(57)【要約】本発明は、TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリンおよびFASからなる群より選択される内因性遺伝子の発現をダウンレギュレートすることのできる核酸を有し、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸、またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードするエレクトロポレーションされた核酸をさらに含む、改変T細胞を作製するための組成物および方法に関する。また、養子療法のため、および自己免疫疾患などの状態を処置するための改変T細胞を含む方法および薬学的組成物も含まれる。2018500006.tif 000007
2018500006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸；ならびに
標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸
を含む改変T細胞。
【請求項２】
遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる前記核酸が、アンチセンスRNA、アンチゴマー（antigomer）RNA、siRNA、shRNA、およびCRISPR系からなる群より選択される、請求項1記載の改変T細胞。
【請求項３】
CRISPR系がpAd5/F35-CRISPRベクターを含む、請求項2記載の改変T細胞。
【請求項４】
前記改変TCRが、野生型TCR、高親和性TCRおよびキメラTCRからなる群より選択される、請求項1記載の改変T細胞。
【請求項５】
前記改変TCRが少なくとも1つのジスルフィド結合を含む、請求項1記載の改変T細胞。
【請求項６】
前記改変TCRがTCR α鎖およびTCR β鎖を含む、請求項1記載の改変T細胞。
【請求項７】
前記改変TCRが、前記鎖のうち少なくとも1つの鎖のC末端に共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項6記載の改変T細胞。
【請求項８】
前記共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項7記載の改変T細胞。
【請求項９】
TCR β鎖が少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、請求項6記載の改変T細胞。
【請求項１０】
TCR α鎖が少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、請求項6記載の改変T細胞。
【請求項１１】
前記改変TCRが少なくとも1つのマウス定常領域を含む、請求項1記載の改変T細胞。
【請求項１２】
前記改変TCRが、野生型TCRの場合よりも標的細胞表面抗原に対する親和性が高い、請求項1記載の改変T細胞。
【請求項１３】
標的細胞表面抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原（TAA）、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、請求項1記載の改変T細胞。
【請求項１４】
共刺激分子をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項1記載の改変T細胞。
【請求項１５】
共刺激分子がCD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、請求項14記載の改変T細胞。
【請求項１６】
CD3が少なくとも2つの異なるCD3鎖を含む、請求項15記載の改変T細胞。
【請求項１７】
前記異なるCD3鎖がCD3ζ鎖およびCD3ε鎖である、請求項16記載の改変T細胞。
【請求項１８】
TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸をT細胞に導入する段階；ならびに
標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸をT細胞に導入する段階
を含む、改変T細胞を作製するための方法。
【請求項１９】
遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる前記核酸が、アンチセンスRNA、アンチゴマーRNA、siRNA、shRNA、およびCRISPR系からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
CRISPR系がpAd5/F35-CRISPRベクターを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
TCRをコードする前記核酸がTCR α鎖およびTCR β鎖を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
標的細胞表面抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原（TAA）、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
前記TCRが、野生型TCR、高親和性TCRおよびキメラTCRからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
T細胞が、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
T細胞を拡大する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
T細胞を拡大する段階が、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションを受けたT細胞を培養することを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
キメラ膜タンパク質が、CD3に対する一本鎖可変断片（scFv）を含み、細胞内ドメインが、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの一部分を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
T細胞を拡大する段階が、T細胞を、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともに培養することを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
T細胞を凍結保存する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項３０】
T細胞に前記核酸を導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸を導入する段階が、拡大されたT細胞に形質導入を行うこと、拡大されたT細胞にトランスフェクションを行うこと、および拡大されたT細胞にエレクトロポレーションを行うことからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項３２】
共刺激分子をコードするRNAをT細胞中にエレクトロポレーションする段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項３３】
共刺激分子がCD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
T細胞の多能性を誘導するためにT細胞においてKlf4、Oct3/4およびSox2を発現させる段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項３５】
請求項1記載の改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物をその必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫亢進と関連した疾患または状態を処置する方法。
【請求項３６】
請求項1記載の改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法。
【請求項３７】
前記状態が自己免疫疾患である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
自己免疫疾患が、後天性免疫不全症候群（AIDS）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病（AIED）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ALPS）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎（celiac sprue-dermatitis hepetiformis）；慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（CIPD）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（PSS）、これは全身性硬化症（SS）としても知られる）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記状態が、がんである、請求項36記載の方法。
【請求項４０】
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
請求項1記載の改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法。
【請求項４２】
標的細胞または組織の溶解を誘導する段階をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
誘導される溶解が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
請求項1記載の改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物を、対象にとって有害である免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法。
【請求項４５】
その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、請求項1記載の改変T細胞の使用。
【請求項４６】
請求項18記載の方法に従って作製された、改変T細胞を含む組成物。
【請求項４７】
請求項18記載の方法に従って作製された改変T細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は米国特許法第119条(e)の下、2014年10月31日付で出願された米国仮特許出願第62/073,651号の優先権を有しており、それらの出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府資金による研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって助成されたCA120409の下での政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
キメラ抗原受容体(CAR)改変T細胞を用いる養子細胞移入(ACT)は、がんの処置のための有望な戦略であることが示されている(Louis et al., 2011, Blood 118:6050-6056（非特許文献1）; Kochenderfer et al., 2010, Blood 116:3875-3886（非特許文献2）およびPorter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-733（非特許文献3）)。
【０００４】
レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いた組み込みに関連する安全性の懸念は、ACTに用いられる細胞の改変にとって大きな懸案事項である。T細胞受容体(TCR)またはCAR RNAエレクトロポレーションによるT細胞のRNAトランスフェクションなど、オンターゲットまたはオフターゲットの望ましくない副作用を避けるために、いくつかの進歩がなされている(Zhao, 2006, Mol Ther 13:151-159（非特許文献4）; Mitchell et al., Smits et al., 2004, Leukemia 18:1898-1902（非特許文献5）)。RNAおよびT細胞の両方の投与量を最小化することによって、そのような方法は、複数の遺伝子の細胞への導入を効率的に可能にする。しかしながら、CARの一過性発現の主な制約は、RNAトランスフェクションされたT細胞の準最適なエフェクター活性および機能性である。CARの機能を改善するため、複数回のT細胞注入および/または低用量化学療法のかなりの使用が用いられている(Barrett et al., 2013, Hum Gene Ther 24(8):717-27（非特許文献6）)。
【０００５】
併用療法および追加処置の必要性を避けると同時にCARのエフェクター活性および機能性を改善するために、様々な試みがなされている。トランスフェクションプロセス中のRNAの増加は、T細胞機能、特にインビボでの抗腫瘍活性に悪影響を及ぼす(Barrett et al., 2011, Hum Gene Ther 22:1575-1586（非特許文献7）)。抗CD3抗原抗体断片を抗腫瘍抗原抗体断片に融合させた別の構築体もまた、がん処置のための臨床試験において試験されている(Bargou et al., 2008, Science 321:974-977（非特許文献8）; Klinger et al., 2012, Blood 119:6226-6233（非特許文献9）)。残念ながら、これらの構築体は、短い半減期、標的細胞部位への接近性不良、および適切な長期シグナル伝達機能の欠如という理由から、機能が著しく制限されていた。
【０００６】
TCRの臨床研究は、形質導入されたTCRの発現レベルが低いことに加えて、α鎖とβ鎖の誤対合が妨げとなっている。T細胞が2種類の異なるTCR（ネイティブ性α/β、外因性α/β、およびネイティブ性/外因性「誤対合」ヘテロダイマー）の鎖を転写する場合には4種類のTCRが細胞表面に発現される可能性があるため、このアプローチを用いる上での重大障壁となっているのは明らかである。これまでに実施された諸研究では、前臨床試験により、TCR誤対合が有害な自己抗原認識を誘導する恐れがあることが明らかに実証されている。
【０００７】
がんの処置を目的とするTCRおよびCAR T細胞の初期の臨床データでは有望な結果が示されているが、患者に対するリスクは大きく、また、一部の患者のT細胞は、TCRまたはCARの再方向付け（redirection）を行って同種ドナー由来T細胞の強制的な改変を行った後でも、有効な処置となるのに十分な効力を持たない。しかし、注入された同種T細胞上の内因性αβ T細胞受容体がレシピエントにおいて主要組織適合抗原および副組織適合抗原を認識して、移植片対宿主病（GVHD）を招く可能性はある。その結果として、自己CAR T細胞の注入を用いる現行の臨床試験の大半は、養子細胞移入後の正常組織のTCRを介した有害な認識を防ぐ免疫寛容に頼っている。このアプローチは、初期的な臨床的成果を挙げてはいるが、患者特異的なT細胞製品を製造する時間および費用が制約となっている。このため、患者特異的なT細胞製品を製造するための時間および費用を免れながらT細胞を改変するための、より安全な方法に対しては需要が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Louis et al., 2011, Blood 118:6050-6056
【非特許文献２】Kochenderfer et al., 2010, Blood 116:3875-3886
【非特許文献３】Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-733
【非特許文献４】Zhao, 2006, Mol Ther 13:151-159
【非特許文献５】Mitchell et al., Smits et al., 2004, Leukemia 18:1898-1902
【非特許文献６】Barrett et al., 2013, Hum Gene Ther 24(8):717-27
【非特許文献７】Barrett et al., 2011, Hum Gene Ther 22:1575-1586
【非特許文献８】Bargou et al., 2008, Science 321:974-977
【非特許文献９】Klinger et al., 2012, Blood 119:6226-6233
【発明の概要】
【０００９】
本明細書において記載するように、本発明は、TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子の遺伝子発現を変化させることができる核酸を有し、かつ標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸をさらに含む、改変T細胞を作製するための組成物および方法に関する。
【００１０】
本発明の1つの局面は、TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸；ならびに標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸を含む、改変T細胞を含む。
【００１１】
別の局面において、本発明は、TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸をT細胞に導入する段階；ならびに標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸をT細胞に導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法を含む。
【００１２】
さらに別の局面において、本発明は、本明細書に記載された改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫亢進と関連した疾患または状態を処置する方法を含む。
【００１３】
なお別の局面において、本発明は、本明細書に記載の改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法を提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を含む。
【００１５】
さらに別の局面において、本発明は、本明細書に記載の改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物を、対象にとって有害である免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法を含む。
【００１６】
なお別の局面において、本発明は、その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本明細書に記載の改変T細胞の使用を含む。
【００１７】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の方法に従って作製された改変T細胞を含む組成物を含む。
【００１８】
さらに別の局面において、本発明は、本明細書に記載の方法に従って作製された改変T細胞を含む薬学的組成物を含む。
【００１９】
本明細書において描写される本発明の上記の諸局面および任意の他の局面のさまざまな態様において、遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸は、アンチセンスRNA、アンチゴマー（antigomer）RNA、siRNA、shRNA、およびCRISPR系、例えばpAd5/F35-CRISPRベクターなどからなる群より選択される。
【００２０】
1つの態様において、改変TCRは、野生型TCR、高親和性TCRおよびキメラTCRからなる群より選択される。別の態様において、改変TCRは、少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。さらに別の態様において、改変TCRはTCR α鎖およびTCR β鎖を含む。なお別の態様において、改変TCRは、前記鎖のうち少なくとも1つの鎖のC末端に、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインなどの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。別の態様において、TCR β鎖は少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む。さらに別の態様において、TCR α鎖は少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む。なお別の態様において、改変TCRは少なくとも1つのマウス定常領域を含む。
【００２１】
別の態様において、改変TCRは、野生型TCRの場合よりも標的細胞表面抗原に対する親和性が高い。なお別の態様において、標的細胞表面抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原（TAA）、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される。
【００２２】
別の態様において、本明細書に記載の改変T細胞は、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lなどの共刺激分子をコードする外因性核酸をさらに含む。1つの態様において、本明細書に記載の改変T細胞を作製する方法は、共刺激分子をコードするRNAをT細胞中にエレクトロポレーションする段階をさらに含む。共刺激分子がCD3であるいくつかの態様において、CD3は少なくとも2つの異なるCD3鎖、例えばCD3ζ鎖およびCD3ε鎖などを含む。
【００２３】
別の態様において、T細胞は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる。
【００２４】
さらに別の態様において、本明細書において記載されたような改変T細胞を作製する方法は、T細胞を拡大する段階をさらに含む。1つの態様において、T細胞を拡大する段階は、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションを受けたT細胞を培養することを含む。キメラ膜タンパク質のT細胞内へのエレクトロポレーションが行われるいくつかの態様において、キメラ膜タンパク質はCD3に対する一本鎖可変断片（scFv）を含み、細胞内ドメインはCD28および4-1BBの細胞内ドメインの一部分を含む。別の態様において、T細胞を拡大する段階は、T細胞を、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともに培養する段階を含む。
【００２５】
なお別の態様において、本明細書において記載されたような改変T細胞を作製する方法は、T細胞を凍結保存する段階をさらに含む。別の態様において、本明細書に記載の方法は、核酸をT細胞に導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む。
【００２６】
1つの態様において、核酸を導入することは、拡大されたT細胞に形質導入を行うこと、拡大されたT細胞にトランスフェクションを行うこと、および拡大されたT細胞にエレクトロポレーションを行うことからなる群より選択される。
【００２７】
さらに別の態様において、本明細書に記載の方法は、T細胞の多能性を誘導するために、T細胞においてKlf4、Oct3/4およびSox2を発現させる段階をさらに含む。
【００２８】
本明細書において描写される本発明の上記の諸局面および任意の他の局面のさまざまな態様において、本発明は、改変T細胞を対象に投与することを含む。1つの態様において、対象は、自己免疫疾患などの状態を有する。いくつかの態様において、自己免疫疾患は、後天性免疫不全症候群（AIDS）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病（AIED）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ALPS）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎（celiac sprue-dermatitis hepetiformis）；慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（CIPD）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（PSS）、これは全身性硬化症（SS）としても知られる）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。別の態様において、状態はがん、例えば、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるがんである。
【００２９】
別の態様において、本明細書に記載の方法は、標的細胞または組織の溶解、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）などを誘導する段階をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことにより、より良く理解されるであろう。本発明を実例で説明するために、現時点で好ましい態様を図面として示している。しかし、本発明は、図面中に示された態様の厳密な配置および手段には限定されないことが理解されるべきである。
【図１】図1A〜1Cで構成される図1は、CRISPRのデザインおよび293T細胞におけるTCR αβ-CD3複合体のターゲティングの説明図である。図1Aは、TCR-αおよびβ定常領域のゲノム遺伝子座内のCRISPR gRNAターゲティング部位を示している。各エクソンはブロックによって示されている。黒のブロックはコード領域を表している。グレーの柱状部は非コード領域を表している。13種類のgRNAをTCR α定常領域（TRAC）のエクソン1を標的とするように設計し、10種類のgRNAをTCR β定常領域1（TRBC1）および2（TRBC2）のエクソン1上の保存された配列を標的とするように設計し、10種類のgRNAをβ-2ミクログロビン遺伝子のエクソン1を標的とするように設計した。図1Bは、典型的なgRNAスカフォールド配列を示している。gRNA PCR産物をオーバーラップPCRによって生成させて、T7プロモーターとともにMSGVベクター中にクローニングした。図1Cは、細胞内へのCAS9 mRNAおよびgRNAのトランスフェクション後の293T TCR TRACおよびTRBCのゲノムPCR産物中に複数のピークが存在することを示す、サンガー法によるシークエンシングの結果を示している。
【図２】図2A〜2Eで構成される図2は、初代T細胞におけるTCR αβ-CD3複合体の破壊を示している。図2Aは、BTX830による初代T細胞へのCAS9 mRNAおよびgRNAのエレクトロポレーションのために用いたパラメータを示している表である。2mmキュベットに360V 1msを用いたところ、day3ビーズにより刺激した初代T細胞のエレクトロポレーションに関して最良の平均蛍光強度（MFI）および効率が得られた。図2Bは、通常の37℃ 5％ CO2条件よりもはるかに高いMFIを有する、32℃ 5％ CO2でインキュベートしたT細胞を示している一群のグラフである。図2Cは、初代T細胞内に移入したCRISPR系の概略説明図である。初代T細胞のビーズ刺激から3日後に、T細胞内へのCAS9 mRNAおよびgRNAのエレクトロトランスファーを行った。続いてT細胞を100lU/mLのIL-2とともに培養し、一部の細胞は32℃ 5％ CO2の下で1日培養し、続いてさらに7〜9日培養した。エレクトロポレーションの7〜9日後にCD3の発現をフローサイトメトリーによって分析した。図2Dは、37℃でのターゲティング効率が32℃での約2.5倍の高さであることを示している一群のグラフである。図2Eは、TCR βを標的とするさまざまな量および比のCAS9およびgRNAのエレクトロトランスファーから6日後のCD3のダウンレギュレーションを示している一群のグラフである。CD3発現を、CD3に対する染色によって分析した。エレクトロポレーション後の第6日時点の代表的なフローデータを示している。四半分（quadrant）は、T細胞集団におけるCD3陰性細胞のパーセンテージを示している。
【図３】図3A〜3Dで構成される図3は、T細胞におけるTCRneg αまたはβノックアウト体は、TCRpos T細胞の除去によって濃縮できることを示している。図3Aは、T細胞におけるTCRneg αまたはβノックアウト体の、マイクロビーズ除去の前および後のCD3発現を示している一群のグラフである。フローサイトメトリーはCD3の発現を図示している。右下の四半分における数字は、T細胞集団におけるCD3陰性細胞のパーセンテージを表している。図3Bは、複数のピークがCD3neg濃縮T細胞のゲノムPCR産物中に観察されたことを示している一群のシークエンシングのグラフである。図3Cは、CRISPRによって改変されたα鎖、β鎖の単一ノックアウトT細胞、およびαβ二重ノックアウトT細胞における、CD3マイクロビーズ濃縮後のCD4およびCD8 T細胞レパートリー分析を示している一群のグラフである。データは、CD8 T細胞集団の比がCRISPR改変によって強化されたことを示しており、これはCD8 T細胞がCD4 T細胞よりも容易に改変されうることを示唆している。図3Dは、CRISPR改変後にTCR αおよびβ遺伝子座に導入された欠失および挿入のシークエンシングの結果を示している。
【図４】図4A〜4Cで構成される図4は、gRNAの複数回のエレクトロトランスファーにより、初代T細胞におけるCRISPR系のターゲティング効率が大きく向上したことを示している。図4Aは、gRNAの複数回のエレクトロポレーションにより、ターゲティング効率が大きく向上したことを示している一群のグラフである。24時間以内に最大3回までT細胞にエレクトロポレーションを行うことにより、ほぼ80％に近い最も高いターゲティング効率が得られた。初期の実験では、T細胞において15％のTCRターゲティング効率しか達成されなかった。T細胞内へのCAS9 mRNAのエレクトロトランスファー後には、CAS9の持続的発現が観察された。切断効率の低さの理由としては、gRNAの急速な分解が原因である可能性が高い。CD3陰性集団がより高度に得られた。図4Bは、キャッピングはgRNAの機能を損なわせるが、2回目のgRNAの早期導入ではより高い効率が得られたことを示している一群のグラフである。図4Cは、ND221におけるTRACおよびTRBCを標的とするgRNAの複数回のエレクトロトランスファーにより、それぞれおよそ64.5％および57.5％の切断率が得られたことを示している一群のグラフである。
【図５】図5Aおよび5Bで構成される図5は、TCRneg T細胞が種々の刺激条件下で拡大しうることを示している。図5Aは、TCRneg T細胞内へのTCR α鎖およびβ鎖の再導入後にTCRneg T細胞がCD3発現を取り戻したことを示している一群のグラフである。TCRneg T細胞内へのTCR α鎖およびβ鎖のエレクトロポレーションを行った後に、CD3およびVb13.1が検出された。CD3発現レベルはTCRpos T細胞と同等であった。図5Bは、TCRneg T細胞を刺激するために用いた種々の条件後の拡大倍率を示している一群のグラフである。PBMC REPではおよそ500倍の拡大が得られ、一方、CD3/CD28ビーズまたはK562 aAPC再刺激では約25〜58倍の拡大が得られた。
【図６Ａ】種々の条件下での拡大後のTCRneg T細胞の特徴を示している。図6Aは、種々の条件下での拡大後のTCRneg T細胞表現型の特徴を示している一群のグラフである。
【図６Ｂ】種々の条件下での拡大後のTCRneg T細胞の特徴を示している。図6Bは、種々の条件下での拡大後のTCRneg T細胞表現型の特徴を示している一群のグラフである。
【図７】図7A〜7Cで構成される図7は、インビトロでの再方向付け後の、強力な抗腫瘍活性を有する拡大したTCRneg T細胞を示している。図7Aは、細胞内への抗NY-ESO 1G4 TCRの導入によってTCRneg T細胞が再方向付けされうることを示している一群のグラフである。CAS9モック（MOCK）群と比較して、1G4 TCRによる再方向付けを受けた場合、TCRneg T細胞は、外因性および内因性のTCR α鎖およびβ鎖の誤対合がより少ないことが原因で、より高レベルのVb13.1発現を示した。図7Bは、1G4 TCRによる再方向付けを受けたTCRneg T細胞が、腫瘍（Nalm6-ESO）細胞株と共培養した場合に高い脱顆粒活性を有していたことを示している一群のグラフである。図7Cは、1G4 TCRによる再方向付けを受けたTCRneg T細胞が、腫瘍細胞株に対する高い細胞傷害性を有していたことを示しているグラフである。
【図８】図8は、方向付けを受けたTCRneg T細胞が、再方向付け後にNSGマウスにおける腫瘍の増殖を抑えることを示している一群の説明図である。
【図９】図9A〜9Dで構成される図9は、β-2ミクログロビンの破壊によって、HLA-クラスIの排除が得られたことを示している。図9Aは、HEK293細胞におけるβ-2ミクログロビン遺伝子座を破壊しうるCRISPRのシークエンシングデータを示している。図9Bは、β-2ミクログロビンの破壊によってbHLA-クラスI陰性T細胞集団が生じたことを示している一群のグラフである。図9Cは、cIFNgが初代T細胞においてβ-2ミクログロビンのターゲティング効率を向上させたことを示している一群のグラフである。図9Dは、HLA-クラスIneg T細胞がマイクロビーズ除去によって濃縮されたことを示している一群のグラフである。
【図１０】図10は、初代T細胞におけるHLA-クラスIおよびTCRの同時ノックアウトを示している一群のグラフである。CD4およびCD8 T細胞をCD3/CD28ダイナビーズによって刺激した。刺激から3日後に、拡大したT細胞に、CAS9 mRNAのエレクトロポレーションを、TCR β定常領域（TRBC）およびβ-2ミクログロビンを標的とするgRNAとともに行った。エレクトロポレーションから6日後に、TCR発現およびβ-2ミクログロビン発現の両方を、抗CD3モノクローナル抗体（mAb）および抗β-2ミクログロビンmAbを用いて評価した。数字は各四半分における集団のパーセンテージを表している。
【図１１】図11A〜11Dで構成される図11は、初代T細胞におけるHLA-クラスIおよびTCR α鎖およびβ鎖の三重ノックアウトを示している。図11Aは、CD4およびCD8 T細胞をCD3/CD28ダイナビーズによって刺激したことを示している一群のグラフである。刺激から3日後に、拡大したT細胞に、CAS9 mRNAのエレクトロポレーションを、TCR α、β定常領域（TRAC、TRBC）およびβ-2ミクログロビンを標的とするgRNAとともに行った。エレクトロポレーションから6日後に、TCR発現およびHLA-クラスI発現の両方を、抗CD3モノクローナル抗体（mAb）および抗β-2ミクログロビンmAbを用いて評価した。数字は各四半分における集団のパーセンテージを表している。図11Bは、HLA-クラスIならびにTCR α鎖およびβ鎖三重ノックアウトT細胞の単離を図示している略図である。図11Cは、GFP発現によって検討したエレクトロポレーション効率を示している一群のグラフである。図11Dは、フローサイトメトリーによって測定した、TCRneg T細胞内へのTCR α鎖およびβ鎖の再導入を示している一群のグラフである。TCRneg T細胞全体の中にα陰性集団が約64％およびβ陰性集団が約14％観察された。
【図１２】図12A〜12Dで構成される図12は、293T細胞におけるFASのノックアウトを示している。図12Aは、293T細胞においてFASをノックアウトした場合の複数のピークのSangerシークエンシングの結果を示している画像である。図12Bは、FASタンパク質の表面発現がCRISPRによって妨害されたことを明示するFACSデータを示している一群のグラフである。図12Cは、CRISPRによる相同組換え後に、FASタンパク質がGFPによって置き換えられたことを示している一群の画像である。図12Dは、CRISPRによる相同組換えのパーセンテージを示している、FACSデータの一群のグラフである。
【図１３】図13は、初代T細胞におけるFASのノックアウトを示している。FACSデータは、表面FASタンパク質発現がCRISPRによって消失したことを図示している。
【図１４】図14Aおよび14Bで構成される図14は、293T細胞および初代T細胞におけるPD1のノックアウトを示している。図14Aは、293T細胞においてPD1を標的とした場合の、複数のピークのSangerシークエンシングの結果を示している画像である。図14Bは、CRISPRによって妨害されたPD1タンパク質の表面発現のFACSデータを示している一群のグラフである。
【図１５】図15Aおよび15Bで構成される図15は、293T細胞および初代細胞、例えばCCD1079-SKなどにおけるCTLA4のノックアウトを示している。図15Aは、293T細胞においてCTLA4を標的とした場合の、複数のピークのSangerシークエンシングの結果を示している画像である。図15Bは、限界希釈および単細胞拡大後の配列データを示している画像である。Sangerシークエンシングの結果により、CTLA4ゲノム遺伝子座での欠失および挿入が同定された。
【図１６】図16は、293TにおけるPPP2r2dのノックアウトを示している。Sangerシークエンシングデータにより、293T細胞においてCRISPRによってPPP2r2dが標的とされたことが指し示されている。
【図１７】図17Aおよび17Bで構成される図17は、FASノックアウトT細胞からのiPSCの作製を示している。図17Aは、FASneg T細胞のiPSCへのリプログラミングの過程における形態的変化を示している一群の画像である。FASneg T細胞を指し示す典型的な胚性幹細胞形態の形成を多能性状態として誘導することができる。図17Bは、FASneg T細胞が、野生型対応物の約5倍の効率でiPSCにリプログラミングされたことを示しているグラフである。p53欠損細胞株は、アポトーシス経路が妨げられるという理由で、リプログラミングがより容易であると報告されている。FASノックアウトは、類似の機序でリプログラミング過程を助長することができる。
【図１８】図18Aおよび18Bで構成される図18は、CD3neg T細胞からのiPSCの作製を示している。図18Aは、所定のリプログラミング条件下でCD3neg TCR αまたはβ鎖ノックアウトT細胞によって形成されたES様形態を示している一群の画像である。形態は数回の継代後も一定に保たれている。図18Bは、CD3neg T細胞のリプログラミングは野生型対応物よりも効率が約5倍であることを示している一連のグラフであり、これはTCRノックアウトがT細胞リプログラミングの過程において役割を果たしていること、またはセンダイウイルス感染後の細胞生存度に影響を及ぼすことを示唆する。
【図１９】図19は、siRNAによる内因性T細胞受容体（TCR）のノックダウン、ならびにβ鎖に第2のジスルフィド結合および脱N-グリコシル化を加えたことを示しているグラフである。
【図２０】図20Aおよび20Bで構成される図20は、CAS9 RNAおよびgRNAによるTCRノックアウトを示している。エレクトロポレーションから6日後に、CD3を評価することによって細胞をTCR発現に関して分析した。
【図２１】図21は、CD3マイクロビーズ除去後のPCRシークエンシングの結果を示している説明図である。
【図２２】図22は、NY-ESO-1 TCR RNAエレクトロポレーションから4時間後のCD3の再発現を示している一群のグラフである。
【図２３】図23A〜23Dで構成される図23は、内因性TCRのノックダウンにより、TCR RNAがエレクトロポレーションされたT細胞の導入遺伝子発現および機能の両方が強化されたことを示している一群のグラフである。図23Aは、TCR siRNAを用いたエレクトロポレーションを受けたT細胞（実線の白抜きヒストグラム）、対照siRNAを用いたエレクトロポレーションを受けたT細胞（点線の白抜きヒストグラム）、およびいずれのsiRNAも有しないT細胞（塗りつぶしたヒストグラム）のTCR発現を示している。図23Bは、TCR siRNA、対照siRNAを用いるか、もしくはsiRNAを用いない、野生型NY-ESO-1 TCR（wt）RNAまたはTCR（SD）RNAのエレクトロポレーションを受けた改変T細胞の導入遺伝子（TCR vb13.1）発現を示している。図23Cは、TCR siRNA、対照siRNAを用いるか、もしくはsiRNAを用いない、野生型NY-ESO-1 TCR（wt）RNAまたはTCR（SD）RNAのエレクトロポレーションを受けた改変T細胞のNY-ESO-1テトラマー染色を示している。図23Dは、TCR siRNAノックダウン、野生型NY-ESO-1 TCR RNAがエレクトロポレーションされたT細胞による、HLA-A2／NY-ESO-1陽性腫瘍株の特異的溶解を示している。
【図２４】図24は、マウスモデルへのT細胞の注射後の腫瘍細胞の蛍光を示しているグラフである。NY-ESO-1およびGFP（コメツキムシ緑色タンパク質（click beetle green））の両方を発現するNalm6-CBG-ESO-GFP腫瘍細胞1000万個を、NOD/SCIDマウスに静脈内注射した。腫瘍接種から5日後に、CBRが形質導入されかつRNAがエレクトロポレーションされたT細胞を種々の群に表記の通りに注射し、腫瘍細胞を蛍光によって検出した。
【図２５】図25は、マウスモデルにおける注射した腫瘍およびハイブリッドTCR T細胞の蛍光を経時的に示している一群の画像である。
【図２６】図26は、汎用的CAR19 T細胞の作製を示している一群の画像である。図の一番上にあるのは、汎用的CAR19 T細胞を作製するためのプロトコールの説明図である。左のグラフは、レンチウイルス性CAR19遺伝子形質導入後のCAR19陽性T細胞のパーセンテージを示している。右の一群のグラフは、選別の前および後のTCR単一陰性T細胞およびTCR/HLA-A二重陰性T細胞のパーセンテージを示している。
【図２７】図27は、照射を受けたCD19提示性K562細胞による刺激後のCD19陽性細胞の拡大倍率を示している一群のグラフおよび表である。
【図２８Ａ】図28Aは、K562-CD19により拡大した細胞の内因性およびトランスジェニック性遺伝子発現を示している一群のグラフである。
