(57)【要約】  本発明は、本明細書に規定される通り、真菌症の治療に有用な化合物、それらを含む組成物、及びそれらの治療における使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)の化合物、すなわち4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)-N-(2-ヒドロキシシクロヘキシル)ベンズアミド、又はその医薬として許容し得る塩：
【化１】
2018520104.tif 000038
。
【請求項２】
化合物(Ia)及び(Ib)から選択される立体異性体、又はそれらのいずれか1つの医薬として許容し得る塩：
【化２】
2018520104.tif 000039
の形態の、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
化合物(Ia)、すなわち4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)-N-((1R,2R)-2-ヒドロキシシクロヘキシル)ベンズアミド、又はその医薬として許容し得る塩：
【化３】
2018520104.tif 000040
である、請求項2記載の化合物。
【請求項４】
単独の立体異性体として提供される、請求項1〜3のいずれか1項記載の化合物。
【請求項５】
医薬としての使用のための、請求項1〜4のいずれか1項記載の化合物。
【請求項６】
真菌症の治療における使用のための、又は真菌症に関連する疾患の予防若しくは治療における使用のための、請求項1〜4のいずれか1項記載の化合物。
【請求項７】
真菌症の治療のための、又は真菌症に関連する疾患の予防若しくは治療のための、医薬の製造における請求項1〜4のいずれか1項記載の化合物の使用。
【請求項８】
前記真菌症がアスペルギルス・フミガーツス又はアスペルギルス・フラバスのようなアスペルギルス種、特にアスペルギルス・フミガーツスによって引き起こされる、請求項6又は7記載の使用のための化合物又は使用。
【請求項９】
前記真菌症が、黒酵母菌、リゾプス・オリゼ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ケトミウム・グロボスム、ペニシリウム・クリソゲナム、フザリウム・グラミネアラム、クラドスポリウム・ハーバルム、紅色白癬菌、又はカンジダ種、例えばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、若しくはカンジダ・クルーセイによって引き起こされる、請求項6又は7記載の使用のための化合物又は使用。
【請求項１０】
前記真菌症が、アゾール耐性真菌症である、請求項6又は7記載の使用のための化合物又は使用。
【請求項１１】
第二の又はさらなる活性成分と組合わせた医薬としての使用のための、請求項1〜4のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１２】
1以上の医薬として許容し得る希釈剤又は担体と任意に組合わせて、請求項1〜4のいずれか1項記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
第二の又はさらなる活性成分を含む、請求項12記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記第二の又はさらなる活性成分が、アゾール系抗真菌剤（例えば、ボリコナゾール、ポサコナゾール、イトラコナゾール、又はイサブコナゾール）、アムホテリシンB、エキノカンディン（例えば、カスポファンギン）、及び3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリル-CoAレダクターゼ阻害剤（例えば、ロバスタチン、プラバスタチン、又はフルバスタチン）を含む抗真菌剤から選択される、請求項11記載の使用のための化合物、又は請求項13記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記第二の又はさらなる活性成分が、ボリコナゾール、ポサコナゾール、イトラコナゾール、及びカスポファンギンから選択される、請求項11記載の使用のための化合物、又は請求項13記載の医薬組成物。
【請求項１６】
式（3）の化合物若しくはその塩：
【化４】
2018520104.tif 000041
（式中、Pはアミン保護基を表す。）；又は
式（4）の化合物若しくはその塩：
【化５】
2018520104.tif 000042
。
【請求項１７】
式（5）の化合物又はその塩：
【化６】
2018520104.tif 000043
（式中、RはC1-5アルキルを表す。）。
【請求項１８】
式（6）の化合物又はその塩：
【化７】
2018520104.tif 000044
。
【請求項１９】
真菌症を有する対象の治療方法であって、該対象に有効量の請求項1〜4のいずれか1項記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記真菌症が、アスペルギルス・フミガーツス又はアスペルギルス・フラバスのようなアスペルギルス種、特にアスペルギルス・フミガーツスによって引き起こされる、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記真菌症が、黒酵母菌、リゾプス・オリゼ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ケトミウム・グロボスム、ペニシリウム・クリソゲナム、フザリウム・グラミネアラム、クラドスポリウム・ハーバルム、 紅色白癬菌、又はカンジダ種、例えばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、若しくはカンジダ・クルーセイによって引き起こされる、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
前記真菌症が、アゾール耐性真菌症である、請求項19記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、真菌症の治療に有用な化合物、該化合物を含む組成物、及び該化合物の治療法における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
真菌感染症の発生率は、過去20年間に大幅に増加し、侵襲性形態は、特に免疫不全の又は免疫抑制された患者にあって病的状態及び死の主要な原因となっている。播種性カンジダ症、肺アスペルギルス症、及び出現する日和見菌は、これらの深刻な真菌症を引き起こす最も一般的な病原体である。真菌が一団となって結合し、そのインビトロ又はインビボの基体に接着することを可能にする細胞外マトリックス（ECM）を生成することができることは、真菌に特有の特徴である。これらのバイオフィルムは真菌を宿主免疫系の敵対的環境から保護し、抗微生物殺傷性に抵抗する役割を担う（Kaur及びSinghの文献、2013）。
【０００３】
肺アスペルギルス症は、非侵襲性疾患に罹患する患者と、これに対比される侵襲性状態を有する患者とに分けることができる。さらなる細分が、アスペルギルス症（ABPA；アレルギー性気管支肺アスペルギルス症として知られる）につながるアレルギー構成要素を示す患者を、これを示さない患者と対比して特徴づける目的で使用される。肺アスペルギルス症を突然引き起こす因子、例えば高用量の免疫抑制性医薬又は集中治療室における挿管処置への曝露は、急激に働くおそれがある。あるいは、このような因子は、過去のTBへの感染のように、長期的に働くおそれがある（Denningらの文献、2011a）。アスペルギルスによる慢性的肺感染症は、患者に大規模かつ永続的な肺損傷を残して、その結果終生経口用アゾール系薬物による治療が必要となる場合がある（Limperらの文献、2011）。
【０００４】
増加の一途をたどる研究からは、アスペルギルス感染症が、臨床的喘息において重要な役割を果たし得ることが示唆されている（Chishimbaらの文献、2012; Pasqualottoらの文献、2009）。さらに、最近公開された研究では、アスペルギルス感染症とCOPDの患者における不良な臨床転帰との相関関係が証明された（Bafadhelらの文献、2013）。同様に、横断的研究により、喀痰中のアスペルギルス種及びカンジダ種の存在と悪化した肺機能との間の関連性が示されている（Chotirmallらの文献、2010; Agbetileらの文献、2012）。
【０００５】
侵襲性アスペルギルス症（IA）は、免疫不全の患者、例えば同種異系幹細胞移植又は固形臓器移植（例えば、肺移植）を受ける患者において高い死亡率を示す。免疫不全の患者において報告されたIAの最初の事例は、1953年に発生した。この事件は、治療レジメンへのコルチコステロイド及び細胞傷害性化学療法の導入と同時に発生した（Rankinの文献、1953）。侵襲性アスペルギルス症は、その高い発生率及び関連する死亡率を考慮すると、白血病及び他の血液悪性腫瘍の治療において大きな問題となる。死亡率は通常50％を上回り（Linらの文献、2001）、経口用トリアゾール医薬が利用できるにもかかわらず、長期的な確率は同種異系造血幹細胞移植レシピエントにおいて90％に達し得る（Salmeronらの文献、2012）。固形臓器移植（特に、肺の）を受ける患者において、高用量のステロイドの使用は、患者を感染症にかかりやすくし（Thompson及びPattersonの文献、2008）、これは深刻な問題である。また、この疾患はより軽度の免疫不全患者集団においても出現している。これらの集団には、基礎疾患としてCOPD又は肝硬変に罹患する患者、高用量のステロイドを投与されている患者、及び中心静脈カテーテルを装着した個人又は人工呼吸器により補助されている個人が含まれる（Dimopoulosらの文献、2012）。
