(57)【要約】  本発明は、アミノ酸配列中に改変を含むＡＡＶカプシドタンパク質、ならびに改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターを提供する。本発明は、本発明のウイルスベクターおよびウイルスカプシドをインビボで細胞にまたは対象に投与する方法もまた提供する。
2018503376.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸残基Ｋ４９２、Ｋ５０３およびＮ５８５における改変を含み、アミノ酸残基Ｍ５２３、Ｇ５８０、Ｇ５８１、Ｑ５８３、Ｓ５８６、Ｎ５８７、Ｌ５８８、Ｔ５９０、Ｄ５９２、Ｒ５９３、Ｌ５９４、Ｔ５９５および／またはＡ５９６のうち１または複数における改変をいずれかの組み合わせでさらに含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質であって、前記残基の番号付けは、配列番号１のアミノ酸配列に基づく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質。
【請求項２】
アミノ酸残基Ｋ４９３、Ｋ５０４およびＮ５８６における改変を含み、アミノ酸残基Ｍ５２４、Ｇ５８１、Ｇ５８２、Ｑ５８４、Ｓ５８７、Ｎ５８８、Ｌ５８９、Ｔ５９１、Ｄ５９３、Ｒ５９４、Ｌ５９５、Ｔ５９６および／またはＡ５９７のうち１または複数における改変をいずれかの組み合わせでさらに含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質であって、前記残基の番号付けは、配列番号２のアミノ酸配列に基づく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質。
【請求項３】
Ｋ４９２Ｅ置換、Ｋ５０３Ｅ置換および／またはＮ５８５Ｓ置換をいずれかの組み合わせで含む、請求項１に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質。
【請求項４】
Ｎ５８５Ｒ置換を含む、請求項１に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質。
【請求項５】
Ｋ４９３Ｅ置換、Ｋ５０４Ｅ置換および／またはＮ５８６Ｓ置換をいずれかの組み合わせで含む、請求項２に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質。
【請求項６】
Ｎ５８６Ｒ置換を含む、請求項２に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質。
【請求項７】
配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質。
【請求項８】
配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質。
【請求項９】
配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質。
【請求項１０】
配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質。
【請求項１１】
配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド。
【請求項１３】
（ａ）請求項１２に記載のＡＡＶカプシド；および
（ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸、
を含むウイルスベクターであって、前記核酸が、ＡＡＶカプシドによってカプシド封入されている、ウイルスベクター。
【請求項１４】
薬学的に許容される担体中に請求項１３に記載のウイルスベクターを含む組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載のウイルスベクターまたは請求項１４に記載の組成物と細胞を接触させるステップを含む、細胞中に核酸分子を導入する方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載のウイルスベクターまたは請求項１４に記載の組成物と細胞を接触させるステップを含む、細胞中に核酸分子を導入する方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載のウイルスベクターまたは請求項１４に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、対象に核酸分子を送達する方法。
【請求項１８】
前記ウイルスベクターまたは組成物が、前記対象の中枢神経系に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１３に記載のウイルスベクターまたは請求項１４に記載の組成物と細胞を接触させるステップを含む、表面上にポリシアル酸を有する細胞を選択的に形質導入する方法。
【請求項２０】
中枢神経系の前駆細胞および／または神経芽細胞を請求項１３に記載のウイルスベクターと接触させるステップを含み、前記ウイルスベクターが目的の核酸分子を含む、目的の核酸分子を中枢神経系の前駆細胞および／または神経芽細胞に選択的に送達する方法。
【請求項２１】
対象の前記核酸分子が、治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞および／または神経芽細胞が対象中にある、請求項１５、１６、１９または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象がヒト対象である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１３に記載のウイルスベクターを対象に投与するステップを含み、前記ウイルスベクターが、神経学的障害または欠損を治療することにおいて有効な治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする核酸分子を含む、対象において神経学的障害または欠損を治療する方法。
【請求項２５】
前記ウイルスベクターまたは組成物が、脳室内、大槽内、脳実質内、頭蓋内および／または髄腔内経路を介して投与される、請求項１７、１８、２２、２３および２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞を請求項１３に記載のウイルスベクターまたは請求項１４に記載の組成物と接触させるステップを含む、表面上にポリシアル酸を有する細胞を選択的に形質導入する方法。
【請求項２７】
中枢神経系の前駆細胞および／または神経芽細胞を請求項１３に記載のウイルスベクターと接触させるステップを含み、前記ウイルスベクターが目的の核酸分子を含む、目的の核酸分子を中枢神経系の前駆細胞および／または神経芽細胞に選択的に送達する方法。
【請求項２８】
前記目的の核酸分子が、治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞および／または神経芽細胞が対象中にある、請求項２６から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１３に記載のウイルスベクターを対象に投与するステップを含み、前記ウイルスベクターが、神経学的障害または欠損を治療することにおいて有効な治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする核酸分子を含む、対象において神経学的障害または欠損を治療する方法。
【請求項３１】
前記ウイルスベクターまたは組成物が、脳室内、大槽内、脳実質内、頭蓋内および／または髄腔内経路を介して投与される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象がヒト対象である、請求項２９から３０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権の申立］
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）の下で、その全内容が参照により本明細書の一部をなす２０１５年１月１４日出願の米国仮特許出願第６２／１０３，４６２号の利益を主張する。
【０００２】
［政府支援の明示］
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金第Ｒ０１−ＨＬ０８９２２１号の下で、政府の支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の改変されたカプシドタンパク質、ならびにそれを含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターに関する。特に、本発明は、対象の標的組織（複数可）に関して所望の形質導入プロファイルを付与するためにウイルスベクター中に組み込まれ得る、改変されたＡＡＶカプシドタンパク質およびそれを含むカプシドに関する。
【背景技術】
【０００４】
動物組織およびアデノウイルスストックから単離された新たなアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）株は、治療的遺伝子移入適用に利用可能なＡＡＶベクターのパネルを拡張させた。動物モデルにおいてこれらのＡＡＶ単離体の組織トロピズムをマップするための網羅的試みが、現在進行中である。ＡＡＶベクターのホーミングを選択的臓器へと方向付ける能力は、遺伝子療法および他の治療的適用のために有用である。
【０００５】
本発明者は、所望の標的化特徴を有する核酸送達ベクターに関する当該分野での必要性に取り組む。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、ＡＡＶ４カプシドタンパク質が、アミノ酸残基Ｋ４９２、Ｋ５０３およびＮ５８５における改変を含み、アミノ酸残基Ｍ５２３、Ｇ５８０、Ｇ５８１、Ｑ５８３、Ｓ５８６、Ｎ５８７、Ｌ５８８、Ｔ５９０、Ｄ５９２、Ｒ５９３、Ｌ５９４、Ｔ５９５および／またはＡ５９６のうち１または複数における改変を任意の組み合わせでさらに含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質であって、これらの残基の番号付けは、配列番号１のアミノ酸配列に基づく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質を提供する。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、ＡＡＶ４カプシドタンパク質が、アミノ酸残基Ｋ４９３、Ｋ５０４およびＮ５８６における改変を含み、アミノ酸残基Ｍ５２４、Ｇ５８１、Ｇ５８２、Ｑ５８４、Ｓ５８７、Ｎ５８８、Ｌ５８９、Ｔ５９１、Ｄ５９３、Ｒ５９４、Ｌ５９５、Ｔ５９６および／またはＡ５９７のうち１または複数における改変を任意の組み合わせでさらに含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質であって、これらの残基の番号付けは、配列番号２のアミノ酸配列に基づく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質を提供する。Ｋ４９２Ｅ置換、Ｋ５０３Ｅ置換および／またはＮ５８５Ｓ置換を任意の組み合わせで含む、請求項１に記載のＡＡＶ４カプシドタンパク質。
【０００８】
本発明のＡＡＶ４カプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドが、本明細書中でさらに提供される。（ａ）本発明のＡＡＶカプシドと、（ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸とを含むウイルスベクターがさらに提供され、この核酸は、ＡＡＶカプシドによってカプシド封入されている。また、薬学的に許容される担体中に本発明のウイルスベクターを含む組成物が本明細書中で提供される。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、本発明のウイルスベクターおよび／または本発明の組成物と細胞を接触させるステップを含む、細胞中に核酸分子を導入する方法である。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、本発明のウイルスベクターおよび／または本発明の組成物を対象に投与するステップを含む、対象に核酸分子を送達する方法を提供する。
【００１１】
また、本発明のウイルスベクターまたは本発明の組成物と細胞を接触させるステップを含む、表面上にポリシアル酸を有する細胞を選択的に形質導入する方法が本明細書中で提供される。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、前駆細胞および／または神経芽細胞を本発明のウイルスベクターと接触させるステップを含み、このウイルスベクターが目的の核酸分子を含む、目的の核酸分子を中枢神経系の前駆細胞および／または神経芽細胞に選択的に送達する方法である。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明のウイルスベクターを対象に投与するステップを含み、このウイルスベクターが、神経学的障害または欠損を治療することにおいて有効な治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする核酸分子を含む、対象において神経学的障害または欠損を治療する方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、細胞を本発明のウイルスベクターと接触させるステップを含む、表面上にポリシアル酸を有する細胞を選択的に形質導入する方法を含む。
【００１５】
また、前駆細胞および／または神経芽細胞を本発明のウイルスベクターと接触させるステップを含み、このウイルスベクターが目的の核酸分子を含む、目的の核酸分子を中枢神経系の前駆細胞および／または神経芽細胞に選択的に送達する方法が本明細書中で提供される。
【００１６】
本発明の別の態様は、本発明のウイルスベクターを対象に投与するステップを含み、このウイルスベクターが、神経学的障害または欠損を治療することにおいて有効な治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする核酸分子を含む、対象において神経学的障害または欠損を治療する方法である。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下に示す発明の説明においてより詳細に扱われる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＡＡＶ４（暗灰色棒）または４．１８（淡灰色棒）処理したマウスのＲＭＳおよびＯＢ領域中の、ｔｄＴｏｍ＋細胞の数の定量的分析、ならびにＤｃｘ＋突起およびＰＨ３＋細胞との百分率共局在を示す図である。エラーバーは標準偏差を示し、ｎ．ｓ．、有意でないまたは＊ｐ＜０．０５によって示される統計的有意性は、スチューデントｔ検定によって決定される。全ての実験を四連で実施した。
【図２】ＡＡＶ４およびＡＡＶ４．１８変異体の類似の上衣トロピズムを示す図である。
【図３】本明細書中に記載されるいくつかのＡＡＶ４変異体の相対的遺伝子発現効率を示すグラフプロットを示す図である。
【図４】置換を示す異なるＡＡＶ４クローンのアラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、本発明の代表的実施形態が示された添付の図面を参照してここに記載される。しかし本発明は、異なる形態で具体化してもよく、本明細書中に示される実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ完全となり、本発明の範囲を当業者に完全に伝達するように提供されるものである。
【００２０】
特に規定しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で発明の説明において使用される術語は、特定の実施形態だけを記載することを目的としており、本発明を限定することを意図しない。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【００２１】
［定義］
以下の用語が、本明細書中の記載および添付の特許請求の範囲において使用される。
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も同様に含むことが意図される。
【００２２】
さらに、用語「約」は、本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度などの量などの測定可能な値をいう場合、特定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％またはさらには±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００２３】
また、本明細書中で使用する場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうち１つまたは複数の、任意のおよび全ての可能な組み合わせ、ならびに代替として解釈される場合（「または」）には組み合わせの欠如をいい、かつこれらを包含する。
【００２４】
文脈が他を示さない限り、本明細書中に記載される本発明の種々の特徴が任意の組み合わせで使用され得ることが、具体的に意図される。
【００２５】
さらに、本発明は、本明細書中に示される本発明のいくつかの実施形態、任意の特徴または特徴の組み合わせが排除または割愛できることも企図している。
【００２６】
例えば、特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択できることを本明細書が示す場合をさらに説明するために、この言葉は、各かかる下位の組み合わせが本明細書中に明示的に示されるかのように、例えばＡ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみなどの、これらのアミノ酸（複数可）の任意のサブセットからアミノ酸を選択できることもまた示す。さらに、かかる言葉は、１つまたは複数の特定されたアミノ酸が放棄され得ることもまた示す。例えば、特定の実施形態では、各かかる可能な放棄が明示的に示されるかのように、アミノ酸は、Ａ、ＧまたはＩではなく；Ａではなく；ＧまたはＶではない、など。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「低下する（ｒｅｄｕｃｅ／ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低下」および類似の用語は、少なくとも約２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれ以上の減少を意味する。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、用語「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ／ｅｎｈａｎｃｅｓ）」「増強」および類似の用語は、少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の増加を示す。
【００２９】
用語「パルボウイルス」は、本明細書中で使用する場合、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルス属が含まれるパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）を包含する。自律的パルボウイルスには、パルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス属（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス属（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス属（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）およびコントラウイルス属（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）のメンバーが含まれる。例示的な自律的パルボウイルスには、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、および現在公知のまたは後に発見される任意の他の自律的パルボウイルスが含まれるが、これらに限定されない。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）には、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、１２型ＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。多数の比較的新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（例えば、Ｇａｏら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：６３８１〜６３８８頁；Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３：３７５〜３８３頁；および表１を参照のこと）。
【００３１】
ＡＡＶおよび自律的パルボウイルスの種々の血清型のゲノム配列、ならびにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列が、当該分野で公知である。かかる配列は、文献中またはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースなどの公的データベース中で見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０４４９２７、ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照でき、その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書の一部をなすものとする。例えば以下もまた参照のこと：Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：５５５頁；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６８２３頁；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：１３０９頁；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：９３９頁；Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：３９９４頁；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２１：２０８頁；Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１頁；Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１８５４頁；Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３−：３７５〜３８３頁；国際特許公開公報ＷＯ  ００／２８０６１、ＷＯ  ９９／６１６０１、ＷＯ  ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号；これらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書の一部をなすものとする。表１もまた参照のこと。
