(57)【要約】ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦ−βファミリーのＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体の細胞外ドメイン、またはＴＧＦ−βファミリーのＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体の細胞外ドメインを含む可溶性シングルアーム異種ポリペプチド複合体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩから選択されるＩＩ型受容体の細胞外ドメインを含む可溶性シングルアームポリペプチド複合体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７から選択されるＩ型受容体の細胞外ドメインを含む可溶性シングルアームポリペプチド複合体を提供する。任意選択で可溶性複合体はヘテロ二量体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２のポリペプチドと共有結合的または非共有結合的に会合した第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体であって、
ａ．前記第１のポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列と、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列とを含み、ここで、前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩポリペプチドから選択され；  
ｂ．前記第２のポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含み、ここで、前記第２のポリペプチドは、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドを含まない、
タンパク質複合体。
【請求項２】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項３】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項４】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項５】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項６】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項７】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＡＬＫ１ポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項８】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＡＬＫ２ポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項９】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＡＬＫ３ポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項１０】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＡＬＫ４ポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項１１】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＡＬＫ５ポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項１２】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＡＬＫ６ポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項１３】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドが、ＡＬＫ７ポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項１４】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ．配列番号９、１０、および１１のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号９のアミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のいずれか１つで始まり、配列番号９のアミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項２に記載のタンパク質複合体。
【請求項１５】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、
ａ．配列番号１、２、３、４、５、および６のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号１のアミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つで始まり、配列番号１のアミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項３に記載のタンパク質複合体。
【請求項１６】
前記ＢＭＰＲＩＩポリペプチドが、
ａ．配列番号４６、４７、７１、および７２のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号４６または７１のいずれかのアミノ酸２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４のいずれか１つで始まり、配列番号４６または７１のいずれかのアミノ酸１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、および１５０のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項４に記載のタンパク質複合体。
【請求項１７】
前記ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドが、
ａ．配列番号４２、４３、６７、および６８のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号４２のアミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０または５１のいずれか１つで始まり、配列番号４２のアミノ酸１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５または１６６のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｃ．配列番号６７のアミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４のいずれか１つで始まり、配列番号６７のアミノ酸１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０または１９１のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一、
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項５に記載のタンパク質複合体。
【請求項１８】
前記ＭＩＳＲＩＩポリペプチドが、
ａ．配列番号５０、５１、７５、７６、７９、および８０のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．ａ）配列番号５０、７５、または７９のいずれかのアミノ酸１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４のいずれか１つで始まり、配列番号５０、７５、または７９のいずれかのアミノ酸１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、および１４９のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項６に記載のタンパク質複合体。
【請求項１９】
前記ＡＬＫ１ポリペプチドが、
ａ．配列番号１４および１５のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号１４のアミノ酸２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４のいずれかで始まり、配列番号１４のアミノ酸９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、および１１８のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項７に記載のタンパク質複合体。
【請求項２０】
前記ＡＬＫ２ポリペプチドが、
ａ．配列番号１８および１９のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号１８のアミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５のいずれか１つで始まり、配列番号１８のアミノ酸９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、および１２３のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項８に記載のタンパク質複合体。
【請求項２１】
前記ＡＬＫ３ポリペプチドが、
ａ．配列番号２２および２３のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号２２のアミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、および６１のいずれか１つで始まり、配列番号２２のアミノ酸１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、および１５２のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項９に記載のタンパク質複合体。
【請求項２２】
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、
ａ．配列番号２６、２７、８３、および８４のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号２６または８３のいずれかのアミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４のいずれか１つで始まり、配列番号２６または８３のいずれかのアミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項１０に記載のタンパク質複合体。
【請求項２３】
前記ＡＬＫ５ポリペプチドが、
ａ．配列番号３０、３１、８７、および８８のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号３０または８７のいずれかのアミノ酸２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および３６のいずれか１つで始まり、配列番号３０または８７いずれかのアミノ酸１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項１１に記載のタンパク質複合体。
【請求項２４】
前記ＡＬＫ６ポリペプチドが、
ａ．配列番号３４、３５、９１、および９２のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号３４のアミノ酸１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２のいずれか１つで始まり、配列番号３４のアミノ酸１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｃ．配列番号９１のアミノ酸２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか１つで始まり、配列番号９１のアミノ酸１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、および１５６のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項１２に記載のタンパク質複合体。
【請求項２５】
前記ＡＬＫ７ポリペプチドが、
ａ．配列番号３８、３９、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、および３１３のいずれかの配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一；または
ｂ．配列番号３８のアミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８のいずれか１つで始まり、配列番号３８のアミノ酸９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、または１１３のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、請求項１３に記載のタンパク質複合体。
【請求項２６】
前記タンパク質複合体が、組み換えヘテロ二量体である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項２７】
前記相互作用ペアの第１のメンバーがＩｇＧ重鎖由来の第１の定常領域を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項２８】
前記相互作用ペアの第２のメンバーがＩｇＧ重鎖由来の第２の定常領域を含む、請求項１〜２７のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項２９】
前記ＩｇＧ重鎖由来の第１の定常領域が、第１の免疫グロブリンＦｃドメインである、請求項２７に記載のタンパク質複合体。
【請求項３０】
前記ＩｇＧ重鎖由来の第２の定常領域が、第１の免疫グロブリンＦｃドメインである、請求項２８に記載のタンパク質複合体。
【請求項３１】
前記ＩｇＧ重鎖由来の第１の定常領域が、配列番号２００〜２１４のいずれか１つから選択される配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のタンパク質複合体。
【請求項３２】
前記ＩｇＧ重鎖由来の第２の定常領域が、配列番号２００〜２１４のいずれか１つから選択される配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のタンパク質複合体。
【請求項３３】
前記第１のポリペプチドが、配列番号１０１、１０３、１０４、１０６、１０７、１０９、１１０、１１２、１１３、１１５、１１６、１１８、１１９、１２１、１２２、１２４、１２５、１２７、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、および４２４のいずれか１つから選択される配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３２のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項３４】
前記第２のポリペプチドが、配列番号１３７、１３９、１４０、１４２、４２５、４２６、４２７、および４２８のいずれか１つから選択される配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３３のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項３５】
前記第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、および有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項３６】
前記第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドが、グリコシル化されており、ＣＨＯ細胞における前記Ｉ型受容体ポリペプチドの発現から得ることができるグリコシル化パターンを有する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項３７】
前記タンパク質複合体が、以下の特徴：ｉ）１０−７、１０−８、１０−９、または１０−１０Ｍ未満またはこれと等しいＫＤでＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合する；およびｉｉ）細胞へのＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体媒介性シグナル伝達を阻害する、のうちの１つまたは複数を有する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項３８】
前記タンパク質複合体が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙの１つまたは複数に結合する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項３９】
前記タンパク質複合体が、細胞ベースのアッセイにおいて１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドの活性を阻害する、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項４０】
前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙから選択される、請求項１〜３９のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか１項に記載のタンパク質複合体および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬調製物。
【請求項４２】
ＴＧＦβスーパーファミリー関連状態を有する患者を処置するための方法。
【請求項４３】
前記ＴＧＦβスーパーファミリー関連状態が、筋肉障害、赤血球障害、貧血、骨障害、骨量の減少、線維性障害、慢性腎疾患、代謝性疾患、ＩＩ型糖尿病、肥満症、および心血管障害からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年４月６日に出願された米国仮出願第６２／１４３，５７９号および２０１５年１１月２４日に出願された同第６２／２５９，４２２号に対する優先権の利益を主張する。上記出願の開示は、それらの全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の増殖因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における多種多様な細胞型において生物学的効果を発揮することが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の際にパターン形成および組織特異化において重要な機能を果たし、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心臓発生、造血発生、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化過程に影響を与えることができる。このスーパーファミリーは、２つの一般的な系統発生クレード：スーパーファミリーのうちのより最近進化したメンバーであって、ＴＧＦ−β、アクチビン、およびＮｏｄａｌを含むメンバーと、スーパーファミリーのうちのより遠縁のタンパク質のクレードであって、多数のＢＭＰおよびＧＤＦを含むクレードとに分けられる。Ｈｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁。ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーは、多様な、多くの場合補完的な効果を有する。ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーの活性を操作することにより、生物に有意な生理的変化を引き起こすことが可能になることが多い。例えば、畜牛のピエモンテ種およびベルジャンブルー種は、ＧＤＦ８（また、ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子における機能喪失変異であって、筋量の顕著な増大を引き起こす変異を保有する。Ｇｒｏｂｅｔら（１９９７年）、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、１７巻（１号）：７１〜４頁。さらに、ヒトでも、ＧＤＦ８の不活性の対立遺伝子は、筋量の増大と関連し、報告では、例外的な筋力と関連する。Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２〜８頁。
【０００３】
筋肉、骨、脂肪、赤血球、および他の組織の変化は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドにより媒介されるシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ１、２、３、５、および／または８）を増強または阻害することにより達成することができる。したがって、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの多様なリガンドの活性を調節する作用因子が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁
【非特許文献２】Ｇｒｏｂｅｔら（１９９７年）、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、１７巻（１号）：７１〜４頁
【非特許文献３】Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２〜８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
部分的に、本開示は、シングルＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、またはＭＩＳＲＩＩポリペプチド）を含むヘテロ多量体の複合体を、そのフラグメントおよび改変体を含め、提供する。これらの構築物は、本明細書において「シングルアーム」ポリペプチド複合体と称され得る。任意選択で、本明細書に開示のシングルアームポリペプチド複合体（例えば、シングルアームＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド複合体、例えばＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体）は、対応するホモ二量体の複合体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体、例えばＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ）と比較してを異なるリガンド結合特異性／プロファイル有する。新規の特性が、本明細書の実施例に示されるように、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体ポリペプチドのシングルドメインを含むヘテロ多量体のポリペプチド複合体によって呈示される。
【０００６】
ヘテロ多量体の構造として、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体およびより高次の複合体が挙げられる。好ましくは、本明細書に記載されるようなＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体ポリペプチドは、受容体のリガンド結合ドメイン、例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体の細胞外ドメインを含む。したがって、ある特定の態様では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩから選択されるＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体の細胞外ドメイン、ならびにその短縮体および改変体、またはＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７から選択されるＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体の細胞外ドメイン、ならびにその短縮体および改変体を含む。好ましくは、本明細書に記載されるようなＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型ポリペプチド、ならびにこれを含むタンパク質複合体は可溶性である。ある特定の態様では、本開示のヘテロ多量体複合体は、１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、Ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ミュラー管阻害性物質（ＭＩＳ）、およびＬｅｆｔｙ）に結合する。任意選択で、本開示のタンパク質複合体は、これらのリガンドの１つまたは複数に、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、または１０−１２未満またはこれと等しいＫＤで結合する。概して、本開示のヘテロ多量体複合体は、少なくとも１つのＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドの１つまたは複数の活性を阻害（アンタゴナイズ）し、そのような活性の変更は、例えば、本明細書に記載されるような細胞ベースのアッセイを含む当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定され得る。好ましくは、本開示のタンパク質複合体は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において少なくとも４、６、１２、２４、３６、４８、または７２時間の血清半減期を提示する。任意選択で、本開示のタンパク質複合体は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において少なくとも６、８、１０、１２、１４、２０、２５、または３０日の血清半減期を提示し得る。
【０００７】
ある特定の態様では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、第２のポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合した第１のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバーを含み、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。任意選択で、第２のポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバーに加えて、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドではなく、任意選択で５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００または５００以下のアミノ酸を含み得る、さらなるポリペプチド配列を含む。任意選択で、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー、あるいはＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列と、相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列との間に位置付けられ得る介在配列、例えばリンカー、に直接連結される。リンカーの例として、これらに限定されないが、配列ＴＧＧＧ、ＴＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＳ、およびＧＧＧが挙げられる。
【０００８】
本明細書で記載される相互作用ペアは、二量体化を促進するか、または高次の多量体を形成するように設計されている。一部の実施形態では、相互作用ペアは、相互作用して複合体、特に、ヘテロ二量体の複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列の場合もあるが、実効性のある実施形態は、ホモ二量体の複合体を形成する相互作用ペアを用いることもできる。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、非対称ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりもむしろ、互いと優先的に会合することを意味する。したがって、非対称相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、会合して、ヘテロ二量体の複合体を形成することができる。代替的に、相互作用ペアは、非誘導型であってもよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで、互いと会合しても自己会合してもよく、よって、同じまたは異なるアミノ酸配列を有することができることを意味する。したがって、非誘導型相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、会合して、ホモ二量体の複合体またはヘテロ二量体の複合体を形成することができる。任意選択で、相互作用ペア（例えば、非対称ペアまたは非誘導型相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと共有結合により会合する。任意選択で、相互作用ペア（例えば、非対称ペアまたは非誘導型相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと非共有結合により会合する。
【０００９】
伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体は、非誘導型相互作用ペアの例である一方で、種々の操作されたＦｃドメインが、非対称相互作用ペアとして設計された。したがって、本明細書で記載される相互作用ペアの第１のメンバーおよび／または第２のメンバーは、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含み得る。任意選択で、相互作用ペアの第１のメンバーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。例えば、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号２００〜２１４のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。例えば、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号２００〜２１４のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。一部の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーおよび第２のメンバーは、免疫グロブリンクラスおよびサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。別の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーおよび第２のメンバーは、異なる免疫グロブリンクラスまたはサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。任意選択で、相互作用ペア（例えば、非対称ペアまたは非誘導型相互作用ペア）の第１のメンバーおよび／または第２のメンバーは、例えば、免疫グロブリンの修飾されたＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの修飾された定常ドメインを含む。例えば、本開示のタンパク質複合体は、群：配列番号２００〜２１４から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＩｇＧの第１のＦｃ部分と、群：配列番号２００〜２１４から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＩｇＧの第１の修飾されたＦｃ部分のアミノ酸配列と同じであっても異なっていてもよいＩｇＧの第２のＦｃ部分とを含み得る。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＡｃｔＲＩＩＡ受容体に由来するシングルＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、本明細書に開示のＡｃｔＲＩＩＡ配列（例えば、配列番号９、１０、１１、１０１、１０３、４０１、および４０２）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）配列番号９の２１〜３０のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）で始まり、ｂ）配列番号９のアミノ酸１１０〜１３５のいずれか１つ（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５）のアミノ酸で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＡに対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１０１、１０３、４０１、および４０２）との間に位置付けられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の多量体化ドメインは、相互作用ペアの１つの構成成分を含む。ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００１１】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＡｃｔＲＩＩＢ受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、本明細書に開示のＡｃｔＲＩＩＢ配列（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、１０４、１０６、４０３、および４０４）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ａ）配列番号１の２０〜２９のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）で始まり、ｂ）配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４）のアミノ酸で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢに対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１０４、１０６、４０３、および４０４）との間に位置付けられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の多量体化ドメインは、相互作用ペアの１つの構成成分を含む。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＴＧＦＢＲＩＩ受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドは、本明細書に開示のＴＧＦＢＲＩＩ配列（例えば、配列番号４２、４３、６７、６８、１１３、１１５、４０９、および４１０）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号４２のアミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０または５１のいずれか１つで始まり、ｂ）配列番号４２のアミノ酸１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５または１６６のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号６７、のアミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４のいずれか１つで始まり、ｂ）配列番号６７のアミノ酸１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０または１９１のいずれか１つで終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦＢＲＩＩに対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１１３、１１５、４０９、および４１０）との間に位置付けられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の多量体化ドメインは、相互作用ペアの１つの構成成分を含む。ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＢＭＰＲＩＩ受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、本明細書に開示のＢＭＰＲＩＩ配列（例えば、配列番号４６、４７、７１、７２、１０７、１０９、４０５、および４０６）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号４６または７１の２７〜３４のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）で始まり、ｂ）配列番号４６または７１のアミノ酸１２３〜１５０のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、および１５０）のアミノ酸で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、ＢＭＰＲＩＩに対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＢＭＰＲＩＩポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１０７、１０９、４０５、および４０６）との間に位置付けられる。ＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＭＩＳＲＩＩ受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドは、本明細書に開示のＭＩＳＲＩＩ配列（例えば、配列番号５０、５１、７５、７６、７９、８０、１１０、１１２、４０７、および４０８）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号５０、７５、または７９の１７〜２４のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４）で始まり、ｂ）配列番号５０、７５、または７９のアミノ酸１１６〜１４９のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、および１４９）のアミノ酸で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＭＩＳＲＩＩポリペプチドは、ＭＩＳＲＩＩに対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＭＩＳＲＩＩポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１１０、１１２、４０７、および４０８）との間に位置付けられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の多量体化ドメインは、相互作用ペアの１つの構成成分を含む。ＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＡＬＫ１受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドは、本明細書に開示のＡＬＫ１配列（例えば、配列番号１４、１５、１１６、１１８、４１１、および４１２）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＡＬＫ１ポリペプチドは、ａ）配列番号１４の２２〜３４のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）で始まり、ｂ）配列番号１４のアミノ酸９５〜１１８のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、および１１８）のアミノ酸で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＡＬＫ１ポリペプチドは、ＡＬＫ１に対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＡＬＫ１ポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１１６、１１８、４１１、および４１２）との間に位置付けられる。ＡＬＫ１ポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＡＬＫ２受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＡＬＫ２ポリペプチドは、本明細書に開示のＡＬＫ２配列（例えば、配列番号１８、１９、１１９、１２１、４１３、および４１４）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＡＬＫ２ポリペプチドは、ａ）配列番号１８の２１〜３５のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５）で始まり、ｂ）配列番号１８のアミノ酸９９〜１２３のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、および１２３）のアミノ酸で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＡＬＫ２ポリペプチドは、ＡＬＫ２に対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＡＬＫ２ポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＡＬＫ２ポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１１９、１２１、４１３、および４１４）との間に位置付けられる。ＡＬＫ２ポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＡＬＫ３受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＡＬＫ３ポリペプチドは、本明細書に開示のＡＬＫ３配列（例えば、配列番号２２、２３、１２２、１２４、４１５、および４１６）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＡＬＫ３ポリペプチドは、ａ）配列番号２２の２４〜６１のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、および６１）で始まり、ｂ）配列番号２２のアミノ酸１３０〜１５２のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、および１５２）のアミノ酸で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＡＬＫ３ポリペプチドは、ＡＬＫ３に対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＡＬＫ３ポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＡＬＫ３ポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１２２、１２４、４１５、および４１６）との間に位置付けられる。ＡＬＫ３ポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＡＬＫ４受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＡＬＫ４ポリペプチドは、本明細書に開示のＡＬＫ４配列（例えば、配列番号２６、２７、８３、８４、１２５、１２７、４１７、および４１８）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＡＬＫ４ポリペプチドは、ａ）配列番号２６または８３の２３〜３４のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４）で始まり、ｂ）配列番号２６または８３のアミノ酸１０１〜１２６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）のアミノ酸で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡＬＫ４に対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＡＬＫ４ポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＡＬＫ４ポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１２５、１２７、４１７、および４１８）との間に位置付けられる。ＡＬＫ４ポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＡＬＫ５受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＡＬＫ５ポリペプチドは、本明細書に開示のＡＬＫ５配列（例えば、配列番号３０、３１、８７、８８、１２８、１３０、４１９、および４２０）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＡＬＫ５ポリペプチドは、ａ）配列番号３０または８７の２５〜３６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および３６）で始まり、ｂ）配列番号３０または８７のアミノ酸１０６〜１２６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）のアミノ酸で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＡＬＫ５ポリペプチドは、ＡＬＫ５に対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＡＬＫ５ポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＡＬＫ５ポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１２８、１３０、４１９、および４２０）との間に位置付けられる。ＡＬＫ５ポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＡＬＫ６受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＡＬＫ６ポリペプチドは、本明細書に開示のＡＬＫ６配列（例えば、配列番号３４、３５、９１、９２、１３１、１３３、４２１、および４２２）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＡＬＫ６ポリペプチドは、ａ）配列番号３４、の１４〜３２のアミノ酸のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２）で始まり、ｂ）配列番号３４のアミノ酸１０２〜１２６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＡＬＫ６ポリペプチドは、ａ）配列番号９１、の２６〜６２のアミノ酸のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、および６２）で始まり、ｂ）配列番号９１のアミノ酸１３２〜１５６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、および１５６）で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＡＬＫ６ポリペプチドは、ＡＬＫ６に対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＡＬＫ６ポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＡＬＫ６ポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１３１、１３３、４２１、および４２２）との間に位置付けられる。ＡＬＫ６ポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドがＡＬＫ７受容体に由来するＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含む異種ポリペプチド複合体を提供する。例えば、ＡＬＫ７ポリペプチドは、本明細書に開示のＡＬＫ７配列（例えば、配列番号３８、３９、１３４、１３６、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、４２３、および４２４）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、ＡＬＫ７ポリペプチドは、ａ）配列番号３８の２１〜２８のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８）で始まり、ｂ）配列番号３８のアミノ酸９２〜１１３のいずれか１つ（例えば、配列番号３８のアミノ酸残基９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、または１１３）のアミノ酸で終わるポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。任意選択で、本開示のＡＬＫ７ポリペプチドは、ＡＬＫ７に対して異種である１つまたは複数の部分（ドメイン）をさらに含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＡＬＫ７ポリペプチドは、多量体化ドメインを含む異種ポリペプチドに融合されてもよく、任意選択でリンカードメインがＡＬＫ７ポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、配列番号１３４、１３６、４２３、および４２４）との間に位置付けられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の多量体化ドメインは、相互作用ペアの１つの構成成分を含む。ＡＬＫ７ポリペプチドを含む異種複合体は、別のＩ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含まないが、Ｉ型またはＩＩ型ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドではない追加のポリペプチドを含み得る。
【００２２】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、および有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される、１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型ポリペプチドは、グリコシル化されており、例えば、ＣＨＯ細胞を含む哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現から得ることができるグリコシル化パターンを有する。
【００２３】
ある特定の態様では、本開示は、相互作用ペアのメンバーを含む任意の融合タンパク質を含む本明細書で記載されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型ポリペプチドの任意のものをコードする核酸を提供する。本明細書で開示される核酸は、発現のためにプロモーターに作動可能に連結することができ、本開示はさらに、このような組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞も提供する。細胞は、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞であることが好ましい。
【００２４】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書で記載されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型ポリペプチドの任意のもの、ならびにこのようなポリペプチドを含むタンパク質複合体を作製するための方法を提供する。このような方法は、任意の本明細書で開示される核酸を、適切な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞）内で発現させる工程を含み得る。このような方法は、ａ）細胞を、本明細書で記載されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドの発現に適する条件下で培養する工程であって、前記細胞が、Ｉ型またはＩＩ型ポリペプチド発現構築物で形質転換されている工程と；ｂ）このようにして発現させたＩ型またはＩＩ型ポリペプチドを回収する工程とを含み得る。本明細書に記載のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型ポリペプチド、ならびにそのタンパク質複合体は、タンパク質を細胞培養物から取得する周知の技法のいずれかを使用して粗精製、部分精製または高度精製された分画として回収することができる。
【００２５】
任意の本明細書に記載のタンパク質複合体が医薬調製物に組み込まれ得る。任意選択で、そのような医薬調製物は、他のポリペプチド構成成分に照らして少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％純粋である。任意選択で、本明細書に開示の医薬調製物は、１つまたは複数の追加の活性剤を含み得る。
【００２６】
本開示はさらに、本明細書で記載されるタンパク質複合体および医薬調製物を、これらに限定されないが、例えば、がん、筋肉、骨、脂肪、赤血球、代謝、線維症、および１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのリガンドの影響を受ける他の組織と関連する疾患および障害を含む、多様なＴＧＦ−ベータ関連状態の処置または予防に使用するための方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、Ｉ型受容体ポリペプチドまたはＩＩ型受容体ポリペプチドを含むシングルアーム異種タンパク質複合体の概略例を示す。そのような複合体は、各ポリペプチド鎖内に含まれる多量体化ドメインを介して共有結合的または非共有結合的にアセンブリすることができる。２つのアセンブリされた多量体化ドメインが相互作用ペアを構成し、これは誘導型であっても非誘導型であってもよい。
【００２８】
【図２】図２は、Ｉ型受容体ポリペプチド（「Ｉ」と示す）（例えば、ヒトまたは他の種由来のＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６またはＡＬＫ７タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）またはＩＩ型受容体ポリペプチド（「ＩＩ」と表示される）（例えば、ヒトまたは他の種由来のＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＭＩＳＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩまたはＴＧＦＢＲＩＩタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）を含むシングルアーム異種タンパク質複合体の概略例を示す。例示された実施形態では、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｂ」）を含む融合ポリペプチドの部分であり、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ」）と会合する。融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間に位置付けられ得る。相互作用ペアの第１および第２のメンバー（Ｂ、Ｃ）は誘導型（非対称）であってよく、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味し、あるいは相互作用ペアは非誘導型であってよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができ、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体は非誘導型相互作用ペアの例であり、他方、操作されたＦｃドメインの種類は誘導型（非対称）相互作用ペアとしてデザインされている。
【００２９】
【図３】図３は、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡの結晶構造の合成解析に基づき、ボックスで指し示されるリガンドに直接接触することが本明細書で推定される残基を伴う、ヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン（配列番号５００）およびヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（配列番号２）のアラインメントを示す。
【００３０】
【図４】図４は、種々の脊椎動物の細胞内ドメインのないＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質（それぞれ、配列番号５０１、５０２、５０３、５０４、５０５および５０６）、細胞内ドメインのないヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質（配列番号５０７）、およびコンセンサスＡｃｔＲＩＩ前駆体タンパク質（配列番号５０８）の多重配列アライメントを示す。
【００３１】
【図５】図５は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．１を使用した、ヒトＩｇＧアイソタイプに由来するＦｃドメインの多重配列アラインメントを示す。ヒンジ領域は、点線の下線によって指し示されている。二重の下線は、非対称鎖ペア形成を促進するようにＩｇＧ１  Ｆｃにおいて操作された位置と、他のアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に関する対応する位置の例を指し示す。
【００３２】
