(57)【要約】本開示の側面は、腫瘍それ自身内からの腫瘍に対する強力かつ有効な免疫療法を引き起こし、こうして既存のがん免疫療法および腫瘍検出遺伝子回路の限界を克服する、プラットフォームを提供する。【選択図】図２Ｂ
2018520669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸、および
（ｂ）（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸
を含む操作された遺伝子回路。 
【請求項２】
出力ｍＲＮＡが、合成Ｔ細胞エンゲージャー（engager）（ＳＴＥ）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（engager）（ＢｉＴＥ）をコードする、請求項１に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項３】
出力ｍＲＮＡが、Ｔ細胞表面マーカーに結合する出力タンパク質をコードする、請求項１に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項４】
Ｔ細胞表面マーカーが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ４５である、請求項３に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項５】
出力タンパク質が、Ｔ細胞表面抗原に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項６】
出力ｍＲＮＡが抗がん剤をコードする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項７】
抗がん剤がケモカイン、サイトカインまたはチェックポイント抑制剤である、請求項６に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項８】
（ａ）および／または（ｂ）のプロモータが誘導型のプロモータである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項９】
（ａ）および／または（ｂ）のプロモータが、腫瘍特異的プロモータまたはがんプロモータである、請求項８に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項１０】
（ａ）および／または（ｂ）のプロモータが、ＳＳＸ１またはＨ２Ａ１である、請求項９に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項１１】
（ａ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な２〜５個のｍｉＲＮＡ結合部位をコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項１２】
（ｂ）のヌクレオチド配列が、（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な２〜１０個のｍｉＲＮＡ結合部位をコードする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項１３】
出力タンパク質が、転写因子である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項１４】
出力核酸または出力タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモータを含む、少なくとも１つの核酸をさらに含む、請求項１３に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項１５】
出力ｍＲＮＡが、少なくとも１つの核酸のプロモータへ結合し、転写を活性化し得る転写因子をコードする、請求項１４に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項１６】
（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む追加の出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）、（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸をさらに含む、ここで、追加の出力ｍＲＮＡが、ケモカイン、サイトカイン、チェックポイント抑制剤またはそれらの組み合わせをコードする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの操作された遺伝子回路を含む細胞。
【請求項１８】
細胞が腫瘍細胞である、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの操作された遺伝子回路を、腫瘍を有する対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
対象が、卵巣がん、乳がんまたは肺がんを有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
操作された遺伝子回路が、対象に全身に投与される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
操作された遺伝子回路が、ウイルス送達系を用いて送達される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ウイルス送達系が、レンチウイルス送達系、アデノウイルス送達系またはアデノ随伴ウイルス送達系である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
操作された遺伝子回路が、非ウイルス送達系を用いて送達される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
操作された遺伝子回路が、対象の腫瘍に局所的に投与される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２６】
操作された遺伝子回路が、ヒドロゲルベースの送達系を用いて腫瘍に局所的に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
操作された遺伝子回路の少なくとも１つの出力ｍＲＮＡが、Ｔ細胞表面マーカーに結合する出力タンパク質をコードし、少なくとも１つの他の操作された遺伝子回路の出力ｍＲＮＡが、ケモカイン、サイトカインまたはチェックポイント抑制剤をコードする、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
膜貫通型タンパク質と融合する抗ＣＤ３ｅ  ｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む組成物。
【請求項２９】
膜貫通型タンパク質が、ケモカインのための細胞質切断型Ｄｕｆｆｙ（ダフィー)抗原／受容体（ＤＡＲＣ）を含む、請求項２８に記載の組成物。 
【請求項３０】
ヒトＩｇＧ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、マウスＢ７．１膜貫通型および細胞質ドメインと融合した抗ＣＤ３ｅ  ｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む組成物。
【請求項３１】
（ａ）（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列、に作動可能に連結された第１の腫瘍特異的プロモータを含む第１の核酸、ここで、出力ｍＲＮＡが、合成Ｔ細胞エンゲージャーまたは二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーをコードし、および
（ｂ）（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のプロモータと異なる第２のプロモータを含む第２の核酸
を含む操作された遺伝子回路。 
【請求項３２】
（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む追加の出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された腫瘍特異的プロモータを含む核酸をさらに含む、ここで、追加の出力ｍＲＮＡが、ケモカイン、サイトカイン、チェックポイント抑制剤またはそれらの組み合わせをコードする、請求項３１に記載の操作された遺伝子回路。
【請求項３３】
（ａ）以下に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸
（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）イントロンｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）以下に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸
（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む出力ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）イントロンｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−ＢＳをコードするヌクレオチド配列；および
（ｃ）ｍｉＲＮＡ−ＢＳに作動可能に連結された出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ含む第３の核酸、
ここで、（ａ）（ｉｉｉ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳが（ｂ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、（ｂ）（ｉｉｉ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳが（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、および（ｃ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳが（ａ）（ｉｉ）のｍｉＲＮＡおよび（ｂ）（ｉｉ）のｍｉＲＮＡに相補的である、
を含む操作された遺伝子回路。 
【請求項３４】
（ａ）以下に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸
（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む新生ＲＮＡの転写物をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）以下に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸
（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳをコードするヌクレオチド配列；および
（ｃ）（ｉ）第１のｍｉＲＮＡ−ＢＳおよび（ｉｉ）第２のｍｉＲＮＡ−ＢＳに連結された出力タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモータを含む第３の核酸、
ここで、（ａ）（ｉｉ）の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳが（ｂ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、少なくとも１つの（ｂ）（ｉｉ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳが（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、および（ｃ）（ｉ）の第１のｍｉＲＮＡ−ＢＳはが（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、および（ｃ）（ｉｉ）の第２のｍｉＲＮＡ−ＢＳが（ｂ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的である、
を含む操作された遺伝子回路。 
【請求項３５】
（ａ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸；
（ｂ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸；
（ｃ）（ｉ）第１のｍｉＲＮＡ−ＢＳ、および（ｉｉ）第２のｍｉＲＮＡ−ＢＳに連結する出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第３の核酸、
ここで、（ｃ）（ｉ）の第１のｍｉＲＮＡ−ＢＳが（ａ）のｍｉＲＮＡに相補的であり（ｃ）（ｉｉ）の第２のｍｉＲＮＡ−ＢＳが（ｂ）のｍｉＲＮＡに相補的である、
を含む操作された遺伝子回路。 
【請求項３６】
（ａ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸；および
（ｂ）ｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）に連結する出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸；
ここで、（ｂ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ａ）のｍｉＲＮＡに相補的である、
を含む操作された遺伝子回路。 
【請求項３７】
（ａ）（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸；および
（ｂ）（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む出力ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳに作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸、
ここで、（ａ）の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳが（ｂ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、（ｂ）の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳが（ａ）のｍｉＲＮＡに相補的である、
を含む操作された遺伝子回路。 
【請求項３８】
（ａ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸；
（ｂ）出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸；および
（ｃ）ｍｉＲＮＡ結合部位に連結する出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第３の核酸、
ここで、（ｃ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ａ）のｍｉＲＮＡに相補的である、
を含む操作された遺伝子回路。 
【請求項３９】
（ａ）マイクロＲＮＡ−ＢＳ（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）に連結する出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸；
（ｂ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸、
ここで、（ａ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳは（ｂ）のｍｉＲＮＡに相補的である、
を含む操作された遺伝子回路。 
【請求項４０】
複数の核酸を含む合成プロモータ・ライブラリーであって、各核酸は、各８ｍｅｒのヌクレオチド配列の間にいかなるスペーサーヌクレオチドを伴わずに直列に少なくとも２つの８ｍｅｒのヌクレオチド配列を有するプロモータ配列を含む、前記合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項４１】
各核酸が、各８ｍｅｒのヌクレオチド配列の間にいかなるスペーサーヌクレオチドを伴わずに直列に少なくとも６個の８ｍｅｒのヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項４２】
各核酸が、各８ｍｅｒのヌクレオチド配列の間にいかなるスペーサーヌクレオチドを伴わずに直列に少なくとも１２個の８ｍｅｒのヌクレオチド配列を含む、請求項４０または請求項４１に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項４３】
８ｍｅｒのヌクレオチド配列が、ＮＮＮＮＮＮＮＮであり、ここで、各Ｎは任意のヌクレオチド配列を表す、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項４４】
核酸の各々が、さらに、５’および３’末端に制限ヌクレアーゼ部位を含む、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項４５】
５’末端の制限ヌクレアーゼ部位が、ＳｂｆＩ部位であり、３’末端の制限ヌクレアーゼ部位が、ＡｓｃＩ部位である、請求項４４に記載の合成プロモータ・ライブラリー。 
【請求項４６】
核酸の各々が、さらに、プロモータ配列に作動可能に連結された出力分子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項４７】
出力分子が、検出可能な分子である、請求項４６に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項４８】
複数の核酸を含む合成プロモータ・ライブラリーであって、各核酸は、各８ｍｅｒのヌクレオチド配列の間に３マースヌクレオチドペーサーを伴って直列に少なくとも２つの８ｍｅｒのヌクレオチド配列を有するプロモータ配列を含む、前記合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項４９】
各核酸が、各８ｍｅｒのヌクレオチド配列の間に３ｍｅｒのヌクレオチド・スペーサーを伴って直列に少なくとも６個の８ｍｅｒのヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項５０】
各核酸が、各８ｍｅｒのヌクレオチド配列の間に３ｍｅｒのヌクレオチド・スペーサーを伴って直列に少なくとも９個の８ｍｅｒのヌクレオチド配列を含む、請求項４８または請求項４９に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項５１】
８ｍｅｒのヌクレオチド配列が、ＮＮＮＮＮＮＮＮであり、各Ｎが任意のヌクレオチドを表す、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項５２】
核酸の各々が、さらに、５’および３’末端において制限ヌクレアーゼ部位を含む、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項５３】
５’末端における制限ヌクレアーゼ部位がＳｂｆＩ部位であり、３’末端における制限ヌクレアーゼ部位がＡｓｃＩ部位である、請求項５２に記載の合成プロモータ・ライブラリー。 
【請求項５４】
３ｍｅｒのヌクレオチド・スペーサーが、ＡＧＣ、ＡＴＣ、ＧＡＣ、ＡＣＴ、ＡＧＴ、ＧＴＣ、ＧＡＴ、およびＧＣＴから選択される、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項５５】
３ｍｅｒのヌクレオチド・スペーサーが異なる、請求項５４に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項５６】
核酸の各々が、さらに、プロモータ配列に作動可能に連結された出力分子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項５７】
出力分子が、検出可能な分子である、請求項５６に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項５８】
複数の核酸を含む合成プロモータ・ライブラリーであって、ここで、各核酸は、各１１ｍｅｒのヌクレオチド配列の間に３ｍｅｒのヌクレオチド・スペーサーを伴って直列に少なくとも２つの１１ｍｅｒのヌクレオチド配列を有するプロモータ配列を含む、前記合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項５９】
各核酸は、各１１ｍｅｒのヌクレオチド配列の間に３ｍｅｒのヌクレオチド・スペーサーを伴って直列に少なくとも４つの１１ｍｅｒのヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項６０】
各核酸は、各１１ｍｅｒのヌクレオチド配列の間に３ｍｅｒのヌクレオチド・スペーサーを伴って直列に少なくとも７つの１１ｍｅｒのヌクレオチド配列を含む、請求項５８または請求項５９に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項６１】
１１ｍｅｒのヌクレオチド配列が、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮであって、各Ｎが任意のヌクレオチドである、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項６２】
核酸の各々が、さらに、５’および３’末端に制限ヌクレアーゼ部位を含む、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項６３】
５’末端における制限ヌクレアーゼ部位がＳｂｆＩ部位であり、３’末端における制限ヌクレアーゼ部位がＡｓｃＩ部位である、請求項６２に記載の合成プロモータ・ライブラリー。 
【請求項６４】
３ｍｅｒのヌクレオチド・スペーサーが、ＡＧＣ、ＡＴＣ、ＧＡＣ、ＡＣＴ、ＡＧＴ、ＧＴＣ、ＧＡＴ、およびＧＣＴから選択される、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項６５】
３ｍｅｒのヌクレオチド・スペーサーが異なる、請求項６４に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項６６】
核酸の各々が、さらに、プロモータ配列に作動可能に連結された出力分子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５８〜６５のいずれか一項に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項６７】
出力分子が、検出可能な分子である、請求項６６に記載の合成プロモータ・ライブラリー。
【請求項６８】
出力分子に作動可能に連結された合成プロモータ配列を含む核酸分子を含むライブラリーを得ること、
１以上のタイプの細胞においてライブラリーを発現させること、
出力分子の発現を検出すること、および 
出力分子が発現される細胞を単離すること 
を含む合成プロモータを選択する方法。 
【請求項６９】
単離された細胞において、合成プロモータ配列の配列を決定することをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
１以上のタイプの細胞が、少なくとも２つの異なるタイプの細胞である、請求項６８または請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも２つの異なるタイプの細胞の各々において、出力分子の発現を駆動する合成プロモータ配列を比較して、少なくとも２つの異なるタイプのうちの１つにおいて、少なくとも２つの異なるタイプの細胞のうちの別のものと比較して、より活性な合成プロモータ配列を同定することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも２つの異なるタイプの細胞が、がん細胞および非がん細胞であり、ここで、プロモータが、非がん細胞よりもがん細胞においてより活性があると同定される、請求項７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願 
本願は、２０１５年６月１９日出願の米国仮出願番号６２／１８１，９０６、および２０１６年４月２０日出願の米国仮出願６２／３２５，３１４の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下の利益を主張し、その各々は、その全体において本願明細書に参照によって組み入れられる。 
【０００２】
本開示の側面は、バイオテクノロジーの一般的分野に、およびより詳しくは合成生物学、および免疫学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
化学療法および標的療法などの多くのがん（例えば、卵巣がん）のための既存の処置は、転移性疾患を治癒することができず、腫瘍の再発を予防することができない。さらに、化学療法などの標準治療処置は、重大な罹患率および毒性を引き起こし得る。原発性および転移性卵巣がんを処置し、長期有効性を達成するためには、新しい治療戦略が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
本願明細書において、いくつかの側面においては、腫瘍そのもの内からの腫瘍に対する強力かつ有効な免疫療法を引き起こし、こうして既存のがん免疫療法および腫瘍検出遺伝子回路の限界を克服するプラットフォームが提供される。いくつかの態様において、本開示の操作された遺伝子回路は、腫瘍細胞の抗原非依存性のＴ細胞死滅を引き起こし得る、がん細胞表面上のＴ細胞エンゲージングタンパク質（表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）と呼ばれる）を発現する。いくつかの態様において、操作された遺伝子回路は、腫瘍に送達され（例えば、図２Ａおよび２Ｂ参照）、がん細胞においてのみ選択的に活性化され、ＳＴＥの表面表示、および腫瘍を標的にするＴ細胞を回復する他の免疫調節分子の分泌をもたらす。有利なことは、本開示の操作された遺伝子回路は、全身的に投与することができるが、がん細胞においてのみ局所的に活性化することができ、安全性の向上および副作用の低減をもたらす。したがって、本開示のプラットフォームは、いくつかの態様において、全身送達（例えば、転移の処置）の利点を、局所的処置（例えば、安全性、最小の副作用）の利点と組み合わせる。
【０００５】
既存の療法は、本開示によって克服される特定の制限によって妨げられる。ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）Ｔ細胞療法において、例えば、Ｔ細胞は、各個体に対してオーダーメイドにされなければならない。別の例として、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）（Iwahori K. et al., Molecular Therapy, 2015, 23(1): 171-178, 参照によって本願明細書に組み込まれる）は、それらの短い半減期によって制限され、したがって、４〜８週間、連続静脈内ポンプ注入を要する。両方の療法は、腫瘍細胞表面抗原を標的とする。しかしながら、すべての腫瘍型が検出のために理想的な表面腫瘍抗原を有するわけではない。がん検出遺伝子回路は、これらの回路の全ての（またはほとんどの）腫瘍細胞への送達は事実上不可能であるけれども、毒素を介して細胞死を誘導する細胞内死滅機構を利用することができる。
【０００６】
本開示は、いくつかの側面において、方法および操作された（組み換えまたは合成）遺伝子回路（例えば、操作された哺乳類の遺伝子回路）を提供し、いくつかの態様において、ＲＮＡベースの「論理ゲート」（例えば、遺伝子回路は、主にＲＮＡを含む核酸を含むか、または該遺伝子は、ＲＮＡからなる核酸を含む）と呼ばれ、したがって、異種タンパクは細胞または対象に導入されないので、所望されない免疫原性反応の類を削減する。
【０００７】
いくつかの態様において、本開示は、がん細胞の特異的検出および免疫調整剤（例えば、サイトカイン）の生産のための方法および操作された遺伝子回路を提供する。いくつかの態様において、本願明細書に提供される方法および遺伝子回路は、がん細胞の「bystander killing」のために用いられ、それによって、メモリーＴ細胞は、本開示の操作された遺伝子回路によって直接的に変換されないがん細胞を破壊するように誘発される。
【０００８】
いくつかの態様において、本開示は、特異的な細胞（例えば、がん細胞）から放出される組み合わせの免疫調節剤の標的発現のための方法および操作された遺伝子回路を提供する。いくつかの態様において、操作された遺伝子回路は、ＣＤ３に結合する分子をコードし、該ＣＤ３細胞は、標的がん細胞（抗ＣＤ３細胞）の表面で発現されるとき、Ｔ細胞を直接的に利用して、局所化され標的化された免疫療法をもたらす、操作された遺伝子回路によって標的化／検出されたがん細胞を死滅させる、合成Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）として機能する。他の態様において、操作された遺伝子回路は、２重指向性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）をコードし、該Ｔ細胞が、細胞によって発現され、抗原特異的領域を介して細胞に結合されたときに、Ｔ細胞を利用して細胞を殺す。ＢｉＴＥは、局所生産を提供する操作された遺伝子回路（論理ゲート）およびＳＴＥの使用で観察される同じ利点を使用して、特定の細胞型内で選択的に発現され得る。
【０００９】
いくつかの態様において、ＳＴＥは、ＢｉＴＥが典型的には、Ｔ細胞の死滅を誘発する腫瘍特定表面抗原の認識を要するので、一般的標的免疫療法として使用され得る。
本開示の標的化された免疫療法は、高い有効性および安全性を有する全身送達を可能にする点で、既存の療法とは異なる。いくつかの態様において、他のサイトカインおよび免疫療法剤を使用する併用療法は、本開示の標的免疫療法の効力をさらに増強する。
【００１０】
いくつかの態様において、本開示は、疾患（自己免疫および神経学的疾患を包含するが限定されない）における異常な細胞状態の検出のための、および／または疾患を調節するための免疫調節剤的分子および治療分子の発現または分泌のための方法および操作された遺伝子回路を包含する。
【００１１】
いくつかの態様において、本開示の免疫療法的プラットフォームは、また診断薬として役立ち得る、出力（例えば、検出可能な分子をコードする操作された遺伝子回路）を含む。
【００１２】
いくつかの態様は、免疫調節剤分子（例えば、「表面Ｔ細胞エンゲージャー」またはＳＴＥ）またはマイクロＲＮＡ結合部位に連結された二重特異性モノクローナル抗体をコードするｍＲＮＡ内にマイクロＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結された、がん特異性プロモータを含む、操作された核酸を提供する。
【００１３】
いくつかの態様において、免疫調節剤分子または二重特異性モノクローナル抗体は、操作された核酸の転写が活性化されたときだけ翻訳される。
本願明細書に提供されるのは、また、マイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡ転写をコードする核酸に作動可能に連結されたがん特異性プロモータを含む操作された核酸である。