【図２８Ｂ】図28Bは、内因性TCR発現がTCR単一陰性細胞では陰性に保たれたが、一方、TCR/HLA-A二重陰性T細胞では、K562-CD19により刺激された拡大の後に、TCRおよびHLA-A発現が陰性に保たれたことを示している一群のグラフである。
【図２９Ａ】図29Aは、拡大した汎用的CAR19 T細胞の大半がCD45RO陽性であり、およびCD28発現を中程度レベルで発現したことを示している一群のグラフである。
【図２９Ｂ】図29Bは、拡大した汎用的CAR19 T細胞の大半が、高レベルのCD62L発現および低レベルのCCR7発現を保ったことを示している一群のグラフである。
【図３０Ａ】図30Aは、CRISPR遺伝子編集が、インビトロでの汎用的CAR19 T細胞の抗腫瘍活性に影響を及ぼさなかったことを示しているグラフである。
【図３０Ｂ】図30Bは、TCR単一陰性およびTCR/HLA-A二重陰性CAR19 T細胞が、Nalm6腫瘍細胞による負荷刺激を加えた場合に強固な溶解能力を示したことを示している一群のグラフである。
【図３０Ｃ】図30Cは、これらの細胞の強力な抗腫瘍活性の一部としてのサイトカイン分泌を示している一群のグラフである。
【図３０Ｄ】図30Dは、CAR19 T細胞におけるTCRの単一アブレーションまたはTCRとHLA-Aの二重アブレーションが、Nalm6腫瘍細胞による負荷刺激後に類似の増殖動態を呈したことを示している一群のグラフである。
【図３１】図31は、CRISPR遺伝子編集がインビボでの汎用的CAR19 T細胞の抗腫瘍活性に影響を及ぼさなかったことを示している一群の画像である。未操作のT細胞を投与されたマウス、およびレンチウイルス性GFP形質導入を受けた野生型T細胞を注入されたマウスはすべて、腫瘍細胞注入後に3週間以内に死亡した。客観的な腫瘍退縮を、CAR19 T細胞を投与されたマウスに関して観察した。CRISPRにより編集されたTCR単一陰性またはTCR/HLA-A二重陰性の汎用的CAR19 T細胞は、同じ抗腫瘍活性を示した。
【図３２Ａ】図32Aは、T細胞におけるTCR単一アブレーションまたはTCRおよびHLA-Aの二重アブレーションにより、アロ反応性が著しく低下したことを示している一群のグラフである。
【図３２Ｂ】図32Bは、HLA-A分子の排除により、長期間の共培養（5日間）でNK細胞が活性化されたことを示している一群のグラフである。
【図３２Ｃ】図32Cは、IFNr Eispotアッセイにおいて細胞に同種全血PBMCによる負荷刺激を24時間加えた場合に、オフターゲット（off-target）活性が観察されなかったことを示しているグラフである。
【図３３】図33は、FASアブレーションにより、CAR19 T細胞の抗腫瘍活性が強化されたことを示している一群のグラフである。FAS陰性CAR19 T細胞を作製した。FASアブレーションをフローサイトメトリー分析によって確認した。FASneg T細胞のCAR19遺伝子発現は野生型と同等であった。Nalm6腫瘍細胞との4時間という短期間のインキュベーション後であっても、FASneg CAR19 T細胞におけるCD107a発現は、野生型対応物と比較して大きく強化された。
【図３４Ａ】図34Aは、CAR19 T細胞におけるFASアブレーションにより、インビトロ抗原条件下でCART細胞の生存および増殖が強化されたことを示しているグラフである。FASneg CAR19 T細胞は、細胞を高レベルのCD19+ K562細胞によって刺激した場合に、野生型CAR19 T細胞よりも速く拡大した。
【図３４Ｂ】図34Bは、FASneg CAR19 T細胞ではアポトーシスレベルが低下していたことをアネキシンV染色による測定で示している一群のグラフである。
【図３５Ａ】図35Aは、CAR19 T細胞におけるFASアブレーションにより、動物モデルにおけるCART細胞機能が強化されたことを示しているグラフである。インビトロで観察されていたように、FASneg T細胞は野生型T細胞と比較して増殖の強化を示した。
【図３５Ｂ】図35Bは、FASneg CAR19群が、野生型群と比較した場合に、より優れた抗腫瘍活性を明らかに示したことを示している一群の画像である。
【図３５Ｃ】図35Cは、FASneg CAR19群と野生型群との間での生物発光データの有意差を示しているグラフである。
【図３６】図36は、PD1陰性PSCA-CAR T細胞の作製を示している一群のグラフである。PD1アブレーションはフローサイトメトリー分析によって確認した。PD1陰性細胞をマイクロビーズ除去によって濃縮した。野生型またはPD1陰性PSCA-CAR T細胞を、照射を受けたPSCA抗原提示性PC3腫瘍細胞による刺激によって拡大させた。PSCA-CAR陽性細胞を拡大後に濃縮した。
【図３７】図37は、PSCA-CAR T細胞におけるPD1アブレーションおよびCD137発現により、インビトロ抗原条件下でCART細胞活性化が強化されたことを示している一群のグラフである。
【図３８Ａ】図38Aは、インビボPC3-PSCA-PDL1 NSGモデルにおけるPD1アブレーションを示している一群の画像である。PSCA-CAR T細胞は、野生型群と比較して、CART細胞インビボ抗腫瘍活性の強化を明らかに示した。
【図３８Ｂ】図38Bは、PD1陰性群と野生型群との間の腫瘍量の違いを示しているグラフである。
【図３９】図39は、TCRまたはTCR/HLA-Iのアブレーションを受けたT細胞が移植片対宿主病（GVHD）を引き起こさなかったことを示している一群の組織像である。二重または三重ノックアウトCART細胞を投与されたマウスはGVHDの徴候を全く発症しなかった。対照的に、野生型CD19 CART群のマウス4匹中3匹は第65日までにGVHDを発症し、このことは種々の臓器の組織学的検査によって確かめられた。
【図４０Ａ】図40Aは、TCRまたはTCR/HLA-Iのアブレーションを受けたT細胞が注射された動物の生存率を示しているグラフである。マウスに対して、亜致死的な照射を行って注射した。野生型T細胞の投与を受けたマウス5匹中4匹は、60日間の試験中にGVHDが原因で死亡した。PBS投与群、TCR単一アブレーションおよびTCR/HLA-I二重アブレーションを受けたT細胞の投与群はGVHDのいかなる徴候も示さなかった。
【図４０Ｂ】図40Bは、野生型T細胞、PBS、TCR単一アブレーションまたはTCR/HLA-I二重アブレーションを受けたT細胞の投与を受けたマウスの体重を示している一群のグラフである。
【図４１Ａ】図41Aは、CRISPR/Cas9によってPD1経路およびFas経路を遮断した後の、汎用的CART細胞の抗腫瘍活性の向上を示している一群の画像である。Nalm6-PDL1担持マウスに注射した場合に、PD1ノックアウト汎用的CD19-CART細胞において、より優れた抗腫瘍活性が検出された。
【図４１Ｂ】図41Bは、種々のCRISPR/Cas9編集T細胞の投与を受けたマウスの定量的生物発光データを示しているグラフである。
【図４２】図42は、汎用的CART細胞を作製するためのワンショット（one-shot）システムを示している一群の説明図である。gRNAは分解されやすいことから、単一のレンチウイルスベクターにおいてgRNAをCARとともに構成的に発現する、簡易化したワンショット方法を開発した。
【図４３】図43は、ワンショットシステムによる効率的な遺伝子アブレーションを示している一群のグラフである。Cas9 mRNAのエレクトロトランスファー後に、種々の量のCD3アブレーションが観察された。
【図４４Ａ】図44Aは、FasノックアウトT細胞からのiPSCのリプログラミングからの過程における形態的変化を示している一群の画像である。FASneg T細胞を指し示す典型的な胚性幹細胞形態の形成を多能性状態として誘導することができる。
【図４４Ｂ】図44Bは、FASneg T細胞が野生型対応物の約5倍の効率でiPSCにリプログラミングされたことを示しているグラフである。p53欠損細胞株は、アポトーシス経路が妨害されることが原因で、リプログラミングすることがより容易であることが報告されている。FASノックアウトにより、類似の機序を用いてリプログラミング過程が容易になる可能性がある。
【図４５Ａ】図45Aは、所定のリプログラミング条件下での、CD3neg TCR α鎖またはβ鎖ノックアウトT細胞からのiPSCのES様形態を示している一群の画像である。この形態は数回の継代後も一定に保たれた。
【図４５Ｂ】図45Bは、CD3neg T細胞のリプログラミングの効率が野生型対応物の約5分の1の低さであったことを示しているグラフであり、このことはTCRノックアウトがT細胞リプログラミングの過程においてある役割を果たすこと、またはセンダイウイルス感染後の細胞生存度に影響を及ぼすことを示唆する。
【図４５Ｃ】図45Cは、CD3neg iPSC細胞のホスファターゼ染色を示している一群の画像である。
【図４６】図46は、種々のT-iPSC細胞株における内因性多能性幹細胞遺伝子の誘導を示している一群のグラフである。
【図４７Ａ】図47Aは、Tra-1-60およびSSEA4の発現に関する免疫染色を示している一群の画像である。
【図４７Ｂ】図47Bは、SangerシークエンシングによるT-iPSCのFasノックアウトの確認を示している画像である。
【図４８Ａ】図48Aは、種々の型のCas9による、ナイーブT細胞における遺伝子アブレーションを示している一群のグラフである。CD3はdCas9およびFokI-Cas9によってノックアウトされた。
【図４８Ｂ】図48Bは、dCas9およびFokI-Cas9の遺伝子アブレーションのためには2種類のgRNAが必要であったことを示している一群のグラフである。
【図４８Ｃ】図48Cは、CRISPR/cas9による遺伝子改変T細胞における稀なオフターゲットイベントを示している画像である。
【図４９】図49は、T細胞内にCRISPR/Cas9を導入する戦略を示している一群の画像である。T7プロモーターによって作動されるgRNAの略図を左側に示している。CRISPR系を用いる遺伝子編集を受けた抗原特異的T細胞の作製の略図を右側に示している。T細胞に対して、CD3/CD28ビーズ刺激の3日後に、特異的遺伝子を標的とするCas9 mRNAおよびgRNAによるエレクトロポレーションを行い、続いてIL2の存在下において32℃で24時間培養し、その後に通常の37℃培養条件に戻した。特異的遺伝子が破壊されたT細胞を第8日に選別し、レンチウイルス形質導入またはmRNAエレクトロポレーション遺伝子移入によって、CARまたはTCRによる再方向付けを行った。
【図５０Ａ】図50Aは、T細胞におけるCRISPR/Cas9媒介性の効率的なTCR破壊を示している一群のグラフである。37℃または32℃で培養したCRISPR/Cas9編集T細胞のCD3発現。
【図５０Ｂ】図50Bは、逐次的CRISPR RNAエレクトロポレーション後に培養したCRISPR/Cas9編集T細胞のCD3発現を示している一群のグラフである。
【図５１Ａ】図51Aは、T細胞において起こった効率的なCRISPR遺伝子破壊を示している一群のグラフである。種々のCas9：gRNA比（上および中のパネル）および全CRISPR RNAの量（下側のパネル）を用いてCRISPRの移入を受けたT細胞のCD3発現。
【図５１Ｂ】図51Bは、フローサイトメトリーおよびクローンシークエンシングの両方によって計算したターゲティング効率を示している表である。
【図５２】図52は、細胞から増幅されたDNAに対するミスマッチ選択的T7サーベイヤーヌクレアーゼアッセイによって測定した、TCRを標的とする遺伝子破壊の量を示している画像である。TRACおよびTRBCにおける標的指向化遺伝子破壊の算出量を一番下に示している。矢印は予想されるバンドを指し示している。
【図５３Ａ】図53Aは、TCR αおよびβ遺伝子座のCRISPR媒介性組換え後にPCRアンプリコンのクローン配列分析によって観察された（遺伝子破壊における）インデルの画像である。
【図５３Ｂ】図53Bは、TCR αおよびβ定常領域のゲノム遺伝子座内にTCR αおよびβ CRISPR gRNAターゲティング部位をコードするヒト遺伝子座の略図の画像である。各エクソンはブロックによって示されている。矢印：センス鎖gRNAターゲティング部位；青の矢印：アンチセンス鎖gRNAターゲティング部位。Sangerシークエンシングの結果における複数のピークは、TRACおよびTRBCゲノム遺伝子座でのNHEJのCRISPR媒介性イベントを示している。
【図５４】図54は、精製TCRneg細胞におけるCD3発現を示している一群のグラフである。
【図５５】図55は、1G4 TCR（αおよびβ）またはCAR19 mRNAのエレクトロトランスファーを介したTCR/CD3neg細胞の再方向付けを示している一群のグラフである。
【図５６】図56は、種々の刺激条件を用いた10日後のTCR/CD3neg細胞の拡大を示しているグラフである。
【図５７】図57は、CRISPR/Cas9編集が初代T細胞の抗腫瘍効力を損なわないことを示している一群のグラフである。4種類の異なる拡大手法後のTCR/CD3neg細胞の表現型を示している。
【図５８】図58は、Cas9モック細胞およびTCR/CD3neg細胞へのCD19-CAR RNAのエレクトロトランスファー後の相対的CD19-CAR発現を示している一群のグラフである。
【図５９Ａ】図59Aは、Nalm6標的細胞とのインキュベーション後のCD107放出アッセイによる確認で、CD19-CAR再方向付けCas9モック細胞とTCR/CD3neg細胞との間に有意な機能的な差が観察されなかったことを示している一群のグラフである。3回の独立した実験による代表的なデータを示している。バー、標準誤差。
【図５９Ｂ】図59Bは、Nalm6標的細胞とのインキュベーション後の細胞傷害性アッセイによる確認で、CD19-CAR再方向付けCas9モック細胞とTCR/CD3neg細胞との間に有意な機能的な差が観察されなかったことを示している一群のグラフである。3回の独立した実験による代表的なデータを示している。バー、SE＝標準誤差。
【図５９Ｃ】図59Cは、Nalm6標的細胞とのインキュベーション後のIL2およびIFNγの分泌による確認で、CD19-CAR再方向付けCas9モック細胞とTCR/CD3neg細胞との間に有意な機能的な差が観察されなかったことを示している一群のグラフである。3回の独立した実験による代表的なデータを示している。バー、SE＝標準誤差。
【図５９Ｄ】図59Dは、1×106個のNalm6腫瘍細胞の注射（i.v.）を受けたNOD/scid/γc（-/-）マウス（n＝12）の一群の画像であり、マウスは3群に無作為に選別されている。エレクトロポレーション後のCD19-CARを発現するCas9モックT細胞およびTCR/CD3neg T細胞（10×106個）を4日毎に静脈内注射し、合計3回の注射（矢印）を行った。RNAのエレクトロポレーションを受けていないT細胞を投与したマウスを対照とした。画像は生存動物から表記の通りに入手した。撮像はT細胞投与の開始の1日前から始めた。バー、SE＝標準誤差、EP＝エレクトロポレーション；E：T＝エフェクター・腫瘍比；矢印、T細胞注入の時点；ns、有意でない。****二元配置ANOVA＋Bonferroni事後検定によりP＜0.0001、ns。
【図５９Ｅ】図59Eは、蛍光性細胞のラジアンスを示しているグラフである。
【図６０】図60は、汎用的エフェクター細胞を作製するためのCRISPR/Cas9による二重および三重遺伝子アブレーションを示している一群のグラフである。B2Mを標的とするgRNAによるHLA-I破壊。
【図６１】図61は、本明細書において記載されるような汎用的エフェクター細胞を作製するためのプロトコールの流れ図である。
【図６２】図62は、TCRアブレーションにより、非特異的な殺傷活性が抑止されたことを示している一群のグラフである。624mel-CBGおよびPC3-CBG腫瘍細胞株を、PHAによる前処理を行うかまたは行わないT細胞とともにエフェクター・標的比20：1で24時間インキュベートして、細胞傷害性をルシフェラーゼアッセイに基づいて算出した。データは平均±SDである；n＝3。
【図６３】図63は、遺伝子アブレーションを受けたT細胞に照射を受けた同種PBMCによる負荷刺激を加えるか（左のパネル）、または同種PBMCを照射および遺伝子アブレーションを受けたT細胞と共培養することによって、TCRおよびTCR/HLA破壊のアロ反応性を測定するためのIFNγ Elispotアッセイを示している一群のグラフである。個々のスポットは、刺激要因（stimulator）の存在下で生じたスポットからエフェクターのみによって生じたスポットを差し引いたものとしてy軸上に示されている。**Mann-Whitney検定によりP＜0.01。
【図６４】図64は、CRISPR/Cas9による内因性TCRの破壊により、TCR再方向付けT細胞の機能が向上したことを示している一群のグラフである。Cas9 mRNAのみ（Cas9モック）がトランスフェクトされたT細胞における、またはNY-ESO-1 TCR α RNA（1G4 α、2ug）、β RNA（1G4 β、2ug）もしくはα＋β RNA（1G4 α＋β、2＋2ug）のエレクトロポレーションを受けて内因性TCR αのみ（α KO）、βのみ（β KO）、αおよびβの両方（α＋β KO）が破壊されたCD3neg T細胞における、Vb13.1およびCD3の発現を示している。
【図６５Ａ】図65Aは、HLA-A2/NY-ESO-1陽性細胞株（Nalm6-ESO）または対照細胞株Nalm6により刺激した、TCR（1G4）α/β RNAのエレクトロポレーションを受けたTCR αもしくはβの単一ノックアウトまたはα＋β二重ノックアウトT細胞の、CD107aアップレギュレーションを示している一群のグラフである。
【図６５Ｂ】図65Bは、Nalm6-ESOに対するルシフェラーゼベースのCTLアッセイにおいて（a）に示された、TCR α＋β RNA（1G4 TCR）のエレクトロポレーションを受けたTCR αもしくはβの単一ノックアウトまたはα＋β二重ノックアウトT細胞の溶解能力を示しているグラフである。
【図６６】図66は、2種類の異なるNY-ESO-1 TCR RNA（1G4 TCR、10ugまたは8F TCR、10ug）のエレクトロポレーションを受けたTCR α＋β二重破壊T細胞（TCRneg T細胞）におけるVβおよびCD3の発現を、対照Cas9モックT細胞と比較して示している一群のグラフである。
【図６７Ａ】図67Aは、HLA-A2/NY-ESO-1-陽性細胞株Nalm6-ESO、624-melまたはU266により刺激した、NY-ESO-1 TCR（1G4 TCRまたは8F TCR）RNAのエレクトロポレーションを受けたTCR二重ノックアウトCD8+ T細胞におけるCD107aアップレギュレーションを示している一群のグラフである。Nalm6を陰性対照として用いた。
【図６７Ｂ】図67Bは、HLA-A2/NY-ESO-1-陽性細胞株Nalm6-ESOまたはU266による刺激後の、NY-ESO-1 TCR（1G4 TCRまたは8F TCR）RNAのエレクトロポレーションを受けたTCR二重ノックアウトT細胞のサイトカイン産生（IL-2およびTNF-α）を示している一群のグラフである；888mel黒色腫細胞を陰性対照として用いた。*P＜0.05、**P＜0.01 ****P＜0.0001、二元配置ANOVA＋Bonferroni事後検定による。
【図６８】図68は、レンチウイルス遺伝子移入とCRISPR/Cas9エレクトロポレーションとの組み合わせによる汎用的CART細胞の作製を示している一群の画像である。汎用的CD19-CART細胞の作製の流れ図を示している。刺激後の第1日にT細胞にレンチウイルスCD19-CARによる形質導入を行い、2日後にT細胞に、Cas9 mRNA、ならびにTCR αおよびTCR β鎖ならびにB2Mを標的とするgRNAのエレクトロポレーションを行った。TCRおよびHLA-I二重陰性細胞集団を濃縮し、その後に拡大のために再刺激を行った。
【図６９】図69は、1G4 TCRエレクトロポレーション後にCD3/CD28ビーズ刺激によって拡大させた遺伝子改変レンチ-CD19-CAR T細胞におけるCD19-CAR発現を示している一群のグラフである。
【図７０】図70は、CD19-CAR T細胞の表現型を示している一群のグラフである。
【図７１】図71は、TCR陰性およびTCR/HLA-I二重陰性CD19-CAR T細胞におけるCD107a放出を示しているグラフである。3回の独立した実験による代表的なデータを示している。バー、SE＝標準誤差。
【図７２】図72は、TCR陰性およびTCR/HLA-I二重陰性CD19-CAR T細胞のサイトカイン分泌を示している一群のグラフである。3回の独立した実験による代表的なデータを示している。バー、SE＝標準誤差。
【図７３】図73は、TCR陰性およびTCR/HLA-I二重陰性CD19-CAR T細胞の腫瘍溶解能を示しているグラフである。3回の独立した実験による代表的なデータを示している。バー、SE＝標準誤差。
【図７４】図74は、K562および標的K562-CD19腫瘍細胞とともに1〜10の比で72時間インキュベートしたCFSE標識CD19-CAR T細胞および非形質導入T細胞を示している一群のグラフである。
【図７５Ａ】図75Aは、レンチウイルスベクターを用いてCD19-CARおよびGFPを発現する単回注射を第7日に受けたマウスによるBLIを示しているグラフである。ns、二元配置ANOVA＋Bonferroni事後検定により差なし。1×106個のNalm6細胞の静脈内注射によって、NSGマウス（各群当たりn＝4）において腫瘍を成立させた。第7日から、レンチウイルス（LV）により形質導入されたCD19-CARを発現するT細胞（1×107個）を単回注射により注入した。LV GFPタンパク質を発現するT細胞を対照として注射した。
【図７５Ｂ】図75Bは、LV-GFP T細胞、LV-CD19-CAR T細胞、LV-CD19-CAR-TCR/CD3neg T細胞およびLV-CD19-CAR-TCR/HLA-Ineg T細胞の投与を受けたマウスの全生存率を示しているグラフである。ns、ログランクMantel-Cox検定により差なし。
【図７６】図76は、遺伝子改変CAR T細胞が抗腫瘍効力を保ち、かつGVHDを誘発しなかったことを示している一群の画像である。1×106個のNalm6細胞の静脈内注射によって、NSGマウス（各群当たりn＝4）において腫瘍を成立させた。第7日から、LV-CD19-CARを発現するT細胞（2×107個）を単回注射によって注入した。LV GFPタンパク質を発現するT細胞を対照として用いた。撮像はT細胞投与の開始の1日前から始めた。種々の投与群から無作為に選択したマウスの臓器を第65日に収集し、CD3免疫組織化学染色のために用いた。
【図７７】図77は、PD1、FasおよびTCR α鎖を標的とするpAd5F35-CRISPRのデザインを示している、ベクターの一連の略図である。
【図７８】図78は、抗CD3 ScFvを有するペントン改変pAd5F35-CRISPRのデザイン、ならびにインビトロおよびインビボでのT細胞へのキメラ抗原受容体のノックイン/アウトのためのpAd5F35-CRISPRの模式的な送達を示している説明図である。
【図７９Ａ】図79Aは、PD1-gRNAターゲティング部位に隣接するPCR産物のSangerシークエンシングを示しているグラフである。アデノウイルス-pAd5F35-CRISPR-PD1ウイルスをMD231細胞に形質導入した。3日後に、ゲノムDNAを抽出してPCRを行った。
【図７９Ｂ】図79Bは、アデノウイルス-CRISPR操作後のMDA231細胞におけるターゲティングイベントの配列を示している。PD1 PCR産物をTOPOベクター中にクローニングして、シークエンシングを行った。
【図８０】図80は、gRNA使用の減少により、T細胞拡大倍率が向上し、ノックアウト効率はわずかしか低下しなかったことを示しているチャートである。
【図８１】図81は、T細胞拡大倍率の向上を伴って高いCD3/B2Mノックアウト効率を得る目的でエレクトロポレーション条件を最適化するために用いたパラメータを示しているチャートである。2mmキュベット（EP#10〜13）または4mmキュベットにおいて標準的なエレクトロポレーション（EP）条件と比較。高いCD3/B2Mノックアウト効率が、T細胞拡大倍率の向上を伴って観察された（EP#1および5）。
【図８２】図82は、容認しうるノックアウト効率で最大限の拡大倍率を達成するためのEP条件の最適化を示しているチャートである。
【図８３】図83は、容認しうるノックアウト効率で最大限の拡大倍率を達成するためのEP条件のさらなる最適化を示しているチャートである。
【図８４】図84は、T細胞刺激、レンチウイルス形質導入およびCRISPRエレクトロポレーションの手順の略図。
【図８５】図85は、エレクトロポレーションおよび培養手順後のT細胞数（上側のチャート）および拡大倍率（下側のチャート）を示しているチャートである。
【図８６】図86は、T細胞拡大の平均値を示している一群のグラフである。CD19 CARのみを形質導入したT細胞（TDのみ）、またはCD19 CARを導入し、かつCRISPRによる編集を行ったT細胞（TD/KO）の拡大倍率（左のグラフ）。第10日時点のT細胞の拡大倍率を右のグラフに示している。
【図８７】図87は、拡大したT細胞の第8日時点のCD3/B2M/CAR発現を示している一群のフローグラフである。
【図８８】図88は、CD3+ T細胞除去後のCD3/B2M発現を示している一群のグラフである。
【図８９】図89は、CD19 CAR TD（形質導入）/CRISPRエレクトロポレーションを行ったCD3除去T細胞；CD19 CAR TD/CRISPRエレクトロポレーションを行ったT細胞；およびCD19 CAR TD T細胞における第11日時点のCD3/B2M発現を示している一群のグラフである。非形質導入ND463（NOTD）を陰性対照として用いた。
【図９０】図90は、CD19 CAR TD（形質導入）/CRISPRエレクトロポレーションを行ったCD3除去T細胞；CD19 CAR TD/CRISPRエレクトロポレーションを行ったT細胞；およびCD19 CAR TD T細胞における第11日時点のCD19 CAR発現を示している一群のグラフである。非形質導入ND463（NOTD）を陰性対照として用いた。
【図９１】図91は、CD19 CAR TD（形質導入）/CRISPRエレクトロポレーションを行ったCD3除去T細胞；CD19 CAR TD/CRISPRエレクトロポレーションを行ったT細胞；およびCD19 CAR TD T細胞における第11日時点のCD3/B2M/CAR発現を示している一群のグラフである。非形質導入ND463（NOTD）を陰性対照として用いた。
【図９２】図92は、CD19 CAR TD（形質導入）/CRISPRエレクトロポレーションを行ったCD3除去T細胞；CD19 CAR TD/CRISPRエレクトロポレーションを行ったT細胞；およびCD19 CAR TD T細胞におけるCD3/B2M/CAR発現をまとめたチャートである。
【図９３】図93は、CD19 CAR TD（形質導入）/CRISPRエレクトロポレーションを行ったCD3除去T細胞；CD19 CAR TD/CRISPRエレクトロポレーションを行ったT細胞；およびCD19 CAR TD T細胞におけるCD107aアップレギュレーションを示している一群のグラフである。
【図９４】図94は、第11日時点のT細胞の溶解活性を示している一群のグラフである。
【図９５】図95は、第11日時点のT細胞のサイトカイン産生を示している一群のグラフである。
【図９６】図96は、T細胞拡大を示している一群のグラフである。異常なT細胞増殖は観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
定義
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記述された方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を本発明の試験の実践において用いることができるが、好ましい材料および方法が本明細書において記述される。本発明を記述および主張するうえで、以下の専門用語が用いられる。
【００３２】
本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００３３】
「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)をいうように用いられる。例として、「1つの(an)要素」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００３４】
量、時間的持続時間などのような測定可能な値をいう場合に本明細書において用いられる「約」は、規定値から±20%または±10%、より好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%、なおより好ましくは±0.1%のバラツキを包含するよう意図されるが、これはそのようなバラツキが、開示された方法を実施するのに適切なためである。
【００３５】
本明細書において用いられる「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたT細胞の状態をいう。活性化はまた、誘発されたサイトカイン産生および検出可能なエフェクター機能に関連しうる。「活性化T細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂をしているT細胞をいう。
【００３６】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子をいう。抗体は、天然供給源または組み換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであってもよく、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、典型的には、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab')2、ならびに一本鎖抗体(scFv)およびヒト化抗体を含む、種々の形態で存在しうる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。
【００３７】
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部分をいい、無傷の抗体の抗原決定可変領域をいう。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2およびFv断片、直鎖状抗体、scFv抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３８】
本明細書において用いられる「抗体重鎖」は、天然に存在する立体配座にある全抗体分子中に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方をいう。
【００３９】
本明細書において用いられる「抗体軽鎖」は、天然に存在する立体配座にある全抗体分子中に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうち小さい方をいう。αおよびβ軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
【００４０】
本明細書において用いられる用語「合成抗体」とは、例えば、本明細書において記述されるバクテリオファージによって発現される抗体のような、組み換えDNA技術を用いて作製される抗体を意味する。この用語はまた、抗体タンパク質またはその抗体を規定するアミノ酸配列を発現する抗体コードDNA分子の合成によって作製された抗体であって、そのDNA配列またはアミノ酸配列が、利用可能でかつ当技術分野において周知であるDNA配列またはアミノ酸配列の合成技術を用いて得られた抗体も意味するとみなされるべきである。
【００４１】
本明細書において用いられる「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方が含まれうる。当業者は、事実上、全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として働きうることを理解するであろう。さらに、抗原は、組み換えDNAまたはゲノムDNAに由来することができる。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それゆえ、本明細書においてその用語が用いられる通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が、2つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が生体サンプルから作製され、合成されまたは由来しうることは容易に明らかである。そのような生体サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生体液を含むことができるが、これらに限定されることはない。
【００４２】
本明細書において用いられる「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の増加、またはがん性病状に付随する様々な生理的症状の改善によって明らかになりうる生物学的効果をいう。「抗腫瘍効果」は、腫瘍のそもそもの発生の予防における、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても明らかになりうる。
【００４３】
「自己抗原」という用語は、本発明によれば、免疫系によって外来性であると認識される任意の自己抗原を意味する。自己抗原には、細胞表面受容体を含めて、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００４４】
本明細書において用いられる「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答から生じる障害と定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例としては、とりわけ、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病(I型)、栄養障害性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、尋常性白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、「自己」という用語は、後にその個体に再び導入される、同じ個体に由来する任意の材料をいうよう意図される。
【００４６】
「同種」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片をいう。
【００４７】
「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片をいう。
【００４８】
本明細書において用いられる「がん」という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖によって特徴付けられる疾患と定義される。がん細胞は局所的に広がることもあれば、または血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がることもある。様々ながんの例としては、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がんなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。ある特定の態様において、がんは甲状腺髄様癌である。
【００４９】
本明細書において用いられる「キメラ抗原受容体」または「CAR」という用語は、免疫エフェクター細胞上で発現されるように操作され、抗原に特異的に結合する人工T細胞受容体をいう。CARは、養子細胞移入を伴う療法として用いられうる。T細胞を患者から取り出し、特定の形態の抗原に特異的な受容体を発現するように改変する。いくつかの態様において、CARは、例えば、腫瘍関連抗原に対する特異性をもって発現されている。CARは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、および腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインも含みうる。いくつかの局面において、CARは、CD3ζ膜貫通および細胞内ドメインに融合された、一本鎖可変断片(scFv)由来モノクローナル抗体の融合体を含む。CARデザインの特異性は、受容体のリガンド(例えば、ペプチド)に由来しうる。いくつかの態様において、CARは、腫瘍関連抗原に特異的なCARを発現するT細胞の特異性を再度方向付けることによって、がんを標的とすることができる。
【００５０】
「切断」という用語は、核酸分子の骨格などにおける共有結合の切断のことを指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を非限定的に含む種々の方法によって開始させることができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能である。二本鎖切断は2つの異なる一本鎖切断イベントの結果として起こりうる。DNA切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらしうる。ある態様においては、切断された二本鎖DNAのターゲティングのために融合ポリペプチドを用いることができる。
【００５１】
本明細書において用いられる場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響または変化を与えないアミノ酸改変をいうよう意図される。そのような保存的改変には、アミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発のような、当技術分野において公知の標準的な技法によって、本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、抗体のCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置き換えることができ、この変化した抗体は、本明細書において記述される機能的アッセイ法を用い抗原結合能について試験することができる。
【００５２】
「共刺激リガンド」には、この用語が本明細書において用いられる場合、T細胞上の同族の共刺激分子と特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子のTCR/CD3複合体への結合によって与えられる一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されない、T細胞応答を媒介するシグナルを与える、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上の分子が含まれる。共刺激リガンドは、CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(ICOS-L)、細胞内接着分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3と特異的に結合するリガンドを含むことができるが、これらに限定されることはない。共刺激リガンドはまた、とりわけ、限定されるものではないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3のようなT細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、およびCD83と特異的に結合するリガンドも包含する。
【００５３】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されるものではないが、増殖のような、T細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上の同族の結合パートナーをいう。共刺激分子は、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体を含むが、これらに限定されることはない。
【００５４】
本明細書において用いられる「共刺激シグナル」は、TCR/CD3ライゲーションのような、一次シグナルとの組み合わせで、T細胞増殖、および/または鍵となる分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを導くシグナルをいう。
【００５５】
「CRISPR/CAS」、「クラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文反復配列システム（clustered regularly interspaced short palindromic repeats system）」、または「CRISPR」という用語は、塩基配列の短い繰り返しを含むDNA遺伝子座のことを指す。各繰り返しの後に、ウイルスに対する過去の曝露によるスペーサーDNAの短いセグメントが続く。細菌および古細菌は、外来性核酸の分解を導く短いRNAを用いる、CRISPR‐CRISPR関連（Cas）システム、と呼ばれる適応免疫防御を発達させてきた。細菌において、CRISPR系は、RNAにガイドされるDNA切断によって、侵入する外来性DNAに対する獲得免疫をもたらす。
【００５６】
II型CRISPR/Casシステムでは、「スペーサー」と名付けられた外来性DNAの短いセグメントがCRISPRゲノム遺伝子座に組み込まれ、転写され、プロセシングを受けて短いCRISPR RNA（crRNA）となる。これらのcrRNAはトランス活性化crRNA（tracrRNA）にアニーリングして、Casタンパク質による病原性DNAの配列特異的切断およびサイレンシングを導く。最近の研究により、Cas9タンパク質による標的認識は、crRNA内部の「シード」配列、およびcrRNA結合領域の上流にある保存されたジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を必要とすることが示されている。
【００５７】
関心対象の配列を切断するようにCas9を導くために、本明細書において以後は「ガイドRNA」または「gRNA」と称する、crRNA-tracrRNA融合転写物を、ヒトU6ポリメラーゼIIIプロモーターから設計することができる。CRISPR/CASを介したゲノム編集および調節は、基礎科学、細胞操作および治療法に対する変革性のあるその潜在能力に光を当てることとなった。
【００５８】
「CRISPRi」という用語は、転写レベルなどでの、遺伝子発現の配列特異的遺伝子抑制または阻害のためのCRISPR系のことを指す。
【００５９】
