(57)【要約】  Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体に基づく蛍光プローブが提供される。プローブは、可変する分光特性、骨ミネラルへの結合親和性、および薬理学的活性を有する。プローブを製造するための方法は、２つの相補的な結合方策を使用することを含み、一方はアミノ基を含み、他方はアミノ基への前駆体としてクロライド基を含む。他の態様では、結合部分としてアミノ基およびアジド基を含有する、二官能性Ｎ−複素環式ビスホスホネートが提供される。いくつかの態様では、結合化学によって、３つの臨床的に重要な複素環式ビスホスホネートのいずれかに、可視域から近赤外域までの広い範囲で選択される蛍光色素を結合することが可能になる。【選択図】  なし
2018517121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造影標識に結合したＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を複数含み、
前記造影標識に結合したＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、予め選択された物理的、光学的および生物学的な特性を有する、
骨組織で使用するためのツールキット。
【請求項２】
表１における、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ１）、５−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ２）、６−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ３）、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳ（７ａ４）、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ（７ａ５）、ＡＦ６４７−ＲＩＳ（７ａ６）、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ１）、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ２）、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ３）、ＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣ（７ｂ４）、５（６）−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ（７ｃ１）、５（６）−ＲｈＲ−ｄＲＩＳ（７ｃ２）、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ１）、６−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ２）、ＡＦ６４７−ＺＯＬ（７ｄ３）、８００ＣＷ−ＺＯＬ（７ｄ４）、スルホ−Ｃｙ５−ＺＯＬ（７ｄ５）、５−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ１）、６−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ２）、５−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ１）、および６−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ２）からなる群から選択される、前記造影標識に結合したＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を含む、請求項１に記載のツールキット。
【請求項３】
請求項１に記載のツールキットにおける、前記造影標識に結合したＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体に、骨を暴露させることを備え、
骨、骨代謝、薬物と骨との相互作用、骨へのＢＰの投与、または骨内のＢＰ分布を分析する方法。
【請求項４】
前記骨は、被験者の体外にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載のツールキットにおける、前記造影標識に結合したＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体の１つ以上で被験者を治療すること、および、
前記被験者における１つ以上のビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体をイン・サイチュ（in situ）での蛍光によって可視化することを備える、
治療を必要とする被験者における骨または骨関連疾患を治療する方法。
【請求項６】
治療を必要とする被験者における骨または骨関連疾患を、前記造影標識に結合したＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体の１つ以上で治療するため、および、被験者における１つ以上の前記ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体をイン・サイチュ（in situ）での蛍光によって可視化するための、請求項１に記載のツールキット。
【請求項７】
選択された物理的、光学的および生物学的特性を示す、造影標識に結合したＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体のツールキットを作り出すように、活性化された造影標識と、複数のＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体とを組み合わせることを備え、
アンモノライズされたハロゲン含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体、および、アミノ基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体に、活性化された造影標識を反応させることによって、前記Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体に、前記造影標識を結合させる、骨組織で使用するためのキット（ツールキット）を製造する方法。
【請求項８】
前記造影標識に結合したＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体が、表１における、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ１）、５−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ２）、６−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ３）、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳ（７ａ４）、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ（７ａ５）、ＡＦ６４７−ＲＩＳ（７ａ６）、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ１）、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ２）、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ３）、ＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣ（７ｂ４）、５（６）−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ（７ｃ１）、５（６）−ＲｈＲ−ｄＲＩＳ（７ｃ２）、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ１）、６−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ２）、ＡＦ６４７−ＺＯＬ（７ｄ３）、８００ＣＷ−ＺＯＬ（７ｄ４）、スルホ−Ｃｙ５−ＺＯＬ（７ｄ５）、５−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ１）、６−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ２）、５−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ１）、および６−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ２）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体をハロエポキシドと反応させて、ハロゲン含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を作り出すこと、および、
前記ハロゲン含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を、アミノ基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体に変換することを備える、
修飾されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を製造する方法。
【請求項１０】
ａ）前記Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体が、下記式を有し、
【化１】
2018517121.tif 000035
ｂ）前記ハロゲン含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体が、下記式を有し、または、
【化２】
2018517121.tif 000036
ｃ）前記アミノ基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体が、下記式を有し、
【化３】
2018517121.tif 000037
式中、Ｒ１はイミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンであり、Ｒ２はＨまたはＯＨであり、 Ｒ３はＰ（Ｏ）（ＯＨ）２またはＣ（Ｏ）ＯＨである、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記イミダゾールが、
【化４】
2018517121.tif 000038
またはその類似体であり、
前記ピリジンが、
【化５】
2018517121.tif 000039
またはその類似体であり、
前記イミダゾ［３，２−ａ］ピリジンが、
【化６】
2018517121.tif 000040
またはその類似体である、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハロエポキシドがエピクロロヒドリンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
アミノ基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体のアミノ基を、造影標識と反応させることをさらに備える、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記造影標識が蛍光色素を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記造影標識は、前記アミノ基との反応のための、活性化スクシンイミジルエステル含有の蛍光色素を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アミノ基と前記造影標識との反応によって、下記式のＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を作り出す、請求項１３に記載の方法。
【化７】
2018517121.tif 000041
式中、Ｒ１は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンであり、Ｒ２は、ＨまたはＯＨであり、Ｒ３は、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２またはＣ（Ｏ）ＯＨであり、Ｒ４は、蛍光色素を含む。
【請求項１７】
前記蛍光色素が、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ローダミンレッドＸ、Ｘ−ローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷ、またはスルホ−Ｃｙ５である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
蛍光標識されたアミノ基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体の収率が５０％〜７７％である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
保護されたアミノ基を有するエポキシドを、エステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体と反応させて、保護されたアミノ基およびヒドロキシ基を含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を作り出すこと、
前記保護されたアミノ基およびヒドロキシ基を含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を、スルホニルハライドと反応させて、保護されたアミノ基を含有しスルホニル化され且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を作り出すこと、
前記保護されたアミノ基を含有しスルホニル化され且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体をアジドと反応させて、保護されたアミノ基およびアジドを含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を作り出すこと、および、
前記保護されたアミノ基およびアジドを含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を脱保護して、アジド基およびアミノ基を含有するＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を作り出すこと、を備える、
修飾されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を製造する方法。
【請求項２０】
ａ）前記エステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体が、下記式を有し、
【化８】
2018517121.tif 000042
ｂ）前記保護されたアミノ基およびヒドロキシ基を含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体が、下記式を有し、
【化９】
2018517121.tif 000043
ｃ）前記保護されたアミノ基を含有しスルホニル化され且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体が、下記式を有し、
【化１０】
2018517121.tif 000044
ｄ）前記保護されたアミノ基およびアジドを含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体が、下記式を有し、または、
【化１１】
2018517121.tif 000045
ｅ）前記アジド基およびアミノ基を含有するＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体が、下記式を有し、
【化１２】
2018517121.tif 000046
式中、Ｒ＝Ｍｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはｉＰｒであり；Ｒ１は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンであり；Ｒ２は、ＨまたはＯＨであり；Ｒ３は、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２またはＣ（Ｏ）ＯＨである、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記イミダゾールが、
【化１３】
2018517121.tif 000047
またはその類似体であり、
前記ピリジンが、
【化１４】
2018517121.tif 000048
またはその類似体であり、
前記イミダゾ［３，２−ａ］ピリジンが、
【化１５】
2018517121.tif 000049
またはその類似体である、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記エポキシドが、下記式を有し、
【化１６】
2018517121.tif 000050
前記スルホニルハライドがメタンスルホニルクロライドであるか、または、前記アジドがＮａＮ３であるか、あるいは、それらの任意の組み合わせである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
造影標識、薬物、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子およびポリマーからなる群の１つの物質に、前記アジド基または前記アミノ基あるいはそのそれぞれを独立して反応させることをさらに備える、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記物質が、前記アミノ基との反応のための活性化スクシンイミジルエステルを含有するか、または、前記アジド基との反応のためのアルキンを含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アジド基および前記アミノ基を含有するＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体の収率が、約２８％である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
下記式で表され、
【化１７】
2018517121.tif 000051
式中、Ｒ＝Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、またはｉＰｒであり、Ｒ１は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンであり、Ｒ２は、ＨまたはＯＨであり、Ｒ３は、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２またはＣ（Ｏ）ＯＨである、
アジド基およびアミノ基を含有する二官能性Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体。
【請求項２７】
前記イミダゾールが、
【化１８】
2018517121.tif 000052
またはその類似体であり、
前記ピリジンが、
【化１９】
2018517121.tif 000053
またはその類似体であり、
前記イミダゾ［３，２−ａ］ピリジンが、
【化２０】
2018517121.tif 000054
またはその類似体である、
請求項２６に記載のビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体。
【請求項２８】
物質に結合した、Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を含む組成物であって、下記式を有し、
【化２１】
2018517121.tif 000055
式中、Ｒ１は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンであり、Ｒ２は、ＨまたはＯＨであり、Ｒ３は、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２またはＣ（Ｏ）ＯＨであり、Ｒ４は、造影標識、薬物、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、およびポリマーからなる群より選択された物質を含む、組成物。
【請求項２９】
前記造影標識が、蛍光色素または蛍光消光剤である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記蛍光色素が、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ローダミンレッドＸ、Ｘ−ローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷ、またはスルホ−Ｃｙ５であり、
前記蛍光消光剤が、Ｄａｂｃｙｌ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ＱＳＹ７、またはＱＳＹ９である、
請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を、アジドエポキシドと反応させて、アジド含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を作り出すこと、を備える、
修飾されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を製造する方法。
【請求項３２】
前記アジドエポキシドが、
【化２２】
2018517121.tif 000056
である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アジド含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体のアジド基を、造影標識、薬物、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、およびポリマーからなる群の物質に反応させること、をさらに備え、
前記物質は、前記アジド基との反応のためのアルキン基を含有する、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月２日に出願された仮特許出願番号．６２／１４２，４２８、および、２０１５年４月２日に出願された仮特許出願番号．６２／１４２，４３７の利益を主張し、これらが参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ビスホスホネート類、それらのカルボキシホスホネート類似体、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ビスホスホネート類（ＢＰ類）は、骨粗鬆症やパジェット病などの骨障害の治療用の治療薬であり、癌治療における用途がある［１］。ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）は、窒素含有ビスホスホネート類（Ｎ−ＢＰ類）の抗吸収活性のための細胞内の主要な酵素標的であることが知られているが、骨格での分布および細胞取り込みといった薬理学の詳細は、完全には解明されていない［１ｂ］。何人かの癌患者におけるＮ−ＢＰ類の高用量の使用は、顎骨壊死（ＯＮＪ）として知られている副作用と関係しているが［２］、その病因および機構は不明のままである［３］。抗吸収薬に対する、骨の構造、作用および反応に関するこれらの未解決の疑問は、骨ミネラルへの親和性およびその細胞効果の両方においてＮ−ＢＰ類に類似し得る、新たな造影剤が必要であることを暗示する。
【０００４】
ＢＰ類におけるビスホスホネートのＰ−Ｃ−Ｐ結合は、自然に生じる骨代謝メディエータ、つまり無機ピロリン酸のＰ−Ｏ−Ｐ結合と類似する。従って、ＢＰ類は、骨にみられる主要な無機材料であるハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）にも強い結合親和性を保持し、化学的分解および生物学的分解の両方に対して、例外的な安定性を示す。骨を標的とするＢＰ類の斯かる固有の特性によって、薬物送達研究において、ＢＰ類は、所望の薬物や高分子を骨に導くための理想的な媒体になる［４］。また、ＨＡＰに対する強力かつ選択的なＢＰ類の親和性に起因して、乳癌微小石灰、カルシウム尿石症、およびアテローム性動脈硬化症をマッピングするための分子指標として、適切な造影ラベルを有する修飾ＢＰ類を用いることができる［５］。従って、ビスホスホネートの蛍光プローブは、造影研究における生物学的プローブとして強い関心が持たれている。
【０００５】
放射性同位体で標識された造影プローブと比較して、蛍光プローブは、低い毒性を潜在的に長期にわたって提供することができる高感度プローブになり得る［６］。組織の自家蛍光は、７００−１０００ｎｍの光学窓において最小化されるため、この発光波長を示す近赤外（ＮＩＲ）造影プローブは、in vivo造影のためには理想的である［７］。洗練されたＮＩＲ蛍光支援術中（ＮＩＲ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ）イメージングシステム（ＦＬＡＲＥ（商標））が、乳癌のためのセンチネルリンパ節マッピングを受ける女性における、人間で最初の試験において、最近導入され、使用された［８］。このシステムを臨床的にうまく移行させると、画像誘導の腫瘍手術のためのＮＩＲ造影の利点も提供され［９］、また、疾患の予後におけるＮＩＲ造影や、リアルタイムでの治療効果のモニタリングの大きな可能性を示すこととなる［１０］。
【０００６】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（商標）およびカルボキシフルオロセインに結合された初期世代のＮ−ＢＰ類（アレンドロネート［１１］およびパミドロネート［５ａ、１２］）は、以前に報告されているが、細胞活性がないことが報告された［１１］。同様に、Ｐａｍ７８、Ｐａｍ８００、並びに、市販のＯｓｔｅｏＳｅｎｓｅ（商標）６８０ＥＸおよび７５０ＥＸを含む、パミドロネートの近赤外類似体もまた、in vitroおよびin vivoで可視化されているが、それらの薬理学的活性は、実証されていない。それらの合成化学は、低収率または複雑な精製手順のいずれかに悩まされている［５ａ、１２］。一般に、アレンドロネート／パミドロネートは、活性化された色素のカルボキシル体に結合され、Ｎ−ＢＰの末端アミノ基をアミド結合に変換し、それによって、元のＮ−ＢＰにおける鍵となる薬理作用基が大幅に変わる。活性化された蛍光標識による、Ｎ−ＢＰ類におけるアミノ窒素の直接アシル化は、リセドロネート（ＲＩＳ、スキーム１の１ａ）、ゾレドロネート（ＺＯＬ、スキーム１の１ｄ ）、および、ミノドロネート（ＭＩＮ、スキーム１の１ｅ）等の、第一級アミノ基を欠いた、比較的強力な現代の複素環式Ｎ−ＢＰ薬物には、容易に適用できない。従って、目的とする標識（タグ）や分子にＮ−ＢＰ類を結合させるための新たな方法が望まれている。
【発明の概要】
【０００７】
一の態様では、蛍光色素と、ゾレドロネート、リセドロネートおよびミノドロネート等の複素環式ビスホスホネート薬物とを結合させる新しい方法が提供される。この方法は、医療機関で使用されるあらゆる複素環式ビスホスホネート薬物またはそのホスホノカルボキシレート類似体を、リンカーを介して蛍光色素と組み合わせたツールキットの合成を可能にした。ツールキットは、リンカー方策を用いて、適切に活性化されたあらゆる可視色素または近赤外色素と、現代のあらゆる複素環式ビスホスホネート薬物とを組み合わせることができ、それによって広範囲の骨親和性および蛍光特性、並びに、生物学的活性の有無を獲得する、という概念を包含するものである。ツールキットの創造は、既に開示されたリンカー法を取り入れるものの、さらなるビスホスホネート薬物への結合を与える新規な方法を提供し、他にも利点を有する。
【０００８】
窒素含有ビスホスホネートは、（１−ヒドロキシ−２−ピリジン−３− イルエタン −１，１−ジイル）ビス（ホスホン酸）１、[ヒドロキシ（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）メチレン]ビス（ホスホン酸）、｛１−ヒドロキシ−３−[メチル（ペンチル）アミノ]プロパン−１，１−ジイル}ビス（ホスホン酸）、（３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジイル）ビス（ホスホン酸）、および、（４−アミノ−１−ヒドロキシブタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホン酸）などの、臨床的に関連するＮ−ＢＰ類を含む。
【０００９】
一の態様では、骨組織に使用するためのツールキットが提供される。ツールキットは、造影標識に結合した、複数の、Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を包含し、造影標識に結合したＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、様々な物理的特性、光学的特性（表１参照）および生物学的特性といった、予め選択された特性を示すことができる。光学的特性としては、２００ｎｍおよび９００ｎｍの範囲の光吸収および発光周波数を挙げることができるが、これらに限定されない。物理的特性としては、高結合性から低結合性まで変動する、骨ミネラルへの結合親和性が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的特性としては、高活性からほぼ無活性まで変動する抗プレニル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ツールキットとしては、造影標識に結合された、Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を含み、表１に挙げられており、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ１）、５−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ２）、６−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ３）、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳ（７ａ４）、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ（７ａ５）、ＡＦ６４７−ＲＩＳ（７ａ６）、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ１）、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ２）、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ３）、ＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣ（７ｂ４）、５（６）−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ（７ｃ１）、５（６）−ＲｈＲ−ｄＲＩＳ（７ｃ２）、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ１）、６−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ２）、ＡＦ６４７−ＺＯＬ（７ｄ３）、８００ＣＷ−ＺＯＬ（７ｄ４）、スルホ−Ｃｙ５−ＺＯＬ（７ｄ５）、５−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ１）、６−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ２）、５−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ１）、および、６−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ２）からなる群から選択される。