【００１４】
本明細書にさらに提供されるのは、図３Ａ〜図３Ｄ、図４Ａ、図６Ａ、図７Ａ〜図７Ｈ、図９Ａ、図１４Ａ、図１５Ａ、図１６Ａ、および図１７Ａのいずれかに示される操作された核酸である。
本開示は、また、本願明細書に提供されるように、操作された核酸のいずれかを含むベクトルを提供する。本開示は、また、本願明細書に提供されるように、ベクトルおよび／または操作された核酸のいずれかを含む細胞を提供する。
【００１５】
本開示のいくつかの態様は、（ａ）（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸、および（ｂ）（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸を含む操作された遺伝子回路を提供する。
【００１６】
本開示の別の態様は、以下を含む操作された遺伝子回路を提供する：（ａ）
（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）イントロンｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）をコードするヌクレオチド配列、に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸；
（ｂ）（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む出力ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）イントロンｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−ＢＳをコードするヌクレオチド配列、に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸；および
（ｃ）ｍｉＲＮＡ−ＢＳに連結された出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第３の核酸、ここで、（ａ）（ｉｉｉ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ｂ）（ｉ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳに相補的であり、（ｂ）（ｉｉｉ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、および（ｃ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ａ）（ｉｉ）のｍｉＲＮＡおよび（ｂ）（ｉｉ）のｍｉＲＮＡに相補的である。
【００１７】
本開示のまた別の態様は、以下を含む操作された遺伝子回路を提供する：（ａ）以下に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸、（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む新生ＲＮＡ転写物（例えば、非コード化ＲＮＡ転写物）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）以下に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸、（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳをコードするヌクレオチド配列；および（ｃ）（ｉ）第１のｍｉＲＮＡ−ＢＳおよび（ｉｉ）第２のｍｉＲＮＡ−ＢＳに連結された出力タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモータを含む第３の核酸、ここで、（ａ）（ｉｉ）の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳは（ｂ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、少なくとも１つの（ｂ）（ｉｉ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳは（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、および（ｃ）（ｉ）の第１のｍｉＲＮＡ−ＢＳは（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、および（ｃ）（ｉｉ）の第２のｍｉＲＮＡ−ＢＳは（ｂ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的である。
【００１８】
本開示のなお別の態様は、以下を含む操作された遺伝子回路を提供する：（ａ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸；（ｂ）イントロンｍｉＲＮＡを含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸；および（ｃ）（ｉ）第１のｍｉＲＮＡ−ＢＳ、および（ｉｉ）第２のｍｉＲＮＡ−ＢＳに連結された出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に配列されたプロモータを含む第３の核酸、ここで、（ｃ）（ｉ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ａ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、および（ｃ）（ｉｉ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ｂ）のｍｉＲＮＡに相補的である。
【００１９】
本開示のさらに別の態様は、（ａ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸、および（ｂ）ｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）に連結された出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸、ここで、（ｂ）のｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ａ）のｍｉＲＮＡに相補的である、を含む操作された遺伝子回路を提供する。
【００２０】
本開示の別の態様は、以下を含む操作された遺伝子回路を提供する：（ａ）（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸、および（ｂ）（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む出力ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳ、に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸、ここで、（ａ）の該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ｂ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、（ｂ）の該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ａ）のｍｉＲＮＡに相補的である。
【００２１】
本開示のその上別の態様は、（ａ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸、（ｂ）出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸、および（ｃ）ｍｉＲＮＡ結合部位に連結された出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第３の核酸、ここで、（ａ）の該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ｂ）のｍｉＲＮＡに相補的であり、（ｂ）の該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ａ）のｍｉＲＮＡに相補的である、を含む操作された遺伝子回路を提供する。
【００２２】
本開示のなお別の態様は、（ａ）マイクロＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ−ＢＳ）に連結された出力タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第１の核酸、および（ｂ）イントロンｍｉＲＮＡを含む新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む第２の核酸、ここで、（ａ）の該ｍｉＲＮＡ−ＢＳは、（ｂ）のｍｉＲＮＡに相補的である、を含む操作された遺伝子回路を提供する。
【００２３】
いくつかの態様において、出力ｍＲＮＡは、合成Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）をコードする。
いくつかの態様において、出力ｍＲＮＡは、Ｔ細胞表面マーカーに結合する出力タンパク質をコードする。
いくつかの態様において、Ｔ細胞表面マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ４５である。
いくつかの態様において、出力タンパク質は、Ｔ細胞表面抗原に特異的に結合する抗体、または抗体フラグメントである。
いくつかの態様において、出力ｍＲＮＡは、抗がん剤をコードする。例えば、出力ｍＲＮＡは、ケモカイン、サイトカイン、またはチェックポイント抑制剤をコードし得る。
いくつかの態様において、プロモータは、誘導性のプロモータである。例えば、プロモータは、腫瘍特異的プロモータ（例えば、良性の腫瘍特異的プロモータ、または悪性の腫瘍特異的プロモータ）またはがんプロモータであり得る。
いくつかの態様において、プロモータは、ＳＳＸ１またはＨ２Ａ１である。
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、２−５、または２−１０個のマイクロＲＮＡ結合をコードする。
いくつかの態様において、出力タンパク質は、転写因子である。
いくつかの態様において、出力タンパク質は、抗がん剤である。
いくつかの態様において、出力ｍＲＮＡは、少なくとも１つの核酸のプロモータの転写に結合し、およびそれを活性化することができる転写因子をコードする。
いくつかの態様において、操作された遺伝子回路は、機能性タンパク質二量体の各タンパク質が、分離した核酸にコードされ、分離したプロモータによって調整される、スプリットタンパク質系をコードする核酸を含む。
【００２４】
該発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは図面に示される構成成分の構成および配置の詳細に限定されない。該発明は、さまざまなやり方において、他の態様を受け入れ可能で、実施し、または行うことができる。上の態様および側面の各々は、任意の他の態様または側面に連結し得る。また、本願明細書に使用される表現法および用語は、記載の目的のためであり、限定として見なすべきではない。本明細書における「含有する」「含む」「有する」「包含する」「関与する」およびその変形の使用は、それ以降に列挙した事項、その均等物、追加の事項も包含することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
添付の図面は一定の縮尺で描かれているものではない。明確化の目的のために、全ての構成成分が各図面においてラベル付けされていないかもしれない。
【図１】図１Ａ−１Ｃ。先の免疫療法アプローチの例。（図１A）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法の作用様式。（図１Bおよび１C）二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの作用様式。
【図２】図２Ａ−Ｂ。ＳＴＲＩＣＴ療法の概観。（図２A）ＢｉＴＥを分泌するためにＳＴＲＩＣＴを使用する。（１）腫瘍同定回路は、局所注射または全身投与によって腫瘍に導入される。（２）回路で形質導入された腫瘍細胞は、局所的に拡散するＢｉＴＥおよび他の免疫調節分子を分泌する。（３）ＢｉＴＥは、腫瘍細胞上のＨＥＲ２および局所腫瘍浸潤性Ｔ細胞上のＴ細胞受容体と同時に関わり、こうしてＴ細胞を誘発して腫瘍細胞を直接殺す。ＢｉＴＥはまた、腫瘍部位に近づくために、近くの循環Ｔ細胞をリクルートすることもできる。（４）最初の殺傷の波によって放出された腫瘍抗原は、より多くの腫瘍反応性Ｔ細胞をプライムし、リクルートする。（５）新たにリクルートされたポリクローナルＴ細胞は、ＨＥＲ２陰性腫瘍細胞および抗腫瘍免疫応答の最初の殺傷の波によって殺されない他の異種腫瘍細胞を含む、より多くのがん細胞を殺すことができる。免疫記憶は、腫瘍の再発を防ぐことができる。（図２B）表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）を表示するＳＴＲＩＣＴを使用する。（１）腫瘍同定遺伝子回路は、局所注射または全身投与によって腫瘍に導入される。（２）回路で形質導入された腫瘍細胞は、ＳＴＥおよび他の免疫調節分子を発現する。（３）ＳＴＥは、局所腫瘍浸潤性Ｔ細胞上のＴ細胞受容体と関わり、それによってＴ細胞を誘発して腫瘍細胞を直接殺す。（４）最初の殺傷の波によって放出された腫瘍抗原は、より多くの腫瘍反応性Ｔ細胞を遊走させるようにプライムし、リクルートする。（５）新たにリクルートされたポリクローナルＴ細胞は、抗腫瘍免疫応答の最初の殺傷の波によって殺されない他の異種腫瘍細胞および転移を含む、より多くのがん細胞を殺すことができる。免疫記憶は、腫瘍の再発を防ぐことができる。
【００２６】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ−３Ｈ。ＲＮＡのみの単一出力ＡＮＤゲートのデザイン。（図３Ａ−Ｄ）４個の入力状態およびそれらのおよびそれぞれの出力状態のコンピュータ化層が示される。ＲＮＡベースの論理ＡＮＤゲートは、２つの入力プロモータＰ１およびＰ２の活性を統合し、両方のプロモータが明らかに活性である場合にのみ出力を発生する。このアーキテクチャでは、出力は表面Ｔ細胞エンゲージャ（ＳＴＥ）である。プロモータＰ１は、合成ｍｉＲＮＡイントロン（ｍｉｒＦＦ４）を含むＳＴＥ  ｍＲＮＡの発現を調節している。ＳＴＥ／ｍｉｒＦＦ４転写物（ｍｉｒＦＦ４−ＢＳ）の３’末端に完全一致ｍｉｒＦＦ４結合部位をコードすることにより、負の自己調節フィードバックループを回路に組み込んだ。その結果、プロモータＰ１のみが活性である場合、ＳＴＥ  ｍＲＮＡは、細胞ｍｉＲＮＡ機構によって絶えず分解され、ＳＴＥタンパク質は生成されない（状態３）。プロモータＰ２は、３’末端に複数の隆起したｍｉｒＦＦ４結合部位を有する非コードＲＮＡ（デコイ）を含むｍｉＲＮＡスポンジの発現を調節している。したがって、プロモータＰ２のみが活性である場合、タンパク質出力は生成されない（状態２）。両方のプロモータＰ１およびＰ２が活性である場合、プロモータＰ１によって調節されるＳＴＥ／ｍｉｒＦ４  ｍＲＮＡによって生成されるｍｉｒＦＦ４は、プロモータＰ２によって調節されたｍｉｒＦＦ４スポンジによって隔離され、したがってＳＴＥタンパク質（状態１）の生成を可能にする。
【図３Ｃ−Ｄ】（図３Ａ−Ｄ）４個の入力状態およびそれらのおよびそれぞれの出力状態のコンピュータ化層が示される。ＲＮＡベースの論理ＡＮＤゲートは、２つの入力プロモータＰ１およびＰ２の活性を統合し、両方のプロモータが明らかに活性である場合にのみ出力を発生する。このアーキテクチャでは、出力は表面Ｔ細胞エンゲージャ（ＳＴＥ）である。プロモータＰ１は、合成ｍｉＲＮＡイントロン（ｍｉｒＦＦ４）を含むＳＴＥ  ｍＲＮＡの発現を調節している。ＳＴＥ／ｍｉｒＦＦ４転写物（ｍｉｒＦＦ４−ＢＳ）の３’末端に完全一致ｍｉｒＦＦ４結合部位をコードすることにより、負の自己調節フィードバックループを回路に組み込んだ。その結果、プロモータＰ１のみが活性である場合、ＳＴＥ  ｍＲＮＡは、細胞ｍｉＲＮＡ機構によって絶えず分解され、ＳＴＥタンパク質は生成されない（状態３）。プロモータＰ２は、３’末端に複数の隆起したｍｉｒＦＦ４結合部位を有する非コードＲＮＡ（デコイ）を含むｍｉＲＮＡスポンジの発現を調節している。したがって、プロモータＰ２のみが活性である場合、タンパク質出力は生成されない（状態２）。両方のプロモータＰ１およびＰ２が活性である場合、プロモータＰ１によって調節されるＳＴＥ／ｍｉｒＦ４  ｍＲＮＡによって生成されるｍｉｒＦＦ４は、プロモータＰ２によって調節されたｍｉｒＦＦ４スポンジによって隔離され、したがってＳＴＥタンパク質（状態１）の生成を可能にする。
【図３Ｅ−Ｆ】（図３Ｅ−３Ｈ）蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２を出力として使用した場合のＡＮＤゲート回路の４つの入力状態とそのそれぞれの出力状態。
【図３Ｇ−Ｈ】（図３Ｅ−３Ｈ）蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２を出力として使用した場合のＡＮＤゲート回路の４つの入力状態とそのそれぞれの出力状態。
【００２７】
【図４】図４Ａ−４Ｂ。ｍＫａｔｅ２  ＡＮＤゲート実験結果。（図４Ａ）ＲＮＡベースの論理ＡＮＤゲートデザインを調べるために、ｍＫａｔｅ２出力でコードした。このデザインのためのプロモータ入力として、２つのヒトのプロモータを使用し、それは、多くのヒトのがんにおいて過剰発現される：ＳＳＸ１およびＨ２Ａ１（それぞれ入力１および入力２、入力１はｍＫａｔｅ２およびｍｉｒＦＦ４をコードする）。（図４Ｂ）（ａ）入力１でコード化された完全一致ＦＦ４−ＢＳの数と、（ｂ）入力２でのスポンジ設計の２つの異なるアーキテクチャに関して、異なる設計に対してｍＫａｔｅ２出力レベルを測定した。Ｘ軸注釈：Ｍ＃は入力１を表し、ＦＦ４−ＢＳの＃はｍＫａｔｅ２／ｍｉｒｆｆ４の下流にコードされる。たとえば、Ｍ３は、ゲートイラストに示されているように、３つの完全一致ＦＦ４−ＢＳを持つ入力１を表す。Ｓ０、Ｓ１およびＳ２は３つの異なるスポンジデザインを表す。Ｓ０は、ｍｉｒＦＦ４−ＢＳを有さない陰性対照転写物である。デザインＳ１はデコイ転写物であり、ゲートイラストに示されているように３’にコードされた１０個の隆起したＦＦ４−ＢＳをコードする。デザインＳ２は、Ｓ１に類似しているが、転写物３’にコードされている１０個の隆起したＦＦ４−ＢＳの上流に位置する１０個の隆起したＦＦ４−ＢＳを有する追加の環状イントロンを有する。したがって、ゲート図はデザインＭ３−Ｓ１（プロット内の緑色のダッシュ線で囲んだ）を表す。結果は平均ｍＫａｔｅ２発現（Ｐ１）で表され、それは、細胞塊および残屑を除去するためのＦＡＣＳにおけるＳＳＣ／ＦＳＣについてゲートされた細胞に対する平均ｍＫａｔｅ２である。エラーバーはＳＥＭを表す。我々は出力２条件をテストしなかった。なぜなら、出力タンパク質をコードしていないからである。ＮＴは非トランスフェクト（遺伝子導入）細胞を表す。
【００２８】
【図５】図５。ｍＫａｔｅ２  ＡＮＤゲート実験結果。ＲＮＡベースの論理ＡＮＤゲート設計を再度調べるために、ｍＫａｔｅ２出力でコードされた。ＥＣＦＰはスポンジ転写物にコードされ、ｍｉＲＮＡによるスポンジの分解を測定した。ＳＳＸ１およびＨ２Ａ１は、この設計のプロモータ入力として使用した：それぞれ入力１および入力２、一方で、入力１はｍＫａｔｅ２出力およびｍｉｒＦ４をコードする。（ａ）入力１においてコードされた完全一致ＦＦ４−ＢＳの数、および（ｂ）入力２におけるスポンジ設計の２つの異なるアーキテクチャに関して、異なる実験設定に対するｍＫａｔｅ２およびＥＣＦＰ出力レベルを測定した。Ｘ軸注釈：Ｍ＃は入力１を表し、ＦＦ４−ＢＳの＃は、ｍＫａｔｅ２／ｍｉｒｆｆ４の下流にコードされている。
【００２９】
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｂ。多重出力ＡＮＤ−ゲート回路のデザイン。（図６Ａ）両方のプロモータＰ１およびＰ２が活性である場合、プロモータＰ１によって調節されるＴＦ／ｍｉｒＦＦ４  ｍＲＮＡによって生成されたｍｉｒＦＦ４は、プロモータＰ２によって調節されたｍｉｒＦＦ４スポンジによって隔離され、したがって、人工転写因子（ＴＦ）の生成を可能にする。ＴＦはさらに、そのプロモータに結合し、複数のユーザー定義出力の転写を引き起こす。
【図６Ｂ】（図６Ｂ）多重出力ＡＮＤゲートの出力レベルは調整可能である。ＣＸＣＬ１０は、ｍｉｒＦＦ４ｖ２Ｂイントロンおよび１０の下流のｍｉｒＦＦ４−Ｂを維持するＧＡＬ４ＢＤ−ＶＰ１６ＡＤを調節するＣＸＣＬ１ｐである。ＳＳＸ１０は、ｍｉｒＦＦ４ｖ２Ｂイントロンおよび１０の下流のｍｉｒＦＦ４−Ｂを維持するＧＡＬ４ＢＤ−ＶＰ１６ＡＤを調節するＳＳＸ１ｐである。ＳＳＸ*１０は、５’ＵＴＲの一部がＫＯＺＡＫ配列とともに除去され、ｍｉｒＦＦ４ｖ２Ｂイントロンおよび１０の下流のｍｉｒＦＦ４−Ｂを維持するＧＡＬ４ＢＤ−ＶＰ１６ＡＤを調節する切断されたＳＳＸ１ｐである。スポンジＳ０は陰性対照転写物ＷＯ  ｍｉｒＦＦ４−ＢＳである。スポンジＳ２は、３’位にコードされた１０個の隆起したｍｉｒＦＦ４−ＢＳの上流に位置する１０個の隆起したｍｉｒＦＦ４−ＢＳを有する追加の環状イントロンを有する、３位にコードされた１０個のＦＦ４−ＢＳを有するデコイ転写物である。全ての試料において、ｍＫａｔｅ２出力はＧ５ｐ（５つのＧＡＬ４結合部位を含むプロモータ）の下でコードされる。出力レベルは、Ｐ１とスポンジの異なるアーキテクチャとして異なるプロモータ強度を使用することによって調整可能である。
【００３０】
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｈ。いくつかのブーリアン（Ｂｏｏｌｅａｎ）論理ゲートの設計。ＡＮＤゲートのＲＮＡベースデザインの模式図。ＯＰ：出力タンパク質。Ｎａｎ：新生ＲＮＡ転写物。
【図７Ｂ−Ｃ】いくつかのブーリアン論理ゲートの設計。ＮＡＮＤ、ＸＮＯＲゲートのＲＮＡベースデザインの模式図。ＯＰ：出力タンパク質。Ｎａｎ：新生ＲＮＡ転写物。
【図７Ｄ−Ｅ】いくつかのブーリアン論理ゲートの設計。ＮＯＲ、ＮＯＴゲートのＲＮＡベースデザインの模式図。ＯＰ：出力タンパク質。Ｎａｎ：新生ＲＮＡ転写物。
【図７Ｆ−Ｇ】いくつかのブーリアン論理ゲートの設計。ＸＯＲ、ＩＭＰＬＹゲートのＲＮＡベースデザインの模式図。ＯＰ：出力タンパク質。Ｎａｎ：新生ＲＮＡ転写物。
【図７Ｈ】いくつかのブーリアン論理ゲートの設計。ＮＩＭＰＬＹゲートのＲＮＡベースデザインの模式図。ＯＰ：出力タンパク質。Ｎａｎ：新生ＲＮＡ転写物。
【００３１】
【図８】図８。抗ＨＥＲ２二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）および表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）は、Ｔ細胞を強力な腫瘍死滅およびＩＦＮ−γ分泌を媒介するように誘発する。ＨＥＫ−２９３Ｔ（最小発現ＨＥＲ２）細胞を、示されるようにさまざまなＤＮＡ構築物でトランスフェクト（遺伝子導入）した。遺伝子導入の４８時間後、さまざまなＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間または２４時間共培養した。Ｔ細胞による５時間の細胞毒性をＬＤＨ放出アッセイにより測定し、Ｔ細胞による２４時間のＩＦＮ−γ分泌をＩＦＮ−γＥＬＩＳＡにより測定した。データは、Ｔ細胞が、ＢｉＴＥ分泌腫瘍細胞（グループ１−２）上で強力な腫瘍死滅およびＩＦＮ−γ分泌を媒介することを示す。腫瘍の死滅およびＩＦＮ−γ分泌は、腫瘍細胞上のＨＥＲ２発現レベルと相関する（グループ１−２）。Ｔ細胞はＳＴＥを発現する腫瘍細胞（グループ３−６）上で強い腫瘍死滅およびＩＦＮ−γ分泌を媒介し、細胞毒性およびＩＦＮ−γ分泌は腫瘍抗原（ＨＥＲ２）発現（グループ３−６）とは無関係である。さらに、Ｔ細胞は、非ＢｉＴＥおよび非ＳＴＥ制御タンパク質（グループ７−９）を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞と共培養した場合、最小限の腫瘍死滅およびＩＦＮ−γ分泌を媒介する。
【００３２】
【図９】図９Ａ−９Ｃ。単一出力ＡＮＤゲートアーキテクチャは、腫瘍細胞のＴ細胞死滅効率を微調整するために活用することができる。示されるように、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞はさまざまなＤＮＡ構築物で遺伝子導入した。（図９Ａ）単一出力ＡＮＤゲート駆動ＳＴＥ発現の設計。（図９Ｂ）ｍＫａｔｅ  ＡＮＤゲートの実験結果。（１，０）は、Ｐ１モジュールのみで遺伝子導入された細胞を示した。（１，１）は、Ｐ１およびＰ２モジュールで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は非遺伝子導入細胞を表す。（図９Ｃ）ＳＴＥ  ＡＮＤゲートの実験結果。（１，０）は、Ｐ１モジュールのみで遺伝子導入された細胞を示した。（１，１）は、Ｐ１およびＰ２モジュールで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は、非ＳＴＥタンパク質で遺伝子導入された細胞を示した。Ｃｔｒｌは非遺伝子導入細胞を示した。遺伝子導入の４８時間後、さまざまのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による細胞毒性は、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した。データは、Ｔ細胞がＰ１モジュール（カラム１）で遺伝子導入された２９３Ｔを死滅させ、ＡＮＤゲートアーキテクチャ（カラム２）によって死滅が大幅に増強され得ることを示す。Ｔ細胞は、非ＳＴＥ発現細胞（カラム３および４）において最小の死滅を示す。
【００３３】
【図１０】図１０。抗ＨＥＲ２二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）および表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）は、Ｔ細胞を強力な腫瘍死滅およびＩＦＮ−γ分泌を媒介するように誘発する。示されたＤＮＡ構築物を発現する安定な４Ｔ１細胞（ＨＥＲ２−）は、ヒトＴ細胞と５時間または２４時間共培養した。Ｔ細胞による５時間の細胞毒性をＬＤＨ放出アッセイにより測定し、Ｔ細胞による２４時間のＩＦＮ−γ分泌をＩＦＮ−γＥＬＩＳＡにより測定した。データは、Ｔ細胞が、ＨＥＲ２またはＳＴＥ腫瘍細胞上の最小の死滅およびＩＦＮ−γ分泌を媒介することを示す（グループ１およびグループ３）。Ｔ細胞は、ＳＴＥを発現している腫瘍細胞上の強力な腫瘍死滅およびＩＦＮ−γ分泌を媒介する（グループ２）。Ｔ細胞は、非ＢｉＴＥ分泌腫瘍を有する少数のＢｉＴＥ分泌細胞からなる細胞混合物と共培養した場合にも、強力な腫瘍死滅およびＩＦＮ−γ分泌を媒介する。これは、腫瘍塊におけるＢｉＴＥ分泌細胞の最小数が、堅牢な腫瘍塊の殺傷およびＩＦＮ−γ放出（グループ４）を引き出すことができることを示す。
【００３４】
【図１１】図１１。抗ＨＥＲ２二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）および表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）は、Ｔ細胞を、ヒト乳がん細胞株で頑強な腫瘍死滅を媒介するように誘発する。安定なＭＤＡ−ＭＢ４５３（ＨＥＲ２＋）細胞株は、示されるようなさまざまのＤＮＡ構築物を用いたレンチウイルス変換によって作製された。さまざまなＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による５時間の細胞毒性を、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した。データは、Ｔ細胞が、ＢｉＴＥ分泌腫瘍細胞において強力な腫瘍死滅を媒介することを示す（グループ２）。Ｔ細胞はまた、ＳＴＥを発現する腫瘍細胞上での強力な腫瘍死滅を媒介する（グループ３−４）。さらに、Ｔ細胞は、親ＭＤＡ−ＭＢ４５３腫瘍細胞株と共培養した場合、最小限の腫瘍死滅を媒介する（グループ１）。
【００３５】
【図１２】図１２。ＳＴＥの２つのバージョンの設計。バージョン１（ｖ１）について、抗ＣＤ３ｅ  ｓｃＦｖを不活性膜貫通タンパク質（ＤＡＲＣ）と融合させる。バージョン２（ｖ２）については、抗ＣＤ３ｅ  ｓｃＦｖをヒトＩｇＧ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインと、続いてネズミＢ７．１膜貫通（ＴＭ）および細胞質（ＣＹＰ）ドメインと融合させる。
【００３６】
【図１３】図１３。表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）バージョン１（ｖ１）およびバージョン２（ｖ２）はいずれも、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞上で強力に腫瘍を死滅させるようにＴ細胞を誘発する。レンチウイルス遺伝子導入により、さまざまの誘導性ＳＴＥ発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株が作製された。さまざまのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による５時間の細胞毒性を、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した。データは、Ｔ細胞が、遺伝子導入されたＳＴＥｖ１発現腫瘍細胞（カラム２）上の強力な腫瘍死滅を媒介することを示す。Ｔ細胞はまた、誘導性ＳＴＥｖ１およびＳＴＥｖ２発現腫瘍細胞上の強固な腫瘍死滅を媒介する（カラム３および４）。さらに、非ＳＴＥ発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株（カラム１）と共培養した場合、Ｔ細胞は最小の腫瘍死滅を媒介する。
【００３７】
【図１４】図１４。ＡＮＤゲートアーキテクチャを利用して、腫瘍細胞のＴ細胞死滅効率を微調整することができる。（Ａ）ＳＴＥ発現のための多重出力ＡＮＤゲートの設計。（Ｂ）ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、示されるようにさまざまなＤＮＡ構築物で遺伝子導入した。（１，０）は、ＳＴＥのみで遺伝子導入された細胞を示した。（１，１）は、ＳＴＥおよびスポンジで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は、非ＳＴＥタンパク質で遺伝子導入された細胞を示した。遺伝子導入の４８時間後、さまざまなＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による細胞毒性は、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した。データは、Ｔ細胞がＳＴＥを発現する（１，０）細胞を死滅させ（カラム２およびカラム４）、ＡＮＤゲート（１，１）アーキテクチャによって死滅が大幅に増強され得ること（カラム３および５）を示す。Ｔ細胞は、非ＳＴＥ発現細胞上で最小の死滅を発揮する（カラム１）。
【００３８】
