(57)【要約】【課題】本発明は、メチオニンアデノシントランスフェラーゼ（ＭＡＴ）の生物学的活性を測定するための方法および試薬キットを開示した。【解決手段】試料と試薬を一定割合で混合することにより、ＭＡＴ触媒酵素反応が起こり、この反応とその生成物Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の測定のための競合酵素結合免疫吸着アッセイと、段階的にまたは同時に実施することができる。特定のスペクトルにおけるトレーサー酵素の反応生成物の吸光度を測定し、標準生成物の吸光度と比較して単位時間当たりに生成された生成物ＳＡＭの量を計算することによってＭＡＴ生物活性を計算した。ＳＡＭを定量する方法は、トレーサーを抗ＳＡＭ抗体またはＳＡＭまたはＳＡＭアナログ抗原に標識し、競合原理により、生成されたＳＡＭがある量のＳＡＭ抗原と競合的に抗ＳＡＭ抗体と結合する。本発明の方法を使用するキットは、ＭＡＴ活性の決定をより高感度、正確、高い信頼性、直接的、簡単かつ迅速にする。本発明の方法を用いて正常および肝臓癌細胞におけるＭＡＴ活性および異なる調節因子の影響下でのＭＡＴ活性を測定した。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニンアデノシルトランスフェラーゼの生物学的活性を測定する方法であって、抗Ｓ−アデノシルメチオニン特異的抗体の使用を含む、方法。
【請求項２】
メチオニンアデノシントランスフェラーゼの生物学的活性を測定する方法であって、
（１）メチオニンアデノシルトランスフェラーゼの生物学的活性を保証する緩衝系において、酵素を含むサンプルと基質を反応してＳ−アデノシルメチオニンを生成する工程；および
（２）免疫学的方法を利用してＳ−アデノシルメチオニンの含量を検出し、反応系中におけるメチオニンアデノシントランスフェラーゼの活性の有無および活性のレベルを決定する工程；
を含む、方法。
【請求項３】
請求項２に記載のメチオニンアデノシントランスフェラーゼの生物学的活性を測定する方法であって、（１）中の基質が、メチオニン、アデノシン三リン酸、マグネシウムイオン及びカリウムイオン、並びに適切な酸性度が有する緩衝系を含有する、方法。
【請求項４】
請求項２に記載のメチオニンアデノシントランスフェラーゼの生物学的活性を測定する方法であって、（１）中のサンプルが、遺伝子工学的生成物、生物の組織細胞から精製したサンプル、組織細胞内のメチオニンアデノシントランスフェラーゼ、生物体液、または組織細胞培養液であり、前記生物体液は、血液、血漿、血清、唾液、尿、脳脊髄液、腹腔内もしくは胸腔内滲出液、または組織液である、方法。
【請求項５】
請求項２に記載のメチオニンアデノシントランスフェラーゼの生物学的活性を測定する方法であって、（２）中の免疫学的方法が、抗Ｓ−アデノシルメチオニン特異抗体若しくはトレーサー標識抗Ｓ−アデノシルメチオニン特異抗体、Ｓ−アデノシルメチオニン若しくはその類似物又はそれらのコンジュゲート、上述成分の一つでコーティングされた媒体、および対応するトレーサー検出システムを含む、方法。
【請求項６】
請求項２に記載のメチオニンアデノシントランスフェラーゼの生物学的活性を測定する方法であって、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼの触媒反応と、生成物Ｓ−アデノシルメチオニンが（１）コーティングされたＳ−アデノシルメチオニン抗原と競合的にトレーサー標識抗Ｓ−アデノシルメチオニン抗体と結合する、または（２）トレーサー標識Ｓ−アデノシルメチオニン抗原と競合的にコーティングされた抗Ｓ−アデノシルメチオニン抗体と結合する、免疫反応と、同じ反応系において同時に行える、１ステップ法またはステップバイステップ法の原理による方法。
【請求項７】
メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ生物活性を測定するアッセイキットであって、設計により、抗Ｓ−アデノシルメチオニン抗体又はＳ−アデノシルメチオニン抗原若しくはその類似物でコーティングされたマイクロタイタープレート；トレーサー標識抗Ｓ−アデノシルメチオニン抗体又はトレーサー標識Ｓ−アデノシルメチオニン抗原若しくは標識Ｓ−アデノシルメチオニン類似物；Ｓ−アデノシルメチオニン標準品；メチオニン、アデノシン三リン酸及び適切な緩衝液で構成される酵素基質；陽性クオリティコントロール品；トレーサー検出系；及び適切なｐＨな緩衝系；を含める、アッセイキット。
【請求項８】
請求項７に記載のメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ生物活性を測定するアッセイキットであって、前記Ｓ−アデノシルメチオニン抗原でコーティングされたマイクロタイタープレートが、ポリリジン、ウシ血清アルブミン若しくはその他の担体タンパク質に結合されたＳ−アデノシルメチオニン若しくはＳ−アデノシルメチオニン類似体でコーティングされている、または抗Ｓ−アデノシルメチオニン抗体（モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体）で直接的にコーティングされている、若しくはヒツジ若しくはウサギの抗マウス抗体を介して間接的にＳ−アデノシルメチオニンモノクローナル抗体でコーティングされている、アッセイキット。
【請求項９】
請求項７に記載のメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ生物活性を測定するアッセイキットを用いた、サンプル中のメチオニンアデノシントランスフェラーゼの生物学的活性を測定するための方法であって、
（１）異なる濃度の標準品の調製：前記キットのＳ−アデノシルメチオニン標準品を取り、異なる濃度の標準曲線用サンプルを調製する工程；
（２）タンパク質−ＳＡＭ（若しくはＳＡＭ類似体）コンジュゲート又はポリマー−ＳＡＭ（若しくはＳＡＭ類似体）コンジュゲートでコーティングされたマイクロタイタープレートにおいて、標準曲線穴に調製した異なる濃度の標準品を、測定待ちサンプル穴に測定待ちのサンプルを入れる工程；
（３）西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ標識抗Ｓ−アデノシルメチオニンモノクローナル抗体、メチオニン、ＡＴＰ、及び測定待ちのメチオニンアデノシルトランスフェラーゼのサンプルを入れ、ブレンディングした後３７℃で６０分間反応させ、又はまず酵素反応を２０分間反応させた後標識抗体を加え、３７℃で４０分間反応させ、プレートを洗浄する工程；
（４）アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼの基質を加え、３７℃で１５分呈色させた後、停止液を加え反応を停止させ、マイクロプレートリーダー上で、波長４５０ｎｍを選んで各ウェルの吸光度ＯＤ４５０を読み取る工程；
（５）同じマイクロタイタープレートにおいて、調整した一連の量の分かるＳＡＭ標準品を用い、そのＯＤ４５０と既知の標準品濃度により曲線方程式を獲得して、サンプルのＯＤ４５０を方程式に代入し、その対応する反応生成物ＳＡＭの生成量を求める工程；及び
（６）ＭＡＴを含むサンプルが単位時間当たりに触媒して生成した生成物ＳＡＭの濃度からＭＡＴの酵素活性を計算する工程；
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項５、請求項６又は請求項７に記載のトレーサーであって、酵素、フルオレセイン、コロイド金、化学発光物質、ビオチン、ジゴキシン（又はジゴキシゲニン）、放射性標識物質、または種々のタイプのラテックスミクロスフェアである、トレーサー。
【請求項１１】
請求項７に記載の緩衝系であって、濃度範囲２０〜１００ｍＭのマグネシウムイオン、濃度範囲５０〜４００ｍＭのカリウムイオン、及び濃度範囲５０〜２００ｍＭのトリス塩酸を含有し、ｐＨ範囲が７．４２〜８．５である、緩衝系。
【請求項１２】
