(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの異種ＲＮＡｉ分子を発現する非増殖性トランスジェニック微細藻類を提供する。ＲＮＡｉを発現する非増殖性トランスジェニック微細藻類は、ＲＮＡｉ分子をインタクトかつ機能的な形態で標的生物体に経口送達するのに使用される。微細藻類内に存在する異種ＲＮＡｉ分子は、微細藻類を摂取する生物体または前記生物体の病原体に対して生物学的活性を示し、少なくとも１つの特定の効果を発揮することを特徴とする。具体的には、非増殖性トランスジェニック微細藻類は、動物および植物の有害生物を生物学的に防除する薬剤として使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの異種ＲＮＡｉ分子を含む非増殖性トランスジェニック微細藻類であって、前記ＲＮＡｉ分子が、異種生物体内に存在するポリヌクレオチドに標的化されており、前記微細藻類が前記異種生物体または前記異種生物体の宿主によって摂取されると、前記ＲＮＡｉ分子が、前記異種生物体内に存在する前記ポリヌクレオチドの発現をサイレンシングする、非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２】
乾燥形態である、請求項１に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項３】
複数のコピーの前記ＲＮＡｉ分子を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項４】
前記ＲＮＡｉ分子が、前記非増殖性トランスジェニック微細藻類の核内で転写される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項５】
前記ＲＮＡｉ分子が、前記異種生物体に内在性のポリヌクレオチドおよび前記異種生物体に異種性のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドに標的化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項６】
前記ＲＮＡｉ分子が、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖が一緒に二本鎖を形成し、前記センス鎖が、前記異種生物体内に存在するポリヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１９個の連続する核酸を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項７】
前記ＲＮＡｉ分子が、前記異種生物体に内在性のポリヌクレオチドに標的化されており、前記異種生物体が有害生物である、請求項５〜６のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項８】
前記有害生物が植物の有害生物である、請求項７に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項９】
前記植物の有害生物が、直翅目、鱗翅目および鞘翅目からなる群より選択される目に属するものである、請求項８に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項１０】
前記植物の有害生物が、サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）およびトノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）からなる群より選択されるバッタである、請求項９に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項１１】
前記植物の有害生物がサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）であり、前記ＲＮＡｉ分子が、配列番号１に記載される核酸配列を含むｃｌｋ遺伝子に標的化されている、請求項１０に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項１２】
前記ＲＮＡｉ分子が、配列番号２に記載される核酸配列またはそのフラグメントを含むセンス鎖と、前記配列番号２またはそのフラグメントに相補的なアンチセンス鎖とを含む、請求項１１に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項１３】
前記ＲＮＡｉ分子が、配列番号２に記載される核酸配列を含むセンス鎖と、配列番号６に記載される核酸配列を含むリンカー配列と、配列番号３に記載される核酸配列を含むアンチセンス鎖とを含む、請求項１２に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項１４】
前記有害生物が動物の有害生物である、請求項７に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項１５】
前記動物が、水生動物および陸生動物からなる群より選択される、請求項１４に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項１６】
前記ＲＮＡｉ分子が、前記異種生物体に内在性のポリヌクレオチドに標的化されており、前記異種生物体が、前記非増殖性トランスジェニック微細藻類を摂取する宿主動物の病原体である、請求項５〜６のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項１７】
前記宿主動物が、魚類、甲殻類、家畜およびペットからなる群より選択される、請求項１６に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項１８】
前記宿主動物が魚類または甲殻類であり、前記病原体が、ウオジラミ目に属するカイアシ類である、請求項１７に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項１９】
前記カイアシ類がウオジラミ科に属するものである、請求項１８に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２０】
前記宿主動物がサケ科魚類であり、前記病原体がウオジラミ（サケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ））である、請求項１９に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２１】
前記宿主動物が家禽であり、前記病原体が、タンカクハジラミ科に属する家禽寄生虫である、請求項１７に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２２】
前記家禽寄生虫が、ニワトリオオハジラミ（Ｍｅｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ）およびニワトリハジラミ（Ｍｅｎｏｐｏｎ  ｇａｌｌｉｎａｅ）からなる群より選択される、請求項２１に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２３】
前記ＲＮＡｉ分子が、前記異種生物体に異種性のポリヌクレオチドに標的化されており、前記標的化されるポリヌクレオチドが、前記異種生物体に感染するウイルスのものである、請求項５〜６のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２４】
前記異種生物体が、魚類、甲殻類、家畜およびペットからなる群より選択される、請求項２３に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２５】
前記異種生物体が甲殻類であり、前記ウイルスがホワイトスポット症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）である、請求項２４に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドの発現が、前記トランスジェニック微細藻類を摂取していない生物体内での前記ポリヌクレオチドの発現と比較して少なくとも１０％阻害される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２７】
前記トランスジェニック微細藻類が可食性組成物に製剤化されている、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２８】
前記可食性組成物が、可食性の希釈剤、補形剤または担体からなる群より選択される物質をさらに含む、請求項２７に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項２９】
前記可食性組成物が、陸生動物の飼料組成物および水生動物の飼料組成物からなる群より選択される、請求項２８に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項３０】
植物、動物またはその一部分に適用するよう製剤化されている、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項３１】
前記製剤が、可食性の希釈剤、補形剤または担体からなる群より選択される物質をさらに含む、請求項３０に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項３２】
噴霧懸濁液および塗布剤からなる群より選択される形態に製剤化されている、請求項３０〜３１のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項３３】
前記トランスジェニック微細藻類が海産藻類である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の非増殖性トランスジェニック藻類。
【請求項３４】
前記海産藻類が、フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）種、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）種およびドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種からなる群より選択される、請求項３３に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項３５】
前記微細藻類がフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である、請求項３４に記載の非増殖性トランスジェニック微細藻類。
【請求項３６】
生物体内でのポリヌクレオチドの発現を阻害する方法であって、前記生物体内に存在する前記ポリヌクレオチドに標的化されたＲＮＡｉ分子を含む可食性の非増殖性トランスジェニック微細藻類を前記生物体に与えることを含む、方法。
【請求項３７】
前記ＲＮＡｉ分子が、前記生物体内に存在する前記ポリヌクレオチドの発現をサイレンシングする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物体内に存在する前記ポリヌクレオチドが、前記生物体の内在遺伝子である、請求項３６〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物体が、植物の有害生物および動物の有害生物からなる群より選択される有害生物である、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記有害生物が、直翅目、鱗翅目および鞘翅目からなる群より選択される目に属する植物の有害生物である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記植物の有害生物が、サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）およびトノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）からなる群より選択されるバッタである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＲＮＡｉ分子がｃｌｋ遺伝子に標的化されており、前記ｃｌｋ遺伝子が配列番号１に記載される核酸配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＲＮＡｉ分子が、配列番号２に記載される核酸配列またはそのフラグメントを含むセンス鎖と、前記配列番号２またはそのフラグメントに相補的なアンチセンス鎖とを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記有害生物が動物の有害生物である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記動物が、水生動物および陸生動物からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物体内に存在する前記ポリヌクレオチドが、前記生物体に異種性のものである、請求項３６〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＲＮＡｉ分子が、前記生物体に感染するウイルスに標的化されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記生物体が、魚類、甲殻類、家畜およびペットからなる群より選択される、請求項４６〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物体が甲殻類であり、前記ウイルスがホワイトスポット症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
生物体内でのポリヌクレオチドの発現を阻害する方法であって、前記生物体内に存在する前記ポリヌクレオチドに標的化されたＲＮＡｉ分子を含む可食性の非増殖性トランスジェニック微細藻類を前記生物体の宿主に与えることを含む、方法。
【請求項５１】
前記宿主が、魚類、甲殻類、家畜およびペットからなる群より選択され、前記生物体が前記宿主の病原体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記宿主が魚類または甲殻類であり、前記病原体が、ウオジラミ目に属するカイアシ類である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記カイアシ類がウオジラミ科に属するものである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記宿主がサケ科魚類であり、前記病原体がウオジラミ（サケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ））である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記微細藻類を可食性組成物の中に入れて投与する、請求項３６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記可食性組成物が、可食性の希釈剤、補形剤または担体からなる群より選択される物質をさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記非増殖性トランスジェニック微細藻類を植物、動物またはその一部分に適用されるよう製剤化する、請求項３６〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に動物または植物の有害生物の生物学的防除のため、トランスジェニック微細藻類を摂取する標的生物体に、またはＲＮＡｉ分子を発現する微細藻類を給餌もしくは曝露した介在生物体を介して、標的生物体にＲＮＡｉ分子を送達する、異種ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子を含む非増殖性トランスジェニック微細藻類およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、標的遺伝子の特定領域に相同なセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、標的遺伝子転写産物の切断に影響を及ぼすことによってその機能を阻害する現象のことである。この現象は線虫のカエノラブドゥティティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｔｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）で発見され（Ｇｕｏ，Ｓ．およびＫｅｍｐｈｕｅｓ，Ｋ．Ｊ．１９９５．Ｃｅｌｌ  ８１：６１１−６２０）、のちにトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、植物および哺乳動物細胞に存在することが明らかにされた（Ｗｉａｎｎｙ，Ｆ．およびＺｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ，Ｍ．２０００．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：７０−７５；Ｃｏｇｏｎｉ  Ｃ．２０００．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １０（６）：６３８−４３；Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ．２０００．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｕｇ；１８（８）：８９６−８）。
【０００３】
ＲＮＡｉはＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御され、細胞質内のｄｓＲＮＡ分子によって開始される。ｄｓＲＮＡ分子の供給源は外来性のものであっても内在性のものであってもよい。ｄｓＲＮＡ分子はダイサー酵素によって切断され、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる約２０ヌクレオチドの短い二本鎖フラグメントになる。この短いポリマーによって相補的ｍＲＮＡの切断が誘導される。
