(57)【要約】  本開示は、半翅目害虫における標的コードおよび転写非コード配列のＲＮＡ干渉媒介阻害による半翅目害虫の防除のための核酸分子およびその使用の方法に関する。本開示はまた、半翅目害虫の防除に有用な核酸分子を発現するトランスジェニック植物を作製する方法ならびにそれにより得られる植物細胞および植物に関する。
2018500899.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含む半翅目生物の天然コード配列；配列番号１を含む半翅目生物の天然コード配列の相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の相補体；配列番号１を含む半翅目生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含む半翅目生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが異種プロモーターに作動可能に連結した、単離核酸。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
【請求項４】
前記生物がエウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）（Ｆａｂｒ．）（ネオトロピカルブラウンスティンクバグ）、ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）（Ｌ．）（ミナミアオカメムシ）、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）（ウェストウッド）（レッドバンディッドスティンクバグ）、ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）（スタール）（クサギカメムシ）、チナビア・ヒラレ（Chinavia hilare）（セイ）（グリーンスティンクバグ）、エウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）（セイ）（ブラウンスティンクバグ）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）（ダラス）、ディケロプス・フルカツス（Dichelops furcatus）（Ｆ．）、エデッサ・メジタブンダ（Edessa meditabunda）（Ｆ．）、チアンタ・ペルディトール（Thyanta perditor）（Ｆ．）（ネオトロピカルレッドショルダードスティンクバグ）、チナビア・マルギナツム（Chinavia marginatum）（パリソ・ド・ボーヴォワ）、ホルシアス・ノビレルス（Horcias nobilellus）（ベルグ）（コットンバグ）、テディア・スチグモサ（Taedia stigmosa）（ベルグ）、ホシカメムシ（Dysdercus peruvianus）（Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）、ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）（ウェストウッド）、レプトグロスス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）（ダラス）、ニエストレア・シダエ（Niesthrea sidae）（Ｆ．）、リグス・ヘスペルス（Lygus hesperus）（ナイト）（ウェスタンターニッシュドプラントバグ）およびサビイロカスミカメ（Lygus lineolaris）（パリソ・ド・ボーヴォワ）からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドから転写されるリボ核酸（ＲＮＡ）分子。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現から産生される二本鎖リボ核酸分子。
【請求項７】
ポリヌクレオチド配列を半翅目害虫と接触させることが、前記ポリヌクレオチドと特異的に相補的な内因性ヌクレオチド配列の発現を阻害する、請求項６に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項８】
リボヌクレオチド分子を半翅目害虫と接触させることが、前記害虫を殺すまたはその成長、生殖および／もしくは摂食を阻害する、請求項７に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項９】
第１、第２および第３のＲＮＡセグメントを含み、
前記第１のＲＮＡセグメントが前記ポリヌクレオチドを含み、
前記第３のＲＮＡセグメントが、第２のポリヌクレオチド配列により前記第１のＲＮＡセグメントに連結されており、
前記第１および前記第３のＲＮＡセグメントがリボ核酸に転写されたときにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成するように、前記第３のＲＮＡセグメントが実質的に前記第１のＲＮＡセグメントの逆相補体である、請求項６に記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項１０】
長さが約１５〜約３０ヌクレオチドの二本鎖リボ核酸分子および一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項５に記載のＲＮＡ。
【請求項１１】
異種プロモーターが、植物細胞中で機能的である、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項１３】
原核細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
真核細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】
植物細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドで形質転換された植物。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の植物の種子。
【請求項１８】
検出可能な量の前記ポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の植物から生産される商品生産物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが前記植物において二本鎖リボ核酸分子として発現する、請求項１６に記載の植物。
【請求項２０】
ゼア・マイス（Zea mays）細胞、ダイズ（Glycine max）細胞またはワタ属種（Gossypium sp.）の細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２１】
トウモロコシ、ダイズまたはワタである、請求項１６に記載の植物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが前記植物においてリボ核酸分子として発現し、半翅目害虫が前記植物の一部を摂取したとき、前記リボ核酸分子が、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドと特異的に相補的である内因性ポリヌクレオチドの発現を阻害する、請求項１６に記載の植物。
【請求項２３】
内因性害虫遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの追加のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記さらなるポリヌクレオチドが親ＲＮＡｉ表現型をもたらすｉＲＮＡ分子をコードする、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記さらなるポリヌクレオチドがｂｒａｈｍａまたはｈｕｎｃｈｂａｃｋ遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡ分子をコードする、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記さらなるポリヌクレオチドがｉＲＮＡ分子（致死性ｉＲＮＡ分子）と接触する半翅目害虫の成長および／または発育の減少および／または死亡をもたらすｉＲＮＡ分子をコードする、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記追加のポリヌクレオチドがそれぞれ植物細胞中で機能し得る異種プロモーターに作動可能に連結した、請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
【請求項２８】
半翅目害虫集団を防除する方法であって、半翅目害虫内部の生物学的機能を阻害するように前記半翅目害虫との接触により機能するリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む作用物質を用意することを含み、ＲＮＡが、配列番号１５〜１７；配列番号１５〜１７のいずれかの相補体；配列番号１５〜１７のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１５〜１７のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１の転写物；配列番号１の転写物の相補体；配列番号１の転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；ならびに配列番号１の転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能である、方法。
【請求項２９】
前記作用物質が二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
半翅目害虫集団を防除する方法であって、
半翅目害虫内部の生物学的機能を阻害するように前記半翅目害虫との接触により機能するリボ核酸（ＲＮＡ）分子を半翅目害虫に導入することを含み、ＲＮＡが
配列番号１５〜１７、
配列番号１５〜１７のいずれかの相補体、
配列番号１５〜１７のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、
配列番号１５〜１７のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体、
配列番号１の転写物、
配列番号１の転写物の相補体、
配列番号１の転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、ならびに
配列番号１の転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体
からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能であり、
それにより、ｐＲＮＡｉ表現型を有する半翅目害虫を発生させることを含む、方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡを雄半翅目害虫に導入する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡが雌半翅目害虫に導入され、方法が、前記ｐＲＮＡｉ表現型を有する前記雌半翅目害虫を前記害虫集団中に放つことをさらに含み、前記ｐＲＮＡｉ表現型を有する前記雌半翅目害虫と前記集団の雄害虫との交配が、前記集団の他の雌害虫と雄害虫との交配よりも少ない生存能力のある子孫をもたらす、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
半翅目害虫集団を防除する方法であって、
半翅目害虫内部の生物学的機能を阻害するように前記半翅目害虫との接触により機能する第１および第２のポリヌクレオチド配列を含む作用物質を用意することを含み、前記第１のポリヌクレオチド配列が配列番号１５の約１９〜約３０個の連続したヌクレオチドとの約９０％〜約１００％の配列同一を示す領域を含み、前記第１のポリヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする、方法。
【請求項３４】
リボ核酸分子が二本鎖リボ核酸分子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記半翅目害虫集団が、前記形質転換植物細胞を欠いている同じ宿主植物種の宿主植物に外寄生する同じ害虫種の集団と比較して減少する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
半翅目害虫集団を防除する方法であって、
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換植物細胞を半翅目害虫の宿主植物に加えることを含み、前記ポリヌクレオチドが、発現して、半翅目害虫内部の標的配列の発現を阻害するように前記集団に属する前記半翅目害虫との接触により機能し、前記ポリヌクレオチドを含まない同じ宿主植物種の植物における同じ害虫種の生殖と比べて、前記半翅目害虫または害虫集団の生殖の低減をもたらすリボ核酸分子を生成する、方法。
【請求項３７】
前記リボ核酸分子が二本鎖リボ核酸分子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記半翅目害虫集団が、前記形質転換植物細胞を欠いている同じ種の宿主植物に外寄生する半翅目害虫集団と比較して減少する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
植物における半翅目害虫の外寄生を防除する方法であって、
配列番号１５〜１７；
配列番号１５〜１７のいずれかの相補体；
配列番号１５〜１７のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；
配列番号１５〜１７のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；
配列番号１のいずれかの転写物、
配列番号１の転写物の相補体、
配列番号１の転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、ならびに
配列番号１の転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体
からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能であるリボ核酸（ＲＮＡ）を半翅目害虫の食餌に入れることを含む、方法。
【請求項４０】
前記食餌が前記ポリヌクレオチドを発現するように形質転換された植物細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記特異的にハイブリダイズ可能なＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ分子に含まれる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
コーン作物の収量を改善する方法であって、
請求項１に記載の核酸をコーン植物に導入して、トランスジェニックコーン植物を作製することと、
前記コーン植物を栽培して、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を可能にすることと
を含み、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が半翅目害虫の生殖または成長および半翅目害虫感染に起因する収量の減少を阻害する、方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、前記植物の一部と接触した半翅目害虫における少なくとも第１の標的遺伝子を抑制するＲＮＡ分子を生成する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
トランスジェニック植物細胞を産生する方法であって、
請求項１に記載の核酸を含むベクターで植物細胞を形質転換することと、
複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で前記形質転換植物細胞を培養することと、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドをそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされるリボ核酸（ＲＮＡ）分子の発現について前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
前記ＲＮＡを発現する植物細胞を選択することと
を含む、方法。
【請求項４５】
前記ＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
半翅目害虫抵抗性トランスジェニック植物を作製する方法であって、
請求項４４に記載の方法により産生されたトランスジェニック植物細胞を用意することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生することと
を含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされるリボ核酸分子の発現が、形質転換植物と接触する半翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節するのに十分である、方法。
【請求項４７】
トランスジェニック植物細胞を産生する方法であって、
半翅目害虫から植物を保護する手段を含むベクターで植物細胞を形質転換することと、
複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で前記形質転換植物細胞を培養することと、
半翅目害虫から植物を保護する前記手段をそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、
半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害するための手段の発現について前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段を発現する植物細胞を選択することと
を含む、方法。
【請求項４８】
半翅目害虫保護トランスジェニック植物を産生する方法であって、
請求項４７に記載の方法により産生された前記トランスジェニック植物細胞を用意することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることとを含み、半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する前記手段の発現が、形質転換植物に接触する半翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節するのに十分である、方法。
【請求項４９】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、またはＰＩＰ−１ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項５０】
Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドがＣｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ１１ＡおよびＣｒｙ５１Ａを含む群から選択される、請求項４９に記載の核酸。
【請求項５１】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、またはＰＩＰ−１ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項５２】
Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドがＣｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ１１ＡおよびＣｒｙ５１Ａを含む群から選択される、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、またはＰＩＰ−１ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の植物。
【請求項５４】
Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドがＣｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ１１ＡおよびＣｒｙ５１Ａを含む群から選択される、請求項５３に記載の植物。
【請求項５５】
前記形質転換植物細胞がバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、またはＰＩＰ−１ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドがＣｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ１１ＡおよびＣｒｙ５１Ａを含む群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、その内容がこの参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、「半翅目害虫を防除するためのｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子の親ＲＮＡｉ抑制」についての２０１４年１２月１６日に出願した米国仮特許出願第６２／０９２，７８４号の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般的に、半翅目害虫により引き起こされる植物被害の遺伝子防除に関する。特定の実施形態において、本開示は、植物保護効果を得るための半翅目害虫の細胞における標的コードおよび非コードポリヌクレオチドの同定ならびに標的コードおよび非コードポリヌクレオチドの発現を転写後に抑制または阻害するための組換えＤＮＡ技術の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
カメムシおよび他の半翅目昆虫（異翅目）は、重要な農業害虫群である。世界的に、カメムシの５０を超える密接に関連した種が作物被害をもたらすことが公知である。McPherson & McPherson (2000) Stink bugs of economic importance in America north of Mexico, CRC Press。半翅目昆虫は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、果実、野菜および穀物を含む多数の重要な作物に存在する。
【０００４】
カメムシは、成体期に達する前に複数の若虫期を経る。これらの昆虫は、約３０〜４０日で卵から成体に発育する。若虫および成体の両方が、それらが口外組織の消化および壊死をもたらす消化酵素も注入する軟組織からの液汁を常食とする。消化された植物性物質および栄養物がその後摂取される。植物維管束系からの水および栄養物の枯渇により、植物組織の損傷が生ずる。生育中の穀類および種子の損傷は、収量および発芽が著しく低減するため、最も重大である。著しい昆虫の押寄せをもたらす温暖な気候で複数の世代が発生する。カメムシの現在の管理は、個々の畑ごとの殺虫剤処理に依拠している。したがって、進行中の作物の損失を最小限にするために、代替管理戦略が緊急に必要である。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子のすべて、またはその十分なサイズの任意の一部に対して特異的である干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）分子（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子）がそれによりコードされるｍＲＮＡの分解をもたらす、内因性細胞経路を利用する方法である。近年、ＲＮＡｉは、多くの種および実験系、例えば、エレガンス線虫、植物、昆虫胚および組織培養中細胞における遺伝子「ノックダウン」を実施するために用いられている。例えば、Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47参照。
【０００６】
ＲＮＡｉは、ＤＩＣＥＲタンパク質複合体を含む内因性経路を経るｍＲＮＡの分解を伴う。ＤＩＣＥＲは、長いｄｓＲＮＡ分子を低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる、約２０ヌクレオチドの短い断片に切断する。ｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の２つの一本鎖ＲＮＡに巻き戻される。パッセンジャー鎖は、分解され、ガイド鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。マイクロ阻害リボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子は、ハイブリダイズされたパッセンジャーおよびガイド鎖を連結するポリヌクレオチド「ループ」を含む前駆体分子から切断された構造的に非常に類似した分子であり、同様にＲＩＳＣに組み込まれ得る。転写後遺伝子サイレンシングは、ガイド鎖が相補的ｍＲＮＡ分子に特異的に結合し、ＲＩＳＣ複合体の触媒成分である、アルゴノートによる切断を誘導するときに起こる。この過程は、植物、線虫および一部の昆虫などの一部の真核生物においてｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの濃度が最初は限定されたものであるにもかかわらず生物体全体にわたり全身的に広がることが公知である。
【０００７】
ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡに相補的な転写物のみが切断され、分解され、したがって、ｍＲＮＡ発現のノックダウンは、配列特異的である。植物では、ＤＩＣＥＲ遺伝子のいくつかの官能基が存在する。ＲＮＡｉの遺伝子サイレンシング効果は、何日間も持続し、実験条件下では、９０％以上の標的転写物の存在量の減少と、対応するタンパク質のレベルの結果としての低下につながり得る。昆虫では、少なくとも２種のＤＩＣＥＲ遺伝子が存在し、ＤＩＣＥＲ１は、アルゴノート１によるｍｉＲＮＡ誘導分解を促進する。Lee et al. (2004) Cell 117(1):69-81. ＤＩＣＥＲ２は、アルゴノート２によるｓｉＲＮＡ誘導分解を促進する。Id
【０００８】
昆虫ＤＮＡに相補的な圧倒的大多数の配列（例えば、米国特許第７，６１２，１９４号明細書ならびに米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書、第２０１０／０１９２２６５号明細書および第２０１１／０１５４５４５号明細書で同定された９０００＋配列等）は、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合に植物保護効果をもたらさない。例えば、Baum et al. (2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326は、ＲＮＡｉによりいくつかのウェスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）遺伝子標的を阻害する効果を記載している。これらの著者らは、彼らが試験した２６標的遺伝子のうちの８標的遺伝子が５２０ｎｇ／ｃｍ２を超える非常に高いｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）濃度で実験的に有意な鞘翅目害虫の死亡率をもたらすことができなかったことを報告した。
【０００９】
米国特許第７，６１２，１９４号明細書および米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書の著者らは、ウェスタンコーンルートワームを標的とするコーン植物におけるｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡｉの最初の報告を行った。Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6.これらの著者らは、トランスジェニックＲＮＡｉトウモロコシを開発するための可能な標的遺伝子をスクリーニングする高処理式ｉｎ  ｖｉｖｏ食餌ＲＮＡｉシステムを記載している。２９０の標的の最初の遺伝子プールのうち、１４のみが幼虫防除能を示した。最も有効な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のうちの１つは、液胞ＡＴＰアーゼサブユニットＡ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）をコードする遺伝子を標的とし、対応する内因性ｍＲＮＡの速やかな抑制をもたらし、低濃度のｄｓＲＮＡによる特異的ＲＮＡｉ反応を誘発した。このように、これらの著者らは、可能な害虫管理ツールとしてのｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡｉの可能性を最初に記録し、さらに候補遺伝子の比較的に小さい組からでさえも有効な標的を先験的に正確に特定することができないことを同時に示した。
【００１０】
昆虫防除のためのＲＮＡｉの他の可能な適用は、親ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）を含む。エレガンス線虫（Caenorhabitis elegans）について最初に記載された、ｐＲＮＡｉは、体腔内へのｄｓＲＮＡの注射（または摂取によるｄｓＲＮＡの適用）により同定され、子孫胚における遺伝子の不活性化をもたらした。Fire et al. (1998), supra; Timmons and Fire (1998) Nature 395(6705):854。同様な過程は、モデル鞘翅目であるコクヌストモドキ（Tribolium castaneum）について記載され、胚発育中の分割を制御する３つの固有の遺伝子に対応するｄｓＲＮＡを注射した雌蛹が子孫胚における接合体遺伝子のノックダウンをもたらした。Bucher et al. (2002) Curr. Biol. 12(3):R85-6。この試験における子孫幼虫のほぼすべてが注射の１週間後に遺伝子特異的表現型を示した。機能ゲノミクス研究のためのｄｓＲＮＡの注射は、様々な昆虫において成功したが、ＲＮＡｉが害虫管理ツールとして有効であるためには、ｄｓＲＮＡへの経口曝露による腸環境からのｄｓＲＮＡの取込みおよびその後の必須遺伝子の下方制御が必要である。Auer and Frederick (2009) Trends Biotechnol. 27(11)644-51.
