(57)【要約】本発明は特に、改善されたレプリコンおよびこのレプリコンをコードするベクターを提供し、このレプリコンは、コードされるタンパク質の持続的発現を提供する。このレプリコンはフラビウイルスレプリカーゼと異種タンパク質コーディング配列とを含み、異種タンパク質コーディング配列は、有効性を改善するための分離配列に隣接している。本発明により提供される自己複製ＲＮＡを含め、本発明により提供されるこの核酸は、（例えば免疫付与方法のための）ワクチン等のタンパク質発現の方法および（例えば処置方法のための）抗体などの治療用タンパク質の発現で有用である。
2018513673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（＋）鎖自己複製ＲＮＡをコードする配列を含む、単離された核酸であって、前記自己複製ＲＮＡが、フラビウイルスレプリカーゼコーディング配列と異種タンパク質コーディング配列とを含み、前記異種タンパク質コーディング配列が、少なくとも２つの隣接する分離配列の間に配置されており、前記自己複製ＲＮＡが、ウイルス粒子を形成することができるウイルス構造タンパク質のコーディング配列を欠いており、前記フラビウイルスレプリカーゼが、
（ａ）西ナイルウイルス（West Nile Virus）（ＷＮＶ）レプリカーゼであって、前記ＷＮＶが、ＷＮＶ  ＮＹ９９、ＷＮ  ＮＹ  ２０００−ｃｒｏｗ３３５６、ＨＮＹ１９９９、ＮＹ９９ｆｌａｍｉｎｇｏ３８２９９、ＩＳ９８ＳＴＤ、ｇｏｏｓｅ−Ｈｕｎｇａｒｙ／０３、Ｉｔａｌｙ１９９８Ｅｑｕｉｎｅ、ＲＯ９７５０、ＶＬＧ４、ＬＥＩＶ−Ｖｌｇ９９−２７８８９、ＰａＨ００１、ＰａＡｎ００１、Ｅｇ１０１、Ｃｈｉｎ−０１、Ｓａｒａｆｅｎｄ、Ｂ９５６（ＷＮＦＣＧ）、ｇｏｓｈａｗｋ−Ｈｕｎｇａｒｙ／０４、ＬＥＩＶ−Ｋｒｎｄ８８−１９０、Ｎｅａ  Ｓａｎｔａ−Ｇｒｅｅｃｅ  ２０１０、Ｇｏｓｈａｗｋ−Ｈｕｎｇａｒｙ／０４、Ｇｒｅｅｃｅ／２０１２／Ｋａｖａｌａ．３９．１、Ｉｔａｌｙ／２０１３／Ｒｏｖｉｇｏ／３２．１、Ａｕｓｔｒｉａ／２００８−ｇｈからなる群から選択され、より特に、株がＷＮＶ  ＮＹ９９、ＷＮ  ＮＹ  ２０００−ｃｒｏｗ３３５６もしくはＨＮＹ１９９９から選択される、ＷＮＶレプリカーゼ、または
（ｂ）黄熱ウイルス（Yellow Fever Virus）（ＹＦＶ）レプリカーゼであって、前記ＹＦＶが、１７Ｄワクチン株、Ａｓｉｂｉ株、Ｕｇａｎｄａ４８１、Ａｎｇｏｌａ７１、１７Ｄ−２０４、１７ＤＤ、１７Ｄ−２１３、Ｕｇａｎｄａ２０１０、８８／１９９９からなる群から選択され、より特に、株が１７Ｄワクチン株もしくはＡｓｉｂｉ株である、ＹＦＶレプリカーゼ
である、核酸。
【請求項２】
前記レプリカーゼが、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記分離配列がウイルスの２Ａ配列である、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４】
前記少なくとも２つの隣接する分離配列が組換えを起こさない、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
前記自己複製ＲＮＡの合成が、Ｔ７、ＳＰＣ６、ＣＭＶまたはこれらのいずれかの機能的断片からなる群から選択されるプロモーターにより駆動される、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
前記核酸が、機能的３’ＵＴＲを産生するための、前記自己複製ＲＮＡの下流の配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７】
機能的３’ＵＴＲを産生するための前記配列がリボザイムをコードする、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
前記下流の配列が制限酵素認識配列であり、任意選択でＢｓｐＱＩ部位である、請求項６に記載の核酸。
【請求項９】
前記核酸が、配列番号１または配列番号３と少なくとも約６０％同一な配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記核酸がプラスミドであり、任意選択で前記プラスミドが低コピー数プラスミドである、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１１】
前記異種タンパク質コーディング配列が抗原タンパク質である、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
前記異種タンパク質コーディング配列が治療用タンパク質であり、任意選択で、前記治療用タンパク質が、成長因子、サイトカイン、抗体または抗体の抗原結合断片から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１３】
送達系と複合体化されており、任意選択で、前記送達系が、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、カチオン性ナノエマルションまたは生分解性ポリマーから選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１４】
先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞であって、任意選択で、前記宿主が、ＴｅｔｒＤ（ｍｃｒＡ）１８３  Ｄ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３  ｅｎｄＡ１  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ  Ｈｔｅ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑＺＤＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）Ａｍｙ  Ｃａｍｒ］（例えば、ＸＬ１０Ｇｏｌｄ（登録商標）ウルトラコンピテント）細胞またはＦ−、ｅｎｄＡ１、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｐｈｏＡ、Φ８０ｄ  ｌａｃＺΔ  Ｍ１５、Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）、ΔｍｃｒＡ、λ−（例えば、ＳＴＥＬＬＡＲ（登録商標））細胞から選択される、宿主細胞。
【請求項１５】
先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸によりコードされる自己複製ＲＮＡ。
【請求項１６】
先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸を含む組成物であって、アジュバントを更に含み、任意選択で前記アジュバントが金属塩である、組成物。
【請求項１７】
ＴＬＲアゴニストを更に含み、任意選択で前記ＴＬＲアゴニストがＴＬＲ７アゴニストであり、更に任意選択で前記ＴＬＲ７アゴニストがベンゾナフチリジン化合物である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
目的のタンパク質または前記目的のタンパク質をコードする核酸を発現させる方法であって、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸と、転写機構、翻訳機構、または転写機構および翻訳機構を含む発現系とを接触させる工程を含み、前記核酸の前記異種タンパク質コーディング配列が前記目的のタンパク質である、方法。
【請求項１９】
哺乳類対象中で抗原タンパク質に対する免疫応答を上昇させる方法であって、請求項１１に記載の核酸を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
哺乳類対象に治療用タンパク質を投与する方法であって、請求項１２に記載の核酸を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、特に、改善されたレプリコン、および異種タンパク質の発現用のレプリコンコーディングベクター、ならびにそれらを使用する関連方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
例えばウイルスレプリコンに由来する自己複製リボ核酸（ＲＮＡ）は、様々な目的のためのタンパク質、例えば異種タンパク質の発現、例えば治療用タンパク質の発現およびワクチン用の抗原の発現に有用である。そのようなレプリコンの望ましい特性はタンパク質の持続的発現能力である。
【０００３】
国際公開第９９／２８４８７号パンフレット（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ）およびVarnavski et al., Virology 255, 366-375 (1999)は（＋）鎖自己複製ＲＮＡをコードする核酸配列を開示しており、この核酸配列には、クンジンウイルス（Kunjin Virus）レプリカーゼコーディング配列、フラビウイルスコアタンパク質の一部およびフラビウイルス５’未翻訳領域（ＵＴＲ）をコードするタンパク質コーディング配列が含まれる。このレプリコンをウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）にパッケージングしてワクチンとして使用することができる。
【０００４】
Herd et al., "Recombinant Kunjin virus replicon vaccines induce protective T-cell immunity against human papillomavirus 16 E7-expressing tumour", Virology 319: 237-248 (2004)は（＋）鎖自己複製ＲＮＡをコードする核酸配列を開示しており、この核酸配列には、クンジンウイルス（Kunjin Virus）レプリカーゼコーディング配列、およびワクチンとして使用するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）エピトープをコードするタンパク質コーディング配列が含まれる。
【０００５】
Alcaraz-Estrada et al., "Construction of self-replicating subgenomic West Nile virus replicons for screening antiviral compounds", Methods Mol. Biol. 1030: 283-299 (2013)は（＋）鎖自己複製ＲＮＡをコードする核酸配列を開示しており、この核酸配列には、西ナイルウイルス（West Nile Virus）株９５６レプリカーゼコーディング配列およびレポーター遺伝子が含まれる。
【０００６】
国際公開第２００６／０８６８３８号パンフレット（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｉｎｓｔ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．）は（＋）鎖自己複製ＲＮＡを開示しており、このＲＮＡには、クンジンウイルス（Kunjin Virus）レプリカーゼコーディング配列および腫瘍治療で使用するＧＭ−ＣＳＦタンパク質のタンパク質コーディング配列が含まれる。‘８３３親出願はまた、西ナイルウイルス（West Nile Virus）および黄熱ウイルス（Yellow Fever Virus）の使用も開示する。
【０００７】
Queiroz et al., “Construction of yellow fever virus subgenomic replicons by yeast-based homologous recombination cloning technique”, Anais da Academia Brasileira de Ciencias 85: 159-168 (2010)は（＋）鎖自己複製ＲＮＡをコードする核酸配列を開示しており、この核酸配列には、黄熱ウイルス（Yellow Fever Virus）株１７０レプリカーゼコーディング配列およびレポーター遺伝子が含まれる。
【０００８】
Jones et al., "Construction and applications of yellow fever virus replicons", Virology 331: 247-259 (2005)は、様々なレポーター遺伝子をコードする黄熱ウイルス（Yellow Fever Virus）レプリコンを開示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明は、特に、改善されたレプリコンおよびこのレプリコンをコードするベクターを提供し、このレプリコンは、コードされるタンパク質の持続的発現を提供する。これらのレプリコンは、フラビウイルスレプリカーゼと異種タンパク質コーディング配列とを含む。この異種タンパク質コーディング配列は、有効性を改善するための分離配列（separation sequences）に隣接している。本発明により提供される自己複製ＲＮＡを含め、本発明により提供されるこれらの核酸は、例えばワクチン用の（例えば免疫付与方法のための）タンパク質発現の方法および（例えば処置方法のための）抗体などの治療用タンパク質の発現で有用である。
【００１０】
本発明を下記の例により更に説明するが、これらの例は限定的であると解釈すべきではない。これらの例は下記の図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】レプリコンＷＮＶ００１およびＹ０３０を示す概略図である。ＷＮＶ００１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写前のテンプレート線状化用のＸｂａＩ部位を含み、テンプレート鎖上の望ましくないヌクレオチドをエキソヌクレアーゼでポリッシングしてランオフ（run-off）テンプレートを生成する。Ｙ０３０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写前の線状化用のＳａｐＩ部位を含み、消化直後にランオフテンプレートを生じる。ＵＴＲ＝未翻訳領域、Ｃ＊＝環化配列を維持するように操作された欠失後のカプシド構造タンパク質の残存配列。Ｅ＊＝ＮＳ１シグナル配列を維持するように操作された欠失後のエンベロープ構造タンパク質の残存配列。ＮＳ１−ＮＳ５＝非構造ＷＮＶタンパク質。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、ＢＨＫ細胞でのＷＮＶ００１  ＲＮＡの免疫組織化学的分析からの顕微鏡写真を示す図である。簡潔に述べると、ＲＮＡ  ４μｇでＢＨＫ細胞をエレクトロポレートし、この細胞を固定し、透過性にし（permeabilzied）、エレクトロポレーションの４８時間後にＷＮＶ抗原の存在に関して分析した。ＷＮＶ−ＮＳ１（Ａ６０９）を発現するアルファウイルスレプリコンからのＲＮＡを陽性対照として使用した。図２Ａ：免疫組織化学（ＩＨＣ）に対して陽性に反応するＡ６０９  ＲＮＡでエレクトロポレートした細胞。図２Ｂ：ＷＮＶ００１  ＲＮＡでエレクトロポレートした細胞は、ＩＨＣに対して陽性に反応する細胞をほとんど示さない。図２Ｃ：モックエレクトロポレーションではＩＨＣ陽性細胞は生じない。
【図３】ＢＨＫ細胞でのＹ０３０ＲＮＡのフローサイトメトリー分析をまとめた棒グラフを示す図である。簡潔に述べると、ＢＨＫ細胞をＲＮＡ  １μｇでエレクトロポレートし、エレクトロポレーションの２４時間後にＹＦＶ抗原の存在に関して分析した。モックエレクトロポレーションを陰性対照として実施した。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、異なるＷＮＶレプリコンおよび転写スキームの概略図である。図４Ａ：センスまたはアンチセンスのデルタ型肝炎ウイルスリボザイム（Ｓ−ＨＤＶＲまたはＡＳ−ＨＤＶＲ）配列をＷＮＶ００１の３’ＵＴＲの直後に加え、それぞれセンスＨＤＶＲまたはアンチセンスＨＤＶＲを含む第２世代のレプリコンＷＮＶ００６およびＷＮＶ００７を生成した。図４Ｂ：リボザイム配列の付加により、テンプレート鎖上のエキソヌクレオヌクレアーゼポリッシングの必要性がなくなる。図４Ｂは、Shi et al. Virology 296, 213-233 (2002)が出典である。
【図５】ＨＤＶＲの付加によりＷＮＶレプリコンの効力が有意に改善されることを示す棒グラフである。簡潔に述べると、ＷＮＶ００１、ＷＮＶ００６またはＷＮＶ００７のＲＮＡ  ０．２５μｇ〜４μｇをＢＨＫ細胞中にエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの４８時間後に、フローサイトメトリーによりＷＮＶ抗原の存在に関して細胞を分析した。結果は、試験した全ての範囲でセンスＨＤＶＲ（ＷＮＶ００６に含まれる）が最も強力なＷＮＶレプリコンＲＮＡを得ることを示す。
【図６】ＹＦＶレプリコンの効力へのＳ−ＨＤＶＲの効果を評価するために使用するレプリコンの概略図である。両方のレプリコンは、構造欠失領域（structural deleted region）内に、インフレームで融合したＦＬＡＧタグレポーターを有するＧＦＰを含んだ。
【図７】ＨＤＶリボザイムを付加してもＹＨＦレプリコンの効力が増強されないことを示す棒グラフである。簡潔に述べると、Ｙ０３７またはＹ０４０のＲＮＡ  ０．１μｇ〜１μｇをＢＨＫ細胞中にエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの２４時間後に、フローサイトメトリーによりＹＦＶ抗原の存在に関して細胞を分析した。結果は、センスＨＤＶＲがＹＦＶ効力に有意な影響を及ぼさないことを示す。
【図８】フラビウイルスレプリコンＲＮＡの転写を駆動する改変Ｔ７プロモーターを示す図である。図８Ａ：ＡＴＰにより開始されるレプリコンＲＮＡを生成するために、ＷＮＶ００８またはＹ０４２のレプリコンに付加した様々なプロモーター改変。転写が開示されるヌクレオチドは太字であり、フラビウイルスの真の５’ＵＴＲの最初のヌクレオチドに下線を引いている。ＯＬ＝重複プロモーター−プロモーターの最後のヌクレオチドがフラビウイルス５’ＵＴＲ配列の最初のヌクレオチドと重複する。＊ＷＮＶ００８は、ＡｆｌＩＩクローニング部位を生成するために構造欠失領域中にサイレント変異が存在するＷＮＶ００６と等しい。図８Ｂ：同じｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写下で改変プロモーターを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写後に生成されたＷＮＶ  ＲＮＡの収率。ＷＮＶ００８の転写を駆動する従来のＴ７プロモーターｆ６．５プロモーターにより最大のＲＮＡが得られる。ＷＮＶ０１７およびＷＮＶ０２６の転写を駆動する改変プロモーターは、ＲＮＡ収率を有意に低下させている。ＷＮＶ０２７およびＷＮＶ０２８の転写を駆動する改変プロモーターは、約０．６６〜０．７５倍でＲＮＡ収率を低下させる。ＲＮＡ収率をＷＮＶ００８のＲＮＡ収率に対して正規化している。図８Ｃ：同じｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写条件下で改変プロモーターを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写後に生成されたＹＦＶレプリコンＲＮＡの収率の例。
【図９】ＷＮＶレプリコンＲＮＡの転写を駆動する改変Ｔ７プロモーターがレプリコンの効力を有意に増強することを示す棒グラフである。簡潔に述べると、ＷＮＶ００８、ＷＮＶ０１７、ＷＮＶ０２６、ＷＮＶ０２７またはＷＮＶ０２８  １００ｎｇをＢＨＫ細胞中にエレクトロポレートし、エレクトロポレーションの２４時間後にＷＮＶ抗原の存在に関して分析した。データは、それぞれＷＮＶ０２７およびＷＮＶ０２８におけるレプリコンＲＮＡの転写を駆動するＡＴＰ開始Ｔ７プロモーターｆ２．５（ＯＬ）およびＴ７プロモーターｆ６．５ｍｕｔ（ＯＬ）は、ＷＮＶ００８にける従来のＴ７プロモーターｆ６．５から生成されたＷＮＶ  ＲＮＡよりも約１５倍超で効力を増強したことを示す。
【図１０】ＹＦＶレプリコンＲＮＡの転写を駆動する改変Ｔ７プロモーターが効力をわずかに増強することを示す棒グラフである。簡潔に述べると、Ｙ０３７、Ｙ０４２、Ｙ０４３、Ｙ０４４またはＹ０４５のＲＮＡ  １００ｎｇをＢＨＫ細胞中にエレクトロポレートし、エレクトロポレーションの２４時間後にＹＦＶ抗原の存在に関して分析した。データは、それぞれＹ０４２およびＹ０４３におけるレプリコンＲＮＡの転写を駆動するＡＴＰ開始Ｔ７プロモーターｆ２．５およびＴ７プロモーターｆ６．５ｍｕｔが、Ｙ０３７における従来のＴ７プロモーターｆ６．５から生成されたＹＦＶ  ＲＮＡよりも約２倍超で効力を増強したことを示す。