【図６】図６は、シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ：Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体についての、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較した、リガンド結合データを示す。各タンパク質複合体について、リガンドを、リガンドによるシグナル伝達の阻害と良好に相関する反応速度定数であるオフ速度（ｋｏｆｆまたはｋｄ）によりランク付けし、結合アフィニティの降順に列挙する（最も緊密に結合したリガンドを、一番上に列挙する）。左側において、黄線、赤線、緑線、および青線は、オフ速度定数の大きさを指し示す。特に関心のあるリガンドを太字で強調するが、他はグレーで表し、黒実線は、ヘテロ二量体への結合がホモ二量体と比較して増強されるかまたは不変であるリガンドを指し示すのに対し、破線は、ホモ二量体と比較して実質的に低減した結合を指し示す。示される通り、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体が、５つの高アフィニティーリガンドの各々に、同様の高アフィニティーで結合するのに対し、シングルアームのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、これらのリガンド間をよりたやすく識別する。したがって、シングルアームのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１に強く結合し、ＧＤＦ８およびアクチビンＡに中程度の強度で結合する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体とさらに対照的に、シングルアームのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、ＢＭＰ１０には弱い結合を提示するに過ぎず、ＢＭＰ９には結合しない。これらのデータは、シングルアームのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、ホモ二量体のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃより優れたリガンド選択性を有することを指し示す。
【００３３】
【図７】図７は、シングルアームのＡＬＫ３−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体についてのリガンド結合データを、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体と比較して示す。フォーマットは、図６の場合と同じである。示される通り、シングルアームのＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体について観察されるＢＭＰ４への例外的に緊密な結合を保持する一方で、ＢＭＰ２への結合強度の低減を呈示するので、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体よりＢＭＰ４と、ＢＭＰ２との間を良好に識別する。シングルアームのＡＬＫ３−Ｆｃはまた、ＢＭＰ５（中程度の結合）、ＧＤＦ７（弱い結合）、およびＧＤＦ６（結合なし）の間を、これら３つのリガンドにほぼ同様の強度（全て中程度）で結合するＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体と比較して、良好に識別する。これらのデータは、シングルアームのＡＬＫ３−Ｆｃが、ホモ二量体のＡＬＫ３−Ｆｃより優れたリガンド選択性を有することを指し示す。
【００３４】
【図８】図８は、シングルアームのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体についてのリガンド結合データを、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体と比較して示す。フォーマットは、図６の場合と同じである。示される通り、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体が、アクチビンＢへの優先的な結合を、アクチビンＡおよびＧＤＦ１１への強い結合と合わせて呈示するのに対し、シングルアームのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃは、アクチビンＢを上回るアクチビンＡに対する逆転した優先性を、ＧＤＦ１１（弱い結合剤）を上回るアクチビンＡに対する大幅に増強された選択性と合わせて有する。これらのデータは、シングルアームのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃが、ホモ二量体のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃとは実質的に異なるリガンド選択性を有することを指し示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
１．概観
部分的に、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインまたはＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含むシングルアームヘテロ多量体複合体、そのようなシングルアームヘテロ多量体複合体を作製する方法、およびその使用に関連する。本明細書に記載されるように、シングルアームヘテロ多量体複合体は、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７から選択されるＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメイン、またはＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩから選択されるＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含み得る。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、対応するホモ多量体複合体と比較してＴＧＦβスーパーファミリーリガンドに対する結合の変更されたプロファイルを有する（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体複合体と比較したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体）。
【００３６】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、ＴＧＦ−β、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、骨形成遺伝子タンパク質（ＢＭＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、および抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含む、３０を超える分泌因子から構成される。例えば、Ｗｅｉｓｓら（２０１３年）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（１号）：４７〜６３頁を参照。スーパーファミリーのメンバーであって、脊椎動物および非脊椎動物のいずれにおいても見出されるメンバーは、多様な組織内で遍在的に発現し、動物の寿命を通して発生の最早期に機能する。実際、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、幹細胞の自己再生、原腸形成、分化、器官の形態形成、および成体組織のホメオスタシスの鍵となるメディエーターである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーによるシグナル伝達の異常が、例えば、自己免疫疾患、心血管疾患、線維性疾患、およびがんを含む広範にわたるヒト病態と関連することは、この活性の遍在性と符合する。
【００３７】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドは、１つの単量体の中央３−１／２ターンヘリックスが、他の単量体のベータ−ストランドにより形成される凹部表面に対してパッキングされる、同じ二量体構造を共有する。ＴＧＦ−βファミリーメンバーの大半は、分子間ジスルフィド結合によりさらに安定化される。このジスルフィド結合は、「システインノット」モチーフと称されるモチーフを生成する他の２つのジスルフィド結合により形成されるリングを横切る。例えば、Ｌｉｎら（２００６年）、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、１３２巻：１７９〜１９０頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁を参照。
【００３８】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのシグナル伝達は、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体の異種複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介され、これらは、リガンド刺激の際に、下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化および活性化する［Ｍａｓｓａｇｕｅ、２０００年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１巻：１６９〜１７８頁］。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、予測セリン／スレオニンキナーゼ特異性を持つ細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。概して、Ｉ型受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介する一方、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドの結合に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型の受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。
【００３９】
ＴＧＦ−βファミリーは、結合するＩ型受容体と、活性化させるＳｍａｄタンパク質とに基づき、系統発生上の２つの分枝に分けることができる。１つは、近年進化した分枝であり、例えば、ＴＧＦ−β、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ３およびＮｏｄａｌを含む。他の分枝は、スーパーファミリーのより遠い関連タンパク質を含み、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７を含む。例えば、Ｈｉｎｃｋ、（２０１２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８６：１８６０−１８７０を参照。
【００４０】
ＴＧＦ−βアイソフォームは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの基礎となるメンバーであり、そのうち、哺乳動物では、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３と表示される３つのアイソフォームが公知である。生物活性な成熟ＴＧＦ−βリガンドは、ホモ二量体として機能し、主に、Ｉ型受容体であるＡＬＫ５を介してシグナル伝達するが、内皮細胞内のＡＬＫ１を介してもシグナル伝達することが見出されている。例えば、Ｇｏｕｍａｎｓら（２００３年）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、１２巻（４号）：８１７〜８２８頁を参照。ＴＧＦ−β１は、最も夥多であり、かつ、遍在的に発現するアイソフォームである。ＴＧＦ−β１は、創傷治癒において重要な役割を果たすことが公知であり、恒常的に活性なＴＧＦ−β１トランス遺伝子を発現するマウスは、線維症を発症する。例えば、Ｃｌｏｕｔｈｉｅｒら（１９９７年）、Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１００巻（１１号）：２６９７〜２７１３頁を参照。ＴＧＦ−β１はまた、Ｔ細胞の活性化および調節性Ｔ細胞の維持にも関与する。例えば、Ｌｉら（２００６年）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２５巻（３号）：４５５〜４７１頁を参照。ＴＧＦ−β２の発現は、また、ヒト神経膠芽腫細胞において最初に説明されたが、胚神経系のニューロン内および星状膠細胞内で生じる。ＴＧＦ−β２は、Ｔリンパ球のインターロイキン２依存性増殖を抑制することが公知である。ＴＧＦ−β３は当初、ヒト横紋筋肉腫細胞系から単離され、以来、肺腺癌および腎癌細胞系において見出されている。ＴＧＦ−β３は、口蓋および肺の形態形成に重要であることが公知である。例えば、Ｋｕｂｉｃｚｋｏｖａら（２０１２年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０巻：１８３頁を参照。
【００４１】
アクチビンは、当初、濾胞刺激ホルモン分泌の調節因子として発見されたＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであり、その後、多様な生殖的および非生殖的役割が特徴付けられている。主要なアクチビン形態Ａ、Ｂ、およびＡＢは、２つの近縁のβサブユニットのホモ／ヘテロ二量体（それぞれ、βＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である。ヒトゲノムはまた、主に肝臓内で発現する、アクチビンＣおよびアクチビンＥもコードし、βＣまたはβＥを含有するヘテロ二量体形態もまた公知である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞の生存を支援し得、細胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及ぼし得、そして、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機能の作用因子である。例えば、ＤｅＰａｏｌｏら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１９８巻：５００〜５１２頁；Ｄｙｓｏｎら（１９９７年）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．７巻：８１〜８４頁；およびＷｏｏｄｒｕｆｆ（１９９８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５巻：９５３〜９６３頁を参照。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによってアンタゴナイズされる。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌の制御において、アクチビンは、ＦＳＨの合成および分泌を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの合成および分泌を低減する。アクチビンの生活性を調節し得、そして／または、アクチビンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ、ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知）およびα２−マクログロブリンが挙げられる。
【００４２】
本明細書で記載される通り、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであれ、βＡサブユニットに特異的に結合する作用因子である。ヘテロ二量体の複合体（例えば、βＡβＢヘテロ二量体）の場合、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、βＡサブユニット内に存在するエピトープには特異的であるが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」にアンタゴナイズする（これを阻害する）本明細書で開示される作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてあれ、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用因子である。βＡβＢヘテロ二量体の場合、「アクチビンＡ」を阻害する作用因子は、βＡサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）の活性は阻害しない作用因子である。この原則はまた、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合し、かつ／またはこれらを阻害する作用因子にも当てはまる。「アクチビンＡＢ」にアンタゴナイズする本明細書で開示される作用因子は、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性と、βＢサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性とを阻害する作用因子である。
【００４３】
ＢＭＰおよびＧＤＦは、併せて、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの特徴的折り畳みを共有するシステインノットサイトカインのファミリーを形成する。例えば、Ｒｉｄｅｒら（２０１０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、４２９巻（１号）：１〜１２頁を参照。このファミリーは、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ１０としても公知）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２としても公知）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１としても公知）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７としても公知）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ５としても公知）、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３（ＶＧＲ２としても公知）、ＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１５およびｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃを含む。骨形成を誘導する能力であって、ＢＭＰにそれらの名称を与えた能力のほか、ＢＭＰ／ＧＤＦは、広範にわたる組織の発達における形態形成活性も提示する。ＢＭＰ／ＧＤＦホモおよびヘテロ二量体は、Ｉ型およびＩＩ型受容体の二量体の組合せと相互作用して、複数の可能なシグナル伝達複合体をもたらし、ＳＭＡＤ転写因子の２つの競合するセットのうちの１つを活性化させる。ＢＭＰ／ＧＤＦは、高度に特異的で、局在化された機能を有する。これらは、ＢＭＰ／ＧＤＦ発現の発達上の制限を含む多数の形で調節されており、高アフィニティである特定のＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドに結合し、それによってリガンド活性を阻害するいくつかタンパク質の分泌を介して調節されている。興味深いことに、これらの内因性アンタゴニストのいくつかは、それ自体ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドに相似している。
【００４４】
増殖および分化因子８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知であり、骨格筋量の負の調節因子である。ＧＤＦ８は、発生中および成体中の骨格筋において高度に発現する。遺伝子導入マウスにおけるＧＤＦ８欠失変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成を特徴とする。例えば、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）、３８７巻：８３〜９０頁を参照。骨格筋量の同様の増加は、ウシおよび、驚くべきことに、ヒトにおけるＧＤＦ８の天然に存在する変異において明らかである。例えば、Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４年）、Ｇｒｏｗｔｈ、３８巻：５０１〜５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ、Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．、（１９９４年）３８巻：７５２〜７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、（１９９７年）９４巻：１２４５７〜１２４６１頁；Ｋａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、（１９９７年）７巻：９１０〜９１５頁；およびＳｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２〜８頁を参照。研究は、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋肉消耗には、ＧＤＦ８タンパク質の発現の増加が随伴することも示している。例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、ＰＮＡＳ、（１９９８年）９５巻：１４９３８〜４３頁を参照。加えて、ＧＤＦ８は、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節することが可能であり、筋芽細胞の増殖を調節し得る。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ００／４３７８１号頁を参照。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合的に結合し、その生物活性を不活性化することができる。例えば、Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：６４０７〜６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：７６４６〜７６５４頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９０年）、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５〜４３頁を参照。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質として、フォリスタチン、および、潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる。例えば、Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜２３２頁を参照。
【００４５】
ＢＭＰ１１としても公知のＧＤＦ１１は、マウス発生時に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現する分泌タンパク質である。例えば、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９９年）、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、２２巻：２６０〜２６４頁；およびＮａｋａｓｈｉｍａら（１９９９年）、Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．、８０巻：１８５〜１８９頁を参照。ＧＤＦ１１は、中胚葉組織および神経組織の両方のパターン形成において、固有の役割を果たす。例えば、Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜３２頁を参照。ＧＤＦ１１は、発生中のニワトリの肢における軟骨形成および筋発生の負の調節因子であることが示された。例えば、Ｇａｍｅｒら（２００１年）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２２９巻：４０７〜２０頁を参照。筋内のＧＤＦ１１の発現はまた、ＧＤＦ８と同様の方式での筋肉の増殖の調節におけるその役割も示唆する。加えて、脳内のＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ１１はまた、神経系の機能に関連する活性を有し得ることを示唆する。興味深いことに、ＧＤＦ１１は、嗅上皮における神経発生を阻害することも見出された。例えば、Ｗｕら（２００３年）、Ｎｅｕｒｏｎ、３７巻：１９７〜２０７頁を参照。よって、ＧＤＦ１１は、筋疾患および神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症）などの疾患を処置するのに、インビトロおよびインビボにおいて適用することができる。
【００４６】
骨形成性タンパク質１（ＯＰ−１）とも呼ばれるＢＭＰ７は、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。加えて、ＢＭＰ７は、広範にわたる生理プロセスも調節する。例えば、ＢＭＰ７は、上皮骨形成現象の一因となる、骨誘導因子であり得る。また、ＢＭＰ７がカルシウムの調節および骨のホメオスタシスにおいても役割を果たすことも見出されている。アクチビンと同様に、ＢＭＰ７も、ＩＩ型受容体であるＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。しかし、ＢＭＰ７とアクチビンとは、異なるＩ型受容体を動員して、ヘテロマーの受容体複合体となる。観察されるＢＭＰ７の主要なＩ型受容体が、ＡＬＫ２であったのに対し、アクチビンはもっぱらＡＬＫ４（ＡｃｔＲＩＩＢ）に結合した。ＢＭＰ７とアクチビンとは、顕著に異なる生体応答を誘発し、異なるＳＭＡＤ経路を活性化させた。例えば、Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら（１９９８年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７３巻：２５６２８〜３６頁を参照。
【００４７】
ミュラー管阻害性物質（ＭＩＳ）としてもまた公知の抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）は、ＴＧＦ−ベータファミリーの糖タンパク質である。１つのＡＭＨ関連ＩＩ型受容体が同定されており、ＡＭＨＲＩＩ、または代替的にＭＩＳＲＩＩと命名されている。ＡＭＨは、ヒト男性の胚におけるミュラー管の退縮を誘導する。ＡＭＨは、生殖年齢の女性において発現し、周期または妊娠に伴っては変動しないが、卵母細胞の数量および質の両方が減少するにつれて徐々に減少することが見出されたことから、ＡＭＨが、卵巣生理についてのバイオマーカーとして用いられ得ることが示唆される。例えば、Ｚｅｃら、（２０１１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ  Ｍｅｄｉｃａ、２１巻（３号）：２１９〜３０頁を参照されたい。
【００４８】
代替的にＡＣＶＲＬＫ１としても公知の、ＡＣＶＲＬ１遺伝子の産物であるアクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１）は、その発現が主に内皮細胞に制約されるＩ型受容体である。例えば、ＯＭＩＭ登録番号：６０１２８４を参照されたい。ＡＬＫ１は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０などのＴＧＦ−ベータファミリーのリガンドの結合により活性化し、ＡＬＫ１によるシグナル伝達は、発達上の血管形成および病理学的血管形成のいずれの調節においても、極めて重要である。ＡＬＫ１の発現は、早期のマウス発生における脈管形成および血管新生の部位と重なり合い、ＡＬＫ１ノックアウトマウスは、重度の血管異常のために、胎生約１１．５日で死ぬ（例えば、ＣｕｎｈａおよびＰｉｅｔｒａｓ（２０１１年）、Ｂｌｏｏｄ、１１７巻（２６号）：６９９９〜７００６頁を参照されたい）。ＡＬＫ１の発現についてはまた、肝星細胞および軟骨細胞などの他の細胞型においても記載されている。加えて、ＡＬＫ１は、アクチビン受容体様キナーゼ２（ＡＬＫ２）と共に、間葉系幹細胞内のＢＭＰ９誘導性骨形成シグナル伝達に重要であることが見出されている。例えば、ＣｕｎｈａおよびＰｉｅｔｒａｓ（２０１１年）、Ｂｌｏｏｄ、１１７巻（２６号）：６９９９〜７００６頁を参照されたい。
【００４９】
代替的にＡｃｔＲＩＡまたはＡＣＶＲＬＫ２としても公知の、ＡＣＶＲ１遺伝子の産物であるＡＬＫ２は、アクチビンおよびＢＭＰに結合することが示されているＩ型受容体である。ＡＬＫ２ノックアウトマウスは、原腸形成の直後に死ぬので、ＡＬＫ２は、胚発生に極めて重要である。例えば、Ｍｉｓｈｉｎａら（１９９９年）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２１３巻：３１４〜３２６頁；およびＯＭＩＭ登録番号：１０２５７６を参照されたい。ＡＬＫ２における恒常的活性変異は、筋肉、腱、および靭帯を含む線維性組織を、自発的に、または損傷したときに骨化させる稀な遺伝性障害である進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）と関連する。ＡＬＫ２の２０６位におけるアルギニンからヒスチジンへの変異は、ヒトでは、ＦＯＰと関連する天然に生じる変異である。この変異は、リガンドの結合を伴わないＡＬＫ２を介するＢＭＰ特異的シグナル伝達を誘導する。例えば、Ｆｕｋｕｄａら、（２００９年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２８４巻（１１号）：７１４９〜７１５６頁；およびＫａｐｌａｎら、（２０１１年）、Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．、１２３７巻：５〜１０頁を参照されたい。
【００５０】
代替的にＡＣＶＲＬＫ３としても公知の、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の産物であるアクチビン受容体様キナーゼ３（ＡＬＫ３）は、ＢＭＰファミリー内の複数のリガンドの効果を媒介するＩ型受容体である。遍在的な組織発現を伴ういくつかのＩ型受容体と異なり、ＡＬＫ３は、より特化した機能性と符合する制約された発現パターンを提示する。例えば、ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ（１９９３年）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８巻：２８７９〜２８８７頁；およびＯＭＩＭ登録番号：６０１２９９を参照されたい。ＡＬＫ３は一般に、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、およびＢＭＰファミリーの他のメンバーに対する高アフィニティーの受容体として認識されている。ＢＭＰ２およびＢＭＰ７は、造骨性分化の強力な刺激因子であり、現在、脊椎固定術およびある特定の非癒合骨折において骨形成を誘導するのに臨床で使用されている。ＡＬＫ３は、骨芽細胞においてＢＭＰ２およびＢＭＰ４によるシグナル伝達の媒介の鍵となる受容体と考えられている。例えば、Ｌａｖｅｒｙら（２００８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８３巻：２０９４８〜２０９５８頁を参照されたい。ホモ接合性のＡＬＫ３ノックアウトマウスは、胎生早期（約９．５日）に死ぬが、骨芽細胞にＡＬＫ３の条件的破壊を保有する成体マウスは、新たに形成された骨は組織化不良の証拠を示したものの、骨量の増大を呈示することが最近報告されている。例えば、Ｋａｍｉｙａ（２００８年）、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．、２３巻：２００７〜２０１７頁；およびＫａｍｉｙａ（２００８年）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３５巻：３８０１〜３８１１頁を参照されたい。この知見は、ＢＭＰ２およびＢＭＰ７（ＡＬＫ３のリガンド）の、臨床使用における造骨剤としての有効性と、驚くべき対照をなしている。
【００５１】
ＡＣＶＲＬＫ４としても代替的に公知の、ＡＣＶＲ１Ｂ遺伝子の産物であるアクチビン受容体様キナーゼ４（ＡＬＫ４）は、ＴＧＦ−ベータファミリーの多数のリガンドであって、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、およびＧＤＦを含むリガンドのシグナルを伝達するＩ型受容体である。ＡＬＫ４の変異は、膵臓がんと関連し、ヒト下垂体腫瘍では、ドミナントネガティブの切断型ＡＬＫ４アイソフォームが、高度に発現する。例えば、Ｔｓｕｃｈｉｄａら、（２００８年）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ、５５巻（１号）：１１〜２１頁；およびＯＭＩＭ登録番号：６０１３００を参照されたい。
【００５２】
ＴＧＦＢＲ１遺伝子の産物であるアクチビン受容体様キナーゼ５（ＡＬＫ５）は、大半の細胞型において広く発現する。ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのいくつかのリガンドであって、ＴＧＦ−ベータ、アクチビン、およびＧＤＦ−８を含むリガンドは、ＡＬＫ５を介してシグナル伝達し、下流のＳｍａｄ  ２およびＳｍａｄ  ３を活性化させる。ＡＬＫ５を欠損するマウスは、卵黄嚢および胎盤の血管発生において重度の欠損を呈示し、循環赤血球を欠き、妊娠中期で死ぬ。これらの胚は、正常な造血能を有するが、内皮細胞の増殖および不適正な遊走が増強されていることが見出された。したがって、ＡＬＫ５依存性シグナル伝達は、血管新生には重要であるが、造血前駆細胞の発達、および機能的な造血には重要でない。例えば、Ｌａｒｓｓｏｎら、（２００１年）、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２０巻（７号）：１６６３〜１６７３頁；およびＯＭＩＭ登録番号：１９０１８１を参照されたい。内皮細胞では、ＡＬＫ５は、ＡＬＫ１によるシグナル伝達と協同的かつ反対に作用する。ＡＬＫ５は、細胞の遊走および増殖を阻害するが、これは、ＡＬＫ１の反対の効果であることが注目される。例えば、Ｇｏｕｍａｎｓら（２００３年）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、１２巻（４号）：８１７〜８２８頁を参照されたい。加えて、ＡＬＫ５は、筋成長を負に調節すると考えられる。筋ジストロフィーについてのマウスモデルの筋内におけるＡＬＫ５のノックダウンは、線維症を減少させ、筋成長と関連する遺伝子の発現を増大させることが見出された。例えば、Ｋｅｍａｌａｄｅｗｉら、（２０１４年）、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、３巻、ｅ１５６頁を参照されたい。
【００５３】
アクチビン受容体様キナーゼ６（ＡＬＫ６）は、ＢＭＰＲ１Ｂ遺伝子の産物であり、その欠損は、ヒトおよびマウスの両方における軟骨異形成および四肢欠損と関連する。例えば、Ｄｅｍｉｒｈａｎら、（２００５年）、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．、４２巻：３１４〜３１７頁を参照されたい。ＡＬＫ６は、骨格の発達を通して広く発現し、マウスでは、軟骨形成に要請される。例えば、Ｙｉら、（２０００年）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２７巻：６２１〜６３０頁；およびＯＭＩＭ登録番号：６０３２４８を参照されたい。
【００５４】
アクチビン受容体様キナーゼ７（ＡＬＫ７）は、ＡＣＶＲ１Ｃ遺伝子の産物である。ＡＬＫ７ヌルマウスは、生存可能であり、生殖可能であり、骨格奇形も四肢奇形も示さない。ＡＬＫ７を介するＧＤＦ３シグナル伝達は、インスリン感受性および肥満症において役割を果たすと考えられる。これは、ＡＬＫ７ヌルマウスが、脂肪蓄積の低減および食餌誘導性肥満症に対する抵抗性を示すという結果により裏付けられる。例えば、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、（２００８年）、ＰＮＡＳ、１０５巻（２０号）：７２５２〜７２５６頁を参照されたい。ＡＬＫ７に媒介されるＮｏｄａｌシグナル伝達は、様々な異なるがん細胞系において腫瘍促進効果および腫瘍抑制効果の両方を有することが示されている。例えば、Ｄｅ  Ｓｉｌｖａら、（２０１２年）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、３巻：５９頁；およびＯＭＩＭ登録番号：６０８９８１を参照されたい。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「ＡｃｔＲＩＩ」という用語は、ＩＩ型アクチビン受容体のファミリーを指す。このファミリーは、ＡＣＶＲ２Ａ遺伝子によりコードされるアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）と、ＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子によりコードされるアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）との両方を含む。ＡｃｔＲＩＩ受容体は、アクチビン、ＧＤＦ８（ミオスタチン）、ＧＤＦ１１、ならびにＢＭＰのサブセット、とりわけ、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７を含むＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの様々なリガンドに結合する、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体である。ＡｃｔＲＩＩ受容体は、筋障害および神経筋障害（例えば、筋ジストロフィー、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および筋委縮症）、所望されない骨／軟骨成長、脂肪組織障害（例えば、肥満症）、代謝性障害（例えば、２型糖尿病）、および神経変性障害を含む、様々な生物学的障害に関与している。例えば、Ｔｓｕｃｈｉｄａら、（２００８年）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ、５５巻（１号）：１１〜２１頁、Ｋｎｏｐｆら、Ｕ．Ｓ．８，２５２，９００、ならびにＯＭＩＭ登録番号：１０２５８１および６０２７３０を参照されたい。
【００５６】
ＴＧＦＢＲ２遺伝子によりコードされる形質転換増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲＩＩ）は、ＴＧＦ−ベータリガンドに結合し、下流のＳｍａｄ  ２およびＳｍａｄ  ３エフェクターを活性化させることが公知のＩＩ型受容体である。例えば、Ｈｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁；およびＯＭＩＭ登録番号：１９０１８２を参照されたい。ＴＧＦＢＲＩＩを介するＴＧＦ−ベータシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、調節性Ｔ細胞の維持、および前軟骨性幹細胞の増殖において極めて重要である。例えば、Ｌｉら、（２００６年）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２５巻（３号）：４５５〜４７１頁；およびＣｈｅｎｇら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｓｃｉ．、２０１４年、１５巻、１２６６５〜１２６７６頁を参照されたい。
【００５７】
ＢＭＰＲ２遺伝子によりコードされる骨形成タンパク質受容体ＩＩ（ＢＭＰＲＩＩ）は、ＢＭＰ７およびＢＭＰ４を含むＢＭＰリガンドに結合することが公知のＩＩ型受容体である。ＢＭＰＲＩＩへの効率的なリガンド結合は、適切なＴＧＦＢＲのＩ型受容体の存在に依存する。例えば、Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇら、（１９９５年）、ＰＮＡＳ、９２巻：７６３２〜７６３６頁を参照されたい。ＢＭＰＲＩＩにおける変異は、ヒトでは、肺高血圧症と関連する。ＯＭＩＭ登録番号：６００７９９を参照されたい。
【００５８】
代替的に抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体としても公知の、ＡＭＨＲ２遺伝子の産物であるミュラー管阻害性物質受容体ＩＩ（ＭＩＳＲＩＩ）は、ＩＩ型ＴＧＦ−ベータスーパーファミリー受容体である。ＭＩＳＲＩＩは、ＭＩＳリガンドに結合するが、シグナル伝達には、ＡＬＫ３またはＡＬＫ６などの適切なＩ型受容体の存在を要請する。例えば、Ｈｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁；およびＯＭＩＭ登録番号：６００９５６を参照されたい。ＭＩＳＲＩＩは、ヒトでは性分化に関与し、ヒトの男性では、ミュラー管の退縮に要請される。ＡＭＨは、生殖年齢の女性において発現し、周期または妊娠に伴っては変動しないが、卵母細胞の数量および質の両方が減少するにつれて、徐々に減少することが見出されたことから、ＡＭＨが、卵巣生理のバイオマーカーとして用いられ得ることが示唆される。例えば、Ｚｅｃら、（２０１１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ  Ｍｅｄｉｃａ、２１巻（３号）：２１９〜３０頁；およびＯＭＩＭ登録番号：６００９５６を参照されたい。
【００５９】
ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６および／またはＢＭＰ７）によって開始される細胞内シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達）をアンタゴナイズするためのＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７）の細胞外ドメインまたはＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）の細胞外ドメインを含むシングルアームヘテロ多量体複合体、好ましくは可溶性ヘテロ多量体複合体の使用に関連する。本明細書に記載されるように、そのようなアンタゴニストシングルアームヘテロ多量体複合体は、これらに限定されないが、例えば、がん、筋肉、骨、脂肪、赤血球、代謝、線維症およびＴＧＦ−βスーパーファミリーの１つまたは複数のリガンドによって影響を受ける他の組織に関連した疾患および障害を含む、種々のＴＧＦ−β関連状態の処置または予防に有用であり得る。
【００６０】
特に、本開示のデータは、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインまたはＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含むシングルアームヘテロ多量体複合体が、対応するホモ多量体複合体との比較において異なるリガンド選択性プロファイルを有することを実証する。
【００６１】
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作製方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、それが使用される特定の文脈から明らかである。
【００６２】
「へテロマー」または「ヘテロ多量体」という用語は、少なくとも第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドとを含む複合体であって、第２のポリペプチドのアミノ酸配列が、第１のポリペプチドと、少なくとも１つのアミノ酸残基だけ異なる複合体を指す。へテロマーは、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチドにより形成される「ヘテロ二量体」を含む場合もあり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドに加えて、ポリペプチドが存在するより高次の構造を形成する場合もある。ヘテロ多量体の例示的な構造として、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、およびさらなるオリゴマー構造が挙げられる。本明細書では、ヘテロ二量体を、Ｘ：Ｙまたは、これと同義に、Ｘ−Ｙと表示する［表示中、Ｘは第１のポリペプチド鎖を表し、Ｙは第２のポリペプチド鎖を表す］。本明細書では、より高次のへテロマーおよびオリゴマー構造を対応する形式で表示する。ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、組換え（例えば、１つまたは複数のポリペプチド構成要素が、組換えタンパク質であり得る）であり、単離されており、かつ／または精製されている。
【００６３】
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共通する進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
【００６４】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有している場合も共有していない場合もある、核酸もしくはアミノ酸配列間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
【００６５】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に照らした「配列同一性パーセント（％）」とは、配列を決定し、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後における、保存的置換は配列同一性の一部と考えない場合の、候補配列内のアミノ酸残基（または核酸）の百分率であって、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列内のアミノ酸残基（または核酸）と同一であるアミノ酸残基（または核酸）の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある種々の方式で、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列を決定するのに適切なパラメータであって、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。しかし、本明細書の目的では、アミノ酸（核酸）配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムである、ＡＬＩＧＮ−２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは、使用説明書と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から一般に利用可能であるが、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上の使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変化しない。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「Ｘに実質的に結合しない」とは、「Ｘ」に対する作用因子のＫＤが、約１０−７より大きい、１０−６より大きい、１０−５より大きい、１０−４より大きい、またはそれより大きい（例えば、ＫＤを決定するのに使用されるアッセイにより検出可能でない結合）を意味することが意図され。
２．シングルアームＴＧＦβスーパーファミリー受容体ポリペプチドを含むヘテロ多量体複合体
【００６７】
ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のシングルアームＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質複合体に関する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示のポリペプチドは、第２のポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合した第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成することができ、ここで、第１のポリペプチドは、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列を含み；第２のポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドを含まない。相互作用ペアは、相互作用して、複合体、特にヘテロ二量体の複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列であってよいが、実効的な実施形態はホモ二量体の配列を形成する相互作用ペアも利用してよい。本明細書に記載されるように、相互作用ペアの１つのメンバーは、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチド、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、９、１０、１１、１４、１５、１８、１９、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、３９、４２、４３、４６、４７、５０、５１、６７、６８、７１、７２、７５、７６、７９、８０、８３、８４、８７、８８、９１、９２、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、および３１３のいずれかの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに融合されていてもよい。好ましくは、相互作用ペアは、改善された血清半減期を付与するか、またはポリエチレングリコール部分（ｍｏｉｅｔｙ）などの別の部分が結合されたアダプターとして作用して、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの単量体形態と比較して改善された血清半減期を提供するように選択される。
【００６８】
本明細書で示される通り、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのＩ型受容体またはＩＩ型受容体の単量体（シングルアーム）形態は、それらの対応ホモ二量体の形態と比較して実質的に変更されたリガンド結合選択性を呈示し得るが、単量体形態は、血清貯留時間（半減期）が短い傾向があり、これは、治療状況では所望されない。血清半減期を改善する共通の機構は、ポリペプチドを、ＩｇＧの定常ドメイン部分（例えば、Ｆｃ部分）を有するホモ二量体の融合タンパク質として発現させることである。しかし、ホモ二量体のタンパク質（例えば、Ｆｃ融合構築物で）として発現させたＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドは、単量体形態と同じ活性プロファイルを呈示しないかもしれない。本明細書において実証されるように、問題は、単量体形態を半減期延長部分と融合させることによって解決することができ、驚くべきことに、これは、相互作用ペアの１つのメンバーがＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドに融合されており、相互作用ペアの別のメンバーが部分に融合されていないか、または異種部分に融合されているタンパク質として、そのような非対称ヘテロ二量体の融合タンパク質を発現させることによって容易に達成することができ、相互作用ペアによって付与される血清半減期の改善と合わさった新規のリガンド結合プロファイルをもたらす。
【００６９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７ならびに配列番号１４、１５、１８、１９、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、３９、８３、８４、８７、８８、９１、９２、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３）または少なくとも１つのＴＧＦ−βスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ、ならびに配列番号１、２、３、４、５、６、９、１０、１１、４２、４３、４６、４７、５０、５１、６７、６８、７１、７２、７５、７６、７９、および８０）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連し、これは、本明細書において一般に、「本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体」または「ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体」と称され得る。好ましくは、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は可溶性であり、例えば、シングルアームヘテロ多量体複合体は、少なくとも１つのＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの可溶性部分または少なくとも１つのＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの可溶性部分含む。概して、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体の細胞外ドメインは、Ｉ型またはＩＩ型受容体の可溶性部分に対応する。したがって、一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、１つまたは複数のＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、および／またはＡＬＫ７受容体細胞外ドメイン）の細胞外ドメインまたはＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、および／またはＭＩＳＲＩＩ受容体細胞外ドメイン）の細胞外ドメインを含む。ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩの例示的な細胞外ドメインは、本明細書に開示されており、そのような配列、ならびにそのフラグメント、機能的改変体および改変形態を、本開示の発明に従って使用することができる（例えば、シングルアームヘテロ多量体複合体組成物およびその使用）。
【００７０】
例えば、３フィンガーの毒素フォールドとして公知の構造モチーフを規定することは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体の受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に配置された１０、１２、または１４の保存されたシステイン残基により形成される。例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、（１９９９）  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ６：１８−２２；Ｈｉｎｃｋ（２０１２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８６：１８６０−１８７０を参照のこと。任意の本明細書に記載の異種複合体は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのＩ型またはＩＩ型受容体のそのようなドメインを含み得る。これらの保存されたシステインの最外殻により画されるようなＴＧＦβスーパーファミリー受容体のコアとなるリガンド結合性ドメインは、配列番号１（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９〜１０９位；配列番号９（ＡｃｔＲＩＩＡ前駆体）の３０〜１１０位；配列番号１４（ＡＬＫ１前駆体）の３４〜９５位；配列番号１８（ＡＬＫ２前駆体）の３５〜９９位；配列番号２２（ＡＬＫ３前駆体）の６１〜１３０位；配列番号２６および８３（ＡＬＫ４前駆体）の３４〜１０１位；配列番号３０および８７（ＡＬＫ５前駆体）の３６〜１０６位；配列番号３４（ＡＬＫ６アイソフォームＢ前駆体）の３２〜１０２位；配列番号３８、３０５、および３０９（ＡＬＫ７前駆体）の２８〜９２位；配列番号４２（ＴＧＦＢＲＩＩアイソフォームＢ前駆体）の５１〜１４３位；配列番号４６および７１（ＢＭＰＲＩＩ前駆体）の３４〜１２３位；配列番号５０、７５、および７９（ＭＩＳＲＩＩ前駆体）の２４〜１１６位；配列番号６７（ＴＧＦＢＲＩＩアイソフォームＡ前駆体）の４４〜１６８位；および配列番号９１（ＡＬＫ６アイソフォームＡ前駆体）の６２〜１３２位に対応する。これらのシステインによって画されるコア配列に隣接する構造的に秩序のより乏しいアミノ酸は、必ずしもリガンド結合性を変更することなく、いずれかの末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７残基だけ短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮型についての例示的な細胞外ドメインとして、配列番号２、３、５、６、１０、１１１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、３０２、３０６、３１０、および３１３が挙げられる。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、Ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、その活性を阻害（アンタゴナイズ）する。特に、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体を使用して、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによって媒介される細胞内シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達）をアンタゴナイズすることができる。本明細書に記載されるように、そのようなアンタゴニストヘテロ多量体複合体は、これらに限定されないが、例えば、がん、筋肉、骨、脂肪、赤血球、代謝、線維症およびＴＧＦ−βスーパーファミリーの１つまたは複数のリガンドによって影響を受ける他の組織に関連した疾患および障害を含む、種々のＴＧＦ−β関連状態の処置または予防のためのものであり得る。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、対応するホモ多量体複合体との比較して異なるリガンド結合プロファイルを有する（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体に対して対応するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃホモ二量体）。本明細書に記載されるように、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体として、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびシングルアームの単一となった複合体に基づくさらなるオリゴマー構造が挙げられる。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、ヘテロ二量体である。
【００７２】