【０００６】
既存の抗真菌医薬は主に、経口又は全身のいずれかで投与される。これらの一般的に利用される送達経路は肺気道感染症を治療するのに不十分であり、それは感染の場で実現される薬物濃度が、諸臓器中で実現される薬物濃度を下回る傾向があるためである。このことは肝臓について特に当てはまり、毒性の場となる：ボリコナゾールで治療された患者の最大15％が、上昇したトランスアミナーゼレベルを経験する（Levinらの文献、2007; Lat及びThompsonの文献、2011）。また、肝臓の曝露は肝臓P450酵素の阻害に起因する重大な薬物相互作用に帰結する（Jeongらの文献、2009; Wexlerらの文献、2004）。
【０００７】
さらに、病院及び農業の両方でトリアゾールの使用が普及したために、一部の場所において耐性真菌症の出現が増加し、問題となっている（Denningらの文献、2011b; Bowyer及びDenningの文献、2014）。
【０００８】
向上した効率で送達され、改善された全身忍容性プロファイルをもたらす新規抗真菌医薬に対する切迫した医学的ニーズが存在することは明白である。
【発明の概要】
【０００９】
（発明の概要）
第一の態様において、本発明は化合物(I)、すなわち4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)-N-(2-ヒドロキシシクロヘキシル)ベンズアミド、又はその医薬として許容し得る塩（「本発明の化合物」）：
【化１】
2018520104.tif 000002
を提供する。
【００１０】
化合物(I)は2-アミノシクロヘキサノール基内に2つの立体中心を含み、その4つの考えられる立体異性体のいずれかの形態で、単独の立体異性体、又は任意の比率の立体異性体の混合物（ラセミ混合物を含む）のいずれかとして提供される。
【００１１】
好ましい態様において、本発明はtrans-2-アミノシクロヘキサノールの鏡像異性体から誘導された2つの立体異性体である、以下に示す化合物(Ia)及び(Ib)：
【化２】
2018520104.tif 000003
から選択される立体異性体の形態の化合物(I)、及びその医薬として許容し得る塩を提供する。
【００１２】
より好ましい態様において、本発明は以下に示す化合物(Ia)、すなわち4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)-N-((1R,2R)-2-ヒドロキシシクロヘキシル)ベンズアミド、又はその医薬として許容し得る塩：
【化３】
2018520104.tif 000004
を提供する。
【００１３】
適当には、化合物(Ia)のような化合物(I)は、単独の立体異性体として提供される。
【００１４】
本明細書で以下に開示する生物学的データにより、化合物(I)、及び特にその立体異性体である化合物(Ia)が、インビトロアッセイにおけるアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）の成長の強力な阻害剤であることが明らかとなる。免疫抑制されたマウスにおいて、化合物(Ia)は、アスペルギルス・フミガーツス感染症の強力な阻害を示した。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
（図面の簡単な説明）
【図１】化合物(Ia)を用いた治療的処置の、アスペルギルス・フミガーツスに感染した、免疫不全の好中球減少症マウスの肺におけるCFUに対する効果を示している。
【図２】化合物(Ia)を用いた治療的処置の、アスペルギルス・フミガーツスに感染した、免疫不全の好中球減少症マウスにおける血清ガラクトマンナン濃度に対する効果を示している。
【図３】化合物(Ia)を用いた治療的処置の、アスペルギルス・フミガーツスに感染した、免疫不全の好中球減少症マウスの肺におけるアスペルギルス・フミガーツスDNA含有量に対する効果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明の化合物は、市販の出発物質から、以下に示す合成手順（スキーム1）によって調製できる。そのような反応に典型的に利用される条件下での適当に保護されたピペラジン誘導体と、4-ブロモ-2-メチルフェノールとのブッフバルトカップリングにより、N-アリール化生成物1が生じる。そのような変換に適当なアミン保護基（P）は、Boc基（P ＝ CO2tBu）のようなウレタン基である。当業者には、多岐にわたる条件が、この種の変換に影響を与えるために使用できることが認識されよう。特に、パラジウム触媒並びにRuPhosG3及びRuPhosのようなホスフィン配位子は、塩基、例えば炭酸セシウム又はリチウムヘキサメチルジシラジドの存在下でルーチンに利用される。
【００１７】
（スキーム1）
【化４】
2018520104.tif 000005
【００１８】
結果として生じるフェノール1と、((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メタノール（2、X ＝ OH）の適当な求電子性誘導体との塩基性条件下での反応により、エーテル3が生成する。そのような化合物の一例は、商業的供給源から高い鏡像異性体純度のものが容易に入手可能な、対応するトシラート（2、X ＝ OTs）である。トシラートは代表例であり、Xはまた、代替の脱離基、例えばハロゲン、典型的には塩素とすることができる。アミン保護基の選択的除去により、一置換ピペラジン4が現れる。Boc誘導体（R ＝ CO2tBu）の場合、脱保護工程は典型的に、ニートで又は溶媒、例えばDCMの存在下で、強鉱酸又は強有機酸、例えばTFAにカルバマートを曝露することにより試みられる。
【００１９】
アミン4と4-ブロモ安息香酸アルキルとの塩基性条件、触媒作用下の第二のブッフバルトカップリングにより、R'がC1-5アルキルのような低級アルキル、例えばメチル又はエチルを表すN,N'-ビスアリール化生成物5が生じる。エステル5の鹸化は、水及び適当な水混和性溶媒の混合物中で、塩基、例えばアルカリ金属水酸化物での処理により、好都合に試みられる。酸生成物6と、2-アミノシクロヘキサノールとの当技術分野で広く利用可能な標準的なアミドカップリング条件下での反応により、化合物(I)が生じる。化合物(I)の4つの別個の立体異性体の各々は、対応する2-アミノシクロヘキサノールの単独の立体異性体を用いることによって生成することができる。対応する2-アミノシクロヘキサノールの立体異性体は、それぞれ高い立体異性体純度のものを商業的に入手可能である。
【００２０】
保護基及びそれを除去するための手段は、「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」（Theodora W. Greene及びPeter G. M. Wuts著、John Wiley & Sons 社から出版；第4版、2006, ISBN-10: 0471697540）に記載されている。アミドの調製手順の総説は、「アミド結合形成及びペプチドカップリング（Amide bond formation and peptide coupling）」（Montalbetti, C.A.G.N.及びFalque, V.の文献、Tetrahedron, 2005, 61, 10827-10852）に包含されている。
【００２１】
式(I)の化合物の医薬として許容し得る塩には、特に、該化合物の医薬として許容し得る酸付加塩が含まれる。式(I)の化合物の医薬として許容し得る酸付加塩は、式(I)の化合物が形成することができる治療上活性のある無毒な酸付加塩を含むことが意図される。これらの医薬として許容し得る酸付加塩は、遊離塩基形態を、適当な溶媒又は溶媒混合物中にて、そのような適当な酸で処理することによって好都合に得ることができる。適当な酸は、例えば、無機酸、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば、塩酸若しくは臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など;又は有機酸、例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、p-アミノサリチル酸、パモン酸などを含む。
【００２２】
逆に、該塩形態を、適当な塩基での処理によって、遊離塩基形態に変換することができる。
【００２３】
化合物(I)の定義には、該化合物の全ての互変異性体が含まれることが意図される。
【００２４】
