(57)【要約】  インビトロ3D細胞培養実験のためのマイクロ流体デバイスは、細胞培養物を維持するためのスキャフォールド物質が少なくとも部分的に充填された細胞培養チャンバーを備える本体部を含む。本体部に、スキャフォールド物質に沿って流体流を誘導するための細胞培養チャンバーと連通する流体流路が提供される。スキャフォールド物質の上方の培養チャンバーは、スキャフォールド物質への直接アクセスのために、本体部の外側上面に提供されるアクセスポート内へと開く。スキャフォールド物質は、流体流路をアクセスポートから分離する流体流障壁を形成する。
2018515146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
・細胞培養物を維持するためのスキャフォールド物質が少なくとも部分的に充填された細胞培養チャンバー、及び
・前記スキャフォールド物質に沿って流体流を誘導するための、前記細胞培養チャンバーと連通する流体流路
を備える本体部を含む、
インビトロ3D細胞培養実験のためのマイクロ流体デバイスであって、
前記スキャフォールド物質の上方の前記培養チャンバーが、前記流体流路をアクセスポートから分離する流体流障壁を形成する前記スキャフォールド物質への直接アクセスのために、前記本体部の外側上面に提供されるアクセスポート内へと開くことを特徴とする、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記本体部が、複数の流体流路のセットを含み、各流体流路が、それぞれの流体流を前記スキャフォールド物質に沿って誘導するために前記細胞培養チャンバーと連通し、前記スキャフォールド物質が、それぞれの流体流路を分離することを特徴とする、請求項1に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記アクセスポートが、前記細胞培養チャンバーの直上に提供されることを特徴とする、請求項1又は2に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記流体流路が、前記本体部におけるチャネルであり、各チャネルが、前記本体部の外表面のそれぞれの入口開口部と前記本体部の外表面の出口開口部との間に延在することを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記アクセスポートが、前記本体部の外側上面と前記培養チャンバーへの開口部との間に延びる高さ寸法を有し、前記高さ寸法が、前記本体部の外側上面とそれぞれのチャネルの底面との間に延在する各チャネルの入口開口部の高さ寸法よりも大きいことを特徴とする、請求項4に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記本体部が、前記アクセスポートと前記培養チャンバーとの間に制限壁を含み、前記制限壁が、少なくとも1つの通路開口部を含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
前記制限壁が、円錐状の形状のアクセスポートを画定することを特徴とする、請求項6に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
前記スキャフォールド物質が、外側上面の反対側の前記本体部の底部上に置かれることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
前記流体流路が、前記培養チャンバーの側面で、前記スキャフォールド物質と連通することを特徴とする、請求項8に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
それぞれの流体流路が、前記本体部の底部と外側上面との間の相互に異なる高さで、前記スキャフォールド物質と連通することを特徴とする、請求項9に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
前記流体流路のうちの少なくとも1つが、前記流体流路のうちの別の1つと比較して、前記スキャフォールド物質とのより大きな連通面積を有することを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
前記本体部が、少なくとも3つの流体流路を含むことを特徴とする、請求項1から11のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
3つの流体流路が、前記培養チャンバーのそれぞれの側面でおよそ120度離れて、前記スキャフォールド物質と連通することを特徴とする、請求項12に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
前記3つの流体流路のうちの少なくとも1つが、上面の反対側の前記培養チャンバーの下面で、前記スキャフォールド物質と連通することを特徴とする、請求項12に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
前記流体流路が、少なくともその一部に沿って前記本体部の壁により分離され、前記壁が、壁端部を有し、前記壁端部が、前記培養チャンバーを画定し、前記スキャフォールド物質のための支持構造を形成することを特徴とする、請求項1から14のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
前記本体部の壁のうち少なくとも前記壁端部が、疎水性材料のものであることを特徴とする、請求項15に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１７】