【００１１】
親ＲＮＡｉは、トビムシ（Orchesella cincia）（Konopova and Akam (2014) Evodevo 5(1):2）；トビイロウンカ（Nilaparvata lugens）；カブラハバチ（Athalia rosae）（Yoshiyama et al. (2013) J. Insect Physiol. 59(4):400-7）；チャバネゴキブリ（Blattella germanica）（Piulachs et al. (2010) Insect Biochem. Mol. Biol. 40:468-75）；およびエンドウヒゲナガアブラムシ（Acyrthosiphon pisum）（Mao et al. (2013) Arch Insect Biochem Physiol 84(4):209-21）を含む、多くの昆虫種における胚遺伝子の機能を記述するために用いられた。これらのすべての例におけるｐＲＮＡｉ反応は、親雌の血体腔内へのｄｓＲＮＡの注射により達成された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ここに開示するのは、核酸分子（例えば、標的遺伝子、ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）、ならびに例えば、エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）（Ｆａｂｒ．）（ネオトロピカルブラウンスティンクバグ、「ＢＳＢ」）；Ｅ．セルブス（E. servus）（セイ）（ブラウンスティンクバグ）；ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）（Ｌ．）（ミナミアオカメムシ）；ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）（ウェストウッド）（レッドバンディッドスティンクバグ）；ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）（スタール）（クサギカメムシ）；チナビア・ヒラレ（Chinavia hilare）（セイ）（グリーンスティンクバグ）；Ｃ．マルギナツム（C. marginatum）（パリソ・ド・ボーヴォワ）；ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）（ダラス）；Ｄ．フルカツス（D. furcatus）（Ｆ．）；エデッサ・メジタブンダ（Edessa meditabunda）（Ｆ．）；チアンタ・ペルディトール（Thyanta perditor）（Ｆ．）（ネオトロピカルレッドショルダードスティンクバグ）；ホルシアス・ノビレルス（Horcias nobilellus）（ベルグ）（コットンバグ）；テディア・スチグモサ（Taedia stigmosa）（ベルグ）；ホシカメムシ（Dysdercus peruvianus）（Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）；ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）（ウェストウッド）；レプトグロスス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）（ダラス）；ニエストレア・シダエ（Niesthrea sidae）（Ｆ．）；リグス・ヘスペルス（Lygus hesperus）（ナイト）（ウェスタンターニッシュドプラントバグ）；およびサビイロカスミカメ（L. lineolaris）（パリソ・ド・ボーヴォワ）を含む半翅目害虫の防除のためのそれらの使用の方法である。特定の例において、半翅目害虫における１つまたは複数の天然核酸の少なくとも一部と相同的であり得る例示的な核酸分子を開示する。いくつかの実施形態では、半翅目害虫は、害虫の次世代を生む害虫の現存世代の能力を低下させることによって防除される。特定の例において、半翅目害虫への核酸分子の送達は、害虫に有意な死亡率をもたらさないが、それから生み出される生存能力のある子孫の数を減少させる。
【００１３】
これらおよびさらなる例において、天然核酸分子は、標的遺伝子であり得、その産物は、例えばかつ制限なく、代謝過程に関与し、生殖過程に関与し、および／または若虫の発育および／または幼虫の発育に関与し得る。いくつかの例において、それと相同のポリヌクレオチドを含む核酸分子による標的遺伝子の発現の転写後抑制は、半翅目害虫の成長および／または生殖の低下をもたらし得る。特定の例において、ｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子を転写後サイレンシングの標的遺伝子として選択する。特定の例において、転写後阻害に有用な標的遺伝子は、本明細書でＢＳＢ＿ｋｒｕｐｐｅｌ（配列番号１）と呼び、本明細書でいくつかの箇所においてＢＳＢ＿ｋｒと呼ぶ、新規遺伝子である。したがって、配列番号１；配列番号１の相補体；および／または前述のもののいずれかの断片（例えば、配列番号３および配列番号４）も本明細書で開示する。
【００１４】
標的遺伝子産物（例えば、ｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子の産物）内のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子も開示する。例えば、核酸分子は、配列番号２（ＢＳＢ  ＫＲＵＰＰＥＬ）；および／またはＢＳＢ＿ｋｒの産物内のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。標的遺伝子産物内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの逆相補体であるポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに開示する。
【００１５】
さらに、半翅目害虫標的遺伝子、例えば、ｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子のすべてまたは一部と相補的であるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子の産生に用いることができるｃＤＮＡポリヌクレオチドも開示する。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡは、植物または細菌等の遺伝子操作生物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで産生され得る。特定の例において、ＢＳＢ＿ｋｒ（配列番号１）から転写されたｍＲＮＡのすべてまたは一部と相補的であるｉＲＮＡ分子を生成するのに用いることができるｃＤＮＡ分子を開示する。
【００１６】
さらに、半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段および半翅目害虫から植物を保護する手段をさらに開示する。半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段は、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７、ならびに前述のものの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドからなる一本または二本鎖ＲＮＡ分子である。半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段の機能的等価体は、配列番号１を含むＢＳＢ遺伝子から転写されたｍＲＮＡのすべてまたは一部と実質的に相同である一本もしくは二本鎖ＲＮＡ分子を含む。半翅目害虫から植物を保護する手段は、プロモーターに作動可能に連結した半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子であり、該ＤＮＡ分子は、コーン植物のゲノムに組み込まれることができる。
【００１７】
害虫内部の生物学的機能を阻害するように害虫により取り込まれることにより機能するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を半翅目害虫に与えることを含む、半翅目害虫の集団を防除する方法を開示する。ここで、ｉＲＮＡ分子は、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号３；配列番号３の相補体；配列番号４；配列番号４の相補体；配列番号１のすべてもしくは一部を含む半翅目生物（例えば、ＢＳＢ）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１のすべてもしくは一部を含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの相補体；配列番号１５のすべてもしくは一部を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コードポリヌクレオチド；ならびに配列番号１５のすべてもしくは一部を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コードポリヌクレオチドの相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドのすべてもしくは一部を含む。
【００１８】
特定の例において、害虫内部の生物学的機能を阻害するように害虫により取り込まれることにより機能するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を半翅目害虫に与えることを含む、半翅目害虫の集団を防除する方法を開示する。ここで、ｉＲＮＡ分子は、配列番号１５；配列番号１５の相補体；配列番号１６；配列番号１６の相補体；配列番号１７；配列番号１７の相補体；配列番号１のすべてもしくは一部を含む半翅目（例えば、ＢＳＢ）生物の天然コードポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；ならびに配列番号１のすべてもしくは一部を含む半翅目（例えば、ＢＳＢ）生物の天然コードポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドの相補体のすべてまたは一部からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む。
【００１９】
ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを発現する食餌ベースのアッセイまたは複数の遺伝子組換え植物細胞における半翅目害虫に与えることができる方法も本明細書に開示する。これらおよびさらなる例において、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡは、半翅目害虫により摂取させることができる。本発明のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡの摂取は、害虫におけるＲＮＡｉをもたらし得る。これがひいては代謝過程、生殖過程および／または若虫の発育に必須の遺伝子のサイレンシングをもたらし得る。したがって、半翅目害虫の親の防除に有用な例示的ポリヌクレオチド（複数可）を含む核酸分子を半翅目害虫に与える、方法を開示する。特定の例において、本発明の核酸分子の使用により防除される半翅目害虫は、ＢＳＢであり得る。いくつかの例において、半翅目害虫への核酸分子の送達は、害虫に有意な死亡率をもたらさないが、それから生み出される生存能力のある子孫の数を減少させる。いくつかの例において、半翅目害虫への核酸分子の送達は、害虫に有意な死亡率をもたらし、それから生み出される生存能力のある子孫の数も減少させる。
【００２０】
前述および他の特徴は、添付図面に準拠して進められる、いくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】単一対のプライマーを含む単一の転写鋳型から（図１Ａ）および２つの転写鋳型から（図１Ｂ）ｄｓＲＮＡを生成するために用いた戦略の描写を含む図である。
【図２】キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（ＤＭＥ）およびエウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）（ＢＳＢ）  ＫＲＵＰＰＥＬタンパク質配列のドメイン構成の描写を含む図である。キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）およびＥ．ヘロス（E. heros）  ＫＲＵＰＰＥＬタンパク質は、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ内のＳＭＡＲＴデータベースを用いて注釈付けした、４つのＣ２Ｈ２型亜鉛フィンガーを含む。
【図３】非リフュージ植物が殺虫タンパク質および親活性ｉＲＮＡを発現する場合の殺虫タンパク質（Ｒ）およびＲＮＡｉ（Ｙ）に対して抵抗性の対立遺伝子頻度の増加の割合に対する「リフュージパッチ」（すなわち、トランスジェニック作物において殺虫性ｉＲＮＡまたは組換えタンパク質を発現しなかった）から出現した雌ＢＳＢ成体におけるｐＲＮＡｉ効果の相対的な規模の効果を示すモデリングデータの要約を含む図である。
【図４】非リフュージ植物が殺虫タンパク質ならびに幼虫活性および親活性ｉＲＮＡ分子の両方を発現する場合の殺虫タンパク質（Ｒ）およびＲＮＡｉ（Ｙ）に対して抵抗性の対立遺伝子頻度の増加の割合に対する「リフュージパッチ」（すなわち、ＢＳＢ若虫活性干渉ｄｓＲＮＡをトランスジェニック作物におけるＢＳＢ活性殺虫タンパク質と共に含む植物のトランスジェニック作物において殺虫性ｉＲＮＡまたは組換えタンパク質を発現しなかった）から出現した雌ＢＳＢ成体におけるｐＲＮＡｉ効果の相対的な規模の効果を示すモデリングデータの要約を含む図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
配列表
添付の配列表に挙げる核酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に規定の通りに、ヌクレオチド塩基の標準文字略記を用いて示す。列挙した核酸およびアミノ酸配列は、記述されたように配列したヌクレオチドおよびアミノ酸モノマーを有する分子（すなわち、それぞれポリヌクレオチドおよびポリペプチド）を定義する。列挙した核酸およびアミノ酸配列は、記述されたように配列したヌクレオチドおよびアミノ酸モノマーを含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドの属もそれぞれ定義する。遺伝コードの重複性を考慮すると、コード配列を含むヌクレオチド配列も、参照配列からなるポリヌクレオチドと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの属を記述することが理解される。アミノ酸配列は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドＯＲＦの属を記述することがさらに理解される。
【００２３】
各核酸配列の１つの鎖のみを示すが、相補鎖は、表示鎖の記載により含められるものと理解される。一次核酸配列の相補体および逆相補体は、一次配列によって必然的に開示されるので、核酸配列の相補的配列および逆相補的配列は、他の状態であることが明確に述べられていない限り（または配列が出現する文脈から他の状態であることが明らかでない限り）、該核酸配列の任意の参照により含められる。さらに、ＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列は、それが転写されたＤＮＡの配列によって決定される（チミン（Ｔ）に対するウラシル（Ｕ）核酸塩基の置換を別にすれば）ことは、当技術分野で理解されているので、ＲＮＡ配列は、それをコードするＤＮＡ配列への参照により含められる。添付の配列表において、
配列番号１は、本明細書でいくつかの箇所においてＢＳＢ＿ｋｒと呼ぶ、例示的なＥ．ヘロス（E. heros）ｋｒｕｐｐｅｌ  ＤＮＡを示す。
【００２４】
【化１】
2018500899.tif 000003
配列番号２は、例示的なＥ．ヘロス（E. heros）ｋｒｕｐｐｅｌ  ＤＮＡによりコードされるＥ．ヘロス（E. heros）ＫＲＵＰＰＥＬポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００２５】
【化２】
2018500899.tif 000004
配列番号３は、その相補鎖が転写されて、例示的なＢＳＢ  ｋｒｕｐｐｅｌ  ｄｓＲＮＡのセンス鎖になる、例示的なＥ．ヘロス（E. heros）ｋｒｕｐｐｅｌ  ＤＮＡ（ＢＳＢ＿ｋｒ−１）を示す。
【００２６】
【化３】
2018500899.tif 000005
配列番号４は、その相補鎖が転写されて、さらなる例示的なＢＳＢ  ｋｒｕｐｐｅｌ  ｄｓＲＮＡのセンス鎖になる、例示的なＥ．ヘロス（E. heros）ｋｒｕｐｐｅｌ  ＤＮＡ（ＢＳＢ＿ｋｒ−２）を示す。
【００２７】
【化４】
2018500899.tif 000006
配列番号５は、Ｔ７ファージプロモーターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号６は、植物発現ベクターに見いだされるようなＹＦＰヘアピンＲＮＡ形成配列ｖ２を示す。大文字の塩基は、ＹＦＰセンス鎖であり、下線付き塩基は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含み、小文字の下線付きでない塩基は、ＹＦＰアンチセンス鎖である。
【００２８】
【化５】
2018500899.tif 000007
配列番号７は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む例示的なＤＮＡを示す。
配列番号８〜１１は、ＢＳＢ＿ｋｒ−１およびＢＳＢ＿ｋｒ−２ポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に用いたプライマーを示す。
配列番号１２は、例示的なＹＦＰ  ｄｓＲＮＡ（ＹＦＰｖ２）のセンス鎖のＤＮＡ鋳型を示す。
【００２９】
【化６】
2018500899.tif 000008
配列番号１３および１４は、ＹＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅に用いたプライマーを示す。
配列番号１５〜１７は、例示的なｋｒｕｐｐｅｌポリヌクレオチドおよびその断片を含む核酸から転写された例示的なＲＮＡを示す。
配列番号１８は、Ａｃｔｉｎ−ＯＲＦを示す。
【００３０】
【化７】
2018500899.tif 000009
配列番号１９〜２１は、Ａｃｔｉｎ−ｑＰＣＲに用いたプライマーおよびプローブを示す。
【００３１】
発明を実施するための態様（複数可）
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
本発明者らは、ｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニック植物に対する標的害虫種であるネオトロピカルブラウンスティンクバグを用いて、害虫管理のためのツールとしてのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を開発した。これまでのところ、特定の昆虫におけるＲＮＡｉの標的として提案されたほとんどの遺伝子は、それらの目的を達成しておらず、特定された有用な標的は、若虫期における致死をもたらすものを典型的には含む。本明細書では、本発明者らは、例えば、ｋｒｕｐｐｅｌ  ｄｓＲＮＡを成体雌に与えることによりｉＲＮＡ分子を送達した場合に、胚の発育を妨げることが示されている、ネオトロピカルブラウンスティンクバグにおけるｋｒｕｐｐｅｌ（ｋｒ）のＲＮＡｉ媒介ノックダウンについて述べる。しかし、ｋｒｕｐｐｅｌ  ｄｓＲＮＡに曝露した雌から収集された卵には孵化がほぼ完全に存在しなかった。本明細書における実施形態では、成体昆虫への注射によりｋｒｕｐｐｅｌ  ｄｓＲＮＡを送達する能力は、害虫（例えば、半翅目）の管理に非常に有用であるＲＮＡｉ効果をもたらすものである。さらに、若虫および成体半翅目害虫の両方における複数の標的配列に作用を及ぼす可能性は、ＲＮＡｉ技術を含む害虫管理への持続可能なアプローチを開発する機会を増大させ得るものである。
【００３２】
本明細書で開示するのは、半翅目害虫の外寄生の遺伝的防除のための方法および組成物である。半翅目害虫集団のＲＮＡｉ媒介防除のための標的遺伝子として用いる半翅目害虫の生活環に必須の１つまたは複数の遺伝子（複数可）（例えば、正常な生殖能力ならびに／または若虫および／もしくは幼虫の発育に必須の遺伝子（複数可））を特定する方法も提供する。ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡプラスミドベクターは、成長、生存、発育および／または生殖に必須の１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）を抑制するように設計することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子を形成することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、半翅目害虫における標的遺伝子のコードまたは非コード配列と相補的である核酸分子による標的遺伝子の発現の転写後抑制または阻害の方法を提供する。これらおよびさらなる実施形態では、半翅目害虫は、標的遺伝子のコードまたは非コード配列と相補的である核酸分子のすべてまたは一部から転写される１つまたは複数のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子を摂取し、それにより植物保護効果をもたらし得る。
【００３３】
他の実施形態は、半翅目害虫の少なくとも部分的な防除を達成するために標的遺伝子（複数可）のコードおよび／または非コード配列と相補的であるｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを用いる、標的遺伝子産物の発現の配列特異的阻害を含む。開示するのは、例えば、配列番号１に示すような、ポリヌクレオチド；およびそれらの断片を含む一組の単離および精製核酸分子である。いくつかの実施形態では、安定化ｄｓＲＮＡ分子は、標的遺伝子の転写後サイレンシングまたは抑制のために、これらのポリヌクレオチド、それらの断片、またはこれらのポリヌクレオチド１つを含む遺伝子から発現させることができる。特定の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかのすべてまたは一部を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子（複数可）をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡをそのゲノムに有する組換え宿主細胞（例えば、植物細胞）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子（複数可）は、害虫または害虫の子孫における標的遺伝子の発現を転写後に検出されなくするまたは阻害するために半翅目害虫により摂取されたときに生成され得る。組換えＤＮＡは、例えば、配列番号１；配列番号１の断片；ならびに配列番号１を含む遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチド、および／またはその相補体を含み得る。
【００３５】
代替的実施形態は、配列番号１５（例えば、配列番号１５〜配列番号１７）のすべてまたは一部を含む少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子（複数可）をコードする組換えＤＮＡをそのゲノムに有する組換え宿主細胞を含む。半翅目害虫により摂取される場合、ｉＲＮＡ分子（複数可）は、害虫または害虫の子孫における標的ｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子（例えば、配列番号１のポリヌクレオチドのすべてまたは一部を含むＤＮＡ）の発現を停止または阻害し、それにより、害虫における生殖、ならびに／または害虫の子孫における成長、発育、および／もしくは摂食の停止をもたらし得る。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができる少なくとも１つのＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡをそのゲノムに有する組換え宿主細胞は、形質転換植物細胞であり得る。いくつかの実施形態は、そのような形質転換植物細胞を含むトランスジェニック植物を含む。そのようなトランスジェニック植物に加えて、トランスジェニック植物世代の子孫植物、トランスジェニック種子およびトランスジェニック植物産物をすべて提供し、それらのそれぞれが組換えＤＮＡ（複数可）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子は、トランスジェニック植物細胞において発現させることができる。したがって、これらおよび他の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、トランスジェニック植物細胞から単離することができる。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、コーン（ゼア・マイス（Zea mays））ダイズ（Glycine max）、ワタ（Gossypium spp.）およびイネ科（Poaceae）の植物からなる群から選択される植物である。
【００３７】
他の実施形態は、半翅目害虫細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を含む。これらおよび他の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子を提供することができる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結することができ、転写終結配列にも作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、半翅目害虫細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法は、（ａ）ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより植物細胞に形質転換を起こさせることと、（ｂ）複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で形質転換植物細胞を培養することと、（ｃ）ベクターをそのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、（ｄ）選択された形質転換植物細胞がベクターのポリヌクレオチドによりコードされたｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子を含むことを判定することとを含み得る。植物は、そのゲノムに組み込まれたベクターを有し、ベクターのポリヌクレオチドによりコードされたｄｓＲＮＡ分子を含む植物細胞から再生させることができる。
【００３８】
したがって、そのゲノムに組み込まれたｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのポリヌクレオチドによりコードされたｄｓＲＮＡ分子を含むトランスジェニック植物も開示する。特定の実施形態では、植物におけるｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子の発現は、害虫の生殖が抑制されるように、形質転換植物もしくは植物細胞と接触する（例えば、形質転換植物、植物の一部（例えば、葉もしくは植物細胞）を常食とすることにより）半翅目害虫の細胞中または形質転換植物もしくは植物細胞と接触する（例えば、親からの伝達により）半翅目害虫の子孫の細胞中の標的遺伝子の発現を調節するのに十分である。本明細書で開示するトランスジェニック植物は、半翅目害虫の外寄生に対する耐性および／またはそれからの保護を示し得る。特定のトランスジェニック植物は、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）；ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）；ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）；アクロステルヌム・ヒラレ（Acrosternum hilare）；エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）；エウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）：チナビア・ヒラレ（Chinavia hilare）；Ｃ．マルギナツム（C. marginatum）；ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）；Ｄ．フルカツス（D. furcatus）；エデッサ・メジタブンダ（Edessa meditabunda）；チアンタ・ペルディトール（Thyanta perditor）；ホルシアス・ノビレルス（Horcias nobilellus）；テディア・スチグモサ（Taedia stigmosa）；ホシカメムシ（Dysdercus peruvianus）；ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）；レプトグロスス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）；ニエストレア・シダエ（Niesthrea sidae）；リグス・ヘスペルス（Lygus hesperus）；およびサビイロカスミカメ（L. lineolaris）からなる群から選択される１つまたは複数の害虫（複数可）からの保護および／または保護の向上を示し得る。
【００３９】
半翅目害虫へのｉＲＮＡ分子等の防除剤の送達の方法もまた、本明細書に開示する。そのような防除剤は、宿主において摂食する、成長する、または別の方法で被害を引き起こす半翅目害虫集団の能力の低下を直接的または間接的にもたらし得る。いくつかの実施形態では、害虫またはその子孫における少なくとも１つの標的遺伝子を抑制し、それにより、親ＲＮＡｉをもたらし、害虫宿主における植物被害を低減または撲滅するための半翅目害虫への安定化ｄｓＲＮＡ分子の送達を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、半翅目害虫における標的遺伝子の発現を阻害する方法は、害虫における生殖、ならびに／または害虫の子孫における成長、発育、および／もしくは摂食の停止をもたらし得る。いくつかの実施形態では、該方法は、ｉＲＮＡ分子に接触する害虫（複数可）の死亡を直接的にもたらさずに、外寄生に際しての害虫の次世代の構成数を著しく減少させ得る。いくつかの実施形態では、該方法は、ｉＲＮＡ分子に接触する害虫（複数可）の死亡ももたらすと同時に、外寄生に際しての害虫の次世代の構成数を著しく減少させ得る。
【００４０】
いくつかの実施形態では、半翅目害虫の外寄生の排除または低減を達成するために植物、動物および／または植物もしくは動物の環境に用いるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子を含む組成物（例えば、局所組成物）を提供する。特定の実施形態では、組成物は、半翅目害虫に与える栄養組成物もしくは供給源、または食物源であり得る。いくつかの実施形態は、害虫が利用できる栄養組成物または食物源を作ることを含む。ｉＲＮＡ分子を含む組成物の摂取は、半翅目害虫の１つまたは複数の細胞による該分子の取込みをもたらし得、これがひいては害虫またはその子孫の細胞（複数可）における少なくとも１つの標的遺伝子の発現の阻害をもたらし得る。半翅目害虫の外寄生による植物または植物細胞の摂取または被害は、害虫の宿主にｉＲＮＡ分子を含む１つまたは複数の組成物を供給することにより、害虫が存在する宿主組織または環境中またはその上において制限または排除することができる。
【００４１】
本明細書で開示する組成物および方法は、半翅目害虫による被害を防除するための他の方法および組成物と組み合わせて一緒に用いることができる。例えば、半翅目害虫から植物を保護するための本明細書で述べたｉＲＮＡ分子は、半翅目害虫に対して有効な１つもしくは複数の化学物質、半翅目害虫に対して有効なバイオ農薬、輪作、ＲＮＡｉ媒介性の方法およびＲＮＡｉ組成物の特徴と異なる特徴を示す遺伝子組換え技術（例えば、半翅目害虫に有害である植物におけるタンパク質（例えば、Ｂｔ毒素）の組換え産生）、ならびに／または非親ｉＲＮＡ分子（例えば、ｉＲＮＡ分子を摂取する半翅目害虫における成長、発育、摂食および／または死の原因の停止をもたらす致死性ｉＲＮＡ分子）の組換え発現のさらなる使用を含む方法に用いることができる。
【００４２】
ＩＩ．  略語
ＢＳＢ          ネオトロピカルブラウンスティンクバグ（Euschistus heros）
ｄｓＲＮＡ      二本鎖リボ核酸
ＧＩ            成長阻害
ＮＣＢＩ        米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）
ｇＤＮＡ        ゲノムデオキシリボ核酸
ｉＲＮＡ        阻害リボ核酸
ＯＲＦ          オープンリーディングフレーム
ＲＮＡｉ        リボ核酸干渉
ｍｉＲＮＡ      マイクロリボ核酸
ｓｉＲＮＡ      低分子阻害リボ核酸
ｈｐＲＮＡ      ヘアピンリボ核酸
ｓｈＲＮＡ      短ヘアピン型リボ核酸
ｐＲＮＡｉ    親ＲＮＡ干渉
ＵＴＲ          非翻訳領域
ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応
ｑＰＣＲ        定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＩＳＣ        ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体
ＲＨ            相対湿度
ＳＥＭ          平均値の標準誤差
ＹＥＰ          黄色蛍光タンパク質
【００４３】
ＩＩＩ．用語
続く説明および表において、多くの用語が用いられている。そのような用語に与えるべき範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確で、一貫した理解を可能にするために、以下の定義を記載する。
【００４４】
（生物との）接触：  本明細書で用いているように、核酸分子に関連して、生物（例えば、半翅目害虫）「との接触」または「による取込み」という用語は、生物体内への核酸分子のインターナリゼーション、例えばかつ制限なしに、生物による該分子の摂取（例えば、摂食することによる）；核酸分子を含む組成物と生物を接触させること；核酸分子を含む組成物による生物の注射；および核酸分子を含む溶液による生物の浸漬を含む。
【００４５】
コンティグ：  本明細書で用いているように、「コンティグ」という用語は、単一遺伝源に由来する一組の重複ＤＮＡセグメントから再構築されているＤＮＡ配列を意味する。
【００４６】
コーン植物体：  本明細書で用いているように、「コーン植物体」という用語は、ゼア・マイス種（Zae mays）（トウモロコシ）の植物を意味する。
【００４７】
発現：  本明細書で用いているように、コードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子または導入遺伝子）の「発現」は、しばしばタンパク質の合成を含む、核酸転写単位のコード化情報（例えば、ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡ）が細胞の作動、非作動または構造部分に変換されるプロセスを意味する。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加または減少させる作用因子への細胞、組織または生物体の曝露による影響を受け得る。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡを経てタンパク質までの経路のどこかで調節することもできる。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡ等の中間分子の分解に作用するコントロールにより、またはそれらが行われた後に特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、画分化、もしくは分解により、またはそれらの組合せにより起こる。遺伝子発現は、制限なく、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕもしくはｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む、当技術分野で公知のいずれかの方法によりＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。
【００４８】
遺伝物質：  本明細書で用いているように、「遺伝物質」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の、すべての遺伝子および核酸分子を含む。
【００４９】
半翅目害虫：  本明細書で用いているように、「半翅目害虫」という用語は、広範囲の宿主植物を常食とし、刺して、吸う口器を有する、例えばかつ制限なしに、カメムシ科（Pentatomidae）、メクラカメムシ科（Miridae）、ホシカメムシ科（Pyrrhocoridae）、ヘリカメムシ科（Coreidae）、クモヘリカメムシ科（Alydidae）およびロパルス科（Rhopalidae）の昆虫を含む、半翅目の害虫を意味する。特定の例において、半翅目害虫は、エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）（Ｆａｂｒ．）（ネオトロピカルブラウンスティンクバグ）、ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）（Ｌ．）（ミナミアオカメムシ）、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）（ウェストウッド）（レッドバンディッドスティンクバグ）、ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）（スタール）（クサギカメムシ）、チナビア・ヒラレ（Chinavia hilare）（セイ）（グリーンスティンクバグ）、エウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）（セイ）（ブラウンスティンクバグ）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）（ダラス）、ディケロプス・フルカツス（Dichelops furcatus）（Ｆ．）、エデッサ・メジタブンダ（Edessa meditabunda）（Ｆ．）；チアンタ・ペルディトール（Thyanta perditor）（Ｆ．）（ネオトロピカルレッドショルダードスティンクバグ）、チナビア・マルギナツム（Chinavia marginatum）（パリソ・ド・ボーヴォワ）、ホルシアス・ノビレルス（Horcias nobilellus）（ベルグ）（コットンバグ）、テディア・スチグモサ（Taedia stigmosa）（ベルグ）、ホシカメムシ（Dysdercus peruvianus）（Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）、ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）（ウェストウッド）、レプトグロスス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）（ダラス）、ニエストレア・シダエ（Niesthrea sidae）（Ｆ．）、リグス・ヘスペルス（Lygus hesperus）（ナイト）（ウェスタンターニッシュドプラントバグ）およびサビイロカスミカメ（Lygus lineolaris）（パリソ・ド・ボーヴォワ）を含むリストから選択される。
【００５０】
阻害：  本明細書で用いているように、「阻害」という用語は、コードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）に対する効果を記述するために用いる場合、コードポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡおよび／またはコードポリヌクレオチドのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質産物の細胞レベルの測定可能な低下を意味する。いくつかの例において、コードポリヌクレオチドの発現は、発現がほぼ無くなるように阻害することができる。「特異的阻害」は、特異的阻害が達成される細胞中の他のコードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）の発現に後に影響を及ぼすことのない標的コードポリヌクレオチドの阻害を意味する。
【００５１】
単離された：  「単離（された）」生物学的構成成分（核酸またはタンパク質等）は、構成成分の化学的または機能的変化がもたらされるのと同時に、構成成分が天然に存在する生物体の細胞中の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離された、とは別に産生された、またはから精製された（例えば、核酸は、核酸を染色体における残りのＤＮＡに連結している化学結合を切断することによって染色体から単離することができる）。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準精製方法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。該用語は、宿主細胞中で組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドも含む。
【００５２】
核酸分子：  本明細書で用いているように、「核酸分子」という用語は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方を含み得る、ヌクレオチドの重合体、ならびに合成体および上記のものの混合重合体を意味し得る。ヌクレオチドまたは核酸塩基は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、いずれかの型のヌクレオチドの修飾体を意味し得る。「核酸分子」は、本明細書で用いているように、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義語である。核酸分子は、特に示さない限り、通常、長さが少なくとも１０塩基である。慣例により、核酸分子のヌクレオチド配列は、分子の５’末端から３’末端の方向に読み取られる。核酸分子の「相補体」は、核酸分子の核酸塩基と塩基対（すなわち、Ａ−Ｔ／ＵおよびＧ−Ｃ）を形成し得る核酸塩基を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００５３】
いくつかの実施形態は、ｍＲＮＡ分子の相補体であるＲＮＡ分子に転写される鋳型ＤＮＡを含む核酸を含む。これらの実施形態では、ｍＲＮＡ分子に転写される核酸の相補体は、ＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを５’→３’方向に転写する）がｍＲＮＡ分子とハイブリダイズし得る相補体からの核酸を転写するように、５’→３’の配向で存在する。別途明確に述べない限り、または文脈から他の状態であることが明白でない限り、「相補体」という用語は、したがって、５’から３’まで、参照核酸の核酸塩基と塩基対を形成し得る核酸塩基を有するポリヌクレオチドを意味する。同様に、明示的に別の定めをした場合を除いて（または文脈から他の状態であることが明らかである場合を除いて）、核酸の「逆相補体」は、逆の配向の相補体を意味する。前述のことを以下の実例で示す。
ＡＴＧＡＴＧＡＴＧ  ポリヌクレオチド
ＴＡＣＴＡＣＴＡＣ  ポリヌクレオチドの「相補体」
ＣＡＴＣＡＴＣＡＴ  ポリヌクレオチドの「逆相補体」
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態は、ヘアピンＲＮＡ形成ＲＮＡｉ分子を含み得る。これらのＲＮＡｉ分子では、一本鎖ＲＮＡ分子が相補的および逆相補的ポリヌクレオチドを含む領域にわたって「折り重なり」、それ自体とハイブリダイズし得るように、ＲＮＡ干渉により標的とされる核酸の相補体および逆相補体の両方を同じ分子に見いだすことができる。
【００５５】
「核酸分子」は、すべてのポリヌクレオチド、例えば、一本および二本鎖型のＤＮＡ；一本鎖型のＲＮＡ；ならびに二本鎖型のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、個々の一本鎖としての、または二重らせんにおける核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の両方を意味する。「リボ核酸」（ＲＮＡ）という用語は、ｉＲＮＡ（阻害ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｈｐＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ、対応するアシル化アミノ鎖を負荷されているか、または負荷されていないかを問わず）およびｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を含む。「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）という用語は、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。「ポリヌクレオチド」および「核酸」、ならびにその「断片」という用語は、例えば、ｇＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、オペロン、およびペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするまたはコードするように適合させることができる工学的に操作したより小さいポリヌクレオチドを含む用語と当業者により理解される。
【００５６】
オリゴヌクレオチド：  オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、より長い核酸セグメントの切断により、または個々のヌクレオチド前駆体を重合させることにより、形成させることができる。自動合成器により、長さが数百塩基までのオリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは、相補的核酸に結合し得るので、それらは、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして用いることができる。ＤＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、ＤＮＡの増幅のための技術である、ＰＣＲに用いることができる。ＰＣＲにおいて、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長させ、相補鎖を複製することを可能にする、「プライマー」と一般的に呼ばれる。
【００５７】
核酸分子は、天然および／または非天然ヌクレオチド結合により結合した天然および修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。核酸分子は、当業者により容易に理解されるように、化学的もしくは生化学的に修飾することができ、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。そのような修飾は、例えば、標識、メチル化、類似体による１つまたは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合：例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等；荷電結合：例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等；ペンダント部分：例えば、ペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソレラン等；キレート剤；アルキル化剤；修飾結合：例えば、アルファアノマー核酸等）を含む。「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖、部分二重らせん、三重らせん、ヘアピン、環状およびパドロック型立体配座を含む、任意の位相幾何学的立体配座も含む。
【００５８】
ＤＮＡに関して本明細書で用いているように、「コードポリヌクレオチド」、「構造ポリヌクレオチド」または「構造核酸分子」という用語は、適切な調節エレメントの制御下におかれた場合、転写およびｍＲＮＡにより、ポリペプチドに最終的に翻訳されるポリヌクレオチドを意味する。ＲＮＡに関しては、「コードポリヌクレオチド」という用語は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるポリヌクレオチドを意味する。コードポリヌクレオチドの境界は、５’末端における翻訳開始コドンおよび３’末端における翻訳停止コドンにより決定される。コードポリヌクレオチドは、ｇＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ＥＳＴｓ；および組換えポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書で用いているように、「転写非コードポリヌクレオチド」は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されない５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよびイントロンセグメント等のｍＲＮＡ分子のセグメントを意味する。さらに、「転写非コードポリヌクレオチド」は、細胞中で機能するＲＮＡ、例えば、構造ＲＮＡ（例えば、５ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡおよび２８ＳｒＲＮＡなどにより例示されるリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ））、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）ならびにＵ４、Ｕ５、Ｕ６など等のｓｎＲＮＡに転写される核酸を意味する。転写非コードポリヌクレオチドは、例えばおよび制限なく、小ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）も含み、この用語は、小細菌非コードＲＮＡ；小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）；マイクロＲＮＡ；小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）；および長鎖非コードＲＮＡを記述するためにしばしば用いられる。さらに、「転写非コードポリヌクレオチド」は、核酸における遺伝子内「スペーサー」として天然に存在し得、ＲＮＡ分子に転写されるポリヌクレオチドを意味する。
【００６０】
致死性ＲＮＡ干渉：本明細書で用いているように、「致死性ＲＮＡ干渉」という用語は、例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮおよび／またはｈｐＲＮＡが送達される個々の対象の死または生存能力の低下をもたらすＲＮＡ干渉を意味する。
【００６１】
親ＲＮＡ干渉：本明細書で用いているように、「親ＲＮＡ干渉」（ｐＲＮＡｉ）という用語は、例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮおよび／またはｈｐＲＮＡが送達される対象（例えば、半翅目害虫）の子孫に観測可能なＲＮＡ干渉表現型を意味する。いくつかの実施形態では、ｐＲＮＡｉは、半翅目害虫へのｄｓＲＮＡの送達を含み、それによって害虫が生存能力のある子孫を産む能力をより低くされる。ｐＲＮＡｉを開始する核酸は、核酸が送達される集団における死亡の発生率を増加させ得るまたは増加させ得ない。特定の実施形態では、ｐＲＮＡｉを開始する核酸は、核酸が送達される集団における死亡の発生率を増加させない。例えば、半翅目害虫の集団にｐＲＮＡｉを開始する１つまたは複数の核酸を与えることができ、この場合、害虫は、生存し、交配するが、核酸（複数可）を与えられていない同じ種の害虫により産生される卵よりも生存能力のある子孫を孵化する能力が低い卵を産生する。ｐＲＮＡｉの１つの機序において、雌に送達された親ＲＮＡｉは、雌の子孫胚における接合体遺伝子発現をノックダウンすることができる。Bucher et al. (2002) Curr. Biol. 12(3):R85-6.