【００１１】
別の態様においては、骨、骨代謝、骨と薬物との相互作用、骨へのＢＰ投与、もしくは骨内のＢＰ分布、またはそれらの任意の組み合わせ、を分析するための方法が提供される。この方法は、ツールキットにおける、造影標識に結合されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体、または薬学的に許容されるその塩に、骨を暴露することを包含する。この方法では、骨は、被験者の身体の内部にあってもよく、または他の場合には、骨は、被験者から除去され、被験者の身体の外部にあってもよい。
【００１２】
さらなる態様においては、治療を要する被験者において骨または骨関連疾患を治療するための方法が提供される。この方法は、ツールキットにおける、造影標識に結合されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体、または薬学的に許容されるその塩、の１種以上を用いて被験者を治療すること、１種以上のビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を、in situで蛍光によって被験者において可視化することを含む。疾患としては、骨粗しょう症、パジェット病、顎の骨壊死、または、例えば骨への転移性の癌または多発性骨髄腫等の、あらゆる骨関連癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
さらなる態様において、治療を必要とする被験者における骨または骨関連疾患を治療し、且つ、被験者において１種以上のビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体をin situでの蛍光によって可視化するための組成物が提供され、その組成物は、ツールキットにおける、造影標識に結合されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体、または薬学的に許容されるその塩の１種以上を含む。
【００１４】
別の態様において、骨造影キット（ツールキット）を製造する方法が提供される。この方法は、Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体の複数と、活性化された造影標識とを組み合わせて、予め選択された広範囲の物理的、光学的および生物学的特性を示し且つ造影標識に結合されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体、または薬学的に許容されるその塩のツールキットを作り出すものであり、アンモノライズされたハロゲン含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体、および、アミノ基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体と、活性化された造影標識とを反応させることによって、造影標識を、Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体に結合させる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、アンモニアとの反応によってハロゲン化アルキル部分をアルキルアミンに変換させて、その後、サクシニミジルエステルなどの当業者に知られた活性化カルボキシレート基を含む造影標識と反応させることによって、ハロゲン含有リンカー−Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体の複合体に、造影標識を結合させることができる。あるいは、ジシクロヘキシルジカルボンイミドといった当業者に知られた活性化試薬が、未修飾のカルボキシレート基と共に使用されてもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、造影標識に結合されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、表１に含まれ、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ１）、５−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ２）、６−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ３）、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳ（７ａ４）、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ（７ａ５）、ＡＦ６４７−ＲＩＳ（７ａ６）、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ１）、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ２）、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ３）、ＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣ（７ｂ４）、５（６）−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ（７ｃ１）、５（６）−ＲｈＲ−ｄＲＩＳ（７ｃ２）、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ１）、６−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ２）、ＡＦ６４７−ＺＯＬ（７ｄ３）、８００ＣＷ−ＺＯＬ（７ｄ４）、スルホ−Ｃｙ５−ＺＯＬ（７ｄ５）、５−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ１）、６−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ２）、５−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ１）、および６−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ２）からなる群より選択される。
【００１７】
さらなる態様では、修飾されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を製造する方法が、提供される。この方法は、ａ）Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を、ハロエポキシドと反応させて、ハロゲン含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を作り出すこと、および、ｂ）ハロゲン含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を、アミノ基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体に変換すること、を備える。
【００１８】
上記方法のいくつかの実施形態では、ａ）Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、下記式を有し、
【化１】
2018517121.tif 000003
ｂ）ハロゲン含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、下記式を有し、
【化２】
2018517121.tif 000004
または、ｃ）アミノ基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、下記式を有する。式中、Ｒ１は、イミダゾール、ピリジン、イミダゾ［３，２−ａ］ピリジンであり、Ｒ２は、ＨまたはＯＨである。また、Ｒ３は、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２またはＣ（Ｏ）ＯＨである。
【化３】
2018517121.tif 000005
【００１９】
上記方法の特定の実施形態において：
ａ）イミダゾールは、
【化４】
2018517121.tif 000006
またはその類似体であり、
ｂ）ピリジンは、
【化５】
2018517121.tif 000007
またはその類似体であり、
また、ｃ）イミダゾ［３，２−ａ］ピリジンは、
【化６】
2018517121.tif 000008
またはその類似体である。
【００２０】
類似体は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンがアルキル置換された及び／又はハロゲン置換されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ハロエポキシドは、エピクロロヒドリンである。
【００２２】
類似体は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンがアルキル置換された及び／又はハロゲン置換されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２３】
いくつかの実施形態では、上記方法は、アミノ基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体のアミノ基と、以下のものに限定されないが、いずれも活性化された状態で、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ローダミンレッドＸ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ Ｘ）、Ｘ―ローダミン（Ｘ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷ、またはスルホ−Ｃｙ５（Ｓｕｌｆｏ−Ｃｙ５）などの造影標識とを、反応させることをさらに備える。いくつかの実施形態では、造影標識は、蛍光色素を含み、斯かる蛍光色素は、アミノ基との反応のための、活性化スクシンイミジルエステル含有の蛍光色素であってもよい。
【００２４】
上記方法のいくつかの実施形態では、造影標識とアミノ基との反応は、下記式に示された、Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を生成させる。
【化７】
2018517121.tif 000009
ここで、Ｒ１は、イミダゾール、ピリジン、イミダゾ［３，２−ａ］ピリジンであり、Ｒ２はＨまたはＯＨである。Ｒ３は、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２またはＣ（Ｏ）ＯＨである。また、Ｒ４は蛍光色素を含む。特定の実施形態において、蛍光色素は、いずれも活性化された状態の、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ローダミンレッドＸ、Ｘ−ローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷ、またはスルホ−Ｃｙ５（Ｓｕｌｆｏ−Ｃｙ５）であってもよい。
【００２５】
上記方法のいくつかの実施形態では、蛍光標識されたアミノ基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体の収率は、約５０％−７７％である。
【００２６】
別の態様では、修飾されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を製造する方法が提供される。この方法は、下記のことを備える。
ａ）エステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体と、保護されたアミノ基を有するエポキシドとを反応させて、保護されたアミノ基およびヒドロキシ基を含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を生成させること、
ｂ）保護されたアミノ基およびヒドロキシ基を含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を、スルホニルハライドと反応させて、保護されたアミノ基を含有しスルホニル化され且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を生成させること、
ｃ）保護されたアミノ基を含有しスルホニル化され且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を、アジドと反応させて、保護されたアミノ基およびアジド基を含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を生成させること、および、
ｄ）保護されたアミノ基およびアジド基を含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を脱保護させて、アジド基およびアミノ基を含有するＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を生成させること。
【００２７】
上記方法のいくつかの実施形態において：
ａ）エステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、下記式を有し、
【化８】
2018517121.tif 000010
ｂ）保護されたアミノ基およびヒドロキシ基を含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、下記式を有し、
【化９】
2018517121.tif 000011
ｃ）保護されたアミノ基を含有しスルホニル化され且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、下記式を有し、
【化１０】
2018517121.tif 000012
ｄ）保護されたアミノ基およびアジドを含有し且つエステル保護されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、下記式を有し、
【化１１】
2018517121.tif 000013
または、ｅ）アジド基およびアミノ基を有するＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体は、下記式を有する：
【化１２】
2018517121.tif 000014
式中、Ｒ＝Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、またはｉＰｒであり、Ｒ１は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンであり、Ｒ２は、ＨまたはＯＨである。また、Ｒ３は、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２またはＣ（Ｏ）ＯＨである。
【００２８】
上記方法の特定の実施形態において：
ａ）イミダゾールは、
【化１３】
2018517121.tif 000015
またはその類似体であり、
ｂ）ピリジンは、
【化１４】
2018517121.tif 000016
またはその類似体であり、
また、ｃ）イミダゾ［３，２−ａ］ピリジンは、
【化１５】
2018517121.tif 000017
またはその類似体である。
【００２９】
類似体は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンがアルキル置換された及び／又はハロゲン置換されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３０】
上記方法の特定の実施形態において、エポキシドは、下記式を有し、 
【化１６】
2018517121.tif 000018
スルホニルハライドは、塩化メタンスルホニルであり、または、アジドは、ＮａＮ３であり、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００３１】
上記方法のいくつかの実施形態において、該方法は、アジド基もしくはアミノ基、またはこれらのそれぞれを独立させて、下記ａ）〜ｇ）からなる群の物質と反応させることをさらに備え、ａ）以下に限定されないが、（６）−カルボキシフルオレセイン、ローダミンレッドＸ、Ｘ−ローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷ、およびスルホ−Ｃｙ５といった蛍光色素、または、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ＱＳＹ７、およびＱＳＹ９といった蛍光消光剤、などの造影標識；ｂ）以下に限定されないが、例えばＮ−ビスホスホネートなどの骨の障害の治療に有効な化合物、癌の治療に有効な化合物、または、抗生物質もしくは抗ウイルス薬などの、微生物感染によって引き起こされる疾患の治療に有効な化合物、といった薬剤； ｃ）タンパク質;ｄ）ペプチド；ｅ）オリゴヌクレオチド; ｆ）ナノ粒子；およびｇ）ポリマー。特定の実施形態において、上記の物質は、アミノ基との反応のための活性化されたスクシンイミジルエステルを含有するか、または、アジド基と反応するためのアルキンを含有する。
【００３２】
上記方法のいくつかの実施形態では、アジド基およびアミノ基を含むＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体の収率は、約２８％である。
【００３３】
別の態様において、アジド基およびアミノ基を含有する、二官能性のＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体が、提供される。いくつかの実施形態において、この化合物は、下記式を有し、
【化１７】
2018517121.tif 000019
Ｒ＝Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、またはｉＰｒであり、Ｒ１は、イミダゾール、ピリジン、イミダゾ［３，２−ａ］ピリジンであり、Ｒ２は、ＨまたはＯＨである。また、Ｒ３は、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２またはＣ（Ｏ）ＯＨである。
【００３４】
特定の実施形態において；
ａ）イミダゾールは、
【化１８】
2018517121.tif 000020
またはその類似体であり、
ｂ）ピリジンは、
【化１９】
2018517121.tif 000021
またはその類似体であり、
また、ｃ）イミダゾ［３，２−ａ］ピリジンは、
【化２０】
2018517121.tif 000022
またはその類似体である。
【００３５】
類似体は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンがアルキル置換された及び／又はハロゲン置換されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３６】
さらなる態様において、物質に結合したＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を含む、組成物が提供される。いくつかの実施形態において、斯かる組成物は、下記式を有し、
【化２１】
2018517121.tif 000023
ここで、Ｒ１は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンであり、Ｒ２は、ＨまたはＯＨであり、Ｒ３は、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２またはＣ（Ｏ）ＯＨである。また、Ｒ４は、造影標識、薬物、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、およびポリマーからなる群から選択された物質を含む。
【００３７】
特定の実施形態において,:
ａ）イミダゾールは、
【化２２】
2018517121.tif 000024
またはその類似体であり、
ｂ）ピリジンは、
【化２３】
2018517121.tif 000025
またはその類似体であり、
また、ｃ）イミダゾ［３，２−ａ］ピリジンは、
【化２４】
2018517121.tif 000026
またはその類似体である。
【００３８】
類似体は、イミダゾール、ピリジン、またはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジンがアルキル置換された及び／又はハロゲン置換されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３９】
いくつかの実施形態において、上記の物質は、蛍光色素または蛍光消光剤であり、特定の実施形態において、蛍光色素は、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ローダミンレッドＸ、Ｘ−ローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷ、またはスルホ−Ｃｙ５であってもよい。蛍光消光剤は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ＱＳＹ７、またはＱＳＹ９であってもよい。
【００４０】
別の実施形態では、修飾されたＮ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を製造する方法が、提供される。この方法は、アジドエポキシドと、Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体とを反応させて、アジド含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体を生成させることを備える。
【００４１】
上記方法のいくつかの実施形態では、アジドエポキシドは、
【化２５】
2018517121.tif 000027
である。
【００４２】
この方法のいくつかの実施形態において、ａ）この方法は、造影標識、薬物、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、およびポリマーからなる群の物質に、アジド含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体のアジド基を、反応させることをさらに備え、上記物質は、アジド基との反応のためのアルキン基を含み; ｂ）この方法は、アジド基含有Ｎ−複素環式ビスホスホネート−リンカー化合物のアジド基を、第一級アミノ基に還元し、次に、造影標識の活性化カルボン酸エステル基と、第一級アミノ基とを反応させることによって、造影プローブを製造するために使用することができ、; ｃ）造影標識は、蛍光色素であってもよく；ｄ）Ｎ−複素環式ビスホスホネートは、他の方法や、本発明の他の態様の実施形態で使用されるために説明されたＮ−複素環式ビスホスホネートのいずれであってもよい。
【００４３】
上述した方法、組成物、治療、分析方法、ツールキットのいずれにおいても、造影標識は、近赤外スペクトル範囲で確認できる吸収スペクトルおよび発光スペクトルを有するいかなる蛍光分子であってもよく、造影目的に適したシグナルを生じるいかなる分子であってもよい。いくつかの実施形態では、造影標識は、蛍光標識だけでなく放射性標識も含有することができる。
【００４４】
一般的には、Ｎ−複素環式ビスホスホネートまたはそのホスホノカルボキシレート類似体のあらゆる実施形態におけるアミノ基は、アミノ基と容易に反応する性質の活性化エステル誘導体へと変換されたカルボン酸基を含む蛍光色素を用いることによって、蛍光色素などの造影標識に結合されてもよい。
【００４５】
より完全な本発明の理解のために、添付の図面と併せて以下の説明をここに参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｂは、蛍光ビスホスホネート「ツールキット」の合成を表すスキーム１の描写である。図１Ａにおいて、条件は、Ａ（１）：約５％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、４０〜５０℃；  Ａ（２）：１：１  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、室温；  Ｂ（１）：Ｈ２Ｏ、室温；  Ｂ（２）：ＮＨ３・Ｈ２Ｏ、室温；  （Ｃ）：ＦＡＭ，ＳＥ（８）、ＲｈＲ−Ｘ，ＳＥ（９）、ＲＯＸ，ＳＥ（１０）、ＡＦ６４７，ＳＥ（１１）または８００ＣＷ，ＳＥ（１２）、ＮａＨＣＯ３／ＤＭＦ、ｐＨ８．３−９．０、室温、暗条件下。
【図１Ｂ】図１Ｂにおいて、特定の実施形態が記載。
【図２】図２は、二官能性アジド含有Ｎ−複素環式ビスホスホネート（アミノ−アジド −パラ−ｄＲＩＳ）の概略図である。影付きの星形および三角形は、蛍光標識、目的とする薬物分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子またはポリマーなどの、同じであっても異なっていてもよい、結合された材料を表す。
【図３】図３は、蛍光ＢＰプローブのＨＡＰカラム結合アッセイの結果を示すグラフである。データは、ＲＩＳ（ＦＡＭ複合体；５（６）−ＲｈＲ複合体；５（６）−ＲＯＸ複合体；ＡＦ６４７複合体；８００ＣＷ複合体が図示）に対して正規化された相対保持時間として、３つの個別の試験からの平均±ＳＤによって示されている。
【図４−１】図４は、ＨＡＰカラム上の４つの蛍光ＢＰ／ＰＣプローブの結合のための吸着等温線のグラフのパネルである。図において、図４Ａ：５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ；  図４Ｂ：５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ；  図４Ｃ：ＡＦ６４７−ＲＩＳ；   図４Ｄ：ｐＨ６．８でのＨＡＰへのＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣ、であり、それぞれの吸着等温線のグラフの下に、同じデータのスキャッチャードプロット（Scatchard plot）を含む。データは、平均±ＳＤである（ｎ＝３）。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５−１】図５は、いくつかの蛍光ＢＰ造影プローブにおける、プレニル化アッセイおよびＪ７７４．２細胞生存率アッセイの結果のパネルである。図において、図５Ａ−５Ｃは、非プレニル化Ｒａｐ１Ａ（ｕＲａｐ１Ａ）におけるウェスタンブロットアッセイの結果を示す。ＲＩＳ（Ａ）、ｄＲＩＳ（Ｂ）、およびＺＯＬ（Ｃ）の蛍光類似体の１０μＭもしくは１００μＭ、そのままのＢＰ、または媒体で、２４時間、Ｊ７７４．２マクロファージをそれぞれ処理した。βアクチンの検出は、ローディングコントロールとして提供された。非プレニル化Ｒａｐ１Ａおよびβアクチンの存在量比が、各サンプルについて染色部分以下に示されている。図５Ｄ−５Ｆは、Ｊ７７４．２マクロファージの細胞生存率アッセイの結果を示す。次に、ＲＩＳ（Ｄ）、ｄＲＩＳ（Ｅ）、およびＺＯＬ（Ｆ）の蛍光類似体の１０μＭ、１００μＭ、または５００μＭ、そのままのＢＰ、または媒体で、４８時間、細胞をそれぞれ処理した。 結果は、独立して少なくとも２回実施した試験の平均値±ＳＤとして示されている。
【図５−２】図５−１の続き。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
いくつかの実施形態において、可変分光特性、骨ミネラル結合親和性、および薬理活性を有し、例えば２１の蛍光プローブを含有する、骨造影ツールキットが、２つの相補的な結合方策を使用して作り出される。臨床的に重要な３つの複素環式ビスホスホネートの骨薬物（リセドロネート、ゾレドロネート、およびミノドロネートまたはその類似体）のいずれかに、近赤外域で認識され幅広く選択される蛍光色素を結合させることが、結合化学によって可能になる。その一連の結果によって提供されることは、単独でまたは組み合わせて骨関連の造影用途で使用するときに、プローブにおける蛍光発光波長、相対的な骨への親和性、および、抗プレニル化活性の有無を「うまく組み合わせる」ために柔軟性が大きく向上し選択肢が多いことである。
【００４８】
最近、本発明者らは、いわゆる「マジックリンカー（magic linker）」合成（スキーム１、経路Ａ）［１３］を取り入れて、ＲＩＳ（１ａ）または関連するホスホノカルボキシレート（ＰＣ、１ｂ）類似体と、５（６）−カルボキシフルオレセイン（８）とから作り出された、蛍光標識された複素環式Ｎ−ＢＰの最初の例を製造した。良好な位置選択性で、非常に温和な条件下（中性に近いｐＨ、水性アルコール、４０℃）において、複素環式ビスホスホネート薬物へ一般的なリンカー基を付加するために、合成は、エポキシド誘導体５を用いることに特に注力した。生成物２ａ−２ｃの脱保護の後、得られた薬物−リンカー複合体４ａ−４ｃは、好都合なことに、ａ）造影色素の活性化エステルへ容易に結合するためのリンカー部分における第一級アミン、ｂ）酵素触媒反応におけるＦＰＰＳ中間体カルボカチオン［１４］に類似する、正に荷電したピリジニウム窒素、および、ｃ）疎水性アルキル鎖［１３］の付加に関連して低下した水溶性を補うための、追加されたヒドロキシ基を含んでいた。
【００４９】
