(57)【要約】遺伝子操作された細菌、その医薬組成物、および高フェニルアラニン血症に関連する疾患をモジュレートおよび治療する方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする１つまたは複数の遺伝子であって、天然ではＰＡＬ遺伝子に付随していない、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している遺伝子と、
ｂ）フェニルアラニントランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子であって、天然ではフェニルアラニントランスポーター遺伝子に付随していない、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している遺伝子と
を含む、遺伝子操作された細菌。
【請求項２】
Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つまたは複数の遺伝子であって、天然ではＬＡＡＤ遺伝子に付随していない、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項３】
ＰＡＬをコードする前記遺伝子に作動可能に連結している前記プロモーターおよびフェニルアラニントランスポーターをコードする前記遺伝子に作動可能に連結している前記プロモーターが、同じプロモーターの別々のコピーである、請求項１または請求項２に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項４】
ＰＡＬをコードする前記遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコードする前記遺伝子が、同じプロモーターの同じコピーに作動可能に連結している、請求項１または請求項２に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項５】
ＬＡＡＤをコードする前記遺伝子が、ＰＡＬをコードする前記遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコードする前記遺伝子のプロモーターとは異なるプロモーターに作動可能に連結している、請求項２〜４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項６】
ＰＡＬをコードする前記遺伝子、フェニルアラニントランスポーターをコードする前記遺伝子、およびＬＡＡＤをコードする前記遺伝子に作動可能に連結している前記プロモーター（複数可）が、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項７】
ＰＡＬをコードする前記遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコードする前記遺伝子に作動可能に連結している前記プロモーター（複数可）が、哺乳動物の小腸に見出される外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項８】
ＰＡＬをコードする前記遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコードする前記遺伝子に作動可能に連結している前記プロモーター（複数可）が、低酸素または嫌気的条件下で直接的または間接的に誘導される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項９】
ＰＡＬをコードする前記遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコードする前記遺伝子に作動可能に連結している前記プロモーター（複数可）が、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーター、およびＤＮＲ応答性プロモーターからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１０】
ＰＡＬをコードする前記遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコードする前記遺伝子が、同じプロモーターの同じコピーに作動可能に連結している、請求項５〜９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１１】
ＬＡＡＤをコードする前記遺伝子が、哺乳動物の消化管に天然に存在する環境要因によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下にある、請求項２〜９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１２】
ＬＡＡＤをコードする前記遺伝子が、哺乳動物の消化管に天然には存在しない環境要因によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下にある、請求項２〜９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１３】
フェニルアラニントランスポーターをコードする前記遺伝子が、前記細菌における染色体上に位置する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１４】
フェニルアラニントランスポーターをコードする前記遺伝子が、前記細菌におけるプラスミド上に位置する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１５】
ＰＡＬをコードする前記遺伝子が、前記細菌におけるプラスミド上に位置する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１６】
ＰＡＬをコードする前記遺伝子が、前記細菌における染色体上に位置する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１７】
前記ＰＡＬが、アナベナ・バリアビリス由来（ＰＡＬ１）またはフォトラブダス・ルミネセンス由来（ＰＡＬ３）である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１８】
前記フェニルアラニントランスポーターがＰｈｅＰである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１９】
前記操作された細菌が、ＰＡＬをコードする遺伝子の１〜５個のコピー、フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子の１〜５個のコピー、および任意選択でＬＡＡＤをコードする遺伝子の１〜５個のコピーを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項２０】
前記細菌がプロバイオティクス細菌である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項２１】
前記細菌が、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、エシェリキア属、ラクトバチルス属、およびラクトコッカス属からなる群から選択される、請求項２０に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項２２】
前記細菌が、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅである、請求項２１に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項２３】
前記細菌が、前記細菌が哺乳動物の消化管に存在する場合に相補される遺伝子の栄養要求株である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項２４】
哺乳動物の消化管がヒトの消化管である、請求項２３に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項２５】
前記細菌が、ジアミノピメリン酸またはチミジン生合成経路における酵素の栄養要求株である、請求項２３または２４に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項２６】
前記細菌が、前記細菌に対して有毒な物質をコードする遺伝子を保有するようにさらに操作され、前記遺伝子が、哺乳動物の消化管に天然には存在しない環境要因によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下にある、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細菌、および薬学的に許容される担体を含む薬学的に許容される組成物。
【請求項２８】
経口投与用に製剤化された、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
高フェニルアラニン血症を低減させるか、または高フェニルアラニン血症に関連する疾患を治療する方法であって、請求項２７または２８に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
前記疾患が、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、瀬川病、および肝疾患からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１６１，１３７号、および２０１５年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５６，０５２号に対する優先権の利益を主張し、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、高フェニルアラニン血症（Ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉａ）を低減させるための組成物および治療方法に関する。特定の態様では、本開示は、哺乳動物における高フェニルアラニン血症を低減させることができる遺伝子操作された細菌に関する。特定の態様では、本明細書に開示される組成物および方法は、高フェニルアラニン血症、例えばフェニルケトン尿症に関連する疾患を治療するために使用され得る。
【０００３】
フェニルアラニンは、食品タンパク質において主に見出される必須アミノ酸である。典型的に、少量がタンパク質合成のために利用され、残りは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）および補因子テトラヒドロビオプテリンを必要とする酵素経路においてチロシンにヒドロキシル化される。高フェニルアラニン血症は、有毒であり、脳障害を引き起こす可能性がある、過剰なレベルのフェニルアラニンに関連する疾患の群である。原発性高フェニルアラニン血症は、ＰＡＨ遺伝子の突然変異および／または補因子代謝の遮断によって生じるＰＡＨ活性の欠損によって引き起こされる。
【０００４】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、ＰＡＨ遺伝子の突然変異によって引き起こされる高フェニルアラニン血症の重症型である。ＰＫＵは、世界中で最も一般的な先天性代謝異常（３，０００人の出生のうちで１人）として位置付けられている常染色体性劣性遺伝病であり、米国において約１３，０００人の患者に影響を及ぼしている。４００超の異なるＰＡＨ遺伝子突然変異が同定されている（Ｈｏｅｋｓら、２００９年）。現在のＰＫＵ療法は、タンパク質制限からなる大幅に変更された食事を必要とする。一般的に、出生時からの治療により、脳障害および精神遅滞は低減する（Ｈｏｅｋｓら、２００９年；Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）。しかしながら、タンパク質制限食は注意深くモニターされなければならず、必須アミノ酸およびビタミンが食事中に補われなければならない。さらに、低タンパク質食品を利用することは、それらが、変更されていない対応物であるそれらの高タンパク質よりコストがかかるので課題がある（Ｖｏｃｋｌｅｙら、２０１４年）。
【０００５】
ＰＫＵを有する小児において、低フェニルアラニン食を続けることで成長遅延が一般的である（Ｄｏｂｂｅｌａｅｒｅら、２００３年）。成人において、骨粗鬆症、母性ＰＫＵ、およびビタミン欠乏症などの新たな問題が発生する場合がある（Ｈｏｅｋｓら、２００９年）。血液脳関門を自由に通過することができる血液中の過剰なレベルのフェニルアラニンは、神経学的障害、行動障害（例えば、過敏症、疲労）、および／または身体症状（例えば、痙攣、皮膚発疹、カビ臭物体）の原因となる可能性もある。国際的ガイドラインは生涯にわたる食事によるフェニルアラニン制限を推奨しているが、これは困難であり、非現実的であると広範に見なされており（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）、「ＰＫＵを伴う生活に対して最大の課題を克服するために継続的な努力−生涯にわたる低ｐｈｅ食の遵守が必要とされる」（Ｍａｃｌｅｏｄら、２０１０年）。
【０００６】
残留ＰＡＨ活性を有する患者のサブセットにおいて、補因子テトラヒドロビオプテリン（ＴＨＢ、ＢＨ４、Ｋｕｖａｎ、またはサプロプテリンとも称される）の経口投与が、血中フェニルアラニンレベルを低下させるために食事制限と一緒に使用され得る。しかしながら、補因子療法はコストがかかり、フェニルケトン尿症の軽症型に適しているだけである。Ｋｕｖａｎの年間コストは、例えば、患者１人当たり５７，０００ドルほどの高さになる場合がある。さらに、Ｋｕｖａｎの副作用には、胃炎および重度のアレルギー反応（例えば、喘鳴、立ちくらみ、吐き気、皮膚の潮紅）が含まれ得る。
【０００７】
酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）は、フェニルアラニンを無毒なレベルのアンモニアおよびｔｒａｎｓケイ皮酸に代謝することができる。ＰＡＨと異なり、ＰＡＬは、フェニルアラニンを代謝するためにＴＨＢ補因子活性を必要としない。ＰＡＬを使用した経口酵素療法の研究が行われているが、「ＰＡＬは手頃なコストにて十分な量で利用できないので、ヒトおよび動物でさえも研究は継続されなかった」（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）。組換えＰＡＬ（ＰＥＧ−ＰＡＬ）のペグ化形態もまた、注射可能な治療形態として開発中である。しかしながら、ＰＥＧ−ＰＡＬを投与されたほとんどの対象は、注射部位反応に悩まされ、および／またはこの治療用酵素に対する抗体が発生した（Ｌｏｎｇｏら、２０１４年）。したがって、ＰＫＵを含む、高フェニルアラニン血症に関連する疾患のための、効果があり、信頼性があり、および／または長期間の治療に対する重要で満たされていない必要性が存在している。
【０００８】
Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）は、フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化を触媒して、フェニルピルベート、ならびに微量のアンモニアおよび過酸化水素を生成する。フェニルピルビン酸（ＰＰＡ）は、医薬品、食品、および化学工業において広範に使用されており、ＰＰＡは、多くのキラル薬および食品添加物の製造における未加工の中間体であるＤ−フェニルアラニンを合成するための出発物質である。したがって、ＬＡＡＤは工業的ＰＰＡ産生の観点から研究されている（Ｈｏｕら、２０１５年、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５年１０月；９９（２０）：８３９１〜４０２頁；「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」）。フェニルピルベートは、血液脳関門を横切ることができず（Ｓｔｅｅｌｅ、Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ．１９８６年６月；４５（７）：２０６０〜４頁；「Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．」、この変換はＰＫＵの神経学的表現型を制御する際に有用であることを示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｏｕら、２０１５年、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５年１０月；９９（２０）：８３９１〜４０２頁；「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」
【非特許文献２】Ｓｔｅｅｌｅ、Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ．１９８６年６月；４５（７）：２０６０〜４頁；「Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．
【発明の概要】
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）をコードし、発現する遺伝子操作された細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼおよび／またはフェニルアラニンヒドロキシラーゼおよび／またはＬ−アミノ酸デアミナーゼをコードし、発現し、高フェニルアラニン血症を低減させることができる遺伝子操作された細菌を提供する。
【００１１】
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は非病原性であり、フェニルアラニンの毒性レベルを低減させるために消化管に導入され得る。特定の実施形態では、フェニルアラニンアンモニアリアーゼおよび／もしくはフェニルアラニンヒドロキシラーゼおよび／もしくはＬ−アミノ酸デアミナーゼは、遺伝子操作された細菌によって安定に産生され、ならびに／または遺伝子操作された細菌はｉｎ  ｖｉｖｏおよび／もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定に維持される。特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニンのそれらの取り込みを増加させるためにフェニルアラニントランスポーター遺伝子をさらに含む。本発明はまた、遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物、および高フェニルアラニン血症に関連する障害をモジュレートし、治療する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）および高フェニルアラニン血症を特徴とする障害を治療するための合成生物を示した図である。
【図２−１】図２Ａ：フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ作用の概略を示した図である。図２Ｂ：フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）作用の概略を示した図である。
【図２−２】図２Ｃ：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）作用の概略を示した図である。図２Ｄ：Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ；例えば、プロテウス・ミラビリス由来）作用の概略を示した図である。
【図３】フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）および高フェニルアラニン血症を特徴とする障害を治療するための合成生物を示した図である。
【図４】フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）および高フェニルアラニン血症を特徴とする障害を治療するための合成生物を示した図である。
【図５】フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）および高フェニルアラニン血症を特徴とする障害を治療するための合成生物を示した図である。
【図６】例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３に含まれるように、高コピープラスミドにＰＡＬ３をコードする遺伝子およびＴｅｔプロモーター配列を含む構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図７】例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０７、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０５、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０６に含まれるように、低コピープラスミドにＰＡＬ３をコードする遺伝子およびＦＮＲプロモーター配列を含む構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図８】例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０１のように、低コピープラスミドにＰＡＬ３をコードする遺伝子およびＴｅｔプロモーター配列を含む構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図９】Ｔｅｔプロモーター配列の制御下のクローニングしたＬＡＡＤ遺伝子およびＴｅｔリプレッサー遺伝子を含む、例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１に含まれる構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図１０】ｐｈｅＰの第２のコピーをＮｉｓｓｌｅ  ｌａｃＺ遺伝子に挿入するために組み換えを使用する、ｐｈｅＰノックイン株の構築物の概略を示した図である。
【図１１】例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０３、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０３に含まれるように、ＰｈｅＰをコードする遺伝子、ＴｅｔＲをコードする遺伝子および染色体挿入のためのｔｅｔプロモーター配列を含む構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図１２Ａ】低コピーのカナマイシン耐性プラスミド（ｐＳＣ１０１複製開始点においてＦＮＲプロモーター配列の制御下にクローニングしたＰＡＬ３遺伝子を含む構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。嫌気的条件下で、ＰＡＬ３はフェニルアラニンを非毒性トランス−ケイ皮酸に分解する。
【図１２Ｂ】ＰｆｎｒＳプロモーターによって駆動され、Ｎｉｓｓｌｅ染色体のｌａｃＺ座に挿入される内在性大腸菌高親和性フェニルアラニントランスポーター、ｐｈｅＰのコピーをさらに示した図である。
【図１３Ａ】本開示の非限定的実施形態の概略を示した図である。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ染色体に組み込まれたフェニルアラニン分解成分を示す。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたプラスミドを含まない細菌株を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるプラスミド接合を防ぐ。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子を多数挿入すると、コピー数の増加および／またはフェニルアラニン分解活性の増大が生じる。いくつかの実施形態では、内在性大腸菌高親和性フェニルアラニントランスポーター、ｐｈｅＰのコピーは、ＰｆｎｒＳプロモーターによって駆動され、ｌａｃＺ座に挿入される。
【図１３Ｂ】本開示の非限定的実施形態の概略を示した図である。本開示の非限定一実施形態の概略図を示し、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ染色体は、ゲノムの４つの異なる挿入部位（ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩおよびｃｅａ）に挿入されたＰｆｎｒＳ−ＰＡＬの４個のコピーおよび異なる挿入部位（ｌａｃＺ）に挿入されたフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１個のコピーを含有するように遺伝子操作される。この実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はＰ．ルミネセンスから得られたＰＡＬ３で、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は大腸菌由来のｐｈｅＰである。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ５１１である。
【図１３Ｃ】本開示の非限定的実施形態の概略を示した図である。本開示の好ましい一実施形態の概略図を示し、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ染色体は染色体の異なる組み込み部位（ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＰ／Ｔ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩおよびｃｅａ）に挿入された酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３）の制御下にＰＡＬの５個のコピー、および染色体の異なる組み込み部位（ｌａｃＺ）に挿入された酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）制御下にフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１個のコピーを含有するように遺伝子操作される。ゲノムはさらに、ｔｈｙＡ遺伝子が除去され、かつ／または無関係の遺伝子に置換されてｔｈｙＡ栄養要求性を含むように、ならびにカナマイシン耐性遺伝子を含むように遺伝子操作される。
【図１４】例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５に含まれるように、ａｒａＣをコードする遺伝子およびプロテウス・ミラビリスのＬＡＡＤをコードする遺伝子および染色体組み込み用の内在性アラビノースオペロンに染色体を挿入するためのアラビノース誘導性プロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）配列を含む非制限的構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図１５Ａ】無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）で誘導され、次にフェニルアラニン４ｍＭ（６６００００ｎｇ／ｍＬ）を補給した培地で増殖させた、低コピー（ＬＣ；ＳＹＮ−ＰＫＵ１０１）もしくは高コピー（ＨＣ；ＳＹＮ−ＰＫＵ１０２）プラスミドのＰＡＬ１または低コピー（ＬＣ；ＳＹＮ−ＰＫＵ２０１）もしくは高コピー（ＨＣ；ＳＹＮ−ＰＫＵ２０２）プラスミドのＰＡＬ３を発現する細菌を含む試料中のフェニルアラニン濃度を示した図である。試料は０時間、４時間および２３時間後に取り出す。フェニルアラニン濃度は質量分析によって判定する。
【図１５Ｂ】誘導して４時間後および２３時間後の試料中のケイ皮酸塩レベルを示す。ＰＡＬ３発現株では、ＰＡＬ３遺伝子は、大腸菌と同じ分類学的亜門の腸内細菌、フォトラブダス・ルミネセンスから得られる。
【図１６Ａ】低コピー（ＬＣ）もしくは高コピー（ＨＣ）プラスミドのＰＡＬ１もしくはＰＡＬ３を発現する細菌か、または染色体に組み込まれたＴｅｔプロモーターによって駆動されるｐｈｅＰの１個のコピーをさらに含む細菌を含む試料におけるフェニルアラニン濃度を示した図である。細菌は、ＡＴＣで誘導し、次に、フェニルアラニン４ｍＭ（６６００００ｎｇ／ｍＬ）を補給した培地でＯＤ６００が２．０になるまで増殖させた。試料は、誘導して０時間後、２時間後および４時間後に取り出し、フェニルアラニン濃度は質量分析によって判定した。特に、さらにｐｈｅＰのコピーを含むと、４時間でフェニルアラニン（４ｍＭ）が分解された。
【図１６Ｂ】誘導して２時間後および４時間後の試料中のケイ皮酸塩レベルを示した図である。いくつかの実施形態では、ケイ皮酸塩は株の活性の代替的バイオマーカーとして使用することができる。ＰｈｅＰが過剰発現すると、遺伝子操作された細菌のフェニルアラニン代謝が改善される。この一連のデータで分析した株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０３、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３である。
【図１７】図１７Ａ：非誘導条件下でのＰＡＬ構築物の非限定的な一実施形態を示した図である。酸素（Ｏ２）による好気的条件下でＦＮＲの二量体化を防ぎ、ＰＡＬおよび／またはｐｈｅＰ遺伝子発現を活性化したことによる、比較的低いＰＡＬおよびＰｈｅＰ産生を示した図である。図１７Ｂ：誘導条件下でのＰＡＬ構築物の非限定的な一実施形態を示した図である。嫌気的条件下で、ＦＮＲが二量体化し、ＦＮＲプロモーターによってＰＡＬおよびｐｈｅＰの発現が誘導されたことによるＰＡＬおよびＰｈｅＰ産生の上方制御を示す（「ＰＡＬ」および「ｐｈｅＰ」上の不規則な曲線）。１つの長方形または長方形群の近くの矢印は、このような遺伝子（複数可）の（矢印の示す方向への）転写の駆動に関与するプロモーターを示す。各長方形の上の矢印は、各遺伝子の発現産物を示す。
【図１８】表３で示したＦＮＲプロモーターの例から選択されたＦＮＲに関与するプロモーター（Ｐｆｎｒ１−５）からｌａｃＺを発現する低コピープラスミドを保有する細菌を含む試料中のβ−ガラクトシダーゼレベルを示した図である。様々なＦＮＲに関与するプロモーターを使用して、様々な発現レベルおよびダイナミックレンジの嫌気性誘導性レポーターのライブラリーを作製した。これらのプロモーターは、強力なリボソーム結合部位を含んだ。細菌培養物は、好気的（＋Ｏ２）または嫌気的（−Ｏ２）条件下で増殖させた。試料を４時間後に取り出し、β−ガラクトシダーゼレベルをベースにしたプロモーター活性は、標準β−ガラクトシダーゼ比色アッセイを実施することによって分析した。
【図１９Ａ】ＦＮＲプロモーターの１例（ＰｆｎｒＳ）の制御下のｌａｃＺ遺伝子の概略を示した図である。ＬａｃＺはβ−ガラクトシダーゼ酵素をコードし、細菌における一般的なレポーター遺伝子である。
【図１９Ｂ】ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の関数としてＦＮＲプロモーター活性を示した図である。低コピーｆｎｒＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子を保有する遺伝子操作された細菌株、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を酸素の存在下または非存在下で増殖させた。標準β−ガラクトシダーゼ比色アッセイの値は、Ｍｉｌｌｅｒ単位（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）で表す。これらのデータは、ｆｎｒＳプロモーターが嫌気的条件下で１時間以内に高レベルの遺伝子発現の駆動を開始することを示唆している。
【図１９Ｃ】酸素の存在下および非存在下の両方における、ｌａｃＺを発現する細菌細胞培養物の経時的な増殖を示した図である。
【図２０Ａ】野生型Ｎｉｓｓｌｅの試料、ＴｅｔプロモーターもしくはＦＮＲプロモーター例からＰＡＬ３を発現する低コピープラスミドを含む細菌またはＴｅｔプロモーターによって駆動され、染色体に組み込まれたｐｈｅＰの１個のコピーをさらに含む細菌の試料において、好気的条件下で産生されるフェニルアラニンレベルを示した図である。試料は、ＡＴＣおよびフェニルアラニン４ｍＭ（６６００００ｎｇ／ｍＬ）を補給した培地でインキュベートした。試料は、０時間後、２時間後、４時間後および２４時間後に取り出した。フェニルアラニン濃度は、質量分析によって判定した。
【図２０Ｂ】野生型Ｎｉｓｓｌｅの試料、ＴｅｔプロモーターもしくはＦＮＲプロモーター例からＰＡＬ３を発現する低コピープラスミドを含む細菌またはＴｅｔプロモーターによって駆動され、染色体に組み込まれたｐｈｅＰの１個のコピーをさらに含む細菌の試料において、嫌気的条件下で産生されるフェニルアラニンレベルを示した図である。試料は、ＡＴＣおよびフェニルアラニン４ｍＭ（６６００００ｎｇ／ｍＬ）を補給した培地でインキュベートした。試料は、０時間後、２時間後、４時間後および２４時間後に取り出した。フェニルアラニン濃度は、質量分析によって判定した。これらのデータは、ＦＮＲに関与するｆｎｒＳプロモーターは、嫌気的条件下でテトラサイクリン誘導性プロモーターのようにＰＡＬ３発現の活性化に有効であることを示唆している。
【図２１】染色体にｐｈｅＰのコピーをさらに挿入した、または挿入しない合成プロバイオティクス株の培養物におけるフェニルアラニン濃度を示した図である。増殖して１．５時間後に、培養物を９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。インキュベートして４時間後に、フェニルアラニン４ｍＭを含有するアッセイ緩衝液に細菌を再懸濁した。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に３時間取り出した。さらにｐｈｅＰのコピーを含む株（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０５；左）のフェニルアラニン分解速度は、ｐｈｅＰのコピーをさらに含まない株（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０８およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０７；右）よりも高かった。
【図２２】染色体の様々な位置に単一のＰＡＬ３挿入を含む株のトランス−ケイ皮酸塩濃度（ＰＡＬ活性）を示した図である。
【図２３】染色体の様々な位置に複数のＰＡＬ３挿入を含む株のトランス−ケイ皮酸塩濃度（ＰＡＬ活性）を示した図である。
【図２４】合成プロバイオティクス株ＳＹＮ−ＰＫＵ５１１の培養物における経時的なフェニルアラニン濃度を示した図である。増殖して２．５時間後に、培養物を９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。フェニルアラニンを含有する培地中で３．５時間誘導した後、全細胞抽出物を３０分毎に３時間にわたって調製し、フェニルアラニンを質量分析によって定量した。ＳＹＮ−ＰＫＵ５１１は、５つの染色体位置に組み込まれた、嫌気的に（ＦＮＲ）制御されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の５個のコピーを含み、ｌａｃＺ座に組み込まれた、嫌気的に制御された高親和性Ｐｈｅトランスポーター（ｐｈｅＰ）をコードする遺伝子を含む。
【図２５Ａ】Ｔｅｔ誘導性プロモーターによって駆動されるＬＡＡＤを有する高コピーｐＵＣ５７−プラスミドを含む合成プロバイオティクス株、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１の培養物におけるフェニルアラニン濃度を示した図であり、細胞は震盪フラスコ中で３７℃で増殖させ、対数期初期にＴＣＡで２時間誘導した。細胞を遠心分離し、フェニルアラニンを含有するアッセイ緩衝液中に再懸濁した。細胞は、様々な細胞濃度および様々な酸素レベルで測定した。細胞は、１４ｍｌ培養試験管内で２５０ｒｐｍで震盪しながら好気的にインキュベートした（１ｍｌ）。微好気的条件では、細胞（１ｍｌ）は１．７ｍｌコニカル管内で震盪せずにインキュベートした。細胞は、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバー内で嫌気的にインキュベートした。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に２時間取り出した。２つの細胞密度を使用した好気的条件下でのフェニルアラニン濃度を示す。ＡおよびＢは、同じ実験条件下で繰り返した。好気的条件での活性は約５０μｍｏｌ／時間／１ｅ９細胞である。
【図２５Ｂ】Ｔｅｔ誘導性プロモーターによって駆動されるＬＡＡＤを有する高コピーｐＵＣ５７−プラスミドを含む合成プロバイオティクス株、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１の培養物におけるフェニルアラニン濃度を示した図であり、細胞は震盪フラスコ中で３７℃で増殖させ、対数期初期にＴＣＡで２時間誘導した。細胞を遠心分離し、フェニルアラニンを含有するアッセイ緩衝液中に再懸濁した。細胞は、様々な細胞濃度および様々な酸素レベルで測定した。細胞は、１４ｍｌ培養試験管内で２５０ｒｐｍで震盪しながら好気的にインキュベートした（１ｍｌ）。微好気的条件では、細胞（１ｍｌ）は１．７ｍｌコニカル管内で震盪せずにインキュベートした。細胞は、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバー内で嫌気的にインキュベートした。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に２時間取り出した。ＡおよびＢは、同じ実験条件下で繰り返した。好気的、微好気的または嫌気的に増殖させた細胞のフェニルアラニン濃度を示す。
【図２６】図２６Ａ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおける給餌前後のフェニルアラニン濃度を示した図である。試験開始時に、ホモ接合体ＢＴＢＲ−Ｐａｈｅｎｕ２マウスにＡＴＣ１００マイクログラム／ｍＬおよび５％スクロースを補給した水を投与した。固形飼料を撤去することによってマウスを一晩（１０時間）絶食させ、フェニルアラニンの基準レベルを決定するために翌朝下顎を出血させて血液試料を収集した。マウスに再度固形飼料を与え、１時間後に細菌（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２または対照Ｎｉｓｓｌｅ）１００マイクロリットル（５×１０９ＣＦＵ）を強制経口投与し、さらに２時間給餌した。血清フェニルアラニン濃度は、強制経口投与の２時間後に判定した。図２６Ｂ：給餌前後の血中フェニルアラニン濃度のパーセント（％）変化を雌または雄の群平均として示した図である（ｐ＜０．０１）。
【図２７Ａ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ（ｎ＝３０）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝３３）、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３（ｎ＝３４）またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝３４）２００μＬを強制経口投与した。フェニルアラニン注射の２時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。これらのデータは、遺伝子操作されたプロバイオティクス株ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３を経口投与すると、モック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較して、マウスの血中フェニルアラニンレベルが有意に低下することを示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００００１）。ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３は、フェニルアラニンの腸管再循環を妨害することができる。
【図２７Ｂ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ（ｎ＝３０）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝３３）またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０３（ｎ＝３４）２００μＬを強制経口投与した。フェニルアラニン注射の４時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。これらのデータは、遺伝子操作されたプロバイオティクス株ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３を経口投与すると、モック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較して、マウスの血中フェニルアラニンレベルが有意に低下することを示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００００１）。ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３は、フェニルアラニンの腸管再循環を妨害することができる。
【図２８】図２８は、ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ（ｎ＝３０）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝３３）、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３（ｎ＝３４）またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝３４）２００μＬを強制経口投与した。フェニルアラニン注射後の血中フェニルアラニン濃度は、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｆｎｒＳ−ＰＡＬを含有する低コピープラスミド）が腸管再循環モデルにおける循環Ｐｈｅレベルの低下において少なくともＳＹＮ−ＰＫＵ３０３（Ｔｅｔ−ＰＡＬを含有する高コピープラスミド）と同じくらい有効であることを示している。
【図２９−１】図２９Ａ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／平均群体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の２時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。これらのデータは、遺伝子操作されたプロバイオティクス株ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を経口投与すると、モック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較して、マウスの血中フェニルアラニンレベルが有意に低下することを示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００００１）。図２９Ｂ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の４時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。これらのデータは、遺伝子操作されたプロバイオティクス株ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を経口投与すると、モック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較して、マウスの血中フェニルアラニンレベルが有意に低下することを示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００００１）。
【図２９−２】図２９Ｃ：図２９Ａで示したデータの散布図を示す。図２９Ｄ：図２９Ｂで示したデータの散布図を示す。
【図３０】図３０Ａ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ（ｎ＝１２）２００μＬ、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）２００μＬまたはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を１００、２００もしくは４００μＬ（各投与群においてｎ＝１２）を強制経口投与した。ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４処置したマウスのモック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較した血中フェニルアラニンレベルの用量依存的減少を示している（＊３０％減少；ｐ＜０．０５）。この実験は、これと同じ計画の８つの研究の１つを表しており、それぞれはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４が腸管再循環フェニルアラニンを妨害することができることを示している。図３０Ｂ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ（ｎ＝１２）２００μＬ、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）２００μＬまたはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を１００、２００もしくは４００μＬ（各投与群においてｎ＝１２）を強制経口投与した。ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４処置したマウスのモック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較した血中フェニルアラニンレベルの用量依存的減少を示している（＊３０％減少；ｐ＜０．０５）。この実験は、これと同じ計画の８つの研究の１つを表しており、それぞれはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４が腸管再循環フェニルアラニンを妨害することができることを示している。
【図３１】図３１Ａ：ＰＫＵ特異的フェニルアラニン代謝物の概略を示した図である。機能的ＰＡＨの非存在下でのフェニルアラニンからフェニルピルビン酸およびフェニル乳酸への変換の概略を示す。これらの代謝物は、実施例２４〜２６に記載したように質量分析によって、またはその他の手段によって検出することができる。図３１Ｂ：ＰＡＬ特異的フェニルアラニン代謝物の概略を示した図である。ＰＡＬ３によるフェニルアラニンからトランス−ケイ皮酸への変換の概略を示しており、これは肝酵素によって馬尿酸にさらに代謝される。これらの代謝物は、実施例２４〜２６に記載したように質量分析によって、またはその他の手段によって検出することができる。
【図３２−１】図３２Ａ：基準に対する血中フェニルアラニン濃度およびフェニルアラニンの濃度を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示し、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４の総代謝活性は８１．２μｍｏｌ／時間と算出され、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１に対する全低下量Δｐｈｅは４５％であった（Ｐ＜０．０５）。図３２Ｂ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。
【図３２−２】図３２Ｃ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルピルビン酸濃度を示す。図３２Ｄ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニル乳酸濃度を示す。
【図３２−３】図３２Ｅ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中ｔ−ケイ皮酸濃度を示す。図３２Ｆ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中馬尿酸濃度を示す。
【図３３−１】図３３Ａ：基準に対する血中フェニルアラニン濃度およびフェニルアラニンの濃度を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示し、ＳＹＮ−ＰＫＵ５１７の総代謝活性は３９．６μｍｏｌ／時間と算出され、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１に対する全低下量Δｐｈｅは１７％であった（Ｐ＜０．０５）。図３３Ｂ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。
【図３３−２】図３３Ｃ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルピルビン酸濃度を示す。図３３Ｄ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニル乳酸濃度を示す。
【図３３−３】図３３Ｅ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後のｔ−ケイ皮酸濃度を示す。図３３Ｆ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中馬尿酸濃度を示す。
【図３４Ａ】基準に対する血中フェニルアラニン濃度およびフェニルアラニンの濃度を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示し、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５の総代謝活性は１３３．２μｍｏｌ／時間と算出され、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１に対する全低下量Δｐｈｅは３０％であった（Ｐ＜０．０５）。
【図３４Ｂ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。
【図３４Ｃ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルピルビン酸濃度を示す。
【図３４Ｄ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニル乳酸濃度を示す。
【図３４Ｅ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後のｔ−ケイ皮酸濃度を示す。
【図３４Ｆ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中馬尿酸濃度を示す。
【図３５】フェニルアラニン、ならびに、活性が増加したＰＡＬ酵素を選択するための標的を絞らないアプローチに有用な２つの毒性類似体、ｐ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンおよびｏ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンを示した図である。Ｐ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンおよびｏ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンはフェニルアラニンの代わりに細胞タンパク質に組み込まれ、細胞死を引き起こす。これらの化合物は、ＰｈｅＰによって容易に取り込まれ、以下に示したようにＰＡＬの基質となることができるので、Ｐｈｅ消費活性が改善した株を同定するための遺伝子選択およびスクリーニングにおいて使用することができる。より効率的なＰＡＬ代謝を可能にする突然変異は、フェニルアラニン類似体の細胞タンパク質への組み込みを妨害することができ、したがって高濃度の類似体の下での増殖を可能にする。
【図３６】大腸菌１９１７Ｎｉｓｓｌｅ染色体内の組み込み部位例のマップを示した図である。これらの部位は、本質的な遺伝子発現を妨害することなく回路成分を染色体に挿入することができる領域を示す。バックスラッシュ（／）を使用して、挿入が分散的にまたは収束的に発現した遺伝子の間に生じることを示す。ｔｈｙＡなどの生合成遺伝子内の挿入は、栄養要求体を作製するために使用することができる。いくつかの実施形態では、個々の回路成分は指示した部位の２つ以上に挿入される。
【図３７】赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を構造的に発現する３つの細菌株を示した図である。株１〜３では、ｒｆｐ遺伝子が細菌染色体内の異なる部位に挿入されており、蛍光の下で様々な程度の明るさを生じる。未改変大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（４株）は蛍光を生じない。
【図３８】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮｉｓｓｌｅの存在を示したグラフである。ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅをマウスに抗生物質で予備治療することなく強制経口投与した。投与後、全部で６匹のマウスの糞便ペレットをモニターして、マウス胃腸管内にまだ存在している投与したＮｉｓｓｌｅの量を判定した。棒は、マウスに投与した細菌の数を表している。線は、毎日糞便試料から回収されたＮｉｓｓｌｅの数を連続して１０日間表している。
【図３９Ａ】ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２培養物中におけるフェニルアラニン濃度を経時的に示した図である。増殖して１．５時間後に、ＡＴＣをＳＹＮ−ＰＫＵ３０２の培養物に添加し、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。誘導して４時間後に、フェニルアラニン４ｍＭを含有し、様々なｐＨ（ｐＨ範囲７．２５〜２．２５）のアッセイ緩衝液に細菌を再懸濁した。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に２時間にわたって取り出した。フェニルアラニン分解速度は、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２におけるアッセイ緩衝液のｐＨが低下するにつれて低下した。
【図３９Ｂ】ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４培養物中におけるフェニルアラニン濃度を経時的に示した図である。増殖して１．５時間後に、ＡＴＣをＳＹＮ−ＰＫＵ３０４の培養物に添加し、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。誘導して４時間後に、フェニルアラニン４ｍＭを含有し、様々なｐＨ（ｐＨ範囲７．２５〜２．２５）のアッセイ緩衝液に細菌を再懸濁した。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に２時間にわたって取り出した。フェニルアラニン分解速度は、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４株におけるアッセイ緩衝液のｐＨが低下するにつれて低下した。
【図４０】多数の作用機構（ＭｏＡ）を含む大腸菌１９１７Ｎｉｓｓｌｅ染色体の概略の１例を示した図である。
【図４１】ＰＡＬ３およびｐｈｅＰ遺伝子がＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）の１例の制御下で同時転写される構築物の１例の遺伝子組成を示した図である。
【図４２】図４２Ａ：Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＦＮＲプロモーターの１例（ＰｆｎｒＳ）に作動可能に連結し、ＰＡＬ３遺伝子が強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。ＯＦＦ方向（３’から５’）にＩｎｔ５部位が隣接したＰＡＬ３遺伝子の概略図を示している。いかなる強力な構成的プロモーター配列も使用することができる。図４２Ｂ：Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＦＮＲプロモーターの１例（ＰｆｎｒＳ）に作動可能に連結し、ＰＡＬ３遺伝子が強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。Ｉｎｔ５遺伝子発現が嫌気的条件下で活性化される場合、ＰＡＬ３のＯＮ方向（５’から３’）へのリコンビナーゼによるフリッピングがＰＡＬ３の産生およびフェニルアラニン代謝を導く。いかなる強力な構成的プロモーター配列も使用することができる。
【図４３】図４３Ａ：Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。ＯＦＦ方向にＩｎｔ５部位が隣接したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の概略図を示している。図４３Ｂ：Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。Ｉｎｔ５遺伝子発現が嫌気的条件下で活性化される場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子はＯＮ方向にフリッピングされる。図４３Ｃ：Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。Ｔ７駆動プロモーター（ＰＴ７）の制御下にＰＡＬ３の１個のコピーを含む遺伝子操作された細菌株において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現は、ＰＡＬ３の産生およびフェニルアラニン代謝を導く。
【図４４Ａ】Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。ＯＦＦ方向にＩｎｔ５が隣接したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の概略図を示す。
【図４４Ｂ】Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。Ｉｎｔ５遺伝子発現が嫌気的条件下で活性化される場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子はＯＮ方向にフリッピングされる。
【図４４Ｃ】Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。Ｔ７駆動プロモーター（ＰＴ７）の制御下にＰＡＬ３の１個のコピーを含む遺伝子操作された細菌株において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現は、ＰＡＬ３の産生およびフェニルアラニン代謝を導く。
【図４５】図４５Ａ：異なる誘導性プロモーターおよびリボソーム結合部位を使用した、ＰＡＬ３発現を活性化するためのリコンビナーゼをベースにしたスイッチの概略を示した図である。リコンビナーゼ発現は、ＰＡＬ３遺伝子のＯＮ方向への組み換えフリッピングを引き起こし、ＰＡＬ３の産生およびフェニルアラニンの分解を導く。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼをベースにしたスイッチは、誘導因子の特定のレベルに応答するように調整される。図４５Ｂ：誘導因子の濃度とＯＮ方向にＰＡＬ３を含有する構築物の割合の間の関係を示した図である。影の領域は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける誘導因子の予測有効範囲を示す。
【図４６Ａ】異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の別の非限定的実施形態を示した図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は転写を抑制する立体構造をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に結合して活性化する立体構造的変化を受け、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は組換え細菌細胞内に蓄積するが、ＴｅｔＲは毒素の発現を妨害する（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下である）。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素もＴｅｔＲも発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素が発現し細胞を死滅させる。組換え細菌においては見いだされない本質的遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される本開示の別の非限定的実施形態も示す。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子はａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある本質的遺伝子の転写を抑制する立体構造をとり、細菌細胞は生存することができない。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はａｒａＢＡＤプロモーターに結合して活性化させる立体構造的変化を受け、本質的遺伝子の発現を誘導し、細菌細胞の生存能を維持する。
【図４６Ｂ】抗毒素が構成的プロモーターから発現し、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の非限定的実施形態を示した図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は転写を抑制する立体構造をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はａｒａＢＡＤプロモーターに結合して活性化させる立体構造変化を受け、ＴｅｔＲの発現を誘導し、こうして毒素の発現を妨害する。しかし、アラビノースが存在しない場合、ＴｅｔＲは発現せず、毒素が発現し、最終的に抗毒素を打ち負かし、細胞を死滅させる。抗毒素の発現を調節する構成的プロモーターは、毒素の発現を駆動するプロモーターよりも弱いプロモーターであろう。ａｒａＣ遺伝子は、この回路の構成的プロモーターの制御下にある。
【図４６Ｃ】異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の別の非限定的実施形態を示した図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は転写を抑制する立体構造をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はａｒａＢＡＤプロモーターに結合して活性化させる立体構造変化を受け、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は組換え細菌細胞内に蓄積するが、ＴｅｔＲは毒素の発現を妨害する（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下である）。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素もＴｅｔＲも発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素が発現し細胞を死滅させる。ａｒａＣ遺伝子は、構成的プロモーターまたはこの回路の誘導性プロモーター（例えば、ＡｒａＣプロモーター）のいずれかの制御下にある。
【図４７】遺伝子操作された安全成分としてＧｅｎｅＧｕａｒｄを使用することを示した図である。遺伝子操作されたＤＮＡは全て、条件的に破壊することができるプラスミドに存在する。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ等、２０１５年を参照のこと。
【図４８】図４８Ａ：野生型ｃｌｂＡ構築物の概略図である。図４８Ｂ：ｃｌｂＡノックアウト構築物の概略図である。
【図４９】野生型ｃｌｂＡ構築物およびｃｌｂＡノックアウト構築物の配列例を示した図である。
【図５０】細胞内で発現したキメラペプチドが内膜および外膜を横断して周囲の宿主環境に移動することができるように、ペプチドを組換えによって天然の鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに融合することによって、目的の治療用ペプチドを分泌するように改変された鞭毛を使用する、鞭毛ＩＩＩ型分泌に基づいた分泌系の概略を示した図である。
【図５１】治療用ペプチド（ｓｔａｒ）をＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己分泌体（ａｕｔｏ−ｓｅｃｒｅｔｅｒ）のベータ−ドメインに融合させることができる、組換えタンパク質の細胞外産生のためのＶ型分泌系の概略を示した図である。この系では、Ｎ末端シグナル配列はタンパク質をＳｅｃＡ−ＹＥＧ機構に導き、これは、タンパク質を、内膜を越えて周辺質に移動させ、続いてシグナル配列を切断する。ベータドメインはＢａｍ複合体に動員され、そこでベータドメインは折り畳まれ、ベータバレル構造として外膜に挿入される。次に、治療用ペプチドがリンカー配列の前のベータバレル構造の中空孔に通される。治療用ペプチドは、自己触媒的切断によって、または膜関連ペプチダーゼ（ハサミ）をリンカーの相補的プロテアーゼ切断部位にターゲティングすることによって、リンカー系から開放される。