【図１１】構造欠失領域中に挿入された最適化導入遺伝子発現カセットを有するＷＮＶレプリコンまたはＹＦＶレプリコンの概略図である。最適化ＷＮＶ構築物は、重複したＡＴＰ開始プロモーターおよびリボザイムの両方を含む。最適化ｆＹＦＶ構築物は、ＡＴＰ開始プロモーターおよび正確な線状化部位を含む。
【図１２】最適化されたＷＮＶレプリコンおよびＹＦＶレプリコンが強力であることを示す棒グラフである。簡潔に述べると、各ＲＮＡ  ２５０ｎｇをＢＨＫ細胞中にまたはＨｅｌａ細胞中にトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後、４８時間後または７２時間後にＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳ分析により効力を観察した。ＷＮＶは効力がＴＣ８３レプリコンと類似しているが、ＹＦＶは効力がより低い。
【図１３】ＹＦＶレプリコンおよびＷＮＶレプリコンがＴＣ８３レプリコンと比べて細胞毒性が低いことを示す棒グラフである。簡潔に述べると、各ＲＮＡ  ２５０ｎｇをＢＨＫ細胞中にまたはＨｅｌａ細胞中にトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後、４８時間後および７２時間後に、死滅したレプリコン陽性細胞の割合により細胞毒性を決定した。
【図１４】ＷＮＶレプリコンおよびＹＦＶレプリコンが７２時間にわたりＧＦＰを発現することができることを示す棒グラフである。簡潔に述べると、各ＲＮＡ  ２５０ｎｇをＢＨＫ細胞中にまたはＨｅｌａ細胞中にトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後、４８時間後または７２時間後に、平均蛍光強度により発現を決定した。
【図１５】ＨＤＶＲの付加によりＷＮＶレプリコンの効力が有意に改善されることを示す棒グラフである。簡潔に述べると、ＷＮＶ００１ＲＮＡ（ＸｂａＩ／マング・ビーンテンプレートに由来するＲＮＡ）、ＷＮＶ００６ＲＮＡ（センスＨＤＶＲテンプレレートに由来するＲＮＡ）またはＷＮＶ００７ＲＮＡ（アンチセンスＨＤＶＲテンプレートに由来するＲＮＡ）０．２５μｇ〜４μｇをＢＨＫ細胞中にエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの４８時間後に、フローサイトメトリーによりＷＮＶ抗原の存在に関して細胞を分析した。
【図１６】リボザイムを使用して生成されたＲＮＡが、ランオフテンプレートを使用して生成されたＲＮＡと比べて更により強力であったことを示す棒グラフである。テンプレート鎖からの非天然ヌクレオチドを整えるためのマング・ビーンヌクレアーゼ処理を必要とすることなく完全なランオフ末端を生成するために、ＰＣＲを使用してＷＮＶ００６のテンプレートＤＮＡを開発した。ＰＣＲにより生成されたテンプレートからのＲＮＡを、リボザイムの助けを借りて生成されたＲＮＡに対して評価した。理論的には、全てのＲＮＡ転写物は同じ最終産物を生じるはずである。
【図１７】ＰＣＲまたはＳａｐＩ線状化により生成されたＤＮＡテンプレートに由来するＹＦＶレプリコンＲＮＡは効力が同等であることを示す棒グラフである。完全なランオフ末端を生成するために、ＰＣＲを使用してＹ０３０またはＹ０３１のテンプレートＤＮＡを開発した。或いは、完全なランオフ末端を生成するために、操作されたＳａｐＩ部位を使用してＹ０３０およびＹ０３１のテンプレートＤＮＡを生成した。
【図１８】更なる構築物の概略図である。ＷＮＶ００６に由来する第２世代のＷＮＶ００８構築物（クローニング目的のために、構造欠失領域中のＣタンパク質の残余部分とＥタンパク質の残余部分との間でＡＦｌＩＩクローニング部位が操作された）中への完全長融合ペプチド呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質（ＦＬＦＰＤ．ＲＳＦＶ）およびＧＦＰ二重レポーターカセットの、以下からの付加：ＷＮＶ００８（レポーターカセットが付加されていないおよびセンスＨＤＶＲを有するＷＮＶレプリコン）、ＷＮＶ０１０（構造欠失領域中に挿入されているＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ’およびＧＦＰ’二重レポーターカセット。ＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ’およびＧＦＰ’の両方に、’で表されるＣ末端ＦＬＡＧタグを付けた。天然のＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦシグナルペプチドを、通常は構造タンパク質ｐｒＭ用のシグナルペプチドとして働く構造タンパク質ＣのＣ末端からの配列で置き換えた。ＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦおよびＧＦＰの両方を、口蹄疫ウイルス由来のフリンプロテアーゼ部位およびＦ２Ａ自己タンパク質分解部位で離した。ブタテッショウウイルス由来の類似のフリンプロテアーゼおよびＧＳＧＰ２Ａ自己タンパク質分解部位をＧＦＰ’の後に付加し、ウイルスポリペプチドから離した）、ＷＮＶ０１１（ＲＳＶＦ．ＦＬＦＰＤの天然のシグナルペプチドを維持した以外は、類似のレポーターを構造欠失領域中に付加した）、またはＷＮＶ０１２（存在する天然のＮＳｉＩ部位を使用して、類似のレポーターを３’ＵＴＲの上流領域中に付加した。このレポーターは、ＷＮＶ０１１中に存在するものと同一であるが、代わりに追加のフリン＋ＧＳＧＰ２Ａ配列を終止コドンで置き換えた）。
【図１９−１】図１９Ａ〜図１９Ｃは、ＷＮＶ０１０、ＷＮＶ０１１およびＷＮＶ０１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験をまとめた図である。図１９Ａ：レポーター構築物をトランスフェクトした細胞の蛍光顕微鏡画像。簡潔に述べると、各ＲＮＡ  ４μｇをＢＨＫ細胞中にエレクトロポレートし、ＧＦＰ発現を介したレポーター機能に関して観察した。エレクトロポレーションの７２時間後に撮影した。ＷＮＶ０１０およびＷＮＶ０１１からのＲＮＡでエレクトロポレートした細胞中では約４８時間でＧＦＰ発現が容易に見られたが、ＷＮＶ０１２からのＲＮＡでエレクトロポレートした細胞はエレクトロポレーションの７２時間後まで観測可能なＧＦＰ発現を示さなかった。図１９Ｂ：フローサイトメトリーのデータ。簡潔に述べると、ＢＨＫ細胞を各ＲＮＡ  ４μｇでエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの７２時間後に細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＷＮＶ抗原の存在またはＧＦＰ発現に関して分析した。データは、ＷＮＶ抗原＋集団により決定した場合にＷＮＶ００８  ＲＮＡのみが約１９．５％の効力を生じることを示す。細胞をＷＮＶ０１０およびＷＮＶ０１１のＲＮＡでそれぞれエレクトロポレートした場合には、効力が約８％および４％まで低下する。ＷＮＶ０１２の効力はほとんど無視できるほどであった。フローサイトメトリーのデータは、ＧＦＰ発現がＷＮＶ抗原の存在と共に直線的に増加することも示しており、このことは予想されるはずである。図１９Ｃ：ＢＨＫ細胞溶解物の抗ＦＬＡＧウエスタンブロット。簡潔に述べると、ＢＨＫ細胞を各構築物４μｇでエレクトロポレートし、溶解物を回収し、エレクトロポレーションの４８時間後に抗ＦＬＡＧ抗体により分析し、ＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ’ＦＬＡＧ＋フリンＦ２Ａ＋ＧＦＰ’ＦＬＡＧを発現するＶＥＥレプリコンを陽性対照（Ａ６１１）として使用した。Ａ６１１溶解物は、切断されていないＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ’ＦＬＡＧ＋フリンＦ２Ａ＋ＧＦＰ’ＦＬＡＧポリペプチドならびにＲＳＶＦ’ＦＬＡＧおよびＧＦＰ’ＦＬＡＧを明らかに示す。ＷＮＶ００８でエレクトロポレートした細胞由来の溶解物は、予想したようにシグナルを示さなかった。ＷＮＶ０１０およびＷＮＶ０１１のＲＮＡをトランスフェクトした細胞の溶解物では、予想したように、ＧＦＰ’ＦＬＡＧ＋フリンＧＳＧＰ２Ａペプチドと同様に切断されていないレポーターのわずかなバンドを見出すことができる。なぜならば、細胞質ＧＦＰはフリンによって切断され得ないが、切断されたＲＳＦＶ’ＦＬＡＧはバックグランド反応性と重複し、明確に見出すことができないからである。ＷＮＶ０１２の溶解物中では、検出可能な抗ＦＬＡＧシグナルを観測しなかった。おそらくは、この構築物からのレポーターの発現が非常に低かったからである。
【図１９−２】図１９Ａ〜図１９Ｃは、ＷＮＶ０１０、ＷＮＶ０１１およびＷＮＶ０１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験をまとめた図である。図１９Ｂ：フローサイトメトリーのデータ。簡潔に述べると、ＢＨＫ細胞を各ＲＮＡ  ４μｇでエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの７２時間後に細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＷＮＶ抗原の存在またはＧＦＰ発現に関して分析した。データは、ＷＮＶ抗原＋集団により決定した場合にＷＮＶ００８  ＲＮＡのみが約１９．５％の効力を生じることを示す。細胞をＷＮＶ０１０およびＷＮＶ０１１のＲＮＡでそれぞれエレクトロポレートした場合には、効力が約８％および４％まで低下する。ＷＮＶ０１２の効力はほとんど無視できるほどであった。フローサイトメトリーのデータは、ＧＦＰ発現がＷＮＶ抗原の存在と共に直線的に増加することも示しており、このことは予想されるはずである。
【図１９−３】図１９Ａ〜図１９Ｃは、ＷＮＶ０１０、ＷＮＶ０１１およびＷＮＶ０１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験をまとめた図である。図１９Ｃ：ＢＨＫ細胞溶解物の抗ＦＬＡＧウエスタンブロット。簡潔に述べると、ＢＨＫ細胞を各構築物４μｇでエレクトロポレートし、溶解物を回収し、エレクトロポレーションの４８時間後に抗ＦＬＡＧ抗体により分析し、ＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ’ＦＬＡＧ＋フリンＦ２Ａ＋ＧＦＰ’ＦＬＡＧを発現するＶＥＥレプリコンを陽性対照（Ａ６１１）として使用した。Ａ６１１溶解物は、切断されていないＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ’ＦＬＡＧ＋フリンＦ２Ａ＋ＧＦＰ’ＦＬＡＧポリペプチドならびにＲＳＶＦ’ＦＬＡＧおよびＧＦＰ’ＦＬＡＧを明らかに示す。ＷＮＶ００８でエレクトロポレートした細胞由来の溶解物は、予想したようにシグナルを示さなかった。ＷＮＶ０１０およびＷＮＶ０１１のＲＮＡをトランスフェクトした細胞の溶解物では、予想したように、ＧＦＰ’ＦＬＡＧ＋フリンＧＳＧＰ２Ａペプチドと同様に切断されていないレポーターのわずかなバンドを見出すことができる。なぜならば、細胞質ＧＦＰはフリンによって切断され得ないが、切断されたＲＳＦＶ’ＦＬＡＧはバックグランド反応性と重複し、明確に見出すことができないからである。ＷＮＶ０１２の溶解物中では、検出可能な抗ＦＬＡＧシグナルを観測しなかった。おそらくは、この構築物からのレポーターの発現が非常に低かったからである。
【図２０】図２０Ａおよび図２０Ｂは、Ａ）二重レポーター遺伝子または単一レポーター遺伝子を有するＹＦＶレプリコンの概略図およびＢ）ＢＨＫ細胞での試験をまとめた棒グラフである。
【図２１−１】図２１Ａおよび図２１Ｂは、構築物の概略図およびウエスタンブロットの結果を示す写真である。図２１Ａは、自己切断２Ａ部位を有しない（Ｙ０３７もしくはＹ０４０）、１個のＣ末端Ｐ２Ａ部位を有する（Ｙ０３８）、またはＮ末端Ｆ２Ａ部位とＣ末端Ｐ２Ａ部位とを有するＹＦＶレプリコン中へのＧＦＰ’ＦＬＡＧレポーターの添加の概略図である。図２１Ｂは、ＧＦＰ’ＦＬＡＧがＮ末端Ｐ２ＡおよびＣ末端Ｆ２Ａに隣接する場合（Ｙ０３９）にウイルスポリペプチド鎖からのＧＦＰ’ＦＬＡＧレポーターの完全な分離を明らかにする抗ＦＬＡＧウエスタンブロットの写真である。
【図２１−２】図２１Ａおよび図２１Ｂは、構築物の概略図およびウエスタンブロットの結果を示す写真である。図２１Ｂは、ＧＦＰ’ＦＬＡＧがＮ末端Ｐ２ＡおよびＣ末端Ｆ２Ａに隣接する場合（Ｙ０３９）にウイルスポリペプチド鎖からのＧＦＰ’ＦＬＡＧレポーターの完全な分離を明らかにする抗ＦＬＡＧウエスタンブロットの写真である。
【図２２】ＧＦＰ’ＦＬＡＧ、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬＵＣ）または抗ＹＦＶｓｃＦｖ−ｈＦｃｓを発現する最適化フラビウイルスレプリコンの概略図である。この時点では、ＦＬＵＣを発現するＹＦＶを構築しておらず試験もしていない。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂは、実験結果をまとめた棒グラフである。図２３Ａ）ＧＦＰ’ＦＬＡＧまたはＦＬＵＣを発現する誘導体（ＷＮＶ０２９およびＷＮＶ０３０）と比較した、レポーターを有しない最適化ＷＮＶレプリコン（ＷＮＶ０２８）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効力アッセイ。効力アッセイの結果は、レポーターカセットの導入により効力が約０．５倍低下することを示す。図２３Ｂ）ｓｃＦｖ−ｈＦｃを発現するレプリコン（ＷＮＶ０３８およびＷＮＶ０３９）と比較したＧＦＰ’ＦＬＡＧを発現するレプリコン（ＷＮＶ０２９）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効力アッセイ。効力アッセイの結果は、ｓｃＦｖ−ｈＦｃを発現するレプリコンが更なる効力の低下を経験することを示す。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｃは、全てのＷＮＶ構築物が目的のレポーター遺伝子を産生することを示す図である。図２４Ａ：ＷＮＶ０２８、ＷＮＶ０２９からのＲＮＡまたはモックエレクトロポレーションでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞からの細胞溶解物の抗ＦＬＡＧウエスタンブロット。図２４Ａ：２Ａ部位プロセシング後のＧＦＰ’ＦＬＡＧのサイズに対応するＷＮＶ０２９溶解物レーンにおいて約３２ｋｂのバンドが見える。図２４Ｂ）ＢＨＫ細胞溶解物からのルシフェラーゼデータ。細胞を、ＷＮＶ０２８（陰性対照、左端）、ＷＮＶ０３０（ルシフェラーゼを発現するＷＮＶ、中央）またはＡ１００７（ルシフェラーゼを発現するＴＣ８３陽性対照、右端）でエレクトロポレートし、エレクトロポレーションの２４時間後または４８時間後に回収した。データは、ＷＮＶ０３０がルシフェラーゼを発現することができることを示す。図２４Ｃ：ＷＮＶ０３８、ＷＮＶ０３９またはＡ６１２（ｓｃＦｖ−ｈＦｃを発現する対照）からのＲＮＡでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞からの細胞上清の抗ｈＦＣウエスタンブロットを示す図である。ブロットは、ｓｃＦｖ−ｈＦｖがＷＮＶ０３８またはＷＮＶ０３９でエレクトロポレートした細胞中で発現されており、かつ適切なサイズであり、かつこの細胞から分泌されていることを示す。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｃは、ＴＣ８３およびＷＮＶに対するＹＦＶレプリコン機能の評価をまとめた図である。図２５Ａ：ＢＨＫ細胞中でのＧＦＰ発現による、最適化された、ＧＦＰを発現するＴＣ８３レプリコン、ＷＮＶレプリコンまたはＹＦＶレプリコン（それぞれＡ７５０、ＷＮＶ０２９、Ｙ０４２）の経時的な効力アッセイ。この特定のアッセイのために、エレクトロポレーションの代わりにカチオン性トランスフェクション試薬を使用してＢＨＫ細胞をトランスフェクトした。データは、フローサイトメトリー分析により全てのレプリコンがＧＦＰを発現することができることを示す。図２５Ｂ：最適化された、ｓｃＦｖ−ｈＦｃを発現するＴＣ８３レプリコン、ＷＮＶレプリコンまたはＹＦＶレプリコン（それぞれＡ６１２−Ａ６１３、ＷＮＶ０３８−ＷＮＶ０３９およびＹ０４６−Ｙ０４７）の効力アッセイ。ＢＨＫ細胞をＲＮＡでエレクトロポレートし、レプリコン特異的抗原の存在により効力を決定した（ｄｓＲＮＡ染色により検出されたＴＣ８３レプリコンの存在、抗ＷＮＶ  ＭＨＩＡＦにより検出されたＷＮＶの存在、抗ＹＦＶ  ＭＨＩＡＦにより検出されたＹＦＶの存在）。図２５Ｃ：Ｙ０４６、Ｙ０４７またはＡ６１２（ｓｃＦｖ−ｈＦｃを発現する対照）からのＲＮＡでエレクトロポレートしたＢＨＫ細胞からの細胞上清の抗ｈＦｃウエスタンブロット。ブロットは、ｓｃＦｖ−ｈＦｖがＹ０４６またはＹ０４７でエレクトロポレートした細胞中で発現されているおよび適切なサイズであるおよびこの細胞から分泌されていることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
第１の実施形態では、本発明は、（＋）鎖自己複製ＲＮＡをコードする配列を含む、単離された核酸であって、自己複製ＲＮＡが、フラビウイルスレプリカーゼコーディング配列と異種タンパク質コーディング配列とを含み、異種タンパク質コーディング配列が、少なくとも２つの隣接する分離配列の間に配置されており、自己複製ＲＮＡが、ウイルス粒子を形成することができるウイルス構造タンパク質のコーディング配列を欠いている、核酸を提供する。
【００１３】
「フラビウイルスレプリカーゼ」は、例えば転写機構、翻訳機構、または転写機構および翻訳機構を含む適切な発現系中でのウイルスＲＮＡ複製に必要な最小機構（例えばタンパク質因子および／またはヌクレオチド因子）を含む。代表的な発現系として宿主細胞が挙げられ、例えば昆虫宿主細胞または哺乳類宿主細胞が挙げられる。一部の実施形態では、フラビウイルスレプリカーゼは、天然に存在する配列、キメラ配列および合成誘導体等の、１種または複数のフラビウイルスのＮＳＰ（非構造タンパク質、ＮＳとも呼ばれる）３〜５（例えば、任意選択でＮＳ１、ＮＳ２（ＮＳ２Ａ、ＮＳ２ＢもしくはＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂの両方を含む）、またはＮＳ１およびＮＳ２を含む）を含む。
【００１４】
第２の実施形態では、本発明は第１の実施形態に係る核酸を提供し、フラビウイルスレプリカーゼは西ナイルウイルス（West Nile Virus）（ＷＮＶ）レプリカーゼである。
【００１５】
第３の実施形態では、本発明は第２の実施形態に係る核酸を提供し、ＷＮＶは、ＷＮＶ  ＮＹ９９、ＷＮ  ＮＹ  ２０００−ｃｒｏｗ３３５６、ＨＮＹ１９９９、ＮＹ９９ｆｌａｍｉｎｇｏ３８２９９、ＩＳ９８ＳＴＤ、ｇｏｏｓｅ−Ｈｕｎｇａｒｙ／０３、Ｉｔａｌｙ１９９８Ｅｑｕｉｎｅ、ＲＯ９７５０、ＶＬＧ４、ＬＥＩＶ−Ｖｌｇ９９−２７８８９、ＰａＨ００１、ＰａＡｎ００１、Ｅｇ１０１、Ｃｈｉｎ−０１、Ｓａｒａｆｅｎｄ、Ｂ９５６（ＷＮＦＣＧ）、ｇｏｓｈａｗｋ−Ｈｕｎｇａｒｙ／０４、ＬＥＩＶ−Ｋｒｎｄ８８−１９０、Ｎｅａ  Ｓａｎｔａ−Ｇｒｅｅｃｅ  ２０１０、Ｇｏｓｈａｗｋ−Ｈｕｎｇａｒｙ／０４、Ｇｒｅｅｃｅ／２０１２／Ｋａｖａｌａ．３９．１、Ｉｔａｌｙ／２０１３／Ｒｏｖｉｇｏ／３２．１、Ａｕｓｔｒｉａ／２００８−ｇｈから選択され、より特に、この株は、ＷＮＶ  ＮＹ９９、ＷＮ  ＮＹ  ２０００−ｃｒｏｗ３３５６またはＨＮＹ１９９９から選択される。
【００１６】
第４の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれかに係る核酸を提供し、レプリカーゼは、配列番号２に対して少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。一部のその他の実施形態では、フラビウイルスレプリカーゼは、例えば配列番号２または配列番号４で示されるＹＦＶ配列もしくはＷＮＶ配列に対して、またはＮＳ３〜５に対応し、もしくはより特に、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＳ２Ａ、ＮＳ２ＢもしくはＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂの両方を含む）、もしくはＮＳ１およびＮＳ２を更に含む、ＹＦＶ配列もしくはＷＮＶ配列の一部に対して、少なくとも約６０％（例えば約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９％もしくはより高い）相同である。フラビウイルスレプリカーゼに関する更なる配列がＮＣＢＩ参照受託番号ＡＢＵ５４８３８に記載されており、これにはウイルスポリタンパク質中の所定のＮＳＰの境界が記載されている。ＷＮＶ、ＹＦＶのその他の株由来のまたはその他のフラビウイルス（例えば群：アロア（Aroa）、デング熱（Dengue）、日本脳炎（Japanese encephalitis）（ＷＮＶを含む）、ココベラ（Kokobera）、ウンタヤ（Ntaya）、スポンドウェニ（Spondweni）、黄熱（Yellow fever）、エンテベ（Entebbe）、モディック（Modic）およびリオブラボー（Rio Bravo））由来の対応する配列を本発明で使用することができ、公的に入手可能な配列中のアノテーションによりおよび本明細書に記載されている参照配列との（例えばＢＬＡＳＴによる）アラインメントにより容易に同定することができる。更なる株を表Ａおよび表Ｂに記載する。更なる株がBakonyi et al. Emerg. Infect. Dis. 12(4):618-23 (Apr. 2006)、Hernandez-Triana et al. Front. Public Health 2:271. doi: 10.3389/fpubh.2014.00271、Wang, et al., J. of General Virology 78:1349-1352 (1997)、Wang et al. Virology 225: 274-281 (1996)に記載されており、これらはそれぞれ、その記載内容が参照により組み込まれる。
