(57)【要約】  任意で、抗血管形成剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、及び抗ＰＤＧＦ剤との併用療法における、年齢関連性黄斑変性等の網膜漏出及びＣＮＶに関連する眼の疾患、障害又は状態の治療及び予防のための活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）の使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜漏出及び脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）に関連する眼の疾患、障害又は状態の治療法に使用するための、薬学的に許容可能な担体及び活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
上記治療法が、網膜漏出及び脈絡膜血管新生に関連する眼の疾患、障害又は状態の治療又は予防である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
網膜漏出及びＣＮＶに関連する眼の疾患、障害又は状態は、直接的にＣＮＶによって引き起こされる疾患、障害又は状態であって、ＣＮＶの進行段階を第２ステージ若しくはその合併症として特徴づけるか、又は同調的若しくは非同調的なＣＮＶの続発症として特徴づける、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
上記眼の疾患が、年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）、病的近視、色素線条を伴う弾性線維性仮性黄色腫、ホヒト・小柳・原田病（ＶＫＨ）等の非感染性ブドウ膜炎、感染性ブドウ膜炎、視神経炎、乳頭浮腫、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、ベーチェット病及び網膜症等の視神経の炎症性疾患から選択され、
上記眼の障害が、慢性的炎症、酸化ダメージ、ドルーゼ発生、リポフスチンの蓄積、ブルッフ膜の異常、血圧及び血流の調節を妨げ、虚血状態を引き起こす眼球内での血管変化、生理学的加齢、遺伝的要因及び環境的要因から選択され、
上記眼の状態が、眼の医学的手術の間の網膜の外傷及び合併症に続いて脈絡膜血管新生及び網膜漏出が発生する偶発的、副次的な事象である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
上記眼の疾患がＡＭＤである、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
上記活性化プロテインＣがヒトＡＰＣの野生型の配列、ＡＰＣの機能的な部分配列、ＡＰＣ若しくはＡＰＣの機能的な部分配列の誘導体、又はＡＰＣ若しくはその機能的な部分配列の変異体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
上記機能的な部分的配列が、野生型ＡＰＣのアミノ酸配列の、９５％まで、９０％まで、８５％まで、８０％まで、７５％までを含み、上記機能的な部分配列が、野生型又は野生型に近い型のＡＰＣの機能を維持している、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
上記ＡＰＣ変異体のアミノ酸配列が、野生型ＡＰＣのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％一致している、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
抗血管形成剤、抗炎症剤、抗菌剤、免疫抑制剤、抗ＰＤＧＦ剤、抗真菌剤及び抗ウイルス剤より選択される１つ以上の活性剤との併用療法において使用される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
上記抗血管形成剤が、抗ＶＥＧＦ剤又は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）阻害剤であって、上記免疫抑制剤が、ステロイドである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
網膜漏出及び脈絡膜血管新生に関連する眼の疾患、障害又は状態の治療のための薬剤の製造における活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の使用。
【請求項１２】
上記治療が、網膜漏出及び脈絡膜血管新生に関連する眼の疾患、障害又は状態の予防を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
網膜漏出及びＣＮＶに関連する眼の疾患、障害又は状態が、直接的にＣＮＶによって引き起こされる疾患、障害又は状態であり、ＣＮＶの進行段階を第２ステージ若しくはその合併症として特徴づけるか、又はＣＮＶを同調的若しくは非同調的なＣＮＶの続発症として特徴づける、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
上記眼の疾患が、年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）、病的近視、色素線条を伴う弾性線維性仮性黄色腫、ホヒト・小柳・原田病（ＶＫＨ）等の非感染性ブドウ膜炎、感染性ブドウ膜炎、視神経炎、乳頭浮腫、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、ベーチェット病及び網膜症等の視神経の炎症性疾患から選択され、
上記眼の異常が、慢性的炎症、酸化ダメージ、ドルーゼ発生、リポフスチンの蓄積、ブルッフ膜の異常、血圧及び血流の調節を妨げ、虚血状態を引き起こす眼球内での血管変化、生理学的加齢、遺伝的要因及び環境的要因から選択され、
上記眼の状態が、眼の医学的手術の間の網膜の外傷及び合併症に続いて脈絡膜血管新生及び網膜漏出が発生する偶発的、副次的な事象である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
上記眼の疾患がＡＭＤである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
上記活性化プロテインＣがヒトＡＰＣの野生型の配列、ＡＰＣの機能的な部分配列、ＡＰＣ若しくはその機能的な部分配列の誘導体、又はＡＰＣ若しくはその機能的な部分配列の変異体を含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
上記機能的な部分配列が、野生型ＡＰＣのアミノ酸配列の、９５％まで、９０％まで、８５％まで、８０％まで又は７５％までを含み、上記機能的な部分的配列が、野生型又は野生型に近い型のＡＰＣの機能を維持している、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
上記ＡＰＣ変異体のアミノ酸配列が、野生型ＡＰＣのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％一致している、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
上記治療が、抗血管形成剤、抗炎症剤、抗菌剤、免疫抑制剤、抗ＰＤＧＦ剤、抗真菌剤及び抗ウイルス剤より選択される１つ以上の活性剤との併用療法である、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
上記抗血管形成剤が、抗ＶＥＧＦ剤又は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）阻害剤であって、上記免疫抑制剤が、ステロイドである、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、そのいくつかの実施形態において、眼疾患の治療、より詳しくは、限定されるものではないが、網膜漏出及び脈絡膜血管新生に関連した眼疾患の治療及び又は予防に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）とは眼の網膜の下にある脈絡膜層の内部に新生血管が形成されることである。脈絡膜は網膜と強膜（眼の白い部分）との間の領域であり、眼に酸素及び養分を供給する。ＣＮＶは新生血管が脈絡膜内部で成長し始め、脈絡膜と網膜との間の膜であるブルッフ膜（網膜を支持している下地）を突き破って網膜に侵入し、網膜を分裂させることで発症する。脈絡毛細管が最初にブルッフ膜（ＢｒＭ）を貫通した後、侵入する血管が退行又は拡張する（ＣＮＶの開始）。次に、ＣＮＶの初期から後期にかけて、拡張した血管が通常、次の３つの異なるパターンのうちの１つのパターンで拡張する：ＢｒＭと網膜色素上皮との間の階層中（ＲＰＥ下、いわゆるタイプ１ＣＮＶ）、ＲＰＥ（眼の黒く裏張りされた部分）と視細胞との間の階層中（網膜下、いわゆるタイプ２ＣＮＶ）、又は、同時に両方の部位（複合パターン、いわゆるタイプ３ＣＮＶ）に拡張する（背景技術の図１Ａ−１Ｃ参照）。網膜内のＣＮＶの流血及び滲出などの漏出は、急性的な目に見える症状を説明しており、最も顕著な症状は、失明である。
【０００３】
ＣＮＶの位置、成長パターン及びタイプは患者の年齢及びＣＮＶと関係性のある基礎疾患に依存する。ＣＮＶは年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）、筋疾患及び色素線条のようなさまざまな眼疾患における重い失明の主な原因となる。
【０００４】
古典的ＣＮＶと潜在的ＣＮＶとは区別されているが、それらは複合型としても発症し得る。潜在的なＣＮＶはＲＰＥの下で増殖する。古典的なＣＮＶは潜在型及び複合型よりもまれである。それは漏出性の年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）として発症することがあるが、その他の脈絡網膜性の疾患に続発することもある。古典的なＣＮＶの診断には血管造影法を必要とし、血管造影法において、ＲＰＥと視神経網膜との間の血管増殖によって引き起こされる早期段階では、はっきりと目に見え、明確に区別された過蛍光として定義され、後期段階では漏出物の増加を伴う。古典的なＣＮＶの初期症状は変視症、視力の低下、中心視野の異常である。ＣＮＶの検眼鏡での徴候は網膜浮腫、多量の滲出、並びに網膜下及び網膜内の出血を伴った網膜下の灰白色化である。もしその状態が治療されなければ、通常、その損傷の拡大とそれに引き続く視細胞の消失の進行が続くであろう。
【０００５】
