(57)【要約】本発明は、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する抗体および抗体の抗原結合性断片、およびこれを使用する方法を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、ＬＥＰＲに結合し、ＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する抗体および抗体の抗原結合性断片を含む。他の実施形態では、本発明は、ＬＥＰＲに結合し、抗原に対するＬＥＰＲの感作を増強する抗体および抗体の抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、本発明は、レプチンの存在および非存在下でＬＥＰＲに結合する抗体および抗体の抗原結合性断片を含む。本発明の抗体および抗原結合性断片は、リポジストロフィー、ならびにレプチン欠損またはレプチン耐性に関連する、またはそれによって引き起こされる他の疾患および障害の処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合し、ＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
（ｉ）表面プラズモン共鳴によって測定した場合に約１５０ｎＭ未満のＫＤで２５℃にて単量体ヒトＬＥＰＲに結合する；
（ｉｉ）表面プラズモン共鳴によって測定した場合に約１分超のｔ１／２で２５℃にて単量体ヒトＬＥＰＲに結合する；
（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴によって測定した場合に約５ｎＭ未満のＫＤで２５℃にて二量体ヒトＬＥＰＲに結合する；
（ｉｖ）表面プラズモン共鳴によって測定した場合に約１５分超のｔ１／２で２５℃にて二量体ヒトＬＥＰＲに結合する；
（ｖ）ヒトレプチンと複合体形成したヒトＬＥＰＲに結合する；
（ｖｉ）ＬＥＰＲ：レプチン相互作用を遮断しない；
（ｖｉｉ）ヒトレプチンの存在および非存在下で細胞表面発現ＬＥＰＲに結合する；および
（ｖｉｉｉ）細胞に基づくレポーターアッセイにおいて約９０ｐＭ未満のＥＣ５０でＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する
からなる群より選択される１つまたは複数の性質を呈する、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
レプチンに比べ少なくとも５０％の有効性で、細胞に基づくレポーターアッセイにおいてＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する、請求項１または２に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
レプチンに比べ少なくとも７０％の有効性で、細胞に基づくレポーターアッセイにおいてＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する、請求項３に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合し、（ａ）配列番号２、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号７４、または配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｂ）配列番号１０または配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
配列番号２／１０、１８／１０、２６／１０、３４／１０、４２／１０、５０／１０、５８／６６、７４／６６、および８２／６６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む、請求項５に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
配列番号２／１０、１８／１０、２６／１０、３４／１０、４２／１０、５０／１０、５８／６６、７４／６６、および８２／６６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項５または６に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
ＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する、請求項７に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
配列番号２／１０、１８／１０、２６／１０、３４／１０、４２／１０、５０／１０、５８／６６、７４／６６および８２／６６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と、ＬＥＰＲへの結合について競合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
配列番号２／１０、１８／１０、２６／１０、３４／１０、４２／１０、５０／１０、５８／６６、７４／６６および８２／６６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じＬＥＰＲ上のエピトープに結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
レプチン欠損またはレプチン耐性に関連した、またはそれによって引き起こされる疾患または状態を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に請求項１１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
レプチン欠損またはレプチン耐性に関連した、またはそれによって引き起こされる前記疾患または前記状態が、リポジストロフィー、肥満、メタボリック症候群、食事誘発性食物渇望、機能性視床下部性無月経、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、インスリン受容体における変異に起因する重度インスリン耐性、アルツハイマー病、レプチン欠損、レプチン耐性、妖精症／ドナヒュー症候群、およびラブソン−メンデンホール症候群からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
患者におけるリポジストロフィー状態を処置するための方法であって、それを必要とする患者に請求項１１に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記リポジストロフィー状態が、先天性全身性リポジストロフィー、後天性全身性リポジストロフィー、家族性部分的リポジストロフィー、後天性部分的リポジストロフィー、遠心性腹部リポジストロフィー、環状脂肪組織萎縮症、局在性リポジストロフィー、およびＨＩＶ関連リポジストロフィーからなる群より選択される、方法。
【請求項１５】
シグナル伝達欠損ＬＥＰＲ変異またはシグナル伝達障害ＬＥＰＲ変異に関連した、またはそれによって引き起こされる疾患または状態を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に請求項１１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記シグナル伝達欠損ＬＥＰＲ変異または前記シグナル伝達障害ＬＥＰＲ変異が、ＬＥＰＲ−Ａ４０９ＥまたはＬＥＰＲ−Ｐ３１６Ｔである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
シグナル伝達欠損ＬＥＰＲ変異またはシグナル伝達障害ＬＥＰＲ変異に関連した、またはそれによって引き起こされる前記疾患または前記状態が、早期発症肥満である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体に第２の治療剤を投与することをさらに含み、前記第２の治療剤が、組換えヒトレプチン、ＰＣＳＫ９インヒビター、スタチン、エゼチミベ、インスリン、インスリン改変体、インスリン分泌促進物質、メトホルミン、スルホニル尿素、ナトリウムグルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）インヒビター、ＧＬＰ−１アゴニスト／類似体、グルカゴン（ＧＣＧ）インヒビター、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）インヒビター、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）インヒビター、フェンテルミン、オーリスタット、トピラメート、ブプロピオン、トピラメート／フェンテルミン、ブプロピオン／ナルトレキソン、ブプロピオン／ゾニサミド、プラムリンチド／メトレレプチン、ロルカセリン、セチリスタット、テソフェンシン、およびベルネペリットからなる群より選択される、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合し、抗原に対してＬＥＰＲを感作させる、単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２０】
ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合し、（ａ）配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号７４、または配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｂ）配列番号１０または配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む、請求項１９に記載の単離抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項２１】
配列番号２６／１０、３４／１０、４２／１０、５０／１０、５８／６６、７４／６６、および８２／６６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む、請求項２０に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２２】
ヒトＬＥＰＲを特異的に結合し、水素／重水素交換によって決定した場合に配列番号１１３のアミノ酸１６２〜１６９および配列番号１１３のアミノ酸１７０〜１８１と相互作用する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２３】
それぞれ、配列番号４、６、および８ならびに配列番号１２、１４、および１６からなる群より選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ならびにＬＣＤＲ２ドメインを含む、請求項２２に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項２４】
配列番号２／１０からなるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項２２に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する抗体および抗体の抗原結合性断片、ならびにこれらの抗体を使用する治療法および診断法に関する。
【０００２】
配列表
配列表の公式コピーは、２０１６＿１０＿１１＿１０１７８ＷＯ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ａｓ＿Ｆｉｌｅｄ＿ＳＴ２５．ＴＸＴのファイル名、２０１６年１０月１１日の作成日、約９９．６キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に明細書と同時的に提出されている。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれている配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
レプチンは、脂肪組織によって主に発現されるポリペプチドホルモンであり、代謝の調節、エネルギー収支、および食物摂取に関与する。レプチン活性は、レプチン受容体との相互作用、およびこの受容体を通じたシグナル伝達によって媒介される。レプチン受容体（「ＬＥＰＲ」、「ＷＳＸ」、「ＯＢ受容体」、「ＯＢ−Ｒ」、および「ＣＤ２９５」としても公知）は、大きい（８１８アミノ酸）細胞外ドメインを有するクラスＩサイトカイン受容体ファミリーの一回膜貫通型受容体である。レプチン欠損、レプチン耐性、ならびにある特定のＬＥＰＲシグナル伝達欠損／シグナル伝達障害変異は、肥満、２型糖尿病、脂質異常症、リポジストロフィー、肝臓脂肪症、非アルコール性およびアルコール性脂肪肝疾患、重度インスリン耐性、妖精症／ドナヒュー症候群、ラブソン−メンデンホール症候群、ならびに関連合併症に関連している。レプチン耐性、レプチン欠損、および低レプチン血症（ｈｙｐｏｌｅｐｔｉｎｅｍｉａ）（例えば、リポジストロフィー）に対処する治療手法は、罹患した個体への追加のレプチンまたはレプチン類似体の送達に主に注力されてきた。しかし、このような手法は、特にレプチン耐性個体において限られた効力を一般に示しており、有害な副作用が頻繁に付随する。よって、レプチン耐性、およびレプチン欠損または低レプチン血症に関連した他の状態を処置するための代替手法の必要性が当技術分野において存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する抗体およびこれらの抗原結合性断片を提供する。本発明の抗体は、アゴニスト抗体であり；すなわち、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体がＬＥＰＲに結合すると、とりわけ、細胞内のレプチン受容体シグナル伝達が活性化する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＬＥＰＲへの結合についてレプチンと競合しない。本発明の抗体は、例えば、被験体におけるレプチンの通常の生物活性を模倣、置換、または補充するのに有用である。したがって、本発明の抗体および抗原結合性断片は、レプチン耐性およびレプチン欠損に関連した疾患および障害の治療的処置において有用である。
【０００５】
本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）の場合もあり、抗原結合性部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖ断片）だけを含む場合もあり、機能性に影響を及ぼす、例えば、残留するエフェクター機能を消失させるように修飾することができる（Ｒｅｄｄｙら、２０００年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４巻：１９２５〜１９３３頁）。
【０００６】
本発明の例示的な抗ＬＥＰＲ抗体は、本明細書で表１および２に列挙されている。表１は、例示的な抗ＬＥＰＲ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を示す。表２は、例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を示す。
【０００７】
本発明は、表１に列挙したＨＣＶＲのアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
【０００８】
本発明はまた、表１に列挙したＬＣＶＲのアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
【０００９】
本発明はまた、ＬＥＰＲに特異的に結合し、表１に列挙したＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかと対になった表１に列挙したＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含むＨＣＶＲとＬＣＶＲとのアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む抗体またはこれらの抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表１に列挙した例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体またはこれらの抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０、１８／１０、２６／１０、３４／１０、４２／１０、５０／１０、５８／６６、７４／６６、および８２／６６からなる群より選択される。
【００１０】
本発明はまた、表１に列挙したＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、またはこれらと実質的に類似する配列であって、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
【００１１】
本発明はまた、表１に列挙したＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、またはこれらと実質的に類似する配列であって、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
【００１２】
本発明はまた、表１に列挙したＨＣＤＲ３のアミノ酸配列、またはこれらと実質的に類似する配列であって、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
【００１３】
本発明はまた、表１に列挙したＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、またはこれらと実質的に類似する配列であって、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
【００１４】
本発明はまた、表１に列挙したＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、またはこれらと実質的に類似する配列であって、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
【００１５】
本発明はまた、表１に列挙したＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、またはこれらと実質的に類似する配列であって、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＬＥＰＲに特異的に結合し、表１に列挙したＬＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかと対になった表１に列挙したＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかを含むＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３とのアミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはこれらの抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表１に列挙した例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む抗体またはこれらの抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号８／１６、２４／１６、３２／１６、４０／１６、４８／１６、５６／１６、６４／７２、８０／７２、および８８／７２からなる群より選択される。
【００１７】
本発明は、ＬＥＰＲに特異的に結合し、表１に列挙した例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかの中に含有される６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のセットを含む抗体またはこれらの抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号４、６、８、１２、１４、１６；２０、２２、２４、１２、１４、１６；２８、３０、３２、１２、１４、１６；３６、３８、４０、１２、１４、１６；４４、４６、４８、１２、１４、１６；５２、５４、５６、１２、１４、１６；６０、６２、６４、６８、７０、７２；７６、７８、８０、６８、７０、７２；および８４、８６、８８、６８、７０、７２からなる群より選択される。
【００１８】
関連した実施形態では、本発明は、ＬＥＰＲに特異的に結合し、表１に列挙した例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかによって規定されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の中に含有される６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のセットを含む抗体またはこれらの抗原結合性断片を提供する。例えば、本発明は、ＬＥＰＲに特異的に結合し、配列番号２／１０、１８／１０、２６／１０、３４／１０、４２／１０、５０／１０、５８／６６、７４／６６、および８２／６６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の中に含有されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む抗体またはこれらの抗原結合性断片を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列中のＣＤＲを同定するための方法および技法は、当技術分野で周知であり、本明細書に開示の指定されたＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列中のＣＤＲを同定するのに使用することができる。ＣＤＲの境界を同定するのに使用することができる例示的な慣習としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義がある。一般論として、Ｋａｂａｔ定義は、配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の場所に基づき、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの手法間の妥協案である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７３巻：９２７〜９４８頁（１９９７年）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻：９２６８〜９２７２頁（１９８９年）を参照。抗体内のＣＤＲ配列を同定するのに、公共データベースも利用可能である。
【００１９】
本発明は、抗ＬＥＰＲ抗体またはこれらの部分をコードする核酸分子も提供する。例えば、本発明は、表１に列挙したＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供するが、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙したＨＣＶＲ核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明はまた、表１に列挙したＬＣＶＲのアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子も提供するが、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙したＬＣＶＲの核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