【００１７】
第５の実施形態では、本発明は第１の実施形態に係る核酸を提供し、フラビウイルスレプリカーゼは黄熱ウイルス（Yellow Fever Virus）（ＹＦＶ）レプリカーゼである。
【００１８】
第６の実施形態では、本発明は第５の実施形態に係る核酸を提供し、ＹＦＶは、１７Ｄワクチン株、Ａｓｉｂｉ株、Ｕｇａｎｄａ４８１、Ａｎｇｏｌａ７１、１７Ｄ−２０４、１７ＤＤ、１７Ｄ−２１３、Ｕｇａｎｄａ２０１０、８８／１９９９であり、より特に、この株は１７Ｄワクチン株またはＡｓｉｂｉ株である。
【００１９】
第７の実施形態では、本発明は第５または第６の実施形態に係る核酸を提供し、レプリカーゼは、配列番号４に対して少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。一部のその他の実施形態では、レプリカーゼは、配列番号４に対して少なくとも６０％の相同性（例えば約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９％またはより高い）を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
第８の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれか１つに係る核酸を提供し、分離配列はウイルスの２Ａ配列である。代表的な２Ａ配列を下記の表１に記載し、当業者により容易に同定することもできる。
【００２１】
第９の実施形態では、本発明は第８の実施形態に係る核酸を提供し、２つの隣接する分離配列は、口蹄疫ウイルスの２Ａ、ブタテッショウウイルスの２Ａまたはピコルナウイルスの２Ａから選択される。
【００２２】
第１０の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれか１つに係る核酸を提供し、少なくとも２つの隣接する分離配列は組換えを起こさない（do not recombine）。
【００２３】
第１１の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれか１つに係る核酸を提供し、自己複製ＲＮＡは、ウイルス単離体の天然の開始配列に対応する機能的５’ＵＴＲを保持する。機能的５’ＵＴＲは、適切な発現系の存在下でＲＮＡが自己複製するのに必要な最小配列を含む。ウイルス単離体の天然の開始配列は、天然に存在する５’ＵＴＲに対応しており、一部の実施形態では、５’ウイルスの配列の最初の約２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個もしくは７０個のヌクレオチドまたはより多くを含む。
【００２４】
第１２の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれか１つに係る核酸を提供し、自己複製ＲＮＡの合成は、Ｔ７、ＳＰＣ６、ＣＭＶまたはこれらのいずれかの機能的断片から選択されるプロモーターにより駆動される。ある特定のその他の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、Ｔ７、ＳＰＣ６、ＣＭＶまたは上述のいずれかの機能的断片から選択されるプロモーターに作動的に付随する（例えば、その発現が、このプロモーターにより駆動される）。
【００２５】
第１３の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれか１つに係る核酸を提供し、この核酸は、機能的３’ＵＴＲを産生するための、自己複製ＲＮＡの下流の配列を含む。
【００２６】
第１４の実施形態では、本発明は第１３の実施形態に係る核酸を提供し、機能的３’ＵＴＲを産生するための配列はリボザイムをコードする。リボザイムは、ＲＮＡを切断するＲＮＡ配列である。本発明で有用なリボザイムは、例えば機能的３’ＵＴＲ配列、即ち、ウイルスタンパク質により認識されるおよびウイルス形成に必要な環化配列のような配列を保持することにより、本発明により提供される自己複製ＲＮＡを切断して自己複製ＲＮＡの機能を保持する。一部の特定の実施形態では、本発明は、天然に存在する３’ＵＴＲの産生で有用なリボザイムをコードする核酸を提供する。
【００２７】
第１５の実施形態では、本発明は第１４の実施形態に係る核酸を提供し、リボザイムはデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムまたはその機能的変異体である。ＨＤＶリボザイムまたは本発明で有用なあらゆるその他のリボザイムの「機能的変異体」は、ヌクレオチド置換を含むが、例えば三次構造でヌクレオチドが塩基対を形成して三次塩基対形成を保つヌクレオチドの変異によっても機能性を保持する。
【００２８】
第１６の実施形態では、本発明は第１３の実施形態に係る核酸を提供し、下流の配列は例えばＢｓｐＱＩ部位等の制限酵素認識配列である。
【００２９】
第１７の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれか１つに係る核酸を提供し、この核酸は、配列番号１または配列番号３と少なくとも約６０、６５、６０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．９％同一な配列を含む。
【００３０】
第１８の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれか１つに係る核酸を提供し、この核酸はプラスミドであり、任意選択で、このプラスミドは低コピー数プラスミドである。代表的な低コピー数プラスミドとして、ｐ１５Ａ複製起点を含むプラスミド（例えば（ＮＥＢの）ｐＡＣＹＣ、ｐＡＣＮＲ（ＮＥＢのｐＡＣＹＣ１７７に由来する、Bredenbeek et al., J. Gen. Virol. 84: 1261-68 (2003)を参照されたい））、ＢＲ３２２複製起点を含むプラスミド（例えばＳＩＧＭＡのｐＢＲ３２２）、ＳＣ１０１複製起点を含むプラスミド（例えば（ＡＴＣＣの）ｐＳＣ１０１）および同類のものが挙げられる。
【００３１】
関連する態様では、本発明はまた、本発明により提供される核酸を含む宿主細胞も提供する。
【００３２】
そのため、第１９の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれか１つに係る核酸を含む宿主細胞を提供し、任意選択で、この宿主は、ＴｅｔｒＤ（ｍｃｒＡ）１８３  Ｄ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３  ｅｎｄＡ１  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ  Ｈｔｅ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑＺＤＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）Ａｍｙ  Ｃａｍｒ］（例えばＸＬ１０Ｇｏｌｄ（登録商標）ウルトラコンピテント）細胞またはＦ−、ｅｎｄＡ１、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｐｈｏＡ、Φ８０ｄ  ｌａｃＺΔ  Ｍ１５、Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）、ΔｍｃｒＡ、λ−（例えばＳＴＥＬＬＡＲ（登録商標））細胞から選択される。
【００３３】
別の関連する態様では、本発明は、例えば、本発明により提供される核酸のいずれかでコードされるまたは本発明により提供される任意の核酸から発現され得る（例えば転写され得る）自己複製ＲＮＡを提供する。第１２の実施形態では、本発明は、上述の実施形態のいずれか１つの核酸によりコードされる自己複製ＲＮＡを提供する。一部のその他の実施形態では、本発明は、フラビウイルスレプリカーゼをコードする配列と異種タンパク質コーディング配列とを含む自己複製ＲＮＡであって、異種タンパク質コーディング配列が、少なくとも２つの隣接する分離配列の間に配置されており、自己複製ＲＮＡが、ウイルス粒子を形成することができるウイルス構造タンパク質を欠いている、自己複製ＲＮＡを提供する。
【００３４】
第２１の実施形態では、本発明は、フラビウイルスレプリカーゼをコードする配列と異種タンパク質コーディング配列とを含む自己複製ＲＮＡであって、異種タンパク質コーディング配列が、少なくとも２つの隣接する分離配列の間に配置されており、自己複製ＲＮＡが、ウイルス粒子を形成することができるウイルス構造タンパク質を欠いている、自己複製ＲＮＡを提供する。
【００３５】
第２２の実施形態では、本発明は、上述の実施形態のいずれか１つに係る核酸を提供し、前記異種タンパク質コーディング配列は抗原タンパク質である。
【００３６】
第２３の実施形態では、本発明は第２２の実施形態に係る核酸を提供し、抗原タンパク質は、哺乳類対象に投与された場合に病原体に対する免疫応答を上昇させ、任意選択で、病原体は、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性またはがん性であり、任意選択で、より特に、抗原タンパク質は病原体の外表面上で発現される。
【００３７】
第２４の実施形態では、本発明は第１〜第２１の実施形態のいずれか１つに係る核酸を提供し、異種タンパク質コーディング配列は治療用タンパク質であり、任意選択で、この治療用タンパク質は、成長因子、サイトカイン、抗体または抗体の抗原結合断片から選択される。
【００３８】
第２５の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれか１つに係る核酸を提供し、この核酸は送達系と複合体化されており、任意選択で、この送達系は、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、カチオン性ナノエマルションまたは生分解性ポリマーから選択される。
【００３９】
第２６の実施形態では、本発明は上述の実施形態のいずれか１つの核酸を含む組成物を提供する。
【００４０】
第２７の実施形態では、本発明は、核酸が第２０の実施形態の核酸（the nucleic acid the twenty）である第２６の実施形態に係る組成物であって、アジュバントを更に含み、任意選択で、このアジュバントは金属塩である、組成物を提供する。
【００４１】
第２８の実施形態では、本発明は、第２６または第２７の実施形態に係る組成物であって、ＴＬＲアゴニストを更に含み、任意選択で、このＴＬＲアゴニストはＴＬＲ７アゴニストであり、更に任意選択で、このＴＬＲ７アゴニストはベンゾナフチリジン（benzonapthyridine）化合物である、組成物を提供する。
【００４２】
第２９の実施形態では、本発明は、目的のタンパク質または目的のタンパク質をコードする核酸を発現させる方法であって、上述の請求項のいずれか１つの核酸と、転写機構、翻訳機構、または転写機構および翻訳機構を含む発現系とを接触させる工程を含み、核酸の異種タンパク質コーディング配列が目的のタンパク質である、方法を提供する。
【００４３】
第３０の実施形態では、本発明は第２９の実施形態に係る方法を提供し、発現系は無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系であり、任意選択で、核酸は自己複製ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である。
【００４４】
第３１の実施形態では、本発明は第２９の実施形態に係る方法を提供し、発現系は翻訳系を含み、任意選択で、核酸は請求項１７または１８の自己複製ＲＮＡである。
【００４５】
第３２の実施形態では、本発明は第２９〜第３１の実施形態のいずれか１つに係る方法を提供し、発現系は真核細胞である。
【００４６】
第３３の実施形態では、本発明は第３２の実施形態に係る方法を提供し、真核細胞は昆虫細胞である。
【００４７】
第３４の実施形態では、本発明は第３２の実施形態に係る方法を提供し、真核細胞は哺乳類細胞である。
【００４８】
第３５の実施形態では、本発明は第３４の実施形態に係る方法を提供し、哺乳類細胞はＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である。
【００４９】
第３６の実施形態では、本発明は、哺乳類対象中で抗原タンパク質に対する免疫応答を上昇させる方法であって、第２２の実施形態の核酸を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００５０】
第３７の実施形態では、本発明は、哺乳類対象に治療用タンパク質を投与する方法であって、請求項２４の核酸を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００５１】
第３８の実施形態では、本発明は第３６または第３７の実施形態に係る方法を提供し、哺乳類対象はヒトである。
【００５２】
【表１】
2018513673.tif 000003
【００５３】
【表２】
2018513673.tif 000004
【００５４】
配列のアラインメントおよび比較に有用なプログラムとして、ＦＡＳＴＡ（Lipman and Pearson, Science, 227: 1435-41 (1985)およびLipman and Pearson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444-48）、ＢＬＡＳＴ（McGinnis & Madden, Nucleic Acids Res., 32:W20-W25 (2004)（特にＭｅｇａＢｌａｓｔを記載する最新のＢＬＡＳＴ参考文献）、Zhang et al., J. Comput. Biol., 7(1-2):203-14 (2000)（ＭｅｇａＢｌａｓｔで実行される「貪欲アルゴリズム（greedy algorithm）」を記載する）、Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)（最初のＢＬＡＳＴ論文））、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ（Needleman and Wunsch, J. Molec. Bio., 48 (3): 443-53(1970)）、Ｓｅｌｌｅｒｓ（Sellers, Bull. Math. Biol., 46:501-14 (1984)およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Smith and Waterman, J. Molec. Bio., 147: 195-197 (1981)）、ならびにその他のアルゴリズム（Gerhard et al., Genome Res., 14(10b):2121-27 (2004)に記載されているアルゴリズム等）が挙げられ、これらは参照により組み込まれる。
【００５５】
「転写機構」は、適切なＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列、ポリメラーゼ結合部位等の存在下でＲＮＡ転写物を生成することができる。転写機構として、全細胞、生物またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を挙げることができる。
【００５６】
「翻訳機構」は、適切なＲＮＡ配列、例えばリボソーム結合部位等の存在下でポリペプチドを生成することができる。翻訳機構として、全細胞、生物またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を挙げることができる。
【００５７】
「分離配列」は、２種以上のポリペプチドを形成する単一の転写物を促進する。代表的な分離配列として、ウイルスの２Ａ配列、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）、シグナル配列およびプロテアーゼ認識部位が挙げられる。代表的なウイルスの２Ａ配列（任意選択で、ＧＳＧリンカー等のリンカー配列を有する、または有しない）として、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｔ２Ａ（表１に記載されている）、ピコルナウイルス、またはSzymczak-Workman et al. Cold Spring Harbor Protoc, 2012(2): 199-204 (2012)に記載されている配列が挙げられ、この文献は参照により組み込まれる。代表的なＩＲＥＳ配列を表２に示す。
【００５８】
「ウイルス粒子を形成することができるウイルス構造タンパク質を欠いている」自己複製ＲＮＡは、相補的なヘルパー配列の非存在下では、成熟ウイルス粒子を形成することができない（例えば結晶構造または電子顕微鏡法等の様々な技術で評価した場合に、例えば全カプシドタンパク質コーディング配列を欠いている場合がある）。しかしながら、本明細書で使用する場合、「ウイルス粒子を形成することができるウイルス構造タンパク質を欠いている」自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡを複製するのに必要なエレメント（例えば環化配列およびシグナル配列）を保持することができる。代表的な環化配列およびシグナル配列を表３および表４に記載しており、Khromykh et al., J. Virol. 75: 6719-28 (2001)およびHahn et al., J. Mol. Biol. 198: 33-41 (1987)で更に記載されており、これらは両方とも参照により組み込まれる。例えば、ＷＮＶの場合、タンパク質ＣのＮ末端コーディング領域（参照受託番号ＥＦ５３００４７に関してｎｔ．９７〜１８９）；対応するＲＮＡ配列は必須のシス作用エレメントであり、マイナスセンスＲＮＡ合成の制御において役割を果たす場合がある。Ｅタンパク質のＣ末端コーディング配列（参照受託番号ＥＦ５３００４７に関してｎｔ．２３８０〜２４６９）は維持された。なぜならば、この領域は、非構造タンパク質１（ＮＳ１）の移行およびプロセシングを導いた後に残りの非構造タンパク質ＮＳ２〜ＮＳ５の翻訳およびプロセシングを導くシグナル配列として作用するからである。これらの欠失により、ＷＮＶは非感染性になるが複製能力を有する。ＹＦＶレプリコン等のその他のフラビウイルスレプリコンでも同様の欠失を実施することができる。
【００５９】
異種タンパク質コーディング配列
第３９の実施形態では、本発明は（例えば、哺乳類対象等の宿主への）投与方法を提供し、この投与方法によって、自己複製ＲＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳され、異種タンパク質コーディング配列が発現され、例えば、レシピエント中での異種タンパク質コーディング配列に対する免疫応答を誘発することができ、または治療効果をもたらすことができ、異種タンパク質コーディング配列は治療用タンパク質である。
【００６０】
免疫原性タンパク質
第４０の実施形態では、本発明は上述の態様および実施形態のいずれかの異種タンパク質コーディング配列を提供し、この異種タンパク質コーディング配列は抗原タンパク質または免疫原であり、これらの用語を互換的に使用することができる。
【００６１】
