(57)【要約】  抗ＣＸＣＬ１２抗体分子およびその使用、そして特にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＣＸＣＬ１２の生物学的活性を阻害することが可能な抗ＣＸＣＬ１２抗体分子、ならびにＣＸＣＬ１２仲介性疾患を治療するためのその使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＸＣＬ１２に特異的に結合し、そしてＣＸＣＬ１２仲介性生物学的活性を阻害する、単離抗ＣＸＣＬ１２抗体分子であって、抗体分子が、アミノ酸（ａ）Ｐ１０およびＲ１２、ならびに場合によって、Ｅ１５、Ｉ２８、Ｐ３２、Ｎ４５および／またはＫ５４の１またはそれより多く、あるいは（ｂ）Ｐ１０およびＱ４８、ならびに場合によってＫ５４およびＮ４５の１またはそれより多くを含む、配列番号２４に示すようなアミノ酸配列を有するＣＸＣＬ１２のエピトープに結合する、前記抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項２】
ＣＸＣＬ１２誘導性癌細胞増殖阻害、癌細胞遊走阻害、癌細胞接着阻害および／または癌転移阻害より選択される１またはそれより多い生物学的活性を有する、請求項１の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項３】
血管形成阻害の生物学的活性を有する、請求項１または請求項２の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項４】
血管形成がＶＥＧＦ誘導性血管形成である、請求項３の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項５】
ヒトＣＸＣＬ１２に特異的に結合し、そしてＣＸＣＬ１２仲介性生物学的活性を阻害する、単離抗ＣＸＣＬ１２抗体分子であって、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ならびに（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、ならびに（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む、前記抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項６】
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列、または１若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ならびに（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、ならびに（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１７の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３をさらに含む、請求項５の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項７】
ヒトＣＸＣＬ１２に特異的に結合し、そしてＣＸＣＬ１２仲介性生物学的活性を阻害する、単離抗ＣＸＣＬ１２抗体分子であって：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、ならびに（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む、前記抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項８】
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、ならびに（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３をさらに含む、請求項７の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項９】
抗体分子のＣＤＲのアミノ酸配列が、配列番号１〜６または配列番号１２〜１７のいずれか１つに比較した際、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む、請求項５〜８のいずれか一項の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項１０】
ＣＸＣＬ１２に結合し、そして：
１１４＿３Ｈ１  ＶＨドメイン（配列番号７）、ならびに、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、および場合によって配列番号１および配列番号２より選択されるアミノ酸配列を含む１またはそれより多いＶＨ  ＣＤＲを含むＶＨドメイン、からなる群より選択される、抗体ＶＨドメイン；ならびに／あるいは
１１４＿３Ｈ１  ＶＬドメイン（配列番号９）、ならびに、配列番号４、５および６より選択されるアミノ酸配列を含む１またはそれより多いＶＬ  ＣＤＲを含むＶＬドメイン、からなる群より選択される、抗体ＶＬドメイン
を含む、先行する請求項のいずれか一項の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項１１】
ＣＸＣＬ１２に結合し、そして：
１１３＿１Ｈ１２  ＶＨドメイン（配列番号１８）、ならびに、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、および場合によって配列番号１２および配列番号１３より選択されるアミノ酸配列を含む１またはそれより多いＶＨ  ＣＤＲを含むＶＨドメイン、からなる群より選択される、抗体ＶＨドメイン；ならびに／あるいは
１１３＿１Ｈ１２  ＶＬドメイン（配列番号２０）、ならびに、配列番号１５、１６および１７より選択されるアミノ酸配列を含む１またはそれより多いＶＬ  ＣＤＲを含むＶＬドメイン、からなる群より選択される、抗体ＶＬドメイン
を含む、先行する請求項のいずれか一項の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項１２】
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列に、少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列に、少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または（ｃ）（ａ）におけるようなＶＨ配列および（ｂ）におけるようなＶＬ配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に、少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列に、少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、または（ｃ）（ａ）におけるようなＶＨ配列および（ｂ）におけるようなＶＬ配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項１４】
完全抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、イントラボディ、ナノボディ、ディアボディ、トリアボディ、二重特異性抗体およびキメラ抗体である、先行する請求項のいずれか一項の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項１５】
ヒト抗体またはヒト化抗体である、先行する請求項のいずれか一項の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項記載の抗体分子を含む、イムノコンジュゲート。
【請求項１７】
抗体分子が、療法的活性部分、例えば細胞傷害性部分または免疫刺激性部分にコンジュゲート化されている、請求項１６のイムノコンジュゲート。
【請求項１８】
細胞傷害性部分が、アルキル化剤、アルカロイド、白金配位化合物、細胞傷害性ペプチド、放射性剤、または細胞傷害性部分への変換が可能なプロドラッグである、請求項１６または請求項１７のイムノコンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項記載の抗体分子またはイムノコンジュゲートおよび薬学的に許容されうる賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
ヒトまたは動物の身体の治療法において使用するための、請求項１〜１８のいずれか一項記載の抗体分子またはイムノコンジュゲート。
【請求項２１】
ＣＸＣＬ１２仲介性疾患の治療のためである、請求項２０記載の、ヒトまたは動物の身体の治療法において使用するための、抗体分子またはイムノコンジュゲート。
【請求項２２】
ＣＸＣＬ１２仲介性癌の治療法において使用するための、またはＷＨＩＭ症候群の治療のための、請求項１〜１８のいずれか一項記載の抗体分子またはイムノコンジュゲート。
【請求項２３】
ＣＸＣＬ１２仲介性癌がＣＸＣＬ１２を過剰発現する、請求項２２記載の抗体分子またはイムノコンジュゲート。
【請求項２４】
ＣＸＣＬ１２仲介性癌の治療において使用するための薬剤製造における、請求項１〜１８のいずれか一項記載の抗体分子またはイムノコンジュゲートの使用。
【請求項２５】
請求項１〜１８のいずれか一項記載の抗体分子またはイムノコンジュゲートを、治療の必要がある個体に投与する工程を含む、ＣＸＣＬ１２仲介性癌を有する個体を治療する方法。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のいずれか一項の、治療法において使用するための抗体またはイムノコンジュゲート、使用あるいは方法であって、ＣＸＣＬ１２仲介性癌がＣＸＣＬ１２を過剰発現する、前記抗体またはイムノコンジュゲート、使用あるいは方法。
【請求項２７】
請求項２２〜２５のいずれか一項の、治療法において使用するための抗体またはイムノコンジュゲート、使用あるいは方法であって、抗体が、ＶＥＧＦ誘導性血管形成を阻害し、そして／またはＣＸＣＬ１２誘導性癌細胞遊走を阻害する、前記抗体またはイムノコンジュゲート、使用あるいは方法。
【請求項２８】
請求項２２〜２７のいずれか一項の、治療法において使用するための抗体、使用または方法であって、癌が、卵巣癌、乳癌、骨癌、前立腺癌、甲状腺癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、眼内リンパ腫、濾胞中心リンパ腫、ＣＭＬ、結腸直腸癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、神経芽腫、腎臓癌、脳癌、例えば神経膠腫および星状細胞腫、横紋筋肉腫、肺癌、例えば小細胞肺癌、黒色腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えばＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、および白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または急性リンパ芽球性白血病である、前記抗体、使用または方法。
【請求項２９】
請求項２２〜２８のいずれか一項の、治療法において使用するための抗体、使用または方法であって、抗体を、化学療法剤、抗体療法、免疫調節療法、手術と組み合わせて、または放射療法と組み合わせて、または細胞仲介性療法と組み合わせて投与する、前記抗体、使用または方法。
【請求項３０】
請求項２２〜２９のいずれか一項の、治療法において使用するための抗体、使用または方法であって、抗体を血管形成阻害剤と組み合わせて投与する、前記抗体、使用または方法。
【請求項３１】
請求項３０の、治療法において使用するための抗体、使用または方法であって、血管形成阻害剤が、血管形成促進性増殖因子受容体をターゲットとする、抗体またはペプチド−抗体融合体、例えばベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、セツキシマブ（エルビタックス（登録商標））、ラムシルマブ（シラムザ（登録商標））、イクルクマブ、ＨｕＭＶ８３３、２Ｃ３、アフリベルセプト（ザルトラップ（登録商標））およびＩＭＣ−１Ｃ１１；小分子キナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ（ネキサバール（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、パゾパニブ（ボトリエント（登録商標））、エベロリムス（アフィニトール（登録商標））、ＡＥＥ７８８、ＡＡＬ８８１、ＡＡＬ９９３、ＺＤ４１９０、ＡＢＴ−８６９（リニファニブ）、ＰＴＫ７８７（バタラニブ）、ＡＭＧ７０６（モテサニブ）、セディラニブ（レセンチン）、アキシチニブ（インライタ（登録商標））、バンデタニブ（カプレルサ（登録商標））、ＳＵ６６６８、ＺＤ１８３９、テラチニブ、ニンテダニブ（バルガテフ（登録商標））、ブリバニブ・アラニネート、ＢＭＳ−６０５５４１、ＢＭＳ−６４５７３７、ＣＥＰ−７０５５、ドビチニブ、ＣＰ−５４７，６３２、Ｅ７０８０、ＧＷ６５４６５２、ＫＲＮ６３３、チボザニブ、ＯＳＩ−９３０、ＰＤ１７３０７４、ＰＦ−００３３７２１０、ＳＵ１４９８、セマキサニブ（ＳＵ５４１６）、ＳＵ５６１４、ＳＵ１１６５７、ＳＵ１４８１３、ＴＫＩ−２８、ＴＫＩ−３１およびＺＭ３２３８８１；天然血管形成阻害剤、例えばエンドスタチンおよびアンギオスタチン；ならびに血管形成を阻害可能な薬剤、例えばサリドマイド、スクアラミンおよびアンギオザイムより選択される、前記抗体、使用または方法。
【請求項３２】
ＣＸＣＬ１２仲介性状態を有する患者の診断または予後のための方法において使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項記載の抗体分子。
【請求項３３】
請求項３２の、診断または予後のための方法において使用するための抗体分子であって、方法が、抗体を用いて、試料中のＣＸＣＬ１２の存在または量を決定し、そしてＣＸＣＬ１２阻害剤で患者を治療するありうる転帰と、ＣＸＣＬ１２の存在または量を相関させる工程を含む、前記抗体分子。
【請求項３４】
画像化法において使用するための、請求項１〜１８のいずれか一項記載の抗体分子またはイムノコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子およびその使用に、そしてより具体的には、ＣＸＣＬ１２の生物学的活性を阻害することが可能である抗ＣＸＣＬ１２抗体分子、および癌を治療するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ・ケモカイン１２（ＣＸＣＬ１２）はまた、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）としても知られ、ヒトにおいてはＣＸＣＬ１２遺伝子によってコードされるＣＸＣケモカインタンパク質である。該タンパク質は、２つのＧタンパク質共役受容体、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ７に結合することが知られる。該タンパク質は、造血および血管形成を含む、多くの発生および生理学的プロセスに関与する。ＣＸＣＬ１２は、ＣＸＣＲ４依存機構を通じて、骨髄から内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を補充することによって血管形成に役割を果たし、これによって、発癌および腫瘍進行に関連する新規血管形成の重要な因子となっている。遊走は、ＣＸＣＬ１２が腫瘍発展および進行に影響を及ぼす別の重要な方式である。ＣＸＣＬ１２はまた、いくつかの癌の臓器特異的転移にも役割を果たし、ここで受容体ＣＸＣＲ４を発現する癌細胞は、リガンド、ＣＸＣＬ１２を放出する転移ターゲット組織に誘引される。ＣＸＣＬ１２はまた、ＣＸＣＲ４陽性間質細胞を補充するようにも作用し、そして免疫細胞浸潤を制御する。例えば、ＣＸＣＬ１２は制御Ｔ細胞の補充を通じて、免疫抑制環境を産生し、転移前ニッチの形成を補助しうる（Ｚｈａｏら，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １（２）：  １５２−１６１，  ２０１２）。前立腺癌において、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）は、ＣＸＣＬ１２を通じて単球補充およびＭ２極性化に関与する（Ｃｏｍｉｔｏら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ３３：  ２４２３−２４３１，  ２０１４）。高レベルのＣＸＣＬ１２は、膵臓癌モデルにおいて、少数のＴ細胞と関連し、そしてＰＤ−Ｌ１およびＣＸＣＲ４阻害剤での組み合わせ治療を通じて、Ｔ細胞浸潤を増加させることが可能であった。Ｔ細胞浸潤におけるこの増加には、腫瘍体積の有意な減少が付随し、癌の免疫調節におけるＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４軸の役割が強調される（Ｆｅｉｇら，  ＰＮＡＳ，  １１０（５０）：  ｐ２０２１２−２０２１７，  ２０１３）。
【０００３】
ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７経路は、したがって、腫瘍増殖、生存および血管形成におけるその役割を考慮すると、潜在的な療法ターゲットとしてかなりの関心を呼んできた（Ｂａｌｋｗｉｌｌら，  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １４：  １７１−１７９，  ２００４）。
【０００４】
ＷＯ  ２００８／０１８６４１（小野薬品工業およびＭｅｄａｒｅｘ，  Ｉｎｃ．）は、ＳＤＦ−１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を開示し、そして乳癌、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫ならびに自己免疫障害を含む、多様なＢ細胞悪性疾患を治療するためのその医学的使用を提唱する。Ｚｈｏｎｇら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９：  ４４３３−４４４５，  ２０１３；  ＤＯＩ：  １０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１３−０９４３）は、ハムスター・モノクローナル抗体３０Ｄ８のヒト化型を開示し、そして該抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ヒトおよびネズミＣＸＣＬ１２に結合可能であったことを示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ  ２００８／０１８６４１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｚｈａｏら，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １（２）：  １５２−１６１，  ２０１２
