(57)【要約】本発明は、1つ以上のクリプトフィシン誘導体（大環状デプシペプチド）が1つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合する自壊性リンカーにより共有結合される、抗体-またはペプチド-薬物コンジュゲート化合物に関する。リンカーは、プロテアーゼのための切断部位およびジケトピペラジンを形成できるジペプチド単位を含む。これらの化合物は、癌ならびに免疫または感染性疾患などの他の疾患および障害の診断または処置の方法において有用であり得る。
2018517762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)
【化１】
2018517762.tif 000041
(I)
［式中、
Rは、-CO-CH2-X-(A)n-Bであり、
Xは、NRaおよびOからなる群より選択され、Raは、HおよびC1-C10アルキルからなる群より選択され；
Aは、自壊性リンカーであり、
nは、0または1であり；
Bは、ペプチド、ポリペプチド／タンパク質および抗体からなる群より選択される］
で示されるコンジュゲート、およびそれらの医薬的に許容される塩。
【請求項２】
抗体がモノクローナル抗体またはナノボディである、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
ナノボディが、単一ドメイン抗体およびラクダ抗体からなる群より選択される、請求項2に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
モノクローナル抗体が、トラスツマブ、ゲムツズマブ、ブレンツキシマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、ペルツズマブからなる群より選択される、請求項に2記載の抗体薬物コンジュゲート（ADC）。
【請求項５】
ペプチドBがソマトスタチン受容体に結合する、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
ペプチドが、オクトレオチド、パシレオチドまたはランレオチドからなる群より選択される、請求項5に記載のコンジュゲート（PDC）。
【請求項７】
自壊性リンカーAが、式(II)
【化２】
2018517762.tif 000042
(II)
［式中、R1が、H、(C1-C10)アルキルからなる群より選択され、R2が、適宜R1と一緒に、アミノ酸側鎖の残基であり、R3が、H、(C1-C10)アルキルからなる群より選択され、R4が、適宜R3と一緒に、アミノ酸側鎖の残基である］
で示される部分である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
自壊性リンカーAが、
【化３】
2018517762.tif 000043
からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
式(III)
【化４】
2018517762.tif 000044
(III)
［式中、R1、R2、R3およびR4が、上記で定義するとおりであり、Xが、NH、N-(C1-C10)-アルキル、Oからなる群より選択され；mAbがモノクローナル抗体もしくはナノボディ、またはペプチドもしくはポリペプチドを表す］
を有する、請求項7に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
式(IV)
【化５】
2018517762.tif 000045
(IV)
で示される、請求項7に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
式(V)
【化６】
2018517762.tif 000046
(V)
［式中、R1が、H、(C1-C10)アルキルからなる群より選択され、R4が、適宜R1と一緒に、アミノ酸側鎖の残基であり；Xが、NH、N-(C1-C10)、アルキル Oからなる群より選択され；mAbはモノクローナル抗体、ペプチドまたはポリペプチドを表す］
で示される、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
式(VI)
【化７】
2018517762.tif 000047
(VI)
で示される、請求項6に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
少なくとも1つの医薬的に許容されるビヒクルおよび／または添加剤との混合物中に活性成分として請求項1〜12のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
医薬としての使用のための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
癌または自己免疫疾患または感染性疾患からなる群より選択される疾患の治療的処置のための、請求項14に記載の使用ためのコンジュゲート。
【請求項１６】
診断剤としての使用のための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
癌または自己免疫疾患または感染性疾患からなる群より選択される疾患の診断のための、請求項16に記載の使用ためのコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品化学の分野に関するものであり、特に抗癌活性化合物、より具体的には、化学療法の大環状デプシペプチド薬物または毒素とコンジュゲートした抗体に関する。本発明はまた、癌、自己免疫疾患または感染性疾患におかされた哺乳類細胞または対象体のインビトロ、インサイチュおよびインビボでの診断または処置における使用のための上記化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌、免疫学的および血管新生障害の患者の標的処置のための抗体治療が確立されている。この目的のために、治療用モノクローナル抗体（TMA）が開発されている（Firer M. A. J. Hematol. Oncol. 2012, 5, 70; Mullard, A. Nature Rev. Drug Discov. 2013, 12, 329）。しかしながら、単独で用いられる場合前臨床研究で有望であった多くのTMAは、癌細胞毒性が不十分であるため、クリニックで失敗した。
【０００３】
癌、免疫学的および血管新生障害の患者の標的処置のためのモノクローナル抗体治療が確立されている。成功した抗体治療の例は、組み換えDNA由来ヒト化モノクローナル抗体であるHERCEPTIN（登録商標）（トラスツマブ）であり、これは、ヒト上皮細胞増殖因子受容体2タンパク質、HER2（ErbB2）の細胞外ドメインに高親和性で選択的に結合する（US5,821,337；US6,054,297；US6,407,213；US6,639,055；Coussens L, et al (1985) Science 230:1132-9；Slamon D J, et al (1989) Science 244:707-12）。HERCEPTINは、広範な先行抗癌治療を受けたErbB2過剰発現乳癌の患者の処置において画期的であるが、この集団の患者の大多数は、HERCEPTIN処置に応答しないかまたはほとんど応答しない。
【０００４】
このような問題を克服するために、モノクローナル抗体（mAb、例えばトラスツマブ）が極めて細胞毒性な薬物に結合している抗体-薬物コンジュゲート（ADC）の分野において指数関数的成長があった。ADCは、癌の治療においてますます重要性を増している。3個のADC：Mylotarg（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン、Wyeth Pharmaceuticals）、Adcetris（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン、Seattle Genetics）およびKadcyla（登録商標）（アド-トラスツマブエムタンシン、Roche）が、米国FDAにより承認されており、35個のADCが現在臨床試験中である。腫瘍選択性はmAbにより示され、一方、リンカーは、生理学的条件下での薬物の放出、安定性および全体的な溶解性に関与する。
【０００５】
Mylotarg（登録商標）は、カリケアミシンに結合するhu CD33抗体から構成され、急性骨髄性白血病の処置のために2000年に承認されたが、2010年に取消された。Adcetris（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン、Seattle Genetics、下記式1）は、2011年に承認され、古典的ホジキンリンパ腫（HL）および全身性未分化大細胞リンパ腫（sALCL）に発現する、CD30に対する抗体に連結するモノメチルアウリスタチンE（MMAE）から構成される。Kadcyla（登録商標）（アド-トラスツマブエムタンシン、Roche、下記式2）は、難治性ヒト上皮細胞増殖因子受容体2（HER2）陽性転移または局所進行性乳癌の処置のために2013年に承認され、メルタンシン（DM1）に対する細胞毒性剤に結合するモノクローナル抗体トラスツマブ（Herceptin）を含む。
【０００６】
アド-トラスツマブエムタンシン（Kadcyla（登録商標））およびブレンツキシマブベドチン（Adcetris（登録商標））は、現在米国食品医薬品局（FDA）および欧州医薬品庁（EMA)により承認されている唯2つのADCである。
【化１】
2018517762.tif 000003
【０００７】
クリプトフィシンの異常な活性が、最近いくつかの特許において認められている。Endocyteは、切断可能なジスルフィドリンカーを備えたクリプトフィシン葉酸コンジュゲート（式3）について特許を受けた。このような葉酸コンジュゲートは、葉酸受容体を過剰発現する癌細胞株を標的とする（US2009/002993）。
【化２】
2018517762.tif 000004
式3
【０００８】
Sanofi-Aventisは、ごく最近クリプトフィシン抗体-薬物コンジュゲート（ADC）のデータを開示する2つの特許を公開した（US2011/001052；FR2947269）。主に、修飾アリール置換基を有するクリプトフィシン誘導体が、適切な官能性を有するクリプトフィシンを得るために選択された（式4）。
【化３】
2018517762.tif 000005
式4
【０００９】
異なるリンカータイプのうち、切断可能なジスルフィド-、PEG-、チオエーテル-およびチアゾールリンカーが用いられた。すべての場合において、リンカーは、EphA2受容体を標的にするモノクローナル抗体であるhu2H11に連結した。ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231に対する2つのクリプトフィシンADCのIC50値もまた報告された。式4で示されるADCは、立体障害チオエーテルリンカーを含み、0.710 nMのIC50値を示す。別のADCは、立体障害ジスルフィドリンカーを含む（IC50：0.150 nM）。置換されたクリプトフィシンは、薬物耐性細胞に対する細胞毒性活性が失われたことが報告された。