本発明はまた、表１に列挙したＨＣＤＲ１のアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子も提供するが、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙したＨＣＤＲ１の核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
本発明はまた、表１に列挙したＨＣＤＲ２のアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子も提供するが、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙したＨＣＤＲ２の核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明はまた、表１に列挙したＨＣＤＲ３のアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子も提供するが、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙したＨＣＤＲ３の核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
本発明はまた、表１に列挙したＬＣＤＲ１のアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子も提供するが、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙したＬＣＤＲ１の核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
本発明はまた、表１に列挙したＬＣＤＲ２のアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子も提供するが、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙したＬＣＤＲ２の核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
本発明はまた、表１に列挙したＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子も提供するが、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙したＬＣＤＲ３の核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子であって、ＨＣＶＲが、３つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）のセットを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットが、表１に列挙した、例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のうちのいずれかにより規定される核酸分子も提供する。
【００２８】
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子であって、ＬＣＶＲが、３つのＣＤＲ（すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）のセットを含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットが、表１に列挙した、例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のうちのいずれかにより規定される核酸分子も提供する。
【００２９】
本発明はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子であって、ＨＣＶＲが、表１に列挙したＨＣＶＲのアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲが、表１に列挙したＬＣＶＲのアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙したＨＣＶＲの核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、および表２に列挙したＬＣＶＲの核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらと実質的に類似する配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。本発明のこの態様に従う、ある特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのいずれも、表１に列挙した、同じ抗ＬＥＰＲ抗体に由来する。
【００３０】
本発明は、抗ＬＥＰＲ抗体の重または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターも提供する。例えば、本発明は、上述した核酸分子、すなわち、表１に示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲ配列のうちのいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。このようなベクターが導入された宿主細胞、ならびに抗体または抗体断片の産生を許容する条件下で宿主細胞を培養することによって抗体またはこれらの部分を産生させる方法、ならびにそのように産生された抗体および抗体断片を回収する方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
別の態様では、本発明は、ＬＥＰＲに特異的に結合する組換えヒト抗体またはその断片、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。関連した態様では、本発明は、抗ＬＥＰＲ抗体と第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＬＥＰＲ抗体と有利には組み合わされる任意の薬剤である。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、抗ＬＥＰＲ抗体または本発明の抗体の抗原結合部分を使用してＬＥＰＲシグナル伝達を増強または刺激するための治療法を提供する。本発明のこの態様による治療法は、本発明の抗体または抗体の抗原結合性断片を含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。処置される障害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ＬＥＰＲシグナル伝達を刺激もしくは活性化することによって、またはレプチンの天然の活性を別段に模倣することによって改善、好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、阻害、または防止される任意の疾患または状態である。
【００３３】
他の実施形態は、次の詳細な説明を再検討することにより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡ（４５０ｎｍにおける吸光度）によって測定した場合の、漸増濃度の試験抗ＬＥＰＲ抗体または対照分子の存在下での二量体ヒトＬＥＰＲのヒトレプチンへの結合を表す。
【００３５】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、野生型ＬＥＰＲ（円）、シグナル伝達欠損ＬＥＰＲ変異体（Ａ４０９Ｅ、正方形）、またはシグナル伝達障害ＬＥＰＲ変異体（Ｐ３１６Ｔ、三角形）を発現するＨＥＫ２９３細胞内のＬＥＰＲシグナル伝達の程度を例示する。ＬＥＰＲシグナル伝達は、漸増濃度のレプチン（図２Ａ）、Ｈ４Ｈ１６６５０（図２Ｂ）、またはＨ４Ｈ１６６７９（図２Ｃ）で処置された細胞から調製されるウェスタンブロットからのデンシトメトリーによって測定されるｐＳＴＡＴ３−Ｙ７０５／ＳＴＡＴ３の比として表現される。
【００３６】
【図３】図３は、３ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、または３ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１６６５０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１６６７９Ｐ２、Ｈ４Ｈ１７３１９Ｐ２、もしくはＨ４Ｈ１７３２１Ｐ２から選択されるＬＥＰＲ抗体のいずれかを投薬されたレプチン欠損マウスの日々の食物摂取量の平均を示す。
【００３７】
【図４】図４は、３ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、または３ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１６６５０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１６６７９Ｐ２、Ｈ４Ｈ１７３１９Ｐ２、もしくはＨ４Ｈ１７３２１Ｐ２から選択されるＬＥＰＲ抗体のいずれかを投薬されたマウスの体重の平均パーセント変化を示す。
【００３８】
【図５】図５は、平均±ＳＥＭとして表現される、抗体処置の１日前（陰影の無いバー）および６日後（陰影のあるバー）にμＣＴによって定量化された各抗体処置群における動物の平均脂肪量を示す。
【００３９】
【図６】図６は、Ｈ４Ｈ１８４８２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４８７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４９２Ｐ２、またはアイソタイプ対照から選択される３０ｍｇ／ｋｇの抗体を供給されたマウスの体重のパーセント変化を示す。
【００４０】
【図７】図７Ａは、抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１８４８２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４８７Ｐ２、またはＨ４Ｈ１８４９２Ｐ２を投薬する前のマウスの脂肪量を示す。図７Ｂは、３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４８２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４８７Ｐ２、またはＨ４Ｈ１８４９２Ｐ２で処置されたマウスの脂肪量を示す。
【００４１】
【図８】図８は、試験した抗ＬＥＰＲ抗体が、ＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−ｌｕｃ／Ｍｆ  ＬＥＰＲ細胞株内のサル（Ｍｆ）ＬＥＰＲを活性化したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明について記載する前に、このような方法および条件は、変動しうるので、本発明は、記載される特定の方法および実験条件に限定されるものではないことを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態だけについて記載することを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
【００４３】
別段に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書では、用語「約」は、特定の述べた数値を参照して使用されるとき、値が、述べた値から１％以下変動し得ることを意味する。例えば、本明細書では、表現「約１００」は、９９および１０１ならびに間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００４４】
本明細書に記載のものと類似するまたは等価な任意の方法および材料を、本発明を実施または試験するのに使用することができるが、好適な方法および材料を次に記載する。
【００４５】
定義
表現「レプチン受容体」、「ＬＥＰＲ」などは、本明細書では、配列番号１１３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ４８３５７も参照）に示したアミノ酸配列を含むヒトレプチン受容体を指す。科学文献で使用されるＬＥＰＲの代替の名称には、「ＯＢ受容体」、「ＯＢ−Ｒ」、および「ＣＤ２９５」が含まれる。ＬＥＰＲは、「ＷＳＸ」とも呼ばれる（例えば、米国特許第７，５２４，９３７号を参照）。表現「ＬＥＰＲ」は、単量体および多量体（例えば、二量体）ＬＥＰＲ分子の両方を含む。本明細書では、表現「単量体ヒトＬＥＰＲ」は、いかなる多量体化ドメインも含有または所有せず、かつ別のＬＥＰＲ分子と直接物理的に接続していない単一ＬＥＰＲ分子として通常の条件下で存在するＬＥＰＲタンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体ＬＥＰＲ分子は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む「ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ」と本明細書で呼ばれる分子である（例えば、本明細書の実施例３を参照）。本明細書では、表現「二量体ヒトＬＥＰＲ」は、リンカー、共有結合、非共有結合によって、または抗体Ｆｃドメインなどの多量体化ドメインによって互いに接続された２つのＬＥＰＲ分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体ＬＥＰＲ分子は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む「ｈＬＥＰＲ．ｍＦｃ」と本明細書で呼ばれる分子であり（例えば、本明細書の実施例３を参照）、または配列番号１１６のアミノ酸配列を含む「ｈＬＥＰＲ．ｈＦｃ」と本明細書で呼ばれる分子である。本明細書では、「抗ＬＥＰＲ抗体」、「ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体」、「ＬＥＰＲ特異的結合タンパク質」などの表現は、別段に具体的に示されていない限り、全長ヒトＬＥＰＲ、単量体ヒトＬＥＰＲ、二量体ヒトＬＥＰＲ、またはＬＥＰＲ細胞外ドメインを含むかもしくはそれからなる他の構築物に結合する分子を指す。
【００４６】
本明細書でのタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質断片へのすべての言及は、非ヒト種由来であると明示的に指定されていない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質断片のヒトバージョンを指すように意図されている。よって、表現「ＬＥＰＲ」は、非ヒト種、例えば、「マウスＬＥＰＲ」、「サルＬＥＰＲ」など由来であると指定されていない限り、ヒトＬＥＰＲを意味する。
【００４７】
本明細書では、表現「細胞表面発現ＬＥＰＲ」は、１種もしくは複数のＬＥＰＲタンパク質またはその細胞外ドメインであって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の表面に発現され、その結果、ＬＥＰＲタンパク質の少なくとも一部分が細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合部分に接近可能である、ＬＥＰＲタンパク質またはその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面発現ＬＥＰＲ」は、通常（例えば、天然または野生型状態において）、ＬＥＰＲタンパク質を発現する細胞の表面に発現されるＬＥＰＲタンパク質を含み得、またはそれからなり得る。代替として、「細胞表面発現ＬＥＰＲ」は、通常、その表面にヒトＬＥＰＲを発現しないが、その表面にＬＥＰＲを発現するように人工的に操作された細胞の表面に発現されるＬＥＰＲタンパク質を含み得、またはそれからなり得る。
【００４８】
本明細書では、「抗ＬＥＰＲ抗体」または「ヒトレプチン受容体に結合する抗体」などの表現は、単一特異性を有する一価抗体、ならびにＬＥＰＲに結合する第１のアームおよび第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含み、抗ＬＥＰＲアームは、本明細書の表１に示したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のうちのいずれかを含む、二重特異性抗体の両方を含む。
【００４９】
用語「抗体」は、本明細書では、特定抗原（例えば、ＬＥＰＲ）に特異的に結合し、またはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」は、４本のポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互接続された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨと本明細書で省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲまたはＶＬと本明細書で省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域とともに散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に並べられた３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。本発明の異なる実施形態では、抗ＬＥＰＲ抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列配列と同一である場合があり、または天然もしくは人工的に改変されている場合がある。アミノ酸コンセンサス配列は、２個またはそれよりも多いＣＤＲに並行分析に基づいて定義され得る。
【００５０】
用語「抗体」は、本明細書では、完全抗体分子の抗原結合性断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性断片」などの用語は、本明細書では、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合性断片は、例えば、任意の適当な標準技法、例えば、タンパク質消化、または抗体可変ドメインおよび任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）および発現を伴う組み換え遺伝子操作技法などを使用して完全抗体分子から導出することができる。このようなＤＮＡは、公知であり、かつ／または例えば、商業的供給元、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、または合成することができる。ＤＮＡは配列決定し、化学的に、または分子生物学技法を使用することによって操作して、例えば、１個または複数の可変および／もしくは定常ドメインを並べて適当な構成にし、またはコドンを導入し、システイン残基を作出し、アミノ酸を修飾し、付加し、もしくは欠失させることなどを行うことができる。
【００５１】
抗原結合性断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小限の認識ユニットがある。他の操作された分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなども、本明細書で使用する場合、表現「抗原結合性断片」内に包含される。
【００５２】
抗体の抗原結合性断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むことになる。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであり得、一般に、１つまたは複数のフレームワーク配列に隣接し、またはそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含むことになる。ＶＬドメインと付随したＶＨドメインを有する抗原結合性断片では、ＶＨおよびＶＬドメインは、任意の適当な配置内で互いに対して位置し得る。例えば、可変領域は、二量体であり得、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ二量体を含有し得る。代替として、抗体の抗原結合性断片は、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有し得る。
【００５３】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合的に連結した少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。非限定的な本発明の抗体の抗原結合性断片内に見出され得る可変および定常ドメインの例示的構成としては、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬがある。上記に列挙した例示的構成のいずれかを含む可変および定常ドメインの任意の構成において、可変および定常ドメインは、互いに直接連結されている場合があり、あるいは完全もしくは部分ヒンジまたはリンカー領域によって連結され得る。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子中の隣接する可変および／または定常ドメインとの間で可撓性または半可撓性連結をもたらす、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個またはそれよりも多い）のアミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合性断片は、互いに非共有結合性会合で上記に列挙した可変および定常ドメイン構成のいずれかの、かつ／または１つもしくは複数のモノマーＶＨもしくはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合による）ホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
【００５４】
完全抗体分子と同様に、抗原結合性断片は、単一特異性または多特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多特異性抗原結合性断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことになり、各可変ドメインは、別個の抗原に、または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示の例示的な二重特異性抗体形式を含めた任意の多特異性抗体形式を、当技術分野で利用可能な慣例的な技法を使用して本発明の抗体の抗原結合性断片の文脈において使用するのに適合させ得る。
【００５５】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、ヒト抗体である。用語「ヒト抗体」は、本明細書では、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むように意図されている。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３中でヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏで体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書では、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むように意図されていない。
