(57)【要約】  企図された抗ウイルス／癌治療は、宿主ゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡのネオエピトープの解析、およびこのようなネオエピトープに対する免疫療法剤の設計を含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のオミックスデータを解析する方法であって、
患者の病変組織のオミックスデータを解析すること、および前記オミックスデータ中の非患者核酸の存在を同定することと、
前記非患者核酸を病原体の参照核酸と相関させることと、
前記病原体の前記参照核酸の複数のエピトープを同定すること、および前記非患者核酸内のネオエピトープを同定することと、
前記複数のエピトープおよび前記ネオエピトープのそれぞれのＨＬＡ適合スコアを計算することと、
前記複数のエピトープおよび前記ネオエピトープの前記それぞれのＨＬＡ適合スコアを使用して、患者特異的免疫療法組成物を生成することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記オミックスデータは、全ゲノムシーケンシングを介して得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オミックスデータが、同じ患者の非病変組織に対して適合される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記病原体がウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記病原体が、前記病原体ゲノムの少なくとも一部分を前記患者ゲノムに組み込む病原体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記参照核酸の前記複数のエピトープが、前記病原体の少なくとも１つの発現された遺伝子について計算される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記病変組織の前記オミックスデータを使用して、前記患者のＨＬＡ型をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで決定するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子の複数の配列を含むＨＬＡ参照配列を提供するステップと、
前記オミックスデータを複数のｋ−ｍｅｒのそれぞれのセットに分けるステップと、
前記ＨＬＡ参照配列および前記複数のｋｍｅｒのそれぞれのセットを使用して複合ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフを作成するステップと、
前記既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子中の対応するセグメントに適合するｋｍｅｒによってそれぞれの票（ｖｏｔｅ）から計算される複合適合スコアを使用して、前記既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子のそれぞれをランク付けするステップと、
前記患者の前記ＨＬＡ型として最上位のＨＬＡ対立遺伝子を同定するステップと、によって前記患者のＨＬＡ型を決定するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数のエピトープおよび前記ネオエピトープの前記それぞれのＨＬＡ適合スコアが、ＭＨＣ−ＩサブタイプおよびＭＨＣ−ＩＩサブタイプの適合スコア間で区別される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者特異的免疫療法組成物が、ＭＨＣ−ＩＩ提示経路についてＭＨＣ−ＩＩと適合するエピトープまたはネオエピトープを誘導し、前記エピトープまたはネオエピトープの前記ＭＨＣ−ＩＩ提示は、１００ｎＭ以下の計算された解離定数を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者特異的免疫療法組成物が、１００ｎＭ以下の計算された解離定数を有するＨＬＡ適合エピトープを使用して生成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者特異的免疫療法組成物が、１００ｎＭ以下の計算された解離定数を有するＨＬＡ適合エピトープを排他的に使用して生成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者特異的免疫療法組成物が、１００ｎＭ以下の計算された解離定数を有するＨＬＡ適合ネオエピトープを使用して生成される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者特異的免疫療法組成物が、１００ｎＭ以下の計算された解離定数を有するＨＬＡ適合ネオエピトープを排他的に使用して生成される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者特異的免疫療法組成物が、癌を治療するために前記患者に投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
患者のオミックスデータを使用する方法であって、
患者の病変組織のオミックスデータを解析すること、および前記オミックスデータ中の非患者核酸または疾患特異的核酸の存在を同定することと、
前記非患者核酸または疾患特異的核酸を病原体の参照核酸または疾患の参照核酸と相関させることと、
前記非患者核酸または前記疾患特異的核酸の複数のネオエピトープをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成することと、
前記複数のネオエピトープのＨＬＡ適合スコアを計算することと、
１００ｎＭ以下の計算された解離定数を有するＨＬＡ適合ネオエピトープをコードする核酸を使用して、前記ＨＬＡ適合ネオエピトープをコードする前記核酸を前記患者に送達することができる核酸構築物を生成することと、を含む、方法。
【請求項１７】
前記非患者核酸がウイルス核酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のネオエピトープが、前記疾患の前記病原体核酸の発現遺伝子について生成される、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸構築物がアデノウイルスを含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸構築物がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９カセットを含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸構築物が、前記非患者核酸または前記疾患特異的核酸に排他的に特異的であるガイドＲＮＡをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
患者のオミックスデータを用いて癌を治療する方法であって、
患者の病変組織のオミックスデータを解析すること、および前記オミックスデータ中の非患者核酸または疾患特異的核酸の存在を同定することと、
前記非患者核酸または疾患特異的核酸を病原体の参照核酸または疾患の参照核酸と相関させることと、
前記非患者核酸または前記疾患特異的核酸の複数のネオエピトープをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成することと、
前記複数のネオエピトープのＨＬＡ適合スコアを計算することと、
１００ｎＭ以下の計算された解離定数を有するＨＬＡ適合ネオエピトープをコードする核酸を生成して、前記ＨＬＡ適合ネオエピトープをコードする前記核酸を前記患者に送達することができる核酸構築物を生成することと、
前記癌を有する患者に前記核酸構築物を含む免疫治療組成物を投与することと、を含む、方法。
【請求項２３】
前記オミックスデータは、全ゲノムシーケンシングを介して得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記オミックスデータが、同じ患者の非病変組織に対して適合される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記病原体がウイルスである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記病原体が、前記病原体ゲノムの少なくとも一部分を前記患者ゲノムに組み込む病原体である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記非患者核酸または前記疾患特異的核酸の前記複数のネオエピトープが、前記病原体の少なくとも１つの発現遺伝子について生成される、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記病変組織の前記オミックスデータを使用して、前記患者のＨＬＡ型をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで決定するステップをさらに含む、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子の複数の配列を含むＨＬＡ参照配列を提供するステップと、
前記オミックスデータを複数のｋ−ｍｅｒのそれぞれのセットに分けるステップと、
前記ＨＬＡ参照配列および前記複数のｋｍｅｒのそれぞれのセットを使用して複合ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフを作成するステップと、
前記既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子中の対応するセグメントに適合するｋｍｅｒによってそれぞれの票から計算される複合適合スコアを使用して、前記既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子のそれぞれをランク付けするステップと、
前記患者の前記ＨＬＡ型として最上位のＨＬＡ対立遺伝子を同定するステップと、によって、前記患者のＨＬＡ型を決定するステップをさらに含む、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数のネオエピトープの前記それぞれのＨＬＡ適合スコアが、ＭＨＣ−ＩサブタイプおよびＭＨＣ−ＩＩサブタイプの適合スコア間で区別される、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫療法組成物が、ＭＨＣ−ＩＩ提示経路についてＭＨＣ−ＩＩと適合したネオエピトープを誘導し、前記ネオエピトープの前記ＭＨＣ−ＩＩ提示が１００ｎＭ以下の計算された解離定数を有する、請求項２２〜３０のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫療法組成物が、１００ｎＭ以下の計算された解離定数を有するＨＬＡ適合ネオエピトープを使用して生成される、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
１００ｎＭ以下の計算された解離定数を有するＨＬＡ適合ネオエピトープを排他的に用いて前記免疫療法組成物が生成される、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年１０月１２日に出願された米国仮出願第６２／２４０４７１号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明の分野は、ウイルス性疾患および新生物性疾患の治療であり、特にこれらはウイルス関連疾患の免疫学的治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
本背景の説明は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であるか、または現在請求されている発明と関連していること、または具体的もしくは暗示的に参照されている出版物がいずれも先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
ヒト乳頭腫ウイルスは、様々な上皮組織に感染する比較的小さいＤＮＡウイルスであり、皮膚型および粘膜親和型に分類することができる。さらに、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）は、感染組織における悪性形質転換を促進するそれらの能力の違いに応じて、低および高リスク型として分類することもできる。例えば、ＨＰＶ型１６および１８は、子宮頸癌の９９％以上に関連する粘膜親和型ＨＰＶである。これらの癌の大部分において、ウイルスＤＮＡゲノムは宿主のゲノムに組み込まれる。ほとんどのＨＰＶ型の感染は、かなりの数の症例において自己限定的である。しかし、特に感染が高リスク型ＨＰＶであった場合、臨床的に関連する患者の一部において、持続感染および新生物形質転換が観察される。
【０００５】
より近年では、ワクチン配合物が、最も一般的な高リスクＨＰＶ型に対して利用可能になっている。残念なことに、ワクチン接種は、一般に、すでに確立された感染に対しては有効ではない。さらに、ワクチン接種は、ウイルスが十分な遺伝的変化を受けた場合にはあまり効果的でないこともある。効果的なＨＰＶ治療は、同時のゲノム不安定性によってさらに複雑になり得る。これらは、ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７と通常のＤＮＡ損傷応答（典型的には宿主ｐ５３およびｐＲｂタンパク質を介して媒介される）との相互作用に一般的に起因する。
【０００６】