【図５２】内膜および外膜両方を通るチャネルを形成するＨｌｙＢ（ＡＴＰ結合カセット分泌体；ＨｌｙＤ（膜融合タンパク質）；およびＴｏｌＣ（外膜タンパク質）を使用してパッセンジャーペプチドを細胞質から直接細胞外空間に移動させる、Ｉ型分泌系の概略図である。ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分は、このペプチドの分泌を媒介するために治療用ペプチド（ｓｔａｒ）のＣ末端部分に融合させる。
【図５３】グラム陰性細菌の外膜および内膜の概略、ならびに漏出性または不安定化した外膜を形成し、それによって、治療用ポリペプチド、例えば、ジスルフィド結合を含有する真核細胞由来の治療用ペプチドを細胞外空間に容易に移動させるために欠落させる様々な標的を示した図である。外膜をペプチドグリカン骨格につなぎ止めるタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌおよび／または周辺質プロテアーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子、例えば、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、ｎｌｐｌの不活性化突然変異は、漏出性表現型を生じる。突然変異の組み合わせは、漏出性表現型を相乗的に増強することができる。
【図５４】本開示の遺伝子操作された細菌を設計し、生産する非限定的方法の概略を示した図である。
【図５５】図５５Ａ：本開示の遺伝子操作された細菌の上流および下流生産の非限定的製造方法の概略を示した図である。開始培養１（ＳＣ１）のパラメータ：白金耳量のグリセロールストック、期間一晩、温度３７℃、２５０ｒｐｍで震盪を示す。図５５Ｂ：本開示の遺伝子操作された細菌の上流および下流生産の非限定的方法の概略を示した図である。開始培養２（ＳＣ２）のパラメータ：ＳＣ１の１／１００希釈、期間１．５時間、温度３７℃、２５０ｒｐｍで震盪を示す。図５５Ｃ：本開示の遺伝子操作された細菌の上流および下流生産の非限定的方法の概略を示した図である。生産用バイオリアクターのパラメータ：接種−ＳＣ２、温度３７℃、ｐＨ設定７．００、ｐＨ不感帯０．０５、溶解酸素設定点５０％、溶解酸素カスケード撹拌／ガスＦＬＯ、撹拌限界３００〜１２００ｒｐｍ、ガスＦＬＯ限界１分当たり０．５〜２０標準リットル、期間２４時間を示す。図５５Ｄ：本開示の遺伝子操作された細菌の上流および下流生産の非限定的方法の概略を示した図である。収集のパラメータ：速度４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離、洗浄１×１０％グリセロール／ＰＢＳ、遠心分離、１０％グリセロール／ＰＢＳに再懸濁を示す。図５５Ｅ：本開示の遺伝子操作された細菌の上流および下流生産の非限定的方法の概略を示した図である。バイアル充填／貯蔵のパラメータ：１〜２ｍＬずつ分注、−８０℃を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、遺伝子操作された細菌、その医薬組成物、ならびに高フェニルアラニン血症に関連する障害をモジュレートおよび治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、非天然フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードし、哺乳動物においてフェニルアラニンを処理し、低減させることができる遺伝子を含む。したがって、遺伝子操作された細菌およびこれらの細菌を含む医薬組成物は、ＰＫＵを含む、高フェニルアラニン血症に関連する状態を治療および／または予防するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。特定の態様では、遺伝子操作された細菌を含む組成物は、高フェニルアラニン血症に関連する障害を治療および／または予防するために本開示の方法において使用され得る。
【００１４】
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語が最初に定義される。これらの定義は、本開示の残りの部分を考慮して、および当業者によって理解されるように読まれるべきである。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。さらなる定義が詳細な説明の全体を通して記載されている。
【００１５】
「高フェニルアラニン血症（Ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉａ）」、「高フェニルアラニン血症（ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉｃ）」、および「過剰なフェニルアラニン」は、体内の増加したまたは異常に高い濃度のフェニルアラニンを指すために本明細書において交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症の診断シグナルは、少なくとも２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｄＬ、または少なくとも２５ｍｇ／ｄＬの血中フェニルアラニンレベルである。本明細書において使用される場合、高フェニルアラニン血症に関連する疾患には、限定されないが、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、および瀬川病が含まれる。罹患者は、進行性および不可逆性の神経学的欠損、精神遅滞、脳症、てんかん、湿疹、低成長、小頭症、振戦、四肢痙攣、および／または低色素沈着を患う可能性がある（Ｌｅｏｎａｒｄ  ２００６年）。高フェニルアラニン血症はまた、他の状態、例えば肝疾患に続発する可能性がある。
【００１６】
「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ」および「ＰＡＬ」は、フェニルアラニンをｔｒａｎｓ−ケイ皮酸およびアンモニアに変換または処理するフェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）を指すために使用される。ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸は、毒性が低く、哺乳動物における肝臓酵素によって、尿中に分泌される馬尿酸に変換される。ＰＡＬは、過剰のフェニルアラニンを代謝するための酵素ＰＡＨの代わりになり得る。ＰＡＬ酵素活性はＴＨＢ補因子活性を必要としない。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは原核生物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。代替の実施形態では、ＰＡＬは真核生物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、限定されないが、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を含む、細菌種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、アナベナ・バリアビリスに由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされ、本明細書において「ＰＡＬ１」と称される（Ｍｏｆｆｉｔｔら、２００７年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、フォトラブダス・ルミネセンスに由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされ、本明細書において「ＰＡＬ３」と称される（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００５年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、酵母種、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる（Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９８５年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、植物種、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる（Ｗａｎｎｅｒら、１９９５年）。ＰＡＬの任意の適切なヌクレオチドおよびアミノ酸配列、またはその機能的断片が使用され得る。
【００１７】
「フェニルアラニンヒドロキシラーゼ」および「ＰＡＨ」は、補因子テトラヒドロビオプテリンと併せてヒト体内でチロシンを作製するためにフェニルアラニンの芳香族側鎖のヒドロキシル化を触媒する酵素を指すために使用される。ＰＡＨをコードするヒト遺伝子は、２２位と２４．２位との間の第１２染色体の長（ｑ）腕に位置する。ＰＡＨのアミノ酸配列は哺乳動物の間で高度に保存されている。ヒトおよび哺乳動物ＰＡＨについての核酸配列は周知であり、広く利用可能である。ＰＡＨについての完全長ヒトｃＤＮＡ配列は１９８５年に報告された（Ｋｗｏｋら、１９８５年）。ＰＡＨの活性断片もまた周知である（例えば、Ｋｏｂｅら、１９９７年）。
【００１８】
「Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ」および「ＬＡＡＤ」は、それらのそれぞれのケト酸、アンモニア、および過酸化水素を生成するためにＬ−アミノ酸の立体特異的酸化的脱アミノ化を触媒する酵素を指すために使用される。例えば、ＬＡＡＤはフェニルアラニンのフェニルピルベートへの変換を触媒する。多数のＬＡＡＤ酵素が当該分野において公知であり、それらの多くは、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、およびモルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）などの細菌、または毒液に由来する。ＬＡＡＤはフェニルアラニン分解の速い反応速度を特徴とする（Ｈｏｕら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５年１０月；９９（２０）：８３９１〜４０２頁；「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」）。大部分の真核生物および原核生物のＬ−アミノ酸デアミナーゼは細胞外であるが、プロテウス種ＬＡＡＤは、酵素活性が存在する周辺質間隙に外側で面している細胞膜（内膜）に局在している。この局在化の結果として、内膜を通る細胞質へのフェニルアラニン輸送は、プロテウス属ＬＡＡＤにより媒介されるフェニルアラニン分解に必要とされない。フェニルアラニンは、トランスポーターを必要とせずに外膜を通して周辺質に容易に取り込まれ、基質の利用可能性を改善するトランスポーターの必要性を取り除く。
【００１９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、限定されないが、プロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌を含む、細菌種に由来するＬＡＡＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌種は、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるＬＡＡＤは、周辺質間隙に面しており、周辺質間隙において触媒活性を生じる細胞膜に局在している。
【００２０】
「フェニルアラニン代謝酵素」または「ＰＭＥ」は、フェニルアラニンを分解することができる酵素を指すために使用される。当該技術分野において公知の任意のフェニルアラニン代謝酵素は、遺伝子操作された細菌によってコードされ得る。ＰＭＥには、限定されないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（Ｌ−ＡＡＤ）、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが含まれる。
【００２１】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼまたはアミノトランスフェラーゼとの反応は補因子を必要とするが、Ｌ−ＡＡＤおよびＰＡＬはさらなる補因子を全く必要としない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるＰＭＥは補因子を必要とする。いくつかの実施形態では、この補因子は、遺伝子操作された細菌の投与と同時または連続して提供される。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は補因子を産生することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はアミノトランスフェラーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるＰＭＥは補因子を必要としない。理論に束縛されるものではないが、補因子の必要性がないことは、酵素によるフェニルアラニン分解の速度が基質の利用可能性に依存し、補因子の利用可能性によって制限されないことを意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によって産生されるＰＭＥはＰＡＬである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によって産生されるＰＭＥはＬＡＡＤである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＭＥの組合せをコードする。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＰＭＥの触媒活性は酸素レベルに依存する。いくつかの実施形態では、ＰＭＥは微好気的条件下で触媒的に活性である。非限定的な例として、ＬＡＡＤ触媒活性は酸素に依存する。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤは微好気的条件などの低酸素条件下で活性である。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＭＥは、例えば結腸に見出されるような非常に低いレベルの酸素で、または酸素の非存在下で機能する。非限定的な例として、ＰＡＬ活性は酸素の存在に依存しない。
【００２３】
特定の実施形態では、新たなまたは改善されたＰＭＥは、当該分野において公知または本明細書に記載される方法に従って同定され得、遺伝子操作された細菌によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる酵素は、ウイルス、原核生物または真核生物から単離された野生型酵素である。いくつかの実施形態では、酵素配列は、安定性または触媒活性などの酵素の１つまたは複数の特異的性質を増加させるようにさらに修飾または突然変異されている。
【００２４】
「フェニルアラニン代謝産物」とは、フェニルアラニンの分解の結果として生成される代謝産物を指す。代謝産物は、基質としてフェニルアラニンを使用して酵素によってフェニルアラニンから直接的に、またはフェニルアラニン代謝産物基質に対して作用する、代謝経路の下流の異なる酵素によって間接的に生成されてもよい。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＰＭＥをコードする遺伝子操作された細菌によって産生される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＰＡＨ活性から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたＰＡＨから直接的または間接的に生じる。いくつかの実施形態では、代謝産物はチロシンである。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、不完全なＰＡＨ活性に起因してＰＫＵ患者の血液または尿中に蓄積する。このようなＰＫＵ代謝産物の非限定的な例は、フェニルピルビン酸およびフェニル−乳酸である。他の例には、フェニルアセテート、フェニルエチルアミン、およびフェニルアセチルグルタミンが含まれる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＰＡＬ作用から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたＰＡＬから直接的または間接的に生じる。このようなＰＡＬ代謝産物の非限定的な例は、ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸および馬尿酸である。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＬＡＡＤ作用から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたＬＡＡＤから直接的または間接的に生じる。このようなＬＡＡＤ代謝産物の例は、フェニルピルベートおよびフェニル乳酸である。
【００２７】
「フェニルアラニントランスポーター」は、フェニルアラニンを細菌細胞に輸送することができる膜輸送タンパク質を指すために使用される（例えば、Ｐｉら、１９９１年を参照のこと）。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において、ｐｈｅＰ遺伝子は、フェニルアラニン輸送を担う高親和性フェニルアラニン特異的パーミアーゼをコードする（Ｐｉら、１９９８年）。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、限定されないが、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、および大腸菌を含む、細菌種に由来するｐｈｅＰ遺伝子によってコードされる。他のフェニルアラニントランスポーターには、ａｒｏＰ遺伝子によってコードされ、高親和性でフェニルアラニンを含む３つの芳香族アミノ酸を輸送し、ＰｈｅＰと一緒に、フェニルアラニン取り込みの最大の部分を担うアーゲネラル（Ａａｇｅｎｅｒａｌ）アミノ酸パーミアーゼが含まれる。さらに、低レベルのフェニルアラニン輸送活性は、ＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系の活性まで追跡され、そのＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系は、２つの周辺質結合タンパク質である、ＬＩＶ結合タンパク質（ＬＩＶ−Ｉ系）およびＬＳ結合タンパク質（ＬＳ系）、ならびに膜成分であるＬｉｖＨＭＧＦからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、細菌種に由来するａｒｏＰ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、ＬＩＶ結合タンパク質およびＬＳ結合タンパク質ならびに細菌種に由来するＬｉｖＨＭＧＦ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰ、ａｒｏＰ、およびＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系から選択される１種より多いフェニルアラニントランスポーターを含む。
【００２８】
「フェニルアラニン」および「Ｐｈｅ」は、式Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨを有するアミノ酸を指すために使用される。フェニルアラニンは、チロシン、ドーパミン、ノルエピネフリン、およびエピネフリンの前駆体である。Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸であり、食品タンパク質中に主に見出されるフェニルアラニンの形態である。立体異性体Ｄ−フェニルアラニンは食品タンパク質中により少ない量で見出され、ＤＬ−フェニルアラニンは両方の形態の組合せである。フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤＬ−フェニルアラニンのうちの１つまたは複数を指すことができる。
【００２９】
「作動可能に連結している」とは、核酸配列、例えばｃｉｓで作用する核酸配列の発現を可能にするように調節領域配列に結合している、例えばＰＡＬをコードする遺伝子を指す。調節領域は、目的の遺伝子の転写を誘導することができ、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、およびイントロンを含んでもよい核酸である。
【００３０】
「誘導可能なプロモーター」とは、１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結している調節領域を指し、遺伝子の発現は前記調節領域の誘導因子の存在下で増加する。
【００３１】
「直接的に誘導可能なプロモーター」とは、フェニルアラニン代謝酵素、例えばＰＡＬをコードする遺伝子に作動可能に連結している調節領域を指し、前記調節領域の誘導因子の存在下で、フェニルアラニン代謝酵素が発現される。「間接的に誘導可能なプロモーター」とは、２つ以上の調節領域、例えば、第１の分子、例えば、フェニルアラニン代謝酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結している第２の調節領域を調節できる、転写調節因子をコードする遺伝子に作動可能に連結している第１の調節領域を含む調節系を指す。第１の調節領域の誘導因子の存在下で、第２の調節領域は活性化または抑制され得、それによってフェニルアラニン代謝酵素の発現を活性化または抑制する。直接的に誘導可能なプロモーターおよび間接的に誘導可能なプロモーターの両方は、「誘導可能なプロモーター」に包含される。
【００３２】
「外因性環境条件」とは、上記のプロモーターが直接的または間接的に誘導される設定または状況を指す。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の上部消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の下部消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の小腸に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件とは、健康または疾患状態における哺乳動物の消化管に特異的である分子または代謝産物、例えばプロピオネートの存在を指す。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素、微好気的、または嫌気的条件である。
【００３３】
「外因性環境条件」とは、本明細書に記載されるプロモーターが誘導される設定または状況を指す。「外因性環境条件」という語句は、操作された微生物に対して外部であるが、宿主対象環境に対して内因性または天然である環境条件を指すことを意味する。したがって、「外因性」および「内因性」は、環境条件が哺乳動物の身体に対して内因性であるが、無傷微生物細胞に対して外部または外因性である環境条件を指すために交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の上部消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の下部消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の小腸に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素、微好気的、または嫌気的条件である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管に特異的である分子または代謝産物、例えばプロピオネートである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、組織特異的または疾患特異的代謝産物または分子である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は低ｐＨ環境である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物はｐＨ依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの態様では、細菌は酸素レベルを検知できる進化した転写因子を有する。異なるシグナル伝達経路が異なる酸素レベルによって誘発され得、異なる動態を伴って発生する。
【００３４】
「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」とは、１つまたは複数の酸素レベル感受性転写因子が結合できる核酸配列を指し、対応する転写因子の結合および／または活性化は下流の遺伝子発現を活性化する。
【００３５】
酸素レベル依存性転写因子の例には、限定されないが、ＦＮＲ、ＡＮＲ、およびＤＮＲが含まれる。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーター、およびＤＮＲ応答性プロモーターは当該分野において公知である（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９年；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒら、１９８９年；Ｇａｌｉｍａｎｄら、１９９１年；Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年；Ｈｏｅｒｅｎら、１９９３年；Ｓａｌｍｏｎら、２００３年を参照のこと）。非限定的な例は表１に示される。
【００３６】
非限定的な例において、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、環境酸素が低いかまたは全くない条件下で高度に発現することが知られている、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅフマレートおよび硝酸レダクターゼ遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）に由来した（ＤｕｒａｎｄおよびＳｔｏｒｚ、２０１０年；Ｂｏｙｓｅｎら、２０１０年）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、Ｎｉｓｓｌｅにおいて天然に見出される包括的転写調節因子ＦＮＲによって嫌気的条件下で活性化される。嫌気的条件下で、ＦＮＲは二量体を形成し、その制御下で特異的遺伝子のプロモーターにおける特異的配列に結合し、それによってそれらの発現を活性化する。しかしながら、好気的条件下で、酸素はＦＮＲ二量体における鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性型に変換する。このように、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターはタンパク質またはＲＮＡの発現をモジュレートするために採用される。ＰｆｎｒＳは、本出願において、ＦＮＲＳ、ｆｎｒＳ、ＦＮＲ、Ｐ−ＦＮＲＳプロモーターおよびプロモーターＰｆｎｒＳを示す他のそのような関連した指定として交換可能に使用される。
【００３７】
【表１】
2018515106.tif 000002
【００３８】
本明細書において使用される場合、「非天然」核酸配列とは、通常、細菌に存在しない核酸配列、例えば内因性配列の追加のコピー、または細菌の異なる種、株、もしくは亜株由来の配列などの異種配列、または同じ亜型の細菌由来の非修飾配列と比較して修飾および／もしくは突然変異されている配列を指す。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は合成の天然に存在しない配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌら、２０１３年を参照のこと）。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットにおける１つもしくは複数の遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態では、「非天然」とは、天然において互いに同じ関係で見出されない２つ以上の核酸配列を指す。非天然核酸配列はプラスミドまたは染色体上に存在し得る。さらに、任意の調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットの複数のコピーが細菌に存在してもよく、調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットの１つまたは複数のコピーは、突然変異されてもよいか、または別様で本明細書に記載されるように変化されてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、コピー数を高めるために、または複数の異なる機能を実行する遺伝子カセットの複数の異なる成分を含むように同じ調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットの複数のコピーを含むように操作される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、天然では前記遺伝子に付随していない直接的または間接的に誘導可能なプロモーター、例えば、ＰＡＬをコードする遺伝子に作動可能に連結しているＦＮＲプロモーターまたはＬＡＡＤに作動可能に連結しているＰａｒａＢＡＤプロモーターに作動可能に連結しているフェニルアラニン代謝酵素をコードする遺伝子を含む。
【００３９】
「構成的プロモーター」とは、その制御下および／またはそれが作動可能に連結しているコード配列または遺伝子の連続的な転写を促進することができるプロモーターを指す。構成的プロモーターおよびバリアントは当該分野において周知であり、限定されないが、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、構成的大腸菌σＳプロモーター（例えば、ｏｓｍＹプロモーター（国際遺伝子操作機構（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ）（ｉＧＥＭ）標準生物学的パーツ登録所（Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓ）名称ＢＢａ＿Ｊ４５９９２；ＢＢａ＿Ｊ４５９９３））、構成的大腸菌σ３２プロモーター（例えば、ｈｔｐＧヒートショックプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ４５５０４））、構成的大腸菌σ７０プロモーター（例えば、ｌａｃｑプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、大腸菌ＣｒｅＡＢＣＤリン酸検知オペロンプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）、ｌａｃＺプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｉプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｖプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０））、構成的バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）σＡプロモーター（例えば、プロモーターｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、プロモーター４３（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、ＰｌｉａＧ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０００）、ＰｌｅｐＡ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００２）、Ｐｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００３））、構成的バチルス・サブティリスσＢプロモーター（例えば、プロモーターｃｔｃ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモーターｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１１））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プロモーター（例えば、サルモネラ由来のＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、サルモネラ由来のＰｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、バクテリオファージＳＰ６プロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））、およびそれらの機能的断片が含まれる。
【００４０】
「消化管」とは、食物の移動および消化、栄養素の吸収、ならびに老廃物の排出を担う器官、腺、管、および系を指す。ヒトにおいて、消化管は、口から始まり肛門で終わり、食道、胃、小腸、および大腸をさらに含む、胃腸（ＧＩ）管を含む。消化管はまた、脾臓、肝臓、胆嚢、および膵臓などの副器官および腺を含む。上部胃腸管は、食道、胃、および小腸の十二指腸を含む。下部胃腸管は、小腸の残りの部分、すなわち空腸および回腸、ならびに大腸の全て、すなわち盲腸、結腸、直腸、および肛門管を含む。細菌は、消化管全体にわたって、例えば胃腸管において、特に腸において見出され得る。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「遺伝子配列」という用語は、遺伝子配列、例えば核酸配列を指すことを意味する。遺伝子配列または遺伝学的配列（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、完全な遺伝子配列または部分的な遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子配列または遺伝学的配列は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むことを意味し、また、タンパク質またはポリペプチドをコードしない遺伝学的配列、例えば、調節配列、リーダー配列、シグナル配列、または他の非タンパク質コード配列を含むことを意味する。
【００４２】
「微生物」とは、典型的に単細胞からなる微視的、超微視的、または超顕微鏡的なサイズの生物または微生物を指す。微生物の例には、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、特定の藻類、および原生動物が含まれる。いくつかの態様では、微生物は、目的の１つまたは複数の治療分子またはタンパク質を産生するように操作される（「操作された微生物」）。特定の態様では、微生物は、その環境、例えば消化管から特定の代謝産物または他の化合物を吸収し、異化するように操作される。特定の態様では、微生物は、特定の有益な代謝産物または他の化合物（合成または天然に存在する）を合成し、それらをその環境中へ放出するように操作される。特定の実施形態では、操作された微生物は操作された細菌である。特定の実施形態では、操作された微生物は操作されたウイルスである。
【００４３】
「非病原性細菌」とは、宿主において疾患または有害な反応を引き起こすことができない細菌を指す。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、消化管の常在微生物叢に存在する共生細菌である。非病原性細菌の例には、限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテイロデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリア属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サブティリス、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・サブティリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、およびサッカロミセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）が含まれる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第６，８３５，３７６号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第７，７３１，９７６号）。天然の病原性細菌は、病原性を低減または取り除くように遺伝子操作されてもよい。
【００４４】
「プロバイオティクス」は、適量の微生物を含有する宿主生物に対して健康の利点を与えることができる、生きている非病原性の微生物、例えば細菌を指すために使用される。いくつかの実施形態では、宿主生物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物はヒトである。非病原性細菌のいくつかの種、株、および／または亜型は、現在、プロバイオティクスとして認識されている。プロバイオティクス細菌の例には、限定されないが、ビフィドバクテリア属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、エシェリキア属、ラクトバチルス属、およびサッカロミセス属、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、およびサッカロミセス・ブラウディが含まれる（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティクスは細菌のバリアントまたは突然変異株であってもよい（Ａｒｔｈｕｒら、２０１２年；Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓら、２０１０年；Ｏｌｉｅｒら、２０１２年；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅら、２００６年）。非病原性細菌は、所望の生物学的特性、例えば生存率を向上または改善させるように遺伝子操作されてもよい。非病原性細菌は、プロバイオティクス特性を提供するように遺伝子操作されてもよい。プロバイオティクス細菌は、プロバイオティクス特性を向上または改善させるように遺伝子操作されてもよい。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌は、非天然遺伝子物質、例えばＰＡＬ遺伝子を保有する細菌宿主細胞を指すために使用され、その非天然遺伝子物質が保持され、発現され、および／または増殖されるように、それは宿主ゲノム内に組み込まれるか、または自己複製染色体外プラスミド上で増殖する。安定な細菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば培地中、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば消化管内で生存および／または増殖できる。例えば、安定な細菌は、ＰＡＬ遺伝子を保有するプラスミドまたは染色体が宿主細胞中で安定に維持される、ＰＡＬ遺伝子を含む遺伝子組換え細菌であってもよく、それによりＰＡＬは宿主細胞中で発現され得、宿主細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで生存および／または増殖できる。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質、例えば、ＰＡＬ遺伝子またはＰＡＨ遺伝子の発現の安定性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質、例えば、ＰＡＬ遺伝子またはＰＡＨ遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「モジュレートする」および「治療する」という用語ならびにそれらの同語源語は、疾患、障害、および／もしくは状態、またはそれらのうちの少なくとも１つの識別できる症状の改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」とは、必ずしも患者によって識別できるとは限らない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」とは、物理的（例えば、識別できる症状の安定化）、生理的（例えば、物理的パラメータの安定化）のいずれかまたは両方で、疾患、障害、および／または状態の進行を阻害することを指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」とは、疾患、障害、および／もしくは状態の進行を遅らせること、またはそれらの進行を反転させることを指す。本明細書において使用される場合、「予防する」およびその同語源語は、発症を遅延させること、あるいは所与の疾患、障害および／もしくは状態またはそのような疾患、障害、および／もしくは状態に関連した症状に罹るリスクを低減させることを指す。
【００４７】
治療を必要とするものは、特定の医学的疾患を既に有する個体、および疾患を有するリスクがあるか、または最終的に疾患に罹り得る個体を含んでもよい。治療の必要性は、例えば、疾患の発生、疾患の存在もしくは進行、または疾患を有する対象の治療に対する受容の可能性に関連する１つまたは複数のリスク因子の存在によって評価される。原発性高フェニルアラニン血症、例えばＰＫＵは、治癒が知られていない先天的遺伝子突然変異によって引き起こされる。高フェニルアラニン血症はまた、他の状態、例えば肝疾患に続発する可能性がある。高フェニルアラニン血症を治療することは、過剰なフェニルアラニンおよび／または関連する症状を低減させるか、または取り除くことを包含することができ、必ずしも基礎疾患を取り除くことを包含する必要はない。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体および／または賦形剤などの他の成分との本発明の遺伝子操作された細菌の調製物を指す。
【００４９】
交換可能に使用されてもよい「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に著しい刺激を引き起こさず、投与される細菌性化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。助剤はこれらの語句に含まれる。
【００５０】
「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性な物質を指す。例には、限定されないが、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤が含まれる。
【００５１】
「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、症状の発症の予防、遅延、または状態、例えば高フェニルアラニン血症の症状の改善をもたらす化合物の量を指すために使用される。治療有効量は、例えば、重症度を治療し、予防し、低減させ、発症を遅延させ、および／または過剰なフェニルアラニンレベルに関連する疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発生のリスクを低減させるのに十分であり得る。治療有効量、および投与の治療有効頻度は、当該分野において公知であり、以下に説明される方法によって決定され得る。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド（単数）」および「ポリペプチド（複数）」を含み、アミド結合（すなわちペプチド結合）によって直線状に連結しているアミノ酸モノマーからなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（複数可）を指し、特定の長さの生成物を指すわけではない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖（複数可）を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または交換可能に使用されてもよい。「ジペプチド」という用語は、２つの連結しているアミノ酸のペプチドを指す。「トリペプチド」という用語は、３つの連結しているアミノ酸のペプチドを指す。「ポリペプチド」という用語はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的起源に由来してもよいか、または組換え技術によって産生されてもよい。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺伝子操作された細菌またはウイルスによって産生される。本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸のサイズであってもよい。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有してもよいが、必ずしもこのような構造を有する必要はない。定義された三次元構造を有するポリペプチドは折り畳まれたと称され、定義された三次元構造を保有しないが、多数の異なる立体配座を採用できるポリペプチドは折り畳まれていないと称される。「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、タンパク質もしくはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を指してもよいか、または非タンパク質配列、例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列、および他のペプチド配列から選択される配列に対応するアミノ酸配列を指してもよい。
【００５３】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体とは、その天然の環境に存在しないポリペプチドを指す。特定の精製レベルは必要とされない。限定されないが、細菌または哺乳動物細胞を含む宿主細胞中で発現される組換えにより産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、断片化、または部分的もしくは十分に精製されている天然または組換えポリペプチドがそうであるように、本発明の目的においては、単離されたとみなされる。組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術によって産生された、すなわちポリペプチドをコードする外因性組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換された細胞、微生物または哺乳動物から産生されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養物中で発現されるタンパク質またはペプチドは、典型的にグリカンを含まない。前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体またはバリアント、およびそれらの任意の組合せもまた、ポリペプチドとして含まれる。「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」という用語は、元のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する元のポリペプチドの少なくとも１つまたは複数の特性を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、タンパク質分解断片、および欠失断片を含む。断片はまた、特異的抗体もしくは生物活性断片または本明細書に記載される任意のポリペプチドに由来する免疫学的に活性な断片を含む。バリアントは天然に存在してもよいか、または天然に存在しなくてもよい。天然に存在しないバリアントは、当該分野において公知の突然変異誘発法を使用して産生され得る。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含んでもよい。
【００５４】
ポリペプチドはまた、融合タンパク質も含む。本明細書において使用される場合、「バリアント」という用語は、元のペプチドまたは元のペプチドと十分に類似する配列を含む融合タンパク質を含む。本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、２つ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。典型的に、融合タンパク質は周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え技術から生じる。融合タンパク質は、その融合タンパク質の成分である個々の元のタンパク質と類似した構造機能（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）、および／または類似した調節機能（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）、および／または類似した生化学機能（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）および／または免疫学的活性（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）を有してもよい。「誘導体」は、限定されないが、２０個の標準的なアミノ酸の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドを含む。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。１つのペプチドのアミノ酸は、それが同一または保存的アミノ酸置換である場合、第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。保存的置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、ｅｄ．、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８年）、およびＡｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９年）、７７９〜７８５頁に記載されているものが含まれる。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は保存的変化または置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「十分に類似する」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有するように、第２のアミノ酸配列と比較して十分または最低限の数の同一または等価のアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似していると本明細書において定義される。好ましくは、バリアントは本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似している。このようなバリアントは、一般に、本発明のペプチドの機能的活性を保持する。バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換によって、天然および野生型ペプチドとアミノ酸配列がそれぞれ異なるペプチドを含む。それらは天然に存在するバリアントおよび人工的に設計されたバリアントであってもよい。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、２つのポリペプチド配列を接続または連結する、例えば２つのポリペプチドドメインを連結する合成または非天然もしくは天然に存在しないアミノ酸配列を指す。本明細書において使用される場合、「合成」という用語は、天然に存在しないアミノ酸配列を指す。例示的なリンカーが本明細書に記載される。さらなる例示的なリンカーは米国特許出願公開第２０１４００７９７０１号に提供されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「コドン最適化配列」という用語は、既存のコード配列から修飾された、あるいは例えば、コード配列から転写された転写ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するように、またはコード配列の転写を改善するように設計された配列を指す。コドンの最適化には、限定されないが、発現宿主生物のコドンの選好性に適合するように、コード配列についてのコドンを選択することを含むプロセスが含まれる。
【００５８】
多くの生物は、成長ポリペプチド鎖において特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンを使用するためのバイアスまたは選好性を示す。コドンの選好性またはコドンバイアス、生物間でのコドン使用頻度の差異は、遺伝暗号の縮重によって許容され、多くの生物の間で文書により十分に立証されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、次に、そのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいた所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「分泌系」または「分泌タンパク質」という用語は、目的のタンパク質または治療タンパク質を微生物、例えば細菌細胞質から分泌または排出することができる天然または非天然の分泌機構を指す。分泌系は、単一タンパク質を含んでもよいか、または複合体、例えばＨｌｙＢＤにおいて構築される２つ以上のタンパク質を含んでもよい。グラム陰性細菌についての分泌系の非限定的な例には、修飾されたＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、溶血素分泌系）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、およびＶＩＩ型分泌系、耐性−結節形成−分裂（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、種々の単一膜分泌系が含まれる。グラム陽性細菌についての分泌系の非限定的な例には、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌系が含まれる。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、目的のタンパク質または治療タンパク質を特異的分泌系へ誘導するためのＲＮＡまたはペプチド起源のいずれかの「分泌タグ」を含む。いくつかの実施形態では、分泌系は、操作した細菌から目的のタンパク質を分泌する前にこのタグを除去することができる。例えば、Ｖ型自己分泌媒介性分泌（ａｕｔｏ−ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）において、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然のＳｅｃ系によって細胞質から周辺質区画への「パッセンジャー」ペプチドの転位の際に除去される。さらに、自己分泌因子が外膜を横切って移行すると、Ｃ末端分泌タグは、自己触媒的またはプロテアーゼによって触媒されるいずれかの、例えばＯｍｐＴ切断によって除去され得、それによって目的のタンパク質を細胞外環境に放出する。］］
【００６０】
本明細書において使用される場合、「トランスポーター」という用語は、分子、例えば、アミノ酸、毒素、代謝産物、基質などを細胞外環境から微生物へ取り込むための機構、例えばタンパク質（複数可）を指すことを意味する。
【００６１】
本明細書において使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、明確に反対であることが示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【００６２】
「および／または」という語句は、列挙における要素の間で使用される場合、（１）単一の列挙された要素のみが存在すること、または（２）列挙の１つより多い要素が存在することのいずれかを意味することを意図する。例えば、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、その選択が、Ａ単独；Ｂ単独；Ｃ単独；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；またはＡ、Ｂ、およびＣであってもよいことを示す。「および／または」という語句は、列挙における要素の「少なくとも１つ」または「１つもしくは複数」と交換可能に使用されてもよい。
【００６３】
細菌
本発明の遺伝子操作された細菌は過剰のフェニルアラニンを低減させることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は非病原性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は共生細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、病原性を低減させるか、または取り除くように修飾または突然変異された天然の病原性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。例示的な細菌には、限定されないが、バチルス属、バクテイロデス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリア属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、大腸菌、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、サッカロミセス属、およびスタフィロコッカス属、例えば、バチルス・コアグランス、バチルス・サブティリス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・サブティリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ラクティス、およびサッカロミセス・ブラウディが含まれる。特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、バクテロイデス・サブティリス、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、およびラクトバチルス・ラクティスからなる群から選択される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、最も特徴付けられたプロバイオティクスの１つに進化している腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）のグラム陰性細菌である、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ）である（Ｕｋｅｎａら、２００７年）。その株はその完全な無害により特徴付けられ（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）、ＧＲＡＳ（一般に安全と認識されている（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ））状態を有する（Ｒｅｉｓｔｅｒら、２０１４年、下線は筆者による）。ゲノムシークエンシングにより、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅが重要なビルレンス因子（例えば、大腸菌α−溶血素、Ｐ−線毛付着因子）を欠失していることが確認された（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）。さらに、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは病原性接着因子を保有せず、腸毒素または細胞毒素を全く産生せず、侵襲性ではなく、尿路病原性ではないことが示されている（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。早くも１９１７年に、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、治療的使用のために、Ｍｕｔａｆｌｏｒと呼ばれる医薬用カプセルにパッケージ化された。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの治療効果および安全性は納得できるように証明されていることは一般に認められている（Ｕｋｅｎａら、２００７年）。
【００６５】
当業者は、本明細書に開示される遺伝子組換えが、細菌の他の種、株、および亜型に適合され得ることを理解する。さらに、１つまたは複数の異なる種由来の遺伝子が互いに導入されてもよく、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス由来のＰＡＬ遺伝子は大腸菌において発現され得（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）、原核生物および真核生物のフェニルアラニンアンモニアリアーゼは配列相同性を共有することが知られている（ＸｉａｎｇおよびＭｏｏｒｅ、２００５年）。
【００６６】
非修飾大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば、消化管もしくは血清中の防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）、または投与後数時間もしくは数日の死滅スイッチ（ｋｉｌｌ  ｓｗｉｔｃｈ）の活性化によって破壊され得る。このように、遺伝子操作された細菌は継続的な投与を必要とする場合がある。いくつかの実施形態では、滞留時間はヒト対象について計算される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間は、本発明の遺伝子操作された細菌について計算され得る（例えば、図３８を参照のこと）。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はＰＡＬをコードする遺伝子を含み、ＰＡＬ遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、細菌は非天然ＰＡＬ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のＰＡＬ遺伝子のさらなるコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではＰＡＬ遺伝子に付随していない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はＰＡＨをコードする遺伝子を含み、ＰＡＨ遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、細菌は非天然のＰＡＨ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のＰＡＨ遺伝子のさらなるコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではＰＡＨ遺伝子に付随していない。
【００６８】
遺伝子操作された細菌はフェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする遺伝子をさらに含む。特定の実施形態では、細菌は、フェニルアラニントランスポーターをコードする天然遺伝子のさらなるコピーを含み、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。代替の実施形態では、細菌は、非天然フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子を含み、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。両方の実施形態は、「非天然」フェニルアラニントランスポーターという用語に包含される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、天然ではｐｈｅＰ遺伝子に付随していない。いくつかの実施形態では、同じプロモーターは、ＰｈｅＰおよびＰＡＬまたはＰＡＨの発現を制御する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはｐｈｅＰに作動可能に連結しているプロモーターは、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の小腸に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的である分子または代謝産物、例えばプロピオネートの存在によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、テトラサイクリンへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。
【００７０】
高フェニルアラニン血症の低減
本発明の遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）をコードする遺伝子を含み、高フェニルアラニン血症を低減させることができる。
【００７１】