「疾患」は、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されなければその動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、その動物が恒常性を維持できるが、その動物の健康状態が障害のない場合よりも好ましくない健康状態である。未処置のまま放置されても、障害が必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
【００６０】
本明細書で使用される「ダウンレギュレーション」という用語は、1つまたは複数の遺伝子発現の低下または消失の事を指す。
【００６１】
「有効量」または「治療的有効量」は、本明細書において互換的に用いられ、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、または治療的もしくは予防的利益をもたらす、本明細書において記述される化合物、製剤、材料もしくは組成物の量のことを指す。そのような結果には、当技術分野において適当な任意の手段によって判定されるような抗腫瘍活性が含まれうるが、これに限定されることはない。
【００６２】
「コードする」とは、定義されたヌクレオチド(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)配列または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的過程において他の重合体および高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、cDNAまたはmRNAのような、ポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性ならびにそれに起因する生物学的特性をいう。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。mRNA配列と同一であり通常は配列表に示されるヌクレオチド配列であるコード鎖も、遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖もともに、タンパク質、またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードするということができる。
【００６３】
本明細書において用いられる場合、「内因性」とは、生物、細胞、組織もしくは系の内部に由来するか、またはそれらの内部で産生される、任意の材料をいう。
【００６４】
本明細書において用いられる場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織もしくは系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で産生される、任意の材料をいう。
【００６５】
本明細書において用いられる「拡大する」という用語は、T細胞の数の増加のように、数が増加することをいう。1つの態様において、エクスビボで拡大したT細胞は、培養物中に当初存在している数と比べて数が増加する。別の態様において、エクスビボで拡大したT細胞は、培養物中の他の細胞型と比べて数が増加する。本明細書において用いられる「エクスビボ」という用語は、生物(例えば、ヒト)から取り出され、生物の外側で(例えば、培養皿、試験管、またはバイオリアクタ中で)増殖された細胞をいう。
【００６６】
本明細書において用いられる「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳と定義される。
【００６７】
「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性エレメントを含む; 発現のための他のエレメントは宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給されうる。発現ベクターには、組み換えポリヌクレオチドを組み入れたコスミド、プラスミド(例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるもの)ならびにウイルス(例えば、センダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような、当技術分野において公知の全てのものが含まれる。
【００６８】
本明細書において用いられる「相同性」とは、2つの重合体分子間の、例えば、2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子のような、2つの核酸分子間の、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性をいう。2つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占められている場合; 例えば、2つのDNA分子の各々における位置がアデニンによって占められているなら、それらはその位置で相同である。2つの配列間の相同性は、一致しているまたは相同である位置の数の一次関数である; 例えば、2つの配列における位置の半分(例えば、10サブユニット長の重合体における5つの位置)が相同であるなら、2つの配列は50%相同であり; 位置の90% (例えば、10中9)が一致しているまたは相同であるなら、2つの配列は90%相同である。
【００６９】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含んだキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片(Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体の他の抗原結合部分配列のような)である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、持ち込まれたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体性能をさらに改良かつ最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつFR領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つの、および典型的には2つの、可変ドメインの実質的に全てを含む。また、ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
【００７０】
「完全ヒト」とは、分子全体がヒト由来であるか、または抗体のヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる、抗体のような、免疫グロブリンをいう。
【００７１】
本明細書において用いられる「同一性」とは、2つのポリペプチド分子間のような、2つの重合体分子間の、特に2つのアミノ酸分子間のサブユニット配列同一性をいう。2つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する場合; 例えば、2つのポリペプチド分子の各々における位置がアルギニンによって占められているなら、それらはその位置で同一である。2つのアミノ酸配列がアライメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する程度または同一性は、百分率として表現されることが多い。2つのアミノ酸配列間の同一性は、一致しているまたは同一である位置の数の一次関数である; 例えば、2つの配列における位置の半分(例えば、10アミノ酸長の重合体における5つの位置)が同一であるなら、2つの配列は50%同一であり; 位置の90% (例えば、10中9)が一致しているまたは同一であるなら、2つのアミノ酸配列は90%同一である。
【００７２】
本明細書において用いられる「免疫グロブリン」または「Ig」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。B細胞によって発現される抗体は、BCR (B細胞受容体)または抗原受容体といわれることもある。このタンパク質のクラスに含まれる5つの成員は、IgA、IgG、IgM、IgDおよびIgEである。IgAは、唾液、涙液、母乳、消化管分泌物、ならびに気道および泌尿生殖路の粘液分泌物のような、身体分泌物中に存在する主要な抗体である。IgGは、最も一般的な循環血中抗体である。IgMは、ほとんどの対象で一次免疫応答において産生される主要な免疫グロブリンである。これは凝集反応、補体固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御において重要である。IgDは抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として働いている可能性がある。IgEは、アレルゲンに対する曝露時に肥満細胞および好塩基球からのメディエータの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【００７３】
本明細書において用いられる「免疫応答」という用語は、リンパ球が抗原分子を異物と同定し、抗体の形成を誘導し、および/またはリンパ球を活性化して抗原を除去する場合に起きる抗原に対する細胞応答と定義される。
【００７４】
本明細書において用いる場合、「人工多能性幹細胞」または「iPS細胞」とは、T細胞などの成体細胞から作製される多能性幹細胞のことを指す。成体細胞におけるKlf4、Oct3/4およびSox2などのリプログラミング因子の発現は、細胞を、増殖および複数の細胞型への分化を行える多能性細胞に変換させる。
【００７５】
本明細書において用いられる場合、「説明材料（instructional material）」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用できる刊行物、記録、略図または他の任意の表現媒体を含む。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび/もしくは組成物を含む容器に添付されてもよく、または核酸、ペプチドおよび/もしくは組成物を含む容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、説明材料および化合物がレシピエントによって共同的に用いられることを意図して、説明材料は容器とは別に出荷されてもよい。
【００７６】
「単離された」とは、天然の状態から変えられたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば、宿主細胞のような、非天然環境で存在することができる。
【００７７】
本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の低下のことを指す。
【００７８】
本明細書で使用される「ノックアウト」という用語は、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の消失のことを指す。
【００７９】
本明細書において用いられる「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科(Retroviridae)ファミリーの属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中でも独特である; それらはかなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNA中に送達することができるため、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIVおよびFIVは全て、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子移入を達成するための手段を与える。
【００８０】
本明細書において用いられる用語「改変された」とは、本発明の分子または細胞の変化した状態または構造を意味する。分子は化学的に、構造的に、および機能的になど、多くの方法で改変されうる。細胞は、核酸の導入によって改変されうる。
【００８１】
本明細書において用いられる用語「調節する」とは、処置もしくは化合物の非存在下での対象における応答のレベルと比較して、および/または他の点では同一であるが処置を受けていない対象における応答のレベルと比較して、対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は対象、好ましくはヒトにおいて、天然のシグナルもしくは応答をかく乱させ、および/またはそれに影響を与え、それにより有益な治療応答を媒介することを包含する。
【００８２】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基に関する以下の略語が用いられる。「A」はアデノシンをいい、「C」はシトシンをいい、「G」はグアノシンをいい、「T」はチミジンをいい、および「U」はウリジンをいう。
【００８３】
特別の定めのない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型である、かつ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。RNAまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、型によっては、イントロンを含みうる程度までイントロンを含みうる。
【００８４】
「機能的に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の、後者の発現を結果的にもたらす、機能的連結をいう。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列との機能的関係の下で配置されている場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与えるなら、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたDNA配列は連続的であり、2つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせることが必要な場合、同じ読み枠の中にある。
【００８５】
「過剰発現された」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織または臓器の内部にある固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または臓器からの正常細胞における発現のレベルと比べて異常なレベルであることを示すよう意図される。腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられる固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野において公知の標準的なアッセイ法によって判定することができる。
【００８６】
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)もしくは胸骨内注射、または輸注法が含まれる。
【００８７】
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸はヌクレオチドの重合体である。したがって、本明細書において用いられる核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらは単量体「ヌクレオチド」に加水分解されうるという一般知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解されうる。本明細書において用いられる場合、ポリヌクレオチドには、非限定的に、組み換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCR(商標)などを用いた組み換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含む、当技術分野において利用可能な任意の手段により、ならびに合成手段により得られる全ての核酸配列が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００８８】
本明細書において用いられる場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基で構成される化合物をいう。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互につなぎ合わされた2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書において用いられる場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーともいわれる短鎖と、当技術分野において一般にタンパク質といわれる長鎖の両方をいい、そのなかには多くのタイプがある。「ポリペプチド」には、とりわけ、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変種、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００８９】
本明細書において用いられる「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列と定義される。
【００９０】
本明細書において用いられる場合、「プロモーター/調節配列」という用語は、プロモーター/調節配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現のために必要とされる核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の場合には、この配列はエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントを含んでもよい。プロモーター/調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現させるものであってもよい。
【００９１】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件の下で、遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００９２】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、実質的にはプロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００９３】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするまたは遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、実質的には細胞が、プロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００９４】
「センダイウイルス」とは、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）のある1つの属のことを指す。センダイウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれることも宿主細胞の遺伝情報を変えることもない、影響力のない（negative）一本鎖RNAウイルスである。センダイウイルスの宿主範囲は著しく広く、ヒトへの病原性もない。センダイウイルスは組換えウイルスベクターとして用いられ、一過性であるが強い遺伝子発現の能力がある。
【００９５】
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。「細胞表面受容体」という語句は、シグナルを受け取り、細胞の原形質膜を越えてシグナルを伝達しうる分子および分子の複合体を含む。
【００９６】
「一本鎖抗体」とは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖断片が、操作されたアミノ酸の長さを介してFv領域に連結されている、組み換えDNA技法によって形成された抗体をいう。米国特許第4,694,778号; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041に記述されているものを含めて、一本鎖抗体を作製する様々な方法が知られている。
【００９７】
抗体に関して本明細書において用いられる用語「特異的に結合する」とは、特異的抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識または結合しない抗体を意味する。例えば、1つの種由来の抗原に特異的に結合する抗体が、1つまたは複数の種由来のその抗原に結合してもよい。しかし、そのような異種間反応性はそれ自体で、特異的としての抗体の分類を変化させることはない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体が、その抗原の異なる対立遺伝子型に結合してもよい。しかし、そのような交差反応性はそれ自体で、特異的としての抗体の分類を変化させることはない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗体、タンパク質またはペプチドと第2の化学種との相互作用に関連して用い、相互作用が化学種上の特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味してもよい; 例えば、抗体は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的であるなら、エピトープAを含む分子(または遊離した、標識されていないA)の存在は、標識された「A」およびその抗体を含む反応において、その抗体に結合した標識されたAの量を減らすであろう。
【００９８】
「刺激」という用語は、刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)がその同族リガンドと結合し、それによって、限定されるものではないが、TCR/CD3複合体を介するシグナル伝達のような、シグナル伝達事象を媒介することにより誘導される、一次応答を意味する。刺激は、TGF-βのダウンレギュレーション、および/または細胞骨格構造の再編成などのような、ある特定の分子の発現の変化を媒介することができる。
【００９９】
「刺激分子」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合する、T細胞上の分子を意味する。
【０１００】
本明細書において用いられる「刺激リガンド」は、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上に存在する場合、T細胞上の同族結合パートナー(本明細書において「刺激分子」といわれる)と特異的に結合し、それによって活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むが、これらに限定されない、T細胞による一次応答を媒介することのできるリガンドを意味する。刺激リガンドは当技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を包含する。
【０１０１】
「対象」という用語は、免疫応答が誘発されうる生物(例えば、哺乳動物)を含むよう意図される。本明細書において用いられる「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物でありうる。非ヒト哺乳動物には、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびネズミ哺乳動物のような、家畜およびペットが含まれる。好ましくは、対象はヒトである。
【０１０２】
本明細書において用いられる場合、「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。また、実質的に精製された細胞とは、その天然の状態において通常結び付いている他の細胞型から分離された細胞をいう。ある例では、実質的に精製された細胞の集団とは、均質な細胞集団をいう。他の例では、この用語は、単に、天然の状態において通常結び付いている細胞から分離された細胞をいう。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロで培養されない。
【０１０３】
「標的部位」または「標的配列」とは、結合が起きるのに十分な条件の下で結合分子が特異的に結合しうる核酸の一部分を規定するゲノム核酸配列をいう。
【０１０４】
本明細書において用いられる場合、「T細胞受容体」または「TCR」という用語は、抗原の提示に応答してT細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体をいう。TCRは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合した抗原を認識する役割を担う。TCRは、アルファ(a)およびベータ(β)鎖のヘテロ二量体から構成されるが、一部の細胞ではTCRはガンマおよびデルタ(γ/δ)鎖からなる。TCRは、構造的に類似しているが、異なる解剖学的位置および機能を有するα/βおよびγ/δ形態で存在しうる。各鎖は、2つの細胞外ドメイン、つまり可変ドメインおよび定常ドメインから構成される。いくつかの態様において、TCRは、TCRを含む任意の細胞（例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、記憶T細胞、調節性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、およびγδT細胞を含む）上で改変されうる。
【０１０５】
本明細書において用いられる「治療的」という用語は、処置および/または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。
【０１０６】
本明細書において用いられる「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクションされた、形質転換された、または形質導入されたものである。この細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
【０１０７】
疾患を「処置する」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、対象が被っている疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。
【０１０８】
本明細書において用いられる「転写制御下」または「機能的に連結された」という語句は、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するためにプロモーターがポリヌクレオチドに関して正しい位置および方向にあることを意味する。
【０１０９】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結び付いたポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない、多数のベクターが当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１１０】
範囲: 本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな局面を範囲の形式で提示することができる。範囲の形式の記述は、単に簡便にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、可能な全ての部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記述は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などのような部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6を具体的に開示したものとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０１１１】
説明
移植片対宿主病（GVHD）を回避するための汎用的T細胞が、臨床的状況では非常に望まれている。しかし、同種T細胞の使用には、HLA-A分子の認識を通じての宿主の免疫系による拒絶反応を理由とするリスクがある。複数の遺伝子を操作するためのターゲティング戦略は複雑であり、取り組みではT細胞において低い効率しか得られておらず、GVHDおよび宿主対移植片反応を同時に予防することもできていない。
【０１１２】
FAS受容体/FASリガンド（FAS/FASL）アポトーシスシグナル伝達経路は、T細胞機能を負の方向に調節する。PD1およびCTLA4は、T細胞における2つの主要な抑制性シグナル伝達経路である。CTLA-4、PD-1またはPD-L1の抗体媒介性遮断に起因する抗腫瘍免疫の強化は、これらの経路を阻害することによって免疫療法の効率を向上させうる可能性を示唆する。本発明は、免疫原性が低下した改変T細胞を作製するための手段としてTCR α鎖およびβ鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD-1、および/またはFASが除去された、改変T細胞の作製を含む。
【０１１３】
本発明は、内因性遺伝子発現をノックダウンすること、および改変T細胞受容体もしくはキメラ抗原受容体のいずれかを発現させることによって改変T細胞を作製するための方法および組成物を含む。いくつかの態様において、本発明は、改変T細胞を作製するための方法を含む。そのような改変T細胞を治療用組成物に入れ、それを必要とする患者に投与することができる。
【０１１４】
内因性遺伝子発現のノックダウン
本発明は、T細胞における内因性遺伝子発現のダウンレギュレーション、例えば、T細胞受容体（TCR）のαおよび/もしくはβ鎖、β-2ミクログロブリン、CTLA-4、FAS、PD1、または主要組織適合複合体タンパク質、例えばHLA分子などをダウンレギュレートすることを含む。1つの態様において、遺伝子発現がダウンレギュレートされたT細胞は、同種環境における免疫原性が低下している。別の態様において、免疫原性が低下したT細胞は、標的指向化エフェクター活性のための改変TCRまたはCARを発現する。
【０１１５】
1つの局面において、本発明は、内因性遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸をT細胞に導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法であって、遺伝子がTCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される方法を含む。細胞に対する免疫応答が生じることに関与する内因性遺伝子、例えばTCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリンまたはHLA分子などの発現をダウンレギュレートすることにより、改変T細胞の免疫媒介性拒絶反応が低下する。例えば、内因性TCR、MHCまたはβ-2ミクログロブリン遺伝子の発現をダウンレギュレートすることにより、宿主免疫系による拒絶反応を引き起こす恐れのあるT細胞上のアロ抗原の表面提示が取り除かれる。また、T細胞における抑制性シグナル伝達経路を調節する内因性遺伝子、例えばCTLA-4、PD1および/またはFASなどをダウンレギュレートすることにより、免疫抑制性微小環境に曝露された場合の改変T細胞の抗腫瘍効力が強化される。
【０１１６】
1つの局面において、内因性遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、またはレンチウイルス性もしくは他のウイルス性形質導入などによって、T細胞に導入される。別の局面において、本発明は、内因性遺伝子発現をダウンレギュレートすることができるエレクトロポレーションされた核酸を含む、改変T細胞を含む。さらに別の局面において、改変T細胞は、内因性TCR遺伝子発現をダウンレギュレートすることができるエレクトロポレーションされた核酸を含む。別の局面において、改変T細胞を含む組成物が、本明細書に記載の方法に従って作製される。さらに別の局面において、本発明は、本明細書に記載の方法に従って作製された改変T細胞を含む、または本明細書に記載の方法に従って作製された改変T細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を含む。
【０１１７】
内因性遺伝子発現を調節することができる核酸は、内因性遺伝子発現をダウンレギュレートし得る。1つの態様において、内因性遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸は、アンチセンスRNA、アンチゴマーRNA、siRNA、shRNA、およびCRISPR系からなる群より選択される。内因性遺伝子発現を、例えば、アンチセンスRNA、アンチゴマーRNA、siRNA、shRNA、CRISPR系などによって、ダウンレギュレートすること、ノックダウンすること、減少させること、および/または阻害することができる。
【０１１８】
CRISPR/Cas
CRISPR/Casシステムは、標的指向化された遺伝子変化を誘導するための手軽で効率的なシステムである。Cas9タンパク質による標的認識は、ガイドRNA（gRNA）内部の「シード」配列、およびgRNA結合領域の上流にある保存されたジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を必要とする。CRISPR/CASシステムはそのため、細胞株（293T細胞など）、初代細胞およびCAR T細胞においてgRNAを再設計することによって、事実上あらゆるDNA配列を切断するように操作することができる。CRISPR/CASシステムは、単一のCAS9タンパク質を2種類またはそれを上回るgRNAと共発現させることによって、複数のゲノム遺伝子座を同時に標的とすることができ、このことはこのシステムを、複数遺伝子の編集または標的遺伝子の相乗的活性化のために比類なく適するものとしている。
【０１１９】
遺伝子発現を阻害するために用いられるCRISPR/Casシステムの一例であるCRISPRiは、米国特許出願公開第2014/0068797号に記載されている。CRISPRiは、RNAにガイドされるCas9エンドヌクレアーゼを利用する永続的な遺伝子破壊を誘導してDNA二本鎖切断を導入し、それは誤りがちの（error-prone）修復経路の引き金となり、結果的にフレームシフト突然変異をもたらす。触媒として作用のない（catalytically dead）Cas9は、エンドヌクレアーゼ活性を欠く。ガイドRNAと共発現されると、転写伸長、RNAポリメラーゼ結合、または転写因子結合に特異的に干渉するDNA認識複合体が生成される。このCRISPRiシステムは、標的とされた遺伝子の発現を効率的に抑制する。
【０１２０】
CRISPR/Cas遺伝子破壊は、標的遺伝子に対して特異的なガイド核酸配列、およびCasエンドヌクレアーゼが細胞に導入され、Casエンドヌクレアーゼが標的遺伝子の箇所で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成した場合に起こる。1つの態様において、CRISPR系は、pAd5F35-CRISPRベクターなどの、ただしこれには限定されない発現ベクターを含む。1つの態様において、改変T細胞は、Cas発現ベクターとある遺伝子に対して特異的なガイド核酸配列とをT細胞に導入することによって作製される。別の態様において、Cas発現ベクターは、Cas9エンドヌクレアーゼの発現を誘導する。T7、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、当技術分野において公知の他のヌクレアーゼ、およびそれらの任意の組み合わせを非限定的に含む、他のエンドヌクレアーゼを用いることもできる。
【０１２１】
1つの態様において、Cas発現ベクターの誘導は、T細胞を、Cas発現ベクター中の誘導性プロモーターを活性化する作用物質に曝露させることを含む。そのような態様において、Cas発現ベクターは、誘導性プロモーター、例えば、抗生物質への曝露によって（例えば、テトラサイクリン、またはテトラサイクリンの誘導体、例えばドキシサイクリンによって）誘導可能であるものなどを含む。しかし、他の誘導性プロモーターも使用できることが理解される必要がある。誘導因子は、誘導性プロモーターの誘導をもたらす選択的条件（例えば、作用物質、例えば抗生物質への曝露）であってもよい。これはCas発現ベクターの発現をもたらす。
【０１２２】
ガイド核酸配列はある遺伝子に対して特異的であり、Casエンドヌクレアーゼにより誘導される二本鎖切断のためにその遺伝子を標的とする。ガイド核酸配列の配列は、その遺伝子の遺伝子座内にあってもよい。1つの態様において、ガイド核酸配列は、長さが少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40ヌクレオチドであるか、またはそれを上回る。
【０１２３】
ガイド核酸配列は、免疫原性を低下させるかまたは免疫抑制性微小環境に対する感受性を低下させると考えられる遺伝子といった、任意の配列に対して特異的であってよい。1つの態様において、遺伝子は、T細胞受容体（TCR）鎖（α、β、γおよび/もしくはδ鎖など）、β-2ミクログロブリン、FAS、PD1、主要組織適合複合体タンパク質（HLAクラスI分子および/もしくはHLAクラスII分子など）、CTLA-4、またはそれらの任意の組み合わせに対して特異的な配列を含みうる。
【０１２４】
ガイド核酸配列には、RNA配列、DNA配列、それらの組み合わせ（RNA-DNA複合配列）、または合成ヌクレオチドを有する配列が含まれる。ガイド核酸配列は、単一分子または二重分子であってよい。1つの態様において、ガイド核酸配列は単一のガイドRNAを含む。
【０１２５】
T細胞受容体
抗原特異的TCRを保有するT細胞による養子免疫療法は、がんおよびある特定の慢性ウイルス感染症の処置において治療能を有する。特異的TCRによるT細胞の遺伝子操作には、T細胞を細胞内抗原に対して再方向付けるという利点がある。ほとんどの発がんタンパク質が細胞内にあることを考えると、発がんドライバータンパク質に対して特異的な一群のTCRの開発には大きな魅力がある。
【０１２６】
本発明はまた、本明細書において記載されるような遺伝子発現がダウンレギュレートされ、かつ外因性T細胞受容体（TCR）を有する改変T細胞も含む。1つの局面において、本発明は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸、ならびにTCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子発現を調節することができる核酸をT細胞に導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法であって、T細胞が改変TCRを発現することができる方法を含む。
【０１２７】
別の局面において、本発明は、外因性標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸、ならびにTCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸を含む改変T細胞を含み、ここでT細胞は改変TCRを発現し、かつ内因性遺伝子発現はT細胞においてダウンレギュレートされる。本発明はまた、本明細書に記載の改変T細胞を含む細胞の集団も含む。
【０１２８】
T細胞受容体は、抗原の提示に応答してT細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体である。TCRの刺激は、抗原ペプチドをT細胞に提示し、TCR複合体に結合して一連の細胞内シグナル伝達カスケードを誘導する、抗原提示細胞上の主要組織適合遺伝子複合体分子(MHC)によって誘発される。
【０１２９】
TCRは、一般に、リガンド認識に関与するTCRヘテロ二量体を形成する6つの異なる膜結合鎖から構成される。TCRは、構造的に類似しているが、異なる解剖学的位置および機能を有するα/βおよびγ/δ形態で存在する。1つの態様において、TCRは、TCR α鎖およびTCR β鎖を含み、したがってTCRをコードする核酸は、TCR α鎖およびTCR β鎖をコードする核酸を含む。別の態様において、TCR α鎖もしくはTCR β鎖またはこれらの両方の鎖は、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む。
【０１３０】
各鎖は、2つの細胞外ドメイン、つまり可変ドメインおよび定常ドメインから構成される。1つの態様において、TCRは少なくとも1つのマウス定常領域を含む。定常ドメインは、細胞膜の近位にあり、続いて膜貫通ドメインおよび短い細胞質尾部がある。1つの態様において、改変TCRは、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む。可変ドメインは、TCRが結合特異性を有する特定の抗原およびMHC分子の決定に寄与する。次に、固有の抗原-MHC複合体に対するT細胞の特異性は、T細胞によって発現される特定のTCRに存在する。
【０１３１】
定常ドメインおよび可変ドメインの各々は、鎖内ジスルフィド結合を含みうる。1つの態様において、TCRは少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域(CDR)に類似した高度に多型性のループを含む。TCR配列の多様性は、リンクされた可変部(V)、多様性部(D)、結合部(J)および定常部遺伝子の体細胞再編成を介して作り出される。
【０１３２】
機能的α鎖およびγ鎖ポリペプチドは、再構成されたV-J-C領域により形成されるが、β鎖およびδ鎖はV-D-J-C領域からなる。細胞外定常ドメインは、膜近位領域および免疫グロブリン領域を含む。
【０１３３】
1つの態様において、TCRは、野生型TCR、高親和性TCR、およびキメラTCRを含む。TCRが改変される場合、それは野生型TCRよりも標的細胞表面抗原に対して高い親和性を有しうる。TCRがキメラTCRである態様において、TCRはキメラドメインを含んでもよく、例えば、TCRは少なくとも1つの鎖のC末端に共刺激シグナル伝達ドメインを含む。他の態様において、TCRは、改変されたα鎖またはβ鎖のような、改変された鎖を含みうる。そのような改変には、N-脱グリコシル化、変化したドメイン(特異的な抗原を標的とするまたは親和性を増加させるために操作された可変領域など)、1つまたは複数のジスルフィド結合の付加、異なる種に由来する鎖の全体または断片、およびそれらの任意の組み合わせが含まれうるが、これらに限定されることはない。
【０１３４】