したがって、治療およびワクチン接種が改善されたにもかかわらず、ＨＰＶ感染、および特に持続的なＨＰＶ感染に関するいくつかの問題が依然として残っている。したがって、ＨＰＶ感染の治療を改善するシステムおよび方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、現在、オミックス解析を用いて、病原体または疾患に対する免疫療法組成物の有効性を検証または増大させることができることを発見した。好ましくは、患者から得られたオミックスデータは、病原体および／または疾患に関する参照オミックスデータと比較され、ネオエピトープは、病原体および／または疾患についての参照オミックスデータに別の方法で見出されるエピトープと比較して、患者のＨＬＡ型に対して増加したか、または新しいか、かつ／または失われた結合親和性を有する患者のオミックスデータから同定される。さらに、病原体または疾患のオミックス解析は、患者のＨＬＡ型に高親和性で結合することが予想されるネオエピトープの合理的設計を導くためにも使用することができ、このように同定されたネオエピトープは発現のために病変細胞に発現／搬入させることができる。
【０００８】
最も好ましくは、オミックス解析ならびにＨＬＡタイピングおよびＨＬＡマッチングのすべてが、全ゲノムシーケンシングデータを用いてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実施される。さらに、ウイルス性疾患が特に企図されているが、遺伝病因を有する他の疾患もまた好適であると考えられる。
【０００９】
ＨＬＡタイピングは、患者配列データから、特に配列決定装置からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列を用いたＨＬＡタイピングのための高精度変異体呼び出しを伴うことが企図されている。いくつかの実施形態では、患者のＨＬＡ型の決定は、ＨＬＡ参照配列を患者オミックスデータと適合させることを伴う。オミックスデータは、患者の健康な組織から誘導され得るが、好ましい実施形態では、このオミックスデータは病変組織から誘導される。ＨＬＡ参照配列は、既知の異なるＨＬＡ対立遺伝子の複数の配列を含む。患者オミックスデータは、好ましくは複数のｋ−ｍｅｒのそれぞれのセットに分けることができる複数の配列リードを含み、ＨＬＡ参照配列および複数のｋ−ｍｅｒのそれぞれのセットを使用して複合ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフを作成することができる。
【００１０】
好ましい実施形態では、既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子の各々は、票（ｖｏｔｅ）によって計算される複合適合スコアを使用してランク付けされる。票は、既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子の対応するセグメントと適合する各ｋ−ｍｅｒについて集計し、かつ、対立遺伝子をランク付けするために使用され得る。ランク付けにおいて最上位の対立遺伝子は、患者の一次ＨＬＡ型として同定され、一次ＨＬＡ型と適合するｋ−ｍｅｒに対する偏りを有する残りの対立遺伝子を再ランク付けすることで、患者の二次ＨＬＡ型となる。
【００１１】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、同様の数字が同様の構成要素を表す添付の図面とともに、以下の好ましい実施形態の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１の表は、予測されたＨＬＡ型に関してエピトープおよびネオエピトープを結合する例示的な結果を示す。
【図２】図２は、患者ＨＬＡ型に対する高い結合親和性を有する予測された結合変異体エピトープ（ネオエピトープ）を示す（強調表示されている）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、現在、免疫療法組成物の有効性が治療前に容易に確認でき、かつ／または免疫療法組成物が、患者および疾患特異的様式で病変組織を特に標的とするように調製できることを発見した。最も典型的には、企図される組成物、システムおよび方法は、ネオエピトープが獲得されるか、かつ／または人工的に導入される疾患または病原体に関連するネオエピトープの検出に依存する。例えば、ネオエピトープは、宿主ゲノムへのＤＮＡのウイルス挿入（例えば、レトロ）ならびに宿主および病原体のゲノムにおける付随する変化（例えば、ＨＰＶ組み込み後の突然変異率またはゲノム不安定性の増加による）によって獲得され得るか、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１カセットを介した）ネオエピトープ（複数可）をコードする組換え核酸の標的組み込みを介して宿主に導入され得る。最も好ましくは、標的化された挿入は、病原体（例えば、ウイルス）または疾患（例えば、癌遺伝子）に関連する核酸配列中またはその近傍にある。
【００１４】
例えば、本発明の主題の１つの特に企図された態様では、子宮頸癌または前腫瘍性病変（または他のウイルス関連腫瘍）から生検を行い、全ゲノムシーケンシングを行って、このように病変組織のオミックスデータを得るようにする。さらに、発現遺伝子および／または発現レベルを同定するために、エクソーム解析および／またはＲＮＡ解析を行うことができる。このようなものにはさらに、腫瘍に近接する１つ以上のリンパ節および遠隔転移または循環腫瘍細胞からの生検を含み得る。さらに、オミックス解析が行われ、オミックスデータが、患者適合正常組織（すなわち、同じ患者由来の非病変組織）に対して直接に比較され、患者特異的突然変異の変化が得られることが一般に好ましい。
【００１５】
ほとんどの場合、オミックスデータは、標準組織プロセシングプロトコルおよびシーケンシングプロトコルに従って生検試料から得られる。本発明の主題に限定されるものではないが、データが患者適合腫瘍データ（例えば、腫瘍データ対同一患者の正常データ）であり、データフォーマットがＳＡＭ、ＢＡＭ、ＧＡＲ、またはＶＣＦフォーマットであることが典型的には好ましい。しかし、非適合または適合対他の参照（例えば、前の患者の正常データまたは前の患者の腫瘍データ、またはホモ統計学）も本明細書での使用に好適であると考えられる。したがって、オミックスデータは、「新鮮な」オミックスデータまたは前の手順（もしくは異なる患者であっても）から得られたオミックスデータであってもよい。
【００１６】
さらに企図される態様では、オミックス解析は、１つ以上のウイルス配列（例えば、国際公開ＷＯ２０１５／０４８５４６号に記載されているとおり、異なるウイルスまたは血清型のコレクション由来）を含み得る１つ以上の参照核酸配列も使用する。したがって、オミックス解析は、患者の天然核酸配列に限定されるものではなく、このようなオミックス解析はまた、非患者核酸および最も典型的には病原体核酸（例えば、寄生虫、ウイルス、細菌、真菌など）を検索し、同定することが認識されよう。別の例では、参照核酸はまた、以前の生検からの核酸配列、および以前の発癌性突然変異を含む核酸配列データであり得ることも認識されたい。したがって、異なる時点からではあるが、参照配列を患者から得ることもでき、このため、以前に存在しなかったまたは検出されなかった腫瘍におけるクローンドリフトの同定または新規突然変異の導入が可能になる。
【００１７】
別の観点から見ると、迅速な解析は、（健康な宿主組織または非宿主組織から得ることができる）参照ゲノムをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで修飾することによって達成され得ることが企図される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでは、１つ以上の非患者ゲノム配列（および最も好ましくはウイルスゲノム全体）を参照ゲノムと融合させて、キメラ参照核酸配列を形成する。
【００１８】
結果として、本発明者らは、ウイルス関連腫瘍およびキメラ参照核酸配列からの核酸配列を保存する配列データベースに解析エンジンを情報的に連結する方法を企図しており、このキメラ参照核酸配列は少なくとも１つのウイルス核酸配列および哺乳動物核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ参照核酸配列は、代替的または追加的に、少なくとも１つの疾患特異的核酸配列を含む。次いで、解析エンジンを使用して、キメラ参照核酸配列中のウイルス核酸配列のうちの少なくともいくつかと、ウイルス関連腫瘍由来の核酸配列中の対立遺伝子との組み込みを同定する。
【００１９】
キメラ参照核酸配列に使用するのに好適な参照ゲノムとしては、同じ患者の全ゲノム核酸配列が挙げられ、これらは、典型的には非病変組織から得られる。例えば、参照ゲノム核酸は、全血から、癌性組織に隣接する組織から、または頬側スワブもしくは生検から得ることができる。あるいは、参照ゲノムは、患者から早期に採取された試料、または以前の全ゲノムシーケンシングの試行から得られてもよい。さらに別の態様では、参照ゲノムは同じ種（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）由来のゲノム配列、好ましくは性別によって層別化されたもの、または同じ種の平均もしくはコンセンサス配列であってもよい。最も典型的には、参照ゲノムはゲノム全体であるか、またはそれを包含する。しかし、ゲノムの小さい部分も企図され、少なくとも１つの染色体、または２〜５の染色体、または５〜１０の染色体、または１０を超える染色体を含む。あるいは、参照ゲノムは、全エクソームまたは全トランスクリプトームの一部分（例えば、１〜１０％、１０〜３０％、３０〜６０％、または６０〜９０％）の代表のみであってもよい。したがって、かつさらに別の観点から見て、参照ゲノムは、典型的には、ヒト（または他の種）の全ゲノムの少なくとも１０％、または少なくとも３０％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％を含むことになる。
【００２０】
キメラ参照核酸配列において使用するための好適な非患者ゲノムとしては、少なくとも１つのウイルスの全ゲノム核酸配列が挙げられ、より典型的には、疾患と既知の関連を有するウイルスのコレクション、特に、腫瘍関連ウイルス（すなわち、癌性疾患に関連することが公知のウイルス）が挙げられる。例えば、本明細書での使用に適していると考えられるウイルスのゲノム配列は、ＨＴＬＶ−１（成人Ｔ細胞白血病関連）、ＨＰＶウイルス（子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、および肛門性器癌関連）、ＨＨＶ−８（カポジ肉腫、原発性滲出液リンパ腫、キャッスルマン病関連）、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫、上咽頭癌、移植後リンパ腫およびホジキン病関連）、ＨＢＶおよびＨＣＶ（肝細胞癌関連）、ＳＶ４０（脳腫瘍、骨癌、中皮腫関連）、ＢＫＶ（前立腺癌関連）、ＪＣＶ（脳腫瘍関連）、ＨＥＲＶ（胚細胞腫瘍、乳癌、卵巣癌、および黒色腫関連）、ＨＭＴＶ（乳癌関連）、ＫＳＨＶ（カポジ肉腫関連）、ならびにＴＴＶ（消化管癌、肺癌、乳癌、および骨髄腫関連）、のゲノム配列が挙げられる。しかし、好適なウイルスには、特定の疾患関連に関して現在知られていないものも含まれることを認識されたい。
【００２１】
その一方で、本明細書での使用に好適なウイルス配列はまた、１つ以上の共通分類子によって層別化することができ、これらは、ウイルスの群において、臓器特異性（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、癌型特異性、またはリスクタイプを含むことができる。例えば、ウイルスがＨＰＶウイルスである場合、好適な非患者ゲノム配列としては、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、６９、７３、および／または８２など、高リスクの頸部または他の泌尿生殖器癌に関連するものを挙げることができる。最も典型的には、非患者ゲノムは、ゲノム全体であるか、またはそれを包含する。しかし、ゲノムのより小さい部分も企図され、非患者ゲノムの一部分、例えば、１つ以上の単一の非患者遺伝子または転写単位、またはウイルスの全ゲノムの少なくとも１０％、または少なくとも３０％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％を含む。
【００２２】
キメラ参照核酸配列に使用するための好適な疾患特異的核酸配列には、少なくとも１つの疾患特異的な既知のネオエピトープ、スプライス変異または染色体転座が含まれ、より典型的には、疾患特異的な既知のネオエピトープ、スプライス変異、または染色体転座のコレクションが含まれる。例えば、疾患特異的な既知のネオエピトープは、当技術分野で公知のもの、またはＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのペプチドデータベース、免疫エピトープデータベース、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓなどの利用可能なデータベースで同定されたものを含むことができる。疾患特異的スプライス変異は、当技術分野で公知のもの、またはＥｎｓｅｍｂｌ、ＴＣＧＡ  ＳｐｌｉｃｅＳｅｑなど（例えば、子宮頸癌組織におけるＫＬＨＤＣ７Ｂ、ｓｙｃｐ２、またはＨＭＭＲ遺伝子の選択的スプライシング）の利用可能なデータベースで同定されたものを含み得ることを認識されたい。疾患特異的染色体転座には、当技術分野で公知のもの、またはＤｉｓｅａｓｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  Ｏｎｌｉｎｅ、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍｉｔｅｌｍａｎ  Ｄａｔａｂａｓｅなど（例えば、２．３Ｍｂ間隔の子宮頚癌組織における３番染色体の１１ｑ１３転座）の利用可能なデータベースで同定されたものを含み得ることが企図されている。
【００２３】