【００５６】
本発明の抗体は、一部の実施形態では、組換えヒト抗体であり得る。用語「組換えヒト抗体」は、本明細書では、組換え手段によって調製、発現、作出、または単離されたすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞内にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを使用して発現される抗体（以下でさらに記載される）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体（以下でさらに記載される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離される抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２年）、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：６２８７〜６２９５頁を参照）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作出、もしくは単離される抗体などを含むように意図されている。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用されるとき、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異誘発）に付され、よって組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連する一方で、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然に存在しない場合がある配列である。
【００５７】
本発明は、例えば産生中に所望の抗体形態の収量を改善するのに望ましい場合がある、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３領域内で１つまたは複数の変異を有する抗体を包含する。
【００５８】
本発明の抗体は、単離抗体であり得る。「単離抗体」は、本明細書では、その天然環境の少なくとも１種の成分から同定および分離され、かつ／または回収された抗体を意味する。例えば、抗体が天然に存在し、または天然に産生される生物体の少なくとも１種の成分から、または組織もしくは細胞から分離または回収された抗体は、本発明の目的に関して「単離抗体」である。単離抗体は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体も含む。単離抗体は、少なくとも１つの精製または単離ステップに付された抗体である。ある特定の実施形態によれば、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００５９】
本発明は、抗体が由来した対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１個または複数のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含む本明細書に開示の抗ＬＥＰＲ抗体の改変体を含む。このような変異は、本明細書で開示されアミノ酸配列を、例えば、公表の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列の配列と比較することにより、たやすく確認することができる。本発明は、本明細書で開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する、抗体およびそれらの抗原結合性断片を含むが、この場合、１または複数のフレームワーク領域内および／またはＣＤＲ領域内の、１または複数のアミノ酸を、抗体が由来した生殖細胞系列の配列の対応する残基、または別のヒト生殖細胞系列の配列の対応する残基、または対応する生殖細胞系列残基の保存的アミノ酸置換（本明細書では、このような配列変化をまとめて、「生殖細胞系列変異」と称する）に照らして変異させる。当業者は、本明細書で開示される、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列から始めて、１カ所または複数カ所の個々の生殖細胞系列変異またはそれらの組み合わせを含む、多数の抗体および抗原結合性断片を容易に作製することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基の全てを、抗体が由来した、元の生殖細胞系列の配列内で見出される残基へと復帰変異させる。他の実施形態では、ある特定の残基だけを、元の生殖細胞系列の配列へと復帰変異させる、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内、もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出される残基だけを変異させるか、またはＣＤＲ１内、ＣＤＲ２内、もしくはＣＤＲ３内に見出される残基だけを変異させる。他の実施形態では、フレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基のうちの１または複数を、異なる生殖細胞系列の配列（すなわち、抗体が元来由来した生殖細胞系列の配列と異なる、生殖細胞系列の配列）の対応する残基に変異させる。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク領域内および／またはＣＤＲ領域内の、２カ所またはこれを超える生殖細胞系列変異の任意の組み合わせを含有することが可能であり、この場合、例えば、ある特定の個々の残基を、特定の生殖細胞系列の配列の対応する残基に変異させる一方で、元の生殖細胞系列の配列と異なる、ある特定の他の残基を維持するか、または異なる生殖細胞系列の配列の対応する残基に変異させる。１カ所または複数カ所の生殖細胞系列変異を含有する抗体および抗原結合性断片が得られたら、これらを、結合特異性の改善、結合アフィニティーの増大、アンタゴニスト性またはアゴニスト性の生物学的特性（場合により）の改善または増強、免疫原性の低減など、１または複数の所望の特性について容易に調べることができる。この一般的な方式で得られた、抗体および抗原結合性断片は、本発明の中に包含される。
【００６０】
本発明は、本明細書に開示の例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかにおいて見出される１つまたは複数の可変ドメインまたはＣＤＲアミノ酸配列と実質的に類似するまたは実質的に同一であるアミノ酸配列を含む抗ＬＥＰＲ抗体およびこれらの抗原結合性断片を含む。
【００６１】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似する」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントされたとき、少なくとも９５％配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、１個のアミノ酸残基が類似する化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変化させない。２つまたはそれよりも多いアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合では、パーセント配列同一性または類似度は、上向きに調整されて置換の保存的特質について補正される場合がある。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２４巻：３０７〜３３１頁を参照。類似する化学的性質を伴った側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸があり、（７）硫黄含有側鎖は、システインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。代替として、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１４４３〜１４４５頁において開示されたＰＡＭ２５０対数尤度行列中に正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列中に負でない値を有する任意の変化である。
【００６２】
ポリペプチドの配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、配列分析ソフトウェアを使用して典型的には測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を使用して類似する配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、ＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有し、これらのプログラムは、デフォルトパラメータを用いて使用されて異なる種の生物体由来の、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の相同性ポリペプチドなどの密接に関連しているポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照。ポリペプチド配列は、デフォルトまたは推奨パラメータを使用するＦＡＳＴＡ、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最良の重複領域についての、アラインメントおよびパーセント配列同一性をもたらす（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００年）、上記）。本発明の配列を、異なる生物体由来の多数の配列を含有するするデータベースと比較する場合の別の好適なアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用するコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜４０２頁を参照。
【００６３】
Ｆｃ改変体を含む抗ＬＥＰＲ抗体
本発明のある特定の実施形態によれば、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減少させる１個または複数の変異を含むＦｃドメインを含む抗ＬＥＰＲ抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域内で変異を含む抗ＬＥＰＲ抗体を含み、変異により、酸性環境中（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム中）でＦｃドメインのＦｃＲｎへのアフィニティーが増大する。このような変異は、動物に投与されるとき、抗体の血清半減期を増大させることができる。このようなＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）；２５０位および４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位（例えば、ＳもしくはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）での修飾；または４２８位および／もしく４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦもしくはＹ）での修飾；または２５０位および／もしくは４２８位での修飾；または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位での修飾がある。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）、および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）修飾；２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
【００６４】
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群より選択される変異の１つまたは複数の対または群を含むＦｃドメインを含む抗ＬＥＰＲ抗体を含む。上記Ｆｃドメイン変異のすべての可能な組み合わせ、および本明細書に開示の抗体可変ドメイン内の他の変異は、本発明の範囲内に企図されている。
【００６５】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、エフェクター機能が低減された修飾Ｆｃドメインを含み得る。本明細書では、「エフェクター機能が低減された修飾Ｆｃドメイン」は、野生型の天然に存在するＦｃドメインと比べて、修飾、変異、短縮などされており、その結果、修飾Ｆｃを含む分子が、Ｆｃ部分の野生型の天然に存在するバージョンを含む対照薬分子と比べて細胞殺傷（例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ）、補体活性化、食作用、およびオプソニン化からなる群より選択される少なくとも１つの効果の重大性または程度の低減を呈する免疫グロブリンの任意のＦｃ部分を意味する。ある特定の実施形態では、「エフェクター機能が低減された修飾Ｆｃドメイン」は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）への結合が低減または減弱されたＦｃドメインである。
【００６６】
本発明のある特定の実施形態では、修飾Ｆｃドメインは、ヒンジ領域内に置換を含む改変体ＩｇＧ１  Ｆｃまたは改変体ＩｇＧ４  Ｆｃである。例えば、本発明との関連で使用するための修飾Ｆｃは、改変体ＩｇＧ１  Ｆｃを含み得、ＩｇＧ１  Ｆｃヒンジ領域の少なくとも１つのアミノ酸は、ＩｇＧ２  Ｆｃヒンジ領域由来の対応するアミノ酸と置き換えられている。代替として、本発明との関連で使用するための修飾Ｆｃは、改変体ＩｇＧ４  Ｆｃを含み得、ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ領域の少なくとも１つのアミノ酸は、ＩｇＧ２  Ｆｃヒンジ領域由来の対応するアミノ酸と置き換えられている。本発明との関連で使用することができる非限定的かつ例示的な修飾Ｆｃ領域は、米国特許出願公開第２０１４／０２４３５０４号に示されている。
【００６７】
本発明との関連で使用することができる他の修飾ＦｃドメインおよびＦｃ修飾は、ＵＳ２０１４／０１７１６２３；ＵＳ８，６９７，３９６；ＵＳ２０１４／０１３４１６２；ＷＯ２０１４／０４３３６１に示された修飾のいずれかを含む。本明細書に記載の修飾Ｆｃドメインを含む抗体または他の抗原結合性融合タンパク質を構築する方法は、当技術分野で公知である。
【００６８】
抗体の生物学的特性
本発明は、ヒトＬＥＰＲに結合し、ＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する抗体およびこれらの抗原結合性断片を含む。このような抗体は、「アゴニスト抗体」と本明細書で呼ばれる場合がある。本発明との関連で、「ＬＥＰＲシグナル伝達の活性化」は、通常、レプチンとＬＥＰＲを発現する細胞内のＬＥＰＲとの相互作用から生じる細胞内効果の刺激を意味する。ある特定の実施形態では、「ＬＥＰＲシグナル伝達の活性化」は、ＳＴＡＴ３の転写活性化を意味し、これは、例えば、レポーター細胞株内で発現されるＳＴＡＴ３の標識化バージョンを使用して、ＳＴＡＴ３活性を直接的または間接的に測定または同定することができる任意の方法を使用して検出することができる。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例７に規定された細胞に基づくアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、細胞に基づくレポーターアッセイにおいてＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する抗体およびこれらの抗原結合性断片を含む。ＬＥＰＲ活性化を検出する細胞に基づくレポーターアッセイ、例えば、本明細書の実施例７に示されたアッセイなどは、ＥＣ５０値（すなわち、最大半量のシグナル伝達を生じさせるのに要求される抗体濃度）および／またはレプチンの存在下で観察される最大シグナル伝達のパーセンテージの観点から表現され得る検出可能シグナルを生成することができる。本発明のある特定の例示的な実施形態では、例えば、本明細書の実施例７に規定されたアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、細胞に基づくレポーターアッセイにおいて約１２．０ｎＭ未満のＥＣ５０値を伴ってＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する抗ＬＥＰＲ抗体が提供されている。本発明のある特定の例示的な実施形態では、例えば、本明細書の実施例７に規定されたアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、細胞に基づくレポーターアッセイにおいて約６５％超のレプチンシグナル伝達と比べた最大パーセント活性化を伴ってＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する抗ＬＥＰＲ抗体が提供されている。
【００６９】
本発明は、高アフィニティーで単量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗体およびこれらの抗原結合性断片を含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例３に規定されたアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、２５℃または３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１５０ｎＭ未満のＫＤで単量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ、配列番号１１４）に結合する抗ＬＥＰＲ抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、例えば、本明細書の実施例３に規定されたアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１５０ｎＭ未満、約１４０ｎＭ未満、約１３０ｎＭ未満、約１２０ｎＭ未満、約１１０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、または約３００ｐＭ未満のＫＤで２５℃にて単量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供されている。
【００７０】
本発明は、例えば、本明細書の実施例３に規定されたアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、２５℃または３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約５０分超の解離半減期（ｔ１／２）で単量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ、配列番号１１４）に結合する抗体およびこれらの抗原結合性断片も含む。ある特定の実施形態によれば、本明細書の実施例３に規定されたアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約５０分超、約５５分超、約６０分超、約６５分超、またはそれより長いｔ１／２で、２５℃で単量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供されている。
【００７１】
本発明は、高アフィニティーで二量体ヒトＬＥＰＲ（例えばｈＬＥＰＲ．ｍＦｃ、配列番号１１５）に結合する抗体およびこれらの抗原結合性断片も含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例３に規定されたアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、２５℃または３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１．５ｎＭ未満のＫＤで二量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、本明細書の実施例３に規定されたアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１５０ｎＭ未満、約１３０ｎＭ未満、約１１０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫＤで２５℃にて二量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供されている。
【００７２】
本発明は、例えば、本明細書の実施例３に規定されたアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、２５℃または３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１０分超の解離半減期（ｔ１／２）で二量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍＦｃ、配列番号１１５）に結合する抗体およびこれらの抗原結合性断片も含む。ある特定の実施形態によれば、本明細書の実施例３に規定されたアッセイ形式、または実質的に類似するアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１０分超、約１５分超、約２０分超、約２５分超、約３０分超、約４０分超、約５０分超、約６０分超、約７０分超、またはそれより長いｔ１／２で、２５℃で二量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供されている。
【００７３】
本発明は、ヒトレプチンと複合体形成したＬＥＰＲ（「ヒトレプチンと複合体形成したＬＥＰＲ」は、表現「レプチン：ＬＥＰＲ」によって表される場合もある）に結合する抗体およびこれらの抗原結合性断片も含む。例えば、本発明は、ｈＬＥＰＲおよびヒトレプチンを含む予め形成された複合体に結合することができる抗体およびこれらの抗原結合性断片を含む。すなわち、ある特定の実施形態によれば、抗ＬＥＰＲ抗体とＬＥＰＲとの相互作用は、ＬＥＰＲと複合体形成したレプチンの存在によって阻害されず；同様に、レプチンとＬＥＰＲとの相互作用も、本発明のこの態様によれば、抗ＬＥＰＲ抗体の存在によって阻害されない。抗体またはその抗原結合性断片がヒトレプチンと複合体形成したＬＥＰＲに結合するか否かを決定する例示的なアッセイ形式は、本明細書の実施例４に示されている。
【００７４】
同様に、本発明は、ＬＥＰＲに結合し、ＬＥＰＲ：レプチン相互作用を遮断しない抗体およびこれらの抗原結合性断片も含む。例えば、本発明は、ＬＥＰＲに結合し、それにより抗体：ＬＥＰＲ複合体を生じさせることができる抗体およびこれらの抗原結合性断片を含み、得られる抗体：ＬＥＰＲ複合体は、レプチンと相互作用して抗体、ＬＥＰＲ、およびレプチンを含む三者複合体を生成することができる。抗体またはその抗原結合性断片がＬＥＰＲとレプチンとの相互作用を遮断または妨害しない様式でＬＥＰＲに結合することができるか否かを決定する例示的なアッセイ形式は、本明細書の実施例５に示されている。
【００７５】