1つの態様において、TCRは、標的細胞抗原に対する特異性を含む。標的細胞表面抗原は、標的細胞の表面を規定する任意のタイプのリガンドを含みうる。例えば、標的細胞表面抗原は、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとしての役割を果たすリガンドを認識するように選択されうる。したがって、TCRの抗原結合ドメインに対するリガンドとして作用しうる細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫の感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞に関連するものが挙げられる。1つの態様において、標的細胞表面抗原は、任意の腫瘍関連抗原(TAA)およびウイルス抗原、疾患細胞関連抗原、またはその任意の断片を含む。
【０１３５】
標的細胞抗原は、主要組織適合遺伝子複合体によってプロセッシングされ提示される事が可能な任意のタンパク質を含みうる。例えば、標的抗原は、特定の疾患状態に関連しうる。したがって、TCRの標的として作用しうる細胞マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫の感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞に関連するものが挙げられる。1つの態様において、標的抗原は、腫瘍関連抗原(TAA)およびウイルス抗原のいずれか、またはその任意の断片を含む。
【０１３６】
1つの局面において、本発明は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸、ならびにTCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸を含む改変T細胞の集団を含み、ここでT細胞は改変TCRを発現することができる。
【０１３７】
T細胞受容体の操作および発現のための手法には、各々のサブユニットを接続するネイティブ性ジスルフィド架橋を含むTCRヘテロダイマーの作製が非限定的に含まれる（Garboczi, et al., (1996), Nature 384(6605): 134-41；Garboczi, et al., (1996), J Immunol 157(12): 5403-10；Chang et al., (1994), PNAS USA 91: 11408-11412；Davodeau et al., (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460；Golden et al., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169；米国特許第6,080,840号）。
【０１３８】
キメラ抗原受容体（CAR）
本発明はまた、本明細書において記載されるような遺伝子発現がダウンレギュレートされ、かつCARを有する改変T細胞も含む。したがって、本発明は、CARまたはCARをコードする核酸を含む改変T細胞を範囲に含み、ここでCARは抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。
【０１３９】
1つの局面において、本発明は、TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸をT細胞に導入する、ならびにキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸をT細胞に導入する段階を含む、改変T細胞を作製する方法であって、CARが共刺激分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む該方法を含む。
【０１４０】
別の局面において、本発明は、内因性遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸、およびキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸を含む改変T細胞を含み、ここで遺伝子発現がダウンレギュレートされるものはTCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択され、CARは共刺激分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。1つの態様において、改変T細胞は、本明細書において別所に記載されたような標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変TCRをコードする外因性核酸をさらに含む。本発明はまた、本明細書に記載の改変T細胞を含む細胞の集団も含む。
【０１４１】
CARの1つもしくは複数のドメイン、またはドメインの断片は、ヒトのものであってよい。1つの態様において、本発明は、完全ヒトCARを含む。所望のドメインをコードする核酸配列は、当技術分野において公知の組換え方法、例えば、標準的な手法を用いて、その遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによって、それを含むことが公知であるベクターから遺伝子を導き出すことによって、またはそれを含有する細胞および組織から直接的に単離することなどによって、入手することができる。または、関心対象の遺伝子を、クローニングされた分子としてではなく、合成によって作製することもできる。
【０１４２】
CARの例は、米国特許第8,911,993号、第8,906,682号、第8,975,071号、第8,916,381号、第9,102,760号、第9,101,584号および第9,102,761号に記載されており、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４３】
抗原結合ドメイン
1つの態様において、CARは、標的細胞上の抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。CARの抗原結合ドメインと結合する抗原として作用しうる細胞表面マーカーの例には、ウイルス感染症、細菌感染症および寄生虫感染症、自己免疫疾患ならびにがん細胞と関連するものが含まれる。
【０１４４】
抗原結合ドメインの選択は、標的細胞の表面に存在する抗原の型および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識するように選択してもよい。
【０１４５】
1つの態様において、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、例えば関心対象の腫瘍またはがんに特異的な抗原等と結合する。1つの態様において、本発明の腫瘍抗原は1つまたは複数の抗原性がんエピトープを含む。
【０１４６】
抗原結合ドメインは、抗原と結合する任意のドメインを含むことができ、それには、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、およびそれらの断片が非限定的に含まれうる。したがって、1つの態様において、抗原結合ドメイン部分は哺乳動物抗体またはその断片を含む。
【０１４７】
抗原結合ドメインは、以下の、ただしこれらには限定されない1つまたは複数の抗原と結合してよい：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1（CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319および19A24とも称される）；C型レクチン様分子-1（CLL-1またはCLECL1）；CD33；上皮増殖因子受容体変異体III（EGFRvIII）；ガングリオシドG2（GD2）；ガングリオシドGD3（aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer）；TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟（BCMA）；Tn抗原（（Tn Ag）または（GalNAcα-Ser/Thr））；プロテアーゼ特異的膜抗原（PSMA）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）；Fms様チロシンキナーゼ3（FLT3）；腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）；CD38；CD44v6；がん胎児性抗原（CEA）；上皮細胞接着分子（EPCAM）；B7H3（CD276）；KIT（CD117）；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2（IL-13Ra2またはCD213A2）；メソテリン；インターロイキン11受容体α（IL-11Ra）；前立腺幹細胞抗原（PSCA）；プロテアーゼセリン21（テスチシン（Testisin）またはPRSS21）；血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）；ルイス（Y）抗原；CD24；血小板由来増殖因子受容体β（PDGFR-β）；ステージ特異的胎児抗原-4（SSEA-4）；CD20；葉酸受容体α；受容体チロシン-プロテインキナーゼERBB2（Her2/neu）；ムチン1、細胞表面関連（MUC1）；上皮増殖因子受容体（EGFR）；神経細胞接着分子（NCAM）；プロスターゼ（Prostase）；前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）；伸長因子2突然変異型（ELF2M）；エフリンB2；線維芽細胞活性化タンパク質α（FAP）；インスリン様増殖因子1受容体（IGF-I受容体）、炭酸脱水酵素IX（CAIX）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、β型、9（LMP2）；糖タンパク質100（gp100）；切断点クラスター領域（BCR）およびエーベルソンマウス白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ1（Abl）からなるがん遺伝子融合タンパク質（bcr-abl）；チロシナーゼ；エフリンA型受容体2（EphA2）；フコシルGM1；シアリルルイス接着分子（sLe）；ガングリオシドGM3（aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer）；トランスグルタミナーゼ5（TGS5）；高分子量黒色腫関連抗原（HMWMAA）；o-アセチル-GD2ガングリオシド（OAcGD2）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー1（TEM1/CD248）；腫瘍内皮マーカー7関連物（TEM7R）；クローディン6（CLDN6）；甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）；Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5、メンバーD（GPRC5D）；染色体Xオープンリーディングフレーム61（CXORF61）；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）；ポリシアル酸；胎盤特異的1（PLAC1）；globoHグリコセラミド（GloboH）の六糖部分；乳腺分化抗原（NY-BR-1）；ウロプラキン2（UPK2）；A型肝炎ウイルス細胞受容体1（HAVCR1）；アドレナリン受容体β3（ADRB3）；パンネキシン3（PANX3）；Gタンパク質共役受容体20（GPR20）；リンパ球抗原6複合体、座位K9（LY6K）；嗅覚受容体51E2（OR51E2）；TCR γ選択的リーディングフレームタンパク質（TARP）；ウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）；がん/精巣抗原1（NY-ESO-1）；がん/精巣抗原2（LAGE-1a）；黒色腫関連抗原1（MAGE-A1）；染色体12pに位置するETS転座変異体遺伝子6（ETV6-AML）；精子タンパク質17（SPA17）；X抗原ファミリー、メンバー1A（XAGE1）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2（Tie 2）；黒色腫がん精巣抗原-1（MAD-CT-1）；黒色腫がん精巣抗原-2（MAD-CT-2）；Fos関連抗原1；腫瘍タンパク質p53（p53）；p53突然変異体；プ��ステイン；サバイビン（surviving）；テロメラーゼ；前立腺がん腫瘍抗原-1（PCTA-1またはガレクチン8）、T細胞1によって認識される黒色腫抗原（メランAまたはMART1）；ラット肉腫（Ras）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害因子（ML-IAP）；ERG（膜貫通型プロテアーゼ、セリン2（TMPRSS2）ETS融合遺伝子）；N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV（NA17）；ペアードボックスタンパク質Pax-3（PAX3）；アンドロゲン受容体；サイクリンB1；v-mycトリ骨髄細胞腫ウイルスがん遺伝子神経芽腫由来ホモログ（MYCN）；RasホモログファミリーメンバーC（RhoC）；チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）；シトクロムP450 1B1（CYP1B1）；CCCTC結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（BORISまたはBrother of the Regulator of Imprinted Sites）、T細胞3によって認識される扁平上皮細胞がん抗原（SART3）；ペアードボックスタンパク質Pax-5（PAX5）；プロアクロシン結合タンパク質sp32（OY-TES1）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（LCK）；Aキナーゼアンカータンパク質4（AKAP-4）；滑膜肉腫、X切断点2（SSX2）；終末糖化産物受容体（RAGE-1）；腎臓ユビキタス1（RU1）；腎臓ユビキタス2（RU2）；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスE6（HPV E6）；ヒト乳頭腫ウイルスE7（HPV E7）；腸管カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質70-2突然変異型（mut hsp70-2）；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1（LAIR1）；IgA受容体のFc断片（FCARまたはCD89）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2（LILRA2）；CD300分子様ファミリーメンバーf（CD300LF）；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA（CLEC12A）；骨髄間質細胞抗原2（BST2）；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2（EMR2）；リンパ球抗原75（LY75）；グリピカン-3（GPC3）；Fc受容体様5（FCRL5）；および免疫グロブリンλ様ポリペプチド1（IGLL1）。
【０１４８】
場合によっては、抗原結合ドメインは、CARが最終的に用いられることになるものと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトに用いる目的には、CARの抗原結合ドメインが、ヒト抗体、本明細書において他所に記載されたようなヒト化抗体、またはそれらの断片を含むことが有益であると考えられる。
【０１４９】
また、抗原結合ドメインが、CARの別のドメインに、例えば、いずれも本明細書において他所に記載されている膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインに、細胞における発現のために機能的に連結されていることも有益である。1つの態様において、抗原結合ドメインをコードする核酸は、膜貫通ドメインをコードする核酸および細胞内ドメインをコードする核酸と機能的に連結されている。
【０１５０】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、CARは、CARの抗原結合ドメインを細胞内ドメインと接続する膜貫通ドメインを含むように設計することができる。1つの態様において、膜貫通ドメインは、CARにおけるドメインの1つまたは複数に天然に付随する。場合によっては、膜貫通ドメインを、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を避けるように選択すること、またはそのためのアミノ酸置換によって選択もしくは改変することもできる。
【０１５１】
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれに由来してもよい。供給源が天然である場合には、ドメインは任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。本発明において特に有用性のある膜貫通領域は、T細胞受容体のα、βまたはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来しうる（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む）。場合によっては、ヒトIg（免疫グロブリン）ヒンジを含む、種々のヒトヒンジも用いることができる。
【０１５２】
1つの態様において、膜貫通ドメインは合成性であってもよく、この場合には、それは主として、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むと考えられる。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に認められるであろう。
【０１５３】
細胞内ドメイン
CARの細胞内ドメイン、または別の言い方では細胞質ドメインは、CARが発現される細胞の活性化の原因となる。「細胞内ドメイン」という用語は、このため、活性化シグナルを伝達するのに十分な細胞内ドメインの任意の部分を含むことを意味する。1つの態様において、細胞内ドメインは、エフェクター機能の原因となるドメインを含む。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化した機能のことを指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であろう。
【０１５４】
1つの態様において、CARの細胞内ドメインは、シグナル活性化および/または形質導入の原因となるドメインを含む。細胞内ドメインは、タンパク質-タンパク質相互作用、生化学的変化、または細胞の代謝、形状、遺伝子発現を変化させる他の応答、またはキメラ細胞内シグナル伝達分子の活性化に対する他の細胞応答を介して、シグナル活性化を伝達することができる。
【０１５５】
本発明に用いるための細胞内ドメインの例には、抗原受容体係合後にシグナル伝達を惹起するように協調的に作用するT細胞受容体（TCR）および任意の共刺激分子の細胞質部分、ならびに同じ機能的能力を有するこれらの要素の任意の誘導体または変異体および任意の合成配列が含まれる。1つの態様において、CARの細胞内ドメインは、二重シグナル伝達ドメインを含む。二重シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の分子のいずれか由来の断片またはドメインを含みうる。
【０１５６】
細胞内ドメインの例には、TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、一般的なFcRγ、FcRβ（Fcε R1b）、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12、T細胞受容体（TCR）、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM（LIGHTR）、SLAMF7、NKp80（KLRF1）、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1（CD226）、SLAMF4（CD244、2B4）、CD84、CD96（Tactile）、CEACAM1、CRTAM、Ly9（CD229）、CD160（BY55）、PSGL1、CD100（SEMA4D）、CD69、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3）、BLAME（SLAMF8）、SELPLG（CD162）、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、本明細書に記載の他の共刺激分子、同じ機能的能力を有する、それらの任意の誘導体、変異体または断片、共刺激分子の任意の合成配列、およびそれらの任意の組み合わせを非限定的に含む、1つまたは複数の分子または受容体由来の断片またはドメインが含まれる。
【０１５７】
1つの態様において、CARの細胞内ドメインは、共刺激分子の任意の部分、例えば、CD3、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1、T細胞受容体（TCR）由来の少なくとも1つのシグナル伝達ドメイン、同じ機能的能力を有する、それらの任意の誘導体または変異体、それらの任意の合成配列、およびそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１５８】
CARの抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはCARの細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインを組み入れてもよい。本明細書で用いる場合、「スペーサードメイン」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖中の抗原結合ドメインまたは細胞内ドメインのいずれかと連結させる働きをする任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドのことを意味する。1つの態様において、スペーサードメインは、最大で300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸で構成される。別の態様において、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは長さが2〜10アミノ酸であるものが、CARの膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間の連結を形成してもよい。リンカーの一例には、グリシン-セリンダブレットが含まれる。
【０１５９】
ヒト抗体
二重特異性抗体またはCARの抗原結合ドメインを用いる場合には、ヒト抗体またはその断片を用いることが好ましいと考えられる。ヒト対象の治療的処置のためには、完全ヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法を、これらの手法の改良法と併せて含む、当技術分野において公知の種々の方法によって作製することができる。また、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；ならびにPCT公開公報第WO 98/46645号、WO 98/50433号、WO 98/24893号、WO 98/16654号、WO 96/34096号、WO 96/33735号およびWO 91/10741号も参照されたい；これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。二重特異性抗体には、重鎖および軽鎖がヒトDNAの1つまたは複数の供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードされている抗体も含まれうる。
【０１６０】
また、ヒト抗体を、機能的内因性免疫グロブリンを発現する能力はないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することはできるトランスジェニックマウスを用いて産生させることもできる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為に、または相同組換えによって、マウス胚性幹細胞に導入することができる。または、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入することもできる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々または同時に、非機能性にすることができる。例えば、キメラマウスおよび生殖系列突然変異型マウスにおける抗体重鎖連結領域（JH）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。この改変された胚性幹細胞を増やし、胚盤胞に微量注入してキメラマウスを生じさせる。続いて、キメラマウスを交配させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を生じさせる。トランスジェニックマウスに対して、通常の様式で、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部分による免疫処置を行う。免疫処置を行ったトランスジェニックマウスから、選択した標的に対して方向付けられた抗体を、従来のハイブリドーマ技術を用いて入手することができる。トランスジェニックマウスによって保有されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子はB細胞分化の際に再編成され、その後にクラススイッチおよび体細胞突然変異を起こす。したがって、そのような手法を用いて、IgG1（γ1）およびIgG3を非限定的に含む、治療的に有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を産生させることが可能である。ヒト抗体を産生させるためのこの技術の概略については、Lonberg and Huszar（Int. Rev. Immunol, 13:65-93 (1995)）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生させるためのこの技術の詳細な考察、ならびにそのような抗体を産生させるためのプロトコールについては、例えば、PCT公開公報第WO 98/24893号、WO 96/34096号およびWO 96/33735号；ならびに米国特許第5,413,923号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,569,825号；第5,661,016号；第5,545,806号；第5,814,318号；および第5,939,598号も参照されたく、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。加えて、Abgenix, Inc.（Freemont, Calif.）およびGenpharm（San Jose, Calif.）などの会社と、選択した抗原に対して方向付けられたヒト抗体を、上記のものに類似した技術を用いて得るための契約を結ぶこともできる。抗原負荷刺激によってヒト抗体の産生がもたらされると考えられる、生殖系列突然変異型マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入に関する具体的な考察については、例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993)；およびDuchosal et al., Nature, 355:258 (1992)を参照されたい。
【０１６１】
また、ヒト抗体を、ファージディスプレイライブラリーから導き出すこともできる（Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)；Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309 (1996)）。ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)）は、免疫処置を受けていないドナーの免疫グロブリン可変（V）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を産生させるために用いることができる。この手法によれば、抗体Vドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージ、例えばM13またはfdの主要コートタンパク質またはマイナーコートタンパク質の遺伝子中にインフレームでクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示させる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択により、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択ももたらされる。このため、ファージはB細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは種々のフォーマットで行うことができる；それらの概説については、Johnson, Kevin S, and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照されたい。V遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに用いることができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫処置を受けたマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離している。免疫処置を受けていないヒトドナーからV遺伝子のレパートリーを構築して、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、本質的にはMarks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993)に記載された手法に従って単離することができる。米国特許第5,565,332号および第5,573,905号も参照されたく、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６２】
また、ヒト抗体をインビトロ活性化B細胞によって作製することもできる（米国特許第5,567,610号および第5,229,275号を参照。これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。また、ヒト抗体を、限定はされないが、Roder et al.（Methods Enzymol, 121:140-167 (1986)）によって記載されたものなどのハイブリドーマ手法を用いてインビトロで作製することもできる。
【０１６３】
ヒト化抗体
または、いくつかの態様においては、非ヒト抗体をヒト化することができ、この場合には、抗体の特定の配列または領域を、ヒトにおいて天然に産生される抗体との類似性を高めるために改変する。例えば、本発明において、抗体またはその断片は非ヒト哺乳動物scFvを含みうる。1つの態様において、抗原結合ドメイン部分はヒト化される。
【０１６４】
ヒト化抗体は、以下のものを非限定的に含む、当技術分野において公知の種々の手法を用いて生成させることができる：CDRグラフティング（例えば、欧州特許第EP 239,400号；国際公開公報第WO 91/09967号；ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号および第5,585,089号を参照。これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）、ベニヤリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）（例えば、欧州特許第EP 592,106号および第EP 519,596号；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814；およびRoguska et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973を参照。これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）、チェーンシャッフリング（chain shuffling）（例えば、米国特許第5,565,332号を参照。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）、ならびに例えば、米国特許出願公開第US2005/0042664号、米国特許出願公開第US2005/0048617号、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、国際公開公報第WO 9317105号、Tan et al., J. Immunol, 169: 1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10(1994)、およびPedersen et al., J. Mol. Biol, 235(3):959-73 (1994)に開示された手法、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。多くの場合、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変更するため、好ましくは改善するために、CDRドナー抗体由来の対応する残基によって置換されると考えられる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法によって、例えば抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためにCDRとフレームワーク残基との相互作用をモデリングすることによって、および特定の位置にある異常なフレームワーク残基を同定するために配列比較によって同定される（例えば、Queen et al., 米国特許第5,585,089号；およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323を参照。これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１６５】
ヒト化抗体は、非ヒト性である供給源からその中に導入された、1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、典型的には「インポート」可変ドメインから採られる。したがって、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子由来の1つまたは複数のCDR、およびヒト由来のフレームワーク領域を含む。抗体のヒト化は当技術分野において周知であり、本質的にはWinterらの方法（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）に従って、ヒト抗体の対応する配列を齧歯動物のCDRまたはCDR配列へと置換すること、すなわち、CDRグラフティング（EP 239,400号；PCT公開公報第WO 91/09967号；および米国特許第4,816,567号；第6,331,415号；第5,225,539号；第5,530,101号；第5,585,089号；第6,548,640号。これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）によって行うことができる。そのようなヒト化キメラ抗体では、実質的にインタクトではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際上は、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基およびおそらくはいくつかのフレームワーク（FR）残基が、齧歯動物抗体における類似部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。また、抗体のヒト化を、ベニヤリングもしくはリサーフェイシング（EP 592,106号；EP 519,596号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)；およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)）またはチェーンシャッフリング（米国特許第5,565,332号）によって達成することもでき、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６６】
ヒト化抗体を作製する上で用いられる、軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させることを目的とする。いわゆる「ベストフィット」法に従って、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。続いて、齧歯動物のものに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（FR）として受け入れる（Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993)；Chothia et al., J. Mol. Biol, 196:901 (1987)、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。もう1つの方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる（(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１６７】
抗体は、標的抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性を保ったままでヒト化することができる。本発明の1つの局面によれば、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた親配列およびさまざまな概念上のヒト化産物の分析の過程によって、ヒト化抗体が調製される。免疫グロブリンの三次元モデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列に関して可能性のある三次元立体構造を図示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検討により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大といった所望の抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント配列およびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接かつ最も実質的に関与している。
【０１６８】
ヒト化抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性を保っている。しかし、ある特定のヒト化方法を用いると、標的抗原に対する抗体の結合の親和性および/または特異性を、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wu et al., J. Mol. Biol, 294:151 (1999)によって記載されたような「定方向進化」の方法を用いて高めることができる。
【０１６９】
他の分子
本発明はまた、共刺激分子または共刺激分子をコードする核酸を含む、本明細書に記載の改変T細胞をさらに含む。1つの態様において、本発明の改変T細胞は、改変T細胞が共刺激分子を発現するように、共刺激分子をコードする外因性核酸をさらに含む。核酸は、T細胞に形質導入を行うこと、T細胞にトランスフェクションを行うこと、またはT細胞にエレクトロポレーションを行うことによって、T細胞に導入することができる。別の態様において、共刺激分子は、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lから選択される。別の態様において、共刺激分子はCD3を含み、かつ少なくとも2つの異なるCD3鎖、例えばCD3ζ鎖およびCD3ε鎖などを含む。
【０１７０】
別の態様において、改変T細胞は、T細胞の多能性を誘導するための、Klf4、Oct3/4および/もしくはSox2、またはKlf4、Oct3/4および/もしくはSox2をコードする核酸をさらに含む。T細胞は、Klf4、Oct3/4およびSox2を発現させることによって多能性に誘導することができる。Klf4、Oct3/4およびSox2は、核酸、ウイルスベクターまたはRNA分子から発現させることができる。1つの態様においては、Klf4、Oct3/4およびSox2をコードするウイルスベクターを、多能性を誘導するためにT細胞に導入する。別の態様においては、多能性を誘導するためにT細胞にセンダイウイルスベクターを導入し、ここでセンダイウイルスベクターはKlf4、Oct3/4およびSox2をコードする。
【０１７１】
核酸の導入
細胞に核酸を導入する方法には、物理的方法、生物学的方法および化学的方法が含まれる。RNAのような、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)を含む市販の方法を用いて、RNAを標的細胞に導入することができる。リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクションを用いて、ポリマーカプセル化を用いて、ペプチド媒介トランスフェクションを用いて、または「遺伝子銃」のような微粒子銃粒子送達系を用いて、RNAを細胞に導入することもできる(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照のこと)。
【０１７２】
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAおよびRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使われている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第5,350,674号および同第5,585,362号を参照されたい。
