、Ｇに富む３’末端を有するＬＰを含むプライマー二本鎖は、内因性消光特性を有しているという考えと一致するものであり、ｄｄＣＴＰTAMRA標識に相補的でない一塩基（または２塩基、すなわちＴ）を有する、対応するＲＰのレポーター蛍光物質で標識化された５’末端の伸長によって、このＧ介在性消光効果が低減されたと考えられるが、二本鎖８において観察されるような、標識化ｄｄＣＴＰの存在下における、活性ポリメラーゼによる偽陽性消光効果には、影響を及ぼさないようであった。二本鎖の偽陽性消光の挙動の違いは、遊離ジデオキシヌクレオシド三リン酸に非相補的な塩基を含むとしても、５’凹部を含むｄｓＤＮＡの末端および５’突出を含むｄｓＤＮＡの末端に対する活性ポリメラーゼの結合効率の潜在的な違いによって説明され得る。
【０１９９】
非相補的な塩基を含むＬＰの５’突出が、同様の５’突出または５’凹部のいずれかを含むＲＰとの二本鎖に含まれることによって、さらに偽陽性効果を低減することができるかどうかを試験しようと考えた。表７に示すように、５’Ｔ突出を含むＬＰとの二本鎖におけるＲＰの３’末端は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって確認されたように、活性ポリメラーゼの存在下において、意外にもｄｄＣＴＰTAMRAで標識化された。対応するＲＰの５’Ｔが伸長するのに向かい合って、同様のＬＰの３’が伸長すること（表７の二本鎖１０〜１２および表６の二本鎖５〜７）が観察されなかったということは、この活性の３’末端配列構成特異性を示し得、これらのＲＰの５’にＦＡＭ標識が存在するということでは、二本鎖１１（表７）および二本鎖６（表６）の結果を考慮した場合に、この矛盾を説明できないと考えられる。表７に示す二本鎖の偽陽性効果の評価は、バックグラウンドの２つのＧ効果、および５’末端のＦＡＭ標識の分子内消光を実行するＲＰの３’のＴＡＭＲＡ標識の潜在性によって、複雑になった。さらに、ＲＰの３’標識化による未取り込みのｄｄＣＴＰTAMRAが減少によっても、活性ポリメラーゼによる偽陽性消光の低減および／またはポリメラーゼの除去によるポリメラーゼ依存的疑似ＦＲＥＴ効果の回避が、期待され得る。これらの効果は、ＣＥで分析された全ての二本鎖のうち、ＲＰの３’標識化の程度が最も高く、二重標識化ＲＰにおける３’−ＴＡＭＲＡ部と５’−ＦＡＭ部との間の距離が最短である、二本鎖１３において最も複雑であり得る。
【０２００】
最適なＬＡＤ二本鎖および解離前処理に関する仮の結論
ここで示される結果から、特に、サーモシクエナーゼ様のＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼの、これまで立証されてこなかったＴｄＴ様活性および非相補的なプライマー伸長活性に関して、これらの活性にかかわらず、二本鎖の解離中に起こる偽陽性効果およびＴｍシフト効果と共に、最適なＬＡＤ二本鎖の重要な性質を要約することができる。
【０２０１】
１．５’がレポーター標識化されたＲＰとの二本鎖における未標識のＬＰは、両方の末端に、１塩基の５’凹部を生じるべきである。平滑末端は、ポリメラーゼのＴｄＴ様活性によって標識化される可能性を有する（表４の二本鎖２および表５の二本鎖４）。ｄｄＮＴＰに相補的な５’突出を含む二本鎖は、ポリメラーゼのプライマー伸長活性によって標識化される恐れがあるので、回避されるべきである。このような突出は、本明細書に記載のポリメラーゼの非相補的なプライマー伸長活性のため、ｄｄＮＴＰに相補的でない場合であっても回避されるべきである（二本鎖１０〜１４）。
【０２０２】
２．ＬＰは、ＳＮＰのどちらかの側に隣接するように設計することができ、可能であれば、３’末端のグアニンを回避して、内因性消光効果を限定するように設計されるべきである。同様に、ＲＰは、レポーター蛍光色素で５’を標識化されてもよく、可能であれば、５’のグアニンは回避されるべきである。消光剤が結合したｄｄＮＴＰによってＬＰが伸長される二本鎖と、ＬＰが未標識のままである二本鎖との間の、温度依存的な消光の違いを測定するものとして、ＬＡＤ法がうまく機能するための必要条件はない。
【０２０３】
なお、５’陥凹末端を有するプライマー二本鎖は、恐らく、消光剤が結合したｄｄＮＴＰの有無にかかわらず、活性ポリメラーゼの偽陽性効果およびＴｍシフト効果の影響を受ける。二本鎖８の結果が示唆するのは、ポリメラーゼの、ｄｓＤＮＡ５’陥凹末端への結合は、平滑末端または３’陥凹末端への結合よりも効率的でなく、そのため、偽陽性効果およびＴｍシフト効果が低減されるということである。これらの効果は、プロテイナーゼＫ処理によってポリメラーゼを不活性化してから、ＲＰの添加および解離を行う（上述したように）ことによって、回避され得る。これを、平滑末端および／または３’陥凹末端を有する二本鎖にも用いることで、偽陽性効果およびＴｍシフト効果の両方が低減され得、ポリメラーゼのＴｄＴ様活性またはプライマー伸長活性によって、解離前の二本鎖の標識化も回避され得る。