【００１０】
反対に、非コンジュゲート化クリプトフィシン（式5）は、多剤耐性（MDR）癌細胞に対してさえ極めて高い細胞毒性を有することが報告されている。クリプトフィシン-52は、多剤耐性（MDR）腫瘍細胞株に対して高い極めて活性を示す。多くのMDR腫瘍細胞は、流出ポンプとして働くP糖タンパク質（P-gp）を発現する。P-gp耐性薬物の合理的な設計が依然困難であるため、この活性はクリプトフィシンの別の価値ある特徴である。
【００１１】
最初の代表例は、1990年にネンジュモ属（Nostoc sp.）のシアノ細菌から単離された。それらの生物活性は、タンパク質チューブリンとの相互作用に基づく。クリプトフィシンは、微小管動態の阻害によってアポトーシスを誘導することが分かった。その結果、クリプトフィシン類似体は、潜在的な抗腫瘍剤として考えられている。
【００１２】
クリプトフィシン-52（LY355703）は、第I相臨床試験を通過したが、その後の第II臨床試験が、選択された用量におけるインビボでの有効性の欠如、高い神経毒性および用量制限毒性のため中止された。
【化４】
2018517762.tif 000006
式5
【００１３】
癌の治療のために現在承認されているADCはごくわずかである。薬物耐性に対処するためにより多様なADCが必要である。
【００１４】
今までクリプトフィシンベースのADCは承認されておらず、クリプトフィシン-55-グリシネートは抗体へのコンジュゲートについて記載されていない。
【００１５】
すべての記載されたクリプトフィシンコンジュゲートは、長い合成経路によってのみ入手可能である（例えばWO2011/001052参照）。しかしながら、Sewaldと共同研究者らは、短くて効率的な合成経路を記述している（Nat. Prod. Rep. 2013, 30, 924-940）。
【００１６】
疾患、特に癌、免疫疾患、感染性疾患の治療において安全に用いるための、薬物コンジュゲート、特に抗体-薬物コンジュゲート（一般にADCとも呼ばれる）およびペプチド-薬物コンジュゲート（一般にPDCとも呼ばれる）を提供することが、依然として強く必要とされている。
【００１７】
また、疾患、特に癌、免疫疾患、感染性疾患の診断において用いるための、薬物コンジュゲート、特に抗体-薬物コンジュゲート（一般にADCとも呼ばれる）およびペプチド-薬物コンジュゲート（一般にPDCとも呼ばれる）を提供することも、依然として強く必要とされている。
【００１８】
多剤耐性を発生する癌、免疫疾患および感染性疾患の治療において用いるための、薬物コンジュゲート、特に抗体-薬物コンジュゲート（一般にADCとも呼ばれる）およびペプチド-薬物コンジュゲート（一般にPDCとも呼ばれる）を提供することが、さらに必要とされている。
【発明の概要】
【００１９】
本発明により、自壊性ペプチド由来リンカーを介してモノクローナル抗体またはペプチド結合しているクロロヒドリンクリプトフィシン-55が、腫瘍細胞に対して極めて効率的であることを見出された。
【００２０】
本発明によるコンジュゲートは、1つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合するので、腫瘍関連抗原または細胞表面受容体、タンパク質または抗原の結合のおかげで診断または処置され得る疾患の診断または処置に用いられ得る。
【００２１】
本発明の対象物は、式(I)
【化５】
2018517762.tif 000007
(I)
［式中、
Rは、-CO-CH2-X-(A)n-Bであり、
Xは、NRaおよびOからなる群より選択され、Raは、HおよびC1-C10アルキルからなる群より選択され；
Aは、自壊性リンカーであり、
nは、0または1であり；
Bは、ペプチド、ポリペプチド／タンパク質および抗体からなる群より選択される］
で示されるコンジュゲート、およびそれらの医薬的に許容される塩である。
【００２２】
本発明の別の対象物は、少なくとも1つの医薬的に許容されるビヒクルおよび／または添加剤との混合物中に活性成分として上記のコンジュゲートを含む、医薬組成物である。
【００２３】
本発明の別の対象物は、医薬として用いるための上記のコンジュゲートである。
【００２４】
本発明の別の対象物は、診断剤として用いるための上記のコンジュゲートである。
【００２５】
本発明のこれらおよびその他の対象物を、実施例および図面により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図1は、パネル中に示される化合物でのHER2-陽性SK-BR3細胞の処理後の細胞生存率アッセイを示す。
【図２】図2は、適切なタンパク質MW標準（示していない）および精製非コンジュゲート化抗体（図2、右パネル）と比較して分析した、薬物リンカー-コンジュゲート化抗体（ここで、ピーク2はクリプトフィシン-55-グリシネート-コンジュゲート化抗体（図2、左パネル）のモノマー型に対応し、ピーク1はオリゴマー型に対応する）の精製を示す。
【図３】図3は、オクトレオチドとの本発明のコンジュゲートでAR42J細胞を処理したときに得られる残存細胞生存率プロットを示す。
【図４】図4は、オクトレオチドとの本発明のコンジュゲートでMCF7細胞を処理したときに得られる残存細胞生存率プロットを示す。
【図５】図5は、野生型および薬物耐性H69AR細胞株におけるクリプトフィシンまたはクリプトフィシン薬物リンカーの細胞毒性を示す。図中、リンカー73は実施例6に示されており、リンカー76は実施例5に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明によるコンジュゲートは、抗体、好ましくはモノクローナル抗体との、またはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との薬物コンジュゲートであり得る。
【００２８】
抗体、特にモノクローナル抗体は、治療において、特に薬物とのコンジュゲートのために周知である。
【００２９】
本発明によるコンジュゲートは、抗体、好ましくはモノクローナル抗体との（この場合、簡単にADCとも呼ばれる）、またはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との（この場合、簡単にPDCとも呼ばれる）薬物コンジュゲートであり得る。
【００３０】
ペプチドは、治療において、特に薬物とのコンジュゲートのために周知である。本発明によるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、L-もしくはD-いずれかまたは両方の配置の天然アミノ酸、および人工ペプチドを含み得る。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様において、コンジュゲート中、抗体は、モノクローナル抗体またはナノボディである。本発明の更なる実施態様によれば、ナノボディは、単一ドメイン抗体およびラクダ抗体からなる群より選択される。
【００３２】
本発明の特に好ましい実施態様において、抗体薬物コンジュゲート（ADC）中、モノクローナル抗体は、トラスツマブ、ゲムツズマブ、ブレンツキシマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、ペルツズマブからなる群より選択される。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様において、ペプチドBは、ソマトスタチン受容体に結合する。本発明の特に好ましい実施態様において、ペプチドは、オクトレオチド、パシレオチドまたはランレオチドからなる群より選択される。
【００３４】
本発明の一実施態様において、コンジュゲート中、自壊性リンカーAは、式(II)
【化６】
2018517762.tif 000008
(II)
［式中、R1は、H、(C1-C10)アルキルからなる群より選択され、R2は、適宜R1と一緒に、アミノ酸側鎖の残基であり、R3は、H、(C1-C10)アルキルからなる群より選択され、R4は、適宜R3と一緒に、アミノ酸側鎖の残基である］
で示される部分である。
【００３５】
好ましい実施態様において、コンジュゲート中、自壊性リンカーAは、
【化７】
2018517762.tif 000009
からなる群より選択される。
【００３６】
本発明の別の一実施態様において、コンジュゲートは、式(III)
【化８】
2018517762.tif 000010
(III)
［式中、R1、R2、R3およびR4は、上記で定義するとおりであり、Xは、NH、N-(C1-C10)アルキル、Oからなる群より選択され；mAbはモノクローナル抗体もしくはナノボディ、またはペプチドもしくはポリペプチドを表す］
を有する。
【００３７】
本発明の別の一実施態様において、コンジュゲートは、式(IV)
【化９】
2018517762.tif 000011
(IV)
を有する。
【００３８】
本発明の別の一実施態様において、コンジュゲートは、式(V)
【化１０】
2018517762.tif 000012
（V）
［式中、R1は、H、(C1-C10)アルキルからなる群より選択され、R4は、適宜R1と一緒に、アミノ酸側鎖の残基であり；Xは、NH、N-(C1-C10)アルキル-、Oからなる群より選択され；mAbはモノクローナル抗体、ペプチドまたはポリペプチドを表す］
を有する。
【００３９】
本発明の別の一実施態様において、コンジュゲートは、式(VI)
【化１１】
2018517762.tif 000013
（VI）
を有する。
【００４０】
本発明の一実施態様において、コンジュゲートは、癌、自己免疫疾患および感染性疾患からなる群より選択される疾患の治療的処置に使用するためのものである。
【００４１】
本発明の一実施態様において、コンジュゲートは、癌、自己免疫疾患および感染性疾患からなる群より選択される疾患の診断に使用するためのものである。インビボ以外に、本発明によるコンジュゲートは、インビトロまたはインサイチュ診断のためにも用いられ得る。
【００４２】
用語C1-C10アルキルで直鎖または分岐鎖が意図される。アルキルの例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、およびそれらのすべての異性体である。
【００４３】
本発明によれば、医薬的に許容される塩は、当該技術分野において周知であり、特定の開示を必要としない。当業者は、塩が本発明の目的に適するかを分かっており、文献、マニュアル、ハンドブックなどの広範な参考文献（例えば、Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), Wiley）に頼ることができる。
【００４４】