第４１の実施形態では、第４０の実施形態の抗原タンパク質は、哺乳類対象に投与された場合に病原体に対する免疫応答を上昇させ、任意選択で、この病原体は、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性またはがん性である。一部のより具体的な実施形態では抗原タンパク質は病原体の外表面上で発現されるが、その他のより特定の実施形態では抗原は非表面抗原であり得、例えばＴ細胞エピトープとして有用であり得る。免疫原は、病原体（例えば細菌、ウイルス、真菌または寄生虫）に対する免疫応答を誘発することができるが、一部のその他の実施形態では、アレルゲンまたは腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発する。免疫応答は、抗体応答（通常はＩｇＧを含む）および／または細胞により媒介される免疫応答を含むことができる。ポリペプチド免疫原は、典型的には、対応する病原体（またはアレルゲンもしくは腫瘍）ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発することができるが、一部の実施形態では、このポリペプチドはミモトープとして作用して、糖類を認識する免疫応答を誘発することができる。免疫原は、典型的には表面ポリペプチドであってよく、例えばアドヘシン、赤血球凝集素、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質等であってよい。
【００６２】
ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド免疫原または複数のポリペプチドをコードすることができる。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原（融合ポリペプチド）としてまたは別々のポリペプチドとして提示され得る。免疫原がレプリコンとは別のポリペプチドとして発現される場合、これらの内の１種または複数は、上流のＩＲＥＳまたは追加のウイルスプロモーターエレメントと一緒に生成され得る。或いは、複数の免疫原は、短い自己触媒性プロテアーゼ（例えば口蹄疫ウイルスの２Ａタンパク質）に融合した個々の免疫原をコードするポリタンパク質からまたはインテインとして発現され得る。
【００６３】
第４２の実施形態では、第４０または第４１の実施形態のポリペプチド免疫原（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種またはより多くの免疫原）を、単独でまたは１種もしくは複数の免疫原（ポリペプチド免疫原と同じまたは異なる）をコードするＲＮＡ分子（例えば自己複製ＲＮＡ）と一緒に使用することができる。
【００６４】
第４３の実施形態では、第４０、第４１または第４２の実施形態の免疫原は、下記の細菌の内の１種に対する免疫応答を誘発する：
【００６５】
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）：膜タンパク質、例えばアドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質および因子Ｈ結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない有用な免疫原。３種の有用なポリペプチドの組合せがGiuliani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(29):10834-9 (2006)で開示されている。
【００６６】
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）：有用なポリペプチド免疫原が国際公開第２００９／０１６５１５号パンフレットで開示されている。これらとして、ＲｒｇＢ線毛サブユニット、ベータ−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、一般的なストレスタンパク質（General stress protein）ＧＳＰ−７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／スレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）および肺炎球菌の表面アドヘシンＰｓａＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）：有用な免疫原として、国際公開第０２／３４７７１号パンフレットおよび国際公開第２００５／０３２５８２号パンフレットで開示されているポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）。
【００６９】
百日咳菌（Bordetella pertussis）：有用な百日咳免疫原として、百日咳毒素または百日咳トキソイド（ＰＴ）、線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、パータクチンならびに凝集原２および凝集原３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）：有用な免疫原として、国際公開第２０１０／１１９３４３号パンフレットで開示されているポリペプチド、例えば溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、フェリクロム結合タンパク質（ferrichrome-binding protein）（ｓｔａ００６）および／またはｓｔａ０１１リポタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
破傷風菌（Clostridium tetani）：典型的な免疫原は破傷風トキソイドである。
【００７２】
コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Cornynebacterium diphtheriae）：典型的な免疫原はジフテリアトキソイドである。
【００７３】
インフルエンザエ菌（Haemophilus influenzae）：有用な免疫原として、国際公開第２００６／１１０４１３号パンフレットおよび国際公開第２００５／１１１０６６号パンフレットで開示されているポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）
【００７５】
ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）：有用な免疫原として、国際公開第０２／３４７７１号パンフレットで開示されているポリペプチドが挙げられるがこれに限定されない。
【００７６】
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）：有用な免疫原として、ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡおよびＭｕｒＧ（例えば国際公開第２００５／００２６１９号パンフレットで開示されている）が挙げられるが、これらに限定されない。ＬｃｒＥ（国際公開第２００６／１３８００４号パンフレット）およびＨｔｒＡ（国際公開第２００９／１０９８６０号パンフレット）が２種の好ましい免疫原である。
【００７７】
クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）：有用な免疫原として、国際公開第０２／０２６０６号パンフレットで開示されているポリペプチドが挙げられるがこれに限定されない。
【００７８】
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）：有用な免疫原として、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰおよび／またはウレアーゼ（国際公開第０３／０１８０５４号パンフレット）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
大腸菌（Escherichia coli）：有用な免疫原として、腸内毒素原性大腸菌（E.coli）（ＥＴＥＣ）に由来する免疫原、腸管凝集性大腸菌（E.coli）（ＥＡｇｇＥＣ）に由来する免疫原、分散接着性大腸菌（diffusely adhering E.coli）（ＤＡＥＣ）に由来する免疫原、腸管病原性大腸菌（E.coli）（ＥＰＥＣ）に由来する免疫原、腸管外病原性大腸菌（extraintestinal pathogenic E.coli）（ＥｘＰＥＣ）に由来する免疫原および／または腸管出血性大腸菌（E.coli）（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ＥｘＰＥＣ株として、尿路病原性大腸菌（E.coli）（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症に関連する大腸菌（E.coli）（ＭＮＥＣ）が挙げられる。有用なＵＰＥＣ免疫原が国際公開第２００６／０９１５１７号パンフレット（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）および国際公開第２００８／０２０３３０号パンフレット（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ）で開示されている。有用なＭＮＥＣ免疫原が国際公開第２００６／０８９２６４号パンフレット（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）で開示されている。いくつかの大腸菌（E.coli）型の有用な免疫原はＡｃｆＤである。国際公開第２００９／１０４０９２号パンフレット（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ）を参照されたい。
【００８０】
炭疽菌（Bacillus anthracis）
【００８１】
エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）：有用な免疫原として、国際公開第２００７／０４９１５５号パンフレットおよび国際公開第２００９／０３１０４３号パンフレットで開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
スタフィロコッカス・エピデルミス（Staphylococcus epidermis）
【００８３】
クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）またはクロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinums）
【００８４】
レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）
【００８５】
コクシエラ・ブルネッティ（Coxiella burnetii）
【００８６】
ブルセラ（Brucella）、例えば、Ｂ．アボルタス（B.abortus）、Ｂ．カニス（B.canis）、Ｂ．メリテンシス（B.melitensis）、Ｂ．ネオトマエ（B.neotomae）、Ｂ．オビス（B.ovis）、Ｂ．スイス（B.suis）、Ｂ．ピニペディアエ（B.pinnipediae）。
【００８７】
フランシセラ（Francisella）例えば、Ｆ．ノビシダ（F.novicida）、Ｆ．フィロミラジア（F.philomiragia）、Ｆ．ツラレンシス（F.tularensis）。
【００８８】
淋菌（Neisseria gonorrhoeae）
【００８９】
梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）
【００９０】
軟性下疳菌（Haemophilus ducreyi）
【００９１】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）
【００９２】
スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）
【００９３】
エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）
【００９４】
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）
【００９５】
リケッチア（Rickettsia）
【００９６】
リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
【００９７】
コレラ菌（Vibrio cholerae）
【００９８】
チフス菌（Salmonella typhi）
【００９９】
ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）
【０１００】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）
【０１０１】
クレブシエラ（Klebsiella）
【０１０２】
第４４の実施形態では、免疫原は、下記のウイルスの内の１種に対する免疫応答を誘発する：
【０１０３】
オルソミクソウイルス（Orthomyxovirus）：有用な免疫原は、インフルエンザＡウイルス、ＢウイルスまたはＣウイルスに由来することができ、例えば赤血球凝集素、ノイラミニダーゼまたはマトリックスＭ２タンパク質であってよい。免疫原がインフルエンザＡウイルスの赤血球凝集素である場合、この免疫原は任意のサブタイプ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６由来であってよい。
【０１０４】
パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）ウイルス：免疫原として、ニューモウイルス（Pneumovirus）（例えば呼吸器合抱体ウイルス、ＲＳＶ）に由来するもの、ルブラウイルス（Rubulavirus）（例えばムンプスウイルス）に由来するもの、パラミクソウイルス（Paramyxovirus）（例えばパラインフルエンザウイルス）に由来するもの、メタニューモウイルス（Metapneumovirus）に由来するものおよびモルビリウイルス（Morbillivirus）（例えば麻疹ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
ポックスウイルス科（Poxviridae）：免疫原として、オルソポックスウイルス（Orthopoxvirus）、例えば、大痘瘡（Variola major）および小痘瘡（Variola minor）が挙げられるが、これらに限定されない真正痘瘡（Variola vera）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
ピコルナウイルス（Picornavirus）：免疫原としてピコルナウイルス（Picornavirus）に由来するものが挙げられ、例えばエンテロウイルス（Enterovirus）に由来するもの、ライノウイルス（Rhinovirus）に由来するもの、ヘパルナウイルス（Heparnavirus）に由来するもの、カルジオウイルス（Cardiovirus）に由来するものおよびアフトウイルス（Aphthovirus）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、このエンテロウイルスはポリオウイルスであり、例えば１型ポリオウイルス、２型ポリオウイルスおよび／または３型ポリオウイルスである。別の実施形態では、このエンテロウイルスはＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態では、このエンテロウイルスはコクサッキーＡウイルスまたはコクサッキーＢウイルスである。
【０１０７】
ブニヤウイルス（Bunyavirus）：免疫原として、オルソブニヤウイルス（Orthobunyavirus）、例えばカリフォルニア脳炎（California encephalitis）ウイルス）に由来するもの、フレボウイルス（Phlebovirus）（例えばリフトバレー熱（Rift Valley Fever）ウイルス）に由来するものまたはナイロウイルス（Nairovirus）（例えばクリミア・コンゴ出血熱（Crimean-Congo hemorrhagic fever）ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定さない。
【０１０８】
ヘパルナウイルス（Heparnavirus）：免疫原として、ヘパルナウイルス（Heparnavirus）、例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
フィロウイルス（Filovirus）：免疫原として、フィロウイルス（filovirus）に由来するもの、例えばエボラ（Ebola）ウイルス、例えばザイールエボラウイルス（Zaire ebolavirus）、アイボリーコーストエボラウイルス（Ivory Coast ebolavirus）、レストンエボラウイルス（Reston ebolavirus）もしくはスーダンエボラウイルス（Sudan ebolavirus）またはマールブルグ（Marburg）ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
トガウイルス（Togavirus）：免疫原として、トガウイルス（Togavirus）、例えばルビウイルス（Rubivirus）、アルファウイルス（Alphavirus）またはアルテリウイルス（Arterivirus）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これには風疹ウイルス（rubella virus）が含まれる。
【０１１１】
フラビウイルス（Flavivirus）：免疫原として、フラビウイルス（Flavivirus）、例えばダニ媒介脳炎（Tick-borne encephalitis）（ＴＢＥ）ウイルス、デング（Dengue）（１型、２型、３型または４型）ウイルス、黄熱（Yellow fever）ウイルス、日本脳炎（Japanese encephalitis）ウイルス、キャサヌール森林（Kyasanur Forest）ウイルス、西ナイル脳炎（West Nile encephalitis）ウイルス、セントルイス脳炎（St. Louis encephalitis）ウイルス、ロシア春夏脳炎（Russian spring-summer encephalitis）ウイルス、ポワッサン脳炎（Powassan encephalitis）ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
ペスチウイルス（Pestivirus）：免疫原として、ペスチウイルス（Pestivirus）、例えば牛ウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）またはボーダー病（ＢＶＤ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
ヘパドナウイルス（Hepadnavirus）：免疫原として、ヘパドナウイルス（Hepadnavirus）、例えばＢ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含むことができる。
【０１１４】
その他の肝炎ウイルス：組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスまたはＧ型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含むことができる。
【０１１５】
ラブドウイルス（Rhabdovirus）：免疫原として、ラブドウイルス（Rhabdovirus）、例えばリッサウイルス（Lyssavirus）、例えば狂犬病ウイルス（Rabies virus）およびベジクロウイルス（Vesiculovirus）（ＶＳＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
カリシウイルス科（Caliciviridae）：免疫原として、カリシウイルス科（Calciviridae）、例えばノーウォーク（Norwalk）ウイルス（ノロウイルス（Norovirus））ならびにノーウォーク（Norwalk）様ウイルス、例えばハワイ（Hawaii）ウイルスおよびスノーマウンテン（Snow Mountain）ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
コロナウイルス：免疫原として、ＳＡＲＡＳコロナウイルス、鶏感染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＥＧＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。このコロナウイルス免疫原はスパイクポリペプチドであってよい。
【０１１８】
レトロウイルス：免疫原として、オンコウイルス（Oncovirus）、レンチウイルス（Lentivirus）（例えばＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２）またはスプーマウイルス（Spumavirus）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
レオウイルス（Reovirus）：免疫原として、オルトレオウイルス（Orthoreovirus）、ロタウイルス（Rotavirus）、オルビウイルス（Orbivirus）またはコルチウイルス（Coltivirus）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