広範囲の構造特性および分光特性を有する蛍光色素分子と組み合わせ、その結果、異なるプローブが同じ造影アッセイにおいて可視化することができる生物学的実験を可能にする蛍光ビスホスホネート「ツールキット」を作り出し、このアプローチをより多様なＮ−ＢＰ類およびそれらの類似体に大幅に拡張することが望ましい、と証明された。いくつかの実施形態は、相補的な合成経路を利用して、臨床用の３つの複素環式Ｎ−ＢＰのいずれの薬物も含む蛍光ビスホスホネートプローブ「ツールキット」を簡単に且つ適応性よく作り出すことを提供する。プローブは、良好な収率（５０から７７％）および高純度（＞９５％）で製造することができ、１Ｈ ＮＭＲ、３１Ｐ ＮＭＲ、ＵＶ−ＶＩＳ、蛍光発光、高分解能質量分析、およびＨＰＬＣによって、完全に特徴付けることができる。類似のプローブは、ＯＮＪのメカニズム［１５］、耳硬化症［１６］、および、腫瘍細胞におけるビスホスホネート輸送におけるマクロファージの役割の発見［１７］の研究に適用されつつある。
【００５０】
蛍光ビスホスホネート「ツールキット」を構築するための代替のアプローチは、図１のスキーム１に描かれている。Ｎ−ＢＰ類やＰＣ類（１ａ−１ｆ）は、既存の合成経路（Ａ）または新たな合成経路（Ｂ）を経由して、適切な「マジックリンカー」エポキシド（５または６）と複合化されることができ、その後、蛍光色素（例えば、市販されているスクシンイミジルエステルを利用することができる）の様々な基のいずれかの活性化エステルと反応させることができる、ＢＰ−リンカー中間体またはＰＣ−リンカー中間体をそれぞれ得て、最終的な蛍光造影プローブを得ることができる。
【００５１】
別の態様では、造影プローブおよび他の用途として使用するための二官能性ビスホスホネートが提供され、これには、他のＮ−複素環式デオキシ−ビスホスホネートおよびその関連類似体に適応可能な、ｄＲＩＳ、ｄＲＩＳＰＣ等のようなパラ−ｄＲＩＳに基づくアミノ／アジド含有二官能性Ｎ−複素環式ビスホスホネートの製造が包含される。２つの官能基である、アジド基およびアミノ基は、一緒に導入されて二重の複合化を可能にし、いくつかの実施形態において導入されたアルキル鎖は、アルキル基固有の疎水性に起因するＨＡＰの結合親和性に対する潜在的影響を最小限に抑えるために、炭素を３つだけ有する。二官能性ヒドロキシ／アジド含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートは、ＲＩＳ、ＺＯＬおよびＭＩＮといったものに限定されないが、このような実際の薬物に一般的な方法を拡大適用する。また、蛍光標識、薬物運搬物、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、およびポリマーなどを含む多くの他の分子へ、新規なリンカーを介して上記のビスホスホネートを結合させるための、迅速かつ選択的な方法が提供される。この方法は、骨／骨材試料における薬物の高感度な検出のための基礎技術を提供する。
【００５２】
いくつかの態様では、アミノ／アジドを含有する二官能性Ｎ−複素環式ビスホスホネート（アミド−アジド−パラ−ｄＲＩＳ、２０、および図２）の合成が、造影プローブの製造のためのクリック反応性を有する化合物を用いて、提供される。これら実施形態におけるＮ−複素環式ＢＰは、デオキシ−ＲＩＳ（パラ−ｄＲＩＳ）の類似体であり、２つの官能性基であるアミノ基とアジド基とは、連続して導入され、例えば、一方の基が造影標識と反応し、他方の基が、薬物、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、蛍光消光剤などと反応することを可能にする。加えて、これら実施形態において導入されたアルキル鎖は、アルキル基固有の疎水性に起因するＨＡＰの結合親和性への潜在的影響を最小限に抑えるために、炭素を３つだけ有する。
【００５３】
さらなる態様において、複素環式窒素含有ビスホスホネートを検出するためのリンカーを含有する、アジド含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートが提供される。１ａ−ｄのような、リセドロネート、ゾレドロネート、またはミノドロネートといった、骨において臨床的に使用される窒素含有複素環式ビスホスホネートの検出に利用可能な、高感度且つ便利な非放射性トレーサー（追跡物）の分析方法が現在のところ無いため、アジド−ＲＩＳと標識化アルキンとの合成およびクリック反応が図示されたスキーム２に示すように、窒素含有複素環式ビスホスホネートとアジドエポキシド３１とを選択的に結合させて、リンカー中間体３２を作り出すことを含む方法が、開発される。化合物３２は、次に、蛍光色素、または、末端アルキン基（３３）を含む他のラベルと結合して、結合された複合体３４を作り出すか、あるいは、限定されないが接触水素化などの一般的な方法によって、アジド基は、第一級アミノ基に還元される。第一級アミノ基を作り出すことによって、スクシンイミジルエステルなどの活性化基を含む蛍光または他のラベルを追加するための複合化が、可能になる。得られた窒素含有ビスホスホネートの蛍光色素複合体は、その蛍光発光によって検出することができる。スキーム２の例では、Ｎ−複素環式ビスホスホネート１ａ（リセドロネート）を、グリシジルアジド３１と結合させて、アジド含有ビスホスホネートリンカー３２を得て、続いてこのリンカーは、蛍光ラベルされたビスホスホネート３４を提供するために、蛍光ラベルされたアルキン３３と反応させることができる。
【化２６】
2018517121.tif 000028
【００５４】
様々な態様において、骨造影蛍光プローブ「ツールキット」が合成される。新しい経路を有する結合方策が開発され、現状の「マジックリンカー」方法と一緒になって、穏やかな条件下で、臨床的に関連する複素環式Ｎ−ＢＰ類および関連類似体の全てに、活性化された蛍光色素を結合させることが可能となる。全ての蛍光プローブは、良好な収率（５０−７７％）および高純度（＞９５％）で製造することができる。親薬物の様々な親和性を反映しつつ、蛍光プローブは、通常、骨ミネラルに対する実質的な親和性を保持する。複合化された蛍光色素は、そのようなプローブを用いて得られたデータを解釈する際の留意事項となる、プローブのミネラル親和性における影響力（通常わずかな減少であるが、ある場合には増強）をある程度与える。ＦＡＭとの複合体は、親ＢＰの抗プレニル化活性を実質的に保持し、これらのプローブを使用した局在化と生物学的活性とを関連付けることが可能である。「ツールキット」を含むプローブの多様な薬理学的特性および分光学的特性は、例えば、骨関連の造影化研究［１５ａ、１７，２５，２７−２８］において、非常に有用となる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、アミノ／アジド含有二官能性Ｎ−複素環式ビスホスホネート（アミノ−アジド−パラ−ｄＲＩＳ、７）が合成され、そして、ＣｕＡＡＣのクリック反応を経由した蛍光プローブの製造においてうまく適用された。パラ−ｄＲＩＳに基づく合成方策は、ｄＲＩＳ、ｄＲＩＳＰＣ等のような他のＮ−複素環式デオキシビスホスホネートおよびその関連類似体に拡張することができる。さらに、２つの官能基である、アジド基およびアミノ基は、この方策によって一緒に導入することができ、二重の複合化を可能にし、導入されたアルキル鎖は、いくつかの実施形態において、３つの炭素だけを有してもよく、アルキル鎖固有の疎水性に起因するＨＡＰの結合親和性への潜在的影響を最小限に抑えることができる。
【００５６】
治療に関連する実施形態において、本発明の化合物の実施形態を医薬組成物として調製することができる。医薬組成物は、化合物、および、薬学的に許容される担体、および／または、希釈剤を含む。化合物は、目的とする特定の疾患を治療するために有効な量で組成物中に存在し、好ましくは患者に許容される毒性を有する。典型的には、医薬組成物は、投与経路に応じた量で、本発明の化合物を含んでもよい。適切な濃度および投与量が、当業者によって容易に決定され得る。
【００５７】
薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、当業者によく知られている。液状溶液として調製された組成物のために、許容される担体および／または希釈剤は、生理食塩水および滅菌水を含み、必要に応じて、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および他の一般的な添加剤を含んでもよい。丸剤、カプセル剤、顆粒剤、または錠剤として調製された組成物のために、組成物は、活性化合物に加えて、分散剤や界面活性剤、結合剤、および潤滑剤のような他の物質を含有できる。適切な方法で、また、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.1990に開示されているような、許容される実践方法に従って、当業者は、化合物をさらに調製してもよい。
【００５８】
本発明は、例示のみを目的としいかなる意味においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない、添付の実施例を参照することによって、より良好に理解することができる。
【実施例】
【００５９】
（実施例１）
図１のスキーム１は、蛍光ビスホスホネート「ツールキット」を作り出すための代替アプローチを示す。
【００６０】
この報告書で検討された、３つの複素環式Ｎ−ＢＰ類の窒素原子の求核性およびルイス塩基性は、変動するものであり［１８］、これらの特性は、それらの複合化反応の主要な決定因子であると考えられる。従って、ＲＩＳのための「マジックリンカー（magic linker）」方法論によると、ＺＯＬ（１ｄ）、ＭＩＮ（１ｅ）、およびそれらに関連する類似体（１ｆ）には変更が必要であった。ΔＧ０≠の順位（ΔＧ０＝０のときのプロセスの活性化自由エネルギーとして定義）は、イミダゾール＞ピリジン＞ １−アザビシクロオクタンの通りであり、求電子種とイミダゾールとの反応のための再編成エネルギーは、他のアミンとの反応におけるものよりも有意に高いこと、また、イミダゾールは、同等の塩基性のピリジンよりも、求核性が低いことが示されている［１９］。異なるｐＨにおけるヘテロ原子のプロトン化状態も、反応性に重要である。例えば、ＲＩＳ、ＺＯＬ、およびＭＩＮの複素環式窒素のｐＫａは、それぞれ５．６７、６．６７、および６．５４であり［２０］、過去におけるＲＩＳの「マジックリンカー（magic linker）」合成では、結合工程における反応混合物のｐＨを６．０に調整した。このような条件下で、５０％よりも高い（計算上約７１．３％）ＲＩＳの窒素が脱プロトン化され、エポキシド環を求核的に攻撃できることとなる［１３］。しかし、ｐＨ６．０では、ＺＯＬの窒素のわずか１８％（ＭＩＮでは２２％）が脱プロトン化され、従って、この反応は、ｐＨ６．０で非常に遅かった（２ｄ）。ｐＨ７．０〜７．５では、反応がより迅速であったが、１ｄ、１ｅ、１ｆのための位置選択性（Ｎ−アルキル化  対  Ｏ−アルキル化）は、ＲＩＳおよびその類似体（１ａ、１ｂ、１ｃ）ほど良好ではなかった。１０〜２０％の副生成物を観察することができ、この副生成物は、ＨＰＬＣ、ＮＭＲおよびＭＳによって、Ｎ，Ｏ（Ｐ）−ジアルキル化（Ｏ−アルキル化は、薬物のホスホネート基／カルボキシレート基とエポキシドとの間で生じる）の生成物であることが確認された。ＭｉｎＰＣ（１ｆ）−エポキシド（５）カップリングの反応速度は、同じ反応条件（同一の反応比、ｐＨ７．５、４０−４５℃）下で、ＺＯＬよりも遅く、これは大きな複素環からの立体効果によると推察される。また、副生成物の割合は、比較的高く、Ｏ−アルキル化生成物も、反応混合物中に観察された。
【００６１】
従って、新しいリンカー前駆体として市販のエピクロロヒドリン６を研究した。安価であることに加えて、エポキシド５と比べてより水溶性であり、より反応性である。エピクロロヒドリンを、化合物１ａ−１ｆと反応させ、中間体３ａ−３ｆを得て、これをアンモノライズ（Ａｍｍｏｎｏｌｙｚｅ）して、最終的な薬物−リンカー複合体４ａ−４ｆを製造した。複合化（スキーム１、経路Ｂ、１ａ−１ｆ→３ａ−３ｆ）は、以前の経路（スキーム１、経路Ａ、１ａ−１ｆ→２ａ−２ｆ）と比較して、同じ反応比およびｐＨ下において、室温でも、より高い速度で進行した。１ｄ−１ｆの副生成物の割合は、経路Ａの場合と同様であった。副生成物が生成されることは、５当量のエピクロロヒドリンを用いた１ａの反応では、観察されなかった（図Ｓ５）。従って、４ａ−４ｃの合成のためには経路Ａを維持する一方で、４ｄ−４ｆの合成のためには経路Ｂを選ぶことを決定した。適切なｐＨ（薬物に依存した７．４−８．０）で、１：５（薬剤：リンカー（６）の反応比を採用した。室温で最大２０時間で、７０−８５％の４ｄ−４ｆが得られた。次の工程において、活性化された蛍光色素との複合化のための純粋な４ｄ−４ｆを分取アニオン交換ＨＰＬＣによって得た。
【００６２】
アセトニトリル中における、エピクロロヒドリンとピリジンまたはイミダゾールとの反応は、エポキシド環が開く代わりに塩素が置換されてエポキシド誘導体を作り出す、ピリジンまたはイミダゾール窒素の求核攻撃をもたらすことを、Demberelnyambaらが報告した［２１］一方で、我々が発見したことは、水性条件下でのエピクロロヒドリンとＮ−ＢＰ類との反応が、単にエポキシドが開環した塩化アルキル生成物を生成させることである。
【００６３】
本発明者らは、Demberelnyambaらの結果を再現することができ、アセトニトリル中でエピクロロヒドリンとピリジンとを反応させると、質量分析および１Ｈ ＮＭＲ（ただし、本発明によって得られたＢの１Ｈ ＮＭＲは、Demberelnyambaらによって得られたものとは異なっていた）によって同定された、生成物Ｂ（スキーム３）のみを得た。
【化２７】
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【００６４】
驚くべきことに、メチレンビスホスホン酸でｐＨを６に調整した水中で、リセドロネート−エピクロロヒドリン複合化のために使用される条件に類似した１：１比で、ピリジンをエピクロロヒドリンと反応させたときに、本発明者らは、複合体ＡおよびＢの混合物（スキーム３）を６：１の比で得て、そして、１：５（ピリジン：エピクロロヒドリン）の反応比では、その比がＡ：Ｂ＝１：２となり、これは、ＲＩＳで観察される位置選択性にＢＰ部分が強く影響することを示唆している。
【００６５】
市販の３つの近赤外色素である、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ［登録商標］（アレクサフルオロ）６４７（ＡＦ６４７）、スルホ−Ｃｙ５、およびＩＲＤｙｅ［登録商標］ ８００ ＣＷ（８００ＣＷ）を含む、識別可能な発光スペクトルを有する一連の蛍光色素を、蛍光ビスホスホネートプローブ「ツールキット」を作り出すために選択した。異なる蛍光色素に対して同様の反応条件下で（スキーム１、工程iii）、反応比率および反応ｐＨをわずかに変更して、薬物−リンカー中間体（４ａ−４ｆ）と、蛍光色素のスクシンイミジルエステル（ＳＥ）との間で複合化をおこなった。反応は、速やかに進行し、ＴＬＣ（１００％ＭｅＯＨを溶離液として使用）によって簡便に追跡することができる。 純粋な蛍光ビスホスホネートプローブ（７ａ−７ｆ）を得るために、クロマトグラフィー分離が、概して有効であった。遊離した色素標識を生成物の混合物から除去するために分取ＴＬＣ（溶離液として１００％ＭｅＯＨ）を必要とした、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ、８）とローダミンＸレッド（ＲｈＲ−Ｘ、９）との複合体を除き、すべての蛍光複合体は、分取逆相ＨＰＬＣによってワンパス（補足データ）で直接的に精製することができた。全ての最終的な蛍光複合体は、ＨＰＬＣ、ＵＶ−ＶＩＳ、蛍光発光分光法、１Ｈ ＮＭＲおよび３１Ｐ ＮＭＲ、高分解能ＭＳによって、完全に特徴付けられた。５−および６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ、８）の異性体の複合体を、それぞれの純粋なＦＡＭ，ＳＥ異性体から直接合成することができること、あるいは、これに代えてＦＡＭ複合体の混合異性体から分離して安価に合成できることは、注目に値する。
【００６６】
製造されたプローブは、広く様々な光波長（表１）で蛍光を発し、細胞および組織中において個々に低い骨親和性および高い骨親和性を有するＢＰ類およびＰＣ類の同時検出を可能にする。異なる用途のためのプローブの選択を導くために、特に、プローブのＨＡＰ親和性と、タンパク質プレニル化への影響とについて、薬理学的に関連する特性を調査した。
【表１】
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【００６７】
ＢＰ類のミネラル結合親和性は、主にホスホネート基によって決定される一方で、Ｒ１−ＯＨ基は、その親和性をさらに高めることができる［１ａ、２２］。これは、（１つのホスホネートがカルボキシレートで置換された）ＲＩＳ、ＲＩＳＰＣ、ｄＲＩＳ（式中、Ｒ１は、Ｈである）の結合親和性を比較することによって実証され、親和性の順位は、ＲＩＳ＞ｄＲＩＳ＞ＲＩＳＰＣ  である［２３］。結合された蛍光色素が、ミネラル結合親和性に影響を与えるか否かを調べるために、ＨＡＰカラムにおける各蛍光ＢＰ複合体の保持時間を測定し、ＲＩＳの保持時間に対して正規化した。図３に示すように、５（６）−ＲＯＸ複合体は、その対応物よりもわずかに高い親和性を示すものの、蛍光複合体は、親化合物と同様の結合親和性を有する。ＡＦ６４７−ＲＩＳは、他の蛍光ＲＩＳ複合体に比べて相対的にＨＡＰ親和性の最も大きい減少を示すが、絶対的な強い結合親和性をそれでもなお維持している。
【００６８】
ｄＲＩＳ複合体とＲＩＳＰＣ複合体との間の差は統計的に有意ではなかったものの、同じ蛍光色素を有する、ＲＩＳ、ｄＲＩＳ、およびＲＩＳＰＣの各複合体の親和性の順位は、ＲＩＳ＞ｄＲＩＳ ／ ＲＩＳＰＣ  と同じままである。また、ラングミュア吸着等温線［２４］による、ＨＡＰについての、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ、ＡＦ６４７−ＲＩＳ、およびＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣの解離定数（Ｋｄ）および最大性能の測定は、ＨＡＰカラムアッセイの結果（図４）、および、以前のin vitro象牙質結合アッセイ［２５］の結果と、ほぼ一致する。
【００６９】
ＺＯＬおよびその蛍光複合体についての結果は、ＲＩＳの結果（図３）と同様である。ＨＡＰカラムにおいて、６−ＦＡＭ−ＺＯＬは、６−ＦＡＭ−ＲＩＳおよび５−ＦＡＭ−ＲＩＳ［１３］の結果と同様に、５−異性体よりもわずかに長い保持時間を有していた一方で、６−ＦＡＭ−ＭＩＮおよび５−ＦＡＭ−ＭＩＮは、親和性において同様であった（図３）。
【００７０】
Ｎ−ＢＰ薬物の主要な薬理学的活性は、タンパク質プレニル化の阻害、および、間接的に破骨細胞が媒介する骨吸収の阻害となる。非プレニル化Ｒａｐ１Ａ（ｕＲａｐ１Ａ）およびＪ７７４．２マクロファージ細胞生存率の検出法は、新規ＢＰおよびその関連類似体の薬理学的活性を評価するためのin vitroスクリーニング法として広く用いられている［１３，２６］。これらの方法において、ＰＣ類似体（ＲＩＳＰＣ、ＭＩＮＰＣ）は、Ｎ−ＢＰ類よりもはるかに活性が小さかったため、蛍光ＢＰおよびデオキシ−ＢＰ（ｄＲＩＳ）の複合体のみを分析した（図５）。
【００７１】
非プレニル化Ｒａｐ１Ａは、５−ＦＡＭ−ＲＩＳ−処理されたＪ７７４．２マウスマクロファージ、また、６−ＦＡＭ−ＲＩＳ処理されたものの両方からの細胞溶解物において、明確に検出できた（図５Ａ）。培養Ｊ７７４．２マクロファージ［１３］、および、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳ−処理したウサギ［２７］から単離された破骨細胞において、以前に報告されているように、メバロン酸経路に影響する能力をそれらが保持していると示唆される。５（６）−ＦＡＭ−ｄＲＩＳも活性を有し、親のＢＰ  ｄＲＩＳに匹敵する効力であった（図５Ｂ）。効力は、元のＺＯＬよりも弱いものの（図５Ｃ）、５−ＦＡＭ−ＺＯＬおよび６−ＦＡＭ−ＺＯＬの両方が、いくらかの活性を保持している。５−ＦＡＭ−ＺＯＬの抗吸収活性が、最近、in vivoでのラットモデルで実証された［１５ａ］。５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳも活性を示す（図５Ａ）。２つの近赤外線ＢＰ複合体である、ＡＦ６４７−ＲＩＳおよび８００ＣＷ−ＺＯＬで処理された細胞は、使用した濃度において、非プレニル化Ｒａｐ１Ａの蓄積を示さず、蛍光ＢＰプローブは不活性であることが示唆された。ＡＦ６４７−ＲＩＳ処理および８００ＣＷ−ＺＯＬ処理されたＪ７７４．２マクロファージが、高濃度で生存細胞数のわずかな減少を示すことを除いて、細胞生存率検出法の結果は、プレニル化アッセイに従ったもの（図５Ｄ−Ｆ）であり、例えば、カルシウムのキレート化によって増殖培地中の遊離カルシウムイオンの利用可能性が下がるといった、非特異的効果によるものと推察される。８００ＣＷおよびＡＦ６４７の大きな蛍光体の立体効果によって、これらの蛍光ＢＰ複合体の生物学的不活性を説明できると推察される。
【００７２】
実施例２
二官能性Ｎ−複素環式ビスホスホネート
Sharplessらによって最初に提案された後に、「クリック化学」の概念は、多くの注目を得た［２９］。彼らは、クリック化学反応の基準を満たす多くの反応、すなわち「モジュラー型であり、広範囲に及び、高収量であり、無害な副生成物のみを作り出し（つまり、クロマトグラフィーせずに除去することができる）、立体特異性があり、実施が簡単であり、安全であって簡単に除去できる溶媒を用いる」反応をも特定した。すべてのこれらのクリック反応のなかでも、特にＣｕ（Ｉ）触媒が劇的に反応を促進するだけでなく高い位置選択性を提供することがわかったときに［３２，３３］、１，２，３−トリアゾールを作り出すための、アルキンおよびアジドのヒュスゲン１，３−双極子付加環化反応は、間違いなく「最高のもの」であり、「中央台」に立つ［３０，３１］。銅（Ｉ）の触媒によるアルキン−アジドカップリング（ＣｕＡＡＣ）反応は、間違いなく最も強力なクリック化学反応となっており、創薬、ポリマーおよび材料科学だけでなく、生体複合体に広く適用されている［３４−３９］。
【００７３】
臨床上使用されるビスホスホネートのＲ２側鎖における窒素原子が、前述したような抗吸収薬理活性において重要な役割を果たすことが、知られている。ＣｕＡＡＣクリック反応は、分子中に１，２，３−トリアゾール複素環を導入するために非常に効率的な方法であり、新規なビスホスホネートの開発へのその可能性が示唆される。また、ＢＰ類は、薬物送達研究および造影プローブ研究における「魔法の弾丸」として使用することができ、ＣｕＡＡＣ反応条件は、通常、生物学的システムと互換性があることから、アルキニルビスホスホネートまたはアジドビスホスホネートのＣｕＡＡＣ反応が、これらの研究において適用されるはずである［３９］。
【００７４】
しかしながら、以下の式１４〜１８の化合物のような、アルキニル／アジド含有ビスホスホネートを作ることへの関心は、この数年で始まったばかりである。２００７年になって初めて、OsipovおよびRoeschenthaler［４０］が、テトラエチルブタ−３−イン−１，１−ジイルジホスホネート（tetraethyl but-3-yne-1,1-diyldiphosphonate）（１４）またはテトラエチルヘプタ−１，６−ジイン−４，４−ジイルジホスホネート（tetraethyl hepta-1,6-diyne-4,4-diyldiphosphonate）（１５）を使用した、ビスホスホネートの合成におけるＣｕＡＡＣクリック化学の最初の応用を報告した。一連のアジドアルキルホスホネート、アジドアルキルホスフィネート、およびアジドアルキルホスフィンオキシドが合成され、それらの１，３−双極子反応が以前に検討されていた［４１］が、上記報告はＣｕＡＡＣ反応の導入の５年後である。最近、Wiemerらは、同じ出発材料１４［４２］であるアルキニルビスホスホネートから、トリアゾール系のゲラニルゲラニルトランスフェラーゼII阻害剤の合成のために、ＣｕＡＡＣ反応を使用したことを報告した。Gueninらは、ＨＭＢＰｙｎｅ（１６）を合成し、その化合物をγ−Ｆｅ２Ｏ３系酸化鉄ナノ粒子の塗料に応用し、さらなる「クリック」改良［４３］のために準備されるアンカー足場材料として作用させた。McKennaらは、α−アジドビスホスホネートエステルおよび酸（１７ａ−ｄ）の最初の例を報告し、α，βブリッジ位置またはβ，γブリッジ位置のいずれかにおいて、ＣＨＮ３またはＣ（ＣＨ３）Ｎ３を含む新規のヌクレオチド類似体の調製においてα−アジドビスホスホン酸を適用したが、それらのＣｕＡＡＣ反応は、報告されていない［４４］。Herczeghらは、Ｏ−シリル化３−アジドプロピルテトラエチルビスホスホネート（１８）を利用し、抗菌剤［４５］として、１，２，３−トリアゾールが結合した、一連のシプロフロキサシンのヒドロホスホネート誘導体を合成した。Chenらは、最近、ＥｔＯＨ−水（１：１）中におけるβ−アジドビスホスホネート（５）の合成を報告し（１９）、また、中間体化合物１８［４６］を経由するように提案された、トリアゾールビスホスホネートのワンポット合成について研究した。メタノール、メタノール−水（１：１）、またはアセトニトリルのような溶媒中では、Chenら使用した同じ出発物質［４７］からは、化合物１８が得られなかったことを、SzajnmanおよびRodriguezらが報告したことに留意すべきである。
【化２８】
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【００７５】
目的とする標的分子とＣｕＡＡＣ反応によってさらに複合化させることができるいくつかのビスホスホネートに、アルキニル基またはアジド基を導入するための別の方法は、ビスホスホネートの末端アミノ基を有する、アレンドロネートおよびパミドロネートといったアルキニル／アジド含有試薬の直接結合によるものである［４８−５１］。しかしながら、発明者らの知る限りでは、アルキニル／アジド含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートは、いまだ文献によって報告されていない。
【００７６】
アミノ−アジド−パラ−ｄＲＩＳの合成は、スキーム４に概説されている。容易に入手可能なテトライソプロピルメチレンビスホスホネート（２１）を、ＮａＨで処理してカルボアニオンを生成させ、次に、４−（クロロメチル）ピリジン（２２）と反応させて、パラ−ｄＲＩＳ（２３）を得た。反応は、室温（ｒ．ｔ．）においておそらく立体障害によってかなり遅いため、反応を促進し歩留まりを向上させるために、温度を７０℃に上昇させる。また、一置換化合物２３に加えて、わずかに二置換化合物も生成した。カラムクロマトグラフィーによってまず化合物２３を精製すると、部分的に脱アルキル化された生成物が観察され、ホスホン酸エステルがシリカゲルカラム上で加水分解されることが示唆された。以後の反応のためにエステル保護が必要であることから、カラムクロマトグラフィーを回避するために抽出／洗浄操作を開発した。
【化２９】
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【００７７】
抽出精製後に得られた化合物２４を、中間体化合物２５を経由する、ＮＨＢｏｃ−アジド−パラ −ｄＲＩＳ（２６）の製造のために使用した。温度が６０℃より高いと、パラ−ｄＲＩＳ（１０）化合物が、反応混合物中に約２１％観察され、ＣＮ結合の切断が示唆されることが見出された。注目すべきことに、化合物２４はかなり安定しており、ＣＮ結合の切断は、観察されず、ＣＮ結合の開裂において、近接するアジド基が潜在的に触媒の役割を有することが暗示される。温度が５０℃まで低下したときに、ＣＮ結合の切断が最小化され、化合物２６の安定性が温度依存性であることが示された。最終的に、最適化後にＢＴＭＳ法によってイソプロピル基を脱保護し、生成物をＨＰＬＣによってさらに精製し、目的とする分子であるアミノ−アジド−パラ−ｄＲＩＳ（２０）を得た。この合成経路は、ｄＲＩＳ、ｄＲＩＳＰＣ等の他のＮ−複素環式デオキシビスホスホネートおよびこれに関連する類似体にも適用可能であることに留意すべきである
【００７８】
アルキン含有蛍光色素（スキーム５に従って合成された５（６）−ＦＡＭ−アルキン（２９）と反応させることによって、アミノ−アジド−パラ−ｄＲＩＳ（２０）のクリック性能を調べた。異なる温度（室温および５５℃）でのＨ２Ｏにおける反応を最初に試みたところ、４８時間後に、１０％未満のトリアゾール生成物（３０）が確認された。反応の前後で明らかな沈殿物を観察することができ、この沈殿物は、まだＣｕＳＯ４から完全にＣｕ（Ｉ）に変換されていないＣｕ（ＩＩ）の複合物、または、微量Ｏ２によって後に酸化されたＣｕ（ＩＩ）の複合物として提示されるため、前もって作っておいた銅（Ｉ）触媒を添加して反応を試み、Ｏ２の導入を避けるために真空ライン下で反応を進めた。しかしながら、すべての反応物が混合された後に沈殿物がなお存在した。結果として、ｐＨが８未満の場合に、水溶液中における５（６）−ＦＡＭ−アルキン（２９）生成物およびトリアゾール生成物（３０）の溶解性が低いことが沈殿の原因であることがわかった。従って、０．２Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）を反応媒体（スキーム５）として使用すると、反応を続けても全く沈殿が観察されなかった。反応混合物のＴＬＣ分析（溶離液として１００％ＭｅＯＨ）によって、室温または４５℃のいずれかで一晩インキュベートした後に、ほぼすべての５（６）−ＦＡＭ−アルキンが消費され、トリアゾール生成物（３０）に変換されたことが示唆された。
【化３０】
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【化３１】
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【００７９】
トリアゾール生成物（３０）の溶解性にｐＨも影響するため、ｐＨの調整による沈殿法を、化合物を精製するために用いる。沈殿物が生じないようになるまで、０．５ＭのＨＣｌによって反応混合物のｐＨを３．０に調整した。次に、沈殿物を遠心分離によって回収し、続いて、アセトン（０．５ｍＬ×２）および希釈ＨＣｌ（ｐＨ＝３．０、０．２５ｍＬ×２）によって連続的に洗浄した。さらに、生成物３０の５−異性体、６−異性体を分取逆相ＨＰＬＣで分離した。
【００８０】
実施例３