本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＢに対する言及は、現在同定されている形態のうちの任意の１つに対する言及であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび予測セリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。
【００７３】
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含する。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、本開示を通して提供されるほか、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号においても提供されている。本明細書で記載される、全てのＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記で提供される、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のタンパク質配列（配列番号１）の番号付けに基づく。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のタンパク質配列は、以下の通りである。
【化１】
2018517664.tif 000002
【００７４】
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、内因性Ｎ−連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
プロセシング後の細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。
【００７５】
【化２】
2018517664.tif 000003
【００７６】
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端における「ＳＧＲ・・・」配列により生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
【００７７】
【化３】
2018517664.tif 000004
【００７８】
配列番号１の６４位においてアラニン（Ａ６４）を有するＡｃｔＲＩＩＢの形態についてはまた、文献、例えば、Ｈｉｌｄｅｎら（１９９４年）、Ｂｌｏｏｄ、８３巻（８号）：２１６３〜２１７０頁を参照されたい、においても報告されている。本出願人らは、Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティが比較的低いことを確認した。これに対し、６４位においてアルギニン（Ｒ６４）を有する、同じＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティが、低ｎＭ〜高ｐＭの範囲である。したがって、Ｒ６４を有する配列を、本開示におけるヒトＡｃｔＲＩＩＢのための「野生型」参照配列として使用する。
６４位においてアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態は、以下の通りである。
【化４】
2018517664.tif 000005
【００７９】
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
代替的なＡ６４形態の、プロセシング後の細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。
【化５】
2018517664.tif 000006
【００８０】
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端における「ＳＧＲ・・・」配列により生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
【化６】
2018517664.tif 000007
【００８１】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１〜５１３をコードする、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５〜１５６０からなる核酸配列を、下記（配列番号７）に示す。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。シグナル配列に下線を付す。
【化７−１】
2018517664.tif 000008
【化７−２】
2018517664.tif 000009
【００８２】
プロセシング後のヒト細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列は、以下（配列番号８）の通りである。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。
【化８】
2018517664.tif 000010
【００８３】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ可溶性細胞外ドメインおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡ可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを、図３に例示する。このアラインメントは、両方の受容体内のアミノ酸残基であって、ＡｃｔＲＩＩリガンドに直接接触すると考えられるアミノ酸残基を指し示す。図４は、種々の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡの多重配列アラインメントを描示する。これらのアラインメントからは、リガンド結合性ドメイン内の鍵となるアミノ酸位置であって、通常のＡｃｔＲＩＩ−リガンドの結合活性に重要なアミノ酸位置を予測することが可能であるほか、通常のＡｃｔＲＩＩ−リガンドの結合活性を顕著に変更させずに、置換に対して許容性を有する可能性が高いアミノ酸位置を予測することも可能である。例えば、Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８（１）：９７−１０８；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（１）：１８−２２；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６）ＰＮＡＳ  １０３（２０：７６４３−７６４８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２２（７）：１５５５−１５６６；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号および同第７，８４２，６６３号を参照。
【００８４】
例えば、Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失により、受容体のアクチビンに対するアフィニティーが低減されることを示した。本願配列番号１のアミノ酸２０〜１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１１９）−Ｆｃ」は、プロリンノット領域および完全な膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−Ｆｃと比較してＧＤＦ−１１およびアクチビンへの結合が減少している（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと）。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１２９）−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されているにもかかわらず、野生型と比較して同様だがいくらか減少した活性を保持する。したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９（配列番号１に照らして）で終止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て活性であると予想されるが、１３４または１３３で終止する構築物が最も活性であり得る。同様に、残基１２９〜１３４（配列番号１に照らして）のいずれかにおける変異によってリガンドの結合親和性が大幅に変更されるとは予想されない。この裏付けとして、Ｐ１２９およびＰ１３０（配列番号１に照らして）の変異によってリガンドの結合は実質的に低下しないことは当該技術分野において公知である。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、早ければアミノ酸１０９（最後のシステイン）で終了し得るが、１０９〜１１９（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８または１１９）で終わる形態は、リガンドの結合が減少していると予想される。アミノ酸１１９（配列番号１に照らして）は、不完全に保存されているので、容易に変更または切断される。１２８以後（本願配列番号１に照らして）で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップはリガンドの結合活性を保持しているはずである。１１９〜１２７（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６または１２７）（配列番号１に照らして）で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップは、中間の結合能を有する。これらの形態はいずれも、臨床的または実験的な設定に応じて使用することが望ましい場合がある。
【００８５】
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端では、アミノ酸２９またはその手前（配列番号１に照らして）で始まるタンパク質が、リガンド結合活性を保持することが予想される。アミノ酸２９は、開始システインを表す。２４位（配列番号１に照らして）における、アラニンからアスパラギンへの変異は、リガンド結合に実質的に影響を及ぼさずに、Ｎ−連結グリコシル化配列を導入する。例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい。これにより、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域であって、アミノ酸２０〜２９に対応する領域内の変異は、十分に許容されることが確認される。特に、２０、２１、２２、２３、および２４位（配列番号１に照らして）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップは、一般的なリガンド結合活性を保持し、２５、２６、２７、２８、および２９位（配列番号１に照らして）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップもまた、リガンド結合活性を保持するはずである。例えば、米国特許第７，８４２，６６３号において示されているデータは、驚くべきことに、２２、２３、２４、または２５で始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物は、最大の活性を有することを実証する。
【００８６】
まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合部分）は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９を含む。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの一部であって、配列番号１のアミノ酸２０〜２９に対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９で始まり）、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４に対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４で終わる）一部に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の例は、配列番号１の２０〜２９位（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９位）、または２１〜２９位（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９位）で始まり、１１９〜１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、１１９〜１３３位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３位）、１２９〜１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、または１２９〜１３３位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３位）で終わる、ポリペプチドを含む。他の例は、配列番号１の２０〜２４位（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４位）、２１〜２４位（例えば、２１、２２、２３、または２４位）、または２２〜２５位（例えば、２２、２２、２３、または２５位）で始まり、１０９〜１３４位（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、１１９〜１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、または１２９〜１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）で終わる構築物を含む。これらの範囲内の改変体、特に、配列番号１の対応する部分に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する改変体もまた、企図される。
【００８７】
本開示は、図３に示されるように、合成ＡｃｔＲＩＩＢ構造の分析結果を含み、これは、一部において、リガンド結合ポケットが残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８〜Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３〜Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８〜Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４〜Ｆ１０１によって規定されることを実証している。これらの位置において、保存的変異は許容されると予想される。Ｒ４０はツメガエルにおいてＫであり、この位置の塩基性アミノ酸が許容されることを示している。Ｑ５３は、ウシのＡｃｔＲＩＩＢではＲであり、ツメガエルのＡｃｔＲＩＩＢではＫであり、したがって、Ｒ、Ｋ、Ｑ、ＮおよびＨを含めたアミノ酸がこの位置で許容される。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドについての一般式は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であって、任意選択で、２０〜２４位（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４位）または２２〜２５位（例えば、２２、２３、２４、または２５位）の範囲の位置で始まり、１２９〜１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）の範囲の位置で終わり、リガンド結合ポケット内に、１つ、２つ、５つ、１０、または１５以下の保存的アミノ酸変化を含み、リガンド結合ポケット内の４０、５３、５５、７４、７９、および／または８２位に、０、１つ、または複数の非保存的変更を含むアミノ酸配列である。可変性が特に良好に許容され得る結合ポケットの外側の部位は、細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端（上述のように）、および４２〜４６位および６５〜７３位（配列番号１に照らして）を含む。６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ａ６４バックグラウンドにおけるリガンドの結合を実際に改善し、したがって、Ｒ６４バックグラウンドにおいてリガンドの結合に対する好ましくない影響を有さないと予想される。例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと。この変化により、Ａ６４バックグラウンドにおけるＮ６５のグリコシル化が排除される可能性があり、したがって、この領域における著しい変化が許容される可能性があることが実証されている。Ｒ６４Ａ変化は許容性が乏しいが、Ｒ６４Ｋは良好に許容され、したがって、Ｈなどの別の塩基性残基が６４位において許容され得る。例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと。
【００８８】
ＡｃｔＲＩＩＢは、完全に保存された細胞外ドメインの大きなストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を持ち、ほぼ全ての脊椎動物にわたって良好に保存されている。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、種々の脊椎動物の生物体からのＡｃｔＲＩＩＢ配列を比較することにより、変更され得る残基への洞察がもたらされる。したがって、活性な、本開示の方法に従う有用なヒトＡｃｔＲＩＩＢ改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＢの配列からの対応する位置の１つまたは複数のアミノ酸を含み得、または、ヒトまたは他の脊椎動物の配列中の残基と同様の残基を含み得る。以下の例は、活性なＡｃｔＲＩＩＢ改変体を定義するためのこのアプローチを例示している。Ｌ４６は、ツメガエルのＡｃｔＲＩＩＢではバリンであるので、この位置は変更され得、任意選択で、Ｖ、ＩまたはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更され得る。Ｅ５２は、ツメガエルではＫであり、これは、この部位で、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなどの極性残基を含めた多種多様の変化が許容され得ることを示している。Ｔ９３は、ツメガエルではＫであり、これは、この位置において幅広い構造的差異が許容されることを示しており、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性残基が好ましい。Ｆ１０８は、ツメガエルではＹであり、したがって、Ｙまたは他の疎水性群、例えばＩ、ＶまたはＬが許容されるはずである。Ｅ１１１は、ツメガエルではＫであり、これは、この位置において、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨ、ならびにＱおよびＮを含めた、荷電残基が許容されることを示している。Ｒ１１２は、ツメガエルではＫであり、これは、この位置において、ＲおよびＨを含めた塩基性残基が許容されることを示している。１１９位のＡは比較的不完全に保存されており、げっ歯類ではＰとして、ツメガエルではＶとして現れ、したがって、この位置では本質的にいかなるアミノ酸も許容されるはずである。
【００８９】
本明細書に記載されるバリエーションは、種々の方法で組み合わせられ得る。さらに、本明細書中に記載される変異誘発プログラムの結果は、保存が多くの場合有益であるアミノ酸位がＡｃｔＲＩＩＢにあることを示す。配列番号１に照らして、これらとしては、６４位（塩基性アミノ酸）、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、そして特にトリプトファン）、３７位（酸性、そして特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が挙げられる。したがって、本明細書中に開示されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて、本開示は保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存が望ましいと考えられる他の位置は以下の通りである：５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８位（極性または荷電、特にＥ、Ｄ、ＲまたはＫ）、全て配列番号１に照らして。
【００９０】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン）。
別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１のアミノ酸２０〜２９（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９で始まる）に対応する残基で始まり、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４で終わる）に対応する位置で終わるＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１のアミノ酸２０〜２９（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９で始まる）に対応する残基で始まり、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４で終わる）に対応する位置で終わるＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含み、ここで、配列番号１のＬ７９に対応する位置は酸性アミノ酸である（すなわち、ＤまたはＥアミノ酸残基）。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含み、ここで、配列番号１のＬ７９に対応する位置は酸性アミノ酸である（すなわち、ＤまたはＥアミノ酸残基）。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０４、１０６、４０３、または４０４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％���７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０４、１０６、４０３、または４０４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含み、ここで、配列番号１のＬ７９に対応する位置は酸性アミノ酸である（すなわち、ＤまたはＥアミノ酸残基）。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０４、１０６、４０３、または４０４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むか、から本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０４、１０６、４０３、または４０４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むか、から本質的になるか、またはからなり、ここで配列番号１のＬ７９に対応する位置は酸性アミノ酸である（すなわち、ＤまたはＥアミノ酸残基）。
【００９１】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＡ」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡｃｔＲＩＩＡタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＡへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡｃｔＲＩＩＡファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【００９２】
用語「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示を通して提供されるほか、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号においても提供されている。本明細書で記載される、全てのＡｃｔＲＩＩＡ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記で提供される、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体のタンパク質配列（配列番号９）の番号付けに基づく。
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列は以下の通りである：
【化９】
2018517664.tif 000011
【００９３】
シグナルペプチドを一重下線で指し示し；細胞外ドメインを太字のフォントで示し；潜在的な内因性Ｎ連結グリコシル化部位を二重下線で示す。
プロセシング後の細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド配列は以下の通りである：
【化１０】
2018517664.tif 000012
細胞外ドメインのＣ末端「テール」を一重下線で指し示す。「テール」が削除された配列（Δ１５配列）は以下の通りである：
【化１１】
2018517664.tif 000013
【００９４】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号１２）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９〜１７００に対応する。シグナル配列に下線を付す。
【化１２−１】
2018517664.tif 000014
【化１２−２】
2018517664.tif 000015
プロセシング後の細胞外ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【化１３】
2018517664.tif 000016
【００９５】
活性な（例えば、リガンド結合）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの一般式は、配列番号９のアミノ酸３０で始まり、アミノ酸１１０で終わるポリペプチドを含むものである。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含み得る。任意選択で、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸１２〜８２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、任意選択で、配列番号９に照らして、それぞれ、１〜５（例えば、１、２、３、４、または５）または３〜５（例えば、３、４、または５）の範囲の位置で始まり、１１０〜１１６（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、または１１６）または１１０〜１１５（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１５）の範囲の位置で終わり、リガンド結合ポケット内の１、２、５、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化、およびリガンド結合ポケット内の４０位、５３位、５５位、７４位、７９位および／または８２位における０、１または複数の非保存的変更を含むポリペプチドを含む。
【００９６】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号９、１０、１１、１０１、１０３、４０１、または４０２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号９、１０、１１、１０１、１０３、４０１、または４０２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むか、からなるか、またはから本質的になる。
【００９７】
ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＴＧＦＢＲＩＩ」とは、任意の種に由来するトランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩ型（ＴＧＦＢＲＩＩ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＴＧＦＢＲＩＩへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＴＧＦＢＲＩＩファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【００９８】
用語「ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド」は、ＴＧＦＢＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＴＧＦＢＲＩＩ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＴＧＦＢＲＩＩ前駆体のタンパク質配列（配列番号４２）の番号付けに基づく。
基準のヒトＴＧＦＢＲＩＩ前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列  ＮＰ＿００３２３３．４）は以下の通りである：
【化１４】
2018517664.tif 000017
【００９９】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド配列は以下の通りである：
【化１５】
2018517664.tif 000018
【０１００】
ＴＧＦＢＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号４４）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００３２４２．５のヌクレオチド３８３〜２０８３に対応する。シグナル配列に下線を付す。
【０１０１】
【化１６】
2018517664.tif 000019
プロセシング後の細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１０２】
【化１７】
2018517664.tif 000020
ＴＧＦＢＲＩＩの代替的アイソフォームであるアイソフォームＡ（ＮＰ＿００１０２００１８．１）、は以下の通りである：
【化１８】
2018517664.tif 000021
【０１０３】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォームＡ）は以下の通りである：
【化１９】
2018517664.tif 000022
【０１０４】
ＴＧＦＢＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォームＡ）をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号６９）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１０２４８４７．２のヌクレオチド３８３〜２１５８に対応する。シグナル配列に下線を付す。
【０１０５】
【化２０−１】
2018517664.tif 000023
【化２０−２】
2018517664.tif 000024
プロセシング後の細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド（アイソフォームＡ）をコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１０６】
【化２１】
2018517664.tif 000025
【０１０７】
前述のＴＧＦβＲＩＩアイソフォーム（配列番号４２、４３、６７、および６８）のいずれも、ＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＣにおいて天然に生じるように、ＴＧＦβＲＩＩＥＣＤのＣ末端付近に位置付けられるグルタメート残基のペア（配列番号４２の１５１位および１５２位；配列番号４３の１２９位および１３０位；配列番号６７の１７６位および１７７位；または配列番号６８の１５４位および１５５位）の間に３６アミノ酸（配列番号９５）の挿入を組み込むことができる（Ｋｏｎｒａｄら、、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：３１８、２００７）。
【化２２】
2018517664.tif 000026
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド（例えば、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＴＧＦＢＲＩＩの細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号４２、４３、６７、６８、１１３、１１５、４０９、または４１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号４２、４３、６７、６８、１１３、１１５、４０９、または４１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であり、配列番号９５が上記されるようなペア形成したグルタメート残基の間に挿入された、少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号４２、４３、６７、６８、１１３、１１５、４０９または４１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含むか、からなるか、またはから本質的になる。
【０１０９】
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＢＭＰＲＩＩ」とは、任意の種に由来する骨形成タンパク質受容体ＩＩ型（ＢＭＰＲＩＩ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＢＭＰＲＩＩへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＢＭＰＲＩＩファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１１０】
用語「ＢＭＰＲＩＩポリペプチド」は、ＢＭＰＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＢＭＰＲＩＩ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体のタンパク質配列（配列番号４６）の番号付けに基づく。
基準のヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９５．２）は以下の通りである：
【化２３】
2018517664.tif 000027
【０１１１】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチド配列は以下の通りである：
【化２４】
2018517664.tif 000028
【０１１２】
ＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列を以下に示し（配列番号４８）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１２０４．６のヌクレオチド１１４９〜４２６２に従う。シグナル配列に下線を付す。
【０１１３】
【化２５−１】
2018517664.tif 000029
【化２５−２】
2018517664.tif 000030
細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１１４】
【化２６】
2018517664.tif 000031
ＢＭＰＲＩＩの代替的アイソフォームであるアイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８６５１９．１）は以下の通りである：
【化２７】
2018517664.tif 000032
【０１１５】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォーム２）は以下の通りである：
【化２８】
2018517664.tif 000033
【０１１６】
ヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号７３）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列Ｕ２５１１０．１のヌクレオチド１６３〜１７５２に対応する。シグナル配列に下線を付す。
【０１１７】
【化２９−１】
2018517664.tif 000034
【化２９−２】
2018517664.tif 000035
細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１１８】
【化３０】
2018517664.tif 000036
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＢＭＰＲＩＩポリペプチド（例えば、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＢＭＰＲＩＩの細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＢＭＰＲＩＩポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号４６、４７、７１、７２、１０７、１０９、４０５、または４０６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号４６、４７、７１、７２、１０７、１０９、４０５、または４０６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩポリペプチドからなるか、またはから本質的になる。
【０１２０】
ある特定の態様では、本開示は、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＭＩＳＲＩＩ」とは、任意の種に由来するミュラー管阻害性物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＲＩＩ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＭＩＳＲＩＩへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＭＩＳＲＩＩファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１２１】
用語「ＭＩＳＲＩＩポリペプチド」は、ＭＩＳＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＭＩＳＲＩＩ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体のタンパク質配列（配列番号５０）の番号付けに基づく。
基準のヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６５４３４．１）は以下の通りである：
【化３１】
2018517664.tif 000037
【０１２２】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＭＩＳＲＩＩポリペプチド配列は以下の通りである：
【化３２】
2018517664.tif 000038
【０１２３】
ＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号５２）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０２０５４７．２のヌクレオチド８１〜１７９９に対応する。シグナル配列に下線を付す。
【０１２４】
【化３３−１】
2018517664.tif 000039
【化３３−２】
2018517664.tif 000040
細胞外ヒトＭＩＳＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１２５】
【化３４】
2018517664.tif 000041
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質配列の代替的アイソフォームであるアイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１５８１６２．１）、は以下の通りである：
【化３５】
2018517664.tif 000042
【０１２６】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＭＩＳＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォーム２）は以下の通りである：
【化３６】
2018517664.tif 000043
【０１２７】
ＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号７７）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１６４６９０．１のヌクレオチド８１−１５１４に対応する。シグナル配列に下線を付す。
【０１２８】
【化３７】
2018517664.tif 000044
プロセシング後の可溶性（細胞外）ヒトＭＩＳＲＩＩポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１２９】
【化３８】
2018517664.tif 000045
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質配列の代替的アイソフォームであるアイソフォーム３（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１５８１６３．１）、は以下の通りである：
【化３９】
2018517664.tif 000046
【０１３０】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＭＩＳＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォーム３）は以下の通りである：
【化４０】
2018517664.tif 000047
【０１３１】
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号８１）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１６４６９１．１のヌクレオチド８１−１５１４に対応する。シグナル配列に下線を付す。
【０１３２】
【化４１】
2018517664.tif 000048
プロセシング後の可溶性（細胞外）ヒトＭＩＳＲＩＩポリペプチド（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１３３】
【化４２】
2018517664.tif 000049
【０１３４】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＭＩＳＲＩＩポリペプチド（例えば、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＭＩＳＲＩＩの細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＭＩＳＲＩＩポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号５０、５１、７５、７６、７９、８０、１１０、１１２、４０７、または４０８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号５０、５１、７５、７６、７９、８０、１１０、１１２、４０７、または４０８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩポリペプチドからなるか、またはから本質的になる。
【０１３５】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡＬＫ１」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体様キナーゼー１タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡＬＫ１タンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡＬＫ１への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡＬＫ１ファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１３６】
用語「ＡＬＫ１ポリペプチド」は、ＡＬＫ１ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＡＬＫ１関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＡＬＫ１前駆体のタンパク質配列（配列番号１４）の番号付けに基づく。
ヒトＡＬＫ１前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００１１．２）は以下の通りである：
【化４３】
2018517664.tif 000050
【０１３７】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ１ポリペプチド配列は以下の通りである：
【化４４】
2018517664.tif 000051
【０１３８】
ヒトＡＬＫ１前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号１６）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００００２０．２のヌクレオチド２８４−１７９２に対応する。シグナル配列に下線を付す。
【０１３９】
【化４５】
2018517664.tif 000052
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１４０】
【化４６】
2018517664.tif 000053
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１ポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ１ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＡＬＫ１の細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＡＬＫ１ポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１４、１５、１１６、１１８、４１１、または４１２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１４、１５、１１６、１１８、４１１、または４１２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ１ポリペプチドからなるか、またはから本質的になる。
【０１４２】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ２ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡＬＫ２」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体様キナーゼー２（ＡＬＫ２）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡＬＫ２タンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡＬＫ２への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡＬＫ２ファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１４３】
用語「ＡＬＫ２ポリペプチド」は、ＡＬＫ２ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＡＬＫ２関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＡＬＫ２前駆体のタンパク質配列（配列番号１８）の番号付けに基づく。
ヒトＡＬＫ２前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１０９６．１）は以下の通りである：
【化４７】
2018517664.tif 000054
【０１４４】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ２ポリペプチド配列は以下の通りである：
【化４８】
2018517664.tif 000055
【０１４５】
ヒトＡＬＫ２前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号２０）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０５．４のヌクレオチド４３１−１９５７に対応する。シグナル配列に下線を付す。
【０１４６】
【化４９−１】
2018517664.tif 000056
【化４９−２】
2018517664.tif 000057
細胞外ＡＬＫ２ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１４７】
【化５０】
2018517664.tif 000058
【０１４８】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ２ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ２ポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＡＬＫ２の細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＡＬＫ２ポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１８，１９、１１９、１２１、４１３、または４１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号１８，１９、１１９、１２１、４１３、または４１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドからなるか、またはから本質的になる。
【０１４９】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ３ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡＬＫ３」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体様キナーゼー３（ＡＬＫ３）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡＬＫ３タンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡＬＫ３への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡＬＫ３ファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１５０】
用語「ＡＬＫ３ポリペプチド」は、ＡＬＫ３ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＡＬＫ３関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＡＬＫ３前駆体のタンパク質配列（配列番号２２）の番号付けに基づく。
ヒトＡＬＫ３前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４３２０．２）は以下の通りである：
【化５１】
2018517664.tif 000059
【０１５１】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ３ポリペプチド配列は以下の通りである：
【化５２】
2018517664.tif 000060
【０１５２】
ヒトＡＬＫ３前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号２４）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３２９．２のヌクレオチド５４９−２１４４に対応する。シグナル配列に下線を付し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
【化５３−１】
2018517664.tif 000061
【化５３−２】
2018517664.tif 000062
細胞外ヒトＡＬＫ３ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【化５４】
2018517664.tif 000063
【０１５３】
活性な（例えば、リガンド結合）ＡＬＫ３ポリペプチドの一般式は、任意のアミノ酸位置２５−３１（すなわち、ｆ配列番号２２の２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、または３１位）で始まり、任意のアミノ酸位置１４０−１５２ｏｆ配列番号２２（すなわち、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、または１５２）で終わるポリペプチドを含むものである。その教示の全体が参考として本明細書に援用される米国特許第８，３３８，３７７号を参照のこと。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３ポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ３ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ３ポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＡＬＫ３の細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＡＬＫ３ポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号２２のアミノ酸位置２５−３１（すなわち、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、または３１位）で始まり、配列番号２２のアミノ酸位置１４０−１５３（すなわち、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、または１５２）で終わるアミノ酸を含むか、からなるか、またはから本質的になる。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号２２、２３、１２２、１２４、４１５、または４１６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ３ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号２２、２３、１２２、１２４、４１５、または４１６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ３ポリペプチドからなるか、またはから本質的になる。
【０１５５】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡＬＫ４」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体様キナーゼー４タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡＬＫ４タンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡＬＫ４への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡＬＫ４ファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１５６】
用語「ＡＬＫ４ポリペプチド」は、ＡＬＫ４ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＡＬＫ４関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＡＬＫ４前駆体のタンパク質配列（配列番号２６）の番号付けに基づく。
標準的なヒトＡＬＫ４前駆体のタンパク質配列（アイソフォームＡ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４２９３）は、以下の通りである。
【化５５】
2018517664.tif 000064
【０１５７】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ヒトＡＬＫ４ポリペプチド配列は以下の通りである：
【化５６】
2018517664.tif 000065
【０１５８】
ＡＬＫ４前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号２８）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３０２．４のヌクレオチド７８〜１５９２に対応する。シグナル配列に下線を付し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
【０１５９】
【化５７】
2018517664.tif 000066
細胞外ＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１６０】
【化５８】
2018517664.tif 000067
ヒトＡＬＫ４前駆体の代替的アイソフォームであるアイソフォームＢ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６４７３２．３）、は以下の通りである：
【化５９】
2018517664.tif 000068
【０１６１】
細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド配列（アイソフォームＢ）は以下の通りである：
【化６０】
2018517664.tif 000069
【０１６２】
アイソフォームＢのＡＬＫ４前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号８５）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０２０３２７．３のヌクレオチド１８６〜１５４７に対応する。細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
【０１６３】
【化６１】
2018517664.tif 000070
ＡＬＫ４ポリペプチド（アイソフォームＢ）の細胞外ドメインをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１６４】
【化６２】
2018517664.tif 000071