パルボウイルス（Parvovirus）：免疫原としてパルボウイルスＢ１９（Parvovirus B19）に由来するものが挙げられるが、これに限定されない。
【０１２１】
ヘルペスウイルス（Herpesvirus）：免疫原としてヒトヘルペスウイルス、例えば、単なる例として単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex Virus）（ＨＳＶ）（例えばＨＳＶ１型およびＨＳＶ２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（Varicella-zoster virus）（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（Epstein-Barr virus）（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス（Human Herpesvirus 6）（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（Human Herpesvirus 7）（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペスウイルス８（Human Herpesvirus 8）（ＨＨＶ８）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
パポーバウイルス（Papovavirus）：免疫原として、パピローマウイルス（Papillomavirus）およびポリオーマウイルス（Polyomavirus）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３または６５であってよく、例えば血清型６、１１、１６および／または１８の内の１種または複数であってよい。
【０１２３】
アデノウイルス（Adenovirus）：免疫原として血清型３６（Ａｄ−３６）に由来するものが挙げられる。
【０１２４】
一部の実施形態では、免疫原は、魚、例えば：伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（salmon pancreatic disease virus）（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（fish lymphocystis disease virus）（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（タイセイヨウサケのピコルナ様ウイルとしても公知である）、陸封型サケウイルス（landlocked salmon virus）（ＬＳＶ）、タイセイヨウサケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（trout strawberry disease virus）（ＴＳＤ）、ギンザケ腫瘍ウイルス（coho salmon tumor virus）（ＣＳＴＶ）またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）に感染するウイルスに対する免疫応答を誘発する。
【０１２５】
真菌免疫原は皮膚糸状菌（Dermatophytres）に由来することができ、例えばエピデルモフィトン・フロッコースム（Epidermophyton floccusum）、ミクロスポルム・オーズアニー（Microsporum audouini）、ミクロスポルム・カニス（Microsporum canis）、ミクロスポルム・ジストルツム（Microsporum distortum）、ミクロスポルム・エクイヌム（Microsporum equinum）、ミクロスポルム・ギプセウム（Microsporum gypsum）、ミクロスポルム・ナヌム（Microsporum nanum）、トリコフィトン・コンセントリクム（Trichophyton concentricum）、トリコフィトン・エクイヌム（Trichophyton equinum）、トリコフィトン・ガリネ（Trichophyton gallinae）、トリコフィトン・ジプセウム（Trichophyton gypseum）、トリコフィトン・メグニニ（Trichophyton megnini）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）、トリコフィトン・キンケアヌム（Trichophyton quinckeanum）、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン・シェーンレイニ（Trichophyton schoenleini）、トリコフィトン・トンスランス（Trichophyton tonsurans）、トリコフィトン・ベルコスム（Trichophyton verrucosum）、Ｔ．ベルコスム・アルブム変種（T. verrucosum var. album）、ジスコイデス変種（var. discoides）、オクラセイム変種（var. ochraceum）、トリコフィトン・ビオラセウム（Trichophyton violaceum）および／もしくはトリコフィトン・ファビホルメ（Trichophyton faviforme）;またはアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowi）、アスペルギルス・フラバタス（Aspergillus flavatus）、アスペルギルス・グラウクス（Aspergillus glaucus）、ブラストシゾミセス・カピタツス（Blastoschizomyces capitatus）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・エノラーゼ（Candida enolase）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・ステラトイデア（Candida stellatoidea）、カンジダ・クセイ（Candida kusei）、カンジダ・パラクエセイ（Candida parakwsei）、カンジダ・ルシタニエ（Candida lusitaniae）、カンジダ・シュードトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、カンジダ・ギリエルモンディ（Candida guilliermondi）、クラドスポリム・カリオニイ（Cladosporium carrionii）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatidis）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ゲオトリクム・クラバタム（Geotrichum clavatum）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、微胞子虫門（Microsporidia）、エンセファリトゾーン属（Encephalitozoon）種、セプタタ・インテスティナリス（Septata intestinalis）およびエンテロシトゾーン・ビエヌーシ（Enterocytozoon bieneusi）に由来することができ、あまり一般的でないのは、ブラキオラ（Brachiola）種、ミクロスポリジウム属（Microsporidium）種、ノゼマ属（Nosema）種、プレイストフォラ属（Pleistophora）種、トラキプレイストフォラ（Trachipleistophora）種��ビタフォルマ（Vittaforma）種パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、ピシウムン・インシジオスム（Pythiumn insidiosum）、ピチロスポルム・オバーレ（Pityrosporum ovale）、出芽酵母（Sacharomyces cerevisae）、サッカロミセス・ブラウディ（Saccharomyces boulardii）、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、スケドスポリウム・アピオスペルム（Scedosporium apiosperum）、スポロトリクス・シェンキィ（Sporothrix schenckii）、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffei）、マラセジア属（Malassezia）種、フォンセセア属（Fonsecaea）種、ワンギエラ属（Wangiella）種、スポロトリクス属（Sporothrix）種、バシジオボラス属（Basidiobolus）種、コニディオボラス属（Conidiobolus）種、クモノスカビ属（Rhizopus）種、ムコール属（Mucor）種、アブシディア属（Absidia）種、モルチエレラ属（Mortierella）種、クニンガメラ属（Cunninghamella）種、サクセネア（Saksenaea）種、アルテルナリア属（Alternaria）種、クルブラリア属（Curvularia）種、ヘルミントスポリウム属（Helminthosporium）種、フサリウム属（Fusarium）種、アスペルギルス属（Aspergillus）種、ペニシリウム属（Penicillium）種、アモノリニア（Monolinia）種、リゾクトニア属（Rhizoctonia）種、ペシロミセス属（Paecilomyces）種、ピトミケス（Pithomyces）種およびクラドスポリウム属（Cladosporium）種である。
【０１２６】
第４５の実施形態では、免疫原は、プラスモジウム（Plasmodium）属の寄生虫、例えば熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）または卵形マラリア原虫（P. ovale）に対する免疫応答を誘発する。そのため、本発明は、マラリアに対して免疫付与するために使用され得る。一部の実施形態では、免疫原は、ウオジラミ（Caligidae）科の寄生虫、特にレペオフィティルス（Lepeophtheirus）属およびカリグス（Caligus）属の寄生虫、例えばレペオフィティルス・サルモニス（Lepeophtheirus salmonis）またはカリグス・ロゲルクレッセイイ（Caligus rogercresseyi）等のシーライス（sea lice）に対する免疫応答を誘発する。
【０１２７】
第４６の実施形態では、免疫原は、花粉アレルゲン（樹木、ハーブ、草およびイネ科の草の花粉アレルゲン）、昆虫アレルゲンまたはクモアレルゲン（吸入性アレルゲン、唾液アレルゲンおよび毒液アレルゲン、例えばダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよびユスリカアレルゲン、ハチ毒アレルゲン）、（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス等からの）動物の毛アレルゲンおよびフケアレルゲン、ならびに食物アレルゲン（例えばグリアジン）に対する免疫応答を誘発する。樹木、イネ科の草およびハーブからの重要な花粉アレルゲンは、ブナ目（Fagales）、モクセイ目（Oleales）、マツ目（Pinales）およびスズカケノキ科（platanaceae）の分類学上の目に由来し、この分類学上の目には、カバノキ（カバノキ属（Betula））、ハンノキ（ハンノキ属（Alnus））、ハシバミ（ハシバミ属（Corylus））、シデ（クマシデ（Carpinus））およびオリーブ（オリーブ属（Olea））、ヒマラヤスギ（スギ属（Cryptomeria）およびビャクシン属（Juniperus））、スズカケノキ（プラタナス（Platanus））、イネ目（Poales）の序列、例えばドクムギ（Lolium）属、アワガエリ（Phleum）属、イチゴツナギ（Poa）属、ギョウギシバ（Cynodon）属、カモガヤ（Dactylis）属、シラゲガヤ（Holcus）属、クサヨシ（Phalaris）属、ライムギ（Secale）属およびモロコシ（Sorghum）属の草、キク目（Asterales）およびイラクサ目（Urticales）の序列、例えばブタクサ（Ambrosia）属、ヨモギ（Artemisia）属およびヒカゲミズ（Parietaria）属のハーブが含まれるが、これらに限定されない。その他の重要な吸入性アレルゲンは、ヒョウヒダニ（Dermatophagoides）属およびユーログリファス（Euroglyphus）属のチリダニ、貯蔵庫ダニ（storage mite）、例えばレピドグリフィス（Lepidoglyphys）、ニクダニ属（Glycyphagus）およびチロファグス属（Tyrophagus）に由来するもの、ゴキブリ、ユスリカおよびノミ、例えばチャバネゴキブリ属（Blatella）、ワモンゴキブリ属（Periplaneta）、ユスリカ属（Chironomus）およびイヌノミ属（Ctenocepphalides）に由来するもの、ならびに哺乳類、例えばネコ、イヌおよびウマに由来するもの、毒液アレルゲン、例えば針で刺すまたはかみつく昆虫、例えばミツバチ（ミツバチ科（Apidae））、スズメバチ（スズメバチ科（Vespidea））およびアリ（アリ科（Formicoidae））等のハチ目（Hymenoptera）の分類学上の目に由来するものである。
【０１２８】
第４７の実施形態では、免疫原は：（ａ）がん精巣抗原、例えばＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１、ならびにＲＡＧＥファミリー、ＢＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリーおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド、例えばＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６およびＭＡＧＥ−１２（これらを、例えばメラノーマ、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸および膀胱の腫瘍に対処するために使用することができる）；（ｂ）変異抗原、例えばｐ５３（様々な固形腫瘍、例えば大腸、肺、頭頸部がんと関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えばメラノーマ、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連する）、ＣＤＫ４（例えばメラノーマと関連する）、ＭＵＭ１（例えばメラノーマと関連する）、カスパーゼ８（例えば頭頸部がんと関連する）、ＣＩＡ０２０５（例えば膀胱がんと関連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、ベータカテニン（例えばメラノーマと関連する）、ＴＣＲ（例えばＴ細胞非ホジキンリンパ腫と関連する）、ＢＣＲ−ａｂ１（例えば慢性骨髄性白血病と関連する）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ０２０５、ＣＤＣ−２７およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現抗原、例えばガレクチン４（例えば結腸直腸がんと関連する）、ガレクチン９（例えばホジキン病と関連する）、プロテイナーゼ３（例えば慢性の骨髄性白血病と関連する）、ＷＴ１（例えば様々な白血病と関連する）、炭酸脱水酵素（例えば腎がんと関連する）、アルドラーゼＡ（例えば肺がんと関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えばメラノーマと関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連する）、マンマグロビン、アルファ−フェトプロテイン（例えば肝癌と関連する）、ＫＳＡ（例えば結腸直腸がんと関連する）、ガストリン（例えば膵臓がんおよび胃がんと関連する）、テロメラーゼ触媒性タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば乳がんおよび卵巣がんと関連する）、Ｇ−２５０（例えば腎細胞癌と関連する）、ｐ５３（例えば乳がん、結腸がんと関連する）ならびに癌胎児抗原（例えば乳がん、肺がん、および結腸直腸がん等の消化管のがんと関連する）；（ｄ）共通抗原、例えばメラノーマ−メラニン形成細胞分化抗原、例えばＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えばメラノーマと関連する）；（ｅ）前立腺関連抗原、例えばＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２、例えば前立腺がんと関連する；（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫と関連する）から選択される腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原として、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、例えばＥ６およびＥ７、Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス抗原、ＴＳＰ−���８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１  Ｔｇｐ７２、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３（ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳおよび同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
治療用タンパク質
第４８の実施形態では、上述の態様および実施形態のいずれかの異種タンパク質コーディング配列は治療用タンパク質であり、任意選択で、この治療用タンパク質は、成長因子、サイトカイン、抗体または抗体の抗原結合断片から選択される。
【０１３０】
「抗体」は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリンまたはその一部を意味しており、供給源、起源の種、作製方法および特徴にかかわらず、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドを包含する。非限定的な例として、用語「抗体」には、ヒト抗体、オランウータン抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヤギ抗体、ヒツジ抗体およびニワトリ抗体が含まれる。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体およびＣＤＲ−グラフト化抗体が含まれるが、これらに限定されない。本発明の目的のために、この用語には、特に明記しない限り、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＶＨＨ（ナノボディとも称される）、および抗原結合機能を保持するその他の抗体断片も含まれる。下記で更に記載するように、抗体は、免疫グロブリンをベースとしない抗原結合分子も意味する。
【０１３１】
抗体を、例えば伝統的なハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, Nature 256: 495-499 (1975)）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、または抗体ライブラリを使用するファージディスプレイ技術（Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)、Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)）により作製することができる。様々なその他の抗体作製技術に関して、Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい。