本発明の好ましい態様において、クリプトフィシン-55グリシネートまたはクリプトフィシングリコレートが用いられる。それらは細胞毒性を示し、これはクリプトフィシン-55（表1）より実質的に低くなく、またコンジュゲートに適する官能基の利益を有する。この官能基により、クリプトフィシン-55-グリシネートまたはクリプトフィシン-55-グリコレートは、モノクローナル抗体（例えば、全乳房腫瘍の20〜25％で過剰発現するHER2-受容体に高い選択性を示すトラスツマブ）にプロテアーゼ切断可能な自壊性リンカーを介してコンジュゲートされ得る。
【化１２】
2018517762.tif 000014
式(IV)クリプトフィシン-55-グリシネートADC
【００４５】
自壊性リンカーは、薬物-コンジュゲート、特に抗体-薬物コンジュゲート（ADC）およびペプチド-薬物コンジュゲートの設計において周知であり、例えばUS 6214345および関連参考文献；またはCarl P.L. et al. (1982)を参照されたい。リンカーは、タンパク質に存在する官能基（チオール、アミンなど）に反応性である結合部位（マレイミド、活性エステルなど）と、親水性スペーサー（例えばエチレングリコールベース）と、プロテアーゼ切断部位（例えばVal-Cit）と、クリプトフィシン-55、クリプトフィシン-55グリシネート、クリプトフィシン-55グリコレートもしくは他のペプチド模倣クリプトフィシン-55誘導体を放出できるジペプチド（スキーム2）またはトリペプチド単位（スキーム1）から構成される。クリプトフィシン-55は、クリプトフィシン-52に変換されると推定される。
【００４６】
【化１３】
2018517762.tif 000015
スキーム1  プロテアーゼによる切断は、ジケトピペラジンおよびクリプトフィシン-55誘導体（例えばグリシネート）（R1 = H、アルキル、R2 = 任意のアミノ酸側鎖、R3 = H、(C1-C10)アルキル、R4 = 任意のアミノ酸側鎖、X = NH、N(C1-C10)アルキル、O）を放出する。
【００４７】
【化１４】
2018517762.tif 000016
スキーム2  プロテアーゼによる切断は、ジケトピペラジン（X = NHまたはN-(C1-C10)アルキル）またはジケトモルホリン（X = O）およびクリプトフィシン-55（R1 = H、(C1-C10)アルキル、R4 = 任意のアミノ酸側鎖、X = NH、N(C1-C10)アルキル、O）を放出する。
【００４８】
本発明のコンジュゲートは、当該技術分野で周知である従来技術にしたがって製造され得る。
【００４９】
例えば、クリプトフィシン-52は、Weiss C, et al (2012) Beilstein Journal of Organic Chemistry 8:2060-6およびWeiss C, et al (2013) Natural Product Reports 30:924-40により公開された経路にしたがって製造され得る。
【００５０】
クリプトフィシン-55は、クリプトフィシン-52から出発して、例えばクリプトフィシン-52のオキシラン環を開環することにより製造できる。ハロゲン原子を誘導するためのオキシラン環の開環は、十分当業者の知識の範囲内である。例えば塩酸が用いられ得る。反応媒体は、通常、この種の反応、ならびに反応条件および所望の生成物の反応および単離の後処理に適した有機溶媒である。
【００５１】
クリプトフィシン-55-グリシネートはまた、周知の合成方法にしたがって製造され得て、例えば、対応するトリフルオロ酢酸塩を介する（Liang J, et al (2005) Investigational New Drugs 213-224参照）。
【００５２】
本発明に適切な自壊性リンカーおよびそれらの製造も周知である。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様において、tert-ブチル-15-ヒドロキシ-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエートは、Seitz O, et al (1997) Journal of Organic Chemistry 62:813-826で公表された手順にしたがって合成され得る。tert-ブチル-15-マレイミド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエートは、Warnecke A, (2002) Dissertationにしたがって合成され得る。15-マレイミド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸は、Warnecke A, (2002) Dissertationにしたがって製造され得る。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様において、マレイミド-PEG-Val-Cit-Pro-Glyは、標準的なFmoc SPPS [Fields G and Noble R L, (2009) International Journal of Peptide and Protein Research 33,3:161-214]にしたがって合成され得る。
【００５５】
他の周知の自壊性リンカーが本発明において用いられ得る。
【００５６】
その後、クリプトフィシン-55-グリシネートペプチドは、周知のマレイミドコンジュゲーション法により製造され得る。
【００５７】
クリプトフィシン-55-グリシネートとの抗体-薬物コンジュゲート（ADC）は、この分野における一般知識にしたがって製造され得る。例えば、TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）法での抗体鎖間ジスルフィド結合の部分還元、または2-MEA（2-メルカプトエチルアミン・HCl）法での抗体鎖間ジスルフィド結合の部分還元による。
【００５８】
任意の他の適切な方法が好都合には用いられ得る。
【００５９】
本発明によるペプチド-薬物コンジュゲート（PDC）はまた、従来法で製造され得る。
【００６０】
本発明のADCおよびPDCは、インビトロによりそれらの有効性について試験され得て、例えば、ADCについては抗体を認識する細胞株の選択、またはPDCについてはペプチドにより認識される受容体の提示、または実験動物モデルを用いたインビボ法による。
【００６１】
本発明によるクリプトフィシン-55-グリシネートADCは、Her2-陽性乳癌腫細胞株（SK-BR3）に対してトラスツマブより極めて高い細胞毒性を示す。
【００６２】
クリプトフィシン-55およびクリプトフィシン-55-グリシネートと異なり、ADC細胞毒性効果は、HER2発現が低い乳癌腫細胞株であるMCF7またはHER2発現が低い結腸癌腫細胞株であるHCT116と比較して、HER2-陽性SK-BR3細胞株に対して極めて選択的である。
【００６３】
本発明によるクリプトフィシンベースのコンジュゲートはいくつかの利点を提供する：
【００６４】
放出されたクリプトフィシン誘導体は、既にナノモル濃度またはサブナノモル濃度の腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を示す。
【００６５】
放出されたクリプトフィシン誘導体はPgPの基質でないため、クリプトフィシンに対する耐性は低くなり得る。
【００６６】
合成経路は、コンジュゲーション前にその骨格に化学修飾を受ける必要のないクリプトフィシンである、クリプトフィシン-55-グリシネートに基づく。
【００６７】
HER2過剰発現乳房腫瘍細胞の選択的アドレッシングが抗体を介して可能である。
【００６８】
ADCは、ジケトピペラジン誘導体または類似体の形成を伴うリンカーの酵素切断後における薬物遊離の代替メカニズムを提供する。
【００６９】
クリプトフィシン誘導体が異なるコンジュゲートを合成するために用いられ得て、これにより薬物コンジュゲートのより高い多様性を提供し得る。
【００７０】
本発明によるコンジュゲートは、有効量のコンジュゲートが少なくとも1つの医薬的に許容されるビヒクルおよび／または少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤と混合される、医薬組成物によって投与され得る。
【００７１】
該組成物は、獣医学またはヒト投与に適する。
【００７２】
本発明の組成物は、組成物を動物またはヒトいずれかの対象体へ投与することを可能にする任意の形態であり得る。例えば、組成物は、固形、液体またはガス（エアロゾル）の形態であり得る。投与の典型的な経路としては、経口、局所、非経腸、舌下、直腸、膣、眼および鼻腔内が挙げられるが、これらに限定されない。非経腸投与としては、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または点滴技術が挙げられる。組成物は、好ましくは非経腸的、より好ましくは静脈内投与される。本発明の医薬組成物は、本発明のコンジュゲートを投与時に生物学的に利用可能にするように製剤化され得る。組成物は、1つ以上の投与単位の形態を取り得る。
【００７３】
医薬組成物の製造で用いられる材料は、用いられる量において無毒性でなければならない。
【００７４】
医薬組成物中の活性成分の用量は、様々な因子、例えば投与される対象体の種類（例えばヒト）、本発明のコンジュゲートの特定の形態、投与様式、および使用される組成物に依存する。
【００７５】
医薬的に許容される担体およびビヒクルは、当該技術分野において周知であり、更なる説明を必要としない。それらは、固形、例えば粒子の形態であり得るか、または液体、例えば経口シロップ剤または注射可能な液剤であり得る。また担体またはビヒクルは、例えば吸入投与で有用なエアロゾル組成物を提供するように、ガス状であり得る。
【００７６】
経口投与が意図されるとき、組成物は、好ましくは固形または液体形態であり、ここで、半固形、半液体、懸濁液およびゲル形態は、固形または液体いずれかとして本明細書で見なされる形態内に含まれる。
【００７７】
経口投与のための固形組成物として、組成物は、散剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル剤、チューイングガム、ウェーハまたは同様のの形態に製剤化され得る。このような固形組成物は、典型的には1つ以上の不活性希釈剤を含む。また、以下の1つ以上が存在し得る：結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースまたはゼラチン；添加剤、例えばデンプン、ラクトースまたはデキストリン、崩壊剤、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、コーンスターチなど；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン、香料、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料、および着色剤。
【００７８】
組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態であるとき、それは、上記タイプの材料に加えて、液体担体、例えばポリエチレングリコール、シクロデキストリンまたは脂肪油を含み得る。