【００３２】
【表１】
2018503376.tif 000003
【００３３】
自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章および第７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）中により詳細に記載されている。ＡＡＶ２（Ｘｉｅら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５〜１０頁）、ＡＡＶ４（Ｐａｄｒｏｎら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７〜５８頁）、ＡＡＶ５（Ｗａｌｔｅｒｓら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３３６１〜７１頁）およびＣＰＶ（Ｘｉｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７〜５２０頁およびＴｓａｏら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１４５６〜６４頁）の結晶構造の説明もまた参照のこと。
【００３４】
用語「トロピズム」とは、本明細書中で使用する場合、特定の細胞または組織へのウイルスの優先的な侵入と、任意選択的に、その後の、例えば組換えウイルスについて細胞中でのウイルスゲノムが保有する配列（複数可）の発現（例えば、転写および任意選択的に翻訳）、対象の異種核酸の発現をいう。当業者は、ウイルスゲノムからの異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは他の方法で調節される核酸配列について、トランス作用因子の非存在下では開始されない場合があることを理解するであろう。ｒＡＡＶゲノムの場合、ウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定に組み込まれたプロウイルスから、非組み込みエピソームから、ならびに細胞内でウイルスが取り得る任意の他の形態からであり得る。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「全身性トロピズム」および「全身性形質導入」（および同等の用語）は、本発明のウイルスカプシドまたはウイルスベクターが、身体中の組織（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓および／または膵臓）に対して、それぞれトロピズムを示すことまたはそれらの組織を形質導入することを示す。本発明の実施形態では、筋組織（例えば、骨格筋、横隔膜筋および心筋）の全身性形質導入が観察される。他の実施形態では、骨格筋組織の全身性形質導入が達成される。例えば、特定の実施形態では、身体中の本質的に全ての骨格筋が形質導入される（しかし、形質導入の効率は筋の型によって異なり得る）。特定の実施形態では、四肢筋、心筋および横隔膜筋の全身性形質導入が達成される。任意選択的に、ウイルスカプシドまたはウイルスベクターは、全身性経路（例えば、静脈内、関節内またはリンパ内などの全身性経路）を介して投与される。あるいは、他の実施形態では、カプシドまたはウイルスベクターは、局所送達される（例えば、足蹠に、筋内、皮内、皮下、外用）。本発明に従う改変されたウイルスベクターの例は、表５に提供される。
【００３６】
特に示さない限り、「効率的な形質導入」もしくは「効率的なトロピズム」または同様の用語は、適切な対照を参照することにより決定され得る（例えば、対照のそれぞれ形質導入またはトロピズムの、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上）。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、骨格筋、心筋、横隔膜筋、膵臓（膵島β細胞を含む）、脾臓、胃腸管（例えば、上皮および／または平滑筋）、中枢神経系の細胞、肺、関節細胞および／または腎臓を効率的に形質導入するまたはそれらに対する効率的なトロピズムを有する。適切な対照は、所望のトロピズムプロファイルを含む種々の因子に依存する。
【００３７】
同様に、ウイルスが標識組織について「効率的に形質導入しない」もしくは「効率的なトロピズムを有さない」または同様の用語であるか否かを、適切な対照を参照して決定することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓、腎臓、生殖腺および／または生殖細胞について、効率的に形質導入しない（即ち、効率的なトロピズムを有さない）。特定の実施形態では、組織（複数可）（例えば肝臓）の望ましくない形質導入は、所望の標的組織（複数可）（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋および／または中枢神経系の細胞）の形質導入レベルと比較して、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下である。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、特に示さない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的実施形態では、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡ配列である。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分、例えば、そのポリヌクレオチドと一般的には関連して見出される細胞もしくはウイルスの構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的実施形態では、「単離された」ヌクレオチドは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれ以上富化されている。
【００４１】
同様に、「単離された」ポリペプチドとは、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分、例えば、そのポリペプチドと一般的には関連して見出される細胞もしくはウイルスの構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。代表的実施形態では、「単離された」ポリペプチドは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれ以上富化されている。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、ウイルスベクターを「単離する」もしくは「精製する」（または文法的等価物）とは、そのウイルスベクターが、出発材料中の他の成分の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的実施形態では、「単離された」または「精製された」ウイルスベクターは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれ以上富化されている。
【００４３】
「治療的タンパク質」は、細胞または対象中のタンパク質の非存在または欠損から生じる症状を緩和、低下、予防、遅延および／または安定化できるタンパク質、ならびに／あるいは利益を他の方法で対象に付与するタンパク質である。
【００４４】
「治療的ＲＮＡ分子」または「機能的ＲＮＡ分子」は、本明細書中で使用する場合、当該分野で公知の、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライソソーム媒介性のトランススプライシングをもたらすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６頁；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照のこと）、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐら、（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２４３１頁を参照のこと）、および「ガイド」ＲＮＡなどの任意の他の非翻訳ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４９２９頁；Ｙｕａｎらに対する米国特許第５，８６９，２４８号）などであり得る。
【００４５】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ／ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「〜の治療」（およびその文法的な変形）は、対象の状態の重症度が低下され、少なくとも部分的に改善または安定化されること、および／あるいは少なくとも１つの臨床症状における幾分かの緩和、軽減、減少または安定化が達成されること、および／あるいは疾患または障害の進行の遅延が存在することを意味する。
【００４６】
用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ／ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防」（およびその文法的な変形）とは、対象における疾患、障害および／または臨床症状（複数可）の発症の予防および／または遅延、ならびに／あるいは本発明の方法の非存在下で生じるものと比較した、疾患、障害および／または臨床症状（複数可）の発症の重症度における低下をいう。予防は、疾患、障害および／または臨床症状（複数可）の完全な非存在のように、完全であり得る。予防は部分的でもあり得、その結果、対象における疾患、障害および／または臨床症状（複数可）の出現ならびに／あるいは発症の重症度は、本発明の非存在下で生じるものよりも低くなる。
【００４７】
「治療有効」量は、本明細書中で使用する場合、いくらかの改善または利益を対象に提供するのに充分な量である。代替的に述べると、「治療有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状におけるいくらかの緩和、軽減、減少または安定化を提供する量である。いくらかの利益が対象に提供される限り、治療効果は完全である必要も治癒的である必要もないことを、当業者は理解するであろう。
【００４８】
「予防有効」量は、本明細書中で使用する場合、対象における疾患、障害および／または臨床症状の発症を予防および／または遅延するのに充分な量、ならびに／あるいは本発明の方法の非存在下で生じるものと比較して、対象における疾患、障害および／または臨床症状の発症の重症度を低下および／または遅延させるのに充分な量である。いくらかの利益が対象に提供される限り、予防のレベルが完全である必要がないことを、当業者は理解するであろう。
【００４９】
用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸分子」は、本明細書中で互換的に使用され、ウイルス中に天然に存在しない核酸配列をいう。一般に、異種核酸は、対象のタンパク質または非翻訳ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームを含む（例えば、細胞または対象への送達のため）。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」とは、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子をいう。あるいは、いくつかの文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡ単独をいうために使用され得る。
【００５１】
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（即ち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは一般に、ウイルスを生成するためにシスの末端反復（複数可）（ＴＲ（複数可））だけを必要とする。それ以外の全てのウイルス配列は不可欠ではなく、トランスエレメントとして供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７頁）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大化するように、１つまたは複数のＴＲ配列を保持するだけである。構造タンパク質および非構造タンパク質をコードする配列は、トランスエレメントとして提供され得る（例えば、プラスミドなどのベクターから、またはその配列をパッケージング細胞中に安定に組み込むことによる）。本発明の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、典型的にはベクターゲノムの５’末端および３’末端に存在し、異種核酸配列に隣接するがそれらと連続している必要はない少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）配列（例えば、ＡＡＶのＴＲ配列）、任意選択的に２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ−ＴＲ）を含む。ＴＲは、互いに同じでも異なってもよい。
【００５２】
用語「末端反復」または「ＴＲ」には、ヘアピン構造を形成し、逆位末端反復として機能する（即ち、例えば複製、ウイルスパッケージング、組み込みおよび／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を媒介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列が含まれる。ＴＲは、ＡＡＶのＴＲまたは非ＡＡＶのＴＲであり得る。例えば、非ＡＡＶ−ＴＲ配列、例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ−１９）または任意の他の適切なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製起点として機能するＳＶ４０ヘアピン）のＴＲ配列がＴＲとして使用され得、これは、短縮、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変され得る。さらに、ＴＲは、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，４７８，７４５号に記載された「ダブル−Ｄ配列」などのように、部分的に合成でも完全に合成でもよい。
【００５３】
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ−ＴＲ」は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、あるいは１１が含まれるがこれらに限定されない任意のＡＡＶ、または現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶに由来し得る（例えば、表１を参照のこと）。末端反復が、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を媒介する限り、ＡＡＶ末端反復はネイティブ末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブのＡＡＶ−ＴＲ配列は、挿入、欠失、短縮および／またはミスセンス変異によって変更されていてもよい）。
【００５４】
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報ＷＯ  ００／２８００４およびＣｈａｏら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６１９頁に記載されるように、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、指向性トロピズムを有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（即ち、ウイルスＴＲおよびウイルスカプシドが異なるパルボウイルスに由来するもの）であり得る。
【００５５】
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報ＷＯ  ０１／９２５５１（その開示は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、二重鎖パルボウイルス粒子であり得る。従って、いくつかの実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムが、本発明のウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。
【００５６】
さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含み得る。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、用語「アミノ酸」は、任意の天然に存在するアミノ酸、その改変形態および合成アミノ酸を包含する。
【００５８】
天然に存在する左旋性（Ｌ−）アミノ酸を表２に示す。
【００５９】
あるいは、アミノ酸は、改変されたアミノ酸残基であり得（非限定的な例を表３に示す）、および／または翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化（ｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ））によって改変されたアミノ酸であり得る。
【００６０】
【表２】
2018503376.tif 000004
【００６１】
【表３】
2018503376.tif 000005
【００６２】
さらに、天然に存在しないアミノ酸は、Ｗａｎｇら（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５〜４９頁（２００６））によって記載されるような「非天然」アミノ酸であり得る。これらの非天然アミノ酸は、対象の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結するために有利に使用され得る。
【００６３】
＜改変されたＡＡＶカプシドタンパク質ならびにそれを含むウイルスカプシドおよびウイルスベクター＞
本発明は、アミノ酸配列中に変異（即ち、改変）を含むＡＡＶカプシドタンパク質、ならびに改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターを提供する。本発明者らは、本明細書中に記載されるアミノ酸位置における改変が、（ｉ）表面上にポリシアル酸を有する細胞の選択的形質導入；（ｉｉ）シアル酸（ＳＡ）からポリシアル酸（ＰＳＡ）への受容体特異性における切り替え；（ｉｉｉ）脳の至る所での細胞の増強された形質導入；および（ｉｉｉ）移動中の前駆細胞へのＡＡＶベクターの再方向付け、が含まれるがこれらに限定されない１または複数の所望の特性を、改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスベクターに付与できることを発見した。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明の改変されたＡＡＶカプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ４カプシドタンパク質のアミノ酸配列またはＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ウシＡＡＶ、Ｒｈ３２、Ｒｈ３３およびＲｈ３４が含まれるがこれらに限定されない別のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質の対応する領域中に、１または複数の変異（即ち、改変）を含む。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、アミノ酸配列における「変異」または「改変」には、そのそれぞれに１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ以上のアミノ酸が関与し得る、置換、挿入および／または欠失が含まれる。特定の実施形態では、改変は置換である。例えば、特定の実施形態では、ＡＡＶ４カプシドタンパク質配列は、アミノ酸位置４９２、５０３、５８５、５２３、５９０、５８１、５８３、５９４および／または５９６において任意の組み合わせで改変される。アミノ酸番号付けは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４４９２７を有するＡＡＶ４カプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）：
【化１】
2018503376.tif 000006
または以下のアミノ酸配列（配列番号２）を有するＡＡＶ４カプシドタンパク質：
【化２】
2018503376.tif 000007
に基づく。
【００６６】
本発明の改変されたウイルスカプシドタンパク質は、１つのＡＡＶカプシドタンパク質由来のアミノ酸が別のＡＡＶカプシドタンパク質に置換されたＡＡＶカプシドタンパク質であり得るがこれに限定されず、置換および／または挿入されたアミノ酸は、任意の供給源由来であり得、さらに、天然に存在するまたは部分的もしくは完全に合成であり得る。さらに、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質は、ネイティブアミノ酸配列または合成アミノ酸配列を有し得る。
【００６７】
従って、一実施形態では、本発明は、カプシドタンパク質が、Ｋ４９２、Ｋ５０３およびＮ５８５における変異を含み、以下のアミノ酸残基部位Ｍ５２３、Ｇ５８０、Ｇ５８１、Ｑ５８３、Ｓ５８６、Ｎ５８７、Ｌ５８８、Ｔ５９０、Ｄ５９２、Ｒ５９３、Ｌ５９４、Ｔ５９５および／またはＡ５９６のうち１または複数における変異を任意の組み合わせでさらに含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、このＡＡＶ４カプシドタンパク質は、Ｋ４９２Ｅ変異、Ｋ５０３Ｅ変異および／またはＮ５８５Ｓ変異を任意の組み合わせで含み得る。さらなる実施形態では、このＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸残基部位Ｋ４９２、Ｋ５０３、Ｍ５２３、Ｇ５８０、Ｇ５８１、Ｑ５８３、Ｎ５８５、Ｓ５８６、Ｎ５８７、Ｌ５８８、Ｔ５９０、Ｄ５９２、Ｒ５９３、Ｌ５９４、Ｔ５９５および／またはＡ５９６のうち１または複数における変異単一または変異の任意の組み合わせを含み得、この変異は、その位置におけるネイティブアミノ酸でない任意の他のアミノ酸によるネイティブアミノ酸の置換である。これらそれぞれの位置におけるネイティブアミノ酸を置換し得るアミノ酸残基の例は、表２および３に示される。