本明細書で使用される用語、化合物(I)の「単独の立体異性体」は、該化合物中に2-アミノシクロヘキサノール基が存在するために生じる化合物(I)の他の3つの立体異性体を実質的に含まない高いジアステレオマー純度かつ高い鏡像異性体純度の両方を有する形態で提供される立体異性体である。典型的には、該単独の立体異性体は、化合物(I)の含有量の少なくとも98％、99％、99.5％、又は99.9％ w/wを構成する（すなわち、その他の立体異性体は化合物(I)の含有量の2％、1％、0.5％、又は0.1％ w/w未満を構成する）。
【００２５】
文脈からそうでないことが明確に示されない限り、化合物(I)の定義には、該化合物の全ての溶媒和物（該化合物の塩の溶媒和物を含む）を含むことが意図される。溶媒和物の例には、水和物がある。
【００２６】
本件開示の化合物は、指定された1以上の原子が天然の、又は天然に存在しない同位体である実施態様を含む。一実施態様において、該同位体は安定同位体である。従って、本件開示の化合物には、例えば重水素を含む化合物などがある。
【００２７】
また、本件開示は本明細書で定義される化合物の全ての多形形態に拡張される。
【００２８】
本明細書に記載される新規中間体、例えば式(3)、(4)、(5)、及び(6)の化合物並びにそれらの塩は、本発明のさらなる態様を形成する。塩には、医薬として許容し得る塩（例えば、先に記載の塩）及び医薬として許容し得ない塩がある。酸（例えば、カルボン酸）の塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、及びカルシウム塩を含む第1族及び第2族の金属塩がある。
【００２９】
一実施態様において、本発明の化合物を、任意に1以上の医薬として許容し得る希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物が提供される。
【００３０】
適当には、本発明の化合物は、肺又は鼻に局所的に、特に、肺に局所的に投与される。従って、一実施態様において、本発明の化合物を、任意に1以上の局所に許容される希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物が提供される。
【００３１】
肺又は鼻腔内投与用の適当な組成物には、粉末、液体溶液、液体懸濁液、溶液若しくは懸濁液を含む点鼻剤、又は加圧若しくは非加圧エアロゾルがある。
【００３２】
該組成物は、単位剤形で好都合に投与することができ、例えば、「レミントン薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」、第17版、Mack Publishing Company, Easton, PA.,(1985)に記載されているような、医薬分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。該組成物は、複数単位剤形で好都合に投与することもできる。
【００３３】
鼻又は肺への局所投与は、水性溶液又は懸濁液などの非加圧製剤の使用によって達成することができる。そのような製剤は、ネブライザー、例えば、手持ち式及び携帯式であり得るネブライザー又は家庭若しくは病院で使用するための（すなわち、非携帯式の）ネブライザーによって投与することができる。装置例は、RESPIMAT吸入器である。該製剤は、水、緩衝剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、粘性調節剤、界面活性剤、及び共溶媒（例えば、エタノール）などの賦形剤を含むことができる。懸濁液及びエアロゾル製剤（加圧式又は非加圧式を問わない）は、典型的に、微細に分割された形態の、例えば、0.5〜10 μm、例えば、約1〜5 μmのD50を有する、本発明の化合物を含む。粒径分布は、D10、D50、及びD90値を用いて表すことができる。粒径分布のD50中央値は、分布を二等分するミクロン単位の粒径と定義される。レーザー回折から得られる測定は、体積分布と記載される方が正確であり、従って、この手順を用いて得られるD50値は、Dv50値（体積分布の中央値）と呼ばれる方が意味が通る。本明細書で使用されるように、Dv値は、レーザー回折を用いて測定される粒径分布を指す。同様に、レーザー回折との関連で使用されるD10及びD90値は、Dv10及びDv90値を意味するものと理解され、それぞれ、分布の10％がD10値よりも下に位置し、分布の90％がD90値よりも下に位置する粒径を指す。
【００３４】
本発明の具体的な一態様によれば、水性媒体に懸濁した微粒子形態の本発明の化合物を含む医薬組成物が提供される。水性媒体は、典型的に、水並びに緩衝剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、粘性調節剤、及び界面活性剤から選択される1以上の賦形剤を含む。
【００３５】
鼻又は肺への局所投与は、エアロゾル製剤の使用によって達成することもできる。エアロゾル製剤は、典型的に、適当なエアロゾル噴射剤、例えば、クロロフルオロカーボン（CFC）又はハイドロフルオロカーボン（HFC）に懸濁又は溶解した活性成分を含む。適当なCFC噴射剤としては、トリクロロモノフルオロメタン（噴射剤11）、ジクロロテトラフルオロメタン（噴射剤114）、及びジクロロジフルオロメタン（噴射剤12）が挙げられる。適当なHFC噴射剤としては、テトラフルオロエタン（HFC-134a）及びヘプタフルオロプロパン（HFC-227）が挙げられる。噴射剤は、典型的に、全吸入組成物の40重量％〜99.5重量％、例えば、40重量％〜90重量％を構成する。該製剤は、共溶媒（例えば、エタノール）及び界面活性剤（例えば、レシチン、トリオレイン酸ソルビタンなど）を含む、賦形剤を含むことができる。他の考えられる賦形剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グリセリンなどが挙げられる。エアロゾル製剤はキャニスターに包装され、適当な用量は（例えば、Bespak、Valois、又は3Mによるか、或いはAptar、Coster、又はVariによって供給されるような）定量バルブによって送達される。
【００３６】
肺への局所投与は、乾燥粉末製剤の使用によって達成することもできる。乾燥粉末製剤は、微細に分割された形態の、典型的に、1〜10μmのMMD又は0.5〜10μm、例えば、約1〜5μmのD50を有する、本件開示の化合物を含む。微細に分割された形態の本発明の化合物の粉末は、微粒子化プロセス又は同様のサイズ低下プロセスによって調製することができる。微粒子化は、ジェットミル、例えば、Hosokawa Alpineによって製造されているものを用いて実施することができる。得られる粒径分布は、（例えば、Malvern Mastersizer 2000S機器による）レーザー回折を用いて測定することができる。該製剤は、典型的に、局所で許容される希釈剤、例えば、通常、比較的大きい粒径、例えば、50μm以上、例えば、100μm以上のMMD又は40〜150μmのD50の、ラクトース、グルコース、又はマンニトール（好ましくは、ラクトース）を含む。本明細書で使用されるように、「ラクトース」という用語は、α-ラクトース一水和物、β-ラクトース一水和物、α-ラクトース無水物、β-ラクトース無水物、及び非晶質ラクトースを含む、ラクトース含有成分を指す。ラクトース成分は、微粒子化、篩別、ミル粉砕、圧縮、凝集、又は噴霧乾燥によって処理することができる。様々な形態の市販型のラクトースも包含され、これには、例えば、Lactohale（登録商標）（吸入等級ラクトース; DFE Pharma）、InhaLac（登録商標）70（乾燥粉末吸入器用の篩別ラクトース; Meggle）、Pharmatose（登録商標）（DFE Pharma）、及びRespitose（登録商標）（篩別吸入等級ラクトース; DFE Pharma）製品がある。一実施態様において、該ラクトース成分は、α-ラクトース一水和物、α-ラクトース無水物、及び非晶質ラクトースからなる群から選択される。好ましくは、該ラクトースはα-ラクトース一水和物である。
【００３７】
また、乾燥粉末製剤は、他の賦形剤、例えば、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、又はステアリン酸マグネシウムを含み得る。
【００３８】
乾燥粉末製剤は、典型的に、乾燥粉末吸入器（DPI）装置を用いて送達される。例となる乾燥粉末送達系としては、SPINHALER、DISKHALER、TURBOHALER、DISKUS、SKYEHALER、ACCUHALER、及びCLICKHALERが挙げられる。乾燥粉末送達系のさらなる例としては、ECLIPSE、NEXT、ROTAHALER、HANDIHALER、AEROLISER、CYCLOHALER、BREEZHALER/NEOHALER、MONODOSE、FLOWCAPS、TWINCAPS、X-CAPS、TURBOSPIN、ELPENHALER、MIATHALER、TWISTHALER、NOVOLIZER、PRESSAIR、ELLIPTA、ORIEL乾燥粉末吸入器、MICRODOSE、PULVINAL、EASYHALER、ULTRAHALER、TAIFUN、PULMOJET、OMNIHALER、GYROHALER、TAPER、CONIX、XCELOVAIR、及びPROHALERが挙げられる。