【０２０４】
偽陽性効果を低減する他の処理として、本明細書で述べたように、ＬＰ標識化後のサンプルをホスファターゼで処理して、消光剤が結合したｄｄＮＴＰを不活性化するか、または未標識のｄｄＮＴＰを添加して、消光剤が結合したｄｄＮＴＰを競合させてもよい。偽陽性効果およびＴｍシフト効果の両方を低減するために、ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌと交差反応する、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体をサンプルに添加してから、ＲＰの添加および解離を行うこともできる。
【０２０５】
【表３】
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【０２０６】
【表４】
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【０２０７】
【表５】
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【０２０８】
【表６】
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【０２０９】
【表７】
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【０２１０】
実施例２
材料および方法
ＬＰ標識化のための鋳型生成
ウシのミオスタチン（ＭＳＴＮ）配列を含むプラスミドをポリメラーゼ連鎖反応に用いて、標識プローブ（ＬＰ）の標識化用の鋳型を生成した。手短に言うと、プラスミドＤＮＡ１００ｐｇを、以下の反応成分に添加した：１．２５Ｕ ＨＯＴ ＦＩＲＥＰｏｌ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、１×Ｂ２バッファー、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（ここまで全てソリス・バイオダイン製、エストニア）、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、米国）、０．１〜０．２μＭ センスプライマー（ＳＰ）および０．１〜０．２μＭ アンチセンスプライマー（ＡＳＰ；プライマー配列は表８を参照）、全量３０μＬ。アプライド・バイオシステムＶｅｒｉｔｉ（商標）サーマルサイクラー（ライフ・テクノロジー、米国）を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、この増幅は、９５℃で１０分間の初期活性化ステップを含み、その後、９５℃で３０秒間の変性、５０〜６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分３０秒間の伸長を３０サイクル行い、さらに７２℃で７分間の最終伸長ステップを含むものであった。１×ＴＡＥバッファーおよび０．６μｇ／ｍＬ 臭化エチジウムを含む１％アガロースゲル上にて各反応液５μＬを電気泳動した後、ＵＶ照射によってＰＣＲ産物を可視化した。各反応液の残り２５μＬに、３ＵのエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ；バイオラボ、イプスウイッチ、マサチューセッツ州、米国）および８Ｕのシュリンプアルカリホスファターゼ（ＵＳＢコーポレーション、クリーブランド、オハイオ州、米国）を添加した後、３７℃で９０分間インキュベートし、８０℃で１５分間インキュベートして氷上に置いた。
【０２１１】
【表８】
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【０２１２】
標識プライマーの末端標識化