それぞれの流路を分離するそれぞれの壁の少なくとも2つの壁端部が、前記培養チャンバーの仮想外周を画定するよう互いに対して配置され、前記スキャフォールド物質が、前記仮想外周により範囲を定められることを特徴とする、請求項15又は16に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１８】
前記本体部が、マイクロ流体チップであることを特徴とする、請求項1から17のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
前記チップが、複数の培養チャンバー並びに対応するアクセスポート及び流体流路を含むことを特徴とする、請求項18に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２０】
前記流体流路のうちの少なくともいくつかが、連続する培養チャンバー間で共有されることを特徴とする、請求項19に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２１】
前記本体部が、外側上面を有する天板及び底部を有する別個の底板を含み、これらの板が、互いに接着されることを特徴とする、請求項1から20のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２２】
前記底板が、少なくともほぼ完全に平面であることを特徴とする、請求項21に記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養物を維持するためのスキャフォールド物質が少なくとも部分的に充填された細胞培養チャンバー、及びスキャフォールド物質に沿って流体流を誘導するための細胞培養チャンバーと連通する流体流路（fluid path）を備える本体部を含む、インビトロ3D細胞培養実験のためのマイクロ流体デバイスに関する。本発明は、本発明のマイクロ流体デバイスを使用した、複雑な生体組織の再構築を含む、インビトロ3D細胞培養実験のための方法に更に関する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロ細胞培養実験は、生物科学及び医科学において、個別細胞又はより大きな細胞培養物の一部としての細胞の細胞挙動の研究を可能にするために重要である。たとえば、細胞による生体分子の摂取の研究は、細胞、組織、器官及び対象レベルに対するかかる生体分子の効果の知識及び理解の向上をもたらしえ、ひいては、たとえば、オーダーメイド医療の発達をもたらしうる。現在の薬物候補物質の薬物動態学的及び毒性学的評価は、高コストで、労働集約的で、時間がかかり、倫理的に問題のある動物試験システムに大きく依存しており、このシステムは、臨床効果及び毒性について非常に限定された予測値しか示さない。
【０００３】
したがって、細胞をインビトロで培養し、増殖させ、分化させるための多くの方法及びデバイスが開発されてきた。従来の、そして依然として使用されることが多い方法は、好適な成長表面、たとえば液体又はゼリー状培養培地で満たされた細胞培養ディッシュ上での細胞又は細胞培養物の成長及び維持である。培養培地は、所望の仕方で細胞又は細胞培養物の成長及び維持に影響を及ぼす特定の成分を含んでいてもよい。しかしながら、何らかの用途のためのこれらの2次元(2D)細胞培養物モデルの予測値は、生理的文脈の欠如ゆえに、依然として非常に限定されうる。
【０００４】
3Dスキャフォールド、たとえばスキャフォールド物質、たとえばヒドロゲル中にカプセル化された細胞を用いて組織様結合が得られるが、細胞培養条件の制御に制約がある。3Dモデルは、薬物動態学的研究に必要な複雑性をほぼ欠いている。かかるモデルの多くの用途について、細胞培養物への栄養供給に制約があり、薬物に対する細胞応答を混乱させうる代謝廃棄産物の蓄積がある。3Dモデルはまた、インビボで存在する空間時間的な生化学勾配を模倣できず、機械的キュー、たとえば流動、灌流、圧力、機械的応力の供給を欠く。それはまたリアルタイムイメージングにとっても問題であり、反応拡散現象により、生細胞において生化学的解析をほとんど実施できない。更に、活動性の脈管及び関門組織を有する複数の器官/組織模倣物を統合するマイクロシステムを工学的に製造することは容易に可能ではない。
【０００５】
マイクロ流体デバイス、たとえばマイクロ流体チップは、これらの制約への対処を可能にする。マイクロ流体デバイスを用いて、正確に画定された幾何学形状において、流体流をマイクロメートル及びナノリットルスケールで制御できる。マイクロ単位の幾何学的寸法ゆえに、流体流動は層流であり、非常に低量の流体体積の配置が可能である。流体流のタイミングを正確に決定できる能力は、マイクロ環境の正確な化学的及び物理的制御を可能にする。マイクロ流体デバイスにおける細胞培養物について、細胞に送達される用量をナノリットル以下で測定でき、正確性が顕著に改善する。流体の小体積効果が、組織内の細胞又は細胞集団の生理的条件を、より大きな体積で培養された細胞よりも適切に模倣する。マイクロ流体システムはまた、社会的状況での細胞移動の詳細な解析を可能にする。マイクロ環境の空間時間的キュー及び培養細胞の幾何学形状を形成する能力を制御することは、たとえば、マイクロ流体チップにおける初代神経細胞及び細胞株の研究を可能にする。
【０００６】