【００６８】
さらなる実施形態では、本発明は、ＡＡＶ４カプシドタンパク質が、アミノ酸残基Ｋ４９２、Ｋ５０３およびＮ５８５における改変を含み、アミノ酸残基Ｍ５２３、Ｇ５８０、Ｇ５８１、Ｑ５８３、Ｓ５８６、Ｎ５８７、Ｌ５８８、Ｔ５９０、Ｄ５９２、Ｒ５９３、Ｌ５９４、Ｔ５９５および／またはＡ５９６のうち１または複数における改変を任意の組み合わせでさらに含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質であって、これらの残基の番号付けは、配列番号１のアミノ酸配列に基づく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質を提供する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、上で言及したＡＡＶ４カプシドタンパク質は、Ｋ４９２Ｅ置換、Ｋ５０３Ｅ置換および／またはＮ５８５Ｓ置換を任意の組み合わせで含み得る。いくつかの実施形態では、上で言及したＡＡＶ４カプシドタンパク質は、Ｎ５８５Ｒ置換を含み得る。
【００７０】
本発明は、ＡＡＶ４カプシドタンパク質が、アミノ酸残基Ｋ４９３、Ｋ５０４およびＮ５８６における改変を含み、アミノ酸残基Ｍ５２４、Ｇ５８１、Ｇ５８２、Ｑ５８４、Ｓ５８７、Ｎ５８８、Ｌ５８９、Ｔ５９１、Ｄ５９３、Ｒ５９４、Ｌ５９５、Ｔ５９６および／またはＡ５９７のうち１または複数における改変を任意の組み合わせでさらに含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質であって、これらの残基の番号付けは、配列番号２のアミノ酸配列に基づく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質をさらに提供する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、上で言及したＡＡＶ４カプシドタンパク質は、Ｋ４９３Ｅ置換、Ｋ５０４Ｅ置換および／またはＮ５８６Ｓ置換を任意の組み合わせで含み得る。いくつかの実施形態では、上で言及したＡＡＶ４カプシドタンパク質は、Ｎ５８６Ｒ置換を含み得る。
【００７２】
一実施形態では、本発明のＡＡＶ４カプシドタンパク質は、ＡＡＶ４．１８−６ａのアミノ酸配列（配列番号２９）を含み得る。
【００７３】
一実施形態では、本発明のＡＡＶ４カプシドタンパク質は、ＡＡＶ４．１８−６ｂのアミノ酸配列（配列番号３０）を含み得る。
【００７４】
一実施形態では、本発明のＡＡＶ４カプシドタンパク質は、ＡＡＶ４．１８−６ｃのアミノ酸配列（配列番号３１）を含み得る。
【００７５】
一実施形態では、本発明のＡＡＶ４カプシドタンパク質は、ＡＡＶ４．１８−５ａのアミノ酸配列（配列番号３２）を含み得る。
【００７６】
一実施形態では、本発明のＡＡＶ４カプシドタンパク質は、ＡＡＶ４．１８−５ｂのアミノ酸配列（配列番号３３）を含み得る。
【００７７】
さらなる実施形態では、本発明のＡＡＶ４カプシドタンパク質は、本明細書および配列表において本明細書中に示されるアミノ酸配列のいずれかを含み得る。
【００７８】
本明細書中に記載される置換を有するＡＡＶ４カプシドタンパク質のさらなる非限定的な例は、図４中に提供され（ａａｖ４＿１、ａａｖ４＿２、ａａｖ４＿３、ａａｖ４＿１０、ａａｖ４＿１３、ａａｖ４＿１４、ａａｖ４＿２０、ａａｖ４＿２２、ａａｖ４＿２４、ａａｖ４＿２６、ａａｖ４＿２７、ａａｖ４＿２８、ａａｖ４＿３１、ａａｖ４＿３９、ａａｖ４＿４０、ａａｖ４＿４３、ａａｖ４＿４９、ａａｖ４＿６０、ａａｖ４＿６３、ａａｖ４＿８０およびａａｖ４＿９０）、異なる形質転換された細胞型（Ｙ軸）に対するこれらのクローンの相対的遺伝子発現効率（Ｘ軸）は、図３中に提供される。
【００７９】
本明細書中に記載されるＡＡＶ４カプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド、ならびにこのＡＡＶカプシドを含むウイルスベクターが、本明細書中でさらに提供される。また、薬学的に許容される担体中に本発明のウイルスベクターを含む組成物が本明細書で提供される。
【００８０】
本明細書中で記載する場合、多数のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質の核酸およびアミノ酸配列は、当該分野で公知である。従って、参照ＡＡＶ４カプシドタンパク質のアミノ酸位置４９２、５０３、５８５、５２３、５８０、５８２、５８３、５９４および５９６に「対応する」アミノ酸（複数可）は、例えば、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ウシＡＡＶ、クローン性単離体Ｒｈ３２、クローン性単離体Ｒｈ３３またはクローン性単離体Ｒｈ３４が含まれる任意の他のＡＡＶカプシドタンパク質について容易に決定できる（例えば、当該分野で周知のように、配列アラインメントを使用して）。
【００８１】
本発明は、本発明の改変されたカプシドタンパク質が、現在公知のまたは後に発見される任意のＡＡＶのカプシドタンパク質を改変することによって生成され得ることを企図している。さらに、改変されるＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、表１に示されるＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａもしくは３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１カプシドタンパク質あるいは任意のＡＡＶ）であり得るがそれらに限定されない。当業者は、ＡＡＶカプシドタンパク質に対する種々の操作が当該分野で公知であり、本発明が天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質の改変に限定されないことを理解するであろう。例えば、改変されるカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶ（例えば、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２あるいは現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶに由来する）と比較して、既に変更を有していてもよい。かかるＡＡＶカプシドタンパク質もまた、本発明の範囲内である。
【００８２】
従って、特定の実施形態では、改変されるＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶに由来し得るが、カプシドタンパク質中に挿入および／または置換されたならびに／あるいは１つまたは複数のアミノ酸の欠失によって変更された、１つまたは複数の外来配列（例えば、ネイティブウイルスにとって外因性である）をさらに含み得る。
【００８３】
従って、特定のＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、表１に示されたＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１もしくはＡＡＶ１２カプシドタンパク質、または任意のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質など）に本明細書中で言及する場合、ネイティブカプシドタンパク質ならびに本発明の改変以外の変更を有するカプシドタンパク質を包含する意図である。かかる変更には、置換、挿入および／または欠失が含まれる。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、そこに挿入された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０の、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満または７０未満のアミノ酸を含む（本発明の挿入以外に）。本発明の実施形態では、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０の、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満または７０未満のアミノ酸置換を含む（本発明に従うアミノ酸置換以外に）。本発明の実施形態では、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０の、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満または７０未満のアミノ酸の欠失を含む（本発明のアミノ酸欠失以外に）。
【００８４】
従って、例えば用語「ＡＡＶ４カプシドタンパク質」には、ネイティブＡＡＶ４カプシドタンパク質配列を有するＡＡＶカプシドタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０４４９２７を参照のこと）ならびにネイティブＡＡＶ４カプシドタンパク質配列中に置換、挿入および／または欠失（本明細書に記載したもの）を含むものが含まれる。
【００８５】
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列を有する、あるいはネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似または同一なアミノ酸配列を有する。例えば、特定の実施形態では、「ＡＡＶ４」カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ４カプシドタンパク質配列、ならびにネイティブＡＡＶ４カプシドタンパク質配列と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似または同一な配列を包含する。
【００８６】
２つ以上のアミノ酸配列間の配列類似性または同一性を決定する方法は、当該分野で公知である。配列類似性または同一性は、当該分野で公知の標準的な技術を使用して決定され得、この技術には、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２、４８２頁（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３頁（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５、２４４４頁（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５頁（１９８４）に記載されるＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム、または検査が含まれるがこれらに限定されない。
【００８７】
別の適切なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０）およびＫａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、５８７３〜５７８７頁（１９９３）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：４６０〜４８０頁（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、任意選択的にデフォルト値に設定されるいくつかの検索パラメータを使用する。これらのパラメータは、ダイナミックな値であり、特定の配列の組成および対象の配列がそれに対して検索されている特定のデータベースの構成に依存して、プログラム自体によって設定されるが、これらの値は、感度を増加させるために調整されてよい。
【００８８】
さらに、さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁に報告されるｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴである。
【００８９】
本発明の代表的実施形態では、置換は、ネイティブＡＡＶ４カプシドタンパク質のＫ４９２、Ｋ５０３およびＮ５８５（ＶＰ１番号付けを使用する）において、または他のＡＡＶの対応する位置、即ち、ネイティブＡＡＶ４カプシドタンパク質のアミノ酸位置４９２、５０３および５８５に対応するアミノ酸においてなされ、少なくとも１つの置換は、Ｍ５２３、Ｇ５８０、Ｇ５８１、Ｑ５８３、Ｌ５９４および／もしくはＡ５９６において単一でもしくは任意の組み合わせで、または他のＡＡＶの対応する位置、即ち、ネイティブＡＡＶ４カプシドタンパク質のアミノ酸位置５２３、５８０、５８１、５８３、５９４および／もしくは５９６に対応するアミノ酸においてなされる。ネイティブＡＡＶ４におけるこれらの位「に対応する」他のＡＡＶ血清型または改変されたＡＡＶカプシド中のアミノ酸位置は、当業者に明らかであり、配列アラインメント技術（例えば、ＷＯ  ２００６／０６６０６６の図７を参照のこと）および／または結晶構造解析（Ｐａｄｒｏｎら、（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７〜５８頁）を使用して容易に決定され得る。
【００９０】
本発明は、本発明の改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を含む、本質的にこれからなる、またはこれからなるウイルスカプシドもまた提供する。特定の実施形態では、ウイルスカプシドは、さらに自律的パルボウイルスカプシドまたはディペンドウイルスカプシドであり得るパルボウイルスカプシドである。任意選択的に、ウイルスカプシドはＡＡＶカプシドである。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、表１に示されるＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１または任意の他のＡＡＶであるか、あるいは１つまたは複数の挿入、置換および／または欠失により上述のいずれかから誘導される。
【００９１】
改変されたウイルスカプシドは、例えば米国特許第５，８６３，５４１号に記載された「カプシドビヒクル」として使用され得る。改変されたウイルスカプシドによってパッケージングされ得、細胞中に移入され得る分子には、異種ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、有機小分子、金属またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００９２】
異種分子は、ＡＡＶ感染において天然には見出されない分子、例えば、野生型ＡＡＶゲノムによってコードされない分子として規定される。さらに、治療的に有用な分子は、宿主標的細胞中への分子の移入のために、キメラウイルスカプシドの外側と会合し得る。かかる会合した分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、有機小分子、金属、炭水化物、脂質および／またはポリペプチドが含まれ得る。本発明の一実施形態では、治療的に有用な分子は、カプシドタンパク質に共有結合される（即ち、コンジュゲート化または化学的にカップリングされる）。分子を共有結合する方法は、当業者に公知である。
【００９３】
本発明の改変されたウイルスカプシドはまた、新規カプシド構造に対する抗体を惹起するのに用途を見出す。さらなる代替として、外因性アミノ酸配列は、細胞への抗原提示のために、例えば、外因性アミノ酸配列に対する免疫応答を生じるために対象に投与するために、改変されたウイルスカプシド中に挿入され得る。
【００９４】
他の実施形態では、ウイルスカプシドは、対象のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする核酸を送達するウイルスベクターの投与の前および／または同時に（例えば、互いに数分以内または数時間以内）、特定の細胞部位を遮断するために投与され得る。例えば、本発明のカプシドは、特定の細胞上の細胞受容体を遮断するために送達され得、遮断された細胞の形質導入を低下させ得、他の標的（例えば、ＣＮＳの前駆細胞および／または神経芽細胞）の形質導入を増強し得る送達ベクターが、その後にまたは同時に投与され得る。
【００９５】
代表的実施形態によれば、改変されたウイルスカプシドは、本発明に従う改変されたウイルスベクターの前および／または同時に対象に投与され得る。さらに、本発明は、本発明の改変されたウイルスカプシドを含む組成物および医薬製剤を提供するが、任意選択的に、この組成物は、本発明の改変されたウイルスベクターもまた含む。
【００９６】
本発明は、本発明の改変されたウイルスカプシドおよびカプシドタンパク質をコードする核酸分子（任意選択的に、単離された核酸分子）もまた提供する。核酸分子を含むベクター、ならびに本発明の核酸分子および／またはベクターを含む細胞（インビボまたは培養物中）がさらに提供される。適切なベクターには、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、バキュロウイルスなど）、プラスミド、ファージ、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが含まれるがこれらに限定されない。かかる核酸分子、ベクターおよび細胞は、例えば、本明細書中に記載される改変されたウイルスカプシドまたはウイルスベクターの生成のための試薬（例えば、ヘルパーパッケージング構築物またはパッケージング細胞）として使用され得る。
【００９７】
本発明に従うウイルスカプシドは、例えばバキュロウイルスからの発現によるなどの、当該分野で公知の任意の方法を使用して生成され得る（Ｂｒｏｗｎら、（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９８：４７７〜４８８頁）。
【００９８】
本発明に従うＡＡＶカプシドタンパク質への改変は、「選択的」改変である。このアプローチは、ＡＡＶ血清型間のサブユニット全体または大きいドメインのスワップを用いる以前の研究とは対照的である（例えば、国際特許公開公報ＷＯ  ００／２８００４およびＨａｕｃｋら、（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７７：２７６８〜２７７４頁を参照のこと）。特定の実施形態では、「選択的」改変は、約２０、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４または３個未満の連続アミノ酸の挿入および／または置換および／または欠失を生じる。
【００９９】
本発明の改変されたカプシドタンパク質およびカプシドは、現在公知のまたは後に同定される任意の他の改変をさらに含み得る。
【０１００】
例えば、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスカプシドは、例えば、国際特許公開公報ＷＯ  ００／２８００４号に記載されるように、別のウイルス、任意選択的に別のパルボウイルスまたはＡＡＶ由来のカプシドサブユニットの全てまたは一部を含み得るという意味で、キメラであり得る。
【０１０１】
ウイルスカプシドは、ウイルスカプシドを所望の標的組織（複数可）上に存在する細胞表面分子と相互作用するよう方向付ける標的化配列（例えば、ウイルスカプシド中に置換または挿入されたもの）を含む標的化ウイルスカプシドであり得る（例えば、国際特許公開公報ＷＯ  ００／２８００４号およびＨａｕｃｋら、（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７７：２７６８〜２７７４頁）；Ｓｈｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：３５３〜３６１頁（２００６）［ＡＡＶカプシドサブユニットの５２０位および／または５８４位におけるインテグリン受容体結合モチーフＲＧＤの挿入を記載している］；および米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２カプシドサブユニットのアミノ酸４４７位、５３４位、５７３位および５８７位の後にＲＧＤモチーフを含むＰ１ペプチドの挿入を記載している］を参照のこと）。挿入を許容するＡＡＶカプシドサブユニット内の他の位置は当該分野で公知である（例えば、Ｇｒｉｆｍａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：９６４〜９７５頁（２００１）に記載される４４９位および５８８位）。
【０１０２】
例えば、いくつかの本発明のウイルスカプシドは、対象の殆どの標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞および／または肺）に向かう比較的非効率なトロピズムを有する。標的化配列は、これらの低形質導入ベクター中に有利に組み込まれ得、それにより、所望のトロピズムおよび任意選択的に特定の組織（複数可）に対する選択的トロピズムをウイルスカプシドに付与する。標的化配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質、カプシドおよびベクターは、例えば国際特許公開公報ＷＯ  ００／２８００４号中に記載されている。別の可能性として、低形質導入ベクターを所望の標的組織（複数可）に再方向付けする手段として、Ｗａｎｇら（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５〜４９頁（２００６））に記載される１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸が、直交部位においてＡＡＶカプシドサブユニット中に組み込まれ得る。これらの非天然アミノ酸は、グリカン（マンノース−樹状細胞標的化）；特定のがん細胞型への標的化送達のためのＲＧＤ、ボンベシンまたはニューロペプチド；増殖因子受容体、インテグリンなどの特定の細胞表面受容体に標的化されたファージディスプレイから選択されるＲＮＡアプタマーまたはペプチドが含まれるがこれらに限定されない対象の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結するために有利に使用され得る。アミノ酸を化学的に改変する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６を参照のこと）。
【０１０３】
代表的実施形態では、標的化配列は、特定の細胞型（複数可）への感染を指向するウイルスカプシド配列（例えば、自律的パルボウイルスカプシド配列、ＡＡＶカプシド配列または任意の他のウイルスカプシド配列）であり得る。
【０１０４】
別の非限定的な例として、ヘパリン結合ドメイン（例えば、ＲＳウイルスヘパリン結合ドメイン）が、得られた変異体にヘパリン結合を付与するために、典型的にはＨＳ受容体に結合しないカプシドサブユニット（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）中に挿入または置換され得る。
【０１０５】