【非特許文献２】Ｃｏｍｉｔｏら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ３３：  ２４２３−２４３１，  ２０１４
【非特許文献３】Ｆｅｉｇら，  ＰＮＡＳ，  １１０（５０）：  ｐ２０２１２−２０２１７，  ２０１３
【非特許文献４】Ｂａｌｋｗｉｌｌら，  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １４：  １７１−１７９，  ２００４
【非特許文献５】Ｚｈｏｎｇら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９：  ４４３３−４４４５，  ２０１３；  ＤＯＩ：  １０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１３−０９４３）
【発明の概要】
【０００７】
広く、本発明は、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子のアフィニティ成熟、ならびに該抗体分子が、ＣＸＣＲ４誘導性癌細胞遊走を阻害可能であり、そして／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＶＥＧＦ誘導性血管形成を阻害可能であることを示す、細胞に基づくアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能検証に基づく。これらの特性のため、本発明の抗体分子は、特に転移およびまたは腫瘍血管新生を阻害することによって、癌の治療において使用されることが可能になる。
【０００８】
したがって、第一の側面において、本発明は、ヒト、および場合によってネズミＣＸＣＬ１２に特異的に結合し、そしてＣＸＣＬ１２仲介性生物学的活性を阻害する、単離抗ＣＸＣＬ１２抗体分子であって、抗体分子が、アミノ酸（ａ）Ｐ１０およびＲ１２、ならびに場合によって、Ｅ１５、Ｉ２８、Ｐ３２、Ｎ４５および／またはＫ５４の１またはそれより多く、あるいは（ｂ）Ｐ１０およびＱ４８、ならびに場合によってＫ５４およびＮ４５の１またはそれより多くを含む、配列番号２４に示すようなアミノ酸配列を有するヒトＣＸＣＬ１２のエピトープに結合する、前記抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を提供する。
【０００９】
さらなる側面において、本発明は：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、ならびに（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；そして場合によって（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、ならびに（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を提供する。
【００１０】
さらなる側面において、本発明は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ならびに（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、ならびに（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；そして場合によって（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列、または１若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ならびに（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、ならびに（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１７の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を提供する。
【００１１】
さらなる側面において、本発明は、本明細書に開示するような抗体分子またはイムノコンジュゲートおよび薬学的に許容されうる賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。
さらなる側面において、本発明は、ヒトまたは動物の身体の治療法において使用するための、本明細書に開示するような抗体分子またはイムノコンジュゲートを提供する。
【００１２】
さらなる側面において、本発明は、ＣＸＣＬ１２仲介性状態の治療法において使用するための、本明細書に開示するような抗体分子またはイムノコンジュゲートを提供する。
さらなる側面において、本発明は、ＣＸＣＬ１２仲介性状態の治療において使用するための薬剤製造における、本明細書に開示するような抗体分子またはイムノコンジュゲートの使用を提供する。
【００１３】
さらなる側面において、本発明は、本明細書に開示するような抗体分子またはイムノコンジュゲートを、治療の必要がある個体に投与する工程を含む、ＣＸＣＬ１２仲介性状態を有する個体を治療する方法を提供する。
【００１４】
さらなる側面において、本発明は、ＣＸＣＬ１２仲介性状態を有する患者の診断または予後のための方法において使用するための、本発明の抗体分子を提供する。例えば、該方法は、抗体を用いて、試料中のＣＸＣＬ１２の存在または量を決定し、そしてＣＸＣＬ１２阻害剤で患者を治療するありうる転帰と、ＣＸＣＬ１２の存在または量を相関させる工程を含む。
【００１５】
本発明の医学的使用および治療法において、好ましくは、ＣＸＣＬ１２仲介性状態は、癌および／または免疫細胞遊走および／または転移を含む、癌である。本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを用いて治療可能な癌のタイプには、卵巣癌、乳癌、骨癌、前立腺癌、甲状腺癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、眼内リンパ腫、濾胞中心リンパ腫、ＣＭＬ、結腸直腸癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、神経芽腫、腎臓癌、脳癌、例えば神経膠腫および星状細胞腫、横紋筋肉腫、肺癌、例えば小細胞肺癌、黒色腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えばＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、および白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病が含まれる。他の態様において、本発明は、ＷＨＩＭ症候群の治療のために使用可能である。
【００１６】
他の使用において、本発明を、ＣＸＣＬ１２シグナル伝達が関与する状態の治療のために、小分子ＣＸＣＲ４阻害剤（プレリキサフォル、ＡＭＤ３１００）の使用と同様に、例えば細胞可動化、例えば骨髄における幹細胞可動化、例えば細胞移植のための調製において、使用することも可能である。
【００１７】
本発明の態様は、ここで、付随する図を参照しながら、例として、そして限定ではなく記載されるであろう。しかし、本発明の多様なさらなる側面および態様は、本開示を考慮して、当業者には明らかであろう。
【００１８】
本明細書で使用する「および／または」は、他のものを含むまたは含まない、２つの明記する特徴または構成要素の各々の特定の開示として解釈されるものとする。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、ちょうど各々が本明細書に個々に示されるように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特定の開示として解釈されるものとする。
【００１９】
文脈が別に指示しない限り、上に示す特徴の説明および定義は、本発明のいかなる特定の側面または態様にも限定されず、そして記載するすべての側面および態様に等しく適用される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】抗ＣＸＣＬ１２抗体を発現するために用いたベクター系。Ａ）ｐＳＡＮＧ１０−３Ｆベクターを用いた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）発現。このプラスミド中、ｓｃＦｖ遺伝子の転写は、バクテリオファージＴ７プロモーターの調節下にある。制限部位ＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩは、可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）遺伝子をＦａｂおよびＩｇＧ発現ベクター内にサブクローニングすることを容易にする。Ｂ）ｐＢＩＯＣＡＭ−７ベクターを用いた、Ｆａｂ抗体発現。このプラスミドは、ＣＭＶプロモーターの調節下で、二シストロン性Ｆａｂ発現カセットを含有する。重鎖および軽鎖遺伝子間に存在するＰ２Ａ配列は、リボソームスキップ機構によって、その下流の抗体重鎖ポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１）の放出を可能にする。Ｐ２Ａペプチドは、フューリン切断によって、抗体軽鎖から翻訳後に除去される。Ｃ）ｐＢＩＯＣＡＭ１−２二重プラスミド系を用いたＩｇＧ発現。重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−Ｃｈ３）および軽鎖発現カセットは、２つの異なるプラスミド中に位置する。プラスミドｐＢＩＯＣＡＭ−１は軽鎖遺伝子をコードし、そしてｐＢＩＯＣＡＭ−２は重鎖カセットをコードする。抗体遺伝子の転写は、両プラスミド中のＣＭＶプロモーターの調節下にある。ｐＳＡＮＧ１０−３ＦおよびｐＢＩＯＣＡＭ７において、抗体遺伝子に融合されたヘキサヒスチジン（６ｘ−Ｈｉｓ）およびトリＦＬＡＧタグは、発現された抗体の精製および免疫検出を可能にする。
【図２】抗ＣＸＣＬ１２  ＦａｂおよびＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。リード抗ＣＸＣＬ１２抗体およびその親クローンを、ＦａｂおよびＩｇＧとしてＨＥＫ−２９３細胞中で発現させた。ＳＹＰＲＯ（登録商標）レッド染色を用いて、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、アフィニティ精製抗体を可視化した。クローン０９３＿２Ｄ０６、０９３＿２Ａ０２、１１４＿３Ｈ１（１１４＿３Ｈ０１と表示）および１１３＿１Ｈ１２をそれぞれ、Ｆａｂ（レーン１〜４）およびＩｇＧ（レーン５〜８）として装填した。Ｆａｂ調製のいくつかにおけるＶＨ−ＣＨ１バンドのスメアは、Ｆｌａｇタグ付けタンパク質においてしばしば起こる、ＦＬＡＧタグの切断による可能性があった。
【図３−１】ＳＰＲを用いた抗ＣＸＣＬ１２抗体のアフィニティ測定。Ａ）ストレプトアビジンチップ（ストレプトアビジンをあらかじめ固定させたカルボキシメチル化デキストランマトリックス）上に固定されたビオチン化ＣＸＣＬ１２へのリードおよび親抗ＣＸＣＬ１２  Ｆａｂの多数の濃度のセンソグラム。Ｂ）１：１ラングミュア結合モデルを用いて、１１４＿３Ｈ１（１１４＿３Ｈ０１と表示）の結合定数を決定した。オフ速度が非常に速いため、定常状態結合モデルを用いて、親クローン０９３＿２Ｄ０６の平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。Ｃ）抗体１１３＿１Ｈ１２およびその親クローン０９３＿２Ａ０２は、二相結合プロファイルを示した。２状態結合モデルを用いて、これらの抗体の結合定数を決定した。すべての計算のため、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアを用いた。
【図３−２】ＳＰＲを用いた抗ＣＸＣＬ１２抗体のアフィニティ測定。Ａ）ストレプトアビジンチップ（ストレプトアビジンをあらかじめ固定させたカルボキシメチル化デキストランマトリックス）上に固定されたビオチン化ＣＸＣＬ１２へのリードおよび親抗ＣＸＣＬ１２  Ｆａｂの多数の濃度のセンソグラム。Ｂ）１：１ラングミュア結合モデルを用いて、１１４＿３Ｈ１（１１４＿３Ｈ０１と表示）の結合定数を決定した。オフ速度が非常に速いため、定常状態結合モデルを用いて、親クローン０９３＿２Ｄ０６の平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。Ｃ）抗体１１３＿１Ｈ１２およびその親クローン０９３＿２Ａ０２は、二相結合プロファイルを示した。２状態結合モデルを用いて、これらの抗体の結合定数を決定した。すべての計算のため、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアを用いた。
【図４】卵巣癌細胞のＣＸＣＬ１２誘導性遊走。Ａ）上部チャンバー中の蛍光標識ヒト卵巣癌細胞（ＴＯＶ−２１Ｇ）および下部チャンバー中のＣＸＣＬ１２を、コラーゲンコーティングした多孔性膜によって分離した。膜を渡る細胞の遊走を、蛍光スキャンによって定量化した。Ｂ）細胞遊走を誘導するために最適であるヒトＣＸＣＬ１２濃度を、ＣＸＣＬ１２の用量設定（２０〜１２００ｎｇ／ｍｌ）によって決定した。阻害アッセイにおいて、細胞遊走を刺激するために、８０ｎｇ／ｍｌ  ＣＸＣＬ１２を選択した。すべてのエラーバーは標準偏差に相当する。
【図５】抗ＣＸＣＬ１２抗体による癌細胞遊走の阻害。蛍光スキャンを用いて、ＣＸＣＬ１２に向かう蛍光標識ＴＯＶ−２１Ｇ細胞のトランスウェル遊走を定量化した。０．３９〜５００ｎＭの範囲の１１４＿３Ｈ１（１１４＿３Ｈ０１と表示）および１１３＿１Ｈ１２  ＩｇＧの用量設定を、下部チャンバーにおいて、８０ｎｇ／ｍｌ（１０ｎＭ）ヒトＣＸＣＬ１２と混合して、ＣＸＣＬ１２誘導性遊走に対するこれらの抗体の影響を試験した。抗リゾチーム抗体（５００ｎＭ）をアイソタイプ対照として用いた。すべてのエラーバーは、標準偏差に相当する。
【図６Ａ】抗ＣＸＣＬ１２抗体による血管形成の阻害。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ゼラチンコーティングチャンバースライド上で６日間増殖させた線維芽細胞上にプレーティングした。これらの２つの細胞タイプを、ＶＥＧＦ、ならびにリード抗ＣＸＣＬ１２抗体１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２を含有する培地中で、７日間共培養した。リゾチームに結合するＩｇＧ（非特異的ＩｇＧ）をアッセイのアイソタイプ対照として用いた（パネルＡ）。共培養７日後、細胞を血小板／内皮接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１、血管形成のマーカー）に関して染色して、光学顕微鏡検査によって、細管の形成および分枝を視覚化した。ＡｎｇｉｏＳｙｓ画像分析ソフトウェアを用いて、細管総数、分枝接合部数（図６Ａ）、および細管全長（図６Ｂ）を計算した。
【図６Ｂ】抗ＣＸＣＬ１２抗体による血管形成の阻害。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ゼラチンコーティングチャンバースライド上で６日間増殖させた線維芽細胞上にプレーティングした。これらの２つの細胞タイプを、ＶＥＧＦ、ならびにリード抗ＣＸＣＬ１２抗体１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２を含有する培地中で、７日間共培養した。リゾチームに結合するＩｇＧ（非特異的ＩｇＧ）をアッセイのアイソタイプ対照として用いた（パネルＡ）。共培養７日後、細胞を血小板／内皮接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１、血管形成のマーカー）に関して染色して、光学顕微鏡検査によって、細管の形成および分枝を視覚化した。ＡｎｇｉｏＳｙｓ画像分析ソフトウェアを用いて、細管総数、分枝接合部数（図６Ａ）、および細管全長（図６Ｂ）を計算した。
【図７】ＣＸＣＬ１２抗体１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２の重鎖および軽鎖配列整列。
【図８】ＣＸＣＬ１２抗体１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２の重鎖および軽鎖配列整列とＷＯ  ２００８／０１８６４１の抗体との配列整列
【図９】ＡおよびＢ。抗体（ヒトＩｇＧ２形式の１１３＿１Ｈ１２（ｈＡＢ１１３）、キメラネズミＩｇＧ２ａ形式の１１３＿１Ｈ１２（ｍＡＢ１１３）、およびキメラネズミＩｇＧ２ａ形式の１１４＿３Ｈ１（ｍＡＢ１１４））が、ヒトＣＸＣＬ１２の存在下でのネズミ転移性黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）およびヒト卵巣癌細胞株（ＴＯＶ−２１）の遊走をブロッキングする際の有効性を決定するための実験の結果を示す遊走トラック。
【図１０】肺への遊走および転移の開始のためにＣＸＣＲ４を必要とするＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞に基づく、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験転移モデル細胞遊走の結果。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を、第０日、尾静脈注射を通じて、Ｃ５７Ｂｌマウス内に導入し、そして治療を第１日に開始した。治療措置は、毎日２回の臨床的ＣＸＣＲ４阻害剤、ＡＭＤ３１００（プレリキサフォル）５ｍｇ／ｋｇか、あるいは週２回のキメラネズミＩｇＧ２ａ形式の抗ＣＸＣＬ１２抗体の１０、１５または２０ｍｇ／ｋｇのいずれかであった。対照アームのマウスを、２０ｍｇ／ｋｇの対照抗体で週２回処置した。すべてのマウスを第１４日に処分し、そして肺中の転移コロニーの数を定量化した。１１３＿１Ｈ１２の２０ｍｇ／ｋｇ用量で、ＡＭＤ３１００のものに同等な阻害レベルが達成された。
【図１１】本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体が、ｓｃＦｖ−ＦｃおよびヒトＩｇＧ２形式のヒトＣＸＣＬ１２によって誘導されたＴＯＶ２１Ｇ癌細胞の遊走をブロッキングすることを示す、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞トランスウェル遊走アッセイの結果。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
抗ＣＸＣＬ１２抗体分子
別に言及しない限り、抗体残基は、本明細書において、Ｋａｂａｔ番号付けスキームにしたがって番号付けされる。