3Dスキャフォールドシステムとのマイクロ流体の統合は、動的3D構造の創出等、培養条件を生化学及び生体力学の両方の面で適応させることを可能にし、培養細胞からの人工組織の形成を可能にするマイクロ環境を提供する。マイクロ流体細胞培養デバイスは、所定の面積又は体積における細胞数及び細胞密度の正確な制御を可能にし、複雑な幾何学形状での細胞の配置を提供できる。マイクロ流体デバイスにおいて、細胞をスキャフォールド物質、たとえばヒドロゲル中で3次元幾何学形状へと組織できるので、組織内のものと類似した3D構造の細胞を培養することが可能である。マイクロ流体デバイスにおいて、組織学的観点並びに生理的及び機能的観点の両方から各組織を近似的に模倣する、同型組織培養モデル及び異型組織培養モデルが得られる。これは、たとえば、高スループットの薬理学的研究を可能にし、再生目的でのマイクロ流体細胞培養システムの使用ももたらしうる。
【０００７】
マイクロ流体細胞培養デバイスにおける空間的に分離されたマイクロ流体区画の小寸法は、単一のデバイス上のチャンバー内の多数の個別に制御可能な細胞培養物の構築を可能にする。これは、実験の高並列化、試料及び反応の高スループット並びにそれゆえ再現性の改善を、試薬費用の低減とともに容易にする。
【０００８】
上述の利点から、マイクロ流体は、単一細胞動態の解析のために特に価値あるものとなった。マイクロ流体デバイスの助けを得て、細胞成長及び細胞サイズの調節を直接観察でき、単一細胞の系列を複数世代にわたって追跡できる。分子レベルでは、マイクロ流体は、単一細胞における転写因子及び遺伝子発現動態の特徴づけを可能にし、そのことにより、生物システムの機能に関する私たちの理解に実質的に貢献する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在利用可能なインビトロ3D細胞培養実験のためのマイクロ流体デバイスは、細胞培養物及び培養条件を、潜在的な外部からの影響から遮断する閉鎖系を含み、デバイスの培養チャンバー内で成長する細胞培養物への限定的なアクセシビリティしか提供しない。したがって、既知のデバイスは、培養細胞の同時操作及び解析、特に、高い空間及び時間分解能を用いた複雑な幾何学形状の細胞のモニタリング並びに実験中又は実験後の個別の回収を、やや困難にする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
結果として、特に薬物研究、ワクチン開発及び他のタイプの医学研究に応用できる細胞培養研究のための、改善されたマイクロ流体システムが必要とされている。したがって、本発明は、あらゆるタイプの細胞、たとえば脈管細胞及び器官細胞の研究を、個別に又は組織及び臓器の機能単位で、インビトロで可能にする、細胞培養研究のための新規デバイス及び方法を提供する。本発明のこれら及び他の態様は、以下の本明細書及び特許請求の範囲から明らかである。
【００１１】
本発明の一態様では、インビトロでの複雑な生体組織の再構築のためのマイクロ流体デバイスが提供される。本発明の流体デバイスにより再構築されたインビトロの複雑な生体組織は、生きた多細胞生物、たとえば植物又は動物のインビボ組織を、近似的に模倣することが示される。したがって、本発明は、上に記載のインビトロ3D細胞培養実験のためのマイクロ流体デバイスを提供し、このマイクロ流体デバイスは、スキャフォールド物質の上方の培養チャンバーが、流体流路をアクセスポートから分離する流体流障壁を形成するスキャフォールド物質への直接アクセスのために、本体部の外側上面に提供されるアクセスポート内へと開くことを特徴とする。本発明によるデバイスにおけるアクセスポートは、そこの下の培養チャンバーへの直接アクセスを提供する。したがって、スキャフォールド物質は、アクセスポートを通じて培養チャンバー内に簡便に提供され、デバイス内で培養される細胞又は培養チャンバー内の条件は、アクセスポートを介して容易に操作できる。アクセスポートは、たとえば、培養チャンバー内の細胞の容易な播種又は回収を可能にする。
【００１２】
必要ならば、アクセスポート上に好適なカバー又は蓋を配置することにより、マイクロ流体デバイス内の細胞培養環境を外部環境から封鎖できる。カバー又は蓋は、マイクロ流体デバイスの一体部分であっても分離体であってもよい。カバー又は蓋は、好ましくは、マイクロ流体デバイスの本体部と取外し可能に接続され、このことは、任意の所望の時点でアクセスポートを開閉することを可能にする。
【００１３】
本明細書で使用する「流体流障壁」という用語は、流体流の制限を形成する任意の手段を指す。流体流障壁は、流体の自由な流れの方向を一定程度変えるために使用できる。流体流障壁は、一切の流体流の通過を許さないという意味で完全な制限であっても、一部の流体流の通過を可能にするという意味で部分的な制限であってもよい。流体流障壁は、いずれにせよ、流体又はそれらの一部、たとえば流体中の物質、粒子、又は他の成分が、流体流障壁を拡散により通過することを可能にしてもよい。アクセスポートからの流体流路を分離する流体流障壁を形成する、マイクロ流体デバイスの培養チャンバーにおけるスキャフォールド物質の提供ゆえに、マイクロ流体デバイスにおける流体流路を通じて流れる任意の流体の大部分が、培養チャンバーに沿って方向づけられ、培養チャンバーを通過する強い流体流を防止する。結果として、スキャフォールド物質の外側上に曝露される細胞のみが、場合によって表面を横切る剪断応力を受けると考えられ、一方でこれは、スキャフォールド物質に捕捉された細胞培養物については当てはまらないか、又はほとんど当てはまらないと考えられる。
【００１４】