【０１７３】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズのような、コロイド分散系、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めて脂質に基づく系が含まれる。インビトロおよびインビボでの送達媒体として用いるための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
【０１７４】
使用に適した脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ; リン酸ジセチル(「DCP」)は、K & K Laboratories (Plainview, NY)から得ることができ; コレステロール(「Choi」)は、Calbiochem-Behringから得ることができ; ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)から得られうる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質のストック溶液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として用いられる。「リポソーム」は、密閉された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される種々の単層状および多層状脂質媒体を包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有すると特徴付けることができる。多層状リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水溶液に懸濁させると、自発的に形成される。脂質成分は閉鎖構造の形成前に自己再構成を受け、脂質二重層の間に水および溶解溶質を閉じ込める(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造とは溶液中で異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとり、または脂質分子の不均一な凝集体として単に存在しうる。リポフェクトアミン-核酸複合体も企図される。
【０１７５】
外因性核酸を宿主細胞に導入するために、またはその他の方法で本発明の阻害剤に細胞を曝露するために用いられる方法にかかわらず、宿主細胞における核酸の存在を確認するために、種々のアッセイ法が実施されうる。そのようなアッセイ法には、例えば、サザンおよびノザンブロッティング、RT-PCRおよびPCRのような、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ法; 例えば、免疫学的手段(ELISAおよびウエスタンブロット)によって、または本発明の範囲に入る薬剤を同定するための本明細書において記述されるアッセイ法によって、特定のペプチドの存在または非存在を検出するような「生化学的」アッセイ法が含まれる。
【０１７６】
1つの態様においては、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含むT細胞受容体（TCR）をコードする核酸を、拡大したT細胞に導入する。TCRをコードする核酸は、内因性TCR遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸と同一または別個の核酸であってもよい。TCRをコードする核酸は、内因性TCR遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸と同時に、または逐次的にT細胞に導入することができる。1つの態様において、TCRをコードする核酸は、内因性TCR遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸よりも以前に導入される。
【０１７７】
さらに、核酸を、拡大したT細胞の形質導入、拡大したT細胞のトランスフェクション、および拡大したT細胞のエレクトロポレーションなどの任意の手段によって導入することができる。1つの核酸を1つの方法によって導入し、T細胞に導入しようとするもう1つの核酸を異なる方法によって導入してもよい。
【０１７８】
RNA
1つの態様において、T細胞に導入される核酸はRNAである。別の態様において、RNAは、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含むmRNAである。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)生成された鋳型を用いたインビトロ転写によって産生される。任意の供給源由来の関心対象のDNAは、適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを用いてインビトロmRNA合成のための鋳型にPCRによって直接変換することができる。DNA供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列または任意の他の適切なDNA供給源であることができる。インビトロ転写のための所望の鋳型は、キメラ膜タンパク質である。例として、鋳型は、抗体、抗体の断片または抗体の一部分をコードする。別の例として、鋳型は、抗CD3のような、抗体の一本鎖可変ドメインを含む細胞外ドメイン、および共刺激分子の細胞内ドメインを含む。1つの態様において、RNAキメラ膜タンパク質の鋳型は、共刺激分子に対する抗体に由来する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの一部分に由来する細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードする。
【０１７９】
PCRを用いてインビトロでのmRNA転写のための鋳型を作製することができ、これが次いで、細胞に導入される。PCRを実施するための方法は、当技術分野において周知である。PCRで用いるためのプライマーは、PCRの鋳型として用いられるDNAの領域に実質的に相補的な領域を有するようにデザインされる。本明細書において用いられる「実質的に相補的」とは、プライマー配列中の塩基の大部分または全部が相補的であるか、または1つもしくは複数の塩基が非相補的である、もしくはミスマッチであるヌクレオチドの配列をいう。実質的に相補的な配列は、PCRに用いられるアニーリング条件の下で、意図されたDNA標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、DNA鋳型の任意の部分に実質的に相補的であるようにデザインすることができる。例えば、プライマーは、5'および3' UTRを含む、細胞内で通常転写される遺伝子の部分(読み取り枠)を増幅するようにデザインすることができる。プライマーは、関心対象の特定ドメインをコードする遺伝子の一部分を増幅するようにデザインすることもできる。1つの態様において、プライマーは、5'および3' UTRの全部または一部分を含むヒトcDNAのコード領域を増幅するようにデザインされる。PCRに有用なプライマーは、当技術分野において周知である合成方法によって作製される。「フォワードプライマー」は、増幅されるDNA配列の上流にあるDNA鋳型上のヌクレオチドと実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」とは、コード鎖に対して増幅されるDNA配列の、5'側の位置をいうように本明細書において用いられる。「リバースプライマー」は、増幅されるDNA配列の下流にある二本鎖DNA鋳型と実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」とは、コード鎖に対して増幅されるDNA配列の、3'側の位置をいうように本明細書において用いられる。
【０１８０】
RNAの安定性および/または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造が用いられてもよい。RNAは、好ましくは5'および3' UTRを有する。1つの態様において、5' UTRは長さが0〜3000ヌクレオチドである。コード領域に付加される5'および3' UTR配列の長さは、UTRの異なる領域にアニールするPCRのためのプライマーをデザインすることを含むが、これに限定されない、異なる方法によって変化させることができる。この手法を用いて、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要とされる5'および3' UTRの長さを変えることができる。
【０１８１】
5'および3' UTRは関心対象の遺伝子の、天然に存在する内因性5'および3' UTRであることができる。あるいは、関心対象の遺伝子に対して内因性ではないUTR配列を、フォワードプライマーおよびリバースプライマーにUTR配列を組み入れることによって、または鋳型の他の任意の改変によって付加することができる。関心対象の遺伝子に対して内因性ではないUTR配列の使用は、RNAの安定性および/または翻訳効率を変化させるのに有用であることができる。例えば、3' UTR配列中のAUに富むエレメントはmRNAの安定性を低下させうることが知られている。それゆえ、当技術分野において周知であるUTRの特性に基づいて転写されたRNAの安定性を増加させるように、3' UTRを選択またはデザインすることができる。
【０１８２】
1つの態様において、5' UTRは、内因性遺伝子のコザック(Kozak)配列を含むことができる。あるいは、関心対象の遺伝子に対して内因性ではない5' UTRが上記のようにPCRによって付加される場合、コンセンサスコザック配列は、5' UTR配列を付加することによって再デザインすることができる。コザック配列は、いくつかのRNA転写産物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのRNAに必要とされるようではない。多くのmRNAに対してのコザック配列の必要性は、当技術分野において公知である。他の態様において、5' UTRは、そのRNAゲノムが細胞内で安定なRNAウイルスに由来することができる。他の態様において、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、様々なヌクレオチド類似体を3'または5' UTRにおいて用いることができる。
【０１８３】
遺伝子クローニングを必要とせずにDNA鋳型からRNAの合成を可能にするために、転写のプロモーターはDNA鋳型に対して、転写される配列の上流に付け加えられるべきである。RNAポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5'末端に付加される場合、RNAポリメラーゼプロモーターは、転写される読み取り枠の上流でPCR産物に組み入れられるようになる。1つの態様において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記述されるように、T7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、T3およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されることはない。T7、T3およびSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。
【０１８４】
1つの態様において、mRNAは、リボソーム結合、細胞内でのmRNAの翻訳開始および安定性を決定する5'末端のキャップおよび3'ポリ(A)尾部の両方を有する。環状DNA鋳型、例えば、プラスミドDNAでは、RNAポリメラーゼは真核細胞での発現には適さない長い鎖状体の生成物を産生する。3' UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写は、転写後にポリアデニル化されても真核生物のトランスフェクションにおいて効果的ではない正常なサイズのmRNAをもたらす。
【０１８５】
直鎖状DNA鋳型上で、ファージT7 RNAポリメラーゼは鋳型の最後の塩基を越えて転写産物の3'末端を伸長させることができる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。
【０１８６】
DNA鋳型へのポリA/Tストレッチの組み込みの従来の方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドDNAに組み込まれたポリA/T配列は、プラスミドの不安定性を引き起こすことがあり、その理由は、細菌細胞から得られたプラスミドDNA鋳型が、欠失および他の異常で高度に損なわれていることが多いためである。これにより、クローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、信頼できないことも多い。それが、クローニングなしにポリA/T 3'ストレッチを有するDNA鋳型の構築を可能にする方法が非常に望ましいという理由である。
【０１８７】
転写DNA鋳型のポリA/Tセグメントは、100T尾部(サイズは50〜5000 Tであることができる)のようなポリT尾部を含むリバースプライマーを用いることによってPCR中に、またはDNAライゲーションもしくはインビトロ組み換えを含むが、これらに限定されない、任意の他の方法によってPCR後に産生することができる。ポリ(A)尾部はまた、RNAに安定性を与え、RNAの分解を低減させる。一般に、ポリ(A)尾部の長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関がある。1つの態様において、ポリ(A)尾部は、100〜5000個のアデノシンである。
【０１８８】
RNAのポリ(A)尾部は、大腸菌(E. coli)ポリAポリメラーゼ(E-PAP)のような、ポリ(A)ポリメラーゼを用いてインビトロ転写後にさらに伸長することができる。1つの態様において、ポリ(A)尾部の長さを100ヌクレオチドから300〜400ヌクレオチドに増加させると、RNAの翻訳効率が約2倍増加する。さらに、異なる化学基の3'末端への結合は、mRNA安定性を増加させることができる。そのような結合は改変された/人工のヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含むことができる。例えば、ATP類似体は、ポリ(A)ポリメラーゼを用いてポリ(A)尾部に組み入れることができる。ATP類似体はRNAの安定性をさらに増すことができる。
【０１８９】
5'キャップもRNA分子に安定性をもたらす。好ましい態様において、本明細書において開示される方法により産生されるRNAは、5'キャップを含む。5'キャップは、当技術分野において知られ、本明細書において記述されている技法を用いて提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
【０１９０】
本明細書において開示される方法によって産生されるRNAは、内部リボソーム侵入部位(IRES)配列を含むこともできる。IRES配列は、mRNAとのキャップ非依存性リボソーム結合を開始させ、翻訳の開始を容易にする任意のウイルス配列、染色体配列または人為的にデザインされた配列でありうる。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、酸化防止剤、および界面活性剤のような細胞透過性および生存性を促進する因子を含有できる、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質を含めることができる。
【０１９１】
RNAトランスフェクション
いくつかの態様において、TCRをコードするRNAが細胞中にエレクトロポレーションされる。1つの態様において、TCRをコードするRNAは、インビトロで転写されたRNAである。
【０１９２】
開示された方法は、遺伝子操作されたT細胞が標的がん細胞を殺傷する能力の評価を含めて、がん、幹細胞、急性および慢性感染症ならびに自己免疫疾患の分野において、基礎研究および療法におけるT細胞活性の調節に適用することができる。
【０１９３】
本方法はまた、例えば、プロモーターまたは投入RNAの量を変化させることにより、広範囲にわたって発現レベルを制御する能力を提供し、発現レベルを個別に調節することを可能にする。さらに、PCRに基づくmRNA産生の技法は、異なる構造およびそれらのドメインの組み合わせを有するmRNAのデザインを非常に容易にする。
【０１９４】
本発明のRNAトランスフェクション方法の1つの利点は、RNAトランスフェクションが本質的に一過性で、ベクター不含であることである。RNA導入遺伝子は、いかなる追加のウイルス配列も必要とせずに最小の発現カセットとして、リンパ球に送達され、簡単なインビトロでの細胞活性化後にその中で発現されることができる。これらの条件下では、宿主細胞ゲノムへの導入遺伝子の組み込みは起こる可能性が低い。RNAのトランスフェクションの効率およびリンパ球集団全体を均一に改変する能力のため、細胞のクローニングは必要ではない。
【０１９５】
インビトロで転写されたRNA (IVT-RNA)を用いたT細胞の遺伝的改変では、2つの異なる戦略を利用し、そのどちらも様々な動物モデルにおいて逐次的に試験されている。リポフェクションまたはエレクトロポレーションによって細胞に、インビトロで転写されたRNAをトランスフェクションする。移入されたIVT-RNAの長期発現を達成するために、様々な改変を用いてIVT-RNAを安定化することが望ましい。
【０１９６】
いくつかのIVTベクターは、文献において公知であり、これはインビトロ転写のための鋳型として標準化された様式で利用され、安定化されたRNA転写産物が産生されるように遺伝子操作されている。現在、当技術分野において用いられているプロトコールは、以下の構造: RNA転写を可能にする5' RNAポリメラーゼプロモーター、その後に非翻訳領域(UTR)が3'側および/または5'側のいずれかで隣接した関心対象の遺伝子、ならびに50〜70個のAヌクレオチドを含む3'ポリアデニルカセットを有するプラスミドベクターに基づく。インビトロ転写に先立ち、環状プラスミドは、II型制限酵素によってポリアデニルカセットの下流で線状化される(認識配列は切断部位に対応する)。したがってポリアデニルカセットは、転写産物中の後のポリ(A)配列に対応する。この手順の結果として、一部のヌクレオチドは、線状化後に酵素切断部位の一部として残り、3'末端でポリ(A)配列を伸長またはマスクする。この非生理的な突出部が、そのような構築体から細胞内に産生されるタンパク質の量に影響を与えるかどうかは、明らかではない。
【０１９７】
RNAは、より伝統的なプラスミドまたはウイルス手法に比べていくつかの利点を有する。RNA供給源からの遺伝子発現は転写を必要とせず、タンパク質産物はトランスフェクション後に迅速に産生される。さらに、RNAは核ではなく、細胞質に接近しさえすればよいため、ゆえに、典型的なトランスフェクション法で極めて高いトランスフェクション率が得られる。さらに、プラスミドに基づく手法では、関心対象の遺伝子の発現を駆動するプロモーターが、研究中の細胞において活性であることが必要とされる。
【０１９８】
別の局面において、RNA構築体はエレクトロポレーションによって細胞に送達される。例えば、米国特許第2004/0014645号、米国特許第2005/0052630A1号、米国特許第2005/0070841A1号、米国特許第2004/0059285A1号、米国特許第2004/0092907A1号に教示されているように哺乳動物細胞への核酸構築体のエレクトロポレーションの製剤および方法論を参照されたい。任意の既知の細胞型のエレクトロポレーションに必要な電場強度を含む様々なパラメータは、関連する研究文献ならびに当技術分野における多数の特許および出願において一般的に知られている。例えば、米国特許第6,678,556号、米国特許第7,171,264号、および米国特許第7,173,116号を参照されたい。エレクトロポレーションの治療的適用のための装置は、例えばMedPulser(商標) DNAエレクトロポレーション治療システム(DNA Electroporation Therapy System) (Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.)のように市販されており、米国特許第6,567,694号; 米国特許第6,516,223号、米国特許第5,993,434号、米国特許第6,181,964号、米国特許第6,241,701号、および米国特許第6,233,482号のような特許に記述されており; エレクトロポレーションは、例えば米国特許第20070128708A1号に記述されているようにインビトロでの細胞のトランスフェクションのために用いることもできる。エレクトロポレーションは、インビトロで細胞に核酸を送達するために利用することもできる。したがって、当業者に公知の多くの利用可能な装置およびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用する発現構築体を含めて核酸の細胞へのエレクトロポレーション介在性の投与は、関心対象のRNAを標的細胞に送達するための素晴らしい新たな手段となる。
【０１９９】
1つの態様において、本方法は、TCR α鎖およびβ鎖をコードするRNAをエレクトロポレーションする段階を含む。TCR α鎖およびβ鎖は、同じまたは別個のRNA上にコードされることができる。αおよびβが別個のRNAによってコードされる場合、RNAはコエレクトロポレーションされうる。
【０２００】
別の態様において、本方法は、共刺激分子をコードする核酸をエレクトロポレーションする段階をさらに含みうる。共刺激分子核酸は、TCR RNAとコエレクトロポレーションされうる。
【０２０１】
T細胞の供給源
拡大の前に、T細胞の供給源が対象から得られる。対象の非限定的な例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の態様において、当技術分野において利用可能な任意の数のT細胞株が用いられうる。ある特定の態様において、T細胞は、フィコール(Ficoll)分離のような、当業者に公知の任意の数の技法を用いて、対象から収集された血液の単位から得ることができる。1つの態様において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスまたは白血球除去輸血によって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含めて、リンパ球を含む。アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)のような、適切な緩衝液もしくは培地またはその後の加工処理段階のため、カルシウムを欠くかつマグネシウムを欠きうるか、もしくは全部ではないが多くの二価陽イオンを欠きうる洗浄溶液の中に細胞を配してもよい。洗浄後、細胞は、例えば、Ca不含、Mg不含PBSのような、種々の生体適合性緩衝液に再懸濁されうる。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分が除去され、細胞は培地に直接再懸濁されうる。
【０２０２】
別の態様において、T細胞は、赤血球を溶解し、例えばパーコール(PERCOLL)(商標)勾配を通じた遠心分離によって単球を枯渇させることにより、末梢血から単離される。あるいは、T細胞は臍帯から単離することができる。いずれにせよ、T細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択技法によってさらに単離することができる。
【０２０３】
このように単離された臍帯血単核細胞は、CD34、CD8、CD14、CD19およびCD56を含むが、これらに限定されない、特定の抗原を発現する細胞を枯渇させることができる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、腹水のような、抗体を含む生体サンプル、物理的支持体に結合した抗体、および細胞結合抗体を用いて達成することができる。
【０２０４】
陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成することができる。好ましい方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを用いる陰性磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および/または選択である。例えば、陰性選択によりCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。
【０２０５】
陽性または陰性選択による所望の細胞集団の単離のため、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度を変えることができる。ある特定の態様において、細胞およびビーズの最大の接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積を有意に減少させる(すなわち、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましい場合がある。例えば、1つの態様において、20億個の細胞/mlの濃度が用いられる。1つの態様において、10億個の細胞/mlの濃度が用いられる。さらなる態様において、1億個超の細胞/mlが用いられる。さらなる態様において、10、15、20、25、30、35、40、45、または50百万個の細胞/mlの細胞濃度が用いられる。さらに別の態様において、75、80、85、90、95、または100百万個の細胞/mlの細胞濃度が用いられる。さらなる態様において、125または150百万個の細胞/mlの濃度を用いることができる。高濃度を用いることで、細胞収量、細胞活性化、および細胞拡大の増加をもたらすことができる。
【０２０６】
T細胞は、単球除去段階を必要としない、洗浄段階の後に凍結することもできる。理論によって束縛されることを望むわけではないが、凍結およびその後の解凍段階は、顆粒球およびある程度は単球を細胞集団中で除去することにより、いっそう均一な生成物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄段階の後、細胞は凍結用溶液中に懸濁されうる。多くの凍結用溶液およびパラメータが当技術分野において公知であり、この文脈において有用であるが、非限定的な例において、1つの方法は、20% DMSOおよび8%ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または他の適当な細胞凍結用培地を用いることを伴う。次に、細胞を毎分1℃の割合で-80℃まで凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相中に貯蔵する。制御凍結の他の方法、ならびに-20℃でまたは液体窒素中での瞬時の無制御凍結が用いられうる。
【０２０７】
1つの態様において、T細胞の集団は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株のような細胞内に含まれる。別の態様において、末梢血単核細胞は、T細胞の集団を含む。さらに別の態様において、精製されたT細胞は、T細胞の集団を含む。
【０２０８】
キメラ膜タンパク質
一般に、T細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質およびT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを付着させた表面との接触によって拡大する。本発明は、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行う段階、およびエレクトロポレーションを受けたT細胞を培養する段階を含む、T細胞の集団を拡大する新規方法であって、集団内のエレクトロポレーションを受けたT細胞が少なくとも10倍に拡大する方法を含む。本発明のキメラ膜タンパク質は、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント、例えば抗体などを含む。1つの態様において、キメラ膜タンパク質は、CD3に対する一本鎖可変断片（scFv）、ならびにCD28および4-1BBの細胞内ドメインの一部分に由来する細胞内ドメインを含む。
【０２０９】
キメラ膜タンパク質の発現により、CD3を発現する細胞といった集団内の他の細胞との相互作用が可能になり、その結果、エレクトロポレーションを受けたT細胞の拡大が刺激され、活性化される。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、CD3を発現する細胞が、エレクトロポレーションを受けたT細胞の表面上に発現されているキメラ膜タンパク質と接触して結合することは考えられる。キメラ膜タンパク質を発現する少なくとも1つのT細胞は、CD3を発現する別の細胞と相互作用する。この相互作用は、エレクトロポレーションを受けたT細胞の拡大を刺激する。
【０２１０】
1つの態様において、T細胞は、内因性遺伝子のダウンレギュレーションの前に拡大される。別の態様においては、改変T細胞を拡大する。
【０２１１】
細胞外ドメイン
本発明は、共刺激分子に対して方向付けられた抗体に由来する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む。共刺激分子は、CD3、CD28、またはそれらの組み合わせなど、ただしそれらには限定されない、T細胞を共刺激する任意の分子を含む。1つの態様において、細胞外ドメインは、抗CD3、抗CD28またはそれらの組み合わせに由来する抗原結合ドメインを含みうる。別の態様において、細胞外ドメインは、CD3に対する一本鎖可変断片（scFv）を含む。
【０２１２】
別の態様において、細胞外ドメインは、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖可変断片の抗原結合ドメイン、およびそれらの断片を非限定的に含む、抗原と結合する抗体の任意の部分を含みうる。場合によっては、細胞外ドメインは、キメラ膜タンパク質が最終的に用いられることになるものと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトに用いる目的には、キメラ膜タンパク質の細胞外ドメインがヒト抗体またはその断片を含むことが有益であると考えられる。したがって、1つの態様において、細胞外ドメイン部分は、ヒト抗体、または本明細書において別所に記載されたようなその断片を含む。または、いくつかの態様において、細胞外ドメイン部分は、本明細書において別所に記載されたようにヒト化された非ヒト抗体を含む。
【０２１３】
細胞内ドメイン
細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域を含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインのことを指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子のことである。
【０２１４】
キメラ膜タンパク質の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞のエフェクター機能のうち少なくとも1つの活性化の原因である。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体を使用しうるが、多くの場合には鎖全体を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が用いられる範囲において、そのような短縮部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに用いることができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、それ故に、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含む。
【０２１５】
キメラ膜タンパク質に用いるための細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例には、CD28、4-1BB、T細胞受容体（TCR）、共刺激分子の細胞内ドメインの任意の部分、同じ機能的能力を有する、これらの配列の誘導体または変異体、任意の合成配列、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。1つの態様において、細胞内ドメインは、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの一部分を含む。
【０２１６】
キメラ膜タンパク質の他のドメイン
キメラ膜タンパク質の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはキメラ膜タンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖中の細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかと連結させる働きをする、オリゴペプチドまたはポリペプチドなどのスペーサードメインを組み入れてもよい。スペーサードメインは最大で300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸で構成される。
【０２１７】
いくつかの態様において、キメラ膜タンパク質は膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、キメラ膜タンパク質ヒンジドメインをさらに含む。1つの態様において、キメラ膜タンパク質をコードするRNAは、膜貫通ドメインおよびヒンジドメイン、例えばCD28膜貫通ドメインおよびCD8-αヒンジドメインをさらに含む。
【０２１８】
T細胞の拡大
本明細書において開示されるデータによって実証されているように、本明細書に開示される方法によってT細胞を拡大する段階により、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、またはそれを上回って、ならびにそれらの間のいずれかおよびすべての全体的および部分的な整数倍に増やすことができる。1つの態様において、T細胞は約20倍〜約50倍の範囲で拡大される。
【０２１９】
培養後に、T細胞を培養装置内にて細胞培地中で、ある期間にわたって、または細胞が最適な継代のために集密もしくは高い細胞密度に達するまでインキュベートし、その後に別の培養装置への継代を行う。培養装置は、インビトロで細胞を培養するために一般的に用いられる任意の培養装置であってよい。好ましくは、細胞を別の培養装置に継代する前の集密のレベルは70％またはそれを上回る。より好ましくは、集密のレベルは90％またはそれを上回る。期間は、インビトロでの細胞の培養に適する任意の時間であってよい。T細胞培地の入れ替えは、T細胞の培養中にどの時点に行ってもよい。好ましくは、T細胞培地を約2〜3日毎に入れ替える。続いてT細胞を培養装置から採取し、その上でT細胞を直ちに用いるか、または後に用いるための貯蔵のために凍結保存することができる。1つの態様において、本発明は、拡大したT細胞を凍結保存する段階を含む。凍結保存されたT細胞は、T細胞に核酸を導入する前に解凍される。
【０２２０】
別の態様において、本方法は、T細胞を単離する段階およびT細胞を拡大する段階を含む。別の態様において、本発明は、拡大の前にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。さらに別の態様において、凍結保存されたT細胞は、キメラ膜タンパク質をコードするRNAによるエレクトロポレーションのために解凍される。
【０２２１】
細胞のエクスビボでの拡大のためのもう1つの手順は、米国特許第5,199,942号に記載されている（これは参照により本明細書に組み入れられる）。米国特許第5,199,942号に記載されたような拡大を別の選択肢としてもよく、または本明細書に記載の他の拡大方法に加えてもよい。手短に述べると、T細胞のエクスビボ培養および拡大は、米国特許第5,199,942号に記載されたものなどの細胞増殖因子の添加、または他の因子、例えばflt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドなどの添加を含む。1つの態様において、T細胞を拡大する段階は、T細胞を、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともに培養する段階を含む。
【０２２２】
本明細書において記述される培養段階(本明細書において記述される作用物質との接触またはエレクトロポレーション後)は、非常に短くてもよく、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23時間など、24時間未満であってもよい。本明細書においてさらに記述される培養段階(本明細書において記述される作用物質との接触)は、もっと長くてもよく、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14またはそれ以上の日数であってもよい。
【０２２３】
培養細胞を記述するために、様々な用語が用いられる。細胞培養は、一般に、生物から採取され、制御された条件下で増殖された細胞をいう。初代細胞培養は、生物から直接採取された、かつ最初の継代培養前の、細胞、組織または臓器の培養である。細胞は、細胞増殖および/または分裂を促進する条件の下で増殖培地に入れられた場合、培養で拡大され、より大きな細胞集団をもたらす。細胞が培養で拡大される場合、細胞増殖の速度は、典型的には、倍加時間としても知られる、細胞が倍になるのに必要な時間量によって測定される。
【０２２４】
継代培養の各回は、継代といわれる。細胞が継代培養される場合、その細胞は継代されたといわれる。特定の細胞集団、または細胞株は、継代された回数によって言及されるか、または特徴付けられることもある。例えば、10回継代された培養細胞集団は、P10培養といわれうる。初代培養、すなわち、組織からの細胞単離後の最初の培養はP0に指定される。最初の継代培養の後に、細胞は二次培養(P1または継代1)として記述される。第2の継代培養後、細胞は三次培養(P2または継代2)となる、など。継代中に多くの集団倍加が存在しうることが当業者によって理解されよう; それゆえ培養の集団倍加数は継代数よりも多い。継代間の期間中の細胞の拡大(すなわち、集団倍加の数)は、播種密度、基質、培地および継代間の時間を含むが、これらに限定されない、多くの因子に依存する。
【０２２５】
1つの態様において、細胞は数時間(約3時間)〜約14日間、またはその間の任意の時間単位の整数値の間、培養されうる。T細胞培養に適切な条件には、血清(例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト血清)、インターロイキン-2 (IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-βおよびTNF-α、または当業者に公知の細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含有しうる適切な培地(例えば、最小必須培地もしくはRPMI培地1640または、X-vivo 15, (Lonza))が含まれる。細胞増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤が含まれるが、これらに限定されることはない。培地は、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20、Optimizerにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンを添加したものであって、無血清であるか、適切な量の血清(もしくは血漿)もしくは規定のホルモン群、ならびに/またはT細胞の増殖および拡大に十分な量のサイトカインを補充したかのいずれかのものを含むことができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養物にのみ含められ、対象に注入しようとする細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、空気に加えて5% CO2)の下で維持される。
【０２２６】
T細胞を培養するために用いられる培地は、T細胞を共刺激できる作用物質を含みうる。例えば、CD3を刺激できる作用物質はCD3に対する抗体であり、CD28を刺激できる作用物質はCD28に対する抗体である。これは、本明細書において開示されるデータによって実証されるように、本明細書において開示される方法によって単離された細胞は、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、またはそれ以上拡大されうるからである。1つの態様において、T細胞は、エレクトロポレーションを受けた集団を培養することにより約20倍〜約50倍、またはそれ以上の範囲内で拡大する。
【０２２７】
1つの態様において、本方法は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする核酸を、拡大されたT細胞に導入する段階、および共刺激分子をコードするRNAをT細胞中にエレクトロポレーションする段階を含み、ここでエレクトロポレーションを受けたT細胞は、TCRおよび共刺激分子を発現することができる。
【０２２８】
別の態様において、本方法は、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される少なくとも1つの共刺激分子で、拡大されたT細胞を刺激する段階をさらに含む。刺激は、共刺激分子をコードするRNAとのコエレクトロポレーションを含みうる。そのような態様において、拡大されたT細胞は、CD3をコードするRNAでさらにエレクトロポレーションされまたはコエレクトロポレーションされる。CD3には、CD3ζ鎖およびCD3ε鎖のような、少なくとも2つの異なるCD3鎖が含まれる。
【０２２９】
別の態様において、T細胞を拡大する方法は、さらなる適用のために拡大されたT細胞を単離する段階をさらに含むことができる。さらに別の態様において、拡大する方法は、培養する段階に先立って拡大されたT細胞の、引き続いてのエレクトロポレーションをさらに含むことができる。引き続いてのエレクトロポレーションは、TCRをコードする核酸を用いて、拡大されたT細胞に形質導入を行うこと、拡大されたT細胞にトランスフェクションを行うこと、または拡大されたT細胞にエレクトロポレーションを行うことなど、拡大されたT細胞集団に、作用物質をコードする核酸を導入することを含むことができ、該作用物質が、T細胞をさらに刺激する。作用物質は、さらなる拡大、エフェクター機能、または別のT細胞機能を刺激するなどして、T細胞を刺激しうる。1つの態様において、作用物質核酸は、キメラ膜タンパク質RNAとコエレクトロポレーションされる。別の態様において、TCR RNAのような、作用物質核酸は、エレクトロポレーションを受けた集団を培養した後にエレクトロポレーションされる。さらなる態様において、TCR RNAなどの作用物質核酸は、凍結保存されていた拡大されたT細胞にエレクトロポレーションされる。