【図１５】図１５。ＡＮＤゲートアーキテクチャは、腫瘍細胞のＴ細胞死滅効率を微調整するために利用することができる。（Ａ）ＳＴＥ発現の多重出力ＡＮＤゲートの設計。（Ｂ）ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、示されるようにさまざまなＤＮＡ構築物で遺伝子導入した。（１，０）は、ＳＴＥのみで遺伝子導入した細胞を示した。（１，１）は、ＳＴＥおよびスポンジで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は、非ＳＴＥタンパク質で遺伝子導入された細胞を示した。遺伝子導入の４８時間後、さまざまなＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による細胞毒性は、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した。データは、Ｔ細胞がＳＴＥを発現する（１，０）細胞を死滅させ（カラム３およびカラム５）、ＡＮＤゲート（１，１）アーキテクチャによって死滅が大幅に増強され得ること（カラム４およびカラム６）を示す。Ｔ細胞は、非ＳＴＥ発現細胞で最小の死滅を示す（カラム１）。（１，０）条件での死滅は、主にＧＡＬ４プロモータ出力の漏出（カラム２対３または５）によって引き起こされる。ＧＡＬ４プロモータ出力の漏出を減少させるためにさらなる改変を行うことができる（ＳＴＥ  ｖ１）。我々は、ＳＴＥ  ｖ１のＫＯＺＡＫ配列を除去し、３’末端にｍｉＲＮＡ結合部位を付加し、両方の機構の組み合わせによりＳＴＥ  ｖ１出力を自己分解させることによりＧＡＬ４プロモータの漏出を減少させるであろう。
【００３９】
【図１６】図１６。ＧＡＬ４−ゲートｖ２アーキテクチャは、腫瘍細胞のＴ細胞死滅効率を微調整するために利用でき、（１，０）状態での細胞毒性はより少ない。（Ａ）ＳＴＥ発現の多重出力ＡＮＤゲートの設計。（Ｂ）ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、示されるようにさまざまなＤＮＡ構築物で遺伝子導入した。（１，０）は、ＳＴＥのみで遺伝子導入された細胞を示した。（１，１）は、ＳＴＥおよびスポンジで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は、非ＳＴＥタンパク質で遺伝子導入された細胞を示した。遺伝子導入の４８時間後、さまざまなＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による細胞毒性は、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した。データは、Ｔ細胞がＳＴＥを発現する（１，０）細胞を死滅させ（カラム３）、ＡＮＤゲート（１，１）アーキテクチャによって死滅を増強し得ること（カラム４）を示す。Ｔ細胞は、ＳＴＥ発現細胞では最小の死滅を示す（カラム１）。このバージョンの（１，０）状態での死滅は、ＧＡＬ４ゲートｖ１アーキテクチャと比較して改善されている（ｖ２は基底レベル（０，０）により近い）。（１，０）状態での死滅を減少させるために、更なる改変を行い得る。ＳＴＥ遺伝子の３’末端にｍｉＲ結合部位を付加することにより、（１，０）状態でのＧＡＬ４プロモータ出力を減少させるであろう。
【００４０】
【図１７】図１７。ＧＡＬ４−ゲートｖ３アーキテクチャは、腫瘍細胞のＴ細胞死滅効率を微調整するために利用することができ、（１，０）状態での細胞毒性をより少なくすることができる。（Ａ）ＳＴＥ発現の多重出力ＡＮＤゲートの設計。（Ｂ）ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、示されるようにさまざまなＤＮＡ構築物で遺伝子導入した。（１，０）は、ＳＴＥのみで遺伝子導入した細胞を示した。（１，１）は、ＳＴＥおよびスポンジで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は、非ＳＴＥタンパク質で遺伝子導入された細胞を示した。遺伝子導入の４８時間後、さまざまなＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による細胞毒性は、ＬＤＨ放出アッセイにより測定した。データは、Ｔ細胞がＳＴＥを発現する（１，０）細胞を最小限に死滅させ（カラム３）、ＡＮＤゲートが活性（１，１）である場合（カラム４）にのみ有効殺傷に達することを示す。Ｔ細胞は、ＳＴＥ発現細胞では最小の死滅を示す（カラム１）。（１，０）状態での死滅は、（０，０）状態と同じくらい低い。（１，１）状態の死滅効果を高めるために、ＧＡＬ４−ＶＰ１６の出力レベルの増加またはＧＡＬ４結合部位の増加などのさらなる改変を行い得る。
【００４１】
【図１８】図１８。合成腫瘍によりリクルートされた免疫細胞療法（ＳＴＲＩＣＴ）の概観。パネル1：腫瘍標的遺伝子回路は、２つの腫瘍特異的合成プロモータの活性を統合し、合成および天然の免疫調整剤の両者が活性の場合にのみそれらの発現を生じさせ、それは、我々の回路に高い腫瘍選択性をもたらす；パネル２：回路は、ヒドロゲルベースの送達を用いて、生体内で送達される；パネル３：変換された細胞のみが、合成表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）および／または腫瘍細胞を死滅させるためにＴ細胞をリクルートする本来の免疫調整剤を発現する；パネル４：腫瘍細胞は、活性化Ｔ細胞によって除去される。
【００４２】
【図１９】図１９。ＲＮＡのみの単一出力ＡＮＤゲートの設計。ＲＮＡベースの論理ＡＮＤゲートは、２つの入力プロモータ、Ｐ１およびＰ２の活性を統合し、両プロモータが明らかに活性の場合のみに、発生し出力する。このアーキテクチャにおいて、出力は蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２である。プロモータＰ１は、合成ｍｉＲＮＡイントロン（ｍｉＲ１）を含むｍＫａｔｅ２  ｍＲＮＡの発現を調整している。我々は、ネガティブな自動調整フィードバックループをｍＫａｔｅ２／ｉＲ１転写物（ｍｉＲ１−ＢＳ）の３’末端の完全一致ｍｉＲ１結合部位をコードすることによって、回路に組み入れた。その結果として、両パラメータＰ１および／またはＰ２が活性の場合のみに、プロモータＰ１によって調整された、ｍＫａｔｅ２／ｍｉＲ１  ｍＲＮＡによって作られたｍｉｒＲ１は、プロモータＰ２によって調整されたｍｉＲ１スポンジによって締め出され、したがって、ｍＫａｔｅ２タンパク質の生成を可能にする。
【００４３】
【図２０】図２０。ＲＮＡのみの単一出力ＡＮＤゲート設計。上のパネルは、ＲＮＡのみの単一出力ＡＮＤゲートの設計詳細を描く。左の表は、ｍｉＲＮＡ結合配列がスポンジング活性に影響することを示す。右のグラフは、各スポンジによるｍＫａｔｅ２折り畳み誘導およびｍｉＲ１によるＥＣＦＰレベル低下を示す。
【００４４】
【図２１】図２１。スポンジにおける結合部位の数および多数のスポンジ転写物がスポンジング活性に影響する。左のパネルは、モジュール１（Ｍ１）およびさまざまのスポンジ（Ｓ６７、Ｓ７３、およびＳ６２）の設計詳細を示す。右の上パネルは、さまざまの実験条件のｍＫａｔｅ２の生の出力レベルおよびＥＣＦＰを示す。右下のパネルは、各スポンジによるｍＫａｔｅ２折り畳み誘導を示す。ＳＣは、対照スポンジ(結合部位なし)を表す。
【００４５】
【図２２】図２２。スポンジアーキテクチャは、スポンジング活性に影響する。左パネルは、さまざまのスポンジ（Ｓ７６、Ｓ９９、Ｓ１００、およびＳ１０１）の設計詳細を示す。右上パネルは、さまざまの実験条件のｍＫａｔｅ２の生の出力レベルおよびＥＣＦＰを示す。右下のパネルは、各スポンジによるｍＫａｔｅ２折り畳み誘導を示す。ＳＣは、対照スポンジ(結合部位なし)を表す。
【００４６】
【図２３】図２３。ｍｉＲＮＡバックボーンは、ゲート性能に影響する。左パネルは、モジュール１（Ｍ１）およびさまざまのスポンジ（ＳｘおよびＳ７６）の設計詳細を示す。右上パネルは、さまざまの実験条件のｍＫａｔｅ２の生の出力レベルおよびＥＣＦＰを示す。右下のパネルは、各スポンジによるさまざまのモジュール１構造物（Ｍ１、Ｍ２Ａ、およびＭ２Ｂはモジュール１の３つのバージョンで、各々は異なるｍｉＲＮＡバックボーンからなる)のｍＫａｔｅ２折り畳み誘導を示す。ＳＣは、対照スポンジ(結合部位なし)を表す。
【００４７】
【図２４】図２４Ａ−２４Ｂ。ドキシサイクリン誘導性ＳＴＥは、Ｔ細胞を誘発してＯＶＣＡＲ８卵巣がん細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を効率的に殺し、ＩＦＮ−γを分泌する。Ｄｏｘ誘導性ＳＴＥ（ＳＴＥ、ＳＴＥｖ２、およびＳＴＥ-ｓｎａｐ）の３つのバージョンはすべて、Ｔ細胞による強力な細胞死滅およびＩＦＮ−ｇ分泌を引き起こし得る。
【００４８】
【図２５】図２５。多重出力回路は、腫瘍細胞を厳しく死滅させる。（図２５Ａ）ＡＮＤゲートによって出力されるＧＡＤは、第３のプロモータを標的にすることができ（Ｐ３）、それはＳＴＥおよび免疫調整モジュールなどの多重タンパク質を発現できる。(図２５Ｂ）遺伝子回路で遺伝子導入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、以下をコードする：ＨＥＫ／ＤＡＲＣ（０，０）−非ＳＴＥタンパク質；ＧＡＤゲート（１，０）−Ｐ１＋Ｐ３が建造するのみ、ここで、Ｐ３はＳＴＥを発現し；ＧＡＤゲート（１，１）−Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３が建造する、ここで、Ｐ３はＳＴＥを発現し；ＨＥＫ／ｃｏｎｓｔ−構成的に発現されたＳＴＥ。遺伝子導入後４８時間、細胞はヒトＴ細胞で５時間共培養された。細胞毒性は、ＬＤＨ放出アッセイによって測定された。Ｔ細胞は、ＡＮＤゲートがＯＮの場合のみに、効率的に死滅された。Ｔ細胞は、ＳＴＥ−ネガティブ細胞（０，０）を最少に死滅させる。（１，０）状態の死滅は、（０，０）状態と同様に低い。ＧＡＤ発現の増加に際し、数ＧＡＤ結合部位は、（１，１）状態の効率をさらに増大させ得る。
【００４９】
【図２６Ａ】図２６。合成腫瘍特異的プロモータは、生来のものよりも高い腫瘍特異性を示す。（Ａ）上のパネルは、合成腫瘍特異的プロモータのデザインを図解する。１６個の転写因子結合部位は、最小プロモータ（後期のアデノウイルスプロモータ）の上流に縦にクローンされる。下のパネルは、合成腫瘍特異的プロモータは、生来のものよりも高い腫瘍特異性を示すことを表す。Ｈ２Ａ１ｐは、生来の腫瘍特異的プロモータである。Ｓ９〜Ｓ１９は、合成プロモータの選択例であり、丸括弧は、転写因子結合部位を表示する。ＯＶＣＡＲ８：卵巣がん細胞。ＩＯＳＥ１２０、ＩＯＳＥ３８６：不死化正常卵巣上皮細胞。ａＨＤＦ：成人ヒト皮膚線維芽細胞。ＣＣＤ：正常結腸線維芽細胞。ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ１２Ａ：不死化正常乳房細胞。
【図２６Ｂ】（Ｂ）上のパネルは、合成腫瘍特異的プロモータのデザインを図解する。１６個の転写因子結合部位は、最小プロモータ（後期のアデノウイルスプロモータ）の上流に縦にクローン化される。下のパネルは、合成腫瘍特異的プロモータは、生来のものよりも高い腫瘍特異性を示すことを表す。ＳＳＸ１およびＨ２Ａ１ｐは、生来の腫瘍特異的プロモータである。Ｓ９〜Ｓ２８は、合成プロモータの選択例であり、丸括弧は、転写因子結合部位を表示する。ａＨＤＦ：成人ヒト皮膚線維芽細胞。ＨＯＶ−ｅｐｉ：原発性卵巣上皮細胞。ＯＶＣＡＲ８：卵巣がん細胞。
【００５０】
【図２７】図２７。多重出力ＡＮＤゲートは、正常細胞におけるよりも腫瘍細胞において有意に高い出力レベルを示す。上部パネルに描かれた回路は、正常細胞（ＩＳＯＥ１２０）におけるよりも腫瘍細胞（ＯＶＣＡＲ８）において約９０倍高い活性を示す。
【００５１】
【図２８】図２８。多重出力ＡＮＤゲートは、正常細胞におけるよりも腫瘍細胞において有意に高い出力レベルを示す。両方のプロモータが活性である場合、Ｇ８−Ｆ回路は正常細胞（ＩＳＯＥ１２０）におけるよりも腫瘍細胞（ＯＶＣＡＲ８）において約９０倍高い活性を示す。Ｇ８−Ｆゲートの出力レベルもまた、入力プロモータ活性レベルよりも高い。
【００５２】
【図２９】図２９。腫瘍細胞上の回路の出力レベルは、ＧＡＤプロモータにおけるＧＡＤ結合部位の数を改変することによって、微調整することができ、出力転写物の下流のｍｉＲＮＡ結合部位の数を調節する。Ｇ８−Ｆゲートの出力レベルもまた、入力プロモータ（Ｓ１９ｐ）活性レベルよりも高い。
【００５３】
【図３０】図３０。多重出力ＡＮＤゲートは、正常細胞におけるよりも腫瘍細胞において有意に高い出力レベルを示す。両方のプロモータが活性である場合、Ｇ８−Ｆ回路は正常細胞（ＩＳＯＥ１２０）におけるよりも腫瘍細胞（ＯＶＣＡＲ８）において約９０倍高い活性を示す。Ｇ８−Ｆゲートの出力レベルもまた、入力プロモータ活性レベルよりも高い。
【００５４】
【図３１Ａ】図３１。多重出力回路は、特に、Ｔ細胞が腫瘍細胞を死滅させ、ＩＦＮ−γを分泌させるように誘発する。（Ａ）ＳＴＥは、正常細胞（ａＨＤＦ、ＨＯＶ−ｅｐｉ）ではなく、回路遺伝子導入腫瘍細胞（ＯＶＣＡＲ８）の強いＴ細胞殺傷を誘発する。回路はまた、状態（１，０）で腫瘍の死滅を最小限に抑える。
【図３１Ｂ】（Ｂ）ＳＴＥは、正常細胞（ａＨＤＦ、ＨＯＶ−ｅｐｉ）ではなく、回路変換腫瘍細胞（ＯＶＣＡＲ８）の強いＴ細胞死滅を誘発する。回路はまた、状態（１，０）で腫瘍の死滅を最小限に抑える。（Ｃ）Ｔ細胞は、回路変換腫瘍細胞によって強力なＩＦＮ−γ分泌を媒介したが、正常細胞では媒介しなかった。
【００５５】
【図３２】図３２。異なる多重出力回路は、異なるレベルの抗腫瘍特異性を示す。Ｇ８−Ｆｖ１およびＧ１４−Ｆｖ１は、正常細胞（ＩＯＳＥ３８６）の死滅よりも著しく高い腫瘍細胞（ＯＶＣＡＲ８）の死滅を誘発する。Ｇ８（８個のＧＡＬ４結合部位を含むプロモータ）、Ｇ１４（１４個のＧＡＬ４結合部位を含むプロモータ）
【００５６】
【図３３Ａ】図３３。異なる多重出力回路は、異なるレベルの抗腫瘍特異性を示す。（図３３Ａ）いくつかのゲートデザイン（Ｇ５−Ｆｖ１、Ｇ８−Ｆｖ１、Ｇ１４−Ｆｖ１、Ｇ５−Ｆｖ２、Ｇ８−Ｆｖ２、Ｇ１４−Ｆｖ２）は、正常細胞（ＩＯＳＥ３８６）よりも著しく高い腫瘍細胞（ＯＶＣＡＲ８）上のＴ細胞によるＩＦＮ−ｇ分泌を誘発し得る。
【図３３Ｂ】（図３３Ｂ）Ｇ８−Ｆゲートは、正常細胞（ａＨＤＦ、ＨＯＶ−ｅｐｉ）ではなく腫瘍細胞（ＯＶＣＡＲ８）に多量のＩＦＮ−γを分泌させるようにＴ細胞を誘発する。
【００５７】
【図３４】図３４。ＳＴＥは、生体内で膵臓腫瘍の負担を強力に減少させる。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘発性ＳＴＥを発揮するＮＢ５０８腫瘍細胞を皮下注射した。接種の１０日後、マウスはＤｏｘ誘発されたまたは未処置の腕にランダム化された。上のパネル：Ｄｏｘ誘発腫瘍（＋Ｄｏｘ）対未処置対照（ｎｔ）において有意に増殖低減が観察された。２匹の＋Ｄｏｘマウスは、皮膚刺激により１７日目に未熟に犠牲にされた。下パネル：処置後２１日目に解剖された全腫瘍は、有意に小さい。
【００５８】
【図３５】図３５。ＳＴＲＩＣＴによって誘発された併用免疫療法は、腹腔内に播種した卵巣がんモデルにおいて腫瘍負荷を有意に減少させた。（Ａ）実験計画と処置スケジュール。（Ｂ）ＳＴＲＩＣＴにより誘発された併用療法は、腫瘍負荷を有意に減少させた。左のパネルは、対照群の腫瘍負荷を表す。右のパネルは、処置された群の腫瘍負荷を表す。括弧は併用療法方策を示す。
【００５９】
【図３６】ＳＴＲＩＣＴによって誘発された併用免疫療法は、腹腔内に播種した卵巣がんモデルにおいて腫瘍負荷を有意に減少させた。これは、図３５と同じデータであるが、全ての群が同じグラフにプロットされていない。
【００６０】
【図３７】図３７。ＳＴＲＩＣＴによって誘発された併用免疫療法は、腹腔内に播種した卵巣がんモデルにおいて腫瘍負荷を有意に減少させた。これは、図３５と同じデータであるが、異なる表示でプロットされている。
【００６１】
【図３８】図３８。ＳＴＲＩＣＴによって誘発された併用免疫療法は、腹腔内に播種した卵巣がんモデルにおいて腫瘍負荷を有意に減少させた。これは、図３５と同じデータであるが、異なる表示でプロットされている。
【００６２】
【図３９】図３９Ａ。ＳＴＲＩＣＴによって誘発された併用免疫療法は、腹腔内に播種した卵巣がんモデルにおいて腫瘍負荷を有意に減少させた。これは、図３５と同じデータであるが、個々のマウスの腫瘍増殖曲線および各群の平均負荷を示した。
【００６３】
【図４０】図４０。ＳＴＲＩＣＴによって誘発された併用免疫療法は、腹腔内に播種した卵巣がんモデルにおいて腫瘍負荷を有意に減少させた。これは、群Ｓ１５ｐ−ＧＡＤ＋Ｇ８ｐ−ＳＴＥ−Ｆが示されていないことを除いて図３５と同じデータであるが、各画像化時間点の腫瘍負荷および各群の平均負荷が示されている。Ｇ８ｐ（８個のＧＡＬ４結合部位を含むプロモータ）。
【００６４】
【図４１】図４１。ＳＴＲＩＣＴによって誘発された併用免疫療法は、腹腔内に播種した卵巣がんモデルにおいて腫瘍負荷を有意に減少させた。これは、図３５と同じデータであるが、ここには腫瘍接種後３６日目の個々のマウスの腫瘍負荷の生物発光画像を示した。
【００６５】
【図４２】図４２。ＳＴＲＩＣＴによって誘発された併用免疫療法は、腹腔内に播種した卵巣がんモデルにおいて腫瘍負荷を有意に減少させた。これは、図３５と同じデータであるが、ここには腫瘍接種後４３日目の個々のマウスの腫瘍負荷の生物発光画像を示した。
【００６６】
【図４３】図４３。ＳＴＲＩＣＴによって誘発された併用免疫療法は、腹腔内に播種した卵巣がんモデルにおいて腫瘍負荷を有意に減少させた。これは、図３５と同じデータであるが、ここには腫瘍接種後７日目と４３日目の個々のマウスの腫瘍負荷の生物発光画像を示した。
【００６７】
【図４４】図４４。がん特異的合成プロモータを同定するパイプライン。ｍＫａｔｅ２発現を駆動する合成プロモータのライブラリーが、正常細胞およびレンチウイルスを有するがん細胞に導入された。ｍＫａｔｅ２陽性細胞を選別し、次世代の配列決定を利用して、各細胞型の豊富な合成プロモータ配列を同定した。正常細胞ではなくがん細胞において高度に濃縮された合成プロモータ配列がクローン化され、腫瘍特異的活性がさらに検証されるであろう。
【００６８】
【図４５】図４５。合成プロモータ・ライブラリーの設計。８ｍｅｒ配列の全交換の構成のデザイン１が、各８ｍｅｒ間にスペーサーなしで直列に（１２回の反復で）構築された。８ｍｅｒ配列の全交換から構成されたデザイン２は、各８ｍｅｒの間に３ｍｅｒのスペーサーを伴って直列に（９回の反復で）構築された。選択的１１ｍｅｒ配列を構成するデザイン３は、各１１ｍｅｒの間に３ｍｅｒスペーサーを伴わずに直列に（７回の反復で）構築された。
【００６９】
【図４６】図４６。選択された合成プロモータの活性。ＦＡＣＳソーティングから単離した４０個の合成プロモータの活性が３つの異なる細胞株上で試験された。４０個の合成プロモータが広い範囲の転写活性を提供することを観察した。
【００７０】
【図４７】図４７。合成プロモータの正規化された活性。ＦＡＣＳソーティングから単離した４０個の合成プロモータの活性が３つの異なる細胞株上で試験された。４０個の合成プロモータが広い範囲の転写活性を提供することを観察した。データは、各細胞株のための構成プロモータ（ＵｂＣｐ）に対して正規化された。
【００７１】
詳細な説明 
本開示の合成腫瘍リクルート免疫細胞療法（ＳＴＲＩＣＴ）は、いくつかの態様において、コンビナトリアル免疫調節産物（例えば、抗原およびサイトカイン）を有する細胞特異的診断および治療回路（操作された遺伝子回路／論理ゲート）を含む。細胞特異的遺伝子回路は、主にＲＮＡに基づき、こうして典型的には対象において不利な免疫原性反応を誘発しない。コンビナトリアル免疫調節産物は、例えば、合成Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）、二重指向性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、抗体、抗体フラグメント、サイトカインおよび細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発する他の分子を含み得る。
【００７２】
本開示のいくつかの側面において、ＧＡＬ４ゲートは、調整可能な多重出力コンビナトリアル療法を可能にする。有効なコンビナトリアル療法のために、回路出力として追加の重要な免疫モジュレーターを実施することができる。いくつかの態様において、サイトカインは、免疫細胞機能を増強するために使用され得る；例えば、Ｔｈ１応答を増強し、抑制性腫瘍微小環境に戻るために、ＩＬ−１２を使用し得る。いくつかの態様において、ケモカインは免疫細胞をリクルートするために使用し得る。例えば、ＣＣＬ２１を用いてＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団をリクルートすることができる。いくつかの態様において、免疫チェックポイント遮断抑制剤は、抗がん免疫を増強するために使用され得る；例えば、抗ＰＤ１  ｍＡｂ、抗ＰＤＬ１  ｍＡｂ、および抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂである。
【００７３】
さらに、いくつかの態様において、抗ＨＥＲ２  ＢｉＴＥは、Ｔ細胞を誘発して、強力なＨＥＲ２＋腫瘍死滅およびサイトカイン生成を媒介する。いくつかの態様において、さまざまなＳＴＥが、Ｔ細胞がさまざまなタイプの腫瘍細胞の死滅させるのを誘発し得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ  ＡＮＤゲート・アーキテクチャを利用して、ＳＴＥ発現レベルおよびＴ細胞腫瘍死滅効率を微調整し得る。いくつかの態様において、全腫瘍集団における低い比のＢｉＴＥ分泌細胞は、強力な腫瘍死滅を誘発するのに十分である。
【００７４】
図２Ａおよび２Ｂに示すように、本明細書で提供される方法は、がん細胞の標的破壊を導く。例えば、腫瘍同定遺伝子回路は、まず、局所注射または全身投与によって腫瘍に導入される（図２Ａ（１）および２Ｂ（１））。次に、遺伝子回路で変換された腫瘍細胞は、表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）を表示し、免疫調節分子を発現する（図２Ａ（２））。ＳＴＥは、局所腫瘍浸潤性Ｔ細胞上のＴ細胞受容体と関わり、腫瘍細胞を根絶するようにＴ細胞を誘発する（図２Ａ（３））。最初の根絶の波によって放出された腫瘍抗原は、その後、より多くの腫瘍反応性Ｔ細胞をプライムして、リクルートする（図２Ａ（４））。新たにリクルートされたポリクローナルＴ細胞は、第１波抗腫瘍免疫応答によって根絶されない他の異種腫瘍細胞および転移を含む、より多くのがん細胞を根絶する（図２Ａ（５））。免疫記憶は腫瘍再発を予防する。
【００７５】
また、図３Ａ〜３Ｄは、ＲＮＡベースの論理ＡＮＤゲートを示す。ＲＮＡベースの論理ＡＮＤゲートは、２つの入力プロモータＰ１およびＰ２の活性を統合し、両方のプロモータが明らかに活性である場合にのみ生成し、出力する。このアーキテクチャにおいて、出力は表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）である。プロモータＰ１は、合成ｍｉＲＮＡイントロン（ｍｉｒＦＦ４）を含むＳＴＥ  ｍＲＮＡの発現を調節している。ＳＴＥ／ｍｉｒＦ４転写物（ｍｉｒＦＦ４−ＢＳ）の３’末端に完全一致するｍｉｒＦＦ４結合部位をコードすることにより、負の自己調節フィードバックループを回路に導入した。その結果、プロモータＰ１のみが活性である場合、ＳＴＥ  ｍＲＮＡは細胞ｍｉＲＮＡ機構によって絶えず分解され、ＳＴＥタンパク質は生成されない（図３Ｃ、状態３）。プロモータＰ２は、３’末端に複数の隆起したｍｉｒＦＦ４結合部位を有する非コードＲＮＡ（デコイ）を含むｍｉＲＮＡスポンジの発現を調節する。したがって、プロモータＰ２のみが活性である場合、タンパク質産物は生成されない（図３Ｂ、状態２）。両方のプロモータＰ１およびＰ２が活性である場合、プロモータＰ１によって調節されるＳＴＥ／ｍｉｒＦ４  ｍＲＮＡによって生成されるｍｉｒＦＦ４は、プロモータＰ２によって調節されるｍｉｒＦＦ４スポンジによって力価測定され、したがってＳＴＥタンパク質の生成を可能にする（図３Ａ、状態１）。
【００７６】
本開示のいくつかの態様は、（ａ）（ｉ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の核酸、および（ｂ）第１のプロモータとは異なり、および（ａ）（ｉ）のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の核酸を含む、操作された遺伝子回路を提供する。
【００７７】
いくつかの態様において、出力ｍＲＮＡは、Ｔ細胞表面マーカーに結合する出力タンパク質をコードする。例えば、出力タンパク質は、細胞毒性Ｔ細胞応答を誘い出すタンパク質であり得る。したがって、出力タンパク質は、Ｔ細胞の表面上の抗原（例えば、ＣＤ３抗原）に結合する受容体であり得る。表面マーカーは、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ４５であり得る。その他のＴ細胞表面マーカーも本開示に包含される。いくつかの態様において、出力タンパク質は、Ｔ細胞表面抗原に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【００７８】
出力タンパク質の特異的な非限定例は、図１２に示される。「ＳＴＥ  ｖ１」は、Ｔ細胞を誘発するための抗ＣＤ３ε  ｓｃＦＶ  ＶＬおよびＶＨドメインを含む。したがって、いくつかの態様において、遺伝子回路の第１の核酸は、膜貫通タンパク質の抗ＣＤ３ε  ｓｃＦＶ  ＶＬおよびＶＨドメインをコードする出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のプロモータを含む。「ＳＴＥ  ｖ２」は、ヒトＩｇＧ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、続いてネズミＢ７．１膜貫通（ＴＭ）および細胞質（ＣＹＰ）ドメインと融合した抗ＣＤ３ｅ  ｓｃＦｖを含む。したがって、いくつかの態様において、遺伝子回路の第１の核酸は、ヒトＩｇＧ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、続いてネズミＢ７．１膜貫通および細胞質ドメインをコードする、出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１プロモータを含む。
【００７９】
いくつかの態様において、出力ｍＲＮＡは、ケモカイン、サイトカインまたはチェックポイント抑制剤をコードする。
いくつかの態様において、第１のプロモータおよび／または第２のプロモータは誘導性プロモータである。典型的には、第１のプロモータは、第２のプロモータとは異なる。例えば、遺伝子回路におけるプロモータは、いくつかの態様において、細胞内に存在する異なる入力シグナル（例えば、異なる転写因子）によって調節され得る−入力１は第１プロモータを調節し、入力２は第２プロモータを調節する。
【００８０】
第１および／または第２のプロモータ（第１のプロモータ、第２のプロモータ、または両方のプロモータ）は、腫瘍特異的プロモータ（または疾患特異的プロモータ）であり得、つまり、腫瘍細胞またはがん細胞によってのみ発現される信号によって調節されるか、または少なくとも３０％（例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）非腫瘍／非がん細胞で発現されるレベルよりも高いレベルで腫瘍／がん細胞において発現される信号によって調節される。
【００８１】
本明細書で提供されるように、遺伝子回路の操作された核酸は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡが結合するヌクレオチド配列であり、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲＮＡに相補的である。したがって、ｍｉＲＮＡは、その同種のｍｉＲＮＡ結合部位に結合すると言われている。操作された核酸は、１〜５０のｍｉｒＲＮＡ結合部位を含み得る。いくつかの態様において、デコイ分子（細胞中の同種のｍｉＲＮＡを「吸収」するように機能する）をコードする操作された核酸は、５−１０、５−２０または５−３０のｍｉＲＮＡ結合部位をコードする。いくつかの態様において、デコイ分子をコードする操作された核酸は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のｍＲＮＡ結合部位をコードする。いくつかの態様において、ＳＴＥ  ｍＲＮＡなどの出力ｍＲＮＡをコードする操作された核酸は、１−５または１−１０のｍｉＲＮＡ結合部位をコードする。いくつかの態様において、出力ｍＲＮＡをコードする操作された核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｍＲＮＡ結合部位をコードする。
【００８２】
典型的には、免疫調節分子をコードするｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ結合部位の数は、デコイＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位、任意に非コードｍＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモータ）の数より少ない。ｍｉＲＮＡ、したがって同種のｍＲＮＡ結合部位の長さは、変化し得る。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡの長さは、１５−５０、１５−４０、１５−３０または１５−２０のヌクレオチドである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡの長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のヌクレオチドである。
いくつかの態様において、出力タンパク質は転写因子（例えば、転写速度を制御するためにＤＮＡに結合するタンパク質）である。
【００８３】
操作された核酸および遺伝子回路 
本開示は、腫瘍／がん細胞内から、その腫瘍／がん細胞および周囲のがん細胞に対する免疫療法を誘発することができる操作された遺伝子回路を提供する。「遺伝子回路」は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を制御するように細胞内で互いに相互作用する分子（例えば、転写因子、補因子およびポリメラーゼなどの核酸およびタンパク質）の集合をいう。本明細書で提供されるように、遺伝子回路は、典型的には、少なくとも２つの核酸を含み、１つはイントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む出力メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし、もう１つはいくつかのｍｉＲＮＡ結合部位をコードする。「イントロンｍｉＲＮＡ」は、出力分子を一緒にコードする２つのエキソンエキソン間のｍＲＮＡ転写物内に配置されるｍｉＲＮＡである。
【００８４】
ｍＲＮＡ転写物のイントロンｍｉＲＮＡは、転写物の成熟期中に「スプライスアウト（切り出し）」される。例えば、図３Ａを参照すると、「ＳＴＥ−ＥＸ１−ｍｉｒＦＦ４−ＳＴＥ−ＥＸ２」（上段）は、合成Ｔ細胞エンゲジャー（ＳＴＥ）をコードする遺伝子の２つのエキソンの間に配置されたマイクロＲＮＡ  ｍｉｒＦＦ４をコードするＤＮＡ配列を表す。図３の第２列の構築物はＳＴＥをコードするｍＲＮＡ転写物を表し、成熟中であり、それによって、イントロンマイクロＲＮＡ  ｍｉｒＦＦ４はＲＮＡスプライシングによって除去される。次いで、デコイ分子（同種のｍｉｒＦＦ４結合部位を含む分子）が細胞中に存在するかどうかに応じて、ＳＴＥをコードする成熟ｍＲＮＡは、その後翻訳されてＳＴＥタンパク質を生成し得る。
【００８５】