【０００４】
ＲＮＡｉは、複数の研究分野、例えば、真核生物の遺伝子機能決定および遺伝子ノックダウンのゲノミクスに極めて有望な手段となることが明らかにされている。ＲＮＡｉは特異性が高いため、癌およびウイルス性疾患を特異的に制圧する医薬品のほか、農業および水産養殖での有害生物防除に使用することが可能であることから、バイオテクノロジーにおいて大きな可能性を秘めている。
【０００５】
微細藻類（単細胞藻類または植物プランクトン）は、地球上の微生物のうち最大の界であるが、最も理解が進んでいない界でもある。陸生動物に対して植物がそうであるように、微細藻類は天然の栄養基盤であり、水中食物連鎖のあらゆる植物栄養素のうち最初の供給源となるものである。藻は、遺伝子操作された酵素、ワクチンをはじめとするタンパク質を含めた生物活性分子を産生するための効率的なプラットフォームとしての役割を果たし得る。産生された分子は、微細藻類から抽出したり、微細藻類に含まれる形で標的生物体に経口的に送達したりすることが可能である。これまでに藻体内での組換えタンパク質の発現が報告されており、細胞色素体内での発現を含め、藻細胞内で外来タンパク質を産生させる様々な方法が利用可能である。
【０００６】
米国特許出願公開第２００８／０１０７６５２号には、水生動物の疾患の予防、改善または治療へのトランスジェニック微細藻類の使用が開示されている。トランスジェニック藻類は水生動物に直接的または間接的に給餌される。この方式は、免疫原性ペプチド、一本鎖抗体フラグメントおよびＤＮＡワクチンを送達するのに提案される。
【０００７】
核酸分子は、様々な生化学的応用、診断応用および治療応用への実用が有望視される多用途の手段として登場した。しかし、効率的な送達システムがないため、このような分子の使用は未だまれである。給餌による核酸送達システムの開発に成功を収めるには様々な障壁が立ちはだかっており、その最も大きなものが腸粘膜である。腸粘膜は物理的バリアおよび生化学的バリアの両方の役割を果たし、身体の外部環境と内部環境とを隔てている。
【０００８】
米国特許第８，６３３，０２８号には、甲殻類をはじめとする無脊椎動物でのｄｓＲＮＡによる特異的および非特異的免疫の誘導が開示されている。その提供されるシステムおよび方法には、エビに感染するウイルスに標的化したｄｓＲＮＡでエビを治療することが含まれる。１つの例示的実施形態では、海産エビのバナメイエビ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ  ｖａｎｎａｍｅｉ）にｄｓＲＮＡを注射することよってウイルス感染を阻止している。
【０００９】
しかし、注射による核酸の非経口投与は、リスクが伴ううえに被投与者が苦痛および恐怖を感じる点で不利なものである。核酸の非経口投与にはほかにも、様々な方法が提唱されている。例えば、米国特許第８，５２４，６７９号には、細胞間移行を介してｄｓＲＮＡを含めた核酸を哺乳動物の標的細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達する方法が開示されている。この核酸の送達は、動物細胞に直接トランスフェクションすることによるものである。米国特許第８，４４５，４５６号には、疼痛の治療または軽減へのＲＮＡ干渉を仲介する核酸分子の使用が開示されている。しかし、この発明は、核酸分子を注射により患者に投与することを開示している。標的生物体が水生動物または多数の陸生動物である場合、非経口投与は事実上、不可能である。
【００１０】
ＲＮＡｉ剤のほかの適用様式が検討されている。例えば、米国特許第８，４０４，８３２号にはｓｉＲＮＡの経口投与が開示されており、ここでは、ｓｉＲＮＡ鎖を化学修飾する。
【００１１】
経口送達のまた別の例が、寄生線虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）の特定の遺伝子を標的とするよう設計されたｄｓＲＮＡを有するトランスジェニック植物で明らかにされている。線虫がトランスジェニック植物の細胞内に侵入すると、その細胞質を摂取し、ｄｓＲＮＡのＲＮＡｉ活性によって死滅する。このため、トランスジェニック植物は線虫に対して高い抵抗性を示す（Ｙａｄａｖら，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２００６．１４８（２）：２１９−２２，Ｋｌｉｎｋら，Ｐｌａｎｔａ．２００９．２３０（１）：５３−７１）。
【００１２】
植食昆虫から作物の保護にＲＮＡｉを使用することが実現可能であることが示されている（Ｐコメ  Ｄ  ＲおよびＧａｔｅｈｏｕｓｅ  Ｊ  Ａ．２００８．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６（７）：３９３−４００；Ｋａｔｏｃｈ  Ｒ．ら，２０１３．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７１：８４７−８７３）。この方法は、昆虫の血体腔内への二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の注射に依存するものであり、現場条件では実用的ではなく、またｄｓＲＮＡを食餌の形で直接給餌するにしても、ｄｓＲＮＡの不安定性の問題がある。したがって、この技術を利用するには、ｄｓＲＮＡを昆虫に確実に給餌する方法の開発が必要条件となる。
【００１３】
米国特許出願公開第２０１３／０３１５８８３号には、微細藻類を含めたトランスジェニック植物にサイレンシングＲＮＡ発現させて寄生虫および病原体の遺伝的に制御することが開示されている。この発明は、植物が、葉緑体内に効率的に取り込まれる形でサイレンシングＲＮＡを発現することが可能であることを利用するものであり、このＲＮＡが摂取された後、病原体または寄生虫内で標的遺伝子の発現を阻害するよう作用することができる。
【００１４】
トランスジェニック植物の分野での主な難点の１つが、各タイプのトランスジェニック作物の生産に特有の手段が必要になるという点であるが、あるタイプのトランスジェニック藻類は任意の所望の作物の保護に使用し得る。さらに、遺伝子を改変した植物および藻類が環境に及ぼす影響に関する社会的懸念が高まりつつある。繁殖可能な性質の植物および藻類が自然環境中に広まり、野生型種が外来遺伝子で汚染される可能性がある。
【００１５】
生物体の代謝および行動の過程の多くは概日時計による支配を受けている。昆虫では、概日時計およびその分子機構が多岐にわたる方法で繁殖に影響を及ぼすことがわかっている。求愛、交尾および産卵を含めた繁殖行動が日内リズムの強い影響下にある（Ｔｏｂｂａｃｋ  Ｊ．ら，２０１１．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４１（５）：３１３−３２１）。哺乳動物および昆虫の概日調節ネットワークの核となる遺伝子の１つに「ｃｌｏｃｋ」（ｃｌｋ）と呼ばれるものがある。サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）では、ほかの昆虫とは異なり、ｃｌｋ遺伝子をサイレンシングするよう標的化された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の注射が用量依存性に成虫および５齢幼虫で致死的なものとなる。ｃｌｋノックダウン５齢幼虫は成虫に脱皮することができるが、ｄｓＲＮＡの量に応じて、成虫に達する時間が対照よりも長くなる。成虫では、ｃｌｋノックダウン個体は脂肪体および卵巣が対照個体のようには発達しない（Ｔｏｂｂａｃｋ  Ｊら，２０１２．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１（３）：３６９−３８１）。
【００１６】
ＲＮＡｉを仲介する核酸分子を給餌により投与するのは、遺伝子サイレンシングに最も望ましい方法の１つであるが、この送達方法の実用性は、主にＲＮＡｉ分子の不安定性および安全性の問題を理由に未だ困難なものとなっている。このため、生産および使用が容易であり、ＲＮＡｉ分子の生物活性を維持し、生物学的に活性な分子の全身吸収を促進し、環境には悪影響を及ぼさない経口送達システムが大いに必要とされており、このようなシステムがあれば極めて有利になると考えられる。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、ＲＮＡｉを仲介する核酸分子を生物体に経口送達し生物体によるＲＮＡｉ分子の全身吸収をもたらす、非増殖性微細藻類の調製物を提供する。具体的には、本発明は、微細藻類以外の標的生物体の細胞内に存在するポリヌクレオチドに標的化された少なくとも１つの異種ＲＮＡｉ分子を含む、乾燥トランスジェニック微細藻類の調製物を提供する。生物体は、昆虫有害生物を含めた水性動物または陸生動物であり得る。水生動物または陸生動物がトランスジェニック微細藻類を摂取すると、ＲＮＡｉ分子が標的ポリヌクレオチドをサイレンシングする。さらに、微細藻類は、ＲＮＡｉ分子を発現する微細藻類を給餌または曝露した介在生物体を介して水生動物または陸生動物に供給することができる。具体的な例示的実施形態では、植物の有害生物、特に昆虫の場合、有害生物の遺伝子をサイレンシングするよう標的化されたＲＮＡｉ分子を含む非増殖性トランスジェニック微細藻類で植物の少なくとも一部分を覆ってもよい。
【００１８】
他の代替的実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、標的動物に有害作用を及ぼす遺伝子（１つまたは複数）の発現を阻害するよう標的化されていてよい。ＲＮＡｉ分子が、標的動物に有害作用を及ぼす遺伝子を阻害する場合、ＲＮＡｉ分子はその動物の生存および繁栄を向上させる。
【００１９】
本発明の微細藻類ＲＮＡｉ送達調製物は、微細藻類細胞が生きたものではなく繁殖することができないため、遺伝子操作された生物体が環境中に広まるリスクが一切生じないという点で従来のＲＮＡｉ発現微細藻類よりも有利である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子を含む非増殖性微細藻類を動物の給餌に適用可能な動物用飼料または飼料添加物として使用するか、有害生物の天然の食物の一部として使用する。
【００２１】
異種ＲＮＡｉ分子は、異種標的生物体に摂取された後も生物学的に活性であり、安定でありかつ特異性が高く、前記標的生物体内の標的遺伝子の発現を阻害することを特徴とする。
【００２２】
本発明は、乾燥微細藻類内で発現したｄｓＲＮＡ分子が、微細藻類を摂取する昆虫にインタクトの活性型で転移され得るという予想外の発見に一部基づくものである。本明細書でのちに例示するある特定の実施形態では、標的遺伝子は昆虫の発生に不可欠な遺伝子であるため、前記遺伝子のサイレンシングによって昆虫の発生が阻害され、かつ／または負の変化を受ける。
【００２３】
いかなる理論にも作用機序にも束縛されることを望むものではないが、ＲＮＡｉ分子の活性が保存されるのは、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの安定な構造および乾燥工程によるものであると思われる。さらに、微細藻類の細胞壁、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）の細胞壁は、ＲＮＡｉ分子が標的水生動物または陸生動物の消化管内で分解されるのを防ぐ天然のカプセル化材料としての役割を果たすため、ＲＮＡｉ分子を標的動物の血液または血リンパに吸収させることが可能である。次いで、ＲＮＡｉ分子は前記動物の細胞内で標的遺伝子の発現を阻害する。ＲＮＡｉ分子が脊椎動物または昆虫の発達した消化器系を通過した後もインタクトの状態であるのは全く予想外のことである。
【００２４】
一態様では、本発明は、少なくとも１つの異種ＲＮＡｉ分子を含む非増殖性トランスジェニック微細藻類であって、ＲＮＡｉ分子が異種生物体内に存在するポリヌクレオチドに標的化されており、微細藻類が前記異種生物体または前記異種生物体の宿主によって摂取されると、前記ＲＮＡｉ分子が異種生物体内に存在するポリヌクレオチドの発現をサイレンシングする、非増殖性トランスジェニック微細藻類を提供する。
【００２５】
特定の実施形態では、非増殖性トランスジェニック微細藻類は乾燥形態である。特定の例示的実施形態では、凍結乾燥法またはマイクロ波真空乾燥法を用いてトランスジェニック微細藻類を乾燥させる。
【００２６】
特定の実施形態では、非増殖性トランスジェニック微細藻類は、複数のコピーのＲＮＡｉ分子を含む。
【００２７】
特定の例示的実施形態では、ＲＮＡｉ分子は微細藻類の核内で転写される。
【００２８】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖とアンチセンス鎖は一緒に二本鎖を形成し、前記センス鎖は、異種生物体内に存在する標的ポリヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１９個の連続する核酸を含む。ほかの実施形態では、少なくとも１９個の連続する核酸は、異種生物体内に存在する標的ポリヌクレオチドと比較して１個、２個、３個または４個の置換を含む。可能なものそれぞれが本発明の個々の実施形態となる。
【００２９】
特定の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ約２０〜約１５００ヌクレオチドの長さを有する。別法として、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ約５０〜約１０００ヌクレオチドの長さを有し、さらなる別法として、各鎖は約１００〜約８００ヌクレオチドを有し、さらなる別法として、各鎖は約１５０〜約５００ヌクレオチドの長さを有する。
【００３０】
特定の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖はリンカー配列によって分離されている。特定の例示的実施形態では、リンカー配列はイントロン配列である。いくつかの実施形態では、イントロンは微細藻類フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）由来のものであり、配列番号６に記載される核酸配列を有する。ほかの特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡｉ分子の全長は約１，０００ｂｐ〜約１，５００ｂｐである。本発明の特定の例では、ＲＮＡｉ分子の全長は約１２００ｂｐである。いかなる特定の理論にも作用機序にも束縛されることを望むものではないが、イントロンの存在およびＲＮＡｉ分子の全長が微細藻類の加工過程、特に乾燥過程および微細藻類が標的生物体によって摂取される過程でＲＮＡｉ分子が予想外に安定であることに寄与し、それにより、ＲＮＡｉ分子が標的生物体の遺伝子または標的生物体内に存在する外来遺伝子に対してサイレンシング活性を発揮することが可能になる。
【００３１】
形質転換後に微細藻類が細胞壁の構造を維持または再生する限り、様々な微細藻類種を本発明の教示に従って使用することができる。特定の例示的実施形態では、微細藻類は真核微細藻類である。特定の実施形態では、微細藻類は海産微細藻類である。特定の実施形態では、海産微細藻類は、特に限定されないが、フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）；ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種；ナンノクロロプシス・オキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ）、ナンノクロロプシス・サリナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ）を含めたナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）種；ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）種、テトラセルミス・スエシカ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ）、テトラセルミス・チュイィ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｃｈｕｉｉ）を含めたテトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）種；イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）；パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）種；アンフィプロラ・ヒアリン（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ）；キートケロス・ムエレリ（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）；およびネオクロリス・オレオアブンダンス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ）からなる群より選択される。可能なものそれぞれが本発明の個々の実施形態となる。
【００３２】
特定の例示的実施形態では、微細藻類は、フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）種、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）種およびドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種からなる群より選択される。
【００３３】
本発明の特定の例示的実施形態では、微細藻類はフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である。いかなる特定の理論にも作用機序にも束縛されることを望むものではないが、Ｐ．トリコルヌタム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）のケイ化された壁は、藻細胞内で発現したＲＮＡｉ分子を藻バイオマスの増殖、回収および加工全体にわたる外部の厳しい環境から、さらには藻を摂取する動物の消化管の環境から保護するカプセル化の一形態として作用し得る。
【００３４】
特定の実施形態では、異種生物体内に存在する標的ポリヌクレオチドは前記生物体の内在遺伝子である。