Ｂ１９は、その受容体としてグロボシドを使用する初代赤血球前駆細胞に感染する（Ｂｒｏｗｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１１４頁）。Ｂ１９の構造は、８Åの分解能まで決定されている（Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０３：１０６頁）。グロボシドに結合するＢ１９カプシドの領域は、アミノ酸３９９〜４０６の間（Ｃｈａｐｍａｎら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９４：４１９頁）、βバレル構造ＥとＦとの間のループアウト（ｌｏｏｐｅｄ  ｏｕｔ）領域（Ｃｈｉｐｍａｎら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７５０２頁）にマップされている。従って、Ｂ１９カプシドのグロボシド受容体結合ドメインは、それを含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターを赤血球細胞に標的化するために、ＡＡＶカプシドタンパク質中に置換され得る。
【０１０６】
代表的実施形態では、外因性標的化配列は、改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターのトロピズムを変更するペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、標的化ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するものであってもよく、あるいは完全にまたは部分的に合成であってもよい。例示的な標的化配列には、細胞表面受容体および糖タンパク質に結合するリガンドおよび他のペプチド、例えば、ＲＧＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩなど）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、α、βまたはγ）、ニューロペプチドおよびエンドルフィンなど、ならびにそれらの同族受容体へと細胞を標的化する能力を保持したその断片が含まれる。他の例示的なペプチドおよびタンパク質には、サブスタンスＰ、ケラチノサイト増殖因子、ニューロペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン、β−エンドルフィン、ロイシンエンケファリン、リモルフィン、α−ネオエンケファリン、アンジオテンシン、ニューマジン（ｐｎｅｕｍａｄｉｎ）、血管作用性腸ペプチド、ニューロテンシン、モチリン、および上記のようなそれらの断片が含まれる。なおさらなる代替として、毒素（例えば、破傷風毒素または蛇毒、例えば、α−ブンガロトキシンなど）由来の結合ドメインが、標的化配列としてカプシドタンパク質中に置換され得る。なおさらなる代表的実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｃｌｅｖｅｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：Ｒ３１８（１９９７））に記載される「非典型的」インポート／エクスポートシグナルペプチド（例えば、線維芽細胞増殖因子−１および−２、インターロイキン１、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質など）によるＡＡＶカプシドタンパク質中への置換によって改変され得る。特定の細胞による取込みを方向付けるペプチドモチーフもまた包含され、例えば、ＦＶＦＬＰペプチドモチーフは、肝臓細胞による取込みを誘発する。
【０１０７】
ファージディスプレイ技術ならびに当該分野で公知の他の技術が、対象の任意の細胞型を認識するペプチドを同定するために使用され得る。
【０１０８】
標的化配列は、受容体（例えば、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質またはプロテオグリカン）を含む、細胞表面結合部位に標的化する任意のペプチドをコードし得る。細胞表面結合部位の例としては、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸および他のグリコサミノグリカン、シアル酸部分、ポリシアル酸部分、糖タンパク質、およびガングリオシド、ＭＨＣ  Ｉ糖タンパク質、マンノース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フコース、ガラクトースを含めた、膜糖タンパク質上に見出される炭水化物成分などが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０９】
なおさらなる代替として、標的化配列は、細胞中への進入を標的化する別の分子への化学的カップリングのために使用され得る（例えば、そのＲ基を介して化学的にカップリングされ得るアルギニンおよび／またはリシン残基を含み得る）ペプチドであり得る。
【０１１０】
本発明の上述の実施形態は、本明細書中に記載されるように細胞または対象に異種核酸を送達するために使用され得る。従って、一実施形態では、本発明は、細胞を本発明のウイルスベクターおよび／または組成物と接触させるステップを含む、細胞中に核酸分子を導入する方法を提供する。
【０１１１】
さらに、本発明のウイルスベクターおよび／または本発明の組成物を対象に投与するステップを含む、対象に核酸分子を送達する方法が本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、このウイルスベクターまたは組成物は、対象の中枢神経系に投与される。
【０１１２】
さらに、細胞を本発明のウイルスベクターおよび／または本発明の組成物と接触させるステップを含む、表面上にポリシアル酸を有する細胞を選択的に形質導入する方法が本明細書中で提供される。
【０１１３】
本発明は、前駆細胞および／または神経芽細胞を本発明のウイルスベクターと接触させるステップを含み、このウイルスベクターが目的の核酸分子を含む、目的の核酸分子を中枢神経系の前駆細胞および／または神経芽細胞に送達する方法をさらに提供する。この方法のいくつかの実施形態では、目的の核酸分子は、治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする。
【０１１４】
上記方法のいくつかの実施形態では、表面上にポリシアル酸を有する細胞、中枢神経系の前駆細胞および／または神経芽細胞は、対象中にあり得、いくつかの実施形態では、この対象はヒト対象であり得る。
【０１１５】
本発明は、本発明のウイルスベクターを対象に投与するステップを含み、このウイルスベクターが、神経学的障害または欠損を治療することにおいて有効な治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする核酸分子を含む、対象において神経学的障害または欠損を治療する方法をさらに提供する。この方法のいくつかの実施形態では、このウイルスベクターは、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃａｌ）、大槽内、脳実質内、頭蓋内および／または髄腔内経路を介して投与される。
【０１１６】
さらなる実施形態では、本発明は、細胞を、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質を含むウイルスベクターと接触させるステップを含み、このカプシドタンパク質が、Ｋ４９２、Ｋ５０３およびＮ５８５における変異を含む、表面上にポリシアル酸を有する細胞を選択的に形質導入する方法を提供する。
【０１１７】
また、前駆細胞および／または神経芽細胞を、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質を含むウイルスベクターと接触させるステップを含み、このカプシドタンパク質が、Ｋ４９２、Ｋ５０３およびＮ５８５における変異を含み、このウイルスベクターが、目的の核酸分子を含む、目的の核酸分子（ＮＯＩ）を中枢神経系の前駆細胞および／または神経芽細胞に送達する方法が本明細書中で提供される。この方法のいくつかの実施形態では、目的の核酸分子は、治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードし得、いくつかの実施形態では、この中枢神経系の前駆細胞および／または神経芽細胞は、対象中にあり得る。
【０１１８】
この方法のさらなる実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質を含むウイルスベクターを対象に投与するステップを含み、このカプシドタンパク質が、Ｋ４９２、Ｋ５０３およびＮ５８５における変異を含み、このウイルスベクターが、神経学的障害または欠損を治療することにおいて有効な治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする核酸分子を含む、対象において神経学的障害または欠損を治療する方法が提供される。この方法のいくつかの実施形態では、このウイルスベクターは、脳室内、大槽内、脳実質内、頭蓋内および／または髄腔内経路を介して投与される。この方法のいくつかの実施形態では、この対象はヒト対象である。
【０１１９】
いくつかのＡＡＶカプシドタンパク質について、対応するアミノ酸位置が、ウイルス中に部分的にまたは完全に存在するかどうか、あるいは完全に存在していないかに依存して、対応する改変が挿入および／または置換となることを、当業者は理解するであろう。同様に、ＡＡＶ４以外のＡＡＶを改変する場合、特定のアミノ酸位置（複数可）は、ＡＡＶ４中の位置とは異なる位置であり得る（例えば、ＡＡＶ４中のＳ２５７に対応するアミノ酸残基の代表的例を示す表４を参照のこと）。本明細書中の別の箇所で考察するように、対応するアミノ酸位置（複数可）は、周知の技術を使用して当業者に容易に明らかとなろう。
【０１２０】
上記改変は、互いに組み合わせて、および／あるいは現在公知のまたは後に発見される任意の他の改変と組み合わせて、本発明のカプシドタンパク質またはカプシド中に取り込まれ得る。
【０１２１】
【表４】
2018503376.tif 000008
【０１２２】
本発明は、本発明の改変されたカプシドタンパク質およびカプシドを含むウイルスベクターもまた包含する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスカプシドおよび／またはベクターゲノムを含んでいる）、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶカプシドおよび／またはベクターゲノムを含んでいる）である。代表的実施形態では、ウイルスベクターは、本発明の改変されたカプシドサブユニットを含む改変されたＡＡＶカプシドとベクターゲノムとを含む。
【０１２３】
例えば、代表的実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）本発明の改変されたカプシドタンパク質を含む改変されたウイルスカプシド（例えば、改変されたＡＡＶカプシド）と、（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶ−ＴＲ）を含む核酸とを含み、この末端反復配列を含む核酸は、改変されたウイルスカプシドによってカプシド封入されている。核酸は、２つの末端反復（例えば、２つのＡＡＶ−ＴＲ）を任意選択的に含み得る。
【０１２４】
代表的実施形態では、ウイルスベクターは、対象のタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする異種核酸分子を含む組換えウイルスベクターである。組換えウイルスベクターは、以下により詳細に記載される。
【０１２５】
本発明の改変されたカプシドタンパク質、ウイルスカプシドおよびウイルスベクターは、そのネイティブ状態において特定の位置に示されたアミノ酸を有するカプシドタンパク質、カプシドおよびウイルスベクター（即ち、変異体ではない）を排除することが、当業者に理解されるであろう。
【０１２６】
＜ウイルスベクターを生成する方法＞
本発明は、本発明のウイルスベクターを生成する方法をさらに提供する。１つの代表的実施形態では、本発明は、ウイルスベクターを生成する方法を提供し、この方法は、（ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ−ＴＲ配列）を含む核酸鋳型と、（ｂ）核酸鋳型の複製およびＡＡＶカプシド中へのカプシド封入に充分なＡＡＶ配列（例えば、本発明のＡＡＶカプシドをコードするＡＡＶのｒｅｐ配列およびＡＡＶのｃａｐ配列）とを、細胞に提供するステップを含む。任意選択的に、核酸鋳型は、少なくとも１つの異種核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、核酸鋳型は２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含み、これらは、（存在する場合）異種核酸配列に対して５’側および３’側に位置するが、異種核酸配列と直接隣接している必要はない。
【０１２７】
核酸鋳型ならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた核酸鋳型を含むウイルスベクターが細胞中で生成されるような条件下で提供される。この方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含み得る。ウイルスベクターは、培地からおよび／または細胞を溶解することによって回収され得る。
【０１２８】
細胞は、ＡＡＶウイルスの複製を許容する細胞であり得る。当該分野で公知の任意の適切な細胞が使用され得る。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能を提供するトランス補完性（ｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完性細胞であり得る。
【０１２９】
ＡＡＶ複製およびカプシド配列は、当該分野で公知の任意の方法によって提供され得る。現在のプロトコールは典型的に、単一のプラスミド上のＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、一緒に提供される必要はないが、一緒に提供するのが簡便であり得る。ＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失型アデノウイルスベクターのＥ１ａ領域またはＥ３領域中に挿入される）。ＥＢＶベクターもまた、ＡＡＶのｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現するために使用され得る。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであるが、連続的な細胞分裂の間中、高コピー数をなおも維持することである（即ち、「ＥＢＶベースの核エピソーム（ＥＢＶ  ｂａｓｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｐｉｓｏｍｅ）」と称される染色体外エレメントとして細胞中に安定に組み込まれる、Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７頁を参照のこと）。
【０１３０】
さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞中に安定に取り込まれ得る。
【０１３１】
典型的には、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防止するために、ＴＲと隣接していない。
【０１３２】
核酸鋳型は、当該分野で公知の任意の方法を使用して細胞に提供され得る。例えば、鋳型は、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施形態では、核酸鋳型は、ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失型アデノウイルスのＥ１ａ領域またはＥ３領域中に挿入される）。別の説明として、Ｐａｌｏｍｂｏら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：５０２５頁は、ＡＡＶ−ＴＲが隣接するレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターを記載している。ＥＢＶベクターもまた、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上記したように、鋳型を送達するために使用され得る。
【０１３３】
別の代表的実施形態では、核酸鋳型は、複製するｒＡＡＶウイルスによって提供される。なお他の実施形態では、核酸鋳型を含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体中に安定に組み込まれる。
【０１３４】
ウイルス力価を増強するために、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が、細胞に提供され得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当該分野で公知である。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルス配列またはヘルペスウイルス配列は、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：１２９５頁、ならびに米国特許第６，０４０，１８３号および同第６，０９３，５７０号によって記載されるような、効率的なＡＡＶ生成を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって提供され得る。
【０１３５】
さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体中に埋め込まれたまたは安定な染色体外エレメントとして維持されるヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン中にパッケージングすることはできない、例えば、ヘルパーウイルス配列にＴＲは隣接していない。
【０１３６】
単一のヘルパー構築物上のＡＡＶ複製およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であり得ることを、当業者は理解するであろう。このヘルパー構築物は、非ウイルス構築物でもウイルス構築物でもよい。１つの非限定的説明として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。
【０１３７】
１つの特定の実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、核酸鋳型をさらに含み得る。ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルスの欠失した領域（例えば、Ｅ１ａ領域またはＥ３領域）中に挿入され得る。
【０１３８】
さらなる実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施形態によれば、ｒＡＡＶ鋳型は、プラスミド鋳型として提供され得る。
【０１３９】
別の例示的実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、ｒＡＡＶ鋳型は、プロウイルスとして細胞中に取り込まれる。あるいは、ｒＡＡＶ鋳型は、染色体外エレメント（例えば、ＥＢＶベースの核エピソーム）として細胞内で維持されるＥＢＶベクターによって提供される。
【０１４０】
さらなる例示的な実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ｒＡＡＶ鋳型は、別個の複製するウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ｒＡＡＶ鋳型は、ｒＡＡＶ粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。
【０１４１】
上述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは典型的に、アデノウイルスの複製およびパッケージングに充分なアデノウイルスの５’および３’のシス配列（即ち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列および存在する場合にはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルス骨格中に埋め込まれ、５’および３’のシス配列がそれに隣接しており、その結果これらの配列は、アデノウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。上記のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列には一般に、これらの配列がＡＡＶビリオン中にパッケージングされないように、ＴＲが隣接していない。
【０１４２】
Ｚｈａｎｇら（（２００１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１８：７０４〜１２頁）は、アデノウイルスならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーを記載している。
【０１４３】
ヘルペスウイルスもまた、ＡＡＶパッケージング法においてヘルパーウイルスとして使用され得る。ＡＡＶのｒｅｐタンパク質（複数可）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、拡大縮小可能なＡＡＶベクター生成スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ−２  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）ベクターが、Ｃｏｎｗａｙら（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：９８６頁およびＷＯ  ００／１７３７７号に記載されている。
【０１４４】
さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えばＵｒａｂｅら（２００２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：１９３５〜４３頁によって記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するためのバキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞中で生成され得る。
【０１４５】
混入するヘルパーウイルスを含まないＡＡＶベクターストックは、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得る。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に識別され得る。ＡＡＶはまた、ヘパリン基質に対する親和性に基づいて、ヘルパーウイルスから分離され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：９７３頁）。任意の混入するヘルパーウイルスが複製コンピテントにならないように、欠失型複製欠損ヘルパーウイルスが使用され得る。アデノウイルス初期遺伝子発現のみがＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するために必要なので、さらなる代替として、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーが使用され得る。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス変異体は当該分野で公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。