【００２２】
ＣＸＣＬ１２の全長アミノ酸配列を配列番号２３として示し、そしてこれは８９アミノ酸からなる。例示する抗体を選択するために用いた合成６８アミノ酸ＣＸＣＬ１２断片のアミノ酸配列を、配列番号２４に示す。以下の実施例に記載するエピトープマッピング研究は、配列番号２５に示すアミノ酸配列を有する野生型成熟ＣＸＣＬ１２ポリペプチドを用い、これはポリヒスチジンタグおよびリンカー配列を含む。好ましくは、本発明の抗体分子は、配列番号２３に示すようなアミノ酸１〜６８、または生物学的に活性であるその断片に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＸＣＬ１２ポリペプチドに結合することが可能である。本発明の抗体分子またはイムノコンジュゲートの生物学的活性の例には、例えばＣＸＣＲ４とＣＸＣＬ１２の相互作用、および場合によってまたＣＸＣＲ７とＣＸＣＬ１２の相互作用をブロッキングする、ＣＸＣＬ１２への結合が含まれる。さらに、本発明の抗体分子またはイムノコンジュゲートによって阻害（アンタゴナイズ）されうるＣＸＣＬ１２の生物学的活性には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＶＥＧＦ誘導性血管形成の阻害ならびに／あるいはＣＸＣＬ１２誘導性癌細胞遊走および／または伝播および／または転移の阻害が含まれる。本発明の抗体分子またはイムノコンジュゲートはまた、免疫細胞浸潤を制御する際のＣＸＣＬ１２の役割も阻害しうる。癌細胞遊走および転移を決定するためのアッセイを本明細書の実施例に記載する。
【００２３】
以下の実施例に詳細に記載するように、一次抗ＣＸＣＬ１２抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティ成熟を２つの工程で行った。最初に、一次抗体配列を、軽鎖シャッフリングによって多様化させて、誘導体ライブラリーを生成した。次に、それぞれに合わせた選択およびスクリーニング法を用いて、軽鎖シャッフリングライブラリーからアフィニティ改善変異体を同定した。一次抗ＣＸＣＬ１２抗体を多様化させるために軽鎖シャッフリングを用いる理論的根拠は以下の通りであった。ｉｎ  ｖｉｖｏ（免疫前Ｂ細胞レパートリー）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙライブラリー」）での未刺激（ｎａｉｖｅ）免疫レパートリーの元来の多様性は、生殖系列可変遺伝子セグメントのコンビナトリアル再編成に由来する。軽鎖可変領域（ＶＬ）は、長いＶ遺伝子セグメントおよび短い連結（Ｊ）遺伝子セグメントの組み合わせによってコードされる。対照的に、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする遺伝子は、３つの遺伝子セグメント、Ｖセグメント、Ｊセグメント、および多様性（Ｄ）セグメントから組み立てられ、そしてしたがって、２つの可変鎖のうち、より多様である。特にＣＤＲ３領域での、この増加した多様性のため、ＶＨドメインは、抗原結合において、そしてエピトープ特異性定義において、支配的な役割を果たす傾向がある。ＶＬドメインもまた結合アフィニティおよび抗体発現レベルを微調整する際に寄与するため、望ましい発現特性を持つ高アフィニティ抗体を同定するために、ライブラリー中に可能な限り多くのＶＨ−ＶＬの組み合わせを有することが重要である。以下の実施例において、２０の抗ＣＸＣＬ１２抗体の重鎖可変領域と、カッパおよびラムダ軽鎖可変ドメインのレパートリーを組み合わせることによって、２ｘ１０８の軽鎖シャッフリングライブラリーを生成した。したがって、元来の重鎖各々は、およそ１０００万の新規軽鎖パートナーと対形成した。ファージディスプレイ選択３ラウンドを、ストリンジェントな条件下で行って、鎖シャッフリングライブラリーから、高アフィニティ結合剤に関して濃縮した。抗原濃度を減少させるか、またはより厳しいおよびより長い洗浄工程を用いるかによって、選択条件のストリンジェンシーを各ラウンドで増加させた。こうした選択法は、より低い解離定数を持つ抗体クローンの優先的な濃縮を容易にする。
【００２４】
溶液相において、アフィニティ成熟選択を行い、選択のストリンジェンシーを決定する際に重要なパラメータである、抗原濃度の正確な調節を可能にする。このプロセスで同定された、最低の解離定数を示す２つの抗体（１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２）を、詳細な特徴付けおよび最適化のためのリード抗体として選択した。１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２ならびにその親クローン（それぞれ、０９３＿２Ｄ０６および０９３＿２Ａ０２）の完全な動力学的分析によって、軽鎖シャッフリング後のアフィニティ改善を確認した。１１４＿３Ｈ１に関する１ｎＭの計算アフィニティは、その親抗体０９３＿２Ｄ０６（ＫＤ＝３．８μＭ）より３８００倍の改善に相当する。もう一方の親抗体０９３＿２Ａ０２のアフィニティ（ＫＤ＝１６．７ｎＭ）は、初めから比較的高く、その娘クローン、１１３＿１Ｈ１２に対するアフィニティ改善は、ＫＤ＝３．７ｎＭを導いた。
【００２５】
結合および動力学的研究に加えて、細胞に基づく機能アッセイにおいて、抗体分子の生物学的特性を試験して、ありうるｉｎ  ｖｉｖｏ強度を決定したが、これは、特に、抗体分子が複雑な生物学的機能を調節するように意図される場合、これが必ずしも結合と相関しないためである。癌転移および腫瘍支持血管系の確立におけるＣＸＣＬ１２の役割を考慮して、本発明の抗体分子の生物学的特性には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＸＣＬ１２誘導性癌細胞遊走の阻害および／またはＶＥＧＦ誘導性血管形成の阻害が含まれる。
【００２６】
トランスウェル遊走アッセイを用いて、ＣＸＣＬ１２誘導性癌細胞遊走を阻害する生物学的特性を決定することも可能であり、本明細書で用いるこのアッセイは、白血球の走化性反応を研究するために用いられたボイデンチャンバーアッセイ（Ｂｏｙｄｅｎ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １１５，  ４５３−４６，  １９６２）の修飾型であって、上部チャンバーに植え付けられた蛍光標識癌細胞、例えばヒト卵巣癌細胞ＴＯＶ−２１Ｇの、多孔性膜を渡り、そしてＣＸＣＬ１２を含有する下部チャンバー内への遊走を決定する。
【００２７】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および線維芽細胞を、抗ＣＸＣＬ１２抗体およびＶＥＧＦを含有する培地中で一緒に培養する、細胞に基づくアッセイを用いて、血管形成を阻害する生物学的特性を決定することも可能である。ＶＥＧＦの存在下でのこれらの２つの細胞タイプの相互作用は、ｉｎ  ｖｉｖｏの小さい毛細血管に似た三次元チューブの形成を生じる。Ｈｅｔｈｅｒｉｄｇｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ３９，  １５９７−１６００，  ２０１１）を参照されたい。
【００２８】
機能的特性を評価するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ癌細胞遊走アッセイおよび血管形成アッセイを用いて、２つのリード抗体、１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２を試験した。どちらの抗体も、卵巣癌細胞のＣＸＣＬ１２誘導性遊走を阻害し、１１４＿３Ｈ１が１１３＿１Ｈ１２を上回った。どちらの抗体に関しても、このアッセイで観察されるＩＣ５０は、ＳＰＲ分析から計算されるＫＤ値に匹敵した。さらに、抗体クローン１１３＿１Ｈ１２は、ＶＥＧＦ誘導性血管形成を有意に阻害し、一方、抗体クローン１１４＿３Ｈ１は、ＶＥＧＦ誘導性血管形成を部分的に阻害した。
【００２９】
特定の理論によって束縛されることは望ましくないが、抗体特性のこの相違は、ＣＸＣＬ１２がＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ７の両方との相互作用を通じて血管形成を誘導しうる事実の結果である可能性もある。したがって、１１４＿３Ｈ１はＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４相互作用のみをブロッキングするが、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ７をブロッキングせず、血管形成の部分的阻害を生じることが可能でありうる。対照的に、１１３＿１Ｈ１２は、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ７両方へのＣＸＣＬ１２結合をブロッキングし、ＣＸＣＬ１２誘導性血管形成のより優れた阻害を導く可能性もある。
【００３０】
したがって、本発明は、抗体クローン１１３＿１Ｈ１２または１１４＿３Ｈ１に基づく抗体分子を提供する。
１つの側面において、本発明は、抗体１１４＿３Ｈ１のＣＤＲ配列に基づく以下のＣＤＲ配列：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；ならびに／あるいは
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；ならびに／あるいは
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；ならびに／あるいは
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；ならびに／あるいは
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２；ならびに／あるいは
（ｆ）配列番号の６アミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３
の少なくとも１、２、３、４、５、または６を含む、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を提供する。
【００３１】
１つの態様において、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子は、場合によって１またはそれより多いアミノ酸置換、欠失または挿入を含む、上に定義するような６つのＣＤＲすべてを含む。
さらなる側面において、本発明は、抗体１１３＿１Ｈ１２のＣＤＲ配列に基づく以下のＣＤＲ配列：
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；ならびに／あるいは
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；ならびに／あるいは
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；ならびに／あるいは
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列、または１若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；ならびに／あるいは
（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２；ならびに／あるいは
（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列、または１、２、３若しくはそれより多いアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含む配列番号１７の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３
の少なくとも１、２、３、４、５、または６またはそれより多くを含む、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を提供する。
【００３２】
１つの態様において、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子は、場合によって１またはそれより多いアミノ酸置換、欠失または挿入を含む、上に定義するような６つのＣＤＲ（配列番号１２〜１７）すべてを含む。
【００３３】
軽鎖可変領域（ＶＬ）は、長いＶ遺伝子セグメントおよび短い連結（Ｊ）遺伝子セグメントの組み合わせによってコードされる。対照的に、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする遺伝子は、３つの遺伝子セグメント、Ｖセグメント、Ｊセグメント、および多様性（Ｄ）セグメントによって組み立てられ、そしてしたがって、２つの可変鎖よりもより多様である。特にＣＤＲ３領域での、この増加した多様性のため、ＶＨドメインは、抗原結合において、そしてエピトープ特異性定義において、支配的な役割を果たす傾向がある。
【００３４】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、場合によって、各々１、２、３またはそれより多いアミノ酸置換、欠失または挿入を含む、本明細書に定義するような例示する抗体の重鎖のＣＤＲを、異なる抗体分子由来の軽鎖と組み合わせて含む、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を提供する。
【００３５】
さらなる側面において、本発明は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号３より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む、抗ＣＸＣＬ１２抗体を提供する。
【００３６】
さらなる側面において、本発明の抗体分子は、配列番号７に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むＶＨドメインを含む。いくつかの態様において、ＶＨ配列は、参照配列に対して、１またはそれより多い置換、挿入、または欠失を含む一方、抗体分子はＣＸＣＬ１２への結合の特性、そして場合によって本明細書に記載するような本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の１またはそれより多くの他の生物学的活性を保持する。好ましくは、ＶＨドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号３より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３より選択される１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含む。
【００３７】
さらなる側面において、本発明の抗体分子は、配列番号９に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの態様において、ＶＨ配列は、参照配列に対して、１またはそれより多い置換、挿入、または欠失を含む一方、抗体分子はＣＸＣＬ１２への結合の特性、そして場合によって本明細書に記載するような本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の１またはそれより多くの他の生物学的活性を保持する。好ましくは、ＶＬドメインは、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３より選択される１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含む。
【００３８】
いくつかの態様において、本発明の抗体分子は、配列番号７に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号７に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むＶＨドメイン、および配列番号９に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号９に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むＶＬドメインを含む。
【００３９】
さらなる側面において、本発明は、（ａ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１４より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む、本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体を提供する。
【００４０】
さらなる側面において、本発明の抗体分子は、配列番号１８に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むＶＨドメインを含む。いくつかの態様において、ＶＨ配列は、参照配列に対して、１またはそれより多い置換、挿入、または欠失を含む一方、抗体分子はＣＸＣＬ１２への結合の特性、そして場合によって本明細書に記載するような本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の１またはそれより多くの他の生物学的活性を保持する。好ましくは、ＶＨドメインは、（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１４より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３より選択される１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含む。
【００４１】
さらなる側面において、本発明の抗体分子は、配列番号２０に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの態様において、ＶＨ配列は、参照配列に対して、１またはそれより多い置換、挿入、または欠失を含む一方、抗体分子はＣＸＣＬ１２への結合の特性、そして場合によって本明細書に記載するような本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の１またはそれより多くの他の生物学的活性を保持する。好ましくは、ＶＬドメインは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３より選択される１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含む。
【００４２】
いくつかの態様において、本発明の抗体分子は、配列番号１８に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号１８に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むＶＨドメイン、および配列番号２０に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号２０に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むＶＬドメインを含む。