したがって、「出力メッセンジャーＲＮＡ」または「出力ｍＲＮＡ」は、操作された核酸の特定のヌクレオチド配列によってコードされたｍＲＮＡを単にいう。典型的にイントロンマイクロＲＮＡを含む出力ｍＲＮＡは、いくつかの態様において、Ｔ細胞表面マーカーに結合する出力タンパク質をコードする。いくつかの態様において、出力ｍＲＮＡは、抗がん剤をコードする。「抗がん」剤は、がん細胞に曝されたときに、がん細胞を死滅させるか、またはがん細胞の細胞分裂速度を低下させる（例えば、抗がん剤に曝されていないがん細胞に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％）ために使用され得る。いくつかの態様において、出力ｍＲＮＡは、本明細書の何処かで論じられているように、キラー遺伝子、新抗原、がん細胞が増殖および／または生存のために依存する代謝物を分解する代謝酵素、ケモカイン、サイトカインまたはチェックポイント抑制剤をコードする。他の抗がん剤は、本開示に包含される。
【００８６】
多少の入力および／または出力が本開示によって包含されるけれども、本開示の遺伝子回路は、また、典型的に２つの入力および１つの出力を有する「論理ゲート」と呼ばれるか、または「論理ゲート」として機能し得る。論理ゲート（例えば、ＡＮＤ、ＯＲ、ＸＯＲ、ＮＯＴ、ＮＡＮＤ、ＮＯＲおよびＸＮＯＲ）は、出力が生成される「オン」状態および出力が生成されない「オフ」状態に関して記述され得る。例えば、図３Ａ〜図３ＤはＡＮＤ論理ゲートを示しており、それは、１つはプロモータＰ１によって制御され、もう１つはプロモータＰ２によって制御される、２つの構築物を含む遺伝子回路である。
【００８７】
Ｐ１に連結された左側の構築物の転写は、入力１の存在下で活性化され、Ｐ２に連結された右側の構築物の転写は、入力２の存在下で活性化される。このＡＮＤゲートでは、ＳＴＥタンパク質である出力分子は、入力１と入力２の存在下でのみ生成される（図３Ａ）。入力２（図３Ｂ）または入力１（図３Ｃ）のみの存在下において、ＳＴＥタンパク質は生成されない。同様に、入力１も入力２も利用できない場合、ＳＴＥタンパク質は生成されない（図３Ｄ）。入力１のみが存在すると、ＳＴＥ  ｍＲＮＡ転写物が生成される。しかし、切除されたイントロンｍｉＲＮＡの存在は、ＳＴＥ  ｍＲＮＡの翻訳およびＳＴＥタンパク質の生成を妨げる（図３Ｃ）。入力１および入力２の両方が存在する場合、ＳＴＥ  ｍＲＮＡ転写物および切除されたイントロン性ｍｉＲＮＡの両方が依然として生成される。しかし、切除されたイントロン性ｍｉＲＮＡは、デコイｍｉＲＮＡ結合部位によって「吸い取られ」、その転写は入力２によって活性化される。したがって、ＳＴＥ  ｍＲＮＡの多くは、結合したｍｉＲＮＡを含まず、ＳＴＥタンパク質を生成するように翻訳され得る。
【００８８】
その他の論理回路は、図７Ｂ−７Ｈに示される。
図７Ｂは、（ａ）（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む出力ｍＲＮＡ（ＯＰ−ＥＸ１−−−ＯＢ−ＥＸ２）をコードするヌクレオチド配列（ｍｉＲＮＡ１）、（ｉｉ）イントロンｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（ｍｉＲＮＡ３）、および（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列（ｍｉＲＮＡ２−ＢＳ（Ｐ））に作動可能に連結されたプロモーター（Ｐ１）を含む第1の核酸；（ｂ）（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む出力ｍＲＮＡ（ＯＰ−ＥＸ１−−−ＯＢ−ＥＸ２）をコードするヌクレオチド配列（ｍｉＲＮＡ２）、（ｉｉ）イントロンｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（ｍｉＲＮＡ３）、および（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−ＢＳをコードするヌクレオチド配列（ｍｉｒＲＮＡ１−ＢＳ（Ｐ））、に作動可能に連結されたプロモータ（Ｐ２）を含む第２の核酸；ならびに（ｃ）ｍｉＲＮＡ−ＢＳに連結された出力タンパク質（ＯＰ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ（Ｐｓ）を含む第３の核酸（ｍｉＲＮＡ３−ＢＳ（Ｐ））であって、ｍｉＲＮＡ１がｍｉＲＮＡ１−ＢＳに相補的で結合し、ｍｉＲＮＡ３はｍｉＲＮＡ３−ＢＳ（Ｐ）に相補的で結合し、ｍｉＲＮＡ２はｍｉＲＮＡ２−ＢＳ（Ｐ）に相補的で結合する、を含む論理ゲートを示す。
【００８９】
図７Ｃは、（ａ）（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む、新生ＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列（Ｎａｎ−ＥＸ１−−−Ｎａｎ−ＥＸ２）（例えば、非コードＲＮＡ転写物またはおよびタンパク質をコードするＲＮＡ転写物）（ｍｉＲＮＡ１）、および（ｉｉ）４つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列（ｍｉＲＮＡ２−ＢＳ（Ｂｘ４））に作動可能に連結されたプロモータ（Ｐ１）を含む第１の核酸；（ｂ）（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む新生ＲＮＡ転写物（Ｎａｎ−ＥＸ１−−−Ｎａｎ−ＥＸ２）をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉ）４つのｍｉＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列（ｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｂｘ４）に作動可能に連結されたプロモーター（Ｐ２）を含む第２の核酸（ｍｉＲＮＡ２）；ならびに（ｃ）（ｉ）第１のｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｐ））、および（ｉｉ）第２のｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ２−ＢＳ（Ｐ））に連結された出力タンパク質（ＯＰ）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモータ（Ｐｓ）を含む第３の核酸、ここで、ｍｉＲＮＡ１がｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｂｘ４）に相補的で結合し、ｍｉＲＮＡ２がｍｉＲＮＡ２−ＢＳ（Ｂｘ４）に相補的で結合する、を含む論理ゲートを示す。
【００９０】
図７Ｄは、（ａ）イントロンｍｉＲＮＡを含む、新生ＲＮＡ転写物（Ｎａｎ−ＥＸ１−−−Ｎａｎ−ＥＸ２）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ（Ｐ１）を含む第１の核酸（ｍｉＲＮＡ１）；（ｂ）イントロンｍｉＲＮＡを含む、新生ＲＮＡ転写物（Ｎａｎ−ＥＸ１−−−Ｎａｎ−ＥＸ２）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター（Ｐ２）を含む第２の核酸（ｍｉＲＮＡ２）；（ｃ）（ｉ）第１のｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｐ））、および（ｉｉ）第２のｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ２−ＢＳ（Ｐ））に連結された出力タンパク質（ＯＰ）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター（Ｐｓ）を含む第３の核酸、ここで、ｍｉＲＮＡ１はｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｐ）に相補的で結合し、ｍｉＲＮＡ２はｍｉＲＮＡ２−ＢＳに相補的で結合する、を含む論理ゲートを示す。
【００９１】
図７Ｅは、（ａ）イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、新生ＲＮＡ転写物（Ｎａｎ−ＥＸ１−−−Ｎａｎ−ＥＸ２）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター（Ｐ１）を含む第１の核酸；（ｂ）ｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｐ））に連結された出力タンパク質（ＯＰ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ（Ｐｓ）を含む第２の核酸、ここで、ｍｉＲＮＡ１は、  ｍｉＲＮＡ−ＢＳ（Ｐ）に相補的で結合する、を含む論理ゲートを示す。
【００９２】
図７Ｆは、（ａ）（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む、出力ｍＲＮＡ（ＯＰ−ＥＸ１−−−ＯＰ−ＥＸ２）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）４つのｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ２−ＢＳ（Ｂｘ４））に作動可能に連結されたプロモーター（Ｐ１）を含む第１の核酸；および（ｂ）（ｉ）イントロンｍｉＲＮＡを含む、出力ｍＲＮＡ（ＯＰ−ＥＸ１−−−ＯＰ−ＥＸ２）をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉ）４つのｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｂｘ４）に作動可能に連結されたプロモータ（Ｐ２）を含む第２の核酸（ｍｉＲＮＡ２）、ここで、ｍｉＲＮＡ１が、ｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｂｘ４）に相補的で結合し、ｍｉＲＮＡ２がｍｉＲＮＡ２−ＢＳ（Ｂｘ４）に相補的で結合する、を含む論理ゲートを示す。
【００９３】
図７Ｇは、（ａ）イントロンｍｉＲＮＡを含む、新生ＲＮＡ転写物（Ｎａｎ−ＥＸ１−−−Ｎａｎ−ＥＸ２）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター（Ｐ１）を含む第１の核酸（ｍｉＲＮＡ１）；（ｂ）出力タンパク質（ＯＰ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ（Ｐ２）を含む第２の核酸；ならびに（ｃ）ｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｐ））に連結された出力タンパク質（ＯＰ）をコードするプロモータ（Ｐｓ）を含む第３の核酸、ここで、ｍｉＲＮＡ１がｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｐ）に相補的で結合する、を含む論理ゲートを示す
【００９４】
図７Ｈは、（ａ）ｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲＮＡ１−ＢＳ）に連結された出力タンパク質（ＯＰ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ（Ｐ１）を含む第１の核酸；および（ｂ）イントロンｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ１）を含む、新生ＲＮＡ転写物（Ｎａｎ−ＥＸ１−−−Ｎａｎ−ＥＸ２）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ（Ｐ２）を含む第２の核酸、ここで、ｍｉＲＮＡ１が、ｍｉＲＮＡ１−ＢＳ（Ｐ）に相補的で結合する、を含む論理ゲートを示す。
【００９５】
「核酸」は、一緒に共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドであり、場合によってはホスホジエステル結合（例えば、ホスホジエステル「バックボーン」）を含み得る。「操作された核酸」（「構築物」ともいう）は、天然には存在しない核酸である。しかしながら、操作された核酸全体は天然に存在しないが、天然に存在するヌクレオチド配列を含み得ることを理解すべきである。いくつかの態様において、操作された核酸は、異なる生物に由来する（例えば、異なる種に由来する）ヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの態様において、操作された核酸は、マウスヌクレオチド配列、細菌ヌクレオチド配列、ヒトヌクレオチド配列および／またはウイルスヌクレオチド配列を含む。
【００９６】
操作された核酸には、組換え核酸および合成核酸が含まれる。「組換え核酸」は、核酸（例えば、単離された核酸、合成核酸またはそれらの組み合わせ）を結び付けることによって構築され、いくつかの態様において、生きた細胞内で複製することができる分子である。「合成核酸」は、増幅された、または化学的に、または他の手段によって合成された分子である。合成核酸は、化学修飾されるか、さもなければ化学修飾されるが天然に存在する核酸分子と塩基対を形成するものを含む。組換え核酸および合成核酸には、上記のいずれかの複製から生じる分子も含まれる。
【００９７】
いくつかの態様において、本開示の核酸は、例えば、少なくとも部分的に、ホスホラミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合および／またはペプチド核酸を含む、他のバックボ−ンを含み得る、核酸類似体であると考えられる。核酸は、特定されるように、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）であり得るか、または一本鎖および二本鎖配列の両方の部分を含み得る。いくつかの態様において、核酸は、三本鎖配列の部分を含み得る。核酸は、核酸がデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド（例えば、人工または天然）、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基との任意の組合せを含むＤＮＡ、ゲノムおよび／またはｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドのいずれかであり得る。
【００９８】
本開示の核酸は、１つ以上の遺伝子要素を含み得る。「遺伝子要素」は、核酸発現において役割（例えば、プロモータ、エンハンサー、ターミネーター）を果たす特定のヌクレオチド配列をいうか、または操作された核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、タンパク質および／または例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉分子をコードするヌクレオチド配列）の分泌物をコードする。
本開示の核酸は、標準的な分子生物学的方法（例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Pressを参照）を用いて生成することができる。 
【００９９】
いくつかの態様において、核酸は、GIBSON ASSEMBLY（登録商標）クローニング（例えば、Gibson, D.G. et al. Nature Methods, 343〜345, 2009; and Gibson, D.G. et al. Nature Methods, 901〜903, 2010を参照。その各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる）を用いて生成される。GIBSON ASSEMBLY（登録商標）は、典型的には、単一チューブ反応において３つの酵素活性、すなわち、５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの３’伸長活性およびＤＮＡリガーゼ活性を用いる。５’エキソヌクレアーゼ活性は、５’末端配列を後退させ、アニーリングのための相補的配列を曝す。ポリメラーゼ活性は、そのうえ、アニールされた領域上のギャップを埋める。次いで、ＤＮＡリガーゼがニックをシールし、ＤＮＡフラグメントを共有結合する。隣接するフラグメントの重複配列は、Golden Gate Assemblyで使用されるものよりもずっと長く、したがって、正しいアセンブリの割合が高くなる。
【０１００】
いくつかの態様において、操作された核酸は、ベクター上の細胞に送達される。「ベクター」は、例えばそれが複製および／または発現され得る細胞内に遺伝物質（例えば、操作された核酸）を人工的に運ぶためのビヒクルとして使用される核酸（例えば、ＤＮＡ）をいう。いくつかの態様において、ベクターはエピソームベクターである（例えば、Van Craenenbroeck K. et al. Eur. J. Biochem. 267, 5665, 2000参照。本明細書に参照によって組み込まれる）。ベクターの非限定的な例は、プラスミド（例えば、図３）である。プラスミドは、宿主細胞中で自動的に複製することができる二本鎖の概して環状のＤＮＡ配列である。プラスミドベクターは、典型的には宿主中のプラスミドの半独立した複製および導入遺伝子挿入を可能にする複製起源を含む。プラスミドは、例えば、核酸挿入物の挿入のためのヌクレオチドオーバーハング、および挿入物のいずれかの側への複数の制限酵素コンセンサス部位を含む、「多重クローニング部位」を含む、より多くの特徴を有し得る。ベクターの別の非限定的な例は、ウイルスベクターである。
【０１０１】
したがって、いくつかの態様において、遺伝子操作された遺伝子回路は、ウイルス送達系（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連、ヘルパー依存性アデノウイルス系、ハイブリッドアデノウイルス系、単純ヘルペス、ポックスウイルス、レンチウイルス、Epstein-Barrウイルスなど）、または非ウイルス送達系（例えば、物理的：裸のＤＮＡ、ＤＮＡ衝撃、エレクトロポレーション、流体力学的、超音波または磁気感受性；または化学的：カチオン性脂質、異なるカチオン性ポリマーまたは脂質ポリマー）を用いて細胞 へ送達される（Nayerossadat N Adv Biomed Res. 2012; 1:27、本明細書中に参考によって組み込まれる）。いくつかの態様において、非ウイルスベースの送達系は、ヒドロゲルベースの送達系である（例えば、Brandl F, et al. Journal of Controlled Release, 2010,142(2): 221-228を参照。参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０２】
マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）は、植物、動物およびいくつかのウイルスに見られる小さな非コードＲＮＡ分子（例えば、約２２個のヌクレオチドを含む）であり、ＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節においてワイルド型条件下で典型的に機能する。
【０１０３】
遺伝要素 
操作された核酸の発現は、例えば目的の分子をコードする核酸を含む核酸に作動可能に連結されたプロモータによって駆動される。「プロモータ」は、核酸配列の残りの開始および転写の速度が制御される、核酸配列の制御領域をいう。プロモータは、それが調節する核酸配列の発現を駆動し、または該核酸配列の転写を駆動する。プロモータはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る下位領域を含み得る。プロモータは、構成的、誘導的、活性化可能、抑制可能、組織特異的またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１０４】
本明細書において、プロモータは、転写開始および／またはその配列の発現を制御（「駆動」）するように調節する核酸配列と関連して正しい機能的位置および配向にある場合、「作動可能に連結された」と見なされる。
プロモータは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られ得るように、遺伝子または配列に自然に関連するプロモータであり得る。かかるプロモータは、「内因性」ということができる。
【０１０５】
いくつかの態様において、コード核酸配列は、その自然環境においてコードされた配列と通常は関連していないプロモータをいう、組換えまたは異種プロモータの制御下に配置し得る。かかるプロモータには、他の遺伝子のプロモータ；他の細胞から単離されたプロモータ；当技術分野で知られている遺伝子工学の方法によって発現を変化させる異なる転写調節領域および／または突然変異の異なる要素を含むものなどの「天然に存在しない」合成プロモータまたはエンハンサーが含まれ得る。プロモータおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を用いて配列を生成することができる（米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第５，９２８，９０６号参照）。
【０１０６】
いくつかの態様において、プロモータは、インデューサー信号の存在下、インデューサー信号によって接触または影響されたときに、転写活性を調節する（例えば、開始または活性化する）ことによって特徴付けられる、プロモータをいう「誘導性プロモータ」である。インデューサー信号は、誘導性プロモータに由来する転写活性を調節する際に活性であるように、誘導性プロモータと接触する内因性または通常は外因性の条件（例えば、光）、化合物（例えば、化学的または非化学的化合物）またはタンパク質であり得る。したがって、核酸の「転写を調節する信号」は、誘導性プロモータに作用するインデューサー信号をいう。転写を調節する信号は、使用される制御系に応じて、転写を活性化または不活性化し得る。転写の活性化は、転写を駆動するプロモータに直接作用するか、またはプロモータが転写を駆動することを妨害するリプレッサーを不活性化によって間接的にプロモータに作用させることに関与し得る。逆に、転写の失活は、転写を妨げるためにプロモータに直接作用するか、またはプロモータに作用するリプレッサーを活性化することによってプロモータに間接的に作用することに関与し得る。
【０１０７】
インデューサー信号の付与または除去は、作動可能に連結された核酸配列の転写の活性化と不活性化との間の切り替えをもたらす。したがって、核酸配列に作動可能に連結されたプロモータの活性状態は、プロモータが核酸配列の転写を能動的に調節している状態（すなわち、連結された核酸配列が発現されている状態）をいう。逆に、核酸配列に作動可能に連結されたプロモータの不活性状態は、プロモータが核酸配列の転写を能動的に調節していない状態（すなわち、連結された核酸配列が発現していない状態）をいう。
【０１０８】
本開示の誘導性プロモータは、光、ｐＨ、温度、放射線、浸透圧、生理食塩水勾配、細胞表面結合および１以上の外因性または内因性誘導剤濃度の変化などの１以上の生理学的条件によって誘導され得る（または抑制され得る）。外因性インデューサー信号または誘導剤は、限定されないが、アミノ酸およびアミノ酸類似体、糖類および多糖類、核酸、タンパク質転写活性化因子および抑制因子、サイトカイン、毒素、石油系化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質類似体、ホルモンまたはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１０９】
本開示の誘導性プロモータは、本明細書に記載されるかまたは当業者に公知の任意の誘導性プロモータを含む。誘導プロモータの例には、限定されないが、アルコール調節プロモータ、テトラサイクリン調節プロモータ（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモータ、およびテトラサイクリン・リセッサー・タンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリン・オペレーター配列（ｔｅｔＯ）およびテトラサイクリン  トランスアクチベーター融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む他のテトラサイクリン応答性プロモータ系など）などの化学的／生化学的に調節された、および物理的に調節されたプロモータ、ステロイド調節プロモータ（例えば、ラット  グルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、モスエクジソン受容体に基づくプロモータ、ステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモータ）、金属調節プロモータ（例えば、イースト、マウス、ヒト由来のメタロチオネイン（金属イオンと結合および金属イオンを封鎖するタンパク質）遺伝子）、病因調節プロモータ（例えば、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導される）、温度／熱誘導性プロモータ（例えば、ヒートショックプロモータ）および光調節プロモータ（例えば、植物細胞からの光応答性プロモータ）が含まれる。
【０１１０】
いくつかの態様において、本開示のインデューサー信号は、アロラクトース（allolactose）の分子模倣物である、イソプロピルβ-Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、すなわちｌａｃオペロンの転写を誘発する乳糖代謝産物であり、遺伝子がｌａｃオペレーターの制御下にあるタンパク質発現を誘導するために用いられる。ＩＰＴＧはｌａｃリプレッサーに結合し、アロステリック様式でｌａｃオペレーターから四量体リプレッサーを放出し、それにより、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、β−ガラクトシドの単糖類への加水分解を触媒するヒドロラーゼ酵素などのｌａｃオペロンにおける遺伝子の転写を可能にする。硫黄（Ｓ）原子は、細胞によって非加水分解性であり、細胞がインデューサーを代謝または分解することを妨げる化学結合を生成する。ＩＰＴＧは、例えば１００μＭ〜１．０ｍＭの濃度範囲のタンパク質発現の効果的なインデューサーである。使用される濃度は、必要とされる誘導の強さ、ならびに使用される細胞またはプラスミドの遺伝子型に依存する。ｌａｃリプレッサーを過剰生成する突然変異体ｌａｃＩｑが存在する場合、より高いＩＰＴＧ濃度が必要な場合がある。青白い画面では、ＩＰＴＧがＸ−ｇａｌと一緒に使用される。青白色のスクリーンによって、非組換えプラスミドではなく組換えプラスミドで形質転換したコロニーをクローニング実験で同定することができる。
他の誘導性プロモータ系は当該分野で公知であり、本開示に従って使用することができる。
【０１１１】
免疫調整剤 
免疫調節剤は、免疫応答を調節する薬剤（例えば、タンパク質）である。本開示は、いくつかの態様において、がん性細胞の表面で発現されるか、またはがん性細胞から分泌されるか、またはがん性細胞から分泌される免疫調節剤をコードする核酸を含む操作された遺伝子回路を提供する。
【０１１２】
いくつかの態様において、免疫調節剤は、合成Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）である。「合成Ｔ細胞エンゲージャー」は、Ｔ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）の表面上の分子に結合する（例えば、リガンド−受容体結合相互作用を介して）分子であるか、然もなければ細胞毒性Ｔ細胞応答を誘い出す。いくつかの態様において、ＳＴＥは、Ｔ細胞の表面上のリガンドに結合する受容体である。いくつかの態様において、ＳＴＥは抗ＣＤ３抗体または抗体フラグメントである。本開示のＳＴＥは、典型的には、ＳＴＥをコードする核酸が送達されるがん細胞または他の疾患細胞の表面で発現されるか、または分泌される。
【０１１３】
本開示のＳＴＥの例には、Ｔ細胞表面抗原に結合する抗体、抗体フラグメントおよび受容体が含まれる。Ｔ細胞表面抗原には、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４５が含まれる。本開示の遺伝子回路によって発現されるＳＴＥはまた、以下に記載される免疫調節剤のいずれかから選択され得る。
いくつかの態様において、本開示の遺伝子回路は、ケモカイン、サイトカインまたはチェックポイント抑制剤の発現を調節する。
【０１１４】
免疫調節剤には、免疫刺激剤および免疫抑制剤が含まれる。本明細書中で使用されるように、免疫刺激剤は、それが投与される対象において、単独でまたは別の薬剤との組み合わせで、免疫応答（既存の免疫応答の増強を含む）を刺激する薬剤である。
【０１１５】
例には、抗原、アジュバント（例えば、イミキモド、イミダゾキノリンなどのＴＬＲリガンド、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸、モノホスホリルリピドＡまたは他のリポ多糖誘導体を含む核酸、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、フラジェリン、ムラミルジペプチド）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５（またはこれらのサイトカインのスーパーアゴニスト／突然変異体）ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３リガンドなど）を含むサイトカイン、免疫刺激剤抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３、またはこれらの分子の単鎖／抗体フラグメント）などが含まれる。
【０１１６】
本明細書中で使用されるように、免疫抑制剤は、それが投与される対象において、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、免疫応答を抑制する薬剤である。例には、ステロイド、レチノイン酸、デキサメタゾン、シクロホスファミド、抗ＣＤ３抗体または抗体フラグメント、および他の免疫抑制剤が含まれる。
抗原は、がん抗原、自己抗原、微生物抗原、アレルゲン、または環境抗原であり得るが、これらに限定されない。抗原は、性質上、ペプチド、脂質、または炭水化物であり得るが、そのように限定されない。
【０１１７】
がん抗原は、がん細胞によって優先的に発現される抗原であり（例えば、非がん細胞よりもがん細胞においてより高いレベルで発現される）、場合によってはがん細胞によって単独で発現される。がん抗原は、がん細胞内またはがん細胞の表面上で発現され得る。がん抗原は、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＦＡＰ、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ＡＭＬ１、 前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、ＰＳＡ−３、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３ゼータ鎖、およびＣＤ２０であり得る。
【０１１８】
がん抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−  Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５からなる群から選択され得る。がん抗原は、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９からなる群から選択し得る。
【０１１９】