ほとんどの研究では、ＣＮＶは主に成長因子の影響又はＢｒＭにあいた穴によって引き起こされると仮定されている。しかし、正常な斑及び異常な斑の多細胞モデルの三次元シミュレーションに基づく徹底的なコンピュータシミュレーション研究（Shirinifard et al. 2012,PLos Computational Biology, 8(5):1-32）は、ＣＮＶが下記（１）〜（３）の欠陥の組み合わせによって引き起こされるという仮説のもと、ＣＮＶの３つの成長パターン（タイプ１−３）を再現した：
（１）ＲＰＥ−ＲＰＥ上皮接合部の接着、（２）ＲＰＥ基底膜複合体の、ＢｒＭとの接着（ＲＰＥ−ＢｒＭ接着）及び（３）ＲＰＥの、視細胞外節との接着（ＲＰＥ−ＰＯＳ接着）。研究の鍵となる発見は内部先端細胞がＢｒＭを貫通したとき、次の項目の１つ以上が引き起こされる可能性があるということである：
（１）正常な上皮との接合、ＢｒＭとの底部の付着及びＰＯＳとの先端部の付着を伴うＲＰＥは、ＣＮＶに抵抗性を示す。
【０００６】
（２）ＢｒＭの小さな穴はそれ自身ではＣＮＶを起こさない。
【０００７】
（３）正常な上皮との接合、正常な先端部のＲＰＥ−ＰＯＳ付着を伴うが、ＢｒＭとの接着は弱い（ＢｒＭ内の脂質の蓄積に起因する）ＲＰＥは早期のＲＰＥ下のＣＮＶを引き起こす。色素性網膜細胞とブルッフ膜との接着の減少は、老化に典型的なタイプのＣＮＶである。
【０００８】
（４）ＲＢＥがＢｒＭと正常に接着しているが、先端部のＲＰＥ−ＰＯＳ接着又は上皮のＲＰＥ−ＲＰＥ接着が減少している（炎症に起因する）場合、早期の網膜下のＣＮＶが引き起こされる。隣接した色素性網膜細胞間の接着の減少は重度の感染による炎症の典型であり、若い成人にみられる侵入のパターンである。
【０００９】
（５）ＲＰＥ−ＲＰＥ上皮間の結合とＲＰＥ−ＢｒＭの接着が同時に減少すると、しばしば複合型ＣＮＶを進行させるＲＰＥ下ＣＮＶ又は網膜下ＣＮＶのいずれかが引き起こされる。これらの発見は以下のことを示す。
【００１０】
そのほとんどが炎症、又は自己免疫疾患若しくは障害のような全身の疾患若しくは障害、又は眼の疾患若しくは障害を同調的又は非同調的に引き起こす、ＣＮＶの原因となるものは数多くある。しかし、接着は網膜の構造を維持するうえで重要なメカニズムであるため、接着における欠陥はＣＮＶの開始及び進行、それに続く網膜における漏出を引き起こすように思われる。
【００１１】
ＣＮＶに対する現在の主な２つの対処法は、薬、主に抗血管形成剤を眼に注射して、侵入した血管を消滅させるか（ほとんどの場合、同様に網膜を損傷し、必要な血管も消滅させてしまう）、血管をレーザー閉鎖するか（これは網膜に傷を与え得る）である。どちらの対処法も血管の侵入を引き起こす根本的な問題には対処していないため、再発はよくあることであり、多くの患者がいまだに１、２年のうちに視力を失っている。
【００１２】
プロテインＣ系は宿主防御系について負のフィードバック制御を提供しており、重要な組織成分のバランスのとれた再構築を促進し得る。プロテインＣ系における重要な分子関連物にはプロテインＣ、プロテインＳ、トロンボモジュリン、内皮性プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、ＰＡＲ１及びＰＡＲ３が含まれる。プロテインＣはセリンプロテアーゼ活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の酵素原、すなわち前駆物質である。プロテインＣは肝臓でかなりのプロセシングを経て１重鎖のポリペプチドとして合成され、ジスルフィド結合によって繋ぎ合わされた重鎖（Ｍｒ＝４０，０００）及び軽鎖（Ｍｒ＝２１，０００）を備える２重鎖分子を生成する。循環型二重鎖中間体は、重鎖のアミノ酸末端の１２残基のペプチド（同様に活性化ペプチドとして知られている）のトロンビン媒介開裂によって、生物学的に活性型の分子、ＡＰＣに変換される。細胞質セリンプロテアーゼ阻害剤による循環型ＡＰＣの不活性化はＡＰＣを一掃するための主要なメカニズムである。
【００１３】
薬理学的ＡＰＣは体中のほぼすべての器官において回復と組織の恒常性を促進している。ＡＰＣは複数の多様な独立した細胞活性を操作する細胞情報伝達を開始しており、それらの多くは細胞保護活性と称され、抗アポトーシス活性及び抗炎症活性、遺伝子発現の有用な改変を含んでいる。ＡＰＣは内皮、上皮のバリアを安定化させ、血管が漏出するのを防いでいる（Gliffin et al., Blood, 2015, 125(19):2898-2907; Vetrano et al.,2011, PNAS, 108(49): 1983019835）。
【００１４】
以上の説明はこの分野における関連技術の一般的な見解を述べたものであり、それに含まれる情報が本特許出願に対する先行技術を構成することを認めるものと解釈されるべきではない。
【００１５】
〔発明の概要〕
網膜色素上皮（ＲＰＥ）とブルッフ膜との間の恒常性の崩壊が生じたとき、悪循環が脈絡血管新生（ＣＮＶ）としても知られている脈絡膜新生血管形成を引き起こす。現在、細胞接着は血管が網膜に侵入することを防ぐ鍵の１つであり、接着のタイプ、すなわちＲＰＥ−ＲＰＥ上皮接合部接着、ＲＰＥ基底膜複合体の、ブルッフ膜との接着、又はＲＰＥの、視細胞外節との接着のうち少なくとも１つにおける欠陥の組み合わせで、ＣＮＶとなる可能性、ＣＮＶのパターン及びＣＮＶの進行速度を決定することができると認められている。
【００１６】
本発明者は眼球内の正常な接着を取り戻す治療法に対しての未だ検討されていないニーズに取り組むことに成功し、それによりＣＮＶを治療するとともに、及び網膜における有害な脈絡膜新生血管の漏出を阻止又は予防する手段を提供する。これらの治療法はＡＰＣの利用を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態の態様において、治療を必要とする被験体に対して効果的な量のＡＰＣを投与する工程を含む、網膜漏出及びＣＮＶに関連する眼の疾患、障害又は状態の治療の方法が提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態の態様において、網膜漏出及び脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）に関連する眼の疾患、障害又は状態の治療法において使用するための、薬学的に許容可能な担体及び活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を含む薬学的組成物が提供される。
【００１９】
いくつかの実施形態の態様において、網膜漏出及び脈絡膜血管新生に関連する眼の疾患、障害又は状態の治療のための薬剤の製造における活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の使用が提供される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記治療法は、網膜漏出及びＣＮＶに関連する眼の疾患、障害又は状態の治療又は予防である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、網膜漏出及びＣＮＶに関連する疾患、障害又は状態は、直接的にＣＶＮによって引き起こされ、ＣＮＶの進行段階を第２ステージ若しくはその合併症として特徴づけるか、又はＣＮＶをその同調的若しくは非同調的なＣＮＶの続発症として特徴づけるものである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、上記眼の疾患は年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）、病的近視、網膜色素線条を伴う弾性線維性仮性黄色腫、非感染性ブドウ膜炎、感染性ブドウ膜炎、視神経の炎症性疾患（視神経炎、乳頭浮腫、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、ベーチェット病及び網膜症等）から選択される。また、
上記眼の障害は慢性的炎症、酸化ダメージ、ドルーゼ発生、リポフスチンの蓄積、ブルッフ膜の異常、血圧及び血流の調節を妨げ、虚血状態を引き起こす眼球内での血管変化、生理学的加齢、遺伝的要因及び環境的要因から選択される。また、
上記眼の状態は、眼の医学的手術の間の網膜の外傷及び合併症に続いてＣＮＶ及び網膜漏出が発生する偶発的、副次的な事象である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、上記眼の疾患はＡＭＤである。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ＡＰＣはヒトＡＰＣの野生型の配列、ＡＰＣの機能的な部分配列、ＡＰＣ若しくはその機能的な部分配列の誘導体、又はＡＰＣ若しくはその機能的な部分配列の変異体を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、上記機能的な部分配列は野生型ＡＰＣのアミノ酸配列の９５％まで、９０％まで、８５％まで、８０％まで、７５％までを含み、それは野生型又は野生型に近い型のＡＰＣの機能を維持している。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記ＡＰＣ変異体のアミノ酸配列は、野生型ＡＰＣのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％一致している。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＡＰＣ及びそれを含む薬学的組成物は、抗血管形成剤、抗炎症剤、抗菌剤、免疫抑制剤、抗ＰＤＧＦ剤、抗真菌剤及び抗ウイルス剤から選択される１つ以上の活性剤との併用療法において使用される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記抗血管形成剤は抗ＶＥＧＦ剤又は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）阻害剤であり、上記免疫抑制剤はステロイドである。
【００２９】
この概要は下記の図面の簡単な説明及び詳細な説明においてさらに記載される概念を簡略化した形で選択したものを紹介している。この概要は請求された主題の鍵となる特徴又は本質となる特徴を特定することを意図しておらず、請求された主題の範囲を制限するために用いられることも意図していない。
【００３０】
他に定義されていない場合、本明細書において使用されているすべての技術用語及び／又は科学用語は、発明が関係する分野の当業者によって通例理解されているものと同じ意味を持つ。本明細書において記載されているものと類似又は同等の方法及び材料は実施形態の実施又は試験において使用できるが、模範的な方法及び材料については以下に記載する。訴訟問題において、定義を含む特許明細書は規制するであろう。付け加えて、材料、方法及び実施例は一例にすぎず、必ずしも限定することを意図しない。