【００７９】
組成物は、液剤、例えばエリキシル剤、シロップ剤、溶液、乳剤または懸濁剤の形態であり得る。液剤は、経口投与または注射による送達に有用であり得る。経口投与が意図されるとき、組成物は、甘味剤、防腐剤、色素／着色剤および風味向上剤の1つ以上を含み得る。注射による投与のための組成物において、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤および等張化剤の1つ以上がまた含まれ得る。
【００８０】
本発明の液体組成物はまた、それらが溶液、懸濁剤または他の形態であるかに関わらず、次の1つ以上を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、好ましくは生理的食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、不揮発性油、例えば溶媒または懸濁媒体として働き得る合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリシン、シクロデキストリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および等張調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経腸組成物は、ガラス、プラスチックまたは他の材料製のアンプル、使い捨てシリンジ、複数回用量バイアルに封入され得る。生理的食塩水は、好ましいアジュバントである。
【００８１】
注射可能な組成物は、好ましくは無菌である。
【００８２】
特定の障害または病態の処置に効果的である本発明のコンジュゲートの量は、障害または病態の性質に依存し、標準的な臨床技術により決定され得る。また、インビトロまたはインビボアッセイは、最適な用量範囲を同定するのを助けるために適宜使用され得る。組成物中使用される正確な用量はまた、投与経路および疾患または障害の重篤度に依存し、実施者の判断および各患者の状況にしたがって決定されるべきである。
【００８３】
本発明による組成物は、適切な用量が得られるような有効量の本発明のコンジュゲートを含む。
【００８４】
用量は、投与される対象体の体重または体表面積により決定され得る。
【００８５】
一般的に用量は、典型的には約0.1 mg/kg動物体重〜約250 mg/kg動物体重である。
【００８６】
別の一実施態様において、投与は、腫瘍部位（またはより前の部位）または自己免疫疾患の発現にて直接注射によりなされ得る。
【００８７】
別の一実施態様において、本発明のコンジュゲートは、小胞、特にリポソーム中において送達され得る（Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327参照; 一般に同書参照）。
【００８８】
また別の一実施態様において、本発明のコンジュゲートは、制御放出システム中において送達され得る。一実施態様において、ポンプが用いられ得る（Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987)；Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980)；Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989) 参照）。別の一実施態様において、ポリマー材料が用いられ得る（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press, Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983) 参照; Levy et al., Science 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989) もまた参照）。また別の一実施態様において、制御放出システムは、本発明の化合物または組成物の標的、例えば脳の近傍に置き得て、これにより全身用量のほんの一部のみが必要とされる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 参照）。Langerによるレビュー（Science 249: 1527-1533 (1990)）で論じられた他の制御放出システムが用いられ得る。
【００８９】
用語担体は、本発明のコンジュゲートと共に投与される希釈剤、アジュバントまたは添加剤を指す。このような医薬担体は、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えばピーナツ油、大豆油、鉱油、ごま油などを含む、水および油などの液体であり得る。担体は、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、ウレアなどであり得る。また、助剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤および着色剤が用いられ得る。一実施態様において、動物に投与されるとき、本発明の化合物または組成物および医薬的に許容される担体は、無菌である。本発明の化合物が静脈内投与されるとき、水は好ましい担体である。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液もまた、特に注射可能な液剤に、液体担体として使用され得る。適切な医薬的に許容される担体はまた、添加剤、例えばデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。本組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤を含み得る。
【００９０】
本組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、ペレット剤およびカプセル剤、液体含有カプセル剤、散剤、徐放性製剤、坐剤、乳剤、エアロゾル剤、スプレー剤、懸濁剤の形態、または使用に適した他の形態をとり得る。
【００９１】
一般的な言及は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」になされ得る。
【００９２】
以下の実施例は本発明をさらに例示する。
【実施例】
【００９３】
実施例1
TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）法での抗体鎖間ジスルフィド結合の部分還元によるクリプトフィシン-55-グリシネートADCの製造
新たに製造したPBS-EDTA-緩衝液pH7.2から、TCEP-PBS-EDTA-溶液［100μLのPBS-EDTA-溶液中の3 mM TCEP（Sigma-Aldrich）］およびmAb-PBS-EDTA-溶液（0.8 mLのPBS-EDTA-溶液中の9 mg/mLトラスツマブ；62μMトラスツマブ）を製造した。TCEP-PBS-EDTA-溶液をmAb-PBS-EDTA-溶液に加え、得られた溶液を25℃で60分間インキュベートした。試薬の最終濃度は次のとおりであった：8 mg/mL還元トラスツマブ（55μM）、290μM TCEP。
【００９４】
その後、PBS-EDTA-緩衝液pH7.2中で予め平衡化したHiTrap Desalting Sephadex G25-5 mL（GE Healthcare/Amersham）カラムでAkta製の装置を用いて脱塩を行い、0.25 mL容量のフラクションをPBS-EDTA-緩衝液中回収した。すべてのフラクションをタンパク質含量について試験した（2μLの各フラクションを200μLのBradford-溶液に加えた）。タンパク質-含有フラクションを合わせ、抗体濃度をBradfordアッセイにより再決定して、3.3 mg/mL（22.8μM）を得て、5 mgの全抗体を回収した（70％回収）。遊離-SHの濃度を、Elmann試薬 DTNB（5,5'-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸)、Sigma-Aldrich/Fluka）およびL-Cyでの標準曲線（40-50-100-200-400-800μM）を用いて決定した。総-SH濃度は、68.24μMであり、抗体当たり平均で3つの遊離-SHを有した。
【００９５】
鎖間ジスルフィド結合の部分還元を上記のように繰り返し、マレイミド-PEG-Val-Cit-Pro-Gly-クリプトフィシン-55-グリシネートの溶液（DMSO中1.5 mM；100μL）を試料（900μL）に連続撹拌下2時間4℃で直接滴下し、10％DMSO中150μMの最終濃度に達し、遊離-SH基に対して1：1のモル比および抗体に対して3：1のモル比（抗体最終濃度が50μMであり、総遊離SHの150μMに相当する）を得た。並行して、S-S還元抗体コントロール試料をコントロールとして非コンジュゲートのままとした。インキュベーション時間の終わりに、各試料をすぐにHiTrap Sephadex G25カラムにロードし、上記のように脱塩を行った。上記のようにプールしたフラクションについてBradfordおよびElmannアッセイを行い、結果を以下に要約する。
【表１】
2018517762.tif 000017
【００９６】
選択された免疫コンジュゲーション反応条件下でSH/IgGの平均数は2.7から0.5に減少したことから、薬物リンカーへの結合が約2の薬物-抗体比（DAR）で生じたことが示唆される。
【００９７】
その後、Akta製の装置を用いて分取ゲル排除クロマトグラフィーを行った。500μLのクリプトフィシン-55-グリシネート-コンジュゲート化および非コンジュゲート化mAb 試料をSuperdex 200 10/300 GLカラム（GE Healthcare/Amersham）にロードし、PBS-EDTA pH7.2をクロマトグラフ緩衝液として用い、0.5 ml/分の流速を適用した。250μLのフラクションを回収した。薬物リンカー-コンジュゲート化抗体の精製は、2つのタンパク質ピークに保持され、ここで、適切なタンパク質MW標準（図2、左パネル）との比較により評価されるように、ピーク2はクリプトフィシン-55-グリシネート-コンジュゲート化抗体のモノマー型に対応し、ピーク1はオリゴマー型に対応する。これに対して、非コンジュゲート化mAb試料は、抗体のモノマー型（"mAbコントロール"）に対応するシングルピークを生じた（図2、右パネル）。ピークフラクションをプールし、タンパク質濃度をBradfordアッセイにより決定した。結果を以下に要約する。
【表２】
2018517762.tif 000018
【００９８】
実施例2
2-MEA（2-メルカプトエチルアミン・HCl）法での抗体鎖間ジスルフィド結合の部分還元によるクリプトフィシン-55-グリシネートADCの製造