Ｅｘｏ−ＳＡＰ処理したＰＣＲ産物である鋳型４μＬ（または、鋳型を含まないコントロールとしてのＨ2Ｏ）を、全反応体積が２０μＬとなるように、１６μＬの標識化反応マスターミックス［５Ｕ ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、１×反応バッファーＣ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２（ここまで全てソリス・バイオダイン製）、０．４μＭ ｄｄＮＴＰ消光剤（ＡＴＴＯ５４０Ｑ標識化ジデオキシウリジン三リン酸、ＡＴＴＯ６１２Ｑ標識化およびＤＹＱ６６０標識化ジデオキシシチジン三リン酸；ジェナ・バイオサイエンス、ドイツ）およびＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない水に溶解させた０．１μＭ ＬＰ（表８）］に添加した。用いた熱サイクル条件は以下の通りである：９５℃で１０〜１２分間の初期活性化ステップを行い、その後、９６℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリングおよび伸長の組み合わせを１０サイクル行い、最後は１０℃で維持した。
【０２１３】
末端転移酵素標識化
０．１μＭ 標識プローブ、１×ＴｄＴバッファー、０．５ｍＭ ｄｄＮＴＰ消光剤（ＡＴＴＯ５４０Ｑ標識化ジデオキシウリジン三リン酸、ＡＴＴＯ６１２Ｑ標識化およびＤＹＱ６６０標識化ジデオキシシチジン三リン酸；ジェナ・バイオサイエンス、ドイツ）、０．２５ｍＭ ＣｏＣｌ2、０．２Ｕ／μＬ 末端（デオキシヌクレオチド）転移酵素（ニュー・イングランド・バイオサイエンス（New England Biosciences）を含む反応液を３７℃で１時間インキュベートし、その後、酵素を、７５℃で３０分間、熱で不活性化した。
【０２１４】
融解曲線分析
レポータープローブを添加して融解曲線分析を行う前に、サンプルを、プロテイナーゼＫ（終濃度は、Ｈ2Ｏ、１×バッファーＣ、または１×ＴｄＴバッファー中、２５〜５８μｇ／ｍＬ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、終濃度は、Ｈ2Ｏ、１×バッファーＣ、または１×ＴｄＴバッファー中、２５〜５８μｇ／ｍＬ）、ＳＤＳ（終濃度は、Ｈ2Ｏ、１×バッファーＣ、または１×ＴｄＴバッファー中、０．１〜０．２５％）で処理するか、または単に等量のＨ2Ｏ、１×バッファーＣ、または１×ＴｄＴバッファーを添加した。その後、サンプルを、５６℃で３０分間インキュベートした。次いで、レポータープローブを、終濃度が０．０２５〜０．１μＭとなるように添加した。ポリメラーゼの不活性化に、ＳＤＳがプロテイナーゼＫと同程度に効果的であって、それによって、Ｔｍシフト効果および疑似ＦＲＥＴ効果の両方を低減することができるということが一旦判明したら、レポータープローブを、ＳＤＳ（終濃度は、Ｈ2Ｏ、１×バッファーＣ、または１×ＴｄＴバッファー中、０．１〜０．２５％）を含む溶液に直接添加した。反応液を、以下の温度プロファイルで、蛍光検出サーモサイクラー（ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ、アプライド・バイオシステム）にセットした：９５℃で１５秒間、２５〜３０℃で１５秒間、９５℃で１５秒間、および６０℃で１５秒間。これらの最後の４ステップは、蛍光が検出され、温度測定値に対する蛍光の導関数（ｄＦ／ｄＴ）として、解離曲線で表される、解離段階を含む。どちらのオリゴヌクレオチドも、蛍光物質と結合していない二本鎖を含むサンプルには、ＥｖａＧｒｅｅｎ（ビオチウム（Biotium））を、終濃度が１Ｘとなるように添加した。
【０２１５】
結果および考察
ポリメラーゼ依存的疑似ＦＲＥＴ効果はｄｄＮＴＰ−消光剤非依存的である
ポリメラーゼ依存的疑似消光（ＦＲＥＴ）効果を生じる考えられる機構を調査するために、鋳型を欠き、＋／−ＬＰ（標識プローブ）、＋／−ｄｄＵＴＰ−ＡＴＴＯ５４０Ｑの全ての組み合わせを含むモック標識化反応を行った。モック標識化反応では、まず、９５℃で１０分間インキュベートを行って、ＨＯＴ ＴＥＲＭＩＰｏｌ ＤＮＡポリメラーゼを活性化させた後、各反応液を二分割した。一方の組には、プロテイナーゼＫ（１×バッファーＣ中）を、終濃度が５８μｇ／ｍＬとなるように添加し、他方の組には、同体積の１×バッファーＣを添加した。両方のサンプルの組を５６℃で３０分間インキュベートした後、３０℃〜９５℃で融解曲線を作成した。ＦＡＭ標識化ＲＰ Ｃ３１３Ｙ ＲＰ （Ｕ）ＦＡＭおよびＨＥＸ標識化ＲＰ ｎｔ８２１ ＲＰ （Ｕ）ＨＥＸは、それぞれに相補的なＬＰである、Ｃ３１３Ｙ ＬＰ （Ｃ＿Ｕ）およびｎｔ８２１ （ｄｅｌ１１） ＬＰ （Ｕ）を含むサンプルにおいて、消光剤標識化ｄｄＮＴＰの有無にかかわらず、消光応答を示したが、サンプルは全てプロテイナーゼＫ未処理であり、ポリメラーゼは活性なままであった（図７，パネルＡおよびパネルＢ）。これらの結果から、ポリメラーゼ依存的疑似ＦＲＥＴ効果は、ＨＥＸを含む二本鎖においても観察されたので、オリゴヌクレオチドの一方が蛍光色素ＦＡＭで標識化されている二本鎖に特異的ではないということが確認される（図７、パネルＢ）。