試薬およびスペクトル計測：５（６）− 、５−、および、６−カルボキシフルオレセインのスクシンイミジルエステル（ＦＡＭ，ＳＥ）を、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国）から購入した。５（６）−ローダミンレッド−Ｘ，ＳＥ（５（６）−ＲｈＲ，ＳＥ）、５（６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン，ＳＥ（５（６）−ＲＯＸ，ＳＥ）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７，ＳＥ（ＡＦ６４７，ＳＥ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国）から購入した。スルホ−Ｃｙ，ＳＥを、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ社（米国）から購入した。ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ，ＳＥを、ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンス社（米国）から購入した。化合物１ａ−１ｃは、親切にもＷａｒｎｅｒＣｈｉｌｃｏｔｔ医薬品（元Ｐ＆Ｇ医薬品）から提供された。化合物１ｄ（ゾレドロン酸）を、Ｍｏｌｅｋｕｌａ社（英国）から購入した。化合物１ｅ（ミノドロン酸）を、上海Ｈｅｎｇｒｕｉ国際貿易有限公司（中国）から購入した。化合物１ｆ（３−ＩＰＥＨＰＣ）を、公開された手順［５２］に従って、我々の研究室で合成した。他のすべての化合物は、Ａｌｄｒｉｃｈ社またはＡｌｆａ Ａｅｓａｒ社から購入した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）は、ＫＯＨをもとに蒸留した。ＣＨ２Ｃｌ２は、Ｐ２Ｏ５をもとに蒸留した。アリルアミンは、Ｎ２下で蒸留した。全ての他の化合物は、製造業者によって供給されるものを使用した。薄層クロマトグラフィーを、Ｍｅｒｃｋｓ社のシリカゲル６０ Ｆ２５４プレートで行い、展開したプレートを３５４ｎｍのＵＶランプの下で可視化した。ＨＰＬＣ分離は、ＲａｉｎａｎＤｙｎａｍａｘ吸光度検出器モデルＵＶ−ＤＩＩを用いてＲａｉｎａｎＤｙｎａｍａｘモデルＳＤ−２００システムで行った。ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚ（Ｖａｒｉａｎ社）、５００ＭＨｚ（Ｖａｒｉａｎ社）、６００ＭＨｚ（Ｖａｒｉａｎ社）、または５００ＭＨｚ（Ｂｒｕｋｅｒ社）のいずれかの装置で記録した。ＵＶスペクトルは、ＤＵ ８００ 分光計で記録し、蛍光発光スペクトルは、ＤａｔａＭａｘソフトウェアバージョン２．２０を備えたＪｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ Ｈｏｒｉｂａ Ｆｌｕｏｒｏ Ｍａｘ−３蛍光光度計（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ社）、Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ Ｎａｎｏｌｏｇ蛍光光度計（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ社）、ＳＨＩＭＡＤＺＵの分光蛍光光度計ＲＦ−５３０１ＰＣ、または、９２８ ＰＭＴ検出器を備えたＰＴＩ ＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒモデルＣ−６０ＳＥ分光計のいずれかで取得した。高分解能質量スペクトルは、ＷｉｎＮＴ（２０００）データシステムを備えたＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＥ−ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ分光計で、ＵＣ Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ高分解能質量分析施設において、ＲｏｎＮｅｗ博士によって行った。他の質量スペクトルは、ＥＳＩ Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰｍａｘ ＩＯＮ Ｔｒａｐ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分光計で取得した。その他の参考文献［５３−５４］を参照されたい。
【００８１】
薬物−リンカー中間体４ａ〜４ｃの合成
一般的手順：親薬物（１ａ−１ｃ）を水に溶解し、１ＭのＮａＯＨでｐＨを５．７から６．０に調整した。エポキシド５を、最小限のメタノール（ＭｅＯＨ）中に溶解し、上記の水溶液に添加すると、わずかな沈殿が生じることとなった。沈殿物は、加熱（４０〜５０℃）中に、反応が進行するにつれて消失した。反応を３１Ｐ ＮＭＲによって追跡した。所望の生成物の９０％−９５％が得られた後（３１Ｐ ＮＭＲ）、溶媒を真空中で除去し、得られた白色粉末をジエチルエーテルで洗浄し、濾過し、デシケータ中で乾燥させた。１：１のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏで、標準的な脱保護を実施した。反応混合物を室温で３〜４時間撹拌した後、溶媒を真空中で除去し、得られた結晶をジエチルエーテルおよびＭｅＯＨを用いて洗浄し、薬物−リンカー中間体を得た。
【００８２】
１−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）ピリジニウム（４ａ）の合成
（１−ヒドロキシ−２−ピリジン−３−イルエタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホン酸）１ａ（２８８ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ、１．００当量）のモノナトリウム塩を、４ｍＬの水に溶解し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを６．２に調整した。この溶液に、最小限のＭｅＯＨ中の５の１６４ｍｇ（０．９４ｍｍｏｌ、１．００当量）を加えた。反応混合物を４０℃で１８．５時間撹拌し、３１Ｐ ＮＭＲによれば９０％の２ａが得られた。溶媒を真空中で除去し、残留物を、ジエチルエーテルで洗浄し、濾過し、デシケータ中で乾燥させた。続いて、２ａの白色固体をさらに精製することなく使用した。1H NMR (D2O): δ 8.68 (s, 1H), 8.46 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 8.42 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.2, 5.8 Hz, 1H), 4.67- 4.62 (part. obscured(不明瞭) by HDO, about 1H), 4.27 (dd, J = 13.6, 9.6 Hz, 1H), 4.13- 3.92 (m, 1H), 3.41- 3.10 (m, 4H), 1.31 (s, 9H).31P NMR (D2O) δ 16.55 (d, J = 21.7s Hz, 1P), 16.33 (d, J = 21.9 Hz, 1P)。
【００８３】
２ａの全サンプルを５０：５０の水：ＴＦＡ（ｖ／ｖ）に溶解した。溶液を室温で３時間撹拌した後、１Ｈ ＮＭＲに従うと、４ａの１００％の収率が達成された。次に、溶媒を真空中で除去し、得られた固体をエーテルで洗浄し、濾過し、乾燥し、白色の結晶として４ａを得て、さらに精製することなく使用した。1H NMR (D2O): δ 8.71 (s, 1H), 8.54 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.44 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 8.1, 6.0 Hz, 1H), 4.74 (part. obscured(不明瞭) by HDO, about 1H), 4.41- 4.21 (m, 2H), 3.39- 3.21 (m, 3H), 2.96 (dd, J = 13.0, 9.9 Hz, 1H).31P NMR (D2O): δ 16.35 (d, J = 26.4 Hz, 1P), 16.04 (d, J = 27.7 Hz, 1P)。
【００８４】
１−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２−カルボキシ−２−ヒドロキシ−２−ホスホノエチル）ピリジニウム（４ｂ）の合成
化合物１ｂ（０．５２ｇ、２．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）、２−ヒドロキシ−２−ホスホノ−３−ピリジン−３−イルプロパン酸を、１０ｍＬの水に溶解し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ５．９に調整した。この溶液に、最小限のＭｅＯＨ中の５の０．４５ｇ（２．５７ｍｍｏｌ、１．２２当量）を加えた。反応混合物を５０℃で６時間撹拌し、次に、室温で一晩撹拌し、９０％の２ｂを得た（３１Ｐ ＮＭＲ）。溶媒を真空中で除去し、残渣をジエチルエーテルで洗浄し、濾過し、デシケータ中で乾燥させると、２ｂ（ジアステレオ異性体混合物）が残った。これをさらに精製せずに使用した。1H NMR (D2O): δ 8.53 - 8.49 (brd, 1H), 8.47 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.29 - 8.24 (m, 1H), 7.78 (dd, J = 8.3 Hz, 6.2 Hz, 1H), 4.64- 4.58 (brd, 1H), 4.27- 4.19 (m, 1H), 4.00- 3.91 (m, 1H), 3.49- 3.43 (m, 1H), 3.23- 3.00 (m, 3H), 1.27 (s, 9H).31P NMR (D2O): δ 14.97 (s, 1P)。
【００８５】
２ｂの全サンプルを、５０：５０の水：ＴＦＡ（ｖ／ｖ）に溶解した。室温で４時間撹拌した後、１Ｈ ＮＭＲに従うと、４ｂの１００％の収率が得られた。次に、溶媒を真空中で除去し、残留物を、ジエチルエーテルで洗浄し、濾過し、乾燥し、白色の結晶として４ｂ（ジアステレオマー混合物）を得た。これをさらに精製することなく使用した。1H NMR (D2O): δ 8.68- 8.64 (m, 1H), 8.63- 8.59 (m, 1H), 8.42- 8.39 (m, 1H), 7.91 (dd, J = 8.0 Hz, 6.4 Hz, 1H), 4.78- 4.72 (m, 1H), 4.46- 4.33 (m, 1H), 4.24- 4.14 (m, 1H), 3.59- 3.49 (m, 1H), 3.33- 3.21 (m, 2H), 2.95 (ddd, J = 13.3, 10.0, 3.6 Hz, 1H).31P NMR (D2O): δ 12.73- 12.51 (m, 1P) 。
【００８６】
１−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２，２−ジホスホノエチル）ピリジニウム（４ｃ）の合成
化合物１ｃ（３８．０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１．００当量）、（２−ピリジン−３−イルエタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホン酸）を、１ｍＬの水に溶解し、１ＭのＮａＯＨでｐＨを５．４に調整した。この溶液に、最小限のＭｅＯＨ中の５の２５．５ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ、１．０７当量）を加えた。反応混合物を４０℃で一晩撹拌し、３１Ｐ ＮＭＲによって反応を追跡した。１９時間後、８０％の２ｃを得た。従って、ＭｅＯＨ中の５の５．３０ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ、０．２１当量）を追加で反応混合物に加えた。４２時間後、所望の生成物の９０％を得た。溶媒を真空中で除去し、得られた白色粉末を、ジエチルエーテルで洗浄し、濾過し、乾燥し、２ｃを得て、さらに精製することなく使用した。1H NMR (D2O): δ 8.69 (s, 1H), 8.49 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 8.42 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 8.1 Hz, 6.1 Hz, 1H), 4.66 - 4.61 (m, 1H), 4.27 (dd, J = 13.5 Hz, 9.6 Hz, 1H), 4.00- 3.94 (m, 1H), 3.30- 3.10 (m, 4H), 2.15 (tt, J = 21.0 Hz, 7.2 Hz, 1H), 1.26 (s, 9H).31P NMR (D2O): δ 17.25 (s, 2P)。
【００８７】
２ｃの全サンプルを、５０：５０の水：ＴＦＡ（ｖ／ｖ）に溶解した。室温で４時間撹拌した後、１Ｈ ＮＭＲに従うと、４ｃの１００％の収率が得られた。溶媒を真空中で除去し、残渣をジエチルエーテルとメタノールとで洗浄し、濾過し、乾燥し、白色結晶として４ｃを得た。これをさらに精製することなく使用した。1H NMR (D2O): δ 8.73 (s, 1H), 8.54 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 8.45 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.89 (dd, J = 8.1 Hz, 6.1 Hz, 1H), 4.76- 4.70 (m, 1H), 4.37 (dd, J = 13.4 Hz, 9.3 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 3.37- 3.13 (m, 3H), 2.98 (dd, J = 13.1, 9.8 Hz, 1H), 2.28 (tt, J = 21.4, 7.2 Hz, 1H).31P NMR (D2O): δ 17.35 (s, 2P)。
【００８８】
薬物−リンカー中間体３ａの合成
経路Ｂ：化合物１ａ（５７ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、１当量）（１−ヒドロキシ−１−ホスホノ−２−ピリジン−３−イル−エチル）ホスホン酸）を、４ｍＬのＤ２Ｏに溶解し、Ｎａ２ＣＯ３（固体）でｐＨを６．０に調整した。この溶液に、エピクロロヒドリン６（７９μＬ、１ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。反応混合物を室温で撹拌した。反応の進行を３１Ｐ ＮＭＲおよび１Ｈ ＮＭＲによって追跡した。４時間で、もはやエピクロロヒドリンは、反応混合物中に残っていなかった。約８％未反応の出発材料が３１Ｐ ＮＭＲによって観察され、Ｏ−アルキル化の副生成物は、観察されなかった。1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.72 (s, 1H), 8.49 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 8.44 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.80 (dd, J = 8.0, 6.1 Hz, 1H), 4.74 (dd, J = 13.5, 2.9 Hz, 1H), 4.47 (dd, J = 13.6, 9.3 Hz, 1H), 4.29 (dtd, J = 9.3, 4.7, 2.9 Hz, 1H), 3.77- 3.56 (m, 2H), 3.29 (t, J = 11.6 Hz, 2H)。
【００８９】
薬物−リンカー中間体４ｄ（３−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−１−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム）の合成
経路Ａ：化合物１ｄ（４０．０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）、［１−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エタン−１，１−ジイル］ビス（ホスホン酸）を、３ｍＬの水に溶解し、Ｎａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ７．４に調整した。この溶液に、最小限のＭｅＯＨ中の５の５１ｍｇ（０．２９ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。反応混合物を５０℃で一晩撹拌し、反応を３１Ｐ ＮＭＲによって追跡した。１９時間後、７６％の２ｄが得られた。従って、ＭｅＯＨ中の５の１０．９ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ、０．４２当量）を反応混合物に追加で添加した。４１時間後、出発物質の残留は１０％未満となり、所望の化合物２ｄの８１％を副生成物の約１５％とともに得た。溶媒を真空中で除去し、得られた白色粉末を、ジエチルエーテルで洗浄し、濾過し、乾燥し、２ｄを得た。これをさらに精製することなく使用した。２ｄの全サンプルを、５０：５０の水：ＴＦＡ（ｖ／ｖ）に溶解した。一晩室温で撹拌した後、Ｂｏｃ基が完全に脱保護され、１Ｈ ＮＭＲに従うと所望の化合物４ｄを得ていた。溶媒を真空中で除去し、残渣をジエチルエーテルとメタノールとで洗浄し、濾過し、乾燥し、次に、ＳＡＸ ＨＰＬＣ精製に供した。ＳＡＸカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社２１．４ｍｍ×２５０ｍｍ ＳＰ１５／２５ ヌクレオゲルカラム）、流量９ｍＬ／分、２３０ｎｍでのＵＶ−ＶＩＳ検出。Ａ：Ｈ２Ｏ、Ｂ：０．５Ｍ ＴＥＡＢ液 ｐＨ７．５を使用して、１０分かけて０〜３０％へ増加し、１０〜１５分まで３０％に維持し、次に、１５〜３５分まで緩衝液Ｂの１００％へ増加させる勾配を利用して、試料を溶出させた。１２〜１４分で溶出する最大ピーク（保持時間は、異なる操作間で±１．５分の誤差を有する）を回収し、そして溶媒を蒸発させ、次の工程の反応のために化合物４ｄを得た。1H NMR (D2O): δ 8.76 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 4.53 (dd, J = 7.4, 6.8 Hz, 2H), 4.33 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 4.11 - 4.07 (m, 2H), 3.21- 3.17 (m, 1H), 2.89 (brd, 1H).31P NMR (D2O): δ 14.02 (s, 2P)。
【００９０】
経路Ｂ：化合物１ｄ（５０．０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）［１−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エタン−１，１−ジイル］ビス（ホスホン酸）を、４ｍＬの水に溶解し、Ｎａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ７．８−７．４に調整した。この溶液に６の７２．８μＬ（０．９３ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、３１Ｐ ＮＭＲによって反応を追跡した。１９時間後、約１５％の副生成物とともに、７９％の３ｄを得て、１０％未満の出発物質が残った。反応混合物の溶液をジエチルエーテル（３×）で洗浄し、水相の溶媒を真空中で除去し、３ｄを得て、さらに精製することなく使用した。３ｄの全サンプルを２ｍＬのＮＨ３・Ｈ２Ｏに溶解した。３０時間、室温で撹拌した後、塩素が置換され、ＭＳによれば所望の化合物４ｄが得られていた。溶媒を真空中で除去し、残渣をジエチルエーテルとメタノールとで洗浄し、濾過し、乾燥し、次に、ＳＡＸ ＨＰＬＣ精製に供した。ＳＡＸカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社２１．４ｍｍ×２５０ｍｍ ＳＰ１５／２５ ヌクレオゲルカラム）、流量９ｍＬ／分、２３０ｎｍでのＵＶ−ＶＩＳ検出。Ａ：Ｈ２Ｏ、Ｂ：０．５Ｍ ＴＥＡＢ液 ｐＨ７．５を使用して、１０分かけて０〜３０％へ増加し、１０〜１５分まで３０％に維持し、次に、１５〜３５分まで緩衝液Ｂの１００％へ増加させる勾配を利用して、試料を溶出させた。１５〜３５分で溶出する最大ピーク（保持時間は、異なる操作間で±１．５分の誤差を有する）を回収し、そして溶媒を蒸発させ、次の工程の反応のために化合物４ｄを得た。1H NMR (D2O): δ 8.76 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 4.53 (dd, J = 7.4, 6.8 Hz, 2H), 4.33 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 4.11 - 4.07 (m, 2H), 3.21- 3.17 (m, 1H), 2.89 (brd, 1H).31P NMR (D2O): δ 13.9 (s, 2P)。
【００９１】
薬物−リンカー中間体４ｅ（１−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−１−イウム、経路Ｂ）の合成
化合物１ｅ（１４０．４ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、１．００当量）、（１−ヒドロキシ−２−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル−１−ホスホノエチル）ホスホン酸を、４ｍＬの水に溶解し、１０Ｍ ＮａＯＨで、ｐＨを７．４−７．８に調整した。この溶液に、６の１７０．９μＬ（２．１８ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、３１Ｐ ＮＭＲによって反応を追跡した。１９時間後、約１５％の副生成物とともに、３ｅの７０％を得て、約１５％の出発物質が残った。反応混合物の溶液をジエチルエーテルで洗浄（３−５回）し、水相の溶媒を真空中で除去し、３ｅを得た。これをさらに精製することなく使用した。３ｅの全サンプルを８ｍＬのＮＨ３・Ｈ２Ｏに溶解した。４４時間、室温で撹拌した後、塩素が置換され、ＭＳによれば所望の化合物４ｅを得ていた。溶媒を真空中で除去し、残渣をジエチルエーテルとメタノールとで洗浄し、濾過し、乾燥し、次に、ＳＡＸ ＨＰＬＣ精製に供した。ＳＡＸカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社２１．４ｍｍ×２５０ｍｍ ＳＰ１５／２５ ヌクレオゲルカラム）、流量９ｍＬ／分、２８０ｎｍでのＵＶ−ＶＩＳ検出。Ａ：Ｈ２Ｏ、Ｂ：０．５Ｍ ＴＥＡＢ液ｐＨ７．６を使用して、１０分かけて０〜３０％へ増加し、１０〜１８分まで３０％に維持し、次に、１８〜３５分まで緩衝液Ｂの１００％へ増加させる勾配を利用して、試料を溶出させた。９．４−１１．５分で溶出する最大ピーク（保持時間は、異なる操作間で±１．５分の誤差を有する）を回収し、そして溶媒を蒸発させ、次の工程の反応のために化合物４ｅを得た。1H NMR (D2O): δ 8.77 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.87- 7.70 (m, 3H), 7.32 (dt, J = 7.8, 4.2 Hz, 1H), 4.47 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 4.40- 4.13 (m, 2H), 3.53 (t, J = 11.3 Hz, 2H), 3.29- 3.20 (m, 1H), 2.99- 2.90 (part. obscured(不明瞭) by triethylamine, about 1H).31P NMR (D2O): δ 16.6 (s, 2P)。
【００９２】
薬物−リンカー中間体４ｆ（１−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２−カルボキシ−２−ヒドロキシ−２−ホスホノエチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−１−イウム、経路Ｂ）の合成
化合物１ｆ（１００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、１．００当量）、２−ヒドロキシ−３−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル−２−ホスホノプロピオン酸を、２．８５ｍＬの水に溶解し、１０Ｍ ＮａＯＨで、ｐＨを７．４−７．８に調整した。この溶液に６の１３７μＬ（１．７５ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、３１Ｐ ＮＭＲによって反応を追跡した。１９時間後、約２４％の副生成物とともに６１％の３ｆを得た。約１５％の出発物質が残っていた。反応混合物の溶液をジエチルエーテルで洗浄（３−５回）し、水相の溶媒を真空中で除去し、３ｆを得た。これをさらに精製することなく使用した。３ｆの全サンプルを５ｍＬのＮＨ３・Ｈ２Ｏに溶解した。４４時間室温で撹拌した後、塩素が置換され、ＭＳによれば所望の化合物４ｆを得ていた。溶媒を真空中で除去し、残渣をジエチルエーテルとメタノールとで洗浄し、濾過し、乾燥し、次に、ＳＡＸ ＨＰＬＣ精製に供した。ＳＡＸカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社２１．４ｍｍ×２５０ｍｍ ＳＰ１５／２５ ヌクレオゲルカラム）、流量９ｍＬ／分、２８０ｎｍでのＵＶ−ＶＩＳ検出。Ａ：Ｈ２Ｏ、Ｂ：０．５Ｍ ＴＥＡＢ液 ｐＨ７．６を使用して、１０分かけて０〜３０％へ増加し、１０〜１８分まで３０％に維持し、次に、１８〜３５分まで緩衝液Ｂの１００％へ増加させる勾配を利用して、試料を溶出させた。９．３−１１．５分で溶出する最大ピーク（保持時間は、異なる操作間で±１．５分の誤差を有する）を回収し、そして溶媒を蒸発させ、次の工程の反応のために化合物４ｆを得た。1H NMR (D2O): δ 8.64 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.91- 7.71 (m, 2H), 7.62 (s, 1H), 7.29 (ddd, J = 7.0, 5.9, 2.2 Hz, 1H), 4.51- 4.39 (m, 1H), 4.35- 4.14 (m, 2H), 3.66 (dd, J = 15.8, 3.6 Hz, 1H), 3.35 (dd, J = 15.7, 7.4 Hz, 1H), 3.26- 3.15 (m, 1H), 2.98- 2.79 (m, 1H).31P NMR (D2O): δ 14.8。
【００９３】
化合物７ａ−７ｆの製造のための一般的な方法
以下の合成工程および精製工程を、最小限の照明下で実施した。４ａ−ｆ（３−５当量）をＨ２Ｏに溶解した。固体のＮａ２ＣＯ３でｐＨを８．３に調整した。５（６）−ＦＡＭ，ＳＥ（１当量）、５（６）−ＲｈＲ−Ｘ，ＳＥ（１当量）、５（６）−ＲＯＸ，ＳＥ（１当量）（市販の５（６）−ＲＯＸ，ＳＥ（混合異性体）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供される特性データによれば、５−ＲＯＸ，ＳＥ、６−ＲＯＸ，ＳＥ、および、ｂｉｓＳＥを９８：１：１の比で含み、この工程で精製した後、微量成分が分離され、最終生成物は、５異性体である）、ＡＦ６４７，ＳＥ（１当量、ＡＦ６４７の構造は、対応するＢＰ／ＰＣ複合体のＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲによって決定され、文献で提案された構造とは異なる［５５］）、スルホ−Ｃｙ５，ＳＥ（１当量）、またはＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷ，ＳＥ（１当量）を、無水ＤＭＦに溶解し、上記の水溶液と組み合わせた。Ｎａ２ＣＯ３でｐＨを８．２−８．５に再調整し、沈殿物を溶解し、３時間〜一晩、室温の暗条件下で反応混合物を撹拌した。ＦＡＭと、５（６）−ＲｈＲ−Ｘ複合体（７ａ１−７ａ４、７ｂ１−７ｂ２、７ｃ１−７ｃ２、７ｄ１−７ｄ２、７ｅ１−７ｅ２、７ｆ１−７ｆ２）との粗生成物を、２０×２０ｃｍまたは７×２０ｃｍのプレートにおける（選択されたＴＬＣプレートの大きさは粗生成物の合計量に依存する）、１００％ＭｅＯＨで溶出したＴＬＣによって精製した。他の色素複合体の粗反応混合物は、ＴＬＣで精製しなかった。基点（Ｒｆ＝０）に残ったホスホネート含有化合物を水で抽出し、抽出工程を支援するために、結合した水性抽出物をキレックス（Chelex）（ナトリウム型）で処理することができる。溶液を遠心分離し、次に真空中で濃縮した。続いて、得られた固体を、水、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡｃ、ｐＨ５．０−５．５）の２０％ＭｅＯＨ、または、トリエチルアンモニウム炭酸塩緩衝液（ＴＥＡＣ、ｐＨ７．０−７．８）のいずれかに溶解し、Ｎａｎｏｓｅｐ ３０Ｋオメガフィルターによって濾過した。次に、適切な方法に従って、分取／半分取逆相ＨＰＬＣによって溶液を精製した。標識された生成物の最終的な量を、ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルから算出し、また、単離された溶離液を減圧および凍結乾燥で濃縮した。
【００９４】
方法Ａ：ＤｙｎａｍａｘＣ１８カラム（２１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μｍ、１００オングストロームの細孔サイズ）、流量８．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでＵＶ検出、下記の勾配率：１０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ液（ｐＨ５．０−５．５）またはＴＥＡＣ液（ｐＨ７．０−７．８、緩衝液Ａ）から、１２分で、７５％ＭｅＯＨ  ０．１ＭのＴＥＡＡｃ液（ｐＨ５．０−５．５）またはＴＥＡＣ液（ｐＨ７．０−７．８、緩衝液Ｂ）の４０％へ、直線的に増加させ、次に１２分から１００分まで緩衝液Ｂの７０％へ増加。
【００９５】
方法Ｂ：ＤｙｎａｍａｘＣ１８カラム（２１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μｍ、１００オングストロームの細孔サイズ）、流量８．０ｍＬ／分、２６０ｎｍでＵＶ検出、２０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＣ（ｐＨ７．０−７．８ 緩衝液Ａ）で定組成溶離を１２分間、１２分から２２分まで、直線的に、７０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＣ（ｐＨ７．０−７．８ 緩衝液Ｂ）の１００％へ増加。
【００９６】