【０１４６】
＜組換えウイルスベクター＞
本発明のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボおよびインビボで細胞に核酸を送達するために有用である。特に、ウイルスベクターは、哺乳動物を含む動物、細胞に核酸を送達または移入するために有利に使用され得る。
【０１４７】
対象の任意の異種核酸配列（複数可）は、本発明のウイルスベクター中で送達され得る。対象の核酸には、治療的（例えば、医療用途または獣医学用途のため）もしくは免疫原性（例えば、ワクチンのため）タンパク質を含むポリペプチドおよび／または機能的もしくは治療的ＲＮＡ分子をコードする核酸が含まれる。
【０１４８】
治療的ポリペプチドには嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＦＴＲ））、ジストロフィン（ミニジストロフィンおよびマイクロジストロフィン）が含まれる、例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５：１３０頁；米国特許公開公報２００３０１７１３１号；国際公開公報ＷＯ／２００８／０８８８９５号、Ｗａｎｇら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３７１４〜１３７１９頁（２０００）；およびＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃら  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７〜６４頁（２００８）を参照のこと）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：３４９頁）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α１−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子−３および−４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）タンパク質［ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦが含まれる］、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子−αおよび−βなど）、リソソーム酸α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死増殖因子α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウムハンドリングをモジュレートする分子（例えば、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＰＰ１のインヒビター１およびそれらの断片［例えば、ＷＯ  ２００６／０２９３１９号およびＷＯ  ２００７／１００４６５号］）、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子、ＩＲＡＰなどの抗炎症性因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体が含まれる；例示的なＭａｂは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｍａｂである）、ニューロペプチドおよびその断片（例えば、ガラニン、ニューロペプチドＹ（米国特許第７，０７１，１７２号を参照のこと）、バソヒビンな��の血管新生インヒビターならびに他のＶＥＧＦインヒビター（例えば、バソヒビン２［ＷＯ  ＪＰ２００６／０７３０５２号を参照のこと］）が含まれるがこれらに限定されない。他の例示的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ−リガンド、およびそれを必要とする対象において治療効果を有する任意の他のポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターは、モノクローナル抗体および抗体断片、例えば、ミオスタチンに対する抗体または抗体断片を送達するためにも使用され得る（例えば、Ｆａｎｇら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：５８４〜５９０頁（２００５）を参照のこと）。
【０１４９】
ポリペプチドをコードする異種核酸配列には、レポーターポリペプチド（例えば酵素）をコードする異種核酸配列が含まれる。レポーターポリペプチドは当該分野で公知であり、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。
【０１５０】
任意選択的に、異種核酸は、分泌型ポリペプチド（例えば、そのネイティブ状態で分泌型ポリペプチドであるポリペプチド、または例えば当該分野で公知の分泌シグナル配列との作動可能な関連によって分泌されるように操作されたポリペプチド）をコードする。
【０１５１】
あるいは、本発明の特定の実施形態では、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライソソーム媒介性のトランススプライシングをもたらすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４頁６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照のこと）、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２４３１頁を参照のこと）および「ガイド」ＲＮＡなどの他の非翻訳ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４９２９頁；Ｙｕａｎらに対する米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードし得る。例示的な非翻訳ＲＮＡには、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または化学療法による損傷を予防するために心臓に投与するため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／または予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を治療するため、例えば、Ａｎｄｉｎｏら  Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１０：１３２〜１４２頁（２００８）およびＬｉら  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ．２６：５１〜５５頁（２００５）を参照のこと）；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子（例えば、心血管疾患を治療するため、例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａら  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４〜８７１頁（２００２）を参照のこと）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、癲癇のため）、ならびに病原性生物およびウイルス（例えば、Ｂ型および／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスなど）に対するＲＮＡｉが含まれる。
【０１５２】
さらに、選択的スプライシングを指示する核酸配列が送達され得る。説明するために、ストロフィンエクソン５１の５’および／または３’スプライス部位に相補的なアンチセンス配列（または他の阻害配列）が、このエクソンの読み飛ばしを誘導するためにＵ１またはＵ７低分子核内（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターと合わせて送達され得る。例えば、アンチセンス／阻害配列（複数可）に対して５’側に位置するＵ１またはＵ７  ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列は、本発明の改変されたカプシド中にパッケージングされて送達され得る。
【０１５３】
ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有し、宿主染色体上の遺伝子座と組み換わる異種核酸もまた含み得る。このアプローチは、例えば、宿主細胞中の遺伝的欠陥を修正するために利用され得る。
【０１５４】
本発明は、例えばワクチン接種のための免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベクターもまた提供する。核酸は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶのｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原など由来の免疫原が含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の対象の任意の免疫原をコードし得る。
【０１５５】
ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は当該分野で公知である（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：８５０７頁；Ｙｏｕｎｇらに対する米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａらに対する米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，８６３，５４１号を参照のこと）。抗原は、パルボウイルスカプシド中に存在し得る。あるいは、抗原は、組換えベクターゲノム中に導入された異種核酸から発現され得る。本明細書中に記載されるおよび／または当該分野で公知の対象の任意の免疫原は、本発明のウイルスベクターによって提供され得る。
【０１５６】
免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を惹起するのに適した、ならびに／または微生物、細菌、原生動物、寄生生物、真菌および／もしくはウイルスの感染および疾患が含まれるがこれらに限定されない感染および／もしくは疾患に対して対象を保護するのに適した任意のポリペプチドであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原などの、インフルエンザウイルス免疫原）もしくはレンチウイルス免疫原（例えば、ＨＩＶもしくはＳＩＶのエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＩＶのマトリックス／カプシドタンパク質ならびにＨＩＶもしくはＳＩＶのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物などの、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原）であり得る。免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス核カプシドタンパク質およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質などのラッサ熱ウイルス免疫原）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物などのワクシニアウイルス免疫原）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子産物などの、エボラウイルス免疫原またはマールブルグウイルス免疫原）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦおよび／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質などの感染性ヒトコロナウイルス免疫原、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原またはトリ感染性気管支炎ウイルス免疫原）でもあり得る。免疫原性ポリペプチドはさらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）ムンプス免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）免疫原、および／または当該分野で現在公知のまたは免疫原として後に同定される任意の他のワクチン免疫原であり得る。
【０１５７】
あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍細胞またはがん細胞の抗原であり得る。任意選択的に、腫瘍抗原またはがん抗原は、がん細胞の表面上に発現される。例示的ながんおよび腫瘍細胞の抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２８１頁（１９９１））に記載されている。他の例示的ながん抗原および腫瘍抗原には、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、β−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３５１５頁；Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７頁；Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３１２４頁）、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００  ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ−１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９頁）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＮＳＥ、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ−１、ＣＡ７２−４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ−ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ、（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３頁）；ムチン抗原（国際特許公開公報ＷＯ  ９０／０５１４２号）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；および／あるいは現在公知のまたは以下のがんに関連することが後に発見される抗原：メラノーマ、腺癌腫、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がん、および現在公知のまたは後に同定される任意の他のがんまたは悪性状態（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１〜９１頁を参照のこと）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１５８】
さらなる代替として、異種核酸は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで細胞中において生成されることが望ましい任意のポリペプチドをコードし得る。例えば、ウイルスベクターは、培養細胞中に導入され得、発現された遺伝子産物がそこから単離される。
【０１５９】
対象の異種核酸（複数可）が適切な制御配列と作動可能に関連し得ることが、当業者に理解されよう。例えば、異種核酸は、発現制御エレメント、例えば転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどと、作動可能に関連し得る。
【０１６０】
さらに、対象の異種核酸（複数可）の調節された発現は、転写後レベルで、例えば、オリゴヌクレオチド、小分子および／または特定の部位におけるスプライシング活性を選択的に遮断する他の化合物（例えば、ＷＯ  ２００６／１１９１３７号に記載される）の存在または非存在によって、異なるイントロンの選択的スプライシングを調節することによって、達成され得る。
【０１６１】
種々のプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望されるレベルおよび組織特異的発現に依存して使用され得ることを、当業者は理解するであろう。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに依存して、構成的または誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であり得、天然配列または合成配列であり得る。外来とは、転写開始領域が、その転写開始領域が導入される野生型宿主において見出されないものであることを意図する。
【０１６２】
特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象にとってネイティブであり得る。代表的実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列にとってネイティブであり得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは一般に、対象の標的細胞（複数可）において機能するように選択される。さらに、特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的でも誘導性でもよい。
【０１６３】
誘導性発現制御エレメントは典型的に、異種核酸配列（複数可）の発現の調節を提供することが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的プロモーター／エンハンサーエレメントまたは好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントであり得、筋特異的または好ましい（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好ましいものが含まれる）、神経組織特異的または好ましい（脳特異的または好ましいものが含まれる）、眼特異的または好ましい（網膜特異的および角膜特異的なものが含まれる）、肝臓特異的または好ましい、骨髄特異的または好ましい、膵臓特異的または好ましい、脾臓特異的または好ましい、および肺特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントが含まれる。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、ホルモン誘導性エレメントおよび金属誘導性エレメントが含まれる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６４】
異種核酸配列（複数可）が標的細胞において転写され、次いで翻訳される実施形態では、特異的開始シグナルが一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために含まれる。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得るこれらの外因性翻訳制御配列は、天然および合成の両方の、種々の起源のものであり得る。
【０１６５】
本発明に従うウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範な細胞中に異種核酸を送達する手段を提供する。ウイルスベクターは、例えば、インビトロでポリペプチドを生成するために、またはエクスビボの遺伝子療法のために、対象の核酸をインビトロで細胞に送達するために使用され得る。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性もしくは治療的ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを発現するために、それを必要とする対象に核酸を送達する方法において、さらに有用である。この様式で、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡは、対象中においてインビボで生成され得る。対象は、ポリペプチドの欠乏症を有するので、そのポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチドまたは機能的ＲＮＡの生成は、いくらかの有益な効果を付与し得るので、この方法が実施され得る。
【０１６６】
ウイルスベクターは、（例えば、スクリーニング方法と合わせて、例えばポリペプチドを生成するためまたは対象に対する機能的ＲＮＡの影響を観察するためのバイオリアクタとして対象を使用して）培養細胞または対象において対象のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを生成するためにも使用され得る。
【０１６７】