【００６２】
ゲノム：  本明細書で用いているように、「ゲノム」という用語は、細胞の核内に見いだされる染色体ＤＮＡを意味し、細胞の細胞分画物内に見いだされるオルガネラＤＮＡも意味する。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子が植物細胞のゲノムに組み込まれるように、ＤＮＡ分子を植物細胞に導入することができる。これらおよびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は、植物細胞の核ＤＮＡに組み込むか、または植物細胞の葉緑体もしくはミトコンドリアのＤＮＡに組み込むことができる。「ゲノム」という用語は、細菌に適用するとき、細菌細胞内の染色体およびプラスミドの両方を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子が細菌のゲノムに組み込まれるように、ＤＮＡ分子を細菌に導入することができる。これらおよびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は、染色体に組み込むか、または安定プラスミドとしてもしくはそれに位置することができる。
【００６３】
配列同一性：「配列同一性」または「同一性」という用語は、本明細書で用いているように２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関連して、規定の比較ウインドウにわたり最大の一致が得られるようにアラインメントさせた場合に同じである２つの分子の配列における残基を意味する。
【００６４】
本明細書で用いているように、「配列同一性の百分率」という用語は、２つの最適にアライメントされた分子の配列（例えば、核酸配列またはポリペプチド配列）を比較ウインドウにわたり比較することにより決定される値を意味し、比較ウインドウにおける配列の一部は、２つの配列の最適のアライメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を測定して、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって計算する。参照配列と比較してすべての位置で同一である配列は、参照配列と１００％同一であると言われ、またその逆も同じである。
【００６５】
比較のために配列をアライメントする方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列のアラインメントの方法および相同性の計算の詳細な考察は、例えばAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10において見いだすことができる。
【００６６】
米国国立生物技術情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990)）が、いくつかの配列解析プログラムに関連して使用するために、米国国立生物技術情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの情報源およびインターネット上で利用できる。このプログラムを用いて配列同一性をどのようにして決定するかの説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」セクションのもとにインターネット上で入手できる。核酸配列の比較のために、デフォルトパラメーターに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いてＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ  ２配列」関数（function）を用いることができる。参照ポリヌクレオチドの配列とのはるかにより大きい配列類似性を有する核酸は、この方法により評価する場合、同一性百分率の増加を示す。
【００６７】
特異的にハイブリダイズ可能な／特異的に相補的な：  本明細書で用いているように、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」という用語は、安定かつ特異的な結合が核酸分子と標的核酸分子との間で起こるように十分な程度の相補性を示す用語である。２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションは、２つの核酸分子の核酸塩基間の逆平行アライメントの形成を伴う。２つの分子は、そのとき逆鎖上の対応する塩基との水素結合を形成して、それが十分に安定である場合、当技術分野で周知の方法を用いて検出できる二重らせん分子を形成することができる。ポリヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるにはその標的核酸と１００％相補的である必要はない。しかし、ハイブリダイゼーションが特異的であるために存在しなければならない相補性の量は、用いるハイブリダイゼーション条件の関数である。
【００６８】
特定の厳密度をもたらすハイブリダイゼーション条件は、最適なハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸の組成および長さによって異なる。一般的に、洗浄時間も厳密性に影響を及ぼすが、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（とりわけＮａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）は、ハイブリダイゼーションの厳密性を決定づける。特定の厳密度を達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapter 9 and 11;およびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に述べられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示および指針は、例えば、Tijssen, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993;およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見いだすことができる。
【００６９】
本明細書で用いているように、「厳密条件」は、ハイブリダイゼーション分子の配列の間に２０％未満のミスマッチおよび標的核酸分子内に相同ポリヌクレオチドが存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を含む。「厳密条件」は、厳密性のさらなる特定のレベルを含む。したがって、本明細書で用いているように、「中厳密性」条件は、２０％を超える配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高厳密性」の条件は、１０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件であり、「超高厳密性」の条件は、５％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。
【００７０】
以下は、代表的で、非限定的なハイブリダイゼーション条件である。
高厳密条件（少なくとも９０％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドを検出する）：  ５ｘ  ＳＳＣ緩衝液中での６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温でそれぞれ１５分間２回洗浄する；および０．５ｘ  ＳＳＣ緩衝液で６５℃でそれぞれ２０分間２回洗浄する。
中厳密条件（少なくとも８０％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドを検出する）：  ５ｘ〜６ｘＳＳＣ緩衝液中での６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温でそれぞれ５〜２０分間２回洗浄する；および１ｘ  ＳＳＣ緩衝液で５５〜７０℃でそれぞれ３０分間２回洗浄する。
非厳密対照条件（少なくとも５０％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする）：  ６ｘ  ＳＳＣ緩衝液中での室温〜５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２ｘ〜３ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温〜５５℃でそれぞれ２０〜３０分間少なくとも２回洗浄する。
【００７１】
本明細書で用いているように、核酸に関する「実質的に相同」または「実質的相同性」という用語は、参照核酸と厳密条件下でハイブリダイズする連続した核酸塩基を有すポリヌクレオチドを意味する。例えば、配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかの参照核酸と実質的に相同である核酸は、配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかの参照核酸と厳密条件（例えば、上に示した中厳密条件）のもとでハイブリダイズする核酸である。実質的に相同であるポリヌクレオチドは、少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。例えば、実質的に相同であるポリヌクレオチドは、７９％、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％および約１００％等の、約８０％〜１００％の配列同一性を有し得る。実質的相同性の特性は、特異的ハイブリダイゼーションに密接に関連している。例えば、特異的結合が望まれる条件下、例えば、厳密ハイブリダイゼーション条件下で非標的ポリヌクレオチドに対する核酸の特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在する場合に、核酸分子は、特異的にハイブリダイズする。
【００７２】
本明細書で用いているように、「オルソログ」という用語は、共通の祖先の核酸から発生し、２つ以上の種において共通の機能を保持し得る２つ以上の種における遺伝子を意味する。
【００７３】
本明細書で用いているように、５’→３’方向に読み取られたポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが３’→５’方向に読み取られた場合の他のポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチドと相補的である場合、２つの核酸分子は、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの逆相補体と配列同一性を示す。これらの用語および記述は、当技術分野で十分に定義されており、当業者に容易に理解される。
【００７４】
作動可能に連結した：第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドと機能的関係にある場合、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結している。組換えよって産生させる場合、作動可能に連結したポリヌクレオチドは、一般的に連続しており、２つのコード領域を連結するために必要な場合、同じ読取枠に（例えば、翻訳段階で融合されるＯＲＦで）ある。しかし、核酸は、作動可能に連結されるのに連続している必要はない。
【００７５】
「作動可能に連結した」という用語は、調節遺伝エレメントおよびコードポリヌクレオチドに関連して用いる場合、調節エレメントが連結されたコードポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節エレメント」または「制御エレメント」は、転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コードポリヌクレオチドの翻訳に影響を及ぼすポリヌクレオチドを意味する。調節エレメントは、プロモーター；翻訳リーダー；イントロン；エンハンサー；ステム−ループ構造；レプレッサー結合ポリヌクレオチド；終結配列を有するポリヌクレオチド；ポリアデニル化認識配列を有するポリヌクレオチド等を含み得る。特定の調節エレメントは、それと作動可能に連結したコードポリヌクレオチドの上流および／または下流に位置し得る。また、コードポリヌクレオチドと作動可能に連結した特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連相補鎖上に位置し得る。
【００７６】
プロモーター：  本明細書で用いているように、「プロモーター」という用語は、転写の開始の上流にあり、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与し得るＤＮＡの領域を意味する。プロモーターは、細胞中の発現のためにコードポリヌクレオチドに作動可能に連結することができる、あるいはプロモーターは、細胞中の発現のためにコードポリヌクレオチドに作動可能に連結することができるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結することができる。「植物プロモーター」は、植物細胞中の転写を開始することができるプロモーターであり得る。発育制御下のプロモーターの例としては、葉、根、種子、繊維、木質導管、仮導管または厚膜組織等の特定の組織における転写を優先的に開始するプロモーター等がある。そのようなプロモーターは、「組織優先的」と呼ばれる。特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型特異的」プロモーターは、１つまたは複数の器官における特定の細胞型、例えば、根または葉における維管束細胞における発現を主として推進する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあり得るプロモーターであり得る。誘導性プロモーターにより転写を開始させ得る環境条件の例としては、嫌気性条件および光の存在等がある。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的および誘導性プロモーターは、「非構成性」プロモーターのクラスを構成する。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境条件下またはほとんどの組織もしくは細胞型で活性であり得るプロモーターである。
【００７７】
任意の誘導性プロモーターを本発明のいくつかの実施形態で用いることができる。Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366を参照のこと。誘導性プロモーターにより、転写の速度は、誘導剤に応答して増大する。例示的な誘導性プロモーターは、銅に応答するＡＣＥＩシステムに由来するプロモーター；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシに由来するＩｎ２遺伝子；Ｔｎ１０のＴｅｔレプレッサー；およびその転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導され得る（Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421）、ステロイドホルモン遺伝子に由来する誘導性プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００７８】
例示的な構成性プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター等の、植物ウイルスに由来するプロモーター；イネアクチン遺伝子に由来するプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；およびＡＬＳプロモーター、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５‘側のＸｂａｌ／ＮｃｏＩ断片（または前記Ｘｂａｌ／ＮｃｏＩ断片と類似のポリヌクレオチド）（国際ＰＣＴ公開国際公開第９６／３０５３０号パンフレット）を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
さらに、あらゆる組織特異的または組織優先的プロモーターは、本発明のいくつかの実施形態で用いることができる。組織特異的プロモーターに作動可能に連結したコードポリヌクレオチドを含む核酸分子を用いて形質転換した植物は、特定の組織において、もっぱら、または優先的にコードポリヌクレオチドの産物を産生し得る。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターは、インゲンマメ属に由来するもの等の、種子優先的プロモーター；キャブまたはルビスコに由来するもの等の葉特異的および光誘導性プロモーター；ＬＡＴ５２に由来するもの等の葯特異的プロモーター；Ｚｍ１３に由来するもの等の花粉特異的プロモーター；およびａｐｇに由来するもの等の小胞子優先的プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００８０】
ダイズ植物：  本明細書で用いているように、「ダイズ植物」という用語は、ダイズ属種（Glycine sp.）の植物、例えば、ダイズ（G. max）を意味する。
【００８１】
形質転換：  本明細書で用いているように、「形質転換」または「形質導入」という用語は、細胞への１つまたは複数の核酸分子（複数可）の移入を意味する。核酸分子の細胞ゲノムへの取込みにより、またはエピソーム複製により、核酸分子が細胞により安定に複製されるようになる場合、細胞は、細胞に形質導入された核酸分子によって「形質転換」される。本明細書で用いているように、「形質転換」という用語は、核酸分子をそのような細胞に導入することができるすべての技術を含む。例は、ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3）；リポフェクション（Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）；マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）；直接ＤＮＡ取込み；および微粒子銃（Klein et al. (1987) Nature 327:70）を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
導入遺伝子：  外因性核酸。いくつかの例において、導入遺伝子は、半翅目害虫に見いだされる核酸分子と相補的であるポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡの１つまたは両方の鎖（複数可）をコードするＤＮＡであり得る。さらなる例において、導入遺伝子は、アンチセンスポリヌクレオチドであり得、アンチセンスポリヌクレオチドの発現は、標的核酸の発現を阻害し、それにより、親ＲＮＡｉ表現型をもたらす。またさらなる例において、導入遺伝子は、遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子、産業的または薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業的形質をコードする遺伝子）であり得る。これらおよび他の例において、導入遺伝子は、導入遺伝子のコードポリヌクレオチド（例えば、プロモーター）と作動可能に連結した調節エレメントを含み得る。
【００８３】
ベクター：  例えば、形質転換細胞を生産するために細胞に導入する核酸分子。ベクターは、複製起点等の、宿主細胞中で複製することを可能にする遺伝エレメントを含み得る。ベクターの例は、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、または外因性ＤＮＡを細胞内に運ぶウイルスを含むが、これらに限定されない。ベクターは、アンチセンス分子、ならびに／または選択可能マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝エレメントを生産するものを含む、１つまたは複数の遺伝子も含み得る。ベクターは、細胞を形質導入、形質転換または感染させ、それにより、ベクターによりコードされる核酸分子および／またはタンパク質を細胞に発現させる。ベクターは、細胞への核酸分子の侵入を達成することを促進する物質を場合によって含む（例えば、リポソーム、タンパク質コーティング等）。
【００８４】
収量：  同時に同じ条件下で成長する同じ成長場所における基準品種の収量と比べて約１００％またはそれ以上の安定化収量。特定の実施形態では、「収量向上」または「収量の向上」は、栽培品種が、同時に同じ条件下で成長する当作物に害であり、本明細書における組成物および方法により標的にされる、著しい密度の半翅目害虫を含む同じ成長場所における基準品種の収量と比べて１０５％またはそれ以上の安定化収量を有することを意味する。
【００８５】
特に示さないまたは黙示しない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、本明細書で用いているように、「少なくとも１つ」を意味する。
【００８６】
特に説明しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、例えば、Lewin’s Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびMeyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見いだすことができる。特に示さない限り、すべての百分率は、重量によるものであり、すべての溶媒の混合割合は、容積によるものである。すべての温度は、摂氏温度である。
【００８７】
ＩＶ．半翅目害虫ポリヌクレオチドを含む核酸分子
Ａ．概要
本明細書で述べるのは、半翅目害虫の防除に有用な核酸分子である。述べる核酸分子は、標的ポリヌクレオチド（例えば、天然遺伝子および非コードポリヌクレオチド）、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｈｐＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む。例えば、半翅目害虫における１つまたは複数の天然核酸のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であり得るｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子をいくつかの実施形態で述べる。これらおよびさらなる実施形態では、天然核酸（複数可）は、１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）であり得、その産物は、例えばかつ制限なしに、生殖過程に関与または若虫の発育に関与し得る。本明細書で述べる核酸分子は、核酸分子が特異的に相補的である少なくとも１つの天然核酸（複数可）を含む細胞に導入される（例えば、親からの伝達により）場合、細胞中でＲＮＡｉを開始し、その後、天然核酸（複数可）の発現を低減または排除し得る。いくつかの例において、それに特異的に相補的な核酸分子による標的遺伝子の発現の低減または排除は、半翅目害虫における生殖、ならびに／または害虫の子孫における成長、発育、および／もしくは摂食の停止をもたらし得る。これらの方法は、例えば、ｉＲＮＡ分子に接触する害虫（複数可）の死亡を直接的にもたらさずに、外寄生に際しての害虫の次世代の構成数を著しく減少させ得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、半翅目害虫における少なくとも１つの標的遺伝子を選択することができ、標的遺伝子は、ｋｒｕｐｐｅｌポリヌクレオチドを含む。特定の例において、配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかのうちから選択されるポリヌクレオチドを含む、半翅目害虫における標的遺伝子が選択される。
【００８９】
他の実施形態では、標的遺伝子は、ｋｒｕｐｐｅｌポリヌクレオチドのタンパク質産物（すなわち、ＫＲＵＰＰＥＬポリペプチド）のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一（例えば、少なくとも８４％、８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％または１００％同一）である連続したアミノ酸配列を含むポリペプチドにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで逆翻訳することができるポリヌクレオチドを含む核酸分子であり得る。標的遺伝子は、例えば、害虫からの保護効果を植物にもたらすための、その転写後阻害が生存能力のある子孫を産む害虫の能力に対する有害な影響を有する、半翅目害虫における核酸であり得る。特定の例において、標的遺伝子は、配列番号２のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ翻訳産物であるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、約１００％または１００％同一である連続したアミノ酸配列を含むポリペプチドにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで逆翻訳することができるポリヌクレオチドを含む核酸分子である。
【００９０】
いくつかの実施形態で提供するのは、その発現が、半翅目害虫におけるコードポリヌクレオチドによりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部と特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子をもたらす、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、発現ＲＮＡ分子の半翅目害虫による摂取の後、害虫の細胞中または害虫の子孫の細胞中のコードポリヌクレオチドの下方制御を得ることができる。特定の実施形態では、半翅目害虫の細胞中のコードポリヌクレオチドの下方制御は、害虫における生殖および／または増殖、ならびに／または害虫の子孫における成長、発育、および／もしくは摂食の低減または停止をもたらし得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、標的半翅目害虫遺伝子の５’ＵＴＲ；３’ＵＴＲ；スプライスリーダー；イントロン；アウトロン（例えば、トランススプライシングでその後修飾される５’ＵＴＲ  ＲＮＡ）；ドナトロン（トランススプライシングのためのドナー配列を提供するのに必要な非コードＲＮＡ）等の転写非コードＲＮＡおよび他の非コード転写ＲＮＡを含む。そのようなポリヌクレオチドは、モノシストロン性およびポリシストロン性遺伝子の両方に由来し得る。
【００９２】
したがって、いくつかの実施形態に関連して半翅目害虫における標的核酸のすべてまたは一部に対して特異的に相補的である少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）についても本明細書で述べる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、複数の標的核酸、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の標的核酸のすべてまたは一部と相補的であるポリヌクレオチド（複数可）を含み得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、植物または細菌等の遺伝子組換え生物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで産生され得る。半翅目害虫における標的核酸のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であるｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子および／またはｈｐＲＮＡ分子の産生に用いることができるｃＤＮＡも開示する。特定の宿主標的の安定な形質転換を達成するのに用いる組換えＤＮＡ構築物をさらに述べる。形質転換宿主標的は、組換えＤＮＡ構築物から有効レベルのｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子を発現し得る。植物細胞中で機能し得る異種プロモーターに作動可能に連結した、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクターについても述べるものであり、該ポリヌクレオチド（複数可）の発現により、半翅目害虫における標的核酸のすべてまたは一部に特異的に相補的である連続した核酸塩基の連なりを含むＲＮＡ分子が結果として生じる。
【００９３】
特定の実施形態において、半翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、ｋｒｕｐｐｅｌポリヌクレオチド（例えば、配列番号１）を含むエウスキスツス属（Euschistus）から単離された天然核酸のすべてまたは一部；発現したとき、ｋｒｕｐｐｅｌによりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてもしくは一部と特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子をもたらすＤＮＡ；ｋｒｕｐｐｅｌによりコードされるＲＮＡ分子のすべてもしくは一部と特異的に相補的である少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）；ｋｒｕｐｐｅｌによりコードされるＲＮＡ分子のすべてもしくは一部と特異的に相補的であるｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子および／またはｈｐＲＮＡ分子の産生に用いることができるｃＤＮＡ；ならびに形質転換宿主標的が１つまたは複数の前述の核酸分子を含む、特定の宿主標的の安定な形質転換を達成するのに用いる組換えＤＮＡ構築物を含み得る。
【００９４】
Ｂ．核酸分子
本発明は、とりわけ、半翅目害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子；ならびに半翅目害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子発現を阻害するために細胞もしくは微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができるＤＮＡ分子を提供する。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１９個の連続したヌクレオチド）の断片（例えば、配列番号３および配列番号４）；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含む半翅目生物（例えば、ＢＳＢ）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１を含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの相補体；配列番号１を含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１を含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のポリヌクレオチド（複数可）を含む単離核酸分子を提供する。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドの半翅目害虫との接触またはそれによる摂取は、害虫の成長、発育、生殖および／または摂食を抑制する。
【００９６】
