(57)【要約】  支持体（１）の表面に広がるポリマーブラシ上に接着性パターンを印刷し、ナノメートルサイズの抗付着層（２）を形成する方法であって、前記層（２）を、ベンゾフェノンを含有する第１の水溶液（４）に接触させる工程と、その後に、前記パターンに応じて且つ表面エネルギーに応じて、前記ベンゾフェノンの吸収スペクトル内の波長の放射線（３）で前記層を照射する工程とを含む方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノメートルサイズの抗付着層（２）を形成して、支持体（１）の表面に広がるポリマーブラシ上に接着性パターンを印刷する方法であって、
前記層（２）を、ベンゾフェノンを含有する第１の水溶液（４）に接触させる工程と、
その後に、前記パターンに応じて且つ表面エネルギーに応じて、前記ベンゾフェノンの吸収スペクトル内の波長の放射線（３）で前記層を照射する工程と
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記層（２）の厚さは、１ｎｍ〜２０ｎｍであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記波長は、３００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲で選択されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、
前記ポリマーは、ポリＮＩＰＡＭであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、
前記支持体（１）は、ガラスであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項３に記載の方法であって、
前記支持体（１）はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法であって、
前記ＰＥＧ層に伝達される前記照射の前記表面エネルギーは、１０ｍＪ／ｍｍ２〜１０００ｍＪ／ｍｍ２であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項５に記載の方法であって、
前記ポリＮＩＰＡＭ層に伝達される前記照射の前記表面エネルギーは、１００ｍＪ／ｍｍ２〜１００００ｍＪ／ｍｍ２であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、
前記ＰＤＭＳのヤング率は、１５ｋＰａ未満であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
前記ポリマーブラシ上にタンパク質のパターンを印刷する方法であり、
すすぐことにより、前記層（２）と前記第１の水溶液（４）との間の接触を除去する工程と、
その後に、前記層（２）を、前記タンパク質を含有する第２の水溶液と接触させる工程とを
さらに含む方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、
前記ポリマーブラシ上にナノシェルのパターンを印刷する方法であり、
すすぐことにより、前記層（２）と前記第１の水溶液（４）との間の接触を除去する工程と、
前記層（２）を、前記ナノシェルを含有する第２の溶液と接触させる工程とを
さらに含む方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、
前記ポリマーブラシ上にＤＮＡ鎖のパターンを印刷する方法であり、
すすぐことにより、前記層と前記第１の水溶液（４）との間の接触を除去する工程と、
前記層（２）を、前記ＤＮＡ鎖を含有する第２の溶液と接触させる工程とを
さらに含む方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法を適用することであって、
前記表面エネルギーを空間的に変化させることによって、前記支持体（１）の表面に接着勾配を有する接着性パターンを製造することへの適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学的に定めたパターンに従って、基材上にタンパク質をグラフトする分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際出願公開第ＷＯ２０１３／１３５８４４号（以後、「ＳＴＵＤＥＲ」又は「当該刊行物」）は、基材上へのタンパク質の微細構造グラフト化のための装置、即ち光化学印刷装置を開示する。当該刊行物では、基材の上面のパターンに基づく場所において、水溶液中のベンゾフェノン（ＢＰ）とタンパク質との混合物が照射される。この照射を受けた場所にタンパク質の耐久性のある転写が得られ、これにより印刷が行われる。ただし、当該刊行物に記載される方法では、ベンゾフェノンの存在下で照射と同時に、タンパク質を基材に転写している。