新たに製造したPBS-EDTA-緩衝液（137 mM NaCl；2.7 mM KCl；10 mM Na2HPO4；2 mM KH2PO4；10 mM EDTA；pH = 7.2）から、2-MEA-PBS-EDTA-溶液（100μLのPBS-EDTA-溶液中6 mgの2-MEA）およびmAb-PBS-EDTA-溶液（1 mLのPBS-EDTA-溶液中10 mgのトラスツマブ；68.7μMトラスツマブ）を製造した。2-MEA-PBS-EDTA-溶液（300μL）をmAb-PBS-EDTA-溶液（1 mL）に加え、得られた溶液を37℃で90分間インキュベートした。試薬の最終濃度は次のとおりであった：7.7 mg/mL還元トラスツマブ（53μM）、13.8 mg 2-MEA（122 mM）。
【００９９】
HiTrap Desalting Sephadex G25 5 cmカラム（PBS-EDTA-緩衝液）で脱塩を行い、0.5 mL容量のフラクションを回収した。すべてのフラクションをタンパク質含量について視覚的に試験した（2μLの各フラクションを200μLのBradford-溶液に加えた）。タンパク質-含有フラクションを合わせ、マレイミド-PEG-Val-Cit-Pro-Gly-クリプトフィシン-55-グリシネートの溶液（DMSO中1.82 mM；150μL）を加えた。6℃で2時間インキュベーション後、1.5 mL未満の容量まで溶液を濃縮した。Akta Purifier（Superdex 200 highload 16/60カラム；PBS-EDTA-緩衝液）での精製は、mAb-Cry-55-リンカー-ピーク1（1.54μg/μL）およびmAb-Cry-55-リンカー-ピーク2（0.32μg/μL）に濃縮された2つのフラクションを生じた。ピーク1および2は、上記の2つの抗体凝集状態に対応した。
【０１００】
実施例3
細胞生存率アッセイ
腫瘍細胞株（乳癌腫細胞株SKBR-3およびMCF7および結腸癌腫細胞株HCT116）をAmerican Type Culture Collectionから得て、標準的なプロトコールにしたがって増殖させた。SKBR-3細胞は、高Her2レベルを発現することが知られており、それ故にトラスツマブ-感受性であり、一方、MCF7およびHCT116細胞は、低Her2発現を示し、それ故にトラスツマブ-耐性である。クリプトフィシン-55-グリシネートADCコンジュゲートの腫瘍細胞生存率への影響を、CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Promega）を用い製造業者プロトコールにしたがって評価した。非コンジュゲート化トラスツマブとトラスツマブADC間の差異を検出することを可能にするために、発明者らは、トラスツマブのみがSKBR-3細胞生存率に約30％影響を及ぼし、一方遊離クリプトフィシン55はすべての腫瘍細胞株に等しく効果的である、実験条件（濃度範囲、インキュベーション時間）を先に確認した。細胞を黒色壁の96ウェルプレートに蒔き（SKBR-3およびMCF7については1ウェル当たり5000細胞；HCT116については1ウェル当たり2000細胞）、一晩37℃で5％CO2の加湿雰囲気中接着させた。その後、培地を除去し、トラスツマブADC、非コンジュゲート化トラスツマブまたは遊離クリプトフィシン類似体（CRY-55、CRY55-Gly）の濃度を高めて含有する新鮮な培地と交換し、細胞を96時間37℃で5％CO2中インキュベートした。5〜8個の3回繰り返してのデータ点を各実験条件について記録した。インキュベーションの終わりに、Perkin Elmer Wallac 1450 MicroBeta TriLux検出器を用いて発光を測定した。化合物の細胞毒性を、PBS（抗体）または0.1％DMSO（化合物）で処理した細胞と比較して評価した。Kaleidagraphソフトウェアを用いて4パラメータロジスティック方程式に生存率データを合わせることにより、CC50値を計算した。種々の化合物でSK-BR3細胞を処理したときに得られた残存細胞生存率プロットを図1に示す。新規のクリプトフィシン-55-グリシネートADC（図1、下パネル）は、裸のトラスツマブ（図1、右上パネル）よりこのHer2-陽性乳癌腫細胞株に極めて高い細胞毒性効果を示し、これは、クリプトフィシン-55およびクリプトフィシン-55-グリシネート（それぞれ図1、左上および中央上パネル）により示されるものに匹敵する。クリプトフィシン-55およびクリプトフィシン-55-グリシネートと異なり、ADCの細胞毒性効果は、Her2-低MCF7およびHCT116細胞株と比較してHER2-陽性SK-BR3細胞に極めて選択的である（表1）。
【表３】
2018517762.tif 000019
【０１０１】
実施例4
クリプトフィシン-52の製造
【化１５】
2018517762.tif 000020
M = 669.20 g/mol C36H45ClN2O8
クリプトフィシン-52をWeiss C, et al (2012) Beilstein Journal of Organic Chemistry 8:2060-6およびWeiss C, et al (2013) Natural Product Reports 30:924-40により公表された経路にしたがって製造した。
【０１０２】
クリプトフィシン-55の製造
【化１６】
2018517762.tif 000021
M = 705.67 g/mol C36H46Cl2N2O8
クリプトフィシン-52（40 mg；60μmol；1 eq）を高真空で乾燥し、続いて無水DCM（1 mL）に溶解させた。溶液を-50℃に冷却し、HCl（ジオキサン中4 M；74.7μL；0.30 mmol；5 eq）を加えた。2時間撹拌後、溶液を室温（rt）まで昇温し、揮発性物質を減圧下除去した。カラムクロマトグラフィー（SiO2；PE/EtOAc 1：3）によりクリプトフィシン-55（43 mg；60μmol；quant.）を無色の固体として得た。
Rf (PE/EtOAc 1:3) = 0.27;
1H-NMR (600 MHz, クロロホルム-d, TMS) δ [ppm] = 7.41 - 7.34 (m, 5H, uA-CarH); 7.21 (m, 1H, uC-NH); 7.22 (d, 1H, J = 2.2 Hz, uB-C2'H); 7.08 (dd, 1H, J = 8.3/2.1 Hz, uB-C6'H); 6.86 (d, 1H, J = 8.4 Hz, uB-C5'H); 6.78 (ddd, 1H, J = 15.1/10.6/4.4 Hz, uA-CβH); 5.78 (dd, 1H, J = 15.1/1.8 Hz, uA-CαH); 5.52 (d, 1H, J = 7.9 Hz, uB-NH); 5.16 (ddd, 1H, J = 10.6/8.2/2.0 Hz, uA-CδH); 4.93 (dd, 1H, J = 10.2/3.5 Hz, uD-CαH); 4.75 (ddd, 1H, J = 7.9/7.7/5.2 Hz, uB-CαH); 4.65 (d, 1H, J = 9.6 Hz, uA-CηH); 4.01 (dd, 1H, J = 9.7/1.9 Hz, uA-CζH); 3.88 (s, 3H, uB-OCH3); 3.38 (dd, 1H, J = 13.4/8.2 Hz, uC-CHAHBNH); 3.18 (dd, 1H, J = 13.5/3.8 Hz, uC-CHAHBNH); 3.14 (dd, 1H, J = 14.5/5.2 Hz, uB-CβHAHB); 3.06 (dd, 1H, J = 14.4/7.6 Hz, uB-CβHAHB); 2.70 (m, 1H, uA-CγHAHB); 2.49 (m, 1H, uA-CεH); 2.38 (ddd, 1H, J = 14.5/10.9/10.9 Hz, uA-CγHAHB); 1.78 (ddd, 1H, J = 14.0/4.5/4.0 Hz, uD-CβHAHB); 1.72 (m, 1H, uD-CγH); 1.43 (ddd, 1H, J = 14.0/8.7/3.5 Hz, uD-CβHAHB); 1.23 (s, 3H, uC-C(CH3)2); 1.17 (s, 3H, uC-C(CH3)2); 1.04 (d, 3H, J = 6.9 Hz, uA-CεHCH3); 0.93 (d, 3H, J = 1.4 Hz, uD-CδH3); 0.92 (d, 3H, J = 1.2 Hz, uD-CδH3).
【０１０３】
クリプトフィシン-55-グリシネートトリフルオロアセテートの製造
【化１７】
2018517762.tif 000022
M = 875.28 g/mol C40H50Cl3F3N3O11
クリプトフィシン-55-グリシネートトリフルオロアセテートの製造をLiang J, et al (2005) Investigational New Drugs 213-224にしたがって行ったが、合成は、第1反応工程後精製することなくなされた。さらに、生成物をカラムクロマトグラフィーでなくRP-HPLCで精製し、クリプトフィシン-55-グリシネートトリフルオロアセテートの塩を得た。
1H-NMR (500 MHz, クロロホルム-d, TMS) δ [ppm] = 7.37 - 7.32 (m, 3H, uA-CarH); 7.29 (dd, 2H, J = 7.3/2.3 Hz, uA-CarH); 7.22 (m, 1H, uC-NH); 7.20 (d, 1H, J = 2.2 Hz, uB-C2'H); 7.06 (dd, 1H, J = 8.4/2.2 Hz, uB-C6'H); 6.84 (d, 1H, J = 8.5 Hz, uB-C5'H); 6.60 (bs, 1H, uB-NH); 6.53 (ddd, 1H, J = 15.2/10.9/4.2 Hz, uA-CβH); 5.74 (dd, 1H, J = 15.3/1.8 Hz, uA-CαH); 5.45 (dm, 1H, J = 10.1 Hz, uA-CζH); 4.94 (dd, 1H, J = 10.4/2.9 Hz, uD-CαH); 4.85 - 4.79 (m, 2H, uA-CδH/uA-CηH); 4.54 (ddd, 1H, J = 8.1/8.1/5.3 Hz, uB-CαH); 3.87 (s, 3H, uB-OCH3); 3.63 (d, 1H, J = 16.7 Hz, Gly-CHAHB); 3.30 (m, 1H, uC-CβHA); 3.20 (m, 1H, uC-CβHB); 3.16 - 3.06 (m, 2H, Gly-CHAHB/uB-CβHA); 2.91 (dd, 1H, J = 14.5/8.6 Hz, uB-CβHB); 2.64 (m, 1H, uA-CεH); 2.53 (m, 1H, uA-CγHA); 2.22 (m, 1H, uA-CγHB); 1.93 (m, 1H, uD-CβHA); 1.70 (m, 1H, uD-CγH); 1.65 (m, 1H, uD-CβHB); 1.18 (s, 3H, uC-CH3); 1.12 (s, 3H, uC-CH3); 1.00 (d, 3H, J = 7.2 Hz, uA-CεHCH3); 0.98 (d, 3H, J = 6.7 Hz, CH3); 0.93 (d, 3H, J = 6.5 Hz, CH3).