【００３９】
本発明の化合物は、真菌症の治療において、及び真菌症に関連する疾患の予防又は治療のために有用である。
【００４０】
本発明の一態様において、真菌症の治療及び真菌症に関連する疾患の予防又は治療のための医薬の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【００４１】
本発明の別の態様において、真菌症を有する対象の治療方法であって、該対象に有効量の本発明の化合物を投与することを含む、前記方法が提供される。
【００４２】
本発明の別の態様において、対象における真菌症に関連する疾患の予防又は治療方法であって、該対象に有効量の本発明の化合物を投与することを含む、前記方法が提供される。
【００４３】
真菌症は、特に、アスペルギルス種、例えばアスペルギルス・フミガーツスによって引き起こされ得る。
【００４４】
真菌症に関連する疾患は、例えば肺アスペルギルス症である。
【００４５】
本発明の化合物は、真菌症の発症前に該化合物を投与することにより、予防的環境下で使用することができる。
【００４６】
対象には、ヒト及び動物対象、特にヒト対象が含まれる。
【００４７】
本発明の化合物は、アスペルギルス・フミガーツス感染症などの真菌症の治療、及びリスクのある対象におけるアスペルギルス・フミガーツス感染症などの真菌症に関連する疾患の予防又は治療のために特に有用である。リスクのある対象には、未熟児、肺又は心臓に先天的な欠陥を有する小児、免疫不全の対象（例えば、HIV感染症に罹患する対象）、喘息患者、嚢胞性線維症を有する対象、高齢の対象、及び心臓又は肺に影響する慢性健康状態（例えばうっ血性心不全又は慢性閉塞性肺疾患）を患う対象が含まれる。
【００４８】
また、本発明の化合物は、黒酵母菌（Aureobasidium pullulans）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ケトミウム・グロボスム（Chaetomimum globosum）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminerarum）、クラドスポリウム・ハーバルム（Cladosporium herbarum）、紅色白癬菌（Trichophyton rubrum）、カンジダ種、例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、及びカンジダ・クルーセイ（Candida krusei）、並びに他のアスペルギルス種、例えばアスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）によって引き起こされる真菌症を含む他の真菌症の治療（及びそれらと関連する疾患の予防又は治療）に有用である。
【００４９】
また、本発明の化合物は、アゾール耐性真菌症、例えばアゾール耐性アスペルギルス種、例えばアスペルギルス・フミガーツスによって引き起こされる真菌症の治療（及びそれらに関連する疾患の予防又は治療）において有用であると期待される。
【００５０】
本発明の化合物は、第二の又はさらなる活性成分と組み合わせて投与することができる。第二の又はさらなる活性成分は、例えば、アゾール系抗真菌剤（例えば、ボリコナゾール、又はポサコナゾール）、アムホテリシンB、エキノカンディン（例えば、カスポファンギン）、及び3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリル-CoAレダクターゼ阻害剤（例えば、ロバスタチン、プラバスタチン、又はフルバスタチン）を含む他の抗真菌剤から選択することができる。適当なアゾール系抗真菌剤の他の例には、イトラコナゾール及びイサブコナゾールがある。
【００５１】
第二の又はさらなる活性成分は、例えば、ボリコナゾール、ポサコナゾール、イトラコナゾール、及びカスポファンギンから選択することができる。
【００５２】
第二の又はさらなる活性成分は、真菌症、例えばアスペルギルス・フミガーツス感染症、又は真菌症、例えばアスペルギルス・フミガーツス感染症に関連する疾患、又は真菌症、例えばアスペルギルス・フミガーツス感染症に併発する状態の治療又は予防のために適当な活性成分を含む。
【００５３】
本発明の化合物は、第二の又はさらなる活性成分と共製剤化してもよく、又は該第二の又はさらなる活性成分は、同一の若しくは異なる経路により別々に投与されるように製剤化してもよい。
【００５４】
例えば、本発明の化合物は、抗真菌剤、例えばボリコナゾール又はポサコナゾール、あるいはイトラコナゾール又はイサブコナゾールで既に全身治療されている患者に投与することができる。
【００５５】
例えば、本発明の化合物は、アムホテリシンB、エキノカンディン、例えばカスポファンギン、及び3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリル-CoAレダクターゼ阻害剤、例えばロバスタチン、プラバスタチン、又はフルバスタチンから選択される1以上の薬剤と共製剤化することができる。
【００５６】
本発明の一態様によれば、(a)本発明の化合物を、任意に1以上の希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物；(b)第二の活性成分を、任意に1以上の希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物；(c)任意に、各々第三の又はさらなる活性成分を、任意に1以上の希釈剤又は担体と組み合わせて含む、1以上のさらなる医薬組成物；及び(d)それを必要とする対象への該医薬組成物の投与のための説明書を含むパーツのキットが提供される。それを必要とする対象は、アスペルギルス・フミガーツス感染症などの真菌症に罹患するか又は罹患しやすい可能性がある。
【００５７】
本発明の化合物は、適当な間隔で、例えば、1日に1回、1日に2回、1日に3回、又は1日に4回、投与することができる。
【００５８】
平均体重（50〜70 kg）のヒトについての適当な投与量は、約50 μg/日〜10 mg/日、例えば、500 μg/日〜5 mg/日であると考えられるが、投与されるべき正確な用量は、当業者により決定され得る。
【００５９】
本発明の化合物は、以下の有利な特性：
特に肺又は鼻腔への局所投与後の抗真菌活性、特にアスペルギルス種、例えばアスペルギルス・フミガーツスに対する活性が強いこと；
好ましくは1日1回の投与と結びついた肺における作用が長く持続すること；
肺又は鼻腔への局所投与後の全身性暴露が少ないこと；及び
特に肺又は鼻腔への局所投与後の安全性プロファイルが許容され得ること、の1以上を有すると期待される。
【実施例】
【００６０】
（実験の節）
本明細書で使用される略語を以下に定義する（表1）。定義されていない略語はいずれも、その一般的に認められている意味を伝えるものとする。
【００６１】
表1：略語
【表１】
2018520104.tif 000006
2018520104.tif 000007
2018520104.tif 000008
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【００６２】
（一般的手順）
全ての試薬及び溶媒は、商業的供給源から入手したか、又は引用文献に従って調製した。そうでないことが明言されない限り、全ての反応を撹拌しながら行った。有機溶液は、無水硫酸マグネシウムによりルーチンに乾燥させた。
【００６３】
（分析方法）
（逆相HPLC法）
Waters Xselect CSH C18 XPカラム、2.5 μm（4.6×30mm）、40℃;流量2.5〜4.5 mL分-1、0.1％v/vギ酸（方法1a）又は水中の10 mM NH4HCO3（方法1b）のいずれかを含むH2O-MeCN勾配で4分かけて溶出させ、254 nmでのUV検出を利用する。勾配情報: 0〜3.00分、95％H2O-5％MeCNから5％H2O-95％MeCNに上昇させる; 3.00〜3.01分、5％H2O-95％MeCNで保持し、流量を4.5mL分-1に増大させる; 3.01〜3.50分、5％H2O-95％MeCNで保持する; 3.50〜3.60分、95％H2O-5％MeCNに戻し、流量を3.50 mL 分-1に減少させる; 3.60〜3.90分、95％H2O-5％MeCNで保持する; 3.90〜4.00分、95％H2O-5％MeCNで保持し、流量を2.5 mL分-1に減少させる。
【００６４】
（1H NMR分光法：）
1H NMRスペクトルは、残存する重水素化されていない溶媒を参照として用いて、400MHzで、Bruker Advance III分光計で獲得し、そうでないことが明示されない限り、DMSO-d6中で実行した。
【００６５】
（化合物（Ia-d）の調製：化合物(I)の立体異性体）
光学的に純粋なcis及びtrans 2-アミノへキサノールの合成は、過去に報告されている（Jacobsenらの文献、1997）。これらの材料は多くの商業的供給源から高い鏡像異性体純度のものを入手可能であり、供給されたままのものを使用した。
【００６６】
（tert-ブチル4-(4-ヒドロキシ-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-カルボキシラート）