フェニルアラニン代謝酵素の例には、限定されないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（Ｌ−ＡＡＤ）、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが含まれる。フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼまたはアミノトランスフェラーゼとの反応は補因子を必要とするが、Ｌ−ＡＡＤおよびＰＡＬは追加の補因子を全く必要としない。理論に束縛されるものではないが、補因子を必要としないことは、遺伝子操作された細菌によってコードされる酵素によるフェニルアラニン分解が基質の利用可能性に依存し、補因子の利用可能性によって制限されないことを意味する。
【００７２】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ；ＥＣ４．３．１．２４）は、Ｌ−フェニルアラニンをアンモニアおよびｔｒａｎｓ−ケイ皮酸に変換する反応を触媒する酵素である。フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｌ−Ｐｈｅに特異的であり、Ｌ−チロシンにはより低い程度で特異的である。ＰＡＬによって触媒される反応は、ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸およびアンモニアを生じるためのＬ−フェニルアラニンの自然発生する、非酸化的脱アミノ化である。哺乳動物酵素（ＰＡＨ）と異なり、ＰＡＬは単量体であり、補因子を必要としない（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００７年；８５：２７３〜８２頁．  Ａ  ｍｏｄｅｒｎ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅ）。微生物において、それは、微生物が唯一の炭素および窒素源としてＬ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）を利用することを可能にする異化作用の役割を有する。一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はＰＡＬ遺伝子を含む。ＰＡＬは、フェニルアラニンを非毒性レベルのｔｒａｎｓケイ皮酸およびアンモニアに変換することができる。ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸（ＴＣＡ）は、ＴＣＡ代謝産物である安息香酸および馬尿酸にさらに変換され得る（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００７年６月；４２（６）：８１１〜７頁；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｉｃ，ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｎｄ  ｈｉｐｐｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ＧＣ−ＭＳ  ａｎａｌｙｓｉｓ）。ＰＡＬ酵素活性はＴＨＢ補因子活性を必要としない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、限定されないが、アクロモバクター・キシロソキシダンス、シュードモナス・アエルギノーザ、フォトラブダス・ルミネセンス、アナベナ・バリアビリス、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスを含む、細菌種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、細菌種はフォトラブダス・ルミネセンスである。いくつかの実施形態では、細菌種は、アナベナ・バリアビリスである。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、真核生物種、例えば、酵母種、植物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。複数の異なるＰＡＬタンパク質が当該分野において公知である。遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ遺伝子が発現されると、同じ条件下で同じ細菌亜型の非修飾細菌より多くのフェニルアラニンを変換する。したがって、ＰＡＬを含む遺伝子操作された細菌は、ＰＫＵを含む、高フェニルアラニン血症に関連する状態を治療するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アナベナ・バリアビリスＰＡＬ（「ＰＡＬ１」）を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フォトラブダス・ルミネセンスＰＡＬ（「ＰＡＬ３」）を発現する。目的のＰＡＬ配列の非限定的な例は表２に示される。
【００７４】
ＬＡＡＤは、イミノ酸中間体を介してアンモニアおよび過酸化水素の生成と共に、立体特異的酸化、すなわち酸素を消費する、Ｌ−アミノ酸のα−ケト酸への脱アミノ化を触媒する。Ｌ−ＡＡＤは、ヘビ毒、および多くの細菌（Ｂｉｆｕｌｃｏら、２０１３年）、具体的にはプロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌の細胞膜に見出される。Ｌ−ＡＡＤ（ＥＣ  １．４．３．２）は二量体構造を有するフラビン酵素である。各サブユニットは、非共有結合フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子）を含有し、外部補因子を全く必要としない。プロテウス・ミラビリスは２種類のＬ−ＡＡＤを含有する（ＤｕｅｒｒｅおよびＣｈａｋｒａｂａｒｔｙ  １９７５年）。１つは広範な基質特異性を有し、脂肪族および芳香族Ｌ−アミノ酸のケト酸、典型的にはＬ−フェニルアラニンへの酸化を触媒する（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３５３８３．１）（Ｂａｅｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１年、５１、１２９〜１３５頁；「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」）。他の種類は塩基性Ｌ−アミノ酸に対して主に作用する（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ６６９８１９．１）。細菌、真菌、および植物源由来のＬＡＡＤは、窒素源としてＬ−アミノ酸（すなわち、酵素活性によって産生されたアンモニア）の利用に関与するように見える。ほとんどの真核生物および原核生物のＬ−アミノ酸デアミナーゼは、膜結合型であるプロテウス種ＬＡＡＤ由来を除いて、細胞外に分泌される。プロテウス・ミラビリスにおいて、Ｌ−ＡＡＤは、酵素活性が存在する周辺質間隙に外側で面している細胞膜に位置することが報告されている（Ｐｅｌｍｏｎｔ  Ｊら、（１９７２年）「Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ５４：１３５９〜１３７４頁）。
【００７５】
一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤ遺伝子を含む。ＬＡＡＤはフェニルアラニンを非毒性レベルのフェニルピルベートに変換することができ、そのフェニルピルベートはまた、例えば肝臓酵素によってフェニルラクテートにさらに分解され得る。フェニルピルベートは血液脳関門を横切ることができず、ＬＡＡＤにより、別の潜在的に有毒な代謝産物の蓄積を可能にせずに脳内のフェニルアラニンのレベルを低減させることができる。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤは、限定されないが、プロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌を含む、細菌種に由来するＬＡＡＤ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ミラビリスである。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ブルガリスである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はプロテウス・ミラビリスＬＡＡＤ酵素ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３５３８３．１を発現する。目的のＬＡＡＤ配列の非限定的な例は表２に示される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ酵素はヘビ毒に由来する。本発明によれば、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤ遺伝子が発現されると、同じ条件下で同じ細菌亜型の非修飾細菌より多くのフェニルアラニンを変換する。したがって、ＬＡＡＤを含む遺伝子操作された細菌は、ＰＫＵを含む高フェニルアラニン血症に関連する状態を治療するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は天然に存在するような野生型酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は野生型配列に対する突然変異を含む酵素をコードする。いくつかの実施形態では、突然変異は酵素の安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、突然変異は酵素の触媒活性を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表２に列挙されたタンパク質の１つまたは複数をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１〜８のいずれかの配列を含むポリペプチドの１つまたは複数をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１〜８の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、突然変異を含む、表２の１つまたは複数の酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＰＡＨをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および／または活性を有する突然変異ＰＡＨをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＰＡＬをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および／または活性を有する突然変異ＰＡＬをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＬＡＡＤをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および／または活性を有する突然変異ＬＡＡＤをコードする。所望の特性を有する酵素をスクリーニングする方法は、当該分野において公知であり、本明細書に記載される。
【００７７】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００７８】
ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、またはＰＡＨ遺伝子は、遺伝子操作された細菌におけるプラスミドまたは染色体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は構成的プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は、本明細書に記載されているような外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は、哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物の存在下などの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は、低酸素、微好気的、または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、ＰＭＥ遺伝子、例えばＰＡＬ遺伝子の発現は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気的環境下で活性される。
【００７９】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、哺乳動物の消化管などの低酸素または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導されるＰＡＬ遺伝子をコードする。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、限定されないが、胃、十二指腸、および回腸を含む、近位腸に見出される条件などの酸素化、低酸素、または微好気的条件によって直接的または間接的に誘導されるＬＡＡＤ遺伝子をコードする。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、哺乳動物の消化管に天然に存在する環境要因によって直接的または間接的に誘導されるＰＭＥ遺伝子をコードする。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、哺乳動物の消化管に天然には存在しない環境要因、例えばアラビノースによって直接的または間接的に誘導されるＰＭＥ遺伝子をコードする。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、炎症状態下で哺乳動物の消化管に天然に存在する環境要因によって直接的または間接的に誘導されるＰＭＥ遺伝子をコードする。
【００８０】
細菌は、酸素レベルを検知することができる進化した転写因子を有する。異なるシグナル伝達経路は異なる酸素レベルによって誘発され得、異なる動態を伴って発生する。酸素レベル依存性プロモーターは、１つまたは複数の酸素レベル検知転写因子が結合できる核酸配列であり、対応する転写因子の結合および／または活性化は下流の遺伝子発現を活性化する。一実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現される。より具体的な態様では、ＰＡＬ遺伝子は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気的環境下で活性化される酸素レベル依存性プロモーターの制御下にある。
【００８１】
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フマル酸および硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーターの制御下で発現されるＰＭＥ、例えばＰＡＬを含む。大腸菌において、ＦＮＲは、好気的から嫌気的代謝への転換を制御する主要な転写活性化因子である（Ｕｎｄｅｎら、１９９７年）。嫌気的状態において、ＦＮＲは、嫌気的増殖への適応に関与する数百の遺伝子を活性化する活性ＤＮＡ結合タンパク質に二量体化する。好気的状態において、ＦＮＲは酸素による二量体化が阻止され、不活性である。いくつかの実施形態では、複数の異なるＦＮＲ核酸配列は遺伝子操作された細菌に挿入される。代替の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、代替の酸素レベル依存性プロモーター、例えばＡＮＲプロモーター（Ｒａｙら、１９９７年）、ＤＮＲプロモーター（Ｔｒｕｎｋら、２０１０年）の制御下で発現されるＰＭＥ、例えばＰＡＬを含む。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝は消化管などの低酸素または嫌気的環境において特に活性化される。
【００８２】
シュードモナス・アエルギノーザにおいて、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元の嫌気的調節（ＡＮＲ）転写調節因子は、「酸素制限または嫌気的条件下で誘導可能な生理学的機能の発現に必要とされる」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年；Ｓａｗｅｒｓ  １９９１年）。シュードモナス・アエルギノーザＡＮＲは大腸菌ＦＮＲと相同であり、「コンセンサスＦＮＲ部位（ＴＴＧＡＴ−−−−ＡＴＣＡＡ）はＡＮＲおよびＦＮＲによって効率的に認識された」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年）。ＦＮＲと同様に、嫌気的状態において、ＡＮＲは嫌気的増殖に対する適応を担う多数の遺伝子を活性化する。好気的状態において、ＡＮＲは不活性である。シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、およびシュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）の全てはＡＮＲの機能的類似体を有する（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、１９９１年）。ＡＮＲによって調節されるプロモーター、例えば、ａｒｃＤＡＢＣオペロンのプロモーターは当該分野において公知である（例えば、Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年を参照のこと）。
【００８３】
ＦＮＲファミリーはまた、「シュードモナス・アエルギノーザの嫌気的硝酸塩呼吸」（Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年）のためにＡＮＲと併せて必要とされる転写調節因子である、異化型硝酸塩呼吸調節因子（ＤＮＲ）（Ａｒａｉら、１９９５年）も含む。特定の遺伝子について、ＦＮＲ結合モチーフは、「おそらくＤＮＲによってのみ認識される」（Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年）。外因性環境条件および対応する調節領域によって制御される任意の適切な転写調節因子が使用され得る。非限定的な例には、ＡｒｃＡ／Ｂ、ＲｅｓＤ／Ｅ、ＮｒｅＡ／Ｂ／Ｃ、およびＡｉｒＳＲが含まれ、その他は当該分野において公知である。
【００８４】
ＦＮＲプロモーター配列は当該分野において公知であり、任意の適切なＦＮＲプロモーター配列は本発明の遺伝子操作された細菌において使用され得る。任意の適切なＦＮＲプロモーターは任意の適切なＰＡＬと組み合わされてもよい。非限定的なＦＮＲプロモーター配列は表３に提供され、非限定的なＰＡＬ配列もまた、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、配列番号９、配列番号１０、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号１１）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号１２）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号１３）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号１４）、強力なリボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号１５）、強力なリボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター（配列番号１６）、嫌気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子であるｆｎｒＳ（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号９またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号１７）、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号１８）、およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ（配列番号１９）のうちの１つまたは複数を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０のＤＮＡ配列またはその機能的断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【００８６】
【表３−１】
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【表３−２】
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【００８７】
他の実施形態では、ＰＭＥ、例えばＰＡＬは、転写活性化因子、例えばＣＲＰについての結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現される。ＣＲＰ（環状ＡＭＰ受容体タンパク質またはカタボライト活性化タンパク質すなわちＣＡＰ）は、グルコースなどの急速に代謝可能な炭水化物が存在する場合、あまり有益ではない炭素源の取り込み、代謝、および同化を担う遺伝子を抑制することによって細菌において主要な調節的役割を果たす（Ｗｕら、２０１５年）。グルコースに対するこの選好性は、グルコース抑制、および炭素カタボライト抑制と呼ばれている（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、２００８年；ＧｏｒｋｅおよびＳｔｕｌｋｅ、２００８年）。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ、例えばＰＡＬ発現は、ＣＲＰ結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ発現は、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲプロモーターによって制御される。これらの実施形態では、環状ＡＭＰは、グルコースが環境中に存在しない場合にＣＲＰに結合する。この結合により、ＣＲＰの立体配座変化が引き起こされ、ＣＲＰがその結合部位に強く結合することを可能にする。次いで、ＣＲＰ結合は、直接的タンパク質間相互作用を介してＦＮＲプロモーターに対してＲＮＡポリメラーゼを動員することにより、ＰＭＥ遺伝子、例えばＰＡＬ遺伝子の転写を活性化する。グルコースの存在下で、環状ＡＭＰはＣＲＰに結合せず、ＰＭＥ、例えばＰＡＬ遺伝子転写が抑制される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子についての結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）は、例えば、グルコースをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地に添加することによって十分な量のグルコースが存在する場合に、ＰＭＥ、例えばＰＡＬが嫌気的条件下で発現されないこと確実にするために使用される。
【００８８】
別の実施形態では、ＰＭＥ、例えばＬＡＡＤは、発現がグルコースの存在下で抑制されるように、転写活性化因子、例えばＣＲＰについての結合部位に融合した誘導可能なプロモーターの制御下で発現される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤはＦＮＲプロモーターの制御下にはない。ＬＡＡＤはフェニルアラニンのフェニルピルベートへの分解を触媒するために酸素を必要とする。したがって、最低限の活性である厳密に嫌気的条件下でＬＡＡＤ発現を誘導することは望ましくない（図２５）。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬまたはＬＡＡＤは、環境（例えば、哺乳動物の消化管）内の特異的分子または代謝産物に対して応答する誘導可能なプロモーターの制御下で発現される。例えば、短鎖脂肪酸プロピオネートは、消化管に局在する主要な微生物発酵代謝産物である（Ｈｏｓｓｅｉｎｉら、２０１１年）。一実施形態では、ＰＡＬ遺伝子発現はプロピオネートにより誘導可能なプロモーターの制御下にある。より特定の実施形態では、ＰＭＥ遺伝子発現は、哺乳動物の消化管内のプロピオネートの存在によって活性化されるプロピオネートにより誘導可能なプロモーターの制御下にある。健康および／または疾患状態において、哺乳動物の消化管に見出される任意の分子または代謝産物はＰＭＥ遺伝子発現を誘導するために使用され得る。非限定的な例には、プロピオネート、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋、および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニア、およびマンガンが含まれる。代替の実施形態では、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子発現は、糖アラビノースの存在下で活性化されるＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。一実施形態では、ＬＡＡＤ発現はＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。一実施形態では、ＬＡＡＤの発現は好気的または微好気的条件下で発生する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、当該分野において公知の方法、例えば、リボソーム結合部位の最適化、転写調節因子の操作、および／またはｍＲＮＡ安定性の増加によってさらに最適化される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬが宿主細胞において発現され得、宿主細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば培地中、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば消化管中で生存および／または増殖できるように、ＰＡＬ遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は２つ以上の異なるＰＡＬ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は同じＰＡＬ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、低酸素または嫌気条的件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
【００９３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤが宿主細胞において発現され得、宿主細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば培地中、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば消化管中で生存および／または増殖できるように、ＬＡＡＤ遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は２つ以上の異なるＬＡＡＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は同じＬＡＡＤ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、例えばアラビノースまたはテトラサイクリンによって誘導可能であるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体に存在し、例えばアラビノースによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
【００９４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲ、および異なる細菌種由来の対応するプロモーターを含む。非天然の酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、同じ条件下で細菌における天然の転写調節因子およびプロモーターと比較して、低酸素または嫌気的環境において、前記プロモーターに作動可能に連結している遺伝子、例えばＰＡＬの転写を増加させる。特定の実施形態では、非天然の酸素レベル依存性転写調節因子は、ナイセリア・ゴノレア（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）由来のＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１年を参照のこと）。いくつかの実施形態では、対応する野生型の転写調節因子はインタクトなままであり、野生型活性を保持する。代替の実施形態では、対応する野生型の転写調節因子は、野生型活性を低減させるか、または除去するように欠失または突然変異される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型の酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲ、および同じ亜型の細菌由来の野生型のプロモーターと比較して突然変異されている対応するプロモーターを含む。突然変異したプロモーターは、同じ条件下で野生型のプロモーターと比較して、低酸素または嫌気的環境において、野生型の転写調節因子への結合を向上させ、前記プロモーター、例えばＰＡＬに作動可能に連結している遺伝子の転写を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型の酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲプロモーター、および同じ亜型の細菌由来の野生型の転写調節因子に対して突然変異されている対応する転写調節因子を含む。突然変異した転写調節因子は、同じ条件下で野生型の転写調節因子と比較して、低酸素または嫌気的環境において、野生型プロモーターへの結合を向上させ、前記プロモーター、例えばＰＡＬに作動可能に連結している遺伝子の転写を増加させる。特定の実施形態では、突然変異した酸素レベル依存性転写調節因子は、二量体化およびＦＮＲ活性を向上させるアミノ酸置換を含むＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅら、２００６年を参照のこと）。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、酸素レベル検知転写調節因子をコードする内因性遺伝子、例えばＦＮＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびＰＡＬをコードする遺伝子は異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびＰＡＬをコードする遺伝子は同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびＰＡＬをコードする遺伝子は異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびＰＡＬをコードする遺伝子は同じ染色体上に存在する。いくつかの場合、発現安定性を向上させるために誘導可能なプロモーターの制御下で酸素レベル検知転写調節因子を発現することが有益であり得る。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子およびフェニルアラニン代謝酵素はプロモーター領域から多岐に転写される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非修飾の細菌と比較して、血中フェニルアラニンを少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍低減させるために、哺乳動物の消化管の低酸素環境などの外因性環境条件下でＰＡＬを産生する。特定の非修飾細菌は感知できるレベルのフェニルアラニンプロセシングを有さない。これらの細菌の遺伝子組換え型を使用した実施形態では、フェニルアラニンのＰＡＬ媒介性プロセシングは外因性環境条件下で感知できる。フェニルアラニンは当該分野において公知の方法、例えば、血液採取および質量分析によって測定され得る。いくつかの実施形態では、シンナメートはＰＡＬ活性を評価するために当該分野において公知の方法によって測定される。シンナメート産生はフェニルアラニン分解と直接的に相関し、いくつかの実施形態では、シンナメートは、株活性についての代替のバイオマーカーとして使用され得る（図１６Ｂ）。シンナメートは肝酵素によって馬尿酸にさらに分解され得、両方は実施例２４〜２６に記載されるように測定され得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ発現はＰＡＬ活性を評価するために当該分野において公知の方法によって測定される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非修飾細菌と比較して、血中フェニルアラニンを少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍低減させるためにＬＡＡＤを産生する。特定の非組換え細菌は感知できるレベルのフェニルアラニンプロセシングを有さない。これらの細菌の遺伝子組換え型を使用した実施形態では、フェニルアラニンのＬＡＡＤ媒介性プロセシングは外因性環境条件下で感知できる。フェニルアラニンは当該分野において公知の方法、例えば、血液採取および質量分析によって測定され得る。ＬＡＡＤにより生成した分解産物であるピルビン酸およびフェニルピルベートは、実施例２４〜２６に記載されるように質量分析を使用して測定され得、ＬＡＡＤ活性のさらなる読み出し情報として使用され得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨは、低コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは非誘導条件下で発現の漏れを減少させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨは、高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ発現を増加させるのに有用であり得、それによってフェニルアラニンの代謝を増加させ、高フェニルアラニン血症を低減させる。いくつかの実施形態では、高コピープラスミド上で発現されるＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨを含む遺伝子操作された細菌は、異種ｐｈｅＰおよび天然ｐｈｅＰのさらなるコピーの非存在下で、低コピープラスミド上で発現される同じＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨを含む遺伝子操作された細菌と比較してフェニルアラニン代謝を増加させないか、またはフェニルアラニンレベルを減少させない。高および低コピープラスミド上の同じＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子を含む遺伝子操作された細菌が生成された。例えば、高コピープラスミドおよび低コピープラスミド上のＰＡＬ１またはＰＡＬ３のいずれかが生成され、各々は代謝され、フェニルアラニンを同様のレベルまで低減させた（図１５）。したがって、いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝の律速段階はフェニルアラニン利用可能性である（例えば、図１６を参照のこと）。これらの実施形態では、細胞へのフェニルアラニン輸送を増加させ、それによってフェニルアラニン代謝を向上させることが有益であり得る。ｐｈｅＰと併せて、低コピーＰＡＬプラスミドでさえ、試験試料からＰｈｅをほぼ完全に除去することができる（例えば、図１６Ａを参照のこと）。さらに、ｐｈｅＰを組み込んでいるいくつかの実施形態では、高フェニルアラニン代謝を維持しながらＰＡＬ発現の安定性を向上させ、形質転換した細菌上の負の選択圧を低減させるために、併用して低コピーＰＡＬ発現プラスミドを使用することがさらに有益であり得る。代替の実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは高コピープラスミドと併用して使用される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、トランスポーターはフェニルアラニン分解を増加させることができない。例えば、プロテウス・ミラビリスＬＡＡＤは、酵素触媒作用が周辺質で発生する細胞膜に局在する。フェニルアラニンは、トランスポーターを必要とせずに外膜を容易に横切ることができる。したがって、遺伝子操作された細菌がＬＡＡＤを発現する実施形態では、トランスポーターは、フェニルアラニン代謝を必要としなくてもよいか、または改善しなくてもよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子は染色体上で発現される。いくつかの実施形態では、染色体からの発現はＰＭＥの発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子は、遺伝子操作された細菌における１つまたは複数の組み込み部位において細菌染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ、ｔｈｙＡ、およびｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数において細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位が使用されてもよい（例えば、図３６を参照のこと）。挿入部位は、ゲノム内、例えば、（栄養要求株を作製するために）ｔｈｙＡなどの生存および／もしくは増殖に必要とされる遺伝子内、ゲノム複製部位付近などのゲノムの活性領域内、ならびに／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣとの間などの、意図しない転写のリスクを低減させるために分岐プロモーターの間のいずれの場所にあってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤの１個より多いコピー、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多いコピーが、遺伝子操作された細菌における１つまたは複数の組み込み部位において細菌染色体に組み込まれる。ＰＭＥ遺伝子の１個より多いコピーは、同じＰＭＥ遺伝子の１個より多いコピーまたは異なるＰＭＥ遺伝子の１個より多いコピーであってもよい。
【０１０２】
例示的な構築物は以下の４〜１３に示される。表４は、染色体への挿入のためのＰｈｅＰおよびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２１）を示し、ｐｈｅＰ配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表５は、高コピープラスミド上でＰＡＬ１およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２２）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表６は、高コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２３）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表７は、高コピープラスミド上のＰＡＬ１およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２４）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表８は、高コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２５）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表９は、低コピープラスミド上のＰＡＬ１およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２６）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表１０は、低コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２７）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表１１は、低コピープラスミド上のＰＡＬ１およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２８）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表１２は、低コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２９）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表１３は、ｐｈｅＰをコードする遺伝子、ＴｅｔＲをコードする遺伝子、および染色体への挿入のためのＴｅｔプロモーター配列を含む例示的な構築物の配列（配列番号３０）を示し、ｐｈｅＰ配列には下線を引き、ＴｅｔＲ配列は四角で囲い、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。
【０１０３】
【表４−１】
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【表４−２】
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【０１０４】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【０１０５】
【表６−１】
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【表６−２】
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【０１０６】
【表７−１】
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【表７−２】
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【０１０７】
【表８−１】
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【表８−２】
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【０１０８】
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【０１０９】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【０１１０】
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【０１１１】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【０１１２】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【０１１３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は配列番号２１〜３０のいずれかのうちの１つまたは複数の配列を含む遺伝子配列を含有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２１〜３０の配列のうちのいずれかと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の配列を含む遺伝子配列を含有する。
【０１１４】
フェニルアラニン輸送
ＰＡＬ１およびＰＡＬ３の各々は、遺伝子操作された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおいて高コピープラスミドおよび低コピープラスミド上で発現された。驚くべきことに、各々の構築物は、フェニルアラニンを同様のレベルまで代謝し、低減させ（図１５）、フェニルアラニン代謝の律速段階はフェニルアラニン利用可能性であった（図１６）。したがって、いくつかの実施形態では、細胞へのフェニルアラニン輸送を増加させ、それによってフェニルアラニン代謝を向上させることが有益である。予想外に、低コピーＰＡＬプラスミドでさえ、ｐｈｅＰと併用して発現されると、試験試料からＰｈｅをほぼ完全に除去することができる（図１６Ａ）。さらに、高フェニルアラニン代謝を維持しながらＰＡＬ発現の安定性を向上させ、形質転換した細菌上の負の選択圧を低減させるために、ｐｈｅＰと併用して低コピーＰＡＬ発現プラスミドを使用することはさらに有益であり得る。代替の実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは高コピープラスミドと併用して使用される。
【０１１５】
遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子をさらに含む。フェニルアラニントランスポーターは、細胞へのフェニルアラニン輸送を向上させるために、本発明の遺伝子操作された細菌において発現され得るか、または修飾され得る。
【０１１６】
ＰｈｅＰは、細菌細胞にフェニルアラニンを輸送できる膜輸送タンパク質である（例えば、Ｐｉら、１９９１年を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換え細菌における天然のｐｈｅＰ遺伝子は修飾されていない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は天然のｐｈｅＰ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は非天然のｐｈｅＰ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、その天然のプロモーター、誘導可能なプロモーター、天然のプロモーターより強力なプロモーター、例えばＧｌｎＲＳプロモーターもしくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御されるｐｈｅＰ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子ならびにフェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子は、プロモーター領域から多岐に転写される。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰ、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の各々の発現は、異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰ、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の発現は、同じプロモーターによって制御される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細菌における天然のｐｈｅＰ遺伝子は修飾されず、天然のｐｈｅＰ遺伝子の１つまたは複数のさらなるコピーが、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム内に挿入される。代替の実施形態では、天然のｐｈｅＰ遺伝子は修飾されず、異なる細菌種由来の非天然のｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム内に挿入される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細菌における天然のｐｈｅＰ遺伝子は修飾されず、天然のｐｈｅＰ遺伝子の１つまたは複数のさらなるコピーが、プラスミド上で、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＭＥの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。代替の実施形態では、天然のｐｈｅＰ遺伝子は修飾されず、異なる細菌種由来の非天然のｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、プラスミド上で、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、天然のｐｈｅＰ遺伝子は突然変異誘発され、フェニルアラニン輸送の増加を示す突然変異体が選択され、突然変異誘発されたｐｈｅＰ遺伝子は単離され、遺伝子操作された細菌に挿入される（例えば、Ｐｉら、１９９６年；Ｐｉら、１９９８年を参照のこと）。本明細書に記載されるフェニルアラニントランスポーター修飾はプラスミドまたは染色体上に存在し得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のｐｈｅＰ遺伝子は修飾されず、１つまたは複数のさらなるコピーの天然の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ  ｐｈｅＰ遺伝子が、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノム内に挿入される。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のｐｈｅＰ遺伝子は修飾されず、異なる細菌由来の非天然のｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノム内に挿入される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のｐｈｅＰ遺伝子は修飾されず、１つまたは複数のさらなるコピーの天然の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ  ｐｈｅＰ遺伝子は、プラスミド上で、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のｐｈｅＰ遺伝子は修飾されず、異なる細菌由来の非天然のｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、プラスミド上で、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。
【０１２１】
大腸菌は、芳香族アミノ酸を蓄積するための５つの異なる輸送系（ＡｒｏＰ、Ｍｔｒ、ＰｈｅＰ、ＴｎａＢ、およびＴｙｒＰ）を有することが報告されている。ａｒｏＰ遺伝子によってコードされる一般的なアミノ酸ペルメアーゼは、フェニルアラニンを含む３つの芳香族アミノ酸を高親和性で輸送し、ＰｈｅＰと一緒に、フェニルアラニン取り込みの大部分を担うと考えられている。さらに、フェニルアラニンの低レベルの蓄積が芳香族アミノ酸トランスポーター欠損大腸菌株（ΔａｒｏＰ  ΔｐｈｅＰ  Δｍｔｒ  Δｔｎａ  ΔｔｙｒＰ）において観察され、ＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系の活性まで追跡され、そのＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系は、２つの周辺質結合タンパク質である、ＬＩＶ結合タンパク質（ＬＩＶ−Ｉ系）およびＬＳ結合タンパク質（ＬＳ系）、ならびに膜成分、ＬｉｖＨＭＧＦからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである（Ｋｏｙａｎａｇｉら、およびその中の参考文献；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｓ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｒｄ  Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はａｒｏＰ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のａｒｏＰ遺伝子は修飾されず、天然の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ  ａｒｏＰ遺伝子の１つまたは複数のさらなるコピーが、プラスミド上または染色体中で、ＰＭＥの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、もしくはａｒａＢＡＤプロモーター、ＰＭＥの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然のａｒｏＰ遺伝子は修飾されず、異なる細菌由来の非天然のａｒｏＰ遺伝子のコピーは、プラスミド上または染色体中で、ＰＭＥの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばＦＮＲプロモーターもしくはＡｒａＢＡＤプロモーター、またはＰＭＥの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、あるいは構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。
【０１２３】
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じまたは異なる誘導可能なまたは構成的プロモーターの制御下で、ＡｒｏＰおよびＰｈｅＰを含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子は染色体上で発現される。いくつかの実施形態では、染色体からの発現はｐｈｅＰの発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子は遺伝子操作された細菌における１つまたは複数の組み込み部位において細菌染色体内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ、ｔｈｙＡ、およびｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数において細菌ゲノム内に挿入される。任意の適切な挿入部位が使用されてもよい（例えば、図３６を参照のこと）。挿入部位は、ゲノム内、例えば、（栄養要求株を作製するために）ｔｈｙＡなどの生存および／もしくは増殖に必要とされる遺伝子内、ゲノム複製部位付近などのゲノムの活性領域内、ならびに／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣとの間などの、意図しない転写のリスクを低減させるために分岐プロモーターの間のいずれの場所にあってもよい。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は複数の作用機構および／または１つもしくは複数の栄養要求性を含む。特定の実施形態では、細菌は、染色体上の異なる組み込み部位（例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＰ／Ｔ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ、およびｃｅａ）において挿入される酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３）の制御下でＰＡＬの５つのコピー、および染色体上の異なる組み込み部位（例えば、ｌａｃＺ）において挿入される酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）の制御下でフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１つのコピーを含むように遺伝子操作される。より特定の態様では、細菌は、カナマイシン耐性遺伝子、およびｔｈｙＡ栄養要求性をさらに含むように遺伝子操作され、ｔｈｙＡ遺伝子は欠失され、および／または非関連遺伝子と置き換えられる。
【０１２６】
複数の作用機構
いくつかの実施形態では、細菌は、複数の作用機構（ＭｏＡ）、例えば、（例えば、コピー数を向上させるために）同じ生成物の複数のコピーを生成する回路または複数の異なる機能を実行する回路を含むように遺伝子操作される。挿入部位の例には、限定されないが、ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔ、ｄａｐＡ、およびｃｅａ、ならびに図３６に示されるその他が含まれる。例えば、遺伝子操作された細菌は、４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、およびｌａｃＺにおいて挿入されたＰＡＬの４つのコピーを含んでもよい。遺伝子操作された細菌はまた、４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ、およびｃｅａにおいて挿入されたＰＡＬの４つのコピー、ならびに異なる組み込み部位、例えば、ｌａｃＺにおいて挿入されたフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１つのコピーを含んでもよい（図１３Ｂ）。あるいは、遺伝子操作された細菌は、３つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、およびｌａｃＺにおいて挿入されたＰＡＬの３つのコピー、ならびに３つの異なる挿入部位、例えば、ｄａｐＡ、ｃｅａ、およびａｒａＣ／ＢＡＤにおいて挿入されたフェニルアラニントランスポーター遺伝子の３つのコピーを含んでもよい。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（１）野生型または（安定性または代謝活性を増加させるための）突然変異型においてフェニルアラニンを分解するためＰＡＬ、ＰＡＨ、ＬＡＡＤ、（２）野生型または（安定性または代謝活性を増加させるための）突然変異型においてフェニルアラニンを取り込むためのトランスポーターＰｈｅＰまたはＡｒｏＰ、（３）分泌および細胞外フェニルアラニン分解のためのＰＡＬ、ＰＡＨ、ＬＡＡＤ、および／またはＰｈｅＰ、（４）本明細書に記載されているような分泌機構の成分、（５）栄養要求性、例えば、デルタＴｈｙＡ、（６）限定されないが、カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性を含む抗生物質耐性、（７）本明細書に記載されているように酸素代謝に関与する遺伝子の突然変異／欠失ならびに（８）内因性Ｎｉｓｓｌｅフェニルアラニン合成経路の遺伝子の突然変異／欠失（例えば、Ｐｈｅ栄養要求性についてデルタＰｈｅＡ）のうちの１つまたは複数を含む。
【０１２８】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下に）およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＨの１つまたは複数のコピーおよびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＨの１つまたは複数のコピーおよびＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。ＰＭＥおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。
【０１２９】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、ＰＡＨの１つまたは複数のコピー、およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、ＰＡＨの１つまたは複数のコピー、およびＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。あるいは、ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは、低または高コピープラスミドに含まれるＰＭＥおよび／またはトランスポーターと組み合わせて、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。
【０１３０】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つまたは複数のコピー、例えば（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つまたは複数のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。ＰＭＥおよびトランスポーターは本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。あるいは、ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。
【０１３１】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。ＰＭＥおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。あるいは、配置されたＰＭＥおよび／またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。
【０１３２】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。
【０１３３】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの３つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの３つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。
【０１３４】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。
【０１３５】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。
【０１３６】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌のための１つまたは複数のＰＭＥと組み合わせてフェニルアラニンを代謝するための１つまたは複数のＰＭＥを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌のための１つまたは複数のＰＭＥと組み合わせてフェニルアラニンを代謝するための１つまたは複数のＰＭＥおよびフェニルアラニントランスポーターを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌のための１つまたは複数のＰＭＥと組み合わせてフェニルアラニンを代謝するための１つまたは複数のＰＭＥおよびフェニルアラニントランスポーターを含み、また、栄養要求性および／または抗生物質耐性も含む。本明細書に記載される分泌系は、複数の作用機構を有する遺伝子操作された細菌においてＰＭＥを分泌するために利用される。
【０１３７】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（野生型遺伝子に加えて）ＰｈｅＰの２つのさらなるコピーを含む。これにより、ＰｈｅＰ遺伝子の１つが突然変異を獲得する場合に冗長性が提供される。一実施形態では、ＰｈｅＰ遺伝子はｌａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌにおいて挿入される。一実施形態では、ＰｈｅＰの２つのコピーはＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬ３の３つのコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐｌにおいて挿入されたＰＡＬ３の３つのコピーを含む。一実施形態では、ＰＡＬ３の３つのコピーの発現はＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤの１つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌はアラビノースオペロンにおいて挿入されたＬＡＡＤの１コピーを含む。一実施形態では、ＬＡＡＤは内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗生物質耐性および栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡを含まない。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗生物質耐性を含まない。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗生物質耐性も、栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡも含まない。
【０１３８】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー、例えばＰＡＬ３、ＰｈｅＰの２つのコピー（内因性ＰｈｅＰに加えて）、およびＬＡＡＤの１つのコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー、例えばＰＡＬ３、ＰｈｅＰの２つのコピー（内因性ＰｈｅＰに加えて）、およびＬＡＡＤの１つのコピー、ならびに栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー、ＰｈｅＰの２つのコピー（内在性ＰｈｅＰに加えて）、およびＬＡＡＤの１つのコピー、ならびに抗生物質耐性遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー、ＰｈｅＰの２つのコピー（内因性ＰｈｅＰに加えて）、およびＬＡＡＤの１つのコピー、ならびに抗生物質耐性遺伝子および栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡを含む。