他の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号１５；配列番号１５の相補体；配列番号１６；配列番号１６の相補体；配列番号１７；配列番号１７の相補体；配列番号１５〜配列番号１７のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１５〜配列番号１７のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含む遺伝子から半翅目生物において転写された天然ポリリボヌクレオチド；配列番号１を含む遺伝子から半翅目生物において転写された天然ポリリボヌクレオチドの相補体；配列番号１を含む遺伝子から半翅目生物において転写された天然ポリリボヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１を含む遺伝子から半翅目生物において転写された天然ポリリボヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のポリヌクレオチド（複数可）を含み得る。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドの半翅目害虫との接触またはそれによる摂取は、害虫の成長、発育、生殖および／または摂食を抑制する。
【００９７】
代替的実施形態では、本発明の核酸分子は、半翅目害虫の細胞、組織または器官における標的遺伝子発現を阻害するように細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができる少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のＤＮＡ（複数可）を含み得る。そのようなＤＮＡ（複数可）は、ｄｓＲＮＡ分子（複数可）を形成することができるコード化ＲＮＡの転写を開始または増大させるようにＤＮＡ分子を含む細胞中で機能するプロモーターに作動可能に連結させることができる。一実施形態では、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のＤＮＡ（複数可）は、配列番号１のポリヌクレオチドに由来し得る。配列番号１の誘導体は、配列番号１の断片を含む。いくつかの実施形態では、そのような断片は、例えば、配列番号１の少なくとも約１５個の連続したヌクレオチド、またはその相補体を含み得る。したがって、そのような断片は、例えば、配列番号１の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００個またはそれ以上の連続したヌクレオチド、またはその相補体を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような断片は、例えば、配列番号１の少なくとも１９個の連続したヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の連続したヌクレオチド）、またはその相補体を含み得る。
【００９８】
いくつかの実施形態は、部分的または完全に安定化したｄｓＲＮＡ分子を半翅目害虫に導入して、半翅目害虫の細胞、組織または器官における標的遺伝子の発現を抑制することを含む。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）として発現させ、半翅目害虫により取り込ませた場合、配列番号１（たとえば、配列番号３および配列番号４）およびその相補体の１つまたは複数の断片を含むポリヌクレオチドは、死、発育停止、成長阻害、性比の変化、一腹子数の減少、半翅目害虫による感染の停止および／または摂食の停止の１つまたは複数をもたらし得る。特定の例において、配列番号１およびその相補体の１つまたは複数の断片を含むポリヌクレオチド（例えば、約１５〜約３００個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）は、害虫の次世代を産む害虫の現存世代の能力の低下をもたらす。
【００９９】
特定の実施形態では、本発明により提供されるｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１を含む標的遺伝子からの転写物に相補的なポリヌクレオチドおよび／または配列番号１の断片に相補的なポリヌクレオチドを含み、半翅目害虫におけるその標的遺伝子の阻害は、害虫または害虫の子孫の成長、発育または他の生物学的機能に必須であるポリペプチドまたはポリヌクレオチド物質の減少または除去をもたらす。選択されるポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号１の連続した断片または前述のもののいずれかの相補体との約８０％〜約１００％の配列同一性を示し得る。例えば、選択されるポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号１の連続した断片または前述のもののいずれかの相補体との７９％；８０％；約８１％；約８２％；約８３％；約８４％；約８５％；約８６％；約８７％；約８８％；約８９％；約９０％；約９１％；約９２％；約９３％；約９４％；約９５％；約９６％；約９７％；約９８％；約９８．５％；約９９％；約９９．５％；または約１００％の配列同一性を示し得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現を阻害するように細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができるＤＮＡ分子は、１つまたは複数の標的半翅目害虫種に見いだされる天然ポリヌクレオチドのすべてまたは一部に特異的に相補的である単一ポリヌクレオチドを含み得る。あるいは該ＤＮＡ分子は、複数のそのような特異的に相補的ポリヌクレオチドからキメラとして構築することができる。
【０１０１】
他の実施形態では、核酸分子は、「リンカー」により分離された第１および第２のポリヌクレオチドを含み得る。リンカーは、これが望ましい場合、第１および第２のポリヌクレオチドの間の二次構造の形成を促進するヌクレオチドの任意の配列を含む領域であり得る。一実施形態では、リンカーは、ｍＲＮＡのセンスまたはアンチセンスコードポリヌクレオチドの一部である。リンカーは、代わりになるべきものとして、核酸分子と共有結合することができるヌクレオチドまたはそのホモログの任意の組合せを含み得る。いくつかの例において、リンカーは、イントロン（例えば、ＳＴ−ＬＳ１イントロンとして）を含み得る。
【０１０２】
例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、異なるＲＮＡ分子のそれぞれが第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、第１および第２のポリヌクレオチドが互いに相補的である、１つまたは複数の異なるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含み得る。第１および第２のポリヌクレオチド配列は、スペーサーによりＲＮＡ分子内でつなぐことができる。スペーサーは、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドの一部を構成し得る。第１および第２のヌクレオチドポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子の発現は、第１および第２のヌクレオチドポリヌクレオチドの特異的な分子内塩基対合による、本発明のｄｓＲＮＡ分子の形成をもたらし得る。第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドは、半翅目害虫に固有のポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子もしくは転写非コードポリヌクレオチド）、その誘導体またはそれと相補的なポリヌクレオチドと実質的に同一であり得る。
【０１０３】
ｄｓＲＮＡ核酸分子は、重合リボヌクレオチドの二本鎖を含み、リン酸−糖主鎖またはヌクレオシドの修飾を含み得る。ＲＮＡ構造の修飾は、特異的阻害を可能にするように調整することができる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を生成することができるように、ｄｓＲＮＡ分子をユビキタス酵素法により修飾することができる。この酵素法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、真核生物におけるＤＩＣＥＲ等のＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ酵素を利用し得る。Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-8;およびHamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2を参照のこと。ＤＩＣＥＲまたは機能的に同等のＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素は、より大きいｄｓＲＮＡ鎖および／またはｈｐＲＮＡ分子を、それぞれが長さが約１９〜２５ヌクレオチドである、より小さいオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）に切断する。これらの酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、２〜３ヌクレオチドの３’突出ならびに５’リン酸および３’ヒドロキシル末端を有する。ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素から生成されたｓｉＲＮＡ分子は、細胞中の一本鎖ＲＮＡに巻き戻され、分離される。ｓｉＲＮＡ分子は、次に標的遺伝子から転写されたＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、両ＲＮＡ分子は、その後、固有の細胞ＲＮＡ分解メカニズムにより分解される。このプロセスは、標的生物における標的遺伝子によりコードされるＲＮＡの効果的な分解または除去をもたらし得る。その結果は、標的遺伝子の転写後サイレンシングである。いくつかの実施形態では、異種核酸分子から内因性ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、半翅目害虫における標的遺伝子の下方制御を効果的に媒介し得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、分子間ハイブリダイゼーションによりｉｎ  ｖｉｖｏでｄｓＲＮＡ分子を形成することができる一本鎖ＲＮＡ分子に転写され得る少なくとも１種の非天然ポリヌクレオチドを含み得る。そのようなｄｓＲＮＡは、一般的に自己集合性であり、標的遺伝子の転写後阻害を達成するために半翅目害虫の栄養源に供給することができる。これらおよびさらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、それぞれが半翅目害虫における異なる標的遺伝子と特異的に相補的である、２種の非天然ポリヌクレオチドを含み得る。そのような核酸分子をｄｓＲＮＡ分子として、半翅目害虫に供給する場合、ｄｓＲＮＡ分子は、害虫における少なくとも２種の異なる標的遺伝子の発現を阻害する。
【０１０５】
Ｃ．核酸分子を得ること
半翅目害虫における様々なポリヌクレオチドは、ｉＲＮＡおよびｉＲＮＡをコードするＤＮＡ分子等の、本発明の核酸分子の設計のための標的として用いることができる。しかし、天然ポリヌクレオチドの選択は、簡単なプロセスではない。半翅目害虫における少数の天然ポリヌクレオチドのみが有効な標的となる。例えば、本発明の核酸分子により特定の天然ポリヌクレオチドを効果的に下方制御することができるかどうか、または特定の天然ポリヌクレオチドの下方制御が半翅目害虫の成長、生存能力、増殖および／または生殖に対する有害作用を有するかどうかは、確実に予測することはできない。それらから単離されたＥＳＴ等の、天然半翅目害虫ポリヌクレオチドの圧倒的大多数は、害虫の成長、生存能力、増殖および／または生殖に対する有害効果を有さない。半翅目害虫に対して有害作用を有し得る天然ポリヌクレオチドのどれが宿主植物におけるそのような天然ポリヌクレオチドと相補的な核酸分子を発現させ、宿主植物に害をもたらすことなく、摂食により害虫に対して有害作用をもたらすための組換え技術に用いることができるかどうかも予測できない。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子（例えば、半翅目害虫の宿主植物に供給するｄｓＲＮＡ分子）は、代謝または異化生化学的経路、細胞分裂、生殖、エネルギー代謝、若虫の発育、幼虫の発育、転写調節などに関与するポリペプチド等の、半翅目害虫の生殖および／または発育に必須のタンパク質またはタンパク質の一部をコードするｃＤＮＡを標的とするように選択される。本明細書で述べるように、その少なくとも１つのセグメントが標的有害生物の細胞中で産生されるＲＮＡの少なくとも実質的に同じセグメントと特異的に相補的である、１つまたは複数のｄｓＲＮＡを含む標的生物による（例えば注射又は局所的接触による）組成物の接触は、交配する、産卵する、または生存能力のある子孫を産むことの不全またはその能力の低下をもたらし得る。半翅目害虫に由来する、ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、害虫による外寄生に抵抗性の植物細胞を構築するために用いることができる。半翅目害虫の宿主植物（例えば、Ｚ．マイス（Z. mays）、Ｇ．マックス（G. max）およびワタ属種（Gossypium sp.））は、例えば、本明細書に提供する半翅目害虫に由来する１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むように形質転換を起こさせることができる。宿主に形質転換を起こさせたポリヌクレオチドは、形質転換宿主内の細胞または生体液中でｄｓＲＮＡ配列を形成する１つまたは複数のＲＮＡをコードし、ひいては害虫がトランスジェニック植物との栄養関係を結ぶ場合／時にｄｓＲＮＡを利用できるようにし得る。これは、害虫の細胞中の１つまたは複数の遺伝子の発現の抑制と、最終的に生殖および／または発育の阻害をもたらし得る。
【０１０７】
代替的実施形態では、半翅目害虫の成長、発育および生殖に本質的に関与する遺伝子を標的とする。本発明に用いる他の標的遺伝子は、例えば、半翅目害虫の生存能力、運動、移動、成長、発育、感染性および餌場の確定に重要な役割を果たすものを含み得る。したがって、標的遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子または転写因子であり得る。さらに、本発明に用いる天然半翅目害虫ポリヌクレオチドは、その機能が当業者に公知であり、そのポリヌクレオチドが標的半翅目害虫のゲノムにおける標的遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能である、植物、ウイルス、細菌または昆虫遺伝子のホモログ（例えば、オルソログ）から得ることもできる。ハイブリダイゼーションにより既知のヌクレオチド配列を有する遺伝子のホモログを同定する方法は、当業者に公知である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を生成するためのポリヌクレオチドを含む核酸分子を得る方法を提供する。１つのそのような実施形態は、（ａ）半翅目害虫におけるｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制時に１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）をそれらの発現、機能および表現型について解析するステップと、（ｂ）ｄｓＲＮＡ媒介抑制解析で生殖または発育表現型の変化（例えば、低下）を示す標的半翅目害虫のポリヌクレオチドまたはそのホモログのすべてもしくは一部を含むプローブによりｃＤＮＡまたはｇＤＮＡライブラリーを探査するステップと、（ｃ）プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定するステップと、（ｄ）ステップ（ｂ）で同定されたＤＮＡクローンを単離するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）で単離されたクローンを含むｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片の配列を決定するステップであって、配列決定された核酸分子がＲＮＡまたはそのホモログのすべてもしくは実質的な部分を含んでいるステップと、（ｆ）遺伝子、またはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのすべてもしくは実質的な部分を化学的に合成するステップとを含む。
【０１０９】
さらなる実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子の実質的な部分を生成するためのポリヌクレオチドを含む核酸断片を得る方法は、（ａ）標的半翅目害虫の天然ポリヌクレオチドの一部と特異的に相補的である第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを合成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローニングベクターに存在するｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ挿入断片を増幅するステップとを含み、増幅核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ分子の実質的な部分を含む。
【０１１０】
本発明の核酸は、多くのアプローチにより単離し、増幅し、または生成することができる。例えば、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子は、ｇＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリー、またはその一部から得られた標的ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または標的転写非コードポリヌクレオチド）のＰＣＲ増幅により得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、標的生物から抽出することができ、核酸ライブラリーは、当業者に公知の方法を用いてそれから作製することができる。標的生物から得られたｇＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、標的遺伝子のＰＣＲ増幅および配列決定に用いることができる。確認済みのＰＣＲ産物は、最小プロモーターによりセンスおよびアンチセンスＲＮＡを生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型として用いることができる。あるいは、核酸分子は、ホスホルアミダイト化学等の標準的な化学を用いる自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）モデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置）の使用を含む、多くの技術（例えば、Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214;およびAgrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423）のいずれかにより合成することができる。例えば、Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311；米国特許第４，９８０，４６０号明細書、第４，７２５，６７７号明細書、第４，４１５，７３２号明細書、第４，４５８，０６６号明細書および第４，９７３，６７９号明細書を参照のこと。ホスホロチオエート、ホスホルアミデート等の非天然主鎖基をもたらす代替の化学も用いることができる。
【０１１１】
本発明のＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子は、手動または自動化反応により当業者により化学的もしくは酵素的に、あるいはＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む細胞中でｉｎ  ｖｉｖｏで生成することができる。ＲＮＡは、部分または完全有機合成によっても生成することができ、任意の修飾リボヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素または有機合成により導入することができる。ＲＮＡ分子は、細胞ＲＮＡポリメラーゼまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）により合成することができる。ポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な発現構築物は、当技術分野で公知である。例えば、国際ＰＣＴ公開国際公開第０９７／３２０１６号パンフレットならびに米国特許第５，５９３，８７４号明細書、第５，６９８，４２５号明細書、第５，７１２，１３５号明細書、第５，７８９，２１４号明細書および第５，８０４，６９３号明細書を参照のこと。化学的にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素合成により合成されるＲＮＡ分子は、細胞に導入する前に精製することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィーまたはそれらの組合せにより混合物から精製することができる。あるいは、化学的にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素合成により合成されるＲＮＡ分子は、例えば、試料の処理による損失を避けるために、精製せずにまたは最小限の精製で用いることができる。ＲＮＡ分子は、保存のために乾燥するか、または水溶液に溶解することができる。溶液は、ｄｓＲＮＡ分子の二重らせん鎖のアニーリングおよび／または安定化を促進するための緩衝剤または塩を含んでいてもよい。
【０１１２】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、単一自己相補的ＲＮＡ鎖により、または２つの相補的ＲＮＡ鎖から形成させることができる。ｄｓＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏで１つまたは２つのＲＮＡ鎖の転写を媒介し得る。あるいはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を媒介するのにクローン化ＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。半翅目害虫における標的遺伝子の転写後阻害は、宿主の器官、組織もしくは細胞型における特異的転写（例えば、組織特異的プロモーターを用いることによる）；宿主における環境条件の刺激（例えば、感染、ストレス、温度および／または化学誘導物質に応答性である誘導性プロモーターを用いることによる）；および／または宿主の発育段階もしくは年齢における工学的転写（例えば、発育段階特異的プロモーターを用いることによる）により宿主標的化することができる。ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ鎖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで転写されるかどうかを問わず、ポリアデニル化され得るか、またはされ得ず、細胞の翻訳装置によりポリペプチドに翻訳されることができ得るか、またはでき得ない。
【０１１３】
Ｄ．組換えベクターおよび宿主細胞形質転換
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞または植物細胞）への導入のためのＤＮＡ分子であって、ＲＮＡへの発現ならびに半翅目害虫による摂取により、害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子の抑制を達成するポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子も提供する。したがって、いくつかの実施形態は、半翅目害虫における標的遺伝子発現を阻害するための植物細胞中でｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子として発現することができるポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供する。発現を開始または増大させるために、そのような組換え核酸分子は、１つまたは複数の調節エレメントを含んでいてもよく、調節エレメントは、ｉＲＮＡとして発現することができるポリヌクレオチドに作動可能に連結することができる。植物において遺伝子抑制分子を発現させる方法は、公知であり、本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いることができる。例えば、国際ＰＣＴ公開国際公開第０６／０７３７２７号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号明細書を参照のこと。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み得る。そのような組換えＤＮＡ分子は、摂取により半翅目害虫細胞における内因性標的遺伝子（複数可）の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードし得る。多くの実施形態では、転写ＲＮＡは、安定化構造で、例えば、ヘアピンならびにステムおよびループ構造として提供することができるｄｓＲＮＡ分子を形成し得る。
【０１１５】
他の実施形態では、ｄｓＲＮＡの１本の鎖は、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかを含む半翅目生物（例えば、ＢＳＢ）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかを含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの相補体；配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかを含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかを含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドによりコードされるＲＮＡと実質的に相同であるポリヌクレオチドからの転写により形成され得る。
【０１１６】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子は、少なくとも１つのプロモーターに対して、１つのポリヌクレオチドがセンス配向をなし、他のポリヌクレオチドがアンチセンス配向をなすように、少なくとも２つのポリヌクレオチドが配列し、センスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドが、例えば、約５から約１０００ヌクレオチドのスペーサーにより連結またはつながれている、コード領域を含み得る。スペーサーは、センスおよびアンチセンスポリヌクレオチド間のループを形成する可能性がある。センスポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドは、標的遺伝子（例えば、配列番号１を含むｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子）またはその断片によりコードされるＲＮＡと実質的に相同であり得る。しかし、いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、スペーサーを含まないｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードし得る。複数の実施形態では、センスコードポリヌクレオチドおよびアンチセンスコードポリヌクレオチドは、異なる長さであり得る。
【０１１７】
半翅目害虫に対する有害効果または半翅目害虫に対する植物保護効果を有すると同定されたポリヌクレオチドは、本発明の組換え核酸分子における適切な発現カセットの創製により発現ｄｓＲＮＡ分子に容易に取り込むことができる。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、標的遺伝子ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１および前述のもののいずれかの断片を含むｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子）によりコードされるＲＮＡに対応する第１のセグメントを選択し、このポリヌクレオチドを第１のセグメントに相同または相補的でない第２のセグメントスペーサー領域に連結し、これを、少なくとも一部が第１のセグメントと実質的に相補的である第３のセグメントに連結することにより、ステムおよびループ構造を有するヘアピンとして発現させることができる。そのような構築物は、第１のセグメントと第３のセグメントとの分子内塩基対合によりステムおよびループ構造を形成し、ループ構造が生じ、第２のセグメントを含む。例えば、米国特許出願公開第２００２／００４８８１４号明細書および第２００３／００１８９９３号明細書ならびに国際ＰＣＴ公開国際公開第９４／０１５５０号パンフレットおよび国際公開第９８／０５７７０号パンフレットを参照のこと。ｄｓＲＮＡ分子は、例えば、ステム−ループ構造（例えば、ヘアピン）等の二本鎖構造の形態で生成することができ、それにより、天然半翅目害虫ポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡの生成は、ｓｉＲＮＡの生成の増大をもたらす、またはｄｓＲＮＡヘアピンプロモーターの転写遺伝子サイレンシングを防ぐためにメチル化を低下させる、例えば、追加の植物発現性カセット上の標的遺伝子の断片の共発現により増大する。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態は、１つまたは複数のｉＲＮＡ分子の発現の半翅目害虫阻害レベルを達成するための植物への本発明の組換え核酸分子の導入（すなわち、形質転換）を含む。組換えＤＮＡ分子は、例えば、線状または閉環プラスミド等のベクターであり得る。ベクターシステムは、単一ベクターもしくはプラスミド、または宿主のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む２つ以上のベクターもしくはプラスミドであり得る。さらに、ベクターは、発現ベクターであり得る。本発明の核酸は、例えば、連結コードポリヌクレオチドまたは他のＤＮＡエレメントの発現を駆動するために１つまたは複数の宿主において機能する適切なプロモーターの制御下でベクターに適切に挿入することができる。多くのベクターがこの目的のために利用でき、適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズおよびベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に主として依存する。各ベクターは、その機能（例えば、ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する個々の宿主細胞に依存する様々な構成成分を含む。
【０１１９】
トランスジェニック植物に半翅目害虫からの保護を与えるために、例えば、組換えＤＮＡを組換え植物の組織または液内でｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ分子）に転写させることができる。ｉＲＮＡ分子は、宿主植物種に被害をもたらし得る半翅目害虫内部の対応する転写ポリヌクレオチドと実質的に相同であり、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み得る。半翅目害虫は、例えば、ｉＲＮＡ分子を含むトランスジェニック宿主植物の細胞または液を摂取することにより、トランスジェニック宿主植物の細胞中で転写されるｉＲＮＡ分子と接触し得る。したがって、標的遺伝子の発現は、トランスジェニック宿主植物に外寄生する半翅目害虫体内のｉＲＮＡ分子により抑制される。いくつかの実施形態では、標的半翅目害虫における標的遺伝子の発現の抑制は、害虫による攻撃に耐性のある植物をもたらし得る。