【０１６５】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＡＬＫ４の細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＡＬＫ４ポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号２６、２７、８３、８４、１２５、１２７、４１７、または４１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号２６、２７、８３、８４、１２５、１２７、４１７、または４１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドからなるか、またはから本質的になる。
【０１６６】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ５ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡＬＫ５」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体様キナーゼー５タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡＬＫ４タンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡＬＫ５への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡＬＫ５ファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１６７】
用語「ＡＬＫ５ポリペプチド」は、ＡＬＫ５ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＡＬＫ５関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＡＬＫ５前駆体のタンパク質配列（配列番号３０）の番号付けに基づく。
基準のヒトＡＬＫ５前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４６０３．１）は以下の通りである：
【化６３】
2018517664.tif 000072
【０１６８】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ５ポリペプチド配列は以下の通りである：
【化６４】
2018517664.tif 000073
【０１６９】
ＡＬＫ５前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号３２）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４６１２．２のヌクレオチド７７〜１５８５に対応する。シグナル配列に下線を付し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
【０１７０】
【化６５−１】
2018517664.tif 000074
【化６５−２】
2018517664.tif 000075
細胞外ヒトＡＬＫ５ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１７１】
【化６６】
2018517664.tif 000076
ヒトＡＬＫ５前駆体タンパク質配列の代替的アイソフォームであるアイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５２５２２０７．１）、は以下の通りである：
【化６７】
2018517664.tif 000077
【０１７２】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ５ポリペプチド配列（アイソフォーム２）は以下の通りである：
【化６８】
2018517664.tif 000078
【０１７３】
ヒトＡＬＫ５前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号８９）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＸＭ＿００５２５２１５０．１のヌクレオチド７７〜１５９７に対応する。シグナル配列に下線を付し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
【０１７４】
【化６９−１】
2018517664.tif 000079
【化６９−２】
2018517664.tif 000080
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ５ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１７５】
【化７０】
2018517664.tif 000081
【０１７６】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ５ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ５ポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＡＬＫ５の細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＡＬＫ５ポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号３０、３１、８７、８８、１２８、１３０、４１９、または４２０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号３０、３１、８７、８８、１２８、１３０、４１９、または４２０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドからなるか、またはから本質的になる。
【０１７７】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ６ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡＬＫ６」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体様キナーゼー６タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡＬＫ６タンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡＬＫ６への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡＬＫ６ファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１７８】
用語「ＡＬＫ６ポリペプチド」は、ＡＬＫ６ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＡＬＫ６関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＡＬＫ６前駆体のタンパク質配列（配列番号３４）の番号付けに基づく。
基準のヒトＡＬＫ６前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９４．１）は以下の通りである：
【化７１】
2018517664.tif 000082
【０１７９】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ６ポリペプチド配列は以下の通りである：
【化７２】
2018517664.tif 000083
【０１８０】
ＡＬＫ６前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号３６）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１２０３．２のヌクレオチド２７５〜１７８０に対応する。シグナル配列に下線を付し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
【０１８１】
【化７３】
2018517664.tif 000084
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ６ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１８２】
【化７４】
2018517664.tif 000085
ヒトＡＬＫ６前駆体タンパク質配列の代替的アイソフォームであるアイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２４３７２２．１）は以下の通りである：
【化７５】
2018517664.tif 000086
【０１８３】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ６ポリペプチド配列（アイソフォーム２）は以下の通りである：
【化７６】
2018517664.tif 000087
【０１８４】
ヒトＡＬＫ６前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は以下に示され、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１２５６７９３．１のヌクレオチド２２〜１６１７に対応する。シグナル配列に下線を付し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
【０１８５】
【化７７】
2018517664.tif 000088
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ６ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１８６】
【化７８】
2018517664.tif 000089
【０１８７】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ６ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ６ポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＡＬＫ６の細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＡＬＫ６ポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号３４、３５、９１、９２、１３１、１３３、４２１、または４２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号３４、３５、９１、９２、１３１、１３３、４２１、または４２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドからなるか、またはから本質的になる。
【０１８８】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ７ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡＬＫ７」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体様キナーゼー７タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡＬＫ７タンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡＬＫ７への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡＬＫ７ファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１８９】
用語「ＡＬＫ７ポリペプチド」は、ＡＬＫ７ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＡＬＫ７関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＡＬＫ７前駆体のタンパク質配列（配列番号３８）の番号付けに基づく。
ヒトＡＬＫ７のいくつかの天然に生じるアイソフォームが記載されている。基準のヒトＡＬＫ７アイソフォーム１前駆体タンパク質の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６６０３０２．２）は以下の通りである：
【化７９】
2018517664.tif 000090
【０１９０】
シグナルペプチドを一重下線で示し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ７アイソフォーム１ポリペプチド配列は以下の通りである：
【化８０】
2018517664.tif 000091
【０１９１】
ヒトＡＬＫ７アイソフォーム１前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号４０）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿１４５２５９．２のヌクレオチド２４４〜１７２２に対応する。シグナル配列に下線を付し、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
【０１９２】
【化８１】
2018517664.tif 000092
プロセシング後の細胞外ＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム１）をコードする核酸配列は以下の通りである：
【０１９３】
【化８２】
2018517664.tif 000093
【０１９４】
ヒトＡＬＫ７の代替的アイソフォームであるアイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１０４５０１．１）のアミノ酸配列は、以下のようにそのプロセシング後の形態において示される（配列番号３０１）、ここで、細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
【化８３】
2018517664.tif 000094
細胞外ＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム２）のアミノ酸配列は以下の通りである：
【０１９５】
【化８４】
2018517664.tif 000095
【０１９６】
プロセシング後のＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号３０３）、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１１０３１．１のヌクレオチド２７９〜１６０７に対応する。細胞外ドメインを太字のフォントで示す。
【０１９７】
【化８５】
2018517664.tif 000096
【化８６】
2018517664.tif 000097
細胞外ＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、以下の通りである（配列番号３０４）：
【０１９８】
【化８７】
2018517664.tif 000098
【０１９９】
代替的なヒトＡＬＫ７前駆体タンパク質であるアイソフォーム３（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１０４５０２．１）、のアミノ酸配列を以下の通りに示し（配列番号３０５）、ここで、シグナルペプチドを一重下線で指し示す。
【化８８】
2018517664.tif 000099
【０２００】
プロセシング後のＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム３）のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号３０６）．このアイソフォームは膜貫通ドメインを欠き、したがってその全体が可溶性であると提唱されている（Ｒｏｂｅｒｔｓら、、２００３、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６８：１７１９−１７２６）。配列番号３０６のＮ末端改変体は以下に説明されるように予測される。
【化８９】
2018517664.tif 000100
【０２０１】
プロセッシングされていないＡＬＫ７ポリペプチド前駆体タンパク質（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号３０７）、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１１０３２．１のヌクレオチド２４４〜１４８２に対応する。シグナル配列は、実線の下線で示される。
【０２０２】
【化９０】
2018517664.tif 000101
プロセシング後のＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は、以下の通りである（配列番号３０８）：
【０２０３】
【化９１】
2018517664.tif 000102
【０２０４】
代替的なヒトＡＬＫ７前駆体タンパク質であるアイソフォーム４（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１０４５０３．１）、のアミノ酸配列を以下の通りに示し（配列番号３０９）、ここで、シグナルペプチドを一重下線で指し示す。
【化９２】
2018517664.tif 000103
【０２０５】
プロセシング後のＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム４）のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号３１０）。ＡＬＫ７アイソフォーム３同様に、アイソフォーム４は膜貫通ドメインを欠き、そのため、その全体は可溶性であることが提唱されている（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００３、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６８：１７１９−１７２６）。配列番号３１０のＮ末端改変体は以下で説明するように予測される。
【化９３】
2018517664.tif 000104
【０２０６】
プロセッシングされていないＡＬＫ７ポリペプチド前駆体タンパク質（アイソフォーム４）をコードする核酸配列は以下に示され（配列番号３１１）、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１１０３３．１のヌクレオチド２４４〜１２４４に対応する。シグナル配列は、実線の下線で示される。
【０２０７】
【化９４】
2018517664.tif 000105
プロセシング後のＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム４）をコードする核酸配列は、以下の通りである（配列番号３１２）：
【０２０８】
【化９５】
2018517664.tif 000106
【０２０９】
ラットの完全長ＡＬＫ７（アイソフォーム１）（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６２０７９０．１を参照のこと）のシグナル配列およびヒトとラットＡＬＫ７との間の高度な配列同一性に基づいて、ヒトＡＬＫ７アイソフォーム１のプロセシング後の形態は、以下の通りである（配列番号３１３）ことが予測される。
【化９６】
2018517664.tif 000107
【０２１０】
プロセシング後のＡＬＫ７アイソフォーム１の活性改変体は、配列番号３９がＮ末端で１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸だけ短縮され、配列番号３１３がＮ末端で１または２アミノ酸だけ短縮されていると予測される。配列番号３１３と符合して、ヒトＡＬＫ７アイソフォーム３（配列番号３０６）およびヒトＡＬＫ７アイソフォーム４（配列番号３１０）のプロセシング後の形態においてロイシンがＮ末端アミノ酸であることが予測される。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ７ポリペプチド（フラグメント、機能的改変体、およびその改変形態を含む）を含むシングルアームヘテロ多量体複合体に関連する。好ましくは、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ７ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ７ポリペプチドを含むシングルアームヘテロ多量体複合体及びその使用）は可溶性である（例えば、ＡＬＫ７の細胞外ドメイン）。別の好ましい実施形態では、本開示の発明に従う使用のためのＡＬＫ７ポリペプチドは１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し、かつ／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害（アンタゴナイズ）する。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号３８、３９、１３４、１３６、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、４２３、または４２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ７ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体は、配列番号３８、３９、１３４、１３６、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、４２３、または４２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ７ポリペプチドからなるか、またはから本質的になる。
【０２１２】
一部の実施形態では、本開示は、治療効力または安定性（例えば、保管寿命およびインビボのタンパク質分解に対する抵抗性）を増強することなどを目的として、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６およびＡＬＫ７）またはＴＧＦ−βスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩ）の構造を改変することにより機能的改変体を作製することを企図する。改変体は、アミノ酸の置換、欠失、付加またはそれらの組み合わせによっても生成することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの単発的な置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単発的な置換、スレオニンのセリンでの単発的な置換、または、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的変異）は、結果として生じる分子の生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないと予想するのは理にかなっている。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化の結果として、機能的相同体がもたらされるのかどうかは、非改変もしくは野生型ポリペプチドと比較した場合に、野生型ポリペプチドと同様の様式で細胞内の応答を生成するか、または、１つまたは複数のＴＧＦ−βリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙを含む）に結合する、改変体ポリペプチドの能力を評価することにより、たやすく決定することができる。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更させるような本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６およびＡＬＫ７）またはＴＧＦ−βスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩ）の特異的変異を企図する。このような変異は、１または複数のグリコシル化部位（例えば、Ｏ−連結もしくはＮ−連結のグリコシル化部位）を導入もしくは排除するように選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含み、この配列は、適切な細胞のグリコシル化酵素によって特異的に認識される。変化はまた、（Ｏ−連結グリコシル化部位については）ポリペプチドの配列への、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によってなされ得る。グリコシル化認識部位の第１位もしくは第３位のアミノ酸の一方もしくは両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または、第２位におけるアミノ酸の欠失）は、改変されたトリペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。ポリペプチドにおける糖質部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的もしくは酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）フリーのカルボキシル基；（ｃ）フリーのスルフヒドリル基（例えば、システインのもの）；（ｄ）フリーのヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの）；（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。ポリペプチド上に存在する１または複数の糖質部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのポリペプチドの曝露を含み得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどもしくは全ての糖の切断を生じる。ポリペプチドにおける、炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら［Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７年）、１３８巻：３５０頁］により記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。ポリペプチドの配列は、適切なように、使用される発現系のタイプに応じて調節され得る。というのも、哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得る。一般に、ヒトにおいて使用するための本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体シングルアーム複合体は、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞���（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株）において発現され得るが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることと期待される。
【０２１４】
本開示はさらに、変異体、特に、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６およびＡＬＫ７）またはＴＧＦ−βスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩ）のコンビナトリアル変異体のセットを生成する方法のほか、短縮型変異体も生成する方法も企図する。コンビナトリアル変異体のプールは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＴＧＦ−βスーパーファミリーＩＩ型受容体配列を同定するためにとりわけ有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、薬物動態の変更またはリガンドへの結合の変更など、特性を変更させたポリペプチド改変体を生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、そして、このようなアッセイは、改変体を評価するために使用され得る。ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドバリアントは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ｎｏｄａｌ、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳおよびＬｅｆｔｙ）に結合して、ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドのＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体への結合を妨害する能力、および／または、ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドにより引き起こされるシグナル伝達に干渉する能力についてスクリーニングされ得る。  
【０２１５】
本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の活性は、細胞ベースのアッセイまたはインビボアッセイで調べることができる。例えば、シングルアームヘテロ多量体複合体の、マウス細胞における筋生成に関与する遺伝子の発現に対する効果を評価することができる。これは、必要に応じて、１つまたは複数の組換えＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドタンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ｎｏｄａｌ、ＧＤＮＦ，ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳおよびＬｅｆｔｙ）の存在下で実施することができ、細胞に、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体シングルアーム複合体と、任意選択で、ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドとを生成するように、トランスフェクトすることができる。同様に、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体を、マウスまたは他の動物に投与することができ、当技術分野で認識されている方法を使用して筋形成または筋強度など、１つまたは複数の計測値を評価することができる。同様に、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドまたはそのバリアントの活性を、本明細書に記載されるようなアッセイおよび当技術分野において通常の知識のものによって、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞および／またはニューロン細胞において、これらの細胞の成長に対するいずれかの効果について試験することができる。ＳＭＡＤ応答性のレポーター遺伝子を、このような細胞株内で使用して、下流のシグナル伝達に対する効果をモニタリングすることができる。
【０２１６】
コンビナトリアル由来の改変体を、参照ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体と比べて増大した選択性を有するか、または一般に効力を増大させて生成することができる。このような改変体は、組換えＤＮＡ構築物から発現されたとき、遺伝子治療のプロトコルにおいて使用され得る。同様に、変異誘発は、対応する非改変ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体とは劇的に異なる細胞外半減期を有する改変体を生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、タンパク質分解、または、非改変ポリペプチドの崩壊もしくは他の方法で不活性化をもたらす他の細胞プロセスに対してより安定性であるかもしくは安定性が低いかのいずれかにされ得る。このような改変体およびこれをコードする遺伝子は、そのポリペプチドの半減期を調節することによってポリペプチド複合体レベルを変更するのに利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的作用を生じ得、そして、誘導性の発現系の一部である場合、細胞外での組換えポリペプチド複合体レベルのより厳しい制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質では、変異は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の半減期を変更するために、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において作製され得る。
【０２１７】
コンビナトリアルライブラリーは、各々が潜在的なＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体配列の少なくとも一部を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成することができる。例えば、潜在的なＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体をコードするヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、または代替的に、大型の融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのための）として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることができる。
【０２１８】
潜在的な相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成し得る、多くの方式が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動式ＤＮＡ合成器で実行することができ、次いで、合成遺伝子は、発現に適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ，  ＳＡ（１９８３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９巻：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１年）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．  ３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２７３〜２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８巻：１０５６頁；Ｉｋｅら（１９８３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１１巻：４７７頁を参照。このような技法は、他のタンパク質の指向進化で利用されている。例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：３８６〜３９０頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９巻：２４２９〜２４３３頁；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：４０４〜４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７巻：６３７８〜６３８２頁のほか、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号を参照。
【０２１９】
代替的に、変異誘発の他の形態も、コンビナトリアルライブラリーを生成するのに活用することができる。例えば、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、例えば、アラニン走査変異誘発［例えば、Ｒｕｆら（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３巻：１５６５〜１５７２頁；Ｗａｎｇら（１９９４年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３０９５〜３０９９頁；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３年）、Ｇｅｎｅ、１３７巻：１０９〜１１８頁；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３年）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１８巻：５９７〜６０１頁；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６８巻：２８８８〜２８９２頁；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０８３２〜１０８３８頁；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁を参照］を使用して、リンカー走査変異誘発［例えば、Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３巻：６５３〜６６０頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９２年）、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２巻：２６４４〜２６５２頁；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：３１６頁を参照］によって、飽和変異誘発［例えば、Ｍｅｙｅｒｓら、（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：６１３頁を参照］によって、ＰＣＲ変異誘発［例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９年）、Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１巻：１１〜１９頁を参照］によって、または化学的変異誘発［例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２年）、Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４年）、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、７巻：３２〜３４頁を参照］を含むランダム変異誘発によって、スクリーニングすることにより、ライブラリーから生成および単離することができる。特に、コンビナトリアルの状況におけるリンカー走査変異誘発は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの短縮型（生体活性）形態を同定するための魅力的な方法である。
【０２２０】
当該分野では、広範にわたる技法であって、点変異および短縮により作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技法、および、このために、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技法が公知である。このような技法は一般に、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体のコンビナトリアル変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用される技法は典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングする工程と、適切な細胞を結果として得られるベクターのライブラリーで形質転換する工程と、所望の活性の検出により、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させる工程とを含む。好ましいアッセイは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ｎｏｄａｌ、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）についての結合アッセイならびに／または細胞シグナル伝達についてのアッセイを含む。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体シングルアームヘテロ多量体複合体はさらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチド内に天然に存在する任意の翻訳後修飾に加えて翻訳後修飾を含み得る。このような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類もしくは単糖類およびホスフェイトのような非アミノ酸成分を含み得る。このような非アミノ酸成分の、シングルアームヘテロ多量体複合体の機能に対する影響は、他のシングルアームヘテロ多量体複合体改変体について本明細書中に記載されるようにして試験され得る。本開示のポリペプチドの新生形態を切断することによってポリペプチドが細胞内で生成される場合、翻訳後プロセシングもまた、このタンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能にとって重要となり得る。様々な細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）が、このような翻訳後の活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、そして、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを保証するように選択され得る。
【０２２２】
ある特定の態様では、本明細書に記載のポリペプチドは、相互作用ペアの相補的メンバーを含む少なくとも１つのポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合した少なくとも１つのＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成し得る。好ましくは、本明細書に開示のポリペプチドはシングルアームヘテロ二量体の複合体を形成するが、より高次のヘテロ多量体の複合体（ヘテロ多量体）もまた含まれ、これらに限定されないが、例えば、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらなるオリゴマー構造である（例えば、図１を参照のこと）。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、少なくとも１つの多量体化ドメインを含む。本明細書に開示される場合、用語「多量体化ドメイン」は、少なくとも第１のポリペプチドと少なくとも第２のポリペプチドとの間の共有結合的または非共有結合的な相互作用を促進するアミノ酸またはアミノ酸の配列を指す。本明細書に開示のポリペプチドは、多量体化ドメインに共有結合的または非共有結合的に連結し得る。好ましくは、多量体化ドメインは、シングルアームポリペプチド（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドおよびＴＧＦ−βスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドを含む融合ポリペプチド）と、相互作用ペアの相補的メンバーとの間の相互作用を促進して、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進し、任意選択でホモ多量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を妨げるかまたはそれ以外の様式で不利にさせ、それによって所望のヘテロ多量体の収率を上昇させる（例えば、図２を参照のこと）。
【０２２３】
当該分野で公知の多くの方法を使用して、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を生成することができる。例えば、天然には生じないジスルフィド結合は、フリーのチオールが第２のポリペプチド（例えば、相互作用ペアの相補的メンバー）上の別のフリーのチオール含有残基と相互作用して、ジスルフィド結合が第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドとの間で形成されるように、第１のポリペプチド（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドを含む融合ポリペプチド）上で、天然に生じるアミノ酸をシステインなどのフリーのチオール含有残基で置きかえることにより構築することができる。ヘテロ多量体の形成を促進する相互作用の追加の例は、Ｋｊａｅｒｇａａｒｄら、ＷＯ２００７１４７９０１などに記載されているイオン性相互作用；Ｋａｎｎａｎら、Ｕ．Ｓ．８，５９２，５６２などに記載されている静電ステアリング効果；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｕ．Ｓ．２０１２０３０２７３７などに記載されているコイルドコイル相互作用；ＰａｃｋおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、（１９９２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻：１５７９〜１５８４頁などに記載されているロイシンジッパー；およびＰａｃｋら、（１９９３年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１巻：１２７１〜１２７７頁などに記載されているヘリックスターンヘリックスモチーフを含むが、これらに限定されない。多様なセグメントの連結は、例えば、化学的架橋、ペプチドリンカー、ジスルフィド架橋などによる共有結合、またはアビジン−ビオチンなどによるアフィニティ相互作用、またはロイシンジッパー技術を介して得ることができる。
【０２２４】
ある特定の態様では、多量体化ドメインは、相互作用ペアの１つの構成成分を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示のポリペプチドは、第２のポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合した第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成することができ、ここで、第１のポリペプチドは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含む。相互作用ペアは、相互作用して、複合体、特にヘテロ二量体の複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列であり得るが、実効的な実施形態はホモ二量体の複合体を形成することができる相互作用ペアもまた利用し得る。相互作用ペアの１つのメンバーは、例えば、配列番号２、３、５、６、１０、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、３０２、３０６、３１０および３１３のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド配列を含む本明細書に記載されるようなＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドに融合されてもよい。血清半減期の延長などの特性／活性の改善を付与するように相互作用ペアを選択することもでき、特性／活性の改善をもたらすように別の部分をその上に結合させるアダプターとして作用するように相互作用ペアを選択することもできる。例えば、ポリエチレングリコール部分を、相互作用ペアの構成要素の一方または両方へと結合させて、血清半減期の改善などの特性／活性の改善をもたらすことができる。
【０２２５】
相互作用ペアの第１および第２のメンバーは非対称ペアであってもよく、これは、ペアのメンバーが、自己会合よりも優先的に互いに会合することを意味する。したがって、非対称相互作用ペアの第１および第２のメンバーは会合して、ヘテロ二量体の相互作用ペア複合体を形成することができる（例えば、図２を参照）。代替的に、相互作用ペア非誘導型であってもよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なく互いに会合することも自己会合することもでき、そのため、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。したがって、非誘導相互作用ペアの第１および第２のメンバーは会合して、ホモ二量体相互作用ペア複合体またはヘテロ二量体の作用ペア複合体を形成してもよい。任意選択で、相互作用ペアの第１のメンバー（例えば、非対称ペアまたは非誘導相互作用ペア）は、共有結合的に相互作用ペアの第２のメンバーに会合する。任意選択で、相互作用ペアの第１のメンバー（例えば、非対称ペアまたは非誘導相互作用ペア）は、非有結合的に相互作用ペアの第２のメンバーに会合する。
【０２２６】
具体例としては、本開示は、免疫グロブリンのＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、もしくはＣＨ３ドメインなど、免疫グロブリンの定常ドメインまたは、Ｆｃドメインを含むポリペプチドに融合させた少なくともＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドを含むタンパク質複合体を提供する。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来するＦｃドメインを本明細書に提示する。ＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性を減殺する、他の変異も公知であり、本開示には、集合的に、これらの改変体のいずれかが含まれ、本開示のシングルアーム多量体複合体の有利な構成要素として使用することができる。任意選択で、配列番号２０８のＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、Ｌｙｓ−３２２およびＡｓｎ−４３４（対応する全長ＩｇＧ１に従った番号付け）などの残基に１つまたは複数の変異を有する。ある場合において、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べてＦｃγ受容体に結合する能力が低減する。他の場合において、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べてＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合する能力が増加する。
【０２２７】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号２０８）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、天然に存在する改変体を有する位置を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号２０８に対し８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおける天然に存在する改変体は、配列番号２０８において使用される番号付け方式に従ったＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含むであろう（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７を参照）。
【化９７】
2018517664.tif 000108
【０２２８】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号２０９）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、二重の下線は、配列データの矛盾が存在する位置を指し示す（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従う）。部分的に、本開示は、配列番号２０９に対し７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【化９８】
2018517664.tif 000109
【０２２９】
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）に使用することができるアミノ酸配列の２つの例を下記に示す。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は、他のＦｃ鎖におけるものの最大４倍の長さとなることができ、同様の１７残基セグメントに先行される３つの同一１５残基セグメントを含有する。下記に示される第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号２１０）は、単一１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有する一方、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号２１１）は、全長ヒンジ領域を含有する。いずれの場合でも、点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従った天然に存在する改変体を有する位置を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号２１０および２１１に対し８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【化９９】
2018517664.tif 000110
【０２３０】
Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在する改変体（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８６０を参照）は、配列番号２１０において使用される番号付け方式に変換された場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらの変種のうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長を特徴とする構造的多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照］。特に、改変体ＷＩＳは、Ｖ領域の大部分およびＣＨ１領域の全てを欠いている。これは、ヒンジ領域に通常存在する１１個に加えて、７位に余分な鎖間ジスルフィド結合を有する。改変体ＺＵＣは、Ｖ領域の大部分、ＣＨ１領域の全ておよびヒンジの一部を欠く。改変体ＯＭＭは、対立遺伝子型または別のガンマ鎖サブクラスを表すことができる。本開示は、これらの改変体のうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む追加的な融合タンパク質を提供する。
【０２３１】
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号２１２）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号２１２に対し８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなるポリペプチドを提供する。
【化１００】
2018517664.tif 000111
【０２３２】
Ｆｃドメインにおける種々の操作された変異が、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号２０８）に関して本明細書に提示されており、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の変異は、図５におけるＧ１Ｆｃとそれらのアラインメントに由来することができる。不等なヒンジ長のため、アイソタイプアラインメント（図５）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号２０８、２０９、２１０および２１２において異なるアミノ酸番号を保持する。また、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおける通り、番号付けが、全ＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域からなる）を包摂する場合、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域（例えば、配列番号２０８、２０９、２１０、２１１または２１２）からなる免疫グロブリン配列内の所与のアミノ酸位置は、同じ位置とは異なる番号により特定されることも理解することができる。例えば、ヒトＧ１Ｆｃ配列（配列番号２０８）、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７）、およびヒトＩｇＧ１重鎖内で選択されるＣＨ３位置の間の対応関係は、以下の通りである。
【表Ａ】
2018517664.tif 000112
【０２３３】
単一細胞株からの非対称の免疫グロブリンに基づくタンパク質の大規模産生において生じる問題は、「鎖会合課題」として公知である。二重特異性抗体の産生において顕著に直面するように、鎖会合課題は、単一細胞株において異なる重鎖および／または軽鎖が産生される場合に、固有に生じる複数の組合せの中から所望の多重鎖タンパク質を効率的に産生するという難題に関係する［例えば、Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６５３〜６６３頁を参照］。この問題は、同じ細胞内で２種の異なる重鎖および２種の異なる軽鎖が産生される場合に最も喫緊となり、この場合、１種のみが典型的に望まれるときに、総計１６通りの可能な鎖組合せ（これらのいくつかは同一であるが）が存在する。にもかかわらず、同じ原理が、２種の異なる（非対称）重鎖のみを取り込む所望の多重鎖融合タンパク質の収量縮小の原因である。
【０２３４】
単一細胞株においてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望のペア形成を増加させて、許容される収量で好ましい非対称融合タンパク質を産生する様々な方法が、当該分野で公知である［例えば、Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６５３〜６６３頁を参照］。Ｆｃ含有鎖の所望のペア形成を得るための方法として、電荷に基づくペア形成（静電ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ））、「ノブ・ホール型（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」立体ペア形成およびＳＥＥＤｂｏｄｙペア形成およびロイシンジッパーベースのペア形成が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９巻：６１７〜６２１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（１９９８年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６巻：６７７〜６８１頁；Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３巻：１９５〜２０２頁；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（２０１０）；２８５：１９６３７−１９６４６；Ｗｒａｎｉｋら（２０１２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７：４３３３１−４３３３９；ＵＳ５９３２４４８；ＷＯ１９９３／０１１１６２；ＷＯ２００９／０８９００４およびＷＯ２０１１／０３４６０５を参照。