【０００３】
この装置は、基材上のパターンの画像に従って照射する照明装置と、タンパク質とベンゾフェノンとを同時に含有する水溶液を送液可能なマイクロ流体装置とが、同じ位置に配された組み合わせより構成される。この結果、印刷システムが嵩張るという問題が生じる。また、ベンゾフェノンと照明装置からの光が組み合わされた作用により、タンパク質が損傷するリスクも生じる。理想的には、接着されたタンパク質なしで、タンパク質に対してのみ接着性を有するパターンを、照明装置により基材上に印刷することが有用であろう。その後、タンパク質（蛍光タンパク質等）の水溶液と接触させることにより、基材上に実像パターンが現像される。このタンパク質は、接着性パターン中の照射を受けた部分に優先的に接着して、実像パターンを形成する。しかし、このような溶液については、タンパク質抗付着層で被覆された支持体上に印刷される、潜像の接着性パターン又は後に現像される接着性パターンを生成可能な処理が、あるタンパク質に対して利用できるかどうかによって決まる。タンパク質抗付着層とは、印刷を実施する程度の時間の範囲では当該層にタンパク質が付着しないような材料からなる層を意味すると理解される。
【０００４】
抗付着層で被覆されたこのような基材、即ち抗付着基材は、特に、以下のような支持体から形成されてもよい。例えば、照明システムからの光を透過するような光学的性能を有するガラスを一例として挙げられる硬い支持体、又は、ＰＤＭＳが一例として挙げられる軟らかい支持体である。前述のガラス及びＰＤＭＳは、ポリマーブラシ材料で被覆されるか、又は、ＰＥＧ及びポリＮＩＰＡＭなどの分子鎖によって支持体にブラシとして付着するポリマーで被覆される。この種の抗付着基材では、ポリマー鎖は、ブラシの毛のように、支持体に一方の端で付着し、他方の端は自由端である。
【０００５】
他の方法として、抗付着基材上の抗付着材料パターンをレーザー除去することを用い、マスクを介してタンパク質抗付着基材に適用されるフォトリソグラフィ等がある。このような他の方法により、従来技術では、当該基材へタンパク質を選択的にグラフト化できるようにする、基材の照射を受けたゾーンに応じたパターンを有する抗付着支持体を得ることが可能であり、このゾーンからポリマーブラシ又は抗付着材料が光エネルギーによって除去されている。
【０００６】
材料の除去は基材を照射することによって引き起こされ、また、除去した程度の差により、陥没した部分による像（後で実像となる）ができあがると考えられる。これらの差を光位相差技術（光路に対してのみ感受性がある）により観察すると、接着性パターンは、抗付着材料の除去に対応する状態になっているか、又は、材料の性質のある変化に対応する状態になっている。この変化とは、材料の光学指数を変えたり、照射を受けたポリマー鎖のゾーンへタンパク質が後で好適な接着をするようにさせたりするものである。潜像を観察可能な他の方法（特に、原子間力顕微鏡法、偏光解析法、Ｘ線分析など）は、これらの方法についてＰＥＧ層を完全に除去することにより潜像ができていることを証明できる場合もある。このため、このような除去手法は濃度勾配を生じさせることができず、ＰＥＧ又は抗付着層の除去は必然的に完全に行われる。
【０００７】
照射へのブラシの暴露量に比例する接着性を有する、又は、これに対して連続的に変化する接着性を有する、抗付着支持体又はポリマーブラシ支持体を、あるパターンに基づいて製造する方法であって、照射と同時に分子をブラシに接着する必要はない方法であることが、究極的には望ましい。代わりに、これらの分子は、後からブラシに接着されることが望ましい。
【０００８】
一般的な説明
以下の定義が本出願に適用される。
【０００９】
「接着性パターン」は、表面パターンの一種である。この表面パターンに応じて、当該パターンの外の領域では抗接着性層か抗付着層かポリマーブラシ層で被覆された支持体上において、特定の分子が経時的に安定した様態で分布する。前述の分子は、特に、タンパク質（特に抗体）、ナノシェル、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）鎖、ＲＮＡ鎖、バクテリア等である。また、抗接着性ゾーン即ち抗付着ゾーンの外、又は、抗接着性ゾーン即ち抗付着ゾーンのセットの外において、前述のパターンが定められている。このため、基材上のゾーンのセットの補足表面よりも対象の分子に対して接着性が強いゾーン又はパターンのセットとして、接着性パターンを基材上に定めてもよい。パターンが存在するために必要な接着効果の差は、ポリマーブラシについて、分子の水溶液と接触することなく、従来技術で利用可能な少なくとも２つの方法によって推測され得る：