【００３５】
特定の実施形態では、異種生物体は有害生物である。このような実施形態では、ＲＮＡｉ分子が有害生物の成長および／また再発生に不可欠な遺伝子の発現をサイレンシングし、前記サイレンシングが前記有害生物に有害作用を及ぼす。特定の例示的実施形態では、有害生物は植物の有害生物である。特定の例示的実施形態では、植物の有害生物は、作物、森林植物（特に樹木）、観賞植物またはその任意の組合せを攻撃する昆虫である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、昆虫は直翅目に属するものである。他の実施形態では、昆虫はサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）である。他の実施形態では、昆虫はトノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）である。いくつかの実施形態では、昆虫は鱗翅目に属するものである。特定の例示的実施形態では、鱗翅目はハスモンヨトウである。他の例示的実施形態では、ハスモンヨトウはエジプトヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）である。他の実施形態では、昆虫は鞘翅目に属するものである。例示的実施形態では、鞘翅目は甲虫である。特定の例示的実施形態では、甲虫はチャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）である。
【００３７】
他の実施形態では、有害生物は動物の有害生物である。いくつかの実施形態では、動物は水産養殖動物である。特定の例示的実施形態では、水産養殖動物は魚類および甲殻類から選択される。
【００３８】
ほかの実施形態では、動物は陸生動物である。特定の例示的実施形態では、陸生動物は家畜およびペットから選択される。
【００３９】
他の実施形態では、異種生物体の標的内在遺伝子のサイレンシングは、前記異種生物体による被害を受ける植物、特に作物または動物に有益な効果を示す。このような実施形態では、生物体の標的内在遺伝子のサイレンシングは、微細藻類を摂取する生物体の成長、発生、生存、健康状態および繁栄のうちの少なくとも１つのものに対して有害作用を示し、このため、微細藻類またはそれを含む組成物は駆除剤と呼ばれることがある。可能なものそれぞれが本発明の個々の実施形態となる。
【００４０】
特定の実施形態では、異種生物体は昆虫のトノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）である。特定の実施形態では、異種生物体は昆虫のサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）である。特定の例示的実施形態では、ＲＮＡｉ分子はサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）ｃｌｋ遺伝子に対して標的化されており、このためバッタの発生および／または死滅に障害をもたらす。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、配列番号１に記載される核酸配列を含むサバクトビバッタのｃｌｋ遺伝子に標的化されている。特定の例示的実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、配列番号２に記載される核酸配列またはそのフラグメントを含むセンス鎖と、前記配列番号２またはそのフラグメントに実質的に相補的なアンチセンス鎖とを含む。特定の例示的実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、配列番号２に記載される核酸配列を含むセンス鎖と、配列番号６に記載される核酸配列を含むリンカー配列と、配列番号３に記載される核酸配列とを含むアンチセンス鎖を含む。
【００４１】
特定の例示的実施形態では、本発明は、サバクトビバッタのｃｌｋ遺伝子に標的化されたＲＮＡｉ分子を含み、ｃｌｋ遺伝子が配列番号１に記載される核酸配列を含む、非増殖性トランスジェニック微細藻類を提供する。ほかの例示的実施形態では、本発明は、配列番号２に記載される核酸配列を含むセンス鎖と、配列番号６に記載される核酸配列を含むリンカー配列と、配列番号３に記載される核酸配列を含むアンチセンス鎖とを含むＲＮＡｉ分子を含む、非増殖性トランスジェニック微細藻類を提供する。
【００４２】
他の実施形態では、異種生物体内に存在するポリヌクレオチドは前記生物体に対する異種遺伝子である。特定の例示的実施形態では、異種ポリヌクレオチドは異種生物体に感染するウイルスのものであり、ＲＮＡｉ分子はウイルス遺伝子に対して標的化されている。
【００４３】
特定の例示的実施形態では、異種生物体は甲殻類であり、異種ポリヌクレオチドはホワイトスポット症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）のものである。
【００４４】
さらにほかの実施形態では、異種生物体は病原体であり、非増殖性トランスジェニック微細藻類は病原体の宿主によって摂取される。このような実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、病原体のポリヌクレオチドの発現をサイレンシングするようにそのポリヌクレオチドに標的化されている。
【００４５】
例示的実施形態では、病原体ポリヌクレオチドのサイレンシングは、病原体の成長および／または増殖および／または発生に有害作用を及ぼし、このため、その病原体が感染する宿主生物体の成長、発生、生存、繁栄および健康状態のうちの少なくとも１つのものに対して正の効果を示す。
【００４６】
特定の実施形態では、病原体は、寄生虫および細菌からなる群より選択される。
【００４７】
特定の例示的実施形態では、感染宿主は水産養殖生物体である。特定の実施形態では、水産養殖生物体は魚類および甲殻類から選択される。特定の例示的実施形態では、標的病原体はウオジラミ目のカイアシ類である。他の実施形態では、カイアシ類はウオジラミ科に属するものである。さらにほかの実施形態では、カイアシ類は、宿主の海産魚、とりわけサケ科の魚の粘膜、表皮組織および血液を食物とする海産外部寄生虫であるサケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）である。
【００４８】
また別の実施形態では、感染宿主は、家畜およびペットからなる群より選択される。可能なものそれぞれが本発明の個々の実施形態となる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、家畜は家禽であり、寄生虫はタンカクハジラミ科に属するものである。特定の例示的実施形態では、家禽の寄生虫はニワトリオオハジラミ（Ｍｅｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ）およびニワトリハジラミ（Ｍｅｎｏｐｏｎ  ｇａｌｌｉｎａｅ）からなる群より選択される。
【００５０】
特定の実施形態では、標的遺伝子または標的ポリヌクレオチドの発現は、トランスジェニック微細藻類を摂取していない生物体の同じ標的遺伝子または標的ポリヌクレオチドの発現と比較して少なくとも１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９９％またはそれ以上阻害されている。
【００５１】
さらにほかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子はｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡを発現する異種ポリヌクレオチドは、長さが約２０〜２５核酸のセンス配列と、前記２０〜２５核酸に相補的なアンチセンス配列とを含む。
【００５２】
また別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ分子をＤＮＡ構築物に組み込み、その微細藻類での発現を可能にする。一実施形態では、ＤＮＡ構築物は、プロモーター、エンハンサー、複製起点、転写終止配列などからなる群より選択される少なくとも１つの発現調節エレメントを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物はプロモーターを含む。プロモーターは、当該技術分野で公知の構成的プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよい。典型的な実施形態では、プロモーターは、微細藻類で作動可能な構成的プロモーターである。他の実施形態では、ＤＮＡ構築物は転写終止配列シグナルをさらに含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子をコードするポリヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の上流に位置する単一のプロモーターと作動可能に連結されている。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子の各鎖は、それ自体のプロモーターを有するポリヌクレオチドによってコードされている。いくつかの実施形態では、各プロモーターは、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されており、かつ同ポリヌクレオチドの上流に位置する。特定の実施形態では、各鎖は異なるＤＮＡ構築物から転写される。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明の微細藻類は、それ自体を投与または摂取しても、あるいは可食性の希釈剤、補形剤または担体をさらに含む可食性組成物に製剤化してもよい。「可食性」という用語は、本明細書ではその広い範囲で使用され、水生動物ならびに昆虫を含めた植物および動物の有害生物によって摂取され得る組成物を包含する。微細藻類またはそれを含む組成物はさらに、食品添加物として使用してもよい。
【００５５】
特定の実施形態では、藻をベースとする可食性製剤は、水産養殖用の飼料組成物を含めた動物飼料組成物である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、藻をベースとする可食性組成物は、異種生物体の食物源を少なくとも一部覆うよう製剤化されている。特定の例示的実施形態では、生物体は植物性昆虫または植物寄生虫であり、藻をベースとする可食性組成物は、植物を少なくとも一部覆うものである。
【００５７】
特定の実施形態では、異種生物体は直翅目に属するものである。また別の実施形態では、生物体は鱗翅目に属するものである。さらにほかの実施形態では、生物体は鞘翅目に属するものである。
【００５８】
さらにほかの実施形態では、生物体は線形動物門に属するものである。
【００５９】
また別の実施形態では、藻をベースとする可食性製剤は、動物寄生虫を含めた動物病原体の宿主の食物源としての役割を果たし、ＲＮＡｉ分子は動物病原体のポリヌクレオチドに標的化されている。いくつかの実施形態では、動物病原体は寄生虫のウオジラミであり、宿主は魚のサケである。他の実施形態では、宿主は水産養殖動物または陸生動物であり、動物病原体はウイルスまたは細菌である。
【００６０】
特定の実施形態では、微細藻類を噴霧懸濁液の形態に製剤化する。いくつかの実施形態では、噴霧懸濁液を作物に噴霧する。いくつかの実施形態では、噴霧懸濁液を植物の葉に噴霧する。特定の実施形態では、懸濁液を果実のなどの植物の可食部分に噴霧する。他の実施形態では、微細藻類懸濁液をコムギ実生に噴霧する。
【００６１】
ほかの態様では、本発明は、生物体にＲＮＡｉ分子を経口送達する方法を提供し、この方法は、ＲＮＡｉ分子を発現するポリヌクレオチドを含む非増殖性トランスジェニック微細藻類を生物体に経口投与することを含み、ＲＮＡｉ分子は、生物体内に存在する遺伝子またはその一部の発現をサイレンシングする。
【００６２】
生物体は、上に記載したいずれかの生物体である。
【００６３】
特定の例示的実施形態では、本発明は、サバクトビバッタのｃｌｋ遺伝子をサイレンシングする方法を提供し、この方法は、ｃｌｋ遺伝子に標的化されたＲＮＡｉ分子を含む非増殖性トランスジェニック微細藻類をサバクトビバッタに経口送達することを含み、前記ｃｌｋ遺伝子は、配列番号１に記載される核酸配列を含む。ほかの例示的実施形態では、本発明は、サバクトビバッタのｃｌｋ遺伝子をサイレンシングする方法を提供し、この方法は、配列番号２に記載される核酸配列を含むセンス鎖と、配列番号６に記載される核酸配列を含むリンカー配列と、配列番号３に記載される核酸配列を含むアンチセンス鎖とを含むＲＮＡｉ分子を含む非増殖性トランスジェニック微細藻類をサバクトビバッタに経口送達することを含む。
【００６４】
微細藻類は、上に記載したいずれかの微細藻類である。特定の実施形態では、非増殖性トランスジェニック微細藻類は乾燥形態である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、生物体の食物を覆うことによって非増殖性トランスジェニック微細藻類を投与する。上に記載したいずれかの生物体に給餌するよう組成物を製剤化する。
【００６６】
本発明の範囲には、短いポリヌクレオチドおよび長いポリヌクレオチド、１つまたは複数の核酸置換を有するＲＮＡアナログおよびポリヌクレオチドアナログならびに当該技術分野で公知の核酸誘導体、非天然核酸および合成核酸を含めたホモログ、アナログ、バリアントならびに誘導体が包含されるが、ただし、本発明の教示によるトランスジェニック藻類の摂取後に上記のバリアントおよび改変物がＲＮＡｉ活性を保持しなければならないことが明確に理解されるべきである。
【００６７】
本発明のその他の目的、特徴および利点については、以下の説明および図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ｃｌｋのセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列のフラグメント（ｄｓＲＮＡ−Ｃｌｋ）を含むｐＰｈａＴ発現ベクターの略図である。
【図２】ＧＦＰの核酸配列フラグメントのセンスおよびアンチセンス（ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰ）を含むｐＰｈａＴ発現ベクターの略図である。
【図３】ｍＣｈｅｒｒｙの核酸配列フラグメントのセンスおよびアンチセンス（ｄｓＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を含むｐＰｈａＴ発現ベクターの略図である。
【図４】ｄｓＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙを発現するトランスジェニック藻を給餌したチャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）の血リンパ中のｍＣｈｅｒｒｙに標的化されたｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）の相対的定量化（ＲＱ）を示す図である。トランスジェニック藻（ｄｓｍＣｈｅｒｒｙ）もしくは野生型藻（ＷＴ）を噴霧したキャベツの葉または藻を全く噴霧しなかったキャベツの葉（Ｍｏｃｋ）を給餌したチャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）の血リンパから全ＲＮＡ試料を抽出した。試料をｄｓＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ特異的プライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲ解析による相対的定量化に供した。合成ＲＮＡ（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ社）を参照として用いた。ΔΔＣｔ法を用いて解析を実施した。
【図５】エジプトヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）の血リンパ中に存在するｄｓＲＮＡ−ＧＦＰ（ｄｓＧＦＰ）およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）のＲＮＡレベルの相対的定量化（ＲＱ）を示す図である。ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰを発現するトランスジェニック藻を噴霧したトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の葉を給餌したエジプトヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）の血リンパ中のｄｓＲＮＡ−ＧＦＰおよびＴＢＰの有無を調べた。野生型（ＷＴ）藻を対照とした。
【図６Ａ】サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）の生殖巣および脳のそれぞれ内在性ｃｌｏｃｋおよび内在性ｐｅｒｉｏｄのＲＮＡレベルの相対的定量化（ＲＱ）を示す図である。図６Ａは、若齢バッタ生殖巣のｃｌｏｃｋのｍＲＮＡレベルを示す。最初の脱皮後の若齢成虫の生殖巣からＲＮＡを抽出した。ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻（ｄｓＣｌｏｃｋ）を給餌したバッタのｃｌｏｃｋのｍＲＮＡレベルは、ＷＴ藻を給餌したバッタよりも３６％低いことが検出された（ｐ値＝０．０２７）。図６Ｂは、若齢バッタ脳のｐｅｒｉｏｄのｍＲＮＡレベルを示す。バッタの脳からＲＮＡを抽出した。ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻を給餌したバッタのｐｅｒｉｏｄのｍＲＮＡレベルは、ＷＴ藻を給餌したバッタよりも２７％低いことが検出された。試料を特異的プライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲ解析による相対的定量化に供した。ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として用いた。