メチオニンアデノシントランスフェラーゼの生物学的活性を測定するための最適の緩衝系であって、ｐＨが７．４２または８．５の周辺であるトリス塩酸緩衝系で、濃度範囲５０〜１００ｍＭのマグネシウムイオン、濃度範囲５０〜２００ｍＭのカリウムイオン及び濃度範囲１００〜２００ｍＭのトリスを含む、緩衝系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の検出に関し、特に、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）の生物活性の測定の方法及び測定試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生活がホストに依存する寄生物を除き、全ての種の体細胞においてメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（Ｍｅｔｈｉｎｉｎｅ  Ａｄｅｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＭＡＴ、ＥＣ２．５．１．６）（別称：Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ））が存在する。ＭＡＴの遺伝子配列は非常に高い保守性があり、ヒトと大腸菌の間に、ＭＡＴ遺伝子配列が５９％の同源性を有する。哺乳動物において、三つの遺伝子によってコードされる３つのＭＡＴのアイソザイムが存在し、ＭＡＴ−ＩとＭＡＴ−ＩＩＩが、同一の遺伝子（ＭＡＴ１ａ）にコードされる触媒サブユニットα１から構成される。ＭＡＴ−Ｉは四量体であり、ＭＡＴ−ＩＩＩは主に成人肝細胞に存在する二量体である。ＭＡＴ−ＩＩは、別のＭＡＴ遺伝子（ＭＡＴ２ａ）によりコードされる触媒サブユニットα２から構成し、他の細胞、胎児肝臓および肝がん細胞に存在する。ＭＡＴ２β遺伝子は、ＭＡＴ−ＩＩを主に調節する調節サブユニットβをコードする。体内のＭＡＴ触媒反応は２つの段階に分けられる：（１）メチオニン（ＭＥＴ）とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を触媒して、Ｓ−アデノシルメチオニン（活性メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、ＳＡＭ、又はＡｄｏＭｅｔとして知られている）及びトリポリリン酸（ＰＰＰｉ）を生成し、ＳＡＭおよびＰＰＰｉがまだＭＡＴの表面上に残るステップ；および（２）ＭＡＴのホスファターゼ活性で、ＰＰＰｉをさらに二リン酸（ＰＰｉ）と無機単リン酸（Ｐｉ）に分解するステップ。
【０００３】
ＭＡＴは、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）からＳ−アデノシルメチオニンの産生を触媒する。ＭＡＴは、トリホスファターゼ活性を有し、三リン酸をピロリン酸およびリン酸に分解する。その酵素活性はＭｇ2+およびＫ+に依存し、酵素反応は以下の通りである。
【０００４】
【化１】
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【０００５】
ＡＴＰおよびＳＡＭは生物体内の最も一般的な中間代謝産物である。メチオニン回路は、最初にＭｅｔを活性化する必要があり、ＳＡＭを形成し、ＳＡＭが生命プロセスに重要な物質、例えばDAN、ＲＮＡ、リポタンパク質、ホルモン、神経伝達物質などにメチル基を供給して、ホモシステイン（ＨＣＹ）になり、最終的に、テトラヒドロ葉酸によって提供されるメチル基によりメチオニンになる。肝臓では、メチオニン回路は追加的機能を持っており、主に高メチオニン食または高タンパク食の後に、血中の高い濃度のメチオニンを迅速に除去し、最終的にホモシステイン、システイン、シスタチオニン、グルタチオンを経て、他の器官に輸送される。
【０００６】
ＳＡＭは、いくつかの機能は極めて多様かつ重要な硫黄含有生理活性物質の一つで、メチオニンサイクルのキーとなる物質で、人類の重要なメチル化修飾プロセスの中に唯一のメチルドナーである。それは、トランスメチル化、トランススルファレーション、トランスアミド化反応において重要な役割を果たす。メチル化関連細胞機能、ポリアミン合成、およびホモシステインに対するメチオニンの比に直接的な影響がある。様々な生命に関する重要な代謝反応および細胞増殖、分化において非常に重要である。ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼは、ヒトゲノム中の遺伝子の総数の１％を占める。研究によると、肝臓中の特定の濃度のＳＡＭを維持することが、肝機能の機能において重要な役割を果たすことを示している。約８５％のメチル化反応と約５０％のメチオニン代謝は肝臓において完成され、肝臓が（ＭＡＴ−Ｉ／ＩＩＩ活性の増強によって）血液メチオニンレベルを調節する重要な役割を有することだけでなく、ＳＡＭが肝細胞の再生、分化、および様々な要因（アルコール、薬品、放射線、病原性微生物、ウイルス、寄生虫など）による肝細胞損傷への敏感性の調節においての重大な意義を示唆した。よって、異なる状況下でのＭＡＴの生物学的活性及びその産物ＳＡＭの含量の正確、敏感、かつ便利な測定は人々のメチオニンサイクルへの理解を深め、そして異なる組織、臓器の異なる生理学的および病理学的条件下での調節関係に対する重要な研究ツールを提供する。
【０００７】
肝臓炎症または酸化ストレスに起因する肝臓損傷において、ＭＡＴ酵素の部分的な不活性化が観察された。ＭＡＴ１ａ遺伝子は、肝硬変および肝臓癌において全く発現しない。ＭＡＴＩ／ＩＩＩ欠損マウスではＳＡＭのレベルが低下し、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）を欠くマウスではＳＡＭのレベルが上昇した。いずれの場合も、マウスにおける肝臓癌の発生率は有意に増加した。
【０００８】
多くの研究は、ＭＡＴとその触媒的合成産物ＳＡＭが、胚発生、発達、成長、分化、健康、および疾患などのヒトの生活活動の様々な段階で重要な役割を果たすことを示しているが、その原因はＳＡＭがメチオニンサイクルと炭素代謝に非常に重要な特別な役割を持ち、人体の代謝に直接関連しているからである。身体のＳＡＭの含有量は、年齢、性別、人種、体重、食事、投薬状態、健康状態、および病気に基づいて変動する。この特徴を考慮して、我々はＳＡＭの合成および分解の両方から原因を調べるべきである。したがって、さまざまな状況でのＭＡＴの生物学的活性レベルを調べることは、多くの重要な代謝および健康問題を研究するために大きな実用的意義を有する。
【０００９】
ＭＡＴ酵素活性中心は２種類の立体配置があり、第１種の立体配置はＳＡＭ合成に有利であり、第２種の立体配置は３リン酸加水分解活性を有する。第２種の立体配置の酵素反応は、第１種の立体配置より著しく遅い。第１種の立体配置から第２種の立体配置への変換には時間がかかる。２種類の立体配置の違いは、トリホスファターゼおよびニトロシル化に対する感受性にある。
【００１０】
現在、ＭＡＴ活性の測定方法は２つある。方法１：ＭＡＴが飽和濃度のメチオニン、ＡＴＰおよびＰＰＰＩの存在の条件下で、最終的にＰｉを生成し、マラカイトグリーン及びモリブデン酸アンモニウム直接染色により無機リン酸の含量を測定する；方法２：高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）法で、ＭＡＴの触媒的合成産物ＳＡＭの量を測定する。
【００１１】
前記方法１に重大な制限がある：（１）反応系中にＰＰＰｉ、ＰＰｉがＰｉと共存し、マラカイトグリーン及びモリブデン酸アンモニウムはＰＰＰｉおよびＰＰｉにもある程度結合し、Ｐｉの測定値は正確ではない；（２）感度が高くない；（３）ＭＡＴ三リン酸活性を生じるには、立体配置の変化を経る必要があるので、トリホスファターゼの反応生成物Ｐｉの測定には遅延効果があり、間接法で遅延的に産生したＰｉを測定するので、この方法のばらつきは大きい；（４）ＭＡＴのトリホスファターゼ活性は、Ｍｅｔによる影響が大きくて、この方法の安定性が影響される；（５）単にトリホスファターゼの活性によるＭＡＴのＳＡＭ合成能力（または活性）の推定はそれ自体制限があり、おそらくＭＡＴのこれらの２つの活性が非比例で、尚且つ恐らく異なるＭＡＴ活性（ＳＡＭ合成とＰＰＰｉ加水分解）が異なる要因で異なる程度の影響を受ける可能性が高いため、ＭＡＴのホスファターゼ加水分解活性を用いって、ＭＡＴのＳＡＭ合成活性を正確に反映することは困難である。
【００１２】
Ｆｅｒｎaｎｄｅｚ−Ｉｒｉｇｏｙｅｎの報告により、変異体のＭＡＴ−ＩおよびＭＡＴ−ＩＩＩは野生型のＭＡＴ−ＩおよびＭＡＴ−ＩＩＩと比べ、三リン酸加水分解酵素活性とＳＡＭ合成酵素活性のそれぞれの受ける影響が違い、いくつかの変異体のトリホスファターゼ活性が変化しない一方、そのＳＡＭ合成酵素活性が非常に有意に減少した；いくつかの変異体では、ＳＡＭ合成能力が増強された一方、三リン酸加水分解酵素活性が減少した；他の場合には、２つの酵素の活性は様々な程度まで低下した。要するに、様々な可能性が存在する。
【００１３】
Ｓａｎｘｈｅｚ  ｄｅｌ  Ｐｉｎｏらは、ＭＡＴ−ＩＩＩの第１２１位のシステイン残基にＮＯ基を導入し（ニトロソ化）、ＭＡＴのＳＡＭ合成活性が著しく低下したが、トリホスファターゼ活性が阻害されないことを見出した。したがって、Ｐｉを測定することによってＭＡＴの活性を測定することは、ＳＡＭ合成酵素活性およびトリホスファターゼ活性の全体的な結果を反映するだけであり、ＳＡＭを合成するＭＡＴの能力をうまく反映できず、結果は不正確であり、大きな限界がある。
【００１４】