【０１２０】
本発明の組換え核酸分子により形質転換された植物細胞との栄養関係にある半翅目害虫へのｉＲＮＡ分子の送達を可能にするために、植物細胞中のｉＲＮＡ分子の発現（すなわち、転写）が必要である。したがって、組換え核酸分子は、核酸分子を増幅させる細菌細胞および核酸分子を発現させる植物細胞等の、宿主細胞中で機能する異種プロモーター配列等の１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結した本発明のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１２１】
本発明の核酸分子に用いるのに適するプロモーター配列は、すべてが当技術分野で周知である、誘導性、ウイルス、合成または構成性であるものを含む。そのようなプロモーターを記載している非限定的な例としては、米国特許第６，４３７，２１７号明細書（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；第５，６４１，８７６号明細書（イネアクチンプロモーター）；第６，４２６，４４６号明細書（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；第６，４２９，３６２号明細書（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；第６，２３２，５２６号明細書（トウモロコシＡ３プロモーター）；第６，１７７，６１１号明細書（構成性トウモロコシプロモーター）；第５，３２２，９３８号明細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６号明細書（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）；第６，４３３，２５２号明細書（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；第６，４２９，３５７号明細書（イネアクチン２プロモーターおよびイネアクチン２イントロン）；第６，２９４，７１４号明細書（光誘導性プロモーター）；第６，１４０，０７８号明細書（塩誘導性プロモーター）；第６，２５２，１３８号明細書（病原体誘導性プロモーター）；第６，１７５，０６０号明細書（リン欠乏誘導性プロモーター）；第６，３８８，１７０号明細書（二方向プロモーター）；第６，６３５，８０６号明細書（ガンマコイキシンプロモーター）；ならびに米国特許出願公開第２００９／７５７，０８９号明細書（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）等がある。追加のプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9）およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導プラスミド上で運ばれる）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター等のカリモウイルスプロモーター（Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24）；ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-2）；ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8）；スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8）；Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83）；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号明細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６号明細書）；ＦＭＶ  ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号明細書および第５，３７８，６１９号明細書）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号明細書）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号明細書）；およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｖ０００８７；Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7）等がある。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、葉特異的プロモーターまたは花粉特異的プロモーター等の組織特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本発明による半翅目害虫の防除のためのポリヌクレオチドまたは断片は、該ポリヌクレオチドまたは断片に対して反対の転写方向に配向した２つの組織特異的プロモーター間でクローニングされ得る。そして、それらは、トランスジェニック植物細胞中で作動可能であり、その中で発現して、上述のように、その後にｄｓＲＮＡ分子を形成し得るトランスジェニック植物細胞中のＲＮＡ分子を生成する。植物組織において発現したｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子発現の抑制が達成されるように半翅目害虫により摂取することができる。
【０１２３】
対象の核酸分子に任意選択的に作動可能に連結することができるさらなる調節エレメントとしては、プロモーターエレメントとコードポリヌクレオチドとの間に位置する翻訳リーダーエレメントとして機能する５’ＵＴＲ等がある。翻訳リーダーエレメントは、完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在し、それは、一次転写物のプロセシングおよび／またはＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例としては、トウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）、植物ウイルス外被タンパク質、植物ルビスコリーダーおよびその他等がある。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照のこと。５’ＵＴＲの非限定的な例としては、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号明細書）；ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）；ＡｔＡｎｔｌ；ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7）；およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｖ０００８７；およびBevan et al. (1983) Nature 304:184-7）等がある。
【０１２４】
対象の核酸分子に任意選択的に作動可能に連結することができる追加の調節エレメントとしては、３’非翻訳配列、３’転写終結領域またはポリアデニル化領域等もある。これらは、ポリヌクレオチドの下流に位置する遺伝エレメントであり、ポリアデニル化シグナル、および／または転写またはｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことができる他の調節シグナルをもたらすポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物においてｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすように機能する。ポリアデニル化エレメントは、様々な植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し得る。３’転写終結領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ３’領域（ｎｏｓ３’；Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）である。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80に示されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ｐｓ．ＲＢｃＳ２−Ｅ９；Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｅ０１３１２）からのもの等がある。
【０１２５】
いくつかの実施形態は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドに作動可能に連結した上述の調節配列の少なくとも１つを含む単離かつ精製ＤＮＡ分子を含む植物形質転換ベクターを含み得る。発現した場合、該１つまたは複数のポリヌクレオチドは、半翅目害虫における天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部と特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のＲＮＡ分子（複数可）を生じさせる。したがって、該ポリヌクレオチド（複数可）は、標的半翅目害虫ＲＮＡ転写物内に存在するポリヌクレオチドのすべてまたは一部をコードするセグメントを含み得、標的害虫転写物のすべてまたは一部の逆向き反復配列を含み得る。植物形質転換ベクターは、複数の標的ポリヌクレオチドに特異的に相補的なポリヌクレオチドを含み、それにより、標的半翅目害虫の１つまたは複数の集団または種の細胞中の２つ以上の遺伝子の発現を阻害するための複数のｄｓＲＮＡの生成を可能にし得る。異なる遺伝子に存在するポリヌクレオチドに特異的に相補的なポリヌクレオチドのセグメントは、トランスジェニック植物における発現のための単一複合核酸分子中に組み合わせることができる。そのようなセグメントは、連続していても、またはスペーサーにより分離されていてもよい。
【０１２６】
他の実施形態では、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド（複数可）を既に含む本発明のプラスミドは、同じプラスミドにおける追加のポリヌクレオチド（複数可）の逐次的挿入により修飾することができ、追加のポリヌクレオチド（複数可）は、最初の少なくとも１つのポリヌクレオチド（複数可）と同じ調節エレメントに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、複数の標的遺伝子の阻害のために設計することができる。いくつかの実施形態では、阻害される複数の遺伝子は、同じ半翅目害虫種から得ることができ、これにより、核酸分子の有効性が増大し得る。他の実施形態では、遺伝子は、異なる害虫（例えば、半翅目害虫）から得ることができ、これにより、作用物質（複数可）が有効である害虫の範囲が拡大し得る。複数の遺伝子を抑制または発現と抑制の組合せの標的とする場合、ポリシストロン性ＤＮＡエレメントを作製することができる。
【０１２７】
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、植物細胞等の形質転換細胞に選択可能な表現型を付与する選択可能マーカーを含み得る。選択可能マーカーは、本発明の組換え核酸分子を含む植物または植物細胞を選択するためにも用いることができる。マーカーは、殺生物剤抵抗性、抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン、ジェネチシン（Ｇ４１８）、ブレオマイシン、ハイグロマイシン等）または除草剤耐性（例えば、グリホセート等）をコードし得る。選択可能マーカーの例は、カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８等を用いて選択することができるｎｅｏ遺伝子；ビアラホス抵抗性をコードするｂａｒ遺伝子；グリホセート耐性をコードする突然変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を付与する突然変異アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子：およびメトトレキセート抵抗性ＤＨＦＲ遺伝子であり得るが、これらに限定されない。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリン等に対する抵抗性を付与する複数の選択可能マーカーが利用できる。そのような選択可能マーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号明細書、第５，６３３，４３５号明細書、第５，７８０，７０８号明細書および第６，１１８，０４７号明細書に示されている。
【０１２８】
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、スクリーニング可能マーカーも含み得る。スクリーニング可能マーカーは、発現をモニターするために用いることができる。例示的なスクリーニング可能マーカーとしては、様々な色原性基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードするＲ遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al. (1988) “Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.” In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp.263-82）；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41）；様々な色原性基質が公知である酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、色原性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow et al. (1986) Science 234:856-9）；色原性カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55）；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2）；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化し、これが次にメラニンに縮合することを可能にする酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14）；およびα−ガラクトシダーゼ等がある。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、上述の組換え核酸分子は、トランスジェニック植物の創製ならびに半翅目害虫に対する感受性の低下を示すトランスジェニック植物を調製するための植物における異種核酸の発現の方法に用いることができる。植物形質転換ベクターは、例えば、ｉＲＮＡ分子をコードする核酸分子を植物形質転換ベクターに挿入し、これらを植物に導入することによって調製することができる。
【０１３０】
宿主細胞の形質転換の適切な方法としては、例えば、プロトプラストの形質転換による（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号明細書参照）、乾燥／抑制媒介ＤＮＡ取込みによる（例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8参照）、エレクトロポレーションによる（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号明細書参照）、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌による（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号明細書および第５，４６４，７６５号明細書参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換による（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号明細書、第５，５９１，６１６号明細書、第５，６９３，５１２号明細書、第５，８２４，８７７号明細書、第５，９８１，８４０号明細書および第６，３８４，３０１号明細書参照）およびＤＮＡコーティング粒子の促進による（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号明細書、第５，５５０，３１８号明細書、第５，５３８，８８０号明細書、第６，１６０，２０８号明細書、第６，３９９，８６１号明細書および第６，４０３，８６５号明細書参照）等の、ＤＮＡを細胞に導入することができる方法等がある。コーンを形質転換するのにとりわけ有用な技術は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号明細書および第５，５９１，６１６号明細書ならびに国際ＰＣＴ公開国際公開第９５／０６７２２号パンフレットに記載されている。これらのような技術の適用により、事実上あらゆる種の細胞を安定に形質転換させることができる。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込む。多細胞種の場合、トランスジェニック細胞をトランスジェニック生物に再生することができる。これらの技術のいずれも、例えば、トランスジェニック植物のゲノムに１つまたは複数のｉＲＮＡ分子をコードする１つまたは複数の核酸を含むトランスジェニック植物を産生するのに用いることができる。
【０１３１】
発現ベクターを植物に導入するために最も広く用いられている方法は、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）の天然の形質転換システムに基づいている。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞に遺伝的に形質転換を起こさせる植物病原性土壌細菌である。それぞれＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、植物の遺伝的形質転換に関与する遺伝子を運ぶ。Ｔｉ（腫瘍誘導）プラスミドは、形質転換植物に転移する、Ｔ−ＤＮＡとして公知である大きいセグメントを含む。Ｔｉプラスミドの他のセグメントである、Ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ転移に関与する。Ｔ−ＤＮＡ領域は、末端反復配列に隣接する。修飾バイナリーベクターにおいて、腫瘍誘導遺伝子が欠失しており、Ｖｉｒ領域の機能は、Ｔ−ＤＮＡ境界エレメントが隣接する外来ＤＮＡを導入するために用いられる。Ｔ領域は、トランスジェニック細胞および植物の効率的な回収のための選択可能マーカー、ならびに核酸をコードするｄｓＲＮＡ等の導入のためのポリヌクレオチドを挿入するための多重クローニング部位も含み得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号明細書、第４，６９３，９７７号明細書、第４，８８６，９３７号明細書および第５，５０１，９６７号明細書ならびに欧州特許第０１２２７９１号明細書参照）またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＲｉプラスミドに由来する。追加の植物形質転換ベクターとしては、例えば、および制限なく、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7；Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42により；および欧州特許第０１２０５１６号明細書に記載されているもの、ならびに前述のもののいずれかに由来するもの等がある。天然で植物と相互作用するシノリゾビウム属（Sinorhizobium）、リゾビウム属（Rhizobium）およびメソリゾビウム属（Mesorhizobium）等の他の細菌を、多くの多様な植物への遺伝子導入を媒介するように修飾することができる。これらの植物関連共生細菌は、非病害性Ｔｉプラスミドおよび適切なバイナリーベクターの両方の獲得により遺伝子導入に適格にすることができる。
【０１３３】
外因性ＤＮＡをエント細胞に供給した後、形質転換細胞は、一般的にさらなる培養および植物再生のために同定される。形質転換細胞を同定する能力を改善するために、前述の選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を形質転換体を生成するために用いる形質転換ベクターとともに用いることを望むことができる。選択可能マーカーを用いる場合、細胞を選択剤または複数の選択剤に曝露することにより、形質転換細胞は、形質転換された可能性のある細胞集団内で同定される。スクリーニング可能マーカーを用いる場合、所望のマーカー遺伝子形質について細胞をスクリーニングすることができる。
【０１３４】
選択剤への曝露で生残している細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性と評価された細胞は、植物の再生を補助する培地中で培養することができる。いくつかの実施形態では、任意の適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）は、成長調節剤等のさらなる物質を含めることにより改良することができる。植物再生努力を開始するのに十分な組織が利用できるまで、または手作業による選択を反復した後、組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）、組織を成長調節剤を含む基礎培地上に維持し、その後、芽条形成を促す培地に移す。十分な芽条形成が起こるまで、培養物を定期的に移す。芽条が形成されたならば、それらを根形成を促す培地に移す。十分な根が形成されたならば、さらなる成長および成熟のために植物を土壌に移すことができる。
【０１３５】
再生植物における対象の核酸分子（例えば、半翅目害虫における標的遺伝子発現を抑制する１つまたは複数のｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ）の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイとしては、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲならびに核酸配列決定等の分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロット）によるまたは酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出等の生化学的アッセイ；葉部または根部アッセイ等の植物部位アッセイ；ならびに全再生植物の表現型の解析等がある。
【０１３６】
組込みイベントは、例えば、例えば対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅により解析することができる。ＰＣＲ遺伝子型決定は、ゲノムに組み込まれた対象の核酸分子を含むと予測された単離宿主植物カルス組織から得られたｇＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と、それに続くＰＣＲ増幅産物の標準クローニングおよび配列解析を含むが、これらに限定されないと理解される。ＰＣＲ遺伝子型決定の方法は、十分に記載され（例えば、Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53）、任意の植物種（例えば、Ｚ．マイス（Z. mays）、Ｇ．マックス（G. max）およびワタ属種（Gossypium sp.））または細胞培養物を含む組織型に由来するｇＤＮＡに適用することができる。
【０１３７】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）依存性形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、一般的に１つの染色体に挿入された単一組換えＤＮＡを含む。該単一組換えＤＮＡのポリヌクレオチドは、「トランスジェニックイベント」または「組込みイベント」と呼ばれる。そのようなトランスジェニック植物は、挿入外来ポリヌクレオチドに対して異型接合である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子に対して同型接合であるトランスジェニック植物は、単一外来遺伝子を含む独立分離トランスジェニック植物をそれ自体、例えば、Ｔ０植物と性的に交配（自殖）して、Ｔ１種子を産生することにより得ることができる。産生されたＴ１種子の４分の１は、導入遺伝子に対して同型接合となる。Ｔ１種子を発芽させることにより、一般的に異型接合体と同型接合体との区別を可能にするＳＮＰアッセイまたは熱増幅アッセイ（すなわち、接合性アッセイ）を用いて異型接合性について試験することができる植物が得られる。
【０１３８】
特定の実施形態では、半翅目害虫阻害効果を有する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０種またはそれ以上の異なるｉＲＮＡ分子が植物細胞中で産生される。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、異なる形質転換イベントで導入された複数の核酸から、または単一形質転換イベントで導入された単一核酸から発現させることができる。いくつかの実施形態では、複数のｉＲＮＡ分子が単一プロモーターの制御下で発現する。他の実施形態では、複数のｉＲＮＡ分子が複数のプロモーターの制御下で発現する。半翅目害虫の同じ種の異なる集団、あるいは半翅目害虫の異なる種の両方において、１つもしくは複数の半翅目害虫内部の異なる遺伝子座（例えば、配列番号１で定義される遺伝子座）に対してそれぞれ相同である複数のポリヌクレオチドを含む単一ｉＲＮＡ分子を発現させることができる。
【０１３９】
組換え核酸分子による植物の直接形質転換に加えて、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第１の植物をそのようなイベントを欠いている第２の植物と交配することにより、トランスジェニック植物を作製することができる。例えば、ｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を形質転換に適用できる第１の植物系統に導入して、トランスジェニック植物を産生することができ、そのトランスジェニック植物を第２の植物系統と交配して、ｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを第２の植物系統に移入することができる。
【０１４０】
本発明はまた、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む商品生産物を含む。特定の実施形態は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組換え植物または種子から生産された商品生産物を含む。本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む商品生産物は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、植物の粗びき粉、油、粉砕もしくは全粒または種子、あるいは組換え植物または種子の粗びき粉、油、または粉砕もしくは全粒を含む食品を含むと思われるが、これらに限定されないものとする。ここで企図した１つまたは複数の一次産品または商品生産物中の本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドの検出は、一次産品または商品生産物が、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制法を用いて植物害虫を防除する目的のために本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現するように設計されたトランスジェニック植物から生産されるという事実上の証拠である。
【０１４１】
いくつかの態様では、形質転換植物細胞から得られたトランスジェニック植物により生産された種子および商品生産物が含まれ、種子または商品生産物は、検出可能な量の本発明の核酸を含む。いくつかの実施形態では、そのような商品生産物は、例えば、トランスジェニック植物を得て、それらから食品または飼料を調製することによって生産することができる。本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む商品生産物としては、例えば、および制限なく、本発明の１つまたは複数の核酸を含む、植物の粗びき粉、油、粉砕もしくは全粒または種子、ならびに組換え植物または種子の粗びき粉、油、または粉砕もしくは全粒を含むあらゆる食品等がある。１つまたは複数の一次産品または商品生産物中の本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドの検出は、一次産品または商品生産物が、半翅目害虫を防除する目的のために本発明の１つまたは複数のｉＲＮＡ分子を発現するように設計されたトランスジェニック植物から生産されるという事実上の証拠である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子を含むトランスジェニック植物または種子は、制限なく、以下を含む、そのゲノムに少なくとも１つの他のトランスジェニックイベントも含み得る配列番号１により定義されるもの以外の半翅目害虫における遺伝子座を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；半翅目害虫以外の生物（例えば、植物寄生線虫）における遺伝子を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；殺虫タンパク質（例えば、バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホセートに対する耐性を与える遺伝子）；ならびに収量の増加、脂肪酸代謝の変化または細胞質雄性不稔性の回復等のトランスジェニック植物における望ましい表現型に寄与する遺伝子。特定の実施形態では、植物病害および昆虫被害の防除の増大のための所望の形質を達成するために本発明のｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを植物における他の昆虫防除および病害抵抗性形質と組み合わせることができる。異なる作用機序を用いる昆虫防除形質を組み合わせることは、単一の防除形質を有する植物と比べて優れた耐久性を有する保護トランスジェニック植物をもたらし得る。その理由は、例えば、形質（複数可）に対する抵抗性が圃場で起こる可能性が低いためである。
【０１４３】
Ｖ．半翅目害虫における標的遺伝子の抑制
Ａ．概要
本発明のいくつかの実施形態では、半翅目害虫の防除に有用な少なくとも１つの核酸分子を半翅目害虫に与えることができ、核酸分子は、害虫（複数可）におけるＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングをもたらす。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）を半翅目害虫宿主に与えることができる。いくつかの実施形態では、半翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、核酸分子を害虫と接触させることによって害虫に与えることができる。これらおよびさらなる実施形態では、半翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、害虫の給餌基体、例えば、栄養組成物に加えることができる。これらおよびさらなる実施形態では、半翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、害虫（複数可）により摂取される核酸分子を含む植物物質の摂取により与えることができる。特定の実施形態では、核酸分子は、植物物質に導入された組換え核酸の発現により、例えば、組換え核酸を含むベクターによる植物細胞の形質転換および形質転換植物細胞からの植物物質または全植物の再生により、植物物質中に存在する。