流体流障壁の提供を、組織、たとえば肺、骨、関節軟骨、及び脈管組織の構造の統制を助ける機械力を模倣するために使用できる。重要なことに、線維芽細胞、平滑筋細胞、骨細胞、及び軟骨細胞を含む多くの細胞タイプが、3次元環境内に存在し、間質液の力に曝露されている。生理間質流は、流体が組織の細胞外マトリックス、多くの場合血管と毛細リンパ管との間を通過することである。それは、間質腔を通過する大きなタンパク質の輸送に必要な対流を提供し、微小循環の重要な成分を構成する。間質流はまた、間質組織化及び構造を決定するのに重要な役割を果たしうる特定の機械環境を、間質内の細胞に提供する。したがって、本発明によるマイクロ流体デバイスは、スキャフォールド物質内の培養細胞を間質液の力に曝露し、細胞に必要又は意図される栄養素及び/又は他の生体分子を提供するために、スキャフォールド物質を通過する流体流路からの流体流が間質流のそれを模倣することを可能にする、流体流路と培養チャンバーとの間の流体流障壁を形成するスキャフォールド物質を用いてもよい。組織内で単層を形成し、管腔又は表面を創出し、表面を横切る剪断応力に曝露される細胞のタイプ、たとえば内皮及び上皮細胞は、スキャフォールド物質の外側上に播種し、デバイスの流体流路を通過する流体の流体流に曝露させることができる。
【００１５】
好ましい一実施形態によれば、本発明のマイクロ流体デバイスは、本体部が、それぞれが細胞培養チャンバーと連通する、各流体流をスキャフォールド物質に沿って誘導するための流体流路のセットを含むことを特徴とし、スキャフォールド物質は各流体流路を分離する。本発明によるマイクロ流体デバイスにおける2つ、3つ、4つ、5つ又は更に多くの流体流路からなる流体流路のセットは、スキャフォールド物質の異なる位置にある培養チャンバーへの流体又は流体の成分の供給を可能にし、そのことにより、組織の供給管、たとえば血管及び毛細リンパ管のネットワークを模倣する。目的の成分、たとえば栄養素、化学物質、シグナルタンパク質並びに/又は他の生体分子及び因子を、培養チャンバー内の細胞培養物に供給するため、異なる又は同一の流体が各流体流路を通じて流れていてもよい。
【００１６】
更に好ましい一実施形態によれば、本発明のマイクロ流体デバイスは、アクセスポートが、細胞培養チャンバーの直上に提供されることを特徴とする。アクセスポートがこのように細胞培養チャンバーの直上に提供されるがゆえに、アクセスポートは、細胞培養チャンバーに対する遮られない視野を提供する。したがって、複雑な幾何学形状の培養チャンバー内の細胞を、高い空間及び時間分解能を用いてモニタリングすることが可能である。加えて、スキャフォールド物質の上のアクセスポート内に培地、たとえば流体を提供することにより、スキャフォールド物質上に培地圧が適用され、流体がスキャフォールド物質を通過して灌流するよう刺激する。
【００１７】
本発明のマイクロ流体デバイスの特定の一実施形態は、この点に関して、アクセスポートが、本体部の外側上面と培養チャンバーへの開口部との間を延びる高さ寸法を有し、この高さ寸法が、本体部の外側上面と各チャネルの底面との間に延在する各チャネルの入口開口部の高さ寸法よりも大きいことを特徴とする。たとえば、アクセスポートは、本体部の外側上面で開いていてもよく、この表面は、チャネルの入口開口部が提供される本体部の外表面に対して高い位置にある。チャネルの入口開口部が提供される本体部の外表面は、本体部の外側上面よりも低く位置する本体部の任意の表面、たとえば本体部のより低い水平面、凹面、角度がついた又は垂直な側面等であってよい。したがって、アクセスポートに適用される流体の柱の高さは、デバイスの流体チャネルに適用される各流体のそれと異なっていてもよい。結果として、培養チャンバーへの流体チャネルの流体又は流体成分の拡散及び/又は灌流速度は、アクセスポートにより少量又は多量の流体を適用することにより、所望のとおり制御できる。
【００１８】
更に好ましい一実施形態では、本発明によるマイクロ流体デバイスは、流体流路が、本体部のチャネルであり、各チャネルが、本体部の外表面の各入口開口部と本体部の外表面の出口開口部との間に延在することを特徴とする。チャネルは、入口開口部からスキャフォールド物質に沿って、出口開口部へと流体流を誘導でき、流体はマイクロ単位の量であり、したがって、培養チャンバー内の細胞培養物に供給される流体又は流体成分の量の正確な制御を可能にする。
【００１９】
本発明によるマイクロ流体デバイスの更に好ましい一実施形態は、本体部が、アクセスポートと培養チャンバーとの間に制限壁を含み、制限壁が、少なくとも1つの通路開口部を含むことを特徴とする。制限壁は、アクセスポート内に適用される物質を培養チャンバーへと誘導する手段を提示する一方で、その下に提供されるスキャフォールド物質及び細胞培養物をある程度保護する。たとえば、アクセスポートは、注入手段、たとえばシリンジ又はピペットの先端部の導入が、制限壁まで可能なような寸法であってもよく、そのことにより、かかる注入手段が培養チャンバー内のスキャフォールド物質の完全性に影響を与えるのを防止する。好ましくは、かかるアクセスポートは、培養チャンバーへの物質又は材料の供給を促進するよう、注入手段を通路開口部へと誘導する。この点に関して、本発明のマイクロ流体デバイスは特定の一実施形態において、制限壁がアクセスポートの円錐状の形状を画定することを特徴とする。
【００２０】