従って、Ｆｅｒｎaｎｄｅｚ−Ｉｒｉｇｏｙｅｎの報告において、ＳＡＭ合成活性は、上記の方法２、すなわち高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法で、生成されたＳＡＭの量を測定した。実際、ＳＡＭの含量を測定するためにＨＰＬＣ法またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法のいずれかが使用されても、ＭＡＴの活性を評価することは非常に不正確である。我々は、ＳＡＭが合成された後しばらくの間ＭＡＴと結合されていることを知っているが、ＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳ  ／ＭＳ法は（１）自由状態のＳＡＭ分子しか測定できない；（２）ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳのサンプルは特別な取り扱いが必要で、長い時間と多くの手順の後では、ＳＡＭ含量の減少が必然である；（３）ＳＡＭの量をタイムリーに測定することができない（ＳＡＭ分子は非常に不安定であり、ＳＡＭをタイムリーに測定する必要がある）。これらのすべての要因で、測定されたＳＡＭの値がかなり不正確であり、ましてや酵素反応速度論を反映する目的を達成することは言うまでもない。
【００１５】
従って、正確、迅速、かつ直接的にメチオニンアデノシルトランスフェラーゼの生物学的活性を測定できる検出方法の開発が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（本発明の目的と要旨）
本発明の目的は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼの生物学的活性を正確、迅速、且つ直接的に測定する方法及びこの方法を利用した試薬キットを提供することである。本発明が関わるワンステップ法または同時法がその合成した産物ＳＡＭの含量を直接測定することは、ＭＡＴ活性測定分野における革新である。ＭＡＴがＳＡＭを合成する唯一の酵素であり、インビボ法またはエクスビボ法にかかわらず、本発明が最も直接的に、速やかにＳＡＭの含有量をその場で測定し、ＭＡＴ活性のレベルを評価できる。試料中のＳＡＭ含量とＭＡＴ活性を、同時に測定することができる。本発明において、ＭＡＴが触媒する生化学反応とＳＡＭを測定する免疫反応と同時に行われ、２つのプロセスが有機的に組み合わされた。これは分子の性状が極めて不安定なＳＡＭを正確に測定するために、特に重要な意義がある。本発明の革新は、特異的な抗Ｓ−アデノシルメチオニン抗体を用いてメチオニンアデノシルトランスフェラーゼの生物学的活性を測定することである。メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ生物学的活性の測定方法は、以下の構成要素を有する：（１）メチオニンアデノシントランスフェラーゼの生物学的活性を保証する緩衝系において、酵素含有試料と基質を反応させて、ある量のＳ−アデノシルメチオニンを生成する；（２）免疫学的方法を使用してＳ−アデノシルメチオニンの含量を測定し、反応系中のメチオニンアデノシントランスフェラーゼの活性の有無およびその活性レベルを測定する。それらの中に：基質は、適切な酸−アルカリ緩衝系においてメチオニン、アデノシン三リン酸、マグネシウムイオン、およびカリウムイオンを含有する；サンプルは、遺伝子操作された製品、生物学的組織細胞からの精製サンプル、組織細胞内のメチオニンアデノシントランスフェラーゼ、生物学的液体（血液、血漿、血清、唾液、尿、脳脊髄液、腹部または胸部の滲出液、組織液など）、または組織細胞培養液であり得る；イムノアッセイ法は、抗Ｓ−アデノシルメチオニンの特異的抗体、各種のトレーサーで結合した抗体、Ｓ−アデノシルメチオニンもしくはその類似体、結合したＳ−アデノシルメチオニン、または結合したその類似体で構成され得る；メチオニンアデノシルトランスフェラーゼの触媒反応で生成したＳ−アデノシルメチオニンは、コートされたＳ−アデノシルメチオニン抗原またはトレーサー標識Ｓ−アデノシルメチオニン抗原と競合的に、トレーサー標識抗Ｓ−アデノシンメチオニン抗体または被覆された抗Ｓ−アデノシルメチオニン抗体と結合する免疫応答が、同時に進行できる１ステップ法原理に基づいている。
【００１７】
従来技術（マラカイトグリーンおよびモリブデン酸アンモニウムの直接染色法による無機リン酸Ｐｉの含量の測定；ＨＰＬＣまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による、ＭＡＴの触媒生成物ＳＡＭの含量の測定）に存在する問題を解決するために、本発明は、試料中のメチオニンアデノシルトランスフェラーゼの生物学的活性を測定するための方法を提供し、１つの方案は以下の工程を含む：
【００１８】
（１）異なる濃度の標準品の調製：試薬キット中のＳ−アデノシルメチオニン標準品を取り、緩衝液で異なる濃度の標準曲線サンプルを調製する工程；
（２）タンパク質（もしくはポリマー）−ＳＡＭ抗原複合体、またはタンパク質（もしくはポリマー）−ＳＡＭ類似体抗原複合体で被覆したマイクロタイタープレートにおいて、標準曲線ウェルに調製した異なる濃度の標準品を入れ、サンプルウェルに試験するサンプルを入れる工程；
（３）セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ標識抗Ｓ−アデノシルメチオニンモノクローナル抗体、メチオニン、アデノシン三リン酸、および測定するメチオニンアデノシントランスフェラーゼのサンプルを添加し、混合後３７℃で６０分間反応させ、反応終了後にプレートを洗浄する工程；
（４）ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ基質を添加し、３７℃で１５分間発色させ、停止液を添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長でウェルの吸光度（ＯＤ４５０）を読み取る工程；
（５）同じ酵素結合プレートで既知の濃度勾配を有する一連のＳＡＭを標準品として標準曲線を作り、それらのＯＤ４５０および既知の標準濃度から曲線方程式を得、次にサンプルのＯＤ４５０を方程式に代入し、対応する反応産物ＳＡＭの生産量を求める工程；
（６）ＭＡＴ試料を含む一定質量のサンプルの単位時間当たりの触媒産物ＳＡＭの生成濃度に基づいてＭＡＴ酵素活性を計算する工程。
【００１９】
前記工程（２）において検出される試料は、遺伝子操作された試料、生物学的組織細胞からの精製試料、生物学的体液、または組織培養液であり得る。
【００２０】
前記工程（３）における３７℃での反応時間は、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、又は９０分でありえる。
【００２１】
先行技術と比較して、本発明の有益な効果は、
１．Ｐｉの代わりに直接的に産物ＳＡＭの含有量を測定でき、ＭＡＴの合成ＳＡＭの能力を直接反映し、ＭＡＴの立体配置の変化の影響を受けない；
２．本発明におけるＳＡＭの生成と測定は、同じシステム内の１ステップで完了し、遅れはなく、その結果は正確でタイムリーである。
３．ＳＡＭの免疫学的アッセイは、特異的であるだけでなく、非常に敏感であり、ＳＡＭの存在形式、つまり結合形式および解離形式によって影響されない。
４．先行技術と比較して、本発明は特殊な器具を必要とせず、従来のマイクロプレートリーダーを利用すれば、検出することができる。
【００２２】
したがって、本発明のキットを使用することにより、ＭＡＴ活性の測定がより正確で信頼性があり、直接的で、簡単で迅速であり、試料中のＭＡＴ活性およびＳＡＭ濃度を同時に得ることができる。
【００２３】
本発明の大きな意義は、研究者がいつでもＭＡＴ酵素活性を簡便かつ正確に測定でき、異なる集団におけるＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ１Ｂ、ＭＡＴ２遺伝子の発現プロファイルの理解、メチオニン回路に関する研究開発作業の詳細な理解、メチオニン代謝、インビボメチル化状態（メチル化プロセス）の解明、様々な状況におけるメチル化メカニズムの議論、エピジェネティクスの詳細な研究、並びに代謝性疾患、腫瘍発生、発生、予後、栄養、疾病、および健康に関する研究およびモニタリングにおいて非常に重要である。さらに、様々な代謝プロセス、例えば、ホモシステイン−システイン−グルタチオンの産生（トランススルフレーションプロセス）およびポリアミン（トランスアミド化プロセス）なども、ＳＡＭの産生に関連する。
【００２４】
本発明の別の目的は、以下の成分を含むメチオニンアデノシルトランスフェラーゼの生物学的活性のアッセイキットを提供する：抗Ｓ−アデノシルメチオニン抗体、又はＳ−アデノシルメチオニン抗原またはその類似体で被覆されたマイクロプレート；トレーサー標識抗Ｓ−アデノシルメチオニン抗体またはトレーサー標識Ｓ−アデノシルメチオニン抗原、もしくは標識Ｓ−アデノシルメチオニン類似体；Ｓ−アデノシルメチオニン標準品；メチオニン、ＡＴＰ、マグネシウムイオンおよびカリウムイオンの緩衝液を含む酵素基質溶液；陽性対照（メチオニンアデノシントランスフェラーゼ）；トレーサー検出系；および適切な緩衝系。その中、前記のＳ−アデノシルメチオニン抗原でコーティングされたマイクロタイタープレートは、ポリリシン（ＰＬＬ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または他のタンパク質キャリアと連結されたＳ−アデノシルメチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン類似物抗原でコーティングされている。または、抗アデノシルメチオニン抗体（モノクローナルおよびポリクローナル）で直接的に、またはヤギまたはウサギ抗マウスによって間接的に抗アデノシルメチオニンモノクローナル抗体でコーティングされている；トレーサは、酵素、フルオレセイン、金コロイド、化学発光物質、ビオチン、ジゴキシン（またはジゴキシゲニンオリジナル）、放射性標識物質、蛍光ラテックス微小球の各種マイクロスフィアおよびカラーラテックスビーズなどを含む；使ったトレーサーに対応する表示システム；取り外し可能なＥＬＩＳＡストリップで構成されたマイクロプレート；基質溶液と緩衝システムについては、反復の試験の後にその各成分の最適濃度、ｐＨ、および反応時間、などを確定する。