【００４３】
さらなる側面において、本発明は、アミノ酸（ａ）Ｐ１０およびＲ１２、ならびに場合によって、Ｅ１５、Ｉ２８、Ｐ３２、Ｎ４５および／またはＫ５４の１またはそれより多く、あるいは（ｂ）Ｐ１０およびＱ４８、場合によってＫ５４およびＮ４５の１またはそれより多くを含む、配列番号２４または２５に示すようなアミノ酸配列を有するＣＸＣＬ１２のエピトープに結合可能である、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を提供する。例示的な抗体１１４＿３Ｈ１はエピトープ（ａ）に結合し、そして抗体１１３＿１Ｈ１２はエピトープ（ｂ）に結合する。
【００４４】
Ｅ１５は、受容体またはヘパリン結合に関与する領域の外である。すべての他のエピトープ残基は、受容体結合に関与する領域内であり、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４８０６１（ＳＤＦ１＿ヒト）の全長タンパク質の番号付けにしたがって、２９〜３３、３９〜４１、４８〜５０、６０〜７０である。
【００４５】
１つの側面において、本発明は、ＣＸＣＬ１２に結合し、そして１１４＿３Ｈ１  ＶＨドメイン（配列番号７）および／または１１４＿３Ｈ１  ＶＬドメイン（配列番号９）を含む、単離抗体分子を提供する。好ましくは、ＣＸＣＬ１２はヒトＣＸＣＬ１２であり、そして場合によってまた、ネズミＣＸＣＬ１２である。
【００４６】
さらなる側面において、本発明は、ＣＸＣＬ１２に結合し、そして１１３＿１Ｈ１２  ＶＨドメイン（配列番号１８）および／または１１３＿１Ｈ１２  ＶＬドメイン（配列番号２０）を含む、単離抗体を提供する。好ましくは、ＣＸＣＬ１２はヒトＣＸＣＬ１２であり、そして場合によってまた、ネズミＣＸＣＬ１２である。
【００４７】
一般的に、ＶＨドメインは、ＶＬドメインと対形成して、抗体抗原結合部位を提供するが、以下にさらに論じるように、抗原に結合させるために、ＶＨドメインのみを用いることも可能である。好ましい態様において、１１４＿３Ｈ１または１１３＿１Ｈ１２  ＶＨドメイン（配列番号７または１８）は１１４＿３Ｈ１または１１３＿１Ｈ１２  ＶＬドメイン（配列番号９または２０）と対形成し、したがって、１１４＿３Ｈ１または１１３＿１Ｈ１２  ＶＨおよびＶＬドメインの両方を含む抗体抗原結合部位が形成される。他の態様において、１１４＿３Ｈ１または１１３＿１Ｈ１２  ＶＨは、１１４＿３Ｈ１または１１３＿１Ｈ１２  ＶＬ以外のＶＬドメインと対形成する。軽鎖乱交雑は、当該技術分野でよく確立されている。
【００４８】
１１４＿３Ｈ１または１１３＿１Ｈ１２  ＶＨまたはＶＬドメインから１またはそれより多いＣＤＲを取り、そして適切なフレームワーク内に取り込むことも可能である。これを以下にさらに論じる。１１４＿３Ｈ１  ＶＨ  ＣＤＲ、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を、それぞれ配列番号１、２および３に示す。１１４＿３Ｈ１  ＶＬ  ＣＤＲ、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を、それぞれ配列番号４、５および６に示す。１１３＿１Ｈ１２  ＶＨ  ＣＤＲ、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を、それぞれ配列番号１２、１３および１４に示す。１１３＿１Ｈ１２  ＶＬ  ＣＤＲ、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を、それぞれ配列番号１５、１６および１７に示す。
【００４９】
１つの側面において、本発明は、ＣＸＣＬ１２に結合し、そして：
１１４＿３Ｈ１  ＶＨドメイン（配列番号７）、ならびに、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、および配列番号１および配列番号２より選択されるアミノ酸配列を含む１またはそれより多いＶＨ  ＣＤＲを含むＶＨドメイン、からなる群より選択される、抗体ＶＨドメイン；ならびに／あるいは
１１４＿３Ｈ１  ＶＬドメイン（配列番号９）、ならびに、配列番号４、５および６より選択されるアミノ酸配列を含む１またはそれより多いＶＬ  ＣＤＲを含むＶＬドメイン、からなる群より選択される、抗体ＶＬドメイン
を含む、抗ＣＸＣＬ１２抗体を提供する。
【００５０】
１つの側面において、本発明は、ＣＸＣＬ１２に結合し、そして：
１１３＿１Ｈ１２  ＶＨドメイン（配列番号１８）、ならびに、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、および場合によって配列番号１２および配列番号１３より選択されるアミノ酸配列を含む１またはそれより多いＶＨ  ＣＤＲを含むＶＨドメイン、からなる群より選択される、抗体ＶＨドメイン；ならびに／あるいは
１１３＿１Ｈ１２  ＶＬドメイン（配列番号２０）、ならびに配列番号１５、１６および１７より選択されるアミノ酸配列を含む１またはそれより多いＶＬ  ＣＤＲを含むＶＬドメイン、からなる群より選択される、抗体ＶＬドメイン
を含む、抗ＣＸＣＬ１２抗体を提供する。
【００５１】
実施例に示すように、本発明の抗体分子は、親抗体の特性を保持しつつ、ＣＤＲの配列に対するいくつかのアミノ酸改変を許容することが可能である。例えば、抗体分子のＣＤＲのアミノ酸配列は、各々、配列番号１〜６および１２から１７のいずれか１つに比較した際、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸置換、欠失または挿入を含むことも可能である。
【００５２】
当該技術分野に周知であるように、ＣＤＲは、本明細書に開示するような抗体の有用な特性の保持を確実にするために、場合によって１またはそれより多いさらなる配列改変を伴う、ある範囲の異なる抗体タイプまたはフレームワーク領域に存在することも可能である。例えば、図１１は、本発明の抗体が、ｓｃＦｃ−Ｆｖ融合およびヒトＩｇＧ２形式で機能することを示す。
【００５３】
ＶＨおよびＶＬドメインは各々、典型的には、抗原結合に関与し、フレームワーク領域が散在する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。１つの例示的な態様において、本発明は、それぞれ、配列番号１、２および３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに／あるいは、それぞれ配列番号４、５および６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、抗体分子を提供する。さらなる例示される態様において、本発明は、それぞれ、配列番号１２、１３および１４の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに／あるいは、それぞれ配列番号１５、１６および１７の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、抗体分子も提供する。
【００５４】
本発明はまた、配列番号１１または配列番号２２に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、ｓｃＦｖ形式の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子も提供する。
【００５５】
一般的に、本発明は、ＣＸＣＬ１２の生物学的活性を阻害することが可能な抗体分子、すなわち当業者に理解されるようなアンタゴニスト抗体分子に関する。例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ癌細胞遊走アッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏ血管形成アッセイにおいて、特性を決定することも可能である。生物学的活性には、ＣＸＣＬ１２誘導性癌細胞増殖阻害、癌細胞遊走阻害、癌細胞接着阻害、癌転移阻害、および／または血管形成阻害、例えばＶＥＧＦ誘導性血管形成阻害が含まれる。場合によって、本発明の抗体分子は、ＣＸＣＬ１２に結合し、そして隔離して、それによって、存在する生物学的系において受容体と相互作用することを妨げることによって機能する。
【００５６】
標準技術、例えば表面プラズモン共鳴を用いて、例えば以下の実験例に記載するように、例えばＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の結合動力学およびアフィニティ（平衡解離定数Ｋｄとして表される）を決定することも可能である。あるいは、関心対象の抗体のＦａｂ型およびＣＸＣＬ１２で、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）を用いて、Ｋｄを測定することも可能である。
【００５７】
抗ＣＸＣＬ１２抗体分子は、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＣＸＣＬ１２に関する解離定数を有することも可能である。例えば、抗体分子は、１〜２０ｎＭ、例えば９〜１５ｎＭのＣＸＣＬ１２に関するアフィニティを有することも可能である。好ましくは、本発明の抗体分子は、ヒトＣＸＣＬ１２に関して、１０ｎＭ未満、より好ましくは５ｎＭ未満、そして最も好ましくは３ｎＭ未満のアフィニティ定数（ＫＤ）を有する。さらに、本発明の抗体は、好ましくはまた、他の種のＣＸＣＬ１２、例えばネズミＣＸＣＬ１２にも結合し、動物疾患モデルと適合する。当業者に周知の技術、例えば以下の実験例に例示するようなＢｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ分析を用いて、ＣＸＣＬ１２への結合に関するアフィニティ定数を決定することも可能である。
【００５８】
上記側面または態様のいずれかに記載の本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。抗体分子は、抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ディアボディ、またはＦ（ａｂ’）２完全抗体、トリアボディ、二重特異性抗体またはキメラ抗体であることも可能である。
【００５９】
本発明にしたがった抗体の好ましい形式には、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＦａｂおよびｓｃＦｖが含まれる。別の態様において、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子は、全抗体であってもよい。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭまたは任意のアイソタイプサブクラス、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４であることも可能である。抗ＣＸＣＬ１２抗体分子は、モノクローナル抗体であってもよい。抗体分子、ならびにその構築法および使用は、例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：  １１２６−１１３６（２００５）に記載される。
【００６０】
抗体分子は、通常、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合ドメインを含むが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のみを含む抗原結合ドメインもまた可能である（例えばラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）またはサメ抗体）。こうした抗体は、本発明の範囲内に含まれる。
【００６１】
いくつかの例において、本発明の抗体分子を修飾して、抗体分子がグリコシル化される度合いを改変することも可能である。これは、親抗体中に存在するグリコシル化部位の１またはそれより多くを生成するかまたは除去するように、アミノ酸配列を改変することによって、達成可能である。特に、抗体分子がＦｃ領域を含む場合、特にＦｃ領域のフコシル化を減少させることによる、Ｆｃ領域に付着した炭水化物の改変は、抗体分子の特性を変化させることが可能であることが知られ、ＡＤＣＣ機能を増加させることが可能である。
【００６２】
本明細書に記載するような抗ＣＸＣＬ１２抗体分子は、混入物質、例えば他のポリペプチドおよび／または血清構成要素に結合可能な抗体を含まないという意味で、単離されていることも可能である。大部分の目的のため、モノクローナル抗体が好ましいが、ポリクローナル抗体もまた使用可能である。
【００６３】
抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を産生する方法には、哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）をタンパク質またはその断片で免疫することが含まれる。当該技術分野に知られる多様な技術のいずれかを用いて、免疫動物から抗体を得て、そして好ましくは関心対象の抗原に対する抗体の結合を用いて、スクリーニングすることも可能である。例えば、ウエスタンブロッティング技術または免疫沈降を用いてもよい（Ａｒｍｉｔａｇｅら，  １９９２，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：  ８０−８２）。動物からの抗体および／または抗体産生細胞の単離には、動物を屠殺する工程が伴うことも可能である。
【００６４】
哺乳動物をペプチドで免疫する代わりにまたはその補助として、例えば表面上に機能する免疫グロブリン結合ドメインをディスプレイするラムダバクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを用いて、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え産生ライブラリーからタンパク質に特異的な抗体を得てもよい。ライブラリーは未刺激であってもよく、すなわちいかなるタンパク質（または断片）でも免疫されていない生物から得た配列から構築されていてもよく、または関心対象の抗原に曝露されている生物から得た配列を用いて構築されたものであってもよい。
【００６５】
本発明において、実施例に記載する方法を使用して，アンタゴニスト特性を有する抗ＣＸＣＬ１２抗体のさらなる例に関してスクリーニングすることも可能である。産生および／または単離後、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の生物学的活性を試験してもよい。例えば、ＣＸＣＬ１２誘導性癌細胞増殖阻害、癌細胞遊走阻害、癌細胞接着阻害、癌転移阻害および／または血管形成阻害、例えばＶＥＧＦ誘導性血管形成阻害より選択される１またはそれより多い生物学的活性を決定してもよい。
【００６６】
例えばＥＬＩＳＡを用いて、そして／または１またはそれより多いタグ化されていない抗体分子の存在下で検出可能である特異的レポーター分子を１つの抗体分子にタグ付けして、同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する抗体分子の同定を可能にすることによって、抗体分子間の競合をｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易にアッセイすることも可能である。こうした方法は、一般の当業者に容易に知られる。
【００６７】
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードする核酸分子も提供する。核酸分子は、例えば、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子をコードする核酸に機能可能であるように連結された調節配列を有する発現ベクター内に核酸配列を取り込んで、その発現を調節することによって、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を発現するために有用である。ベクターには、他の配列、例えば挿入された核酸の発現を駆動するプロモーターまたはエンハンサー、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子が融合体として産生されるような核酸配列、および／または宿主細胞中で産生されたポリペプチドが細胞から分泌されるような分泌シグナルをコードする核酸が含まれることも可能である。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切であるような他の配列を含む、適切な制御配列を含有する、適切なベクターを選択するかまたは構築してもよい。ベクターは、適切であるように、プラスミドまたはウイルス性、例えばファージ、またはファージミドであってもよい。さらなる詳細に関しては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：  第２版，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。核酸の操作のための、例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質分析における、多くの既知の技術およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９２に詳細に記載される。
【００６８】
ベクターが機能する宿主細胞内にベクターを形質転換し、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子が産生されるように宿主細胞を培養し、そして宿主細胞または周囲の培地から抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を回収することによって、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を得ることも可能である。この目的のために、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）株、昆虫細胞（例えばバキュロウイルスで形質転換されたもの）、酵母、および真核細胞、例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞を含む、原核および真核細胞を用いる。宿主細胞の選択を用いて、これらの細胞において発現される抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の特性を調節することも可能であり、例えば宿主細胞においてポリペプチドが沈着する場所を調節するか、またはグリコシル化およびリン酸化などの特性に影響を及ぼすことも可能である。ポリペプチドが適切なシグナルリーダーペプチドにカップリングされて発現される場合、細胞から培地内に分泌されることも可能である。発現による産生後、場合によっては、本発明の抗体分子を宿主細胞および／または培地から単離および／または精製することも可能であり、そして続いて、望ましいように、例えば本出願において別の箇所に記載するように、１またはそれより多いさらなる構成要素、例えばキャリアーを含んでもよい組成物の配合において、用いることも可能である。