【００１０】
−原子間力顕微鏡法。ブラシのポリマー鎖の長さの減少を示すことができる。このような減少により、これらのゾーンにおける抗接着性効果の低下即ち接着効果の増加が生じる。
【００１１】
−位相差顕微法。最も接着性を有するゾーンでブラシを通る光路の変動を示すことができる。このような変動は、接着効果の変動に関連する。
【００１２】
「ポリマーブラシ」は、特にタンパク質、ナノシェル、ＤＮＡ鎖、及びバクテリアに対して抗付着であるナノメートル層（ナノメートルサイズの厚さ、つまり通常は１ｎｍ〜１００ｎｍ）を示す。このようなナノメートル層は、抗付着基材を形成するために、支持体の表面に存在する。本出願日時点にて、このようなブラシは、支持体の表面にグラフト化されるポリマー鎖のセットからなると推定され、このセットがＰＥＧについては支持体の表面上に１ｎｍ〜２０ｎｍ、ポリＮＩＰＡＭについては１ｎｍ〜３０ｎｍの厚さを有するゾーンに広がると推定される。１ｎｍ〜２０ｎｍの範囲では、このブラシは、特に、タンパク質、ナノシェル、ＤＮＡ鎖又はバクテリアに対して、抗接着又は抗付着特性を有すると推定される。ポリエチレングリコール層（「ＰＥＧ」層）や、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）層（ポリＮＩＰＡＭ層）は、ポリマーブラシの例である。
【００１３】
「厚さ」は、ポリマーブラシについて、ブラシを形成するポリマー鎖の自由端から支持体への距離の測定値を指す。例えば、ＰＥＧについては、層の厚さはＰＥＧ鎖の長さ、即ち、これらの鎖を作り上げるエチレングリコールモノマーの数で制御される。ブラシの自由面にレリーフを印刷する又は厚さの変化を持たせて印刷するために、これらの鎖は、基材に対して傾斜させたり、ブラシの毛における動作に類似した任意の態様で圧縮又は修正したりすることを特にしてもよい。
【発明の概要】
【００１４】
この文脈において、本発明は、ナノメートルサイズの抗付着層を形成して、支持体の表面に広がるポリマーブラシ上に接着性パターンを印刷する方法であって、
−前記層を、ベンゾフェノンを含有する第１の水溶液に接触させる工程と、
−その後に、前記パターンに応じて且つ表面エネルギーに応じて、前記ベンゾフェノンの吸収スペクトル内の波長の放射線で前記層を照射する工程とを含む。
本方法の変形例では、
−前記層の厚さは、１ｎｍ〜２０ｎｍであり、
−前記波長は、３００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲で選択され、
−前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、
−前記ポリマーは、ポリＮＩＰＡＭであり、
−前記支持体は、ガラスであり、
−前記支持体は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）であり、
−前記ＰＥＧ層に伝達される前記照射の前記表面エネルギーは、１０ｍＪ／ｍｍ２〜１０００ｍＪ／ｍｍ２であり、
−前記ポリＮＩＰＡＭ層に伝達される前記照射の前記表面エネルギーは、１００ｍＪ／ｍｍ２〜１００００ｍＪ／ｍｍ２であり、
−前記ＰＤＭＳ支持体のヤング率は、１５ｋＰａ未満である。
本発明はまた、前記ポリマーブラシ上にタンパク質のパターンを印刷するための上記方法に関し、
本方法は、
−すすぐことにより、前記層と前記第１の溶液との間の接触を除去する工程と、
−その後に、前記層を、前記タンパク質を含有する第２の水溶液と接触させる工程とをさらに含む。
本発明はまた、前記ポリマーブラシ上にナノシェルのパターンを印刷する上記方法に関し、
本方法は、
−すすぐことにより、前記層と前記第１の水溶液との間の接触を除去する工程と、
−前記層を、前記ナノシェルを含有する第２の溶液に接触させる工程とをさらに含む。
本発明はまた、前記ポリマーブラシ上にＤＮＡ鎖のパターンを印刷するための上記方法に関し、
本方法は、
−すすぐことにより、前記層と前記第１の水溶液との間の接触を除去する工程と、
−前記層を、前記ＤＮＡ鎖を含有する第２の溶液に接触させる工程とをさらに含む。
【００１５】
本発明はまた、接着性パターンを印刷する前記方法の適用に関し、
前記表面エネルギーを空間的に変化させることによって、前記支持体（１）の表面に接着勾配を有する接着性パターンを製造することへの適用である。