【０１０４】
自壊性リンカーの製造
【化１８】
2018517762.tif 000023
M = 322.39 g/mol C15H30O7
tert-ブチル-15-ヒドロキシ-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエートをSeitz O, et al (1997) Journal of Organic Chemistry 62:813-826で公表された手順にしたがって合成した。
テトラエチレングリコール（40.61 mL；45.64 g；235 mmol）の無水THF（125 mL）中溶液に、ナトリウム片（1/4 cm）を加えた。ナトリウムが完全に反応した後、アクリル酸tert-ブチル（11.98 mL；10.57 g；82.5 mmol）を20分間かけて滴下し、得られた溶液を室温で一晩撹拌した。pHをNaOH溶液（1N）で7〜8に調節し、溶媒を真空中除去した。残渣を飽和NaCl溶液（75 mL）に溶解させ、EtOAc（3 x 100 mL）で抽出した。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒の蒸発後、tert-ブチル-15-ヒドロキシ-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエート（21.87 g；67.8 mmol；82％、アクリル酸tert-ブチルに基づく）を無色の油状物として得た。
1H-NMR (500 MHz, クロロホルム-d, TMS) δ [ppm] = 3.77 - 3.57 (m, 18H; OCH2); 3.01 (bs, 1H, OH); 2.51 (t, 2H, J = 6.6 Hz, CH2COOtBu); 1.45 (s, 9H, C(CH3)3);
13C{1H}-NMR (126 MHz, クロロホルム-d, TMS) δ [ppm] = 171.1 (COO); 80.7 (C(CH3)3); 72.6/70.8/70.7/70.6/70.5/67.0 (OCH2); 61.9 (HOCH2); 36.4 (CH2CO); 28.2 (C(CH3)3).
【０１０５】
【化１９】
2018517762.tif 000024
M = 401.45 g/mol C19H31NO8
tert-ブチル-15-マレイミド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエートをWarnecke A, (2002) Dissertationにしたがって合成した。Ph3P（1.09 g；4.14 mmol；1 eq）を無水THF（25 mL）に溶解さ、得られた溶液を-70℃に冷却した。DIAD（0.8 mL；4.14 mmol；1 eq）を1分間かけて加え、黄色の溶液を5分間-70℃で撹拌した。その後、tert-ブチル-15-ヒドロキシ-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエート（2.0 g；6.20 mmol；1.5 eq）を加え、マレイミド（401 mg；4.14 mmol；1 eq）の添加前に、溶液をさらに5分間撹拌した。5分間-70℃でさらに撹拌後、冷却浴を外し、混合物を室温まで昇温した。撹拌を18時間室温で継続し、その後溶媒を真空中除去し、油状残渣をカラムクロマトグラフィー（SiO2；PE/EtOAc 1：3）により精製した。tert-ブチル-15-マレイミド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエート（0.61 g；1.51 mmol；36％）を無色の油状物として得た。
Rf (PE/EtOAc 1:3) = 0.27;
Rf (PE/EtOAc 1:1) = 0.19;
1H-NMR (500 MHz, クロロホルム-d, TMS) δ [ppm] = 6.70 (s, 2H, CH=CH); 3.71 (m, 4H, CH2); 3.66 - 3.53 (m, 14H, CH2); 2.49 (t, 2H, J = 6.6 Hz, CH2COOtBu); 1.44 (s, 9H, C(CH3)3);
13C{1H}-NMR (126 MHz, クロロホルム-d, TMS) δ [ppm] = 171.0 (CH2COOtBu); 170.8 (COCH=CHCO); 134.3 (CH=CH); 80.6 (C(CH3)3); 70.8/70.73/70.70/70.65/70.5/70.2/68.0/67.1 (OCH2); 37.3 (NCH2); 36.4 (CH2COOtBu); 28.3 (C(CH3)3).
【０１０６】
【化２０】
2018517762.tif 000025
M = 345.35 g/mol C15H23NO8
15-マレイミド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸をWarnecke A, (2002) Dissertationにしたがって製造した。tert-ブチル-15-マレイミド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエート（1.74 g；4.33 mmol）を無水DCM（8 mL）に溶解させ、TFA（8 mL）を加えた。溶液を室温で1時間撹拌した。次に揮発性化合物を真空中除去し、残渣を再びDCM（20 mL）に溶解させた。Amberlyst A-21（6 g）を溶液に加え、すべてを1時間室温で撹拌した。次に固体をろ別し、ろ液を濃縮乾固した。15-マレイミド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸（1.46 g；4.23 mmol；98％）を暗黄色の油状物として得た。
1H-NMR (500 MHz, クロロホルム-d, TMS) δ [ppm] = 9.38 (bs, 1H, COOH); 6.71 (s, 2H, CH=CH); 3.75 (dt, 4H, J = 21.6/5.8 Hz, NCH2/CH2); 3.68 - 3.58 (m, 14H, CH2); 2.63 (t, 2H, J = 6.1 Hz, CH2COOH).
【０１０７】
【化２１】
2018517762.tif 000026
M = 755.81 g/mol C33H53N7O13
マレイミド-PEG-Val-Cit-Pro-Glyを標準的なFmoc SPPS [Fields G and Noble R L, (2009) International Journal of Peptide and Protein Research 33,3:161-214]にしたがって合成した。
詳細は次の表を参照。
【表４】
2018517762.tif 000027
【０１０８】
レジンから切断後、残渣をRP-HPLCにより精製し、マレイミド-PEG-Val-Cit-Pro-Gly（0.61 g；0.81 mmol；70％）を無色の凍結乾燥物として得た。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm] = 12.24 (bs, 1H, COOH); 8.10 (dd, 1H, J = 6.1/5.8 Hz, Gly-NH); 8.06 (d, 1H, J = 7.3 Hz, Cit-NHCO); 7.81 (d, 1H, J = 8.9 Hz, Val-NHCO); 7.02 (s, 2H, CH マレイミド); 6.02 (bm, 1H, Cit-NH); 4.43 (dd, 1H, J = 13.4/7.5 Hz, Cit-CαH); 4.31 (dd, 1H, J = 8.3/3.9 Hz, Pro-CαH); 4.20 (dd, 1H, J = 8.8/6.7 Hz, Val-CαH); 3.78 (dd, 1H, J = 17.5/6.1 Hz, Gly-CHA); 3.69 (m, 1H, Pro-CγHA); 3.68 (dd, 1H, J = 17.5/5.8 Hz, Gly-CHB); 3.62 - 3.53 (m, 5H, PEG-CH2 /Pro-CγHB); 3.53 - 3.41 (m, 16H, PEG-CH2); 3.00 - 2.90 (m, 2H, Cit-CH2NH); 2.45 (m, 1H, PEG-CHAHBCONH); 2.34 (m, 1H, PEG-CHAHBCONH); 2.01 (m, 1H, Pro-CβHA); 1.97 - 1.87 (m, 2H, Val-CβH/Pro-CδHA); 1.87 - 1.79 (m, 2H, Pro-CβHB/Pro-CγHB); 1.67 (m, 1H, Cit-CβHA); 1.49 (m, 1H, Cit-CβHB); 1.44 - 1.36 (m, 2H, Cit-CγH2); 0.81 (d, 3H, J = 6.8 Hz, Val-CH3); 0.79 (d, 3H, J = 6.8 Hz, Val-CH3);
13C{1H}-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ [ppm] = 172.0 (Pro-CO); 171.3 (COOH); 171.0 (Val-CO); 170.9 (マレイミド-CO); 170.1 (Cit-CONH); 170.0 (PEG-CONH); 158.9 (Cit-CONH2); 134.6 (マレイミド-CH); 69.8/69.77/69.72/69.66/69.5/69.4/67.0 (PEG-CH2); 59.3 (Pro-Cα); 57.1 (Val-Cα); 50.2 (Cit-Cα); 46.8 (Pro-Cγ); 40.6 (Gly-CH2); 30.7 (Val-Cβ); 29.2 (Pro-Cβ); 28.3 (Cit-Cβ); 26.1 (Cit-Cγ); 24.4 (Pro-Cδ); 19.2 (Val-Cγ); 18.1 (Val-Cγ);
HRMS (ESI-FT-ICR):
測定[m/z] = 778.35962 [C33H53N7O13+Na]+
計算[m/z] = 778.35936 [C33H53N7O13+Na]+.