【００３１】
〔図面の簡単な説明〕
いくつかの実施形態は、ほんの一例として付随する図面を参照して本明細書に記載されている。現段階において図面を細部にわたって具体的に参照することにより、示された事項が一例であり、実施形態の実例の議論を目的としていることが強調される。この点において、図を用いた記載は、どのように実施形態が実施され得るかを当業者に対して明らかにする。
【００３２】
図面において
図１Ａ−１Ｃは血液網膜関門（ＢＲＢｓ）（１Ａ）、網膜の基本構造（１Ｂ）、年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）における脈絡膜血管新生を特徴づける網膜（１Ｃ）の背景技術の略図であり、
図２Ａ-２Ｄは、０．０μｇ／ｍｌ  ＡＰＣ（コントロール、１Ａ）；０．１μｇ／ｍｌ  ＡＰＣ（１Ｂ）；１μｇ／ｍｌ  ＡＰＣ（１Ｃ）；又は１０μｇ／ｍｌ  ＡＰＣ（１Ｄ）を用いた処理に続いて、ウサギ抗ＺＯ-１抗体（非常に明るい）とＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）（核染色：明るく、丸い円形の領域）を用いて染色された網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の共焦点顕微鏡の画像であり、
図３は０．０、０．１又は１μｇ/ｍｌ  ＡＰＣで処理したＡＲＰＥ−１９細胞のＦＩＴＣ−デキストラン浸透率（コントロールに対する％）を示したグラフである（４回の実験の平均結果）。
【００３３】
図４は網膜のレーザーでの光凝固、及び、硝子体内への生理食塩水、ベバシズマブ（２５μｇ／匹）又はＡＰＣ（１μｇ／匹）の注入を行った、平らな脈絡膜の脈絡膜内血管面積を示したグラフである。
【００３４】
図５Ａ−５Ｂはレーザーでの光凝固、及び、生理食塩水、又はＡＰＣ（１μｇ/匹）の注入を行った平面化された脈絡膜−ＲＰＥ切片の血管の体積（５Ａ）及び深さ（５Ｂ）を示したグラフである。並びに
図６Ａ−６Ｃはレーザーでの光凝固及び、生理食塩水、又はＡＰＣ（１μｇ/匹）の注入を行った模範的な平面化された網膜全体の（１μｍ）距離Ｚの積層画像（６Ａ−６Ｂ）及びグラフ（６Ｃ）である。血管は画像において非常に明るく表示されている。
【００３５】
〔発明の詳細な説明〕
開示される実施形態の態様は、眼疾患の治療法、における活性化プロテインＣの利用、より具体的にはこれに限らないが、脈絡膜血管新生及び網膜漏出に関連する眼の疾患の治療に関する。
【００３６】
少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、開示される実施形態は、出願を、以下の記載に説明された、又は実施例によって例示された詳細に必ずしも制限しない。本発明はその他の実施形態若しくは、さまざまな方法で実施又は実行することができる。
【００３７】
最適な網膜の機能は、適切で厳重に制御された環境を必要とする。この制御は、機能的な区画を隔て、それらの恒常性を維持し、それらの間の輸送を制御するタイトジャンクションタンパク質により形成される細胞バリアにより確立される。血液網膜関門（ＢＲＢ）、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）から構成される外側のバリアと、網膜毛細血管内皮の間の内側のバリアとは、高度に動的な構造であり、変化する外部環境と同様に生化学的要求に迅速に対応することができる。
【００３８】
ほとんどの網膜疾患は内側または外側のＢＲＢの血管漏出及び損傷に関わる。網膜内部で発生し、失明を引き起こす血管新生には２つのタイプがある：血管が、網膜毛細血管から派生し、硝子体及び神経網膜の層に侵入する、網膜血管新生（ＲＮＶ）。並びに血管が、脈絡膜血管から派生し網膜下の空間に侵入する、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）がある。ＣＮＶは、ＢＲＢへのダメージにより引き起こされる、ブルッフ膜を通る未成熟な脈絡膜血管の成長を示す年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）の隠れた合併症であり、未熟な脈絡膜血管は網膜下において体液漏出又は出血を起こしうる（背景図１Ｂ及び１Ｃ参照）。ＣＮＶは、ＡＭＤ以外の様々な眼の疾患、例えば、色素線条及び高度近視における重い失明の主な原因となる。
【００３９】
現在のＣＮＶに対する主な２つの治療は、抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト）を眼内へ注入することによって、侵入する血管を（多くの場合、網膜を損傷するとともに、必要な血管を消失させてしまう）、又は網膜の損傷を引き起こしうる、血管のレーザー凝固のいずれかである。しかしながらどちらの治療法も血管の侵入を引き起こす根本的な原因に対処するものではない。加えて、何度も投与を繰り返すことで、多くの場合、抗ＶＥＧＦ剤への治療反応が減少する。それ故、再発はよくあることで、未だに多くの患者が１、２年のうちに視力を失っている。根本的な病因は非常に複雑でわかりにくいため、疾患の原因に対する直接的な治療法に到達することは困難なままである。
【００４０】
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、とりわけ、内皮及び上皮のバリア保護特性を持つ細胞質セリンプロテアーゼである。
【００４１】
ＣＮＶの治療及び網膜漏出の予防へのさらに続いている要求を満たすための治療モダリティの研究において、本発明者は網膜内でのＲＰＥの重要な接合部における接着が損なわれた部分へのＡＰＣのバリア保護効果を構想し、それにより網膜漏出及びＣＮＶの予防又は改善がもたらされる。
【００４２】
本発明者は、ＲＰＥ及びＢＲＢにおけるＡＰＣの保護効果を分析するためにインビトロ及びインビボのモデルを考案し、ＡＰＣの硝子体内投与に基づくＣＮＶの新規な治療法の実施に成功した。
【００４３】
下記の実施例の項目での実証により、ヒト網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）のインビトロモデルにおいて、ＡＰＣはタイトジャンクションタンパク質Ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ＺＯ−１）のＡＲＰＥ１９細胞膜への転位を誘発し、標識されたデキストランのＲＰＥ浸透性を未処理細胞と比較して減少させた（本明細書の実施例１及び２参照）。本発明者によって考案されたインビボモデルにおいて、オスのＣ５７ＢＬ/６Ｊマウスにおける間接的なダイオードレーザー光凝固によって、ＣＮＶが誘発された。外傷を与えた直後のＡＰＣ（１μｇ/体）の硝子体内投与は、ＣＮＶ面積を劇的に減少させ（本明細書の実施例３）、３次元分析からわかるように同様にＣＮＶ体積及び深さも減少させた（本明細書の実施例４参照）。ＡＰＣの効果は、ＣＮＶに対して一般的に好まれる現在の治療法であるベバシズマブの効果に匹敵した。
【００４４】
本発明者はさらに、マウスにおけるレーザー外傷に伴う血管の形成を定量化し、ＡＰＣは脈絡膜から網膜への血管の発達と貫通を有意に減少させるということを実証することに成功した（本明細書の実施例５参照）。
【００４５】
いくつかの実施形態の態様において、網膜漏出及び脈絡膜血管新生に関連する眼の疾患、障害及び状態の予防又は治療の方法が提供され、当該方法はそれを必要とする患者に対して効果的な量の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を投与する工程を含む。
【００４６】
本明細書において使用される「活性化プロテインＣ」は、当該技術分野において知られているＡＰＣの多様な形態、及び、未だ発見されていない形態も含むように広範な様式で解釈される。制限されない例は以下を含む：ヒトＡＰＣの野生型配列；ヒトＡＰＣの多型変異体；ヒトＡＰＣの種間相同体；野生型ヒトＡＰＣ、又はその多型変異体、若しくは種間相同体の機能的な部分配列；野生型ヒトＡＰＣ、又はその多型変異体、種間相同体、若しくは機能的な部分配列の誘導体；及び野生型ヒトＡＰＣ、又はその多型変異体、種間相同体、若しくは機能的な部分配列の変異体（突然変異体）。本明細書において使用される「ＡＰＣの投与」という用語は、これらの１つ以上の形態のＡＰＣを投与することを表しており、単一の投薬形態の組み合わせ、又は一つ以上の別々の投薬形態の連続した投与のいずれかであり、それぞれ本明細書において記載されるＡＰＣの１つ以上の形態を含むものである。
【００４７】
本明細書において使用される「脈絡膜血管新生に関連する」という用語は、ＣＮＶによって直接的に引き起こされる疾患、障害又は状態、つまり、ＣＮＶの発達を、例えば、ＣＮＶの第２ステージ若しくは合併症であり、任意にＣＮＶプロセスに起因して悪化、激化若しくは進行するものとして特徴づける疾患、障害又は状態を表す。同調的又は非同調的な続発症としてＣＮＶを特徴づける疾患、障害又は状態、つまり、先行して発症した疾患又は障害（例えば感染性又は非感染性の疾患）の結果としてもたらされるＣＮＶを特徴づける疾患、障害又は状態もまた、本明細書に記載するＣＮＶに関連する疾患、障害又は状態である。
【００４８】
本明細書において記載する方法によって治療可能であるＣＮＶに関連する眼の疾患としては、以下に限られたものではないが、年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）、病的近視、及び色素線条を伴う弾性繊維偽黄色腫が挙げられる。
【００４９】
ＣＮＶ及び網膜における血液漏出は、以下に限られたものではないが、視神経症、並びに乳頭浮腫、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、血管閉塞、ベーチェット病及び糖尿病合併症（例えば網膜症）等のその他の炎症性疾患等の、脈絡膜及び網膜内での無数の炎症性又は非炎症性の疾患から引き起こされ得る。
【００５０】
ＣＮＶは感染性ブドウ膜炎及び非感染性ブドウ膜炎の両方の続発症となり得る。その感染性疾患において、トキソプラズマ症（寄生虫Toxoplasma gondiiによって引き起こされ、トキソプラズマ性脈絡網膜炎の主な原因となる）、Toxocara canis、結核及びウイルス性網膜症はＣＮＶの同調的又は非同調的な続発症となり得る。ＣＮＶに関連する非感染性ブドウ膜炎としては、以下に限られたものではないが、点状脈絡膜内層症（ＰＩＣ）、多巣性脈絡膜炎（ＭＦＣ）、急性後部多発性板状色素上皮炎（ＡＰＭＰＰＥ）、匐行性脈絡膜炎（ＳＣ）、推定眼ヒストプラスマ症（ＰＯＨＳ）及びホヒト・小柳・原田病（ＶＫＨ）が挙げられる。