アクセスポートと培養チャンバーとの間の制限壁は、スキャフォールド物質の上方に配置され、スキャフォールド物質の上面全体の上方に自由空間を残すことが更に好ましい。したがって、スキャフォールド物質に流体圧を適用するようアクセスポートが流体で満たされるとき、流体は、スキャフォールド物質の上面の上方の自由空間にある制限壁の少なくとも1つの通路開口部を介して蓄積し、その表面全体に流体又は流体の成分を供給し、少なくともほぼ等しい流体圧をその表面全体にわたって適用すると考えられる。本明細書で使用する制限壁という用語は、アクセスポート及び培養チャンバーにより画定される本体部の空間の断面サイズを、アクセスポートと培養物との間の制限された開口部を画定するよう局所的に制限できる任意の手段を指す。かかる手段は、アクセスポート及び培養チャンバーにより画定される空間に面し、前記空間内に内向きに延在する、本体部の一体部分を含んでいてもよい。手段は、代わりに又は加えて、アクセスポート及び培養チャンバーにより画定される本体部の空間内に提供される、分離した手段を含んでいてもよい。
【００２１】
マイクロ流体デバイスのアクセスポート及び培養チャンバーは、幅寸法が同一であっても、幅が異なっていてもよい。特に、アクセスポートの幅は、培養チャンバーの幅より狭くても大きくてもよい。培養チャンバーより大きい幅を有するアクセスポートは、培養チャンバーの幅とほぼ等しい幅寸法を有する通路開口部を含む制限壁により、培養チャンバーから分離されていてもよい。したがって、培養チャンバーは、その幅全体にわたって、通路開口部を通じて直接アクセス可能であり、これは、培養チャンバー全体を充填及び空にすることを可能にする一方で、より広いアクセスポートは、充填材料を通路開口部へと容易に誘導することを可能にし、通路開口部の下方の培養チャンバーに対する遮られない視野を提供する。
【００２２】
マイクロ流体デバイスの培養チャンバー及び流体流路は、任意の形状のものであってよく、互いに形状が異なっていてもよい。たとえば、本発明によるマイクロ流体デバイスの好ましい一実施形態では、流体流路のうちの1つ又は複数が、他の流体流路と比較してより小さい又はより大きい寸法を有し、そのことにより、異なる量の流体を培養チャンバーへとスキャフォールド物質に沿って誘導することを可能にし、異なる供給チャネル、たとえば異なるサイズの血管及び/又は毛細リンパ管を模倣する。
【００２３】
更に好ましい一実施形態では、本発明によるマイクロ流体デバイスは、スキャフォールド物質が外側上面の反対側の本体部の底部上に置かれることを特徴とする。したがって、培養チャンバー内に提供されたあとのスキャフォールド物質は、ただ底部上に置くことにより、培養チャンバー内で維持できる。
【００２４】
本発明によるマイクロ流体デバイスの更に好ましい一実施形態は、培養チャンバーの側面で流体流路がスキャフォールド物質と連通することを特徴とする。スキャフォールド物質の側面に沿った流体流路を通じて流れる流体からの栄養素又は他の物質は、スキャフォールド物質において拡散し、スキャフォールド物質全体を通じて培養チャンバーの幅方向に勾配を特に形成すると考えられる。したがって、スキャフォールド物質において培養される細胞は、培養チャンバー内での幅寸法でのそれらの位置に特に応じて、異なる量のかかる栄養素又は他の物質を提供される。かかる勾配が得られる細胞培養物に与える効果は、アクセスポートを通じて上方から容易に視認できる。
【００２５】
流体流路は、スキャフォールド物質の全高にわたってスキャフォールド物質と連通する寸法であってもよく、たとえば、流体流路を画定する各チャネルの高さは、培養チャンバー内のスキャフォールド物質の高さと同一であっても、培養チャンバーの高さと同一であってもよい。代わりに、流体流路はまた、スキャフォールド物質の一部分、たとえば、培養チャンバー内のスキャフォールド物質の全高の一部にわたってしか連通しないよう構成できる。流体流路を画定するチャネルの高さは、スキャフォールド物質の全高未満であってもよく、又は、チャネルは、スキャフォールド物質の高さとほぼ同等の高さを有していてもよく、制限要素がチャネルと培養チャンバーとの間に提供されて、流体流路とスキャフォールド物質との間の連通表面を制限する。制限要素は、更なる制限壁、又は柱又は他の形状のマイクロ流体デバイスの本体部の一部であってもよい。特に、制限要素は、培養チャンバーとチャネルとの間に延在し、それらの間の連通開口部を画定する、本体部の垂直方向を向いた壁であり、この連通開口部は、対応する流体流路とスキャフォールド物質との間の流体連通を可能にする。
【００２６】
更に好ましい一実施形態では、本発明によるマイクロ流体デバイスは、各流体流路が、本体部の底部と外側上面との間の相互に異なる高さでスキャフォールド物質と連通することを特徴とする。したがって、異なる流体流路が、栄養素又は他の物質を異なる高さでスキャフォールド物質に提供でき、したがって、スキャフォールド物質におけるかかる栄養素又は他の物質の第三次元勾配を創出し、かかる勾配及びかかる第三次元において細胞培養物に与える対応効果の研究を可能にする。
【００２７】
更に好ましい一実施形態によれば、本発明のマイクロ流体デバイスは、流体流路のうちの少なくとも1つが、別の流体流路と比較して、スキャフォールド物質とのより大きな連通面積を有することを特徴とする。流体流路とスキャフォールド物質との間のより大きな連通面積により、より多量の流体又はその成分を細胞に供給することが可能である一方で、かかる流体又はその成分のより正確な局所供給のための、より小さな連通面積を使用できる。
【００２８】
特定の一実施形態によれば、本発明のマイクロ流体デバイスは、本体部が少なくとも3つの流体流路を含むことを特徴とする。更なる特定の一実施形態では、本発明によるマイクロ流体デバイスは、培養チャンバーの側面で互いにおよそ120度離れて3つの流体流路がスキャフォールド物質と連通することを特徴とする。本発明によるマイクロ流体デバイスの更なる特定の一実施形態は、培養チャンバーの上面の反対側の下面で少なくとも3つの流体流路のうちの少なくとも1つがスキャフォールド物質と連通することを特徴とする。この実施形態では、培養チャンバー内のスキャフォールド物質のすべての幾何学的側面、すなわち、スキャフォールド物質の上面、下面、及び側面は、インビボ組織のものを模倣する細胞の複雑な3Dネットワークを創出するため、流体流路のそれぞれを通じて流れ、アクセスポートに提供される流体から、栄養素又は他の物質を提供されうる。