キメラ参照核酸配列は、参照ゲノム核酸配列に付加される１つ以上の個々の単位として非患者核酸配列（複数可）を含むことが特に好ましい。最も典型的には、それぞれの非患者核酸配列の個々の単位は、個々の染色体として編成／標識される。他の利点の中でも、このような配置（特に、配列比較が漸増同期アライメント（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を用いて行われる場合）を用いることにより、ゲノム組み込み、コピー数決定、および影響を受ける対立遺伝子の位置の迅速な同定が可能になることに留意されたい。したがって、非患者核酸配列は、参照ゲノム核酸配列と同じフォーマット（例えば、ＢＡＭ、ＳＡＭ、ＦＡＳＴＡ、またはＦＡＳＴＡインデックス）で編成されることも企図される。ただし、代替的フォーマットは明示的に除外されない。したがって、上記を考慮して、哺乳動物のキメラ参照核酸配列の染色体数が、ウイルス関連腫瘍由来の核酸配列の染色体数を有意に超え得ることを認識されたい。例えば、キメラ参照核酸配列の染色体数は、ウイルス関連腫瘍由来の核酸配列の染色体数を少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、さらに多く超えてもよい。実際、正確な染色体数は、含まれる非患者ゲノム配列の数によって決定される。
【００２４】
そのために、本発明者らは、患者の病変組織における非患者核酸の存在を同定する方法を企図する。この方法では、哺乳動物組織由来の１つ以上の核酸配列およびそれぞれの異なる供給源（例えば、異なるウイルス、異なる病原体、異なる細菌、それらの組み合わせなど）由来の１つ以上の非患者核酸配列を保存している配列データベースに編集エンジンを情報的に連結することによってゲノム解析のための参照配列を修飾させる。次いで、編集エンジンを用いて、哺乳動物組織由来の核酸配列（複数可）を複数の非患者核酸配列にマージして単一のキメラ核酸配列ファイルとする。当然ながら、このような編集は、比較的少数の選択された非患者ゲノム配列を用いる場合は手動で、ウイルスのコレクションが比較的大きい場合には自動化様式で実施できることを認識されたい。さらに、編集エンジンは、任意のフォーマットの非患者配列を（例えば、哺乳動物／ヒト）参照配列にマージすることができ、また、非患者配列は、いつでも所望の最終フォーマット（例えば、ＢＡＭ、ＳＡＭ、ＦＡＳＴＡ、またはＦＡＳＴＡのインデックスフォーマット）に変換できることを認識されたい。しかし、非患者配列が既に所望の最終フォーマット（例えば、ＢＡＭ、ＳＡＭ、ＦＡＳＴＡ、またはＦＡＳＴＡインデックスフォーマット）にあることが一般に好ましい。例えば、参照配列（複数可）は、関連するＦＡＳＴＡインデックスを有するＦＡＳＴＡファイルに保存され得、次いで、そのファイルは、上記のように１つ以上の非患者ゲノム配列とマージされ得る。所望／必要に応じて、ＢＡＭフォーマットを更に変換することができる。さらに、非患者配列を含む患者の病変問題（ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅｄ  ｉｓｓｕｅ）の配列データも、ＢＡＭファイルに保存することができる。
【００２５】
さらに、キメラ核酸配列の構造に関しては、哺乳動物組織由来の核酸配列が、染色体構造に続く単一のキメラ核酸配列ファイルに編成され（例えば、ＢＡＭフォーマットの場合）、ウイルス核酸配列が、単一のキメラ核酸配列ファイル内でそれぞれの単一の染色体として編成されていることが特に好ましい。一旦キメラ核酸配列ファイルが組み立てられると、このようにして生成されたキメラ核酸配列ファイルを用いて配列データベースを更新することが好ましい。当然、編集エンジンは、哺乳動物組織由来の核酸配列とウイルスゲノム配列ライブラリー由来の１つ以上のウイルス核酸配列とのオンザフライマージ（ｏｎ−ｔｈｅ−ｆｌｙ  ｍｅｒｇｅ）のために用いてもよく、これにより、漸増同期アライメントを以下にさらに説明するように実施できることを認識されたい。好適な配列およびそれの一部分に関しては、上記で既に説明したのと同じ考慮が適用される。
【００２６】
本発明の主題のさらに特に好ましい態様において、キメラ参照核酸配列およびウイルス関連腫瘍由来の核酸配列は、漸増同期アライメントを用いて処理され、ゲノム交換の組み込み、共増幅および位置の迅速な同定が可能になる。例えば、本発明の主題を限定するものではないが、ゲノム解析は、ソフトウェアツールを用いて実施し、このソフトウェアツールでは、キメラ参照核酸配列（健常組織または参照組織由来のゲノム核酸配列を含む）が同期され、ウイルス関連腫瘍（または他の病変組織）由来の核酸配列に対して段階的に比較されることが一般的に好ましい。１つの特に好ましいツールとしては、以前に国際公開ＷＯ２０１３／０７４０５８（Ａ１）に記載されたＢＡＭＢＡＭが挙げられる。
【００２７】
このようなアプローチを使用することで、異種間で組み込まれた配列の存在がそれぞれの試料（例えば、ウイルスおよび患者）内に発見され得るのみでなく、位置、コピー数、突然変異など、その全てが、疾患の存在、進行および／または転帰に関して重要な影響を有し得ることは特に認識されたい。特に、患者ゲノムにおけるウイルス配列の組み込みが、ゲノム突然変異の増加と関連している場合、患者ゲノムに組み込まれたウイルス配列における突然変異も同様に検出され得る。したがって、本発明者らは、１つ以上の異種間の組み込み事象を検出する方法のみでなく、このような事象の特徴付けを行い、その後治療および予後の評価の基礎として使用することを企図する。
【００２８】
例えば、本発明者らはさらに、患者の子宮頸癌由来の核酸配列およびキメラ参照核酸配列を保存している配列データベースに解析エンジンを情報的に連結させる方法を企図しており、キメラ参照核酸配列は、患者由来の参照配列（好ましくは適合した正常な核酸配列）およびＨＰＶウイルスの１つ以上のウイルス核酸配列を含む。次いで、解析エンジンを使用して、キメラ参照核酸配列中のウイルス核酸配列のうちの少なくともいくつかと、子宮頸腫瘍由来の核酸配列中において癌遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子（例えば、ＥＲＢＢ２などの増殖因子受容体をコードする遺伝子、または腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調節に関与する遺伝子、および／または細胞の分裂に関与する遺伝子）との組み込みを同定する。
【００２９】
参照配列は、複数のエピトープを計算するために使用されることが一般に好ましい。最も典型的には、エピトープは、２〜５０個のアミノ酸、より典型的には５〜３０個のアミノ酸、最も典型的には９〜１５個のアミノ酸の長さを有すると計算される。このようなエピトープは、参照配列全体を段階的に網羅してもよいか、または特定の一部分（例えば、エキソンのみ）を網羅してもよい。同様に、非患者核酸は、少なくとも非患者核酸が参照配列と異なる位置について、複数のネオエピトープを計算するために使用される。このようにして計算されたエピトープおよびネオエピトープは、以下にさらに詳細に記載されるように、患者特異的ＨＬＡ型に対するそれらの親和性についてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで解析が行われる。
【００３０】
このようなネオエピトープのＨＬＡ親和性の知識は、以下の少なくとも２項目の貴重な情報を提供することを認識されたい：（ａ）別の方法で免疫療法に適したエピトープの欠失を認識し、それに応じて欠失されたエピトープを標的としないように免疫療法を調節し得る。（ｂ）免疫療法に適したネオエピトープの生成を認識し、それに応じてネオエピトープを標的とするように免疫療法を調節し得る。病原体（または癌遺伝子、または腫瘍抑制遺伝子）の核酸が突然変異率の増加を受ける疾患で、エピトープにおけるこのような変化が特に関連することは、さらに認識されるものとする。このような突然変異率の増加は、ゲノム不安定性に起因し得る。このゲノム不安定性は、病原体または他の遺伝的欠陥（例えば、ウイルスＥ６／Ｅ７遺伝子産物の干渉を介して）、化学療法薬または放射線への曝露などによって導入され得る。異なる観点から見ると、免疫療法治療の選択肢は調節または予測することができ、このため、より効果的な治療に繋がり得る。
【００３１】
ネオエピトープについては、ネオエピトープは、独特の腫瘍特異的抗原を生成する腫瘍細胞におけるランダム突然変異として特徴付けられることを認識されたい。したがって、ハイスループットゲノムシーケンシングは、患者特異的ネオエピトープの迅速かつ特異的な同定を可能にするものである。この解析では、同じ患者の適合した正常組織も考慮する。特に、同時係属中の米国仮出願第６２／１４４７４５号に開示されているように、非常に少数のネオエピトープはある免疫応答を違法にする必要があるようであり、結果的に癌免疫療法の作り出すための独特の機会を提示する。
【００３２】
特に好ましい態様において、腫瘍特異的ネオエピトープは、少なくとも２つの基準を使用して同定される：第一に、腫瘍ゲノム試料中の突然変異が患者の適合した正常試料に対して同定され、オミックスデータ中の非患者（または以前に突然変異した患者）の核酸の存在を検出する。第二に、非患者（または以前に突然変異した患者）の核酸を病原体の参照核酸または同じ患者の事前に突然変異した核酸配列と相関させる。当然のことながら、確認された発現を有する配列は、その後の解析のために一般的に好ましいことに留意されたい。
【００３３】
当然のことながら、癌および患者特異的突然変異に基づいて新しいペプチド配列を導くものを同定するために、同定された配列の差異についてさらなる下流解析を実施し得ることも認識されたい。換言すれば、サイレント突然変異は、同定されたネオエピトープのリストから排除され得る。したがって、ネオエピトープは、変異のタイプ（例えば、欠失、挿入、転換、遷移、転座）および影響（例えば、ナンセンス、ミスセンス、フレームシフトなど）を考慮することによって同定することができ、これは、第１のコンテンツフィルタとして機能し得、このフィルタを介して、サイレントおよび他の非関連（例えば、非発現）突然変異が排除される。ネオエピトープ配列は、比較的短い長さ（例えば７〜１１ｍｅｒ）の配列ストレッチとして定義することができ、このようなストレッチがアミノ酸配列内に変化（複数可）を含むことはさらに認識されたい。最も典型的には、変化したアミノ酸は中心アミノ酸位置またはその近傍にある。例えば、典型的なネオエピトープは、Ａ４−Ｎ−Ａ４、またはＡ３−Ｎ−Ａ５、またはＡ２−Ｎ−Ａ７、またはＡ５−Ｎ−Ａ３、またはＡ７−Ｎ−Ａ２の構造を有することができ、Ａはアミノ酸であり、Ｎは変化したアミノ酸である（野生型または適合した正常と比較して）。
【００３４】
本明細書で企図されるネオエピトープ配列は、比較的短い長さ（例えば、５〜３０ｍｅｒ、より典型的には７〜１１ｍｅｒ、または１２〜２５ｍｅｒ）を有する配列ストレッチとして定義され得、このようなストレッチはアミノ酸配列内に変化（複数可）を含むことをさらに認識されたい。最も典型的には、変化（複数可）は、中心または中心近傍（例えば、中心位置から４未満、または５未満、または６未満のアミノ酸）に位置する。したがって、異なる観点から見ると、本明細書で企図されるネオエピトープ配列は、適合した正常配列に対して単一のアミノ酸が交換されたもの、および変化したアミノ酸の位置がネオエピトープ配列の中心に位置しているか、もしくは中心近傍にあるもの（例えば、９ｍｅｒでは、変化したアミノ酸は２、３、４または５位にあり、より典型的には３、４または５位にあり、最も典型的には４または５位にある）を特に含む。したがって、変化したアミノ酸の位置に応じて、変化したアミノ酸を含む多数のネオエピトープ配列に単一のアミノ酸変化が提示され得ることを認識されたい。有利には、このような配列の可変性により、ネオエピトープの複数の選択肢が可能になり、したがって、１つ以上の望ましい形質（例えば、患者ＨＬＡ型に対する最も高い親和性、最も高い構造安定性など）を基準として選択可能な潜在的に有用な標的の数が増える。最も典型的には、ネオエピトープは、２〜５０個のアミノ酸、より典型的には５〜３０個のアミノ酸、最も典型的には９〜１５個のアミノ酸の長さを有するように計算され、変化したアミノ酸は、好ましくは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）へのその結合を改善する様式で、中心に配置されるか、または別の場所に置かれる。
【００３５】
例えば、エピトープがＭＨＣ−Ｉ複合体によって提示される場合、典型的なエピトープ長は約８〜１１個のアミノ酸であり、ＭＨＣ−ＩＩ複合体により提示するための典型的なエピトープ長は、約１３〜１７個のアミノ酸の長さを有する。容易に認識されるように、ネオエピトープにおける変化したアミノ酸の位置は中心以外であってもよく、実際のペプチド配列およびその配列を有するネオエピトープのその実際のトポロジーはかなり変化し得る。さらに、ネオエピトープが合成ペプチドとして免疫コンピテント（または他の）細胞に提示される場合、合成ペプチドは、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ系によって最終的に結合されるペプチド部分よりも有意に長くなり得、これにより、細胞内でのタンパク質分解プロセシングが可能になることを認識されたい。例えば、企図される合成ペプチドは、このため、変化したアミノ酸の上流および下流に８〜１５個のアミノ酸を有してもよい。
【００３６】
コンピュータ解析を容易にする（および上記のような）好ましい実施形態では、エピトープおよびネオエピトープの解析は、抗体結合に必要な最小サイズ（例えば、少なくとも５〜６個のアミノ酸）、および最大サイズ２０個のアミノ酸（場合によってはさらに長い）を有する比較的小さい断片に限定されることが企図される。したがって、エピトープおよびネオエピトープは、好ましくは、７〜１２個のアミノ酸の長さを有する。例えば、好適なネオエピトープは、変化したアミノ酸を含む９個のアミノ酸の長さを有し得る。
【００３７】