【００５１】
例えば、ＣＮＶは一般にＭＦＣと関連があり、それは３２〜４０％の患者で見出され、ＰＯＳＨにおいて、視力悪化の主な原因は黄斑内でのＣＮＶの発生であり、それは滲出及びそれに続く損傷をもたらす。
【００５２】
細菌もまた眼に影響を与え、ＣＮＶは（稀ではあるが）最も重大な続発症の１つとなり得る。網膜における細菌増殖は心内膜炎、大動脈弁感染、腎膿症及び骨膿症、並びに静注薬物乱用のなかで脈絡膜へ転移することで起こり得る。脈絡膜新生血管膜は典型的に活動性又は非活動性の脈絡膜肉芽腫の近くに発生する。古典的なＣＮＶは一般に細菌性心内膜炎において典型的に発生し、脈絡膜網膜の一次病巣、又は委縮性瘢痕の領域の近くで進行する。
【００５３】
ウイルスもまた、主に後期合併症としてＣＮＶに関連しており（Neri etal., 2009, Middle East Afr J Ophthalmol., 16(4): 245-251）、例えば、西ナイルウイルスが黄斑内に広範な虚血性毛細血管障害を引き起こし、脈絡網膜損傷の近くに脈絡膜血管新生を進行させ得る。
【００５４】
ＣＮＶはCandida albicans、Cryptococcus neoformans及びAspergillusfumigatus等の菌類の後期続発症となり得、それらは眼の潜在的病原体として記載されている。
【００５５】
本明細書において記載される方法の実施形態に係るＡＰＣを用いた治療による利益を享受し得るＣＮＶに関連した眼の疾患としては、以下に限られたものではないが、酸化ダメージ、ドルーゼ発生、リポフスチン蓄積、ブルッフ膜の異常、通常の血圧及び血流の調節を妨げ、養分の交換及び代謝廃物の除去の制限及び虚血状態を引き起こす眼中の血管変化、生理学的加齢、遺伝的要因（補体活性化経路における変異）並びに環境的要因（例えば、喫煙、放射線被曝、ビタミンの不足等）が挙げられる。例えば、ＣＮＶは古い脈絡網膜の傷から二次的に発生し得る。
【００５６】
本明細書において定義される「ＣＮＶに関連する状態」は、例えば網膜の外傷、手術などの眼の医療処置の間の合併症、レーザー治療又は定期検査等の、結果としてＣＮＶが発症する偶発的、副次的、一時的な事象を表す。
【００５７】
本明細書において使用される「治療法」、「治療」、「治療する工程」「治療する」という言葉は、相互変換可能であり以下を表す：（ａ）疾患、障害及び／又は状態になりやすいがまだそうとは診断されていない人体において発生する疾患、障害又は状態の予防；（ｂ）疾患、障害又は状態の抑制、すなわちその発達の阻止；（ｃ）疾患、障害又は状態の軽減、緩和又は改善、すなわち疾患、障害及び／又は状態を減退させること；（ｄ）疾患、障害又は状態の回復。言い換えれば、「治療法」、「治療する」、「治療」及び「治療する工程」という用語は、確立された状態の治療自体と同じように、予防、つまり、「予防する」、「予防」、「予防する工程」まで拡大される。従って、「予防する」、「予防」、「予防する工程」という用語の使用は組成物の投与時点の状態に苦しむ患者ではなく、例えば、網膜漏出又はＣＮＶのような上述の状態に過去に苦しんでいた患者への活性剤の投与となり得る。
【００５８】
故に、「治療」、「治療法」等の用語は、以下に限られたものではないが、被験者の状態における変化を含む。その変化は主観的又は客観的であり得、治療される疾患、障害又は状態の症状又は徴候等の特徴と関連し得る。例えば、もしも患者が視力の改善、中心視野異常の軽減又は痛みの減少を示す場合、治療は成功である。同様に、もしも臨床医が蛍光眼底血管造影法（ＦＡ）、インドシアニングリーン血管造影法（ＩＣＧＡ）又は眼のコヒーレンス断層撮影（ＯＣＴ）等によって客観的変化を示す場合もまた、治療は成功である。あるいは、臨床医は、患者の検査において損傷の大きさ又はその他の異常（例えば、網膜浮腫に付随した網膜下の灰白色化、激しい滲出、並びに網膜下及び網膜中の出血）の減少を示し得る。これもまた改善又は治療の成功を示す。被験者の状態の悪化の予防もまたその用語に含まれる。治療による利益は、本明細書において論じられているように治療された状態の反応を示すあらゆる主観的又は客観的な要因を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、眼の疾患、障害又は状態を治療又は予防する方法は、それを必要とする被験体へ、約１０μｇ／ｍｌから約２５０μｇ／ｍｌまで、約１０μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌまで、約１０μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌまで、約２０μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌまで、約３０μｇ／ｍｌから約９０μｇ／ｍｌまで、約３０μｇ／ｍｌから約８０μｇ／ｍｌまで、約４０μｇ／ｍｌから約７０μｇ／ｍｌまで、例えば１回の投薬量が約６０μｇ/ｍｌとなるように、これらの間の部分的な範囲及び中間の値を含む、効果的な量のＡＰＣを投与する工程を含み得る。
【００６０】
いくつかの任意の実験形態において、ＣＮＶに関連する眼の疾患、障害、又は状態の治療におけるＡＰＣの応用は、例えば硝子体内注入などの硝子体内投与による影響を受ける。
【００６１】
任意に、これらの実施形態において、網膜内の（硝子質の）液体が、２０−５０の要因によって本明細書において記載される効果的な分量で投与されるＡＰＣを希釈することを考慮し、約０．０２ｍｌから約０．１ｍｌの一部、約０．０３ｍｌから約０．０７ｍｌ、約０．０４ｍｌから約０．０６ｍｌ、好ましくは０．０５ｍｌで、これらの間の部分的な範囲及び中間の値を含む、以上に記載した任意の効果的な濃度の範囲に眼内洗浄溶液で希釈されたＡＰＣを調製した。任意に、それぞれの分量を調製し、例えばインシュリン注射器内に、任意に、使用直前まで、例えば、−７０℃で保管する。任意に、例えば０．３％レボフロキサシン点眼薬を注入の直後に塗布した。
【００６２】
上記方法のいくつかの実施形態において、本明細書において記載される効果的な分量のＡＰＣは局所的に眼に塗布される。
【００６３】
本明細書において記載されるＣＮＶ及び網膜内の血管漏出を治療する方法は、他の治療モダリティ、特にＣＮＶの発達の主要な原動力又は引き金へ対処する治療モダリティと組み合わせた場合に役立ち、例えば相乗効果をもたらし得る。
【００６４】
網膜及び脈絡膜の慢性潜在的炎症及び臨床的炎症がＣＮＶの病因の根拠となり得、これにより網膜内漏出を引き起こすことを考慮に入れると、併用療法を特徴とするいくつかの実施形態において、非感染性炎症に続発するＣＮＶに対する治療方針は炎症プロセスの制御を行うものであろう。従って、全身性の薬剤、例えばデキサメタゾン等の副腎皮質ホルモン（例えばＯｚｕｒｄｅｘ）及びその誘導体を、免疫抑制剤とともに使用又は使用しない場合、ＡＰＣとともに示されうる。付け加えて、又は代わりに、任意の硝子体内の抗ＶＥＧＦ剤等の、血管新生プロセスを直接的に狙った治療法は、特に、抗炎症治療法が不十分な反応を示した場合、示される。例えば、ＣＮＶが、再発した網膜脈絡膜炎と関連する実施形態において、抗トキソプラズマ抗生物質と副腎皮質ステロイドの古典的な組み合わせは、任意に、抗ＶＥＧＦ治療法と一緒に患者へ提供される。血管新生プロセスを直接的に狙った抗炎症および抗ＶＥＧＦ治療法を含む併用療法は、重症の場合に推奨される。併用治療モダリティに使用され得る抗ＶＥＧＦ剤の制限されない例としては、ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びアフリベルセプトを含む。
【００６５】
どの理論によって制限されることもなく、ＡＰＣは、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）１、ＰＡＲ３、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）及びその他のような細胞受容体と相互作用し、バリア保護及び安定化をもたらすシグナル伝達を誘発すると考えられている。一方、抗ＶＥＧＦ剤はＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ受容体と結合し活性化するＶＥＧＦの機能を阻害する。これらの作用形態の違いの点において、１つ以上の抗ＶＥＧＦ剤とＡＰＣの共投与を特徴とする併用療法はＣＮＶの治療又は予防において相乗的な効果を持ち得る。いくつかの実施形態において、ＣＮＶに関連する眼の疾患、障害及び状態の治療における単一の活性化剤としてのＡＰＣの使用は抗ＶＥＧＦに抵抗性のある患者に適用される。
【００６６】
いくつかの模範的な実施形態において、ＣＮＶが自己炎症性疾患に続いて発生した場合、例えば、ステロイド、シクロスポリンＡ及び、いくつかの場合において、アザチオプリン等の免疫抑制剤と併用してより多くのＡＰＣが患者へ投与され得る。ステロイドは眼周囲又は全身性のステロイドでよい。
【００６７】
いくつかの模範的な実施形態において、ＣＮＶが網膜内の唯一の信頼できる所見であり、その他の異常が検知されない特発性脈絡膜血管新生（ＩＣＮＶ）では、ＡＰＣ治療法は抗炎症薬物療法と組み合わされ得る。
【００６８】
炎症プロセスは局所領域的なだけではなく、免疫システム全体が関与していると考えられるため、全身性ステロイドの使用が常に考えられる。脈絡膜の新しい血管の制御についての免疫抑制の安全性及び効果は公知である。免疫抑制剤の選択は薬物そのものの特徴をもとに確立されるべきである。例えば、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）は動脈疾患の改善及びＣＮＶ病理生理学に関した可溶性媒介物質の量を減少させることに効果があると証明されているため、それは炎症性ＣＮＶの長期的な制御に対する薬物として選択され得る。
【００６９】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、網膜脈絡膜血管の疾患において活性化される血管新生カスケードにおける重要な役割を担っている（Ali Sadiq et al. 2015, http://dx.coi.org/10.1016/j.sjopt.2015.05.005）。ＣＮＶプロセスにおけるＰＤＧＦの関与に対して可能性のある解釈の一つとして、続発的な血小板凝集及びＰＤＧＦの放出を伴う、網膜血液関門に達する傷上の硝子体及び網膜下の空間への血小板及び単核白血球の侵入が挙げられる。活性化マクロファージから分泌されたＩＬ−１及びＴＧＦ−Ｂ等のインターロイキンはＰＤＧＦのさらなる合成を引き起こし得る。
【００７０】