【図６Ｂ】サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）の生殖巣および脳のそれぞれ内在性ｃｌｏｃｋおよび内在性ｐｅｒｉｏｄのＲＮＡレベルの相対的定量化（ＲＱ）を示す図である。図６Ａは、若齢バッタ生殖巣のｃｌｏｃｋのｍＲＮＡレベルを示す。最初の脱皮後の若齢成虫の生殖巣からＲＮＡを抽出した。ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻（ｄｓＣｌｏｃｋ）を給餌したバッタのｃｌｏｃｋのｍＲＮＡレベルは、ＷＴ藻を給餌したバッタよりも３６％低いことが検出された（ｐ値＝０．０２７）。図６Ｂは、若齢バッタ脳のｐｅｒｉｏｄのｍＲＮＡレベルを示す。バッタの脳からＲＮＡを抽出した。ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻を給餌したバッタのｐｅｒｉｏｄのｍＲＮＡレベルは、ＷＴ藻を給餌したバッタよりも２７％低いことが検出された。試料を特異的プライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲ解析による相対的定量化に供した。ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として用いた。
【図７Ａ】ｃｌｋ遺伝子のサイレンシングによって卵莢１個当たりの孵化幼虫数が減少することを示す図である。図７Ａは、ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現するトランスジェニック微細藻類（ｄｓＣｌｏｃｋ）を給餌したバッタの孵化した卵の数が、ＷＴ藻を給餌したバッタの２分の１に満たないことを示す。図７Ｂは、さらなる実験の結果を示しており、実験全体を通じて、ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現するトランスジェニック藻（特異的ｄｓＲＮＡ）を塗布した葉を給餌したバッタの卵から孵化した幼虫の数が、ｄｓＧＦＰ発現藻（対照ｄｓＲＮＡ）を塗布した葉を給餌したバッタの卵から孵化した幼虫の数よりも少ないことがわかる。
【図７Ｂ】ｃｌｋ遺伝子のサイレンシングによって卵莢１個当たりの孵化幼虫数が減少することを示す図である。図７Ａは、ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現するトランスジェニック微細藻類（ｄｓＣｌｏｃｋ）を給餌したバッタの孵化した卵の数が、ＷＴ藻を給餌したバッタの２分の１に満たないことを示す。図７Ｂは、さらなる実験の結果を示しており、実験全体を通じて、ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現するトランスジェニック藻（特異的ｄｓＲＮＡ）を塗布した葉を給餌したバッタの卵から孵化した幼虫の数が、ｄｓＧＦＰ発現藻（対照ｄｓＲＮＡ）を塗布した葉を給餌したバッタの卵から孵化した幼虫の数よりも少ないことがわかる。
【図８Ａ】ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻（ｄｓＣｌｏｃｋ）を給餌したサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）とＷＴ藻を給餌したサバクトビバッタ（Ｓ．ｇｒｅｇａｒｉａ）との間の給餌中の運動量の変化を示す図である。２時間の給餌時間にわたってバッタをモニターし、各ケージについて運動量の変化の％の平均値を求めた。各ケージの個体数は４０個体とした。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃはそれぞれ独立した反復を示す。
【図８Ｂ】ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻（ｄｓＣｌｏｃｋ）を給餌したサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）とＷＴ藻を給餌したサバクトビバッタ（Ｓ．ｇｒｅｇａｒｉａ）との間の給餌中の運動量の変化を示す図である。２時間の給餌時間にわたってバッタをモニターし、各ケージについて運動量の変化の％の平均値を求めた。各ケージの個体数は４０個体とした。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃはそれぞれ独立した反復を示す。
【図８Ｃ】ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻（ｄｓＣｌｏｃｋ）を給餌したサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）とＷＴ藻を給餌したサバクトビバッタ（Ｓ．ｇｒｅｇａｒｉａ）との間の給餌中の運動量の変化を示す図である。２時間の給餌時間にわたってバッタをモニターし、各ケージについて運動量の変化の％の平均値を求めた。各ケージの個体数は４０個体とした。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃはそれぞれ独立した反復を示す。
【図９】ｃｌｋ遺伝子に対して特異的に標的化されたｄｓＲＮＡを発現する藻の経口送達が、サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）の雌雄の分配に影響を及ぼすことを示す図である。ｄｓｃｌｏｃｋ発現藻またはｄｓＧＦＰ発現藻を塗布したコムギ新芽をサバクトビバッタ（Ｓ．ｇｒｅｇａｒｉａ）に２７日間給餌した。４つの独立した反復の雌雄の成虫の数をカウントし、雄個体／雌個体の比の平均値を算出した（ｐ値＝０．０１）。
【図１０】ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰ（ｄｓＧＦＰ）を発現する藻を給餌した甲殻類の血リンパ中のｄｓＲＮＡ−ＧＦＰの検出を示す図である。甲殻類のレッドクロウ（Ｃｈｅｒａｘ  ｑｕａｄｒｉｃａｒｉｎａｔｕｓ）にｄｓＲＮＡ−ＧＦＰ発現藻またはＷＴ藻を含有する飼料ペレットを給餌した。レッドクロウ（Ｃｈｅｒａｘ  ｑｕａｄｒｉｃａｒｉｎａｔｕｓ）の血リンパから抽出したＲＮＡを膜に負荷し、ＤＩＧで標識したＧＦＰ  ＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰ発現藻（ｄｓＧＦＰ）を給餌した個体の試料にはシグナルが検出されたが、陰性対照試料（ＷＴ藻）にはシグナルが検出されなかった。各スポットは全身の血リンパの１％を表す。ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰ発現藻から陽性対照ＲＮＡを抽出した。数値は各スポットの全ＲＮＡ量（ｎｇ）を表す。
【図１１Ａ】凍結乾燥後の藻細胞には生存能がないことを示す図である。図１１Ａ：凍結乾燥させたフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）藻粉末１グラム（細胞を３．４２×１０１０個含有する）をＡＳＷ（人工海水）９ｍｌと混合した。混合物４００μｌをＡＳＷ寒天プレート上に播くか、ＡＳＷ中に播いて懸濁させ、１０日間維持した。図１１Ｂ：凍結乾燥させた藻と同数の細胞を含む新鮮なフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）の藻液体培養物を同様の条件下で播いた。１０日後、細胞増殖をモニターした。
【図１１Ｂ】凍結乾燥後の藻細胞には生存能がないことを示す図である。図１１Ａ：凍結乾燥させたフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）藻粉末１グラム（細胞を３．４２×１０１０個含有する）をＡＳＷ（人工海水）９ｍｌと混合した。混合物４００μｌをＡＳＷ寒天プレート上に播くか、ＡＳＷ中に播いて懸濁させ、１０日間維持した。図１１Ｂ：凍結乾燥させた藻と同数の細胞を含む新鮮なフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）の藻液体培養物を同様の条件下で播いた。１０日後、細胞増殖をモニターした。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、標的生物体にＲＮＡｉ分子を効率的で、安定であり、かつ環境に安全な方法で経口送達する組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ＲＮＡｉを仲介するポリヌクレオチド分子を含む非増殖性トランスジェニック微細藻類およびそれを含む可食性組成物を提供する。
【００７０】
本発明は、ＲＮＡｉ分子が、トランスジェニック微細藻類を摂取する生物体の細胞または組織内でその生物活性を発揮することを開示する。ＲＮＡｉ分子は、非増殖性トランスジェニック微細藻類を摂取する生物体に存在する標的遺伝子またはその一部に相補的な配列を含む。これに加えて、またはこれに代えて、標的遺伝子は、前記生物体の病原体に存在するものである。その結果、標的遺伝子の発現が阻害される。ＲＮＡｉは、例えば、生物体が有害生物である場合、または生物体が、宿主生物体内に侵入しその細胞内で生存する病原体である場合に、その生物体に有害作用を及ぼすために使用し得る。さらに、ＲＮＡｉは、摂取する生物体の内在遺伝子の発現を変化させることによって、その生物体の成長、発生または繁栄に有益な効果を及ぼし得る。
【００７１】
本発明は、トランスジェニック微細藻類が加工され、それが昆虫に摂取されるまでの過程全体を通じて、ＲＮＡｉ分子がインタクトの状態であるという予想外の発見に一部基づくものである。特定の理論にも作用機序にも束縛されることを望むものではないが、天然のカプセル化材料としての役割を果たす藻細胞と、ｄｓＲＮＡの比較的安定な構造とが相まって、ＲＮＡｉ分子を加工過程、具体的には乾燥過程、さらには生物体の消化器系内での分解から保護する。
【００７２】
本発明の藻類が乾燥および保管が可能であると同時に、生物体によって乾燥藻類が摂取された後もＲＮＡｉ活性が保持されるというのは予想外のことである。本発明の藻をベースとするＲＮＡｉ送達システムの重要な利点は、図１１に例示するように、本発明の乾燥藻類を水で戻しても増殖することが不可能であり、このため、遺伝子改変微細藻類が偶発的に自然環境中に拡散することは起こり得ないことである。
【００７３】
本発明の技術のさらなる利点は、この技術が、微細藻類を様々な標的生物体に直接的に、または標的生物体の天然の食物を介して間接的に適用することが可能であるという意味で汎用的であるという点にある。遺伝子操作の工程では（標的遺伝子は別として）標的生物体に対する特異性を必要としない。これに対し、トランスジェニック植物（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を発現するもの）を作製するにあたっては、各作物について個別に形質転換する方法を知る必要がある。
【００７４】
本発明のさらなる利点は、藻を餌の一部として摂取しない動物にも、例えば藻類を前記動物の通常飼料に噴霧する（例えば、昆虫が摂取する植物にトランスジェニック微細藻類を噴霧する）ことによって藻類を与えることが可能なことである。本発明の非増殖性トランスジェニック微細藻類製剤のさらなる利点は、保存可能期間が長いことである。特定の実施形態では、乾燥トランスジェニック微細藻類を４℃で６〜１２か月間保存することができる。
【００７５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は通常、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって仲介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す。通常、細胞内の長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは、長いｄｓＲＮＡからｓｉＲＮＡの短い断片へのプロセシングに関与する。ダイサー活性によって生じるｓｉＲＮＡは通常、長さが約２１〜２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対の二本鎖を含む。
【００７６】
ＲＮＡｉ応答はこのほか、ｓｉＲＮＡを含み一般にＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、この複合体は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を仲介する。ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で標的ＲＮＡの切断が起こる。本発明は、プロセシングまたは作用のいかなる機序にも束縛されることなく、プロセシングの有無を問わず、遺伝子発現をレギュレートする手段としてのＲＮＡｉに関するものである。
【００７７】
定義
「微細藻類」という用語は、本明細書ではその最も広い範囲で使用され、通常淡水系および海水系にみられる顕微レベルの単細胞真核藻類を指す。微細藻類の大きさは、種に応じて数マイクロメートル（μｍ）から数百マイクロメートルの範囲であり得る。本発明の特定の実施形態では、この用語は海産真核微細藻類を指す。
【００７８】
本明細書で使用される「乾燥」という用語は、本発明のトランスジェニック微細藻類に関して使用される場合、トランスジェニック微細藻類の総質量のうち２０％以下、通常１５％以下の水分を含む微細藻類調製物を指す。
【００７９】
本明細書で使用される「非増殖性」という用語は、本発明のトランスジェニック微細藻類に関して使用される場合、微細藻類が分裂して子孫を生じることができないという意味で生存できない微細藻類を指す。
【００８０】
「ＲＮＡｉ分子」および「ＲＮＡ干渉分子」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語にはセンス鎖とアンチセンス鎖とを有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）配列が包含され、アンチセンス鎖は標的遺伝子に対して高い相補性を有する。これらの用語にはこのほか、ｄｓＲＮＡを発現するポリヌクレオチドが包含される。センス鎖およびアンチセンス鎖は、部分的に二本鎖であるという特徴または完全に二本鎖であるという特徴を有し得る。二本鎖ＲＮＡがダイサータンパク質によって約２０ヌクレオチドに切断されても、発現したｄｓＲＮＡが約２０ヌクレオチドの長さであってもよく、このヌクレオチドが、のちにその相補的なｍＲＮＡの切断を誘導する。その結果、標的遺伝子の発現が減少する。
【００８１】
「ダウンレギュレートされる」、「阻害される」、「減少する」および「サイレンシングされる」（時制を問わない）という用語は、ＲＮＡｉ分子が標的とする遺伝子に関するものである場合、それを発現する１つまたは複数の二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ構築物の存在下での遺伝子（１つまたは複数）の発現レベルが、上記の１つまたは複数の二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ構築物の不在下でのレベルよりも低下することを指す。「ダウンレギュレートされる」、「阻害される」、「減少する」および「サイレンシングされる」という用語は、本明細書では標的遺伝子の発現が１〜１００％低いことを表すのに使用される。例えば、発現が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上減少し得る。
【００８２】
二本鎖ＲＮＡの配列は、完全長の標的遺伝子に対応するものであっても、そのサブ配列に対応するものであってもよい。二本鎖ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列が実質的に標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的である点で遺伝子に「標的化され」ている。本発明の二本鎖ＲＮＡは様々な長さのものであり得る。二本鎖ＲＮＡの各鎖の長さは、約２０〜約１５００ヌクレオチドの長さであるのが好ましい。あるいは、センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ約５０〜約１０００ヌクレオチドの長さを有し、あるいは、各鎖が約１００〜約８００ヌクレオチドを有し、あるいは各鎖が約１５０〜約５００ヌクレオチドの長さを有する。しかし、約１２〜約２０ヌクレオチドのＲＮＡ鎖も本発明に包含される。
【００８３】
「異種生物体」、「標的生物体」および「異種標的生物体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、トランスジェニック微細藻類以外の生物体を指す。本発明の特定の実施形態では、異種生物体はトランスジェニック微細藻類を摂取する生物体である。ＲＮＡｉ分子は、標的生物体のポリヌクレオチドに標的化されていても、異種生物体内の異種ポリヌクレオチド、具体的にはウイルスに標的化されていてもよい。本発明の他の実施形態では、標的生物体はトランスジェニック微細藻類を摂取する宿主生物体の病原体であり、したがって、ＲＮＡｉ分子は病原体のポリヌクレオチドに標的化されている。特定の実施形態では、病原体は寄生虫または細菌である。
【００８４】
「遺伝子」という用語は、その最も広い意味で、１つまたは複数のプロモーターおよび遠位調節エレメントによって転写が調節され、最終産物（タンパク質またはＲＮＡ）レベルで遺伝情報の一部を共有することによって関連付けられている機能性タンパク質または非コードＲＮＡの合成に関する情報を格納する、分離したゲノム領域を指す。本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、ＲＮＡまたはタンパク質の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。ＲＮＡまたはタンパク質は、完全長のコード配列によってコードされていても、その一部分によってコードされていてもよい。遺伝子に関して使用される「その一部分」という用語は、その遺伝子のフラグメントを指す。フラグメントは、数ヌクレオチドの大きさから、遺伝子配列全体から１ヌクレオチドを除いた大きさの範囲であり得る。
【００８５】