【０２３５】
例えば、特異的ポリペプチドの間の相互作用を促進し得る１つの手段は、Ａｒａｔｈｏｏｎら、Ｕ．Ｓ．７，１８３，０７６およびＣａｒｔｅｒら、Ｕ．Ｓ．５，７３１，１６８などにおいて記載されている、凸部対凹部（ノブ・ホール）（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ））相補領域を操作することによる手段である。「凸部」は、第１のポリペプチド（例えば、第１の相互作用ペア）の界面に由来する小型のアミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることにより構築する。任意選択で、大型のアミノ酸側鎖をより小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチド（例えば、第２の相互作用ペア）の界面上に、凸部と同一または同様なサイズの相補的「凹部」を創出する。第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの界面に位置および寸法が適切な凸部または凹部が存在する場合は、隣接する界面において、それぞれ、対応する凹部または凸部を操作することが必要とされるだけである。
【０２３６】
中性のｐＨ（７．０）では、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、負に帯電し、リシン、アルギニン、およびヒスチジンは、正に帯電している。これらの帯電残基を使用して、ヘテロ二量体の形成を促進し、同時に、ホモ二量体の形成を妨げることができる。反対の電荷の間では、誘引性の相互作用が生じ、同じ電荷の間では、排斥性の相互作用が生じる。部分的に、本明細書で開示されるタンパク質複合体は、帯電界面残基の部位指向変異誘発を実行することにより、ヘテロ多量体の形成（例えば、ヘテロ二量体の形成）を促進するための誘引性の相互作用、および任意選択で、ホモ二量体の形成（例えば、ホモ二量体の形成）を妨げるための排斥性の相互作用を使用する。
【０２３７】
例えば、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの界面は、ドメイン間相互作用に関与する４つの固有の電荷残基ペア：Ａｓｐ３５６−Ｌｙｓ４３９’、Ｇｌｕ３５７−Ｌｙｓ３７０’、Ｌｙｓ３９２−Ａｓｐ３９９’、およびＡｓｐ３９９−Ｌｙｓ４０９’［第２の鎖内の残基の番号付けは（’）で指し示している］を含む。ここで、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン内の残基を表示するのに使用される番号付けスキームは、ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けスキームに準拠することに留意されたい。ＣＨ３ドメイン間相互作用に存在する２回転対称に起因して、構造内では、各固有の相互作用が２回現れる（例えば、Ａｓｐ３９９−Ｌｙｓ４０９’およびＬｙｓ４０９−Ａｓｐ３９９’）。野生型配列では、Ｋ４０９−Ｄ３９９’は、ヘテロ二量体の形成およびホモ二量体の形成のいずれにも好都合である。第１の鎖内の電荷極性を切り換える単一の変異（例えば、Ｋ４０９Ｅ；陽性電荷から、陰性電荷への切換え）は、第１の鎖のホモ二量体の形成に不都合な相互作用をもたらす。この不都合な相互作用は、同じ電荷間（陰性間；Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９’およびＤ３９９−Ｋ４０９Ｅ’）で生じる排斥性の相互作用のために発生する。第２の鎖内の電荷極性を切り換える同様の変異（Ｄ３９９Ｋ’；陰性電荷から、陽性電荷への切換え）は、第２の鎖のホモ二量体の形成に不都合な相互作用（Ｋ４０９’−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９Ｋ−Ｋ４０９’）をもたらす。しかし、同時に、これらの２つの変異（Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｋ’）は、ヘテロ二量体の形成には好都合な相互作用（Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９−Ｋ４０９’）をもたらす。
【０２３８】
ヘテロ二量体の形成およびホモ二量体の阻止における静電ステアリング効果は、追加の帯電残基の変異によりさらに増強することができ、これは、第２の鎖内の反対に帯電した残基とペア形成する場合もしない場合もあり、例えばＡｒｇ３５５およびＬｙｓ３６０が挙げられる。下記の表は、電荷を変化させる可能な変異であって、本明細書に記載のポリペプチド複合体のヘテロ多量体の形成を増強するのに単独または組合せで使用し得る変異を列挙する。
【表Ｂ】
2018517664.tif 000113
【０２３９】
一部の実施形態では、相互作用が静電的に不都合となるように、本出願の融合タンパク質内のＣＨ３間の界面を構成する１つまたは複数の残基を、帯電アミノ酸で置き換える。例えば、界面内の正に帯電したアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）を、負に帯電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置き換える。代替的に、または前出の置換と組み合わせて、界面内の負に帯電したアミノ酸を、正に帯電したアミノ酸で置き換える。ある特定の実施形態では、アミノ酸を、所望の電荷特徴を有する天然に生じないアミノ酸で置き換える。負に帯電した残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）をＨｉｓへと変異させることは、立体的問題を引き起こし得る側鎖体積の増大をもたらすことに留意されたい。さらに、Ｈｉｓのプロトンドナー形態およびプロトンアクセプター形態は、局在化環境に依存する。デザイン戦略とともにこれらの問題を考慮に入れるべきである。ヒトＩｇＧサブクラスおよびマウスＩｇＧサブクラスでは、界面残基が高度に保存されるため、本明細書で開示される静電ステアリング効果は、ヒトおよびマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に適用することができる。この戦略はまた、ＣＨ３ドメインの界面における非帯電残基の帯電残基への改変にも拡張することができる。
【０２４０】
部分的に、本開示は、電荷ペア形成（静電ステアリング）に基づいて相補的となるように操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。静電相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドに任意に融合して、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ）させて、所望の多重鎖構築物（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体）の生成に有利に働くことができる。静電ステアリングに基づくこの例において、配列番号２００［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｅ１３４Ｋ／Ｄ１７７Ｋ）］および配列番号２０１［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｋ１７０Ｄ／Ｋ１８７Ｄ）］は、操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、配列番号２００または配列番号２０１のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図５を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号２００および２０１）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図５を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号２００および２０１）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
【化１０１】
2018517664.tif 000114
【０２４１】
部分的に、本開示は、立体相補性が操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。部分的に、本開示は、立体相補性の例としてノブ・ホールペア形成を提供する。立体相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドに任意に融合して、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ）させて、所望の多重鎖構築物（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体）の生成に有利に働くことができる。ノブ・ホールに基づくこの例において、配列番号２０２［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｔ１４４Ｙ）］および配列番号２０３［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｙ１８５Ｔ）］は、操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドは、配列番号２０２または配列番号２０３のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図５を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号２０２および２０３）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図５を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号２０２および２０３）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
【化１０２】
2018517664.tif 000115
【０２４２】
ジスルフィド結合と組み合わせたノブ・ホールペア形成に基づくＦｃ相補性の例が、配列番号２０４［ｈＧ１Ｆｃ（Ｓ１３２Ｃ／Ｔ１４４Ｗ）］および配列番号２０５［ｈＧ１Ｆｃ（Ｙ１２７Ｃ／Ｔ１４４Ｓ／Ｌ１４６Ａ／Ｙ１８５Ｖ）］に開示される。これらの配列における操作されたアミノ酸置換に二重の下線を引き、構築物のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドは、配列番号２０４または配列番号２０５のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図５を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号２０４および２０５）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図５を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号２０４および２０５）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
【化１０３】
2018517664.tif 000116
【０２４３】
部分的に、本開示は、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ  ＣＨ３ドメインの指状嵌合型（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ）β−ストランドセグメントを生成するように操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。このような方法は、ＳＥＥＤｂｏｄｙ融合タンパク質の形成を可能にするストランド交換操作ドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体の使用を含む［例えば、Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌ  ２３巻：１９５〜２０２頁を参照］。ＳＥＥＤｂｏｄｙ相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドに任意に融合して、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現されて、所望の多重鎖構築物の生成に有利に働くことができる。ＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｓｂ）ペア形成に基づくこの例において、配列番号２０６［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＡＧ）］および配列番号２０７［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＧＡ）］は、ＩｇＡ  Ｆｃに由来する操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的ＩｇＧ  Ｆｃ配列の例であり、構築物のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、配列番号２０６または配列番号２０７のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃの対応する位置におけるアミノ酸置換（図５を参照）が、下記の相補的ＩｇＧ−ＩｇＡペア（配列番号２０６および２０７）において使用することができるＦｃ単量体を生成するであろうと認めることができる。
【化１０４】
2018517664.tif 000117
【０２４４】
部分的に、本開示は、切断可能なロイシンジッパードメインであって、Ｆｃ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に結合させたロイシンジッパードメインを伴う非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。ロイシンジッパーの結合は、ヘテロ二量体の抗体重鎖の優先的なアセンブリーを引き起こすのに十分である。例えば、Ｗｒａｎｉｋら（２０１２年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８７巻：４３３３１〜４３３３９頁を参照。本明細書で開示される通り、ロイシンジッパー形成鎖に結合させたＦｃ配列のペアの一方を、任意選択のリンカーを伴うかまたは伴わずに、構築物のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドへと任意に融合させて、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、選択した細胞内で相補的なロイシンジッパー形成鎖に結合させたＦｃ配列と共に共発現させて、所望の多重鎖構築物の生成を優先することができる。精製後における、構築物の、細菌性エンドプロテイナーゼであるＬｙｓ−Ｃによるタンパク質分解性消化により、ロイシンジッパードメインを放出することができ、構造が天然Ｆｃと同一のＦｃ構築物をもたらす。ロイシンジッパーのペア形成に基づくこの例では、配列番号２１３［ｈＧ１Ｆｃ−Ａｐ１（酸性）］および配列番号２１４［ｈＧ１Ｆｃ−Ｂｐ１（塩基性）］が、相補的なＩｇＧ  Ｆｃ配列［配列中、操作された相補的ロイシンジッパー配列に下線を付す］の例であり、構築物のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、配列番号２１３または配列番号２１４のいずれかに融合させてよいが、これらの両方には融合させない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃ、および天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を踏まえると、任意選択のリンカーを伴うかまたは伴わずに、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３Ｆｃ、またはｈＧ４Ｆｃ（図５を参照されたい）に結合させたロイシンジッパー形成配列により、下記（配列番号２１３および２１４）の相補的なロイシンジッパー形成ペアにおいて使用され得るＦｃ単量体が生成されることが理解され得る。
【化１０５】
2018517664.tif 000118
【０２４５】
融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なるエレメントは、所望の機能性と符合する任意の様式で配列し得ることが理解される。例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインを、異種ドメインに対してＣ末端に配置することもでき、代替的に、異種ドメインを、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドドドメインに対してＣ末端に配置することもできる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドドドメインと、異種ドメインとは、融合タンパク質内で隣接する必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列を、いずれかのドメインに対してＣ末端またはＮ末端に含めることもでき、ドメインの間に含めることもできる。
【０２４６】
例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体融合ポリペプチドは、式Ａ−Ｂ−Ｃで示されるようなアミノ酸配列を含み得る。Ｂ部分はＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインに対応する。ＡおよびＣ部分は、独立に、０、１または１より多くのアミノ酸であり得、ＡおよびＣ部分の両方は、存在する場合、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に結合されていてもよい。リンカーは、グリシン（例えば、２〜１０、２〜５、２〜４、２〜３グリシン残基）またはグリシンおよびプロリン残基が豊富であってもよいし、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一配列またはスレオニン／セリンおよび／またはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号５８）、ＧＧＧＧ（配列番号５９）、ＴＧ４（配列番号６０）、ＳＧ４（配列番号６１）、ＴＧ３（配列番号６２）またはＳＧ３（配列番号６３）の単回または反復、を含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体融合ポリペプチドは、式Ａ−Ｂ−Ｃで示されるようなアミノ酸配列を含み、ここで、Ａはリーダー（シグナル）配列、ＢはＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドドドメインからなり、Ｃは、インビボ安定性、インビボ半減期、摂取／投与、組織局在化または分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製の１つまたは複数を増強するポリペプチド部分である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体融合ポリペプチドは、式Ａ−Ｂ−Ｃで示されるようなアミノ酸配列を含み、ここで、ＡはＴＰＡリーダー配列であり、ＢはＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは免疫グロブリンＦｃドメインである。好ましい融合タンパク質は、配列番号１０１、１０３、１０４、１０６、１０７、１０９、１１０、１１２、１１３、１１５、１１６、１１８、１１９、１２１、１２２、１２４、１２５、１２７、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６および４０１〜４２４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、所望の特性を付与するために１つまたは複数の異種部分（ドメイン）をさらに含む。例えば、いくつかの融合ドメインが、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。このような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。アフィニティ精製の目的では、グルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル−もしくはコバルト−結合化樹脂のような、アフィニティクロマトグラフィーのための適切なマトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓＴＭシステム（Ｑｉａｇｅｎ）のような「キット」の形態で利用可能である。別の例としては、融合ドメインは、リガンドトラップポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに、「エピトープタグ」（これは、特定の抗体に利用可能な、通常は短いペプチド配列である）が挙げられる。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放することを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位を有する。解放されたタンパク質は、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって、融合ドメインから単離され得る。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、ポリペプチドを安定化させ得る１または複数の修飾を含み得る。例えば、このような修飾は、ポリペプチドのインビトロ半減期を増強させるか、ポリペプチドの循環半減期を増強させる、かつ／または、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。このような安定化修飾としては、融合ポリペプチド（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインと安定化ドメインとを含む融合ポリペプチドが挙げられる）、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加が挙げられる）、および糖質部分の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの炭水化物部分の除去が挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「安定化ドメイン」は、融合ポリペプチドの場合のように融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すだけでなく、炭水化物部分のような非タンパク質性修飾、または、ポリエチレングリコールのような非タンパク質性部分も含む。
【０２４９】
好ましい実施形態では、本明細書で記載される方法に従い使用されるＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、単離ポリペプチド複合体である。本明細書で使用する場合、単離タンパク質（またはタンパク質複合体）または単離ポリペプチド（またはポリペプチド複合体）とは、その天然環境の成分から分離されたタンパク質またはポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示のシングルアームヘテロ多量体複合体を、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣ）により決定した場合に、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より高い純度まで精製する。当該分野では、抗体純度を評価するための方法が周知である［例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、（２００７年）、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、Ｂ８４８巻：７９〜８７頁を参照］。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドならびにそのシングルアームヘテロ多量体複合体は、当該分野で公知の様々な技法により生成することができる。例えば、ポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３年）；およびＧｒａｎｔ  Ｇ．  Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２年）において記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を使用して合成することができる。加えて、自動式ペプチド合成器も、市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  ３９６型；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ９６００を参照）。代替的に、それらのフラグメントまたは改変体を含む、本開示のポリペプチドおよび複合体は、当該分野で周知の、種々の発現系［例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用して、組換えにより生成することもできる。さらなる実施形態では、改変ポリペプチドまたは非改変ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、またはＰＡＣＥ（ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）の使用を介する、組換えにより生成された全長ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの消化により生成することができる。（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）コンピュータ解析を使用して、タンパク質分解性切断部位を同定することができる。  
【０２５１】
３．ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ポリペプチドをコードする核酸
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体（そのフラグメント、機能的改変体、および融合タンパク質を含む）をコードする、単離核酸および／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号１２は、天然に存在するヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体のポリペプチドをコードするが、配列番号１３は、ＡｃｔＲＩＩＡのプロセシング後の細胞外ドメインをコードする。対象核酸は、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。このような核酸は、ＤＮＡ分子でもよく、ＲＮＡ分子でもよい。これらの核酸は、例えば、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を作製するための方法において使用することができる。
【０２５２】
本明細書で使用する場合、単離核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、その核酸分子を通常含有するが、その核酸分子が染色体外またはその天然の染色体位置と異なる染色体位置に存在する細胞内に含有される核酸分子を含む。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１０２、１０５、１０８、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１および３１２の任意の１つの改変体である核酸を含むことが理解される。改変体ヌクレオチド配列は、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失により異なる配列であって、対立遺伝子改変体を含む配列を含み、したがって、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１０２、１０５、１０８、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１および３１２の任意の１つに表示されるヌクレオチド配列と異なるコード配列を含む。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１０２、１０５、１０８、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１および３１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である単離または組み換えの核酸配列にコードされる。当業者は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１０２、１０５、１０８、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１および３１２に相補的な配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列も本開示の範囲内であることを理解する。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離されていてもよく、組み換えであってもよく、かつ／または異種ヌクレオチド配列と融合されていてもよく、ＤＮＡライブラリにおけるものでもよい。
【０２５５】
他の実施形態では、本開示の核酸はまた、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１０２、１０５、１０８、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１および３１２に指定されるヌクレオチド配列、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１０２、１０５、１０８、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１および３１２の相補配列、またはこれらのフラグメントに対して高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションの後に、５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方が変更されても、温度または塩濃度が一定に保たれ、他の変数が変更されてもよい。一実施形態では、本開示は、室温における６×ＳＳＣとその後の室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【０２５６】
遺伝子コードにおける縮重に起因して配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１０２、１０５、１０８、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１および３１２に示される核酸と異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が１より多いトリプレットによって示される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに対する同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、哺乳動物細胞の中には、本主題のタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が存在することが予想される。当業者は、天然の対立遺伝子改変に起因して、所与の種の個体間に、特定のタンパク質をコードする核酸の１または複数のヌクレオチド（約３〜５％までのヌクレオチド）におけるこれらの改変が存在し得ることを理解する。任意およびあらゆるこのようなヌクレオチドの改変と、結果として生じるアミノ酸の多型とは、本開示の範囲内である。
【０２５７】
特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において１または複数の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代表的には、上記１または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化する。
【０２５８】
本開示の特定の態様では、本主題の核酸は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドをコードし、そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステム、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子（ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。
【０２５９】
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。  
【０２６０】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される１または複数の真核生物の転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年）を参照。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β−ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が挙げられる。
【０２６１】
好ましい実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本主題のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ））。明らかであるように、本主題の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
【０２６２】
本開示はまた、１または複数の本主題のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株］において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０２６３】
したがって、本開示はさらに、本主題のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な条件下で培養され得る。ポリペプチドは、ポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、細胞質または膜画分から単離されてもよいし、回収し、溶解された細胞から得られてもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本主題のポリペプチドは、タンパク質を精製するための当該分野で公知の技法であって、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫アフィニティ精製、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドに融合させたドメインに結合する作用因子によるアフィニティ精製（例えば、プロテインＡカラムを使用して、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型受容体−ＦｃまたはＩＩ型受容体−Ｆｃ融合ポリペプチドまたはタンパク質複合体を精製することができる）を含む技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはこれらの両方から単離することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、その精製を容易とするドメインを含有する融合ポリペプチドまたはタンパク質複合体である。
【０２６４】
一部の実施形態では、精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多く、任意の順序で含む工程により達成する。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了し得る。ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型受容体−ＦｃまたはＩＩ型受容体−Ｆｃ融合ポリペプチドまたはタンパク質複合体は、サイズ除外クロマトグラフィーにより決定した場合に、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度まで精製することができ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより決定した場合に、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度まで精製することができる。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に、非ヒト霊長動物、齧歯動物（マウス）、およびヒトにおいて、望ましい結果を達成するのに十分なレベルであるべきである。
【０２６５】
別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドの所望の部分のＮ末端に位置するポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩまたはＩＩ型受容体融合ポリペプチドまたはタンパク質複合体を提供し得る。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、（１９９１年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８巻：８９７２頁を参照。
【０２６６】
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくは突出（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと。
【０２６７】
（４．スクリーニングアッセイ）
ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の使用であって、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（作用因子）を同定するための使用に関する。このスクリーニングを介して同定される化合物を、インビボまたはインビトロにおける組織成長を調節する能力を評価するために、試験して、骨、軟骨、筋肉、脂肪および／またはニューロンなどの組織を調節するそれらの能力を評価することができる。これらの化合物は、例えば、動物モデルにおいて試験することができる。
【０２６８】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達）を標的化することによって組織成長を調節するための治療剤についてスクリーニングするための多数のアプローチが存在する。特定の実施形態では、選択された細胞株においてＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体媒介性の作用を混乱させる作用因子を同定するために、化合物のハイスループットスクリーニングが行われ得る。特定の実施形態では、アッセイは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の、その結合パートナー、例えばＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドなど（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ｎｏｄａｌ、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）への結合を特異的に阻害または減少させる化合物をスクリーニングおよび同定するために行われ得る。あるいは、アッセイは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の、その結合パートナー、例えばＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドなどへの結合を増強しない化合物を同定するために使用され得る。さらなる実施形態では、化合物は、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体と相互作用するその能力によって同定され得る。
【０２６９】
種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本開示を考慮すれば、本明細書中に明示的に記載されない形式は、本明細書中に記載されていないにもかかわらず、当業者によって理解される。本明細書中に記載されるように、本発明の試験化合物（作用因子）は、任意の組み合わせ化学の方法によって作製され得る。あるいは、本主題の化合物は、インビボまたはインビトロで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因子として作用するその能力について試験される化合物（作用因子）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物によって生成されても（例えば、天然の生成物）、化学的に生成されても（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、組換えにより生成されてもよい。本発明によって企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。ある特定の実施形態では、試験作用因子は、約２０００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機分子である。
【０２７０】
本開示の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、または、組み合わせ化学によって作製されたような、より複雑度の高いライブラリーにおいて提供され得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび有機化合物の他の分類を含み得る。試験システムに対する試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニング段階において、単離された形態または化合物の混合物としてのいずれかであり得る。任意選択で、化合物は、任意選択で他の化合物で誘導体化され得、そして、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化クロスリンカー、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２７１】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所与の期間に調査される化合物の数を最大にするためには、ハイスループットアッセイが望ましい。精製もしくは半精製（ｓｅｍｉ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）されたタンパク質で誘導され得るような、無細胞のシステムにおいて行われるアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的における変更の迅速な発生と比較的容易な検出とを可能にするように作られ得るという点で、しばしば、「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの作用は、一般に、インビトロのシステムでは無視され得るが、その代わりに、このアッセイは主として、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体とその結合パートナー（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ｎｏｄａｌ、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）との間の結合親和性の変更において明らかになり得るような、分子標的に対する薬物の作用に焦点を当てている。
【０２７２】
単なる例示として、本開示の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある化合物は、アッセイの意図に応じて適宜、通常ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し得る単離および精製されたＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体と接触させられる。その後、化合物とＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体との混合物は、適当なＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ｎｏｄａｌ、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）に加えられる。ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体およびスーパーファミリーリガンドの検出および定量は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体とその結合タンパク質との間の複合体の形成の阻害（または助長）における化合物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価され得る。さらに、比較のためのベースラインを提供するためのコントロールアッセイもまた行われ得る。例えば、コントロールアッセイでは、単離および精製されたＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を含む組成物に加えられ、そして、ヘテロ多量体リガンド複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が混合され得る順序は変化し得、そして、同時に混合され得ることが理解される。さらに、適切な無細胞アッセイ系を与えるように、精製したタンパク質の代わりに、細胞の抽出物および溶解物が使用され得る。
【０２７３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の他のタンパク質への結合は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識されたタンパク質、例えば、放射標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）、または、酵素標識されたＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体およびその結合タンパク質を用いて、イムノアッセイによって、あるいは、クロマトグラフィーによる検出によって定量され得る。
【０２７４】
特定の実施形態では、本開示は、直接的または間接的のいずれかで、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体とその結合タンパク質との間の相互作用の程度を測定する、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー遷移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波管（ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号を参照）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサ、および表面力センサに基づくもののような、他の検出様式が、本開示の多くの実施形態と適合性がある。
【０２７５】
さらに、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体とその結合パートナーとの間の相互作用を妨害または助長する作用因子を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知である相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３年）Ｃｅｌｌ  ７２巻：２２３〜２３２頁；Ｍａｄｕｒａら（１９９３年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８巻：１２０４６〜１２０５４頁；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４巻：９２０〜９２４頁；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８巻：１６９３〜１６９６頁を参照のこと。特定の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体とその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物（例えば、低分子またはペプチド）を同定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する［例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７巻：９１９〜２９頁；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７巻：３７４〜８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照］。
【０２７６】
特定の実施形態では、本主題の化合物は、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体と相互作用するその能力によって同定される。化合物と、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体との間の相互作用は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射性標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むインビトロの生化学的な方法を用いて、タンパク質レベルで同定され得る。例えば、Ｊａｋｏｂｙ  ＷＢら（１９７４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４６巻：１頁を参照。特定の場合には、化合物は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体に結合する化合物を検出するためのアッセイのような、機構ベースのアッセイにおいてスクリーニングされ得る。これは、固相もしくは流体相の結合事象を含み得る。あるいは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体をコードする遺伝子は、レポーターシステム（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）と共に細胞中にトランスフェクトされ、そして、好ましくは、ハイスループットスクリーニングによって、ライブラリーに対して、または、ライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。他の機構ベースの結合アッセイ（例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ）が使用され得る。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定されているか、または、固定された抗体によって捕捉されている標的を用いて行われ得るか、あるいは、キャピラリー電気泳動によって分離され得る。結合した化合物は通常、比色エンドポイントあるいは蛍光または表面プラズモン共鳴を用いて検出され得る。
５．例示的な治療的使用
【０２７７】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せを使用して、ＴＧＦβスーパーファミリー受容体（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＴＧＦＢＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩ）および／またはスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ｎｏｄａｌ、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳおよびＬｅｆｔｙ）の異常活性と関連する疾患または状態を処置または予防することができる。本明細書では一般に、これらの疾患、障害、または状態を、「ＴＧＦβスーパーファミリー関連状態」と称する。ある特定の実施形態では、本発明は、個体に、本明細書で記載されるようなＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せの治療有効量を投与することにより、それを必要とする個体を処置または予防する方法を提供する。「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、本明細書を通して互換的である。本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体のいずれも潜在的に、本明細書で開示される治療的使用のために、個別にまたは組合せで利用することができる。これらの方法は特に、例えば、齧歯動物、霊長動物、およびヒトを含む哺乳動物の治療的処置および予防的処置を目的とする。
【０２７８】
本明細書中で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的試料において、無処置の対照試料に対して、処置試料における障害もしくは状態の出現を低下させるか、あるいは、無処置の対照試料に対して、障害もしくは状態の１または複数の症状の発症を遅延させるか、または、重篤度を低下させるような化合物を指す。用語「処置する」は、本明細書中で使用される場合、一度確立された状態の改善もしくは除去を含む。いずれの場合にも、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断、および、治療剤の投与の意図される結果において認識され得る。
【０２７９】
天然のＴＧＦβスーパーファミリー受容体−リガンド複合体は、組織成長のほか、種々の構造の適正な形成などの早期発生プロセスにおいて、または、性的発育、下垂体ホルモンの生成、ならびに骨および軟骨の創出を含む、１つもしくは複数の発生後能において不可欠の役割を果たす。したがって、ＴＧＦβスーパーファミリー関連状態／障害は、組織成長の異常および発生の欠損を含むが、これらに限定されない。加えて、ＴＧＦβスーパーファミリー関連状態は、炎症、アレルギー、自己免疫疾患、感染性疾患および腫瘍など、細胞の増殖および分化の障害を含むがこれらに限定されない。
【０２８０】
例示的なＴＧＦβスーパーファミリー関連状態は、神経筋障害（例えば、筋ジストロフィーおよび筋萎縮）、うっ血性閉塞性肺疾患（およびＣＯＰＤに関連する筋消耗）、筋消耗症候群、サルコペニアおよび悪液質、脂肪組織障害（例えば、肥満）、２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ、成人発症型糖尿病）ならびに骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）を含む。他の例示的なＴＧＦβスーパーファミリー関連状態は、筋肉変性障害（ｍｕｓｃｕｌｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）および神経筋障害、組織修復（例えば、創傷治癒）、神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症）ならびに免疫学的障害（例えば、リンパ球の異常な増殖または機能に関連する障害）を含む。
【０２８１】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組み合わせが、筋ジストロフィーのための処置の一部として使用される。用語「筋ジストロフィー」とは、骨格筋、ならびに、ある場合には、心臓および呼吸筋の段階的な筋力低下および劣化を特徴とする、変性性筋疾患の群を指す。筋ジストロフィーは、筋肉の微視的変化と共に始まる、進行性の筋消耗および筋力低下を特徴とする遺伝性障害である。筋肉が経時的に変性するにつれて、個人の筋強度は減衰する。本主題のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を含むレジメンで処置され得る、例示的な筋ジストロフィーとして、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー−ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドゥジー−デジェリン型としてもまた公知である）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ；スタイナート病としてもまた公知である）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）が挙げられる。
【０２８２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、フランスの神経学者である、Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ａｍａｎｄ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅにより、１８６０年代において、最初に記載された。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、ＤＭＤのこの変化形について１９５０年代に最初に記載したドイツの医師であるＰｅｔｅｒ  Ｅｍｉｌ  Ｂｅｃｋｅｒに因んで名付けられた。ＤＭＤは、男性において最も高頻度の遺伝性疾患の１つであり、３，５００人中１人の少年に影響を及ぼす。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕部に位置するジストロフィン遺伝子が欠失すると生じる。男性が保有するＸ染色体のコピーは、１つだけであるので、男性が有するジストロフィン遺伝子のコピーも１つだけである。ジストロフィンタンパク質を伴わないと、筋肉は、収縮および弛緩の周期において容易に損傷する。疾患の早期では、筋肉は、再生により代償されるが、後に、筋前駆細胞は、進行する損傷に追いつけなくなり、健常筋肉は、非機能的な線維脂肪性組織で置きかえられる。
【０２８３】
ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子における異なる変異から生じる。ＢＭＤ患者は、いくらかのジストロフィンを有するが、量が不十分であるか、または質が不良である。いくらかのジストロフィンの存在で、ＢＭＤを有する患者の筋肉は、ＤＭＤを有する患者の筋肉と同等の重篤または迅速な変性からは保護される。
【０２８４】