【０２３０】
治療
本明細書において記述される改変T細胞は、治療のための組成物中に含まれうる。組成物は、薬学的組成物を含み、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。改変T細胞を含む薬学的組成物の治療的有効量が投与されうる。
【０２３１】
1つの局面において、本発明は、有効量の改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を含む。この態様において、T細胞は本明細書中の他の箇所に記載されるように改変される。改変T細胞は、誘導される溶解が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である場合など、標的細胞または組織の溶解を誘導するために投与されうる。
【０２３２】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載される改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法を含む。
【０２３３】
さらに別の態様において、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法は、本明細書に記載される改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物を、その必要のある対象に投与する段階を含む。
【０２３４】
本明細書において記述されるように作製された改変T細胞は、均質でありかつT細胞機能を保有し得る。さらに、改変T細胞は、糖尿病、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、GVHD、同種移植寛容誘導増強、移植片拒絶反応などの自己免疫疾患に共通する免疫反応等の免疫反応を抑制するために、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトに投与することができる。さらに、本発明の細胞は、疾患を処置または緩和するために、減弱されたまたはさもなければ阻害された免疫応答、特に細胞媒介性免疫応答が望ましい任意の状態の処置に用いることができる。1つの局面において、本発明は、本明細書に記載される改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象において、自己免疫疾患などの状態を処置することを含む。
【０２３５】
自己免疫疾患の例としては、後天性免疫不全症候群(AIDS、これは自己免疫成分を伴うウイルス性疾患である)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑ならびにヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０２３６】
本明細書において記述されるように作製されたT細胞は、炎症性障害を処置するために改変され使用されることもできる。炎症性障害の例としては、慢性および急性炎症性障害が挙げられるが、これらに限定されることはない。炎症性障害の例としては、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、骨関節炎、敗血症、卒中、組織および臓器の移植、血管炎、糖尿病性網膜症ならびに人工呼吸器誘発肺損傷が挙げられる。
【０２３７】
別の態様において、本明細書において記述される改変T細胞は、その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造に用いられうる。
【０２３８】
本発明の細胞は、適切な前臨床および臨床の実験および試験において判定される投与量および経路でならびに時間で投与することができる。細胞組成物は、これらの範囲内の投与量で複数回投与されうる。本発明の細胞の投与は、当業者によって判定される所望の疾患または状態を処置するのに有用な他の方法と組み合わされてもよい。
【０２３９】
投与される本発明の細胞は、治療を受けている対象に関して自家、同種異系(allogeniec)または異種でありうる。
【０２４０】
本発明の細胞の投与は、当業者に公知の任意の簡便な様式で行われうる。本発明の細胞はエアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、植込みまたは移植により対象に投与されうる。本明細書において記述される組成物は患者へ経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、リンパ節内に(intranodally)、髄内に、筋肉内に、静脈内(i.v.)注射により、または腹腔内に投与されうる。他の例では、本発明の細胞は、対象における炎症部位、対象における局所疾患部位、リンパ節、臓器、腫瘍などに直接注射される。
【０２４１】
本明細書において記述される細胞は、多くのマトリックスを用いて投与することもできる。本発明では、そのようなマトリックスを、人工リンパ系器官として、典型的にはT細胞の調節によって免疫系を支持、維持または調節するように作用するという新しい状況のなかで利用する。したがって、本発明は、組織工学において有用性が実証されているマトリックス組成物および製剤を利用することができる。したがって、本発明の組成物、装置および方法において使用されうるマトリックスのタイプは、実質的に無限であり、生物学的マトリックスおよび合成マトリックスの両方を含みうる。1つの特定の例では、米国特許第5,980,889号; 同第5,913,998号; 同第5,902,745号; 同第5,843,069号; 同第5,787,900号; または同第5,626,561号によって記載されている組成物および装置が利用され、したがってこれらの特許は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。マトリックスは哺乳動物宿主に投与した場合に生体適合性であることに一般に関係する特徴を含む。マトリックスは天然材料および/または合成材料から形成されてもよい。マトリックスは、インプラントのような、動物の体内に永久的な構造もしくは除去可能な構造を残すことが望ましい場合には、非生分解性であっても; または生分解性であってもよい。マトリックスはスポンジ、インプラント、管、テルファパッド(telfa pad)、繊維、中空糸、凍結乾燥成分、ゲル、粉末、多孔性組成物、またはナノ粒子の形態をとりうる。さらに、マトリックスは、播種された細胞または産生されたサイトカインもしくは他の活性剤の持続放出を可能にするようにデザインすることができる。ある特定の態様において、本発明のマトリックスは可撓性および伸縮性であり、無機塩、水性液および酸素を含む溶存気体剤のような物質を透過させる半固体足場と記述されうる。
【０２４２】
本明細書ではマトリックスを生体適合性物質の一例として用いる。しかしながら、本発明はマトリックスに限定されるわけではないので、マトリックスという用語が出てきた場合、これらの用語はいずれも、細胞の保持または細胞の横断を許し、生体適合性であり、その物質の中を高分子が直接横断することを許すのでその物質そのものが半透過性膜であるか、または特定の半透過性物質と一緒に用いることができる、装置および他の物質を含むと読み取られるべきである。
【０２４３】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、本明細書において記述される改変T細胞を、1つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含みうる。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などのような緩衝液; グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、マンニトール; タンパク質; ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸; 抗酸化剤; EDTAまたはグルタチオンのようなキレート剤; アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム); および保存料を含みうる。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために製剤化される。
【０２４４】
本発明の薬学的組成物は、処置される(または予防される)疾患に適切な様式で投与されうる。臨床試験によって適切な投与量が判定されうるが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子によって判定されよう。
【０２４５】
「免疫学的に有効な量」、「抗免疫応答に有効な量」、「免疫応答を阻害する有効量」または「治療量」が示されている場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、免疫応答、および状態の個体差を考慮して、医師により決定され得る。本明細書において記述される改変T細胞を含む薬学的組成物は、104〜109個の細胞/kg体重、好ましくは105〜106個の細胞/kg体重の投与量で、それらの範囲内の全ての整数値を含めて、投与されうると一般に言及することができる。T細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されうる。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技法を用いることにより投与することができる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照のこと)。特定の患者に対する最適な投与量および処置計画は、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて処置を調整することにより、医学分野の当業者によって容易に判定されることができる。
【０２４６】
ある特定の態様において、活性化T細胞を対象に投与し、続いて血液を再び採血し(またはアフェレーシスを行い)、本発明にしたがってそれからT細胞を活性化し、これらの活性化および拡大されたT細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは数週間ごとに複数回行うことができる。ある特定の態様において、T細胞は、10 ml〜400 mlの採血から活性化されうる。ある特定の態様において、T細胞は、20 ml、30 ml、40 ml、50 ml、60 ml、70 ml、80 ml、90 mlまたは100 mlの採血から活性化される。理論によって束縛されるべきではないが、この複数の採血/複数の再注入プロトコールを用いて、T細胞のある特定の集団を選び出すことができる。
【０２４７】
本発明のある特定の態様において、本明細書において記述される方法、またはT細胞が治療レベルにまで拡大される当技術分野において公知の他の方法を用いて拡大され改変された細胞は、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン-2、シタラビン(ARA-Cとしても公知)またはMS患者に対するナタリズマブ処置もしくは乾癬患者に対するエファリズマブ処置もしくはPML患者に対する他の処置のような薬剤による処置を含むが、これらに限定されない多くの関連処置法と一緒に(例えば、その前に、それと同時にまたはその後に)患者に投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばサイクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレートおよびFK506、抗体、または他の免疫除去剤、例えばCAMPATH、抗CD3抗体もしくは他の抗体療法、サイトキシン(cytoxin)、フルダリビン(fludaribine)、サイクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに放射線照射と併用されてもよい。これらの薬物はカルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害し(サイクロスポリンおよびFK506)、または増殖因子によって誘導されるシグナル伝達に重要なp70S6キナーゼを阻害する(ラパマイシン)。(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学療法剤、例えばフルダラビンを用いたT細胞除去療法、外部ビーム放射線療法(XRT)、シクロホスファミド、または抗体、例えばOKT3もしくはCAMPATHと一緒に(例えば、その前に、それと同時にまたはその後に)患者に投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去療法の後に投与される。例えば、1つの態様において、対象は、高用量化学療法を用いた標準的な処置の後に末梢血幹細胞移植を受けてもよい。ある特定の態様において、移植後に、対象は本発明の拡大された免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、外科手術の前または後に、拡大された細胞が投与される。
【０２４８】
患者に投与される前記処置の投与量は、処置される状態および処置のレシピエントの正確な性質によって変化する。ヒト投与のための投与量の拡大縮小は、当技術分野において認められている実践にしたがって行うことができる。CAMPATHの用量は、例えば、一般的に、成人患者については1〜約100 mgの範囲であり、通常、1〜30日間、毎日投与される。好ましい一日用量は1〜10 mg/日であるが、場合によっては、40 mg/日までの高用量が用いられてもよい(米国特許第6,120,766号に記述されている)。
【０２４９】
本発明において有用な方法および組成物は、実施例に記載の特定の製剤に限定されないことが理解されるべきである。以下の実施例は当業者に、本発明の、細胞を作製および使用する方法、拡大および培養方法、ならびに治療方法の完全な開示かつ記述を提供するために記載されており、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【０２５０】
本発明の実践には、別段の指示がない限り、分子生物学(組み換え技法を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法が利用され、それらは十分に当業者の認識範囲内である。そのような技法は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, fourth edition (Sambrook, 2012);「Oligonucleotide Synthesis」(Gait, 1984);「Culture of Animal Cells」(Freshney, 2010);「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」(Weir, 1997);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller and Calos, 1987);「Short Protocols in Molecular Biology」(Ausubel, 2002);「Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting」, (Babar, 2011);「Current Protocols in Immunology」(Coligan, 2002)のような、文献のなかで十分に説明されている。これらの技法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明の形成(making)および実践において考慮されうる。特定の態様に特に有用な技法は、以下の項で論じられる。
【実施例】
【０２５１】
実験的実施例
本発明は、以下の実験的実施例を参照して、さらに詳細に説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、特記しない限り、限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供された教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【０２５２】
さらなる説明なしに、当業者は、上記の説明および以下の実施例を用いて、本発明の化合物を作製して利用し、かつ特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指し示したものであり、本開示の残りの部分を多少なりとも限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２５３】
これらの実験に用いた材料および方法を以下に説明する。
【０２５４】
初代ヒトリンパ球：
初代リンパ球を、記載されるように(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586)、CD3およびCD28刺激性抗体(Life Technologies社, Grand Island, NY, カタログ)でコーティングされたマイクロビーズにより刺激した。10日目に、T細胞を90％ウシ胎児血清と10％ジメチルスルホキシド(DMSO)の溶液中に1×108細胞/バイアルで凍結保存した。
【０２５５】
NALM-6は、German DSMZ Cell Collection（DSMZカタログコード：ACC 128）から購入した。K562およびPC3は、American Type Culture Collectionから購入した。624mel黒色腫株は、Surgery Branch（NCI/NIH）から購入した。細胞株はすべて指示された通りに培養し、マイコプラズマ混入に関して定期的に検査して、陰性であることを確かめた。
【０２５６】
mRNAエレクトロポレーションおよびレンチウイルス形質導入のためのTCR構築物の作製：
関連刊行物によって得られたシークエンシング情報に基づいて、種々の突然変異（1G4および8F）およびCAR（PSCAまたはCD19）を有する1G4 NY-ESO-1 TCRを合成するか、かつ/またはPCRによって増幅し（The Journal of experimental medicine 2005, 201(8):1243-1255；J Immunol 2008, 180(9):6116-6131）、pGEM.64A RNAベースのベクターまたはpTRPEレンチウイルスベクター中にサブクローニングした。
【０２５７】
ヒト初代T細胞の調製：
健常志願者ドナーから、初代ヒトCD4 T細胞およびCD8 T細胞を、RosetteSepキット（Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canada）を用いた陰性選択による白血球アフェレーシス後に単離した。標本はすべて、大学の施設内審査委員会（University Institutional Review Board）によって承認されたプロトコールに準拠して収集し、各ドナーから書面によるインフォームド・コンセントを得た。
【０２５８】
CRISPRの設計および構築：
Cas9 DNAをPCRによって合成し、続いてPGEMベクター中に挿入した。gRNAはGN19によりNGG PAM部位を用いて選択し、いくつかはN20からNGG PAM部位を用いて選択した。gRNAはすべて、13塩基対を上回る誤対合で構成される相補的配列を含み、オフターゲットmRNA部位の可能性のある部位は除外された（表1）。gRNAを図1Aに示されているように設計し、オーバーラップPCRによって合成した。gRNA PCR産物をすべて、MSGVベクター中にライゲートした。インビトロで転写されたCAS9およびgRNAは、TCR α、β鎖およびβ-2ミクログロビンの定常領域を標的とした。gRNAは、TCR α定常領域のエクソン1内の配列、TCR β定常領域1および2の両方のエクソン1に共通するコンセンサス配列、β-2ミクログロブリンまたはPD1のいずれかを標的とするように設計した。gRNAをコードする配列をオーバーラップPCRを用いて組み立て、T7プロモーターを含有するMSGVベクター中にクローニングした。これらのプラスミドをEcoRIにより直線化した。gRNAをインビトロ転写させた。Cas9 mRNAは、mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRAキット（Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いてインビトロ転写させた。mRNAを単回使用用にヌクレアーゼ非含有バイアル内に-80℃で保存した。動物試験のために用いたgRNAターゲティング配列は以下の通りである：
2018500006.tif 000003
【０２５９】
フローサイトメトリー：
表記の特異性を有する以下のモノクローナル抗体および試薬を、適切なアイソタイプ対照とともに用いた。BD Biosciences（San Jose, CA）より：APC結合抗CD3（555335）、FITC-抗CD8（555366）、PE-抗CD8（555635）、FITC-抗CD27（555440）、PE-抗CD107（555801）、PE-抗β-2ミクログロビン（551337）、FITC-抗HLA（555552）；Biolegend（San Diego, CA）より：FITC-抗CD45RO（304204）、APC-抗CD62L（304814）、APC-抗CCR7（353214）；およびBeckman Coulterより（Pasadena, CA）：PE-抗Vb13.1（IM2021U）。データは、FACS Accuri（BD Biosciences, San Jose, CA）によりCellQuestバージョン3.3（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いて取得し、FCS Expressバージョン3.00（De Novo Software, Los Angeles, CA）またはFlowJoバージョン7.6.1（Tree Star, Inc. Ashland, OR）によって分析した。
【０２６０】
初代T細胞の増殖：
初代ヒトT細胞を、10％ FCS、100-U/mlペニシリン、100-g/ml硫酸ストレプトマイシン、10-mM Hepesを加えたRPMI 1640中で培養し、抗CD3/抗CD28でコーティングした磁気ビーズにより細胞・ビーズ比1：3で刺激した。2日毎に細胞の計数および栄養素添加を行い、増殖動態低下および細胞サイズの両方による判断でT細胞が休止状態に入ったと思われる時点で、T細胞を機能的アッセイのために用いるかまたは凍結保存した。
【０２６１】
CD3neg T細胞の作製：
DNAスーパーコイルプラスミドをSpeIおよびEcoRIのそれぞれによって直線化した。gRNAを、T7 mScript（商標）Standard mRNA Production System（Cambio, C-MSC100625, Cambridge, England）によってインビトロ転写させた。mRNAはすべて（Cas9、TCR α、TCR βおよびCAR）、mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRAキット（Life Technologies, AM1345, Carlsbad, CA）を用いてインビトロ転写させた。エレクトロポレーションの前に、T細胞をCD3/CD28ダイナビーズによって3日間刺激した。1,000万個の初代T細胞を脱ビーズ処理し、その後に20μg Cas9、10μg gRNA種の細胞へのエレクトロトランスファーをBTX830によって360V、1msパラメータで行い、その後に10μg gRNAの2回目および/または3回目のエレクトロトランスファーを行った。さらに、T細胞を3倍のOPTI-MEMで洗浄し、OPTI-MEM（Invitrogen）中に細胞1〜3×108個/mlの最終濃度で再懸濁させた。その後に、2mmキュベット内で0.1mlの細胞を10μgのIVT RNA（または指定の通り）と混合し、エレクトロポレーションを行った。1000万個の初代T細胞を脱ビーズ処理し、その後に20μgのCas9および10μgのgRNA種の細胞へのエレクトロトランスファーを、BTX830（Harvard Apparatus BTX）を360Vおよび1msで用いて行った；この過程に続いて、12〜24時間後に、5μgのgRNAの2回目および3回目のエレクトロトランスファーを行った。
【０２６２】
エレクトロポレーション後に、細胞を直ちに、予熱した2mLの培地中に入れ、37℃、5％ CO2で培養するか、または32℃、5％ CO2で1日培養し、続いて37℃、5％ CO2に戻した。
【０２６３】
TCR αおよびβ二重破壊、またはTRAC、TRBCおよびB2M三重破壊：
TCR αおよびβ二重ノックアウトT細胞を作製するためには、Cas9 mRNAと、TCR α鎖（TRAC）およびTCR β鎖（TRBC）を標的とする2種類の異なるgRNAとのコエレクトロポレーションを行った。TCR αおよびβ二重ノックアウトT細胞は、2段階で精製することができた：1）1G4 TCR α鎖RNAのエレクトロポレーション後の抗CD3マイクロビーズによるTCR陽性細胞およびα鎖単一ノックアウト細胞の除去、ならびに2）TCR β鎖RNAのエレクトロポレーション後の抗CD3マイクロビーズによるTCR β鎖単一ノックアウト細胞の除去。TRAC、TRBCおよびB2M三重破壊のためには、T細胞に対して、抗CD3/CD28ビーズ刺激から3日後に、Cas9 mRNA、ならびにTCR α鎖およびβ鎖ならびにβ-2ミクログロブリンを標的とするgRNAによるエレクトロポレーションを行った。HLA-I陰性細胞集団を第9日に濃縮し、TCR α鎖RNAによるエレクトロポレーションを行った。TCR陰性集団を第10日に濃縮した。5日後に、これらの細胞に対してTCR β鎖RNAによるエレクトロポレーションを行い、翌日にTCR陰性細胞集団を選別して汎用的T細胞を得た。第18日に、汎用的T細胞にTCRまたはCAR RNAによるエレクトロポレーションを行い、汎用的エフェクター細胞を作製した。TCRおよびHLA-I分子の発現を各段階で確かめた。
【０２６４】
汎用的CART細胞の作製：
CD19またはPSCA CARのレンチウイルス形質導入とCRISPR/gRNAのRNAエレクトロポレーションとを組み合わせることによって、汎用的CART細胞を作製した。抗CD3/CD28ビーズ刺激から1日後に、T細胞に対してレンチウイルス-CD19またはPSCA CARによる形質導入を行った。2日後に、Cas9と、TCR α、β鎖、B2M、PD1を標的とするgRNAとを、エレクトロポレーションによってT細胞に移入した。CRISPR送達から6日後に、CD3、HLA-I、PD1に関して陰性であるT細胞をマイクロビーズ除去によって選別した。
【０２６５】
CD3neg T細胞の濃縮：
Auto MACS緩衝液で洗浄した細胞を、CD3マイクロビーズ（Miltenyi Biotec, 130-050-101, Auburn, CA）とともに4℃で30分間インキュベートした。2回洗浄した後に、細胞をLDカラム（MiltenyiBiotec, 130-042-901, Auburn, CA）に通過させ、通過画分をさらに用いるために収集した。CD3neg T細胞のCD3発現を1G4TCR αおよびβmRNAのコエレクトロポレーションによって回復させ、細胞を単回のRapid Expansion Protocol（REP）、CD3/CD28 DynabeadsまたはK562ベースのaAPCによって拡大させた。
【０２６６】
CD3neg T細胞の作製および増殖：
CD3neg T細胞では、外因性1G4TCR α鎖およびTCR β鎖のインビトロ転写させたmRNA（各鎖について5μg）のエレクトロトランスファーによって、CD3発現が回復した。これらの細胞を、単回のRapid Expansion Protocol（REP）を用いて拡大させた。3人の異なるドナー由来のPBMC：ND052 105×106個、ND405 83×106個、ND410 136×106個に照射を行い、続いて混合して、合計324×106個のPBMCを得た。PBMCを再懸濁させて最終容積90mlとし、続いてR10を添加して300mlにして混合し、2つのT150mlフラスコに分けた。OKTを最終濃度30ng/mlとして添加した。第2日に、IL-2を50 CU/mlとして添加した。第5日から、2日毎に細胞の計数および栄養素添加を行い、増殖動態低下および細胞サイズの両方による判断でT細胞が休止状態に入ったと思われる時点で、それらを機能的アッセイのために用いるかまたは凍結保存した。
【０２６７】
Sangerシークエンシング：
T細胞におけるTCR α鎖（TRAC）、TCR β鎖1（TRBC1）およびTCR β鎖2（TRBC2）のゲノム破壊のレベルを、Surveyor Nucleaseアッセイ（Transgenomics, Omaha, NE）によって決定した。標的破壊率を濃度測定によって定量した。標的遺伝子座の増幅のために用いたPCRプライマーは以下であった：
2018500006.tif 000004
【０２６８】
PCR産物を精製してTOPOクローニングベクター（Invitrogen）にライゲートし、続いて大腸菌（E.coli）に形質転換導入した。単一のクローンを取り出して、インデルを計算するためにシークエンシングを行った。
【０２６９】
エレクトロポレーション用のsiRNAおよびCRISPRiの作製：
2018500006.tif 000005
のいずれかに関するTCR定常領域を標的とするRNA二重鎖を、Custom RNAi Design Tool（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）を用いて設計し、siRNAを合成した（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）。TCR αおよびβの両方に対するsiRNAを混合し、内因性TCRノックダウンのために刺激T細胞へのエレクトロポレーションを行った。
【０２７０】
mRNAインビトロ転写およびT細胞エレクトロポレーション：
T7 mscript systemsキット(CellScript社)を用いて、インビトロ転写(IVT) RNAを作製した。CD3/CD28ビーズで刺激したT細胞に、以前に記載されるように(Cancer research 2010, 70(22):9053-9061)、BTX EM830 (Harvard Apparatus BTX社)を使用して、IVT RNAを用いてエレクトロポレーションを行った。簡単に述べると、T細胞を3回洗浄し、OPTI-MEM (Invitrogen社)中に最終濃度1〜3×108細胞/mlで再懸濁した。続いて、0.1mlの細胞を10μgのIVT RNAと(または示されるように)混合して、2mmキュベット内でエレクトロポレーションを行った。
【０２７１】
ELISAアッセイ：
標的細胞である、CD19を発現する異なる腫瘍細胞株を洗浄し、R10培地(10％ウシ胎児血清を補充したRPMI 1640; Invitrogen社)中に1×106細胞/mlで懸濁した。100μlの各標的細胞タイプを96ウェル丸底プレート(Corning社)に2つ組で加えた。エフェクターT細胞を洗浄し、R10培地中に1×106細胞/mlで再懸濁した後、100μlのT細胞を、示されたウェル中の標的細胞と一緒にした。また、T細胞のみを含むウェルを対照として用意した。このプレートを37℃で18〜20時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取して、ELISAアッセイ(eBioscience社)に供した。
【０２７２】
CD107a染色：
96ウェルプレートで160μlの完全RPMI培地中にエフェクター細胞：T細胞比1：1 (1×105個のエフェクター対1×105個の標的)で細胞をまいた。20μlのフィコエリトリン標識した抗CD107a抗体(BD Biosciences社, 555801)を加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした後、Golgi Stop (RPMI培地3ml中に2μlのGolgi Stop、20μｌ/ウェル; BD Biosciences社, 51-2092KZ)を加えて、プレートをさらに2.5時間インキュベートした。次いで、5μlのFITC-抗CD8および5μlのAPC-抗CD3を添加して、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルをFACS緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２７３】
ルシフェラーゼに基づくCTLアッセイ：
Naml6-CBG腫瘍細胞を作製し、ルシフェラーゼに基づく細胞傷害性Tリンパ球アッセイの修正版において使用した。簡単に述べると、クリックビートル緑色ルシフェラーゼ(CBG)をpELNSベクターにクローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、Naml6腫瘍細胞に形質導入して、CBG発現により選別した。得られたNaml6-CBG細胞を洗浄し、R10培地に1×105細胞/mlで再懸濁し、100μlのCBG標識細胞を異なる比のT細胞(例えば30：1、15：1など)と共に37℃で一晩インキュベートした。その混合物100μlを96ウェルの白色ルミノメータプレートに移した。基質100μlを細胞に添加して、発光を直ちに測定した。結果を、腫瘍細胞を含むがT細胞は含まないウェルにおけるルシフェラーゼ活性に基づく殺傷のパーセントとして報告した（%殺傷＝100-((エフェクター細胞および標的細胞培養物を含むウェルからのRLU)/(標的細胞を含むウェルからのRLU)×100))。
【０２７４】
マウス異種移植研究：
研究は、以前に記載されたように、いくつかの変更を加えて行った(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009, 106(9):3360-3365)。簡単に説明すると、0日目に、6〜10週齢のNOD/SCIDγ(NSG)マウスの右脇腹に1×106個のPC3-CBG腫瘍細胞を皮下注入し、5日目に同じマウスの左脇腹にSK-OV3-CBG腫瘍細胞(5×106細胞/マウス、皮下)を投与した。このマウスを、PC3-CBG腫瘍の接種後23日目に尾静脈を介してT細胞で治療したところ、両方の腫瘍とも体積が約200mm3となった。レンチウイルスにより形質導入されたT細胞は、1×107細胞/マウス(10M)または3×106細胞/マウス(3M)で投与した。手短に述べると、Nalm6腫瘍モデルについては、6〜10週齡NOD/SCIDγ（NSG）マウスに対して、1×106個のコメツキムシ緑色タンパク質（CBG）形質導入Nalm6（Nalm6-CBG）細胞を、第0日に尾静脈を経由して注射した。T細胞投与は腫瘍接種後の第7日に開始した。PC3-PDL1固形腫瘍モデルについては、6〜10週齡NOD/SCIDγ(NSG)マウスに対して、1×106個のPSCA、PD-L1およびCBG形質導入PC3（PC3-PSCA-PDL1-CBG）腫瘍細胞を、第0日に右側腹部に皮下注射した。PC3-PDL1-CBG腫瘍接種後の第22日に尾静脈を介してマウスにT細胞を投与し、腫瘍がおよそ200mm3の体積になるようにした。T細胞は2×106個/マウス（2M）として投与した。動物を無作為化し、ベースライン腫瘍サイズに基づいて群に分けた。動物はすべて実験に含め、実施した動物実験のすべてについて盲検下での腫瘍評価を行った。
【０２７５】
T細胞刺激、レンチウイルス形質導入およびCRISPRエレクトロポレーションの手順：
図84は、T細胞の刺激、レンチウイルス形質導入およびCRISPRエレクトロポレーションを行うために用いた手順を示している。第0日に、T細胞を3人のドナーから入手した（100×106個/ドナー）。細胞を抗CD3/抗CD28ビーズによりT細胞：ビーズ比1：3で刺激した。細胞の濃度は、0.5×106個/ml、100mL/フラスコとなるように調整した。第1日に、刺激したT細胞に、CD19 CARレンチウイルスにより、感染多重度（MOI）2で形質導入を行った。50mL（25×106個）のT細胞を非改変T細胞として確保しておいた（第9群）。第3日に、ビーズを取り除いて細胞をOpti-MEM培地中で2回洗浄し、各ドナー由来の形質導入T細胞を、CART/モックEP（10mL、50×106個/mL）およびCART/CRISPR（10mL、50×106個/mL）の2つの群に分けた。続いて細胞に、120μgのCAS9 RNA/400μLのT細胞を500V/1msで用いて、CAS9 RNA（1回目のEP）によるエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、第1、3、5および7群の細胞は、続いてT細胞を半分は新たな培地中で、半分は培養馴化培地中で培養することによって分けた。第4日に、細胞を2回洗浄し、Opti-MEM中に50×106個/mLで再懸濁させた。20μg TRBC4およびB2M gRNAの、400μLのT細胞へのエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、細胞を、半分は新たな培地で、半分は培養馴化培地である中で1×106個/mLで培養した。第5日および7日に、細胞を分けて、半分は新たな培地で、半分は培養馴化培地である中に再懸濁させた。第8日に、低密度カラムによって第2、4および6群からCD3+ 細胞を取り除いた。CD3- T細胞を、半分は新たな培地で、半分は培養馴化培地である中に0.5〜1×106個/mLで再懸濁させて、細胞を拡大するために培養した。第11日に、T細胞を採取して、3人のドナー由来の細胞25×105個を核型分析のために搬送した。残りの細胞はアリコート化して凍結させた。
【０２７６】
実験の結果について以下に説明する。
【０２７７】
実施例1：T細胞上のTCR-CD3複合体のCRISPRを用いた破壊
TCR α鎖の定常領域を標的とする13種類のgRNA、TCR β鎖の定常領域を標的とする10種類のgRNA、およびβ-2ミクログロビン遺伝子を標的とする10種類のRNA（図1A〜1Cおよび図9A〜9D）を開発し、293T細胞において検討した。初代ヒトT細胞をエクスビボで3日間、抗CD3/抗CD28ダイナビーズとともに3日間増殖させた。遺伝子ノックアウトを媒介するにはCRISPRの一過性発現で十分であることから、CAS9およびgRNAをコードするインビトロ転写させたRNAのエレクトロトランスファーを利用することによってCRISPRを一過性に発現させる「ヒット-エンド-ラン（hit-and-run）」送達戦略を開発した（図2C）。
【０２７８】
TCR発現を測定するために、TCR抗体が発現された時にのみ細胞表面に存在するCD3に対して特異的なmAbを用いた。エレクトロトランスファーから6日後に、フローサイトメトリー分析により、TRBCを標的とするCRISPRが、ドナーND147における初代T細胞上のCD3発現を13.7というレベルで排除したことが明らかになった（図2D）。TCRノックアウトの効率はエレクトロトランスファーされたmRNAの量と相関した（図2D）。初代T細胞におけるRNAのエレクトロトランスファーは十分な耐容性があったが、細胞生存度の幾分の低下が観察され、それは導入されたRNAの量の増加と相関した。ZFNおよびTALENによって媒介される遺伝子破壊は、細胞を軽度の低体温に一過性に曝露させた場合に、より効率的であることが報告されている。同じ現象がこのCRISPR系でも観察された。
【０２７９】
T細胞をエレクトロトランスファー後に32℃で1日培養した。CD3のCRISPR媒介性破壊は、エレクトロポレーションを行ったT細胞を32℃で培養した場合、37℃と比較して最大で2.5倍良好であった。このアプローチを用いると、TRACおよびTRBCを標的とするCRISPRを用いて、エレクトロポレーションを行ったT細胞のそれぞれ5.43％および16.7％でCD3の発現が失われた（図2D、下側のパネル）。CAS9モック試料におけるCD3陰性細胞のレベルには変化がなく、生存度（トリパンブルーにより測定）の認識しうる低下も観察されなかった。
【０２８０】
gRNAのエレクトロトランスファーを2回および3回行った場合、初代T細胞上のCD3発現が排除される効率のレベルは大きく向上した。
・TRACのターゲティング：gRNAの3回のエレクトロトランスファー後には77％に達するレベルになり（図4A）、
・TRACまたはTRBCのターゲティングでは、gRNAの2回目のエレクトロトランスファー後にそれぞれ64.5％または57.5％に達するレベルになり、生存度の幾分の低下が伴ってみられた（図4C）。
【０２８１】
エレクトロポレーションを受けたT細胞が、意図したgRNA標的部位（TCR αまたはβ遺伝子座）で遺伝的に改変されたことを確かめるために、TRAC、TRBC1またはTRBC2内部の標的部位に隣接する特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いてSangerシークエンシングを行った。標的部位から始まる指定PCR産物での複数のピークはCRISPRのエレクトロトランスファー後にのみ存在し、破壊率は細胞表面CD3発現の喪失と相関していた（図1Cおよび3B）。初代T細胞におけるこれらの実験により、TRACまたはTRBCを標的とするように設計されたCRISPRは、Sangerシークエンシングによって評価されかつCD3のフローサイトメトリー分析によって確かめられたように、αβ TCR発現の永続的な妨害を招くことが確かめられた。
【０２８２】
実施例2：TCR αβ陰性T細胞の濃縮
将来の臨床応用のために、TCRが破壊された集団の供給源を単離するための迅速で強固な方法を利用することができる。この問題への取り組みを始めるために、臨床的に承認されている常磁性ビーズおよび除去カラムを用いる陰性選択によってTCR/CD3neg集団を濃縮した。単一の除去段階により、CD3neg集団が99％を上回って濃縮された（図3A）。CD3neg集団を非トランスフェクト対照細胞から濃縮することはできなかった。連続的除去段階では、99％を上回る濃縮が得られ、CD4またはCD8 T細胞サブセットへのバランス傾斜は見られなかった（図3C）。シークエンシング結果からも、CRISPR改変後にはTCR αおよびβ遺伝子座に欠失および挿入が導入されたことが示された（図3D）。
【０２８３】
実施例3：CRISPRによるHLA-クラスIneg T細胞の作製