がん抗原は、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α-フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イジオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、Ｓｍａｄファミリーの腫瘍抗原、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード化核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、ＣＤ２０およびｃ−ｅｒｂＢ−２からなる群から選択され得る。
【０１２０】
細胞および細胞発現 
本開示の操作された遺伝子回路は、典型的には、全身的に送達され、およびがん性細胞、良性腫瘍細胞または他の疾患細胞のような特定の細胞型において、条件的に（入力信号の存在または不存在に基づいて）活性化される（回路の転写が活性化される）。このようにして、いくつかの態様において、遺伝子回路（論理ゲート）は、腫瘍細胞またはがん細胞を有する対象に送達され、遺伝子回路（論理ゲート）が腫瘍細胞またはがん細胞において発現される。
【０１２１】
がん性細胞は、前がん性新生物、悪性腫瘍、転移、またはがん性または前がん性とみなされるような制御されない細胞増殖によって特徴付けされる任意の疾患または障害を含むが、これらに限定されない任意のタイプのがん性細胞であり得る。がんは、原発性または転移性のがんであり得る。がんには、眼球がん、胆道がん、膀胱がん、胸膜がん、胃がん、卵巣がん、髄膜がん、腎臓がん、グリア芽腫および髄芽腫を含む脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、絨毛がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、急性リンパ性白血病および骨髄性白血病を含む血液学新生物、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、ボーエン病およびパジェット病を含む上皮新生物、肝臓がん、肺がん、ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫が含まれる。
【０１２２】
また、神経芽細胞種、扁平上皮がんを含む口腔がん、上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じるものを含む卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫を含む肉腫、メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞がん、および扁平上皮がんを含む皮膚がん、皮膚セミノーマ、非セミノーマ、奇形腫、絨毛がん、間質腫瘍および胚細胞腫瘍などの胚腫瘍を含む精巣がん、甲状腺がんおよび髄質がんを含む甲状腺がん、ならびに腎臓がんを含む腎臓がんを含むが、これらに限定されない。腺がんおよびウィルムス腫瘍を含む腎がんを含むが、それらに限定されない。一般的に遭遇するがんには、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がんおよび脳腫瘍が含まれる。いくつかの態様において、腫瘍はメラノーマ、がん腫、肉腫またはリンパ腫である。
【０１２３】
本開示の操作された核酸は、広範囲の宿主細胞型において発現され得る。いくつかの態様において、操作された核酸は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、細菌細胞（大腸菌細胞）、酵母細胞、昆虫細胞、または他のタイプの細胞で発現される。本開示の操作された核酸は、インビボで、例えば、ヒト対象のような対象において、発現され得る。
【０１２４】
いくつかの態様において、操作された核酸は哺乳動物細胞で発現される。例えば、いくつかの態様において、操作された核酸は、ヒト細胞、霊長類細胞（例えば、ベロ細胞）、ラット細胞（例えば、ＧＨ３細胞、ＯＣ２３細胞）またはマウス細胞（例えばＭＣ３Ｔ３細胞）において発現される。限定されないが、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、国立がん研究所（National Cancer Institute）の６０のがん細胞株（ＮＣＩ６０）、ＤＵ１４５（前立腺がん）細胞、Ｌｎｃａｐ（前立腺がん細胞）、ＭＣＦ−７（乳がん）細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（乳がん）細胞、ＰＣ３（前立腺がん）細胞、Ｔ４７Ｄ（乳がん）細胞、ＴＨＰ−１（急性骨髄性白血病）細胞、Ｕ８７（glioblastoma；グリオブラストーマ）細胞、ＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞（骨髄腫からクローン化された）およびＳａｏｓ−２（骨がん）細胞を含むさまざまなヒト細胞株がある。いくつかの態様において、操作された核酸は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３またはＨＥＫ ２９３Ｔ細胞）で発現される。 
【０１２５】
いくつかの態様において、操作された核酸は、例えば多能性幹細胞（例えば、ヒト誘導性多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を含むヒト多能性幹細胞）などの幹細胞（例えばヒト幹細胞）で発現される。「幹細胞」とは、培養において不定期に分裂し、特殊細胞を生じさせる能力を有する細胞をいう。「多能性幹細胞」とは、生物の全ての組織に分化することができるけれども、それのみで完全な生物発達を維持することができない幹細胞をいう。「ヒト誘導多能性幹細胞」とは、胚性幹細胞の特性を維持するために重要な遺伝子および因子を強制的に発現させることによって、胚性幹細胞様の状態を再プログラミングされた体細胞（例えば、成熟または成体）をいう。（例えば、Takahashi and Yamanaka, Cell 126 (4): 663〜76, 2006を参照されたい。本明細書に参照によって組み込まれる）。ヒト誘導多能性幹細胞細胞種は、幹細胞マーカーを発現し、３つの胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）の全てに特徴的な細胞を生成することができる。
【０１２６】
本開示にしたがって用いられ得る細胞株の追加の非限定的例は、２９３−Ｔ、２９３−Ｔ、３Ｔ３、４Ｔ１、７２１、９Ｌ、Ａ−５４９、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ４３１、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ  ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ２Ｃ１２、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＧＲ８、ＣＨＯ、ＣＭＬ  Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、Ｅ１４Ｔｇ２ａ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、ＨＵＶＥＣ、Ｊ５５８Ｌ細胞、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、Ｋｕ８１２、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ  １、２、３．．．．４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＧ６３、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ  ６、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＲＣ５、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＡＬＭ−１、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ  Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ  ２、ＰＴＫ２、Ｒａｊｉ、ＲＢＬ細胞、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓ２、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ２１、Ｓｆ９、ＳｉＨａ、ＳＫＢＲ３、ＳＫＯＶ−３、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ２、Ｔ８４、ＴＨＰ１、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、  ＹＡＣ−１ならびにＹＡＲ細胞を含む。
【０１２７】
いくつかの態様において、本開示の細胞は改変される。改変された細胞は、外来性の核酸または天然に存在しない核酸を含む細胞である。いくつかの態様において、改変された細胞は、ゲノム核酸中に変異を含む。いくつかの態様において、改変された細胞は、外因性の独立して複製する核酸（例えば、エピソームベクター上に存在する操作された核酸）を含む。いくつかの態様において、改変された細胞は、外来または外因性の核酸を細胞に導入することによって生成される。核酸は、例えば、エレクトロポレーション（例えば、Heiser W.C. Transcription Factor Protocols: Methods in Molecular Biology(TM) 2000; 130: 117-134を参照）、化学物質（例えば、リン酸カルシウムまたは脂質（例えば、Lewis W.H., et al., Somatic Cell Genet. 1980 May; 6(3): 333-47; Chen C., et al., Mol Cell Biol. 1987 August; 7(8): 2745〜2752参照）、組換えプラスミドを含む細菌プロトプラストとの融合（例えば、Schaffner W. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Apr; 77(4): 2163-7参照）、精製された ＤＮＡを細胞の核内に直接的に形質導入、結合、またはマイクロ注入すること（例えば、Capecchi M.R. Cell. 1980 Nov; 22(2 Pt 2): 479-88を参照）などの従来法によって導入し得る。 
【０１２８】
いくつかの態様において、細胞を改変してレポーター分子を発現させる。いくつかの態様において、細胞は、レポーター分子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または他のレポーター分子などの蛍光タンパク質）に作動可能に連結された誘導性プロモータを発現するように改変される。
【０１２９】
いくつかの態様において、細胞は、目的の内因性タンパク質を過剰発現するように改変される（例えば、発現レベルを増加させるように目的のタンパク質をコードする内因性遺伝子の近くにプロモータまたは他の調節要素を導入または改変することによって）。いくつかの態様において、細胞は突然変異誘発によって改変される。いくつかの態様において、（例えば、挿入または相同組換えを介して）目的の遺伝子変化を生じるために、操作された核酸を細胞に導入することによって、細胞を改変する。
【０１３０】
いくつかの態様において、操作された核酸は、例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）または他のタイプの細胞における発現のために、コドン最適化され得る。コドン最適化は、１つの種のヌクレオチドのＤＮＡ配列を別の種のヌクレオチドのＤＮＡ配列に変換することによって目的の遺伝子の翻訳効率を増加させることによって、生きている生物におけるタンパク質発現を最大にする技術である。コドン最適化の方法は周知である。
【０１３１】
本開示の操作された核酸は、一過的に発現され得るか、または安定して発現され得る。「一過性細胞発現」とは、細胞の核ゲノムに組み込まれていない核酸の細胞による発現をいう。これに対して、「安定細胞発現」とは、細胞の核ゲノムおよびその娘細胞に残存する核酸の細胞による発現をいう。典型的には、安定した細胞発現を達成するために、細胞内での安定した発現を意図するマーカー遺伝子および外因性核酸（例えば、操作された核酸）で、細胞が共遺伝子導入される。マーカー遺伝子は、細胞にいくつかの選択可能な利点（例えば、毒素、抗生物質または他の因子に対する耐性）を与える。いくつかの遺伝子導入された細胞は、偶然に外因性核酸をそれらのゲノムに組み込まれるであろう。例えば毒素が細胞培養物に添加されると、そのゲノムに組み込まれた毒素耐性マーカー遺伝子を有する少数の細胞のみが増殖することができ、他の細胞は死滅する。
【０１３２】
この選択圧を一定期間適用した後、安定したトランスフェクションを有する細胞のみが残り、さらに培養することができる。本開示に従って使用するためのマーカー遺伝子および選択剤の例には、限定されないが、メトトレキセートを伴うジヒドロ葉酸塩レダクターゼ、メチオニンスルホキシミンを有するグルタミンシンテターゼ、ハイグロマイシンを有するハイグロマイシン  ホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシンを有するピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼおよびＧ４１８としても知られているジェネテシンを有するネオマイシン  ホスホトランスフェラーゼが含まれる。
一過性に遺伝子導入されたおよび／または安定に遺伝子導入された細胞における核酸の発現は、構成的または誘導的であり得る。本明細書で提供されるような使用のための誘導性プロモータが、上に記載されている。
【０１３３】
本開示のいくつかの側面は、１〜１０個の操作された核酸を含む細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の操作された核酸を含む。「操作された核酸を含む」細胞は、操作された核酸のコピー（２以上の）を含む細胞であることを理解されるべきである。したがって、「少なくとも２つの操作された核酸を含む」細胞は、第１の操作された核酸のコピーおよび操作された第２の核酸のコピーを含む細胞であり、第１の操作された核酸は、第２の操作された核酸とは異なる。２つの操作された核酸は、例えば配列組成（例えば、ヌクレオチドのタイプ、数および配置）、長さ、または配列組成と長さの組み合わせに関して互いに異なっていてもよい。例えば、同じ細胞内の２つの操作された核酸のＳＤＳ配列は、互いに異なっていてもよい。
【０１３４】
本開示のいくつかの側面は、１〜１０個またはそれ以上のエピソームベクターを含む細胞を提供し、各ベクターは、例えば操作された核酸を含む。いくつかの態様において、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のベクターを含む。
また、本明細書では、いくつかの側面において、（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれ以上の）操作された核酸またはエピソームベクター（例えば、操作された核酸を含む）細胞に導入することを含む方法が提供される。本明細書の何処かで論じられたように、例えば、エレクトロポレーション、化学物質（例えば、リン酸カルシウムまたは脂質）トランスフェクション、組換えプラスミドを含む細菌プロトプラストとの融合、形質導入、結合または精製されたＤＮＡの細胞核への直接マイクロ注入などのような従来の方法によって、操作された核酸を細胞に導入することができる。
【０１３５】
インビボ送達 
本開示の操作された核酸は、当該分野で公知の任意のインビボ送達方法によって、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）に送達され得る。例えば、操作された核酸は、静脈内に送達され得る。いくつかの態様において、操作された核酸は送達ビヒクル（例えば、非リポソームナノ粒子またはリポソーム）中に送達される。いくつかの態様において、操作された遺伝子回路は、がんまたは他の疾患を有する対象に全身的に送達され、対象のがん細胞または罹患細胞において特異的に活性化される（転写が活性化される）。
【０１３６】
上で議論したように操作された遺伝子回路は、ウイルス送達システム（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連、ヘルパー依存性アデノウイルス系、ハイブリッドアデノウイルス系、単純ヘルペス、ポックスウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）または非ウイルス送達系（例えば、物理的：裸のＤＮＡ、ＤＮＡ衝撃、エレクトロポレーション、流体力学的、超音波または磁気感受性;または化学的：カチオン性脂質、異なるカチオン性ポリマーまたは脂質ポリマー）（Nayerossadat N et al. Adv Biomed Res. 2012; 1: 27、本明細書に参照により組み込まれる）を用いて対象の細胞に送達し得る。いくつかの態様において、非ウイルスベースの送達系は、ヒドロゲルベースの送達系である（例えば、Brandl F, et al. Journal of Controlled Release, 2010, 142(2): 221-228参照、参照により本明細書に組み込まれる）。 
【０１３７】
合成プロモータ・ライブラリー 
合成プロモータ・ライブラリーが提供され、それは、複数の核酸を含み、ここで、ライブラリー中の各核酸が合成プロモータ配列を含む。合成プロモータ・ライブラリーの３つのデザインが提供される。２つのデザイン（「デザイン１」および「デザイン２」）において、ライブラリーのプロモータ配列は、直列に連結された８ｍｅｒのヌクレオチド配列を含む（頭から尾へ）。これらのデザインの１つ（「デザイン２」）において、３ｍｅｒヌクレオチド・スペーサーを８ｍｅｒヌクレオチド配列の各対の間に配置する。第３の設計（「デザイン３」）において、ライブラリーの核酸配列は、１１ｍｅｒヌクレオチド配列の各対の間に配置された３ｍｅｒヌクレオチド・スペーサーを伴って、直列に連結された１１ｍｅｒヌクレオチド配列を含む（頭から尾へ）。
【０１３８】
直列の８ｍｅｒまたは１１ｍｅｒのヌクレオチド配列の数は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の８ｍｅｒまたは１１ｍｅｒのヌクレオチド配列であり得る。核酸中の各８ｍｅｒまたは１１ｍｅｒヌクレオチド配列の配列はランダムであり得る（すなわち、配列NNNNNNNN、各Ｎは任意のヌクレオチドを表す）。任意の核酸における８ｍｅｒまたは１１ｍｅｒヌクレオチド配列は、 ランダムであり得、その結果、プロモータ・ライブラリー中の複数の核酸は、実質的にすべての可能な配列、またはライブラリーのために選択された核酸の長さの全ての可能な配列を表す。その代わりに、特定のヌクレオチド配列または組成物（例えば、ピリミジン含量）が好ましいか、または必要とされる場合、または好ましくないか、または回避される場合、８ｍｅｒまたは１１ｍｅｒヌクレオチド配列は、望んだ通りに、特定の位置または特定のヌクレオチド含量の特定のヌクレオチドを有するように設計され得る。かかる場合、プロモータ・ライブラリー中の複数の核酸は、すべての可能な配列の選択されたサブセットを表す。
【０１３９】
いくつかの態様において、定義された配列のヌクレオチド・スペーサーは、各８ｍｅｒまたは１１ｍｅｒヌクレオチド配列の間に配置される。ヌクレオチド・スペーサーは、好ましくは３ｍｅｒヌクレオチドであるが、１、２、４または５ヌクレオチドなどの他の長さスペーサーを使用することができる。いくつかの態様における３ｍｅｒヌクレオチド・スペーサーは、ＡＧＣ、ＡＴＣ、ＧＡＣ、ＡＣＴ、ＡＧＴ、ＧＴＣ、ＧＡＴ、およびＧＣＴから選択される。いくつかの態様において、ライブラリー中の核酸に使用される各ヌクレオチド・スペーサーは、同じ核酸中の他のヌクレオチド・スペーサーとは異なる。
【０１４０】
いくつかの態様において、合成プロモータ・ライブラリー中の核酸は、５’および３’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに含む。いくつかの態様において、５’末端の制限エンドヌクレアーゼ部位は、ＳｂｆＩ部位であり、３’末端の制限エンドヌクレアーゼ部位は、ＡｓｃＩ部位である。他の制限エンドヌクレアーゼ部位を使用してもよい。
【０１４１】
いくつかの態様において、合成プロモータ・ライブラリー中の核酸の各々は、プロモータ配列に作動可能に連結された出力分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの態様における出力分子は、検出可能な分子、例えば、蛍光または着色タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ２）、酵素、または当技術分野で公知の任意の他のタイプの検出可能な核酸またはポリペプチドである。
【０１４２】
合成プロモータ・ライブラリーは、合成プロモータを選択する方法において使用し得る。この方法は、出力分子に作動可能に連結された合成プロモータ配列を含む核酸分子を含むライブラリーを得ること、１以上のタイプの細胞においてライブラリーを発現させること、出力分子の発現を検出すること、および出力分子が発現された細胞を単離することを含む。場合により、この方法は、単離された細胞中の合成プロモータ配列の配列を決定することをも含む。
【０１４３】
いくつかの態様において、１つ以上のタイプの細胞は、がん細胞および適合した非がん細胞などの少なくとも２つの異なるタイプの細胞、例えば卵巣がん細胞および卵巣細胞、または乳がん細胞および乳房細胞などである。
【０１４４】
少なくとも２つの異なるタイプの細胞のそれぞれにおいて出力分子の発現を駆動する合成プロモータ配列を比較することにより、少なくとも２つの異なるタイプの細胞のうちの１つにおいて、少なくとも２つの異なるタイプの細胞のもう一方より活性の高い合成プロモータ配列を同定することができる。したがって、少なくとも２つの異なるタイプの細胞ががん細胞および非がん細胞である場合、がん細胞では活性であるが非がん細胞では活性でない、またはその逆の活性を有するプロモータを同定することができる。
【０１４５】
「少なくとも２つの異なるタイプの細胞のうちの１つにおいて、少なくとも２つの異なるタイプの細胞のもう一方よりも活性が高い」とは、プロモータが、該２つのタイプの細胞の１つにおいて、少なくとも１０％、５０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、または７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍または１０００倍（またはそれ以上）の活性を有することを意味する。例えば、これらの方法によってライブラリーから単離された合成プロモータは、１つのタイプの細胞において本質的に不活性であり得、細胞タイプ特異的合成プロモータを提供する別のタイプの細胞において活性であり得る。
【０１４６】
例 
例１： 
２つのヒトプロモータを、本例で使用した操作された遺伝子回路のためのプロモータ入力として使用した。これらのヒトプロモータ、ＳＳＸ１（入力１）およびＨ２Ａ１（入力２）は、多くのヒトのがんにおいて過剰発現される（入力１は、介在するｍｉｒＦ４を含むｍＫａｔｅ２出力をコードする）（図４Ａ）。（ａ）入力１（ｍＫ２の下流）にコード化された完全一致ｍｉｒＦＦ４結合部位（ＦＦ４−ＢＳ）の数、および（ｂ）入力２における「スポンジ」構築物のための２つの異なる配置に関して、異なる回路配置のために、ｍＫａｔｅ２出力レベルを測定した。図４Ｂのｘ軸注釈：Ｍ＃は、ｍＫａｔｅ２／ｍｉｒＦＦ４から下流にコードされたｍｉｒＦＦ４結合部位（ＦＦ４−ＢＳ）の数を有する入力１を表す。例えば、Ｍ３は３つの完全一致ｍｉｒＦＦ４結合部位（ＦＦ４−ＢＳ）を有する入力１を表す（図４Ａ）。
【０１４７】
Ｓ０、Ｓ１およびＳ２は、３つの異なるスポンジ／入力２配置を表す。Ｓ０は、ｍｉｒＦＦ４結合部位を有さないネガティブ対照転写物である。Ｓ１は、構築物の３’末端にコードされた１０の隆起したｍｉｒＦＦ４結合部位を有するデコイ転写物である（図４Ａ）。Ｓ２はＳ１に類似しているが、構築物の３’末端にコードされた１０の隆起したｍｉｒＦＦ４−ＢＳの上流に位置する１０個の隆起したＦＦ４−ＢＳを有する追加の環状イントロンを有する。図４Ａに示す操作された遺伝子回路（論理ゲート）は、図４ＢのＭ３−Ｓ１に対応する（破線のボックスで強調表示）。結果は平均ｍＫａｔｅ２発現（Ｐ１）で表され、それは細胞塊および破片を除去するためのＦＡＣＳにおけるＳＳＣ／ＦＳＣに対してゲートされた細胞の平均ｍＫａｔｅ２である。エラーバーはＳＥＭを表す。ＮＴは非遺伝子導入細胞を表す。
ＥＣＦＰ標識を用いて実験を繰り返した（図５）。
【０１４８】
例２ 
この例に記載された操作された遺伝子回路（Ｇ５）は、ＡＮＤゲート産物がｍＫａｔｅ２ではなく、合成転写因子（図６において「ＴＦ」と表示）であることを除いて、例１に記載のｍＫａｔｅ２をコードする回路（ＡＮＤゲート）に基づく。この例では、ｒｔＴＡ３、ＴＡＬＥ−ＴＦおよびＺＦ−ＴＦなどの任意の転写活性化因子であり得るが、ＴＦは、融合タンパク質ＧＡＬ４ＢＤ−ＶＰ１６  ＡＤ（ウイルスＶＰ１６転写活性化ドメインに融合した酵母ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン）である。あるいは、これは、ＧＡＬ４ＢＤ−ＫＲＡＢなどの転写リプレッサーでもあり得る。出力はレポーター／エフェクタータンパク質ではなく転写因子であるため、ＴＦ標的プロモータの下流にコードされた複数の出力の発現を調節し得る。この例において、標的プロモータ（Ｐ３と注釈）は、５つの上流ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合部位を有する最小ウイルスまたはヒトプロモータからなる合成Ｇ５プロモータである。この合成プロモータのＩ／Ｏ曲線は、ＧＡＬ４結合部位の数で微調整することができる。したがって、各出力の活性化閾値と共に任意の複数の出力間の比は、合成Ｐ３プロモータ中のＧＡＬ４結合部位の数によって決定し得る。
【０１４９】
図６Ｂは実験結果を示す。ＣＸＣＬ１０は、ｍｉｒＦＦ４ｖ２Ｂイントロンおよび１０の下流のｍｉｒＦＦ４−Ｂｓを維持するＧＡＬ４ＢＤ−ＶＰ１６ＡＤを調節するＣＸＣＬ１ｐである。ＳＳＸ１０は、ｍｉｒＦＦ４ｖ２Ｂイントロンおよび１０の下流のｍｉｒＦＦ４−Ｂｓを維持するＧＡＬ４ＢＤ−ＶＰ１６ＡＤを調節するＳＳＸ１ｐである。ＳＳＸ＊１０は、５’ＵＴＲの一部がＫＯＺＡＫ配列とともに除去され、ｍｉｒＦＦ４ｖ２Ｂイントロンおよび１０の下流のｍｉｒＦＦ４−Ｂｓを維持するＧＡＬ４ＢＤ−ＶＰ１６ＡＤを調節する切断型ＳＳＸ１ｐである。スポンジＳ０はネガティブ対照転写物ｍｉｒＦＦ４−ＢＳである。スポンジＳ２は、３’末端にコードされた１０個の隆起したＦＦ４−ＢＳを有するデコイ転写物であり、１０個の隆起したｍｉｒＦＦ４−ＢＳを有する追加の環状イントロンは転写物３’末端にコードされた１０個の隆起したｍｉｒＦＦ４−ＢＳの上流に位置する。すべての試料で、ｍＫａｔｅ２出力はＧ５ｐの下にコードされている。
【０１５０】
例３．ＢｉＴＥおよびＳＴＥは強力な腫瘍殺傷を誘発する
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞 
抗ＨＥＲ２二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）および表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）は、Ｔ細胞を強力な腫瘍殺傷およびＩＦＮ−γ分泌を媒介するように誘発する（図８）。ＨＥＫ−２９３Ｔ（最小発現ＨＥＲ２）細胞を、示されるようにさまざまなＤＮＡ構築物で遺伝子導入した。遺伝子導入の４８時間後、さまざまなＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間または２４時間共培養した。Ｔ細胞による５時間の細胞毒性は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイ（Korzeniewski C and Callewaert DM, Journal of Immunological Methods, 1983, 64(3):313-320参照、参照によって本明細書に組み込まれる。）および２４時間のＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌がＩＦＮ−γＥＬＩＳＡにより測定した。 
【０１５１】
データは、Ｔ細胞が、ＢｉＴＥを分泌する腫瘍細胞（群１−２）上で強力な腫瘍殺傷およびＩＦＮ−γ分泌を媒介することを示す。腫瘍の殺傷およびＩＦＮ−γ分泌は、腫瘍細胞のＨＥＲ２発現レベルと相関する（群１−２）。Ｔ細胞はＳＴＥを発現する腫瘍細胞（群３−６）上で強い腫瘍殺傷およびＩＦＮ−γ分泌を媒介し、細胞毒性およびＩＦＮ−γ分泌は腫瘍抗原（ＨＥＲ２）発現とは無関係である（群３−６）。さらに、Ｔ細胞は、非ＢｉＴＥおよび非ＳＴＥ対照タンパク質を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞と共培養した場合（群７−９）、最小の腫瘍殺傷およびＩＦＮ−γ分泌を媒介する。 
【０１５２】
安定な４Ｔ１細胞 
示されたＤＮＡ構築物（ＳＴＲＩＣＴ０１７＋０１８）を発現する安定な４Ｔ１細胞（ＨＥＲ２−）を、ヒトＴ細胞と５時間または２４時間共培養した（図１０）。Ｔ細胞による５時間の細胞毒性をＬＤＨ放出アッセイにより測定し、Ｔ細胞による２４時間のＩＦＮ−γ分泌をＩＦＮ−γＥＬＩＳＡで測定した（図１０Ａ）。データは、Ｔ細胞が、ＨＥＲ２−またはＳＴＥ腫瘍細胞（群１および３）上の最小の殺傷およびＩＦＮ−γ分泌を媒介することを示す。Ｔ細胞は、ＳＴＥを発現する腫瘍細胞（群２）上で強力な腫瘍殺傷およびＩＦＮ−γ分泌を媒介する。Ｔ細胞は、非ＢｉＴＥ分泌腫瘍を有する少数のＢｉＴＥ分泌細胞からなる細胞混合物と共培養した場合にも、強力な腫瘍殺傷およびＩＦＮ−γ分泌を媒介する。これは、腫瘍塊におけるＢｉＴＥ分泌細胞の最小数が、強力な腫瘍塊の殺傷およびＩＦＮ−γ放出（群４）を導き出し得ることを示す。 
【０１５３】
安定なＨＥＫ２９３Ｔ細胞 
示されたＤＮＡ構築物を発現する安定なＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（最小発現ＨＥＲ２）を、ヒトＴ細胞と５時間または２４時間共培養した。Ｔ細胞による５時間の細胞毒性をＬＤＨ放出アッセイにより測定し、Ｔ細胞による２４時間のＩＦＮ−γ分泌をＩＦＮ−γＥＬＩＳＡで測定した（図１０Ｂ）。データは、Ｔ細胞が、ＢｉＴＥまたはＳＴＥ腫瘍細胞で最小限の殺傷およびＩＦＮ−γ分泌を媒介することを示す（群４）。Ｔ細胞は、ＢｉＴＥを分泌する腫瘍細胞（群１）上で強い細胞毒性およびＩＦＮ−γ分泌を媒介する。Ｔ細胞はまた、ＳＴＥ発現腫瘍細胞（群２および３）上で強力な細胞毒性およびＩＦＮ−γ分泌を媒介する。さらに、Ｔ細胞は、ＢｉＴＥ非分泌腫瘍細胞を有する少数のＢｉＴＥ分泌細胞からなる細胞混合物と共培養した場合、強力な腫瘍殺傷およびＩＦＮ−γ分泌を媒介する。これは、腫瘍塊におけるＢｉＴＥ分泌細胞の最小数が、強力な腫瘍塊の殺傷およびＩＦＮ−γ放出を導き出し得ることを示している（群５および６）。 
【０１５４】
安定したＭＤＡ−ＭＢ４５２（ＨＥＲ２＋）細胞（ヒト乳がん細胞株）