【００２９】
更に好ましい一実施形態では、本発明によるマイクロ流体デバイスは、流体流路が少なくともその一部に沿って本体部の壁により分離され、この壁が壁端部を有し、壁端部が培養チャンバーを画定し、スキャフォールド物質のための支持構造を形成することを特徴とする。壁端部は、スキャフォールド物質のための境界を形成してもよく、これは、スキャフォールド物質が培養チャンバーから流体流路内に漏出し、場合によっては流体流路のうちのいずれかを完全に遮断するのを防止する。更に好ましい一実施形態では、本発明によるマイクロ流体デバイスは、本体部の壁の少なくとも壁端部が、疎水性材料のものであることを特徴とする。したがって、スキャフォールド物質は、細胞培養に好適な親水性材料、たとえば親水性液体、特に水の液滴であってもよく、これは、疎水性壁端部間の培養チャンバー内に維持される。
【００３０】
更に好ましい一実施形態によれば、本発明のマイクロ流体デバイスは、各流路を分離する各壁の少なくとも2つの壁端部が、培養チャンバーの仮想外周(imaginary circumference)を画定するよう互いに対して配置され、スキャフォールド物質が、仮想外周により範囲を定められることを特徴とする。仮想外周は、任意の形状のものであってよい。
【００３１】
特定の一実施形態によれば、本発明のマイクロ流体デバイスは、本体部がマイクロ流体チップであることを特徴とする。本発明によるマイクロ流体デバイスの更に好ましい一実施形態は、マイクロ流体チップが、複数の培養チャンバー並びに対応するアクセスポート及び流体流路を含むことを特徴とする。複数の培養チャンバー並びに対応するアクセスポート及び流体流路は、分離した実験ユニットを形成し、これは、マイクロ流体チップを複数及び/又は並列実験のために使用することを可能にする。チップが本発明によるマイクロ流体デバイスの本体部の簡便な一実施形態であり、たとえば、顕微鏡による培養チャンバー内の細胞培養物の簡便な視覚的検査のために、およそ75×25×1mmの標準的な顕微鏡スライドのサイズに簡便にできるとはいえ、本体部は、代わりに、マルチウェルプレート若しくはマイクロプレートの一部の寸法又はマルチウェルプレート若しくはマイクロプレート、たとえば385ウェルプレートのウェル内に提供するための寸法であってもよい。本発明によるマイクロ流体デバイスの本体部のかかる実施形態では、培養チャンバー、流体流路及びアクセスポートは、ウェルプレートのウェルのそれぞれの底部の近傍に提供できる。ウェルのそれぞれの高さの少なくとも一部又は好ましくは全高を、スキャフォールド物質に対する流体圧を有する流体柱を提供するために使用でき、スキャフォールド物質におけるその灌流速度は制御できる。
【００３２】
本発明によるマイクロ流体デバイスの更に好ましい一実施形態は、流体流路のうちの少なくともいくつかが、連続する培養チャンバー間で共有されることを特徴とする。したがって、連続する培養チャンバーは、共有される流体流路を通じて相互接続され、したがって、分離した要素からなるか又はそれらを含む組織又は器官、たとえば個体のリンパ系において毛細リンパ管により相互接続されたリンパ節を模倣するために使用できる。
【００３３】
更に好ましい一実施形態では、本発明によるマイクロ流体デバイスは、本体部が、外側上面を有する天板及び底部を有する別個の底板を含み、これらの板が、互いに接着されることを特徴とする。流体流路、培養チャンバー及びアクセスポートを含む本体部の空間は、2つの板のそれぞれ又はそれらのうちの1つの外表面に、溝又は凹部として提供でき、結果として本体部は、板を互いに接着するだけで形成できる。特定の一実施形態では、本発明によるマイクロ流体デバイスは、底板が少なくともほぼ完全に平面であることを特徴とする。したがって、天板に空間が提供される一方で、ほぼ完全に平面の底板は、比較的容易に製造される部分であり、底板及び天板を互いに接着することにより空間を封鎖できる。
【００３４】
本発明のこれら及び他の態様は、本出願の一部を形成する添付の図面及び本明細書の以下に記載の対応する実施形態により、更に明らかとなる。図面は、明確且つ明示的に示されない限り、いかなる形でも、本発明の範囲の限定を反映することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】インビトロ3D細胞培養実験のために使用できる、本発明によるマイクロ流体デバイスの一実施形態の上面図を示す図である。
【図２】図1に示す本発明によるマイクロ流体デバイスの実施形態の断面の側面図を示す図である。
【図３】図1及び図2に示す本発明によるマイクロ流体デバイスの実施形態の本体部の端壁により画定される培養チャンバーの拡大概略図を示す図である。
【図４Ａ】本発明による別の一実施形態におけるマイクロ流体デバイスのセットを示す図である。
【図４Ｂ】図4Aの実施形態によるマイクロ流体デバイスの詳細図を、デバイスの中央部の上面図で示す図である。
【図４Ｃ】図4Aの実施形態によるマイクロ流体デバイスの詳細図を、デバイスの中央部の下面図で示す図である。