ゲノム解析は、任意の数の解析方法によって実施され得ることが一般に企図されるが、特に好ましい解析方法としては、ＷＧＳ（全ゲノムシーケンシング）ならびに腫瘍および適合した正常試料の両方のエクソームシーケンスが挙げられる。同様に、配列データのコンピュータ解析は、多数の様式で実施され得る。しかし、最も好ましい方法では、例えば、ＢＡＭファイルおよびＢＡＭサーバを用いて、例えば、米国明細書ＵＳ２０１２／００５９６７０（Ａ１）および同ＵＳ２０１２／００６６００１（Ａ１）に開示されている、腫瘍と正常試料の位置誘導同期アライメントにより、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで解析が実施される。コンピュータに向けられたいずれの言語も、サーバ、インターフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラなどのコンピューティングデバイス、または個別にもしくは集合的に動作する他のタイプのコンピューティングデバイスの任意の好適な組み合わせを含むように、読み取るべきであることに留意されたい。コンピューティングデバイスは、有形の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭなど）に保存されたソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサを備えることは認識されたい。ソフトウェア命令は、開示された装置に関して以下に説明するように、役割、責任、または他の機能を提供するようにコンピューティングデバイスを構成することが好ましい。さらに、開示された技術は、コンピュータに基づくアルゴリズム、プロセス、方法、または他の命令の実施に関連する開示されたステップをプロセッサに実行させるソフトウェア命令を保存する非一時的なコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品として具現化することができる。特に好ましい実施形態では、標準化プロトコルまたはアルゴリズムを使用する様々なサーバ、システム、データベース、またはインターフェース交換データは、可能であれば、ＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、公開−非公開鍵交換、ウェブサービスＡＰＩ、既知の金融取引プロトコル、または他の電子的情報交換方法に基づく。デバイス間のデータ交換は、パケット交換ネットワーク、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮ、または他のタイプのパケット交換ネットワーク、回線交換ネットワーク、セル交換網、または他のタイプのネットワークを介して行うことができる。
【００３８】
結果として、患者および腫瘍特異的ネオエピトープは、患者および腫瘍の種類に固有の可能性のあるエピトープまたはネオエピトープを最終的に予測する、排他的ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ環境において同定され得ることは認識されたい。そのように同定され、選択されたエピトープまたはネオエピトープは、次に、同定された患者のＨＬＡ型に対して、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでさらにフィルタ処理され得る。このようなＨＬＡマッチングは、エピトープまたはネオエピトープのＭＨＣ複合体への強い結合を確実に行い、したがって、エピトープまたはネオエピトープに対する免疫応答を引き起こすのを助けると考えられる。選択または同定されたネオエピトープは、患者にとって非天然であり得ることはさらに認識されたい。しかし、対象のエピトープおよびネオエピトープを同定するために、代替的または追加的フィルタ処理方法を使用できることを認識されたい。
【００３９】
同定されたネオエピトープをフィルタ処理することに関して、ネオエピトープは、オミックス（または他の）解析により、実際にネオエピトープが発現することが明らかになる本明細書での使用に特に好適であることが一般に企図されている。ネオエピトープの発現および発現レベルの同定は、当技術分野で公知のあらゆる様式で実施することができ、好ましい方法としては、ＲＮＡ−ｓｅｑ、定量的ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡ）解析および／または定量的プロテオミクス解析が挙げられる。最も典型的には、ネオエピトープを含めるための閾値レベルは、対応する適合した正常配列の少なくとも２０％の発現レベル、より典型的には少なくとも５０％の発現レベルであり、したがって、（ネオ）エピトープは確実に免疫系で少なくとも潜在的に「目に見える」。結果として、オミックス解析はまた、遺伝子発現の解析（トランスクリプトーム解析）も含み、突然変異を有する遺伝子の発現レベルをこのように同定するのを助けることが一般に好ましい。当技術分野で公知のトランスクリプトーム解析法は数多くあり、既知の方法の全てが本明細書での使用に好適であると考えられる。例えば、好ましい物質としては、ｍＲＮＡおよび一次転写物（ｈｎＲＮＡ）が挙げられ、ＲＮＡ配列情報は、同じ患者の腫瘍試料および適合した正常な（健康な）試料から順に得られる逆転写ポリＡ±ＲＮＡから得ることができる。同様に、ポリＡ±ＲＮＡは典型的にはトランスクリプトームの表現として好ましいが、他の形態のＲＮＡ（ｈｎ−ＲＮＡ、非ポリアデニル化ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）も本明細書での使用に適していると考えられることに留意されたい。好ましい方法には、定量的ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡもしくはｍＲＮＡ）解析および／または定量的プロテオミクス解析が含まれる。最も典型的には、ｑＰＣＲおよび／またはｒｔＰＣＲに基づく方法を用いてＲＮＡ定量およびシーケンシングが行われるが、他の方法（例えば、固相ハイブリダイゼーションに基づく方法）も好適であると考えられる。別の観点から見ると、トランスクリプトーム解析は、癌および患者特異的突然変異を有する遺伝子を同定し、定量化するために（単独またはゲノム解析と組み合わせて）好適であり得る。
【００４０】
したがって、上記を考慮して、腫瘍および適合した正常組織由来のＤＮＡおよびＲＮＡを含む患者試料を使用して、特定の突然変異を同定し、このような突然変異を定量化できることを認識されたい。
【００４１】
同様に、プロテオミクス解析は、多数の様式で実施されて、ネオエピトープの発現を確認することができ、全ての既知の様式またはプロテオミクス解析が本明細書において企図される。しかし、特に好ましいプロテオミクス法としては、抗体に基づく方法および質量分光法（例えば、ＳＲＭ、ＣＲＭ、ＭＲＭ）が挙げられる。さらに、プロテオミクス解析は、タンパク質そのものに関する定性的または定量的情報を提供するのみでなく、タンパク質が触媒活性または他の機能的活性を有するタンパク質活性データも含み得ることに留意されたい。プロテオミクスアッセイを実施するための技術の一例としては、２００４年３月１０日に出願の米国特許明細書第７，４７３，５３２号（Ｄａｒｆｌｅｒら）表題「Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅｓ，  Ｔｉｓｓｕｅｓ，  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ」が挙げられる。
【００４２】
さらに、ネオエピトープは、所定の構造的および／または細胞内位置パラメータを使用して、詳細な解析およびフィルタ処理を受けてもよい。例えば、ネオエピトープ配列は、それらが膜関連位置を有するものとして同定される場合（例えば、細胞の細胞膜の外側に位置する場合）、および／またはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ構造計算によってネオエピトープが溶媒に暴露される可能性があり、または構造的に安定なエピトープなどを提示することが確認される場合、さらに使用するために選択されることが企図される。
【００４３】
フィルタ処理のさらに別の態様において、ネオエピトープは、既知のヒト配列を含むデータベースと比較して、ヒトと同一の配列の使用をこのように避けることができる。さらに、フィルタ処理はまた、患者内のＳＮＰに起因するネオエピトープ配列を除去することを含み得る。例えば、Ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｄｂＳＮＰ）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＨＧＲＩ）と協力して国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって開発され、主催されている様々な生物種内および様々な生物種間の遺伝的変異に関する無料公開アーカイブである。データベースの名前は、多型の１つのクラス（すなわち、一塩基多型（ＳＮＰ））のみのコレクションを意味するが、実際には、以下の比較的広い範囲の分子変異を含む：（１）ＳＮＰ、（２）短い欠失および挿入多型（ｉｎｄｅｌ／ＤＩＰ）、（３）マイクロサテライトマーカーまたは短いタンデムリピート（ＳＴＲ）、（４）多ヌクレオチド多型（ＭＮＰ）、（５）ヘテロ接合配列、および（６）名前付きの突然変異体。ｄｂＳＮＰは、明らかに中性の多型、既知の表現型に対応する多型および変化のない領域を受け入れる。このようなデータベースを用いて、患者および腫瘍特異的ネオエピトープをさらにフィルタ処理して、これらの既知の配列を除去し、複数のネオエピトープ配列を有する治療配列セットを得ることができる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ネオエピトープは、対立遺伝子頻度にＴＰＭ数を乗じたものに基づいてスコア付け／ランク付けして、尤度スコアを得ることができる。次にこのスコアは、ＨＬＡ情報および患者のＨＬＡ型に対する計算されたまたは実際の結合親和性を用いてさらに増強することができる。例えば、例示的なランク付け形式は、以下のとおりであってもよい。
【数１】
2018536225.tif 000003
【００４５】
ここで、ファイルはＦＡＳＴＡフォーマットのファイルであり、エントリは文字「＞」で始まる。これは、単に試料情報を報告するのみである。次行はネオエピトープである。試料情報行には、インデックス付けに使用される番号を含む。試料（例えば、２５４）、Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子ＩＤ（例えば、ＮＭ＿００１０００．３）、ＨＵＧＯ一般名（例えば、ＲＰＬ３９）、変異体分類（例えば、ミスセンス）、タンパク質変化（例えば、ｐ．Ｍ２９Ｋ）、塩基対変化（例えば、Ａ−＞Ｔ）、正常エピトープ（例えば、正常：ＷＩＲＭＫＴＧＮＫ）、対立遺伝子頻度（例えば、ＡＦ：０．１７９１０４４７７６１２）、遺伝子のＴＰＭ（例えば、ＴＰＭ：１０２３．９６）、ＴＰＭ＿ＭＥＤＩＡＮ（すべての遺伝子の中央値発現レベル）（例えば、ＴＰＭ＿ＭＥＤＩＡＮ：７．３５）、ＬＬスコア（ちょうどＡＦｘＴＰＭである）（例えば、ＬＬ：１８３．３９５８２０８９６）、ｎｅｔＭＨＣ予測結合値（例えば、ｎｅｔＭＨＣ：２４２．９６）、ネオエピトープが結合する特異的ＨＬＡ対立遺伝子（例えば、対立遺伝子：ＨＬＡ−Ａ０３０１）。次の行はネオエピトープである（例えば、ＷＩＲＫＫＴＧＮＫ）。
【００４６】
漸増同期解析および膨大なサイズのシーケンスファイルでは、本発明の主題の方法をヒトに実施するには全く適さないものであることを認識されたい。これは、このようなファイル解析を行うことで、１日当たり１０，０００の塩基を解析するとしてもヒトの寿命を容易に上回るためである。さらに、ゲノム配置の解の計算は、ヒトによる行為が不可能になる可能性をさらに高める。さらに、キメラ参照核酸の特定のファイル構造（すなわち、ウイルス配列を個々の染色体として編成／インデックス付けさせ、マージしたウイルス核酸配列および哺乳動物核酸配列）は、劇的に解析時間を改善する技術的効果を有することが指摘されるものとする。これは、こうしたファイル構造が、（ａ）配列全体をメモリにロードするのと比較して、多くのメモリを必要とせずに迅速に処理することができ、かつ（ｂ）このような方法が、非患者オミックスのための情報源の数ごとに別途指示されるため、３つ以上ではなく２つのシーケンスファイルの解析のみを必要とするため、エピトープまたはネオエピトープのゲノム組み込みおよび同定の迅速な解析を可能にするためである。
【００４７】
ＨＬＡ決定は、当技術分野において周知の湿式化学法における種々の方法を用いて実施することができ、これらの方法の全ては、本明細書での使用に好適であると考えられる。しかし、特に好ましい方法では、ＨＬＡ型は、以下でより詳細に示されるように、既知のおよび／または共通のＨＬＡ型の大部分または全てを含む参照配列を用いて、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのオミックスデータから予測することもできる。要するに、患者のＨＬＡ型が確認され（湿式化学法またはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ決定を使用して）、ＨＬＡ型の構造解が計算されるか、またはデータベースから取得され、次にそれがｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのドッキングモデルとして使用され、ネオエピトープのＨＬＡ構造解への結合親和性を決定する。結合親和性の決定に好適な系としては、ＮｅｔＭＨＣプラットフォームが挙げられる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８年７月１日；３６（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５０９−Ｗ５１２参照）。次いで、以前に決定されたＨＬＡ型に対して高親和性（例えば、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満）を有するネオエピトープが選択される。最も高い親和性を計算する際に、ネオエピトープに対する修飾は、エピトープにＮ−および／またはＣ−末端修飾を加えて、ウイルスに発現したネオエピトープのＨＬＡ型への結合をさらに増やすことによって実施することができる。したがって、ネオエピトープは、同定されるときに天然型であり得るか、または特定のＨＬＡ型により良く適合するように、さらに修飾されてもよい。
【００４８】