【０１４４】
Ｂ．ＲＮＡｉ媒介遺伝子抑制
特定の実施形態では、本発明は、例えば、標的ポリヌクレオチドと特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの鎖を含むｉＲＮＡ分子を設計することにより、半翅目（例えば、ＢＳＢ）害虫のトランスクリプトームにおける必須天然ポリヌクレオチド（例えば、必須遺伝子）を標的とするように設計することができるｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）を提供する。そのように設計されたｉＲＮＡ分子の配列は、標的ポリヌクレオチドと同一であり得るか、あるいはｉＲＮＡ分子とその標的ポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを妨げないミスマッチを取り込み得る。
【０１４５】
本発明のｉＲＮＡ分子を半翅目害虫における遺伝子抑制の方法に用い、それにより、植物（例えば、ｉＲＮＡ分子を含む保護形質転換植物）おける害虫によってもたらされる被害のレベルまたは発生率を低下させることができる。本明細書で用いているように、「遺伝子抑制」という用語は、発現の転写後抑制および転写抑制を含む遺伝子またはコードポリヌクレオチドからのタンパク質発現の低下を含む、ｍＲＮＡへの遺伝子転写およびｍＲＮＡのその後の翻訳の結果として産生されるタンパク質のレベルを低下させる周知の方法のいずれかを意味する。転写後抑制は、抑制の標的とする遺伝子から転写されたｍＲＮＡのすべてまたは一部と抑制のために用いる対応するｉＲＮＡ分子との間の特異的相同性によって媒介される。さらに、転写後抑制は、リポソームによる結合のために細胞中で利用できるｍＲＮＡの量の実質的かつ測定可能な低下を意味する。
【０１４６】
ｉＲＮＡ分子がｄｓＲＮＡ分子であるいくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、酵素であるＤＩＣＥＲによって短いｓｉＲＮＡ分子（長さが約２０ヌクレオチド）に切断され得る。ｄｓＲＮＡ分子に対するＤＩＣＥＲ活性により生じた二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、２つの一本鎖ｓｉＲＮＡ、すなわち「パッセンジャー鎖」と「ガイド鎖」に分離され得る。パッセンジャー鎖は、分解することができ、ガイド鎖は、ＲＩＳＣに取り込むことができる。転写後抑制は、ガイド鎖とｍＲＮＡ分子の特異的に相補的なポリヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションおよびその後のアルゴノート（ＲＩＳＣ複合体の触媒構成成分）酵素による切断によって起こる。
【０１４７】
本発明の他の実施形態では、あらゆる形態のｉＲＮＡ分子を用いることができる。当業者は、ｄｓＲＮＡ分子が、調製中および細胞にｉＲＮＡ分子を供給するステップ中に一般的に一本鎖ＲＮＡ分子よりも安定であり、細胞中でも一般的により安定であることを理解するであろう。したがって、例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子は、いくつかの実施形態では同等に有効であり得るが、ｄｓＲＮＡ分子をその安定性のため選択することができる。
【０１４８】
特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させて、半翅目害虫のゲノム内のポリヌクレオチドによりコードされる核酸分子と実質的に相同であるｉＲＮＡ分子を生成することができる、ポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｉＲＮＡ分子は、ステム−ループ構造を含む安定化ｄｓＲＮＡ分子であり得る。半翅目害虫がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｉＲＮＡ分子と接触した後、害虫における標的遺伝子（例えば、必須遺伝子）の転写後阻害が起こり得る。
【０１４９】
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１９個の連続したヌクレオチド）を含む核酸分子からのｉＲＮＡの発現を半翅目害虫における標的遺伝子の転写後阻害のための方法に用いる。ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片（たとえば、配列番号３および配列番号４）；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかを含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかを含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの相補体；配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかを含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、および配列番号１、配列番号３および配列番号４のいずれかを含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される。特定の実施形態では、前述のもののいずれかと少なくとも約８０％同一（例えば、７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％および１００％）である核酸分子の発現を用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、半翅目害虫の少なくとも１つの細胞中に存在するＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。
【０１５０】
ＲＮＡｉ転写後抑制システムが、遺伝子突然変異、系統多型または進化的分岐のため予想され得る標的遺伝子における配列変動に耐えることができることは、本明細書におけるいくつかの実施形態の重要な特徴である。導入される核酸分子が標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズされる限り、導入される核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと絶対的に相同である必要はあり得ない。さらに、導入される核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡに対して、全長である必要はあり得ない。
【０１５１】
本発明のｉＲＮＡ技術を用いる標的遺伝子の阻害は、配列特異的である。すなわち、ｉＲＮＡ分子（複数可）と実質的に相同のポリヌクレオチドは、遺伝的阻害の標的となる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を阻害のために用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、標的ポリヌクレオチドと比べて１つまたは複数の挿入、欠失および／または点突然変異を有するポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を用いることができる。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子と標的遺伝子の一部は、例えば、少なくとも約８０％以上、少なくとも約８１％以上、少なくとも約８２％以上、少なくとも約８３％以上、少なくとも約８４％以上、少なくとも約８５％以上、少なくとも約８６％以上、少なくとも約８７％以上、少なくとも約８８％以上、少なくとも約８９％以上、少なくとも約９０％以上、少なくとも約９１％以上、少なくとも約９２％以上、少なくとも約９３％以上、少なくとも約９４％以上、少なくとも約９５％以上、少なくとも約９６％以上、少なくとも約９７％以上、少なくとも約９８％以上、少なくとも約９９％以上、少なくとも約１００％以上、および１００％の配列同一性を共有し得る。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の二重らせん領域は、標的遺伝子転写物の一部と特異的にハイブリダイズ可能であり得る。特異的にハイブリダイズ可能な分子において、より大きい相同性を示す全長に満たないポリヌクレオチドは、より長く、より低い相同性のポリヌクレオチドを補う。標的遺伝子転写物の一部と同一であるｄｓＲＮＡ分子の二重らせん領域のポリヌクレオチドの長さは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００または少なくとも約１０００塩基であり得る。いくつかの実施形態では、２０〜１００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチドを用いることができ、例えば、１００〜２００または３００〜５００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを用いることができる。特定の実施形態では、約２００〜３００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチドを用いることができる。特定の実施形態では、標的遺伝子のサイズによって、約５００〜１０００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチドを用いることができる。
【０１５２】
特定の実施形態では、半翅目害虫における標的遺伝子の発現は、著しい抑制が起こるように、害虫の細胞内で少なくとも１０％、少なくとも３３％、少なくとも５０％、または少なくとも８０％抑制され得る。著しい抑制は、検出可能な表現型をもたらす閾値を超える抑制（例えば、生殖、摂食、発育等の停止）、あるいはＲＮＡの検出可能な減少および／または標的遺伝子に対応する遺伝子産物が抑制されることを意味する。本発明の特定の実施形態では、抑制は、害虫の実質的にすべての細胞で起こるが、他の実施形態では、抑制は、標的遺伝子を発現する細胞のサブセットでのみ起こる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、転写抑制は、「プロモータートランス抑制」と呼ばれることを達成するように、プロモーターＤＮＡまたはその相補体との実質的な配列同一性を示すｄｓＲＮＡ分子の細胞中の存在によって媒介される。遺伝子抑制は、例えば、ｄｓＲＮＡ分子を含む植物物質を摂取またはそれと接触することにより、そのようなｄｓＲＮＡ分子を摂取またはそれと接触し得る半翅目害虫における標的遺伝子に対して有効であり得る。プロモータートランス抑制に用いるｄｓＲＮＡ分子は、半翅目害虫の細胞中の１つまたは複数の相同または相補的ポリヌクレオチドの発現を阻害または抑制するように特別に設計することができる。植物細胞における遺伝子発現を調節するためのアンチセンスまたはセンス配向ＲＮＡによる転写後遺伝子抑制は、米国特許第５，１０７，０６５号明細書、第５，７５９，８２９号明細書、第５，２８３，１８４号明細書および第５，２３１，０２０号明細書に開示されている。
【０１５４】
Ｃ．半翅目害虫に与えるＲＮＡｉ分子の発現
半翅目害虫におけるＲＮＡｉ媒介遺伝子抑制のためのｉＲＮＡ分子の発現は、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ方式のいずれか１つにより行うことができる。ｉＲＮＡ分子は、次に、例えば、ｉＲＮＡ分子を害虫と接触させることにより、または害虫にｉＲＮＡ分子を摂取もしくは別の方法でインターナリゼーションさせることにより、半翅目害虫に与えることができる。本発明のいくつかの実施形態は、半翅目害虫の形質転換宿主植物、形質転換植物細胞ならびに形質転換植物の子孫を含む。形質転換植物細胞および形質転換植物は、害虫保護効果をもたらすために、例えば、異種プロモーターの制御下で１つまたは複数のｉＲＮＡ分子を発現するように工学的に操作することができる。したがって、形質転換植物および植物細胞が摂食時に半翅目害虫により消費される場合、害虫は、トランスジェニック植物または細胞において発現したｉＲＮＡ分子を摂取し得る。本発明のポリヌクレオチドは、様々な原核および真核微生物宿主に導入して、ｉＲＮＡ分子を生成することもできる。「微生物」という用語は、細菌および菌類等の原核および真核種を含む。
【０１５５】
遺伝子発現の調節は、そのような発現の部分的または完全な抑制を含み得る。他の実施形態では、半翅目害虫における遺伝子発現の抑制の方法は、その少なくとも１つのセグメントが半翅目害虫の細胞内のｍＲＮＡ配列と相補的である、本明細書で述べたポリヌクレオチドの転写後に形成された遺伝子抑制量の少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子を害虫の宿主の組織に供給することを含む。本発明による半翅目害虫により摂取されるｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子等のその改変型を含む、ｄｓＲＮＡ分子は、例えば、配列番号１、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むｋｒｕｐｐｅｌＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。したがって、それらに導入された場合、半翅目害虫における内因性コードポリヌクレオチドまたは標的コードポリヌクレオチドの発現を抑制または阻害する、本発明のｄｓＲＮＡ分子を得るための非天然ポリヌクレオチドおよび組換えＤＮＡ構築物を含むが、これらに限定されない単離され、実質的に精製された核酸分子を提供する。
【０１５６】
特定の実施形態は、半翅目植物害虫における１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）の転写後阻害ならびに植物害虫の集団の防除のためのｉＲＮＡ分子の送達のための送達システムを提供する。いくつかの実施形態では、送達システムは、宿主細胞中で転写されたＲＮＡ分子を含む宿主トランスジェニック植物細胞または宿主細胞の内容物の摂取を含む。これらおよびさらなる実施形態では、本発明の安定化ｄｓＲＮＡ分子を供給する（providing）組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物を創製する。特定のｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物は、組換えＤＮＡ技術（当技術分野で周知である基本技術）を用いて、本発明のｉＲＮＡ分子（例えば、安定化ｄｓＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベーターを構築し、植物細胞または植物を形質転換し、転写ｉＲＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物を生成することにより、産生することができる。
【０１５７】
トランスジェニック植物に半翅目害虫からの保護を与えるために、例えば、組換えＤＮＡ分子をｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子またはｈｐＲＮＡ分子等のｉＲＮＡ分子に転写することができる。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子は、組換え植物の組織または液内でｄｓＲＮＡ分子を形成し得る。そのようなｄｓＲＮＡ分子は、宿主植物に外寄生し得る種類の半翅目害虫体内のＤＮＡから転写される対応するポリヌクレオチドと同一であるポリヌクレオチドから一部構成され得る。半翅目害虫体内の標的遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡ分子により抑制され、半翅目害虫における標的遺伝子の発現の抑制は、トランスジェニック植物が害虫への抵抗をもたらす。ｄｓＲＮＡ分子の調節作用は、例えば、ハウスキーピング遺伝子；転写因子；脱皮関連遺伝子；ならびに細胞代謝または正常成長および発育に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子を含む、細胞分裂、染色体リモデリングおよび細胞代謝または細胞形質転換に関与する内因性遺伝子を含む、害虫において発現する様々な遺伝子に適用できることが示された。
【０１５８】
導入遺伝子からのｉｎ  ｖｉｖｏでの、または発現構築物からの転写のために、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーおよびポリアデニル化シグナル）をいくつかの実施形態で用いて、ＲＮＡ鎖（または（複数の）鎖）を転写することができる。したがって、いくつかの実施形態では、上述のように、ｉＲＮＡ分子を生成するのに用いるポリヌクレオチドは、植物宿主細胞中の機能し得る１つまたは複数のプロモーターエレメントに作動可能に連結することができる。プロモーターは、通常、宿主ゲノムに常在する内因性プロモーターであり得る。本発明のポリヌクレオチドは、作動可能に連結したプロモーターエレメントの制御下で、その転写および／または得られる転写物の安定性に有利に作用するさらなるエレメントにより両側に隣接され得る。そのようなエレメントは、作動可能に連結したプロモーターの上流、発現構築物の３’末端の下流に位置し、プロモーターの上流と発現構築物の３’末端の下流の両方に存在し得る。
【０１５９】
複数の実施形態では、標的遺伝子（例えば、ｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子）の抑制は、親ＲＮＡｉ表現型；ｉＲＮＡ分子と接触した対象（例えば、半翅目害虫）の子孫に観測可能である表現型をもたらす。いくつかの実施形態では、ｐＲＮＡｉ表現型は、害虫が生存能力のある子孫を産む能力がより低くなっていることを含む。ｐＲＮＡｉの特定の例において、ｐＲＮＡｉを開始する核酸は、核酸が送達される集団における死亡の発生率を増加させない。ｐＲＮＡｉの他の例において、ｐＲＮＡｉを開始する核酸は、核酸が送達される集団における死亡の発生率も増加させる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、半翅目害虫の集団をｉＲＮＡ分子と接触させ、それにより、ｐＲＮＡｉをもたらし、害虫は、生存し、交配するが、核酸（複数可）が与えられていない同じ種の害虫により産生される卵よりも生存能力のある子孫を孵化する能力が低い卵を産生する。いくつかの例において、そのような害虫は、産卵しないか、またはｉＲＮＡ分子と接触していない同じ種の害虫において観察可能なものより少数の卵を産む。いくつかの例において、そのような害虫により産卵された卵は、孵化しないか、またはｉＲＮＡ分子と接触していない同じ種の害虫において観察可能なものより著しく低い率で孵化する。いくつかの例において、そのような害虫により産卵された卵から孵化する若虫は、生存能力がないか、またはｉＲＮＡ分子と接触していない同じ種の害虫において観察可能なものより生存能力が低い。
【０１６１】
昆虫による摂食からの保護をもたらす物質を産生するトランスジェニック作物は、昆虫保護物質（複数可）の利益の持続性を低減させる標的害虫集団による適応に脆弱である。伝統的には、トランスジェニック作物に対する害虫の適応の遅延は、（１）「リフュージ（refuges）」（殺虫物質を含まず、したがって、殺虫物質（複数可）に感受性である昆虫の生存を可能にする作物）の植付け；および／または（２）１つの作用機序に抵抗性である個体が第２の作用機序により殺滅されるように、標的害虫に対する複数の作用機序を有する殺虫物質を組み合わせることによって達成される。
【０１６２】
いくつかの例において、ｉＲＮＡ分子（例えば、宿主植物における導入遺伝子から発現する）は、これらの防除技術のいずれかに対して抵抗性の昆虫集団の発生を軽減するための昆虫抵抗性管理遺伝子ピラミッドにおけるバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質技術および／または致死性ＲＮＡｉ技術との併用のための新たな作用機序を提示している。
【０１６３】
親ＲＮＡｉは、いくつかの実施形態では、致死性ＲＮＡｉにより得られる防除と異なる種類の害虫防除をもたらす可能性があり、これを致死性ＲＮＡｉと組み合わせて相乗的な害虫防除をもたらすことができる。したがって、特定の実施形態では、半翅目植物害虫における１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）の転写後阻害のためのｉＲＮＡ分子は、他のｉＲＮＡ分子と組み合わせて冗長ＲＮＡｉターゲティングおよび相乗的ＲＮＡｉ効果を提供することができる。
【０１６４】
卵の死亡または卵生存能力の喪失をもたらす親ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）は、昆虫保護のためのＲＮＡｉおよび他の機序を使用するトランスジェニック作物にさらなる耐久性の利益をもたらす可能性を有する。ｐＲＮＡｉは、曝露昆虫が子孫を産むことと、したがって、殺虫物質（複数可）に対する抵抗性をもたらす、それらが保有する任意の対立遺伝子を次世代に伝えることとを妨げる。ｐＲＮＡｉは、同じ害虫集団からの保護をもたらす１つまたは複数のさらなる殺虫物質と組み合わせる場合に昆虫保護トランスジェニック作物の耐久性を延長させるのにとりわけ有用である。そのようなさらなる殺虫物質は、いくつかの実施形態では、例えば、若虫活性ｄｓＲＮＡ；殺虫タンパク質（バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）または他の生物に由来するもの等）；および他の殺虫物質を含み得る。この利益は、殺虫物質に対して抵抗性である昆虫が、リフュージ作物におけるよりもトランスジェニック作物において集団のより高い割合として発生するために生ずる。次世代に伝えられる抵抗性対立遺伝子と感受性対立遺伝子との比が、ｐＲＮＡｉの非存在下よりもｐＲＮＡｉの存在下で低い場合、抵抗性の発生は遅延する。
【０１６５】
例えば、ｐＲＮＡｉは、ｉＲＮＡ分子を発現する植物に被害を与えている第一害虫世代における個体の数を減少させない可能性がある。しかし、そのような害虫が次世代まで外寄生を持続する能力は、低下する可能性がある。逆に、致死性ＲＮＡｉは、植物に既に外寄生している害虫を死滅させる可能性がある。ｐＲＮＡｉを致死性ＲＮＡｉと組み合わせる場合、親ｉＲＮＡ分子と接触する害虫は、ｉＲＮＡと接触しなかった系外の害虫と交配する可能性があるが、そのような交配の子孫は、生存不能または生存能力がより低く、したがって、植物に外寄生することが不可能である可能性がある。同時に、致死性ｉＲＮＡ分子と接触する害虫は、直接的に影響を受ける可能性がある。これらの２つの効果の組合せは、相乗的であり得る。すなわち、組み合わせたｐＲＮＡｉおよび致死性ＲＮＡｉの効果は、ｐＲＮＡｉおよび致死性ＲＮＡｉの単独での効果の和より大きい可能性がある。ｐＲＮＡｉは、例えば、致死性および親ｉＲＮＡ分子の両方を発現する植物を用意することにより；致死性ｉＲＮＡ分子を発現する第１の植物および親ｉＲＮＡ分子を発現する第２の植物を同じ場所に配置することにより、および／または害虫をｐＲＮｉ分子と接触させ、その後、それらが植物害虫と非生産的に交配することができるように、接触害虫を植物環境中に放つことにより、ｐＲＮＡｉを致死性ＲＮＡｉと組み合わせることができる。
【０１６６】
いくつかの実施形態は、植物を常食とする半翅目害虫により引き起こされる宿主植物（例えば、ダイズ植物）に対する被害を低減する方法であって、本発明の少なくとも１つの核酸分子を発現する形質転換植物細胞を宿主植物に供給することを含み、核酸分子（複数可）は、害虫（複数可）により取り込まれることにより機能して、害虫（複数可）内部の標的ポリヌクレオチドの発現を阻害し、その発現の抑制が、例えば、害虫（複数可）の死亡および／または成長の低減に加えて、生殖の低減をもたらし、それにより、害虫（複数可）により引き起こされる宿主植物に対する被害を低減する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、ｄｓＲＮＡ分子を含む。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれが半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な１つのポリヌクレオチドからなる。
【０１６７】
他の実施形態では、コーン作物の収量を増加させる方法であって、本発明の少なくとも１つの核酸分子をコーン植物に導入することと、核酸を含むｉＲＮＡ分子の発現を可能にするためにコーン植物を培養することとを含み、核酸を含むｉＲＮＡ分子の発現が、半翅目害虫の被害ならびに／あるいは成長を抑制し、それにより、半翅目害虫の外寄生による収量低下を低減または解消する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれ半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能である１つのポリヌクレオチドからなる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、植物作物の収量を増加させる方法であって、本発明の少なくとも１つの核酸分子を雌半翅目害虫に導入する（例えば、注入により、摂取により、噴霧することにより、およびＤＮＡからの発現により）ことと、雌害虫を作物中に放つこととを含み、雌害虫を含む交配対が生存能力のある子孫を産むことが不可能または産む能力がより低くなり、それにより、半翅目害虫の外寄生による収量低下を低減または解消する、方法を提供する。特定の実施形態では、そのような方法は、害虫の次世代の防除をもたらす。同様の実施形態では、方法は、本発明の核酸分子を雄半翅目害虫に導入することと、雄害虫を作物中に放つこととを含む（例えば、ｐＲＮＡｉ雄害虫は、未処理対照より少ない精子を生成する）。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｉＲＮＡ分子を生成するように発現するＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれが半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能である複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能である１つのポリヌクレオチドからなる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、半翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、本発明の少なくとも１つのｉＲＮＡ分子をコードする、ポリヌクレオチドがプロモーターおよび転写終結エレメントに作動可能に連結されている、ポリヌクレオチドを含むベクターにより植物細胞を形質転換することと、複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で形質転換植物細胞を培養することと、ポリヌクレオチドをそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされるｉＲＮＡ分子の発現について形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、ｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック植物細胞を選択することと、半翅目害虫に選択されたトランスジェニック植物細胞を食餌として与えることとを含む、方法を提供する。植物も、組み込まれた核酸分子によりコードされるｉＲＮＡ分子を発現する形質転換植物細胞から再生させることができる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれ半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子（複数可）は、半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる１つのポリヌクレオチドを含む。
【０１７０】
本発明のｉＲＮＡ分子は、植物細胞のゲノムに取り込まれた、または植付けの前の種子に適用されるコーティングもしくは種子処理に取り込まれるような組換え遺伝子からの発現の産物として、植物種（例えば、ダイズ）の種子に取り込むことができる。組換え遺伝子を含む植物細胞は、トランスジェニックイベントであると考えられる。本発明の実施形態に半翅目害虫へのｉＲＮＡ分子の送達のための送達システムも含まれる。例えば、本発明のｉＲＮＡ分子は、害虫（複数可）の細胞に直接導入することができる。導入の方法は、半翅目害虫の食餌中へのｉＲＮＡの直接混入（例えば、害虫の宿主の植物組織と混合することによる）、ならびに本発明のｉＲＮＡ分子を含む組成物の宿主植物組織への散布を含み得る。例えば、ｉＲＮＡ分子は、植物表面上に噴霧することができる。あるいは、ｉＲＮＡ分子は、微生物により発現させることができ、微生物は、植物表面上に塗布することができ、または注入等の物理的手段により根もしくは幹に導入することができる。上で述べたように、トランスジェニック植物は、植物に外寄生することが公知の半翅目害虫を殺すのに十分な量で少なくとも１つのｉＲＮＡ分子を発現するように工学的に操作することもできる。化学または酵素合成により生成したｉＲＮＡ分子は、一般的農業慣行と調和した方法で製剤化することもでき、半翅目害虫による植物被害を防除するためのスプレー式製品として用いることができる。製剤は、効果的な葉の被覆に必要な適切なアジュバント（例えば、展着剤および湿潤剤）、ならびにＵＶ損傷からｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）を保護するためのＵＶ保護剤を含み得る。そのような添加物は、生物殺虫剤産業で一般的に用いられており、当業者に周知である。そのような施用は、半翅目害虫からの植物の保護を向上させるために他のスプレー式殺虫剤施用（生物学的に基づくまたは別の方法）と組み合わせることができる。
【０１７１】
本明細書で引用した刊行物、特許および特許出願を含む、すべての参考文献は、本開示の明示的詳細と不一致でない程度まで、参照によって本明細書に組み込まれ、したがって、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個別かつ具体的に示され、本明細書にその全体が記載されていたかのようなことと同じ程度に組み込まれる。本明細書で述べた参考文献は、本出願の出願日の前のそれらの開示についてのみ記載する。本明細書における何物も、発明者らが先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことの容認と解釈すべきでない。
【０１７２】
以下の実施例は、特定の個別の特徴および／または態様を例示するために示す。これらの実施例は、述べる特定の特徴または態様に本開示を限定するものと解釈すべきではない。
［実施例］
【実施例１】
【０１７３】
ＲＮＡｉ構築物
ＰＣＲによる鋳型の調製およびｄｓＲＮＡ合成。
ｋｒｕｐｐｅｌ  ｄｓＲＮＡの生成のための特異的鋳型を得るために用いる戦略を図１Ａおよび図１Ｂに示す。ｋｒｕｐｐｅｌ  ｄｓＲＮＡ合成に用いるための鋳型ＤＮＡは、特異的プライマーおよび全ＲＮＡから作製した第一鎖ｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより作製する。選択される標的遺伝子領域であるｋｒｕｐｐｅｌについて、２つの別個のＰＣＲ増幅を実施する（図１）。第１のＰＣＲ増幅により、増幅センス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が導入される。第２の反応により、アンチセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が組み込まれる。次いで、標的遺伝子の各領域の２つのＰＣＲ増幅断片をほぼ等量で混合し、混合物をｄｓＲＮＡの生成のための転写鋳型として用いる（図１）。