本発明に係る組み合わされた併用療法のいくつかの実施形態において、網膜内の血管新生プロセスにおけるＰＤＧＦの効果を阻害する抗ＰＤＧＦ剤とともにＡＰＣが共投与され得る。抗ＰＤＧＦ剤の制限されないな例としては、網膜下ＣＮＶにおいて選択的にＰＤＧＦ−ＢＢと結合し拮抗する設計アンキリン反復タンパク質等のＰＤＦＧ拮抗物質が挙げられ、任意にＶＥＧＦ−Ａ（抗ＶＥＧＦタンパク質）に拮抗する同様のタンパク質とともに共投与される。さらに模範的な親和性が高いＰＤＧＦ拮抗物質はＥ１００３０であり、それはＰＤＧＦと結合し、そのＰＤＧＦＲ−βとの結合を阻害する。この拮抗物質はラニビズマブ等の抗ＶＥＧＦ剤とともに共投与された場合に、効果が増大する。
【００７１】
併用療法のいくつかの実施形態において、ＡＰＣは抗血管新生治療法、抗炎症治療法、抗細菌治療法、免疫抑制治療法、抗ＰＤＧＦ治療法、抗真菌治療法及びウイルス治療法から選択された１つ以上の治療とともに提供される。いくつかの実施形態において、共投与される活性剤又は活性薬は、任意的に硝子体内注入によって、単一の投薬形態でＡＰＣとともに投与される。加えて又は代わりに、共投与される活性剤又は活性薬は、ＡＰＣの投与前、投与と同時、又は投与後のいずれかに１つ以上の投薬形態で投与される。いくつかの実施形態において、共投与される活性剤又は活性薬は全身的に投与される。加えて又は代わりに、共投与される活性剤は、任意に硝子体内注入によって、局所的に投与される。
【００７２】
本明細書において記載される治療の方法の実施形態は網膜の状態、回復の進行、患者の許容範囲等の様々な考慮によって決められたＡＰＣ投与の計画を特徴とする。例えば、１回の投与は月１回又は週１回、最長で６週から８週にわたって行われ、一連の投与の間隔及び継続的なＡＰＣ投与の必要性は、治療される網膜、回復の進行及び評価された副作用を基に決定される。
【００７３】
＜薬学的組成物＞
いくつかの実施形態の一態様において、眼の疾患及び障害の治療での使用のために、活性剤として、ＡＰＣ、ＡＰＣの機能的なフラグメント、ＡＰＣ誘導体、ＡＰＣ相同体又はそれらの組み合わせを含む薬学的組成物が提供される。
【００７４】
本発明の任意の実施形態のいくつかにおいて、本明細書において記載される薬学的組成物は、以下に限られたことではないが、年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）、色素線条及び高度近視等のＣＮＶに関連している、又はＣＮＶによって引き起こされる眼の疾患及び障害の治療に使用される。
【００７５】
本明細書において記載される薬学的組成物は活性剤ＡＰＣに加え、薬学的に許容可能な担体及び賦形剤、並びに、任意に、例えば治療された眼における活性剤の維持された分泌を促進する化学成分を含んでいてもよい。
【００７６】
従って、本明細書に記載される任意の方法及び使用では、本明細書に記載される野生型ＡＰＣ又はその機能的な部分配列（フラグメント）、誘導体及び相同体のいずれもそれ自体、又は薬学的に許容可能な担体と混合された薬学的組成物の一部のいずれかとして個人へ提供され得る。
【００７７】
本明細書において使用される「薬学的組成物」は、以下に限られたものではないが、生理学的に適した担体、賦形剤、潤滑剤、緩衝剤、抗菌剤、充填剤（例えば、マンニトール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム）、抗炎症剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、抗ヒスタミン等を含むその他の化学成分を用いた、本明細書において（活性成分として）記載される１つ以上のＡＰＣ、その機能的なフラグメント、誘導体若しくは相同体、又は生理学的に許容可能な塩若しくはそのプロドラッグの調製物を表す。薬学的組成物の目的は、被験者への化合物の投与を促進することである。「活性成分」という用語は化合物を表し、生物学的効果を説明するものである。
【００７８】
本明細書において使用される「生理学的に許容可能な」という用語は、連邦政府若しくは州政府の監督官庁に認可されたもの、又は、動物、より具体的にはヒトに使用するため米国薬局方若しくはほかの一般的に認められた薬局方に掲載されたものを意味する。本明細書において、「生理学的に適している担体」という語句は、生物への重要な刺激を引き起こさず、潜在的活性剤の生物学的活性及び特性を無効にしない、認可された担体又は希釈液を表す。
【００７９】
本明細書において「賦形剤」という用語は、より活性成分の加工及び投与を促進するために薬学的組成物に加えられた不活性物質を表す。賦形剤の例としては、以下に限られたものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類及びデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【００８０】
薬物の調剤及び投与の技術は、“Remington'sPharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版の中に見出されてもよく、それは本明細書において参考として援用される。
【００８１】
従って、本発明に係る使用のための薬学的組成物は、化合物から薬学的に使用できる調製物への加工を促進する賦形剤及び助剤を含む薬学的に許容可能な担体を１つ以上使用する従来の方法において調剤されてよい。適切な調剤は選択された投与経路に依存する。投薬量は採用された投薬形態及び使用された投与経路によって変わり得る。正確な調剤、投与経路及び投薬量は患者の状態の観点から個々の医師によって選択され得る（例えばFingl et al., 1975,“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch.1 p.1を参照）。
【００８２】
薬学的組成物は治療される領域に依存した１つ以上のいずれかの局所的経路における投与のために調剤され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は硝子体内投与に適した形態に調剤される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は適用される領域での局所施用に適した形態に調剤される。
【００８４】
一実施形態において、本明細書中において前述した薬学的組成物は、ＣＮＶに関連する医学的状態の治療に使用されるために、包装資材で包装され、包装資材中又は包装資材上の印刷で特定される。
【００８５】
＜活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）＞
プロテインＣは既知の方法によって凝固因子濃縮物又は細胞質から精製され、その後、インビトロで活性化され、活性化型のＡＰＣを取得し得るが、出発物質の入手が制限されていること及び細胞質中のプロテインＣの濃度が低いことに起因して、そのような工程は複雑及び高価である。更に、ヒトの血液由来の製品の治療的使用は、病気感染のリスクを有する。それゆえ、本発明に係る治療的用途におけるＡＰＣの使用の任意の実施形態のいくつかにおいて、使用されたＡＰＣはＤＮＡ組み換え技術等の既知の遺伝子工学技術によって手に入る、商業的に入手可能な組み換え型のヒト野生型ＡＰＣ、その機能的な部分配列及び、それらの変異体（突然変異体）である。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態において、ＣＮＶに関連する眼の疾患、異常又は状態の治療のために完全長の組み換え型のヒト野生型ＡＰＣが適用される。代わりに又は加えて、ヒトＡＰＣの多型変異体又は種間相同体が適用される。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ヒト野生型ＡＰＣの機能的なフラグメントが、ＣＮＶに関連する眼の疾患、障害又は状態の治療において適用される。本明細書中に定義される場合、「ＡＰＣの機能的なフラグメント」は、野生型タンパク質配列の部分配列、又は、野生型タンパク質配列の多型変異体若しくは種間相同体の部分配列である。機能的なフラグメントは、野生型ＡＰＣのアミノ酸配列の９５％、９０％まで、８５％まで、８０％まで、７５％まで又はそれ未満を含んでいてもよく、野生型又は野生型に近いＡＰＣの機能性を保持している。
【００８８】
いくつかの実施形態において、野生型ＡＰＣの誘導体又はその機能的な部分配列の誘導体が、本発明に係る治療目的のために適用される。本明細書中において使用される「ＡＰＣの誘導体」とは、タンパク質合成後に改変されたアミノ酸配列を含み、野生型ＡＰＣと実質的に同じ生物学的活性を有する、野生型ＡＰＣ、野生型ＡＰＣの多型変異体及び種間相同体、又はそれらの任意の機能的な部分配列を包含する。本明細書中において使用される「実質的に同じ生物学的活性を有する」という語句は、ヒト野生型活性化プロテインＣと、約６０％同一の、約６５％同一の、約７０％同一の、約７５％同一の、約８０％同一の、約８５％同一の、約９０％同一の、約９５％同一の、又は１００％同一の生物学的活性を有するＡＰＣ誘導体を示す。
【００８９】
ＡＰＣ又はその機能的な部分配列の合成後の改変は、１つ以上のアミノ酸の化学的若しくは物理学的改変、又はその両方の改変を含む。化学的又は物理的に改変されたＡＰＣ又はその機能的な部分配列は、本明細書中においてそれぞれ「化学的誘導体」及び「物理的誘導体」と記載される。例えばＡＰＣのアミノ酸配列の誘導体は、野生型の配列と同一であり得るが、合成後の立体構造改変を含む（すなわち、物理的誘導体化）。
【００９０】
本発明の目的のために有用なＡＰＣ誘導体の具体例は、例えば米国特許第５，５１６，６５０号中により詳しく検討及び開示されている。
【００９１】
いくつかの実施形態において、野生型ＡＰＣの変異体又はその機能的な部分配列の変異体が、本発明に係る治療目的のために適用される。本明細書において使用される「ＡＰＣの変異体」及び「ＡＰＣの突然変異体」という用語は、相互変換可能であり、翻訳後の改変を経て、天然にコードされたアミノ酸が１つ以上置換された又は欠失された野生型ＡＰＣ、その多型変異体及び種間相同体、又はそれらの機能的な部分配列を包含する。「ＡＰＣの変異体」又は「ＡＰＣの突然変異体」は更に、天然にコードされたアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸が付加されたものも含む。翻訳後の置換による改変は、天然及び非天然のアミノ酸より選択される１つ以上のアミノ酸によって、ＡＰＣの天然にコードされるアミノ酸が１つ以上置き換えられることを含む。翻訳後の付加による改変は、天然及び非天然のアミノ酸より選択される１つ以上のアミノ酸が、天然にコードされるアミノ酸配列に付加されることを含む。１つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失を引き起こす改変は本明細書中において「生物学的誘導体化」とも表される。