CRISPRが同種T細胞からのHLA-クラスI発現をノックアウトさせる能力を検討するために、β-2ミクログロビンを標的とするgRNAを設計した。293 T細胞において、β-2ミクログロビン遺伝子座をCRISPRによって操作することができた（図9A）。β-2ミクログロビンの破壊によってT細胞表面のHLA-クラスI発現が消失したことが証拠により示された（図9B）。
【０２８４】
IFN-γは、T細胞におけるβ-2ミクログロビンのターゲティング効率をおよそ10倍に向上させた（図9C）。β-2ミクログロビンgRNAの複数回のエレクトロトランスファーにより、66％がβ-2ミクログロビン陰性である集団が得られた（図11A）。
【０２８５】
将来の同種移植の臨床応用のためには、HLA-クラスIヌル集団を単離するための迅速で強固な方法が必要と考えられる。この問題への取り組みを始めるために、細胞をPE-抗β-2ミクログロビン抗体で標識し、臨床的に承認されている常磁性抗PEマイクロビーズおよび除去カラムを用いる陰性選択によってHLA-クラスIneg集団を濃縮した。単一の除去段階により、HLA-クラスIneg集団が99％を上回って濃縮された。HLA-クラスIneg集団を非トランスフェクト対照細胞から濃縮することはできなかった。フローサイトメトリーを介した、濃縮されたHLA-クラスIneg T細胞におけるHLA-クラスIレパートリーの分析により、細胞表面からのHLA-クラスI発現の排除が実証された（図9D）。
【０２８６】
実施例4：CD3neg T細胞は種々の方法によって増殖させることができる
CD3neg T細胞は、外因性1G4-TCR α鎖およびβ鎖をインビトロ転写させたmRNA（各5μg）のエレクトロトランスファー後にCD3発現を取り戻した。これらの細胞を（1）単回の急速拡大プロトコール（Rapid Expansion Protocol：REP）によって拡大し、続いて活性および特異性について検討した。PBMCは3人の異なるドナーから入手した：ND052 105×106個、ND405 83×106個、ND410 136×106個。細胞に照射を行い、続いて混合して、合計324×106個のPBMCを得た。2×106個の細胞にRNAを用いたエレクトロトランスファーを行った。CD3neg Tを再懸濁させて最終容積90mlとし、R10培地を添加して合計容積300mlとした。細胞を2つのT150mlフラスコに分けた。OKTを最終濃度30ng/mlとして添加した。第2日に、IL-2を50 CU/mlとして添加した。第5日から、2日毎に細胞の計数および栄養素添加を行い、増殖動態低下および細胞サイズの両方による判断でT細胞が休止状態に入ったと思われる時点で、それらを機能的アッセイのために用いるかまたは凍結保存した。
【０２８７】
単回のREP後に、CD3neg T細胞を、数が500倍に増加するまで拡大した。これらの細胞を、（2）抗CD3/抗CD28でコーティングされた磁気ビーズにより細胞・ビーズ比1：3で刺激することによって拡大した。
【０２８８】
単回のREP後に、CD3neg T細胞を、数が500倍に増加するまで拡大した。これらの細胞を、（3）照射を受けたK562-CD19およびK562/86/64/A2（2D11）の、濃度1×106個/mlの等量混合物と共培養することによって拡大した。
【０２８９】
単回のREP後に、CD3neg T細胞を、数が500倍に増加するまで拡大した。これらの細胞を、（4）照射を受けたK562-CD19およびK562/86/64/A2（2D11）の、濃度1×106個/mlの等量混合物、および30ng/ml OKTと共培養することによって拡大した。
【０２９０】
単回のREP後に、CD3neg T細胞を、数が500倍に増加するまで拡大した。これらの細胞を、（5）照射を受けたK562-CD19およびK562/86/64/A2（2D11）の、濃度1×106個/mlの等量混合物、および1mg/ml NY-ESOペプチドと共培養することによって拡大した。
【０２９１】
実施例5：TCRのエレクトロトランスファーによるTCRneg T細胞の再方向付け
TCRneg T細胞の機能を検討するために、TCRのエレクトロトランスファーによって、これらの細胞の再方向付けを行った。TCR α鎖およびTCR β鎖を導入することにより、これらの細胞は高レベルのTCRを発現した。Vb13.1の発現は、CAS9モック対照と比較して、エレクトロトランスファーTCRneg T細胞においてはるかに高度であった。（図7A）。細胞を、HLA-A2およびNY-ESOの両方に関して陽性であるNalm-6 NY-ESO白血病細胞株と共培養したところ、細胞は高レベルの107aを示し、このことは脱顆粒活性の上昇を指し示している（図7B）。殺傷アッセイからも、この細胞株に対する強力な傷害性が示された（図7C）。このことは、これらの細胞が、GVHDを誘発しないと考えられ、かつTCR処理を受けた通常のT細胞よりも誤対合傷害性が少ないことから、CARおよびTCRを発現するT細胞を用いた従来の臨床試験よりも潜在的により安全であることを指し示している。
【０２９２】
いくつかの報告により、T細胞をZFNまたはTALENによって遺伝的に編集して、内因性αβ TCRの発現を排除させうることが示されている。望まれないαβ TCRを発現するT細胞を選択的に除去するための本明細書に記載の方法および組成物には、GVHDを処置するため、および内因性TCRが（例えば、転写因子との競合を通じて）CAR機能に有害な影響を及ぼすのを阻害するための、内因性TCRの不完全ノックアウトも含まれる。このため、T細胞におけるαおよびβ定常領域配列を永続的に破壊し、それによってTCR発現を排除するためにデザイナーZFNを用いる、遺伝学的アプローチを設計した。
【０２９３】
ZFNおよびTALENは、DNA結合ドメインをDNA切断ドメインと融合させることによって作製された人工的制限酵素である。ZFNおよびTALENが効率的に働かない場合には、その原因を決定することが困難なことがしばしばである。不首尾が設計の問題を反映していることもあれば、標的配列の到達性、または送達の問題を反映していることもある。同時に、T細胞におけるZFNターゲティング効率は低く、そのため複数の遺伝子を同時に操作することが困難になる。
【０２９４】
ZFNおよびTALENとは異なる、CRISPR/Casシステムが、標的指向化された遺伝子変化を誘導するための、ZFNおよびTALENに代わる手軽で効率的な可能性のある選択肢として最近登場している。最近の研究により、Cas9タンパク質による標的認識は、crRNA内部の「シード」配列、およびcrRNA結合領域の上流にある保存されたジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を必要とすることが示されている。CRISPR/CASシステムはそのため、crRNAを再設計することによって、事実上あらゆるDNA配列を切断するように再標的指向化することができる。本明細書において開示されたデータは、293T細胞および初代T細胞におけるCRISPR/CASによる遺伝子編集の可能性を示す。CRISPR/CASシステムは、単一のCAS9タンパク質を2種類またはそれを上回るgRNAと共発現させることによって、複数のゲノム遺伝子座を同時に標的とすることができ、このことはこのシステムを、多重遺伝子編集または標的遺伝子の相乗的活性化のために比類なく適するものとしている。種々のgRNAをCAS9とともに投与することによって、T細胞における複数の遺伝子を同時に破壊することができる。
【０２９５】
実施例6：CRISPRによるHLA CLASS IおよびTCR α、β鎖の三重ノックアウト
悪性腫瘍および感染性疾患に対する「汎用性のある（off-the-shelf）」同種T細胞療法に向けて取り組むために、病原体および悪性腫瘍に対する免疫を再構築するための、T細胞の注入による細胞療法をデザインした。所望の特性を有するT細胞を十分な数でエクスビボで製造するために必要な時間は、患者に対する時間枠とは適合しないことが多い。その上、疾患が進行している患者由来の自己T細胞は、機能が損なわれている可能性、および所望の抗原に対して寛容である可能性がある。
【０２９６】
このことに対処するために、注入した細胞上の異なる主要組織適合抗原または副組織適合抗原を認識する宿主T細胞によって引き起こされる免疫媒介性拒絶反応を回避する目的で、患者に同種T細胞を注入することができる。T細胞療法の用途を広げるため、かつ将来の同種移植のために、TCRおよびHLA-クラスIが破壊された集団の供給源を単離するための、迅速で強固な方法を作り出すことができる。
【０２９７】
ZFNおよびTALENは、Foklエンドヌクレアーゼの切断ドメインと融合された特異的DNA配列と結合するように設計されたジンクフィンガーDNA結合ドメインを含む。複数の遺伝子を操作する必要がある場合には、ZFNおよびTALENの設計および構築は非常に複雑であり、かつ時間を要するが、これは遺伝子を個別に標的としなければならないためである。本明細書に記載のCRISPR系を用いることにより、遺伝子破壊の効率および短縮された時間経過を得ることができる。
【０２９８】
この問題に対処するために、TRAC、TRBCおよびβ-2ミクログロビンを標的とする3種類の異なるgRNAとともにCAS9のエレクトロトランスファーを行った。細胞をPE-抗β-2ミクログロビン抗体によって標識し、臨床的に承認されている常磁性抗PEマイクロビーズおよび除去カラムを用いる陰性選択によってHLA-クラスIneg集団を濃縮した。単一の除去段階により、HLA-クラスIneg集団が99％を上回って濃縮された（図9D）。続いて細胞にTCR α鎖を再導入して、HLA-クラスIneg CD3neg集団をマイクロビーズによって濃縮した（図11）。5日後に、TCR β鎖を細胞に再導入し、HLA-クラスIneg CD3neg集団をマイクロビーズによって再び濃縮した。2日後に、これらの三重ノックアウト細胞へのTCRのエレクトロトランスファーを行った。エレクトロトランスフォーメーション後の翌日に、細胞をCD3/CD28ダイナビーズで刺激した。続いて、翌日に細胞に抗原特異的TCRのレンチウイルス送達を行い、培養拡大を行った。
【０２９９】
実施例7：CRISPRによるFAS、PD1、CTLA4、PPP2R2Dノックアウト
FAS受容体/FASリガンド（FAS/FASL）アポトーシスシグナル伝達経路はT細胞において広く研究され、特徴も明らかにされている。PD1およびCTLA4は、T細胞における2つの主要な抑制性シグナル伝達経路であり、これらも詳細に研究されている。これらの経路のターゲティングが治療に及ぼしうる影響に関する直接的な証拠が前臨床マウス腫瘍モデルを用いた研究で得られており、それはCTLA-4、PD-1またはPD-L1の抗体媒介性遮断後の抗腫瘍免疫の強化を実証している。ヒトに用いるための類似の抗体が開発されており、初期の臨床データからは有望な結果が示されている。Ppp2r2dノックダウンは、T細胞アポトーシスを阻害し、T細胞増殖を強化し、さらにサイトカイン産生も強化することができる。Ppp2r2dはヒトT細胞の機能を向上させるための標的としての可能性がある。
【０３００】
この問題に対処するために、CAS9と、FAS、PD1、CTLA4、PPP2r2dを標的とする3種類の異なるgRNAの、T細胞中へのエレクトロトランスファーを行った。Sangerシークエンシングデータにより、FAS、PD1、CTLA4、PPP2r2dの指定の遺伝子座がCRISPRによって改変された。FASはさらに、CRISPRによって誘発された相同組換えによってGFPと置き換えられていた。FACSデータにより、FASおよびPD1の表面発現が消失したことが示された。
【０３０１】
実施例8：遺伝子改変初代細胞およびT細胞によるIPS細胞の作製
がんおよび感染性疾患に対する養子T細胞療法の進展は、容易に入手可能でかつ抗原特異的なヒトTリンパ球がないことが妨げとなっている。多能性幹細胞はTリンパ球の無制限な供給源となりうる。この問題に対処するために、初代細胞およびT細胞においてFAS、PD1、CTLA4、PPP2r2dの発現を妨害した。
【０３０２】
初代細胞およびT細胞のリプログラミングのために、センダイウイルスを用いた。iPSCを作製するための方法には、ウイルス媒介性遺伝子形質導入および化学誘導を含む多くのものがある。レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターはリプログラミング遺伝子を発現させるために宿主染色体への組込みを必要とするが、DNAベースのベクター、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびプラスミドベクターはエピソーム性に存在し、組込みを必要としない。しかし、それらは依然としてある特定の頻度で宿主染色体に組み込まれる上、リプログラミング効率は比較的低い。同様に、mRNAベースのリプログラミングは複雑であり、効率が極めて低いことが示されている。
【０３０３】
これらの方法とは異なり、センダイウイルスは宿主ゲノムに組み込まれることも宿主細胞の遺伝情報を変えることもない。センダイウイルスはまた、レンチウイルスおよびレトロウイルスベースの遺伝子形質導入と同等のリプログラミング能力も有する。
【０３０４】
24ウェルプレート内の各ウェルに、10万個の野生型、FASneg、CD3neg TCR α鎖およびTCR β鎖ノックアウトT細胞を播種した。細胞をCD3/CD28ビーズで刺激した。刺激後の第3日に、ビーズを取り除いて、細胞を予熱した1mLのT細胞完全培地中に再懸濁させ、続いて、細胞におけるhKlf4、hOct3/4およびhSox2の発現のための多シストロン性ベクターを含む、算出容積のCytoTuneセンダイウイルス（Life Technologies, Carlsbad, CA）とともにインキュベートした。処理したT細胞を24ウェルプレートに播種し、室温、2250rpmで90分間遠心処理した。さらに1mLの完全T細胞培地を各ウェルに添加し、プレートを5％ CO2の加湿雰囲気下で37℃中で一晩インキュベートした。
【０３０５】
形質導入後の翌日に、T細胞を新たな完全培地で洗浄することによってセンダイウイルスを除去し、細胞を2日間培養した。培地の半分を毎日交換した。感染後の第3日に、細胞をMEFフィーダープレートに移し、サイトカインを加えずにT細胞培地中で培養した。感染から4日後に、細胞を標準的なhES培地中で培養した。培地は毎日交換した。およそ第7日にES様コロニーが観察された。第15日からは細胞を馴化hES培地中で培養し、培養をさらに10日間続けた。形質導入からおよそ25〜30日後にコロニーを取り出した。
【０３０６】
およそ第4日の時点で、細胞塊がフィーダー細胞の上に形成されたが、このことはリプログラミング過程の開始を指し示している。T細胞はiPSCへのリプログラミングの過程で劇的な形態変化をきたした。およそ第12日の時点で、辺縁が緩い大きな細胞塊が出現し始めた。およそ第18日の時点で、T細胞は、明確な辺縁を有する典型的なES様コロニーへと形質転換した。典型的な胚性幹細胞形態が観察され、このことはFASneg、CD3neg TCR α鎖およびTCR β鎖ノックアウトT細胞が、所定のリプログラミング条件下で多能性状態へと誘導されたことを指し示している（図17Aおよび18A）。
【０３０７】
FASneg T細胞はiPSCにリプログラミングさせることがより容易であり、その野生型対応物の約5倍の効率であった（図17B）。同様に、CD3neg T細胞のリプログラミングの効率は野生型対応物の約5倍の高さであった（図18B）。p53欠損細胞株は、アポトーシス経路が妨害されていることが理由で、リプログラミングさせることが容易であると報告されている。FASノックアウトはアポトーシス耐性もさらに誘導する。TCR発現の喪失はT細胞をより不健全なものにするが、これはアポトーシスがリプログラミングの過程に重要な役割を果たすことを指し示している。
【０３０８】
実施例9：siRNAによるT細胞におけるTCRのノックダウン
図19は、野生型NY-ESO-1 TCR（wt）、またはβ鎖（S/SD）に第2のジスルフィド結合および脱N-グリコシル化を有する改変NY-ESO-1 TCRのIFN-γ産生を示しているグラフである。内因性T細胞受容体（TCR）をsiRNAによってノックダウンした上でT細胞にRNAのエレクトロポレーションを行った。NY-ESO-1特異的ペプチドであるp156-165と共にパルス刺激を18時間加えたHLA-A2陽性細胞株によるT細胞の刺激後、IFN-γがELISAによって検出された。
【０３０９】
図20Aおよび20Bで構成される図20は、CAS9 RNAおよびgRNAのコエレクトロポレーションによるTCR αノックダウンを示している。エレクトロポレーションから6日後に、CD3を評価することによって細胞をTCR発現に関して分析した。
【０３１０】
図21は、Sangerシークエンシングを示している。結果は、TCR α（TRAC-5）またはTCR β（TRBC-7）をノックダウンするためにCAS9 mRNAおよびgRNAのいずれかのエレクトロポレーションを行った場合の、CD3陰性濃縮T細胞における複数のピークを示している。
【０３１１】
図22は、内因性TCR β（TRB-7）のノックダウンを受けたCD3陰性T細胞が、NY-ESO-1 TCR αおよびβ（1G4LY95 TCR）RNAのエレクトロポレーションから4時間後にCD3を再発現したことを示している一群のグラフである。正常T細胞（ND424ビーズ）を対照として用い、これはほぼ100％がCD3陽性を示し、内因性TCR vb13.1発現は5.25％であった。
【０３１２】
図23A〜23Dで構成される図23は、内因性TCRのノックダウンにより、TCR RNAエレクトロポレーションT細胞の導入遺伝子発現および機能の両方が強化されたことを示している一群のグラフである。図23Aは、TCR siRNAを用いたエレクトロポレーションを受けたT細胞（実線の白抜きヒストグラム）、対照siRNAを用いたエレクトロポレーションを受けたT細胞（点線の白抜きヒストグラム）、およびいずれのsiRNAも有しないT細胞（塗りつぶしたヒストグラム）のTCR発現を示している。図23Bは、TCR siRNA、対照siRNAを用いるか、もしくはsiRNAを用いない、野生型NY-ESO-1 TCR（wt）RNAまたはTCR（SD）RNAのエレクトロポレーションを受けた改変T細胞の導入遺伝子（TCR vb13.1）発現を示している。図23Cは、TCR siRNA、対照siRNAを用いるか、もしくはsiRNAを用いない、野生型NY-ESO-1 TCR（wt）RNAまたはTCR（SD）RNAのエレクトロポレーションを受けた改変T細胞のNY-ESO-1テトラマー染色を示している。図23Dは、TCR siRNAノックダウン、野生型NY-ESO-1 TCR RNAエレクトロポレーションT細胞による、HLA-A2/NY-ESO-1陽性腫瘍株の特異的溶解を示している。
【０３１３】
図24は、マウスモデルへのT細胞の注射後の腫瘍細胞の蛍光を示しているグラフである。NY-ESO-1およびGFP（コメツキムシ緑色タンパク質）の両方を発現するNalm6-CBG-ESO-GFP腫瘍細胞1000万個を、NOD/SCIDマウスに静脈内注射した。腫瘍接種から5日後に、CBR（コメツキムシ赤色タンパク質（click beetle red））の形質導入およびRNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞を種々の群に表記の通りに注射し、腫瘍増殖を生物発光画像（BLI）によってモニターした。
【０３１４】
図25は、CD19BBZ CAR RNA T細胞または改変NY-ESO-1 TCR RNAを種々の時点で投与された2群のマウスの生物発光画像を示している。
【０３１５】
実施例10：レンチウイルス形質導入と、CRISPRを用いたT細胞上のTCR-CD3複合体の破壊との組み合わせによって作製される、汎用的CAR19 T細胞
図26に示されているように、第0日に初代T細胞を抗CD3/抗CD28ビーズで刺激し、続いてレンチ-CAR19による形質導入を行った。フローサイトメトリーによる検出では、細胞の70％超がCAR19陽性であった。遺伝子ノックアウトを媒介するにはCRISPRの一過性発現で十分であることから、TCR α鎖、TCR β鎖の定常領域およびβ-2ミクログロブリン遺伝子を標的とするCAS9およびgRNAのインビトロ転写させたRNAのエレクトロトランスファーを第3日に利用することによってCRISPRを一過性に発現させる「ヒット-エンド-ラン」送達戦略を開発した。エレクトロトランスファーの後にT細胞を32℃で24時間培養し、続いて通常の条件に戻した。
【０３１６】
TCR発現を測定するためには、CD3に対して特異的なモノクローナル抗体を用いた。CD3を選択した理由は、CD3はTCRが発現された時にのみ細胞表面に存在するためである。初代T細胞にCRISPR構築物のエレクトロポレーションを行った（図26）。TCR単一陰性細胞およびTCR/HLA-A二重陰性細胞はCD19提示性K562細胞への曝露によって拡大し、拡大倍率は100を上回った（図27）。
【０３１７】
拡大後に、細胞はTCR単一陰性またはTCR/HLA-A二重陰性を保っており、CAR19陽性集団が濃縮された。内因性TCR発現はTCR単一陰性細胞では陰性に保たれたが、一方、TCR/HLA-A二重陰性T細胞では、K562-CD19により刺激された拡大の後にTCRおよびHLA-A発現が陰性に保たれた（図28A）。K562-CD19により刺激された拡大によって、CAR19陽性細胞は濃縮された（図28B）。
【０３１８】
拡大した汎用的T細胞の大半はCD45RO陽性（図29A）であり、高レベルのCD62L発現（図29B）、中程度レベルのCD28発現（図29A）および低レベルのCCR7発現（図29B）を保っていた。
【０３１９】
CRISPR遺伝子編集は、インビトロでの汎用的CAR19 T細胞の抗腫瘍活性に影響を及ぼさなかった（図30A）。TCRまたはTCR/HLA-Aの除去は、CAR19発現および抗腫瘍活性に対してわずかな影響しか及ぼさなかった（図30Bおよび30C）。TCR単一陰性およびTCR/HLA-A二重陰性CAR19 Tは、Nalm6腫瘍細胞による負荷刺激を加えた場合に強固な溶解能力を示した（図30B）。CD107a放出およびサイトカイン分泌からも、汎用的細胞における強力な抗腫瘍活性が示された（図30C）。TCR単一アブレーションまたはTCRおよびHLA-A二重アブレーションCAR19 T細胞は、CD19発現細胞による負荷刺激後に類似の増殖動態を呈した（図30D）。
【０３２０】
CRISPR/CAS9により編集されたCAR19 T細胞の抗腫瘍活性を検討するために、TCR単一陰性、TCRおよびHLA-A二重陰性CAR19 Tを、Nalm6腫瘍細胞を担持するNSGマウスに注入した。未操作のT細胞を投与されたマウス、およびレンチウイルス性GFP形質導入を受けた野生型T細胞を注入されたマウスはすべて、腫瘍細胞注入後に3週間以内に死亡した。客観的な腫瘍退縮が、CAR19 T細胞を投与されたマウスに関して観察された（図6）。CRISPR/CAS9はCAR19 T細胞のインビボ腫瘍殺傷活性に影響を及ぼさず、このことから、T細胞療法のためにレンチウイルス遺伝子移入とCRISPR/CAS9を組み合わせることの利点が確かめられた。
【０３２１】
T細胞上のTCR α鎖およびβ鎖ならびにHLA-A分子の完全アブレーションにより、細胞にHLAのマッチしない腫瘍細胞株による負荷刺激を加えた場合の非特異的殺傷は完全に消失した（図32A）。HLA-A分子の排除により、長期間の共培養（5日間）後にNK細胞が活性化された。IFNr Elispotアッセイにおいてこれらの細胞に同種全血PBMCによる負荷刺激を24時間行った後に、オフターゲット活性は観察されなかった。オフターゲット活性が見られなかったことは、T細胞が、同種細胞との遭遇後の急性免疫応答において主要な役割を果たしうることを示唆する。これらの結果はすべて、CRISPR/CAS9により編集されたTCR α鎖およびβ鎖ならびにHLA-A分子（三重陰性）T細胞が、汎用的エフェクタードナー細胞の供給源として役立ちうることを示唆する。
【０３２２】
CAS9と、FASを標的とする種々のgRNAの、T細胞中へのエレクトロトランスファーを行った。FASneg細胞を選別し、続いてレンチウイルスCAR19による形質導入を行った。フローサイトメトリーおよびSangerシークエンシングデータにより、FASがCRISPRによって改変されたことが示された（図33）。FASneg T細胞のCAR19遺伝子発現は野生型と同等であった。Nalm6腫瘍細胞との短期間のインキュベーション後であっても、FASneg CAR19 T細胞におけるCD107a発現は、4時間以内の共培養であっても野生型対応物と比較して大きく強化された。
【０３２３】
いくつかの報告により、弱い抗原刺激であっても、FAS活性化が誘発されてT細胞増殖が促進されることが示されている（Rethi, et al, Blood, vol. 112(4):1195-1204, 2008）。興味深いことに、FASneg CAR19 T細胞は、細胞を高レベルのCD19+ K562細胞によって刺激した場合に、野生型CAR19 T細胞よりもはるかに速く拡大した。このことは、高レベル抗原条件下では、FAS/FASLが活性化ではなくアポトーシスを誘発したことを示唆する（図34A）。アネキシンV染色による測定でも、FASneg CAR19 T細胞はアポトーシスレベルの低下をさらに示した（図34B）。
【０３２４】
インビトロで観察されていたように、FASneg T細胞は野生型T細胞と比較して増殖の強化を示した。CAR19 T細胞のTrue Countアッセイを、Nalm6担持マウスへの細胞の注入後に行ったところ、同様の増殖結果が観察された。FASneg CAR19群は、野生型群と比較した場合に、より優れた抗腫瘍活性を示した（図35B）。この差は、これらの2つの群の間の生物発光データを示している図35Cに図示されている。これらのデータは、CART細胞におけるFASアブレーションにより、その抗腫瘍活性が強化されたことを指し示している。
【０３２５】
CAS9と、PD1を標的とする種々のgRNAの、T細胞中へのエレクトロトランスファーを、PSCA-CARによるレンチウイルス形質導入後に行った。PD1ノックアウト細胞は、CD3/CD28ビーズ刺激後に表面PD1発現が陰性であることによって確認した（図36）。PD1陰性細胞をマイクロビーズ除去によって濃縮し、続いてPSCA抗原提示性PC3腫瘍細胞によって刺激した。PSCA-CAR陽性細胞は野生型群およびPD1陰性群の両方において濃縮された。PC3-PSCA-PDL1腫瘍細胞とのインキュベーション後に、PD1発現は野生型PSCA-CAR T細胞の表面上で迅速にアップレギュレートされ、一方、PD1陰性PSCA-CAR T細胞上で検出されたPD1発現は極めて低レベルであった（図37）。PD1陰性PSCA-CAR T細胞も、T細胞活性化のマーカーであるCD137の大きく強化されかつ持続的な高レベルの発現を示し（図37）、このことはPD1/PDL1抑制性シグナル伝達経路が遮断されたことを指し示している。
【０３２６】
インビボのPC3-PSCA-PDL1 NSGモデルにおいて検討したところ、PD1陰性PSCA-CAR T細胞群では野生型群と比較して、抗腫瘍活性の有意な強化が検出され（図38Aおよび38B）、このことはPD1アブレーションにCART細胞療法のための治療的価値があることを示唆する。
【０３２７】
CRISPRにより操作された汎用的CART細胞の移植片対宿主病（GVHD）に対する効果を検討するために、高用量のT細胞を、Nalm6白血病を有するNSGマウスに投与した。マウスに対して二重または三重ノックアウトCART細胞を投与したところ、GVHDを発症する徴候を全く示さなかった。対照的に、対照的に、野生型CD19 CART群のマウス4匹中3匹は第65日までにGVHDを発症し、このことは種々の臓器の組織学的検査によって確かめられた（図39）。
【０３２８】
別の実験では、細胞をFBS中に再懸濁させて、マウスに亜致死的な照射を行った後に静脈内注入した。臨床的GVHDについて週2〜3回モニターした。野生型T細胞の投与を受けたマウス5匹中4匹は、60日間の試験中に死亡したが、一方、PBS投与群、TCR単一アブレーションおよびTCR/HLA-I二重アブレーションを受けたT細胞の投与群はGVHDのいかなる徴候も示さなかった。野生型T細胞の投与を受けたマウスは体重減少をきたした。しかし、PBS投与群、TCR単一アブレーションおよびTCR/HLA-I二重アブレーションを受けたT細胞の投与群では試験期間中に体重が幾分増加した（図40Aおよび40B）。
【０３２９】
レンチウイルスCD19-CAR形質導入後に、T細胞を、Cas9と、CD3、B2MおよびPD1またはFasを標的とするgRNAとを用いて処理した。三重ノックアウト汎用的CART細胞を、Nalm6-PDL1腫瘍を担持するマウスに注射した。PD1/CD3/HLA-I三重ノックアウト細胞の投与を受けたマウスでは、CD3/HLA-I二重ノックアウト細胞と比較してより優れた抗腫瘍活性が観察され、このことからPD1シグナル伝達経路を遮断することの治療的価値がさらに指し示された（図41Aおよび41B）。これらのデータは、CRISPR/Cas9による汎用的CART細胞の処理を強化する方法を与えるものである。
【０３３０】
gRNAは分解されやすいことから、汎用的CART細胞を作製するための簡易化したワンショット方法を開発した。gRNAを、単一のレンチウイルスベクターにおいてCARとともに構成的に発現させた。ナイーブT細胞に対して、CD3/CD28ダイナビーズによる刺激から1日後に、gRNAおよびCARをコードするレンチウイルスによる形質導入を行った。第3日に細胞にCas9 mRNAによるエレクトロポレーションを行った（図42）。このシステムは、1つのベクターによるいくつかの遺伝子の操作を可能にする（図42）。CD3発現は第6日にフローサイトメトリーによって確認された。このワンショットシステムによる処理を受けたT細胞は、種々のCas9 mRNA群のそれぞれにおいて90％の程度で、一貫した遺伝子アブレーションを示した（図43）。
【０３３１】
がんおよび感染性疾患に対する養子T細胞療法の進展は、容易に入手可能でかつ抗原特異的なヒトTリンパ球がないことが妨げとなっている。多能性幹細胞はTリンパ球の無制限な供給源となりうる。この問題に対処するために、初代細胞およびT細胞においてFAS、PD1、CTLA4、PPP2r2dの発現を妨害した。
【０３３２】
初代細胞およびT細胞のリプログラミングのために、センダイウイルスを用いた。iPSCを作製するための方法には、ウイルス媒介性遺伝子形質導入および化学誘導を含む多くのものがある。レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターはリプログラミング遺伝子を発現させるために宿主染色体への組込みを必要とし、DNAベースのベクター、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびプラスミドベクターはエピソーム性に存在し、組込みを必要としないが、それらは依然としてある特定の頻度で宿主染色体に組み込まれる上、リプログラミング効率は比較的低い。同様に、mRNAベースのリプログラミングは複雑であり、効率が極めて低いことが示されている。
【０３３３】
対照的に、センダイウイルスは宿主ゲノムに組み込まれることも宿主細胞の遺伝情報を変えることもない。センダイウイルスはまた、レンチウイルスおよびレトロウイルスベースの遺伝子形質導入と同等のリプログラミング能力も有する。
【０３３４】
24ウェルプレート内の各ウェルに、10万個の野生型、FASneg、CD3neg TCR α鎖およびTCR β鎖ノックアウトT細胞を播種した。細胞をCD3/CD28ビーズで刺激した。刺激後の第3日に、ビーズを取り除いて、細胞を予熱した1mLのT細胞完全培地中に再懸濁させ、続いて、細胞におけるhKlf4、hOct3/4およびhSox2の発現のための多シストロン性ベクターを含む、算出容積のCytoTuneセンダイウイルス（Life Technologies, Carlsbad, CA）とともにインキュベートした。処理したT細胞を24ウェルプレートに播種し、室温、2250rpmで90分間遠心処理した。さらに1mLの完全T細胞培地を各ウェルに添加し、プレートを5％ CO2の加湿雰囲気下で37℃中で一晩インキュベートした。
【０３３５】
形質導入後の翌日に、T細胞を新たな完全培地で洗浄することによってセンダイウイルスを除去し、細胞を2日間培養した。培地の半分を毎日交換した。感染後の第3日に、細胞をMEFフィーダープレートに移し、サイトカインを加えずにT細胞培地中で培養した。感染から4日後に、細胞を標準的なhES培地中で培養した。培地は毎日交換した。およそ第7日にES様コロニーが観察された。第15日からは細胞を馴化hES培地中で培養し、培養をさらに10日間続けた。形質導入からおよそ25〜30日後にコロニーを取り出した。
【０３３６】
およそ第4日の時点で、細胞塊がフィーダー細胞の上に形成されたが、このことはリプログラミング過程の開始を指し示している。T細胞はiPSCへのリプログラミングの過程で劇的な形態変化をきたした（図44A）。およそ第12日の時点で、辺縁が緩い大きな細胞塊が出現し始めた。およそ第18日の時点で、T細胞は、明確な辺縁を有する典型的なES様コロニーへと形質転換した。FASneg T細胞は、野生型対応物の約5倍の効率でiPSCにリプログラミングされた（図44B）。p53欠損細胞株は、アポトーシス経路が妨げられるという理由で、リプログラミングがより容易であると報告されている。FASノックアウトは、類似の機序でリプログラミング過程を助長することができる。
【０３３７】
CD3neg TCR αまたはβ鎖ノックアウトT細胞からリプログラミングされたiPSCのES様形態が観察された（図45A）。この形態は数回の継代後も一定に保たれた。CD3neg T細胞のリプログラミングの効率は野生型対応物の約5分の1の低さであり（図45B）、このことはTCRノックアウトがT細胞リプログラミングの過程においてある役割を果たすこと、またはセンダイウイルス感染後の細胞生存度に影響を及ぼすことを示唆する。図45Cは、CD3neg iPSC細胞のホスファターゼ染色を示している一群の画像である。
【０３３８】
典型的な胚性幹細胞形態が観察され、このことはFASneg、CD3neg TCR α鎖およびβ鎖ノックアウトT細胞が、所定のリプログラミング条件下で多能性状態へと誘導されたことを指し示している。TCR発現の喪失はT細胞をより不健全なものにするが、本明細書に記載のデータは、アポトーシスがリプログラミングの過程に重要な役割を果たすことを指し示している。
【０３３９】
内因性多能性幹細胞遺伝子の誘導は、種々のT-iPSC細胞株においても検出された（図46）。Tra-1-60およびSSEA4の発現に関する免疫染色により、T-iPSC細胞の幹細胞表現型がさらに指し示されている（図47A）。T-iPSCにおけるFasノックアウトはSangerシークエンシングによって確認された（図47B）。
【０３４０】
dCas9およびFokI-Cas9はオフターゲット活性が比較的弱いと報告されている。T細胞を、それらが改変バージョンのCRISPR/dCAS9およびCRISPR/FokI-CAS9システムによって編集されうるか否かについて評価した（図48A）。フローサイトメトリーデータにより、初代T細胞がCRISPR/dCAS9およびCRISPR/FokI-CAS9のいずれによっても編集されたことが示された（図48B）。CRISPR/dCAS9遺伝子ノックアウトシステムは、少なくとも1対のgRNAによる特異性の強化を示し、ノックアウトイベントをより正確で、かつより特異的なものにした。
【０３４１】
T細胞におけるCRISPR/CAS9のオフターゲットイベントを検討するために、オフターゲット部位でのサーベイヤーアッセイを行った。検討した遺伝子について、ゲノム遺伝子座で明らかな切断は観察されなかった（図48C）。
【０３４２】
実施例11：多重ゲノム編集
複数のゲノム遺伝子座を同時に破壊するCRISPR/Cas9システムを用いることによってCART細胞を作製した。このCART細胞は、同種汎用的CART細胞として用いるために、内因性TCR分子およびHLAクラスI（HLA-I）分子の発現に欠損がある。T細胞受容体（TCR）α鎖、TCR β鎖およびβ-2ミクログロブリン（B2M）の遺伝子が、これらの遺伝子を標的とするgRNAとCas9をコードするmRNAとのコエレクトロポレーションによって、高い効率で破壊された。汎用的TCRまたはCART細胞を、CARのレンチウイルス（LV）送達と、内因性TCRおよびB2M遺伝子を同時に破壊するためのCRISPR RNAエレクトロポレーションとを組み合わせることによって作製した。さらに、内因性PD1の破壊により、固形腫瘍モデルにおけるCAR療法の有効性も強化された。
【０３４３】
gRNAの多重送達により、ヒト初代T細胞における複数の遺伝子が、エフェクター機能を損なうことなしに高い効率で破壊される
TCR、HLAおよび他の遺伝子に欠損のある汎用的T細胞を作製するためには、効率的な多重ゲノム編集が必要である。T細胞における効率的な遺伝子破壊を達成するために、CRISPR/gRNA RNAエレクトロポレーションを最適化した。まず、Cas9およびgRNAと、インビトロ転写システムを用いて生成されたRNAとのコエレクトロポレーションを行い（図49、左）、そして、エレクトロポレーションによってCas9 mRNAおよびgRNAをT細胞に一過性に送達するための「ヒット-エンド-ラン」送達戦略を開発した（図49、右）。
【０３４４】
TCR α定常領域（TRAC）またはβ定常領域（TRBC）を単一のエレクトロポレーションを用いてターゲティングする初期の実験では、それぞれ1％〜3％のCD3陰性（CD3neg）T細胞が得られた（図50A、上側のグラフ）。軽度の低体温への一過性曝露がより効率的な遺伝子破壊を可能にしたか否かを明らかにするために、細胞の編集を37℃または32℃で行った。TRACおよびTRBのCRISPR媒介性破壊は、Cas9/gRNAコエレクトロポレーション後にT細胞を32℃で24時間培養した場合には4倍に増加した（図50A、下側のグラフ）。破壊効率が最大となるCas9：gRNAの最適なモル比は1：1〜2：1であり、遺伝子破壊効率はエレクトロトランスファーされたmRNAの量と相関した（図51A）。
【０３４５】
gRNAはmRNAと比較して急速な分解を受けやすく、それがターゲティング効率を限定している可能性がある。このため、gRNAの複数回の逐次的エレクトロポレーションを、初期のCas9/gRNAエレクトロポレーション後に検討した。破壊頻度の顕著な増加がタンパク質レベルで見られ、3回目のgRNAエレクトロポレーション後には細胞の82.4％がCD3negであった（図50B）。クローンシークエンシングからは、3回目のgRNAエレクトロポレーション後にゲノムターゲティング効率が89.4％に達したことが示された（図51B）。サーベイヤーアッセイにより、gRNAの3回目のエレクトロポレーション後には、TRACおよびTRBCのゲノム遺伝子座での切断率がそれぞれ81.7％および49.3％であることが確かめられた（図52）。TRACおよびTRBC標的部位に隣接するSangerシークエンシングデータにおける複数のピークにより、ゲノムリーディングフレームが標的部位の下流に移行したことが確かめられた（図53A）。CRISPR/Cas9によって媒介されたNHEJによって引き起こされた挿入または欠失（インデル）の発生は、クローンシークエンシングによって確かめられた（図53B）。TCRは、単一段階のCD3陰性選択によってTCR/CD3neg集団を99％を上回って濃縮した（99.70±0.20％）（図54）。
【０３４６】
TCR/CD3neg T細胞を拡大する方法を開発するために、TCR/CD3neg T細胞に、CD3発現を回復させるためのHLA-A2制限1G4 NY-ESO-1 TCR（α＋β）RNAを用いてコエレクトロポレーションを行った（図55、左のパネル）。T細胞刺激/拡大方法の後に、以下を比較した：（1）PBMCをフィーダー細胞として用いた迅速T細胞拡大プロトコール（REP）、（2）抗CD3/CD28ダイナビーズ（ビーズ）、または（3）CD28および4-1BBのリガンドを発現するK562ベースの人工的抗原提示細胞（K562 aAPC）をロードしたOKT3。TCR/CD3neg T細胞にもCD19 CAR RNAのエレクトロポレーションを行い（図55、右のパネル）、続いてCD19を発現する照射を受けたK562 aAPC（K562-CD19）によって刺激した。10日間の単回刺激後に、REP、ビーズ、K562 aAPCおよびK562-CD19に関してそれぞれ751.0±217.1、35.7±9.3、46.3±8.5および57.5±5.0という拡大倍率値が達成された（図56）。
【０３４７】
CRISPR/Cas9遺伝子編集がT細胞の表現型および機能に影響を及ぼすか否かを検討するために、種々の方法によって拡大させたTCR/CD3neg T細胞の表現型を検討したところ、拡大した細胞はすべてCD3陰性を保ち、かつ高レベルのCD27を最も保っており（79.8％〜93.4％）、セントラルメモリー細胞の表現型と一致することが示された（図57）。拡大したTCR/CD3neg T細胞に、それらの抗腫瘍活性を検討するためにCD19 CAR mRNAによる2回目のエレクトロポレーションを行った。TCR/CD3neg T細胞の表面CAR発現は対照群のものと同等であった（図58）。TCR/CD3neg CD19 CAR T細胞をCD19+ Nalm6白血病細胞によって刺激したところ、CD19 CAR+ TCR/CD3neg T細胞のCD107aアップレギュレーション（図59A）、サイトカイン分泌（図59C）および殺傷活性（図59B）は、野生型対照細胞のものと同等であった。CD19 CAR TCR/CD3neg T細胞を、Nalm6担持NSGマウスに、それらのインビボ抗腫瘍活性を検討するために注入した。腫瘍退縮は明白であり、有効性はCART19野生型対応物細胞に関するものと同等であった（図59Dおよび59E）。これらの結果は、内因性TCRのCRISPR/Cas9編集が初代T細胞の養子免疫療法に関する機能に有害な影響を及ぼさないことを指し示している。
【０３４８】
TCR α、βおよびB2M三重破壊T細胞のアロ反応性の低下
TCRの再方向付けを行ったT細胞の養子免疫療法のTCR誤対合関連傷害性を防止するにはTCR α鎖およびβ鎖の両方を破壊することが必要であり、HLA-I複合体の組み立ておよび発現のためにはB2Mが必須である。この点から考えて、汎用的T細胞を作製するためにTCR α鎖およびβ鎖ならびにB2M三重破壊を開発した。まず、B2Mを破壊することによってT細胞上のHLA-I発現を排除しうるかを検討した。T細胞に、B2Mを標的とするCas9/gRNA RNAのエレクトロポレーションを行った。この結果、B2MおよびHLA-I二重陰性集団が79.9％生じた。HLA-Ineg集団を陰性選択によってさらに濃縮することができた（図60）。
【０３４９】