【０１７４】
ＹＦＰ陰性対照を得るために、単一ＰＣＲ増幅を実施した（図１Ｂ）。ＰＣＲ増幅により、増幅センスおよびアンチセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が導入された。次いで、標的遺伝子の各領域の２つのＰＣＲ増幅断片をほぼ等量で混合し、混合物をｄｓＲＮＡの生成のための転写鋳型として用いた（図１Ｂ）。陰性対照ＹＦＰコード領域（配列番号６）のｄｓＲＮＡは、特定のプライマーおよび鋳型としてのＹＦＰコード領域のＤＮＡクローンを用いて生成した。ｋｒｕｐｐｅｌとＹＦＰの増幅されたＰＣＲ産物を、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ高収率転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いたｄｓＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成のための鋳型として用いた。合成されたｄｓＲＮＡは、製造業者の使用説明書により本質的に指示された通りにＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）またはＡＭＢＩＯＮ（登録商標）ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉキットを用いて精製した。ｄｓＲＮＡ調製物をＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）または同等の手段を用いて定量し、ゲル電気泳動により分析して、純度を決定した。
【実施例２】
【０１７５】
実時間ＰＣＲ解析
定量的実時間ＰＣＲ：  転写物の相対的発現レベルは、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０を用いてプローブ加水分解定量的実時間ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析する。ＰＣＲプライマーおよび加水分解プローブは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．０（Ｒｏｃｈｅ）を用いて設計する。ｄｓＲＮＡ注射昆虫または卵をドライアイス上で凍結する。組織の破壊は、１個のステンレススチールビーズを含むキットＲＬＴ溶解緩衝液中でＫｌｅｃｋｏ（商標）組織粉砕機（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて実施する。組織の温浸の後、溶出液について１／２Ｘ提案濃度での３０分間の任意選択のカラム上ＤＮアーゼＩ処理ステップおよび室温で１時間にわたるＴｕｒｂｏ（商標）ＤＮアーゼ（ＡＭ２２３８、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を用いる追加のＤＮアーゼＩ消化によりキットプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙ９６（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１８２）を用いて全ＲＮＡを高処理式で単離する。
【０１７６】
高処理ｑＰＣＲアッセイ用の第一鎖ｃＤＮＡの合成：  以下の修正を加えた製造業者提供のプロトコールに従って大容量ｃＤＮＡ  ＲＴキット（ｐａｒｔ＃４３６８８１３、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いる。全ＲＮＡをヌクレアーゼ不含有水を用いて約１０ｎｇ／μＬに調整する。ＲＮＡ試料（５μＬ、または２５０ｎｇ以下の全ＲＮＡ）を７０℃に１０分間加熱し、４℃に冷却する。５μＬの２Ｘミックスの添加により半反応を開始させる。３’ＵＴＲベースのアッセイの感度を改善するために、ランダムプライマーとしてのみ供給される、プライマーミックスに最初に特注合成Ｔ２０ＶＮオリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を２μＭの最終濃度までスパイクする。第一鎖の合成の後、試料をヌクレアーゼ不含有水で１：３に希釈し、高処理（ＨＴＰ）ｑＰＣＲによりアッセイする準備ができるまで−２０℃で保存する。
【０１７７】
非注射昆虫およびＹＦＰ  ｄｓＲＮＡ注射昆虫を対照として用いる。ＢＳＢ  Ａｃｔｉｎ（Ａｃｔ）を参照遺伝子として用いる（Ponton et al. (2011) J Insect Physiol 57(6):840-50）。実験の遺伝子および参照遺伝子のプライマーおよびプローブを表１に示す。
【０１７８】
【表１】
2018500899.tif 000010
【実施例３】
【０１７９】
植物形質転換ベクターの構築
ｋｒｕｐｐｅｌ（配列番号１）のセグメントを含むｄｓＲＮＡヘアピン形成のための標的遺伝子構築物を含むエントリーベクターを、化学合成断片（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）および標準分子クローニング法の組合せを用いてアセンブルする。ＲＮＡ一次転写物による分子内ヘアピン形成は、互いに逆向きの標的遺伝子セグメントの２つのコピーを（単一転写単位内で）配列させることによって促進され、２つのセグメントは、リンカー配列（例えばＳＴ−ＬＳ１イントロン、配列番号７；Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220:245-250）により分離されている。したがって、一次ｍＲＮＡ転写物は、リンカー配列により分離された、互いの大きな逆向き反復配列としての２つのｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子セグメント配列を含む。プロモーターのコピー（例えば、トウモロコシユビキチン１、米国特許第５，５１０，４７４号明細書；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）に由来する３５Ｓ；イネアクチン遺伝子に由来するプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；ＡＬＳプロモーター；ファセオリン遺伝子プロモーター；ｃａｂ；ｒｕｂｉｓｃｏ；ＬＡＴ５２；Ｚｍ１３および／またはａｐｇ）を一次ｍＲＮＡヘアピン転写物の生成を促進するために用い、３’非翻訳領域、例えばかつ制限なしに、トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子（ＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ  ｖ２；米国特許第６，６９９，９８４号明細書）、ＡｔＵｂｉ１０、ＡｔＥｆ１またはＳｔＰｉｎＩＩを含む断片をヘアピンＲＮＡ発現遺伝子の転写を終結させるために用いる。
【０１８０】
上述のエントリーベクターは、一般的なバイナリーデスティネーションベクターとの標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応に用いて、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介植物胚形質転換用のｋｒｕｐｐｅｌヘアピンＲＮＡ発現形質転換ベクターを生成する。
【０１８１】
ＹＦＰヘアピンｄｓＲＮＡを発現する遺伝子を含む、陰性対照バイナリーベクターは、一般的なバイナリーデスティネーションベクターおよびエントリーベクターを用いて標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応により構築する。エントリーベクターは、トウモロコシユビキチン１プロモーターの発現制御下のＹＦＰヘアピン配列およびトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子の３’非翻訳領域を含む断片を含む。
【０１８２】
バイナリーデスティネーションベクターは、植物作動性プロモーター（例えば、サトウキビ桿状バドナウイルス（ＳｃＢＶ）プロモーター（Schenk et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30）またはＺｍＵｂｉ１（米国特許第５，５１０，４７４号明細書））の調節下の除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；（ＡＡＤ−１  ｖ３、米国特許第７，８３８，７３３号明細書およびWright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5））を含む。これらのプロモーターの５’ＵＴＲおよびイントロンは、プロモーターセグメントの３’末端とＡＡＤ−１コード領域の開始コドンとの間に位置する。トウモロコシリパーゼ遺伝子に由来する３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ；米国特許第７，１７９，９０２号明細書）を含む断片を用いて、ＡＡＤ−１  ｍＲＮＡの転写を終結させる。
【０１８３】
ＹＦＰタンパク質を発現する遺伝子を含む、さらなる陰性対照バイナリーベクターを一般的なバイナリーデスティネーションベクターおよびエントリーベクターを用いて標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応により構築する。バイナリーデスティネーションベクターは、トウモロコシユビキチン１プロモーターの発現調節下の除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；ＡＡＤ−１ｖ３）（上記のような）およびトウモロコシリパーゼ遺伝子に由来する３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ）を含む断片を含む。エントリーベクターは、トウモロコシユビキチン１プロモーターの発現制御下のＹＦＰコード領域およびトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子に由来する３’非翻訳領域を含む断片を含む。
【実施例４】
【０１８４】
昆虫の飼育およびネオトロピカルブラウンスティンクバグ（エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）における候補遺伝子の選択
昆虫の飼育  ネオトロピカルブラウンスティンクバグ（ＢＳＢ；エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros））を６５％相対湿度および１６：８時間明：暗周期の２７℃インキュベーター中で飼育した。２〜３日にわたって採取した１ｇの卵を底に濾紙ディスクを備えた５Ｌ容器中に播種し、この容器を換気のために容器を＃１８網で覆った。各飼育容器で約３００〜４００匹の成体ＢＳＢが発生した。すべての段階において、昆虫に新鮮なサヤマメを週３回与え、ヒマワリの種子、ダイズおよびラッカセイを含む種子混合物（３：１：１重量比）の小袋を週１回交換した。水は、綿栓を芯として備えたバイアルで補給した。最初の２週間の後に、昆虫を週１回新しい容器に移した。
【０１８５】
ＲＮＡｉ標的の選択  ＢＳＢの発育の６段階をｍＲＮＡライブラリーの調製のために選択した。全ＲＮＡは、−７０℃で凍結し、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ）上Ｌｙｓｉｎｇ  ＭＡＴＲＩＸ  Ａ  ２ｍＬ管（ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）中１０容積の溶解／結合緩衝液中でホモジナイズした昆虫から抽出した。全ｍＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従ってｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＭＢＩＯＮ；ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて抽出した。ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ（商標）システム（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いたＲＮＡ配列決定により、ＲＮＡｉ昆虫防除技術に用いる候補標的遺伝子配列が得られた。ＨｉＳｅｑ（商標）は、６試料について合計３７８，０００，０００リードを発生させた。リードは、ＴＲＩＮＩＴＹアセンブラーソフトウエア（Grabherr et al. (2011) Nature Biotech. 29:644-652）を用いて各試料について個別にアセンブルした。アセンブルされた転写物を合わせて、プールされたトランスクリプトームを得た。このＢＳＢプールトランスクリプトームは、３７８，４５７の配列を含む。
【０１８６】
Ｅ．ヘロス（E. heros）ｋｒｕｐｐｅｌオルソログの同定  Ｅ．ヘロス（E. heros）プールトランスクリトームのｔＢＬＡＳＴｎ検索は、ショウジョウバエ（Drosophila）ＫＲＵＰＰＥＬ（Ｋｒ−ＰＡ、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿５２３８６７）タンパク質の配列を用いて実施した。Ｅ．ヘロス（E. heros）ｋｒｕｐｐｅｌ（配列番号１）がエウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）候補標的遺伝子として同定された。
【０１８７】
配列番号１の配列は、新規である。ＧＥＮＢＡＮＫにおける検索によって見いだされた有意な相同ヌクレオチド配列は、存在しなかった。ディアブロティカ（Diabrotica）ＫＲＵＰＰＥＬアミノ酸配列（配列番号２）の最も近いホモログは、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＡＴ４４５１９．１を有するオンコペルタス・ファシアタス（Oncopeltus fasciatus）タンパク質である（８２％類似；相同性領域にわたり７８％同一）。
【０１８８】
鋳型の作製およびｄｓＲＮＡ合成  ｃＤＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて単一の若い成体昆虫（約９０ｍｇ）から抽出した全ＢＳＢ  ＲＮＡから作製した。昆虫を２００μＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を含む１．５ｍＬ小遠心管中でペレット乳棒（ＦＩＳＨＥＲＢＲＡＮＤ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）およびＰｅｓｔｌｅ  Ｍｏｔｏｒ  Ｍｉｘｅｒ（ＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ、Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）を用いて室温でホモジナイズした。ホモジナイズした後、追加の８００μＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を加え、ホモジネートをボルテックスミキサーで混合し、次いで室温で５分間インキュベートした。遠心分離により細胞デブリを除去し、上清を新しい管に移した。１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）について製造業者推奨ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）抽出プロトコールに従って、ＲＮＡペレットを室温で乾燥し、溶出緩衝液Ｔｙｐｅ４（すなわち、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を用いたＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ＡＮＤ  ＧＥＬ  ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ  ＫＩＴ（Ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）；ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）からの２００μＬのトリス緩衝液に再懸濁した。ＲＮＡ濃度は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて測定した。
【０１８９】
ｃＤＮＡは、供給業者の推奨プロトコールに従って、ＲＴ−ＰＣＲ用のＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩＩ  ＦＩＲＳＴ−ＳＴＲＡＮＤ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＳＹＳＴＥＭ（商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて５μｇのＢＳＢ全ＲＮＡ鋳型およびオリゴｄＴプライマーから逆転写した。転写反応の最終容積は、ヌクレアーゼ不含有水で１００μＬとした。
【０１９０】
ＢＳＢ＿ｋｒ−１に対するプライマーであるｄｓＲＮＡ  ＢＳＢ＿ｋｒ−１−Ｆ（配列番号８）およびＢＳＢ＿ｋｒ−１−Ｒ（配列番号９）を用いて、ｄｓＲＮＡ転写のためのＤＮＡ鋳型を増幅した。ＢＳＢ＿ｋｒ−２に対するプライマーであるｄｓＲＮＡ  ＢＳＢ＿ｋｒ−２−Ｆ（配列番号１０）およびＢＳＢ＿ｋｒ−２−Ｒ（配列番号１１）を用いて、ｄｓＲＮＡ転写のためのＤＮＡ鋳型を増幅した。ＤＮＡ鋳型は、１μＬのｃＤＮＡ（上記）を鋳型とした「タッチダウン」ＰＣＲ（１℃／サイクル低下でアニーリング温度を６０℃から５０℃に低下させた）を用いて増幅した。ＢＳＢ＿ｋｒ−１（配列番号３）の４３４ｂｐセグメントおよびＢＳＢ＿ｋｒ−２（配列番号４）の６０５ｂｐセグメントを含む断片が３５サイクルのＰＣＲ中に生成した。上記の手順を用いて、ＹＦＰｖ２＿Ｆ（配列番号１３）およびＹＦＰｖ２＿Ｒ（配列番号１４）プライマーを用いて３０１ｂｐ陰性対照鋳型ＹＦＰｖ２（配列番号１２）を増幅した。ＢＳＢ特異的およびＹＦＰｖ２プライマーは、それらの５’末端にＴ７ファージプロモーター配列（配列番号５）を含み、ｄｓＲＮＡ転写のための上述のＢＳＢ  ＤＮＡ断片の使用を可能にした。
【０１９１】
ｄｓＲＮＡｓは、製造業者の指示に従って用いた、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＮＡｉキット（ＡＭＢＩＯＮ）またはＨｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより２μＬのＰＣＲ産物（上記）を鋳型として用いて合成した。図１を参照のこと。ｄｓＲＮＡは、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）８０００分光光度計で定量し、ヌクレアーゼ不含有０．１Ｘ  ＴＥ緩衝液（１ｍＭトリスＨＣL、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で１μｇ／μＬに希釈した。
【実施例５】
【０１９２】
二齢ネオトロピカルブラウンスティンクバグ（エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros））若虫へのｄｓＲＮＡ注射
ＢＳＢ人工食餌  ＢＳＢ人工食餌は、以下のように調製し、調製してから２週間以内に使用した。凍結乾燥サヤマメをＭＡＧＩＣ  ＢＵＬＬＥＴ（登録商標）ブレンダーで混合して微粉末とし、一方、生（有機栽培）ラッカセイを別個のＭＡＧＩＣ  ＢＵＬＬＥＴ（登録商標）ブレンダーで混合した。混合した乾燥成分を大型ＭＡＧＩＣ  ＢＵＬＬＥＴ（登録商標）ブレンダーで混ぜ合わせた（重量百分率：サヤマメ、３５％；ラッカセイ、３５％；スクロース、５％；複合ビタミン剤（例えば、昆虫用Ｖａｎｄｅｒｚａｎｔ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）、０．９％））が、ブレンダーに蓋をし、十分に振とうして成分を混合した。次いで混合した乾燥成分を混合ボウルに加えた。別個の容器中で、水およびベノミル抗真菌剤（５０ｐｐｍ；  ２５μＬ ２０，０００ｐｐｍ溶液／５０ｍＬ食餌溶液）を十分に混合し、次いで乾燥成分混合物に加えた。溶液が十分に混合されるまで、すべての成分を手により混合した。食餌を所望のサイズに成型し、アルミニウムフォイルで緩やかに包み、６０℃で４時間加熱し、次いで冷却し、４℃で保存した。
【０１９３】
ＢＳＢ血体腔内へのｄｓＲＮＡの注射  ＢＳＢは、６５％の相対湿度および１６：８時間の明：暗光周期の２７℃インキュベーター中で上述のコロニーとして、サヤマメおよび種子食餌を与えて飼育した。二齢若虫（それぞれ体重１〜１．５ｍｇ）を傷害を防ぐために小ブラシを用いて緩やかに取り扱い、氷上のペトリ皿に入れて、昆虫を冷却し、静止させた。各昆虫に５５．２ｎＬの５００ｎｇ／μＬ  ｄｓＲＮＡ溶液（すなわち、２７．６ｎｇ  ｄｓＲＮＡ；１８．４〜２７．６μｇ／ｇ体重の用量）を注射した。注射は、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ８．９ｃｍの＃３−０００−２０３−Ｇ／Ｘガラス毛細管から引き抜いた注射針を取り付けたＮＡＮＯＪＥＣＴ（商標）ＩＩ注射器（ＤＲＵＭＭＯＮＤ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｂｒｏｏｍｈａｌｌ、ＰＡ）を用いて実施した。針の先端を折り、毛細管に軽油を入れ直し、次いで２〜３μＬのｄｓＲＮＡを満たした。ｄｓＲＮＡを若虫の腹部に注射し（試験１回当たりｄｓＲＮＡ１つ当たり１０匹の昆虫に注射）、別の３日に試験を繰り返した。注射した昆虫（ウェル１つ当たり５匹）を、人工ＢＳＢ食餌のペレットを含み、Ｐｕｌｌ−Ｎ−Ｐｅｅｌ（商標）タブ（ＢＩＯ−ＣＶ−４；ＢＩＯ−ＳＥＲＶ）で覆った３２ウェルトレー（Ｂｉｏ−ＲＴ−３２飼育トレー；ＢＩＯ−ＳＥＲＶ、Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ、ＮＪ）に移した。水分は、綿芯を含む１．５ｍＬ小遠心管中の１．２５ｍＬの水により供給した。トレーを２６．５℃、６０％湿度および１６：８明：暗の光周期でインキュベートした。生存数および体重を注射後７日目に測定した。
【０１９４】
ＢＳＢ二齢若虫におけるｋｒｕｐｐｅｌ  ｍＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡの注射  ＹＦＰコード領域、ＹＦＰｖ２と相同のｄｓＲＮＡをＢＳＢ注射実験における陰性対照として用いた。表２に要約するように、二齢ＢＳＢの血体腔内に注射した２７．６ｎｇのＢＳＢ＿ｋｒ−１  ｄｓＲＮＡは、７日以内の死亡率の増加をもたらさなかった。
【０１９５】
【表２】
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【実施例６】
【０１９６】
エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）におけるｄｓＲＮＡ注射後の卵孵化
成虫ＢＳＢ血体腔内へのｄｓＲＮＡの注射  ＢＳＢは、コロニーについて上述したように飼育した。以下の例示において、若い成体（成体脱皮０から３日後まで）を収集し、氷上の第２の容器中で冷却した。生殖器の構造的二型性に基づいて、雌および雄を分離した。雌ＢＳＢを軽量昆虫鉗子で取り扱い、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ８．９ｃｍ  ＃３−０００−２０３−Ｇ／Ｘガラス毛細管から引き抜いた注射針を取り付けたＮＡＮＯＪＥＣＴ（商標）ＩＩ注射器（ＤＲＵＭＭＯＮＤ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｂｒｏｏｍｈａｌｌ、ＰＡ）を用いてｄｓＲＮＡを注射した。針の先端を折り、毛細管に軽油を入れ直し、次いで３μＬのｄｓＲＮＡを満たした。処置１回当たり１０匹から２０匹の雌（それぞれ約９０ｍｇ）にｄｓＲＮＡを注射した。各雌の腹部に６９ｎＬ  １μｇ／μＬ  ｄｓＲＮＡを連続して２回、合計で１３８ｎＬ（１３８ｎｇ）を注射した。１０匹の雌の各バッチを蓋に開口部および換気用の＃１８網を備えた１クオート（約９５０ｍＬ）ビンに移動させた。２匹の成体雄を１０匹の雌の各ビンに加えた。飼育手順で述べたように昆虫に水、サヤマメおよび種子のバイアルを供給した。昆虫を２６．５℃、６０％湿度および１６：８明：暗光周期で飼育した。
【０１９７】
生存雌数、産卵および卵孵化数を注射９日後に開始し、最長２４日間継続して毎日収集した。卵を毎日除去し、ペトリ皿または多ウェルプレートにおける水中１％アガロースの層上に保持した。新鮮なサヤマメを１日おきに成体に供給した。成体昆虫をビンに移し、新鮮な水および食物を毎週与えた。
【０１９８】
ＹＦＰコード領域の３０１ｎｔ配列を標的とする（配列番号１２）ｄｓＲＮＡを注射した雌を陰性対照として用い、非注射雌およびＢＳＢ＿ｋｒ−ｌ（配列番号３）ｄｓＲＮＡを注射した雌と比較した。
【０１９９】
ＢＳＢ雌におけるｋｒｕｐｐｅｌを標的とするｄｓＲＮＡの注射は、産卵に対する有意な効果を有さない。表３に要約するように、ｋｒｕｐｐｅｌ  ｄｓＲＮＡを注射した雌は、ＹＦＰｖ２  ｄｓＲＮＡ注射および非注射対照より多少低い数の卵を産卵した。産卵された卵の平均数／日／雌（表３）は、ＹＦＰ対照と有意に異なっていなかった。ｋｒｕｐｐｅｌ  ｄｓＲＮＡで処理した雌における驚くべきかつ予期しない総孵化率が存在した。孵化した卵の総数は、ＹＦＰｖ２についての８９％の孵化率と比較して、すべての反復で１０％〜３１％の範囲に劇的に低下した（表４）。
【０２００】
【表３】
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【０２０１】
【表４】
2018500899.tif 000013
【実施例７】
【０２０２】
半翅目害虫配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
配列番号１、配列番号３および／または配列番号４を含む核酸の発現ベクターを含む１０〜２０のトランスジェニックＴ０ゼア・マイス（Zea mays）植物を実施例３で述べたように作製する。ＲＮＡｉ構築物のヘアピンｄｓＲＮＡを発現するさらなる１０〜２０のＴ１ゼア・マイス（Zea mays）独立系をＢＳＢチャレンジのために得る。配列番号１のセグメントを含むヘアピンｄｓＲＮＡを得ることができる。これらは、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の分子解析法により確認される。選択される独立Ｔ１系からの全ＲＮＡ調製物は、任意選択的に、ＲＮＡｉ構築物のそれぞれにおけるヘアピン発現カセットのリンカーに結合するように設計されたプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲに用いられる。さらに、ＲＮＡｉ構築物における各標的遺伝子に対する特異的プライマーは、任意選択的に、植物体におけるｓｉＲＮＡ生成に必要なプロセシング前（pre-processed）ｍＲＮＡを増幅し、その生成を確認するために用いられる。各標的遺伝子の所望のバンドの増幅により、各トランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物におけるヘアピンＲＮＡの発現が確認される。標的遺伝子のｄｓＲＮＡヘアピンのｓｉＲＮＡへのプロセシングは、任意選択的に、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを用いて独立トランスジェニック系においてその後確認される。
【０２０３】
さらに、標的遺伝子との８０％を超える配列同一性を有するミスマッチ配列を有するＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子との１００％の配列同一性を有するＲＮＡｉ分子について認められるものと同様の仕方で半翅目害虫に作用する。同じＲＮＡｉ構築物におけるヘアピンｄｓＲＮＡを形成するミスマッチ配列と天然配列との対合は、摂食半翅目害虫の成長、発育、生殖および生存能力に影響を及ぼすことができる植物処理ｓｉＲＮＡを送達する。
【０２０４】
標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｈｐＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの植物体内への送達および摂食による半翅目害虫によるその後の取り込みにより、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによる半翅目害虫における標的遺伝子の下方制御がもたらされる。標的遺伝子の機能が発育の１つまたは複数の段階で重要である場合、半翅目害虫の成長、発育および／または生殖が影響を受け、エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）、ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）、ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）、アクロステルヌム・ヒラレ（Acrosternum hilare）およびエウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）の少なくとも１つの場合、外寄生し、摂食し、発育し、かつ／または生殖することの不成功につながるか、あるいは半翅目害虫の死につながる。次いで、半翅目害虫を防除するために、標的遺伝子の選択およびＲＮＡｉの成功裏での適用を用いる。
【０２０５】
トランスジェニックＲＮＡｉ系および非形質転換ゼア・マイス（Zea mays）の表現型比較
ヘアピンｄｓＲＮＡを創製するために選択した標的半翅目害虫遺伝子または配列は、あらゆる公知の植物遺伝子配列との類似性がない。したがって、これらの半翅目害虫遺伝子または配列を標的とする構築物による（全身性）ＲＮＡｉの生成または活性化は、トランスジェニック植物に対してあらゆる有害な影響を及ぼすことは、予想されない。しかし、トランスジェニック系の発育および形態特性を非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有さない「空」のベクターにより形質転換したトランスジェニック系の植物と比較する。植物の根、芽条、茎葉および生殖特性を比較する。トランスジェニック植物および非形質転換植物の根の長さおよび成長パターンに観察可能な差はない。高さ等の植物の芽条の特性、葉の数およびサイズ、開花時期、花のサイズおよび外観は、同様である。温室内でｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび土壌中で栽培した場合、一般的に、トランスジェニック系と標的ｉＲＮＡ分子の発現のないものとの間に観察可能な形態の差はない。
【実施例８】
【０２０６】
半翅目害虫配列を含むトランスジェニックダイズ（Glycine max）
配列番号１または配列番号１のセグメントを含む核酸の発現ベクターを含む１０〜２０のトランスジェニックＴ０ダイズ（Glycine max）植物を、例えば、以下のような、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換による方法を含む、当技術分野で公知のように作製する。成熟ダイズ（Glycine max）種子を塩素ガスで１６時間にわたり一夜滅菌する。塩素ガスによる滅菌の後、種子をＬＡＭＩＮＡＲ（商標）流フード内の開放容器に入れて、塩素ガスを消散させる。次に、滅菌済み種子に２４℃でブラックボックスを用いて暗所で滅菌Ｈ２Ｏを１６時間吸収させる。
【０２０７】
分割種子ダイズの調製  胚軸の一部を含む分割ダイズ種子プロトコールは、種子外被を分離し、除去し、種子を２つの子葉部分に分割するために種子のへそに沿って、スカルペルに取り付けられた＃１０ブレードを用いて縦方向に切断されているダイズ種子物質の調製を要求している。胚軸を部分的に除去することに十分な注意を払い、胚軸の約１／２〜１／３が子葉の節末端に付着したままとする。
【０２０８】
接種  胚軸の一部を含む分割ダイズ種子を配列番号１、配列番号３および／または配列番号４を含むバイナリープラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（例えば、ＥＨＡ１０１又はＥＨＡ１０５株）の溶液中に約３０分間浸漬する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）溶液は、胚軸を含む子葉を浸漬する前にλ＝０．６  ＯＤ６５０の最終濃度に希釈する。