【００２５】
本発明の引用された例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づくものであり、即ち：Ｓ−アデノシルメチオニン抗原、またはＳ−アデノシルメチオニンアナログでの被覆；  西洋ワサビペルオキシダーゼなどのトレーサーで標識された特異的抗ＳＡＭ抗体；  Ｓ−アデノシルメチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンアナログの標準品；  ＭＡＴ陽性対照物質；メチオニン、ＡＴＰなどで構成された基質溶液；適切な緩衝系；  ＨＲＰの発色基質ＴＭＢ（３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン）または他のトレーサーのディスプレイまたは検出システム；  ＥＬＩＳＡ停止溶液。本発明の実施例で報告されたメチオニン、アデノシン三リン酸およびメチオニンアデノシントランスフェラーゼの量は、メチオニンの濃度およびアデノシン三リン酸の濃度は、使用されるＭＡＴ活性のレベルに応じて、マイクロモルからミリモルに変化する。基質の交差反応が除去され、各実験に対して対照が設定されるので、ほとんどの場合は基質を過量にすべき、有害作用はない。酵素反応系のｐＨは７．４２−８．５である。ＭＡＴ濃度もまた、供給源によって異なり、この実験室では、大腸菌ＭＡＴ遺伝子発現の精製産物を０．３〜１．０ｍｇ  ／  ｍｌの濃度で使用する。適切な緩衝系には、５０〜１００ｍＭのマグネシウムイオン、５０〜４００ｍＭのカリウムイオン、５０〜２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液系が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の詳細な記述）
先行技術と比較して、本発明の要点は、
１．ワンステップ法または同時法は、すなわち、ＭＡＴ酵素反応と生成した鍵となる産物の定量的プロセスを同時に行い、または最初に、ＭＡＴ触媒化学反応を、約２０分間行い（これは特にＭＡＴ活性が非常に低いサンプルに必要）、次に、定量的産物を免疫反応により検出した。抗原−抗体結合には長い時間がかかるため（一般的に３７℃ＩＨであると考えられる）、免疫反応の間、ＭＡＴ触媒化学反応がまだ進行中である、つまり、新しい産物ＳＡＭ世代が持続的に生成している。したがって、化学反応が最初に行われるかどうかにかかわらず、本発明の要点、すなわち、触媒反応と免疫反応が有機的に組み合わされた設計は矛盾しなく、最良の検出感度を達成するためのバリアントだけである。この目的のために、（１）最も正確な方法、遅延なく動的な変更のＭＡＴ活性を反映し、（２）産物ＳＡＭは非常に不安定で、他の定量的方法はもっと正確に測定できるとしても、最初の時間内に非常に不安定な産物ＳＡＭを測定できなければ、ＭＡＴ酵素活性を効率的、確実かつ正確に計算することができない。
２．最短な時間でサンプル中のＭＡＴ活性とＳＡＭ含量を同時に測定できる。
３．免疫学的方法と生化学的反応とを組み合わせることにより、生化学反応中の物質を効率的に、迅速に、特異的かつ敏感に検出することができる。
４．ワンステップ法または同時法でＭＡＴ活性の変化を敏感に反映できる反応液の組成は、酵素的に触媒される生化学反応が正常に進行することを保証するだけでなく、イムノアッセイ工程を効果的に実施することができる。
【００２７】
インビトロでＭＡＴ活性を直接測定する原理を以下に要約する：ＳＡＭ抗原で被覆された酵素結合プレートに適量のＨＲＰ標識抗ＳＡＭ抗体を添加する。次に、ＳＡＭ試験サンプルとして、ＳＡＭスタンダードまたはＭＡＴ活性測定システム（メチオニンおよびアデノシン三リン酸を含む適切な緩衝液、さらにＭＡＴポジティブコントロールまたは測定されるべきＭＡＴ活性を有するサンプル）を添加した。３７℃で一定時間インキュベートし、ＨＲＰ基質ＴＭＢを添加して発色させ、４５０ｎｍで光学密度を読み取る。ＳＡＭの標準曲線に基ついて、ＳＡＭの含有量が計算され、ＳＡＭの量に応じて、ＭＡＴがＳＡＭを触媒反応で生成する能力が推測される。ＭＡＴサンプルは、遺伝子操作されたＭＡＴ、生物学的組織細胞からの精製組織サンプル、組織細胞内のＭＡＴ、生物体液または組織細胞培養液、血液、血漿、血清、唾液、尿、脳脊髄液  腹腔または胸腔内の滲出液、組織液などの生物体液を含む。
【００２８】
本発明の詳細な技術原理および経路を以下に説明する。
【００２９】
１．ＭＡＴ触媒反応原理：
2018536873.tif 000004
【００３０】
２．直接競合ＥＬＩＳＡでＳＡＭを測定する原理と方法：
（Ａ）抗原コーティング法：ＰＬＬまたはＢＳＡ結合ＳＡＭ抗原を予め固相ＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ＢＳＡでブロックし、試験抗原（ＳＡＭサンプル）およびＨＲＰ結合抗ＳＡＭ抗体を同時に添加する。被検抗原とコーティング抗原は競合して酵素標識抗体と結合する。反応後にプレートを洗い、コーティング抗原に結合する酵素標識抗体が残り、試験抗原（遊離抗原）に結合する酵素標識抗体が洗い流される。最後に、基質を添加して発色させると、最終的な発色結果は検出される抗原の量に反比例し、すなわちＯＤ４５０値が高いほど、測定される試料中のＳＡＭ含量は低くなる。実験の過程で、同じＥＬＩＳＡプレートの中に既知の濃度勾配を有する一連のＳＡＭを標準として使用し、標準曲線を取得する。ＯＤ４５０の読み取り値と既知の標準濃度に基ついて、曲線式が得られ、次に試料のＯＤ４５０を式に代入して対応する濃度値を得る。この直接競合ＥＬＩＳＡの原理を図２に示す。
【００３１】
（Ｂ）抗体コーティング法：マイクロタイタープレートをヤギまたはウサギ抗マウスＩｇＧで４℃一晩コーティングして最良の用量の抗ＳＡＭ抗体を添加して３０〜６０分間インキュベートするか、または最適用量の抗ＳＡＭ抗体で直接コーティングし、プレートを洗浄する；  ＨＲＰコンジュゲートＳＡＭ抗原またはその類似体を添加して、ＳＡＭ標準およびサンプルを添加し、標準およびサンプルは、ＨＲＰ結合ＳＡＭ抗原またはその類似体と競合してプレート上のコーティングされた抗ＳＡＭ特異的抗体と結合し、３０分間インキュベートした後プレートを洗浄する；  ＴＭＢを添加し、１５分間反応させ、停止溶液を加え；  ＯＤ４５０を記録する。標準曲線に従って、試料中のＳＡＭの濃度を計算する。
【００３２】
３．上記触媒反応と直接競合ＥＬＩＳＡを組み合わせて、ワンステップ法または同時アプローチの実現可能性を検討する。この方法の結果を正当化するために、本発明は、以下のステップに分けて、本発明の技術的詳細を詳述する。
【００３３】
第１：抗ＳＡＭ抗体とメチオニンアデノシントランスフェラーゼ基質ＡＴＰおよびＬ−Ｍｅｔとの交差反応を排除することである。競合ＥＬＩＳＡによる交差反応の干渉を避けるため。
【００３４】
第２：異なるｐＨ条件下で、メチオニンアデノシントランスフェラーゼと基質ＡＴＰおよびＬ−Ｍｅｔとの間の最適反応比を探索することである。
【００３５】
第３：ＭＡＴの適切な反応時間を確認し、生成されたＳＡＭ反応の量を測定するための適切な時間を設定する。時間の経過とともにＳＡＭの量の変化の曲線を作成する。種々の抗ＳＡＭモノクローナル抗体１１８−６，８４−３およびウサギ抗ＳＡＭポリクローナル抗体と酵素合成ＳＡＭとの反応を確認した。
【００３６】
第４：最適な反応条件下でマウス肝細胞の精製されたＭＡＴの酵素活性を測定する。
【００３７】
第５：最適な反応条件下で、異なるＭＡＴ調節因子下の正常肝細胞株Ｌ０２および肝細胞ガン細胞株ＨｅｐＧ２におけるＭＡＴ酵素活性の変化を測定する。
【００３８】
第６：異なるコーティング抗原およびＳＡＭ標準を用いて実験し、決定された最適反応条件下で、ＭＡＴの活性測定に対する影響を測定する。
【００３９】
４．各成分の最適濃度、反応時間、緩衝液の配合およびｐＨ値、標準曲線および標準品の範囲を最適化する実験を行う。
【００４０】
上記の技術経路は、以下の実施例において完全に確認されている。上記から明らかなように、本発明に含まれる方法の利点には、以下のものが含まれるが、これに限定されない：（１）二次産物Ｐｉではなく、ＭＡＴの重要な産物ＳＡＭを直接的に測定するので、ＭＡＴのＳＡＭ合成能力の最も直接的な反映である；  ２）ＳＡＭの生成と測定は、同じシステムで一度に１ステップで実行され、異なる条件でＭＡＴ活性の変化を見事に捕捉し、酵素の反応時間をよりよく制御することができきる。従って、結果は非常に正確でタイムリーなものになる；（３）高い特異性、感度および親和性を有する抗ＳＡＭ抗体でＳＡＭ産物をタイムリーに定量することは、特異性だけでなく非常に敏感で、ＳＡＭの存在形式（結合型および解離型）の影響を受けない；（４）簡便で高速であり、したがって、試料中のＭＡＴ活性に対する種々の因子の影響を研究するには非常に便利である。その影響が微妙であったとしても測定することができる。