動物における研究は、ＧＤＦ８シグナル伝達経路の阻害が、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者において疾患の種々の側面を有効に処置することができることを指し示す（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら、２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：４１８−４２１；  Ｐｉｓｔｉｌｌｉら、２０１１，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １７８：１２８７−１２９７）。したがって、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体はＧＤＦ８阻害剤（アンタゴニスト）として作用することができ、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者において、インビボで、ＧＤＦ８および／または関連するＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによるシグナル伝達を遮断する代替的な手段を構成する。
【０２８５】
同様に、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、筋成長を必要とする他の疾患状態において、筋量を増大させる有効な手段をもたらし得る。例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（ルーゲーリック病または運動ニューロン疾患ともまた呼ばれる）は、慢性で、進行性で、治癒不能なＣＮＳ障害であって、骨格筋収縮の開始に要求される中枢神経性の構成要素である運動ニューロンを攻撃するＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動ニューロンは、劣化し、最終的に死滅し、個人の脳は、完全な機能および呼びかけ（ａｌｅｒｔ）を正常に保つが、筋肉収縮の開始は脊髄レベルで遮断される。ＡＬＳを発症した個体は、典型的には、４０〜７０歳の間であり、変性する最初の運動ニューロンは、腕部または脚部を支配する運動ニューロンである。ＡＬＳを有する患者は、歩行が困難な場合があり、物を落とし、倒れ、呂律が回らなくなり、制御不能に笑ったり泣いたりする場合がある。疾患が進行すると、四肢における筋肉は、不使用のために萎縮し始める。筋力低下は、消耗性となり、患者は最終的に車椅子を必要とするか、またはベットに伏したままになる。大半のＡＬＳ患者は、疾患発病から３〜５年で、呼吸不全、または肺炎のような換気装置支援による合併症で死ぬ。
【０２８６】
ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体による筋量増加の促進は、筋消耗疾患を患う患者の利益になることもできる。Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（上記）は、ＧＤＦ８発現は、ヒトにおける除脂肪体重と逆相関し、このようなＧＤＦ８遺伝子の発現増加は、ＡＩＤＳ消耗性症候群の男性における体重減少と関連すると報告する。ＡＩＤＳ患者におけるＧＤＦ８の機能を阻害することにより、ＡＩＤＳの少なくともある特定の症状を、完全に消失させないにせよ、緩和することができ、こうして、ＡＩＤＳ患者における生活の質を著明に改善することができる。
【０２８７】
ＧＤＦ８機能の喪失はまた、栄養摂取の減退を伴わない脂肪の減少とも関連する（Ｚｉｍｍｅｒｓら、前出；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、前出）ので、対象のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体はさらに、肥満症および２型糖尿病の発症を緩徐化または予防するための治療剤としても使用することができる。
【０２８８】
がん食欲不振−悪液質症候群は、がんの最も衰弱性かつ生命にかかわる側面にある。この症候群は、死亡時にがん患者のおよそ８０％に存在する、多くの種類のがんに共通の特色であり、不十分な生活の質および化学療法に対する不十分な応答のみならず、匹敵する腫瘍を有するが体重減少していない患者よりも短い生存時間の原因にもなる。発病前体重の５パーセントを超える不随意性の体重減少が、６ヶ月間の期間内に起こる場合、悪液質が典型的にがん患者において疑われる。食欲不振、脂肪および筋肉組織の消耗ならびに心理的窮迫に伴い、悪液質が、がんおよび宿主の間の複雑な相互作用から生じる。がん悪液質は、サイトカイン産生、脂質動員およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに中間代謝の変更に影響を与える。食欲不振が一般的であるが、食物摂取減少単独では、がん患者に観察される体組成の変化を説明することができず、栄養摂取の増加は、消耗性症候群を反転することができない。現在、悪液質過程（ｃａｃｈｅｘｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を制御または反転するための処置は存在しない。成体マウスにおけるＧＤＦ８の全身性過剰発現は、ヒト悪液質症候群に観察されるものと類似の著明な筋肉および脂肪損失を誘導することが判明したため（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上記参照）、対象のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体医薬組成物は、筋肉成長が望まれる悪液質症候群の症状の予防、処置または軽減に有益に使用することができる。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せを、骨形成および／もしくは軟骨形成を誘導する、骨量の減少を予防する、骨の石灰化を増大させる、骨の脱灰を予防する、ならびに／または骨密度を増大させる方法において使用することができる。ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、無症状性の低骨密度を有すると診断された患者において、骨粗鬆症の発症に対する保護的措置として有用であり得る。
【０２９０】
一部の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せは、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨欠損の治癒において医療的に有用であり得る。対象の方法および組成物はまた、閉鎖骨折ならびに開放骨折の低減において予防的に使用することができ、また、人工関節の固定を改善するのにも使用することができる。骨形成作用因子により誘導されるデノボの骨形成は、先天性であるか、外傷誘導性であるか、またはがん治療における切除により引き起こされる頭蓋顔面欠損の修復に有用であり、また、美容整形手術においても有用である。さらに、本発明の方法および組成物は、歯周病の処置、および他の歯牙修復プロセスにおいても使用することができる。ある特定の場合には、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せは、骨形成細胞を誘引する環境をもたらす、骨形成細胞の増殖を刺激する、または骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導することが可能である。本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体はまた、骨粗鬆症の処置においても有用であり得る。さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、軟骨欠損の修復および骨関節炎の予防／転導においても使用することができる。
【０２９１】
Ｒｏｓｅｎら（編）、Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、７版、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．（参照により本明細書に援用される）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せによる処置に供され得る骨障害についての広範な考察を提供する。本明細書では、部分的な列挙を提供する。本発明の方法および組成物は、骨粗鬆症（続発性骨粗鬆症を含む）、副甲状腺機能亢進症、慢性腎疾患／骨ミネラル障害、性ホルモン（例えば、アンドロゲンおよび／またはエストロゲン）の枯渇もしくは除去、グルココルチコイド処置、関節リウマチ、重度の火傷、副甲状腺機能亢進症、高カルシウム血症、低カルシウム血症、低リン血症、骨軟化症（腫瘍誘導性骨軟化症を含む）、高リン血症、ビタミンＤ欠損症、副甲状腺機能亢進症（家族性副甲状腺機能亢進症を含む）および偽性副甲状腺機能低下症、腫瘍の骨転移、腫瘍もしくは化学療法の帰結としての骨量の減少、骨および骨髄の腫瘍（例えば、多発性骨髄腫）、虚血性骨障害、歯周病および口腔内骨量の減少、クッシング病、ページェット病、甲状腺中毒症、慢性下痢状態もしくは吸収不良、腎臓尿細管アシドーシス、または神経性無食欲症などの、骨量の減少を特徴とするか、またはこれを引き起こす状態に適用することができる。本発明の方法および組成物はまた、骨形成または骨治癒の不全を特徴とする状態であって、非癒合骨折、そうでなければ治癒が遅い骨折、胎児および新生児の骨異形成（例えば、低カルシウム血症、高カルシウム血症、カルシウム受容体欠損、およびビタミンＤ欠損症）、骨壊死（顎部の骨壊死を含む）、ならびに骨形成不全症を含む状態にも適用することができる。加えて、同化効果によって、このようなアンタゴニストは、骨損傷または骨糜爛と関連する骨疼痛を減殺させる。抗骨吸収効果の帰結として、このようなアンタゴニストは、造骨性腫瘍転移（例えば、原発性前立腺がんまたは乳がんと関連する）、造骨性骨肉腫、大理石骨病、進行性骨幹異形成、骨内膜性骨化過剰症、骨斑紋症、および流蝋骨症などの、骨形成異常障害を処置するのに有用であり得る。処置され得る他の障害として、線維性異形成および軟骨異形成が挙げられる。
【０２９２】
別の具体的実施形態では、本開示は、軟骨および／もしくは骨の欠損または歯周病と関連する、骨折および他の状態を修復するための治療方法および組成物を提供する。本発明はさらに、創傷治癒および組織修復のための治療方法および組成物も提供する。創傷の種類として、火傷、切創、および潰瘍が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０１１０６号を参照されたい。このような組成物は、薬学的に許容されるビヒクル、担体、またはマトリックスと混合した、本開示の少なくとも１つのＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の治療有効量を含む。
【０２９３】
一部の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せは、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、クッシング病、甲状腺中毒症、慢性下痢状態もしくは吸収不良、腎臓尿細管アシドーシス、または神経性無食欲症などの、骨量の減少を引き起こす状態に適用することができる。女性であること、体重が小さいこと、および座りがちな生活様式をとることは、骨粗鬆症（骨折リスクをもたらす、骨ミネラル密度の喪失）のリスク要因であることが一般に理解されている。しかし、骨粗鬆症はまた、ある特定の医薬の長期にわたる使用からも生じ得る。薬物または別の医学的状態から生じる骨粗鬆症は、続発性骨粗鬆症として公知である。クッシング病では、体内で産生されたコルチゾールの過剰量が、骨粗鬆症および骨折を結果としてもたらす。続発性骨粗鬆症と関連する最も一般的な医薬は、天然で副腎により産生されるホルモンであるコルチゾール様に作用する薬物のクラスであるコルチコステロイドである。骨格の発達には、甲状腺ホルモンの適切なレベルが必要とされるが、過剰な甲状腺ホルモンは、時間経過と共に骨量を減少させ得る。アルミニウムを含有する制酸剤は、腎の問題を有する人、特に、透析を受けている人が高用量を服用する場合、骨量の減少をもたらし得る。続発性骨粗鬆症を引き起こし得る他の医薬として、発作を予防するのに使用されるフェニトイン（Ｄｉｌａｎｔｉｎ）およびバルビツール酸；関節炎、がん、および免疫障害の一部の形態のための薬物であるメトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｆｏｌｅｘ  ＰＦＳ）；一部の自己免疫疾患を処置し、臓器移植患者における免疫系を抑制するのに使用される薬物であるシクロスポリン（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ）；前立腺がんおよび子宮内膜症を処置するのに使用される黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト（Ｌｕｐｒｏｎ、Ｚｏｌａｄｅｘ）；抗凝固薬であるヘパリン（Ｃａｌｃｉｐａｒｉｎｅ、Ｌｉｑｕａｅｍｉｎ）；ならびに高コレステロールを処置するのに使用されるコレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ）およびコレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ）が挙げられる。がん治療から生じる骨量の減少は、広く認識されており、がん治療誘導性骨量減少（ＣＴＩＢＬ）と称されている。骨転移は、骨中の空隙を創出し得るが、これは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体ヘテロ多量体複合体で処置することにより是正することができる。骨量の減少はまた、歯肉の陥凹部に棲息する細菌が毒素および有害な酵素を産生する慢性感染症である歯肉疾患によっても引き起こされ得る。
【０２９４】
さらなる実施形態では、本開示は、異常なまたは望ましくない骨成長と関連する疾患または障害を処置するための方法および治療剤を提供する。例えば、先天性障害である進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を有する患者は、自発的なまたは組織外傷に応答した軟組織内の進行性異所性骨成長に苦しみ、生活の質に多大な影響が及ぶ。加えて、異常な骨成長が、股関節置換術の後で生じる場合もあり、そのため、手術転帰が損なわれ得る。これは、対象の方法および組成物が治療的に有用であり得る病理学的な骨成長および状況のより一般的な例である。この方法および組成物はまた、異常な骨成長の他の形態（例えば、外傷、火傷、または脊髄傷害後の骨の病理学的成長）を処置し、転移性前立腺がんまたは骨肉腫と関連して見られる異常な骨成長と関連する所望されない状態を処置または予防するためにも有用であり得る。
【０２９５】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せを使用して、がんを有する患者における骨形成を促進することができる。ある特定の腫瘍（例えば、前立腺がん、乳がん、多発性骨髄腫、または副甲状腺機能亢進症を引き起こす任意の腫瘍）を有する患者は、腫瘍誘導性の骨量の減少、骨転移、および治療剤に起因して骨量の減少のリスクが高い。このような患者は、骨量の減少または骨転移の証拠の非存在下であっても、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、または複合体の組合せで処置することができる。患者はまた、骨量の減少または骨転移の証拠についてモニタリングされてもよく、指標がリスクの増大を示す場合は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体で処置することができる。一般に、ＤＥＸＡスキャンを利用して骨密度の変化を評価する一方で、骨リモデリングの指標を使用して骨転移の可能性を評価することができる。血清マーカーをモニタリングすることができる。骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）は、骨芽細胞内に存在する酵素である。ＢＳＡＰの血中レベルは、骨リモデリングの増大を結果としてもたらす骨転移および他の状態を有する患者において上昇する。オステオカルシンおよびプロコラーゲンペプチドもまた、骨形成および骨転移と関連する。ＢＳＡＰの増大は、前立腺がんにより引き起こされた骨転移を有する患者において検出されており、より低度で、乳がんに由来する骨転移においても検出されている。ＢＭＰ７レベルは、骨へと転移した前立腺がんでは高度であるが、膀胱がん、皮膚がん、肝臓がん、または肺がんに起因する骨転移では高度でない。Ｉ型カルボキシ末端テロペプチド（ＩＣＴＰ）とは、骨吸収時に形成されるコラーゲン内で見出される架橋である。骨は恒常的に分解および再形成されているので、ＩＣＴＰは全身で見出される。しかし、骨転移の部位では、このレベルは正常な骨の領域より著明に高くなる。ＩＣＴＰは、前立腺がん、肺がん、および乳がんに起因する骨転移において高レベルで見出されている。別のコラーゲン架橋である、Ｉ型Ｎ末端のテロペプチド（ＮＴｘ）は、骨代謝回転時にＩＣＴＰと共に産生される。ＮＴｘの量は、多くの異なる種類のがんであって、肺がん、前立腺がん、および乳がんを含むがんにより引き起こされる骨転移において増大する。ＮＴｘのレベルはまた、骨転移の進行に伴っても上昇する。したがって、このマーカーを使用して、転移を検出し、かつ、疾患の程度を測定することができる。吸収の他のマーカーは、ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンを含む。吸収マーカーまたは骨転移のマーカーの任意の増大は、患者におけるＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せによる治療の必要を指し示す。
【０２９６】
別の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せは、腎疾患から発生する、相互に関連した骨格、心血管、およびミネラル代謝障害の広範にわたる症候群である、慢性腎疾患／骨ミネラル障害（ＣＫＤ−ＭＢＤ）を有する患者において使用することができる。ＣＫＤ−ＭＢＤは、腎性骨形成異常症（ＲＯＤ）としばしば称される多様な骨格病態を包摂し、これは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはこのようなＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せによる処置のための好ましい実施形態である。異なる病原性要因の相対的な寄与に応じて、ＲＯＤは、骨リモデリングの多様な病理学的パターンとして顕在化される（Ｈｒｕｓｋａら、２００８年、Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｂｏｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  （ＣＫＤ−ＭＢＤ）、Ｒｏｓｅｎら（編）、Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、７版、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、３４３〜３４９頁）。スペクトルの一終端では、ＲＯＤは、尿毒症性骨ジストロフィーおよび低骨代謝回転を伴い、活性リモデリング部位の数の減少、骨形成の深刻な抑制、および低骨吸収を特徴とする。他の極では、ＲＯＤは、副甲状腺機能亢進症、高骨代謝回転、および線維性骨炎を伴う。ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せが、同化効果および抗骨吸収効果の両方を及ぼし得ることを踏まえると、これらの作用因子は、ＲＯＤの病態スペクトルにわたる患者において有用であり得る。
【０２９７】
本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せは、他の骨活性医薬剤と共に併用投与することができる。併用投与は、単一の共製剤の投与により達することもでき、同時的な投与により達することもでき、別個の時点における投与により達することもできる。ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、他の骨活性作用因子と共に投与する場合に、特に有利であり得る。患者は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を施されると共に、カルシウムサプリメント、ビタミンＤを服用し、適切な身体運動を行い、かつ／または、場合によって、他の医薬を服用することから利益を得ることができる。他の医薬の例は、ビスホスホネート（アレンドロネート、イバンドロネート、およびリセドロネート）、カルシトニン、エストロゲン、副甲状腺ホルモン、およびラロキシフェンを含む。ビスホスホネート（アレンドロネート、イバンドロネート、およびリセドロネート）、カルシトニン、エストロゲン、およびラロキシフェンは、骨リモデリングサイクルに影響を及ぼし、抗骨吸収医薬として分類される。骨リモデリングは、２つの異なる段階：骨吸収および骨形成からなる。抗骨吸収医薬は、骨リモデリングサイクルのうちの骨吸収部分は、緩徐化するか、または停止させるが、サイクルのうちの骨形成部分は、緩徐化しない。結果として、新たな形成は、骨吸収より大きな速度で持続し、骨密度は、時間経過と共に増大し得る。副甲状腺ホルモンの形態であるテリパラチドは、骨リモデリングサイクルにおける骨形成速度を増大させる。アレンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防（毎日５ｍｇまたは毎週１回３５ｍｇ）および処置（毎日１０ｍｇまたは毎週１回７０ｍｇ）の両方について承認されている。アレンドロネートは、骨量の減少を軽減し、骨密度を増大させ、脊椎、手首、および股関節の骨折のリスクを低減する。アレンドロネートはまた、男性および女性におけるグルココルチコイド誘導性骨粗鬆症であって、これらの医薬（すなわち、プレドニゾンおよびコルチゾン）の長期にわたる使用の結果としての骨粗鬆症の処置と、男性における骨粗鬆症の処置とについて承認されている。ビタミンＤを加えたアレンドロネートは、閉経後女性における骨粗鬆症の処置（ビタミンＤを加えた、毎週１回７０ｍｇ）と、骨粗鬆症を有する男性における骨量を改善する処置とについて承認されている。イバンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置について承認されている。毎月１回の丸剤（１５０ｍｇ）として服用されるイバンドロネートは、各月同じ日に服用するべきである。イバンドロネートは、骨量の減少を軽減し、骨密度を増大させ、脊椎骨折のリスクを低減する。リセドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置について承認されている。毎日（５ｍｇの用量）または毎週（３５ｍｇの用量、またはカルシウムを伴う３５ｍｇの用量）服用されるリセドロネートは、骨量の減少を緩徐化し、骨密度を増大させ、脊椎骨折および非脊椎骨折のリスクを低減する。リセドロネートはまた、男性および女性による使���であって、これらの医薬（すなわち、プレドニゾンおよびコルチゾン）の長期にわたる使用から生じるグルココルチコイド誘導性骨粗鬆症を予防および／または処置する使用が承認されている。カルシトニンとは、カルシウム調節および骨代謝に関与する天然に生じるホルモンである。閉経後５年を超える女性において、カルシトニンは、骨量の減少を緩徐化し、脊椎の骨密度を増大させ、骨折と関連する疼痛を緩和し得る。カルシトニンは、脊椎骨折のリスクを低減する。カルシトニンは、注射（毎日５０〜１００ＩＵ）または経鼻スプレー（毎日２００ＩＵ）として利用可能である。
【０２９８】
患者はまた、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せと、追加の骨活性医薬とを、共に施されることからも利益を得ることができる。エストロゲン療法（ＥＴ）／ホルモン療法（ＨＴ）は、骨粗鬆症の予防について承認されている。ＥＴは、閉経後女性において、骨量の減少を軽減し、脊椎および股関節のいずれでも骨密度を増大させ、股関節および脊椎の骨折のリスクを低減することが示されている。ＥＴは、最も一般には、毎日およそ０．３ｍｇの低用量または毎日およそ０．６２５ｍｇの標準用量を送達する丸剤または皮膚パッチの形態で投与され、７０歳を過ぎて開始しても有効である。単独で服用する場合、エストロゲンは、女性が子宮内膜のがん（子宮内膜がん）を発症するリスクを増大させ得る。このリスクを消失させるために、医療ケア提供者は、無傷の子宮を有する女性のために、ホルモンであるプロゲスチンをエストロゲンと組み合わせて（ホルモン補充療法またはＨＴ）処方する。ＥＴ／ＨＴは、閉経症状を緩和し、骨健康に対して有益な効果を及ぼすことが示されている。副作用として、膣出血、乳房圧痛、気分障害、および胆嚢疾患が挙げれ得る。毎日６０ｍｇのラロキシフェンは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置について承認されている。ラロキシフェンは、選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）と呼ばれる薬物であって、エストロゲンの有益な効果を、それらの潜在的な欠点を伴わずにもたらすように開発された薬物のクラスに由来する。ラロキシフェンは、骨量を増大させ、脊椎骨折のリスクを低減する。ラロキシフェンが、股関節の骨折および他の非脊椎骨折のリスクを低減し得ることを実証するデータは、まだ利用可能ではない。副甲状腺ホルモンの形態であるテリパラチドは、閉経後女性および骨折のリスクが高い男性における骨粗鬆症の処置について承認されている。この医薬は、新たな骨形成を刺激し、骨ミネラル密度を著明に増大させる。閉経後女性では、脊椎、股関節、脚部、肋骨、および手首における骨折の低減が見られた。男性では、脊椎における骨折の低減が見られたが、他の部位における骨折の低減を評価するには、データが不十分であった。テリパラチドは、最長で２４カ月間にわたり、毎日の注射として、自己投与される。
【０２９９】
他の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組み合わせは、動物における体脂肪含量の調節に、およびそれに関係する状態、特に、それに関係する健康を損なう状態の処置または予防に使用することができる。本発明にしたがって、体重を調節（制御）するということは、体重の低減もしくは増加、体重増加の速度の低減もしくは増加、または体重減少の速度の増加もしくは低減を指すことができ、体重を能動的に維持すること、または有意に変化させないこと（例えば、何もしなければ体重を増加または減少させ得る、外部または内部の影響に対して）も含む。本開示の一実施形態は、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せを、それを必要とする動物（例えば、ヒト）に投与することによる、体重の調節に関する。
【０３００】
一部の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せは、動物における体重の低減および／または体重増加の低減に、より具体的には、肥満のリスクがあるまたはこれを患う患者における肥満の処置または好転に使用することができる。別の特異的な実施形態では、本発明は、体重を増加または保持することができない動物（例えば、消耗性症候群の動物）を処置するための方法および化合物を対象にする。このような方法は、体重および／または質量の増加に、または体重および／または質量減少の低減に、または望ましくなく低い（例えば、不健康な）体重および／または質量に関連するもしくはこれに起因する状態の改善に有効である。加えて、高コレステロールの障害（例えば、高コレステロール血症または脂質異常症（ｄｉｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ））は、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組合せにより処置することができる。
【０３０１】
ある特定の態様では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組み合わせを使用して、それを必要とする対象において、赤血球レベルを上昇させ、貧血を処置または予防し、および／または無効赤血球生成を処置または予防することができる。ある特定の態様では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組み合わせを、赤血球レベルを上昇させるための従来の治療アプローチ、特に多因子性の起源の貧血を処置するために使用されるもの、と組み合わせて使用できる。赤血球レベルを上昇させるための従来の治療アプローチとして、例えば、赤血球輸血、１つまたは複数のＥＰＯ受容体活性化因子の投与、造血幹細胞移植、免疫抑制性生物材料（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）および薬物（例えば、コルチコステロイド）が挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組み合わせを使用して、それを必要とする対象において、無効赤血球生成および／または無効赤血球生成に関連した障害を処置または予防することができる。ある特定の態様では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組み合わせは、貧血または無効赤血球生成障害を処置または予防するための従来の治療アプローチ、特に多因子性の起源の貧血を処置するために使用されるもの、と組み合わせて使用できる。
【０３０２】
一般に、本開示で記載されている疾患または状態の処置または予防は、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組み合わせを、「有効量」で投与することにより達成する。作用因子の有効量とは、必要な投与量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の治療結果または予防結果を達成するのに効果的な量を指す。本開示の作用因子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する作用因子の能力などの要因に従い変化し得る。「予防有効量」とは、必要な投与量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の予防結果を達成するのに効果的な量を指す。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組み合わせは、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用して、健常個体および選択された患者集団において赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、または網状赤血球レベルを高めることができる。適切な患者集団の例としては、貧血を有する患者のような望ましくない低い赤血球またはヘモグロビンレベルを有する患者、および、大きな外科手術またはかなりの血液喪失を生じ得る他の処置を受ける予定の患者のような、望ましくない低赤血球またはヘモグロビンレベルを生じる危険性のある患者、が挙げられる。一実施形態では、適切な赤血球レベルを有する患者は、赤血球レベルを増加させるためにＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の組み合わせで処置され、その後、血液が採血され、そして、後に輸血に使用するために保存される。
【０３０４】
本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用して、貧血を有する患者において赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルを高めることができる。ヒトにおけるヘモグロビンレベルおよび／またはヘマトクリットレベルを観察する場合、個体の変動は考慮されるが、適切な年齢および性別の範疇に応じた正常なレベル未満のレベルは、貧血を示し得る。例えば、１０〜１２．５ｇ／ｄｌであり、典型的に、約１１．０ｇ／ｄｌのヘモグロビンレベルは、健常な成人において、正常な範囲内にあると考えられるが、治療の点では、標的レベルが低ければ、心血管副作用を引き起こす可能性は小さい［例えば、Ｊａｃｏｂｓら（２０００年）、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１５巻、１５〜１９頁を参照されたい］。代替的に、ヘマトクリットレベル（細胞により占有される血液試料の容量百分率）を、貧血の尺度として使用することができる。健常個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では、約４１〜５１％の範囲にあり、成人女性では、３５〜４５％の範囲にある。ある特定の実施形態では、患者は、患者を、赤血球、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットの標的レベルに戻すことが意図される投与レジメンで処置することができる。ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルは、個々人で変化するので、最適には、標的ヘモグロビンレベルおよび／または標的ヘマトクリットレベルは、各患者のために個別化することができる。
【０３０５】
貧血は、組織傷害、感染、および／または慢性疾患、特に、がんを有する患者において高頻度で観察される。対象によっては、貧血は、低エリスロポエチンレベルおよび／または骨髄中のエリスロポエチンに対する不適切な応答により識別される［例えば、Ａｄａｍｓｏｎ、２００８年、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１７版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６２８〜６３４頁を参照されたい］。貧血の潜在的な原因としては、例えば、血液喪失、栄養不良（例えば、たんぱく質の食餌性摂取の低減）、薬物療法反応、骨髄に関連する種々の問題および多くの疾患が挙げられる。より具体的には、貧血は、例えば、骨髄移植、固形腫瘍（例えば、乳がん、肺がんおよび結腸がん）；リンパ系の腫瘍（例えば、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫）；造血系の腫瘍（例えば、白血病、骨髄異形成症候群および多発性骨髄腫）；放射線治療；化学療法（例えば、白金を含むレジメン）；炎症および自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、他の炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、急性もしくは慢性の皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）が挙げられるがこれらに限定されない）；急性もしくは慢性の腎疾患もしくは腎不全（特発性もしくは先天性の状態を含む）；急性もしくは慢性の肝臓病；急性もしくは慢性の出血；患者の同種もしくは自己抗体および／または宗教上の理由（例えば、いくつかのエホバの証人（Ｊｅｈｏｖａｈ’ｓ  Ｗｉｔｎｅｓｓ））に起因する赤血球の輸血が可能ではない状況；感染（例えば、マラリアおよび骨髄炎）；異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球病（貧血）、サラセミアを含む）；薬物の使用または乱用（例えば、アルコールの誤用）；輸血を回避するためのあらゆる要因から貧血を有する小児患者；ならびに老齢の患者または循環過負荷に関する問題に起因して輸血を受けることができない貧血とともに基礎心肺疾患を有する患者を含む種々の障害および状態に関連している［例えば、Ａｄａｍｓｏｎ（２００８年）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１７版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６２８〜６３４頁を参照されたい］。
【０３０６】
多くの因子が、がん関連の貧血に寄与し得る。いくつかは、疾患過程自体、および炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン１、インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子の生成に関連する［Ｂｒｏｎら（２００１年）、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８巻（補遺８号）：１〜６頁］。その影響の中で、炎症は重要な鉄調節ペプチドヘプシジンを誘導し、それによってマクロファージからの鉄のエクスポートを阻害し、一般に赤血球生成のための鉄の利用可能性を制限する［例えば、Ｇａｎｚ（２００７年）、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １８巻：３９４〜４００頁を参照のこと］。様々な経路を通しての血液喪失も、がん関連の貧血に寄与することができる。がん進行による貧血の有病率は、前立腺がんでの５％から多発性骨髄腫での９０％まで、がん型によって変動する。がん関連の貧血は、倦怠および生活の質の低下、処置効力の低下および死亡率の増加を含む、重大な結果を患者にもたらす。一部の実施形態において、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用してがん関連の貧血を処置することができた。
【０３０７】
低増殖性貧血は、原発性骨髄機能障害または原発性骨髄不全から生じ得る。低増殖性貧血として、慢性疾患による貧血、腎疾患による貧血、低代謝状態に関連する貧血、およびがんに関連する貧血が挙げられる。これらの種類の各々では、内因性エリスロポエチンレベルは、観察される貧血の程度に対して不適切に低い。他の低増殖性貧血として、初期鉄欠損性貧血、および骨髄への損傷により引き起こされる貧血が挙げられる。これらの種類では、内因性エリスロポエチンレベルは、観察される貧血の程度に対して適切に増加している。顕著な例は、がんおよび／もしくは化学療法薬またはがんの放射線療法により引き起こされる骨髄抑制である。広範にわたる臨床試験の再検討により、軽度の貧血が、化学療法後の患者の１００％で生じ得るのに対し、より重度の貧血は、このような患者の最大８０％で生じ得ることが見出された［例えば、Ｇｒｏｏｐｍａｎら（１９９９年）、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、９１巻：１６１６〜１６３４頁を参照されたい］。骨髄抑制薬には、例えば以下のものが含まれる：１）ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン）およびニトロソウレア（例えば、ストレプトゾシン）などのアルキル化剤；２）葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキセート）、プリン類似体（例えば、チオグアニン）およびピリミジン類似体（例えば、ゲムシタビン）などの代謝拮抗物質；３）アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）などの細胞傷害抗生物質；４）キナーゼインヒビター（例えば、ゲフィチニブ）；５）タキサン（例えば、パクリタキセル）およびビンカアルカロイド（例えば、ビノレルビン）などの分裂抑制剤；６）モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ）；ならびに７）トポイソメラーゼインヒビター（例えば、トポテカンおよびエトポシド）。さらに、低代謝速度をもたらす多くの状態は、軽度から中等度の低増殖性貧血をもたらし得る。内分泌欠乏状態は、そのような状態の１つである。例えば、貧血は、アジソン病、甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、または去勢されたかもしくはエストロゲンで処置された男性で起こることがある。一部の実施形態において、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用して高増殖性貧血を処置することができた。
【０３０８】
慢性腎疾患は、場合によって、低増殖性貧血と関連し、貧血の重症度は、腎機能障害のレベルに応じて変化する。そのような貧血は、主に、エリスロポイエチンの不十分な生成および赤血球の生存の低下による。慢性腎臓疾患は、透析または腎移植が患者生存のために必要とされる末期（５期）疾患まで、数年または数十年にわたって徐々に通常進行する。貧血はしばしばこの過程の初期に発生し、疾患の進行に伴い悪化する。腎臓疾患の貧血の臨床上の結果は十分に記載されており、その例には、左心室肥大の発達、認知機能障害、生活の質の低下、および免疫機能の変化が含まれる［例えば、Ｌｅｖｉｎら（１９９９年）、Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ２７巻：３４７〜３５４頁；Ｎｉｓｓｅｎｓｏｎ（１９９２年）、Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ２０巻（補遺１号）：２１〜２４頁；Ｒｅｖｉｃｋｉら（１９９５年）、Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ２５巻：５４８〜５５４頁；Ｇａｆｔｅｒら（１９９４年）、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ４５巻：２２４〜２３１頁を参照のこと］。一部の実施形態において、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用して急性腎臓疾患もしくは慢性腎臓疾患または急性腎不全もしくは慢性腎不全に関連する貧血を処置することができた。
【０３０９】
外傷または分娩後出血からなど、十分な量の急性失血によって生じる貧血は、急性出血後貧血として公知である。急性失血は、他の血液成分と共に比例的なＲＢＣ枯渇があるので、貧血を伴わない血液量減少を最初に引き起こす。しかし、血液量減少は、血管外から血管区画へ流体を移動させる生理学的機構を急速に引き起こし、血液希釈および貧血をもたらす。慢性であれば、失血により体内に貯蔵されている鉄が徐々に枯渇し、最終的に鉄欠乏症につながる。一部の実施形態において、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用して急性失血によって生じる貧血を処置することができた。
【０３１０】
鉄欠乏性貧血は、中間段階として負の鉄均衡および鉄欠乏赤血球生成を含む、鉄欠乏増加の段階的進行の最終段階である。妊娠、不十分な食事、腸の吸収不良、急性または慢性の炎症および急性または慢性の血液喪失などの状態で例示されるように、鉄欠乏は、鉄要求の増加、鉄摂取の減少または鉄損失の増加から起こることがある。この型の軽度から中等度の貧血では、骨髄は低増殖性のままであり、ＲＢＣ形態はほとんど正常である。しかし、軽度の貧血でさえ、多少の小球性淡色性ＲＢＣを生じることがあり、重度の鉄欠乏貧血への移行には、骨髄の過剰増殖およびますます増加する小球性および淡色性のＲＢＣが付随する［例えば、Ａｄａｍｓｏｎ（２００８年）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１７版；ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６２８〜６３４頁を参照のこと］。鉄欠乏性貧血のための適当な療法は、その原因および重症度によって決まり、経口用鉄製剤、非経口鉄製剤およびＲＢＣ輸血が主要な従来の選択肢である。一部の実施形態において、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、使用して慢性鉄欠乏を処置することができた。
【０３１１】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）とは、骨髄性血球生成の無効および急性骨髄性白血病への転換の危険性を特徴とする血液学的状態の多様な集合である。ＭＤＳ患者では、血液幹細胞が、健常な赤血球、白血球、または血小板に成熟しない。ＭＤＳ障害として、例えば、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰な芽球を有する不応性貧血、変形した過剰な芽球を有する不応性貧血、多系列異形成を有する不応性血球減少症、および孤発性５ｑ染色体異常と関連する骨髄異形成症候群を含む。これらの障害は、造血細胞の量および質の両方における不可逆性の欠失として顕在化するので、ＭＤＳ患者の大半は慢性貧血に罹患している。したがって、ＭＤＳ患者は、赤血球レベルを高めるための、輸血および／または増殖因子（例えば、エリスロポエチンまたはＧ−ＣＳＦ）による処置を最終的に必要とする。しかし、多くのＭＤＳ患者は、このような治療の頻度に起因する副作用を発症する。例えば、高頻度の赤血球輸血を施される患者は、余剰鉄の蓄積に由来する組織損傷および臓器損傷を呈し得る。したがって、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を使用して、ＭＤＳを有する患者を処置することができる。ある特定の実施形態では、ＭＤＳを患う患者は、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して処置することができる。他の実施形態では、ＭＤＳを患う患者は、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体と、ＭＤＳを処置するための１つまたは複数の追加の治療剤であって、例えば、サリドマイド、レナリドミド、アザシチジン（ａｚａｃｉｔａｄｉｎｅ）、デシタビン、エリスロポエチン、デフェロキサミン、抗胸腺細胞グロブリン、およびフィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｒｉｍ）（Ｇ−ＣＳＦ）を含む治療剤との組み合わせを使用して処置することができる。
【０３１２】
鉄動態研究に基づき、再生不良性貧血、出血、または末梢溶血とは元来識別される［例えば、Ｒｉｃｋｅｔｔｓら（１９７８年）、Ｃｌｉｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ、３巻：１５９〜１６４頁を参照されたい］無効赤血球生成は、成熟ＲＢＣの生成が、骨髄中に存在する赤芽球系前駆体（赤芽球）の数が与えられたときに予測されるより少ない、多様な貧血群を説明している［Ｔａｎｎｏら（２０１０年）、Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１０巻：３５８２８３頁］。このような貧血では、エリスロポエチンレベルの上昇にもかかわらず、成熟ＲＢＣ生成の無効に起因して、組織低酸素症が遷延する。最終的には、エリスロポエチンレベルの上昇が赤芽球の大規模な増殖を駆動する悪循環が発生し、これは、髄外赤血球生成に起因する脾腫（脾臓の腫大）［例えば、Ａｉｚａｗａら（２００３年）、Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ、７４巻：６８〜７２頁を参照されたい］、赤芽球誘導性骨病態［例えば、Ｄｉ  Ｍａｔｔｅｏら（２００８年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ、２２巻：２１１〜２１６頁を参照されたい］を潜在的にもたらし、治療的ＲＢＣ輸血の非存在下においてもなお、組織鉄過負荷［例えば、Ｐｉｐｐａｒｄら（１９７９年）、Ｌａｎｃｅｔ、２巻：８１９〜８２１頁を参照されたい］を潜在的にもたらす。したがって、赤血球生成の有効性を促進することにより、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、前述の悪循環を打破し、したがって、根底にある貧血だけでなく、エリスロポエチンレベルの上昇、脾腫、骨病態、および組織鉄過負荷といった関連する合併症も緩和することができる。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を使用して、貧血およびＥＰＯレベルの上昇のほか、脾腫、赤芽球誘導性骨病態、鉄過負荷、およびそれらの付随する病態などの合併症を含む、無効赤血球生成を処置または予防することができる。脾腫に関して、このような病態は、胸痛または腹痛および網内系過形成を含む。髄外造血は、脾臓内だけでなく、潜在的には他の組織内でも、髄外造血性偽腫瘍の形態で生じる場合がある［例えば、Ｍｕｓａｌｌａｍら（２０１２年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ、２巻：ａ０１３４８２頁を参照されたい］。赤芽球誘導性骨病態に関して、付随する病態は、低骨塩密度、骨粗鬆症、および骨疼痛を含む［例えば、Ｈａｉｄａｒら（２０１１年）、Ｂｏｎｅ、４８巻：４２５〜４３２頁を参照されたい］。鉄過負荷に関して、付随する病態は、ヘプシジン抑制および食餌中の鉄の過剰吸収［例えば、Ｍｕｓａｌｌａｍら（２０１２年）、Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ、２６巻（補遺１号）：Ｓ１６〜Ｓ１９頁を参照されたい］、複数の内分泌障害および肝線維症／肝硬変［例えば、Ｇａｌａｎｅｌｌｏら（２０１０年）、Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ、５巻：１１頁を参照されたい］、ならびに鉄過剰性心筋症［Ｌｅｋａｗａｎｖｉｊｉｔら、２００９年、Ｃａｎ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２５巻：２１３〜２１８頁］を含む。
【０３１３】
無効赤血球生成の最も一般的な原因は、完全アルファヘモグロビン鎖の生成と完全ベータヘモグロビン鎖の生成との不均衡が赤芽球の成熟時におけるアポトーシスの増大をもたらす遺伝性異常ヘモグロビン症である、サラセミア症候群である［例えば、Ｓｃｈｒｉｅｒ  （２００２年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、９巻：１２３〜１２６頁を参照されたい］。サラセミアは総体として、世界中で最も高頻度の遺伝子障害であり、疫学的パターンを変化させながら、米国および全世界のいずれにおいても増大しつつある公衆衛生問題に寄与することが予測されている［Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙ（２００５年）、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１０５４巻：１８〜２４頁］。サラセミア症候群は、それらの重症度に応じて命名される。したがって、αサラセミアは、軽症型αサラセミア（αサラセミア形質としてもまた公知であり、２つのα−グロビン遺伝子が影響を受ける）、ヘモグロビンＨ症（３つのα−グロビン遺伝子が影響を受ける）、および重症型αサラセミア（胎児水腫としてもまた公知であり、４つのα−グロビン遺伝子が影響を受ける）を含む。βサラセミアは、軽症型βサラセミア（βサラセミア形質としてもまた公知であり、１つのβ−グロビン遺伝子が影響を受ける）、中間型βサラセミア（２つのβ−グロビン遺伝子が影響を受ける）、ヘモグロビンＥサラセミア（２つのβ−グロビン遺伝子が影響を受ける）、および重症型βサラセミア（クーリー貧血としてもまた公知であり、２つのβ−グロビン遺伝子が影響を受ける結果として、β−グロビンタンパク質の完全な非存在がもたらされる）を含む。βサラセミアは、複数の機関に影響を及ぼし、無視できない罹患率および死亡率と関連し、現在のところ一生にわたるケアを必要とする。近年では、鉄のキレート化と組み合わせた定期的な輸血の使用に起因して、βサラセミアを有する患者の平均余命が延長されているが、輸血および消化管による鉄の吸収過剰の両方から生じる鉄過負荷は、心疾患、血栓症、性腺機能低下症、甲状腺機能低下症、糖尿病、骨粗鬆症、および骨減少症など、重篤な合併症を引き起こし得る［例えば、Ｒｕｎｄら（２００５年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５３巻：１１３５〜１１４６頁を参照されたい］。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して、サラセミア症候群を処置または予防することができる。
【０３１４】
一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、サラセミア症候群に加えて、無効赤血球生成による障害を処置するために使用することができる。このような障害は、鉄芽球性貧血（ｓｉｄｅｒｂｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ）（遺伝性または後天性）；赤血球生成異常性貧血（Ｉ型およびＩＩ型）；鎌状赤血球貧血；遺伝性球状赤血球症；ピルビン酸キナーゼ欠損症；葉酸欠損症（先天性疾患、摂取の減少、または要求量の増加に起因する）、コバラミン欠損症（先天性疾患、悪性貧血、吸収障害、膵臓機能不全、または摂取の減少に起因する）、ある特定の薬物、または説明されていない原因（先天性赤血球生成異常性貧血、不応性巨赤芽球性貧血、または赤白血病）などの状態により潜在的に引き起こされる巨赤芽球性貧血；例えば、骨髄線維症（骨髄化生）および骨髄ろうを含む骨髄ろう性貧血；先天性赤芽球性ポルフィリン症；ならびに鉛中毒を含む。
【０３１５】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、無効赤血球生成のための支持療法と組み合わせて使用することができる。このような療法は、貧血を処置するための、赤血球または全血液による輸血を含む。慢性貧血または遺伝性貧血では、鉄ホメオスタシスのための正常な機構が輸血の反復で圧倒され、最終的には、心臓、肝臓、および内分泌腺などの主要組織において、毒性であり、潜在的に致死性である鉄の蓄積がもたらされる。したがって、無効赤血球生成に慢性的に罹患する患者のための支持療法はまた、尿および／または糞便への鉄の排出を促進し、これにより、組織鉄過負荷を予防するかまたは転導する、１つまたは複数の鉄キレート化分子による処置も含む［例えば、Ｈｅｒｓｈｋｏ（２００６年）、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、９１巻：１３０７〜１３１２頁；Ｃａｏら（２０１１年）、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｐ、３巻（２号）：ｅ１７頁を参照されたい］。有効な鉄キレート化剤は、触媒による、ヒドロキシルラジカルおよび酸化生成物の生成を介して、大半の鉄毒性の主因となる可能性が高い、非トランスフェリン結合鉄の酸化形態である第二鉄に選択的に結合し、これを中和することが可能であるべきである［例えば、Ｅｓｐｏｓｉｔｏら（２００３年）、Ｂｌｏｏｄ、１０２巻：２６７０〜２６７７頁を参照されたい］。これらの作用因子は構造的に多様であるが、全てが、八面体の中和配位錯体を形成することが可能な酸素供与体原子または窒素供与体原子を保有し、個々の鉄原子は１：１（六座キレート化剤）、２：１（三座）、または３：１（二座）の当量比である［Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉら（２００５年）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ、５７巻：５４７〜５８３頁］。一般に、効果的な鉄キレート化剤はまた、比較的低分子量（例えば、７００ダルトン未満）であり、水中および脂質中のいずれにおいても、罹患組織への接触を可能とする可溶性を有する。鉄キレート化分子の具体例は、毎日の非経口投与を必要とする、細菌起源の六座キレート化剤であるデフェロキサミン、ならびに経口活性合成剤であるデフェリプロン（二座）およびデフェラシロクス（三座）を含む。２つの鉄キレート化剤の同日投与からなる組合せ療法は、キレート化単剤療法に対して不応性の患者において有望であり、また、デフェロキサミン（ｄｅｒｅｒｏｘａｍｉｎｅ）単剤に対する患者の服薬遵守不良の問題の克服においても有望である［Ｃａｏら（２０１１年）、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｐ、３巻（２号）：ｅ１７頁；Ｇａｌａｎｅｌｌｏら（２０１０年）、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１２０２巻：７９〜８６頁］。
【０３１６】
本明細書で使用する場合、「〜と組み合わせて」または「併用投与」とは、追加的治療（例えば、第２、第３、第４など）が、体内でなおも効果的である（例えば、複数の化合物は、患者において同時に効果的であり、これは、これらの化合物の相乗効果を含み得る）ような、任意の投与形態を指す。有効性は、血中、血清中、または血漿中の作用因子の測定可能な濃度と相関しない場合もある。例えば、異なる治療用化合物は、同じ製剤において投与することもでき、別個の製剤において、共時的または逐次的に投与することもでき、異なるスケジュールで投与することもできる。したがって、このような処置を施される個体は、異なる治療の組み合わせ効果から利益を得ることができる。本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、１つまたは複数の他の追加の作用因子または支持療法と共時的に、これらの前に、またはこれらの後に投与され得る。一般に、各治療剤は、その特定の作用因子について決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。レジメンにおいて利用する特定の組み合わせは、本開示のアンタゴニストの、治療および／または達成される所望の治療効果に対する適合性を考慮に入れる。
【０３１７】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、無効赤血球生成のために、ヘプシジンまたはヘプシジンアゴニストと組み合わせて使用することができる。主に肝臓で生成される循環ポリペプチドであるヘプシジンは、吸収腸細胞、肝細胞、およびマクロファージに局在化する鉄排出タンパク質であるフェロポーチンの分解を誘導するその能力のために、鉄代謝の主要な調節因子であると考えられている。大まかに述べると、ヘプシジンは、細胞外における鉄の利用可能性を低減するので、ヘプシジンアゴニストは、無効赤血球生成の処置において有益であり得る［例えば、Ｎｅｍｅｔｈ（２０１０年）、Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１０巻：７５０６４３頁を参照されたい］。この視点は、βサラセミアのマウスモデルにおけるヘプシジン発現増大の有益な効果により裏付けられている［Ｇａｒｄｅｎｇｈｉら（２０１０年）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１２０巻：４４６６〜４４７７頁］。
【０３１８】
本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体はまた、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、小型（小球性）、特大（大赤血球性）、奇形または異常な色（淡色性）のＲＢＣを部分的に特徴とする、無秩序なＲＢＣ成熟の貧血の処置にも適当である。
【０３１９】
ある特定の実施形態では、本開示は、貧血を処置または予防することを必要とする個体において、個体に、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体、ならびにＥＰＯ受容体活性化因子の治療有効量を投与することにより、貧血を処置または予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して、ＥＰＯの有害作用に感受性である患者において、これらの活性化因子の必要とされる用量を低減することができる。これらの方法は、患者の治療処理および予防処置のために使用することができる。
【０３２０】
本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して、特により低用量範囲のＥＰＯ受容体活性化因子で、赤血球の増加を達成することができる。これは、高用量のＥＰＯ受容体活性化因子と関連する、公知のオフターゲット効果および危険性を低減するのに有益であり得る。ＥＰＯの主要な有害作用は、例えば、ヘマトクリットレベルまたはヘモグロビンレベルの過剰な上昇および多血症を含む。ヘマトクリットレベルの上昇は、高血圧症（より特定すれば、高血圧症の悪化）および血管内血栓症をもたらし得る。報告されている他のＥＰＯの有害作用であって、それらの一部が高血圧症と関連する有害作用は、頭痛、インフルエンザ様症候群、シャントの閉塞、心筋梗塞、および血栓症に起因する脳痙攣、高血圧性脳症、および赤血球無形成である。例えば、Ｓｉｎｇｉｂａｒｔｉ（１９９４年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、７２巻（補遺６号）：Ｓ３６〜Ｓ４３頁；Ｈｏｒｌら（２０００年）、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１５巻（補遺４号）：５１〜５６頁；Ｄｅｌａｎｔｙら（１９９７年）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４９巻、６８６〜６８９頁；およびＢｕｎｎ（２００２年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３４６巻（７号）、５２２〜５２３頁を参照されたい。