方法Ｃ：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、８０オングストロームの細孔サイズ）、流量６．０ｍＬ／分、２６０ｎｍおよび５６８ｎｍでＵＶ検出、２０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＣ（ｐＨ７．０−７．８ 緩衝液Ａ）で定組成溶離を５分間、１分間で直線的に、７５％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＣ（ｐＨ７．０−７．８ 緩衝液Ｂ）の１００％へ増加。
【００９７】
方法Ｄ：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、８０オングストロームの細孔サイズ）、流量４．０ｍＬ／分、２６０ｎｍおよび５６８ｎｍでＵＶ検出、２０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ（ｐＨ５．０−５．５  緩衝液Ａ）で定組成溶離を５分間、１分間で直線的に、７５％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ（ｐＨ５．０−５．５ 緩衝液Ｂ）の１００％へ増加。
【００９８】
方法Ｅ：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、８０オングストロームの細孔サイズ）、流量４．０ｍＬ／分、２６０ｎｍおよび５６８ｎｍでＵＶ検出、２０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＣ（ｐＨ７．０−７．８ 緩衝液Ａ）で定組成溶離を５分間、１分間で直線的に、７０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＣ（ｐＨ７．０−７．８ 緩衝液Ｂ）の１００％へ増加。
【００９９】
方法Ｆ：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、８０オングストロームの細孔サイズ）、流量４．０ｍＬ／分、２６０ｎｍおよび５７６ｎｍでＵＶ検出、２０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ（ｐＨ５．０−５．５  緩衝液Ａ）で定組成溶離を５分間、５分間で直線的に、７０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ（ｐＨ５．０−５．５ 緩衝液Ｂ）の１００％へ増加。
【０１００】
方法Ｇ：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、８０オングストロームの細孔サイズ）、流量４．０ｍＬ／分、２６０ｎｍおよび５７６ｎｍでＵＶ検出、１０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＣ（ｐＨ７．０−７．８ 緩衝液Ａ）で定組成溶離を５分間、５分間で直線的に、７０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＣ（ｐＨ７．０−７．８ 緩衝液Ｂ）の１００％へ増加。
【０１０１】
方法Ｈ：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、８０オングストロームの細孔サイズ）、流量４．０ｍＬ／分、２６０ｎｍ（７ａ６、７ｂ４）または２３０ｎｍ（７ｄ３）、および５９８ｎｍでＵＶ検出、２０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ（ｐＨ５．０−５．５ 緩衝液Ａ）で定組成溶離を５分間、２０分間で直線的に、７０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ（ｐＨ５．０−５．５ 緩衝液Ｂ）の４０％へ増加。
【０１０２】
方法Ｉ：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、８０オングストロームの細孔サイズ）、流量４．０ｍＬ／分、２３０ｎｍ（７ｄ１−７ｄ２）または２８０ｎｍ（７ｅ１、７ｅ２、７ｆ１、７ｆ２）、および４９２ｎｍでＵＶ検出、下記の勾配率：０．１Ｍ ＴＥＡＣ液（ｐＨ７．０−７．８ 緩衝液Ａ）の１０％ＭｅＯＨから、２５分で、０．１ＭのＴＥＡＣ液（ｐＨ７．０−７．８ 緩衝液Ｂ）の７５％ＭｅＯＨの４０％へ、直線的に増加させ、次に２５分から１００分まで緩衝液Ｂの７０％へ増加。
【０１０３】
方法Ｊ：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、８０オングストロームの細孔サイズ）、流量４．０ｍＬ／分、２３０ｎｍおよび５９８ｎｍでＵＶ検出、２０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ（ｐＨ５．０−５．５  緩衝液Ａ）で定組成溶離を７分間、７分から２５分まで直線的に、７０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ（ｐＨ５．０−５．５ 緩衝液Ｂ）の１００％へ増加。
【０１０４】
方法Ｋ：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、８０オングストロームの細孔サイズ）、流量４．０ｍＬ／分、２３０ｎｍおよび５９８ｎｍでＵＶ検出、２０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ（ｐＨ５．０−５．５  緩衝液Ａ）で定組成溶離を５分間、５分から１５分まで直線的に、７０％ＭｅＯＨ  ０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ（ｐＨ５．０−５．５ 緩衝液Ｂ）の４０％へ増加、１５分から３０分まで緩衝液Ｂで４０％で維持、最後に３０分から３５分まで緩衝液Ｂの１００％へ増加。
【０１０５】
５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ１）：５−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ２）：１−（３−（３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム；  ６−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ３）：１−（３−（４−カルボキシ−３−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム）：
上記の方法に従って合成した、Ｈ２Ｏ ２ｍＬ中の４ａの８６．５ｍｇ（ＴＦＡ−、ＮＡ＋の塩、０．１８ｍｍｏｌ、１．７当量）をＮａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．３に調整したものに、６００μＬの無水ＤＭＦ中の５（６）−ＦＡＭ，ＳＥの５０．０ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）を添加した。反応溶液のｐＨを、さらに８．３に調整し、沈殿物を溶解し、次に、反応混合物を一晩室温にて撹拌した。ＴＬＣ精製（溶離液として１００％ＭｅＯＨ）の後、ＴＥＡＡｃ緩衝液を用いた方法Ａに従って、生成物をＨＰＬＣによって精製した。２５分から７５分に溶出するピークを回収した。緩衝液を蒸発させる間に、生成物が溶液から沈殿した。よって、２回目のＨＰＬＣ精製を方法Ａに従って行ったが、ＴＥＡＣ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出を行った。２９．０ｍｇが得られ、４６．８％の収率（重炭酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.76- 8.62 (m, 1H), 8.54- 8.48 (m, 1H), 8.42 (dt, J = 17.6, 7.8 Hz, 1H), 8.04 (s 0.6 H), 7.92- 7.64 (m, 2H), 7.45 (s, 0.4 H), 7.13 (s, 1H), 6.93 (ddd, J = 9.1, 4.5, 1.9 Hz, 2H), 6.45- 6.38 (m, 4H), 4.82- 4.70 (m, 1H), 4.44- 4.28 (m, 1H), 4.28- 4.12 (m, 1H), 3.65- 3.55 (m, 1H), 3.56- 3.44 (m, 1H), 3.44- 3.19 (m, 2H).31P NMR (D2O): δ 16.36 (s, 2P)。
【０１０６】
５−および６−ＦＡＭ−ＲＩＳ（７ａ２および７ａ３）のＨＰＬＣ分離：７ａ１について記載した方法に従って合成した。方法Ａとして記載されたＨＰＬＣ条件下では、６−ＦＡＭＲＩＳおよび５−ＦＡＭＲＩＳは、それぞれ、極めて異なる保持時間、２７分および４４分で溶出した（保持時間は、異なる操作間で±１．５分の誤差を有する）。各異性体を、別々に回収し、次に、真空中で濃縮し緩衝液を除去した。化合物７ａ２および７ａ３は、上記の方法に従って、５−ＦＡＭ，ＳＥおよび６−ＦＡＭ，ＳＥから直接合成した。７ａ２および７ａ３の詳細なＮＭＲの記述は、参考文献［５６］から見つけることができる。
【０１０７】
５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ１、５（６）−ＦＡＭ−３−ＰＥＨＰＣ、  ５−ＦＡＭ−ＲＩＳＰＣ：３−（２−カルボキシ−２−ヒドロキシ−２−ホスホノエチル）−１−（３−（３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）ピリジン−１−イウム；  ６−ＦＡＭ−ＲＩＳＰＣ：３−（２−カルボキシ−２−ヒドロキシ−２−ホスホノエチル）−１−（３−（４−カルボキシ−３−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）ピリジン−１−イウム  としても知られている）
上述した方法に従って合成した、水１ｍＬ中の中間体４ｂの９４．８ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ、３．５当量）を、Ｎａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．３に調整したものに、２００μＬの無水ＤＭＦ中の５（６）−ＦＡＭ，ＳＥの３０ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。反応溶液のｐＨを、さらに８．４に調整し、沈殿物を溶解し、反応混合物を一晩室温にて撹拌した。ＴＬＣ精製（溶離液として１００％ＭｅＯＨ）の後に、混合物を方法ＢのＨＰＬＣによって精製した。２１から２５分の溶出ピークを７ｂ１として一緒に回収した。２３．２ｍｇを得て、５３．９％の収率（重炭酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.66- 8.44 (m, 2H), 8.29 (brd, 1H), 8.05 (s, 0.6 H), 7.89- 7.68 (m, 2H), 7.45 (s, 0.4 H), 7.13 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.50- 6.35 (m, 4H), 4.43- 4.25 (m, 2H), 3.78- 3.55 (m, 1H), 3.54- 3.41 (m, 2H), 3.41- 3.23 (m, 1H), 2.87 (part. obscured(不明瞭) by triethylamine, about 1H).31P NMR (D2O): δ 15.15 (brs, 1P). HRMS (positive ion MALDI): calcd 679.1324 m/z; found [M]+= 679.1321 m/z。
【０１０８】
５（６）−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ（７ｃ１、５−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ：１−（３−（３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム；  ６−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ：１−（３−（４−カルボキシ−３−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム）。
上記の方法に従って合成した５３ｍｇの中間体４ｃ（０．１ｍｍｏｌ、２．５当量）を１ｍＬのＨＰＬＣ水のなかでＮａ２ＣＯ３（固体）によってｐＨ８．３に調整したものに、１００μＬの無水ＤＭＦ中の５（６）−ＦＡＭ，ＳＥの１８．０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ、１．００当量）を添加した。沈殿物を溶解させるために、反応溶液のｐＨを８．４にさらに調整し、反応混合物を一晩室温にて撹拌した。ＴＬＣ精製の後、方法Ｂによって混合物を精製した。２７分から４５分に溶出するピークを７ｃ１として回収した。９．４ｍｇを得て、３６％の収率（酢酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.73- 8.69 (m, 1H), 8.50 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 8.47- 8.36 (m, 1H), 8.06 (d, J = 1.9 Hz, 0.6 H), 7.94- 7.68 (m, 2H), 7.53 (s, 0.4 H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 9.7, 2.4 Hz, 2H), 6.50- 6.40 (m, 4H), 4.82- 4.72 (m, 1H), 4.42 - 4.29 (m, 1H), 4.29- 4.09 (m, 1H), 3.62 (dd, J = 14.1, 4.5 Hz, 1H), 3.23- 3.11 (obscured(不明瞭) by solvent peak, about 1H), 3.58- 3.32 (m, 2H), 2.14- 1.87 (m, 1H).31P NMR (D2O): δ 17.17 (brs). HRMS (positive ion MALDI): calcd 699.1139 m/z; found [M]+= 699.1137 m/z。
【０１０９】
５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳ（７ａ４、１−｛３−［６−（｛４−［６−（ジエチルアミノ）−３−（ジエチルイミノ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル］−３−スルホベンゼン｝スルホンアミド）ヘキサンアミド］−２−ヒドロキシプロピル｝−３−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）ピリジニウム）
上述した方法に従って合成した、０．５ｍＬのＨ２Ｏ中の化合物４ａの１１．２ｍｇ（０．０３２ｍｍｏｌ、４．９当量）をＮａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ９．０に調整したものに、２５０μＬのＤＭＦ中のＲｈＲ−Ｘ，ＳＥの５ｍｇ（０．００６５ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。ＴＬＣ精製の後、方法Ｃによってこの混合物をＨＰＬＣで精製した。１２．８分から１８分の間に溶出するピーク（保持時間は、異なる操作間で±１．０分の誤差を有する）を回収した。０．２ｍｇを得て、（重炭酸トリエチルアンモニウム塩として）３％の収率であった。1H NMR (D2O): δ 8.66 (s, 1H), 8.49- 8.31 (m, 3H), 8.09 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.59- 7.33 (m, 1H), 7.01- 6.57 (m, 7H), 4.22- 3.89 (m, 3H), 3.55- 3.23 (m, obscured(不明瞭) by solvent peak and TEA peak, around 12H), 3.02- 2.96 (m, obscured(不明瞭) by TEA peak, around 3H), 2.19- 2.01 (m, 2H), 1.47- 1.24 (m, obscured(不明瞭) by TEA peak, around 5H), 1.10 (obscured(不明瞭) by TEA peak, about 12H).31P NMR (D2O): δ 16.76 (s, 2P). HRMS (positive ion MALDI): calcd 1011.2913 m/z, found [M-H]+ = 1010.2866 m/z。
【０１１０】
５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ２、３−（２−カルボキシ−２−ヒドロキシ−２−ホスホノエチル）−１−｛３−［６−（｛４−［６−（ジエチルアミノ）−３−（ジエチルイミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル］−３−スルホベンゼン｝スルホンアミド）ヘキサンアミド］−２−ヒドロキシプロピル｝ピリジニウム）：５（６）−ＲｈＲ−３−ＰＥＨＰＣとしても知られる）
上記の方法に従って合成した、０．５ｍＬのＨ２Ｏ中の化合物４ｂの１０．９ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ、３当量）をＮａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．３に調整したものに、５００μＬのＤＭＦ中の５ｍｇの５（６）−ＲｈＲ−Ｘ，ＳＥを加えた。次に、ＴＬＣ精製の後、方法Ｄによって溶液をＨＰＬＣで精製した。続いて、１３分における溶出ピーク（保持時間が異なる操作間で±１．０分の誤差を有している）を７ｂ２として回収した。２．１ｍｇを得て、収率が３３％（重炭酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (400 MHz, D2O): δ 8.51 (s, 1H), 8.43 (d, J = 10.1 Hz, 2H), 8.29 (s, 1H), 8.09 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.83- 7.66 (m, 1H), 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.87- 6.70 (m, 4H), 6.65 (s, 2H), 4.56- 4.43 (m, 1H), 4.16 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 3.95 (s, 1H), 3.48 (dd, J = 23.6, 8.0 Hz, 8H), 3.28- 3.12 (m, obscured(不明瞭) by solvent, about 4H), 2.93 (td, J = 17.6, 16.8, 8.9 Hz, 3H), 2.10 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.47- 1.21 (m, 5H), 1.09 (obscured(不明瞭) by TEA peak, about 12H).31P NMR (D2O): 15.2 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 975.3148 m/z, found [M-H]+ = 974.3118 m/z。 
【０１１１】
５（６）−ＲｈＲ−ｄＲＩＳ（７ｃ２、１−｛３−［６−（｛４−［６−（ジエチルアミノ）−３−（ジエチルイミノ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル］−３−スルホベンゼン｝スルホンアミド）ヘキサンアミド］−２−ヒドロキシプロピル｝−３−（２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム）。
上述した方法に従って合成した、０．６ｍＬのＨ２Ｏ中の化合物４ｃの９．４ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ、３．３当量）を、Ｎａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．３に調整したものに、ＤＭＦ０．４５ｍＬ中の５（６）−ＲｈＲ−Ｘ，ＳＥの５ｍｇ（０．００６５ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。沈殿が観察された。反応混合物を２時間撹拌し、次に蒸発乾固させた。複合化していない一部の色素を除去するために、得られた固体をアセトン（３×１ｍＬ）で抽出した。得られた沈殿物を約２ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、上記のようにしてＴＬＣで精製し、続いて、ＨＰＬＣ（方法Ｅ）で精製した。１３分から１７．３分の間に溶出する広いピーク（保持時間が異なる操作間で±１．０分の誤差を有する）を回収した。２．７５ｍｇを得て、４２．５％の収率（トリエチルアンモニウム重炭酸塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.67 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 8.50- 8.36 (m, 3H), 8.10 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 7.79 (dd, J = 8.4, 6.4 Hz, 1H), 7.42 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 6.86- 6.68 (m, 4H), 6.68- 6.57 (m, 2H), 4.62- 4.50 (m, 1H), 4.19 (dd, J = 13.3, 9.7 Hz, 1H), 4.10- 3.94 (m, 1H), 3.45 (p, J = 7.0 Hz, 8H), 3.34- 3.13 (m, 4H), 2.97 (q, J = 6.7 Hz, 3H), 2.36- 2.01 (m, 3H), 1.53- 1.23 (m, 5H), 1.10 (td, J = 7.0, 3.2 Hz, 12H).31P NMR (D2O): 17.29 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 995.2695 m/z, found [M-H]+= 994.2872 m/z。
【０１１２】
５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ（７ａ５、５−ＲＯＸ−ＲＩＳ：１６−［２−カルボキシ−４−（｛２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム−１−イル］プロピル｝カルバモイル）フェニル］−３−オキサ９λ５、２３−ジアザヘプタシクロ［１７．７．１．１５，９．０２，１７．０４，１５．０２３，２７．０１３，２８］オクタコサ−１（２７），２（１７），４，９（２８），１３，１５，１８−ヘプタエン−９−イリウム）。
上記の方法に従って合成した、０．８ｍＬのＨ２Ｏ／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）中の化合物４ａの２３．６ｍｇ（０．０４７ｍｍｏｌ、３当量）に、２００μＬの無水ＤＭＦ中の５（６）−ＲＯＸ，ＳＥの１０ｍｇ（０．０１６ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、その溶液を一晩撹拌した。溶媒を真空下で濃縮し、得られた紫色の残渣を０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ緩衝液（ｐＨ５．３）中の２０％ＭｅＯＨに溶解し、ＨＰＬＣ（方法Ｆ）によって精製した。１７．０分（保持時間が異なる操作間で±１．０分の誤差を有する）において溶出するピークを７ａ５として回収した。７．４ｍｇを得て、５４．０％の収率（酢酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.74 (s, 1H), 8.55 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.43 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.81 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.52 (s, 2H), 4.35- 4.21 (m, 2H), 3.57- 3.48 (m, 2H), 3.37- 3.16 (m, 13H), 2.70- 2.62 (m, 2H), 2.47- 2.27 (m, 5H), 1.79- 1.53 (m, 7H).31P NMR (D2O): 16.36 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 873.2660 m/z, found [M-H]+= 873.2647 m/z。
【０１１３】
５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ（７ｂ３，  ５（６）−ＲＯＸ−３−ＰＥＨＰＣ、５−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣとしても知られている：  １６−［２−カルボキシ−４−（｛３−［４−（２−カルボキシ−２−ヒドロキシ−２−ホスホノエチル）ピリジン−１−イウム−１−イル］−２−ヒドロキシプロピル｝カルバモイル）フェニル］−３−オキサ−９λ５、２３−ジアザヘプタシクロ［１７．７．１．１５，９．０２，１７．０４，１５．０２３，２７．０１３，２８］オクタコサ−１（２７），２（１７），４，９（２８）、１３，１５，１８−ヘプタエン−９−イリウム）。
上記の方法に従って合成した、１．６ｍＬのＨ２Ｏ／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）中の４ｂの５４．３ｍｇ（０．１１９ｍｍｏｌ、３当量）と、１ｍＬの無水ＤＭＦ中の５（６）−ＲＯＸ，ＳＥの２５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ、１当量）との溶液を一晩撹拌した。溶媒を真空下で濃縮し、得られた紫色の残渣を、０．１Ｍ ＴＥＡＣ緩衝液（ｐＨ７．０）中の１０％ＭｅＯＨに溶解し、ＨＰＬＣ（方法Ｇ）によって精製した。２１．９分（保持時間が異なる操作間で±１．０分の誤差を有する）において溶出するピークを、７ｂ３として回収した。９．４ｍｇを得て、３５．０％の収率（重炭酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.63 (s, 1H), 8.54 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.03 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.86- 7.78 (m, 1H), 7.75 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.59 (s, 2H), 4.45- 4.33 (m, 1H), 4.31- 4.18 (m, 1H), 3.67- 3.48 (m, 2H), 3.36- 3.14 (m, 13H), 2.83- 2.72 (m, 2H), 2.51- 2.35 (m, 5H), 1.81- 1.62 (m, 7H).31P NMR (D2O): 14.34 (s). HRMS (negative ion MALDI): calcd 835.2750 m/z, found [M-3H]- = 835.2733 m/z。
【０１１４】
ＡＦ６４７−ＲＩＳ（７ａ６、  ２−（５−（３−（６−（（２−ヒドロキシ−３−（３−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム−１−イル）プロピル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−３−メチル−５−スルホ−１−（３−スルホプロピル）インドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエン−１−イル）−３，３−ジメチル−５−スルホ−１−（３−スルホプロピル）−３Ｈ−インドール−１−イウム）。
上記の方法に従って合成した、１ｍＬのＨ２Ｏ／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）中の化合物４ａの２５．９ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ、１０当量）と、２５０μＬの無水ＤＭＦ中のＡＦ６４７，ＳＥの５ｍｇ（０．００５ｍｍｏｌ、１当量）との溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で濃縮し、得られた青色残渣を、０．１ＭのＴＥＡＡｃ緩衝液（ｐＨ５．３）中の２０％ＭｅＯＨに溶解し、ＨＰＬＣ（方法Ｈ）によって精製した。１９．８分（保持時間が異なる操作間で±１．０分の誤差を有する）において溶出するピークを、７ａ６として回収した。４．８ｍｇを得て、７６．７％の収率（酢酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.61 (s, 1H), 8.45 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.00 (t, J = 13 Hz, 2H), 7.80- 7.67 (m, 5H), 7.31- 7.20 (m, 2H), 6.55 (t, J = 12.6 Hz, 1H), 6.37- 6.23 (m, 2H), 4.70- 4.60 (obscured(不明瞭) by HDO, about 1H), 4.14- 3.98 (m, 4H), 2.92- 2.80 (m, 6H), 2.14- 2.10 (m, 5H), 1.95- 1.92 (m, 2H), 1.57- 1.53 (m, 9H), 1.48- 1.45 (m, 1H), 1.29- 1.27 (m, 2H), 1.00- 0.95 (m, 3H), 0.82- 0.79 (m, 3H), 0.45- 0.43 (m, 2H).31P NMR (D2O): δ 16.50 (d, J = 26.9 Hz, 1P), 16.30 (d, J = 29.0 Hz, 1P). HRMS (positive ion MALDI): calcd 1198.2410 m/z, found [M-H]+ = 1197.2358 m/z。