【００４１】
本発明はまた、ＢＳＡおよびヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合したＳＡＭまたはＳＡＭ抗原類似体でコーティングされたプレート、および直接競合ＥＬＩＳＡ法でＳＡＭの（Ｂ）被覆抗体法を検証し、その結果は実施例中の記載と一致した。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
本発明の実施形態または従来技術における技術的解決策をより明確に説明するために、実施形態または従来技術の説明で使用される図面を以下に簡単に説明する。
【００４３】
【図１】図１は、直接競合ＥＬＩＳＡのステップとコンポーネントの概略図である。図は、抗体ではなく、抗原をプレート上に結合させた例を示す。
【図２】図２は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ濃度、メチオニン基質量、および反応系のｐＨがＳ−アデノシルメチオニンの合成に及ぼす影響を示す。ＳＡＭの合成収率はＡ／Ａ０、即ち、サンプルと対照ウェルのＯＤ４５０の比で表す；Ａ／Ａ０が低いほど、コーティングされた抗原と競合してＨＲＰ標識抗体と結合する能力がより大きくて、より高いＳＡＭ産生量、およびより大きなＭＡＴ活性を表す。
【図３】インビトロでのＭＡＴ活性の直接測定のための最適反応時間の決定。ＭＡＴ酵素が基質を触媒して生成するＳＡＭの量は、６０分前に直線的に上昇する段階にある。６０−９０分の間にＳＡＭの量に有意な変化はなかった。１時間後（ｈ）、基質の濃度が不十分であるか、酵素活性が失われている可能性があり、従って、ＳＡＭの生産量が増加しないことを説明する。１．０ｍｇ／ｍｌの酵素濃度は０．６ｍｇ／ｍｌより反応速度が速かった。
【図４】ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）およびＭｅｔの正常な肝臓細胞系Ｌ０２および肝臓癌細胞系ＨｅｐＧ２細胞における異なるＭＡＴ活性調節。縦座標は、ＭＡＴ合成のＳＡＭ濃度である。Ｌ０２細胞におけるＭＡＴ−Ｉ／ＩＩＩおよびＨｅｐＧ２細胞におけるＭＡＴ−ＩＩの活性は、ＧＳＮＯおよび異なる濃度のＭｅｔによって調節された。Ｌ０２細胞について：５００μＭＭｅｔ刺激ＭＡＴ−ＩＩＩ／Ｉ活性、２ｍＭのＭｅｔ刺激は有意ではなかった。ＭＡＴ−ＩＩＩ／Ｉに対するＧＳＮＯニトロシル化の阻害効果も明らかであった。ＨｅｐＧ２細胞：ＭｅｔはＭＡＴ−ＩＩ活性を阻害し、ＧＳＮＯはＭＡＴ−ＩＩに対して阻害効果を示さない。
【図５−１】０．５ｍＭ  Ｍｅｔで２４時間刺激前後、正常な肝細胞Ｌ０２および肝細胞癌腫ＨｅｐＧ２の抗ＳＡＭモノクローナル抗体１：４００の免疫蛍光染色の結果の比較（ｘ２００）。Ａ：Ｌ０２，０ｎＭ  Ｍｅｔ；  Ｂ：Ｌ０２，０．５ｍＭ  Ｍｅｔ  ２４ｈ；  Ｃ：ＨｅｐＧ２，０ｎＭ  Ｍｅｔ；  Ｄ：ＨｅｐＧ２，０．５ｍＭ  Ｍｅｔ  ２４時間。黒色のバックグラウンドでは、緑色蛍光（明るい色）の陽性細胞はＳＡＭ発現を示し、黒色の背景はＳＡＭ発現がないまたは非常に低いことを示す。ＭｅｔはＬ０２細胞のＭＡＴ−ＩＩＩ／Ｉ活性を刺激し、したがってＢ群ではＡ群と比較してＳＡＭ発現が増加した；逆にＨｅｐＧ２細胞ではＭｅｔがＩＩの活性を阻害し、ＳＡＭ発現はＣ群よりＤ群の方が低い。
【図５−２】０．５ｍＭ  Ｍｅｔで２４時間刺激前後、正常な肝細胞Ｌ０２および肝細胞癌腫ＨｅｐＧ２の抗ＳＡＭモノクローナル抗体１：４００の免疫蛍光染色の結果の比較（ｘ２００）。Ａ：Ｌ０２，０ｎＭ  Ｍｅｔ；  Ｂ：Ｌ０２，０．５ｍＭ  Ｍｅｔ  ２４ｈ；  Ｃ：ＨｅｐＧ２，０ｎＭ  Ｍｅｔ；  Ｄ：ＨｅｐＧ２，０．５ｍＭ  Ｍｅｔ  ２４時間。黒色のバックグラウンドでは、緑色蛍光（明るい色）の陽性細胞はＳＡＭ発現を示し、黒色の背景はＳＡＭ発現がないまたは非常に低いことを示す。ＭｅｔはＬ０２細胞のＭＡＴ−ＩＩＩ／Ｉ活性を刺激し、したがってＢ群ではＡ群と比較してＳＡＭ発現が増加した；逆にＨｅｐＧ２細胞ではＭｅｔがＩＩの活性を阻害し、ＳＡＭ発現はＣ群よりＤ群の方が低い。
【実施例】
【００４４】
（詳細な実施方式）
以下に、実験結果およびデータを参照して、本発明をさらに詳細に説明する。言及されていない原材料は、従来の市販の試薬であり、市場から購入できる。
【実施例１】
【００４５】
抗ＳＡＭ抗体のメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ基質ＡＴＰおよびＬ−Ｍｅｔとの交差反応
【００４６】
（実験材料）
ＨＲＰ結合抗ＳＡＭ抗体：Ａｒｔｈｕｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡ００２０１、ＭＡ００１０２、ＰＡ００２０１，；ポリリジン（ＰＬＬ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ＳＡＭ被覆ＥＬＩＳＡプレート：Ａｒｔｈｕｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＣＴ００２０１、ＡＣＴ００２０４；Ｓ−アデノシルメチオニン（ａｚａ−ＳＡＭ）標準品：Ａｒｔｈｕｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＳＴ００２０１；Ｓ−アデノシルメチオニン（アデメチオニン二硫酸トシル酸塩、ＳＡＭｅ）標準品：シグマ  Ａ２４０８、および陝西パイオニアバイオテクノロジー株式会社の同名試薬；メチオニンアデノシントランスフェラーゼ（ＭＡＴ）、Ｎａ２ＨＰＯ４.２Ｈ2Ｏ：北京愛必信バイオテクノロジー株式会社（ＡＢＸＢＩＯ）、Ａｂｔ−Ｐ−００５；ＢＳＡ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４：北京Ｈｕａｍｅｉ  Ｊｉａｃｈｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．；ＫＣＬ：天津Ｄａｍａｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒｙ；ＭｇＳＯ4：Ｈｕｎａｎ  Ｈｏｎｇｙｉ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ  ．；  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．；アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）：Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｊｉｎｇｊｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ  ．；Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）、ＰｒｏＣｌｉｎ  ３００：Ｓｉｇｍａ；ＴＭＢ呈色液：Ｈｕｚｈｏｕ  Ｙｉｎｇｃｈｕａｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．；硫酸：Ｈｕｎａｎ  Ｋａｎｇｄｕ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．；  ９６ウェル酵素結合プレート：米国Ｃｏｒｎｉｎｇ高吸着酵素結合プレート。
【００４７】
（試薬の調製：）
酵素反応緩衝液：１００ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ＰｒｏＣｌｉｎ  １％、ｐＨ値をｐＨ７．４２、ｐＨ８．０、又はｐＨ８．５に調節した；  ＳＡＭアナログ標準（ａｚａ−ＳＡＭ）：９６０ｎＭ、４８０ｎＭ、２４０ｎＭ、１２０ｎＭ、６０ｎＭ、３０ｎＭ、１５ｎＭ、０ｎＭ、緩衝液はｐＨ７．４２の酵素反応緩衝液を用いた；ＳＡＭアナログ（ａｚａ−ＳＡＭ）の品質管理物：２００ｎＭ、緩衝液はｐＨ７．４２の酵素反応緩衝液；  ＳＡＭ標準物（ＳＡＭｅ）：１−４０  ｕＭ、緩衝液はｐＨ７．４２の酵素反応緩衝液；  ＳＡＭの品質管理物（ＳＡＭｅ）：８ｕＭ、緩衝液はｐＨ７．４２酵素反応緩衝液；  ０．５％または０．２％ＩＢ：１０ｎＭ  ＰＢ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４２緩衝液、０．５％または０．２％ＢＳＡ、０．１％ＰｒｏＣｌｉｎ。
【００４８】