【００６９】
したがって、さらなる側面において、本発明は、本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子をコードする核酸、発現を指示する調節配列に機能可能であるように連結された、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子をコードする核酸を含む発現ベクター、およびこの発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。さらにさらなる側面において、本発明は、本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を産生する方法であって、宿主細胞を培養し、そしてこうして産生される抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を単離する工程を含む、前記方法を提供する。
【００７０】
誘導体化抗体分子
本発明の抗体分子を誘導体化して、特性、そして特に薬理学的特性、例えば半減期を修飾する（例えば半減期を増加させる）こともまた可能である。例は、ポリペプチド療法剤の半減期または他の薬理学的特性を増進させるために使用可能な、ポリ（アルキレングリコール）分子、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子への抗体分子のコンジュゲート化である。ＰＥＧ化は、療法ポリペプチド、例えばペプチド、タンパク質および抗体の特性を修飾するための既知の戦略である。一般的に、ポリペプチドへのＰＥＧ分子の付着を用いて、コンホメーション、静電または疎水性特性を改変し、そしてその生物学的および薬理学的特性の改善を導き、例えば薬剤可溶性を増加させ、投薬頻度を減少させ、循環半減期を調節し（特に増加させ）、薬剤安定性を増加させ、そしてタンパク質分解的分解に対する耐性を増加させる。ＰＥＧ化は、ポリペプチドを１またはそれより多いＰＥＧポリマー分子にコンジュゲート化することによって、療法ポリペプチドの分子量を増加させることにより、働く。これは、完全抗体の断片である抗体分子タイプ、例えばＦａｂ断片に特に適用可能である。
【００７１】
反応性ポリ（アルキレングリコール）分子と抗体分子中に存在する適切な官能基を反応させることによって、これを本発明の抗体分子に対して実行することも可能である。本発明の抗体分子中で利用可能な官能基に応じて、選択的方式で、例えば抗体分子中の適切な反応性システイン残基を同定することによって、抗体分子をＰＥＧ化することも可能でありうる。ポリ（アルキレングリコール）分子は、当該技術分野において、交換可能にポリ（酸化アルキレン）分子と称され、そしてポリエーテルである。ポリ（アルキレングリコール）分子は、直鎖、分枝、コームまたは星構造を有してもよく、そして一般的に非常に水溶性である。さらに、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、ハロゲン化アルキルまたはチオール基などの１またはそれより多い反応性官能基を含む、基本ポリ（アルキレングリコール）構造を提供して、ポリ（アルキレングリコール）分子と、他の種、例えばポリペプチドの反応を促進することも可能である。好ましいポリ（アルキレングリコール）分子には、１またはそれより多いヒドロキシル位で化学基で置換されているもの、例えば１〜４の間の炭素原子を有するアルキル基が含まれる。本発明にしたがって使用するための好ましいポリ（アルキレングリコール）分子は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）分子であるが、当業者は、他のポリ（アルキレングリコール）分子、例えばポリプロピレングリコールまたはポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを用いて、本発明の抗体分子を誘導体化することが可能であろう。ＰＥＧを含むポリ（アルキレングリコール）分子は、典型的には、約４００Ｄａ〜約８０ｋＤａの間、より好ましくは約１ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間、そしてより好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの間の分子量、例えば１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａの分子量を有する。本発明にしたがって使用可能なポリ（アルキレングリコール）分子は、当該技術分野に周知であり、そして公的に、例えば商業的に入手可能な供給源、例えばＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
【００７２】
本発明はまた、１またはそれより多い細胞傷害性剤、例えば化学療法剤または薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物、または動物起源のタンパク質毒素、酵素活性毒素、あるいはその断片）、または放射性同位体にコンジュゲート化された、本明細書に記載するような抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を含む、イムノコンジュゲートも提供する。
【００７３】
１つの側面において、本発明のイムノコンジュゲートは、抗体が１またはそれより多い薬剤、例えば化学療法薬剤にコンジュゲート化されている、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体部分は、リンカーを通じて、薬剤に場合によって連結されている。
【００７４】
画像化適用
本発明の抗体分子をさらに標識して、その療法的使用と組み合わせてまたはそれとは独立にのいずれかで、画像化のために使用可能にすることも可能である。ある範囲の画像化および分光適用において抗体を使用可能にする、抗体を標識するための技術は、当該技術分野に周知である。これは、いくつかの異なる医学的または研究適用において、例えば腫瘍学、心臓血管医学または移植片拒絶において、有用でありうる。
【００７５】
画像化のための抗体分子の使用の１つの特定の例は、核医学画像化技術、例えば、放射性核種から放出されるガンマ線を検出し、試料または被験体における放射性核種の分布の二次元画像を産生する画像化技術である単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、および試料または被験体に導入された陽電子放射放射性核種によって間接的に放出されるガンマ線の対を検出することによって、三次元画像を産生する画像化技術である陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）において、放射性核種標識の使用を伴う。放射性核種標識を有する抗体分子はまた、１より多い画像化技術において活性である放射性核種を選択することによって、または１より多いタイプの標識で、抗体分子を標識することによってのいずれかで、画像化技術を組み合わせる、多モード研究にも使用可能である。
【００７６】
本発明の抗体分子を、放射性核種、例えば、複合体として提供される放射性核種で標識してもよいし、または第二の分子、例えばリンカーにコンジュゲート化して、これを標識と会合させてもよい。画像化技術または療法において使用するための放射性核種の例には、テクネチウム、レニウム、銅、コバルト、ガリウムおよびインジウム同位体、例えばＴｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｃｏ−５７、Ｇａ−６７、Ｉｎ−１１１（ＳＰＥＣＴ）、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６０、Ｃｕ−６１、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６７、Ｔｃ−９４ｍ、Ｇａ−６８、Ｃｏ−５５（ＰＥＴ）が含まれる。一般的に、テクネチウム同位体は画像化目的のために、レニウム同位体は療法目的のために、そして銅同位体は画像化および療法の両方の目的のために使用される。
【００７７】
医学的使用
ＣＸＣＬ１２は、ＣＤＣＲ４依存性機構を通じて、骨髄から内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を補充することによって血管形成に関与すると報告されてきており、発癌および腫瘍進行に関連する血管新生において重要な因子となっている。ＣＸＣＬ１２はまた、腫瘍転移においても役割を有し、この場合、受容体ＣＸＣＲ４を発現する癌細胞が、リガンドＣＸＣＬ１２を放出する転移ターゲット組織に誘引される。ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７経路は、したがって、腫瘍増殖、生存および血管形成における役割を考慮すると、潜在的療法ターゲットとして、かなりの関心を生じてきている。
【００７８】
したがって、ＣＸＣＬ１２は、Ｂａｌｋｗｉｌｌら，  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １４：  １７１−１７９，  ２００４に概説されるように、腫瘍の臓器特異的転移において重要であることが示されてきている。ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４を発現する腫瘍には、卵巣癌、乳癌、骨癌、前立腺癌、甲状腺癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、眼内リンパ腫、濾胞中心リンパ腫、ＣＭＬ、結腸直腸癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、神経芽腫、腎臓癌、脳癌、例えば神経膠腫および星状細胞腫、横紋筋肉腫、肺癌、例えば小細胞肺癌、黒色腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えばＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、および白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が含まれる。
【００７９】
ＣＡＦは、ＣＸＣＬ１２を分泌することが知られ、そしてこれは、乳癌（Ｏｒｉｍｏら，  浸潤性ヒト乳癌に存在する間質性線維芽細胞は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２分泌上昇を通じて、腫瘍増殖および血管形成を促進する，  Ｃｅｌｌ，  １２１（３）：  ３３５−３４８，  ２００５）および膵臓癌（Ｆｅｉｇら，  ＦＡＰ発現癌関連線維芽細胞由来のＣＸＣＬ１２ターゲティングは、膵臓癌において、抗ＰＤ−Ｌ１免疫療法と相乗作用する  Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，  １１０：  ５０：  ２０２１２−２０２１７，  ２０１３）において、直接、血管形成および腫瘍増殖を増加させる。さらに、高レベルのＣＸＣＬ１２は、膵臓癌モデルにおいて、少数のＴ細胞と関連し、そしてＰＤ−Ｌ１およびＣＸＣＲ４阻害剤での組み合わせ治療を通じて、Ｔ細胞浸潤を増加させることが可能であった。Ｔ細胞浸潤のこの増加には、腫瘍体積の有意な減少が伴い、癌の免疫調節におけるＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４軸の役割が強調された（Ｆｅｉｇら，  ＰＮＡＳ，  １１０（５０）：  ｐ２０２１２−２０２１７，  ２０１３）。
【００８０】
特定の化学療法剤、抗血管形成剤、および放射線照射は、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４のさらなる上方制御を引き起こすことが示され、これは治療後の腫瘍再発を補助する。ＣＸＣＬ１２レベル増加は、内皮前駆細胞の可動化（Ｓｈａｋｅｄら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，  １４（３）：  ２６３−２７３，  ２００８）および腫瘍への単球の補充（Ｈｕｇｈｅｓら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ７５（１７）：  ＯＦ１−ＯＦ１３，  ２０１５）を誘発し、これは腫瘍浸潤、血管新生および転移を刺激するとともに、抗腫瘍免疫反応を抑制する。したがって、これらのタイプのＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４誘導性剤と、本発明の抗ＣＸＣＬ１２の組み合わせは、臨床的利点がありうる。
【００８１】
他の態様において、本発明の抗体分子またはイムノコンジュゲートを、ＷＨＩＭ症候群の治療において使用することも可能である。ＷＨＩＭ（いぼ、低ガンマグロブリン血症、感染および骨髄性細胞貯留症候群）は、慢性非循環的好中球減少によって特徴付けられる稀な先天性免疫不全障害であり、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の突然変異から生じる。
【００８２】
いくつかの態様において、本発明の抗体分子またはイムノコンジュゲートを、さらなる癌療法と組み合わせて、または放射線療法と組み合わせて、投与してもよい。例えば、本発明の抗体分子またはイムノコンジュゲートを、化学療法剤、抗体療法、免疫調節療法、手術と組み合わせて、または放射線療法と組み合わせて、または細胞仲介性療法と組み合わせて、投与してもよい。いくつかの態様において、抗体分子およびさらなる癌療法を、一緒に、場合によって組み合わせ配合物として投与する。あるいは、抗体分子およびさらなる癌療法を、交互に投与してもよく、さらなる癌療法を抗体分子の前に投与するか、またはさらなる癌療法を抗体分子の後に投与するかいずれであってもよい。臨床実施にしたがって、組み合わせを投与してもよく、例えば約１週間〜３週間の間隔で投与してもよい。
【００８３】
１つの特定の態様において、本発明の抗体分子を血管形成阻害剤と組み合わせて投与する。本発明の抗体分子の作用様式に基づいて、血管形成阻害剤との組み合わせ療法は、相加的または相乗的効果を提供しうる（Ｌｉａｎｇら，  ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２軸は、Ａｋｔシグナル伝達経路を通じて、ＶＥＧＦ仲介性腫瘍血管形成を促進する，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３５９（３）：  ７１６−７２２，  ２００７を参照されたい）。
【００８４】
本明細書で用いるような血管形成阻害剤には、血管形成、脈管形成、または望ましくない血管浸透性を、直接または間接的にのいずれかで阻害する剤が含まれる。血管形成阻害剤には、血管形成因子またはその受容体に結合し、そしてその血管形成活性をブロッキングする剤が含まれる。例えば、ＧｒｏｔｈｅｙおよびＧａｌａｎｉｓ（２００９）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ６（９）：  ５０７−１８（例えば、表１は、巨大分子ＶＥＧＦ阻害剤を列挙する）、Ｉｖｙ，  ＷｉｃｋおよびＫａｕｆｍａｎ（２００９）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ６（９）：  ５６９−７（例えば、補足表１は、小分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤を列挙する）を参照されたい。
【００８５】
血管形成阻害剤には、血管形成促進性増殖因子受容体をターゲティングする抗体またはペプチド−抗体融合物、例えばベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、セツキシマブ（エルビタックス（登録商標））、ラムシルマブ（シラムザ（登録商標））、イクルクマブ、ＨｕＭＶ８３３、２Ｃ３、アフリベルセプト（ザルトラップ（登録商標））およびＩＭＣ−１Ｃ１１が含まれる。他の血管形成阻害剤には、小分子キナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ（ネキサバール（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、パゾパニブ（ボトリエント（登録商標））、エベロリムス（アフィニトール（登録商標））、ＡＥＥ７８８、ＡＡＬ８８１、ＡＡＬ９９３、ＺＤ４１９０、ＡＢＴ−８６９（リニファニブ）、ＰＴＫ７８７（バタラニブ）、ＡＭＧ７０６（モテサニブ）、セディラニブ（リセンチン）、アキシチニブ（インライタ（登録商標））、バンデタニブ（カプレルサ（登録商標））、ＳＵ６６６８、ＺＤ１８３９、テラチニブ、ニンテダニブ（バルガテフ（登録商標））、ブリバニブ・アラニネート、ＢＭＳ−６０５５４１、ＢＭＳ−６４５７３７、ＣＥＰ−７０５５、ドビチニブ、ＣＰ−５４７，６３２、Ｅ７０８０、ＧＷ６５４６５２、ＫＲＮ６３３、チボザニブ、ＯＳＩ−９３０、ＰＤ１７３０７４、ＰＦ−００３３７２１０、ＳＵ１４９８、セマキサニブ（ＳＵ５４１６）、ＳＵ５６１４、ＳＵ１１６５７、ＳＵ１４８１３、ＴＫＩ−２８、ＴＫＩ−３１およびＺＭ３２３８８１が含まれる。天然血管形成阻害剤の例は、エンドスタチンおよびアンギオスタチンである。血管形成を阻害するために用いられる他の薬剤には、サリドマイド、スクアラミンおよびアンギオザイムが含まれる。
【００８６】
ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））は、Ｐｒｅｓｔａら（１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７（２０）：４５９３−４５９９にしたがって生成された、組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。アフィベルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したＶＥＧＦ結合部分からなる組換えペプチド−抗体融合物である。ソラフェニブ（ネキサバール（登録商標））は、受容体チロシンキナーゼ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ（血小板由来増殖因子受容体）、ＲＡＦセリン／スレオニンキナーゼおよびｃ−ＫＩＴをブロッキングする、マルチキナーゼ阻害剤である。化学的用語では、ソラフェニブは、４−［４−［［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］−Ｎ−メチル−ピリジン−２−カルボキサミドと名付けられ、そして構造：
【００８７】
【化１】