「遺伝子」という用語はほかにも、構造遺伝子のコード領域を包含し、かつコード領域の５’末端および３’末端の両方に隣接して約１ｋｂの距離にわたって存在する配列を含み、このため、遺伝子は完全長ｍＲＮＡの長さに対応する。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列を５’非翻訳配列と呼ぶ。コード領域の３’側または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列を３’非翻訳配列と呼ぶ。「遺伝子」という用語にはｃＤＮＡ形態およびゲノム形態の遺伝子が包含され、ゲノム形態またはクローンの遺伝子には、「イントロン」または「介在領域」もしくは「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって中断されるコード領域が含まれる。イントロンは核内転写産物または一次転写産物から除去される、つまり「スプライスアウト」されるため、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。
【００８６】
本明細書で言及される「ポリヌクレオチド分子」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。この用語は、個別のフラグメントの形態またはより大きい構築物の構成要素であるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびその修飾型のポリマーであって、直鎖状または分岐鎖状のもの、一本鎖（ｓｓ）、二本鎖（ｄｓ）、三本鎖（ｔｓ）のものまたはそのハイブリッドを対象とする。この用語にはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含される。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列であり得る。ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は例えば、特に限定されないが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡもしくはそのハイブリッドまたはＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどであり得る。したがって、本明細書で使用される「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方を指すものとする。この用語はさらに、天然の塩基、糖およびヌクレオシド間共有結合からなるオリゴヌクレオチドのほか、それぞれの天然の部分と同様の機能を有する非天然の部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。
【００８７】
本明細書で言及される「相補的」という用語は、核酸の鎖間の塩基対を対象とする。当該技術分野で公知のように、核酸の鎖はそれぞれ、鎖間の塩基対が２つまたは３つの水素結合を介して非共有結合している点で、もう一方の鎖と相補的なものであり得る。反対側の相補的な核酸鎖に存在し水素結合によって結合した２つのヌクレオチドを塩基対と呼ぶ。ワトソン・クリックＤＮＡ塩基対形成に従えば、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）が塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）が塩基対を形成する。ＲＮＡでは、チミンがウラシル（Ｕ）に置き換わっている。核酸の２つの鎖の間の相補性の程度は、鎖間で塩基対を形成するヌクレオチドの数（または割合）によって異なり得る。例えば、「１００％の相補性」は、各鎖の全ヌクレオチドが相補鎖と塩基対を形成することを表す。例えば、「９５％の相補性」は、各鎖の９５％のヌクレオチドが相補鎖と塩基対を形成することを表す。十分な相補性という用語には、約３０％〜約１００％の任意の割合の相補性が包含され得る。
【００８８】
本明細書で配列の長さと関連して使用される「約」という用語は、プラスまたはマイナス１０％の範囲内を指す。
【００８９】
本明細書で使用される「構築物」という用語は、人為的に組み立てるか単離した核酸分子であって、１つまたは複数の核酸配列を含み得るものを指し、核酸配列は、コード配列（すなわち、最終産物をコードする配列）、調節配列、非コード配列またはその任意の組合せであり得る。構築物という用語は、例えばベクターを包含するが、それに限定されるものとして理解されるべきではない。
【００９０】
「発現ベクター」という用語は、異種細胞内に異種核酸フラグメント（ＤＮＡなど）を組み込み発現させる能力を有するベクターを指す。換言すれば、発現ベクターは、転写可能な核酸配列／フラグメント（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）を含むものである。多くのウイルス発現ベクター、原核発現ベクターおよび真核発現ベクターが知られており、かつ／または市販されている。しかるべき発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内にある。
【００９１】
本明細書で使用される「プロモーターエレメント」、「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、一般にコード配列の５’末端に位置し（すなわち、コード配列の前方にある、コード配列の上流に位置し）コード配列の発現を活性化させるスイッチとして機能するヌクレオチド配列を指す。コード配列が活性化されると、それが転写されると考えられる。転写では一般に、コード配列からＲＮＡ分子が合成される（例えばｍＲＮＡなど）。プロモーターは、その全体が天然源に由来するものであっても、天然に存在する様々なプロモーターに由来する様々なエレメントからなるものであっても、場合によっては合成ヌクレオチドセグメントを含むものであってもよい。当業者には、発生の様々な段階において、様々な環境条件に応答して、あるいは種々の発現レベルで、様々なプロモーターが遺伝子の発現を指令し得ることが理解される。ほとんどの細胞型で常に遺伝子を発現させるプロモーターは、「構成的プロモーター」と呼ばれることが多い。
【００９２】
「作動可能に連結されている」という用語は、プロモーターが、選択された核酸配列の発現を調節できるように、その選択された核酸配列がプロモーターに近接していることを意味する。プロモーターは一般に、転写の指令という観点からみて、選択された核酸配列の上流に位置する。
【００９３】
本明細書で使用される「相同性」という用語は、核酸配列に関連して使用される場合、少なくとも２つのヌクレオチド配列の間の類似性または同一性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）が存在し得る。「配列同一性」は、２つ以上のヌクレオチド配列の間の近縁性を比較全長に対する割合で表した尺度の１つである。同一性の算出には、それぞれの配列で一致し、かつ同じ相対位置にあるヌクレオチド残基を考慮に入れる。ギャップ、すなわち、アライメントにおいて、ある残基が一方の配列には存在するが他方の配列には存在しない位置を残基が一致しない位置とみなす。配列アライメントを実施するのに広く用いられ認められているコンピュータプログラムの１つにＣＬＵＳＴＡＬＷ  ｖ１．６（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：４６７３−４６８０，１９９４）がある。
【００９４】
藻類に関して使用される「トランスジェニック」（すなわち、「トランスジェニック藻類」）という用語は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含んでいる藻類を指す。
【００９５】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡ−ＲＮＡ間、ＲＮＡ−ＤＮＡ間またはＲＮＡ−ＰＮＡ間（タンパク質核酸）の相互作用によって標的ＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡの活性を変化させるオリゴヌクレオチドを指す（総説に関しては、ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ，１９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１００４−１０１２を参照されたい）。アンチセンス分子は通常、アンチセンス分子の単一の連続する配列にわたる標的配列に相補的なものである。しかし、ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続していない２つ（場合によってはそれ以上）の標的配列に相補的なものであり得る。
【００９６】
本明細書で使用される「発現」という用語は、標的細胞内での所望の最終産物分子の産生を指す。最終産物分子は、例えばＲＮＡ分子であり得る。
【００９７】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、分子、例えば核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクターなどを標的細胞（１つまたは複数）内、より具体的には標的細胞（１つまたは複数）の膜で囲まれた空間の内部に移入することを指す。分子は、当業者に公知の任意の手段によって標的細胞（１つまたは複数）内に「形質転換する」ことができる。細胞内に分子を「形質転換する」手段としては、例えば、特に限定されないが、熱ショック、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＰＥＩトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子ボンバードメント、トランスフェクション試薬（１つまたは複数）、ウイルスを介する移入など、またはその組合せが挙げられる。
【００９８】
ＲＮＡｉ分子に関して本明細書で使用される「異種」という用語は、標的細胞内に導入し、かつ／または発現させる組換えＤＮＡまたは組換えＲＮＡ分子を対象とする。異種ＲＮＡ分子は、インタクト（すなわち、完全長分子）であっても、細胞内で１つまたは複数の切断部位で切断されてもよい。
【００９９】
本明細書で使用される「標的核酸」という用語は、プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ（またはその一部分）を指す。
【０１００】
本明細書で使用される「異種」という用語は、関心のある生物体の外部を起源とする遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。
【０１０１】
本明細書で使用される「可食性」という用語は、食物として食べるのに適した化合物または組成物を指す。本発明との関連で言えば、この用語には、昆虫をはじめとする植物および／または動物の有害生物が食べることができる化合物／組成物が包含される。
【０１０２】
一態様では、本発明は、ＲＮＡｉ分子を発現する少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含み、ＲＮＡｉ分子が、異種生物体内に存在するポリヌクレオチドに標的化されている、非増殖性トランスジェニック微細藻類を提供する。
【０１０３】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、微細藻類が異種生物体によって摂取されると、前記生物体内に存在するポリヌクレオチドの発現をサイレンシングする。特定の実施形態では、異種生物体内に存在するポリヌクレオチドは前記生物体の内在遺伝子である。他の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、異種生物体の寄生虫または病原体の遺伝子またはその一部分に標的化されている。
【０１０４】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、異種生物体内に存在するポリヌクレオチドの発現をサイレンシングし、異種生物体は、微細藻類を摂取する宿主生物体の病原体である。
【０１０５】
ほかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、異種生物体内に存在するポリヌクレオチドの発現をサイレンシングし、異種生物体は、植物、具体的には少なくとも一部が微細藻類で覆われている作物を食物とする。
【０１０６】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、異種生物体内に存在するポリヌクレオチドの発現をサイレンシングし、異種生物体は、微細藻類を摂取する介在生物体を食物とする。
【０１０７】
特定の実施形態では、異種生物体は植物の有害生物または寄生虫である。特定の例示的実施形態では、植物の有害生物は、表１に示すグループから選択される。
【０１０８】
【表１】
2018520656.tif 000002
2018520656.tif 000003
【０１０９】
特定の実施形態では、異種生物体は動物の有害生物または寄生虫である。特定の例示的実施形態では、動物は魚類であり、有害生物または寄生虫は、表２に示すグループから選択される。
【０１１０】
【表２】
2018520656.tif 000004
2018520656.tif 000005
【０１１１】
ほかの特定の例示的実施形態では、動物は飼育動物であり、異種生物体は、表３に示すグループから選択される有害生物または寄生虫である。
【０１１２】
【表３】
2018520656.tif 000006
【０１１３】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖とアンチセンス鎖は一緒に二本鎖を形成し、前記センス鎖は、異種標的生物体内に存在する標的ポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも１９個の連続する核酸を含む。
【０１１４】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は昆虫のポリヌクレオチドに標的化されている。特定の例示的実施形態では、ＲＮＡｉ分子はｃｌｋ遺伝子に標的化されている。いくつかの実施形態では、ｃｌｋ遺伝子は、配列番号１に記載される核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＱ４２８０３３．２）を含む。
【０１１５】
このような実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、配列番号１に記載される核酸配列またはそのフラグメントと少なくとも９０％の相同性、通常は少なくとも９５％の相同性、より通常には少なくとも９９％の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１またはそのフラグメントに相補的な核酸配列と少なくとも９０％の相同性、通常は少なくとも９５％の相同性、より通常には少なくとも９９％の相同性を有するポリヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを含む。
【０１１６】
特定の例示的実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、配列番号２に記載されるポリヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号３に記載されるポリヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含む。
【０１１７】
配列番号１はサバクトビバッタのｃｌｏｃｋ遺伝子（ｃｌｋ）をコードする。サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）の成虫および第５齢幼虫には、ｃｌｋに標的化された二本鎖ＲＮＡでの処理が致命的なものとなることが明らかにされている（Ｔｏｂｂａｃｋａら，２０１１．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４１：３１３−３２１）。本発明は、微細藻類によって産生されるＲＮＡｉ分子をサバクトビバッタまたはトノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）に給餌する方法を提供する。本発明の非増殖性微細藻類をコムギの新芽、実生または成熟植物体に塗布し、のちにこれをバッタに摂取させる。特定の例示的実施形態では、バッタが摂取する植物に生存不可能な微細藻類またはそれを含む組成物を噴霧する。
【０１１８】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子はカイアシ類のポリヌクレオチドに標的化されている。特定の例示的実施形態では、カイアシ類はサケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）であり、ＲＮＡｉ分子はサケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）のＣＯＰＢ２遺伝子に標的化されている。このような実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、配列番号３５に記載される核酸配列またはそのフラグメントと少なくとも９０％の相同性、通常は少なくとも９５％の相同性、より通常には少なくとも９９％の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号３６に記載される核酸配列またはそのフラグメントと少なくとも９０％の相同性、通常は少なくとも９５％の相同性、より通常には少なくとも９９％の相同性を有するポリヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを含む。
【０１１９】
他の実施形態では、ＲＮＡｉは、摂取動物の成長、発生および生存のうちの少なくとも１つに有益な効果を示す。可能なものそれぞれが本発明の個々の実施形態となる。
【０１２０】
他の実施形態では、ＲＮＡｉは、トランスジェニック微細藻類を摂取する動物に治療効果を示す。特定の実施形態では、ＲＮＡｉは、陸生有害生物に対する抵抗性をもたらす。特定の実施形態では、ＲＮＡｉは、水性有害生物に対する抵抗性をもたらす。特定の実施形態では、ＲＮＡｉは、ウイルスに対する抵抗性をもたらす。
【０１２１】
特定の実施形態では、生物体は魚類である。魚類は任意選択で、食用に育てられているものであっても、食用以外の目的で育てられているもの（後者には、特に限定されないが観賞魚などが含まれる）であってもよい。
【０１２２】
特定の実施形態では、生物体は甲殻類である。甲殻類は任意選択で、食用に育てられているものであっても、食用以外の目的で育てられているもの（後者には、特に限定されないが観賞用甲殻類などが含まれる）であってもよい。