一般に、本発明のウイルスベクターは、治療的ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを送達することが有利な任意の疾患状態を治療および／または予防するために、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする異種核酸を送達するために使用され得る。例示的な疾患状態には、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質）および他の肺の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β−グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β−インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復を除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、癲癇（ガラニン、神経栄養因子）および他の神経学的障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ−リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ、ｍｉｒ−２６ａ［例えば、肝細胞癌腫のため］）、真正糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エクソン読み飛ばしを誘導するためのジストロフィン遺伝子中のスプライスジャンクションに対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ［例えば、ＷＯ／２００３／０９５６４７号を参照のこと］、エクソン読み飛ばしを誘導するためのＵ７  ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＷＯ／２００６／０２１７２４号を参照のこと］、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片）およびベッカー型を含む筋ジストロフィー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠乏症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原貯蔵疾患（例えば、ファブリー病［α−ガラクトシダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］）および他の代謝障害、先天性肺気腫（α１−アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（Ｔａｙ  Ｓａｃｈｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸脱水素酵素）、網膜変性疾患（ならびに眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症についてＰＤＧＦ、および／あるいは例えばＩ型糖尿病における網膜障害を治療／予防するためのバソヒビンもしくはＶＥＧＦの他のインヒビターまたは他の血管新生インヒビター）、固形臓器の疾患、例えば脳（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、膠芽腫［エンドスタチン、アンジオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］が含まれる）、肝臓、腎臓、うっ血性心不全また���末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む心臓（例えば、プロテインホスファターゼインヒビターＩ（Ｉ−１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２アドレナリン受容体、β２アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子などを送達することによる）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（インスリン様増殖因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することによる）、心臓移植物の生存の改善（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎臓欠損症（ｋｉｄｎｅｙ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体などの抗炎症性因子）、肝炎（α−インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠乏症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄性大脳性運動失調症（ｓｐｉｎａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｔａｘｉａｓ）、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患などが含まれるがこれらに限定されない。本発明はさらに、移植の成功率を増加させるためおよび／または臓器移植もしくは補助療法の負の副作用を低下させるために、臓器移植後に使用され得る（例えば、サイトカイン生成を遮断するために免疫抑制剤または阻害核酸を投与することによって）。別の例として、骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）が、例えば、がん患者における破壊（ｂｒｅａｋ）または外科的除去後に、骨同種移植片と共に投与され得る。
【０１６８】
本発明は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を生成するためにも使用され得る。例えば、本発明のウイルスベクターは、例えば成人線維芽細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞などの非多能性細胞中に、幹細胞関連核酸（複数可）を送達するために使用され得る。幹細胞に関連する因子をコードする核酸は、当該分野で公知である。かかる幹細胞および多能性に関連する因子の非限定的な例には、Ｏｃｔ−３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３および／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４および／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよび／またはＮ−ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８が含まれる。
【０１６９】
本発明は、癲癇、脳卒中、外傷性脳損傷、認知障害、行動障害、精神障害、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および軸索／ニューロン再生もしくは修復から利益を得うるまたは軸索／ニューロン再生もしくは修復を必要とし得る任意の他の神経変性状態を治療および／または予防するためにも実施され得る。
【０１７０】
特定の実施形態では、本発明は、例えば、幹細胞分化因子および再プログラム因子、例えば、ＦｏｘＪ１、Ｆｏｘ２、ＮｅｕｒｏＤ２、ＮＧ２もしくはＯｌｉｇ２および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−１３７、ＭｉＲ１２４、ならびにニューロンの発生および分化に関与する任意の他の因子またはｍｉＲＮＡの標的化調節または過剰発現によって、軸索再生およびニューロン修復を促進し、回路を再建し、ならびに／または失われたニューロンを矯正療法として補充するために、実施され得る。
【０１７１】
遺伝子移入は、疾患状態のための療法を理解および提供するためのかなり有望な用途を有する。欠損した遺伝子が既知でありクローニングされている多数の遺伝性疾患が存在する。一般に、上記疾患状態は２つのクラスに入る：（劣性様式で一般に遺伝する、多くは酵素の）欠乏状態、および（調節タンパク質または構造タンパク質が関与し得、典型的には優性様式で遺伝する）バランスを欠いた状態。欠乏状態の疾患について、遺伝子移入は、補充療法のために罹患組織中に正常な遺伝子をもたらすため、ならびにアンチセンス変異を使用して疾患の動物モデルを創出するために使用され得る。バランスを欠いた疾患状態について、遺伝子移入は、モデル系において疾患状態を創出するために使用され得、このモデル系は次いで疾患状態に対抗するための試みにおいて使用され得る。従って、本発明に従うウイルスベクターは、遺伝疾患の治療および／または予防を可能にする。
【０１７２】
本発明に従うウイルスベクターは、機能的ＲＮＡをインビトロまたはインビボで細胞に提供するためにも使用され得る。細胞における機能的ＲＮＡの発現は、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を減殺し得る。従って、機能的ＲＮＡは、それを必要とする対象において特定のタンパク質の発現を減少させるために投与され得る。機能的ＲＮＡはまた、遺伝子発現および／または細胞生理学を調節するため、例えば、細胞もしくは組織培養系を最適化するために、またはスクリーニング方法において、インビトロで細胞に投与され得る。
【０１７３】
さらに、本発明に従うウイルスベクターは、診断方法およびスクリーニング方法において用途を見出し、それにより、対象の核酸が、細胞培養系において、あるいはトランスジェニック動物モデルにおいて、一過的にまたは安定に発現される。
【０１７４】
本発明のウイルスベクターは、当業者に明らかなように、遺伝子の標的化、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコールにおける使用が含まれるがこれらに限定されない種々の非治療的目的のためにも使用され得る。ウイルスベクターは、安全性（伝播、毒性、免疫原性など）を評価する目的のためにも使用され得る。かかるデータは、例えば、臨床的有効性の評価の前に、通常の承認プロセスの一部として、米国食品医薬品局によって検討される。
【０１７５】
さらなる態様として、本発明のウイルスベクターは、対象において免疫応答を生成するために使用され得る。この実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクターが対象に投与され得、その免疫原性ポリペプチドに対する能動免疫応答が、対象によって開始される。免疫原性ポリペプチドは、本明細書中で上記したとおりである。いくつかの実施形態では、防御免疫応答が惹起される。
【０１７６】
あるいは、ウイルスベクターは、エクスビボで細胞に投与され得、変更された細胞が対象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクターが細胞中に導入され、その細胞が対象に投与され、ここで、免疫原をコードする異種核酸が発現され得、対象においてその免疫原に対する免疫応答を誘導し得る。特定の実施形態では、細胞は抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。
【０１７７】
「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原との遭遇後の宿主組織および細胞の関与」を特徴とし、「これは、抗体の合成もしくは細胞媒介反応性の発生またはそれら両方を導く、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖に関与する。」Ｈｅｒｂｅｒｔ  Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ  ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ  １１７（Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ編、１９８５）。代替的に述べると、能動免疫応答は、感染またはワクチン接種による免疫原への曝露後に宿主によって開始される。能動免疫は受動免疫と対比され得、受動免疫は、「能動免疫された宿主から非免疫宿主への、予め形成された物質（抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インターロイキン−２）の移入」を介して達成される（同文献）。
【０１７８】
「防御」免疫応答または「防御」免疫は、本明細書中で使用される場合、疾患の発生率を予防するまたは低下させるという点で、免疫応答が対象にいくらかの利益を付与することを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特にがんまたは腫瘍の治療および／または予防において有用であり得る（例えば、がんまたは腫瘍の形成を予防することによって、がんまたは腫瘍の退縮を引き起こすことによって、および／あるいは転移を予防することによって、および／あるいは転移性小結節の増殖を予防することによって）。防御効果は、治療の利益がその任意の不利益を上回る限り、完全でも部分的でもよい。
【０１７９】
特定の実施形態では、異種核酸を含むウイルスベクターまたは細胞は、以下に記載される免疫原的有効量で投与され得る。
【０１８０】
本発明のウイルスベクターは、１つまたは複数のがん細胞抗原（または免疫学的に類似の分子）あるいはがん細胞に対する免疫応答を生成する任意の他の免疫原を発現するウイルスベクターの投与によるがん免疫療法のためにも投与され得る。説明するために、例えば、がんを有する患者を治療するために、および／または、対象においてがんの発生を予防するために、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することによって、対象においてがん細胞抗原に対する免疫応答が生成され得る。ウイルスベクターは、本明細書中で記載されるように、インビボでまたはエクスビボ方法を使用することによって対象に投与され得る。あるいは、がん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現され得るか、またはウイルスカプシドと他の方法で関連し得る（例えば、上記されるように）。
【０１８１】
別の代替方法として、当該分野で公知の任意の他の治療的核酸（例えば、ＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）が、がんを治療および／または予防するために投与され得る。
【０１８２】
本明細書中で使用する場合、用語「がん」は、腫瘍形成がんを包含する。同様に、用語「がん性組織」は腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は腫瘍抗原を包含する。
【０１８３】
用語「がん」は、当該分野で理解される意味を有し、例えば、身体の離れた部位に伝播する能力を有する組織の制御されない増殖（即ち、転移）である。例示的ながんには、メラノーマ、腺癌腫、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんならびに現在公知のまたは後に同定される任意の他のがんまたは悪性状態が含まれるが、これらに限定されない。代表的実施形態では、本発明は、腫瘍形成がんを治療および／または予防する方法を提供する。
【０１８４】
用語「腫瘍」もまた、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊として、当該分野で理解される。腫瘍は悪性または良性であり得る。代表的実施形態では、本明細書中に開示される方法は、悪性腫瘍を予防および治療するために使用される。
【０１８５】
用語「がんを治療する」、「がんの治療」および等価な用語は、がんの重症度が低下されもしくは少なくとも部分的に排除されること、ならびに／または疾患の進行が減速されるおよび／もしくは制御されること、ならびに／または疾患が安定化されることを意図する。特定の実施形態では、これらの用語は、がんの転移が予防もしくは低下もしくは少なくとも部分的に排除されること、ならびに／または転移性小結節の増殖が予防もしくは低下もしくは少なくとも部分的に排除されることを示す。
【０１８６】
用語「がんの予防」または「がんを予防する」および等価な用語は、その方法が、がんの発症の発生率および／または重症度を、少なくとも部分的に排除または低下および／または遅延させることを意図する。代替的に述べると、対象におけるがんの発症は、尤度もしくは確率において低下され得る、および／または遅延され得る。
【０１８７】
特定の実施形態では、細胞は、がんを有する対象から取り出され得、本発明に従うがん細胞抗原を発現するウイルスベクターと接触され得る。次いで、改変された細胞が対象に投与され、それにより、がん細胞抗原に対する免疫応答が惹起される。この方法は、インビボで充分な免疫応答を開始できない（即ち、充分な量で促進抗体を生成できない）易感染性対象と共に有利に使用され得る。
【０１８８】
免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、単球走化性因子タンパク質−１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびリンホトキシン）によって増強され得ることが、当該分野で公知である。従って、免疫調節性サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）が、ウイルスベクターと合わせて対象に投与され得る。
【０１８９】
サイトカインは、当該分野で公知の任意の方法によって投与され得る。外因性サイトカインが対象に投与され得るか、あるいはサイトカインをコードする核酸が適切なベクターを使用して対象に送達され得、サイトカインがインビボで生成され得る。
【０１９０】
＜対象、医薬製剤および投与様式＞
本発明に従うウイルスベクターおよびカプシドは、獣医学適用および医療適用の両方において用途を見出す。適切な対象には、トリおよび哺乳動物の両方が含まれる。用語「トリ」には、本明細書中で使用する場合、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコなどが含まれるがこれらに限定されない。用語「哺乳動物」には、本明細書中で使用する場合、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどが含まれるがこれらに限定されない。ヒト対象には、新生児、乳幼児、若年、成人および老人の対象が含まれる。
【０１９１】
代表的実施形態では、対象は、本発明の方法「を必要とする」。
【０１９２】
特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中に本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドを含み、任意選択的に、他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、補助剤、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注射について、担体は典型的には液体である。他の投与方法について、担体は固体または液体のいずれかであり得る。吸入投与について、担体は呼吸用であり、任意選択的に、固体または液体の粒状形態であり得る。
【０１９３】
「薬学的に許容される」とは、毒性でなくその他の点でも望ましくない材料、即ち、その材料が、望ましくない生物学的影響をいずれも引き起こすことなしに対象に投与され得ることを意味する。
【０１９４】
本発明の一態様は、核酸をインビトロで細胞に移入する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適した標準的な形質導入法に従って、適切な感染多重度で細胞中に導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞の型および数、ならびに特定のウイルスベクターに依存して変動し得、過度の実験なしに当業者によって決定され得る。代表的実施形態では、少なくとも約１０３感染単位、任意選択的に少なくとも約１０５感染単位が、細胞に導入される。
【０１９５】
ウイルスベクターが導入される細胞（複数可）は、任意の型の細胞であり得、神経細胞（末梢神経系および中枢神経系の細胞、特に、ニューロンおよびオリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｃｙｔｅ）などの脳細胞が含まれる）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮および角膜細胞が含まれる）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸器の上皮細胞）、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞が含まれる）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞などが含まれるがこれらに限定されない。代表的実施形態では、細胞は任意の前駆細胞であり得る。さらなる可能性として、細胞は幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であり得る。なおさらなる代替として、細胞はがん細胞または腫瘍細胞であり得る。さらに、細胞は、上で示したような任意の種起源であり得る。
【０１９６】
ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞中に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は、対象から取り出されたものであり、ウイルスベクターがその細胞に導入され、次いで、その細胞が対象中に戻し投与される。エクスビボでの操作のために対象から細胞を取り出し、その後、対象中に戻し導入する方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）。あるいは、組換えウイルスベクターは、ドナー対象由来の細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の適切な供給源由来の細胞中に導入され得、この細胞が、それを必要とする対象（即ち、「レシピエント」対象）に投与される。
【０１９７】
エクスビボ核酸送達に適した細胞は上記のとおりである。対象に投与する細胞の投薬量は、対象の年齢、状態および種、細胞の型、細胞が発現する核酸、投与様式などに応じて変動する。典型的には、少なくとも約１０２〜約１０８細胞または少なくとも約１０３〜約１０６細胞が、１投薬当たり薬学的に許容される担体中で投与される。特定の実施形態では、ウイルスベクターで形質導入された細胞は、医薬担体と組み合わせて、治療有効量または予防有効量で対象に投与される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが細胞中に導入され、その細胞が、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子として発現されたまたはカプシド中の）に対する免疫原性応答を惹起するために、対象に投与され得る。典型的には、免疫原的有効量のポリペプチドを発現する細胞の量が、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される。「免疫原的有効量」は、医薬製剤が投与される対象において、そのポリペプチドに対する能動免疫応答を誘起するのに充分な、発現されたポリペプチドの量である。特定の実施形態では、投薬量は、防御免疫応答（上で定義した）を生成するのに充分である。免疫原性ポリペプチドを投与することの利益がその任意の不利益を上回る限り、付与される保護の程度は、完全または永続的である必要はない。
【０１９９】
本発明のさらなる態様は、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを対象に投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への、本発明に従うウイルスベクターおよび／またはカプシドの投与は、当該分野で公知の任意の手段によってであり得る。任意選択的に、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、薬学的に許容される担体中で、治療有効用量または予防有効用量で送達される。
【０２００】
本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドはさらに、（例えば、ワクチンとして）免疫原性応答を惹起するために投与され得る。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、免疫原的有効量のウイルスベクターおよび／またはカプシドを含む。任意選択的に、投薬量は、防御免疫応答（上で定義した）を生成するのに充分である。免疫原性ポリペプチドを投与することの利益がその任意の不利益を上回る限り、付与される保護の程度は、完全または永続的である必要はない。対象および免疫原は上記のとおりである。