ＰＬＬ−ＳＡＭ抗原コーティングしたＥＬＩＳＡプレート、ＳＡＭ標準曲線用０．５％ＩＢの０、１５、３０、６０、１２０、２４０および４８０ｎＭの標準品、濃度０、１２０、１２００、３９６０および１２０００ｎＭのＡＴＰおよびＬ−Ｍｅｔ交叉物質を用意した。ＨＲＰ希釈液でＨＲＰ−抗ＳＡＭ酵素抗体１：２５０００に希釈した。標準品、交叉アナログＡＴＰおよびＡＤＰウェルあたり３０μｌ、希釈したＨＲＰ−抗ＳＡＭ抗体はウェルあたり７０μｌを入れた。３７℃反応１時間、プレートを洗浄し、１００μｌＴＭＢ、３７℃、１５分で呈色し、５０ｕｌの停止溶液を加えた後、値を読み取った。
【００４９】
結果は次のとおりです。
【００５０】
【表１】
2018536873.tif 000005
【００５１】
反復実験の結果、ＡＴＰ、ＡＤＰおよびＭｅｔの抗ＳＡＭモノクローナル抗体１１８−６，８４−３およびウサギ抗ＳＡＭ多抵抗Ｒ３に対しての交差率は遥かに１％未満であることが示された。抗ＳＡＭ抗体とメチオニン、アデノシン、Ｓ−アデノシルホモシステインおよびメチルチオアデノシンとの交差率もまた遥かに１％未満である（抗体産物データ参照）。したがって、この実験は反応系内の他の成分との交差反応を有さない。
【実施例２】
【００５２】
酵素活性アッセイ系：異なるｐＨ条件下でのメチオニンアデノシルトランスフェラーゼとメチオニン、アデノシン三リン酸の最適反応比
【００５３】
ＰＬＬ−ＳＡＭ抗原コーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用意し、酵素反応緩衝液ｐＨ７．４２、ｐＨ８．０およびｐＨ８．５で異なる濃度のＡＴＰ、ＭｅｔおよびＭＡＴ酵素溶液を調製した。コードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは４つのＭｅｔ濃度とアデノシン３リン酸の組成を表し、コード１、２、３は３つのＭＡＴ酵素濃度であり、これら２つの組み合わせで、濃度が異なる、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼとメチオニンとアデノシン三リン酸の計１２種類の酵素活性測定液を得た。
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【００５４】
反応混合物を各ウェル当たり３０μｌ、ＨＲＰ標識抗体をウェル当たり７０μｌ入れた。反応を３７℃で１時間行い、プレートを洗浄した後、１００μｌのＴＭＢを各ウェルに添加し、３７℃で１５分間呈色した後、５０μｌの停止溶液を加え、結果を読み取った。結果は次のとおりである。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
ＳＡＭの合成収率は、Ａ／Ａ０、すなわちサンプルウェルとコントロールウェルのＯＤ４５０の比で表される。Ａ／Ａ０が低いほど、コーティング抗原と競合してＨＲＰ標識抗体と結合する能力がより大きく、ＳＭの産生量がより高く、ＭＡＴ活性はより大きくなる。結果は次のとおりである。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
得られた反応速度、すなわちＡ／Ａ０とメチオニン濃度とをプロットして図２に示す結果を得た：（１）異なるｐＨ条件下で、基質および酵素の量が一定である場合、ｐＨ８．５の時、Ａ／Ａ０が最小で、ｐＨ８．０の時、Ａ／Ａ０が最も高かった。しかし、ＳＡＭ生成の増加はそれほど印象的ではなかった。（２）基質ＡＴＰが不変（２．４ｍＭ）で、Ｍｅｔが０．２から，０．８，１．６および２．４ｍＭに増加したとき、ＳＡＭ産生は有意に増加した；（３）ＭＡＴ酵素の量が増加したとき、ＳＡＭの生産は急速に増加した。
【００５９】
上記の３つの異なる条件から、ＳＡＭ生成反応に影響を及ぼす最も強い因子はＭＡＴの量であり、次は基質Ｍｅｔの増加で、最小は緩衝液ｐＨである。また、本実験で用いたＭＡＴは大腸菌ＭＡＴ遺伝子の産物であるため、その触媒能はあまり良くないため、必要な基質濃度は高いが、実験ではミリモル濃度のＭｅｔとＡＴＰでも交差反応が起こらなかった。この実験の目的は高度に活性なＭＡＴをスクリーニングすることではなかったため、このＭＡＴはＭＡＴ活性検出法を確立する需要を満たすことができた。ｐＨ８．５のようなアルカリ条件下でのＭＡＴの活性が比較的高いが、抗原−抗体結合はｐＨ７．４２と比較してｐＨ８．５で低下したため、図２中のＡ／Ａ０はｐＨ７．４２およびｐＨ８．５の時が低く（すなわちＳＡＭ合成の量が多いこと）、ｐＨ８．０でより高い（すなわち、ＳＡＭ合成の量は少ない）ことが現れた。したがって、最良のＭＡＴ測定システムでは、さまざまな要因を考慮する必要がある。ｐＨ値は７．４２および８．５を選ぶのは良いだろう。
【実施例３】
【００６０】
ＭＡＴ活性のインビトロ測定の最も好適な反応時間帯の確定
【００６１】
PLL-SAM抗原被覆ELSIAストリップを用意し、pH7.42の酵素反応緩衝液で0、15、30、60、120、240、480、960nMのSAM標準品および200nMの品質管理品を調製した。ATPおよびMet2.4mM、MAT酵素0.6mg/ml、並びにATPおよびMet2.4mM、MAT酵素1.0mg /ml（すべて最終濃度）をSAM基質および酵素の量として調製した。標準品及びおよび酵素試薬はウェル当たり30μlで、HRP標識抗体はウェル当たり70μlであった。37℃で30分、60分、又は90分反応させ、プレートを洗浄した後、100ulのTMBで37℃15分呈色させ、停止液50μlを加えた後、値を読み取った。
【００６２】
【表４】
2018536873.tif 000009
【００６３】
以上の結果から、60分間でのSAM発生量は30分間でのSAM発生量よりも有意に高かったが、90分と60分はほぼ同じであった。20-90分の間、より細かく時間を分けて測定し、時間に対するSAM収率曲線が得られる。
【００６４】
PLL-SAM抗原被覆ELSIAストリップを用意し、pH7.42の酵素反応緩衝液でSAM標準品および品質管理品を調製した。ATPおよびMet2.4mM、MAT酵素0.6mg/ml、並びにATPおよびMet2.4mM、MAT酵素1.0mg /ml（すべて最終濃度）をSAM基質および酵素の量として調製した。標準品及びおよび酵素試薬はウェル当たり30μlで、HRP標識抗体はウェル当たり70μlであった。37℃、表５の時間で反応させ、プレートを洗浄した後、100ulのTMBで37℃15分呈色させ、停止液を加えた後、値を読み取った。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
合成されたSAM濃度および反応時間をプロットして、図３に示す結果を得た。実験結果は、異なる緩衝系および異なるMAT条件下で数回確認された。その結果、MAT酵素が生成するSAMの量は60分前には直線上昇期にあり、60-80分の間には大きく変化しないことが判明し、基質の濃度が十分でないか、または1時間後に酵素活性が失われて、SAM産生量が増えなかった。反応速度は、酵素濃度が0.6mg/mlよりも1.0mg/mlの方が速かった。
【実施例４】
【００６７】
ＭＡＴ活性のインビトロ測定の最も好適な緩衝系
【００６８】
上記と類似のシステムを用いて、０．０５μｇ／ｍｌのＰＬＬ−ａｚａ−ＳＡＭをコーティングし、１：３００００の一次抗体ＨＲＰ−抗ＳＡＭ抗体１１８−６を加え１時間インキュベートし、各溶液のｐＨを７．４０±０．０５、ＡＴＰを５ｍＭ、Ｍｅｔを４ｍＭ、ＭＡＴ酵素を１ｍｇ／ｍｌに設定した。Ｍｇ２＋を滴定するとき、緩衝液は２５０ｍＭのＫＣｌおよび１００ｍＭのＴｒｉｓを含有した。Ｋ＋を滴定するとき、緩衝液は２０ｍＭのＭｇＳＯ4および１００ｍＭのＴｒｉｓを含有した。Ｍｇ２＋およびＫ＋の最適濃度を決定した後、再びトリスを滴定した。その結果を表６に示す。ＭｇＳＯ４は４ｍＭから１００ｍＭまで増加し、Ａ／Ａ０は徐々に０．４７５を減少したが、４〜５０ｍＭで急速に減少し、５０〜１００ｍＭで徐々に減少した。ＭｇＳＯ４濃度の選択は、５０ｍＭ〜１００ｍＭの間では適切である。ＫＣｌが５０〜４００ｍＭの時、Ａ／Ａ０の変化がわずかで、有意な減少および増加の傾向がなかった、約１５０ｍＭを選択した。トリスはまだ１００ｍＭが最高である。
【００６９】
【表６】
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【実施例５】
【００７０】
異なる条件下での正常肝細胞株Ｌ０２および肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２のＭＡＴ活性
【００７１】
実験材料：
無菌ＰＢＳ、０．２５％トリプシン（上海アラジン（Ａｌａｄｄｉｎ）社）、１０％ＦＢＳ（北京Ｙｕａｎｈｅｎｇ  Ｓｈｅｎｇｍａバイオテクノロジー研究所）を含む１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）、無血清ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍｇ／ｍｌ  Ｍｅｔ無菌濃縮物、ＧＳＮＯ、１５ｃｍ２と７５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（ａｂｃａｍ）、ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；トリフェニレンブルーパウダー（Ａｌａｄｄｉｎ社）：