【０２１６】
ＳＤＳ処理によってＴｍシフト効果および疑似ＦＲＥＴ効果が低減される
レポータープローブを添加する前に、個別の処理およびインキュベーションステップを必要としない、ポリメラーゼを不活性化する他の方法を見つけるために、ＳＤＳを用いた。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、洗浄剤であって、強力なタンパク質変性剤であり、１％未満の濃度で核酸のハイブリダイゼーションに顕著な影響を及ぼさない。ＬＰを含むサンプルに、終濃度が０．１〜０．２５％となるようにＳＤＳを添加した後、ＲＰを添加し、融解曲線分析を行うことを試験した。
【０２１７】
図８は、０．１％までＳＤＳを添加することが、何も添加していない１×バッファーＣで処理したネガティブコントロール反応で見られた、ポリメラーゼに基づくＴｍシフト効果を低減する点で、プロテイナーゼＫと同様に効果的であることを示す。他のコントロール反応を行って、プロテイナーゼＫ処理サンプルで見られたＴｍの低下に、タンパク質の追加は寄与しなかったことを確認した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を同濃度で添加した場合、プロテイナーゼＫで処理したサンプルで観察されたＴｍシフトは見られず、このことは、Ｔｍシフトが、プロテイナーゼＫのポリメラーゼ不活性化活性の結果であり、タンパク質としての一般的な特性によるのではないことを示す。
【０２１８】
0．1％ＳＤＳを、未標識のＬＰに添加した後、ＲＰを添加して融解曲線を作成した場合、0．1％ＳＤＳは、何も添加していない１×バッファーＣで処理したネガティブコントロール反応で見られた、疑似ＦＲＥＴ効果を低減する点でも、プロテイナーゼＫと同様に効果的であった（図９）。他のコントロール反応を行って、プロテイナーゼＫ処理サンプルで見られた疑似ＦＲＥＴの低下に、タンパク質の追加は寄与しなかったことを確認した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を同濃度で添加した場合、ＢＳＡは、疑似ＦＲＥＴを示し、プロテイナーゼＫで処理したサンプルで観察された低減は示さず、このことは、疑似ＦＲＥＴの低減が、プロテイナーゼＫのポリメラーゼ不活性化活性の結果であり、タンパク質としての一般的な特性によるのではないことを示す。なお、蛍光色素であるＣＹ５の場合、ポリメラーゼに基づく疑似ＦＲＥＴ自体は、消光として表れず、むしろ、定義上はＦＲＥＴの一形態である、温度依存的な蛍光の上昇として表れた（図９、パネルＢ）。
ＳＤＳを用いてポリメラーゼを不活性化することによって、追加の試薬添加および間のインキュベーション時間を不要とすることによって、ＬＡＤ法が顕著に改善される。レポータープローブは、ＳＤＳと同時に添加されてもよく、融解曲線の決定を、直接開始することができる。
【０２１９】
二本鎖のＴｍシフト効果はＤＮＡポリメラーゼの一般的な特性である
サーモシクエナーゼ様ではないＤＮＡポリメラーゼは、蛍光色素が結合したｄｄＮＴＰを、ＤＮＡ中に効率よく取り込まないので、ＰＣＲに適した従来のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｈｏｔ ＦＩＲＥＰｏｌ）の、Ｈｏｔ ＴＥＲＭＩＰｏｌで観察された二本鎖安定化Ｔｍシフト効果を生じさせる能力を試験するために、熱不安定な末端（デオキシヌクレオチド）転移酵素を用いて、標識プローブを消光剤標識化ｄｄＮＴＰで標識化した。いったん３７℃での標識化反応が完了すると、末端転移酵素活性を、７５℃で３０分間インキュベートすることで除去した。その後、Ｈｏｔ ＦＩＲＥＰｏｌを反応液に添加し、９５℃で１０〜１２分間、熱によって活性化した後、ポリメラーゼ不活性化ＳＤＳ溶液、またはポリメラーゼが活性なまま残るサンプルバッファーのいずれかに溶解させた相補的なレポータープローブを添加した。
【０２２０】