【０１０９】
マレイミドコンジュゲーションのためのクリプトフィシン-55-グリシネートペプチド
【化２２】
2018517762.tif 000028
M = 1500.51 g/mol C71H100Cl2N10O21
クリプトフィシン-55-グリシネートトリフルオロアセテート（10 mg；13.1μmol；1 eq）およびマレイミド-PEG-Val-Cit-Pro-Gly（29.7 mg；39.3μmol；3 eq）を無水DMF（0.5 mL）に溶解させた。DIPEA（10μL；52.4μmol；4 eq）、TBTU（12.6 mg；39.3μmol；3 eq）およびHOBt・H2O（5.3 mg；39.3μmol；3 eq）の無水DMF（0.5 mL）中溶液をゆっくり加えた。一晩室温で撹拌後、再びDIPEA、TBTUおよびHOBt・H2O（上記と同量）を加えた。それを再びさらに2時間を撹拌し、その後反応溶液を直接RP-HPLCにより精製した。マレイミド-PEG-Val-Cit-Pro-Gly-クリプトフィシン-55-グリシネート（11.8 mg；8μmol；60％）を無色の凍結乾燥物として得た。
HRMS (ESI-FT-ICR):
測定[m/z] = 1521.63460 [C71H100Cl2N10O21+Na]+
計算[m/z] = 1521.63338 [C71H100Cl2N10O21+Na]+.
【０１１０】
実施例5
クリプトフィシン55-オクトレオチドコンジュゲートの合成：
4-ペンチノイル-オクトレオチド（1）：
【化２３】
2018517762.tif 000029
オクトレオチドの線状前駆体をTailhades et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2010, 49, 117により以前に記載されたように製造した。Fmoc-D-Phe-OHカップリング後、Fmoc基をピペリジン/DMF（3：7、2 + 10分間）で除去し、続いてDMF（6 x 1分間）およびCH2Cl2（1 x 1分間）で洗浄した。4-ペンチン酸（4 eq.）をOxyma（4 eq.）およびDIC（4 eq.）の存在下で、撹拌下室温で4時間カップリングさせた。次に、レジンをDMF（6 x 1分間）、CH2Cl2（1 x 1分間）で洗浄し、Et2Oで乾燥した。レジンをTFA/PhOH/H2O/TIS（88：5：5：2）で2時間室温にて切断した。TFAの蒸発および冷Et2Oでの沈殿後、ペプチドをH2O/CH3CNに溶解させ、凍結乾燥した。粗ペプチドをリン酸緩衝液（pH = 7.4、100 mM、ペプチド1 mg当たり2 mL）に溶解させ、混合物を室温で48時間撹拌した。ペプチドをRP-HPLC（下記の方法1）により精製し、凍結乾燥した。
HPLC: tR = 5.02分 (下記の方法A)
MALDI-ToF MS: 1099.5 [M+H]+, 1121.6 [M+Na]+, 1137.5 [M+K]+
【０１１１】
PEGスペーサー（2および3）：
【化２４】
2018517762.tif 000030
（2）
tert-ブチル15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエートをOsswald B., (2015) Dissertation（https://pub.uni-bielefeld.de/publication/2733900）にしたがって合成した。
tert-ブチル-15-ヒドロキシ-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエート（1.50 g；4.65 mmol；1 eq）を無水THF（10 mL）に溶解させ、得られた溶液を0℃に冷却した。メタンスルホニルクロリド（0.54 mL；6.98 mmol；1.5 eq）およびトリエチルアミン（0.97 mL；6.98 mmol；1.5 eq）を滴下し、溶液を30分間0℃で撹拌し、その後一晩室温で撹拌した。NaHCO3（0.27 g；3.20 mmol；0.7 eq）およびNaN3（0.45 g；6.98 mmol；1.5 eq）を蒸留水（10.5 mL）と共に混合物に加え、得られた溶液を20分間室温で撹拌した。THFを真空中除去し、残りの溶液を80℃で4時間撹拌した。冷却後、混合物をDCM（3 x 30 mL）で抽出し、合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた。黄色がかった油状残渣をカラムクロマトグラフィー（SiO2；PE/EtOAc 1：1）により精製した。tert-ブチル15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエート（0.74 g；2.12 mmol；46％）を無色の油状物として得た。
Rf (PE/EtOAc 1:3) = 0.69
Rf (PE/EtOAc 1:1) = 0.4
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm] = 1.44 (s, 9H, C(CH3)3), 2.50 (t, 2H, J = 6.6 Hz, CH2COOtBu), 3.39 (t, 2H, J = 5.1 Hz, CH2N3), 3.57-3.74 (m, 16H).
【０１１２】
【化２５】
2018517762.tif 000031
（3）
15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸をWarnecke A, (2002) Dissertationにしたがって製造した。
tert-ブチル15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカノエート（0.22 g；0.63 mmol）を無水DCM（5 mL）に溶解させ、TFA（5 mL）を加えた。溶液を室温で1.5時間撹拌した。次に、揮発性化合物を真空中除去し、残渣をジエチルエーテル（10 mL）に溶解させ、溶媒を蒸発させた（2回繰り返した）。溶液を濃縮乾固した。15-アジド4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸（0.18 g；0.62 mmol；98％）を無色の油状物として得た。
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm] = 2.63 (t, 2H, J = 6.2 Hz, CH2COOH), 3.39 (t, 2H, J = 5.1 Hz, CH2N3), 3.58-3.71 (m, 14H), 3.76 (t, 2H, J = 6.2 Hz, CH2CH2COOH).
【０１１３】
自壊性リンカー（4）：
【化２６】
2018517762.tif 000032
（4）
アジド-TEG-Val-Cit-Gly-Pro-OH（4）を標準的なFmoc SPPSにしたがって合成した。詳細は次の表を参照。
【表５】
2018517762.tif 000033
【０１１４】
レジンからの切断後、残渣をRP-HPLCにより精製し、アジド-TEG-Val-Cit-Gly-Pro-OH（0.05 g；0.07 mmol；70％）を無色の凍結乾燥物として得た。
MALDI-ToF MS: 702.3 [M+H]+, 724.3 [M+Na]+
【０１１５】
アジド-TEG-Val-Cit-Gly-Pro-Gly-クリプトフィシン-55（5）：
【化２７】
2018517762.tif 000034
（5）
クリプトフィシン-55-グリシネートトリフルオロアセテート（5 mg；5.7μmol；1 eq）およびアジド-TEG-Val-Cit-Gly-Pro-OH（16.0 mg；22.8μmol；4 eq）を無水DMF（0.5 mL）に溶解させた。DIPEA（5.0μL；34.2μmol；6 eq）、PyBOP（11.9 mg；22.8μmol；4 eq）およびHOBt・H2O（3.5 mg；22.8μmol；4 eq）の無水DMF（0.5 mL）中溶液をゆっくり加えた。反応混合物を室温で3.5時間撹拌し、その後溶液を直接RP-HPLCにより精製した。アジド-TEG-Val-Cit-Gly-Pro-クリプトフィシン-55-グリシネート（6.2 mg；4.3μmol；75％）を無色の凍結乾燥物として得た。
HPLC: tR = 7.06分 (方法A)
MALDI-ToF MS: 1467.6 [M+Na]+
【０１１６】
クリプトフィシン-55-オクトレオチドコンジュゲート（6）：
【化２８】
2018517762.tif 000035
（6）
アジド官能化クリプトフィシン（5）（1.5 mg、1.04μmol、1.0 eq）および4-ペンチノイル-オクトレオチド（1）（1.14 mg、1.04μmol、1.0 eq）の混合物をtBuOH/H2O（1 mL、2：1 v/v）に溶解させた。銅粉末（2.0 mg）を加え、混合物を室温で48時間撹拌した。その後、反応混合物をH2O/ACN（5 mL、1：1 v/v）で希釈し、セライト（登録商標）によりろ過した。ろ液を凍結乾燥し、続いてRP-HPLCにより精製した。クリプトフィシン-55-オクトレオチドコンジュゲート（6）を白色固体として得た（0.55 mg、16％収率）。
HPLC: tR = 6.79分 (方法A)
ESI-MS (m/z): 2546.6 [M+H]+, 1273.7 [M+2H]2+, 1284.7 [M+H+Na]2+, 1292.7 [M+H+K]2+, 862.1 [M+2H+K]+ 
HRMS: C121H170Cl2N22O30S2 [M+2H]2+の計算値1272.56304; 測定値1272.56468