【０２０１】
対象に投与されるウイルスベクターおよび／またはカプシドの投薬量は、投与様式、治療および／または予防される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターまたはカプシド、ならびに送達される核酸などに依存し、慣用的な様式で決定され得る。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０３、１０１４、１０１５形質導入単位、任意選択的に約１０８〜１０１３形質導入単位の力価である。
【０２０２】
特定の実施形態では、１回より多い投与（例えば、２回、３回、４回またはそれ以上の投与）が、例えば、毎日、週１回、月１回、年１回などの種々の間隔の期間にわたって、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために使用され得る。
【０２０３】
例示的な投与様式には、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介して）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与が含まれる］、皮内、胸膜内、脳内および関節内）、外用（例えば、気道表面を含む皮膚表面および粘膜表面の両方への、ならびに経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接的な組織または臓器への注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への）が含まれる。投与は、腫瘍への投与であり得る（例えば、腫瘍またはリンパ節の中または近傍）。任意の所与の場合における最も適切な経路は、治療および／または予防される状態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のベクターの性質に依存する。
【０２０４】
標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーを送達することによっても達成され得る。代表的実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーは、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋組織中に移植され、あるいは組織が、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むフィルムまたは他のマトリックスと接触され得る。かかる移植可能なマトリックスまたは基材は、米国特許第７，２０１，８９８号中に記載されている。
【０２０５】
特定の実施形態では、本発明に従うウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、（例えば、筋ジストロフィー、心臓疾患［例えば、ＰＡＤまたはうっ血性心不全］を治療および／または予防するために）骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与される。
【０２０６】
本発明は、全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたは他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を生成するためにも実施され得る。
【０２０７】
注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射の前に液体中で溶液もしくは懸濁液にするのに適した固体形態、または乳濁液のいずれかとして、従来の形態で調製され得る。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを、全身様式ではなく局所様式で、例えば、デポー製剤または徐放性製剤で、投与し得る。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、外科的に移植可能なマトリックスに付着して送達され得る（例えば、米国公開公報ＵＳ−２００４−００１３６４５−Ａ１号に記載される）。
【０２０８】
ウイルスベクターおよびウイルスカプシドは、ＣＮＳの組織（例えば、脳、眼）に投与され得、本発明の非存在下で観察されるものよりも広い分布のウイルスベクターまたはカプシドを有利に生じ得る。
【０２０９】
特定の実施形態では、本発明の送達ベクターは、遺伝性障害、神経変性障害、精神障害および腫瘍を含むＣＮＳの疾患を治療するために投与され得る。
【０２１０】
ＣＮＳの例示的疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄および／または頭部の損傷に起因する外傷（例えば、外傷性脳損傷）、テイ・サックス病、レッシュ・ナイハン病（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、癲癇、脳卒中、脳梗塞、気分障害（例えば、うつ病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次的気分障害）、統合失調症、薬物依存性（例えば、アルコール依存症および他の物質の依存性）、神経症（例えば、不安症、強迫障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、パラノイア、注意欠陥障害、精神性的障害、軸索／ニューロン再生および／もしくは修復から利益を得ることができるまたは軸索／ニューロン再生および／もしくは修復を必要とし得る任意の神経変性状態、認知障害、行動障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食障害または体重障害（例えば、肥満症、悪液質、神経性食欲不振症および過食症（ｂｕｌｅｍｉａ））を含む精神障害、ならびにＣＮＳのがんおよび腫瘍（例えば、原発性腫瘍）が含まれるがこれらに限定されない。
【０２１１】
ＣＮＳの障害には、網膜、後方路（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｔｒａｃｔ）および視神経に関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ぶどう膜炎、加齢性黄斑変性症、緑内障）が含まれる。
【０２１２】
全部ではないが殆どの眼科の疾患および障害は、３つの型の指標のうち１つまたは複数と関連する：（１）血管新生、（２）炎症および（３）変性。本発明の送達ベクターは、抗血管新生因子；抗炎症性因子；細胞変性を遅延させ、細胞温存（ｓｐａｒｉｎｇ）を促進し、または細胞増殖を促進する因子、および上述の組み合わせを送達するために使用され得る。
【０２１３】
例えば、糖尿病性網膜症は、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体中）または眼窩周囲（例えば、テノン下領域中）のいずれかに、１つまたは複数の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。１つまたは複数の神経栄養因子もまた、眼内（例えば、硝子体内）または眼窩周囲のいずれかに同時送達され得る。
【０２１４】
ぶどう膜炎は炎症に関与する。１つまたは複数の抗炎症因子が、本発明の送達ベクターの眼内（例えば、硝子体または前房）投与によって投与され得る。
【０２１５】
比較として、網膜色素変性症は、網膜変性によって特徴付けられる。代表的実施形態では、網膜色素変性症は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼内（例えば、硝子体投与）によって治療され得る。
【０２１６】
加齢性黄斑変性症は、血管新生および網膜変性の両方に関与する。この障害は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体）に、および／あるいは１つまたは複数の抗血管新生因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内または眼窩周囲（例えば、テノンのう下領域中）に投与することによって、治療され得る。
【０２１７】
緑内障は、眼圧の増加および網膜神経節細胞の喪失によって特徴付けられる。緑内障の治療には、本発明の送達ベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を保護する１つまたは複数の神経保護剤の投与が含まれる。かかる薬剤には、眼内に、任意選択的に硝子体内に送達される、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカインおよび神経栄養因子が含まれる。
【０２１８】
他の実施形態では、本発明は、発作を治療するため、例えば、発作の発症、発生率または重症度を低下させるために使用され得る。発作の治療的処置の効力は、行動的手段（例えば、眼または口の震え、チック（ｔｉｃｋ））および／または電気記録手段（殆どの発作は、顕著な電気記録の異常を有する）によって評価され得る。従って、本発明は、経時的な複数の発作を特徴とする癲癇を治療するためにも使用され得る。
【０２１９】
１つの代表的実施形態では、ソマトスタチン（またはその活性断片）が、下垂体腫瘍を治療するために、本発明の送達ベクターを使用して脳に投与される。この実施形態によれば、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする送達ベクターは、微量注入によって下垂体中に投与される。同様に、かかる治療は、先端巨大症（下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療するために使用され得る。ソマトスタチンの核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６；プロセシングされた活性ペプチドソマトスタチン−２８およびソマトスタチン−１４を含む）配列は、当該分野で公知である。
【０２２０】
特定の実施形態では、ベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載された分泌シグナルを含み得る。
【０２２１】
本発明の代表的実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、ＣＮＳに（例えば、脳にまたは眼に）投与される。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉皮質、側頭葉皮質、頭頂葉皮質および前頭葉皮質、基底核、海馬ならびに扁桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ）を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳および下丘中に導入され得る。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、網膜、角膜および／または視神経などの眼の異なる領域にも投与され得る。
【０２２２】
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、送達ベクターのより分散した投与のために、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達され得る。ウイルスベクターおよび／またはカプシドはさらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与され得る。
【０２２３】
このウイルスベクターおよび／またはカプシドは、脳室内、大槽内、脳実質内、頭蓋内、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼窩周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達と合わせた筋内送達が含まれるがこれらに限定されない当該分野で公知の任意の経路によって、ＣＮＳの所望の領域（複数可）に投与され得る。
【０２２４】
特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、ＣＮＳ中の所望の領域または区画への直接的注射（例えば、定位注射）によって、液体製剤で投与される。他の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、所望の領域への外用適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の外用適用によるものであり得る。さらなる代替として、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、固体の持続放出製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照のこと）。
【０２２５】
なおさらなる実施形態では、ウイルスベクターは、運動ニューロンに関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療および／または予防するための逆行性輸送に使用され得る。例えば、ウイルスベクターは、筋肉組織に送達され得、そこからニューロン中に移動し得る。
【０２２６】
本発明を説明してきたが、同内容は以下の実施例においてさらに詳細に説明され、以下の実施例は、本発明の説明目的のためだけに本明細書中に含まれるものであり、本発明を限定する意図ではない。
【実施例】
【０２２７】
［実施例１］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、脳脊髄液（ＣＳＦ）流動を利用し、軸索輸送経路を乗っ取ることによって中枢神経系（ＣＮＳ）中に伝播すると考えられる。これらのプロセスを媒介する宿主受容体の役割は、十分に理解されていない。ここで、本発明者らは、新生児脳におけるＡＡＶ血清型４の輸送およびトロピズムの新規調節因子として、胚神経新生の不可欠なマーカー、ポリシアル酸（ＰＳＡ）を報告する。具体的には、本発明者らは、シアル酸（ＳＡ）からポリシアル酸（ＰＳＡ）への受容体特異性の切り替えを示す、研究室由来のＡＡＶ４変異体を記載する。新生児マウス脳の側脳室中への頭蓋内注射の際に、本発明者らは、吻側移動経路（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒｅａｍ）および嗅球において、２，３−結合型ＳＡ＋上衣裏層（ｅｐｅｎｄｙｍａｌ  ｌｉｎｉｎｇ）から２，８−結合型ＰＳＡ＋の移動中の前駆体への、ウイルストロピズムにおける著しいシフトを観察した。さらに、この機能獲得型表現型は、傍血管（ｐａｒａｖａｓｃｕｌａｒ）輸送経路を介したＡＡＶ４変異体の強固なＣＮＳ伝播と相関する。これらの観察と一致して、基質特異的ノイラミニダーゼを共投与することによって脳内のグリカンダイナミクスを変更させることは、ＡＡＶ４および変異体ビリオンの両方の細胞トロピズムおよび形質導入効率に対する著しい変化を生じた。これらの研究は、宿主発生に関連するグリカンシグネチャーが、脳におけるウイルス輸送およびトロピズムを調節できることを示している。
【０２２８】
ウイルスは、種々の機構を介してＣＮＳに侵入する。本研究では、本発明者らは、発生中の脳におけるウイルス−炭水化物相互作用のダイナミクス、およびウイルストロピズムに対するその影響を研究するためのモデルとして、ＡＡＶを利用する。具体的には、本発明者らは、新生マウスの脳内の脳脊髄液腔中に異なるＡＡＶ株を投与した。受容体用法における切り替えを示す変異体ウイルスは、脳全体にわたって伝播するだけでなく、脳脊髄液を裏打ちする細胞から、移動中の前駆細胞へと再方向付けされる。特異的酵素を使用して脳の炭水化物内容を変更することは、ウイルスの伝播および細胞トロピズムに対する各受容体の示差的影響を確認する。これらの研究は、炭水化物が脳中で複数のレベルでウイルス感染を調節できるという見解を支持している。
【０２２９】
ウイルスは、末梢神経終末の予備的感染に依存する種々の輸送経路を利用することによって、または循環白血球もしくは脳内皮細胞に感染することによって血液を介して、ＣＮＳに進入する。脳内での引き続く伝播は、軸索輸送および経シナプス伝播によって達成される。ＣＮＳ中へのウイルス進入および引き続く定方向性輸送における重要なステップは、受容体としての特異的細胞表面膜糖タンパク質の認識である。例えば、ポリオウイルスは、受容体としてＣＤ１５５を利用するが、アルファヘルペスウイルスは、ＣＮＳ進入のためにネクチン−１を利用し、これらは共に、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。いくつかの膜関連成分もまた、狂犬病ウイルスのＣＮＳ進入に関与している。かかる宿主膜タンパク質の結合の前に、ウイルスは、付着のために細胞表面グリカンに結合することが多い。ウイルス付着因子として利用されている最も多能な宿主グリカンの１つは、シアル酸（ＳＡ）のファミリーである。例えば、ＳＡ受容体は、レオウイルスおよびポリオーマウイルスの神経毒性に関与している。ＳＡ結合親和性をモジュレートすることは、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）の神経毒性株の病原性に影響することもまた示されている。
【０２３０】
これまで、脳組織からの天然の単離体は報告されていないが、ヘルパー依存的パルボウイルスであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、異なる宿主において、頭蓋内または全身性投与後に、広いスペクトルのＣＮＳトロピズムを示す。アストロサイトおよびグリアにもまた形質導入できるという例外はあるが、これらの研究において観察された異なるＡＡＶ株の細胞トロピズムは、主にニューロン性であった。それらのヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）またはヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）と同様に、ＡＡＶ株は、ＣＮＳ内で間質および軸索輸送を受ける。しかし、ＡＡＶ輸送機構およびＣＮＳトロピズムにおけるこの多様性の分子的基礎は、十分に理解されていない。この枠組みの中で、ＡＡＶ単離体は、細胞表面付着のために３種の異なるグリカン、ＳＡ、ガラクトース（ＧＡＬ）およびヘパラン硫酸（ＨＳ）を利用することが示されている。さらに、いくつかの増殖因子受容体およびインテグリンが、ＡＡＶ細胞進入のために必須であると同定されている。本発明者らの研究室などは、マウスモデルにおいて、異なるＡＡＶ血清型の全身運命を決定することにおけるＳＡおよびＧＡＬの役割を最近実証した。
【０２３１】
アフリカミドリザル単離体、ＡＡＶ血清型４は、今日までに知られている進化的および構造的に最も異なる血清型の１つであり、新生児および成体マウスにおいて、脳室内（ＩＣＶ）投与後に上衣裏層に対する選択的トロピズムを示す。さらに、脳室下帯中に直接注射されたＡＡＶ４粒子は、アストロサイトを形質導入して、ＲＭＳ内でグリア管（ｇｌｉａｌ  ｔｕｂｅ）を形成できる。ＡＡＶ４に対する機能的細胞表面付着因子は、Ｏ結合型α２，３−ＳＡ（ムチン）である。本発明者らは、マウスにおいて全身性投与後に、２，３−ＳＡに対する減少した親和性および形質導入欠損表現型を示す新規ＡＡＶ４変異体（ＡＡＶ４．１８）を以前に同定した。本研究では、本発明者らは、ＡＡＶ４および研究室由来変異体株のＣＮＳ輸送および細胞トロピズムを差次的に調節する新規グリカンを同定する。上衣裏層に対する限定的なトロピズムを示すＡＡＶ４とは異なり、研究室由来のＡＡＶ４．１８変異体は、脳実質の至る所に伝播し、新生児マウスにおいて片側ＩＣＶ注射から吻側および尾側の方向で移動中の前駆体に選択的に感染できる。マウス脳におけるＡＡＶ４およびＡＡＶ４．１８のさらなる生化学的特徴付けにより、神経新生の十分に確立されたマーカー、α２，３−結合型ＳＡからα２，８−結合型ポリシアル酸（ＰＳＡ）への受容体特異性における切り替えが確認された。
【０２３２】
このＡＡＶ４．１８変異体は、移動中の前駆体に対する拡張されたトロピズムを示す。ＳＥＺ中のニューロン前駆体は、ＲＭＳを介してＯＢへと移動することが公知であり、その場所で、それらは、発生過程および成体のげっ歯類の脳において顆粒および傍糸球体層の介在ニューロンへと分化する。注射の２週間後に画像化した出生後マウス脳の矢状切片の共焦点顕微鏡分析により、ＡＡＶ４ベクターとＡＡＶ４．１８ベクターとの間での形質導入の著しく異なるパターンが明らかになった。特に、ＡＡＶ４．１８注射マウスは、ＡＡＶ４注射マウスと比較して、ＲＭＳおよびＯＢ（それぞれ、約３および６倍の増加、ｎ＝４匹のマウス）領域において顕著により多いｔｄＴｏｍ発現を示した。次いで、本発明者らは、移動中神経芽細胞マーカーダブルコルチン（Ｄｃｘ）および増殖中細胞マーカーであるホスホヒストンＨ３（ＰＨ３）についての免疫染色を実施して、ＲＭＳおよびＯＢ中の、ｔｄＴｏｍ発現と関連する細胞型を評価した。ＡＡＶ４．１８注射マウス脳中のＲＭＳおよびＯＢ内のｔｄＴｏｍ＋細胞は、ＡＡＶ４注射脳と比較して、Ｄｃｘ＋細胞との有意に増加した共局在を示す。ｔｄＴｏｍ＋発現とＰＨ３＋細胞との共局在の増加を示す同様の傾向が、４．１８注射脳のＲＭＳにおいて観察され、４．１８注射脳のＯＢにおいてはより低いレベルまで観察された。これらの観察は、定量的および統計的分析によって実証された（図１；ｐ＜０．０５）。ＲＭＳおよびＯＢにおけるこれらの著しい差異にもかかわらず、親株および変異体株の両方が、上衣下層（ｓｕｂ−ｅｐｅｎｄｙｍａｌ  ｚｏｎｅ）（ＳＥＺ）において類似の遺伝子発現（ｔｄＴｏｍ＋）プロファイルを示した（図２）。具体的には、上衣細胞に対するマーカー（Ｓ１００β）およびアストロサイトに対するマーカー（ＧＦＡＰ）を用いた免疫共局在研究により、ＡＡＶ４およびＡＡＶ４．１８の両方が、高い同様の効率で、上衣裏層中のＳ１００β＋およびＧＦＡＰ＋細胞に形質導入したことが明らかになった（図２）。類似の形質導入プロファイルおよび上衣トロピズムが、成体マウス脳において観察されたことに言及することも注目すべきである。
【０２３３】
変異体ＡＡＶ４．１８ビリオンは、増強されたＣＮＳ伝播を示す。出生後ＣＮＳ中の前駆体および神経芽細胞に対するＡＡＶ４．１８の選択的トロピズムの基礎をなす機構を理解するために、本発明者らは、ＩＣＶ注射後のマウス脳実質における各ＡＡＶベクターの分布を追跡した。これを達成するために、本発明者らは、新生児マウスにおいて、ＩＣＶ注射を介して、チミジンアナログであるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で標識したゲノムをパッケージングしているＡＡＶベクターを注射した。脳を、ベクター投与の２時間後の早期に回収し、抗ＢｒｄＵ抗体で免疫染色して、脳実質におけるＡＡＶゲノムの体内分布を可視化した。ＡＡＶ４注射マウスは、おそらくはＣＳＦ輸送に起因する、新生児脳のＳＥＺにおける注射の部位の直ぐ近くおよび外髄膜（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｎｉｎｇｅｓ）における強いＢｒｄＵ染色を示す。対照的に、ＡＡＶ４．１８ベクターは、ＳＥＺ中だけでなく、脳実質を通じて、特に皮質領域においても、ＢｒｄＵ標識ウイルス粒子の顕著に拡散性の分布パターンを示す。内皮細胞マーカーＣＤ３１による脳切片の免疫染色分析により、マウス脳の皮質領域中のＣＤ３１＋突起に沿って配置されたＢｒｄＵ＋ＡＡＶ４．１８ゲノムが明らかになった。対照的に、ＡＡＶ４ゲノムは、皮質ではこの表現型を示さなかった。ＡＡＶ４．１８ゲノムの拡張された伝播にもかかわらず、内皮細胞との完全な共局在は観察されなかったことに留意すべきである。これは、移動中の前駆体に対する選択的トロピズムが、一部、新生児脳実質の至る所に伝播するＡＡＶ４．１８の能力に帰する可能性があることを示唆している。