いくつかの態様では、ＨＬＡタイピングは、患者のＨＬＡタイプをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測する方法を伴い、この方法では、既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子の複数の配列を含む参照配列が提供され、かつ複数の患者配列リードが提供され、患者配列リードのうちの少なくともいくつかは、患者特異的ＨＬＡをコードする配列を含む。更なるステップでは、患者配列リードを、複数のｋ−ｍｅｒのそれぞれのセットに分け、次いで、参照配列および複数のｋ−ｍｅｒのそれぞれのセットを使用して複合ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフを作成する。既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子の各々は、複数の患者配列リードのそれぞれの票から計算された複合適合スコアを用いてランク付けされ、各票は、既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子において対応するセグメントに適合するｋ−ｍｅｒを使用することがさらに企図される。
【００４９】
好ましい実施形態では、オミックスデータは、カラーのＤｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフを使用して解析することができ、エッジは、ｋ−ｍｅｒがどの供給源（例えば、参照、正常試料および／または腫瘍試料、異なる時間または年齢で採取された試料、異なる患者または対象群からの試料など）に発見されたかを同定する「色」を有するｋ−ｍｅｒ（ｋ＝１５）であり、および各エッジが隣接するエッジに接続している。例示的なシステムおよび方法は、米国仮出願第６２／２０９８５８号に記載されている。例えば、ゲノム中のｋ−ｍｅｒ位置を保存するために、第１のグラフを参照配列から構築することができる。この参照配列は、すべての既知の（または少なくともすべての共通のＨＬＡ型配列）から構築されることに留意されたい。好ましくは、必要とされる特定のタスクに依存して、ｋ−ｍｅｒは、３〜３００塩基、より好ましくは１０〜１００塩基、最も好ましくは１０〜２０または１３〜１８塩基の長さを有する（例えば、ｋ＝１３）。最初のグラフが確立されると、ゲノムの所与の領域に位置する腫瘍および正常な生シーケンシングデータからのｋ−ｍｅｒ（マッピングされていないアンカーされたリードを含む）が加えられる。必要に応じて、最大サポートが特定のユーザ定義の閾値（例えば、ｋ＝１３であり、閾値は８である）よりも低いリードを刈り込むために、グラフから弱いエッジを除去することができる。このような刈り込みが、通常、配列の予測／アライメントの精度を高める。
【００５０】
さらなるステップにおいて、このように構築された複合グラフは、腫瘍および参照が発散する接合部について解析が行われる。各発散について、縦型探索を使用して、結果的に腫瘍が参照と収束する腫瘍縁部を通るすべての固有の経路を同定する。これは、バブル（ｋ−ｍｅｒを用いた配列情報の違いによって生じる発散点および収束点）として発現し得る。
【００５１】
次に、各バブル解の終点からの統計解析を用いて、最も可能性の高いアラインメントおよび／または配列を同定することができる。最も一般的な実施形態のように、配列は単純な生配列リードではなく、注釈付きＳＡＭまたはＢＡＭファイルであることから、統計解析は各リードのメタデータに基づくリード固有パラメータを含むことができる。したがって、統計解析には、最大サポート、ｋ−ｍｅｒのマッピング／ベース品質、適合正常組織におけるサポートなどが含まれ得る。結果として、参照配列を再構築するための参照エッジに沿ったバックトラック法と、ゲノム中での位置の決定は、典型的にはユーザ定義基準（例えば、最小サポート＞Ｘリード、正常組織中の最大サポート＜Ｙリードなど）を満たすグラフ内での経路について実施され得ることを認識されたい。次いで、こうして再構築された配列および／または構造を使用して、特定の変異体を分類することができる。好ましくは、突然変異体の分類はＶＣＦフォーマットで表されるが、他のフォーマットも企図される。
【００５２】
前述したように、ＨＬＡ／ＭＨＣ参照配列は、典型的には既知の対立遺伝子のライブラリーを含み、このライブラリーはその後、患者のＤＮＡまたはＲＮＡを用いて複合グラフを構築するために使用される参照グラフを形成するために使用される。例えば、患者試料に関してＨＬＡを予測するために、所与のＨＬＡ型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＤＲＢ１、．．．）に対する全ての対立遺伝子のグラフが構築される。本発明の主題に限定するものではないが、単一の患者のＢＡＭファイルからの一対のシーケンシングリードは断片として結合され、ＨＬＡ−Ａグラフを介して「繋がれ」、これによってベストフィットを確立するためにランク付けされる。例えば、問題の断片（共有されたｋ−ｍｅｒの画分として定義される）と最良（または同等）の類似性を有するＨＬＡ対立遺伝子は、各共有ｋ−ｍｅｒについてスコアを１カウント増加させ、次いで、そのスコアに従って最上位のＨＬＡ対立遺伝子を選択することができる。当然のことながら、他のメトリック（例えば、全体的なカバレッジ深度、グラフエッジ、断片によって覆われたＨＬＡ配列の分画など）を収集し、スコアリングに用いることもできることに留意されたい。
【００５３】
最も典型的には、ＨＬＡ参照配列は、少なくとも１％の対立遺伝子頻度を有する少なくとも１つのＨＬＡ型の対立遺伝子を含むか、またはＨＬＡ参照配列は、少なくとも１つのＨＬＡ型の少なくとも１０の異なる対立遺伝子を含み、かつ／または少なくとも２つの異なるＨＬＡ型の対立遺伝子を含む。ＨＬＡ型に関しては、好適なＨＬＡ型は、ＨＬＡ−Ａ型、ＨＬＡ−Ｂ型、ＨＬＡ−Ｃ型、ＨＬＡ−ＤＲＢ−１型、および／またはＨＬＡ−ＤＱＢ−１型を含むことが企図されている。
【００５４】
本発明の主題の１つの例示的な態様では、データベースまたはシーケンシングマシンによって、染色体６ｐ２１．３（またはＨＬＡ対立遺伝子が発見される近傍／その付近にある他の任意の位置）にマッピングする比較的多数の患者配列リードが提供される。最も一般的には、配列リードは、約１００〜３００塩基の長さを有し、リード品質、アライメント情報、配向、位置などのメタデータを含む。例えば、好適なフォーマットには、ＳＡＭ、ＢＡＭ、ＦＡＳＴＡ、ＧＡＲなどが含まれる。本発明の主題に限定されるものではないが、患者配列リードが、少なくとも５倍、より典型的には少なくとも１０倍、さらにより典型的には少なくとも２０倍、最も典型的には少なくとも３０倍のカバレッジ深度を提供することが一般に好ましい。
【００５５】
企図された方法は、患者配列リードに加えて、既知のおよび異なるＨＬＡ対立遺伝子の複数の配列を含む１つ以上の参照配列をさらに使用する。例えば、典型的な参照配列は、そのＨＬＡ型の複数のＨＬＡ対立遺伝子を有する少なくとも１つのＨＬＡ型の配列セグメントを含む合成（対応するヒトまたは他の哺乳動物対応物のない）配列であり得る。例えば、好適な参照配列は、ＨＬＡ−Ａの少なくとも５０の異なる対立遺伝子についての既知のゲノム配列のコレクションを含む。代替的に、または追加的に、参照配列は、ＨＬＡ−Ａの少なくとも５０の異なる対立遺伝子についての既知のＲＮＡ配列のコレクションを含んでもよい。当然のことながら、さらに詳細に後述するように、参照配列はＨＬＡ−Ａの５０の対立遺伝子に限定されず、ＨＬＡ型に関する代替的組成および対立遺伝子の数／組成を有してもよい。最も典型的には、参照配列はコンピュータ可読フォーマットであり、データベースまたは他のデータ記憶装置から提供される。例えば、好適な参照配列フォーマットとしては、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＱ、ＥＭＢＬ、ＧＣＧ、またはＧｅｎＢａｎｋフォーマットが挙げられ、公共のデータレポジトリ（例えば、ＩＭＧＴ、ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、またはＴｈｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｎｅｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＥＵＲＯＳＴＡＭ、www.allelefrequencies.net）のデータから直接得るか、またはこれらのデータから構築されてもよい。あるいは、参照配列は、対立遺伝子頻度、民族対立遺伝子分布、共通または希少対立遺伝子型などの１つ以上の所定の基準に基づいて、個々の既知のＨＬＡ対立遺伝子から構築されてもよい。
【００５６】
ここでは、参照配列を使用して、患者配列リードを、ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフを介して繋げることができ、ベストフィットを有する対立遺伝子を同定することができる。この文脈において、各個体は各ＨＬＡ型について２つの対立遺伝子を保有し、これらの対立遺伝子は非常に類似しているか、場合によっては同一であってもよいことに留意されたい。このような高度の類似性は、従来のアライメントスキームにとって重要な問題を提起する。比較的小さいｋ−ｍｅｒ（典型的には１０〜２０塩基の長さを有する）に配列リードを分けることによってｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフが構築されるアプローチを使用して、および対立遺伝子の配列と適合するその配列リードのｋ−ｍｅｒを基準として、各患者配列リードが対立遺伝子の各々についての票（「定量的リードサポート」）を提供する加重投票プロセスを実施することによって、ＨＬＡ対立遺伝子および非常に密接に関連する対立遺伝子を解明し得ることが企図される。次いで、対立遺伝子の累積的に最も高い票は、予測される最も可能性の高いＨＬＡ対立遺伝子を示す。さらに、対立遺伝子に適合する各断片が、その対立遺伝子の全体的なカバレッジおよびカバレッジ深度を計算するためにも使用されることが、一般に好ましい。高精度ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ＨＬＡタイピングのさらなる態様、好適な方法および考慮事項は、共通に所有されている国際ＰＣＴ／ＵＳ１６／４８７６８に記載されている。
【００５７】
スコアリングは、特に、多くの最上位ヒットが類似している場合（例えば、スコアのかなりの部分が高度に共有されたｋ−ｍｅｒセット由来である場合）、必要に応じて更に改善または改良することができる。例えば、スコアの改良は、現在の最上位ヒットと実質的に類似する対立遺伝子（例えば、＞９９％、または他の所定の値）が将来の検討から除去される重み付けスキームを含むことができる。現在の最上位ヒットによって使用されるｋ−ｍｅｒの数は、因子（例えば、０．５）によって再度重み付けされ、各ＨＬＡ対立遺伝子のスコアは、これらの重み付け数を合計することによって再計算される。この選択プロセスが繰り返し行われて、新しい最上位ヒットを見つける。この方法の精度は、ＤＮＡに存在する２つの対立遺伝子のうちのただ１つであり得る腫瘍によって発現される対立遺伝子の同定を可能にするＲＮＡ配列データを用いてさらに改善され得る。企図されるシステムおよび方法のさらなる有利な態様では、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの両方の組み合わせを処理して、非常に正確であり得るＨＬＡ予測を行うことができ、かつ腫瘍または血液ＤＮＡまたはＲＮＡから誘導され得る。
【００５８】
このような改良は、各ＨＬＡ型が多くの場合非常に類似した対立遺伝子を有するために、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡシーケンシング情報からのＨＬＡ決定に特に有利である。また、従来のアライメント方法は、典型的には、配列が高度の類似性を有する場合には有意な差別化能力を有さない。
【００５９】
当然のことながら、解析およびＨＬＡ予測は、上に示した特定のＨＬＡ型に限定される必要はなく、本明細書では、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＨＬＡ−Ｊ、ＨＬＡ−Ｋ、ＨＬＡ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｖ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ３４５、ＨＬＡ−ＭＩＣＡ、ＨＬＡ−ＭＩＣＢ、ＨＬＡ−ＴＡＰ１、ＨＬＡ−ＴＡＰ２、などの全てのＨＬＡ型および対立遺伝子多型、さらには新たに発見されたＨＬＡ型およびそれらの対応する対立遺伝子が企図されることを認識されたい。さらに、解析は単一のＨＬＡ型に限定される必要はなく、複数のＨＬＡ型が本明細書での使用に好適であることを認識されたい。結果として、参照配列は、それぞれのＨＬＡ型についての対立遺伝子のコレクションを有する２つ、３つ、４つまたはそれ以上のＨＬＡ型を含み得る。各ＨＬＡ型は有意な数の対立遺伝子を有するので、既知の対立遺伝子の全てを参照配列に含める必要はないことが企図される。例えば、参照配列は、少なくとも０．１％、または少なくとも０．５％、または少なくとも１％、または少なくとも２％、または少なくとも５％の対立遺伝子頻度などの特定の閾値を上回る対立遺伝子頻度を有する対立遺伝子を含んでもよい。したがって、異なる観点から見ると、好適な参照配列は、少なくとも１つのＨＬＡ型に対して、少なくとも１０個、または少なくとも３０個、または少なくとも５０個、または少なくとも１００個、または少なくとも２００個、または少なくとも５００個、またはそれ以上の異なる対立遺伝子を含み得る。
【００６０】
一旦、患者および腫瘍特異的ネオエピトープおよびＨＬＡ型が同定されると、ネオエピトープをＨＬＡにドッキングさせ、最良の結合剤（例えば、最低ＫＤ、例えば、５０ｎＭ未満）を決定することによって、コンピュータ解析を行うことができる。このようなアプローチは、患者および腫瘍にとって真性である特定のネオエピトープを同定するだけでなく、細胞上に提示される可能性が最も高いネオエピトープおよび治療効果を有する免疫応答を誘発する可能性が最も高いネオエピトープも同定するであろうことを認識されたい。当然のことながら、このように同定されたＨＬＡ適合ネオエピトープは、さらに後述するようにエピトープをコードする核酸をペイロードとしてウイルスに含める前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生化学的に検証できることも認識されたい。
【００６１】