【化５】
2018520104.tif 000010
tert-ブチルピペラジン-1-カルボキシラート（19.1 g、103 mmol）、4-ブロモ-2-メチルフェノール（16.0 g、86.0 mmol）、RuPhos（798 mg、1.71 mmol）、及びRuPhos G3（1.43 g、1.71 mmol）を装入したフラスコを排気し、窒素で3回再充填した。カニューレを介してLiHMDS（THF中1 M、257 mL、257 mmol)の溶液を加え、反応混合物を70℃で3時間加熱した。RTへの冷却後、混合物を0℃で1 M水性塩酸（400 mL）を加えることによりクエンチし、続いて飽和水性NaHCO3（400 mL）で中和させた。水層をEtOAc（1×400 mL、続いて2×200 mL）で抽出し、合わせた有機抽出物を塩水（500 mL）で洗浄し、乾燥させた。揮発性物質を真空中で除去して粗製生成物を生じ、これをジエチルエーテル：ヘキサン（2：1）（750 mL）中で粉砕し、濾過により回収して標題化合物、中間体1を桃色の個体として得た（20.7 g、 76％）; Rt 2.07分 (方法1b); m/z 293 (M+H)+ (ES+);
【化６】
2018520104.tif 000011
【００６７】
1-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン
【化７】
2018520104.tif 000012
DMSO（408 mL）中の中間体1（21.5 g、66.1 mmol）の溶液に、水性水酸化ナトリウム（28.3 mL、3.5 M、99.0 mmol）を加えた。混合物をRTで30分間撹拌し、続いて((3S,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メチル4-メチルベンゼンスルホナート2（ex APIChem, カタログ番号: AC-8330, 32.7 g, 72.7 mmol）で少量ずつ処理した。反応混合物を30℃で18時間撹拌し、RTへと冷却し、水（600 mL）を加えた。得られた混合物をEtOAc（3×500 mL）で抽出し、合わせた有機抽出物を飽和水性NaHCO3（2×500 mL）及び塩水（500 mL）で洗浄し、続いて乾燥させ、真空中で蒸発させて茶色の油状物質を得た（およそ41 g）。粗製N-Boc保護生成物3の1H NMRによる分析からは、生成物には、一部の未反応の出発物質と一緒におよそ10モル％のアルケン脱離生成物：(R)-1-((2-(2,4-ジフルオロフェニル)-4-メチレンテトラヒドロフラン-2-イル)メチル)-1H-1,2,4-トリアゾール[A]が含まれていることが示唆された。この粗製生成物を、精製することなく続く工程で使用した。
【００６８】
粗製ウレタン3をDCM（260 mL）中に取り、TFA（76.0 mL、991 mmol）で処理した。RTで2時間置いた後、反応混合物を真空中で濃縮して大部分の揮発性物質を除去し、続いてDCM（200 mL）で希釈し、飽和水性NaHCO3（500 mL）でpH 7へと注意深く中和して、エマルションを形成させた。混合物を1 M塩酸（250 mL）の追加によりpH 1へと酸性化し、DCM（350 mL）を加えて二相混合物（二層）を形成させた。水相を分離して保持し、有機相を1 M塩酸（800 mL）で抽出した。合わせた水相を2 M水性水酸化ナトリウム（500 mL）の追加によりpH 14へと塩基性化し、続いてEtOAc（3×500 mL）で抽出した。合わせた有機抽出物を塩水（2000 mL）で洗浄し、続いて乾燥させて真空中で蒸発させると、標題化合物4を粘性の茶色の油状物質（24.6 g、78％）として得た；Rt 1.46 分（方法1a）；m/z 470 (M+H)+ (ES+)；
【化８】
2018520104.tif 000013
【００６９】
（メチル4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)ベンゾエート）
【化９】
2018520104.tif 000014
中間体4（19.1 g、40.7 mmol）、メチル-4-ブロモベンゾエート（10.5 g、48.8 mmol）、RuPhos（0.38 g、0.81 mmol、2 mol％）、RuPhosG3（0.68 g、0.81 mmol、2 mol％）、及び炭酸セシウム（21.2 g、65.1 mmol）を装入したフラスコを排気し、窒素で3回再充填した後、DMF（500 mL）を加えた。混合物を90℃で18時間加熱し、RTへと冷却して水（300 mL）中に注いだ。結果として生じる固体を濾過により回収し、水（3×100 mL）及びジエチルエーテル（3×75 mL）で洗浄し、続いて真空中50℃で乾燥させて、標題化合物5を黄褐色固体（22.8 g、89％）として得た；Rt 2.56分（方法1a）；m/z 604 (M+H)+ (ES+)；
【化１０】
2018520104.tif 000015
【００７０】
（4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)安息香酸）
【化１１】
2018520104.tif 000016
DMSO（1000 mL）中の中間体5（22.8 g、37.8 mmol）の懸濁液に、水（100 mL）中の水酸化リチウム（4.52 g、188 mmol）溶液を加えた。混合物を70℃で22時間加熱し、続いてRTへと冷却し、水（1000 mL）に注ぎ、1 M塩酸（300 mL）を追加することによりpH 2へと酸性化させた。混合物を氷浴中で2時間冷却し、結果として生じる沈殿物を濾過により回収した。フィルターケーキを水（2×200 mL）及びジエチルエーテル（4×200 mL）で洗浄した。粗製固体をTHF（150 mL）で粉砕し、濾過により回収し、続いてジエチルエーテル（3×100 mL）で洗浄し、真空中50℃で乾燥させると、標題化合物6をオフホワイト色の固体（19.7 g、88％）として得た；Rt 2.28分（方法1a）；m/z 590 (M+H)+ (ES+)；
【化１２】
2018520104.tif 000017
【００７１】
（化合物(1a)：4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)-N-((1S,2S)-2-ヒドロキシシクロヘキシル)ベンズアミド）
【化１３】
2018520104.tif 000018
中間体6（100 mg、0.17 mmol）、EDCI（65 mg、0.34 mmol）、及びDMAP（2.07 mg、0.017 mmol）のピリジン（1.0 mL）中混合物に、(1S,2S)-2-アミノシクロヘキサノール塩酸塩（51.4 mg、0.34 mmol）を加えた。反応混合物をRTで16時間撹拌し、続いてDCM（8.0 mL）で希釈し、1 M塩酸（2.0 mL）で洗浄した。混合物をフェーズセパレータに通し、有機物を真空中で蒸発させた。このようにして得られた粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（SiO2、12 g、EtOAc中0-5％ MeOH、勾配溶出）により精製して、標題化合物(Ia)を白色固体（75 mg、64％）として得た。
【００７２】
（化合物(1b-1d)の調製）
本発明の残りの化合物の例を、安息香酸中間体6を2-アミノシクロヘキサノールの適当な単独の立体異性体とカップリングさせることによる同様の方法で調製した。これらの化合物は商業的供給源から容易に入手可能である。Sigma Aldrichから入手した材料は、塩酸塩として供給され、それらに対し、以下の鏡像異性体純度（enantiopurities）：(1S,2S) trans異性体、＞98％ ee；(1R, 2R) trans異性体、＞98％ ee；(1R, 2S) cis異性体、＞97％ ee；(1S, 2R) cis異性体、＞97％ eeが明示されていた。
【００７３】
化合物例(1a-1d)に対するLCMS及び1H NMRスペクトルデータは、以下に提示されている（表2）。
【００７４】
表2：本発明の化合物の分析データ及びスペクトルデータ
【表２】
2018520104.tif 000019
【００７５】
（生物学的試験：実験方法）
（浮遊真菌（planktonic fungus）の成長の評価：培養液微量希釈アッセイ）
このアッセイは、EUCASTにより公開されている変法（Rodriguez-Tudelaらの文献、2008）を用いて実施した。英国公衆衛生庁、Wiltshireからのアスペルギルス・フミガーツスの胞子（NCPF2010、NCPF7010 [メチオニン220変異]、NCPF7099 [グリシンG54変異]）；St Louis病院, Paris, FranceからのTR34/L98H変異体；Delhi大学, Delhi, IndiaからのTR46/Y121F/T289A変異体をサブロー・デキストロース寒天培地中で3日間培養した。ストック胞子浮遊液を、PBS-tween（10 mL；0.05％ Tween-20、100 U/mLペニシリン及び100 U/mLストレプトマイシンを含むリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄することによりサブロー・デキストロース寒天培地培養物から調製した。胞子の数をノイバウエル血球計算盤を用いて評価し、続いてPBSで106胞子/mLに調整した。胞子のワーキング浮遊液（2×105胞子/mL）を、濾過滅菌したBSA MOPS RPMI-1640（50 mL；2 mM L-グルタミン、0.5％ BSA、2％グルコース、0.165 M MOPSを含み、NaOHでpH 7に緩衝能を調整したRPMI-1640）中で調製した。