本発明は、ヒトレプチンの存在下かつ／または非存在下で細胞表面発現ＬＥＰＲに結合する抗体及びこれらの抗原結合性断片も含む。細胞表面発現ＬＥＰＲは、天然に、または操作された細胞株内で、細胞表面に発現され、その結果、抗体またはその抗原結合性断片がＬＥＰＲ分子に結合することができるＬＥＰＲまたはその部分（例えば、ＬＥＰＲの細胞外部分）を意味する。ある特定の実施形態では、細胞表面発現ＬＥＰＲは、タグまたはアンカー（例えば、本明細書の実施例６に例示されたＧＰＩアンカー）を介して細胞に接続されたＬＥＰＲの細胞外ドメインを含む組換え複合体を含む。本発明のこの態様によれば、レプチンの非存在下で細胞表面発現ＬＥＰＲに結合することができ、レプチンの存在下（すなわち、レプチンが細胞表面発現レプチンに結合することができる環境下）でも細胞表面発現ＬＥＰＲに結合することができる抗体が提供されている。すなわち、ある特定の実施形態によれば、抗ＬＥＰＲ抗体と細胞表面発現ＬＥＰＲとの相互作用は、細胞表面発現ＬＥＰＲと複合体形成したレプチンの存在によって阻害されない。本発明のこの態様による抗体は、細胞表面で、抗体、細胞表面発現ＬＥＰＲ、およびレプチンを含む三者複合体を形成することができる。抗体またはその抗原結合性断片が、ヒトレプチンの存在および非存在下で細胞表面発現ＬＥＰＲに結合することができるか否かを決定する例示的なアッセイ形式は、本明細書の実施例６に示されている。
【００７６】
本発明の抗体は、上述の生物学的特性の１つもしくは複数、またはこれらの任意の組み合わせを有し得る。本発明の抗体の生物学的特性の上記リストは、徹底的であるように意図されていない。本発明の抗体の他の生物学的特性は、本明細書の実施例を含む本開示を再検討することにより当業者に明らかとなる。
【００７７】
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明は、１個または複数の保存的置換を有する本明細書に開示のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかの改変体を含む抗ＬＥＰＲ抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書の表１に示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかと比べて、例えば、１０またはそれ未満、８またはそれ未満、６またはそれ未満、４またはそれ未満などの保存的アミノ酸置換を伴ったＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＬＥＰＲ抗体を含む。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書の表１に示された配列（例えば、保存的アミノ酸置換を含む）と比べて改変体ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を含む抗ＬＥＰＲ抗体を提供し、このような改変体抗体は、それにもかかわらず、本明細書に開示の例示的な抗ＬＥＰＲ抗体の１つまたは複数の機能および／または性質を呈する。
【００７８】
ヒトＬＥＰＲの細胞外ドメインは、Ｎ末端サイトカイン受容体相同性ドメイン（ＣＲＨ−１）、免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン、およびレプチン−結合ドメイン（ＬＢＤ）と呼ばれる第２のＣＲＨドメイン（ＣＲＨ−２）を含有する（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２０１２年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２０巻：４８７〜９７頁）。さらに、ＬＥＰＲは、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）および糖タンパク質１３０（ｇｐ１３）と最大の相同性、および類似する細胞外ドメインサイズ、および機構を共有する（Ｈａｎｉｕら（１９９８年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３巻（４４号）：２８６９１〜６９９頁）。
【００７９】
用語「エピトープ」は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域内で特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、１つを超えるエピトープを有し得る。よって、異なる抗体は、抗原上の異なるエリアに結合することができ、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、コンフォメーション性または線形であり得る。コンフォメーションエピトープは、線形ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並べられたアミノ酸によって生成される。線形エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって生成されるものである。ある特定の環境において、エピトープは、抗原上のサッカリド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
【００８０】
本発明は、ヒトＬＥＰＲ（配列番号１１３）のアミノ酸Ｍ１−Ｄ８３９内に見出される１つまたは複数のエピトープと相互作用する抗ＬＥＰＲ抗体を含む。実施例１１に示した通り、ヒトＬＥＰＲ由来の２０１個のペプチドは、抗体Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２に結合しているとき、重水素化取込みが有意に低減された。アミノ酸１６２〜１６９（ヒトＬＥＰＲ、配列番号１１３のアミノ酸ＬＹＶＬＰＥＶＬ）および１７０〜１９１（ヒトＬＥＰＲ、配列番号１１３のアミノ酸ＥＤＳＰＬＶＰＱＫＧＳＦ）に対応するペプチドは、Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２に結合しているとき、重水素化速度がより遅く、この抗体は、配列ＬＹＶＬＰＥＶＬまたはＥＤＳＰＬＶＰＱＫＧＳＦ（配列番号１１３のそれぞれアミノ酸１６２〜１６９または１７０〜１９１）を有する少なくとも２つのヒトＬＥＰＲエピトープに結合することを示した。
【００８１】
本発明の抗体が結合するエピトープは、ＬＥＰＲタンパク質の３個またはそれよりも多い（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多い）アミノ酸の単一の連続した配列からなることができる。代替として、エピトープは、ＬＥＰＲの複数の連続していないアミノ酸（またはアミノ酸配列）からなる場合がある。一部の実施形態では、エピトープは、ＬＥＰＲのレプチン−結合ドメインに、またはそれ付近に位置している。他の実施形態では、エピトープは、ＬＥＰＲのレプチン−結合ドメインと別個の領域に、例えば、抗体が、このようなエピトープに結合しているとき、ＬＥＰＲへのレプチン結合を妨害しないＬＥＰＲの表面上の場所に位置している。
【００８２】
当業者に公知の様々な技法を使用して、特定の抗体によって認識されるエピトープ内のアミノ酸を同定することができる。例示的な技法としては、例えば、アラニン走査変異分析、ペプチドブロット分析、およびペプチド切断分析がある。さらに、抗原のエピトープ除去、エピトープ抽出、および化学修飾などの方法を使用することができる（Ｔｏｍｅｒ、２０００年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、９巻：４８７〜４９６頁）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するのに使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般論として、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質の重水素標識化、その後の重水素−標識化タンパク質への抗体の結合を伴う。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体によって保護された残基（重水素標識化されたままである）を除くすべての残基で水素−重水素交換を起こさせる。抗体が解離した後、標的タンパク質がプロテアーゼ切断および質量スペクトル分析に付され、それによって抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識化残基が明らかになる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９年）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６７巻（２号）：２５２〜２５９頁；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１年）、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、７３巻：２５６Ａ〜２６５Ａ頁を参照。その抗原と複合体形成した抗体のＸ線結晶解析も、抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するのに使用することができる。
【００８３】
本発明は、本明細書に記載の具体的な例示的な抗体（例えば、本明細書の表１に示したアミノ酸配列のうちのいずれかを含む抗体）のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＬＥＰＲ抗体をさらに含む。同様に、本発明は、本明細書に記載の具体的な例示的な抗体（例えば、本明細書の表１に示したアミノ酸配列のうちのいずれかを含む抗体）のいずれかと、ＬＥＰＲへの結合について競合する抗ＬＥＰＲ抗体も含む。
【００８４】
当技術分野で公知の、かつ本明細書に例示されている慣用的な方法を使用することによって、抗体が参照抗ＬＥＰＲ抗体と同じエピトープに結合するか、またはそれと結合について競合するかを決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＬＥＰＲ抗体と同じエピトープに結合するか否かを決定するために、参照抗体を、ＬＥＰＲタンパク質に結合させる。次に、試験抗体のＬＥＰＲ分子に結合する能力が評価される。試験抗体が、参照抗ＬＥＰＲ抗体との飽和結合後にＬＥＰＲに結合することができる場合、試験抗体が参照抗ＬＥＰＲ抗体と異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、試験抗体が、参照抗ＬＥＰＲ抗体との飽和結合後にＬＥＰＲ分子に結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ＬＥＰＲ抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合することができる。次いで追加の慣用的な実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実行して、試験抗体の結合の観察された欠如が参照抗体と同じエピトープに結合することに実際に起因するか、または立体遮断（または別の現象）が観察された結合の欠如の原因であるかを確認することができる。この種類の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体−結合アッセイを使用して実施することができる。本発明のある特定の実施形態によれば、競合的結合アッセイで測定した場合に、例えば、１、５、１０、２０、または１００倍過剰の一方の抗体が、他方の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、またはさらには９９％阻害する場合、２つの抗体は同じ（または重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９０年：５０巻：１４９５〜１５０２頁参照）。代替として、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が他方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は、同じエピトープに結合すると見なされる。一方の抗体の結合を低減または排除するアミノ酸の変異のサブセットのみが他方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は、「重複エピトープ」を有すると見なされる。
【００８５】
抗体が参照抗ＬＥＰＲ抗体と結合について競合する（または結合について交差競合する）か否かを決定するために、上述した結合方法を２つの方向で実施する：第１の方向では、参照抗体を飽和条件下でＬＥＦＲタンパク質に結合させ、その後試験抗体のＬＥＰＲ分子への結合を評価する。第２の方向では、試験抗体を飽和条件下でＬＥＰＲ分子に結合させ、その後参照抗体のＬＥＰＲ分子への結合を評価する。両方向において、第１の（飽和）抗体のみがＬＥＰＲ分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗体は、ＬＥＰＲへの結合について競合すると結論付けられる。当業者が察知することになるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しない場合もあるが、重複または隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
【００８６】
ヒト抗体の調製
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、完全ヒト抗体であり得る。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で公知である。任意のこのような公知の方法を本発明との関連で使用してヒトＬＥＰＲに特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。
【００８７】
例えば、完全ヒトモノクローナル抗体を生成するためのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術、または任意の他の同様の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＬＥＰＲに対する高アフィニティーキメラ抗体が最初に単離される。以下の実験セクションと同様に、抗体は、アフィニティー、リガンド遮断活性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特性について特徴付けられ、選択される。必要であれば、マウス定常領域は、所望のヒト定常領域、例えば、野生型または修飾ＩｇＧ１またはＩｇＧ４と置き換えられて完全ヒト抗ＬＥＰＲ抗体が生成される。選択される定常領域は、具体的な使用によって変動し得るが、高アフィニティー抗原結合性および標的特異性特性は、可変領域内に存在する。ある特定の場合では、完全ヒト抗ＬＥＰＲ抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離される。
【００８８】
生物学的等価物
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体および抗体断片は、記載した抗体のものから変動するが、ヒトＬＥＰＲに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このような改変体抗体および抗体断片は、親配列と比較したとき、アミノ酸の１個または複数の付加、欠失、または置換を含むが、記載した抗体のものと本質的に等価である生物活性を呈する。同様に、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体コードＤＮＡ配列は、開示した配列と比較したとき、ヌクレオチドの１個または複数の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体または抗体断片と本質的に生物学的に等価である抗ＬＥＰＲ抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。このような改変体アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上記に論じられている。
【００８９】
２つの抗原結合性タンパク質または抗体は、例えば、単回用量であれ、複数回用量であれ、同様の実験条件下、同じモル用量で投与された場合に、それらの吸収の速度および程度が有意差を示さない、医薬同等物または医薬代替物であれば、生物学的に同等であると考えられる。一部の抗体は、それらの吸収の程度において同等であるが、それらの吸収の速度において同等でないが、このような吸収速度の差違が、意図的なものであり、例えば、長期使用時において、有効な体内薬物濃度を達成するのに必須ではなく、表示に反映されており、研究される特定の薬物製品にとって、医学的に重要でないと考えられるため、生物学的に同等であると考えうるならば、同等物または医薬代替物と考えられる。
【００９０】
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質は、それらの安全性、純度、および効力において、臨床的に有意義な差違が見られない場合、生物学的に同等である。
【００９１】
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質は、患者を、基準生成物と、生物学的生成物との間で、そのような切換えを伴わずに治療を持続させた場合と比較した、予測される有害作用の危険性の増大であって、免疫原性の臨床的に有意な変化、または有効性の減殺を含む有害作用の危険性の増大を伴わずに、１回または複数回にわたり切り換えうる場合、生物学的に同等である。
【００９２】
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質は、それらのいずれもが、そのような機構が公知である程度において、１または複数の使用条件に対する、１または複数の共通の作用機構により作用する場合、生物学的に同等である。
【００９３】
生物学的等価性は、ｉｎ  ｖｉｖｏ法により裏付けることもでき、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏ法により裏付けることもできる。生物学的等価性の尺度は、例えば、（ａ）ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験であって、抗体またはその代謝物の濃度を、血液中、血漿中、血清中、または他の生物学的流体中で、時間の関数として測定するｉｎ  ｖｉｖｏ試験；（ｂ）ヒトのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるバイオアベイラビリティーデータと相関しており、その妥当な予測であるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験；（ｃ）ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験であって、抗体（またはその標的）の適切な短期的薬理学効果を時間の関数として測定するｉｎ  ｖｉｖｏ試験；および（ｄ）十分にコントロールされた臨床試験であって、抗体の安全性、有効性、もしくはバイオアベイラビリティー、または生物学的等価性を確立する臨床試験を含む。
【００９４】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体の生物学的に同等な改変体は、例えば、残基または配列の多様な置換を施すことにより構築することもでき、生物学的活性に必要とされない、末端または内部の残基または配列を欠失させることにより構築することもできる。例えば、生物学的活性に必須でないシステイン残基は、復元時における、不要であるかまたは不適正な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するように、欠失させるか、または他のアミノ酸で置きかえることができる。他の文脈では、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を消失させるかまたは除去する変異を含む抗ＬＥＰＲ抗体改変体を含みうる。
【００９５】
種選択性および種交差反応性
本発明は、ある特定の実施形態によれば、ヒトＬＥＰＲに結合するが、他の種由来のＬＥＰＲに結合しない抗ＬＥＰＲ抗体を提供する。本発明は、ヒトＬＥＰＲに、かつ１つまたは複数の非ヒト種由来のＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体も含む。例えば、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、ヒトＬＥＰＲに結合することができ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、またはチンパンジーＬＥＰＲの１つまたは複数に、場合によって結合しても、しなくてもよい。本発明のある特定の例示的な実施形態によれば、ヒトＬＥＰＲおよびカニクイザル（例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＬＥＰＲに特異的に結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供される。本発明の他の抗ＬＥＰＲ抗体は、ヒトＬＥＰＲに結合するが、カニクイザルＬＥＰＲに結合しないか、弱い結合しかしない。
【００９６】
多特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性であっても、多特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。多特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得、または１つを超える標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：６０〜６９頁；Ｋｕｆｅｒら、２００４年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２巻：２３８〜２４４頁を参照。本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結され得、またはそれと共発現され得る。例えば、抗体またはその断片は、１種または複数の他の分子実体、例えば、別の抗体または抗体断片などに機能的に連結して（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、または別の方法によって）第２の結合特異性を有する二特異性または多特異性抗体を生じさせることができる。
【００９７】
本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＬＥＰＲに結合し、免疫グロブリンの他方のアームが第２の抗原に特異的である二特異性抗体を含む。ＬＥＰＲ結合アームは、本明細書の表１に示したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含むことができる。
【００９８】