【０３２１】
本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体が、ＥＰＯとは異なる機構で作用するという条件で、これらのアンタゴニストは、ＥＰＯに十分に応答しない患者における赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルを高めるために有用であり得る。例えば、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、通常用量〜増量用量（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週）のＥＰＯの投与が標的レベルまでのヘモグロビンレベルの増加をもたらさない患者に有益であり得る。不適切なＥＰＯ応答を有する患者は、全てのタイプの貧血において見られるが、より多い数の不応者が、がんを有する患者および末期の腎疾患を有する患者において特に頻繁に観察されている。ＥＰＯに対する不適切な応答は、構成的（ＥＰＯでの最初の処置の際に観察される）、または後天的（ＥＰＯでの反復処置の際に観察される）のいずれかであり得る。
【０３２２】
特定の実施形態では、本開示は、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いて処置されているか、または処置される候補の患者を、その患者における１つまたは複数の血液学的パラメータを測定することによって管理するための方法を提供する。血液学的パラメータは、本開示のアンタゴニストを用いた処置の候補である患者に対する適切な投薬を評価するため、処置中に血液学的パラメータをモニタリングするため、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置中に投薬量を調節するかどうかを評価するため、および／または本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの適切な維持用量を評価するために使用され得る。１つまたは複数の血液学的パラメータが正常レベルの外側である場合、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いた投薬は減少、延期または終了され得る。
【０３２３】
本明細書中で提供される方法に従って測定され得る血液学的パラメータとしては、例えば、赤血球レベル、血圧、貯蔵鉄、および、当該分野で認識されている方法を使用する、赤血球レベルの増加と相関する体液中に見出される他の作用因子が挙げられる。そのようなパラメータは、患者からの血液試料を使用して決定され得る。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルの増加により、血圧の上昇が引き起こされ得る。
【０３２４】
一実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いて処置される候補である患者において、１つまたは複数の血液学的パラメータが正常範囲の外側、または正常の高値側である場合、そのときは、血液学的パラメータが自然にまたは治療介入によってのいずれかで正常または許容されるレベルに戻るまで、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の投与の開始が延期され得る。例えば、候補の患者が高血圧または前高血圧である場合、そのときは、患者は、患者の血圧を低下させるために血圧降下剤を用いて処置され得る。個々の患者の状態に適した任意の血圧降下剤が使用され得、例えば、利尿薬、アドレナリンインヒビター（アルファ遮断薬およびベータ遮断薬を含む）、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬が挙げられる。血圧は、食事および運動レジメンを使用して代替的に処置され得る。同様に、候補の患者が正常よりも低いか、または正常の低値側の貯蔵鉄を有する場合、そのときは、患者は、患者の貯蔵鉄が正常または許容されるレベルに戻るまで、適切な食事および／または鉄サプリメントのレジメンを用いて処置され得る。正常よりも高い赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを有する患者に対して、そのときは、そのレベルが正常または許容されるレベルに戻るまで本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の投与が延期され得る。
【０３２５】
特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いて処置される候補である患者において、１つまたは複数の血液学的パラメータが正常範囲の外側、または正常の高値側である場合、そのときは、投与の開始が延期されないことがある。しかし、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の投薬量または投薬の頻度は、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体が投与されると上昇する血液学的パラメータの許容されない増加リスクを低下させる量に設定され得る。あるいは、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体と、望ましくないレベルの血液学的パラメータに対処する治療剤を組み合わせた治療レジメンが患者のために開発され得る。例えば、患者の血圧が上昇している場合、治療レジメンは、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体および血圧降下剤の投与を含めて設計され得る。所望より低い貯蔵鉄を有する患者について、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体および鉄の補給の治療レジメンが開発され得る。
【０３２６】
一実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメータについてのベースラインパラメータは、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いて処置される候補である患者に対して確立され得、適切な投薬レジメンが、ベースライン値に基づいて患者に対して確立される。あるいは、患者の病歴に基づいて確立されたベースラインパラメータが、患者に対して適切な投薬レジメンを通知するために使用され得る。例えば、健康な患者が、規定の正常範囲を超える確立された血圧のベースライン数値を有する場合、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーヘテロ多量体複合体を用いた処置の前に、その患者の血圧を一般集団について正常だとみなされる範囲に至らせる必要がないことがあり得る。患者の、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いた処置前の１つまたは複数の血液学的パラメータのベースライン値は、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いた処置中の、血液学的パラメータの任意の変化をモニタリングするための関連性のある比較値としても使用され得る。
【０３２７】
特定の実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメータは、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いて処置されている患者において測定される。血液学的パラメータは、処置中の患者をモニタリングし、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いた投薬または別の治療剤を用いた追加の投薬の調節または終了を可能にするために使用され得る。例えば、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の投与によって血圧、赤血球レベル、またはヘモグロビンレベルが上昇したか、または貯蔵鉄が減少した場合、そのときは、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の用量は、１つまたは複数の血液学的パラメータに対する本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の作用を減少させるために、その量または頻度が減少され得る。本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の投与によって、患者にとって不都合な１つまたは複数の血液学的パラメータの変化が生じた場合、そのときは、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の投薬は、一時的に、血液学的パラメータが許容されるレベルに戻るまでか、または永久に、のいずれかで終了され得る。同様に、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の投与の用量または頻度を減らした後、１つまたは複数の血液学的パラメータが許容される範囲内に至らない場合、そのときは、投薬は終了され得る。本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いた投薬を減らすかまたは終了する代わりに、またはそれに加えて、患者は、血液学的パラメータの望ましくないレベルに対処する追加の治療剤、例えば、血圧降下剤または鉄のサプリメントなどが投薬され得る。例えば、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いて処置されている患者の血圧が上昇している場合、そのときは、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いた投薬は同じレベルで継続され得、および処置レジメンに血圧降下剤が追加されるか、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いた投薬は減らされ得（例えば、量および／または頻度について）、および処置レジメンに血液降下剤が追加されるか、または、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を用いた投薬は終了され得、および患者は血圧降下剤を用いて処置され得る。
【０３２８】
６．薬学的組成物
ある特定の態様では、本開示のＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体は、単独で投与することもでき、医薬製剤（治療用組成物または薬学的組成物とも称される）の成分として投与することもできる。医薬製剤とは、その中に含有される活性成分（例えば、本開示の作用因子）の生物活性が効果的であることを可能とするような形態にあり、製剤が投与される対象に対して許容不可能に毒性である、さらなる成分を含有しない調製物を指す。本主題の化合物は、ヒト医療または獣医療における使用のために好都合な任意の方式における投与のために製剤化され得る。例えば、本開示の１つまたは複数の作用因子は、薬学的に許容されるキャリアと共に製剤化することができる。薬学的に許容されるキャリアとは、医薬製剤中の、活性成分以外の成分であって、対象に対して一般に非毒性である成分を指す。薬学的に許容されるキャリアは、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、および／または保存剤を含むがこれらに限定されない。一般に、本開示における使用のための医薬製剤は、対象に投与されるとき、発熱物質非含有であり、生理学的に許容される形態にある。本明細書に記載のもの以外の治療的に有用な作用因子であって、任意選択で、上記の製剤中に含まれ得る作用因子を、本開示の方法における主題の作用因子と組み合わせて投与することができる。  
【０３２９】
ある特定の実施形態では、組成物は、非経口投与される［例えば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、動脈内注射、骨内注射、筋内注射、髄腔内注射、皮下注射、または皮内注射により］。非経口投与に適する薬学的組成物は、本開示の１つまたは複数の作用因子を、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌かつ等張の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液、もしくはエマルジョン、または使用直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散液へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含み得る。注射可能な溶液または分散液は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、または製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。本開示の医薬製剤において利用され得る、適切な水性および非水性のキャリアの例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、植物油（例えば、オリーブ油）、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、およびこれらの適切な混合物を含む。適正な流動性は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および、界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０３３０】
一部の実施形態では、本開示の治療法は、インプラントもしくはデバイスから薬学的組成物を全身投与または局所投与する工程を包含する。さらに、薬学的組成物は、カプセル化され得、または、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）へと送達するための形態で注射され得る。特定の実施形態では、本開示の組成物は、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）に本開示の１つまたは複数の作用因子を送達し得、成長中の組織のための構造を提供し得、そして、最適には身体内へと再吸収され得るマトリクスを含み得る。例えば、マトリクスは、本開示の１つまたは複数の作用因子の遅速放出を提供し得る。このようなマトリクスは、他の移植医療用途に現在使用される材料から形成され得る。
【０３３１】
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、見かけ上の様相および界面の特性のうちの１つまたは複数に基づいてもよい。本主題の組成物の特定の用途が、適切な製剤を画定する。組成物のための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ化学的に画定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、生分解性でかつ生物学的に十分に画定されたもの（例えば、骨または皮膚のコラーゲンが挙げられる）である。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクスの成分から構成される。他の可能性のあるマトリクスは、非生分解性でかつ化学的に規定されたもの（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩、または他のセラミクスが挙げられる）である。マトリクスは、上述のタイプの材料のいずれかの組み合わせ（例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンおよびリン酸三カルシウム）を含み得る。バイオセラミクスは、組成物（例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸）中で変化され得、孔径、粒子径、粒子の形状および生分解性のうちの１つまたは複数を変更するように加工され得る。
【０３３２】
ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、局所投与することができる。「局所適用」または「局所」とは、医薬組成物の体表面（例えば、皮膚、創傷部位、および粘膜）との接触を意味する。局所用医薬組成物は、多様な適用形態を有することが可能であり、典型的には、組成物の局所投与時に組織に近接または直接接触して配置されるように適応される薬物含有層を含む。局所投与に適する医薬組成物は、本開示の、液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、フォーム、ペースト、パテ、半固形、または固形として組み合わせて製剤化されたＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体を含み得る。液体形態、ゲル形態、クリーム形態、ローション形態、軟膏形態、フォーム形態、ペースト形態、またはパテ形態の組成物は、組成物を、標的組織上に塗り伸ばすか、スプレーするか、スミアリングするか、ダビングするか、またはローリングすることにより適用することができる。組成物はまた、滅菌包帯、経皮パッチ、プラスター、およびバンデージへと含浸させることもできる。パテ形態、半固形形態または固形形態の組成物は、可塑性であり得る。それらは、伸縮性または非伸縮性（例えば、可撓性または剛性）であり得る。ある特定の態様では、組成物は、複合物の一部を形成し、組成が同じであるか、または異なる繊維、微粒子、または多重層を含み得る。
【０３３３】
液体形態の局所用組成物は、薬学的に許容される溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、および懸濁液を含み得る。有効成分に加えて、液体剤形は、当該分野において一般に使用される不活性の希釈剤であって、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および／もしくは乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、または１，３−ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含む希釈剤を含有し得る。
【０３３４】
局所用のゲル、クリーム、ローション、軟膏、半固形または固形組成物は、多糖、合成ポリマーまたはタンパク質ベースのポリマーなどの１つまたは複数の増粘剤を含み得る。本発明の一実施形態では、本明細書のゲル化剤は、適切に非毒性であり、所望の粘性をもたらすゲル化剤である。増粘剤として、ビニルピロリドン、メタクリルアミド、アクリルアミドＮ−ビニルイミダゾール、カルボキシビニル、ビニルエステル、ビニルエーテル、シリコーン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ビニルアルコール、アクリル酸ナトリウム、アクリレート、マレイン酸、ＮＮ−ジメチルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、アクリルアミド、アクリロイルモルホリン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、コラーゲン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニレン、ポリビニルシリケート、糖（例えば、スクロース、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、トレハロース、マンノース、またはラクトース）で置換されたポリアクリレート、アシルアミドプロパンスルホン酸、テトラメトキシオルトシリケート、メチルトリメトキシオルトシリケート、テトラアルコキシオルトシリケート、トリアルコキシオルトシリケート、グリコール、プロピレングリコール、グリセリン、多糖、アルギネート、デキストラン、シクロデキストリン、セルロース、修飾セルロース、酸化セルロース、キトサン、キチン、グアーガム、カラギーナン、ヒアルロン酸、イヌリン、デンプン、修飾デンプン、アガロース、メチルセルロース、植物ガム、ヒアルロナン（ｈｙｌａｒｏｎａｎｓ）、ハイドロゲル、ゼラチン、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ペクチン、低メトキシペクチン、架橋デキストラン、デンプン−アクリロニトリルグラフトコポリマー、ポリアクリル酸ナトリウムデンプン、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニレン、ポリエチルビニルエーテル、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアルカノエート、ポリ乳酸、ポリラクテート、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、スルホン化ハイドロゲル、ＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ＳＥＭ（スルホエチルメタクリレート）、ＳＰＭ（スルホプロピルメタクリレート）、ＳＰＡ（スルホプロピルアクリレート）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリロキシエチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン、メタクリル酸アミドプロピル−ジメチルアンモニウムスルホベタイン、ＳＰＩ（イタコン酸−ビス（１−プロピルスルホン酸（ｓｕｌｆｏｎｉｚａｃｉｄ）−３）エステル二カリウム塩）、イタコン酸、ＡＭＢＣ（３−アクリルアミド−３−メチルブタン酸）、ベータ−カルボキシエチルアクリレート（アクリル酸二量体）、およびマレイン酸無水物−メチルビニルエーテルポリマー、これらの誘導体、これらの塩、これらの酸、ならびにこれらの組合せによる、ポリマー、コポリマー、および単量体が挙げられ得る。ある特定の実施形態では、本開示の薬学的組成物は、例えば、カプセル、カシェ、丸剤、錠剤、ロゼンジ（スクロースおよびアカシアまたはトラガントなどの矯味矯臭基材を使用する）、散剤、顆粒剤、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油もしくは油中水の液体エマルジョン、またはエリキシルもしくはシロップ、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基材を使用する）、かつ／またはマウスウォッシュの形態で経口投与することもでき、各々が、所定量の、本開示の化合物と、任意選択で、１つまたは複数の他の活性成分とを含有する。本開示の化合物と、任意選択で、１つまたは複数の他の活性成分とはまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとしても投与することができる。
【０３３５】
経口投与のための固体投薬形態（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤および顆粒剤）において、本開示の１または複数の化合物は、１または複数の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア）、湿潤剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、アガー−アガー、炭酸カルシウム、ポテトもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶液抑制因子（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、パラフィン）、吸収加速剤（例えば、四級アンモニウム化合物）、加湿剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）、潤滑剤（例えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤およびこれらの混合物を含む）と共に混合され得る。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、医薬製剤（組成物）はまた、緩衝剤も含み得る。また、同様の種類の固形組成物も、例えば、ラクトースまたは乳糖のほか、高分子量ポリエチレングリコールを含む、１つまたは複数の賦形剤を使用して、軟充填ゼラチンカプセル中および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することができる。
【０３３６】
薬学的組成物の経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加え、液体投薬形態は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒が挙げられる）、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含み得る。不活性な希釈剤に加え、経口用組成物はまた、例えば、加湿剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤、保存剤およびこれらの組み合わせを含む佐剤を含み得る。
【０３３７】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー−アガー、トラガント、およびこれらの組み合わせを含む懸濁剤を含有し得る。
【０３３８】
微生物の作用および／または増殖の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびソルビン酸フェノールを含む、種々の抗細菌剤および抗真菌剤を組み入れることにより確保することができる。
【０３３９】
ある特定の実施形態では、例えば、糖、または塩化ナトリウムを含む等張化剤を組成物中に組み入れることも望ましいと考えられる。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の遅延も、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む、吸収を遅延させる作用因子を組み入れることにより、もたらすことができる。
【０３４０】
投薬レジメンは、本開示の１つまたは複数の作用因子の作用を修飾する種々の要因を考慮して主治医によって決定されることが理解される。赤血球の形成を促進するＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体シングルアームヘテロ多量体複合体の場合では、種々の要因として、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、所望の標的赤血球数、患者の年齢、患者の性別、および患者の食餌、赤血球レベルの低下に寄与し得る任意の疾患の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因が挙げられ得るがこれらに限定されない。他の公知の活性の作用因子の、最終組成物への添加もまた、投与量に影響を及ぼし得る。進行は、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、網状赤血球レベル、および造血プロセスの他の指標のうちの１つまたは複数の定期的な評価によりモニタリングすることができる。
【０３４１】
特定の実施形態では、本開示はまた、本開示の１つまたは複数の作用因子のインビボ産生のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、上に列挙したような障害のうち１つまたは複数を有する細胞または組織中に作用因子配列を導入することによってその治療作用を達成する。作用因子配列の送達は、例えば、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いることによって達成され得る。本開示の１つまたは複数の作用因子配列の好ましい治療的送達は、標的化されたリポソームの使用である。
【０３４２】
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、ＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数のさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移送または組み込み得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、本開示の１つまたは複数の作用因子を含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム中に挿入され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。
【０３４３】
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、レトロウイルスの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【０３４４】
本開示の１つまたは複数の作用因子のための別の標的化送達システムは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。特定の実施形態において、本開示の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用な人工の膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に封入され得、そして、生物学的に活性な形態で細胞へと送達され得る。例えば、Ｆｒａｌｅｙら（１９８１年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、６巻：７７頁を参照。リポソームビヒクルを用いた効率的な遺伝子移入のための方法は当該分野で公知である。例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８を参照。
【０３４５】
リポソームの組成は通常、リン脂質の組み合わせであり、ステロイド（例えば、コレステロール）を含み得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。また、他のリン脂質または他の脂質であって、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシド）、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含むリン脂質または脂質も使用することができる。例えば、器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づいたリポソームの標的化もまた可能であり、当該分野で公知である。
【実施例】
【０３４６】
本発明は、ここで、一般的に記載されるが、単に特定の実施形態および本発明の実施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照するとより容易に理解される。
実施例１．シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の生成および特徴付け
【０３４７】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ異種複合体であって、ヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインが、リンカーが細胞外ドメインと別個のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインに融合された複合体を構築した。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。
【０３４８】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃホモ二量体の複合体よりむしろＡｃｔＲＩＩＢ：Ｆｃ異種複合体の形成を促進するための方法は、非対称異種複合体の形成を誘導するためにＦｃドメインのアミノ酸配列に変更を導入する。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用ペアを作製するための多くの異なるアプローチが、本開示において記載される。
【０３４９】
１つのアプローチでは、それぞれ配列番号１０４〜１０６および１３７〜１３９のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドは、それぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー：
ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号１００）
を利用する。
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１０４）は以下に示される：
【化１０６】
2018517664.tif 000119
【０３５０】
リーダー（シグナル）配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃ）のいずれかよりむしろＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリジンで置き換える）が、上の二重下線で示されるようにＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のＦｃドメインに導入され得る。配列番号１０４のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端リジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは以下の核酸配列（配列番号１０５）にコードされる：
【化１０７】
2018517664.tif 000120
【０３５１】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１０６）は、以下の通りであり、任意選択で、リジン（Ｋ）がＣ末端に付加されて提供されてもよい。
【化１０８】
2018517664.tif 000121
相補的ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１３７）は、ＴＰＡリーダーを利用し、以下の通りである：
【化１０９】
2018517664.tif 000122
【０３５２】
リーダー配列に下線を付し、Ｆｃポリペプチドの任意選択のＮ末端伸長は、二重下線によって示される。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性残基で置き換える）が、上の二重下線で示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号１３７のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０３５３】
この相補的Ｆｃポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１３８）にコードされる。
【化１１０】
2018517664.tif 000123
【０３５４】
成熟単量体Ｆｃポリペプチドの配列は、以下の通りであり（配列番号１３９）、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１１１】
2018517664.tif 000124
【０３５５】
それぞれ、配列番号１０６および配列番号１３９のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０３５６】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進する別のアプローチでは、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４０３−４０４および４２５−４２６のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合、を導入するように変更されている。
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４０３）は、ＴＰＡリーダーを利用し、以下に示される：
【化１１２】
2018517664.tif 000125
【０３５７】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合タンパク質のＦｃドメインに導入され得る。アミノ酸配列ｏｆ配列番号４０３は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは以下の通りである：
【化１１３】
2018517664.tif 000126
【０３５８】
単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号４２５）の相補的形態はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである。
【化１１４】
2018517664.tif 000127
【０３５９】
リーダー配列に下線を付し、Ｆｃポリペプチドの任意選択のＮ末端伸長は、二重下線によって示される。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、上の二重下線で示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２５のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０３６０】
成熟単量体Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４２６）は、以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１１５】
2018517664.tif 000128
【０３６１】
それぞれ、配列番号４０４および配列番号４２６のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０３６２】
種々のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
【０３６３】
ＢｉａｃｏｒｅTMベースの結合アッセイを使用して、上で記載したシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体の複合体のリガンド結合選択性と比較した。シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃおよびホモ二量体のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、独立に、抗Ｆｃ抗体を使用してシステムに捕捉させた。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。結果を以下の表にまとめ、ここで、典型的には最も有効なリガンドトラップと関連するリガンドのオフ速度（ｋｄ）を、グレーの影で表示する。
【表１−１】
2018517664.tif 000129
【表１−２】
2018517664.tif 000130
【０３６４】
これらの比較結合データは、シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、ホモ二量体のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃより優れたリガンド選択性を有することを実証するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体は５つの重要なリガンド（図６のアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のクラスターを参照のこと）に強く結合するが、シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃはこれらのリガンド間をよりたやすく識別する。したがって、シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１に強く結合し、ＧＤＦ８およびアクチビンＡに中程度の強度で結合する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体とさらに対照的に、シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、ＢＭＰ１０には弱い結合を提示するに過ぎず、ＢＭＰ９には結合しない。図６を参照のこと。
【０３６５】
したがって、これらの結果は、シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体より選択的なアンタゴニストであることを実証する。したがって、シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、そのような選択的アンタゴニズムが有利であるある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体より有用である。例として、１つまたは複数のアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のアンタゴニズムを保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、およびＧＤＦ３の１つまたは複数のアンタゴニズムは最小化することが所望される治療適用が挙げられる。前者の群のリガンドの選択的阻害は、後者の群およびその関連する臨床状態のセットと機能的に異なる傾向があるサブファミリーを構成するため、治療上特に有利である。
実施例２．シングルアームＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の生成および特徴付け
【０３６６】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＡＬＫ３の細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の複合体を構築した。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。
【０３６７】
シングルアームＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１２２−１２４および１４０−１４２のＡＬＫ３−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１１６】
2018517664.tif 000131
【０３６８】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ３−ＦｃまたはＦｃ：ＦｃのいずれかよりむしろＡＬＫ３−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性アミノ酸で置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合タンパク質のＦｃドメインに導入され得る。配列番号１２２のアミノ酸配列は、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【０３６９】
このＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１２３）にコードされる。
【化１１７−１】
2018517664.tif 000132
【化１１７−２】
2018517664.tif 000133
【０３７０】
成熟ＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１２４）、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【化１１８−１】
2018517664.tif 000134
相補的ヒトG1Fcポリペプチド（配列番号１４０）はTPAリーダーを利用し、以下の通りである：
【化１１８−２】
2018517664.tif 000135
【０３７１】
リーダー配列に下線を付し、Ｆｃポリペプチドの任意選択のＮ末端伸長は、二重下線によって示される。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ３−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、上の二重下線で示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号１４０のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０３７２】
この相補的Ｆｃポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１４１）にコードされる。
【化１１９】
2018517664.tif 000136
【０３７３】
成熟単量体Ｆｃポリペプチドの配列は、以下の通りであり（配列番号１４２）、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１２０】
2018517664.tif 000137
【０３７４】
それぞれ、配列番号１２４および配列番号１４２のＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ３−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０３７５】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４１５〜４１６および４２７〜４２８のＡＬＫ３−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１５）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１２１】
2018517664.tif 000138
【０３７６】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ３−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ３融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４１５のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０３７７】
成熟ＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１６）は、以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１２２】
2018517664.tif 000139
単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２７）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１２３】
2018517664.tif 000140
【０３７８】
リーダー配列に下線を付し、Ｆｃポリペプチドの任意選択のＮ末端伸長は、二重下線によって示される。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ３−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、上の二重下線で示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２７のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０３７９】
成熟単量体Ｆｃポリペプチドの配列は、以下の通りであり（配列番号４２８）、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１２４】
2018517664.tif 000141
【０３８０】
それぞれ、配列番号４１６および配列番号４２８のＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ３−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種複合体が得られ得る。
【０３８１】
種々のＡＬＫ３−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
【０３８２】
ＢｉａｃｏｒｅTMベースの結合アッセイを使用して、上で記載したシングルアームＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の複合体のリガンド結合選択性を、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体の複合体のリガンド結合選択性と比較した。シングルアームＡＬＫ３−Ｆｃおよびホモ二量体のＡＬＫ３−Ｆｃは、独立に、抗Ｆｃ抗体を使用してシステムに捕捉させた。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。結果を以下の表にまとめ、ここで、典型的には最も有効なリガンドトラップと関連するリガンドのオフ速度（ｋｄ）を、グレーの影で表示する。
【表２】
2018517664.tif 000142
【０３８３】
これらの比較結合データは、シングルアームＡＬＫ３−Ｆｃが、ホモ二量体のＡＬＫ３−Ｆｃより優れたリガンド選択性を有することを指し示す。シングルアームのＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体について観察されるＢＭＰ４への例外的に緊密な結合を保持する一方で、ＢＭＰ２への結合強度の低減を呈示するので、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体よりＢＭＰ４と、ＢＭＰ２との間を良好に識別する（依然として強い結合剤であるが）。シングルアームのＡＬＫ３−Ｆｃはまた、ＢＭＰ５（中程度の結合）、ＧＤＦ７（弱い結合）、およびＧＤＦ６（結合なし）の間を、これら３つのリガンドにほぼ同様の強度（全て中程度）で結合するＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体と比較して、良好に識別する。図７を参照のこと。実施例１に記載された構築物と異なり、シングルアームＡＬＫ３−Ｆｃもホモ二量体のＡＬＫ３−Ｆｃも、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、またはＢＭＰ１０に結合しない。
【０３８４】
したがって、これらの結果は、シングルアームＡＬＫ３−Ｆｃが、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体より選択的なＢＭＰ４のアンタゴニストであることを指し示す。シングルアームＡＬＫ３−Ｆｃは、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体と比較して、よりターゲッティングされた様式で（ＢＭＰ２またはＢＭＰ５、特にＧＤＦ６またはＧＤＦ７の共時的なアンタゴニズム由来の効果を低減して）ＢＭＰ４をアンタゴナイズすると予測することができる。したがって、シングルアームＡＬＫ３−Ｆｃは、そのような選択的アンタゴニズムが有利であるある特定の適用において、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体より有用である。例として、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２および潜在的にＢＭＰ５の１つまたは複数のアンタゴニズムを保持するが、ＢＭＰ６、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７の１つまたは複数のアンタゴニズムは最小化することが所望される治療適用が挙げられる。
実施例３．シングルアームＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ二量体の生成および特徴付け
【０３８５】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ二量体の複合体を構築した。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。
【０３８６】
シングルアームＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１０１〜１０３および１３７〜１３９のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１２５】
2018517664.tif 000143
【０３８７】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃまたはＦｃ−Ｆｃ）のいずれかよりむしろＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号１０１のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０３８８】
このＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１０２）にコードされる。
【化１２６】
2018517664.tif 000144
【０３８９】
成熟ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１０３）、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１２７】
2018517664.tif 000145
【０３９０】
実施例１で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１３７）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性残基で置き換える）を、単量体Ｆｃポリペプチドに導入することができる。配列番号１３７のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端リジンなしで提供されてもよい。この相補的Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３８の核酸にコードされ、成熟単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号１３９）は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０３９１】
それぞれ、配列番号１０３および配列番号１３９のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０３９２】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４０１〜４０２および４２５〜４２６のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４０１）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１２８】
2018517664.tif 000146
【０３９３】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、上の二重下線で示されるようにＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４０１のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０３９４】
成熟ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４０２）は、以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１２９】
2018517664.tif 000147
【０３９５】
実施例１で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２５）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２５および成熟Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２６）のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０３９６】
それぞれ、配列番号４０２および配列番号４２６のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０３９７】
種々のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
【０３９８】
ＢｉａｃｏｒｅTMベースの結合アッセイを使用して、上で記載したシングルアームＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ二量体の複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体の複合体のリガンド結合選択性と比較した。シングルアームＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃおよびホモ二量体のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃは、独立に、抗Ｆｃ抗体を使用してシステムに捕捉させた。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。結果を以下の表にまとめ、ここで、典型的には最も有効なリガンドトラップと関連するリガンドのオフ速度（ｋｄ）を、グレーの影で表示する。
【表３】
2018517664.tif 000148
【０３９９】
これらの比較結合データは、シングルアームＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃが、ホモ二量体のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃとは異なるリガンド選択性（シングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはホモマーＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃとも異なる-実施例１を参照）を有することを指し示す。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体が、アクチビンＢへの優先的な結合を、アクチビンＡおよびＧＤＦ１１への強い結合と合わせて呈示するのに対し、シングルアームのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃは、アクチビンＢを上回るアクチビンＡに対する逆転した優先性を、ＧＤＦ１１（弱い結合剤）を上回るアクチビンＡに対する大幅に増強された選択性と合わせて有する。図８を参照のこと。加えて、シングルアームＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃは、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体で観察されるＧＤＦ８およびＢＭＰ１０に対する中程度の結合を大部分保持する。
【０４００】