当然のことながら、患者および腫瘍特異的ネオエピトープに対する患者のＨＬＡ型の適合は、ＮｅｔＭＨＣ以外のシステムを用いて行うことができ、好適なシステムとしては、ＮｅｔＭＨＣ  ＩＩ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、ＩＥＤＢ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵＲＬ  immuneepitope.org）、ＲａｎｋＰｅｐ、ＰＲＥＤＥＰ、ＳＶＭＨＣ、Ｅｐｉｐｒｅｄｉｃｔ、ＨＬＡＢｉｎｄｉｎｇ、およびその他が挙げられる（例えば、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１；３７４：１−４参照）ことは認識されたい。最も高い親和性を計算する際には、変更されたアミノ酸の位置が移動したネオエピトープ配列のコレクション（上記）を用いることができることに留意されたい。代替的に、または追加的に、ネオエピトープの修飾は、発現されたネオエピトープの患者へのＨＬＡ型への結合をさらに増やすために、Ｎ−および／またはＣ−末端修飾を加えることによって実施され得る。したがって、ネオエピトープは、同定されるときに天然型であり得るか、または特定のＨＬＡ型により良く適合するように、さらに修飾されてもよい。
【００６２】
さらに、所望の場合、対応する野生型配列（すなわち、アミノ酸変化のないネオエピトープ配列）の結合を計算して、確実に高い示差的親和性とすることができる。例えば、ネオエピトープとその対応する野生型配列との間のＭＨＣ結合における特に好ましい高い示差的親和性は、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍など）である。
【００６３】
このような方法は、特定の患者ゲノムに組み込まれたウイルス配列の特異的突然変異など、特定の患者ゲノムにおける特定の突然変異に基づいて免疫療法治療のための新しいウイルスエピトープを同定するという利点を提供することを認識されたい。このようなウイルスエピトープは、「従来」のワクチン接種プロトコルでは同定できない。
【００６４】
遺伝子修飾されたアデノウイルスの「ペイロード」については、２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、およびそれ以上のネオエピトープの発現が好ましく、これは、複数の別個の修飾ウイルス、または（例えば、コンカテマーまたはキメラ配列として）２つ以上のネオエピトープ配列を有するウイルスを用いて達成され得ることが企図されている。
【００６５】
次いで、同定されたＨＬＡ適合ネオエピトープは、１つ以上のタイプの患者、腫瘍、および位置特異的免疫療法において使用されることが好ましい。例えば、免疫療法は、免疫応答を誘発するように発現させるためにウイルス媒介性癌抗原を送達することを含んでもよく、これは、チェックポイント阻害剤でさらに増強され得る。一方、このように同定されたネオエピトープに対する患者特異的抗体、腫瘍特異的抗体および位置特異的抗体（または合成抗体）は、薬物または放射性化学物質の標的化部分として使用され得るか、またはＮＫ細胞と共に使用されて、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発し得る。
【００６６】
組換えウイルスを使用する場合、組換えウイルスを作製する全ての既知の様式が本明細書での使用に好適であると考えられるが、特に好ましいウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど、遺伝子治療において既に確立されているものであることが企図される。しかし、他の適切な選択の中でも、アデノウイルスが特に好ましい。さらに、ウイルスが、選択されたウイルスタンパク質（例えば、Ｅ１、Ｅ３タンパク質）の標的化された欠失によって典型的に達成される複製欠損および非免疫原性ウイルスであることが、さらに一般に好ましい。このような望ましい特性は、Ｅ２ｂ遺伝子機能を欠失させることによってさらに増強され得、高力価の組換えウイルスは、近年報告された（例えば、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８年２月；７２（２）：９２６−９３３）などの遺伝子修飾ヒト２９３細胞を用いて得ることができる。最も典型的には、（ウイルス感染細胞からの発現のための）所望の核酸配列は、当技術分野で周知の適切な調節エレメントの制御下にある。
【００６７】
最も好ましくは、組換え核酸（複数可）の治療用調製物は、エピトープがＭＨＣ−１および／またはＭＨＣ−ＩＩ提示経路に向けられるような配置で、癌関連もしくは癌特異的エピトープ、または患者特異的ネオエピトープをコードする。このような免疫刺激は、皮下送達または共刺激分子および／もしくはチェックポイント阻害剤の（より典型的な）発現によってさらに増強される、より頑強な免疫応答を生じると考えられる。当然のことながら、こうした組換え核酸（複数可）の全ての送達様式が好適であると考えられ、組換え核酸（複数可）は、ＤＮＡワクチンとして配合され得るか、組換えウイルスゲノムの一部であるか、またはトランスフェクション組成物中において送達可能であり得ることは認識されたい。さらに、ウイルスビヒクル（およびペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブなどの任意のチェックポイント阻害剤）の皮下投与は、適切なＢ細胞応答および付随するＩｇＧ１産生をもたらし、これらは、移入されたＮＫ細胞を使用して増幅し得る。最も好ましくは、修飾ＮＫ細胞は高親和性Ｆｃγ受容体（ＣＤ１６）を含み、（腫瘍関連エピトープおよび／またはネオエピトープに対して高い特異性を有する）キメラ抗原受容体をさらに発現し得る。
【００６８】
ウイルスは、典型的には、投与単位当たり１０４〜１０１１個のウイルス粒子のウイルス力価を有する滅菌注射用組成物として配合される、医薬組成物中の治療用ワクチンとして個々にまたは組み合わせて使用され得る。しかし、代替的配合物も本明細書での使用に好適であると考えられ、全ての既知の投与経路および投与様式が本明細書において企図される。本明細書中で使用される場合、医薬組成物または薬物を「投与する」という用語は、医薬組成物または薬物の直接投与および間接的投与の両方を指し、医薬組成物または薬物の直接投与は、典型的には、医療従事者（例えば、医師、看護師など）によって実施され、間接的投与には、直接投与（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達などを介して）のために医薬組成物もしくは薬物を医療従事者に提供するか、または利用できるようにするステップを含む。
【００６９】
最も好ましい態様では、シグナルペプチドは、エンドソームおよびリソソーム区画への輸送のために、または細胞質空間における保持のために使用され得る。例えば、ペプチドがプレ配列を標的とするエンドソームおよびリソソーム区画に搬出される場合、内部標的ペプチドを使用することができる。標的ペプチドのプレ配列は、好ましくはＮ末端に付加され、６〜１３６個の塩基性および疎水性アミノ酸を含む。ペルオキシソームが標的の場合、標的配列はＣ末端にあってもよい。他のシグナル（例えば、シグナルパッチ）を使用してもよく、ペプチド配列において分離し、適切なペプチドの折り畳みの際に機能的になる配列エレメントを含むことができる。さらに、グリコシル化などのタンパク質修飾は、標的化を誘導し得る。他の好適な標的シグナルのうち、本発明者らは、ペルオキシソーム標的シグナル１型（ＰＴＳ１）、Ｃ末端トリペプチド、およびＮ末端近くに位置するノナペプチドであるペルオキシソーム標的シグナル２型（ＰＴＳ２）を企図する。さらに、エンドソームおよびリソソームへのタンパク質の選別は、タンパク質の細胞質ゾルドメイン内のシグナル（典型的には短い線状配列を含む）によって媒介されてもよい。いくつかのシグナルは、チロシンベースの選別シグナルと呼ばれ、ＮＰＸＹまたは
【数２】
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コンセンサスモチーフに適合する。ジロイシンベースのシグナルとして公知の他のシグナルは、［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］またはＤＸＸＬＬコンセンサスモチーフに適合する。これらのシグナルは全て、膜の細胞質面の周辺に関連するタンパク質コート成分によって認識される。
【数３】
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および［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］シグナルは、アダプタタンパク質（ＡＰ）複合体ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３およびＡＰ−４によって特徴的な細かい特異性により認識されるが、ＤＸＸＬＬシグナルは、ＧＧＡとして公知のアダプタの別のファミリによって認識される。また、液胞タンパク質の選別およびエンドソーム機能に関連するＦＹＶＥドメインを加えることができる。さらなる態様において、エンドソーム区画は、ヒトＣＤ１テール配列を用いて標的化することもできる（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２２，５２２−５３１参照）。
【００７０】
このような方法は、そのペプチドが別の方法でそのＭＨＣサブタイプによって提示されなくても、ペプチドとの最も高い親和性を有するＭＨＣサブタイプへのペプチドの特異的送達を可能にすることを認識されたい。
【００７１】
細胞質ゾル区画への輸送または細胞質ゾル区画内での保持は、必ずしも１つ以上の特異的配列要素を必要としない場合がある。しかし、少なくともいくつかの態様では、膜アンカータンパク質または膜アンカータンパク質の膜アンカードメインなど、ＮまたはＣ末端の細胞質保持シグナルが加えられてもよい。例えば、膜アンカータンパク質としては、ＳＮＡＰ−２５、シンタキシン、シナプトプレビン（ｓｙｎａｐｔｏｐｒｅｖｉｎ）、シナプトタグミン、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）、シナプス小胞糖タンパク質（ＳＶ２）、高親和性コリン輸送体、ニューレキシン、電位依存性カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼおよびＮＯＴＣＨが挙げられる。
【００７２】
さらに別の企図される態様では、様々なネオエピトープを多数の様式で配置することができ、転写または翻訳単位は、典型的には短いリンカー（例えば、４〜２０個のアミノ酸を有するフレキシブルリンカー）によって分離された複数のエピトープのコンカテマー配置を有することができ、これはさらにプロテアーゼ切断部位を含み得ることに留意されたい。このようなコンカテマーは、１〜２０個のネオエピトープ（典型的には、ウイルスを介して送達され得る組換え核酸のサイズによって制限される）を有することができ、コンカテマーは、ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ複合体への送達について同一であり得るか、または異なることに留意されたい。したがって、ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩによる優先的または特異的な提示をこのように達成するために、様々なペプチドを特定の細胞区画に送ることができることを認識されたい。別の観点から見ると、腫瘍関連抗原およびネオエピトープは、両方の提示経路を介して、または同時にもしくは連続した投与経路で選択的に一方もしくは他方の経路を介して提示され得ることを認識されたい。さらなる好適な構成および発現カセットに関しては、２０１６年２月１１日に出願された同時係属中の米国仮出願、表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ」、またはそれに関連する出願を参照する。
【００７３】
本発明の主題に限定されるものではないが、ネオエピトープ配列は、タンデムミニ遺伝子（例えば、ａａ１２−ネオエピトープ１２−ａａ１２）として、または単一の転写単位として構成されることが一般に好ましく、これはキメラタンパク質に翻訳されてもされなくてもよい。このように、エピトープは、上記ですでに論じたように、単量体、多量体、個々にもしくはコンカテマーとして、またはＮ末端および／もしくはＣ末端ペプチドとのハイブリッド配列として提示することができることを認識されたい。最も典型的には、核酸配列は、ウイルスおよび／または宿主コドンの選好に適応するために好適なコドン使用を用いて逆翻訳されることが好ましい。しかし、代替コドン使用または非適合コドン使用もまた適切であると考えられる。
【００７４】
さらに、ウイルス送達ビヒクルは、少なくとも１つ、より典型的には少なくとも２つ、より典型的には少なくとも３つ、最も典型的には少なくとも４つの共刺激分子もコードして、感染した樹状細胞とＴ細胞との間の相互作用を増強することが好ましい。例えば、好適な共刺激分子としては、特にＢ７．１（ＣＤ８０）および／またはＢ７．２（ＣＤ８６）と組み合わせたＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−ＬおよびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）が挙げられる。さらに企図される共刺激分子としては、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０ＬおよびＴＬ１Ａが挙げられる。さらに、共刺激分子の発現は、好ましくは、抗原および／またはネオエピトープが１つ以上の共刺激分子と共に提示されるように配位されることを認識されたい。したがって、典型的には、共刺激分子は、内部リボソーム進入部位もしくは２Ａ配列を使用する単一転写産物から、または複数の転写産物から産生されることが企図される。
【００７５】
同様に、ウイルスベクターは、チェックポイント受容体に結合する１つ以上のペプチドリガンドをコードする配列部分をさらに含むことが企図される。最も典型的には、結合は受容体を介するシグナル伝達を阻害するか、少なくとも低減する。特に企図される受容体としては、ＣＴＬＡ−４（特にＣＤ８＋細胞）ＰＤ−１（特にＣＤ４＋細胞）が挙げられる。例えば、ペプチド結合剤としては、抗体断片、特にｓｃＦｖ、および受容体に特異的に結合する小分子ペプチドリガンドを挙げることができる。さらに、ペプチド分子の発現は、好ましくは、抗原および／またはネオエピトープが１つ以上のペプチド分子と共に提示されるように配位されることを認識されたい。したがって、典型的には、ペプチド分子は、内部リボソーム進入部位もしくは２Ａ配列を使用する単一転写産物から、または複数の転写産物から産生されることが企図される。