本発明の文脈で使用されうる、例示的な二特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインの使用を伴うが、この場合、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインと第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインとは、互いと、少なくとも１つのアミノ酸異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差違は、二特異性抗体の、プロテインＡへの結合を、アミノ酸差違を欠く二特異性抗体と比較して低減する。一実施形態では、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴのエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）など、プロテインＡへの結合を低減するかまたは消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含みうる。第２のＣＨ３内で見出されうる、さらなる修飾は、ＩｇＧ１抗体の場合のＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合のＮ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ４抗体の場合のＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）を含む。上記で記載した二特異性抗体フォーマット上の変動は、本発明の範囲内にあることが想定される。
【００９９】
本発明の文脈で使用されうる、他の例示的な二特異性フォーマットは、限定なしに述べると、例えば、ｓｃＦｖベースの二特異性フォーマットまたはダイアボディ二特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ＫＩＨ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ＫＩＨ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）を伴う共通軽鎖など）、交差Ｍａｂ、交差Ｆａｂ、（ＳＥＥＤ）ｂｏｄｙ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、およびＭａｂ２二特異性フォーマットを含む（前出のフォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎら、２０１２年、ｍＡｂｓ、４巻：６号、１〜１１頁、およびこれに引用されている参考文献を参照されたい）。二特異性抗体はまた、ペプチド／核酸コンジュゲーションを使用して構築することもでき、例えば、この場合、直交性の化学反応性を伴う非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを作出するが、ここで、このコンジュゲートは、規定された組成、価数、および形状を伴う、多量体の複合体へと自己アセンブルする（例えば、Ｋａｚａｎｅら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：２０１２年１２月４日］を参照されたい）。
【０１００】
治療用製剤および投与
本発明は、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体またはこれらの抗原結合性断片を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、改善された移入、送達、耐容性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）などをもたらす適当な担体、賦形剤、および他の薬剤などとともに製剤化される。多数の適切な製剤を、すべての創薬化学者に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに見出すことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、蝋、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡなど）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（ｃａｒｂｏｗａｘ）（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物がある。Ｐｏｗｅｌｌら「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、ＰＤＡ（１９９８年）、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、５２巻：２３８〜３１１頁も参照。
【０１０１】
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢およびサイズ、標的とする疾患、状態、投与経路などに応じて変動し得る。好適な用量は、典型的には体重または体表面積によって算出される。成人患者では、約０．０１〜約２０ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇの通常単回用量で本発明の抗体を静脈内投与することが有利であり得る。状態の重症度に応じて、処置の頻度および継続時間を調整することができる。抗ＬＥＰＲ抗体の投与の有効投与量およびスケジュールは、経験的に決定されてもよく、例えば、患者の進行は、定期的な評価によってモニターすることができ、用量をそれに応じて調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングを、当技術分野において周知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９１年、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．  Ｒｅｓ．、８巻：１３５１頁）。
【０１０２】
多様な送達系、例えば、リポソーム内の封入、マイクロ粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することが可能な組換え細胞、受容体により媒介されるエンドサイトーシスが公知であり、本発明の医薬組成物を投与するのに使用することができる（例えば、Ｗｕら、１９８７年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６２巻：４４２９〜４４３２頁を参照されたい）。導入法は、皮内経路、筋内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路を含むがこれらに限定されない。組成物は、任意の簡便な経路、例えば、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内膜を介する吸収（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、および腸粘膜など）を介して投与することができ、他の生体活性薬剤と併せて投与することができる。投与は、全身投与の場合もあり、局所投与の場合もある。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジを用いて皮下または静脈内送達することができる。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達にたやすく適用される。このようなペン型送達デバイスは、再使用可能または使い捨てであり得る。再使用可能なペン型送達デバイスは一般に、医薬組成物を含有する交換式カートリッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物のすべてが投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジをたやすく廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと置き換えることができる。こうして、ペン型送達デバイスを再使用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは、交換式カートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバーに保持されている医薬組成物で予め充填されている。医薬組成物のリザーバーが空になると、デバイス全体が廃棄される。
【０１０４】
多数の再使用可能なペン型送達デバイスおよび自動注射（ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ）送達デバイスが、本発明の医薬組成物の皮下送達において適用を有する。例としては、それだけに限らないが、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン、（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）がある。本発明の医薬組成物の皮下送達において適用がある使い捨てペン型送達デバイスの例としては、それだけに限らないが、ほんの数例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）、およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）がある。
【０１０５】
ある特定の状況では、医薬組成物を制御放出システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．、１４巻：２０１頁を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、１９７４年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａを参照。さらに別の実施形態では、制御放出システムを組成物の標的に近接して配置し、よって全身用量の一部のみを必要とすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、２巻、１１５〜１３８頁を参照）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：１５２７〜１５３３頁による総説において論じられている。
【０１０６】
注射用調製物は、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、および筋内注射、点滴注入などのための剤形を含みうる。これらの注射用調製物は、公知の方法により調製することができる。例えば、注射用調製物は、例えば、上記で記載した抗体またはその塩を、従来注射のために使用されている、滅菌水性媒体中または滅菌油性媒体中で、溶解させるか、懸濁させるか、または乳化させることにより調製することができる。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩液、グルコース、およびアルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］など、適切な可溶化剤と組み合わせて使用しうる他の補助剤などを含有する等張性溶液がある。油性媒体としては、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用しうる、ゴマ油、ダイズ油などが使用される。このようにして調製された注射剤は、適切なアンプルに充填することが好ましい。
【０１０７】
上記で記載した、経口使用または非経口使用のための医薬組成物は、有効成分の用量に適する単位用量の剤形へと調製すると有利である。単位用量にあるこのような剤形は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、注射剤（アンプル）、坐剤などを含む。含有される前記抗体の量は一般に、単位用量にある剤形１つ当たり約５〜約５００ｍｇであり、とりわけ、注射剤の形態では、前記抗体は、約５〜約１００ｍｇで含有されることが好ましく、他の剤形では、約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【０１０８】
抗体の治療的使用
本発明は、それを必要とする被験体に、抗ＬＥＰＲ抗体（例えば、本明細書の表１に示されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のうちのいずれかを含む抗ＬＥＰＲ抗体）を含む治療用組成物を投与することを含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示の抗ＬＥＰＲ抗体のいずれか、またはこれらの抗原結合性断片、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含み得る。
【０１０９】
本発明の抗体は、とりわけ、レプチン欠損、レプチン耐性、低レプチン血症と関連した、またはこれらによって媒介される、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＬＥＰＲシグナル伝達を刺激もしくは活性化し、またはレプチンの天然の活性を模倣することによって別段に処置可能な任意の疾患あるいは障害の処置、防止、および／あるいは好転に有用である。例えば、本発明の抗体およびこれらの抗原結合性断片は、リポジストロフィー状態を処置するのに有用である。本発明の抗体およびこれらの抗原結合性断片によって処置可能である例示的なリポジストロフィー状態としては、例えば、先天性全身性リポジストロフィー、後天性全身性リポジストロフィー、家族性部分的リポジストロフィー、後天性部分的リポジストロフィー、遠心性腹部リポジストロフィー（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、環状脂肪組織萎縮症（ｌｉｐｏａｔｒｏｐｈｉａ  ａｎｎｕｌａｒｉｓ）、局在性リポジストロフィー、およびＨＩＶ関連リポジストロフィーがある。
【０１１０】
本発明は、肥満に関連した１つまたは複数のＬＥＰＲ変異を発現する細胞、組織、および臓器へのレプチンシグナル伝達を回復させるのに有用な抗ＬＥＰＲ抗体およびこれらの抗原結合性断片も含む。例えば、レプチンの存在下でシグナル伝達を呈さない、またはシグナル伝達の低減を呈し、肥満および関連障害と関連したある特定のＬＥＰＲ変異体が同定されている。本明細書では、レプチンの存在下でシグナル伝達を呈さないＬＥＰＲ変異体は、「シグナル伝達欠損ＬＥＰＲ変異体」と呼ばれる。例示的なシグナル伝達欠損ＬＥＰＲ変異は、ＬＥＰＲ−Ａ４０９Ｅである（Ｆａｒｏｏｑｉら、２００７年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５６巻（３号）：２３７〜２４７頁）。本明細書では、レプチンの存在下でシグナル伝達の低減（野生型ＬＥＰＲと比較して）を呈するＬＥＰＲ変異体は、「シグナル伝達障害ＬＥＰＲ変異体」と呼ばれる。例示的なシグナル伝達障害ＬＥＰＲ変異は、ＬＥＰＲ−Ｐ３１６Ｔである（Ｍａｚｅｎら、２０１１年、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ、１０２巻：４６１〜４６４頁）。よって、本発明は、１つまたは複数のシグナル伝達欠損（例えば、Ａ４０９Ｅ）および／またはシグナル伝達障害（例えば、Ｐ３１６Ｔ）ＬＥＰＲ変異体によって引き起こされる、またはこれらと関連した疾患および障害の処置、防止、および／または好転に有用な抗ＬＥＰＲ抗体およびこれらの抗原結合性断片を含む。
【０１１１】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体およびこれらの抗原結合性断片は、肥満、メタボリック症候群、食事誘発性食物渇望（ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｏｏｄ  ｃｒａｖｉｎｇ）、機能性視床下部性無月経、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン耐性、インスリン受容体の変異に起因する重度インスリン耐性、インスリン受容体の変異によって引き起こされない重度インスリン耐性、下流シグナル伝達経路における変異によって引き起こされる、または他の原因によって誘導される重度インスリン耐性を含む重度インスリン耐性、非アルコール性およびアルコール性脂肪肝疾患、アルツハイマー病、レプチン欠損、レプチン耐性、リポジストロフィー、妖精症／ドナヒュー症候群、ラブソン−メンデンホール症候群からなる群より選択される１つまたは複数の疾患または障害の処置または防止にも有用である。
【０１１２】
本明細書に記載の処置の方法の文脈において、抗ＬＥＰＲ抗体は、単剤療法として（すなわち、唯一の治療剤として）、または１種もしくは複数の追加の治療剤と組み合わせて投与することができる（この例は本明細書の他の場所で記載されている）。
【０１１３】
組み合わせ療法および製剤
本発明は、１種または複数の追加の治療的に活性な成分と組み合わせた本明細書に記載の抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかを含む組成物および治療用製剤、ならびにそれを必要とする被験体にこのような組み合わせを投与することを含む処置の方法を含む。
【０１１４】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、１種または複数の追加の治療的に活性な成分、例えば、肥満、高コレステロール血症、高脂血症、２型糖尿病、１型糖尿病、食欲制御、不妊症などを処置するために処方される医薬品と組み合わせて共製剤化および／または投与することができる。このような追加の治療的に活性な成分の例としては、例えば、組換えヒトレプチン（例えば、メトレレプチン［ＭＹＡＬＥＰＴ］）、ＰＣＳＫ９インヒビター（例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体［アリロクマブ、エボロクマブ、ボコシズマブ、ロデルシズマブ、ラルパンシズマブ（ｒａｌｐａｎｃｉｚｕｍａｂ）など］）、スタチン（アトルバスタチン、ロスバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチンなど）、エゼチミベ、インスリン、インスリン改変体、インスリン分泌促進物質、メトホルミン、スルホニル尿素、ナトリウムグルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）インヒビター（例えば、デパグリフロジン（ｄａｐａｇｌｉｆｏｚｉｎ）、カナグリフロジン（ｃａｎａｇｌｉｆｏｚｉｎ）、エンパグリフロジンなど）、ＧＬＰ−１アゴニスト／類似体（例えば、エクステンジン−４、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチドなど）、グルカゴン（ＧＣＧ）インヒビター（例えば、抗ＧＣＧ抗体）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）インヒビター（例えば、抗ＧＣＧＲ抗体、低分子ＧＣＧＲアンタゴニスト、ＧＣＧＲ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ＧＣＧＲアプタマー［例えば、スピーゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）］など）、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）インヒビター（例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体、抗ＡＮＧＰＴＬ８抗体など）、フェンテルミン、オーリスタット、トピラメート、ブプロピオン、トピラメート／フェンテルミン、ブプロピオン／ナルトレキソン、ブプロピオン／ゾニサミド、プラムリンチド／メトレレプチン（Ｍｅｔｒｅｌｅｐｉｎ）、ロルカセリン、セチリスタット、テソフェンシン、ベルネペリットなどがある。
【０１１５】
追加の治療的に活性な成分、例えば、上記に列挙した薬剤またはこれらの誘導体のいずれかを、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体を投与する直前、同時、直後に投与することができる；（本開示の目的に関して、このような投与レジメンは、追加の治療的に活性な成分「と組み合わせた」抗ＬＥＰＲ抗体の投与とみなされる）。本発明は、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体が本明細書の他の場所で記載されている通り、追加の治療的に活性な成分の１種または複数と共製剤化される医薬組成物を含む。
【０１１６】
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によれば、複数回用量の抗ＬＥＰＲ抗体（または抗ＬＥＰＲ抗体と本明細書に述べた追加の治療活性剤のいずれかとの組み合わせを含む医薬組成物）を、既定された時間経過にわたって被験体に投与することができる。本発明のこの態様による方法は、複数回用量の本発明の抗ＬＥＰＲ抗体を被験体に順次投与することを含む。本明細書では、「順次投与すること」は、各用量の抗ＬＥＰＲ抗体が異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、または数カ月）によって分離された異なる日に被験体に投与されることを意味する。本発明は、単回初期用量の抗ＬＥＰＲ抗体、その後１回または複数回の二次用量の抗ＬＥＰＲ抗体、任意選択でその後１回または複数回の三次用量の抗ＬＥＰＲ抗体を患者に順次投与することを含む方法を含む。
【０１１７】
用語「初期用量」、「二次用量」、および「三次用量」は、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体を投与する時間的順序を指す。よって、「初期用量」は、処置レジメンの始めに投与される用量であり（「ベースライン用量」、「負荷用量」、「開始用量」などとも呼ばれる）、「二次用量」は、初期用量後に投与される用量であり、「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初期、二次、および三次用量はすべて、同じ量の抗ＬＥＰＲ抗体を含有し得るが、一般に、投与頻度の観点から互いに異なり得る。しかし、ある特定の実施形態では、初期、二次、および／または三次用量に含まれる抗ＬＥＰＲ抗体の量は、処置の過程の間に互いに変動する（例えば、必要に応じて上下に調整される）。ある特定の実施形態では、２回またはそれよりも多い（例えば、２、３、４、または５回）用量が「負荷用量」として処置レジメンの始めに投与され、その後より少ない頻度に基づいて投与される後続の用量が続く（例えば、「維持用量」）。
【０１１８】
抗体の診断的および分析的使用
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、例えば、診断目的で試料中のＬＥＰＲまたはＬＥＰＲ発現細胞を検出および／または測定するのに使用することもできる。例えば、抗ＬＥＰＲ抗体またはその断片は、ＬＥＰＲの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠如など）によって特徴付けられる状態または疾患を診断するのに使用され得る。ＬＥＰＲの例示的診断アッセイは、患者から得た試料を本発明の抗ＬＥＰＲ抗体と接触させることを含み得、抗ＬＥＰＲ抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識化されている。代替として、標識化されていない抗ＬＥＰＲ抗体をそれ自体検出可能に標識化されている二次抗体と組み合わせて診断適用において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、放射性同位体、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなど；蛍光もしくは化学発光部分、例えば、フルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミンなど；または酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどであり得る。試料中のＬＥＰＲを検出または測定するのに使用され得る具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、およびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）走査がある。