【０１３９】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、ならびに抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、ならびに栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、ならびに抗生物質耐性および栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡを含む。
【０１４０】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位において挿入される）、ＰｈｅＰの２つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位において挿入される）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンにおいて挿入される）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位において挿入される）、ＰｈｅＰの２つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位において挿入される）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンにおいて挿入される）を含み、さらに抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位において挿入される）、ＰｈｅＰの２つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位において挿入される）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（内在性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンにおいて挿入される）を含み、栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡをさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位において挿入される）、ＰｈｅＰの２つのコピー（各々、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位において挿入される）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンにおいて挿入される）を含み、抗生物質耐性および栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡをさらに含む。
【０１４１】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌はＳＹＮ−ＰＫＵ７０５である。一実施形態では、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５は抗生物質耐性をさらに含む。一実施形態では、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５は、栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡをさらに含む。一実施形態では、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５は、抗生物質耐性および栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡをさらに含む。
【０１４２】
表１４は、本開示の遺伝子操作された細菌の非限定的な例を含む。特定の実施形態では、表１４の遺伝子操作された細菌は分泌のためのＰＭＥをさらに含む。
【０１４３】
【表１４−１】
2018515106.tif 000035
【表１４−２】
2018515106.tif 000036
【表１４−３】
2018515106.tif 000037
【０１４４】
分泌
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌細胞質から目的のタンパク質または治療用タンパク質、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬまたはＬＡＡＤを分泌することができる天然の分泌機構（例えば、グラム陽性細菌）または非天然の分泌機構（例えば、グラム陰性細菌）をさらに含む。多くの細菌は細菌細胞外被を横切って基質を輸送するために高度な分泌系に進化している。小分子、タンパク質、およびＤＮＡなどの基質は、細胞外間隙または周辺質（消化管内腔または他の間隙など）内に放出され得、標的細胞内に注入され得るか、または細菌膜に付随され得る。
【０１４５】
グラム陰性細菌において、分泌機構は内膜および外膜の一方または両方に及んでもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は非天然の二重膜貫通分泌系をさらに含む。二重膜貫通分泌系には、限定されないが、Ｉ型分泌系（Ｔ１ＳＳ）、ＩＩ型分泌系（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ）、ＶＩ型分泌系（Ｔ６ＳＳ）、および多剤排出ポンプの耐性−結節形成−分裂（ＲＮＤ）ファミリーが含まれる（本明細書に参照として組み込まれる、Ｐｕｇｓｌｅｙ  １９９３年；Ｇｅｒｌａｃｈら、２００７年；Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎら、２０１５年；Ｃｏｓｔａら、２０１５年；Ｒｅｅｖｅｓら、２０１５年；ＷＯ２０１４１３８３２４Ａ１）。このような分泌系の例は図３〜６に示される。グラム陰性のような細胞外被を有するマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）もまた、ＶＩＩ型分泌系（Ｔ７ＳＳ）をコードできる（Ｓｔａｎｌｅｙら、２００３年）。Ｔ２ＳＳを除いて、二重膜貫通分泌物は一般に、基質を細菌細胞質から細胞外間隙内または標的細胞内に直接輸送する。対照的に、外膜のみを貫通するＴ２ＳＳおよび分泌系は二段階機構を使用することができ、基質は内膜貫通トランスポーターによって最初に周辺質へ移行し、次いで外膜に移動するか、または細胞外間隙内に分泌される。外膜貫通分泌系には、限定されないが、Ｖ型分泌またはオートトランスポーター系（Ｔ５ＳＳ）、ｃｕｒｌｉ線毛分泌系、および線毛構築のためのシャペロン−アッシャー経路が含まれる（Ｓａｉｅｒ、２００６年；Ｃｏｓｔａら、２０１５年）。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌、ビブリオ属（Ｂｉｖｒｉｏ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来のＩＩＩ型またはＩＩＩ型様分泌系（Ｔ３ＳＳ）をさらに含む。Ｔ３ＳＳは、タンパク質を細菌細胞質からニードル複合体を介して宿主細胞質に輸送できる。Ｔ３ＳＳは、細菌細胞質から分子を分泌するが、宿主細胞質内に分子を注入しないように修飾され得る。したがって、分子は消化管腔または他の細胞外間隙内に分泌される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、前記修飾されたＴ３ＳＳを含み、目的のタンパク質または治療用タンパク質を細菌細胞質から分泌できる。いくつかの実施形態では、異種タンパク質またはペプチド、例えば、目的のタンパク質または治療用タンパク質、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬまたはＬＡＡＤなどの分泌された分子は、目的のタンパク質または治療用タンパク質が細菌から分泌することを可能にするＩＩＩ型分泌配列を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、鞭毛ＩＩＩ型分泌経路が、目的の分子、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬまたはＬＡＡＤを分泌するために使用される。いくつかの実施形態では、不完全な鞭毛が、ペプチドを天然の鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに組換えにより融合することによって、目的の治療用ペプチド、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬまたはＬＡＡＤを分泌するために使用される。このように、細胞内で発現されたキメラペプチドは、内膜および外膜を横切って周囲の宿主環境内に動員され得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、Ｖ型オートトランスポーター分泌系が、治療用ペプチド、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬまたはＬＡＡＤを分泌するために使用される。比較的大きなタンパク質フラックスを扱う機構および能力の簡潔さに起因して、Ｖ型分泌系は組換えタンパク質の細胞外産生にとって魅力的である。図１０に示されるように、治療用ペプチド（星印）は、オートトランスポーターのＮ末端分泌シグナル、リンカー、およびベータ−ドメインに融合され得る。Ｎ末端シグナル配列はタンパク質をＳｅｃＡ−ＹＥＧ機構に導き、これは、タンパク質を、内膜を横切って周辺質に移動させ、続いてシグナル配列を切断する。ベータ−ドメインはＢａｍ複合体（「ベータ−バレル構築機構（Ｂｅｔａ−ｂａｒｒｅｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）」）に動員され、そこでベータ−ドメインは折り畳まれ、ベータ−バレル構造として外膜に挿入される。治療用ペプチド、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬまたはＬＡＡＤは、リンカー配列の前のベータ−バレル構造の中空孔に通される。細胞外環境に曝露されると、治療用ペプチド、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬまたはＬＡＡＤは、自己触媒的切断（Ｂａｍ複合体の左側）によって、または膜結合ペプチダーゼ（ブラックシザー（ｂｌａｃｋ  ｓｃｉｓｓｏｒ）；Ｂａｍ複合体の右側）をリンカーにおける相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）プロテアーゼ切断部位にターゲティングすることによってリンカー系から解放され得る。したがって、いくつかの実施形態では、異種タンパク質またはペプチド、例えば、目的のタンパク質または治療用タンパク質などの分泌分子は、分子が細菌から分泌できるようにオートトランスポーターのＮ末端分泌シグナル、リンカー、およびベータ−ドメインを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、溶血素ベースの分泌系が、目的の分子、例えば、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬまたはＬＡＡＤを分泌するために使用される。Ｉ型分泌系は、それらのパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外間隙に直接移行させる利点を与え、他の分泌型の２段階プロセスを不要にする。図１１は、尿路病原性大腸菌のアルファ−溶血素（ＨｌｙＡ）を示す。この経路は、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターであるＨｌｙＢ；膜融合タンパク質であるＨｌｙＤ；および外膜タンパク質であるＴｏｌＣを使用する。これらの３つのタンパク質の集合体は内膜および外膜の両方を通るチャネルを形成する。天然では、このチャネルはＨｌｙＡを分泌するために使用されるが、本開示の治療用ペプチドを分泌するために、ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分が、このペプチドの分泌を媒介するように治療用ペプチド（星印）のＣ末端部分に融合される。
【０１５０】
代替の実施形態では、遺伝子操作された細菌は非天然の単一膜貫通分泌系をさらに含む。単一膜貫通エクスポーターは、分泌系の成分として機能してもよいか、または基質を独立して輸送してもよい。このようなエクスポーターには、限定されないが、ＡＴＰ結合カセットトランスロカーゼ、鞭毛／毒性関連トランスロカーゼ、コンジュゲーション関連トランスロカーゼ、一般的な分泌系（例えば、大腸菌におけるＳｅｃＹＥＧ複合体）、マイコバクテリアおよびグラム陽性細菌のいくつかの種類（例えば、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニ、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））における補助的分泌系ならびにツイン−アルギニン透過（ＴＡＴ）系が含まれる（Ｓａｉｅｒ、２００６年；ＲｉｇｅｌおよびＢｒａｕｎｓｔｅｉｎ、２００８年；Ａｌｂｉｎｉａｋら、２０１３年）。一般的な分泌およびＴＡＴ系の両方は、切断可能なＮ末端シグナルペプチドを有する基質を周辺質に輸送でき、生物薬剤生産という観点から調査されていることが知られている。しかしながら、ＴＡＴ系は折り畳まれた基質を輸送することができるので、早すぎるまたは不正確な折り畳みの可能性を排除するという点で、特定の利点を与えることができる。特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌はＴＡＴまたはＴＡＴ様系を含み、細菌細胞質由来の目的のタンパク質または治療用タンパク質、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬまたはＬＡＡＤを分泌することができる。当業者は、本明細書に開示される分泌系が、細菌の異なる種、株、および亜型において作用するように修飾されてもよく、および／または異なるペイロードを送達するように適合されてもよいことを理解する。
【０１５１】
タンパク質、例えば、治療用ポリペプチド、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬまたはＬＡＡＤを細胞外間隙に移行するために、ポリペプチドは最初に細胞内で翻訳され、内膜を横切って動員され、最終的に外膜を横切って動員されなければならない。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）−特に真核生物起源のもの−は、三次および四次構造を安定化させるためにジスルフィド結合を含有する。外膜を横切ってポリペプチドを移行させるために、これらの結合は周辺質シャペロンの支援を受けて酸化周辺質区画内で正確に形成することができるが、ジスルフィド結合は還元されなければならず、タンパク質は再び折り畳まれなくなる。
【０１５２】
グラム陰性細菌−特にジスルフィド結合を必要とするもの−において適切に折り畳まれたタンパク質を分泌する１つの方法は、不安定化した外膜を有する細菌において周辺質を標的とすることである。このように、タンパク質は酸化環境内に動員され、適切に折り畳まれ得る。組織化された細胞外分泌系とは対照的に、次いでタンパク質は膜漏出によって正確に折り畳まれた形態で周辺質間隙を回避することができる。したがって、これらの「漏出性」グラム陰性突然変異体は生物活性の適切にジスルフィド結合したポリペプチドを分泌することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、「漏出性」または不安定化外膜を有する。漏出を誘導するための細菌外膜の不安定化は、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、およびｎｌｐｌを含む、強固なペプチドグリカン骨格に外膜をつなぎ止めることを担う遺伝子を欠失させるか、または突然変異誘発することよって達成され得る。Ｌｐｐは、１個の細胞当たり約５００，０００個のコピーで存在する細菌細胞中の最も豊富なポリペプチドであり、ペプチドグリカンに対する細菌細胞壁の主要な「ステープル」として機能する。Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｋａｈｎｅ，Ｄ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｓ．  Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２、ａ０００４１４（２０１０年）。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出性表現型を生成するための他の欠失標的である。さらに、周辺質プロテアーゼが失活すると、漏出性表現型が観察された。周辺質にはタンパク質が非常に高密度に充填され、したがってタンパク質の代謝回転を促進するためにいくつかの周辺質タンパク質をコードする。ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐＩなどの周辺質プロテアーゼの除去は、周辺質タンパク質の過剰な蓄積を促すことによって漏出性表現型を誘導することができる。プロテアーゼの突然変異はまた、これらのプロテアーゼによって標的化された分解を阻止することによってエフェクターポリペプチドを保存することができる。さらに、これらの突然変異の組合せは、細胞生存を大きく犠牲にせずに細胞の漏出性表現型を相乗的に向上させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、操作された細菌は１つまたは複数の欠失または突然変異した膜遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は欠失または突然変異したｌｐｐ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、およびｏｍｐＦ遺伝子から選択される１つまたは複数の欠失または突然変異した遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、およびｐａｌ遺伝子から選択される１つまたは複数の欠失または突然変異した遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つまたは複数の欠失または突然変異した周辺質プロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、およびｎｌｐｌから選択される１つまたは複数の欠失または突然変異した周辺質プロテアーゼ遺伝���を有する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、およびｎｌｐｌ遺伝子から選択される１つまたは複数の欠失または突然変異した遺伝子を有する。
【０１５３】
細胞生存に対する妨害を最小化するために、漏出性表現型は、１つもしくは複数の膜または例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、およびｎｌｐｌから選択される周辺質プロテアーゼ遺伝子を誘導可能なプロモーターの制御下に配置することによって誘導可能になり得る。例えば、ｌｐｐまたは他の細胞壁安定タンパク質または周辺質プロテアーゼの発現は、治療用ポリペプチドが送達される（分泌される）のに必要とされる条件において抑制され得る。例えば、誘導条件下で、転写リプレッサータンパク質または設計されたアンチセンスＲＮＡが発現され得、これにより標的膜または周辺質プロテアーゼ遺伝子の転写または翻訳が低減する。反対に、特定のペプチドの過剰発現は、不安定化した表現型、例えば、コリシンまたはＴｏｌＡの第３のトポロジカルドメインの過剰発現をもたらし得、ペプチド過剰発現は、治療ポリペプチドが送達される（分泌される）のに必要とされる条件において誘導され得る。これらの種類のストラテジーは、壊れやすい、漏出性表現型をバイオマス産生から分離する。したがって、いくつかの実施形態では、操作された細菌は、誘導可能なプロモーターの制御下で１つもしくは複数の膜および／または周辺質プロテアーゼ遺伝子を有する。
【０１５４】
表１５および表１６はグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌についての分泌系を列挙している。それらは、操作された細菌由来のポリペプチド、目的のタンパク質または治療用タンパク質を分泌するために使用され得、Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈ．Ｓａｉｅｒ，Ｊｒ．Ｍｉｃｒｏｂｅ／Ｖｏｌｕｍｅ  １、Ｎｕｍｂｅｒ  ９、２００６年「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｏｓｓｅｓｓ  ｍａｎｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｈａｔ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ」に概説されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
【表１５】
2018515106.tif 000038
【０１５６】
【表１６−１】
2018515106.tif 000039
【表１６−２】
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【０１５７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤの分泌のための本明細書に記載される天然または非天然の分泌系を含む。いくつかの実施形態では、分泌系は、修飾されたＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、溶血素分泌系）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、およびＶＩＩ型分泌系、耐性−結節形成−分裂（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、単一膜分泌系、Ｓｅｃおよび、ＴＡＴ分泌系から選択される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によって分泌されたＰＭＥはプロテアーゼに対する耐性を増加させるように修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、投与される１つまたは複数のＰＭＥは、Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、２０１１年、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．２０１１年１１月；１０４（３）：２４９〜２５４頁に記載されるように修飾され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、分泌されたＰＡＬはＡｖ−ｐ．Ｃ５０３Ｓ／ｐ．Ｃ５６５Ｓ／ｐ．Ｆ１８Ａ  ＰＡＬである。いくつかの実施形態では、分泌されたＰＡＬはＰＥＧ−Ａｖ−ｐ．Ｃ５０３Ｓ／ｐ．Ｃ５６５Ｓ／ｐ．Ｆ１８Ａ  ＰＡＬである。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、分泌のための１つまたは複数のＰＭＥは、本明細書に記載されるように誘導可能なプロモーターの制御下にある。一例では、１つまたは複数のＰＭＥはＦＮＲプロモーターの制御下にあり、嫌気的条件下で産生され、分泌される。いくつかの実施形態では、分泌のためのＰＭＥはＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、分泌のためのＰＭＥは構成的プロモーターの制御下にある。
【０１６０】
１つまたは複数のＰＭＥが微生物から分泌または輸送されるいくつかの実施形態では、操作された微生物は分泌タグを含む遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＭＥは、ＰＭＥを特異的分泌系に誘導するためにＲＮＡまたはペプチド起源のいずれかの「分泌タグ」を含む。例えば、Ｉ型溶血素分泌系についての分泌タグは、アルファ溶血素タンパク質（ＨｌｙＡ）のＣ末端５３アミノ酸においてコードされる。ＨｌｙＡ分泌シグナル。
【０１６１】
ＨｌｙＢは孔を形成するために内膜に挿入し、ＨｌｙＤはＨｌｙＢをＴｏｌＣ（外膜孔）と整列させ、それによって内膜および外膜を通るチャネルを形成する。Ｃ末端分泌タグは、自己触媒的またはプロテアーゼによって触媒されるいずれかの、例えばＯｍｐＴ切断によって除去され得、それによってＰＭＥを細胞外環境に放出する。
【０１６２】
Ｖ型自己分泌系はＮ末端Ｓｅｃ依存性ペプチドタグ（内膜）およびＣ末端タグ（外膜）を利用する。これは細胞質から周辺質に到達するようにＳｅｃ系を使用する。次いでＣ末端タグは外膜に挿入し、「パッセンジャータンパク質」が通る孔を形成する。外膜を横切ると、パッセンジャー（抗がん分子）は、自己触媒的インテイン様機構によって、または膜結合プロテアーゼ（すなわちＯｍｐＴ）を介してのいずれかで、膜に埋め込まれたＣ末端タグから放出される。Ｎ末端タグはＳｅｃ系によって除去される。したがって、いくつかの実施形態では、分泌系は、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤを操作された細菌から分泌する前に、このタグを除去することができる。Ｖ型自己分泌媒介性分泌において、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然Ｓｅｃ系による細胞質から周辺質区画への「パッセンジャー」ペプチドの移行の際に除去される。さらに、自己分泌因子が外膜を横切って移行すると、Ｃ末端分泌タグは、自己触媒的またはプロテアーゼによって触媒されるいずれかの、例えばＯｍｐＴ切断よって除去され得、それによって抗がん分子を細胞外環境に放出する。
【０１６３】
鞭毛修飾ＩＩＩ型分泌において、タグはｍＲＮＡの５’非翻訳領域においてコードされ、したがって切断／除去するためのペプチドタグは存在しない。この修飾系は、「シリンジ」部分を含有せず、代わりに、両方の膜を横切り、形成している鞭毛を通って外部へ移行するように鞭毛構造の基底小体を孔として使用する。ｆｌｉＣ／ｆｌｉＤ遺伝子（鞭毛「尾部」／鞭をコードする）が破壊される場合、鞭毛は完全に形成することができず、これにより全体の分泌が促される。いくつかの実施形態では、尾部は完全に除去され得る。ＩＩＩ型の従来の分泌系において、基底小体は鞭毛に非常に似ているが、「尾部」／鞭の代わりに、従来のＴ３ＳＳは、宿主細胞内のパッセンジャータンパク質を注入するためのシリンジを有する。分泌タグはＮ末端ペプチド（長さは異なり、いくつかの異なるタグが存在する、ＰＣＴ／ＵＳ１４／０２０９７２を参照のこと）によってコードされ。Ｎ末端タグはこの分泌系におけるポリペプチドから除去されない。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ＰＭＥは、大腸菌ＣＦＴ０７３のアルファ−溶血素（ｈｌｙＡ）のＣ末端の５３アミノ酸（Ｃ末端分泌タグ）との融合タンパク質として発現される。
【０１６５】
酸素消費酵素
ＬＡＡＤ触媒活性は酸素に依存し、したがって腸、例えば結腸における嫌気的環境において活性ではない場合がある。酸素は胃腸管のより近位の区画に存在する。
【０１６６】
健康なマウスにおいて測定された酸素圧が表１７に示される。Ｈｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９９年４月１３日；９６（８）：４５８６〜９１頁；「Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎａｔｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ  ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｓｐａｔｉａｌ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ＥＰＲ  ｉｍａｇｉｎｇ」、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。近位から遠位胃腸管までの著しい酸素勾配。Ｈｅらによって示されるように、胃腸管に沿って見られる観察された酸素勾配はプロセスの組合せによって説明され得る。理論に束縛されるものではないが、飲み込んだ場合、食物は最初に周囲室内空気の酸素圧で平衡化される。胃およびその後の小腸への通過中に、酸素は粘膜を横切って拡散するので酸素レベルは減少し得る。毛細管レベルの酸素（すなわち、５〜１０ｔｏｒｒ；ｒｅｆ．９）との平衡化の漸進的なプロセスが発生し得る。結腸への通過中に、そこへの多くの細菌定着により、酸素化のさらなる減少が生じる。最後に、遠位結腸の内腔は、予想されるように、この部位における多量の嫌気的細菌に基づいて、著しい低酸素状態を示す。
【０１６７】
【表１７】
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【０１６８】
図２５Ｂに示されるように、ＬＡＡＤ活性は、好気的条件下よりも低いレベルではあるが、微好気的条件において保持される（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。したがって、ＬＡＡＤは、胃、十二指腸、空腸、および回腸などの腸のより近位の領域において活性であり得る。遺伝子操作された細菌によって発現されるＬＡＡＤは、有益には、ＦＮＲプロモーターの制御下の場合、結腸において発現され得るＰＡＬと異なる区画において活性であり得ることが本開示の一部として意図される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＭＥが胃腸系全体にわたって発現され、活性であるように、異なる酸素需要量を有し、および／または異なる酸素条件下で誘導される２つの酵素を発現する。例えば、第１の酵素、例えば、酸素の存在に依存するＬＡＡＤは、構成的または誘導可能なプロモーター（ＰａｒａＢＡＤなど）の制御下で胃、十二指腸および回腸のうちの１つまたは複数において発現され、第２の酵素、例えば、ＰＡＬは、ＦＮＲプロモーターの制御下で結腸において発現される。
【０１６９】
いくつかのストラテジーが、酸素制限条件下でＬＡＡＤ活性をさらに増加させるために利用され得る。例えば、大量の酸素を消費する他の酵素の活性は減少または消失され得る。１つのそのような酵素はＮＡＤＨデヒドロゲナーゼである。大腸菌は２つのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ；ｎｕｏおよびｎｄｈ２を有し、これらの酵素の両方のノックアウトが酸素消費量を８０％減少させることが示されている。いくつかの実施形態では、制限酸素を保存するため、すなわちＬＡＡＤを発現する遺伝子操作された細菌において、より低い外因性酸素条件下でＬＡＡＤを機能させるためにさらなる手段が取られる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は酸素消費に関与する１つまたは複数の遺伝子において突然変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、一方または両方の大腸菌ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼはノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ノックアウトされたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼはｎｕｏである。いくつかの実施形態では、ノックアウトされたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼはｎｄｈ２である。いくつかの実施形態では、ｎｕｏおよびｎｄｈ２はノックアウトされる。ｃｙｄＢ（高親和性末端酸化酵素のサブユニット）、ｃｙｄＤ（シトクロムＤを作製するために必要とされる酵素）、およびｃｙｏＡＢＣ（低親和性シトクロム酸化酵素のサブユニット）などの、呼吸鎖における酵素を含む、大腸菌の酸素代謝に関与する他の酵素もまたノックアウトされ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｃｙｄＢ、ｃｙｄＤ、およびｃｙｏＡＢＣから選択される１つまたは複数の遺伝子におけるノックアウト突然変異／欠失を保有する。
【０１７０】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つまたは複数のＰＭＥが発現され、胃において活性を示す。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つまたは複数のＰＭＥが発現され、十二指腸において活性を示す。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つまたは複数のＰＭＥが発現され、空腸において活性を示す。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つまたは複数のＰＭＥが発現され、回腸において活性を示す。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つまたは複数のＰＭＥが発現され、結腸において活性を示す。
【０１７１】
必須遺伝子および栄養要求株
本明細書において使用される場合、「必須遺伝子」という用語は、細胞増殖および／または生存に必要とされる遺伝子を指す。細菌の必須遺伝子は当業者に周知であり、遺伝子の指向性欠失ならびに／またはランダム突然変異誘発およびスクリーニングによって同定され得る。（例えば、ＺｈａｎｇおよびＬｉｎ、「ＤＥＧ  ５．０，ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ」、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２００９年；３７：Ｄ４５５−Ｄ４５８ならびにＧｅｒｄｅｓら、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｐｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００６年；１７（５）：４４８〜４５６頁を参照のこと、それらの各々の全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる）。
【０１７２】
「必須遺伝子」は、生物が生存している状況および環境に依存し得る。例えば、必須遺伝子の突然変異、修飾、または除去により、栄養要求株になる本開示の遺伝子操作された細菌が得られ得る。栄養要求性の修飾は、細菌がその必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子を欠いているため、生存または増殖に必須の外部から加えられた栄養素の非存在下で細菌を死滅させることを意図する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌のいずれかもまた、細胞生存および／または増殖に必要な遺伝子の欠失または突然変異を含む。一実施形態では、必須遺伝子はＤＮＡ合成遺伝子、例えばｔｈｙＡである。別の実施形態では、必須遺伝子は細胞壁合成遺伝子、例えばｄａｐＡである。さらに別の実施形態では、必須遺伝子は、アミノ酸遺伝子、例えばｓｅｒＡまたはＭｅｔＡである。対応する野生型遺伝子産物が細菌において産生されない限り、限定されないが、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１を含む、細胞生存および／または増殖に必要な任意の遺伝子が標的化されてもよい。表１８は、栄養要求性株を産生するために破壊または欠失され得る例示的な細菌遺伝子を列挙する。これらには、限定されないが、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要な遺伝子が含まれる。
【０１７３】
【表１８】
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【０１７４】
表１９は、経管栄養の２４時間後および４８時間後に検出したときのマウスの消化管における種々のアミノ酸栄養要求株の生存を示す。これらの栄養要求株は、大腸菌のＮｉｓｓｌｅ株ではないＢＷ２５１１３を使用して生成した。
【０１７５】
【表１９】
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【０１７６】
例えば、チミンは細菌細胞増殖に必要とされる核酸であり、その非存在下では、細菌は細胞死を受ける。ｔｈｙＡ遺伝子は、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによってチミン合成における第１段階を触媒する酵素である、チミジル酸シンテターゼをコードする（Ｓａｔら、２００３年）。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子が欠失し、および／または非関連遺伝子と置き換えられているｔｈｙＡ栄養要求株である。ｔｈｙＡ栄養要求株は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地にチミンを添加することによって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでヒトの消化管に天然に見出される高いチミンレベルの存在下で十分な量のチミンが存在する場合にのみ増殖できる。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳動物の消化管に存在する場合に相補される遺伝子の栄養要求性である。十分な量のチミンがないと、ｔｈｙＡ栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の修飾は、細菌細胞が栄養要求性の遺伝子産物の非存在下（例えば消化管の外部）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０１７７】
ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リシン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、細菌細胞壁成長に必要とされる（Ｍｅａｄｏｗら、１９５９年；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、１９７１年）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌のいずれかは、ｄａｐＤが欠失し、および／または非関連遺伝子と置き換えられているｄａｐＤ栄養要求株である。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＡＰを増殖培地に添加することによって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでヒトの消化管に天然に見出される高いＤＡＰレベルの存在下で、十分な量のＤＡＰが存在する場合にのみｄａｐＤ栄養要求株は増殖できる。十分な量のＤＡＰがないと、ｄａｐＤ栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の修飾は、細菌細胞が栄養要求性の遺伝子産物の非存在下（例えば消化管の外部）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０１７８】
他の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、ｕｒａＡが欠失し、および／または非関連遺伝子と置き換えられているｕｒａＡ栄養要求株である。ｕｒａＡ遺伝子は、ピリミジンウラシルの取り込みおよびその後の代謝を促進する膜結合性トランスポーターであるＵｒａＡをコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、１９９５年）。ｕｒａＡ栄養要求株は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地にウラシルを添加することによって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでヒトの消化管に天然に見出される高いウラシルレベルの存在下で十分な量のウラシルが存在する場合にのみ増殖できる。十分な量のウラシルがないと、ｕｒａＡ栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の修飾は、細菌が、栄養要求性の遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管の外部）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０１７９】
複合的な集団において、細菌がＤＮＡを共有することは可能である。非常にまれな状況において、栄養要求性細菌株は、ゲノム欠失を修復し、栄養要求株を恒久的に救出する非栄養要求性株からＤＮＡを受け取ることができる。したがって、１つより多い栄養要求株で細菌株を操作することにより、栄養要求性を救出するのに十分な時間、ＤＮＡ転移が発生する可能性を大きく減少させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、細胞生存および／または増殖に必要な２つ以上の遺伝子の欠失または突然変異を含む。
【０１８０】
必須遺伝子の他の例には、限定されないが、ｙｈｂＶ、ｙａｇＧ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌｄ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒｅ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、ｄｎａＣ、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｉｎｆＢ、ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｙｆｊＢ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏｔ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｙｃｅＱ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｙｍｆＫ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎｄ、ｐｔｈ、ｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｒａｃＲ、ｄｉｃＡ、ｙｄｆＢ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｙｉｂＪ、およびｇｐｓＡが含まれる。他の必須遺伝子は当業者に公知である。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ増殖する１つまたは複数の必須遺伝子において突然変異を有する合成栄養要求株である（ＬｏｐｅｚおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｓｔｒａｉｎ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ  ２０１５年；４（１２）：１２７９〜１２８６頁、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる）。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は必須遺伝子における突然変異を含む。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ、およびａｄｋからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃのうちの１つまたは複数を含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃを含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌのうちの１つまたは複数を含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌを含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇのうちの１つまたは複数を含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇを含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃのうちの１つまたは複数を含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃを含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇのうちの１つまたは複数を含むａｄｋである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇを含むａｄｋである。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はリガンドによって相補される。いくつかの実施形態では、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、およびＬ−ヒスチジンメチルエステルからなる群から選択される。例えば、ｍｅｔＧにおける突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、またはＬ−ヒスチジンメチルエステルによって相補される。ｄｎａＮにおける突然変異（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、または２−アミノベンゾチアゾールによって相補される。ｐｈｅＳにおける突然変異（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって相補される。ｔｙｒＳにおける突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって相補される。ａｄｋにおける突然変異（Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールによって相補される。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、それをリガンドに対して栄養要求性にする１つより多い突然変異必須遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は２つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳにおける突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）およびｍｅｔＧにおける突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）を含む。他の実施形態では、細菌細胞は３つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳにおける突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧにおける突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）、およびｐｈｅＳにおける突然変異（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、必須遺伝子が、図４３〜４７に示されるアラビノース系を使用して置き換えられている条件付き栄養要求株である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載される死滅スイッチ成分および系のいずれかなどの死滅スイッチ回路も含む。例えば、遺伝子操作された細菌は、細胞生存および／または増殖に必要とされる必須遺伝子、例えばＤＮＡ合成遺伝子、例えばｔｈｙＡ、細胞壁合成遺伝子、例えばｄａｐＡおよび／またはアミノ酸遺伝子、例えばｓｅｒＡもしくはＭｅｔＡにおける欠失または突然変異を含んでもよく、また、環境条件および／もしくはシグナル（記載されるアラビノース系など）に応答して発現される１つもしくは複数の転写活性化因子によって調節されるか、または外因性環境条件および／もしくはシグナル（本明細書に記載されるリコンビナーゼ系など）を検知すると発現される１つもしくは複数のリコンビナーゼによって調節される毒素遺伝子も含んでもよい。他の実施形態は、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ、２０１５年；４（３）：３０７〜３１６頁に記載されており、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載される死滅スイッチ成分および系のいずれかなどの死滅スイッチ回路、ならびに条件付き複製起点などの別のバイオセキュリティー系も含む（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年）。
【０１８７】
Ｐｈｅ栄養要求性の付加はまた、フェニルアラニン分解速度を増加させるための有用性も有することができる。例えば、ｐｈｅＡ遺伝子の欠失により、フェニルアラニン栄養要求性がもたらされる。内因性細菌のフェニルアラニン産生の停止によって、環境からの取り込みの増加を促すことができ、また、環境から取り込まれたフェニルアラニンの分解の増加ももたらすことができる。
【０１８８】
遺伝子調節回路
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載される構築物を発現するための多層遺伝子調節回路を含む（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６２／１８４，８１１号を参照のこと）。遺伝子調節回路は、フェニルアラニン代謝酵素を産生するか、または栄養要求株を救出する突然変異細菌をスクリーニングするのに有用である。特定の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の目的の遺伝子を産生する遺伝子操作された細菌を選択する方法を提供する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本発明は、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬまたはＰＡＨ）およびＴ７ポリメラーゼによって調節される遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子操作された細菌を提供する。例えば、遺伝子操作された細菌は、Ｔ７ポリメラーゼをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している第１の遺伝子；フェニルアラニン代謝酵素を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットであって、Ｔ７ポリメラーゼによって誘導されるＴ７プロモーターに作動可能に連結している第２の遺伝子または遺伝子カセット；およびＴ７ポリメラーゼを阻害できる抑制因子であるｌｙｓＹをコードする第３の遺伝子を含む。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、フェニルアラニン代謝酵素は発現されない。ＬｙｓＹは構成的に発現され（Ｐ−ｌａｃ構成的）、さらにＴ７ポリメラーゼを阻害する。酸素の非存在下では、ＦＮＲは二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、Ｔ７ポリメラーゼはｌｙｓＹ阻害を克服するのに十分なレベルで発現され、フェニルアラニン代謝酵素が発現される。いくつかの実施形態では、ｌｙｓＹ遺伝子はさらなるＦＮＲ結合部位に作動可能に連結している。酸素の非存在下では、ＦＮＲは上記のようにＴ７ポリメラーゼ発現を活性化するために二量体化し、また、ｌｙｓＹ発現を阻害する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本発明は、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬまたはＰＡＨ）およびプロテアーゼにより調節される遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子操作された細菌を提供する。例えば、遺伝子操作された細菌はｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している第１の遺伝子；Ｔｅｔ調節領域（ＴｅｔＯ）に作動可能に連結しているフェニルアラニン代謝酵素を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセット；およびＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）に連結しているｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルをコードする第３の遺伝子であって、ＴｅｔＲはＴｅｔ調節領域に結合でき、第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができる、第３の遺伝子を含む。ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼは、ｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルを認識でき、ＴｅｔＲを分解することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、リプレッサーは分解されず、フェニルアラニン代謝酵素は発現されない。酸素の非存在下では、ＦＮＲは二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、それによってｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼの発現を誘導する。ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼは、ｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルを認識し、ＴｅｔＲを分解し、フェニルアラニン代謝酵素が発現される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本発明は、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬまたはＰＡＨ）およびリプレッサーにより調節される遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子操作された細菌を提供する。例えば、遺伝子操作された細菌は、第１のリプレッサーをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している、第１の遺伝子；構成的プロモーターを含む第１の調節領域に作動可能に連結しているフェニルアラニン代謝酵素を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセット；および第２のリプレッサーをコードする第３の遺伝子であって、第２のリプレッサーは、第１の調節領域に結合でき、第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができる、第３の遺伝子を含む。第３の遺伝子は構成的プロモーターを含む第２の調節領域に作動可能に連結しており、第１のリプレッサーは第２の調節領域に結合でき、第２のリプレッサーの発現を阻害することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、第１のリプレッサーは発現されず、第２のリプレッサーは発現され、フェニルアラニン代謝酵素は発現されない。酸素の非存在下では、ＦＮＲは二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、第１のリプレッサーは発現され、第２のリプレッサーは発現されず、フェニルアラニン代謝酵素が発現される。
【０１９２】
これらの実施形態において有用なリプレッサーの例には、限定されないが、ＡｒｇＲ、ＴｅｔＲ、ＡｒｓＲ、ＡｓｃＧ、ＬａｃＩ、ＣｓｃＲ、ＤｅｏＲ、ＤｇｏＲ、ＦｒｕＲ、ＧａｌＲ、ＧａｔＲ、ＣＩ、ＬｅｘＡ、ＲａｆＲ、ＱａｃＲ、およびＰｔｘＳが含まれる（米国特許出願公開第２００３０１６６１９１号）。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本発明は、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬまたはＰＡＨ）および調節性ＲＮＡにより調節される遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子操作された細菌を提供する。例えば、遺伝子操作された細菌は、調節性ＲＮＡをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している、第１の遺伝子、およびフェニルアラニン代謝酵素を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットを含む。第２の遺伝子または遺伝子カセットは、構成的プロモーターに作動可能に連結しており、フェニルアラニン代謝酵素の翻訳を阻害するｍＲＮＡヘアピンを産生できるヌクレオチド配列にさらに連結している。調節性ＲＮＡは、ｍＲＮＡヘアピンを除去でき、リボソーム結合部位を介して翻訳を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、調節性ＲＮＡは発現されず、ｍＲＮＡヘアピンはフェニルアラニン代謝酵素が翻訳されるのを防ぐ。酸素の非存在下では、ＦＮＲは二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、調節性ＲＮＡが発現され、ｍＲＮＡヘアピンが除去され、フェニルアラニン代謝酵素が発現される。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本発明は、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬまたはＰＡＨ）およびＣＲＩＳＰＲにより調節される遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子操作された細菌を提供する。例えば、遺伝子操作された細菌は、Ｃａｓ９タンパク質；ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している、第１の遺伝子；フェニルアラニン代謝酵素を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットであって、構成的プロモーターを含む調節領域に作動可能に連結している、第２の遺伝子または遺伝子カセット；および構成的プロモーターに作動可能に連結しているリプレッサーをコードする第３の遺伝子であって、リプレッサーは調節領域に結合でき、第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができる、第３の遺伝子を含む。第３の遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡに結合できるＣＲＩＳＰＲ標的配列にさらに連結しており、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡへの前記結合はＣａｓ９タンパク質による切断を誘導し、リプレッサーの発現を阻害する。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、ガイドＲＮＡは発現されず、リプレッサーは発現され、フェニルアラニン代謝酵素は発現されない。酸素の非存在下では、ＦＮＲは二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、ガイドＲＮＡが発現され、リプレッサーは発現されず、フェニルアラニン代謝酵素が発現される。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本発明は、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬまたはＰＡＨ）およびリコンビナーゼにより調節される遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子操作された細菌を提供する。例えば、遺伝子操作された細菌は、リコンビナーゼをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している、第１の遺伝子、および構成的プロモーターに作動可能に連結しているフェニルアラニン代謝酵素を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットを含む。第２の遺伝子または遺伝子カセットは、配向が反転し（３’から５’）、リコンビナーゼ結合部位に隣接し、リコンビナーゼは、その配向を戻す（５’から３’）ことによって第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導するためにリコンビナーゼ結合部位に結合できる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、リコンビナーゼは発現されず、遺伝子または遺伝子カセットは３’から５’配向のままであり、機能的フェニルアラニン代謝酵素は産生されない。酸素の非存在下では、ＦＮＲは二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、リコンビナーゼが発現され、遺伝子または遺伝子カセットは５’から３’配向に戻り、機能的フェニルアラニン代謝酵素が産生される（例えば、図４２を参照のこと）。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本発明は、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬまたはＰＡＨ）ならびにポリメラーゼによりおよびリコンビナーゼにより調節される遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子操作された細菌を提供する。例えば、遺伝子操作された細菌は、リコンビナーゼをコードする第１の遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結している、第１の遺伝子；Ｔ７プロモーターに作動可能に連結しているフェニルアラニン代謝酵素を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセット；Ｔ７ポリメラーゼをコードする第３の遺伝子であって、Ｔ７ポリメラーゼはＴ７プロモーターに結合でき、フェニルアラニン代謝酵素の発現を誘導することができる、第３の遺伝子を含む。Ｔ７ポリメラーゼをコードする第３の遺伝子は、配向が反転し（３’から５’）、リコンビナーゼ結合部位に隣接し、リコンビナーゼは、その配向を戻す（５’から３’）ことによってＴ７ポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導するためにリコンビナーゼ結合部位に結合できる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、リコンビナーゼは発現されず、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は３’から５’配向のままであり、フェニルアラニン代謝酵素は発現されない。酸素の非存在下では、ＦＮＲは二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、リコンビナーゼが発現され、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は５’から３’配向に戻され、フェニルアラニン代謝酵素が発現される（例えば、図４３を参照のこと）。
【０１９７】
プラスミド上で発現される合成遺伝子回路は短期間で十分に機能できるが、長期間では能力および／または機能を喪失する（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５年）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長時間にわたって目的の遺伝子を発現するための安定な回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬまたはＰＡＨ）を産生でき、毒素（ｈｏｋ）および寿命の短い抗毒素（ｓｏｋ）を同時に産生する毒素−抗毒素系をさらに含み、プラスミドの喪失により、寿命の長い毒素によって細胞を死滅させる（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５年）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、バチルス・サブティリスプラスミドｐＬ２０由来のａｌｐ７をさらに含み、細胞分裂の間、均等な分離を確実にするためにプラスミドを細胞極に押すことができる繊維を産生する（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５年）。
【０１９８】
宿主−プラスミド相互依存性