【０１３２】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗体分子において抗原の一部または全てに特異的に結合する領域またはこれらに相補的な領域を含む部分を意味する。抗原が大きい場合、抗体が抗原の特定の部分にのみ結合する場合がある。「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗原分子において抗体の抗原結合ドメインとの特異的相互作用の原因となる一部である。抗原結合ドメインは、１つまたは複数の抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインからなるいわゆるＦｄ抗体断片）により提供され得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むことができる。ラクダおよびラマ（ラクダ科、ラクダ科動物）由来の抗体として独特な種類の抗体が挙げられ、この抗体は、重鎖のみによって形成されていて軽鎖を欠いている。そのような抗体の抗原結合部位は１つの単一ドメインであり、ＶＨＨと称される。これらは「ラクダ化抗体」または「ナノボディ」と呼ばれている。例えば、米国特許第５，８００，９８８号明細書および米国特許第６，００５，０７９号明細書ならびに国際出願公開である国際公開第９４／０４６７８号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５９１号パンフレットを参照されたく、これらは参照により組み込まれる。一部の実施形態では、「抗体」として、免疫グロブリン以外の足場をベースとする抗原結合分子が挙げられる。例えば、当技術分野で公知の非免疫グロブリン足場として、小モジュラー免疫医薬（例えば、それぞれ２００８年７月３１日および２００８年９月１８日に公開された米国特許出願公開第２００８０１８１８９２号明細書および米国特許出願公開第２００８０２２７９５８号明細書を参照されたい）、テトラネクチン、フィブロネクチンドメイン（例えばＡｄＮｅｃｔｉｎ、例えば、２００７年４月１２日に公開された米国特許出願公開第２００７／００８２３６５号明細書を参照されたい）、プロテインＡ、リポカリン（例えば米国特許第７，１１８，９１５号明細書を参照されたい）、アンキリン反復ならびにチオレドキシンが挙げられる。非免疫グロブリン足場をベースとする分子は概して、高親和性結合配列を同定するために、ファージディスプレイ（例えばHoogenboom, Method Mol. Biol. 178:1-37 (2002)を参照されたい）、リボソームディスプレイ（例えばHanes et al., FEBS Lett. 450:105-110 (1999)およびHe and Taussig, J. Immunol. Methods 297:73-82 (2005)を参照されたい）または当技術分野で公知のその他の技術（Binz et al., Nat. Biotech. 23:1257-68 (2005)、Rothe et al., FASEB J. 20:1599-1610 (2006)ならびに米国特許第７，２７０，９５０号明細書、米国特許第６，５１８，０１８号明細書および米国特許第６，２８１，３４４号明細書も参照されたい）によるライブラリのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択により製造される。
【０１３３】
送達系
本発明により提供される核酸を任意の適切な手段で送達することができる。この核酸を、裸で、水溶液（例えば緩衝液）で、またはアジュバント送達系等の送達系により送達することができる。従って、別の態様では、本発明により提供される核酸を送達系と複合体化することができる。代表的な送達系として、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、カチオン性ナノエマルション（ＣＮＥ）または生分解性ポリマーが挙げられる。本発明により提供される核酸に有用な送達系は、特にＣＮＥに関して、公開されている国際特許出願である国際公開第２０１２／００６３８０号パンフレット、国際公開第２０１３／００６８３７号パンフレット、国際公開第２０１３／００６８３４号パンフレットに記載されている。ＬＮＰに関しては、国際公開第２０１２／００６３７８号パンフレット、国際公開第２０１２／０３０９０１号パンフレット、国際公開第２０１２／０３１０４６号パンフレット、国際公開第２０１２／０３１０４３号パンフレット、国際公開第２０１３／０３３５６３号パンフレット、国際公開第２０１３／００６８２５号パンフレット、国際公開第２０１１／０７６８０７号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ）および国際公開第２０１５／０９５３４６号パンフレット（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ）を参照されたい。その他の様式に関しては、国際公開第２０１２／００６３５９号パンフレットまたは国際公開第２０１２／００６３７６号パンフレットを参照されたい。上述の出願は全て参照により組み込まれる。
【０１３４】
組成物
別の態様では、本発明は、例えば対象（例えばヒト対象）への投与に適した、本発明により提供される任意の核酸を含む組成物（例えば医薬組成物）を提供する。そのような医薬組成物は、当業者に公知の適切な添加剤を含むことができる。一部の実施形態では、この核酸は本発明により提供される自己複製ＲＮＡである。一部のより具体的な実施形態では、この組成物は金属塩等のアジュバントを更に含む。
【０１３５】
第４９の実施形態では、本発明により提供される組成物のいずれかはＴＬＲアゴニストを更に含むことができ、例えばベンゾナフチリジン化合物等のＴＬＲ７アゴニストを更に含むことができる。ＴＬＲアゴニストおよびこのＴＬＲアゴニストを含む製剤は当技術分野で公知であり、特に国際公開第２００９／１１１３３７号パンフレット、国際公開第２０１１／０４９６７７号パンフレット、国際公開第２０１１／０２７２２２号パンフレット、国際公開第２０１１／０８４５４９号パンフレット、国際公開第２０１２／０３１１４０号パンフレット、国際公開第２０１３／１３１９８５号パンフレット、国際公開第２０１２／１０３４２１号パンフレットに記載されており、これらは参照により完全に組み込まれる。
【０１３６】
使用方法
別の態様では、本発明は、目的のタンパク質または目的のタンパク質をコードする核酸を発現させる方法を提供する。この方法は、本発明により提供される核酸と、転写機構、翻訳機構、または転写機構および翻訳機構を含む発現系とを接触させるステップを含み、この核酸の異種タンパク質コーディング配列は目的のタンパク質である。一部の実施形態では、この発現系は無細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系であり、任意選択で、核酸は自己複製ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である。その他の実施形態では、この発現系は翻訳系を含み、例えば、本発明により提供される核酸は本発明により提供される自己複製ＲＮＡである。
【０１３７】
第５０の実施形態では、この発現系は真核細胞である。より具体的な実施形態では、この真核細胞は昆虫細胞である。その他の具体的な実施形態では、この真核細胞は哺乳類細胞であり、例えばＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である。
【０１３８】
別の態様では、本発明は、哺乳類対象中で抗原タンパク質に対する免疫応答を上昇させる方法であって、本発明により提供される自己複製ＲＮＡを対象に投与することを含み、自己複製ＲＮＡが免疫原をコードする、方法を提供する。
【０１３９】
更に別の態様では、本発明は、哺乳類対象に治療用タンパク質を投与する方法であって、本発明により提供される自己複製ＲＮＡを対象に投与することを含み、自己複製ＲＮＡが治療用タンパク質をコードする、方法を提供する。
【０１４０】
本発明により提供される方法のある特定の具体的な実施形態では、哺乳類対象はヒトである。
【実施例】
【０１４１】
最初のフラビウイルスレプリコンの設計および評価
第１世代の西ナイルウイルス（West Nile Virus）（ＷＮＶ）レプリコンを、ＷＮＶ株３３５６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ４０４７５６．１）の配列から構築した。Shi P.Y., Tilgner M., Lo M., “Construction and Characterization of Subgenomic Replicons of New York Strain of West Nile Virus.” Virology 296: 213-233 (2002)。ｎｔ．９０〜２３７９の欠失を含むこのＷＮＶ配列を、Ｇｅｎｅｗｉｚから３つの断片で注文し、ＷＮＶ００１（図１）を生じるＷＮＶレプリコン配列の上流に従来のＴ７プロモーター配列を用いる従来のクローニング方法を使用して、低コピー数のｐ１５Ａ複製開始点ベクター中において組み立てた。この欠失は、タンパク質ＣのＮ末端コーディング領域（ｎｔ．９７〜１８９）を維持しており、対応するＲＮＡ配列は必須のシス作用エレメントであり、マイナスセンスＲＮＡ合成の制御において役割を果たす場合がある。Hahn, C. et al. J. Mol. Biol. 198, 33-41 (1987)、Khromykh, A. A. and Westaway, E. G., J. Virol. 71(2), 1497-1505 (1997)およびWestaway, E. G. Adv. Virus Res. 33, 45-90 (1987)を参照されたい。Ｅタンパク質のＣ末端コーディング配列（ｎｔ．２３８０〜２４６９）を維持した。なぜならば、この領域は、非構造タンパク質１（ＮＳ１）の移行およびプロセシングを導き、その後に残余の非構造タンパク質ＮＳ２〜ＮＳ５の移行およびプロセシングを導くシグナル配列として作用するからである。両方の領域がＲＮＡゲノムの複製に必要である。これらの欠失により、ＷＮＶは非感染性となるが複製能力がある。完全なＷＮＶレプリコン配列を低コピープラスミドベクター中において組み立てた。なぜならば、完全長ＷＮＶレプリコン配列を高コピープラスミドにクローニングすると不安定になるからである。
【０１４２】
同様の原理を使用しておよびＹＦＶ  １７Ｄワクチン株（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ１５０６２．１）の配列をベースとして黄熱ウイルス（Yellow Fever vVrus）（ＹＦＶ）レプリコンを構築し、レプリコンＹ０３０を得た。このＹＦＶレプリコンは、このＹＦＶレプリコンが非感染性となるが複製能力がある構造遺伝子欠失を含む。ＷＮＶレプリコンと同様に、レプリコン機能に必要なエレメントを保持するために、タンパク質Ｃの２５個のＮ末端アミノ酸およびタンパク質Ｅの２４個のＣ末端アミノ酸に対応するコーディング領域を維持した（図１）。
【０１４３】
ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞中へのエレクトロポレーション、続いて免疫組織化学的（ＩＨＣ）方法を使用したＷＮＶ抗原の存在に関する染色により、ＷＮＶ００１レプリコンＲＮＡを機能的に評価した。ＷＮＶ−ＮＳ１（Ａ６０９）を発現するベネズエラウマ脳炎の非感染性ワクチン株からのレプリコンＲＮＡ（VEE、Geall, A.J. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(36): 140604-14609 (2012)を参照されたい）を陽性対照として使用した。一次抗体としてのＷＮＶ過免疫マウス腹水（Ｒ．Ｂ．Ｔｅｓｈからの贈与物）と、二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）とを使用して、エレクトロポレーションの４８時間後にＩＨＣを実施した。ＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質との反応時に残った青色残基により、陽性細胞を同定した。予想したように、Ａ６０９でエレクトロポレートした細胞は強いＩＨＣ陽性シグナルを示したが、ＷＮＶ００１でエレクトロポレートした細胞の１％未満がＩＨＣ陽性シグナルを示した（図２）。
【０１４４】
フローサイトメトリーを使用して、Ｙ０３０  ＲＮＡ  １μｇのＢＨＫ細胞へのエレクトロポレーション、続いてＹＦＶ抗原の存在に関する染色により、黄熱レプリコンの機能を評価した。エレクトロポレーションの２４時間後に細胞を回収し、一次抗体としてのＹＦＶ過免疫マウス腹水（Ｒ．Ｂ．Ｔｅｓｈからの贈与物）と、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ２ａとを使用して染色した。フローサイトメトリー分析中にＡＰＣチャンネルを使用する蛍光により、陽性細胞を同定した（図３）。
【０１４５】
デルタ型肝炎ウイルスリボザイムは、ＷＮＶレプリコン効力を増強するがＹＦＶレプリコン効力を増強しない
第１世代のＷＮＶ００１レプリコンによる結果は、低い効力（エレクトロポレーションまたはトランスフェクションの後に抗原またはレポーター遺伝子を発現する細胞のパーセントと定義する）を示した。レプリコンの効力を改善するために、センスのまたはアンチセンスのデルタ型肝炎ウイルス配列（それぞれＳ−ＨＤＶＲまたはＡＳ−ＨＤＶＲ）をＷＮＶ００１の３’ＵＴＲのすぐ下流に加え、それぞれＳ−ＨＤＶＲまたはＡＳ−ＨＤＶＲを含む第２世代のレプリコンＷＮＶ００６およびＷＮＶ００７を得た（図４）。
【０１４６】
フローサイトメトリーを使用して、ＢＨＫ細胞中でＷＮＶ００１、ＷＮＶ００６およびＷＮＶ００７のレプリコンＲＮＡを評価した。ある範囲のＷＮＶ００１、ＷＮＶ００６またはＷＮＶ００７のＲＮＡ（０．２５μｇ〜４μｇ）をＢＮＫ細胞中にエレクトロポレートし、エレクトロポレーションの２４時間後に、細胞をＷＮＶ過免疫マウス腹水およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ２ａで染色した（図５）。第２世代のＷＮＶレプリコンＲＮＡでエレクトロポレートした細胞は第１世代のＷＮＶレプリコンと比べて約５倍〜１０倍多いＷＮＶ抗原陽性細胞を示しており、このことは、フローサイトメトリーで定量化した場合にＳ−ＨＤＶＲまたはＡＳ−ＨＤＶＲの付加により効力が有意に改善されたことを示す。試験した全ての範囲で、Ｓ−ＨＤＶＲを含むＷＮＶ００６ＲＮＡでエレクトロポレートした細胞が最高の効力を示した。
【０１４７】
本発明者らは、ＷＮＶレプリコンを使用して得られた結果に基づいて、３’ＵＴＲに続くＨＤＶ−Ｒ配列の付加により、ＹＦＶ  ＲＮＡ効力が更に改善されるかどうかを試験した。リボザイムをＹ０３７（ＧＦＰレポーターを有するＹ０３０をベースとする）の３’ＵＴＲの直後に加えてＹ０４０を生成した。（図６）。効力へのＨＤＶ−リボザイムの効果を試験するために、ある範囲のＹ０３７またはＹ０４０のＲＮＡ（０．１〜１μｇ）でＢＨＫ細胞をエレクトロポレートし、エレクトロポレーションの２４時間後にフローサイトメトリーによりＹＦＶ抗原陽性細胞の割合を決定した。ＷＮＶレプリコンで得られた結果とは異なり、リボザイムを使用してもＹＦＶレプリコンＲＮＡの効力は認識できるほど改善されなかった。（図７）
【０１４８】
本発明者らは、リボザイム配列の付加によりＷＮＶレプリコンの効力が改善されるメカニズムが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写後に天然３’ＵＴＲの発生を促進するかどうかを試験した。これは、下記のテンプレートから生成されたＲＮＡを含むことにより評価した：（１）線状化ＸｂａＩおよびエキソヌクレアーゼポリシングされたＷＮＶ００１、（２）ＰＣＲにより生成されたＷＮＶ００１テンプレート、ならびに（３）ＸｂａＩ線状化ＷＮＶ００６を含むリボザイム。理論的には、ＷＮＶレプリコンＲＮＡを生成するために使用される全てのテンプレートは同じ配列を生じるが、リボザイムの助けを借りて生成されたＲＮＡの効力は、ＸｂａＩ、エキソヌクレアーゼポリシングされたテンプレートまたはＰＣＲにより生成されたテンプレートから生成されたＲＮＡの効力を大きく上回った。図１５〜図１７を参照されたい。
【０１４９】
ＸｂａＩで線状化したおよびエキソヌクレアーゼでポリッシングしたＷＮＶ００１またはＰＣＲで生成したＷＮＶ００１テンプレートを使用したＷＮＶレプリコンＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写は、非テンプレートヌクレオチドの異常な付加に起因して多くの転写物が非天然３’末端を含む可能性があることから、低い効力に悩まされる可能性があり、天然末端を含まない転写物は機能的に障害がある可能性がある、または機能しない可能性がある。リボザイムの付加により、この方法を使用して生成されたＷＮＶレプリコンＲＮＡの優位性をおそらく説明する、正確に定まった天然３’末端の発生が促進される。
【０１５０】
黄熱レプリコンにＨＤＶ−Ｒを付加しても同じ効果が得られなかったが、ＹＦＶレプリコンは、ＷＮＶと比較して初めから著しく高い効力を有した（例えば、ＢＨＫ細胞中にエレクトロポレートされたＹＦＶレプリコンＲＮＡ  １μｇは典型的には、それぞれ約１．５％〜約９％のＷＮＶ抗原陽性細胞を生じるＷＮＶ００１またはＷＮＶ００６のレプリコンＲＮＡ  ４μｇと比較して６０〜７０％のＹＦＶ抗原陽性細胞を生じる）。そのため、ＹＦＶレプリコンＲＮＡの３’ＵＴＲは、更に改変することなく既に効率的に最適化されていた。
【０１５１】
５’ＡＴＰ開始プロモーターはフラビウイルスレプリコンの効力を改善する
第２世代のＷＮＶレプリコンからの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写中ではレプリコンＲＮＡの真の３’末端の生成においてリボザイムの付加が助けとなることを示唆した。本発明者らは、レプリコンＲＮＡの真の５’末端の発生を容易にするであろう改変によりＷＮＶレプリコンの効力が更に増強されるかどうかを試験した。これまで、従来のＴ７クラスＩＩＩｐｈｉ６．５プロモーターを使用してＷＮＶレプリコンＲＮＡの転写を駆動していたが、このプロモーターはＧＴＰで開始され、１つの余分な非ウイルスのグアノシンがレプリコンＲＮＡの５’末端に付加される。従来のＴ７クラスＩＩＩｐｈｉ６．５プロモーターを使用する転写から余分なグアノシンヌクレオチドを含むゲノムウイルスＲＮＡを使用した場合、フラビウイルスのウイルス回収率が低いことが実証されている。更に、レプリコンＲＮＡの５’末端は、細胞内での複製中に訂正されていて、真の配列に戻る。例えばKhromykh and Westaway, J Virol, 68(7): p. 4580-8 (1994)を参照されたい。
【０１５２】
正しい５’末端を有するＷＮＶレプリコンＲＮＡの産生を容易にするために、ＷＮＶ００８（ＷＮＶ００６をベースとするが、ＡｆｌＩＩクローニング部位を生じさせるためにＣ＊とＥ＊との間にサイレント変異を有する）のプロモーターを改変することにより、ＡＴＰ開始転写を駆動する一連の代替Ｔ７プロモーターを生成し、ＷＮＶレプリコンＷＮＶ０１７、ＷＮＶ０２６、ＷＮＶ０２７およびＷＮＶ０２８を得た（図８Ａ）。ＷＮＶ０１７レプリコンＲＮＡを、Ｔ７クラスＩＩｐｈｉ２．５プロモーター（Coleman et al., Nucleic Acids Res, 32(1): p. e14 (2004)）により生成し、ＷＮＶ０２６を、ＧからＡへの置換を含む変異Ｔ７ｐｈｉ６．５プロモーターを使用して転写した。これらのプロモーターの最後のヌクレオチドがフラビウイルスレプリコンＲＮＡの最初のヌクレオチドと重複している重複プロモーター（ＯＬ）も試験した。ＷＮＶ０２７の転写をＴ７プロモーターｐｈｉ２．５（ＯＬ）によって駆動させ、ＷＮＶ０２８の転写をＴ７プロモーターｐｈｉ６．５ｍｕｔ（ＯＬ）によって駆動させた。
【０１５３】
プロモーター改変を最初に試験して、既に使用した、ＷＮＶ００８の転写を駆動するＴ７プロモーターと比較して、転写効率に有害であるかどうかを決定した。それぞれＷＮＶ０１７およびＷＮＶ０２６で使用されるｐｈｉ２．５変異プロモーターおよびｐｈｉ６．５変異プロモーターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写においてＲＮＡ収率を著しく低下させたが、それぞれＷＮＶ０２７およびＷＮＶ０２８で使用されるｐｈｉ２．５（ＯＬ）プロモーターおよびｐｈｉ６．５ｍｕｔ（ＯＬ）プロモーターはＲＮＡ収率に有意な悪影響を及ぼさなかった（図８Ｂ）。改変Ｔ７プロモーターを使用して転写されたＲＮＡの効力を、ＢＨＫ細胞中へのレプリコンＲＮＡ  １００ｎｇのエレクトロポレーションおよびフローサイトメトリーによる２４時間でのＷＮＶ抗原陽性細胞の割合の決定により評価した（図９）。データは、ＷＮＶ０２６を除く第２世代のＷＮＶレプリコンと比べて、転写中にＡ開始Ｔ７プロモーターにより駆動される、第３世代のＷＮＶレプリコンが有意に強力であることを示した。ＷＮＶ０２７およびＷＮＶ０２８からのＲＮＡは、ＷＮＶ００８と比較して効力が約１５倍高かった。
【０１５４】