【０１１９】
本発明によるＬＥＰＲ診断アッセイで使用され得る試料としては、正常または病的状態下で検出可能な量のＬＥＰＲタンパク質またはその断片を含有する患者から入手可能な任意の組織または体液試料がある。一般に、健康な患者（例えば、異常なＬＥＰＲレベルまたは活性に関連した疾患または状態に罹患していない患者）から得られる特定の試料中のＬＥＰＲのレベルを測定して、ＬＥＰＲのベースラインまたは標準レベルを最初に確立する。次いでＬＥＰＲのこのベースラインレベルを、ＬＥＰＲ関連疾患または状態を有すると疑われる個体から得られる試料中で測定されるＬＥＰＲのレベルと比較することができる。
【実施例】
【０１２０】
以下の実施例は、当業者に本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかの完全な開示および記述を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明とみなす範囲を限定するように意図されていない。使用する数値（例えば、量、温度など）に関する精度を保証する取り組みを行っているが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別段に示されていない限り、部分は、重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度は、セ氏温度であり、圧力は、大気または大気付近におけるものである。
【０１２１】
（実施例１：レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質の産生）
抗ＬＥＰＲ抗体は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）をＬＥＰＲの細胞外ドメインを含む免疫原で免疫化することによって得た。抗体免疫応答をＬＥＰＲ特異的イムノアッセイによってモニターした。以前に記載の技法を使用して、完全ヒト抗ＬＥＰＲ抗体を単離および精製した。
【０１２２】
本実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のある特定の生物学的性質を、以下に示す実施例で詳細に記載する。
【０１２３】
（実施例２：重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸および核酸配列）
表１は、本発明の選択された抗ＬＥＰＲ抗体の重鎖および軽鎖可変領域およびＣＤＲのアミノ酸配列の識別子を示す。対応する核酸配列の識別子を表２に示す。
【表１】
2018535948.tif 000002
【表２】
2018535948.tif 000003
【０１２４】
抗体は、典型的には、以下の命名法：Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ２Ｍ」など）、その後の数値的な識別子（例えば、「１６６５０」、「１６６７９」など）、およびその後の「Ｐ」または「Ｎ」接尾辞に従って本明細書で呼ばれる。よって、この命名法によれば、抗体は、例えば、「Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２」、「Ｈ４Ｈ１６６７９Ｐ２」などと本明細書で呼ばれる場合がある。本明細書で使用する抗体の名称のＦｃ接頭辞（Ｈ４Ｈ、Ｈ１Ｍ、およびＨ２Ｍ）は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ４Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有し、一方、「Ｈ１Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ１  Ｆｃを有する（すべての可変領域は、抗体名称の最初の「Ｈ」によって表される通り、完全にヒトのものである）。当業者が理解することになるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗体を、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換することができる、など）が、いずれにしても、表１および２に示した数値的識別子によって示されている可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は、同じままとなり、結合性質は、Ｆｃドメインの特質にかかわらず同一または実質的に類似であると予期される。
【０１２５】
本明細書の実施例で使用する「対照薬（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）ｍＡｂ３００Ｄは、Ｆａｚｅｌｉら（２００６年）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３１２巻：１９０〜２００頁およびＣａｒｐｅｎｔｅｒら（２０１２年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２０巻（３号）：４８７〜９７頁に記載のＦａｂ９Ｆ８を指す。
【０１２６】
（実施例３：表面プラズモン共鳴で得られるヒトモノクローナル抗ＬＥＰＲ抗体の結合アフィニティーおよび動態定数（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔａｎｔ））
精製抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体へのＬＥＰＲ結合に関する平衡解離定数（ＫＤ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００計測器を使用してリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定した。すべての結合研究は、２５℃および３７℃にて１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％  ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ−ＥＴ）ランニング緩衝液で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体を捕捉するために、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、＃ＢＲ−１００８−３９）とアミンカップリングすることによって最初に誘導体化した。結合研究は、以下のＬＥＰＲ試薬に対して実施した：Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグとともに発現されるヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ；配列番号１１４）、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグとともに発現されるｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  ＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｍｆＬＥＰＲ．ｍｍｈ；配列番号１１７）、Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグとともに発現されるヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｈＬＥＰＲ．ｍＦｃ；配列番号１１５）、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグとともに発現されるマウスＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｍＬＥＰＲ．ｍｍｈ；配列番号１１８）、およびＣ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグとともに発現されるラットＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｒＬＥＰＲ．ｍｍｈ；配列番号１１９）。異なる濃度のＬＥＰＲ試薬をＨＢＳ−ＥＴランニング緩衝液（１００ｎＭ〜３．７ｎＭ；３倍連続希釈）中で最初に調製し、抗ヒトＦｃ捕捉抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体表面上に３０μＬ／分の流量で４分間注射し、一方、モノクローナル抗体結合ＬＥＰＲ試薬の解離をＨＢＳ−ＥＴランニング緩衝液中で１０分間モニターした。動的な会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を、リアルタイム結合センサーグラムをＳｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線フィッティングソフトウェアを使用して質量輸送制限を用いた１：１結合モデルにフィッティングすることによって決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、
【化１】
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として動力学的速度定数から算出した。
【０１２７】
２５℃および３７℃での本発明の異なる抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体へのｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ、ｍｆＬＥＰＲ．ＭＭＨ、またはｈＬＥＰＲ．ｍＦｃの結合についての結合動態パラメータを表３から８に示す。
【表３】
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【表４】
2018535948.tif 000006
【表５】
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【表６】
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【表７】
2018535948.tif 000009
【表８】
2018535948.tif 000010
【０１２８】
２５℃で、抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体は、表５に示した通り、７．９３ｎＭ〜１４８ｎＭの範囲のＫＤ値でｈＬＥＰＲ−ＭＭＨに結合した。３７℃で、抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体は、表４に示した通り、１４．８ｎＭ〜３２６ｎＭの範囲のＫＤ値でｈＬＥＰＲ−ＭＭＨに結合した。
【０１２９】
本発明の１２種の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体のうちの１０種がｍｆＬＥＰＲ．ＭＭＨに結合した。２５℃で、抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体は、表７に示した通り、２．２７ｎＭ〜１３９ｎＭの範囲のＫＤ値でｍｆＬＥＰＲ．ＭＭＨに結合した。３７℃で、抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体は、表８に示した通り、５．１８ｎＭ〜２６４ｎＭの範囲のＫＤ値でｍｆＬＥＰＲ．ＭＭＨに結合した。
【０１３０】
２５℃で、抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体は、表７に示した通り、６１３ｐＭ〜５．７ｎＭの範囲のＫＤ値でｈＬＥＰＲ−ｍＦｃに結合した。３７℃で、抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体は、表８に示した通り、１．１６ｎＭ〜１２．８ｎＭの範囲のＫＤ値でｈＬＥＰＲ−ｍＦｃに結合した。
【０１３１】
本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体のいずれも、２５℃または３７℃でｍＬＥＰＲ．ＭＭＨまたはｒＬＥＰＲ．ＭＭＨに結合しなかった（データを示さず）。
【０１３２】
（実施例４：本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、レプチン：ＬＥＰＲ結合の存在下でＬＥＰＲに結合する）
抗ＬＥＰＲ抗体がＬＥＰＲに結合することのヒトレプチンによる遮断を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００計測器のリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して評価した。研究全体を、２５℃にて１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＨＢＳ−ＥＴランニング緩衝液）中で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサー表面を、標準ＥＤＣ／ＮＨＳ表面化学を使用してヒトレプチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９８−ＬＰ）をアミンカップリングすることによって最初に誘導体化した。ヒトＬＥＰＲとヒトレプチンとの複合体を、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグとともに発現させた２０ｎＭのヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｈＬＥＰＲ−ＭＭＨ；配列番号ｘｘ）を、ヒトレプチンを固定化したＢｉａｃｏｒｅセンサー表面上に１０μＬ／分または２５μＬ／分の流量で４分間注射することによって形成して、およそ２００ＲＵの結合応答を達成した。ｈＬＥＰＲ−ＭＭＨへの抗体結合がヒトレプチンによって遮断されるか否かを評価するために、２００ｎＭの抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体を、予め形成させたｈＬＥＰＲ−ＭＭＨ：ヒトレプチン複合体上に、５０μＬ／分または２５μＬ／分の流量で、４〜５分間注射した。本発明のすべての抗ＬＥＰＲ抗体は、ｈＬＥＰＲ−ＭＭＨとヒトレプチンとの複合体（「レプチン：ＬＥＰＲ」）に結合し、シグナル強度はほぼ同等であった。観察された結合をＲＵで表して表９に報告する。この結果は、ヒトレプチンがｈＬＥＰＲ−ＭＭＨの試験した抗ＬＥＰＲ抗体への結合を遮断しないことを示す。
【表９】
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【０１３３】
（実施例５：ヒトレプチン受容体遮断ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡのために、ヒトレプチン（ｈＬｅｐｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９８−ＬＰ−０１Ｍ）を、９６ウェルマイクロタイタープレート上にＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの濃度で４℃にて一晩被覆した。非特異的結合部位を、ＰＢＳ中のＢＳＡの０．５％（ｗ／ｖ）溶液を使用して引き続いてブロックした。Ｃ末端ヒトＦｃタグとともに発現させたＬＥＰＲタンパク質の１０ｎＭの一定量の細胞外ドメイン部分（ｈＬＥＰＲ．ｈＦｃ；配列番号１１６）を、連続希釈物中８．５ｐＭ〜５００ｎＭの範囲の抗ＬＥＰＲ抗体、ｈＬｅｐｔｉｎタンパク質、またはアイソタイプ対照抗体で滴定した。次いでこれらの抗体−タンパク質またはタンパク質−タンパク質複合体を室温（ＲＴ）で１．５時間インキュベートした。複合体を、ｈＬｅｐｔｉｎを被覆したマイクロタイタープレートに引き続いて移し、ＲＴで２時間インキュベートし、ウェルを洗浄し、プレートに結合したｈＬＥＰＲ．ｈＦｃを、西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、＃１０９−０３５−０９８）で検出した。試料をＴＭＢ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５５２１４；製造者の指示書に従って１：１の比で混合した基質ＡおよびＢ）で発色させて比色反応を生じさせ、次いで１Ｍ硫酸で中和した後、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ５プレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１３４】
データ分析は、Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）の中のＳ字状用量応答モデルを使用して実施した。試験した抗体の最大濃度におけるパーセント遮断を、１０ｎＭのｈＬＥＰＲ．ｈＦｃのプレート上のヒトレプチンへの結合を遮断する抗体の能力の指標として算出した。算出において、抗体の非存在下での１０ｎＭのｈＬＥＰＲ．ｈＦｃの結合シグナルを１００％結合または０％遮断として参照し、ｈＬＥＰＲ．ｈＦｃの非存在下での緩衝液単独のベースラインシグナルを０％結合または１００％遮断として参照した。５００ｎＭ抗体濃度における遮断データを表１０に要約する。
【０１３５】
表１０に示した通り、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体のいずれも、ｈＬＥＰＲ．ｈＦｃのｈＬｅｐｔｉｎ被覆表面への結合の２８％超の遮断を実証しなかった。しかし、対照薬抗体およびｈＬｅｐｔｉｎは、陽性対照として、ｈＬＥＰＲ．ｈＦｃのｈＬｅｐｔｉｎ被覆表面への結合を９９％遮断することができた。アイソタイプ対照抗体は、最大で５００ｎＭの濃度で測定可能な遮断を実証しなかった。
【表１０】
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【０１３６】
（実施例６：ＨＥＫ２９３／Ｍｙｃｘ２−ｈＬｅｐＲ（ｅｃｔｏ）−ＧＰＩアンカー型細胞を用いたＦＡＣＳ分析による細胞結合）
レプチン受容体、ＬＥＰＲは、クラスＩサイトカイン受容体ファミリーの一回膜貫通型受容体である（Ｔａｒｔａｇｌｉａら（１９９７年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、７：２７２巻（１０号）：６０９３〜６頁）。ＬＥＰＲは、レプチン、食物摂取および代謝の調節に関与する脂肪組織によって主に発現されるタンパク質に結合することができる（Ｆｒｉｅｄｍａｎら（２０１４年）、Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２２３巻（１号）：Ｔ１〜８頁）。
【０１３７】
抗ＬＥＰＲ抗体による細胞結合を評価するために、ＨＥＫ２９３安定細胞株を生成した。ＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ−ＧＰＩとして以下で知られる１つの細胞株は、ヒトＬＥＰＲの細胞外ドメイン（受託番号Ｐ４８３５７のアミノ酸２２〜８３９（配列番号１１３）、アイソフォームＢ）を、Ｎ末端ｍｙｃ−ｍｙｃタグ、およびＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）の付加をガイドするヒトカルボキシペプチダーゼＭ由来のＣ末端ペプチド配列とともに安定に発現した（Ｄｅｄｄｉｓｈら（１９９０年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５巻：２５号：１５０８３〜８９頁）。その結果、タンパク質は、膜にＧＰＩで係留することができる。ルシフェラーゼレポーター（Ｓｔａｔ３−ルシフェラーゼ、Ｓｔａｔ３−ｌｕｃ、ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃ＣＬＳ−６０２８Ｌ）とともに全長のヒトＬＥＰＲ（受託番号Ｐ４８３５７（配列番号１１３）のアミノ酸１〜１１６５、アイソフォームＢ）を安定に発現させるために、別のＨＥＫ２９３細胞株を生成した。この細胞株は、以下でＨＥＫ２９３／Ｓｔａｔ３−ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ−ＦＬとして知られる。Ｓｔａｔ３−ルシフェラーゼレポーターのみを含むＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／Ｓｔａｔ３−ｌｕｃ）も対照細胞株として生成した。
【０１３８】
ＦＡＣＳ分析のために、ＨＥＫ２９３親細胞およびＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ−ＧＰＩ細胞を解離し、２％  ＦＢＳ含有ＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で５×１０５細胞／ウェルで９６ウェルＶ底プレート上に蒔いた。抗ｈＬＥＰＲ抗体の、細胞に結合する能力がレプチンの存在によって影響されるか否かを試験するために、１μＭヒトレプチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９８−ＬＰ）を含む、または含まないＦＡＣＳ緩衝液を細胞とともに４℃で３０分間インキュベートし、その後ＦＡＣＳ緩衝液中１０ｎＭで抗ＬＥＰＲ抗体または対照抗体を添加した。細胞を４℃で３０分間引き続いてインキュベートし、その後洗浄し、次いで１６μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−６４７コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、＃１０９−５４７−００３）とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＢＤ  ＣｙｔｏＦｉｘ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、＃５５４６５５）を使用して引き続いて固定し、濾過し、ＨｙｐｅｒＣｙｔ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。未染色および二次抗体単独の対照もすべての細胞株について試験した。結果をＦｏｒｅＣｙｔ（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ）およびＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して分析して生存細胞の蛍光の幾何平均を決定した。各試料の蛍光の幾何平均を未染色細胞の幾何平均に対して正規化して、「結合比」と呼ばれる１条件当たりの相対的な結合を得、これらの結合比を試験した各抗体について記録した。
【０１３９】
表１１に示した通り、１０ｎＭで試験した９種の本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、レプチン無しで８２４〜３３７４倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ−ＧＰＩ細胞に結合することを実証した。抗ＬＥＰＲ抗体は、３９８および４１８４倍の結合比で１μＭのレプチンの存在下でも結合した。表１１に示した通り、１０ｎＭで試験した対照薬抗体は、レプチン無しで２３４９倍の結合比でＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ−ＧＰＩ細胞への結合を実証したが、１μＭのレプチンの存在下で細胞への有意により低い結合を示し、結合比は、１１２であった。抗ＬＥＰＲ抗体は、１〜９倍の範囲の１μＭのレプチンを含むおよび含まない結合比でＨＥＫ２９３親細胞へのいかなる有意な結合も実証しなかった。アイソタイプ対照抗体および二次抗体単独の試料も、レプチンの有無にかかわらず、いずれの細胞株に対しても有意な結合を実証せず、結合比は１〜６倍であった。