【００７６】
最後に、ウイルスが複数のネオエピトープをコードする核酸ペイロードを含む場合、複数のネオエピトープが少なくとも付加的にまたは相乗的に宿主免疫応答を増強し得ることが企図されることに留意されたい。同様に、複数のウイルスが異なるネオエピトープを有する各ウイルスとともに使用される場合、複数のネオエピトープが少なくとも付加的にまたは相乗的に宿主免疫応答を増強し得ることが企図される。このような付加的または相乗的効果は、特定の腫瘍または病期に対して真性であり得るか、または特定の患者パラメータ（例えば、年齢、性別、以前の治療など）に特異的であり得る。
【００７７】
１つ以上の患者およびウイルス特異的ネオエピトープに対する合成抗体は、ｎ−ｍｅｒ長（典型的には７〜１１ｍｅｒ）を有する固有のネオエピトープ配列を得るためにオミックスデータのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析（典型的には、全ゲノムシーケンシングおよび発現プロファイリング）によって生成され得る。次いで、これらの配列を用いて実際のペプチド配列を調製する。例えば、癌性ネオエピトープ配列を有するペプチドは、固相（例えば、メリフィールド合成を用いて）で、液相合成を介して、またはより小さいペプチド断片から調製することができる。あまり好ましくない態様では、ペプチドは、好適な宿主での（特に複数のネオエピトープが単一のペプチド鎖上にあり、任意によりネオエピトープまたは切断部位の間にスペーサーがある場合）組換え核酸の発現によって産生させることもできる。ペプチドは固相に固定化され、ネオエピトープに対する特異的結合親和性を有するフィッシング抗体の餌として使用される。次いで、抗体を解析し、解析の結果を用いて合成組換え抗体を調製する。このようにして産生された合成抗体（合成体（ｓｙｎｂｏｄｙ））は結果的に、患者特異的エピトープに高特異性で結合することが期待される。最も顕著なことに、このような合成体は、患者突然変異のコンピュータ解析から収集された情報のみを使用して完全に人工的に生成される。
【００７８】
例えば、１つ以上のペプチドネオエピトープ（例えば、９ｍｅｒ）を固体担体（例えば磁性または色分けしたビーズ）上に固定化し、表面提示抗体断片または抗体に結合させるための餌として使用することができる。最も典型的には、このような表面提示抗体断片または抗体は、Ｍ１３ファージ（例えば、タンパク質ＩＩＩ、ＶＩＩＩなど）と会合しており、抗体断片に関する多数のライブラリーが当技術分野で公知であり、本明細書中に提示された教示と併せて好適である。必要に応じて、より小さいライブラリーを使用して、親和性成熟に供して、当技術分野で周知の方法を用いて結合親和性および／または動力学を改善することもできる（例えば、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ第１巻、第２号、１８９‐２０３．２００２年７月参照）。さらに、抗体ライブラリーが一般に好ましいが、他の足場もまた好適であると考えられ、βバレル、リボソームディスプレイ、細胞表面ディスプレイなどが含まれることに留意されたい（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００６年１月；１５（１）１４−２７参照）。しかし、合成ネオエピトープを使用して、モノクローナル抗体を含む抗体を作製する他の従来の様式も本明細書において明らかに企図される。
【００７９】
合成ペプチド（癌性ネオエピトープを含むまたは対応する）が固相に固定化されるいくつかの実施形態では、ネオエピトープに対する親和性薬剤、ならびに特に抗体を単離および／または精製することができる。最も好ましくは、このような単離には、予め作製された抗体の高多様性ライブラリーが含まれる。本明細書で使用されるとき、文脈によって別段の指示がない限り、用語「抗体（複数可）」は、抗体の全てのアイソタイプおよびサブタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）、ならびにこれらの全ての断片、一価のＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＶｈＨなどが挙げられる。さらに、ヒトまたは非ヒト（例えば、げっ歯類）起源の企図される抗体は、ヒト化され得るか、またはキメラであり得る。典型的な方法において、高多様性ライブラリーは、典型的にはＭ１３ファージに基づき、少なくとも１０９の多様メンバー、または少なくとも１０１０の多様メンバー、もしくはそれ以上の多様性を有するファージディスプレイライブラリー、ならびにｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩ、もしくはｐＩＸを介するか、またはＴ７ファージおよび遺伝子１０キャプシドタンパク質に基づくディスプレイであってもよい。容易に認識されるように、大きな多様性ライブラリーを使用することで、最良の結合剤についてさらに選択され得るいくつかの結合候補抗体が比較的短時間で提供される。実際、固定化合成ペプチドに対する結合親和性が所望よりも小さい場合、当技術分野で周知のプロトコルを用いて親和性成熟によって親和性を改善できることを認識されたい。例えば、低親和性（ＫＤ＞１０−７Ｍ）の結合剤またはより小さいライブラリーのメンバーを、親和性成熟に供して、当技術分野で周知の方法を用いて結合親和性および／または動力学を改善することができる（例えば、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  Ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、１巻、第２号、１８９‐２０３．２００２年７月参照）。さらに、抗体ライブラリーが一般に好ましいが、他の足場もまた好適であると考えられ、βバレル、リボソームディスプレイ、細胞表面ディスプレイなどが含まれることに留意されたい（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００６年１月；１５（１）１４−２７参照）。したがって、好ましい態様では、合成ペプチドは抗体ライブラリー中において餌として使用され、高親和性結合（ＫＤ＜１０−７Ｍ、より典型的にはＫＤ＜１０−８Ｍ）抗体をこのように同定することを認識されたい。
【００８０】
抗体は、これらの抗体をコードする核酸を保有する細胞に直接結合するので、このような核酸を解析して、それぞれ、軽鎖および重鎖のならびに／またはＳＤＲ（特異性決定残基）の高頻度可変性ループ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をコードする配列要素を同定することができることをさらに認識されたい。最も典型的には、決定は標準的なシーケンシング法を用いて行われる。一旦決定されると、高頻度可変性ループ、またはＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、および／もしくはＣＤＲ３−Ｈ、および／またはＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ２−Ｌおよび／もしくはＤＲ３−Ｌ、ならびに／またはＳＤＲは、ヒトまたはヒト化抗体足場または抗体上にグラフトされることが企図される。容易に認識されるように、グラフトは、ヒトまたはヒト化抗体足場または抗体をコードする核酸の遺伝子工学によって行うことができる。例えば、各ＣＤＲ内には、抗原との相互作用に直接関与するより多くの可変位置、すなわち特異性決定残基（ＳＤＲ）が存在するが、ＣＤＲループのコンフォメーションを維持するより保存された残基が存在する。ＳＤＲは、抗原−抗体複合体の３Ｄ構造および／またはＣＤＲの突然変異解析から同定され得る。ＳＤＲグラフトヒト化抗体は、ＳＤＲおよびＣＤＲのコンフォメーションをヒト鋳型上に維持する残基をグラフトすることによって構築される。したがって、癌性ネオエピトープに対する特異性を有するヒトまたはヒト化抗体は、事前に抗原と接触していない細胞において抗体が発現される完全合成様式で調製され得ることは認識されたい。さらに、企図された方法では、ネオエピトープに対する抗体を産生しないかまたは効果的に使用することができなかった患者の治療のための患者および癌特異的抗体の産生が可能になる。
【００８１】
本発明の主題に限定するものではないが、このように調製された合成抗体は、ＩｇＧ（または他のアイソタイプ）として、断片（例えば、二重特異性Ｆａｂもしくは他の二重特異性断片）として、および／またはキメラタンパク質として（例えば、キメラＴ細胞受容体中の外部ドメインとしてのｓｃＦｖなど）、単独で、または治療剤もしくは診断剤と結合させて、および／または細胞への抗体の膜アンカーを確実に行うための膜貫通ドメインを有するハイブリッドタンパク質として、直接使用することができる。
【００８２】
ネオエピトープ配列に対応するかまたはそれを含む合成ペプチドの構造は、Ｘ−Ｌ１−（Ａｎ−Ｌ２）ｍＱであってもよく、式中、Ｘは、共有結合または非共有結合により、合成ペプチドを固相に付着させるのに好適である任意のカップリング基または部分であり、Ｌ１は、合成ペプチドを固相またはカップリング基に共有結合によりリンクする任意のリンカーであることが企図される。Ａｎは、Ａが天然（タンパク質原性）アミノ酸であり、ｎが７〜３０の整数であり、最も典型的には７〜１１または１５〜２５の整数である、ネオエピトープ配列を有する合成ペプチドである。Ｌ２は、特に複数の合成ペプチド配列（同一または異なる）が構築物中に存在し得える任意のリンカーであり、ｍが整数、典型的には１〜３０、最も典型的には２〜１５の整数である。最後に、Ｑは、合成ペプチドの末端を固相（例えば、ペプチドを立体的に拘束するため）、またはレポーター基（例えば、蛍光マーカー）または他の機能的部分（例えば、親和性マーカー）に連結するために使用され得る末端基である。結果として、合成ペプチドが直接ＭＨＣ−１結合に使用される場合、全長は８〜１０個のアミノ酸であることに留意されたい。同様に、合成ペプチドが直接ＭＨＣ−ＩＩ結合に使用される場合、全長は１４〜２０個のアミノ酸である。一方、ＭＨＣ提示の前に合成ペプチドが細胞内でプロセシングされる場合（典型的にはプロテアソームプロセシングを介して）、全長が典型的には１０〜４０個のアミノ酸であり、変化したアミノは、合成ペプチド中の中心位置にあるか、中心位置の近傍にある。
【００８３】
例えば、Ｘは、固相上の対応する結合剤（例えば、アビジン）に結合する非共有結合親和性部分（例えば、ビオチン）であり得るか、または、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のアミノもしくはカルボキシル基と反応する化学基（スペーサーを有するかもしくは有さない）であり得るか、またはペプチドもしくはリンカーＬ１中のスルフヒドリル基と反応する選択的反応性の基（例えば、ヨードアセチルもしくはマレイミド基）であり得る。Ｌ１は、合成ペプチドの固相からの距離を増加させるために使用され得、したがって、典型的には、Ｌ１は、約２〜２０個の炭素−炭素結合（例えば、０．３ｎｍ〜３ｎｍ）に等しい長さを有するフレキシブルな直鎖部分（例えば、グリコール基、アルコキシ基、グリシンなどを含む）を含む。当然のことながら、合成ペプチドは、固相上にペプチドが生成され、したがって別個のカップリング基またはリンカーを必要としない固相を使用し得ることも認識されたい。
【００８４】
特定の合成ペプチドおよびカップリング方法に依存して、固相の性質がかなり変わることがあり、ペプチドの付着のための既知の固相は全て、本明細書での使用に好適であると考えられることは認識されたい。例えば、好適な固相としては、アガロースビーズ、ポリマービーズ（着色または他の方法で個別に対応可能）、マイクロタイタープレート中のウェルの壁面、紙、ニトロセルロース、ガラスなどが挙げられる。当業者は、固相および付着化学的性質の好適な選択を容易に評価することができる。さらに好ましい態様では、固相は一般に、ファージ（または他の足場担体）上に提示されたペプチドが、合成ペプチドを介して固相に可逆的に結合し得るなどの、ファージディスプレイ法に関連するプロトコルに好適であることに留意されたい。さらに企図される用途において、固相は、特に、合成タンパク質が哺乳動物においてワクチンとして、または抗体産生のために非ヒト哺乳動物において免疫原性化合物として使用される場合には、ワクチン接種に使用される担体タンパク質（例えば、アルブミン、ＫＬＨ、破傷風トキソイド、ジフテリア毒素など）であり得ることが認識されよう。同様に、合成タンパク質は、いかなる担体もなく、ワクチンまたは免疫原性化合物として使用することもできる。
【００８５】
合成ネオエピトープに結合する抗体断片または抗体を同定する特定の方法にかかわらず、表示された抗体断片または抗体は、提示構造体（例えば、細胞またはファージ）を介して、表示された抗体の産生を導く対応する遺伝情報、およびそれにより、結合ポケットを形成するために必要なヌクレオチド配列に関する情報を提供することを認識されたい。例えば、表示された構造体が抗体断片または抗体である場合、核酸配列は、それぞれ軽鎖および重鎖の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインの配列情報を提供する。次いで、この情報は、軽鎖および重鎖のそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインの配列情報がグラフトされた核酸配列をインビトロで生成するために使用することができる。次いで、好適な系へのトランスフェクションは、同一の結合特性を有する合成抗体（「合成体」）の発現および産生をもたらす。当然のことながら、抗体という用語は、全長抗体ならびにその断片／部分を含むことに留意されたい。
【００８６】