これらの結果は、シングルアームＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体と比較して実質的に変更されたリガンド選択性を有するアンタゴニストであることを指し示す。したがって、シングルアームＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃは、そのようなアンタゴニズムが有利であるある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体より有用である。例として、アクチビンＢより優先的にアクチビンＡをアンタゴナイズする一方、ＧＤＦ１１のアンタゴニズムは最小化することが所望される治療適用が挙げられる。
【０４０１】
まとめると、前記実施例は、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、シングルアーム異種タンパク質複合体の文脈に置かれると、ホモマータンパク質複合体のいずれの種類と比較しても変更された選択性を呈する新規の結合ポケットを形成し、治療剤として使用可能な新規のタンパク質作用因子の形成を可能とすることを実証する。
実施例４．シングルアームＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の生成および特徴付け
【０４０２】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＢＭＰＲＩＩの細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の複合体を構築した。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。出願人は、ＢＭＰＲＩＩアイソフォームＡ（配列番号７２）の細胞外ドメインを含む追加のシングルアームＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の複合体も構想する。
【０４０３】
シングルアームＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１０７−１０９および１３７−１３９のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１３０】
2018517664.tif 000149
【０４０４】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃ）のいずれかよりむしろＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号１０７のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４０５】
このＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１０８）にコードされる。
【化１３１】
2018517664.tif 000150
【０４０６】
成熟ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１０９）、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１３２】
2018517664.tif 000151
【０４０７】
実施例１で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１３７）の相補的形態はＴＰＡリーダーを使用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込む。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性残基で置き換える）を、単量体Ｆｃポリペプチドに導入することができる。配列番号１３７のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。この相補的Ｆｃポリペプチド配列番号１３８の核酸にコードされる）および成熟単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号１３９）は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４０８】
それぞれ、配列番号１０３および配列番号１３９のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４０９】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４０５〜４０６および４２５〜４２６のＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４０５）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１３３】
2018517664.tif 000152
【０４１０】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、上の二重下線で示されるようにＢＭＰＲＩＩ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４０５のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４１１】
成熟ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４０６）は、以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１３４】
2018517664.tif 000153
【０４１２】
実施例１で説明するように、単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２５）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２５および成熟Ｆｃポリペプチド（配列番号４２６）のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４１３】
それぞれ、配列番号４０６および配列番号４２６のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４１４】
種々のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
【０４１５】
ＢｉａｃｏｒｅTMベースの結合アッセイを使用して、上で記載したシングルアームＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の複合体のリガンド結合選択性を、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体の複合体のリガンド結合選択性と比較した。シングルアームＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃおよびホモ二量体のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃは、独立に、抗Ｆｃ抗体を使用してシステムに捕捉させた。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。結果を以下の表にまとめる。
【表４−１】
2018517664.tif 000154
【表４−２】
2018517664.tif 000155
【０４１６】
これらの比較結合データは、シングルアームＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体によって結合されるリガンドのサブセットに対する結合のみ保持することを指し示す。特に、シングルアームＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体は、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５への結合を保持する一方、ＢＭＰ９への結合は本質的に排除される。
実施例５．シングルアームＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０４１７】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＭＩＳＲＩＩの細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の複合体の構築を構想する。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。出願人は、ＭＩＳＲＩＩアイソフォーム２または３（配列番号７６、８０）の細胞外ドメインを含む追加のシングルアームＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の複合体も構想する。
【０４１８】
シングルアームＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１１０〜１１２および１３７〜１３９のＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１３５】
2018517664.tif 000156
【０４１９】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃ）のいずれかよりむしろＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号１１０のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４２０】
成熟ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１１２）、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１３６】
2018517664.tif 000157
【０４２１】
実施例１で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１３７）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性残基で置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号１３７のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。この相補的Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３８の核酸にコードされ、成熟単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号１３９）は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４２２】
それぞれ、配列番号１１２および配列番号１３９のＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４２３】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４０７〜４０８および４２５〜４２６のＭＩＳＲＩＩ−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４０７）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１３７】
2018517664.tif 000158
【０４２４】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、上の二重下線で示されるようにＭＩＳＲＩＩ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４０７のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４２５】
成熟ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４０８）は、以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１３８】
2018517664.tif 000159
【０４２６】
実施例１で説明するように、単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２５）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２５および成熟Ｆｃポリペプチド（配列番号４２６）のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４２７】
それぞれ、配列番号４０８および配列番号４２６のＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４２８】
種々のＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
実施例６．シングルアームＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の生成および特徴付け
【０４２９】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＴＧＦβＲＩＩ（短いアイソフォーム、配列番号４３）の細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の複合体を構築した。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。出願人は、ＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＡ（配列番号６８）の細胞外ドメインを含む追加のシングルアームＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ複合体、ならびに基準のＴＧＦβＲＩＩ（短いアイソフォーム、配列番号４３）またはＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＡ（配列番号６８）の細胞外ドメインが、本明細書に記載されるようなＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＣに由来する３６アミノ酸挿入（配列番号９５）を含むシングルアームＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ複合体も構想する。
【０４３０】
シングルアームＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１１３〜１１５および１３７〜１３９のＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１３９】
2018517664.tif 000160
【０４３１】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＴＧＦβＲＩＩ−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃ）のいずれかよりむしろＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号１１３のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４３２】
このＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１１４）にコードされる。
【化１４０−１】
2018517664.tif 000161
【化１４０−２】
2018517664.tif 000162
【０４３３】
成熟ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１１５）、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１４１】
2018517664.tif 000163
【０４３４】
実施例１で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１３７）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性残基で置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号１３７のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。この相補的Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３８の核酸にコードされ、成熟単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号１３９）は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４３５】
それぞれ、配列番号１１５および配列番号１３９のＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４３６】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４０９−４１０および４２５−４２６のＴＧＦβＲＩＩ−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４０９）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１４２】
2018517664.tif 000164
【０４３７】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、上の二重下線で示されるようにＴＧＦβＲＩＩ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４０９のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４３８】
成熟ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１０）は以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１４３】
2018517664.tif 000165
【０４３９】
実施例１で説明するように、単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２５）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２５および成熟単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号４２６）のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４４０】
それぞれ、配列番号４１０および配列番号４２６のＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４４１】
種々のＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
【０４４２】
ＢｉａｃｏｒｅTMベースの結合アッセイを使用して、上で記載したシングルアームＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の複合体のリガンド結合選択性を、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体の複合体のリガンド結合選択性と比較した。シングルアームＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃおよびホモ二量体のＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃは、独立に、抗Ｆｃ抗体を使用してシステムに捕捉させた。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。結果を以下の表にまとめる。
【表５−１】
2018517664.tif 000166
【表５−２】
2018517664.tif 000167
【０４４３】
実施例７．シングルアームＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の生成および特徴付け
【０４４４】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＡＬＫ１の細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の複合体を構築した。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。
【０４４５】
シングルアームＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１１６〜１１８および１４０〜１４２のＡＬＫ１−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１４４】
2018517664.tif 000168
【０４４６】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ１−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃ）のいずれかよりむしろＡＬＫ１−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性アミノ酸で置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号１１６のアミノ酸配列は、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【０４４７】
このＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１１７）にコードされる。
【化１４５】
2018517664.tif 000169
【０４４８】
成熟ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１１８）、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【化１４６】
2018517664.tif 000170
【０４４９】
実施例２で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１４０）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ１−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号１４０のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。この相補的Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４１の核酸にコードされ、成熟単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号１４２）は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４５０】
それぞれ、配列番号１１８および配列番号１４２のＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ１−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４５１】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４１１−４１２および４２７−４２８のＡＬＫ１−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１１）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１４７】
2018517664.tif 000171
【０４５２】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ１−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ１融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４１１のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４５３】
成熟ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１２）は以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１４８】
2018517664.tif 000172
【０４５４】
実施例２で説明するように、単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２７）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ１−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２７および成熟Ｆｃポリペプチド（配列番号４２８）のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４５５】
それぞれ、配列番号４１２および配列番号４２８のＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ１−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４５６】
種々のＡＬＫ１−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
【０４５７】
ＢｉａｃｏｒｅTMベースの結合アッセイを使用して、上で記載したシングルアームＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の複合体のリガンド結合選択性を、ＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体の複合体のリガンド結合選択性と比較した。シングルアームＡＬＫ１−Ｆｃおよびホモ二量体のＡＬＫ１−Ｆｃは、独立に、抗Ｆｃ抗体を使用してシステムに捕捉させた。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。結果を以下の表にまとめ、ここで、典型的には最も有効なリガンドトラップと関連するリガンドのオフ速度（ｋｄ）を、グレーの影で表示する。
【表６】
2018517664.tif 000173
【０４５８】
これらの比較結合データは、シングルアームＡＬＫ１−Ｆｃは、ホモ二量体のＡＬＫ１−Ｆｃと比較して変更されたリガンド選択性を有することを指し示す。シングルアームＡＬＫ１−ＦＲｃは、ホモ二量体のＡＬＫ１−Ｆｃで観察されるＢＭＰ１０に対する強い結合を保持する一方、シングルアームＡＬＫ１−Ｆｃに対するＢＭＰ９のオフ速度は、ホモ二量体のＡＫ１−Ｆｃに対する結合のオフ速度よりおよそ１０倍速いため、ＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体ほどＢＭＰ９に緊密に結合しない。これらの結果は、シングルアームＡＬＫ１−Ｆｃが、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体より選択的なアンタゴニストであることを指し示す。したがって、シングルアームＡＬＫ１−Ｆｃは、そのような選択的アンタゴニズムが有利であるある特定の適用において、ホモ二量体のＡＬＫ１−Ｆｃより有用である。例として、ＢＭＰ１０のアンタゴニズムを保持するが、ＢＭＰ９のアンタゴニズムは低減することが所望される治療適用が挙げられる。
実施例８．シングルアームＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０４５９】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＡＬＫ２の細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体の複合体の構築を構想する。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。
【０４６０】
シングルアームＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１１９〜１２１および１４０−１４２のＡＬＫ２−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１４９】
2018517664.tif 000174
【０４６１】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ２−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃ）のいずれかよりむしろＡＬＫ２−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性アミノ酸で置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号１１９のアミノ酸配列は、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【０４６２】
このＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１２０）にコードされる。
【化１５０】
2018517664.tif 000175
【０４６３】
成熟ＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１２１）、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【化１５１】
2018517664.tif 000176
【０４６４】
実施例２で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１４０）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ２−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号１４０のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。この相補的Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４１の核酸にコードされ、成熟単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号１４２）は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４６５】
それぞれ、配列番号１２１および配列番号１４２のＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ２−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４６６】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４１３−４１４および４２７−４２８のＡＬＫ２−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１３）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１５２】
2018517664.tif 000177
【０４６７】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ２−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ２融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４１３のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４６８】
成熟ＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１４）は以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１５３】
2018517664.tif 000178
【０４６９】
実施例２で説明するように、単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２７）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ２−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２７および成熟Ｆｃポリペプチド（配列番号４２８）のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４７０】
それぞれ、配列番号４１４および配列番号４２８のＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ２−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４７１】
種々のＡＬＫ２−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
実施例９．シングルアームＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０４７２】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＡＬＫ４の細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の複合体の構築を構想する。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。出願人は、ＡＬＫ４アイソフォームＢ（配列番号８４）の細胞外ドメインを含む追加のシングルアームＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の複合体も構想する。
【０４７３】
シングルアームＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１２５〜１２７および１４０−１４２のＡＬＫ４−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１５４】
2018517664.tif 000179
【０４７４】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡＬＫ４−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃ）のいずれかよりむしろＡＬＫ４−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性アミノ酸で置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号１２５のアミノ酸配列は、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【０４７５】
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１２６）にコードされる。
【化１５５】
2018517664.tif 000180
【０４７６】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１２７）、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【化１５６】
2018517664.tif 000181
【０４７７】
実施例２で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１４０）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ４−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号１４０のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。この相補的Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４１の核酸にコードされ、成熟単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号１４２）は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４７８】
それぞれ、配列番号１２７および配列番号１４２のＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４７９】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４１７〜４１８および４２７〜４２８のＡＬＫ４−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１７）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１５７】
2018517664.tif 000182
【０４８０】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ４−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４１７のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４８１】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１８）は以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１５８】
2018517664.tif 000183
【０４８２】
実施例２で説明するように、単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２７）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ４−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２７および成熟Ｆｃポリペプチド（配列番号４２８）のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４８３】
それぞれ、配列番号４１８および配列番号４２８のＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４８４】
種々のＡＬＫ４−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
実施例１０．シングルアームＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０４８５】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＡＬＫ５の細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の複合体の構築を構想する。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。出願人は、ＡＬＫ５アイソフォーム２（配列番号８８）の細胞外ドメインを含む追加のシングルアームＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の複合体も構想する。
【０４８６】
シングルアームＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１２８−１３０および１４０−１４２のＡＬＫ５−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１５９】
2018517664.tif 000184
【０４８７】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡＬＫ５−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃ）のいずれかよりむしろＡＬＫ５−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性アミノ酸で置き換える）が、示されるように融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号１２８のアミノ酸配列は、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【０４８８】
このＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１２９）にコードされる。
【化１６０】
2018517664.tif 000185
【０４８９】
成熟ＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１３０）、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【化１６１】
2018517664.tif 000186
【０４９０】
実施例２で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１４０）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ５−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号１４０のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。この相補的Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４１の核酸にコードされ、成熟単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号１４２）は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４９１】
それぞれ、配列番号１３０および配列番号１４２のＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ５−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４９２】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４１９−４２０および４２７−４２８のＡＬＫ５−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１９）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１６２】
2018517664.tif 000187
【０４９３】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ５−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ５融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４１９のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４９４】
成熟ＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４２０）は以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１６３】
2018517664.tif 000188
【０４９５】
実施例２で説明するように、単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２７）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ５−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２７および成熟単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２８）のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０４９６】
それぞれ、配列番号４２０および配列番号４２８のＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ５−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０４９７】
種々のＡＬＫ５−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
実施例１１．シングルアームＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０４９８】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＡＬＫ６の細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ二量体の複合体の構築を構想する。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＡＬＫ６−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。出願人は、ＡＬＫ６アイソフォーム２（配列番号９２）の細胞外ドメインを含む追加のシングルアームＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ二量体の複合体も構想する。
【０４９９】
シングルアームＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１３１〜１３３および１４０−１４２のＡＬＫ６−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＡＬＫ６−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１６４】
2018517664.tif 000189
【０５００】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡＬＫ６−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃ）のいずれかよりむしろＡＬＫ６−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性アミノ酸で置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号１３１のアミノ酸配列は、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【０５０１】
このＡＬＫ６−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１３２）にコードされる。
【化１６５】
2018517664.tif 000190
【０５０２】
成熟ＡＬＫ６−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１３３）、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【化１６６】
2018517664.tif 000191
【０５０３】
実施例２で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１４０）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ６−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号１４０のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。この相補的Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４１の核酸にコードされ、成熟単量体Ｆｃタンパク質（配列番号１４２）は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０５０４】
それぞれ、配列番号１３３および配列番号１４２のＡＬＫ６−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ６−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０５０５】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４２１〜４２２および４２７〜４２８のＡＬＫ６−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＡＬＫ６−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４２１）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１６７】
2018517664.tif 000192
【０５０６】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ６−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ６融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４２１のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０５０７】
成熟ＡＬＫ６−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４２２）は以下の通りであり、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１６８】
2018517664.tif 000193
【０５０８】
実施例２で説明するように、単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２７）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ６−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２７および成熟単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２８）のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０５０９】
それぞれ、配列番号４２２および配列番号４２８のＡＬＫ６−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ６−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０５１０】
種々のＡＬＫ６−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
実施例１２．シングルアームＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０５１１】
出願人は、短いＮ末端伸長を有する単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにリンカーが細胞外ドメインとこの第２のＦｃドメインとの間に位置付けられた別個のＦｃドメインにヒトＡＬＫ７のＮ末端短縮（ＮΔ４）細胞外ドメインが融合された第２のポリペプチドを含む可溶性シングルアームＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体の複合体の構築を構想する。個々の構築物を、それぞれ単量体ＦｃポリペプチドおよびＡＬＫ７−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。出願人は、ＡＬＫ７アイソフォーム１（配列番号３１３）の他のＮ末端短縮型改変体（例えば、ＮΔ５改変体）、ＡＬＫ７アイソフォーム２（配列番号３０２）の細胞外ドメイン、またはＡＬＫ７アイソフォーム３および４（配列番号３０６、３１０）の天然のプロセシング後の配列を含む追加のシングルアームＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体の複合体も構想する。
【０５１２】
シングルアームＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体の形成は、実施例１でシングルアームＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体について記載されたものと同様のアプローチによって誘導され得る。第１のアプローチでは、それぞれ配列番号１３４−１３６および１４０−１４２のＡＬＫ７−Ｆｃおよび単量体Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。
ＡＬＫ７−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを利用し、以下のとおりである：
【化１６９】
2018517664.tif 000194
【０５１３】
リーダーおよびリンカー配列に下線を付す。可能なホモ二量体の複合体（ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡＬＫ７−ＦｃまたはＦｃ：Ｆｃ）のいずれかよりむしろＡＬＫ７−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアニオン性アミノ酸で置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号１３４のアミノ酸配列は、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【０５１４】
このＡＬＫ７−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１３５）にコードされる。
【化１７０】
2018517664.tif 000195
【０５１５】
成熟ＡＬＫ７−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであることが予測され（配列番号１３６）、任意選択でＣ末端にリジンが付加されて提供されてもよい。
【化１７１】
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【０５１６】
実施例２で説明するように、単量体ヒトＧ１Ｆｃポリペプチド（配列番号１４０）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ７−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（アニオン性残基をリジンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号１４０のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。この相補的Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４１の核酸にコードされ、成熟単量体Ｆｃポリペプチド（配列番号１４２）は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０５１７】
それぞれ、配列番号１３６および配列番号１４２のＡＬＫ７−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ７−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０５１８】
非対称Ｆｃ融合ポリペプチドを使用したヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号４２３〜４２４および４２７〜４２８のＡＬＫ７−ＦｃおよびＦｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。
ＡＬＫ７−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４２３）はＴＰＡリーダーを使用し、以下の通りである：
【化１７２】
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【０５１９】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ７−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、４つのアミノ酸置換が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ７融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号４２３のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０５２０】
成熟ＡＬＫ７−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４２４）は、以下の通りであることが予測され、任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【化１７３】
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【０５２１】
実施例２で説明するように、単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２７）の相補的形態は、ＴＰＡリーダーを利用し、任意選択のＮ末端伸長を組み込んでいる。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ７−Ｆｃ：Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、示されるように単量体Ｆｃポリペプチドに導入され得る。配列番号４２７および成熟単量体Ｇ１Ｆｃポリペプチド（配列番号４２８）のアミノ酸配列は任意選択でＣ末端リジンが除去されて提供されてもよい。
【０５２２】
それぞれ、配列番号４２４および配列番号４２８のＡＬＫ７−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび単量体Ｆｃポリペプチドを、ＣＨＯ細胞系から共発現させ、精製して、ＡＬＫ７−Ｆｃ：Ｆｃを含むシングルアーム異種タンパク質複合体が得られ得る。
【０５２３】
種々のＡＬＫ７−Ｆｃ：Ｆｃ複合体の精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
【０５２４】
まとめると、これらの実施例は、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、シングルアーム異種タンパク質複合体の文脈に置かれると、同じ受容体ポリペプチドのホモ二量体の複合体と比較して変更された選択性を呈する新規の結合ポケットを形成し、治療剤として使用可能な新規のタンパク質作用因子の形成を可能とすることを実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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