【０２０９】
共培養  接種後、分割ダイズ種子を濾紙片で覆ったペトリ皿中の共培養培地上でアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）菌株とともに５日間共培養する（Agrobacterium Protocols, vol. 2, 2nd Ed., Wang, K. (Ed.) Humana Press, New Jersey, 2006）。
【０２１０】
芽条誘導  ５日間の共培養後に、分割ダイズ種子をＢ５塩、Ｂ５ビタミン、２８ｍｇ／Ｌ第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＡ、３０ｇ／Ｌスクロース、０．６ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、１．１１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、１００ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌセホタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌバンコマイシン（ｐＨ５．７）からなる液体芽条誘導（ＳＩ）培地で洗浄する。次いで分割ダイズ種子をＢ５塩、Ｂ５ビタミン、７ｇ／Ｌ  Ｎｏｂｌｅ寒天、２８ｍｇ／Ｌ第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＡ、３０ｇ／Ｌスクロース、０．６ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、１．１１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、５０ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌセホタキシム、５０ｍｇ／Ｌバンコマイシン（ｐＨ５．７）からなる芽条誘導Ｉ（ＳＩ  Ｉ）培地上で、子葉の平らな側を上向きにし、子葉の節末端を培地に埋め込んで培養する。２週間の培養の後に、形質転換分割ダイズ種子の外植体を６ｍｇ／Ｌグルホシネート（ＬＩＢＥＲＴＹ（登録商標））を添加したＳＩ  Ｉ培地を含む芽条誘導ＩＩ（ＳＩ  ＩＩ）培地上に移す。
【０２１１】
芽条伸長  ＳＩ  ＩＩ培地上の２週間の培養の後に、子葉を外植体から除去し、子葉の基部で切断を行うことによって胚軸を含むフラッシュシュートパッド（flush shoot pad）を摘出する。子葉から単離したシュートパッドを芽条伸長（ＳＥ）培地に移す。ＳＥ培地は、ＭＳ塩、２８ｍｇ／Ｌ第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤTＡ、３０ｇ／Ｌスクロースおよび０．６ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌアスパラギン、１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ピログルタミン酸、０．１ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ、０．５ｍｇ／Ｌ  ＧＡ３、１ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド、５０ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌセホタキシム、５０ｍｇ／Ｌバンコマイシン、６ｍｇ／Ｌグルホシネート、７ｇ／Ｌ  Ｎｏｂｌｅ寒天（ｐＨ５．７）からなっている。培養を新鮮なＳＥ培地に２週間ごとに移す。培養をＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）生育チャンバー内で８０〜９０μｍｏｌ／ｍ２秒の光度の１８時間明期で２４℃で生育させる。
【０２１２】
発根  子葉シュートパッドの基部で伸長芽条を切断することによって、子葉シュートパッドから発生した伸長芽条を単離し、伸長芽条を１ｍｇ／Ｌ  ＩＢＡ（インドール３−酪酸）に１〜３分間浸漬して、発根を促進する。次に、伸長芽条をｐｈｙｔａトレー中の発根培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２８ｍｇ／Ｌ第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＡ、２０ｇ／Ｌスクロースおよび０．５９ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌアスパラギン、１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ピログルタミン酸、７ｇ／Ｌ  Ｎｏｂｌｅ寒天、ｐＨ５．６）に移す。
【０２１３】
栽培  ２４℃、１８時間明期のＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）生育チャンバー内での１〜２週間の培養の後、根を発生した芽条を被覆ｓｕｎｄａｅカップ中土壌ミックスに移し、小植物の順化のために一定温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）下での１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２秒の光度の長日条件下（１６時間明／８時間暗）のＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）生育チャンバー（モデルＣＭＰ４０３０およびＣＭＰ３２４４、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、Ｃａｎａｄａ）に入れた。発根小植物は、さらなる順化および頑健なトランスジェニックダイズ植物の樹立のために温室に移す前に、ｓｕｎｄａｅカップ中で数週間順化させる。
【０２１４】
ＲＮＡｉ構築物のヘアピンｄｓＲＮＡを発現するさらなる１０〜２０のＴ１ダイズ（Glycine max）独立系をＢＳＢチャレンジのために得る。配列番号３および配列番号４に示すまたはさもなければ配列番号１をさらに含むヘアピンｄｓＲＮＡを得ることができる。これらは、ＲＴ−ＰＣＲまたは当技術分野で公知であるような、他の分子解析法により確認される。選択される独立Ｔ１系からの全ＲＮＡ調製物は、ＲＮＡｉ構築物のそれぞれにおけるヘアピン発現カセットのリンカーに結合するように設計されたプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲに場合によって用いられる。さらに、ＲＮＡｉ構築物における各標的遺伝子に対する特異的プライマーは、植物体におけるｓｉＲＮＡ生成に必要なプロセシング前ｍＲＮＡを増幅し、その生成を確認するために場合によって用いられる。各標的遺伝子の所望のバンドの増幅により、各トランスジェニックダイズ（Glycine max）植物におけるヘアピンＲＮＡの発現が確認される。標的遺伝子のｄｓＲＮＡヘアピンのｓｉＲＮＡへのプロセシングは、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを用いて独立トランスジェニック系においてその後場合によって確認される。
【０２１５】
標的遺伝子との８０％を超える配列同一性を有するミスマッチ配列を有するＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子との１００％の配列同一性を有するＲＮＡｉ分子について認められるものと同様の仕方でＢＳＢに作用する。同じＲＮＡｉ構築物におけるヘアピンｄｓＲＮＡを形成するミスマッチ配列と天然配列との対合により、摂食半翅目害虫の成長、発育、生殖および生存能力に影響を及ぼすことができる植物処理ｓｉＲＮＡがもたらされる。
【０２１６】
標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡの植物体内への送達および摂食による半翅目害虫によるその後の取り込みにより、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによる半翅目害虫における標的遺伝子の下方制御がもたらされる。標的遺伝子の機能が発育の１つまたは複数の段階で重要である場合、半翅目害虫の成長、発育および／または生殖が影響を受け、エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）、ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）、ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）、アクロステルヌム・ヒラレ（Acrosternum hilare）およびエウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）の少なくとも１つの場合、外寄生し、摂食し、発育し、かつ／または生殖することの不成功につながるか、あるいは半翅目害虫の死につながる。半翅目害虫を防除するために、標的遺伝子の選択およびＲＮＡｉの成功裏での適用を用いる。
【０２１７】
トランスジェニックＲＮＡｉ系および非形質転換ダイズ（Glycine max）の表現型比較  ヘアピンｄｓＲＮＡを作製するために選択した標的半翅目害虫遺伝子または配列は、公知の植物遺伝子配列との類似性がない。したがって、これらの半翅目害虫遺伝子または配列を標的とする構築物による（全身性）ＲＮＡｉの生成または活性化は、トランスジェニック植物に対して有害な影響を及ぼすことは、予想されない。しかし、トランスジェニック系の発育および形態特性を非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有さない「空」のベクターにより形質転換したトランスジェニック系の植物と比較する。植物の根、芽条、茎葉および生殖特性を比較する。トランスジェニック植物および非形質転換植物の根の長さおよび成長パターンに観察可能な差はない。高さなどの植物の芽条の特性、葉の数及びサイズ、開花時期、花のサイズおよび外観は、同様である。温室内でｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび土壌中で栽培した場合、一般的に、トランスジェニック系と標的ｉＲＮＡ分子の発現のないものとの間に観察可能な形態の差はない。
【実施例９】
【０２１８】
人工食餌によるＥ．ヘロス（E. heros）バイオアッセイ
人工食餌によるｄｓＲＮＡ摂食アッセイにおいて、注射実験と同様に、人工食餌の約１８ｍｇのペレットおよび水を含む３２ウェルトレーを設置する。２００ｎｇ／μＬの濃度のｄｓＲＮＡを食物ペレットおよび水試料に、２つのウェルのそれぞれに１００μＬ加える。５匹の二齢Ｅ．ヘロス（E. heros）若虫を各ウェルに導入する。水試料およびＹＦＰ転写物を標的とするｄｓＲＮＡを陰性対照として用いる。実験は、異なる３日に反復する。７日間の処置の後に生存昆虫の体重を測定し、死亡率を決定する。
【０２１９】
成体雌Ｅ．ヘロス（E. heros）における摂食バイオアッセイは、上述のように３２ウェルトレーにおいて実施する。若い（１週未満の成体期）交配雌を人工食餌を含むバイオアッセイトレーにトレー１個当たり１匹ずつ導入する。ｄｓＲＮＡへの７日間の曝露後に、最大１０匹の成体雌をサヤマメ、水、種子および２匹の雄を含む容器に移す。雌の生存能力ならびに産卵された卵および孵化した卵の数を次の２週間にわたり記録する。データは、産卵された卵および／または孵化した卵の数が有意に減少していることを示している。
【実施例１０】
【０２２０】
半翅目害虫配列を含むトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
ｋｒｕｐｐｅｌ（配列番号１）のセグメントを含むヘアピン形成のための標的遺伝子構築物を含むシロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換ベクターを実施例４と同様の標準的な分子法を用いて作製する。シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換は、標準的なアグロバクテリウム（Agrobacterium）ベースの手順を用いて実施する。Ｔ１種子は、グルホシネート耐性選択可能マーカーを用いて選択する。トランスジェニックＴ１シロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物を作製し、同型接合単一コピーＴ２トランスジェニック植物を昆虫試験のために作製する。バイオアッセイは、花序を有する発育段階のシロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物において実施する。５〜１０匹の昆虫を各植物上に置き、１４日以内の生存についてモニターする。
【０２２１】
シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換ベクターの構築  ｋｒｕｐｐｅｌ（配列番号１）のセグメントを含むヘアピン形成のための標的遺伝子構築物を含むエントリーベクターに基づくエントリークローンを化学合成断片の組合せ（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）および標準分子クローニング法を用いてアセンブルする。ＲＮＡ一次転写物による分子内ヘアピン形成は、互いに反対の方向の標的遺伝子セグメントの２つのコピーを配置すること（単一転写単位内に）によって促進されるが、２つのセグメントは、リンカー配列（例えば、ＳＴ−ＬＳ１イントロン；配列番号７）により分離されている（Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50）。したがって、一次ｍＲＮＡ転写物は、リンカー配列によって分離された、互いの大きな逆方向反復配列としての２つのｋｒｕｐｐｅｌ遺伝子セグメント配列を含む。一次ｍＲＮＡヘアピン転写物の生成を促進するためにプロモーターのコピー（例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（Callis et al. (1990) J. Biological Chem. 265: 12486-12493）を用い、ヘアピンＲＮＡ発現遺伝子の転写を終結させるためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム２３の３’非翻訳領域を含む断片（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖｌ；米国特許第５，４２８，１４７号明細書）を用いる。
【０２２２】
上述のエントリーベクター内のヘアピンクローンは、一般的なバイナリーデスティネーションベクターとの標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応に用いて、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換用のヘアピンＲＮＡ発現形質転換ベクターを生成する。
【０２２３】
バイナリーデスティネーションベクターは、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、米国特許第７６０１８８５号明細書；Verdaguer et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-39）の制御下の除草剤耐性遺伝子ＤＳＭ−２ｖ２（米国特許出願公開第２０１１／０１０７４５５号明細書）を含む。ＤＳＭ２ｖ２  ｍＲＮＡの転写を終結させるためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム１の３’非翻訳領域を含む断片（ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ６；Huang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22）を用いる。
【０２２４】
ＹＦＰヘアピンＲＮＡを発現する遺伝子を含む、陰性対照バイナリー構築物は、一般的なバイナリーデスティネーションベクターおよびエントリーベクターとの標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応により構築する。エントリー構築物は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）ユビキチン１０プロモーター（上記のような）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＯＲＦ２３  ３’非翻訳領域を含む断片（上記のような）の発現制御下のＹＦＰヘアピン配列（配列番号６）を含む。
【０２２５】
殺虫性ヘアピンＲＮＡを含むトランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）の作製：アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換  ヘアピン配列を含むバイナリープラスミドをアグロバクテリウム（Agrobacterium）菌株ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０ＲＫ）にエレクトロポレートする。組換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）クローンは、組換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーのプラスミド調製物の制限解析により確認される。Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ＃１２１６２）を用いて、製造業者推奨プロトコールに従ってアグロバクテリウム（Agrobacterium）培養からプラスミドを抽出する。
【０２２６】
シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換およびＴ１選択  １２〜１５のシロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物（ｃ．ｖ．  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を２５０μｍｏｌ／ｍ２の光強度、２５℃および１８：６時間の明：暗条件を有する温室内の４’’ポットで生育させる。形質転換の１週間前に一次花茎を切り取る。アグロバクテリウム（Agrobacterium）接種物は、１００ｍｇ／Ｌスペクチオマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを添加した１００ｍＬ  ＬＢブロス（Ｓｉｇｍａ  Ｌ３０２２）中で１０μＬの組換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）グリセロールストックを２８℃でインキュベートし、２２５ｒｐｍで７２時間振とうすることによって調製する。アグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞を収集し、花の浸漬の前に５％スクロース＋０．０４％Ｓｉｌｗｅｔ−Ｌ７７（Ｌｅｈｌｅ  Ｓｅｅｄｓ  カタログ＃  ＶＩＳ−０２）＋１０μｇ／Ｌベンズアミノプリン（ＢＡ）溶液中にＯＤ６０００．８〜１．０まで懸濁する。植物の地上部をアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液中に、緩やかに撹拌しながら５〜１０分間浸漬する。次いで、植物を、結実するまで定期的な散水および施肥による正常な生育のために温室に移す。
【実施例１１】
【０２２７】
トランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）の生育およびバイオアッセイ
ヘアピンＲＮＡｉ構築物により形質転換したＴ１シロイヌナズナ属（Arabidopsis）の選択  各形質転換による最大２００ｍｇのＴ１種子を０．１％アガロース溶液中で層状にする。種子を＃５  ｓｕｎｓｈｉｎｅ培地を含む発芽トレー（１０．５’’ｘ２１’’ｘ１’’；Ｔ．Ｏ．  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、ＭＮ．）に植える。形質転換体は、植えた６および９日後に２８０ｇ／ｈａのＩＧＮＩＴＥ（登録商標）（グルホシネート）に対する耐性について選択する。選択されたイベントを４’’径ポット中に移植する。挿入コピー解析は、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（商標）を用いて加水分解定量的実時間ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により移植してから１週間以内に実施する。ＰＣＲプライマーおよび加水分解プローブは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．０（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＤＳＭ２ｖ２選択可能マーカーと対照して設計する。植物は、２４℃で、１００〜１５０ｍＥ／ｍ２秒の強度の蛍光および白熱光のもとでの１６：８時間明：暗光周期で維持する。
【０２２８】
Ｅ．ヘロス（E. heros）若虫植物摂食バイオアッセイ  少なくとも４つの低コピー（１〜２挿入）、４つの中コピー（２〜３挿入）および４つの高コピー（≧４挿入）イベントを各構築物について選択する。植物を生殖期に成長させる（花および長角果を含む植物）。昆虫の容易な識別のために土壌の表面を約５０ｍＬの容積の白砂で覆う。５〜１０匹の二齢Ｅ．ヘロス（E. heros）若虫を各植物上に導入する。植物を直径が３’’、高さが１６’’で、０．０３’’の壁厚を有するプラスチックチューブ（Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．４８４４８５、Ｖｉｓｉｐａｃｋ  Ｆｅｎｔｏｎ  ＭＯ）で覆い、昆虫を隔離するためにチューブをナイロン網で覆う。植物は、ｃｏｎｖｉｒｏｎ内に通常の温度、光および散水条件下で維持する。１４日目に、昆虫を収集し、体重を測定し、死亡百分率ならびに成長阻害（１−処置体重／対照体重）を計算する。ＹＦＰヘアピン発現植物を対照として用いる。
【０２２９】
Ｅ．ヘロス（E. heros）成体植物摂食バイオアッセイ  ｐＲＮＡｉシロイヌナズナ属（Arabidopsis）Ｔ１植物を選択し、温室内で上述のように生育させる。１〜５匹の新たに出現したＢＳＢ成体を各植物上に放ち、成体が逃げることを防ぐために植物全体を上述のように覆う。放ってから１週間後に、雌成体を各植物から回収し、卵の収集のために実験室で飼育する。親ＲＮＡｉ標的および予期される表現型に応じて、雌1匹当たりの卵の数、卵孵化の百分率および若虫死亡数等のパラメーターを記録し、対照植物と比較する。
【０２３０】
Ｔ２シロイヌナズナ属（Arabidopsis）種子の発生およびＴ２バイオアッセイ  Ｔ２種子は、各構築物についての選択される低コピー（１〜２挿入）イベントから産生される。植物（同型接合および／または異型接合）を上述の、Ｅ．ヘロス（E. heros）若虫および成体摂食バイオアッセイに供する。Ｔ３種子を同型接合体から収集し、将来の解析のために保存する。
【実施例１２】
【０２３１】
さらなる作物種の形質転換
当業者に公知の方法、例えば、米国特許第７，８３８，７３３号明細書の実施例１４またはＰＣＴ国際特許公開第２００７／０５３４８２号パンフレットの実施例１２に以前に記載された実質的に同じ技術を用いることによってカメムシの防除を行うためにワタをｋｒｕｐｐｅｌで形質転換する（葉緑体輸送ペプチドを含むまたは含まない）。
【実施例１３】
【０２３２】
ｐＲＮＡｉ媒介昆虫保護
卵の死亡または卵生存能力の喪失をもたらす親ＲＮＡｉは、昆虫保護のためのＲＮＡｉおよび他の機序を使用するトランスジェニック作物にさらなる耐久性の利益をもたらす。この有用性を示すために基本的な２パッチモデルを用いた。
【０２３３】
１つのパッチは、殺虫成分を発現するトランスジェニック作物を含有し、第２のパッチは、殺虫成分を発現しないリフュージ作物を含有していた。卵は、２つのモデル化パッチにそれらの相対的割合に従って産卵させた。この例では、トランスジェニックパッチは、地表の９５％に相当し、リフュージパッチは、５％に相当していた。トランスジェニック作物は、昆虫に対して活性な殺虫タンパク質を発現した。
【０２３４】
殺虫タンパク質に対する害虫は、一方（Ｓ）が感受性を与え、他方（Ｒ）が抵抗性を与える、２つの可能な対立遺伝子を有する、一遺伝子性としてモデル化した。殺虫タンパク質は、それを常食とする同型接合性感受性（ＳＳ）若虫の９７％死亡率をもたらすようにモデル化した。抵抗性対立遺伝子（ＲＲ）に同型接合性である若虫の死亡はないと仮定した。殺虫タンパク質に対する抵抗性は、不完全に劣性であると仮定し、それにより機能的優性度は０．３である（トランスジェニック作物を常食とする、タンパク質に対する抵抗性について異型接合性（ＲＳ）である若虫の６７．９％の死亡率がある）。
【０２３５】
トランスジェニック作物は、ＲＮＡ干渉（ｐＲＮＡｉ）によって、トランスジェニック作物に曝露される成体雌昆虫の卵を生存不能にする、親活性ｄｓＲＮＡも発現した。ｐＲＮＡｉに対する昆虫抵抗性も、一方（Ｘ）がＲＮＡｉに対する成体雌の感受性を与え、他方（Ｙ）がＲＮＡｉに対する成体雌の抵抗性を与える、２つの可能な対立遺伝子を有する一遺伝子性とみなされた。ｄｓＲＮＡへの高レベルの曝露を仮定して、ｐＲＮＡｉは、同型接合性感受性（ＸＸ）雌により産生された卵の９９．９％が生存不能にするようにモデル化した。このモデルは、ｐＲＮＡｉが、同型接合性抵抗性（ＹＹ）雌により産生された卵生存能力に対して作用を及ぼさないと仮定した。ｄｓＲＮＡに対する抵抗性は、劣性であるものと仮定し、それにより機能的優性度は０．０１である（ｄｓＲＡに対する抵抗性について異型接合性（ＸＹ）である雌により産生された卵の９８．９％が生存不能である）。
【０２３６】
該モデルでは、生存成体間にランダムな交配およびそれらの相対的割合に応じた２つのパッチにわたるランダムな産卵が存在していた。生存能力のある子孫の遺伝子型頻度は、２遺伝子座遺伝系に関するメンデル遺伝学に従っていた。
【０２３７】
ｐＲＮＡｉの効果は、成体雌が親活性ｄｓＲＮＡを発現する植物組織を常食とすることを必要とするものであった。卵の発育の妨害は、トランスジェニック作物からよりもリフュージ作物から出現する成体雌について低い可能性があり、成体は、それらが若虫の発育の後に出現したパッチにおいてより広範囲に摂食し得る。したがって、リフュージパッチから出現した成体雌に対するｐＲＮＡｉの効果の相対的な規模は、変化し、ｐＲＮＡｉ効果の割合は、０（リフュージパッチから出現した成体雌に対するｐＲＮＡｉの効果なし）から１（トランスジェニックパッチから出現した成体雌に対するものとリフュージパッチから出現した成体雌に対するｐＲＮＡｉの同じ効果）までの範囲であった。
【０２３８】
このモデルは、ｐＲＮＡｉの効果が、親活性ｄｓＲＮＡを発現する植物組織を成体雄が常食とすることによってもまたは別法として達成される状況を示すように容易に調節することができると思われる。
【０２３９】
２つの抵抗性対立遺伝子の頻度を世代にわたって計算した。抵抗性対立遺伝子の両方（ＲおよびＹ）の初期頻度は、０．００５と仮定した。結果は、抵抗性対立遺伝子のそれぞれの頻度が０．０５に達する昆虫世代の数として示した。ｐＲＮＡｉによってもたらされる抵抗性遅延を検討するために、ｐＲＮＡｉを含めたシミュレーションを、ｐＲＮＡｉを含まなかったが、他のすべての方法が同じであったシミュレーションと比較した。図３。
【０２４０】
モデルは、トランスジェニック作物における殺虫タンパク質と組み合わせて若虫活性干渉ｄｓＲＮＡを含むように修正することもできた。その場合、若虫ＲＮＡｉは、同型接合性ＲＮＡｉ感受性若虫（遺伝子型ＸＸ）の９７％若虫死亡率の効果を帰せられ、同型接合性ＲＮＡｉ抵抗性（ＹＹ）である若虫に対しては効果を帰せられなかった。ＲＮＡｉ抵抗性（ＸＹ）について異型接合性であった若虫の６７．９％の死亡率が存在した。抵抗性の同じ機序が若虫活性ＲＮＡｉおよびｐＲＮＡｉの両方に適用されることが推定された。前述のように、トランスジェニックパッチから出現した成体雌における効果と比較したリフュージパッチから出現した成体雌におけるｐＲＮＡｉ効果は、０から１まで変化した。前述のように、ｐＲＮＡｉによってもたらされる抵抗性の遅延を検討するために、ｐＲＮＡｉを含めたシミュレーションを、ｐＲＮＡｉを含まなかったが、他のすべての方法（若虫ＲＮＡｉを含む）が同じであったシミュレーションと比較した。図４。
【０２４１】
リフュージパッチから出現した成体雌の卵生存能力に対するｐＲＮＡｉ効果の規模がトランスジェニックパッチから出現した成体についての効果の規模と比較して低かった場合、ｐＲＮＡｉの明らかな抵抗性管理の利益が認められた。殺虫タンパク質に加えて親活性ｄｓＲＮＡを産生したトランスジェニック植物は、殺虫タンパク質のみを産生したトランスジェニック植物と比較してはるかに耐久性が高かった。同様に、殺虫タンパク質および若虫活性ｄｓＲＮＡの両方に加えて親活性ｄｓＲＮＡを産生したトランスジェニック植物は、殺虫タンパク質および若虫活性ｄｓＲＮＡのみを産生したトランスジェニック植物と比較してはるかに耐久性が高かった。後者の場合、耐久性の利益は、殺虫タンパク質および殺虫性干渉ｄｓＲＮＡの両方に当てはまるものであった。
【実施例１４】
【０２４２】
半翅目害虫配列およびさらなるＲＮＡｉ構築物を含むトランスジェニック植物
半翅目害虫以外の生物を標的とするｉＲＮＡ分子に転写される、そのゲノムに異種コード配列を含むトランスジェニック植物を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）手法（Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67）により二次的に形質転換して、１つまたは複数の殺虫性ｄｓＲＮＡ分子（例えば、配列番号１を含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を生成する。実施例３で述べたのと本質的に同様に作製された植物形質転換プラスミドベクターを、半翅目害虫以外の生物を標的とするｉＲＮＡ分子に転写される、そのゲノムに異種コード配列を含むトランスジェニック植物から得られた懸濁細胞または未熟胚中にアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換法により送達する。
【実施例１５】
【０２４３】
ＲＮＡｉ構築物およびさらなる半翅目害虫防除配列を含むトランスジェニック植物
半翅目害虫生物を標的とするｉＲＮＡ分子（例えば、配列番号１を含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）に転写される、そのゲノムに異種コード配列を含むトランスジェニック植物を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）手法（Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67）により二次的に形質転換して、１つまたは複数の殺虫性タンパク質、例えば、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３４およびＣｒｙ３５殺虫性タンパク質を生成する。実施例３で述べたのと本質的に同様に作製された植物形質転換プラスミドベクターを、半翅目害虫生物を標的とするｉＲＮＡ分子に転写される、そのゲノムに異種コード配列を含むトランスジェニック植物から得られた懸濁細胞または未熟胚中にアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換法により送達する。半翅目害虫の防除のためのｉＲＮＡ分子および殺虫性タンパク質を産生する二重形質転換植物が得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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