【００９２】
本明細書中及び当該技術分野において使用される「天然のアミノ酸」とはピロリシン及びセレノシステイン、並びに天然にエンコードされる一般的な２０種のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）を表す。本明細書中において使用される「非天然のアミノ酸」は、以下に限ったものではないが、天然に存在するアミノ酸と実質的に類似の様式で機能するアミノ酸類似体を含む。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物を表し、１つの具体例として、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基と結合しているα炭素が挙げられる。そのようなアミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持したままである一方、改変されたＲ基を有していてもよく（具体例としてノルロイシン）、又は改変されたペプチド主鎖を有していてもよい。アミノ酸類似体の具体例として、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられるが、これに制限されない。
【００９３】
「非天然のアミノ酸」という用語は、更に、化学的に改変されたアミノ酸類似体、並びに、天然にエンコードされるアミノ酸（以下に限られたものではないが、一般的な２０種のアミノ酸、ピロリシン及びセレノシステイン）を含む。化学的に改変されたアミノ酸の具体例として、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン、及びＯ−ホスホチロシンが挙げられるが、これに制限されない。
【００９４】
ＡＰＣタンパク質の翻訳後の改変は、「アミノ末端改変基」、つまりタンパク質末端のアミノ基への分子の結合を含む。１つの具体例として、末端改変基は、ポリエチレングリコール又は血清アルブミンを含む。末端改変基は、以下に限られたものではないが、ＡＰＣの血清半減期を延長させることを含むＡＰＣの治療的特性を改変するために使用され得る。
【００９５】
エンコードされるＡＰＣの配列において１つの天然のアミノ酸又は小さい割合の天然のアミノ酸を変換、付加又は欠失するタンパク質配列の個々の置換、欠失又は付加は、本明細書中においてＡＰＣの「保存的に改変された変異体」とみなされ、上記変換は、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は、化学的に類似しているアミノ酸（類似体）との天然のアミノ酸の置換を引き起こす。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ＡＰＣ誘導体は、アミノ酸の置換、付加若しくは欠失、又はそれらの組み合わせを含み、以下に示す１つ以上の特徴をタンパク質に提供する：野生型ＡＰＣと比較した、受容体に対する親和性の向上、安定性の向上、水溶性の改変（例えば向上）、宿主細胞での溶解性の向上、プロテアーゼ耐性の変化、血清半減期の変化、免疫原性の変化、及び／又は、発現性の変化。本明細書中において使用される生物学的活性の変化とは、ＡＰＣ及びその任意の機能的な部分の、反応性の向上又は低下、選択性の変化、及び基質選択性の向上及び低下を表す。
【００９７】
通常、影響ある改変は、ＡＰＣにおいて安定性及び／又は生物学的活性を向上させるなどの有用な効果をもたらす。更に、ＡＰＣは特定の細胞系におけるアポトーシスに関連していることが知られている。アポトーシスの少なくとも一部に関連する細胞のダメージを軽減又は予防することは、特にそのような細胞ダメージのリスクがある被験体、又はそのような細胞ダメージに苦しむ被験体において、ＡＰＣ突然変異体、例えば、以下に限られたものではないが、抗凝固作用が著しく低下しているが、通常に近い抗アポトーシス活性（細胞保護活性）を保持しているために、抗凝固活性に対する抗アポトーシス活性の割合が、野生型又は内生型活性化プロテインＣ中よりも変異体中のほうが大きい組み換え型ＡＰＣの変異体、を使用することにより影響を与え得る。米国特許第９，１９２，６５７号及び第７，４８９，３０５号に開示されるそのような組み換え型ＡＰＣ突然変異体の３つの例として、ＫＫＫ１９１−１９３ＡＡＡ−ＡＰＣ（Ｌｙｓ１９１−１９３を含む表面に露出したループにおける、リジン１９１、１９２及び１９３のアラニンへの突然変異であり、文献において「３Ｋ３Ａ−ＡＰＣ」としても知られる）、ＲＲ２２９／２３０ＡＡ−ＡＰＣ（アルギニン２２９及び２３０のアラニンへの突然変異）、及びＲＲ２２９／２３０ＡＡプラスＫＫＫ１９１−１９３ＡＡＡ−ＡＰＣ（アルギニン２２９及び２３０のアラニンへの突然変異及びリジン１９１、１９２及び１９３のアラニンへの突然変異の組み合わせ（当該技術分野において「５Ａ−ＡＰＣ」としても知られる））がある。それらの抗凝固作用の減少を考慮すると、それらの模範的なＡＰＣ変異体は、出血のリスクを有意に減少させる（変異体５Ａ−ＡＰＣ及び３Ｋ３Ａ−ＡＰＣは１０％未満の抗凝固活性を残す）。３Ｋ３Ａ−ＡＰＣは神経保護作用及びより広い治療の窓口を提供すると報告されている（Griffin et al., 2015, Blood, 125:2898-2907）。いくつかの実施形態において使用され得るその他のＡＰＣ突然変異体は、ＡＰＣ−２Ｃｙｓ、及びGriffin et al. （上掲）において開示されるＫ１９３Ｅ−ＡＰＣ、Ｅ１４９Ａ−ＡＰＣ、及び、１５８残基（Ａｓｐ）のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ，又はＧｌｙ等の酸性でないアミノ酸残基による置換、又は１５４残基（Ｈｉｓ）のＬｙｓ、Ａｒｇ，又はＬｅｕ等のアミノ酸残基による置換を含むＡＰＣの変異体を含む。
【００９８】
改変された野生型ＡＰＣは、化学的誘導体化、物理的誘導体化、生物学的誘導体化又はそれらのいずれかの組み合わせを特徴とする。いくつかの実施形態において、そのような誘導体化は位置選択的である。いくつかの実施形態において、そのような誘導体化は位置特異的である。
【００９９】
ＡＰＣの化学的、物理的、生物学的誘導体の配列は、野生型ＡＰＣの配列又は野生型ＡＰＣの任意の機能的な部分配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％同一であり得る。
【０１００】
いくつかの実施形態において、いずれかのＡＰＣ誘導体の生物学的活性は、いずれかの野生型ＡＰＣ又は野生型ＡＰＣの機能的な部分配列の生物学的活性と比較して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１１０％、又はそれを上回って（それぞれの間の任意の中間値も含む）増加する。
【０１０１】
「改変された又は改変されていない」という表現は、言及された天然のアミノ酸配列が任意に改変されており、言及されるＡＰＣの天然のアミノ酸配列が改変され得る、又は改変され得ないということを意味する。
【０１０２】
本明細書中に記載される実施形態は、商業的に入手可能なＡＰＣ誘導体の使用を意図する。
【０１０３】
本出願より特許満期に至る間に、多くの関連するＡＰＣ又はＡＰＣの機能的な部分配列の化学的、物理的、生物学的誘導体が開発され、「活性化プロテインＣ、その機能的な部分配列、それらの誘導体、又はそれらの変異体」という用語の範囲は、演繹的にそのような新しい技術のすべてを含むだろう。
【０１０４】
「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(includes)」、「含んでいる(including)」、「有する」及びそれらの活用形の用語は、「含んでいるが限定はしない」ということを意味する。
【０１０５】
「からなる」という用語は「含んでおり、且つ限定される」ということを意味する。
【０１０６】
本明細書において使用される、単数形の「a」「an」及び「the」は、文脈が他に明言しない限り、複数形も含む。例えば「化合物(a compound)」又は「少なくとも１つの化合物(at least onecompound)」は複数の化合物を含み、それらの混合物を含む。
【０１０７】
本明細書中において使用される「方法」という用語は、以下に限られたものではないが、よく知られた、又は化学、薬理学、生物学、生化学、医学分野の従業者によって既知の様式、手段、技法又は手順から既に開発された様式、手段、技法及び手順を含む与えられた課題を達成するための様式、手段、技法又は手順を表す。
【０１０８】
本明細書中において使用される「治療すること」という用語は、状態の進行を無効にする、実質的に阻害する、遅らせる又は覆すこと、状態の臨床的又は美的症状を実質的に回復させること、又は、状態の臨床的又は美的症状の発症を実質的に防ぐことを含む。
【０１０９】
本明細書中において示されるいずれの数値の範囲も、示された範囲中の記載された任意の数値（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の示された数字及び第２の示された数字「の間の範囲」及び第１の示された数字「から」第２の示された数字「までの範囲」という語句は、本明細書中において相互変換可能に使用され、第１の示された数字及び第２の示された数字、並びにそれらの間のすべての分数及び整数も含むことを意味する。
【０１１０】
上記において詳細に描写される多様な実施形態及び態様、並びに、下記請求項にて請求される多様な実施形態及び態様は、続く実施例によって実験的にサポートされることがわかる。
【０１１１】
〔実施例〕
今から下記実施例にて言及するが、これらは上述の記載とともに、いくつかの実施形態を、限定しない方法で説明する。
【０１１２】
[材料及び方法]
（細胞培養）
ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞（ＡＲＰＥ−１９細胞系）をＡＴＣＣ（Manassas,VA）より購入し、製造者の指示に従って標準条件下で培養した。増殖培地は以下を含む：１０％ウシ胎仔血清（Biological Industries, Israel cat # 04-121-1A）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＨＡＭ）１：１（Biological Industries, Israel cat # 01-170-1A）、グルタミン１ｍＭ（Biological Industries, Israel cat # 03-022-1B）、１００μ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１２．５ｕ／ｍｌニスタチン（Biological Industries, Israel cat # 03-032-1B）。１０〜３０のパッセージを用いて実験を行った。免疫蛍光検査のために、細胞を１．３×１０４セル／ｃｍ２の濃度でプレートにまき、最低でも３０日間増殖させた。このとき、培地を２、３日ごとに交換した。細胞を飢餓培地（血清を含まない細胞完全増殖培地）で洗浄し、０．１、１．０、又は１０μｇ／ｍｌの活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を加えて、飢餓培地中で１０分間処理した。１０分後、培地を完全増殖培地と取り換え、細胞を最大４時間インキュベートした。