【０１４０】
表１２に示した通り、レプチン無しで、７０ｎＭで試験した本発明の４種の抗体は、７０７〜１１３１倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ−ＧＰＩ細胞への結合を実証し、かつ４２〜５１の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／Ｓｔａｔ３−ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ−ＦＬ細胞への結合を実証した。抗ＬＥＰＲ抗体は、ＨＥＫ２９３／Ｓｔａｔ３−ｌｕｃ細胞へのいかなる有意な結合も実証せず、結合比は、１〜８倍であった。アイソタイプ対照抗体および二次抗体単独の試料も、試験したいずれの細胞株に対しても有意な結合を実証せず、結合比は１〜２倍であった。
【表１１】
2018535948.tif 000013
【表１２】
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【０１４１】
（実施例７：本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、レプチンの存在下または非存在下でＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する）
バイオアッセイは、ＩＭＲ−３２細胞株、ヒト神経芽細胞腫細胞株内でルシフェラーゼレポーター（ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ；Ｑｉａｇｅｎ、＃ＣＬＳ−６０２８Ｌ）とともに全長ヒトＬＥＰＲ（ｈＬＥＰＲ；受託番号ＮＰ＿００２２９４．２のアミノ酸１〜１１６５）を安定に発現するレポーター細胞株を使用してＬＥＰＲ活性化を介してＳＴＡＴ３の転写活性化を検出するのに開発された。ＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲと呼ぶ得られた安定細胞株を、１０％  ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、１μｇ／ｍＬピューロマイシン、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ、およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補充したＭＥＭ−Ｅａｒｌ培地（完全培地）中で単離および維持した。
【０１４２】
得られるバイオアッセイを使用してレプチンの存在下または非存在下でのＬＥＰＲシグナル伝達に対する本発明の抗ＬＥＰＲ抗体の効果を測定した。バイオアッセイについて、ＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ細胞を、完全培地中、９６ウェル形式で、２０，０００細胞／１００μｌ／ウェルの密度で蒔き、翌日、１％  ＢＳＡおよび０．１％  ＦＢＳ（アッセイ緩衝液）を補充した適切な体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で３０分間にわたって置き換えた。レプチンの非存在下での本発明の抗体の効果を測定するために、抗ＬＥＰＲ抗体またはアイソタイプ対照抗体およびヒトレプチン（ｈＬｅｐｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９８−ＬＰ）を半対数連続希釈（ｈａｌｆ−ｌｏｇ  ｓｅｒｉａｌｌｙ  ｄｉｌｕｔｅ）してアッセイ緩衝液中１００ｎＭ〜３００ｆＭの範囲の最終濃度にし、それを細胞に添加し、５％  ＣＯ２中、３７℃で一晩引き続いてインキュベートした。
【０１４３】
レプチンの存在下での本発明の抗体の効果を測定するために、アッセイ緩衝液中２００ｐＭの固定濃度のヒトレプチンを細胞に添加し、直後に１００ｎＭ〜３００ｆＭの範囲の最終濃度に半対数連続希釈された抗ＬＥＰＲ抗体またはアイソタイプ対照抗体を添加した。次いで試料を５％  ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。次いでＯｎｅＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６０５１）を試料に添加し、ルシフェラーゼ活性を発光モードにてＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。相対光単位（ＲＬＵ）値を得、結果をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰を使用して分析した。ｈＬｅｐｔｉｎ用量応答から得た最大ＲＬＵ値をＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲアッセイにおける１００％の活性化として定義した。
【０１４４】
表１３に示した通り、研究１においてｈＬｅｐｔｉｎの非存在下で、試験した抗ＬＥＰＲ抗体のすべてがＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ細胞の弱い刺激を実証し、ＥＣ５０値は、１３４ｐＭ〜１１．９ｎＭの範囲であり、最大活性化は、ｈＬｅｐｔｉｎ用量応答から得た最大活性化のもののそれぞれ５％〜１３％の範囲であった。研究２においてｈＬｅｐｔｉｎの非存在下で、試験した４種の抗ＬＥＰＲ抗体がＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ細胞の刺激を実証し、ＥＣ５０値は、６１．９ｐＭ〜２０６．９ｐＭの範囲であり、最大活性化は、ｈＬｅｐｔｉｎ用量応答から得た最大活性化に対してそれぞれ６５％〜６８％の範囲であった。研究１において２００ｐＭのｈＬｅｐｔｉｎの存在下で、試験した抗ＬＥＰＲ抗体のすべてがＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ細胞の刺激を実証し、ＥＣ５０値は、２０．２ｐＭ〜５２３ｐＭの範囲であり、最大活性化は、ｈＬｅｐｔｉｎ用量応答から得た最大活性化のもののそれぞれ６６％〜１０７％の範囲であった。これらの抗体は、レプチン誘導ＬＥＰＲシグナル伝達を増強したので、これらの抗体を本明細書で定義する「増強剤」と分類した。研究２において２００ｐＭのｈＬｅｐｔｉｎの存在下で、試験した４種の抗ＬＥＰＲ抗体がＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ細胞の刺激を実証し、ＥＣ５０値は、５１．９ｐＭ〜２５７．３ｐＭの範囲であり、最大活性化は、ｈＬｅｐｔｉｎ用量応答から得た最大活性化に対してそれぞれ７６％〜８８％の範囲であった。ＬＥＰＲシグナル伝達は、レプチンの存在下でこれらの抗体によって認め得るほどには増強されなかった。アイソタイプ対照抗体は、アッセイのいずれにおいてもＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ細胞のいかなる測定可能な刺激も実証しなかった。
【表１３】
2018535948.tif 000015
【０１４５】
（実施例８：本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、シグナル伝達欠損またはシグナル伝達障害ＬＥＰＲ変異体を発現する細胞内でシグナル伝達を活性化する）
レプチン−媒介シグナル伝達の欠損また障害を呈し、早期発症肥満と関連したＬＥＰＲ変異体を同定した。例えば、ＬＥＰＲ−Ａ４０９Ｅは、レプチンシグナルをＳＴＡＴ３に変換しないシグナル伝達欠損変異体ＬＥＰＲタンパク質であり、Ａ４０９Ｅ変異体は、早期発症肥満の単一遺伝子性の原因として元来同定された。（Ｆａｒｏｏｑｉら、２００７年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５６巻（３号）：２３７〜２４７頁）。ＬＥＰＲ−Ｐ３１６Ｔは、やはり早期発症肥満と関連していると示されたシグナル伝達障害変異体ＬＥＰＲタンパク質である。（Ｍａｚｅｎら、２０１１年、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ、１０２巻：４６１〜４６４頁）。
【０１４６】
本実施例では、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体の、シグナル伝達欠損またはシグナル伝達障害ＬＥＰＲ変異体を発現する細胞株内でＬＥＰＲシグナル伝達を刺激する能力を評価した。特に、野生型ＬＥＰＲ、ＬＥＰＲ−Ａ４０９Ｅ（シグナル伝達欠損）、またはＬＥＰＲ−Ｐ３１６Ｔ（シグナル伝達障害）を発現するレポーター細胞株（ＨＥＫ２９３）を構築した。細胞をビヒクルのみ、組換えヒトレプチン、対照ＩｇＧ、または本発明のアゴニスト抗ＬＥＰＲ抗体（Ｈ４Ｈ１６６５０またはＨ４Ｈ１６６７９）で処置し、ＬＥＰＲシグナル伝達の程度（ＳＴＡＴ３発現と比べたｐＳＴＡＴ３−Ｙ７０５発現のウェスタンブロット検出によって測定した）を決定した。
【０１４７】
本発明のアゴニスト抗ＬＥＰＲ抗体（Ｈ４Ｈ１６６５０およびＨ４Ｈ１６６７９）は、用量依存的様式で、ＬＥＰＲ−Ａ４０９Ｅ変異体またはＬＥＰＲ−Ｐ３１６Ｔ変異体を発現する細胞内でＬＥＰＲシグナル伝達を刺激することをこれらの実験において示した（ＳＴＡＴ３発現によって測定した場合）（図２、パネルＢおよびＣ）。対照的に、レプチンで処置すると、ＬＥＰＲ−Ｐ３１６Ｔ変異体を発現する細胞内で中程度のシグナル伝達のみが誘導され、ＬＥＰＲ−Ａ４０９Ｅ変異体を発現する細胞内でシグナル伝達は誘導されなかった（図２、パネルＡ）。さらに、ＬＥＰＲシグナル伝達は、ビヒクルまたはＩｇＧ対照抗体で処置したいずれの細胞株においても検出されなかった（データを示さず）。他のシグナル伝達欠損またはシグナル伝達障害ＬＥＰＲ変異体も本アッセイにおいて試験したが、抗ＬＥＰＲ変異体によって活性化されず（データを示さず）、このレスキュー効果が変異体依存性であり得ることを示唆した。
【０１４８】
本実施例の結果は、本発明のアゴニスト抗ＬＥＰＲ抗体が、ある特定のシグナル伝達欠損またはシグナル伝達障害ＬＥＰＲ変異体（例えば、ＬＥＰＲ−Ｐ３１６ＴまたはＬＥＰＲ−Ａ４０９Ｅ）によって引き起こされる、またはそれと関連した疾患または障害（例えば、早期発症肥満）において有用であり得ることを示す。
【０１４９】
（実施例９：異なる抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体間のＯｃｔｅｔ交差競合）
異なる抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体のパネル間の結合競合について、Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．）でリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法アッセイを使用して決定した。実験全体を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ−ＥＢＴ）を含有する緩衝液中、２５℃にて１０００ｒｐｍの速度でプレートを振盪させて実施した。２種の抗体がＣ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグとともに発現された組換えヒトＬＥＰＲ（ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ；配列番号１１４）上のこれらのそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合することができるか否かを評価するために、約０．２５ｎＭまたは０．３４ｎＭのｈＬＥＰＲ−ＭＭＨを２０μｇ／ｍＬのｈＬＥＰＲ−ＭＭＨを含有するウェル中に５分間バイオセンサーチップを浸漬することによって抗ペンタＨｉｓ抗体被覆Ｏｃｔｅｔバイオセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｉｎｃ、＃１８−５１２２）上に最初に捕捉した。次いで、抗原捕捉したバイオセンサーチップを、第１の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体（引き続いてｍＡｂ−１と呼ぶ）を、ｍＡｂ−１の５０μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェル中に２１０秒間液浸させることによって飽和させた。次いでバイオセンサーチップを、第２の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体（引き続いてｍＡｂ−２と呼ぶ）の５０μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェル中に１５０秒間引き続いて液浸させた。バイオセンサーチップを、実験のあらゆるステップ間においてＨＢＳ−ＥＢＴ緩衝液で洗浄した。リアルタイム結合応答を実験の過程全体の間モニターし、各ステップの最後に結合応答を記録した。ｍＡｂ−１と予め複合体形成したｈＬＥＰＲ−ＭＭＨへのｍＡｂ−２結合の応答を比較し、異なる抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の競合性／非競合性挙動を表１４および表１５に示した通り決定した。
【表１４】
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【表１５】
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【０１５０】
（実施例１０：レプチン欠損の誘導性マウスモデルにおけるＬＥＰＲアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１６６７９Ｐ２、Ｈ４Ｈ１７３１９Ｐ２、およびＨ４Ｈ１７３２１Ｐ２のｉｎ  ｖｉｖｏ効力）
食物摂取、体重、および体脂肪蓄積（ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）に対する本発明の４種の特異的アゴニスト抗ＬＥＰＲ抗体、Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１６６７９Ｐ２、Ｈ４Ｈ１７３１９Ｐ２、およびＨ４Ｈ１７３２１Ｐ２の効果を、ネズミＬＥＰＲ外部ドメイン配列の代わりにヒトＬＥＰＲ外部ドメイン配列から構成されているレプチン受容体を発現する遺伝子操作されたＬＥＰＲＨｕ／Ｈｕマウスのレプチン欠損の誘導性モデルにおいて決定した。レプチン欠損のモデルは、ｈＦｃ−タグ付きマウスＬＥＰＲ外部ドメイン（ｍＬＥＰＲ．ｈＦｃまたは「レプチントラップ」と本明細書で呼ぶ；配列番号１２０）をコードするプラスミドの流体力学的ＤＮＡ送達（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＨＤＤ）によって誘導した。レプチントラップは、発現されるとき分泌され、循環しているレプチンに結合する。レプチントラップをコードするＤＮＡ構築物５０μｇのＨＤＤの後、マウスは、食物消費の増大ならびに体脂肪蓄積および体重の増大を呈した。
【０１５１】
ベースラインの日々の食物摂取量を、レプチントラップの投与の７日前と４日前（−７日目および−４日目）の間に測定した。０日目に、３５匹の１３〜１７週齢の雄ＬＥＰＲＨｕ／Ｈｕマウスを、成功裏にレプチントラップを用いたＨＤＤに供した。ＨＤＤ後６日目と１３日目に、後眼窩血液を収集し、体脂肪蓄積を含む身体組成をμＣＴによって定量化した。ＨＤＤ後７日目に、マウスを０日目からのパーセント体重変化に基づいて７匹のマウスの５つの群にランダム化した。各群は、３ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、３ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１６６５０Ｐ２、３ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１６６７９Ｐ２、３ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１７３１９Ｐ２、または、３ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１７３２１の単回用量を皮下注射を介して受けた。アイソタイプ対照抗体は、いずれの公知のマウスタンパク質にも結合しなかった。食物摂取量および体重を研究の継続時間にわたって各動物について測定した。図３は、各処置群の平均の日々の食物摂取量を要約する。図３において、点線は、ＨＤＤ注射の前の平均ベースライン食物摂取量を表す。０日目からの体重のパーセント変化を各時点で各動物について算出した。図４は、各抗体処置群の動物についての体重の平均パーセント変化を要約する。図５は、抗体処置の１日前および処置から６日後におけるμＣＴによって定量化した各抗体処置群の動物についての平均脂肪量を要約する。すべての結果を平均±ＳＥＭとして表現する。
【０１５２】
図３および４に示した通り、レプチントラップでのＨＤＤの後、食物摂取量および体重パーセント変化の同様の増大が抗体処置前のマウスの群の中で観察された。図３に示した通り、３ｍｇ／ｋｇの抗体Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２またはＨ４Ｈ１６６７９Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して、抗体処置から１日後（ＨＤＤ後８日目）に始まって、測定した後続の時点で食物摂取量の有意な低減を呈した。３ｍｇ／ｋｇの抗体Ｈ４Ｈ１７３１９Ｐ２またはＨ４Ｈ１７３２１Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して、抗体処置から２日後（ＨＤＤ後９日目）および測定した他の後続の時点で食物摂取量の有意な低減を呈した。図４に示した通り、３ｍｇ／ｋｇの抗体Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して、抗体処置から１日後（ＨＤＤ後８日目）および測定した他の後続の時点でパーセント体重変化の有意な低減を呈した。抗体処置から１日後、すなわち８日目に、アイソタイプ対照で処置したマウスは、０日目から体重の２１．１６±１．２７％の増大を示した一方、Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２で処置したマウスは、０日目から体重の１５．５７±０．９％の増大を有した。３ｍｇ／ｋｇの抗体Ｈ４Ｈ１６６７９Ｐ２、Ｈ４Ｈ１７３１９Ｐ２、またはＨ４Ｈ１７３２１Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して、抗体処置から２日後（ＨＤＤ後９日目）および測定した他の後続の時点でパーセント体重変化の有意な低減を呈した。９日目に、０日目からの％体重変化は、アイソタイプ対照、Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１６６７９Ｐ２、Ｈ４Ｈ１７３１９Ｐ２、またはＨ４Ｈ１７３２１Ｐ２で処置したマウスについてそれぞれ、２３．１８±１．２２、１３．１７±１．０５、１２．９５±１．２６、１５．９８±１．７８、および１５．８３±２．０１であった。図５に示した通り、３ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体で処置したマウスは、抗体処置の１日前（ＨＤＤ後６日目）と比較して、抗体処置から６日後（ＨＤＤ後１３日目）に脂肪量（ｆａｔ  ｍａｓｓ）の有意な増大を実証した。３ｍｇ／ｋｇの抗体Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１６６７９Ｐ２、Ｈ４Ｈ１７３１９Ｐ２、またはＨ４Ｈ１７３２１Ｐ２で処置したマウスは、抗体処置前と比較して抗体処置後に脂肪量（ａｄｉｐｏｓｅ  ｍａｓｓ）が増加しなかった。処置の６日後（ＨＤＤ後１３日目）、３ｍｇ／ｋｇの抗体Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１６６７９Ｐ２、またはＨ４Ｈ１７３１９Ｐ２で処置したマウスは、３ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体で処置したマウスと比較して脂肪量の有意な低下を実証した。
【０１５３】
（実施例１１：水素重水素交換によるヒトレプチン受容体（ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ）へのＨ４Ｈ１６６５０Ｐ２結合のエピトープマッピング）
Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２が相互作用するｈＬＥＰＲ．ｍｍｈのアミノ酸残基（配列番号１１４のアミノ酸Ｍ１−Ｄ８３９）を決定するための実験を行った。この目的のために、質量分析を用いたＨ／Ｄ交換エピトープマッピングを実行した。Ｈ／Ｄ交換法の一般的な記述は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９年）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６７巻（２号）：２５２〜２５９頁；ならびにＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１年）、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、７３巻：２５６Ａ〜２６５Ａ頁に示されている。
【０１５４】
実験手順。ＨＤＸ−ＭＳ実験を、重水素標識化のためのＬｅａｐｔｅｃ  ＨＤＸ  ＰＡＬシステム、試料消化およびローディングのためのＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｍ−Ｃｌａｓｓ（Ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｍａｎａｇｅｒ）、分析カラム勾配のためのＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｍ−Ｃｌａｓｓ（μＢｉｎａｒｙ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｍａｎａｇｅｒ）、ならびに消化性ペプチド質量測定のためのＳｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓｉ質量分析計からなる統合Ｗａｔｅｒｓ  ＨＤＸ／ＭＳプラットフォームで実施した。
【０１５５】
標識化溶液をｐＤ７．０（ｐＨ６．６と等価）のＤ２Ｏ中の１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液で調製した。重水素（ｄｅｔｅｒｉｕｍ）標識化のために、ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ（８ｐｍｏｌ／μＬ）または２：１のモル比で抗体とともに予め混合したｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ  ３．８μＬを、様々な時点（例えば、非重水素化対照＝０秒、１分および２０分間標識化した）についてＤ２Ｏ標識化溶液５６．２μＬとともにインキュベートした。重水素化を、試料５０μＬを予備冷却したクエンチ緩衝液（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ２．５中の０．２Ｍ  ＴＣＥＰ、６Ｍ塩化グアニジン）５０μＬに移すことによってクエンチし、混合試料を１．０℃で２分間インキュベートした。次いでクエンチした試料を、オンラインペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化のためにＷａｔｅｒｓ  ＨＤＸ  Ｍａｎａｇｅｒ中に注入した。消化したペプチドを０℃でＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、２．１×５ｍｍ  ＶａｎＧｕａｒｄプレカラム上に捕捉させ、５％〜４０％のＢの９分間の勾配分離（移動相Ａ：水中０．１％ギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸）のために、分析カラムＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、１．０×５０ｍｍに溶出した。質量分析計を３７Ｖのコーン電圧、０．５秒のスキャン時間、および５０〜１７００Ｔｈの質量／電荷範囲に設定した。