2018505144.tif 000002
【００８８】
を有する。
スニチニブ（スーテント（登録商標））は、癌治療に用いられる、小分子マルチターゲティング受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。スニチニブは、ＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦＲをターゲティングすることによって、細胞シグナル伝達を阻害する。化学的用語では、スニチニブは、Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１Ｈ−インドル−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドと名付けられ、そして構造：
【００８９】
【化２】
2018505144.tif 000003
【００９０】
を有する。
パゾパニブ（ボトリエント（登録商標））は、癌の治療において使用されるマルチキナーゼ阻害剤である。パゾパニブは、ｃ−ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦＲをターゲティングすることが知られる。化学的用語では、パゾパニブは、５−［［４−［（２，３−ジメチル−２Ｈ−インダゾル−６−イル）メチルアミノ］−２−ピリミジニル］アミノ］−２−メチルベンゾスルホンアミドと名付けられ、そして構造：
【００９１】
【化３】
2018505144.tif 000004
【００９２】
を有する。
エベロリムス（アフィニトール（登録商標））は、ｍＴＯＲ（哺乳動物ラパマイシン・ターゲット）をターゲティングするシグナル伝達阻害剤である。化学的用語では、エベロリムスは、ジヒドロキシ−１２−［（２Ｒ）−１−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メトキシシクロヘキシル］プロパン−２−イル］−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペントンと名付けられ、そして構造：
【００９３】
【化４】
2018505144.tif 000005
【００９４】
を有する。
ＡＥＥ７８８は、癌に関する治療のために評価されている小分子薬剤である。ＡＥＥ７８８は、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）およびＶＥＧＦＲファミリーメンバーの両方の組み合わせ阻害剤である。化学的用語では、ＡＥＥ７８８は、６−［４−［（４−エチルピペラジン−１−イル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミンと名付けられ、そして構造：
【００９５】
【化５】
2018505144.tif 000006
【００９６】
を有する。
ＰＴＫ７８７（バタラニブ）は、癌治療のために開発されている、血管形成を阻害するプロテインキナーゼ阻害剤である。ＰＴＫ７８７は、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦＲ−ベータおよびｃ−ｋｉｔを阻害する。化学的用語では、ＰＴＫ７８７は、Ｎ−（４−クロロフェニル）−４−（ピリジン−４−イルメチル）フタラジン−１−アミンと名付けられ、そして構造：
【００９７】
【化６】
2018505144.tif 000007
【００９８】
を有する。
さらなる化学療法剤の例には、ＥＧＦＲ経路阻害剤、例えば抗ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、イレッサ（ゲフィチニブまたは（Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−４−アミン）、またはタルセバ（エルロチニブまたはＮ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン）、または他の剤、例えばハーセプチンＴＭ（トラスツズマブ）が含まれる。化学療法剤のさらなる例には、アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチン、アントラサイクリン、植物アルカロイド、例えばタキサンおよびビンカアルカロイド、ならびにトポイソメラーゼ阻害剤、例えばイリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテニポシド、またはフルオロウラシル（５ＦＵ）が含まれる。
【００９９】
さらなる可能性において、本発明の抗体分子を、免疫療法剤、例えば免疫経路剤、小分子剤またはＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４またはＯＸ４０に特異的な抗体とともに投与してもよい。
【０１００】
さらなる可能性において、本発明の抗体分子は、抗体分子が薬剤または毒素に連結されている抗体−薬剤コンジュゲートであってもよい。これを行って、ＣＸＣＬ１２が存在するターゲット部位に、薬剤または毒素を導くことも可能である。このアプローチは、抗体分子を操作して、薬剤または毒素と反応可能な官能基を提供するか、あるいは薬剤または毒素と反応可能なリンカー基を抗体分子に提供する必要がありうる。本発明のこの側面において、薬剤は、患者において、ターゲット部位で、活性薬剤に変換するためのプロドラッグであってもよい。
【０１０１】
したがって、本発明は、細胞傷害性部分または免疫刺激性部分にコンジュゲート化された、本発明の抗体分子を含む、イムノコンジュゲートを提供する。例として、細胞傷害性部分は、アルキル化剤、アルカロイド、白金配位化合物、細胞傷害性ペプチド、放射性剤、または細胞傷害性部分への変換が可能なプロドラッグを提供する。
【０１０２】
さらなる側面において、本発明は、ＣＸＣＬ１２が関与する状態の診断または予後の方法において使用するための抗体分子に関する。いくつかの態様において、全体と見なされる、より広い患者クラスよりも、治療に対してより反応性である可能性が高い患者を同定するためのアッセイにおいて、本発明の抗体分子を用いてもよい。これは次に、例えば本発明の抗体分子を用いた療法を、最も反応する可能性が高い患者に向ける一方、治療が成功する可能性がより低い患者に、別の療法形式を提供することを可能にする。関連する側面に対して、本発明は、試料中のＣＸＣＬ１２の存在に関してアッセイする方法、ＣＸＣＬ１２が抗体分子に結合して複合体を形成するように、本発明の抗体分子と試料を接触させ、そしてこうして産生される複合体を検出する工程を含む方法を提供する。別にまたはさらに、方法はまた、捕捉抗体へのＣＸＣＬ１２の結合を検出するための試薬として、本発明の抗体分子を使用してもよい。好ましくは、方法は、抗体を用いて、試料中のＣＸＣＬ１２の存在または量を決定し、そしてＣＸＣＬ１２阻害剤で患者を治療するありうる転帰と、ＣＸＣＬ１２の存在または量を相関させる工程を含む。
【０１０３】
この場合、抗体分子をＥＬＩＳＡ型形式において用いてもよいし、または別の方式で、検出可能な分子、例えば限定されるわけではないが、放射性または蛍光標識、あるいは発色基質を利用する酵素に連結させてもよい。この技術において使用する放射標識の例は、３２Ｐ、３Ｈまたは１４Ｃである。この技術において使用する蛍光分子の例は、緑色蛍光タンパク質、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＣＴ）Ｃｙ３およびＣｙ５色素である。この技術において使用可能な発色基質を伴う酵素の例は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはグルコースオキシダーゼである。
【０１０４】
好ましくは、本発明の方法は、前記個体から得られる試料に対して行うｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。本発明のいくつかの態様において、方法はしたがって、問題の個体から試料を得るおよび／または分析用の試料を調製する最初の工程を含む。方法において使用するための試料の好ましい例には、血液試料、組織試料または細胞試料が含まれる。
【０１０５】
当業者に明らかであろう、上記技術のさらなる変型が存在する。
薬学的組成物
本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体分子またはイムノコンジュゲートは、薬学的に許容されうる賦形剤とともに、薬学的組成物中に含まれてもよい。薬学的に許容されうる賦形剤は、二次的反応を誘発せず、そして例えば、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の投与の促進、体内でのその寿命および／または有効性の増加、あるいは溶液中の可溶性の増加を可能にする、薬学的組成物内に入る化合物または化合物の組み合わせであることも可能である。これらの薬学的に許容されうるビヒクルが周知であり、そして抗ＣＸＣＬ１２分子の投与様式に応じて、当業者によって適応されるであろう。
【０１０６】
いくつかの態様において、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子またはイムノコンジュゲートを、投与前に再構成するための凍結乾燥型で提供することも可能である。例えば、凍結乾燥抗体分子を滅菌水中で再構成し、そして個体への投与前に生理食塩水と混合することも可能である。
【０１０７】
抗ＣＸＣＬ１２抗体分子は、通常、薬学的組成物の形で投与され、これは、抗体分子に加えて、少なくとも１つの構成要素を含んでもよい。したがって、薬学的組成物は、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子に加えて、当業者に周知の、薬学的に許容されうる賦形剤、キャリアー、緩衝剤、安定化剤または他の材料を含むことも可能である。こうした材料は、非毒性でなければならず、そして抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の有効性に干渉してはならない。キャリアーまたは他の材料の正確な性質は、ボーラス、注入、注射、または以下に論じるような任意の他の適切な経路であってもよい、投与経路に応じるであろう。
【０１０８】
例えば注射による、静脈内投与のため、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を含む薬学的組成物は、発熱物質不含であり、そして適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容されうる水溶液の形であってもよい。適切な当業者は、例えば、等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸添加リンゲル注射液を用いて、適切な溶液を容易に調製可能である。リン酸、クエン酸および他の有機酸；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン；保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、保存剤、安定化剤、緩衝剤、酸化防止剤および／または他の添加剤を、必要に応じて使用してもよい。
【０１０９】
抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を含む薬学的組成物を、治療しようとする状態に応じて、単独で、あるいは同時にまたは連続してのいずれかで他の治療と組み合わせて、投与することも可能である。
【０１１０】
本明細書に記載するような抗ＣＸＣＬ１２抗体分子を、予防的治療（例えば個体において状態が生じるリスクを減少させるか：その開始を遅延させるか；または開始後の重症度を減少させるための、個体における状態の開始前の治療）を含む、ヒトまたは動物の身体の治療法において、用いることも可能である。治療法は、治療の必要がある個体への抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の投与を含んでもよい。
【０１１１】
投与は、通常、「療法的に有効な量」であり、これは患者に対する利益を示すために十分である。こうした利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも軽減であってもよい。投与の実際の量、ならびに投与速度および時間経過は、治療中のものの性質および重症度、治療中の特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、組成物の送達部位、投与法、投与のスケジューリング、および医療従事者に知られる他の要因に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量に関する決定等は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして治療中の疾患の症状および／または進行の重症度に応じうる。抗体分子の適切な用量は、当該技術分野に周知である（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｊ．Ａ．ら（１９９１）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４７：  ６５９−６６４；  Ｂａｇｓｈａｗｅ  Ｋ．Ｄ．ら（１９９１）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ４：  ９１５−９２２）。特定の投薬量は、本明細書に、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００３）に示され、投与しようとする薬剤のタイプにしたがって適切であるように使用可能である。動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較することによって、抗体分子の療法的に有効な量または適切な用量を決定することも可能である。マウスおよび他の試験動物における有効投薬量をヒトに外挿するための方法が知られる。正確な用量は、抗体が予防のためかまたは治療のためか、治療しようとする領域のサイズおよび位置、抗体の正確な性質（例えば全抗体、断片）、ならびに抗体に付着した任意の検出可能標識または他の分子の性質を含む、多くの要因に応じるであろう。
【０１１２】
典型的な抗体用量は、全身適用に関しては１００μｇ〜１ｇの範囲であり、そして局所適用に関しては１μｇ〜１ｍｇであろう。最初のより高い装填用量の後、１またはそれより多いより低い用量を投与してもよい。典型的には、抗体は、全抗体、例えばヒンジおよびＦｃ領域におけるアミノ酸配列の相違にしたがって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプであろう。これらの異なるアイソタイプは、抗体分子のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、およびエフェクター機能を誘導する能力に影響を及ぼす。したがって、ＩｇＧアイソタイプの選択を用いて、本発明の抗体分子のｉｎ  ｖｉｖｏ特性を操作することも可能である。中和可溶性抗原、例えばＣＸＣＬ１２に関しては、エフェクター機能はより重要ではなく、そしてしたがって、宿主免疫系の干渉を伴わずにＣＸＣＬ１２中和の利益を決定するためには、エフェクター機能を欠く抗体アイソタイプ（例えばＩｇＧ２）の使用が好ましい可能性がある。
【０１１３】
これは、成体患者の単回治療のための用量であり、小児および幼児には比例的に調節してもよく、そしてまた他の抗体形式に関しては分子量に比例して調節してもよい。治療は、医師の裁量で、毎日、週２回、毎週、毎月間隔で、反復してもよい。治療は、皮下投与に関しては、２〜４週ごとであってもよく、そして静脈内投与に関しては、４〜８週ごとであってもよい。治療は、周期的であってもよく、そして投与間の期間は、約２週またはそれより長く、例えば約３週またはそれより長く、約４週またはそれより長く、あるいは約月１回である。治療は、術前および／または術後に行ってもよいし、そして／または手術治療もしくは侵襲性処置の解剖学的部位に直接投与するか、または適用してもよい。適切な配合物および投与経路を上に記載する。
【０１１４】
いくつかの好ましい態様において、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の療法的効果は、用量に応じて、数半減期に渡って持続性でありうる。例えば、抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の単回用量の療法的効果は、個体において、１ヶ月またはそれより長く、２ヶ月またはそれより長く、３ヶ月またはそれより長く、４ヶ月またはそれより長く、５ヶ月またはそれより長く、または６ヶ月またはそれより長く持続しうる。
【実施例】
【０１１５】
材料および方法
ファージディスプレイ技術によるＣＸＣＬ１２中和抗体の生成
ＣＸＣＬ１２に関する抗体ライブラリーのパニング
１００億を超える、ｓｃＦｖ形式の抗体クローンを含有する「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ未刺激抗体ライブラリー」を抗ＣＸＣＬ１２抗体の単離に用い、そして次いで、生じた抗体を、細胞に基づくアッセイにおいてスクリーニングして、ＣＸＣＬ１２−ＣＸＣＲ４相互作用をブロッキングする潜在能力を評価した。より詳細には、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンに固定されたビオチン化ＣＸＣＬ１２に関して、２ラウンドのパニングを行った。ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンに結合する抗体クローンに関する濃縮を回避するため、２つの戦略を使用した。いかなるストレプトアビジン結合剤も欠いていたファージライブラリーを用いて、ストレプトアビジン上に固定されたビオチン化ＣＸＣＬ１２に対して、ラウンド１パニングを行った（「脱選択」または「サブトラクティブ選択」として知られる）。ラウンド２に関しては、ＣＸＣＬ１２を固定するために（ストレプトアビジンの代わりに）ニュートラアビジンを用いた。ラウンド２パニングアウトプットから調製したポリクローナルファージを、ＣＸＣＬ１２、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンおよび非特異的抗原（ＮＣＫ１）に対するＴＲＦ結合アッセイで試験して、特異的濃縮を確認した。観察される結合シグナルは、ＣＸＣＬ１２に特異的であり、そしてストレプトアビジン、ニュートラアビジンおよびＮＣＫ１に関する検出可能な結合はまったく観察されなかった。
【０１１６】
抗ＣＸＣＬ１２抗体スクリーニング