【０１１３】
（ヒト活性化プロテインＣ（ＡＰＣ））
ヒト組み換え型野生型ＡＰＣをHaematologic TechnologiesInc. USA (cat # HCAPC-0080)より購入した。
【０１１４】
（インビトロ浸透圧分析）
１μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）Transwell（登録商標）insert（millicell, Millipore Corporation,Switzerland）の上から、細胞を６．７×１０３セル／ｃｍ２の濃度でプレートにまいた。下段のチャンバの６００μｌの培地と上段のチャンバの１００μｌの培地とにおいて、コンフルエントになるまで３０日間細胞を増殖させた。培地は２、３日ごとに交換した。その後、細胞を飢餓培地（１ｍＭグルタミン、１００ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１２．５ｕｎ／ｍｌニスタチンを含んでいる基底培地）で洗浄し、１０．０、１．０、０．１又は０．０μｇ／ｍｌのＡＰＣを含んでいる飢餓培地でインキュベートした。ＡＰＣを用いて１０分間インキュベートした後、上段のチャンバの培地を、７０ｋＤ、１０００μｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）デキストラン（Sigma, Israel, cat # FD-70）で置換し、最大６時間経過させた。下段のチャンバの培地を基底培地で置換した。インサートの下部の培地サンプルを使用した。細胞層を横切る流れを表すＦＩＴＣ蛍光を、マルチ検出型マイクロプレートリーダー（SynergyTM HT, BioTek）を用いて、４８５ｎｍの励起で測定した。更なるインキュベートのために、培地サンプルは下段のチャンバへと戻した。
【０１１５】
ＦＩＴＣ−デキストランの濃度計算のために、蛍光を検量線と比較した。
【０１１６】
（インビトロＺｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ＺＯ−１）免疫染色）
細胞を、３０日間、PermanoxTM Plastic Chamber Slide System （Thermo Scientific, USA cat # 177437）の４穴顕微鏡スライド上で培養した。細胞を飢餓培地で洗浄し、１．０、０．１又は０．０μｇ／ｍｌのＡＰＣを含んでいる飢餓培地を用いて最大４時間にわたってインキュベートした。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラフォルムアルデヒドで固定し、最後に、ＰＢＳ中の０．２％の非イオン化界面活性剤TritonTM X-100を用いて、１０分間透過化させた。ｐＨ６の１０ｍＭクエン酸を用いて、９５℃で１０分間抗原回収を行った後、抗原を投与した。パラホルムアルデヒドの固定によるタンパク質の架橋構造を切断して、隠れていた抗原反応部位を露出させる抗原回収試薬を用いて前処理することで、抗原のデモンストレーションが有意に改善された。サンプルにウサギ抗ＺＯ−１抗体（Invitrogen, cat # 40-2300, 1:100）を加えて、加湿試験槽中で４℃で一晩インキュベートした。その後、二次抗体であるAlexa Fluor（登録商標）５６８ロバ抗ウサギ抗体（Invitrogen, Cat# A10042, 1:100）を加えて、室温で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳで希釈されたNucBlue（登録商標） FixedCell ReadyProbe（登録商標）試薬（Molecular ProbesTM,USA; cat # R37606）を加えて５分間インキュベートした。代表的なスライドの画像を標準的な顕微鏡及びカメラセットを用いてデジタル方式で撮影した。０．５μｍ幅のＺ積層画像を３次元（３Ｄ）共焦点画像として撮影した（Leica TCS SP8）。科学ソフトウェアモジュールであるImaris X 647.1.1（Oxford Instruments, UK）を用いることで、画像を３次元で表現することができた。
【０１１７】
（インビボレーザー動物実験）
脈絡膜レーザー光凝固は、許容されており一般的に使用される、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の誘発方法である。８週目の色素性のオスのマウスを入手し（Harlan Laboratories Ltd., Jerusalem, Israel）、病院のInstitutional Animal Care and Use Committeeの提案に従い扱った。１００ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンを腹腔内（ＩＰ）に注入することで、動物に麻酔をかけた。そして、０．８％のトロピカミド点眼薬を局所的に投与することにより、瞳孔を拡張した。間接ダイオードレーザー検眼鏡（IRIS MedicalTM Oculight（登録商標） SLx System, Iridex, Mountain View, CA,USA）を用いて、治療光線を８１０ｎｍに設定して、レーザー照射を行った。９０ジオプター（Ｄ）の集光レンズ（Volk（登録商標） Optical, Mentor, OH, USA）を用いて、光線を網膜表面に集めた。右眼球後極から３時、６時、９時の方向に、視神経に囲まれた１〜２つの視神経円板の直径（ＤＤ）の間隔で１００ミリ秒間３５０ｍＷの出力の光線を用いることにより、ＣＮＶを誘発した。実施者は白い泡の形成を確認した。レーザー照射に続いて、施術用顕微鏡の下でＡＰＣを硝子体内に注入した。微量注射器（33-gauge; Hamilton（登録商標））を、眼の後方側面空間より硝子体内へ挿入し、以下のうちの少なくとも１つを、１μｌ（マウス１匹あたり）注入した：ＡＰＣ（１μｇ／μｌ）；生理食塩水（コントロールとして）；ベバシズマブ（Avastin（登録商標））（２５μｇ／μｌ）（Genentech, Inc.,South San Francisco, CA, USA and Roche, Basel, Switzerland）。レーザー照射から５日間、平坦にマウントした。
【０１１８】
（デキストラン潅流及び脈絡膜／網膜の平板化）
レーザー照射後の５匹のマウスに、上述した方法で麻酔をかけた。デキストラン潅流のために、２５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように生理食塩水で希釈したフルオレセインイソチオシアネートのデキストラン結合体（ＦＩＴＣ−デキストラン; MW 500 k, Sigma Aldrich,Rehovot, Israel）を、麻酔をかけたマウスの左心室に０．１ｍｌ注入した。眼を摘出してＰＢＳで洗浄した後、４％ホルマリン中に２〜３時間固定した。視神経網膜を剥離した。ＲＰＥ−脈絡膜−強膜の複合体又は視神経網膜をスライドガラス上で平板化するために、３、４か所に放射状の切り込みを入れた。スライドを封入剤であるProLong（登録商標）TM Gold退色防止試薬（Invitrogen, USA）で覆うか、又は下記に記載するように、抗体を用いて更なる染色を行った。
【０１１９】
（平らな脈絡膜／網膜の免疫染色）
抗原を用いて平板化された脈絡膜／網膜を更に染色するために、上述した方法で作製したスライドをＰＢＳで洗浄した。そして０．５％のPBS-１００倍濃縮TritonTM溶液中で、４℃で一晩インキュベートした。そして、スライドを５％標準ロバ血清（ＮＤＳ）中で１時間ブロッキングした後、ラット抗マウスＣＤ３１（eBioscience（登録商標）, San Diego, CA, USA, cat # 14-0311）１：１００を加えて、４℃で一晩インキュベートした。そしてスライドをＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗ラットAlexa Fluor（登録商標） 568 １：１００（Invitrogen）を加えて４℃で一晩インキュベートした。更にＰＢＳ溶液中の４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロライド（ＤＡＰＩ）核酸染料（Sigma, cat # 9542）を１０μｇ／ｍｌ加えて、１５分間インキュベートした。その後、スライドを封入剤であるProLong（登録商標）TM Gold退色防止試薬（Invitrogen, USA）で覆った。
【０１２０】
平らな脈絡膜の画像を、蛍光顕微鏡を使用して撮影した。おそらく平坦にマウントして調製している間に傷ついた領域であろう光透過性を有する領域を排除するために、光学顕微鏡でもまた、平らな脈絡膜を撮影した。
【０１２１】
ＣＮＶの面積を、Image-Jソフトウェア （NIH, Bethesda, MD, USA）を使用して定量化した。損傷面積は詳細に描写された。統計分析のために、一元配置ＡＮＯＶＡテストを用いて分散分析を行った。
【０１２２】
３Ｄ投影画像を、Leica TCS SP8共焦点顕微鏡を使用して撮影した。平板化脈絡膜／網膜の１μｍ間隔のＺ積層画像を標準条件下で撮影した。染色の体積及び深さを、Imarisソフトウェアを使用して測定した。
【０１２３】
［実施例１］
（タイトジャンクションＺｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ＺＯ−１）の細胞局在性におけるＡＰＣの効果）
細胞間結合性複合体は、オクルディンやクローディンのようなタイトジャンクションタンパク質を含む。これらのタンパク質は、細胞骨格に結合し、その結合によって結合安定性をもたらす細胞質内リンタンパク質閉鎖帯（ＺＯ）−１に結合する。ＺＯ−１の分裂により、タイトジャンクションが崩壊し、血管（内皮）又は上皮の浸透性が上昇することがある。タイトジャンクション複合体の細胞骨格への結合及びＲＰＥバリアの統合性の維持におけるＺＯ−１の関与の観点から、ＺＯ−１の細胞局在性におけるＡＰＣに曝す効果を分析した。ＺＯ−１の細胞局在性は、上記「材料と方法」において述べたように、抗ＺＯ−１抗体を用いて免疫蛍光染色を行うことで検討した。