【０１１５】
ＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣ（７ｂ４、  ２−（５−（３−（６−（（３−（３−（２−カルボキシ−２−ヒドロキシ−２−ホスホノエチル）ピリジン−１−イウム−１−イル）−２−ヒドロキシプロピル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−３−メチル−５−スルホ−１−（３−スルホプロピル）インドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエン−１−イル）−３，３−ジメチル５−スルホ−１−（３−スルホプロピル）−３Ｈ−インドール−１−イウム）。ＡＦ６４７−３−ＰＥＨＰＣとしても知られている）
上記の方法に従って合成した、１ｍＬのＨ２Ｏ中の化合物４ｂの２２．５ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ、１０当量）を、Ｎａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．３に調整したものに、３００μＬの無水ＤＭＦ中のＡＦ６４７，ＳＥの５ｍｇ（０．００５ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。溶液を一晩室温で撹拌した。溶媒を真空下で濃縮し、得られた青色残渣を、０．１ＭのＴＥＡＡｃ緩衝液（ｐＨ５．３）中の２０％ＭｅＯＨに溶解し、ＨＰＬＣ（方法Ｈ）によって精製した。１８．８分（保持時間が異なる操作間で±１．０分の誤差を有する）において溶出するピークを、７ｂ４として回収した。５．３ｍｇを得て、８７．２％の収率（酢酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.47 (m, 2H), 8.25 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.94 (t, J = 13.1 Hz, 2H), 7.81- 7.73 (m, 1H), 7.73- 7.63 (m, 4H), 7.26 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 6.52 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 6.25 (dd, J = 13.6, 9.8 Hz, 2H), 4.70- 4.60 (obscured(不明瞭) by HDO, about 1H), 4.21- 4.11 (m, 4H), 3.42- 3.40 (m, 1H), 2.91- 2.83 (m, 5H), 2.20- 2.01 (m, 6H), 1.95- 1.92 (m, 2H), 1.51- 1.50 (m, 9H), 1.25- 1.20 (obscured(不明瞭) by triethylamine peak, about 4H), 0.99- 0.95 (obscured(不明瞭) by triethylamine peak, 4H), 0.69- 0.42 (m, about 2H).31P NMR (D2O): δ 15.21 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 1162.2645 m/z, found [M-H]+ = 1161.2572 m/z。
【０１１６】
５−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ１、  ３−（３−（３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）−１−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム）、および、６−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ２、  ３−（３−（４−カルボキシ−３−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）−１−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム）。
上述した方法に従って合成した、０．５ｍＬのＨ２Ｏ中の化合物４ｄの６０．２ｍｇ（ＴＥＡ＋塩（４当量ＴＥＡ）、０．０８ｍｍｏｌ、２．７当量）をＮａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．４に調整したものに、１００μＬの無水ＤＭＦ中の５（６）−ＦＡＭ，ＳＥの１５．２ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。沈殿物を溶解させるためにｐＨ８．３に調整し、溶液を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ精製の後、生成物をＨＰＬＣ（方法Ｉ）よって精製した。６−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ２）および５−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ１）は、極めて異なる保持時間（保持時間は、異なる操作間で±１．５分の誤差を有する）、２０分および３０分においてそれぞれ溶出した。各異性体を別々に回収し、次に、緩衝液を除去するために真空中で濃縮した。化合物７ｄ１および７ｄ２は、上記の方法に従って、５−ＦＡＭ，ＳＥおよび６−ＦＡＭ，ＳＥから直接合成することができる。以下の詳細なＮＭＲの記述は、ＨＰＬＣで分離された生成物に対応している。７ｄ１および７ｄ２の合計量は、１５．４ｍｇであり、６８．３％の収率であった。５−ＦＡＭ−ＺＯＬ（７ｄ１、トリエチルアンモニウム重炭酸塩）は、９．２ｍｇ得られた（トリエチルアンモニウム重炭酸塩）。1H NMR (D2O): δ 8.74 (s, 1H), 8.11- 8.03 (m, 1H), 7.84 (dd, J = 8.0, 1.9 Hz, 1H), 7.45 (t, J = 1.7 Hz, 1H), 7.34 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.50- 6.43 (m, 4H), 4.57- 4.44 (m, 2H), 4.36 (d, J = 12 Hz, 1H), 4.22- 4.03 (m, 2H), 3.57 (dd, J = 14.0, 4.5 Hz, 1H), 3.43 (dd, J = 14.0, 6.7 Hz, 1H).31P NMR (D2O): δ 14.02 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 704.1041 m/z, found M+ = 704.1013 m/z.6-FAM-ZOL (7d2, トリエチルアンモニウム重炭酸塩): obtained 6.2 mg (トリエチルアンモニウム重炭酸塩).1H NMR (D2O): δ 8.70 (s, 1H), 7.90 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 8.1, 1H), 7.57 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.43 (t, J = 1.7 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.56- 6.42 (m, 4H), 4.56- 4.42 (m, 2H), 4.32 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.17- 3.99 (m, 2H), 3.51 (dd, J = 14.1, 4.2 Hz, 1H), 3.40- 3.33 (m, 1H).31P NMR (D2O): δ 14.03 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 704.1041 m/z, found M+ = 704.1027 m/z。
【０１１７】
ＡＦ６４７−ＺＯＬ（７ｄ３、  ２−（５−（３−（６−（（２−ヒドロキシ−３−（１−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム−３−イル）プロピル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−３−メチル−５−スルホ−１−（３−スルホプロピル）インドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエン−１−イル）−３，３−ジメチル−５−スルホ−１−（３−スルホプロピル）−３Ｈ−インドール−１−イウム）。
上記の方法に従って合成した、５００μＬのＨ２Ｏ中の化合物４ｄの１８．９ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ、５当量）をＮａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．４に調整したものに、３００μＬの無水ＤＭＦ中のＡＦ６４７，ＳＥの１０ｍｇ（０．０１０５ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。この溶液を室温で一晩撹拌し、次に真空下で濃縮し、得られた青色残渣を、０．１ＭのＴＥＡＡｃ緩衝液（ｐＨ５．３）中の２０％ＭｅＯＨに溶解し、ＨＰＬＣ（方法Ｈ）によって精製した。１６．５分において溶出するピークを７ｄ３として回収した（保持時間は、異なる操作間で±１．５分の誤差を有している）。６．６ｍｇを得て、５３．１％の収率（酢酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.63 (s, 1H), 7.99 (t, J = 13.2 Hz, 2H), 7.78- 7.65 (m, 4H), 7.39 (s, 1H), 7.34- 7.20 (m, 3H), 6.55 (t, J = 12.5 Hz, 1H), 6.29 (dd, J = 13.6, 9.7 Hz, 2H), 4.52- 4.48 (m, 2H), 4.26- 4.07 (m, 5H), 3.98- 3.81 (m, 2H), 2.95- 2.85 (m, 5H), 2.13- 2.08 (m, 6H), 1.93- 1.89 (m, 2H), 1.58- 1.54 (m, 9H), 1.34- 1.21 (m, 3H), 1.04- 0.94 (m, 2H), 0.81- 0.66 (m, 1H), 0.52- 0.36 (m, 1H).31P NMR (D2O): δ 13.52 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 1186.2290 m/z, found [M-H]+= 1186.2337 m/z。
【０１１８】
８００ＣＷ−ＺＯＬ（７ｄ４、  （Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（３−（（Ｅ）−２−（１−（６−（（２−ヒドロキシ−３−（１−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム−３−イル）プロピル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イル）ビニル）−２−（４−スルホフェノキシ）シクロヘキサ−２−エン−１−イリデン）エチリデン）−３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）インドリン−５−スルホン酸、ナトリウム塩）：
上記の方法に従って合成した、１ｍＬのＨ２Ｏ中の化合物４ｄの７．４ｍｇ（０．０２１ｍｍｏｌ、５．３当量）をＮａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．４に調整したものに、１００μＬの無水ＤＭＦ中のＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ，ＳＥの５ｍｇ（０．００４ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。溶液を４℃で一晩撹拌し、次に真空下で濃縮し、得られた緑色がかった黒色残渣を、０．１ＭのＴＥＡＡｃ緩衝液（ｐＨ５．３）中の２０％ＭｅＯＨに溶解し、ＨＰＬＣ（方法Ｊ）によって精製した。２３．５分において溶出するピークを７ｄ４として回収した（保持時間は、異なる操作間で±１．５分の誤差を有している）。４．８ｍｇを得て、８３．２％の収率（酢酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.65 (s, 1H), 7.67 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.63- 7.50 (m, 6H), 7.39 (s, 1H), 7.28 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.14- 6.96 (m, 4H), 5.99- 5.84 (dd, J = 14.2, 9.4 Hz, 2H), 4.56- 4.46 (m, 2H), 4.18 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 4.02- 3.66 (m, 6H), 3.15- 3.09 (m, 2H), 2.81- 2.73 (m, 3H), 2.45 (brd, 5H), 2.09- 2.06 (m, 2H), 1.83 (obscured(不明瞭) by solvent peak, around 12H), 1.80- 1.59 (obscured(不明瞭) by solvent peak, around 6H), 1.53- 1.38 (m, 4H).31P NMR (D2O): δ 13.65 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 1330.2865 m/z, found [M-H]+ = 1330.2885 m/z。
【０１１９】
スルホ−Ｃｙ５−ＺＯＬ（７ｄ５、  １−（６−（（２−ヒドロキシ−３−（１−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム−３−イル）プロピル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１，３，３−トリメチル−５−スルホナトインドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエン−１−イル）−３Ｈ−インドール−１−イウム−５−スルホン酸、ナトリウム塩）：
上記の方法に従って合成した、０．９５ｍＬのＨ２Ｏ中の化合物４ｄの２２．７１ｍｇ（０．０６６ｍｍｏｌ、５．１当量）を、Ｎａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．３４に調整したものに、４５０μＬの無水ＤＭＦ中のスルホ−Ｃｙ５，ＳＥの１０ｍｇ（０．０１３ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。沈殿物が認められた。この溶液を室温で一晩撹拌し、次に真空下で濃縮し、得られた青色残渣を、０．１ＭのＴＥＡＡｃ緩衝液（ｐＨ５．３）中の２０％ＭｅＯＨに溶解し、ＨＰＬＣ（方法Ｋ）によって精製した。１８分において溶出するピークを７ｄ５として回収した（保持時間は、異なる操作間で±１．５分の誤差を有している）。５．３ｍｇを得て、４１．２％の収率（酢酸トリエチルアンモニウム塩）であった。1H NMR (D2O): δ 8.65 (s, 1H), 7.81 (td, J = 13.1, 4.3 Hz, 2H), 7.74- 7.56 (m, 4H), 7.39 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.15 (dd, J = 8.4, 2.2 Hz, 2H), 6.32 (t, J = 12.5 Hz, 1H), 6.00 (dd, J = 19.6, 13.7 Hz, 2H), 4.57- 4.44 (m, 2H), 4.17 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.92 (m, 4H), 3.42 (s, 3H), 2.16- 2.09 (m, 2H), 1.68- 1.61 (m, 2H), 1.53- 1.41 (m, 15H), 1.26- 1.17 (obscured(不明瞭) by triethylamine peak, around 3H).31P NMR (D2O): δ 13.51 (s). MS (negative ion ESI): calcd 483.6 m/z, found [M-4H]2- = 484.0 m/z。
【０１２０】
５−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ１、  １−（３−（３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−１−イウム）、および、６−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ２、  １−（３−（４−カルボキシ−３−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）−３−（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−１−イウム）。
上記の方法に従って合成した、１ｍＬのＨ２Ｏ中の化合物４ｅの２２．４ｍｇ（０．０５７ｍｍｏｌ、２．５当量）をＮａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．５８に調整したものに、３００μＬの無水ＤＭＦにおける５（６）−ＦＡＭ，ＳＥの１０．８ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。沈殿物を溶解し、ｐＨ８．４に調整し、溶液を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ精製の後、生成物をＨＰＬＣ（方法Ｉ）で精製した。６−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ２）および５−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ１）は、極めて異なる保持時間、２１．５分および３１．５分（保持時間は、異なる操作間で±３分の誤差を有する）においてそれぞれ溶出した。各異性体を別々に回収し、次に、緩衝液を除去するために真空中で濃縮した。化合物７ｅ１および７ｅ２は、上記の方法に従って、５−ＦＡＭ，ＳＥおよび６−ＦＡＭ，ＳＥから直接合成することができる。以下の詳細なＮＭＲの記述は、ＨＰＬＣで分離された生成物に対応している。７ｅ１および７ｅ２の総量は、１１．６ｍｇであり、６７．２％の収率であった。５−ＦＡＭ−ＭＩＮ（７ｅ１、トリエチルアンモニウム重炭酸塩）：６．３ｍｇを得た（トリエチルアンモニウム重炭酸塩）。1H NMR (D2O): δ 8.77 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.94- 7.67 (m, 4H), 7.31 (td, J = 6.4, 1.6 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 7.03 (s, 1H), 6.55 (dq, J = 5.0, 2.3 Hz, 4H), 4.57- 4.46 (m, 1H), 4.42- 4.21 (m, 2H), 3.72- 3.42 (m, 4H).31P NMR (D2O): δ 16.52 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 754.1198 m/z, found M+ = 754.1178 m/z.6-FAM-MIN (7e2, トリエチルアンモニウム重炭酸塩): obtained 5.3 mg (トリエチルアンモニウム重炭酸塩).1H NMR (D2O): δ 8.75 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.89 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 7.82- 7.67 (m, 4H), 7.55 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.27 (td, J = 6.7, 1.6 Hz, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.63- 6.51 (m, 4H), 4.50- 4.42 (m, 1H), 4.34- 4.19 (m, 2H), 3.63- 3.48 (m, 3H), 3.42 (dd, J = 14.1, 6.9 Hz, 1H). 31P NMR (D2O): δ 16.52 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 754.1198 m/z, found M+ = 754.1187 m/z。
【０１２１】
５−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ１、  ５−ＦＡＭ−３−ＩＰＥＨＰＣとしても知られている。３−（２−カルボキシ−２−ヒドロキシ−２−ホスホノエチル）−１−（３−（３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−１−イウム、  および、  ６−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ２、  ６−ＦＡＭ−３−ＩＰＥＨＰＣとしても知られている。３−（２−カルボキシ−２−ヒドロキシ−２−ホスホノエチル）−１−（３−（４−カルボキシ−３−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−ヒドロキシプロピル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−１−イウム）。
上記の方法に従って合成した、１ｍＬのＨ２Ｏ中の化合物４ｆの２０ｍｇ（０．０５６ｍｍｏｌ、２．５当量）を、Ｎａ２ＣＯ３（固体）でｐＨ８．５７に調整したものに、３００μＬの無水ＤＭＦ中の５（６）−ＦＡＭ，ＳＥの１０．５ｍｇ（０．０２２ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。沈殿物を溶解させるためにｐＨ８．４に調整し、溶液を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ精製の後、生成物をＨＰＬＣ（方法Ｉ）によって精製した。６−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ２）および５−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ１）は、極めて異なる保持時間、１９分および２８分（保持時間は、異なる操作間で±１．５分の誤差を有する）においてそれぞれ溶出した。各異性体を別々に回収し、次に、緩衝液を除去するために真空中で濃縮した。化合物７ｆ１および７ｆ２は、上記の方法に従って５−ＦＡＭ，ＳＥおよび６−ＦＡＭ，ＳＥから直接合成することができる。以下の詳細なＮＭＲの記述は、ＨＰＬＣで分離された生成物に対応している。７ｆ１と７ｆ２の総量は、１１．７ｍｇであり、７３．２％の収率であった。５−ＦＡＭ−ＭＩＮＰＣ（７ｆ１、トリエチルアンモニウム重炭酸塩）は、６．３ｍｇ得られた（トリエチルアンモニウム重炭酸塩）。1H NMR (D2O): δ 8.69 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 8.08 (dq, J = 1.6, 0.8 Hz, 1H), 7.88- 7.75 (m, 3H), 7.68 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.33 (ddd, J = 6.9, 5.8, 2.1 Hz, 1H), 7.27 (dt, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.01 (dt, J = 9.2, 0.9 Hz, 2H), 6.53- 6.46 (m, 3H), 4.50 (dt, J = 14.6, 2.9 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 14.6, 9.0 Hz, 1H), 4.26 (dq, J = 9.2, 5.1, 4.1 Hz, 1H), 3.72 (dd, J = 15.9, 3.2 Hz, 1H), 3.62 (ddd, J = 14.1, 4.8, 1.9 Hz, 1H), 3.48 (ddd, J = 14.0, 7.0, 4.3 Hz, 1H), 3.40 (dd, J = 15.7, 7.4 Hz, 1H).31P NMR (D2O): δ 14.82 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 718.1433 m/z, found M+= 718.1399 m/z.6-FAM-MINPC (7f2, トリエチルアンモニウム重炭酸塩): obtained 5.4 mg (トリエチルアンモニウム重炭酸塩). 1H NMR (D2O): δ 8.64 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.85 (ddd, J = 8.1, 1.8, 0.9 Hz, 1H), 7.78- 7.62 (m, 4H), 7.50 (dt, J = 1.7, 0.8 Hz, 1H), 7.28 (td, J = 6.8, 1.6 Hz, 1H), 7.04- 6.95 (m, 2H), 6.53- 6.45 (m, 4H), 4.46- 4.37 (m, 1H), 4.29- 4.12 (m, 2H), 3.68 (dd, J = 15.7, 3.6 Hz, 1H), 3.52 (dd, J = 14.0, 4.0 Hz, 1H), 3.43- 3.33 (m, 2H).31P NMR (D2O): δ 15.03 (s). HRMS (positive ion MALDI): calcd 718.1433 m/z, found M+ = 718.1416 m/z。
【０１２２】
エピクロロヒドリン（６）とピリジンとの反応の調査
Ｄ２Ｏにおけるピリジン：エピクロロヒドリン（１：５当量比）
ピリジン（１６μＬ、０．２ｍｍｏｌ、１当量）を４ｍＬのＤ２Ｏに溶解し、メチレンビスホスホン酸（固体）を使用してｐＨを６．２にした。この溶液に、エピクロロヒドリン（７９μＬ、１ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。反応の進行を１Ｈ ＮＭＲによって追跡した。４時間でエピクロロヒドリンは、反応混合物中に残っていなかった。残存する未反応のピリジンが約２０％あり、２つの生成物がＡ：Ｂ＝１：２の比率で観察された。
【０１２３】
Ｄ２Ｏにおけるピリジン：エピクロロヒドリン（１：１当量比）
ピリジン（１６μＬ、０．２ｍｍｏｌ、１当量）を４ｍＬのＤ２Ｏに溶解し、メチレンビスホスホン酸（固体）を使用してｐＨを６．２にした。この溶液に、エピクロロヒドリン（１６μＬ、０．２ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。反応の進行を１Ｈ ＮＭＲによって追跡した。４時間でエピクロロヒドリンは、反応混合物中にもはや残っていなかった。残存する未反応のピリジンが約５４％あり、２つの生成物がＡ：Ｂ＝６：１の比率で観察された。
【０１２４】
ＭｅＣＮにおけるピリジン：エピクロロヒドリン（１：５当量比）
ピリジン（１６μＬ、０．２ｍｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル４ｍＬに溶解した。この溶液に、エピクロロヒドリン（７９μＬ、１ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。４時間ですべての揮発物を蒸発させ、残基の１Ｈ ＮＭＲを取得した。化合物Ｂが、唯一の生成物として認められた。1H NMR (400 MHz, D2O): δ 8.92 (d, J = 5.8 Hz, 2H, ring), 8.66 (t, J = 7.6 Hz, 1H, ring), 8.20- 8.08 (m, 2H, ring), 5.19 (dd, J = 14.5, 2.2 Hz, 1H, CH-N), 4.60 (dd, J = 14.5, 7.4 Hz, 1H, CH-N), 3.70 (m, 1H, CHOCH2), 3.13 (t, J = 4.0 Hz, 1H, CHOCH2), 2.83 (dd, J = 4.0, 2.8 Hz, 1H, CHOCH2)。
【０１２５】
Demberelnyambaによって報告された1H NMR (500 mHz, D2O)：8.92-8.85 (m, 2H, ring), 8.66 - 8.59 (m, 1H, ring), 8.16 - 8.10 (m, 2H, ring), 5.11 - 4.66 (m, 1H, CHOCH2), 3.80- 3.63 (m, 2H, CHOCH2), 1.2-1.17 (d, 2H, CH2-N). FAB-MS (MeOH matrix): m/z 135.9 [100%, GlPy]。
【０１２６】
ＵＶ−ＶＩＳ吸収および蛍光発光スペクトル
標識されたすべての試料を水に溶解し、０．１Ｍリン酸緩衝液で希釈するか、または、１×ＰＢＳ（７ｄ５について）で希釈した。標識されたビスホスホネートは、遊離の蛍光標識のカルボン酸と同じ吸光係数（ε）を有すると仮定して、標識されたすべての生成物の最終濃度を、ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルから計算した。ＦＡＭ複合体（７ａ１−７ａ３、７ｂ１、７ｃ１、７ｄ１−７ｄ２、７ｅ１−７ｅ２、７ｆ１−７ｆ２）についてはλ＝４９３ｎｍで（ε＝７３０００Ｍ−１ｃｍ−１ｐＨ７．２）、ＲｈＲ−Ｘ複合体（７ａ４、７ｂ２、７ｃ２）についてはλ＝５６７．５ｎｍで（ε＝１１４８５０Ｍ−１ｃｍ−１ｐＨ７．５）、ＲＯＸ複合体（７ａ５、７ｂ３）についてはλ＝５８０ｎｍで（ε＝７２０００Ｍ−１ｃｍ−１ ｐＨ８．０）、ＡＦ６４７複合体（７ａ６、７ｂ４、７ｄ３）についてはλ＝６４８ｎｍで（ε＝２４００００Ｍ−１ｃｍ−１ｐＨ７．２）、８００ＣＷ複合体（７ｄ４）についてはλ＝７７４ｎｍで（ε＝２４００００Ｍ−１ｃｍ−１ ｐＨ７．４）、スルホ−Ｃｙ５複合体（７ｄ５）についてはλ＝６４４ｎｍで（ε＝２７１０００Ｍ−１ｃｍ−１  ｐＨ７．４、１×ＰＢＳ）でおこなった［５７］。