【図４Ｄ】図4Aの実施形態によるマイクロ流体デバイスの詳細図を、デバイスの中央部の拡大図で示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明によるマイクロ流体デバイスは、複数ユニット生体機能チップとして構成できる。図1〜図3に示すとおり、マイクロ流体デバイスは、PDMSから実質的に形成される本体部1を含み、その内部の複数ユニットのそれぞれが、3つの流体流路10、20、30からなり、これらはチャネルとして構成され、各チャネルは、本体部の外表面2にある対応する入口ポート11、21、31と出口ポート12、22、32との間に延在する。チャネルは、本体部1の中央培養チャンバー3に集まる。培養チャンバー3は、ゲルのブロックの形態のスキャフォールド物質(図2の培養チャンバー3の斜線のブロック)を備える。ゲルのブロックは、本体部の底板2上に置かれる培養チャンバー3内に維持される。ゲルのブロックの側面は、チャネル10、20、30を互いに隔離する本体部の壁の末端部13、23、33(図1及び図3)と結合する。ゲルのブロックは、拡散又は灌流によるチャネルを通じて流れる流体からの栄養素、代謝産物、又は他の成分若しくは化合物の摂取のためのチャネルと連通する。しかしながら、流動は、各チャネルの各入口開口部から、各チャネルの各出口開口部へと、培養チャンバー3内へ流体が直接流れ込むのを防ぐ流体流障壁をもたらすゲルのブロックに沿って誘導される。培養チャンバー3は上面で、本体部1のアクセスポート5へと開かれており、このアクセスポートは、本体部1の外側上面で開いている。アクセスポート5は、培養チャンバー3の直上に提供され、結果として、培養チャンバーはアクセスポートを通じて外部から直接アクセス可能である。アクセスポート5と培養チャンバー3との間に、制限壁(図2)があり、培養チャンバー3とアクセスポート5との間の開口部を画定し、この開口部の断面サイズは、培養チャンバー3及びアクセスポート5のどちらの断面サイズよりも小さい。
【００３７】
このデバイスを用いて、腸組織工学の課題、たとえば、明確に定義された条件下での異なる2-D及び3-D細胞タイプの共培養に対処できる。たとえば、血管/リンパ管内皮又は腸管上皮細胞等の2-D細胞タイプの、並びに、腸間質の様々な接着及び移動細胞、たとえば(筋)線維芽細胞、神経及び免疫細胞等の3-D細胞タイプの、ヒト小腸の管腔から血液への障壁が存在する。この点に関して、流体流路10、20、30と、本実施形態のオープンアクセス培養チャンバー3のスキャフォールド物質との直接的接触は、以下を可能にする。すなわち、1)明確に定義された条件下での、特定の流体流路と連通するスキャフォールド表面上での、血管内皮、リンパ管内皮及び腸管上皮細胞の2-D細胞培養、2)オープンアクセスチャンバーのスキャフォールド物質内での3-D細胞培養、3)オートクリン及びパラクリン細胞性シグナリング及びコミュニケーションを含む、すべての2-D単層と3-D細胞集合スキャフォールドとの直接的相互接触、4)透明底板2を介した、及び/又は、培養チャンバー3の直上にあり、それゆえそれと並んでいるオープンアクセスポート5を介した、細胞性オートクリン及びパラクリンコミュニケーションの直接ライブイメージング、5)培養チャンバーの上のオープンアクセスポートを通じた、3-D細胞集合スキャフォールドからの直接アクセス及びそこからのサンプリング。
【００３８】
一例として、ヒト小腸の腸管上皮の完全分化陰窩-絨毛単位(fully differentiated crypt-villus unit)は、1.5mmの高さに到達しうる。この実施形態による本体部のより大きな流体流路20は、より小さな流体流路10、30と比較して、その3mmの幅及び0.35mmの高さゆえに、マイクロ流体デバイスの平線方向と平行に陰窩-絨毛単位の完全3-D発生及び分化を可能にする。
【００３９】
異なるチャネル10、20、30を介して剪断応力、圧力及び生化学的刺激を用いた培養細胞の生体力学的及び生化学的刺激は、たとえば、毛細血管から間質を通じたリンパ管内への血漿の動力学的運動、酸素等の間質内の様々な化合物、様々なシグナリング分子及び代謝産物の生化学的勾配、並びに間質の毛細状の腸管腔からリンパ系への細胞移動のような、一定の複雑な状況のインビトロ刺激を可能にする。分離された流体流路は、培地(上清)を評価のため異なる流体流路からサンプリングする絶好の機会を提供する。
【００４０】
図4A〜図4Dには、本発明によるマイクロ流体デバイス、特にチップの一実施形態を示し、これは、図1〜図3の実施形態と概ね類似するが、3つの流体流路の代わりに、本体部の中央に位置する培養チャンバーと連通する4つの流体流路を本体部が含む点が、主に異なる。特に図4Aに示すとおり、マイクロ流体デバイスは、複数の培養チャンバー並びに対応するアクセスポート及び流体流路を含み、これらは分離した実験ユニットを形成する。したがって、マイクロ流体チップを、複数及び/又は並列実験のために使用できる。4つの流体流路は、4つの異なる側で、互いにおよそ90度離れて、培養チャンバーと連通するよう構成される。流体流路の入口及び出口開口部はすべて、本体部の外側上面に、その側方端部に沿って提供される。アクセスポートは、より中央に配置され、互いに合わせて整列される。マイクロ流体デバイスは、前述の説明に従い使用できる。
【００４１】
1つのマイクロ流体デバイス、たとえば1つの本体部、たとえばチップにおける本実施形態の複数のユニットの相互接続は、かかるマイクロ流体チップを1つしか使用せずに、より複雑な系、たとえばヒト消化器系(たとえば口-胃-腸)又はヒト身体(たとえば腸-肝臓-心臓(hart))の創出を可能にする。本発明によるマイクロ流体デバイスのこの実施形態の能力は、組織及びマイクロ流体工学のみならず、システム生物学における課題に対処するのにも役立ちうる。インビトロモデルは、個々の生体機能チップのスケールでの生物システムのコミュニケーション及び制御について知るための実験を提供する。この複雑で、強力で、統合されたシステムは、ヒト胃腸管の器官間及び器官内シグナリング及び動態を再現することを可能にする。