Ｙ０３７のプロモーター（それぞれ口蹄疫ウイルスおよびブタテッショウウイルスに由来するＦ２Ａ自己切断ペプチド部位およびＧＳＧＰ２Ａ自己切断ペプチド部位に隣接するＧＦＰレポーターを有するＹ０３０をベースとする）を改変することにより、ＹＦＶレプリコン系中においてＡＴＰ開始改変プロモーターを使用する効果も評価した。ＷＮＶにより実施したように、プロモーター改変を最初に試験してＹＦＶレプリコンの転写効率に有害であるかどうかを決定した。代替プロモーターは、従来のプロモーターと比較してＲＮＡを６０％多く得た（図８Ｃ）。改変Ｔ７プロモーターを使用して転写したＲＮＡの効力を、ＢＨＫ細胞中へのレプリコンＲＮＡ  １００ｎｇのエレクトロポレーションおよびフローサイトメトリーによる２４時間でのＹＦＶ抗原陽性細胞の割合の決定により評価した（図１０）。データは、ＡＴＰ開始プロモーターもＹＦＶレプリコンの効力を改善するが、ＡＴＰ開始プロモーターの使用による最大の効力改善は、従来のプロモーターを使用するＧＴＰ開始ＲＮＡと比べて約２倍大きいだけであることを示した。
【０１５５】
導入遺伝子発現部位の最適化
異種遺伝子を発現するフラビウイルスレプリコンを開発する２つの異なる戦略を評価した。１つの戦略は、３’ＵＴＲの上流領域中にＥＭＣＶ  ＩＲＥＳにより駆動されるレポーター遺伝子を挿入することからなる。第２の戦略は、構造欠失領域内のインフレーム置き換えとしてのレポーター遺伝子の付加に焦点を当てた。ＷＮＶレプリコンまたはＹＦＶレプリコンの３’ＵＴＲの上流領域中にＩＲＥＳにより駆動されるレポーター遺伝子を付加する試みにより、挿入された導入遺伝子の効力および発現が低いレプリコンを得た。対照的に、レプリコンの構造欠失領域中にインフレームで挿入されたレポーター遺伝子により、このレポーターの発現がより高い強力なレプリコンを得た。図１８〜２１を参照されたい。この領域内の遺伝子の挿入の最適化が今後の焦点であった。
【０１５６】
ＦＬＡＧタグ（ＧＦＰ’ＦＬＡＧ）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬＵＣ）および抗ＹＦＶ抗体断片（ｓｃＦｖ−ｈＦｃ）を有するＧＦＰ等の導入遺伝子を、Ｆ２Ａ自己切断ペプチドおよびＧＳＧＰ２Ａ自己切断ペプチドに隣接している、最適化されたＷＮＶまたはＹＦＶベースのレプリコンの構造欠失遺伝子領域中に挿入した（図１１）。ＧＦＰ’ＦＬＡＧ、ＦＬＵＣまたはｓｃＦｖ−ｈＦｃを発現するＷＮＶレプリコンＲＮＡおよびＧＦＰ’ＦＬＡＧまたはｓｃＦｖ−ｈＦｃを発現するＹＦＶレプリコンＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価し、全てが目的の遺伝子を発現することができた。図２２〜図２５を参照されたい。
【０１５７】
フラビウイルスレプリコンは、アルファウイルスレプリコンと比較して代わりの特徴を有する。
複数の細胞株中においてＧＦＰを発現するレプリコンを使用して、様々な測定基準で、ＷＮＶ、ＹＦＶおよびＴＣ８３をベースとするレプリコンの特性を評価した。
【０１５８】
異なる細胞株で作業する場合のトランスフェクション条件をより画一化するためにカチオン性トランスフェクション試薬を使用して、ＢＨＫ細胞中でまたはＨｅＬａ細胞中でレプリコンの効力、細胞毒性および発現を決定した。簡潔に述べると、６ウェルフォーマットでＭＩＲＵＳ  ｍＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）を使用して、ＧＦＰを発現するＴＣ８３レプリコン、ＷＮＶレプリコンまたはＹＦＶレプリコン（Ａ７５０、ＷＮＶ０２９またはＹ０４２）由来のレプリコンＲＮＡ  ２５０ｎｇをＢＨＫ細胞またはＨｅＬａ細胞の８０％コンフルエント層上にトランスフェクトした。各ウェルからの上清および細胞層を２４時間、４８時間および７２時間の時点で回収し、アポトーシス前細胞およびアポトーシス細胞の損なわれている膜中に浸透する遠赤色の生存／死滅染色試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して染色した。フローサイトメトリー分析を使用し、生存細胞集団を使用してレプリコンの効力を決定し、全生存細胞に対するＧＦＰ＋細胞の割合を決定した（図１２）。ＧＦＰ＋細胞を使用してレプリコンの細胞毒性を決定し、全ＧＦＰ＋細胞と比較して死滅したＧＦＰ＋細胞の割合を決定した（図１３）。生存しているＧＦＰ＋細胞の平均蛍光強度により発現を決定した（図１４）。
【０１５９】
ＢＨＫ細胞を使用した効力の結果は、２４時間で、ＴＣ８３をベースとするレプリコンＡ７５０がＷＮＶ０２９と比較して効力がほぼ同等であることを示した。Ｙ０４２は、その他のレプリコンと比べて効力がはるかに低かった。データは、２４時間と４８時間とでの効力の比較では３種全てのレプリコンによって効力が保持されることを示唆する。４８時間と７２時間とでの効力の比較では、Ａ７５０レプリコンまたはＷＮＶ０２９レプリコンのいずれかをトランスフェクトした細胞では効力が劇的に低下したが、Ｙ０４２は、この時点では効力を依然として維持しているように思われる。ＨｅＬａ細胞を使用した効力の結果は、ＷＮＶレプリコンが、ＴＣ８３をベースとするレプリコンと同程度に強力であるが、ＹＦＶをベースとするレプリコンはＨｅＬａ細胞中では低い効力に悩まされることを示した。加えて、４８時間では効力はＴＣ８３レプリコン細胞と比べてＷＮＶレプリコントランスフェクト細胞により良好に保持されたが、７２時間では効力はほぼ同レベルまで低下した。
【０１６０】
ＢＨＫ細胞では、ＧＦＰを発現するＴＣ８３レプリコン（Ａ７５０）は、ＧＦＰを発現するフラビウイルスレプリコンと比べて高いレベルの細胞毒性を示した。しかしながら、７２時間の時点は、ＷＮＶレプリコンを有する細胞が約９％から約５４％へと細胞死滅率を大幅に増加させることを示していた。これには多くの理由が考えられるが、１つの大きな理由は、生存／死滅染色系は、完全に溶解している細胞ではなく膜が損なわれている細胞のみを検出することができるということである。Ａ７５０レプリコンをトランスフェクトされた細胞は、早期の時点ではるかに劇的なレベルのアポトーシスを経験している可能性があり、４８時間および７２時間の時点で生存／死滅染色アッセイにより検出されるには損傷が大きすぎる可能性があり、そのため、この試験条件では細胞毒性の見かけ上のレベルが過小評価されている可能性がある。対照的に、ＷＮＶレプリコンの軽度の細胞毒性は、膜が損なわれてはいるが完全には破壊されていない多くの細胞を導入した可能性がある。そのため、７２時間の試料では見かけ上の細胞毒性が増加しているであろう。このことを更に調べることはできるが、これまでの結果および生存−死滅染色が機能する方法は、ＴＣ８３ベースのレプリコンがフラビウイルスレプリコンと比較して極度に細胞毒性であることを示すことができる。ＨｅＬａを使用した細胞毒性データは、全ての時点でＴＣ８３レプリコンが最も細胞毒性であり、予想したように続いてＷＮＶレプリコンおよびＹＦＶレプリコンであることを示した。細胞毒性のレベルは、実験の継続期間中ずっと全てのレプリコンで増加した。
【０１６１】
ＢＨＫ細胞での発現データは、ＴＣ８３レプリコンからのＧＦＰ発現は経時的に低下することを示し、これは細胞毒性効果による可能性が最も高い。ＷＮＶレプリコンからのＧＦＰ発現は、最初は低かったが４８時間で有意に増加し、続いて７２時間で再び低下する。ＹＦＶレプリコンからのＧＦＰの発現は安定しているように思われた。ＨｅＬａ細胞では、ＴＣ８３レプリコンからのＧＦＰ発現は、ＢＨＫ細胞で低下し続けたように低下し続けたが、フラビウイルスレプリコンからのＧＦＰの発現は、実験の継続期間中ずっと増加し続ける。
【０１６２】
この結果は、ＴＣ８３レプリコンプラットフォームおよびフラビウイルスレプリコンの可能性と比較してフラビウイルスレプリコンの異なる特性を示す。
【０１６３】
図１５〜図２５は、下記で更に記載されるおよび上記でのそれらの記述で記載されている補足データを提供する。
【０１６４】
図１５〜図１７の場合、テンプレートの３’ＵＴＲに付加されたセンスまたはアンチセンスのＨＤＶ−Ｒ配列の助けを借りて生成されたＷＮＶレプリコンＲＮＡは、ＸｂａＩ／マング・ビーンエキソヌクレアーゼ処理により生成されたテンプレートまたはＰＣＲにより生成されたテンプレートから生成されたＷＮＶレプリコンＲＮＡよりも優れていた。
【０１６５】
レポーターの最適化を示すデータ
図１８〜図２２では、異種遺伝子を発現するフラビウイルスレプリコンを開発する２つの異なる戦略を評価した。１つの戦略は、３’ＵＴＲの上流領域中にＥＭＣＶ  ＩＲＥＳにより駆動されるレポーター遺伝子を挿入することからなる。Shi et al. Virology 296, 213-233 (2002)、Khromykh and Westaway J. Virol. 71(2), 1497-1505 (1997)。別の戦略は、構造欠失領域内のインフレーム置き換えとしてのレポーター遺伝子の付加に焦点を当てた。Jones et al. Virology 331 247-259 (2005)。ＷＮＶ００６をベースとするＷＮＶレプリコンでは、効率的な導入遺伝子発現を可能にするであろうＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ−フリンＦ２Ａ−ＧＦＰ二重レポーターカセットを挿入する様々な方法を評価した。これらの研究中では５’ＵＴＲ最適化が未だ発見されていないことから、リボザイム３’ＵＴＲ最適化のみを含むＷＮＶレプリコンに関してレポーター最適化を実施した。
【０１６６】
ＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ−フリンＦ２Ａ−ＧＦＰを発現するレプリコン３種を開発した。２種は構造欠失領域中にレポーターカセットを含んだ。構造欠失領域からカセットを発現するレプリコンの内、一方はＲＳＶＦのプロセシングを駆動するためのウイルスｐＲＭシグナルペプチドを含むが、他方は天然ＲＳＶＦシグナルペプチドを含み、これらの構築物は両方とも、ＧＦＰに続く追加のＧＳＧＰ２Ａ自己タンパク質分解切断部位を含んだ（ＷＮＶ０１０またはＷＮＶ０１１）。３番目のレプリコンは、天然ＮｓｉＩ部位を使用して添加した３’ＵＴＲの上流領域中にＥＭＣＶ−ＩＲＥＳにより駆動されるＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ−フリンＦ２Ａ−ＧＦＰレポーターカセットを含んだ（ＷＮＶ０１２）。ＲＳＶＦレポーター構築物およびＧＦＰレポーター構築物の両方のＣ末端にＦＬＡＧタグも付加した（図１８）。
【０１６７】
これらの構築物からのＲＮＡを、様々な方法を使用してＢＨＫ細胞を使用しｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した（図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ）。最も成功したレポーター遺伝子のセットアップは、ウイルスｐＲＭシグナルペプチドを有する欠失した構造遺伝子領域内にレポーターを含むＷＮＶ０１０であり、続いてＷＮＶ０１１であった。ＩＲＥＳにより駆動されるレポーター構築物は本質的に非現実的であり、非常に少数の細胞がＧＦＰまたはＷＮＶ＋抗原を発現した。これらの予備的研究は、その他のフラビウイルスレプリコンを使用して得られた先の結果と一致して、ＷＮＶ構築物は構造欠失領域中に挿入された場合に異種遺伝子を良好に発現することを示した。
【０１６８】
ＹＦＶレプリコン（これらの試験中に未だ発見されなかった５’ＵＴＲ最適化を含まない）中でＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ−フリンＦ２Ａ−ＧＦＰレポーター遺伝子も評価した。レプリコンＹ０３２は、３’ＵＴＲの上流領域中にＥＭＣＶ−ＩＲＥＳにより駆動されるＦＬＦＰＤ．ＲＳＶＦ−フリンＦ２Ａ−ＧＦＰレポーターカセットを含んだ。Ｙ０３３は、ＷＮＶによる結果に基づいて、レポーターのプロセシングを駆動させるウイルスｐＲＭシグナルペプチドを有する構造欠失領域中にレポーターカセットを含んだ。ＲＳＶＦレポーター構築物およびＧＦＰレポーター構築物の両方のＣ末端にＦＬＡＧタグも付加した。別のレプリコンＹ０３７は、シグナルレポーター遺伝子の有効性を決定するためにＦ２Ａ−ＧＦＰ’ＦＬＡＧ−ＧＳＧＰ２Ａレポーターカセットのみを含んだ（図２０Ａ）。各レプリコンからのＲＮＡをＢＨＫ細胞中にてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験し、エレクトロポレーションの２４時間後および４８時間後に効力を測定した。結果は、３’ＵＴＲに挿入されている二重レポーターにより効力が著しく低下することを示した。構造欠失領域中に挿入されている二重レポーターはＩＲＥＳ−３’ＵＴＲレポーターと比べて有効であったが、効力は依然として大きく低下した。Ｙ０３７中のＧＦＰ単一レポーターは効力に影響を及ぼしていないと思われる。
【０１６９】
ＹＦＶレプリコン中で更なる単一レポーター（図２１）カセットを評価し、結果は、導入遺伝子とＦ２Ａ自己切断ペプチド配列およびＧＳＧＰ２Ａ自己切断ペプチド配列との隣接がレプリコンの効力を改善することおよびウイルスポリペプチド鎖からの導入遺伝子の分離を助けることを示した。
【０１７０】
最適化されたレプリコンレポーターの試験を図２２〜図２５で更に記載する。
【０１７１】
材料および方法
フラビウイルスベクターの構築および増殖：
この研究に記載されている全てのＷＮＶレプリコン配列またはＹＦＶレプリコン配列を、アンピシリン耐性カセットを有する低コピー数（ｐ１５  ｏｒｉ）ベクター中において組み立てた。一般的な制限消化およびライゲーション、ＰＣＲ、部位特異的変異誘発ならびにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング等の様々な分子生物学的ツールを使用してベクターを構築した。ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（Ａｇｉｌｅｎｔ）の形質転換によりＷＮＶベクターを増殖させた。Ｓｔｅｌｌａｒコンピテントセル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の形質転換によりＹＦＶベクターを増殖させた。プラスミドの調製および増殖中では寒天Ｌｕｒｉａブロスプレート（Ｔｅｋｎｏｖａ）上でまたはＬｕｒｉａブロス培地中でカルベニシリン（２５μｇ／ｍｌ）を選択マーカーとして使用した。
【０１７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写用のフラビウイルステンプレートの生成：
ＷＮＶレプリコン配列をもつプラスミドを使用して、様々な方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写前にテンプレートを生成した：（ｉ）ＸｂａＩ線状化およびエキソヌクレアーゼ処理−ＷＮＶ００１等の構築物の場合、３７℃での２時間にわたるＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）消化によりプラスミドＷＮＶ００１を線状化し、続いてマング・ビーンヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理してテンプレート鎖から非天然ヌクレオチドを除去した。（ｉｉ）ＰＣＲテンプレート生成−ＷＮＶ００１等の構築物の場合、消化またはエキソヌクレアーゼ処理を必要とすることなく、プラスミドＷＮＶ００１をＰＣＲテンプレートとして使用してＷＮＶレプリコンテンプレートを生成した。（ｉｉｉ）ＸｂａＩ線状化−リボザイム配列を含む構築物の場合、３７℃での２時間にわたるＸｂａＩ消化によりプラスミドを線状化した。ＹＦＶレプリコン配列をもつプラスミドを使用して、様々な方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写前にテンプレートを生成した。（ｉ）ＰｍｅＩ線状化−リボザイム配列を含む構築物の場合、３７℃での２時間にわたるＰｍｅＩ消化（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）消化によりプラスミドを線状化した。（ｉｉ）ＰＣＲテンプレート生成−消化を必要とすることなく、ＰＣＲを使用してＹＦＶレプリコンテンプレートを生成した。（ｉｉｉ）ＢｓｐＱＩ線状化−５０℃での２時間にわたるＢｓｐＱＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）消化により、ＢｓｐＱＩ線状化部位を含むＹＦＶプラスミドを線状化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全てのタイプのテンプレートの生成用の反応生成物を精製した。
【０１７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写用のアルファウイルステンプレートの生成：
５０℃での２時間にわたるＢｓｐＱＩ消化によりＡ７５０等のＴＣ８３レプリコン配列を含むプラスミドを線状化し、続いてＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。
【０１７４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写：
調製したＤＮＡテンプレート約１μｇ〜５μｇを下記の配合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ミックス５０μｌ〜１００μｌに添加した：４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０（ＳＩＧＭＡ）、ＭｇＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）、６ｍＭのＡＴＰ、６ｍＭのＧＴＰ、６ｍＭのＣＴＰ、６ｍＭのＵＴＰ（ＮＥＢ）、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＳＩＧＭＡ）、２ｍＭのスペルミジン（ＳＩＧＭＡ）、０．００２Ｕ／μｌのピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、１Ｕ／μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）。この反応物を３０℃で２時間にわたりインキュベートした。下記の成分：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭのＫＣｌ（ＳＩＧＭＡ）、２．５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭのＳ−アデノシルメチオニン（ＮＥＢ）、３．５ｍＭのジチオスレイトール、０．０１Ｕ／μｌのＴｕｒｂｏ  ＤＮＡｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．９５Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤、０．２Ｕ／μｌのワクシニアキャッピングシステム（ＮＥＢ）、水を示した最終濃度まで添加してＲＮＡをキャップし、最初の反応の体積を４倍に増加させた。キャッピング反応物を３０℃で１時間にわたりインキュベートした。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物に７．５ＭのＬｉＣｌを２．８Ｍの最終濃度まで添加し、３０分にわたりまたは一晩−２０℃でインキュベートした。遠心分離によりＲＮＡをペレット化した。このペレットを７０％エタノールで１回洗浄して空気乾燥させ、続いてヌクレアーゼフリー水中に再懸濁させた。キャップされていないＲＮＡを必要とする用途の場合、ワクシニアキャッピング酵素を成分として含めなかった。
【０１７５】
ベビーハムスター腎臓細胞またはＨｅＬａ細胞の培養：
ＢＨＫ細胞を、５％ウシ胎仔血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ペニシリン１００ユニットおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で増殖させた。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。１０％ＦＢＳの補充以外は同様の培地製剤を使用してＨｅＬａ細胞を増殖させた。
【０１７６】
ＢＨＫ細胞のエレクトロポレーション：
培地を吸引して１×ＤＰＢＳ  １０ｍｌで洗浄することにより、８０％〜９０％の培養密度でベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞をＴ２２５親フラスコから収集した。このフラスコにトリプシン（０．２５％、フェノールレッド、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）約１０ｍｌを添加して吸引した。細胞を５分にわたり３７℃でインキュベートし、フラスコを撹拌して細胞剥離を補助した。トリプシン処理（trypsination）を停止するために、このフラスコに培地１０ｍｌを添加した。細胞を５分にわたり約４６０×ｇで遠心分離し、培地を除去した。細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に４×１０６個の細胞／ｍｌの最終濃度まで再懸濁させた。マウス胸腺ＲＮＡ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）と共に２ｍｍのキュベットに所望の量のＲＮＡを加えて全ＲＮＡを４．２μｇとし、続いてＯＰＴＩ−ＭＥＭ再懸濁細胞２５０μｌ（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を加えた。下記のパラメータを有するＳｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅプロトコルを使用して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘ−Ｃｅｌｌでエレクトロポレーションを実施した：１２０Ｖ、２５秒パルス、０パルスインターバル、１パルス。エレクトロポレートした細胞を１０分にわたり静置した後、培地２ｍｌを含む６ウェルプレート中のウェルに移した。