【０１２３】
別の実施形態では、生物体は家禽である。家禽は通常、多数で育てられるものであり、このため、家禽に生物学的に活性な薬剤を与えるのに有利な手段は、経口送達によるものである。
【０１２４】
特定の実施形態では、本発明の非増殖性トランスジェニック微細藻類は、それ自体を投与しても、あるいは可食性の希釈剤、補形剤または担体をさらに含む可食性組成物に製剤化してもよい。特定の例示的実施形態では、単独で投与する場合も組成物の中に入れて投与する場合も、非増殖性トランスジェニック微細藻類を乾燥させる。
【０１２５】
本発明のトランスジェニック微細藻類を乾燥させるには、微細藻類が異種生物体によって摂取された後もＲＮＡｉ活性の機能を保持するのに適した乾燥技術を用いる必要がある。通常、乾燥工程全体を５０℃未満の温度で実施する。
【０１２６】
特定の例示的実施形態では、トランスジェニック微細藻類を凍結乾燥させる。他の実施形態では、マイクロ波真空乾燥技術を用いてトランスジェニック微細藻類を乾燥させる。いずれの方法も、固体、液体、顆粒またはカプセル状の原料を大量に低温で脱水するよう設計する。
【０１２７】
特定の例示的実施形態では、乾燥トランスジェニック微細藻類を少なくとも１つの可食性の希釈剤、補形剤または担体と混合する。
【０１２８】
特定の例示的実施形態では、乾燥トランスジェニック微細藻類をゼラチンと混合する。ほかの例示的実施形態では、乾燥トランスジェニック微細藻類を魚油と混合する。いくつかの実施形態では、ゼラチンまたは魚油を０．１〜１０％ｗ／ｗ、通常は０．５〜５％ｗ／ｗの量で加える。
【０１２９】
微細藻類またはそれを含む組成物はさらに、食品添加物として使用することができる。特定の実施形態では、藻をベースとする可食性組成物は動物飼料組成物である。
【０１３０】
また別の実施形態では、藻をベースとする可食性組成物は、単独で、または昆虫の天然食物と組み合わさって昆虫の食物源としての役割を果たす。特定の例示的実施形態では、可食性組成物は、特に限定されないが鱗翅目、鞘翅目および直翅目からなる群より選択される目に属する昆虫の食物源としての役割を果たす。他の例示される実施形態では、藻をベースとする可食性組成物はサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）の食物源となる。また別の実施形態では、藻をベースとする可食性組成物はトノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）の食物源となる。また別の実施形態では、藻をベースとする可食性組成物はエジプトヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）の食物源となる。また別の実施形態では、藻をベースとする可食性組成物は線虫の食物源となる。また別の実施形態では、藻をベースとする可食性製剤はウオジラミの宿主の食物源となる。また別の実施形態では、藻をベースとする可食性組成物は、魚類に給餌するためのものである。また別の実施形態では、藻をベースとする可食性製剤は甲殻類の食物源となる。特定の例示的実施形態では、魚類および／または甲殻類はウイルスに感染している。このような実施形態では、トランスジェニック分子内のＲＮＡｉ分子は、ウイルス遺伝子をサイレンシングするよう標的化されている。また別の実施形態では、藻をベースとする可食性組成物は、家禽に給餌するためのものである。特定の実施形態では、可食性組成物は、ほかの活性な治療剤および／または栄養剤をさらに含み得る。
【０１３１】
このほか、摂取、分布および／または吸収を助けるため、本発明の藻をベースとする可食性組成物を、例えばリポソーム、フェロモンの形で他の分子、化合物の混合物または誘引物質と混合、カプセル化または結合してもよい。
【０１３２】
経口投与用の組成物および製剤としては、散剤、顆粒剤、微粒子剤、水もしくは非水性媒体を用いた懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、ゲル剤、カプセル剤、サシェ剤、錠剤または微小錠剤が挙げられる。
【０１３３】
藻をベースとする可食性組成物を植物および／または動物に塗布するのに適した組成物および製剤としては、散剤、顆粒剤、微粒子剤、水またはゼラチンもしくは油などの非水性媒体を用いた懸濁剤または液剤が挙げられる。
【０１３４】
微細藻類が形質転換後に細胞壁の構造を維持または再生するものである限り、様々な微細藻類種を本発明の教示に従って使用することができる。特定の実施形態では、本発明の教示に従って使用する微細藻類は、海産微細藻類である。特定の実施形態では、微細藻類は、特に限定されないが、フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）；ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種；ナンノクロロプシス・オキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ）、ナンノクロロプシス・サリナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ）を含めたナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）種；ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）種、テトラセルミス・スエシカ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ）、テトラセルミス・チュイィ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｃｈｕｉｉ）を含めたテトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）種；イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）；パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）種；アンフィプロラ・ヒアリン（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ）；キートケロス・ムエレリ（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）；およびネオクロリス・オレオアブンダンス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ）からなる群より選択される。可能なものそれぞれが本発明の個々の実施形態となる。
【０１３５】
特定の具体的な実施形態では、微細藻類は、フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）種、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）種およびドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種からなる群より選択される。可能なものそれぞれが本発明の個々の実施形態となる。
【０１３６】
他の具体的な実施形態では、微細藻類はフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である。
【０１３７】
特定の実施形態では、標的遺伝子の発現は、生物体が前記トランスジェニック微細藻類を摂取しない場合の同じ標的遺伝子と比較して少なくとも１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、通常は９９％阻害されている。
【０１３８】
ほかの態様では、本発明は、生物体にＲＮＡｉ分子を経口送達する方法を提供し、この方法は、少なくとも１つの異種ＲＮＡｉ分子を含む非増殖性トランスジェニック微細藻類を生物体に経口投与することを含み、ＲＮＡｉ分子は、前記生物体内に存在するポリヌクレオチドに標的化されており、それによりその発現を阻害する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、非増殖性トランスジェニック真核微細藻類を動物飼料組成物中に投与する。組成物は、任意の上記の手段によって製剤化する。組成物は、上に記載したいずれかの生物体に給餌するよう製剤化する。
【０１４０】
さらにほかの実施形態では、非増殖性トランスジェニック真核微細藻類を生物体の天然食物とともに投与する。このような実施形態では、生物体の天然食物の少なくとも一部を微細藻類が覆っている。微細藻類は、当該技術分野で公知のようにおよび上に記載したように、生物体の天然食物を覆うように製剤化することができる。
【０１４１】
微細藻類の形質転換には、当該技術分野で公知の任意の方法を本発明の教示に従って用いることができる。形質転換の方法としては、粒子ボンバードメント、エレクトロポレーション、マイクロポレーション、異種ＤＮＡの存在下での細胞のボルテックス、酸洗浄ビーズおよびポリエチレングリコールを介する形質転換が挙げられる。真核藻類を形質転換する方法および手段は、例えば国際出願（ＰＣＴ）出願公開第１９９７／０３９１０６号で見つけることができる。
【０１４２】
トランスジェニック藻類を作製するためのベクターの調製には通常、最初に、藻類ゲノムに組み込むことが可能なプラスミドである発現ベクターに、ＲＮＡｉを転写するポリヌクレオチドをクローン化する。このような発現ベクターでは、異種ＲＮＡｉをコードするＤＮＡ配列が、ＲＮＡ合成を指令する発現調節配列、すなわちプロモーターと作動可能に連結されている。プロモーターは内在プロモーター、すなわち、藻類に通常存在する遺伝子の転写を指令するプロモーターであり得る。特定の実施形態では、ベクターは、形質転換された藻類の選択を可能にするため、耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。特定のこの例示的実施形態では、ベクターは、ゼオシンおよびフレオマイシンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１４３】
形質転換藻類の培養条件は、当業者に公知であり、また本明細書でのちに例示するように、使用する藻類種によって決まる。通常、光合成が可能な条件下で藻類を生育させる。光合成に日光とＣＯ２が必要であるほか、微細藻類の生育には、しかるべき肥料を混合した淡水、汽水または海水のいずれかがさらに必要であるため、例えば屋外の池および湖などで微細藻類を培養してもよい。ただし、開放システムは閉鎖システムよりも汚染が起こりやすく、さらには、屋外の貯水池で生育した遺伝子改変微細藻類が環境に害を及ぼすことも考えられる。さらに、開放システムの方が水温、ＣＯ２濃度および光条件の制御性が低い。生育期は、熱帯地域を除けば大部分が場所に左右され、１年のうち温暖な月に限定される。しかし、開放システムの方が閉じたシステムよりも設置および／または維持にかかる費用が少なくて済む。
【０１４４】
このため、微細藻類を生育させる別の方法として、池またはプールを構造物、例えば「温室型」の構造物で覆うなど、半閉鎖システムを用いることになる。これによりシステムが小規模になるとともに、開放システムに付随する問題点の多くに対処できる。半閉鎖システムの利点は、所望の微細藻類がその生育に必要な栄養素をめぐる侵入生物体との競争に勝つようにすることによって、目的とする微細藻類を侵入生物体よりも優勢にすることができるほか、生育期を長くすることができることにある。例えば、システムを加温または冷却すれば、微細藻類が１年中生育することが可能になる。
【０１４５】
あるいは、環境が開放システムまたは半閉鎖システムよりも厳密な制御下にある光バイオリアクターなどの閉鎖構造物内で微細藻類を生育させてもよい。光バイオリアクターとは、リアクター内に光エネルギーを投入するために何らかの種類の光源を組み込んだバイオリアクターのことである。光バイオリアクターという用語は、環境に対して閉じており、環境とガスおよび汚染物を直接交換することがないシステムを指し得る。光バイオリアクターは、光合成液体細胞浮遊培養物のバイオマス産生を制御するよう設計され、光を照射する閉鎖された培養容器であると言える。光バイオリアクターとしては、例えば、ガラス容器、プラスチック／ガラス管、タンク、プラスチックスリーブおよび袋が挙げられる。光合成の維持に必要なエネルギーを供給するのに使用することができる光源の例としては、例えば、蛍光灯、ＬＥＤおよび自然光が挙げられる。これらのシステムは閉じているため、生物体の生育に必要なあらゆるもの（例えば、二酸化炭素、栄養素、水および光）をバイオリアクター内に導入しなければならない。光バイオリアクターは、その設置および維持に費用がかかるものの、開放システムに勝る利点がいくつかあり、例えば、汚染を防止したり、最小限に抑えたりすること、培養条件（例えば、ｐＨ、光、二酸化炭素および温度）の制御性を高めること、水の蒸発を防ぐこと、脱ガスによる二酸化炭素の損失を低く抑えることのほか、細胞濃度を高くすることが可能である。一方、光バイオリアクターには、例えば冷却すること、混合すること、酸素蓄積および生物付着を制御することなど、特定の必要条件があるため、このようなシステムの構築および稼働には開放システムまたは半閉鎖システムよりも費用がかかる。光バイオリアクターは、（比較的大容量の培養システムの大部分がそうであるように）連続的に回収するよう設定しても、（例えば、ポリエチレン袋での培養のように）１度に１バッチを回収するよう設定してもよい。バッチ式の光バイオリアクターは、例えば栄養素、微細藻類および水を用いて設定し、バッチを回収するまで微細藻類を生育させる。連続式の光バイオリアクターは、例えば常時、毎日または固定した時間間隔で回収することができる。
【０１４６】
本明細書に記載されるいずれかのシステムに、例えば微細藻類の入った液体の表面下からＣＯ２を泡立たせることによって、ＣＯ２を供給することができる。このほか、拡散装置を用いて液体内にＣＯ２を注入することができる。拡散装置には、例えば、バブラ、カーボネータ、エアレータ、ポーラスストーンおよびディフーザとも呼ばれる多孔性のディスクアセンブリまたはチューブアセンブリがある。
【０１４７】
本明細書に記載されるシステムに使用することができる栄養素としては、例えば、窒素（ＮＯ３−またはＮＨ４の形態で）、リンおよび微量金属（Ｆｅ、Ｍｇ、Ｋ、Ｃａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｚｎ、ＶおよびＢ）が挙げられる。栄養素は、例えば固体形態または液体形態のものであり得る。栄養素が固体形態である場合、例えば、それを微細藻類の入った液体に供給する前または光バイオリアクターに供給する前に淡水または海水と混合することができる。
【０１４８】
微細藻類を大規模な培養で生育させてもよく、この場合、大規模培養は、体積が約５リットル超、約１０リットル超または約９０リットル超の培養物を生育させることを指す。大規模生育はこのほか、体積が３００リットルもしくはそれ以上、１０００リットルもしくはそれ以上、または５０００リットル以上の培養物を生育させることであり得る。
【０１４９】
最適な生育温度は通常約１８℃〜約２５℃であるが、種によって異なる。特定の実施形態では、回収前に微細藻類細胞が１０５〜１０８個／ｍｌの密度に達する。
【０１５０】
回収後に何らかの加工を用いて、原料を経口摂取用に、または飼料組成物として調製し得る。従来の工程では通常、藻を生育させた液体培養物から藻類バイオマスを少なくとも一部分離する。任意選択で、標的対象および適用様式に応じて藻類バイオマスをホモジナイズし、かつ／または乾燥させて様々な大きさのペレットにしてもよい。その他の調製様式としては、噴霧乾燥法、流動層乾燥法、または場合によっては原料を液体懸濁液として与える方法が挙げられる。
【０１５１】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより十全に説明するために記載されるものである。ただし、これらは決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される原理の多数の変形形態および修正形態を容易に考案することができる。
【実施例】
【０１５２】
材料および方法
藻の培養および回収
藻の培養および回収を本発明の出願者に対する米国特許出願公開第２０１１／００８１７０６号に記載されている通りに実施した。簡潔に述べれば、珪藻生育用のＦ／２栄養素（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｒら，２００５．Ｒｅｃｉｐｅｓ  ｆｏｒ  ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｓｅａｗａｔｅｒ  ｍｅｄｉａ．Ｉｎ：Ａｌｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｒ．Ａ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ編），ｐｐ．４２９−５３８．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍのものを改変）を多量に含み、ろ過された海水で、藻（フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））を培養した。Ｆ／２を最終培養体積に対して１：１０００の量で７２時間毎に加えた。２１℃の一定温度条件を維持した。１ｍ２ｓ１当たり１００μｍｏｌ光子の光強度で明：暗を１６時間：８時間に設定した。ＣＯ２と空気を混合し、比を制御した状態でエアレーションシステムから培養物に供給した。実験には、藻をその最大培養密度付近で回収した。藻を凝集させるため、水酸化カルシウムを０．１５ｇ／ｍｌのＣａ（ＯＨ）２を含有する微細な粒子懸濁水の形で培養物に添加し、次いで、培養物をろ過または遠心分離した。得られた藻の沈殿物を凍結乾燥させて藻粉末にした。藻粉末を真空バッグ中、２〜８℃の温度で保管した。
【０１５３】
藻の形質転換
Ｉ．粒子ボンバードメントによる形質転換