【００７６】
アッセイについて、まずBSA MOPS RPMI-1640（50 μL/ウェル）を384ウェルプレート（カタログ番号353962, BD Falcon, Oxford, UK）の全体に加えた。続いて、試験化合物（0.5 μL DMSO溶液）をIntegra VIAFLO 96（Integra, Zizers, Switzerland）を用いて4連で加え、プレートミキサーを用いてよく混合した。次に、先に調製した50 μLのワーキング胞子浮遊液を、胞子を加えない対照ウェルを除く全てのウェルに加えた。胞子を加えない対照ウェルについては、BSA MOPS-RPMI溶液（50 μL/ウェル）を代わりに加えた。プレートにプラスチックの蓋をし、48時間インキュベートした（35℃、周囲空気で）。各ウェルの530 nmでのODを、マルチスキャナ（Clariostar: BMG, Buckinghamshire, UK）を用いて測定した。各ウェルに対するパーセンテージ阻害を算出し、各試験化合物に対して作成された濃度反応曲線からMIC50、MIC75及びMIC90値を算出した。
【００７７】
真菌パネルスクリーニングは、Eurofins Panlabs社により実施された。試験品のMIC及びMIC50値は、CLSIのガイドライン：酵母（CLSI M27-A2）（CLSI, 2002）及び糸状菌（CLSI M38-A）（CLSI, 2008）の培養液微量希釈法に従って測定した。
【００７８】
（気管支上皮細胞のアスペルギルス・フミガーツス感染）
BEAS2B細胞を96ウェルプレート中の10％ FBS RPMI-1640に播種し（100 μL; 3×104細胞/ウェル；カタログ番号3596, Sigma Aldrich, Dorset, UK）、続いて実験前に1日インキュベートした（37℃、5％ CO2）。試験化合物（0.5 μL DMSO溶液）又はビヒクル（DMSO）を各ウェルに加えて0.5％の最終DMSO濃度にした。BEAS2B細胞を試験化合物で1時間インキュベート（35℃、5％ CO2）した後、アスペルギルス・フミガーツス（20 uL；英国公衆衛生庁）の分生子浮遊液（10％ FBS RPMI-1640中、0.5×105/mL）に感染させた。プレートを24時間（35℃、5％ CO2）インキュベートした。上清（50 μL）を回収してPCRプレート（カタログ番号L1402-9700, Starlab, Milton Keynes, UK）に移し、これを使用まで凍結した（-20℃）。解凍後、上清（5 μL）をR7-PBS溶液（95 μL；PBS に対し1：4のR7; Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA, USA）を加えることにより1：20に希釈した。これらの試料（50 μL）中のガラクトマンナンレベルを、Platelia GM-EIAキット（Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA, USA）を用いて測定した。各ウェルに対するパーセンテージ阻害を算出し、各試験化合物に対して作成された濃度反応曲線からIC50値を算出した。
【００７９】
（ヒト肺胞二重層のアスペルギルス・フミガーツス感染）
ヒト肺胞上皮細胞及び内皮細胞の二重層からなるヒト肺胞のインビトロモデルは、過去に記載の通りに準備した（Hopeらの文献、2007）。この系を用いると、試験化合物を上部（「空気」区域）及び/又は下部（「全身」区域）区画へと投与することが可能となる。その融通性は、化合物(I)を上部チャンバに投与し、ポサコナゾール又は他の抗真菌剤を下部チャンバに投与することによる組合わせ治療の効果を探求するのに利用されている。初代ヒト肺動脈内皮細胞（HPAEC）を採取し、EGM-2培地（Lonza, Basel, Switzerland）中で106細胞/mLに希釈した。トランズウェルを反転させ、細胞浮遊液（100 μL/ウェル）を各トランズウェルの基部に加えた。反転されたトランズウェルをフローフード内でRTで2時間インキュベートし、その後、トランズウェルを上向きに返した。EGM-2培地を下部区画（700 μL/ウェル）及び上部区画（100 μL/ウェル）に加え、トランズウェルを48時間インキュベートした（37℃、5％ CO2）。続いて、下部区画のEGM-2培地を新鮮なEGM-2培地で交換した。A549細胞を採取し、10％ EBM中で5×105細胞/mLに希釈し、続いて全てのトランズウェルの上部区画（100 μL/ウェル）に加え、プレートを72時間インキュベートした（37℃、5％ CO2）。イトラコナゾール感受性のアスペルギルス・フミガーツスs（NCPF2010）及びイトラコナゾール耐性株（TR34-L98H）の分生子をサブロー・デキストロース寒天培地中で3日間、別々に培養した。いずれかの株のストック分生子浮遊液をPBS-tween（10 mL；0.05％ Tween-20、100 U/mLペニシリン及び100 U/mLストレプトマイシンを含むPBS）で洗浄することによりサブロー・デキストロース寒天培地培養物から調製した。分生子の数をノイバウエル血球計算盤を用いて評価し、PBSで106分生子/mLに調整した。分生子のワーキングストックを、EBM中で使用直前に調製した（105分生子/mL）。
【００８０】
試験化合物及び参照化合物（又はビヒクルとしてのニートのDMSO）を下部区画の処理については24ウェルプレート（3 μL/600 μLの2％ FBS EBMを含むウェル）、上部区画の処理については96ウェルプレート（1 μL/200 μLの2％ FBS EBMを含むウェル）の適当なウェルに加え、0.5％の最終DMSO濃度を提供した。上部区画中の培地を吸引し、適当な試験化合物及び参照化合物、又はビヒクルを含む培地を加えた（100 μL/ウェル）。続いて、トランズウェルを試験化合物及び参照化合物、又はDMSOビヒクルを含む24ウェルプレートに移した。1時間のインキュベーション（35℃、5％ CO2）後、分生子浮遊液（10 μL/ウェル）を各トランズウェルの上部区画に加えた。続いて、プレートを24時間インキュベートした（35℃、5％ CO2）。各区画から上清を回収し（5 μL/区画）、保存した（-20℃）。上清の回収後、毎日培地を交換し、先に記載の通り、全てのウェルを試験化合物及び参照化合物、又はDMSOで3日間処理した。全てのトランズウェルで真菌の成長が肉眼で視認されるようになるまで、試料の回収を続けた。続いて、下部区画の上清中のGMのレベルを、アスペルギルス・フミガーツスの侵入の指標として、ELISA（BioRad, CA, USA）により測定した。
【００８１】
（細胞生存性：レサズリンアッセイ）
BEAS2B細胞を実験の1日前に384ウェルプレート（BD Falcon, カタログ番号353962）中のRPMI-LHC8（等比率で混合されたRPMI-1640及びLHC8培地）中に播種した（100 μL; 3000/ウェル/）。無細胞対照ウェルについては、RPMI-LHC8（100 μL）を加えた。Integra VIAFLO 96（Integra, Zizers, Switzerland）を用いて試験化合物（0.5 μLのDMSO溶液）を加えて、0.5％の最終DMSO濃度を得た。BEAS2B細胞を各試験化合物とともに1日インキュベートした（RPMI-LHC8中、37℃/5％ CO2）。レサズリンストック溶液（5 μL、0.04％）の追加後、プレートをさらに4時間インキュベートした（37℃/5％ CO2）。各ウェルの545 nm（励起）及び590 nm（放出）での蛍光を、マルチスキャナ（Clariostar: BMG Labtech）を用いて測定した。細胞生存性のパーセンテージ低下を各ウェルに対しビヒクル（0.5％ DMSO）処理と比較して算出した。適当な場合、CC50値を各試験化合物に対する濃度反応曲線から作成される濃度反応曲線から算出した。
【００８２】
（インビボ抗真菌活性）
アスペルギルス・フミガーツス（ATCC 13073 [株: NIH 5233], アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関, Manassas, VA, USA）を麦芽寒天（Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan）プレート上、RT（24 ± 1℃）で6〜7日間成長させた。胞子を寒天プレートから無菌的に取り、0.05％ Tween 80及び0.1％寒天を含む滅菌蒸留水中に浮遊させた。感染の日に、胞子の数を血球計算盤により評価し、生理食塩水1 mL当たり1.67×108胞子の濃度を得るように接種材料を調整した。免疫抑制及び好中球減少症を誘導するため、感染の3、2、及び1日前のA/Jマウス（雄、5週齢）にヒドロコルチゾン（Sigma H4881; 125 mg/kg, 皮下,）を投与し、感染の2日前にシクロホスファミド（Sigma C0768; 250 mg/kg, 腹腔内）を投与した。第0日に、動物を胞子浮遊液（30 μL、鼻腔内）により感染させた。