抗ＨＥＲ２二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）および表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）は、Ｔ細胞がヒト乳がん細胞株で強力な腫瘍殺傷を媒介するように誘発する（図１１）。安定したＭＤＡ−ＭＢ４５３（ＨＥＲ２＋）細胞株は、示された通り、さまざまなＤＮＡ構築物（表面ＳＴＲＩＣＴ０３４，０３５）を用いたレンチウイルス変換によって作製した。ドナー＃２Ｔ細胞を使用した。Ｅ：Ｔ比は１０：１；６×１０５；６×１０４であった。さまざまなＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による５時間の細胞毒性を、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した。データは、Ｔ細胞が、ＢｉＴＥを分泌する腫瘍細胞（群２）上で強力な腫瘍殺傷を媒介することを示す。Ｔ細胞はまた、ＳＴＥを発現する腫瘍細胞（群３−４）上で強力な腫瘍殺傷を媒介する。さらに、Ｔ細胞は、親ＭＤＡ−ＭＢ４５３腫瘍細胞株（群１）と共培養した場合、最小限の腫瘍殺傷を媒介する。
【０１５５】
例４．Ｔ細胞は、ドキシサイクリン誘導ＳＴＥ発現細胞を効率的に殺傷する
表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）バージョン１（ｖ１）およびバージョン２（ｖ２）は両方とも、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞上で強力な腫瘍殺傷を媒介するようにＴ細胞を誘発する（図１３）。レンチウイルス変換により、さまざまの誘導性ＳＴＥ発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株を作製した。さまざまのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による５時間の細胞毒性を、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した。データは、Ｔ細胞が、遺伝子導入されたＳＴＥｖ１発現腫瘍細胞（カラム２）上で強力な腫瘍殺傷を媒介することを示す。Ｔ細胞はまた、誘導性ＳＴＥｖ１およびＳＴＥｖ２発現腫瘍細胞（カラム３および４）で強力な腫瘍殺傷を媒介する。さらに、非ＳＴＥ発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株と共培養した場合、Ｔ細胞は最小限の腫瘍殺傷を媒介する（カラム１）。
【０１５６】
例５：腫瘍細胞のＴ細胞殺傷効率における増加 
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞 
ＡＮＤゲート構造は、腫瘍細胞のＴ細胞殺傷効率を増加に利用された（図９）。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞が、示されるように（図９Ａ）さまざまのＤＮＡ構築物（ＳＴＲＩＣＴ０１４）遺伝子導入され、およびドナー＃ＳＴ細胞が使用された。Ｅ：Ｔ比は１０：１；６×１０５：６×１０４であった。右パネル（図９Ｂ）については、（１，０）はＳＴＥのみで遺伝子導入された細胞を示した。（１，１）は、ＳＴＥおよびスポンジで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は、非ＳＴＥタンパク質で遺伝子導入された細胞を示した。Ｃｔｒｌは非遺伝子導入細胞を示した。遺伝子導入の４８時間後、さまざまのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による細胞毒性は、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した。データは、Ｔ細胞が２９３Ｔ／ＳＴＥ発現細胞を殺傷し（カラム１）、ＡＮＤゲート構造（カラム２）によって殺傷が大幅に増強され得ることを示す。Ｔ細胞は、非ＳＴＥ発現細胞上で最小限の殺傷を示す（カラム３および４）。左のパネル（図９Ｃ）では、出力タンパク質をコードしないので、入力２条件は試験されなかった。（０，０）は非遺伝子導入細胞を表す。ＳＳＸ１プロモータのＫｏｚａｋ配列および５’ＵＴＲを除去することにより、状態（１，０）でのＡＮＤゲートの出力をさらに減少させるように追加の実験が行われる。
【０１５７】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＳＴＥに対するＧＡＬ４ゲートｖ１）
示されるようにＨＥＫ−２９３Ｔ細胞がさまざまのＤＮＡ構築物（ＳＴＲＩＣＴ０３７，０３９，０４０）で遺伝子導入され、ドナー＃２のＴ細胞を使用した（図１４）。Ｅ：Ｔ比は１０：１；６×１０５：６×１０４であった。左のパネルは、このＴ細胞毒性実験に用いた回路を示した（図１４Ａ）。右のパネルでは、（１，０）はＳＴＥのみで遺伝子導入された細胞を示した。（１，１）は、ＳＴＥおよびスポンジで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は、非ＳＴＥタンパク質で遺伝子導入された細胞を示した。遺伝子導入の４８時間後、さまざまのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による細胞毒性をＬＤＨ放出アッセイにより測定した（図１４Ｂ）。データは、Ｔ細胞がＳＴＥを発現する（１，０）細胞（カラム２および４）を殺傷させ、ＡＮＤゲート（１，１）構造（カラム３および５）によって殺傷が大幅に増強され得ることを示す。Ｔ細胞は、非ＳＴＥ発現細胞では最小の殺傷を示す（カラム１）。
【０１５８】
示されるように、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をさまざまのＤＮＡ構築物（ＳＴＲＩＣＴ０３９，０４０）で遺伝子導入し、ドナー＃２のＴ細胞を使用した（図１５）。Ｅ：Ｔ比は１０：１；６×１０５：６×１０４であった。図１５Ａは、このＴ細胞細胞毒性実験に用いた回路を示す。図１５Ｂにおいて、（１，０）はＳＴＥのみで遺伝子導入された細胞を示した。（１，１）は、ＳＴＥおよびスポンジで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は、非ＳＴＥタンパク質で遺伝子導入された細胞を示した。遺伝子導入４８後、さまざまのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による細胞毒性は、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した。データは、Ｔ細胞がＳＴＥを発現する（１，０）細胞を殺傷させ（カラム３および５）、ＡＮＤゲート（１，１）構造（カラム４および６）によって殺傷が大幅に増強され得ることを示す。Ｔ細胞は、非ＳＴＥ発現細胞上で最小の殺傷を示す（カラム１）。（１，０）条件での殺傷は、主にＧＡＬ４プロモータ産物の漏出（カラム２対カラム３または５）によって引き起こされる。追加の実験が、ＧＡＬ４プロモータの漏出を減少させるためにＳＴＥ  ｖ１のＫｏｚａｋ配列を除去するよって行われ、および３’末端にｍｉＲＮＡ結合部位を追加し、両方の機構の組み合わせによって、ＳＴＥ  ｖ１産物を自己分解させる。 
【０１５９】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＳＴＥのためのＧＡＬ４ゲート  ｖ２）
ＧＡＬ４ゲートバージョン２（ｖ２）構造は、腫瘍細胞のＴ細胞殺傷効率を微調整し、（１，０）状態での細胞毒性をより少なく発揮させるために利用し得る。示されるように、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をさまざまのＤＮＡ構築物（ＳＴＲＩＣＴ０３９，０４０）で遺伝子導入し、ドナー＃２のＴ細胞を使用した（図１６）。Ｅ：Ｔ比は１０：１；６×１０５：６×１０４であった。図１６Ａは、このＴ細胞細胞毒性実験に用いた回路を示す。図１６Ｂにおいて、（１，０）はＳＴＥのみで遺伝子導入された細胞を示した。（１，１）は、ＳＴＥおよびスポンジで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は、非ＳＴＥタンパク質で遺伝子導入された細胞を示した。遺伝子導入の４８時間後、さまざまのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による細胞毒性は、ＬＤＨ放出アッセイによって測定した（図１６Ｂ）。データは、Ｔ細胞がＳＴＥを発現する（１，０）細胞（カラム３）を殺傷し、ＡＮＤゲート（１，１）構造（カラム４）によって殺傷を増強し得ることを示す。Ｔ細胞は非ＳＴＥ発現細胞上で最小の殺傷を示す（カラム１）。このバージョンの（１，０）状態での殺傷は、ＧＡＬ４ゲートｖ１構造（ｖ２は基底レベル（０，０）により近い）と比較して改善されている。（１，０）状態での殺傷を減少させるために追加の実験が行われる。（１，０）状態でのＧＡＬ４プロモータ産物は、ＳＴＥ遺伝子の３’末端にｍｉＲ結合部位を追加することによって減少する。 
【０１６０】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＳＴＥのためのＧＡＬ４ゲート  ｖ３）
ＧＡＬ４−ゲートバージョン３（ｖ３）構造は、腫瘍細胞のＴ細胞殺傷効率を微調整し、（１，０）状態での細胞毒性をより少なくするために利用し得る。示されるように、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞はさまざまのＤＮＡ構築物（ＳＴＲＩＣＴ０３９，０４０）で遺伝子導入され、ドナー＃２のＴ細胞を使用した（図１６）。Ｅ：Ｔ比は１０：１；６×１０５：６×１０４であった。図１７Ａは、このＴ細胞細胞毒性実験に用いた回路を示す。図１７Ｂにおいて、（１，０）はＳＴＥのみで遺伝子導入された細胞を示した。（１，１）は、ＳＴＥおよびスポンジで遺伝子導入された細胞を示した。（０，０）は、非ＳＴＥタンパク質で遺伝子導入された細胞を示した。遺伝子導入の４８時間後に、さまざまのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、ヒトＴ細胞と５時間共培養した。Ｔ細胞による細胞毒性をＬＤＨ放出アッセイにより測定した（図１７Ｂ）。データは、Ｔ細胞がＳＴＥを発現する（１，０）細胞（カラム３）を最小限に殺傷し、ＡＮＤゲートが活性（１，１）である場合（カラム４）にのみ有効殺傷に達することを示す。Ｔ細胞は、非ＳＴＥ発現細胞上で最小の殺傷を示す（カラム１）。（１，０）状態での殺傷は、（０，０）状態と同程度の長さである。ＧＡＬ４−ＶＰ１６の出力レベルを増加させるか、またはＧＡＬ４結合部位を増加させて、（１，１）状態の殺傷効果を高める追加の実験が行われる。
【０１６１】
例６ 
この例は、２つの支配的な難題を処理する（図２Ａ−２Ｂ）：（１）生命を脅かす毒性を有する介入を置き換えるために安全で有効な新規の乳がん治療法を創出すること、（２）これらの新しい療法を使用して、転移性乳がんに関連する死亡をなくすること、である。
【０１６２】
免疫療法は、臨床試験においてがんに対する強力で潜在的に治癒的な効果を達成してきた。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）などのＴ細胞エフェクター機能を利用する免疫療法は、強力な効果を有する可能性がある［１，２］。しかしながら、特に乳がんのような固形腫瘍の場合、これらの療法に関連する主要な課題がある。現在のＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、費用がかかり、かつ規模を拡大または縮小することが困難である、各患者のためのカスタム細胞分離、遺伝子操作、および拡張を必要とする。また、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、殺傷を媒介するために腫瘍部位に輸送されなければならず、強力な効果のためには長期間の持続が必要であり、これは固形腫瘍に挑戦する可能の難題を引き起こし得る［３］。
【０１６３】
ＢｉＴＥは、Ｔ細胞による腫瘍細胞の関与を可能にするために縦列に融合された２つの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む融合タンパク質であり、したがってＴ細胞誘発腫瘍の殺傷をもたらす。ＢｉＴＥ療法は強力であり、腫瘍標的化抗体（Ａｂ）よりも５桁低い濃度で腫瘍殺傷を与えることができる［２］。しかし乍ら、マルチボーラス注射でさえ、インビボでのそれらの短い半減期（約２時間）のために高い血清ＢｉＴＥ濃度を維持することができない［４］。血液学的がんを処置するＢｉＴＥの臨床試験が成功するには、すべて４〜８週間連続静脈内注入が必要である［２］。
【０１６４】
固形腫瘍は一般に、血液悪性腫瘍よりも免疫細胞に接近しにくいため、固形腫瘍に対するＢｉＴＥ療法の成功は、潜在的な副作用、患者の不便さ、および有効性の低下により望ましくない連続ＢｉＴＥ注入のより長い期間を必要としそうである。最後に、ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＢｉＴＥ療法の両方は、トリプルネガティブ乳がんを含む多くのがん型では利用可能でない細胞外腫瘍特異的抗原を標的とする。さらに、標的抗原は正常細胞によって表示することができ、したがって免疫療法は、重篤な結果を伴う標的外免疫応答をもたらし得る［５］。
【０１６５】
ＣＡＲまたはＢｉＴＥでＴ細胞エフェクター機能を利用することに加えて、代替的アプローチは、がん細胞表面上にＴ細胞結合タンパク質を発現し、Ｔ細胞に基づく殺傷を活性化する腫瘍細胞に遺伝子回路を送達することである。これらの表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）は、インビトロおよびインビボで腫瘍細胞の抗原非依存性Ｔ細胞殺傷を誘発し得る［６−１０］。しかしながら、以前のＳＴＥ研究では、腫瘍細胞内でのみ活性化される遺伝子回路を構築することができなかった。したがって、全身毒性を回避するために、これらの構築物は、腫瘍内注射にのみ限定され、効果の低下および全身性疾患の処置不能をもたらした［７，１０］。これは主要な限定である。なぜなら、多くのがん、特に乳がんでは、転移性疾患が死亡の主要な理由であるからである。したがって、高い抗腫瘍特異性を有する全身性および転移性のがんを処置するために免疫系を利用することができるスケーラブルな治療が緊急に必要とされており、それは本明細書に提供される。
【０１６６】
合成生物学者は、がん特異的プロモータまたはｍｉＲＮＡプロファイルに基づいて、がん状態の非常に特異的な細胞内検出のための遺伝子回路を開発した［１１，１２］。しかしながら、これらの腫瘍検出回路を診療所で使用するには、さらなる開発が必要である。例えば、これらの合成腫瘍検出回路は、がん細胞の１００％に回路を送達することは事実上不可能であるため、腫瘍に対するその有効性を制限する細胞内殺傷機構と結合しているに過ぎない。さらに、高い標的化特異性が、健康な組織の損傷を回避するために必要である。最後に、過去の回路は外来タンパク質を利用してきたが、異所性タンパク質発現を最小にすることは、正常細胞における宿主免疫応答を誘導するのを避けるために不可欠である。
【０１６７】
既存のがん免疫療法および腫瘍検出遺伝子回路の限界を克服するために、腫瘍自体からの腫瘍に対する強力かつ有効な免疫療法を誘発するためのプラットフォーム技術である合成腫瘍リクルート免疫細胞療法（ＳＴＲＩＣＴ）とも呼ばれる遺伝子回路リクルート免疫調節システム（ＴＩＧＲＩＳ）による腫瘍免疫療法が本明細書には提供されている。ＴＩＧＲＩＳは、腫瘍検出遺伝子回路と抗がん免疫療法との組み合わせである。操作された遺伝子回路は、腫瘍に送達することができる。これらの操作された遺伝子回路は、がん細胞においてのみ選択的に活性化され、ＳＴＥの表面ディスプレイおよび腫瘍を標的化するＴ細胞をリクルートするための他の免疫調節分子の分泌を生じる。本発明者らは、ＴＩＧＲＩＳ療法が全身的に投与されることを可能にするが、がん細胞において局所的にのみ活性化され、安全性が高められ、副作用が減少した非常に高い特異性を有する腫瘍検出遺伝子回路を設計した。したがって、ＴＩＧＲＩＳは、全身送達（例えば、転移の処置）の利点と、局所処置（例えば、安全性、最小限の副作用）の利点とを組み合わせ、以下の利点を可能にする。
【０１６８】
本発明者らは、攻撃的な挙動を示し、予後不良と相関する乳がんの処置が困難なサブセットのトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）に対するＴＩＧＲＩＳを開発した［１３−１５］。この乳がんのサブセットは、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、またはＨＥＲ２を発現しないため、ＴＮＢＣのための理想的な標的療法はない。ＴＩＧＲＩＳは、以下を含む他の治療法に関連する主要な障害を克服すべきである：
【０１６９】
１）乳がんの異質性の課題。乳がんは、非常に腫瘍間および腫瘍内で異種であることが知られている［１６］。例えば、ＨＥＲ２発現の異質性は予後不良と相関しており［１７］、伝統的な標的療法は異種のがん集団全体をカバーすることはできない。対照的に、本発明者らは、腫瘍特異的ＳＴＥ発現がＳＴＥ発現がん細胞を殺傷するためにＴ細胞を最初にリクルートすると仮定する。最初の殺傷は、さまざまな標的特異性を有するＴ細胞の追加の波をリクルートすべき免疫原性突然変異抗原を放出すべきである［１８］。これは、腫瘍抗原に対するポリクローナル免疫応答を生成し、異種腫瘍集団の広範な突然変異の景観をカバーし、免疫仲介性の腫瘍再発を予防する。加えて、標的化療法のほとんどすべてが、標的陰性腫瘍変異体の増殖を引き起こし得る。ＴＩＧＲＩＳは腫瘍細胞によって発現される既知の腫瘍特異的抗原を必要としないので、表面抗原のダウンレギュレーションに関与する腫瘍逃避機構によって影響されてはならない。
【０１７０】
２）限定標的化スペクトル。ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＢｉＴＥ療法とは異なり、ＴＩＧＲＩＳは、多くのがんの同定が困難であり得る腫瘍特異的抗原の表面発現に依存しない。むしろ、ＴＩＧＲＩＳは、ＡＮＤゲート論理を介して複数の腫瘍特異的／組織特異的プロモータの共同作用によって活性化され、その結果、単一プロモータ系に対して特異性が増強される。これらの論理回路は、異なるプロモータに対してカスタマイズすることができ、さらなる特異性のために腫瘍特異的／組織特異的なマイクロＲＮＡを組み込むこともでき、したがって柔軟な治療効果を可能にする。さらに、これらのプロモータは、腫瘍細胞の配列決定によって同定することができ、免疫逃避されたがんおよび異種のがん細胞型を克服するために異なる腫瘍に対してカスタマイズすることができる。
【０１７１】
３）転移の致命的な結果。転移性の腫瘍細胞は処置が困難であり、乳がん死の９０％の原因である［１９］。本発明者らの遺伝子回路は、全身的に送達することができるが、その特異性のために局所効果しか持たず、したがって、転移の検出および破壊を潜在的に可能にする。さらに、ＴＩＧＲＩＳによって活性化された抗がんＴ細胞は、破壊のための転移を標的とするために身体を巡回することが期待される。
【０１７２】
４）標的治療中の腫瘍エスケープ変異体の進化。ＴＩＧＲＩＳは、エピトープの拡散を開始することができ、この現象は、異なる腫瘍標的特異性を有する多くのＴ細胞をリクルートする。腫瘍エスケープ変異体の確率は、伝統的な標的療法よりもずっと小さい。
【０１７３】
５）腫瘍の再発の課題。多くの進行した乳がんが最終的に再発し、再発の予測的または予防的手段が利用できない。Ｔ細胞はメモリＴ細胞に分化し、長期間にわたって体内に存在するため、ＴＩＧＲＩＳは将来の腫瘍再発を予防することができる。ここでは、伝統的な治療法を使用して治療するのが難しい乳がんの一部であるＴＮＢＣを例として提供する。
【０１７４】
６）治療的送達の課題。ウイルスまたは非ウイルスベクターを用いた核酸または遺伝子回路などの別個の治療法の送達は、通常、すべての腫瘍細胞を標的とすることができない。ＳＴＥは腫瘍の殺傷を引き起こし、エピトープ拡散現象を引き起こすためにＴ細胞をリクルートすることができるため、本発明者らの腫瘍検出回路が腫瘍細胞の小さな部分に送達され得るだけであっても、この技術は、ＳＴＥによって引き起こされる免疫応答が十分に強力である限り、周囲のがん細胞を殺傷することができる。
【０１７５】
非常に特異的ながん検出回路を設計して、腫瘍細胞にＳＴＥおよび他の免疫調節物質を発現するように命令することにより、原発性腫瘍細胞を排除し、異種腫瘍を標的とし、局所リンパ節浸潤を阻害し、全身転移を標的とするために強力な宿主免疫応答を導き出し得、一方で、また、将来の腫瘍再発を防ぐために免疫記憶を形成する。
【０１７６】
操作されたＴＩＧＲＩＳが、インビトロおよびインビボで治療効果を構築し、検証する。
本発明者らは腫瘍細胞にＳＴＥを表示するように命じる新しいがん検出回路を作った。ＳＴＥが強力な免疫応答を誘発し、インビトロおよびインビボで乳がん細胞を効果的に殺傷させることができるかどうかを試験する。ＴＩＧＲＩＳを用いた乳がん（例えば、ＳＴＥ発現腫瘍細胞の最小フラクションおよび腫瘍細胞表面上の最小ＳＴＥ発現レベル）などの固形腫瘍に対する強力な有効性を達成するために必要な重要なパラメータは不明であるので、本発明者らはこれらをインビトロで決定するインビボアッセイで決定する。本発明者らはまた、ＴＩＧＲＩＳ誘発免疫応答が乳がんにおける腫瘍内異質性にもかかわらず効果的な抗腫瘍療法を可能にするかどうかを試験する。
【０１７７】
ＳＴＥを腫瘍細胞上に表示するがん検出回路を作製し、検証する。本発明者らは、抗ヒトＣＤ３εＡｂ（クローン：ＯＫＴ３）または抗マウスＣＤ３εＡｂ（クローン：２Ｃ１１）由来のｓｃＦｖを、不活性膜アンカータンパク質（例えば、細胞質切断されたＤｕｆｆｙ抗原／ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ））と融合させることによってヒトおよびネズミＳＴＥを作製した（図１２Ａ（上））。本発明者らは、ＴＮＢＣ、慢性骨髄性白血病、および胚性腎腫瘍（それぞれ４Ｔ１、Ｋ５６２、およびＨＥＫ−２９３Ｔ）を代表するさまざまの腫瘍細胞株によって発現された場合、ヒトＳＴＥの機能性を試験するために、インビトロＴ細胞細胞毒性アッセイおよびサイトカイン放出アッセイを実施した。本発明者らは、Ｔ細胞をＳＴＥ発現腫瘍細胞と共培養した場合、Ｔ細胞による強力な細胞毒性およびＩＦＮ−γ生成を観察した（図２４Ｂ）。ヒトおよびマウスＳＴＥは、それぞれヒトＴ細胞およびマウスＴ細胞にのみ結合すべきであるため、これらの構築物は、特異的Ｔ細胞関与が治療効果に必要であることを確認することを可能にする。
【０１７８】
さらに、本発明者らは、がんの細胞内サインを特異的に検出する合成遺伝子回路を設計した。２つのがん特異的プロモータが最小限の閾値を超えて活性化された場合にのみその出力が発現され、したがってＡＮＤゲートを実現する、デュアルプロモーターインテグレーター（ＤＰＩ）と呼ばれるがん検出回路を以前に設計した［１２］。ＤＰＩは、非ヒト転写因子を用いて実施されたが、これは、正常細胞において免疫原性になり得る外来タンパク質を導入し得るため、臨床用途には理想的ではない。ここでは、ＲＮＡのみを用いたＡＮＤゲートを作成し（図３Ａ〜３Ｄ）、これはタンパク質ベースの回路よりコンパクトであるという追加の利点を有する。この回路設計は、２つのプロモータががん細胞で活性化された場合の産物を発現するのみである。本発明者らは、蛍光タンパク質およびＳＴＥを産物として有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＳＳＸ１およびＨ２Ａ１がん特異的プロモータ（以下の説明を参照のこと）を用いて、ＲＮＡのみのＡＮＤゲート構造の同調性、モジュール性および機能性を構築および検証した。
【０１７９】
乳がん細胞を特異的に認識するために、本発明者らのＲＮＡゲートを適合させる。本発明者らの現在の回路では、がん細胞で活性化されたＡＮＤゲートへの両方の入力（４０％の溶解、図４の状態１）を含む細胞間のＴ細胞媒介殺傷には、がん細胞において活性である１つの入力を含むがん細胞（ＳＴＥタンパク質のみを発現するもの、図３Ａ〜３Ｄの状態３）に対して約２倍の増強がある。この回路の性能（例えばＯＮ／ＯＦＦ比の向上）は、ＳＴＥ転写物中のｍｉＲＮＡ結合部位の数を増やし、より強力なｍｉＲＮＡ産生のためにｍｉＲＮＡバックボーンを改変し、ＳＴＥ転写物につき複数のｍｉＲＮＡコピーを作製し、異なるｍｉＲＮＡおよびスポンジのライブラリーを試験し、スポンジ配列および構造を改変し、ｍＲＮＡ分解タグによる漏出を最小限に抑え、ＳＴＥ転写物中のｍｉＲＮＡ結合部位を除去するためのトランス開裂リボザイムを実施し、そしてそれは、正常細胞では高度に発現されるが、腫瘍細胞では下方調整される内在性ｍｉＲＮＡによって結合および抑制される、ＳＴＥ転写物中にさらなるｍｉＲＮＡ結合部位を含む［３１］ことによってさらに増強される。
【０１８０】
本発明者らはまた、他のがん特異的および組織特異的プロモータ（例えば、非常に乳がん特異的であり、ＴＮＢＣ細胞株において検証されているＲＰＣ１およびＲＲＭ２［３２］）を試験し、正常細胞においてではなく４Ｔ１がん細胞（例えば、ＣＯＭＭＡ−１Ｄ、ＥｐＨ４、ＭＣＦ１０Ａ）において本発明者らの回路が活性化されることを立証する。
【０１８１】
本発明者らは、回路を腫瘍細胞に遺伝子導入してまたは安定的に組み込むことにより、回路機能性を試験した。本発明者らはさらに、４Ｔ１および正常な乳房細胞株への送達を可能にし、腫瘍検出感度、特異性、および同調性を確認するために、アデノウイルス、ＡＡＶ、またはＨＳＶベクターにおいて本発明者らの回路をコードする。本発明者らはまた、ヒト患者のがん治療に使用されているＴ−ＶＥＣなどの腫瘍溶解性ＨＳＶベクターを利用する［３３］。
【０１８２】
上記のがん特異的プロモータのいくつかが、４Ｔ１細胞において特異的活性化を達成しない場合、追加のがん特異的プロモータが比較トランスクリプトミクスで、およびＦＡＣＳを用いた標的細胞における特異的活性化のために、バーコード化されたプロモータ・ライブラリーをスクリーニングし、配列決定することによって同定され得る。いくつかのＲＮＡのみの回路で有意なＯＮ：ＯＦＦ比が達成されない場合、ヒト転写因子（人工ジンクフィンガータンパク質［２７］など）が潜在的に免疫原性の外来タンパク質の導入を最小限に抑えるために用い得る。
【０１８３】
インビボでの効果のためにＴＩＧＲＩＳによって標的化される必要がある腫瘍細胞の最小割合を同定する。本発明者らは、インビボで強力な治療効果を達成するために本発明者らの遺伝子回路によって標的とされる必要のある腫瘍細胞の最小割合を明らかにする。全身送達方策は、いくつかの場合、腫瘍細胞の１００％を標的としなさそうなので、この情報はそれらを設計するために用いられる。本発明者らは、ＳＴＥ表示腫瘍細胞（４Ｔ１／ＳＴＥ＋）を非ＳＴＥ表示対応部分（４Ｔ１／ＳＴＥ−）とさまざまな比で混合し、同所性乳がんモデルを作るために免疫能のあるＢＡＬＢ／ｃマウス乳房パッドにそれらを直接埋め込む。４Ｔ１ネズミモデルは、進歩したヒトＴＮＢＣに似ており、非常に悪性で転移性である［３４，３５］。
【０１８４】
腫瘍増殖の動態は、一日おきにキャリパーで腫瘍体積を測定することによってモニターされる。対照マウスの平均生存時間よりも少なくとも２倍長く維持される実験により、本発明者らは動物の経時的生存をモニターする。注射された腫瘍細胞の増殖を効率的に阻害するために必要なＳＴＥ発現腫瘍細胞の最小割合が同定される。ヒトＳＴＥを発現する腫瘍細胞株は、Ｔ細胞の関与特異性を検証するための対照として使用される。実験条件ごとに４〜６匹のマウスを使用する。
【０１８５】
十分なＳＴＥ発現細胞が存在する場合、腫瘍増殖は部分的または完全に抑制され、長期間にわたり無病である生存マウスをもたらすはずである。本発明者らは、２群間および＞２群間の腫瘍体積をそれぞれ比較するためにスチューデントのｔ検定および一方向のＡＮＯＶＡを使用する。生存実験を分析するために、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を使用する。本発明者らはまた、二重生物発光レポーターシステムを用いて設計されたＴ細胞を養子性に移動し、インビボ画像化によるＴ細胞腫瘍浸潤および活性化の動態を追跡する［３６］。本発明者らは、より生理学的に関連する腫瘍モデルにおける本発明者らの所見を検証するために、非常に積極的な自発性ＴＮＢＣモデルであるＣ３（１）／ＳＶ４０  Ｔ−抗原トランスジェニックマウス［３７］を用いてこの研究を拡張する。
【０１８６】
本発明者らは、強力なインビボ有効性を付与するためにＳＴＥを発現する必要がある腫瘍細胞の下限を決定する。平均遺伝子送達効率よりも大きい限界について、本発明者らは複数の免疫刺激エフェクターを同時に分泌することができる新しい回路を設計する。これらの分子には、Ｔ細胞（例えば、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１）を活発に誘引するケモカイン［３８］、免疫刺激性で腫瘍微小環境を呈するサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１）、Ｔ細胞活性のブレーキを発することができる免疫チェックポイント遮断抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤ１  抗体）を含む［４０］。このコンビナトリアルアプローチは、異種の乳がんに対する治療効果を増強する筈である。
【０１８７】
例えば、抗ＰＤ１  抗体は、様々な固形腫瘍型を対象とした複数の臨床試験において、２０〜５０％の応答速度を達成している。しかし、患者が抗ＰＤ１  抗体に応答するためには既存の免疫が必要である［４１，４２］。ＳＴＥと抗ＰＤ１  抗体を一緒に発現させることにより、ＳＴＥは、腫瘍関連抗原および変異抗原に対する既存の免疫を作り出すのを助ける一方で、抗ＰＤ１  抗体は、Ｔ細胞機能、増殖および腫瘍、特にＴ細胞機能を停止させるためのＰＤＬ１（ＰＤ−１リガンド）を発現する腫瘍への浸潤を増強し得る［４３，４４］。
【０１８８】
転移性がんと再発に対するＴＩＧＲＩＳの評価。
進行した乳がんでは、腫瘍細胞リンパ節浸潤および全身性転移が一般に観察され、乳がん死亡率の９０％を占める。手術後のケアの基準は、標的療法と組み合わせた化学療法であるが、これはＴＮＢＣにはあまり有効ではない［１３−１５］。さらに、浸潤性乳がんと診断された患者の２０〜３０％が治療後に再発するが、再発の早期発見のための予防措置または診断マーカーはない。本発明者らは、ＴＩＧＲＩＳによって引き起こされる免疫細胞がリンパ節および全身転移を排除し、長期免疫記憶を達成できるかどうかを試験する。ＴＩＧＲＩＳは、病的状態の最も一般的な原因である全身化学療法およびリンパ節の外科的除去の必要性をなくし、腫瘍再発に対する保護を提供し得る。
【０１８９】
ＴＩＧＲＩＳが全身送達を介して原発腫瘍および転移を排除できるかどうかを決定する。  本発明者らは、操作された遺伝子回路の全身的ウイルス送達が原発性および転移性の腫瘍をインビボで排除できるかどうかを試験する。４Ｔ１細胞は、インビ画像化のためにルシフェラーゼを発現するように設計される。転移の効果を試験するために、本発明者らは上の４Ｔ１同所性モデルを使用するが、リンパ節および重要な器官（肺、肝臓、骨および脳で予想される）の転移が観察された場合にのみ、ウイルス送達回路療法を開始する。本発明者らは、マウスモデルにおける全腫瘍負荷（原発＋転移腫瘍）をモニターする。
【０１９０】
本発明者らは、ウイルスベクターの濃度、タイミング、タイプなどのパラメータを変えることによって、異なる処置プロトコールを試験する［４５］。本発明者らは、生きている動物の画像化を介してＴＩＧＲＩＳによって生成された生体内免疫応答を追跡する。処置後の原発性および転移性腫瘍、特に免疫細胞が肺、肝臓、骨などの容易に侵入する臓器では、腫瘍の増殖の低下が見られるはずです。Ｔ細胞ベースの免疫療法が脳脊髄液に浸潤することが示されたため、脳転移の減少も可能である［１］。本発明者らは、タキサンとアントラサイクリンのような既知の化学療法レジメンとＴＩＧＲＩＳを比較する［４６］。
【０１９１】