新鮮な藻培養物を上記の人工海水（ＡＳＷ）Ｆ／２培地で対数中期（２〜５×１０６細胞／ｍｌ）まで増殖させた。ボンバードメントの２４時間前に細胞を回収し、新鮮なＡＳＷ＋Ｆ／２で２回洗浄し、元の細胞体積の１０分の１をＡＳＷ＋Ｆ／２に再懸濁させた。凝固したＡＳＷ＋Ｆ／２培地の入った５５ｍｍのペトリ皿の中央に細胞懸濁液０．５ｍｌをスポットした。プレートを通常の増殖条件下で乾燥させた。ＰＤＳ  １０００／Ｈｅ微粒子銃形質転換システム（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を製造業者の指示通りに用い、直径２ミクロン超の細胞にはＭ１７タングステン末（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、これより小さい細胞には０．６ミクロン未満の粒子からなるタングステン末（ＦＷ０６、Ｃａｎａｄａ  Ｆｕｊｉａｎ  Ｊｉｎｘｉｎ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｍｅｔａｌｌｕｒｇｙ社、マーカム、オンタリオ州、カナダ）を使用して、ボンバードメントを実施した。タングステンには直線状ＤＮＡをコーティングした。１１００ｐｓｉ（約７５８０ｋＰａ）または１３５０ｐｓｉ（約９３００ｋＰａ）の破裂板を使用した。消耗品はいずれもＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。ボンバードメント後、プレートを通常の増殖条件下で２４時間インキュベートした後、細胞を選択固形培地に播き、単一コロニーが出現するまで通常の増殖条件下でインキュベートした。
【０１５４】
ＩＩ．マイクロポレーションによる形質転換
新鮮な藻培養物を上記のＡＳＷ＋Ｆ／２培地で対数中期まで増殖させた。培養物の試料１０ｍｌを回収し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カースルバッド、カリフォルニア州、米国）で２回洗浄し、緩衝液Ｒ（マイクロポレーション装置およびキットの製造者であるＤｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ、ＮａｎｏＥｎＴｅｋ社（ソウル、韓国）により供給されたもの）２５０μｌに再懸濁させた。細胞１００μｌ毎に直線状ＤＮＡを８μｇ加えた後、細胞にパルスを加えた。通常、細胞の種類に応じて７００〜１７００ボルト、パルス長１０〜４０ミリ秒の範囲の様々なパルスが必要であり、各試料にパルスを１〜５回加えた。パルスを加えた直後、細胞を２００μｌの新鮮な培地（非選択培地）に移した。２５℃、微光下で２４時間インキュベートした後、細胞を選択固形培地上に播き、単一コロニーが出現するまで通常の増殖条件下でインキュベートした。
【０１５５】
血リンパ採取
動物（本明細書でのちに記載する種のもの）を水で洗浄し、８〜１０個体のプールの血リンパをエッペンドルフチューブに採取した。試料を１４０００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；カタログ番号１５５９６０２６）の入った新たなエッペンドルフチューブに移した。試料を液体窒素の中に入れ、使用するまで凍結保存した。
【０１５６】
ＲＮＡ精製
Ｍａｓｔｅｒ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社；カタログ番号ＭＰＲ０９１００）を製造業者の指示通りに用いて、藻からのＲＮＡ抽出を実施した。試料を無ＲＮアーゼ水に再懸濁させ、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ社、カタログ番号ＡＭ１９０７）を製造業者の指示通りに用いてインキュベートした。
【０１５７】
Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；カタログ番号１５５９６０２６）を用いて、またはｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログ番号２１７１８４）により、昆虫血リンパからのＲＮＡ抽出を製造業者の指示通りに実施した。
【０１５８】
Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；カタログ番号１５５９６０２６）を用いて、昆虫の器官からのＲＮＡ抽出を実施した。ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ社、カタログ番号ＡＭ１９０７）を製造業者の指示通りに用いてＲＮＡをインキュベートした。
【０１５９】
ｃＤＮＡ合成
ランダムヘキサマープライマー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社；カタログ番号Ｓ０１４２）を添加したＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カタログ番号１００００４９２５）またはｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社；カタログ番号１７０−８８９０）を製造業者の指示通りに用いたｃＤＮＡ合成には、全ＲＮＡ１μｇを鋳型として用いた。
【０１６０】
ｑＲＴ−ＰＣＲ解析
Ｂｉｏｒａｄ  ＣＦＸ９６にＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カタログ番号１１７４４５００）を製造業者の指示通りに用いたｑＲＴ−ＰＣＲによる相対的定量化によってｃＤＮＡの解析を実施した。プライマーｄｓ−ＧＦＰ  Ｑ２  Ｆｏｒ  ｊｕｎｃおよびｄｓ−ＧＦＰ  Ｑ２  Ｒｅｖ  ｌｉｎｋｅｒ（表１）を用いて、ｍＲＮＡをコードし緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に標的化されたｄｓＲＮＡを増幅した。ＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質をコードする）を参照遺伝子として使用し、Ｑ−ＴＢＰ−ｆｗおよびＱ−ＴＢＰ−ｒｖ（表１）を用いて増幅した。ｄｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ  Ｑ１  Ｆｏｒ  ５’およびｄｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ  Ｑ１  Ｒｅｖ  ｊｕｎｃ（表１）を用いて、赤色蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙに標的化されたｄｓＲＮＡを増幅した。内部対照（Ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ社、イギリス；カタログ番号ＩＮＴ−ＲＮＡ−ＦＡＭ）を参照に用いた。ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋら，２００１．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８）に従ってデータ解析を実施した。
【０１６１】
サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）のｃｌｏｃｋ  ｍＲＮＡ配列を増幅するよう設計されたプライマーＳｇ＿ｃｌｋ＿ＦおよびＳｇ＿ｃｌｋ＿Ｒを用いて、ｃｌｏｃｋ（ｃｌｋ）遺伝子の発現レベルの解析を実施した。藻に形質転換して発現させるｃｌｏｃｋ  ｄｓＲＮＡ配列を特異的に増幅するプライマー、ｄｓＣＬＯＣＫ  Ｑ４  ｆｗおよびｄｓＣＬＯＣＫ  ｒｅｖを設計した（表４）。ｔｉｍｅｌｅｓｓ遺伝子およびｐｅｒｉｏｄ遺伝子の定量化を、それぞれＳｇ＿ｔｉｍ＿ＦとＳｇ＿ｔｉｍ＿ＲおよびＳｇ＿ｐｅｒ＿ＦとＳｇ＿ｐｅｒ＿Ｒ（表４）を用いて実施した。βアクチンまたはＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用し、それぞれＳｇ＿ｂ＿ａｃｔｉｎ＿ＦとＳｇ＿ｂ＿ａｃｔｉｎ＿ＲおよびＳｇ＿ＧＡＰＤＨ＿ＦとＳｇ＿ＧＡＰＤＨ＿Ｒ（表４）を用いて増幅した。ΔΔＣｔ法に従って、またアガロースゲルでｑＲＴ−ＰＣＲ産物を分離することによって、データ解析を実施した。
【０１６２】
【表４】
2018520656.tif 000007
【０１６３】
実施例１：藻でのｃｌｋ、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ  ｄｓＲＮＡの発現
サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）のｃｌｋ  ｍＲＮＡに標的化されたｄｓＲＮＡの構築
ｃｌｋ遺伝子のセンスフラグメント（配列番号２）およびアンチセンスフラグメント（配列番号３）をＢｉｏｍａｔｉｋ  ＵＳＡ社にて合成した。ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩＩによってセンスフラグメントをクローン化し、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩによってアンチセンスフラグメントをクローン化した。ｃｌｋフラグメントをｐＰｈａＴカセットに含まれるイントロンにセンス／アンチセンスの方向でクローン化した（図１、配列番号３７に記載される核酸配列を有するｐＰｈａｔカセット）。
【０１６４】
ＧＦＰ  ｍＲＮＡおよびｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡに標的化されたｄｓＲＮＡの構築：
以下のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによりＧＦＰセンス鎖（配列番号４）を増幅した：ＢａｍＨＩセンスＧＦＰ  Ｆ  ５’−ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−３′（配列番号２５）。ＳａｃＩＩセンスＧＦＰ  Ｒ  ５’−ＧＣＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣ−３’（配列番号２６）。以下のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによりＧＦＰアンチセンス鎖（配列番号５）を増幅した：ＳａｃＩアンチセンスＧＦＰ  Ｆ  ５’−ＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号２７）。ＫｐｎＩアンチセンスＧＦＰ  Ｒ  ５’−ＧＧＧＴＡＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣ−３’（配列番号２８）。
【０１６５】
以下のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによりｍＣｈｅｒｒｙセンス鎖（配列番号２９）を増幅した：ＢａｍＨＩセンスｍＣｈｅｒｒｙ  Ｆ  ５’−ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＴＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧ−３’（配列番号３０）およびＳａｃＩＩセンスｍＣｈｅｒｒｙ  Ｒ：５’−ＧＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧ−３’（配列番号３１）。ｍＣｈｅｒｒｙアンチセンス鎖（配列番号３２）の増幅には以下のプライマーを用いた：ＳａｃＩアンチセンスｍＣｈｅｒｒｙ  Ｆ：５’−ＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＴＡＡＧＴＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧ−３’（配列番号３３）。ＫｐｎＩアンチセンスｍＣｈｅｒｒｙ  Ｒ  ５’−ＧＧＧＴＡＣＣＣＴＧＣＴＴＧＡＴＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧ−３’（配列番号３４）。
【０１６６】
ｐＰｈａＴのｆｃｐＡ構成的プロモーター下にｃｌｋおよびｍＣｈｅｒｒｙ  ｄｓＲＮＡの構築物を調製し、ｐＰｈａＴの誘導プロモーターｐｔＣＡＩ下にＧＦＰの構築物を調製した（それぞれ図２および図３）。構築物を上記の粒子ボンバードメントによって藻（Ｐ．トリコルヌタム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））に形質転換した。形質転換後、ゼオシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社；カタログ番号ａｎｔ−ｚｎ−１；１００μｇ／ｍｌ）を含有する選択プレートに藻を移した。ｃｌｋに標的化されたｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋまたはｄｓｃｌｏｃｋ）、ＧＦＰに標的化されたｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰまたはｄｓＧＦＰ）およびｍＣｈｅｒｒｙに標的化されたｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはｄｓｍＣｈｅｒｒｙ）を発現する藻の陽性クローンを培養し、動物給餌試験用に藻を増殖させた。
【０１６７】
実施例２：給餌によるインタクトのｄｓＲＮＡのゴミムシダマシ血リンパへの送達
チャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）の幼虫を一定温度２４℃および相対湿度５０％、１２時間／１２時間の明／暗照明条件の栽培チャンバに入れた。キャベツの葉に、ｍＣｈｅｒｒｙに標的化されたｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはｄｓｍＣｈｅｒｒｙ）を発現するトランスジェニック藻の粉末または野生型藻の粉末を、いずれの葉も藻粉末で均一に覆われるよう塗布した。藻粉末を植物原料に良好に塗布できるように、（野生型および形質転換藻の）藻粉末と、人工海水（ＡＳＷ）にゼラチンを５％溶かし再蒸留水（ＤＤＷ）で１：３に希釈したものとを混合した。チャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）の幼虫には１６時間餌を与えなかった。実験当日、藻を塗布したキャベツの葉またはゼラチンのみで覆われた葉（ｍｏｃｋ）を幼虫に３〜５時間給餌した。そののち、血リンパを採取し、試料を急速冷凍し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保管した。
【０１６８】
血リンパ試料から抽出したＲＮＡを、ｄｓｍＣｈｅｒｒｙに特異的なプライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲ解析による相対的定量化に供した。合成ＲＮＡ（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ社）を参照として用いた。ΔΔＣｔ法を用いて解析を実施した。ｄｓｍＣｈｅｒｒｙ発現藻を給餌した個体から採取した試料５例のうち３例では、ｄｓｍＣｈｅｒｒｙ  ＲＮＡレベルがＷＴ藻を給餌した個体の２０倍になっていた。各試料には５個体の血リンパのプールが含まれていた（図４）。
【０１６９】
ここに示した結果は、ｄｓＲＮＡを発現する藻をゴミムシダマシの幼虫に給餌することによって、ゴミムシダマシの血リンパにｄｓＲＮＡ分子を送達することが可能であることを初めて示すものである。
【０１７０】
実施例３：給餌によるインタクトのｄｓＲＮＡのエジプトヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）血リンパへの送達
エジプトヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ（Ｐｒｏｄｅｎｉａ）ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）の５齢段階の幼虫を一定温度２４℃および相対湿度５０％、１２時間／１２時間の明／暗照明条件の栽培チャンバに入れた。トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）の葉に、ＧＦＰに標的化されたｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰ）を発現するトランスジェニック藻の粉末または野生型藻の粉末を、いずれの葉も藻粉末（上記のようにゼラチンと混合したもの）で均一に覆われるよう塗布した。藻粉末を塗布した葉をエジプトヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）に給餌した。各処理には、それぞれ１０個体の幼虫からなる５つの独立した反復を用いた。５齢幼虫から血リンパを採取し、ＲＮＡを調製した後、ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰの特異的プライマー（配列番号９〜１０）および負荷対照のＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡ（配列番号７〜８）（表４）を用いたｑＲＴ−ＰＣＲ解析に供した。ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲルに負荷した。血リンパ試料全８例（野生型藻の粉末およびトランスジェニック藻の粉末で覆われた葉を給餌した幼虫から採取したもの）にＴＢＰセグメントの１７５ｂｐの完全長アンプリコン産物が検出された。８３ｂｐのｄｓＲＮＡ−ＧＦＰの完全長アンプリコン産物は、ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰ発現藻を給餌した個体の血リンパ試料４例にのみ検出され、ＷＴ藻を給餌した個体の血リンパには検出されなかった（図５）。以上の結果は、藻に発現したｄｓＲＮＡ分子を、この実施例ではエジプトヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）の幼虫に給餌することによって送達することが可能であることをさらに示すものである。
【０１７１】
実施例４：ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻をバッタの幼虫に給餌することによるｃｌｋ  ｍＲＮＡレベルおよびｐｅｒｉｏｄ  ｍＲＮＡレベルの発現の減少
サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）のｔｉｍｅｌｅｓｓ遺伝子およびｐｅｒｉｏｄ遺伝子は、発現がｃｌｏｃｋタンパク質によって直接調節される２つの遺伝子である。これらの遺伝子の発現レベルは、ｃｌｏｃｋの発現および活性のダウンレギュレーションを明らかにするのによく用いられる（Ｔｏｂｂａｃｋ  Ｊら，２０１１，同上）。