【００８３】
試験物質を1日に1回、第1、2、及び3日にのみ（それにより治療処置レジメンを表す）鼻腔内投与した（35 μLの懸濁液（生理食塩水中0.0032〜10.0 mg/mLの原薬））。長期予防処置については、試験化合物（生理食塩水中0.0032又は0.016 mg/mLの35 μLの懸濁液）を7日間にわたり1日1回鼻腔内投与した。1つの群には第0日の感染30分前に投与したが、その後は投与しなかった一方、第二の群には感染後第1、2、及び3日にさらに投与した。これらの処置パラダイムの効果を、処置が他の群において接種の1日前又は30分前に限定され、その後両方の事例で感染後第1、2、及び3日に処置が行われた場合に得られる効果と比較した。最後の群では、投与は2回、感染前1日及び30分にのみ投与された動物にさらに限定された。
【００８４】
動物の体重を毎日モニタリングし、第3日に薬物の最後の用量を投与してから6時間後、動物を麻酔し、気管に挿管し、BALF血液及び肺組織を回収した。血清中のIL-6及びTNFαのレベルをそれぞれQuantikine（登録商標）マウスIL-6又はTNF-α ELISAキット（R&D systems社, Minneapolis, MN, USA）を用いて測定した。血清中のアスペルギルスGMを、Platelia GM-EIAキット（Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA, USA）を用いて測定した。カットオフ指標（COI）を、式：カットオフ指標＝試料中OD/キットが提供するカットオフ対照のODにより産出した。組織真菌負荷アッセイについて、100 mgの肺組織を無菌的に取り出し、0.2 mLの滅菌蒸留水中の0.1％寒天中でホモジェナイズした。連続希釈された肺ホモジェネートを麦芽寒天プレート（50 μL/プレート）上にプレーティングし、24 ± 1℃で72〜96時間インキュベートした。各プレート上でのA.フミガーツスのコロニーを計数し、真菌力価を肺組織1グラム当たりのCFUとして本明細書中に提示した。
【００８５】
アスペルギルス・フミガーツスDNA含有量の測定について、DNAを感染肺又はアスペルギルス・フミガーツスから、Isoplant（Nippon Gene）により、製造業者の説明書に従って抽出した。任意の長さに＜3 mmに切断された組織を溶液I（抽出緩衝液：300 μL）に混合した。次に溶液II（溶解緩衝液；塩化ベンジル：150 μL）を混合物に加え、続いてボルテックスミキサーで5秒間混合した。50℃、15分間のインキュベーションの後、溶液III（酢酸ナトリウム、pH5.2：150 μL）を加え、混合物を1〜3秒間激しく撹拌し、続いて氷上で15分間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を12,000 g、4℃で15分間遠心分離した。上清の上部水相中のDNAを100％エタノール（×2.5体積）で沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、5〜10 μLのTE緩衝液中に溶解させた。
【００８６】
DNA増幅を96ウェル光学反応プレート中でPremix Ex Taq（商標）（Takara Bio）を用いて実施した。アスペルギルス・フミガーツス18S rRNA遺伝子の断片を、プライマーペア；
【化１４】
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並びにハイブリダイゼーション・プローブ；
【化１５】
2018520104.tif 000021
を用いて増幅させた。リアルタイムPCRを（50 ngのマウスDNAを200 nMのプローブとともに含む25 μL）中で、以下の：50℃、2分間の最初のインキュベーション、95℃、10分間の最初の変性に続いて、95℃、15秒間及び65℃、1分間の工程を55サイクル繰り返す条件下で実施した。50 ngのマウス肺DNA中のアスペルギルス・フミガーツスDNAの量を、0.05〜50,000 pgのアスペルギルス・フミガーツス由来DNAによる標準曲線から評価した。
【００８７】
（スクリーニング結果の概要）
化合物(I)は培養液微量希釈アッセイ（表3）において評価される浮遊真菌の成長に対する強力な阻害活性を示す。
【００８８】
表3  アスペルギルス・フミガーツス分離株の浮遊真菌の成長に対するボリコナゾール、ポサコナゾール、アムホテリシンB、及び化合物（Ia-d）での処理の効果
【表３】
2018520104.tif 000022
表脚注：1. 培養液微量希釈アッセイ、n ＝ 2〜3。
【００８９】
これらのアッセイにおいて、特に化合物(Ia)は、ポサコナゾール耐性株（NCPF7099、NCPF7100、TR34/L98H、及びTR46/Y121F/T289A）並びにポサコナゾール感受性株（NCPF2010）の両方に対し、ポサコナゾール、ボリコナゾール、及びアムホテリシンBが示すよりも有意に高い効力を示した。
【００９０】
また、化合物(Ia及びIc)は気管支上皮細胞の真菌感染に対する強力な阻害活性を示す（表4）。このアッセイ系において、化合物(Ia及びIc)は、ボリコナゾールよりも有意に高い効力を示し、ポサコナゾールよりも高い効力を示した。化合物(Ia、Ib、Ic、及びId)によるインキュベーションは、以下に示した濃度では、BEAS2B気管支上皮細胞の生存性に対し一切又はほとんど影響を有さなかった。
【００９１】
表4：アスペルギルス・フミガーツス（NCPF2010）浮遊真菌の成長、BEAS2B気管支上皮細胞の真菌感染、及びBEAS2B細胞の生存性に対するボリコナゾール、ポサコナゾール、アムホテリシンB、及び化合物(Ia-d)での処理の効果
【表４】
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表脚注：1. 気管支上皮細胞；n ＝ 1〜3；2. n ＝ 3; nt：試験されていない
【００９２】
広範な真菌病原体の成長に対する化合物(I)の効果を、CLSI培養液微量希釈法を用いて評価した。化合物(Ia)は、黒酵母菌、リゾプス・オリゼ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ケトミウム・グロボスム、ペニシリウム・クリソゲナム、フザリウム・グラミネアラム、クラドスポリウム・ハーバルム、及び紅色白癬菌、並びに一部のカンジダ種（とりわけ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、及びカンジダ・クルーセイ）及び一部のアスペルギルス種（とりわけ、アスペルギルス・フラバス）の成長の強力な阻害剤であることが見出された（表5）。
【００９３】
表5  様々な真菌種の成長に対する化合物(Ia)の阻害効果
【表５】
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表脚注：MIC50/MIC100 ＝視認調査による真菌成長の50％及び100％阻害に要求される濃度（CLSI）。ND：測定されていない
【００９４】
アスペルギルス・フミガーツス（アゾール感受性株：NCPF2010；及びアゾール耐性株TR34/L98H）の肺胞への侵入に対する阻害活性を、感染から1日後のヒト肺胞二重層の底部チャンバにおけるガラクトマンナン（GM）を測定することにより、測定した。化合物(Ia)を頂部チャンバに投与すると、底部チャンバにおいて、濃度依存的なGMレベルの阻害が生じ、両方の株に対し最大効果は90％を上回っていた（表6及び7）。
【００９５】
表6  ヒト肺胞二重層（トランズウェル）における下部チャンバへのアスペルギルス・フミガーツス（アゾール感受性株：NCPF2010）の侵入への化合物(Ia)及びポサコナゾールの効果
【表６】
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表脚注：n ＝ 3。
【００９６】
表7  ヒト肺胞二重層（トランズウェル）における下部チャンバへのアスペルギルス・フミガーツス（アゾール耐性株：TR34/L98H）の侵入への化合物(Ia)及びポサコナゾールの効果
【表７】
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表脚注：n ＝ 1
【００９７】
感染後数日間阻害活性をモニタリングしたところ、化合物(Ia)（上部チャンバ中で0.1 μg/mL）又はポサコナゾール（下部チャンバ中で0.01 μg/mL）による単独療法の早期の阻害効果は、急速に消失することが見出された（表8）。対照的に、上部チャンバ中の化合物(Ia)及び下部チャンバ中のポサコナゾール（先述の通り）による組合わせ処理により、感染後の侵入の阻害が持続した。その結果、組合わせ処理に対するDFB50は3.63日となり、どちらかの化合物単独に対する値よりずっと長くなった（表8）。この組合わせ療法の相乗的効果、又は少なくとも相加的な効果は、化合物(Ia)による処理をイトラコナゾール、ボリコナゾール、又はカスポファンギンによる処理と組合わせた場合にも現れた（結果は示さない）。