本発明は、以下の図面の一覧に関連してさらに理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ガラス支持体と、特にタンパク質、ナノシェル、又はＤＮＡ鎖に対して抗付着性である材料の層とからなる抗付着基材の断面図を示す。つまり、前記材料は、この支持体にグラフト化つまり取り付けられるポリマーブラシである。基材は、ベンゾフェノンを含有する水溶液の液滴で、ポリマーブラシの全体又は一部が被覆されている。前述の層の、ベンゾフェノンで被覆されるゾーンＡＢは、支持体を通して照射される（液滴を通してもおそらく実行可能）。この際、ベンゾフェノンの吸収スペクトル内の波長を有する放射線、即ち、３００ｎｍ〜４００ｎｍの放射線で照射される。
【図２】図２は、図１の液滴がすすがれて、ゾーンＡＢにて抗付着材料の表面の空洞によって描かれる潜像を有する基材を示す。このような材料を使用して、ゾーンＡＢの表面に対応するパターンに従って、特にタンパク質、ナノシェル、若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ鎖のパターンを印刷することができる。具体的には、ベンゾフェノンの存在下でポリマーブラシを照射することは、潜在的にゾーンＡＢにおいてポリマーブラシに接着性を与え、特にタンパク質、ナノシェル、ＤＮＡ鎖が接着可能な状態となる。このタンパク質、ナノシェル、ＤＮＡ鎖の接着についてはそれぞれ、タンパク質の溶液、ナノシェルの溶液、ＤＮＡ鎖の溶液とポリマーブラシ層を接触させることで行うことができる。このように、ＡＢのようなゾーンを一セットにしたものに照射することによって、ポリマーブラシが通常は非接着である分子について、接着性パターンや分子の接着性パターンを、ポリマーブラシ上に生成することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
第１の実施形態では、括弧内の参照番号について図１を参照して、ガラス支持体（１）とポリマーブラシ材料の層（２）とからなる抗付着基材を開示する。なお、第１の実施形態では、前記ポリマーブラシ材料は、ＰＥＧ又はポリＮＩＰＡＭである。
【００１８】
この第１の実施形態では、使用する放射線に対して透明であるように選択された支持体（１）を通して、放射線（３）が層（２）にゾーンＡＢ（ＡＢ）にわたって照射されており、この層（２）上にベンゾフェノン水溶液の液滴（４）が付着しゾーンＡＢ（ＡＢ）を被覆している。同様に、この液滴（４）を通して、前述の層に同一のゾーンＡＢにわたって照射することも可能であろう。
【００１９】
使用する放射線は、ベンゾフェノンの吸収スペクトル内の波長を少なくとも１つ含み、このスペクトルは実際には３００ｎｍ〜４００ｎｍにわたっており有用である。この範囲のうち、３９０ｎｍ未満の波長を有する放射線を用いることが好ましい。この場合、層を放射線に暴露する時間が最小となる。
【００２０】
選択された波長でのベンゾフェノンの吸収が低いほど、光源の強度がより大きくなり、又は、照射されるゾーンの暴露時間がより長くなければならない。受けた放射線量（光に対する暴露時間と照明の強さとの積に等しい）が、本発明の効果の程度を支配するパラメータとなる。
【００２１】
グラフト化されるタンパク質が溶液内に含まれないので、必要であれば、放射線の強度は、次にグラフト化されるタンパク質の破壊を生じさせる強度よりも高くされ、劣化することなく当該層が受け取る光エネルギーの表面密度よって限定されるに過ぎない。しかしながら、ベンゾフェノンが存在することにより、ＰＥＧについて、アブレーション又はマスキング技術での場合よりも１０〜１００倍低い光強度を用いることが可能となる。
【００２２】
よって、１０ｍＪ／ｍｍ２〜１０００ｍＪ／ｍｍ２のエネルギー密度を、ＰＥＧ上で接着性パターンを出現させるために用いることができる。よって、本発明は、半導体レーザからの３７２ｎｍの紫外線の波長に対して、一辺４００ミクロンの正方形に２ｍＷの照射が可能な光源があれば十分である。ＰＤＭＳ支持体上のポリＮＩＰＡＭについては、使用可能なエネルギー密度は１００ｍＪ／ｍｍ２〜１００００ｍＪ／ｍｍ２である。ＰＥＧの暴露時間に単に１０を掛けることで、同一の半導体レーザ光源を再度、用いてもよい。
【００２３】
本実施形態の方法の第１の工程では、抗付着基材を、ベンゾフェノン水溶液の液滴と接触させる。次に、第２の工程で、基材の抗付着層のゾーンＡＢを紫外線光源で照射する。
【００２４】
光源のエネルギーを、ゾーンＡＢ上又は一セットのゾーン上で、同時に集中させることができる光学システムならば、何を用いてもよい。このようなシステムは、従来技術により既知である。本実施形態の照明システムを製造するには、マイクロミラーアレイを有する顕微鏡を想定することができる。同様に、液滴をベンゾフェノン水溶液の膜と置き換え、それを層と接触させ、照射後に既知のマイクロ流体手段ですすいでもよい。