【０１７２】
新たに発生したサバクトビバッタ（Ｓ．ｇｒｅｇａｒｉａ）の５齢幼虫を一定温度３７℃、１４時間／１０時間の明／暗照明条件に制御された３０×３０×３５ｃｍのチャンバに４０個体の密度で入れた。各処理には、それぞれ４０個体のバッタからなる３つの独立した反復を用いた。鉢で生育させたコムギ新芽に、ｃｌｋに標的化されたｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋ）を発現するトランスジェニック藻の粉末または野生型（ＷＴ）藻の粉末（上記のようにゼラチンと混合した藻粉末）を、いずれの葉も藻粉末で均一に覆われるまで塗布した。次いで、藻を塗布したコムギ新芽をバッタに４週間給餌した。処理が継続的に実施されるように、コムギ新芽には毎日、藻粉末を塗布した。
【０１７３】
実験第８〜１１日および第２８〜３０日、各処理では、最初の脱皮後の若齢成虫および成虫それぞれから生殖巣および脳を採取した。器官は給餌から３時間後に採取した。ＲＮＡを抽出した後、逆転写、次いでｑＲＴ−ＰＣＲ解析に供した。バッタのハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ、βアクチンの発現ならびにｃｌｏｃｋ遺伝子およびｐｅｒｉｏｄ遺伝子の発現を特異的プライマーで検出した。ΔＣｔ法を用いて、バッタの生殖巣および脳のｃｌｏｃｋ転写産物およびｐｅｒｉｏｄ転写産物の相対的定量化を実施した。ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻を塗布した葉を給餌したバッタのｃｌｏｃｋ遺伝子の相対的発現レベルは、ＷＴ藻を塗布した葉を給餌したバッタと比較して３６％ダウンレギュレートされていることがわかった。ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻を塗布した葉を給餌したバッタのｐｅｒｉｏｄ遺伝子の相対的発現レベルは、ＷＴ藻を塗布した葉を給餌したバッタと比較して２７％ダウンレギュレートされていることがわかった。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた（図６）。この結果から、トランスジェニック藻類を給餌した標的生物体の特定の遺伝子をダウンレギュレートするｄｓＲＮＡ分子を発現させるための発現手段および経口送達手段としてともに藻類を用いることが可能であることがわかる。
【０１７４】
実施例５：ｃｌｏｃｋ遺伝子に標的化されたｄｓＲＮＡを発現する藻をバッタに給餌することによりバッタの卵受精能が低下した
ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻の粉末を塗布したコムギ新芽またはＷＴ藻の粉末を塗布したコムギ新芽を上記のようにサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）の齢幼虫（４〜５齢）に継続的に給餌した。バッタが性的に成熟した第１７日、砂を満たした鉢を各ケージの中に置き、雌に産卵させた。４８時間毎に鉢を回収し、３７℃で１０日間、恒温放置して幼虫を孵化させた。卵莢および孵化した幼虫をカウントし、各処理の卵莢数に対する孵化した幼虫の割合を算出した。ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現するトランスジェニック藻を給餌した雌バッタは卵莢を３１個産卵し、そのうち１２８個が孵化したが、ＷＴ藻を給餌した雌バッタは卵莢を２８個産卵し、そのうち２６２個が孵化した。卵莢数に対する孵化した幼虫の割合（全反復の平均値）は、ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋ発現藻を給餌したバッタの方がＷＴ藻を給餌したバッタよりも２．３倍低い値であった（図７Ａ）。
【０１７５】
さらなる実験では、温度範囲３０〜３７℃、１４時間／１０時間の明／暗照明条件に制御された４５×４５×５０ｃｍのチャンバにサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）の３齢幼虫を１００個体の密度で入れた。各処理には、それぞれ１００個体のバッタからなる４つの独立した反復を用いた。鉢で生育させたコムギ新芽に、ｃｌｋに標的化されたｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋ）またはｄｓＧＦＰを発現するトランスジェニック藻の粉末を、いずれの葉も藻粉末で均一に覆われるまで塗布した。次いで、藻を塗布したコムギ新芽をバッタに４週間給餌し、その間、処理が継続的に実施されるように、藻を塗布した新しいコムギ新芽に毎日与えた。次いで、個体数をカウントし、各処理について４つの独立した反復で、雄バッタ１０個体および雌バッタ１０個体（ｎ＝２０）を温度勾配３０〜３７℃、１４時間／１０時間の明／暗照明条件に制御された４５×４５×５０ｃｍのチャンバに入れた。砂を満たしたプラスチックシリンダ内で３６日間、バッタに交尾および産卵させた。３日毎にシリンダを新しいものと交換した。使用済みのシリンダを回収し、温度勾配３０〜４２℃、１４時間／１０時間の明／暗照明条件に制御されたチャンバに入れた。１０〜１５日間、恒温放置した後、孵化した幼虫を観察しカウントした。実験全体を通じて、ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻を塗布した葉を給餌したバッタの卵から孵化した幼虫の数は、ｄｓＧＦＰ発現藻を塗布した葉を給餌したバッタの卵から孵化した幼虫の数よりも少なかった（図７Ｂ）。幼虫の総数を算出したところ、ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋ発現藻を塗布した葉を給餌したバッタの卵から孵化した幼虫の数は、対照葉（ｄｓＧＦＰ発現藻を塗布したもの）を給餌したバッタの卵から孵化した幼虫の数よりも３０％少ないことがわかった（ｔ検定＝０．０２６）（図７Ａ）。
【０１７６】
以上の結果は、概日時計が生物体の多くの代謝過程および行動過程を支配していることを示唆するこれまでの知見を裏付けるものである。昆虫では、このような時計およびその分子機構が様々な方法で繁殖に影響を及ぼすことがわかっている。求愛、交尾および産卵を含めた繁殖行動は、日周リズムの強い影響下にあることがわかっている（Ｔｏｂｂａｃｋら，２０１１，同上）。
【０１７７】
実施例６：ｃｌｋ遺伝子に対して特異的に標的化されたｄｓＲＮＡを発現する藻の経口送達によりバッタの運動量が減少した
ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻の粉末またはＷＴ藻の粉末（上記のようにゼラチンと混合した藻粉末）を塗布したコムギ新芽をサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）に継続的に給餌した。各処理のケージの１つをＬｉｆｅＣａｍ  ＨＤ−３０００カメラで常時モニターし、ＡｃｔｉｖｅＷｅｂＣａｍプログラムで記録した。３日間の給餌の間のバッタの運動量の測定から、ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋ発現藻を給餌したバッタの総運動量は、ＷＴ藻を給餌したバッタと比較よりも約１．７〜２．５倍少ないことが明らかになった（図８；Ａ〜Ｃ）。ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋを発現する藻を経口給餌することにより、バッタの活性がＷＴ藻を給餌した対照バッタよりも低下した。
【０１７８】
実施例７：トランスジェニック藻類の給餌による甲殻類へのインタクトのｄｓＲＮＡの送達
レッドクロウ（Ｃｈｅｒａｘ  ｑｕａｄｒｉｃａｒｉｎａｔｕｓ）個体（３０±１０ｇ）をケージに入れ各処理に供した。レッドクロウにｄｓＲＮＡ−ＧＦＰ発現藻またはＷＴ藻を含有する飼料ペレットを２８日間、毎日給餌した（７．５ｇ藻／ｇ個体）。第０日および第２８日、給餌から７２時間後に各個体から血リンパ１００μｌを採取した。ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰ発現藻では、６つの独立した反復を用い、ＷＴ藻では、３つの独立した反復を用いた。採取した血リンパをＲＮＡ調製に供し、試料をＲＮＡドットブロットハイブリダイゼーションにより解析した。ドットブロットハイブリダイゼーション法を製造業者の指示に従って実施した（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号１１  ６０３  ５５８  ００１、カタログ番号１１  ５８５  ７６２  ００１、カタログ番号１１  ０９３  ２７４  ９１０、カタログ番号１１  ６８５  ６２７  ００１）。製造業者の指示に従って、直線化した鋳型ＤＮＡからジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識したｄｓＲＮＡ−ＧＦＰの一本鎖ＲＮＡプローブを合成した（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号１１１７５０２５９１０）。
【０１７９】
図１０に示されるように、ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰを発現する藻を含む飼料ペレットを給餌したレッドクロウ（Ｃ．ｑｕａｄｒｉｃａｒｉｎａｔｕｓ）の血リンパ試料６例のうち４例にｄｓＲＮＡ−ＧＦＰの陽性シグナルが検出されたが、対照藻を含む飼料ペレットを給餌したレッドクロウ（Ｃ．ｑｕａｄｒｉｃａｒｉｎａｔｕｓ）の血リンパ試料には３例ともシグナルが検出されなかった。この結果は、藻類に発現したｄｓＲＮＡ分子が、トランスジェニック藻類を給餌した甲殻類の血リンパに導入され得ることを初めて明らかにするものである。
【０１８０】
実施例８：ｃｌｋ遺伝子に対して特異的に標的化されたｄｓＲＮＡを発現する藻の経口送達がサバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）の雌雄の配分に影響を及ぼす
サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）の３齢幼虫を温度勾配３０〜３７℃、１４時間／１０時間の明／暗照明条件に制御された４５×４５×５０ｃｍのチャンバに１００個体の密度で入れた。各処理には、それぞれ１００個体のバッタからなる４つの独立した反復を用いた。鉢で生育させたコムギ新芽に、ｃｌｋに標的化されたｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋ）またはＧＦＰに標的化されたｄｓＲＮＡ（ｄｓＧＦＰ）を発現するトランスジェニック藻の粉末を、いずれの葉も藻粉末（上記のようにゼラチンと混合した藻粉末）で均一に覆われるまで塗布した。次いで、藻を塗布したコムギ新芽をバッタに４週間給餌し、その間、処理が継続的に実施されるように、藻を塗布した新しいコムギ新芽に毎日与えた。次いで各処理について、個体数をカウントし、雌に対する雄の比を算出した。ｄｓＲＮＡ−ｃｌｏｃｋ発現藻を塗布した葉を給餌したバッタの比は、ｄｓＧＦＰ発現藻を塗布した葉を給餌したバッタよりも有意に（ｐ値＝０．０１）小さい値であった（４８％の減少、図９）。以上の結果から、サバクトビバッタ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）のｃｌｏｃｋ遺伝子に標的化されたｄｓＲＮＡを発現する藻の経口送達によりバッタ集団内の性分化が変化したことがわかる。これまでに、概日時計と性的発育および性行動との間に何らかの関係があることが示唆されている。例えば、ｔａｋｅｏｕｔ遺伝子は強力な概日調節遺伝子であることが明らかにされている。Ｄａｕｗａｌｄｅｒらは、ショウジョウバエのｔａｋｅｏｕｔ遺伝子ファミリーが性特異的機能を有する複数の因子をコードすることを示唆しており、同遺伝子ファミリーが生物体の性別、栄養状態および概日周期に関する情報の統合に何らかの役割を果たして成体雄の行動に影響を及ぼすと提唱している（Ｄａｕｗａｌｄｅｒら，２００２．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １６：２８７９−２８９２）。ｃｌｏｃｋ遺伝子に標的化されたｄｓＲＮＡを発現する藻で覆った葉をサバクトビバッタ（Ｓ．ｇｒｅｇａｒｉａ）に給餌したときに観察された雌の数の増加から、ｄｓＲＮＡによるｃｌｏｃｋ遺伝子のダウンレギュレーションが示唆される。
【０１８１】
以上のことを考え合わせると、本発明は、バッタの特定の遺伝子に標的化されたｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニック藻類をバッタに給餌することにより、標的遺伝子の発現および／または活性がダウンレギュレートされることを明白に示している。
【０１８２】
実施例９：凍結乾燥させた藻粉末は生存不可能である
ＧＥＡ  Ｗｅｓｔｆａｌｉａ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（モデルＳＳＤ１８−０６−００７、回転数９７９０ｒｐｍ）またはＡｌｆａ  Ｌａｖａｌ  ＳｅｐａｒａｔｏｒモデルＩＦＢ  ３０３Ｘ−７３（７５００ｒｐｍ）を用いて藻の液体培養物を回収した。藻ペーストを１ｃｍ×１４ｃｍ×１４ｃｍのトレーまたは２ｃｍ×２５ｃｍ×５２ｃｍのプレートに置き、−８０℃で２４時間保管した。翌日、ＶｉｒＴｉｓ凍結乾燥機（商品番号２７０３８９）を用いて−５０℃、２×１０−１Ｔｏｒｒ（約２７Ｐａ）でトレーを２４〜４８時間、凍結乾燥させた。藻粉末を生存能アッセイに用いた。
【０１８３】
凍結乾燥させたフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）藻粉末（細胞数３．４２×１０１０個）１グラムと９ｍｌのＡＳＷ×１とを混合した。混合物４００ｕｌをＡＳＷ寒天プレート上に播くか、ＡＳＷ×１中に播いて懸濁させ、１０日間維持した（図１１Ａ）。液体培養した新鮮なフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）藻細胞を同様の条件下で同数播いた。１０日後、細胞増殖をモニターした（図１１Ｂ）。凍結乾燥藻粉末の培養物には細胞増殖が検出されなかったが、液体藻培養物には良好な増殖がみられた。この結果から、凍結乾燥処置によって藻細胞の生存能がなくなることがわかる。
【０１８４】
実施例１０：藻でのＣＯＰＢ２  ｄｓＲＮＡの構築
サケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）ＣＯＰＢ２遺伝子のセンスフラグメント（配列番号３５）およびアンチセンスフラグメント（配列番号３６）をＢｉｏｍａｔｉｋ  ＵＳＡ社にて合成する。ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩＩによってセンスフラグメントをクローン化し、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩによってアンチセンスフラグメントをクローン化する。ＣＯＰＢ２のフラグメントをｐＰｈａＴカセットに含まれるイントロンにセンス／アンチセンスの方向でクローン化する。
【０１８５】
実施例１１：ＣＯＰＢ２遺伝子に対して特異的に標的化されたｄｓＲＮＡを発現する藻の経口送達によりサケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）の死亡率が増大する
平均体重８０グラムのタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）を０．７５ｍ３のプラスチック水槽に入れ、温度１０℃の海水（塩分濃度３４．５ｐｐｔ）で維持する。魚に１日２回、１５％のＣＯＰＢ２  ｄｓＲＮＡ−発現藻の粉末（魚の飼料の総重量に対するｗ／ｗ）で均一に覆った市販の魚の飼料またはＧＦＰ  ｄｓＲＮＡを発現する藻の粉末（１５％（ｗ／ｗ））で均一に覆った市販の魚の飼料を魚の体重の１％給餌する。各処理には、２５個体の魚からなる３つの独立した反復を用いる。
【０１８６】
１４日間給餌した後、各水槽の魚をウオジラミ（サケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ））の寄生性コペポディド１２０匹で攻撃する。コペポディドを加えてから１０日後および２４日後、各グループ５個体に麻酔をかけて屠殺し、顕微鏡下でウオジラミの数をカウントする。
【０１８７】
上記の特定の実施形態に関する説明によって本発明の一般的性質が十分に明らかになるため、他の者は、この知識を応用することにより、過度の実験を実施することも一般的概念を逸脱することもなく、上記の特定の実施形態を様々な用途に合わせて容易に修正し、かつ／または適合させることが可能であり、したがって、そのような適合および修正は、本開示の実施形態の均等物の意味および範囲に含まれるものとして解釈すべきであり、またそのように意図されるものである。本明細書で使用される表現または用語は、説明を目的とするものであって限定を目的とするものではないことが理解されるべきである。開示される様々な機能を実施するための手段、材料および段階は、本発明を逸脱することなく様々な代替的形態をとり得る。
【図１】
2018520656.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2018520656.tif 000016
【図８Ａ】
2018520656.tif 000017
【図８Ｂ】
2018520656.tif 000018
【図８Ｃ】
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【図９】
2018520656.tif 000020
【図１０】
2018520656.tif 000021
【図１１Ａ】
2018520656.tif 000022
【図１１Ｂ】
2018520656.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月20日(2018.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018520656000001.app
【国際調査報告】
2018520656.tif 000024
2018520656.tif 000025
2018520656.tif 000026