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はまた、宿主−プラスミド相互依存性を生じるように修飾されているプラスミドも含む。特定の実施形態では、相互依存性宿主−プラスミドプラットフォームはＧｅｎｅＧｕａｒｄ（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年）である。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、（ｉ）必要な複製開始タンパク質がｔｒａｎｓで提供される条件付き複製起点；（ｉｉ）ゲノム転座を介して宿主によって救出され、富栄養培地における使用にも適合している栄養要求性の修飾；および／または（ｉｉｉ）広域スペクトル毒素をコードする核酸配列を含む。毒素遺伝子は、プラスミドＤＮＡ自体を、抗毒素を発現しない株（例えば、野性型細菌）にとって不利なものにすることによって、プラスミドが分散しないように選択するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、抗生物質選択を行わずに少なくとも１００世代にわたって安定である。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは宿主の増殖を妨げない。ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、本発明の遺伝子操作された細菌において意図的でないプラスミド増殖を大いに減少させるために使用される。
【０１９９】
相互依存性宿主−プラスミドプラットフォームは、単独で、または本明細書に記載されるものなどの他のバイオセーフティ機構（例えば、死滅スイッチ、栄養要求性）と組み合わせて使用されてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドを含む。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌はＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１つもしくは複数の死滅スイッチを含む。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌はＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１つもしくは複数の栄養要求性を含む。さらに他の実施形態では、遺伝子操作された細菌はＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミド、１つもしくは複数の死滅スイッチ、および／または１つもしくは複数の栄養要求性を含む。
【０２００】
死滅スイッチ
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はまた、死滅スイッチを含む（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６２／１８３，９３５号および第６２／２６３，３２９号を参照のこと）。死滅スイッチは、外部刺激に応答して遺伝子操作された細菌を能動的に死滅させることを意図する。細菌が生存のための必須栄養素を欠いているために細菌が死滅する栄養要求性突然変異とは対照的に、死滅スイッチは、細胞死を引き起こす微生物内の毒性分子の産生を誘導する環境における特定の要因によって誘発される。
【０２０１】
死滅スイッチを含む細菌は、例えば、実験室環境の外部でのバイオ燃料産生微生物の拡散を制限するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究目的のために操作されている。疾患を治療するためにｉｎ  ｖｉｖｏ投与用に操作された細菌もまた、異種遺伝子（複数可）、例えば、フェニルアラニン代謝酵素の発現および送達後、または対象が治療効果を受けた後の特定の時間で死滅するようにプログラムされてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、死滅スイッチは、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬまたはＰＡＨ）および／またはフェニルアラニントランスポーター遺伝子の酸素レベル依存性発現後、しばらくすると、細菌を死滅させるように活性化される。いくつかの実施形態では、死滅スイッチは、フェニルアラニン代謝酵素および／またはフェニルアラニントランスポーター遺伝子の酸素レベル依存性発現後、遅延様式で活性化される。あるいは、細菌は、細菌が疾患部位の外側に拡散した後、死滅するように操作されてもよい。具体的には、微生物による対象の長期間の定着、対象内の目的の領域の外側（例えば、消化管の外側）での微生物の拡散、または環境への対象の外部での微生物の拡散（例えば、対象の便を介して環境に拡散する）を阻止することは有用であり得る。死滅スイッチにおいて使用され得るこのような毒素の例には、限定されないが、バクテリオシン、リシン、および細胞膜を溶解すること、細胞ＤＮＡを分解すること、または他の機構によって細胞死を引き起こす他の分子が含まれる。このような毒素は個々にまたは組み合わせて使用されてもよい。それらの産生を制御するスイッチは、例えば、転写活性化（トグルスイッチ；例えば、Ｇａｒｄｎｅｒら、２０００年を参照のこと）、翻訳（リボレギュレーター）、またはＤＮＡ組換え（リコンビナーゼベースのスイッチ）に基づいてもよく、嫌気状態または反応性酸素種などの環境刺激を検知できる。これらのスイッチは、単一の環境要因によって活性化され得るか、または細胞死を誘導するためにＡＮＤ、ＯＲ、ＮＡＮＤおよびＮＯＲ論理的構成において複数の活性化因子を必要としてもよい。例えば、ＡＮＤリボレギュレータースイッチは、細胞膜を透過性にし、細胞を死滅させる、リシンの発現を誘導するためにテトラサイクリン、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびアラビノースによって活性化される。ＩＰＴＧは、後でアラビノースおよびテトラサイクリンの添加によって活性化される、エンドリシンおよびホリンｍＲＮＡの発現を誘導する。３つ全ての誘導因子が細胞死を引き起こすために存在しなければならない。死滅スイッチの例は当該分野において公知である（Ｃａｌｌｕｒａら、２０１０年）。
【０２０２】
死滅スイッチは、毒素が環境条件または外部シグナルに応答して産生されるように設計されてもよいか（例えば、細菌は外部刺激に応答して死滅する）、または代替として、環境条件がもはや存在しないかもしくは外部シグナルが停止すると、毒素が産生されるように設計されてもよい。
【０２０３】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、例えば低酸素環境において外因性環境シグナルを検知した後に死滅するようにさらにプログラムされる。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、その発現は環境条件またはシグナルに応答して誘導され、最終的に細胞を死滅させる毒素の発現をもたらす１つまたは複数の組換え事象を引き起こす。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、細菌毒素をコードする反転した異種遺伝子のフリッピングであり、その細菌毒素は次いで、その異種遺伝子が第１のリコンビナーゼによってフリッピングされた後、構成的に発現される。一実施形態では、細菌毒素の構成的発現は遺伝子操作された細菌を死滅させる。これらの種類の死滅スイッチ系において、操作された細菌細胞が外因性環境条件を検知し、目的の異種遺伝子を発現すると、組換え細菌細胞はもはや生存できない。
【０２０４】
本開示の遺伝子操作された細菌が、少なくとも１つの組換え事象を引き起こす環境条件またはシグナルに応答して１つまたは複数のリコンビナーゼを発現する別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、外因性環境条件またはシグナルに応答して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする反転した異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、細菌毒素をコードする反転した異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、その異種遺伝子が第１のリコンビナーゼによってフリッピングされた後に構成的に発現される。一実施形態では、抗毒素は毒素の活性を阻害し、それによって遺伝子操作された細菌の死滅を遅延させる。一実施形態では、外因性環境条件がもはや存在しない場合に抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現されなくなると、遺伝子操作された細菌は細菌毒素によって死滅される。
【０２０５】
別の実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第２のリコンビナーゼをコードする反転した異種遺伝子のフリッピング、それに続く、第２のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする反転した異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、第２のリコンビナーゼをコードする反転した異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする反転した異種遺伝子は、第２のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第２のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、第２のリコンビナーゼをコードする異種遺伝子は、その異種遺伝子が第１のリコンビナーゼによってフリッピングされた後に構成的に発現される。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、その異種遺伝子が第２のリコンビナーゼによってフリッピングされた後に構成的に発現される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は細菌毒素によって死滅される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、外因性環境条件に応答して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施形態では、外因性環境条件が存在する場合、抗毒素は毒素の活性を阻害し、それによって遺伝子操作された細菌の死を遅延させる。一実施形態では、外因性環境条件がもはや存在しない場合に抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現されなくなると、遺伝子操作された細菌は細菌毒素によって死滅される。
【０２０６】
一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第２のリコンビナーゼをコードする反転した異種遺伝子のフリッピング、それに続く、第２のリコンビナーゼによる第３のリコンビナーゼをコードする反転した異種遺伝子のフリッピング、それに続く、第３のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする反転した異種遺伝子のフリッピングである。
【０２０７】
一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第１の除去酵素をコードする反転した異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、第１の除去酵素をコードする反転した異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、第１の除去酵素をコードする異種遺伝子は、その異種遺伝子が第１のリコンビナーゼによってフリッピングされた後に構成的に発現される。一実施形態では、第１の除去酵素は第１の必須遺伝子を除去する。一実施形態では、プログラムされた組換え細菌細胞は、第１の必須遺伝子が除去された後に生存できない。
【０２０８】
一実施形態では、第１のリコンビナーゼは、第２の除去酵素をコードする反転した異種遺伝子をさらにフリッピングする。一実施形態では、第２の除去酵素をコードする反転した異種遺伝子は、第２のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第２のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、第２の除去酵素をコードする異種遺伝子は、その異種遺伝子が第１のリコンビナーゼによってフリッピングされた後に構成的に発現される。一実施形態では、第１の必須遺伝子および第２の必須遺伝子の両方が除去されると、遺伝子操作された細菌は死滅するか、またはもはや生存できない。一実施形態では、第１の必須遺伝子が除去されるか、または第２の必須遺伝子が第１のリコンビナーゼによって除去されるかのいずれかの場合、遺伝子操作された細菌は死滅するか、またはもはや生存できない。
【０２０９】
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも１つの組換え事象が発生した後に死滅する。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも１つの組換え事象が発生した後にもはや生存できない。
【０２１０】
これらの実施形態のいずれかにおいて、リコンビナーゼは、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＨＫ０２２、ＨＰ１、Ｒ４、Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３、Ｉｎｔ４、Ｉｎｔ５、Ｉｎｔ６、Ｉｎｔ７、Ｉｎｔ８、Ｉｎｔ９、Ｉｎｔ１０、Ｉｎｔ１１、Ｉｎｔ１２、Ｉｎｔ１３、Ｉｎｔ１４、Ｉｎｔ１５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ１７、Ｉｎｔ１８、Ｉｎｔ１９、Ｉｎｔ２０、Ｉｎｔ２１、Ｉｎｔ２２、Ｉｎｔ２３、Ｉｎｔ２４、Ｉｎｔ２５、Ｉｎｔ２６、Ｉｎｔ２７、Ｉｎｔ２８、Ｉｎｔ２９、Ｉｎｔ３０、Ｉｎｔ３１、Ｉｎｔ３２、Ｉｎｔ３３、およびＩｎｔ３４、またはそれらの生物学的に活性な断片からなる群から選択されるリコンビナーゼであってもよい。
【０２１１】
上記の死滅スイッチ回路において、毒素は環境要因またはシグナルの存在下で産生される。死滅スイッチ回路の別の態様では、毒素は環境要因の存在下で抑制され得（すなわち、産生されず）、次いで環境条件または外部シグナルがもはや存在しなくなると、産生され得る。このような死滅スイッチは抑制ベースの死滅スイッチと呼ばれ、細菌細胞がアラビノースまたは他の糖などの外部要因またはシグナルの存在下でのみ生存できる系を表す。毒素が外部要因またはシグナルの存在下で抑制される（および外部シグナルが除去されると活性化される）、例示的な死滅スイッチ設計は図４３〜４７に示される。本開示は、外因性環境においてアラビノースまたは他の糖を検知すると、１つまたは複数の異種遺伝子を発現する組換え細菌細胞を提供する。この態様では、組換え細菌細胞は、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子、ならびにａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）の制御下の１つまたは複数の遺伝子を含有する。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子はａｒａＢＡＤプロモーターの制御下で遺伝子の転写を抑制する立体配座を取る。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、それをａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、活性化させ得る立体配座変化を受け、そのａｒａＢＡＤプロモーターは、毒素遺伝子の発現を抑制する、所望の遺伝子、例えばＴｅｔＲの発現を誘導する。この実施形態では、毒素遺伝子はアラビノースまたは他の糖の存在下で抑制される。アラビノースが存在しない環境では、ＴｅｔＲ遺伝子は活性化されず、毒素が発現され、それによって細菌を死滅させる。アラビノース系はまた、必須遺伝子を発現するために使用され得、必須遺伝子はアラビノースまたは他の糖の存在下でのみ発現され、アラビノースまたは他の糖が環境に存在しない場合、発現されない。
【０２１２】
したがって、１つまたは複数の異種遺伝子が、外因性環境においてアラビノースを検知すると発現されるいくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種遺伝子はａｒａＢＡＤプロモーターの制御下で直接的または間接的に存在する。いくつかの実施形態では、発現される異種遺伝子は、以下：異種治療遺伝子、抗毒素をコードする異種遺伝子、リプレッサータンパク質もしくはポリペプチドをコードする異種遺伝子、例えばＴｅｔＲリプレッサー、細菌細胞に見出されない必須タンパク質をコードする異種遺伝子、および／または調節タンパク質もしくはポリペプチドをコードする異種のうちの１つまたは複数から選択される。
【０２１３】
Ｐａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＣ、およびＰａｒａＢＡＤを含む、アラビノース誘導性プロモーターは当該分野において公知である。一実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは大腸菌由来である。いくつかの実施形態では、ＰａｒａＣプロモーターおよびＰａｒａＢＡＤプロモーターは、一方の方向において異種遺伝子の発現を制御するＰａｒａＢＡＤプロモーター、および他方の方向において異種遺伝子の発現を制御するＰａｒａＣ（ＰａｒａＢＡＤプロモーターに近接し、それと反対の鎖にある）である両方向性プロモーターとして作動する。アラビノースの存在下では、両方のプロモーターからの両方の異種遺伝子の転写が誘導される。しかしながら、アラビノースの非存在下では、両方のプロモーターからの両方の異種遺伝子の転写は誘導されない。
【０２１４】
本開示の１つの例示的な実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、少なくとも以下の配列：テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質をコードする異種遺伝子に作動可能に連結しているＰａｒａＢＡＤプロモーター、ＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結しているＰａｒａＣプロモーター、およびＴｅｔＲタンパク質によって抑制されるプロモーターに作動可能に連結している細菌毒素をコードする異種遺伝子を有する死滅スイッチを含有する。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、そのＰａｒａＢＡＤプロモーターはＴｅｔＲタンパク質の転写を活性化し、次にそのＴｅｔＲタンパク質は毒素の転写を抑制する。しかしながら、アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣはＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、ＴｅｔＲタンパク質は発現されない。この場合、異種毒素遺伝子の発現は活性化され、毒素が発現される。毒素は組換え細菌細胞内に蓄積し、組換え細菌細胞は死滅する。一実施形態では、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子は構成的プロモーターの制御下にあり、したがって構成的に発現される。
【０２１５】
本開示の一実施形態では、遺伝子操作された細菌は構成的プロモーターの制御下で抗毒素をさらに含む。この状況において、アラビノースの存在下では、毒素はＴｅｔＲタンパク質による抑制に起因して発現されず、抗毒素タンパク質が細胞内に蓄積する。しかしながら、アラビノースの非存在下では、ＴｅｔＲタンパク質は発現されず、毒素の発現が誘導される。毒素は組換え細菌細胞内に蓄積し始める。組換え細菌細胞は、毒素タンパク質が細胞内の抗毒素タンパク質の量と等しいか、またはそれを超える量で存在すると、もはや生存できず、組換え細菌細胞は毒素によって死滅する。
【０２１６】
本開示の別の実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下で抗毒素をさらに含む。この状況において、アラビノースの存在下では、ＴｅｔＲおよび抗毒素が発現され、抗毒素は細胞内に蓄積し、毒素はＴｅｔＲタンパク質による抑制に起因して発現されない。しかしながら、アラビノースの非存在下では、ＴｅｔＲタンパク質および抗毒素の両方は発現されず、毒素の発現が誘導される。毒素は組換え細菌細胞内に蓄積し始める。組換え細菌細胞は、毒素タンパク質が発現されると、もはや生存できず、組換え細菌細胞は毒素によって死滅する。
【０２１７】
本開示の別の例示的な実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、少なくとも以下の配列：組換え細菌細胞に見出されない（および生存のために必要とされる）必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結しているＰａｒａＢＡＤプロモーター、およびＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結しているＰａｒａＣプロモーターを有する死滅スイッチを含有する。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、そのＰａｒａＢＡＤプロモーターは必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子の転写を活性化し、組換え細菌細胞を生存させることができる。しかしながら、アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣはＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、生存に必要な必須タンパク質は発現されない。この場合、組換え細菌細胞はアラビノースの非存在下で死滅する。いくつかの実施形態では、組換え細菌細胞に見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結しているＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、すぐ上に記載されているＴｅｔＲ／毒素死滅スイッチ系と併せて細菌細胞内に存在し得る。いくつかの実施形態では、組み換え細菌細胞に見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結しているＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、すぐ上に記載されているＴｅｔＲ／毒素／抗毒素死滅スイッチ系と併せて細菌細胞内に存在し得る。
【０２１８】
さらに他の実施形態では、細菌は、寿命の短い抗毒素および寿命の長い毒素の両方を産生するプラスミドを有するプラスミド安定系を含んでもよい。この系において、細菌細胞は毒素を中和するために等量の毒素および抗毒素を産生する。しかしながら、細胞がプラスミドを喪失した場合／とき、寿命の短い抗毒素が減衰し始める。抗毒素が完全に減衰すると、細胞を死滅させる寿命の長い毒素の結果として細胞は死滅する。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本開示の操作された細菌は上記の死滅スイッチ回路のいずれかの成分をコードする遺伝子をさらに含む。
【０２２０】
上記の実施形態のいずれかでは、細菌毒素は、リシン、Ｈｏｋ、Ｆｓｔ、ＴｉｓＢ、ＬｄｒＤ、Ｋｉｄ、ＳｙｍＥ、ＭａｚＦ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＸＣＶ２１６２、ｄｉｎＪ、ＣｃｄＢ、ＭａｚＦ、ＰａｒＥ、ＹａｆＯ、Ｚｅｔａ、ｈｉｃＢ、ｒｅｌＢ、ｙｈａＶ、ｙｏｅＢ、ｃｈｐＢＫ、ｈｉｐＡ、ミクロシンＢ、ミクロシンＢ１７、ミクロシンＣ、ミクロシンＣ７〜Ｃ５１、ミクロシンＪ２５、ミクロシンＣｏｌＶ、ミクロシン２４、ミクロシンＬ、ミクロシンＤ９３、ミクロシンＬ、ミクロシンＥ４９２、ミクロシンＨ４７、ミクロシンＩ４７、ミクロシンＭ、コリシンＡ、コリシンＥ１、コリシンＫ、コリシンＮ、コリシンＵ、コリシンＢ、コリシンＩａ、コリシンＩｂ、コリシン５、コリシン１０、コリシンＳ４、コリシンＹ、コリシンＥ２、コリシンＥ７、コリシンＥ８、コリシンＥ９、コリシンＥ３、コリシンＥ４、コリシンＥ６、コリシンＥ５、コリシンＤ、コリシンＭ、およびコリシンＤＦ１３、またはそれらの生物学的に活性な断片からなる群から選択される。
【０２２１】
上記の実施形態のいずれかでは、抗毒素は、抗リシン、Ｓｏｋ、ＲＮＡＩＩ、ＩｓｔＲ、ＲｄｌＤ、Ｋｉｓ、ＳｙｍＲ、ＭａｚＥ、ＦｌｍＢ、Ｓｉｂ、ｐｔａＲＮＡ１、ｙａｆＱ、ＣｃｄＡ、ＭａｚＥ、ＰａｒＤ、ｙａｆＮ、イプシロン、ＨｉｃＡ、ｒｅｌＥ、ｐｒｌＦ、ｙｅｆＭ、ｃｈｐＢＩ、ｈｉｐＢ、ＭｃｃＥ、ＭｃｃＥＣＴＤ、ＭｃｃＦ、Ｃａｉ、ＩｍｍＥ１、Ｃｋｉ、Ｃｎｉ、Ｃｕｉ、Ｃｂｉ、Ｉｉａ、Ｉｍｍ、Ｃｆｉ、Ｉｍ１０、Ｃｓｉ、Ｃｙｉ、Ｉｍ２、Ｉｍ７、Ｉｍ８、Ｉｍ９、Ｉｍ３、Ｉｍ４、ＩｍｍＥ６、クロアシン免疫タンパク質（Ｃｉｍ）、ＩｍｍＥ５、ＩｍｍＤ、およびＣｍｉ、またはそれらの生物学的に活性な断片からなる群から選択される。
【０２２２】
一実施形態では、細菌毒素は遺伝子操作された細菌に対して殺菌性である。一実施形態では、細菌毒素は遺伝子操作された細菌に対して静菌性である。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される遺伝子操作された細菌は栄養要求株である。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１栄養要求株から選択される栄養要求株である。いくつかの実施形態では、操作された細菌は１つより多い栄養要求性を有し、例えば、それらはΔｔｈｙＡおよびΔｄａｐＡ栄養要求株であってもよい。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される遺伝子操作された細菌は、本明細書において提供される死滅スイッチ回路のいずれかなどの死滅スイッチ回路をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、誘導可能なプロモーターおよび反転した毒素配列の制御下で１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、誘導可能なプロモーターおよび１つまたは複数の反転した除去遺伝子の制御下で１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含み、除去遺伝子は必須遺伝子を欠失している酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、ＴｅｔＲリプレッサー結合部位を有するプロモーターの制御下で毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子およびＰａｒａＢＡＤなどの、アラビノースによって誘導される誘導可能なプロモーターの制御下でＴｅｔＲをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン代謝酵素をコードする遺伝子を含む栄養要求株であり、本明細書に記載される死滅スイッチ回路のいずれかなどの、死滅スイッチ回路をさらに含む。
【０２２６】
上記の遺伝子操作された細菌のいくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝酵素を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、細菌内のプラスミド上に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターにプラスミド上で作動可能に連結している。他の実施形態では、フェニルアラニン代謝酵素を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、細菌染色体内に存在し、低酸素または嫌気条件下で誘導されるプロモーターに染色体内で作動可能に連結している。
【０２２７】
医薬組成物および製剤
本発明の遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患、例えばＰＫＵを治療、管理、改善、および／または予防するために使用され得る。単独で、または予防剤、治療剤、および／もしくは薬学的に許容される担体と組み合わせて１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を含む本発明の医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される遺伝子組換えを含むように操作された細菌の１つの種、株、または亜型を含む。代替の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される遺伝子組換えを含むように各々操作された細菌の２つ以上の種、株、および／または亜型を含む。
【０２２８】
本明細書に記載される医薬組成物は、製剤学的用途のための組成物への活性成分の処理を容易にする、賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して従来の方式で製剤化され得る。医薬組成物を製剤化する方法は当該分野において公知である（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照のこと）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腸溶コーティングされてもよいか、またはコーティングされなくてもよい、錠剤、粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット、または粉剤を形成するように錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、従来の混合、溶解、造粒、粉状化、乳化、カプセル化、封入、または噴霧乾燥に供される。適切な製剤は投与経路に依存する。
【０２２９】
本明細書に記載される遺伝子操作された細菌は、任意の適切な剤形（例えば、液体、カプセル、サシェ、硬質カプセル、軟質カプセル、錠剤、腸溶コーティング錠剤、懸濁粉末、顆粒、または経口投与用のマトリクス持続放出製剤）で、および任意の適切な種類の投与（例えば、経口、局所、注射、即時放出、パルス放出、遅延放出、または持続放出）のための医薬組成物に製剤化され得る。遺伝子操作された細菌についての適切な投薬量は、約１０５〜１０１２細菌、例えば約１０５細菌、約１０６細菌、約１０７細菌、約１０８細菌、約１０９細菌、約１０１０細菌、約１０１１細菌、または約１０１１細菌の範囲であり得る。組成物は、１日に１回もしくは複数回、１週に１回もしくは複数回、１カ月に１回もしくは複数回投与されてもよい。組成物は、食事の前、間、または後に投与され得る。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事を食べる前に投与される。一実施形態では、医薬組成物は現在の食事とともに投与される。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事を食べた後に投与される。
【０２３０】
遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、緩衝剤、界面活性剤、中性またはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物に製剤化され得る。例えば、医薬組成物は、限定されないが、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤の付加を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、重炭酸ナトリウム溶液、例えば１モルの重炭酸ナトリウム溶液（例えば胃などの酸性細胞環境を緩衝するため）中で製剤化され得る。遺伝子操作された細菌は中性または塩形態として投与および製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンなどのアニオンと形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンなどのカチオンと形成される塩が含まれる。
【０２３１】
本明細書に開示される遺伝子操作された細菌は、局所的に投与されてもよく、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、噴霧、エアロゾル、溶液、エマルションの形態、または当業者に周知の他の形態で製剤化されてもよい。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照のこと。一実施形態では、噴霧可能ではない局所剤形に関して、局所適用に適合し、水より大きい動粘性係数を有する担体または１つもしくは複数の賦形剤を含む、粘性から半固体または固体形態が利用される。適切な製剤には、限定されないが、滅菌され得るか、または種々の特性、例えば浸透圧に影響を与える助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、バッファー、または塩）と混合され得る、溶液、懸濁剤、エマルション、クリーム、軟膏、粉剤、塗布薬、膏薬などが含まれる。他の適切な局所剤形には、噴霧可能なエアロゾル調製物が含まれ、固体または液体不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧された揮発性物質（例えば、フレオンなどのガス状推進剤）と共に混合物中またはスクイーズボトル内に充填される。保湿剤または保水剤もまた、医薬組成物および剤形に加えられてもよい。このようなさらなる成分の例は当業者に周知である。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は衛生製品として製剤化されてもよい。例えば、衛生製品は、抗菌製剤、または発酵ブロスなどの発酵製品であってもよい。衛生用品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローション、およびリップクリームであってもよい。
【０２３２】
本明細書に開示される遺伝子操作された細菌は、経口投与され、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤化されてもよい。経口用途のための医薬組成物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体賦形剤を使用し、任意選択で、得られた混合物を粉砕し、所望の場合、適切な助剤を加えた後に顆粒の混合物を処理して作製され得る。適切な賦形剤には、限定されないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボメチルセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）などのセルロース組成物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生理学的に許容されるポリマーが含まれる。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの崩壊剤もまた、添加されてもよい。
【０２３３】
錠剤またはカプセルは、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリン、およびトラガカント）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；錠剤崩壊剤（例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤と共に従来の手段によって調製されてもよい。錠剤は当該分野において周知の方法によってコーティングされ得る。コーティングシェルが存在してもよく、一般的な膜には、限定されないが、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物、他の生分解性ポリマー、アルギン酸−ポリリシン−アルギン酸（ＡＰＡ）、アルギン酸−ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン−アルギン酸（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシメチルアクリレート−メチルメタクリレート（ｈｙｄｒｏｙｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ−ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、多層ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリル塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、封入シリカ、硫酸セルロース／アルギ酸ナトリウム／ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸カルシウム、ｋ−カラギーナン−ローカストビーンガムゲルビーズ、ジェラン−キサンタンビーズ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ−無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸、および腸溶コーティングポリマーが含まれる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管または消化管の特定の領域、例えば大腸に放出するために腸溶コーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）、および５．５〜６．５（結腸）である。いくつかの疾患では、ｐＨプロファイルは変更されてもよい。いくつかの実施形態では、コーティングは放出部位を特定するために特定のｐＨ環境で分解される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのコーティングが使用される。いくつかの実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングは異なるｐＨレベルにて分解される。
【０２３５】
経口投与用の液体調製物は、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための溶液、シロップ、懸濁剤、または乾燥製剤の形態を取ることができる。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）；および防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される薬剤を用いて従来の手段によって調製され得る。調製物はまた、必要に応じて緩衝塩、香味料、着色剤、および甘味剤を含有してもよい。経口投与用の調製物は、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌の徐放、制御放出、または持続放出のために適切に製剤化され得る。
【０２３６】
一実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、小児対象への投与に適した組成物に製剤化され得る。当該分野において周知のように、子供は、異なる胃内容排出速度、ｐＨ、胃腸透過性など含む、多くの態様において成人と異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａら、２０１４年）。さらに、小児の製剤許容性ならびに投与経路および味覚特質などの好みが、許容される小児の服薬順守を達成するのに重要である。したがって、一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、飲み込みやすいもしくは溶解可能な剤形、または香味料、甘味料、もしくは味覚遮断剤を加えた組成物などの、より口当たりの良い組成物を含んでもよい。一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物はまた、成人への投与にも適していてもよい。
【０２３７】
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、溶液、シロップ、懸濁剤、エリキシル剤、懸濁剤または溶液として復元するための粉末、分散性／発泡性錠剤、チュアブル錠、グミキャンディー、ロリポップ、アイスキャンディー、トローチ、チューインガム、経口薄片、口腔内崩壊錠、サシェ、軟質ゼラチンカプセル、散剤経口粉末、または顆粒を含んでもよい。一実施形態では、組成物は、キャンディー弾力性、所望のかみごたえのある稠度（ｃｈｅｗｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）、およびより長い保存期間を与える、ゼラチンベースから作製されたグミキャンディーである。いくつかの実施形態では、グミキャンディーはまた、甘味料または香味料を含んでもよい。
【０２３８】
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は香味料を含んでもよい。本明細書において使用される場合、「香味料」は、製剤に明確な味および香りを与える物質（液体または固体）である。香味料はまた、製剤の嗜好性を改善するのにも役立つ。香味料には、限定されないが、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、バブルガム、およびチェリーが含まれる。
【０２３９】
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口投与されてもよい。化合物はまた、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、または対象の食事に直接組み込まれてもよい。経口治療投与のために、化合物は賦形剤と共に組み込まれてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウエハーなどの形態で使用されてもよい。非経口投与以外によって化合物を投与するために、その不活性化を阻止するために物質で化合物をコーティングするか、または物質と共に化合物を同時投与することが必要な場合がある。
【０２４０】
別の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、食べられる製品、例えば食品であってもよい。一実施形態では、食品は、ミルク、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、酢乳、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜−果物ジュース、果物ジュース、スポーツドリンク、菓子、キャンディー、乳児用食品（乳児用ケーキなど）、栄養食品、動物飼料、または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は発酵乳製品などの発酵食品である。一実施形態では、発酵乳製品はヨーグルトである。別の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクセーキ、またはケフィアである。別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティクスとして機能することが意図される他の生細菌細胞を含有する調製物中に組み合わされる。別の実施形態では、食品は飲料である。一実施形態では、飲料は、果物ジュースベースの飲料または植物もしくはハーブ抽出物を含有する飲料である。別の実施形態では、食品はゼリーまたはプディングである。本発明の組換え細菌の投与に適した他の食品は当該分野において周知である。例えば、それらの各々の全内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０３５９８９４号および米国特許出願公開第２０１５／０２３８５４５号を参照のこと。さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルト、またはチーズなどの食品に注入され、噴霧され、または振りかけられる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、組成物は、腸溶コーティングされているか、またはコーティングされていない、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、または微小錠剤によって、腸内投与、空腸内投与、十二指腸内投与、回腸内投与、胃バイパス投与、または結腸内投与用に製剤化される。医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を使用して、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に製剤化されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液、またはエマルションであってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含有してもよい。
【０２４２】
本明細書に記載される遺伝子操作された細菌は、鼻腔内投与されてもよく、エアロゾル形態、噴霧、ミストで、または液滴の形態で製剤化されてもよく、便宜上、適切な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用して加圧パックまたは噴霧器からエアロゾル噴霧提示の形態で送達されてもよい。加圧エアロゾル投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入具または注入器における使用のための（例えば、ゼラチンの）カプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有して製剤化されてもよい。
【０２４３】
遺伝子操作された細菌は、デポー製剤として投与され、製剤化されてもよい。このような長時間作用する製剤は、移植または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射、もしくは点滴を含む、注射によって投与されてもよい。例えば、組成物は、適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤化されてもよい。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、単回剤形の薬学的に許容される組成物が本明細書に開示される。単回剤形は液体または固体形態であってもよい。単回剤形は、修飾せずに患者に直接投与されてもよいか、または投与前に希釈もしくは復元されてもよい。特定の実施形態では、単回剤形は、複数の錠剤、カプセル、丸薬などを含む経口用量を含む、ボーラス形態、例えば、単回注射、単回経口用量で投与されてもよい。代替の実施形態では、単回剤形は、例えば点滴によって一定の期間にわたって投与されてもよい。
【０２４５】
医薬組成物の単回剤形は、医薬組成物をより少ない一定量、単回投与容器、単回投与液体形態、または腸溶コーティングされてもよいか、もしくはコーティングされていなくてもよい、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット、もしくは粉末などの単回投与固体形態に分けることによって調製されてもよい。固体形態の単回用量は、患者に投与する前に液体、典型的には滅菌水または生理食塩水を加えることによって復元されてもよい。
【０２４６】
他の実施形態では、組成物は制御放出または持続放出系において送達され得る。一実施形態では、ポンプが制御または持続放出を達成するために使用されてもよい。別の実施形態では、ポリマー材料が本開示の治療の制御または持続放出を達成するために使用されてもよい（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照のこと）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例には、限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコライド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコライド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが含まれる。持続放出製剤に使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能な不純物を含まず、保管時に安定であり、滅菌され、生分解性であり得る。いくつかの実施形態では、制御または持続放出系は予防または治療標的に近接して配置されてもよく、それによって全身用量の一部しか必要とされない。当業者に公知の任意の適切な技術が使用されてもよい。
【０２４７】
投薬レジメンは治療応答を提供するように調節されてもよい。投薬は、疾患の重症度および応答性、投与経路、治療の時間的経過（数日から数カ月から数年）、および疾患の改善時期を含む、いくつかの要因に依存し得る。例えば、単一ボーラスが一度に投与されてもよく、いくつかの分割用量が所定の期間にわたって投与されてもよく、または用量は、治療状況によって示されるように減少もしくは増加されてもよい。投薬量についての仕様は活性化合物の特有の特徴および達成される特定の治療効果によって決定される。投薬量の値は、軽減されるべき状態の種類および重症度によって変わり得る。任意の特定の対象について、特定の投薬レジメンは、個々の必要性および治療を行う医師の専門的判断に従って経時的に調節されてもよい。本明細書において提供される化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な薬剤的手順によって決定され得る。例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０、およびＩＣ５０が決定され得、毒性と治療効果との間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）が治療指数として計算され得る。有毒な副作用を示す組成物が、副作用を低減させるために潜在的な損傷を最小化するための注意深い変更を行って使用されてもよい。投薬は最初に細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定されてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイならびに動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための広範な投薬量を決定する際に使用され得る。
【０２４８】
成分は、別個に、または例えば、活性剤の量を示すアンプルもしくはサシェなどの密閉容器中の乾燥した凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として、単位剤形で一緒に混合されて供給される。投与様式が注射による場合、注射のための滅菌水または生理食塩水のアンプルが、成分が投与前に混合され得るように提供され得る。
【０２４９】
医薬組成物は薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器にパッケージ化されてもよい。一実施形態では、医薬組成物の１つまたは複数は、密閉容器中の乾燥滅菌した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給され、対象への投与のために適切な濃度に（例えば水または生理食塩水を用いて）復元され得る。一実施形態では、予防もしくは治療剤または医薬組成物の１つまたは複数は、２℃から８℃の間で保存された密閉容器中の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給され、復元後、１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、または１週間以内に投与される。凍結乾燥剤形のために原則として０〜１０％のスクロース（最適には０．５〜１．０％）の抗凍結剤が含まれてもよい。他の適切な抗凍結剤には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。他の適切な増量剤には、グリシンおよびアルギニン（それらのいずれも０〜０．０５％の濃度で含まれてもよい）、ならびにポリソルベート−８０（最適には０．００５〜０．０１％の濃度で含まれる）が含まれる。さらなる界面活性剤には、限定されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。医薬組成物は注射溶液として調製されてもよく、吸収または分散を増加させるために使用されるアジュバント、例えばヒアルロニダーゼなどの、アジュバントとして有用な薬剤をさらに含んでもよい。
【０２５０】
治療方法
本発明の別の態様は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患または高フェニルアラニン血症に関連する症状（複数可）の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症および瀬川病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症はその他の疾患、例えば、肝疾患に続発する。いくつかの実施形態では、本発明は、限定はしないが、神経障害、知能障害、脳症、てんかん、湿疹、成長障害（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ）、小頭症、振戦、四肢痙縮および／または色素沈着低下を含む、これらの疾患に関連する１つまたは複数の症状（複数可）を低減、回復させるか、または排除するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療する対象は、ヒト患者である。
【０２５１】
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、高フェニルアラニン血症、例えば、ＰＫＵに関連する疾患または障害を治療するために、食餌中のフェニルアラニンを代謝することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時に送達する。その他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時には送達しない。研究によって、小腸への膵分泌およびその他の腺分泌物は、高レベルのタンパク質、酵素およびポリペプチドを含有し、これらの異化反応の結果として産生されるアミノ酸は「腸管再循環」として知られるプロセスで血中に再吸収されることが示された（Ｃｈａｎｇ、２００７年；Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ等、１９９９年）。したがって、小腸内の高いフェニルアラニンレベルは部分的には食物摂取とは無関係である可能性があり、ＰＡＬによる分解に利用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌および食物タンパク質は、絶食またはフェニルアラニン制限食の期間後に送達する。これらの実施形態では、高フェニルアラニン血症に罹患している患者は、実質的に通常の食事またはフェニルアラニンを含まない食事よりも制限の少ない食事を再開することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、高フェニルアラニン血症、例えば、ＰＫＵに関連する疾患を治療するために、他の原料、例えば、血液からフェニルアラニンを代謝することができる。これらの実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時に送達する必要はなく、例えば、血液から消化管までフェニルアラニン勾配が形成され、遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを代謝し、高フェニルアラニン血症を低減させる。
【０２５２】
この方法は、本明細書で記載した細菌の少なくとも１種の遺伝子操作された種、株、またはサブタイプを含む医薬組成物を調製し、この医薬組成物を治療有効量で対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば、液体懸濁液で経口投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ジェルカップで凍結乾燥し、経口投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、栄養チューブまたは胃シャントによって投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、直腸内、例えば、浣腸剤によって投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、局所的、小腸内、空腸内、十二指腸内、回腸内および／または結腸内に投与する。
【０２５３】
特定の実施形態では、本明細書で記載した医薬組成物は、対象のフェニルアラニンレベルを低減させるために投与する。いくつかの実施形態では、本発明の開示の方法は、対象のフェニルアラニンレベルを未治療または対照の対象のレベルと比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ超低減させる。いくつかの実施形態では、低減は医薬組成物の投与前後の対象のフェニルアラニンレベルを比較することによって測定する。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症を治療または回復させる方法は、状態または障害の１つまたは複数の症状を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ超改善させる。
【０２５４】
医薬組成物の投与前、投与中および投与後に、対象のフェニルアラニンレベルは、血液、血清、血漿、尿、腹水、脳脊髄液、糞便、小腸粘膜擦過物、組織から収集した試料および／または以下の１つまたは複数の内容物：胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸および肛門管から収集した試料などの生物学的試料で測定することができる。いくつかの実施形態では、方法には、フェニルアラニンを低減させるために本発明の組成物を投与することを含めることができる。いくつかの実施形態では、方法には、対象におけるフェニルアラニンを検出不可能なレベルに低減させるために、本発明の組成物を投与することを含めることができる。いくつかの実施形態では、方法には、フェニルアラニン濃度を検出不可能なレベル、または治療前の対象のフェニルアラニンレベルの約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％もしくは８０％未満に低減させるために、本発明の組成物を投与することを含めることができる。
【０２５５】
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅである。遺伝子操作された細菌は、例えば、消化管内もしくは血清中の防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ等、２００９年）、または死滅スイッチの活性化によって、投与の数時間または数日後に破壊されることがある。したがって、遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物は、治療有効用量および頻度で再投与してもよい。マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮｉｓｓｌｅの滞留期間の長さを図３８に示す。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は投与後の数時間以内または数日以内に破壊されず、消化管で増殖して定着することができる。
【０２５６】
本発明の方法は、医薬組成物を単独で、または１つまたは複数の治療薬とさらに組み合わせて投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、補因子テトラヒドロビオプテリン（例えば、クバン／サプロプテリン）、大型中性アミノ酸（例えば、チロシン、トリプトファン）、グリコマクロペプチド、プロバイオテック（例えば、ＶＳＬ３）、酵素（例えば、ペグ化ＰＡＬ）、および／またはフェニルケトン尿症の治療で使用されるその他の薬剤（Ａｌ  ＨａｆｉｄおよびＣｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ、２０１５年）と併せて投与する。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の組換えによって生成したＰＭＥ酵素、例えば、組換えＰＡＬ、ＬＡＡＤまたはＰＡＨと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、組換え酵素は、安定性および／または送達を改善するためにさらに製剤化する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌と組み合わせて投与する１つまたは複数のＰＭＥ酵素はペグ化する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌と組み合わせて投与する１つまたは複数のＰＭＥ酵素は融合タンパク質として送達する。このような融合タンパク質の非限定的な例は、ＰＭＥと細胞に取り込むための形質導入ドメインとの融合物である。このような形質導入ドメインまたは細胞貫通ペプチドの非限定的な例はＴＡＴペプチドである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌と組み合わせて投与する１つまたは複数のＰＭＥ酵素はナノ粒子中に製剤化する。このようなナノ粒子の非限定的な例は、デキストラン硫酸／キトサンＰＭＥナノ粒子である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌と組み合わせて投与する１つまたは複数のＰＭＥ酵素はＰＭＥ小球体として送達する。このような小球体の非限定的な例は、アルギン酸バリウムＰＭＥ小球体である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌と組み合わせて投与する１つまたは複数のＰＭＥ酵素は非結晶性シリカＰＭＥ粒子として送達する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＨと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬおよびＰＡＨと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬおよびＬＡＡＤと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＨおよびＬＡＡＤと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬ、ＰＡＨおよびＬＡＡＤと組み合わせて投与する。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はペグ化ＰＡＬと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はペグ化ＰＡＨと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はペグ化ＬＡＡＤと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬ融合タンパク質、例えば、細胞貫通ペプチドと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＨ融合タンパク質、例えば、細胞貫通ペプチドと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤ融合タンパク質、例えば、細胞貫通ペプチドと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬ−ナノ粒子と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＨ−ナノ粒子と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤ−ナノ粒子と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬ−小球体と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＨ−小球体と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤ−小球体と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬ−シリカ粒子と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＨ−シリカ粒子と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤ−シリカ粒子と組み合わせて投与する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、組換え酵素補充療法または置換療法、例えば、ＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤを遺伝子操作された細菌なしに投与する。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥはＰＡＬである。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、その内容全体を参考として本明細書に組み込んだＳａｒｋｉｓｓｉａｎ等、２０１１年、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．２０１１年１１月；１０４（３）：２４９〜２５４頁で記載された通りに改変する。いくつかの実施形態では、ＰＡＬはＡｖ−ｐ．Ｃ５０３Ｓ／ｐ．Ｃ５６５Ｓ／ｐ．Ｆ１８Ａ  ＰＡＬである。いくつかの実施形態では、ＰＡＬはＰＥＧ−Ａｖ−ｐ．Ｃ５０３Ｓ／ｐ．Ｃ５６５Ｓ／ｐ．Ｆ１８Ａ  ＰＡＬである。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、ＰＡＬはペグ化する。一実施形態では、ペグ化ＰＡＬはアナベナ・バリアビリス由来である。一実施形態では、ペグ化ＰＡＬはフォトラブダス・ルミネセンス由来である。いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥはＰＡＨである。一実施形態では、ＰＡＨはヒトＰＡＨである。いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥはＬＡＡＤである。いくつかの実施形態では、投与したＬＡＡＤタンパク質は、プロテウス・ミラビリスから得られる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＰＭＥはＰＡＬおよびＰＡＨと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥはＰＡＬおよびＬＡＡＤである。いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥはＰＡＨおよびＬＡＡＤである。いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥはＰＡＬ、ＰＡＨおよびＬＡＡＤである。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、組換え酵素は、安定性および／または送達を改善するためにさらに製剤化する。いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥ酵素はペグ化する。いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥ酵素は融合タンパク質として送達する。このような融合タンパク質の非限定的な例は、ＰＭＥと細胞に取り込むための形質導入ドメインとの融合物である。このような形質導入ドメインまたは細胞貫通ペプチドの非限定的な例はＴＡＴペプチドである。いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥ酵素はナノ粒子中に製剤化する。このようなナノ粒子の非限定的な例は、デキストラン硫酸／キトサンＰＭＥナノ粒子である。いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥ酵素はＰＭＥ小球体として送達する。このような小球体の非限定的な例は、アルギン酸バリウムＰＭＥ小球体である。いくつかの実施形態では、投与した１つまたは複数のＰＭＥ酵素は非結晶性シリカＰＭＥ粒子として送達する。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、ペグ化ＰＡＬを投与する。いくつかの実施形態では、ペグ化ＬＡＡＤを投与する。いくつかの実施形態では、プロテウス・ミラビリス由来のペグ化ＬＡＡＤを投与する。いくつかの実施形態では、ペグ化ＰＡＨを投与する。