【００２５】
図２は、ナノメートル層として形成されたポリマーブラシを示す。ベンゾフェノン溶液の液滴はすすがれおり、ナノメートルサイズの深さを持つ空洞潜像パターンが、図に示すような態様でゾーンＡＢに設けられている。現像するには、引き続き、この空洞即ち潜像パターンを、ポリマーブラシ中のこの空洞上で支持体に接着することができる分子又は分子集合（タンパク質、ナノシェル、ＤＮＡ鎖、バクテリア等）と接触させる必要がある。そして、水溶液中にこれらの分子の存在する状態で、潜像パターンに基づく分子の接着が、ベンゾフェノンの存在下で照射された層のゾーン（本明細書ではＡＢ）で行われる。この分子の接着は、光エネルギーの供給なしに行われる。当該分子は、潜像パターン即ち接着性パターンで、ポリマーブラシ上に吸着されるに過ぎない。これにより、分子の実像パターンがブラシ上に形成される。特に、分子が蛍光性である場合には、接着結果を示すために従来技術で既知の技術で当該分子による像を生成することができる。
【００２６】
しかしながら、水溶液（例えばタンパク質の溶液）に接触させなくても、本発明の効果が得られるかどうかは、ブラシを日光にさらした後に、この後の実像パターンの生成とは独立して予測することができる。これは、照射後に、照射された位置においてブラシ内にナノメートルの深さの空洞があるかどうかを原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いて測定することにより、又は、ブラシ内に光路変動があるかを位相差顕微法にて同位置で光学的に観察することにより行うことができる。よって、特にベンゾフェノンの存在下での照射後にブラシのポリマー鎖の長さの減少が観察されたものを、本発明の方法に好適なポリマーブラシとして他の実験を行うことなく選択することができる。
【００２７】
本発明の第２の実施形態では、図２の装置を、タンパク質の水溶液又はナノシェルの水溶液と接触させる。タンパク質又はナノシェルの性質に選択は、できる限り耐久性のある実像を得るために、支持体に接着することができるタンパク質及びナノシェルに基づいて行われる。
【００２８】
このように、第２の実施形態の方法で、例えば蛍光タンパク質を用いてゾーンＡＢの実像を得ることができる。但し、より一般的には、使用したタンパク質抗付着基材上のタンパク質のパターンが用いられた。更に、照射下での抗付着基材の性質により、蛍光性を発現することができる。この蛍光性は、ゾーンＡＢが受ける照射又は光学放射線量によって連続的に変動する値を有する。より一般的には、このゾーンが光学照明系の解像限界に相当する場合でも、変動するタンパク質の濃度をシミュレーションするための２進小数点の密度に対するリソースが無くとも、このゾーン内の照射によって連続的に変動するタンパク質、ナノシェル、又はＤＮＡ鎖の濃度を実現することを可能とする。
【００２９】
このように、タンパク質、ナノシェル、ＤＮＡ鎖等の濃度方向での接着勾配を、基材又は抗付着層の表面に沿って生成することに、本発明を適用することができる。この勾配の生成については、ベンゾフェノンの存在下でポリマーブラシを照射する工程において、又は、潜像又接着性パターンを印刷する工程において、タイプＡＢのゾーンを幾つか端から端へ並べ、且つ、これらのゾーンに届けられる表面エネルギーを変化させる（例：異なる表面ゾーン（Ｊ／ｍ２）でこれらのゾーンを照射する）ことにより行うことができる。
【００３０】
例えば、ベンゾフェノン存在下でＰＥＧブラシ上に照射量を変動させて照射することによって、タンパク質について連続的に変化する効果が得られている。例えば、接着ゾーン外で５ｎｍと推定される厚さを有するＰＥＧポリマーブラシについて、０ｎｍ減少（接着無し又はパターン外ゾーン）から２ｎｍ減少（最大接着）までの範囲で、厚さを減少させることができる。
【００３１】
本明細書に示す実施形態では、水溶液１リットル当たりのベンゾフェノンの濃度範囲（ミリモル：ｍｍｏｌ／ｌ）が５ｍｍｏｌ／ｌ〜５０ｍｍｏｌ／ｌであるものが用いられた。
【００３２】
本発明は、ポリマーブラシ上にタンパク質の接着性パターンを印刷するための基材製造の分野で、産業上利用可能である。
【図１】
2018500608.tif 000003
【図２】
2018500608.tif 000004
【国際調査報告】
2018500608.tif 000005
2018500608.tif 000006
2018500608.tif 000007
2018500608.tif 000008
2018500608.tif 000009
2018500608.tif 000010