ラウンド２パニングアウトプット由来のｓｃＦｖ集団をＰＣＲ増幅し、そしてｐＳＡＮＧ１０−３Ｆ発現ベクター内にクローニングし、そしてＢＬ２１に形質転換した。ｐｓＡＮＧ１０−３Ｆは、ヘキサ−ヒスチジンタグ（Ｎｉアフィニティ精製のため）およびトリＦＬＡＧタグ（検出のため）をｓｃＦｖ遺伝子下流にコードする。９４０の個々の形質転換体を１０ｘ９６ウェル培養プレートに摘み取り、そして自己誘導培地を用いて、抗体発現を誘導した。一晩誘導後、培地上清中に分泌された組換えモノクローナル抗体を、ＣＸＣＬ１２への結合に関して試験した。ユーロピウムにコンジュゲート化された抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、ビオチン化ＣＸＣＬ１２（９６ウェルプレート中、ストレプトアビジンに固定されている）へのｓｃＦｖ結合を検出する、ＴＲＦ結合アッセイのために、分泌されたｓｃＦｖを含有する培養上清を用いた。１０００ＦＵ（バックグラウンドの１００倍）を超えるシグナルを有するクローンを、ＣＸＣＬ１２結合に関して陽性であると見なした。
【０１１７】
スクリーニングしたクローンのうち、およそ２４％（２２４／９４０）が、ＣＸＣＬ１２結合に関して陽性であることが見出された。上位１８４のクローンを、配列分析およびさらなる特徴付けのために選び取った。４つのプライマーを用い、サンガー配列決定によって、選び取ったクローンの配列を生成し、そして各クローンに関してコンセンサス配列を組み立てた。ＢＬＡＺＥ抗体分析ソフトウェアを用いて、コンセンサス配列のＣＤＲおよびフレームワーク領域を分析した。重鎖および軽鎖のＣＤＲ３における変動に関する分析に集中することによって、１１８のユニークなｓｃＦｖ配列が見出された。これらの配列において、他のＣＤＲまたはフレームワーク残基のさらなる変化があり、さらに３８のユニークな配列が生じ、すなわち配列決定した１８４のうち１５６のユニークな配列があった。フレームワーク領域の詳細な分析によって、特定の重鎖および軽鎖生殖系列ファミリーに関する優先性が明らかになった。Ｖｈ３（６２％）およびＶｈ１（４３％）が最も頻繁に見られた重鎖ファミリーであり、一方、Ｖｋ１（５９％）、次いでＶｋ２（１７％）が軽鎖配列では大部分を占める。
【０１１８】
【表１】
2018505144.tif 000008
【０１１９】
表１．  一次ＣＸＣＬ１２抗体の配列分析のスナップショット。ＢＬＡＺＥソフトウェアを用いてフレームワークおよびＣＤＲ領域を分析し、そしてＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ３配列における類似性に基づいて、抗体をクラスター決定した（例えば０９３＿Ｅ１１および０９３＿Ｅ１０）。
【０１２０】
ＣＸＣＲ４へのＣＸＣＬ１２結合をブロッキングする抗体の同定
一次スクリーニングおよび配列分析から、ユニークなＣＸＣＬ１２結合剤の大きなパネルを同定した。ＣＸＣＬ１２−ＣＸＣＲ４相互作用をブロッキングする抗体を同定するため、フローサイトメトリーを用いた細胞に基づくＣＸＣＬ１２−ＣＸＣＲ４結合アッセイを確立した。ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株（ＭＯＬＴ−４）は、ＣＸＣＲ７発現に関して陰性であることが見出されたため、ＣＸＣＬ１２−ＣＸＣＲ４結合アッセイに関する理想的なＣＸＣＲ４発現細胞株と同定された。このアッセイにおいて、フィコエリトリンとコンジュゲート化したストレプトアビジン（ストレプトアビジン−ＰＥ）を用いて、ビオチン化ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４発現ＭＯＬＴ−４細胞への結合を検出した。次いで、抗ＣＸＣＬ１２抗体を、この相互作用を阻害する能力に関して試験した。
【０１２１】
最初に、いくつかのパイロット実験を行って、最大アッセイ感度を達成するための最適アッセイパラメータ（例えば、検出法、ＣＸＣＬ１２の量、ブロッキング剤の濃度等）を同定した。１工程結合検出法を試験して、そして２工程結合検出法に比較した。１工程結合検出法は、ストレプトアビジン−ＰＥとあらかじめ複合体化したＭＯＬＴ−４細胞のビオチン化ＣＸＣＬ１２での直接染色およびフローサイトメトリーによる結合の検出を伴った。対照的に、２工程結合検出法は、ＭＯＬＴ−４細胞とビオチン化ＣＸＣＬ１２のインキュベーション、洗浄、そして次いで、フローサイトメトリーによる結合検出前のストレプトアビジン−ＰＥでの染色を伴った。２工程検出法は、１工程検出法で観察された蛍光の広い分布に比較して、鋭い蛍光ピークを生じた。さらに、ＣＸＣＬ１２およびストレプトアビジン−ＰＥのプレ複合体化は、ＣＸＣＬ１２分子の四量体提示を生じるであろう。これは、単量体ｓｃＦｖによるＣＸＣＬ１２−ＭＯＬＴ−４細胞相互作用のブロッキングを妨害しうる、アビディティ効果を生じるであろう。これらの理由のため、ＣＸＣＬ１２結合の２工程検出法を、ブロッキングアッセイのために選択した。用量反応分析は、アッセイに関するＣＸＣＬ１２の最適濃度を、７．５μｇ／ｍｌと同定した。
【０１２２】
４０μｇ／ｍｌから出発するビオチン化ＣＸＣＬ１２の２倍希釈シリーズを、ＣＸＣＲ４を発現するＭＯＬＴ−４細胞とインキュベーションした。細胞へのＣＸＣＬ１２結合を、フローサイトメトリーを用いて、ストレプトアビジン−ＰＥによって検出した。各試験試料に関して観察される平均蛍光を、ＣＸＣＬ１２濃度に対してプロットした。
【０１２３】
ブロッキングに関して一次スクリーニングから同定された１１８の抗ＣＸＣＬ１２抗体のうち３９クローンを、重鎖ＣＤＲ３配列多様性および一次スクリーニングにおける結合シグナルに基づいて、このアッセイのために選択した。ｓｃＦｖ抗体をこれらのクローンから産生し、そして固定金属イオンアフィニティクロマトグラフィによって精製した。次いで、精製抗体（および非特異的抗体）を、ＣＸＣＬ１２−ＭＯＬＴ−４細胞結合アッセイにおいて、ブロッキング活性に関して試験した。ＣＸＣＬ１２−ＭＯＬＴ−４細胞結合の阻害パーセントに基づいて、４５％より大きいブロッキング活性を持つ２０の抗体を、さらなる研究のために選択した（表２）。
【０１２４】
【表２】
2018505144.tif 000009
【０１２５】
表２．  細胞に基づくＣＸＣＬ１２−ＣＸＣＲ４結合アッセイ由来の上位２０のブロッキング抗体
一次抗ＣＸＣＬ抗体のアフィニティ成熟および機能的特徴付け
一次抗体ファージディスプレイ選択およびスクリーニングによって、ＣＸＣＲ４へのＣＸＣＬ１２の結合をブロッキングするいくつかの抗体が同定された。療法適用には、しばしば、望ましい臨床効率を達成するため、低ナノモル〜ナノモル未満の範囲のアフィニティを持つモノクローナル抗体が必要である。低ストリンジェンシー条件下での「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙライブラリー」からのパニングは、一般的に、１０ｎＭ〜１μＭの範囲のアフィニティを持つ一次抗体を生じる。こうした抗体は、しばしば、所定の適用のために十分なアフィニティを獲得するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアフィニティ成熟される。
【０１２６】
体液性免疫反応中に起こるｉｎ  ｖｉｖｏプロセスを模倣することによって、抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティ成熟を達成することも可能である。抗原刺激に対する最初の反応は、低アフィニティ抗体を発現するＢ細胞の巨大でそして多様な免疫前レパートリーからの抗原特異的Ｂ細胞の選択を伴う。これらの一次低アフィニティ抗体は、次いで、重鎖および軽鎖可変領域において、点突然変異を蓄積する、体細胞高頻度突然変異と呼ばれるプロセスを経る。高アフィニティ抗体を発現するＢ細胞は、抗原刺激に関して、低アフィニティ抗体を発現するＢ細胞と競合して、生存し、そして増殖する。体細胞高頻度突然変異およびより高いアフィニティの抗体を発現するＢ細胞の優先的な拡大の周期が反復されることによって、免疫系は、次第に、侵入する病原体に対して有効な反応を確立する。ｉｎ  ｖｉｖｏプロセスと同様に、一般的に用いられるｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティ成熟戦略は、２つの重要な工程、一次抗体配列の多様化、およびファージディスプレイ技術などの選択プラットホームを用いた、アフィニティ改善抗体の選択的な濃縮を伴う。一次抗体配列の多様化は、ランダムまたはターゲティング突然変異誘発を用いて、可変領域に突然変異を導入することによって、行うことも可能である。あるいは、選択した重鎖または軽鎖を、鎖シャッフリングとして知られるプロセスによって、パートナー鎖のレパートリーと組み換えることによって、重鎖および軽鎖可変領域の新規組み合わせを作製することも可能である。
【０１２７】
抗体のモジュール性を考慮すると、単純なクローニングによって、鎖シャッフリングされたライブラリーを容易に生成することも可能であり、したがって、これは一次抗ＣＸＣＬ１２抗体をアフィニティ成熟させるために選択される方法であった。重鎖可変ドメインは、一般的に、抗原結合およびエピトープ特異性定義において、支配的な役割を果たすため、一次抗体の結合エピトープを保存するためには、重鎖シャッフリングよりも軽鎖シャッフリングが好ましい。
【０１２８】
鎖シャッフリングされたライブラリーの構築およびＣＸＣＬ１２に関するストリンジェントなファージディスプレイ選択
軽鎖シャッフリングライブラリーを生成するため、上位２０のブロッキング抗体由来の抗体重鎖領域をＰＣＲによって増幅した。生じたＰＣＲ産物を、未刺激ラムダおよびカッパ軽鎖可変領域パートナーのレパートリーを含むファージディスプレイ軽鎖ライブラリー調製物内にクローニングした（ベクターｐＳＡＮＧ４中）。得られたプラスミド集団を、大腸菌ＴＧ１に形質転換して、２．６ｘ１０８  ｓｃＦｖクローンを含有するライブラリーを得た。したがって、各オリジナル重鎖を、およそ１０００万の新規軽鎖パートナーと対形成させた。重鎖挿入頻度を評価するため、軽鎖シャッフリングライブラリー由来の２０のランダムクローンをコロニーＰＣＲスクリーンによって分析した。２０のクローンのうち１９が、全長ｓｃＦｖ遺伝子の存在を示し（未提示）、ライブラリー中のクローンのおよそ９５％が軽鎖シャッフリング組換え体であることが示唆された。
【０１２９】
任意のライブラリーからの高アフィニティ抗体の単離成功には、高アフィニティ結合剤を選択的に濃縮可能であるストリンジェントな選択条件を必要とする。高アフィニティ抗体を、抗原濃度減少を用いた、ファージ選択の反復周期によって濃縮することも可能である。この方法は、限定された量の抗原に関する競合およびより低い解離定数を有する変異体の優先的な濃縮に頼る。抗原濃度の正確な調節のため、溶液相でファージディスプレイ選択を行う。ファージ抗体を溶液中でビオチン化抗原に結合させ、そして続いて、結合したファージを、洗浄および溶出のために、ストレプトアビジンコーティング表面を用いて捕捉する。いくつかの厳しく、そして長い洗浄工程を含めることによって、選択のストリンジェンシーをこの工程でさらに増加させることも可能である。
【０１３０】
高アフィニティ抗ＣＸＣＬ１２抗体を軽鎖シャッフリングライブラリーから単離するため、ビオチン化ＣＸＣＬ１２に対して、３ラウンドの溶液相選択を行った。ある範囲の抗原濃度に対してファージ抗体を選択し、そして「抗原不含」対照とアウトプット数を比較することによって、各周期に関する最適抗原濃度を実験的に決定した。第三ラウンドにはまた、ストリンジェンシーをさらに増加させるため、捕捉されたファージ−抗原複合体を１７時間の洗浄（０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水での毎時６回の洗浄）に供する選択セットを含めた。
【０１３１】
アフィニティ成熟モノクローナル結合剤に関する選択アウトプットのスクリーニング
ラウンド３選択アウトプット由来のｓｃＦｖ集団をＰＣＲ増幅し、そしてｐＳＡＮＧ１０−３Ｆ発現ベクター内にクローニングし、そして生じたプラスミドＤＮＡを大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３細胞内に形質転換した。９６０の個々の形質転換体を１０ｘ９６ウェル培養プレート内に摘み取り、そして自己誘導培地を用いて抗体発現を誘導した。一晩誘導後、培養上清内に分泌された組換えモノクローナル抗体を、ＴＲＦ結合アッセイにおいて、ＣＸＣＬ１２に結合する能力に関してスクリーニングした。多様な選択アウトプットからスクリーニングしたクローンの４８％（４５８／９６０）が、ＣＸＣＬ１２結合に関して陽性であることが見出された。これらのクローンによって示される結合シグナルは、未刺激ライブラリーから単離されたクローンのものより有意に優れていた。鎖シャッフリング選択アウトプットからスクリーニングしたクローンの３７％は、１０，０００蛍光単位（ＦＵ）を超える結合シグナルを示した。対照的に、未刺激ライブラリーから単離されたクローンでは、わずか１２％しか１０，０００ＦＵを超える結合シグナルを示さなかった。スクリーンにおいて試験したクローンは、発現に関して規準化されなかったため、ＣＸＣＬ１２結合において観察された改善は、改善された発現または改善されたアフィニティのためである可能性もあった。
【０１３２】
ＢＬＡＺＥ抗体配列分析ソフトウェアを用いて、ＣＸＣＬ１２結合クローンを分析した。重鎖および軽鎖ＣＤＲ３多様性の分析は、２２７のユニークなクローンを同定した。鎖シャッフリングライブラリーの構築において、２０の異なるＶＨ遺伝子を用いたが、同定した２２７のユニークなクローンの間で、わずか９のＶＨ遺伝子が示された。このセット内で、４つの主要なクローンファミリーがあった。これらは、一次クローン０９３＿２Ａ０２（１２２／２２７）、０９３＿２Ｄ０６（３８／２２７）、０９３＿２Ｇ０７（２４／２２７）および０９３＿２Ａ１０（２２／２２７）のＶＨ遺伝子に由来した。未刺激ライブラリーから単離したクローンと同様、これらの鎖シャッフリングクローンのＶＬ生殖系列使用は、Ｖｋ１（６３％）およびＶｋ２（２２％）生殖系列ファミリーによって大部分が占められた。
【０１３３】
一次スクリーンにおいて、特定のクローンに関して観察されるＣＸＣＬ１２結合シグナルは、抗体発現およびアフィニティの組み合わせた効果に依存した。抗体発現は、クローン間で有意に異なり、一次スクリーンにおける結合シグナルによって抗体をランク付けしても、必ずしもそのアフィニティとは相関しない。したがって、発現に依存しない二次スクリーニングアッセイを用いて、優れた結合動力学を持つ高アフィニティ抗ＣＸＣＬ１２抗体を同定した。このスクリーニングアッセイにおいて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、上位１５０の抗ＣＸＣＬ１２  ｓｃＦｖ抗体の解離定数（オフ速度）を分析した。抗体−抗原相互作用の解離定数は、濃度依存性であり、そしてしたがって、示差抗体発現に関する規準化は必要ではなかった。しかし、ｓｃＦｖ抗体が溶液中で二量体化する傾向があるため、一価抗体−抗原（１：１）相互作用の正確な測定は、複雑になり、そしてしばしば結合定数の誤った決定を生じる。したがって、ｓｃＦｖ−ＳＰＲスクリーンにおいて低解離定数を示す２４抗体のパネルを、別の周期の「オフ速度スクリーン」のために、Ｆａｂ抗体として再フォーマットした。ｓｃＦｖとは異なり、Ｆａｂ抗体は、単量体形式で安定であり、そして正確な動力学分析のために最適である。抗体クローン１１４＿３Ｈ１（０９３＿２Ｄ０６由来）および１１３＿１Ｈ１２（０９３＿２Ａ０２由来）は、試験した２４のＦａｂ抗体のうち、最適なオフ速度（すなわち最低の解離定数）を示した。詳細な特徴付けのため、リード抗ＣＸＣＬ１２抗体として、これらの２つのクローンを選択した。これらの抗体の配列を配列表に提供する。
【０１３４】
哺乳動物細胞におけるＦａｂおよびＩｇＧとしての抗ＣＸＣＬ１２抗体の発現および精製
オフ速度スクリーンの第二の周期までのすべての抗体詳細試験を、ｓｃＦｖ形式の抗体で行った。ｓｃＦｖ形式は、ファージディスプレイ選択によく適しており、そして大腸菌において効率的に発現されるため、リード抗体パネルを同定するための多数のクローンの続くスクリーニングによく適している。しかし、この形式に関連するいくつかの限界があり、このため、下流生物物理的および生物学的特徴付けには最適ではない。例えば、ｓｃＦｖのアフィニティ決定は、溶液中で二量体化する傾向のために複雑になる。ｓｃＦｖ分子は安定性が劣っているため、凝集および沈殿しやすく、それによって、長期保存は限定される。さらに、大腸菌からのｓｃＦｖ沈殿においては、高レベルの内毒素が存在するため、多くの細胞に基づくアッセイにおいて、その使用が制限される。したがって、一次スクリーニングアッセイから同定したｓｃＦｖを、通常、より大きくそしてより安定な抗体形式に再フォーマットし、そして下流特徴付けおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験のため、哺乳動物細胞において発現させる。２つのリード抗ＣＸＣＬ１２抗体およびその親クローンを、ＦａｂおよびＩｇＧに再フォーマットした。Ｆａｂは、結合定数の正確な決定のために最適である。一方、大部分の臨床認可抗体および開発中の抗体に関しては、ＩｇＧが好ましい形式である。その優れたｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、および宿主免疫系に関与する能力は、疾患、例えば癌の治療に理想的である。さらに、ＩｇＧ分子の二価性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、抗原中和能を非常に増進させる。
【０１３５】
本発明の抗ＣＸＣＬ１２抗体の配列を、抗体分子の生成のために設計された任意の適切な発現系において、用いることも可能である。この研究において論じるすべてのｓｃＦｖ抗体は、ｐＳＡＮＧ１０−３Ｆベクターから発現され、このベクターにおいては、単一のＴ７プロモーターがグリシン−セリンリンカーによって連結される重鎖および軽鎖可変ドメインの発現を駆動する（図１Ａ）。この系において、ｓｃＦｖ遺伝子は単一ｍＲＮＡとして転写され、そして単一のタンパク質として翻訳される。対照的に、一般的に用いられる哺乳動物ＦａｂおよびＩｇＧ発現系は、重鎖および軽鎖遺伝子を別個に転写し、そして翻訳する、発現カセットを使用する。ここで、本発明者らは、ＨＥＫ−２９３細胞における抗ＣＸＣＬ１２  Ｆａｂの一過性発現のため、二シストロン性ベクター（ｐＢＩＯＣＡＭ−７）を用いた（図１Ｂ）。ｐＢＩＯＣＡＭ７において、抗体軽鎖（ＶＬ＋ＣＬ）および重鎖（ＶＨ＋ＣＨ）遺伝子は、ブタ・テッショウウイルス−１由来の「リボソームスキップ」ペプチド（Ｐ２Ａペプチドとして知られる）をコードする遺伝子セグメントによって分離される。このＦａｂ発現系は、全Ｆａｂカセットで単一ｍＲＮＡ転写物（ＶＬ＋ＣＬ−Ｐ２Ａ−ＶＨ＋ＣＨ）を産生する。しかし、翻訳中、リボソームは、Ｐ２ＡペプチドのＣ末端でグリシル−プロリルペプチド結合の合成をスキップし、そのすぐ下流のポリペプチド鎖の放出を生じる。次いで、重鎖および軽鎖ポリペプチドは、小胞体（ＥＲ）においてフォールディングされ、そして独立に組み立てられて、Ｆａｂ分子を形成する。軽鎖のＣ末端でのフューリン切断部位によって、Ｆａｂタンパク質からのＰ２Ａペプチドの翻訳後除去が容易になる。
【０１３６】