C121H170Cl2N22O30S2Na [M+2H+Na]3+の計算値856.03843; 測定値856.03890
【０１１７】
分析用HPLC：
分析用HPLCを、PHENOMENEX Jupiter C18カラム（直径4.6mm (ID) × 250mm、粒径5μm）を備えた、THERMO SEPARATION PRODUCTS HPLCユニット（コントローラーSN 4000、ポンプP 4000、オートサンプラーAS 100、検出器UV 6000 LP、測定したUV-吸収λ = 274 nm）で行った。次の溶離液を用いた：
溶離液A：H2O/CH3CN/TFA 95：5：0.1
溶離液B：H2O/CH3CN/TFA 5：95：01
方法A：
2018517762.tif 000036
【０１１８】
分取HPLC：
分取RP-HPL-クロマトグラフィーを、Macherey-nagel C18-カラム（直径10mm (ID) × 250mm、粒径7μm）を備えた、MERCK-HITACHIユニット（コントローラー：D-7000、ポンプ：L7150、検出器：L7420、測定したUV-吸収 λ = 220 nm）で行った。
方法1（分析用HPLCの溶離液AおよびB）：
2018517762.tif 000037
【０１１９】
ESI-MS：
ESI/APCIマススペクトルを、標準ESI/APCI源を備えたEsquire 3000イオントラップ質量分光計（Bruker Daltonik GmbH、Bremen、Germany）を用いて記録した。試料をシリンジポンプでの直接注入により導入した。窒素は、ネブライザーガスおよび乾燥ガスの両方としての機能を果たした。窒素をBruker窒素発生器NGM 11により発生させた。ここに示されているスペクトルは、いくつかのシングルスペクトルの累積および平均化により、Bruker Daltonik esquireNT 5.2 esquireControlソフトフェアで記録される（引用されるようになされる）。DataAnalysisTMソフトウェア3.4をスペクトル処理に用いた。
【０１２０】
HRMS：
正確なESIマススペクトルをThermo-Fisher-Scientific Orbitrap LTQ XLで記録した。
【０１２１】
実施例6
クリプトフィシン55-オクトレオチドコンジュゲートの合成：
実施例5を、次の自壊性リンカーを用いる以外繰り返した：
【化２９】
2018517762.tif 000038
【０１２２】
実施例7
RNA精製および定量的RT-PCR
腫瘍細胞株（ラット膵臓腫瘍細胞株AR42Jおよびヒト乳癌腫細胞株MCF7）をAmerican Type Culture Collectionから得て、標準的なプロトコールにしたがって増殖させた。
【０１２３】
DNAse I treatment（Qiagen）を含むRNeasy Mini Kit（Qiagen、Germantown、MD）を用い、製造業者の推奨にしたがって細胞から全RNAを抽出した。ワンステップRT-PCR反応を96ウェル光学プレートに組立てた。定量的RT-PCRを3回繰り返して次のように行った。25μLの2X Master Mix、0.5μLの100X RT（QuantiTect Probe RT-PCR Kit、Qiagen）、および2.5μLの次のqPCRアッセイの各々（Applied Biosystems/Thermofisher）：ラットSSTR2（Rn01464950_g1）、ヒトSSTR2（Hs00265624_s1）、ラットGAPDH（Rn01775763_g1）およびヒトGAPDH（Hs04420632_g1）を含む、40μLの反応混合物を調製した。その後、3 ng/μLの濃度の全RNA10μLを50μLの最終反応容量で加え、ABI 7900 HTリアルタイムサーマルサイクラー（Perkin Elmer）を用いて定量的RT-PCRを行った（50℃で30分間、95℃で10分間、続いて：95℃で15秒間、60℃で1分間を40サイクル）。GAPDH標準化mRNA発現値に対する2^（-ΔΔc-t）法を用いて定量的計算を行った。RT-qPCR結果について、MCF7細胞におけるSSTR2発現レベルは、AR42J細胞において測定した値（100％と設定する）に対応するパーセンテージとして表される。RT-qPCR結果は、AR42J細胞は比較的高いレベルのSSTR2 mRNAを発現し、一方MCF7細胞発現レベルでは極めて低い（およそ0.6％）ことを示した。
【０１２４】
実施例8
細胞生存率アッセイ
実施例5に記載のクリプトフィシン-55-グリシネート-オクトレオチドコンジュゲートの腫瘍細胞株AR42J（STTR2high）およびMCF7（SSTR2low）の生存率への影響を、CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Promega）を用い製造業者プロトコールにしたがって評価した。細胞を黒色壁の96ウェルプレートに蒔き（1ウェル当たり5000細胞）、一晩37℃で5％CO2の加湿雰囲気中接着させた。その後、培地を除去し、クリプトフィシン-55-グリシネート-オクトレオチドコンジュゲート（CRY55-Gly-Oct）、非コンジュゲート化オクトレオチドまたは遊離クリプトフィシン-55-グリシネート（CRY55-Gly）の濃度を高めて含有する新鮮な培地と交換し、細胞を120時間37℃で5％CO2中インキュベートした。9個の3回繰り返しての1：3段階希釈データ点を各実験条件について記録した（CRY55-GlyおよびCRY55-Gly-Octについては0.0015 nM〜10 nM、非コンジュゲート化オクトレオチドについては0.0015μM〜10μM）。インキュベーションの終わりに、Perkin Elmer Wallac 1450 MicroBeta TriLux検出器を用いて発光を測定した。化合物の細胞毒性を、0.1％DMSOで処理した細胞と比較して評価した。Kaleidagraphソフトウェアを用いて4パラメータロジスティック方程式に生存率データを合わせることにより、IC50値を計算した。種々の化合物でAR42JおよびMCF7細胞を処理したときに得られる残存細胞生存率プロットを図3および図4にそれぞれ示す。STTR2high AR42J腫瘍細胞株において、新規のクリプトフィシン-55-グリシネート-オクトレオチドコンジュゲート（図3、左上パネル）は、裸のオクトレオチド（図3、下パネル）より極めて高い細胞毒性効果を示し、クリプトフィシン-55-グリシネート化合物（図3、右上パネル）により示されるものと極めて同様のIC50値（0.9 nM）を有する。MCF7において、非コンジュゲート化オクトレオチドは、予想通り完全に効果がない（図4、下パネル）。AR42J細胞において観察されるものと異なり、55-グリシネート-オクトレオチドコンジュゲート（図4、左上パネル）は、MCF7細胞生存率を抑制し、クリプトフィシン-55-グリシネート化合物（図4、右上パネル）で測定されるものより著しく低いIC50（90倍）を有する。また、クリプトフィシン-55-グリシネート化合物は、同様の効果を有して2つの細胞株生存率を抑制するが（図3および図4、右上パネルを比較）、コンジュゲート化オクトレオチドの細胞毒性効果は、SSTR2low MCF7細胞と比較してSTTR2high AR42J細胞に極めて選択的であり（図4および図3、左上パネルを比較）、それぞれ0.9 nMおよび27 nMのIC50値を有する。2つの試験した細胞株のすべての化合物についてのIC50値を表に要約する。
【表６】
2018517762.tif 000039
【０１２５】
実施例9
多剤耐性腫瘍細胞株におけるクリプトフィシン-55-グリシネートおよびクリプトフィシン-55-グリシネート薬物-リンカー分子の活性
H69細胞および薬物耐性対応物H69ARをAmerican Type Culture Collectionから得て、標準的なプロトコールにしたがって増殖させた。クリプトフィシンおよびクリプトフィシンコンジュゲートの野生型および薬物耐性腫瘍細胞株の生存率への影響を、CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Promega）を用い製造業者プロトコールにしたがって評価した。細胞を黒色壁の96ウェルプレートに蒔き（1ウェル当たり5000細胞）、一晩37℃で5％CO2の加湿雰囲気中接着させた。その後、培地を除去し、クリプトフィシン類似体またはコントロールとしてのドキソルビシンの濃度を高めて含有する新鮮な培地と交換した。細胞を化合物と120時間37℃で5％CO2中インキュベートした。8個の3回繰り返しての1：3段階希釈データ点を各実験条件について記録した（CRY55-Gly、CRY55-Gly-リンカー73およびCRY55-Gly-リンカー76については0.05 nM〜10 nM、ドキソルビシンについては1.2 nM〜2700 nM）。インキュベーションの終わりに、Perkin Elmer Wallac 1450 MicroBeta TriLux検出器を用いて発光を測定した。化合物の細胞毒性を、0.1％DMSOで処理した細胞と比較して評価した。
【０１２６】
次の表および図5に示されるように、クリプトフィシンまたはクリプトフィシン薬物リンカーは、野生型および薬物耐性細胞において同様の細胞毒性を示し、一方、コントロールとして用いたドキソルビシンは、選択的に野生型細胞の細胞生存率に影響を及ぼし、薬物耐性H69AR細胞株に対してわずかな影響しか及ぼさなかった。
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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