次いで、このようにして産生された抗体断片または抗体をさらに修飾させて、治療または診断エンティティを作り出すことができる。例えば、抗体断片または抗体が（例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ活性の）同位体で標識されている場合、修飾された抗体断片または抗体を画像化に使用することができる。一方、抗体断片または抗体が放射性核種または化学療法剤で標識されている場合、修飾された抗体断片または抗体は、標的化学療法のために使用され得る。さらに企図される態様では、抗体断片または抗体は、免疫原性抗原であることが公知である抗原で修飾することもできる。このような修飾は、患者が以前に同じ抗原で免疫された場合に特に有利である。このようなシナリオでは、ネオエピトープを有する癌細胞は、免疫原性抗原を提示する修飾された抗体で塗装されることが企図される。これは、元のネオエピトープに対する免疫応答が免疫原性でないかまたは抑制されていない場合に特に有利である。
【００８７】
本出願人は、本発明の主題によって同定されたペプチド（例えば、ＴＡＡ、ネオエピトープなど）と共に患者のバルク白血球（ＷＢＣ）を培養することができることをさらに認識している。このようなアプローチは、バルクＷＢＣ中の抗原提示細胞による所望のＭＨＣ／ネオエピトープ複合体の産生を引き起こすことが予想される。したがって、患者のマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞は、病変組織を標的とする所望の性質を呈するように、ＮＫ細胞およびＴ細胞に指示を与える。
【００８８】
本発明の技術のさらに別の態様は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞など）に関連する１つ以上の特徴を検出する方法を含む。より具体的には、試験は、ネオエピトープ反応性Ｔ細胞の同定に用いることができる特定のネオエピトープ（例えば、ＭＨＣＩについては８ｍｅｒ〜１２ｍｅｒ、ＭＨＣＩＩについては１２ｍｅｒ〜２５ｍｅｒなど）を提供することができる。このＴ細胞は、ネオエピトープ／ＭＨＣタンパク質複合体に対する特異的Ｔ細胞受容体を有する。したがって、この方法は、ネオエピトープ反応性Ｔ細胞を採取することを含むことができる。採取されたＴ細胞は、患者に再度組み込むための準備として、エクスビボで増殖または拡大することができる。あるいは、採取されたＴ細胞中のＴ細胞受容体遺伝子を単離し、ウイルスまたは他の養子細胞治療システム（例えば、ＣＡＲ−Ｔ、ＣＡＲ−ＴＡＮＫなど）に移入することができる。ネオエピトープ以外に、本発明の主題の方法は、１つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）も提供し得る。したがって、試験から同定されたＴＡＡに対して感受性である受容体を有するＴ細胞を採取することもできる。これらはまた、エクスビボで増殖または培養され、上述のような同様の治療様式で使用され得る。Ｔ細胞は、合成例のペプチドを産生し、商業的に産生されたＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質と結合させ、次いでこれらのエクスビボ複合体を用いて標的Ｔ細胞に結合させることによって同定することができる。採取されたＴ細胞には、疾患、枯渇Ｔ細胞、または論じられた特徴に応答する他のＴ細胞に対する患者の免疫応答によって活性化されたＴ細胞が含まれ得ることが認識されたい。
【００８９】
別の観点から見ると、ネオエピトープに対する抗体は、ＮＫ細胞、特にＮＫ−９２細胞（高親和性Ｆｃ−細胞受容体を呈するようにさらに修飾されていてもよい）を使用して、標的エンティティとして使用することができる。したがって、本発明の主題のさらに企図された態様において、抗体断片または抗体は、ネオエピトープを表示する細胞に対してこのように免疫応答を刺激し、指向させるために、Ｔ細胞、特にＮＫ細胞に結合され得る。結果的に、患者または他の生物において、免疫化を必要としないプロセスを用いることで、癌性ネオエピトープに対する有効な免疫応答が誘発され、治療抗体の応答時間および利用可能性が劇的に低下する可能性があることは認識されたい。
【００９０】
枯渇Ｔ細胞は、いくつかの異なる経路を介して再活性化され得ることがさらに企図される。１つの経路としては、細胞を再活性化するために、採取された枯渇Ｔ細胞にサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５など）を外因的に添加することが挙げられる。再活性化されたＴ細胞は、おそらくチェックポイント阻害剤（例えば、イピリムマブなど）と共に患者に戻って再度導入することができる。別の経路は、遮断点チェックポイント阻害による枯渇を防ぐことであり、これは、標的のネオエピトープおよび好適な阻害剤（例えば、ＬＡＧ３など）を有するテーラードウイルスを投与することによって達成することができる。
実施例
【００９１】
本発明の主題の方法の一例として、ＨＰＶ１６を保有する子宮頸癌患者を生検し、組織試料を上記のように解析した。非患者参照配列は、ＨＰＶ１６参照配列を含むＨＰＶ配列を含んでいた。特に、配列解析は、ウイルスゲノム中のいくつかの突然変異も明らかにし、４つのネオエピトープを導いた。より具体的には、Ｅ６遺伝子において４つの変異体が見出され、Ｅ７遺伝子において１つの変異体が見出された。ウイルス参照配列を使用する、ＨＰＶ１６ウイルスに対するワクチンのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ生成により、Ｅ６およびＥ７にわたって、２４２個の可能性のあるエピトープを生成させた。患者のオミックス配列データもまたＨＬＡ型を予測するために使用され、その結果を以下の表１に示す。エピトープのＨＬＡ型への結合、ならびにネオエピトープの患者のＨＬＡ型への結合を計算した。次いで、この第２の計算を使用して、患者が結合可能であったエピトープにＨＰＶ１６中の変異体が有意に影響を及ぼすか否かを決定した。
【表１】
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【００９２】
図１の表は、予測されたＨＬＡ型に関してエピトープおよびネオエピトープを結合する例示的な結果を示す。予測された結合エピトープおよびネオエピトープが強調表示されている。第１の列（エントリ）は、評価された２４２個のエピトープおよびネオエピトープのいくつかの識別子を列挙する。第２の列（ペプチド）は、Ｅ６およびＥ７にわたる野生型エピトープおよびネオエピトープのアミノ酸配列を列挙する。第３の列から第７の列（ＨＬＡ−Ａ０２：０１；ＨＬＡ−Ａ６８：０１；ＨＬＡ−Ｂ４４：０２；ＨＬＡ−Ｂ４４：０３；およびＨＬＡ−Ｃ０５：０１）は、予測された患者のＨＬＡ型の一部について、列挙されたエピトープおよびネオエピトープの予測される結合親和性（ｎＭ）を列挙する。注目すべきことに、この例では、高い予測結合親和性（＜５００ｎＭ）を有するエピトープおよびネオエピトープが強調表示されている。第８の列（遺伝子）は、同定する場合には、参照遺伝子のエピトープおよびネオエピトープを同定している（本明細書では、ＨＰＶ１６のＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子）。第９の列（影響を受けた変異体）は、アミノ酸配列によりネオエピトープを同定している。ネオエピトープは、野生型エピトープまたは第２の列のネオエピトープの変異である。
【００９３】
注目すべきことに、エントリ＿７０は、検出されたＨＰＶ１６変異体によって有意に変化する図１に示された唯一のエピトープである。別の観点から見ると、本発明の主題の方法は、患者のゲノム中のＨＰＶ１６配列の突然変異、本明細書では、ＫＬＰＱＬＣＴＥＬからＫＬＰＤＬＣＴＥＬへのＨＰＶ１６参照アミノ酸配列の突然変異を含む患者およびウイルス特異的ネオエピトープを確実に同定した。
【００９４】
図２は、患者ＨＬＡ型に対する高い結合親和性を有する予測された結合変異体エピトープ（ネオエピトープ）を示す（強調表示されている）。個別ＨＰＶワクチンは、ＨＰＶ１６参照ゲノムに基づくか、または健康組織オミックスと病変組織オミックスとの比較に基づいてもよく、図２の２つの変異体エピトープ（ネオエピトープ）を標的化することができなかったことは、特に認識されたい。別の観点から見ると、図２に列挙されたネオエピトープの同定は、ウイルス参照ゲノムと患者ゲノム中に特異的に組み込まれた（および潜在的に引き続き突然変異した）ウイルス配列と比較することなく行うのは不可能である。有利には、患者におけるネオエピトープにつながるミスセンス突然変異は、図２に列挙する患者のＨＬＡ型のうちの少なくとも１つに結合すると予測された。
【００９５】
具体的には、図２に示すように、ネオエピトープＫＬＰＤＬＣＴＥＬは、グアニンからチミンへの野生型Ｅ６核酸配列の塩基変化の結果生じ、野生型グルタミンから変異型アスパラギン酸へのアミノ酸変化を生じる。有利に、ネオエピトープＫＬＰＤＬＣＴＥＬは、ＨＬＡ−Ａ０２：０１では、非常に高い予測結合親和性を有する（１２ｎＭ）。さらに、ネオエピトープＦＱＤＰＱＥＲＰＩは、グアニンからチミンへの野生型Ｅ６核酸配列の塩基変化の結果生じ、野生型アルギニンから変異型イソロイシンへのアミノ酸変化を生じる。ネオエピトープＦＱＤＰＱＥＲＰＩは、ＨＬＡ−Ｃ０５：０１では高い予測結合親和性を有する（２９９ｎＭ）。
【００９６】
したがって、ウイルスＤＮＡが、本発明の主題の方法を用いることによって、比較的高い突然変異率および／またはゲノム不安定性を受ける場合に、ワクチン効力を予測することさえできることは認識されたい。また、本明細書に提示されたデータからも分かるように、患者のＨＬＡ型に結合する１８個の全予測エピトープが同定され、非結合変異体が生成されることにより１つのエピトープも存在せず、これらの変異体により２つのネオエピトープが生成された（およびさもなければ失われた）。
【００９７】
本発明の主題のさらに別の態様では、既に上記で簡単に述べたように、ネオエピトープをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで計算し、続いて罹患組織内の１つ以上の組換え核酸から発現させることもでき、核酸の送達が、好ましくは遺伝子および／または細胞特異的様式で行われる。例えば、病変組織に組み込まれたウイルスＤＮＡが含まれている場合、その非患者ＤＮＡは、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ複合体のアデノウイルスベクター送達を用いて特異的に変化させることができる。これにより、ウイルスＤＮＡに、（典型的にはＨＬＡ適合）宿主において免疫原性であることが既知であるか、または疑われるエピトープがもたらされる。このような送達のための例示的プロトコルは、Ｎａｔｕｒｅ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４、Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｎｕｍｂｅｒ：５１０５（２０１４年）に見出すことができる。一方、病変組織が癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の変異型を含む場合、免疫原性ネオエピトープを細胞に導入するＤＮＡを送達することができる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を記載および請求するために使用される、成分の量、濃度、反応条件などの特性を表す数字は、場合によっては、用語「約」によって変更されると理解されるものとする。したがって、いくつかの実施形態では、記載された説明および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の切り上げ法を適用して解釈されるべきである。
【００９９】
本明細書の説明および以下の特許請求の範囲を通じて使用されるように、「ａ」「ａｎ」「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明確に別のように指示しない限り、複数の言及を含む。また、本明細書の説明で使用されているように、「ｉｎ（において）」の意味は、文脈が明確に別のように指示しない限り、「ｉｎ（において）」および「ｏｎ（の上で）」の意味を含む。文脈が反対に指示しない限り、本明細書に記載された全ての範囲は、その終点を含むものとして解釈されるべきであり、オープンエンド形式の範囲は、商業的に実用的な値を含むと解釈されるべきである。同様に、文脈が反対を示さない限り、値の全てのリストは中間値を含むものとして考慮されたい。
【０１００】
本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書の特定の実施形態に関して提供される任意のおよび全ての例、または例示的な言語（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に本発明をよりよく示すことを意図しており、別に請求された本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な任意の請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【０１０１】
本明細書の発明概念から逸脱することなく、既に説明した以外の多くの変更が可能であることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されるものではない。さらに、明細書および特許請求の範囲の両方を解釈するにあたり、全ての用語は、文脈と一致する最も広い可能な様式で解釈されるべきである。特に、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、要素、構成要素またはステップを非排他的様式で参照するものとして解釈されるべきであり、参照された要素、構成要素、またはステップは、明示的に参照されていない他の要素、構成要素、またはステップと共に存在するか、利用するか、または組み合わせてもよい。明細書の請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ、…．、およびＮからなる群から選択されるものの少なくとも１つを指す場合、Ａ＋Ｎ、またはＢ＋Ｎなどではなく、その群の１つのみの要素を必要とするものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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