いくつかの例において、原発腫瘍がＳＴＥ発現単独で排除されない場合、本発明者らは、上記の複数の免疫刺激エフェクターによる治療を増強する。本発明者らはまた、複数のウイルス注射が治療効果を増強できるかどうかを試験する。さらに、一般的な臨床診療を模倣し、原発腫瘍の外科的除去が転移に対する免疫応答にどのように影響し得るかを試験するために、回路治療前後の原発腫瘍を外科的に除去する。
【０１９２】
全身回路送達は、場合によっては、高い治療効果を達成するための課題を提起し得る。いくつかの態様において、本発明者らのベクター（例えば、アデノウイルス）を小さなペプチドでシュードタイピングして、他の細胞表面受容体を標的とすることによって、ウイルス送達を改善する［４７］。いくつかの態様において、本発明者らは、同時の腫瘍溶解および免疫療法を利用するために、乳がんを標的とすることが示された腫瘍溶解性ウイルスを適合させる［４８］。場合によっては、ウイルス粒子は多くの固形腫瘍において腫瘍周辺部にのみ浸透することがある。したがって、ｉＲＧＤ腫瘍浸透性ペプチドを追加の回路産物として発現させることができる［４９］。これらのペプチドは、抗体、腫瘍溶解性ウイルス、およびナノ粒子を含む多くの治療剤の腫瘍浸透を有意に高め得る［４９−５１］。
【０１９３】
全身送達を試験することに加えて、全身性転移を処置するための原発腫瘍細胞への局所的回路送達の治療効果をまた決定する。免疫調節性腫瘍溶解性ウイルスＴ−Ｖｅｃの局所的な腫瘍注入は、非注入腫瘍の収縮を引き起こし得る［３３］。この知見は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターで達成され得るＴＩＧＲＩＳ回路の局所的送達がまた、治療効果をもたらし得ることを示す。注入された腫瘍において局所免疫応答を生成することによって、ＴＩＧＲＩＳは、転移性腫瘍を標的とし得る全身性免疫応答を開始し得る。
【０１９４】
すべての遺伝子回路を含む腫瘍細胞を殺傷した場合、ＳＴＥ発現を終了させるべきである。しかしながら、制御性および安全性を高めるために、いくつかの態様において、本発明者らは遺伝子回路に合成安全機構を構築する。これらのデザインでは、ゲートが正常細胞で正常に機能している場合は、オフにして、外来タンパク質を発現すべきではない。したがって、正常細胞でゲートが機能しなくなった場合、またはゲートががん細胞で正常に機能している場合にのみ、治療産物タンパク質が外部から切り替えることができる安全機構と一緒に発現されるであろう。まず、ＳＴＥ発現を終了させる、および／またはＳＴＥを発現する細胞を殺傷する誘導性回路を設計する。具体的には、ＳＴＥ産物は、ＧＡＬ４ＢＤ−ＶＰ１６ＡＤ（ＧＡＤ）のような合成転写因子で置き換えられる。
【０１９５】
この構造では、ＳＴＥ、免疫刺激分子、およびｉＲＧＤペプチドのための遺伝子は、条件付きキラー遺伝子のＴＫ１とともに、ＧＡＤ応答性プロモータ、Ｇ５ｐによって調節される。したがって、外来タンパク質は、ＳＴＥ、ＴＫ１および他の産物遺伝子とともに、論理ゲートが活性である場合にのみ発現される。ＴＫ１基質（例えば、ガンシクロビルまたはアシクロビル）の添加は、回路が活性である細胞の殺傷を可能にする。あるいは、本発明者らは、ＧＡＤの代わりに、治療産物発現を促進するために、本発明者らの論理ゲート（例えば、ドキシサイクリン応答性転写因子ｒｔＴＡ３）の産物として誘導性転写因子を生成する。この場合、系全体が外因性誘導物質（例えばドキシサイクリン）の投与なしでは活性化されず、したがって、ＦＤＡ認可の小分子による治療開始および終了を制御するための簡単で安全な機構を提供する。安全性の最終層として、例えば、機能的ＳＴＥを滴定することができるＣＤ３εを誘導発現する分泌型ＳＴＥアンタゴニストを実施する。 
【０１９６】
ＴＩＧＲＩＳが将来の腫瘍再発に対して保護するための免疫記憶を導き出し得るか否かの試験。
ＴＩＧＲＩＳは、再発性乳がんに対する長期免疫記憶を開始するはずである。これを示すために、本発明者らは、尾静脈注射による４Ｔ１腫瘍細胞を有する長期生存者（上記から）に再挑戦する。４Ｔ１腫瘍細胞の尾静脈注射は、主に肺転移をもたらし、これは乳がんの一般的な転移部位である［５２］。生きた動物の画像化を行って、肺および他の生命維持に必要な器官における腫瘍播種をモニターして、再導入された腫瘍細胞に対する予防的免疫があるか否かを決定する。
【０１９７】
初期の処置が原発腫瘍に対して非常に強力な応答を導き出すが、再挑戦に対する有意な保護を導き出さない場合、本発明者らは、さらにＩＬ−７およびＩＬ−１５はメモリＴ細胞形成を引き起こすから、それらを分泌するように腫瘍検出回路を設計する［５３］。さらに、４Ｔ１腫瘍モデルは非常に免疫抑制性である［５４］。したがって、チェックポイント−遮断抗体および／または炎症促進性サイトカイン（上記参照）を組み込むことは、より強力なメモリ応答を生成するのに役立つ場合がある。
【０１９８】
例６の参考文献 
1. Maude, S.L., et al., Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med, 2014. 371(16): p. 1507-17. 
2. Bargou, R., et al., Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody. Science, 2008. 321(5891): p. 974-7. 
3. Gilham, D.E., et al., CAR-T cells and solid tumors: tuning T cells to challenge an inveterate foe. Trends Mol Med, 2012. 18(7): p. 377-84. 
4. Klinger, M., et al., Immunopharmacologic response of patients with B-lineage acute lymphoblastic leukemia to continuous infusion of T cell-engaging CD19/CD3-bispecific BiTE antibody blinatumomab. Blood, 2012. 119(26): p. 6226-33. 
5. Kershaw, M.H., et al., Clinical application of genetically modified T cells in cancer therapy. Clin Trans Immunol, 2014. 3: p. e16. 
6. Liao, K.W., Y.C. Lo, and S.R. Roffler, Activation of lymphocytes by anti-CD3 single-chain antibody dimers expressed on the plasma membrane of tumor cells. Gene Ther, 2000. 7(4): p. 339-47. 
7. Paul, S., et al., Tumor gene therapy by MVA-mediated expression of T-cell-stimulating antibodies. Cancer Gene Ther, 2002. 9(5): p. 470-7. 
8. Liao, K.W., et al., Stable expression of chimeric anti-CD3 receptors on mammalian cells for stimulation of antitumor immunity. Cancer Gene Ther, 2003. 10(10): p. 779-90. 
9. Yang, Z.M., et al., Anti-CD3 scFv-B7.1 fusion protein expressed on the surface of HeLa cells provokes potent T-lymphocyte activation and cytotoxicity. Biochem Cell Biol, 2007. 85(2): p. 196-202. 
10. Liu, Y., et al., Adenovirus-mediated intratumoral expression of immunostimulatory proteins in combination with systemic Treg inactivation induces tumor-destructive immune responses in mouse models. Cancer Gene Ther, 2011. 18(6): p. 407-18. 
11. Weber, W. and M. Fussenegger, Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet, 2012. 13(1): p. 21-35. 
12. Nissim, L. and R.H. Bar-Ziv, A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Mol Syst Biol, 2010. 6: p. 444. 
13. Hudis, C.A. and L. Gianni, Triple-negative breast cancer: an unmet medical need. Oncologist, 2011. 16 Suppl 1: p. 1-11. 
14. Andre, F. and C.C. Zielinski, Optimal strategies for the treatment of metastatic triple-negative breast cancer with currently approved agents. Ann Oncol, 2012. 23 Suppl 6: p. vi46-51. 
15. Foulkes, W.D., I.E. Smith, and J.S. Reis-Filho, Triple-negative breast cancer. N Engl J Med, 2010. 363(20): p. 1938-48. 
16. Polyak, K., Heterogeneity in breast cancer. J Clin Invest, 2011. 121(10): p. 3786-8. 
17. Seol, H., et al., Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol, 2012. 25(7): p. 938-48. 
18. Lawrence, M.S., et al., Discovery and saturation analysis of cancer genes across 21 tumour types. Nature, 2014. 505(7484): p. 495-501. 
19. Weigelt, B., J.L. Peterse, and L.J. van 't Veer, Breast cancer metastasis: markers and models. Nat Rev Cancer, 2005. 5(8): p. 591-602. 
20. Yang, L., et al., Permanent genetic memory with >1-byte capacity. Nat Methods, 2014. 
21. Nissim, L., et al., Multiplexed and Programmable Regulation of Gene Networks with an Integrated RNA and CRISPR/Cas Toolkit in Human Cells. Molecular Cell, 2014. 54(4): p. 698-710. 
22. Farzadfard, F. and T.K. Lu, Genomically encoded analog memory with precise in vivo DNA writing in living cell populations. Science, 2014. 
23. Siuti, P., J. Yazbek, and T.K. Lu, Synthetic circuits integrating logic and memory in living cells. Nat Biotechnol, 2013. 31(5): p. 448-52. 
24. Purcell, O., J. Peccoud, and T.K. Lu, Rule-Based Design of Synthetic Transcription Factors in Eukaryotes. ACS Synthetic Biology, 2013. 
25. Farzadfard, F., S.D. Perli, and T.K. Lu, Tunable and Multi-Functional Eukaryotic Transcription Factors Based on CRISPR/Cas. ACS Synthetic Biology, 2013. 
26. Daniel, R., et al., Synthetic analog computation in living cells. Nature, 2013. 497(7451): p. 619-23. 
27. Khalil, A., et al., A Synthetic Biology Framework for Programming Eukaryotic Transcription Functions. Cell, 2012. 150(3): p. 647-658. 
28. Cheng, A.A. and T.K. Lu, Synthetic Biology: An Emerging Engineering Discipline. Annual Review of Biomedical Engineering, 2012. 14(1): p. 155-178. 
29. Lu, T.K., A.S. Khalil, and J.J. Collins, Next-generation synthetic gene networks. Nat Biotechnol, 2009. 27(12): p. 1139-50. 
30. Friedland, A.E., et al., Synthetic gene networks that count. Science, 2009. 324(5931): p. 1199-202. 
31. Boyerinas, B., et al., The role of let-7 in cell differentiation and cancer. Endocr Relat Cancer, 2010. 17(1): p. F19-36. 
32. Yun, H.J., et al., Transcriptional targeting of gene expression in breast cancer by the promoters of protein regulator of cytokinesis 1 and ribonuclease reductase 2. Exp Mol Med, 2008. 40(3): p. 345-53. 
33. Senzer, N.N., et al., Phase II clinical trial of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-encoding, second-generation oncolytic herpesvirus in patients with unresectable metastatic melanoma. J Clin Oncol, 2009. 27(34): p. 5763-71. 
34. Fantozzi, A. and G. Christofori, Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res, 2006. 8(4): p. 212. 
35. Kaur, P., et al., A mouse model for triple-negative breast cancer tumor-initiating cells (TNBC-TICs) exhibits similar aggressive phenotype to the human disease. BMC Cancer, 2012. 12: p. 120. 
36. Na, I.K., et al., Concurrent visualization of trafficking, expansion, and activation of T lymphocytes and T-cell precursors in vivo. Blood, 2010. 116(11): p. e18-25. 
37. Green, J.E., et al., The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene, 2000. 19(8): p. 1020-7. 
38. Nguyen-Hoai, T., et al., CCL21 (SLC) improves tumor protection by a DNA vaccine in a Her2/neu mouse tumor model. Cancer Gene Ther, 2012. 19(1): p. 69-76. 
39. Ferrone, C.R., et al., Adjuvanticity of plasmid DNA encoding cytokines fused to immunoglobulin Fc domains. Clin Cancer Res, 2006. 12(18): p. 5511-9. 
40. Hirano, F., et al., Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res, 2005. 65(3): p. 1089-96. 
41. Tumeh, P.C., et al., PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature, 2014. 515(7528): p. 568-71. 
42. Gubin, M.M., et al., Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens. Nature, 2014. 515(7528): p. 577-81. 
43. Ghebeh, H., et al., The B7-H1 (PD-L1) T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma: correlation with important high-risk prognostic factors. Neoplasia, 2006. 8(3): p. 190-8. 
44. Soliman, H., F. Khalil, and S. Antonia, PD-L1 expression is increased in a subset of basal type breast cancer cells. PLoS One, 2014. 9(2): p. e88557. 
45. Magnusson, M.K., et al., A transductionally retargeted adenoviral vector for virotherapy of Her2/neu-expressing prostate cancer. Hum Gene Ther, 2012. 23(1): p. 70-82. 
46. Nabholtz, J.M. and A. Riva, Taxane/anthracycline combinations: setting a new standard in breast cancer? Oncologist, 2001. 6 Suppl 3: p. 5-12. 
47. Dmitriev, I., et al., An adenovirus vector with genetically modified fibers demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus receptor-independent cell entry mechanism. J Virol, 1998. 72(12): p. 9706-13. 
48. Zhang, Z., et al., Intravenous administration of adenoviruses targeting transforming growth factor beta signaling inhibits established bone metastases in 4T1 mouse mammary tumor model in an immunocompetent syngeneic host. Cancer Gene Ther, 2012. 19(9): p. 630-6. 
49. Sugahara, K.N., et al., Coadministration of a tumor-penetrating peptide enhances the efficacy of cancer drugs. Science, 2010. 328(5981): p. 1031-5. 
50. Hamilton, A.M., et al., Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. J Mol Med (Berl), 2015. 
51. Puig-Saus, C., et al., iRGD tumor-penetrating peptide-modified oncolytic adenovirus shows enhanced tumor transduction, intratumoral dissemination and antitumor efficacy. Gene Ther, 2014. 21(8): p. 767-74. 
52. Tao, K., et al., Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC Cancer, 2008. 8: p. 228. 
53. Cieri, N., et al., IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood, 2013. 121(4): p. 573-84. 
54. Chen, L., et al., Rejection of metastatic 4T1 breast cancer by attenuation of Treg cells in combination with immune stimulation. Mol Ther, 2007. 15(12): p. 2194-202. 
【０１９９】
例７ 
卵巣がんのための合成腫瘍をリクルートした免疫細胞療法。
原発性および転移性卵巣がんを処置し、長期効果を達成するためには、新しい治療方策が必要である。化学療法および標的治療などの卵巣がんに対する既存の処置では、転移性疾患を治癒することができず、腫瘍の再発を予防することができない。さらに、化学療法などの標準処置は、有意な病的状態と毒性を引き起こし得る。
【０２００】
本明細書において、非常に特異的で効果的で長期間続く、卵巣がんのための変形力のある新しいクラスの免疫療法が提供される。この治療方策である合成腫瘍リクルート免疫細胞療法（ＳＴＲＩＣＴ）は、腫瘍自身を利用して免疫細胞をリクルートして腫瘍を破壊し（図２Ａ〜２Ｂ）、これにより、同調可能で、安全で、長く持続し、効果的であるはずの強いポリクローナル抗腫瘍応答を誘導する。
【０２０１】
具体的には、本発明者らは、複数の腫瘍特異的プロモータが活性化している場合（例えば、ＡＮＤ論理を実施するデジタル遺伝子回路を介して）に限り、卵巣がん細胞において選択的にオンにされる合成遺伝子回路を提供する。これらの合成回路は、ウイルスベクターを介して全身に、または局所に腫瘍に送達し得る。本発明者らは、合成生物学の最近の進歩を利用して、これらの合成遺伝子回路を高度にコンパクトなＲＮＡベース（正常細胞における免疫原性外来タンパク質の発現を避けるため）に設計し、特異的に卵巣がん細胞（他の正常細胞タイプではない）においてのみ活性化される。活性化されると、これらの回路は、表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）およびチェックポイント抑制剤およびサイトカインなどの他の免疫調節分子を表示し、強力で標的化された抗腫瘍免疫応答を誘発する。ＳＴＥは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体と関わり、Ｔ細胞を誘発してＳＴＥ表示細胞を殺傷させるように設計される。さらに、遺伝子回路に安全スイッチを組み込んで、外部でスイッチをオンまたはオフにすることができる。
【０２０２】
Ｔ細胞の第一波は、腫瘍細胞のＳＴＥによる殺傷を起こすように定め、細胞溶解によって放出されるがん抗原のより広いスペクトルを標的化するポリクローナルＴ細胞の第二波が続く。したがって、ＳＴＲＩＣＴによって誘発される免疫療法は、Ｔ細胞が身体全体に播種性免疫監視を提供することができるので、原発性腫瘍および転移性腫瘍の両方を抑制し得る。さらに、これらの免疫応答は、長期記憶が卵巣がんに対して確立されることを可能にし得る。ＳＴＲＩＣＴを適合させ、積極的な挙動を示し、予後不良と相関する、卵巣がんの最も一般的で処置困難なサブセットを処置する（１）。
【０２０３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）などのＴ細胞エフェクター機能を利用する免疫療法は、強力な効果をもたらした（２、３）。しかしながら、これらの療法の使用は、特に卵巣がんなどの固形腫瘍の場合、重大な問題を提起する。現在のＣＡＲ−Ｔ療法は、高価で規模拡大が難しい、すべての患者にとってカスタム細胞エンジニアリングおよび拡張を必要とする。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、強力な腫瘍殺傷および効果（４）を媒介するために、腫瘍部位への運搬、腫瘍特異的抗原の標的化、および長期持続性を必要とし、それらは卵巣がん（５）の主要な課題である。
【０２０４】
ＢｉＴＥには、Ｔ細胞による腫瘍細胞の関与および殺傷を可能にするために直列に融合された２つの一本鎖可変フラグメントを含む。ＢｉＴＥは、腫瘍標的抗体（Ａｂ）よりも５桁低い濃度で激しく強力な腫瘍殺傷を与えることができる（３）。しかしながら、ＢｉＴＥはインビボで短い半減期（約２時間）を有し（６）、固体腫瘍は一般に、血液学的悪性腫瘍よりも免疫細胞に接近しにくいため、固体腫瘍の治療に成功するには、副作用、患者の便宜性、および治療効果のために挑戦的な長時間の静脈内ＢｉＴＥ注射を要しそうである。さらに、表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）がＴ細胞媒介性殺傷（７−１１）をリクルートするためにがん細胞上に表示されているが、かかるシステムは、重大な副作用なしに全身療法を可能にすることを特に目標としていない。
【０２０５】
近年、Ｔ−Ｖｅｃなどの腫瘍溶解性ウイルスは、メラノーマを処置するＦＤＡの認可に近づいている。腫瘍崩壊ウイルスは、腫瘍細胞を殺傷するためにウイルス複製に依存する。しかしながら、特定の腫瘍細胞において複製するだけの腫瘍溶解性ウイルスを設計することは困難であり、腫瘍溶解性ウイルスは臨床試験において卵巣がんと比較してまだ良好な効果を示さなかった。加えて、合成生物学者は、がん特異的プロモータまたはマイクロＲＮＡプロファイルに基づいて、がん細胞の高度に特異的な細胞内検出のための遺伝子回路を開発した（１２，１３）。しかしながら、合成腫瘍検出回路は細胞内殺傷機構と結合しているに過ぎず、がん細胞の１００％に回路を送達することは事実上不可能であるため、がんに対する効果は限られる。
【０２０６】
合成がん検出回路を用いて腫瘍細胞にＳＴＥを表示し、他の免疫調節因子を分泌させることによって、本発明者らは、原発性腫瘍細胞を排除し、二次ポリクローナルＴ細胞応答を誘発するために、強力な宿主免疫応答を導き出すことができる。本発明者らは、ＳＴＲＩＣＴが局所リンパ節浸潤を阻害し、全身転移を標的とし、将来の再発を防ぐために免疫記憶を形成できるかどうかを試験する。強力な免疫応答はがんに対して有効であり、合成遺伝子回路は、細胞内マーカーを有するがん細胞を特異的に検出するように設計し得る。
【０２０７】
本発明者らは、標的原発性、転移性、および再発する卵巣がんのためのＳＴＲＩＣＴを用いる少なくとも２つの方法を提供する：
１）本発明者らは、腫瘍細胞にＳＴＥを表示し、免疫調節エフェクターを分泌させるように命令するがん検出回路を提供する。インビトロおよびインビボでの治療効果を検証する。インビトロで、本発明者らは、Ｔ細胞誘発細胞毒性およびＳＴＲＩＣＴに起因するＴ細胞によって分泌される重要なサイトカインを測定する。インビボで、本発明者らは、ＩＤ８マウスモデルを用いてＳＴＲＩＣＴにより効率的な腫瘍クリアランスを達成するために標的化する必要があるＳＴＥ表示腫瘍細胞の最小数を決定する（１４）。
【０２０８】
２）本発明者らは、マウスモデルにおける原発性卵巣腫瘍、転移および再発に対してＳＴＲＩＣＴを評価する。本発明者らは、ＳＴＲＩＣＴによって転移性腫瘍が排除され、ＳＴＲＩＣＴが最初の処置後に生存したマウスのがん再発を予防できることを示すために、ＩＤ８マウスモデルを使用する。ＳＴＲＩＣＴの効果、特異性および同調性を試験するための対照は、非活動性ＳＴＥ、非活動性遺伝子回路、非がん性卵巣細胞および他の正常組織における遺伝子回路の試験、およびヒト対ネズミＳＴＥの使用を含む遺伝子回路、ならびにヒトＴ細胞対マウスＴ細胞である。
【０２０９】
この開示は、腫瘍をそれら自身に敵対することによって卵巣がんを処置するための方法を提供する。ＳＴＲＩＣＴは、卵巣がんおよび原発性および転移性腫瘍に対する播種性Ｔ細胞活性に対する長期活性を可能にする。本発明者らの治療用構築物は、さまざまな異なる卵巣がんに対してカスタマイズすることができ、臨床慣習対操作された細胞療法において、容易に拡張および展開することができる。
【０２１０】
ＳＴＲＩＣＴは、原発性および転移性疾患に対して強い治療効果を達成し、持続性の免疫記憶を誘導し、安全スイッチを組み込み、治療適用に必要なコスト、労力およびインフラストラクチャを削減し得る。ＳＴＲＩＣＴは、原発性および転移性腫瘍に対して有効であり、腫瘍再発に対する長期間の予防を達成し得る。ＳＴＲＩＣＴは、腫瘍内からのポリクローナル抗腫瘍免疫応答および長期持続性免疫記憶の便利で標的化された安全な誘導を可能にすることによって、他の処置の限界を克服するはずである。ＳＴＲＩＣＴは、毒性および副作用を有し、他のがんに対して広範に拡張可能な卵巣がんの標準処置を最終的に置き換え得る。ＳＴＲＩＣＴは、卵巣がんに対する免疫系を利用することにより、長期的な疾患を抑制することができる変形力のある新しい処置法である。
【０２１１】
ＳＴＲＩＣＴは、原発性、転移性腫瘍に対して効果的であり得、長期の腫瘍再発予防を達成し得る。ＳＴＲＩＣＴは、限定的な効果、および有意の毒性、ならびに副作用を有する標準処置を置き換え得る。さらに、該技術は広範囲に適用され、がんの広い領域に対して再プログラム化し得る強力な技術プラットフォームを確立する。
【０２１２】
例７の引用参考文献 
1. Ries LAG YJ, Keel GE, Eisner MP, Lin YD, Horner M-J (editors) (2007) SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. National Cancer Institute, SEER Program, NIH Pub No. 07-6215. 