【０２３４】
ＡＡＶ４．１８変異体による上衣形質導入は、シアル酸（ＳＡ）に部分的にのみ依存する。ＡＡＶ４株および４．１８株の差次的形質導入プロファイルを媒介するカプシド−受容体相互作用を精査するために、本発明者らは、Ｐ０マウス脳において、細胞表面シアログリカンから末端ＳＡを酵素的に除去した。具体的には、酵素ノイラミニダーゼＩＩＩは、末端２，３−結合型ＳＡおよび２，６−結合型ＳＡを切断し、前者は、親ＡＡＶ４株に対する同族細胞付着因子である。マウス脳の細胞表面グリカン構造に対するこの処理の影響を評価するために、本発明者らは、Ｏ−結合型シアル酸部分に結合するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ジャカリンを用いて、矢状切片を免疫染色した。ＩＣＶ投与の２週間後、ノイラミニダーゼ共注射は、ＡＡＶ４注射マウスの上衣細胞および脈絡叢におけるｔｄＴｏｍ発現を完全に抑止し、これは、これらの脳におけるジャカリン染色の喪失と相関する。この結果は、ＡＡＶ４が、新生児マウス脳における形質導入のためにアルファ２，３−結合型シアル酸および／またはアルファ２，６−結合型シアル酸を利用することを示唆している。対照的に、上衣裏層のＡＡＶ４．１８媒介性ｔｄＴｏｍ発現は、この選択的酵素処理によって部分的にのみ抑止される。本発明者らは、ＡＡＶ４．１８が、ジャカリン＋染色が見られない場合に、上衣細胞に形質導入することをさらに観察した。これらの結果は、ＡＡＶ４．１８変異体が、新生児マウス脳中の上衣裏層および脈絡叢に形質導入するために、シアル酸非依存的機構を獲得した可能性があることを示している。
【０２３５】
この変異体ＡＡＶ４．１８株は、神経新生バイオマーカーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）への、受容体特異性における切り替えを示す。ポリシアル酸化形態（ＰＳＡ、アルファ２，８−結合型シアル酸）の神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）は、ＯＢ神経新生の間に、ＲＭＳの移動中の前駆細胞において発現される。ＰＳＡ−ＮＣＡＭは、嗅球先駆細胞の吻側移動を媒介することにおいて中心的な役割を果たし、ＰＳＡまたはＮＣＡＭのいずれかにおける欠乏症は、異常な嗅覚組織形成を生じる、ＳＥＺおよびＲＭＳにおける前駆細胞の蓄積を引き起こす。上衣細胞から、移動中の神経芽細胞へのウイルストロピズムにおけるこの切り替えの基礎をなす可能性のある機構を精査するために、本発明者らは、新生児マウス脳のシアログリカン組成を選択的にモジュレートした。本発明者らは、２種の異なる酵素、ノイラミニダーゼＩＩＩ（先に記載した）または２，８−結合型ポリシアル酸（ＰＳＡ）を選択的に切断するエンドノイラミニダーゼ−Ｎの影響を比較した。未処理の対照と類似の様式で、ノイラミニダーゼＩＩＩの共注射は、ＡＡＶ４．１８注射マウス脳中のＲＭＳまたはＯＢにおけるｔｄＴｏｍ＋細胞とＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋細胞との間の共局在の程度を変更させなかった。対照的に、２，８−結合型ＰＳＡを切断するエンドノイラミニダーゼ−Ｎの共投与は、ＡＡＶ４．１８注射マウス脳におけるｔｄＴｏｍレポーター遺伝子発現の完全な喪失を生じた。この観察は、これらのマウスにおける移動中の前駆体連続体に沿ったＰＳＡ−ＮＣＡＭ染色の喪失によってさらに実証された。合わせると、これらの結果は、ＡＡＶ４．１８が、２，３−結合型ＳＡから２，８−結合型ＰＳＡへのグリカン受容体特異性における切り替えを受けており、発生中の脳中の神経芽細胞を形質導入するために後者のグリカンを必要とするという見解を支持している。
【０２３６】
ＡＡＶ４．１８ベクターの細胞トロピズムのさらなる特徴付けにより、ＲＭＳおよびＯＢにおける前駆体移動連続体に沿ったｔｄＴｏｍ＋細胞とＰＳＡ−ＮＣＡＭ免疫染色との間の明確な相関が明らかになった。見かけの共局在は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ標識領域中の成熟ニューロンマーカーＮｅｕＮでは観察されなかったが、移動経路に沿ったいくつかのｔｄＴｏｍ＋細胞は、ＲＭＳおよびＯＢにおいてアストロサイトマーカーであるＧＦＡＰと共局在し、ＲＣ２／ネスチン免疫染色突起と密接に関連した。尾側方向におけるｔｄＴｏｍ＋移動前駆体の特徴付けは、同様の結果を生じた。従って、ＡＡＶ４．１８は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋の移動中神経芽細胞ならびにＳＥＺ−ＲＭＳ−ＯＢ連続体中のグリア管の周囲ＧＦＡＰ＋網目構造内の細胞を潜在的に形質導入する能力を明らかに獲得している。
【０２３７】
ＲＭＳおよびＯＢにおける親ＡＡＶ４株と同様の評価により、ノイラミニダーゼＩＩＩ処理ありまたはなしでの、移動中の前駆体の最小限の形質導入が明らかになった。対照的に、エンドノイラミニダーゼ−Ｎ処理は、ＲＭＳおよびＯＢにおいてＡＡＶ４．１８形質導入を完全に抑止したが、親ＡＡＶ４ビリオンは、ＲＭＳではなくＯＢ中の細胞を形質導入する拡張された能力を示した。これらのマウス由来の矢状切片に対して実施した免疫共局在研究により、ＯＢ中のＮｅｕＮ＋細胞における有意な導入遺伝子発現（ｔｄＴｏｍ＋）が示された。これらの結果は、２，８−結合型ＰＳＡがＡＡＶ４伝播を負に調節し、ＡＡＶ４カプシド上の２，３−結合型ＳＡ結合部位について競合することによって形質導入を遮断するという見解を間接的に支持している。
【０２３８】
ＡＡＶなどのパルボウイルスによる首尾よい感染には、細胞表面受容体結合、エンドサイトーシス取込み、カプシド脱コート、核進入およびゲノム放出、その後の第２鎖合成および引き続く転写を含む、一連の綿密に編成された事象が関与する。第１のステップ、即ち、宿主細胞表面へのパルボウイルス付着は、異なるグリカンによって媒介される。脳では、ヘパラン硫酸（ＨＳ）とのＡＡＶカプシド相互作用は、特によく研究されている。一次受容体としてＨＳを利用するＡＡＶ血清型２の直接的な脳実質注射は、顕著にニューロン性の形質導入プロファイルを生じる。可溶性ヘパリンの共注射は、げっ歯類モデルにおける頭蓋内注射後にＡＡＶ２のＣＮＳ伝播を改善し、引き続いてその形質導入効率を改善することが示されている。ＨＳに結合する能力はまた、ＡＡＶ血清型６のＣＮＳ形質導入プロファイルを制限するようである。しかし、この効果は、カプシド表面上のリシン残基（Ｋ５３１）を変異させてＨＳ結合を消失させることによって、一部逆転され得る。これらの初期の研究は、脳におけるウイルス伝播およびトロピズムを調節するグリカン発現パターンの能力を強調している。
【０２３９】
本研究で、本発明者らは、新生児マウス脳中の移動中の前駆体を選択的に形質導入する新規ＡＡＶ変異体を特徴付けた。この変異体は、ランダムに変異したＡＡＶ４カプシドライブラリーから元々発見され、ＳＡ結合欠損変異体として特徴付けられた。全身投与した場合、このＡＡＶ４．１８変異体は、親ＡＡＶ４血清型に対する同族受容体であるＯ−結合型２，３−ＳＡに対する低い結合親和性に起因して、マウスにおいて減弱した心肺トロピズムを示す。新生児マウス脳では、天然単離体のＡＡＶ４は、脳室注射後に上衣細胞を排他的に形質導入する。興味深いことに、ＳＥＺ中に直接注射した場合、ＡＡＶ４は、ＳＶＺ中のＢ型アストロサイトおよびＲＭＳを覆うグリアを形質導入できる。ここで、本発明者らの研究は、この二者が、ＩＣＶ投与後の上衣裏層への形質導入を制限する可能性が高い、ＡＡＶ４カプシドの高いＳＡ結合親和性から潜在的に生じることを示している。対照的に、低親和性ＡＡＶ４．１８変異体は、単回ＩＣＶ注射後に、上衣障壁を貫通して脳実質中に入ることができ、移動中の神経芽細胞および増殖中の細胞に対して選択的に形質導入できる。マウス脳の遠位領域へのＡＡＶ４．１８粒子の増強された伝播が、これらの領域内の成熟ニューロンの首尾よい形質導入を生じないことは注目に値する。むしろ、免疫組織化学的分析は、皮質に達するＡＡＶ４．１８粒子が、内皮細胞に対して実際に形質導入することなく、脳微小血管系と密接に関連することを示唆している。この観察は、ウイルス粒子などの間質溶質が、静脈傍流出または「グリンパティック（ｇｌｙｍｐｈａｔｉｃ）」クリアランス経路を利用し得ることを示唆している。対応して、本発明者らは、ＳＡにゆるく結合したＡＡＶ４．１８粒子が、脳実質の増強された貫通をもたらす、白質索および血管周囲空間を介した間質液輸送によって影響される可能性がより高いと推論している。本発明者らは、基質特異的ノイラミニダーゼのＩＣＶ注射による、マウス脳からの２，３−結合型ＳＡまたは２，８−結合型ＳＡの選択的酵素的除去の影響を評価することによって、これらの知見をさらに拡張させた。ＡＡＶ４形質導入は、早期の処理によって完全に抑止されるが、上衣壁、脈絡叢中の細胞のサブセット、およびポリシアル酸化ＮＣＡＭについて陽性に染色する移動中の前駆体のＡＡＶ４．１８形質導入は、影響を受けないままである。２，８−結合型ＳＡの選択的切断が、マウス脳におけるＡＡＶ４．１８形質導入の完全な喪失をもたらしたとき、ＡＡＶ４．１８によるグリカン受容体用法におけるこの切り替えが明らかに実証された。合わせると、これらの結果は、ＡＡＶ４．１８が、脳実質の至る所に伝播できるだけでなく、ＰＳＡ（２，８−結合型ＳＡ）を選択的に利用して、マウス前脳中の出生後の移動中前駆体を形質導入できるという見解を支持している。
【０２４０】
ＡＡＶ４．１８粒子によって示される拡張された受容体用法および選択的細胞トロピズムは、単なる偶然ではない。アルファ２，８−結合型シアル酸の直鎖ホモポリマー（ポリシアル酸／ＰＳＡ）は、胚および成体の神経新生において不可欠な役割を果たすことが周知である。脳の２つの領域、即ち、ＯＢおよび海馬歯状回は、持続的に神経原性であり、げっ歯類において、成体期に至るまで一定の前駆体連鎖移動を受ける。成体神経新生と胚神経新生（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｅｓ）との間には複数の差異があるにもかかわらず、一貫したＰＳＡ−ＮＣＡＭ発現は、成体期を通じてこれら両方の領域において観察される特徴である。ＰＳＡの生化学的特性は、ＰＳＡを、細胞−細胞付着の強力な負の調節因子にしている。これは、神経新生の間の先駆細胞の首尾よい移動のために重要である。これは、潜在的に、ＰＳＡ−ＮＣＡＭが嗅覚神経新生の間にニューロン先駆細胞において高度に発現される理由である。さらに、エンドノイラミニダーゼ−Ｎ処理を使用するＰＳＡの酵素的除去は、ＲＭＳを破壊し、皮質および線条体などの非特異的領域への神経芽細胞分散をもたらす。従って、ＡＡＶ４．１８による移動中の前駆体の選択的形質導入は、宿主生物の発生段階と共に変動し得るこの独自のグリカン付着因子の発現パターンに直接帰することができる。
【０２４１】
ＰＳＡは、細胞培養物または静脈内投与後の心臓および肺などの全身性臓器などにおける、ＣＮＳ以外の生理学的設定におけるＡＶ４または関連変異体のトロピズムまたは形質導入効率に機能的に影響しないようである。発生中の脳は、この新規ウイルス−グリカン相互作用のための独自の設定を提供する可能性がある。第２に、ＡＡＶ４および変異体ビリオンによるＰＳＡ認識を媒介する構造座標は未だ決定されていない。予備的構造モデリングにより、親ＡＡＶ４株と比較して、ＡＡＶ４．１８変異体について変更された表面静電性が明らかになった。カプシド表面電荷密度の操作は、分岐鎖または直鎖の２，３−結合型ＳＡグリカンに対する親和性を減少させ得るが、同時に、負に荷電したＰＳＡ糖ポリマー（ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）を認識する拡張された能力を与えると推測することは魅力的である。本発明者らの全体的なアプローチは、ＣＮＳにおけるウイルス−グリカン相互作用を変更させることの機能的意義、ウイルスニューロトロピズム（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｓｍ）に対する、発生的に調節されるグリカン発現プロファイルの影響の理解を助け、同時に、脳における遺伝子移入適用のために特定のグリカン構造を好むようにウイルスを操作するためのロードマップを提供する。
【０２４２】
組換えＡＡＶベクター産生。組換えＡＡＶ４および変異体ＡＡＶ４．１８ベクターを、最新の三重プラスミドトランスフェクション法を使用して生成した。簡潔に述べると、これは、（ａ）ｐＸＲ４ヘルパープラスミドまたは変異体ｐＸＲ４．１８ヘルパープラスミド；（ｂ）アデノウイルスヘルパープラスミドｐＸＸ６−８０；および（ｃ）ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターによって駆動され、ＡＡＶ２ゲノム由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）が隣接する、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴｏｍ）レポーター遺伝子をコードするｐＴＲ−ＣＢＡ−ｔｄＴｏｍプラスミド、のトランスフェクションを伴った。ベクター精製を、セシウム勾配超遠心を使用して実施し、ウイルス力価を、ＣＢＡプロモーターのために設計したプライマー（ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）（フォワード、５’−ＣＧＴ  ＣＡＡ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＴＡＴ  ＴＴ−３’（配列番号３４）；リバース、５’−ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＴＡＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号３５））と共にＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を使用して、定量的ＰＣＲによって得た。
【０２４３】
チミジンアナログ５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識ゲノムをパッケージングするＡＡＶ粒子を生成するために、本発明者らは、改変されたベクター産生プロトコールを適応した。簡潔に述べると、三重プラスミドトランスフェクションの１時間後に、ＨＥＫ２９３産生細胞を、培地１ｍｌ当たり１０μｇのＢｒｄＵ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）の最終濃度の、ＢｒｄＵおよび５−フルオロ−２’−デオキシウリジンの１０：１モル濃度混合物で処理した。ＢｒｄＵ標識ゲノムをパッケージングするベクターを、上記のように精製および定量した。
【０２４４】
脳室内（ＩＣＶ）注射。全ての動物実験を、ＮＩＨガイドラインに従い、ＵＮＣ実験動物委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたとおりに繁殖および維持したＢａｌｂ／ｃマウスで実施した。新生児Ｐ０仔を、氷上に１分間配置することによる低体温と、その後の定位脳室内大脳注射とによって、迅速に麻酔した。２６ｓゲージ針を備えたＨａｍｉｌｔｏｎ  ７００シリーズのシリンジ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、ＫＯＰＦ−９００小動物定位機器（ＫＯＰＦ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ）に取り付け、マウスに、ＣＢＡ−ｔｄＴｏｍレポーターカセットをパッケージングするＡＡＶ４またはＡＡＶ４．１８ベクターの１×１０９粒子の用量（容量３μｌ）を、それらの左側脳室に片側注射した。発生中のマウス脳（Ｐ１４）を回収し、事後固定し、以下に記載したように免疫染色した。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識ウイルスを追跡するために、５μＬの容量中７．４×１０８のベクターゲノム含有粒子を、Ｐ０マウスの左側脳室中に注射した。新生児脳を、注射の２時間後に回収し、パラホルムアルデヒド中で事後固定し、切片化し、以下に記載したように免疫染色した。組換えシアリダーゼ共注射実験のために、ベクターを、５．２ｍＵのノイラミニダーゼＩＩＩ型（シアリダーゼ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）または１．４５Ｕのエンドノイラミニダーゼ−Ｎ（ＡＢＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）のいずれかと混合して、４．３μｌの総注射容量にした。全ての新生児注射を、矢状静脈洞に対して０．５ｍｍ、横静脈洞に対して２ｍｍ吻側、および１．５ｍｍの深さで実施した。ベクター投与後、マウスを、加熱ランプ下で甦生し、寝具中でこすり、その後母獣のもとに戻した。
【０２４５】
組織処理、共焦点顕微鏡および免疫蛍光分析。２週齢のマウスを、過量のトリブロモエタノール（アバチン）（１．２５％溶液１０ｇ当たり０．２ｍｌ）と、その後のＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドの経心腔的灌流とによって屠殺した。脳を取り出し、２４時間にわたって事後固定し、５０μｍ厚切片を、Ｌｅｉｃａ  ＶＴ  １０００Ｓ振動刃ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ  １０００Ｓ、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＬ）を使用して得た。自由浮遊脳切片を、ＰＢＳ中１０％のヤギ血清および１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で１時間ブロッキングし、その後、一次モノクローナル抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体、ウサギ抗Ｓ１００β（Ｓｉｇｍａ、１：１０００）、マウス抗ＧＦＡＰ（Ａｂｃａｍ、１：１０００）、モルモット抗Ｄｃｘ（Ａｂｃａｍ、１：１０００）、ヤギ抗ホスホヒストンＨ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：１０００）、マウス抗ＢｒｄＵ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−０３３９００、１：２５００）、ウサギ抗ＮｅｕＮ（Ａｂｃａｍ、１：７５０）、マウス抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（ＤＳＨＢ、１：７５０）およびマウス抗Ｒｃ２／ネスチン（ＤＳＨＢ、１：７５０）を利用した。二次抗体を、ヤギにおいて作製し、Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ６４７（Ａｂｃａｍ、１：５００）とコンジュゲートした。ジャカリン染色のために、ＦＩＴＣ−ジャカリン中で、室温における１．５時間の自由浮遊マウス脳切片のインキュベーションを用いたブロッキングステップに従った（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、１：４０）。ジャカリンを、ＰＢＳ−Ｔ中３％のヤギ血清中２０μｇ／ｍｌの作業濃度まで希釈した。免疫染色した脳切片を、Ｚｅｉｓｓ  ＣＬＳＭ  ７００共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して可視化し、Ｚｅｎ（登録商標）Ｂｌａｃｋソフトウェアを用いて分析した。ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター発現と異なる細胞型特異的マーカーとの共局在（％）を、Ｓ１００β／ＧＦＡＰ／Ｄｃｘ／ＰＨ３＋であった形質導入細胞（ｔｄＴｏｍ＋）の数と、形質導入細胞（ｔｄＴｏｍ＋）の総数との比率から導出した。細胞を、Ｐ１４マウス脳中の上衣下層、吻側移動経路、嗅球または他の関連の領域における２００μｍ２面積の非重複視野中で計数した。
【０２４６】
［実施例２］
ＡＡＶ４カプシド上の表面ループドメインを、脳室内注射後の脳において、ランダム変異誘発および選択のプロセスを介して、さらなる反復性の改変のために選択した。これらの第２世代変異体を、元の鋳型カプシドとしてＡＡＶ４．１８を使用して生成した。従って、これらの変異体は、変異Ｋ４９２ＥおよびＫ５０３Ｅを少なくとも含む。いくつかの実施形態では、これらの変異体は、Ｎ５８５ＳまたはＮ５８５Ｒを含む、Ｎ５８５残基における異なるアミノ酸置換を含む。合計で数個の新たな第２世代変異体を、このプロセスを介して同定した。これらのクローンは、（ｉ）ＡＡＶ４．１８と同程度（変異体６ａ、５ａ、５ｂ）または（ｉｉ）より高い形質導入効率を有する拡張された前駆細胞トロピズム（変異体６ｂ、６ｃ）、として分類され得る細胞トロピズムを示した。
【０２４７】
変異体のこのパネルは、上衣細胞、脈絡叢、吻側および尾側移動経路にある移動中の前駆体、嗅球、皮質ならびに海馬領域に選択的な、ＣＮＳにおける高効率の遺伝子移入のための試薬を提供する。これらにより、脳卒中、癲癇、神経変性、脳動静脈奇形、リソソーム蓄積症および他の疾患を含む種々のＣＮＳ適応症の遺伝子療法に利用可能な試薬のパネルへと、第１世代変異体ＡＡＶ４．１８が拡張される。表５は、ＣＮＳ注射後の異なる変異体の結果をまとめる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現は、表中に記載されるスコアリング系によって示される。
【０２４８】
上記は本発明の例示であり、本発明の限定として解釈すべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって規定され、特許請求の範囲の均等物が本明細書中に含まれる。
【０２４９】
［配列］
【化３Ａ】
2018503376.tif 000009
【化３Ｂ】
2018503376.tif 000010
【化３Ｃ】
2018503376.tif 000011
【化３Ｄ】
2018503376.tif 000012
【化３Ｅ】
2018503376.tif 000013
【化３Ｆ】
2018503376.tif 000014
【化３Ｇ】
2018503376.tif 000015
【化３Ｈ】
2018503376.tif 000016
【化３Ｉ】
2018503376.tif 000017
【化３Ｊ】
2018503376.tif 000018
【化３Ｋ】
2018503376.tif 000019
【化３Ｌ】
2018503376.tif 000020
【０２５０】
【表５】
2018503376.tif 000021
【図１】
2018503376.tif 000022
【図２】
2018503376.tif 000023
【図３】
2018503376.tif 000024
【図４（１）】
2018503376.tif 000025
【図４（２）】
2018503376.tif 000026
【配列表】
2018503376000001.xml
【国際調査報告】
2018503376.tif 000039
2018503376.tif 000040
2018503376.tif 000041