【００９８】
表8：ヒト肺胞二重層（トランズウェル）における下部チャンバへのアスペルギルス・フミガーツス（NCPF2010）の侵入に対する化合物(Ia)、ポサコナゾール、及び処理組合わせの効果
【表８】
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表脚注：1. 0.1 μg/mLで投与した；2. 0.01 μg/mLで投与した；DFB50：対照の50％の真菌負荷に達するのにかかる日数
【００９９】
さらに、この組合わせ処理をアスペルギルス・フミガーツスのアゾール耐性株：TR34-L98Hに感染した二重層において試験した（表9）。上部チャンバ中での化合物(Ia)（0.3 μg/mL）又は下部チャンバ中でのポサコナゾール（0.1 μg/mL）による単独療法は、限定された利益を示した。対照的に、化合物(Ia)及びポサコナゾールの組合わせは、下部チャンバへの真菌の侵入に対する著しい阻害効果を示した。
【０１００】
表9  肺胞二重層細胞系（トランズウェル）における下部チャンバへのアスペルギルス・フミガーツス（アゾール耐性株：TR34-L98H）の侵入に対する化合物(Ia)、ポサコナゾール、及び処理組合わせの効果
【表９】
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表脚注：1. 0.3 μg/mLで投与した；2. 0.1 μg/mLで投与した；DFB50：対照の50％の真菌負荷に達するのにかかる日数
【０１０１】
接種後第1、2、及び3日に免疫不全の好中球減少症マウスへ鼻腔内投与した場合（治療的処置）、化合物(Ia)はポサコナゾールに要求されるよりも低い用量で、3日間にわたって測定されたアスペルギルス・フミガーツス感染によって引き起こされた体重減少に対する多少の保護を示した（表10）。
【０１０２】
表10：免疫不全の好中球減少症マウスのA.フミガーツス感染によって引き起こされる体重減少に対する化合物(Ia)又はポサコナゾールでの処置の効果
【表１０】
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表脚注：1. 処置を開始した第1日の動物の体重と比較したA.フミガーツス感染によって引き起こされた体重減少（％）；2. 2つの別々の試験が実施された。
【０１０３】
さらに、化合物(Ia)による治療的処置は、肺中の真菌負荷、血清中のガラクトマンナン濃度、及び肺中のアスペルギルス・フミガーツスDNA含有量に対し、ポサコナゾールよりも優れた効果を示した。化合物(I)に対するこれらのデータを、表11及び図1、2、及び3に示す。
【０１０４】
表11：アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全の好中球減少症マウスの肺におけるCFU、血清中のガラクトマンナン濃度、及び肺中のアスペルギルスDNAに対する化合物(Ia)による予防的及び治療的処置の効果
【表１１】
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表脚注：真菌負荷のデータは、平均±平均の標準誤差（SEM；n ＝ 6）として示されている。
【０１０５】
独立した実験で治療的に投与されたポサコナゾール及び化合物(Ia)に対するID50値も、以下に提示されている（表12）。
【０１０６】
表12：アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全の好中球減少症マウスの肺中の真菌負荷、血清中のガラクトマンナン濃度、及び肺組織中のアスペルギルス・フミガーツスDNA含有量に対する、ポサコナゾール及び化合物(Ia)による治療的処置についてのID50値。
【表１２】
2018520104.tif 000031
表脚注：nt：試験されていない
【０１０７】
また、化合物(Ia)による治療的処置により、アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全の好中球減少症マウスにおける血清サイトカイン濃度が阻害されることが見出された（表13及び14；図1、2、及び3）。血清サイトカインレベルの阻害に対し算出されたID50値（表14）は、肺真菌負荷、血清ガラクトマンナン濃度、及び肺アスペルギルス・フミガーツスDNA含有量について観察されたID50値（上記）と非常によく似ている。
【０１０８】
表13：アスペルギルス・フミガーツスに感染した、免疫不全の好中球減少症マウスの血清中のIL-6及びTNFαレベルに対する化合物(Ia)による治療的処置の効果
【表１３】
2018520104.tif 000032
表脚注：バイオマーカー濃度のデータは、平均±平均の標準誤差（SEM）として示されている、N ＝ 6。
【０１０９】
表14：アスペルギルス・フミガーツスに感染した、免疫不全の好中球減少症マウスの血清中のIL-6及びTNFαレベルに対する化合物(Ia)による治療的処置についてのID50値。
【表１４】
2018520104.tif 000033
【０１１０】
また、アスペルギルス・フミガーツスに感染した、免疫不全の好中球減少症マウスにおける化合物(Ia)による長期予防投与の効果を評価した。化合物(Ia)による長期予防は、先立つ試験で使用された用量よりも25倍低い用量で、肺中の真菌負荷並びにBALF及び血清の両方におけるGM濃度を阻害することが見出された（表15）。さらに、7日間の予防により1日の予防的処置が生み出すよりも大きな抗真菌効果が生み出されたことから、データは反復投与した際に肺における抗真菌効果が蓄積されることを示唆している。第-7日から第0日までの処置が、第-1日及び第0日のみでの処置の結果として生じるよりも優れた第3日での抗真菌効果を生み出すという発見により、肺において化合物の作用が持続することが示唆された。
【０１１１】
表15  アスペルギルス・フミガーツスに感染した、免疫不全の好中球減少症マウスにおける肺中の真菌負荷（CFU）並びにBALF及び血清中のGM濃度に対する化合物(Ia)の長期予防的投与の効果
【表１５】
2018520104.tif 000034
表脚注：1. 全てのビヒクル及び薬物処置群について、N値は5とした；2. 真菌負荷及びGMレベルに対するデータは、平均±平均の標準誤差及びビヒクルに対するパーセンテージ阻害として示されている。
【０１１２】
（インビボ薬物動態）
動物、例えばマウスの肺への投与は、肺用治療薬について一般的に使用される手法であり、結果としての全身の投与化合物への曝露を特徴づけるために、投与後様々な時点で血漿を回収する。
【０１１３】
本発明の化合物は、そのような先に言及したインビボ系において試験することができる。
【０１１４】
（化合物(I)の生物学的プロファイルの概要）
４つの立体異性体の全ての形態での化合物(I)は、アスペルギルス・フミガーツスの浮遊成長（planktonic growth）及び気管支上皮細胞の感染の強力な阻害剤であることが見出された。化合物(Ia)は、ポサコナゾール耐性及びボリコナゾール耐性のアスペルギルス・フミガーツス分離株の成長を阻害し、これらの株に対するポサコナゾール、ボリコナゾール、及びアムホテリシンBの効力よりも高い効力を示した。また、多種多様な他の病原性真菌が化合物(Ia)に感受性であることが見出された。化合物(Ia)とポサコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾール、及びカスポファンギンとの組合わせに対し、相乗効果又は少なくとも相加効果が示された。インビボでは、アスペルギルス・フミガーツスに感染した、免疫不全の好中球減少症マウスにおいて、化合物(Ia)は治療的又は予防的に投与された場合に、アスペルギルス・フミガーツス感染症並びに関連する肺免疫反応の強力な阻害を示した。また、化合物(Ia)は感染依存的な体重減少を低下させるのに有効であった。これらの阻害効果は、ポサコナゾールの阻害効果よりも優れていた。化合物(I)の有益な抗真菌効果が、治療的背景において観察されることは、臨床上重要である。
【０１１５】
（参考文献）
【化１６】
2018520104.tif 000035
2018520104.tif 000036
2018520104.tif 000037
【図１】
2018520104.tif 000045
【図２】
2018520104.tif 000046
【図３】
2018520104.tif 000047
【配列表】
2018520104000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月28日(2018.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018520104000001.app
【国際調査報告】
2018520104.tif 000048
2018520104.tif 000049
2018520104.tif 000050