【０２６５】
一実施形態では、例えば、細胞貫通ペプチドとのＰＡＬ融合タンパク質を投与する。一実施形態では、例えば、細胞貫通ペプチドとのＬＡＡＤ融合タンパク質を投与する。一実施形態では、例えば、細胞貫通ペプチドとのＰＡＨ融合タンパク質を投与する。いくつかの実施形態では、ＰＡＬナノ粒子を投与する。いくつかの実施形態では、ＰＡＨナノ粒子を投与する。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤナノ粒子を投与する。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ小球体を投与する。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ小球体を投与する。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ小球体を投与する。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ−シリカ粒子を投与する。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ−シリカ粒子を投与する。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ−シリカ粒子を投与する。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＨ、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤはアプロチニン、例えば、アプロチニン４０ｍｇ／ｍｌと共に製剤化する。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、ＰＭＥは遺伝子治療薬として送達する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤおよび／またはＰＡＨを送達するために、遺伝子治療ベクターを使用する。遺伝子治療ベクターは当業界では公知で、限定はしないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。あるいは、製剤化した、または裸のＰＭＥ遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡを送達することができる。
【０２６８】
１つまたは複数のさらなる治療薬の選択において肝心なことは、薬剤（複数可）が本発明の遺伝子操作された細菌と適合すること、例えば、薬剤（複数可）が細菌を妨害したり、死滅させたりしてはならないことである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は食物と一緒に投与する。他の実施形態では、医薬組成物は食物を食べる前後に投与する。医薬組成物は、１つまたは複数の食事の改善、例えば、低フェニルアラニン食と組み合わせて投与することができる。医薬組成物の投与量および投与頻度は、疾患の症状の重症度および進行に基づいて選択することができる。適切な治療有効用量および／または投与頻度は、治療する臨床医が選択することができる。
【０２６９】
本発明の方法にはまた、本明細書で記載した医薬組成物を含むキットが含まれる。キットには、限定はしないが、使用説明書、その他の試薬、例えば、標識、さらなる治療薬、対象におけるフェニルアラニンレベルまたは高フェニルアラニン血症に関連するその他の分子もしくは代謝物のレベルを測定するための装置または材料、投与用に本発明の医薬組成物を調製するための装置またはその他の材料および対象に投与するための装置またはその他の材料を含む、１つまたは複数のその他の構成要素を含めることができる。使用説明書には、例えば、高フェニルアラニン血症の患者における推奨投与量および／または投与形式などの治療的応用のための指導を含めることができる。キットはさらに、１つまたは複数の別々の医薬品調製物において、少なくとも１つのさらなる治療薬、および／または適切ならば製剤化された本発明の１つまたは複数の遺伝子操作されたさらなる細菌株を含有することができる。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、キットは医薬組成物を対象に投与するために使用する。いくつかの実施形態では、キットは医薬組成物を単独で、または１つまたは複数のさらなる治療薬と組み合わせて対象に投与するために使用する。いくつかの実施形態では、キットは医薬組成物の対象への投与前、投与中、投与後の対象におけるフェニルアラニンレベル（例えば、血中フェニルアラニンレベル）を測定するために使用する。特定の実施形態では、キットは、血液フェニルアラニンレベルが増加するか、または異常に高いとき、医薬組成物を単独で、または１つまたは複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与および／または再投与するために使用する。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症の診断シグナルは、少なくとも２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｄＬまたは少なくとも２５ｍｇ／ｄＬの血中フェニルアラニンレベルである。
【０２７１】
表２０は、古典的ＰＫＵ患者の平均のフェニルアラニンレベルをベースにした、標的分解速度の非限定的例を示す。
【０２７２】
【表２０−１】
2018515106.tif 000044
【表２０−２】
2018515106.tif 000045
【０２７３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．１５から約８．０１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．１５から約２μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．６から約８．０１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．２から約２．６７μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．１５から約０．６μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．２２から約０．９μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．３から約１．２１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．５４から約２．１６μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約１．１３から約４．５３μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約１．８４から約７．３８μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約１．６１から約６．４３μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約２から約８．０１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約０．１から約１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約１から約２μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約２から約３μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約３から約４μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約４から約５μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約５から約６μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約６から約７μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約７から約８μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を実現する。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は０．１５μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間未満の標的低減速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約８．０１μｍｏｌ／１０９ＣＦＵ／時間超の標的低減速度を実現する。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約１７８ｍｇと２３８２ｍｇとの間の標的低減速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は１．０８ｍｍｏｌから１４．４２ｍｍｏｌの標的低減速度を実現する。いくつかの実施形態では、低減は１．０８ｍｍｏｌ未満である。いくつかの実施形態では、低減は１４．４２ｍｍｏｌ超である。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、標的低減速度および標的分解速度は、古典的ＰＫＵフェニルアラニンレベルをベースにしている。いくつかの実施形態では、標的低減速度および標的分解速度は、軽度ＰＫＵで認められたフェニルアラニンレベルをベースにしている。いくつかの実施形態では、標的低減速度および標的分解速度は、軽度高フェニルアラニン血症で認められたフェニルアラニンレベルをベースにしている。
【０２７９】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療
本発明の遺伝子操作された細菌は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば動物モデルにおいて評価することができる。高フェニルアラニン血症に関連する疾患または疾患の任意の適切な動物モデルを使用することができる（例えば、Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ等、１９９９年参照）。いくつかの実施形態では、動物モデルは、ＰＫＵのマウスモデルである。特定の実施形態では、ＰＫＵのマウスモデルは、ＰＡＨ突然変異体ＢＴＢＲマウス（ＢＴＢＲ−Ｐａｈｅｎｕ２、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。これらの実施形態では、マウスモデルは、Ｐａｈ遺伝子のエクソン７に化学的に（ＥＮＵ）誘導したホモ接合体ミスセンス変異（Ｔ８３５Ｃ）を含有し、アミノ酸２６３のフェニルアラニンからセリンへの置換（Ｆ２６３Ｓ）を引き起こす。この残基は、結晶構造分析によって示されたようにＰＡＨ酵素の活性部位に位置し、ＰＡＨ活性の完全な消失を引き起こす。通常の食餌では、これらの突然変異マウスは変化していない対照と比較して、血清フェニルアラニンレベルの１０から２０倍の増加を示す。本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば、強制経口投与によって動物に投与することができ、治療の有効性は、例えば、治療前後の血中フェニルアラニンおよび／またはケイ皮酸塩を測定することによって判定する。動物モデルでは、ＧＩ管内での遺伝子操作された細菌の滞留時間は、ヒトにおける滞留時間よりも短いことがあることに注意されたい。動物を殺処分し、組織試料を収集して分析する。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌の投与によって生じるいかなる潜在的毒性も判定するために、薬物動態学的および薬力学的研究は非ヒト霊長類において実行することができる。遺伝子操作された細菌の薬物動態および薬物動力学。このような試験の非限定的例を実施例３０および３１に記載する。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤを発現する遺伝子操作された細菌は、糞において特異的に検出することができ、その他の大腸菌株と区別することができる。フェニルアラニンデアミナーゼ試験「フェニルアラニン斜面寒天培地」は、この目的のために使用することができる。フェニルアラニン寒天は、微生物がフェニルアラニンを使用して、フェニルアラニンをフェニルピルビン酸に変換することができるかどうかを判定するために使用する。フェニルアラニン寒天上に試料を含有する試験管に試験化学物質を添加すると、フェニルピルビン酸が緑色の化合物に変換され、試験結果が陽性であることを示す。野生型大腸菌は、フェニルアラニンからフェニルピルビン酸を生成することができその他の大腸菌株からの区別を可能にする酵素をコードしないので、フェニルピルビン酸を生成しない。遺伝子操作された細菌は、当業界で公知のＰＣＲをベースにした試験によってフェニルピルビン酸を生成することができるその他の細菌種から区別することができる。例えば、種特異的配列を増幅することができる。例えば、様々な細菌の変換された領域を増幅する汎用ＰＣＲは、標本のスクリーニングにおいていかなる病原体も検出するのに理想的である。この目的のために、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の変換された領域を汎用ＰＣＲの標的遺伝子として使用することができ、この１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、多数の細菌種を区別することができる種特異的領域を含有する。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、フェニルアラニンデアミナーゼ試験は、糞便試料において遺伝子操作された細菌を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲをベースにした試験は、その他の細菌種から遺伝子操作された細菌を区別するために実行することができる。
【０２８３】
スクリーニング方法
本開示のいくつかの実施形態では、遺伝子操作株は、例えば、ＰＭＥ酵素活性を増加させるか、または株がフェニルアラニンを取り込む能力を増加させるために、スクリーニング方法および選択方法を使用することによって改善することができる。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、ＰＭＥ活性が改善した細菌株を作製するために役立つ。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、フェニルアラニン取り込み能力が改善した細菌株を作製するために役立つ。いくつかの実施形態では、スクリーニングによって、ＰＭＥ活性が改善し、基質取り込みも増強された細菌株を同定することができる。使用することができるスクリーニング方法の非限定的例を本明細書で記載する。
【０２８４】
生体分子を輸送する能力が増強した細菌株の作製
培養が簡単で、生成時間が短く、集団密度が非常に高く、ゲノムが小さいので、微生物は時間尺を短縮して特有の表現型に進化させることができる。適応実験室進化（ＡＬＥ）は、好ましい表現型を有する株を進化させる選択圧下で微生物を継代する方法である。最も一般的には、炭素／エネルギー源の利用を増加させるか、または株を環境ストレス（例えば、温度、ｐＨ）に適合させて、それによって、炭素基質またはストレス下で増殖することができる突然変異株が、集団におけるあまり適合していない株を打ち負かし、最終的に集団で優位を占めるようにするために、ＡＬＥを適用する。
【０２８５】
これと同じ方法を、栄養要求株を作製することによって任意の必須代謝物に適用することができる。栄養要求株は、必須代謝物を合成することができない株で、したがって、増殖するための培地に代謝物を供給しなければならない。この場合、栄養要求株を作製し低量の代謝物で継代することによって、得られた優位な株は、この必須代謝物を獲得して取り込む能力が高まっているはずである。
【０２８６】
例えば、アミノ酸を産生する生合成経路が破壊された場合、前記アミノ酸を高い親和性で捕捉することができる株をＡＬＥによって進化させることができる。最初に、増殖を支持する最小限の濃度が確立するまで、栄養要求性アミノ酸の様々な濃度で株を増殖させる。次に、この株をこの最小限の濃度で継代し、アミノ酸濃度を規則正しい間隔で低下させて希釈した。徐々に、アミノ酸に対して−増殖限界濃度で−最も競争力がある細胞が優位な集団になる。これらの株はおそらくアミノ酸−トランスポーターに突然変異を有していて、必須かつ制限されているアミノ酸を取り込む能力が増強しているのだろう。
【０２８７】
同様に、アミノ酸を形成するために上流の代謝物を使用することができない栄養要求株を使用することによって、上流の代謝物を効率的に取り込むことができるだけでなく、代謝物を必須の下流の代謝物に変換することができる株を進化させることができる。これらの株はまた、上流の代謝物の取り込みを増加させるように突然変異を進化させるが、下流の酵素の発現もしくは反応速度が増加した、または基質利用が競合する経路が低減した突然変異を含有していてもよい。
【０２８８】
以前の実施例では、微生物に本来備わっている代謝物は栄養要求性変異によって必須となったので、内在性代謝物を増殖限界で補給することによって選択を行った。しかし、非天然化合物を消費することができる表現型は、その消費を必須化合物の産生に結びつけることによって進化させることができる。例えば、必須化合物または必須化合物の前駆体を産生することができる異なる生物の遺伝子を単離した場合、この遺伝子を組換えによって異種宿主に導入し、発現させることができる。この新たな宿主株はこうして以前の非代謝性基質から必須栄養素を合成する能力を有するようになる。これによって、すぐ下流の代謝物を変換することができない栄養要求株を作製し、非天然化合物の増殖限界量で選択して組換え酵素を同時発現させることによって、類似のＡＬＥ方法を適用することができる。これは、非天然基質の輸送、異種酵素の発現および活性ならびに下流の天然酵素の発現および活性に突然変異を引き起こすこととなる。この方法の重要な必要条件は、非天然代謝物の消費を増殖に必須の代謝物の産生に結びつける能力であることを強調したい。
【０２８９】
選択機構の基礎を確立し、補給の最小限レベルを確立したら、実際のＡＬＥ実験を進めることができる。この方法全体を通じて、いくつかのパラメータは注意深くモニターしなければならない。培養物は指数増殖期で維持し、飽和／定常期に至らないようにすることが重要である。これは、増殖速度を各継代およびその後の希釈中に点検し、それに応じて調整しなければならないことを意味している。希釈が大幅になるような程度まで増殖速度が上昇したら、増殖速度が低下し、選択圧が増加し、継代中の小集団の偏りが大きくなるほど希釈が著しくならないように、栄養要求性補給の濃度を減少させるべきである。さらに、規則正しい間隔で細胞を希釈して、固体培地で増殖させ、ＡＬＥ培養で認められる増殖速度表現型を確認するために個々のクローンを試験するべきである。
【０２９０】
いつ停止するかを予測して、ＡＬＥ実験を停止するにはまた用心を要する。進化誘導の成功は実験全体を通じて「スクリーニングした」突然変異体の数と直接結びつき、突然変異は一般的にＤＮＡ複製中のエラーの関数なので、累積した細胞分裂（ＣＣＤ）はスクリーニングした突然変異体総数の代わりとなる。以前の研究によって、様々な炭素源で増殖させるために有益な表現型は約１０１１．２ＣＣＤ１で単離することができることが示された。この割合は、ＤＮＡ複製エラーを増加させる原因となる化学的変異誘発物質、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を培養物に添加することによって高めることができる。しかし、継代の継続が増殖速度の限界に達するか、または増殖速度の改善をもたらされない場合、集団の適応度はかなり最大に収束しており、ＡＬＥ実験を停止することができる。
【０２９１】
ＡＬＥ実験の結果、細胞は希釈して、固体培地で単離して、培養フラスコの増殖表現型に合致する増殖表現型についてアッセイするべきである。次に、選択したもののうち最良の性能のものをゲノムＤＮＡのために用意し、全ゲノム配列決定に送る。配列決定によって、改善した表現型をもたらすことができるゲノム全体に生じた突然変異を明らかにするはずであるが、サイレント変異（利益はもたらさないが、所望する表現型を損なわない変異）も含まれるはずである。ＮＴＧまたはその他の化学的変異誘発物質の存在下で進化させた培養物では、さらによりサイレ揮毫ントな自然突然変異がある。現在の状態で最良の性能の株に満足したならば、使用者はこの株の適用を進めることができる。そうでなければ、ゲノム操作技術によって変異を親株に再導入することによって、進化した株から関与する変異を解析することができる。Ｌｅｅ，Ｄ．−Ｈ．、Ｆｅｉｓｔ，Ａ．Ｍ．、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃ．Ｌ．＆  Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｂ．Ｏ．「Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  Ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ  Ｔｉｍｅｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６、ｅ２６１７２（２０１１年）を参照のこと。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、ＡＬＥ法は、フェニルアラニン取り込みが改善した遺伝子操作された細菌を同定するために使用することができる。
【０２９３】
ＰＭＥ活性を改善するための特異的なスクリーニング
遺伝子選択を使用するスクリーニングは、遺伝子操作された細菌におけるフェニルアラニン消費を改善するために実行する。毒性のあるフェニルアラニン類似体は、細胞タンパク質に組み込まれることによって作用（ＭＯＡ）機構を発揮し、細胞死をもたらす。パラログｐ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンおよびオルソログｏ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンなどのこれらの化合物は、活性が増加したＰＡＬ酵素を選択するための非標的アプローチに有用である。これらの毒性化合物は、細胞タンパク質に取り込まれるよりもＰＡＬによって非毒性代謝物に代謝され得ると仮定すると、フェニルアラニン分解活性が改善した遺伝子操作された細菌は、高レベルのこれらの化合物に耐性があり、これに基づいてスクリーニングし、選択することができる。
【０２９４】
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Ａｌ  Ｈａｆｉｄ  Ｎ，Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ  Ｊ．  Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．  Ｔｒａｎｓｌ  Ｐｅｄｉａｔｒ．２０１５  Ｏｃｔ；４（４）：３０４−３１７．  ＰＭＩＤ：２６８３５３９２；
Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４  Ａｐｒ  ９；４０（３）：２２３−２２９．ＰＭＩＤ：１５０３９０９８；
Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｕｒａｃｉｌ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒａＡ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５  Ａｐｒ；１７７（８）：２００８−２０１３．ＰＭＩＤ：７７２１６９３；
Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｒ  ａｎｄ  ｎｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＣＲＰ／ＦＮＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，ＤＮＲ，ｉｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ＡＮＲ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９５  Ａｕｇ  ２８；３７１（１）：７３−７６．ＰＭＩＤ：７６６４８８７；
Ａｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｃａｎｃｅｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１２  Ｏｃｔ  ５；３３８（６１０３）：１２０−１２３．ＰＭＩＤ：２２９０３５２１；
Ｃａｌｌｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｃｋｉｎｇ，Ｔｕｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１０；２７（３６）：１５８９８−１５９０３．ＰＭＩＤ：２０７１３７０８；
Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＤＮＲ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｈａｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００９  Ｓｅｐ；１５５（Ｐｔ  ９）：２８３８−２８４４．ＰＭＩＤ：１９４７７９０２；
Ｃｈａｎｇ，ｅｄ．（２００７）  “Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｅｆｅｃｔｓ．”  Ｉｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ，Ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌ／Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ｐｐ．１４７−１５９；
Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ８６０２．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７１  Ｍａｙ；６６（２）：１６１−１６９．ＰＭＩＤ：４９９９０７３；
Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  Ｊｕｎ  ２２；１０７（２５）：１１５３７−１１５４２．  ＰＭＩＤ：２０５３４５２２；
Ｄａｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｍａｙ  ２７；７（２８９）：２８９ｒａ８４．ＰＭＩＤ：２６０１９２２０；
Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ．Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００８  Ａｐｒ；１１（２）：８７−９３．ＰＭＩＤ：１８３５９２６９；
Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ  ＣＮＣＭ  Ｉ−７４５  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｎｏｖ；１４（１１）：１５９３−１６０９．ＰＭＩＤ：２４９９５６７５；
Ｄｏｂｂｅｌａｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ．Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓ．２００３；２６（１）：１−１１．ＰＭＩＤ：１２８７２８３４；
Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＦＮＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８９  Ｊｕｌ；３（７）：８６９−８７８．ＰＭＩＤ：２６７７６０２；
Ｅｓｔｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＵＰ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９８  Ａｕｇ  １８；９５（１７）：９７６１−９７６６．ＰＭＩＤ：９７０７５４９；
Ｇａｌｉｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＦＮＲ−ｌｉｋｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１  Ｍａｒ；１７３（５）：１５９８−１６０６．ＰＭＩＤ：１９００２７７；
Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｏｇｇｌｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０３：３３９−３４２．ＰＭＩＤ：１０６５９８５７；
Ｇｅｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｐｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ｏｃｔ；１７（５）：４４８−４５６．ＰＭＩＤ：１６９７８８５５；
Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８５  Ｊａｎ；１６１（１）：３１４−３２０．ＰＭＩＤ：２９８１８０５；
Ｇｏｒｋｅ  Ｂ，Ｓｔｕｌｋｅ  Ｊ．Ｃａｒｂｏｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｍａｎｙ  ｗａｙｓ  ｔｏ  ｍａｋｅ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８  Ａｕｇ；６（８）：６１３−６２４．ＰＭＩＤ：１８６２８７６９；
Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＦＮＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  ＤＮＲ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｎｉｔｒｉｔｅ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９８  Ｓｅｐ  １５；１６６（２）：２１３−２１７．ＰＭＩＤ：９７７０２７６；
Ｈｏｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｕｌｔ  ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ．Ｎｅｔｈ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００９  Ｊａｎ；６７（１）：２−７．ＰＭＩＤ：１９１５５５４０；
Ｈｏｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｎｉｔｒｏｕｓ−ｏｘｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３  Ｎｏｖ  １５；２１８（１）：４９−５７．ＰＭＩＤ：８２４３４７６；
Ｈｏｓｓｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ  ａｓ  ａ  ｈｅａｌｔｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ．Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ．２０１１  Ｍａｙ；６９（５）：２４５−２５８．ＰＭＩＤ：２１５２１２２７；
Ｉｓａｂｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｓｔｉｍｕｌｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１１  Ｊａｎ  ２０；１２：５１．ＰＭＩＤ：２１２５１２５５；
Ｉｖａｎｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｄｒｕｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ．  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１４  Ａｕｇ；１３４（２）：３６１−３７２．  ＰＭＩＤ：２５０２２７３９；Ｋｏｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１９９７  Ｊｕｎ；  ６（６）：１３５２−１３５７．ＰＭＩＤ：９１９４１９８；
Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８５  Ｊａｎ  ２９；  ２４（３）：５５６−５６１．ＰＭＩＤ：２９８６６７８；
Ｌｅｏｎａｒｄ  ＪＶ  （２００６）．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ．  Ｉｎｂｏｒｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４ｔｈ  ｅｄ  （ｐｐ．２６３−２７２）．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｍｅｄｉｚｉｎ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；
Ｌｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  １  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｒＡｖＰＡＬ−ＰＥＧ  ｉｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１４  Ｊｕｌ  ５；  ３８４（９９３７）：３７−４４；
Ｌｏｐｅｚ  Ｇ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＪＣ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｓｔｒａｉｎ．ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｄｅｃ  １８；４（１２）：１２７９−１２８６．ＰＭＩＤ：２６０７２９８７；
Ｍａｃｌｅｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ．Ａｎｎ  Ｎｅｓｔｌｅ  Ｅｎｇ．２０１０  Ｊｕｎ；６８（２）：５８−６９．ＰＭＩＤ：２２４７５８６９；
Ｍｅａｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９５９  Ｊｕｌ；７２（３）：３９６−４００．ＰＭＩＤ：１６７４８７９６；
Ｍｉｌｌｅｒ  （１９７２）  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；
Ｍｏｆｆｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅｓ：ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７  Ｊａｎ  ３０；４６（４）：１００４−１０１２．ＰＭＩＤ：１７２４０９８４；
Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＮＲ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｃｈａｒｇｅ  ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ｎｏｖ  ３；２８１（４４）：３３２６８−３３２７５．ＰＭＩＤ：１６９５９７６４；
Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６  Ａｕｇ  １１；３１３（５７８８）：８４８−５１．ＰＭＩＤ：１６９０２１４２；
Ｏｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｓｔｒａｉｎ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｔｓ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ．２０１２  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３（６）：５０１−５０９．ＰＭＩＤ：２２８９５０８５；
Ｐｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅＰ  ｇｅｎｅ，ｗｈｉｃｈ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１  Ｊｕｎ；１７３（１２）：３６２２−３６２９．ＰＭＩＤ：１７１１０２４；
Ｐｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９６  Ｍａｙ；１７８（９）：２６５０−２６５５．ＰＭＩＤ：８６２６３３４；
Ｐｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｐｒｏｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８  Ｎｏｖ；１８０（２１）：５５１５−５５１９．ＰＭＩＤ：９７９１０９８；
Ｐｕｒｃｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｈａｏｓ．２０１３  Ｊｕｎ；２３（２）：０２５１１２．ＰＭＩＤ：２３８２２５１０；
Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｒ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９７  Ｎｏｖ  １５；１５６（２）：２２７−２３２．ＰＭＩＤ：９５１３２７０；
Ｒｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｏｃｔ  １０；１８７：１０６−１０７．ＰＭＩＤ：２５０９３９３６；
Ｒｅｍｂａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９９  Ａｕｇ  ２１；３５４（９１７９）：６３５−６３９．ＰＭＩＤ：１０４６６６６５；
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （２０１２），２２ｎｄ  ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．
Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ＦＮＲ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ａｕｇ  ８；２７８（３２）：２９８３７−２９８５５．ＰＭＩＤ：１２７５４２２０；
Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ：ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９９  Ｍａｒ  ２；９６（５）：２３３９−２３４４．ＰＭＩＤ：１００５１６４３；
Ｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍａｚＥＦ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｍｏｄｕｌｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｙｍｉｎｅｌｅｓｓ  ｄｅａｔｈ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００３  Ｍａｒ；１８５（６）：１８０３−１８０７．ＰＭＩＤ：１２６１８４４３；
Ｓａｗｅｒｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１  ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＦＮＲ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１  Ｊｕｎ；５（６）：１４６９−１４８１．ＰＭＩＤ：１７８７７９７；
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Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  −  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．２００９；２１：１２２−１５８；
Ｔｒｕｎｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｒ  ａｎｄ  Ｄｎｒ  ｒｅｇｕｌｏｎｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０  Ｊｕｎ；１２（６）：１７１９−１７３３．ＰＭＩＤ：２０５５３５５２；
Ｕｋｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｅａｋｙ  ｇｕｔ  ｂｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００７  Ｄｅｃ  １２；２（１２）：ｅ１３０８．ＰＭＩＤ：１８０７４０３１；
Ｕｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ａｃｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９７  Ｊｕｌ  ４；１３２０（３）：２１７−２３４．ＰＭＩＤ：９２３０９１９；
Ｖｏｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｆｅｂ；１６（２）：１８８−２００．ＰＭＩＤ：２４３８５０７４；
Ｗａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５  Ｊａｎ；２７（２）：３２７−３３８．ＰＭＩＤ：７８８８６２２；
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｓｔｌＡ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｉｎ  Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＴＴ０１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００５  Ａｕｇ；１５１（Ｐｔ  ８）：２５４３−２５５０．ＰＭＩＤ：１６０７９３３３．
Ｗｉｎｔｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ＡＮＲ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ａｎｄ  ＦＮＲ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈａｖｅ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｂｕｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｎａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９６  Ｍａｒ；１４２  （Ｐｔ  ３）：６８５−６９３．ＰＭＩＤ：８８６８４４４；
Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ．ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｍａｒ  ２０；４（３）：３０７−３１６．ＰＭＩＤ：２４８４７６７３；
Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｆｏＸ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  （ｃＡＭＰ）  ａｎｄ  ｃＡＭＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｏｃｔ  ７；５：１４９２１．ＰＭＩＤ：２６４４２５９８；
Ｘｉａｎｇ  Ｌ，Ｍｏｏｒｅ  ＢＳ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ  ｌｙａｓｅ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００５  Ｊｕｎ；１８７（１２）：４２８６−４２８９．ＰＭＩＤ：１５９３７１９１；
Ｚｈａｎｇ  Ｒ，Ｌｉｎ  Ｙ．ＤＥＧ  ５．０，ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００９  Ｊａｎ；３７（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４５５−Ｄ４５８．ＰＭＩＤ：１８９７４１７８；
Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｃｙａｎｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｄｅｐｅｎｄ  ｏｎ  ａｎｒ，ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｗｉｔｈ  ｆｎｒ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１  Ｊｕｎ；５（６）：１４８３−１４９０．ＰＭＩＤ：１７８７７９８．
【実施例】
【０２９５】
以下の実施例は、本開示の実施形態の例である。当業者ならば、本開示の趣旨または範囲を変化させることなく実施することができる数々の改変および変更を認識するだろう。このような改変および変更は、本開示の範囲内に包含される。実施例は、決して本開示を限定しない。
【実施例１】
【０２９６】
ＰＡＬプラスミドの構築
大腸菌ＮｉｓｓｌｅにおけるＰＡＬ産生の誘導を容易にするために、アナベナ・バリアビリス（「ＰＡＬ１」）またはフォトラブダス・ルミネセンス（「ＰＡＬ３」）のＰＡＬ遺伝子、ならびに転写および翻訳エレメントを合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）ベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。ＰＡＬ遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下に置いた。誘導ＦＮＲプロモーターまたはＴｅｔプロモーターの制御下にあるＰＡＬ１およびＰＡＬ３それぞれについて低コピーおよび高コピープラスミドを生成した。ＦＮＲプロモーターの例を表３に示す。これらの構築物の構成およびヌクレオチド配列を図６〜９に示す。しかし、上記のように、その他のプロモーターを使用してＰＡＬ遺伝子を発現させてもよく、その他のＰＡＬ遺伝子を使用してもよく、その他のフェニルアラニン代謝制御遺伝子を使用してもよい。
【実施例２】
【０２９７】
大腸菌の形質転換
本明細書で記載したプラスミドはそれぞれ、以下のステップにしたがって、本明細書で記載した試験のために大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに形質転換した。試験管、溶液およびキュベットは全て予め４℃まで冷却した。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅを一晩培養したものを、アンピシリンを含有する溶原培地（ＬＢ）５ｍＬで１：１００に希釈し、ＯＤ６００が０．４〜０．６に達するまで増殖させた。次に大腸菌細胞を４℃で２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を除去し、細胞を４℃の水１ｍＬに再懸濁した。再度、大腸菌細胞を４℃で２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を除去し、細胞を４℃の水０．５ｍＬに再懸濁した。再度、大腸菌細胞を４℃で２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を除去し、細胞を最後に４℃の水０．１ｍＬに再懸濁した。電気穿孔器を２．５ｋＶに設定した。プラスミド（０．５μｇ）を細胞に添加し、ピペットで混合し、冷却した滅菌キュベットにピペットで入れた。乾燥したキュベットを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加した。室温のＳＯＣ培地１ｍＬをすぐに添加し、混合物を培養試験管に移し、３７℃で１時間インキュベートした。アンピシリンを含有するＬＢプレートに細胞を広げ、一晩インキュベートした。
【実施例３】
【０２９８】
ＰＡＬ１とＰＡＬ２を発現する高コピープラスミドと低コピープラスミドとの間のフェニルアラニン代謝の比較
同じＰＡＬ遺伝子、低コピープラスミドもしくは高コピープラスミド（ＳＹＮ−ＰＫＵ１０１  ａｎｄ  ＳＹＮ−ＰＫＵ１０２）にＰＡＬ３または低コピープラスミドもしくは高コピープラスミド（ＳＹＮ−ＰＫＵ２０１およびＳＹＮ−ＰＫＵ２０２）にＰＡＬ３を含む遺伝子操作された細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるフェニルアラニン代謝についてアッセイした。
【０２９９】
遺伝子操作された細菌は、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）で誘導し、次に、フェニルアラニン４ｍＭ（６６００００ｎｇ／ｍＬ）を補給した培地で２時間増殖させた。試料は、０時間後、４時間後および２３時間後に取り出し、実施例２４〜２６に記載したようにフェニルアラニン（図１５Ａ）およびトランス−ケイ皮酸（ＴＣＡ）（図１５Ｂ）濃度を質量分析によって判定した。
【０３００】
高コピープラスミドおよび低コピープラスミド株は、フェニルアラニンを類似のレベルまで代謝し、低減させることが見いだされた（図１５）。フェニルアラニンレベルの大きな低減およびＴＣＡレベルの増加が、ＰＡＬ３を発現する株で認められた。
【実施例４】
【０３０１】
フェニルアラニントランスポーター−ＰｈｅＰの細菌染色体への組み込み
いくつかの実施形態では、細胞へのフェニルアラニンの輸送を増加させ、それによってフェニルアラニン代謝を高めることが有利であり得る。したがって、誘導性プロモーターによって駆動される天然の高親和性フェニルアラニントランスポーター、ＰｈｅＰの第２のコピーを相同組み換えによってＮｉｓｓｌｅゲノムに挿入した。構築物の構成を図１１に示す。ｐｈｅＰ遺伝子をＰｔｅｔプロモーターの下流に置き、テトラサイクリンリプレッサー、ＴｅｔＲは分岐して転写させた（例えば、図１１を参照のこと）。この配列はＧｅｎｅｗｉｚによって合成された（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。合成したＴｅｔＲ−ＰｈｅＰ構築物を染色体に組み込むことができるベクターを作製するために、ギブソンアッセンブリを最初に使用して、Ｎｉｓｓｌｅ  ｌａｃＺ座に相同なＤＮＡの１０００ｂｐ配列をＲ６Ｋ複製開始点プラスミドｐＫＤ３に付加した。これは、ＮｉｓｓｌｅゲノムのｌａｃＺ座に組み込むために、これらの相同腕の間にクローニングされたＤＮＡを標的とする（図１０）。ギブソンアッセンブリを使用してＴｅｔＲ−ＰｈｅＰ断片をこれらの腕の間にクローニングした。ＰＣＲを使用して、相同腕の全配列ならびに相同腕の間にｐｈｅＰ配列を含有するこのプラスミドからこの領域を増幅した。このＰＣＲ断片を使用して、エレクトロコンピテントＮｉｓｓｌｅ−ｐＫＤ４６、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含有する株を形質転換した。形質転換後、細胞を２時間増殖させてからクロラムフェニコール２０μｇ／ｍＬに３７℃で播種した。３７℃で増殖させることによって、ｐＫＤ４６プラスミドをキュアリングする。無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）誘導性ｐｈｅＰを含有する形質転換体は、ｌａｃマイナス（ｌａｃ−）およびクロラムフェニコール耐性であった。
【実施例５】
【０３０２】
フェニルアラニン分解に対するフェニルアラニントランスポーターの影響
フェニルアラニン分解に対するフェニルアラニントランスポーターの影響を判定するために、染色体に組み込まれたＴｅｔプロモーターによって駆動されるｐｈｅＰのコピーの存在下または非存在下で、低コピー（ＬＣ）または高コピー（ＨＣ）プラスミドのＰＡＬ１またはＰＡＬ３を発現する遺伝子操作された細菌によって実現した、フェニルアラニン分解およびトランス−ケイ皮酸塩蓄積を評価した。
【０３０３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける試験では、インキュベーションは全て３７℃で実施した。Ｔｅｔプロモーターによって駆動するＰＡＬ遺伝子を含むプラスミドで形質転換した大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの培養物を一晩増殖させ、その後ＬＢで１：１００に希釈した。細胞を震盪（２００ｒｐｍ）しながら対数期初期まで増殖させた。無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＰＡＬの発現を誘導し、細菌をさらに２時間増殖させた。その後、細菌をペレットにして、洗浄し、最少培地に再懸濁し、フェニルアラニン４ｍＭを補給した。実施例２４〜２６に記載したように、質量分析によってフェニルアラニンを定量するために０時間後、２時間後および４時間後（図１６Ａ）、ケイ皮酸を定量するために２時間後および４時間後（図１６Ｂ）に一定量を取り出した。図１６に示したように、ＰＡＬと併せてｐｈｅＰを発現させると、ＰＡＬ単独またはｐｈｅＰ単独と比較してフェニルアラニンの分解が著しく増強する。特に、ｐｈｅＰをさらにコピーすることによって４時間でフェニルアラニン（４ｍＭ）の分解が完了する（図１６Ａ）。図１６Ｂは、誘導して２時間後および４時間後の試料中のケイ皮酸塩レベルを示す。ケイ皮酸塩産生はフェニルアラニン分解に直接関与するので、これらのデータは、フェニルアラニン消失がフェニルアラニン異化反応によるものであり、ケイ皮酸塩は株の活性の代替バイオマーカーとして使用できることを示唆している。ＰｈｅＰ過剰発現は、遺伝子操作された細菌のフェニルアラニン代謝を改善する。
【０３０４】
結論として、ｐｈｅＰと併せると、低コピーＰＡＬ発現プラスミドであっても試験試料からほとんど完全にフェニルアラニンを排除することができる（図１６Ａおよび１６Ｂ）。さらに、特定の理論に拘束されることは望まないが、ｐｈｅＰを組み込むいくつかの実施形態では、高いフェニルアラニン代謝を維持しながらＰＡＬ発現の安定性を増強するために、および形質転換した細菌に対する負の選択圧を低減させるために、低コピーＰＡＬ発現プラスミドを併せて使用するとさらに有利であり得る。他の実施形態では、高コピーＰＡＬ発現プラスミドと併せてフェニルアラニントランスポーターを使用する。
【実施例６】
【０３０５】
ＦＮＲプロモーター活性
異なるＦＮＲプロモーターのプロモーター活性を測定するために、ｌａｃＺ遺伝子ならびに転写および翻訳エレメントを合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。ｌａｃＺ遺伝子は、表３で開示したＦＮＲプロモーター配列の例のいずれかの制御下に置いた。これらの構築物のヌクレオチド配列を表２１〜２８（配列番号３１〜３８）に示す。しかし、上記のように、ｌａｃＺ遺伝子は、その他の誘導性プロモーターの活性を分析するためにそれらのプロモーターによって駆動することができ、その他の遺伝子をプロモーター活性の指標としてｌａｃＺ遺伝子の代わりに使用することもできる。あるいは、ベータ−ガラクトシダーゼをレポーターとして使用することもでき、結果の例を図１８に示す。
【０３０６】
表２１は、ｌａｃＺをコードする遺伝子およびＦＮＲプロモーターの１例、Ｐｆｎｒ１（配列番号３）を含む構築物の１例のヌクレオチド配列を示す。この構築物は、Ｎｉｓｓｌｅ  ｎｉｒＢ１遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の翻訳融合物を含み、この翻訳融合物はｌａｃＺコーディング領域の８番目のコドンにインフレームで融合している。Ｐｆｎｒ１配列は太字の小文字で、プロモーター内の予測されたリボソーム結合部位には下線が引いてある。ｌａｃＺ配列は下線を引いた大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字で、構築物の合成に使用したクローニング部位は通常の大文字で示す。
【０３０７】
表２２は、ｌａｃＺをコードする遺伝子およびＦＮＲプロモーターの１例、Ｐｆｎｒ２（配列番号６）を含む構築物の１例のヌクレオチド配列を示す。この構築物は、Ｎｉｓｓｌｅ  ｙｄｆＺ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の翻訳融合物を含み、この翻訳融合物はｌａｃＺコーディング領域の８番目のコドンにインフレームで融合している。Ｐｆｎｒ２配列は太字の小文字で、プロモーター内の予測されたリボソーム結合部位には下線が引いてある。ｌａｃＺ配列は下線を引いた大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字で、構築物の合成に使用したクローニング部位は通常の大文字で示す。
【０３０８】
表２３は、ｌａｃＺをコードする遺伝子およびＦＮＲプロモーターの１例、Ｐｆｎｒ３（配列番号７）を含む構築物の１例のヌクレオチド配列を示す。この構築物は、Ｎｉｓｓｌｅ  ｎｉｒＢ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の転写融合物を含み、この転写融合物は強力なリボソーム結合部位に融合したプロモーター領域のみを使用する。Ｐｆｎｒ３配列は太字の小文字で、プロモーター内の予測されたリボソーム結合部位には下線が引いてある。ｌａｃＺ配列は下線を引いた大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字で、構築物の合成に使用したクローニング部位は通常の大文字で示す。
【０３０９】
表２４は、ｌａｃＺをコードする遺伝子およびＦＮＲプロモーターの１例、Ｐｆｎｒ４（配列番号８）を含む構築物の１例のヌクレオチド配列を示す。この構築物は、Ｎｉｓｓｌｅ  ｙｄｆＺ遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子の転写融合物を含む。Ｐｆｎｒ４配列は太字の小文字で、プロモーター内の予測されたリボソーム結合部位には下線が引いてある。ｌａｃＺ配列は下線を引いた大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字で、構築物の合成に使用したクローニング部位は通常の大文字で示す。
【０３１０】
表２５は、ｌａｃＺをコードする遺伝子およびＦＮＲプロモーターの１例、Ｐｆｎｒ５（配列番号９）を含む構築物の１例のヌクレオチド配列を示す。この構築物は、ｌａｃＺに融合した嫌気的に誘導される低分子ＲＮＡ遺伝子、ｆｎｒＳ１の転写融合物を含む。Ｐｆｎｒｓ配列は太字の小文字で、プロモーター内の予測されたリボソーム結合部位には下線が引いてある。ｌａｃＺ配列は下線を引いた大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字で、構築物の合成に使用したクローニング部位は通常の大文字で示す。
【０３１１】
表２６は、ＰＡＬ３をコードする遺伝子およびＦＮＲプロモーターの１例、Ｐｆｎｒ３（配列番号７）を含む構築物の１例のヌクレオチド配列を示す。この構築物は、Ｎｉｓｓｌｅ  ｎｉｒＢ遺伝子とＰＡＬ３遺伝子の転写融合物を含み、この転写融合物は強力なリボソーム結合部位に融合したプロモーター領域のみを使用する。Ｐｆｎｒ３配列は太字の小文字で、プロモーター内の予測されたリボソーム結合部位には下線が引いてある。ＰＡＬ３配列は下線を引いた大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字で、構築物の合成に使用したクローニング部位は通常の大文字で示す。
【０３１２】
表２７は、ＰＡＬ３をコードする遺伝子およびＦＮＲプロモーターの１例、Ｐｆｎｒ４（配列番号８）を含む構築物の１例のヌクレオチド配列を示す。この構築物は、Ｎｉｓｓｌｅ  ｙｄｆＺ遺伝子およびＰＡＬ３遺伝子の転写融合物を含む。Ｐｆｎｒ４配列は太字の小文字で、プロモーター内の予測されたリボソーム結合部位には下線が引いてある。ＰＡＬ３配列は下線を引いた大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字で、構築物の合成に使用したクローニング部位は通常の大文字で示す。
【０３１３】
表２８は、ＰＡＬ３をコードする遺伝子およびＦＮＲプロモーターの１例、Ｐｆｎｒｓ（配列番号９）を含む構築物の１例のヌクレオチド配列を示す。この構築物は、ＰＡＬ３に融合した嫌気的に誘導される低分子ＲＮＡ遺伝子、ｆｎｒＳ１の転写融合物を含む。Ｐｆｎｒｓ配列は太字の小文字で、プロモーター内の予測されたリボソーム結合部位には下線が引いてある。ＰＡＬ３配列は下線を引いた大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字で、構築物の合成に使用したクローニング部位は通常の大文字で示す。
【０３１４】
【表２１−１】