【０１２４】
図２Ａ〜Ｄに、ウサギ抗ＺＯ−１抗体で染色したＲＰＥ細胞（明るい線）、及び、NucBlue（登録商標）Fixed Cell ReadyProbe（登録商標）試薬で染色したＲＰＥ細胞（核染色）の共焦点顕微鏡画像を示す。１μｇ／ｍｌのＡＰＣは、ＡＲＰＥ１９細胞膜におけるＺＯ−１タンパク質の調節、転位及び蓄積までを誘導したことが明らかに理解できる。これらの結果は、上皮細胞周囲の膜におけるＺＯ−１の蓄積はタイトジャンクション構造によって形成された物理的障壁をとおした異常な浸透性及び血管新生を防ぎ得ることを示唆している。
【０１２５】
［実施例２］
（インビトロでのＲＰＥ細胞の浸透性におけるＡＰＣの効果）
ＺＯ−１の転位に伴って、ＲＰＥにおける浸透性は低下するのかどうかという疑問を解決するために、ＡＰＣの非存在下又は存在下において、細胞層を横切る標識されたデキストランの移動を分光光度計で観測することによって、細胞浸透率を求めた。インビトロでのＡＲＰＥ−１９細胞の浸透率を、上記「材料及び方法」中に記載したプロトコルに従って測定した。
【０１２６】
４回の反復実験の結果を図３に要約する。図３からわかるように、ＲＰＥ細胞を１μｇ／ｍｌのＡＰＣに曝すことによって、ＲＰＥ単層を通したＦＩＴＣデキストランの漏出が劇的に減少した。このことは、ＡＰＣがＲＰＥバリアを安定化させたことを暗示している。
【０１２７】
［実施例３］
（レーザー光凝固後のＣＮＶ面積の定量）
上記「材料と方法」に記載した方法で、オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、間接ダイオードレーザー光凝固によって脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を誘発した。損傷後すぐに、１匹あたり１μｇとなる割合で１μｌのＡＰＣを、又は１匹あたり２５μｇとなる割合で１μｌのベバシズマブを、マウスの硝子体内に注入した。上記「材料と方法」に記載した方法で、抗ＣＤ３１を使用した抗体免疫蛍光染色によって平らな脈絡膜のＣＮＶ面積を測定した。分化クラスター３１（ＣＤ３１、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）としても知られる）は、内皮細胞間接合部の大部分を形成するタンパク質である。免疫組織化学において、ＣＮＶのビルディングブロックである内皮細胞の存在を実証するために、主にＣＤ３１を用いる。レーザーによる損傷より５日間、imageJ画像処理ソフトウェアを使用して、ＣＮＶ面積を評価した。
【０１２８】
図４で示すように、ＡＰＣ処理によりＣＮＶ面積が劇的に減少した。ＡＰＣの効果は、現在の一般的に好まれるＣＮＶの治療法であるベバシズマブの効果に匹敵する効果であった。
【０１２９】
［実施例４］
（ＣＮＶの体積及び深さにおけるＡＰＣ処理の効果（３次元分析））
上記「材料と方法」に記載した方法で、オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、間接ダイオードレーザー光凝固によってＣＮＶを誘発した。損傷後すぐに、１匹あたり１μｇとなる割合で１μｌのＡＰＣ、又は１μｌの生理食塩水のどちらかを、マウスの硝子体内に注入した。レーザー照射の５日後、マウスに麻酔をかけた。そして、０．１５ｍｌのフルオレセインイソチオシアネートデキストラン結合体（ＦＩＴＣ−デキストラン）を０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように生理食塩水で希釈した。それを個々のラットの左心室に注入した。眼を摘出した。脈絡膜−ＲＰＥと網膜とを分離し、「材料と方法」で記載した方法で、スライド上で平板化し、マウントした。共焦点顕微鏡を使用して画像を撮影した。３Ｄ画像解析ソフトウェアを使用した３Ｄ再構築画像上で、ＣＮＶの定量を行った。
【０１３０】
図５Ａ及び５Ｂは、脈絡膜−ＲＰＥ切片でのＣＮＶの体積（５Ａ）及びＣＮＶの深さ（５Ｂ）を示す。ＡＰＣ処理により、ＣＮＶの体積及び深さが劇的に減少することが明らかに実証された。
【０１３１】
［実施例５］
（脈絡膜から網膜への新しく形成された血管の貫通におけるＡＰＣの効果）
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、血管新生を誘発した。損傷後すぐに、１匹あたり１μｇとなるような割合で、１μｌのＡＰＣ、又は１μｌの生理食塩水のどちらかを、マウスの硝子体内に注入した。そして、上記「材料と方法」に記載した方法で、デキストラン潅流及び網膜の平板化を行った。標準条件下で、平板化された網膜の１μｍ間隔のＺ積層画像を撮影した。光凝固及びそれに続くデキストランの潅流の５日後の網膜全体のＺ切片の測定の要約が、図６Ａ〜６Ｃに提示されている。
【０１３２】
図６Ａ、６Ｂに示した網膜全体の代表的な画像は、網膜の深層部における血管の親和力は、レーザーによって誘発され、ＡＰＣによって阻害されるということを実証している。
【０１３３】
網膜切片での血管新生領域の測定の定量を、図６Ｃに示す。明らかに示されるように、ＡＰＣによって網膜への血管の貫通が有意に減少した。
【０１３４】
本発明を、本発明の特定の実施形態と共に記載しているが、多くの代替物、改変及び変形が、当業者にとって明らかであろう。従って、添付の請求項の精神及び幅広い範囲に該当する全ての代替物、改変及び変形が本明細書中に包含される。
【０１３５】
各々の刊行物、特許又は特許出願が、参照として本明細書中に組み込まれていると具体的に個々に明示されている場合と同様に、本明細書中で言及した刊行物、特許及び特許出願の全ては、本明細書中において参照としてその全体が明細書に組み込まれている。加えて、本明細書中のいずれの参照の引用又は識別は、本発明に対する先行技術としてそのような参照を利用してよいことを認めたとは解釈されない。使用しているセクションの見出しにおいては、必ずしも限定として解釈されない。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１Ａ】血液網膜関門（ＢＲＢｓ）の背景技術の略図である。
【図１Ｂ】網膜の基本構造の背景技術の略図である。
【図１Ｃ】年齢関連性黄斑変性（ＡＭＤ）における脈絡膜血管新生を特徴づける網膜の背景技術の略図である。
【図２Ａ】０．０μｇ／ｍｌ  ＡＰＣ（コントロール）を用いた処理に続いて、ウサギ抗ＺＯ-１抗体（非常に明るい）とＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）（核染色：明るく、丸い円形の領域）を用いて染色された網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の共焦点顕微鏡の画像である。
【図２Ｂ】０．１μｇ／ｍｌ  ＡＰＣを用いた処理に続いて、ウサギ抗ＺＯ-１抗体（非常に明るい）とＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）（核染色：明るく、丸い円形の領域）を用いて染色された網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の共焦点顕微鏡の画像である。
【図２Ｃ】１μｇ／ｍｌ  ＡＰＣを用いた処理に続いて、ウサギ抗ＺＯ-１抗体（非常に明るい）とＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）（核染色：明るく、丸い円形の領域）を用いて染色された網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の共焦点顕微鏡の画像である。
【図２Ｄ】１０μｇ／ｍｌ  ＡＰＣを用いた処理に続いて、ウサギ抗ＺＯ-１抗体（非常に明るい）とＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）（核染色：明るく、丸い円形の領域）を用いて染色された網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の共焦点顕微鏡の画像である。
【図３】０．０、０．１又は１μｇ/ｍｌ  ＡＰＣで処理したＡＲＰＥ−１９細胞のＦＩＴＣ−デキストラン浸透率（コントロールに対する％）を示したグラフである（４回の実験の平均結果）。
【図４】網膜のレーザーでの光凝固、及び、硝子体内への生理食塩水、ベバシズマブ（２５μｇ／匹）又はＡＰＣ（１μｇ／匹）の注入を行った、平らな脈絡膜の脈絡膜内血管面積を示したグラフである。
【図５Ａ】レーザーでの光凝固、及び、生理食塩水、又はＡＰＣ（１μｇ/匹）の注入を行った平面化された脈絡膜−ＲＰＥ切片の血管の体積を示したグラフである。
【図５Ｂ】レーザーでの光凝固、及び、生理食塩水、又はＡＰＣ（１μｇ/匹）の注入を行った平面化された脈絡膜−ＲＰＥ切片の血管の深さを示したグラフである。
【図６Ａ】レーザーでの光凝固及び、生理食塩水、又はＡＰＣ（１μｇ/匹）の注入を行った模範的な平面化された網膜全体の（１μｍ）距離Ｚの積層画像である。血管は画像において非常に明るく表示されている。
【図６Ｂ】レーザーでの光凝固及び、生理食塩水、又はＡＰＣ（１μｇ/匹）の注入を行った模範的な平面化された網膜全体の（１μｍ）距離Ｚの積層画像である。血管は画像において非常に明るく表示されている。
【図６Ｃ】レーザーでの光凝固及び、生理食塩水、又はＡＰＣ（１μｇ/匹）の注入を行った模範的な平面化された網膜全体の（１μｍ）距離Ｚのグラフである。
【図１Ａ】
2018536715.tif 000002
【図１Ｂ】
2018536715.tif 000003
【図１Ｃ】
2018536715.tif 000004
【図２Ａ】
2018536715.tif 000005
【図２Ｂ】
2018536715.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2018536715.tif 000008
【図３】
2018536715.tif 000009
【図４】
2018536715.tif 000010
【図５Ａ】
2018536715.tif 000011
【図５Ｂ】
2018536715.tif 000012
【図６Ａ】
2018536715.tif 000013
【図６Ｂ】
2018536715.tif 000014
【図６Ｃ】
2018536715.tif 000015
【国際調査報告】
2018536715.tif 000016
2018536715.tif 000017