【０１５６】
ヒトＬＥＰＲ由来のペプチドを同定するために、非重水素化試料からのＬＣ−ＭＳＥデータを、Ｗａｔｅｒｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ（ＰＬＧＳ）ソフトウェアを介してヒトＬＥＰＲ、ペプシン、およびこれらのランダム化された配列を含むデータベースに対して処理および探索した。同定したペプチドをＤｙｎａｍＸソフトウェアにインポートし、２つの判定基準：１）アミノ酸１個当たりの最小産物：０．２、および２）複製ファイル閾値：３によってフィルタリングした。次いでＤｙｎａｍＸソフトウェアにより、各時間で３回反復して複数の時点にわたって保持時間および高質量精度（＜１０ｐｐｍ）に基づいて各ペプチドの重水素取り込みを自動的に決定した。
【０１５７】
結果。ＭＳＥデータ取得とカップリングしたオンラインペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩカラムを使用して、ヒトＬＥＰＲ由来の合計２０１ペプチドを抗体の非存在または存在下で再現性良く同定し、７０％の配列カバレッジ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）を示した。５種のペプチドは、表１６に示した通りＨ４Ｈ１６６５０Ｐ２に結合しているとき、重水素化取込みが有意に低減していた（セントロイドデルタ値＞０．４ダルトン、ｐ値＜０．０５）。記録されたペプチド質量は、３回の反復からのセントロイドＭＨ＋質量の平均値に対応する。これらのペプチドは、アミノ酸１６２〜１６９（ヒトＬＥＰＲ；配列番号１１３のアミノ酸ＬＹＶＬＰＥＶＬ）およびアミノ酸１７０〜１８１（ヒトＬＥＰＲ；配列番号１１３のアミノ酸ＥＤＳＰＬＶＰＱＫＧＳＦ）に対応し、Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ２に結合しているとき、より遅い重水素化速度を有した。これらの同定された残基はまた、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ４８３５７（配列番号１１３；ヒトレプチン受容体）として定義されたヒトＬＥＰＲの残基酸１６２〜１６９および１７０〜１８１に対応する。
【表１６】
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【０１５８】
（実施例１２：ヒト化ＬＥＰＲマウスにおけるＬＥＰＲ増強剤抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効力試験）
体重および体脂肪蓄積に対する本発明の３種の特異的増強剤抗ＬＥＰＲ抗体、Ｈ４Ｈ１８４８２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４８７Ｐ２、およびＨ４Ｈ１８４９２Ｐ２の効果を、単独で収容された遺伝子操作されたＬＥＰＲＨｕ／Ｈｕマウスにおいて決定した。このマウスは、ネズミＬＥＰＲ外部ドメイン配列の代わりにヒトＬＥＰＲ外部ドメイン配列から構成されるレプチン受容体（ｍＬＥＰＲ．ｈＦｃ、配列番号１２０）を発現する。
【０１５９】
−１９日目に、体脂肪蓄積を含む身体組成をμＣＴによって定量化した。０日目に、４８匹の１４〜１６週齢の雌ＬＥＰＲＨｕ／Ｈｕマウスを体重に基づいて１２匹のマウスの４つの群にランダム化した。０日目および１１日目に、各群からのマウスは、３０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４８２Ｐ２、３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４８７Ｐ２、または、３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４９２Ｐ２の単回用量を皮下注射を介して受けた。アイソタイプ対照抗体は、いずれの公知のマウスタンパク質にも結合しない。体重を各動物について研究の継続時間にわたって測定した。０日目からの体重のパーセント変化を各時点で各動物について算出した。図６は、各処置群の動物についての体重の平均パーセント変化を要約する。図６は、抗体処置の１９日前および処置から１１日後におけるμＣＴによって定量化した各抗体処置群の動物についての平均脂肪量を要約する。すべての結果を平均±ＳＥＭとして表現する。
【０１６０】
図６に示した通り、ＬＥＰＲ増強剤抗体を投薬した後、体重のパーセント変化の低下が観察されたが、アイソタイプ対照抗体を投薬した後では観察されなかった。図６に示した通り、３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４８２Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して、処置の２日後（２日目）に始まって、他の時点でパーセント体重変化の有意な低下を呈した。３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４８７Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して、２日目に始まって、他の時点でパーセント体重変化の有意な低下を呈した。３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４９２Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して、４、５、および１７日目にパーセント体重変化の有意な低下を呈したが、他の時点では呈さなかった。３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４８２Ｐ２で処置したマウスは、Ｈ４Ｈ１８４９２Ｐ２を注射したマウスと比較して、６日目に始まって、後続の日にパーセント体重変化の有意な低下を呈したが、７、１４、および１７日目では呈さなかった。３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４８７Ｐ２で処置したマウスは、Ｈ４Ｈ１８４９２Ｐ２を注射したマウスと比較して、３日目に始まって、他の時点でパーセント体重変化の有意な低下を呈したが、４および５日目では呈さなかった。
【０１６１】
図７Ａに示した通り、処置前（−１９日目）に群間で脂肪量の差異はなかった。図７Ｂに示した通り、３０ｍｇ／ｋｇの抗体Ｈ４Ｈ１８４８２およびＨ４Ｈ１８４８７で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体と比較して処置の１７日後（１２日目）に、脂肪量の統計的に有意な低下を示したが、Ｈ４Ｈ１８４９２で処置したマウスは呈さなかった。
【０１６２】
本発明の範囲は、本明細書で記載される具体的実施形態により限定されない。実際、本発明前出の記載および添付の図面から、当業者には、本明細書で記載される改変に加えて、多様な改変が明らかとなるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に収まることが意図される。
【０１６３】
（実施例１３：サルＬＥＰＲシグナル伝達に対する本発明の抗ＬＥＰＲ抗体の効果）
サルレプチン受容体の転写活性化を評価するために、安定細胞株を開発した。ルシフェラーゼレポーター（ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ；ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃ＣＬＳ−６０２８Ｌ）とともにヒトＬＥＰＲ（ｈＬＥＰＲ；受託番号ＮＰ＿００２２９４．２のアミノ酸８４０〜１１６５）の膜貫通ドメインおよび細胞質ゾルドメインと融合したＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  ＬＥＰＲ（ＭｆＬＥＰＲ；８２７のトレオニンがアラニンに変更された受託番号ＸＰ＿００５５４３１９４．１のアミノ酸２２〜８３７）の細胞外ドメインを安定に発現させるために、ＩＭＲ−３２細胞（ヒト神経芽細胞腫ＡＴＣＣ）を生成した。以下でＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ＭｆＬＥＰＲと呼ぶ得られた細胞株を単離し、１０％  ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、１μｇ／ｍＬピューロマイシン、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ、およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補充したＭＥＭ−Ｅａｒｌ培地中で維持した。
【０１６４】
レプチンの非存在下でのサルＬＥＰＲシグナル伝達に対する本発明の抗ＬＥＰＲ抗体の効果を測定するためのバイオアッセイを実施した。バイオアッセイのために、ＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ＭｆＬＥＰＲ細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＯｐｔｉｍｅｍ中の０．１％  ＦＢＳ（アッセイ緩衝液）で９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで蒔き、５％  ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ヒトレプチン（ｈＬｅｐｔｉｎ）、抗ＬＥＰＲ抗体、またはアイソタイプ対照抗体を、アッセイ緩衝液中５０ｎＭ〜０．８ｐＭに連続希釈し（＋試験分子を含まない緩衝液単独を含有する試料）、細胞に添加した。５％  ＣＯ２下で３７℃にて５．５時間後、ルシフェラーゼ活性を、ＯｎｅＧｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６０３１）およびＶｉｃｔｏｒ（商標）Ｘマルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。結果を、Ｐｒｉｓｍ（商標）６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰（４パラメーターロジスティクス）を使用して分析してＥＣ５０値を得た。抗体の活性化のパーセンテージを、ｈＬｅｐｔｉｎにより達成されたＲＬＵの最大範囲のものと比べた、抗体により達成されたＲＬＵの最大範囲として算出した。
【０１６５】
表１７に示した通り、ｈＬｅｐｔｉｎの非存在下で、試験した抗ＬＥＰＲ抗体のすべては、ＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｍｆＬＥＰＲ細胞内でサルＬＥＰＲシグナル伝達の活性化を示し、ＥＣ５０値は、２６６ｐＭ〜３６８ｐＭの範囲であり、最大活性化は、７６％〜８２％の範囲であり、１００％の活性化は、ｈＬｅｐｔｉｎで得られた。ｈＬｅｐｔｉｎは、３３３ｐＭのＥＣ５０値で活性化した。アイソタイプ対照抗体は、ＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｍｆＬＥＰＲ細胞のいかなる測定可能な刺激も実証しなかった。
【表１７】
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【０１６６】
（実施例１４：Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＭＦＩシグナルを使用したヒトＬＥＰＲの全長細胞外ドメインへのエピトープ結合）
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体が結合するヒトＬＥＰＲのエピトープを決定するために、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＦＬＥＸＭＡＰ（ＦＭ３ＤＤ、ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐ）フローサイトメトリーに基づく分析を利用して抗ＬＥＰＲ抗体の組換えヒトＬＥＰＲタンパク質ドメインとの相互作用を特徴付けた。アッセイのために、およそ３百万個のカルボキシル化ＭｉｃｒｏｐｌｅｘＲミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ、カタログ番号ＬＣ１０００Ａ）を、０．１Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ６．２（活性化緩衝液）中で洗浄、ボルテックス、および超音波処理し、次いで遠心分離して上清を除去した。ミクロスフェアを、２５℃で、活性化緩衝液１２０μＬ中に再懸濁し、カルボキシレート基（−ＣＯＯＨ）を、５０ｍｇ／ｍＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２４５００）１５μＬを添加し、その後５０ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２２９８０）１５μＬを添加することによって活性化した。１０分後、反応物のｐＨを、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５（カップリング緩衝液）６００μＬを添加して５．０に低減し、ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離して上清を除去した。活性化されたビーズを、カップリング緩衝液中でマウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧを含む２０μｇ／ｍＬモノクローナル抗ｍｙｃ抗体５００μＬと直ちに混合し、２５℃で２時間インキュベートした。カップリング反応を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０  ５０μＬを添加することによってクエンチし、ミクロスフェアを急速にボルテックスし、遠心分離し、ＤＰＢＳ  １ｍＬで４回洗浄してカップリングしていないタンパク質および他の反応成分を除去した。
【０１６７】
Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグとともに発現されたヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ヒトＬＥＰＲ−ＭＭＨ、配列番号１１３）、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグとともに発現されたヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１（Ｄ１）（ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ、アミノ酸２０９〜２３６を含むヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１（Ｄ１）−ＭＭＨ、配列番号１１３のアミノ酸１〜２０８）、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグとともに発現されたヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１（Ｄ１、Ｄ２）ドメイン（ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ、アミノ酸３１９〜３４６を含む、ヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１  （Ｄ１、Ｄ２）−ＭＭＨ、配列番号１１３のアミノ酸１〜３１８）、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグとともに発現されたヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１−Ｉｇ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）ドメイン（ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ、アミノ酸２７９〜３０６を含む、ヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）−ＭＭＨ、配列番号１１３のアミノ酸１〜２７８）、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグとともに発現されたヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１−Ｉｇ（Ｄ２、Ｄ３）ドメイン（ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ、アミノ酸１９９〜２２６を含むヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１−Ｉｇ（Ｄ２、Ｄ３）−ＭＭＨ、配列番号１１３のアミノ酸１〜１９８）、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグとともに発現されたヒトＬＥＰＲ  Ｉｇ（Ｄ３）ドメイン（ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ、アミノ酸８９〜１１６を含むヒトＬＥＰＲ  Ｉｇ（Ｄ３）−ＭＭＨ、配列番号１１３のアミノ酸１〜８８）、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグとともに発現されたヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ２ドメイン（ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ、アミノ酸２０８〜２３５を含むヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ２−ＭＭＨ、配列番号１１３のアミノ酸１〜２０７）、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグとともに発現されたヒトＬＥＰＲ  ＦＮＩＩＩドメイン（ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ、アミノ酸２０５〜２３２を含むヒトＬＥＰＲ  ＦＮＩＩＩ−ＭＭＨ、配列番号１１３のアミノ酸１〜２０４）、およびＣ末端ｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグとともに発現されたヒトＬＥＰＲ  Ｉｇ−ＣＲＨ２−ＦＮＩＩＩドメイン（ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ、アミノ酸５１１〜５３８を含むヒトＬＥＰＲ  Ｉｇ−ＣＲＨ２−ＦＮＩＩＩ−ＭＭＨ、配列番号１１３のアミノ酸１〜５１０）を含む一過性に発現されたＬＥＰＲタンパク質を、無血清ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１０３３０２０）中に懸濁し、次いで遠心分離によって清澄化した。抗ｍｙｃモノクローナル抗体が固定化されたミクロスフェアのアリコートを上述した通り調製し、これらのタンパク質上清のそれぞれ１ｍＬに個別に添加した。ミクロスフェアを穏やかに混合し、２５℃で２時間インキュベートし、ＤＢＰＳ  １ｍＬで２回洗浄し、遠心分離して上清を除去し、最後にＤＰＢＳ緩衝液１ｍＬ中に再懸濁した。全長ヒトＬＥＰＲとの、およびヒトＬＥＰＲドメインタンパク質のそれぞれとの個々の反応からの抗ｍｙｃ  ＩｇＧ結合ミクロスフェア４８μＬを引き抜き、ＰＢＳ＋２０���ｇ／ｍＬ  ＢＳＡ＋０．０５％  アジ化ナトリウム（ブロッキング緩衝液）３．６ｍＬ中で一緒に混合した。
【０１６８】
この混合プールから、ミクロスフェア７５μＬを９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＭＳＢＶＮ１２５０）のウェルごとに蒔き、個々の抗ヒトＬＥＰＲモノクローナル抗体（０．５または５μｇ／ｍＬ）２５μＬと混合し、２５℃で２時間インキュベートし、次いで０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤＰＢＳ（洗浄緩衝液）２００μＬで２回洗浄した。個々のミクロスフェアに結合した抗ＬＥＰＲ抗体レベルを検出し、その量を定量化するために、ブロッキング緩衝液中の２．５μｇ／ｍＬ  Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０６３−０９）１００μＬまたはブロッキング緩衝液中の１．２５μｇ／ｍＬのＲ−フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−１１６−０７２）１００μＬを添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。３０分後、試料を洗浄緩衝液２００μＬで２回洗浄し、洗浄緩衝液１５０μＬ中に再懸濁した。ミクロスフェアのメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）は、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析器で測定した。
【表１８】
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【０１６９】
Ｌｕｍｉｎｅｘに基づく分析の結果を表１８で表にする。Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＭＦＩシグナル強度は、本発明の１２種の抗ＬＥＰＲ抗体が完全なヒトＬＥＰＲ細胞外ドメインに結合したことを示す。抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１８４１７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４３８Ｐ２、およびＨ４Ｈ１８４９２Ｐ２は、ヒトＬＥＰＲのＣＲＨ１  Ｄ２ドメイン内のエピトープに結合した。抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１８４４９Ｐ２、Ｈ４Ｈ１６６５０Ｐ、およびＨ４Ｈ１６６７９Ｐは、ヒトＬＥＰＲのＣＲＨ１（Ｄ１〜２）ドメイン内のエピトープに結合した。抗ＬＥＰＲ抗体対照薬ｍＡＢは、ヒトＬＥＰＲのＣＲＨ２ドメイン内のエピトープに結合した。抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１８４４５Ｐ２は、ヒトＬＥＰＲのＦＮＩＩＩドメイン内のエピトープに結合した。抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１８４４６Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４８２Ｐ２、およびＨ４Ｈ１８４８７Ｐ２は、ヒトＬＥＰＲのＩｇ−ＣＲＨ２−ＦＮＩＩＩドメイン内のエピトープに結合した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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