【００４２】
別段定義しない限り、本明細書において使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により理解されるのと同じ意味を有する。本発明における使用のための方法及び材料を本明細書に記載する。しかしながら、当該技術分野において知られている他の好適な方法及び材料もまた使用できる。材料及び例は例示に過ぎず、特に指示のない限り、限定することを意図しない。別段記載しない限り、以下の定義を使用する。
【００４３】
本明細書で使用する「マイクロ流体デバイス」という用語は、小さなスケール、典型的にはミリメートル未満のスケールに幾何学的に制約された流体の正確な制御及び操作を可能にし、細胞培養物、特に3D細胞培養物の実験に好適な任意のデバイスを指す。このデバイスは、細胞環境の制御を可能にするツールである。本明細書で使用するマイクロ流体デバイスの特定の一実施形態は、マイクロ流体チップである。特にマイクロ流体チップ等のマイクロ流体デバイスは、好ましくは、SiO2、ガラス及び合成ポリマーの材料のうちの1つ又は複数でできている。合成ポリマーとして、ポリシロキサン、特にポリジメチルシロキサン(PDMS)が好ましいが、他のポリマー、たとえばポリカーボネート(PC)、ポリスチロール(PS)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)又は環状オレフィンコポリマー(COC)も使用できる。特に、マイクロ流体デバイスのための材料としてのPDMSは、所望の幾何学的構造の容易な実施を可能にし、優れた生細胞イメージング条件を提供する。なぜなら、PDMSは比較的透明であり、安定的な光学的特徴、特に、低い自己蛍光レベルを有するからである。したがって、PDMSでできたマイクロ流体細胞培養デバイスは、蛍光生細胞イメージングの使用を可能にし、単一細胞並びに集団レベルでの多数の細胞応答の強力な特徴づけを提供する。ポリジメチルシロキサン(PDMS)のソフトリソグラフィーは、細胞培養用途のためのマイクロ流体デバイスの製造のための簡便な方法である。この手法を用いて、マイクロメートル単位の分解能の構造を、ハードマスターからPDMSに成型できる。かかるマイクロ流体デバイスは、流体流並びに培地、薬物及びシグナリング因子の生細胞への送達の正確な空間及び時間制御を可能にする。
【００４４】
2種以上の上の材料の混合物が、デバイス又はデバイスの一部のために用いられうるとはいえ、マイクロ流体デバイスは、最大で数種の異なる材料しか含まず、好ましくは、少なくともほぼ全体が、本体部の変形に対する高い耐性を提供する単一の材料、たとえばCOCでできていることが好ましい。
【００４５】
本明細書で使用する「3D細胞培養物」という用語は、細胞が互いに対して3次元に、すなわち、幅、奥行及び高さを有するよう配置された細胞培養物を指す。かかる3D細胞培養物は、ほとんどの細胞について、組織、器官及び対象における細胞間環境をより良好に模倣する。本発明によるマイクロ流体デバイスは、かかる3D細胞培養物を培養するのに特に好適であるが、2D細胞培養物のためにも使用できる。
【００４６】
本明細書で使用する「スキャフォールド物質」という用語は、多次元、好ましくは3次元の空間的関係において生細胞を維持することが可能な、任意の物質を指す。スキャフォールド物質は、液体、ゲル又は固体であってもよい。本発明によるマイクロ流体デバイスにおける使用のためのスキャフォールド物質の非限定的な例は、水、ヒドロゲル、寒天ゲル、マイクロポアスキャフォールド、マイクロファイバースキャフォールド、膜及びホローファイバーである。
【００４７】
本明細書で使用する「流体」という用語は、適用される剪断応力下で連続的に流れる任意の物質を指す。本明細書で使用する流体は、液体、気体及びプラズマを含んでいてもよい。
【００４８】
本明細書で使用する「流体流路」という用語は、一定量の流体が流れて通過できる任意の空間、たとえばコンパートメント、チャネル、チャンバー、又はキャビティを指す。
【００４９】
明確さ及び簡潔な説明を目的として、同じ又は別個の態様及びその好ましい実施形態の一部として特徴が本明細書に記載されている。しかしながら、本発明の範囲は、記載の特徴の全部又は一部の組合せを有する実施形態を含んでいてもよいことが認められると考えられる。
【符号の説明】
【００５０】
1  本体部
2  本体部の外表面
3  中央培養チャンバー
5  アクセスポート
10  流体流路
11  入口ポート
12  出口ポート
13  壁の末端部
20  流体流路
21  入口ポート
22  出口ポート
23  壁の末端部
30  流体流路
31  入口ポート
32  出口ポート
33  壁の末端部
【図１】
2018515146.tif 000003
【図２】
2018515146.tif 000004
【図３】
2018515146.tif 000005
【図４Ａ】
2018515146.tif 000006
【図４Ｂ】
2018515146.tif 000007
【図４Ｃ】
2018515146.tif 000008
【図４Ｄ】
2018515146.tif 000009
【国際調査報告】
2018515146.tif 000010
2018515146.tif 000011
2018515146.tif 000012