ＩｇＧ形式での抗ＣＸＣＬ１２抗体の発現のため、重鎖および軽鎖発現カセットが２つの異なるプラスミド上で所持される、二重プラスミド系を用いた（図１Ｃ）。これらのプラスミドのＨＥＫ−２９３細胞への同時トランスフェクションに際して、ＥＲにおいてＩｇＧ分子に組み立てられる前に、重鎖および軽鎖遺伝子が別個に転写され、そして翻訳される。ＩｇＧ抗体は、ヒンジおよびＦｃ領域のアミノ酸配列の相違にしたがって、４つのアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）に分けられる。これらの異なるアイソタイプは、抗体分子のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、およびエフェクター機能を誘導する能力に影響を及ぼす。したがって、ＩｇＧアイソタイプの選択を用いて、本発明の抗体分子のｉｎ  ｖｉｖｏ特性を操作することも可能である。中和可溶性抗原、例えばＣＸＣＬ１２に関しては、エフェクター機能はより重要ではない。実際、宿主免疫系の干渉を伴わずにＣＸＣＬ１２中和の利益を決定するためには、将来のｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために、エフェクター機能を欠く抗体を有することが望ましい。したがって、本発明者らは、減少した抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を示す、ＩｇＧ２アイソタイプを選択した。
【０１３７】
ＦａｂおよびＩｇＧ発現のため、リード抗体（１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２）およびその親クローン（０９３＿２Ｄ０６および０９３＿２Ａ０２）の可変領域を、ｐＢＩＯＣＡＭ−７ベクターおよびＩｇＧ２発現プラスミド（ｐＢＩＯＣＡＭ−１およびｐＢＩＯＣＡＭ２−ＩｇＧ２）内にサブクローニングした。
【０１３８】
トランスフェクション等級のＤＮＡを、これらのプラスミドから調製し、そして一過性抗体発現のため、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした。それぞれ、ニッケルおよびプロテインＧアフィニティクロマトグラフィ法を用いて、細胞培養上清からＦａｂおよびＩｇＧ抗体を精製した（トランスフェクション６日後）。図２に例示するように、精製ＦａｂおよびＩｇＧは、期待されるサイズの重鎖および軽鎖ドメインで構成された。
【０１３９】
抗ＣＸＣＬ１２抗体のアフィニティ測定
リード抗ＣＸＣＬ１２抗体およびその親クローンを、完全動力学分析に供して、アフィニティ成熟後の結合定数の改善を決定した。ＳＰＲを用いて、ストレプトアビジンチップ上に固定されたビオチン化ＣＸＣＬ１２へのＦａｂ抗体の結合を分析した（図３）。各結合相互作用に適した結合モデルを用いて、これらの抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を決定した（図３ＢおよびＣ）。試験した４つの抗体のうち、１１４＿３Ｈ１は、１ｎＭのＫＤで、ＣＸＣＬ１２に対する最高のアフィニティを有した。これは、鎖シャッフリング後、親クローン０９３＿２Ｄ０６（ＫＤ＝３８００ｎＭ）から、アフィニティで３８００倍の改善に相当する。０９３＿２Ａ０２およびそのアフィニティ成熟変異体１１３＿１Ｈ１２はどちらも、二相性結合プロファイルを示し、最初の迅速な解離相の後に、はるかにより緩慢な第二の解離相を生じた。こうした結合プロファイルは、一般的に、２工程結合を生じる、リガンドの抗体（または任意の他の分析物）誘導性のコンホメーション変化を伴う結合相互作用に関連する。１１３＿１Ｈ１３および０９２＿２Ａ０２両方の２つの異なる調製物を、ＳＰＲによって分析した。どちらのタンパク質バッチを用いても類似の結果が得られ、観察される結合プロファイルがアーチファクトではなく、また特定のタンパク質調製に関する問題ではないことが確認された。同じＶＨ系譜由来の抗体のみが、二相性結合を示すという事実は、これらの抗体が、二工程結合機構を有するという仮説を支持する。したがって、二状態結合モデルを用いて、これらの抗体のアフィニティを決定した（図３Ｃ）。１１３＿１Ｈ１２および０９３＿２Ｄ０６の計算される結合アフィニティは、それぞれ、３．７ｎＭおよび１６．７ｎＭであり、これは、軽鎖シャッフリング後のアフィニティの４．５倍の改善に相当する。
【０１４０】
リード抗ＣＸＣＬ１２抗体による癌細胞遊走の阻害
ＣＸＣＲ４発現癌細胞の、ＣＸＣＬ１２リッチ環境への遊走は、多くの悪性腫瘍において、転移を促進する、重要な要因の１つである。ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４依存性癌細胞遊走の阻害は、本発明の療法的抗ＣＸＣＬ１２抗体分子の重要な生物学的特性である。したがって、リード抗体１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２を、トランスウェル遊走アッセイを用いて、卵巣癌細胞のＣＸＣＬ１２誘導性遊走をブロッキングする能力に関して試験した。本明細書で用いるトランスウェル遊走アッセイは、白血球の走化性反応を研究するために用いられたボイデンチャンバーの修飾型であった。このアッセイにおいて、上部チャンバーに植え付けられた蛍光標識ヒト卵巣癌細胞（ＴＯＶ−２１Ｇ）の、多孔性膜を渡り、そしてＣＸＣＬ１２を含有する下部チャンバー内への遊走を分析した（図４Ａ）。以前の研究によって、より高い濃度でＣＸＣＬ１２二量体が形成され、細胞遊走を阻害しうることが示されてきている。したがって、細胞遊走を刺激するために最適なＣＸＣＬ１２濃度を実験的に決定した（図４Ｂ）。
【０１４１】
リード抗ＣＸＣＬ１２抗体が卵巣癌細胞のＣＸＣＬ１２誘導性遊走を阻害する能力を評価するため、上述のトランスウェル遊走アッセイにおいて、１１４＿３Ｈ１  ＩｇＧおよび１１３＿１Ｈ１２  ＩｇＧの用量設定を行った。どちらの抗体も、用量依存方式で、ＴＯＶ−２１Ｇ細胞の遊走を阻害する（図５）。１１４＿Ｈ０１および１１３＿１Ｈ１２の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）は、それぞれ、４．６（±０．５）ｎＭおよび１３．２（±４．１）ｎＭであった。これらの値は、ＳＰＲによって決定した平衡解離定数に一致する。さらなる複製実験は、より高い品質データを生じ、これによって、１１４＿Ｈ０１および１１３＿１Ｈ１２のＩＣ５０値は、それぞれ、５ｎＭおよび９ｎＭと確認された。
【０１４２】
リード抗ＣＸＣＬ１２による血管形成の阻害
腫瘍の生存および増殖は、酸素および栄養素の適切な供給を提供する、補助血管ネットワークに非常に依存する。ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４軸は、腫瘍補助血管系を確立するための新規血管の形成（血管形成）を促進する際に重要な役割を果たす。ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＲ４は、周知の血管形成促進因子であるＶＥＧＦと正のフィードバックループを形成する。このループにおいて、ＶＥＧＦは、ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＲ４両方の発現を刺激する。逆に、ＣＸＣＲ４のＣＸＣＬ１２誘導性活性化は、内皮細胞によるＶＥＧＦの産生を上方制御する。したがって、リード抗ＣＸＣＬ１２抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成アッセイで試験して、細管の形成および分枝を阻害する能力を評価した。
【０１４３】
このアッセイにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および線維芽細胞を、抗ＣＸＣＬ１２抗体およびＶＥＧＦを含有する培地中でともに培養した。これらの２つの細胞タイプは、ＶＥＧＦの存在下で相互作用して、ｉｎ  ｖｉｖｏの小さい毛細血管に似た三次元管の形成を生じる。免疫組織化学によって、共培養７日後の抗ＣＸＣＬ１２抗体の阻害効果を分析した（図６）。
【０１４４】
血管形成を分析するための最も価値あるパラメータは、細管の長さおよび細管あたりの分枝数である。内皮細胞は、ＶＥＧＦ刺激に際して、長く、そして分枝した細管を形成し、そしてこれは、非特異的抗体の存在によっては影響を受けなかった。１１３＿１Ｈ１２で、細管形成および分枝の有意な阻害が観察された（図６Ｂ）。
【０１４５】
ＷＯ  ２００８／０１８６４１の抗体との比較
ＷＯ  ２００８／０１８６４１は、抗ＣＸＣＬ１２抗体の２つの対、１Ｄ３および１Ｈ２ならびに１Ｃ６および２Ａ５を記載する。該抗体対は、ＣＸＣＬ１２の共通のエピトープを認識する。
【０１４６】
ＷＯ  ２００８／０１８６４１の抗体の重鎖および軽鎖配列を、本発明の抗体の配列と整列させ、そして図８に整列を示す。これは、本発明の抗体１１４＿Ｈ０１および１１３＿１Ｈ１２に比較した際、これらの抗体のＣＤＲ配列において有意な相違があることを示す。
【０１４７】
抗体のアフィニティもまた比較した。抗体１１４＿Ｈ０１のヒトＣＸＣＬ１２に関するアフィニティ定数（ＫＤ）は２．４ｎＭであり、そして抗体１１３＿１Ｈ１２のものは４．２ｎＭであった。これは、１Ｄ３  ＫＤ＝１５１ｎＭ；１Ｈ２  ＫＤ＝１７６ｎＭ；１Ｃ６  ＫＤ＝３．６ｎＭ；および２Ａ５  ＫＤ＝４．６ｎＭであるＷＯ  ２００８／０１８６４１の抗体に関して報告された値に匹敵する。アフィニティデータは、本発明の抗体１１４＿Ｈ０１および１１３＿１Ｈ１２が、ＩｇＧではなくＦａｂ形式の抗体を用い、これは一般的には先行技術に比較して、本発明の抗体のアフィニティを過小評価するであろうにもかかわらず、ＷＯ  ２００８／０１８６４１の抗体に関して報告された最高の結果と同程度に優れているかまたはより優れたアフィニティを有することを示す。
【０１４８】
エピトープマッピング
抗体１１３＿１Ｈ１２および１１４＿Ｈ０１が結合するエピトープを、ＷＯ  ２００８／０１８６４１に開示される４つの例示される抗体が結合するエピトープに比較した。これらの実験は、１１３＿１Ｈ１２がＷＯ  ２００８／０１８６４１の抗体１Ｄ３および１Ｈ２とエピトープを共有する一方、１１４＿３Ｈ１がＷＯ  ２００８／０１８６４１の抗体と１残基しか共有しないユニークなエピトープを有することを示した。Ｅ１５は、受容体またはヘパリン結合に関与する領域の外である。すべての他のエピトープ残基は、受容体結合に関与する領域内にあり、これはＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４８０６１（ＳＤＦ１＿ヒト）全長タンパク質の番号付けにしたがって、２９〜３３、３９〜４１、４８〜５０、６０〜７０である。ＷＯ  ２００８／０１８６４１は、受容体結合に関与する残基が、アミノ酸残基７〜１９の間にあることを開示する。
【０１４９】
【表３】
2018505144.tif 000010
【０１５０】
キメラネズミＩｇＧ２ａ主鎖中の抗ＣＸＣＬ１２モノクローナル抗体の特性
１１３＿１Ｈ１２および１１４＿３Ｈ１の可変領域を、ネズミＩｇＧ２ａ発現系内にクローニングし、ネズミ定常領域およびヒト可変領域を含む、キメラ抗体の産生を可能にした。このタイプのキメラ抗体は、完全ヒト抗体の投与に際して生じうる、抗体に対する免疫反応を減少させるため、免疫適格性動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験に好ましい可能性がある。
【０１５１】
Ａ）遊走アッセイ
ネズミ転移性黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）およびヒト卵巣癌細胞株（ＴＯＶ２１Ｇ）を用いて、キメラネズミＩｇＧ２ａおよび完全ヒトＩｇＧ２形式の抗体が、ヒトおよびネズミ細胞株の細胞遊走をブロッキングする能力を調べた。
【０１５２】
すべての抗体を、５０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。ヒトＣＸＣＬ１２リガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を５００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた。ＤＭＥＭ（Ｂ１６Ｆ１０研究のため）またはＲＰＭＩ（ＴＯＶ２１Ｇ研究のため）中で、抗体およびリガンドを調製した。各タイムラプス遊走アッセイに関して、３〜４ｘ１０６細胞を、カバースリップ遊走チャンバー内部で、コラーゲン−細胞混合物中で用いた。細胞懸濁物を、１（細胞）：２（コラーゲン）の比で、コラーゲン混合物と合わせた。コラーゲン混合物は、１：２；１５比の重炭酸ナトリウム、１０ｘＭＥＭおよびコラーゲン（３ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で構成された。細胞−コラーゲン混合物に抗体を添加して、そして生じた混合物を、遊走チャンバー内に入れ、この中で、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって、コラーゲンを重合させた。ひとたび重合したら、ＣＸＣＬ１２リガンドを添加して、ケモカイン勾配を産生し、そしてＣＸＣＬ１２に向かう細胞の移動を、タイムラプス画像化を用いて決定した。３．５〜４時間の期間に渡って、１写真／分の間隔で画像を採取した。タイムラプス画像化によって、細胞遊走トラックの可視化を可能にし、これを次いで、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて分析し、細胞遊走の度合いを決定した。
【０１５３】
ＣＸＣＬ１２および３つのブロッキング抗体の存在下での、Ｂ１６Ｆ１０細胞の遊走距離を、図９ＡおよびＢに示す。
すべての抗体、ヒトＩｇＧ２形式の１１３＿１Ｈ１２（ｈＡＢ１１３）、キメラネズミＩｇＧ２ａ形式の１１３＿１Ｈ１２（ｍＡＢ１１３）、およびキメラネズミＩｇＧ２ａ形式の１１４＿３Ｈ１（ｍＡＢ１１４）は、Ｂ１６Ｆ１０細胞において、細胞遊走を実質的にブロッキングするのに有効であり、そしてＴＯＶ−２１細胞においてもまた、ある程度までブロッキングした。このアッセイにおいて、ヒトＩｇＧ２形式の１１３＿１Ｈ１２（ｈＡＢ１１３）は、ＴＯＶ２１Ｇ細胞遊走のブロッキングに関しては不活性であり、一方、ｍＡＢ１１３は完全に活性であり、そしてｍＡＢ１１４はその中間であった。しかし、図５の結果から、本発明者らは、ヒトＩｇＧ２形式の１１３＿１Ｈ１２抗体は、ＣＸＣＬ１２に向かうＴＯＶ２１Ｇ細胞株の遊走を阻害可能であることを知っており、そしてしたがって、この不活性結果は、例外である可能性が高い。これらの結果を図９Ａに要約する。
【０１５４】
さらに、すべての３つの抗体は、Ｂ１６Ｆ１０細胞のＣＸＣＬ１２依存性遊走の阻害に有効であった。これを図９Ｂに図式的に示す。したがって、これらの実験によって、キメラネズミＩｇＧ２ａ形式の抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遊走アッセイで働き、そして癌細胞遊走を阻害可能であることを確認する。
【０１５５】
Ｂ）血清安定性試験
キメラネズミＩｇＧ２ａ形式の抗体１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２の血清安定性を試験した。ヒト血清を用いて、血清安定性アッセイを行った。抗体を１００μｇ／ｍｌの濃度で、血清中、６、１２、２４および４８時間インキュベーションした。抗体含有血清をＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ中で５０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、そしてＡに上述するようなタイムラプス遊走アッセイに用いた。これらの実験によって、キメラネズミＩｇＧ２ａ形式の抗体が、血清中で４８時間に渡って安定であり、そして血清中で４８時間後もなお、ＣＸＣＬ１２依存性Ｂ１６Ｆ１０細胞遊走を阻害する際に活性であることが見出された。これは、どちらの抗体も、血清中で非常に安定であることを確認する。
【０１５６】
Ｃ）ｉｎ  ｖｉｖｏ肺転移
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞は、肺への遊走および転移の開始にＣＸＣＲ４を必要とする。単純な実験転移ｉｎ  ｖｉｖｏモデルを用いて、キメラネズミＩｇＧ２ａ抗体が、ＣＸＣＬ１２に干渉し、そしてしたがって転移発展をブロッキングする能力を評価した。第０日、尾静脈注射を通じて、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７Ｂｌマウス内に導入し、そして第１日に治療を開始した。治療措置は、臨床的ＣＸＣＲ４阻害剤ＡＭＤ３１００（プレリキサフォル）の５ｍｇ／ｋｇを毎日２回、あるいは１０、１５または２０ｍｇ／ｋｇいずれかのネズミＩｇＧ２ａ形式の抗ＣＸＣＬ１２抗体を週２回のいずれかであった。対照アームのマウスは、２０ｍｇ／ｋｇのネズミＩｇＧ２ａ対照抗体で週２回治療された。すべてのマウスを第１４日に処分し、そして肺中の転移性コロニーの数を、手動計数によって定量化した。図１０に示すように、キメラネズミ１１４＿３Ｈ１および１１３＿１Ｈ１２抗体は、どちらも、転移発展阻害に活性であった。特に、抗体１１３＿１Ｈ１２がより強力であり、そしてＣＸＣＲ４の小分子アンタゴニスト、ＡＭＤ３１００の５ｍｇ／ｋｇで見られるものと同等の阻害を２０ｍｇ／ｋｇで生じた。したがって、どちらの抗体もＣＸＣＲ４依存性肺転移を阻害する際に、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効である。
【０１５７】
【化７−１】
2018505144.tif 000011
【０１５８】
【化７−２】
2018505144.tif 000012
【０１５９】
【化７−３】
2018505144.tif 000013
【０１６０】
【化７−４】
2018505144.tif 000014
【０１６１】
【化７−５】
2018505144.tif 000015
【０１６２】
参照：
本明細書に言及するすべての文書は、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
2018505144.tif 000016
【図２】
2018505144.tif 000017
【図３−１】
2018505144.tif 000018
【図３−２】
2018505144.tif 000019
【図４】
2018505144.tif 000020
【図５】
2018505144.tif 000021
【図６Ａ】
2018505144.tif 000022
【図６Ｂ】
2018505144.tif 000023
【図７】
2018505144.tif 000024
【図８】
2018505144.tif 000025
【図９】
2018505144.tif 000026
【図１０】
2018505144.tif 000027
【図１１】
2018505144.tif 000028
【配列表】
2018505144000001.xml
【国際調査報告】
2018505144.tif 000034
2018505144.tif 000035
2018505144.tif 000036
2018505144.tif 000037
2018505144.tif 000038
2018505144.tif 000039