【０１２７】
ＦＡＭ複合体およびＲｈＲ−Ｘ複合体の発光スペクトルは、それぞれ、４９０ｎｍまたは５２０ｎｍの励起波長を用いて記録した。ＡＦ６４７複合体およびスルホ−Ｃｙ５複合体の発光スペクトルは、６００ｎｍの励起波長を用いて記録した。５（６）−ＲＯＸ複合体の発光スペクトルは、５７５ｎｍの励起波長を用いて記録した。ＩＲＤｙｅ ＣＷ８００複合体の発光スペクトルは、７５０ｎｍの励起波長を用いて記録した。励起スリット、出射スリット、積分時間および増分の設定を、試料濃度および分光計に応じて、それぞれの化合物に最適なスペクトルを得るように決定した。
【０１２８】
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーアッセイ
高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システムは、Ｗａｔｅｒｓ６５０Ｅ高度タンパク質精製システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｗａｔｅｒｓのクロマトグラフィー部門、ミルフォード、マサチューセッツ州）、６００Ｅシステムコントローラ、および、ＵＶ吸光度評価のための４８４調整可能吸光度検出器から構成されていた。セラミックハイドロキシアパタイト［ＨＡＰ、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ タイプＩＩ ２０μｍ  １００ｇ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社  ヘラクレス、カリフォルニア州］を、１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化し、０．６６ｃｍ（直径）×６．５ｃｍ（長さ）のガラスカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ  ｖａｌｖｅ（商標）社、ケンブリッジ、英国）に充填し、Ｗａｔｅｒｓ６５０Ｅ高度タンパク質精製システムに接続した。各サンプルを、１ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で調製し、１ｍＭのサンプルの１００μＬ（０．１μｍｏｌ）をＦＰＬＣシステムに注入した。その結果、化合物は、吸収され、続いて、ｐＨ６．８の１〜１０００ｍＭのリン酸塩の直線濃度勾配によって２ｍＬ／分の流速で溶出された。自動画分コレクター（Ｇｉｌｓｏｎ社、フランス）を用いて、各試料の画分を８０本のチューブに回収し、続いて、その後の紫外線分光検出（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳ ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州）、または、蛍光分光検出（ＷＡＬＬＡＣ ＶＩＣＴＯＲ（商標）１４２０マルチラベルカウンター、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国）のために使用した。各画分は、０．３分で溶離液を含んでいた。各サンプルの溶出分析結果は、３回における統計分析（Ｐｒｉｓｍ社、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、米国）によって決定した。保持時間のコントロール／対照としてそのままのＢＰ（ＲＩＳ、ＺＯＬおよびＭＩＮ）を用いて、各蛍光プローブのクロマトグラフィー分析結果を、ＢＰに対して正規化し、異なる時点で行われる分離の相対的な比較を可能にした。そのままのＢＰに対する正規化された平均保持時間±標準偏差（ＳＤ）として、データを提示する。
【０１２９】
ラングミュア吸着等温線による、ＢＰ−ＨＡＰ相互作用の定量的測定
０．１５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．８）を含む１ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を新たに調製した。１ｍＭのＰＢＳ中に化合物を溶解することによって、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ、ＡＦ６４７−ＲＩＳ、およびＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣの保存溶液（ストック溶液）を作り、１０ｍＭ溶液を得た。ハイドロキシアパタイト（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）セラミックハイドロキシアパタイト  タイプＩＩ  ２０μＭ  １００ｇ）をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社  ヘラクレス、カリフォルニア州から得た。
【０１３０】
蛍光ＢＰ／ＰＣ類の骨ミネラルへの親和性を測定し、比較するために、同一の実験条件下で、吸着等温線の調査を行った。正確に秤量したＨＡＰ粉末（１．４〜１．６ｍｇ）を、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１ｍＭのＰＢＳの適切な量を含有する４ｍＬの透明なバイアル液（ｐＨ６．８）に、３時間懸濁した。予備混合した後、１０ｍＭのＢＰ保存溶液を加え、蛍光ＢＰ／ＰＣ添加剤を２５、５０、１００、２００および３００μＭの濃度範囲とした。ＨＡＰとの平衡は、バイアルを転倒型振とう機上で室温で１６時間回転させることによって行った。各サンプルは３回調製した。平衡期間の後、固形物と上清とを分離するために、バイアルを５分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清の０．３ｍＬを回収し、平衡溶液濃度をナノドロップＵＶ分光計を用いて測定した。検量線のために、同じ等温緩衝液を含む保存溶液から、一連の希釈によって蛍光ＢＰ／ＰＣ標準サンプルを調製し、０から４００μＭの範囲とした。目的とする蛍光ＢＰの標準溶液を用いて、較正曲線を描いた。
【０１３１】
ＨＡＰに結合した蛍光ＢＰ／ＰＣの量（μｍｏｌ／ｍ２）は、次の式を用いて、蛍光ＢＰ／ＰＣ添加剤の初期濃度（μＭ）に対する、平衡後に検出された蛍光ＢＰ／ＰＣの終点濃度を比較することによって計算した。
【０１３２】
蛍光ＢＰ／ＰＣ ＨＡＰ表面濃度＝（蛍光ＢＰ／ＰＣ初期濃度−終点濃度）／サンプルのＨＡＰ表面積。ここで、サンプルのＨＡＰ表面積は、我々の場合、６７００ｍ２／Ｌであった。ＢＰ終点濃度に対する、蛍光ＢＰ／ＰＣのＨＡＰ表面濃度のプロットは、吸着等温線を提供した。
【０１３３】
蛍光ＢＰ／ＰＣ濃度の増加の関数として、ＨＡＰへの蛍光ＢＰ／ＰＣの結合平衡を決定するために、Ｐｒｉｓｍプログラム（Ｇｒａｐｈｐａｄ社、ＵＳＡ）に実装された非線形曲線フィッティングアルゴリズムを使用して、実験データを飽和結合方程式に適合させた：Ｙ（特異的結合）＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／（Ｋｄ＋Ｘ）。ここで、Ｘは、蛍光ＢＰ／ＰＣの濃度であり、Ｙは、特異的結合であり、Ｂｍａｘは、結合部位の最大数でありＹ軸と同じ単位で表される。Ｋｄは、平衡解離定数であり、Ｘ軸（濃度）と同じ単位で表される。薬物濃度がＫｄと等しい場合は、平衡状態において結合部位の半分が占有されている。
【０１３４】
タンパク質プレニル化の阻害および細胞生存率アッセイ
タンパク質プレニル化における蛍光ＢＰプローブの効果を決定するために、Ｊ７７４．２マウスマクロファージを、２４ウェルプレートに、２×１０５細胞（ｃｅｌｌ）／ｍＬで播き、一晩付着させた。次に、１０μＭまたは１００μＭのＲＩＳ、ｄＲＩＳ、ＺＯＬの蛍光類似体、そのままのＢＰまたは媒体で、細胞をそれぞれ２４時間処理した。細胞を放射性免疫沈降緩衝液中に溶解し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によってタンパク質を分離し、ウェスタンブロッティングによって、ポリビニルジフルオリド膜に移した。次に、Ｒａｐ１Ａ（ｕＲａｐ１Ａ）の非プレニル化体およびハウスキーピングタンパク質βアクチンに対する抗体とともに膜をインキュベートし、蛍光標識二次抗体のインキュベーションと、ＬＩ−ＣＯＲ赤外線イメージャ上の膜の走査とによって、抗体を検出した。示された結果は、独立した２つの実験の代表である。非プレニル化Ｒａｐ１Ａの存在量とβアクチンの存在量との比を、図５のブロットの下に、各サンプルについて示す。
【０１３５】
細胞生存率に対する蛍光ＢＰ類似体の効果を決定するために、Ｊ７７４．２マウスマクロファージを、９６ウェルプレートに２×１０５細胞（ｃｅｌｌ）／ｍＬで播き、一晩付着させた。次に、１０μＭ、１００μＭ、または５００μＭの、ＲＩＳ、ｄＲＩＳおよびＺＯＬの蛍光類似体、および、そのままのＢＰまたは媒体で、それぞれ細胞を４８時間処理した。インキュベーション期間の終了時に、各ウェルにアラマーブルー試薬を添加し、インキュベーションをさらに３時間続けた。プレートリーダーで蛍光を検出し、媒体コントロールに対する％として表した。結果は、少なくとも２回実施した２以上の独立した実験の平均値±ＳＤとして示されている。
【０１３６】
二官能性のアジド含有Ｎ−複素環式ビスホスホネート（アミノ−アジド−パラ−ｄＲＩＳ、７、１−（３−アミノ−２−アジドプロピル）−４−（２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム）の合成

パラ−ｄＲＩＳ（２３，テトライソプロピル（２−（ピリジン−４−イル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート））の合成：
１０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のＮａＨ（４２０ｍｇ、油中６０％、９．６３ｍｍｏｌ、１．１当量）に、０℃で、１５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の４−（クロロメチル）ピリジン−塩酸（１．４３ｇ、８．７１ｍｍｏｌ、１当量）を、Ｎ２状況下で撹拌しながら添加した。別のフラスコにおいて、１５ｍＬの乾燥ＴＨＦに分散させた１．０３ｇのＮａＨ（油中６０％、２５．７８ｍｍｏｌ、３当量）に対して、テトライソプロピルメチレンビスホスホネート（６．０ｇ、１７．４２ｍｍｏｌ、２当量）を０℃でＮ２の下で滴下し、０℃で３０〜４５分間撹拌を続け、続いて、室温で１時間続けた。テトライソプロピルメチレンビスカルボアニオン溶液に、０℃で、４−（クロロメチル）ピリジン溶液を添加し、７０℃で８時間撹拌した。１００−２００μＬのエタノールを加えて反応を止めて、冷凍庫で０．５時間冷却し、次に、冷却した１００ｍＬのＨ２Ｏ中に分散させ、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×２）で抽出した。有機ＣＨ２Ｃｌ２相を、冷却した０．２５Ｍ ＨＣｌ溶液１５０ｍＬに分散させた。よく振って、水相を回収し、さらにＣＨＣｌ３によって抽出した。ＣＨＣｌ３相を回収し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、次に、濃縮して、１．９ｇの２３を得た。５０％の収率であった。1H NMR (D2O): δ 8.56 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.62- 4.52 (m, 4H), 3.33 (td, J = 15.9, 7.1 Hz, 2H), 2.98 (tt, J = 23.9, 7.1 Hz, 1H), 1.14 (ddd, J = 25.2, 6.2, 1.4 Hz, 24H).31P NMR (D2O): δ 19.83 (s). MS: calcd 435.1 m/z, found [M+Na]+ = 458.1 m/z。
【０１３７】
パラ−ｄＲＩＳ−リンカー−ＯＨ（２４、  ４−（２，２−ビス（ジイソプロポキシホフホリル）エチル）−１−（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−ヒドロキシプロピル）ピリジン−１−イウム）の合成：
耐圧ガラスバイアル中のイソプロパノール２ｍＬに、パラ−ｄＲＩＳの５００ｍｇ（２３、１．１５ｍｍｏｌ、１当量）を溶解した。次に、シリンジで溶液に、１００μＬのＤＩＥＡ（０．５７ｍｍｏｌ、０．５当量）を添加し、続いて、イソプロパノール１ｍＬ中のリンカー５（７９０ｍｇ、４．５６ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。反応混合物を１００℃で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で留去し、１２ｍＬのＣＨＣｌ３を反応混合物に添加し、次に、３−４ｍＬのＨ２Ｏ中に分散させた。よく振って、水相を回収した（４−５回繰り返す）。水相をさらにエーテルによって洗浄し、過剰のリンカー５を除去し、ＣＨＣｌ３で再抽出した。最終のＣＨＣｌ３相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮して、５２０ｍｇの２４を得た。７５％の収率であった。1H NMR (CDCl3): δ 9.38- 9.27 (m, 2H), 7.83 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 6.14 (m, 2H), 5.09- 4.99 (m, 1H), 4.80- 4.64 (m, 5H), 4.21- 4.04 (m, 1H), 3.39- 3.19 (m, 4H), 2.50 (tt, J = 23.6, 6.4 Hz, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.28- 1.22 (m, 24H).31P NMR (CDCl3): δ 18.73 (s). MS: calcd 609.3 m/z, found M+ = 609.1 m/z。
【０１３８】
パラ−ｄＲＩＳ−リンカー−Ｎ３−エステル（２６、  １−（２−アジド−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロピル）−４−（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）ピリジン−１−イウム）の合成：
パラ−ｄＲｉｓＢＰ−リンカー−ＯＨの４５０ｍｇ（２４、０．７４ｍｍｏｌ、１当量）を、耐圧ガラスバイアル中の４ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。次に、２２５μＬのＴＥＡ（１．６ｍｍｏｌ、２．２当量）をシリンジで溶液に加えた。１００μＬのＭｓＣｌ（１．２９ｍｍｏｌ、１．７当量）を、氷浴／水浴中で滴下して混合物に加え、化合物２４が完全に中間体２５に変換（ＭＳおよび３１Ｐ ＮＭＲによって追跡）されるまで、反応混合物を１．５時間、撹拌した。反応混合物を短時間で濾過し、乾燥するまで濾液を減圧下でポンプで吸い出し、定量的に褐色油状の中間体２５を得た。
【０１３９】
５ｍＬの無水ＤＭＦに、３５０ｍｇの中間体２５（０．５１ｍｍｏｌ、１当量）を溶解させ、これに、３３０ｍｇのＮａＮ３（５．１ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、５０℃の油浴で、３０時間、激しく反応混合物を撹拌した。反応物をＭＳおよび３１Ｐ ＮＭＲによって追跡した。
【０１４０】
上記の混合物を濾過し、濾液を真空下で濃縮し、褐色のオイルを得た。オイルを溶解するために、３ｍＬのＣＨＣｌ３を使用し、不溶性の固体を濾別した。ＣＨＣｌ３の溶媒を除去し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィーによって精製した（Ｒｆ＝０．３、ＣＨＣｌ３／メタノール、５：１）。０．２２０ｍｇの化合物２６を得た。７０％の収率であった。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.31 (s, 2H), 7.91 (s, 2H), 6.35 (s, 1H), 5.37 (s, 1H), 4.72 (dh, J = 24.3, 6.3 Hz, 4H), 4.55- 4.32 (m, 2H), 3.66- 3.45 (m, 2H), 3.45- 3.24 (m, 2H), 2.61 (t, J = 25.3 Hz, 1H), 1.38 (s, 9H), 1.29- 1.21 (m, 24H).31P NMR (CDCl3): δ 18.76 (s). MS (positive ion MALDI): calcd 634.3 m/z, found M+ = 634.1 m/z。
【０１４１】
アミノ−アジド−パラ−ｄＲＩＳ（２０、  １−（３−アミノ−２−アジドプロピル）−４−（２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム）の合成
パラ−ｄＲＩＳ−リンカー−Ｎ３−エステル（２６、０．０８ｍｍｏｌ）の５０ｍｇを耐圧ガラスバイアル中の１ｍＬのＣＨ３ＣＮに溶解させ、続いて、ＢＴＭＳの０．３ｍＬを添加した。２４時間室温で混合物を撹拌した。次に、混合物を真空下でポンピングして乾固させ、メタノール０．５ｍＬを添加し、０．５時間撹拌した。さらに、メタノールを除去し、ＨＰＬＣ精製のための粗生成物を得た。分取Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８カラム、１００オングストローム、２１．２ｍｍ×２５０ｍｍ、５μ）、流速：８ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ−ＶＩＳ検出。Ａ：０．１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）、ｐＨ７．８、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ、２０分かけて溶離液Ｂを０〜３％へ増加し、その後、２０分から２４分まで溶離液Ｂを１００％へ増加させ、続いて、２４分から２５分まで溶離液Ｂを０％に減少させた勾配を用いて、試料を溶出した。１７．６分（保持時間は、異なる操作間で±１．０分の誤差を有する）において溶出するピークを回収し、溶媒を蒸発させ、２３ｍｇの化合物２０を得た。８０％の収率であった。1H NMR (500 MHz, D2O): δ 8.55 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.95 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 4.63 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 13.9, 9.7 Hz, 1H), 4.06- 3.96 (m, 1H), 3.34- 3.19 (m, 2H), 2.90 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 2.73 (dd, J = 13.7, 7.4 Hz, 1H), 2.23- 2.07 (tt, J = 20.8, 7.3 Hz, 1H).31P NMR (D2O): δ 14.8. MS: calcd 366.1 m/z, found [M-2H]- = 364.4 m/z, [M+Na]+ = 388.0, [M+2Na]+ = 410.0 m/z。
【０１４２】
アミノ−アジド−パラ−ｄＲＩＳ（２０）のクリック可能な反応性の研究
５（６）−ＦＡＭ−アルキン（２９、  ５−ＦＡＭ−アルキン：２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（プロパ−２−イン−１−イルカルバモイル）安息香酸；  ６−ＦＡＭ−アルキン：２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（プロパ−２−イン−１−イルカルバモイル）安息香酸）の合成：
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の５（６）−カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステルの１０．４ｍｇ（０．０２２ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、４．２μＬ（０．０６５ｍｍｏｌ、３当量）のプロパルギルアミンを添加した。室温で５時間撹拌した後、溶媒を真空下で除去し、シリカゲルＴＬＣプレート（Ｒｆ＝０．７、アセトン／ＣＨ２Ｃｌ２、１：１）によって粗混合物を精製し、７．７ｍｇ（８５％）の５（６）−ＦＡＭ−アルキン（２９）を得た。1H NMR (500 MHz, Methanol-d4): δ 8.98 (dt, J = 1.5, 0.6 Hz, 1H), 8.73 (dd, J = 8.0, 1.7 Hz, 1H), 8.70- 8.62 (m, 2H), 8.18 (dt, J = 1.3, 0.5 Hz, 1H), 7.86 (dt, J = 8.0, 0.6 Hz, 1H), 7.28- 7.20 (m, 7H), 7.11 (ddd, J = 9.0, 6.9, 2.4 Hz, 4H), 4.76 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 4.64 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 3.19 (td, J = 2.6, 0.4 Hz, 1H), 3.11 (td, J = 2.5, 0.5 Hz, 1H). MS: calcd 413.1 m/z, found [M-H]- = 412.3 m/z, [M+H]+ = 414.4 m/z。
【０１４３】
５（６）−ＦＡＭ−トリアゾール−パラ−ｄＲＩＳ（３０、  ５−異性体：１−（３−アミノ−２−（４−（（３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）プロピル）−４−（２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム；  ６−異性体：１−（３−アミノ−２−（４−（（４−カルボキシ−３−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）プロピル）−４−（２，２−ジホスホノエチル）ピリジン−１−イウム）の合成：
アミノ−アジド−パラ−ｄＲＩＳの４．６ｍｇ（２０、１２．６μｍｏｌ、１．８当量）、および、５（６）−ＦＡＭ−アルキンの３ｍｇ（２９、７μｍｏｌ、１当量）を、耐圧バイアル中の水に溶解させた。最終濃度が０．２Ｍとなり１ｍＬの容量となるように、０．５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）緩衝液、ｐＨ８．０を加えた。ＣｕＳＯ４／アスコルビン酸ナトリウム溶液（Ｄ２Ｏ中の５０ｍＭ／７５ｍＭ、２０％当量、Ｃｕ触媒）の２８μＬを加えた。ポンプによって溶液を脱気した後、アルゴンを流し、これを３回繰り返した。溶液を半分に分割した。室温および４５℃の水浴中で一晩インキュベートした。
【０１４４】
Ｃｈｅｌｅｘ樹脂を添加し続いて２時間の超音波によって反応を止めた。次に、ＴＬＣ（溶出液１００％メタノール）によって混合物を追跡し、反応する物質である５（６）−ＦＡＭ−アルキン（２９）がほぼ存在しないことが示された。次に、沈殿が生成しなくなるまで、０．５ＭのＨＣｌによって反応混合物をｐＨ３．０に調整した。沈殿物を遠心分離によって回収し、次に、アセトン溶液（０．５ｍＬ×２）、希釈したＨＣｌ（ｐＨ３．０、０．２５ｍＬ×２）で順次洗浄した。３ｍｇを得て、収率５７％であった。３１Ｐ ＮＭＲスペクトルによって、５（６）−ＦＡＭ−トリアゾール−パラ−ｄＲＩＳ生成物（３０）の純度は＞９８％であることが示された。MS: calcd 779.2 m/z, found [M-2H]- = 777.5 m/z, [M+Na]+= 801.3 m/z。
【０１４５】
５−異性体および６−異性体を、さらに逆相ＨＰＬＣによって分離した。沈殿した生成物を０．１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液に再溶解させ、以下の条件において、半分取逆相ＨＰＬＣによって分離した：Ｂｅｃｋｍａｎ社 Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ、５μ、８０オングストロームの細孔サイズ）、流速４．０ｍＬ／分、２５６ｎｍおよび３７０ｎｍでのＵＶ検出、移動相：緩衝液Ａ（１０％メタノール中の０．１Ｍ ＴＥＡＢ、ｐＨ８．０）および緩衝液Ｂ（７５％メタノール中０．１Ｍ ＴＥＡＢ、ｐＨが８．０）。勾配は次の通り：２０分で、緩衝液Ｂの０％から緩衝液Ｂの１００％へ直線的に増加。５−異性体および６−異性体は、極めて異なる保持時間、７．２分および９．６分で溶出した。各ピークを回収し、真空下で溶媒を除去した。５−異性体：1H NMR (400 MHz, D2O): δ 8.26 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 7.99- 7.75 (m, 5H), 7.58 (s, 1H), 7.06 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.64- 6.47 (m, 4H), 5.25 (s, 1H), 5.13- 4.89 (m, 3H), 3.47 (d, J = 20.7 Hz, 2H), 3.26- 3.17 (m, 1H), 3.01- 2.87 (m, 2H), 2.19 (s, 1H).31P NMR (400 MHz, D2O): δ 17.05.  ６−異性体: 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 8.30 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 8.10 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.88 (t, J = 6.3 Hz, 3H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.64- 6.55 (m, 4H), 5.36 (s, 1H), 5.14 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 5.08- 4.91 (m, 1H), 4.58 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.72- 3.46 (m, 2H), 3.22 (s, 2H), 2.94 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 2.23 (s, 1H).31P NMR (400 MHz, D2O): δ 17.03。
【０１４６】
化合物３０のＵＶ−ＶＩＳ吸収および蛍光発光スペクトルの測定：
化合物３０の６−および５−異性体を水に溶解し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈した。化合物３０の２つの異性体は、遊離の蛍光標識のカルボン酸と同じ吸光係数（ε）を有すると仮定して、標識された生成物の最終濃度を、λ＝４９３ｎｍ（ε＝７３０００Ｍ−１ｃｍ−１ｐＨ７．２）でのＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルから算出する。
【０１４７】
アジド基含有ビスホスホネートを経由する、蛍光標識されたＮ−複素環式ビスホスホネートの合成
グリシジルアジド３１の合成
３１を製造するために、エピクロルヒドリン６（５ｍｍｏｌ）を、アジ化ナトリウムの水溶液（８．０ｍＬ中に２６．０ｍｍｏｌ）に溶解し、４．６ｍＬの酢酸を次に添加し、溶液を３０℃で５時間撹拌した。溶液をジエチルエーテル（３×８ｍＬ）で抽出した。混ざり合った有機相を、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ値６．５）の１０ｍＬによる分液で５回洗浄した。有機相を乾燥し、ロータリーエバポレーターでジエチルエーテルを除去し、４５０ｍｇの１−アジド−３−クロロ−２−プロパノールを得た（収率：６７％）。グリシジルアジド３１を、１−アジド−３−クロロ−２−プロパノールから水溶液として製造した。０．２ｍＬの水に２１０ｍｇを加えて撹拌し、溶液のｐＨが１２．５で安定するまで、１Ｍ ＮａＯＨを５分間でゆっくりと添加した後、１ＭのＨＣｌでｐＨを７．０に調整し、さらに水を加えて、０．５Ｍのグリシジルアジド３１を含む、３．２ｍＬ容量とした。
【０１４８】
アジド含有Ｎ−複素環式ビスホスホネートリンカー３２の合成
０．５ｍＬのＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ値６．０）中のリセドロン酸１ａ（０．１５ｍｍｏｌ）に、０．０４ｍＬの２Ｍ ＮａＯＨ、および、グリシジルアジド３１の０．６ｍＬ（５００ｍｍｏｌ）を順次加えた。溶液を室温で一晩保持した後、ＳＡＸカラムＨＰＬＣ精製に供して、６５ｍｇの白色固体のビスホスホネート−リンカー３２を得た（収率：８５．８％）。
【０１４９】
蛍光標識されたＮ−複素環式ビスホスホネート３４の合成
０．５ｍＬのトリエチルアミン重炭酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）中の、ビスホスホネート−リンカー３２（６．５μｍｏｌ）および蛍光標識されたアルキン３３（６．５μｍｏｌ）をＡｒでフラッシュし、耐圧バイアル中に密封した。その後、６．５ｕＬのＣｕＳＯ４／アスコルビン酸ナトリウム溶液（５０ｍｍｏｌ／２５０ｍｍｏｌ、１０％当量、銅触媒）を注入し、溶液を室温で１時間保持した後、逆相ＨＰＬＣによって精製し、トリアゾール３４の１．９ｍｇを得た（収率：５０％）。
【０１５０】
以下の刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
[1] a) R. G. G. Russell, N. B. Watts, F. H. Ebetino, M. J. Rogers, Osteoporos. Int. 2008, 19, 733-759; b) F. Ebetino, A. Hogan, S. Sun, M. Tsoumpra, X. Duan, J. Triffitt, A. Kwaasi, J. Dunford, B. Barnett, U. Oppermann, M. Lundy, A. Boyde, B. Kashemirov, C. McKenna, R. Russell, Bone 2011, 4920-33. 