2018515106.tif 000046
【表２１−２】
2018515106.tif 000047
【０３１５】
【表２２−１】
2018515106.tif 000048
【表２２−２】
2018515106.tif 000049
【０３１６】
【表２３−１】
2018515106.tif 000050
【表２３−２】
2018515106.tif 000051
【０３１７】
【表２４−１】
2018515106.tif 000052
【表２４−２】
2018515106.tif 000053
【０３１８】
【表２５−１】
2018515106.tif 000054
【表２５−２】
2018515106.tif 000055
【０３１９】
【表２６−１】
2018515106.tif 000056
【表２６−２】
2018515106.tif 000057
【０３２０】
【表２７−１】
2018515106.tif 000058
【表２７−２】
2018515106.tif 000059
【０３２１】
【表２８】
2018515106.tif 000060
【０３２２】
前述したように、プラスミドはそれぞれ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに形質転換した。形質転換した大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの培養物を一晩増殖させ、その後ＬＢで１：２００に希釈した。細胞は、２５０ｒｐｍで震盪しながら好気的に、または９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバー内で嫌気的に増殖させた。インキュベーション４〜６時間後、試料を収集し、β−ガラクトシダーゼアッセイ（Ｍｉｌｌｅｒ、  １９７２年）を実施することよってプロモーター活性を分析した。図２０に示したように、ＦＮＲプロモーターの活性は、好気的条件と比較して嫌気的条件下で大いに増強された。
【実施例７】
【０３２３】
ＦＮＲプロモーターの活性測定
ＦＮＲプロモーター駆動遺伝子発現の動力学を判定するために、低コピーｆｎｒＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子を保有する大腸菌株（図１９Ａ）を２５０ｒｐｍで震盪しながら好気的に増殖させた。培養物は１時間後に分割し、３７℃で好気的に、または（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給した）Ｃｏｙ嫌気性チャンバー内で嫌気的にインキュベートした。プロモーター活性は、標準比色アッセイ（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２年）を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性の関数として測定した。図１９Ｂは、ｆｎｒＳプロモーターは嫌気的条件下で１時間以内に高レベルの遺伝子発現の駆動を開始することを示す。酸素の存在下および非存在下の両方における、ｌａｃＺを発現する細菌細胞培養物の増殖曲線を図１９Ｃに示す。
【実施例８】
【０３２４】
組換え大腸菌におけるＦＮＲプロモーターによるＰＡＬの産生
ＦＮＲプロモーターの例のいずれかによって駆動されるＰＡＬ遺伝子を含むプラスミドで形質転換した大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの培養物を一晩増殖させ、その後ＬＢで１：２００に希釈した。細菌細胞はさらに、Ｔｅｔプロモーターによって駆動され、染色体に組み込まれるｐｈｅＰ遺伝子を含むことができる。ＡＴＣを培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加してｐｈｅＰの発現を誘導し、細胞は、２５０ｒｐｍで震盪しながら好気的に、または９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバー内で嫌気的に増殖させた。４時間インキュベートした後、細胞をペレットにして、洗浄し、０．５％グルコースおよびフェニルアラニン４ｍＭを補給したＭ９最少培地に再懸濁した。フェニルアラニン定量のために、０時間後、２時間後、４時間後および２４時間後に一定量を収集した（図２０）。図２０Ｂに示したように、ＦＮＲプロモーターによって駆動されるＰＡＬ３を発現する遺伝子操作された細菌は、好気的条件下と比較して嫌気的条件下で培地からフェニルアラニンをより効率的に除去する（図２０Ａ）。ＰＡＬ３と併せてｐｈｅＰを発現するとさらにフェニルアラニンのレベルが減少した。
【実施例９】
【０３２５】
ｐｈｅＰを過剰発現する、または過剰発現しない組換え大腸菌におけるフェニルアラニン分解
ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０５株はＰＡＬ３遺伝子を保有する低コピープラスミドおよびｌａｃＺ座に組み込まれたｐｈｅＰのコピーを含有する。ＳＹＮ−ＰＫＵ３０８およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０７株はまた、ＰＡＬ３遺伝子を保有する低コピープラスミドを含有するが、ｌａｃＺ座にはｐｈｅＰのコピーは組み込まれていない。４つの株全てにおいて、ＰＡＬ３およびｐｈｅＰ（適用するならば）の発現は、酸素レベル依存性プロモーターによって制御される。
【０３２６】
染色体にｐｈｅＰを有する、および有さない操作された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおけるフェニルアラニン分解の速度を決定するために、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０７を一晩培養したものを、アンピシリンを含有するＬＢで１：１００に希釈し、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０８およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０５を一晩培養したものを、カナマイシンを含有するＬＢで１：１００に希釈した。全株を１．５時間増殖させた後、培養物を９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。誘導して４時間後に、細菌をペレットにして、ＰＢＳで洗浄して、アッセイ緩衝液１ｍＬに再懸濁した。アッセイ緩衝液は、０．５％グルコース、８．４％炭酸水素ナトリウムおよびフェニルアラニン４ｍＭを補給したＭ９最少培地を含有した。
【０３２７】
活性をアッセイするために、コロニー形成単位（ｃｆｕ）の開始カウントを系列希釈および播種を使用して定量した。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、各細胞アッセイから一定量を３０分毎に３時間にわたって取り出した。具体的には、細菌細胞１５０μＬをペレットにして、上清をＬＣ−ＭＳ分析のために収集し、細胞を含まないアッセイ培地をゼロ時間点として使用した。図２１は、染色体（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０５；左）にｐｈｅＰを有する株ならびに染色体にｐｈｅＰを欠如した株（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０８およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０７；右）で認められたフェニルアラニン分解を示す。これらのデータは、ｐｈｅＰ過剰発現は、合成プロバイオティクスにおいてフェニルアラニン分解速度を増加させるために重要であることを示す。
【実施例１０】
【０３２８】
染色体にＰＡＬ３を１個または複数挿入した株の活性
挿入部位および挿入数の遺伝子操作された細菌の活性に対する影響を評価するために、様々な染色体位置に異なるＰＡＬ３を１個挿入した株および複数のＰＡＬ３を挿入した株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を測定した。
【０３２９】
細胞をＬＢ中で一晩増殖させ、１：１００に希釈した。増殖１．５時間後に、培養物を９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。誘導して４時間後に、細菌をフェニルアラニン５０ｍＭを含有するアッセイ緩衝液に再懸濁した。２９０ｎｍの吸光度によるトランス−ケイ皮酸塩定量のために、細胞アッセイから一定量を２０分毎に１．５時間にわたって取り出した。結果を図２２および２３および表３９および表４０に示す。図２２は、染色体の様々な位置に単一のＰＡＬ３挿入を含む株のトランス−ケイ皮酸塩濃度（ＰＡＬ活性）を示す。図２３は、染色体の様々な位置に複数のＰＡＬ３挿入を含む株のトランス−ケイ皮酸塩濃度（ＰＡＬ活性）を示す。
【０３３０】
【表２９】
2018515106.tif 000061
【０３３１】
【表３０】
2018515106.tif 000062
【実施例１１】
【０３３２】
染色体にＰＡＬ３の５個のコピーを有する株の活性
嫌気的に（ＦＮＲ）制御されたＰＡＬ３の５個のコピーが組み込まれ、ｌａｃＺ座に組み込まれた嫌気的に制御されたｐｈｅＰを含む株、株ＳＹＮ−ＰＫＵ５１１の活性を評価した。
【０３３３】
遺伝子操作された細菌を一晩増殖させ、希釈して、さらに２．５時間増殖させた。次に、培養物を９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。フェニルアラニンを含有する培地（フェニルアラニン４ｍＭ）中で３．５時間誘導した後、全細胞抽出物を３０分毎に３時間にわたって調製し、フェニルアラニンを質量分析によって定量した。結果を図２４に示す。細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は８μｍｏｌ／時間／１ｅ９細胞であった。フェニルアラニンレベルは２時間後に元のレベルの約半分に低下した。
【実施例１２】
【０３３４】
ＬＡＡＤを発現する株の活性
ＬＡＡＤ発現がＰＡＬ３に対して代替の、追加の、または補足的なフェニルアラニン分解手段として使用できるかどうかを評価するために、Ｔｅｔ誘導性プロモーターによって駆動されるＬＡＡＤを発現する高コピープラスミドを含有する遺伝子操作された株、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１の能力を、様々な細胞濃度および様々な酸素レベルで測定した。
【０３３５】
ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１を一晩培養したものを１：１００に希釈し、対数期初期まで増殖させてからＡＴＣ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２時間誘導した。細胞を遠心分離し、以下の通りにインキュベートした。
【０３３６】
細胞（１ｍｌ）は、１４ｍｌ培養管内で好気的にインキュベートし、２５０ｒｐｍで震盪した（図２５ＡおよびＢ）。微好気的条件では、細胞（１ｍｌ）は１．７ｍｌコニカル管内で震盪せずにインキュベートした。細胞は、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバー内で嫌気的にインキュベートした（図２５Ｂ）。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に２時間にわたって取り出し、結果を図２５Ａおよび２５Ｂに示す。図２５Ａは、細胞濃度依存性好気的活性を示す。好気的条件における活性は約５０μｍｏｌ／時間／１ｅ９細胞であり、いくらかの活性は微好気的条件下で保持され、環境空気未満の酸素濃度の環境下での活性を可能にし得る。微好気的条件下でのＳＹＮ−ＰＫＵ４０１の活性を、嫌気的条件下のＳＹＮ−ＰＫＵ３０４と比較したが、活性は細胞密度に依存しているようである。
【０３３７】
表４１および表４２は目的のＬＡＡＤ構築物を含有する。表４１は、プラスミドにプロテウス・ミラビリス由来のＬＡＡＤをコードする遺伝子およびＴｅｔリプレッサー遺伝子およびＴｅｔプロモーター配列およびＲＢＳおよびリーダー領域を含む構築物の１例の配列を示しており、配列番号３９、ＬＡＡＤ配列には下線を引いてあり、ＴｅｔＲ配列はイタリック体で、Ｔｅｔプロモーター配列は太字で、ＲＢＳおよびリーダー領域は下線を引いたイタリック体である。表４２は、ａｒａＣをコードする遺伝子およびプロテウス・ミラビリス由来のＬＡＡＤをコードする遺伝子および内在性アラビノースオペロンに染色体挿入するためのアラビノース誘導性プロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）配列を含む構築物の１例の配列を示しており（配列番号４０）、ａｒａＣ配列には下線を引いてあり、ＰａｒａＢＡＤプロモーター配列は太字で、ＬＡＡＤ配列はイタリック体で、ＲＢＳおよびリーダー領域は下線を引いたイタリック体である。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は配列番号２０〜４２のＤＮＡ配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約９９％相同な核酸配列またはそれらの機能的断片を含む。
【０３３９】
【表３１】
2018515106.tif 000063
【０３４０】
【表３２−１】
2018515106.tif 000064
【表３２−２】
2018515106.tif 000065
【実施例１３】
【０３４１】
ＰＫＵのマウスモデルにおけるＰＡＬ発現細菌の有効性
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験のために、ＢＴＢＲ−Ｐａｈｅｎｕ２マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、ＰＫＵのモデルとして使用するためにホモ接合型に交配した。ＴｅｔプロモーターからＰＡＬ３を発現する低コピーｐＳＣ１０１複製開始点のプラスミドならびにゲノムに組み込まれたＴｅｔプロモーターによって駆動されるｐｈｅＰの１個のコピーを保有する細菌（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２）を増殖させた。ＳＹＮ−ＰＫＵ１は、投与前にＡＴＣによって２時間誘導した。細菌をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、１０９ＡＴＣ誘導性ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２または対照Ｎｉｓｓｌｅ細菌を強制経口投与によってマウスに投与した。
【０３４２】
試験開始時に、マウスにＡＴＣ１００マイクログラム／ｍＬおよび５％スクロースを補給した水を与えた。マウスは、一晩（１０時間）固形飼料を除去することによって絶食させ、フェニルアラニンの基準レベルを決定するために翌日下顎出血によって血液試料を収集した。血液試料をヘパリン化試験管に収集し、２Ｇで２０分管遠心分離して血漿を生成し、その後取り出して−８０℃で保存した。マウスに固形飼料を再度与え、既にＡＴＣで２時間誘導した細菌１００μＬ（５×１０９ＣＦＵ）を１時間後に強制経口投与した。マウスは固形飼料に２時間戻した。血漿試料は、前述したように調製した。
【０３４３】
図２６Ａは給餌前後のフェニルアラニンレベルを示し、図２６Ｂは、給餌前後の血中フェニルアラニンレベルのパーセント（％）変化を雌雄群平均として示す（ｐ＜０．０１）。図２６に示したように、ＳＹＮ−ＰＫＵ１で治療したＰＫＵマウスは、対照と比較して給餌後の血清フェニルアラニンレベル上昇の著しい低減を示す。
【実施例１４】
【０３４４】
フェニルアラニン皮下曝露後のＰＡＬ発現細菌の有効性
ストレプトマイシン耐性大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を凍結保存物から１０１０細胞／ｍＬの密度まで増殖させた。ｌａｃＺ座に組み込まれたＴｅｔプロモーターの制御下にｐｈｅＰの１個のコピーおよびＴｅｔプロモーター制御下にＰＡＬ３を発現する高コピープラスミドを含有する細菌（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３）をＡ６００が０．２５になるまで増殖させ、その後ＡＴＣ（１００ｎｇ／ｍＬ）によって４時間誘導した。細菌を遠心分離して、洗浄して、炭酸水素緩衝液に１×１０１０細胞／ｍＬの密度まで再懸濁してから−８０℃で凍結した。
【０３４５】
試験の少なくとも３日前に（すなわち、−６日から−３日）開始して、ホモ接合体ＢＴＢＲ−Ｐａｈｅｎｕ２マウス（約６〜１２週齢）を、フェニルアラニンを含まない固形飼料およびフェニルアラニン０．５グラム／Ｌを補給した水で維持した。１日目に、マウスを治療群に無作為化し、フェニルアラニン基準レベルを決定するために顎下皮膚穿刺によって血液試料を収集した。マウスの体重も測定して、各群の平均体重を決定した。次に、群の平均体重にしたがって、マウスに皮下注射によってフェニルアラニンを体重１グラム当たり０．１ｍｇで単回投与した。注射して３０分後および９０分後に、Ｈ２Ｏ（ｎ＝３０）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝３３）またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０３（ｎ＝３４）２００μＬをマウスに強制経口投与によって投与した。フェニルアラニン曝露２時間後および４時間後に血液試料を収集し、血中のフェニルアラニンレベルは質量分析を使用して測定した。
【０３４６】
図２７は、フェニルアラニン注射の２時間後（図２７Ａ）および４時間後（図２７Ｂ）の基準濃度に対するフェニルアラニン血中濃度を示す。これらのデータは、フェニルアラニンの皮下注射がホモ接合体ｅｎｕ２／ｅｎｕ２マウスにおいて高フェニルアラニン血症を引き起こし、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３の経口投与がフェニルアラニン曝露後の血中フェニルアラニンレベルを対照群と比較して有意に低下させる（４時間後でｐ＜０．００００１）ことを示唆している。さらに、これらの結果によって、経口投与した遺伝子操作された細菌および遺伝子操作されていない親Ｎｉｓｓｌｅは、食餌曝露に関係なく血中フェニルアラニンレベルに有意な影響を及ぼし得ることが確認される。したがって、ＰＫＵ特異的プロバイオティクスは、食餌と併せて同時投与する必要がないこともある。
【実施例１５】
【０３４７】
全身フェニルアラニンに対するＰＡＬ発現細菌の用量応答活性
ストレプトマイシン耐性大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を凍結保存物から１０１０細胞／ｍＬの密度まで増殖させた。ｌａｃＺ座に組み込まれたＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にｐｈｅＰの１個のコピーおよびＰｆｎｒＳプロモーター制御下にＰＡＬ３を発現する低コピープラスミドを含有する細菌（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４）をＡ６００が０．２５になるまで増殖させ、その後細菌発酵槽を窒素で４時間パージすることによって嫌気的に誘導した。細菌を遠心分離して、洗浄して、炭酸水素緩衝液に５×１０９細胞／ｍＬの密度で再懸濁してから−８０℃で凍結した。
【０３４８】
試験の少なくとも３日前に（すなわち、−６日から−３日）開始して、マウスをフェニルアラニンを含まない固形飼料およびフェニルアラニン０．５グラム／Ｌを補給した水で維持した。１日目に、マウスを治療群に無作為化し、フェニルアラニン基準レベルを決定するために顎下皮膚穿刺によって血液試料を収集した。マウスの体重も測定して、各群の平均体重を決定した。次に、群の平均体重にしたがって、マウスに皮下注射によってフェニルアラニンを体重１グラム当たり０．１ｍｇで単回投与した。注射して３０分後および９０分後に、Ｈ２Ｏ２００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１  ２００μＬ（ｎ＝３３）またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４  １００μＬ、２００μＬもしくは４００μＬ（各投与群についてｎ＝１２）をマウスに強制経口投与によって投与した。フェニルアラニン投与２時間後および４時間後に血液試料を収集し、血中のフェニルアラニンレベルは質量分析を使用して測定した。
【０３４９】
図３０は、フェニルアラニン注射後の基準濃度に対するフェニルアラニン血中濃度を示す。これらのデータは、フェニルアラニンの皮下注射後の、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４治療したマウスの血中フェニルアラニンレベルのモック治療（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）の投与と比較した用量依存的減少を示している（＊３０％減少；ｐ＜０．０５）。
【実施例１６】
【０３５０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるフェニルアラニン分解活性（ＰＡＬ）
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるフェニルアラニン活性の相関を比較するために、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ＰＡＬ３を発現する低コピープラスミドを含有し、ＬａｃＺ座にＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰの染色体挿入を有する）をＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてストレプトマイシン耐性を有する対照Ｎｉｓｓｌｅ株）と比較した。
【０３５１】
試験の少なくとも３日前に（すなわち、−６日から−３日）開始して、ホモ接合体ＢＴＢＲ−Ｐａｈｅｎｕ２マウス（約６〜１２週齢）を、フェニルアラニンを含まない固形飼料およびフェニルアラニン０．５グラム／Ｌを補給した水で維持した。１日目に、マウスを治療群に無作為化し、フェニルアラニン基準レベルを決定するために顎下皮膚穿刺によって血液試料を収集した。マウスの体重も測定して、各群の平均体重を決定した。次に、群の平均体重にしたがって、マウスに皮下注射によってフェニルアラニンを体重１グラム当たり０．１ｍｇで単回投与した。注射して３０分後および９０分後に、細菌をマウスに強制経口投与によって投与した。
【０３５２】
細胞を調製するために、細胞をＬＢ（２Ｌ）で１：１００に希釈し、好気的に１．５時間増殖させ、その後嫌気性チャンバーに４時間移した。投与する前に、細胞を２００倍に濃縮し、凍結した（１５％グリセロール、グルコース２ｇ／Ｌ、ＰＢＳ溶液）。細胞を氷上で解凍し、４ｅ１０ｃｆｕ／ｍＬで、炭酸水素１Ｍに９：１に混合した。各マウスに全部で８００μＬ、または２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウスを強制経口投与した。
【０３５３】
フェニルアラニン曝露２時間後および４時間後に血液試料を収集し、血中のフェニルアラニンレベルは質量分析を使用して測定し、１時間当たりのフェニルアラニン濃度の変化を計算した。結果を図３２に示す。測定した総代謝活性は８１．２μｍｏｌ／時間で、フェニルアラニンの変化の低下は全体で４５％（Ｐ＜０．０５）であった。これら同じ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は２．８μｍｏｌ／時間／１ｅ９細胞を示した。
【０３５４】
さらに、様々な代謝物を測定して、２次代謝物が遺伝子操作された細菌のフェニルアラニン消費の速度を評価するための追加的パラメータとして使用できるかどうかを判定した。ＰＡＨ活性がＰＫＵで低減する場合、蓄積したフェニルアラニンはＰＫＵ特異的代謝物フェニルピルビン酸に変換され、さらにフェニル乳酸に変換され得る。遺伝子操作された細菌の存在下で、フェニルアラニンはＰＡＬによってＰＡＬ特異的代謝物トランス−ケイ皮酸に変換され、次に肝酵素によって馬尿酸にさらに変換され得る（図３２）。血液試料のフェニルピルビン酸、フェニル酢酸、トランス−ケイ皮酸および馬尿酸を実施例２４〜２６に記載したように分析した。結果を図３２Ｃ、３２Ｄ、３２Ｅおよび３２Ｆに示したところ、これらは図３２Ａおよび３２Ｂに示したフェニルアラニン分解と一致する。ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４については、ＰＡＬ特異的代謝物が４時間後に検出され、さらにＳＹＮ−ＰＫＵ９０１と比較して低レベルのＰＫＵ特異的代謝物が認められ、ＰＡＬフェニルアラニン分解はＰＫＵ特異的代謝物からＰＡＬ特異的代謝物に転換する原因となり得ることを示唆している。
【実施例１７】
【０３５５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるフェニルアラニン分解活性（ＰＡＬ）
ＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ＰＡＬの２染色体挿入（２×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ））およびｐｈｅＰ染色体挿入（ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ））、ｔｈｙＡ栄養要求性（ｋａｎ／ｃｍ）を含む）をＳＹＮ−ＰＫＵ９０１と比較した。
【０３５６】
マウスを維持し、給餌し、前述のようにフェニルアラニンを投与した。強制経口投与用の細菌細胞を調製するために、細胞をＬＢ（２Ｌ）で１：１００に希釈し、好気的に１．５時間増殖させ、その後嫌気性チャンバーに４時間移した。投与する前に、細胞を２００倍に濃縮し、凍結した（１５％グリセロール、グルコース２ｇ／Ｌ、ＰＢＳ溶液）。細胞を氷上で解凍し、４ｅ１０ｃｆｕ／ｍＬを炭酸水素１Ｍに９：１に混合した。各マウスに全部で８００μＬ、または３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウスを強制経口投与した。
【０３５７】
前述のように、血液試料を収集し、基準と比較したフェニルアラニン濃度の変化を計算した。結果を図３３Ａおよび３３Ｂに示す。測定した総代謝活性は３９．６μｍｏｌ／時間で、フェニルアラニンの変化の低減は全体で１７％（Ｐ＜０．０５）であった。これらの同じ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は１．１μｍｏｌ／時間／１ｅ９細胞を示した。
【０３５８】
フェニルアラニンおよびＰＫＵおよびＰＡＬ代謝物の絶対レベルを図３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅおよび３３Ｆに示したところ、図３３Ａおよび３３Ｂに示したフェニルアラニン分解と一致する。ＳＹＮ−ＰＫＵ５１７については、ＰＡＬ特異的代謝物が４時間後に検出され、さらに、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１と比較して低レベルのＰＫＵ特異的代謝物が認められ、ＰＡＬフェニルアラニン分解は、ＰＫＵ特異的代謝物からＰＡＬ特異的代謝物に転換する原因となり得ることを示している。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、尿を予定された時点で収集し、フェニルアラニンレベルならびにＰＡＬおよびＰＫＵ代謝物のレベルを分析する。
【実施例１８】
【０３６０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるフェニルアラニン分解活性（ＰＡＬ）
ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ＰＡＬの３染色体挿入（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ））およびｐｈｅＰの２染色体挿入（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ））およびＬＡＡＤ（内在性アラビノースオペロン内に組み込まれたＰａｒａＢＡＤプロモーターによって駆動される）を含む）をＳＹＮ−ＰＫＵ９０１と比較した。
【０３６１】
マウスを維持し、給餌し、前述のようにフェニルアラニンを投与した。強制経口投与用の細菌細胞を調製するために、細胞をＬＢ（２Ｌ）で１：１００に希釈し、好気的に１．５時間増殖させ、その後嫌気性チャンバーに４時間移した。投与する前に、細胞を２００倍に濃縮し、凍結した（１５％グリセロール、グルコース２ｇ／Ｌ、ＰＢＳ溶液）。細胞を氷上で解凍し、５ｅ１０ｃｆｕ／ｍＬを炭酸水素１Ｍで９：１に混合した。各マウスに全部で８００μＬ、または３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウスを強制経口投与した。注意：この株はＬＡＡＤ遺伝子を含有するが、この試験では誘導されなかった。
【０３６２】
前述のように、血液試料を収集し、基準と比較したフェニルアラニン濃度の変化を計算した。結果を図３４Ａに示す。測定した総代謝活性は１３３．２μｍｏｌ／時間で、フェニルアラニンの変化の低減は全体で３０％（Ｐ＜０．０５）であった。これらの同じ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は３．７μｍｏｌ／時間／１ｅ９細胞を示した。
【０３６３】
フェニルアラニンおよびＰＫＵおよびＰＡＬ代謝物の絶対レベルを図３４Ｃ、３４Ｄ、３４Ｅおよび３４Ｆに示したところ、図３４Ａおよび３４Ｂに示したフェニルアラニン分解と一致した。ＰＡＬ特異的代謝物が４時間後に検出され、さらに、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１と比較して低レベルのＰＫＵ特異的代謝物が認められ、ＰＡＬフェニルアラニン分解は、ＰＫＵ特異的代謝物からＰＡＬ特異的代謝物に転換する原因となり得ることを示している。測定した総代謝活性は、ＰＡＬ３プラスミドをベースにした株ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４の測定した総代謝活性よりも大きく、フェニルアラニンの全体の低減はＳＹＮ−ＰＫＵ３０４に近づいた（４５％と比較して３０％）。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、尿は予定の時点で収集し、フェニルアラニンレベルならびにＰＡＬおよびＰＫＵ代謝物のレベルを分析する。
【実施例１９】
【０３６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるフェニルアラニン分解活性（ＰＡＬ）ＬＡＡＤ
遺伝子操作された細菌によるフェニルアラニン分解に対するＰ．プロテウスＬＡＡＤの適合性をさらにｉｎ  ｖｉｖｏで評価する。細菌株ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１（Ｔｅｔ誘導性プロモーターによって駆動されるＬＡＡＤを含む高コピープラスミドを含む）をＳＹＮ−ＰＫＵ９０１と比較する。
【０３６６】
マウスを維持し、給餌し、前述のようにフェニルアラニンを投与する。強制経口投与用の細菌細胞を調製するために、細胞をＬＢ（２Ｌ）で１：１００に希釈し、好気的に１．５時間増殖させ、その後ＡＴＣを添加して細胞をさらに２時間増殖させる。投与する前に、細胞を２００倍に濃縮し、保存するために凍結する。細胞を氷上で解凍し、再懸濁する。細胞を炭酸水素１Ｍで９：１に混合する。各マウスに全量８００μＬを４回で、または全量で２×１０９から１×１０１０の範囲の細菌を強制経口投与する。血液試料を前記の実施例で記載したマウスから収集し、フェニルアラニン、フェニルピルビン酸、フェニル酢酸、トランス−ケイ皮酸および馬尿酸レベルを分析する。フェニルアラニンおよび総代謝活性の低減量全体を計算する。
【実施例２０】
【０３６７】
組換え大腸菌におけるフェニルアラニン分解に対するｐＨの影響
ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０２におけるフェニルアラニン分解速度が低ｐＨによって影響を受けるかどうかを判定するために、両株の一晩培養物をＬＢで１：１００に希釈し、震盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で増殖させた。増殖１．５時間後に、ＡＴＣ（１００ｎｇ／ｍＬ）をＳＹＮ−ＰＫＵ３０２およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０４の培養物に添加し、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給した）に入れた。誘導して４時間後に、細菌をペレットにして、ＰＢＳで洗浄し、アッセイ緩衝液（０．５％グルコース、８．４％炭酸水素ナトリウムおよびＰｈｅ４ｍＭを含むＭ９最少培地）に再懸濁し、濃度を５ｅ９細胞／ｍＬにした。アッセイ緩衝液は、ＨＣｌ１Ｍを使用してｐＨの値を７．２５〜２．２５の範囲で徐々に低下させて調製した。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、各細胞アッセイから一定量を３０分毎に２時間にわたって取り出した。図３９に示したように、フェニルアラニン分解速度は、両株ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２（図３９Ａ）およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（図３９Ｂ）におけるアッセイ緩衝液のｐＨが低下するにつれて減少した。
【実施例２１】
【０３６８】
ジペプチドおよびトリペプチドの分解
ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４およびＳＹＮ−ＰＫＵ７０５の一晩培養した株を１：１００に希釈し、対数初期まで増殖させてから、ＰＡＬおよびｐｈｅＰを誘導するために嫌気的条件に転換した。ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５の１培養物はまた、アラビノースで誘導してＬＡＡＤタンパク質を誘導した。本試験の焦点は、ジおよびトリペプチドの形状に隔離したとき、ＰＫＵ株がＰｈｅを分解することができるかどうかを判定することであった。株を誘導した後、細胞を遠心分離し、Ｍ９最少培地、０．５％グルコース、ＭＯＰＳ５０ｍＭおよびＰｈｅまたはＰｈｅを含有する、ジもしくはトリペプチド５０ｍＭを含有するアッセイ緩衝液に再懸濁した。上清試料を２０分毎に全部で８０分間にわたって取り出し、上清をＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で分析して、２９０ｎｍの吸光度（トランス−ケイ皮酸の吸収ピーク）を測定した。結果を表４３に示すが、ＰＫＵ株はジおよびトリペプチドの形状であってもＰｈｅを迅速に分解することができることが示された。
【０３６９】
【表３３】
2018515106.tif 000066
【実施例２２】
【０３７０】
染色体挿入を使用した細菌株の遺伝子操作
ｐｈｅＰおよび／またはＰＡＬ３遺伝子を大腸菌ＮｉｓｓｌｅｔゲノムのＦＮＲ応答性プロモーターの制御下に直接組み込んだ細菌株を構築した。以下に記載した方法は、染色体挿入を含む遺伝子操作された細菌株（例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０２および／または表１４に挙げた組み込み株のいずれか）のために使用することができる。
【０３７１】
ＳＹＮ−ＰＫＵ９０２株（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３−ｐｈｅＰ）は、ｌａｃＺ座に組み込まれたＰＡＬ３の１個のコピーおよびｐｈｅＰの１個のコピーを含有し、両遺伝子は単一のｆｎｒＳプロモーターに作動可能に連結し、バイシストロニックメッセージで同時転写される（図４１）。表２１は、ＰＡＬ３およびｐｈｅＰ遺伝子がＦＮＲプロモーターの１例の制御下で同時転写される構築物の１例の配列を示し（配列番号３１）、ＦＮＲプロモーター配列は太字で、ＰＡＬ３配列は四角で囲い、ｐｈｅＰ配列には下線を引き、リボソーム結合部位は網掛けで強調してある。
【０３７２】
ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３−ＰｈｅＰ配列を染色体に組み込むことができるベクターを作製するために、ギブソンアッセンブリを使用して、Ｎｉｓｓｌｅ  ｌａｃＺ座に相同なＤＮＡの１０００ｂｐ配列をノックインノックアウト（ＫＩＫＯ）プラスミドのフリッパーゼ再結合標的（ＦＲＴ）部位に隣接したクロラムフェニコール耐性（ｃｍＲ）カセットの両側に付加した。次に、ギブソンアッセンブリを使用して、ＦＲＴ−ｃｍＲ−ＦＲＴ部位近傍の、これらの相同腕の間のＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３−ｐｈｅＰ  ＤＮＡ配列をクローニングした。断片挿入の成功は、配列決定によって確認した。ＰＣＲを使用して、ｌａｃＺ：：ＦＲＴ−ｃｍＲ−ＦＲＴ：：ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３−ｐｈｅＰ：：ｌａｃＺ領域全体を増幅した。このノックインＰＣＲ断片を使用して、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含有するエレクトロコンピテントＮｉｓｓｌｅ株を形質転換した。形質転換後、細胞を３７℃で２時間増殖させた。３７℃で増殖させることによって、温度感受性プラスミドをキュアリングした。断片の染色体組み込みが成功した形質転換体をクロラムフェニコール２０μｇ／ｍＬで選択した。
【０３７３】
ＳＹＮ−ＰＫＵ５０１株（ｍａｌＰＴ：：ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３、ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）は、ｍａｌＰ／Ｔ座に組み込まれたＰＡＬ３の１個のコピーおよびｌａｃＺ座に組み込まれたｐｈｅＰの１個のコピーを含有し、両遺伝子は別々のｆｎｒＳプロモーターに作動可能に連結している（表２８；配列番号３８参照）。ＳＹＮ−ＰＫＵ５０２株（ｍａｌＰＴ：：ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３、ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３−ｐｈｅＰ）は、ｍａｌＰ／Ｔ座にｆｎｒＳプロモーターの制御下に組み込まれたＰＡＬ３の１個のコピー（表２８；配列番号３８参照）、ならびにｌａｃＺ座に組み込まれたＰＡＬ３−ｐｈｅＰ構築物を含有し、ｌａｃＺ座の両遺伝子は単一のｆｎｒＳプロモーターに作動可能に連結しており、バイシストロニックメッセージで同時転写される（表２１；配列番号３１参照）。
【０３７４】
ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３配列（配列番号３８）をＳＹＮ−ＰＫＵ５０１およびＳＹＮ−ＰＫＵ５０２の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ染色体に組み込むことができるベクターを作製するために、ギブソンアッセンブリを使用してＤＮＡ相同体の１０００ｂｐ配列をＫＩＫＯプラスミドのＦＲＴに隣接したカナマイシン耐性（ｋｎＲ）カセットの両側のＮｉｓｓｌｅ  ｍａｌＰおよびｍａｌＴ座に付加した。次に、ギブソンアッセンブリを使用して、ＦＲＴ−ｋｎＲ−ＦＲＴ部位近傍の、これらの相同腕の間のＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３  ＤＮＡ配列をクローニングした。断片挿入の成功は、配列決定によって確認した。ＰＣＲを使用して、ｍａｌＰ：：ＦＲＴ−ｋｎＲ−ＦＲＴ：：ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３：：ｍａｌＴ領域全体を増幅した。このノックインＰＣＲ断片を使用して、ｌａｃＺ座にＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰまたはバイシストロニックＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３−ｐｈｅＰを既に含有し、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子を発現するエレクトロコンピテントＮｉｓｓｌｅ株を形質転換した。形質転換後、細胞を３７℃で２時間増殖させた。断片の組み込みが成功した形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍＬで選択した。これらの同じ方法を使用して、ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３配列（配列番号３８）をＳＹＮ−ＰＫＵ５０６およびＳＹＮ−ＰＫＵ５０７のｍａｌＥ／Ｋ挿入部位に組み込むことができるベクターを作製した。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、リコンビナーゼをベースにしたスイッチは、ＰＡＬ３発現の活性化に使用することができる。ＳＹＮ−ＰＫＵ６０１株（ｍａｌＰＴ：：ＰｆｎｒＳ−Ｉｎｔ５、ｒｒｎＢＵＰ−ＰＡＬ３；ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）は、ｍａｌ／Ｔ座に組み込まれた、ＰｆｎｒＳプロモーターに作動可能に連結したＩｎｔ５リコンビナーゼならびに強力な構成的プロモーターの制御下にＰＡＬ３の１個のコピーを含有する（図４２）。表４５は、ＰｆｎｒＳ−Ｉｎｔ５の１例、ｒｒｎＢＵＰ−ＰＡＬ３構築物の配列（配列番号４２）を示しており、ＰｆｎｒＳ、Ｉｎｔ５およびＰＡＬ３の方向は逆向きである。Ｉｎｔ５配列は太字で、ＰｆｎｒＳ配列は四角で囲い、ＰＡＬ３配列には下線を引き、リコンビナーゼ部位は下線を引いた太字である。リボソーム結合部位は網掛けで強調し、ｒｒｎＢＵＰ構成的プロモーター配列は波線で囲ってある。いかなる強力なプロモーターも使用することができるが、ＰＡＬ３の高発現をもたらすためにＵＰエレメント含有大腸菌ｒｒｎＢＵＰプロモーターを選択した（Ｅｓｔｒｅｍ等、１９９８年）。ＳＹＮ−ＰＫＵ６０１はまた、ｌａｃＺ座に組み込まれたｐｈｅＰの１個のコピーを含有する。
【０３７６】
ＳＹＮ−ＰＫＵ６０１株を構築するために、ＰｆｎｒＳ駆動Ｉｎｔ５遺伝子およびｒｒｎＢＵＰ駆動リコンビナーゼに隣接したＰＡＬ３遺伝子配列をＧｅｎｅｗｉｚ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）によって合成した。ギブソンアッセンブリを使用してＤＮＡ相同体の１０００ｂｐ配列をＰｆｎｒＳ−Ｉｎｔ５の両側、ｒｒｎＢＵＰ−ＰＡＬ３  ＤＮＡ配列の両側のＮｉｓｓｌｅ  ｍａｌＰおよびｍａｌＴ座に付加し、相同腕の間のこの配列をクローニングした。断片のＫＩＫＯプラスミドへの挿入の成功は、配列決定によって確認した。ＰＣＲを使用して、ＰｆｎｒＳ−Ｉｎｔ５、ｒｒｎＢＵＰ−ＰＡＬ３領域全体を増幅した。このノックインＰＣＲ断片を使用して、ｌａｃＺ座にＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰを既に含有し、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子を発現するエレクトロコンピテントＮｉｓｓｌｅ株を形質転換した。形質転換後、細胞を３７℃で２時間増殖させた。ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３断片のｍａｌＰＴ遺伝子間領域への組み込みが成功した形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍＬで選択した。この戦略はまた、ＰＡＬ３発現にＴ７ポリメラーゼ活性を必要とするリコンビナーゼをベースにした株を構築するために使用することができる（図４３）。表４６は、ＰｆｎｒＳ−Ｉｎｔ５、ｒｒｎＢＵＰ−Ｔ７構築物の１例の配列（配列番号４３）を示しており、ＰｆｎｒＳ、Ｉｎｔ５およびＴ７ポリメラーゼ遺伝子の方向は逆向きである。Ｉｎｔ５配列は太字で、ＰｆｎｒＳ配列は四角で囲い、Ｔ７ポリメラーゼ配列には下線を引いて、リコンビナーゼ部位は下線を引いた太字である。リボソーム結合部位は網掛けで強調し、ｒｒｎＢＵＰ構成的プロモーター配列は波線で囲ってある。表４４は、ＰＴ７−ＰＡＬ３構築物の１例の配列を示しており、ＰＴ７配列は網掛けで強調し、リボソーム結合部位には下線を引き、ＰＡＬ３配列は太字である。
【０３７７】
【表３４−１】
2018515106.tif 000067
【表３４−２】
2018515106.tif 000068
【０３７８】
【表３５−１】
2018515106.tif 000069
【表３５−２】
2018515106.tif 000070
【表３５−３】
2018515106.tif 000071
【０３７９】
【表３６−１】
2018515106.tif 000072
【表３６−２】
2018515106.tif 000073
【表３６−３】
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【０３８０】
【表３７】
2018515106.tif 000075
【０３８１】
ＰＡＲＡ−Ｉｎｔ５構築物、ＰＴ７−ＰＡＬ３構築物およびＰＬａｃ−Ｔ７ポリメラーゼ構築物を含むＳＹＮ−ＰＫＵ６０２株を構築するために（図４４）、ギブソンアッセンブリは本質的に前述したように使用した。
【０３８２】
表４８は、Ａｒａ座に組み込むためのＰＡＲＡ−Ｉｎｔ５構築物の１例の配列（配列番号４５）を示す。Ｉｎｔ５配列は太字で、ＴＳＳおよびＲＢＳ部位を含有するＰａｒａ配列には下線を引いて、ＡｒａＣ配列はイタリック体である。
【０３８３】
【表３８】
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【実施例２３】
【０３８４】
ＤｅｌｔａＴｈｙＡの生成
栄養要求突然変異は、必須栄養素を産生するための必要な遺伝子（複数可）が欠如していることにより生存または増殖に必須の栄養素の外部からの添加がない場合、細菌の死滅を引き起こす。栄養要求性が改変した遺伝子操作された細菌を生成するために、オリゴヌクレオチド合成に必須の遺伝子、ｔｈｙＡを欠失させた。大腸菌ＮｉｓｓｌｅにおけるｔｈｙＡ遺伝子の欠失は、チミジンを補給しなければＬＢプレートでコロニーを形成することができない株を生じる。
【０３８５】
ｔｈｙＡ：：ｃａｍＰＣＲ断片は、以下のようにＰＣＲを３回使用して増幅した。１００μｍの濃度で使用したプライマーの配列を表４９に示す。
【０３８６】
【表３９】
2018515106.tif 000077
【０３８７】
１回目のＰＣＲでは、鋳型としてｐＫＤ３  １ｎｇ、２×ｐｈｕｓｉｏｎ  ２５μＬ、プライマーＳＲ３６およびＳＲ３８  ０．２μＬおよびＤＭＳＯを０、０．２、０．４もしくは０．６μＬ含有するＰＣＲ反応物４×５０μＬを、ヌクレアーゼを含まない水で５０μＬの体積にして、以下のサイクル条件下で増幅した。
ステップ１：９８℃３０秒
ステップ２：９８℃１０秒
ステップ３：５５℃１５秒
ステップ４：７２℃２０秒
ステップ２〜４を３０回反復
ステップ５：７２℃５分
【０３８８】
その後、各ＰＣＲ反応物５μＬをアガロースゲルで泳動し、適切な大きさのＰＣＲ産物を確認した。ＰＣＲ産物は、ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して製造者の指示に従い残存するＰＣＲ反応物から精製し、ヌクレアーゼを含まない水３０μＬで溶出した。
【０３８９】
２回目のＰＣＲでは、１回目から精製したＰＣＲ産物１μＬを、プライマーＳＲ３３およびＳＲ３４  ０．２μＬ以外は前述した通りのＰＣＲ反応物４×５０μＬにおいて鋳型として使用した。サイクル条件は、１回目のＰＣＲ反応で前述したものと同じであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで泳動して増幅を確認し、精製して、前述のように３０μＬで溶出した。
【０３９０】
３回目のＰＣＲでは、２回目から精製したＰＣＲ産物１μＬをプライマーＳＲ４３およびＳＲ４４以外は前述した通りのＰＣＲ反応物４×５０μＬにおいて鋳型として使用した。サイクル条件は、１回目および２回目で記載したものと同じであった。増幅を確認し、ＰＣＲ産物を精製し、前述のように溶出した。濃度および純度は、分光光度計を使用して測定した。得られた直鎖ＤＮＡ断片は、ｔｈｙＡの上流に相同な９２ｂｐ、ｆｒｔ部位に隣接したクロラムフェニコールカセットおよびｔｈｙＡ遺伝子の下流に相同な９８ｂｐを含有し、組換え用に増殖させたｐＫＤ４６を含有する大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７株に形質転換した。エレクトロポレーション後、チミジン３ｍＭを含有するＳＯＣ培地１ｍｌを添加し、細胞を震盪しながら３７℃で２時間回復させた。その後、細胞を１００００×ｇで１分間ペレットにして、上清を廃棄し、細胞ペレットはチミジン３ｍＭを含有するＬＢ１００μＬに再懸濁し、ｔｈｙ３ｍＭおよびクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天プレートに広げた。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。ＬＢプレートに出現したコロニーを再度画線した。＋ｃａｍ２０μｇ／ｍｌ＋または−ｔｈｙ３ｍＭ。（ｔｈｙＡ栄養要求株は、ｔｈｙ３ｍＭを補給した培地でのみ増殖する）。
【０３９１】
次に、抗生物質耐性をｐＣＰ２０形質転換で除去した。ｐＣＰ２０は酵母Ｆｌｐリコンビナーゼ遺伝子、ＦＬＰ、クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子、ならびに温度感受性複製を有する。選択した抗生物質を含有するＬＢ培地で細菌を３７℃でＯＤ６００＝０．４〜０．６になるまで増殖させた。細胞１ｍＬを以下の通りに洗浄した：細胞を１６０００×ｇで１分間ペレットにした。上清を廃棄し、ペレットを氷冷１０％グリセロール１ｍＬに再懸濁した。この洗浄ステップは３回反復した。最終的なペレットを氷冷１０％グリセロール７０μＬに再懸濁した。次に、細胞をｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡ  １ｎｇでエレクトロポレートし、チミジン３ｍＭを補給したＳＯＣ１ｍＬをすぐにキュベットに添加した。細胞を再懸濁し、培養試験管に移して、３０℃で１時間増殖させた。その後、細胞を１００００×ｇで１分間ペレットにして、上清を廃棄し、細胞ペレットはチミジン３ｍＭを含有するＬＢ１００μＬに再懸濁し、ｔｈｙ３ｍＭおよびカルベニシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天プレートに広げ、３０℃で１６〜２４時間増殖させた。次に、形質転換体を非選択的に（抗生物質無しで）４２℃でコロニー精製した。
【０３９２】
コロニー精製した形質転換体を試験するために、コロニーをピペットチップで４２℃プレートから採取し、ＬＢ１０μＬに再懸濁した。細胞懸濁液３μＬをピペットで一連の３枚のプレート、Ｃａｍ（３７℃；宿主株のゲノムにおけるＣａｍＲ遺伝子の有無の試験）、Ａｍｐ（３０℃、ｐＣＰ２０プラスミドにおけるＡｍｐＲの有無の試験）およびＬＢのみ（クロラムフェニコールカセットおよびｐＣＰ２０プラスミドを欠如した所望する細胞）に３７℃で移した。ＣａｍでもＡｍｐプレートでも増殖しない場合、コロニーはキュアリングしたと考えられ、コロニーを採取し、ＬＢプレートに再度画線して単一のコロニーを得て、３７℃で一晩増殖させた。
【実施例２４】
【０３９３】
フェニルアラニンの定量（ダンシルクロリド誘導体化）
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、試料中のフェニルアラニンレベルの定量を必要とする本明細書で記載したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのために、ダンシルクロリド誘導体化プロトコールを以下のように使用した。
【０３９４】
試料調製
フェニルアラニン標準物（１０００、５００、２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬ水溶液）を調製した。氷上で、試料１０μＬをＶ底ポリプロピレン９６ウェルプレートにピペットで入れ、Ｌ−フェニル−ｄ５−アラニン内部標準物１μｇ／ｍＬを含む６０％アセトニトリル１９０μＬを添加した。プレートを密封加熱してよく混合し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、希釈した試料５μＬをＶ底９６ウェルポリプロピレンプレート内の誘導体化混合物（ＮａＨＣＯ３  １０ｍＭ  ｐＨ９．７  ８５μＬおよびダンシルクロリド１０ｍｇ／ｍＬ（アセトニトリルで希釈）１０μＬ）９５μＬｍに添加しプレートを密封加熱してよく混合した。誘導体化するために試料を６０℃で４５分間インキュベートし、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、誘導体化した試料２０μＬを丸底９６ウェルプレート内の０．１％ギ酸を含む水１８０μＬに添加し、プレートを密封加熱してよく混合した。
【０３９５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
フェニルアラニンは、タンデム質量分析に結合させた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってＴｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘトリプル４重極質量分析計を使用して測定した。ＨＰＬＣ法の詳細は表５０および表５１に記載する。タンデム質量分析の詳細は表５２に記載する。
【０３９６】
【表４０】
2018515106.tif 000078
【０３９７】
【表４１】
2018515106.tif 000079
【０３９８】
【表４２】
2018515106.tif 000080
【実施例２５】
【０３９９】
トランス−ケイ皮酸の定量（トリフルオロエチルアミン誘導体化）
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、試料中のトランス−ケイ皮酸レベルの定量を必要とする本明細書で記載したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのために、トリフルオロエチルアミン誘導体化プロトコールを以下のように使用した。
【０４００】
試料調製
トランス−ケイ皮酸標準物（５００、２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬ水溶液）を調製した。氷上で、試料１０μＬをピペットでＶ底ポリプロピレン９６ウェルプレートに入れた。次に、トランス−ケイ皮酸−ｄ７内部標準物２μｇ／ｍＬを含む８０％アセトニトリル３０μＬを添加し、プレートを密封加熱してよく混合し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、希釈した試料２０μＬを丸底９６ウェルポリプロピレンプレート内のＭＥＳ１０ｍＭ  ｐＨ４、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）２０ｍＭ、トリフルオロエチルアミン２０ｍＭ  １８０μＬに添加した。プレートを密封加熱してよく混合し、試料を室温で１時間インキュベートした。
【０４０１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
トランス−ケイ皮酸は、タンデム質量分析に結合させた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってＴｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘトリプル４重極質量分析計を使用して測定した。ＨＰＬＣ法の詳細は表５３および表５４に記載する。タンデム質量分析詳細を表５５に記載する。
【０４０２】
【表４３】
2018515106.tif 000081
【０４０３】
【表４４】
2018515106.tif 000082
【０４０４】
【表４５】
2018515106.tif 000083
【実施例２６】
【０４０５】
フェニルアラニン、トランス−ケイ皮酸、フェニル酢酸、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸、馬尿酸および安息香酸の定量（２−ヒドラジノキノリン誘導体化）
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、試料中のフェニルアラニン、トランス−ケイ皮酸、フェニル酢酸、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸、馬尿酸および安息香酸レベルの定量を必要とする本明細書で記載したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのために、２−ヒドラジノキノリン誘導体化プロトコールを以下のように使用した。
【０４０６】
試料調製
水に各標準物２５０、１００、２０、４、０．８、０．１６および０．０３２μｇ／ｍＬを含有する標準溶液を調製した。氷上で、試料１０μＬをピペットでＶ底ポリプロピレン９６ウェルプレートに移し、Ｌ−フェニル−ｄ５−アラニン１μｇ／ｍＬ、馬尿酸−ｄ５  １μｇ／ｍＬおよびトランス−ケイ皮酸−ｄ７内部標準物０．２５μｇ／ｍＬを含むアセトニトリルに、２−ヒドラジノキノリン（２−ＨＱ）、ジピリジルジスルフィドおよびトリフェニルホスフィン５０ｍＭを含有する誘導体化溶液９０μＬを添加した。プレートを密封加熱してよく混合し、誘導体化のために試料を６０℃で１時間インキュベートし、その後４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。丸底９６ウェルプレート内で、誘導体化試料２０μＬを、０．１％ギ酸を含む水１８０μＬに添加した。プレートを密封加熱してよく混合した。
【０４０７】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
２−ＨＱによって誘導体化された代謝物は、タンデム質量分析に結合させた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってＴｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘトリプル４重極質量分析計を使用して測定した。ＨＰＬＣ法の詳細は表５６および表５７に記載する。タンデム質量分析の詳細を表５８に記載する。
【０４０８】
【表４６】
2018515106.tif 000084
【０４０９】
【表４７】
2018515106.tif 000085
【０４１０】
【表４８】
2018515106.tif 000086
【実施例２７】
【０４１１】
染色体挿入およびプラスミドを保有する株の相対的な有効性
染色体挿入を有する遺伝子操作された細菌株とプラスミドを保有する遺伝子操作された細菌株との間のフェニルアラニン分解速度を比較するために、一晩培養物をＬＢで１：１００に希釈し、震盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で増殖させた。増殖１．５時間後に、培養物を９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。誘導して４時間後に、細菌をペレットにして、ＰＢＳで洗浄し、アッセイ緩衝液（０．５％グルコース、８．４％炭酸水素ナトリウムおよびＰｈｅ４ｍＭを含むＭ９最少培地）に再懸濁した。３０分から９０分のフェニルアラニン分解速度（すなわち、アッセイ溶液の消失）またはケイ皮酸塩蓄積を１ｅ９細胞に正規化した。表５９は、全株の正規化した速度を示し、遺伝子操作されたプラスミドを保有する株および染色体挿入を含む遺伝子操作された株の非限定的例の遺伝子型および活性について記載している。
【０４１２】
【表４９−１】
2018515106.tif 000087
【表４９−２】
2018515106.tif 000088
【表４９−３】
2018515106.tif 000089
【表４９−４】
2018515106.tif 000090
【実施例２８】
【０４１３】
改善されたＰｈｅ消費のスクリーニング
遺伝子選択を使用するスクリーニングは、遺伝子操作された細菌におけるフェニルアラニン消費を改善するために実行する。毒性のあるフェニルアラニン類似体は、細胞タンパク質に組み込まれることによって作用機構（ＭＯＡ）を発揮し、細胞死をもたらす。これらの化合物は、活性が増加したＰＡＬ酵素を選択するための非標的アプローチへの有用性を評価した。これらの毒性化合物は、細胞タンパク質に取り込まれるよりもＰＡＬによって非毒性代謝物に代謝され得ると仮定すると、フェニルアラニン分解活性が改善した遺伝子操作された細菌は、高レベルのこれらの化合物に耐性があり、これをベースにしてスクリーニングし、選択することができる。
【０４１４】
様々な遺伝子操作された細菌株ならびに対照Ｎｉｓｓｌｅを２つの類似体、ｐ−フルオロ−ＤＬ−最小のフェニルアラニン（ｐ−ｆｌｕｏｒｏ−ＤＬ−ｍｉｎｉｍｕｍ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）およびｏ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニン（図３５）の漸増濃度で処置した。最小阻止濃度（ＭＩＣ）を判定し、野生型Ｎｉｓｓｌｅに対する変化倍率を判定した。結果を表６０に示す。
【０４１５】
これらの結果は、パラ類似体はｐｈｅＰによって容易に取り込まれるものと考えられ、ＰＡＬの基質となる可能性があり、オルソログはｐｈｅＰによって容易に取り込まれるものと考えられ、ＰＡＬの基質となる可能性があることを示している。結果として、これらの化合物は活性の大きなＰＡＬ酵素をスクリーニングするために有用である。
【０４１６】
【表５０】
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【実施例２９】
【０４１７】
カニクイザルにおいて毎日２８日間にわたって経鼻胃管投与した後の、遺伝子操作された細菌の反復投与の薬物動態および薬力学的試験（非ＧＬＰ）
遺伝子操作された細菌または大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの単独投与によって生じるいかなる潜在的毒性も評価するために、雌カニクイザルに毎日２８日間にわたって経鼻胃管（ＮＧ）投与した後に遺伝子操作された細菌および大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの薬物動態および薬力学を試験する。カニクイザルを選択するのは、この種が系統学的にも生理学的にもヒトに密接に関係していて、非臨床毒性試験のために通常使用される種であるからである。遺伝子操作された細菌は、ヒトにおいて推奨される投与経路と同じ経鼻胃管投与によって投与する。動物の全体的な健康状態（臨床的所見）、体重、臨床病理（血清化学、血液学および血液凝固）を追跡する。血漿のアンモニアレベルを分析し、糞便試料の細菌負荷を調べる。
【０４１８】
遺伝子操作された株は、染色体に組み込まれたＰＡＬ３の１つまたは複数のコピーおよび染色体に組み込まれたＰｈｅＰの１つまたは複数のコピーを含み、それぞれＦＮＲＳプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された株はまた、アラビノース誘導性プロモーター、例えば、ＰａｒａＢＡＤによって駆動されるＬＡＡＤの１つまたは複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、これらの株はさらに、栄養要求性変異、例えば、ｄｅｌｔａＴｈｙＡを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はさらに、抗生物質耐性、例えばカナマイシン耐性を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、栄養要求性変異を含まない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗生物質耐性を含まない。
【０４１９】
材料、動物および投与計画
試験は、米国食品医薬品局によって発行された医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施基準（連邦行政規則集の２１巻、第５８章；１９７９年６月２０日施行）および医薬品の安全性試験の実施基準のＯＥＣＤ原則（Ｃ［９７］１８６／最終；１９９７年施行）を遵守して実施する。動物は、実験動物の管理と使用に関する指針（米国学術研究会議、２０１１年）に記載された推奨に基づいて個々に収容する。
【０４２０】
試験に使用した動物は、３〜８歳（最初の身体検査時）の３〜６ｋｇ（最初の身体検査時）の実験用に生産された非ナイーブ雌カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（ＳＮＢＬ  ＵＳＡ飼育、カンボジア産）である。
【０４２１】
試験期間中、動物にはＰＭＩ  ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）Ｆｉｂｅｒ−Ｐｌｕｓ（登録商標）サル用食餌５０４９ビスケットを１日２回与えた。動物は、投薬前に少なくとも２時間、および投薬後１時間以内は絶食させた。動物はまた、必要な場合は特定の手順で絶食させた（例えば、血清化学用の採血の前、糞便収集前）。食餌は汚染物質を定期的に分析し、製造者の指示範囲内であることを確認する。試験の成績を妨害するレベルでは汚染物質は存在しないと予想される。食品分析記録は、試験施設の記録に保持される。
【０４２２】
動物には全て、新鮮な飲用水を自由に与える。水は定期的に汚染物質を分析する。試験の成績を妨害するレベルでは汚染物質は存在しない。動物には、試験期間を通じて果実、野菜、その他の栄養補助食品およびケージエンリッチメント装置を与える。
【０４２３】
以前に隔離した動物は、投与開始（１日目）前に７日間試験室に馴化させる。最後の投薬は２８日目に行う。動物を試験群に割り当てるために、体重を組み込んだ層別ランダム化方式を使用する。表６１に示したように動物を群に割り当てて処置する。