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）：ＮａＣｌ  ８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２．８８５ｇ、ＫＣｌ  ０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２ｇ、超純水１０００ｍｌ；トリプシン（０．２５％トリプシン）：トリプシン０．１ｇ、４％ＥＤＴＡ溶液２００μｌ、１×ＰＢＳ溶液３９．８ｍｌ；トリプシンを完全に溶解させ、０．２μｍの滅菌フィルター（Ｐａｌｌ）で濾過した。
トリパンブルー溶液（４％トリフェニルブルー溶液）：トリフェニルブルー１．６ｇ、超純水４０ｍｌ、濾紙で濾過した。
【００７２】
実験設計を表７に示す。
【００７３】
【表７】
2018536873.tif 000012
【００７４】
実験ステップ：
１．観察フラスコ内の細胞が約８０％のコンフルエントになったら、１０％ウシ胎児血清を含む１６４０培地を除去し、ＰＢＳで洗浄する。
２．２群を採取し１ｍＭ  ＧＳＮＯを含む無血清ＭＥＭ培地を加え、インキュベーターで３０分間処理する。
３．ＧＳＮＯを含む無血清培地を除去し、ＰＢＳで洗浄する。
４．Ｍｅｔを含む無血清ＭＥＭ培地（５％ウシ胎仔血清と２  ｍＭグルタミンを含む）を上記表のパラメーターに従ってフラスコに添加する。対照群にはＭｅｔを含まないＭＥＭを加える。インキュベーター内に２４時間インキュベートする。
５．バイアルから培養液を取り除き、適切な量のトリプシンをフラスコの底を全部覆うように加える。
６．フラスコを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに２〜３分間置き、細胞が脱落し始めると、１０％ＦＢＳを含む１６４０培地５ｍｌを加えて終わらせる。
７．遠心分離後、約１ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、トリパンブルーで計数する。
８．各群の細胞懸濁液１ｍｌを採取し、氷浴中にて超音波で破砕する（実施例５を参照）。上清を１５０００ｇで遠心分離する。
９．実施例３に記載した方法で３７℃で６０分間反応させ、細胞上清中のＭＡＴ活性を測定した。
【００７５】
ＥＬＩＳＡアッセイに使用した各実験群の細胞の量はまったく同じではなかったので、最終的にＬ０２、ＨｅｐＧ２を細胞数２×１０7に計数、調整した。  種々の条件下でＭＡＴによって触媒されるＳＡＭの量を表８および図４に示す。
【００７６】
【表８】
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【００７７】
ヒト正常肝細胞株Ｌ０２は、ＭＡＴ１ａ遺伝子によってコードされる触媒サブユニットα１からなる二量体ＭＡＴ−ＩＩＩまたは四量体ＭＡＴ−Ｉを発現するが、ＨｅｐＧ２肝癌細胞はＭＡＴ２ａ／２ｂ遺伝子によってコードされる触媒サブユニットα２および調節サブユニットβからなる四量体ＭＡＴ−ＩＩを発現する。これらの２つの遺伝子によってコードされる２つのＭＡＴ酵素のＭｅｔ刺激に対する応答、細胞型および役割の発現は同じではない。成人の肝細胞に存在するＭＡＴ−ＩＩＩまたはＭＡＴ−Ｉは、Ｍｅｔ刺激に敏感であり、その機能は、高Ｍｅｔ食餌中に血中のＭｅｔレベルを急速に低下させることであり、したがって、ＭＡＴ−ＩＩＩまたはＭＡＴ−Ｉ活性は、Ｍｅｔ刺激によって増加する［５］。  我々の結果は、５００μＭのＭｅｔがインビトロで２４時間刺激しＭＡＴ−ＩＩＩまたはＭＡＴ−１活性は有意に増加し、ＧＳＮＯニトロ化後のＭＡＴ−ＩＩＩまたはＭＡＴ−Ｉの阻害も有意であった。２ｍＭのＭｅｔは、ＭＡＴ−ＩＩＩまたはＭＡＴ−Ｉ活性に対する刺激効果を示さなくて、かえてＭＡＴ活性をわずかに減少させた。その理由は明らかではなかったが、２ｍＭ  ＭｅｔにおけるＧＳＮＯニトロシル化阻害活性の効果は明らかに残った。対照的に、肝臓癌細胞株においては、ＭｅｔがＭＡＴ−ＩＩ活性を阻害する用量反応関係は、文献報告［１２］と一致し、すなわちＭｅｔ濃度が高いほど、ＭＡＴ−ＩＩの活性が低い。さらに、本発明者らの結果は、ニトロシル化がＭＡＴ−ＩＩに対する極めて弱い効果しかなかった。これは報告されたＧＳＮＯのＮＯがＭＡＴ−ＩＩＩの１２１位でシステインに結合することによりＭＡＴ酵素活性を阻害することと一致する［５］、即ち、ＧＳＮＯが主にＭｅｔ刺激によるＭＡＴ−ＩＩＩ／Ｉの活性増強を阻害する。
【００７８】
競合ＥＬＩＳＡでＳＡＭの定量を行った同時、これらの２つの細胞株の免疫蛍光染色を以下のように行った：
（１）ＨｅｐＧ２およびＬ０２細胞をフラスコから消化、脱落させた。
（２）１０５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含む１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で再懸濁した。
（３）トリパンブルーで計数した後、細胞を２４ウェルに７．５×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、各種細胞を８ウェルに播種した。
（４）２４穴を培地で１  ｍｌ／ウェルに満たし、インキュベーター内に２４時間置いた。
（５）元の培地をウェルから取り出し、表１に従って５％ＦＢＳ  ＭＥＭ培地または５００μＭのＭｅｔを含む上記培地を１ｍｌ／ウェルを添加し、インキュベーター内で２４時間インキュベートした。
（６）プレートを２４時間インキュベーターに入れた後、培地を捨て、３７°Ｃ予め温めたＰＢＳで２回洗浄し、各ウェルに８０％冷アセトンを５００μｌ加え、−２０℃、２０分で固定させ、ＰＢＳで３回洗浄した。
（７）一次抗体の効果：ＰＢＳで０．５％脱脂粉乳を調製し、抗ＳＡＭモノクローナル抗体を１：４００に希釈し、これを５０μＬ／ウェル入れ、３７℃湿潤箱で１時間、ＰＢＳで３回洗浄した。
（８）二次抗体の効果：０．５％スキムミルクでＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ  を１：５００希釈し、各ウェルに５０μＬ入れ、３７℃湿潤箱で４５分、ＰＢＳで（暗所で）５回洗浄した後、通常蛍光顕微鏡観察し、写真撮影した。
（９）０．５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、ジアミジノ−２−フェニルインドール）１００μＬを添加し２０分間で細胞核を染色し、ＰＢＳで５回洗浄した後、共焦点レーザー走査顕微鏡で直接観察し、写真撮影した。
【００７９】
図５は、上記と同様の条件下で、Ｌ０２およびＨｅｐＧ２細胞の０．５ｍＭのＭｅｔで２４時間刺激した後、およびＭｅｔの刺激なしでの免疫蛍光染色の結果の比較を示す。定性的な結果は、０．５ｍＭのＭｅｔが２４ｈ刺激した後、Ｌ０２細胞におけるＳＡＭの合成が増加した。これは、ＭＡＴ−ＩＩＩ／Ｉ活性の増加によるものであった。ＨｅｐＧ２細胞において、ＭｅｔはＭＡＴ−ＩＩ活性を阻害するので、Ｍｅｔ処理群におけるＳＡＭの合成量は減少した。免疫蛍光染色レーザー共焦点顕微鏡の結果は、上記の結果を再度確認した。
【実施例６】
【００８０】
マウス肝臓から精製されたＭＡＴ酵素活性の測定
【００８１】
実験装置：
ＰＰＳタンパク質精製システム（中国科学アカデミー工学研究所）、超音波破砕機（寧波新芝）、高速冷凍遠心分離機（湘立遠心分離機）
【００８２】
試薬調製：
組織ホモジネート：ショ糖０．２５Ｍ、トリス１０ｍＭ、ＥＧＴＡ  ０．１Ｍ、β−メルカプトエタノール０．１％、ｐＨ７．５；緩衝液Ａ：ＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、トリス１０ｍＭ、ｐＨ７．５；緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋６００ｍＭ  ＫＣｌ；透析液：緩衝液Ａ＋７５ｍＭ  ＫＣｌ；  ｐＨ７．４２酵素反応緩衝液：  １００ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ＰｒｏＣｌｉｎ１％、調整ｐＨ７．４２；  ５０％ＤＭＳＯ：緩衝液Ａ＋等容量のＤＭＳＯ。
【００８３】
肝組織ホモジネート：
１．マウスを解剖し、肝臓から結合組織を取り除き、重さが除去された１．５  ｍｌチューブに入れ、肝臓の正味重量を０．６ｇとした。
２．洗浄液が透明になるまで、１ｍｌの生理食塩水で肝臓を３〜５回洗浄した。
３．肝臓を切って清潔な組織ホモジナイザーに入れ、氷浴の組織ホモジネートを肝臓の３倍量に加えた。氷浴で６〜８分間回転して研磨し、十分に粉砕した。  ホモジネートをデカントし、ホモジナイザーに組織ホモジネートを肝重の１倍の容量を添加し、チューブの壁を洗浄して、吸出して、ホモジネートの中に置いた。
４．組織液氷浴を粉砕のために超音波粉砕機に入れ、φ６プローブ、電力８０％、作業時間３秒、休止時間３秒で、３０分間の超音波処理をした。
５．組織液を１５，０００×ｇ、２０分高速冷却遠心分離し、上清を定性濾紙で濾過し合計１５０ｍｌをえた。