2. Maude SL, Frey N, Shaw PA, Aplenc R, Barrett DM, Bunin NJ, Chew A, Gonzalez VE, Zheng Z, Lacey SF, Mahnke YD, Melenhorst JJ, Rheingold SR, Shen A, Teachey DT, Levine BL, June CH, Porter DL, & Grupp SA (2014) Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med 371(16):1507-1517. 
3. Bargou R, Leo E, Zugmaier G, Klinger M, Goebeler M, Knop S, Noppeney R, Viardot A, Hess G, Schuler M, Einsele H, Brandl C, Wolf A, Kirchinger P, Klappers P, Schmidt M, Riethmuller G, Reinhardt C, Baeuerle PA, & Kufer P (2008) Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody. Science 321(5891):974-977. 
4. Kershaw MH, Westwood JA, Slaney CY, & Darcy PK (2014) Clinical application of genetically modified T cells in cancer therapy. Clin Trans Immunol 3:e16. 
5. Gilham DE, Debets R, Pule M, Hawkins RE, & Abken H (2012) CAR-T cells and solid tumors: tuning T cells to challenge an inveterate foe. Trends Mol Med 18(7):377-384. 
6. Klinger M, Brandl C, Zugmaier G, Hijazi Y, Bargou RC, Topp MS, Gokbuget N, Neumann S, Goebeler M, Viardot A, Stelljes M, Bruggemann M, Hoelzer D, Degenhard E, Nagorsen D, Baeuerle PA, Wolf A, & Kufer P (2012) Immunopharmacologic response of patients with B-lineage acute lymphoblastic leukemia to continuous infusion of T cell-engaging CD19/CD3-bispecific BiTE antibody blinatumomab. Blood 119(26):6226-6233. 
7. Liao KW, Lo YC, & Roffler SR (2000) Activation of lymphocytes by anti-CD3 single-chain antibody dimers expressed on the plasma membrane of tumor cells. Gene Ther 7(4):339-347. 
8. Paul S, Regulier E, Rooke R, Stoeckel F, Geist M, Homann H, Balloul JM, Villeval D, Poitevin Y, Kieny MP, & Acres RB (2002) Tumor gene therapy by MVA-mediated expression of T-cell-stimulating antibodies. Cancer Gene Ther 9(5):470-477. 
9. Liao KW, Chen BM, Liu TB, Tzou SC, Lin YM, Lin KF, Su CI, & Roffler SR (2003) Stable expression of chimeric anti-CD3 receptors on mammalian cells for stimulation of antitumor immunity. Cancer Gene Ther 10(10):779-790. 
10. Yang ZM, Li EM, Lai BC, Wang YL, & Si LS (2007) Anti-CD3 scFv-B7.1 fusion protein expressed on the surface of HeLa cells provokes potent T-lymphocyte activation and cytotoxicity. Biochem Cell Biol 85(2):196-202. 
11. Liu Y, Tuve S, Persson J, Beyer I, Yumul R, Li ZY, Tragoolpua K, Hellstrom KE, Roffler S, & Lieber A (2011) Adenovirus-mediated intratumoral expression of immunostimulatory proteins in combination with systemic Treg inactivation induces tumor-destructive immune responses in mouse models. Cancer Gene Ther 18(6):407-418. 
12. Weber W & Fussenegger M (2012) Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet 13(1):21-35. 
13. Nissim L & Bar-Ziv RH (2010) A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Mol Syst Biol 6:444. 
14. Roby KF, Taylor CC, Sweetwood JP, Cheng Y, Pace JL, Tawfik O, Persons DL, Smith PG, & Terranova PF (2000) Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis 21(4):585-591. 
【０２１３】
例８ 
肺がんのための合成腫瘍リクルート免疫細胞療法。
新規の治療方策が原発性および転移性肺がんを処置し、長期効果を達成するために必要である。化学療法および標的療法などの肺がんのための既存の処置は、疾患を治癒し、腫瘍再発を予防することはできない。加えて、化学療法などの標準処置は、有意の病的状態および毒性を引き起こし得る。
【０２１４】
本明細書には、いくつかの態様において、高度の特異的、効果的、および長期持続する肺がんのための免疫療法が提供されている。この治療方策の合成腫瘍リクルート免疫細胞療法（ＳＴＲＩＣＴ）は、免疫細胞をリクルートし、腫瘍を破壊するために腫瘍自身を利用し(図２Ａ−２Ｂ）、それによって、同調可能で、安全な、長期持続し、ならびに効果的であるはずの強いポリクローナル抗腫瘍応答を引き起こす。
【０２１５】
具体的には、本発明者らは、複数の腫瘍特異的プロモータが活性のとき(例えば、ＡＮＤ論理を実施するデジタル遺伝子回路を介して)にのみ、肺がん細胞に選択的にオンにされる合成遺伝子回路を設計する。これらの合成回路は、腫瘍にウイルスベクターを介して全身に、または局所的に送達され得る。本発明者らは、合成生物学における最近の進歩を利用して、非常にコンパクトな、ＲＮＡベースの（正常細胞における免疫原生の外来タンパク質を発現するのを回避するために)、および特異的に肺がん細胞（他の任意の正常細胞においてではなく)においてのみ活性化される、これらの合成遺伝子回路を設計する。活性化される場合、これらの回路は、表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）およびチェックポイント抑制剤およびサイトカインなどのその他の免疫調節分子を表示し、強力な標的抗腫瘍免疫応答を誘発する。ＳＴＥは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体を関わらせるように設計され、Ｔ細胞がＳＴＥ表示細胞を殺傷させるように誘発する。さらに、本発明者らは、遺伝子回路に安全スイッチを組み込み、それらが外部的にオンまたはオフされることを可能にする。
【０２１６】
Ｔ細胞の第一波は、腫瘍細胞のＳＴＥに指示された殺傷を行うべきであり、細胞溶解によって放出されるがん抗原のより広いスペクトルを標的とするポリクローナルＴ細胞の第二波が続く。したがって、ＳＴＲＩＣＴによって誘発された免疫療法は、Ｔ細胞が体全体に播種性免疫監視を提供することができるので、原発性および転移性腫瘍の両方を抑制し得る。さらに、これらの免疫応答は、長期記憶が肺がんに対して確立されることを可能にし得る。
【０２１７】
本発明者らは、肺がんの最も一般的で治療が困難な非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を標的とするためにＳＴＲＩＣＴを適合させる。ＮＳＣＬＣは、宿主Ｔ細胞エフェクター機能を活性化する免疫療法である抗ＰＤ−１免疫チェックポイント遮断抗体（Ａｂ）を用いるなどのいくつかの免疫療法に応答するので、ＳＴＲＩＣＴはＮＳＣＬＣに対する効果を発揮するはずである（１，２）。
【０２１８】
抗ＰＤ−１抗体は、ＮＳＣＬＣを処置するためにＦＤＡによって承認されているが、抗ＰＤ−１抗体の延命効果の増大は、ドセタキセルに対してわずか３．２ヶ月であり、さらに改善する必要がある。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）などのＴ細胞エフェクター機能を利用する他の免疫療法は、他のがんに対して強力な効果を達成している（３，４）。しかしながら、これらの療法の使用は、肺がんのような固形腫瘍にとって重大な課題を提起する。現行のＣＡＲ−Ｔ療法は、高価で規模拡大が難しい、すべての患者のカスタム細胞エンジニアリングおよび拡張を必要とする。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍部位に移動し、腫瘍特異的抗原を標的とし、肺がんの主要な課題である強力な腫瘍殺傷および効果（５）を媒介するために長期間持続する必要がある（６）。
【０２１９】
ＢｉＴＥには、Ｔ細胞による腫瘍細胞の関与および殺傷を可能にするために直列に融合された２つの一本鎖可変フラグメントが含まれる。ＢｉＴＥは、腫瘍標的抗体よりも５桁低い濃度で強くて強力な腫瘍殺傷を与え得る（４）。しかしながら、ＢｉＴＥはインビボで短い半減期（〜２時間）を有し（７）、固体腫瘍は一般に、血液悪性腫瘍よりも免疫細胞に接近しにくいので、固形腫瘍のための成功する治療は、副作用、患者の便宜性、および治療効果のために課題である、長期間の連続的な静脈内ＢｉＴＥ注入を要しそうである。加えて、表面Ｔ細胞エンゲージャー（ＳＴＥ）は、Ｔ細胞媒介性殺傷（８−１２）をリクルートするためにがん細胞上に表示されているが、かかるシステムは、重大な副作用なしに全身療法を可能にすることを特に標的としていない。
【０２２０】
最近、Ｔ−Ｖｅｃなどのウイルス複製に基づいて腫瘍細胞を殺傷させる腫瘍溶解性ウイルスは、メラノーマを処置するためのＦＤＡ認可に近づいている。しかしながら、特定の腫瘍細胞においてのみ複製する腫瘍溶解性ウイルスを設計することは困難であり得、腫瘍溶解性ウイルスは、臨床試験において肺がんに対して優れた効果を未だ実証されていない。加えて、合成生物学者は、がん特異的プロモータまたはマイクロＲＮＡプロファイルに基づいて、がん細胞の高度に特異的な細胞内検出のための遺伝子回路を開発してきた（１３，１４）。しかしながら、合成腫瘍検出回路は細胞内殺傷機構と結合しているに過ぎず、がん細胞の１００％に回路を送達することは事実上不可能であるため、がんに対する効果は限られている。
【０２２１】
腫瘍細胞にＳＴＥを表示し、他の免疫調節剤を分泌させるように合成がん検出回路を利用することにより、本発明者らは、原発性腫瘍細胞を排除し二次的なポリクローナルＴ細胞応答を誘発するための強力な宿主免疫応答を導き出すことができる。本発明者らは、ＳＴＲＩＣＴが局所リンパ節浸潤を阻害し、全身転移を標的とし、将来の再発を防ぐために免疫記憶を形成できることを示す。強力な免疫応答はがんに対して有効であり、合成遺伝子回路は、細胞内マーカーでがん細胞を特異的に検出するように設計することができる。
【０２２２】
本発明者らは、ＳＴＲＩＣＴを用いて原発性肺がん、転移性肺がんおよび再発性肺がんを標的とするための少なくとも２つの方法を提供する。
１）がん検出回路を作り、腫瘍細胞にＳＴＥを表示させ、免疫調節エフェクターを分泌させる。インビトロおよびインビボでの治療効果を検証する。インビトロで、本発明者らは、Ｔ細胞誘発細胞毒性およびＳＴＲＩＣＴに起因するＴ細胞によって分泌される重要なサイトカインを測定する。インビボで、本発明者らは、Ａ５４９異種移植片肺がんモデル（１５）を用いたＳＴＲＩＣＴによる効率的な腫瘍クリアランスを達成するために標的化する必要があるＳＴＥディスプレイ腫瘍細胞の最小数を決定する。
【０２２３】
２）本発明者らは、原発性肺腫瘍、転移、およびマウスモデルにおける再発に対するＳＴＲＩＣＴを評価する。本発明者らは、Ａ５４９異種移植モデルおよびＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ自発腫瘍モデル（１６）を使用して、転移性腫瘍がＳＴＲＩＣＴによって排除され、ＳＴＲＩＣＴが初期処置後に生存したマウスのがん再発を予防し得ることを示す。ＳＴＲＩＣＴの効果、特異性および同調性を試験するための対照は、非活動性ＳＴＥ、非活動性回路、非がん性肺細胞および他の正常組織における試験回路、ならびにヒト対マウスＳＴＥおよびヒト対マウスＴ細胞を表示する回路を含む。
【０２２４】
この開示は、腫瘍をそれら自身に敵対させることによって肺がんを処置するための方法を提供する。高度に特異的ながん検出回路は、肺がんに対する免疫療法とまだ統合されていない。ＳＴＲＩＣＴは、肺がんに対する長期活性、および原発性および転移性腫瘍に対する播種性Ｔ細胞活性を可能にするはずである。本発明者らの治療用構築物は、さまざまな異なる肺がんに対してカスタマイズすることができ、臨床慣行対操作された細胞療法において、より容易に拡張および展開し得るはずである。
【０２２５】
ＳＴＲＩＣＴは、原発性および転移性疾患に対して強力な治療効果を達成し、持続性の免疫記憶を誘導し、安全スイッチを組み込み、治療的使用に必要なコスト、労力およびインフラストラクチャを削減することができる。ＳＴＲＩＣＴは、原発性および転移性腫瘍に対して有効であり、腫瘍再発に対する長期的な予防を達成するはずである。ＳＴＲＩＣＴは、腫瘍内からのポリクローナル抗腫瘍免疫応答および長期持続性免疫記憶の便利で標的化された安全な誘導を可能にすることによって、他の処置の限界を克服するはずである。ＳＴＲＩＣＴは、毒性および副作用を有し、他のがんに対して広範に拡大可能な肺がんの標準処置法を最終的に置き換える可能性がある。ここでは、ＳＴＲＩＣＴが、肺がんに対する免疫システムを利用することにより、長期的な疾患を抑制し得る変形力のある新しい処置法であることを目指している。
この開示は、肺がんを含む広範ながんに対して広く適用および再プログラム化することができる強力な技術プラットフォームを提供する。
【０２２６】
例８の引用参考文献 
1. S. L. Topalian et al., Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med 366, 2443-2454 (2012). 
2. J. R. B. Scott N. Gettinger, Naiyer A. Rizvi, Neal Ready, Laura Quan Man Chow, Scott J. Antonia, Marc E. Buyse, Jacek Jassem, Friedrich Graf Finckenstein, Lucio Crino;, Thomas James Lynch, A phase III comparative study of nivolumab (anti-PD-1; BMS-963558; ONO-4538) versus docetaxel in patients (pts) with previously treated advanced/metastatic nonsquamous non-small-cell lung cancer (NSCLC). J Clin Oncol, suppl; abstr TPS8121 (2013). 
3. S. L. Maude et al., Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med 371, 1507-1517 (2014). 
4. R. Bargou et al., Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody. Science 321, 974-977 (2008). 
5. M. H. Kershaw, J. A. Westwood, C. Y. Slaney, P. K. Darcy, Clinical application of genetically modified T cells in cancer therapy. Clin Trans Immunol 3, e16 (2014). 
6. D. E. Gilham, R. Debets, M. Pule, R. E. Hawkins, H. Abken, CAR-T cells and solid tumors: tuning T cells to challenge an inveterate foe. Trends Mol Med 18, 377-384 (2012). 
7. M. Klinger et al., Immunopharmacologic response of patients with B-lineage acute lymphoblastic leukemia to continuous infusion of T cell-engaging CD19/CD3-bispecific BiTE antibody blinatumomab. Blood 119, 6226-6233 (2012). 
8. K. W. Liao, Y. C. Lo, S. R. Roffler, Activation of lymphocytes by anti-CD3 single-chain antibody dimers expressed on the plasma membrane of tumor cells. Gene Ther 7, 339-347 (2000). 
9. S. Paul et al., Tumor gene therapy by MVA-mediated expression of T-cell-stimulating antibodies. Cancer Gene Ther 9, 470-477 (2002). 
10. K. W. Liao et al., Stable expression of chimeric anti-CD3 receptors on mammalian cells for stimulation of antitumor immunity. Cancer Gene Ther 10, 779-790 (2003). 
11. Z. M. Yang, E. M. Li, B. C. Lai, Y. L. Wang, L. S. Si, Anti-CD3 scFv-B7.1 fusion protein expressed on the surface of HeLa cells provokes potent T-lymphocyte activation and cytotoxicity. Biochem Cell Biol 85, 196-202 (2007). 
12. Y. Liu et al., Adenovirus-mediated intratumoral expression of immunostimulatory proteins in combination with systemic Treg inactivation induces tumor-destructive immune responses in mouse models. Cancer Gene Ther 18, 407-418 (2011). 
13. W. Weber, M. Fussenegger, Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet 13, 21-35 (2012). 
14. L. Nissim, R. H. Bar-Ziv, A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Mol Syst Biol 6, 444 (2010). 
15. K. Kondo et al., Orthotopically implanted SCID mouse model of human lung cancer suitable for investigating metastatic potential and anticancer drug effects. Oncol Rep 12, 991-999 (2004). 
16. M. C. Kwon, A. Berns, Mouse models for lung cancer. Mol Oncol 7, 165-177 (2013). 
【０２２７】
例９ 
合成プロモータ・ライブラリー。 
本明細書において提供されるのは、いくつかの態様において、転写因子の翻訳後調節を特徴付けるための単純で迅速でコスト効率のよい方法である。該方法は、例えば、研究および個人用医薬の両方にとって重要である目的の細胞状態を標的化するために使用され得る、非常に特異的で非常に短い合成プロモータを同定するために使用され得る。これは、例えば、特異的な細胞状態において活性化される高度に特異的な結合モチーフを同定することによって行い得る。ＲＮＡレベルは常にタンパク質活性と相関してはいず（ｐ５３は大きな例である）、ＴＦへのＴＦの結合が転写活性化と必ずしも相関しないので例えば、ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＣｈＩＰ−Ｓｅｑなどの現行の方法は誤解を招く可能性がある（例えば、ＴＦはリプレッサーとして機能することができる）。
【０２２８】
本開示の方法は、いくつかの態様において、特異的な細胞状態で活性化される結合モチーフおよびこれらのモチーフの活性化レベルの直接的な証拠を提供する。バイオインフォマティクス層は、これらのモチーフに関連する転写因子の特徴付けを可能にし、したがって、関心事の細胞状態で活性化された転写カスケードを解読することを可能にする。図４６および４７において、合成プロモータがＮＢ５０８低ライブラリーから単離された。
【０２２９】
いくつかの本発明の態様を本明細書に記載し説明してきたが、当業者は、機能を実行し、および／または結果を得るためのさまざまな他の手段および／または構造、および／または本明細書に記載された利点の１つ以上をたやすく見越すであろうし、そのような変形および／または修正の各々は、本明細書に記載される本発明の態様の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意図し、実際のパラメータ、寸法、材料および／または構成は、特定の適用、または本発明の教示が使用される特定の適用に依存するであろう。当業者は、本明細書に記載の特定の本発明の態様に対する多くの均等物を認識するか、またはルーチンを超えない実験を用いて確認することができる。
【０２３０】
したがって、前述の態様は単なる例示として提示され、添付の特許請求の範囲およびそれと均等の範囲内で、本発明の態様は、具体的に記載され請求される以外の方法で実施され得ることが理解されるべきである。本開示の本発明の態様は、本明細書に記載される個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に向けられる。加えて、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、かかる特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の２つ以上の任意の組み合わせが、本発明の範囲内である。
【０２３１】
本明細書で定義され使用されている全ての定義は、辞書定義、参照により組み込まれた文献の定義、および／または定義された用語の通常の意味を支配すると理解されるべきである。
本明細書中に開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して、参照によって組み込まれており、場合によっては、その全体が本明細書に包含されている。
本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確に反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０２３２】
本明細書および特許請求の範囲において使用される「および／または」という語句は、そのように結合された要素の「一方または両方」、すなわち場合によっては結合的に存在し、他方では非結合的に存在する要素である。「および／または」と列挙された複数の要素は、同じように、すなわちそのように結合された要素の「１つまたはそれより大の」と解釈されるべきである。具体的に同定された要素に関連するかどうかにかかわらず、「および／または」句によって具体的に特定される要素以外の他の要素が任意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの開放型言語と併せて使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一態様において、Ａのみ（任意にＢ以外の要素も含む）；別の態様においては，Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）に；さらに別の態様においては、ＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む）などに結合する。
【０２３３】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、１または１より大なる要素のリストを参照して、「少なくとも１つの」という語句は、１または１より大なる要素のリストのうちの１または１より大なる要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきである。必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙された各要素の少なくとも１つを含まず、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外しない。具体的に定義された要素に関連するか否かに関わらず、この定義はまた、「少なくとも１つ」という語句が指し示す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外に、要素が任意に存在することを可能にする。
【０２３４】
したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様においては，Ａが、Ｂが存在しない（および場合によってはＢ以外の元素を含む）少なくとも１つの、任意に１つ以上のＡを含む。別の態様においては、Ａは存在しない（および場合によりＡ以外の要素を含む）少なくとも１つのＢを任意に２つ以上含むことができる。さらに別の態様においては、少なくとも１つ、任意に１より多くのＡおよび１より多くのＢを含むことができる（および任意に他の要素を含む）等を参照し得る。
【０２３５】
それとは逆に明確に示されていない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書で請求されるいずれの方法においても、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしもステップまたは行為が列挙された順序に限定されないことを理解すべきである。
【０２３６】
特許請求の範囲、同様に上の明細書において、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「携行する(carrying)」「有する(having)」、「含む(containing)」、「関与する(involving)」、「保持する(holding)」、「構成する(composed of)」などの全ての移行的な語句は、オープンエンドで理解すべきで、すなわち、含むが限定されないことを意味する。「からなる(consisting of)」および「本質的にからなる(consisting essentially of)」という移行句だけが、米国特許商標庁の特許審査手続マニュアルのセクション2111.03に規定されているように、それぞれクローズドまたはセミクローズド移行句であるものとする。
【図１】
2018520669.tif 000003
【図２】
2018520669.tif 000004
【図３Ａ−Ｂ】
2018520669.tif 000005
【図３Ｃ−Ｄ】
2018520669.tif 000006
【図３Ｅ−Ｆ】
2018520669.tif 000007
【図３Ｇ−Ｈ】
2018520669.tif 000008
【図４】
2018520669.tif 000009
【図５】
2018520669.tif 000010
【図６Ａ】
2018520669.tif 000011
【図６Ｂ】
2018520669.tif 000012
【図７Ａ】
2018520669.tif 000013
【図７Ｂ−Ｃ】
2018520669.tif 000014
【図７Ｄ−Ｅ】
2018520669.tif 000015
【図７Ｆ−Ｇ】
2018520669.tif 000016
【図７Ｈ】
2018520669.tif 000017
【図８】
2018520669.tif 000018
【図９】
2018520669.tif 000019
【図１０】
2018520669.tif 000020
【図１１】
2018520669.tif 000021
【図１２】
2018520669.tif 000022
【図１３】
2018520669.tif 000023
【図１４】
2018520669.tif 000024
【図１５】
2018520669.tif 000025
【図１６】
2018520669.tif 000026
【図１７】
2018520669.tif 000027
【図１８】
2018520669.tif 000028
【図１９】
2018520669.tif 000029
【図２０】
2018520669.tif 000030
【図２１】
2018520669.tif 000031
【図２２】
2018520669.tif 000032
【図２３】
2018520669.tif 000033
【図２４】
2018520669.tif 000034
【図２５】
2018520669.tif 000035
【図２６Ａ】
2018520669.tif 000036
【図２６Ｂ】
2018520669.tif 000037
【図２７】
2018520669.tif 000038
【図２８】
2018520669.tif 000039
【図２９】
2018520669.tif 000040
【図３０】
2018520669.tif 000041
【図３１Ａ】
2018520669.tif 000042
【図３１Ｂ】
2018520669.tif 000043
【図３２】
2018520669.tif 000044
【図３３Ａ】
2018520669.tif 000045
【図３３Ｂ】
2018520669.tif 000046
【図３４】
2018520669.tif 000047
【図３５】
2018520669.tif 000048
【図３６】
2018520669.tif 000049
【図３７】
2018520669.tif 000050
【図３８】
2018520669.tif 000051
【図３９】
2018520669.tif 000052
【図３９−１】
2018520669.tif 000053
【図４０】
2018520669.tif 000054
【図４１】
2018520669.tif 000055
【図４２】
2018520669.tif 000056
【図４３】
2018520669.tif 000057
【図４４】
2018520669.tif 000058
【図４５】
2018520669.tif 000059
【図４６】
2018520669.tif 000060
【図４７】
2018520669.tif 000061
【配列表】
2018520669000001.app
【国際調査報告】
2018520669.tif 000062
2018520669.tif 000063
2018520669.tif 000064
2018520669.tif 000065