[2] a) I. Reid, M. Bolland, A. Grey, Bone 2007, 41, 318-320; b) A. Siddiqi, A. Payne, S. 
Zafar, Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod.2009, 108, e1-8. 
[3] a) I. Reid, Bone 2009, 44, 4-10; b) M. Allen, D. Burr, J Oral Maxillofac Surg 2009, 67, 61-70. 
[4] S. Zhang, G. Gangal, H. Uludag, Chem. Soc. Rev.2007, 36, 507-531. 
[5] a) K. Bhushan, E. Tanaka, J. Frangioni, Angew. Chem. Int. Ed.2007, 46, 7969-7971; b) J. 
Figueiredo, C. Passerotti, T. Sponholtz, H. Nguyen, R. Weissleder, J. Urol. 2008, 179, 1610-1614; c) F. Jaffer, P. Libby, R. Weissleder, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.2009, 29, 1017-1024; d) S. Subramanian, F. Jaffer, A. Tawakol, J. Nucl. Cardiol. 2010, 17, 135-144. 
[6] V. Kubicek, I. Lukes, Future Med. Chem.2010, 2, 521-531. 
[7] S. Hilderbrand, R. Weissleder, Curr. Opin. Chem. Biol.2010, 14, 71-79. 
[8] S. Troyan, V. Kianzad, S. Gibbs-Strauss, S. Gioux, A. Matsui, R. Oketokoun, L. Ngo, A. 
Khamene, F. Azar, J. Frangioni, Ann. Surg. Oncol.2009, 16, 2943-2952. 
[9] S. Gioux, H. Choi, J. Frangioni, Mol. Imaging.2010, 9, 237-255. 
[10] F. Leblond, S. Davis, P. Valdes, B. Pogue, J. Photochem. Photobiol B.2010, 98, 77-94. 
[11] a) K. Thompson, M. Rogers, F. Coxon, J. Crockett, Mol. Pharmacol. 2006, 69, 1624- 1632; b) F. P. Coxon, K. Thompson, A. J. Roelofs, F. H. Ebetino, M. J. Rogers, Bone 2008, 42, 848-860. 
[12] A. Zaheer, R. Lenkinski, A. Mahmood, A. Jones, L. Cantley, J. Frangioni, Nat. 
Biotechnol.2001, 19, 1148-1154. 
[13] B. A. Kashemirov, J. L. Bala, X. Chen, F. H. Ebetino, Z. Xia, R. G. G. Russell, F. P. 
Coxon, A. J. Roelofs, M. J. Rogers, C. E. McKenna, Bioconjug. Chem. 2008, 19, 2308- 2310. 
[14] M. Martin, W. Arnold, H. r. Heath, J. Urbina, E. Oldfield, Biochem. Biophys. Res. 
Commun.1999, 263, 754-758. 
[15] a) A. Hokugo, S. Sun, S. Park, C. E. McKenna, I. Nishimura, Bone 2013, 53, 59-68; b) S. 
Cheong, S. Sun, B. Kang, O. Bezouglaia, D. Elashoff, C. E. McKenna, T. L. Aghaloo, S. Tetradis, J. Oral Maxillofac. Surg. 2014; c) S. Bae, S. Sun, T. Aghaloo, J. E. Oh, C. E. McKenna, M. K. Kang, K. H. Shin, S. Tetradis, N. H. Park, R. H. Kim, Int. J. Mol. Med. 2014, 34, 559-563. 
[16] W. S. Kang, S. Sun, K. Nguyen, B. A. Kashemirov, C. E. McKenna, S. A. Hacking, A. 
M. Quesnel, W. F. Sewell, M. J. McKenna, D. H. Jung, Otol. Neurotol.2015, In press. 
[17] S. Junankar, G. Shay, J. Jurczyluk, N. Ali, J. Down, N. Pocock, A. Parker, A. Nguyen, S. 
Sun, B. Kashemirov, C. E. McKenna, P. I. Croucher, A. Swarbrick, K. Weilbaecher, T. G. Phan, M. J. Rogers, Cancer discovery 2015, 5, 35-42. 
[18] A. Hounslow, J. Carran, R. Brown, D. Rejman, G. Blackburn, D. Watts, J. Med. Chem. 
2008, 51, 4170-4178. 
[19] M. Baidya, F. Brotzel, H. Mayr, Org. Biomol. Chem.2010, 8, 1929-1935. 
[20] Note: pKa of ZOL and MIN were calculated by MarvinSketch and the error is ±0.5. The concentration of microspecies was calculated according to the Henderson-Hasselbalch equation. 
[21] D. Demberelnyamba, S. J. Yoon, H. Lee, Chem. Lett.2004, 33, 560-561. 
[22] E. R. van Beek, C. W. G. M. Lowik, F. H. Ebetino, S. E. Papapoulos, Bone 1998, 23, 437-442. 
[23] X. Duan, PhD thesis, University of Oxford 2010. 
[24] R. G. G. Russell, Z. Xia, J. E. Dunford, U. Oppermann, A. Kwaasi, P. A. Hulley, K. L. Kavanagh, J. T. Triffitt, M. W. Lundy, R. J. Phipps, B. L. Barnett, F. P. Coxon, M. J. Rogers, N. B. Watts, F. H. Ebetino, Ann. NY. Acad. Sci. Skeletal Biology and Medicine, Pt B 2007, 1117, 209-257. 
[25] A. J. Roelofs, C. A. Stewart, S. T. Sun, K. M. Blazewska, B. A. Kashemirov, C. E. 
McKenna, R. G. G. Russell, M. J. Rogers, M. W. Lundy, F. H. Ebetino, F. P. Coxon, J. Bone Miner. Res.2012, 27, 835-847. 
[26] a) M. S. Marma, Z. D. Xia, C. Stewart, F. Coxon, J. E. Dunford, R. Baron, B. A. 
Kashemirovli, F. H. Ebetino, J. T. Triffitt, R. G. G. Russell, C. E. McKenna, J. Med. Chem.2007, 50, 5967-5975; b) C. E. McKenna, B. A. Kashemirov, K. M. Blazewska, I. Mallard-Favier, C. A. Stewart, J. Rojas, M. W. Lundy, F. H. Ebetino, R. A. Baron, J. E. Dunford, M. L. Kirsten, M. C. Seabra, J. L. Bala, M. S. Marma, M. J. Rogers, F. P. Coxon, J. Med. Chem.2010, 53, 3454-3464. 
[27] A. J. Roelofs, F. P. Coxon, F. H. Ebetino, M. W. Lundy, Z. J. Henneman, G. H. 
Nancollas, S. Sun, K. M. Blazewska, J. L. Bala, B. A. Kashemirov, A. B. Khalid, C. E. McKenna, M. J. Rogers, J. Bone Miner. Res.2010, 25, 606-616. 
[28] a) J. Turek, F. H. Ebetino, M. W. Lundy, S. T. Sun, B. A. Kashemirov, C. E. McKenna, M. A. Gallant, L. I. Plotkin, T. Bellido, X. C. Duan, J. T. Triffitt, R. G. G. Russell, D. B. Burr, M. R. Allen, Calcif. Tissue Int. 2012, 90, 202-210; b) J. A. Vermeer, I. D. Jansen, M. Marthi, F. P. Coxon, C. E. McKenna, S. Sun, T. J. de Vries, V. Everts, Bone 2013, 57, 242-251; c) A. Verhulst, S. Sun, C. E. McKenna, P. C. D’Haese, Plos ONE 2015, 10, e0121861.
[29] Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B., Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions. Angew Chem Int Ed 2001, 40 (11), 2004-2021. 
[30] Bock, V. D.; Hiemstra, H.; van Maarseveen, J. H., Cu-I-catalyzed alkyne-azide "click" cycloadditions from a mechanistic and synthetic perspective. Eur J Org Chem 2006, (1), 51-68. 
[31] Meldal, M.; Tornoe, C. W., Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev 2008, 108 (8), 2952-3015. 
[32] Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B., A stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed 2002, 41 (14), 2596-2599. 
[33] Tornoe, C. W.; Christensen, C.; Meldal, M., Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J Org Chem 2002, 67 (9), 3057-3064. 
[34] Kolb, H. C.; Sharpless, K. B., The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug Discov Today 2003, 8 (24), 1128-1137. 
[35] Lutz, J. F., 1,3-dipolar cycloadditions of azides and alkynes: A universal ligation tool in polymer and materials science. Angew Chem Int Edit 2007, 46 (7), 1018-1025. 
[36] Binder, W. H.; Kluger, C., Azide/alkyne-"click" reactions: Applications in material science and organic synthesis. Curr Org Chem 2006, 10 (14), 1791-1815. 
[37] Seo, T. S.; Li, Z. M.; Ruparel, H.; Ju, J. Y., Click chemistry to construct fluorescent oligonucleotides for DNA sequencing. J Org Chem 2003, 68 (2), 609-612. 
[38] Moses, J. E.; Moorhouse, A. D., The growing applications of click chemistry. Chem Soc Rev 2007, 36 (8), 1249-1262. 
[39] Presolski, S. I.; Hong, V. P.; Finn, M. G., Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol 2011, 3 (4), 153-162. 
[40] Skarpos, H.; Osipov, S. N.; Vorob'eva, D. V.; Odinets, I. L.; Lork, E.; Roschenthaler, G. V., Synthesis of functionalized bisphosphonates via click chemistry. Org Biomol Chem 2007, 5 (15), 2361-2367. 
[41] Gajda, A.; Gajda, T., Synthesis and reactivity of azidoalkylphosphonates, -phosphinates and -phosphine oxides. Curr Org Chem 2007, 11 (18), 1652-1668. 
[42] Zhou, X.; Hartman, S. V.; Born, E. J.; Smits, J. P.; Holstein, S. A.; Wiemer, D. F., Triazole-based inhibitors of geranylgeranyltransferase II. Bioorg Med Chem Lett 2013, 23 (3), 764-766. 
[43] Guenin, E.; Hardouin, J.; Lalatonne, Y.; Motte, L., Bivalent alkyne-bisphosphonate as clickable and solid anchor to elaborate multifunctional iron oxide nanoparticles with microwave enhancement. J Nanopart Res 2012, 14 (7). 
[44] Chamberlain, B. T.; Upton, T. G.; Kashemirov, B. A.; McKenna, C. E., alpha-Azido Bisphosphonates: Synthesis and Nucleotide Analogues. J Org Chem 2011, 76 (12), 5132-5136. 
[45] McPherson, J. C.; Runner, R.; Buxton, T. B.; Hartmann, J. F.; Farcasiu, D.; Bereczki, I.; Roth, E.; Tollas, S.; Ostorhazi, E.; Rozgonyi, F.; Herczegh, P., Synthesis of osteotropic hydroxybisphosphonate derivatives of fluoroquinolone antibacterials. Eur J Med Chem 2012, 47, 615-618. 
[46] Chen, X. L.; Li, X.; Yuan, J. W.; Qu, L. B.; Wang, S. H.; Shi, H. Y.; Tang, Y. C.; Duan, L. K., Simple, efficient one-pot method for synthesis of novel N-attached 1,2,3-triazole containing bisphosphonates. Tetrahedron 2013, 69 (20), 4047-4052. 
[47] Ferrer-Casal, A.; Barboza, A. P.; Szajnman, S. H.; Rodriguez, J. B., 1, 3-Dipolar Cycloadditions of the Versatile Intermediate Tetraethyl Vinylidenebisphosphonate. Synthesis 2013, 45, 2397-2404. 
[48] Liu, X. M.; Thakur, A.; Wang, D., Efficient synthesis of linear multifunctional poly(ethylene glycol) by copper(I)-catalyzed huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. 
Biomacromolecules 2007, 8 (9), 2653-2658. 
[49] Liu, X. M.; Lee, H. T.; Reinhardt, R. A.; Marky, L. A.; Wang, D., Novel biomineral-binding cyclodextrins for controlled drug delivery in the oral cavity. J Controlled Release 2007, 122 (1), 54-62. 
[50] Hein, C. D.; Liu, X. M.; Chen, F.; Cullen, D. M.; Wang, D., The Synthesis of a Multiblock Osteotropic Polyrotaxane by Copper(I)-Catalyzed Huisgen 1,3-Dipolar 
Cycloaddition. Macromol Biosci 2010, 10 (12), 1544-1556. 
[51] Drago, C.; Arosio, D.; Casagrande, C.; Manzoni, L., Bisphosphonate-functionalized cyclic Arg-Gly-Asp peptidomimetics. Arkivoc 2013, ii (Issue in Honor of Prof. Richard R. 
Schmidt), 185-200. 
[52] C. E. McKenna, B. A. Kashemirov, K. M. Blazewska, I. Mallard-Favier, C. A. Stewart, J. Rojas, M. W. Lundy, F. H. Ebetino, R. A. Baron, J. E. Dunford, M. L. Kirsten, M. C. Seabra, J. L. Bala, M. S. Marma, M. J. Rogers, F. P. Coxon, J. Med. Chem.2010, 53, 3454-3464. 
[53] B. A. Kashemirov, J. L. Bala, X. Chen, F. H. Ebetino, Z. Xia, R. G. G. Russell, F. P. Coxon, A. J. Roelofs, M. J. Rogers, C. E. McKenna, Bioconjugate Chem.2008, 19, 2308-2310. 
[54] L. Rocheblave, F. Bihel, C. De Michelis, G. Priem, J. Courcambeck, B. Bonnet, J. C. Chermann, J. L. Kraus, J. Med. Chem.2002, 45, 3321-3324. 
[55] S. S. White, H. T. Li, R. J. Marsh, J. D. Piper, N. D. Leonczek, N. Nicolaou, A. J. Bain, L. M. Ying, D. Klenerman, J. Am. Chem. Soc.2006, 128, 11423-11432. 
[56] B. A. Kashemirov, J. L. Bala, X. Chen, F. H. Ebetino, Z. Xia, R. G. G. Russell, F. P. Coxon, A. J. Roelofs, M. J. Rogers, C. E. McKenna, Bioconjug. Chem.2008, 19, 2308-2310. 
[57] a) I. V. Kutyavin, S. G. Lokhov, I. A. Afonina, R. Dempcy, A. A. Gall, V. V. Gorn, E. Lukhtanov, M. Metcalf, A. Mills, M. W. Reed, S. Sanders, I. Shishkina, N. M. J. Vermeulen, Nucleic Acids Res.2002, 30, 4952-4959; b) I. Mende, P. Hoffmann, A. Wolf, R. Lutterbuse, E. Kopp, P. A. Baeuerle, A. de Baey, P. Kufer, Int. Immunol.2005, 17, 539-547; c) C. Lefevre, H. C. Kang, R. P. Haugland, N. Malekzadeh, S. Arttamangkul, R. P. Haugland, Bioconjugate Chem. 1996, 7, 482-489; d) D. Maurel, J. Kniazeff, G. Mathis, E. Trinquet, J. P. Pin, H. Ansanay, Anal. Biochem.2004, 329, 253-262; e) M. Balaz, M. Sundberg, M. Persson, J. Kvassman, A. Monsson, Biochemistry (Mosc).2007, 46, 7233-7251; f) Li-Cor IRDye 800CW, SE sectroscopic property, on the World Wide Web at licor.com/bio/products/reagents/irdye/800cw/nhs_ester (accessed October, 2014); g) Lumiprobe Sulfo-Cy5, SE sectroscopic property, on the World Wide Web at lumiprobe.com/p/sulfo-cy5-nhs-ester (accessed October, 2014).
【０１５２】
好ましい実施形態に関連付けて本発明を説明してきたが、当業者が容易に理解するであろうように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく改良および変形が利用されてもよいことを理解すべきである。従って、そのような改良は、本発明の範囲および添付の請求項範囲で実践されてもよい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【国際調査報告】
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