TCR α、β鎖およびB2Mを欠く三重ノックアウトT細胞を作製するために、Cas9 mRNAと、TRAC、TRBCおよびB2Mを標的とする3種類の異なるgRNAとのコエレクトロポレーションを行った。その結果、CD3およびHLA-I二重陰性細胞集団は65.4％であった（図61）。二重および三重ノックアウト細胞の強化後に、TCR α鎖およびβ鎖ならびにB2M三重ノックアウトT細胞では、HLAがマッチしない腫瘍細胞株の非特異的殺傷が消失した（図62）。これらの細胞に、IFNγ Elispotアッセイにおいて同種全血照射PBMCによる負荷刺激を加えたところ、応答は観察されなかった（図63、左のパネル）。HLA-I分子のアブレーションによってもアロ反応性は著しく低下し、このことは同種PBMCと照射を受けたB2M破壊細胞との共培養によって確かめられた（図63、右のパネル）。以上の結果は、TCR α鎖およびβ鎖ならびにB2Mを欠く三重陰性T細胞が、宿主免疫系による拒絶反応に抵抗しながら、同時に移植片対宿主病を引き起こすことを不可能にする、養子免疫療法のための汎用的T細胞の供給源として役立つ可能性を示唆する。
【０３５０】
TCR再方向付けを行った内因性TCR破壊T細胞の抗腫瘍活性の向上
TCR α鎖およびβ鎖がCRISPR/Cas9により破壊されたT細胞は、NY-ESO-1 TCR（1G4）による再方向付けを受けた後に、細胞表面上のトランスジェニックTCR発現が増大した。トランスジェニックTCR発現は、TCR α鎖もしくはβ鎖の単一ノックアウトまたはα/β二重ノックアウトでそれぞれ67.6％、78.8％または94.3％であり、これに対して野生型T細胞では46.8％であった。トランスジェニックTCR発現の向上は、特にα/β二重ノックアウトT細胞に関する抗原特異的なCD107a発現の増加（図65A）および細胞傷害性の強化（図65B）によって明らかなように、T細胞機能の強化につながった。
【０３５１】
ある別の実験で、α/β二重ノックアウトT細胞に、異なるNY-ESO-1 TCR（8F）をトランスフェクトさせた。1G4 TCRと対比して、この8F TCRは、トランスジェニックTCR発現（図66；TCR/CD3negでは60.1％、これに対して野生型T細胞（Cas9モックT細胞）では44.7％（約5％の内因性TCR Vβ8バックグラウンドを伴う））および機能（図67AにおけるCD107a発現、および図67Bにおけるサイトカイン産生）の両方に関して高度に有意な向上を示した。これらの結果は、トランスジェニックTCRの発現および機能に対して内因性TCRが異なる影響を及ぼすことを強く示す。
【０３５２】
汎用的CART細胞は抗腫瘍効力を保ち、GVHDを引き起こさない
CD19 CARのLV形質導入とCas9/gRNAのRNAエレクトロポレーションとを組み合わせることによって、汎用的CD19 CART細胞を作製した（図68）。細胞を拡大したところ、残りのCD3neg細胞は高レベルのCD19 CAR発現を有していた（図69）。拡大したT細胞の大半はCD45RO陽性であり、高レベルのCD62L発現および中程度レベルのCD28発現を保っており、これはセントラルメモリー細胞の状態に一致する（図70）。拡大したTCR/HLA-I二重陰性CD19 CARTは、CD107a放出（図71）、サイトカイン分泌（図72）、溶解能力（図73）および増殖（図74）といった頑健なインビトロ抗腫瘍活性を示し、これらは野生型CD19 CART細胞と同程度に効力が強かった。
【０３５３】
T細胞を、播種性Nalm6白血病を担持するNSGマウスに注入した。内因性TCRが破壊されたCART細胞（LV-CD19 CAR TCRneg）またはTCRおよびHLA-Iが同時破壊されたCART細胞（LV-CD19 CAR TCR/HLA-Ineg）を投与されたマウスは、野生型CD19 CART細胞（LV-CD19 CAR）を投与されたマウスと同程度の腫瘍退縮を示し（図75Aおよび75B）、このことはTCRのみの破壊もTCRとB2Mとの破壊もCART細胞の抗腫瘍活性に影響を及ぼさないことを示唆する。
【０３５４】
操作されたT細胞のGVHDに対する効果を検討するために、高用量のT細胞（20×106個/マウス）を、Nalm6白血病を有するNSGマウスに投与した。図76に示されているように、TCR破壊のみを有するCD19 CART細胞（LV-CD19 CAR TCR/CD3neg）またはTCRおよびB2Mの同時破壊を有するCD19 CART細胞（LV-CD19 CAR TCR/HLA-Ineg）を用いて処置されたマウスは、野生型CD19 CAR T細胞（LV-CD19 CAR）を用いて処置されたマウスと同程度の腫瘍退縮を示した。二重または三重ノックアウトCAR T細胞を用いて処置されたマウスはGVHDの徴候を全く発症しなかった。対照的に、野生型CD19 CART（LV-CD19 CAR）群のマウス4匹中3匹は第65日までにGVHDを発症し、このことは種々の臓器の組織学的検査によって確かめられた。このように、TCRのみの破壊もTCRとHLA-Iとの破壊もCART細胞のインビボ抗腫瘍活性に影響を及ぼさず、同時にアロ反応性は排除される。
【０３５５】
初代T細胞へのアデノウイルス性CRISPR送達
CRISPR/Cas9システムは、モデル生物および細胞株において、遺伝子調節および遺伝子編集の目的に急速に活用されるようになっている。ウイルスベクターは、分裂細胞および静止状態の初代細胞を含む、他の細胞型に対してもCRISPRの適用可能性を広げるために特に適すると考えられる。Cas9および単一のガイドRNA（gRNA）分子をコードするアデノウイルス、すなわち第2世代の線維改変型アデノウイルスを、PD1、FasおよびTRAC遺伝子座にCas9ヌクレアーゼを運ぶために用いた（図77）。腫瘍細胞へのアデノウイルス媒介性のCRISPR形質導入により（図78）、最大約71％という高い割合で標的指向化突然変異誘発が生じた（図79Aおよび79B）。アデノウイルスは、それらが静止状態にあっても、CRISPRをヒトT細胞に導入するための有用なプラットフォームとなる。このアプローチは、数多くの実験状況においてCRISPRの遺伝子調節および編集の潜在能力を調査するのに役立つと考えられる。
【０３５６】
エレクトロポレーションの最適化
CD3およびB2Mのノックアウト効率ならびにT細胞拡大を、4mmキュベットおよび2mmキュベットにおけるCas9およびgRNAのエレクトロポレーション（EP）の後に評価した。2mmキュベットを用いる標準的なEP条件（360v/1ms、1回目のEP‐20μg Cas9 RNA＋ 10μg gRNA/100μl T細胞、2回目のEP‐5μg gRNA/100μl T細胞）では、T細胞拡大が約2.7倍の時点でそれぞれ81.8％および88.6％というCD3およびB2Mの最も高いノックアウト率が示され（EP#1）、これに対して対照EP T細胞（EP#12）では拡大倍率が約18.8であった。gRNA用量を減少させると（EP#2〜5）、T細胞拡大は劇的に増加したが、CD3およびB2Mのノックアウト効率に対する影響はわずかであった。図80を参照のこと。4mmキュベットを用いる標準的なEP条件では、CD3およびB2Mのノックアウト効率が著しく低下し（EP#8）、このことは、4mmキュベットを用いるためにはEP条件（電位または/およびパルス幅）をさらに最適化する必要があることを示唆する。
【０３５７】
2mmキュベット（EP#10〜13）または4mmキュベットにおける標準的なエレクトロポレーション（EP）条件と比較した。高いCD3/B2Mノックアウト効率が観察され、T細胞拡大倍率の向上も伴っていた（EP#1および5）。図81を参照のこと。
【０３５８】
60％を上回るCD3/B2Mノックアウト効率で最大限のT細胞拡大倍率を達成する目的でEP条件をさらに最適化するために、種々のEP条件およびRNA量を検討した。この結果、EP#1が（400v/2ms/120μg CAS9 RNA）でありかつEP#2が（500v/1ms/20μg gRNA）であるEP#4に関して比較的高いCD3/B2Mノックアウト効率（CD3に関して63.5％、B2Mに関して84.8％）を伴って拡大倍率の向上が示された。図82を参照のこと。
【０３５９】
EP条件を最適化するために、さらなる実験を行った。その結果、検討した最も好都合な条件と比較して（図82におけるEP#1）、500v/1ms/120μg CAS9 RNA（EP#1）および500v/1ms/20μg gRNA（EP#2）を用いると、CD3/B2Mノックアウト効率およびT細胞拡大の増加が生じた（EP#3）。図83を参照のこと。
【０３６０】
大規模なエレクトロポレーションおよび拡大
大規模エレクトロポレーションによって高いノックアウト効率および拡大効率が得られるか否かを明らかにするための実験を行った。第0日に、抗CD3/抗CD28ビーズを用いて、3人のドナーから入手したT細胞（100×106個/ドナー、0.5×106/mlに濃縮）を刺激した。第1日に、刺激したT細胞にCD19 CARレンチウイルスを形質導入した。50mL（25×106個）のT細胞を非改変T細胞として確保した（第9群）。第3日に、ビーズを取り除いて、各ドナーからの形質導入T細胞をCART/モックEP（10mL、5×106個）およびCART/CRISPR（10mL、50×106個）の2群に分けた。続いて細胞に対してCAS9 RNAによるエレクトロポレーションを行い（1回目のEP）、第1、3、5および7群の細胞を分けた。第4日に、T細胞へのgRNAのエレクトロポレーションを行い、細胞を1×106個/mLとして培養した。第5日および7日に、細胞を分けた。第8日に、CD3+ 細胞を第2、4および6群から取り除いた。第11日に、T細胞を採取して、3人のドナー由来の細胞25×105個を核型分析のために搬送した。
【０３６１】
（表１）実験群
2018500006.tif 000006
【０３６２】
T細胞数（図85の上側のチャート）および拡大倍率（図85の下側のチャート）を、エレクトロポレーションおよび培養手順の後に評価した。CD19 CARのみを形質導入したT細胞（TDのみ）、またはCD19 CARを導入し、かつCRISPRによる編集を行ったT細胞（TD/KO）の拡大倍率を図86の左のグラフに示しており、T細胞の第10日時点の拡大倍率を図86の右のグラフに示している。エレクトロポレーション条件およびCAS9/gRNA用量を最適化することによって、およそ60〜70％というCD3/B2Mノックダウン効率およそ30倍というT細胞拡大が10日後に観察された（図87は第10日時点のCD3/B2M/CAR発現を示している）。
【０３６３】
CD3/CD28ビーズ刺激およびCRISPR RNAエレクトロポレーションの8日後に、CD3陽性T細胞を取り除いた。図88は、第8日時点の3人のドナー集団におけるCD3/B2M発現を示している。第11日に、T細胞を、CD3、B2MおよびCARの発現を検出するためのFACS染色に供した。非形質導入ND463（NOTD）を陰性対照として用いた。図89は、 CD19 CAR TD（形質導入）/CRISPRエレクトロポレーションを行ったCD3除去T細胞；CD19 CAR TD/CRISPRエレクトロポレーションを行ったT細胞；およびCD19 CAR TD T細胞における、CD3およびB2M発現を示している。図90は、CD19 CAR TD/CRISPRエレクトロポレーションを行ったCD3除去T細胞；CD19 CAR TD/CRISPRエレクトロポレーションを行ったT細胞；およびCD19 CAR TD T細胞における、CAR発現を示している。図91は、CD19 CAR TD（形質導入）/CRISPRエレクトロポレーションを行ったCD3除去T細胞；CD19 CAR TD/CRISPRエレクトロポレーションを行ったT細胞；およびCD19 CAR TD T細胞における、第11日時点のCD3/B2M/CAR発現を示している。図92は、種々のT細胞群におけるCD3/B2M/CAR発現をまとめている。
【０３６４】
第11日に、種々のT細胞群を、図93中の表記の通りに、CD19陽性細胞株であるRajiまたはNalm6によって刺激した。K562をCD19陰性対照として用いた。4時間の共培養後に、陰性対照を除くT細胞群のそれぞれで、CD107aアップレギュレーションが検出された。
【０３６５】
第11日に、T細胞の殺傷能力を、図94中の表記の通りに、T細胞とCD19陽性標的細胞であるNalm6-CBGとの共培養後に、発光性細胞傷害性リンパ球（CTL）アッセイを用いて検討した。同じく第11日に、T細胞のサイトカイン産生を、T細胞群をNalm6標的細胞で刺激することによって分析した。図95を参照のこと。
【０３６６】
T細胞を、100 U/mlのIL-2を含有する培地中で最長26日間にわたって培養した。図96に示されているその結果は、3人のドナー由来の、CRISPRにより編集されたT細胞に関して異常なT細胞増殖は観察されなかったことを示している。
【０３６７】
CRISPR/Cas9システムの最も魅力ある用途の1つとして、多重ゲノム編集はT細胞ベースの養子免疫療法を進展させることが大きく期待される。しかし、DNAトランスフェクションのターゲティング効率の低さは、初代T細胞における多重ゲノム操作の使用の制約となっている。Cas9 mRNAおよびgRNAのコエレクトロポレーションを介してT細胞にCRISPRを導入するための「ヒット-エンド-ラン」送達戦略を開発した。最大で3回のgRNAエレクトロポレーションと軽度の低体温への一過性曝露との組み合わせにより、タンパク質レベルで80％を上回るターゲティング効率が、単一の遺伝子破壊では常に達成された。さらに有望なことに、TRAC、TRBCおよびB2Mの三重遺伝子破壊により、精製および選択を全く行わずに、二重陰性CD3およびHLA-Iが約65％得られた。また、これらの結果により、遺伝子破壊T細胞の99％を上回る純度への濃縮を、臨床的に承認された常磁性ビーズを用いて容易に達成しうること、および精製T細胞が10日間で最大500倍に拡大することも実証された。拡大したT細胞は、それらの遺伝子破壊表現型を保っており、セントラルメモリーT細胞と一致する特徴を呈した。破壊されたT細胞はGVHDを引き起こさず、このことはそれらが同種CAR T細胞として用いられうることを示唆する。重要なこととして、遺伝子編集を受けたT細胞は、インビトロおよび種々の腫瘍マウスモデルの両方で抗腫瘍活性を示し、それらは非遺伝子編集T細胞と同程度の効力、またはそれを上回る効力を有した。したがって、合成細胞を作製するための本明細書に記載の過程は、現行のGMPを遵守した製造手順へと容易に変換することができると考えられる。
【０３６８】
本明細書に記載のデータは、CRISPR/Cas9が、初代ヒトT細胞における強力な多重ゲノム編集ツールであることを実証している。これまでの報告により、GVHDを回避するために内因性TCR α鎖およびβ鎖の発現を排除させる目的で、T細胞をZFNまたはTALENによって遺伝的に編集可能であることが示されている。T細胞においてジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）およびTALエフェクターヌクレアーゼTALENによって複数の遺伝子を操作するターゲティング戦略の複雑性が原因で、これまでの研究では、前臨床動物モデルにおいてGVHDおよび宿主対移植片反応を同時に予防することはできていない。また、CRISPR/Cas9によって、またはHLA-Eなどの非古典的HLAクラスI分子の発現による刺激性NKリガンドの除去によって、NK細胞活性化を中断させることもでき、このことは汎用的T細胞をNK細胞媒介性拒絶反応から防御する可能性があると考えられる。
【０３６９】
まとめると、強力な抗腫瘍活性を有し、かつアロ反応性が低下している臨床的規模の汎用的CART細胞を、多重CRISPR技術を用いて効率的に作製することができた。このアプローチは、現行のGMPを遵守した製造手順に組み入れることができ、HIV/AIDSに対するZFNを用いる移入療法が好首尾に臨床に変換されていることを考慮すれば、臨床への変換が行われる可能性は高い。汎用的CAR T細胞およびTCR T細胞は、自己T細胞に代わる選択肢となる可能性がある。それどころか、チェックポイント分子が無効化された汎用的CAR T細胞およびTCR T細胞は、がんおよび感染性疾患に対する自己T細胞を用いる現行のCART療法よりも有効で、かつ用途がより広いと考えられる。
【０３７０】
他の態様
本明細書における変数の定義における要素のリストの記述は、単一の要素または列記された要素の組み合わせ（または部分的組み合わせ）としての、その変数の定義を含む。本明細書における態様の記述は、単一の態様としての、または他の態様もしくはその一部分と組み合わせられた、その態様を含む。
【０３７１】
本明細書で引用した各特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は特定の態様に関連して開示されているが、本発明の他の態様および変形は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような態様および同等の変形を包含するように解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
2018500006.tif 000008
【図１Ｂ】
2018500006.tif 000009
【図１Ｃ】
2018500006.tif 000010
【図２Ａ】
2018500006.tif 000011
【図２Ｂ】
2018500006.tif 000012
【図２Ｃ】
2018500006.tif 000013
【図２Ｄ】
2018500006.tif 000014
【図２Ｅ】
2018500006.tif 000015
【図３Ａ】
2018500006.tif 000016
【図３Ｂ】
2018500006.tif 000017
【図３Ｃ】
2018500006.tif 000018
【図３Ｄ】
2018500006.tif 000019
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2018500006.tif 000021
【図４Ｃ】
2018500006.tif 000022
【図５Ａ】
2018500006.tif 000023
【図５Ｂ】
2018500006.tif 000024
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2018500006.tif 000029
【図８】
2018500006.tif 000030
【図９Ａ】
2018500006.tif 000031
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2018500006.tif 000033
【図９Ｄ】
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【図１０】
2018500006.tif 000035
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
2018500006.tif 000040
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
2018500006.tif 000043
【図１３】
2018500006.tif 000044
【図１４Ａ】
2018500006.tif 000045
【図１４Ｂ】
2018500006.tif 000046
【図１５Ａ】
2018500006.tif 000047
【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
2018500006.tif 000050
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2018500006.tif 000053
【図２１】
2018500006.tif 000054
【図２２】
2018500006.tif 000055
【図２３Ａ】
2018500006.tif 000056
【図２３Ｂ】
2018500006.tif 000057
【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
2018500006.tif 000060
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2018500006.tif 000065
【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図５９Ｃ】
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【図５９Ｄ】
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【図５９Ｅ】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
2018500006.tif 000123
【図７９】
2018500006.tif 000124
【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
2018500006.tif 000138
【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【配列表】
2018500006000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月7日(2017.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸；ならびに
標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸
を含む改変T細胞。
【請求項２】
遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる前記核酸が、アンチセンスRNA、アンチゴマー（antigomer）RNA、siRNA、shRNA、およびCRISPR系からなる群より選択される、請求項1記載の改変T細胞。
【請求項３】
CRISPR系がpAd5/F35-CRISPRベクターを含む、請求項2記載の改変T細胞。
【請求項４】
前記改変TCRが、野生型TCR、高親和性TCRおよびキメラTCRからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の改変T細胞。
【請求項５】
前記改変TCRが少なくとも1つのジスルフィド結合を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の改変T細胞。
【請求項６】
前記改変TCRがTCR α鎖およびTCR β鎖を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の改変T細胞。
【請求項７】
前記改変TCRが、前記鎖のうち少なくとも1つの鎖のC末端に共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項6記載の改変T細胞。
【請求項８】
前記共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項7記載の改変T細胞。
【請求項９】
TCR β鎖が少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、請求項6記載の改変T細胞。
【請求項１０】
TCR α鎖が少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、請求項6記載の改変T細胞。
【請求項１１】
前記改変TCRが少なくとも1つのマウス定常領域を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の改変T細胞。
【請求項１２】
前記改変TCRが、野生型TCRの場合よりも標的細胞表面抗原に対する親和性が高い、請求項1〜11のいずれか一項記載の改変T細胞。
【請求項１３】
標的細胞表面抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原（TAA）、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか一項記載の改変T細胞。
【請求項１４】
共刺激分子をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の改変T細胞。
【請求項１５】
共刺激分子がCD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、請求項14記載の改変T細胞。
【請求項１６】
CD3が少なくとも2つの異なるCD3鎖を含む、請求項15記載の改変T細胞。
【請求項１７】
前記異なるCD3鎖がCD3ζ鎖およびCD3ε鎖である、請求項16記載の改変T細胞。
【請求項１８】
TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸をT細胞に導入する段階；ならびに
標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸をT細胞に導入する段階
を含む、改変T細胞を作製するための方法。
【請求項１９】
遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる前記核酸が、アンチセンスRNA、アンチゴマーRNA、siRNA、shRNA、およびCRISPR系からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
CRISPR系がpAd5/F35-CRISPRベクターを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
TCRをコードする前記核酸がTCR α鎖およびTCR β鎖を含む、請求項18〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
標的細胞表面抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原（TAA）、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、請求項18〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記TCRが、野生型TCR、高親和性TCRおよびキメラTCRからなる群より選択される、請求項18〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
T細胞が、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる、請求項18〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
T細胞を拡大する段階をさらに含む、請求項18〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
T細胞を拡大する段階が、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションを受けたT細胞を培養することを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
キメラ膜タンパク質が、CD3に対する一本鎖可変断片（scFv）を含み、細胞内ドメインが、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの一部分を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
T細胞を拡大する段階が、T細胞を、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともに培養することを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
T細胞を凍結保存する段階をさらに含む、請求項18〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
T細胞に前記核酸を導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸を導入する段階が、拡大されたT細胞に形質導入を行うこと、拡大されたT細胞にトランスフェクションを行うこと、および拡大されたT細胞にエレクトロポレーションを行うことからなる群より選択される、請求項18〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
共刺激分子をコードするRNAをT細胞中にエレクトロポレーションする段階をさらに含む、請求項18〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
共刺激分子がCD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
T細胞の多能性を誘導するためにT細胞においてKlf4、Oct3/4およびSox2を発現させる段階をさらに含む、請求項18〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
請求項1〜17のいずれか一項記載の改変T細胞を含む、対象における免疫亢進と関連した疾患または状態を処置するための薬学的組成物。
【請求項３６】
請求項1〜17のいずれか一項記載の改変T細胞を含む、対象における状態を処置するための薬学的組成物。
【請求項３７】
前記状態が自己免疫疾患である、請求項36記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
自己免疫疾患が、後天性免疫不全症候群（AIDS）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病（AIED）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ALPS）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎（celiac sprue-dermatitis hepetiformis）；慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（CIPD）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（PSS）、これは全身性硬化症（SS）としても知られる）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項37記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記状態が、がんである、請求項36記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項39記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項1〜17のいずれか一項記載の改変T細胞を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための薬学的組成物。
【請求項４２】
標的細胞または組織の溶解を誘導する、請求項41記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
誘導される溶解が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）である、請求項42記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
請求項1〜17のいずれか一項記載の改変T細胞を含む、養子細胞移入療法において対象にとって有害である免疫反応を予防または処置するための薬学的組成物。
【請求項４５】
その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、請求項1〜17のいずれか一項記載の改変T細胞の使用。
【請求項４６】
請求項18記載の方法に従って作製された、改変T細胞を含む組成物。
【請求項４７】
請求項18記載の方法に従って作製された改変T細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
別の態様において、本明細書に記載の方法は、標的細胞または組織の溶解、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）などを誘導する段階をさらに含む。
[本発明1001]
TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸；ならびに
標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸
を含む改変T細胞。
[本発明1002]
遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる前記核酸が、アンチセンスRNA、アンチゴマー（antigomer）RNA、siRNA、shRNA、およびCRISPR系からなる群より選択される、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1003]
CRISPR系がpAd5/F35-CRISPRベクターを含む、本発明1002の改変T細胞。
[本発明1004]
前記改変TCRが、野生型TCR、高親和性TCRおよびキメラTCRからなる群より選択される、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1005]
前記改変TCRが少なくとも1つのジスルフィド結合を含む、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1006]
前記改変TCRがTCR α鎖およびTCR β鎖を含む、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1007]
前記改変TCRが、前記鎖のうち少なくとも1つの鎖のC末端に共刺激シグナル伝達ドメインを含む、本発明1006の改変T細胞。
[本発明1008]
前記共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインである、本発明1007の改変T細胞。
[本発明1009]
TCR β鎖が少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、本発明1006の改変T細胞。
[本発明1010]
TCR α鎖が少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、本発明1006の改変T細胞。
[本発明1011]
前記改変TCRが少なくとも1つのマウス定常領域を含む、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1012]
前記改変TCRが、野生型TCRの場合よりも標的細胞表面抗原に対する親和性が高い、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1013]
標的細胞表面抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原（TAA）、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1014]
共刺激分子をコードする外因性核酸をさらに含む、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1015]
共刺激分子がCD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、本発明1014の改変T細胞。
[本発明1016]
CD3が少なくとも2つの異なるCD3鎖を含む、本発明1015の改変T細胞。
[本発明1017]
前記異なるCD3鎖がCD3ζ鎖およびCD3ε鎖である、本発明1016の改変T細胞。
[本発明1018]
TCR α鎖、TCR β鎖、β-2ミクログロブリン、HLA分子、CTLA-4、PD1およびFASからなる群より選択される内因性遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸をT細胞に導入する段階；ならびに
標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体（TCR）をコードする核酸をT細胞に導入する段階
を含む、改変T細胞を作製するための方法。
[本発明1019]
遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる前記核酸が、アンチセンスRNA、アンチゴマーRNA、siRNA、shRNA、およびCRISPR系からなる群より選択される、本発明1018の方法。
[本発明1020]
CRISPR系がpAd5/F35-CRISPRベクターを含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
TCRをコードする前記核酸がTCR α鎖およびTCR β鎖を含む、本発明1018の方法。
[本発明1022]
標的細胞表面抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原（TAA）、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、本発明1018の方法。
[本発明1023]
前記TCRが、野生型TCR、高親和性TCRおよびキメラTCRからなる群より選択される、本発明1018の方法。
[本発明1024]
T細胞が、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる、本発明1018の方法。
[本発明1025]
T細胞を拡大する段階をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1026]
T細胞を拡大する段階が、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションを受けたT細胞を培養することを含む、本発明1025の方法。
[本発明1027]
キメラ膜タンパク質が、CD3に対する一本鎖可変断片（scFv）を含み、細胞内ドメインが、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの一部分を含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
T細胞を拡大する段階が、T細胞を、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともに培養することを含む、本発明1025の方法。
[本発明1029]
T細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1030]
T細胞に前記核酸を導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記核酸を導入する段階が、拡大されたT細胞に形質導入を行うこと、拡大されたT細胞にトランスフェクションを行うこと、および拡大されたT細胞にエレクトロポレーションを行うことからなる群より選択される、本発明1018の方法。
[本発明1032]
共刺激分子をコードするRNAをT細胞中にエレクトロポレーションする段階をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1033]
共刺激分子がCD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
T細胞の多能性を誘導するためにT細胞においてKlf4、Oct3/4およびSox2を発現させる段階をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1035]
本発明1001の改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物をその必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫亢進と関連した疾患または状態を処置する方法。
[本発明1036]
本発明1001の改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法。
[本発明1037]
前記状態が自己免疫疾患である、本発明1036の方法。
[本発明1038]
自己免疫疾患が、後天性免疫不全症候群（AIDS）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病（AIED）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ALPS）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎（celiac sprue-dermatitis hepetiformis）；慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（CIPD）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（PSS）、これは全身性硬化症（SS）としても知られる）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記状態が、がんである、本発明1036の方法。
[本発明1040]
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
本発明1001の改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法。
[本発明1042]
標的細胞または組織の溶解を誘導する段階をさらに含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
誘導される溶解が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）である、本発明1042の方法。
[本発明1044]
本発明1001の改変T細胞を含む有効量の薬学的組成物を、対象にとって有害である免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法。
[本発明1045]
その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本発明1001の改変T細胞の使用。
[本発明1046]
本発明1018の方法に従って作製された、改変T細胞を含む組成物。
[本発明1047]
本発明1018の方法に従って作製された改変T細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【国際調査報告】
2018500006.tif 000142