【０４２４】
【表５１】
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【０４２５】
Ｎｉｓｓｌｅ対照および遺伝子操作された細菌の保存物は、２．２％グルコースおよびチミジン３ｍＭを含む１×ＰＢＳに溶かした１５％グリセロール溶液で１×１０９ｃｆｕ／ｍＬおよび１×１０１１ｃｆｕ／ｍＬに調製し、８６から−６０℃で維持する（表６１参照）。炭酸水素ナトリウムを含む２０％グリセロールで作製したＰＢＳを対照媒体として使用する。炭酸塩濃度は０．３６Ｍで、炭酸水素ナトリウムとしては０．１２Ｍである（表ＸＸＸ参照）。各投与日に、細菌および媒体対照を冷凍庫から取り出し、氷上に置き、解凍して、投与するまで氷上に置く。
【０４２６】
動物に０．１×１０９または１×１０１２ｃｆｕ／動物で投与する。動物には全て経鼻胃管投与（ＮＧ）によって投与し、その後対照／媒体を１日１回２８日間にわたってフラッシュする。各群の炭酸水素塩の濃度および体積は表ＹＹＹに明記する。バイアルは、シリンジで用量を抜き取る前に、少なくとも３回反転させる。投与部位および投与時間（フラッシュの終了時間）を記録する。
【０４２７】
分析
全体条件：臨床的観察は、各動物について馴化の２日目に開始して１日２回実施する。最初の観察は午前中、居室清掃前である。２回目の観察は、ＡＭ観察の４時間後以降である。投与期間中、２回目の観察は用量投与の４時間後（±１０分）に実施する。必要ならば、さらに臨床的観察を実施する。
【０４２８】
体重：各動物の体重を最初の給餌の６日前、１、８、１５、２２および２９日目ならびに用量投与前にも測定する。必要ならば、随時体重測定をさらに行う。
【０４２９】
血液収集：血液は、拘束した、意識下にある動物の末梢静脈から収集する。可能なときはいつでも血液は１回の採血で収集し、その後適切に分割する。検体収集頻度を表６２にまとめて示す。
【０４３０】
【表５２】
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【０４３１】
血液学：血液約１．３ｍＬを２ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ試験管に入れてＡｄｖｉａ自動分析装置を用いて調べる。測定するパラメータは、白血球、赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球分布幅、血小板、平均血小板容積、白血球百分率（絶対値）：好中球絶対数、リンパ球絶対数、単核球絶対数、好酸球絶対数、好塩基球絶対数、網状赤血球パーセントおよび網状赤血球絶対数である。
【０４３２】
血液凝固：血液約１．３ｍＬを１．８ｍＬ  ３．２％クエン酸ナトリウム試験管に入れて調べる。以下の血液凝固パラメータ：活性化部分トロンボプラスチン時間、フィブリノーゲンおよびプロトロンビン時間は、ＳＴＡＣｏｍｐａｃｔ自動分析器を使用して判定する。クエン酸ナトリウム処理した血漿は、分析前に−６０から−８６℃で保存し、分析後廃棄する。
【０４３３】
血清化学：動物は、試料を取り出す前に４時間絶食させる。以下のパラメータ：アルブミン、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、総ビリルビン量、カルシウム、総コレステロール、クレアチニンキナーゼ、クレアチニン、グルコース、無機リン、総タンパク質量、トリグリセリド、ナトリウム、カリウム、グロブリン塩化物、アルブミン／グロブリン比、血中尿素窒素およびガンマグルタミルトランスフェラーゼは、４ｍＬ血清分離器試験管内で血液約１ｍＬを用いてＡＵ６８０分析器を使用して試験する。
【０４３４】
残存した血清は−６０から−８６℃で保存し、試験終了前に廃棄する。
【０４３５】
血漿試料：動物は、試料を取り出す前に４時間絶食させる。血液試料は、表ＹＹＹに挙げた目標とする時点に大腿静脈から収集する。血液チューブに目標とする量の血液を分取した後、鉱物油約０．０５ｍＬを添加して血液表面を覆う。試験管を反転させずに、氷冷ラックに置く。血液試料収集日および時間を記録した。血液試料の最小量は、２ｍｌヘパリンリチウム試験管に収集した１ｍｌである。収集して１５分以内に、試料を２から８℃で遠心分離して、血漿を得る。血漿をバイアルに移し、−６０から−８６℃で保存する。検体は分析する前にドライアイス上で保存する。検体の分析は、血液アンモニア分析器を使用して実行する。
【０４３６】
フェニルアラニン、トランス−ケイ皮酸、および馬尿酸は、タンデム質量分析に結合させた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってＴｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘトリプル４重極質量分析計を使用して測定する。
【０４３７】
糞便試料収集：表ＹＹＹに挙げた目標とする時点で動物当たり２つの糞便試料を収集する。試料収集日および時間を記録する。ＰＢＳ約５ｍＬを含む５０ｍＬファルコンチューブを容器として使用する（糞便が液体の場合、ＰＢＳは添加しない）。糞便試料の重さを測定するために、検体採取前後の容器の重さを調べる。試料は、各動物のケージの底から収集する。新鮮で汚染されていない試料を得るために、残存する食品は除去し、収集前に残渣および／または水を除去するためにケージ受け皿を清掃して拭く。試料は収集直後に氷上に置く。試料は、分析するまで−２０から−１５℃で保存する。検体分析は、ＰＣＲ分析法を使用して実行する。
【実施例３０】
【０４３８】
４週間回復させたカニクイザルにおける４週間毒性試験（ＧＬＰ）
遺伝子操作された細菌の投与によって生じるいかなる潜在的毒性も評価するために、遺伝子操作された細菌を雌カニクイザルにＧＬＰ条件下で毎日２８日間にわたって経鼻胃管（ＮＧ）投与した後に薬物動態および薬力学を試験する。
【０４３９】
遺伝子操作された株は、染色体に組み込まれたＰＡＬ３の１つまたは複数のコピーおよび染色体に組み込まれたＰｈｅＰの１つまたは複数のコピーを含み、それぞれＦＮＲＳプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された株はまた、アラビノース誘導性プロモーター、例えば、ＰａｒａＢＡＤによって駆動されるＬＡＡＤの１つまたは複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、これらの株はさらに、栄養要求性変異、例えば、ｄｅｌｔａＴｈｙＡを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はさらに、抗生物質耐性、例えばカナマイシン耐性を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、栄養要求性変異を含まない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗生物質耐性を含まない。
【０４４０】
試験は、米国食品医薬品局によって発行された医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準（連邦行政規則集の２１巻、第５８章；１９７９年６月２０日施行）および医薬品の安全性試験の実施基準のＯＥＣＤ原則（Ｃ［９７］１８６／最終；１９９７年施行）を遵守して実施する。動物は、実験動物の管理と使用に関する指針（米国学術研究会議、２０１１年）に記載された推奨に基づいて個々に収容する。
【０４４１】
材料は全てＧＭＰ基準で製造すること以外は本質的に実施例２９に記載したように、動物に対して遺伝子操作された細菌または対照媒体を投与する。投与は、表６３にまとめて示す。さらに、動物は１４日間馴化し、投与期間は毎日２８日間で、その後２８日間休薬する。さらに、動物は組織学的分析を実施するために試験終了時に安楽死させる。
【０４４２】
【表５３】
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【０４４３】
試験分析は、表６４に記載したように実施する。血液学、血液凝固、血清化学および血漿試料パラメータは、本質的に実施例３０に記載した通りで、実施例３０で記載した方法を使用して分析する。糞便試料の収集および分析は、本質的に実施例３０に記載した通りである。
【０４４４】
【表５４】
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【実施例３１】
【０４４５】
ＰＭＥ分泌用にＨｌｙＡタグを有する遺伝子操作された細菌
ＰＭＥ分泌用の構築物は、表６５に示したように作製した。その後、この配列に、例えば、ＨＩＳタグをＣ末端分泌配列の前に挿入してタグ付けする。大腸菌は低コピープラスミドの構築物で形質転換する。分泌したＰＭＥは、アフィニティークロマトグラフィー（Ｈｉｓタグ）を使用して培地から単離する。ＰＭＥ分子量は、ウェスタンブロットによって確認する。精製した酵素の活性は、フェニルアラニン含有緩衝液中でｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで試験する。代謝物は、実施例２４〜２６で記載したように経時的に測定する。
【０４４６】
【表５５−１】
2018515106.tif 000096
【表５５−２】
2018515106.tif 000097
【表５５−３】
2018515106.tif 000098
【表５５−４】
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【表５５−５】
2018515106.tif 000100
【０４４７】
【表５６−１】
2018515106.tif 000101
【表５６−２】
2018515106.tif 000102
【実施例３２】
【０４４８】
さらに構築物を含む遺伝子操作された細菌
ＰＭＥ分泌用の構築物は、表６６に示したように作製した。
【０４４９】
【表５７−１】
2018515106.tif 000103
【表５７−２】
2018515106.tif 000104
【表５７−３】
2018515106.tif 000105
【図１】
2018515106.tif 000106
【図２−１】
2018515106.tif 000107
【図２−２】
2018515106.tif 000108
【図３】
2018515106.tif 000109
【図４】
2018515106.tif 000110
【図５】
2018515106.tif 000111
【図６】
2018515106.tif 000112
【図７】
2018515106.tif 000113
【図８】
2018515106.tif 000114
【図９】
2018515106.tif 000115
【図１０】
2018515106.tif 000116
【図１１】
2018515106.tif 000117
【図１２Ａ】
2018515106.tif 000118
【図１２Ｂ】
2018515106.tif 000119
【図１３Ａ】
2018515106.tif 000120
【図１３Ｂ】
2018515106.tif 000121
【図１３Ｃ】
2018515106.tif 000122
【図１４】
2018515106.tif 000123
【図１５Ａ】
2018515106.tif 000124
【図１５Ｂ】
2018515106.tif 000125
【図１６Ａ】
2018515106.tif 000126
【図１６Ｂ】
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【図１７】
2018515106.tif 000128
【図１８】
2018515106.tif 000129
【図１９Ａ】
2018515106.tif 000130
【図１９Ｂ】
2018515106.tif 000131
【図１９Ｃ】
2018515106.tif 000132
【図２０Ａ】
2018515106.tif 000133
【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
2018515106.tif 000139
【図２５Ｂ】
2018515106.tif 000140
【図２６】
2018515106.tif 000141
【図２７Ａ】
2018515106.tif 000142
【図２７Ｂ】
2018515106.tif 000143
【図２８】
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【図２９−１】
2018515106.tif 000145
【図２９−２】
2018515106.tif 000146
【図３０Ａ】
2018515106.tif 000147
【図３０Ｂ】
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【図３１】
2018515106.tif 000149
【図３２−１】
2018515106.tif 000150
【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３−１】
2018515106.tif 000153
【図３３−２】
2018515106.tif 000154
【図３３−３】
2018515106.tif 000155
【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月22日(2018.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図１】フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）および高フェニルアラニン血症を特徴とする障害を治療するための合成生物を示した図である。
【図２−１】図２Ａ：フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ作用の概略を示した図である。図２Ｂ：フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）作用の概略を示した図である。
【図２−２】図２Ｃ：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）作用の概略を示した図である。図２Ｄ：Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ；例えば、プロテウス・ミラビリス由来）作用の概略を示した図である。
【図３】フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）および高フェニルアラニン血症を特徴とする障害を治療するための合成生物を示した図である。
【図４】フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）および高フェニルアラニン血症を特徴とする障害を治療するための合成生物を示した図である。
【図５】フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）および高フェニルアラニン血症を特徴とする障害を治療するための合成生物を示した図である。
【図６】例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３に含まれるように、高コピープラスミドにＰＡＬ３をコードする遺伝子およびＴｅｔプロモーター配列を含む構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図７】例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０７、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０５、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０６に含まれるように、低コピープラスミドにＰＡＬ３をコードする遺伝子およびＦＮＲプロモーター配列を含む構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図８】例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０１のように、低コピープラスミドにＰＡＬ３をコードする遺伝子およびＴｅｔプロモーター配列を含む構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図９】Ｔｅｔプロモーター配列の制御下のクローニングしたＬＡＡＤ遺伝子およびＴｅｔリプレッサー遺伝子を含む、例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１に含まれる構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図１０】ｐｈｅＰの第２のコピーをＮｉｓｓｌｅ  ｌａｃＺ遺伝子に挿入するために組み換えを使用する、ｐｈｅＰノックイン株の構築物の概略を示した図である。
【図１１】例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０３、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０３に含まれるように、ＰｈｅＰをコードする遺伝子、ＴｅｔＲをコードする遺伝子および染色体挿入のためのｔｅｔプロモーター配列を含む構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図１２Ａ】低コピーのカナマイシン耐性プラスミド（ｐＳＣ１０１複製開始点においてＦＮＲプロモーター配列の制御下にクローニングしたＰＡＬ３遺伝子を含む構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。嫌気的条件下で、ＰＡＬ３はフェニルアラニンを非毒性トランス−ケイ皮酸に分解する。
【図１２Ｂ】ＰｆｎｒＳプロモーターによって駆動され、Ｎｉｓｓｌｅ染色体のｌａｃＺ座に挿入される内在性大腸菌高親和性フェニルアラニントランスポーター、ｐｈｅＰのコピーをさらに示した図である。
【図１３Ａ】本開示の非限定的実施形態の概略を示した図である。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ染色体に組み込まれたフェニルアラニン分解成分を示す。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたプラスミドを含まない細菌株を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるプラスミド接合を防ぐ。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子を多数挿入すると、コピー数の増加および／またはフェニルアラニン分解活性の増大が生じる。いくつかの実施形態では、内在性大腸菌高親和性フェニルアラニントランスポーター、ｐｈｅＰのコピーは、ＰｆｎｒＳプロモーターによって駆動され、ｌａｃＺ座に挿入される。
【図１３Ｂ】本開示の非限定的実施形態の概略を示した図である。本開示の非限定一実施形態の概略図を示し、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ染色体は、ゲノムの４つの異なる挿入部位（ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩおよびｃｅａ）に挿入されたＰｆｎｒＳ−ＰＡＬの４個のコピーおよび異なる挿入部位（ｌａｃＺ）に挿入されたフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１個のコピーを含有するように遺伝子操作される。この実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はＰ．ルミネセンスから得られたＰＡＬ３で、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は大腸菌由来のｐｈｅＰである。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ５１１である。
【図１３Ｃ】本開示の非限定的実施形態の概略を示した図である。本開示の好ましい一実施形態の概略図を示し、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ染色体は染色体の異なる組み込み部位（ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＰ／Ｔ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩおよびｃｅａ）に挿入された酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＰｆｎｒＳ−ＰＡＬ３）の制御下にＰＡＬの５個のコピー、および染色体の異なる組み込み部位（ｌａｃＺ）に挿入された酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）制御下にフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１個のコピーを含有するように遺伝子操作される。ゲノムはさらに、ｔｈｙＡ遺伝子が除去され、かつ／または無関係の遺伝子に置換されてｔｈｙＡ栄養要求性を含むように、ならびにカナマイシン耐性遺伝子を含むように遺伝子操作される。
【図１４】例えば、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５に含まれるように、ａｒａＣをコードする遺伝子およびプロテウス・ミラビリスのＬＡＡＤをコードする遺伝子および染色体組み込み用の内在性アラビノースオペロンに染色体を挿入するためのアラビノース誘導性プロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）配列を含む非制限的構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図１５Ａ】無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）で誘導され、次にフェニルアラニン４ｍＭ（６６００００ｎｇ／ｍＬ）を補給した培地で増殖させた、低コピー（ＬＣ；ＳＹＮ−ＰＫＵ１０１）もしくは高コピー（ＨＣ；ＳＹＮ−ＰＫＵ１０２）プラスミドのＰＡＬ１または低コピー（ＬＣ；ＳＹＮ−ＰＫＵ２０１）もしくは高コピー（ＨＣ；ＳＹＮ−ＰＫＵ２０２）プラスミドのＰＡＬ３を発現する細菌を含む試料中のフェニルアラニン濃度を示した図である。試料は０時間、４時間および２３時間後に取り出す。フェニルアラニン濃度は質量分析によって判定する。
【図１５Ｂ】誘導して４時間後および２３時間後の試料中のケイ皮酸塩レベルを示す。ＰＡＬ３発現株では、ＰＡＬ３遺伝子は、大腸菌と同じ分類学的亜門の腸内細菌、フォトラブダス・ルミネセンスから得られる。
【図１６Ａ】低コピー（ＬＣ）もしくは高コピー（ＨＣ）プラスミドのＰＡＬ１もしくはＰＡＬ３を発現する細菌か、または染色体に組み込まれたＴｅｔプロモーターによって駆動されるｐｈｅＰの１個のコピーをさらに含む細菌を含む試料におけるフェニルアラニン濃度を示した図である。細菌は、ＡＴＣで誘導し、次に、フェニルアラニン４ｍＭ（６６００００ｎｇ／ｍＬ）を補給した培地でＯＤ６００が２．０になるまで増殖させた。試料は、誘導して０時間後、２時間後および４時間後に取り出し、フェニルアラニン濃度は質量分析によって判定した。特に、さらにｐｈｅＰのコピーを含むと、４時間でフェニルアラニン（４ｍＭ）が分解された。
【図１６Ｂ】誘導して２時間後および４時間後の試料中のケイ皮酸塩レベルを示した図である。いくつかの実施形態では、ケイ皮酸塩は株の活性の代替的バイオマーカーとして使用することができる。ＰｈｅＰが過剰発現すると、遺伝子操作された細菌のフェニルアラニン代謝が改善される。この一連のデータで分析した株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ２０３、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３である。
【図１７】図１７Ａ：非誘導条件下でのＰＡＬ構築物の非限定的な一実施形態を示した図である。酸素（Ｏ２）による好気的条件下でＦＮＲの二量体化を防ぎ、ＰＡＬおよび／またはｐｈｅＰ遺伝子発現を活性化したことによる、比較的低いＰＡＬおよびＰｈｅＰ産生を示した図である。図１７Ｂ：誘導条件下でのＰＡＬ構築物の非限定的な一実施形態を示した図である。嫌気的条件下で、ＦＮＲが二量体化し、ＦＮＲプロモーターによってＰＡＬおよびｐｈｅＰの発現が誘導されたことによるＰＡＬおよびＰｈｅＰ産生の上方制御を示す（「ＰＡＬ」および「ｐｈｅＰ」上の不規則な曲線）。１つの長方形または長方形群の近くの矢印は、このような遺伝子（複数可）の（矢印の示す方向への）転写の駆動に関与するプロモーターを示す。各長方形の上の矢印は、各遺伝子の発現産物を示す。
【図１８】表３で示したＦＮＲプロモーターの例から選択されたＦＮＲに関与するプロモーター（Ｐｆｎｒ１−５）からｌａｃＺを発現する低コピープラスミドを保有する細菌を含む試料中のβ−ガラクトシダーゼレベルを示した図である。様々なＦＮＲに関与するプロモーターを使用して、様々な発現レベルおよびダイナミックレンジの嫌気性誘導性レポーターのライブラリーを作製した。これらのプロモーターは、強力なリボソーム結合部位を含んだ。細菌培養物は、好気的（＋Ｏ２）または嫌気的（−Ｏ２）条件下で増殖させた。試料を４時間後に取り出し、β−ガラクトシダーゼレベルをベースにしたプロモーター活性は、標準β−ガラクトシダーゼ比色アッセイを実施することによって分析した。
【図１９Ａ】ＦＮＲプロモーターの１例（ＰｆｎｒＳ）の制御下のｌａｃＺ遺伝子の概略を示した図である。ＬａｃＺはβ−ガラクトシダーゼ酵素をコードし、細菌における一般的なレポーター遺伝子である。
【図１９Ｂ】ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の関数としてＦＮＲプロモーター活性を示した図である。低コピーｆｎｒＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子を保有する遺伝子操作された細菌株、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を酸素の存在下または非存在下で増殖させた。標準β−ガラクトシダーゼ比色アッセイの値は、Ｍｉｌｌｅｒ単位（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）で表す。これらのデータは、ｆｎｒＳプロモーターが嫌気的条件下で１時間以内に高レベルの遺伝子発現の駆動を開始することを示唆している。
【図１９Ｃ】酸素の存在下および非存在下の両方における、ｌａｃＺを発現する細菌細胞培養物の経時的な増殖を示した図である。
【図２０Ａ】野生型Ｎｉｓｓｌｅの試料、ＴｅｔプロモーターもしくはＦＮＲプロモーター例からＰＡＬ３を発現する低コピープラスミドを含む細菌またはＴｅｔプロモーターによって駆動され、染色体に組み込まれたｐｈｅＰの１個のコピーをさらに含む細菌の試料において、好気的条件下で産生されるフェニルアラニンレベルを示した図である。試料は、ＡＴＣおよびフェニルアラニン４ｍＭ（６６００００ｎｇ／ｍＬ）を補給した培地でインキュベートした。試料は、０時間後、２時間後、４時間後および２４時間後に取り出した。フェニルアラニン濃度は、質量分析によって判定した。
【図２０Ｂ】野生型Ｎｉｓｓｌｅの試料、ＴｅｔプロモーターもしくはＦＮＲプロモーター例からＰＡＬ３を発現する低コピープラスミドを含む細菌またはＴｅｔプロモーターによって駆動され、染色体に組み込まれたｐｈｅＰの１個のコピーをさらに含む細菌の試料において、嫌気的条件下で産生されるフェニルアラニンレベルを示した図である。試料は、ＡＴＣおよびフェニルアラニン４ｍＭ（６６００００ｎｇ／ｍＬ）を補給した培地でインキュベートした。試料は、０時間後、２時間後、４時間後および２４時間後に取り出した。フェニルアラニン濃度は、質量分析によって判定した。これらのデータは、ＦＮＲに関与するｆｎｒＳプロモーターは、嫌気的条件下でテトラサイクリン誘導性プロモーターのようにＰＡＬ３発現の活性化に有効であることを示唆している。
【図２１】染色体にｐｈｅＰのコピーをさらに挿入した、または挿入しない合成プロバイオティクス株の培養物におけるフェニルアラニン濃度を示した図である。増殖して１．５時間後に、培養物を９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。インキュベートして４時間後に、フェニルアラニン４ｍＭを含有するアッセイ緩衝液に細菌を再懸濁した。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に３時間取り出した。さらにｐｈｅＰのコピーを含む株（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０５；左）のフェニルアラニン分解速度は、ｐｈｅＰのコピーをさらに含まない株（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０８およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０７；右）よりも高かった。
【図２２】染色体の様々な位置に単一のＰＡＬ３挿入を含む株のトランス−ケイ皮酸塩濃度（ＰＡＬ活性）を示した図である。
【図２３】染色体の様々な位置に複数のＰＡＬ３挿入を含む株のトランス−ケイ皮酸塩濃度（ＰＡＬ活性）を示した図である。
【図２４】合成プロバイオティクス株ＳＹＮ−ＰＫＵ５１１の培養物における経時的なフェニルアラニン濃度を示した図である。増殖して２．５時間後に、培養物を９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。フェニルアラニンを含有する培地中で３．５時間誘導した後、全細胞抽出物を３０分毎に３時間にわたって調製し、フェニルアラニンを質量分析によって定量した。ＳＹＮ−ＰＫＵ５１１は、５つの染色体位置に組み込まれた、嫌気的に（ＦＮＲ）制御されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の５個のコピーを含み、ｌａｃＺ座に組み込まれた、嫌気的に制御された高親和性Ｐｈｅトランスポーター（ｐｈｅＰ）をコードする遺伝子を含む。
【図２５Ａ】Ｔｅｔ誘導性プロモーターによって駆動されるＬＡＡＤを有する高コピーｐＵＣ５７−プラスミドを含む合成プロバイオティクス株、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１の培養物におけるフェニルアラニン濃度を示した図であり、細胞は震盪フラスコ中で３７℃で増殖させ、対数期初期にＴＣＡで２時間誘導した。細胞を遠心分離し、フェニルアラニンを含有するアッセイ緩衝液中に再懸濁した。細胞は、様々な細胞濃度および様々な酸素レベルで測定した。細胞は、１４ｍｌ培養試験管内で２５０ｒｐｍで震盪しながら好気的にインキュベートした（１ｍｌ）。微好気的条件では、細胞（１ｍｌ）は１．７ｍｌコニカル管内で震盪せずにインキュベートした。細胞は、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバー内で嫌気的にインキュベートした。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に２時間取り出した。２つの細胞密度を使用した好気的条件下でのフェニルアラニン濃度を示す。ＡおよびＢは、同じ実験条件下で繰り返した。好気的条件での活性は約５０μｍｏｌ／時間／１ｅ９細胞である。
【図２５Ｂ】Ｔｅｔ誘導性プロモーターによって駆動されるＬＡＡＤを有する高コピーｐＵＣ５７−プラスミドを含む合成プロバイオティクス株、ＳＹＮ−ＰＫＵ４０１の培養物におけるフェニルアラニン濃度を示した図であり、細胞は震盪フラスコ中で３７℃で増殖させ、対数期初期にＴＣＡで２時間誘導した。細胞を遠心分離し、フェニルアラニンを含有するアッセイ緩衝液中に再懸濁した。細胞は、様々な細胞濃度および様々な酸素レベルで測定した。細胞は、１４ｍｌ培養試験管内で２５０ｒｐｍで震盪しながら好気的にインキュベートした（１ｍｌ）。微好気的条件では、細胞（１ｍｌ）は１．７ｍｌコニカル管内で震盪せずにインキュベートした。細胞は、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバー内で嫌気的にインキュベートした。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に２時間取り出した。ＡおよびＢは、同じ実験条件下で繰り返した。好気的、微好気的または嫌気的に増殖させた細胞のフェニルアラニン濃度を示す。
【図２６】図２６Ａ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおける給餌前後のフェニルアラニン濃度を示した図である。試験開始時に、ホモ接合体ＢＴＢＲ−Ｐａｈｅｎｕ２マウスにＡＴＣ１００マイクログラム／ｍＬおよび５％スクロースを補給した水を投与した。固形飼料を撤去することによってマウスを一晩（１０時間）絶食させ、フェニルアラニンの基準レベルを決定するために翌朝下顎を出血させて血液試料を収集した。マウスに再度固形飼料を与え、１時間後に細菌（ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２または対照Ｎｉｓｓｌｅ）１００マイクロリットル（５×１０９ＣＦＵ）を強制経口投与し、さらに２時間給餌した。血清フェニルアラニン濃度は、強制経口投与の２時間後に判定した。図２６Ｂ：給餌前後の血中フェニルアラニン濃度のパーセント（％）変化を雌または雄の群平均として示した図である（ｐ＜０．０１）。
【図２７Ａ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ（ｎ＝３０）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝３３）、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３（ｎ＝３４）またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝３４）２００μＬを強制経口投与した。フェニルアラニン注射の２時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。これらのデータは、遺伝子操作されたプロバイオティクス株ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３を経口投与すると、モック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較して、マウスの血中フェニルアラニンレベルが有意に低下することを示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００００１）。ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３は、フェニルアラニンの腸管再循環を妨害することができる。
【図２７Ｂ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ（ｎ＝３０）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝３３）またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０３（ｎ＝３４）２００μＬを強制経口投与した。フェニルアラニン注射の４時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。これらのデータは、遺伝子操作されたプロバイオティクス株ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３を経口投与すると、モック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較して、マウスの血中フェニルアラニンレベルが有意に低下することを示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００００１）。ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３は、フェニルアラニンの腸管再循環を妨害することができる。
【図２８】図２８は、ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ（ｎ＝３０）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝３３）、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３（ｎ＝３４）またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝３４）２００μＬを強制経口投与した。フェニルアラニン注射後の血中フェニルアラニン濃度は、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｆｎｒＳ−ＰＡＬを含有する低コピープラスミド）が腸管再循環モデルにおける循環Ｐｈｅレベルの低下において少なくともＳＹＮ−ＰＫＵ３０３（Ｔｅｔ−ＰＡＬを含有する高コピープラスミド）と同じくらい有効であることを示している。
【図２９−１】図２９Ａ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／平均群体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の２時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。これらのデータは、遺伝子操作されたプロバイオティクス株ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を経口投与すると、モック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較して、マウスの血中フェニルアラニンレベルが有意に低下することを示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００００１）。図２９Ｂ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の４時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。これらのデータは、遺伝子操作されたプロバイオティクス株ＳＹＮ−ＰＫＵ３０３およびＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を経口投与すると、モック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較して、マウスの血中フェニルアラニンレベルが有意に低下することを示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００００１）。
【図２９−２】図２９Ｃ：図２９Ａで示したデータの散布図を示す。図２９Ｄ：図２９Ｂで示したデータの散布図を示す。
【図３０】図３０Ａ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ（ｎ＝１２）２００μＬ、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）２００μＬまたはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を１００、２００もしくは４００μＬ（各投与群においてｎ＝１２）を強制経口投与した。ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４処置したマウスのモック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較した血中フェニルアラニンレベルの用量依存的減少を示している（＊３０％減少；ｐ＜０．０５）。この実験は、これと同じ計画の８つの研究の１つを表しており、それぞれはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４が腸管再循環フェニルアラニンを妨害することができることを示している。図３０Ｂ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後の基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示した図である。フェニルアラニン（０．１ｍｇ／群平均体重グラム）を注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏ（ｎ＝１２）２００μＬ、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）２００μＬまたはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４を１００、２００もしくは４００μＬ（各投与群においてｎ＝１２）を強制経口投与した。ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４処置したマウスのモック処置（Ｈ２Ｏ）または親株（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）を投与したマウスと比較した血中フェニルアラニンレベルの用量依存的減少を示している（＊３０％減少；ｐ＜０．０５）。この実験は、これと同じ計画の８つの研究の１つを表しており、それぞれはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４が腸管再循環フェニルアラニンを妨害することができることを示している。
【図３１】図３１Ａ：ＰＫＵ特異的フェニルアラニン代謝物の概略を示した図である。機能的ＰＡＨの非存在下でのフェニルアラニンからフェニルピルビン酸およびフェニル乳酸への変換の概略を示す。これらの代謝物は、実施例２４〜２６に記載したように質量分析によって、またはその他の手段によって検出することができる。図３１Ｂ：ＰＡＬ特異的フェニルアラニン代謝物の概略を示した図である。ＰＡＬ３によるフェニルアラニンからトランス−ケイ皮酸への変換の概略を示しており、これは肝酵素によって馬尿酸にさらに代謝される。これらの代謝物は、実施例２４〜２６に記載したように質量分析によって、またはその他の手段によって検出することができる。
【図３２−１】図３２Ａ：基準に対する血中フェニルアラニン濃度およびフェニルアラニンの濃度を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示し、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４の総代謝活性は８１．２μｍｏｌ／時間と算出され、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１に対する全低下量Δｐｈｅは４５％であった（Ｐ＜０．０５）。図３２Ｂ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。
【図３２−２】図３２Ｃ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルピルビン酸濃度を示す。図３２Ｄ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニル乳酸濃度を示す。
【図３２−３】図３２Ｅ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中ｔ−ケイ皮酸濃度を示す。図３２Ｆ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニンを注射して３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ３０４（ｎ＝１２）８００μＬ（２．９ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中馬尿酸濃度を示す。
【図３３−１】図３３Ａ：基準に対する血中フェニルアラニン濃度およびフェニルアラニンの濃度を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示し、ＳＹＮ−ＰＫＵ５１７の総代謝活性は３９．６μｍｏｌ／時間と算出され、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１に対する全低下量Δｐｈｅは１７％であった（Ｐ＜０．０５）。図３３Ｂ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。
【図３３−２】図３３Ｃ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルピルビン酸濃度を示す。図３３Ｄ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニル乳酸濃度を示す。
【図３３−３】図３３Ｅ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後のｔ−ケイ皮酸濃度を示す。図３３Ｆ：ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分後および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝９）、ＳＹＮ−ＰＫＵ８０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ５１７（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中馬尿酸濃度を示す。
【図３４Ａ】基準に対する血中フェニルアラニン濃度およびフェニルアラニンの濃度を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８００μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。基準に対する血中フェニルアラニン濃度を示し、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５の総代謝活性は１３３．２μｍｏｌ／時間と算出され、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１に対する全低下量Δｐｈｅは３０％であった（Ｐ＜０．０５）。
【図３４Ｂ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルアラニン濃度を示す。
【図３４Ｃ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニルピルビン酸濃度を示す。
【図３４Ｄ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中フェニル乳酸濃度を示す。
【図３４Ｅ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後のｔ−ケイ皮酸濃度を示す。
【図３４Ｆ】ＰＫＵのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるフェニルアラニン皮下曝露後のフェニルアラニンおよびＰＫＵ特異的代謝物およびＰＡＬ特異的代謝物の絶対値を示した図である。フェニルアラニン注射の３０分および９０分後に、マウスにＨ２Ｏを全部で８００μＬ（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＰＫＵ７０５（ｎ＝１２）８μＬ（３．６ｅ１０ｃｆｕ／マウス）を強制経口投与した。フェニルアラニン注射の０時間後および４時間後の血中馬尿酸濃度を示す。
【図３５】フェニルアラニン、ならびに、活性が増加したＰＡＬ酵素を選択するための標的を絞らないアプローチに有用な２つの毒性類似体、ｐ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンおよびｏ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンを示した図である。Ｐ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンおよびｏ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンはフェニルアラニンの代わりに細胞タンパク質に組み込まれ、細胞死を引き起こす。これらの化合物は、ＰｈｅＰによって容易に取り込まれ、以下に示したようにＰＡＬの基質となることができるので、Ｐｈｅ消費活性が改善した株を同定するための遺伝子選択およびスクリーニングにおいて使用することができる。より効率的なＰＡＬ代謝を可能にする突然変異は、フェニルアラニン類似体の細胞タンパク質への組み込みを妨害することができ、したがって高濃度の類似体の下での増殖を可能にする。
【図３６】大腸菌１９１７Ｎｉｓｓｌｅ染色体内の組み込み部位例のマップを示した図である。これらの部位は、本質的な遺伝子発現を妨害することなく回路成分を染色体に挿入することができる領域を示す。バックスラッシュ（／）を使用して、挿入が分散的にまたは収束的に発現した遺伝子の間に生じることを示す。ｔｈｙＡなどの生合成遺伝子内の挿入は、栄養要求体を作製するために使用することができる。いくつかの実施形態では、個々の回路成分は指示した部位の２つ以上に挿入される。
【図３７】赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を構造的に発現する３つの細菌株を示した図である。株１〜３では、ｒｆｐ遺伝子が細菌染色体内の異なる部位に挿入されており、蛍光の下で様々な程度の明るさを生じる。未改変大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（４株）は蛍光を生じない。
【図３８】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮｉｓｓｌｅの存在を示したグラフである。ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅをマウスに抗生物質で予備治療することなく強制経口投与した。投与後、全部で６匹のマウスの糞便ペレットをモニターして、マウス胃腸管内にまだ存在している投与したＮｉｓｓｌｅの量を判定した。棒は、マウスに投与した細菌の数を表している。線は、毎日糞便試料から回収されたＮｉｓｓｌｅの数を連続して１０日間表している。
【図３９Ａ】ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２培養物中におけるフェニルアラニン濃度を経時的に示した図である。増殖して１．５時間後に、ＡＴＣをＳＹＮ−ＰＫＵ３０２の培養物に添加し、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。誘導して４時間後に、フェニルアラニン４ｍＭを含有し、様々なｐＨ（ｐＨ範囲７．２５〜２．２５）のアッセイ緩衝液に細菌を再懸濁した。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に２時間にわたって取り出した。フェニルアラニン分解速度は、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０２におけるアッセイ緩衝液のｐＨが低下するにつれて低下した。
【図３９Ｂ】ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４培養物中におけるフェニルアラニン濃度を経時的に示した図である。増殖して１．５時間後に、ＡＴＣをＳＹＮ−ＰＫＵ３０４の培養物に添加し、９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに入れた。誘導して４時間後に、フェニルアラニン４ｍＭを含有し、様々なｐＨ（ｐＨ範囲７．２５〜２．２５）のアッセイ緩衝液に細菌を再懸濁した。質量分析によってフェニルアラニンを定量するために、細胞アッセイから一定量を３０分毎に２時間にわたって取り出した。フェニルアラニン分解速度は、ＳＹＮ−ＰＫＵ３０４株におけるアッセイ緩衝液のｐＨが低下するにつれて低下した。
【図４０】多数の作用機構（ＭｏＡ）を含む大腸菌１９１７Ｎｉｓｓｌｅ染色体の概略の１例を示した図である。
【図４１】ＰＡＬ３およびｐｈｅＰ遺伝子がＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）の１例の制御下で同時転写される構築物の１例の遺伝子組成を示した図である。
【図４２】図４２Ａ：Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＦＮＲプロモーターの１例（ＰｆｎｒＳ）に作動可能に連結し、ＰＡＬ３遺伝子が強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。ＯＦＦ方向（３’から５’）にＩｎｔ５部位が隣接したＰＡＬ３遺伝子の概略図を示している。いかなる強力な構成的プロモーター配列も使用することができる。図４２Ｂ：Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＦＮＲプロモーターの１例（ＰｆｎｒＳ）に作動可能に連結し、ＰＡＬ３遺伝子が強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。Ｉｎｔ５遺伝子発現が嫌気的条件下で活性化される場合、ＰＡＬ３のＯＮ方向（５’から３’）へのリコンビナーゼによるフリッピングがＰＡＬ３の産生およびフェニルアラニン代謝を導く。いかなる強力な構成的プロモーター配列も使用することができる。
【図４３】図４３Ａ：Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。ＯＦＦ方向にＩｎｔ５部位が隣接したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の概略図を示している。図４３Ｂ：Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。Ｉｎｔ５遺伝子発現が嫌気的条件下で活性化される場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子はＯＮ方向にフリッピングされる。図４３Ｃ：Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。Ｔ７駆動プロモーター（ＰＴ７）の制御下にＰＡＬ３の１個のコピーを含む遺伝子操作された細菌株において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現は、ＰＡＬ３の産生およびフェニルアラニン代謝を導く。
【図４４Ａ】Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図４４Ｂ】Ｉｎｔ５リコンビナーゼ遺伝子がＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に作動可能に連結し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がリコンビナーゼ部位に隣接して強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した構築物の１例の遺伝子構成を示した図である。
【図４５】図４５Ａ：異なる誘導性プロモーターおよびリボソーム結合部位を使用した、ＰＡＬ３発現を活性化するためのリコンビナーゼをベースにしたスイッチの概略を示した図である。リコンビナーゼ発現は、ＰＡＬ３遺伝子のＯＮ方向への組み換えフリッピングを引き起こし、ＰＡＬ３の産生およびフェニルアラニンの分解を導く。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼをベースにしたスイッチは、誘導因子の特定のレベルに応答するように調整される。図４５Ｂ：誘導因子の濃度とＯＮ方向にＰＡＬ３を含有する構築物の割合の間の関係を示した図である。影の領域は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける誘導因子の予測有効範囲を示す。
【図４６Ａ】異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の別の非限定的実施形態を示した図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は転写を抑制する立体構造をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に結合して活性化する立体構造的変化を受け、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は組換え細菌細胞内に蓄積するが、ＴｅｔＲは毒素の発現を妨害する（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下である）。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素もＴｅｔＲも発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素が発現し細胞を死滅させる。組換え細菌においては見いだされない本質的遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される本開示の別の非限定的実施形態も示す。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子はａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある本質的遺伝子の転写を抑制する立体構造をとり、細菌細胞は生存することができない。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はａｒａＢＡＤプロモーターに結合して活性化させる立体構造的変化を受け、本質的遺伝子の発現を誘導し、細菌細胞の生存能を維持する。
【図４６Ｂ】抗毒素が構成的プロモーターから発現し、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の非限定的実施形態を示した図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は転写を抑制する立体構造をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はａｒａＢＡＤプロモーターに結合して活性化させる立体構造変化を受け、ＴｅｔＲの発現を誘導し、こうして毒素の発現を妨害する。しかし、アラビノースが存在しない場合、ＴｅｔＲは発現せず、毒素が発現し、最終的に抗毒素を打ち負かし、細胞を死滅させる。抗毒素の発現を調節する構成的プロモーターは、毒素の発現を駆動するプロモーターよりも弱いプロモーターであろう。ａｒａＣ遺伝子は、この回路の構成的プロモーターの制御下にある。
【図４６Ｃ】異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の別の非限定的実施形態を示した図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は転写を抑制する立体構造をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はａｒａＢＡＤプロモーターに結合して活性化させる立体構造変化を受け、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は組換え細菌細胞内に蓄積するが、ＴｅｔＲは毒素の発現を妨害する（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下である）。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素もＴｅｔＲも発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素が発現し細胞を死滅させる。ａｒａＣ遺伝子は、構成的プロモーターまたはこの回路の誘導性プロモーター（例えば、ＡｒａＣプロモーター）のいずれかの制御下にある。
【図４７】遺伝子操作された安全成分としてＧｅｎｅＧｕａｒｄを使用することを示した図である。遺伝子操作されたＤＮＡは全て、条件的に破壊することができるプラスミドに存在する。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ等、２０１５年を参照のこと。
【図４８】図４８Ａ：野生型ｃｌｂＡ構築物の概略図である。図４８Ｂ：ｃｌｂＡノックアウト構築物の概略図である。
【図４９】野生型ｃｌｂＡ構築物およびｃｌｂＡノックアウト構築物の配列例を示した図である。
【図５０】細胞内で発現したキメラペプチドが内膜および外膜を横断して周囲の宿主環境に移動することができるように、ペプチドを組換えによって天然の鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに融合することによって、目的の治療用ペプチドを分泌するように改変された鞭毛を使用する、鞭毛ＩＩＩ型分泌に基づいた分泌系の概略を示した図である。
【図５１】治療用ペプチド（ｓｔａｒ）をＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己分泌体（ａｕｔｏ−ｓｅｃｒｅｔｅｒ）のベータ−ドメインに融合させることができる、組換えタンパク質の細胞外産生のためのＶ型分泌系の概略を示した図である。この系では、Ｎ末端シグナル配列はタンパク質をＳｅｃＡ−ＹＥＧ機構に導き、これは、タンパク質を、内膜を越えて周辺質に移動させ、続いてシグナル配列を切断する。ベータドメインはＢａｍ複合体に動員され、そこでベータドメインは折り畳まれ、ベータバレル構造として外膜に挿入される。次に、治療用ペプチドがリンカー配列の前のベータバレル構造の中空孔に通される。治療用ペプチドは、自己触媒的切断によって、または膜関連ペプチダーゼ（ハサミ）をリンカーの相補的プロテアーゼ切断部位にターゲティングすることによって、リンカー系から開放される。
【図５２】内膜および外膜両方を通るチャネルを形成するＨｌｙＢ（ＡＴＰ結合カセット分泌体；ＨｌｙＤ（膜融合タンパク質）；およびＴｏｌＣ（外膜タンパク質）を使用してパッセンジャーペプチドを細胞質から直接細胞外空間に移動させる、Ｉ型分泌系の概略図である。ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分は、このペプチドの分泌を媒介するために治療用ペプチド（ｓｔａｒ）のＣ末端部分に融合させる。
【図５３】グラム陰性細菌の外膜および内膜の概略、ならびに漏出性または不安定化した外膜を形成し、それによって、治療用ポリペプチド、例えば、ジスルフィド結合を含有する真核細胞由来の治療用ペプチドを細胞外空間に容易に移動させるために欠落させる様々な標的を示した図である。外膜をペプチドグリカン骨格につなぎ止めるタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌおよび／または周辺質プロテアーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子、例えば、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、ｎｌｐｌの不活性化突然変異は、漏出性表現型を生じる。突然変異の組み合わせは、漏出性表現型を相乗的に増強することができる。
【図５４】本開示の遺伝子操作された細菌を設計し、生産する非限定的方法の概略を示した図である。
【図５５】図５５Ａ：本開示の遺伝子操作された細菌の上流および下流生産の非限定的製造方法の概略を示した図である。開始培養１（ＳＣ１）のパラメータ：白金耳量のグリセロールストック、期間一晩、温度３７℃、２５０ｒｐｍで震盪を示す。図５５Ｂ：本開示の遺伝子操作された細菌の上流および下流生産の非限定的方法の概略を示した図である。開始培養２（ＳＣ２）のパラメータ：ＳＣ１の１／１００希釈、期間１．５時間、温度３７℃、２５０ｒｐｍで震盪を示す。図５５Ｃ：本開示の遺伝子操作された細菌の上流および下流生産の非限定的方法の概略を示した図である。生産用バイオリアクターのパラメータ：接種−ＳＣ２、温度３７℃、ｐＨ設定７．００、ｐＨ不感帯０．０５、溶解酸素設定点５０％、溶解酸素カスケード撹拌／ガスＦＬＯ、撹拌限界３００〜１２００ｒｐｍ、ガスＦＬＯ限界１分当たり０．５〜２０標準リットル、期間２４時間を示す。図５５Ｄ：本開示の遺伝子操作された細菌の上流および下流生産の非限定的方法の概略を示した図である。収集のパラメータ：速度４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離、洗浄１×１０％グリセロール／ＰＢＳ、遠心分離、１０％グリセロール／ＰＢＳに再懸濁を示す。図５５Ｅ：本開示の遺伝子操作された細菌の上流および下流生産の非限定的方法の概略を示した図である。バイアル充填／貯蔵のパラメータ：１〜２ｍＬずつ分注、−８０℃を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４８】
さらに構築物を含む遺伝子操作された細菌
ＰＭＥ分泌用の構築物は、表６７に示したように作製した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４９】
【表５７−１】
2018515106.tif 000189
【表５７−２】
2018515106.tif 000190
【表５７−３】
2018515106.tif 000191
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2018515106.tif 000192
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４４Ｃ
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
2018515106.tif 000193
2018515106.tif 000194
2018515106.tif 000195
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