【０１７７】
ｍＲＮＡのカチオン性トランスフェクション
ＢＨＫまたはＨｅＬａを２５０ｋ／ウェルで６ウェルプレートに播種し、８０％の培養密度まで増殖させた。ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡキット（ＭＩＲＵＳ）を使用して、細胞中にＲＮＡをトランスフェクトした。１つのウェルのトランスフェクションプロトコルは下記の通りであり、適切にスケールアップすることができる：ＲＮＡ  ２５０ｎｇを２６５μｌの全体積までＯｐｔｉ−ＭＥＭに希釈した；ｍＲＮＡブースト試薬１μｌを直ちに添加し、穏やかに旋回させ、続いてＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ試薬１μｌを添加した；この溶液を再び緩やかに旋回させ、３分にわたり室温でインキュベートした；このトランスフェクション溶液を完全増殖培地（ＢＨＫ細胞またはＨｅＬａ細胞それぞれの場合にＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳまたはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に２．５ｍｌの最終体積まで希釈し、緩やかに混合した。トランスフェクトするウェルから培地を吸引し、トランスフェクション培地と交換した。細胞を３７℃５％ＣＯ２で４時間にわたりインキュベートした後、トランスフェクション培地を通常の増殖培地に置き換えた。
【０１７８】
ＷＮＶ抗原を発現する細胞を検出するための免疫組織化学：
エレクトロポレートした細胞を含むウェル（６ウェルフォーマット）を１×ＤＰＢＳで洗浄し、３分にわたり−２０℃のアセトン：メタノール（１：１ｖ／ｖ）で固定した。固定溶液を吸引し、細胞層を１×ＤＰＢＳで洗浄し、続いて室温で１時間にわたりＰＢＳ＋２％正常ヤギ血清（ＮＧＳ、ＳＩＧＭＡ）ブロッキング溶液を添加した。ブロッキング後、細胞を、１時間にわたり室温でＰＢＳ＋２％ＮＧＳ中の抗ＷＮＶマウス過免疫腹水（ＭＨＩＡＦ、Ｒ．Ｂ．Ｔｅｓｈからの贈与物）の一次抗体溶液の１：１０００希釈液と共にインキュベートした。一次抗体溶液を除去し、細胞を１×ＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、ＰＢＳ＋２％ＮＧＳ中の１：１０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ（ＨＡＬ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）の二次抗体溶液を添加し、２時間にわたり室温でインキュベートした。二次抗体溶液を除去し、１×ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を可視化するために、細胞層にＴｒｕｅ  Ｂｌｕｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ）を添加し、青色が現れるまで室温で５分インキュベートした。
【０１７９】
ウエスタンブロット分析：
下記のように細胞上清および／または細胞溶解物にウエスタンブロットを実施した。上清を収集し、遠心分離して破片をペレット化した。破片を含まない上清を分析まで−２０℃で保管した。培地を吸引して細胞層を１×ＤＰＢＳで洗浄することにより細胞溶解物を収集した。洗浄液を除去し、細胞溶解を促進するためにピペッティングしながらＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して細胞を溶解させた。溶解物を遠心分離して破片をペレット化した。溶解物を分析まで−２０℃で保管した。上清または溶解物を４×ＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈し、還元を必要とする用途の場合、１ＭのＤＴＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を６２．５ｍＭの最終濃度まで添加した。試料を５分にわたり９５℃で加熱し、続いてＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にロードし、１時間にわたり１５０Ｖで１×ＭＯＰＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で泳動させた。ｉＢｌｏｔ  Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して、ゲルをニトロセルロース膜上に移した。ニトロセルロース膜を１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ＋１０％ミルクでブロックした。膜を１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、下記のように用途に応じてＷＮＶ抗原、ＹＦＶ抗原またはＦＬＡＧタグに関して染色した。ＷＮＶ抗原染色：膜に一次抗体溶液（１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ中の抗ＷＮＶ  ＭＨＩＡＦの１：１０００希釈）を添加し、２時間にわたり室温でインキュベートし、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次いで、ブロットに二次抗体溶液（１×ＰＢＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ中の１：１００００希釈Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ）を添加し、１時間にわたり室温でインキュベートした。試料を５分にわたり１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎおよび１×ＰＢＳで３回洗浄した。ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造業者の指示に従ってブロットに添加した。ウエスタンブロットフィルムをＥＬＣハイパーフィルム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）への曝露により現像し、Ｋｏｎｉｃａ  Ｍｉｎｏｌｔａ  ＳＲＸ−１０１ＡＸ線装置を使用して処理した。ＹＦＶ抗原染色：一次抗抗体溶液（１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ中の抗ＷＮＶ  ＭＨＩＡＦの１：１０００希釈）を使用した以外は上記と同じプロトコル。ＦＬＡＧタグ抗原染色：一次抗体溶液（１×ＰＢＳ−Ｔ中のマウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体１μｇ／ｍｌ、クローンＭ２、ＳＩＧＭＡ  Ｆ１８０４  ＳＬＢＤ６９７６）を使用した以外は上記と同じプロトコル。
【０１８０】
ルシフェラーゼアッセイ：
培地を細胞から除去し、細胞層を１×ＤＰＢＳで洗浄した。洗浄液を除去し、１×Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、続いて削り取って細胞層の溶解を促進させた。破片を遠心分離によってペレット化して廃棄した。溶解物を分析まで−８０℃で保管した。ルシフェラーゼ活性を測定するために、試料を解凍して室温で平衡化し、各試料２０μｌを９６ウェル平底の不透明ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中のウェルに添加した。このプレートを、Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ９６０ルミノメーターおよび下記のパラメータを使用し、付随するＭｉｋｒｏＷｉｎ２０００ソフトウェアを使用して分析した：ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを注入する；２秒休止；１秒読み取り。
【０１８１】
フローサイトメトリー分析による抗原レプリコンの効力：
培地を細胞から除去し、細胞層を１×ＤＰＢＳで洗浄した。細胞にトリプシン（０．２５％）を添加し、細胞が剥離し始めるまで３７℃でインキュベートした。ピペッティングにより剥離を促進させ、９６ウェル丸底プレート中に移した。３分にわたる約４６２×ｇでの遠心分離により細胞をペレット化した。トリプシンをデカントし、細胞を染色緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．２５％ウシ血清アルブミン＋０．２％ＮａＮ３）で１回洗浄し、上記と同様にペレット化した。ペレットをＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ）中に再懸濁させ、２０分にわたり４Ｃでインキュベートして再ペレット化した。細胞を、洗浄と洗浄の間にペレット化しながらＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液、ＢＤ、１×ＰＢＳで１×に希釈する）で２回洗浄した。ＴＣ８３、ＷＮＶまたはＹＦＶからの抗原を、試料毎に下記のように検出した。ＴＣ８３抗原検出：Ｊ２モノクローナル抗体マウス、ＩｇＧ２ａ、カッパ鎖（Ｓｃｉｃｏｎｓ）０．７５μｌをＺｅｎｏｎ  Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）マウスＩｇＧ２標識キット成分Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．７５μｌに希釈し、室温で５分にわたりインキュベートし、続いてＺｅｎｏｎ  Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）マウスＩｇＧ２Ａ標識キット成分Ｂ  ０．７５μｌを添加し、室温で５分にわたりインキュベートした。染色剤をｐｅｒｍ／ｗａｓｈ溶液５７．５μｌで希釈し、この希釈溶液５０μｌで細胞ペレットを再懸濁させ、４℃で３０分にわたりインキュベートした。染色した細胞を再ペレット化し、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄して染色緩衝液で２回洗浄した。細胞をＢＤ  ＦＡＣｓＣａｌｉｂｕｒ  Ｅ−４６４７  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔに通し、全細胞集団と比較して抗原陽性細胞の数を決定することにより、ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェアを使用して効力を決定した。ＷＮＶ抗原検出：抗ＷＮＶ  ＭＨＩＡＦを成分Ａで希釈した以外は上記と同じプロトコル。ＹＦＶ抗原検出：抗ＹＦＶ  ＭＨＩＡＦを成分Ａで希釈した以外は上記と同じプロトコル。
【０１８２】
ＧＦＰを発現するレプリコンを使用する効力、細胞毒性および発現の分析
ＧＦＰを発現するレプリコンをトランスフェクトした細胞から培地を回収して、０．２５％トリプシンによる処理によって、細胞層と共に、あらゆる死滅したまたは付着していない細胞を収集した。モックトランスフェクト細胞を陰性対照として使用し、培地中の１０μｇ／μｌのピューロマイシンで処理した細胞を陽性対照として使用した。培地およびトリプシン処理した細胞を組み合わせ、３分にわたり約４６２×ｇで一緒に遠心分離した。細胞ペレットを１×ＤＰＢＳで洗浄し、９６ウェル丸底プレート中の１つのウェルに移した。細胞をペレット化し、１×ＤＢＰＳ中のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１：１０００希釈液に再懸濁させ、３０分にわたり４℃でインキュベートした。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色した細胞をペレット化し、１×ＤＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミンで２回洗浄した。試料をＢＤ  ＦＡＣｓＣａｌｉｂｕｒ  Ｅ−４６４７  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔに通し、ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェアを使用してデータを分析した。レプリコンの存在を示すＧＦＰ陽性細胞に関してゲーティングし、続いてＧＦＰ陽性集団内の死滅細胞の割合を決定することにより、細胞毒性を決定した。生存細胞および生存集団内のＧＦＰ陽性細胞の割合に関してゲーティングすることにより効力を決定した。ＧＦＰ発現は、生存しているＧＦＰ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析にすることにより決定した。
【０１８３】
本出願においていくつかのパラメータを記載する全ての数値境界、例えば「約」、「少なくとも」、「より少ない」および「より多い」に関して、この記載はまた、列挙されている値によって境界が示される任意の範囲も必然的に包含することを理解すべきである。従って、例えば記載「少なくとも１、２、３、４または５」は、特に範囲１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５および４〜５等も記載する。
【０１８４】
非特許文献および参照配列情報等の本明細書で引用されている全ての特許、出願またはその他の参考文献に関して、それらは、引用されている命題のためだけでなく全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることを理解すべきである。参照により組み込まれる文書と本出願との間で何らかの矛盾が存在する場合には、本出願は調整することができる。本出願で開示されている参照遺伝子配列と関連する全ての情報、例えばゲノム遺伝子座、ゲノム配列、機能的アノテーション、対立遺伝子多様体および参照ｍＲＮＡ（例えばエクソン境界または応答エレメントを含む）およびタンパク質配列（例えば保存されているドメイン構造）を含むＧｅｎｅＩＤまたは受託番号（典型的にはＮＣＢＩ受託番号を言及する）、ならびに化学的参照物（例えばＰｕｂＣｈｅｍ化合物、ＰｕｂＣｈｅｍ物質またＰｕｂＣｈｅｍバイオアッセイエントリ、例えばこれらでのアノテーション、例えば構造およびアッセイ等）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
本出願で使用されている見出しは便宜のみを目的としており、本出願の解釈には影響を及ぼさない。
【０１８６】
本発明により提供される態様それぞれの好ましい特色は、変更すべきところは変更して本発明の他の態様全てに適用可能であり、限定されることなく従属請求項により例示され、実施例を含む本発明の特定の実施形態および態様の個々の特色（例えば数値範囲および代表的な実施形態等の要素）の組合せおよび並べ替えも包含する。例えば、実施例で例示されている特定の実験パラメータは、本発明を逸脱することなく、段階的に特許請求されている本発明での使用に適応され得る。例えば、開示されている材料に関して、これらの化合物の様々な個々のおよび集合的な組合せおよび並べ替えそれぞれの具体的な言及が明白に開示されていない場合があるが、それぞれが具体的に意図されており、かつ本明細書に記載される。そのため、要素Ａ、ＢおよびＣの群が開示され、要素Ｄ、ＥおよびＦの群ならびに要素Ａ〜Ｄの組合せの例が開示されている場合、それぞれが個別に列挙されていなくても、それぞれは個々にかつ集合的に意図されている。そのため、この例では、組合せＡ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜ＥおよびＣ〜Ｆそれぞれが具体的に意図されており、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに例示的組合せＡ〜Ｄの開示から開示されていると見なされるべきである。同様に、これらの任意の部分集合または組合せも具体的に意図されており、かつ開示されている。そのため、例えば、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜ＦおよびＣ〜Ｅの下位群が具体的に意図されており、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに例示的組合せＡ〜Ｄから開示されていると見なされるべきである。この概念は、問題の組成物の要素およびこの組成物を製造するまたは使用する方法のステップ等の本出願の全ての態様に適用される。
【０１８７】
本明細書の教示に従って当業者により認識される本発明の上記の態様を、それらが先行技術に対して新規および非自明である限り任意の組合せまたは並べ替えで特許請求することができ、そのため、ある要素が、当業者に公知である１つまたは複数の参考文献に記載されている限り、上記の態様は、特に特色または特色の組合せの否定的な但し書きまたは放棄により、特許請求されている本発明から除外され得る。
【０１８８】
配列表
ＷＮＶレプリコンのヌクレオチド配列（ＵＴＲを含む）；配列番号１：
【化１】
2018513673.tif 000005
2018513673.tif 000006
2018513673.tif 000007
2018513673.tif 000008
【０１８９】
ＷＮＶレプリコンのペプチド配列（５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含まない）；配列番号２：
【化２】
2018513673.tif 000009
2018513673.tif 000010
【０１９０】
ＹＦＶレプリコンのヌクレオチド配列（ＵＴＲを含む）；配列番号３：
【化３】
2018513673.tif 000011
2018513673.tif 000012
2018513673.tif 000013
2018513673.tif 000014
2018513673.tif 000015
【０１９１】
ＹＦＶレプリコンのペプチド配列（５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含まない）；配列番号４：
【化４】
2018513673.tif 000016
2018513673.tif 000017
【０１９２】
【表３】
2018513673.tif 000018
【０１９３】
【表４】
2018513673.tif 000019
2018513673.tif 000020
2018513673.tif 000021
【０１９４】
【表５】
2018513673.tif 000022
【０１９５】
【表６】
2018513673.tif 000023
【０１９６】
【表７】
2018513673.tif 000024
【図１】
2018513673.tif 000025
【図２】
2018513673.tif 000026
【図３】
2018513673.tif 000027
【図４】
2018513673.tif 000028
【図５】
2018513673.tif 000029
【図６】
2018513673.tif 000030
【図７】
2018513673.tif 000031
【図８】
2018513673.tif 000032
【図９】
2018513673.tif 000033
【図１０】
2018513673.tif 000034
【図１１】
2018513673.tif 000035
【図１２】
2018513673.tif 000036
【図１３】
2018513673.tif 000037
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2018513673.tif 000040
【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
2018513673.tif 000043
【図１９−２】
2018513673.tif 000044
【図１９−３】
2018513673.tif 000045
【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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