６．ホモジナイズした組織液１００ｍｌあたり硫酸アンモニウム３１．３ｇをゆっくり加えて、攪拌しながら、飽和が５０％になるように硫酸アンモニウムを全部で４７ｇ加えた。３０分間撹拌し、６０分間放置した。
７．高速冷却遠心で上清を捨て、沈殿物を予め冷却した透析液１５０ｍｌで溶解し、２Ｌの透析液で透析し、１回透析液を交換した。
【００８４】
ＤＥＡＥカラム処理
１．透析サンプル処理：透析サンプルを取り出し、冷却で高速遠心分離し沈殿を捨て、上清を濾紙でろ過して２３０ｍｌのサンプルを得た。
２．６０ｍｌのＤＥＡＥを取り、カラム（３×２０ｃｍ）を充填し、ＰＰＳクロマトグラフィーシステムにおいて、脱イオン水で１０ｍｌ／分の流速で３０分間すすぎ、透析緩衝液で平衡化した。
３．低速シェーカーを用いてサンプルとフィラーを４℃の冷蔵庫の中に９０分間混合した。
４．カラムを充填し、クロマトグラフィーシステム上において透析バッファーで６ｍｌ／分３０分すすぎ、ＵＶをゼロにセットした。
５．溶出：１００％緩衝液Ｂ２０分、流速６ｍｌ／分で塩を直線勾配で引き上げた。ＵＶモニタリングピークが現れると、それらはピークの終わりまで採取され、チューブ１本につき５ｍｌとなる。計３８本のチューブを集めた。
【００８５】
ＤＥＡＥ溶出サンプルＭＡＴ活性試験：
ＰＬＬ−ＳＡＭ抗原ＥＬＳＩＡプレートを取り、酵素反応緩衝液ｐＨ７．４２  ＡＴＰおよびＭｅｔ  ２ｍＭおよび溶出サンプル５０％でＭＡＴ反応系を調製する。対照としてＡＴＰ＆Ｍｅｔを使用して、各溶離液によって産生されるＳＡＭの量を測定するためにＳＡＭキットを使用した。間接反応ＭＡＴ活性および溶出範囲。活性単位は、ＭＡＴ酵素１ミリグラムあたり１分間に生成されるＳＡＭのｎＭの数として定義される。
【００８６】
【表９】
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【００８７】
表９の反応速度Ａ／Ａ０＜９０％の溶出部分が競合により有意に阻害された。１０−２３試験管からの溶出画分をプールし、一晩透析してフェニルセファロースファストフローカラムに入れるための準備をした。透析後の濃度は５．９８ｍｇ／ｍｌであり、合計７０ｍｌであった。この部分の活性：２８ｎＭ／６０／０．０１５ｍｌ×５．９５ｍｇ／ｍｌ＝５．３Ｕ（ｎＭ／分／ｍｇ）でした。
【００８８】
フェニルセファロースファストフローカラム処理
１．２０ｍｌのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ充填剤で充填し、脱イオン水で１０ｍｌ／分の流速で１０分間すすぎ、緩衝液Ａ＋  ２２０ｍＭ  ＫＣｌで平衡化した。
２．サンプルとフィラーを、低速シェーカーを使用して９０分間、４℃の冷凍庫に混合した。
３．クロマトグラフィーシステムに入れ、ＵＶをゼロ化した。
４．予め冷却した５０％ＤＭＳＯ  ６ｍｌ／分で溶出し、溶出ピークを収集、透析した。
【００８９】
溶出サンプルの検出
上記と同じように、溶出したサンプルを３チューブプールし、１５μｌの負荷および１５ｎＭのＳＡＭ産生で、ＭＡＴ活性についてアッセイした。この画分の比活性は１５ｎＭ／６０／０．０１５ｍｌ×２．９３ｍｇ／ｍｌ＝５．７Ｕ（ｎＭ／分／ｍｇ）。
【００９０】
サンプルの残量が限られているため、それ以上の精製は行われなかった。しかしながら、ＭＡＴ活性は、２ステップカラムクロマトグラフィー成分で測定された。本発明のＭＡＴ活性を測定する方法は、ラット肝臓から精製されたＭＡＴ酵素活性アッセイにも適していることが示唆された。
【実施例７】
【００９１】
異なる操作ステップがＳＡＭ生成に及ぼす影響
【００９２】
産生されたＳＡＭの量に対する異なるステップまたは方法の影響を明らかにするために、最初にＭＡＴ酵素および基質を、先に記載した最適緩衝系および基質濃度を用いてＰＬＬ−ａｚａ−ＳＡＭ被覆プレートにおいて３７℃で２０分間反応させ、続いてＨＲＰ標識抗ＳＡＭ抗体と４０分間反応させた。同時に、ＭＡＴを基質およびＨＲＰ標識抗ＳＡＭ抗体と１時間直接反応させた。結果は、ステップバイステップまたは２ステップ法によって生成されるＳＡＭの量は、ワンステップ法によって生成されるＳＡＭの量よりも高かった。その理由は、最初の２０分間の反応では、システムの総容量はわずか３０ｕｌであり、そのＭＡＴ濃度および基質濃度は理論的にワンステップ法よりも２．３３倍高いからである。表１０は、生成されたＳＡＭの量に対するこれらの２つの異なる操作ステップの効果を比較する。ＭＡＴが低濃度の０．３ｍｇ／ｍｌの場合、２ステップ法で生成されたＳＡＭはワンステップ法で生成されたＳＡＭの２．８１倍であり、ＭＡＴ濃度が０．６ｍｇ／ｍｌの場合には２ステップ法で生成されたＳＡＭはワンステップ法で生成されたＳＡＭの１．７６倍であり、ＭＡＴ濃度を１ｍｇ／ｍｌに増加させると、２ステップ法で生成されたＳＡＭは１ステップ法で生成されたＳＡＭの１．４２倍であった。ＭＡＴが増加し続ける場合、ステップバイステップ法または２ステップ法によって生成されるＳＡＭ量は、１ステップ法のＳＡＭ量と近接するようになることが予測され得る。ＳＡＭ産生の増加（２．８１，１．７６，１．４２倍）は基質濃度およびＭＡＴ濃度（３．３３倍）の増加より小さかったが、ステップバイステップ法はＳＡＭ収量の改善有用であり、特にＭＡＴの濃度または活性が低い場合、ステップバイステップ法の効果および利点がより顕著になる。測定されるサンプルのＭＡＴ活性が高く、異なる条件のグループ間の差異を比較することだけが必要である場合、１ステップ法は、より簡単で便利であり、測定値にほとんど影響を与えない。
【００９３】
【表１０】
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【００９４】
本発明の多数の実施例は、我々の確立されたシステムがＭＡＴの生物学的活性を測定する際に非常に高感度で正確で信頼できることを実証した。この例ではステップバイステップ法を使用したが、ＭＡＴ触媒化学反応を独立した最適環境でより効率的に進行させ、定量的な免疫学的試験を直ちに実施することを目的とした。第２ステップの４０分のイムノアッセイでは、ＭＡＴによって触媒される化学反応は依然進行中であり、新たに生成されたＳＡＭは直ちに競合免疫応答に関与し、したがって、最適なシステム内で生成されたＳＡＭのすべては、トレーサーマーカー標識高度特異的抗ＳＡＭ抗体と競合的に結合することに関与するため、結果は非常に正確であり、様々な原因によりＳＡＭが減少し測定結果が不正確になることはない。したがって、本発明は、両方のアプローチが非常に有用であり、特定の状況に応じて正しく使用され得ることを提案する。
【実施例８】
【００９５】
前述した異なる被覆抗原および標準を用いたＭＡＴ活性の測定
【００９６】
コーティング抗原として１μｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＳＡＭｅを使用した他、標準抗原はコーティング抗原と同じバッチのＳＡＭｅを使用し、抗ＳＡＭ抗体としてＨＲＰ−抗ＳＡＭ８４−３（Ａｒｔｈｕｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＨ００２０２）を使用した。表１１は、１つの実験の結果を示しており、標準物としてＳＡＭｅの直線性は非常に良好であり、０．３ｍｇ／ｍｌの場合、触媒されたＳＡＭは約３μＭと測定された。ＳＡＭアナログａｚａ−ＳＡＭをプレートのコーティング材及び標準アナログとして使用した場合と、ＳＡＭｅをプレートのコーティング材及び標準として使用した場合と、両方がＭＡＴ活性の変化を反映できることを示している。抗体との結合力の差異または他の因子に起因して、同じ光学密度の読みに達するために、必要とされる抗原の量が異なり、２つのシステムの間に測定値及び線形範囲の差異が生じたが、（標準）曲線が線形であり、敏感にＭＡＴ活性の変化を反映できる点については両者が同様である。したがって、本発明に記載の２つの系はどちらも使用することができる。
【００９７】
しかしながら、複数の試験は、本実施例において、ＳＡＭｅをプレートのコーティング材および標準物として使用した結果、実施例１〜７で用いたＳＡＭアナログ抗原および安定な類似体をコーティング材および標準物として使用した方法と比べ、再現性は低く、線形範囲は不安定であった。しかしながら、原料ＳＡＭｅの供給源を限定して、いくつかの関連するプロセスおよび方法を規範化した場合、本例中の解決策も応用できる。
【００９８】
【表１１】
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【００９９】
上記の実施例は、本発明の好適な実施例であるが、本発明の実施形態は上記の実施例に限定されるものではなく、本発明の精神および原理から逸脱することなく行われる他の変更、修正、置換、組み合わせ、および簡略化は、同等の置換方法であり、すべてが本発明の保護範囲に含まれる。
【参考文献】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【国際調査報告】
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