図１０に示すように、活性なＤＮＡポリメラーゼを含むサンプルは全て、ポリメラーゼを不活性化した同じサンプルと比較して、Ｔｍが上昇した消光曲線を示す。この効果は、４つの異なる蛍光色素（ＦＡＭ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＲＯＸおよびＣＹ５）を含むＲＰと、２つの異なる消光剤（ＡＴＴＯ５４０ＱおよびＡＴＴＯ６１２Ｑ）を含むＬＰで見られた。Ｔｍが上昇することに加えて、消光曲線の幅が、活性ポリメラーゼサンプルにおいて広くなっているように見える。これは、Ｈｏｔ ＴＥＲＭＩＰｏｌ（例えば図８）よりも、Ｈｏｔ ＦＩＲＥＰｏｌ（図１０）の方で、より顕著であると考えられる。活性ポリメラーゼサンプルの消光曲線の相対的な幅は、ポリメラーゼの二本鎖に対する相対的な結合親和性を反映していると解釈される。したがって、Ｈｏｔ ＴＥＲＭＩＰｏｌは、二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性がより高いと考えられ、これによって、かさ高い修飾を受けたｄｄＮＴＰを取り込む、サーモシクエナーゼ様ポリメラーゼの向上した能力についての説明が可能になる。
【０２２１】
ポリメラーゼ依存的な二本鎖のＴｍシフトは結合した蛍光物質を必要としない
ポリメラーゼ依存的なＴｍシフト効果は、両方のオリゴヌクレオチドが蛍光物質／消光剤に結合している二本鎖のみで観察される特性ではないということを確認するために、二本鎖ＤＮＡのヌクレオチド対の間に可逆的に介在する場合にのみ蛍光を発する、ｄｓＤＮＡ結合蛍光色素であるＥｖａＧｒｅｅｎを用いた。図１１は、プロテイナーゼＫ処理によってポリメラーゼが不活性化されたサンプルと比較して、長さが１６ヌクレオチド対の二本鎖および２０ヌクレオチド対の二本鎖（それぞれ、パネルＡおよびパネルＢ）が、活性ポリメラーゼ存在下において、より高いＴｍの蛍光ピークを示すということを示す。ＳＤＳは、ＥｖａＧｒｅｅｎのｄｓＤＮＡ結合能を無効にするので（データは示さない）、ポリメラーゼを不活性化するのには使うことができなかった。長さが３０ヌクレオチド対の二本鎖および６０ヌクレオチド対の二本鎖において、Ｔｍシフトはより顕著ではない（図１１、パネルＣおよびパネルＤ）。二本鎖が長くなると、ＥｖａＧｒｅｅｎが介在することができる塩基対の数が増加するので、二本鎖の長さに応じて、蛍光強度が増大することが期待される。より短い二本鎖の活性ポリメラーゼサンプルにおける、低い相対蛍光は（図１１、パネルＡおよびＢ）、ポリメラーゼがＥｖａＧｒｅｅｎの結合を物理的に阻害していること、またはポリメラーゼがＥｖａＧｒｅｅｎの蛍光を消光していることを示し得る。
【０２２２】
４つの蛍光チャンネルのそれぞれ２つのＴｍにおいて８つのアリルの遺伝子型解析のためのＬＡＤ技術の使用
変異が二重筋肉化形質の原因要素である、ウシのミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子の３つのアンプリコン領域にわたる、４つの多型（３つのＳＮＰおよび１つのインデル多型）の遺伝子型を、ＬＡＤ技術を用いて解析した。図１２は、ＬＡＤ技術によって、４つの多型遺伝子座全てにおいて、個々のヘテロ接合体を表すＭＳＴＮ遺伝子の３つの増幅領域の、８つのアリルを全て検出することに成功したことを示す。アリルは、４つの蛍光検出チャンネルのそれぞれにおいて、２つの異なるＴｍの消光ピークとして検出された（図１２、パネルＡ〜Ｄ）。蛍光検出チャンネルのいずれにおいても、鋳型を含まないコントロールサンプルでは、消光シグナルは観察されなかった（図１２、パネルＡ〜Ｄ）。１蛍光チャンネルあたりの分離可能なＴｍの範囲および数を増加させることによって、またこのようなチャンネルを追加することによって、最大で６０個の異なるアリルの多重化遺伝子型解析にＬＡＤ技術を用い得るということが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６ｃｏｎｔ．】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１０ｃｏｎｔ．】
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【図１１】
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【図１１ｃｏｎｔ．】
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【図１２】
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【図１２ｃｏｎｔ．】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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